СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ЭКСТРАКТА ИЗ КОРНЯ МОЛОЧАЯ ПАЛЛАСА
METHOD FOR PRODUCTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE EXTRACT FROM PALLAS MILKWORT ROOT

Изобретение относится к фармации и медицинской промышленности и касается создания биологически активного экстракта из корня молочая Палласа.
Актуальной задачей современной фармакологии является создание наиболее эффективных и безопасных лекарственных средств. В настоящее время создается много лекарственных средств, полученных путем химического синтеза, эффективных, но имеющих серьезные побочные эффекты, ограничивающие их использование в клинической практике. Для лечения и профилактики хронических воспалительных процессов наиболее целесообразно использование растительных препаратов с низкой токсичностью и большей широтой терапевтического действия, доступных по цене для пациентов. В связи с этим поиск и создание новых средств на растительной основе является актуальной задачей.
Одним из перспективных направлений фармакологии является разработка лекарственных средств, в частности биологически активного экстракта из молочая Палласа, характеризующегося выраженной терапевтической активностью. Известно, что настой и отвар из корня молочая Палласа обладают многонаправленным терапевтическим действием и в медицинской практике их применяют для лечения импотенции, аденомы простаты, туберкулеза, анемии, сепсиса, эндометриоза, миомы матки, воспаления (см. Буданцева А.А. Дикорастущие полезные растения России. / А.А.Буданцева // СПб., Изд. СПХФА, 2001. - 663 с.; Лекарственные растения Забайкалья: методические рекомендации / Б.И.Дулепова и др. Чита, 1991; Судаков К.В. Нормальная физиология / К.В.Судаков // М.: МИА, 1999, с.193-197; Телятьев В.В. Целебные клады Центральной Сибири / В.В.Телятьев. - Иркутск. 2000).
Важно отметить, что в литературе нет данных о методах получения и использования экстракта из корня молочая Палласа, в описании многочисленных свойств молочая отсутствуют научные доказательства антигипоксического, антиоксидантного, тиреотропного и андрогенного эффектов.
Известны различные способы получения экстрактов из растительного сырья.
Известен способ, заключающийся в перемешивании измельченного сырья с касторовым маслом при соотношении 1:1 к количеству экстрактивных веществ и обработке ультразвуком с частотой 19-22 Гц, интенсивностью 1,5-2,3 Вт в течение 1-8 часов при температуре 30-35°C, затем охлаждении до 18-20°C, добавлении хладона 11 и экстракции в течение 1,5-2 часов, при этом растворители берутся в соотношении (15-20):(75-80) (см. а.с. №1337399, МКИ А61K 35/78, 1987. Способ получения экстрактов из растительного сырья / А.А.Вецванг, Г.В.Авраменко, А.Э.Чиксте, М.В.Огилец, У.Э.Браслиньш, А.И.Борисенокова - №4651734/30-14; опубликовано 19.12.1988 г.).
Известен способ получения сухого экстракта из травы кориандра посевного с трехкратной экстракцией травы кориандра 40% этиловым спиртом при отношении сырье: экстрагент, равном 1:5, в течение 1 часа при каждом экстрагировании с последующим объединением извлечений, фильтрацией, удалением спирта и выдерживанием полученного водного остатка в течение 5 часов при температуре +10°C, что позволяет затем отделить осадок, высушить водное извлечение и получить продукт (см. патент RU №2314822 С2, МПК А61K 36/23. Способ получения сухого экстракта из травы кориандра посевного, обладающего антистрессорным, седативным, ноотропным и гипотензивным действием / Э.Т.Оганесян, А.Ю.Пархоменко, З.М.Нерсесян, В.Е.Погорелый, Л.М.Макарова. Пятигорская государственная фармацевтическая академия - №2006106436/15. Заявлено 01.03.2006. Опубликовано 20.01.2008. Бюл. №2).
