СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИЦИНА И ПСЕВДОГИПЕРИЦИНА
METHOD FOR SIMULTANEOUS PRODUCTION OF HYPERICIN AND PSEUDOHYPERICIN

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способа производства субстанций препаратов, содержащих нафтодиантроновые пигменты растений - гиперицин и псевдогиперицин для медицины, ветеринарии, биотехнологии и научных исследований.
В научной и патентной литературе есть известные сведения о способах экстракции указанных пигментов из растительного сырья, способах разделения указанных пигментов. В связи с этим коллектив авторов считает необходимым привести сравнительный анализ уже известных способов экстракции и разделения указанных пигментов.
В описании изобретения имеются следующие сокращения и обозначения:
- H - гиперицин;
- РН - псевдогиперицин;
- МАЭ - микроволновая активация процесса экстракции;
- (об/об/об) - объемные отношения;
- ТСХ - тонкослойная хроматография;
- УЗВ - ультразвуковая ванна;
- ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;
- ГЖХ - газожидкостная хроматография;
- ТМС-производных - триметилсилильных производных;
- ИК-спектры - инфракрасные спектры;
- спектры поглощения в УФ-(ультрафиолетовой) области.
Известен способ экстракции гиперицина и псевдогиперицина в аппаратах Сокслета и хроматографического выделения псевдогиперицина [Zotou Α., Loukou Ζ. Determination of Hypericin and Pseudohypericin in Extracts from Hypericum perforatum L. and Pharmaceutical Preparations by Liquid Chromatography-Fluorescence Detection // Chromatographia, 2001. - V. 54. - P. 218-224]. Способ осуществляют путем экстракции пигментов смесью метанол-ацетон (1:1) в течение 6 часов, при постоянном кипячении экстрагента, концентрирования экстракта пигментов до сухого остатка, растворения сухого экстракта в метаноле и выделения РН препаративной жидкостной хроматографией в течение десяти дней, концентрирования фракций, содержащих по данным ВЭЖХ анализа РН, методом лиофильной сушки.
Недостатками указанного способа экстракции пигментов и выделения РН являются: применение высокотоксичных растворителей: метанол и смесь метанола с ацетоном (1:1). Большая продолжительность экстракции пигментов на аппарате Сокслета (6 ч) и высокие трудозатраты на стадии выделения РН методом жидкостной хроматографии в течение 10 дней.
Известен способ экстракции пигментов зверобоя и обогащения экстракта гиперицинами [Стасевич О.В., Леонтьев В.Н., Коваленко Н.А., Супиченко Г.Н. Хроматографический анализ и разделение гиперицинсодержащего экстракта зверобоя // Труды БГТУ, 2012. - №4 (151). - С. 183-185]. Способ осуществляют экстракцией пигментов в аппарате Сокслета этанолом, препаративным разделением экстракта жидкостной хроматографией на сорбенте Diaion НР-20, элюированием пигментов с сорбента водными растворами спирта концентрации (0, 20, 40, 60, 80 и 100%), а также смесью этанолоа и хлороформа (1:1). Установлено, что при этом гиперицины концентрируются при элюировании 80%-ным этанолом в объеме 304-356 мл, а также смесью этанола с хлороформом в объеме 540-564 мл. В результате авторам удалось повысить концентрацию H в полученных фракциях с 0,08% до 0,34%.
Недостатками указанного способа экстракции пигментов и выделения H являются: применение высокотоксичных растворителей - смесь этанола с хлороформом (1:1). Применение сорбента для хроматографического обогащения пигментов, не обеспечивающего селективное разделение H и РН с получением препаративно чистых соединений. Большая продолжительность процесса хроматографического разделения пигментов на сорбентах с полистирольной матрицей, типа «Diaion НР-20».
