СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ
METHOD OF OBTAINING LIPOSOMES

Изобретение относится к области биотехнологии, преимущественно связанной с получением липосомальных дисперсий для косметических и медицинских целей. Данные дисперсии могут найти применение в качестве систем доставки в живые организмы биологически активных веществ.
Классические или немодифицированные липосомы являются мульти- или одноламеллярными везикулами, преимущественно состоящими из фосфолипидов, кроме того, часто в их состав входит холестерин (Хол). Последний повышает жесткость бислойной мембраны, снижает ее проницаемость для включенного вещества и увеличивает стабильность бислоя в присутствии биологических жидкостей [S.Vemuri, C.T.Rhodes, Preparation and characterization of liposomes as therapeutic delivery systems: a review // Pharm. Acta Helv. 70 (1995) 95 - 111].
Существуют разные способы получения липосом, и выбор метода, как правило, зависит от задач, поставленных при разработке той или иной липосомальной формы.
Наиболее просто получаются мультиламеллярные липосомы, так как липиды, используемые для получения липосом, самопроизвольно образуют при гидратировании подобные бислойные структуры [V.Р.Torchilin and V.Weissig, Liposomes A Practical Approach, Second Edition, // Oxford University Press, 2003]. Однако их размер (до 100 мкм) ограничивает их применение, так, например, они не могут использоваться для внутривенного введения без дополнительной обработки для уменьшения размеров частиц.
Одним из перспективных способов получения липосом является получение липосом из пролипосом. Пролипосомы - это субстанция, которая при разбавлении водой дает липосомы без дополнительной обработки ультразвуком, экструзией и т.д. Пролипосомы могут быть как жидкими (липосомы из них получают при разбавлении водой или соответствующим буферным раствором) [М.А.Schubert, C.C.Müller-Goymann. Solvent injection as a new approach for manufacturing lipid nanoparticles - evaluation of the method and process parameters // Eur. J.Pharm. Biopharm., 2003, V.55, P.125-131] так и твердыми, обычно в этом случае как вспомогательное вещество применяют сорбит, (липидный слой на порошок сорбита наносится выпариванием из раствора липидов органического растворителя) [К.-Н. Song, S.-J. Chung, C.-K. Shim. Preparation and evaluation of proliposomes containing salmon calcitonin // J.Cont. Rel., 2002, V.84, P.27-37].
Существует метод получения липосомальных дисперсий путем впрыска растворов липидов (в органических растворителях) в водные растворы [V.Р.Torchilin and V.Weissig, Liposomes A Practical Approach, Second Edition, // Oxford University Press, 2003].
Наиболее близким по достигаемому результату является следующий способ получения липосом. Раствор липидов в органическом растворителе упаривается до образования сухой липидной пленки, которая гидратируется водным раствором, в результате чего формируется липосомальная дисперсия, которая, при необходимости, измельчается путем экструзии [V.Р.Torchilin and V.Weissig, Liposomes A Practical Approach, Second Edition, // Oxford University Press, 2003].
Техническим результатом изобретения является возможность регулирования (контролируемого снижения) проницаемости липосомального бислоя, что позволяет создавать системы доставки биологически активных веществ с определяемыми заранее параметрами высвобождения.
Существенным отличием предложенного способа, позволяющим достичь данный технический результат, является введение в состав исходной липидной смеси алканов С16-С38 (как в индивидуальном виде, так и в виде сложных смесей), преимущественно в количествах 5-20% мол, причем верхняя граница при необходимости может быть расширена вплоть до полного насыщения бислоя вводимыми алканами. Предпосылкой для данного изобретения была наша гипотеза: длинные углеводородные цепи (длиннее, чем длина жирно-кислотной цепи основной массы фосфолипидов) могут интеркалировать оба монослоя, проникая одним концом в один монослой, а другим концом в другой монослой, таким образом соединяя их.
Пример 1
Получали четыре образца липосомальных дисперсий; в качестве липида, формирующего бислой, использовали яичный фосфатидилхолин (яФХ). К растворенной в хлороформе смеси липидов яФХ/Хол 7/3 (28 мг) добавляли соответствующее количество парафина и перемешивали до полного растворения, после чего упаривали досуха на роторном испарителе. Липидную пленку гидратировали 3 мл водного раствора доксорубицина (ДР) 40 мкг/мл. Полученную липосомальную дисперсию 19 раз продавливали через фильтр с диаметром пор 200 нм. Невключившийся доксорубицин отделяли от липосом с помощью гель-фильтрации. Степень включения ДР определяли как отношение концентрации вещества в липосомах к общей концентрации в исходной дисперсии с учетом разбавления на колонке. Концетрацию ДР в образцах определяли после разрушения липосом спектрофотометрически на длине волны 480 нм. Степень включения для данных образцов составила 39.5±3.4%. Липосомальные дисперсии выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего повторно производили определение содержания модельного вещества в липосомах. Количество доксорубицина, вышедшего из липосом за 1 ч, приведено в табл.1.
Табл. 1.
Изменение проницаемости бислоя липосом (яФХ/Хол 7/3) при добавлении парафина (смеси высших алканов).
Образец
Количество парафина
Количество ДР, вышедшего из липосом за 1 ч
I
-
64.0%
II
0.8 мг (5% мол)
54.9%
III
1.6 мг (10% мол)
15.6%
IV
3.2 мг (20% мол)
3.4%
Пример 2
Получали четыре образца липосомальных дисперсий; в качестве липида, формирующего бислой, использовали соевый фосфатидилхолин (сФХ). К растворенной в хлороформе смеси липидов сФХ/Хол 7/3 (28 мг) добавляли соответствующее количество парафина и перемешивали до полного растворения, после чего упаривали досуха на роторном испарителе. Липидную пленку гидратировали 3 мл водного раствора доксорубицина (ДР) 40 мкг/мл. Полученную липосомальную дисперсию 19 раз продавливали через фильтр с диаметром пор 200 нм. Невключившийся доксорубицин отделяли от липосом с помощью гель-фильтрации. Степень включения ДР определяли как отношение концентрации вещества в липосомах к общей концентрации в исходной дисперсии с учетом разбавления на колонке. Концетрацию ДР в образцах определяли после разрушения липосом спектрофотометрически на длине волны 480 нм. Степень включения для данных образцов составила 36.4±3.1%. Липосомальные дисперсии выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего повторно производили определение содержания модельного вещества в липосомах. Количество доксорубицина, вышедшего из липосом за 1 ч, приведено в табл. 2.
Табл. 2.
Изменение проницаемости бислоя липосом (сФХ/Хол 7/3) при добавлении парафина (смеси высших алканов).
Образец
Количество парафина
Количество ДР, вышедшего из липосом за 1 ч
I
-
67.1%
II
0.8 мг (5% мол.)
56.8%
III
1.6 мг (10% мол.)
17.2%
IV
3.2 мг (20% мол.)
4.2%