КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ БЕЛКОВЫЙ МАТЕРИАЛ И СОЕДИНЕНИЯ, СОДЕРЖАЩИЕ НЕОКИСЛЯЮЩИЕСЯ СТРУКТУРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
COMPOSITION CONTAINING PROTEIN MATERIAL AND COMPOUNDS WHICH CONTAIN UNOXIDISABLE STRUCTURAL ELEMENTS OF FATTY ACIDS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Было показано, что применением сочетания не подвергающихся β-окислению структурных элементов жирных кислот и белкового материала достигаются неожиданные синергические эффекты. Настоящее изобретение относится к композиции, полученной комбинированием соединений, содержащих не подвергающиеся β-окислению структурные элементы жирных кислот и белковый материал, и к применению указанной композиции для изготовления фармацевтической или пищевой композиции для профилактики и/или лечения резистентности к инсулину, ожирения, диабета, жировой инфильтрации печени, гиперхолестеринемии, дислипидемии, атеросклероза, коронарной болезни сердца, тромбоза, стеноза, вторичного стеноза, инфаркта миокарда, инсульта, повышенного кровяного давления, эндотелиальной дисфункции, состояния повышенной свертываемости крови, синдрома поликистоза яичников, метаболического синдрома, злокачественной опухоли, воспалительных нарушений и пролиферативных нарушений кожи. Указанная композиция также может использоваться в качестве дополнительного компонента в корме для повседневного кормления животных в целях влияния на состав тканей их организма в общем, конкретно на состав жирных кислот.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В более ранних патентных заявках автор изобретения описал лечебное применение не подвергающихся β-окислению аналогов жирных кислот по настоящему изобретению для лечения и профилактики ожирения (NO 2000 5461), диабета (NO 2000 5462), первичного и вторичного стеноза (NO 2000 5463), злокачественной опухоли (NO 2002 5930), пролиферативных нарушений кожи (NO 2003 1080), воспалительных и аутоиммунных нарушений (NO 2003 2054). В других более ранних патентных заявках автор изобретения описал лечебное применение белковых материалов по настоящему изобретению, включая белковый материал одноклеточных организмов (NO 2003 3082) и гидролизат белков рыбы (NO 2003 3078).
Неожиданно авторы настоящего изобретения показали, что применение сочетания не подвергающихся β-окислению структурных элементов жирных кислот с белковым материалом достигаются синергические полезные биологические эффекты. Авторы изобретения показали, что сочетание не подвергающихся β-окислению структурных элементов жирных кислот с белковым материалом приводит к снижению концентрации в плазме холестерина, триглицеридов и фосфолипидов и к повышению активности ацил-CoA-оксидазы жиров. Кроме того, авторы изобретения описывают, каким образом не подвергающиеся β-окислению структурные элементы жирных кислот и белковый материал могут быть непосредственно добавлены в корм для животных. Корм является легко перевариваемым, и для него было показано неожиданное действие на состав жирных кислот у животных. На основе этих неожиданных открытий, ожидается, что сочетание не подвергающихся β-окислению структурных элементов жирных кислот и белкового материала будет обладать повышенным профилактическим и/или терапевтическим действием на все заболевания, против которых эффективны не подвергающиеся β-окислению структурные элементы жирных кислот, по сравнению с эффектом структурных элементов жирных кислот в отдельности.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к применению препарата, содержащего сочетание:
1) ферментированного и/или гидролизованного белкового материала,
2) одного или нескольких соединений, содержащих не подвергающийся β-окислению структурный элемент жирной кислоты, представленный
2
2n+1
2
2
2
2
2
(a) общей формулой R''-COO-(CH)-X-R', где Х представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO и группу SO; и R'' представляет собой атом водорода или алкильную группу, содержащую от 1 до 4 атомов углерода; при условии, что по меньшей мере один Х представляет собой не CH, и/или
(b) общей формулой (I),
где R1, R2 и R3 представляют собой
i) атом водорода; или
ii) группу формулы CO-R, где R представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, и главная цепь указанного R содержит от 1 до 25 атомов углерода; или
2
2n+1
2
2
2
2
iii) группу формулы СО-(CH)-X-R', где Х представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO и группу SO;
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
3
6
2
iv) структурный элемент, выбранный из группы, содержащей - POCHCHNHCOOH (фосфатидилсерин), POCHCHNH (фосфатидилэтаноламин), POCHCHN(СН) (фосфатидилхолин), POCHCHOHCHOH (фосфатидилглицерин) и РО(СНОН) (фосфатидилинозитол); где R1, R2, и R3 выбраны независимо из i), ii), iii) или iv), но по меньшей мере один из R1, R2, или R3 определяется как iii); при условии, что по меньшей мере один Х представляет собой не СН, и/или
(с) общей формулой (II),
где A1, A2 и A3 выбраны независимо и представляют собой атом кислорода, атом серы или группу N-R4, в которой R4 представляет собой атом водорода или линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, содержащую от 1 до 5 атомов углерода;
где R1, R2 и R3 представляют собой
i) атом водорода или линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, содержащую от 1 до 23 атомов углерода; или
ii) группу формулы CO-R, в которой R представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, и главная цепь указанного R содержит от 1 до 25 атомов углерода; или
2
2n+1
2
2
2
2
iii) группу формулы СО-(СН)-X-R', где Х представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO и группу SO;
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
3
6
iv) структурный элемент, выбранный из группы, содержащей - POCHCHNHCOOH (фосфатидилсерин), POCHCHNH (фосфатидилэтаноламин), POCHCHN(СН) (фосфатидилхолин), POCHCHOHCHOH (фосфатидилглицерин) и РО(СНОН) (фосфатидилинозитол);
2
где R1, R2, и R3 выбраны независимо из i), ii), iii) или iv), но по меньшей мере один из R1, R2, или R3 определяется как iii); при условии, что по меньшей мере один Х представляет собой не CH, и/или
соли, пролекарства или комплекса соединений по пп.(а)-(с) для получения фармацевтической или пищевой композиций для профилактики и/или лечения резистентности к инсулину, ожирения, диабета, жировой инфильтрации печени, гиперхолестеринемии, дислипидемии, атеросклероза, коронарной болезни сердца, тромбоза, стеноза, вторичного стеноза, инфаркта миокарда, инсульта, повышенного кровяного давления, эндотелиальной дисфункции, состояния повышенной свертываемости крови, синдрома поликистоза яичников, метаболического синдрома, злокачественной опухоли, воспалительного нарушения и пролиферативного нарушения кожи.
Предпочтительно, указанная профилактика и/или лечение злокачественной опухоли включает в себя ингибирование: первичных и вторичных новообразований, роста опухолей, инвазии первичной опухоли в соединительную ткань и формирования вторичных опухолей; при этом воспалительное нарушение выбрано из группы, содержащей иммуноопосредованные нарушения, такие как ревматоидный артрит, системный васкулит, системная красная волчанка, системная склеродермия, дерматомиозит, полимиозит, различные аутоиммунные эндокринные нарушения (например, тиреоидит и адреналит), различные иммуноопосредованные неврологические нарушения (например, рассеянный склероз и миастению), различные сердечно-сосудистые нарушения (например, миокардит, застойная сердечная недостаточность, артериосклероз и стабильная и нестабильная стенокардия и гранулематоз Вегенера), воспалительные заболевания кишечника и болезнь Крона, неспецифический колит, панкреатит, нефрит, холестаз/фиброз печени, острое и хроническое отторжение трансплантата после трансплантации органа и заболевания, которые обладают воспалительным компонентом, такие как, например, болезнь Альцгеймера или нарушенная/способная к улучшению когнитивная функция.
Указанное пролиферативное нарушение кожи выбрано из группы, содержащей псориаз, атопический дерматит, неспецифический дерматит, первично ирритантный контактный дерматит, аллергический контактный дерматит, ламеллярный ихтиоз, эпидермолитический гиперкератоз, предзлокачественный индуцированный действием солнца кератоз и себорею.
Далее, изобретение относится к применению корма для животных, содержащего общепринятые компоненты корма и сочетание:
1) ферментированного и/или гидролизованного белкового материала,
2) одного или нескольких соединений, содержащих не подвергающиеся β-окислению структурные элементы жирных кислот, представленные
2
2n+1
2
2
2
2
2
(a) общей формулой R''-COO-(CH)-X-R', где Х представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO и группу SO; и R'' представляет собой атом водорода или алкильную группу, содержащую от 1 до 4 атомов углерода; при условии, что по меньшей мере один Х представляет собой не СН, и/или
(b) общей формулой (I),
где R1, R2 и R3 представляют собой
i) атом водорода; или
ii) группу формулы CO-R, где R представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, и главная цепь указанного R содержит от 1 до 25' атомов углерода; или
2
2n+1
2
2
2
2
iii) группу формулы СО-(СН)-X-R', где Х представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу CH, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO и группу SO;
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
3
6
iv) структурный элемент, выбранный из группы, содержащей - POCHCHNHCOOH (фосфатидилсерин), POCHCHNH (фосфатидилэтаноламин), POCHCHN(СН) (фосфатидилхолин), POCHCHOHCHOH (фосфатидилглицерин) и РО(СНОН) (фосфатидилинозитол);
2
где R1, R2, и R3 выбраны независимо из i), ii), iii) или iv), но по меньшей мере один из R1, R2, или R3 определяется как iii); при условии, что по меньшей мере один Х представляет собой не СН, и/или
(с) общей формулой (II),
где A1, A2 и A3 выбраны независимо и представляют собой атом кислорода, атом серы или группу N-R4, в которой R4 представляет собой атом водорода или линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, содержащую от 1 до 5 атомов углерода;
где R1, R2 и R3 представляют собой
i) атом водорода или линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, содержащую от 1 до 23 атомов углерода; или
ii) группу формулы CO-R, где R представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, и главная цепь указанного R содержит от 1 до 25 атомов углерода; или
2
2n+1
2
2
2
2
iii) группу формулы СО-(СН)-X-R', где Х представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу CH, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO и группу SO;
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
3
3
3
2
2
3
6
iv) структурный элемент, выбранный из группы, содержащей - POCHCHNHCOOH (фосфатидилсерин), POCHCHNH (фосфатидилэтаноламин), POCHCHN(СН) (фосфатидилхолин), POCHCHOHCHOH (фосфатидилглицерин) и РО(СНОН) (фосфатидилинозитол);
2
где R1, R2, и R3 выбраны независимо из i), ii), iii) или iv), но по меньшей мере один из R1, R2, или R3 определяется как iii); при условии, что по меньшей мере один Х представляет собой не СН, и/или
соли, пролекарства или комплекса соединений по пп.(а)-(с) для улучшения общего состава липидов в организме животного.
Предпочтительно, улучшение общего состава липидов включает в себя снижение общего уровня липидов в организме, более предпочтительно, снижение общего уровня насыщенных жирных кислот в организме или увеличение общего уровня n-3 жирных кислот в организме.
При этом указанный белковый материал выбран из группы, включающей белковый материал одноклеточных организмов (SCP), гидролизат белков рыбы и ферментированный белковый материал сои, в частности, Gendaxin.
Далее, соединение, содержащее не подвергающийся β-окислению структурный элемент жирной кислоты представляет собой не подвергающуюся (3-окислению жирную кислоту, в частности, тетрадецилтиоуксусную кислоту (ТТА), тетрадецилселеноуксусную кислоту и/или 3-тиа-15-гептадецин; а Х представляет собой атом серы или атом селена.
Соединение, содержащее не подвергающийся β-окислению структурный элемент жирной кислоты, может представлять собой фосфолипид, где указанный фосфолипид выбран из группы, содержащей фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин и/или дифосфатидилглицерин.
Конкретнее, соединение, содержащее не подвергающийся β-окислению структурный элемент жирной кислоты может представлять собой производное фосфатидилхолина 1,2-дитетрадецилтиоацетоил-sn-глицеро-3-фосфохолин, производное фосфатидилэтаноламина 1,2-дитетрадецилтиоацетоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, или моно-, ди- или триацилглицерид, в частности, триацилглицерид, содержащий тетрадецилтиоуксусную кислоту (ТТА).
Композиция согласно изобретению дополнительно может включать растительный и/или рыбий жир, который содержит полиненасыщенные жирные кислоты, например, подсолнечное масло, соевое масло и оливковое масло.
