Способ количественного определения сирингина в коре сирени обыкновенной
METHOD FOR QUANTIFYING SYRINGIN IN THE BARK OF COMMON LILAC

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении анализа содержания сирингина в коре сирени обыкновенной.
Действующая система контроля качества требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих дифференцированно определять конкретные БАС.
Syringa vulgaris
Oleaceae
Eleutherococcus senticosus
Araliaceae
Сирень обыкновенная ( L., сем. Маслинные - ) – листопадный кустарник, культивируется как декоративное растение, но известно своими лечебными свойствами (1-4). При фитохимическом изучении учеными СамГМУ и ВИЛАР выявлено, что доминирующим биологическим активным соединением коры сирени является циннамилгликозид сирингин (2,3,5). В официальной медицине кора сирени обыкновенной используется в качестве сырья для получения государственного стандартного образца элеутерозида В (сирингина) (ВФС 42-2088-92 «Cирингин-стандартный образец»), используемого при оценке качества корневищ и корней элеутерококка колючего ( Maxim, сем. Аралиевые – ), лекарственных препаратов и биологически активных добавок на основе сырья элеутерококка колючего (2, 5).
Для определения содержания сирингина в коре сирени используются спектрофотометрические, хроматоспектрофотометрические методы, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (2,5).
В качестве прототипа нами взят фармакопейный способ определения сирингина в корневищах и корнях элеутерококка колючего (6). Способ предусматривает дробную экстракцию сирингина с использованием в качестве экстрагента 96 % этанолом при нагревании с обратным холодильником на водяной бане. ВЭЖХ-анализ содержания сирингина проводится в следующих условиях (6):
- колонка из нержавеющей стали 250×4,6 мм, эндкепированный октадецилсиликагель для хроматографии, диаметр 5 мкм,
- элюирование в градиентном режиме, подвижная фаза – раствор фосфорной кислоты концентрированной в воде и ацетонитрил для хроматографии в разных соотношениях.
- детекция при длине волны 266 нм.
Продолжительность анализа может составлять до 45 мин.
На наш взгляд, используемые в прототипе параметры экстракции не позволяют обеспечить высокий выход сирингина, так как сирингин мало и медленно растворим в 95 % этаноле (2,3).
Кроме этого, известно, что при градиентном режиме корректировка условий является более критичной, может привести к некорректной идентификации пиков, их наложению или сдвигам, при которых интересующие вещества могут выйти после указанного времени регистрации хроматограммы (7).
Таким образом, целью изобретения является разработка нового способа определения количественного содержания сирингина в коре сирени обыкновенной с увеличенным выходом сирингина и меньшей продолжительностью анализа при сохранении правильности, специфичности и прецизионности метода.
Техническим результатом является увеличение выхода сирингина и уменьшение продолжительности способа количественного определения сирингина в коре сирени обыкновенной.
Технический результат достигается тем, что способ осуществляют путем экстракции сирингина из коры сирени обыкновенной 70 % этиловым спиртом, ВЭЖХ-анализа полученных извлечений в изократическом режиме элюирования с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила и 1% раствора уксусной кислоты в воде в соотношении 15:85 и детекцией при длине волны 266 нм.
X
Содержание сирингина в коре сирени обыкновенной в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах () вычисляют по формуле
,
где H – среднее значение высоты пика сирингина, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца;
о
H – среднее значение высоты пика сирингина, вычисленное из хроматограмм раствора стандартного образца сирингина;
V – объем извлечения, мл;
P – разведение;
о
V – объем раствора стандартного образца сирингина, мл,
1
V – объем вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл;
2
V – объем вводимой пробы раствора стандартного образца сирингина, мкл;
о
m – масса стандартного образца, г;
m – масса сырья, г;
W – потеря в массе при высушивании сырья, в процентах;
0,95 – коэффициент пересчета сирингина на безводное вещество.
Способ осуществляют следующим образом. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (раствор А). 5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят водой очищенной до метки (раствор В).
1 мкл раствора В вводят в жидкостной хроматограф «Милихром-6» с УФ-детектором. Хроматографируют в условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: стальная колонка «КАХ-6-80-4» (2 мм х 80 мм; Separon-C18, диаметр 5 мкм), подвижная фаза – ацетонитрил : 1% раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 15:85, скорость элюирования – 100 мкл/мин, объем элюента - 1000 мкл.
