Конструирование лигандов маркерных белков для диагностики инфаркта миокарда на основе принципа комплементарности

УДК 616.127-005.8-07 В. А. Карасев

Конструирование лигандов маркерных белков для диагностики инфаркта миокарда на основе принципа комплементарности

Ключевые слова: конструирование лигандов, принцип комплементарности, маркерные белки, микрочипы, диагностика инфаркта миокарда.

Keywords: design of ligands, the principle of complementarity, marker proteins, microchips, diagnosis of myocardial infarction.

В разработки лигандов маркерных

белков инфаркта миокарда (миоглобина, тро-понинов и креатинфосфокиназы) для диагностических микрочипов проведен анализ пространственной структуры этих белков. В результате в качестве лигандов предложены: для миоглобина — последовательность аминокислот из области 69—78; для тропонинов — фрагмент тропонина Т с 223-й аминокислоты по 260-ю. Для креатинфосфокиназы предложено сшивать субъединицы гетеродимера и использовать их в качестве лигандов целиком путем прикрепления к подложке. Предложенные ли-ганды испытываются экспериментально в процессе создания микрочипов.

Введение

К актуальным проблемам диагностики сердечно-сосудистых заболеваний относится создание высокоточных и чувствительных экспресс-методов, основанных на определении характерных биохимических показателей. Для этих целей разрабатываются биосенсорные системы (миниатюрные аналитические платформы) [1]. В дополнение к электрокардиографическим методам такие системы позволяют более надежно ставить диагнозы (например, доклинический диагноз инфаркта миокарда). В качестве основы для разработки биосенсорных систем используют специфические маркеры инфаркта миокарда, определяемые в крови пациентов. Наиболее часто в качестве таких маркеров служат миоглобин, тропонины и креатинфосфокиназа [2].

Чтобы иметь молекулы маркеров в достаточном количестве, необходимо определиться с методом их получения. Наиболее распространенным и эффективным методом выделения специфических био-

молекул и биоструктур считается метод аффинной хроматографии [3]. Он состоит в том, что к подложке прикрепляется лиганд, способный к специфическому связыванию с соответствующей молекулой (в нашем случае — с молекулой маркера). В последнее время для создания лигандов используются полинуклеотидные последовательности (аптамеры) [3] — синтетические однонитевые молекулы РНК или ДНК, способные специфически связываться с другими молекулами (молекулами-мишенями). Данный подход эмпиричен, так как теория создания аптамеров еще не создана.

Основными требованиями к лиганду являются химическое сродство к какому-либо участку молекулы маркера и избирательность по отношению к выделяемому маркеру. В подходящих условиях маркер связывается лигандом на основе принципа молекулярного распознавания. Дальнейшее определение количественного содержание маркера можно проводить непосредственно на матрице. Известно много вариантов молекулярного распознавания [3], однако далеко не все они подходят для создания приборов экспресс-диагностики инфаркта миокарда.

Среди разнообразных принципов, используемых в процессах молекулярного распознавания, можно выделить принцип комплементарности и самоком-плементарности белковых фрагментов, суть которого состоит в следующем.

Как известно, большинство белков являются олигомерами, т. е. структурами, состоящими из различного, но обычно четного числа субъединиц: 2, 4, 8 и т. д. В димере две субъединицы образуют область контакта (рис. 1).

Поскольку димер обладает вращательной симметрией (группа симметрии С2), то расположение его функциональных групп также должно быть симметрично. Свойство дополнительности (компле-

№ Б(3Б)/2014 |

биотехносфера

Рис. 1 \ Димерный белок и его область контакта

ментарности) можно распространить не только на сам контакт (например « + » и «-» между двумя субъединицами, как показано на рис. 1), но и на правую и левую части каждой области контакта каждой субъединицы. Иными словами, в области контакта в субъединице имеется комплементар-ность двух его половин (самокомплементарность), что хорошо видно на рис. 1. Комплементарность распространяется не только на заряженные группы или группы, способные образовывать водородные связи, но и на выступы и впадины, образуемые неполярными боковыми цепями этого фрагмента, т. е. на весь профиль контактного участка. Однако для точного распознавания двух симметричных фрагментов наиболее важны только первые два типа групп, которые способствуют правильной ориентации и фиксации контактных участков.

