МНОГОСЛОЙНЫЕ СОСУДИСТЫЕ ТРУБОЧКИ
MULTILAYERED VASCULAR TUBES

Данная заявка притязает на приоритет по предварительной заявке на патент США №61/314238, поданной 16 марта 2010 года; и заявке Великобритании №1008781.5, поданной 26 мая 2010 года, описание каждой их которых приведено здесь во всей свой полноте посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к области регенеративной медицины и тканевой инженерии. В частности, изобретение относится к получению многослойных сосудистых трубочек, содержащих фибробласты, гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки и имеющих особые признаки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В США существует потребность в замене кровеносных сосудов для пораженных артерий или замене органов брюшной полости, в частности сосудистых трансплантатах маленького диаметра. Маленькие артерии с диаметрами меньше чем шесть миллиметров не могут быть заменены искусственными материалами из-за высоких скоростей тромбообразования (Connolly et al. (1988); Greisler et al. (1988)).
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Описаны сконструированные многослойные сосудистые трубочки, способы получения таких трубочек, а также применения таких трубочек в терапевтических, диагностических и исследовательских целях. Сконструированные сосудистые трубочки, описанные здесь, не содержат предварительно образованного каркаса, так как предварительно образованные каркасы не используются в получении описанных здесь сконструированных многослойных сосудистых трубочек. Настоящее изобретение обеспечивает, среди прочего, жизнеспособные сконструированные многослойные сосудистые трубочки, которые не содержат материалов предварительно образованного каркаса и являются, таким образом, терапевтически приемлемыми альтернативами сконструированным многослойным сосудистым трубочкам.
В одном аспекте описаны сконструированные многослойные сосудистые трубочки, содержащие, по меньшей мере один слой дифференцированных взрослых фибробластов, по меньшей мере один слой дифференцированных взрослых гладкомышечных клеток, при этом любой слой, кроме того, содержит дифференцированные взрослые эндотелиальные клетки, при этом указанные трубочки имеют следующие характеристики: (а) соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно от 1:99 до 45:55; (b) инженерная многослойная сосудистая трубочка является деформируемой; (с) внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше; (d) длина трубочки составляет примерно до 30 см; (е) толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки; при условии, что инженерная многослойная сосудистая трубочка не содержит предварительно образованного каркаса.
В одном варианте фибробласты, гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки являются аутологичными. В другом варианте прочность на разрыв является достаточной, чтобы выдерживать физиологическое кровяное давление. В еще другом варианте просвет трубочки образован формирующим просвет удаляемым материалом наполнителя. В еще другом варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно от 5:95 до 25:75. В еще другом варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно 15:85. В еще другом варианте инженерная многослойная сосудистая трубочка является деформируемой. В еще другом варианте внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше. В еще другом варианте внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 0.5 мм или меньше. В еще другом варианте толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной по участку трубочки. В еще другом варианте толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной по длине трубочки. В еще другом варианте трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых фибробластов. В еще другом варианте трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых гладкомышечных клеток. В еще другом варианте трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых эндотелиальных клеток. В еще другом варианте трубочка имеет разветвленную структуру. В еще другом варианте трубочка, кроме того, содержит магнитные частицы. В еще другом варианте трубочка предназначена для использования в шунтировании. В еще другом варианте трубочка предназначена для использования в артериовенозном доступе. В еще другом варианте трубочка предназначена для использования в тестировании лекарственных средств. В еще другом варианте трубочка предназначена для использования в тестировании устройств для сердечно-сосудистой системы. В еще другом варианте устройством для сердечно-сосудистой системы является стент. В некоторых вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка является неиннервированной. В некоторых вариантах указанные взрослые фибробласты являются несосудистыми фибробластами.
В другом аспекте предложены способы формирования инженерной многослойной сосудистой трубочки, которые предусматривают: расположение по меньшей мере одного тела матрицы наполнителя, по меньшей мере одного многоклеточного тела гладкомышечных клеток, в котором клетки сцеплены друг с другом, по меньшей мере одного многоклеточного тела эндотелиальных клеток, в котором клетки сцеплены друг с другом, и по меньшей мере одного многоклеточного тела фибробластных клеток, в котором клетки сцеплены друг с другом, для образования требуемой структуры сосудистой трубочки, при этом одно или более тел матрицы наполнителя образуют просвет трубочки и множество тел матрицы наполнителя окружают трубочку; сцепление многоклеточных тел инженерной многослойной трубочки; при условии что в любой момент времени не используется предварительно образованный каркас.
В одном варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам в инженерной многослойной сосудистой трубочке составляет примерно от 1:99 до 45:55. В другом варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам в инженерной многослойной сосудистой трубочке составляет примерно от 5:95 до 25:75. В еще другом варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам в инженерной многослойной сосудистой трубочке составляет примерно 15:85. В еще другом варианте просвет трубочки составляет примерно 6 мм или меньше. В еще другом варианте просвет трубочки составляет примерно 0.5 мм или меньше. В еще другом варианте гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки и/или фибробласты являются аутологичными. В еще другом варианте гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки и/или фибробласты представляют собой человеческие взрослые дифференцированные клетки. В еще другом варианте способ, кроме того, предусматривает культивирование инженерной многослойной сосудистой трубочки в камере для созревания. В некоторых вариантах одно или более многоклеточных тел клеток являются вытянутыми. В некоторых вариантах одно или более многоклеточных тел клеток являются по существу сферическими.
В другом аспекте созданы сконструированные многослойные сосудистые трубочки, содержащие по меньшей мере один слой дифференцированных взрослых фибробластов, по меньшей мере один слой дифференцированных взрослых гладкомышечных клеток, при этом любой слой, кроме того, содержит дифференцированные взрослые эндотелиальные клетки, при этом указанная трубочка имеет следующие характеристики: (а) соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно от 5:95 до 25:75; (b) инженерная многослойная сосудистая трубочка является деформируемой; (с) внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше; (d) длина трубочки составляет примерно до 30 см; (е) толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки; при условии что инженерная многослойная сосудистая трубочка не содержит любого предварительно образованного каркаса.
В одном варианте прочность на разрыв является достаточной для того, чтобы выдерживать физиологическое кровяное давление. В другом варианте просвет трубочки образован формирующим просвет телом наполнителя. В еще другом варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно 15:85. В еще другом варианте толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной по всей длине трубочки. В еще одном варианте трубочка дополнительно содержит магнитные частицы. В еще другом варианте трубочка имеет разветвленную структуру. В еще другом варианте трубочка предназначена для использования в шунтировании. В еще другом варианте трубочка предназначена для использования в артериовенозном доступе. В еще одном варианте трубочка предназначена для использования в тестировании лекарственных средств. В еще другом варианте трубочка предназначена для использования в тестировании устройств для сердечно-сосудистой системы. В еще другом варианте устройством для сердечно-сосудистой системы является стент. В некоторых вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка является неиннервированной. В некоторых вариантах указанные дифференцированные взрослые фибробласты являются несосудистыми фибробластами.
В другом аспекте предложены сконструированные многослойные сосудистые трубочки, содержащие внешний слой дифференцированных взрослых фибробластов, по меньшей мере один внутренний слой дифференцированных взрослых гладкомышечных клеток и дифференцированных взрослых эндотелиальных клеток, и при этом указанная трубочка имеет следующие характеристики: (а) соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам примерно от 1:99 до 45:55; (b) внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше; (с) длина трубочки составляет примерно до 30 см; (d) толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки; при условии что инженерная многослойная сосудистая трубочка не содержит любого предварительно образованного каркаса.
В одном варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно от 5:95 до 25:75. В другом варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно 15:85. В еще другом варианте внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше. В еще другом варианте внутренний диаметр инженерной сосудистой трубочки составляет примерно 0.5 мм или меньше. В еще другом варианте инженерная многослойная сосудистая трубочка является деформируемой. В еще другом варианте трубочка имеет разветвленную структуру. В еще другом варианте длина трубочки составляет примерно от 1 см до 30 см. В еще другом варианте толщина трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки. В еще другом варианте толщина трубочки является по существу равномерной по длине трубочки. В еще другом варианте трубочка имеет наружную поддерживающую структуру. В еще другом варианте трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых фибробластов. В еще другом варианте трубочка по существу не содержит недифференцированных гладкомышечных клеток. В еще другом варианте трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых эндотелиальных клеток. В еще другом варианте трубочка содержит магнитные частицы. В некоторых вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка является неиннервированной. В некоторых вариантах указанные дифференцированные взрослые фибробласты являются несосудистыми фибробластами.
В другом аспекте предложены способы лечения пациента, которые предусматривают обеспечение инженерной многослойной сосудистой трубочки, содержащей по меньшей мере один слой дифференцированных взрослых фибробластов, по меньшей мере один слой дифференцированных взрослых гладкомышечных клеток, при этом любой слой, кроме того, содержит дифференцированные взрослые эндотелиальные клетки, при этом указанная трубочка имеет следующие характеристики: (а) соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам примерно от 1:99 до 45:55; (b) инженерная многослойная сосудистая трубочка является деформируемой; (с) внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше; (d) длина трубочки составляет примерно до 30 см; (е) толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки; при условии что инженерная многослойная сосудистая трубочка не содержит любого предварительно образованного каркаса.
В одном варианте фибробласты, гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки инженерной многослойной сосудистой трубочки являются аутологичными. В одном варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 15:85. В еще другом варианте прочность на разрыв инженерной многослойной сосудистой трубочки является достаточной для того, чтобы выдерживать физиологическое кровяное давление. В еще другом варианте просвет инженерной многослойной сосудистой трубочки образован формирующим просвет тела наполнителем. В еще другом варианте инженерная многослойная сосудистая трубочка является деформируемой. В еще другом варианте внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше. В еще другом варианте внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 0.5 мм или меньше. В еще другом варианте длина трубочки составляет примерно от 1 см до 30 см. В еще другом варианте толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки. В еще другом варианте толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является в основной равномерной по длине трубочки. В еще другом варианте инженерная многослойная сосудистая трубочка имеет разветвленную структуру. В еще другом варианте инженерная многослойная сосудистая трубочка, кроме того, содержит магнитные частицы. В некоторых вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка является неиннервированной. В некоторых вариантах указанные дифференцированные взрослые фибробласты являются несосудистыми фибробластами. В еще другом варианте пациент нуждается в коронарном или периферическом шунтировании. В еще другом варианте пациент нуждается в гемодиализе. В еще другом варианте пациент имеет терминальную стадию почечной недостаточности. В еще другом варианте нуждающийся пациент имеет диабет. В еще другом варианте нуждающийся пациент имеет артериосклероз. В еще другом варианте нуждающийся пациент имеет врожденный порок сердца.
В другом аспекте предложены сконструированные многослойные сосудистые трубочки, содержащие внешний слой дифференцированных взрослых фибробластов, по меньшей мере один внутренний слой дифференцированных взрослых гладкомышечных клеток и дифференцированных взрослых эндотелиальных клеток, и имеющие следующие характеристики: (а) соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам примерно от 5:95 до 25:75; (b) инженерная многослойная сосудистая трубочка является деформируемой; (с) внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше; (d) длина трубочки составляет примерно от 1 см до 30 см; (е) толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки; при условии что инженерная многослойная сосудистая трубочка не содержит любого предварительно образованного каркаса.
