МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР ГРАНУЛОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ДНК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ВЕКТОР
MODIFIED HUMAN GRANULOCYTE COLONY-STIMULATING FACTOR AND METHOD FOR ITS PREPARING, DNA, EXPRESSING VECTOR

Область техники
Насто щее изобретение относитс  к модифицированному колониестимулирующему фактору гранулоцитов человека (hG-CSF), гену, кодирующему указанный пептид, вектору, содержащему указанный ген, микроорганизму, трансформированному указанным вектором, и способу получени  модифицированного hG-CSF с использованием указанного микроорганизма.
Предпосылки изобретени
Термин "колониестимулирующий фактор" (CSF) включает колониестимулирующий фактор гранулоцитов/макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF) и колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), продуцируемые Т-клетками, макрофагами, фибробластами и эндотелиальными клетками. GM-CSF стимулирует стволовые клетки гранулоцитов или макрофагов, вызыва  их дифференцировку и пролиферацию колоний гранулоцитов или макрофагов. M-CSF и G-CSF индуцируют соответственно образование колоний макрофагов и гранулоцитов. In vivo G-CSF вызывает дифференцировку лейкоцитов костного мозга и усиливает функцию зрелых гранулоцитов и, следовательно, определ ет их клиническую значимость при лечении лейкоза.
G-CSF человека (hG-CSF) представл ет собой белок, состо щий из 174 или 177 аминокислот, причем разновидность, включающа  174 аминокислоты, обладает более высокой активностью, стимулирующей нейтрофилы (Morishita, К. et al., J. Biol. Chem., 262, 15208-15213 (1987)). Аминокислотна  последовательность hG-CSF, состо ща  из 174 аминокислот, показана на фиг.1. Были выполнены многочисленные исследовани  по массовому продуцированию hG-CSF при помощи гена, кодирующего указанный hG-CSF.
Например, компанией Chugai Pharmaceuticals Co., Ltd (Япони ) была представлена аминокислотна  последовательность hG-CSF и кодирующий ее ген (корейска  патентна  публикаци  №91-5624 и 92-2312) и описан способ получени  белков, обладающих активностью hG-CSF, методом генетической рекомбинации (патенты Кореи №47178, 53723 и 57582). В соответствии с описанным способом в клетке млекопитающего продуцируют гликозилированный hG-CSF, использу  геномную ДНК или кДНК, содержащую полинуклеотид, кодирующий hG-CSF. Гликозилированный hG-CSF имеет цепь О-гликозидного сахара, но известно, что указанна  цепь не нужна дл  обеспечени  активности hG-CSF (Lawrence, M. et al., Science, 232, 61 (1986). Кроме того, хорошо известно, что продуцирование гликозилированного hG-CSF с использованием клеток млекопитающего требует использовани  дорогосто щих веществ и устройств, поэтому такой способ  вл етс  неприемлемым с экономической точки зрени .
Были предприн ты попытки продуцировать негликозилированный hG-CSF, использу  микроорганизмы, например Е. coli. В результате выполнени  таких исследований получен hG-CSF, содержащий 175 или 178 аминокислот с остатком метионина, присоединенным у N-конца, благодар  использованию в микроорганизме инициирующего кодона ATG. Однако дополнительный остаток метионина вызывает нежелательные иммунные реакции в организме человека при введении рекомбинантного hG-CSF (европейска  патентна  публикаци  № 256843). Кроме того, больша  часть метионинсодержащего hG-CSF, продуцированного в Е. coli, осаждаетс  в клетках в виде нерастворимых телец включени , которые необходимо превратить в активную форму путем повторной укладки цепи при значительной потере выхода продукта. В этой св зи следует отметить, что четыре из п ти остатков Cys, присутствующих в hG-CSF дикого типа, участвуют в образовании дисульфидных св зей, в то врем  как последний остаток вызывает агрегацию продукта hG-CSF в процессе повторной укладки цепи, что уменьшает выход продукта.
Чтобы решить проблемы, св занные с продуцированием чужеродного белка в микробной клетке, недавно были предприн ты попытки создать способ на основе эффективной секреции целевого белка через мембрану микробной клетки во внеклеточный домен.
Например, при осуществлении способа с использованием сигнального пептида требуемый белок экспрессирован в форме слитого белка, в котором сигнальный пептид присоединен к N-концу белка. При прохождении слитого белка через клеточную мембрану сигнальный пептид удал етс  ферментом и требуемый белок секретируетс  в зрелой форме. Способ секреторного продуцировани   вл етс  эффективным, так как продуцированна  аминокислотна  последовательность обычно идентична последовательности дикого типа. Однако выход продукта при осуществлении способа секреторного продуцировани  часто оказываетс  довольно низким из-за недостаточно эффективного переноса через мембрану и последующей очистки. Это согласуетс  с известными данными о том, что выход белка млекопитающего, продуцированного секреторным способом в прокариотах,  вл етс  очень низким, поэтому ни один из микробных способов не был признан пригодным дл  эффективной экспрессии и секреции растворимого hG-CSF, не имеющего дополнительного остатка метионина, присоединенного к N-концу.