Впервые анализ области контактов субъединиц белков был проведен авторами работы [4]. До настоящего времени принципы комплементарности и самокомплементарности поверхностей субъединиц для создания аффинных лигандов использовались нечасто. Применительно к конкретным белкам — маркерам инфаркта миокарда — такой анализ не проводился. Целью настоящей работы является попытка предложить аффинные лиганды, в которых для распознавания использован принцип ком-плементарности и самокомплементарности области контактов лигандов и субъединиц белков-маркеров инфаркта миокарда.

Объекты исследования и методы их анализа

Объекты исследования. В данной работе для анализа области контактов субъединиц использовались структуры белков, близкие к структуре маркеров и исследованные методом рентгеноструктурного анализа (РСА). Координаты атомов этих белков получали из Protein Data Bank.

Миоглобин — один из основных маркеров инфаркта миокарда [2], обычно выделяющийся из

крови в виде одной субъединицы. Известно более сотни структур миоглобинов человека, полученных в виде одной субъединицы и исследованных методом РСА, но для разработки лигандов мио-глобина они не подходят. Из общебиологических соображений можно было ожидать, что в подходящих условиях он все же является олигомером и состоит как минимум из двух субъединиц (димер). И в самом деле, известны две структуры миогло-бина млекопитающих, полученные в виде диме-ров: димер миоглобина свиньи (1MWD)1 и димер миоглобина лошади (3VM9). Для нашего анализа подходящей оказалась структура второго димера. Перенесение результатов данного анализа на мио-глобин человека, как будет показано ниже, обусловлено близким сходством первичных структур этих двух миоглобинов.

Тропонины, как и миоглобин, используются в качестве маркеров инфаркта миокарда [2]. Известны три типа тропонинов: C, T и I. В Protein Data Bank имеются два файла (1J1D и 1J1E), в которых представлена информация о структуре всех трех тропонинов человека. Исследованы также структуры тропонинов цыпленка (1DTL, 1YTZ, 1YV0) и кролика (2Z5H), но они существенно отличаются от структуры тропонина человека. В нашей работе проанализированы участки плотного контакта комплекса тропонинов, который послужил основой для разработки соответствующих лигандов.

Креатинфосфокиназа (КФК) — магнийзависи-мый фермент, который содержится в цитоплазме и митохондриях миокарда, а также в скелетных мышцах и тканях мозга. КФК катализирует реакцию образования креатинфосфата, являющегося одной из форм переноса энергии между клеточными компартментами, состоящими из креатина и АТФ (аденозинтрифосфата).

В различных тканях фермент КФК состоит из четного числа субъединиц и представлен в виде пар: ММ (изофермент М в мышцах), ВВ (изофер-мент В в мозгу) и MB (изофермент М в миокарде). При инфаркте миокарда [2] в крови существенно повышается уровень фермента, состоящего из двух разных субъединиц (MB). Формы М и В были исследованы методом РСА. Мышечная форма КФК кур (файл 1CRK) содержит 4 идентичные субъединицы, тогда как митохондриальная форма КФК человека состоит из 8 идентичных субъединиц (файлы 1QK1, 2GL6). Мышечная форма кристаллизуется в виде октамера и содержит два типа контактов.

Методы анализа структуры маркерных белков. Анализ участков структуры маркерных белков в целях ее воссоздания при взаимодействии между лигандом и маркером проводился с помощью «Ви-зуализатора надмолекулярных структур Protein 3D» [5]. При анализе области контактов отдельных субъединиц белка, выполнявшемся с помощью

1 Здесь и далее ссылки даются на код файла с информацией о структуре, хранящегося в Protein Data Bank.

