Определение внеклеточных ДНК крови клиническое и диагностическое значение

Ю.А. КОВАЛЕВА, А.А. ХАСАНОВ, Л.М. СИНГАТУЛЛИНА

Казанский государственный медицинский университет Казанский государственный университет

Определение внеклеточных ДНК крови — клиническое и диагностическое значение

I Ковалева Юлия Анатольевна

врач акушер-гинеколог акушерского физиологического отделения Клиники медицинского университета 420097, г. Казань, ул. Зинина, д. 5, кв. 14, тел.: 8-905-020-18-88, e-mail: julia201@mail.ru

Авторы представили обзор литературы, касающийся определения внеклеточных ДНК в крови. Показана их прогностическая и диагностическая значимость при различных патологических состояниях. Особое значение имеет определение внеклеточных ДНК в перинатальной патологии.

Ключевые слова: внеклеточные ДНК, механизмы, диагностическое значение.

YA KOVALEV^ A.A. KHASANOV, L.M. SINGATULLINA

Kazan State Medical University Kazan State University

Determination of extracellular DNA in the blood — clinical and diagnostic value

The authors present a literature review concerning the definition of extracellular DNA in the blood. It is shown their predictive and diagnostic value in various pathological conditions. Particular importance is the definition of extracellular DNA in perinatal pathology. Keywords: extracellular DNA, mechanisms, diagnostic value.

До определенного времени считалось, что ДНК находится только в клеточных структурах: преимущественно в ядрах клеток и некоторое количество — в митохондриях, где она исполняет роль носителя генетической информации. К настоящему времени уже установлено, что небольшие количества ДНК обнаруживаются и вне клеток, прежде всего в плазме крови животных и человека. Интерес к внеклеточным ДНК неизмеримо возрос после того, как выяснилось, что количество ее может существенно возрастать при ряде заболеваний, что возможно учитывать как ранний признак соответствующих патологий. Это придало совершенно четкое практическое значение дальнейшему изучению циркулирующих нуклеиновых кислот.

Циркулирующая ДНК может появляться в кровотоке в результате гибели ядросодержащих клеточных элементов, созревания эритроцитов и тромбоцитов, а также активной секреции нуклеиновых кислот во внеклеточное пространство.

Кроме того, при развитии инфекционных заболеваний в крови пациентов обнаруживаются нуклеиновые кислоты возбудителей. Уровень экзогенной ДНК в кровообращении больных, как правило, не превышает нескольких десятков пкг/мл, что слишком мало по сравнению с приводимыми в литературе данными для нормального содержания внеклеточной ДНК (до 60 нг/мл) [1]. При беременности уже на первом месяце в кровотоке матери появляется фетальная ДНК [2], обнаружение которой открывает новые возможности для неинвазивной пренатальной диагностики.

Одним из известных механизмов появления внДНК в кровотоке может быть процесс образования и созревания пост-клеточных структур крови — тромбоцитов и эритроцитов. В кровотоке эритроциты функционируют в течение всего периода своей жизни (100-120 суток), а затем разрушаются макрофагами селезенки, печени и красного костного мозга.

В процессе созревания эритроцита, когда клетка находится в составе эритробластного островка или мигрирует через стенку кровеносных сосудов костного мозга в кровоток, происходит выталкивание ядра. За счет ежедневного обновления эритроцитов в составе ядер в кровь попадает значительное количество ДНК, которая в основной массе быстро фагоцитируется макрофагами стромы, но часть ДНК может оставаться циркулировать в кровотоке. Менее представлены в крови тромбоциты — безъядерные постклеточные структуры, образующиеся в результате фрагментации участков цитоплазмы мегакариоцитов. Тромбоциты циркулируют в крови в течение 5-10 суток, после чего фагоцитируются макрофагами, преимущественно в селезенке и легких.