Перечисленные способы имеют следующие недостатки:
- ни один из перечисленных экстрактов не обладает одновременно анти-гипоксическим, ноотропным, антиоксидантным, тиреотропным и андрогенным действием;
- применение в качестве экстрагентов липофильных органических растворителей не позволяет максимально удалить смолы;
- трудоемкость и сложность технологического процесса;
- использование дорогостоящих экстрагентов и оборудования.
За прототип для заявляемого объекта выбран способ получения биологически активного экстракта из растительного сырья (см. патент RU №2040265 С1. Способ получения биологически активного экстракта / Т.В.Хомова, С.Д.Гусакова, А.И.Глушенкова, А.З.Садиков, Х.Н.Арипов. Институт химии растительных веществ АН Республики Узбекистан - №50656000/14. Заявлено 13.10.1992. Опубликовано 25.07.1995).
Данный способ заключается в экстракции жидких отходов производства аллапинина из корневищ аконита северного трехкратно хлороформом, отделении хлороформных извлечений, промывке водой до нейтральной среды, упаривании и дальнейшей обработке 96% этанолом, отстаивании, отделении декантацией надосадочной жидкости и фильтрации.
Недостатками указанного способа являются:
- в данном способе отсутствует этап удаления смол, обладающих токсическим действием на органы и ткани;
- использование высоких концентраций этанола способствует наименее эффективному извлечению фосфолипидов.
Техническим результатом изобретения является получение комплекса биологически активных веществ, присутствующих в растениях рода Молочай, обогащенных полифенольными соединениями, с высокой Р-витаминной и антиоксидантной активностью, без токсического и раздражающего действия на организм.
Результат достигается тем, что способ получения биологически активного экстракта из корня молочая Палласа, включающий измельчение растительного сырья, экстрагирование, обработку этанолом и очистку, отличается тем, что экстрагирование растительного сырья производят путем трехкратной обработки ацетоном при соотношении сырья и растворителя 1:1,0-1,2 в течение 60-80 минут при 20-25°C с промывкой каждой из порций водой до нейтральной среды, высушиванием сырья и дальнейшей однократной обработкой хлороформом при соотношении сырья и растворителя 1:1,5-1,7 в течение 180-200 минут при 20-25°C, после экстрагирования осуществляют сгущение экстракта, обработку этанолом производят при концентрации 30±1% и температуре этанола 70±4°C в течение 180-200 минут, а после очистки полученный экстракт подвергают деалколизации.
По сравнению с прототипом в предлагаемом способе экстрагирование производят дополнительно ацетоном, что позволяет максимально удалить смолы, содержащие токсические антрагликозиды. Последующая обработка меньшими концентрациями этанола способствует более эффективному извлечению фосфолипидов, а использование перед употреблением экстракта метода выпаривания позволит максимально деалколизировать субстрат.
Способ получения биологически активного экстракта осуществляется следующим образом: корень, собранный в период увядания надземных частей растения, очищают от коры, разрезают продольно тонкими пластами и высушивают в сухом, хорошо проветриваемом и темном месте, измельчают и просеивают через сито с диаметром 10 мм. Далее сырье экстрагируют ацетоном в колбе при температуре 20-25°C (кратность экстракции - 3, время - 60-80 минут, соотношение сырье:экстрагент 1:1,0-1,2). Каждая из порций промывается холодной проточной водой до нейтральной реакции и высушивается при температуре 20-25°C в сухом месте до постоянного веса. Далее сырье экстрагируют хлороформом в течение 180-200 минут при температуре 20-25°C (соотношение сырье:экстрагент 1:1,5-1,7) с последующим сгущением в вакууме на ротационном испарителе возгонкой при 50°C (время возгонки 40-50 мин). Далее проводится извлечение горячим 30±1% раствором спирта в соотношении 1:1 при температуре 70±4°C в течение 180-200 минут на водяной или песчаной бане. Экстракт отстаивается 12 часов в темном месте при комнатной температуре. Затем средняя фаза отделяется и фильтруется через 4-слойный марлевый фильтр. Перед употреблением экстракт деалколизируется методом выпаривания.
