МОДИФИЦИРОВАННАЯ ГИАЛУРОНОВАЯ КИСЛОТА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
MODIFIED HYALURONIC ACID, METHOD FOR PRODUCTION THEREOF AND USE THEREOF

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[001] Настоящее изобретение в целом относится к модифицированной гиалуроновой кислоте (ГК) и к способу ее получения, в частности, к модифицированному полиглицерином производному ГК, полученному путем прививания глицидола на ГК. Также настоящее изобретение относится к применению производного ГК для получения композиции дермального филлера, к гидрогелю, содержащему сшитую ГК и модифицированное полиглицерином производное ГК, и к способу получения указанного гидрогеля. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению указанного гидрогеля в качестве косметического и/или эстетического продукта, в частности, в качестве дермального филлера для наполнения, замещения и/или поддержки тканей.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[002] Гиалуроновая кислота (ГК) представляет собой природный неиммуногенный гликозаминогликан, состоящий из соединенных повторяющихся звеньев N-ацетил-D-глюкозамина и D-глюкуроновой кислоты ([α-1,4-D-глюкуроновой кислоты-β-1,3-N-ацетил-D-глюкозамин],,). Благодаря своей высокой водопоглощающей способности и уникальным вязкоэластичным свойствам ГК применяется в различных областях, таких как доставка лекарственных средств и тканевая инженерия, в терапии (например, как добавка к суставной жидкости при артрите или как стимулятор заживления ран), и для косметического применения.
[003] В последние несколько лет ГК все чаще применяют в дермальных филлерах, поскольку они обеспечивают эстетические улучшения, ранее доступные только при хирургическом вмешательстве, но при меньшей стоимости и более удобным и безопасным образом. В настоящее время ГК является наиболее широко применяемым разлагаемым материалом для дермальных филлеров как в Европе, так и в США. Поскольку ГК быстро разлагается и обратно всасывается в организме, ГК обычно сшивают для увеличения времени нахождения in vivo до примерно от 6 до 18 месяцев. Сшивание можно осуществлять посредством ряда стратегий, включая диэпоксидное, опосредуемое карбодиимидом, альдегидное и дивинилсульфоновое сшивание, причем «золотым стандартом» является диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола (BDDE).
[004] Дермальные филлеры на основе сшитой ГК применяют, в числе прочего, для восстановления объема мягких тканей лица, для создания молодого контура лица, увеличения объемов губ и щек, заполнения складок и морщин, разглаживания и уменьшения заметности тонких морщин, неглубоких морщин и складок (например, носогубных складок, межбровных морщин, морщин «марионетки» и складок в углах рта). Косметическую/эстетическую коррекцию проводят без хирургического вмешательства, и эффект сохраняется в течение некоторого времени, пока гиалуроновая кислота не абсорбируется организмом.
[005] Кроме того, в данной области техники известны модификации ГК многими различными путями для изменения механических и/или химических свойств филлеров на основе ГК в зависимости от конкретного применения. Также применяют химические модификации для получения производных ГК, способных к полимеризации in vivo, самопроизвольно или под действием внешнего пускового фактора, такого как УФ-излучение или нагревание. Три функциональные группы ГК, которые могут быть модифицированы, представляют собой первичные и вторичные гидроксильные группы, карбоксильную группу глюкуроновой кислоты и N-ацетильную группу (после дезаминирования). Химическая модификация ГК расширяет и улучшает физические свойства, таким образом создавая новые степени свободы по сравнению с традиционным сшитыми BDDE гелями ГК, свойства которых (например, высокую или низкую вязкость, или однофазность/связность или двухфазность/дисперсность) обусловлены главным образом количеством ГК и степенью сшивания.
[006] В US 2010/0035838 А1 описан комбинированный подход к сшиванию ГК, которая взаимодействует в присутствии сшивающего агента BDDE и глицидола в качестве маскирующего агента, с образованием сшитого геля ГК, обладающего стойкостью к ферментативному разложению в физиологических условиях. Поскольку во время сшивания присутствуют оба эпоксидных соединения (т.е. BDDE и глицидол), способ приводит к получению трехмерной полимерной структуры неопределенного состава.
[007] В WO 2014/152632 А1 описана композиция на основе ГК, подходящая для применения в качестве гидрофильного покрытия медицинского устройства. Указанная композиция представляет собой продукт взаимодействия ГК и эпоксидной структуры модифицированного глицидолкарбамата (GC).
[008] В JP 5022618 В2 описана гидроксиалкилированная ГК, имеющая следующую общую формулу:
1
6
1
6
7
где R - R представляют собой водород или связанную через простую эфирную связь гидроксиалкильную группу, при условии, что не все R - R представляют собой водород, R представляет собой водород или щелочной металл, и n представляют собой целое число в диапазоне 1-10000, где гидроксиалкильная группа предпочтительно представляет собой одну или более из 2-гидроксипропильной группы, 2-гидроксибутильной группы и 2,3-дигидроксипропильной группы. Гидроксиалкилированная ГК обладает увлажняющим действием на кожу и применяется в качестве увлажнителя для топических составов и увлажняющих средств, таких как косметические кремы.
[009] Кроме того, было предложено придавать дополнительные выгодные свойства дермальным филлерам путем включения различных веществ, таких как витамины, полиолы, минеральные соли и тому подобное, которые обладают действием, улучшающим здоровье кожи. Например, в US 2012/0108674 А1 описан стерильный сшитый гидрогель ГК, имеющий определенные реологические свойства, который обеспечивает замедленное высвобождение глицерина в течение длительного промежутка времени. Однако все еще существует возможность усовершенствования для продления непрерывного высвобождения глицерина.
[0010] Хотя в настоящее время доступно множество различных дермальных филлеров с различными физическими и химическими характеристиками, сохраняется постоянная заинтересованность в новых продуктах - дермальных филлерах с улучшенными свойствами. Идеальный дермальный филлер должен хорошо переноситься, иметь как можно меньше побочных эффектов и обеспечивать достаточно длительное сохранение эффекта (продолжительность), эффективно увеличивать объем и легко инъецироваться. Кроме того, желательно, чтобы дермальный филлер обладал дополнительными преимуществами, такими как включение местного анестетика для улучшенного комфорта пациента, или включение витаминов, полиолов, минеральных солей и тому подобное. Дермальные филлеры на основе ГК обладают многими из этих желаемых свойств. ГК не обладает иммуногенностью, демонстрирует превосходную переносимость и, в сшитом виде, обладает хорошей лифтинговой способностью и стабильна в организме в течение длительного времени.
[0011] Однако гели на основе ГК зачастую трудно инъецировать из-за слишком высокой силы экструзии, необходимой для инъецирования дермального филлера на основе ГК через тонкую иглу. Поэтому для снижения силы экструзии часто смешивают смазывающую фазу, например свободную (не сшитую) ГК, с фазой, сшитой ГК, перед стерилизацией. Кроме того, филлеры на основе ГК не всегда имеют желаемый оптимальный баланс свойств, например продолжительности действия, лифтинговой способности и легкости инъецирования, для данного применения. Кроме того, включение дополнительных веществ может ухудшать физические/химические характеристики гелеобразного дермального филлера и/или может не обеспечивать желаемого эффекта или обеспечивать лишь кратковременный эффект.
ЗАДАЧА ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012] Учитывая вышесказанное, задачей настоящего изобретения является обеспечение улучшенного дермального филлера, не только обладающего долговременным сохранением эффекта in vivo и высокой лифтинговой способностью, но также обеспечивающего легкость инъецирования и дополнительные преимущества.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0013] Вышеуказанная задача решена посредством обеспечения модифицированного глицерином производного ГК и его применения в композиции дермального филлера, содержащей сшитую ГК и указанную модифицированную глицерином несшитую ГК в качестве «модифицированной смазывающей фазы». Этот новый тип дермального филлера на основе ГК обладает хорошей долговечностью и улучшенными реологическими свойствами, что дает превосходный объем при сохранении легкости инъецирования. Кроме того, дермальный филлер на основе ГК обладает дополнительным преимуществом, заключающимся в медленном и непрерывном высвобождении молекул глицерина, обеспечивающем длительное снабжение кожи глицерином.
