Длительное действие тетрапептидамида на метаболизм биогенных аминов в структурах мозга

УДК 612.44+612.821

Вестник СПбГУ. Сер. 3. 2012. Вып. 3

Е. Л. Доведова, Н. Д. Ещенко

ДЛИТЕЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ ТЕТРАПЕПТИДАМИДА НА МЕТАБОЛИЗМ БИОГЕННЫХ АМИНОВ В СТРУКТУРАХ МОЗГА

Всестороннее изучение биологических эффектов коротких пептидов привлекает в последние годы большое внимание. Установлено, что подобные пептиды определяют и регулируют болевую чувствительность, имеют непосредственное отношение к развитию амнезии, в значительной мере определяют эмоциональные и поведенческие реакции. Некоторые из них участвуют в патогенезе ряда нервно-психических заболеваний. Особый интерес представляют короткие пептиды, которые обладают широким спектром регуляторных функций — от стресс-протекторного и антидепрессантного до гипногенного и обезболивающего действия [1-3]. Подобные пептиды и их синтетические производные нашли применение в клинике. Например, на основе дельта-сон индуцирующего пептида в лаборатории химии пептидов Института биоорганической химии РАН создан препарат Дельтаран, использующийся в клинике в виде интрано-зального раствора [4, 5]. Подобные аналоги в настоящее время широко используются в медицинской практике; выпущена целая серия биопротеинов под общим названием «пептид-био», улучшающих жизнедеятельность организма [6, 7].

Большой интерес исследователей к изучению опиоидных пептидов обусловлен не только теоретическими соображениями, но и практической необходимостью замены синтетических обезболивающих средств эндогенными соединениями — энкефалина-ми и их аналогами. Как известно, природные пептиды весьма нестабильны в организме, они быстро расщепляются пептидазами. Поэтому усилия многих специалистов направлены на поиск путей получения более устойчивых и не вызывающих побочных эффектов аналогов биологически активных веществ эндогенного происхождения. В частности установлено, что наличие на С-конце пептидов группы глицин-пролин существенно повышает их устойчивость к протеолизу. Примером такого синтетического «глипролинового» пептида может служить препарат Семакс, обладающий выраженным длительным нейропротекторным и ноотропным эффектом, и нашедший применение в клинике [8, 9].

Еще одним путем повышения устойчивости пептидов к расщеплению протеазами является введение в молекулу ^аминокислот. Подобное соединение — простейший аналог энкефалинов тетрапептидамид (ТПА) получен в лаборатории синтеза пептидов ВКНЦ РАМН. Он имеет структуру ^Туг-А1а^1у-РЬе^Н2 и способен связываться со специфическими опиоидными рецепторами. Как было обнаружено ранее, судя по электрофизиологическим и поведенческим показателям, ТПА, помимо анальгетическо-го эффекта, способен снижать двигательную активность и ослаблять тонус мышц [10].

К настоящему времени в литературе накоплены многочисленные данные, свидетельствующие о тесных связях регуляторных пептидов с различными медиаторными системами в центральной и периферической нервной системах. Установлено, что нейро-пептиды могут модулировать метаболизм или высвобождение нейромедиаторов [11-13].

© Е. Л. Доведова, Н. Д. Ещенко, 2012

Целью данной работы было изучение действия ТПА на метаболизм нейромедиа-торов серотонина и дофамина в структурах мозга крыс и кроликов в течение разных сроков после однократного введения препарата. Эффекты ТПА сравнивали с действием другого препарата — дельта-сон индуцирующего пептида (ДСИП). Известно, что ДСИП обладает гипногенными и нейропротекторными свойствами, повышает резистентность животных к различным видам стрессорных воздействий [14-16], однако это влияние пептида оказывается относительно кратковременным.

Методика исследования

Эксперименты проводили на крысах линии Вистар и кроликах породы Шиншилла. Исследуемые пептиды ТПА или ДСИП, приготовленные на физиологическом растворе, вводили внутримышечно однократно из расчета 500 мкг и 100 мкг на 1 кг массы тела соответственно. Группе контрольных животных вводили физиологический раствор. Параллельно проводили наблюдение за поведением животных в течение времени действия препаратов.

