Вольтамперометрическое исследование антиоксидантной активности жидких культур пропионовокислых бактерий

МИКРОБИОЛОГИЯ

УДК 579.0:579.872.1:57.013

ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ЖИДКИХ КУЛЬТУР

ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

Л.В. Драчёва*, Е.В. Дорожко*, О.А. Аврамчук*, Е.И. Короткова*,

Е.П. Рыжкова, Хао Ли, И.В. Данилова

Прямым высокочувствительным вольтамперометрическим методом установлено, что жидкие культуры штаммов Propionibacterium freudenreichii способны проявлять высокий анти-оксидантный эффект. Это позволило рассчитать величину кинетического критерия, количественно характеризующего антиоксидантную активность данных культур.

Ключевые слова: вольтамперометрический метод, Propionibacterium freudenreichii, жидкие культуры, антиоксидантная активность.

Propionibacterium freudenreichii

относится к группе так называемых классических или "молочных" пропионовокислых бактерий (ПКБ). По ряду свойств они близки к лактобациллам и би-фидобактериям, для которых ранее было установлено, что они обладают выраженными антиокси-дантными свойствами (Драчёва, 2005, 2007; Драчёва и др., 2008). Основным продуктом жизнедеятельности ПКБ является пропионовая кислота. Наряду с ней они активно продуцируют и такие жизненно важные экзометаболиты, как витамины группы В, в том числе В12 и фолиевую кислоту (Hugenholtz et al., 2002), а также свободные нуклеотиды (Иконников и др., 1982). Отличительной особенностью ПКБ является повышенное содержание в их клетках корриноидов, т.е. соединений группы витамина В12 (Рыжкова (Иордан), 2003).

Неоднозначность метаболизма ПКБ, возможность его перестроек впервые была выявлена при изучении влияния молекулярного кислорода на энергетический обмен этих бактерий. Пропионовокислое брожение (с участием витамина В12) является основным энергодающим процессом, однако определенный вклад в его протекание вносят фумаратное (анаэробное) и кислородное дыхание. Молекулярный кислород и витамин В12 служат факторами перестройки энергетического обмена.

Естественный высокий уровень корриноидов, на 2—3 порядка превышающий таковой у многих прототрофов, оказался существенным для аэротолерантности P. freudenreichii на минимальной среде (Рыжкова, 2003). Корриноиды — сложные биомоле-

кулы с уникальной кобальт-углеродной связью, обратимое расщепление которой определяет их множественные химические и биохимические функции. В защите клеток анаэробных прокариот возможно их участие как древних неспецифических фак-торов-антиоксидантов для тиоловых соединений. Возможно, это обусловлено особенностью генезиса ПКБ в условиях древней Земли. Вместе с тем ПКБ содержат ферменты, которые участвуют в антиокислительной защите собственных клеток. Среди них — флавиновые оксидазы, супероксиддисмута-за, каталаза, пероксидаза, цитохромы (Краева, Воробьева, 1981). Однако сами эти ферменты могут быть уязвимы при воздействии кислорода (Pritchard et al., 1977; Pritchard, Asmundson, 1980) и нуждаются в защите.

В связи с вышесказанным штаммы P. freudenreichii были выбраны нами в качестве объектов исследования. Это имеет и практическую направленность, поскольку ПКБ сейчас рассматривают в качестве пробиотиков и как факторы антимикробной защиты пищевых продуктов. Продуцируя экзоме-таболиты, такие как пропионовая и уксусная кислоты, диацетил, пропионицины, данные бактерии проявляют антимикробные свойства, подавляя рост бацилл разных видов, а также микроскопических грибов (Lind et al., 2007).

Активные формы кислорода (АФК) в умеренных концентрациях в живом организме выступают в роли медиаторов процессов передачи клеточного сигнала. Но в условиях повышенного содержания они оказывают повреждающее действие в виде избыточной концентрации свободных радикалов, по-

* Томский политехнический университет: 634035, г. Томск, пр-т Ленина, 43.