[0014] В первом аспекте настоящего изобретения предложено модифицированное глицерином производное гиалуроновой кислоты (ГК) или его соль, в котором по меньшей мере первичная гидроксильная группа при С6-атоме углерода во всех или в части N-ацетил-D-глюкозаминовых звеньев в ГК превращена в присоединенные простоэфирной связью глицеринсодержащие фрагменты. В частности, присоединенные простоэфирной связью глицеринсодержащие фрагменты представляют собой полиглицериновые структуры в форме дендримерных сверхразветвленных фрагментов поли(простого эфира)-полиглицериновой структуры.
[0015] Во втором аспекте настоящего изобретения предложен способ получения производного гиалуроновой кислоты (ГК) или его соли согласно настоящему изобретению, включающий стадии:
(a) растворения ГК в водном щелочном растворе с получением растворенной ГК,
(b) добавления глицидола к растворенной ГК со стадии (а),
(c) взаимодействия глицидола и ГК с получением модифицированного глицерином производного ГК, и
(d) выделения указанного модифицированного глицерином производного ГК.
[0016] На стадии очистки (d) получают модифицированное глицерином производное ГК в очищенной форме, подходящей для дальнейшего применения. Указанная стадия обычно включает стадию нейтрализации и стадию выделения с выделением/очисткой модифицированного глицерином производного ГК из реакционной смеси, полученной на стадии (с).
[0017] В третьем аспекте настоящего изобретения предложено производное гиалуроновой кислоты (ГК) или его соль, получаемое способом получения производного ГК или его соли согласно настоящему изобретению.
[0018] Получаемое таким образом производное привитой полиглицерином гиалуроновой кислоты является сильно гидрофильным и считается безопасным, поскольку боковые фрагменты полиглицерина разлагаются in vivo с выделением эндогенного глицерина, который затем метаболизируется в печени и не оказывает влияния на превосходный профиль безопасности гиалуроновой кислоты.
[0019] В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению производного гиалуроновой кислоты (ГК) или его соли согласно настоящему изобретению для получения композиции дермального филлера. Предпочтительно, производное ГК или его соль вводят в несшитой форме, в частности, в форме раствора, в предварительно полученный сшитый гель ГК, в частности, сшитый BDDE гель ГК, с получением материала дермального филлера, обладающего свойствами отличными от сшитого геля ГК. Следовательно, производное ГК или его соль может действовать как «модифицированная смазывающая фаза».
[0020] В пятом аспекте настоящего изобретения предложена композиция дермального филлера, содержащая сшитую гиалуроновую кислоту (ГК) или ее соль и производное ГК или его соль согласно настоящему изобретению.
[0021] В шестом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения композиции дермального филлера согласно настоящему изобретению, включающий стадии:
(i) обеспечения модифицированного глицерином производного гиалуроновой
кислоты (ГК) или его соли согласно настоящему изобретению,
(ii) обеспечения сшитой ГК,
(iii) объединения производного ГК и сшитой ГК с получением указанной композиции дермального филлера.
[0022] После объединения модифицированного глицерином производного ГК (Гли-ГК) и сшитой ГК полученную комбинацию обычно гомогенизируют с получением высоко гомогенного и, предпочтительно, связанного геля ГК/Гли-ГК. Заем полученный гель обычно стерилизуют, что удобно делать при помощи нагревания во влажной среде, такого как автоклавирование.
[0023] В седьмом аспекте настоящего изобретения предложен набор, содержащий композицию дермального филлера согласно настоящему изобретению, содержащую сшитую ГК или ее соль и производное ГК или его соль, и, необязательно, инструкцию по применению.
[0024] В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции дермального филлера согласно настоящему изобретению в косметических целях. Примеры косметического применения включают, без ограничения, косметическую коррекцию тонких морщин на лице, морщин на лице, межбровных морщин, носогубных складок, «морщин марионетки», щечных складок, морщин вокруг губ, «гусиных лапок», субдермальную поддержку бровей, скуловых и щечных жировых подушечек, носослезных борозд, носа, губ, щек, области вокруг рта, подглазничной области, асимметрии лица, нижней части овала лица и подбородка.
[0025] В девятом аспекте настоящего изобретения предложен способ замещения или наполнения биологической ткани или увеличения объема биологической ткани для косметических целей, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции дермального филлера согласно настоящему изобретению, содержащей сшитую ГК или ее соль и производное ГК или его соль согласно настоящему описанию.
[0026] Предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения приведены в прилагаемой формуле изобретения. Дополнительные варианты реализации и другие предметы, выгоды и признаки настоящего изобретения будут понятны из следующего подробного описания изобретения и примеров.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0027] Было обнаружено, что модификация ГК глицидолом изменяет свойства полученных производных ГК и приводит к получению уникальных и интересных свойств при сохранении известных желательных свойств ГК, таких как превосходные вязкоэластичные (реологические) свойства, а также биосовместимость и неиммуногенность. Кроме того, композиция дермального филлера, содержащая производное ГК согласно настоящему изобретению и сшитую ГК, обеспечивает продленное сохранение эффекта in vivo и превосходную способность увеличения объема, и при этом легко инъецируется через тонкие иглы.
[0028] Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что прививание глицидола на ГК приводит к образованию структуры поли(эфира)-полиспирта, содержащей повторяющийся фрагмент глицерина (иногда также называемой «структура полиглицидола»), которая придает ГК превосходные физические характеристики в отношении, например, влажности, набухания, когезионной способности и/или гидратации. В частности, полагают, что полученная поли(простой эфир)-полиглицериновая структура представляет собой дендримерную сверхразветвленную пол и глицериновую молекулу, которая может быть похожа на полиглицериновую структуру, показанную ниже (которая, однако, не связана с ГК):
[0029] Кроме того, опять-таки не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что гидролитическое расщепление in vivo структуры полиглицерина приводит к постоянному или непрерывному высвобождению глицерина в окружающие ткани. Глицерин представляет собой эндогенную молекулу и играет основную роль в гидратации кожи, в эластичности кожи и в восстановлении эпидермального барьера. Однако сообщалось, что количество глицерина в коже уменьшается с возрастом. Различные полезные действия глицерина на эпидермис, в частности, включают гидратацию рогового слоя эпидермиса (самого внешнего слоя кожи), улучшение барьерной функции кожи, механических свойств кожи, защиты от раздражающих воздействий и ускорение процессов регенерации кожи.
[0030] После высвобождения глицерин мигрирует из зоны инъекции дермального филлера в роговой слой эпидермиса, где оказывает свое полезное действие на кожу. Другими словами, полагают, что модифицированное глицерином производное ГК, при инъекции в кожу, действует как «резервуар» или «депо» глицерина и обеспечивает непрерывное длительное поступление глицерина (т.е. поступление в течение недель, например, по меньшей мере 4 недель, и до месяцев). Таким образом, основное преимущество и дополнительная выгода композиции дермального филлера согласно настоящего изобретения заключаются в том, что постепенное высвобождение in vivo глицерина из модифицированных глицерином производных ГК в гидрогеле дермального филлера согласно настоящему изобретению можно применять для увлажнения кожи, восстановления активности клеток кожи, сохранения механических свойств плотности и эластичности кожи, стимуляции регенерации кожи и/или предотвращения старения кожи.
[0031] Другое преимущество настоящего изобретения заключается в улучшении физических и/или химических свойств известных дермальных филлеров на основе сшитой ГК (сГК) без ухудшения существующих желаемых свойств и характеристик дермальных филлеров на основе сГК посредством введения производных ГК согласно настоящему изобретению в виде отдельной фазы в несшитой форме в (существующий) гидрогель на основе сГК (например, Belotero, Etermis, и т.д.) перед стерилизацией. Следовательно, указанный подход также позволяет сохранить существующие стадии производства известных (например, BDDE) филлеров на основе сшитой ГК. Кроме того, указанная стратегия позволяет регулировать и/или подстраивать свойства дермального филлера на основе ГК под необходимые или желательные для данного применения.
[0032] В первом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному глицерином производному гиалуроновой кислоты (ГК) или его соли, в котором по меньшей мере первичная гидроксильная группа при С6-атоме углерода во всех или в части N-ацетил-D-глкжозаминовых звеньев в ГК превращена в присоединенные простоэфирной связью глицеринсодержащие фрагменты.
