ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО
ANTIVIRAL AGENT

Изобретение относится к новым биологически активным химическим соединениям, обладающим противовирусной активностью, может применяться в медицине и ветеринарии для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых патогенными для человека, лабораторных и домашних животных вирусами, в частности ортопоксвирусами.
Наиболее опасными для человеческой популяции из-за чрезвычайно высокой патогенности, многообразия и эпидемиологических показателей являются вирусы рода ортопоксвирусов (семейство Poxviridae, род Orthopoxvirus). В последние годы неожиданную остроту и актуальность приобрела проблема натуральной оспы, поскольку вакцинация населения с 1980 г. не проводится, появилась значительная прослойка населения без иммунитета или с ослабленным иммунитетом и отсутствуют гарантии полного исчезновения возбуждающих это заболевание вирусов, а также потенциальной возможности несанкционированной утечки вирусного материала из мест его официального хранения. Более того, в условиях постоянного роста категорий населения с иммунодефицитными состояниями сама идея вакцинации живым вирусом осповакцины становится проблематичной, и весьма важное значение приобретает задача успешного купирования поствакцинальных осложнений, а также вспышек заболеваний, вызванных другими ортопоксвирусами, патогенными для человека, с помощью высокоэффективных химиотерапевтических препаратов. Хорошо известна высокая патогенность вирусов оспы обезьян, оспы коров, относящихся к тому же роду Orthopoxvirus и способных вызывать заболевание у людей со смертельным исходом. Так, в последнее время в Африке, особенно в районах с высоким процентом ВИЧ-инфицированных отмечаются вспышки оспы обезьян (летальность достигает 10-20%). Широкое распространение вируса оспы обезьян по территории США в 2003 году посредством луговых собачек также показывает совершенно необычный эпидемический потенциал ортопоксвирусов. Кроме того, существует реальная возможность селекции новых вариантов ортопоксвирусов в природных условиях, а также создания новых генетических вариантов ортопоксвирусов с необычными свойствами. Возможность такого подхода была продемонстрирована в лабораторных условиях для маловирулентного штамма вируса оспы мышей, который после генетических манипуляций стал патогенным для этих животных.
В настоящее время фактически отсутствуют эффективные средства специфической профилактики и лечения заболеваний, вызываемых вирусами рода ортопоксвирусов, поэтому поиск и создание высокоэффективных противовирусных препаратов, обладающих высокой активностью, низкой токсичностью и продолжительным действием в отношении ортопоксвирусов, является важной задачей для обеспечения безопасности здоровья и жизни людей.
Предшествующий уровень техники
Известен препарат метисазон (выпускается также под названиями Кемовиран (Kemoviran); Марборан (Mar-Boran); Вирузон (Viruzon)), который обладает невысокой профилактической активностью в отношении вируса натуральной оспы.

Известен препарат цидофовир (Vistide), который проходит в настоящее время исследования как профилактический или лечебный препарат, но пока его исследования не закончены. На фармацевтическом рынке в настоящее время практически нет препаратов, активных в отношении вирусов группы оспы, в этой связи разработка таких веществ может стать важным шагом в обеспечении фармакологической безопасности жизни людей.
