Апробация диагностических тест-систем с использованием наночастиц серебра в качестве маркеров специфических антител для скрининга исследуемого материала на наличие антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза, туляремии и ботулотоксина в дот-иммуноанализе

Апробация диагностических тест-систем с использованием наночастиц серебра в качестве маркеров специфических антител для скрининга исследуемого материала на наличие антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза, туляремии и ботулотоксина в дот-иммуноанализе

Т.Ю. Загоскина1 (T_Y_Z_@mail.ru), С.В. Балахонов1, Е.Ю. Марков1, В.Б. Николаев1, Е.Н. Субычева1, Е.А. Чапоргина1, Е.П. Михайлов3, О.Б. Бодрых2, Ю.О. Попова1

1ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

2ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Иркутской области», г. Иркутск 3ФКУЗ «Алтайская противочумная станция» Роспотребнадзора, г. Горно-Алтайск

Резюме

Сконструированы тест-системы с применением высокодисперсных золей серебра в качестве маркера специфических антител для детекции антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза, туляремии и ботулотоксина методом дот-иммуноанализа. Показаны их высокая чувствительность и специфичность.

Проведена апробация тест-системы на обнаружение антигенов чумного микроба в полевом материале из Горно-Алтайского природного очага чумы.

Показана высокая эффективность использования дот-иммуноанализа для скрининга клинического материала и пищевых продуктов на ботулотоксин.

Разработанные тест-системы позволяют исследовать микрообъемы клинического материала, технически просты и не требуют использования лабораторных животных, дорогостоящего оборудования, специальной подготовки персонала, могут с успехом применяться в практическом здравоохранении - в лабораториях разного уровня оснащенности и, что особенно ценно, в полевых условиях в режиме чрезвычайных ситуаций.

Ключевые слова: коллоидное серебро, дот-иммуноанализ, возбудители чумы, бруцеллеза, туляремии; антигены, ботулотоксин

Approbation of Diagnostic Test-Systems with Use of Silver Nano-particles as Markers of Specific Antibodies for Screening of the Investigated material for presence of antigens of plague, Brucellosis, tularemia causative agents and Botulotoxin in dot-immunoassay

T.Yu. Zagoskina1 (T_Y_Zj@mail.ru), S.V. Balakhonov1, E.Yu. Markov1, V.B. Nikolaev1, E.N. Subycheva1, E.A. Chaporgina1, E.P. Mikhailov3, O.B. Bodrykh2, Yu.O. Popova1

1Federal State Institution of Public Health «Irkutsk Research Antiplague Institute»of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance

2Federal Budget Healthcare institution «Center of Hygiene and Epidemiology in Irkutsk Region», Irkutsk

3Federal State Institution of Public «Altai Antiplague Station» of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human

Well-Being Surveillance, Gorno-Altaisk

abstract

Test systems with high dispersed silver sol application as a marker of specific antibodies are developed for detection of antigens of plague, brucellosis, tularemia causative agents and botulotoxin by dot-immunoassay. Its high sensitivity and specificity is shown. Test-system was approbated for detection of Yersinia pestis antigens in a field material from Altay mountain natural plague focus. High efficiency of a dot-immunoassay for screening of a clinical material and foodstuffs for botulotoxin is shown. The developed test-systems allow to investigate microvolumes of a clinical material. They are technically simple and do not require the use of laboratory animals, the expensive equipment, special staff training and can be applied with success in practical public health services, in laboratories of different equipment and that is especially valuable, in field conditions in a mode of emergency situations. Key words: colloid silver, dot-immunoassay, causative agents of plague, brucellosis, tularemia; antigen, botulotoxin

Введение этиологию. Контроль за распространением инфек-

В настоящее время около 70% всех регистри- ций в мире затруднен ввиду современных темпов руемых болезней человека имеют инфекционную и масштабов миграции населения. Кроме того, в

последние годы реальной угрозой считается возможность преднамеренного использования патогенных биологических агентов в террористических целях.

