Контроль продуктов жарки масла подсолнечного рафинированного дезодорированного методом подсчета доминантных летальных мутаций

ХИМИЯ

Вестн. Ом. ун-та. 2012. № 2. С. 115-118.

УДК 665.347.8:578.542:001.89 И.В. Батлуцкая, К.А. Тарасова

КОНТРОЛЬ ПРОДУКТОВ ЖАРКИ МАСЛА ПОДСОЛНЕЧНОГО РАФИНИРОВАННОГО ДЕЗОДОРИРОВАННОГО МЕТОДОМ ПОДСЧЕТА ДОМИНАНТНЫХ ЛЕТАЛЬНЫХ МУТАЦИЙ

Разработан алгоритм эксперимента по генетическому анализу с использованием дрозофилы для биологического контроля продуктов жарки масла подсолнечного рафинированного дезодорированного.

Ключевые слова: масло, генетический анализ, биологический контроль.

1. История вопроса

Характерной чертой современной науки является создание новых методов на стыках ее смежных областей. Примером служит развитие биологических методов анализа, базирующихся на достижениях таких областей биологии, как микробиология, генетика, зоология, ботаника, а также аналитической химии.

Биологический контроль - это вид анализа, в основе которого лежат биологические методы оценки. Они основаны на том, что для жизнедеятельности живых организмов необходима среда строго определенного химического состава. При изменении этого состава организм подает соответствующий ответный сигнал. Установление связи характера или интенсивности ответного сигнала организма (называемого индикаторным) с количеством введенного в среду или исключенного из нее компонента служит для его обнаружения или определения.

Все вещества по отношению к живым организмам можно условно разделить на жизненно необходимые, токсичные и физиологически неактивные. Очевидно, только в двух первых случаях можно ожидать сравнительно быструю ответную реакцию организма (аналитический сигнал).

В настоящее время синтезировано огромное количество веществ, с которыми может контактировать человек и многие из которых могут быть токсичными и обладать канцерогенными свойствами. Химический канцерогенез обусловлен воздействием на организм химических факторов. Химические канцерогены в настоящее время представляют собой обширную группу широко варьирующих по структуре органических и неорганических соединений с видовой и тканевой избирательностью [1].

Практически все химические канцерогены сами по себе не являются канцерогенными. С этой точки зрения их рассматривают как преканце-рогены, которые в организме человека или животных подвергаются метаболическим превращениям, после чего активируются и становятся реактивными структурами [2]. Форма химического вещества, в итоге реагирующая с макромолекулами клетки (конечный канцероген), должна содержать реактивный электрофильный атом, который может взаимодействовать со многими нуклеофильными центрами в полинуклеотидах и белках [3].

Особое значение в осуществлении канцерогенного эффекта химических соединений придается реакции конечных канцерогенов с нуклеиновыми кислотами. Это объясняется прежде всего тем, что нуклеиновые кислоты представляют основу генетического материала клетки, и всякие нарушения в структуре последнего должны повлечь за собой те или иные наследственные изменения.

© И.В. Батлуцкая, К.А. Тарасова, 2012

Большинство канцерогенов разных классов образуют in vivo комплексы с нуклеиновыми кислотами. Чаще всего они взаимодействуют с атомом азота гуанина в седьмом положении. Однако следует отметить, что атомы углерода и кислорода гуанина, находящиеся в 1, 3 и 7-м положениях, и цитозина в 3-м положении могут быть также местами присоединения канцерогенов.

Помимо непосредственного действия канцерогенов на молекулы-мишени, возможен еще один механизм их повреждения -это активация образования свободных радикалов в клетках организма. Свободные радикалы повреждают хроматин, ДНК, мембраны, изменяют регуляцию внутриклеточного кальция. Свободные радикалы могут также проявлять мутагенные свойства, связанные с нарушением структуры молекул ДНК и рибосомной РНК [4].