этой программы, особое внимание уделялось поиску в анализируемых белках элементов симметрии и комплементарности.

Особенностью данного визуализатора является наличие в нем формы представления (рендеринга) белка в виде систем сопряженных ионно-водород-ных связей (ССИВС), рассматриваемых в качестве основы для построения биоструктур и каналов переноса энергии в этих структурах [6]. Представление белка в виде ССИВС оказалось полезным при поиске подходящих лигандов, что будет показано ниже.

Результаты и их обсуждение

Разработка лиганда для миоглобина. В качестве базового подхода к выбору лиганда использовался пространственный анализ структуры миогло-бина. При этом мы исходили из того, что первичные структуры миоглобинов и их пространственные третичные структуры близки между собой. Для подтверждения этого в табл. 1 приведены фрагменты ряда первичных структур миоглобинов млекопитающих (с 50-й аминокислоты по 110-ю).

Выбор участка с 50-й аминокислоты по 110-ю связан с тем, что в пределах этой последовательности находится область контакта субъединиц в миоглобине лошади. Как свидетельствуют данные табл. 1, из 60 аминокислот только в 19 положениях наблюдается вариабельность, причем значительная часть аминокислот представлена близкородственными заменами (типа Ser <—> Thr, Ile <—> Leu <—> Val) или единичными заменами. Эти данные позволяют использовать результаты, полученные на разных миоглобинах, при разработке лиган-да для выделения миоглобина человека.

Анализ области контакта субъединиц миоглобина лошади. В димере свиньи область контакта субъединиц ограничена всего несколькими атомами, вследствие чего он не представляет для нас интереса. В димере лошади область контакта субъединиц довольно протяженна, и потому именно эта структура использовалась для анализа и последующего проектирования лиганда.

Как видно из рис. 2, в димере миоглобина лошади протяженный контакт двух спиральных участков наблюдается в интервале от 71-й аминокислоты до 89-й. Более детально область контакта

Таблица 1

Сопоставление первичных структур миоглобинов млекопитающих

M

5O

5l

52

53

54

55

5б

57

5B

59

6O

б1

б2

63

б4

б5

бб

б7

6B

б9

7O

rat

pig

bos

hum

hor

Lys »

» » » » »

Ser

»

» »

Thr

Ser

Thr

Glu

»

» » » » »

Glu

»

Glu

Met

Asp

Asp »

Ala

Asp

Ala

Glu

»

» »

Lys »

» »

Ser

Gly

Arg

Arg

Lys

Ala

»

» »

Ser

»

» » » » »

Glu

»

» » » » »

Asp »

» » » » »

Leu

»

» » » » »

Lys »

» »

Arg

Lys

Lys »

» » » » »

His

Gly

»

» » » » »

Cys »

Asn »

»

Ala

Thr

»

» » » »

Val

Thr

Val

Leu

»

» » » » »

Thr

M

7l

72

73

74

75

7б

77

7B

79

BO

B1

B2

B3

B4

B5

B6

B7

BB

B9

9O

9l

rat

pig

bos

hum

hor

Ala

»

» » » » »

Leu

»

» » » » »

Gly

»

» » » » »

Thr

»

Gly

»

» » »

Ile

»

» » » » »

Leu

Lys »

» » » » »

Lys »

» » » » »

Lys »

» » » » »

Gly

»

» » » » »

Gln

»

His »

» » »

His »

» » » » »

Ala

»

Glu

»

» » »

Ala

»

» » » » »

Glu

Ile

»

Gln

Leu

»

» » »

Lys »

» » »

Pro

»

» »

Leu

His

Pro

Ala

»

» » » » »

Gln

M

92

93

94

95

9б

97

9B

99

lOO

lOl

lO2

103

lO4

lO5

106

lO7

10B

lO9

llO

rat

pig

bos

hum

hor

Ser

»

» » » » »

