СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ ФОСФОЛИПИДОВ
NATURAL PHOSPHOLIPID AGENT

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается средства, содержащего фосфолипиды природного происхождения, которое может использоваться в медицине и косметологии.
Известны различные лекарственные препараты, содержащие природные (эсенциальные) фосфолипиды. Это Бренциале форте, Ливолин, Ливолин Форте, Липостабил, Фосфатидилхолин, Фосфоглив, Фосфолипиды эссенциальные, Эссел форте, Эссенциале, Эссенциале Н, Эссенциале форте, Эссенциале форте Н, Эссенциальные фосфолипиды, Эссливер форте, ЭФЛ [19].
Активным действующим веществом данных препаратов является фосфатидилхолин (ФХ). Известно, что доля ФХ в фосфолипидном компоненте биомембран весьма существенна. Считают, что в 100 г печени здоровых людей содержится около 12-14 г фосфолипидов, из которых 70-80% приходится на фосфатидилхолин. 50-70% липидного компонента мембран эндоплазматической сети гепатоцитов составляют фосфолипиды преимущественно этого типа [26]. Поэтому для использования в качестве гепатопротекторов применяют «эссенциальные» фосфолипиды, которые являются высокоочищенной фракцией фосфатидилхолинов соевых бобов, содержащей эссенциальные ненасыщенные жирные кислоты (линолевую, олеиновую, линоленовую).
Основным активным ингредиентом ЭФЛ принято считать полиненасыщенный фосфатидилхолин - 1,2-дилинолеоилфосфатидилхолин (DLPC). Наличие двух эссенциальных полиненасыщенных жирных кислот определяет существенное отличие ЭФЛ от фосфолипидов, содержащихся в мембранах организма человека, где преобладают насыщенные или мононенасыщенные жирные кислоты [6, 10]. На долю DLPC приходится 40-52% от общего количества фосфатидилхолинов, входящих в состав ЭФЛ, в то время как в организме полиненасыщенные фосфатидилхолины типа DLPC составляют примерно 1,3% [6, 11].
При введении в организм содержащие ЭФЛ препараты обладают метаболическим и гепатопротекторным действием, регулируют липидный и углеводный обмен. Применяются они, как правило, в составе комплексной терапии при следующих заболеваниях: гепатиты, лекарственные и алкогольные поражения печени, отравления, жировая дистрофия печени, цирроз печени, печеночная недостаточность, печеночная кома, операции в гепатобилиарной области, гиперлипопротеинемия, заболевания органов сердечно-сосудистой системы (ишемическая болезнь сердца, нарушение церебрального и периферического кровообращения, атеросклероз, диабетическая ангиопатия), заболевания органов пищеварения (хронический панкреатит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки), токсикоз беременности, лучевая болезнь, псориаз, атопический дерматит, экзема и другие [3, 6, 8, 9, 11, 26].
Также известны многочисленные биологически активные добавки к пище, содержащие фосфолипиды, выделенные из яичного желтка (лецитин), например кардиолецитин [25]. Для них также описаны фармакологические свойства, характерные для ЭФЛ, выделенных из сои.
Известен также патент РФ 2308940, касающийся способа получения липосом, обладающих иммунокорригирующим и гепатопротекторным действием, характеризующийся тем, что проводят экстракцию фосфолипидов из печени байкальской нерпы, растворяют смесь полученных фосфолипидов и жир байкальской нерпы в органическом растворителе в соотношении 4:6 с антиоксидантом - токоферолом. При этом в комплексе фосфолипидов в печени байкальской нерпы преобладают фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин.
Известно оксигенированное средство для использования в дерматологии и косметике на основе фосфолипидов дрожжей, описанное в патенте ЕР 0713380 В1. Данный фосфолипидный комплекс используется не самостоятельно, а в сочетании с фторкарбонами и активными компонентами.
В качестве ближайшего аналога может быть указан патент РФ 2283114, касающийся фармацевтической композиции на основе фосфолипидов растительного и животного происхождения, обладающей выраженной гепатопротекторной активностью и позволяющей нормализовать жировой, белковый и углеводный обмен.
Несмотря на широту фармакологического эффекта известных фосфолипидных препаратов как растительного, так и животного происхождения, включая ближайший аналог, до настоящего времени не известно средство, обладающее одновременно цитопротекторной, антитоксической, антигипоксической, антиоксидантной, гепатопротекторной, церебропротекторной, кардиопротекторной активностью, способностью нормализовать липидный и энергетический обмен.
Задачей настоящего изобретения является создание более эффективного средства за счет расширения спектра фармакологической активности препаратов на основе природных фосфолипидов.
Задача решается новым средством, содержащим комплекс эссенциальных фосфолипидов, выделенных из дрожжей, используемых в пивоварении, пекарском производстве, кондитерской промышленности, таких как Saccharomyceus cervaesae, включающий от 30 до 99% смеси фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламина (ФЭА), фосфатидилсерина (ФС) и остальное - другие фосфолипиды дрожжей: фосфатидную кислоту (ФК), фосфатидилинозитол (ФИ), кардиолипин (КЛ), фосфатидилглицерин (ФГ), плазмалоген. Указанный фосфолипидный комплекс предлагается для использования в качестве средства, обладающего цитопротекторной, антитоксической, антигипоксической, антиоксидантной, гепатопротекторной, церебропротекторной, кардиопротекторной активностью и способностью нормализовать липидный и энергетический обмен.
Данный фосфолипидный комплекс может использоваться в составе твердой или жидкой лекарственной формы как для энтерального (внутрь), так и для парентерального применения (инъекции, инфузии), а также может применяться наружно в виде мазей, эмульсий, растворов, свечей и т.д.
Для получения указанных форм могут быть пригодны общепринятые в технологии лекарственных средств вспомогательные вещества.
Для выделения комплекса могут быть использованы различные известные способы и их вариации.
В частности, экстракцию фосфолипидов из дрожжей производили по Фолчу [32], либо смесью этанол-хлороформ, либо другими органическими растворителями, либо углекислотой с последующей очисткой. Оценку содержания фосфолипидов в экстракте проводили путем их фракционирования в тонком слое силикагеля на пластинах фирмы "Мерк" (Германия) в системе растворителей хлороформ : метанол: аммиак (65:35:5). Идентификацию хроматографических пятен индивидуальных ФЛ производили с помощью стандартов ("Sigma", США) в атмосфере, насыщенной парами йода. Количество ФЛ выражали в мг липидного фосфора, минерализованного сжиганием проб ФЛ в смеси концентрированных серной и азотной кислот в песочной бане при 180-200°С до состояния прозрачности с последующим расчетом количества неорганического фосфора, определяемого по цветной реакции молибденово-кислого аммония с витамином С [6]. Наличие отдельных фосфолипидов в составе экстракта пивных дрожжей (ЭПД) подтверждено методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Комплекс может быть использован в виде жидкого, сухого или густого дрожжевого экстракта.
