Способ получения биологического материала, передаваемого на генетическое исследование в программах преимплантационного генетического тестирования эмбрионов человека
METHOD OF PRODUCING BIOLOGICAL MATERIAL TRANSFERRED FOR GENETIC RESEARCH IN PROGRAMS OF PREIMPLANTATION GENETIC TESTING OF HUMAN EMBRYOS

Изобретение относится к медицине, а именно, к репродуктологии, клинической эмбриологии и генетике.
in vitrо.
Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) уже давно практикуется в клиниках при проведении экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и включает в себя как преимплантационный генетический скрининг (ПГС) случайной анеуплоидии, так и преимплантационную генетическую диагностику (ПГД) наследственной патологии. Развитию ПГТ в настоящее время способствует  внедрение в клиническую практику современных методов молекулярно-генетического анализа, таких, как comparative genomic hybridization (CGH), microarray-based CGH (aCGH), single-nucleotide polymorphism (SNP) genotyping arrays, whole genome amplification (WGA) [Imudia AN, Plosker S. The Past, Present, and Future of Preimplantation Genetic Testing. Clin Lab Med. 2016 Jun;36(2):385-99. doi: 10.1016/j.cll.2016.01.012].   Использование современных молекулярно-генетических технологий расширяет возможности исследования генетического статуса эмбрионов человека, полученных
Независимо от того, какой метод молекулярно-генетического анализа используют для ПГТ, исследование проводят на материале ДНК одной или нескольких эмбриональных клеток. Первые работы, в которых была продемонстрирована биопсия клеток у эмбрионов человека в целях генетической диагностики, выполнены на третьи сутки эмбрионального развития, когда эмбрион находится на стадии дробления и состоит из шести-восьми клеток (бластомеров) [Handyside AH, Pattinson JK, Penketh RJ, Delhanty JD, Winston RM, Tuddenham EG. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet. 1989 Feb 18;1(8634):347-9].
Основное ограничение метода биопсии на стадии дробления - это исключительно малое количество клеток, которое возможно получить (не более одной-двух). В некоторых случаях количества генетического материала, выделенного из 1-2 бластомеров, может быть недостаточно для получения достоверного результата анализа. В настоящее время биопсия на третьи сутки все еще является наиболее распространенной, несмотря на то, что в рядом исследований уже было показано ее возможное негативное влияние на развитие эмбрионов [Cimadomo D, Capalbo A, Ubaldi FM, Scarica C, Palagiano A, Canipari R, Rienzi L. The impact of biopsy on human embryo developmental potential during preimplantation genetic diagnosis. Biomed Res Int. 2016;2016:7193075. doi: 10.1155/2016/7193075].
По сравнению с биопсией бластомеров на третьи сутки развития, метод биопсии трофэктодермы бластоцист на пятые сутки развития признан более эффективным и перспективным [Cimadomo D, Capalbo A, Ubaldi FM, Scarica C, Palagiano A, Canipari R, Rienzi L. The impact of biopsy on human embryo developmental potential during preimplantation genetic diagnosis. Biomed Res Int. 2016;2016:7193075. doi: 10.1155/2016/7193075].
При биопсии клеток трофэктодермы бластоцист возможно получение большего объема клеточного материала для исследования, чем при биопсии на стадиях дробления - от 5 до 10. Увеличение числа эмбриональных клеток, полученных в результате биопсии, упрощает проведение генетического анализа, повышает достоверность результата и позволяет выявить генетическую патологию, используя современные молекулярно-генетические методы [Harton GL, Magli MC, Lundin K, Montag M, Lemmen J, Harper JC; European Society for Human Reproduction and Embryology (ESHRE) PGDConsortium/Embryology Special Interest Group. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Group--best practice guidelines for polarbody and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Hum Reprod. 2011 Jan;26(1):41-6. doi: 10.1093/humrep/deq265].
Из запатентованных альтернативных методов известен способ биопсии клеток трофобласта (трофэктодермы) при множественных клетках, не участвующих в компактизации, в программах преимплантационного генетического скрининга эмбрионов человека по патенту РФ 2613788 [МПК А61В 10/00, А61В 10/02, опубл. 21.03.2017 г.]. Согласно изобретению, бластоцистам, при наличии множественных клеток, не участвующих в компактизации, полностью удаляют зону пеллюцида, освобождают клетки трофобласта, проводят биопсию и не включают клетки, не участвующие в компактизации, в материал, передаваемый на генетическую диагностику.
