Количественная нагрузка вируса папилломы человека 16 типа и прогнозирование эффективности лечения рака шейки матки

Количественная нагрузка вируса папилломы человека 16 типа и прогнозирование эффективности лечения рака шейки матки

Киселева В.И., Крикунова Л.И., Любина Л.В., Мкртчян Л.С., Безяева Г.П.,

Панарина Л.В., Скугарев С.А., Куевда Д.А.1, Трофимова О.В.1, Саенко А.С.

ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России, Обнинск;

1 ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора России, Москва

В соскобах из цервикального канала и биоптатах опухоли 64 больных раком шейки матки (с гистологически верифицированным первичным вирусом папилломы человека 16 типа) до начала лечения методом ПЦР в режиме реального времени исследованы: количественная нагрузка, физический статус вируса и экспрессия вирусного онкогена Е7. В группе пациентов с интегрированной ДНК ВПЧ показано, что чем выше степень интеграции вируса, тем ниже его количественная нагрузка, выше экспрессия вирусного онкогена Е7 и ниже частота безре-цидивной выживаемости больных. В группе с эписомальной ДНК ВПЧ не наблюдалось корреляции вирусной нагрузки ни с экспрессией Е7 (R=-0,36, p=0,34, n=9), ни с выживаемостью больных. Предполагается, что вирусная нагрузка в опухолях с интегрированной ДНК ВПЧ 16 может косвенным образом отражать тяжесть прогноза заболевания раком шейки матки.

Ключевые слова: рак шейки матки, вирус папилломы человека, количественная нагрузка, интеграция, экспрессия, прогноз.

В настоящее время этиологическая роль вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска (ВКР) в канцерогенезе рака шейки матки (РШМ) убедительно доказана. В ряде работ показано, что персистенция вируса с высокой нагрузкой может способствовать быстрой прогрессии цитологически нормальных клеток шейки матки в диспластически измененные и далее - в опухолевые [2, 4, 8, 9, 14, 16]. Роль количественной нагрузки ВПЧ ВКР в прогнозе течения уже состоявшегося РШМ до сих пор окончательно не определена. По данным одних авторов, чем выше вирусная нагрузка, тем лучше клинический исход заболевания [5, 13]. По другим данным, вирусная нагрузка не имеет никакого значения для прогноза, значимой является только экспрессия вируса [3]. Задачей настоящего исследования явилось изучение возможной связи между количеством копий ДНК ВПЧ 16 и экспрессией вирусного онкогена Е7 у больных РШМ и значения вирусной нагрузки для прогноза данного заболевания.

Материалы и методы

Исследуемую группу составили 64 больные с гистологически верифицированным первичным ВПЧ 16-положительным раком шейки матки. Степень распространенности опухолевого процесса оценивали в ходе комплексного обследования с использованием ультразвукового метода исследования (УЗИ) с допплеровским картированием, компьютерной томографии (КТ) и магнитно-резонансной томографии (МРТ). Основным методом лечения являлась сочетанная лучевая терапия. У больных с местно-распространенными формами заболевания проводилось химиолучевое лечение, которое предусматривало проведение сочетанной лучевой терапии на

Киселева В.И.* - в.н.с., к.б.н.; Крикунова Л.И. - зав. отделением, д.м.н., проф.; Любина Л.В. - в.н.с., к.м.н.; Мкртчян Л.С. - с.н.с., к.м.н.; Безяева Г.П. - н.с.; Панарина Л.В. - н.с.; Скугарев С.А. - врач-онколог; Саенко А.С. - зам. директора по научн. работе, д.м.н., проф. ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России. Куевда Д.А. - зам. заведующего отд. по научн. работе; Трофимова О.В. - научн. сотр. ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора России.

‘Контакты: 249036, Калужская обл., Обнинск, ул. Королева, 4. Тел.: (48439) 9-72-77; e-mail: vaivki@mrrc.obninsk.ru.

фоне 3-х циклов нормодозной полихимиотерапии препаратами платины и фторурацила. Эффективность терапии оценивали по степени регрессии опухоли спустя 3 месяца после окончания курса лечения.

