УСТРОЙСТВО ДЛЯ СКАНИРОВАНИЯ БИОЧИПОВ

Полезная модель относится к устройствам флуоресцентного анализа материалов и может быть использована для анализа люминесцирующих биочипов (микрочипов), используемых для проведения исследований и серийных анализов в биологии и медицине.
Биочипом (микрочипом, белковым биочипом) называют матрицу с нанесенными молекулами белков или нуклеиновых кислот для одновременного проведения большого количества анализов в одном образце. Биочип представляет собой предметное стекло (слайд) размером, в частности, 76 мм на 25 мм с химически модифицированной подложкой, на которую в матричном порядке нанесены микрокапли (так называемые, «споты» - «spots»), содержащие белковые молекулы, например, антитела, в определенной концентрации. Как правило, споты имеют форму, близкую к кружкам диаметром от 20 мкм до 200 мкм. Споты обычно объединены в группы, «субэрреи», количество слотов в субэррее от 50 до 140. При проведении иммунных реакций белковые молекулы слотов связываются с молекулами аналита и с белковыми молекулами, меченными флуорофором (например, красители Cyanin 3 или Cyanin 5). Благодаря этому о результатах иммунометрических реакций можно судить по интенсивности флуоресценции слотов под воздействием возбуждающего флюоресценцию излучения, и с использованием заранее построенных калибровочных кривых определить наличие инфекции или степень прогрессирования воспалительного процесса /см., например, Васин А.В. и др. «Универсальный диагностический олигонуклеотидный микрочип для определения и субтипирования вируса гриппа А человека и животных» - по www.cyberLeninka.ru, 2013/.
1
2
Общий принцип флуоресцентного анализа, применяемый в современных считывателях биочипов, заключается в возбуждении флуоресценции на исследуемом образце подходящим по спектру и мощности источником излучения (полупроводниковые лазеры, светодиоды, ртутные лампы), причем используют оптическое (лазерное) излучение на волне λ, а флуоресцирует слот на волне λ, сканируют слот лазерным лучом с заданной скоростью, обеспечивают разделение полезного сигнала флуоресценции от фона (шума), выделяют фильтрацией необходимые области спектра флуоресценции и производят дальнейшую фото- или видеорегистрацию этого образца при помощи фотоприемных устройств с заданным коэффициентом усиления. В программно-управляемых устройствах далее производят цифровую обработку сигналов фотоприемных устройств для выделения пикселей, отображающих люминесцирующие споты, осуществляют их привязку к объекту исследований, производят расчет интенсивности флуоресценции каждого спота с учетом поправок на фон, анализируют полученные значения и проводят статистический анализ данных от слотов при проведении нескольких повторов измерений для повышения надежности результатов анализа.
Известны два типа устройств для люминесцентного анализа, в которых возбуждение флуоресценции производится сфокусированным пучком лазерного излучения (лазерные конфокальные микроскопы) или расфокусированным пучком лазерного излучения, причем лазерное сканирование объекта исследования может осуществляться как перемещением исследуемого объекта при воздействии лазерного излучения (предметного стола с объектом исследования), так и перемещением пятна засветки лазерным излучением неподвижного объекта исследования. При исследовании люминесценции биочипов технические особенности указанных типов устройств могут влиять на такие существенные характеристики исследования как информативность, повторяемость и достоверность результатов.
Известны приборы для флуоресцентного анализа биочипов, такие как серия приборов InnoScan 710-910 производства компании Innopsys (USA) / /www.Innopsys.com/en/lifesciences-products/microarrays/innoscan/innoscan-710/, или конфокальные сканеры биочипов серии ScanArray компании Perkin Elmer (USA), например, считыватель ScanArray Express /https://www.artisantg.com/Scientific/78869/Perkin Elmer Packard ScanArray Express Series Microarray Scanners/. Известные компьютеризированные приборы характеризуются высокой чувствительностью, широким динамическим диапазоном, воспроизводимостью результатов и высоким разрешением, что достигается, в частности, за счет использования оптимизированной конфокальной оптики, обеспечивающей разделение сигнала флуоресценции образца, возбужденного падающим на образец лазерным излучением, и флуоресценции фона, пространственную фильтрацию световых лучей с помощью конфокальной диафрагмы и получение изображения каждого из сканированных лазером элементов поверхности образца и их последующую регистрацию и программную обработку.
