КОНТРОЛЬ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ БЕЛКА И КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, КАСАЮЩИЕСЯ ЭТОГО

1. Способ уменьшения уровня гликозилирования белка, указанный способ включает экспрессию белка, содержащего, по крайней мере, один сайт гликозилирования в клетке-хозяине, выращиваемой в культуре в присутствии ингибитора гликозилирования в количестве, ингибирующем гликозилирование, где указанный белок включает более низкий уровень гликозилирования по сравнению с другим идентичным белком, продуцируемым в другой идентичной клетке-хозяине, выращиваемой при других идентичных условиях в отсутствие указанного ингибитора, таким образом контролируя уровень гликозилирования указанного белка.
2. Способ по п.1, где указанный сайт гликозилирования находится в лигандсвязывающем сайте или антигенсвязывающем сайте.
3. Способ по п.2, где указанный уровень гликозилирования выбирают из группы, включающей сайт гликана, расположенный в указанном сайте гликозилирования и величину гликозилирования в указанном сайте гликозилирования.
4. Способ по п.3, где указанный сайт гликозилирования выбирают из группы, включающей O-связанный сайт гликозилирования и N-связанный сайт гликозилирования.
5. Способ по п.4, где указанный сайт гликозилирования представляет собой N-связанный сайт гликозилирования, и, кроме того, где указанный сайт гликозилирования включает аминокислотную последовательность аспарагин-Х-серин или аспарагин-Х-треонин, где Х является любой аминокислотой, за исключением пролина.
6. Способ по п.5, где указанный ингибитор гликозилирования представляет собой, по крайней мере, один ингибитор, выбираемый из группы, включающей туникамицин, гомолог туникамицина, стрептовирудин, микоспоцидин, амфомицин, цушимицин, антибиотик 24010, антибиотик ММ 19290, бацитрацин, коринетоксин, шоудомицин, дуимицин, 1-дезоксиманноноджиримицин, дезоксиноджиримицин, N-метил-1-дезоксиманноджиримицин, брефелдин А, аналог глюкозы, аналог маннозы, 2-дезокси-D-глюкозу, 2-дезоксиглюкозу, D-(+)-маннозу, D-(+) галактозу, 2-дезокси-2-фтор-D-глюкозу, 1,4-дидезокси-1,4-имино-D-маннит (DIM), фторглюкозу, фторманнозу, UDP-2-дезоксиглюкозу, GDP-2-дезоксиглюкозу, ингибитор гидроксиметилглутарил-СоА редуюазы, 25-гидроксихолестерол, гидроксихолестерол, сваинсонин, циклогексимид, пуромицин, актиномицин D, моненсин, м-хлоркарбонилцианидфенилгидразон (СССР), компактин, доличил-фосфорил-2-дезоксиглюкозу, N-ацетил-D-глюкозамин, гигоксантин, тимидин, холестерол, глюкозамин, маннозамин, кастаноспермин, глутамин, бромокондуритол, кондуритолэпоксид, производное кондуритола, гликозилметил-п-нитрофенилтриазен, β-гидроксинорвалин, трео-β-фтораспарагин, δ-лактон D-(+)-глюконовой кислоты, ди(2-этилгексил)фосфат, трибутилфосфат, додецилфосфат, 2-диметиламиноэтиловый эфир (дифенилметил)-фосфорной кислоты, [2-(дифенил фосфинилокси)этил]триметиламмония йодид, йодацетат и фторацетат.
7. Способ по п.6, где указанный ингибитор гликозилирования представляет собой 2-дезокси-D-глюкозу.
8. Способ по п.7, где указанное количество, ингибирующее гликозилирование, находится в интервале приблизительно от 0,5 г/л до 3 г/л.
9. Способ по п.8, где указанный способ дополнительно включает поддержание концентрации глюкозы в указанной культуре в интервале приблизительно от 0,05 г/л до 10 г/л.
10. Способ по п.8, где клетку-хозяин выбирают из группы, включающей дрожжевую клетку, клетку насекомого и клетку млекопитающего.
11. Способ по п.10, где указанную клетку-хозяин млекопитающего выбирают из группы, включающей СНО клетку, NS0 клетку, NS0/1, Sp2/0, клетку человека, НЕК 293, ВНК, COS, Hep G2, PER.C6, COS-7, TM4, CV1, VERO-76, MDCK, BRL 3А, W138, ММТ 060562, TR1, MRC5 и FS4.
12. Способ по п.11, где указанная клетка-хозяин представляет собой СНО клетку.
13. Способ по п.12, где указанный сайт гликозилирования представляет собой, по крайней мере, один сайт гликозилирования, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, включающей аспарагин-изолейцин-треонин (NIT), аспарагин-глицин-серин (NGS), аспарагин-серин-треонин (NST) и аспарагин-треонин-серин (NTS).
14. Белок, продуцируемый согласно способу по п.10.
15. Белок, продуцируемый согласно способу по п.13.
16. Белок по п.15, где указанный белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающую часть, и, кроме того, где указанное антитело представляет собой античеловеческое IgE антитело.
17. Белок по п.16, где указанное антитело представляет собой человеческое антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотною последовательность SEQ ID NO:8, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.