Наличие ДНК ВПЧ исследовали до начала лечения в соскобах эпителиальных клеток из цервикального канала и наружной поверхности шейки матки (ШМ), а также в соответствующих биоптатах опухоли. Выделение ДНК проводили сорбентным методом с применением наборов «ДНК-сорб В» - для соскобов и «ДНК-сорб С» - для биоптатов (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора России - ФГУН ЦНИИЭ). Анализ количественной нагрузки, физического статуса ДНК ВПЧ 16 и экспрессии вирусного онкогена Е7 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на «iCycler iQ» («BioRad», Германия) и «Rotor Gene» («Corbett Research», Австралия). В одной пробирке амплифицировали участки генов Е2 и Е7 вируса и гена р-глобина. Степень интеграции оценивали по соотношению количества Е7/Е2 (Е7 интегрируется, Е2 не интегрируется в геном) с помощью разработанного нами алгоритма с учетом стандартного отклонения и коэффициента вариации. Вирусную нагрузку определяли по количеству копий Е7 гена на 105 клеток. Уровень экспрессии вирусного онкогена Е7 оценивали по количеству мРНК транскриптов после обработки образцов ДНК-азой, с учетом остаточной ДНК, не подвергшейся деградации. В качестве контроля сохранности РНК одновременно проводили амплификацию участков мРНК гена домашнего хозяйства GapdH. Полученные значения РНК ВПЧ 16 нормализовали на 105 клеток.

Статистический анализ результатов проводили в соответствии с критериями Фишера и Спирмана.

Результаты и обсуждение

Из 64 больных интегрированная форма ДНК ВПЧ 16 обнаружена у 21 пациентки (31,8 %), из них в 10 случаях обнаружена 100 % интеграция и в 11 - частичная. У 45 пациенток (68,2 %) ДНК ВПЧ 16 выявлена в эписомальной форме. Эта группа объединяет больных как с чисто эпи-сомальной ДНК вируса, так и с очень низкой степенью ее интеграции, которая находится за пределами чувствительности метода оценки физического статуса ВПЧ. По клинико-морфологическим характеристикам опухоли с интегрированной и эписомальной ДНК ВПЧ распределяются примерно в одинаковых пропорциях (таблица 1).

Таблица 1

Клинико-морфологические характеристики опухолей

Характеристики опухолей и стадия Физический статус ДНК ВПЧ 16

заболевания Интегрированная форма Эписомальная форма

Морфология РШМ n = 21 n = 43

Ороговевающий + in situ 5

Неороговевающий 16

Аденокарцинома - 2

Стадия заболевания

0 - 2

I 5

II 7

III 7

IV 2

Исследуемые опухоли по критерию вирусной нагрузки распределились следующим образом: высокая (количество копий ДНК ВПЧ на 100 тыс. клеток равно или выше 5 1д) - 39 случаев, низкая - (1д копий ДНК ВПЧ/100 тыс. клеток < 5) - 25 случаев. Информация о состоянии больных спустя 2 и 3 года после курса терапии получена в 61 и 50 % случаев соответственно. Анализ отдаленных результатов показал выраженную тенденцию более высокой частоты рецидивов заболевания и смертности в группе с условно низким содержанием вируса (таблица 2). Когда аналогичный анализ провели раздельно по группам с интегрированной ДНК вируса (степень интеграции от 25 до 100 %) и эписомальной, оказалось, что в 1-ой группе частота безрецидив-ной выживаемости больных обратно коррелирует с вирусной нагрузкой (р=0,03 и р=0,05 спустя 2 и 3 года после лечения) и со степенью интеграции вируса в клетку (р=0,09 и р=0,02 соответственно). Кроме того, в этой группе выявлена четкая обратная корреляция вирусной нагрузки со степенью интеграции ДНК вируса (Я=-0,73; р=0,001; п=16), прямая корреляция степени интеграции ДНК с экспрессией вирусного гена Е7 (Я=0,7; р=0,02; п=9) и тенденция обратной корреляции вирусной нагрузки с экспрессией гена Е7 (Я=-0,6; р=0,07; п=10). Т.е., чем выше степень интеграции вируса, тем ниже его количественная нагрузка и тем выше экспрессия вирусного онкогена Е7 и хуже прогноз РШМ. Важно отметить, что выявленные корреляции не зависят от морфологических характеристик и стадий опухолей. В группе с эписомальной ДНК ВПЧ 16 не наблюдалось ни прямой, ни обратной корреляции вирусной нагрузки ни с экспрессией Е7 (Я=-0,36, р=0,34, п=9), ни с выживаемостью больных.

