УСТРОЙСТВО ОДНОМОЛЕКУЛЯРНОГО МАССИВНОГО ОПТИЧЕСКОГО ПАРАЛЛЕЛЬНОГО АНАЛИЗА

Устройство предназначено для одномолекулярного массивного оптического параллельного анализа последовательностей нуклеиновых кислот при молекулярно-биологических и генетических исследованиях, для метагеномики, палеогенетики, биомедицины.
Аналогом устройства одномолекулярного массивного оптического параллельного анализа является устройство, описанное в патенте США /1/. Устройство имеет меньшую чувствительность либо разрешение вследствие применения одного матричного детектора изображения и вследствие этого требует проведение предварительной амплификации образцов.
Ближайшим аналогом устройства одномолекулярного массивного оптического параллельного анализа является устройство, описанное в патенте США 121. Устройство состоит из системы подачи жидких реагентов, осветительного блока, системы автофокусировки, датчиков изображения и оптической системы разделения изображения, состоящей из разделяющихся пучков оптических волокон либо из пирамидального зеркала. Разделитель изображения на основе пучков оптических волокон требует применения систем ввода и вывода изображения в волокна, а пирамидальное зеркало сложно в производстве.
Деление изображения в устройстве-прототипе производится с помощью четырехгранного зеркала или разделяющихся пучков оптических волокон. Четырехгранное зеркало сложно в производстве и настройке, а использование пучков оптических волокон требует применение систем ввода и вывода изображения в них, что значительно усложняет конструкцию и увеличивает потери в оптической системе.
Задача полезной модели - упрощение изготовления устройства при сохранении чувствительности и пространственного разрешения.
Устройство одномолекулярного массивного оптического параллельного анализа, содержащее проточную ячейку, систему ее перемещения, микрообъектив, источники излучения, оптическую систему засветки, оптическую систему преобразования изображения, четыре матричных приемника изображения, систему подачи жидкостей и систему управления, отличающееся тем, что оптическая система преобразования изображения имеет в своем составе три двугранных зеркала, расположенных так, что пучок света от объектива делится на два приблизительно равных сегмента одним двугранным зеркалом, а затем каждый луч делится также на два приблизительно равных сегмента двугранными зеркалами и получившиеся в результате четыре луча попадают каждый в соответствующий приемник изображения.
Основным элементом устройства одномолекулярного массивного оптического параллельного анализа является стеклянная проточная ячейка 4 с внутренними каналами для жидкости, к горизонтальной поверхности которых прикреплены исследуемые молекулы нуклеиновой кислоты. Проточная ячейка располагается на площадке, положение которой в пространстве задается системой перемещения 5. Над проточной ячейкой находится оптический блок 2, который имеет в своем составе микрообъектив и двугранное зеркало, служащее для направления в объектив луча освещения из осветительного блока в приемный блок. Осветительный блок 1 имеет в своем составе источники излучения и оптическую систему, обеспечивающую равномерную засветку поля зрения микрообъектива светом. Приемный блок 3 своей приемной оптической системой разделяет входящий свет на четыре сегмента и направляет их на четыре матричных приемника изображения 11, что необходимо для увеличения разрешающей способности. Проточная ячейка подключена трубками к системе подачи жидкостей 7, служащей для подачи в проточную ячейку реагентов в заданной последовательности и их удаления в сливную емкость. Система управления 6 синхронизирует перемещение проточной ячейки и подачу жидкостей в нее, работу оптического блока и захват изображения приемниками, выполняет настройку фокуса путем перемещения проточной ячейки в вертикальном направлении, производит совмещение соседних кадров, коррекцию смещения ячейки в горизонтальной плоскости по характерным точкам изображения, производит определение последовательности оснований в каждой молекуле путем соотнесения сигнала флюоресценции с типом основания подаваемого раствора. Приемный блок производит разделение изображения на четыре сегмента и направление их в четыре матричных приемника изображения. Входящий в приемный блок от объектива луч света попадает на двугранное зеркало 8 и разделяется на два луча, содержащих каждый половину изображения. Далее эти лучи попадают каждый на свое двугранное зеркало 9, 10 и разделяются на два луча каждый, содержащий каждый четверть исходного изображения. Далее лучи регистрируются матричными приемниками изображения 11. Такая конструкция вчетверо увеличивает разрешение получаемого изображения и при этом проще и дешевле в производстве и настройке.
При работе устройства происходит промывка проточной ячейки реагентом, содержащим один тип азотистых оснований, химически связанных с флюоресцентными метками и терминаторами. При этом происходит присоединение оснований из раствора к комплементарным основаниям анализируемых молекул. Далее происходит промывка ячейки для удаления реагента. После этого происходит считывание изображения флюоресцентных меток со всей площади проточной ячейки приемником изображения при последовательном перемещении ячейки в фокальной плоскости объектива. После этого производится промывка ячейки реагентами, удаляющими флюоресцентные метки и терминаторы, но присоединившиеся основания остаются на своих местах. Далее цикл повторяется со сменой типа азотистых оснований. Всего в цикле проходит присоединение четырех типов оснований - аденина, гуанина, цитозина и тимина (или урацила), соединенных с флюоресцентными метками. Далее цикл повторяется заданное количество раз в зависимости от ожидаемой длины молекул нуклеиновой кислоты, находящихся в проточной ячейке, либо до тех пор пока система управления не зарегистрирует прекращение присоединения оснований к заданной доле молекул, что является признаком окончания процесса.
На фиг. 1 представлено устройство одномолекулярного массивного оптического параллельного анализа, где:
1 - осветительный блок,
2 - оптический блок,
3 - приемный блок,
4 - проточная ячейка,
5 - система перемещения,
6 - система управления,
7 - система подачи жидкостей.
На фиг. 2 показано расположение двугранных зеркал приемной оптической системы, где:
стрелками показан луч света, проходящий через устройство,
8, 9, 10 - двугранные зеркала,
11 - матричные приемники изображения.
В рамках функциональной проверки работы устройства одномолекулярного массивного оптического параллельного анализа были проведены исследования нескольких культур бактерий паразитирующих на картофеле (pectobacterium carotovorum, dickeya solani и dickeya dianthicola), вследствие чего у корнеплода развивается, так называемая, черная ножка - болезнь влекущая загнивание плода. В результате проведенных исследований устройство показало высокий уровень покрытия исследуемых последовательностей ДНК и подтвердила возможность полногеномного секвенирования этих бактерий.
Главными преимуществами устройства одномолекулярного массивного оптического параллельного анализа является отсутствие необходимости в формировании библиотек и более простая пробоподготовка, отсутствие стадий лигации и амплификации на всех этапах секвенирования, а также высокая чувствительность системы и возможность секвенирования индивидуальных молекул, что позволяет максимально сократить объем необходимого для анализа материала. Секвенирование молекул РНК посредством устройства, позволят получить наиболее полные данные о дифференциальной экспрессии кодирующих и некодирующих генов, включая информацию о сплайс вариантах, с минимальным порогом различия меньше двух, что недоступно при использовании других методов. На базе разрабатываемого устройства возможна разработка тестов на метастазирование рака, прогнозирование возможностей рецидива и оценка предрасположенности к онкозаболеваниям. Обладающее высокой точностью прочтения устройство позволяет детектировать экспрессируемые однонуклеотидные полиморфизмы в генах, а также определять места альтернативного сплайсинга.
Источники информации
1. Патент США 20130228703.
2. Патент США 20080030721 (прототип).