Авторы насто щего изобретени  ранее сообщали об использовании нового секреторного сигнального пептида, полученного путем модификации сигнального пептида терморезистентного энтеротоксина II Е. coli (открыта  корейска  патентна  публикаци  № 2000-19788), при продуцировании hG-CSF. В частности, был получен экспрессирующий вектор, содержащий ген hG-CSF, присоединенный к 3'-концу модифицированного сигнального пептида терморезистентного энтеротоксина II Е. coli, и экспрессирован биологически активный, зрелый hG-CSF с использованием Е. coii, трансформированного вышеуказанным экспрессирующим вектором. Однако больша  часть экспрессированного hG-CSF накапливаетс  в цитоплазме, а не в периплазме.
Авторы насто щего изобретени  предприн ли попытку создать эффективный секреторный способ получени  hG-CSF в микроорганизме и обнаружили, что модифицированный hG-CSF, полученный путем замены по крайней мере одного аминокислотного остатка, в частности 17-го остатка цистеина, hG-CSF дикого типа другой аминокислотой, позвол ет сохранить биологическую активность белка дикого типа, при этом в микроорганизме можно эффективно экспрессировать и секретировать модифицированный hG-CSF, не имеющий остатка метионина у N-конца, использу  соответствующий секреторный сигнальный пептид.
Краткое изложение существа изобретени
Целью насто щего изобретени   вл етс  получение модифицированного колониестимулирующего фактора гранулоцитов человека (hG-CSF), который можно эффективно продуцировать при помощи микроорганизма.
Другой целью насто щего изобретени   вл етс  получение гена, кодирующего указанный пептид, и вектора, содержащего указанный ген,
Другой целью насто щего изобретени   вл етс  получение микроорганизма, трансформированного указанным вектором.
Еще одной целью насто щего изобретени   вл етс  представление способа получени  hG-CSF без остатка метионина, присоединенного к аминоконцу, с использованием указанного микроорганизма.
Одним объектом насто щего изобретени   вл етс  модифицированный hG-CSF, отличающийс  тем, что по крайней мере одна из 1-ой, 2-ой, 3-ей и 17-ой аминокислот hG-CSF дикого типа заменена другой аминокислотой.
Краткое описание чертежей
Вышеуказанные и другие цели и особенности насто щего изобретени  будут очевидны из нижеследующего описани  изобретени  со ссылкой на прилагаемые чертежи, где:
На фиг.1 показаны нуклеотидна  и аминокислотна  последовательности колониестимулирующего фактора гранулоцитов человека дикого типа, состо щие из 174 аминокислотных остатков (SEQ ID NOS: 1 и 2).
На фиг.2 показан способ создани  вектора pT-CSF.
На фиг.3 показан способ создани  вектора pT14S1SG.
На фиг.4 показан способ создани  вектора pT14SS1SG.
На фиг.5 показан способ создани  вектора pT140SSG-4T22Q.
На фиг.6 показан способ создани  вектора pT14SS1S17SEG.
На фиг.7 показан способ создани  вектора pTO1SG.
На фиг.8 показан способ создани  вектора pBADG.
На фиг.9 показан способ создани  вектора pBAD2M3VG.
На фиг.10а и 10b приведены результаты анализов методом вестерн-блоттинга, которые подтверждают экспрессию hG-CSF и по-разному модифицированных hG-CSF в рекомбинантных лини х клеток, и указаны молекул рные массы экспрессированных белков.
На фиг.11 показана клеточна  активность hG-CSF и модифицированного hG-CSF, продуцированного в рекомбинантных лини х клеток.
Подробное описание изобретени
Модифицированные hG-CSF по насто щему изобретению получают, замен   одну или несколько аминокислот hG-CSF дикого типа (SEQ ID NO: 2), предпочтительно 1-ую, 2-ую, 3-ю и 17-ю аминокислоты другими аминокислотами. Более предпочтительные факторы получают, замен   17-ю аминокислоту hG-CSF аминокислотой, котора  не зар жена при нейтральном рН. Конкретные примеры предпочтительных модифицированных hG-CSF имеют аминокислотную последовательность hG-CSF дикого типа за исключением того, что:
(a) 1-а  аминокислота  вл етс  Ser;
(b) 1-а  аминокислота  вл етс  Ser и 17-а  аминокислота  вл етс  X;
(c) 2-а  аминокислота  вл етс  Met и 3-  аминокислота  вл етс  Val;
(d) 2-а  аминокислота  вл етс  Met, 3-  аминокислота  вл етс  Val и 17-а  аминокислота  вл етс  X; или
(f) 17-а  аминокислота  вл етс  X,
где Х означает аминокислоту, котора  не зар жена при нейтральном рН, предпочтительно Ser, Thr, Ala или Gly, более предпочтительно Ser.
Четыре из п ти остатков Суs в hG-CSF участвуют в образовании дисульфидных св зей, в то врем  как 17-ый остаток Cys остаетс  несв занным в естественном состо нии. Когда в рекомбинантных клетках экспрессировано большое количество hG-CSF, 17-ый остаток Cys принимает участие в образовании межмолекул рных дисульфидных св зей, вызыва  накопление агломерированного hG-CSF в цитоплазме. Однако в модифицированном hG-CSF по насто щему изобретению, имеющем в положении 17 не Суs, а другой аминокислотный остаток, така  проблема отсутствует, поэтому его можно эффективно продуцировать секреторным способом, использу  должным образом трансформированный микроорганизм.