[0033] В контексте настоящего изобретения термин «производное», применяемый к гиалуроновой кислоте (ГК), относится к ГК, полученной из природной ГК путем химической модификации, такой как образование простого или сложного эфира. В настоящем описании термин «гиалуроновая кислота» или «ГК» означает гиалуроновую кислоту, гиалуронат и любую их соль, например, гиалуронат натрия. Также термин «производное ГК» в настоящем описании предназначен охватывать любую соль, в частности, натриевую соль, производного ГК.
[0034] Производное ГК согласно настоящему изобретению является «модифицированным глицерином», что относится к любой ковалентной связи, в частности, простой эфирной связи, с глицеринсодержащим фрагментом. В частности, термин «модифицированный глицерином» в настоящем описании означает, что ГК модифицирована глицеринсодержащим фрагментом, который присоединен посредством простоэфирной связи к С6-атому углерода всех или в части N-ацетил-D-глюкозаминовых звеньев в ГК. Кроме того, термин «модифицированный глицидолом» или подобный имеет аналогичное значение и применяется взаимозаменяемо с термином «модифицированный глицерином» или подобным, если явно не указано иное.
[0035] Выражение «все или часть N-ацетил-D-глкжозаминовых звеньев в ГК модифицированы» не предназначен налагать никаких конкретных ограничений, а только отражает тот факт, что химический синтез может не приводить к образованию 100% желаемого продукта реакции. Другими словами, если только «часть» групп ОН в положении С6 модифицированы в присоединенные простоэфирной связью глицеринсодержащие фрагменты, это означает, что существуют группы ОН, не превратившиеся в простой эфир, то есть, оставшиеся «свободными» первичными группами ОН.
[0036] Предпочтительно, глицеринсодержащие фрагменты модифицированного глицерином производного ГК согласно настоящему изобретению присоединены к С6-атому углерода N-ацетил-D-глюкозаминовых звеньев в ГК в таком количестве, что производное содержит от 1 до 100, предпочтительно, от 2 до 50, более предпочтительно, от 5 до 20 и наиболее предпочтительно, от 10 до 20 указанных глицеринсодержащих фрагментов на 100 повторяющихся дисахаридных звеньев в ГК. Отметим, что в рамках настоящего изобретения не исключено, что другие функциональные группы ГК, т.е. группы СООН и другие группы ОН, в частности, другие (вторичные) группы ОН, модифицированы глицерином, хотя и в гораздо меньшей степени. Следовательно, хотя производное ГК согласно первому аспекту настоящего изобретения относится к образованию простого эфира в положении С6, возможно, и не исключено явным образом в настоящем описании, предпочтительно присоединять глицеринсодержащие фрагменты к любой из других групп ОН в повторяющемся дисахаридном звене ГК. Однако, в рамках настоящего изобретения, полиглицеринсодержащий фрагмент предпочтительно присоединен исключительно, по существу исключительно или преимущественно посредством простоэфирной связи к С6-атому углерода в GlcNac.
GlcNac
2
2
2
2
1
2
1
2
1
2
[0037] Термин «глицеринсодержащий фрагмент» в настоящем описании относится к фрагменту, присоединенному к ГК, предпочтительно или преимущественно посредством простоэфирной связи к С6-атому углерода в N-ацетил-D-глюкозаминовых звеньях ГК (т.е. ГК-C6-O-«глицеринсодержащий фрагмент») и может содержать или состоять из одного глицеринового звена (например, -О-СН-СНОН-СН-ОН) или двух или более присоединенных простоэфирными связями глицериновых звеньев. Структура полиглицерина, образованна указанными двумя или более звеньями глицерина, в частности, образованная пятью или более звеньями глицерина, может иметь, и обычно имеет, форму дендримерной сверхразветвленной структуры полиглицерина (например, -O-CH-CHOR-CH-OR, где R и R независимо представляют собой атом водорода или линейный или разветвленный фрагмент полиглицерина, при условии, что оба R и R не представляют собой атомы водорода, причем указанный линейный или разветвленный фрагмент полиглицерина может, например, содержать от 1 до 50, от 5 до 30 или от 10 до 20 присоединенных простоэфирными связями глицериновых звеньев).
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
[0038] Термин «звено глицерина» в настоящем описании относится к химическим группам, имеющим скелет глицерина, в частности, может относиться к звену -СН-СНОН-СНОН («концевое звено», Т), звену -СН-СНОН-CHO- (линейное звено, L), звену -СН-СН(O-)-СНО- (разветвленное или «дендритное» звено, D), и комбинации звеньев, полученных из глицерина, соединения с тремя атомами углерода и тремя гидроксильными группами, формулы ОСНСНОНСНОН. Так, в случае, если «глицеринсодержащий фрагмент» состоит только из одного звена глицерина, структура следующая: ГК-Т. В случае двух звеньев глицерина структура следующая: ГК-L-T, т.е. ГК-(СН-СНОН-CHO-R) с R=Т. В случае трех звеньев глицерина структура следующая: ГК-L-L-T или ГК-D(T)-T.
[0039] В настоящем изобретении глицеринсодержащий фрагмент предпочтительно содержит п звеньев глицерина, где n равно по меньше мере 5, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15. Верхний предел n определяется конкретными условиями синтеза. Обычно n не превышает 40 или 30, или 20 звеньев глицерина. Согласно настоящему изобретению, глицеринсодержащий фрагмент, содержащий три или более звеньев глицерина, предпочтительно и преимущественно имеет разветвленную или - в частности, если n равно или больше 5 - сверхразветвленную структуру полиглицерина.
4
6
6
6
6
6
4
6
5
6
5
6
6
6
6
6
6
[0040] Производное ГК согласно настоящему изобретению обычно получают из ГК или ее соли со средней молекулярной массой в диапазоне от 1,0×10 Да до 5,0×10 Да, предпочтительно, от 1,0×10 Да до 4,5×10 Да, более предпочтительно, от 2,0×10 Да до 4,0×10 Да. Средняя молекулярная масса ГК также может варьироваться от 5×10 Да до 3,0×10 Да, более предпочтительно, от 1,0×10 Да до 2,0×10 Да или от 3,0×10 Да до 1,0×10 Да. Исходная ГК для получения производного ГК согласно настоящему изобретению ничем более не ограничена и может, например, включать смесь препаратов ГК с различными средними молекулярными массами, например, первая средняя молекулярная масса составляет менее 1,0×10 Да и вторая средняя молекулярная масса составляет более 1,0×10 Да, причем разница между первой и второй молекулярными массами предпочтительно составляет более 0,1×10 Да, более 0,5×10 Да или более 1,0×10 Да.
[0041] В рамках настоящего изобретения среднюю молекулярную массу полимеров ГК предпочтительно определяют путем вискозиметрии по уравнению Марка-Хувинка. Уравнение Марка-Хувинка устанавливает взаимосвязь между характеристической вязкостью (η) и средневязкостной молекулярной массой, и обеспечивает возможность определения средней молекулярной массы полимера по данными характеристической вязкости и наоборот. В контексте настоящего изобретения характеристическую вязкость предпочтительно измеряют согласно методике, определенной в европейской Фармакопее 7.0 (гиалуроновая кислота, статья №1472, 01/2011). Для расчета средней молекулярной массы ГК по данным характеристической вязкости в рамках настоящего изобретения применяют следующее уравнение Марка-Хувинка:
3
-5
3
3
3
3
где [η]=характеристическая вязкость в м/кг, М = средневязкостная молекулярная масса, K = 2,26×10 и а = 0,796. Согласно настоящему изобретению, характеристическая вязкость исходного материала ГК обычно варьируется от 1,350 м/кг (1350 мл/г) до 4,500 м/кг (4500 мл/г), в частности, от 2,0 м/кг до 4,0 м/кг.