Предпочтительно, указанную композицию вводят или дают с пищей животному или человеку. Животное может представлять собой сельскохозяйственное животное, такое как куриные, млекопитающие, относящиеся к крупному рогатому скоту, овцам, козам или свиньям, или комнатное животное, такое как собака или кошка; кроме того, указанное животное может представлять собой рыбу или моллюсков, таких как лосось, треска, тиляпия, двустворчатые моллюски, устрицы, омар или крабы.
Суточная доза соединений, содержащих не подвергающиеся β-окислению структурные элементы жирных кислот составляет приблизительно 1-200 мг/кг, предпочтительно 5-50 мг/кг, для употребления человеком, и приблизительно 1-2000 мг/кг, предпочтительно 5-500 мг/кг, для потребления животными.
Суточная доза белкового материала составляет приблизительно 5-500 мг/кг, предпочтительно 50-300 мг/кг, для употребления человеком, и от 5 мг/кг вплоть до общих суточных затрат белка для потребления животными.
Суточная доза масла составляет приблизительно 1-300 мг/кг, предпочтительно 10-150 мг/кг, для употребления человеком и от 1 мг/кг вплоть до общих суточных затрат жиров для потребления животными.
Корм для животных согласно изобретению может представлять собой пищевую композицию, ветеринарную композицию, и/или функциональный пищевой продукт.
Далее, изобретение относится к композиции для профилактики и/или лечения резистентности к инсулину, ожирения, диабета, жировой инфильтрации печени, гиперхолестеринемии, дислипидемии, атеросклероза, коронарной болезни сердца, тромбоза, стеноза, вторичного стеноза, инфаркта миокарда, инсульта, повышенного кровяного давления, эндотелиальной дисфункции, состояния повышенной свертываемости крови, синдрома поликистоза яичников, метаболического синдрома, злокачественной опухоли, воспалительного нарушения и пролиферативного нарушения кожи, где указанная композиция содержит сочетание:
1) ферментированного и/или гидролизованного белкового материала,
2) одного или нескольких соединений, содержащих не подвергающиеся β-окислению структурные элементы жирных кислот, представленные
2
2n+1
2
2
2
2
2
(а) общей формулой R''-COO-(CH)-X-R', где X представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO и группу SO; и R'' представляет собой атом водорода или алкильную группу, содержащую от 1 до 4 атомов углерода; при условии, что по меньшей мере один Х представляет собой не СН, и/или
(b) общей формулой (I),
где R1, R2 и R3 представляют собой
i) атом водорода; или
ii) группу формулы CO-R, где R представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, и главная цепь указанного R содержит от 1 до 25 атомов углерода; или
2
2n+1
2
2
2
2
iii) группу формулы СО-(СН)-X-R', где Х представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO и группу SO;
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
3
6
iv) структурный элемент, выбранный из группы, содержащей - POCHCHNHCOOH (фосфатидилсерин), POCHCHNH (фосфатидилэтаноламин), POCHCHN(СН) (фосфатидилхолин), POCHCHOHCHOH (фосфатидилглицерин) и РО(СНОН) (фосфатидилинозитол);
2
где R1, R2, и R3 выбраны независимо из i), ii), iii) или iv), но по меньшей мере один из R1, R2, или R3 определяется как iii); при условии, что по меньшей мере один Х представляет собой не СН, и/или
(с) общей формулой (II),
где A1, A2 и A3 выбраны независимо и представляют собой атом кислорода, атом серы или группу N-R4, в которой R4 представляет собой атом водорода или линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, содержащую от 1 до 5 атомов углерода;
где R1, R2 и R3 представляют собой
i) атом водорода или линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, содержащую от 1 до 23 атомов углерода; или
ii) группу формулы CO-R, в которой R представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, и главная цепь указанного R содержит от 1 до 25 атомов углерода; или
2
2n+1
2
2
2
2
iii) группу формулы СО-(СН)-X-R', где Х представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO и группу SO;
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
3
3
3
2
2
3
6
iv) структурный элемент, выбранный из группы, содержащей - POCHCHNHCOOH (фосфатидилсерин), POCHCHNH (фосфатидилэтаноламин), POCHCHN(СН) (фосфатидилхолин), POCHCHOHCHOH (фосфатидилглицерин) и РО(СНОН) (фосфатидилинозитол);
2
где R1, R2, и R3 выбраны независимо из i), ii), iii) или iv), но по меньшей мере один из R1, R2, или R3 определяется как iii); при условии, что по меньшей мере один Х представляет собой не СН, и/или
соли, пролекарства или комплекса соединений по пп.(а)-(с).
Предпочтительно, вышеуказанный белковый материал выбран из группы, включающей белковый материал одноклеточных организмов (SCP), гидролизат белков рыбы и ферментированный белковый материал сои (например, Gendaxin).
Также предпочтительно, композиция по изобретению содержит суточную дозу соединения, содержащего не подвергающийся β-окислению аналог жирной кислоты, приблизительно 1-200 мг/кг, предпочтительно 5-50 мг/кг, для употребления человеком и приблизительно 1-2000 мг/кг, предпочтительно 5-500 мг/кг, для потребления животными.
Кроме того, композиция может дополнительно содержать растительный и/или рыбий жир; соединение, содержащее не подвергающийся β-окислению структурный элемент жирной кислоты, представляет собой не подвергающуюся β-окислению жирную кислоту, в частности, тетрадецилтиоуксусную кислоту (ТТА), тетрадецилселеноуксусную кислоту и/или 3-тиа-15-гептадецин; а Х представляет собой атом серы или атом селена.
Кроме того, соединение, содержащее не подвергающийся β-окислению структурный элемент жирной кислоты, может представлять собой фосфолипид, выбранный из группы, содержащей фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин, и/или дифосфатидилглицерин; или производное фосфатидилхолина 1/2-дитетрадецилтиоацетоил-sn-глицеро-3-фосфохолин; или производное фосфатидилэтаноламина 1,2-дитетрадецилтиоацетоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин.
Альтернативно, соединение, содержащие не подвергающийся β-окислению структурный элемент жирной кислоты, представляет собой моно-, ди- или триацилглицерид, содержащий тетрадецилтиоуксусную кислоту (ТТА).
В соответствии с изобретением, растительный или рыбий жир содержит полиненасыщенные жирные кислоты и выбран из группы, содержащей подсолнечное масло, соевое масло и оливковое масло.
Предпочтительно, композиция содержит суточную дозу белкового материала приблизительно 5-500 мг/кг, предпочтительно 50-300 мг/кг, для употребления человеком и от 5 мг/кг вплоть до общих суточных затрат белка для потребления животными.
Кроме того, композиция согласно изобретению может содержать суточную дозу масла приблизительно 1-300 мг/кг, предпочтительно 10-150 мг/кг, для употребления человеком и от 1 мг/кг вплоть до общих суточных затрат жиров для потребления животными.
При этом композиция может представлять собой корм для животных, дополнительно содержащий общепринятые компоненты корма, например корм для рыб, в частности, корм для лосося, а общепринятые компоненты корма содержат рыбную муку и/или рыбий жир.
Изобретение также относится к способу получения продукта животного происхождения с улучшенной композицией жирных кислот, предусматривающему кормление животного, предназначенного для получения продукта, кормом для животных, содержащим общепринятые компоненты корма и сочетание:
1) ферментированного и/или гидролизованного белкового материала,
2) одного или нескольких соединений, содержащих не подвергающиеся β-окислению структурные элементы жирных кислот, отображаемых
2
2n+1
2
2
2
2
2
(а) общей формулой R''-COO-(CH)-X-R', где Х представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу CH, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO и группу SO; и R'' представляет собой атом водорода или алкильную группу, содержащую от 1 до 4 атомов углерода; при условии, что по меньшей мере один Х представляет собой не СН, и/или
(b) общей формулой (I),
где R1, R2 и R3 представляют собой
i) атом водорода; или
ii) группу формулы CO-R, где R представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, и главная цепь указанного R содержит от 1 до 25 атомов углерода; или
2
2n+1
2
2
2
2
iii) группу формулы СО-(CH)-X-R', где Х представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO и группу SO;
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
3
3
3
2
2
3
6
iv) структурный элемент, выбранный из группы, содержащей - POCHCHNHCOOH (фосфатидилсерин), POCHCHNH (фосфатидилэтаноламин), POCHCHN(СН) (фосфатидилхолин), POCHCHOHCHOH (фосфатидилглицерин) и РО(СНОН) (фосфатидилинозитол);
2
где R1, R2, и R3 выбраны независимо из i), ii), iii) или iv), но по меньшей мере один из R1, R2, или R3 определяется как iii); при условии, что по меньшей мере один Х представляет собой не СН, и/или
(с) общей формулой (II),
где A1, A2 и A3 выбраны независимо и представляют собой атом кислорода, атом серы или группу N-R4, в которой R4 представляет собой атом водорода или линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, содержащую от 1 до 5 атомов углерода;
где R1, R2 и R3 представляют собой
i) атом водорода или линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, содержащую от 1 до 23 атомов углерода; или
ii) группу формулы CO-R, в которой R представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, и главная цепь указанного R содержит от 1 до 25 атомов углерода; или
2
2n+1
2
2
2
2
iii) группу формулы СО-(CH)-X-R', где Х представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу CH, группу SO и группу SO;
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
3
3
3
2
2
3
6
iv) структурный элемент, выбранный из группы, содержащей - POCHCHNHCOOH (фосфатидилсерин), POCHCHNH (фосфатидилэтаноламин), POCHCHN(СН) (фосфатидилхолин), POCHCHOHCHOH (фосфатидилглицерин) и РО(СНОН) (фосфатидилинозитол);
2
где R1, R2, и R3 выбраны независимо из i), ii), iii) или iv), но по меньшей мере один из R1, R2, или R3 определяется как iii); при условии, что по меньшей мере один Х представляет собой не СН, и/или
соли, пролекарства или комплекса соединений по пп.(а.)-(с).
Вышеуказанный продукт животного происхождения может представлять собой мясной продукт, продукт на основе масла или продукт на основе кожи.
Далее, изобретение относится к применению препарата, содержащего комбинацию:
1) белкового материала и
2) растительного масла или рыбьего жира, в которой белковый материал выбран из группы, включающей белковый материал одноклеточных организмов (SCP), гидролизат белков рыбы, ферментированный белковый материал сои, предпочтительно Gendaxin, для получения фармацевтической или пищевой композиции для профилактики и/или лечения гиперхолестеринемии и состояний, на которые негативно влияют повышенные уровни холестерина, резистентности к инсулину, ожирения, диабета, жировой инфильтрации печени, дислипидемии, атеросклероза, коронарной болезни сердца, тромбоза, стеноза, вторичного стеноза, инфаркта миокарда, инсульта, повышенного кровяного давления, эндотелиальной дисфункции, состояния повышенной свертываемости крови, синдрома поликистоза яичников, метаболического синдрома, злокачественной опухоли, воспалительных нарушений и пролиферативных нарушений кожи.
При этом растительное масло или рыбий жир содержит полиненасыщенные жирные кислоты, и растительное масло выбрано из группы, содержащей подсолнечное масло, соевое масло и оливковое масло.
Указанная профилактика и/или лечение злокачественной опухоли, предпочтительно, включает в себя ингибирование:
первичных и вторичных новообразований, роста опухолей, инвазии первичной опухоли в соединительную ткань и формирования вторичных опухолей.
В соответствии с изобретением, воспалительное нарушение выбирают из группы, содержащей иммуноопосредованные нарушения, такие как ревматоидный артрит, системный васкулит, системная красная волчанка, системная склеродермия, дерматомиозит, полимиозит, различные аутоиммунные эндокринные нарушения (например, тиреоидит и адреналит), различные иммуноопосредованные неврологические нарушения (например, рассеянный склероз и миастению), различные сердечно-сосудистые нарушения (например, миокардит, застойная сердечная недостаточность, артериосклероз и стабильная и нестабильная стенокардия и гранулематоз Вегенера), воспалительные заболевания кишечника и болезнь Крона, неспецифический колит, панкреатит, нефрит, холестаз/фиброз печени, острое и хроническое отторжение трансплантата после трансплантации органа и заболевания, которые обладают воспалительным компонентом, такие как, например, болезнь Альцгеймера или нарушенная/способная к улучшению когнитивная функция.