Модифицированный hG-CSF по насто щему изобретению может быть кодирован геном, содержащим нуклеотидную последовательность, выведенную из аминокислотной последовательности модифицированного hG-CSF в соответствии с генетическим кодом. Известно, что может быть несколько разных кодонов, кодирующих специфическую аминокислоту, вследствие вырожденности кодона, поэтому в объем насто щего изобретени  вход т все нуклеотидные последовательности, выведенные из аминокислотной последовательности модифицированного hG-CSF. Предпочтительно последовательность гена модифицированного hG-CSF включает один или несколько предпочтительных кодонов Е. coli.
Полученный таким образом ген можно вставить в обычный вектор, чтобы получить экспрессирующий вектор, который, в свою очередь, можно ввести в приемлемого хоз ина, например Е. coli. Экспрессирующий вектор может дополнительно содержать сигнальный пептид. Типичными сигнальными пептидами  вл ютс  сигнальный пептид терморезистентного энтеротоксина II Е. coli (SEQ ID NO: 53), модифицированный сигнальный пептид терморезистентного энтеротоксина II Е. coli (SEQ ID NO: 54), сигнальный пептид бета-лактамазы (SEQ ID NO: 24), сигнальный пептид Gene III (SEQ ID NO: 42) или их модифицированный пептид, но указанные пептиды не ограничивают число сигнальных пептидов, пригодных дл  использовани  в насто щем изобретении. Промотор, используемый дл  получени  экспрессирующего вектора по насто щему изобретению, относитс  к типу, способному экспрессировать гетерологичный белок в микроорганизме-хоз ине. В частности, lac, Tac и арабинозный промотор  вл ютс  предпочтительными при экспрессии гетерологичного белка в Е. coli.
Экспрессирующими векторами по насто щему изобретению, использующимис  в качестве примера,  вл ютс  pT14SS1SG, PT14SS1S17SEG, pTO1SG, pTO1S17SG, pTО17SG, pTО17TG, pTО17AG, pTО17GG, pBAD2M3VG, pBAD17SG и pBAD2M3V17SG.
Экспрессирующие векторы по насто щему изобретению можно вводить в такие микроорганизмы, как, например, Е. coli BL21(DE3) (Novagen), Е. coli XL-1 синий (Novagen), путем обычной трансформации (Sambrook et al., см. выше), получа  при этом трансформанты Е. coli BL21(DE3)/DT14SS1SG (НМ 10310), Е.coli BL21(DE3)/pT14SS1S17SEG (HM 10311), E. coli BL21(DE3)/ pTO1SG (HM 10409), E. coli BL21(DE3)/pTО1S17SG (HM 10410), E. coli BL21(DE3)/pTО17SG (HM 10411), E. coli BL21(DE3)/pTО17TG (HM 10413), E. coli BL21 (DE3)/pTО17AG (HM 10414), E. coli BL21(DE3)/pTO17GG (HM 10415), E. coli BL21 (DE3)/ pBAD2M3VG (HM 10510), E. coli BL21 (DE3)/ pBAD17SG (HM 10511) и E. coli BL21 (DE3)/ pBAD2M3V17SG (HM 10512).
Среди трансформированных микроорганизмов предпочтительными  вл ютс  трансформанты E. coli BL21(DE3)/ pT14SS1S17SEG (HM 10311), E. coli BL21(DE3)/ pTО1S17SG (HM 10410), E. coli BL21(DE3)/ pTО17SG (HM 10411) и E. coli BL21 (DE3)/ pBAD2M3VG (HM 10510), которые были задепонированы в Корейском центре регистрации культур микроорганизмов (КССМ) (адрес: Department of Food Engineering, College of Eng., Yonsei University, Sodaemungu, Seoul 120-749, Republic of Korea) 24 марта 1999 г. под номерами доступа КССМ-10154, КССМ-10151, КССМ-10152 и КССМ-10153 в соответствии с положени ми Будапештского договора о международном признании регистрации микроорганизмов при проведении патентной экспертизы.
Модифицированный белок hG-CSF по насто щему изобретению можно получить, культивиру  трансформированные микроорганизмы с целью экспрессии гена, кодирующего модифицированный белок hG-CSF, секреции модифицированного белка hG-CSF в периплазму и выделени  модифицированного белка hG-CSF из периплазмы.
Трансформированный микроорганизм можно культивировать в соответствии с известным способом (Sambrook et al., см. выше). Культуру микроорганизмов центрифугируют или фильтруют, собира  таким образом микроорганизм, секретирующий модифицированный белок hG-CSF. Трансформированный микроорганизм можно разрушить обычным способом (Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1989)) с получением раствора периплазмы. Например, микроорганизм можно разрушить в гипотоническом растворе, например дистиллированной воде, при помощи осмотического шока. Модифицированный hG-CSF может быть выделен из раствора периплазмы обычным способом (Sambrook et al., см. выше), например, при помощи ионообменной хроматографии, гель-фильтрационной хроматографии на колонках или иммуногель-хроматографии на колонках. Например, hG-CSF можно очистить, последовательно выполн   хроматографию на колонках с СМ-сефарозой и хроматографию на колонках с фенилсефарозой.
Модифицированный белок hG-CSF, полученный по насто щему изобретению, не имеет остатка метионина у N-конца и обладает биологической активностью, котора  равна или выше активности hG-CSF дикого типа. Поэтому указанный белок можно использовать в разных област х применени .
Нижеследующие примеры приведены дл  более полной иллюстрации насто щего изобретени  и не ограничивают его объем.
Пример 1. Получение гена, кодирующего hG-CSFГен кДНК, кодирующий hG-CSF, получают, выполн   полимеразную цепную реакцию (PCR) с использованием матрицы hG-CSF (R&D system, США). Использованные затравки описаны в патенте США NO: 4810643.