В одном варианте прочность на разрыв является достаточной, чтобы выдерживать физиологическое кровяное давление. В другом варианте трубочка образована формирующим просвет телом наполнителя. В другом варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно 15:85. В другом варианте толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной по всей длине трубочки. В другом варианте трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых фибробластов. В другом варианте трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых гладкомышечных клеток. В другом варианте трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых эндотелиальных клеток. В другом варианте трубочка содержит магнитные частицы. В другом варианте трубочка имеет разветвленную структуру. В некоторых вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка является неиннервированной. В некоторых вариантах указанные дифференцированные взрослые фибробласты является несосудистыми фибробластами. В другом варианте трубочка предназначена для использования в шунтировании. В другом варианте трубочка предназначена для использования в артериовенозном доступе. В другом варианте трубочка предназначена для использования в тестировании лекарственных средств. В другом варианте трубочка предназначена для тестирования устройства для сердечно-сосудистой системы. В другом варианте устройством для сердечно-сосудистой системы является стент. В одном варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам в инженерной многослойной сосудистой трубочке составляет примерно от 5:95 до 25:75. В другом варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам в инженерной многослойной сосудистой трубочке составляет примерно 15:85. В другом варианте просвет трубочки составляет примерно 6 мм или меньше. В другом варианте гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки и/или фибробласты представляют собой человеческие взрослые дифференцированные клетки. В другом варианте способ предусматривает культивирование инженерной многослойной сосудистой трубочки в камере созревания.
В другом аспекте предложены сконструированные многослойные сосудистые трубочки, содержащие внешний слой дифференцированных взрослых фибробластов, по меньшей мере один внутренний слой дифференцированных взрослых гладкомышечных клеток и дифференцированных взрослых эндотелиальных клеток и имеющие следующие характеристики: (а) удаляемое формирующее просвет тело наполнителя; (b) соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно от 5:95 до 25:75; (с) внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше; (d) длина трубочки составляет примерно от 1 см до 30 см; (е) толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной; (f) внешняя поддерживающая структура; при условии, что инженерная многослойная сосудистая трубочка является неиннервированной и не содержит любого предварительно образованного каркаса.
В одном варианте удалена внешняя поддерживающая структура. В другом варианте удалено формирующее просвет тело наполнителя. В одном варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно 15:85. В другом варианте инженерная многослойная сосудистая трубочка является деформируемой. В другом варианте трубочка имеет разветвленную структуру.
В другом аспекте предложены сконструированные многослойные сосудистые трубочки, содержащие дифференцированные гладкомышечные клетки, дифференцированные взрослые эндотелиальные клетки и дифференцированные взрослые фибробласты, при этом указанные клетки сцеплены друг с другом, и при этом указанная трубочка имеет следующие характеристики: (а) соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно от 1:99 до 45:55; (b) внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше; (с) длина трубочки составляет примерно до 30 см; (d) толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки; при условии что инженерная многослойная сосудистая трубочка не содержит любого предварительно образованного каркаса.
В некоторых вариантах дифференцированные взрослые гладкомышечные клетки, дифференцированные взрослые эндотелиальные клетки и дифференцированные взрослые фибробласты равномерно распределены в инженерной сосудистой трубочке. В других вариантах дифференцированные взрослые гладкомышечные клетки, дифференцированные взрослые эндотелиальные клетки и дифференцированные взрослые фибробласты неравномерно распределены в инженерной сосудистой трубочке. В других вариантах клетки распределены в слоях. В еще других вариантах один или более слоев характеризуются распределением типов клеток, которое отличается от одного или более других слоев. В некоторых вариантах клетки неравномерно распределены в момент образования инженерной сосудистой трубочки. В некоторых вариантах один или более типов клеток мигрируют или сегрегируют до некоторой степени, создавая, таким образом, неоднородное распределение.
В некоторых вариантах инженерная сосудистая трубочка является деформируемой. В одном варианте фибробласты, гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки являются аутологичными. В другом варианте прочность на разрыв является достаточной для того, чтобы выдерживать физиологическое кровяное давление. В еще другом варианте просвет трубочки образован удаляемым формирующим просвет телом наполнителя. В еще другом варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно от 5:95 до 25:75. В еще другом варианте соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно 15:85. В еще другом варианте инженерная сосудистая трубочка является деформируемой. В еще другом варианте внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше. В еще другом варианте внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 0.5 мм или меньше. В еще другом варианте толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной по участку трубочки. В еще другом варианте толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной по длине трубочки. В еще другом варианте трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых фибробластов. В еще другом варианте трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых гладкомышечных клеток. В еще другом варианте трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых эндотелиальных клеток. В еще другом варианте трубочка имеет разветвленную структуру. В еще другом варианте трубочка, кроме того, содержит магнитные частицы. В еще другом варианте трубочка предназначена для шунтирования. В еще другом варианте трубочка предназначена для использования в артериовенозном доступе. В еще другом варианте трубочка предназначена для использования в тестировании лекарственных средств. В еще другом варианте трубочка предназначена для использования в тестировании устройств для сердечно-сосудистой системы. В еще другом варианте устройством для сердечно-сосудистой системы является стент. В некоторых вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка является неиннервированной. В некоторых вариантах указанные дифференцированные взрослые фибробласты являются несосудистыми фибробластами.
Термины «сцепляться», «сцепленные» и «сцепление», используемые здесь, относятся к межклеточным адгезионным свойствам, благодаря которым происходит связывание клеток, клеточных агрегатов, многоклеточных тел и/или слоев. Термины используются взаимозаменяемо с терминами «сливаться», «слитый» и «слияние».
Используемый здесь термин «каркас» относится к синтетическим каркасам, таким как полимерные каркасы, несинтетическим каркасам, таким как слои внеклеточного матрикса, и любым другим типам предварительно образованного каркаса, который является единым целым с физической структурой инженерной многослойной сосудистой трубочки и не удаляется из трубочки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Новые признаки изобретения представлены подробно в прилагаемой формуле. Лучшее понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения будет получено при обращении к следующему подробному описанию с иллюстративными вариантами, в которых использованы принципы изобретения, и сопровождающих чертежей, в которых:
ФИГ. 1 представляет собой иллюстративное окрашивание гематоксилином и эозином смешанного клеточного цилиндра HASMC-HAEC (человеческих аортальных гладкомышечных клеток - человеческих аортальных эндотелиальных клеток).
ФИГ. 2 представляет собой геометрическое расположение для конструирования сосудистой трубочки, имеющей внешний слой HDF и внутренний слой HASMC-HAEC с использованием многоклеточных тел HDF и смешанных многоклеточных тел HASMC-HAEC.
ФИГ. 3А представляет собой иллюстративную неизолированную многослойную сосудистую трубочку.
ФИГ. 3В представляет собой иллюстративную изолированную многослойную сосудистую трубочку, образованную путем сцепления между цилиндрами, инкапсулированными внутри агарозной поддерживающей структуры, через 24 часа инкубации.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Тканевая инженерия обеспечивает решение проблем, вызванных возрастающей потребностью в замене органов, связанной с нехваткой органов для трансплантации, включая кровеносные сосуды (Langer and Vacanti (1993)). В США существует потребность в замене кровеносных сосудов для пораженных артерий или в замене органов брюшной полости, в особенности сосудистых трансплантатах маленького диаметра. Кроме того, выявлена потребность в улучшенных кровеносных сосудах для исследовательских применений. Маленькие артерии с диаметрами меньше чем пять-шесть мм не могут быть заменены искусственными материалами из-за высоких скоростей тромбообразования (Connolly et al. (1988); Greisler et al. (1988)). Сосудистые трансплантаты, созданные путем тканевой инженерии, обеспечивают практическое решение проблемы нехватки нативных трансплантируемых кровеносных сосудов и, кроме того, применяются в тестировании устройств для сердечно-сосудистой системы и тестировании лекарственных средств.
Нативные сосуды содержат три слоя: внутренний слой (интима), состоящий из эндотелиальных клеток, средний слой (медиа) гладкой мускулатуры сосудов и внешний слой (адвентиция) фибробластов. Идеальные сосудистые трансплантаты, созданные путем тканевой инженерии, не должны содержать синтетического каркаса, который может так или иначе оказывать влияние на поведение трансплантата в течение длительного времени или препятствовать его первичной биологической функции. Многослойные сосудистые трубочки, описанные здесь, обеспечивают этот результат. Желательно получить путем тканевой инженерии сосудистые трансплантаты с маленьким диаметром, которые имеют внутренние диаметры примерно 6 мм или меньше. Многослойные сосудистые трубочки, описанные здесь, обеспечивают этот результат (а также большие диаметры при необходимости). Остальным не удалось создать синтетический не содержащий каркас эластичный трансплантат, который может выдерживать физиологическое кровяное давление. Многослойные сосудистые трубочки, описанные здесь, обеспечивают этот результат. Остальным не удалось воссоздать сосудистую конструкцию, содержащую три основных типа клеток, присутствующих в сосудистых тканях: фибробласты, гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки, в отсутствие поддерживающих биоматериалов. Многослойные сосудистые трубочки, описанные здесь, обеспечивают этот результат.
Сборку конструкции многослойной сосудистой трубочки, содержащей фибробласты, гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки, которая является деформируемой, по существу равномерной, не содержит синтетического каркаса и имеет внутренний диаметр примерно 0.5 мм или меньше, до сих пор не смогли осуществить. Многослойные сосудистые трубочки, описанные здесь, обеспечивают этот результат.
Описаны сконструированные многослойные сосудистые трубочки, содержащие, по меньшей мере один слой дифференцированных взрослых фибробластов, по меньшей мере один слой дифференцированных взрослых гладкомышечных клеток, при этом любой слой, кроме того, содержит дифференцированные взрослые эндотелиальные клетки, при этом указанная трубочка обладает, по меньшей мере, одной из следующих характеристик: (а) соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно от 1:99 до 45:55; (b) инженерная многослойная сосудистая трубочка является деформируемой; (с) внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше; (d) длина трубочки составляет примерно до 30 см; (е) толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки; при условии что инженерная многослойная сосудистая трубочка не содержит любого предварительно образованного каркаса. В конкретных вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка обладает, по меньшей мере, двумя из этих характеристик. В еще других конкретных вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка обладает, по меньшей мере, тремя из этих характеристик. В еще более конкретных вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка обладает, по меньшей мере, четырьмя из этих характеристик. В еще более конкретных вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка обладает всеми этими характеристиками. В некоторых вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка является неиннервированной. В некоторых вариантах указанные дифференцированные взрослые фибробласты являются несосудистыми фибробластами.
Кроме того, описаны способы формирования инженерной многослойной сосудистой трубочки, которые предусматривают: расположение, по меньшей мере, одного тела матрицы наполнителя, по меньшей мере одного многоклеточного тела гладкомышечных клеток, в котором клетки сцеплены друг с другом, по меньшей мере одного многоклеточного тела эндотелиальных клеток, в котором клетки сцеплены друг с другом, и по меньшей мере одного многоклеточного тела фибробластов, в котором клетки сцеплены друг с другом для формирования требуемой структуры сосудистой трубочки, при этом одно или более тел матрицы наполнителя формируют просвет трубочки и множество тел матрицы наполнителя окружают трубочку; и сцепление многоклеточных тел инженерной многослойной сосудистой трубочки; при условии, что в любой момент времени не используют предварительно образованного каркаса.
В одном варианте многоклеточное тело представляет собой вытянутое клеточное тело. Термин «вытянутое клеточное тело», используемый в тексте, приведен только в качестве примера, но не ограничивающего варианта. Соответственно, опытный в данной области специалист с помощью представленного здесь описания сможет применить сведения о вытянутом клеточном теле к любому другому клеточному телу (например, невытянутым клеточным телам). В одном варианте клеточное тело представляет собой по существу сферическое клеточное тело.
Кроме того, описаны сконструированные многослойные сосудистые трубочки, содержащие по меньшей мере один слой дифференцированных взрослых фибробластов, по меньшей мере один слой дифференцированных взрослых гладкомышечных клеток, при этом любой слой, кроме того, содержит дифференцированные взрослые эндотелиальные клетки, при этом указанная трубочка обладает следующими характеристиками: (а) соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно от 5:95 до 25:75; (b) инженерная многослойная сосудистая трубочка является деформируемой; (с) внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше; (d) длина трубочки составляет примерно до 30 см; (е) толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки; при условии что инженерная многослойная сосудистая трубочка не содержит любого предварительно образованного каркаса.