Известно, что производные адамантана являются потенциальными источниками веществ с противовирусными свойствами. В частности, ингибиторы вируса осповакцины выявлены в ряду адамантоил-1-гидразинов (Гужова С.В., Даниленко Г.И., Коробченко Л.В., Денисова Л.В., Андреева О.Т., Бореко Е.И., Даниленко В.Ф., Баклан В.Ф. Ингибиторы вируса вакцины в ряду адамантоил-1-гидразинов // Физиол. Активн. В-ва. Киев: Наукова думка. 1986. вып.18. С.24). Изомерные 1-(аминобензоил)аминоадамантаны наряду с действием на различные типы вирусов проявляют умеренную активность в отношении вируса осповакцины (Вотяков В.И., Андреева О.Т., Кицара М.С. и др. // В сб.: Физиологически активные вещества. Киев. 1978. Вып.10. С.88). Опубликованы данные о выраженном ингибирующем действии на размножение вирусов осповакцины замещенных аминоацетиладамантиламинов, аминоалкоксиацетиладамантиламинов и тромантадина (May G., Peteri D. // Arzneimitt. - Forsch. 1973. Bd.23. N.5. S.718). Широкий ряд гидрокси-, азотсодержащих и серосодержащих функциональных производных адамантанового ряда проявил слабую и умеренную степень активности против вируса осповакцины (Климочкин Ю.Н., Леонова М.В., Коржев И.Р., Моисеев И.К., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Бореко Е.И., Николаева С.Н. // Хим.-фарм. журнал. 1992. N.7-8. С.58; Климочкин Ю.Н., Моисеев И.К., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Бореко Е.И. // Хим.-фарм. журнал. 1991. Т. 25. N. 7. С.46; Климочкин Ю.Н., Моисеев И.К., Абрамов О.В., Владыко Г.В., Коробченко Л.В., Бореко Е.И. // Хим.-фарм. ж. 1991. Т.25. N.7. С.49).
Недостатком вышеперечисленных аналогов является невысокая активность соединений в отношении вируса осповакцины.
Среди производных адамантана известно биологически активное соединение 1-адамантаноилгидразон α-азидометил(1-адамантил)кетона (прототип), обладающее противовирусной активностью в отношении вируса осповакцины (Авторское свидетельство СССР №1568481, МПК C07D 253/06, опубл. 2006).
Однако указанное соединение не изучалось на предмет противовирусной активности в отношении вируса оспы коров, вируса оспы обезьян, вируса оспы мышей и других ортопоксвирусов. К недостаткам этого соединения следует отнести также и недостаточно высокую эффективность в отношении вируса осповакцины.
1
2
Известны 3-фенил-6-R-7-R-1,2,4-бензотриазины (соединение СК-29 и его производные), обладающие противовирусной активностью, в частности в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека (патент РФ №2252218, МПК C07D 253/10, A61K 31/53, опубл. 20.05.2005) [1]. Однако и эти химические соединения обладают недостаточной противовирусной активностью и невысоким индексом селективности в отношении ортопоксвирусов.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является химическое соединение 4-трифторметил-N-(3,3а,4,4а,5,5а,6,6а-октагидро-1,3-диоксо-4,6-этеноциклопроп [f]изоиндол-2(1Н)-ил)бензамид (ST-246), обладающий противовирусной активностью в отношении ортопоксвирусов с высоким индексом селективности (заявка США №20060235051, МПК A61K 31/4439, C07D 403/02, опубликовано 19.10.2006 г.) [2]. Указанное химическое соединение имеет достаточно сложную двухстадийную технологию получения, что повышает стоимость получения данного продукта.
Другим важным обстоятельством является то, что опыт использования различных противовирусных средств показывает (а) необходимость использования комбинации нескольких препаратов для повышения эффективности лечения вирусной инфекции и (б) легкость появления новых вариантов вирусов, устойчивых к действию монопрепарата, и (с) высокую токсичность для организма многих антивирусных препаратов. Это привело к тому, что для лечения ряда вирусных заболеваний, например ВИЧ-инфекции, используются одновременно 3-5 различных препаратов. Причем рекомендуется последовательное использование нескольких таких смесей для достижения максимального терапевтического эффекта и для предупреждения появления новых лекарственно устойчивых вариантов патогенных вирусов. Исследование прототипа заявления [2] показало, что лекарственно устойчивые к ST-246 ортопоксвирусы возникают чрезвычайно легко. Это является одним из существенных недостатков прототипа заявления. Преодолеть этот недостаток возможно только через создание новых высокоэффективных антивирусных препаратов для комплексной терапии ортопоксвирусных инфекций несколькими противовирусными препаратами.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение нового химического соединения, имеющего более простую (одностадийную) технологию получения, обладающего высоким индексом селективности и противовирусным действием, в отношении различных видов ортопоксвирусов, патогенных для человека, лабораторных и домашних животных.