Одним из простых объяснений появления внеклеточных нуклеиновых кислот в крови могут быть постоянно идущие в организме процессы отмирания клеток и деградации их хроматина. Таким образом, в первую очередь источником внеклеточной ДНК крови может быть некроз [3] или апоптоз ядросодержащих клеточных элементов крови или эндотелиальных клеток [4]. Апоптоз — наиболее широко представленная форма программируемой клеточной смерти, которая приводит к ежедневной гибели части клеток. Примерный подсчет показывает, что в организме человека в результате апоптоза деградирует 1-10 г ДНК в сутки. Апоптотические клетки и апоптотические тельца поглощаются и перевариваются макрофагами, дендритными или эндотелиальными клетками [5]. Возможно, часть апоптотических телец избегает этой участи и попадает в кровь.

В норме некроз распространен значительно меньше, чем апоптоз. Некроз может индуцироваться тяжелыми необратимыми повреждениями, такими как затянувшаяся ишемия, высокие дозы ионизирующего излучения, высокая температура и обработка агентами, которые повреждают клеточную мембрану или блокируют продукцию энергии в клетке. Некроз характеризуется конденсацией хроматина, увеличением размера клетки с ее последующим лизисом. Поскольку в норме некротические клетки в основном не обнаруживаются, этот тип клеточной гибели не может обеспечивать появление значительной части ДНК в плазме, хотя он часто наблюдается при развитии опухолей, вероятно, как результат недостаточной ва-скуляризации. В то же время некроз не может рассматриваться как основной источник внеклеточной ДНК у онкологических больных, поскольку высокие концентрации циркулирующей в крови ДНК зачастую наблюдаются не только на последней стадии с обширными метастазами, но и на первом этапе развития опухоли [6]. Тем не менее в некоторых случаях, например при травме, некроз может вносить значительный вклад в генерацию циркулирующих ДНК крови. Действительно, обнаружена достоверная корреляция увеличения концентрации циркулирующей в крови ДНК в зависимости от тяжести травмы у пациентов [7].

Позднее высказано предположение, что появление ДНК в крови онкологических больных может быть связано не только с процессом апоптоза, но и с активной секрецией ДНК. По-видимому, ДНК могут появляться и циркулировать в крови как в результате формирования постклеточных структур крови и гибели клеток, так и путем секреции во внеклеточное пространство. Однако следует отметить, что механизмы, обеспечивающие активную секрецию внеклеточных ДНК, окончательно не выяснены, так же, как и вклад каждого из процессов в появление циркулирующих нуклеиновых кислот во внеклеточной среде.

Авторы предполагают, что короткий срок циркуляции олигонуклеотидов в крови может быть связан не только с разрушающим действием сывороточных нуклеаз, но и с быстрым

выведением олигомеров из циркуляции и перераспределением по органам и тканям. Отмечается двухступенчатый характер выведения олигонуклеотидов из кровеносного русла [8]. Первый этап характеризуется высокой скоростью снижения концентрации в крови олигонуклеотидов со временем полужизни менее 30 минут. Второй этап — это длительная циркуляция в крови олигомера в низкой концентрации, со временем полужизни 20-40 часов. Современные данные о длительности циркуляции внеклеточной ДНК полностью их подтверждают: время полужизни фетальной ДНК в кровотоке родившей женщины составляет 16 минут, а полное ее выведение достигается за 2 часа [9].

Исследования фармакокинетики олигонуклеотидов показали, что за первые сутки с мочой выводится около 30% введенного материала. Действительно, недавно обнаружены опухолеспецифические нуклеиновые кислоты не только в крови, но и в моче больных с новообразованиями, локализованными вдали от мочевыводящих путей [10].