При этом указанное пролиферативное нарушение кожи может быть выбрано из группы, содержащей псориаз, атопический дерматит, неспецифический дерматит, первично ирритантный контактный дерматит, аллергический контактный дерматит, ламеллярный ихтиоз, эпидермолитический гиперкератоз, предзлокачественный индуцированный действием солнца кератоз и себорею.
Предпочтительно, композицию согласно изобретению вводят или дают с пищей животному или человеку, где животное представляет собой сельскохозяйственное животное, такое как куриные, млекопитающие, относящиеся к крупному рогатому скоту, овцам, козам или свиньям; или комнатное животное, такое как собака или кошка; кроме того, животное может представлять собой рыбу или моллюсков, таких как лосось, треска, тиляпия, двустворчатые моллюски, устрицы, омар или крабы.
Суточная доза белкового материала может составлять приблизительно 5-500 мг/кг, предпочтительно 50-300 мг/кг, для употребления человеком, и от 5 мг/кг вплоть до общих суточных затрат белка для потребления животными.
Суточная доза масла может составлять приблизительно 1-300 мг/кг, предпочтительно 10-150 мг/кг, для употребления человеком и от 1 мг/кг вплоть до общих суточных затрат жиров для потребления животными.
При этом корм для животных по изобретению может представлять собой пищевую композицию, ветеринарную композицию, и/или функциональный пищевой продукт.
Изобретение далее относится к композиции для профилактики и/или лечения гиперхолестеринемии и состояний, на которые негативно влияют повышенные уровни холестерина, резистентности к инсулину, ожирения, диабета, жировой инфильтрации печени, дислипидемии, атеросклероза, коронарной болезни сердца, тромбоза, стеноза, вторичного стеноза, инфаркта миокарда, инсульта, повышенного кровяного давления, эндотелиальной дисфункции, состояния повышенной свертываемости крови, синдрома поликистоза яичников, метаболического синдрома, злокачественной опухоли, воспалительных нарушений и пролиферативных нарушений кожи, содержащей комбинацию:
1) белкового материала и
2) растительного масла или рыбьего жира,
в которой белковый материал выбран из группы, включающей белковый материал одноклеточных организмов (SCP), гидролизат белков рыбы, ферментированный белковый материал сои, предпочтительно Gendaxin.
В указанной композиции, растительное масло или рыбий жир содержит полиненасыщенные жирные кислоты, причем растительное масло выбрано из группы, содержащей подсолнечное масло, соевое масло и оливковое масло.
Композиция может содержать суточную дозу белкового материала приблизительно 5-500 мг/кг, предпочтительно 50-300 мг/кг, для употребления человеком и от 5 мг/кг вплоть до общих суточных затрат белка для потребления животными.
Также, композиция может содержать суточную дозу масла приблизительно 1-300 мг/кг, предпочтительно 10-150 мг/кг, для употребления человеком и от 1 мг/кг вплоть до общих суточных затрат жиров для потребления животными.
Предпочтительно, композиция может представлять собой корм для животных, дополнительно содержащий общепринятые компоненты корма.
Более предпочтительно, корм для животных представляет собой корм для рыб, в частности, для лосося, а общепринятые компоненты корма содержат рыбную муку и/или рыбий жир.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к применению препарата, содержащего сочетание:
1) белкового материала,
2) одного или нескольких соединений, содержащих не подвергающиеся β-окислению структурные элементы жирных кислот, представленные
2
2n+1
2
2
2
2
(a) общей формулой R''-COO-(CH)-X-R', где Х представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу СН, группу SO и группу SO; и R'' представляет собой атом водорода или алкильную группу, содержащую от 1 до 4 атомов углерода; и/или
(b) общей формулой (I),
где R1, R2 и R3 представляют собой
i) атом водорода; или
ii) группу формулы CO-R, в которой R представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, и главная цепь указанного R содержит от 1 до 25 атомов углерода; или
2
2n+1
2
2
2
2
iii) группу формулы CO-(CH)-X-R', где X представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу CH, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу CH, группу SO и группу SO;
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
3
3
3
2
2
3
6
iv) структурный элемент, выбранный из группы, содержащей -POCHCHNHCOOH (серин), POCHCHNH (этаноламин), POCHCHN(CH) (холин), POCHCHOHCHOH (глицерин) и PO(CHOH) (инозитол); где R1, R2, и R3 выбраны независимо из i), ii), iii) или iv), но по меньшей мере один из R1, R2, или R3 определяется как iii); и/или
(c) общей формулой (II),
где A1, A2 и A3 выбраны независимо и представляют собой атом кислорода, атом серы или группу N-R4, в которой R4 представляет собой атом водорода или линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, содержащую от 1 до 5 атомов углерода;
где R1, R2 и R3 представляют собой
i) атом водорода или линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, содержащую от 1 до 23 атомов углерода; или
ii) группу формулы CO-R, в которой R представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, и главная цепь указанного R содержит от 1 до 25 атомов углерода; или
2
2n+1
2
2
2
2
iii) группу формулы CO-(CH)-X-R', где X представляет собой атом серы, атом селена, атом кислорода, группу CH, группу SO или группу SO; n представляет собой число от 0 до 11; и R' представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, где главная цепь указанного R' содержит от 13 до 23 атомов углерода и необязательно одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу CH, группу SO и группу SO;
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
3
3
3
2
2
3
6
iv) структурный элемент, выбранный из группы, содержащей -POCHCHNHCOOH (серин), POCHCHNH (этаноламин), POCHCHN(CH) (холин), POCHCHOHCHOH (глицерин) и PO(CHOH) (инозитол);
где R1, R2 и R3 выбраны независимо из i), ii), iii) или iv), но по меньшей мере один из R1, R2, или R3 определяется как iii); и/или
соли, пролекарства или комплекса соединений по пп. (a)-(c).
В предпочтительном варианте осуществления соединения по этому изобретению по меньшей мере один из R1, R2 или R3 представляет собой алкил.
В предпочтительном варианте осуществления соединения по этому изобретению по меньшей мере один из R1, R2 или R3 представляет собой алкен.
В предпочтительном варианте осуществления соединения по этому изобретению по меньшей мере один из R1, R2 или R3 представляет собой алкин.
В предпочтительном варианте осуществления соединения по этому изобретению по меньшей мере один из R1, R2 или R3 представляет собой тетрадецилтиоуксусную кислоту.
В предпочтительном варианте осуществления соединения по этому изобретению по меньшей мере один из R1, R2 или R3 представляет собой тетрадецилселеноуксусную кислоту.
Предпочтительными вариантами осуществления соединений по этому изобретению являются не подвергающиеся β-окислению жирные кислоты.
В предпочтительном варианте осуществления соединения по этому изобретению X представляет собой атом серы или атом селена.
Предпочтительными вариантами осуществления соединений по этому изобретению являются тетрадецилтиоуксусная кислота (TTA), тетрадецилселеноуксусная кислота и 3-тиа-15-гептадецин.
В предпочтительном варианте осуществления соединения по этому изобретению n представляет собой 0 или 1.
В предпочтительном варианте осуществления соединения по этому изобретению указанное соединение представляет собой фосфолипид, где указанный фосфолипид выбран из группы, содержащей фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин, дифосфатидилглицерин.
В предпочтительном варианте осуществления соединения по этому изобретению указанное соединение представляет собой триацилглицерин.
В предпочтительном варианте осуществления соединения по этому изобретению указанное соединение представляет собой диацилглицерин.
В предпочтительном варианте осуществления соединения по этому изобретению указанное соединение представляет собой моноацилглицерин.
В предпочтительном варианте осуществления соединения по этому изобретению указанное соединение представляет собой производное фосфатидилхолина (PC) 1,2-дитетрадецилтиоацетоил-sn-глицеро-3-фосфохолин.
В предпочтительном варианте осуществления соединения по этому изобретению указанное соединение представляет собой производное фосфатидилэтаноламина (PE) 1,2-дитетрадецилтиоацетоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин.
Предпочтительными вариантами осуществления соединений по этому изобретению являются моно-, ди- или триацилглицериды.
Предпочтительными вариантами осуществления соединений по этому изобретению являются триацилглицериды, содержащие тетрадецилтиоуксусную кислоту (TTA).
В предпочтительном варианте осуществления соединения формулы (II) каждый из A1 и A3 представляет собой атом кислорода, в то время как A2 представляет собой атом серы или группу N-R4, в которой R4 представляет собой атом водорода или линейную или разветвленную алкильную группу, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную, содержащую от 1 до 5 атомов углерода.
Соединения по этому изобретению являются аналогами природных соединений и по существу распознаются теми же системами, которые перерабатывают природные соединения, включая ферменты, которые осуществляют β-окисление и в некоторых случаях ω-окисление природных длинноцепочечных жирных кислот. Аналоги отличаются от их природных эквивалентов тем, что они не могут полностью окисляться таким способом.
2
2n+1
Соединения по этому изобретению могут представлять собой не подвергающиеся β-окислению аналоги жирных кислот, как представлено формулой R''CCO-(CH)-X-R'. Однако указанные соединения также могут представлять собой более сложные структуры, полученные из одного или нескольких из указанных не подвергающихся β-окислению аналогов жирных кислот, как представлено общими формулами (I) или (II). Эти соединения представляет собой аналоги природных моно-, ди- и триацилглицеринов или фосфолипидов, включая фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин и дифосфатидилглицерин. Указанные соединения также могут содержать замену в остове глицерина, как представлено в формуле (II). Указанного замещения кислорода(ов) достигают замещением кислорода(ов) группой, содержащей серу или азот. Это может блокировать гидролиз перед захватом в тонком кишечнике, таким образом, повышая биодоступность соединений.
Указанные выше комплексные структуры, полученные из одного или нескольких из указанных не подвергающихся β-окислению структурных элементов жирных кислот, оказывают свой эффект вследствие того, что они содержат аналоги жирных кислот, которые не способны к полному β-окислению. Указанные комплексные структуры могут оказывать эффект в качестве целых структур и в качестве образованных вследствие природной деградации продуктов, содержащих аналоги жирных кислот. Вследствие того, что соединения не способны к полному β-окислению, они накапливаются и это запускает повышение β-окисления природных жирных кислот. Множество эффектов соединений по этому изобретению являются следствием такого повышения β-окисления.
2
2
В процессе β-окисления ферментативно окисленная жирная кислота расщепляется между атомами углерода 2 и 3 (если считать от карбоксильного конца жирной кислоты), что приводит к удалению двух атомов углерода с каждой стороны участка окисления в виде уксусной кислоты. Эта стадия затем повторяется с только что укороченной на два атома углерода жирной кислотой и снова повторяется до тех пор, пока жирная кислота не окислится полностью. β-окисление является обычным путем, которым in vivo осуществляется катаболизм большинства жирных кислот. Блокирования β-окисления соединениями по этому изобретению достигают встраиванием не подвергающейся окислению группы в положение X формулы по настоящему изобретению. Вследствие того, что механизм β-окисления хорошо известен, X определяется как S, O, SO, SO, CH или Se. Специалист в данной области может допустить, без изобретательского уровня, что эти соединения все будут блокировать β-окисление аналогичным образом.
2
2
Кроме того, соединения могут содержать более одного блока, т.е. в дополнение к X, R' может необязательно содержать одну или несколько гетерогрупп, выбранных из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу CH, группу SO и группу SO. В качестве примера, для того, чтобы вызвать изменения в деградации жирной кислоты и, таким образом, получить модулированный эффект, в качестве X можно встроить два или три атома серы. Большое количество атомов серы в некоторой степени также приводит к изменению полярности и стабильности. С фармакологической точки зрения для избежания или предотвращения проблем, связанных с устойчивостью, как правило, более желательно иметь возможность получить набор соединений, чем только одно соединение.
2
2
2n+1
2
В дополнение к структуре X, его положение также является предметом обсуждения. Расстояние от X до карбоксильного конца жирной кислоты определяется тем, какое количество групп CH находится между X и карбоксильным концом жирной кислоты, которое определятся как (CH), где n представляет собой число от 0 до 11. Таким образом, получается нечетное число групп CH, то есть положение X относительно карбоксильной группы такое, при котором X в итоге блокирует β-окисление. Диапазон значений n выбран так, чтобы включать все варианты аналога жирных кислот, который обладает требуемым биологическим эффектом. Поскольку теоретически β-окисление может действовать на молекулы неограниченной длины, n может представлять собой бесконечную величину, однако на практике это не так. Длина жирных кислот, которые в норме подвергаются β-окислению, как правило, составляет от 14 до 24 атомов углерода, и такая длина, таким образом, является наиболее оптимальной для осуществления ферментативного β-окисления. Таким образом, диапазоны n и R' приведены так, чтобы структурные элементы жирных кислот охватывали этот диапазон. (Аналогично для того, чтобы получить аналоги природных соединений параметр ii) формул (I) и (II) определяет R, как обладающий от 1 до 25 групп углерода, и параметр i) формулы (II) определяет алкильную группу, как содержащую от 1 до 23 атомов углерода.) Общее количество атомов углерода в остове жирной кислоты предпочтительно составляет между 8 и 30, наиболее предпочтительно между 12 и 26. Этот диапазон размеров также является желательным для захвата структурных элементов жирных кислот по настоящему изобретения и их транспорта через клеточные мембраны.
