ПОЛНОСТЬЮ СБАЛАНСИРОВАННЫЙ ПО ПИТАТЕЛЬНОЙ ЦЕННОСТИ ПРЕПАРАТ ДЛЯ МЛАДЕНЦЕВ, ПРОБИОТИЧЕСКАЯ СМЕСЬ ДЛЯ ДЕТЕЙ И СПОСОБ СНИЖЕНИЯ ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ВОСПАЛЕНИЯ У МЛАДЕНЦА ИЛИ РЕБЕНКА.
COMPLETELY BALANCED IN NUTRITIONAL VALUE PREPARATION FOR BABIES, PROBIOTIC BABY FOOD AND METHOD OF REDUCTION OR PREVENTION OF INFLAMMATION IN BABY OR CHILD

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Настоящее изобретение в основном относится к пробиотическим препаратам для младенцев и к детским питательным продуктам.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
B. longum
[0002] В целом, настоящее изобретение относится, в одном варианте своего осуществления, к препарату для младенцев или к детскому питательному продукту, включающему источник белка, источник жира, источник углевода и AH1206.
В.
longum
[0003] В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу ослабления воспаления у младенца или ребенка, включающему введение  AH 1206 младенцу или ребенку.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0004] Для более полного понимания настоящего изобретения текст описания содержит относящиеся к нему и прилагаемые в соответствующем разделе чертежи.
B. longum
[0005] На фиг.1 проиллюстрирована BOX полимеразно-цепьевая реакция (BOX PCR) (биоанализатор) со штрих-кодом профиля для AH1206. Размеры пар оснований были определены с использованием программного обеспечения Agilent 2100.
B. longum
[0006] На фиг.2 приведен график, иллюстрирующий выделение AH1206 из фекалий в течение 8-дневного периода кормления исследуемым продуктом, где показано, что AH1206 способен выживать в желудочно-кишечном тракте мышей.
В. longum
[0007] На фиг.3 приведена диаграмма, демонстрирующая эффект  AH1206 на продукцию цитокина интерлейкина (IL)-10 мононуклеарными клетками периферической крови человека (PBMC). Полученные результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка измерения (СКО) (n=6).
В. longum
4
[0008] На фиг. 4 показан график, демонстрирующий эффект  AH1206 на рекрутинг эозинофилов в легких сенсибилизированных мышей. На фиг. 4А показано, что общее число клеток в бронхоальвеолярном лаваже (BAL) снижалось у мышей, которым скармливали АН1206. На фиг.4В показан результат дифференциального подсчета клеток в BAL, из которого видно, что снижение количества клеток отмечается в основном в популяции эозинофилов. (Количество клеток представлено на оси y (×10); *=p<0,05 в сравнении с плацебо).
В. longum
[0009] На фиг. 5A и 5В приведены графики, демонстрирующие эффект: (A) применения пробиотических бактерий  AH1206 и (B) плацебо на общее число клеток в жидкости BAL после провокации овальбумином (OVA) у чувствительных животных (n=10/группу, *=р<0,05, в сравнении с вариантом только OVA провокации).
В. longum
[00010] На фиг. 6A и 6В приведены графики, иллюстрирующие эффект: (А) применения  AH1206 и (B) плацебо на реактивность дыхательных путей к метахолину, по результатам оценки изменений в длительности паузы (Penh) у OVA-сенсибилизированных мышей через 24 часа после интраназальной провокации OVA или солевым раствором. Каждая точка на графике обозначает среднее значение ± СКО (n=10/группу *=p<0,05, в сравнении с вариантом применения только OVA).
[00011] На фиг.7 приведен график, показывающий уровень цитокина, фактора некроза опухолевой ткани (TNF) в BAL жидкости у OVA-сенсибилизированных мышей. Каждая колонка обозначает среднее значение ± СКО (n=10, *=p<0,05, в сравнении с вариантом провокации OVA, MRS (deMann, Rogose and Sharpe) контроль с применением бульона).
[00012] На фиг. 8А и 8В приведены графики, иллюстрирующие эффект перорального введения пробиотического штамма АН1206 на продукцию (А) TNF цитокина и (В) интерферона (IFN)-γ цитокина в активированных спленоцитах у OVA-сенсибилизированных мышей (CD23/CD28-стимулированные спленоциты). Каждая колонка обозначает среднее значение ± СКО (n=10, *=p<0,05, в сравнении с вариантом провокации OVA, MRS контроль с применением бульона).
[00013] На фиг. 9 приведен график, показывающий, что уровни OVA-специфического иммуноглобулина Е (IgE) в сыворотке, выделенной из мышей, которым скармливали АН1206, значительно ниже, чем в контролях без введения АН1206 (**р=<0,01).
[00014] На фиг.10 приведен график, иллюстрирующий эффект перорального введения пробиотического штамма АН1206 на продукцию TNF-α в активированных спленоцитах у OVA-сенсибилизированных мышей (CD23/CD28-стимулированные спленоциты). Для каждой группы приведено среднее значение (*р=<0,5, **р=<0,01, в сравнении с OVA-провокацией и провокацией холерным токсином (СТ), MRS контроль с применением бульона).
+
+
[00015] На фиг.11 приведен график, показывающий, что CD4 CD25 клетки у животных, которым скармливали АН1206, существенно снижали свою пролиферацию (n=10 для всех групп, за исключением контроля, где n=20).
+
+
[00016] На фиг. 12А и В приведены графики, показывающие процент клеток в популяции CD4, которые также являются CD25, согласно результатам оценки по методу проточной цитометрии (n=11 для группы, в которой животных не обрабатывали, n=20 для группы плацебо и n=10 для группы животных, которым скармливали АН1206).
+
[00017] На фиг. 13 показано, что у стерильных мышей, которым скармливали АН1206, наблюдается позитивная регуляция, проявляемая в проценте CD4/CD25 клеток, экспрессирующих фактор транскрипции FoxP3 (n=8 или 9 на группу) (*р<0,05 в сравнении с плацебо).
[00018] На фиг.14 приведен график, иллюстрирующий стабильность пробиотического штамма АН1206 в течение 3 месяцев.
НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[00019] Ниже, для целей более детального пояснения вариантов осуществления настоящего изобретения, приводится описание одного или нескольких примеров. Следует понимать, что каждый из примеров дается для лучшего понимания настоящего изобретения, но не с целью ограничения его каким-либо образом. Фактически, для специалистов в данной области очевидно, что в настоящее изобретение могут быть введены различные модификации или использованы различные вариации на его основе, без отступления от области или принципов настоящего изобретения. Так, например, особенности, проиллюстрированные здесь или описанные как часть одного из вариантов настоящего изобретения, могут быть использованы при осуществлении другого варианта или могут привести к еще одному варианту.
[00020] Таким образом, следует полагать, что настоящее изобретение включает все те модификации и вариации, которые охватываются областью прилагаемой ниже формулы изобретения и соответствующими ее эквивалентами. Другие объекты, особенности и аспекты настоящего изобретения описываются ниже в настоящем тексте или станут очевидными из приведенного подробного описания. Для специалиста в данной области понятно, что в настоящей заявке приводится описание лишь некоторых репрезентативных вариантов осуществления настоящего изобретения и что описание не следует рассматривать как ограничивающее каким-либо образом настоящее изобретение, которое охватывает более широкий диапазон вариантов и аспектов.
[00021] Как было отмечено выше, настоящее изобретение в основном относится к пробиотическим препаратам для младенцев и к питательным продуктам для детей. Материалы, относящиеся к пробиотическим смесям/препаратам для младенцев и к питательным продуктам для детей, могут включать патенты США No 7179460 (Dennen, et al.) и 5922375 (Luchansky, et al.).
Bifidobacterium longum
B. longum
B. longum
[00022] Техническая проблема, которую нужно было решить в настоящем изобретении, заключается в разработке пробиотических смесей/препаратов для младенцев и питательных продуктов для детей, содержащих новые пробиотики. Таким образом, в одном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к смеси/препарату для младенцев или к питательному продукту для детей, содержащему  штамм AH1206. Штамм AH1206 был депонирован 11 мая 2006 г. в Шотландии в Национальной Коллекции промышленных, морских и пищевых бактерий (National Collections of Industrial, Marine, and Food Bacteria (NCIMB), Scotland, UK) с номером доступа NCIMB 41382. NCIMB представляет собой Международный Депозитарий, признанный Будапештским Договором. Указанный штамм толерантен к кислоте и желчи и способен проходить в желудочно-кишечный тракт. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения,  AH1206 был выделен из фекалий младенца.
B. longum
Bifidobacterium
[00023] В другом варианте осуществления настоящего изобретения смесь/препарат для младенцев или питательный продукт для детей содержит штамм AH1206 или его мутант или вариант. Указанный мутант может представлять собой генетически модифицированный мутант. А вариант может представлять собой природный вариант . В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанный штамм может представлять собой пробиотик. В других вариантах осуществления настоящего изобретения указанный штамм может быть представлен в форме биологически чистой культуры. В еще других вариантах осуществления настоящего изобретения указанный штамм представляет собой выделенный штамм.
