БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БУТАНОЛА И МАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ
BIOTECHNOLOGY METHOD FOR BUTANOL AND BUTYRIC ACID PRODUCTION

-1
Настоящее изобретение относится к способу получения С4-веществ, предпочтительно масляной кислоты и/или бутанола, содержащему стадии контакта ацетогенной бактериальной клетки в водной среде с синтетическим газом и инкубации смеси, полученной на стадии a), при температуре от 0 до 100°C в течение по меньшей мере 30 минут, где водная среда содержит, на стадии b), этанол и/или ацетат при общей объединенной концентрации по меньшей мере 0.1 г л.
2
Эра не возобновляемого ископаемого топлива подходит к концу. Тогда как до настоящего времени химики могли полагаться на фактически неограниченную подачу угля, нефтяного и природного газа, доступность таких ресурсов, образованных бактериями, планктоном, растительного и животного материала, хранящегося в океанских отложениях более чем миллионы лет, должна ограничиться в самом ближайшем будущем. Более того, горение ископаемого топлива было связано с увеличением в атмосфере концентраций CO и связанных с климатических изменений, наиболее заметным из которых является глобальное потепление. Поэтому следующие процессы образования для получения химических веществ массового производства, таких как бутанол, масляная кислота и их производные, обычно получаемых из ископаемых источников, должны будут основываться на возобновляемых ресурсах, т.е. веществах, которые легко и, с точки зрения геологических временных масштабов, быстро возобновляются.
Промышленная биотехнология, т.е. применение биокатализаторов, таких как ферменты или каталитически активные организмы в качестве промышленных катализаторов, обеспечивает альтернативы многим обычным процессам с применением ископаемых источников в качестве сырья. Биокатализаторы способны не только превращать соединения из возобновляемых материалов, но также часто сельскохозяйственные или промышленные отходы, от которых необходимо было бы избавляться другим образом, но которые не требуют применение токсичных соединений, и, наконец, но не в меньшей степени, уменьшать выбросы парниковых газов по сравнению с обычными подходами.
3
2
2
2
3
2
2
Множество способов получения бутанола (CH-CH-CH-CH-OH) и масляной кислоты (CH-CH-CH-COOH, часто упоминаемых как бутират) и его С4 производные, были описаны в уровне техники, но большинство из них основывается на крекинге ископаемого топлива и окислении полученных коротких углеводородов. Напротив, было описано несколько процессов, которые начинаются с углерода в форме монооксида углерода или диоксида углерода, соединений, доступных из отходящих газов и, например, синтез-газа.
Синтез-газ, термин, относящийся к различным смесям, содержащим по меньшей мере одно из воды и водорода, и по меньшей мере одно из монооксида углерода и диоксида углерода, представляет собой возобновляемый источник углерода и является легко доступным во всем мире, так как процессы его получения с применением различных исходных веществ известны, включая паровой реформинг природного газа или жидких углеводородов и газификацию угля или биомассы.
Применение синтез-газа для получения соединений, содержащих углеводородные цепи, было описано в уровне техники. Однако ранее описанные способы зависели от добавления дополнительных субстратов, в частности гидратов углерода, таких как глюкоза. Способы на основе микробиологического потребления синтез-газа в качестве источника углерода к скорее неудовлетворительным выходам желательных соединений.
Поэтому задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения С4- веществ, предпочтительно бутанола и/или масляной кислоты, исходя из монооксида углерода или диоксида углерода, предпочтительно в форме синтез-газа.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения С4-веществ, предпочтительно бутанола и/или масляной кислоты, исходя из монооксида углерода или диоксида углерода, который является улучшенным по сравнению со способами, известными из уровня техники, с точки зрения выхода и/или чистоты образованных бутанола и/или изомасляной кислоты, или доли С4-веществ, предпочтительно бутанола и/или изомасляной кислоты, образованных из атомов углерода, полученных из синтез-газа, скорее, чем из других источников углерода, в частности углеводов, таких как глюкоза.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения С4-веществ, исходя из синтез-газа, в котором выход С4 продуктов относительно углерод-содержащих реагентов, отличных от монооксида углерода и диоксида углерода, улучшается, т.е. количество соединений углерода, отличных от монооксида углерода и диоксида углерода, необходимых для синтеза, уменьшается.
Согласно одному объекту настоящего изобретения задача настоящего изобретения решается посредством способа получения С4-веществ, предпочтительно масляной кислоты и/или бутанола, содержащего стадии:
а) контакта ацетогенной бактериальной клетки в водной среде с синтез-газом при анаэробных условиях,
b) инкубации смеси, полученной на стадии а), при температуре от 0 до 100°C в течение по меньшей мере 30 минут,
-1
где водная среда содержит, на стадии b), этанол и/или ацетат при общей объединенной концентрации, превышающей 0.1 г л.
В первом варианте выполнения первого объекта настоящего изобретения, задача решается посредством способа, где этанолом и/или ацетатом является экзогенно полученный этанол и/или ацетат.
-1
-1
Во втором варианте выполнения первого объекта настоящего изобретения, который также является вариантом выполнения первого варианта выполнения настоящего изобретения, задача решается посредством способа, где общая объединенная концентрация этанола и/или ацетата составляет от 0.5 г л до 20 г л.