Несмотря на то, что аналоги жирных кислот с нечетным положением блокатора β-окисления X, удаленным от карбоксильного конца, блокируют окисление, величина их биологического эффекта может варьировать. Это происходит вследствие различия времени биологической деградации для различных соединений. Авторы изобретения провели эксперименты с целью показать эффект дальнейшего удаления X от карбоксильного конца жирной кислоты. В этих экспериментах активность (нмоль/мин/мг/белок) митохондриального β-окисления аналогов жирных кислот в печени измеряли при наличии серы в 3, 5 и 7 положениях относительно карбоксильного конца. Активность составляла 0,81 для серы в 3 положении, 0,61 для серы в 5 положении, 0,58 для серы в 7 положении и 0,47 для пальмитиновой кислоты, не блокирующего β-окисление контроля. Как ожидалось, это показывает, что β-окисление действительно блокируется аналогами жирных кислот с различным положением блока, и что их эффект снижается при дальнейшем удалении положения блока от карбоксильного конца, вследствие того, что требуется больше времени для достижения блока при β-окислении, так что к тому времени деградируется большее количество жирных кислот. Однако поскольку отклонение является значительным при переходе от 3 к 5 положению, но небольшим при переходе от 5 к 7 положению, то обоснованно можно предположить, что при продвижении вдоль цепи это отклонение будет далее уменьшаться, и, таким образом, что к тому моменту, когда совсем не будет наблюдаться никакого эффекта (по сравнению с контролем), положение, безусловно, окажется значительно удаленным.
Таким образом, обоснованным является включение в качестве соединений по настоящему изобретению структурных элементов жирных кислот и других соединений, представленных общими формулами (I) и (II), (которые содержат указанный аналог(и) жирной кислоты), которые блокируют β-окисление на различных расстояниях от карбоксильного конца аналогов, как соединений по настоящему изобретению, действительно блокирующих β-окисление, даже если эффект может быть модулированным. Это модулирование в конечном итоге может различаться при истощающих условиях; в различных тканях, при истощающих дозировках, и при изменении аналога жирных кислот, так чтобы он не легко распадался, как описано далее. Таким образом, обоснованным является включение в формулу всех расстояний блокатора β-окисления от карбоксильного конца аналога жирной кислоты, которые являются биологически пригодными.
Несмотря на то, что структурные элементы жирных кислот, как описано, с блоком в положении X не могут подвергаться β-окислению, они тем не менее могут подвергаться ω-окислению. Это значительно менее универсальный и более медленный биологический процесс, при котором происходит окисление жирных кислот не с карбоксильного конца, а предпочтительнее с метильной/гидрофобной концевой группы, здесь обозначаемой R'. При этом каскаде атом углерода с ω-конца жирной кислоты гидроксилируется членом семейства ферментов цитохрома P450. Затем эта гидроксилированная жирная кислота превращается алкогольдегидрогеназой в альдегид, и затем этот альдегид превращается альдегиддегидрогеназой в карбоксильную группу. В результате, конечным продуктом каскада является дикарбоновая жирная кислота, которая может далее деградироваться ω-окислением с ω-конца.
Полагают, что ω-окисление является главным путем деградации структурных элементов жирных кислот, как описано, с блоком в положении X. Таким образом, проводили эксперименты, где R' изменяли для блокирования ω-окисления введением тройной связи в метильный конец аналога жирной кислоты. Результатом этого оказался аналог жирной кислоты 3-тиа-15-гептадецин, для которого при тестировании были показаны следующие ожидаемые результаты: существенно увеличенное время деградации in vivo. Это является важным для применения структурных элементов жирных кислот в фармацевтическом препарате, поскольку это может усиливать эффекты подвергающихся β-окислению структурных элементов жирных кислот дальнейшим снижением их распада.
С другой стороны, как в случае блокирования β-окисления, общепринятой практикой является выявление других структурных элементов жирных кислот, которые будут блокировать ω-окисление точно таким же способом, на основе знаний о том, как происходит ω-окисление. Например, двойная связь будет обладать таким же эффектом, как и тройная связь, и, таким образом, в определение метильной/гидрофобной концевой группы молекулы, обозначаемой здесь R', включается, что она может быть насыщенной или ненасыщенной. Разветвление также может приводить к блокированию окисления, так что группа R' определяется как линейная или разветвленная.
2
2
1
4
1
4
2
5
1
4
В целях блокирования ω-окисления встраиванием заместителя в R', указанный R' может быть замещен в одном или нескольких положениях гетерогруппой, выбранной из группы, содержащей атом кислорода, атом серы, атом селена, атом кислорода, группу CH, SO и группу SO. R' также может быть замещен одним или несколькими соединениями, выбранными из группы, содержащей фторид, хлорид, гидрокси, C-Салкокси, C-Салкилтио, C-Сацилокси или C-Салкил.
Таким образом, соединения в соответствии с настоящим изобретением представляют собой либо жирные кислоты, аналогичные природным жирным кислотам, которые не способны подвергаться β-окислению, либо природные липиды, содержащие указанные аналоги жирных кислот. Было показано, что in vivo структурные элементы жирных кислот строго предпочтительно встраиваются в фосфолипиды. В некоторых случаях действительно является предпочтительным имитировать свойства и встраивать структурные элементы жирных кислот в природные липиды, такие как моно-, ди- и триглицериды и фосфолипиды. Это приводит к изменению всасывания соединений (при сравнении жирных кислот с жирными кислотами, встраиваемыми в более крупные липидные структуры) и может повышать биодоступность или стабильность.
Например, можно получать комплекс встраиванием жирной кислоты(кислот), которая не способна подвергаться β-окислению, в триацилглицерин. Такие соединения охватываются формулами (I) и (II). При пероральном приеме такого триацилглицерина, например, в продукте корма для животных, он, вероятно, будет транспортироваться подобно любому триацилглицерину из тонкого кишечника в хиломикронах и из печени в липопротеинах крови для запасания в жировой ткани или использования в мышцах, сердце или печени, с гидролизом триацилглицерина до глицерина и 3 свободных жирных кислот. Свободные жирные кислоты на данном этапе окажутся исходным соединением по настоящему изобретению, и не будут более представлять собой комплекс.
Другие возможные глицерофосфолипидные производные жирных кислот по настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилинозитолы, фосфатидилсерины и фосфатидилглицерины.
Другим способом этерификации жирных кислот, выявленным in vivo, который легко можно использовать для получения комплекса с соединением по настоящему изобретению, может являться получение спирта или полиспирта, соответствующего жирной кислоте, например, можно получить производное сфинголипида, такое как церамид или сфингомиелин, получением соответствующего аминоспирта. Подобно глицерофосфолипидным комплексам, такие комплексы могут быть в высокой степени нерастворимыми в воде и менее гидрофильными. Эти типы гидрофобных комплексов по настоящему изобретению будут легче проходить через биологические мембраны.
Другими возможными полярными комплексами по настоящему изобретению могут быть, но не ограничиваться ими, лизофосфолипиды, фосфатидиновая кислота, алкоксисоединения, глицероуглеводороды, ганглиозиды и цереброзиды.
Несмотря на то, что могут существовать большие структурные различия между различными соединениями, содержащими не подвергающиеся β-окислению структурные элементы жирных кислот по настоящему изобретению, можно ожидать, что биологические функции всех таких соединений являются очень сходными вследствие того, что все они блокируют β-окисление сходным образом. Такая неспособность структурных элементов жирных кислот к β-окислению (и в некоторых случаях, к ω-окислению) приводит к накоплению аналогов в митохондриях, которые запускают β-окисление in vivo природных жирных кислот, которое в свою очередь приводит к множеству биологических эффектов соединений, содержащих структурные элементы жирных кислот по настоящему изобретению. (Berge RK et al. (2002) Curr Opin Lipidol 13(3):295-304).
Каскад β-окисления жирных кислот представляет собой главный путь метаболизма жиров. Начальная и скорость-лимитирующая реакция осуществляются ацил-CoA-оксидазой в пероксисомах печени. Ацил-CoA-оксидаза катализирует дегидрогенизацию ацил-CoA-тиоэфиров до соответствующего транс-2-еноил-CoA. Аналог жирной кислоты формулы (I), тетрадецилтиоуксусную кислоту (TTA), авторы изобретения ранее использовали для анализа различных биологических эффектов жирных кислот. Для настоящего изобретения анализировали ее действие на ацил-CoA-оксидазу, а также эффект белкового материала, отдельно или в сочетании.
Конкретный белковый материал, анализируемый здесь, представляет собой ферментированный белковый материал сои. Также в процессе анализа авторами настоящего изобретения находится белковый материал одноклеточных организмов и гидролизат белков рыбы. Несмотря на то, что эти материалы представляют собой комплекс и содержат не только белок, авторы настоящего изобретения полагают, что в качестве активного ингредиента выступает белковая часть, усиливая лечебные эффекты не подвергающихся β-окислению жирных кислот по настоящему изобретению. Исходя из результатов для ферментированного белкового материала сои, описанного здесь, авторы настоящего изобретения ожидают сходных результатов для белкового материала одноклеточных организмов и гидролизата белка рыбы.
При анализе на наличие активности ацил-CoA-оксидазы для TTA отдельно, было показано значительное повышение активности по сравнению с отрицательным контролем. Ферментированный белковый материал сои отдельно практически не обладал активностью. Но при совместном применении TTA и ферментированного белкового материала сои, активность ацил-CoA-оксидазы была более чем в два раза выше по сравнению с активностью TTA отдельно. Такое усиление TTA в качестве активатора ацил-CoA-оксидазы ферментированным белковым материалом сои оказалось совершенно неожиданным. Усиление определенно нельзя было объяснить аддитивным эффектом TTA и ферментированного белкового материала сои; неожиданный синергический эффект оказался значительно более сильным.
Для настоящего изобретения, также анализировали действие не подвергающихся β-окислению структурных элементов жирных кислот на уровень фосфолипидов в плазме, а также действие ферментированного белкового материала сои, отдельно или в сочетании с TTA. TTA приводила к снижению уровня фосфолипидов по сравнению с контролем, в то время как ферментированный белковый материал сои по существу незначительно повышал уровень фосфолипидов. Однако при совместном применении TTA и ферментированного белкового материала сои, уровень фосфолипидов неожиданно снижался в большей степени, чем уровень для TTA отдельно. Такое усиление ферментированным белковым материалом сои TTA в качестве средства, снижающего уровень фосфолипидов в плазме, оказалось совершенно неожиданным. Как в случае активности ацил-CoA-оксидазы усиление также нельзя объяснить аддитивным эффектом TTA и ферментированного белкового материала сои.
Для настоящего изобретения, также анализировали эффект не подвергающихся β-окислению структурных элементов жирных кислот, а также эффект ферментированного белкового материала сои, отдельно или в сочетании с TTA, на уровень холестерина в плазме. Также анализировали эффекты рыбьего жира отдельно, с TTA, с ферментированным белковым материалом сои, или как с TTA, так и c ферментированным белковым материалом сои. Было показано, что TTA отдельно приводит к значительному снижению уровня холестерина в плазме, и ферментированный белковый материал сои или рыбий жир отдельно также обладают эффектом снижения уровня холестерина. Для ферментированного белкового материала сои и рыбьего жира также было показано снижение уровня холестерина в большей степени, чем для каждого из них по отдельности. При добавлении рыбьего жира или ферментированного белкового материала сои к TTA, эффект снижения уровня холестерина оказался неожиданно более высоким, чем эффект TTA отдельно. При одновременном добавлении всех трех компонентов: TTA, рыбьего жира и ферментированного белкового материала сои, эффект в отношении снижения уровня холестерина был наибольшим. Такой эффект синергии между TTA, рыбьим жиром и ферментированным белковым материалом сои оказался совершенно неожиданным.