Bifidobacteria
Bifidobacterium longum
in vitro
[00024] В контексте настоящего описания термины "мутант", "вариант" и "генетически модифицированный вариант" включают штамм , генетические и/или фенотипические свойства которого были изменены в сравнении с родительским штаммом. Природные варианты  включают спонтанные изменения селективно выделенных целевых качеств. Мягкое изменение свойств родительского штамма достигается за счет применения традиционных () стратегий генетических манипуляций, таких как разрушение и конъюгационный перенос.
Bifidobacteria
[00025] Генетическая модификация включает введение экзогенных и/или эндогенных последовательностей ДНК в геном штамма , например, путем встраивания в геном бактериального штамма с использованием векторов, включающих плазмидную ДНК, или бактериофагов. Природные или индуцированные мутации включают изменения по меньшей мере одного основания, такие как делеция, вставка, трансверсия или другие модификации ДНК, которые могут приводить к изменению аминокислотной последовательности, кодируемой данной последовательностью ДНК.
Bifidobacteria
in vitro
in vitro
[00026] Термины "мутант", "вариант" и "генетически модифицированный мутант" также включают штамм , который был подвергнут генетическим изменениям, которые накапливаются в геноме на уровне, соответствующем таковому в природе для всех микроорганизмов, и/или соответствуют генетическим изменениям, которые являются результатом спонтанной мутации, и/или приобретения генов, и/или потери генов, которые не достигаются при мягких () манипуляциях на уровне генома, но достигаются путем селекции природных вариантов и/или мутантов, которые содержат выбранное положительное свойство, способствующее выживанию бактерии в условиях воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды, таких как антибиотики. Мутант может быть получен при деликатном () встраивании специфических генов в геном, где указанное встраивание не меняет в корне биохимическую природу функционирования организма, но продукты которого могут использоваться для идентификации или селекции бактерии, например, на основе резистентности к антибиотикам.
Bifidobacteria
Bifidobacteria
Bifidobacteria
[00027] Для любого специалиста в данной области понятно, что мутантный или вариантный штаммы  могут быть идентифицированы при анализе гомологии последовательности данной ДНК с последовательностью родительского штамма. Штаммы , демонстрирующие близкую идентичность по последовательности с родительским штаммом, рассматриваются как мутантный или вариантный штаммы. Штамм  с показателем идентичности по последовательности (гомологии) 96% или более, таким как 97% или более, или 98% или более, или 99% или более, с последовательностью родительской ДНК, может рассматриваться как мутантный или вариантный. Гомология по последовательности может быть определена с использованием алгоритма для оценки гомологии в режиме «он-лайн», встроенного в программу "BLAST", которая доступна на странице в Интернете http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
Bifidobacteria
[00028] Мутанты родительского штамма также включают полученные из  штаммы, характеризующиеся показателем идентичности по последовательности на уровне 85%, таким как показатель гомологии по последовательности, равный по меньшей мере 90%, или показатель гомологии по последовательности, равный по меньшей мере 95% с полинуклеотидной последовательностью межгенного спейсера 16s-23s из родительского штамма. Указанные мутанты могут дополнительно включать мутации ДНК в других последовательностях ДНК в бактериальном геноме.
Bifidobacterium
Bifidobacterium
[00029] В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный штамм  представлен в виде живых клеток. В альтернативном варианте, штамм может быть представлен в виде инактивированных клеток. Термин "инактивированный" означает, что метаболическая активность или репродуктивная активность штамма была снижена или устранена. Инактивация может быть проведена по любому известному в настоящее время в данной области способу, или подходящий способ может быть разработан. Так, например, инактивация может быть достигнута путем тепловой обработки, лиофилизации, ультрафиолетового облучения, гамма-облучения, давления, химического разрушения, механического разрушения или за счет изменения величины pH. Например, пробиотик может быть инактивирован при тепловой обработке с использованием температур в диапазоне от 80°C до 100°C в течение 10 минут. Пробиотик может быть также инактивирован ультрафиолетовым светом при проведении облучения в течение 5 минут на расстоянии 5 см от лампы UVC мощностью 30 ватт. Альтернативно, пробиотик может быть инактивирован путем облучения гамма-лучами в дозе 2 Грей-кг (kGy) с использованием источника кобальта-60, расположенного на расстоянии 20 см. В контексте настоящего описания термин "инактивированный" является синонимом термина "неживой".
B. longum
[00030] В одном варианте осуществления настоящего изобретения штамм AH1206 может быть введен в качестве добавки в композицию для детей или младенцев. Термин "младенец" относится к человеку в постнатальном периоде в возрасте примерно менее 1 года. Термин "ребенок" относится к человеку в возрасте примерно от 1 до 12 лет. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ребенок имеет возраст примерно от 1 до 6 лет. В других вариантах осуществления настоящего изобретения ребенок имеет возраст примерно от 7 до 12 лет.
В. longum
4
12
6
9
9
12
6
[00031] Количество  AH1206, вводимое в качестве добавки в композицию по настоящему изобретению, соответствует от примерно 1×10 до примерно 1×10 колониеобразующих единиц (кое) на грамм композиции. В другом варианте осуществления настоящего изобретения количество, вводимое в качестве добавки в композицию по настоящему изобретению, соответствует от примерно 1×10 до примерно 1×10 кое на грамм композиции. В другом варианте осуществления настоящего изобретения количество, вводимое в качестве добавки в композицию по настоящему изобретению, соответствует от примерно 1×10 до примерно 1×10 кое на грамм композиции. В другом варианте осуществления настоящего изобретения количество, вводимое в качестве добавки в композицию по настоящему изобретению, соответствует по меньшей мере примерно 1×10 кое на грамм композиции.
B. longum
B. longum
B. longum
B. longum
[00032] Форма введения AH1206 по настоящему изобретению не является решающим фактором, главное, чтобы ребенку или младенцу вводилось эффективное количество. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, AH1206 вводят ребенку или младенцу через таблетки, пилюли, с использованием инкапсулирования, каплет, желатиновых капсул, капсул, масляных капель, пакетиков, жидкостей, жидких концентратов, порошков, эликсиров, растворов, суспензий, эмульсий, леденцов, шариков и их сочетаний. В другом варианте  AH1206 инкапсулируют в сахар, жир или полисахарид. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения AH1206 добавляют к пищевому продукту или напитку и потребляют. Указанный пищевой продукт или напиток может представлять собой пищевую добавку или питательный продукт для детей, такой как дополнительная питательная смесь, принимаемая после еды, молочная смесь для маленьких детей (1-3 лет), напиток, молоко, йогурт, фруктовый сок, напиток, приготовленный на основе фруктов, жевательная таблетка, печенье, крекер или молочный порошок.
[00033] В других вариантах осуществления настоящего изобретения указанный продукт может представлять собой питательный продукт для младенцев, такой как препарат/смесь для младенцев или обогатитель грудного молока. В контексте настоящего описания термин "препарат/смесь для младенцев" обозначает композицию, которая, будучи заменителем грудного молока, удовлетворяет все потребности младенца в питательных веществах. Термин "обогатитель грудного молока" относится к композиции, которая может быть добавлена к грудному молоку для повышения питательной ценности грудного молока. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанная композиция представляет собой кислый продукт (согласно нормам, установленным для некоторых пищевых продуктов медицинского назначения).
[00034] Указанный питательный продукт может представлять собой такой продукт, который предназначен для приема нормальным по сроку рождения младенцем, недоношенным младенцем, младенцем с низким весом при рождении или младенцем с очень низким весом при рождении. В контексте настоящего описания термины "недоношенный" или "недоношенный младенец" могут включать младенцев с низким весом при рождении или младенцев с очень низким весом при рождении. Младенцы с низким весом при рождении включают таких младенцев, которые родились в сроки от примерно 32 до примерно 37 недели беременности или которые имели вес при рождении от примерно 3,25 до примерно 5,5 фунтов. Младенцы с очень низким весом при рождении включают таких младенцев, которые родились в сроки ранее, чем примерно 32 неделя беременности, или которые имели вес при рождении, равный примерно 3,25 фунтов. Таким образом, недоношенные младенцы могут включать младенцев, которые родились в сороки ранее, чем примерно 37 неделя беременности, и/или которые имели при рождении вес менее чем примерно 5,5 фунтов.
[00035] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанные композиции могут вводиться энтерально или парентерально. В контексте настоящего описания термин "энтеральный" обозначает введение через или внутрь желудочно-кишечного, или пищеварительного, тракта, а термин "энтеральное введение" включает прием пищи через рот, внутрижелудочное кормление, транспилорическое введение или любой другой вариант введения в пищеварительный тракт. Термин "парентерально" относится к приему в организм или к такому варианту введения в организм, который отличен от пути, связанного с пищеварительным трактом, такому как внутривенная или внутримышечная инъекция.