His »

» » » » »

Ala

»

» » » » »

Thr

»

» »

Asn

Thr

»

Lys »

» » » » »

His

Lys »

» » » » »

Ile

»

» » » » »

Pro

»

» » » » »

Val »

Ile

Val »

»

Ile

Lys »

» » » » »

Tyr

Leu

»

» » » » »

Glu

»

» » » » »

Phe

Ile

»

» » » » »

Ser

»

» » » » »

Glu

»

» »

Val

Ile

Asp

Ala

»

»

Glu

Cys

Asp

Ala

Сокращения: rat — крыса; mou — мышь; ner — нерпа; pig — свинья; bos — бык; hum — человек; hor — лошадь. Нумерация последовательностей слева направо.

№ Б(3Б)/2014 I

биотехносфера

mou

ner

»

»

»

mou

»

ner

»

mou

ner

Рис. 2

Область контакта субъединиц в димере миоглобина лошади

Субъединица В

Субъединица А

Рис. 3 \ Область контакта двух субъединиц в миоглобине лошади

субъединиц показана на рис. 3, где использовано представление структуры в виде ССИВС. Видно симметричное взаимодействие C—NH2-rpynn Lys 78 и Н0—С=0-групп Glu 85, принадлежащих двум разным субъединицам. Симметрия взаимодействия двух противоположных по свойствам аминокислот обеспечивает их взаимное узнавание и фиксацию этих двух участков в димере.

Как видно из рис. 3, кроме водородной связи между Lys 78 и Glu 85 наблюдается также водородная связь 0—С=0-группы Glu 85 с ССИВС основной цепи противолежащей субъединицы, что также способствует фиксации и взаимному узнаванию субъединиц димера.

Сопостаеление последовательности аминокислот в миоглобинах и гемоглобинах. В миоглобинах человека и лошади выделенные участки легко сопоставить на основе данных табл. 1. Такое сравнение показывает, что они практически не отличаются друг от друга. Это означает, что для миоглобина человека эта область контакта будет аналогична.

Согласно требованиям к созданию лигандов, выделенная область должна быть избирательной к миоглобинам. Можно предположить, что одним из белков, который мог бы конкурировать за распознавание этой области, является гемоглобин, субъ-

единицы которого также имеют сходную структуру. Для проверки этого предположения мы сопоставили последовательности аминокислот миоглобина человека с соответствующими последовательностями a- и b-субъединиц гемоглобина человека (файл 4HHB, табл. 2). Видно, что на этом участке нет никакого сходства между первичными структурами a- и b-субъединиц гемоглобина и миоглобина человека, что вполне соответствует нашим требованиям.

Практически это означает, что для специфического выделения миоглобина человека можно предложить синтезировать последовательность аминокислот из области 69—78. Преимуществом этого фрагмента, помимо участия в контакте двух субъединиц, является гидрофильность данного участка (он содержит много гидрофильных аминокислот — Lys, Glu, Thr), так что проблем с его растворимостью, видимо, не будет.

Разработка лиганда для тропонина. Как и мио-глогобин, тропонины могут служить маркерами инфаркта миокарда. Существуют три типа тропо-нинов: C, T и I. При создании лиганда нами также был предпринят структурный подход с использованием «Визуализатора надмолекулярных структур Protein 3D» [2] для анализа комплекса тропо-нинов.

Таблица 2 Последовательности аминокислот фрагментов 69-98 a-субъединицы

l 69 TS S6 Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu Thr Leu Ser Glu

2 69 TS S6 Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala His Ala His Lys

3 69 TS 85 Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys Gly His His Glu Ala Glu Ile Lys Pro Leu Ala

l 9S Leu Arg Val Asp Pro Val Asn Phe

2 9T Leu His Cys Asp Lys Leu His Val

3 9S Gln Ser His Ala Thr Lys His Lys

Известна всего одна работа [7], в которой получен комплекс всех трех тропонинов человека — C, T и I. В Protein Data Bank имеются два файла, близких по структуре: 1J1D и 1J1E.

