ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЬФА-2-МИКРОГЛОБУЛИНА ФЕРТИЛЬНОСТИ (АМГФ)/ГЛИКОДЕЛИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

Полезная модель относится к биотехнологии и медицине, а именно к приспособлениям для иммуноферментного анализа и используется для диагностики состояния репродуктивной функции человека.
Альфа-2-микроглобулин фертильности (АМГФ) - гликопротеин с молекулярной массой 50-60 кДа. Второе название «гликоделин» отражает уникальное свойство белка - зависимое от пола гликозилирование и наличие различных гликоформ в зависимости от источника продукции: амниотической - гликоделин А, спермальной - гликоделин S (Seppala М., Taylor R.N., Koistinen H., Koistinen R., Milgrom E. Glycodelin: a major lipocalin protein of the reproductive axis with diverse action in cell recognition and differentiation. Endocrine Reviews. 2002. V.23. N4. P.401-430.), фолликулярной - гликоделин F (Chiu P. С., Koistinen H., Koistinen R., et al. Zona binding inhibitory factor-1 from human follicular fluid is an isoform of glycodelin. Biol. Reprod. 2003. V.69. P.365-372), кумулюсной - гликоделин С (Chiu P.C., Chung M.K., Koistinen R., et al. Cumulus oophorus-associated glycodelin-C displaces sperm bound glycodelin-A and -F and stimulates spermatozoa-zona pellucida binding. J.Biol. Chem. 2007. V.282. N.8. P.5378-5388.) Количественное определение АМГФ/гликоделина в биологичеких жидкостях может быть использовано для дифференциальной диагностики и контроля эффективности лечения нарушений репродуктивного здоровья.
Из уровня техники известны иммуноферментные тест-системы для количественного определения гликоделина в биологических жидкостях. Наиболее близким аналогом к заявляемому решению является иммуноферментная тест-система для определения гликоделина «Гликоделин (РР14) ELISA» (инструкция по применению набора реагентов «Гликоделин (РР14) ELISA» производства "Bioserv Diagnostics", Германия, ID Number DE 245754641). Она состоит из:
1. полистиролового стрипованного планшета с 96 лунками, покрытыми антителами к гликоделину;
2. набора стандартных растворов гликоделина с концентрацией 3, 6, 25, 50,100 нг/мл;
3. стандарта 0/раствора для разведения;
4. раствора ферментного конъюгата, представляющего моноклональные антигликоделиновые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена;
5. субстратный набор тетраметилбензидина (ТМБ);
6. стоп-раствора (2М НСl).
Данная тест-система позволяет количественно определять гликоделин в сыворотке крови, семенной жидкости, амниотической жидкости и менструальных выделениях.
Недостатками ближайшего аналога явяляются неспособность определять гликоделин в фолликулярной жидкости.
Определение АМГФ/гликоделина в фолликулярной жидкости необходимо для оценки качества яйцеклеток перед проведением экстракорпорального оплодотворения, что позволило бы в значительной мере повысить эффективность этого способа лечения бесплодия.
Задачей полезной модели является создание иммуноферментной тест-системы, способной количественно определять гликоделин одномоментно во всех вышеперечисленных биологических жидкостях, включая фолликулярную жидкость.
Задача решается использованием двух типов высокоспецифичных моноклональных антител: против АМГФ/гликоделина, реагирующих с различными гликоформами белка, продуцируемых штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L. (патент РФ №2360966) и против разных изоформ АМГФ/гликоделина, продуцируемых штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L. (патент РФ №2355762).
В качестве первичных антител, адсорбируемых на лунках планшета, использовались моноклональные антитела, реагирующие с различными гликоформами гликоделина, содержащегося в амниотической жидкости, сыворотки крови, семенной жидкости и фолликулярной жидкости, а в качестве детектирующих антител - высокочувствительные моноклональные антитела.
Данная тест-система включает:
1. 96-луночный полистироловый планшет с иммобилизованными на дне лунок монолональными антителами к различным изоформам гликоделина, содержащимся в амниотической жидкости, сыворотке крови, семенной жидкости и фолликулярной жидкости;
2. флаконы с лиофилизированными стандартами АМГФ/гликоделина для получения растворов с концентрацией 0 нг/мл, 1 нг/мл, 3 нг/мл, 6 нг/мл, 12 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл и 100 нг/мл;
3. флакон с буферным раствором для разведения (0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина, 0,025% раствор Tween-20 на фосфатно-солевом буфере, рН 7,4.);
4. флакон с концентрированным конъгатом моноклональных антител к различным изоформам антигена с пероксидазой хрена.;
5. флакон субстратного буферного раствора (100 мМ цитратный буфер, рН 4,5, с добавлением 0,001% перекиси водорода);
6. флакон с раствором хромогена (тетраметилбензидина);
7. флакон со стоп-реагентом (1Н серная кислота).