Заявляемое средство во всех приводимых ниже примерах использовали либо в максимально эффективных, либо в сопоставимых с таковыми дозах, установленных в предварительных экспериментах.
Для подтверждения заявляемой активности были проведены исследования по влиянию заявляемого средства в лабораторном эксперименте на животных.
Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.
Пример №1. Исследование антитоксических свойств ЭПД
Беспородным белым мышам обоего пола массой 18-22 г вводили внутрижелудочно и внутрибрюшинно ЭПД (50 мг/кг ежедневно в течение 5 суток). На 6-е сутки однократно внутрибрюшинно вводили 10% масляный раствор тетрахлорметана (токсикант, инициирующий образование свободных радикалов) [9] в полулетальной дозе 1,28 мг/кг. На 7-е сутки после введения тетрахлорметана смотрели выживаемость животных. В контрольной группе наблюдалась выживаемость 50% животных. В группе, получавшей ЭПД, наблюдалась 100% выживаемость мышей при обоих способах введения фосфолипидного экстракта (внутрь и внутрибрюшинно). В последующих экспериментах установлено, что процент выживших животных варьирует в зависимости от дозы и от способа получения экстракта (метода экстракции и очистки), но экстракты с идентичным содержанием фосфолипидов оказывали сходное по выраженности защитное действие. Эксперимент показал отчетливое антитоксическое действие ЭПД независимо от способа введения препарата. Важно, что эффект ЭПД проявился в условиях сублетальной активации во всем организме животного процесса образования свободных радикалов и перекисного окисления липидов, что указывает на вклад в механизм антитоксического эффекта ЭПД антирадикального и антиоксидантного действия - важнейших компонентов цитопротекторного действия лекарственных препаратов [10, 12].
Пример №2. Исследование антитоксических свойств разных доз ЭПД
4
4
50
4
4
Изучали влияние ЭПД на выживаемость белых беспородных половозрелых мышей-самцов в возрасте 1,5-2 месяца, массой 25-30 г при интоксикации тетрахлорметаном (CCl), вызывающим образование свободных радикалов. ССl вводили в виде 10% масляного раствора в полулетальной дозе (ЛД) 1,28 мг/кг, установленной опытным путем. Мыши опытной группы были разделены на две подгруппы. Одна получала внутрижелудочно ЭПД в дозах 10, 50 и 150 мг/кг ежедневно в течение 5-ти суток до введения токсиканта (профилактическое введение). Другая подгруппа получала в тех же дозах ЭПД после введения CCl; первое введение - через 30 мин после применения токсиканта. В таблице 1 приведены данные, характеризующие антитоксическое действие ЭПД. Установлено, что и при профилактическом и при лечебном введении экстракт дозозависимо снижает смертность мышей при интоксикации ССl. Способ получения экстракта, содержащего фосфолипиды (экстракция органическими растворителями, углекислотой), не оказывал существенного влияния на их антитоксическую активность при сохранении идентичной дозировки экстракта в пересчете на содержание чистых фосфолипидов.
Введение ЭПД парентерально (внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно) с профилактической и лечебной целью вызывало сходный эффект, дозозависимо ограничивая гибель животных при интоксикации тетрахлорметаном. Защитный эффект ЭПД был получен также при использовании в качестве токсикантов лекарственных препаратов изониазида, доксорубицина, анальгина, аминазина, циклофосфана и других токсичных лекарственных препаратов. Приведенный пример указывает на антитоксическое действие ЭПД при различных способах введения.
Таблица 1
Влияние ЭПД на выживание мышей при интоксикации CCl<sub>4</sub> в ЛД<sub>50</sub>
Группы
Выжившие животные, %
Профилактическое введение
Лечебное ведение
Контроль
50
50
ЭПД 10 мг/кг
60
55
ЭПД 50 мг/кг
100
76
ЭПД 150 мг/кг
100
90
Пример 3. Исследование защитного действия ЭПД на функциональное состояние митохондрий печени при токсическом поражении
-3
-5
-3
-3
-3
-3
-4
-2
-3
2
4
4п
4o
3
2
3
4п
3
4o
Гепатопротекторное действие ЭПД оценивали по функциональному состоянию митохондрий (MX) гомогената печени белых беспородных половозрелых мышей-самцов массой 25-30 г. Для этого полярографическим методом оценивали скорости потребления кислорода MX в различных метаболических состояниях по Б.Чансу [15]. Среда инкубации: 0,12·М КСl, 1·10M Hepes-буфер, 2·10 М ЭДТА, 2·10 М КНРO (рН 7,2; t=26°С). В качестве субстратов окисления использовали сукцинат 1·10 M и 5·10 М, смесь НАД-зависимых субстратов малата и глутамата по 3·10 М. Регистрировали скорость дыхания MX до (V), после (V) и во время цикла фосфорилирования добавленной 1·10 Моль АДФ (V). В работе использован ингибитор аминотрансфераз - аминооксиацетат (АОА) 0,2·10 М, а также ингибитор СДГ - малонат 2·10 М. Во всех измерениях абсолютные значения скоростей потребления кислорода выражены в нанограммах атомарного кислорода в минуту на мг белка гомогената (нгА[O]/мин/мг). Для оценки энергетического статуса использовали коэффициенты стимуляции дыхания СД=V/V, дыхательного контроля ДК=V/V и сопряженности окислительного фосфорилирования АДФ/0.
Математическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [18]. Использовали 5% уровень значимости, характеризующий достоверные отличия между группами при вероятности ошибочного вывода р<0,05.
4
50
4
Контрольной группе животных вводили CCl в виде 10% масляного раствора в полулетальной дозе (ЛД) 1,28 мг/кг.Опытные животные до введения ССl в течение 5 дней получали внутрижелудочно один раз в день ЭПД в дозе 50 мг/кг.