Было показано, что TTA снижает уровень триглицеридов в плазме вследствие увеличения количества митохондрий и стимуляции митохондриального β-окисления обычных насыщенных и ненасыщенных жирных кислот до кетоновых тел (Froyland L et al. (1997) J Lipid Res 38:1851-1858). Для настоящего изобретения, было выявлено, что такой эффект дополнительно неожиданно усиливается добавлением ферментированного белкового материала сои. В этих экспериментах, результаты для ферментированного белка сои оказались совершенно удивительными и неожиданными. TTA, как и ожидалось, снижает уровень триглицеридов. Ферментированный белок сои отдельно по существу повышает уровень триглицеридов на 30% по сравнению с контролем, но тем не менее усиливает эффект TTA в отношении снижения уровня триглицеридов на 50%. Эти синергические эффекты также оказались очень неожиданными.
Для настоящего изобретения, анализировали эффект кормления атлантического лосося кормом, содержащим не подвергающиеся β-окислению аналоги жирных кислот, обычные компоненты корма и ферментированный белковый материал сои. В примере 2.1, корм для рыб состоял из покрытых обычных кормовых гранул с рыбьим жиром, включающих TTA и ферментированный белковый материал сои. Такой корм затем использовали в примере 2.2 в качестве питания для атлантического лосося, и наличие TTA оказывало благоприятные эффекты на полученный таким образом корм для рыб по сравнению с эквивалентным кормом без TTA (примеры 2.3 и 2.4).
Обычные используемые кормовые гранулы содержат главным образом рыбную кормовую муку, немного пшеницы и витаминные и минеральные добавки. Масло, используемое для покрытия гранул, также было морского происхождения, из мойвы, и содержало различные количества смешанной с ним TTA. В таблице 1 описаны состав и химическая композиция рационов. Корм представлял собой обычный корм, хорошо подходящий для анализируемых видов (в этом примере атлантический лосось), для которого при добавлении TTA были показаны благоприятные эффекты.
Как ранее было показано в этой заявке, TTA, введенная совместно с белком обладает дополнительным полезным эффектом по сравнению с эффектом TTA отдельно. Тот факт, что этот обычный корм является кормом с высоким содержанием жиров и белков и с низким содержанием углеводов, вероятно, усиливает полезные эффекты TTA по сравнению с эффектами TTA, вводимой отдельно, или совместно с питанием с большим количеством углеводов.
В примере 2.4 определяли эффекты конкретного белкового материала, ферментированного белкового материала сои. Ферментированный белковый материал сои получают в результате ферментации бобов сои. Он содержит модифицированные и немодифицированные белки сои и изофлавоны, а также другие составляющие сои. В предпочтительном варианте осуществления по этому изобретению используется ферментированный белковый материал сои Gendaxin.
В таблице 2 описан состав жирных кислот рационов. В составе жирных кислот рационов существовали совсем незначительные различия (все содержали приблизительно 100% рыбий жир), процентное содержание n-3 жирных кислот (FA) было практически одинаковым. Рацион, в который была добавлена TTA, при этом, приводил к значительным изменениям процентного содержания в составе n-3 жирных кислот фосфолипидов (PL), триацилглицеринов (TAG) и свободных жирных кислот (FFA) в жабрах, сердце и в печени атлантического лосося. Введение TTA в течение 8 недель также приводило к снижению процентного содержания насыщенных FA практически во всех липидных фракциях. Процентное содержание n-3 FA, особенно DHA, повышалось в жабрах и сердце, как можно видеть в примере 2.3.
Атлантический лосось, которого кормили рационом, содержащим TTA, рос медленнее, чем рыбы, которых кормили контрольным рационом. Уровень липидов в организме рыб, которых кормили рационом с добавлением TTA, был значительно более низким, чем уровень у рыб, которых кормили контрольным рационом.
Существуют благоприятные действия на здоровье самих рыб, которых кормили кормом по этому изобретению. У старых рыб может развиваться склероз артерий и приводить к проблемам со здоровьем, как и у человека, и снижение липидов оказывает благоприятный эффект в этом отношении.
В общем, полагают, что постные сорта мяса, полученные способом по настоящему изобретению, являются полезными у большинства видов животных, которых разводят для потребления. Таким образом, эффект снижения общего уровня липидов сам по себе является преимущественным. Кроме того, конкретные изменения в составе жирных кислот являются особенно положительными. Общепризнанным является то, что употребление меньшего количества насыщенных жирных кислот полезно для здоровья, и повышенное потребление n-3 связано с пользой для здоровья всего организма, от снижения вероятности заболеваний сердца до противовоспалительных эффектов и даже для повышения интеллекта у детей.
Другие животные продукты, полученные из животных, которых кормили кормом по настоящему изобретению, также могут обладать полезными эффектами. В качестве примера рыбий жир, полученный таким образом, будет обладать преимущественным пищевым составом по сравнению с маслом из рыбы, которую кормили коммерческим рационом. Другие продукты, такие как шкура рыбы, также могут обладать положительными эффектами, наблюдаемыми при улучшении состава тканей всего организма.
Уровень жирных кислот в крови в норме определяется относительными скоростями расщепления жиров и этерификации в жировой ткани и потреблением жирных кислот в мышцах. В мышцах жирные кислоты ингибируют потребление глюкозы и окисление. Повышенный уровень жирных кислот и триацилглицерина в крови и мышцах, таким образом, коррелирует с ожирением и резистентностью к инсулину, а также со снижением способности метаболизировать глюкозу (Olefsky JM (2000) J Clin Invest 106:467-472; Guerre-Millo M et al. (2000) J Biol Chem 275:16638-16642). Авторы настоящего изобретения показали наличие стимуляции окисления жирных кислот и снижения концентрации жирных кислот в плазме не подвергающимися β-окислению структурными элементами жирных кислот и белковым материалом, также необязательно содержащими масляный компонент. Авторы настоящего изобретения, таким образом, ожидают, что композиции по настоящему изобретению могут использоваться для профилактики и лечения резистентности к инсулину и вызванных ей заболеваний (Shulman GI (2000) J Clin Invest 106(2):171-176). Было выявлено, что TTA полностью предотвращает вызванную рационом с высоким содержанием жиров резистентность к инсулину и ожирение, и снижает ожирение, гипергликемию и чувствительность к инсулину у крыс с ожирением (Madsen M et al. (2002) J Lipid Res 43 (5): 742-50). Вследствие неожиданных синергических результатов, обнаруженных авторами изобретения при использовании как TTA, так и белкового материала, а также необязательно масла, без подтверждения какой-либо объясняющей полученные результаты конкретной теорией, авторы настоящего изобретения в настоящее время ожидают, что такое сочетание окажется даже более эффективным при лечении этих состояний. Авторы настоящего изобретения также ожидают, что эффект TTA будет усиливаться белковым материалом, а также необязательно маслом, при лечении сходных заболеваний и нарушений, включая повышенное кровяное давление, повышенный уровень липидов и холестерина, эндотелиальную дисфункцию, состояние повышенной свертываемости крови, синдром поликистоза яичников и метаболический синдром.
Семейство рецепторов, активируемых пролифератором пероксисом (PPAR), являются плейотропными регуляторами клеточных функций, таких как клеточная пролиферация, дифференцировка и гомеостаз липидов (Ye JM et al. (2001) Diabetes 50:411-417). Семейство PPAR содержит три подтипа; PPARα, PPARβ и PPARγ. TTA является сильным лигандом для PPARα (Forman BM, Chen J, Evans RM (1997) Proc Natl Acad Sci 94:4312-4317; Gottlicher M et al. (1993) Biochem Pharmacol 46:2177-2184; Berge RK et al. (1999) Biochem J 343(1):191-197), а также активирует PPARβ и PPARγ (Raspe E et al. (1999) J Lipid Res 40:2099-2110). В качестве активатора PPARα TTA стимулирует катаболизм жирных кислот повышением их потребления клетками. Снижение уровня триглицеридов в плазме посредством TTA вызывает переключение метаболизма клеток печени в направлении регулируемого PPARα катаболизма жирных кислот в митохондриях. (Graf HJ et al. (2003) J Biol Chem 278(33):30525-33). Несмотря на то, что эффект TTA на уровень триацилглицеринов в плазме определяется активацией PPARα, что показано устранением этого эффекта у мышей с нокаутом PPARα, рыбий жир не вызывает снижения триацилглицерина в плазме даже у мышей с нокаутом (Dallongeville J et al. (2001) J Biol Chem 276:4634-4639).
Дополнение рациона n-3 полиненасыщенными жирными кислотами, подобными кислотам, находящимся в рыбьем жире, стимулирует активность ацил-CoA-оксидазы пероксисом печени и, таким образом, окисление жирных кислот в печени и в меньшей степени в скелетных мышцах (Ukropec J et al. (2003) Lipids 38(10):1023-9). Было показано, что рацион с увеличенным содержанием рыбьего жира повышает как активность, так и уровень мРНК ферментов окисления жирных кислот пероксисом и митохондрий печени (Hong DD et al. (2003) Biochim Biophys Acta: Mol Cell Biol Lipids 1635 (l):29-36). Рыбий жир вызывал повышение относительного содержания пероксидной ацил-CoA-оксидазы в печени, но не в мышцах крыс, и авторы предположили, что это происходит вследствие того, что n-3 жирные кислоты защищают от индуцируемой жирами резистентности к инсулину, выступая в качестве лигандов PPARα, индуцируя пролиферацию пероксисом в печени (не внутримышечную). Экспрессия гена PPARα не менялась. (Neschen S et al. (2002) Am J Physiol Endocrinol Metab 282:E395-E401)
Как можно видеть в указанных выше абзацах, биохимические детали того, каким именно образом TTA, белковый материал и необязательно масло влияют на метаболизм жиров, подробно не известны. Эффекты могут быть или могут не быть опосредованы одним путем, как TTA, так и масла могут, например, действовать в качестве лигандов PPARα или независимо от PPARα. Если они действуют одинаковыми путями, то нельзя ожидать усиления TTA маслами, вследствие того, что TTA представляет собой сильный активатор PPARα, который, как можно ожидать, будет полностью обеспечивать активацию PPARα. Даже при сложении, эффект TTA и масла при их сочетании окажется неожиданным. Еще меньше известно о том, как белок влияет на β-окисление или другие аспекты метаболизма жиров. Таким образом, нельзя предсказать эффекты одновременного введения белкового материала и TTA. Однако получение синергического эффекта выше аддитивного эффекта, как можно видеть для TTA и ферментированного белкового материала сои во всех испытаниях по настоящему изобретению, оказалось очень неожиданным. Подвергаемые β-окислению структурные элементы жирных кислот обладают множеством эффектов, и авторы настоящего изобретения не знают, каким образом все они возникают, но исходя из неожиданных результатов по настоящему изобретению авторы ожидают, что все они будут усиливаться белковым материалом и необязательно маслами, без подтверждения какой-либо конкретной теорией.
Лиганды PPAR нарушают пролиферацию различных клеточных линий злокачественных опухолей. В частности, было выявлено, что TTA снижает пролиферацию множества клеточных линий злокачественных опухолей (Berge K et al. (2001) Carcinogenesis 22:1747-1755; Abdi-Dezfuli F et al. (1997) Breast cancer Res Treat 45:229-239; Tronstad KJ et al. (2001) Biochem Pharmacol 61:639-649; Tronstad KJ et al. (2001) Lipids 36:305-313). Это снижение связано со снижением уровня триацилглицеринов (Tronstad KJ et al. (2001) Biochem Pharmacol 61:639-649) и опосредуется как PPAR-зависимыми, так и PPAR-независимыми путями (Berge K et al. (2001) Carcinogenesis 22:1747-1755). Поскольку ферментированный белок сои повышает способность TTA снижать уровень триацилглицеринов, то, таким образом, очень вероятно, что он также будет повышать антипролиферативные эффекты TTA, обеспечивая такое повышение способности TTA к профилактике и лечению злокачественных опухолей. TTA может использоваться для профилактики и/или лечения злокачественной опухоли, включая ингибирование: первичных и вторичных новообразований, роста опухолей, инвазии первичной опухоли в соединительную ткань и образования вторичных опухолей (NO 2002 5930).