После обнаружения циркулирующей ДНК в крови человека и животных были предприняты попытки выявить корреляцию между концентрацией внеклеточной ДНК и развитием ряда патологических состояний. Для определения концентрации внеклеточной ДНК в плазме/сыворотке крови использовали разнообразные методы, в связи с чем данные о концентрации циркулирующей ДНК в норме значительно варьируют. Наиболее достоверными представляются данные последних исследований, в которых концентрацию ДНК определяли при помощи флуоресцентных красителей и количественной ПЦР Литературные данные позволяют сделать вывод, что в норме концентрация циркулирующей ДНК не должна превышать 5060 нг/мл плазмы/сыворотки, а увеличение концентрации до 100 нг/мл и выше может указывать на возможное развитие патологии [11].

Интерес к внеклеточной ДНК плазмы крови в настоящее время все более возрастает, что связано с прогностической и диагностической значимостью этого показателя при лучевом облучении, онкологических, аутоиммунных заболеваниях, неврологических расстройствах и посттравматическом синдроме. При перечисленной патологии существенно изменяются не только концентрация, но и фракционный состав внеклеточной ДНК: появление в плазме крови ее низкомолекулярных фрагментов зачастую возникает во время развития рака, инсульта, при ишемических процессах.

Доказано появление низкомолекулярной фракции ДНК в плазме крови при лучевой патологии уже через несколько часов после воздействия ионизирующих излучений, причем с прямо пропорциональной зависимостью прироста фракции от дозы воздействия и снижением при улучшении состояния больного [12]. Кроме того, отмечена диагностическая значимость концентрации циркулирующей в крови ДНК при оценке тяжести травмы. Обнаруженная достоверная корреляция уровня внеклеточной ДНК с тяжестью травмы позволяет прогнозировать возможность травматического шока и оценить степень тяжести травмы [13].

Уровень циркулирующей ДНК в крови возрастает при развитии аутоиммунной патологии [14], причем концентрация ДНК в плазме больных системной красной волчанкой, находящихся в состоянии ремиссии, не отличается от нормы, а значительное повышение концентрации циркулирующей ДНК отмечено только у пациентов с активной формой заболевания [15].

Относительно невысоким уровнем свободной ДНК в сыворотке больных характеризуются вирусные заболевания, в частности гепатиты В и С [16]. Поэтому прогностическую значимость может иметь, по-видимому, измерение уровня

ДНК в сыворотке крови больных гепатитом лишь в динамике заболевания.

Активно разрабатываются методики исследования внДНК у онкологических больных. Уровень циркулирующей ДНК возрастает также при развитии целого ряда онкологических заболеваний [17]. Некоторые исследователи предлагают использовать концентрацию циркулирующей в крови ДНК для дифференцированного диагноза доброкачественных и злокачественных опухолей желудочно-кишечного происхождения, утверждая, что при злокачественных опухолях, по сравнению с доброкачественными, концентрация ДНК значительно повышается (412 ± 63 и 118 + 14 нг/мл соответственно). Этим данным противоречат работы ряда авторов [18, 19], в которых показано, что уровень циркулирующей ДНК при развитии патологии по сравнению с нормой достоверно повышается уже на ранних стадиях заболевания, однако четкой корреляции между концентрацией ДНК в плазме крови онкологических больных и клиническим течением заболевания не прослеживается. Корреляции между концентрацией циркулирующей ДНК и локализацией опухоли не найдено, однако при метастазах в крови наблюдается более высокое содержание циркулирующей ДНК.

По-видимому, определение концентрации ДНК в крови может быть использовано для мониторинга эффективности хирургического лечения [18] и/или радио- [20], химио- или гормонотерапии. При этом наибольший интерес вызывает именно динамика изменения уровня циркулирующих нуклеиновых кислот, а не единичное значение их концентрации в крови. Возрастание концентрации циркулирующих ДНК позволяет сделать заключение о прогрессировании заболевания, в частности о появлении метастазов.

Для повышения диагностической ценности были предприняты попытки связать концентрацию и форму циркуляции ДНК с развитием патологии. Оказалось, что концентрация циркулирующих в крови нуклеосом коррелирует с клиническим статусом пациента после химио- и радиационной терапии. Поскольку большинство лекарств, применяемых в химиотерапии, индуцируют апоптоз в опухолевых и отчасти в нормальных клетках, по содержанию нуклеосом в крови пациентов возможен мониторинг эффективности специфической терапии злокачественных образований.