3
6
3
6
3
6
4
5
5
6
6
6
6
6
6
6
[0042] Хотя исходная ГК, применяемая для получения производного ГК согласно настоящему изобретению, может иметь указанную выше среднюю молекулярную массу, готовые производные ГК могут иметь меньшую молекулярную массу из-за того, что синтез производного ГК проводят в щелочных условиях в водном растворе. Так, ГК (только полимерная часть ГК или «основная цепь» ГК) производных ГК согласно настоящему изобретению может иметь среднюю молекулярную массу, составляющую примерно от 2,0×10 Да до 1,0×10 Да или от 3,0×10 Да до 0,5×10 Да, или от 5,0×10 Да до 0,2×10 Да, или от 1,0×10 Да до 1,0×10 Да. Готовое производное ГК (т.е. замещенная глицидолом ГК) обычно имеет среднюю молекулярную массу, составляющую примерно от 0,5×10 Да примерно до 3,5×10 Да, в частности, от 1,0×10 Да до 3,0×10 Да, конкретнее, от 1,3×10 Да до 2,5×10 Да и наиболее конкретно, от 1,5×10 Да до 2,0×10 Да, в зависимости от степени прививки полиглицериновых фрагментов и длины цепи данного производного ГК.
3
3
3
3
[0043] Хотя уравнение Марка-Хувинка не одинаково для ГК и соответствующего производного ГК, вышеуказанное уравнение Марка-Хувинка и параметры (K, а) можно применять для определения средней молекулярной массы производного ГК согласно настоящему изобретению. Характеристическая вязкость производного ГК согласно настоящему изобретению может варьироваться от 0,020 м/кг (20 мл/г) до 1,500 м/кг (1500 мл/г), в частности, от 0,100 м/кг (100 мл/г) до 1,000 м/кг (1000 мл/г). Комплексная вязкость производного ГК может варьироваться от 0,04 Па⋅с до 1,0 Па⋅с или от 0,1 Па⋅с до 0,5 Па⋅с.
[0044] Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения производного гиалуроновой кислоты (ГК) или его соли согласно настоящему изобретению, включающему стадии:
(a) растворения ГК в водном щелочном растворе с получением растворенной ГК,
(b) добавления глицидола к растворенной ГК со стадии (а),
(c) взаимодействия глицидола и ГК с получением модифицированного глицерином производного ГК, и
(d) выделения указанного модифицированного глицерином производного ГК.
[0045] В контексте настоящего изобретения способ получения производного гиалуроновой кислоты или его соли может быть основан на подходе «прививки от» или на подходе «прививки на», но конкретные ограничения на конкретный подход к прививке отсутствуют.
[0046] На стадии (а), ГК (исходную ГК) растворяют. Предпочтительно, сначала ГК растворяют в водном растворе (например, дистиллированной воде) в течение заданного времени (например, от 0,5 ч до 12 ч) для перехода ГК в раствор и ее набухания. Затем доводят рН смеси до щелочного рН (например, от 9 до 12, в частности, от 10 до 11) путем введения основания (например, NaOH, предпочтительно, раствора NaOH). Затем, на стадии (b), к растворенной ГК добавляют заданное количество глицидола (обычно в избытке, например, 2 эквивалента, моль/моль). Количество ГК, содержащееся в реакционной смеси, может варьироваться от 10 мг/мл до 100 мг/мл, или, в частности, от 20 мг/мл до 50 мг/мл. На стадии (с) смеси дают прореагировать в течение заданного времени (например, от 0,5 ч до 5 ч) при заданной температуре (например, от 40°С до 55°С). Наконец, на стадии (d), очищают модифицированное глицерином производное ГК, содержащееся в реакционной смеси, полученной на стадии (с).
[0047] Согласно настоящему изобретению, стадия (d) указанного способа может включать подстадию (d1) нейтрализации реакционной смеси, полученной на стадии (с), содержащей модифицированное глицерином производное ГК, или подстадию (d2) выделения модифицированного глицерином производного ГК из реакционной смеси с получением модифицированного глицерином производного ГК в чистом виде, или обе подстадии (d1) и (d2). На подстадии (d1) нейтрализацию можно осуществлять путем подкисления, например, с использованием кислоты, такой как соляная кислота. Удобно, если выделение (одновременно включающее стадию очистки) на подстадии (d2) можно проводить путем диализа и/или осаждения, как известно специалистам в данной области техники.
[0048] В третьем аспекте настоящее изобретение относится к производному гиалуроновой кислоты (ГК), которое может быть получено при помощи способа согласно настоящему изобретению. Благодаря привитым структурам полиглицерина производное ГК является высоко гидрофильным. Кроме того, сверхразветвленные структуры полиглицерина, как считается, снижают спутывание полимеров ГК, что приводит к меньшим вязкостям, чем у немодифицированной ГК.
[0049] В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению производного гиалуроновой кислоты (ГК) или его соли согласно настоящему изобретению для получения композиции дермального филлера. Предпочтительно, производное ГК или его соль вводят в несшитой форме, в частности, в форме раствора, в заранее полученный сшитый гель ГК, в частности, в сшитый BDDE гель ГК, с получением материала дермального филлера со свойствами, отличными от сшитого геля ГК. Так, производное ГК или его соль могут действовать как «модифицированная смазывающая фаза».
[0050] В настоящем описании термин «дермальный филлер» в широком смысле относится к материалам, разработанным для придания объема участку с нехваткой мягких тканей. Термин «дермальный филлер» имеет то же значение и используется взаимозаменяемо с термином «наполнитель мягких тканей». То есть, термин «дермальный филлер» не предназначен накладывать никаких ограничений на место и тип инъекции, помимо того, что «наполнитель мягких тканей» подходит или применяется в косметических/эстетических целях. Термин «композиция» в настоящем описании должен означать композицию, применяемую или подходящую для применения в качестве дермального филлера. Термин «композиция дермального филлера» в рамках настоящего изобретения в целом относится к веществу, которое добавляет, замещает или увеличивает объем под кожей, что приводит, например, к разглаживанию кожных морщин, увеличению губ, улучшению внешнего вида кожи или лечению шрамов. Ее обычно применяют в области дермы, такой как ниже эпидермиса или выше подкожной клетчатки, и ее можно инъецировать подкожно, гиподермально или внутрикожно, или в некоторых комбинациях.
[0051] Согласно настоящему изобретению композиция дермального филлера обычно находится в форме геля или гидрогеля. Термин «гель» в настоящем описании в целом относится к материалу, обладающему текучестью при комнатной температуре или температуре тела, промежуточной между текучестью жидкости и твердого тела. Кроме того, термин «гель» включает материал, способный поглощать воду, и, таким образом, может быть также назван в настоящем описании «гидрогелем». В настоящем изобретении композиция дермального филлера в общем случае содержит физиологически приемлемую несущую текучую среду, в частности, апирогенный изотонический буферный раствор, в частности, физиологический солевой раствор или буферный физиологический солевой раствор.
[0052] Кроме того, композиция дермального филлера согласно настоящему изобретению в общем случае является «инъекционной». Это означает, что композиция дермального филлера подходит для инъецирования в кожу или другую ткань для доставки композиции филлера мягких тканей в желаемое место применения. «Инъекционную» композицию согласно настоящему изобретению можно вводить через шприц в нормальных условиях под нормальным давлением. Кроме того, композиция дермального филлера согласно настоящему изобретению предпочтительно является стерильной. Стерилизацию можно осуществлять путем воздействия на композицию дермального филлера, предпочтительно после помещения в шприц, влажным теплом, например, путем автоклавирования.
[0053] В пятом аспекте настоящее изобретение относится к композиции дермального филлера согласно настоящему изобретению, которая содержит сшитую гиалуроновую кислоту (ГК) и производное ГК согласно настоящему изобретению. Производное ГК в общем случае является несшитым и применяется в виде отдельной фазы, вводимой в (заранее подготовленную) фазу сшитой ГК.
[0054] В контексте настоящего изобретения отсутствуют ограничения для сшитой гиалуроновой кислоты, и она может включать сшитую гиалуроновую кислоту, полученную из одного вида гиалуроновой кислоты или из двух или более видов гиалуроновой кислоты, отличающихся по молекулярной массе (см., например, US 2010/0316683 А1 или WO 2013/185934 А1, включенные в настоящую заявку посредством ссылок). Также, в рамках настоящего изобретения, сшитая гиалуроновая кислота может представлять собой полиуплотненный гель, характеризующийся вариациями степени сшивки внутри геля, т.е. «полиуплотненный» гель имеет (по меньшей мере) два различных уровня плотности, с более плотными частями (более высокая степень сшивки) и менее плотными частями (меньшая степень сшивки).