Кроме того, описаны сконструированные многослойные сосудистые трубочки, содержащие внешний слой дифференцированных взрослых фибробластов, по меньшей мере один внутренний слой дифференцированных гладкомышечных клеток и дифференцированных взрослых эндотелиальных клеток, и при этом указанная трубочка обладает, по меньшей мере, одной из следующих характеристик: (а) соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно от 1:99 до 45:55; (b) внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше; (с) длина трубочки составляет примерно до 30 см; (d) толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки; при условии что инженерная многослойная сосудистая трубочка не содержит любого предварительно образованного каркаса. В конкретных вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка обладает, по меньшей мере, двумя из этих характеристик. В еще более конкретных вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка обладает, по меньшей мере, тремя из этих характеристик. В еще более конкретных вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка обладает, по меньшей мере, четырьмя из этих характеристик. В еще более конкретных вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка обладает всеми этими характеристиками. В некоторых вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка является неиннервированной. В некоторых вариантах указанные дифференцированные взрослые фибробласты являются несосудистыми фибробластами.
Кроме того, описаны способы лечения пациента, которые предусматривают обеспечение инженерной многослойной сосудистой трубочки, содержащей по меньшей мере один слой дифференцированных взрослых фибробластов, по меньшей мере один слой дифференцированных гладкомышечных клеток, при этом любой слой, кроме того, содержит дифференцированные взрослые эндотелиальные клетки, при этом указанная трубочка обладает следующими характеристиками: (а) соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно от 1:99 до 45:55; (b) инженерная многослойная сосудистая трубочка является деформируемой; (с) внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше; (d) длина трубочки составляет примерно до 30 см; (е) толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки; при условии что инженерная многослойная сосудистая трубочка не содержит любого предварительно образованного каркаса.
Кроме того, описаны сконструированные многослойные сосудистые трубочки, содержащие дифференцированные взрослые гладкомышечные клетки, дифференцированные взрослые эндотелиальные клетки и дифференцированные взрослые фибробласты, при этом указанные клетки сцеплены друг с другом, и при этом указанная трубочка обладает следующими характеристиками: (а) соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно от 1:99 до 45:55; (b) внутренний диаметр инженерной многослойной сосудистой трубочки составляет примерно 6 мм или меньше; (с) длина трубочки составляет примерно до 30 см; (d) толщина инженерной многослойной сосудистой трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки; при условии что инженерная многослойная сосудистая трубочка не содержит любого предварительно образованного каркаса.
Типы клеток, используемые в инженерных многослойных сосудистых трубочках, необязательно получены из аллогенных тканей (клетки или ткани, которые происходят или получены от донора того же вида, что и реципиент) или из аутологичных трансплантатов (клетки или ткани, которая происходит или получена от реципиента), и необязательно являются свежими или криосохраненными. Клетки могут дифференцироваться из клеток стволового мозга, например мультипотентной регенеративной клетки с потенциалом дифференциации в различные другие типы клеток, которые выполняют одну или более определенных функций и обладают способностью к самообновлению, или из клеток-предшественников, например унипотентной или мультипотентной регенеративной клетки с потенциалом дифференциации, по меньшей мере, в один тип клетки и с ограниченной или отсутствием способности к самообновлению. Источниками клеток могут служить, например, человеческие аортальные клетки, человеческие клетки пуповины, человеческая жировая ткань, человеческий костный мозг, человеческая плацента или любой другой источник человеческих дифференцированных клеток. Предпочтительно, чтобы типы клеток, используемые в инженерных многослойных сосудистых трубочках, описанных здесь, представляли собой взрослые дифференцированные клетки.
Типы клеток, используемые в инженерных многослойных сосудистых трубочках, могут быть культивированы любым известным в данной области способом. Способы культивирования клеток и тканей известны в данной области и описаны, например, в Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures; Freshney (1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, содержание которой приведено здесь во всей своей полноте посредством ссылки. Общие методики культивирования клеточных культур млекопитающих, клеточных линий и систем клеточных культур, которые могут использоваться в сочетании с настоящим изобретением, также описаны в Doyle, A., Griffiths, J. В., Newell, D. G., (eds.) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998), содержание которого приведено здесь во всей своей полноте посредством ссылки.
2
2
Соответствующие условия выращивания для клеток млекопитающих в культуре хорошо известны в данной области. Среда клеточной культуры, как правило, содержит незаменимые питательные вещества и необязательно дополнительные элементы, такие как факторы роста, соли, минералы, витамины и т.д., которые могут быть выбраны в соответствии с культивируемым типом(ами) клеток. Конкретные ингредиенты могут быть выбраны для усиления клеточного роста, дифференциации, секреции определенных белков и т.д. В целом, стандартная среда для выращивания, содержащая модифицированную по способу Дульбекко среду Игла с низким содержанием глюкозы (DMEM), ПО мг/л пирувата и глутамина, дополненную 10-20% фетальной бычьей сывороткой (FBS) или телячьей сывороткой и 100 ед/мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина, является подходящей, как и различные другие стандартные среды, хорошо известные в данной области. Предпочтительно, чтобы клетки культивировались в стерильных условиях в атмосфере 3-15% СО, предпочтительно 5% СО, при температуре тела животного, от которого была получена клетка, или приближающейся к ней. Например, человеческие клетки предпочтительно культивировать приблизительно при 37°С.
Клетки можно также культивировать с агентами клеточной дифференцировки для индуцирования дифференцировки клеток вдоль желаемой линии. Например, клетки можно культивировать с факторами роста, цитокинами, и т.д. Термин «фактор роста», используемый здесь, относится к белку, полипептиду или комплексу полипептидов, включая цитокины, которые продуцируются клеткой и которые могут влиять на саму клетку и/или множество других соседних или удаленных клеток. Как правило, факторы роста нарушают рост и/или дифференциацию определенных типов клеток либо при развитии, либо в ответ на множество физиологических или окружающих стимулов. Некоторые, но не все факторы роста являются гормонами. Примерами факторов роста являются инсулин, инсулиноподобный фактор роста (IGF),фактор роста нервов (NGF), фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактор роста кератиноцитов (KGF), факторы роста фибробластов (FGF), включая основной FGF (bFGF), происходящие из тромбоцитов факторы роста (PDGF), включая PDGF-AA и PDGF-AB, гепатоцитарный фактор роста (HGF), трансформирующий фактор роста-альфа (TGF-α), трансформирующий фактор роста-бета (TGF-J3), включая TGF(31 и TGF(33, эпидермальный фактор роста (EGF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), интерлейкин-6 (IL-6), IL-8 и подобные. Описание факторов роста, среди прочих источников, можно найти в Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Darnell et al., eds., 1986; Principles of Tissue Engineering, 2d ed., Lanza et al., eds., Academic Press, 2000. Опытному специалисту будет понятно, что любой или все факторы роста в кондиционированной среде, описанной здесь, охвачены настоящим изобретением.
2
Фибробласты, гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки настоящего изобретения можно культивировать по отдельности перед их объединением в многоклеточное тело для формирования в сосудистую трубочку. Например, фибробласты, гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки выращивают по отдельности в культуре в культуральных флаконах и после слияния пересевают и смешивают вместе в одну культуру для формирования смешанной клеточной суспензии и центрифугируют с удалением супернатанта для образования высокоплотного и компактного клеточного осадка для получения смешанной клеточной пасты. Подходящие смешанные клеточные суспензии содержат комбинации фибробластов и гладкомышечных клеток, фибробластов и эндотелиальных клеток, а также гладкомышечных клеток и эндотелиальных клеток. Клетки в смешанной клеточной суспензии выдерживают для агрегации друг с другом и инициирования адгезии клетка-клетка, например, путем инкубации на орбитальном встряхивателе. Смешанную массу формируют в многоклеточное тело, например, путем аспирации в капиллярную пробирку. Клеточные цилиндры затем вытесняют из капиллярных пробирок в канавки формы, например, с помощью плунжера. Или же, фибробласты, гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки вводят по отдельности в многоклеточные тела, включающие, например, вытянутые клеточные тела. Вытянутые клеточные тела могут содержать более чем один компонент внеклеточного матрикса, предварительно смешанного с клетками. Многоклеточное тело затем инкубируют при 37°С и 5% СО для дальнейшего внедрения в сосудистые трубочки с помощью биопринтера.
Многоклеточные тела настоящего изобретения могут также содержать один или более компонентов внеклеточного матрикса (ЕСМ) или одно или более производных одного или более компонентов ЕСМ дополнительно к множеству клеток. Например, вытянутые клеточные тела могут содержать различные белки ЕСМ (например, желатин, фибриноген, фибрин, коллаген, фибронектин, ламинин, эластин и/или протеогликаны). Компоненты ЕСМ или производные компонентов ЕСМ добавляют в клеточную массу, используемую для формирования вытянутого клеточного тела. Компоненты ЕСМ или производные компонентов ЕСМ, добавленные в клеточную массу, очищены от веществ животного или человеческого происхождения или получены рекомбинантными методами, известными в данной области. Или же компоненты ЕСМ или производные компонентов ЕСМ секретируются естественным путем клетками в вытянутом клеточном теле, или клетки, используемые для получения вытянутого клеточного тела, генетически трансформируют любым подходящим известным в области способом для изменения уровня экспрессии одного или более компонентов ЕСМ или производных компонентов ЕСМ и/или одной или более молекул клеточной адгезии или молекул адгезии клетка-субстрат (например, селектины, интегрины, иммуноглобулины и кадгерины). Компоненты ЕСМ или производные компонентов ЕСМ могут содействовать сцеплению клеток в вытянутом клеточном теле. Например, желатин и/или фибриноген добавляют в клеточную массу, которую используют для формирования вытянутого клеточного тела. Фибриноген может быть превращен в фибрин путем добавления тромбина.
Соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам может быть любым соотношением между примерно 1:99 и 45:55 эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам в многоклеточном теле. Например, соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам в инженерной многослойной сосудистой трубочке может составлять примерно 1:99, примерно 5:95, примерно 10:90, примерно 15:85, примерно 20:80, примерно 25:75, примерно 30:70, примерно 35:65, примерно 40:60, примерно 45:55 или любое соотношение между примерно 1:99 и 45:55 эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам.
В некоторых вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых фибробластов. В некоторых вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых гладкомышечных клеток. В некоторых вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка по существу не содержит недифференцированных взрослых эндотелиальных клеток.
2
Фибробласты настоящего изобретения можно культивировать, например, в культуральных флаконах. После слияния фибробласты пересевают и центрифугируют с удалением супернатанта для формирования клеточной массы из одной культуры клетки. Клеточную массу фибробластов формируют в вытянутое клеточное тело, например, путем аспирации в капиллярную пробирку. Вытянутое клеточное тело затем вытесняют из капиллярных пробирок в канавки формы, например, с помощью плунжера. Вытянутое клеточное тело затем инкубируют при 37°С и 5% СО для последующего внедрения в сосудистые трубочки с помощью биопринтера.
2
Гладкомышечные клетки настоящего изобретения также можно культивировать, например, в культуральных колбах. После слияния гладкомышечные клетки пересевают и центрифугируют с удалением супернатанта для формирования клеточной массы из одной клеточной культуры. Клеточную массу гладкомышечных клеток формируют в вытянутое клеточное тело, например, путем аспирации в капиллярную пробирку. Вытянутое клеточное тело затем вытесняют из капиллярных пробирок в канавки формы, например, с помощью плунжера. Вытянутое клеточное тело затем инкубируют при 37°С и 5% СО для дальнейшего внедрения в сосудистые трубочки с помощью биопринтера.
2
Эндотелиальные клетки настоящего изобретения также можно культивировать, например, в культуральных колбах. После слияния эндотелиальные клетки пересевают и центрифугируют с удалением супернатанта для формирования клеточной массы из одной клеточной культуры. Клеточную массу эндотелиальных клеток формируют в вытянутое клеточное тело, например, путем аспирации в капиллярную пробирку. Вытянутое клеточное тело затем вытесняют из капиллярных пробирок в канавки формы, например, с помощью плунжера. Вытянутое клеточное тело затем инкубируют при 37°С и 5% СО для дальнейшего внедрения в сосудистые трубочки с помощью биопринтера.