[00036] Композиции по настоящему изобретению могут обеспечивать минимальную, частичную или полную поддержку организма с точки зрения обеспечения его питательными компонентами. Указанные композиции могут представлять собой пищевые добавки или заменители пищи. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанные композиции могут вводиться в сочетании с пищей или питательной композицией. Согласно этому варианту, указанная композиция может либо перемешиваться с пищей или питательным продуктом до ее/его приема пациентом, или может вводиться указанному пациенту перед приемом пищи или питательной композиции или после приема пищи или питательной композиции. Указанные композиции могут вводиться недоношенным младенцам в виде скармливаемой ему композиции для младенца, грудного молока, обогатителя грудного молока или в виде сочетания этих форм введения. Указанные композиции могут представлять собой, хотя и необязательно, полностью сбалансированный по питательной ценности продукт. Термин «полностью сбалансированный по питательной ценности» в контексте настоящего описания означает, что композиция содержит адекватный набор питательных веществ, необходимых для поддержания здоровья человека в течение длительных периодов его жизни.
B. longum
B. longum
[00037] Настоящее изобретение, в некоторых вариантах его осуществления, может включать пренатальную диетическую добавку, принимаемую беременной женщиной, что обеспечивает поступление AH1206 в плод, пока он находится в матке. В других вариантах настоящее изобретение может включать постнатальную диетическую добавку, принимаемую кормящей матерью, что обеспечивает поступление AH1206 в организм новорожденного через молоко матери.
В. longum
[00038] Если  AH1206 вводят через препарат для младенцев или за счет питательного продукта для детей, то композиция может быть полностью сбалансированной по питательной ценности и может содержать подходящие типы и количества липидов, углеводов, белков, витаминов и минералов. Количество липида или жира в типичном случае может варьироваться от примерно 3 до примерно 7 г/100 ккал. В качестве источника липидов может использоваться любой известный или используемый источник липидов, например молочный жир, липиды из яичного желтка, рыбий жир, растительные масла, такие как пальмовое масло, соевое масло, пальмолин, пальмоядровое масло, кокосовое масло, масло на основе триглицеридов со средней длиной цепи, подсолнечное масло с повышенным содержанием олеиновой кислоты, оливковое масло, сафлоровое масло с повышенным содержанием олеиновой кислоты и сложные эфиры жирных кислот.
[00039] Количество белка в типичном случае может варьироваться от примерно 1 до примерно 5 г/100 ккал. Источники белка могут представлять собой любые известные или используемые в данной области источники белка, например молочный белок, твердые вещества из нежирного молока, нежирное молоко, белок молочной сыворотки, казеин, соевый белок, белок животного происхождения, белок из злаков, белок из овощей или их сочетания. Указанная композиция может содержать белки и/или пептиды, обогащенные глютамином/глютаматом. Источник белка может быть интактным, частично гидролизованным или в значительной мере гидролизованным. Источник белка, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, может представлять собой сочетание интактного и гидролизованного белка. Источник белка может представлять собой изолят или концентрат.
[00038] В некоторых вариантахкомпозиция по настоящему изобретению может содержать источник азота (например, аминокислоты и/или белок), так что общее количество аминокислот или белка может составлять от примерно 1 г/100 килокалорий (ккал) до примерно 10 г/100 ккал от общего количества композиции, в некоторых вариантах от примерно 2 г/100 ккал до примерно 6 г/100 ккал. Количество источника липидов на 100 ккал от общего количества композиции может варьироваться в диапазоне от значения выше, чем 0 г, до примерно 6 г, в некоторых вариантах от примерно 0,5 г до примерно 5,5 г, и еще в других вариантах от примерно 2 г до примерно 5,5 г; а количество источника неволокнистого углевода на 100 ккал от общего количества композиции может составлять от примерно 5 г до примерно 20 г, и в некоторых вариантах может составлять от примерно 7,5 г до примерно 15 г. Количество витаминов и минералов в полностью сбалансированной по питательным веществам композиции может быть достаточным для того, чтобы соответствовать на 100% принятой в США рекомендуемой для дневного употребления норме (RDI), составляющей от примерно 500 до примерно 3000 ккал, в некоторых вариантах от примерно 1000 до примерно 3000 ккал. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция может не содержать белка. В таком варианте указанная композиция может содержать источник, эквивалентный по ценности белку, который содержит 100% свободных аминокислот.
[00041] Количество углевода в типичном случае варьируется от примерно 8 до примерно 12 г/ккал. Источники углеводов могут представлять собой любые известные или используемые в данной области источники углеводов, например лактозу, фруктозу, глюкозу, кукурузный сироп, твердый материал из кукурузного сиропа, мальтодекстрины, сахарозу, крахмал, твердые вещества из рисового сиропа, рисовый крахмал, модифицированный кукурузный крахмал, модифицированный крахмал из тапиоки, рисовую муку, соевую муку и их сочетания. Указанная композиция может включать одно или несколько вспомогательных веществ, бактериальный компонент, лекарственное средство или биологически активное соединение.
B. longum
[00042] Соответственно, коммерчески доступные композиции для младенцев и другие соответствующие композиции могут использоваться в практике осуществления настоящего изобретения. Так, например, такие препараты, как энфамил, препарат энфамил для недоношенных детей (Enfamil Premature Formula), энфамил с содержанием железа (Enfamil with Iron), лактофри (Lactofree), нутрамиген (Nutramigen), прегестимил (Pregestimil) и прособи (ProSobee) (доступные от компании Mead Johnson & Company, Evansville, IN, U.S.A.) могут содержать в качестве добавки подходящие количества АН1206 и использоваться в практике осуществления настоящего изобретения.
1
2
3
6
12
3
[00043] Композиция по настоящему изобретению может необязательно включать один или несколько указанных ниже витаминов или их производных, включающих, без ограничения, биотин, витамин B, или тиамин, тиамин-пирофосфат, витамин B, или рибофлавин, флавинмононуклеотид, флавинадениндинуклеотид, пиридоксин-гидрохлорид, тиамин-мононитрат, фолиевую кислоту, витамин B, или ниацин, никотиновую кислоту, никотинамид, ниацинамид, никотинамидадениндинуклеотид, триптофан, биотин, пантотеновую кислоту, витамин B, витамин B, кобаламин, метилкобаламин, дезоксиаденозилкобаламин, цианокобаламин, пантотенат кальция, пантотеновую кислоту, витамин С, аскорбиновую кислоту, витамин А, ретинол, ретиналь, ретиноевую кислоту, бета-каротин, витамин D, витамин D, кальциферол, холекальциферол, дигидроксивитамин D, 1,25-дигидроксихолекальциферол, 7-дегидрохолестерол, холин, витамин Е, ацетат витамина Е, витамин К, менадион, менахинон, филлохинон, нафтохинон и их смеси.
[00044] Композиция по настоящему изобретению может необязательно включать один или несколько из указанных ниже минералов или их производных, включающих, без ограничения, фосфор, калий, серу, натрий, докузат натрия, хлорид, марганец, магний, стеарат магния, карбонат магния, оксид магния, гидроксид магния, сульфат магния, медь, сульфат меди, иодид, бор, цинк, оксид цинка, хром, молибден, железо, карбонил-железо, гемосидерин, фумарат железа, полисахарид-железо, фторид, селен, молибден, фосфат кальция или ацетат кальция, фосфат калия, сульфат магния или оксид магния, хлорид натрия, хлорид калия или ацетат калия, ортофосфат железа, альфа-токоферилацетат, сульфат цинка или оксид цинка, глюконат меди, хлорид хрома или пиколонат хрома, иодид калия, селенат натрия, молибдат натрия, филлохинон, цианокобаламин, селенит натрия, сульфат меди, инозит, иодид калия, кобальт и их смеси. Неограничивающие примеры производных минеральных соединений включают соли, щелочные соли, сложные эфиры и хелаты любого из числа приведенных выше минеральных соединений.
[00045] Композиция по настоящему изобретению может также содержать эмульгаторы и стабилизаторы, такие как соевый лецитин, каррагинан или их сочетания. Композиция по настоящему изобретению может необязательно содержать другие вещества, которые могут оказывать благоприятный эффект, такие как лактоферрин, нуклеотиды, нуклеозиды, иммуноглобулины и их сочетания.
B. longum
Lactobacillus rhamnosus GG (LGG)
Bifidobacterium longum
Bifidobacterium animalis subsp
lactis BB-12
[00046] В одном варианте осуществления настоящего изобретения AH1206 может вводиться в сочетании с одним или несколькими пробиотиками. Термин «пробиотик» в контексте настоящего описания обозначает микроорганизм, который оказывает благоприятные эффекты на здоровье организма-хозяина. Любой пробиотик, известный в данной области, может быть приемлем в данном варианте осуществления настоящего изобретения, при условии, что такой пробиотик оказывает нужный результат. В конкретном варианте указанный пробиотик может быть выбран из , видов  и . . В этом варианте осуществления настоящего изобретения один или несколько добавленных пробиотиков могут представлять собой живые или неживые микроорганизмы.