В указанных приборах исследуемый биочип освещают сфокусированным лазерным пучком, сфокусированное излучение формирует в плоскости биочипа световое пятно малого размера, как правило, существенно меньше размера спота, что обеспечивает высокую плотность мощности возбуждающего излучения и способствует увеличению интенсивности флуоресценции исследуемого объекта. Регистрирующим устройством выступает фотоприемник с диафрагмой, вырезающей зону регистрации размером порядка 5 мкм. Для получения флуоресцентного сигнала от всех слотов биочипа и его полного флуоресцирующего изображения производится механическое двух-координатное лазерное сканирование с шагом примерно 5 мкм путем перемещения предметного стола с расположенным в нем биочипом. Скорость сканирования, определяемая числом линий сканирования в секунду, зависит от требуемого разрешения в пикселе цифрового изображения спота, и к примеру, для сканера Innoscan 710 (производит обработку 1 слайда) она составляет 10-35 линий в секунду.
Использование в конфокальной оптике лазерных сканирующих микроскопов одноэлементных фотоприемников (чаще всего, ФЭУ) обеспечивает достижение предельно высокой чувствительности измерений, однако необходимость прецизионного сканирования приводит к значительной потере времени (характерное время эксперимента составляет 20-30 минут) и существенному удорожанию прибора из-за высокой стоимости точных механических устройств.
В простых оптических системах существует проблема обеспечения равномерности освещения объекта при лазерном сканировании, если требуется сканировать относительно большие площади поверхности объекта, что связано с расходимостью пучка лазерного излучения и неравномерностью плотности излучения по сечению пучка лазерного излучения, влиянием отражений лазерного излучения от поверхностей элементов конструкции, фоновой флуоресценции. Применительно к биочипам неравномерность освещения их поверхности способна привести к различным условиям возбуждения флуоресценции в слотах и искажению результатов исследования. Обеспечение равномерности освещения образца достигается, в частности, узкополосным фильтром или дихроичными зеркалами для пропускания только излучения лазера на длине волны возбуждения флуоресценции образца, который установлен между лазером и объектом /RU 133932, RU 153630/, и/или использованием набора источников оптического излучения (в т.ч., с системой световодов) для равномерного освещения биочипа /RU 148808, RU 153630/. Другой проблемой является обеспечение позиционирования пучка лазерного излучения на слотах, разделенных промежутками, при сканировании и выбор оптимального размера светового пучка, поскольку возможно возникновение паразитной флуоресценции.
Известен оптико-флуоресцентный сканер биочипов с автоматической фокусировкой возбуждающего флуоресценцию излучения, предназначенный для исследования одного чипа, который включает компьютеризированную систему управления элементами сканнера, источник излучения, объектив, располагаемый над биочипом, оптически связанный с устройством регистрации в виде ПЗС-камеры, а также механическое устройство подстройки фокуса объектива путем вращения линзы объектива с использованием приводного ремня для сохранения неизменным поля зрения объектива /CN 206974904 (U) «CCD biochip fluorescence scanner's automatic focusing device», G01N 21/64, публ. 06.02.2018/. Устройство является простым по структуре, автоматизированным, однако наличие механического узла в оптической системе может влиять на точность позиционирования оптического луча на отдельных участках биочипа и фоновую флуоресценцию, и, как итог, на информативность результатов исследований.
Известно устройство для сканирования биочипов /US 6329661 В1 «BIOCHIP SCANNER DEVICE», G01N 21/64, публ. 11.12.2001/, предназначенное для количественного исследования биочипа, содержащего множество линейных массивов однородных флуоресцентных мишеней (спотов), расположенных известным (равномерным) образом. Устройство включает лазер, модулятор (оптический прерыватель) лазерного луча, сканирующую головку для приема модулированного лазерного луча и фокусировки его в фокальное пятно выбранного размера и сканирующую механику, связанную со сканирующей головкой для перемещения ее относительно биочипа для направления фокусного пятна лазерного излучения на флуоресцентные мишени для их последовательного и поочередного освещения. Размер фокального пятна устанавливают близким, практически равным, размеру флуоресцентной мишени, при этом сфокусированный в фокальное пятно лазерный луч вызывает практически полное возбуждение освещенной флуоресцентной мишени при полной нечувствительности к внефокусному излучению. Сканирующая головка включает объектив, составленный из двух линз, и имеет поле зрения, также практически равное размеру флуоресцентной мишени, обеспечивает последовательное освещение флуоресцентных мишеней и передачу сигналов флуоресценции мишеней, которые последовательно поступают в канал регистрации флуоресценции. При этом и подача модулированного лазерного луча возбуждения флуоресценции в сканирующую головку и сбор флуоресценции от каждой мишени производится посредством оптического волокна. В качестве лазера используют твердотельный лазер с диодной накачкой, He-Ne лазер, диодный лазер и др., излучающие на длине волны возбуждения конкретного флуорофора. Сканирующая головка соединена с механическим устройством типа каретки, обеспечивающим ее перемещение в трех измерениях относительно неподвижного, размещенного на столе (с контролируемой температурой) биочипа: в плоскости стола по координатам X и У по сигналам контроллера, и вручную - по координате Z. Это позволяет реализовать метод линейного сканирования по строкам (Row Scanning - RS), в котором сканируемая область ограничена рядами массива биочипа, каждая строка сканируется в один проход лазерного луча, а размер лазерного луча сопоставляется с размером спота (флуоресцирующей мишени). Амплитуды пиков флуоресценции регистрируются при одной скорости сканирования и дают результат, полученный с одинаковой чувствительностью. Изменением скорости сканирования регулируется чувствительность устройства. Известное устройство характеризуется высокой надежностью и чувствительностью, обеспечивает равные условия освещенности каждого спота и исключения вклада фоновой флуоресценции, однако наличие механической системы перемещения сканирующей головки и лазерного луча заданной ширины при сканировании требуют исключительно точной механики и не исключают появления погрешностей в позиционировании лазерного луча на споте вследствие инерционности механической системы при высоких скоростях сканирования.