[0055] Полиуплотненные гели можно получить, например, при помощи первой реакции сшивания для сшивания первого полисахарида(ов), с последующей второй реакцией сшивания для сшивания второго полисахарида(ов), с образованием дважды сшитого геля. Указанные первый и второй полисахарид(ы) могут, например, независимо представлять собой одну и ту же гиалуроновую кислоту или две различные гиалуроновые кислоты, отличающиеся по средней молекулярной массе (например, гиалуроновая кислота с низкой молекулярной массой и с высокой молекулярной массой). Способ двойного сшивания (динамическая технология сшивания) известен в данной области техники и описан, например, в ЕР 1711552 В1, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[0056] Сшитая ГК может присутствовать в композиции в концентрации от 0,1% до 4,0%, предпочтительно, от 0,5% до 3,5%, более предпочтительно от 1,0% до 3,0% или от 1,5% до 2,8%, и наиболее предпочтительно, от 2,0% до 2,5% масс/об. или масс/масс, (что аналогично масс/об., поскольку плотность гидрогеля близка к 1 г/мл). В настоящем изобретении сшитую гиалуроновую кислоту можно получить путем сшивания одной гиалуроновой кислоты или путем сшивания первой гиалуроновой кислоты и второй гиалуроновой кислоты и, факультативно, еще по меньшей мере одной гиалуроновой кислоты, причем первая, вторая и еще по меньшей мере одна гиалуроновая кислота отличаются по молекулярной массе.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
3
3
6
6
6
6
6
6
6
6
3
3
[0057] В настоящем изобретении ГК предпочтительно имеет среднюю молекулярную массу, составляющую от 0,5×10 Да до 4,0×10 Да, в частности, от 1,0×10 Да до 3,0×10 Да или от 1,5×10 Да до 2,5×10 Да. В случае применения двух различных ГК, первая гиалуроновая кислота может иметь среднюю молекулярную массу, составляющую от 1,0×10 Да до 5,0×10 Да, предпочтительно, от 0,5×10 Да до 2,0×10 Да, более предпочтительно, от 1,0×10 Да до 1,5×10 Да (или характеристическую вязкость, составляющую от 1,35 м/кг до 1,8 м/кг). Вторая гиалуроновая кислота предпочтительно имеет среднюю молекулярную массу, составляющую более 1,0×10 Да и до 5,0×10 Да, в частности, от 1,5×10 Да до 4,0×10 Да, предпочтительно, от 2,0×10 Да до 4,0×10 Да, и наиболее предпочтительно, от 2,8×10 Да до 3,2×10 Да (или от 2,8 м/кг до 3,2 м/кг).
[0058] Сшитая ГК предпочтительно сшита BDDE (диглицидиловым эфиром 1,4-бутандиола). Сшитая BDDE гиалуроновая кислота может иметь степень модификации, выраженную как отношение суммы моно- и дисвязанных поперечных сшивок BDDE к сумме дисахаридных звеньев гиалуроновой кислоты, от 0,5% до 25%, предпочтительно, от 1,0% до 15%, более предпочтительно, от 2,0% до 10% и наиболее предпочтительно, от 3,0% до 8,0% или от 4,0% до 7%.
[0059] Степень модификации можно определить при помощи MP согласно известным в данной области техники способам (Edsman et al., Gel Properties of Hyaluronic Acid Dermal Fillers, Dermatol. Surg. 2012, 38:1170-1179; Guarise et al., SEC determination of cross-link efficiency in hyaluronan fillers, Carbohydrate Polymers 2012, 88: 428-434; Kenne et al., Modification and cross-linking parameters in hyaluronic acid hydrogels - Definitions and analytical methods, Carbohydrate Polymers 2013, 91: 410-418).
2
[0060] Вкратце, диализированные и стерилизованные гели разлагают перед регистрацией спектра ЯМР. Разложение можно осуществлять при помощи хондроитиназы AC (Edsman et al., supra; Kenne et al., supra), NaOH (Guarise et al., supra), введения гиалуронидазы (например, 150 Ед. овечьей гиалуронидазы на 1 г геля) или путем выдержки при 90°С в течение по меньше мере 35 ч. Затем полученные растворы лиофилизируют, растворяют в DO и тщательно гомогенизируют.
2
3
2
2
[0061] Спектры ЯМР можно регистрировать, например, при 500 МГц, с импульсом 20 градусов, с несколькими повторениями, при комнатной температуре, для получения спектра с подходящим разрешением. Согласно литературным данным, степень модификации (MoD) оценивают, вычисляя отношение сигналов N-ацетила ГК к метиленовым сигналам BDDE. Для N-ацетила ГК основные сигналы расположены около 2,0 м.д., и для BDDE, растворенного в DO, около 1,6 м.д. Для расчета степени модификации определяют интегральные значения, учитывая соотношение протонов 3Н в N-ацетиле (СН) к 4Н в метилене (СНСН), как указано в литературе (Edsman et al., supra, and Kenne et al., supra).
[0062] Согласно настоящему изобретению, производное ГК присутствует в композиции дермального филлера в концентрации, составляющей по меньшей мере 0,1%, например, от 0,1% до 50%, предпочтительно, от 1,0% до 30%, более предпочтительно, от 5% до 25%, и наиболее предпочтительно, от 10% до 20%, об./об. Альтернативно, производное ГК может присутствовать в композиции дермального филлера в концентрации, составляющей от 0,001% до 2,0%, от 0,01% до 1,0%, от 0,05% до 0,5% или от 0,1% до 0,3% по масс./масс. Кроме того, средняя молекулярная масса и вязкость производного ГК могут быть такими, как определено выше.
[0063] Композиция дермального филлера может, кроме того, содержать одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из анестетиков, полиолов, витаминов, аминокислот, металлов, антиоксидантов, гидроксиапатитовых частиц и минеральных солей (например, соль Zn). Предпочтительно, композиция дермального филлера содержит по меньшей мере один местный анестетик, предпочтительно, лидокаин (например, лидокаина HCI). Местный анестетик, в частности лидокаин, может присутствовать в композиции дермального филлера в концентрации, составляющей, например, от 0,05% масс. до 5,0% масс., от 0,1% масс. до 4,0% масс., от 0,2% масс. до 3,0% масс., от 0,3% масс. до 2,0% масс., или от 0,4% масс. до 1,0% масс.
[0064] В контексте настоящего изобретения введение местного анестетика особенно желательно из-за его способности облегчать боль при инъекции. Примеры местных анестезирующих агентов включают, без ограничения, амбукаин, амоланон, амилокаин, беноксинат, бензокаин, бетоксикаин, бифенамин, бупивакаин, бутакаин, бутамбен, бутаниликаин, бутетамин, бутоксикаин, картикаин, хлоропрокаин, кокаэтилен, кокаин, циклометикаин, дибукаин, диметизохин, диметокаин, диперодон, дицикломин, экгонидин, экгонин, этилхлорид, этидокаин, бета-эукаин, эупроцин, феналкомин, формокаин, гексилкаин, гидрокситетракаин, изобутил-пара-аминобензоат, лейцинокаина мезилат, левоксадрол, лидокаин, мепивакаин, меприлкаин, метабутоксикаин, метилхлорид, миртекаин, непаин, октокаин, ортокаин, оксетазаин, паретоксикаин, фенакаин, фенол, пиперокаин, пиридокаин, полидоканол, прамоксин, прилокаин, прокаин, пропанокаин, пропаракаин, пропипокаин, пропоксикаин, псевдококаин, пиррокаин, ропивакаин, салициловый спирт, тетракаин, толикаин, тримекаин, золамин и соли указанных соединений.
[0065] Подходящие полиолы для применения в настоящем изобретении включают, без ограничения, глицерин, маннит, сорбит, пропиленгликоль, эритрит, ксилит, маннит и лактит.Особенно подходящими для применения в настоящем изобретении являются маннит и глицерин. Кроме того, полиол предпочтительно представляет собой гликоль, факультативно, в комбинации с одним или более вышеуказанными полиольными соединениями, в частности, маннитом. Полиол(ы) можно, например, включать в композицию дермального филлера в концентрации, составляющей от 0,1% до 25%, или от 1% до 20%, или от 2% до 15% об./об., в частности, в концентрации от 5% до 10% об./об.
