Метод идентификации и количественного определения генно-инженерно- модифицированного картофеля линии PH05-026-0048

Материалы XVII Всероссийского конгресса с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты нутрициологии и диетологии. Лечебное, профилактическое и спортивное питание»

Целью данной работы являлась разработка метода количественного определения содержания ДНК генно-моди-фицированного (ГМ) картофеля линии PH05-026-0048 в анализируемых образцах в формате двухкомпонентной (дуплексной) ПЦР-РВ по технологии TaqMan PCR.

Материал и методы. Дуплексная система количественного определения ГМ картофеля линии PH05-026-0048 включала использование двух систем ПЦР-РВ, каждая из которых имела специфические ДНК-праймеры и флуоресцентно-меченные зонды: первая выявляла последовательность ДНК, специфичную для трансформационного события (PH05-026-0048); вторая - ДНК, специфичную для соответствующего вида растения. Разработка метода дуплексной ПЦР включала выбор таксон-специфичного гена, оптимизацию реакционной смеси, проверку эффективности и валидацию метода.

Результаты и обсуждение. По результатам анализа литературных данных в качестве вероятных претендентов на роль таксон-специфичных генов картофеля были рассмотрены монокопийные гены sus4, Stp23 и fru (Кочиева и др., 2013), последовательность которых высокоспецифична для генома картофеля (Potato Genome Sequencing Consortium, 2011). Монокопийное состояние генов, а также высокая специфичность праймерных систем делают ДНК маркеры на их основе наиболее эффективными при количественном определении геномной ДНК картофеля. На основании проверки эффективности всех трех таксон-специфичных праймерных систем для дальнейшей работы был выбран ген Stp23.

Для обеспечения точности двухкомпонентного анализа уровень амплификации одной из мишеней не должен превышать уровень амплификации другой, так как «доминирующая мишень» будет потреблять общие реагенты в бoльшем количестве, смещая баланс эффективностей реакций. Для решения этой задачи была проведена оптимизация состава реакционной смеси [концентрация праймеров, зондов, ионов Mg2+, дезоксирибонуклеотидов, бычьего сывороточного альбумина (БСА)] и протокола проведения ПЦР в режиме реального времени: амплифика-ционная смесь для идентификации PH05-026-0048 и контрольного гена Stp23в дуплексной системе содержала 2,5х реакционный буфер для проведения ПЦР-РВ в присутствии ROX (НПК «Синтол», Россия), праймеры, специфичные для ГМ-компонента (PH05F/PH05R) и целевого таксона (GPF3/GPR3) в количестве 250 и 150 нМ соответственно, зонды - 250 и 200 нМ соответственно; БСА 0,02%; MgCl2 - 3,0 мМ; dNTP - 0,3 мМ. Температурно-временной профиль реакции: начальная денатурация 95°С - 5 мин, последующие 50 циклов: 95 °С- 20 с, 58 °С - 20 с, 62 °С - 40 с.

В соответствии с требованиями по валидации (МУК 4.2.3389-16) экспериментально подтверждены линейность, прецизионность, правильность метода. Высокая эффективность предложенного метода доказана результатами независимых амплификаций анализируемого фрагмента ДНК в диапазоне концентраций от 0,1 до 5%, при этом угол наклона стандартной кривой лежал в интервале от -3,2 до -4,1, а коэффициент корреляции линейной регрессии (R2) превышал 0,98. Предел обнаружения (LOD) составил 0,038% или 22 копии геномной ДНК картофеля линии PH05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК (RSDr <25%). Предел количественного обнаружения (LOQ) - 0,12% или 66 копий геномной ДНК картофеля линии PH05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК (RSDr <25%).

Таким образом, разработан метод количественного определения ДНК ГМ картофеля линии PH05-026-0048 в формате дуплексного ПЦР-анализа. Линейность, прецизионность, правильность и предел определения метода подтверждены в исследованиях in vitro и свидетельствуют о его надежности, что позволяет рекомендовать данный метод для использования в рамках надзора за обращением ГМ картофеля в Российской Федерации.

Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет гранта Российского научного фонда (проект №16-16-04123).

Тышко Н.В.1, Шестакова С.И.1, Садыкова Э.О.1, Сухачева М.В.2, Груздев Д.С.2

МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННОГО КАРТОФЕЛЯ ЛИНИИ РН05-026-0048

1 ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва

2 Центр «Биоинженерия» РАН, ФГУ «Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии"» РАН, Москва

Сложившаяся практика контроля за генно-инженерно-модифицированными организмами растительного происхождения (ГМО) предусматривает использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения, идентификации и количественного определения целевого участка ДНК, характерного для соответствующего ГМО. Поскольку список генно-модифицированных (ГМ) сельскохозяйственных культур, представленных на мировом рынке, постоянно растет (508 линий по ситуации на июль 2018 г.), расширение перечня ПЦР протоколов также осуществляется в плановом порядке. Официальному утверждению метода контроля за ГМО в Российской Федерации предшествует процедура валидации, направленная на подтверждение правомерности применения именно этого метода и объективности полученных результатов.