ражающих биомакромолекулы (белков, ДНК) и клетки организма, в первую очередь разрушая липиды их мембран. В ходе эволюции в организме человека возникла защитная антиоксидантная система, которая базируется на комплексе ферментов: оксидазы, супероксиддисмутазы, каталазы, а также витаминов А, С, Е и некоторых коферментов.

К антиоксидантам относится широкий круг органических соединений, обладающих антирадикальной и антиокислительной способностью. Разнообразие этих соединений обусловлено различиями в механизме их окисления-восстановления. Важно отметить, что для эффективного поддержания оптимальной концентрации АФК в организме человека, особенно при оксидативном стрессе (для защиты его естественной иммунной системы), целесообразно использовать экзогенные антиоксиданты, в том числе и микроорганизмы, обладающие такими свойствами.

Целью настоящей работы явилось исследование антиокислительных (антиоксидантных) свойств жидких культур пропионовокислых бактерий (двух штаммов Propionibacterium freudenreichii) при использовании высокочувствительного вольтамперо-метрического метода.

Материлы и методы

В работе использовали жидкие культуры штаммов Propionibacterium freudenreichii RVS-2-ims (I) и Propionibacterium freudenreichii RVS-4-irf (II), которые были изолированы из твердых сыров, идентифицированы (фенотипически и филогенетически) и депонированы в ВКПМ под номерами B-9653 and B-9654 соответственно.

Бактерии культивировали на глюкозо-минераль-ной (минимальной) питательной среде 72 ч при 30° при свободном доступе воздуха и при периодической нейтрализации образуемых кислот. Образцы для анализа были нейтральными (рН 6,8—7,0). Концентрация живых клеток в конце культивирования составляла (3—4) х 109 КОЕ/см3. Микроскопию клеток проводили с помощью микроскопа Laboval-4 (фирма "Karl Zeiss Jena", Германия). Выращенные культуры хранили более двух недель при 6°.

Для изучения антиоксидантной активности ПКБ использовали электрохимический метод катодной вольтамперометрии. Методика эксперимента заключалась в получении вольтамперограмм катодного восстановления кислорода с помощью портативного программируемого анализатора "Антиоксидант" (фирма "Полиант", г. Томск). Элетрохимическая ячейка прибора представляла собой стеклянный стаканчик, в который последовательно помещали фоновый электролит и анализируемые образцы биопрепаратов. В качестве фонового электролита был выбран фосфатный буфер (рН 6,86). В электрохими-

ческой ячейке также находился индикаторный ртут-но-пленочный электрод, хлорид-серебряный электрод сравнения и хлорид-серебряный вспомогательный электрод. Объемы отбираемых проб составляли 0,1; 0,5 и 1,0 см3. В работе использовали магнитную мешалку.

Ангиоксидантную активность образцов определяли, используя метод катодной вольтамперометрии, в частности процесс электровосстановления кислорода, ЭВ О2 (стадии 1—4). Он обладает рядом преимуществ, но главное — в его основе лежит модельная реакция ЭВ О2, протекающая на индикаторном электроде по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в тканях и клетках организма человека:

О2 + е ^ 02",

02" + Н+ ^ Н02,

Н02 + Н+ + е ^ Н202,

Н202 + 2Н+ + 2е ^ 2Н20.

В данном способе рассматривается одноэлект-ронное восстановление кислорода с образованием активных кислородных радикалов: 02" Н02 (стадии 1—3). Предполагается, что антиоксиданты, имеющие восстановительную природу, реагируют с кислородом и его активными радикалами на поверхности индикаторного электрода, что отражается в уменьшении катодного тока ЭВ О2 на ртутно-пле-ночном электроде в области потенциалов от 0 до —0,7 В по следующему механизму:

о2 + е ^ 02" + я-0Н ^ Н02 + я=0, Н02 + Я-0Н ^ Н202 + Я=0.

Описанным выше вольтамперометрическим методом исследовали антиоксидантные свойства образцов двух анализируемых культур ПКБ и среды, на которой культивировали бактерии, в качестве контроля.

Результаты и обсуждение

На рисунке представлены вольтамперограммы электровосстановления кислорода в отсутствие и в присутствии образцов культуры Р. frеudеnrеichii яу5-2-1ш8 при разбавлении 1 : 100 (рисунок, А), 1 : 20 (рисунок, Б) и 1:10 (рисунок, В) и различном времени проведения эксперимента (от 4 до 20 мин).