1
2
3
5
6
7
9
12
[0066] Подходящие витамины включают витамин С, витамин Е и витамины группы В, т.е. один или более из витаминов B, В, В, B, В, В, В и В. Концентрация витамина С или витамина Е предпочтительно составляет от примерно 0,01 мг/мл до примерно 10,0 мг/мл, более предпочтительно, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 5,0 мг/мл, и общая концентрация витаминов группы В предпочтительно составляет от примерно 0,01 мг/мл до примерно 10,0 мг/мл, более предпочтительно, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 5,0 мг/мл. Витамины могут присутствовать для стимуляции и поддержания клеточного метаболизма и, таким образом, стимуляции производства коллагена. Особенно предпочтительными для применения являются витамин С, витамин Е и витамин Вб.
5
6
6
6
[0067] Кроме того, предполагают, что композиция дермального филлера может содержать несшитую ГК. В частности, композиция дермального филлера может дополнительно содержать от 0,001% до 15%, в частности, от 1% до 10% об./об. несшитой гиалуроновой кислоты. Молекулярная масса указанной несшитой гиалуроновой кислоты предпочтительно составляет от 3,0×10 Да до 4,0×10 Да, в частности, от 1,0×10 Да до 3,0×10 Да. Предпочтительно, композиция дермального филлера согласно настоящему изобретению не содержит никаких сшитых полимеров, кроме сшитой ГК согласно настоящему описанию, и, более предпочтительно, также не содержит никаких несшитых полимеров, кроме производного ГК и/или несшитой (т.е. свободной) ГК.
[0068] Кроме того, композиция дермального филлера обычно содержит буферный агент, например, фосфатный буфер, для регулировки рН. рН обычно находится в диапазоне от 6,5 до 7,5, от 6,5 до 7,4, или от 6,5 до 7,1, или может находиться в диапазоне от 6,8 до 7,4.
[0069] В шестом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции дермального филлера согласно настоящему изобретению, включающему стадии:
(i) обеспечения производного гиалуроновой кислоты (ГК), как определено в любом из пунктов формулы изобретения 1-3,
(ii) обеспечения сшитой ГК,
(iii) объединения производного ГК и сшитой ГК с получением указанной композиции дермального филлера.
[0070] Способ может дополнительно включать стадию стерилизации полученной композиции дермального филлера, необязательно, после помещения в шприц, предпочтительно, при помощи нагревания во влажной среде, такого как автоклавирование.
[0071] В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему композицию дермального филлера согласно настоящему изобретению и, необязательно, инструкцию по применению. В предпочтительном варианте реализации набор включает шприц, заранее наполненный композицией дермального филлера согласно настоящему изобретению. В инструкции по применению предпочтительно указано, что набор предназначен для применения в косметических целей, в частности, описанные ниже.
[0072] В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции дермального филлера согласно настоящему изобретению в косметических целях, например, для улучшения внешнего вида, в частности, лица. Косметические применения включают, без ограничения, заполнение морщин и тонких морщин на коже, в частности, тонких морщин и морщин на лице (например, межбровных морщин, носогубных складок, складок на подбородке, «морщин марионетки», щечных складок, морщин вокруг рта и «гусиных лапок»). Другие примеры косметических применений включают заполнение углублений кожи, маскировку шрамов и впадин на висках, обеспечение субдермальной поддержки бровей, скуловые и щечные жировые подушечки, коррекцию носослезной борозды, коррекцию носа, подбородка и нижней части овала лица, увеличение объема губ, поддержку щек, воздействие на область вокруг рта, подглазничную область и асимметрию лица, и/или улучшение гидратации и текстуры кожи.
[0073] В девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу замещения или наполнения биологической ткани или увеличения объема биологической ткани в косметических целях, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции дермального филлера согласно настоящему изобретению.
[0074] Композицию дермального филлера согласно настоящему изобретению обычно вводят субъекту в эффективном количестве путем инъекции, такой как подкожная или внутрикожная инъекция. Например, композицию можно инъецировать внутрикожно или подкожно с использованием методики последовательных проколов. Термин «эффективное количество» относится к количеству (инъецируемой) композиции наполнителя мягких тканей, достаточному для оказания полезных или желаемых косметических (эстетических) или терапевтических результатов. «Субъект» в настоящем изобретении представляет собой любого индивидуума или пациента, обычно человека, нуждающегося в лечении определенного состояния или заболевания.
[0075] Ниже настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано следующими неограничительными примерами.
ПРИМЕРЫ
[0076] Следующие примеры демонстрируют, что модифицированное глицерином производное гиалуроновой кислоты (ГК) согласно настоящему изобретению обеспечивает возможность получения геля на основе ГК, обладающего превосходными физическими (например, механическими и реологическими) свойствами.
Сокращения
[0077] В следующем разделе использованы следующие сокращенные обозначения:
Материалы и способы
Материалы
6
[0078] В экспериментах использовали гиалуроновую кислоту бактериальной ферментации (MW=1,5×10 Да), раствор 1 М HCl и раствор 2 М NaOH, и глицидол. Растворители и ГК применяли в том виде, в каком получали, без дополнительной очистки или высушивания. Все реакции проводили в нормальных атмосферных условиях при комнатной температуре, если не указано иное.
Спектры ЯМР
1
2
[0079] Спектры ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker при комнатной температуре. Спектры 1Н ЯМР записывали при 500 МГц. Химические сдвиги (δ) (также называемые сигналами или Н ЯМР сигналами) указывали в миллионных долях (м.д.). Все спектры ГК и модифицированной ГК регистрировали с использованием образцов в расщепленном состоянии. Такие образцы получали путем осаждения образцов в изопропаноле, высушивания осажденного образца, расщепления полученного образца под действием 50 Ед. гиалуронидазы при 40°С в течение 12 ч в водном растворе, и наконец, высушивания замораживанием расщепленного образца. Перед регистрацией ЯМР образцы растворяли в DO в концентрации примерно 20 мг/мл до однородности. Спектры ЯМР применяли для определения степени модификации (MoD).
Реологические измерения
[0080] Реологические измерения проводили на реометре Anton Paar MRC 302 (Anton Paar, Graz, Austria), снабженном конусом и пластинкой с диаметром 50 мм и углом 1°, с зазором 0,1 мм, в диапазоне частот от 10 до 0,1 Гц, при деформации 0,1%. Указывали реологические значения при 1 Гц. Все измерения проводили при постоянной температуре 25°С, если не указано иное.
Измерение силы экструзии
[0081] Силу экструзии гелей измеряли при помощи иглы 30G  (TSK Laboratory) при скорости экструзии примерно 0,21 мм/сек с использованием стандартного 1,0 мл стеклянного шприца (BD Hypak SCF, 1 мл длинный RF-PRTC, ISO 11040, внутренний диаметр 6,35 мм) на анализаторе текстур TA.XTPLUS.
Синтез модифицированной гиалуроновой кислоты
3
3
[0082] Модифицированное глицерином производное ГК (Гли-ГК) синтезировали по следующей методике (гипер)прививки. Вначале растворяли сырье ГК (имеющее характеристическую вязкость 3,1 м/кг) в воде до однородности. Затем добавляли гидроксид натрия. Затем добавляли глицидол, например, в количестве 1,0 эквивалента (моль/моль экв.), рассчитанного по молекулярной массе (ГК = 402 г/моль, глицидол = 74 г/моль) и проводили реакцию с ГК примерно при 50°С в течение примерно 3 ч для прививки глицидола на основную цепь ГК и, факультативно, роста привитой боковой цепи путем присоединения избытка мономеров глицидола (к глицидолу, привитому на основную цепь ГК). Также можно применять более мягкие условия реакции, например, 40°С и примерно от 1,5 до 2,0 с. Альтернативно, сырье ГК (например, сухие волокна ГК с 3,1 м/кг) можно вводить в водный раствор NaOH/глицидола, с последующим взаимодействием в вышеуказанных условиях реакции.
[0083] Этот тип реакции «прививка от» в итоге приводит к получению линейно-сверхразветвленного привитого сополимера (LHGC), т.е. гиалуроновой кислоты с привитым сверхразветвленным полиглицерином (HA-g-nbPG). Описанный путь синтеза показан на Схеме 1 ниже.