В третьем варианте выполнения первого объекта настоящего изобретения, который также является вариантом выполнения первого и второго вариантов выполнения настоящего изобретения, задача решается посредством способа, где синтез-газ содержит от 40 до 100, предпочтительно от 40 до 95% CO.
2
В четвертом варианте выполнения первого объекта настоящего изобретения, который также является вариантом выполнения первого-третьего вариантов выполнения настоящего изобретения, задача решается посредством способа, где синтез-газ содержит менее 10% CO.
В пятом варианте выполнения первого объекта настоящего изобретения, который также является вариантом выполнения первого-четвертого вариантов выполнения настоящего изобретения, задача решается посредством способа, где синтез-газ содержит менее 10% CO.
В шестом варианте выполнения первого объекта настоящего изобретения, который также является вариантом выполнения первого-пятого вариантов выполнения настоящего изобретения, задача решается посредством способа, где способ содержит стадию
с) отделения и при необходимости рециклизации этанола и/или ацетата из смеси после стадии b).
В седьмом варианте выполнения первого объекта настоящего изобретения, который также является вариантом выполнения первого-шестого вариантов выполнения настоящего изобретения, задача решается посредством способа, где ацетогенная бактериальная клетка выбирается из группы, содержащей Clostridium, Moorella и Carboxythermus и предпочтительно представляет собой Clostridium carboxidivorans.
В восьмом варианте выполнения первого объекта настоящего изобретения, который также является вариантом выполнения первого-седьмого вариантов выполнения настоящего изобретения, задача решается посредством способа, где pH на стадиях а) и b) поддерживается между 3 и 7, предпочтительно 4-6, более предпочтительно 5-5.5.
В девятом варианте выполнения первого объекта настоящего изобретения, который также является вариантом выполнения первого-восьмого вариантов выполнения настоящего изобретения, задача решается посредством способа, где стадия b) осуществляется при температуре от 15°C до 45°C, предпочтительно от 30°C до 40°C.
В десятом варианте выполнения первого объекта настоящего изобретения, который также является вариантом выполнения первого-девятого вариантов выполнения настоящего изобретения, задача решается посредством способа, где синтез-газ обеспечивает более 80, предпочтительно более 90% углерода, изначально присутствующего на стадии а).
В одиннадцатом варианте выполнения первого объекта настоящего изобретения, который также является вариантом выполнения первого-девятого вариантов выполнения настоящего изобретения, задача решается посредством способа, который осуществляется непрерывным образом.
В двенадцатом варианте выполнения первого объекта настоящего изобретения, который также является вариантом выполнения первого-одиннадцатого вариантов выполнения настоящего изобретения, стадия b) осуществляется в отсутствии углеводов.
В соответствии со вторым объектом настоящего изобретения задача настоящего изобретения решается посредством применения этанола и/или ацетата для увеличения доли синтез-газа, превращаемого ацетогенной бактериальной клеткой в С4-вещества, предпочтительно масляную кислоту и/или бутанол.
В первом варианте выполнения второго объекта настоящего изобретения, задача решается посредством применения, в котором этанол и/или ацетат представляют собой экзогенно полученный этанол и/или ацетат и предпочтительно добавляются в водную среду, содержащую ацетогенную бактериальную клетку до накопления обнаруживаемых количеств этанола и/или ацетата, эндогенно продуцируемых указанной клеткой.
-1
-1
Во втором варианте выполнения второго объекта настоящего изобретения, который также является вариантом выполнения первого варианта выполнения второго объекта настоящего изобретения, задача решается посредством применения, в котором ацетат и/или этанол присутствуют в водной среде, содержащей ацетогенную бактериальную клетку при общей объединенной концентрации этанола и/или ацетата, превышающей 0.5 г л, но не 20 г л.
В третьем варианте выполнения второго объекта настоящего изобретения, который также является вариантом выполнения первого и второго вариантов выполнения второго объекта настоящего изобретения, задача решается посредством применения, в котором ацетогенная бактериальная клетка выбирается из группы, включающей Clostridium, Moorella и Carboxythermus и предпочтительно представляет собой Clostridium carboxidivorans.
Без ограничения какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что присутствие этанола или ацетата индуцирует экспрессию генов, необходимых для превращения синтез-газа в С4-вещества, предпочтительно бутанол и/или масляную кислоту, таким образом, повышая способность ацетогенной бактериальной клетки метабилизировать монооксид углерода и диоксид углерода из синтез-газа.