Таблица 2

Сравнение отдаленных результатов лечения больных РШМ с ВПЧ 16 в зависимости от количественной нагрузки и физического статуса вируса

Физический статус и 1д копий Е7 ВПЧ 16 на 105 клеток 2 года после лечения 3 го да после лечения

ремиссия прогрессирование + умерли Р ремиссия прогрессирование + умерли Р

Интегрированная + эписомальная формы >5 <5 19

Интеграция

Интеграция 25-80 % 80-100 % 6

Эписомальная форма >5 <5 14 (77,8 %) 4 (21,2 %) 0,56 6 (85,7 %) 4 (14,3 %) 4 ю 0, )) %% 00 о <5 <5 (3 (2 41 )) %% о (6 (8 94

Таким образом, в соответствии с полученными результатами можно полагать, что ответ РШМ на противоопухолевую терапию, по-видимому, непосредственно не связан с количественной нагрузкой ВПЧ 16, на исход заболевания, скорее всего, влияет физический статус вируса.

Известно, что высокая степень интеграции обусловливает повышенную стабильность вирусных транскриптов [6], усиливает экспрессию вирусных онкогенов Е6/Е7 [13] и может служить фактором плохого прогноза эффективности лечения РШМ [7, 10-12, 15]. Причиной выявленной статистически значимой обратной корреляции выживаемости больных с вирусной нагрузкой в группе с интегрированной ДНК ВПЧ, возможно, является утрата вирусом способности к репродукции в процессе интеграции его в клетку [1]. Тем не менее, выявленные корреляции позволяют считать, что вирусная нагрузка в опухолях с интегрированной ДНК ВПЧ 16 может косвенным образом отражать тяжесть прогноза заболевания.

Обнаруженные в литературе противоречивые сведения относительно роли количественной нагрузки ВПЧ ВКР в прогнозе эффективности противоопухолевой терапии и исхода заболевания РШМ, возможно, связаны с тем, что, как правило, анализ проводился в группах, объединяющих опухоли, ассоциированные и с эписомальной, и с интегрированной формой вируса. В этом случае результаты могут зависеть от того, какую долю в группе составляют опухоли с интегрированной ДНК ВПЧ.

Настоящее исследование поддержано Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках Государственного контракта № 16.512.11.2096 «Разработка метода диагностики гиперпролиферативных заболеваний органов женской репродуктивной системы на основе интеграции молекулярно-генетических и клинико-радиологических методов».

Литература

1. Киселев В.И., Ашрафян Л.А., Бударина С.О. и др. Этиологическая роль вируса папилломы человека в развитии рака шейки матки: генетические и патогенетические механизмы, возможности терапии и профилактики //Гинекология. 2004. Т. 6, № 4. С. 174-180.

2. Куевда Д.А., Ермакова Н.В., Шипулина О.Ю. и др. Высокая вирусная нагрузка и интеграция ВПЧ в геном человека как молекулярные маркеры диспластических изменений шейки матки //Молекулярная диагностика - 2007: сб. трудов 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Москва, 2007. Т. 3. С. 130-132.

3. de Boer M.A., Jordanova E.S., Kenter G.G. et al. High Human Papillomavirus Oncogene mRNA and Not Viral DNA Load Is Associated with Poor Prognosis in Cervical Cancer Patients //Clin. Cancer Res. 2007. V. 13, N 1. P. 132-138.

4. Cricca M., Morselli-Labate A.M., Venturoli S. et al. Viral DNA load, physical ststus and E2/E6 ratio as markers to grade HPV 16 positive women for high-grade cervical lesions //Gynecol. Oncol. 2007. V. 106, N 3. P. 549-557.

5. Datta N.R., Kumar P., Singh S. et al. Does preteatment human papillomavirus (HPV) titers predict radiation response and survival outcomes in cancer cervix? - a pilot study //Gynecol. Oncol. 2006. V. 103, N 1. P. 100-105.

6. Jeon S., Lambert P.F. Integration of human papillomavirus type16 into the human genome leads to increased stability of E6 and E7 mRNAs: implication for cervical carcinogenesis //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92, N 5. P. 1654-1658.

7. Josefsson A.M., Magnusson N., Ylitalo N. et al. Viral load of human papillomavirus 16 as a determinant for development of cervical carcinoma in situ: a nested case-control study //Lancet. 2000. V. 355, N 9222. P. 2189-2193.