18. Белок по п.17, где указанное антитело включает, по крайней мере, один N-связанный сайт гликозилирования, который не занят и/или содержит, по крайней мере, на один углеводный заместитель меньше, чем указанное другое идентичное антитело, продуцируемое в отсутствие указанного ингибитора гликозилирования, где указанный сайт выбирают из группы, включающей сайт гликозилирования по аспарагину 73 (N73) и сайт гликозилирования по аспарагину 301 (N301) тяжелой цепи относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8.
19. Белок по п.18, где указанное антитело включает N-связанный сайт гликозилирования по аспарагину 73, который не занят.
20. Белок по п.15, где указанный белок включает лигандсвязывающий сайт (LBS) рецептора конечных продуктов гликации (RAGE), включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, включающей SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15.
21. Белок по п.20, где указанный белок представляет собой RAGE гибридный белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 без сигнальной последовательности, которая включает от аминокислотного остатка номер 1 до аминокислотного остатка номер 23, где указанный гибридный белок лишен терминального лизинового остатка (Lys438).
22. Белок по п.21, указанный RAGE гибридный белок, содержащий, по крайней мере, один N-связанный сайт гликозилирования, который не занят, и/или содержит, по крайней мере, на один углеводный заместитель меньше, чем другой идентичный RAGE гибридный белок, продуцируемый в отсутствие указанного ингибитора гликозилирования, где указанный сайт представляет собой, по крайней мере, один сайт, выбираемый из группы, включающей аминокислотный остаток аспарагина под номером 2 (N2), аминокислотный остаток аспарагина под номером 58 (N58) и аминокислотный остаток аспарагина под номером 288 (N288), все касательно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 без сигнальной последовательности (аминокислоты 1-23).
23. Белок по п.22, где указанный белок включает, по крайней мере, два N-связанных сайта гликозилирования, которые не заняты, и/или содержат, по крайней мере, на один углеводный заместитель меньше.
24. Белок по п.22, где указанный белок включает три N-связанных сайта гликозилирования, по крайней мере, один из которых не занят, и/или содержит, по крайней мере, на один углеводный заместитель меньше.
25. Белок по п.18, где указанный белок проявляет увеличенное связывание с антигеном по сравнению с указанным другим идентичным белком, продуцируемым в отсутствие указанного ингибитора.
26. Белок по п.22, где указанный белок проявляет увеличенное связывание с RAGE лигандом по сравнению с указанным другим идентичным белком, продуцируемым в отсутствие указанного ингибитора.
27. Способ по п.11, указанный способ включает также температурный сдвиг от температуры в интервале приблизительно от 34°С до 39°С до температуры в интервале приблизительно от 28°С до 33°С.
28. Способ по п.27, указанный способ включает температурный сдвиг от температуры в интервале приблизительно от 34°С до 37°С до температуры в интервале приблизительно от 30,5°С до 31,5°С.
29. Фармацевтическая композиция, которая содержит белок по п.14 и фармацевтически приемлемый носитель.
30. Фармацевтическая композиция, которая содержит белок по п.15 и фармацевтически приемлемый носитель.
31. Композиция, которая содержит количество гибридного белка, где гибридный белок включает RAGE полипептид, связанный с иммуноглобулиновым полипептидом,
a) где RAGE полипептид включает фрагмент RAGE человека (SEQ ID NO:3), где фрагмент RAGE человека включает лигандсвязывающий сайт и, по крайней мере, один аминокислотный остаток, который может быть гликозилирован,
H
H
H
b) где иммуноглобулиновый полипептид включает С2 домен или часть С2 домена иммуноглобулина и С3 домен иммуноглобулина, и
c) где N-терминальный остаток иммуноглобулинового полипептида связан с С-терминальным остатком RAGE полипептида; и
где, по крайней мере, 0,5% гибридного белка является агликозилированным.
32. Композиция по п.31, где, по крайней мере, 30% от общего количества гибридного белка является агликозилированным.
33. Композиция по п.31, где процент гибридного белка в полностью гликозилированной форме меньше, чем процент гибридного белка во всех неполностью гликозилированных формах.
34. Композиция по п.31, где гибридный белок включает, по крайней мере, три аминокислотных остатка, которые могут быть гликозилированы, где первый потенциальный сайт гликозилирования представляет собой аминокислотный остаток RAGE лигандсвязывающего сайта, вторым потенциальным сайтом гликозилирования является аминокислотный остаток RAGE полипептида и третьим потенциальным сайтом гликозилирования является аминокислотный остаток иммуноглобулинового полипептида.
35. Композиция, которая содержит белок, содержащий, по крайней мере, один потенциальный сайт гликозилирования, где количество полностью гликозилированного белка меньше, чем количество менее полного гликозилированного белка, и также содержит фармацевтически приемлемый носитель.
36. Композиция по п.35, где указанный белок включает два потенциальных сайта гликозилирования, и где количество полностью гликозилированного белка меньше, чем объединенное количество белка, содержащего один сайт, который является негликозилированным и/или включает более низкий уровень гликозилирования, и количество белка, содержащего два сайта, которые являются негликозилированными и/или содержат более низкий уровень гликозилирования.