Проводят УФ-детектирование при длине волны 266 нм, диапазон чувствительности 0,5. Проводят не менее 3 параллельных определений.
Параллельно 1 мкл раствора стандартного образца сирингина вводят в хроматограф и хроматографируют, как описано выше. Проводят определение высоты пика сирингина и рассчитывают среднюю высоту пика по результатам трех параллельных определений.
X
Содержание сирингина в коре сирени обыкновенной в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах () вычисляют по формуле
,
где H – среднее значение высоты пика сирингина, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца;
о
H – среднее значение высоты пика сирингина, вычисленное из хроматограмм раствора стандартного образца сирингина;
V – объем извлечения, мл;
P – разведение;
о
V – объем раствора стандартного образца сирингина, мл,
1
V – объем вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл;
2
V – объем вводимой пробы раствора стандартного образца сирингина, мкл;
о
m – масса стандартного образца, г;
m – масса сырья, г;
W – потеря в массе при высушивании сырья, в процентах;
0,95 – коэффициент пересчета сирингина на безводное вещество.
Примечание:
Приготовление раствора стандартного образца сирингина.
Около 0,025 г (точная навеска) государственного стандартного образца сирингина (содержание основного вещества ≥95 %) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в небольшом количестве 95% этилового спирта при нагревании на водяной бане, доводят 95% этиловым спиртом до метки, перемешивают.
Валидационная оценка разработанной методики проводилась по показателям: специфичность, линейность, правильность (открываемость), прецизионность. Специфичность методики определялась по соответствию времен удерживания стандартного образца сирингина и соответствующего пика на ВЭЖХ-хроматограмме испытуемого раствора, а также по разрешению между наиболее близкими пиками и фактору асимметрии пиков сирингина.
На фиг. 1 представлена ВЭЖХ-хроматограмма стандартного раствора сирингина, на фиг. 2 – ВЭЖХ-хроматограмма водно-спиртового извлечения из коры сирени обыкновенной (обозначения: 1 – водно-спиртовое извлечение из коры сирени обыкновенной; 2 – стандартный образец сирингина). В условиях ВЭЖХ-анализа время удерживания пика сирингина на хроматограммах стандартного образца сирингина и водно-спиртового извлечения из коры сирени обыкновенной составило 4,046±0,070 мин и 4,092±0,082 мин соответственно.
Определение линейности проводили на пяти уровнях концентраций растворов сирингина (с концентрациями в диапазоне от 0,3424 до 0,5136 мг/мл). Коэффициент корреляции составил 0,99971. Этот диапазон можно рассматривать как аналитическую область методики.
Правильность методики определяли методом добавок путем добавления раствора сирингина с известной концентрацией (80 %, 100 % и 120 %) к испытуемому раствору. При этом средний процент открываемости составил 98,8 %.
Исследование внутренней прецизионности методики указывает на сходимость полученных концентраций анализируемого вещества: ошибка определения среднего результата содержания сирингина в коре сирени обыкновенной с доверительной вероятностью 95 % составляла ±3,20 %. При оценке внутрилабораторной прецизионности также показаны удовлетворительные результаты, так как относительная погрешность определения сирингина в первый и второй дни анализа находится в диапазоне от 0,82 % до 1,20 %.
Нами было также изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 представлено влияние различных параметров экстракции (экстрагент, продолжительность экстракции, соотношение «сырье-экстрагент») на полноту извлечения сирингина из коры сирени обыкновенной. В результате эксперимента было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 70 % этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 60 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:30.
Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.
Предлагаемый способ поясняется следующим примером.
Пример.
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (раствор А). 5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят водой очищенной до метки (раствор В).
1 мкл раствора В вводят в жидкостной хроматограф «Милихром-6» с УФ-детектором. Хроматографируют в условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: стальная колонка «КАХ-6-80-4» (2 мм х 80 мм; Separon-C18, диаметр 5 мкм), подвижная фаза – ацетонитрил : 1% раствор уксусной кислоты в воде в соотношении 15:85, скорость элюирования – 100 мкл/мин, объем элюента - 1000 мкл.