Настоящее изобретение относится к получению С4-веществ, предпочтительно бутанола и/или масляной кислоты, с применением ацетогенной бактериальной клетки. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "ацетогенная бактериальная клетка", как применяется в настоящей заявке, относится к бактериальной или простейшей клетке, которая способна продуцировать ацетат при анаэробных условиях, предпочтительно с применением водорода в качестве донора электронов и диоксида углерода в качестве акцептора электронов или монооксида углерода вместо диоксида углерода. Из уровня техники известно множество ацетогенных бактерий, включая, но без ограничения к этому, Clostridium aceticum (Wieringa, К.Т. (1936), J. Microbiol. Serol. 3, 263-273), Acetobacterium woodi (Balch, W.E., Schobert, S., Tanner, R.S., and Wolfe, R.S. (1977), Int. J. Sys. Bacteriol. 27, 335-361), Clostridium thermaceticum (Fontaine, F.E, Peterson, W.H., McCoy, E. and Johnson, M.J. (1942), J. Bact. 43, 701-715), Clostridium lungdahlii (WO 0068407), Clostridium autoethanogenum (Aribini et al., Archives of Microbiology 161, 345-351), Moorella sp. HUC22-1 (Sakai et al., Biotechnology Letters 29, 1697-1612) и бактерии рода Carboxydothermus (Svetlichny et al. (1991), Systematic and Applied Microbiology 14, 254-260). Эти и другие ацетогенные бактериальные клетки являются коммерчески доступными для приобретения, например у the American Tissue and Culture Collection (ATTC), USA, или у the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany. Объем настоящего изобретения также включает смешанную культуру, содержащую по меньшей мере две ацетогенные бактериальные клетки.
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "С4-вещество", как применяется в настоящей заявке, относится к любому органическому соединению, содержащему в общем четыре атома углерода, в любой комбинации с функциональными группами, содержащими атомы, отличные от углерода. В более предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения термин "С4-вещество", как применяется в настоящей заявке, относится к любой производной, полученной из бутанола или бутирата. В наиболее предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения указанную производную получают дериватизацией, которая включает любую реакцию, отличную от тех, которые включают простое добавление или удаление атомов углерода в отношение бутанола или бутирата или их производных, включая, но без ограничения к этому, окисление, в частности гидроксилирование, восстановление и метильные сдвиги, где признак "чистое добавление или удаление атомов углерода" не исключает временное добавление или удаление атомов углерода, например, тетеринг С4-вещества или производной временно к ферменту или его кофактору. Примеры С4-веществ включают 1-бутанол (упоминаемый в настоящей заявке как "бутанол"), 2-бутанол, бутират, 1,4-бутандиол, 2,3-бутандиол, аминобутан, тиобутанол, изобутенол и изобутанол.
Настоящее изобретение допускает применение как ацетогенных бактериальных клеток дикого типа, так и генетически модифицированных ацетогенных бактериальных клеток. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, генетически модифицированная ацетогенная бактериальная клетка представляет собой ацетогенную бактериальную клетку, которая была модифицирована таким образом, что активность по меньшей мере одного фермента, участвующего в метаболическом пути Вуда-Льюнгдаля, т.е. пути превращения монооксида углерода, диоксида углерода и водорода в ацетат. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "фермент, участвующий в метаболическом пути Вуда-Льюнгдаля", как применяется в настоящей заявке, включает любой фермент, который связывает или предпочтительно принимает в качестве субстрата, один из субстратов указанного пути, предпочтительно монооксид углерода, диоксид углерода или водород, или любое из промежуточных соединений, образованных в этом пути, исходя из любого из этих субстратов, так как субстраты превращаются в ацетат или его производные. В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "фермент, участвующий в метаболическом пути Вуда-Льюнгдаля", как применяется в настоящей заявке, относится к ферменту из группы, включающей CO дегидрогеназу и ацетил-CoA синтазу (Diekert and Wohlfahrt, (1994) Antonie van Leeuwenhoek 66 (1-3), 209-221). Методики, которые могут применяться для генетической модификации бактериальных клеток описаны в уровне техники, например в Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press), как способы повышения активности фермента в бактериальной клетке, например, путем повышения экспрессии гена, кодирующего фермент, имеющий представляющую интерес активность, посредством амплификации хромосомального гена (WO 03/014330 и WO 03/040373). В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, ацетогенная бактериальная клетка выбирается из группы, включающей Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei и Clostridium ljungdahlii.
-1
-1
Важно, что способ осуществляется при анаэробных условиях. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "анаэробные условия", как применяется в настоящей заявке, означает, что насыщение рассматриваемого раствора кислородом, в порядке увеличения предпочтения, составляет менее 30, 20, 10, 5, 2.5 или 1 процента насыщения, где 100% насыщения означает концентрацию присутствующего кислорода, если раствор интенсивно продувается чистым газом кислородом при адекватных условиях, например, при 20°C при атмосферном давлении. В отношении газа, термин "анаэробные условия", как применяется в настоящей заявке, означает, в предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, что газ содержит, в порядке увеличения предпочтения и со ссылкой на общий объем, менее 30, 20, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.1, 0.01% кислорода. В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "анаэробные условия", как применяется в настоящей заявке, означает, что концентрация кислорода, либо в газовой смеси, либо в растворе, является такой, что она не ингибирует рост анаэробных ацетогенных бактерий, предпочтительно Clostridium carboxidivorans. Специалист в данной области техники знаком с методиками, которые могут применяться, чтобы обрабатывать реакционные сосуды и растворы анаэробно, например, продувка непроницаемого сосуда газом и растворы с азотом, аргоном или тому подобным, или дополнение водных растворов ферментативными системами, потребляющими кислород, например 0.6% (мас./об.) β-D-глюкозы, 0.5 единиц мл глюкоза-оксидазы (Sigma) и 200 единиц мл каталазы (Sigma), как описано Richter, С.D. et al. (2002), J. Biol. Chem. 277 (5), 3094-3100.