B. longum
[00047] В другом варианте осуществления настоящего изобретения AH1206 может быть объединен с одним или несколькими пребиотиками. Термин «пребиотик» в контексте настоящего описания обозначает нерасщепляемый пищевой ингредиент, который стимулирует рост и/или активность пробиотиков. Любые пребиотики, известные в данной области, могут применяться в данном варианте осуществления настоящего изобретения, при условии, что их использование приводит к желаемому результату. Пребиотики, используемые в настоящем изобретении, могут включать олигосахариды, полисахариды и другие пребиотики, которые содержат фруктозу, ксилозу, сою, галактозу, глюкозу и маннозу. Более конкретно, пребиотики, используемые в настоящем изобретении, могут включать лактулозу, глюко-олигосахарид, инулин, полидекстрозу, галакто-олигосахарид, фрукто-олигосахарид, изомальто-олигосахарид, соевые олигосахариды, лактосахарозу, ксило-олигосахарид и гентио-олигосахарид.
B. longum
B. longum
B. longum
B. longum
B. longum
[00048] В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция может содержать другие активные агенты, такие как длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты (LCPUFA). Подходящие LCPUF включают, без ограничения, α-линолевую кислоту, γ-линолевую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, эйкозопентаноевую кислоту (EPA), арахидоновую кислоту (ARA) и/или докозагексаноевую кислоту (DHA). В одном варианте AH1206 вводят в сочетании с DHA. В другом варианте AH1206 вводят в сочетании с ARA. В еще одном варианте AH1206 вводят в сочетании с DHA и ARA. В коммерчески доступный препарат для младенцев, который содержит DHA, ARA или их сочетание, может быть введен AH1205, и такой препарат может использоваться в настоящем изобретении. Так, например, коммерчески доступный препарат энфамил липил (Enfamil LIPIL), который содержит эффективные количества DHA и ARA, может содержать в качестве добавки AH 1206, и такой препарат может быть использован в рамках настоящего изобретения.
B. longum
[00049] В одном варианте осуществления настоящего изобретения DHA и ARA вводят в сочетании с AH1206. В этом варианте весовое соотношение ARA:DHA может составлять от примерно 1:3 до примерно 9:1. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанное соотношение составляет от примерно 1:2 до примерно 4:1. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанное соотношение составляет от примерно 2:3 до примерно 2:1. В одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное соотношение составляет примерно 2:1. В одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное соотношение составляет примерно 1:1,5. В других вариантах осуществления настоящего изобретения указанное соотношение составляет примерно 1:1,3. В еще других вариантах указанное соотношение составляет примерно 1:1,9. В одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, указанное соотношение составляет примерно 1,5:1. В еще другом варианте указанное соотношение составляет примерно 1,47:1.
[00050] В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения количество DHA составляет примерно от 0,0 вес.% до 1,00 вес.% от содержания всех жирных кислот. Так, уровень DHA может составлять примерно 0,32 вес.%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения уровень DHA может составлять примерно 0,33 вес.%. В другом варианте уровень DHA может составлять примерно 0,64 вес.%. В еще одном варианте уровень DHA может составлять примерно 0,67 вес.%. В еще одном варианте уровень DHA может составлять примерно 0,96 вес.%. В еще одном варианте уровень DHA может составлять примерно 1,00 вес.%.
[00051] В разных вариантах осуществления настоящего изобретения количество ARA составляет от 0,0 вес.% до 0,67 вес.% от содержания всех жирных кислот. В другом варианте уровень ARA может составлять примерно 0,67 вес.%. В другом варианте уровень ARA может составлять примерно 0,5 вес.%. В еще одном варианте уровень DHA может находиться в диапазоне от примерно 0,47 вес.% до 0,48 вес.%.
[00052] В том случае, если DHA входит в состав препарата, то его эффективное количество, в данном варианте осуществления настоящего изобретения, в типичном случае составляет от примерно 3 мг на кг веса тела в день до примерно 150 мг на кг веса тела в день. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанное количество составляет от примерно 6 мг на кг веса тела в день до примерно 100 мг на кг веса тела в день. В другом варианте указанное количество составляет от примерно 10 мг на кг веса тела в день до примерно 60 мг на кг веса тела в день. В еще одном варианте указанное количество составляет от примерно 15 мг на кг веса тела в день до примерно 30 мг на кг веса тела в день.
[00053] Если в препарат по настоящему изобретению включается ARA, то в этом варианте осуществления настоящего изобретения количество этого компонента в типичном случае составляет от примерно 5 мг на кг веса тела в день до примерно 150 мг на кг веса тела в день. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанное количество варьируется от примерно 10 мг на кг веса тела в день до примерно 120 мг на кг веса тела в день. В другом варианте указанное количество варьируется от примерно 15 мг на кг веса тела в день до примерно 90 мг на кг веса тела в день. В еще одном варианте указанное количество варьируется от примерно 20 мг на кг веса тела в день до примерно 60 мг на кг веса тела в день.
[00054] Если используется препарат для младенцев, то количество DHA в препарате для младенцев может варьироваться от 5 мг/100 ккал до примерно 80 мг/100 ккал. В одном варианте осуществления настоящего изобретения уровень DHA варьируется от примерно 10 мг/100 ккал до примерно 50 мг/100 ккал; и в другом варианте указанно количество варьируется от примерно 15 мг/100 ккал до примерно 20 мг/100 ккал. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения количество DHA составляет примерно 17 мг/100 ккал.
[00055] Если используется препарат для младенцев, то количество ARA в препарате для младенцев может варьироваться от примерно 10 мг/100 ккал до примерно 100 мг/100 ккал. В одном варианте осуществления настоящего изобретения количество ARA может варьироваться от примерно 15 мг/100 ккал до примерно 70 мг/100 ккал. В другом варианте осуществления настоящего изобретения количество ARA варьируется от примерно 20 мг/100 ккал до примерно 40 мг/100 ккал. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения количество ARA составляет примерно 34 мг/100 ккал.
[00056] Если используется препарат для младенцев, то указанный препарат для младенцев может включать в качестве добавки масла, содержащие DHA и ARA, и для введения может использоваться известная в данной области стандартная методика. Так, например, DHA и ARA могут быть добавлены к препарату путем замещения эквивалентным количеством масла, такого как подсолнечное масло с повышенным содержанием олеиновой кислоты, обычно присутствующего в композиции. В качестве другого примера можно отметить вариант, когда масла, содержащие DHA и ARA, могут быть добавлены в препарат путем замещения эквивалентным количеством всей оставшейся жировой смеси, в норме присутствующей в композиции без DHA и ARA.
[00057] В случае использования, источник DHA и ARA может представлять собой любой источник, известный в данной области, такой как масло морских организмов, рыбий жир, масло одноклеточных, липиды яичного желтка и липиды мозга. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения DHA и ARA могут быть взяты из масла одноклеточных от компании Martek, DHASCO или их вариантов. DHA и ARA могут быть введены в смесь в своей природной форме, при условии, что остающийся источник LCPUFA не приводит к какому-нибудь заметному воздействию на младенца. В альтернативном варианте DHA и ARA могут использоваться в очищенном виде.
[00058] В одном варианте осуществления настоящего изобретения источники DHA и ARA представляют собой масла из одноклеточных организмов, как описано в патентах США No 5374567; 5550156 и 5397591, которые приведены в настоящем описании в качестве ссылок. Однако настоящее изобретение не ограничивается только такими маслами.
B. longum
B. longum
B. longum
B. longum
B. longum
B. longum
[00059] В одном варианте осуществления настоящего изобретения источник LCPUFA, который содержит EPA, используют в сочетании с AH1206. В другом варианте источник LCPUFA, который по существу не содержит EPA, используют в сочетании с AH1206. Так, например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения в препарат для младенцев, содержащий менее чем 16 мг EPA/100 ккал, вводят в качестве добавки AH1206 и используют в способе по настоящему изобретению. В другом варианте в препарат для младенцев, содержащий менее, чем 10 мг EPA/100 ккал, вводят в качестве добавки AH1206 и используют в способе по настоящему изобретению. В еще одном варианте в препарат для младенцев, содержащий менее чем примерно 5 мг EPA/100 ккал, вводят в качестве добавки AH1206 и используют в способе по настоящему изобретению. Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает препарат для младенцев, в который добавлен AH1206 и который не содержит даже следовых количеств EPA.
B. longum
[00060] Следует понимать, что сочетание AH1206 и пробиотиков, пребиотиков, LCPUFA или других активных ингредиентов может вводиться в виде одной композиции или в виде отдельных композиций, который вводятся в одно и то же или в разное время и с использованием одинаковых или разных способов введения.
[00061] В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция может использоваться в протоколах иммунизации и вакцинации. Пероральная иммунизация с использованием бактерий-пробиотиков в качестве векторов будет не только защищать организм хозяина от инфекции, но может имитировать иммунологические стимулы, которые в норме создает патоген, способствуя тем самым иммунологическому обучению организма-хозяина.
[00062] В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция используется для лечения, снижения и/или профилактики воспаления. В контексте настоящего описания, термин «лечение» обозначает ослабление болезни, расстройства или симптомов болезни, улучшение состояния или излечивание от болезни, расстройства или симптомов болезни или состояния. Термин «снижение» обозначает уменьшение выраженности количества или степени. Термин «профилактика» обозначает остановку или предупреждение заболевания, расстройства или симптома заболевания или состояния за счет некоторого воздействия.