Известен способ получения H и РН, приведенный в патенте [US Patent 5047435 Antiviral compositions containing aromatic polycyclic diones and method for treating retrovirus infections / Lavie; David (Rehovot, IL); Meruelo; Daniel (Scarborough, NY); Lavie; Gad (New York, NY); Revel; Michel (Rehovot, IL); Vande Velde; Vincent (Boncelles, BE); Rotman; Dalia (Rehovot, IL) Assignee: New York University (New York, NY); Yeda Research and Development Company, Ltd. (Rehovot, IL), Foreign Application Priority Data: Aug 08, 1986. Intern'l Class: A61K 031/015; A61K 045/08; A61L 002/18; A61L 015/00/], заключающийся в сушке растительного сырья при 55°С, измельчении сырья, экстракции 1 кг травы зверобоя ацетоном (около 5-10 л на кг) в аппарате Сокслета до обесцвечивания растворителя в извлечении (9-55 ч), концентрирования ацетонового экстракта выпариванием в вакууме досуха с получением остатка 95 г, хроматографического фракционирования полученного сухого экстракта на колонке, заполненной силикагелем 60 (0,06-0,20 мм). Для этого авторы патента растворяют 25 г полученного сухого экстракта в 500 мл ацетона, добавляют равное количество силикагеля 60 и упаривают на роторном испарителе с перемешиванием до получения однородной и сухой смеси, которую затем помещают в верхнюю часть хроматографической колонки, содержащей один кг силикагеля 60 и элюируют хлороформом до тех пор, пока растворитель не достигнет дна колонки. Затем колонку промывают смесью растворителей, включающей хлороформ-ацетон-метанол, 75:15:10 (об/об/об). После снижения интенсивности красной окраски элюата промывают колонку смесью растворителей хлороформ-ацетон-метанол, 55:15:10 (об/об/об). Собирают фракции по 250 мл. Каждую фракцию анализируют методом ТСХ. Дальнейшую очистку и разделение H и РН достигают последовательно двукратной флеш-хроматографией с использованием силикагеля 60 (меш 0,04-0,06) под давлением. Получают два основных компонента: H с выходом 0,19 г и РН с выходом 0,73 г.
Недостатками указанного способа экстракции пигментов и выделения H и РН являются: применение высокотоксичных растворителей - хлороформ, ацетон, метанол. Применение сорбента для хроматографического обогащения пигментов силикагеля 60, не обеспечивающего селективное разделение гиперицина и псевдогиперицина с получением препаративно чистых соединений в одну стадию флеш-хроматографии. Большая продолжительность процесса экстракции сырья ацетоном в аппарате Сокслета и хроматографического разделения пигментов на сорбентах типа силикагель 60.
3
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ экстракции H и РН из лекарственной фитомассы зверобоя продырявленного, описанный в статье [Пунегов В.В., Костромин В.И., Фомина М.Г., Зайнуллин В.Г., Юшкова Е.А., Белых Д.В., Чукичева И.Ю., Зайнуллин Г.Г. Экстрагирование гиперицина и псевдогиперицина из зверобоя продырявленного в условиях микроволновой активации процесса // Химия растительного сырья, 2014. - №1. - С. 125-130] и принимаемого за прототип в части стадии экстракции целевых пигментов. Способ экстракции H и РН заключается в измельчении лекарственной фитомассы зверобоя продырявленного до травяной муки, проходящей через сито с ячейкой 0,5 мм, трехкратной экстракции липофильных веществ хлороформом при гидромодуле, равном тридцати, с активацией процесса массопереноса обработкой суспензии сырье-хлороформ ультразвуком в течение 30 с, выдержки суспензии при комнатной температуре в течение 30 мин, фильтрования хлороформного экстракта хлорофилла и липидов через слой ваты и бумажного фильтра, сушки обезжиренного сырья в вакууме в токе воздуха с целью полного удаления паров хлороформа из сырья, трехкратной экстракции суммы H и РН из обезжиренного сырья в течение 60 с водным раствором этилового спирта или изопропанола при гидромодуле от 20 до 48 в условиях микроволновой активации процесса экстракции (далее по тексту МАЕ (э)) с нагреванием суспензии в микроволной камере до 65°С при частоте СВЧ излучения 2450 МГц, удельной мощности СВЧ в условиях эксперимента 0,0205 Вт/см. Полученные экстракты объединяют и концентрируют в вакууме на роторном испарителе с целью рекуперации растворителей.