Эффективная борьба с возбудителями инфекционных болезней требует быстрой и достоверной диагностики. Не все учреждения здравоохранения имеют базу для выполнения сложных анализов и в связи с этим нуждаются в оснащении надежными, простыми, недорогими, доступными, экспрессными диагностическими тестами. Для России с ее огромной территорией и удаленностью населенных пунктов от диагностических центров такие тесты особенно актуальны. Многие нозологические формы имеют сходную клиническую картину, и для правильной постановки диагноза необходимы лабораторные методы, среди которых важное место занимает иммунохимический анализ, в частности дот-иммуноанализ. Этот тест обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может быть использован для определения видовой принадлежности возбудителя. Актуальность дальнейших разработок и модифицирования дот-иммуноанализа обусловлена также необходимостью решения ряда практических задач: расширения круга определяемых антигенов; обеспечения возможности одновременной детекции нескольких аналитов в одном тесте; упрощения операций и сокращения времени проведения анализа; снижения стоимости тестирования; снижения или устранения риска для здоровья пользователей и окружающей среды.

В Иркутском научно-исследовательском противочумном институте предложено и экспериментально обосновано применение в качестве маркера специфических иммунных реагентов наночастиц серебра (альтернатива ферментным меткам), позволяющих создавать простые и недорогие тесты с визуальным учетом результатов, а также пригодных как для массового скрининга исследуемого материала, так и для выполнения индивидуальных анализов для обнаружения возбудителей чумы, бруцеллеза, туляремии, ботулинического токсина и диагностики вызываемых ими заболеваний [1 -13].

Цель работы - испытание сконструированных с использованием методологии иммунокаталитиче-ского анализа тест-систем для дот-иммуноанализа (ДИА) с применением высокодисперсного золя серебра в качестве маркера ботулотоксина и специфических антител, позволяющих проводить скрининг материала на наличие антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза и туляремии.

Материалы и методы

При конструировании соответствующих диагностических тест-систем для дот-иммуноанализа использованы специфические антитела, источником которых служили гипериммунные сыворотки, полученные при иммунизации кроликов вакцинными штаммами возбудителей чумы и туляремии, виру-

лентными штаммами бруцелл, и коммерческие диагностические ботулинические поливалентные или моноспецифические сыворотки типов А, В и Е, традиционно применяемые в реакции биологической нейтрализации токсина. Выделение IgG осуществляли комбинированным методом с использованием каприловой кислоты и сульфата аммония. Золь серебра готовили путем восстановления из раствора азотнокислого серебра боргидридом натрия [2, 3, 9, 10]. В качестве стабилизатора биозонда использовали растворы бычьего сывороточного альбумина и полиэтиленгликоля. После коррекции pH золь серебра насыщали соответствующими антителами.

Постановку дот-иммуноанализа осуществляли традиционным способом, предполагающим адсорбцию исследуемого материала, содержащего бактериальные антигены и ботулотоксин, на нитро-целлюлозной мембране, блокирование свободных сайтов связывания раствором казеината натрия. Детекцию адсорбированных на твердой фазе антигенов осуществляли с помощью соответствующих антител, меченных наночастицами коллоидного металла. Визуализацию результатов реакции проводили погружением мембран в раствор проявителя, состоящего из метола, лимонной кислоты и азотнокислого серебра, с последующим промыванием их проточной водой. Общее время проведения анализа - примерно два часа. Пробы, содержащие искомые антигены, выявлялись в виде темно-серых пятен. В отрицательном контроле и при отсутствии искомых антигенов в испытуемом образце окрашивание не проявлялось [2, 3, 9 - 11].

Нами исследовано 22 штамма чумного микроба основного, алтайского, гиссарского, кавказского и удэгейского подвидов из природных очагов чумы, 19 штаммов бруцелл всех известных видов, пять штаммов возбудителя туляремии. В качестве антигенных фракций использованы фракция 1, Fc-антиген, основной соматический антиген, липополисахарид (ЛПС), «мышиный» токсин, клеточные оболочки (всего 32 антигенные фракции), изолированные из клеток штамма Yersinia pestis EV; ЛПС, белково-полисаха-ридный Аг, солевые, мочевинные и цетавлоновые экстракты (всего 30 антигенных фракций), изолированные из клеток штамма Brucella abortus 19 BA; ЛПС и мочевинные экстракты (всего 20 антигенных фракций) из клеток вакцинного штамма Francisella tularensis B-15.

Результаты и обсуждение

При исследовании полевого материала из Горно-Алтайского природного очага чумы (190 проб) методом ДИА были получены положительные результаты в 8 пробах (смывы с органов длиннохвостого суслика Citellus undulatus - 4, даурской пищухи Ochotona daurica - 3, плоскочерепной полевки Alticola strelzovi - 1), что составило 4,2%. При параллельном исследовании образцов в РПГА зарегистрировано наличие антигенов чумного ми-

кроба в пяти пробах, что составило 2,6%. Отмечалось совпадение положительных результатов в ДИА и РПГА. Большее количество положительных находок, полученных методом ДИА, в сравнении с РПГА объясняется более высокой чувствительностью твердофазных иммунохимических методов по сравнению с агглютинационными.