8. Koshiol J., Lindsay L., Pimenta J. et al. Persistent Human Papillomavirus Infection and Cervical Neoplasia: A Systematic Review and Meta-Analysis //Am. J. Epidemiol. 2008. V. 168, N 2. P. 123-137.

9. Kulmala S.-M. A., Syrjanen S.M., Gyllensten U.B. et al. Early integration of high copy HPV 16 detectable in women with normal and low grade cervical cytology and histolofy //J. Clin. Pathol. 2006. V. 59. P. 513-517.

10. Lindel K., Burri P., Studer H.U. et al. Human papillomavirus status in advanced cervical cancer: predictive and prognostic significance for curative radiation treatment //Int. J. Gynecol. Cancer. 2005. V. 15. P. 278-284.

11. Lindel K., de Villiers E.M., Burri P. et al. Impact of viral E2-gene status on outcome after radiotheraphy for patients with human papillomavirus 16-positive cancer of the uterine cervix //Int. J. Radat. Oncol. Biol. Phys. 2006. V. 65, N 3. P. 760-765.

12. Nambaru L., Meenakumari B., Swaminathan R. et al. Prognostic significance of HPV physical satus and integration sites in cervical cancer //Asian. Pac. J. Cancer Prev. 2009. V. 10, N 3. P. 355-360.

13. Rosty C., Sheffer M., Tsafrir D. et al. Identification of a proliferation gene cluster associated with HPV E6/E7 expression level and viral DNA load in invasive cervical carcinoma //Oncogene. 2005. V. 27, Issue 47. P. 7094-7104.

14. Spartz H., Lehr E., Zhang B. et al. Progression from productive infection to integration and oncogenic transformation in human papillomavirus type 59-immortalized foreskin keratinocytes //Virology. 2005. V. 336, N 1. P. 11-25.

15. Unger E.R., Vernon S.D., Thoms W.W. et al. Human papillomavirus and disease-free survival in FIGO stage 1b cervical cancer //J. Infect. Dis. 1995. V. 172, N 5. P. 1184-1190.

16. Wang S., Hildesheim A. Chapter 5: Viral and Host in Human Papillomavirus Persistence and Progression //J. National Cancer Institute. Monographs. 2003. N. 31. P. 35-40.

Quantitative human papillomavirus type 16 viral load and prognosis of cervical cancer treatment efficiency

Kiseleva V.I., Krikunova L.I., Lyubina L.V., Mkrtchyan L.S., Bezyaeva G.P., Panarina L.V., Skugarev S.A., Kuevda D.A.1, Trofimova O.B.1, Saenko A.S.

Medical Radiological Research Center of the Russian Ministry of Health and Social Development, Obninsk;

1 Federal State Center of Science Central Research Institute of Epidemiology, Moscow

The quantitative load, physical status of human papillomavirus (HPV) 16 and viral oncogene E7 expression were examined by real time polymerase chain reaction in endoservical scrapings and biopsy material taken in 64 patients with histologically verified primary HPV 16-positive cervical cancer of stages I-IV prior to treatment. It was shown that in patients with integrated HPV DNA, the higher the degree of integration of the virus, the lower the quantitative load and the higher expression of the viral oncogene E7 and worse prognosis of cervical cancer. No correlation between viral load and expression of E7 (R = -0.36, p = 0.34, n = 9) or the survival of patients was observed in the group with episomal HPV DNA. It is expected that the viral load in tumors with integrated HPV 16 DNA may indirectly reflect the prognosis of the disease severity.

Key words: cervical cancer, human papilloma virus, quantitative load, integration, expression, prognosis.

Kiseleva V.I.* - Lead. Res., C. Sc., Biol; Krikunova L.I. - Head of Dep., MD, Prof.; Lyubina L.V. - Lead. Res., C. Sc., Med.; Mkrtchyan L.S. -Sen. Res., C. Sc., Med.; Bezyaeva G.P. - Researcher; Panarina L.V. - Researcher; Skugarev S.A. - Physician; Saenko A.S. - Deputy Director, MD, Prof. MRRC. Kuevda D.A. - Deputy Head of Dep., Trofimova O.B. - Researcher. Central Research Institute of Epidemiology.

‘Contacts: 4 Korolyov str., Obninsk, Kaluga Region, Russia, 249036. Tel: (48439) 9-72-77; e-mail: vaivki@mrrc.obninsk.ru.