Недостатками указанного способа экстракции H и РН являются: применение в качестве экстрагента липофильных веществ токсичного хлороформа. Для полного удаления паров хлороформа из обезжиренного сырья требуется много времени. При этом пары хлороформа не подвергаются улавливанию и загрязняют атмосферу. Кроме того, как правило, технический хлороформ содержит в следовых количествах диоксины, которые могут вызвать контаминацию растительного сырья при использовании хлороформа.
Экстракцию H и РН осуществляют быстрым нагреванием суспензии спирт-сырье в СВЧ камере до 65°С за 60 с, но при температуре более 60°С происходит интенсивная экстракция гликозидов флавоноидов и крахмала из фитомассы в раствор и загрязнение экстракта пигментов балластными, в данном случае, веществами. Эти вещества в дальнейшем снижают селективность хроматографического разделения H и РН в условиях флеш-хроматографии. Кроме того, в условиях постоянного быстрого нагревания суспензии сырье-экстрагент в СВЧ камере возможен локальный перегрев, сопровождающийся частичным разрушением целевых пигментов, а также при этом есть реальная опасность внезапного теплового выброса экстракционной массы из экстрактора.
Технический результат заключается в упрощении и сокращении затрат, повышении вариабельности экстракции растительного сырья и условий проведения экстракции, повышении эффективности стадии глубокой очистки гиперицина и псевдогиперицина методом препаративной жидкостной флеш-хроматографии от сопутствующих экстрактивных веществ растения.
Изобретение поясняется рисунками:
- на рис. 1 приведена хроматограмма ВЭЖХ анализа полученных пигментов. ВЭЖ хроматограммы чистых пигментов зверобоя продырявленного - гиперицина и псевдогиперицина, по вертикали: единицы оптической плотности (Б (бел.)), по горизонтали - время хроматографического удерживания компонентов, мин. Хроматограф «Милихром-5», VIS-детектор, колонка 80*2 мм, сорбент «Нуклеосил С18», 5 мкм, элюент ацетонитрил-этанол с линейным градиентом возрастания концентрации этанола, подкисленного уксусной кислотой (1%).
- на рис. 2 приведены ИК-спектры (ИК-спектр гиперицина (тонкая пленка на диске KBr), идентичный с ИК-спектром псевдогиперицина. Фурье спектрометр «Инфралюм ФТ-02».
- на рис. 3 приведен спектр поглощения в УФ- и видимой области спиртовых растворов полученных образцов гиперицина и псевдогиперицина. Спектрометр Shimadzu UV1700 (Япония).
В  таблице 1 отражены условия реализации способа одновременного получения гиперицина (Н) и псевдогиперицина (РН), состав пигментов, практический выход и степень извлечения из растительного сырья.
Способ осуществляется следующим образом: сырьем для производства гиперицина и псевдогиперицина является измельченная лекарственная фитомасса растений Hypericum maculatum Crantz и Hypericum peforatum L., заготавливаемая в фазе бутонизации или массового цветения растений.