Исследование распределения циркулирующей ДНК в крови больных раком молочной железы и желудочно-кишечного тракта [19] показало, что при развитии данной патологии на фоне повышения концентрации циркулирующей ДНК в плазме происходит достоверное снижение концентрации дезоксирибонуклеиновых кислот, связанных с поверхностью форменных элементов крови, по сравнению со здоровыми донорами. По-видимому, изменение распределения циркулирующей ДНК в крови онкологических больных характерно для злокачественных новообразований, и данные о концентрации циркулирующей ДНК в плазме крови и на поверхности клеток могут быть использованы для дифференциальной диагностики опухолей. При этом очевидно, что для точной постановки диагноза необходим анализ онкоспецифических последовательностей циркулирующих ДНК, а связанные с поверхностью циркулирующие ДНК могут быть использованы наряду с циркулирующей ДНК плазмы для ПЦР-диагностики рака.

Выявлено значительное увеличение концентрации внДНК у недоношенных новорожденных и у новорожденных с перинатальной патологией, описано влияние внДНК на изменения иммунного статуса новорожденных при перинатальных поражениях [21].

В 1997 году впервые было продемонстрировано присутствие фетальной внеклеточной ДНК в плазме и сыворотке

беременных женщин [22]. Данное открытие способствовало интенсивному изучению плодной ДНК в качестве потенциального маркера для неинвазивной пренатальной диагностики. Метод измерения концентрации внДНК плода в крови матери основывался на обнаружении последовательности Y-хромосомы (SRY) методом количественной ПЦР в реальном времени. Была прослежена положительная связь между сроком беременности и уровнем фетальной внДНК. Биологические основы, благодаря которым происходит увеличение концентрации внДНК матери и плода с развитием беременности, остаются неясными. К этому приводит усиление трансплацентарного транспорта нуклеиновых кислот или интенсификация про-лиферативных/апоптотических процессов в самой плаценте. Существует мнение, что повышение концентрации внеклеточной фетальной ДНК в материнской циркуляции происходит вследствие возможной редукции выведения ДНК из организма матери, причиной чего могут быть различные физиологические изменения функций органов выделения женщины в течение беременности. Доказано [23], что в плазме крови беременных женщин циркулируют более длинные молекулы ДНК, чем в плазме небеременных женщин. При этом молекулы фетальной ДНК в целом короче, чем материнской ДНК, и более фрагментированы. Предполагается, что фетальная ДНК попадает в кровь матери путем транспорта через плаценту фетальных клеток, которые быстро разрушаются иммунной системой матери и в результате лизиса клеток плаценты и прямого выброса ДНК плода в кровь матери [24]. Фетальная ДНК обнаруживается уже на первых неделях развития плода (у 80% беременных женщин она обнаруживается на 28й день после зачатия). Эти данные свидетельствуют в пользу того, что фетальная ДНК появляется в крови матери раньше времени формирования системы кровообращения плода. В настоящее время многие работы подтверждают, что источником внДНК плода в материнском кровотоке являются клетки трофобласта.

Одни из первых работ, посвященных изучению фетальной внДНК в крови матери как маркера для неинвазивной пренатальной диагностики были направлены на обнаружение последовательностей Y-хромосомы как маркера плода мужского пола в крови беременных женщин с целью дородовой диагностики заболеваний, сцепленных с полом [25]. Было показано, что чувствительность определения локусов Y-хромосомы до 7-й недели беременности методом обычной ПЦР составляет 95%, а при использовании ПЦР в реальном времени пол эмбриона со 100% точностью можно определить уже на 5-й неделе развития.

Проведены работы по выявлению резус-антигена Rh-D плода в крови резус-негативных женщин [26], что позволяет сформировать группу риска и как можно раньше начать мероприятия, направленные на предотвращение резус-конфликта между матерью и плодом.