4
Установлено, при интоксикации ССl снижаются на 30-50% скорости дыхания MX печени в различных метаболических состояниях как при окислении эндогенных, так и экзогенных субстратов обоего типа (флавин- и НАД-зависимых). Страдает и смешанное дыхание (окисление малата с глутаматом), и «чистое» НАД-зависимое - в присутствии малоната; уменьшаются величины коэффициентов дыхательного контроля (ДК) и сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/O), видно, что процесс затрагивает весь внутримитохондриальный комплекс ферментов, поскольку изменения наблюдаются и в присутствии аминооксиацетата, вычленяющего работу легко окисляемых аминотрансфераз (таблицы 2, 3, 4). Усиление нагрузки на MX повышением концентрации субстрата (сукцината) в среде инкубации способствует большему нарушению процесса окислительного фосфорилирования, а изоцитрат, привносимый для устранения торможения сукцинатдегидрогеназы оксалоацетатом, не оказывает при интоксикации стимулирующего действия на фермент, что говорит о развитии глубокого торможения активности СДГ.
4
Содержащий фосфолипиды ЭПД предупреждает повреждение MX печени при интоксикации ССl. При этом сохраняются высокие скорости дыхания MX при окислении различных субстратов (эндогенных и экзогенных), проявляется стимулирующее действие изоцитрата на сукцинатоксидазную активность MX, существенно ограничивается снижение коэффициента ДК (сохранение энергетического контроля дыхания), предупреждается повреждение сопряженного с дыханием фосфорилирования. В целом можно сказать, что по совокупности эффектов ЭПД оказывает антитоксическое, цитопротекторное, мембранопротекторное, энергопротекторное, нормализующее метаболизм, гепатопротекторное действие.
Таблица 2
Влияние ЭПД на скорость фосфорилирующего дыхания (нгА[O<sub>2</sub>]/мин/мг) MX печени мышей при интоксикации ССl<sub>4</sub> (X±m, n=6)
Субстраты
Группы
Интактные
CCl<sub>4</sub>
ЭПД
Эндогенные
42,8±1,5
23,0±1,8*
46,8±1,7<sup>∧</sup>
Сукцинат, 1 мМ
87,3±2,1
59,2±7.1*
71,0±2,7<sup>∧</sup>
Сукцинат, 5 мМ
87,3±2,6
69,6±4,2*
77,1±4,4<sup>∧</sup>
Изоцитрат+сукцинат
72,8±3,8
71,9±5,2
81,6±4,8<sup>∧</sup>
Малат+глутамат
43,7±1,9
34,4±3,6*
52,2±2,6<sup>∧</sup>
Малат+глутамат+малонат
53,0±1,5
31,5±4,1*
46,8±2,3<sup>∧</sup>
Малат+глутамат+АОА
43,1±2,1
34,2±4,4*
46,8±3,4<sup>∧</sup>
Примечание: здесь и в других таблицах примера (*) - различие с соответствующим показателем в контроле достоверно при р<0,05; (<sup>∧</sup>) - различие с соответствующим показателем при гипоксии достоверно при р<0,05
Таблица 3
Влияние ЭПД на сопряженность окислительного фосфорилирования MX печени мышей при интоксикации ССl<sub>4</sub> (X+m, n=6)
Субстраты
Группы
Интактные
CCl<sub>4</sub>
ЭПД
Эндогенные
2,7±0,13
2,36±0,13*
2,64±0,14<sup>∧</sup>
Сукцинат, 1 мМ
2,23±0,09
2,05±0,07*
2,16±0,08
Сукцинат, 5 мМ
2,06±0,04
1,43±0,04*
2,00±0,09<sup>∧</sup>
Изоцитрат + сукцинат
2,23±0,03
1,44±0,05*
2,00±0,07<sup>∧</sup>
Малат + глутамат
2,97±0,07
2,61±0,08*
2,87±0,10<sup>∧</sup>
Малат + глутамат + малонат
3,25±0,05
2,73±0,08*
3,10±0,06<sup>∧</sup>
Малат + глутамат + АОА
3,25±0,06
2,45±0,10*
2,89±0,13<sup>∧</sup>
Таблица 4
Влияние курсового введения ЭПД на коэффициенты стимуляции дыхания и дыхательного контроля MX печени мышей при интоксикации ССl<sub>4</sub> (X+m, n=6)
Субстраты
Группы
Интактные
ССl<sub>4</sub>
ЭПД
СД
ДК
СД
ДК
СД
ДК
Эндогенные
1,28±0,08
1,65±0,03
2,43±0,27*
1,27±0,15*
1,65±0,14<sup>∧</sup>
1,67±0,070<sup>∧</sup>
Сукцинат, 1 мМ
1,38±0,05
1,80±0,05
1,58±0,18
1,32±0,03*
1,51±0,06
1,43±0,06<sup>∧</sup>
Сукцинат, 5 мМ
1,71±0,04
1,80±0,04
2,38±0,24*
1,21±0,06*
1,77±0,06^
1,59±0,04<sup>∧</sup>
Изоц.+сукц, 5 мМ
1,67±0,05
1,50±0,07
1,66±0,08
1,19±0,02*
1,53±0,06
1,35±0,08<sup>∧</sup>
Малат+глутамат
1,50±0,10
1,65±0,11
2,16±0,33<sup>*</sup>
1,37±0,03*
2,26±0,13*
1,60±0,16<sup>∧</sup>
Малат+глутамат+малонат
1,89±0,04
1,77±0,09
1,86±0,5
1,36±0,08*
1,96±0,05
1,54±0,11<sup>∧</sup>
Малат+глутамат+АОА
1,48±0,07
1,48±0,08
1,73±0,1*
1,17±0,09*
1,91±0,08<sup>∧</sup>
1,62±0,10<sup>∧</sup>
Эффект ЭПД проявлялся в той же мере и при внутрибрюшинном введении препарата.
Пример 4. Исследование антиоксидантных свойств ЭПД
4
4
50
4
Антиоксидантные свойства ЭПД оценивали по способности ограничивать развитие процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в печени при интоксикации животных тетрахлорметаном (CCl). Исследование проведено на белых беспородных мышах обоего пола. Контрольной группе животных вводили ССl в виде 10% масляного раствора в полулетальной дозе (ЛД) 1,28 мг/кг. Известно, что тетрахлорметан является гепатотропным ядом, способствующим активации свободнорадикальных процессов и пероксидации липидов мембран [9]. Опытные животные до введения ССl в течение 5 дней получали внутрижелудочно один раз в день ЭПД в дозе 50 мг/кг.
О развитии ПОЛ судили по накоплению в гомогенате печени первичных - диеновых конъюгатов (ДК) и оснований Шиффа (ОШ) и вторичного продукта пероксидации - малонового диальдегида (МДА) [28].
Математическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [18]. Использовали 5% уровень значимости, характеризующий достоверные отличия между группами при вероятности ошибочного вывода р<0,05.
4
При интоксикации ССl выявлена активация свободнорадикальных процессов, о чем свидетельствует рост содержания первичных и вторичных продуктов липопероксидации - оснований Шиффа, малонового диальдегида (МДА) при спонтанном перекисном окислении липидов (ПОЛ) в печени мышей по сравнению с показателями у интактных животных (Таблица 5).
Установлено, что ЭПД существенно ограничивает накопление в печени первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов при интоксикации, оказывая гепатопротеторное антиоксидантное действие. Эффект ЭПД сохранялся и при внутрибрюшинном способе введения.
Таблица 5
Влияние ЭПД на накопление в печени первичных и вторичных продуктов ПОЛ при интоксикации CCl<sub>4</sub> (Х±m, n=6)
Показатели
Интактные
CCl<sub>4</sub>
ЭПД
малоновый диальдегид, нмоль/мг белка
0,73±0,08
2,44±0,52*
1,05±0,19
диеновые конъюгаты, нмоль/мг белка
0,93±0,08
1,07±0,23
1,43±0,79
основания Шиффа, нмоль/мг белка
2,00±0,16
3,80±0,08*
3,10±0,43
Примечание: * - различие с показателем интактной группы достоверно при р<0,05.
Пример 5. Кардиопротекторное действие ЭПД
Ишемическая (коронарная) болезнь сердца, развивающаяся вследствие атеросклероза коронарных артерий, является ведущей причиной инвалидизации и смертности трудоспособного населения [20]. Прогрессирование атеросклероза в коронарных артериях приводит к несоответствию между уровнем коронарного кровотока и потребностью миокарда в кислороде и субстратах с нарастанием в кардиомиоцитах ишемии и гипоксии, обусловливающих резкое изменение метаболизма и энергообеспечения. Угнетение синтеза АТФ и креатининфосфата при этом приводит к нарушению ритма сердечной деятельности и сократительной функции миокарда [29, 34].
Фармакотерапию ишемии миокарда осуществляют путем увеличения доставки кислорода в ишемизированную зону либо снижением потребности миокарда в кислороде. Для этого используют β-адреноблокаторы, нитраты, ингибиторы АПФ, антагонисты кальция, препараты метаболического типа действия, антиагрегантные средства [20, 21]. Одним из основных средств метаболической терапии ИБС является триметазидин - селективный ингибитор длинноцепочечной 3-кетоацил-КоА-тиолазы [21]. Он тормозит β-окисление жирных кислот, не повреждая гликолиз, что создает метаболические предпосылки утилизации лактата и уменьшения лактоацидоза в ишемизированном миокарде. Препарат также частично снижает активность фосфолипазы А2 и интенсивность ПОЛ, что в целом ведет к улучшению функционального состояния сердечной мышцы. Препараты фосфолипидной природы с целью кардиопротекции не используются. В данном примере продемонстрировано кардиопротекторное действие ЭПД при гипоксии и нарушении ритма сердца, приводящем к ишемизации миокарда.
Эксперимент проведен на белых беспородных крысах-самцах массой 220-240 г. Животные профилактически получали ЭПД в 1% крахмальном геле в дозе 50 мг/кг внутрь 1 раз в сутки курсом 5 дней, последняя доза - за 1 ч до гипоксии или аритмии. Контролем служили животные, получавшие внутрь эквиобъемное количество 1% крахмального геля.
Нормабарическую гиперкапническую гипоксию моделировали, помещая крыс в герметическую емкость объемом 3 л на 1,5 ч. Гипоксия является типовым патологическим процессом, сопровождающим целый ряд заболеваний. Независимо от вида гипоксии в основе характерных для нее нарушений лежит недостаточность аэробной энергопродукции в MX [4, 12, 13, 14]. Дефицит энергии вызывает многообразные метаболические сдвиги, в том числе активирует свободнорадикальное окисление в клетке [12]. Гипоксия играет особо важную роль в патогенезе различных патологий: острых нарушений кровообращения, хронической ишемии, токсических и постгипоксических энцефалопатий, черепно-мозговой травмы, отравлении нейротропными и кардиотропными ядами, коматозных состояниях [4, 12, 27].
Исследование функциональной активности MX сердца проводили на первые сутки после гипоксической травмы. Экспериментальную аритмию, приводящую к ишемизации миокарда, моделировали однократным внутрижелудочным введением обзидана в дозе 200 мг/кг [22]. Запись электрокардиограммы у крыс проводили до и через 5 мин после введения обзидана. Далее для определения латентного времени возникновения экстрасистолии электрокардиограмму регистрировали с интервалом в 5 мин в течение 40 мин после введения обзидана. У этих же животных оценивали антиоксидантную активность препарата по накоплению МДА в гомогенате сердца после аритмогенного воздействия обзидана. Исследовали фоновое содержание МДА и изменение его концентрации в течение 1 ч [1,28].
-1
-3
-2
-1
-1
-1
-3
-2
-3
-4
-3
-3
2
4
2
4п
3
4o
3
4п
3
4о
Функциональное состояние MX в гомогенате сердца крыс оценивали полярографически [15]. Среда выделения содержала: 3·10 М сахарозы, 2·10М трис-буфера, 1·10 М ЭДТА, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1,2·10 М КС1, рН 7,2, t=0°С. Среда инкубации: 3·10 М сахарозы, 1,2·10 М КСl, 5·10 М КНРO, 1·10 М Hepes-буфера, 1·10 М ЭДТА, рН 7,2, t=26°С. Рассчитывали скорости потребления кислорода в ммкатО/мин/мг белка MX до, во время и после цикла фосфорилирования добавленной до концентрации 1·10 М АДФ (V, V и V) и время фосфорилирования. В качестве субстратов использовали флавинзависимый - сукцинат 1·10 М и НАД-зависимые - малат и глутамат, по 3·10 М. Вычисляли коэффициенты стимуляции дыхания (СД=V/V), дыхательного контроля (ДК=V/V) и сопряженности окислительного фосфорилирования АДФ/O.
Математическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [18]. Использовали 5% уровень значимости, характеризующий достоверные отличия между группами при вероятности ошибочного вывода р<0,05.
Гипоксия приводила к увеличению скорости окисления субстратов MX сердца крыс и уменьшению сопряженности окислительного фосфорилирования при окислении сукцината и НАД-зависимых субстратов (Табл.6). Полученные данные указывают на деэнергизацию MX, нарушение активности быстрого метаболического кластера, нарушение энергетического контроля дыхания, разобщение окислительного фосфорилирования, что свидетельствует о наличии не только функциональных, но и структурных патологических изменений на уровне MX [16, 17, 34].