'
Чтобы получить ген кДНК, кодирующий зрелый hG-CSF, вектор pUC19-G-CSF (Biolabs, США) подвергают PCR, использу  затравки SEQ ID NOS: 3 и 4. Затравка SEQ ID NO: 3 предназначена дл  получени  сайта рестрикции NdeI (5-САТАТС-3') вверху от кодона первой аминокислоты (треонин) зрелого hG-CSF, и затравка SEQ ID NO: 4 предназначена дл  получени  сайта рестрикции BamHI (5'-GGATCC-3') внизу от кодона терминации.
Амплифицированный ген hG-CSF расщепл ют при помощи NdeI и BamHI и получают ген, кодирующий зрелый hG-CSF. Ген hG-CSF ввод т на участке NdeI/BamHI вектора pET14b (Novagen, США), получа  при этом вектор pT-CSF.
На фиг.2 показан вышеописанный способ создани  вектора pT-CSF.
Пример 2. Создание вектора, содержащего ген, кодирующий сигнальный пептид энтеротоксина Е. coli и модифицированный hG-CSF
(Стади  1) Клонирование гена сигнального пептида энтеротоксина II Е. coli
Чтобы получить ген сигнального пептида энтеротоксина II Е. coli, создают пару комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NOS: 5 и 6, на основе нуклеотидной последовательности сигнального пептида энтеротоксина II Е. coli, которые синтезируют в синтезаторе ДНК (модель 380В, Applied Biosystem, США).
Вышеуказанные олигонуклеотиды предназначены дл  получени  сайта рестрикции BspHI (сайты, комплементарные сайтам рестрикции NcoI) вверху от инициирующего кодона энтеротоксина II Е. coli и сайта рестрикции MluI, вводимого путем молчащей замены у другого конца.
Оба олигонуклеотида отжигают при 95°С, получа  при этом фрагменты ДНК с "тупыми" концами, имеющие нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид энтеротоксина II Е. coli (ген STII).
Ген STII ввод т на сайте SmaI вектора pUC19 (Biolabs, США) и получают вектор pUC19ST.
(Стади  2) Получение гена, кодирующего STII/hG-CSF
Чтобы получить ген, кодирующий STII/hG-CSF, вектор рТ-CSF, полученный в препаративном примере 1, подвергают PCR, использу  затравки SEQ ID NOS: 7 и 8. Затравка SEQ ID NO: 7 предназначена дл  замены первого кодона hG-CSF кодоном Ser, и затравка SEQ ID NO: 8 предназначена дл  получени  сайта рестрикции BamHI (5'-GGATCC-3') внизу от кодона терминации.
Амплифицированные фрагменты ДНК расщепл ют при помощи MluI и BamHI и затем ввод т на участке MluI/BamHI вектора pUC19ST, полученного на стадии 1, и получают вектор PUC19S1SG. Созданный таким образом вектор pUC19S1SG содержит ген, кодирующий STII/hG-CSF (именуемый геном STII-hG-CSF).
Вектор pUC19S1SG расщепл ют при помощи BspHI и BamHI, получа  при этом фрагмент ДНК (522 п.о.). Фрагмент ДНК ввод т на участке NcoI/ BamHI вектора pET14b (Novagen, США), получа  при этом вектор pT14S1SG.
На фиг.3 показан вышеописанный способ создани  вектора PT14S1SG.
(Стади  3) Присоединение последовательности Шайна-Дальгарно энтеротоксина II Е. coli к гену STII-hG-CSF
Вектор pT14S1SG, полученный на стадии 2, подвергают PCR, использу  затравки SEQ ID NOS: 9 и 10. Затравка SEQ ID NO: 9 предназначена дл  получени  последовательности Шайна-Дальгарно (именуема  последовательностью STII SD) энтеротоксина II Е. coli и сайта рестрикции XbaI, и затравка SEQ ID NO: 10 предназначена дл  получени  сайта рестрикции BamHI внизу от кодона терминации зрелого hG-CSF с целью создани  фрагмента ДНК (STII SD-STII-hCSF), содержащего ген STII SD и STII-hG-CSF.
Фрагмент STII SD-STII-hG-CSF расщепл ют при помощи XbaI и BamHI и затем ввод т на участке XbaI/BamHI вектора pET14b (Novagen, США), получа  вектор pT14SS1SG.
На фиг.4 показан вышеописанный способ создани  вектора PT14SS1SG.
E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pT14SS1SG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli HM 10310.
(Стади  4) Создание вектора, содержащего ген, кодирующий слитый белок STII/hG-CSF
Первый кодон модифицированного гена hG-CSF плазмиды pT14SS1SSG, полученной на стадии 3, замен ют на Thr путем сайт-направленного мутагенеза (Papworth, С. et al., Strategies, 9, 3 (1996)), осуществл   PCR в отношении плазмиды с использованием смысловой затравки (SEQ ID NO: 12), содержащей модифицированную нуклеотидную последовательность, комплементарной антисмысловой затравки (SEQ ID NO: 13) и pfu (Stratagene, США).
Выдел ют амплифицированный фрагмент ДНК и добавл ют к нему рестрикционный фермент Dpnl, чтобы удалить нетрансформированные плазмиды.
E. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производ т определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, и таким образом получают плазмиду pT14SSG, котора  содержит ген, имеющий Thr вместо первой аминокислоты hG-CSF (SEQ ID NO: 11).