Известно портативное устройство для сканирования биочипов /US 6407395 В1 «Portable biochip scanner device», G01N 21/64, публ. 18.06.2002/, предназначенное для количественного исследования биочипа, содержащего линейный массив однородных флуоресцентных мишеней (спотов), расположенных известным (равномерным) образом. Устройство содержит лазер, систему линз для фокусирования лазерного излучения, оптоволокно для ввода сфокусированного лазерного излучения в линзу для коллимирования лазерного излучения возбуждения флуоресценции, дихроичное зеркало для отклонения коллимированного лазерного пучка на линзу-объектив для фокусировки лазерного луча возбуждения флуоресценции в фокальное пятно на биочипе, средство для подачи флуресцентного света от каждой флуоресцентной мишени из биочипа на детектор, который обеспечивает выход сигнала на средство для обработки и отображения выходного сигнала детектора. Биочип, содержащий линеаризованный ряд спотов (эррей), для сканирования размещен на основании, которое дискретно перемещается относительно пучка возбуждающего лазерного излучения. В устройстве использован твердотельный (диодный) лазер, излучающий на волне возбуждения конкретного флуорофора, работающий в режиме непрерывной волны, отношение фокусных расстояний линз для коллимирования луча и линзы-объектива выбирают таким образом, чтобы иметь диаметр пучка на биочипе, равный размеру элементов массива биочипа. Средство для подачи флуоресцентного света от каждой флуоресцентной мишени из биочипа на детектор образовано линзой-объективом, которая собирает и коллимирует флуоресцентное излучение от спотов, направляет его на дихроичное зеркало, пройдя которое свет попадает на эмиссионный (интерференционный) фильтр излучения, и линзу, фокусирующую свет на диафрагму (пинхол), отклоняющую рассеянный свет, который может создать паразитный фон. Блок обработки и отображения выходного сигнала флуоресценции спотов выполнено программно-ориентированным и включает фотоприемник (фотоумножитель), аналого-цифровой преобразователь (АЦП) и микропроцессор (компьютер), интегрирующий и отображающий сигнал, например, на дисплее и управляющий сканированием посредством команд.
Данное устройство реализует тот же принцип линейного дискретного сканирования, что и устройство по патенту US 6329661, однако оно рассчитано на одновременное исследование меньшего количества спотов (линеаризованный ряд спотов), обладает меньшими габаритами и более простой оптической схемой, однако относительное перемещение возбуждающего лазерного луча и установка его на споты производится путем смещения биочипа с использованием механических устройств, что также не исключает появления погрешностей в позиционировании лазерного луча на споте вследствие инерционности механической системы или вибраций, а следовательно, влияет на надежность и точность измерений сигнала флуоресценции. Кроме того, известное устройство обеспечивает только линейное сканирование, что сужает его эксплуатационные возможности.
Следует отметить, что использование механических системы перемещения исследуемых объектов в поле их облучения является превалирующим /см. например, RU 2371721, DE 10038080, CN 1731153, US 2005157300, US 2005233376 A
Известное устройство для сканирования биочипов, включающее лазерный источник излучения, коллиматор лазерного излучения, средство отклонения лазерного луча, фокусирующий объектив, держатель для установки биочипа для сканирования, линзу-объектив для сбора излучения флуоресценции от биочипа, фотоприемное устройство и блок управления и обработки выходного сигнала флуоресценции (включающее компьютер), является наиболее близким к предлагаемому техническому решению.
Заявляемое устройство решает задачу исключения механического управления позиционированием лазерного луча возбуждения флуоресценции спотов при двумерном сканировании биочипов, в том числе, линейном дискретном сканировании.
Задача решена тем, что в устройстве для сканирования биочипов, включающем лазерный источник излучения, коллиматор лазерного излучения, средство отклонения лазерного луча, фокусирующий объектив, держатель для установки биочипа при сканирования, линзу-объектив для сбора излучения флуоресценции от биочипа, фотоприемное устройство и блок управления и обработки выходного сигнала фотоприемного устройства, включающий компьютер с программными средствами, в соответствии с полезной моделью, средство для отклонения лазерного луча выполнено в виде двухкоординатной гальванометрической системы сканирования с двумя зеркалами и подключено к блоку управления, а фотоприемное устройство выполнено в виде матричного фотоприемника.