ЭПД способствовал увеличению на 30% времени жизни животных при гипоксии. Под действием ЭПД при гипоксии уменьшались скорости дыхания MX сердца крыс при окислении субстратов обоего типа, нормализовалась величина коэффициента АДФ/O (Табл.6). Судя по полученным данным, ЭПД оказывал кардиопротекторное действие, нормализуя процессы клеточного дыхания и окислительного фосфорилирования в миокарде крыс при экспериментальной гипоксии. Учитывая совокупную нормализацию под действием ЭПД в гомогенате миокарда животных, перенесших гипоксию, не только скоростей дыхания MX, но коэффициентов СД, ДК и АДФ/O при утилизации и сукцината, и НАД-зависимых субстратов, можно говорить о регуляторно-метаболическом, мембранопротекторном, цитопротекторном действии ЭПД на уровне миокарда, что в целом указывает на его антигипоксический кардиопротекторный эффект [16, 17, 34].
Введение обзидана приводило к снижению частоты сердечных сокращений (ЧСС) на 25,4% и вызывало возникновение экстрасистол у 30% крыс. При введении ЭПД курсом 5 дней и за 1 ч до введения обзидана экстрасистолы у животных встречались значительно реже (у 10%, р<0,05). ЧСС под действием обзидана на фоне введении ЭПД не выходила за рамки физиологической нормы для крыс. В миокарде животных, перенесших аритмию, выявлено увеличение содержания продуктов ПОЛ по сравнению с контрольной группой (Табл.7). ЭПД ограничивал накопление МДА в гомогенате миокарда животных, получавших обзидан в аритмогенной дозе. Эффект ЭПД сохранялся и при внутрибрюшинном способе введения. Очевидно, что при экспериментальной аритмии, где присутствует ишемическая компонента, ЭПД, препятствуя нарушению функциональной активности сердца, оказывает защитное противоишемическое, антиоксидантное, кардиопротекторное действие, предупреждая нарушение энергетического обмена.
Таблица 7
Влияние ЭПД на накопление продукта перекисного окисления липидов (МДА, нмоль/мл) в гомогенате сердца крыс при экспериментальной аритмии (Х±m, n=6)
Группы
Время инкубации, мин
0
30
60
Контроль
6,11±0,04
7,32±0,09
8,05±0,17
Аритмия
7,02±0,03
8,26±0,12*
11,89±0,23*
ЭПД
7,24±0,03
7,55±0,09<sup>∧</sup>
8,26±0,19<sup>∧</sup>
Пример 6. Церебропротекторное, антиоксидантное, нормализующее энергетический обмен действие ЭПД при энцефалопатии
Исследовали церебропротекторное лечебное действие ЭПД в эксперименте на животных при моделировании нарушения β-окисления жирных кислот. Метаболизм жирных кислот нарушается при хроническом гепатите алкогольной и лекарственной этиологии, приобретенных и врожденных энзимопатиях, синдроме Рейе, возникающем у детей при приеме кислоты ацетилсалициловой на фоне вирусных инфекций, и при многих других патологических состояниях [7, 31, 33]. Ингибирование β-окисления жирных кислот в печени сопровождается интенсивным поступлением в кровь длинноцепочечных и дикарбоновых жирных кислот, а также дефектами детоксикации аммиака, фенолов и билирубина. Эти токсические вещества вызывают тяжелую энцефалопатию [35]. Для ее фармакотерапии применяют гепатопротективные средства, которые в результате улучшения метаболических процессов в печени ослабляют повреждающее воздействие эндогенных токсинов на головной мозг [5]. В данном примере показано нормализующее действие ЭПД фосфолипидной природы на биоэнергетику головного мозга и процессы липидной пероксидации при экспериментальной энцефалопатии, вызванной у крыс инъекцией ингибитора β-окисления жирных кислот 4-пентеноевой кислоты (4-ПК).
Эксперименты проведены на белых крысах-самцах массой 180-200 г. Для ингибирования β-окисления жирных кислот животные в течение 7 дней получали ежедневные внутрибрюшинные инъекции 4-ПК (ISN, США) в дозе 20 мг/кг [36]. С 8-го дня эксперимента на протяжении 14 дней им вводили в желудок ЭПД в дозе 50 мг/кг в виде суспензии на 1% крахмальной слизи. Контрольные животные получали крахмальную слизь. Крыс декапитировали под эфирным наркозом через 12 ч после последнего введения ЭПД.
Церебропротекторное действие ЭПД оценивали по функциональному состояние MX гомогената головного мозга, исследуя полярографическим методом показатели дыхательной активности органелл в различных метаболических состояниях по Чансу [15]. Условия эксперимента аналогичны описанным в примере №3. Активность липопероксидации оценивали по скорости образования спонтанного и аскорбатзависимого малонового диальдегида (МДА, нмоль/мг белка/мин), содержанию диеновых конъюгатов (ЕД/мг липидов) и оснований Шиффа (ЕД/мг липидов) [10]. Результаты обрабатывали методом парных сравнений по критерию Вилкосона-Манна-Уитни, вероятность ошибочного вывода не превышала 5% (р<0,05) [18].
4o
4п
4o
4п
В остром периоде энцефалопатии в MX головного мозга крыс при окислении и эндогенных и экзогенных субстратов снижались скорости дыхания во всех метаболических состояниях, удлинялось время и уменьшалась сопряженность фосфорилирования добавленной АДФ. Снижение сопряженности окислительного фосфорилирования сопровождалось частичной утратой энергетического контроля дыхания. При утилизации эндогенных субстратов это проявлялось ростом скорости дыхания MX после цикла фосфорилирования добавленной АДФ (V>V). Энергизация MX под влиянием субстрата - ЯК восстанавливала энергетический контроль дыхания (V=V) и нивелировала уменьшение сопряженности окислительного фосфорилирования до 11% по сравнению с 54% при утилизации эндогенных субстратов (Табл.8), что указывает на развитие функциональных метаболических нарушений, энергетический и субстратный дефицит.