[0084] Как можно видеть, подход «прививка от» приводит к получению модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты, имеющей дендримерную сверхразветвленную структуру полиглицерина на цепи ГК. Длина цепи n зависит от молекулярной массы сырья и условий щелочной обработки, тогда как число звеньев глицидола m, которые представляют собой концевой моноэфир m***, внутримолекулярный диэфир m** или межмолекулярный триэфир m*, является результатом стехиометрического отношения глицидола к повторяющимся дисахаридным звеньям в ГК. Предлагаемая структура полиглицерина относится к количеству m*, в то время как звенья m** и m*** существенно важны для создания и увеличения количества функциональных групп - доноров и акцепторов водорода.
[0085] Поскольку наиболее нуклеофильной группой в ГК является гидроксильная группа в положении С6 N-ацетил-D-глюкозамина (Glc/VAc), весьма вероятно образование полиглицериновой структуры именно в этом положении полимера ГК. Исходя из pKa, гидроксильная группа в положении С6 депротонируется первой, по сравнению с вторичными ОН пиранозы, и дендримерный полиглицерин образуется в первую очередь в положении Сб. После присоединения глицидола полученный алкоксид атакует метиленовые атомы углерода в оксирановом кольце глицидола, приводя к раскрытию цикла и образованию новой функциональной группы спирта (или алкоксида) (механизм анионной полимеризации с раскрытием цикла). Новообразованные первичные спирты (алкоголяты) конкурируют с первичными спиртовыми (алкоголятными) группами при С6 в ГК - из-за стерической затрудненности примерной цепи ГК и жесткой структуры пиранозы - что, как полагают, приводит к росту полиглицериновой структуры на исходном глицериновом фрагменте, присоединенном в положение С6 главной цепи ГК.
[0086] Затем продукт реакции глицидол-ГК нейтрализовывали (рН=7) при помощи HCI, разбавляли и гомогенизировали путем перемешивания/диспергирования. Затем продукт обезвоживали с помощью цикла добавление этанола/ пропускание через сито/ отжимание, с последующим высушиванием в вакуумном шкафу при повышенной температуре (45°С).
[0087] Для изучения зависимости степени модификации ГК от использованного количества глицидола готовили следующие образцы модифицированной глицидолом ГК (Гли-ГК) согласно вышеописанной методике синтеза с использованием различных количеств глицидола (см. Таблицу 1).
Получение гидрогелей
[0088] Для изучения влияния глицидола на сшитые BDDE гидрогели ГК готовили четыре различных гидрогеля на основе ГК, как указано в Таблице 2.
[0089] В случае геля А, глицидол вводили после предварительной сшивки ГК при помощи BDDE в одностадийной методике.
[0090] Гель В получали согласно предшествующему уровню техники, описанному в US 2010/0035838 А1, где BDDE и глицидол одновременно добавляли к ГК для создания сшитого гидрогеля (конкурентные условия).
[0091] Гель С получали также, как стандартный сшитый BDDE гидрогель ГК.
[0092] Гель D получали по методике согласно настоящему изобретению, где Гли-ГК вводили в виде отдельной фазы в готовый сшитый BDDE гидрогель ГК.
Результаты и обсуждение Прививка глицидола
1
[0093] Прививание глицидола на ГК подтверждали по спектрам протонного ядерного магнитного резонанса (Н ЯМР). Во-первых, снимали спектры со стандартными добавками сшитой ГК чтобы проверить наличие фрагментов глицерина в результате прививания глицидола. Бесспорные сигналы глицерина можно найти при 3,71 (д, J = 4,3 Гц, 1Н), 3,69 (с, 1Н), 3,61 (д, J = 6,5 Гц, 2Н), 3,59 (д, J = 6,5 Гц, 1Н). Конкретные расщепление и сдвиг этих сигналов зависят от разветвления повторяющихся звеньев m (см. Схему 1, выше). К сожалению, было обнаружено, что указанные характеристические сигналы полностью перекрываются сигналами глюкопиранозного кольца в повторяющихся звеньях гиалуроновой кислоты (результаты не показаны).
[0094] Значительное различие было отмечено только при введении глицидола в достаточных количествах, обеспечивающих возможность образования сверхразветвленных структур. Следовательно, невозможно вычислить абсолютное количество привитых звеньев по данным ЯМР, но можно подтвердить включение глицидола и вычислить в относительных величинах. Таким образом, значения интегралов специфичных для глицидола сигналов в спектре ЯМР являются ключевыми параметрами для подтверждения успешной прививки и количества структур полиглицерина, присутствующих на главной цепи ГК.
1
[0095] В частности, записанные спектры Н ЯМР анализировали путем сравнения бесспорных сигналов полиглицерина, которые ожидали найти примерно при 3,90 м.д. - 3,96 м.д. (~ 3,90 м.д.) и примерно при 3,60 м.д. - 3,55 м.д. (~ 3,60 м.д.), причем сигнал N-ацетила в ГК (3Н) при 2,08 м.д. принимали равным 3,00. Как следствие приравнивания сигнала ЗН к 3,00, ожидали получить для сигналов аномерных протонов при 4,62 и 4,51 (2Н) значение интеграла около 2,00, и для сигнала ГК при 3,40 м.д. (1Н) ожидали получить значение около 1,00, по числу протонов в двух мономерах ГК. Кроме того, ожидали, что значения интегралов для сигналов привитого глицидола будут тем выше, чем выше количество привитого глицидола, в то время как сигналы, относящиеся к основной цепи ГК, должны оставаться постоянными. Как показано в Таблице 3, указанные закономерности действительно наблюдались для трех синтезированных образцов Гли-ГК.
Реологические свойства модифицированной глицидолом ГК
[0096] Влияние прививки глицидола оценивали путем измерения модуля накопления G' и комплексной вязкости μ. Образцы модифицированной глицидолом ГК (ГК + 0,5 экв., 1,0 экв. или 2,0 экв. глицидола) получали, подвергая синтезированные производные Гли-ГК исчерпывающему диализу, с последующим доведением концентрации Гли-ГК до 20 мг/мл. Было обнаружено, что как G', так и μ были низкими (результаты не показаны), как полагают, в результате щелочного (NaOH) разложения исходного материала ГК. Следовательно, изменение рН, в частности, снижение рН ниже 10, вероятно, ограничит гликозидное отщепление и, следовательно, обеспечит дополнительную возможность модификации конечных свойств модифицированной глицидолом ГК.
[0097] Кроме того, наблюдалась тенденция, согласно которой более высокие количества глицидола, применяемые при синтезе Гли-ГК, давали меньшие значения вязкости (результаты не показаны). Следовательно, изменение рН на стадии щелочного разложения и количества глицидола потенциально можно оптимизировать для создания дермальных филлеров, обладающих улучшенными и/или точно регулируемыми свойствами.
Водопоглощающая способность модифицированной глицидолом ГК
[0098] Водопоглощающую способность модифицированной глицидолом ГК и исходной (т.е. «свободной», несшитой или немодифицированной ГК) изучали при помощи динамической сорбции паров на приборе Dynamic Vapor Sorption Intrinsic от Surface Measurement Systems Ltd. Использовали следующие образцы:
- немодифицированная ГК (степень модификации, MoD = 0 мольн. %), и
- модифицированная глицерином ГК (MoD = 12,8 мольн. %).
[0099] Образцы высушивали в течение ночи в вакууме при комнатной температуре. Для определения поведения при сорбции паров воды образцы затем подвергали воздействию атмосферы с возрастающей относительной влажностью при постоянной температуре (25°С). Относительную влажность повышали ступенчато, по 5%, от 0% до 95%. на каждой ступени регистрировали увеличение массы образца после установления постоянного значения. Оба образца испытывали в двух повторениях и для анализа использовали средние значения. Увеличение массы образца в ходе измерений указывает на поглощение воды из атмосферы.
[00100] Было обнаружено, что модифицированная глицерином гиалуроновая кислота поглощает больше воды, чем исходная ГК, при высокой относительной влажности (>85%; примерно на 5-10% больше при 90% относительной влажности и примерно на 15-20% при 95% относительной влажности). То есть, модификация глицерином увеличивает способность гиалуроновой кислоты связывать воду.
Реологические свойства гелей на основе ГКА-D
[00101] Четыре различных геля (гели А, В, С и D, описанные выше) исследовали для определения влияния введения модифицированной глицидолом ГК на реологические свойства гидрогелей на основе ГК. Полученные результаты показаны в Таблице 4.