E. coli BL21(DS3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pT14SSG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli HM 10301.
(Стади  5) Создание вектора, содержащего ген, кодирующий модифицированный STII/hG-CSF
Вектор pT14SSG, полученный на стадии 4, подвергают PCR, использу  комплементарные затравки SEQ ID NOS: 15 и 16, которые предназначены дл  замены 4-го кодона STII кодоном Thr в соответствии со способом, описанным на стадии 4, и получают модифицированную плазмиду.
E. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производ т определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, и получают таким образом плазмиду, котора  содержит ген, имеющий Thr вместо 4-ой аминокислоты STII (SEQ ID NO: 14).
Полученную таким образом плазмиду расщепл ют при помощи XbaI и MluI и ввод т на участке XbaI/MluI вектора pT14SSG, полученного на стадии 4, получа  вектор pT14SSG-4T.
(Стади  6) Создание вектора, содержащего ген, кодирующий модифицированный STII/hG-CSF
Вектор pT14SSG-4T, полученный на стадии 5, подвергают PCR, использу  комплементарные затравки SEQ ID NOS: 18 и 19, которые предназначены дл  замены 22-го кодона STII кодоном Gln в соответствии со способом, описанным на стадии 4, и получают модифицированную плазмиду.
Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производ т определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, и получают таким образом плазмиду pT14SSG-4T22Q, котора  содержит ген, имеющий Gln вместо 22-ой аминокислоты STII (SEQ ID NO: 17).
(Стади  7) Создание вектора, содержащего модифицированную последовательность STII SD и гена, кодирующего модифицированный STII/hG-CSF
Вектор pT14SSG-4T22Q, полученный на стадии 6, подвергают PCR, использу  комплементарные затравки SEQ ID NOS: 20 и 21, в соответствии со способом, описанным на стадии 4, и получают вектор рТ14OSSG-4T22Q, имеющий шесть нуклеотидных последовательностей между последовательностью STII SD (GAGG) и инициирующим кодоном STII (модифицированна  последовательность STII SD SEQ ID NO: 71).
На фиг.5 показан вышеописанный способ создани  вектора pT14OSSG-4T22Q.
Е. coli BL21(DE3) трансформируют вектором рТ14OSSG-4T22Q и получают трансформант, обозначаемый как Е. coli HM 10302.
Пример 3. Создание вектора, содержащего ген, кодирующий модифицированный hG-CSF
Чтобы получить ген модифицированного hG-CSF, олигомер S1 (SEQ ID NO: 22), имеющий предпочтительные дл  Е. coli кодоны и Ser вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF, и олигомер AS1 (SEQ ID NO:) синтезируют в синтезаторе ДНК (модель 380В, Applied Biosystem, США).
Олигонуклеотиды в количестве 0,5 мкл (50 пмоль) подвергают взаимодействию при 95°С в течение 15 минут и выдерживают в течение 3 часов до достижени  температуры 35°С. Смесь осаждают в этаноле и подвергают гель-электрофорезу (SDS-PAGE), получа  при этом двухцепочечный олигомер с "липкими" концами.
Плазмиду pT14SS1SG, полученную на стадии 3 примера 2, расщепл ют при помощи ApaI и BstXI и затем лигируют с двухцепочечным олигомером с "липкими" концами, получа  вектор PT14SS1S17SEG. Вектор pT14SS1S17SEG содержит ген, кодирующий hG-CSF, который имеет предпочтительные дл  Е. coli кодоны у аминоконца и Ser вместо 1-ой и 17-ой аминокислот hG-CSF.
На фиг.6 показан вышеописанный способ создани  вектора pT14OSS1S17SEG.
Е. coli BL21(DE3) трансформируют вектором pT14SS1S173EG и получают трансформант, обозначаемый как Е. coli HM 10311, который задепонирован в Корейском центре регистрации культур микроорганизмов (КССМ) 24 марта 1999 г. под номером доступа КССМ-10154.
Пример 4. Создание вектора, содержащего ген, кодирующий сигнальный пептид OmpA E. coli и модифицированный hG-CSF
Вектор, содержащий ген, кодирующий промотор Тас и сигнальный пептид OmpA (SEQ ID NO: 24), а также ген, кодирующий модифицированный hG-CSF, получают следующим образом:
Сайт рестрикции HindIII
Вектор pT-CSF, полученный в примере 1, подвергают PCR, использу  затравку (SEQ ID NO: 27), предназначенную дл  замены 1-го кодона hG-CSF кодоном Ser, и другую затравку (SEQ ID NO: 28), предназначенную дл  получени  сайта рестрикции EcoRI (5'-GAATTC-3') внизу от кодона терминации, и получают фрагмент ДНК, содержащий ген, кодирующий модифицированный hG-CSF.
Фрагмент ДНК расщепл ют при помощи HindIII и EcoRI и затем ввод т на участке HindIII/EcoRI вектора pFlag.CTS (Eastman, США), получа  вектор pTО1SG, который содержит ген, кодирующий сигнальный пептид OmpA E. coli и модифицированный hG-CSF (SEQ ID NO: 29).
На фиг.7 показан вышеописанный способ создани  вектора pTO1SG.
E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTOlSG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli НM 10409.