На примере исследованных образцов штамма видно, что они проявляют выраженную антиок-сидантную активность, уменьшая величину тока. При этом наиболее значительно эффект проявляется

13 ВМУ, биология, № 4

Вольтамперограммы электровосстановления кислорода в отсутствие (1) и в присутствии (2—6) образца Propionibacterium freudenre-ichii RVS-2-ims при разбавлении 1 : 100 (А), 1 : 20 (Б) и 1 : 10 (В) и при времени опыта t = 4 мин (2), t = 8 мин (3), t = 12 мин (4),

t = 16 мин

при наименьшем (1:10) разбавлении. Таким образом, чем выше концентрация культуры ПКБ в анализируемом образце, тем более высокую антиокси-дантную активность проявляет биопрепарат. Также следует отметить, что и питательная среда, хотя и в незначительной степени, но также обладает анти-оксидантными свойствами.

В результате проведенных исследований строили зависимость изменения предельного тока электровосстановления кислорода от времени протекания процесса.

На основании полученных данных была рассчитана количественная характеристика антиоксидант-ной активности ПКБ, в качестве которой использовали кинетический критерий К, мкмоль/дм3 • мин. Он отражает количество прореагировавших с анализируемым образцом кислородных форм во времени, следствием чего является эффективность взаимодействия образца с кислородными радикалами, которая определяется по формуле

K =

Со

t l1 I

Полученные результаты были обработаны статистически следующим образом:

К5Г — среднее значение кинетического крите-

рия: X =

X X

i=1

3

Si — стандартное отклонение одного определения:

Sr — относительное стандартное отклонение: * - $.

Рассчитанные значения кинетического критерия антиоксидантной активности для исследуемых образцов жидких культур ПКБ приведены в таблице.

Значения кинетического критерия антиоксидантной активности образцов жидких культур ПКБ и питательной среды

где Со2 — концентрация кислорода в фоновом растворе, мкмоль/дм3; // — текущее значение предельного тока ЭВ О2 в присутствии анализируемого образца ПКБ, мкА; 1о — значение предельного тока ЭВ О2 в отсутствие анализируемого образца ПКБ, мкА; t — время протекания процесса, мин.

Наименование образца Разбавление мкмоль/дм3 • мин Sr

P. freudenreichii RVS-2-ims:

Образец 1а 1 : 100 0,41 0,084

1 : 20 1,62 0,071

1 : 10 4,12 0,031

Окончание таблицы

Наименование образца Разбавление Дуг, мкмоль/дм3 • мин Sr

Образец 1б 1 : 100 0,53 0,047

1 : 20 1,84 0,038

1 : 10 1,84 0,014

P. freudenreichii RVS-4-irf:

Образец 1а 1 : 100 0,51 0,031

1 : 20 1,53 0,016

1 : 10 3,68 0,020

Образец 1б 1 : 100 0,41 0,057

1 : 20 1,56 0,049

1 : 10 3,82 0,020

Питательная среда 1 : 100 0,12 0,021

1 : 20 0,24 0,023

1 : 10 0,38 0,022

Представленные данные свидетельствуют о том, что культуры исследованных штаммов Propionibacterium freudenreichii RVS-2-ims (I) и Propionibacterium freudenreichii RVS-4-irf (II) обладают выражен-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Драчева Л.В. 2005. Антиоксидантные свойства пробиотических биопрепаратов // Сб. мат-лов III съезда Общества биотехнологов России. Москва, 25—27 октября 2005 г. М. С. 41.

Драчева Л.В. 2007. Антиоксидантная активность пробиотических биоантиоксидантов // Клиническое питание. № 1—2. 39.

Драчева Л.В., Короткова Е.И., До-рож к о Е . В . 2008. Применение вольтамерометриче-ского метода при изучении биоантиоксидантов // Пищ. промышленность. № 4. 28—29.

Иконников Н.П., Иордан Е.П., Воробьева Л.И. 1982. Выделение нуклеотидов и их производных иммобилизованными клетками Propionibacterium shermanii // Прикл. биохим. и микробиол. 8. № 1. 34—40.