Через 30 или 90 мин (краткосрочное воздействие) и через трое суток (длительное воздействие) животных декапитировали в соответствии с требованиями, предъявляемыми при работе с животными.

Из двигательной зоны коры больших полушарий и хвостатого ядра мозга крыс с помощью дифференциального центрифугирования выделяли фракцию «грубых» митохондрий, которую использовали для спектрофотометрического определения активности ферментов. Анализировали активность тирозингидроксилазы (ТирГД) [17] и триптофангидроксилазы (ТрпГД) [18], участвующих в синтезе дофамина или серотонина соответственно. Кроме того, определяли активность ферментов, окисляющих эти нейромедиаторы: моноаминооксидазы типа А (МАО А) с серотонином как субстратом, используя метод Н. Попова и соавторов [19] в нашей модификации [20], и моноаминооксидазы типа Б (МАО Б) с п-нитрофенилэтиламином в качестве субстрата [21].

Субклеточные фракции из двигательной зоны коры и хвостатого ядра мозга кроликов выделяли в градиенте плотности сахарозы (0,8-1,4 М) для последующего определения активности МАО А и МАО Б, а также содержания серотонина [22].

Активность ферментов выражали в условных единицах: ДЕ250 (для МАО А), ДЕ450 (для МАО Б) или ДЕ355 (для триптофангидроксилазы), рассчитанных на 1 мг белка фракции за 60 мин. Активность тирозингидроксилазы выражали в нмоль/мг белка за 60 мин.

Полученные экспериментальные данные анализировали с помощью пакета статистических программ STATISTICA 5.0. Различия между контрольной и опытной группами считали достоверными при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты, представленные в табл. 1, указывают на наличие определенных изменений дофаминергической и серотонинергической систем в структурах мозга крыс через 30 мин после введения животным ДСИП, судя по активности ферментов синтеза и утилизации нейромедиаторов. Обращает на себя внимание разная выраженность изменений в исследованных структурах мозга и реципрокность сдвигов в отношении метаболизма дофамина и серотонина.

Таблица 1. Активность ферментов метаболизма серотонина и дофамина в митохондриях мозга крыс после однократного введения ДСИП

Условия опыта Ферменты

ТрпГД МАО А ТирГД МАО Б

Двигательная зона коры больших полушарий

Контроль 1,07 ± 0,21 0,25 ± 0,05 1,20 ± 0,19 0,48 ± 0,08

ДСИП, 30 мин 1,16 ± 0,20 0,32 ± 0,06* 1,17 ± 0,17 0,34 ± 0,06*

ДСИП, 90 мин 1,10 ± 0,17 0,30 ± 0,06 1,21 ± 0,16 0,41 ± 0,10

Хвостатое ядро

Контроль 4,03 ± 0,59 0,45 ± 0,07 2,10 ± 0,19 0,50 ± 0,07

ДСИП, 30 мин 4,68 ± 0,37 0,74 ± 0,09* 1,72 ± 0,23 0,41 ± 0,06

ДСИП, 90 мин 3,90 ± 0,41 0,50 ± 0,09 1,88 ± 0,25 0,49 ± 0,04

* р < 0,05 при сравнении с контролем (тест Вилкоксона).

Наиболее резко через 30 мин после введения ДСИП менялась активность моно-аминоксидаз: активность МАО А, окисляющей серотонин, возрастала почти на 30% в двигательной зоне коры мозга, еще более значительное (в среднем на 62%) повышение активности этого фермента найдено в хвостатом ядре. Напротив, активность МАО Б, участвующей в утилизации дофамина, в обеих структурах мозга уменьшалась: на 29% в коре и примерно на 20% в хвостатом ядре (тенденция к снижению активности).

В то же время активность ферментов, участвующих в биосинтезе нейромедиато-ров, — триптофан- и тирозингидроксилаз через 30 мин после введения ДСИП в митохондриях коры оставалась близкой к контрольным значениям. В митохондриях хвостатого ядра следует отметить тенденцию к повышению активности фермента, синтезирующего серотонин (на 16%) и, напротив, тенденцию к снижению активности фермента синтеза дофамина (на 18%).