Пример 5. Создание вектора, содержащего ген, кодирующий сигнальный пептид OmpA E. coli и модифицированный hG-CSF
Первый кодон гена модифицированного hG-CSF плазмиды pTO1SG, полученного в примере 4, замен ют Thr путем сайт-направленного мутагенеза (Papworth, С. et al., Strategies, 9, 3 (1996), выполн   PCR в отношении плазмиды pTO1SG, полученной в примере 4, с использованием смысловой затравки (SEQ ID NO: 30), предназначенной дл  замены 1-го кодона hG-CSF кодоном Thr, и комплементарной антисмысловой затравки (SEQ ID NO: 31).
E. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производ т определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, и получают таким образом плазмиду pTОG, котора  содержит ген, имеющий Thr вместо первой аминокислоты hG-CSF.
E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTOG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli НМ 10401.
Пример 6. Получение модифицированных hG-CSF
(a) Получение [Ser1, Serl7] hG-CSF
Вектор pTO1SG, полученный в примере 4, подвергают PCR, использу  смысловую затравку (SEQ ID NO: 32), предназначенную дл  замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Ser, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 33), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.
E. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производ т определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получа  таким образом плазмиду pTO1S17SG, котора  содержит ген, имеющий Ser вместо 1-ой и 17-ой аминокислот hG-CSF.
E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTO1S17SG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli НМ 10410, который задепонирован в Корейском центре регистрации культур микроорганизмов (КССМ) 24 марта 1999 г. под номером доступа КССМ-10151.
(b) Получение [Ser17] hG-CSF
Вектор pTOG, полученный в примере 5, подвергают PCR, использу  смысловую затравку (SEQ ID NO: 32), предназначенную дл  замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Ser, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 33), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.
Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производ т определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получа  таким образом плазмиду pTO17SG, котора  содержит ген, имеющий Ser вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF.
Е. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTO17SG и получают трансформант, обозначаемый Е. coli HM 10411, который задепонирован в Корейском центре регистрации культур микроорганизмов (КССМ) 24 марта 1999 г. под номером доступа КССМ-10152.
(с) Получение [Thrl7] hG-CSF
Вектор pTOG, полученный в примере 5, подвергают PCR, использу  смысловую затравку (SEQ ID NO: 34), предназначенную дл  замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Thr, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 35), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.
Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производ т определение последовательности оснований ДНК,  выделенной из  трансформированных колоний, получа  таким образом плазмиду pTO17TG, котора  содержит ген, имеющий Thr вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF.
Е. coli BL21(DE3) (Stratagen, США) трансформируют вектором pTO17TG и получают трансформант, именуемый Е. coli HM 10413.
(d) Получение [А1а17] hG-CSF
Вектор pTOG, полученный в примере 5, подвергают PCR, использу  смысловую затравку (SEQ ID NO: 36), предназначенную дл  замены 17-го кодона hG-CSF кодоном А1а, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 37), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.
Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производ т определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получа  таким образом плазмиду pTО17AG, котора  содержит ген, имеющий Аlа вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF.
Е. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTО17AG и получают трансформант, именуемый Е. coli HM 10414.
(e) Получение [Gly17] hG-CSF
Вектор pTOG, полученный в примере 5, подвергают PCR, использу  смысловую затравку (SEQ ID NO: 38), предназначенную дл  замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Gly, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 39), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.
Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производ т определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получа  таким образом плазмиду pTO17GG, котора  содержит ген, имеющий Gly вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF.
Е. coli BL21 (DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTO17GG и получают трансформант, именуемый Е. coli НМ 10415.
(f) Получение [Asp17] hG-CSF
Вектор pTOG, полученный в примере 5, подвергают PCR, использу  смысловую затравку (SEQ ID NO: 40), предназначенную дл  замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Asp, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 41), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.
Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производ т определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получа  таким образом плазмиду pTО17APG, котора  содержит ген, имеющий Asp вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF.
Е. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pTО17APG и получают трансформант, именуемый Е. coli НМ 10416.
Пример 7. Создание вектора, содержащего ген, кодирующий сигнальный пептид Gene III E. coli и модифицированный hG-CSF
(а) Создание вектора, содержащего ген, кодирующий арабинозный промотор и сигнальный пептид Gene III E. Coli.
Вектор, содержащий ген, кодирующий арабинозный промотор и сигнальный пептид Gene III E. coli (SEQ ID NO: 42), a также ген, кодирующий модифицированный hG-CSF, получают следующим образом:
Сайт рестрикции NcoI
Плазмиду pBAD gIIIA (Invitrogen, США), содержащую ген, кодирующий арабинозный промотор и сигнальный пептид Gene III, расщепл ют при помощи NcoI, одноцепочечные ДНК удал ют при помощи ДНК-полимеразы Кленова и получают двухцепочечную ДНК с "тупыми" концами, которую затем расщепл ют при помощи BgIII, получа  при этом фрагмент вектора с "тупым" концом и "липким" концом.
Вектор pT-CSF, полученный в примере 1, подвергают PCR, использу  смысловую затравку (SEQ ID NO: 46), имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую со 2-ой по 9-ую аминокислоты hG-CSF (SEQ ID NO: 45), и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 47), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают фрагмент ДНК с "тупыми" концами, содержащий ген hG-CSF и сайт рестрикции BamHI у карбоксильного конца. Полученный фрагмент затем расщепл ют при помощи BamHI, получа  фрагмент гена hG-CSF с "тупым" концом и "липким" концом.