3
3
Верхнюю часть олиственных стеблей зверобоя в фазе бутонизации-массового цветения длиной 20-25 см срезают и высушивают вне действия прямого солнечного света. Высушенное сырье перемалывают до частиц, проходящих через сито с ячейкой 0,5 мм. Травяную муку зверобоя вносят в стеклянную колбу объемом 1 л и экстрагируют липофильные вещества (хлорофиллы, каротиноиды, липиды) гексаном или петролейным эфиром, содержащим 10-20% (объемная доля) ацетона, при гидромодуле 4,8. Интенсивно перемешивают суспензию в течение 20 мин и выдерживают в ультразвуковой ванне в течение 5 мин при удельной мощности ультразвукового излучателя 39 Вт/дм. Полученный экстракт отделяют фильтрованием. Сырье на фильтре дополнительно промывают раствором гексан-ацетон предпочтительно при объемном отношении 8:2 три раза по 0,1 л. Сырье, очищенное от липофильных веществ, высушивают в вакууме водоструйного насоса для удаления следов растворителей. Экстракт липофильных веществ концентрируют на ротационном испарителе в вакууме при температуре 45°С досуха для рекуперации гексана (или петролейного эфира) и ацетона. Полученная хлорофилльно-каротиноидная паста является сопутствующим продуктом при производстве гиперицина и псевдогиперицина. Пасту извлекают из кубовой емкости и фасуют в герметичные пластиковые емкости. Обезжиренное сырье вносят в экстрактор, снабженный обратным холодильником, и приливают 55%-ного этанола или изопропанола в таком количестве, чтобы гидромодуль был в интервале 40-48. Суспензию выдерживают 30 мин для набухания сырья и трехкратно экстрагируют гиперицин и псевдогиперицин в СВЧ камере с частотой излучения 2450 МГц, с удельной мощностью 41,6 Вт/дм при гидромодуле 40-48 с нагреванием суспензии сырье-экстрагент до 60-70°С (предпочтительно 66°С) за 29-46 мин (предпочтительно за 42 мин), с периодическим перемешиванием суспензии в условиях широтно-импульсной модуляции СВЧ излучения со скважностью пачек импульсов, равной 1,3, длительностью пачек импульсов СВЧ 23 с. Полученный после фильтрации (или центрифугирования) суммарный экстракт в объеме 14,3 л концентрируют в вакууме с одновременным облучением экстракта в отгонной колбе емкостью 10 л лампой накаливания в 95 Вт на ротационном испарителе при температуре 50°С досуха. Получают 60 г сухого экстракта фиолетового цвета. При облучении экстракта в процессе концентрирования в вакууме в течение 2,5 ч происходит фотоциклизация сопутствующих соединений: протогиперицина и протопсевдогиперицина соответственно до H и PH. Фотоциклизация указанных веществ позволяет повысить практический выход целевых пигментов. С целью дальнейшего фракционирования методом флеш-хроматографии суммарный экстракт пигментов смешивают с водой (0,25 л), диспергируют в УЗВ и смешивают с 300 г сорбента «Диасорб 130 С16Т». Для преципитации сорбент с экстрактом высушивают в вакууме при перемешивании на ротационном испарителе при температуре 50°С. Досушивают преципитат в вакууме масляного насоса при остаточном давлении 0,05-0,08 Па. Преципитат H и РН на «Диасорбе С16» представляет собой порошок коричнево-фиолетового цвета в количестве 360 г. В форколонку системы для препаративной флеш-хроматографии «FLASH150» вносят преципитат пигментов и элюируют псевдогиперицин и гиперицин через хроматографическую колонку внутренним диаметром 160 мм и высотой слоя сорбента 320 мм, заполненную сорбентом, фракции 40-64 мкм, содержащим на поверхности пор силикагеля функциональный покров из диметилоктадецилсилильных групп. Колонка снабжена пневматической системой для радиального сжатия сорбента в колонке, а также входным и выходным радиальным распределителем потока элюента вдоль колонки. В качестве элюента используют водные растворы этилового спирта с возрастанием концентрации от 5% до 60%. Для подавления диссоциации пигментов и увеличения селективности хроматографического разделения используют элюенты, подкисленные уксусной кислотой. Элюируют пигменты с колонки в режиме ступенчатого градиента концентрации этилового спирта. Псевдогиперицин элюируется из колонки 20 и 30%-ным этанолом. Гиперицин элюируется 40 и 45%-ным этанолом. Полученные фракции по 5 л каждая анализируются методом ВЭЖХ по тексту на аналитическом хроматографе «Милихром 