B. longum
B. longum
[00063] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное изобретение включает использование AH1206 в процессе производства композиции с целью ее применения для снижения воспаления у младенца или ребенка. В примерах 2-6 показано, что введение AH1206 может привести к снижению или предупреждению воспаления у младенца или ребенка. Воспаление может быть снижено в области желудочно-кишечного тракта, дыхательного тракта или может быть снижено системное воспаление. Указанное снижение воспаления может способствовать ослаблению аллергии или астмы.
Clostridium difficili
E. coli
[00064] В данном варианте осуществления настоящего изобретения указанное воспаление представляет собой воспаление в области дыхательного тракта, такое как астма, аллергический ринит, синусит, воспаление тканей дыхательных путей, инфекция верхних дыхательных путей, грипп, круп, воспаление, вызванное респираторно-синцитиальным вирусом, бронхит, капиллярный бронхит, пневмония или воспаление просвета дыхательных путей. Аналогично, воспаление может представлять собой воспаление в области желудочно-кишечного тракта, такое как диарея, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, энтероколит, язвенный колит, аллергический колит, синдром раздраженной кишки, паучит, пост-инфекционный колит, диарею, вызванную инфекцией , диарею, вызванную ротавирусной инфекцией, или пост-инфекционную диарею, или диарею, связанную с воздействием инфекционного агента, такого как . В других вариантах осуществления настоящего изобретения указанное воспаление может представлять собой системное воспаление, такое как ревматоидный артрит. Термин «системный» в контексте настоящего описания применяется для обозначения поражения или другого воздействия, затрагивающего весь организм.
[00065] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанное снижение или предупреждение воспаления может представлять собой ослабление или предупреждение атопических состояний или заболеваний. Так, например, снижение или предупреждение воспаления может приводить к ослаблению или предупреждению атопического дерматита. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения снижение или предупреждение воспаления может приводить к ослаблению или предупреждению общих для младенцев или детей заболеваний. Например, снижение или предупреждение воспаления может ослаблять или предупреждать диарею или острый отит среднего уха. В еще одном варианте снижение или предупреждение воспаления может ослаблять или предупреждать пищевую аллергию.
B. longum
B. longum
[00066] Считается, что AH1206 действует по механизму антагонистского воздействия путем исключения провоспалительных микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта или сайта воспаления. Считается также, что AH1206 действует также путем снижения уровней провоспалительных цитокинов.
[00067] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный штамм может модифицировать уровни IL-10 у пациента. IL-10 продуцируется Т-клетками, B-клетками, моноцитами и макрофагами. Указанный цитокин усиливает пролиферацию и дифференцировку B-клеток в антитело-секретирующие клетки. IL-10 проявляет в основном противовоспалительную активность. Он оказывает позитивную регуляцию экспрессии IL-1RA моноцитами и в значительной мере подавляет воспалительную активность моноцитов. IL-10 ингибирует моноцитарную продукцию цитокинов, реактивных видов кислорода и азотистых интермедиатов, экспрессию главного комплекса тканевой совместимости (MHC) класса II, паразитарную агрессию и продукцию IL-10 по механизму обратной связи. Было также показано, что этот цитокин блокирует продукцию моноцитами кишечной коллагеназы и коллагеназы типа IV, создавая препятствия на пути реакций, зависимых от простагландин-E2-циклического аденозинмонофосфата (PGE2-cAMP), и, в этой связи, представляет собой важный фактор, регулирующий деструктивные процессы в соединительной ткани, которые происходят при хронических воспалительных заболеваниях. Таким образом, в данном варианте указанный штамм может оказывать позитивную регуляцию или индуцировать секрецию с повышением уровня IL-10 у младенцев или детей, принимающих данный штамм.
B. longum
B. longum
B. longum
[00068] В других вариантах осуществления настоящего изобретения указанный штамм AH1206 осуществляет отрицательную регуляцию, или снижает секрецию TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5 и/или IFN-γ или других провоспалительных цитокинов или хемокинов. TNF-α, как провоспалительный цитокин, инициирует каскад цитокинов и биологических эффектов, которые являются результатом воспаления. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения процент Т-регуляторных клеток может быть повышен при введении AH1206. В других вариантах введение AH1206 ингибирует индукцию OVA-специфического IgE ответа.
[00069] В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению используется для поддержания гомеостаза иммунной системы. В других вариантах, композиция по настоящему изобретению используется для повышения или усиления иммунитета у пациента.
[00070] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения усиление иммунитета или подавление воспаления может включать стимуляцию целостности кишечного тракта, снижение проницаемости кишечного тракта, повышение синтеза муцина, его секреции и/или качества; усиление созревания и дифференцировки эпителия кишечника, улучшение всасывания питательных веществ, повышение продукции растворимых факторов, которые осуществляют перенос соединений с противомикробной активностью, стимуляцию, повышение или поддержку резистентности к инфекции, поддержку клеточных или гуморальных ответов против вирусной или бактериальной инфекции, повышенную цитотоксичность (как противовирусную, так и противоопухолевую), повышение или поддержку системных и/или слизистых реакций на вакцинацию, повышение или поддержку клеточного и/или гуморального иммунитета, повышение или поддержку естественного иммунитета (включая активность нейтрофилов, фагоцитов, макрофагов и естественных клеток-киллеров), повышение или поддержку адаптивного Т- и В-клеточного иммунитета, стимуляцию цитокинов типа хелперных Т-клеток 1 (Th1) (повышенная экспрессия IL-1, IL-2, IFN-γ, IL-12, TNF-α; человеческого лейкоцитарного антигена-Dr (HLA-Dr)), подавление воспаления или продукции системных и слизистых медиаторов воспаления (включая цитокины и/или хемокины), ослабление сенсибилизации за счет снижения уровня общих и/или аллерген-специфичных IgE, снижение продукции аллергических цитокинов, снижение профиля Th2-поддерживающих иммуноглобулинов и их сочетания.
B. longum
B. longum
Bifidobacterium
Bacteroides, Eubacteria
Clostridia
Bifidobacterium
[00071] Образование полифункциональных цитокинов самых различных опухолевых типов может указывать на то, что у пациентов с раком протекают выраженные воспалительные реакции. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения AH1205 может использоваться при лечении симптомов рака. В связи с противовоспалительными свойствами AH1205, этот штамм бактерий может снижать уровень трансформации злокачественных клеток. Кроме того, бактерии кишечника могут создавать из компонентов пищи вещества с генотоксической, канцерогенной и опухолевой активностью, а бактерии кишки могут активировать проканцерогенез с образованием реакционноспособных с ДНК агентов. В основном, виды  характеризуются низкой активностью ферментов, метаболизирующих ксенобиотики, в сравнении с другими, имеющимися в кишке популяциями бактерий, такими как  и . В этой связи, повышение количества бактерий рода  в кишке может благоприятным образом модифицировать уровни этих ферментов.
B. longum
[00072] В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения введение AH1205 может сочетаться с противовоспалительной терапией, такой как терапия с использованием нестероидных противовоспалительных средств (НСПВС) или с использованием инфликсимаба.
B. longum
[00073] Микрофлора кишечника младенцев быстро устанавливается в течение первых нескольких недель после рождения. Природа колонизации микрофлоры кишечника первоначально определяется воздействием на нее в ранний период жизни микробов из окружающей среды, а также состоянием здоровья младенца. Младенцы, рожденные через кесарево сечение, преждевременно родившиеся младенцы или другие младенцы, которые провели первые часы жизни в стерильном инкубаторе, и/или младенцы, которым вводили антибиотики на самых ранних этапах их жизни, будут, скорее всего, характеризоваться значительной задержкой в развитии здоровой микрофлоры кишечника. В связи с тем, что такие младенцы не имели возможности получить здоровую микрофлору кишечника от своих матерей или из окружающей среды, то введение им AH1205 может быть полезно для развития и функционирования иммунной системы кишечника.
[00074] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанный младенец или ребенок представляет собой такого младенца или ребенка, для которого необходимо лечение, ослабление или профилактика воспаления. Указанный пациент может иметь риск воспаления в связи с генетической предрасположенностью, питанием, образом жизни, заболеваниями или расстройствами. Так, например, преждевременно рожденный младенец или младенец со сниженным иммунитетом может иметь риск воспаления и, в этой связи, здесь имеется потребность в таком лечении, ослаблении или в такой профилактике.
[00075] Композиция по настоящему изобретению может быть упакована в любой известный контейнер самого разного типа из числа тех, которые могут использоваться для хранения питательных продуктов, такой как стеклянный контейнер, контейнер, обернутый картоном, пластиковый контейнер и металлические банки с покрытием. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанную композицию упаковывают с использованием техники герметичного запечатывания. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композицию вводят в контейнер для однократной дозы. Упаковка композиции может быть осуществлена в асептических условиях. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанную композицию готовят таким образом, чтобы ее было удобно вводить в организм преждевременно родившегося младенца через назогастральные трубки, назодуоденальные трубки или назоеюнальные трубки.
[00076] Композиция по настоящему изобретению может характеризоваться стабильностью при хранении. Термин «стабильный при хранении» означает, что данная готовая к употреблению композиция сохраняется в гомогенной однофазной форме (то есть не разделяется на фазы, видимые при визуальном осмотре), и/или это также означает, что при визуальном осмотре после хранения в течение ночи в холодильнике в композиции не выявляется осадка.