2+
2+
2+
2+
in vitro
in vivo
Таким образом, наиболее известными и распространенными являются методы биопсии на третьи или пятые сутки раннего эмбрионального развития. В недавнем исследовании группой авторов был предложен метод биопсии на четвертые сутки развития, на стадии компактной морулы [Захарова Е.Е., Залетова В.В. Проведение биопсии эмбрионов человека на стадии компактной морулы повышает диагностическую надежность преимплантационного генетического скрининга (ПГС) и обеспечивает высокую частоту наступления беременности (по данным 215 циклов ЭКО-ИКСИ с ПГС). Проблемы репродукции, 4, 2013. стр. 75-81]. Долгое время проведение биопсии у компактной морулы на четвертые сутки считалось невозможным из-за наличия адгезивных контактов между эмбриональными клетками на данной стадии развития. Одновременно с этим, в фундаментальных исследованиях на эмбрионах мыши было показано, что процесс формирования адгезивных контактов у компактной морулы млекопитающих зависит от присутствия ионов Ca, и в бескальциевой среде происходит естественное изменение конформации трансмембранных белков, что приводит к исчезновению адгезивных контактов (декомпактизации морулы). В присутствии ионов Ca процесс является обратимым. После помещения эмбрионов в среду для культивирования с содержанием ионов Ca адгезивные контакты формируются заново, процесс компактизации естественным образом восстанавливается в течение 1-2-х последующих часов [Pey R, Vial C, Schatten G, et al. (1998) Increase of intracellular Ca2+ and relocation of E-cadherin during experimental decompaction of mouse embryos. Proc Natl Acad Sci USA 95:12977-12982]. Захаровой Е.Е. и соавторами было показано, что после культивирования компактных морул человека в среде без содержания ионов Ca происходит их декомпактизация - клетки теряют адгезивные контакты и перестают быть связанными друг с другом. Отсутствие контактов между клетками у декомпактизированной морулы делает возможным безопасное и эффективное извлечение нескольких клеток для анализа. Показано, что при проведении биопсии на стадии компактной морулы после декомпактизации возможно получение в среднем от 4-х до 7-ми клеток для анализа. Этот результат сопоставим с результатом биопсии трофэктодермы бластоцисты, и значительно превосходит возможности биопсии на стадии дробления, когда количество получаемых бластомеров ограничено 1-2 клетками. Эмбриональные клетки, полученные при биопсии морул, не травмируются и сохраняют жизнеспособность. Данный факт отличает метод биопсии морул от способа биопсии трофэктодермы бластоцист, когда часть клеток может получить повреждения, связанные с особенностями методики проведения данной процедуры (механическое или лазерное отсечение фрагмента трофэктодермы). Целостность и жизнеспособность биоптированных клеток играет важную роль при выделении ДНК для анализа любым известным методом, так как повышает точность и достоверность исследования. Согласно полученным данным, проведение биопсии эмбрионов человека на стадии компактной морулы повышает диагностическую надежность ПГТ именно за счет количества и качества материала (живые клетки), используемого для диагностики. Кроме того, теми же авторами показано, что биопсия эмбриональных клеток на стадии компактной морулы не имеет негативного влияния как на развитие  и , так и на состояние новорожденных детей [Захарова Е.Е., Залетова В.В. Биопсия на стадии компактной морулы: 91 роды, 107 детей. Проблемы репродукции, 4, 2017, стр. 105-108].
Для любого метода молекулярно-генетического тестирования ключевым является количество и качество биологического материала, полученного для анализа (в данном случае эмбриональных клеток). Чем больше материала получено, тем достовернее исследование. Однако возможности методов биопсии ограничены биологическими особенностями тестируемого объекта (доимплантационного эмбриона). Как правило, максимально возможное количество клеток, которое удается получить при биопсии трофэктодермы бластоцит без риска для развития эмбриона, в среднем не превышает десяти. В том случае, если из полученного материала не удается выделить ДНК в достаточном для исследования количестве (при малом количестве полученных клеток или вследствие их гибели и деградации ДНК), прибегают к процедуре повторной биопсии. Повторная биопсия бластоцист в большинстве случаев выполняется на шестые сутки развития с повторным замораживанием/размораживанием эмбрионов, и не гарантирует получения качественного материала в достаточном количестве, а также не исключает дополнительный риск для дальнейшего развития эмбриона [Harton GL, Magli MC, Lundin K, Montag M, Lemmen J, Harper JC; European Society for Human Reproduction and Embryology (ESHRE) PGDConsortium/Embryology Special Interest Group. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Group--best practice guidelines for polarbody and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Hum Reprod. 2011 Jan;26(1):41-6. doi: 10.1093/humrep/deq265].