Преимуществом предлагаемого способа по сравнению с прототипом является упрощение процесса, т.е. в известном способе осуществляется 9 операций, в предлагаемом нами - 7. Кроме того, трехкратная предварительная обработка сырья ацетоном в предлагаемом способе позволяет максимально удалить смолы, содержащие антрагликозиды, которые обладают сильным раздражающим действием на слизистую желудочно-кишечного тракта. Трехчасовая экстракция хлороформом с последующей возгонкой в вакууме также позволяет максимально удалить алкалоиды - носители токсичности.
Изучение фармакологической активности полученного экстракта проводили на белых лабораторных крысах массой 160-200 г, выращенных в виварии Читинской государственной медицинской академии. Животные содержались в стационарных условиях вивария, получали стандартный корм и воду без ограничения. В эксперименте участвовали опытная и контрольная группы (см. Методические рекомендации по оценке качества лабораторных животных для медико-биологических исследований / А.М.Беспалов, Р.Ф.Кузина. - М., 1985. - 63 с.).
Экстракт молочая Палласа вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мл/кг. Животным контрольной группы вводили изотонический раствор натрия хлорида 0,9% в эквивалентном объеме.
50
Исследование острой токсичности по определению LD проводили по методу Кербера на мышах.
Антигипоксический эффект МП оценивали по времени жизни в гермообъеме в условиях гиперкапнической гипоксии по методу Г.В.Ковалева (Г.В.Ковалев. Ноотропные средства // Г.В.Ковалев. - Волгоград. 1990. - 355 с.). Антиоксидантный эффект изучали методом определения ТБК-активных продуктов перекисного окисления липидов (Андреева Л.И. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой / см. Л.И.Андреева, Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. // Лаб. Дело. - 1988. - №11. - С.41-43). Хемилюминесцентным методом определяли антиокислительную активность крови (АОА) (Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я.Буреш // М.: Высшая школа. - 1999. - 399 с.; Зенков Н.К. Окислительный стресс / Н.К.Зенков, В.З.Ланкин, Е.Б. Меньщикова. // М.: МАИК Наука/Интерпериодика, 2001. - 344 с.). В работе использовали хемилюминометр BioOrbit 1251, диспенсер LKB 1291, аналого-цифровой преобразователь фирмы Ampersand Ltd, программно-аппаратный комплекс МультиХром для Windows, версия 1.52k.
В серии опытов проведены исследования по влиянию экстракта молочая Палласа на функцию щитовидной железы. Для этого в течение 14 дней вводили препараты: Мерказолил 25 мг/кг (Машковский М.Д. Лекарственные средства / М.Д.Машковский // М., 2004. - изд. 14. - Т.2. С.9-10), ЭМП 1 мл/100 г, Тироксин - 0,25 мг/кг (Машковский М.Д. Лекарственные средства / М.Д.Машковский // М., 2004. - изд.14. - Т.2. С.9-10).
4
Изучали познавательную и локомоторную активность крыс в «Открытом поле» (Патент RU №2040265 С1. Способ получения биологически активного экстракта / Т.В.Хомова, С.Д.Гусакова, А.И.Глушенкова, А.З.Садиков, Х.Н.Арипов. Институт химии растительных веществ АН Республики Узбекистан - №50656000/14. Заявлено 13.10.1992. Опубликовано 25.07.1995), динамику массы тела и содержание тироксина в сыворотке методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов ИФА-ТТ производства НПО «Иммунотех».