5» и по результатам анализа объединяются отдельно фракции, содержащие псевдогиперицин и гиперицин. Фракции красного цвета, содержащие целевые пигменты концентрируются в вакууме на ротационном испарителе. В результате получают фракцию концентрата псевдогиперицина и гиперицина. Полученные концентраты псевдогиперицина и гиперицина растворяют соответственно в 800 мл и 300 мл 95%-ного этилового спирта при кипячении. Растворы фильтруют через мембранный фильтр из фторопласта с порами 0,2 мкм и концентрируют с одновременной вакуумной кристаллизацией на ротационном испарителе ИР-1М при остаточном давлении 33-13 кПа (25-10 мм рт. ст.) до остатка объемом соответственно 5 и 2 мл. Остаток, содержащий целевые продукты, отфильтровывают через мембранный фильтр из фторопласта с порами 0,2 мкм. Получают, после сушки в вакууме при 60°С, на фильтре в кристаллическом виде 0,06-0,073 г псевдогиперицина и 0,014-0,21 г гиперицина. По данным ВЭЖХ анализа массовая доля псевдогиперицина и гиперицина в полученных образцах 94-98%.
Маточные растворы, содержащие этанол упаривают досуха. Твердый остаток, представляющий собой смесь минорных диантроновых соединений зверобоя и следов каротиноидов растения, является сопутствующим продуктом производства гиперицина и псевдогиперицина. Его извлекают из отгонной колбы и после сушки в вакууме фасуют в герметичную тару. Смесь ацетон-гексан и ацетон-петролейный эфир перегоняют на ректификационной установке и после обезвоживания синтетическим цеолитом CaX, используют многократно для производства опытных партий пигментов зверобоя с целью медико-биологических исследований их свойств. Растительное сырье после экстракции целевых пигментов помещают в кубовую емкость лабораторной ретификационной установки и путем перегонки производят рекуперацию этилового спирта или изопропанола, сорбированного растительным жомом. Растительный остаток утилизируют.
Данный способ можно с успехом использовать в фармацевтической промышленности, поэтому он соответствует критерию «промышленно применимо», «новизна» и «изобретательский уровень».
Способ одновременного производства гиперицина и псевдогиперицина конкретизируется следующими примерами:
Пример 1. Подготовка растительного сырья. Верхнюю часть олиственных стеблей зверобоя пятнистого (Hypericum maculatum Crantz) в фазе бутонизации-массового цветения длиной 20-25 см срезали и высушивали вне действия прямого солнечного света. Сырье было заготовлено в Сыктывдинском районе Республики Коми, а сырье зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) заготавливали с экспериментальных делянок Ботанического сада Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Высушенное сырье перемалывали на мельнице до частиц, проходящих через сито с ячейкой 0,5 мм. По результатам ВЭЖХ анализа, в полученной травяной муке из зверобоя пятнистого содержится 0,095% суммы гиперицина и псевдогиперицина, в том числе 0,075% псевдогиперицина и 0,020% гиперицина. Травяная мука из зверобоя продырявленного содержит 0,087% суммы гиперицина и псевдогиперицина, в том числе 0,065% псевдогиперицина и 0,022% -гиперицина.
3
Пример 2. Экстракция сопутствующих липофильных веществ (хлорофиллы и каротиноиды, триглицериды). 124 г воздушно-сухой травяной муки зверобоя пятнистого внесли в стеклянную колбу объемом 1 л и прилили 0,6 л гексана, содержащего 10% (объемная доля) ацетона. Гидромодуль 5. Интенсивно перемешивали суспензию на магнитной мешалке в течение 20 мин и выдерживали в УЗВ-2/150-ТН (ООО «Рэлтек», Россия) в течение 5 мин при удельной мощности ультразвукового излучателя 39 Вт/дм. Полученный экстракт фильтровали на нутч-фильтре. Сырье на фильтре дополнительно промывали раствором гексан-ацетон (9:1) три раза по 0,1 л. Сырье, очищенное от липофильных веществ, высушивали в вакууме водоструйного насоса для удаления следов растворителей. Экстракт концентрировали на ротационном испарителе ИР-1 (ОАО «Химлаборприбор», г. Клин, Россия) в вакууме при температуре 45°С досуха для рекуперации гексана и ацетона. Полученная хлорофилльно-каротиноидная паста является сопутствующим продуктом при производстве гиперицина и псевдогиперицина. Пасту извлекали из кубовой емкости и фасовали в герметичные пластиковые емкости.