Одной из важных функций пренатальной диагностики является своевременное определение у плода хромосомных заболеваний [27]. Показано, что уровень фетальной ДНК в плазме и сыворотке матери, при вынашивании плода с синдромом Дауна, повышается в среднем в 2 раза. Изменяется уровень внДНК при других анеуплодиях — повышается в случае три-сомии по хромосоме 13, и остается низким при трисомии 18. Предполагается, что возможной причиной изменения концентрации внДНК при развитии плода с аномальным кариотипом является патология плаценты (ворсины с неправильной структурой могут быть либо гипер- либо гиповаскуляризированы, что усиливает или ослабляет выход клеток и нуклеиновых кислот плода в материнский кровоток). Помимо измерения концентрации внДНК плода в крови матери в настоящее время исследуются новые молекулярные маркеры для обнаружения

хромосомного дисбаланса у плода, а также выполнены успешные эксперименты по выявлению у плода однонуклеотидных полиморфизмов и точковых мутаций.

Еще в 1999 году было обнаружено почти 5-кратное повышение внДНК плода в кровотоке матери при преэклампсии по сравнению с группой женщин с нормально протекающей беременностью [28]. При дальнейшем изучении этой патологии выявлены не только рост концентрации внДНК плода, но и значительное повышение внДНК матери, причем увеличение обоих показателей соответствовало степени тяжести заболевания. Кроме того, было показано, что концентрация внДНК плода возрастает задолго до появления первых клинических симптомов. Так как ДНК плазмы является маркером клеточной гибели, повышенная концентрация фетальной ДНК может быть результатом некроза и апоптоза клеток плаценты. А нарушение функции почек и печени, наблюдаемое при преэклампсии, ослабляет выведение циркулирующей ДНК из материнской крови.

Увеличение концентрации фетальной ДНК в крови матери описаны и при других нарушениях течения беременности, таких как начавшийся самопроизвольный выкидыш в I триместре, преждевременные роды [29], истинное приращение плаценты [30].

Современные технологии позволяют использовать новые знания в практической медицине. Дальнейшее изучение нуклеиновых кислот плода в крови матери необходимо с целью разработки новых маркеров в неинвазивной пренатальной диагностике патологических состояний плода на раннем этапе их возникновения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Hacker H J., Zhang W., Tokus M., Bock T., Schroder C.H. Patterns of circulating hepatitis В virus serum nucleic acids during lamivudine therapy. Ann. N. Y. Acad. 2004. Sci. 1022, 271-281.

2. Федченко В.И., Гурьев CO., Семенова Н.В. Неинвазивная пренатальная ПЦР диагностика пола. Биомед. химия 2005; 51: 527-535.

3. Rainer T.H., Lo Y.M., Chan L.Y.. et al. Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using plasma DNA and other variables. Ann. N.Y Acad. Sci. 2001; 945: 211-220.

4. Jahr S., Hentze H., Englisch S., et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancel Res. 2001; 61: 1659-1665

5. Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation. Exp. Cell. Res. 2000; 256: 12-28.

6. Laktionov P.P. Tamkovich S.N., Rykova E.Yu.. et al. Extracellular circulating nucleic acids in human plasma in health and disease. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004; 23: 879-883.

7. Lam N.Y.. RainerT.H., Chan L.Y.. Joynt G.M.. Lo YM.

Time course of early and late changes in plasma DNA in trauma patients. Clin. Chem. 2003; 49: 1286-1291.

8. ShawJ.P., Kent K., Bird J., Fishback J., Froehler B. Modified deoxyoligonucleotides stable lo exsonuclease degradation in serum. Nucleic Acids Res. 1991; 19: 747-750

9. Lo Y.M., Zhang J., Leung T.M.et al. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am. J. Hum. Genet. 1999; 64: 218-224.