Сопоставление степени изменения активности ферментов метаболизма нейроме-диаторов позволяет предположить, что более резкое повышение активности МАО А при мало меняющейся активности триптофангидроксилазы способствует снижению уровня серотонина в коре, и особенно в хвостатом ядре. Аналогичное сопоставление активности МАО Б и тирозингидроксилазы указывает на возможное повышение количества дофамина в коре.

Таким образом, на основании этих данных можно говорить о нарушении ме-диаторных процессов в исследованных структурах мозга после кратковременного (30 мин) воздействия ДСИП. Обращает на себя внимание большая чувствительность к действию пептида ферментов утилизации нейромедиаторов (МАО) по сравнению с ферментами, участвующими в их синтезе (ТрпГД и ТирГД).

Через 90 мин после однократного введения крысам ДСИП практически все исследованные показатели как в двигательной зоне коры мозга, так и в хвостатом ядре были близки к контрольным значениям (см. табл. 1), что свидетельствует о прекращении действия пептида. При анализе поведенческих характеристик установлен кратковременный анальгетический эффект, который наблюдался в течение первых восьми-деся-ти минут после введения ДСИП животным.

Более выраженное и длительное изменение активности моноаминоксидаз обнару-

жено нами (табл. 2) после однократного введения крысам другого исследуемого пептида (ТПА).

Таблица 2. Активность моноаминоксидаз типа А и Б в митохондриях мозга крыс в норме и после однократного введения тетрапептидамида

Условия опыта Двигательная зона коры мозга Хвостатое ядро

Ферменты Ферменты

МАО А МАО Б МАО А МАО Б

Контроль 0,25 ± 0,05 0,48 ± 0,08 0,45 ± 0,07 0,50 ± 0,07

ТПА, 30 мин 0,39 ± 0,06* 0,35 ± 0,06* 0,77 ± 0,11* 0,42 ± 0,11

ТПА, 3 сут 0,37 ± 0,05* 0,38 ± 0,05* 0,65 ± 0,03* 0,32 ± 0,08*

* р < 0,05 при сравнении с контролем (тест Вилкоксона).

Через 30 мин после введения крысам ТПА направленность изменений активности обоих типов моноаминоксидаз была аналогична той, которая обнаружена после введения ДСИП (см. табл. 1), а именно: активация МАО А и подавление МАО Б в обоих исследованных структурах мозга. Следует обратить внимание на то, что в митохондриях двигательной зоны коры введение ТПА приводило к более выраженному повышению активности МАО А (в среднем на 56% по сравнению с контролем), чем в опытах с введением ДСИП (увеличение на 28%).

Принципиально важно, что в отличие от экспериментов с ДСИП, активность ферментов деградации серотонина и дофамина не возвращалась к контрольным значениям даже через трое суток после однократного введения ТПА.

Сходные изменения активности МАО А найдены в субклеточных фракциях, выделенных в градиенте плотности сахарозы из мозга кроликов после введения ТПА (рис. 1). Как через 30 мин, так и через трое суток после инъекции ТПА активность

%

300 250 200 150 100 50 0

Кора

Хвостатое ядро *

* *

I II

1  -

III

III

Рис. 1. Влияние ТПА на активность МАО А в субклеточных фракциях коры и хвостатого ядра мозга кроликов в разные сроки после однократного введения пептида:

1 — активность фермента через 30 мин после введения ТПА; 2 — активность фермента через трое суток после введения ТПА.

I — субфракция «легких» синаптосом; II — субфракция «тяжелых» синаптосом; III — субфракция митохондрий. Активность фермента выражена в % от контроля, принятого за 100%; * — р < 0,05 при сравнении с контролем.

фермента, окисляющего серотонин, была выше контрольных значений: во фракциях коры мозга — на 50-65%, в еще большей степени (в 1,75-2,5 раза) она повышалась во фракциях хвостатого ядра.