Исследованный методом РСА комплекс представляет собой димер, в котором каждая молекула тропонинов представлена в соотношении 1 : 1 : 1. Общий вид комплекса тропонинов C, T и I (файл 1J1D), визуализированный с помощью программы Protein 3D, показан на рис. 4. Видно, что тропони-ны C, T и I образуют комплекс в виде одной субъединицы, а две субъединицы, ориентированные под углом друг к другу, образуют димер. В области не очень плотного контакта субъединиц, который возникает между С и F цепями двух комплексов, четко видна водородная связь между двумя аргининами (Arg 74 C и Arg 74 F), расположенными на оси вращения комплекса.

Такое «центральное» положение распознающих групп не очень благоприятно для конструирования лигандов, обладающих высокой специфичностью, поскольку имеется достаточно боковых цепей аргининов, способных формировать аналогичные связи. Отметим, что во второй структуре (файл 1ЛЕ) контакта двух аргининов вообще не выявлено. В связи с этим мы обратились к анализу взаимодействия отдельных цепей внутри субъединицы (рис. 5). Видно, что молекула тропонина С (серого цвета), расположенная в левой части субъединицы молекулы, имеет множественные контакты с двумя другими тропонинами, а молекулы тропонина I (светло-серого цвета) и тропонина Т (черного цвета) плотно контактируют и имеют изломы а-спирали. Для тропонина Т излом расположен в области с 223-й аминокислоты по 226-ю, а для тропонина I — в области с 87-й аминокислоты по 91-ю.

Рис 4 \ Димерный комплекс тропонинов человека

№ 6(36)/2014 I

биотехносфера

Тропонин T

Тропонин С

Тропонин I

Рис. 5

Комплекс тропонинов С, T, I

Анализ взаимодействия тропонинов в субъединице. Подробный анализ этой структуры позволил установить, что а-спираль молекулы тропонина Т контактирует с двумя ветвями тропонина I, начиная с 222-го атома и заканчивая примерно 260-м.

Имеются две пары специфичных водородных связей: связь между Glu 257 тропонина T и Asn 121 тропонина I, а также связь между Glu 252 тропонина T и Arg 88 тропонина I (рис. 6). Были найдены и другие водородные связи между боковыми цепями

Тропонин I

Тропонин T

Рис. 6

Водородные связи между тропонином T

Таблица 3

Последовательность аминокислот тропонина Т, рекомендуемая в качестве лиганда для выделения маркерного тропонина

223 225

230

235

240

His Leu Asn Glu Asp Gln Leu Arg Glu Lys Ala Lys Glu Leu Trp Gln Thr Ile

245

250

255

260

Tyr Asn Leu Glu Ala Glu Lys Phe Asp Leu Gln Glu Lys Phe Lys Gln Gln Lys Tyr Glu

Рис. 7 \ Контакты субъединиц КФК митохондрий человека в тетрамере

этих цепей тропонинов. Область контакта тропонинов весьма специфична, поскольку между боковыми цепями обеих молекул наблюдаются водородные связи, способствующие их взаимному узнаванию. Это хорошо видно на рис. 6, использующем форму представления ССИВС, где показаны отмеченные выше водородные связи между боковыми цепями тропонина Т и обеими ветвями тропонина I.

Из представленных данных следует, что участок тропонина Т с 223-й аминокислоты по 260-ю (табл. 3) перспективен для создания на его основе лиганда, который позволял бы выделять весьма специфичный тропонин I.

Предложения по креатинфосфокиназе. Мышечная форма КФК кристаллизуется в виде октамера и содержит контакты двух типов.

Контакт первого типа возникает между субъединицами тетрамера. На рис. 7 видно, что все субъединицы в пределах тетрамера имеют очень слабые гетерологичные (асимметричные) контакты.