2
2
2
Синтез-газ является основным источником углерода для получения согласно настоящему изобретению С4-веществ, предпочтительно бутанола и/или масляной кислоты. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "синтез-газ", как применяется в настоящей заявке, относится к смеси, содержащей по меньшей мере одно из воды и водорода (H) и по меньшей мере одно из монооксида углерода (CO) и диоксида углерода (CO), где общий объединенный объем воды, водорода, монооксида углерода и диоксида углерода составляет по меньшей мере 80, предпочтительно 90 процентов от общего объема смеси. Другие компоненты включают азот, инертные газы и тому подобное. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, синтез-газ содержит от 40 до 95% монооксида углерода. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, синтез-газ содержит от 40 до 100, предпочтительно от 40 до 95% диоксида углерода и от 0.5 до 20% H. В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, синтез-газ содержит менее 10% диоксида углерода. В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, синтез-газ содержит менее 10% монооксида углерода. В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения синтез-газ содержит по меньшей мере 5, предпочтительно 10% монооксида углерода. В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, общий объединенный объем водорода и диоксида углерода составляет, в порядке увеличения предпочтения, более 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 99 процентов от общего объема смеси. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "контакт" микроорганизма с "синтез-газом" любого состава, указанного в настоящей заявке, как применяется в настоящей заявке, означает, что микроорганизм присутствует в атмосфере, содержащей синтез-газ конкретного состава.
В соответствии со способом согласно настоящему изобретению ацетогенная бактериальная клетка вступает в контакт с синтез-газом в отсутствии кислорода в водной среде. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "водная среда" охватывает любой водный раствор, который содержит количество солей и буферов, необходимое для роста или поддержания ацетогенной бактериальной клетки и для поддержания ацетогенеза. Например, водная среда согласно Hurst, К.М., and Lewis, R. (2010), Biochemical Engineering Journal 2010, 48, 159-165 может применяться для осуществления методик согласно настоящему изобретению. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, водная среда содержит дрожжевой экстракт.
3
2
3
-
-1
-1
Важным аспектом настоящего изобретения является, что этанол (CH-CH-OH) и/или ацетат (CH-COO) присутствуют в водной среде в результате начала реакции при общей объединенной концентрации, т.е. сумме концентрации катиона ацетата и концентрации этанола, равной по меньшей мере 0.1 г л. В других предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения концентрация этанола и/или ацетона составляет 0.1 - 50, 0.2 - 40, 0.25 - 20 или 0.5 - 20 г л.
Скорее, чем ожидать эндогенный ацетат, продуцируемый клеткой, экзогенно полученный ацетат и/или этанол первоначально применяется на стадии а) в водной среде. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "экзогенно полученный" ацетат и/или этанол, как применяется в настоящей заявке, относится к ацетату и этанолу, полученным или очищенным в отдельном реакционном сосуде до контакта ацетогенной бактериальной клетки, в отличие от ацетата и/или этанола, полученного на стадии b), т.е. после стадии а). В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "экзогенно полученный" ацетат и/или этанол содержит ацетат и/или этанол, продуцированный ацетогенной бактериальной клеткой или, в действительности, той же ацетогенной бактериальной клеткой, как применяется на стадии а), но удаляется из реакционного сосуда, отделяется от какого-либо С4-вещества, полученного и рециклизованного. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, концентрация экзогенно полученного ацетата и/или этанола поддерживается в водной среде в объеме или диапазоне объемов, присутствующих с самого начала и пока реакция, катализируемая ацетогенной бактериальной клеткой на стадии b), продолжается. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, ацетат и/или этанол в водной среде в целом упоминается как экзогенный до тех пор, пока более 80, предпочтительно более 90% общего ацетата и/или этанола, присутствующего в водной среде, составляют экзогенно полученный ацетат и/или этанол.
Смесь, полученная на стадии а), может инкубироваться в течение по меньшей мере 0.5, 1, 2, 3, 5, 10, 12, 16, 24, 36, 48, 120 или 160 часов. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, восстанавливающий агент присутствует на стадии b). Специалистам в данной области техники известны восстанавливающие агенты, например, тиол-содержащие агенты, такие как цистеин или дитионит. Начальная концентрация может составлять по меньшей мере 0.1, 0.5, 1, 2, 5 или 10 мМ.
Предпочтительно способ содержит рециклизуемый этанол и/или ацетат из смеси после стадии b). В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, Это означает, что некоторая часть реакционной смеси со стадии b) удаляется, и ацетат и/или этанол отделяется от любого образованного С4-вещества, с последующим переносом полученного ацетата и/или этанола, таким образом, назад в реакционную смесь. Некоторая часть реакционной смеси может удаляться со стадии b) по партиям или, предпочтительно, непрерывным образом. В последнем случае, реакционная смесь, удаляемая непрерывно, может быть собрана до стадии отделения.
Специалисту в данной области техники известны способы, которые могут применяться для отделения ацетата и/или этанола от любого бутанола и/или масляной кислоты, присутствующих в водном растворе, например, экстракция с применением гидрофобного органического растворителя, дистилляция или тому подобное.