Для выяснения механизма активации афродиатической активности молочая был поставлен эксперимент по изучению полового поведения (Лисаковская О.В. Влияние горца птичьего и некоторых адаптогенов на функциональные показатели репродуктивной системы. Автореф. дисс.… канд. мед. наук, Томск, 1999 г., 27 с.). На 1 этапе эксперимента определяли влияние экстракта на показатели полового поведения. Экстракт вводили энтерально в дозе 1 мл/кг половозрелым крысам-самцам, содержащимся отдельно от самок в течение 30 суток. Оценивали количество обнюхиваний, облизываний, садок, эякуляций и суммарный показатель половой активности при спаривании самцов с самками, находившимися в состоянии эструса (Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я.Буреш // М.: Высшая школа. - 1999. - 399 с.). Состояние эструса у самок вызывали введением подкожно 0,05 мл 2% масляного раствора синэстрола в течение 5 дней. Фазу цикла определяли на основании цитологического исследования влагалищных мазков. На 2 этапе эксперимента использовали модель «фармакологической кастрации» андрокуром - блокатором эндогенных рецепторов (ципротерона ацетатом) (150 мг/кг, вводили энтерально в течение 30 дней) (см. Машковский М.Д. Лекарственные средства. / М.Д.Машковский. // М., 2004. - изд. 14. - Т.2. С.449-450), проскаром - специфическим ингибитором 5-альфа-редуктазы (1 мг/кг) (там же, с.450) и синэстролом (40 мг/кг) (там же, с.42-43). Препараты вводили в течение 30 суток.
Третий этап эксперимента заключался в исследовании действия экстракта молочая Палласа на фоне антиандрогенных препаратов: в течение 30 дней экстракт вводили одновременно с андрокуром, проскаром и синэстролом. Наряду с показателями полового поведения определяли содержание тестостерона в сыворотке методом иммуноферментного анализа.
Проведенные исследования острой токсичности позволяют отнести полученный нами экстракт из корня молочая Палласа к 4-му классу опасности по ГОСТу 112.1.007-76 или к практически нетоксичным веществам по классификации Сидорова К.К. (1973) (Сидоров К.К. О гармонизации отечественных и международных классификаций острой токсичности химических соединений / К.К.Сидоров // Токсикологический вестник. - 2004. - №6. - С.39).
50
Рассчитанная величина LD в нашем эксперименте составила 3750,8±163,4 мг/кг при энтеральном введении и 2960,6±144,6 мг/кг при парентеральном введении.
При исследовании устойчивости к гипоксии введение экстракта молочая Палласа продлевало жизнь животных в условиях острой прогрессирующей нормобарической гиперкапнической гипоксии на 93% относительно показателей контрольной группы (в контроле резервное время жизни составило 27,5±1,7 мин; в опытной группе - 53,2±3,3 мин при р<0,001).
При оценке антиоксидантной активности экстракт молочая Палласа снижал содержание ТБК-продуктов на 37% по сравнению с контрольной группой. В условиях гиперкапнической гипоксии сохраняются антиоксидантные свойства экстракта - содержание ТБК-активных продуктов снижается на 36% по сравнению с показателями группы с гипоксией (см. табл.1).
2+
По данным хемилюминограммы (см. табл.2) экстракт молочая Палласа достоверно увеличивает продолжительность латентного периода в 3 раза относительно контроля, что свидетельствует о собственной высокой антиоксидантной активности экстракта, в условиях гипоксии антиоксидантная активность экстракта сохраняется. Максимально возможная интенсивность ПОЛ (Н), индуцированная Fe, достоверно возрастает под влиянием экстракта молочая Палласа на 139% относительно контроля при нормоксии, в условиях гиперкапнической гипоксии его эффект сохраняется. Экстракт достоверно снижает показатели быстрой вспышки, характеризующей содержание гидроперекисей липидов, на 30% относительно контроля. Показатели хемилюминограммы доказывают наличие выраженной антиоксидантной активности у исследуемого экстракта.