Изменение активности фермента, участвующего в биосинтезе серотонина, и содержания самого нейромедиатора в мозге кроликов через трое суток после введения ТПА носило несколько иной характер (рис. 2). В двигательной зоне коры повышение активности триптофангидроксилазы (в среднем в 1,7 раза) сопровождалось менее выраженным накоплением нейромедиатора, уровень которого превышал контрольные значения лишь на 28-30%, что может быть связано с усилением деградации серотонина под действием МАО А (см. рис. 1). Эти результаты указывают на то, что в двигательной зоне коры под действием ТПА происходит длительная (трое суток) активация всей системы обмена серотонина.

Напротив, в хвостатом ядре показатели синтеза серотонина (содержание медиатора и активность ТрГД) через трое суток после инъекции ТПА оказались значительно ниже контрольного уровня (см. рис. 2) на фоне уже отмеченной выше активации МАО А. Таким образом, выявились сложные взаимоотношения в реакции разных структур мозга на длительное действие ТПА.

В литературе имеются сведения о подобной селективности действия пептидов в различных структурах мозга. Например, установлено разнонаправленное действие гептопептида пролонгированного действия Селанк (синтетического аналога тафтси-на) на содержание моноаминов и их метаболитов, а также возбуждающих и тормозных аминокислот в коре, стриатуме и других структурах мозга крыс линии Вистар [23, 24].

Определение активности МАО Б во фракциях синаптосом и митохондрий мозга кроликов в разные сроки после введения ТПА (рис. 3) подтвердило реципрокность изменений МАО Б по сравнению с МАО А (см. рис. 1), как это было найдено в экспериментах на крысах (см. табл. 2). Обращает на себя внимание тот факт, что через трое суток после однократной инъекции ТПА снижение активности МАО Б было более выраженным по сравнению с краткосрочным (30 мин) воздействием; особенно это относится к фракциям, выделенным из хвостатого ядра.

Анализ наших экспериментальных данных показывает, что ТПА после однократного введения оказывает длительное и выраженное влияние на метаболизм нейро-медиаторов дофамина и серотонина. Цитохимические данные, полученные Л. М. Гер-штейн [25] в аналогичных опытах, свидетельствуют о том, что под влиянием ТПА происходят определенные изменения в содержании и концентрации структурированных белков цитоплазмы и ядер нейронов.

%

200

150

100

50

0

Кора

Хвостатое ядро

I

1 2

1 2

Рис. 2. Влияние ТПА на активность триптофангидроксилазы и содержание серотонина в структурах мозга кроликов через трое суток после однократного введения пептида:

1 — содержание серотонина; 2 — активность триптофангидроксилазы. Активность фермента и количество нейромедиатора выражены в % от контроля, принятого за 100%; * — р < 0,05 при сравнении с контролем.

% 150 г

Кора

Хвостатое ядро

100

50 -

0 Ц—И- - - - -

I II III I II III

1

Рмс. 3. Влияние ТПА на активность МАО Б в субклеточных фракциях коры и хвостатого ядра мозга кроликов в разные сроки после однократного введения пептида

Условные обозначения как на рис. 1.

Судя по ряду физиологических показателей, после краткосрочного (около 30 мин) анальгетического периода у животных под влиянием ТПА проявлялись двигательные расстройства по типу гипокинезии, сохраняющиеся длительное время, — у крыс в течение нескольких недель [10]. На основании результатов данного исследования можно предположить, что период анальгетического действия ТПА характеризуется изменением состояния моноаминергических систем, в первую очередь серотонинергической, а в более поздние сроки (3-6 сут) после введения ТПА происходит нарушение взаимоотношений медиаторных систем.

Особого обсуждения заслуживает вопрос о сроках, при которых регистрируются столь выраженные и многообразные биохимические эффекты после однократного введения ТПА. К сожалению, в нашем распоряжении нет конкретных данных о метаболической стабильности ТПА. Однако по аналогии с другими опиоидными пептидами и их производными, а также принимая во внимание сроки появления и исчезновения наиболее изученного эффекта опиоидов (анальгетическое действие), характерного для ТПА, можно с большой вероятностью предположить, что к третьим суткам после введения препарата общее содержание ТПА в организме будет ничтожным по сравнению с исходным. Следовательно, наблюдаемые на третьи сутки изменения биохимических и физиологических показателей можно толковать либо как следствие особо длительного сохранения ТПА в каких-то определенных структурах мозга, либо как результат включения каскадных механизмов.