Технической проблемой, решаемой предлагаемым изобретением, является получение большего и достаточного количества качественного (живого) материала для проведения генетической диагностики в программах ПГТ эмбрионов человека.
Технический результат состоит в дополнительном естественном увеличении объема живого клеточного материала для исследования, полученного при биопсии морул, что позволяет упростить выполнение и повысить достоверность результата генетического анализа, в том числе с одновременным применением нескольких методов диагностики (при необходимости).
2+
in vitro
Для достижения вышеуказанного технического результата в способе получения материала, передаваемого на генетическую диагностику в программах ПГТ, включающем следующие стадии: культивирование эмбрионов на стадии компактной морулы в среде, свободной от ионов Ca, с целью их декомпактизации; биопсию клеток декомпактизированной морулы; дополнительно проводят культивирование эмбриональных клеток, полученных в результате биопсии, с целью естественного увеличения их количества.
Изобретение поясняется следующими  материалами.
Фиг. 1 - А - С - Этапы выполнения биопсии на стадии компактной морулы (4 сутки развития). В результате предварительного культивирования в среде без содержания Са2+ эмбрион декомпактизирован; D - Эмбрион спустя 2 часа после биопсии - компактная морула (культивирование в стандартной среде с содержанием Ca2+).
Фиг. 2. А - Полученные в результате биопсии на стадии компактной морулы (4 сутки развития) эмбриональные клетки и эмбрион сразу после биопсии (декомпактизирован); В - Эмбриональные клетки и эмбрион спустя 2 часа после биопсии (компактизация); С - Эмбриональные клетки спустя 14 часов культивирования после биопсии и эмбрион на стадии ранней бластоцисты (5 сутки развития);  D - Эмбрион на стадии бластоцисты (вылупление), спустя 46 часов после биопсии (6 сутки развития).
Фиг. 3. А - эмбриональные клетки спустя 14 часов культивирования после биопсии; В - зафиксированные  ядра  эмбриональных клеток, полученных в результате биопсии с последующим культивированием в течение 14 часов (флуоресцентная микроскопия, окраска DAPI).
in vitro
Способ получения материала, передаваемого на генетическую диагностику в программах ПГТ эмбрионов человека, осуществляют следующим образом: на четвертые сутки развития эмбрионы, полученные  методом ЭКО, и достигшие стадии компактной морулы, культивируют в стандартной среде для биопсии эмбрионов без содержания ионов Ca2+ (например, среда культуральная для ЭКО, регистрационное удостоверение № ФСЗ 2011/09730) до момента декомпактизации (в среднем 10-15 минут) (Фиг.1). Биопсию декомпактизированной морулы осуществляют микрохирургическим способом с использованием микроскопа инвертируемого для лабораторных исследований, оснащенного системой микроманипуляторов и микроинъекторов (например, Axio Vert.A1 с принадлежностями, регистрационный номер медицинского изделия № ФСЗ 2012/11987), а также с использованием комплекта микроинструментов (холдинг микропипетка, микропипетка для биопсии, микропипетка для механического хэтчинга; регистрационное удостоверение № ФСЗ 2008/01522).
2,
0
in vitro
Отличительной особенностью биопсии на стадии компактной морулы от других методов является то, что как правило все полученные при биопсии клетки не имеют повреждений цитоплазматической мембраны, являются жизнеспособными и сохраняют потенциал к митозу (фиг. 2). Для увеличения количества материала для ПГТ эмбриональные клетки, полученные в результате биопсии, культивируют в стандартной среде для культивирования эмбрионов человека (например, среда для культивирования, регистрационное удостоверение № ФСЗ 2011/09730) в стандартных условиях (инкубатор с газовой средой, содержащей 6% CO6% O2, с температурой 37С) не менее 3-х часов. Так, при культивирования  в течение 12-16 часов эмбриональные клетки, полученные на стадии компактной морулы, в среднем проходят один-два митотических цикла, их количество, по меньшей мере, удваивается (фиг.3).