Испытания тест-системы на обнаружение бо-тулотоксина проведены на клиническом материале (рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения, кровь, моча) от больных с установленным клиническим диагнозом «ботулизм», госпитализированных в городскую инфекционную больницу. Положительные результаты исследования клинического материала в ДИА полностью (100%) совпадали с аналогичными результатами, полученными в рутинной реакции биологической нейтрализации токсина на белых мышах, что подтверждает эффективность и специфичность сконструированной тест-системы. При этом дот-иммуноанализ более экспрессен, экономичен, производителен, технологичен, безопасен, не требует наличия лабораторных животных.

Выводы

1. В процессе работы нами установлено, что коллоидное серебро является стандартным, легко-

воспроизводимым маркером, пригодным для использования в качестве метки специфических антител. Сконструированные тест-системы позволяют быстро и качественно провести детекцию антигенов возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза и ботулотоксина.

2. Тест-системы для дот-иммуноанализа сочетают высокую чувствительность (> 104 м.к./мл корпускулярных бактериальных и >10 нг/мл растворимых антигенов указанных возбудителей), миниатюризацию (объем пробы ~ 1 - 2 мкл), простоту выполнения и достаточно быстрое получение результатов (около 2 ч).

3. Тест-системы с использованием наночастиц серебра в качестве маркеров специфических антител значительно дешевле существующих аналогов, для реализации не требуют дорогостоящего оборудования, а возможность визуального учета результатов позволяет использовать их в качестве сигнальных тестов в полевых условиях, а также в условиях работы санитарно-противо-эпидемических бригад в режиме чрезвычайных ситуаций. Кроме того, применение разработанных тест-систем дает возможность оперативно осуществлять эпидемиологический мониторинг и проводить быструю оценку ситуации при возникновении биологических угроз. Ш

Литература

1. Загоскина Т.Ю., Докорина А.А., Михайлов Л.М., Меринов С.П., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Исследование сывороток крови работников мясокомбината на бруцеллез в дот-иммуноанализе и рутинных серологических реакциях. Сибирь-Восток (Иркутск). 2004. Вып. 2: 13, 14.

2. Загоскина Т.Ю., Калиновский А.И., Марков Е.Ю., Докорина А.А., Голубинский Е.П. Использование специфических антител, меченных частицами коллоидного серебра, для выявления антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа. Клин. лаб. диагностика. 2002; 6: 38, 39.

3. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Обнаружение антигенов бруцелл с помощью частиц коллоидных металлов в качестве маркеров специфических антител. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001; 3: 65 - 69.

4. Загоскина Т.Ю., Докорина А.А., Николаев В.Б., Марков Е.Ю., Андреевская Н.М., Михайлова В.А., Балахонов С.В., Голубинский Е.П. Дот-имуноанализ с частицами коллоидного серебра для обнаружения возбудителя чумы и его антигенов. Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний: Тез. докл. Междунар. конф. (8 - 10 сентября 2004 г., Новосибирская обл.). Новосибирск: ЦЭРИС; 2004: 245.

5. Николаев В.Б., Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Субычева Е.Н., Андреевская Н.М., Михайлова В.А., Белобородов Ю.В., Балахонов С.В., Белькова С.А., Попова Ю.О., Козулина К.Ю., Голубинский Е.П. Использование иммунозолей для визуальной индикации в дот-иммуноанализе возбудителя чумы и его антигенов. VI Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием «Генодиагностика инфекционных болезней. 2007» («Молекулярная диагности-ка-2007») (28 - 30 ноября 2007 г., Москва): Сб. тр. В.И. Покровский, ред. Москва; 2007; I: 386 - 388.

6. Субычева Е.Н., Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Николаев В.Б., Балахонов С.В., Голубинский Е.П. Использование дот-иммуноанализа для детекции возбудителя чумы. Совр. аспекты эпидемиологич. надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России: Матер. науч.-практ. конф. (21 - 22 марта 2007 г., Ставрополь). Ставрополь; 2007; II: 123, 124.