Феномен длительных физиологических эффектов, вызываемых короткими пептидами и их производными, хорошо согласуется с теорией «функционального континуума» этих соединений [1, 8, 9]. Согласно этой теории, предполагается, что при взаимодействии пептидов с соответствующими клеточными рецепторами формируется сложный многоступенчатый каскадный процесс, когда пептид, помимо непосредственной биологической активности, может индуцировать выход других эндогенных регуляторов.

Кроме того, длительные эффекты ТПА могут быть связаны с процессом ингиби-рования ферментов деградации энкефалинов, что приводит к замедлению их распада. Подобное предположение было высказано в отношении препарата Селанк, проявляющего длительный анксиолитический эффект в структурах мозга [23, 26]. Замедление протеолитической деградации ТПА может быть связано с присутствием в его молекуле d-формы тирозина.

Полученные нами результаты и литературные данные позволяют сделать заключение о том, что вызванное введением ТПА длительное изменение двигательных функций определяется специфической реакцией корковых и подкорковых структур двигательной системы, при которой происходит нарушение метаболизма нейромедиаторов серотонина и дофамина, а также обмена белков.

Литература

1. Ашмарин И. П. Сигнальные молекулы и социальное поведение // Нейрохимия. 2001. Т. 18, № 4. С. 243-250.

2. Козина Л. С., Стволинский С. Л., Фёдорова Т. Н. Изучение антиоксидантных и мембра-нопротекторных свойств коротких пептидов в модельных экспериментах // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. 2008. № 6. С. 31-36.

3. Лысенко А. В., Арутюнян А. В., Козина Л. С. Пептидная регуляция адаптации организма к стрессорным воздействиям. СПб.: ВМедА, 2005. 207 с.

4. Конорова И. Л., Ганнушкина И. В., Коплик Е. В., Антелава А.Л. Профилактика препаратом Дельтаран негативных последствий перенесенного эмоционального стресса при последующей церебральной ишемии низкорезистентных животных // Бюл. экспер. биол. и мед. 2006. Т. 141, № 5. С. 499-502.

5. Koplik E. V., Umrykhin E. P. Delta-sleep inducing peptide and Deltaran: potential approaches to antistress protection // Neurosci. Behav. Physiol. 2008. Vol. 38. P. 953-957.

6. Бондаренко Т. И., Майборода Е. А., Михалева И. А. Биологическая активность синтетических аналогов природных олигопептидов // Матер. VII Всерос. науч. конф. «Химия и медицина, Архимед-2009». Уфа, 2009. С. 131.

7. Khavinson V. Kh., Arutjunyan A. V., Kozina L. S. Geroprotective peptides of the pineal gland and antioxidative protection system / Abstr. 18th World Congress of Gerontology. Rio de Janeiro, Brazil, 2005 // J. Gerontology. Vol. 60, N 1. 2005. P. 106.

8. Ашмарин И. П. Перспективы практического применения некоторых фундаментальных исследований малых регуляторных пептидов // Вопр. мед. химии. 1984. Т. 3. С. 2-7.

9. Нейропептиды — индивидуальные регуляторы и предшественники комплекса биологически активных молекул / Вьюнова Т. В., Шевченко К. В., Шевченко В. П., Безуглов В. В., Мясоедов Н. Ф. // Тез. докл. Междунар. конф. «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». СПб., 2008. С. 26.

10. Попова Н. С., Доведова Е.Л., Адрианов О. С. Системные, клеточные и молекулярные перестройки, обусловленные воздействием пептидов с различной опиоидной активностью // Физи-ол. журн. СССР. 1987. № 6. С. 730-736.

11. Экспериментальное развитие концепции О. С. Адрианова о соотношении функциональных и нейрохимических процессов: регуляторные пептиды при дисфункции медиаторных систем / Адрианов О. С., Попова Н. С., Доведова Е. Л., Герштейн Л. М., Качалова Л. А. // Усп. физиол. наук. 2000. Т. 31, № 1. С. 71-80.

