ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙ ДАТЧИК ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ

Полезная модель относится к области электрохимических методов анализа, в частности к потенциометрическому определению суммарной антиоксидантной активности веществ.
Известно устройство [Анализатор кулонометрический «Эксперт-006». ТУ 4215-003-41541647-95 Технические условия; Руководство по эксплуатации и методика поверки] для осуществления измерения суммарной антиоксидантной активности веществ кулонометрическим способом по электрогенерированному брому или хлору, вступающих во взаимодействие с присутствующими антиоксидантами [Абдулин И.Ф., Турова Е.Н., Будников Г.К. Кулонометрическая оценка антиоксидантной способности экстрактов чая электрогенерируемым бромом // Журн. аналит. химии. 2001. Т.56. №6. - С.627-629].
Выбор в качестве титранта электрогенерированных соединений брома обусловлен их способностью вступать в различные реакции: радикальные, окислительно-восстановительные, электрофильного замещения и присоединения по кратным связям.
За величину суммарной антиоксидантной активности (АОА) принимается количество электричества (кКл/100 г), что затрудняет оценку получаемых результатов.
Однако, не все вещества, обладающие антиоксидантной активностью, одинаково реагируют с галогенами-титрантами, а некоторые из них не взаимодействуют с галогенами вовсе. При этом необходимы сравнительно большие объемы аналита, применение перемешивания и специального оборудования (кулонометрического анализатора).
Известен также анализатор для определения суммарной антиоксидантной активности объектов [патент РФ на полезную модель №54196], в котором реализуется вольтамперометрический способ определения суммарной активности актиоксидантов [Патент РФ №2224997], заключающийся в съемке вольтамперограмм тока электровосстановления кислорода на ртутно-пленочном электроде в трехэлектродной электрохимической ячейке в интервале потенциалов от 0,0 до -0,6 В (отн.насыщ.х.с.э.). в присутствии вещества-антиоксиданта. В качестве электрода сравнения и вспомогательного электрода использованы хлорид-серебряные электроды.
Недостатком является использование ртутьсодержащих веществ в качестве рабочего электрода, что является небезопасным при проведении анализа. Кроме того, измерения необходимо проводить в одном концентрационном диапазоне для всех типов антиоксидантов, тогда, как широко известно, что ряд антиоксидантов активны в разных концентрационных диапазонах и их нельзя сравнивать друг с другом, используя данный критерий.
В этом способе антиоксидантная активность может оцениваться двумя критериями: концентрационным и кинетическим. Применение первого из них требует постоянной концентрации растворенного кислорода в анализируемом растворе, что, как известно, связано с метеорологическими параметрами (температура и атмосферное давление). Второй критерий - кинетический, основан также на измерении скорости потребления кислорода и выражается в мкмоль/л мин.
Для устранения этих недостатков в анализатор [Патент на полезную модель РФ №92539] введены дополнительные элементы и узлы для дезактивации мешающих анализу растворенных веществ, управления сигналами электрохимической ячейки, вывода и обработки данных, равномерного перемешивания раствора, термостатирования и др., что значительно усложняет и удорожает анализатор, а, следовательно, и сам анализ.
При этом сохраняется проблема уменьшения объема аналита и сокращение времени анализа. Также не представляется возможным использование анализатора в полевых условиях.
Описана установка, известная как «ЦветЯуза-01-AA» [Патент РФ №2238554] для определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных веществ путем их электрохимического окисления, которая содержит емкость для растворителя, насос, дозатор, выполненный в виде многоходового крана, связанного с выходом насоса, с устройством ввода анализируемого вещества и с термостатированной электрохимической ячейкой амперометрического детектора, усилитель электрического сигнала, аналого-цифровой преобразователь и устройство регистрации выходного сигнала. Установка содержит амперометрический детектор, а электрохимическая ячейка не содержит электрода сравнения [Патент РФ 2238555]
Основным недостатком данного устройства является то, что анализ направлен на определение индивидуальных веществ, а не суммарный показатель их активности. Такая установка используется в большей степени для исследования антиоксидантных свойств индивидуальных биологически активных веществ, и не предназначена для исследования биологических объектов, имеющих сложный композиционный состав. Кроме того, сложное и дорогое оборудование не всегда оправдано для проведения рутинных анализов.
НПО «ИВА» (Екатеринбург, РФ) выпускает многофункциональный потенциометрический анализатор МПА-1, предназначенный для измерения суммарной антиоксидантной активности веществ [патент РФ 2235998] и заключающееся в измерении сдвига потенциала платинового электрода относительно хлорид-серебряного электрода, возникающего при введении в раствор медиаторной системы с исследуемым образцом. Этот анализатор содержит электродную пару: платиновый измерительный электрод и хлорид-серебряный электрод, находящихся в измерительной ячейке с принудительным перемешиванием анализируемого раствора. Электроды подключены к измерительному прибору, управляемому микропроцессором.