2,6
8,10
2,6
8,10
Технический результат достигается новым биологически активным органическим соединением - 4-{3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0.0]додец-11-ен-4-ил}-4-азатетрацикло[5.3.2.0]додец-11-ен-3,5-дионом формулы I:
проявляющим противовирусную активность в отношении различных видов ортопоксивирусов, который может найти применение в медицинской и ветеринарной практике в качестве препарата для лечения широкого спектра ортопоксвирусных инфекций человека, лабораторных и домашних животных. Соединение I получают взаимодействием гидразина с 4,4а,5,5а,6,6а-гексагидро-4,6-этено-1H-циклопроп[f]изобензофуран-1,3(3aH)-дионом, взятыми в соотношении 1:2 в уксусной кислоте при 50-60°С в течение 2,5 часов по следующей схеме:
Сопоставительный анализ с аналогами показывает, что заявляемое соединение принципиально отличается тем, что является полициклическим, содержит в молекуле тетраацилированный гидразиновый фрагмент, оба атома азота которого являются частью гетероциклических - изоиндольных структур.
2,6
8,10
2,6
8,10
13
-1
3
3
22
20
2
4
2
Пример 1. Получение 4-{3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0.0]додецен-11-ен-4-ил}-азатетрацикло-4-[5.3.2.0.0]додецен-11-ен-3,5-диона. К охлажденному до 0°С раствору 7.6 г (40 ммолей) 4,4а,5,5а,6,6а-гексагидро-4,6-этено-1H-циклопроп[f]изобензофуран-1,3(3aH)-диона в 50 мл уксусной кислоты при перемешивании добавили по каплям в течение 7 мин 1,1 г (20 ммолей) 90% гидразин-гидрата. Образовался гомогенный раствор, из которого примерно через 10 мин начинает выпадать осадок. Суспензию перемешивали при 50-60°С 2,5 часа и еще 1 час при 20°С, выпавший осадок отфильтровали, промыли на фильтре водой (5 раз по 25 мл), сушили на воздухе до постоянного веса. Получили 7.0 г (93%) вещества в виде белых кристаллов; т.пл. 274°С (этанол). ПМР (300 Мгц, CDCl), δ, м.д.: 5.83 (дд, J=3.9, 3,9 Гц, 4Н), 3.39 (уш. м, 4Н), 3.08 (дд, J=3.5, 3,5 Гц, 4Н), 1.08 (уш. м, 4Н), 0.26 (м, 4Н). ЯМР С (300 Мгц, CDCl), δ, м.д.: 4.70, 9.77, 9.82, 33.66, 33.69, 44,31, 44.42, 127.92, 128.06, 172.12, 172.89. ИК-спектр (KBr), см: 731, 1188, 1297, 1319, 1734, 2953, 3018. Вычислено, %: С, 68.57; Н, 5.45; N, 7.27. CHNO·0.5HO. Найдено, %: С, 68.97; Н, 5.32; N, 7.26.
Предложенный способ получения соединения I отличается от прототипа [Пат. США N 2006/0235051; T.R.Bailey, S.R.Rippin et al, J. Med. Chem., V 50, N 7, 1442 (2007)] тем, что реакция проводится в уксусной кислоте при 50-60°С, не требует использования абсолютных растворителей и третичных аминов в качестве катализаторов.
Способ получения заявляемого вещества прост в исполнении, исходные вещества легко доступны, выход составляет 93% от теоретически рассчитанного. Предлагаемое соединение устойчиво на воздухе, легко растворимо в диметилформамиде и диметилсульфоксиде, мало растворимо в алифатических спиртах, ацетоне, воде, практически нерастворимо в эфире, гексане.