Проводят УФ-детектирование при длине волны 266 нм, диапазон чувствительности 0,5. Проводят не менее 3 параллельных определений.
Параллельно 1 мкл раствора стандартного образца сирингина вводят в хроматограф и хроматографируют, как описано выше. Проводят определение высоты пика сирингина и рассчитывают среднюю высоту пика по результатам трех параллельных определений.
X, %
Содержание сирингина в коре сирени обыкновенной в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах () вычисляют по формуле
где H = 472,7941 – среднее значение высоты пика сирингина, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца;
о
H = 327,3610 – среднее значение высоты пика сирингина, вычисленное из хроматограмм раствора стандартного образца сирингина;
m = 1,0510 – масса сырья, г;
о
m= 0,0249 – масса стандартного образца, г;
W = 11 – потеря в массе при высушивании сырья, в процентах;
Примечание:
Приготовление раствора стандартного образца сирингина.
Около 0,025 г (точная навеска) государственного стандартного образца сирингина (содержание основного вещества ≥95%) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в небольшом количестве 95% этилового спирта при нагревании на водяной бане, доводят 95% этиловым спиртом до метки, перемешивают.
Испытание проведено в трех повторностях. Все данные были статистически обработаны. Содержание сирингина составило 5,01 % ± 0,18 %.
Таким образом, предлагаемый способ количественного определения сирингина в коре сирени обыкновенной обладает следующими преимуществами:
1. Элюирование в изократическом режиме позволяет избежать проблем (некорректная идентификация пиков, их наложение или сдвиги, при которых интересующие вещества могут выйти после указанного времени регистрации хроматограммы), возникающих при проведении хроматографического анализа в градиентном режиме.
2. Продолжительность хроматографического анализа составляет 10 мин по сравнению с 45 мин в прототипе.
3. Использование в разработанном способе 70 % этилового спирта позволяет повысить эффективность экстракции в 2 раза (при сравнении результатов анализа сирингина при использовании в качестве экстрагентов 70 % этанола и 95 % этанола, как в прототипе) (таблица 1).
+
4. Ошибка определения среднего результата содержания сирингина с доверительной вероятностью 95 % составляет 3,20 %, что свидетельствует о высокой воспроизводимости методики.
ИСТОЧНИКИ  ИНФОРМАЦИИ
Syringa
1. Спиридович, Е.В. Анализ вторичных метаболитов в коре видов рода сирень ( L.), интродуцированных в Центральном ботаническом саду НАН Беларуси  / Е.В. Спиридонович, П.С. Шабуня, С.А. Фатыхова и др. // Вестник фармации. – 2018. – Т. 82, № 4. – С. 28-37.
2. Климова, И.Ю. Аналитические и технические исследования по разработке новых препаратов на основе коры сирени обыкновенной / Инна Юрьевна Климова // Дисс. на соискание … уч. степени канд. фармац. наук. – Самара, 2005. – 159 с.
Syringa vulgaris
3. Куркин, В.А., Фенольные соединения коры  / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Н.А. Гриненко и др. // Химия природных соединений. – 1989. - № 4. – С. 581–582.
Syringa vulgaris
4. Woźniak, M. Effects of phytochemically characterized extracts from and isolated secoiridoids on mediators of inflammation in a human neutrophil model / M. Woźniak, B. Michalak, J. Wyszomierska et al. // Front. Pharmacol. – 2018. – Vol. 9. – P. 349. doi: 10.3389/fphar.2018.00349.
5. Авдеева, Е.В. Фитохимические и аналитические исследования по созданию галеновых препаратов на основе лекарственного растительного сырья, содержащего производные коричных спиртов / Е.В. Авдеева // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. – 2007. – № 2. – С. 129-136.
Eleutherococci senticosi rhizomata et radices
6. ФС.2.5.0053.15 Элеутерококка колючего корневища и корни () / Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд., Т. IV. – Министерство здравоохранения Российской Федерации, 2018. URL: http://resource.rucml.ru/feml/pharmacopia/14_4/HTML/1467/index.html#zoom=z.
7. ОФС.1.2.1.2.0001.15 Хроматография / Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. – Министерство здравоохранения Российской Федерации, 2018. URL: http://www.femb.ru/femb/pharmacopea.php.