Особое внимание уделяется исследованию процессов репарации ДНК - устранению вызванных канцерогенами нарушений в структуре ДНК. В результате репарации ДНК происходят элиминация и замена измененных нуклеотидов путем ресинтеза удаленных участков и присоединения вновь синтезированных нуклеотидных последовательностей к ДНК. Восстановление ДНК обеспечивается сложным ферментным аппаратом. Репарация ДНК, если она полноценна, может в значительной степени лимитировать канцерогенез [5].

Обобщенным показателем эффективности действия определяемого соединения на индикаторный организм является либо выживаемость, либо летальный исход. В роли индикаторных организмов могут выступать микроорганизмы, беспозвоночные, позвоночные. В настоящее время известны некоторые исследования по воздействию химических веществ на дрозофилу. В этом плане дрозофила является довольно удобным объектом, благодаря своей чувствительности к компонентам среды и ярко выраженным ответным сигналам, поступающим на изменения её состава.

К таким сигналам можно отнести индуцированные, т. е. искусственно вызванные под влиянием разнообразных внешних агентов, мутации. Методы по учету таких мутаций впервые были разработаны Мёллером.

При изучении на дрозофиле мутагенного действия того или иного агента задача исследования сводится к обнаружению и учету летальных мутаций, возникающих под влиянием данного агента. Частоту летальных мутаций у опытных мух сравнивают с частотой летальных мутаций у контрольных. Наличие достоверных различий в частоте возникновения летальных мутаций у опытных и контрольных мух служит доказательством эффективности этого агента на возникновение данного типа наследственных изменений.

2. Описание метода

Для биологической оценки продуктов жарки масла подсолнечного рафинированного дезодорированного мы использовали мух дрозофил (Drosophila melanogaster) двух линий: линия мух дикого типа с хорошо изученным спонтанным фоном мутабильно-сти Сап1:оп-8 и мух искусственно выведенной мутированной линии Muller-5. Последние характеризуются особой структурой Х-хромосом у самок, которые включают в себя 2 инверсии - sc8 и б 49!, одна внутри другой, что приводит к запиранию кроссин-говера. Инверсия sc8 захватывает большую часть Х-хромосомы. Поскольку в длинных инверсиях перекрест все же изредка происходит, в инверсию sc8 введена другая, более короткая инверсия, б 491, которая подавляет перекрест в средней области Х-хромосо-мы. Таким образом, порядок генов в хромосоме sc8 б 491 нарушен дважды, поэтому перекрест в ней полностью исключен.

У данной линии мух нарушена система репарации ДНК, вследствие чего они отличаются пониженной жизнеспособностью [6]. В качестве исследуемого вещества использовались продукты жарки масла подсолнечного. Канцерогенную активность определяли по способности веществ индуцировать доминантные летальные мутации у дрозофилы.

Доминантные летальные мутации (ДЛМ) представляют собой генетические изменения, индуцированные в родительских зародышевых клетках и приводящие к гибели первого поколения потомков на эмбриональных стадиях развития.

Частота ДЛМ определялась по методике Белоконь как процент отложенных нераз-вившихся яиц по отношению к общему числу отложенных яиц [7].

Формула для расчета частоты доминантных летальных мутаций

A - B

N =-------100 %,

A

где N - частота доминантных летальных мутаций; А - общее количество отложенных яиц; В - количество вылетевших мух; А - В -число неразвившихся яиц.

Для проведения эксперимента в стандартную питательную среду для содержания дрозофилы мы добавляли 10 мл продуктов жарки подсолнечного масла (из расчета на 1 литр воды). На приготовленной среде были поставлены скрещивания.

Для скрещивания 15-17 самок линии Muller-5 были помещены с таким же количеством самцов в колбы с экспериментальной средой в трех повторностях. Аналогичные скрещивания были поставлены и для мух линии Сап1:оп-8.

Для контроля мы использовали мух линии Muller-5 и Сап1:оп-8, выращенных на нормальной питательной среде также в трех

Контроль продуктов жарки масла подсолнечного рафинированного дезодорированного..