[00077] Приведенные ниже примеры даны для пояснения различных вариантов осуществления настоящего изобретения. Другие варианты, соответствующие области настоящего изобретения, которые описаны в прилагаемой формуле изобретения, также станут очевидными для специалистов при рассмотрении данного описания или вариантов его осуществления, приведенных в настоящем описании. Следует иметь в виду, что описание, так же как и прилагаемые примеры, является лишь репрезентативной информацией, соответствующей области и принципам настоящего изобретения, описанным в формуле настоящего изобретения, которая приведена в настоящем тексте после примеров. В данных примерах все проценты приведены в весовых частях, если особо не указано иное.
ПРИМЕР 1
[00078] В данном примере приводится характеристика бактерий, выделенных из фекалий младенцев.
Выделение пробиотических бактерий
2
Bifidobacterium
[00079] Получали свежие фекалии от 3-дневного новорожденного мальчика, находившегося на грудном вскармливании, и серийное разведение образцов помещали на TPY среды (триптиказа, пептон и дрожжевой экстракт) и MRS среды (deMann, Rogosa и Sharpe) с добавкой 0,05 вес.% цистеина и мупироцина. Чашки инкубировали в анаэробных банках (BBL, Oxoid) с использованием наборов, приводящих к выделению CO (Anaerocult A, Merck), в течение 2-5 дней при температуре 37°C. Полученные грамположительные, отрицательные по каталазе бактериальные изоляты в форме палочек или раздвоенные/плейоморфные формы бактерий наносили штрихами на сложные неселективные среды для оценки чистоты (MRS и TPY). Изоляты культивировали стандартным способом на среде MRS или TPY, если особо не указано иное, при температуре 37°C в анаэробных условиях. Предположительные  вносили в 40% глицерин и хранили при температуре -20°C и -80°C.
Bifidobacteria
Bifidobacterium
[00080] После выделения чистого штамма , который был обозначен как AH1206, оценивали микробиологические показатели этого штамма, и результаты проведенной оценки показаны в таблице 1. Штамм AH1206 представляет собой грамположительную, отрицательную по каталазе плейоморфную бактерию, которая является положительной по фруктозо-6-фосфатфосфокеталазе, что подтверждает ее идентичность в качестве . С использованием минимальных сред, в которые был введен единственный источник углерода, было показано, что штамм AH1206 способен расти на всех исследованных источниках углерода (глюкоза, лактоза, рибоза, арабиноза, галактоза, раффиноза, фруктоза, солодовый экстракт, манноза, мальтоза, сахароза).
<b>Таблица 1</b>
<b>Физико-химические характеристики <i>B. longum </i>AH1206</b>
Характеристики штамма
<i>B. longum </i>AH1206
Окрашивание по Граму
+
Каталаза
-
Подвижность
-
F6PPK*
+
Коагуляция молока
+
Анаэробное культивирование при 45°С
_
Аэробное культивирование при 45°С
_
Ферментация углеводов
Глюкоза
+
Лактоза
+
Рибоза
+
Арабиноза
+
Галактоза
+
Раффиноза
+
Фруктоза
+
Солодовый экстракт
+
Манноза
+
Мальтоза
+
Сахароза
+
* означает тест на фруктозо-6-фосфатфосфокетолазу
Идентификация вида
Bifidobacteria
Bifidobacterium
Bifidobacterium
longum
[00081] Проводили секвенирование 16s межгенного спейсера (IGS) для идентификации видов выделенных . В общих чертах, процедура состояла в том, что вначале выделяли ДНК из AH1206 с использованием 100 мкл раствора для экстракции и 25 мкл раствора для получения ткани (набор Sigma, XNAT2). Далее образцы инкубировали в течение 5 минут при температуре 95°C и затем добавляли 100 мкл нейтрализующего раствора (набор XNAT2). Проводили количественный анализ раствора геномной ДНК с использованием спектрофотометра Nanodrop, после чего полученные образцы хранили при температуре 4°C. Затем проводили ПЦР с использованием праймеров IGS, IGS L: 5'-GCTGGATCACCTCCTTTC-3' (SEQ ID NO:3), который основан на последовательности SEQ ID NO:1, и IGS R: 5'-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3' (SEQ ID NO:4), который основан на последовательности SEQ ID NO:2. Циклическую обработку проводили в следующих условиях: при температуре 94°C в течение 3 минут (1 цикл), при температуре 94°C в течение 30 секунд, при температуре 53°C в течение 30 секунд, при температуре 72°C в течение 30 секунд (28 циклов). Реакционная смесь для проведения ПЦР содержала: 4 мкл (50 нг) ДНК, смесь для проведения ПЦР (набор XNAT2), 0,4 мкМ IGS L и R праймеров (MWG Biotech, Germany). Реакцию ПЦР проводили в аппарате для термоциклической обработки Эппендорф (Eppendorf). Продукты ПЦР (10 мкл) разделяли вместе с маркерами молекулярного веса (с лэддером по 100 п.н., Roche) в 2% агарозном геле при окрашивании этидиум-бромидом в TAE буфере для определения профиля IGS. Продукты ПЦР, проведенной для , (одна полоса) очищали с использованием набора Promega Wizard для очистки продуктов ПЦР. Очищенные продукты ПЦР секвенировали с использованием праймерных последовательностей (указанных выше) для аналаза межгенного спейсерного участка. Данные секвенирования далее обрабатывали с использованием информации из нуклеотидной базы данных Национального Центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information (NCBI)) для подтверждения идентичности полученного штамма по гомологии на уровне нуклеотидов. Далее, на основе информации о последовательности ДНК проводили поиск с использованием стандартной программы BLAST для оценки гомологии на уровне нуклеотид/нуклеотид (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Был идентифицирован ближайший вариант по спариванию с данной последовательностью, после чего сравнивали эти последовательности с использованием программного обеспечения DNASTAR MegAlign. Полученные при этом последовательности (SEQ ID NO:1 [прямая последовательность IGS] и SEQ ID NO:2 [обратная последовательность IGS]) приведены в списке последовательностей. Поиск в базе данных NCIMB показал, что AH1206 содержит уникальную последовательность IGS, которая характеризуется самой близкой гомологией по последовательности к . Бумажный вариант и вариант в машиночитаемом формате списка последовательностей для таблицы 3 прилагается и полностью доступен в качестве ссылки. Компьютерный файл на диске идентифицирован как AH1206_ST25.txt, Size: 2 KB, Created September 12, 2008.
[00082] Для разработки штрих-кода профиля ПЦР для AH1206 проводили ПЦР с использованием BOX праймеров. Циклическую обработку проводили в следующих условиях: при температуре 94°C в течение 7 минут (1 цикл); при температуре 94°C в течение 1 минуты, при температуре 65°C в течение 8 минут (30 циклов) и при температуре 65°C в течение 16 минут. Реакционная смесь для проведения ПЦР содержала 50 нг ДНК, смесь для ПЦР (набор XNAT2) и 0,3 мкМ праймера BOXA1R (5'- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3,) (SEQ ID NO:5) (MWG Biotech, Germany). Реакции ПЦР проводили в аппарате для термоциклической обработки Эппендорф (Eppendorf). Продукты ПЦР (1 мкл) разделяли вместе с маркером на молекулярный вес (лэддер для ДНК 7500, Agilent, Germany) с использованием ДНК 7500 LabChip на биоанализаторе Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Germany). Штрих-код (профиль ПЦР продукта) был определен с использованием программного обеспечения для биоанализатора Agilent Bioanalyzer, где были идентифицированы количество пиков (продуктов ПЦР) и их размер (фиг. 1).
Профили чувствительности к антибиотику
B. longum
[00083] Профили чувствительности штамма  к антибиотику были определены с использованием теста «чувствительности на диске». Культуры растили в подходящей бульонной среде в течение 24-48 часов, распределяли по агаровой среде в чашке Петри (100 мкл) и на агар помещали диски, содержащие известные концентрации антибиотиков. Штаммы оценивали на чувствительность к антибиотикам после 1-2 дней инкубации при температуре 37°C в анаэробных условиях. Штаммы рассматривали как чувствительные, если отмечались зоны ингибирования размером 1 мм или более. Также независимо оценивали минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) для каждого антибиотика. Значения MIC для клиндамицина, ванкомицина и метронидазола составляли 0,32, 0,75 и 0,38, соответственно.
Кишечный транзит
Bifidobacterium
longum
[00084] Для определения, может ли штамм  выживать при низких значениях pH, эквивалентных имеющимся в желудке условиям, бактериальные клетки собирали из свежих ночных культур, промывала дважды фосфатным буфером (pH 6,5) и ресуспендировали в бульоне TPY, доведенном до значения pH 2,5 (с использованием 1M HCl). Клетки инкубировали при температуре 37°C и выживание бактерий оценивали с интервалами 5, 30, 60 и 120 минут при подсчете их количеств в чашках Петри. Штамм AH1206 хорошо выживал в течение 5 минут при pH 2,5, тогда как после 30 минут уже не наблюдалось восстановления никаких жизнеспособных клеток.