Пример 2. Исследование противовирусной активности заявляемого соединения. Для оценки противовирусной активности соединений использовали следующую методику. Культуру клеток Vero выращивали в лунках плоскодонных 96-луночных планшетов. В культуральную среду добавляли серийные разведения исследуемых соединений и соответствующий вирус. После инкубирования в течение 3-5 суток монослой клеток прокрашивали витальным красителем нейтральным красным, после удаления красителя и отмывки избытка красителя вносили лизирующий раствор и количество красителя, включенного в монослой клеток, учитывали на спектрофотометре при длине волны 490 нм. В качестве контролей использовали лунки планшета, в которые вирус не вносили (контроль токсичности соединений), в который вносили вирус без соединений (контроль вируса) и лунки, в которые не вносили ни вирус, ни соединения (контроль культуры клеток). Данная методика основана на способности тестируемых соединений предотвращать репродукцию вируса и его распространения от клетки к клетке, в связи с чем клетки не погибают и сохраняют способность фагоцитировать нейтральный красный. Результаты анализировали с помощью программы SoftMax (версия 4.0, Molecular Devices, Menio Park, USA).
В качестве исследуемых вирусов использовали патогенный для человека вирус оспы коров (штамм Гришак) и вирус осповакцины, штамм ЛИВП, используемый для вакцинации населения. Помимо ортопоксвирусов, патогенных для человека, для оценки противовирусной активности использовали вирус эктромелии (оспы мышей), штамм К-1.
Анализ полученных данных наглядно показывает, что заявляемое соединение (НИОХ-4) и соединение-прототип (ST-246) обладают высоким противовирусным действием, в частности в отношении ортопоксвирусов, патогенных для человека.
Как видно из данных таблицы 1, исследованные соединения (заявляемое НИОХ-4 и прототип ST-246) эффективно подавляют размножение ортопоксвирусов в культуре клеток: ингибируют размножение трех видов ортопоксвирусов в концентрациях 0,033-0,117 и 0,002-0.003 мкг/мл соответственно, значения которых по величине существенно превосходят препарат-аналог [1] на основе производных бензотриазинов, активная концентрация которого составляет 0.49-2.23 мкг/мл.
2,6
8,10
2,6
8,10
Таким образом, технический результат изобретения подтверждается тем, что заявляемое соединение 4-{3,5-Диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.0.0]додец-11-ен-4-ил}-4-азатетрацикло[5.3.2.0.0]додец-11-ен-3,5-дион формулы I проявляет высокую противовирусную активность по отношению к широкому ряду ортопоксвирусов и отличается от прототипа [Заявка на патент США №20060235051] тем, что является полициклическим, содержит в молекуле тетраацилированный гидразиновый фрагмент, оба атома азота которого являются частью гетероциклических - изоиндольных структур.
Пример 3. Оценка противовирусной активности заявляемого препарата (НИОХ-4) по отношению к вирусам: аденовирус человека 5-го серотипа, эховирус 12-го типа, вирус Западного Нила и вирус простого герпеса 2 типа.
50
2
50
Оценку противовирусной активности исследуемых соединений проводили на культурах клеток АД293 (аденовирус человека 5-го серотипа и эховирус 12-го типа) и Vero (вирус Западного Нила и вирус простого герпеса 2 типа) в 96-луночных планшетах. IC соединений в отношении вышеуказанных вирусов определяли посредством регистрации ингибирования вирусиндуцированного цитопатического эффекта в присутствии различных концентраций исследуемых препаратов (конечные концентрации в лунках микропланшет с клеточным монослоем 80, 40, 20, 10 и 5 мкг/мл). После добавления к клеткам исследуемых соединений в вышеуказанных концентрациях проводили инфицирование клеток различными вирусами. Для этого использовали инфицирующие дозы каждого вируса, вызывающие 90% цитопатический эффект через трое суток после инфицирования. После инкубации клеток в планшетах в течение 72 ч при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO, клетки фиксировали 5% раствором глутарового альдегида. Цитопатический эффект визуализировали окрашиванием клеток 0.1% раствором кристаллического фиолетового и регистрировали спектрофотометрически при 570 нм. IC рассчитывали согласно G. Yang et al., 2005.