Судя по полученным данным, при модели энцефалопатии преимущественно нарушается наиболее активный путь утилизации субстратов, связанный с образованием и окислением эндогенной ЯК, - быстрый метаболический кластер, что указывает на развитие нарушений на уровне внутренней мембраны MX [13, 14, 16, 17, 30]. Добавление в среду инкубации MX головного мозга ингибитора СДГ малоната подтвердило торможение сукцинатзависимой энергопродукции: на фоне значительного угнетения дыхания и фосфорилирования сопряженность окислительного фосфорилирования снижалась лишь на 30%, тогда как при утилизации НАД-зависимых субстратов и образовании эндогенной ЯК в цикле Кребса (окисление без малоната в среде инкубации) она становилась меньше на 55% (Табл.8).
В ткани головного мозга усиливалось перекисное окисление липидов, накапливались первичные и вторичные продукты липопероксидации. Изменения метаболического статуса головного мозга крыс при нарушении β-окисления жирных кислот проявлялись угнетением двигательной активности животных, они имели болезненный, неопрятный вид.
К 14 дню после окончания инъекций 4-ПК субъективное состояние животных ухудшалось, а патологические изменения в ткани мозга усиливались. Существенно возрастала продукция первичных и вторичных продуктов липопероксидации, в большей мере, чем в остром периоде экспериментальной энцефалопатии, угнеталась дыхательная активность MX при окислении флавин- и НАД-зависимых субстратов, прогрессировало разобщение окислительного фосфорилирования (снижение коэффициента АДФ/O, рост Тр) (Табл.8).
Двухнедельная терапия крыс ЭПД существенно улучшала субъективное состояние животных, они стали более опрятными и подвижными. Оценка состояния MX головного мозга показала изменение в сторону нормы параметров дыхательной активности и окислительного фосфорилирования. Признаки улучшения носили более выраженный характер при использовании в качестве субстрата окисления ЯК (нормализация коэффициента АДФ/O), что свидетельствует о мембранопротекторном действии ЭПД. По устранению торможения СДГ можно предположить восстановление энергетического потенциала MX и компонентов системы антиперекисной защиты клетки (пиридиннуклеотиды, глутатион). Это подтверждается выраженным снижением концентрации в ткани мозга первичных и вторичных продуктов липидной пероксидации (Табл.8). Эффект ЭПД сохранялся и при внутрибрюшинном способе введения.
Полученные данные указывают, что ЭПД ослабляет вызванную нарушением метаболизма липидов деэнергизацию MX головного мозга, восстанавливает скорости утилизации субстратов цикла Кребса, сопряженность окислительного фосфорилирования, нормализует активность быстрого метаболического кластера MX, тормозит перекисное окисление липидов. Очевидно, что в механизме выявленного церебропротекторного действия ЭПД важную роль играет стабилизация клеточных мембран и в частности внутренней мембраны MX, где локализованы некоторые ферменты цикла трикарбоновых кислот (в частности сукцинатдегидрогеназа) и переносчики дыхательной цепи.
Таблица 8
Влияние ЭПД на окислительное фосфорилирование и липопероксидацию в гомогенате головного мозга на фоне экспериментального нарушения β-окисления жирных кислот, вызванное 4-пентеноевой кислотой (М±m, n=10)
Показатели
Интактные животные
4-ПК в течение 7 дней
4-ПК спустя 14 дней
ЭПД + 4-ПК
Окисление эндогенных субстратов
V<sub>4п</sub>
38,0±1,7
25,8±0,8<sup>1</sup>
12,4±0,3<sup>1,2</sup>
22,5±0,2<sup>1-3</sup>
V<sub>3</sub>
52,7±0,6
45,6±2,2<sup>1</sup>
41,6±0,5<sup>1,2</sup>
51,9±0,4<sup>1-3</sup>
V<sub>40</sub>
38,4±1,1
31,4±2,9<sup>1</sup>
13,8±0,8<sup>1,2</sup>
34,7±2,4<sup>2,3</sup>
АДФ/O
1,65±0,02
0,90±0,40<sup>1</sup>
0,90±0,10<sup>1</sup>
1,50±0,10<sup>1-3</sup>
Тp
1,20±0,10
2,30±0,30<sup>1</sup>
2,80±0,10<sup>1,2</sup>
0,90±0,10<sup>2,3</sup>
Окисление ЯК
V<sub>4п</sub>
37,9±0,3
28,9±0,8<sup>1</sup>
16,5±0,4<sup>1,2</sup>
26,2±1,2<sup>1,3</sup>
V<sub>3</sub>
91,7±3,7
77,3±6,5<sup>1</sup>
32,1±1,6<sup>1,2</sup>
66,7±0,8<sup>1-3</sup>
V<sub>40</sub>
36,3±1,3
25,5±1,9<sup>1</sup>
15,3±0,5<sup>1,2</sup>
38,5±2,4<sup>1-3</sup>
АДФ/O
2,10±0,20
1,87±0,21<sup>1</sup>
1,35±0,03<sup>1,2</sup>
2,10±0,20<sup>3</sup>
Тp
0,80±0,02
1,63±0,09<sup>1</sup>
1,60±0,02<sup>1,2</sup>
0,80±0,02<sup>3</sup>
Окисление малата + глутамат
V<sub>4п</sub>
33,6±1,4
26,6±1,4<sup>1</sup>
l6,3±0,4<sup>1,2</sup>
35,5±1,8<sup>2,3</sup>
V<sub>3</sub>
85,1±3,1
71,4±3,5<sup>1</sup>
30,3±0,5<sup>1,2</sup>
63,1±1,6<sup>1-3</sup>
V<sub>40</sub>
29,8±1,2
30,1±0,7
16,2±0,7<sup>1,2</sup>
35,6±1,7<sup>1-3</sup>
АДФ/O
2,70±0,07
1,20±0,04<sup>1</sup>
0,90±0,06<sup>1,2</sup>
1,72±0,02<sup>1-3</sup>
Тp
0,80±0,08
0,90±0,03
1,50±0,05<sup>1,2</sup>
1,10±0,09<sup>1-3</sup>
Окисление малата + глутамат в присутствии малоната
V<sub>4п</sub>
29,2±1,9
24,8±0,6<sup>1</sup>
16,1±0,9<sup>1,2</sup>
41,7±2,1<sup>1-3</sup>
V<sub>3</sub>
70,6±2,6
53,7±4,8<sup>1</sup>
28,1±0,5<sup>1,2</sup>
65,4±3,7<sup>1-3</sup>
V<sub>40</sub>
29,4±0,4
30,1±1,3
13,9±0,1<sup>1,2</sup>
43,3±2,5<sup>1-3</sup>
АДФ/O
2,02±0,07
1,42±0,40<sup>1</sup>
1,27±0,05<sup>1,2</sup>
1,80±0,08<sup>1-3</sup>
Тp
0,70±0,05
0,80±0,02
1,40±0,14<sup>1,2</sup>
0,80±0,04<sup>3</sup>
Показатели липопероксидации
МДА спонтанный аскорбатзависимый
0,13±0,010,25±0,03
0,28±0,02<sup>1</sup>0,58±0,01<sup>1</sup>
0,36±0,04<sup>1,2</sup>0,98±0,05<sup>1,2</sup>
0,21±0,05<sup>1-3</sup>0,48±0,01<sup>1-3</sup>
Диеновые конъюгаты
0,24±0,03
0,51±0,07<sup>1</sup>
1,15±0,09<sup>1,2</sup>
0,55±0,07<sup>1-3</sup>
Основания Шиффа
1,85±0,10
2,38±0,12<sup>1</sup>
2,75±0,10<sup>1,2</sup>
2,19±0,09<sup>1-3</sup>
Примечание. Р<0,05: <sup>1</sup> - по отношению к интактным животным,<sup>2</sup> - по отношению к 4-ПК, введенной в течение 7 дней,<sup>3</sup> - по отношению к 4-ПК спустя 14 дней после окончания инъекций.
