НАПРАВЛЕННАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ МЕЖДУ ГОМОЛОГИЧНЫМИ ХРОМОСОМАМИ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Способ направления рекомбинации ДНК между гомологичными хромосомами в соматической клетке растения, включающий следующие стадии:
(а) осуществление экспрессии системы нуклеаз в указанной соматической клетке растения,
где указанная система нуклеаз содержит систему сгруппированных коротких палиндромных повторов (CRISPR)/белков, ассоциированных с CRISPR (Cas),
где указанная CRISPR/Cas система нуклеаз содержит CRISPR-ассоциированную эндонуклеазу и молекулу гРНК, где указанная молекула гРНК связывается в указанном предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, направляя тем самым указанную CRISPR-ассоциированную эндонуклеазу на расщепление ДНК в указанном предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени,
где указанная экспрессированная система нуклеаз направлена на предварительно выбранный эндогенный сайт-мишень, содержащий полиморфные аллели на указанных гомологичных хромосомах, при этом при экспрессии указанной системы нуклеаз ДНК по меньшей мере одного из указанных полиморфных аллелей расщепляется в указанном предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, при этом указанная нуклеаза расщепляет ДНК, создавая двухнитевой разрыв в ДНК по меньшей мере одного из указанных полиморфных аллелей;
(b) осуществление анализа потомства указанной соматической клетки растения, или ткани растения, выращенной из указанной соматической клетки растения, или растения, выращенного из указанной соматической клетки, или потомства указанного растения на гомологичную рекомбинацию между указанными гомологичными хромосомами, где указанная гомологичная рекомбинация включает кроссинговер или генную конверсию (не сопровождающуюся кроссинговером); и
(c) выбор указанного потомства указанной соматической клетки растения или растительной ткани, выращенной из указанной соматической клетки растения, или растения, выращенного из указанной соматической клетки, или потомства указанного растения, в которых произошла направленная гомологичная рекомбинация.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза (нуклеаза Cas) представляет собой Cas9 или ее гомологи.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная соматическая клетка растения происходит из существующей гибридной или гетерозиготной клетки растения, имеющей полиморфные аллели в указанном предварительно выбранном сайте.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанная существующая гибридная или гетерозиготная клетка растения происходит из растения дикого типа.
5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанный способ обеспечивает получение соматической клетки растения, содержащей направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или ткани растения, содержащей указанную соматическую клетку растения, где ткань растения содержит направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или растения, содержащего указанную соматическую клетку растения, или его растения-потомка, где растение содержит направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или плода, полученного от растения, содержащего указанную соматическую клетку растения, или его растения-потомка, где плод содержит направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или семян, полученных от растения, содержащего указанную соматическую клетку растения, или его растения-потомка, где семена содержат направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или любой их комбинации.
6. Способ по п. 5, где соматическая клетка растения, содержащая направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или ткань растения, содержащая направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или растение, содержащее направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или плод, содержащий направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или семена, содержащие направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или любая их комбинация обладает комбинацией родительских признаков, не присутствующей ни у одного из родителей.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанные родительские признаки включают повышенную засухоустойчивость, повышенную устойчивость к сельскохозяйственным вредителям, повышенную устойчивость к патогенам, улучшенное содержание питательных веществ или улучшенные параметры роста, или любой другой признак, полезный для клетки растения, ткани растения, растения, плода или семени.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная соматическая клетка растения происходит от клетки из потомства, полученного при скрещивании двух растений, при этом каждая из указанных родительских клеток растения содержит полиморфный аллель по сравнению с указанным партнером в указанном предварительно выбранном сайте.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанный способ обеспечивает получение соматической клетки растения, содержащей направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или ткани растения, содержащей указанную соматическую клетку растения, содержащую направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или растения, содержащего указанную соматическую клетку растения, содержащую направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или его растения-потомка, или плода, полученного от растения, содержащего указанную соматическую клетку растения, содержащую направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или его растения-потомка, или семян, полученных от растения, содержащего указанную соматическую клетку растения, содержащую направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или его растения-потомка, или любой их комбинации, обладающих полученной в результате комбинацией родительских признаков, не присутствующей ни у одного из родителей.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанные родительские признаки, рекомбинированные посредством указанной направленной гомологичной рекомбинации, включают повышенную засухоустойчивость, повышенную устойчивость к сельскохозяйственным вредителям, повышенную устойчивость к патогенам, улучшенное содержание питательных веществ или улучшенные параметры роста, или любой другой признак, полезный для клетки растения, ткани растения, растения, плода или семени.