B. longum
B. longum
[00085] При выходе из желудка, предположительные пробиотки в тонком кишечнике подвергаются воздействию солей желчных кислот. Для определения способности штамма выживать при воздействии желчи делали посев культур штрихом на чашки Петри с агаром TPY, содержащим в качестве добавки 0,3% (вес/объем), 0,5%, 1%, 2%, 5%, 7,5% или 10% свиной желчи. Рост AH1206 выявлялся на чашках, содержащих до 1% желчи.
B. longum
B. longum
9
[00086] На модели мышей оценивали способность AH1206 к транзиту через желудочно-кишечный тракт. Мышам ежедневно вводили в пищу 1×10 AH1206 и фекалии анализировали на присутствие вводимого микроорганизма. Выявление AH1205 осуществляли путем выделения спонтанного резистентного к рифампицину варианта бифидобактерий. Рифампицин включали в чашки с TPY с той целью, чтобы оценить возможность транзита и гарантированно подтвердить, что продолжается рост только резистентных, потреблявших рифампицин бифидобактерий. Образцы фекалий собирали ежедневно, и была подтверждена способность  к транзиту через желудочно-кишечный тракт (фиг. 2).
Противомикробная активность
Salmonella typhimurium
Campylobacter jejuni
Clostridium difficile
Clostridial
[00087] Индикаторные патогенные микроорганизмы, использованные в данном исследовании, размножали в следующей среде в указанных ниже условиях выращивания: (37°C, аэробные условия) в триптон-соевом бульоне/агаре с добавкой 0,6% дрожжевого экстракта (TSAYE, Oxoid),  (37°C, анаэробные условия) и E. coli 0157:H7 (37°C, анаэробные условия) на кровяном агаре и  (37°C, анаэробные условия) в усиленной среде для  (RCM, Oxoid). Все штаммы инокулировали в свежую ростовую среду и в экспериментах проводили культивирование в течение ночи перед дальнейшим использованием.
B. longum
B. longum
Salmonella typhimurium, Campylobacter jejuni, E. coli 0157:H7
Clostridium difficile
[00088] Антимикробную активность детектировали с использованием метода оценки отсроченной реакции. В общих чертах, процедура включала инкубирование AH1206 в течение 36-48 часов. Десятикратные серийные разведения распределяли (100 мкл) по среде с TPY агаром в чашке Петри. После ночной инкубации на чашки с видимыми колониями наслаивали индикаторные бактерии. Лужайку индикаторных бактерий получали при инокулировании размягченного слоя 2% (объем/объем) ночной индикаторной культуры, которую выливали на поверхность TPY чашек с инокулированными бактериями. Чашки Петри снова инкубировали в течение ночи в условиях, подходящих для роста индикаторных бактерий. Индикаторные культуры с зонами ингибирования более 1 мм в радиусе рассматривали как чувствительные к исследуемой бактерии. Штамм AH1206 ингибировал рост всех исследованных патогенных организмов, и зоны очищения составляли 14, >80, 13,33 и 17 мм для  и , соответственно.
ПРИМЕР 2
B. longum
in vivo
[00089] В данном примере поясняется процесс продукции цитокина мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC) в качестве реакции на . PBMC выделяли от здоровых доноров путем центрифугирования в градиенте плотности. PBMC стимулировали штаммом пробиотических бактерий в течение 72 часов при температуре 37°C. По прошествии указанного периода времени культуральные супернатанты собирали, центрифугировали, отбирали аликвоты и хранили их при температуре -70°C до определения уровней IL-10 с использованием цитометрического анализа с бусами (CBA) (BD BioSclences). Штамм AH1206 индуцировал выраженную секрецию противовоспалительного цитокина IL-10 человеческими PBMC, указывая на то, что данный штамм пробиотических бактерий может индуцировать противовоспалительный ответ также  (фиг. 3). В качестве противовоспалительного средства он может использоваться для ослабления и предупреждения воспаления у человека.
ПРИМЕР 3
B. longum
[00090] В данном примере, на мышиной модели астмы, описывается эффект AH1206, направленный на ослабление респираторного заболевания. В данном исследовании использовали, в качестве модели аллергического воспаления дыхательных путей, OVA-сенсибилизированных мышей BALB/c. Мышей сенсибилизировали путем внутрибрюшинной (в/б) инъекции OVA и развитие заболевания запускали интраназальной провокацией OVA. Через двадцать четыре часа после последней провокации (день 15) у мышей оценивали реакцию реактивности дыхательных путей при проведении BAL процедуры. OVA-сенсибилизированные мыши после провокации солевым раствором служили в качестве контроля. Начиная с 1 дня (т.е. с момента первой OVA-сенсибилизации) животным вводили пробиотические бактерии через желудочный зонд с иглой. Животных, которым через желудочный зонд вводили MRS, использовали в качестве контроля.
B. longum
[00091] Воспаление дыхательных путей оценивали при подсчете в жидкости BAL характерных для воспаления клеток. Клетки отбирали из BAL жидкости после центрифугирования и ресуспендировали в фосфатно-буферном растворе (ФБР). Клетки в BAL окрашивали триптаном синим и затем с помощью гемоцитометра оценивали жизнеспособность клеток. Готовили мазки на BAL клетки с использованием Cytospin (Thermo Shandon, Pittsburg, PA) и окрашивали их реактивом HEMA3 (Biochemical Sciences, Swedesboro, NJ) для дифференциального подсчета клеток, и количество клеток в каждом лаваже в целом составляло 200. Потребление животными  АН1206 привело к значительному снижению общего количества клеток в BAL, в сравнении с плацебо, при этом наиболее выраженное различие наблюдалось в популяции эозинофилов (фиг. 4).
B. longum
[00092] Данное исследование было проведено дополнительно с целью оценки, способны ли пробиотические бактерии AH1206 подавлять аллергические реакции у OVA-сенсибилизированных мышей с аллергическим воспалением дыхательных путей, взятых в качестве модели. В общих чертах, процедура состояла в том, что взрослых самцов мышей BALB/c сенсибилизировали путем внутрибрюшинной (в/б) инъекции OVA в день 0 и день 6. В дни 12 и 14 проводили интраназальную провокацию мышей с использованием OVA. Через двадцать четыре часа после последней провокации (день 15) у мышей оценивали реакцию реактивности дыхательных путей при проведении BAL процедуры. Сенсибилизированные OVA/квасцами мыши после провокации солевым раствором служили в качестве контроля. Животным вводили пробиотические бактерии или плацебо в течение всего испытания. Воспаление дыхательных путей (уровень цитокинов и количество клеток) оценивали при подсчете в жидкости BAL характерных для воспаления клеток. Реактивность дыхательных путей также определяли с использованием плетизмографии Buxco всего организма. Спленоциты также выделяли от OVA-сенсибилизированных мышей и инкубировали в присутствии анти-CD3 и анти-CD28 антител, после чего определяли уровни цитокинов в супернатантах по методу проточной цитометрии.
B. longum
[00093] Введение AH1206 не вызывало значительного снижения клеток, выделенных из BAL жидкости после провокации, в сравнении с животными, которым скармливали бульон (фиг. 5). При оценке реактивности дыхательных путей было показано, что провокация сенсибилизированных мышей с использованием OVA приводила к усилению гиперреактивности дыхательных путей (AHR) на метахолин, в сравнении с мышами, которым проводили провокацию солевым раствором. Однако отсутствовала модуляция такой повышенной реактивности дыхательных путей, по данным оценки изменений в длительности паузы (фиг. 6).
[00094] Уровни цитокинов в BAL измеряли по процедуре цитометрического анализа с бусами, и было показано отсутствие выраженных различий в количествах IL-10, IFN-γ, IL-6 и CCL2. При этом AH1206 существенно снижал уровни TNF-α, в сравнении с OVA-контролем (фиг. 7).
B. longum
Такое снижение уровня TNF-α, предположительно, указывало на то, что AH 1205 мог ослаблять или предупреждать развитие респираторного заболевания и подавлять или предупреждать аллергические реакции. Не отмечалось значительных различий по уровням IL-10, IFN-γ, IL-6 и CCL2 (фиг. 6).
[00095] Оценивали количественно уровни цитокинов в супернатантах спленоцитов при проведении цитометрического анализа с бусами (CBA) с последующей стимуляцией анти-CD3 или анти-CD28 антителами. У мышей, которым скармливали АН1206, не наблюдалось повышенное высвобождение IL-10 из OVA-стимулированных спленоцитов, ассоциированное с OVA-стимуляцией in vivo. Не было заметных различий в уровнях IL-6, TNF и MCP-1 (CCL2). У животных, которым скармливали АН1206, не повышалось высвобождение IL-10 из CD3/CD28 спленоцитов. Однако у животных, которым скармливали АН1206, существенно снижалась секреция провоспалительных цитокинов TNF-α и IFN-γ в культуральных супернатантах спленоцитов (фиг.8). В случае других исследованных цитокинов не отмечалось существенных различий.