Контакт второго типа — контакт двух субъединиц, принадлежащих к разным тетрамерам, — гомологичен (группа симметрии С2), что хорошо

а)

Рис. 8

Гомологичные контакты субъединиц креатинфосфокиназы митохондрий человека между двумя тетрамерами (файл 1QK1). Формы представления: а - атомы; б - ССИВС

№ БС3Б)/20М"|

биотехносфера

видно на рис. 8, а. Он является существенно более плотным, что хорошо видно на рис. 8, б.

На рис. 8, б также видно, что ССИВС переходят из одной субъединицы в другую. Однако, в отличие от рассмотренных выше структур миоглоби-на и тропонинов, эти ССИВС состоят из нескольких фрагментов, сформированных благодаря всей укладке третичной структуры субъединиц.

Мозговая креатинфосфокиназа изучена в форме, содержащей две субъединицы (файл 3B6R). Имеются также еще две структуры (файлы 3DRB и 3DRE). Их анализ показал, что контакты в них также состоят из различных участков, сближенных благодаря формированию третичной структуры субъединиц. Вследствие этого подход, примененный к проектированию лигандов миоглобина и тропонинов, не применим к структуре КФК. По-видимому, в этом случае имеет смысл получить димерные гетерокомплексы КФК, состоящие из субъединиц обоих типов (В и М), сшить их и прикрепить к носителю, а в дальнейшем использовать их в таком виде в качестве лигандов для выделения КФК из крови пациентов.

Заключение

В целях разработки лигандов для белковых маркеров инфаркта миокарда (миоглобина, тропонинов и креатинфосфокиназы) с помощью визуализатора надмолекулярных структур Protein 3D была проанализирована пространственная структура этих белков.

В качестве лигандов миоглобина было предложено синтезировать последовательность аминокислот из области 69—78, которая в структуре димера мио-глобина участвует в образовании симметричного комплементарного контакта двух субъединиц.

На основе анализа структуры димерного комплекса тропонинов человека, в котором тропонин Т

образует комплементарный контакт с двумя фрагментами тропонина I с формированием фиксирующих водородных связей, сделан вывод о том, что для выделения маркерного тропонина I наиболее подходит фрагмент тропонина Т с 223-й аминокислоты по 260-ю.

В отличие от предыдущих маркерных белков, молекула креатинфосфокиназы состоит из множества субъединиц, контактирующих между собой посредством функциональных групп, которые сближены благодаря специфической укладке третичной структуры субъединиц. Вследствие этого для выделения КФК предложено сшивать субъединицы гетеродимера и использовать их в качестве лигандов для выделения субъединичных комплексов КФК.

В настоящее время предложенные лиганды и ряд их модификаций, связанных с необходимостью детектирования выделяемых белков флуорометри-ческим методом, проходят апробацию на создаваемых микрочипах.

Литература

1. Зимина Т. М., Лучинин В. В. Миниатюрные аналитические платформы: ожидания, реальность и перспективы // На-ноиндустрия. 2010. № 5. С. 80-88.

2. Markers of acute coronary syndrome in emergency room / V. Loria, I. Dato, G. L. De Maria, L. M. Biasucci // Minerva Med. 2008. Vol. 99. P. 497-517.

3. Pharmaceutical and biomedical applications of affinity chromatography: recent trends and developments / D. S. Hage, J. A. Anguizola, C. Bi [et al.] // J. Pharm. Biomed. Anal. 2012. Vol. 69. P. 93-105.

4. Morgan R. S., Miller S. L., McAdon J. M. The symmetry of self-complementary surfaces // J. Mol. Biol. 1979. Vol. 127. P. 31-38.

5. Демченко E. Л., Карасев В. А. Визуализатор надмолекулярных биоструктур «Protein 3D». Зарегистрирован в РО-САПО: № 980143. 03.05.1998.

6. Карасев В. А., Лучинин В. В. Введение в конструирование бионических наносистем. М.: Физматлит, 2009.