+3
+2
3
6
4
6
Медиаторная система, состоящая из пары соединений с химическим элементом в разных степенях окисления, например, Fe и Fe в соединениях K[Fe(CN)] и K[Fe(CN)] обеспечивает возможность окислять широкий круг веществ - антиоксидантов.
К недостаткам анализатора МПА-1 относятся:
- применим только для анализа водорастворимых объектов и для определения только водорастворимых антиоксидантов;
- использование органических растворителей лимитируется тем, что они неконтролируемо смещают потенциал измерительного электрода, что делает невозможной оценку оксидантно/антиоксидантной активности исследуемого объекта;
- на границе раздела электрод-раствор, содержащим органический растворитель, в который погружен сравнительный хлорид-серебряный электрод, возникает диффузионный потенциал, чей вклад в измеряемую величину ЭДС, оценить практически невозможно;
- процесс измерения является двухступенчатым: сначала измеряется ЭДС ячейки с электродами, погруженными в медиаторную систему, а затем после введения в раствор исследуемого вещества.
Наиболее близким техническим решением является устройство, описанное в патенте РФ 2486499.
Это устройство, включает двухкамерную емкость для размещения сравнительного и измерительного электродов, выполненных из одного материала, соединенных друг другом посредством электролитического ключа и подключенных к прибору для измерения ЭДС. В обе камеры заливается раствор медиаторной системы, а в камеру, где расположен измерительный электрод, вносят анализируемую пробу.
К недостаткам такого устройства можно отнести следующее:
- отсутствие общепринятого стандартного хлорид-серебряного электрода не дает объективной оценки состояния ред-окс системы медиатора, потенциал которой зависит от соотношения концентрации присутствующих разновалентных элементов;
- большие объемы раствора медиатора, которые необходимо обновлять перед каждым измерением;
- необходимость перемешивания;
- техническая конструкция не предусматривает ее использование в полевых условиях.
Техническая проблема, решаемая настоящей полезной моделью. - расширение спектра анализируемых веществ при одновременном упрощении процедуры анализа.
Технический результат - возможность исследования антиоксидантной активности веществ, нерастворимых в воде за счет уменьшения объемов медиатора/измерительной камеры.
Заявленное устройство за счет уменьшения объемов измерительной камеры обеспечивает также сокращение времени проведения исследований и обеспечивает возможность использования в полевых условиях.
Технический результат достигается тем, что в электрохимическом датчике для измерения антиоксидантной активности веществ, имеющем корпус, состоящий из двух камер, соединяющихся друг с другом посредством электролитического ключа, в одной из которых размещен сравнительный хлорид-серебряный, а в другой измерительный электроды, подключенные к прибору для измерения ЭДС, измерительная камера содержит трубчатый электрод из углеграфитового материала с внутренним капиллярным каналом, на входе которого установлен клапан ввода анализируемой жидкости.
На фиг. 1 изображена схема электрохимического датчика для измерения антиоксидантной активности растворов. На фиг. 2 приведен общий вид устройства.
Электрохимический датчик состоит из корпуса (1) и в своем составе содержит: камеру (2) для хлорид-серебряного электрода сравнения (5) и камеру (3) для трубчатого измерительного электрода (6) имеющего капиллярный канал. Камеры сообщаются между собой посредством электролитического ключа (4), а электроды имеют контакты (7) для подключения к измерительному устройству; клапан ввода (8) анализируемой жидкости; поджимные втулки со штуцерами (9, 10); технологическое отверстие (11) и отверстие (12) для пополнения насыщенным раствором хлорида калия в камере вспомогательного электрода.
Электрохимический датчик имеет разборную конструкцию.
Корпус электрохимического датчика и все детали выполнены из прозрачного оргстекла. Рабочий электрод выполнен из углеграфитовой массы, полученной из измельченного до размеров частиц менее 0,3 мм спектрального угля СУ-3 смешанного с расплавленным парафином в соотношении углеграфит : парафин 50:50%, масс. Расплавленную углеграфитовую смесь заливали в тонкостенную медную трубку, диаметром 6 мм. После застывания смеси по центру углеграфитовой заготовки проделывали сквозное отверстие диаметром 1 мм. Капиллярный канал электрода полировали с помощью хлопчатобумажной нити, пропущенной через него.