Пример 7. Исследование церебропротекторных свойств ЭПД при гипоксии
Эксперименты проведены на белых неинбредных крысах-самцах массой 200-250 г. Использовали модель нормобарической гиперкапнической гипоксии, помещая животных в герметичную емкость объемом 3 л на 1,5 ч, что соответствует гипоксии средней степени тяжести, приближенной к реальным ситуациям в клинической практике [23]. ЭПД вводили животным профилактически в желудок 1 раз в сутки в течение 5 суток в дозах 50 мг/кг, 300 мг/кг и 500 мг/кг. Контрольные крысы получали в эквиобъемном количестве 1% крахмальный гель.
Функциональное состояние MX оценивали по дыхательной активности гомогената головного мозга полярографическим методом [15]. Условия эксперимента и оцениваемые показатели аналогичны описанным в примере №6, субстрат окисления - сукцинат 1 мМ. Способность исследуемого препарата ингибировать развивающуюся в ткани мозга при гипоксии липидную пероксидацию оценивали по изменению аскорбатзависимого ПОЛ (накопление связываемых с тиобарбитуровой кислотой продуктов перекисного окисления липидов) в гомогенате головного мозга [10, 12]. Достоверность различий оценивали по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни при уровне значимости 5% (р<0,05) [18].
Результаты эксперимента показывают, что гипоксия средней степени тяжести вызывает выраженные изменения энергопродукции в MX головного мозга (Табл.9). В частности, повышаются все скорости окисления субстратов и разобщается окислительное фосфорилирование. Оценка состояния процессов липидной пероксидации в гомогенате головного мозга крыс, перенесших гипоксию (Табл.10), указывает на возрастание по сравнению с контролем исходного уровня перекисей, а также более интенсивное их накопление в процессе инкубации. Полученные данные хорошо согласуются с имеющимися в литературе относительно патогенеза гипоксических нарушений в ЦНС. Известно, что при острых нарушениях мозгового кровообращения, хронической ишемии мозга, токсической и постгипоксической энцефалопатии, черепно-мозговых травмах, отравлении нейротропными ядами, коматозных состояниях гипоксические явления в ткани мозга определяют картину повреждения. Она связана, в первую очередь, с недостаточностью аэробной энергопродукции в MX, развивающимся перекисным окислением липидов [4, 12, 13, 14, 27].
ЭПД во всех исследуемых дозах оказывает значимое церебропротекторное, антигипоксическое действие, нормализуя показатели дыхательной активности MX мозга. Эффект носит дозозависимый характер и более выражен при максимальной использованной дозировке ЭПД, когда показатели скоростей дыхания MX и сопряженности окислительного фосфорилирования практически не отличаются от таковых в контрольной группе (Табл.9). Столь же отчетливо проявляется действие ЭПД на показатель ПОЛ (Табл.10). Полученные данные указывают на способность ЭПД ограничивать ПОЛ в ткани мозга при гипоксии, что является важнейшим компонентом цитопротекторного, мембраностабилизирующего эффектов [4, 10, 12].
Таблица 9
Влияние ЭПД на показатели дыхательной активности MX гомогената головного мозга крыс, перенесших гипоксию (X; σ; n=10)
Показатели
Контроль
Гипоксия
ЭПД 50 мг/кг + гипоксия
ЭПД 300 мг/кг + гипоксия
ЭПД 500 мг/кг + гипоксия
V<sub>4п</sub>
44,0; 0.85
64,5; 4,5*
56,1; 1,7*<sup>∧</sup>
52,0; 2,2*<sup>∧</sup>
48,2; 1.7<sup>∧</sup>
V<sub>3</sub>
83,5; 5.90
118,0; 5,7*
115,0; 3,6*
106,5; 4,8*<sup>∧</sup>
93,4; 3,4<sup>∧</sup>
V<sub>4o</sub>
46,0; 1.83
56,3; 1,2*
50,6; 2,1<sup>∧</sup>
49,2; 3,1<sup>∧</sup>
47,7; 2,1<sup>∧</sup>
АДФ/O
2,02; 0.21
1,61; 0,10*
1,83; 0,06*<sup>∧</sup>
1,94; 0,10<sup>∧</sup>
1,98; 0,06<sup>∧</sup>
Примечание: здесь и в следующей таблице (*) - различие с соответствующим показателем в контроле достоверно при р<0,05; (<sup>∧</sup>) - различие с соответствующим показателем при гипоксии достоверно при р<0,05.
Таблица 10
Влияние ЭПД на показатели перекисного окисления липидов гомогената головного мозга крыс, перенесших гипоксию (X; σ; n=10)
Группы
Время инкубации гомогената, мин
0
15
30
45
60
контроль
0,121; 0,060
0,247; 0,012
0,302; 0,026
0,335; 0,022
0,507; 0,032
гипоксия
0,219; 0,012*
0,282; 0,021*
0,331; 0,028
0,450; 0,024*
0,693; 0,029*
ЭПД 50 мг/кг
0,190:0,009*<sup>∧</sup>
0,271; 0,012*<sup>∧</sup>
0,326; 0,016*
0,415; 0,022*<sup>∧</sup>
0,574; 0,023<sup>*∧</sup>
ЭПД 300 мг/кг
0,172; 0,008*<sup>∧</sup>
0,255; 0,014<sup>∧</sup>
0,310; 0,010^
0,370; 0,020<sup>∧</sup>
0,557; 0,027<sup>∧</sup>
ЭПД 500 мг/кг
0,143; 0,010<sup>∧</sup>
0,240; 0,017<sup>∧</sup>
0,308; 0,014^
0,352; 0,018<sup>∧</sup>
0,540; 0,025<sup>∧</sup>
Таким образом, приведенные примеры указывают на то, что комплекс фосфолипидов, выделенный из дрожжей, используемых в пивоварении, пекарском производстве и кондитерской промышленности (Saccharomyceus cervaesae), обладает цитопротекторной, антитоксической, антигипоксической, антиоксидантной, гепатопротекторной, церебропротекторной, кардиопротекторной активностью и способностью нормализовать липидный и энергетический обмен. Его эффект проявляется независимо от способа введения (внутрь или парентерально) и достаточно выражен как при профилактическом, так и при лечебном применении.