Как правило, агонисты PPAR модулируют воспалительный ответ. TTA модулирует воспалительный ответ подавлением высвобождения воспалительного цитокина интерлейкина-2 и подавлением стимулированной PHA пролиферации периферических мононуклеарных клеток (Aukrust P et al. (2003) Eur J Clin Invest 33(5):426-33). Модулирование цитокина посредством TTA может быть опосредовано PPAR или изменением уровня простагландинов, или модификацией опосредуемой липидами передачи сигнала, последняя из них также является возможным механизмом действия полиненасыщенных жирных кислот, таких, какие находятся в маслах. Теперь, когда авторы изобретения обнаружили неожиданные результаты в отношении настоящего изобретения, они, таким образом, ожидают, что белковый материал и необязательно масло, в сочетании с не подвергающимися β-окислению структурными элементами жирных кислот будут усиливать эффект структурных элементов жирных кислот на воспалительные нарушения, включая иммуноопосредованные нарушения, такие как ревматоидный артрит, системный васкулит, системная красная волчанка, системная склеродермия, дерматомиозит, полимиозит, различные аутоиммунные эндокринные нарушения (например, тиреоидит и адреналит), различные иммуноопосредованные неврологические нарушения (например рассеянный склероз и миастения), различные сердечно-сосудистые нарушения (например миокардит, застойная сердечная недостаточность, артериосклероз и стабильная и нестабильная стенокардия, и гранулематоз Вегенера), воспалительные заболевания кишечника, болезнь Крона, неспецифический колит, панкреатит, нефрит, холестаз/фиброз печени, острое и хронической отторжение трансплантата после трансплантации органа, а также пролиферативные нарушения кожи, такие как псориаз, атопический дерматит, неспецифический дерматит, первично ирритантный контактный дерматит, аллергический контактный дерматит, ламеллярный ихтиоз, эпидермолитический гиперкератоз, предзлокачественный индуцированный действием солнца каратоз и себорея, и заболевания, которые обладают воспалительным компонентом, такие как, болезнь Альцгеймера или нарушенная/способная к улучшению когнитивная функция.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 показано, что повышение активности ацил-CoA жиров TTA усиливается ферментированным белковым материалом сои.
На фиг.2 показано, что эффект TTA в отношении снижения уровня фосфолипидов усиливается ферментированным белковым материалом сои.
На фиг.3 показано, что эффект TTA в отношении снижения уровня холестерина усиливается ферментированным белковым материалом сои и рыбьим жиром.
На фиг.4 показано, что эффекты TTA в отношении снижения уровня триацилглицеринов усиливаются ферментированным белковым материалом сои.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ЗАЯВКЕ
Животные
В этом контексте термин "животные" включает в себя млекопитающих, таких как человек и фермерские (сельскохозяйственные) животные, особенно животных экономического значения, таких как куриные, млекопитающие, относящиеся к крупному рогатому скоту, овцам, козам и свиньям, особенно животных, посредством которых получают пригодные для потребления человеком продукты, такие как мясо, яйца и молоко. Далее подразумевается, что термин включает в себя рыбу и моллюсков, таких как лосось, треска, тиляпия, двустворчатые моллюски, устрицы, омар или крабы. Также термин включает в себя домашних животных, таких как собаки и кошки.
Корм для животных
Термин "корм для животных" относится к пище для животных (как определено выше). Корм для животных, как правило, содержит соответствующие количества жиров, белков, углеводов, витаминов и минералов, необходимых для жизнеобеспечения определенного реципиента-животного, и может содержать дополнительные компоненты для улучшения вкуса, консистенции, цвета, запаха, стабильности, срока хранения и т.д., или антибиотики или другие компоненты, добавляемые для пользы для здоровья животного. Корм для животных предпочтительно, но не обязательно представляет собой сухое вещество, наиболее предпочтительно, гранулированное вещество. Также подразумевается, что термин "корм для животных" включает в себя пищевые композиции, ветеринарные композиции, и/или функциональные пищевые продукты для потребления животными.
Мясо
Термин "мясо" относится к сырому мясу любого животного, как определено выше. Таким образом, все виды содержащего белок сырого мяса млекопитающих, птиц, рабы и моллюсков, рассматриваются как мясо. Термин "мясной продукт" относится к любому продукту из мяса, как определено выше.
Растительные жиры и/или рыбий жир
Они включают в себя все виды масла растительного или морского происхождения, включая, но не ограничиваясь ими, жирные или нелетучие масла, а также эфирные или летучие масла, и любое их сочетание. Они не обязательно должны находиться в жидкой форме. Подсолнечное масло, которое использовалось для настоящего изобретения, в действительности представляет собой масло из семян подсолнечника, а не из самого цветка.
Рыбий жир
Этот термин включает в себя все виды масла морского происхождения.
Пищевая композиция
Подразумевается, что этот термин включает в себя любое потребляемое внутрь вещество, включая, но не ограничиваясь ими, пищевые добавки, функциональные пищевые продукты, растительные добавки и т.д. для употребления человеком и животными. Термин также включает в себя пищевые продукты для употребления человеком и корм для животного, где композиция по настоящему изобретению представляет собой дополнительный компонент, а не основной ингредиент. Это особенно относится к корму для животных, где любой корм может быть дополнен композицией по настоящему изобретению, для достижения ее биологических эффектов.
Лечение
В отношении фармацевтических аспектов применения этого изобретения, термин "лечение" относится к снижению тяжести заболевания.
Профилактика
Термин "профилактика" относится к предотвращению данного заболевания, т.е. соединение по настоящему изобретению вводят перед развитием состояния. Это означает, что соединения по настоящему изобретению могут использоваться в качестве профилактических средств или в качестве ингредиентов в пищевой композиции в целях предотвращения риска или развития данного заболевания.
Ферментация
Расщепление органических веществ микроорганизмами или ферментами, включая гидролиз.
Гидролиз
Ферментативное или химическое расщепление, при котором комплексные молекулы расщепляются на более простые элементы химической реакцией с водой.
Белковый материал одноклеточных организмов (SCP)
SCP представляет собой материал, содержащийся в одноклеточных микроорганизмах. В частности, микроорганизмы могут представлять собой грибы, дрожжи и бактерии. Материал SCP обладает высоким относительным содержанием белков.
Гидролизат белков рыбы (FPH), обработанный ферментами
Материал FPH представляет собой белковый гидролизат, полученный в результате ферментативной обработки материала рыбы. Материал FPH обладает высоким относительным содержанием белков и пептидов.
Ферментированный белковый материал сои
Ферментированный белковый материал сои получают в результате ферментации бобов сои. Он содержит модифицированные и немодифицированные белки сои и изофлавоны, а также другие компоненты сои.
Пищевая композиция
Подразумевается, что этот термин включает в себя употребляемый внутрь материал, включая, но не ограничиваясь ими, пищевые добавки, функциональные пищевые продукты, растительные добавки и т.д. для употребления человеком или животными. Термин также включает в себя пищевые продукты для употребления человеком и корм для животных, где композиция по настоящему изобретению является дополнительным компонентом и не является основным ингредиентом. Это особенно относится к корму для животных, где любой корм может быть дополнен композицией по настоящему изобретению, для достижения ее биологических эффектов.
ВВЕДЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ
В качестве фармацевтического лекарственного средства композиция по настоящему изобретению может быть введена непосредственно животному любым пригодным способом, включая парентеральное, интраназальное, пероральное введение, или посредством всасывания через кожу. Она может быть введена местно или системно. Конкретный способ введения каждого средства зависит, например, от анамнеза рецепиента-человека или животного.
Примеры парентерального введения включают в себя подкожное, внутримышечное, внутривенное, интраартериальное и внутрибрюшинное введение.
В качестве общего положения, общее фармацевтически эффективное количество каждого из не подвергающихся β-окислению структурных элементов жирных кислот, вводимого парентерально в дозе предпочтительно находится в диапазоне от приблизительно 1 мг/кг/сутки до 200 мг/кг/сутки на массу тела пациента для человека, хотя, как описано выше, можно проводить его значительное терапевтическое разделение. Доза от 5-50 мг/кг/сутки является наиболее предпочтительной. Доза ферментированного белкового материала сои или другого белкового материала 5-500 мг/кг/сутки является предпочтительной, и доза 50-300 мг/кг/сутки является наиболее предпочтительной. Доза рыбьего жира или другого масла 1-300 мг/кг/сутки является предпочтительной, и доза 10-150 мг/кг/сутки рыбьего жира или другого масла является наиболее предпочтительной.
При постоянном введении, все соединения по настоящему изобретению, как правило, вводят в виде 1-4 инъекций в сутки или длительными подкожными инфузиями, например, с использованием мини-дозатора. Также может использоваться раствор из мешка для внутривенного введения. Основным фактором при выборе соответствующей дозы является конечный результат, определяемый по снижению общей массы тела или соотношения жира и мышечной массы, или по другим критериям измеряемого контроля, или по профилактике ожирения или профилактике связанных с ожирением состояний, как определяется соответствующим образом квалифицированным специалистом.
В случае парентерального введения, в одном варианте осуществления соединения по настоящему изобретению изготовлены смешиванием каждого из них с соответствующей степенью чистоты в единичной дозированной инъецируемой форме (раствор, суспензия или эмульсия) c фармацевтически приемлемым носителем, т.е., с носителем, который является нетоксичным для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и совместимым с другими ингредиентами состава.
Как правило, составы получают объединением соединений по настоящему изобретению с жидкими носителями, или мелкоизмельченными твердыми носителями, или и с теми, и с другими в равномерную и однородную смесь. Затем, если необходимо, продукту придают форму желательного препарата. Предпочтительно носитель представляет собой носитель для парентерального введения, более предпочтительно, раствор, который является изотоничным крови реципиента. Примеры таких носителей включают в себя воду, физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Неводные носители, такие как жирные масла и этилолеат, а также липосомы, также являются пригодными здесь.
Если целесообразно, носитель может содержать небольшие количества дополнительных компонентов, таких как вещества, которые увеличивают изотоничность и химическую стабильность. Такие вещества не являются токсичными для реципиента в используемых дозах и концентрациях и включают в себя буферы, такие как фосфатный, цитратный, сукцинатный, ацетатный буфер и другие буферы на основе органических кислот или их солей; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота или аргинин; моносахариды, дисахариды и другие углеводороды, включая целлюлозу или ее производные, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; спирты на основе сахаров, такие как маннит или сорбит; противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты, полоксамеры или PEG.
В случае пероральных фармакологических композиций, могут использоваться такие носители, например, как вода, желатин, камеди, лактоза, крахмалы, стеарат магния, тальк, масла, полиалкенгликоль, вазелиновое масло и т.п. Такой фармацевтический препарат может быть в виде единичной дозированной формы и может дополнительно содержать другие терапевтически полезные вещества или общепринятые фармацевтические адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, буферы и т.п. Фармацевтические препараты могут быть в виде общепринятых жидких форм, таких как таблетки, капсулы, драже, ампулы и т.п., в виде общепринятых дозированных форм, таких как ампулы, и в виде суппозиториев и т.п.
Кроме того, соединения по настоящему изобретению, т.е. аналоги не подвергающихся β-окислению жирных кислот и белковый материал или аналоги не подвергающихся β-окислению жирных кислот и белковый материал и масло, могут использоваться в пищевых препаратах, как определено выше, в случае которых дозировка не подвергающихся β-окислению аналогов жирных кислот представляет собой дозировку, как для описанных лекарственных средств или ниже, в то время как количество белкового материала и масла предпочтительно является пригодным для изготовления пищевых и кормовых материалов. Как часть пищевой композиции и, особенно, корма для животных, масло и белковый материал могут представлять собой значительную часть корма, и, таким образом, обладать пищевой ценностью, а также усиливать эффекты не подвергающиеся β-окислению аналоги жирных кислот. Рыбий жир может включать в себя вплоть до всех жиров питательной композиции, и ферментированный белковый материал сои может включать в себя вплоть до всех белков пищевой композиции. В корме для животных, количество не подвергающегося β-окислению аналога жирной кислоты может быть вплоть до 10 раз выше, чем в продуктах для употребления человеком, то есть вплоть до 2 г/кг/сутки на массу тела животного. Такой корм для животных может использоваться для повседневного кормления животных. Ферментированный белковый материал сои особенно пригоден в качестве функционального белка в пищевых продуктах, в частности, при использовании в качестве заместителя природной плазмы в кормах для животных и кормах для домашних животных. Композиция корма для животных также может содержать дополнительные ингредиенты, такие как жиры, сахара, соль, вкусовые добавки, минералы и т.д. Кроме того, продукту можно придавать форму кусков, сходных с природными кусками мяса по внешнему виду и консистенции. Продукт по этому изобретению обладает дополнительными преимуществами в том, что его легко изготавливать с содержанием необходимых пищевых добавок, он легко переваривается животными и обладает привлекательным вкусом для животных.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Получение не подвергающихся β-окислению структурных элементов жирных кислот по настоящему изобретением подробно описано в более ранних патентных заявках Норвегии No. 20005461, 20005462, 20005463 и 20024114 заявителя. В этих документах также описаны исследования токсичности TTA. Препарат моно-, ди- и триглицеридов и содержащих азот липидов в соответствии по этому изобретению подробно описан в патентной заявке США No. 10/484350. Препарат фосфолипидов, включающий серин, этаноламин, холин, глицерин и инозитол по этому изобретению подробно описан в более ранней патентной заявке Норвегии No. 20045562 заявителя.