Форма гелевой матрицы может быть изготовлена для инкубации гладкомышечных / эндотелиальных и фибробластных клеточных цилиндров. Форма гелевой матрицы может состоять из любой биосовместимой гелевой матрицы, такой как агароза, агар или других биосовместимых гидрогелей, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Материал гелевой матрицы является проницаемым для питательной среды, но устойчивым к врастанию, миграции и адгезии клеток. Форма гелевой матрицы может быть стерилизованной. Форма гелевой матрицы может быть изготовлена с использованием негативной формы, которую помещают поверх гелевой матрицы и оставляют для приобретения гелем формы гелевой матрицы. Например, можно использовать негативную форму, покрытую тефлоном. Вытянутые клеточные тела можно инкубировать в форме гелевой матрицы в течение 24 часов, например, перед реаспирацией в капиллярную пробирку для формирования в сосудистую структуру. В некоторых вариантах форма гелевой матрицы характеризуется цилиндрической формой. В некоторых вариантах форма гелевой матрицы характеризуется полуцилиндрической формой. В некоторых вариантах форма гелевой матрицы характеризуется прямоугольной формой.
Клетки в вытянутых клеточных телах можно оценивать на жизнеспособность клетки, например, с использованием обычной гистологии, например путем окрашивания гематоксилином-эозином (Н&Е). Клетки в вытянутых клеточных телах можно также оценивать на легкость обработки. Например, можно оценить количество загибов цилиндров (например, скручивание) по завершении времени инкубации. Например, можно использовать шкалу оценки субъективных предпочтений. Например, шкалу загибов можно задать для вытянутого клеточного тела на 1-10-балльной основе, где балл 1 означает, что вытянутое клеточное тело не имеет загибов, и балл 10 означает, что вытянутое клеточное тело загнуто с образованием спиралеподобных структур. К тому же, целостность вытянутых клеточных тел, например когерентность, можно оценить по завершении времени инкубации с использованием шкалы субъективной оценки. Например, эти две шкалы позволяют выбрать предпочтительные условия получения вытянутых клеточных тел для обеспечения легкой обработки во время формирования многослойной сосудистой трубочки. Например, шкала когерентности может быть задана для вытянутого клеточного тела на 10-балльной основе, где бал 1 означает, что цилиндр сохранил свою гладкую цилиндрическую структуру полностью, и бал когерентности 10 означает, что цилиндрическая структура была потеряна.
Многослойные сосудистые трансплантаты могут быть образованы, например, путем сборки множества многоклеточных тел и выдерживания тел для сцепления. В некоторых вариантах сцепление клеток, клеточных агрегатов, многоклеточных тел и/или слоев происходит путем адгезии клетка-клетка. В других вариантах происходит слияние клеток, клеточных агрегатов, многоклеточных тел и/или слоев. В некоторых вариантах многослойные сосудистые трансплантаты образованы путем сборки множества вытянутых клеточных тел в требуемую трубчатую форму с эластичной консистенцией и выдерживания вытянутых клеточных тел для сцепления. В других вариантах происходит сцепление клеток и/или клеточных агрегатов в вытянутых клеточных телах с образованием сосудистой тубулярной конструкции с эластичной консистенцией, требуемой плотностью клеток и целостностью, достаточной для легкого манипулирования и обработки.
Способ получения вытянутых клеточных тел предусматривает стадии: 1) обеспечения клеточной массы, содержащей множество предварительно выбранных клеток или клеточных агрегатов с требуемой плотностью клеток и вязкостью, 2) формирование клеточной массы в требуемую трубчатую форму, 3) формирование вытянутых клеточных тел посредством созревания.
По существу сферические клеточные тела, взятые отдельно или в комбинации с вытянутыми клеточными телами, являются подходящими для построения сосудистой трубочки описанного здесь типа. Способ получения по существу сферических клеточных тел предусматривает стадии 1) обеспечения клеточной массы, содержащей множество предварительно выбранных клеток или клеточных агрегатов требуемой плотности клеток и вязкости, 2) формирования клеточной массы в цилиндрическую форму, 3) резки цилиндров на равные фрагменты, 4) выдерживания фрагментов в течение ночи на ротационном шейкере для скручивания и 5) формирования по существу сферических клеточных тел посредством созревания.
Вытянутое тело наполнителя можно использовать в комбинации с указанными выше вытянутыми клеточными телами для построения сосудистой трубочки. Вытянутое тело наполнителя содержит материал, имеющий заранее определенную форму, такую как палочка, или другую форму, и несмотря на проницаемость для питательной среды, материал предотвращает вращивание, миграцию и сцепление клеток. Тело наполнителя может быть изготовлено из материала, такого как агароза, агар или других биосовместимых гидрогелей, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ). При построении инженерной многослойной сосудистой трубочки вытянутые тела наполнителя могут быть использованы в соответствии с предварительно установленным рисунком для задания поддерживающей структуры для сосудистой трубочки. Вытянутое тело наполнителя можно использовать для формирования просвета многослойного сосудистого трансплантата. Образующее просвет тело наполнителя может быть удаляемым для формирования просвета трубочки. Примеры вытянутых тел наполнителя и вытянутых клеточных тел и способы их формирования можно найти в патенте США №12/491228.
Сконструированные многослойные сосудистые трубочки настоящего изобретения в некоторых вариантах содержат слои. В других вариантах слои характеризуются присутствием одного или более типов клеток. В еще других вариантах слои характеризуются расположением внутри инженерной многослойной сосудистой трубочки. В некоторых вариантах слои характеризуются концентрацией одного или более компонентов, элементов или соединений и/или физическими свойствами, такими как податливость, прочность или эластичность. В некоторых вариантах один или более слоев являются различными. В других вариантах один или более слоев являются разделимыми. В некоторых вариантах один или более слоев являются смежными. В других вариантах один или более слоев являются неразделимыми. В еще других вариантах один или более слоев характеризуются свойствами, которые изменяются с непрерывным градиентом по участку инженерной многослойной сосудистой трубочки. В некоторых вариантах один или более слоев характеризуются свойствами, которые изменяются во времени.
2
Инженерная многослойная сосудистая трубочка может быть изготовлена с использованием внутреннего слоя вытянутых клеточных тел гладкомышечных клеток и эндотелиальных клеток и внешнего слоя вытянутых клеточных тел фибробластов. Можно использовать геометрическое расположение, которое показано на Фигуре 2, при этом геометрический рисунок вытянутых клеточных тел гладкомышечных клеток и эндотелиальных клеток, вытянутых клеточных тел фибробластов и вытянутых тел матрицы наполнителя образует трехмерную сосудистую структуру. Многослойную сосудистую трубочку можно формировать на базовой пластине, имеющей гелевую матрицу, такую как агароза. Например, гелевую матрицу аспирируют в капиллярные пробирки и дают образоваться гелю, например, в холодном (4°С) растворе PBS, вытесняют из капилляра и укладывают непосредственно на базовую пластину с гелевой матрицей для формирования вытянутого тела матрицы наполнителя. Второе вытянутое тело матрицы наполнителя присоединяют к первому и процесс повторяют до формирования требуемой поддерживающей структуры. Раствор для смачивания, такой как PBS, распределяют по поверхности вытянутых тел матрицы наполнителя по мере их осаждения для сохранения их влажными и оставляют для адгезии между телами. Вытянутые тела фибробластов осаждают на следующий слой поверх вытянутых тел гелевой матрицы для формирования внешнего слоя многослойной сосудистой трубочки и вытянутые тела гладкомышечных клеток и эндотелиальных клеток затем вытесняют для продолжения послойного формирования внутреннего слоя. После вытеснения каждого вытянутого клеточного тела смачивающий раствор, такой как культуральная среда, распределяют по поверхности осажденных тел для содействия осаждению следующего вытянутого клеточного тела и предотвращения дегидратации уже осажденных вытянутых клеточных тел. Этот процесс повторяют до формирования требуемой сосудистой структуры. К тому же, инженерная многослойная сосудистая трубочка может быть изготовлена с использованием слоев, состоящих по существу из сферических клеточных тел, по отдельности или в комбинации с вытянутыми клеточными телами. Требуемая сосудистая структура может быть прямой трубочкой или может быть трубочкой, имеющей одно или более разветвлений (например, разветвленная структура). После завершения всей сосудистой конструкции гелевую матрицу распределяют поверх каждого конца конструкции и оставляют для образования геля. После образования геля всю конструкцию погружают в смачивающий раствор, такой как культуральная среда, и инкубируют для сцепления между клеточными цилиндрами, например, в течение 24 часов при 37°С и 5% СО.
Инженерная многослойная сосудистая трубочка может быть образована любыми способами, известными в данной области. Например, инженерная многослойная сосудистая трубочка может быть образована путем укладки вручную вытянутых и/или по существу сферических клеточных тел и вытянутых тел гелевой матрицы, например, с помощью микропипетки, или автоматически, например, с помощью специального биопринтера (например, такого, который описан в патенте США№10/590446).
Или же многослойные сосудистые трубочки можно формировать с использованием комбинации различных способов, таких как засевание клеток и сборка множества вытянутых клеточных тел и/или множества вытянутых тел наполнителя. Например, эндотелиальными клетками можно высевать (например, пропускать) просвет сосудистой трубочки, образованный вытянутыми клеточными телами гладкомышечных клеток и вытянутыми клеточными телами фибробластов. В качестве другого примера, слой фибробластов может обволакивать сосудистую трубочку, образованную вытянутыми телами гладкомышечных клеток и эндотелиальных клеток. В еще другом варианте предварительно образованное клеточное тело используют для формирования сосудистых трубочек, содержащих более одного типа клеток. В еще другом варианте слой используют для формирования сосудистых трубочек, содержащих более чем один тип клеток.
В некоторых вариантах предварительно образованное клеточное тело, используемое для формирования сосудистых трубочек, содержит все три типа клеток (эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и фибробласты); в таком примере каждый тип клетки мигрирует в соответствующее положение (например, во время пребывания внутри камеры созревания) для формирования инженерной многослойной сосудистой трубочки. В других вариантах предварительно образованное клеточное тело, используемое для формирования сосудистых трубочек, содержит два типа клеток (выбранных из эндотелиальных клеток, гладкомышечных клеток и фибробластов) и оба типа клеток мигрируют в соответствующее положение (например, во время пребывания внутри камеры созревания) для формирования инженерной многослойной сосудистой трубочки. В некоторых вариантах клетки каждого типа равномерно распределены внутри клеточного тела или слоя сосудистой трубочки. В других вариантах клетки каждого типа локализованы в конкретных участках внутри клеточного тела или слоя сосудистой трубочки.
В некоторых вариантах многослойные сосудистые трубочки настоящего изобретения являются неиннервированными. В некоторых вариантах многослойные сосудистые трубочки настоящего изобретения содержат дифференцированные взрослые фибробласты, которые являются несосудистыми фибробластами.
По завершении инкубационного периода окружающую поддерживающую структуру гелевой матрицы удаляют и сцепленную многослойную сосудистую трубочку помещают в камеру созревания (например, биореактор) для роста и формирования внеклеточного матрикса. Поддерживающую структуру/тело наполнителя удаляют из просвета сосудистой трубочки и/или окружения сосудистой трубочки путем вытягивания тела наполнителя или другими способами, такими как термообратимые или фоточувствительные способы.
2
2
2
2
Внутрипросветную перфузию жидкости можно использовать во время созревания инженерной многослойной сосудистой трубочки. Например, внутрипросветную перфузию можно использовать при помещении многослойной сосудистой трубочки в камеру созревания (например, биореактор). Внутрипросветная перфузия начинается при относительно низких давлениях и увеличивается в процессе созревания инженерной многослойной трубочки. Например, внутрипросветная перфузия увеличивается до уровней, которые имитируют или превышают давления и напряжения сдвига в нативных тканях. Например, внутренние давления для артериальных и венозных многослойных трубочек могут подвергаться давлениям меньше чем 60 мм рт.ст., 60-150 мм рт.ст., 150-200 мм рт.ст или больше чем 200 мм рт.ст. для имитации нормального и/или повышенного кровяного давления. Более низкие давления целесообразны на ранних стадиях созревания инженерной многослойной трубочки для того, чтобы избежать разрыва ткани. Аналогично сконструированные многослойные трубочки могут подвергаться напряжению сдвига меньше чем 5 дин/см, 5-30 дин/см, 30-60 дин/см или больше чем 60 дин/см для имитации нормальных и/или повышенных напряжений сдвига в кровеносной системе, с более низкими уровнями, предпочтительно используемыми на начальном этапе. Такие методы внутрипросветной перфузии известны в данной области.