Краева Н . И . , Воробьева Л.И. 1981. Су-

пероксиддисмутаза, каталаза и пероксидаза пропионово-кислых бактерий // Микробиология. 50. № 5. 813—817.

ными антиоксидантными свойствами. При этом образцы культур штамма I проявляют более высокую антиоксидантную активность в соответствии с величиной кинетического критерия по сравнению с образцами штамма II.

Заключение

Полученные результаты позволяют заключить, что исследованные штаммы пропионовокислых бактерий вида P. freudenreichii обладают существенными антиоксидантными свойствами, т.е. могут служить в качестве эффективно действующих биоан-тиоксидантов. Это имеет научное и практическое значение, так как расширяет возможности использования ПКБ, например, для обогащения биологически активными веществами пищевых продуктов, в частности при создании физиологически функциональных продуктов питания.

В настоящее время European Food Safety Authority (EFSA) включил Propionibacterium freudenreichii в список безопасных пищевых микроорганизмов, т.е. присвоил данной бактерии статус Qualified Presumption of Safety (QPS). Рассматривается возможность включения классических ПКБ в список GRAS (USA).

Рыжкова (Иордан) Е.П. 2003. Множественные функции корриноидов в биологии прокариотических организмов // Прикл. биохим. и микробиол. 39. № 2. 133-159.

Hugenholtz J., Hunik J., Santos H., S m i d E . 2002. Nutraceutical production by Propionibacteria // Le Lait (Dairy Scince & Technol). 82. N 1. 103—112.

Lind H., Sj ö gren J., Gohil S. Kenne L., Schnürer J., Broberg A. 2007. Antifungal compounds from cultures of dairy Propionibacteria type strains // FEMS Microbiol. Lett. 271. N 2. 310—315.

Pritchard G.G., Asmundson R.V. 1980. Aerobic electron transport in Propionibacterium shermanii effects of cyanide //Adv. Microbiol. 126. 167—173.

Pritchard G.G., Wimpenny J.W.T., Morris H.A., Levis M.W.A., Hughes D.E. 1977. Effects of oxygen on Propionibacterium shermanii grown in continuous culture // J. Gen. Microbiol. 102. N 1. 223—233.

Поступила в редакцию 31.03.09

ANTIOXIDANT ACTIVITY OF PROPIONIC ACID BACTERIA

(IN LIQUID CULTURES) INVESTIGATED WITH VOLT-AMPEREMETRY

L.V. Dracheva, E.V. Dorozhko, O.A. Avramchuk, E.I. Korotkova, E.P. Ryzhkova, H. Lee, I.V. Danilova

We have demonstrated for the first time that liquid cultures of Propionibacterium freudenreichii possessed significant antioxidant activity. High sensitive volt-ampere-metric approach was applied. Kinetic criterion of the activity has been calculated based on experimental data.

Key words: volt-amperemetric method, Propionibacterium freudenreichii, liquid cultures, anti-oxidant activity.

Сведения об авторах:

Драчёва Лидия Васильевна — канд. хим. наук, науч. консультант кафедры электрохимических методов анализа. Тел. (3822)563-832; e-mail: npp-poliant@yandex.ru

Дорожко Елена Владимировна — аспирант кафедры электрохимических методов анализа. Тел. (3822)563-832; e-mail: npp-poliant@yandex.ru

Аврамчук Олеся Александровна — канд. хим. наук, ст. науч. сотр. кафедры электрохимических методов анализа. Тел. (3822)563-832; e-mail: npp-poliant@yandex.ru

Короткова Елена Ивановна — канд. хим. наук, доц. кафедры электрохимических методов анализа. Тел. (3822)563-832; e-mail: npp-poliant@yandex.ru

Рыжкова Евгения Петровна — докт. биол. наук, доцент по званию, ст. науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-45-45; e-mail: epr322@mail.ru

Хао Ли — аспирант кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-30-60; e-mail: lihaohao1980@mail.ru

Данилова Ирина Валентиновна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-45-45; e-mail: danlip@mail.ru