3
3
3
-
+
-
+
Любое органическое соединение, упоминаемое в настоящей заявке, например, С4-вещества, ацетат, этанол, бутират и бутанол, содержат как протежированные формы рассматриваемого соединения, а также различные соли соединения. Например, ацетат может содержать как уксусную кислоту (CH-COOH), но также различные соли уксусной кислоты, например, ацетат натрия (CH-COONa), ацетат калия (CH-COOK), ацетат аммония  или тому подобное.
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения изобретение осуществляется непрерывным образом, где водные растворы из сосуда, применяемого для осуществления стадий а) и b), непрерывно удаляются, отделяются во фракцию, обогащенную С4-веществами, предпочтительно бутанолом и/или масляной кислотой, и другую фракцию, обогащенную ацетатом и/или этанолом, и последняя фракция добавляется в сосуд, применяемый для осуществления стадий а) и b).
Температура на стадиях а) и b) должна выбираться учитывая с одной стороны потребности ацетогенной бактериальной клетки и термодинамические параметры с другой стороны. Из уровня техники известны диапазоны температур, а также оптимальные температуры для огромного круга ацетогенных бактерий. Например, Clostridium thermoaceticum может инкубироваться при температурах до 60°C (Fontaine et al., 1942). Смотрите также стандартную литературу по микробиологии в отношении температур, которые могут применяться для роста ацетогенных бактериальных и низших клеток, например, Dworkin et al. (2006) The Prokaryotes - A Handbook on the Biology of Bacteria, Volume 2. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, температура, применяемая на стадии b) составляет от 0 до 100°C, от 10 до 80°C, от 20 до 60°C и от 30 до 45°C. Давление применяемого синтез-газа составляет, в предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, от 0.5 до 10 бар, более предпочтительно от 0.8 до 8, даже более предпочтительно от 1.5 до 6 бар. В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, давление составляет более 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 бар. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, применяемое давление превышает атмосферное давление. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, единица "относительное давление", как упоминается в настоящей заявке, относится к давлению относительно локального атмосферного или окружающего давления. Например, если локальное атмосферное давление составляет 1 бар, и давление внутри сосуда составляет 1.8 бар, тогда относительное давление составляет 0.8 бар (относительное давление).
Особенным преимуществом настоящего изобретения является то, что образование С4-веществ, предпочтительно бутанола и/или масляной кислоты, не зависит от присутствия значительных количеств органических соединений, содержащих углеродные цепи из более двух атомов углерода. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, стадии а) и b) могут, но не обязательно, осуществляться в отсутствии углеводов. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "в отсутствии углеводов" означает что концентрация углеводов составляет, в порядке увеличения предпочтения, менее 5, 1, 0.5, 0.1 или 0.05% (масса на объем). В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "углеводы" означает любое органическое соединение, имеющее по меньшей мере две функциональные группы, выбранные из группы, содержащей гидроксильную, альдегидную или кето группы, и содержит прямую углеродную цепь из пяти или более атомов углерода. Примерные углеводы содержат гексозы, такие как глюкоза или фруктоза, пентозы, такие как рибулоза, и сложные сахара, содержащие два или более углеводных мономеров, например, сахарозу.
Подобным образом, предпочтительно, что синтез-газ, в порядке увеличения предпочтения, обеспечивает более 70, 75, 80, 85, 90 или 95% углерода, изначально присутствующего на стадии а). В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "синтез-газ обеспечивает более чем X % углерода, изначально присутствующего на стадии а)", как применяется в настоящей заявке, означает, что более чем X % атомов углерода, присутствующих в реакционном сосуде, представляют собой атомы углерода в молекулах монооксида углерода или диоксида углерода. Например, синтез-газ обеспечивает более 90% присутствующего углерода, если присутствует 9 молей диоксида углерода, менее 1 моля метана и некоторое количество водорода, но никаких других соединений, содержащих по меньшей мере один атом углерода.
Способ может осуществляться порционным образом. В этом случае термин "инкубация смеси … в течение по меньшей мере X минут" означает, как применяется в настоящей заявке, в предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, что порция ацетогенных бактериальных клеток хранится в течение X минут в специальных условиях, например, в присутствии водной среды, в присутствии синтез-газа в контакте с ацетогенной бактериальной клеткой, установленной температуре, давлении этанола и/или ацетата и так далее. Альтернативно, способ может осуществляться непрерывным образом. В этом случае термин "инкубация смеси … в течение по меньшей мере X минут", означает, как применяется в настоящей заявке, в предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, что среднее время, проводимое молекулой реагента, например водорода, в сосуде или специальных условиях, составляет X минут. Например, если газонепроницаемый сосуд содержит 10 литров водорода, водород добавляется при скорости потока 1 литр в минуту, и конструкция сосуда является такой, что молекулы водорода могут покидать сосуд в порядке входа, после среднего времени пребывания, другими словами, время, которое молекулы водорода проводят в сосуде, инкубируемые при установленных условиях, составляет 10 минут.