Результаты, представленные в таблице 2, показали, что соединение НИОХ-4 фактически не ингибирует репликацию эховируса 12-го типа, аденовируса человека 5-го серотипа, вируса Западного Нила и вируса простого герпеса 2 типа. Препарат использовался в субтоксических концентрациях для этого типа клеток, что также дополнительно подтверждает нетоксичность препарата для клеток АД293. Отсутствие активности препарата НИОХ-4 в отношении двух типов ДНК-содержащих вирусов и двух типов РНК-содержащих вирусов говорит о том, что механизм действия препарата не связан с типом нуклеиновой кислоты.
50
Для препарата НИОХ-4 IC в отношении вируса осповакцины составляет 0.033 мкг/мл (Таблица 1), что показывает высокую специфичность действия препарата в отношении ортопоксвирусов и свидетельствует о высокой степени селективности препарата НИОХ-4 в отношении этой группы вирусов. Индекс селективности составил не менее 3000 для всех исследованных вирусов и вируса осповакцины.
Пример 4. Оценка токсического воздействия заявляемого препарата (НИОХ-4) на лабораторных животных.
7
Сравнительное исследование острой токсичности заявляемого соединения НИОХ-4 и соединения-прототипа (ST-246) проводили на модели беспородных белых мышей с привитыми опухолями мышиной саркомы TG-180. Используемая экспериментальная модель позволяет выявлять патологическое воздействие субтоксических доз исследуемых препаратов на организм лабораторных животных. Клетки мышиной саркомы TG180 эффективно прививаются половозрелым самкам с формированием быстро прогрессирующих асцитических опухолей, приводящих к летальному исходу. Саркому прививали самкам белых беспородных мышей массой 20-22 г посредством внутрибрюшинного введения (10 клеток на мышь в 0.5 мл физраствора). Через сутки группам мышей с привитыми опухолями (6 мышей на каждую группу) внутрибрюшинно вводили исследуемые соединения в дозе 5 или 1 мг/кг. Контрольной группе мышей с привитыми опухолями по той же схеме вводили физраствор. Наличие токсического воздействия определяли по степени влияния введения испытуемых соединений на сроки гибели животных, обусловленной развивающимся опухолевым процессом. Результаты представлены в таблице 3. Соединение-прототип ST-246 в дозе 5 мг/кг вызывает статистически достоверное снижение средней продолжительности жизни (СПЖ) мышей с привитой саркомой TG-180; введение соединения НИОХ-4 в обеих использованных дозах не влияет на сроки гибели мышей (СПЖ не отличается от таковой для группы контрольных мышей). Таким образом, на модели мышей с привитыми опухолями показано, что НИОХ-4 менее токсичен, чем соединение-прототип ST-246.
Таким образом, технический результат изобретения дополнительно подтверждается тем, что препарат НИОХ-4 при низкой токсичности для клеток млекопитающих еще обладает выраженной селективностью по отношению к трем видам ортопоксвирусов и не ингибирует репликацию других РНК- и ДНК-содержащих вирусов.
Таблица 3
Влияние введения заявляемого соединения НИОХ-4 и соединения-прототипа (ST-246) на сроки гибели мышей с привитыми опухолями мышиной саркомы TG-180
Препарат
Доза (мг/кг)
Средняя продолжительность жизни, сутки
НИОХ-4
5.0
25.5±3.0
То же
1.0
24.6±2.5
ST-246
5.0
16.0±1.5
То же
1.0
23.5±2.0
Контроль
25.2±2.5