Полученный материал может быть использован для проведения цитогенетического исследования методом FISH, или для проведения любого молекулярно-генетического исследования, основанного на выделении и амплификации ДНК. Таким образом, доступно выполнение исследования любым известным молекулярно-генетическим методом на максимально возможном диагностическом уровне. Эмбрионы после биопсии немедленно возвращают в стандартные условия культивирования, далее осуществляют их культивирование и перенос в полость матки по результату тестирования, или криоконсервируют для переноса в последующем цикле.
Реализация предложенного способа подтверждена клиническими исследованиями. При реализации требуется проведение биопсии эмбрионам человека на стадии компактной морулы. Согласно общепринятым требованиям, биопсия эмбриональных клеток в целях ПГТ должна быть безопасна для развития эмбрионов, но при этом должна обеспечивать достаточное количество материала для анализа. В клиническом исследовании проанализировано 355 циклов ЭКО с ПГТ, в которых была выполнена биопсия на стадии компактной морулы.
Биопсия была проведена 1084 эмбрионам хорошего качества на стадии компактной морулы (4 сутки развития), полученным в 355 циклах ЭКО.  Клетки компактной морулы были исследованы в рамках ПГТ. В зависимости от клинических показаний применялись методы исследования FISH и NGS. По результатам клинического исследования биопсия на стадии компактной морулы позволяет получить порядка 3-7 живых клеток для анализа без последующего культивирования, и в среднем 10-15 живых клеток после культивирования. Перенос эмбрионов осуществлен в 323 циклах (507 эмбрионов) на 5-6 сутки после пункции яичников.
Проведено  сравнение группы ЭКО/ПГТ (биопсия на стадии компактной морулы) с группой контроля (ЭКО) по следующим параметрам: доля бластоцист на 5-6 сутки развития, индекс имплантации после переноса эмбрионов, частота наступления клинической беременности, срок родов, рост и вес детей при рождении, оценка по шкале Апгар через первые 5 минут (в том числе доля детей со значением <7), наличие врожденной патологии.
Для каждого из параметров проводили расчет среднего арифметического, моды, стандартных отклонений и квартилей. Для определения  распределения каждого из  показателей использовали критерии Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова (при n > 100). Для сравнения показателей в группах  использовали U критерий Манна-Уитни и t-критерий Стьюдента для двух независимых величин, а также точный критерий Фишера для четырёхпольной таблицы сопряжённости. Уровень значимости в статистических тестах был принят 0.05.
Всего 91,2% (989/1084) морул после биопсии достигли стадии бластоцисты качества А-В (по системе классификации Гарднера) к 5-6 суткам развития.  Клиническая беременность  диагностирована в 34% случаев (110/323),  17,2% беременностей прервались (19/110). Всего рождено 110 детей (107 живых) от 91 родов. По результатам сравнения группы ЭКО/ПГТ с группой контроля, статистически значимых различий ни по одному из исследуемых параметров не выявлено.
in vitro
in vivo
Таким образом, проводимая на стадии компактной морулы биопсия эмбриональных клеток является безопасной и  не имеет негативного влияния как на развитие эмбрионов  и , так и на состояние новорожденных детей. Методом биопсии на стадии компактной морулы, в том числе с последующим культивированием биопсированных клеток, возможно получение живого клеточного материала в достаточном количестве для проведения анализа любым молекулярно-генетическим методом, существующим на сегодняшний день. При биопсии на 4 сутки развития перенос эмбрионов после генетической диагностики возможен в текущем цикле ЭКО, на 5-6 сутки после пункции яичников.
Клинические примеры.
Пример 1.