Если предусмотрен крупномасштабный процесс, можно предпочтительно осуществлять методики согласно настоящему изобретению непрерывным образом. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "непрерывным образом", как применяется в настоящей заявке, относится к способу, который содержит непрерывную подачу субстрата в биореактор и удаление среды, содержащей продукты, из биореактора. Непрерывный способ содержит, кроме того, непрерывную подачу питательных веществ. Клетки в биореакторе могут расти, альтернативно, может быть ограничена подача питательных веществ, чтобы заставить клетки достичь стационарной фазы, т.е. рост ограничивается недостатком питательных веществ, но клетки остаются метаболически активными и продолжают продолжать субстраты, такие как синтез-газ. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, термин "стационарная фаза", как применяется в настоящей заявке, означает, что клетки, подвергшиеся такой фазе, являются метаболически активными, но не размножаются.
Настоящее изобретение может осуществляться с применением любого вида сосуда, который позволяет поддерживать анаэробные условия. В случае осуществления в небольшом масштабе, может применяться газонепроницаемая рукавица, обеспечивающая окружающую среду с низким содержанием кислорода или без кислорода. В случае большого масштаба, ферментер синтез-газ большого объема оказывается более практичным. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, реакционная смесь подвергается непрерывному перемешиванию, чтобы обеспечить, что клетки, питательные вещества, субстраты и продукты равномерно распределяются в водной среде.
Аналитические инструменты, известные из уровня техники, позволяет непрерывно контролировать множество соединений в биореакторе, например, путем регулярного отбора образцов из реакционной смеси и анализа их посредством ВЭЖХ. Ключевые параметры, такие как pH и концентрация субстратов и продуктов, могут регулироваться онлайн, если это необходимо. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения применяются концентрация по меньшей мере одного из этанола и бутанола при постоянном наблюдении и уровни, доводимые до концентраций, совместимых с ростом и каталитической активностью ацетогенной бактериальной клетки.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими чертежами и не ограничивающими примерами, которые раскрывают признаки настоящего изобретения, варианты выполнения настоящего изобретения, объекты и преимущества настоящего изобретения.
Фиг. 1 показывает разницу между концентрациями продукта в начале и конце культивации в соответствии с содержанием углерода, как получено в Примере 1. Единица "ммольС/л" относится к количеству углерода в ммоль на литр.
Фиг. 2 показывает разницу между концентрациями продукта в начале и конце культивации в соответствии с содержанием углерода, как получено в Примере 2. Единица "ммольС/л" относится к количеству углерода в ммоль на литр.
Фиг. 3 показывает количества продукта в начале и конце культивации в соответствии с содержанием углерода, как получено в Примере 3 с применением штамма Clostridium drakei.
Фиг. 4 показывает разницу между концентрациями продукта в начале и конце культивации в соответствии с содержанием углерода, как получено в Примере 3 с применением штамма Clostridium ljungdahlii.
Пример 1: Получение масляной кислоты в отсутствии или присутствии этанола
4
2
4
2
4
Прекультуру Clostridium carboxidivorans DSMZ 15243 выращивали в анаэробных бутылках, объемом 1 л, запаянных с применением бутил-каучуковой мембраны, содержащих 200 мл модифицированного PETC согласно Hurst, К.М., and Lewis, R. (2010), Biochemical Engineering Journal 2010, 48, 159-165, содержащей 1 г дрожжевого экстракта, 19 г MES, 30 мл раствора минеральных солей, 10 мл раствора микроэлементов и 10 мл раствора витаминов. Раствор минеральных солей содержит 80 г NaCl, 100 г хлорида аммония, 10 г хлорида калия, 10 г монофосфата калия, 20 г сульфата магния и 4 г хлорида кальция на литр. Раствор витаминов содержит 0.01 г пиридоксина, 0.005 г тиамина, 0.005 г рибофлавина, 0.005 г пентотената кальция, 0.005 г тиоктацида, 0.005 г п-аминобензойной кислоты, 0.005 г никотиновой кислоты, 0.005 витамина В12, 0.002 г фолиевой кислоты и 0.01 г MESNA на литр. Раствор микроэлементов содержит 2 г нитрилуксусной кислоты, 1 г MnSO, 0.8 г аммония сульфата железа, 0.2 г хлорида кобальта, 0.2 г сульфата цинка, 0.02 г хлорида меди (II), 0.02 г хлорида никеля, 0.02 г молибдата натрия, 0.02 г NaSeO, 0.02 NaWO на литр. Значение pH довели до 5.9.
2
2
Перед инокуляцией среду кипятили в течение 20 минут и затем продули чистым азотом в течение 20 минут. Затем автоклавировали при 121°C в течение 20 минут, затем охладили, затем наполнили, применяя технический газ, содержащий 50% CO, 45% Н и 5% CO при относительном давлении, равном 1 бар. Затем давление довели до относительного давления, равного 0.8 бар.
Также, перед инокуляцией, 1.5 мл раствора, содержащего 4% каждого из сульфата натрия и гидрохлорида цистеина в качестве восстанавливающего агента, добавили при стерильных анаэробных условиях.
Культуру выращивали при 37°C и 100 оборотах в минуту. Культуру переносили в свежую среду каждые 72 часа.
2
Для экспериментов среду предпочтительно приготовили таким же образом, применяя технический газ, содержащий 95% CO и 5% CO. Кроме того, 0.6 г на литр этанола добавили до половины колб при стерильных анаэробных условиях.