Определение концентрации АМГФ/гликоделина в биологических жидкостях с помощью с использованием данной тест-системы производится следующим образом.
Подготовка образцов для анализа. Анализируемые образцы разводятся буферным раствором для разведения в следующем соотношении: сыворотка крови небеременных женщин 1:5, сыворотка крови беременных 1:50, менструальная кровь 1:500, сперма 1:2000, амниотическая жидкость 1:500, фолликулярная жидкость 1:2.
Приготовление стандартов. Во флаконы с соответствующими стандартами вносится по 0,5 мл буферного раствора для разведения.
Приготовление конъюгата. Концентрат конъюгата разводят буферным раствором для разведения в соотношении 1:1000.
Постановка анализа. В лунки планшета последовательно вносится по 100 мкл растворов стандартов и исследуемых образцов в дублях. Планшет накрывается крышкой и инкубируется при комнатной температуре в течение часа на шейкере со скоростью 700 встряхиваний/мин. Затем жидкость из планшета удаляется декантированием, и лунки планшета промываются от несвязавшихся компонентов дистиллированной воды. Вода удаляется из лунок декантированием планшета и постукиванием перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге. Процедура промывки повторяется еще 4 раза. Затем в лунки вносится по 100 мкл разведенного конъюгата. Планшет инкубируется в течение одного часа при комнатной температуре на шейкере со скоростью 700 встряхиваний/мин, затем промывается 5 раз вышеописанным способом. В чистой стеклянной посуде смешивается раствор хромогена и субстратный буферный раствор в соотношении 1:4. В лунки вносится по 100 мкл полученной смеси. Планшет инкубируется в темноте в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем реакция останавливается внесением в лунки по 50 мкл стоп-реагента. Оптическая плотность регистрируется с помощью многоканального спектрофотометра при длине волны 450 нм. По полученным значениям средней оптической плотности каждого из стандартов строится калибровочная кривая. По оси абсцисс откладывается оптическая плотность, по оси ординат - концентрация АМГФ/гликоделина в нг/мл. Расчет концентрации исследуемых образцов биологических жидкостей производится путем вычисления среднего значения оптической плотности каждого образца, нахождения полученного значения на калибровочной кривой и соответствующего ему значению концентрации на оси ординат. Полученное значение концентрации АМГФ/гликоделина в исследуемой жидкости умножается на фактор разведения. Общая продолжительность анализа - 3,5 часа.
При оценке параметров полученной тест-системы установлены:
1. Воспроизводимость стандартной кривой. Средняя концентрация пробы, определяемая на середине участка калибровочной кривой, соответствовала истинной концентрации АМГФ/гликоделина с коэффициентом вариации 8%.
2. Контроль надежности. Коэффициент вариации теста на открытие (соответствие измеренной с помощью тест-системы аналита предписанной концентрации) составлял 10%, теста на парралеллизм разведенных образцов - 9%.
3. Внутривидовой коэффициент вариации контрольной сыворотки крови с низким, средним и высоким содержанием АМГФ/гликоделина представлен в табл.1.
Табл.1.
образец
Кол-во повторов
Концентрация, нг/мл
Стандартное отклонение, нг/мл
Коэффициент вариации, %
1
20
91,2
8,4
9,2
2
20
423,8
29,6
6,9
3
20
803,3
44,2
5,5
4. Специфичность. Перекрестных реакций с α-фетопротеином, плацентарным α1-микроглобулином, С-реактивным белком, сывороточным альбумином человека, трофобластическим β1-глобулином, фолликулостимулирующим и лютеинизирующим гормонами, хорионическим гонадотропином.
5. Чувствительность тест-системы- 1 нг/мл.
Пример использования. Всего данной тест-системой было проанализировано 329 образцов различных биологических жидкостей. Результаты количественного определения АМГФ/гликоделина представлены в табл.2.
Табл.2.
Исследуемая биологическая жидкость
Количество проанализированных образцов
Полученные значения концентрации АМГФ/гликоделина
Семенная жидкость
200
4-400 мкг/мл
Амниотическая жидкость
25
3-54 мкг/мл
Сыворотка крови женщин
25
90-840 нг/мл
Фолликулярная жидкость
79
1-14 нг/мл
Технический уровень достигается путем расширения диапазона анализируемых биологических жидкостей, содержащих АМГФ/гликоделин.