Кроме того, как известно в данной области, во внутрипросветной перфузии могут быть задействованы пульсирующие силы. Например, пульсирующие силы могут использоваться для имитации естественной пульсации крови, циркулирующей в артериях и венах. Например, можно использовать частоту пульса менее 60/мин, 60-90/мин, 75/мин, более 90/мин или 140-160/мин, или более 160/мин, или любую другую частоту пульса для имитации пульса в состоянии покоя взрослого или плода. На начальном этапе использование пульсирующей силы может быть относительно низким с повышением до физиологических уровней по мере созревания тканевой конструкция.
Сконструированные многослойные сосудистые трубочки настоящего изобретения не используют любого предварительно образованного каркаса, например, для формирования любого слоя сосудистой трубочки или формирования трубчатой формы. В качестве неограничивающего примера сконструированные многослойные сосудистые трубочки настоящего изобретения не используют любых предварительно образованных, синтетических каркасов, таких как полимерные каркасы, слои внеклеточного матрикса, или любые другие типы предварительно образованного каркаса. В некоторых вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка не содержит любых предварительно образованных каркасов. В некоторых вариантах инженерная многослойная сосудистая трубочка содержит обнаруживаемое, но следовое или незначительное количество каркаса, например, меньше чем 0.5% от общего состава. В других вариантах следовые или незначительные количества каркаса являются недостаточными для нарушения поведения трансплантата в течение длительного периода времени или препятствования его первичной биологической функции.
Сконструированные многослойные сосудистые трубочки настоящего изобретения задействуют не только формирование листов клеток, например, листов клеток фибробластов для образования сосудистой трубочки.
Сконструированные многослойные сосудистые трубочки настоящего изобретения могут иметь внутренний диаметр примерно 6 мм, примерно 5 мм, примерно 4 мм, примерно 3 мм, примерно 2 мм, примерно 1 мм или примерно 0.5 мм или меньше, или любой промежуточный диаметр, предпочтительно примерно 6 мм или меньше. Сконструированные сосудистые трубочки могут иметь длину в диапазоне примерно от 1 см или короче, до примерно 30 см или длиннее. Предпочтительно, чтобы сосудистая трубочка имела длину в диапазоне примерно от 1 см до 30 см.
После подвергания инженерных многослойных трубочек перфузии, например в течение 4 дней или дольше, внутренний слой смешанных гладкомышечных клеток и эндотелиальных клеток в сочетании с внешним слоем фибробластов выдерживают для клеточной адгезии, перестройки и миграции, что обеспечивает формирование нативной структуры интимы, среды и адвентициальной оболочки с эндотелиальными клетками, мигрирующими внутрь, гладкомышечными клетками, мигрирующими в середину, и фибробластами, остающимися на внешнем слое.
Или же, для управления перестройкой клеток и миграцией различных типов клеток в инженерных многослойных трубочках можно использовать магнитные поля. Например, сконструированные многослойные трубочки могут содержать магнитные частицы (например, ферромагнитные наночастицы, и т.д.) и подвергаться воздействию магнитных полей для управления перестройкой клеток и миграцией.
Толщина трех слоев сосудистых трубочек является по существу равномерной, по меньшей мере, для участка длины сосудистой трубочки, например, плюс или минут 20% или меньше. В некоторых вариантах толщина сосудистой трубочки равна плюс или минут 10% или меньше, или плюс или минут 5% или меньше. Толщина сосудистой трубочки может также быть по существу равномерной по длине сосудистой трубочки. Толщина каждого слоя сосудистой трубочки может также совпадать с толщиной нативной сосудистой ткани.
Кроме того, инженерные многослойные сосудистые трубочки настоящего изобретения являются податливыми и имеют толщину, которая выдерживает давления, сравнимые с нативными физиологическими давлениями крови. Например, прочность на разрыв инженерной многослойной сосудистой трубочки является достаточной для того, чтобы выдерживать физиологическое кровяное давление. Различные способы можно использовать для тестирования биомеханических свойств инженерных многослойных сосудистых трубочек. Подходящие способы тестирования биомеханических свойств сосудистой трубочки предусматривают измерение прочности на разрыв и податливостей. Кроме того, подходящими для использования являются исследования напряженно-деформированного состояния, такие как испытание на растяжение в условиях однократной нагрузки, испытание на релаксацию напряжения и испытание на разрыв при растяжении. Также, могут быть использованы дополнительные испытания, известные опытным в данной области специалистам.
Сконструированные многослойные сосудистые трубочки настоящего изобретения можно использовать в нескольких применениях; например, сосудистые трубочки можно использовать в шунтировании, артериовенозном доступе, в тестировании лекарственных средств или тестировании устройств для сердечно-сосудистой системы. Примерами устройств для сердечно-сосудистой системы, в которых можно использовать сосудистые трубочки, являются стенты.
Кроме того, описаны способы лечения пациентов, которые предусматривают обеспечение, по меньшей мере, одной многослойной сосудистой трубочки настоящего изобретения. Пациентом, нуждающимся в инженерной многослойной сосудистой трубочке, может быть, например, пациент, нуждающийся в коронарном или периферическом шунтировании, или пациент, нуждающийся в гемодиализе. Нуждающийся пациент может иметь поврежденные кровеносные сосуды. Нуждающийся пациент может также являться, например, пациентом, имеющим терминальную стадию почечной недостаточности, диабет, артериосклероз или врожденный порок сердца. Сконструированные многослойные сосудистые трубочки настоящего изобретения можно использовать для лечения любого пациента, нуждающегося в замене кровеносного сосуда.
Несмотря на то, что в настоящем изобретении представлены и описаны предпочтительные варианты, для опытных в данной области специалистов будет очевидно, что такие варианты представлены только в качестве примера. Для опытных в данной области специалистов появятся многочисленные вариации, изменения и замены без отступления от сущности изобретения. Должно быть понятно, что различные альтернативные варианты описанным в настоящем изобретении вариантам могут быть использованы при осуществлении изобретения на практике. Предполагается, что последующая формула определяет объем изобретения, способы, структуры и их эквиваленты, таким образом, охвачены настоящим изобретением.
ПРИМЕРЫ
Следующие конкретные примеры следует рассматривать как иллюстративные и не ограничивающие каким-либо образом остальное описание. Предполагается, что опытный в данной области специалист на основе описания использует настоящее изобретение в полном объеме. Все публикации, указанные здесь, включены посредством ссылки во всей своей полноте. Ссылки свидетельствуют об известности и широком распространении такой информации.
Пример 1: Смешанные клеточные цилиндры HASMC-HAEC
Материалы и способы
1. Клеточная культура
4
2
1.1. Гладкомышечные клетки: Первичные человеческие аортальные гладкомышечные клетки (HASMC; GIBCO / Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) хранили и размножали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с низким содержанием глюкозы (DMEM; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 ед/мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В, 0.01М HEPES (все от фирмы Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), 50 мг/л пролина, 50 мг/л глицина, 20 мг/л аланина, 50 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мкг/л CuSO (все от фирмы Sigma, St. Louis, МО) при 37°С и 5% СО. Конфлюэнтные культуры HASMC между пассажами 4 и 8 использовали во всех исследованиях.
2
1.2. Эндотелиальные клетки: Первичные человеческие аортальные эндотелиальные клетки (НАЕС; GIBCO / Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) хранили и размножали в среде Medium 200 (Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), дополненной 2% FBS, 1 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста, 3 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 10 мкг/мл гепарина, 100 ед/мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина и 0.25 мкг/мл амфотерицина В (все от фирмы Invitrogen Corp., Carlsbad, СА). Клетки выращивали в покрытых желатином (из свиной сыворотки; Sigma, St. Louis, МО), обработанных флаконах для культуры ткани при 37°С и 5% СО. Конфлюэнтные культуры НАЕС между пассажами 4 и 8 использовали во всех исследованиях.
2. Агарозная форма
2.1. Приготовление 2% (вес/объем) раствора агарозы: 1 т агарозы с низкой температурой плавления (Ultrapure LMP; Invitrogen Corp., Carlsbad, С А) растворяют в 50 мл фосфатно-буферного солевого раствора Дульбекко (DPBS; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА). Вкратце, DPBS и агарозу нагревают до 85°С на горячей плите при постоянном перемешивании до полного растворения агарозы. Агарозный раствор стерилизуют методом паровой стерилизации при 125°С в течение 25 минут. Агарозный раствор остается в жидкой фазе до тех пор, пока температура сохраняется выше 36.5°С. Ниже этой температуры происходит фазовое превращение, вязкость агарозного раствора увеличивается и агароза формирует твердый гель.
2.2. Приготовление агарозной формы: Агарозную форму изготавливают для инкубации клеточных цилиндров с использованием формы с тефлоновым покрытием, подходящей для 10 см чашки Петри. Вкратце, тефлоновую форму предварительно стерилизуют с использованием 70% раствора этанола и подвергают воздействию УФ-излучения в течение 45 минут. Стерилизованную форму помещают поверх 10 см чашки Петри (VWR International LLC, West Chester, PA) и надежно закрепляют. Эту конструкцию (тефлоновая форма + чашка Петри) помещают в вертикальное положение и 45 мл предварительно нагретого, стерильного 2% раствора агарозы заливают в пространство между тефлоновой формой и чашкой Петри. Конструкцию затем помещают в горизонтальное положение при комнатной температуре на 1 час для завершения образования геля агарозы. После образования геля тефлоновую форму удаляют и агарозную форму дважды промывают DPBS. Затем в агарозную форму добавляют 17.5 мл культуральной среды HASMC.
3. Цилиндры HASMC-HAEC
2
2
2
3.1. Изготовление смешанных клеточных цилиндров HASMC-HAEC: Для получения смешанных клеточных цилиндров HASMC и НАЕС собирают по отдельности и затем смешивают в заранее установленных пропорциях. Вкратце, культуральную среду удаляют из флаконов с конфлюэнтной культурой и клетки промывают DPBS (1 мл/5 см площади роста). Клетки отделяют от поверхности культуральных флаконов путем инкубации в присутствии трипсина (1 мл/15 см площади роста; Invitrogen Corp., Carlsbad, С А) в течение 10 минут. HASMC отделяют с использованием 0.15% трипсина, и НАЕС отделяют с использованием 0.1% трипсина. После инкубации во флаконы добавляют соответствующую культуральную среду (2Х объем по отношению к объему трипсина). Клеточную суспензию центрифугируют в течение 6 минут при 200g с последующим полным удалением раствора супернатанта. Клеточный осадок ресуспендируют в соответствующей культуральной среде и подсчитывают количество клеток в гемацитометре. Соответствующие объемы HASMC и НАЕС объединяют для получения смешанной клеточной суспензии, содержащей 5, 7.5, 10, 12.5 и 15% НАЕС (как % общей клеточной популяции). Смешанные клеточные суспензии центрифугируют в течение 5 минут при 200g с последующим полным удалением раствора супернатанта. Смешанный клеточный осадок ресуспендируют в 6 мл культуральной среды HASMC и переносят в 20 мл стеклянные пробирки (VWR International LLC, West Chester, PA) с последующей инкубацией на орбитальном встряхивателе при 150 об/мин в течение 60 минут и при 37°С и 5% СО. Это позволяет клеткам агрегировать друг с другом и инициировать адгезию клетка-клетка. После инкубации клеточную суспензию переносят в 15 мл центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 минут при 200g. После удаления супернатантной среды клеточный осадок ресуспендируют в 400 мкл культуральной среды HASMC и несколько раз пипетируют вверх и вниз для обеспечения разрушения всех клеточных кластеров. Клеточную суспензию переносят в 0.5 мл микроцентрифужные пробирки (VWR International LLC, West Chester, PA), помещенные внутрь 15 мл центрифужной пробирки с последующим центрифугированием в течение 4 минут при 2000g для образования высокоплотного и компактного клеточного осадка. Супернатантную среду аспирируют и клетки переносят в капиллярные пробирки (OD 1.5 мм, ID 0.5 мм, L 75 м; Drummond Scientific Co., Broomall, PA) путем аспирации таким образом, чтобы получить клеточные цилиндры длиной 50 мм. Клеточную массу внутри капилляров инкубируют в среде HASMC в течение 20 минут при 37°С и 5% СО. Клеточные цилиндры затем вытесняют из капиллярных пробирок в канавки агарозной формы (покрытой средой HASMC) с помощью плунжера, поставляемого вместе с капиллярами. Клеточные цилиндры инкубируют в течение 24 и 48 часов при 37°С и 5% СO.