117

повторениях. Все колбы с мухами содержались в одинаковых условиях (в термостате при температуре около 26°С). Далее производилась отсадка родительского поколения мух и подсчет количества отложенных яиц в каждой колбе. Через 1-3 дня после начала вылета имаго подсчитывалось количество вылетевших мух, производились расчеты частоты доминантных летальных мутаций.

Полученные данные обрабатывали статистически. Достоверность различий между контролем и опытом определялась по критерию Стьюдента.

3. Полученные результаты

В табл. 1 представлены сроки цикла развития мух линий Оап1оп-8 и Muller-5. Так, цикл развития мух линии Muller-5 на экспериментальной среде более растянут по сравнению с циклом линии Canton-S и составил от стадии яйца до стадии взрослого имаго 16 дней. У мух нормальной линии он равен 11 дней. На контрольной среде при тех же условиях циклы развития обеих линий приближены к норме и составляют 10 дней у нормальной линии и 12 дней у линии Muller-5.

Таблица 1

Сроки цикла развития мух линий Muller-5 и Са^оп-Б

Стадия Опытная среда Контрольная среда

Muller-5 Сапїоп-S Muller-5 Сапїоп-S

Яйцо 5-е сут. 2-е сут. 2-е сут. 2-е сут.

Личинка 7-е сут. 3-е сут. 3-е сут. 3-е сут.

Куколка 12-е сут. 7-е сут. 7-е сут. 7-е сут.

Имаго 16-е сут. 11-е сут. 12-е сут. 10-е сут.

Отмечено также, что общее количество яиц, отложенных мухами нормальной линии и в опыте, и в контроле, больше аналогичных показателей у мух мутированной линии. Данные по общему количеству яиц, отложенных линиями Muller-5 и Оап1оп-8 в опыте и контроле, приведены в табл. 2 и на рис. 1.

Таблица 2

Общее количество яиц, отложенных линиями Muller-5 и Са^оп-Б, в опыте и контроле

Среда Количество Muller-5 1 Сапїоп-S

Номер колбы

I II III I II III

Опытная отложенных яиц 161 146 164 213 194 201

вылетевших мух 36 31 39 156 143 149

Контроль- ная отложенных яиц 175 168 179 210 221 225

вылетевших мух 134 129 135 198 209 211

с

о

Линия Drosophila melanogaster

13 Кол-во отложенных яиц

И Кол-во вылетевших мух

Кол-во отложенных яиц

Кол-во вылетевших мух

Рис. 1. Показатели подсчета общего количества яиц, отложенных линиями Muller-5 и Cаntоn-S, в опыте и контроле

Наблюдается различие между количеством яиц, отложенных мухами мутированной линии на опытной среде по сравнению с контролем. То же наблюдается и у мух нормальной линии.

По данным, приведенным в табл. 2, был произведен расчет величины показателя частоты ДЛМ. Результаты подсчета показаны в табл. 3 и на рис. 2.

Таблица 3 Показатели частоты доминантных летальных мутаций у мух линий Muller-5 и СапЬп-Б в опыте и контроле

Линия № колбы Частота ДЛМ

Опыт Контроль

I 72,6 23,4

Muller-5 II 78,7 23,2

III 76,2 24,6

I 26,7 5,7

Cаntоn-S II 26,2 5,4

III 25,8 6,2

р -

шоп и ш УМЫ I П

Шег-5 Canton-S

to

ш

и

В

Линия Drosophila melanogaster Частота ДЛМ

Частота ДЛМ

Рис. 2. Показатели частоты доминантных летальных мутаций у мух линий Muller-5 и Cаntоn-S, в опыте и контроле

Наблюдаются достоверные различия между величиной показателя частоты доминантных летальных мутаций мух линии Muller-5 в опыте и контроле. Так, в опыте частота ДЛМ мух рассматриваемой линии составила в среднем 76 %, тогда как в контроле этот показатель равен около 23 %.