Материал и методы. Подтверждение характеристик, определенных для количественного метода идентификации ГМ картофеля линии РН05-026-0048, было проведено с использованием сертифицированных стандартных образ-

Качество и безопасность пищи. Методы контроля

цов [Certified Reference Material (CRM)] ERM-BF435a (0% ГМО, немодифицированный картофель) и ERM-BF435b (100% ГМ картофель линии PH05-026-0048), AV43-6-G7 (CRM, ERM-BF431e). Метод идентификации ГМ картофеля линии PH05-026-0048, основан на полимеразной цепной реакции (ПЦР-РВ) по технологии TaqMan PCR. Протокол ПЦР разработан и валидирован European Commission Joint Research Centre. Идентификация трансформационного события выполнена с использованием пары праймеров, один из которых расположен внутри перенесенной генетической конструкции, другой - в области геномной ДНК картофеля, прилегающей к трансгенной вставке, олигонуклеотидного зонда с репортерным флуоресцентным красителем FAM (6-карбоксифлуоресцеин) на 5'-конце и гасителем BHQ1, относящимся к семейству красителей Black Hole Quenchers, - на З'-конце.

Относительное количество ГМ картофеля PH05-026-0048 определяли на основании калибровочной кривой (график зависимости логарифма процента концентрации от величины ACt для каждой калибровочной точки).

Результаты и обсуждение. Специфичность праймерной системы для идентификации трансформационного события PH05-026-0048 методом ПЦР-РВ подтверждена в исследованиях с другими ГМ линиями картофеля, а также результатами BLAST-анализа.

Диапазон применения метода, определяемый как интервал между наибольшей и наименьшей концентрациями определяемого вещества в образце, при котором аналитическая методика имеет приемлемый уровень прецизионности, правильности и линейности, вычисляли по калибровочной кривой с содержанием ГМ картофеля РН05-026-0048 от 0,1 до 50%. Угол наклона стандартной кривой в диапазоне рабочих концентраций от 0,1 до 50% составлял 3,392°, коэффициент корреляции линейной регрессии равен 0,99, эффективность амплификации составляла 90,7%. Данные результаты подтверждают наличие прямо пропорциональной зависимости аналитического сигнала от количества определяемого вещества в образце и соответственно линейность метода. Предел обнаружения геномной ДНК составляет 0,019% или 11 копий ДНК картофеля линии PH05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК при RSDr <25%. Предел количественного обнаружения составляет 0,06% или 36 копий ДНК картофеля линии PH05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК при RSDr < 25%.

Таким образом, результаты проведенных исследований подтвердили характеристики, определенные для количественного метода идентификации ГМ картофеля линии PH05-026-0048. Высокая специфичность праймеров, линейность и точность метода соответствуют как требованиям международной лаборатории Евросоюза (European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed), так и свидетельствует о его надежности и пригодности для обеспечения эффективного надзора за обращением ГМ картофеля в Российской Федерации.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда №16-16-04123.

Фомина С.Ф., Степанова Н.В.

ИЗУЧЕНИЕ ПИТАНИЯ ДЕТЕЙ г. КАЗАНИ И РИСК ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ, СВЯЗАННЫЙ С ХИМИЧЕСКОЙ КОНТАМИНАЦИЕЙ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Институт фундаментальной медицины и биологии, ФГАОУ ВО «Казанский федеральный университет»

Актуальность. В последние десятилетия внимание всего мирового сообщества привлечено к проблеме оценки влияния факторов окружающей среды на здоровье детей. Этиопатогенетическая роль питания как фактора риска в современных условиях определяет характер развития алиментарно-зависимых патологий у детей и подростков. В научных публикациях, где представлены расчеты уровней риска для детского населения, не учтена возрастная структура детей, отсутствует информация о значениях факторов экспозиции и лишь в единичных работах используется региональные значения. Вместе с тем известно, что поведенческие факторы экспозиции с возрастом изменяются.

Цель - провести оценку баланса потребления продуктов питания детей 3-6 лет и анализ неканцерогенного риска для здоровья, обусловленного контаминацией продуктов питания свинцом, кадмием, мышьяком и ртутью.

Материал и методы. Оценка баланса потребления продуктов питания детей проводилась в двух основных направлениях: индивидуальное и семейное питание (анкетно-опросный метод) и оценка питания в коллективах, где ребенок получает полный или частичный рацион (хронометражно-весовой метод). Сравнительный анализ фактического потребления основных пищевых веществ, макро- и микроэлементов, витаминов был произведен на основе СанПин 2.4.1.3049-13 (с изм. от 04.04.2014) «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, содержанию и организации режима работы дошкольных образовательных организаций» и МР 2.3.1.2432-08 «Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации». Оценка экспозиции свинца (Pb), кадмия (Cd), мышьяка (As) и ртути (Hg), поступающих с продуктами питания, была проведена за 2011-2014 гг. на основании медианы и 95th percentile в соответствии с МУ 2.3.7.2519-09. Оценку неканцерогенного риска осуществляли по результатам исследований в пищевых группах продуктов свинца, кадмия, мышьяка и ртути, выполненных на базе аккредитованной лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Татарстан» в соответствии с Р 2.1.10.1920-04 и Агентства по охране окружающей среды USEPA.

Результаты. Сравнительный анализ фактического потребления основных пищевых веществ макро- и микроэлементов с физиологическими нормами для детей дошкольного возраста показал, что соотношение белков, жиров