12. Вальдман А. В., КозловскаяМ. М., Ашмарин И. П. Модулирующее действие некоторых пептидов на моноаминергические процессы мозга как основа их психотропного эффекта // Вопр. мед. химии. 1984. Т. 30, № 3. С. 56-63.

13. Менджерицкий А. М., Ускова Н. И., Лысенко А. В., Маклецова М. Г. Hейромедиаторный механизм адаптивного действия дельта-сон индуцирующего пептида в экспериментальной ау-диогенной эпилепсии, вызванной гипокинезией // Эксперим. клин. фармакол. 1996. T. 59, № 1. С. 8-10.

14. Структурно-функциональная организация нейронов коры большого мозга у крыс с различной устойчивостью к эмоциональному стрессу при воздействии пептида, вызывающего дельта-сон / Боголепов H. H., Попова Э. H., Коплик Е. В., Кривицкая Г. H., Судаков К. В. // Морфология. 2003. T. 123, № 2. С. 15-10.

15. Стрекалова Т. В. Дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП): проблемы эндогенного происхождения и биологической активности // ^йрохимия. 1998. T. 15, № 3. С. 227-239.

16. Khvatova E. M., Samartzev V. N., Zagoskin P. A. Delta-sleep inducing peptide (DSIP): effect on respiration activity in rat brain mitochondria and stress protective potency under experimental hypoxia // Peptides. 2003. Vol. 24, N 2. P. 307-311.

17. Минеева-Вяльх М. Ф. Метод прямого спектрофотометрического определения скорости тирозингидроксилазной реакции // Вопр. мед. химии. 1976. T. 22, № 2. С. 274-279.

18. Friedman P., Kapplman H., Haufman S. Partial purification and characterization of Triptophan Hydroxylase from rabbit hindbrain // J. Biol. Chem. 1972. Vol. 274. P. 4165-4173.

19. Popov N., Roseler C., Niemann C., Matties H. Eine emplindiche methode zur Bestimmung der Monoaminoxidase in Gewebe durgh Aldehydsemicarbazon-Messung // Acta. Biol. Med. Germ. 1971. N 26. S. 239-245.

20. Доведова Е. Л., Хрусталев Д. А. Сравнительная характеристика ферментативных систем обмена нейромедиаторов в мозге крыс Вистар и Август при различных сроках воздействия амфетамина in vivo // ^йрохимия. 2007. T. 24, № 2. С. 150-155.

21. Методы исследования активности и специфического торможения моноаминоксидаз митохондрий / Горкин В. З., Веревкина А. В., Гриднева Л. И., Жердева Л. В., Леонтьева Г. А., Кричен-кова Р. С., Комиссарова H. В., Кляшторин А. Б., Романова Л. А., Северина И. С. // Современные методы в биохимии. № 2. М.: Медицина. 1968. С. 155-177.

22. Коган Б. Н., Нечаев Н. В. Чувствительный и быстрый метод одновременного определения дофамина, норадреналина, серотонина, 5'-оксииндолуксусной кислоты в одной пробе // Лабораторное дело. 1979. № 5. С. 301-303.

23. Изучение эффектов гептапептида Селанка на содержание моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс Вистар / Клодт П. М., Кудрин В. С., Шркевич В. Б., Козловская М. М., Майский А. И., Раевский К. С. // Психофармакол. биол. наркол. 2005. T. 5, № 3. С. 984-988.

24. Влияние гептапептида Селанка на содержание возбуждающих и тормозных аминокислот в структурах мозга крыс Вистар / Шркевич В. Б., Клодт П. М., Кудрин В. С., Майский А. И., Раевский К. С. // Психофармакол. биол. наркол. 2007. T. 7, № 2. С. 1563-1567.

25. Герштейн Л. М. ^йрохимические и нейрофизиологические перестройки в структурах мозга при воздействии некоторых нейропептидов // ^йрохимия. 1987. T. 6, № 1. С. 51-56.

26. Зозуля А. А., Кост Н. В., Соколов О. И., Габаева Н. В. Ингибирующее действие Селанка на энкефалин-деградирующие ферменты как возможный механизм его анксиолитической активности // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2001. T. 131, № 4. С. 315-317.

Статья поступила в редакцию 15 марта 2012 г.