10. Bryzgunova O.E., Skvortsova Т.Е., Kolesnikova E.V. et al. Isolation and comparative study of cell-free nucleic acids from human urine. Ann. N. Y Acad. Sci. 2006; 1075: 334-340.

11. Тамкович С.Н., Власов В.В., Лактионов П.П. Циркулирующие ДНК крови и их использование в медицинской диагностике. Молекулярная биология 2008; 42: 1: 12-23.

12. Vasilyeva I.N. Low-molecular-weight DNA in blood plasma as an index of the influence of ionizing radiation. Ann. N. Y Acad Sci. 2001; 945: 221-228.

13.Lam NY., Rainer Т.Н.. Chan L. Y., Joynt G.M., Lo YM. Time course of early and late changes in plasma DNA in trauma patients. Clin. Chem. 2003; 49: 1286-1291.

14. Steinman C.R. Circulating DNA in systemic lupus erythematosus. Association with central nervous system involvement and systemic vasculitis. 1979. Am.1. Med. 67. 429-435.

15. RaptisL.. Menard H. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. .1. Clin. Invest. 1980; 66: 1391-1399.

16. Шевчук Н.А. Время-разрешенный иммуно-флюоресцентный анализ на ДНК и исследование содержания ДНК в сыворотке человека. Вопр. мед. Химии 2001; 47: 439-448.

17. Anker P., Mulcahy H., Stroun M. Circulating nucleic acids in plasma and serum as a noninvasive investigation for cancer: time for large-scale clinical studies? Int. I. Cancer. 2003; 103: 149-152.

18. Sozzi G., Conte D., Mariani L.. et al. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients. Cancer Res. 2001; 61: 4675-4678.

19.Тамкович С.Н., Брызгунова О.Е., Рыкова Е.Ю.. и др. Циркулирующие нуклеиновые кислоты в крови больных раком желудка и толстой кишки. Биомед. химия 2005; 51: 321-328.

20. Lo Y M. Leung S.F., Chan L.Y. et al. Kinetics of plasma Epstein-Barr virus DNA during radiation therapy for nasopharynceal carcinoma. Cancer Res. 2000; 60: 2351-2355

21. Туаева Н.О. Внеклеточная ДНК и ее участие в иммунном ответе у новорожденных детей: автореферат дисс. ... канд. биол. Наук. Казань, 2007. 22. Lo YM.D., Corbetta N., Chamberlain P.F. et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997; 350: 485-487.

23. Chan K.C.A., Zhang J. et all. Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma. Clin. Chem. 2004; 50: 88-92.

24. Токарева А.Г, Лебедев И.Н. и др. Внеклеточные нуклеиновые кислоты плода в крови матери: характеристика, происхождение, значение для пренатальной диагностики. Медицинская генетика 2006; 5: 8(50).

25. Farina A., Caramelli E., Concu M. et al. Testing normality of fetal DNA concentration in maternal plasma at 10-12 completed weeks gestation: a preliminary approach to a new marker for genetic screening. Prenat. Diagn. 2002; 22: 148-152.

26. Li Y., Zimmerman B., Zhong X.Y., et al. Determination of RhD zygosity using real-time guantitative PCR. Swiss Med. Wkly. 2003; 133: 442-445.

27. Gahan P., Swaminathan R. et al. Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum V.-2008. Annals of the New York Academy of sciences. 345

28. Lo Y.M.D., Leung T.N., Tein M.S.C. et al. Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum in preeclampsia. Clin. Cem. 1999; 45: 184-188.

29. Farina A., Leshane E. S., Romero R. et al. High levels of fetal cell-free DNA in maternal serum: a risk factor for spontaneous preterm delivery. Am. J. Obstet.Gynecol. 2005; 193: 421-425.

30. Sekizawa A., Jimbo M., Saito H. et al. Increased cell-free fetal DNA in plasma of two women with invasive placenta. Clin. Chem. 2002; 48: 353-354.