Пациенты О., 28 лет, обратились с жалобами на отсутствие беременности. При обследовании супруга, Пациента О., выявлено нарушение сперматогенеза (криптозооспермия), синдром Клайнфельтера (аномальный кариотип 47,ХYY). Рекомендовано  достижение беременности методом ЭКО с генетической диагностикой методом FISH для исключения у эмбрионов анеуплоидии по половым хромосомам. В результате ЭКО получено 5 эмбрионов. Три эмбриона достигли стадии компактной морулы к четвертому дню развития, им была выполнена биопсия. От каждого эмбриона получено от 3 до 5 клеток. После культивирования клеток в течение 10 часов выполнена их фиксация с целью проведения исследования методом FISH. Получены препараты с зафиксированными ядрами клеток в количестве от 7 до 13 на каждый эмбрион. Интерпретируемый результат получен по всем трем образцам. По результатам FISH исследования два эмбриона без анеуплоидии по половым хромосомам (XX, XY), один эмбрион с анеуплоидией X0. На шестые сутки развития по результатам генетической диагностики Пациентке О. выполнен перенос двух эмбрионов на стадии бластоцисты. Наступила одноплодная беременность, завершившаяся рождением доношенного здорового мальчика.
Пример 2.
Пациенты П., 32 и 36 лет, обратились с жалобами на отсутствие беременности, неразвивающуюся беременность в анамнезе. При обследовании пары у супруга, Пациента П., выявлен аномальный кариотип 45,XY,der(13;14)(q10;q10), робертсоновская транслокация. Рекомендовано достижение беременности методом ЭКО с генетической диагностикой методом FISH для исключения у эмбрионов анеуплоидии хромосом 13, 14. В результате ЭКО получено 11 эмбрионов. Семь эмбрионов достигли стадии компактной морулы к четвертому дню развития, им была выполнена биопсия. От каждого эмбриона получено от 3 до 4 клеток. После культивирования клеток в течение 14 часов выполнена их фиксация с целью проведения исследования методом FISH. Получены препараты с зафиксированными ядрами клеток в количестве от 6 до 12 на каждый эмбрион. Интерпретируемый результат получен по всем семи образцам. По результатам FISH исследования: три эмбриона без анеуплоидии хромосом 13, 14 (отсутствие транслокации или сбалансированнная транслокация); у четырех эмбрионов выявлена анеуплоидия с участием хромосом 13, 14 (несбалансированная робертсоновская транслокация). На шестые сутки развития по результатам генетической диагностики Пациентке П. выполнен перенос двух эмбрионов на стадии бластоцисты (третий эмбрион криоконсервирован). Наступила беременность двойней, завершившаяся оперативными родами на сроке 36 недель (здоровые мальчик и девочка).
Пример 3.
Пациентка В., 39 лет, обратилась с жалобами на отсутствие беременности. Первичное бесплодие, поздний репродуктивный возраст, нормальный кариотип у супругов, многократные неэффективные попытки ЭКО в анамнезе. В рамках программы ЭКО было рекомендовано проведение генетического скрининга для выявления анеуплоидии по всем хромосомам методом NGS. В результате ЭКО получено 6 эмбрионов, все они достигли стадии компактной морулы к четвертому дню развития, им была выполнена биопсия, эмбрионы криоконсервированы.  От каждого эмбриона получено от 4 до 6 клеток. После культивирования клеток в течение 6 часов их количество было увеличено до 7-9 от каждого эмбриона. Полученный материал использован для проведения анализа методом NGS. Интерпретируемый результат получен по всем шести пробам. По результатам диагностики у трех эмбрионов выявлена множественная анеуплоидия, три эмбриона без анеуплоидии. Перенос единственного эмбрионов без анеуплоидии запланирован в предстоящих программах переноса размороженных эмбрионов (ПРЭ).
Пример 4.
Пациенты Н., 28 и 32 лет, обратились с жалобами на отсутствие беременности, привычное невынашивание беременности, кариотип у супруги 46,XY,t(1;2)(q12;p25) (реципрокная транслокация). В рамках программы ЭКО было рекомендовано проведение генетической диагностики для выявления у эмбрионов несбалансированной хромосомной аномалии методоми  aCGH или NGS. В результате ЭКО получено 12 эмбрионов, 5 из них достигли стадии компактной морулы к четвертому дню развития, им была выполнена биопсия, эмбрионы криоконсервированы.  От каждого эмбриона получено от 4 до 7 клеток. После культивирования клеток в течение 7 часов их количество было увеличено до 8-12 от каждого эмбриона. Полученный материал использован для проведения анализа методом NGS. Интерпретируемый результат получен по всем пяти пробам. По результатам исследования у всех пяти эмбрионов выявлено несбалансированное хромосмное нарушение. Перенос эмбрионов не рекомендован.