Экспериментальные результаты, приведенные ниже, показывают, что белковый материал и/или масло по существу усиливают биологические эффекты не подвергающихся β-окислению аналогов жирных кислот.
Пример 1. Биологические эффекты композиции по этому изобретению у крыс
1.1 Получение гидролизата белков рыбы (FPH)
Исходные материалы
FPH получали из остатков мышечной ткани рыбы на костном скелете после разделывания на филе. Скелеты без голов недавно разделанного на филе атлантического лосося (Salmon Salar, L.) получали непосредственно с линии производства и замораживали при -20±2°C. В течение недели замороженные скелеты использовали для процесса ферментативного гидролиза.
Гидролиз
™
™
Ферментативный гидролиз проводили с помощью Protamex при pH приблизительно 6,5 и при температуре 55±2°C. Protamex (E.C. 3.4.21.62/3.4.24.28) представляет собой протеазный комплекс Bacillus из Novozymes AS (Багсверд, Дания) и соответствует чистоте, требуемой для пищевых ферментов. Соотношение скелетов лосося и воды составляло 1,14. Для гидролиза использовали соотношение ферментов к субстрату 11,1 ЕА/кг неочищенного белка. Через 60 мин ферментативной обработки температуру поднимали до 98°C, которая достигалась через 105 мин.
Очистка
2
внутри
снаружи
Крупные кости оставляли в емкости для гидролиза, а мелкие кости удаляли фильтрованием гидролизата через сито. Затем нерастворимую фракцию удаляли в двухфазном сепараторе (Westfalia, Германия, SC.35-26-177, 15 кВт, 7200 об/мин), затем оставшуюся смесь разделяли в трехфазном сепараторе (Westfalia, Германия, SB-7-36-+76, 4 кВт, 8520 об/мин) на масло лосося, фракцию эмульсии и водную фракцию. Водную фракцию концентрировали (NitroAtomicer, Дания, испаритель с падающей пленкой, Ff 100), фильтровали через ультрамембрану с паспортным ограничением молекулярной массы 100 000 (системы мембран PCI, UK, PF100, 2,65 м) и в конце отфильтрованную через ультрамембрану фракцию (фракцию UF) подвергали распылительной сушке (Niro Atomizer, Дания, колонна P-63, Т=200°C, Т=84°C).
Конечный продукт
Фракция UF называется гидролизатом белков рыбы (FPH). Материал FPH содержит приблизительно 83% белка, 10% золы и приблизительно 2% липидов, исходя из сухой массы. Дополнительные характеристики FPH можно найти в предшествующей заявке No 2003 3078 заявителя. Синтез FPH был приведен в качестве примера, а не для иллюстрации синтеза всех белковых материалов или даже гидролизатов белков рыбы формулы (I).
1.2 Получение белкового материала одноклеточных организмов (SCP)
Исходные материалы
-1
3
3
4
2
4
2
2
2
2
4
4
2
4
2
4
2
2
2
2
2
3
3
2
2
4
2
Микробную культуру, содержащую Methylococcus capsulatus (Bath), Ralstonia sp., Brevibacillus agri и Aneurinibacillus sp, все коммерчески доступны в Norferm Denmark AS, Оденс, Дания, получали в петлевом ферментере постоянной ферментацией природного газа в среде соли аммония/минеральные соли (AMS) при 45°C, pH 6,5 и при скорости разбавления 0,15 ч. Литр среды содержал следующие компоненты: 10 мг NH, 75 мг HPO·2HO, 380 мг MgSO·7HO, 100 мг CaCl·2HO, 200 мг KSO, 75 мг FeSO·7HO, 1,0 мг CuSO·5HO, 0,96 мг ZnSO·7HO, 120 мкг CoCl·6HO, 48 мкг MnCl·4HO, 36 мкг HBO, 24 мкг NiCl·6HO и 1,20 мкг NaMoO·2HO.
Получение
Ферментер заполняли водой, которую стерилизовали нагреванием в течение 10 сек при 125°C. Дополнительные пищевые добавки регулировали в соответствии с их потреблением. Непрерывную ферментацию проводили для 2-3% биомассы (исходя из сухой массы).
Материал одноклеточных организмов получали непрерывно и подвергали центрифугированию в промышленной центрифуге непрерывного действия при 3000 об/мин, с последующей ультрафильтрацией с использованием мембран с предельным размером 100000 Дальтон. Затем полученный в результате продукт подвергали стерилизации в теплообменнике в течение приблизительно 90 секунд при приблизительно 130°C.
Дополнительные характеристики SSP могут быть найдены в предшествующей заявке No 2003 3082 заявителя. Синтез SSP приведен в качестве примера, а не для иллюстрации синтеза всех белковых материалов или даже белковых материалов одноклеточных организмов формулы (I).
1.3 Ферментированный белковый материал сои
Ферментированный белковый материал сои получали в результате ферментации бобов сои. Он содержит модифицированные и немодифицированные белки сои и изофлавоны, а также другие компоненты сои. В предпочтительном варианте осуществления по этому изобретению используется ферментированный белковый материал сои Gendaxin, коммерчески доступный в Aximed, Берген, Норвегия. Gendaxin приведен в качестве примера, а не для иллюстрации всех белковых материалов или даже ферментированных белковых материалов сои формулы (I).
1.4 Биологические эффекты композиций по этому изобретению у крыс
Химические реактивы
Химические реактивы получали из общепринятых коммерческих источников, и они были химически чистыми. В качестве контроля (отрицательного) использовали карбоксиметилцеллюлозу (CMC). Рыбий жир был коммерчески доступен у Hordafor.
Животные
Самцов крыс Вистар с массой от 250 до 358 г приобретали в AnLab Ltd. (Прага, Чешская Республика) и содержали в клетках из проволоки при температуре 22±1°C и в комнате с контролируемым освещением (свет от 7 до полудня до 7 после полудня). В приеме пищи и воды не было ограничений. В каждой клетке держали три крысы. Увеличение массы и потребление корма определяли каждые сутки.
Рационы
Крыс кормили стандартным рационом Chow ST1 (Velaz, Прага, Чешская Республика).
Введение
Перед началом эксперимента самцам крыс Вистар давали возможность приспособиться к новым окружающим условиям. Затем им проводили введение каждые сутки в течение 10 суток посредством кормления через зонд. В качестве носителя и отрицательного контроля использовали CMC. В каждой группе по введению было по 4 крысы. В группах, в которых вводили TTA, вводили 150 мг/кг массы тела/сутки TTA, растворенной в CMC или маслах. В группах, в которых вводили рыбий жир, вводили 3 мл (приблизительно 2,5 г)/кг массы тела/сутки. В группах, в которых вводили ферментированный белковый материал сои, вводили 0,45 г/кг массы тела/сутки. В качестве носителя и отрицательного контроля использовали CMC. На следующие сутки после последнего введения крыс умерщвляли.
Умерщвление и извлечение тканей
™
Крысам проводили анестезию смесью 1:1 Hypnorm (фентанил цитрат 0,315 мг/мл и флуанизон 10 мг/мл, Janssen Animal Health) и Dormicum (мидазолам 5 мг/мл, F. Hoffmann-La Roche), вводимой подкожно. Проводили забор крови непосредственно из сердца с использованием промытого гепарином шприца. Печень сразу удаляли, взвешивали и разделяли на две части, которые сразу охлаждали на льду или замораживали в жидком азоте соответственно. Плазму и ткани хранили при -80°C до проведения анализа. Протокол был одобрен Управлением Норвегии по биологическим экспериментам на живых животных.
Получение субклеточных печеночных фракций
Печени крыс гомогенизировали по отдельности в ледяном растворе сахарозы (0,25 моль/л сахарозы в 10 ммоль/л буфера HEPES pH 7,4 и 1 ммоль/л ЭДТА) с использованием гомогенизатора Potter-Elvehjem. Субклеточное фракционирование печени проводили, как описано ранее (Berge RK et al. (1984) Eur J Biochem 141:637-44). Процедуру проводили при 0-4°C и фракции хранили при -80°C. Белок оценивали набором для анализа белков BioRad с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.
Анализ фермента
Активность ацил-CoA-оксидазы жиров измеряли в пероксисомной фракции печени как описано ранее (Small GM, Burdett K, Connock MJ (1985) Biochem J 227: 205-10). Результаты представляли в качестве активности ацил-CoA оксидазы жиров относительно общего белка, вычитали исходную активность (активность контроля), данные, которые представлены на фиг. 1, нормировали по отношению к активности TTA.
Анализ липидов
Липиды плазмы и печени определяли ферментативно на системе Technicon Axon (Miles, Территаун, NY) с использованием набора для триглицеридов из Bayer, для общего холестерина (Bayer, Территаун, NY) и набора PAP 150 для фосфолипидов, содержащих холин, из bioMerieux. Результаты представлены относительно общего белка. Результаты были представлены относительно общего белка, и данные, которые представлены на фиг. 2-4, нормировали по отношению к активности положительного контроля (без добавления TTA или масел; т.е. "нормальному" уровню). Результаты были представлены относительно общего белка, и данные, которые представлены на фиг. 2-4, нормировали по отношению к активности положительного контроля (без добавления TTA или масел; т.е. "нормальному" уровню).
Пример 2
Биологические эффекты композиции по этому изобретению у атлантического лосося
2.1 Экспериментальная модель, включающая получение корма для рыб
2
3
Экспериментальный рацион на основе рыбной муки был предоставлен EWOS и содержал 0,01% YO в качестве инертного маркера для определения перевариваемости (3-мм гранулы). В таблице 1 представлены составы и химические композиции трех видов рационов. Все три вида рационов были получены из одной кормовой смеси. Различные рационы были получены покрытием обычных кормовых гранул различными маслами и смесями. Рационы включали в себя либо рыбий жир (жир мойвы) (контроль), рыбий жир с добавлением 0,5% TTA (0,5% TTA) или рыбий жир с добавлением 1,5% TTA (1,5% TTA).
Состав жирных кислот в рационах отчетливо отражает, что использовался рыбий жир (жир мойвы) (таблица 2). Жир мойвы содержал относительно высокий уровень мононенасыщенных FA и также был обогащен n-3 FA с длинной цепью, 20:5 n-3 (EPA) и 22:6 n-3 (DHA). Корм, однако, содержал значительное количество рыбной муки, которая содержала n-3 FA, обеспечивая более высокий уровень этих FA в рационе, чем в добавленном масле.
В дополнение к приведенным выше рационам, были изготовлены идентичные рационы, с 0,5% Gendaxin и 0% или 0,9% TTA (исходя из общей сухой массы корма).
Контроль: рыбий жир, 0,5% TTA: рыбий жир с добавлением 0,5% TTA, 1,5% TTA: рыбий жир с добавлением 1,5% TTA. Количество каждой жирной кислоты представлено в качестве процентного содержания от общих жирных кислот.
2.2: Выращивание атлантического лосося на корме, содержащем TTA
Рыба, условия и схема эксперимента
Испытание проводили в научно-исследовательской станции AKVAFORSK, Sunndalsora, Норвегия. Атлантический лосось (Salmon salar) со средней исходной массой приблизительно 86 г помещали в 15 цилиндрических конических емкостей (диаметр 0,85 м), по 40 в емкость. Емкости наполняли морской водой с постоянной температурой 12°C. Рыбам давали возможность приспособиться к температуре и кормили коммерческим кормом в течение двух недель перед началом испытания. Испытание по выращиванию состояло из периода времени 8 недель.