7. Николаев В.Б., Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Попова Ю.О., Докорина А.А., Мирончук Ю.В. Использование специфических реагентов, меченых частицами коллоидного серебра, для обнаружения антигенов Francisella tularensis и антител к ним методом дот-иммуноанализа. Карантинные и зоо-нозные инфекции в Казахстане: Материалы международной научно-практической конференции «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы», посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкурганской противочумной станции (Талдыкурган, 1 - 2 августа 2001 г.). Алматы; 2001; 3: 196 - 198.

8. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Балахонов С.В., Николаев В.Б., Субычева Е.Н. Использование наночастиц золота и серебра для скрининга исследуемого материала в дот-иммуноанализе на наличие антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза, туляремии и ботулотоксина. Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества независимых государств: Материалы IX Межгосударственной науч.-практ. конф. госудраств-участников СНГ (30 сентября - 2 октября, 2008 г., Волгоград). Волгоград; 2008: 75 - 77.

9. Загоскина Т.Ю., Субычева Е.Н., Носырева Л.И., Бодрых О.Б., Марков Е.Ю., Вейде А.А., Долгова Т.М., Тайкова Т.С., Балахонов С.В. Конструирование тест-системы для скрининга пищевых продуктов и клинического материала на ботулотоксин в дот-иммуноанализе. Журнал инфекционной патологии. Иркутск. 2009; 16 (3): 20 - 23.

10. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Балахонов С.В. Современные подходы к детекции и идентификации ботулинических токсинов. Инфекционные болезни. 2012; 1: 64 - 73.

11. Носкова О.А., Загоскина Т.Ю., Субычева Е.Н., Марков Е.Ю., Лекомцева С.Е., Бодрых О.Б., Балахонов С.В. Клинико-эпидемиологические особенности и совершенствование лабораторной диагностики ботулизма в Иркутской области. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2013; 2 (90); 1: 102 - 106.

12. Zagoskina TYu., Markov ЕТи., Nikolaev V.B., Balakhonov S.W., Andreevskaya N.M., Poltavchenko A.G., Dokorina A.A., Golubinsky E.P The use of silver immunosols for detection of Yersinia pestis antigens in dot immunoassay . Scientific Journal of Center for Infectious Diseases with Natural Foci. 2002; 10: 53 - 55.

13. Zagoskina T.Yu., Noskova O.A., Markov E.Yu., Subycheva E.N., Dolgova T.M., Taikova T.S., Balakhonov S.V. Construction and approbation of solid-phase test systems using inorganic corpuscular markers for express-diagnostics of zoonotic diseases. One World-One Health: Emerging and Re-Emerging Infectious Diseases Preparedness and Response: Proceedings of International Conference (11 - 12 April, 2013). Ulaanbaatar; 2013: 187 - 191.

References

1. Zagoskina T.Yu., Dokorina A.A., Mikhailov L.M., Merinov S.P., Markov E.Yu., Kalinovsky A.I., Golubinsky E.P Testing of blood sera from workers of a meatpacking plant for brucellosis by dot-immunoassay and routine serological reactions. Sibir-Vostok. (Irkutsk). 2004; 2: 13, 14 (in Russian).

10.

11.

12.

13.

Zagoskina T.Yu., Kalinovsky A.I., Markov E.Yu., Dokorina A.A., Golubinsky E.R Use of specific antibodies labeled with colloid silver particles for detection of Brucella antigens by dot-immunoassay. Klin. lab. diagnostika. 2002; 6: 38 - 39 (in Russian).

Zagoskina T.Yu., Markov E.Yu., Kalinovsky A.I., Golubinsky E.R Detection of Brucella antigens using colloid metal particles as markers of specific antibodies. Zhurn. mikrobiol., epidemiol. i immunobiol. 2001; 3: 65 - 69 (in Russian).

Zagoskina T.Yu., Dokorina A.A., Nikolaev V.B., Markov E.Yu., Andreevskaya N.M., Mikhailova V.A., Balakhonov S.V., Golubinsky E.R. Dot-immunoassay with colloid silver particles for detection of the plague causative agent and its antigens. Development of the international cooperation in the field of the infectious disease studying: Brief outline reports of the International Conference (September 8-10, 2004, Novosibirsk region). Novosibirsk: TSERIS; 2004: 245 (in Russian).

Nikolaev V.B., Zagoskina T.Yu., Markov E.Yu., Subycheva E.N., Andreevskaya N.M., Mikhailova V.A., Beloborodov Yu.V., Balakhonov S.V., Belkova S.A., Ropova Yu.O., Kozulina K.Yu., Golubinsky E.R Use of immunosols for visual indication in dot-immunoassay of the plague agent and its antigens. VI All-Russian Scientific-Practical Conference with International Rarticipation «Genodiagnostics of Infectious Diseases. 2007» («Molecular diagnostics-2007») (November 28 - 30, 2007, Moscow): Collected Rapers. (Editorship of V.I. Rokrovsky. Moscow; 2007: I: 386 - 388 (in Russian).