Растворы инокулировали при стерильных анаэробных условиях, применяя 10 об. % инокулята из 48 часовой культуры. Колбы встряхивали при 37°C при 100 оборотах в минуту в течение 160 часов. Сухую биомассу и концентрацию продукта определяли в начале и конце эксперимента.
Концентрации уксусной кислоты, этанола, масляной кислоты и бутанола определяли с применением ВЭЖХ. Колонку aminex HPX-87Н применяли в качестве стационарной фазы. 5 мМ серной кислоты применяли в качестве элюента при постоянной скорости потока, равной 0.6 мл/мин. Температура колонки составляла 40°C. Этанол и бутанол определяли, применяя детектор показателя преломления. Диодно-матричный детектор применяли при длине волны 210 нм для обнаружения уксусной кислоты и масляной кислоты. Концентрации соединений вычисляли посредством интеграции пика, применяя графики калибровки соответствующего соединения при определенных концентрациях.
Фиг. 1 показывает разницу между концентрациями продукта в начале и конце культивации относительно содержания углерода.
В присутствии этанола образовалось 105 нмольС/л уксусной кислоты по сравнению с 97.17 ммольС/л, образованного в отсутствии этанола. 22.06 ммольС/л масляной кислоты образовалось в присутствии этанола по сравнению с 13.57 ммольС/л в отсутствии этанола, где применялись равные количества биомассы, более конкретно 480 мг/л.
В результате добавление этанола приводит к значительному увеличению количества образуемой масляной кислоты.
Пример 2: Получение масляной кислоты в отсутствии или присутствии ацетата
Протокол эксперимента соответствует описанному в Примере 1, за исключением того факта, что 2 г/л добавляли до половины колбы вместо 0.6 г/л этанола, и что применяемая порция синтез-газа содержала 50% монооксида углерода и 50% водорода.
Фиг. 2 показывает разницу между концентрациями продукта в начале и конце культивации относительно содержания углерода. В присутствии ацетата образовалось 42,13 нмольС/л масляной кислоты по сравнению с 26,43 ммольС/л, образованными в отсутствии ацетата.
В результате, добавление ацетата также приводит к увеличению количества образованной масляной кислоты.
Пример 3: Получение масляной кислоты в присутствии уксусной кислоты или этанола с применением альтернативных штаммов и газовых смесей
Применяемые среда и растворы:
ATCC 1754 модифицированная (PETC минимальная среда)
2
Вещество смешали с витаминами и микроэлементами и установили значение pH и объем NaOH раствора с применением деминерализованной (VE вода). Затем значение pH довели до 6.0 с применением NaOH раствора, сред вскипятили и перенесли в стойкие к давлению стеклянные бутылки, объемом 1 л. Затем среду охладили на льду и продули N для удаления любого оставшегося кислорода.
Затем среду автоклавировали. Затем в среду добавили восстанавливающий агент, и объем установили с применением анаэробной VE воды. Восстанавливающий агент стерилизовали отдельно и хранили при анаэробных условиях.
ATCC 1754 модифицированная (PETC)
2
Вещество смешали с витаминами и микроэлементами и установили значение pH и объем NaOH раствора с применением деминерализованной (VE вода). Затем значение pH довели до 6.0 с применением NaOH раствора, сред вскипятили и перенесли в стойкие к давлению стеклянные бутылки, объемом 1 л. Затем среду охладили на льду и продули N для удаления любого оставшегося кислорода.
Затем среду автоклавировали. Затем в среду добавили восстанавливающий агент, и объем установили с применением анаэробной VE воды. Восстанавливающий агент стерилизовали отдельно и хранили при анаэробных условиях.
ATCC 1754 модифицированная (PETC модифицированная)
2
Вещество смешали с витаминами и микроэлементами и установили значение pH и объем NaOH раствора с применением деминерализованной (VE вода). Затем значение pH довели до 6.0 с применением NaOH раствора, сред вскипятили и перенесли в стойкие к давлению стеклянные бутылки, объемом 1 л. Затем среду охладили на льду и продули N для удаления любого оставшегося кислорода.
Затем среду автоклавировали. Затем в среду добавили восстанавливающий агент, и объем установили с применением анаэробной VE воды. Восстанавливающий агент стерилизовали отдельно и хранили при анаэробных условиях.
микроэлементы ATCC 1754
Прежде всего, нитрилуксусную кислоту растворили в 1 л деминерализованной воды (VE вода), и значение pH довели до 6.0 с применением KOH раствора. Затем добавили все другие химические вещества. Раствор микроэлементов хранили при 4°C в темноте.
Витамины 141
Вещества растворили в 1 л деминерализованной воды (VE вода) и заморозили при -20°C в стерильных пробирках falcon порциями по 10 мл до применения.
Минеральный раствор PETC мод.
Вещества растворили в 1 л деминерализованной воды (VE вода).
Минеральный раствор хранили при 4°C в темноте.
Восстанавливающий агент ATCC 1754
2
Прежде всего, NaOH растворили в 1 л деминерализованной воды (VE вода) и вскипятили. Затем раствор перенесли в стойкие к давлению стеклянные бутылки объемом 1 л и продули N при охлаждении на льду. Другие вещества добавили при охлаждении раствора. Затем автоклавировали восстанавливающий агент в течение 20 минут.