Фрагмент гена hG-CSF встраивают в созданный выше вектор, получа  таким образом вектор pBADG, который содержит ген, кодирующий сигнальный пептид Gene III E. coli и hG-CSF (SEQ ID NO: 48).
На фиг.8 показан вышеописанный способ создани  вектора pBADG.
E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pBADG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli НМ 10501.
(b) Получение [Met2, Val3] hG-CSF
Плазмиду pBAD gIIIA (Invitrogen, США) расщепл ют при помощи NcoI и BgIII и получают фрагмент, имеющий два "липких" конца.
Вектор pT-CSF, полученный в примере 1, подвергают PCR, использу  смысловую затравку (SEQ ID NO: 50), имеющую нуклеотидную последовательность, кодирующую с 1-ой по 9-ую аминокислоты [Met2, Val3] hG-CSF (SEQ ID NO: 49), и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 51), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают фрагмент ДНК с "тупыми" концами, содержащий ген hG-CSF и сайт рестрикции BamHI у карбоксильного конца, который затем расщепл ют при помощи NeoI и BamHI, получа  таким образом фрагмент гена hG-CSF, имеющий два "липких" конца.
Сайт рестрикции NcoI
Фрагмент гена hG-CSF встраивают в созданный выше вектор и получают вектор pBAD2M2VG, содержащий ген, кодирующий сигнальный пептид Gene III E. coli, и Met и Val вместо 2-ой и 3-ей аминокислот hG-CSF (SEQ ID NO: 52).
На фиг.9 показан вышеописанный способ создани  вектора pBAD2M3VG.
E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pBAD2M3VG и получают трансформант, обозначаемый как E. coli HM 10510, который задепонирован в Корейском центре регистрации культур микроорганизмов (КССМ) 24 марта 1999 г. под номером доступа КССМ-10153.
(с) Получение [Ser17] hG-CSF
Вектор pBADG, полученный в пункте (а), подвергают PCR, использу  смысловую затравку (SEQ ID NO: 32), предназначенную дл  замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Ser, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 33), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.
Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производ т определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получа  таким образом плазмиду pBAD17SG, котора  содержит ген, имеющий Ser вместо 17-ой аминокислоты hG-CSF.
Е. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pBAD17SG и получают трансформант, обозначаемый как Е. coli HM 10511.
(d) Получение [Met2, Val3, Serl7] hG-CSF
Bектор pBAD2M3VG, полученный в пункте (b), подвергают PCR, использу  смысловую затравку (SEQ ID NO: 32), предназначенную дл  замены 17-го кодона hG-CSF кодоном Ser, и комплементарную антисмысловую затравку (SEQ ID NO: 33), в соответствии со способом, описанным на стадии 4 примера 2, и получают модифицированную плазмиду.
Е. coli XL-1 синий (Novagen, США) трансформируют модифицированной плазмидой. Производ т определение последовательности оснований ДНК, выделенной из трансформированных колоний, получа  таким образом плазмиду pBAD2M3V17SG, котора  содержит ген, имеющий Met, Val и Ser соответственно вместо 2-ой, 3-ей и 17-ой аминокислот hG-CSF.
E. coli BL21(DE3) (Stratagene, США) трансформируют вектором pBAD2M3V17SG и получают трансформант, именуемый как E. coli HM 10512.
Пример 8. Получение hG-CSF
Трансформанты, полученные в примерах 2-7, культивируют в среде LB (1% бактотриптона, 0,5% бактодрожжевого экстракта и 1% NaCl) и затем инкубируют в присутствии индуктора экспрессии (IPTG) в течение 3 часов или культивируют без IPTG в течение более 15 часов. Все культуры центрифугируют со скоростью 6000 оборотов/мин в течение 20 минут дл  осаждени  бактериальных клеток, после чего осадок суспендируют в 1/10 объема изотонического раствора (20% сахарозы, 10 мМ трис-Сl буферного раствора, содержащего 1 мМ EDTA, рН 7,0). Суспензию оставл ют выстаиватьс  при комнатной температуре в течение 30 минут, затем центрифугируют со скоростью 7000 оборотов/мин в течение 10 минут и собирают бактериальные клетки. Полученные клетки вновь суспендируют в дистиллированной воде при 4°С, центрифугируют со скоростью 7000 оборотов/мин в течение 10 минут и получают супернатант в виде раствора периплазмы. Содержание hG-CSF в растворе периплазмы определ ют методом ELISA (Kato, К. et al., J. Immunol., 116, 1554 (1976)), использу  антитело против hG-CSF (Aland, США), которое вычисл ют в виде количества hG-CSF, продуцируемого в 1 л культуры. Результаты приведены в таблице.
Пример 9. Очистка hG-CSF
Трансформант Е. coli НМ 10411, полученный в примере 6(b), культивируют в среде LB, после чего культуру центрифугируют со скоростью 6000 оборотов/мин в течение 20 минут и собирают клетки. Выполн   способ по примеру 8, из клеток получают раствор периплазмы.
Раствор периплазмы довод т до рН 5,0-5,5, адсорбируют в колонке с СМ-сефарозой (Pharmacia Inc., Швеци ), предварительно уравновешенной до рН 5,3, и промывают колонку 25 мМ NaCl. hG-CSF элюируют, последовательно добавл   в колонку буферные растворы, содержащие 50 мМ, 100 мМ и 200 мМ NaCl, и фракции, содержащие hG-CSF, собирают и объедин ют.