При экспериментальном гипотиреозе получены данные о четкой активации познавательной активности при использовании экстракта: на фоне гипотиреоза ЭМП более эффективно, чем L-тироксин, восстанавливает исследовательскую и локомоторную активность животных (см. табл.3). Исследовательская активность возрастает на 127% относительно группы с мерказолилом, двигательная активность также увеличивается на 93%. L-тироксин исследовательскую активность крыс увеличивает на 25%, на локомоторную активность не оказывает влияния.
4
Когнитивные показатели коррелировали с содержанием тироксина в сыворотке. Мерказолил снижал на 24% уровень тироксина в сыворотке, ЭМП увеличивал на 75% уровень тироксина по сравнению с мерказолилом, в то время как тироксин повышал уровень Т только на 27% (см. табл.4).
Динамику массы тела крыс оценивали на 7 и 14 сутки эксперимента. Животные, получавшие мерказолил, через 7 суток дали прибавку 13%, через 14 суток - 17%. Под влиянием экстракта масса тела снизилась через 7 суток на 12,2%, через 14 суток - на 12,4%. L-тироксин при экспериментальном гипотиреозе не оказывал влияния на массу тела крыс.
При исследовании афродиатической активности получены следующие данные. Экстракт молочая Палласа стимулирует половую активность крыс, увеличивая суммарный показатель половой активности на 288% по сравнению с интактными животными.
На фоне андрокура экстракт молочая восстанавливает половую активность крыс, увеличивая показатель суммарной половой активности в 6 раз (наиболее интенсивно возрос показатель эякуляций) и содержание тестостерона на 145% (см. табл.5). На фоне проскара экстракт молочая Палласа не был эффективен, тестостерон недостоверно повышался на 7,7%. На фоне синэстрола экстракт молочая Палласа увеличивал суммарный показатель в 2 раза, уровень тестостерона увеличивал на 50% (см. табл.5, чертеж). Таким образом, можно предположить, что афродиатическая активность экстракта молочая Палласа объясняется активацией андрогенных рецепторов и антиэстрогенным действием.
Таким образом, проведенное фармакологическое исследование свидетельствует о том, что экстракт из корня молочая Палласа не токсичен и обладает вышеупомянутыми фармакологическими эффектами.
Проводили качественный и количественный анализ двух фенольных производных - рутина и кверцетина - методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Gilson с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «МультиХром» для Windows.
В качестве неподвижной фазы использовали металлическую колонку размером 4,6×250 мм PLATINUM EPS С 18 100, размер частиц 5 мкм.
Подвижная фаза состояла из смеси растворителей метанол-вода-фосфорная кислота, концентрированная в соотношении 400:600:5. Скорость подачи элюента 0,5 мл/мин, температура 20-23°C. Продолжительность хроматографирования 150 мин. Детектирование производили на УФ-детекторе Gilson при длине волны 254 нм. В качестве стандартных образцов использовали хроматографически чистые вещества: рутин - ФС 42-2508-87, ВИЛАР - ТУ 9369-141-048668244-02; кверцетин - ФС 42-290-79 ВИЛАР - ТУ 9369-128-04868244-03.
Время удерживания рутина на колонке составило 1109 с, количественное соотношение флавоноидов в пересчете на рутин составило 1,83±0,13%. Время удерживания кверцетина составило 1444 с, количественное содержание кверцетина составило 0,32±0,08%. Таким образом, экстракт из корня молочая Палласа, приготовленный предлагаемым методом, имеет высокое содержание веществ с Р-витаминной активностью (рутина) и антиоксидантной активностью (кверцетина).
Предлагаемый способ позволяет получить комплекс биологически активных веществ, присутствующих в растениях рода Молочай, представляющих собой комплекс биологически активных веществ, обогащенных полифенольными соединениями с высокой Р-витаминной и антиоксидантной активностью.