Пример №8
Возможность получения различных форм на основе ЭПД для различных способов применения может быть продемонстрирована представленными ниже составами.
1. Инъекционная форма:
100,0 мг комплекса фосфолипидов, содержащего 99% фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина (ФЭА), фосфатидилсерина (ФС) и 1% смеси изофосфатидной кислоты (ФК), фосфатидилинозитола (ФИ), кардиолипина (КЛ), фосфатидилглицерина (ФГ), плазмалогена;
вода для инъекций 5 мл;
буферный раствор лимонной кислоты с натрия цитратом до рН 6.
2. Капсулы желатиновые для перорального введения:
300,0 мг ЭПД, содержащего помимо витаминов группы В и витамина Е комплекс фосфолипидов, состоящий из 30% фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина (ФЭА), фосфатидилсерина (ФС) и 70% смеси изофосфатидной кислоты (ФК), фосфатидилинозитола (ФИ), кардиолипина (КЛ), фосфатидилглицерина (ФГ), плазмалогена;
25,0 мг крахмала;
1,0 мг стеарата кальция;
50 мг лактозы.
3. Состав для наружного применения:
50,0 мг ЭПД, содержащего помимо витаминов группы В и витамина Е комплекс фосфолипидов, состоящий из 30% фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилэтаноламина (ФЭА), фосфатидилсерина (ФС) и 70% смеси изфосфатидной кислоты (ФК), фосфатидилинозитола (ФИ), кардиолипина (КЛ), фосфатидилглицерина (ФГ), плазмалогена;
50 мг масла зародышей пшеницы;
До 100 г - мазевая основа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., Кишкун А.А. // Лаб. дело. 1988. №11. С.41-43.
2. Бабьев И.П., Чернов И.И. Биология дрожжей. М., Саентифик пресс, 2004.
3. Белобородова Э.И. Венгеровский А.И., Саратиков А.С. // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. 2000. №10/11. С.75-77.
4. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. М., 1989.
5. Буеверов А.О., Маевская М.В. // Клинические перспективы гастроэнтерол. и гепатол. 2005. №1. С.9-16.
6. Бурлакова, Е.Б. Липиды биологических мембран / Е.Б.Бурлакова, А.В.Олесенко, С.А.Аристархова. Ташкент. 1982. 262 с.
7. Венгеровский А.И., Батурина Н.О., Саратиков А.С. // Эксперим. и клин. фармакол. 2000. №2. С.76-80.
8. Венгеровский А.И., Саратиков А.С. // Бюл. эксперим. мед. 2002. Приложение №1. С.38-40.
9. Венгеровский А.И., Чучалин В.С., Паульс О.В. и др. // Бюл. экспер. биол. и мед. 1987. №4. С.430-432.
10. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М. - 1972. - 252 с.
11. Гундерманн К.Й. // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. 2002. №2. С.21-24.
12. Зозуля Ю.А., Барабой В.А., Сутковой Д.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга. М., Знание-М, 2000.
13. Кондрашова М.Н. и др. Адаптация к гипоксии посредством переключения метаболизма на превращения янтарной кислоты // Митохондрии. М., 1973. С.112-130.
14. Кондрашова М.Н. и др. Гомеостазирование физиологических функций на уровне митохондрий // Молекулярные механизмы клеточного гомеостаза. Красноярск, 1987. С.40-66.
15. Кондрашова М.Н., Ананенко А.А. // Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. М., 1973. С.106-129.
16. Кондрашова М.Н. // Биофизика, 1989. Т.34, №3. С.450-458.
17. Кондрашова М.Н. // Биохимия. 1991.Т.56, №3. С.388-405.
18. Лакин Г.Ф. Биометрия. Москва. 1973. 243 с.
19. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Москва. 2005. 1200 С.
20. Оганов Р.Г., Масленникова Г.Я. // Кардиология, 2000. №6. С.4-8.
21. Регистр лекарственных средств России / Под ред. Г.Л.Вышковского. М.: Изд-во ООО «РЛС-2004». 2004. С.489-490.
22. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2000. С.340-345.
23. Сайфутдинов P.P., Хазанов В.А. // Экспер. и клин. фармакол. 1997. Т.61, №5. С.27-29.
24. Саратиков А.С., Буркова В.Н., Венгеровский А.И. Новые гепатопротективные и противовоспалительные препараты пелоидов. Томск, 2004.
25. Сас Е.И. // Поликлиника. 2007. №1 С.65-68.
26. Скакун, Н.П. // Эксп.и клин. фармакол. 1993. Т.56, №1. С.69-72.
27. Смирнов А.В., Криворучко Б.И. // Анестезиол. и реаниматол. 1997. №3. С.97-98.
28. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. М.: Медицина, 1978. С.66-68.
29. Трифонова О.Ю., Хазанов В.А. // Регуляторы энергетического обмена. Клин.-фармакол. аспекты. Томск, Изд-во Том. ун-та, 2004. С.7-14.
30. Хазанов В.А. // Регуляторы энергетич. обмена. Томск, 2004. С.3-7.
31. Blei A., Cordoba J. // Am. J. Gastroenterol. 2001. Vol.96, N12. P.1968-1976.
32. Folch J., Lee S.M., Sloane-Stanley G. // J. Biol. Chem. 1957. Vol.226. P.497-509.
33. Hazell A., Butterworth R. // Proc. Soc. Exp.Med. 1999. Vol.222. N1. P.99-112.
34. Jose Marin-Garcia: Mitochondria and the heart. 2005.
35. Rao К., Norenberg М. // Metab. Brain Dis. 2001. Vol.16, N1. P.67-78.
36. Sakaida N., Senzaki H., Shikata N., Morii S. // Acta Pathol. Jpn. 1990. Vol.40. N9. P.635-642.