Объединенные фракции подвергают хроматографии на колонках с фенилсефарозой (Pharmacia Inc., Швеци ), получа  при этом [Ser17] hG-CSF с чистотой 99%.
Далее вышеописанный способ выполн ют, использу  трансформанты Е. coli НМ 10311, НМ 10409, НМ 10411, НМ 10413, HМ 10414, НМ 10415, НМ 10510 и НМ 10512, полученные соответственно в примерах 3, 4, 6(b), 6(с), 6(d), 6(е), 7(b) и 7(d).
Каждую очищенную фракцию hG-CSF подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натри  (SDS-PAGE) с целью определени  чистоты и примерной концентрации hG-CSF и затем анализируют методом ELISA дл  определени  точной концентрации hG-CSF в растворе периплазмы. В качестве контрольного вещества используют Met-hG-CSF (Kirin amgen).
На фиг.10а приведены результаты SDS-PAGE, где дорожка 1 соответствует Met-G-CSF, дорожка 2 соответствует раствору трансформанта Е. coli НМ 10411 в периплазме и дорожка 3 соответствует очищенному [Ser17] hG-CSF. Как показано на фиг.10b, молекул рна  масса [Ser17] hG-CSF аналогична молекул рной массе hG-CSF дикого типа и раствор трансформанта Е. coli НМ 10411 в периплазме характеризуетс  высоким содержанием [Ser17] hG-CSF.
Кроме того, производ т определение N-концевых аминокислотных последовательностей разных hG-CSF и нуклеотидных последовательностей, кодирующих с 1-ой по 32-ую аминокислоты, полученные с использованием трансформантов НМ 10311, НМ 10409, НМ 10411, НМ 10413, НМ 10414, НМ 10415, НМ 10510 и НМ 10512, приведенных соответственно в SEQ ID NOS: 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 и 70. Полученный результат показывает, что модифицированный hG-CSF по насто щему изобретению не имеет остатка метионина у N-конца.
Нитроцеллюлозный фильтр (Bio-Rad Lab., США) смачивают буферным раствором дл  блоттинга (170 мМ глицина, 25 мМ трис HCl (рН 8), 20% метанола) и белки, отделенные на геле, анализируют методом вестерн-блоттинга на нитроцеллюлозном фильтре (Bio-Rad Lab., США) в течение 3 часов. Фильтр выдерживают в 1% казеине в течение 1 часа и трижды промывают PBS, содержащим 0,05% Tween 20. Фильтр помещают в раствор козьего анти-G-CSF антитела (R&D System, AB-214-NA, США), разведенный PBS, и подвергают взаимодействию при комнатной температуре в течение 2 часов. После окончани  реакции фильтр трижды промывают раствором PBST, чтобы удалить непрореагировавшее антитело. Добавл ют конъюгированный с пероксидазой хрена кроличьего антикозьего IgG(Bio-Rad Lab., США), разведенный PBS, и подвергают взаимодействию при комнатной температуре в течение 2 часов. Фильтр промывают PBST и добавл ют раствор пероксидазы из набора веществ (Bio-Rad Lab., США) дл  осуществлени  окрашивани . Результаты вышеописанного вестерн-блоттинга приведены на фиг.10b, где дорожка 1 соответствует положительному контролю, Met-G-CSF, и дорожка 2 соответствует очищенному [Ser17] hG-CSF. Как показано на фиг.10b, молекул рна  масса [Ser17] hG-CSF равна молекул рной массе hG-CSF дикого типа.
Пример 10. Клеточна  активность hG-CSF и модифицированного hG-CSF
5
4
2
Линию клеток HL-60 (ATCC CCL-240, полученную из костного мозга белой 36-летней женщины, страдающей промиелоцитарным лейкозом) культивируют в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной тел чьей сыворотки, довод т до 2,2×10 клеток/мл и добавл ют DMSO (диметилсульфоксид, со степенью чистоты дл  культивировани /SIGMA) до концентрации 1,25% (об./об.). В 96-луночный планшет (Corning/96-луночный планшет с низкой степенью испарени ) добавл ют 90 мкл полученного раствора в количестве 2×10 клеток/лунку и инкубируют при 37°С и 5% СО в течение 48 часов.
Все модифицированные [Ala17] hG-CSF, [Gly17] hG-CSF, [Ser17] hG-CSF и [Thr17] hG-CSF развод т в средах RPMI 1640 до концентрации 500 нг/мл и 10 раз последовательно развод т двукратным количеством среды RPMI 1640.
Полученный раствор добавл ют в лунки в количестве 10 мкл/лунку и инкубируют при 37°С в течение 48 часов. В качестве положительного контрол  используют коммерчески доступный hG-CSF (Jeil Pharmaceutical).
Увеличенную концентрацию линии клеток определ ют, использу  коммерчески доступный титр клеток CellTiter96™ (№ по каталогу G4100, Promega), на основании измеренной оптической плотности при 670 нм.
Как показано на фиг.11, клеточна  активность модифицированных hG-CSF аналогична или выше, чем у положительного контрольного вещества, hG-CSF дикого типа.
Очевидно, что помимо описанных и проиллюстрированных вариантов осуществлени  данного изобретени  возможны разные изменени  и модификации в пределах насто щего изобретени , которые ограничиваютс  только объемом прилагаемой формулы изобретени .
Будапештский договор о международном признании регистрации микроорганизмов при проведении патентной экспертизы приведен в конце описани .
Список последовательностей приведен в конце описани .