[00102] Полученные результаты демонстрируют различие в реологических свойствах гелей на основе ГК, придаваемое ГК, обработанной BDDE и/или глицидолом. Стандартный сшитый BDDE гель ГК, представленный гелем С, дает гидрогель со свойствами типичных дермальных филлеров. Присутствие глицидола во время сшивания при получении геля В влияет на процесс сшивания и значительно «ослабляет» гель.
[00103] Дополнительная обработка сшитой BDDE ГК глицидолом в последовательной реакции дает «более крепкий» гель с точки зрения лифтинговой способности, на что указывает повышенное значение G' (см. гель А). Тем не менее, конкурентное присутствие глицидола и BDDE в случае геля А приводит к неизвестным результатам, поскольку BDDE способен взаимодействовать с глицидолом и/или ГК. Поэтому образуется нежелательная неизвестная сетчатая структура, которая по существу невоспроизводима и, следовательно, делает невозможным установление стабильного способа производства.
[00104] Смешивание модифицированного глицидолом производного ГК с (заранее полученным) стандартным сшитым BDDE гидрогелем, как в случае геля D согласно настоящему изобретению, приводит к желаемому смазывающему действию, как показывает сниженное усилие инъецирования, равное 17,1 Н, и адекватной комплексной вязкости, близкой к комплексной вязкости стандартного сшитого BDDE гидрогеля ГК (см. гель С).
Сравнение гидрогелей сГК/Гли-ГК и сГК/свободная ГК с точки зрения усилия инъецирования, модуля накопления и тангенса потерь
[00105] Цель данного примера заключается в оценке способности несшитой модифицированной глицерином ГК (Гли-ГК) служить заменой свободной ГК (несшитой ГК) в качестве смазывающего вещества в составах сшитых гелей на основе ГК. Для этого оценивали усилие инъецирования (УИ), модуль накопления (С) и тангенс потерь (tanδ=G''/G').
[00106] Измеряли следующие образцы:
- сшитый BDDE гидрогель ГК («основа»; Mw ГК=2,8 МДа) - без смазывающей фазы,
- «основа» со смазывающей фазой 5% свободной ГК (Mw = 1,5 МДа),
- «основа» со смазывающей фазой 2% (масс./масс.) Гли-ГК,
- «основа» со смазывающей фазой 5% (масс./масс.) Гли-ГК, и
- «основа» со смазывающей фазой 8% (масс./масс.) Гли-ГК,
3
2
где смазывающую фазу Гли-ГК получали согласно вышеописанной методике (Mw = 2,88 МДа, степень модификации (MoD): 11,8, характеристическая вязкость: 1,9 м/кг, комплексная вязкость (20 мг/мл в НО при 1 Гц): 28 Па⋅с).
[00107] Результаты измеренного усилия инъецирования и реологических характеристик показаны в Таблице 5. Как можно видеть, усилие инъецирования (УИ) для чистой основы без смазывающей фазы («Lub») гораздо выше, чем для основы со смазывающей фазой. Кроме того, то же низкое усилие инъецирования, т.е. то же смазывающее действие, наблюдалось для свободной ГК и для Гли-ГК при 5% (масс./масс). При применении 2% (масс/масс.) Гли-ГК усилие инъецирования несколько возрастало, тогда как 8% (масс/масс.) Гли-ГК давало небольшое снижение усилия инъецирования. То есть, по-видимому, наблюдается обратная линейная корреляция между содержанием Гли-ГК в основе и усилием инъецирования (или смазывающим действием).
[00108] Как можно также видеть из Таблицы 5, как и свободная ГК, Гли-ГК приводит только к небольшому снижению модуля накопления (или модуля упругости) G'. Фактически, для 5% (масс./масс.), G' по существу одинаков для свободной ГК и для Гли-ГК. Кроме того, введение 5% Гли-ГК приводит к относительно небольшому увеличению тангенса потерь (tanδ). Обнаружено одинаковое увеличение tan5 в случае свободной ГК и Гли-ГК.
[00109] Полученные результаты показывают эквивалентность Гли-ГК и свободной ГК сточки зрения предполагаемого применения в качестве смазывающего агента. Следовательно, механические и физические свойства, придаваемые Гли-ГК, были сопоставимы с указанными свойствами, придаваемыми свободной ГК, в то время как Гли-ГК дополнительно придает превосходную способность поглощать воду благодаря полиглицериновым структурам, привитым на главную цепь ГК.
Ферментативное разложение модифицированной глицидолом ГК и гелей на основе ГК, содержащих модифицированную глицидолом ГК
[00110] Изучали возможность ферментативного разложения модифицированной глицидолом ГК (Гли-ГК) и состава филлера на основе ГК, содержащего Гли-ГК в качестве смазывающей фазы, по сравнению с немодифицированной (или «свободной») ГК и состава филлера на основе ГК, содержащего свободную ГК (или «исходную ГК») в качестве смазывающей фазы. Использовали следующие образцы:
- модифицированная глицерином ГК (Mw = 1,7 МДа; MoD: 15 мол. %); 20 мг/мл в 0,9% растворе NaCl
- свободная ГК (Mw = 1,3 МДа; MoD: 0 мол. %); 20 мг/мл в 0,9% растворе NaCl
- гель сГК/Гли-ГК: сшитая BDDE ГК с несшитой модифицированной глицерином ГК в качестве смазывающей фазы
- гель сГК/свободная ГК: сшитая BDDE ГК с несшитой ГК в качестве смазывающей фазы
[00111] Жесткость гидрогеля, которую оценивали путем измерения модуля накопления G', применяли для наблюдения за протеканием процесса расщепления во времени. Ферментативное разложение запускали гиалуронидазой, которая катализирует гидролиз 1,4-гликозидных связей в ГК. Эксперименты проводили на реометре Anton Paar MCR 302 Rotational Rheometer (деформация 0,1%, температура 36°С, частота 1,0 Гц). 500 мг гидрогеля расщепляли под действием 50 Ед. гиалуронидазы, растворенной в 150 мкл воды для инъекций. Измерения проводили в двух повторениях и для анализа использовали средние значения.
[00112] Неожиданно было обнаружено, что ферментативное разложение Гли-ГК сравнимо с разложением исходной ГК с такой же молекулярной массой (результаты не показаны). Аналогично, два состава геля сшитой BDDE ГК, с исходной ГК или Гли-ГК в качестве смазывающей фазы, показали сходное поведение при ферментативном разложении. Следовательно, ферментативное разложение модифицированной глицерином ГК возможно в тех же временных рамках, что и для исходной гиалуроновой кислоты.
Термическая стабильность состава геля на основе ГК, содержащего модифицированную глицерином ГК в качестве смазывающего вещества
[00113] Для проверки влияния модифицированной глицерином ГК («Гли-ГК») в качестве смазывающей фазы, по сравнению с несшитой (или «свободной») ГК на стабильность состава сшитой ГК (сГК), оценивали реологические данные до и после стерилизации геля и данные исследований стабильности при 40°С (1 и 3 месяца). Реологические измерения проводили на реометре Anton Paar MCR 302 Rotational Rheometer. Модуль накопления G' измеряли дважды при 25°С, при деформации 0,1% и частоте 1 Гц. Исследовали следующие образцы:
- сГК/свободная ГК: 1,805% (масс/масс.) сшитой BDDE ГК плюс 0,095% (масс./масс.) несшитой ГК (партии 1, 2 и 3), и
- сГК/свободная Гли-ГК: 1,805% (масс/масс.) сшитой BDDE ГК плюс 0,095% (масс./масс.) несшитой Гли-ГК.
[00114] Было обнаружено, что падение модуля накопления G' после стерилизации (127°С, 6,5 мин) составляет, округленно, 50%, и близко для обоих испытанных составов (см. Таблицу 5). Аналогично, испытания на стабильность через 1 и 3 месяца приводят к схожему падению G'. Резюмируя, полученные данные показывают, что модифицированная глицерином смазывающая фаза оказывает на стабильность состава по существу такие же полезные действия, что и свободная ГК (см. Таблицу 6).
[00115] Приведенные выше результаты экспериментов показали, что введение модифицированного глицидолом производного гиалуроновой кислоты в традиционные сшитые BDDE гели ГК представляет собой многообещающий подход к разработке новых дермальных филлеров, обладающих превосходными физическими, механическими и реологическими свойствами.