ПЛАНШЕТ

Полезная модель относится к области биотехнологии, а именно к оборудованию и приспособлениям для проведения иммуноферментного анализа, в частности, используемого в области аллергодиагностики.
Известно использование для иммуноферментного анализа полистироловых планшетов, выпускаемых различными компаниями, например, компанией Polepast (Германия) (Иммунологические методы, ред. Г.М. Фринель, М., Медицина, 1987, с. 166; La systeme. Product Catalogue, p. 13-18). Планшет, как правило, представляет собой снабженную бортиками плоскость, на поверхности которой выполнены лунки, внутренняя поверхность, которых покрыта слоем содержапщм антигены или антитела. Такие планшеты, в частности, применяемые для определения обшето и специфических антител класса Е, выпускаются ТОО «Аллерген, г. Ставрополь, Нин «Аквапаст, г. Санкт- Петербург, фирма «DRG , США и другими производителями.
Недостатком планшетов являются ограниченный перечень определяемых антител, что затрудняет их использование в аллергодиагностике, высокая стоимость, что затрудняет их параллельное использование для анализа большого количества проб.
Наиболее близким по технической сути является планшет для иммуноферментного анализа, представляющий собой снабженную бортиками плоскость, на поверхности которой выполнены лунки, внутренняя поверхность, которых покрыта слоем содержащим антиген и очищенный вирус инфекционного бронхита кзф ( свид. на НМ №7205,1995, кл G01N  ).
Недостатком данного решения является невозможность использования данного планшета для диагностики аллергии.
Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание более универсального и простого в эксплуатации планшета, способного обеспечивать высокую точность и воспроизводимость результатов.
Задача решалась использованием планшета для иммз юферментного анализа, на поверхность л)шок которого нанесена дополнительно подложка, выполненная из смеси аллергенов и бычьего сывороточного альбзтлина, а нанесершый на подложку анализируемый слой содержит комплекс иммуноглобулинов IgE и сыворотки 1ФОВИ человека.
Общий вид планшета приведен на фиг 1, где представлены вид сверху и вид сбоку планшета, а также структура его лунки. Планшет состоит из горизонтальной поверхности (пластины) 1 с бортиками 2. на пластине 1 выполнены лунки 3. На внутренней поверхности лунок 3 нанесена подложка 4, а затем анализируемый слой 5. Для фиксации л)пяок на пластине 1 могут быть нанесены координаты лунок в виде букв и цифр.
Получение и использование планшета осуществляют следующим образом. Во все лунки 3 планшета для образования подложки 4 вносят по 100 мкл аллергенов, разведенных в 10 раз в карбонатнобикарбонатном буферном растворе (КББ). Для лучшей пршшпаемости подложки 4 в раствор предварительно добавляют 20 мкл сывороточного альбумина (бьиьего или человеческого). Затем планшеты инкубируют 16-18 часов при температуре +  и не прилишзше к поверхности лунки частицы удаляют путем стряхивания из перевернутого планшета n/Hjm растворением в смеси КББ с твином-80 и последующим удалением раствора путем стряхивания. Для получения анализируемого слоя 5 в лунки 3 внести по 100 мкл исследуемых сывороток, разведенных в 5 раз в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) при рН 7.4.
Расписывают протокол опыта на схеме планшета, и в соответствии с протоколом, в лунки с отрицательным контролем вносят по 0,1 см кубическому отрицательной сыворотки крови, в лунки, предназначенные для контроля раствора конъюгата и субстрат - зфомогенной смеси, вносят по ОД см кубическому раствора КББ, во все остальные лунки вносят по 0,1 см кубическому исследуемых сывороток. Затем перемешивают растворы в лунках 3 с помощью шейкера в течение 30 сек, планшет за1фывают крышкой и выдерживают в течение 16-18 часов при температуре + .
Не вошедшие в слой 5 частицы удаляют резким стряхиванием и/или промыванием раствором КББ с твин-20. Затем планшет просушивают по внешней стороне лунок, уложив его на фильтровальную бумагу. Полученный таким образом планшет готов для проведения анализа.
С этой целью готовят раствор конъюгата моноклональных антител к IgE человека, меченых пероксидазой хрена (производства ООО «Полигност, с. Петербург) при разведении 1:100 и вносят по ОД мл этого раствора во все лунки планшета. Планшет помещают в термостат на 2 часа при температуре . Посла этого избыток раствора конъюгата удаляют, лунки промывают КББ с твин-80 и подсушивают путем постукивания перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.
За 15-20 минут до использования готовят раствор субстратхромогенной смеси (СХС). Для этого 2 таблетки ортофенилендиамина (ОФД) растворяют в 10 мл фосфатно-цитратного буферного раствора (ФЦБ) при рП 5.0 и добавляют раствор гидроперита до конечной концентрации последнего 0,3%. Во все лунки 3 на слой 5 наносят по 0,1 мл СХС и помещают планшет в зашищенное от света место при температзфе +18 - 22°С на 20 минут.
По истечении указанного срока для остановки ферментативной реакции во все лунки планшета вносят по 0,05 мл 2N серной кислоты.
Регистрацию оптической плотности (ОП) растворов в лунках планшета проводят при длине во:шы 492 нм на фотометре с вертикальным ТШ1ОМ сканирования.
Учет результатов производят не позднее чем через 10-15 минут после добавления раствора серной кислоты. Величина оптической плотности в лунках с о1рицательным контролем не должна превышать 0,2. Исследуемые пробы сывороток оцениваются как положительные, если значения в них в 1,7 раз и более превышают значения ОП отрицательного контроля. Используют оценку реакции по 4-х балльной шкале:
1уровень (реакция отрицательная) значения ОП в исследуемых образцах сывороток менее, чем в 1,7 раз превышают значение ОП отрицательного контроля;
2уровень (реакция положительная, низкий уровень) - значения ОП в исследуемых образцах сывороток в 1,7 - 2,0 раза превышают ОП отрицательного контроля;
3уровень (реакция положительная, средний уровень) - значения ОП в исследуемых образцах сывороток в 2,0 - 3,0 раза превышают ОП отрицательного контроля;
4уровень (реакция положительная, высокий уровень) - значения ОП в исследуемых образцах сывороток более, чем в 3 раза превышают ОП отрицательного контроля.
Полученные с помош;ью заявляемого планшета результаты отличаются высокой надежностью, планшет позволяет провести одновременные испытания на аллергенность больного к большому числу бытовых, пищевых и пальцевых аллергенов.