4. Оценка жизнеспособности смешанного клеточного цилиндра и легкость обработки
4.1. Оценка жизнеспособности клеток: Для оценки жизнеспособности клеток в смешанных клеточных цилиндрах по завершении 24, 48 и 72 часов режима инкубации проводят гистологическое исследование. Вкратце, в каждый момент времени смешанные клеточные цилиндры аспирируют обратно в капиллярные пробирки (вручную с помощью плунжера) и переносят в многолуночные планшеты. Цилиндры фиксируют в 10%-ном нейтральном забуференном формалине в течение, по меньшей мере, 24 часов перед погружением в парафин. Погруженные цилиндры рассекают (в поперечном направлении) и выполняют Н & Е окрашивание.
4.2. Оценка легкости обработки: Для оценки легкости обработки смешанных клеточных цилиндров оценивают два отдельных параметра. Сначала оценивают количество цилиндров, загнутых в каждый момент завершения времени инкубации.
Используют систему оценки субъективных предпочтений. Затем оценивают целостность клеточных цилиндров в каждый момент завершения времени инкубации с использованием второй субъективной шкалы. Вместе, эти две шкалы позволяют выбрать предпочтительные условия для приготовления цилиндров для обеспечения легкости обработки на последующих стадиях.
Результаты
1. Жизнеспособность клеток и легкость обработки смешанных клеточных цилиндров HASMC-HAEC
Смешанные клеточные цилиндры HASMC-HAEC изготавливают таким образом, чтобы содержать 5, 7.5, 10, 12.5 и 15% НАЕС согласно способу, описанному выше. Цилиндры инкубируют в агарозной форме в течение 24 и 48 часов. В каждый момент времени цилиндры оценивают по шкале загибов и когерентности. В Таблицах 1 и 2 приведены результаты. Как видно, по мере увеличения времени инкубации от 24 до 48 часов легкость обработки уменьшается для всех смешанных клеточных цилиндров. Цилиндры, которые содержат 15% НАЕС и оставшиеся 85% HASMC, являются самыми легкими для обработки через 24 часа инкубационного периода в агарозной форме. Кроме того, цилиндры, содержащие 5% НАЕС и 95% HASMC, являются самыми трудными для обработки в оба момента времени.
Окрашивание Н&Е (Фиг.1) используют для оценки жизнеспособности клеток для каждого условия во все моменты времени. Окрашивание показало, что все цилиндры, инкубированные в течение 24 часов в агарозной форме, содержат клетки, которые являются самыми жизнеспособными (о чем свидетельствует, по меньшей мере, количество розового окрашивания) и жизнеспособность клеток уменьшается с увеличением времени инкубации. Более того, через 24 часа инкубации в агарозной форме жизнеспособность клеток в цилиндрах, содержащих 15% НАЕС и 85% HASMC, является самой высокой.
«Шкала загибов» установлена для каждого цилиндра на 10-бальной основе, при этом балл 1 означает цилиндры, показывающие отсутствие загибов и балл 10 означает, что цилиндры загнуты с образованием спиралеподобных структур.
«Шкала когерентности» установлена для каждого цилиндра на 10-бальной основе, при этом балл 1 означает цилиндры, которые сохранили свою гладкую цилиндрическую структуру полностью и балл 10 по шкале когерентности означает, что цилиндрическая структура является полностью потерянной.
Таблица 1
Шкала загибов
Время инкубации, час
% НАЕС (% общего числа клеток)
5
7.5
10
12.5
15
24
3
2
3
2
1
48
5
4
5
5
3
Таблица 2: Шкала когерентности
Время инкубации, час
% НАЕС (% общего количества клеток)
5
7.5
10
12.515
24
4
3
3
2
1
48
7
6
6
6
5
Пример 2: Многослойные сосудистые трубочки
Материалы и способы
1. Клеточная культура
4
2
1.1. Гладкомышечные клетки: Первичные человеческие аортальные гладкомышечные клетки (HASMC; GIBCO / Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) хранили и размножали в среде Дульбекко, модифицированной средой Игла с низким содержанием глюкозы (DMEM; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 ед/мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В, 0.01М HEPES (все от Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), 50 мг/л пролина, 50 мг/л глицина, 20 мг/л аланина, 50 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мкг/л CuSO (все от фирмы Sigma, St. Louis, МО) при 37°С и 5% СО. Конфлюэнтные культуры HASMC между пассажами 4 и 8 использовали во всех исследованиях.
2
1.2. Эндотелиальные клетки: первичные человеческие аортальные эндотелиальные клетки (НАЕС; GIBCO / Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) хранили и размножали в среде Medium 200 (Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), дополненной 2% FBS, 1 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста, 3 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 10 мкг/мл гепарина, 100 ед/мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина и 0.25 мкг/мл амфотерацина В (все от фирмы Invitrogen Corp., Carlsbad, СА). Клетки выращивали на покрытых желатином (из свиной сыворотки; Sigma, St. Louis, МО) флаконах, обработанных культурой тканей при 37°С и 5% СО. Конфлюэнтные культуры НАЕС между пассажами 4 и 8 использовали во всех исследованиях.
2
1.3. Фибробласты: Первичные человеческие дермальные фибробласты (HDF; GIBCO / Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) хранили и размножали в среде Medium 106 (Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), дополненной 2% FBS, 1 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста, 3 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 10 мкг/мл гепарина, 100 ед/мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина (все от фирмы Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) при 37°С и 5% СО. Конфлюэнтные культуры HDF между пассажами 4 и 8 использовали во всех исследованиях.
2. Агарозный раствор и форма
2.1. Приготовление 2% и 4% (вес/объем) раствора агарозы: 1 г или 2 г (для 2% или 4% соответственно) агарозы с низкой температурой плавления (Ultrapure LMP; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) растворяют в 50 мл фосфатно-буферного раствора Дульбекко (DPBS; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА). Вкратце, DPBS и агарозу нагревают до 85°С на горячей плите при постоянном перемешивании до полного растворения агарозы. Раствор агарозы стерилизуют методом паровой стерилизации при 125°С в течение 25 минут. Раствор агарозы остается в жидкой фазе до тех пор, пока температура сохраняется выше 36.5°С. Ниже этой температуры происходит фазовое превращение, вязкость агарозного раствора увеличивается и агароза формирует твердый гель.
2.2. Приготовление агарозной формы: Агарозную форму изготавливают для инкубации клеточных цилиндров с использованием формы, покрытой тефлоном, подходящей для чашки Петри 10 см. Вкратце, тефлоновую форму предварительно стерилизуют с использованием 70% раствора этанола и подвергают воздействию УФ-излучения в течение 45 минут. Стерилизованную форму помещают поверх 10 см чашки Петри (VWR International LLC, West Chester, PA) и прочно закрепляют. Эту конструкцию (тефлоновая форма + чашка Петри) помещают в вертикальное положение и 45 мл предварительно нагретого стерильного 2% раствора агарозы заливают в пространство между тефлоновой формой и чашкой Петри. Конструкцию затем помещают в горизонтальное положение при комнатной температуре на 1 час для завершения образования геля агарозы. После образования геля тефлоновую форму удаляют и агарозную форму промывают дважды DPBS. Затем 17.5 мл культуральной среды HASMC добавляют в агарозную форму для инкубации смешанных клеточных цилиндров HASMC-HAEC или 17.5 мл культуральной среды HDF добавляют в агарозную форму для инкубации клеточных цилиндров HDF.
3. Клеточные цилиндры
2
2
2
2
2
3.1. Изготовление смешанных клеточных цилиндров HASMC-HAEC: Для приготовления смешанных клеточных цилиндров HASMC и НАЕС по отдельности собирают и затем смешивают в заранее установленных пропорциях. Вкратце, культуральную среду удаляют из флаконов с конфлюэнтной культурой и клетки промывают DPBS (1 мл/5 см площади роста). Клетки отделяют от поверхности культуральных флаконов путем инкубации в присутствии трипсина (1 мл/15 см площади роста; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) в течение 10 минут. HASMC отделяют с использованием 0.15% трипсина, и НАЕС отделяют с использованием 0.1% трипсина. После инкубации соответствующую культуральную среду добавляют во флаконы (2Х объема по отношению к объему трипсина). Клеточную суспензию центрифугируют в течение 6 минут при 200g с последующим полным удалением раствора супернатанта. Клеточный осадок ресуспендируют в соответствующей культуральной среде и подсчитывают количество клеток в гемацитометре. Соответствующие объемы HASMC и НАЕС объединяют для получения смешанной клеточной суспензии, содержащей 15% НАЕС и оставшиеся 85% HASMC (как % общей клеточной популяции). Смешанную клеточную суспензию центрифугируют в течение 5 минут при 200g с последующим полным удалением раствора супернатанта. Смешанный клеточный осадок ресуспендируют в 6 мл культуральной среды HASMC и переносят в 20 мл стеклянные пробирки (VWR International LLC, West Chester, PA), с последующей инкубацией на орбитальном встряхивателе при 150 об/мин в течение 60 минут, и при 37°С и 5% СО. Это позволяет клеткам агрегировать друг с другом и инициировать адгезию клетка-клетка. После инкубации клеточную суспензию переносят в 15 мл центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при 200g. После удаления супернатантной среды клеточный осадок ресуспендируют в 400 мкл культуральной среды HASMC и пипетируют вверх и вниз несколько раз для обеспечения разрушения всех клеточных кластеров. Клеточную суспензию переносят в 0.5 мл микроцентрифужную пробирку (VWR International LLC, West Chester, PA), помещенную внутрь 15 мл центрифужной пробирки с последующим центрифугированием в течение 4 минут при 2000g для формирования высокоплотного и компактного клеточного осадка. Супернатантную среду аспирируют и клетки переносят в капиллярные пробирки (OD 1.5 мм, ID 0.5 мм, L 75 м; Drummond Scientific Co., Broomall, PA) путем аспирации таким образом, чтобы получить клеточные цилиндры длиной 50 мм. Клеточную массу внутри капилляров инкубируют в среде HASMC в течение 20 минут при 37°С и 5% СО. Клеточные цилиндры затем вытесняют из капиллярных трубочек в канавки агарозной формы (покрытой средой HASMC) с помощью плунжера, поставляемого вместе с капиллярами. Клеточные цилиндры инкубируют в течение 24 часов при 37°С и 5% СО.