Хлорид-серебряный полуэлемент (5) электрода сравнения изготавливали из осадка хлорида серебра и контакта из серебряной проволоки. Процедура изготовления хлорид-серебряного электрода известна из авторского свидетельства СССР №1132210.
Клапан для ввода анализируемой жидкости расположен в корпусе датчика непосредственно перед входом в канал измерительного трубчатого электрода и содержит перфорированную прокладку из силиконовой резины и ввинчиваемой в корпус поджимной втулки, имеющей отверстие под наконечник пипеточного дозатора. Ослабляя (вывинчиванием) или поджимая (ввинчиванием) втулкой перфорированную прокладку достигается возможность ввода анализируемой жидкости в канал измерительного электрода.
Сборка электрохимического датчика осуществляется в следующей последовательности:
Через технологическое отверстие (11) пропустить асбестовую нить и сформировать прессованием подручным инструментом (игла, спица, шило) электролитический ключ (4). Загерметизировать технологическое отверстие.
В камеру измерительного электрода (3) вставить измерительный трубчатый электрод (6) и плотно поджать его с помощью ввинчивания поджимной втулки (10). Герметичность обеспечивается прокладками в виде кольца из силиконовой резины. В камеру для хлорид-серебряного электрода (2) ввинтить хлорид-серебряный полуэлемент (5), обеспечив герметичность камеры резиновой прокладкой-кольцом. Через отверстие (12) в камере вспомогательного электрода ввести насыщенный раствор хлористого калия. Установить на место расположения клапан (8) для ввода анализируемой пробы. Ввод пробы осуществляется через перфорированную прокладку из силиконовой резины с помощью микропипеточного дозатора. Подключить контакты измерительного и вспомогательного электродов к измерительному устройству (милливольтметр, самопишущий потенциометр, аналогово-цифровой преобразователь и пр.).
Электрохимический датчик функционирует следующим образом:
Ввести с помощью микропипеточного дозатора посредством клапана (8) жидкость: раствор медиатора, подготовленные смеси стандартов антиоксидантов в медиаторе или подготовленную к анализу исследуемую пробу. Отметить установившиеся показания ЭДС измерительным прибором.
Нетрудно определить объем микроячейки, в которую инжектируется с помощью микропипеточного дозатора или шприца анализируемая жидкость.
Так, при длине капиллярного канала измерительного электрода 10 мм и диаметре 1 мм рабочий объем составляет 0,00785 см (<10 мкл). Тогда при введении с помощью пипетки-дозатора 1000 мкл анализируемой жидкости осуществляется почти стократная промывка ячейки самим аналитом, что исключает загрязнение и разбавление пробы предшествующими аналитами и обеспечивает воспроизводимость измерения ЭДС. Стабильные показания измерительного прибора достигаются в течение 15 секунд.
Электрохимический датчик может работать в проточно-инжекционном режиме. Для этого удаляется заглушка (резиновая прокладка) у передней поджимной втулки (9) и к штуцеру подключается перистальтический насос, посредством которого прокачивается раствор медиаторной системы.
Вся процедура определения антиоксидантной активности веществ заключается в следующем.
3
6
4
6
В отдельном объеме смешивают 0,5 мл экстракта растений с 4,5 мл раствора медиатора, содержащего 0,005 М K[Fe(CN)] + 0,001М K[Fe(CN)] в 0,05М фосфатном буфере с рН 6,86. 1,0 мл этой смеси с помощью пипеточного микродозатора инжектируют через клапан в капиллярный канал измерительного электрода, расположенного в измерительной камере датчика.
В качестве стандарта антиоксидантной активности используют свежеприготовленные водные и спиртовые растворы аскорбиновой кислоты с известной концентрацией или другие общепринятые вещества антиоксиданты (дигидрокверцитин, тролокс, галловая кислота), относительно которых необходимо произвести оценку антиоксидантной активности. Берут низшую и высшую точки предполагаемого диапазона концентраций антиоксиданта. Калибровочный раствор готовят аналогично анализируемой пробы: смешивают 4,5 мл раствора медиатора с 0,5 мл раствора стандарта актиоксиданта.
Расчет антиоксидантной активности вещества относительно принятого стандарта проводят по построенному графику или по формуле
2
где s - концентрация стандарта аскорбиновой кислоты (или другого стандарта), соответствующей верхней границе ожидаемого диапазона анализируемых растворов;
k - крутизна электродной функции датчика:
1
2
1
2
где E и Е устойчивые показания потенциометра при измерении стандартов растворов аскорбиновой кислоты (или другого стандарта) с концентрациями, соответствующими нижней (s мг/мл) и верхней (s, мг/мл) границе ожидаемого диапазона анализируемых растворов, а Ех - показания потенциометра в анализируемом растворе.