Достоверное различие между величиной показателя частоты доминантных летальных мутаций в опыте по сравнению с контролем наблюдается и у мух линии Сап1:оп-8. Так, в опыте он составил около 26 %, а в контроле - примерно 6 %.

Однако различия между величинами рассматриваемого показателя у мух мутированной линии намного больше, чем у мух нормальной линии, и равны соответственно 53 и 20 %.

Исходя из полученных данных можно предположить, что растянутость цикла развития мух линии Muller-5 по сравнению с Normal может быть обусловлена чувствительностью мутированной линии к изменению химического состава питательной среды. Это предположение доказывает тот факт, что в контроле сроки жизненного цикла почти в норме.

Кроме того, включение в питательную среду дополнительного компонента приводит к существенным изменениям количества яиц, отложенных мухами рассматриваемых линий, и индуцирует у мух обеих линий доминантные летальные мутации.

В результате наличия мутации в хромосомах мух линии Muller-5 и нарушения системы репарации величина частоты ДЛМ у них намного выше по сравнению с этим показателем в контроле, а также по сравнению с мухами линии Сап1:оп-8. Это обусловливается тем, что введенный в питательную среду химический компонент взаимодействует с генетическим аппаратом клетки, нарушая последовательность нуклеотидов. Система репарации ДНК мутированной линии мух не справляется полностью с нарушениями, что приводит к быстрому росту частоты доминантных летальных мутаций.

Система репарации ДНК мух нормальной линии устраняет повреждения, благодаря чему показатель частоты ДЛМ у мух рассматриваемой линии намного ниже по сравнению с мухами мутированной линии Muller-5.

Следует также отметить, что не для всех мух линии с мутацией наблюдался летальный исход. Примерно 24 % яиц развились до

имаго и не погибли. У мух линии Сап1:оп-8 этот показатель намного выше и составляет около 75 %. Можно предположить что это является следствием наличия в продуктах жарки масла подсолнечного натуральных антиоксидантов - токоферолов, которые благодаря своему антиоксидантному действию могли частично подавить вредное воздействие на клетку продуктов жарки, вследствие чего не все мухи искусственно выведенной мутированной линии погибли на опытной среде.

Заключение

Проведенное нами исследование, а также полученные в нем результаты подтверждают необходимость разработки методов биологического контроля пищевых продуктов с целью выявления в их составе химических агентов, являющихся опасными для нашего организма

В ходе эксперимента определено влияние продуктов жарки масла подсолнечного с добавлением натуральных токоферолов на линии Muller-5 и Са^оп-Э дрозофилы. Добавление в питательную среду исследуемого вещества индуцирует у мух обеих линий доминантные летальные мутации. Показатели частоты ДЛМ у мух линии Muller-5 выше тех же показателей у мух нормальной линии, что связано с нарушением системы репарации ДНК мух искусственно выведенной линии и высокой чувствительностью их к дополнительному компоненту питательной среды. Наличие натуральных токоферолов частично нейтрализует вредное воздействие на организм исследуемого вещества.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Абелев Г. И., Альтштейн А. Д., Белицкий Г. А. Канцерогенез. М. : Медицина, 2004. 576 с.

[2] Асланян М. М., Тарасов В. А., Литвинов С. С. и др. Генетика онкогенеза // Открытое образование. 2006. № 3. С. 25-28.

[3] Коничев А. С., Севастьянова Г. А. Молекулярная биология. М. : Академия, 2003. 397 с.

[4] Горбунова В. Н., Имянитов Е. Н. Генетика и канцерогенез. СПб. : СПбГПМА, 2007. 24 с.

[5] Жестянников В. Д. Репарация ДНК и ее биологическое значение. Л. : Наука, 1979. 285 с.

[6] Медведев Н. Н. Практическая генетика. М. : Наука, 1968. 294 с.

[7] Белоконь Е. М. Методические указания к определению мутагенной активности химических препаратов на дрозофиле. Львов : ЛГУ, 1984. 26 с.