2
2
2
2
3.2. Изготовление клеточных цилиндров HDF: Цилиндры HDF готовят способом, аналогичным способу приготовления смешанных клеточных цилиндров HASMC-HAEC. Вкратце, культуральную среду удаляют из флаконов с конфлюэнтной культурой HDF и клетки промывают DPBS (1 мл/5 см площади роста). Клетки отделяют от поверхности культуральных флаконов путем инкубации в присутствии трипсина (0.1%; 1 мл/15 см площади роста; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) в течение 10 минут. После инкубации культуральную среду HDF добавляют во флаконы (2Х объема по отношению к объему трипсина). Клеточную суспензию центрифугируют в течение 6 минут при 200g с последующим полным удалением раствора супернатанта. Клеточный осадок ресуспендируют в 6 мл культуральной среды HDF и переносят в 20 мл стеклянные пробирки (VWR International LLC, West Chester, PA) с последующей инкубацией на орбитальном встряхивателе при 150 об/мин в течение 75 минут и при 37°С и 5% СО. После инкубации клеточную суспензию переносят в 15 мл центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при 200g. После удаления супернатантной среды клеточный осадок ресуспендируют в 400 мкл культуральной среды HDF и пипетируют вверх и вниз несколько раз для обеспечения разрушения клеточных кластеров. Клеточную суспензию переносят в 0.5 мл микроцентрифужную пробирку (VWR International LLC, West Chester, PA), помещенную внутрь 15 мл центрифужной пробирки с последующим центрифугированием в течение 4 минут при 2000g для формирования высокоплотного и компактного клеточного осадка. Супернатантную среду аспирируют и клетки переносят в капиллярные пробирки (OD 1.5 мм, ID 0.5 мм, L 75 мм; Drummond Scientific Co., Broomall, PA) путем аспирирования таким образом, чтобы получить клеточные цилиндры длиной 50 мм. Клеточную массу внутри капилляров инкубируют в культуральной среде HDF в течение 20 минут при 37°С и 5% СО. Клеточные цилиндры затем вытесняют из капиллярных пробирок в канавки агарозной формы (покрытые средой HDF). Клеточные цилиндры инкубируют в течение 24 часов при 37°С и 5% СO.
4. Изготовление многослойных сосудистых трубочек
4.1. Приготовление агарозной базовой пластины: Агарозную базовую пластину изготавливают путем заливания 10 мл предварительно нагретой (>40°С) агарозы (2% вес/объем) в 10 см чашку Петри. Сразу же после заливания агарозу равномерно распределяют таким образом, чтобы покрыть все основание чашки и формировать равномерный слой. Чашку Петри инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут для полного превращения агарозы в гель.
2
4.2. Многослойная сосудистая трубочка: Сосудистые трубочки, состоящие из внешнего слоя HDF и внутреннего слоя HASMC-HAEC, изготавливают с использованием цилиндров HDF и смешанных клеточных цилиндров HASMC-HAEC. Используют геометрическое расположение, показанное на Фигуре 2. Вкратце, по завершении 24-часового периода инкубации зрелые цилиндры HDF и HASMC-HAEC аспирируют обратно в капиллярные трубочки и помещают в соответствующую культуральную среду до дальнейшего использования. Поддерживающую структуру, состоящую из агарозных палочек, готовят следующим образом. Предварительно нагретую 2% агарозу аспирируют в капиллярные пробирки (L=50 мм) и быстро охлаждают в холодном растворе PBS (4°С). Застывшие агарозные цилиндры длиной 5 см вытесняют из капилляра (с помощью плунжера) и укладывают непосредствнно на агарозную базовую пластину. Второй агарозный цилиндр присоединяют к первому, и процесс повторяют до осаждения 10 агарозных цилиндров для формирования первого слоя. На этой стадии 20 мкл PBS разливают по поверхности агарозных цилиндров для сохранения их влажными. Последующие шесть агарозных цилиндров осаждают на верхний слой 1 в положения, как показано на Фигуре 2 (слой 2). Три цилиндра HDF затем осаждают в положения 4,5 и 6 для завершения слоя 2. После вытеснения каждого цилиндра HDF 40 мкл культуральной среды HDF разливают по поверхности осажденного цилиндра для содействия осаждению последующего цилиндра, а также для предотвращения дегидратации клеточных цилиндров. Осаждают следующие агарозные цилиндры для слоя 3 с последующими цилиндрами HDF в положениях 3 и 6. После повторного смачивания структуры с культуральной средой HDF смешанные цилиндры HASMC-HAEC укладывают в положения 4 и 5. Соответственно, 40 мкл среды HASMC и 40 мкл среды HDF разливают по поверхности клеточных цилиндров. Слой 4 завершают осаждением агарозных цилиндров в положения 1 и 7, цилиндров HDF в положения 2 и 6, смешанных цилиндров HASMC-HAEC в положения 3 и 5, и под конец 4% агарозного цилиндра в положение 4. Слои 5, 6 и 7 завершают аналогично путем укладки агарозных цилиндров с последующими цилиндрами HDF и под конец цилиндрами HASMC-HAEC в положения, показанные на Фигуре 2. После завершения всей конструкции 0.5 мл теплой агарозы разливают поверх каждого конца конструкции и оставляют для превращения в гель при комнатной температуре на 5 минут. После образования геля этой агарозы 30 мл среды HASMC добавляют в чашку Петри (для обеспечения полного погружения всей конструкции). Конструкцию инкубируют в течение 24 часов при 37°С и 5% СО для сцепления клеточных цилиндров. По окончании 24 часов окружающую агарозную поддерживающую структуру удаляют и получают сцепленную многослойную сосудистую трубочку (Фиг.3).
Пример 3: Конструкции кровеносных сосудов с SVF-клетками жировой ткани
Материалы и способы
1. Клеточная культура
4
2
1.1. Клетки, подобные гладкомышечным клеткам (SMC), полученные из стромальной сосудистой фракции (SVF): Клетки, подобные гладкомышечным клеткам (SMC), получают из адгезивных фракций клеток, выделенных после расщепление липоаспиратов коллагеназой. При расщеплении образуется популяция клеток, известных как стромальная сосудистая фракция (SVF). SVF-клетки наносят на стандартные культуральные пластики, и адгезивные клетки селектируют с помощью соответствующих условий культивирования. Клетки, подобные гладкомышечным клеткам (SMC), получают из стромальной сосудистой фракции (SVF) липоаспиратов жировой ткани, хранят и размножают в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, с высоким содержанием глюкозы (DMEM; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 ед/мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В, 0.01М HEPES (все от Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), 50 мг/л пролина, 50 мг/л глицина, 20 мг/л аланина, 50 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мкг/л CuSO (все от Sigma, St. Louis, МО) при 37°С и 5% СО. Конфлюэнтные субкультуры SVF-SMC между пассажами 3 и 8 используют во всех исследованиях.
1.2. SVF-EC: Эндотелиальные клетки, полученные из стромальной сосудистой фракции (SVF), хранят и размножают в среде роста, которую, как правило, используют для выращивания первичных изолятов bona fide эндотелиальных клеток (ЕС). В частности, SVF-EC хранят в Ml99, дополненной 10%) FBS, 1 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста, 3 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 10 мкг/мл гепарина, 100 ед/мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина.
2
Клетки выращивают в обработанных тканевой культурой флаконах при 37°С и 5% СО. Конфлюэнтные культуры SVF-EC между пассажами 3 и 8 используют во всех исследованиях.
2. Агарозные растворы и форма
2.1. Приготовление 2% и 4% (вес/объем) раствора агарозы: 1 г или 2 г (для 2% или 4% соответственно) агарозы с низкой температурой плавления (Ultrapure LMP; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) растворяют в 50 мл фосфатно-буферного солевого раствора Дульбекко (DPBS; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА). Вкратце, DPBS и агарозу нагревают до 85°С на горячей плите при постоянном перемешивании до полного растворения агарозы. Раствор агарозы стерилизуют методом паровой стерилизации при 125°С в течение 25 минут. Раствор агарозы остается в жидкой фазе до тех пор, пока температура сохраняется выше 36.5°С. Ниже этой температуры происходит фазовый переход, вязкость раствора агарозы увеличивается и агароза формирует твердый гель.
2.2. Приготовление агарозной формы: Агарозную форму изготавливают для инкубации клеточных цилиндров с использованием формы, покрытой тефлоном, подходящей для 100 мм чашки Петри. Вкратце, тефлоновую форму предварительно стерилизуют с использованием 70% раствора этанола и подвергают воздействию УФ-излучения в течение 45 минут. Стерилизованную форму помещают поверх 100 мм чашки Петри (VWR International LLC, West Chester, PA) и надежно закрепляют. Эту конструкцию (тефлоновая форма + чашка Петри) помещают в вертикальное положение и 45 мл предварительно нагретого стерильного 2% раствора агарозы заливают в пространство между тефлоновой формой и чашкой Петри. Конструкцию затем помещают в горизонтальное положение при комнатной температуре на 1 час для завершения образования геля агарозы. После образования геля тефлоновую форму убирают и агарозную форму промывают DPBS. Затем 17.5 мл культуральной среды HASMC добавляют в агарозную форму для инкубации смешанных клеточных цилиндров SVF-SMC:SVF-EC, или 17.5 мл культуральной среды HDF добавляют в агарозную форму для инкубации клеточных цилиндров HDF.
3. Клеточные цилиндры
2
2
2
2
3.1. Изготовление смешанных клеточных цилиндров SVF-SMC: SVF-EC: Для приготовления смешанных клеточных цилиндров собирают по отдельности SVF-SMC и SVF-EC, и затем смешивают в заранее установленных пропорциях. Вкратце, культуральную среду удаляют из флаконов с конфлюэнтной культурой и клетки промывают DPBS (1 мл/5 см площади роста). Клетки отделяют от поверхности культуральных флаконов путем инкубации в присутствии TrypLE (Invitrogen Corp., Carlsbad, С А) в течение 5-10 минут. После инкубации во флаконы добавляют соответствующую культуральную среду для того, чтобы подавить ферментативную активность. Клеточную суспензию центрифугируют в течение 6 минут при 200g с последующим полным удалением супернатантного раствора. Клеточный осадок ресуспендируют в соответствующей культуральной среде и подсчитывают количество клеток в гемацитометре. Соответствующие объемы SVF-SMC и SVF-EC объединяют для получения смешанной клеточной суспензии, содержащей 15% SVF-EC и оставшиеся 85% SVF-SMC (как % общей клеточной популяции). Смешанную клеточную суспензию центрифугируют в течение 5 минут при 200g с последующим полным удалением раствора супернатанта. Смешанный клеточный осадок ресуспендируют в 6 мл культуральной среды SVF-SMC и переносят в 20 мл стеклянные флаконы (VWR International LLC, West Chester, PA) с последующей инкубацией на орбитальном встряхивателе при 150 об/мин в течение 60 минут и при 37°С и 5% СO. Это позволяет клеткам образовывать агрегаты друг с другом и инициировать адгезию клетка-клетка. После инкубации клеточную суспензию переносят в 15 мл центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при 200g. После удаления супернатантной среды клеточный осадок ресуспендируют в 400 мкл культуральной среды SVF-SMC и пипетируют вверх и вниз несколько раз для обеспечения разрушения всех клеточных кластеров. Клеточную суспензию переносят в 0.5 мл микроцентрифужную пробирку (VWR International LLC, West Chester, PA), помещенную внутрь 15 мл центрифужной пробирки с последующим центрифугированием в течение 4 минут при 2000g для формирования высокоплотного и компактного клеточного осадка. Супернатантную среду аспирируют и клетки переносят в капиллярные пробирки (OD 1.25 мм, ID 0.266 мм, L 75 мм; Drurnmond Scientific Co., Broomall, PA) путем аспирирования таким образом, чтобы получить клеточные цилиндры длиной 50 мм. Клеточную массу внутри капилляров инкубируют в среде SVF-SMC в течение 20 минут при 37°С и 5% СО. Клеточные цилиндры затем вытесняют из капиллярных пробирок в канавки агарозной формы (покрытой средой SVF-SMC) с помощью плунжера, поставляемого вместе с капиллярами. Клеточные цилиндры инкубируют в течение 6-12 часов при 37°С и 5% СО.
4. Изготовление сосудистых трубочек
4.1. Приготовление агарозной базовой пластины: Агарозную базовую пластину изготавливают путем заливания 12 мл предварительно нагретой (>60°С) агарозы (2% вес/объем) в 10 см чашку Петри. Сразу же после заливания агароза равномерно распределяется по поверхности всей базы чашки и формирует равномерный слой. Чашку Петри инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут для полного превращения агарозы в гель.