11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что одна из указанных родительских соматических клеток растения содержит указанную систему нуклеаз, и при этом активность расщепления ДНК указанной системы нуклеаз направлена на полиморфный аллель, присутствующий в другой родительской клетке растения, не содержащей указанную систему нуклеаз.
12. Способ по п. 8, отличающийся тем, что одна из указанных родительских соматических клеток растения содержит нуклеазу Cas, и другая из указанных родительских соматических клеток растения содержит молекулу гРНК, при этом указанная молекула гРНК связывается в указанном предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, направляя тем самым указанную нуклеазу Cas на расщепление ДНК в указанном предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени.
13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная соматическая клетка растения включает клетку из потомства растений, полученного при скрещивании двух полиморфных родительских линий, приводящем к созданию гибридного растения, при этом каждая из указанных родительских линий растений содержит полиморфный аллель в указанном предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, и при этом только одна из указанных родительских линий содержит указанную систему нуклеаз.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что указанный способ обеспечивает получение соматической клетки растения, содержащей направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или ткани растения, содержащей указанную соматическую клетку растения, содержащую направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или растения, содержащего указанную соматическую клетку растения, содержащую направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или его растения-потомка, или плода, полученного от растения, содержащего указанную соматическую клетку растения, содержащую направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или его растения-потомка, или семян, полученных от растения, содержащего указанную соматическую клетку растения, содержащую направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или его растения-потомка, или любой их комбинации, обладающих комбинацией родительских признаков, не присутствующей ни у одного из родителей.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указанные родительские признаки включают повышенную засухоустойчивость, повышенную устойчивость к сельскохозяйственным вредителям, повышенную устойчивость к патогенам, улучшенное содержание питательных веществ или улучшенные параметры роста, или любой другой признак, полезный для клетки растения, ткани растения, растения, плода или семени.
16. Способ по п. 13, отличающийся тем, что указанная система нуклеаз содержит нуклеазу Cas и молекулу гРНК, при этом указанная молекула гРНК связывается в указанном предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, направляя тем самым указанную нуклеазу Cas на расщепление ДНК в указанном предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, и при этом ДНК-расщепляющая активность указанной системы нуклеаз проявляется только в отношении гетерологичного аллеля, присутствующего в родительской клетке растения дикого типа.
17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная соматическая клетка растения содержится в ткани растения или в целом растении.
18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный предварительно выбранный эндогенный сайт-мишень содержит ДНК, содержащую ген, часть гена или регуляторную расположенную в 3'-5' направлении или расположенную в 5'-3' направлении последовательности гена, или любую их комбинацию, и при этом экспрессия указанного гена или ее отсутствие влияет на рост, засухоустойчивость, устойчивость к сельскохозяйственным вредителям, устойчивость к патогенам или содержание питательных веществ, или любой другой признак, полезный для клетки растения, ткани растения, растения, плода или семени, или любую их комбинацию.
19. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный предварительно выбранный эндогенный сайт-мишень содержит область эухроматина или гетерохроматина.
20. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное осуществление экспрессии включает конститутивную индукцию экспрессии, индуцибельную индукцию экспрессии, тканеспецифичную индукцию экспрессии или специфичную для определенных условий индукцию экспрессии, или любую их комбинацию.
21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная соматическая клетка растения включает протопласт.
22. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная соматическая клетка растения включает клетку культурного растения.
23. Способ по п. 1, отличающийся тем, что анализ указанного растения включает анализ части указанного растения или его потомства, включая лист, стебель, почку, плод, семя.
1
2
24. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное отобранное потомство согласно стадии (с), включает поколения F, F или F3, или любое последующее поколение, или обратные скрещивания на 1-3 поколения, или любое последующее поколение, полученное при обратном скрещивании.
25. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ обеспечивает получение соматической клетки растения, содержащей указанную направленную гомологичную рекомбинацию в указанном предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или ткани растения, содержащей соматическую клетку растения, содержащую, указанную направленную гомологичную рекомбинацию в указанном предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или растения, содержащего соматическую клетку растения, содержащую, указанную направленную гомологичную рекомбинацию в указанном предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или его растения-потомка, или плода, полученного от растения, содержащего соматическую клетку растения, содержащую, направленную гомологичную рекомбинацию в указанном предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или его растения-потомка, или семян, полученных от растения, содержащего соматическую клетку растения, содержащую, указанную направленную гомологичную рекомбинацию в предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, или его растения-потомка, или любой их комбинации, при этом указанные клетка, ткань, растение или его потомство, плод или семя имеют комбинацию родительских признаков, где указанная комбинация не присутствует ни у одного из родителей.
26. Способ по п. 25, где указанная клетка, ткань, растение или его потомство, плод или семя содержат гены для повышенной засухоустойчивости, повышенной устойчивости к сельскохозяйственным вредителям, повышенной устойчивости к патогенам, улучшенного содержания питательных веществ, улучшенных параметров роста или любого другого признака, полезного для клетки растения, ткани растения, растения или его потомства, плода или семени, или любой их комбинации, по сравнению с контрольными клеткой растения, растением или его потомством, плодом или семенем.
27. Генетически сконструированное растение томата, обладающее комбинацией полезных признаков или качеств, полученное способом, включающим направленную рекомбинацию ДНК между гомологичными хромосомами в гибридной соматической клетке растения, при этом указанный способ включает следующие стадии:
(а) осуществление экспрессии CRISPR/Cas системы нуклеаз в указанной клетке растения, при этом указанная экспрессированная система нуклеаз направлена на предварительно выбранный эндогенный сайт-мишень, содержащий полиморфные аллели на гомологичных хромосомах, при этом при экспрессии указанной системы нуклеаз ДНК по меньшей мере одного из указанных полиморфных аллелей расщепляется в указанном предварительно выбранном эндогенном сайте-мишени, при этом указанная нуклеаза расщепляет ДНК, создавая двухнитевой разрыв в ДНК по меньшей мере одного из указанных полиморфных аллелей;
(b) осуществление анализа потомства указанной соматической клетки растения, или ткани растения, выращенной из указанной клетки растения, или растения, выращенного из указанной соматической клетки растения, или потомства указанного растения на гомологичную рекомбинацию между указанными гомологичными хромосомами, при этом указанная гомологичная рекомбинация включает кроссинговер или генную конверсию (не сопровождающуюся кроссинговером);
(c) выбор клетки растения, включающей потомство указанной соматической клетки растения, ткани растения, включающей потомство указанной соматической клетки растения, полученного из нее растения, включающего потомство указанной соматической клетки растения, или потомства указанного растения, содержащего потомство указанной соматической клетки растения, в которых произошла направленная гомологичная рекомбинация, наблюдаемая при указанном анализе на стадии (b);
(d) выращивание указанной клетки растения, включающей потомство указанной соматической клетки растения или полученной из нее ткани растения, включающей потомство указанной соматической клетки растения или полученного из нее растения, включающего потомство указанной соматической клетки растения, или потомства указанного растения, включающего потомство указанной соматической клетки растения, с получением генетически сконструированного растения томата, содержащего указанную направленную гомологичную рекомбинацию,
при этом указанное генетически сконструированное растение томата представляет собой генетически сконструированное растение Solanum lycopersicum, которое экспрессирует гетерологичную CRISPR/Cas систему нуклеаз и обладает комбинацией полезных качеств или признаков, не присутствующей ни у одного из родительских растений, из которых происходила гибридная соматическая клетка,
где указанные полезные качества или признаки выбирают из группы, состоящей из повышенной засухоустойчивости, повышенной устойчивости к сельскохозяйственным вредителям, повышенной устойчивости к патогенам, улучшенного содержания питательных веществ, улучшенного параметра роста или любых их комбинаций, и указанное генетически сконструированное растение томата пригодно для культивирования в засушливых условиях, для культивирования в присутствии вредителей, для культивирования в присутствии патогенов, для получения томатов с улучшенным содержанием питательных веществ или с улучшенным ростом или любой их комбинации.
28. Растение по п. 27, отличающееся тем, что указанный предварительно выбранный эндогенный сайт-мишень содержит область эухроматина или гетерохроматина.