3
Пример 3. Экстракция гиперицина и псевдогиперицина. Обезжиренное сырье вносили в полипропиленовый экстрактор объемом 6 л, снабженный обратным холодильником, и прилили 4960 мл 55%-ного этанола. Суспензию выдерживали 30 мин для набухания сырья и трехкратно экстрагировали пигменты в СВЧ камере с частотой излучения 2450 МГц, с удельной мощностью 41,6 Вт/дм при гидромодуле 40 с нагреванием суспензии сырье-экстрагент до 66°С за 42 мин, с периодическим перемешиванием суспензии в условиях широтно-импульсной модуляции СВЧ излучения со скважностью пачек импульсов, равной 1,3, длительностью пачек импульсов СВЧ 23 с. Полученный после фильтрации суммарный экстракт в объеме 14,3 л концентрировали в вакууме с одновременным облучением экстракта в отгонной колбе емкостью 10 л лампой накаливания в 95 Вт на ротационном испарителе ИР-10М (ОАО «Химлаборприбор», г. Клин, Россия) при температуре 50°С досуха. Получили 60 г сухого экстракта фиолетового цвета. При облучении экстракта в процессе концентрирования в вакууме в течение 2,5 ч происходит фотоциклизация сопутствующих соединений: протогиперицина и протопсевдогиперицина соответственно до Н и РН. Фотоциклизация указанных веществ позволяет повысить практический выход целевых пигментов. С целью дальнейшего фракционирования методом флеш-хроматографии суммарный экстракт пигментов смешивали с водой (0,25 л), диспергировали в УЗВ и смешивали со 300 г сорбента «Диасорб 130 С16Т» (ЗАО БиоХимМак СТ» г. Москва, Россия) фракции 160-250 мкм. Для преципитации сорбент с экстрактом высушивали в вакууме при перемешивании на ротационном испарителе ИР-1 при температуре 50°С. Досушивали в вакууме масляного насоса при остаточном давлении 0,05-0,08 Па. Преципитат пигментов на «Диасорбе С16» представлял собой порошок коричнево-фиолетового цвета в количестве 360 г.
3
Пример 4. Фракционирование пигментов флеш-хроматографией. В форколонку системы для препаративной флеш-хроматографии «FLASH150», (Biotage, USA) внесли полученный по примеру 3, преципитат пигментов в количестве 360 г и элюировали псевдогиперицин и гиперицин через хроматографическую колонку внутренним диаметром 160 мм и высотой слоя сорбента 320 мм, заполненную сорбентом, фракции 40-64 мкм, содержащим на поверхности пор силикагеля функциональный покров из диметилоктадецилсилильных групп. Колонка снабжена пневматической системой для радиального сжатия сорбента в колонке, а также входным и выходным радиальным распределителем потока элюента вдоль колонки. В качестве элюента использовали водные растворы этилового спирта с возрастанием концентрации от 5% до 60%. Для подавления диссоциации пигментов и увеличения селективности хроматографического разделения использовали элюенты, подкисленные уксусной кислотой с объемной долей 1%. Элюировали пигменты с колонки в режиме ступенчатого градиента концентрации этилового спирта. Расход элюента на выходе колонки составлял 850 см/мин при давлении на входе колонки 6 атм (607,95 кПа). В первых фракциях, элюированных этанолом 5-15% целевые пигменты не были обнаружены методом ВЭЖХ анализа. Методом ГЖХ-анализа ТМС-производных в этих фракциях обнаружены моно- и дисахариды, гликозиды флавоноидов, преимущественно рутин. Псевдогиперицин элюировали из колонки 20 и 30%-ным этанолом. Гиперицин элюировался 40 и 45%-ным этанолом. Полученные 17 фракций по 5 л каждая анализировали методом ВЭЖХ на аналитическом хроматографе «Милихром 5» (ООО «Медикант», г. Орел, Россия) и по результатам анализа объединяли отдельно фракции, содержащие псевдогиперицин и гиперицин. Фракции красного цвета, содержащие целевые пигменты, концентрировали в вакууме на ротационном испарителе ИР-10М. В результате получена фракция концентрата псевдогиперицина в количестве 0,0883 г (практический выход 0,072%) и гиперицина 0,0221 г (практический выход 0,018%). По данным ВЭЖХ анализа содержание псевдогиперицина в полученном образце составляло 95%, а гиперицина во втором образце 96% (см. табл. 1).