Кроме того, устройство является программно-ориентированным устройством для дискретного линейного сканирования биочипов.
Кроме того, биочип выполнен в виде упорядоченной совокупности линейных однородных массивов флуоресцирующих мишеней (спотов), размещенных на химической модифицированной поверхности основания.
Технический результат от использования заявляемого устройства состоит в обеспечении практической безинерционности сканирования биочипа в двух измерениях за счет использования гальванометрической системы сканирования, что обеспечивает высокую скорость и точность программируемой переустановки лазерного луча на нужные споты в условиях быстропротекающих процессов возбуждения и затухания флуоресценции. При этом расширяются возможности исследования, т.к. в известных технических решениях с механической системой позиционирования лазерного луча или биочипа не представляется возможным, при необходимости, перейти от возбуждения спота в одной линии к споту другой линии без прохождения всех промежуточных элементов ряда.
Блок-схема устройства представлена на фиг. 1, макет устройства (без внешнего корпуса) представлен на фиг. 2. Устройство содержит лазерный источник излучения (1), коллиматор лазерного излучения (2), двухкоординатную гальванометрическую систему сканирования с двумя зеркалами (3) и (4), фокусирующий объектив (5), линзу-объектив (6), матричный (многоэлементный) фотоприемник (7), а также блок управления и обработки выходного сигнала фотоприемного устройства, включающий компьютер с программными средствами (8), держатель образца с установленным в нем на время сканирования биочипом (9).
Устройство работает следующим образом. Лазерное излучение от лазера 1, работающего в непрерывном режиме, (например, диодный лазер) коллимируется в параллельный пучок с помощью коллиматора (2) и подается на первое зеркало гальванометрического сканатора (3), далее на второе зеркало гальванометрического сканатора (4), которые выполняют управляющие команды блока управления и обработки информации (8), а затем фокусируется на поверхность биочипа с помощью объектива (5) в световое фокальное пятно, размер которого близок к размеру спота и выбран таким образом, чтобы спот был освещен полностью (на практике - от 50 мкм до 200 мкм). Вращением зеркал (3) и (4), управляемым компьютером по программе, обеспечивается перемещение светового пятна в плоскости биочипа, размещенного на держателе (9). Фокусировка светового пятна на споте биочипа сопровождается возбуждением флуоресценции материала спота на длине волны излучения флуорофора. Излучение флуоресценции от спота является изотропным, но проходя через линзу-объектив (6), фокусируется и поступает на матричный фотоприемник (7), в котором оптический сигнал преобразуется в электрический и далее поступает в блок управления и обработки информации (8), где программно обрабатывается и представляется в форме таблиц, графиков, RGB-изображений и т.п.
2
Современные гальванометрические сканаторы обеспечивают высокую скорость сканирования (не менее 10 м/с), система сканирования позволяет мобильно перемещаться от одного спота к другому, а программное обеспечение позволяет синхронизировать процесс съемки отдельного кадра с интервалами освещения каждого спота. При этом матричный фотоприемник (7) позволяет регистрировать интенсивность флуоресценции от каждой точки спота и формировать его полное флуоресцентное изображение. В результате сложения всех кадров, на которых получено изображение отдельного спота, формируется изображение, на котором отображается флуоресценция всех исследуемых спотов биочипа. Поскольку данная система сканирования является практически безынерционной, временем перехода от спота к слоту можно пренебречь, и, таким образом, общее время исследования равно времени регистрации излучения флуоресценции одного спота, умноженному на число спотов. При высокой плотности мощности возбуждающего излучения удается обеспечить высокую чувствительности измерений при одновременном снижении времени регистрации излучения флуоресценции, например, на длине волны λ 543 нм для красителя Су 3, от единичного спота при его среднем диаметре порядка 50-100 мкм, до 1 секунды, при этом общее время анализа биочипа, например, стандартным размером 22×22 мм, как правило, не превышает двух минут.
Безинерционный гальванический сканатор с зеркалами (3) и (4) позволяет нужным образом позиционировать и фиксировать лазерный луч возбуждения флуоресценции в процессе поочередного освещения спотов и, тем самым, менять время экспозиции и регистрации флуоресценции текущего спота в соответствии с заданной программой и с учетом яркости флуоресценции исследуемых спотов, т.к. в большинстве реальных анализов яркость флуоресцирующих спотов может различаться на несколько порядков. Соответственно, для регистрации ярких спотов рационально использовать малое время экспозиции, а для слабо светящихся экспозицию, напротив, увеличить. Такой подход позволяет расширить динамический диапазон измерений и минимизировать время эксперимента.