Применяемые штаммы:
COX-Cdr-001 (Clostridium drakei)
COX-Clj-001 (Clostridium ljungdahlii)
Прекультуры:
Применяемые штаммы переносились в прекультуры с применением рабочих криокультур, полученных незамедлительно (до культур с применением 4 мл культуры в экспоненциальной фазе и 1 мл 50% раствора глицерина для превращения, хранили при -80°C). Каждая прекультура состояла из 5 мл ATCC 1754 мод. (PETC)-среды и фиксированного инокулята штаммов. Идеальная плотность инокулята была определена в предварительных экспериментах для соответствующего штамма.
COX-Cdr-001: 0.1% в 5 мл среды
COX-Clj-001: 10% в 5 мл среды
Культуры:
50 мл каждой из любой применяемой среды переносили в стерильные анаэробные (без кислорода) стойкие к давлению стеклянные бутылки, объемом 250 мл, и инокулировали с применением 10% (5 мл) применяемых штаммов, взятых из свежеприготовленных трехдневных прекультур.
Колбы с культурами закрыли с применением стерильной бутилкаучуковой пробки и красной крышки (содержащей три отверстия). Полые иглы (компания Sterican, ∅ 0.90×40 мм) проткнули через все три отверстия. Манометр для контроля давления присоединили к одной из полых игл (в идеале к игле по середине). Клапаны присоединили к другим полым иглам, так чтобы добавляемый в колбу с культурой газ и удаляемый из нее газ могли контролироваться независимо друг от друга.
Каждый из штаммов культивировали дважды для получения воспроизводимых результатов.
Получение культур:
Перед началом культивации каждую из бутылок трижды продули с применением синтез-газа. Это осуществляли путем присоединения к одному из клапанов трубки для прокачки газа в бутылку и к другому клапану для выделения газа, удаляемого из под крышки согласно регуляциям.
Посредством открытия клапана с трубкой для добавления газа синтез-газ прокачивается в колбу с культурой до тех пор, пока игла на дисплее манометра не покажет значение давления 0.8 бар. Затем клапан для добавления газа закрывается, а клапан для удаления газа открывается до тех пор, пока игла на дисплее манометра не покажет значение давления 0 бар. Эту процедуру повторяют дважды для каждой колбы с культурой. Когда методика повторяется в четвертый раз давление в бутылке поддерживается, т.е. к культурам снова добавляется синтез-газ.
Образцы культур затем были готовы для культивации при 35°C и 100 оборотах в минуту на качающейся водяной бане.
Взятие образцов:
Один или два раза в день 1 мл культуры удалялся для определения оптической плотности при 600 нм (оценка роста культуры).
В начале и в конце эксперимента каждый из двух образцов по 1.5 мл переносится в пробирки Эппендорфа, объемом 2 мл, и применяются для ЯМР анализа.
Добавление газа:
Через регулярные промежутки времени (несколько раз в день) давление внутри колбы с культурой проверяется, чтобы гарантировать, что оно постоянно. На рост культур и их метаболизм затрачиваются варьирующиеся количества синтез-газа. В случае если давление падает, добавляется еще газ, как описано выше. Такая же процедура осуществляется, если газ удаляется из колбы с культурой до отбора образца.
Конец эксперимента:
Эксперимент заканчивается через приблизительно одну неделю путем непрерывной продувки азотом в течение 10 минут каждой колбы с культурой до удаления полых игл для повышения безопасности. Культуры переносили в стерильные пробирки falcon, объемом 50 мл, под стерильной крышкой, и центрифугировали в течение 30 минут при 4500 g. Работать далее при анаэробных условиях было уже не обязательно. Восстановленную клеточную массу отобрали, и супернатанты культур перенесли в стерильные шприцы, объемом 50 мл, под стерильной крышкой. Их переносили в новые стерильные пробирки falcon, объемом 50 мл, через стерильный фильтр размера 0.2 мкм, и замораживали при -20°C в качестве образцов.
Эксперимент 1: Культивирование с применением дрожжевого экстракта и 0.6 г/л этанола (BF-DM-12-COX-038)
2
2
Эксперименты осуществляли с применением модифицированной ATCC 1754 (PETC)-среды, содержащей 1 г/л дрожжевого экстракта. В дополнение применялось 0.6 г/л этанола в качестве источника углерода. Применяемая газовая смесь содержала 30% CO и 70% H.
Эксперимент 2: Культивирование с применением дрожжевого экстракта и 2 г/л уксусной кислоты (BF-DM-12-COX-041)
Эксперимент осуществляли, как описано в эксперименте 1, за исключением того, что вместо этанола в среду добавлялась уксусная кислота.
Эксперимент 3: Культивирование с применением дрожжевого экстракта (BF-DM-12-COX-042) (сравнительный эксперимент)
Для прямого сравнения применялась такая же среда, но без добавления этанола или уксусной кислоты.
Результаты показаны на Фиг. 3 и 4. В результате, эффект, показанный в Примере 1, может быть воспроизведен с применением альтернативной газовой смеси и других штаммов ацетогенных бактерий.