Пример 5. Очистка методом перекристаллизации образцов гиперицина и псевдогиперицина, полученных по примеру 4. 0,0883 г псевдогиперицина и 0,0221 г гиперицина растворяли соответственно в 800 мл и 300 мл 95%-ного этилового спирта при кипячении в конических колбах, полученные растворы фильтровали через мембранный фильтр из фторопласта с порами 0,2 мкм (ЗАО «БиоХимМак СТ», г. Москва, Россия) и концентрировали с одновременной вакуумной кристаллизацией на ротационном испарителе ИР-1М (ОАО «Химлаборприбор», г. Клин, Россия) при остаточном давлении 33-13 кПа (25-10 мм рт. ст.) до остатка объемом соответственно 5 и 2 мл. Остаток, содержащий целевые продукты, отфильтровывали через мембранный фильтр из фторопласта с порами 0,2 мкм. Получили, после сушки в вакууме при 60°С, на фильтре в кристаллическом виде 0, 0879 г псевдогиперицина и 0,0218 г гиперицина. По данным ВЭЖХ анализа массовая доля псевдогиперицина в полученном образце составляет 98, 6%, гиперицина - 99,5% (табл. 1). В виде примеси псевдогиперицин содержит 1,4% гиперицина, а образец гиперицина содержит 0,5% псевдогиперицина. Полученные пигменты исследовали физико-химическими методами, показаными на рисунках. На рис. 1 приведена хроматограмма ВЭЖХ анализа полученных пигментов. На рис. 2 приведены ИК-спектры, а на рис. 3 спектры поглощения в УФ- и видимой области спектра спиртовых растворов полученных пигментов.
По результатам хромато-масс-спектрометрического анализа растворов полученных пигментов, установлено, в масс-спектре, фиксирующем отрицательные ионы, для образца псевдогиперицина характерен сигнал молекулярного иона со значением m/z 519, для образца гиперицина соответствующий сигнал регистрируется со значением m/z 503.
Пример. 6. Рекуперация растворителей, утилизация маточных растворов и отработанного сырья. Маточные растворы, содержащие этанол, упаривали досуха. Твердый остаток, представляющий собой смесь минорных диантроновых соединений зверобоя и следов каротиноидов растения, является сопутствующим продуктом производства гиперицина и псевдогиперицина. Его извлекали из отгонной колбы и после досушки в вакууме фасовали в герметичную тару. Смесь ацетон-гексан и ацетон-петролейный эфир перегоняли на ректификационной установке и после обезвоживания синтетическим цеолитом СаХ использовали многократно для производства опытных партий пигментов зверобоя с целью медико-биологических исследований их свойств. Растительное сырье после экстракции целевых пигментов помещали в кубовую емкость лабораторной ретификационной установки и путем перегонки производили рекуперацию этилового спирта, сорбированного растительным жомом. Растительный остаток утилизировали.