2
4.2. Сосудистая трубочка: Изготавливают сосудистые трубочки, состоящие из смешанных клеточных цилиндров SVF-SMC:SVF-EC. Вкратце, по завершении 6-часового периода инкубации зрелые цилиндры SVF-SMC и SVF-EC аспирируют обратно в капиллярные пробирки и помещают в соответствующую культуральную среду до последующего использования. Поддерживающую структуру, состоящую из агарозных палочек, готовят следующим образом. Предварительно нагретую 2% агарозу аспирируют в капиллярные пробирки (L=50 мм) и быстро охлаждают в холодном растворе PBS (4°С). Застывший агарозный цилиндр длиной 5 см вытесняют из капилляров (с помощью плунжера) и укладывают непосредственно на агарозную базовую пластину. Второй агарозный цилиндр присоединяют к первому и процесс повторяют до тех пор, пока соответствующее количество агарозных цилиндров не будет вытеснено для того, чтобы соответствовать конечной трубчатой геометрии. Трубчатые конструкции сосудов, содержащие многоклеточные цилиндры SVF-SMC и SVF-EC, изготавливают с использованием послойного процесса печатания, при этом агарозные цилиндры в центре трубчатой клеточной конструкции состоят из 4%-ной агарозы. После завершения всей конструкции 0.5 мл теплой агарозы разливают по поверхности каждого конца конструкции и оставляют для превращения в гель при комнатной температуре на 5 минут. После образования геля этой агарозы, 30 мл среды SVF-SMC добавляют в чашку Петри (для обеспечения полного погружения всей конструкции). Конструкцию инкубируют в течение 12-24 часов при 37°С и 5% СО для сцепления прилегающих клеточных цилиндров. По завершении 12-24 часов окружающую агарозу поддерживающую структуру удаляют и изолируют сцепленную сосудистую трубочку.
Пример 4: Конструкции кровеносных сосудов с многоклеточными цилиндрами HASMC-HDF-HAEC
Материалы и способы
1. Клеточная культура
4
2
1.1. Гладкомышечные клетки: Первичные человеческие аортальные гладкомышечные клетки (HASMC; GIBCO / Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) хранят и размножают в среде Игла, модифицированной по Дульбекко с низким содержанием глюкозы (DMEM; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 ед/мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В, 0.01М HEPES (все от Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), 50 мг/л пролина, 50 мг/л глицина, 20 мг/л аланина, 50 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мкг/л CuSO (все от фирмы Sigma, St. Louis, МО) при 37°С и 5% СО. Конфлюэнтные культуры HASMC между пассажами 4 и 8 используют во всех исследованиях.
2
1.2. Эндотелиальные клетки: Первичные человеческие аортальные эндотелиальные клетки (НАЕС; GIBCO / Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) хранят и размножают в среде 199 (Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), дополненной 10% FBS, 1 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста, 3 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 10 мкг/мл гепарина, 100 ед/мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина и 0.25 мкг/мл амфотерацина В (все от фирмы Invitrogen Corp., Carlsbad, СА). Клетки выращивают в покрытых желатином (из свиной сыворотки; Sigma, St. Louis, МО) обработанных флаконах для культуры ткани, при 37°С и 5% СО. Конфлюэнтные культуры НАЕС между пассажами 4 и 8 используют во всех исследованиях.
2
1.3. Фибробласты: Первичные человеческие дермальные фибробласты (HDF; GIBCO / Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) хранят и размножают в среде Medium 106 (Invitrogen Corp., Carlsbad, С A), дополненной 2% FBS, 1 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста, 3 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 10 мкг/мл гепарина, 100 ед/мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина (все от фирмы Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) при 37°С и 5% СО. Конфлюэнтные культуры HDF между пассажами 4 и 8 используют во всех исследованиях.
2. Агарозный раствор и форма
2.1. Приготовление 2% и 4% (вес / объем) раствора агарозы: 1 г или 2 г (для 2% или 4% соответственно) агарозы с низкой температурой плавления (Ultrapure LMP; Invitrogen Corp., Carlsbad, С А) растворяют в 50 мл фосфатно-буферного раствора Дульбекко (DPBS; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА). Вкратце, DPBS и агарозу нагревают до 85°С на горячей плите при постоянном перемешивании до полного растворения агарозы. Раствор агарозы стерилизуют методом паровой стерилизации при 125°С в течение 25 минут. Раствор агарозы остается в жидкой фазе до тех пор, пока температура сохраняется выше 36.5°С. Ниже этой температуры происходит фазовый переход, вязкость агарозного раствора увеличивается и агароза формирует твердый гель.
2.2. Приготовление агарозной формы: Агарозную форму изготавливают для инкубации клеточных цилиндров с использованием формы, покрытой тефлоном, подходящей для 10 см чашки Петри. Вкратце, тефлоновую форму предварительно стерилизуют с использованием 70% раствора этанола и подвергают воздействию УФ-излучения в течение 45 минут. Стерилизованную форму помещают поверх 10 см чашки Петри (VWR International LLC, West Chester, PA) и прочно закрепляют. Эту конструкцию (тефлоновая форма + чашка Петри) устанавливают в вертикальное положение и 45 мл предварительно нагретого стерильного 2% раствора агарозы заливают в пространство между тефлоновой формой и чашкой Петри. Конструкцию затем устанавливают горизонтально при комнатной температуре на 1 час для завершения образования геля агарозы. После образования геля тефлоновую форму удаляют и агарозную форму промывают дважды DPBS. Затем 17.5 мл культуральной среды HASMC добавляют в агарозную форму для инкубации смешанных клеточных цилиндров.
3. Цилиндры HASMC-HDF-HAEC
2
2
2
2
2
3.1. Изготовление смешанных клеточных цилиндров HASMC-HDF-HAEC: Для приготовления смешанных клеточных цилиндров по отдельности собирают цилиндры HASMC, HDF, НАЕС и затем смешивают в заранее установленных пропорциях (например, соотношения HASMC:HDF:HAEC составляют 70:25:5). Вкратце, культуральную среду удаляют из флаконов с конфлюэнтной культурой и клетки промывают DPBS (1 мл/5 см площади роста). Клетки отделяют от поверхности культуральных флаконов путем инкубации в присутствии трипсина (1 мл/15 см площади роста; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) в течение 10 минут. HASMC и HDF отделяют с использованием 0.15% трипсина и НАЕС отделяют с использованием 0.1% трипсина. После инкубации соответствующую культуральную среду добавляют во флаконы (2Х объема по отношению к объему трипсина). Клеточную суспензию центрифугируют в течение 6 минут при 200g после полного удаления супернатантного раствора. Клеточную массу ресуспендируют в соответствующей культуральной среде и подсчитывают количество клеток в гемацитометре. Соответствующие объемы HASMC, HDF и НАЕС объединяют для получения смешанной клеточной суспензии. Смешанные клеточные суспензии центрифугируют в течение 5 минут при 200g с последующим аспирированием раствора супернатанта. Смешанную клеточную массу ресуспендируют в 6 мл культуральной среды HASMC и переносят в 20 мл стеклянные пробирки (VWR International LLC, West Chester, PA), с последующей инкубацией на орбитальном встряхивателе при 150 об/мин в течение 60 минут и при 37°С и 5% СО. Это позволяет клеткам агрегировать друг с другом и инициировать адгезию клетка-клетка. После инкубации клеточную суспензию переносят в 15 мл центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при 200g. После удаления супернатантной среды клеточный осадок ресуспендируют в 400 мкл культуральной среды HASMC и пипетируют вверх и вниз несколько раз для обеспечения разрушения всех клеточных кластеров. Клеточную суспензию переносят в 0.5 мл микроцентрифужную пробирку (VWR International LLC, West Chester, PA), помещенную внутрь 15 мл центрифужной пробирки с последующим центрифугированием в течение 4 минут при 2000g для формирования высокоплотного и компактного клеточного осадка. Супернатантную среду аспирируют и клетки переносят в капиллярные пробирки (OD 1.5 мм, ID 0.5 мм, L 75 м; Drummond Scientific Co., Broomall, PA) путем аспирации таким образом, чтобы получить клеточные цилиндры длиной 50 мм. Клеточную массу внутри капилляров инкубируют в среде HASMC в течение 20 минут при 37°С и 5% СО. Клеточные цилиндры затем вытесняют из капиллярных трубочек в канавки агарозной формы (покрытой средой HASMC) с помощью плунжера, поставляемого вместе с капиллярами. Клеточные цилиндры инкубируют в течение 6-24 часов при 37°С и 5% СО.
4. Изготовление сосудистых трубочек с многоклеточными цилиндрами (HASMC:HDF: НАЕС)
4.1. Приготовление агарозной базовой пластины: Агарозную базовую пластину изготавливают путем заливания 10 мл предварительно нагретой (>40°С) агарозы (2% масса/объем) в 10 см чашку Петри. Сразу же после заливания агарозу равномерно распределяют таким образом, чтобы покрыть все основание чашки и формировать равномерный слой. Чашку Петри инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут для полного превращения агарозы в гель.
2
4.2. Многослойная сосудистая трубочка: Сосудистые трубочки, состоящие из цилиндров, содержащих все три клеточных типа, HASMC:HDF:HAEC, изготавливают с использованием многоклеточных цилиндров. Используют геометрическое расположение с 6-12 клеточными цилиндрами и 1-7 центральными агарозными цилиндрами, соответственно. Вкратце, по завершении 6-12-часового периода инкубации зрелые цилиндры HASMC-HDF-HAEC аспирируют обратно в капиллярные пробирки и помещают в соответствующую культуральную среду до дальнейшего использования. Поддерживающую структуру, состоящую из агарозных палочек, готовят следующим образом. Предварительно нагретую 2% агарозу аспирируют в капиллярные пробирки (L=50 мм) и быстро охлаждают в холодном растворе PBS (4°С). Застывшие агарозные цилиндры длиной 5 см вытесняют из капилляра (с помощью плунжера) и укладывают непосредственно на агарозную базовую пластину. Второй агарозный цилиндр присоединяют к первому, и процесс повторяют до тех пор, пока 7 или 10 агарозных цилиндров не осаждается для формирования первого слоя. Подробно описано изготовление сосудистой трубочки с 6 многоклеточными цилиндрами и 1 центральным агарозным цилиндром. На данном этапе 20 мкл PBS разливают по поверхности агарозных цилиндров для сохранения их влажными. Последующие два агарозных цилиндра осаждают поверх слоя 1, при этом первый агарозный цилиндр осаждают в крайнем левом конце и второй агарозный цилиндр справа от него. Два многоклеточных цилиндра HASMC-HDF-HAEC затем осаждают справа от двух агарозных цилиндров в Слое 2. Соответственно, 20 мкл среды HASMC распределяют по поверхности клеточных цилиндров. Еще два агарозных цилиндра осаждают справа от двух многоклеточных цилиндров. Слой 3 конструируют с агарозным цилиндром в крайнем левом конце слоя. Многоклеточный цилиндр осаждают справа от этого цилиндра. 4% агарозный цилиндр затем осаждают справа от многоклеточного цилиндра. Другой многоклеточный цилиндр осаждают справа от 4% агарозного цилиндра. В заключение, другой 2% агарозный цилиндр осаждают справа от второго многоклеточного цилиндра. Соответственно, 20 мкл среды HASMC распределяют по поверхности клеточных цилиндров. Слой 4 начинают с 2% агарозного цилиндра в правом конце с последующим осаждением двух клеточных цилиндров справа от агарозного цилиндра. Слой 4 завершают последним агарозным цилиндром справа от двух многослойных цилиндров. Соответственно, 20 мкл среды HASMC распределяют по поверхности клеточных цилиндров. Слой 5 конструируют путем осаждения 3 агарозных цилиндров поверх Слоя 4. После завершения всей конструкции 0.5 мл теплой агарозы распределяют над каждым краем конструкции и оставляют для образования геля при комнатной температуре на 5 минут. После образования геля этой агарозы 30 мл среды HASMC добавляют в чашку Петри (для обеспечения полного погружения всей конструкции). Конструкцию инкубируют в течение 12-24 часов при 37°С и 5% СO для сцепления между смежными клеточными цилиндрами. По завершении 12-24 часов окружающую агарозную поддерживающую структуру удаляют с получением сцепленных многослойных сосудистых трубочек (Фиг.3).