Таблица 1
Влияние экстракта молочая Палласа на содержание ТБК-активных продуктов при нормоксии и гиперкапнической гипоксии (мкМоль/л×10<sup>-1</sup>)
Группа
Кол-во ТБК-активных продуктов
Контроль (физ. р-р 1 мл/кг вн/брюшинно)
7,31±0,48
Экстракт молочая Палласа (1 мл/кг вн/брюшинно)
4,60±1,10*
Гипоксия (25 мин)
15,56±2,14**
Экстракт молочая Палласа (1 мл/кг вн/брюшинно) + Гипоксия (25 мин)
10,0±0,82*
Примечание: * достоверные отличия (р<0,05) относительно контроля, ** достоверные отличия (р<0,001) относительно контроля
Таблица 2
Влияние экстракта молочая Палласа на показатели хемилюминесценции при нормоксии и гипоксии
Группа
h (mV) (быстрая вспышка)
τ (мин) (латентный период)
H (mV) (медленная вспышка)
Контроль (физ. р-р 1 мл/кг вн/брюшинно)
85,9±10,04
1,32±0,39
60,89±5,74
Экстракт молочая Палласа (1 мл/кг вн/брюшинно)
60,02±2,68*
3,86±0,50*
145,73±2,87**
Гипоксия (25 мин)
23,82±1,94**
2,5±0,04*
43,1±3,25*
Экстракт молочая Палласа (1 мл/кг вн/брюшинно) + Гипоксия (25 мин)
40,16±10,22*
3,2±0,08*
54,0±2,12*
Примечание: * достоверные отличия (р<0,05), ** достоверные отличия (р<0,001) относительно контроля
Таблица 3
Влияние экстракта молочая Палласа на показатели поведения крыс в «открытом поле» при экспериментальном гипотиреозе
Группа
Суммарная исследовательская активность
Суммарная двигательная активность
Контроль (физ. р-р 1 мл/кг вн/брюшинно)
46,4±2,11
55,12±3,70
Мерказолил 25 мг/кг
21,2±1,80*
27,70±2,19**
Мерказолил 25 мг/кг + Экстракт молочая Палласа 1 мл/кг
48,3±1,84
53,41±3,34
Мерказолил 25 мг/кг + L-Тироксин 0,25 мг/кг
26,55±1,90*
26,62±1,17*
Примечание: * достоверные отличия (р<0,05), ** достоверные отличия (р<0,001) относительно контроля
Таблица 4
Содержание тироксина в сыворотке крови крыс при экспериментальном гипотиреозе (нМоль/л)
№
Группа
Содержание тироксина (М±m)
1
Контроль (физ. p-р 1 мл/кг вн/брюшинно)
32,75±0,85
2
Мерказолил 25 мг/кг
25,4±0,5*
3
Мерказолил 25 мг/кг + Экстракт молочая Палласа 1 мл/кг
42,8±1,2*
4
Мерказолил 25 мг/кг + L-тироксин 0,25 мкг/кг
31,1±0,9*
Примечание: * достоверные отличия (Р<0,05) относительно контроля
Таблица 5
Влияние экстракта молочая Палласа на содержание тестостерона в сыворотке крови крыс при «фармакологической кастрации» (нМоль/л)
№
Группа
Содержание тестостерона (М±m)
1
Контроль
11,05±0,71
2
Экстракт молочая Палласа 1 мл/кг
10,34±0,58
3
Андрокур 150 мг/кг
2,38±0,64
4
Андрокур 150 мг/кг + Экстракт молочая Палласа 1 мл/кг
5,85±0,17**
5
Проскар 1 мг/кг
3,89±0,18
6
Проскар 1 мг/кг + Экстракт молочая Палласа 1 мл/кг
4,19±0,78
7
Синэстрол 40 мг/кг
3,46±0,13
8
Синэстрол 40 мг/кг + Экстракт молочая Палласа 1 мл/кг
5,18±0,13**
Примечание: * достоверные отличия (р<0,05), ** достоверные отличия (р<0,001) относительно контроля