ПРИМЕР 4
Bifidobacterium
longum
Bifidobacterium
longum
in vitro
[00096] Цель настоящего исследования заключалась в том, чтобы определить, подавляют ли пробиотические бактерии  AH1206 аллергические реакции у мышей, взятых в качестве модели OVA-индуцированной аллергии. Мышей BALB/c разделили на группы (8/группу) и кормили плацебо,  AH1206 или дистиллированной водой в течение четырех недель. Еженедельно всем мышам вводили перорально через зонд овальбумин и холерный токсин в 300 мкл фосфатно-буферного раствора (ФБР), за исключением одной группы тех животных, которым давали дистиллированную воду, служивших в качестве контроля, и которым перорально через зонд вводили только 300 мкл ФБР. После четырех недель введения в таком режиме у каждой мыши отбирали образец крови пункцией лицевой вены и проводили иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA) для измерения уровней OVA-специфичных IgE. Клетки селезенки и лимфатического узла брыжейки выделяли и стимулировали  ЛПС (LPS) и антиCD3/CD28 и иммунодоминантным OVA пептидом. Th1 и Th2 цитокины определяли по процедуре цитометрического анализа с бусами (CBA).
[00097] В группе животных, которым давали АН1206, индуцировалось значительно меньше OVA-специфичного IgE, чем в группе приема плацебо и группах, взятых в качестве положительного контроля (фиг. 9). При этом не отличались результаты для группы отрицательного контроля и для группы животных, которым скармливали AH1206, указывая на то, что введение AH1206 полностью предупреждало индукцию OVA-специфичного IgE ответа. Полученные в данном примере результаты также указывают на то, что введение AH1206 может предупреждать развитие воспаления у людей. С использованием непарного теста Стьюдента была проведена статистическая обработка полученных данных.
[00098] Выделяли спленоциты от BALB/c мышей, которым давали пробиотик, плацебо и дистиллированную воду, а также от животных, которых не стимулировали или которым вводили для стимуляции липополисахарид (ЛПС), антиCD3/CD28 или иммунодоминатный OVA пептид, и затем оценивали продукцию цитокинов TNF-a, IL-2, IFN-γ, IL-4 и IL-5 при проведении Th1/Th2 цитометрического анализа с бусами. Полученные для цитокинов результаты показаны в объединенном виде в таблице 2.
<b>Таблица 2</b>
<b>Результаты анализа цитокинов</b><b>Нестимулированные спленоциты</b>
Штамм
TNF-α
IL-2
IFN-γ
IL-4
IL-5
AH1206
<b>ЛПС-стимулированные спленоциты</b>
Штамм
TNF-α
IL-2
IFN-γ
IL-4
IL-5
AH1206
<img file="00000001.tif" he="9" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000001.tif" he="9" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
<b>АнтиCD3/CD28-стимулированные спленоциты</b>
Штамм
TNF-α
IL-2
IFN-γ
IL-4
IL-5
AH1206
<img file="00000001.tif" he="9" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000001.tif" he="9" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000001.tif" he="9" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000002.tif" he="17" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000001.tif" he="9" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000002.tif" he="17" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000002.tif" he="17" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000002.tif" he="17" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000002.tif" he="17" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
rt = относительноNC = Отрицательный контроль (питье воды, провокация ФБР)РС = Положительный контроль (питье воды, провокация OVA и CN)
[00099] В нестимулированных спленоцитах не выявлялось изменений относительно результатов для контрольных животных. Высвобождение TNF-α и IFN-γ из ЛПС-стимулированных спленоцитов было значительно выше в случае животных, которым давали AH1206, чем в группе отрицательного контроля, но эти уровни соответствовали результатам, полученным для положительных контролей при OVA-сенсибилизации и введении холерного энтеротоксина. Стимуляция с использования CD3/CD28 приводила к выраженным изменениям в сигнальной функции лимфоцитов у животных, которым скармливали пробиотик. Так, у животных, которым давали AH1206, наблюдалась значительно меньшая секреция TNF-α, в сравнении с положительным контролем, но эти уровни были выше, чем в отрицательном контроле (фиг. 10). Животные, которым скармливали AH1206, характеризовались существенно сниженными уровнями IFN-γ, IL-2, IL-4 и IL-5, в сравнении с животными из группы положительного контроля, которым не давали пробиотик.
ПРИМЕР 5
B. longum
in vitro
+
+
+
+
+
+
+
+
[000100] В данном исследовании оценивали эффект потребления пробиотиков на количество регуляторных Т-клеток у здоровых мышей и их активность. Мышам BALB/c (10/группу) скармливали AH 1206 или плацебо в течение трех недель. После потребления пробиотиков/плацебо, выделяли CD4 CD25 T-регуляторные клетки и определяли их супрессорную активность  путем измерения пролиферации анти-CD3/CD28-стимулированных CFSE-меченых CD4 респондерных Т-клеток с использованием проточной цитометрии. CD4 респондерные клетки инкубировали вместе с CD4CD25 Т-клетками в качестве контроля. Процент CD4CD25 клеток (регуляторные Т-клетки) в мышиных спленоцитах, которые были также FoxP3 положительными, определяли в селезенке мышей, которым скармливали пробиотик или плацебо.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
[000101] Процент CD4 клеток, которые пролиферировали при совместной инкубации с CD4CD25 клетками из мышей, которым скармливали пробиотик/плацебо, сравнивали с процентом CD4 клеток, которые пролиферировали при совместной инкубации с CD4CD25 клетками из мышей, исследованных в рамках того же испытания. В каждом случае пролиферация Т-клеток была ниже в культурах, содержащих CD4CD25 клетки, в сравнении с культурами, содержащими только CD4 клетки, которые были истощены по CD25 клеткам (фиг. 11).
+
+
+
+
+
Bifidobacterium
longum
[000102] В данном исследовании в популяции CD4 определяли процент тех клеток, которые также были CD25 (фиг. 12). Группа мышей, которым скармливали  AH1205, содержала значительно больше CD4 T-клеток, которые были также CD25 клетками (т.е. Т-регуляторные клетки), чем животные, которым скармливали плацебо (р=0,0081). Этот результат, предположительно, указывает на то, что процент Т-регуляторных клеток в популяции CD4 клеток значительно повышался при скармливании животным AH1206. Этот результат показывает, что введение AH1206 может также снижать или предупреждать воспаление у человека.
+
+
+
+
+
[000103] В данном исследовании также определяли количество CD4CD25 FoxP3 клеток во всех популяциях спленоцитов мышей, которым скармливали пробиотик или плацебо. Количество CD4CD25 T-регуляторных клеток, экспрессирующих FoxP3, не менялось в клетках селезенки мышей, которым скармливали пробиотик, в сравнении с вариантом мышей, которым скармливали плацебо или которых не кормили вообще.
ПРИМЕР 6
Bifidobacterium longum
[000104] Приобретали 6-недельных стерильных мышей и поддерживали в микробиологически чистом помещении в отделении биологической службы в UCC. Животным скармливали пробиотический штамм  AH1206 в течение 9 дней или оставляли без микробиологической нагрузки (контроль). Индукцию Т-регуляторных клеток оценивали по методу проточной цитометрии.
+
+
+
[000105] Количество CD4CD25Foxp3 клеток в селезенке стерильных животных, которым скармливали AH1206, значительно возрастало после начала введения AH1206 (фиг. 13). И снова, этот результат указывает на то, что введение AH1206 может снизить или предупредить воспаление у человека. Общее количество CD3/CD4 или CD3/CD8 клеток не менялось.
ПРИМЕР 7. Результаты оценки стабильности
[000106] Стабильность пробиотического штамма AH1206 оценивали более 3 месяцев при температуре 30°C (фиг. 13). Полученные результаты показали, что LGG продемонстрировал слабую стабильность в течение исследуемого периода, поскольку наблюдалось снижение на два логарифма после 3-месячного периода хранения, тогда как штамм AH1206 в течение того же периода был вполне стабильным без признаков снижения жизнеспособности.
[000107] Все ссылки, приведенные в данном описании, включая, без ограничения, все бумажные носители, публикации, патенты, заявки на патент, презентации, тексты, сообщения, рукописные материалы, брошюры, книги, интернет-сообщения, журнальные статьи и другие периодические издания, включены в качестве ссылок полностью в настоящее описание. Приведенное в настоящем описании обсуждение ссылок дано лишь для обобщения выводов, сделанных авторами, и на их основе нельзя делать заключения относительно достигнутого уровня в данной области. Заявители сохраняют за собой право оспаривать правильность и точность приведенных ссылок.
[000101] Указанные и другие модификации и вариации настоящего изобретения могут быть внесены в практику осуществления настоящего изобретения специалистами в данной области в соответствии с принципами и областью настоящего изобретения, которые более конкретно обозначены в прилагаемой формуле изобретения. Кроме того, следует понимать, что аспекты различных вариантов осуществления настоящего изобретения могут быть изменены в целом или частично. В этой связи для специалистов в данной области понятно, что приведенное выше описание дано лишь в качестве примера, и оно никоим образом не ограничивает настоящее изобретение, поскольку настоящее изобретение полностью описано в прилагаемой формуле изобретения. Соответственно, принципы и область прилагаемой формулы изобретения не должны ограничиваться описанием содержащихся в данном тексте вариантов осуществления.