Эти же формулы могут быть заложены в алгоритм работы анализатора суммарной антиоксидантной активности, включающего электрохимический датчик, подключенный к компьютеру посредством микропроцессорной платформы «Arduino».
При определении нерастворимых в воде антиоксидантов анализируемую пробу и стандарты антиоксидантов, относительно которых проводится измерение, готовят в идентичных условиях. Для лучшего извлечения жирорастворимых антиоксидантов предпочтительно использовать ацетоно-спиртовые смеси.
Действие (работоспособность) полезной модели иллюстрируется следующими примерами:
1
2
Пример 1. Определение антиоксидантной активности водных экстрактов лекарственных растений. Определяли антиоксидантную активность относительно условно принятого стандарта - аскорбиновой кислоты для мяты перечной, цветов ромашки, шалфея. Стандартные растворы аскорбиновой кислоты с концентрацией s=0,1 мг/мл и s=1,0 мг/мл.
3
6
4
6
1
2
1
2
1,0 г воздушно-сухой массы растения заливали 100 мл кипящей дистиллированной водой и настаивали в течение 10 минут. Раствор остужали до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр. 0,5 мл экстракта смешивали с 4,5 мл раствора медиатора, содержащего 0,005 М K[Fе(CN)] + 0,001М K[Fe(CN)] в 0,05М фосфатном буфере с рН 6,86. 1,0 мл полученной смеси вводили через клапан в капиллярный канал измерительного электрода и записывали установившееся показание (Ех) измерительного прибора. Предварительно электрохимический датчик калибровали по стандартным растворам аскорбиновой кислоты, подготовленных аналогичным образом, смешивание 0,5 мл стандарта с 4,5 мл медиатора. Записывали показания прибора для стандарта аскорбиновой кислоты s (0,1 мг/мл) и для стандарта s (1,0 мг/мл), соответственно E и Е. Рассчитывали крутизну электродной функции и рассчитывали антиоксидантную активность экстракта по формуле
Для улучшения метрологических показателей измерения рекомендуется проводить калибровку электрохимического датчика через каждые 5-7 измерений. Результаты измерений представлены в таблице 1:
Пример 2. Определение антиоксидантной активности фиточаев.
Поступали аналогичным образом, описанным в первом примере. Анализировали антиоксидантную активность фитопродукции известных производителей.
Результаты определения представлены в таблице 2.
Пример 3. Определение антиоксидантной активности спиртовых экстрактов растений.
Органические растворители способны дополнительно экстрагировать нерастворимые в воде антиоксиданты. Использовали 40% раствор этилового спирта (водку). Навеску растительной биомассы 1,0 г настаивали в 100 мл водки в течение 20 минут. Стандарты аскорбиновой кислоты также готовили на водке.
Измерения проводили аналогично примерам 1 и 2.
Сравнение результатов анализа представлено в таблице 3.
Как видно спиртсодержащие экстракты растений обладают большей антиоксидантной активностью по сравнению с водными экстрактами. Это объясняется дополнительной экстрагируемостью нерастворимых в воде антиоксидантов, присутствующих в биомассе растений.
Пример 4. Определение антиоксидантной активности растительного сырья относительно других антиоксидантных стандартов. Проведено сравнение результатов определения суммарной антиоксидантной активности некоторых растений относительно аскорбиновой кислоты, дигидроквертицина, галловой кислоты, кофейной кислоты, фенилантраниловой кислоты. Результаты представлены в таблице 4.
В результате исследований выявлено, что сравнительно высоким антиоксидантным потенциалом обладают трава репешка и лист перечной мяты.
Показано, что использование других стандартов для расчета суммарной АОА в лекарственном растительном сырье (ЛРС) и фитопрепаратах практически не изменяет соотношения между величинами, хотя и дает другие значения. При этом, чем сильнее антиоксидант стандарт, тем меньше значение суммарной антиоксидантной активности в изучаемом объекте.
Приведенные примеры показывают, что трубчатый измерительный электрод с капиллярным каналом и клапан для ввода анализируемой жидкости обеспечивают применение малых объемов аналита, быстрое установление ЭДС, отказ от необходимости перемешивания анализируемого раствора, осуществление проточно-инжекционного режима эксплуатации датчика и его использование в полевых условиях, т.е. достигается выполнение поставленных задач. Полезная модель обеспечивает улучшение эксплуатационных характеристик: расширение спектра анализируемых веществ (возможность исследования антиоксидантной активности веществ, нерастворимых в воде), уменьшение объемов анализируемых растворов, упрощение процедуры анализа, сокращение времени его проведения, возможность использования в полевых условиях.