Пример 7. Получение гиперицина и псевдогиперицина осуществляли согласно примерам 1-6, но для обезжиривания сырья использовали смесь ацетона и гексана в объемном соотношении 2:8 при гидромодуле 5. Практический выход и состав пигментов отражен в табл. 1.
Пример 8. Получение гиперицина и псевдогиперицина осуществляли согласно примерам 1-6, но растительное сырье обезжиривают органическим растворителем состава гексан: ацетон (8:2) или петролейный эфир: ацетон (8:2) при гидромодуле 5 в течение 5 минут. Практический выход и состав пигментов отражен в табл. 1.
Пример 9. Получение гиперицина и псевдогиперицина осуществляли согласно примерам 1-6, но растительное сырье обезжиривают органическим растворителем состава гексан: ацетон (9:1) или петролейный эфир: ацетон (9:1) при гидромодуле 5 в течение 5 минут. Практический выход и состав пигментов отражен в табл. 1.
Пример 10. Получение гиперицина и псевдогиперицина осуществляли согласно примерам 1-6, но СВЧ экстракцию пигментов осуществляли с применением 55%-ного изопропанола при гидромодуле 40. Практический выход и состав пигментов отражен в табл. 1.
Пример 11. Получение гиперицина и псевдогиперицина осуществляли согласно примерам 1-6, но СВЧ экстракцию пигментов осуществляли с применением 55%-ного этилового спирта, но при гидромодуле 48. Практический выход и состав пигментов отражен в табл. 1.
Пример 12. Получение гиперицина и псевдогиперицина осуществляли согласно примерам 1-6, но СВЧ экстракцию пигментов осуществляли с применением 55%-ного изопропанола при гидромодуле 48. Практический выход и состав пигментов отражен в табл. 1.
Пример 13. Получение гиперицина и псевдогиперицина осуществляли согласно примерам 1-6, но СВЧ экстракцию пигментов осуществляли с применением 55%-ного этилового спирта при гидромодуле 40 с нагреванием до 70°С за 46 мин. Практический выход и состав пигментов отражен в табл. 1.
Пример 14. Получение гиперицина и псевдогиперицина осуществляли согласно примерам 1-6, но СВЧ экстракцию пигментов осуществляли с применением 55%-спирта при гидромодуле 40 с нагреванием до 60°С. Практический выход и состав пигментов отражен в табл. 1.
Пример 15. Получение гиперицина и псевдогиперицина осуществляли согласно примерам 1-6, но в качестве сырья использовали 124 г травяной муки зверобоя пятнистого (Hypericum perforatum L). Практический выход и состав пигментов отражен в табл. 1.
3
Пример 16. Получение гиперицина и псевдогиперицина осуществляют согласно примерам 1-6, но СВЧ экстракцию пигментов осуществляют с в режиме широтно-импульсной модуляции СВЧ излучения частотой 2450 МГц с удельной мощностью 55,5 Вт/дм три раза при гидромодуле 40 с нагреванием суспензии сырье-экстрагент до 66°С за 29 мин. Практический выход и состав пигментов отражен в табл. 1.
Пример 17. Получение гиперицина и псевдогиперицина осуществляют согласно примерам 1-6, но вместо фильтрования экстракта целевых пигментов используют центрифугирование суспензии сырье-экстракт на центрифуге Т230 в течение 10 мин при скорости вращения ротора центрифуги до 10000 об/мин.
Супернатант сливают с осадка, объединяют с получением 15 л суммарного экстракта и концентрируют в вакууме. Практический выход и состав пигментов отражен в табл. 1.
Таким образом предполагаемый объект позволяет упростить технологию получения целевых веществ - гиперицина и псевдогиперицина за счет отказа от применения высокотоксичного хлороформа, сократить продолжительность всех технологических стадий способа, уменьшить затраты электроэнергии и трудозатраты по сравнению с аналогом и прототипом, повысить экологическую безопасность производства целевых пигментов.