Рационы представляли собой рационы, как описано выше в таблице 2, которые содержали либо рыбий жир (жир мойвы) (контроль), либо рыбий жир с добавлением 0,5% TTA (0,5% TTA), либо рыбий жир с добавлением 1,5% TTA (1,5% TTA). Три рациона случайным образом распределяли на три емкости. Корм распределяли с помощью электрической системы подачи (Akvaprodukter AS, Sunndalsora). Емкости были разработаны таким образом, чтобы избыток корма собирался из отходящей воды в коробки из проволочного каркаса. Избыток корма собирали, и это позволяло вычислить массу потребленного корма.
Рацион, включающий в себя Gendaxin, использовали в отдельном эксперименте, но схема эксперимента была аналогичной описанной выше схеме.
Исходный и конечный забор образцов
Рыб не кормили в течение 2 суток перед исходным забором образов. Шести рыбам из каждой емкости проводили анестезию с помощью MS-222 в начале и в конце эксперимента и определяли среднюю массу и среднюю длину. Эти шесть рыб умерщвляли ударом по голове и вскрывали брюшную полость. Образцы печени, сердца, жабр и почек сразу замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C. Эти образцы затем использовали для анализа состава жирных кислот. Дополнительным пяти рыбам из каждой емкости проводили анестезию и умерщвляли. Этих рыб использовали для определения состава всего тела.
Перед конечным забором образцов кормление рыб не прекращали. Из пяти рыб из каждой емкости выделяли образцы экскрементов в соответствии со способом, описанным Austreng (Aquaculture, 1978 13:265-272). Перед анализом образцы экскрементов из каждой емкости объединяли. Образцы хранили при -20°C.
Вторую жаберную дугу удаляли из рыбы, которой провели анестезию, и промывали ледяным буфером SEI (150 мМ сахарозы, 10 нМ ЭДТА, 50 мМ имидазола, pH 7,3) и сразу замораживали в жидком азоте. Ткани жабр хранили при -80°C. Печени гомогенизировали в ледяной среде с сахарозой.
Прирост
Средняя масса рыб в группах со всеми рационами приблизительно утроилась в процессе испытания, от исходного значения 86 г до конечного значения приблизительно 250 г. SGR снижалась при повышении доз TTA в рационе, от SGR 1,8 в контрольной группе до SGR 1,7 в группе c 0,5% TTA и SGR 1,5 в группе с 1,5% TTA (таблица 3). Между группами по рациону не было значимых различий в коэффициентах упитанности (таблица 3).
Потребление корма и перевариваемость пищевой добавки
В этом испытания были выявлены только небольшие различия в перевариваемости (таблица 4). Перевариваемость FA во всех группах по рационам была высокая, более чем 96% для суммы всех FA для рыб, которых кормили контрольным рационом и рационом с 0,5% TTA, и более 90% для рыб, которых кормили рационом с 1,5% TTA. Перевариваемость для насыщенных FA была, как правило, ниже, чем перевариваемость для других FA.
Для содержания белков, жиров и энергии и отдельных жирных кислот в рационе атлантического лосося, содержащем Контроль: рыбий жир, 0,5% TTA: рыбий жир с добавлением 0,5% TTA, 1,5%TTA: рыбий жир с добавлением 1,5% TTA
Данные представляют собой средние значения ±SEM
Значения в одном ряду с различными надстрочными знаками являются достоверно различающимися; nd = не определяется.
2.3 Биологические эффекты TTA
Химические реактивы
Уксусная кислота, хлороформ, петролейный эфир и метанол были получены из Merck (Дармштадт, Германия). Бензол был получен из Rathburn Chemicals Ltd. (Walkerburn, Шотландия) и 2',7'-дихлорфлуоресцеин из Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO, USA). Метанольный раствор HCl и 2,2-диметоксипропан приобретали в Supelco Inc. (Bellfonte, PA, USA). Покрытые стеклом планшеты на основе силикагеля K6 получали в Whatman International Ltd. (Мейдстон, Великобритания).
Химический анализ
В образцах рыбы, полученных в начале и в конце эксперимента анализировали сухой остаток, жиры, белки, золу и энергетическую ценность. Во всех рационах и образцах экскрементов анализировали сухой остаток (высушиванием при 105°C до постоянной массы), жиры (экстракцией этилацетатом, как описано в NS 9402, 1994), белки (с помощью Kjeltec Autoanalyser-N*6.25), крахмал, золу (нагреванием до 550°C до постоянной массы), энергию и оксид иттрия (с использованием ICP-AES после мокрого озоления образцов). Энергетическую ценность рационов, фекалий и образцов целых рыб определяли с помощью адиабатической калориметрии в бомбе, с использованием калориметрической бомбы Parr 1271.
Экстракция липидов и анализ жирных кислот
Общие липиды экстрагировали из гомогенизированных жабр, печени и сердца с использованием способа, описанного Folch (J Biol Chem 1957 226:497-509). Фазы хлороформ-метанол из жабр сушили в атмосфере азота и растворяли в гексане. Фосфолипиды (PL), триацилглицерин (TAG) и свободные жирные кислоты (FFA) разделяли тонкослойной хроматографией (TLC) с использованием смеси петролейного эфира, диэтилового эфира и уксусной кислоты (113:20:2 по объему) в качестве подвижной фазы. Липиды визуализировали распылением на плашки TLC 0,2% (мас./об.) 2'7'-дихлорфлуоресцеина в метаноле и их идентифицировали сравнением с известными стандартами при УФ-свете.
-1
-1
Пятна, соответствующие PL, FFA, и TAG счищали в стеклянные пробирки и затем проводили транс-метилирование в течение ночи 2,2-диметоксипропаном, метанольной-HCL и бензолом при комнатной температуре, как описано Mason и Waller (Anal Chem 1964 36:583). Метиловые эфиры разделяли, в основном, на неполярной колонке со сплавленными капиллярами газовой хроматографий, как описано Rosjo (Fish Physiol Biochem 1994 13:119-132). Метиловые эфиры FA разделяли на газовом хроматографе (Perkin-Elmer Auto system GC, оборудованный инжектором, программируемым инжектором с разделением/без разделения) с колонкой CP wax 52 (с длиной 25 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки 0,2 мкм), детектором ионизации пламени и системой данных 1022. Газ-носитель представлял собой He, и температура инжектора и детектора составляла 280°C. Температуру печи повышали от 50°C до 180°C со скоростью 10°C мин и затем повышали до 240°C со скоростью 0,7°C мин . Относительное количество каждой представленной жирной кислоты определяли измерением площади пика, соответствующего этой кислоте.
Вычисления
Коэффициент видимой перевариваемости (ADC) вычисляли, как описано Austreng (Aquaculture, 1978 13:265-272). Коффициент упитанности (CF), гепатосоматический индекс (HSI), удельный фактор роста (SGR) и коэффициент роста на единицу теплоты (TGC) вычисляли следующим образом, на основе индивидуальных показателей массы и длины:
(ln W1-ln W0)/сутки)
SGR=(e-1)·100
1
0
1/3
1/3
TGC=(W -W )·1000/(сутки·°C)
0
1
где W представляет собой исходную массу, W представляет собой конечную массу, t представляет собой температуру в течение суток.
-3
CF=100·W·(длина по Смиту)
-1
HSI=100·масса печени · W
Статистический анализ
Для всех данных проводили однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) и различия ранжировали по критерию множественных сравнений Дункана. Уровень значимости был установлен при значении 5%.
Состав тела и печени
Рыбы, которых кормили рационом с 1,5% TTA, обладали более низким уровнем липидов в теле (9,6%), чем рыбы, которых кормили контрольным рационом (10,6%) (таблица 5). Не было выявлено статистически значимых различий в общем содержании липидов между рыбами, которых кормили контрольным рационом, и рыбами, которых кормили рационом с TTA (таблица 6). Гепатосоматический индекс был значительно выше у рыб, которых кормили рационом с 1,5% TTA (1,2%), чем у рыб, которых кормили контрольным рационом (1,1%) (таблица 6).
Контроль: рыбий жир, 0,5% TTA: рыбий жир с добавлением 0,5% TTA, 1,5% TTA: рыбий жир с добавлением 1,5% TTA.
ab
Различия между средними значениями в данном ряду являются достоверными (p<0,05), как указано различными надстрочными буквами.
Результаты представляют собой средние значения ±SEM (n=3). Значения в одном ряду с различными надстрочными буквами являются достоверно различными.
Состав жирных кислот печени, жабр и сердца
9
9
Состав жирных кислот PL, TAG и FFA в жабрах, печени и сердце представлен в таблицах 7, 8 и 9. TTA входила в состав фракции PL в жабрах (0,8%) и сердце (0,7%) атлантического лосося, которого кормили рационом с 1,5% TTA. TTA также входила в состав фракций TG и FFA в жабрах (таблица 7). Следовые количества TTA и ее продуктов, полученных под действием Δ десатуразы, входили в состав липидов печени, в то время как не было выделено продуктов Δ десатуразы из липидов сердца и жабр.
Процентное содержание n-3 FA в печени, жабрах и сердце также зависело от рациона, который давали рыбам. Процентное содержание EPA+DHA было значительно выше у рыб, которых кормили рационом с 1,5% TTA, чем у контрольных рыб, во всех липидных фракциях жабр и сердца. В печени, с другой стороны, TTA приводила только к умеренному повышению процентного содержания DHA и небольшому снижению процентного содержания EPA. Процентное содержание пальмитиновой кислоты (16:0) и суммы всех насыщенных FA было значительно ниже во фракции PL жабр, сердца и печени рыб, которых кормили рационом с 1,5% TTA, чем у рыб, которых кормили контрольным рационом (таблицы 7, 8, 9). Сумма всех мононенасыщенных FA была значительно ниже во фракциях TG и FFA жабр у рыб, которых кормили рационом 1,5% TTA, чем у рыб, которых кормили контрольным рационом (таблица 8). Напротив, процентное содержание суммы мононенасыщенных FA во фракциях PL и TAG печени было выше у рыб, которых кормили более высокими дозами TTA (таблица 9).
2.4 Биологические эффекты композиции по этому изобретению, включающей ферментированный белковый материал сои
Химические реактивы
Gendaxin получали из Aximed, Берген, Норвегия. Одна капсула Gendaxin содержит 35 мг изофлавонов, помимо этого 10 мг генистеина и 15 мг дайдзеина.
Анализ липидов
Липиды плазмы определяли ферментативно с помощью системы Technicon Axon (Miles, Tarrytown, NY) с использованием набора для триглицеридов из Bayer, набора для общего холестерина (Bayer, Территаун, NY) и набора PAP 150 для содержащих холин фосфолипидов из bioMerieux. Результаты представлены в ммоль/л в таблице 10.
Из представленных выше данных ясно, что добавление Gendaxin в корм рыбы оказывает положительный эффект на состав жирных кислот в плазме лосося. Уровень холестерина, триглицеридов и фосфолипидов при добавлении 0,25% Gendaxin в корм рыб снижался по сравнению с контролем. Дальнейшее добавление Gendaxin и TTA дополнительно улучшало состав жирных кислот в плазме.
Анализ ферментов
Активность ацил-CoA-оксидазы жиров определяли в пероксисомальной фракции печени, как описано ранее (Small GM, Burdett K, Connock MJ (1985) Biochem J 227: 205-10). Результаты представлены в качестве активности ацил-CoA-оксидазы жиров относительно общего белка в таблице 11.
Таблица 11β-окисление в печени
Бета-окисление
Контроль0,5% Gendaxin+0,9% TTA
0,9401,501
Из представленных выше данных очевидно, что добавление в корм для рыб Gendaxin и TTA оказывает положительный эффект на β-окисление, поскольку β-окисление значительно повысилось.
Пример 3
В соответствии с экспериментальной моделью, представленной в примере 1, авторы настоящего изобретения провели эксперимент по кормлению на самцах крыс Вистар (см. таблицу 12) со следующими компонентами корма:
30% жиров
20% белков
5% волокон
10% сахарозы
3,5% минеральной смеси AIN93G
1,0% витаминной смеси AIN-93
Остальное: Крахмал
Компонент жиров представляет собой 30% свиного жира, или 2,5-5% свиного жира замещено на рыбий жир, или 0,15 свиного жира замещено на TTA. Белковый материал представляет собой 20% белок молока (казеин), или половина его замещена белком рыбы или "Биопротеином".