Subycheva E.N., Zagoskina T.Yu., Markov E.Yu., Nikolaev V.B., Balakhonov S.V., Golubinsky E.R Use of dot-immunoassay for detection of the plague causative agent. Sovr. aspecty epidemiol. nadzora za osobo opasnymi infect. zabolevaniyami na yuge Rossa: Mater. nauch.-praktich. conf. (March 21 - 22, 2007, Stavropol). Stavropol, 2007; II: 123, 124 (in Russian).

Nikolaev V.B., Zagoskina T.Yu., Markov E.Yu., Ropova Yu.O., Dokorina A.A., Mironchuk Yu.V. Use of specific reagents labeled with colloid silver particles for detection of Francisella tularensis antigens and its antibodies by dot-immunoassay. Quarantine and zoonoses infections in Kazakhstan: Materials of the International Scientific-Rractical Conference «Modern epidemic potential of the natural plague foci» devoted to the 10 Anniversary of Republic Kazakhstan sovereignty and the 50 Anniversary Taldykurgan Antiplague station (Taldykurgan, August 1 - 2, 2001). Almaty; 2001; 3: 196 - 198 (in Russian). Zagoskina T.Yu., Markov E.Yu., Balakhonov S.V., Nikolaev V.B., Subycheva E.N. Use of gold and silver nanoparticles for screening of an investigated material in dot-immunoassay for presence of antigens of plague, brucellosis, tularemia causative agents and botulotoxin. Modern technologies in realization of global strategy for control of infectious diseases at the territory of the states - participants of Unity of the independent states: Materials of IX Interstate Scientific-Rractical Conf. of CIS States-Rarticipants (September 30 - October 2, 2008, Volgograd). Volgograd; 2008: 75 - 77 (in Russian).

Zagoskina T.Yu., Subycheva E.N., Nosyreva L.I., Bodrykh O.B., Markov E.Yu., Veide A.A., Dolgova T.M., Taikova T.S., Balakhonov S.V. Design of test-system for screening of foodstuffs and clinical material for botulotoxin in dot-immunoassay. Zhurn. Infekt. Ratologii. Irkutsk; 2009: 16 (3): 20 - 23 (in Russian). Zagoskina T.Yu., Markov E.Yu., Balakhonov S.V. Modern approaches to detection and identification of botulinic toxins. Infektsionnye bolesni. 2012; 1: 64 -73 (in Russian).

Noskova O.A., Zagoskina T.Yu., Subycheva E.N., Markov E.Yu., Lekomtseva S.E., Bodrykh O.B., Balakhonov S.V. Clinical-epidemiological peculiarities and improvement of botulism laboratory diagnostics in the Irkutsk region. Bulletin Vostochno-Sibirskogo Nauchnogo Centra Sibirskogo Otdeleniya RAMS. 2013; 2 (90) Rart. 1: 102 - 106 (in Russian).

Zagoskina T.Yu., Markov E.Yu., Nikolaev V.B., Balakhonov S.V., Andreevskaya N.M., Roltavchenko A.G., Dokorina A.A., Golubinsky E.R. The use of silver immunosols for detection of Yersinia pestis antigens in dot-immunoassay. Scientific Journal of Center for Infectious Diseases with Natural Foci. 2002; 10: 53 - 55.

Zagoskina T.Yu., Noskova O.A., Markov E.Yu., Subycheva E.N., Dolgova T.M., Taikova T.S., Balakhonov S.V. Construction and approbation of solid-phase test systems using inorganic corpuscular markers for express-diagnostics of zoonotic diseases. One World - One Health: Emerging and Re-Emerging Infectious Diseases Rreparedness and Response: Rroceedings of international Conference (11 - 12 April, 2013). Ulaanbaatar; 2013: 187 - 191.

Доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора Иркутского противочумного института по научной работе с 1939 по 1947 год Николай Акимович ГАЙСКИЙ

Организатор производства диагностических и профилактических медицинских иммунобиологических препаратов и питательных сред в Институте. В 1943 году в условиях военного времени сконструировал и внедрил в практику высокоэффективную живую аттенуированную туляремийную вакцину.