Модель закрытой тупой тяжелой травмы печени с коагулопатией у мелких лабораторных животных
MODEL OF CLOSED BLUNT SEVERE LIVER INJURY WITH COAGULOPATHY IN SMALL LABORATORY ANIMALS

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной хирургии, и предназначено для моделирования закрытой  тупой тяжелой травмы печени с коагулопатией  у мелких лабораторных животных. До 80 % травм печени имеют тупой закрытый характер повреждения и на современном этапе развития хирургии лечатся консервативно.  При травме III-V степени (E. Moore, 1994) применяется оперативный подход ввиду наличия сопутствующей посттравматической коагулопатии и  продолжающегося кровотечения. Посттравматическая коагулопатия характеризуется гиперфибринолизом, гипофибриногенемией, снижением активности протеина С, антитромбина III, дисфункцией тромбоцитов, удлинением протромбинового и/или активированного частичного тромбопластинового времени, а также увеличивает летальность у травмированных пациентов в 4 раза. Большинству таких пациентов на  догоспитальном этапе и  по современным стандартам проводится малообъемная инфузионная терапия, а среднее время  доставки в стационар составляет  по данным НИИ скорой помощи  им. И.И. Джанелидзе около часа. Моделирование тяжелой травмы печени у мелких лабораторных животных  является актуальным, так как преследует цель возможной апробации новых способов  и тактики лечения.
Известный близкие способы  моделирования тупой тяжелой травмы печени с коагулопатией у мелких лабораторных животных.
Модель закрытой травмы печени у крыс, описанная Ю.М. Гаиным  с соавторами  https://cyberleninka.ru/article/v/modelirovanie-otkrytoy-i-zakrytoy-travmy-zhivota-oslozhnyonnoy-smertelnym-vnutribryushnym-krovotecheniem-s-priznakami/. Cуть модели в том, что животному в наркозе выполняется лапаротомия, в положении на правом боку в рану выводится левая доля печени и по ее диафрагмальной поверхности наносится повреждение с помощью ударного аппарата, который  представляет  из себя полую медную трубку, запаянную с одного конца, внутри корпуса располагается жесткая пружина и латунный стержень (отбойник) с фиксатором, к трубке припаян столик, на который и укладывается повреждаемый орган. Все манипуляции осуществляются  после предварительного введения  в хвостовую  вену  крысы гепарина в дозе 750 Ед на 1 кг веса животного. После повреждения  брюшная полость послойно ушивается и каждые 10 минут выполняется мониторинг  состояния до 90-110 минут, при этом средняя кровопотеря составляет до 26,4%, и отмечается удлинение тромбинового,  протромбинового времени, активированного частичного тромбопластинового времени, снижение уровня фибриногена. Общим с нашей моделью травмы можно считать тупой механизм повреждения печени и развивающуюся коагулопатию. Отличается наша методика тем, что   травма наносится  при полной герметичности брюшной полости, т.е является истинно закрытой, и не используются препараты, способные вызывать нарушение свертывания. Кроме того   в нашей модели   присутствует этапность  оказания лечебных мероприятий. Таким образом,  аналог не отвечает реалиям тяжелой травмы печени и скорее отражает ситуацию, которая характеризуется как открытое тупое повреждение печени и вызванное гепарином кровотечение с развитием  коагулопатии.
Модель тупой травмы печени у крыс  линии Sprague-Dawley массой 330-460 г,  описанная Morgan C.E. с соавторами в 2015 году https://pdfs.semanticscholar.org/c1cd/1fa087073d7bacfde6ba4ce268ed2a90a4b2.pdf. Модель травмы подразумевает выполнение повреждения паренхимы  левой   доли   печени    после   лапаротомии   перфоратором  для  получения гистологического образца кожи  12 мм диаметра. Кровопотеря составляет 16%  объема циркулирующей крови, при этом достигается снижение среднего артериального давления на  10-15 мм рт.ст. Не смотря  на незначительное удлинение протромбинового времени, количество тромбоцитов и фибриногена  не отличается от контроля. Инфузионная терапия не проводится. Наблюдение продолжается 30 минут.  Общим с предложенной нами моделью можно считать травматическое повреждение печени у крыс и схожий объем кровопотери. Отличается же тем, что повреждение не является закрытым тупым и не отвечает поставленной цели моделирования такой травмы, т.е. не сопровождается тяжелым травматическим шоком  с коагулопатией и не предусматривает моделирования реальной ситуации от этапа повреждения до момента лапаротомии в операционной. По тем же причинам не валидными могут быть другие модели повреждения печени, описанные этими же авторами, когда травма  печени наносится животному после лапаротомии посредством  резекции доли, не смотря на возможное развитие большей  кровопотери и  коагулопатии.
Наиболее близким аналогом является модель непроникающей травмы печени, описанная   Cox J.M. и  Kalns  J. E.  в 2010 году  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2890397/ .
Способ подразумевает  использование самцов  крыс линии Sprague–Dawley массой 275-325 г, которых под наркозом изофлюраном располагают в полоборота на ¾ на операционном столике, устанавливают на живот ниже мечевидного отростка и реберной дуги поливинилхлоридную трубку длиной 100 см  и  опускают в полость трубки  стальной ударный элемент  с плоской поверхностью  массой 73,6 г и длиной 8 мм, который наносит тяжелое  травмирующее воздействие  на печень животного. Разрывы при этом составляют от 2 см и выше с кровопотерей от 2 мл. Наблюдение проводят в течение 2 часов. Общим с предложенной нами методикой  можно считать использование  энергии  свободно падающего груза  на переднюю брюшную стенку с возможным значительным закрытым тупым повреждением  печени и внутрибрюшным кровотечением. Отличается  же наша методика тем, что травмирующее воздействие  наносится  грузом массой 425 г  с высоты 28 см (25 см от поверхности передней брюшной стенки + 3 см - передне-задний размер тела животного на уровне удара)  лабораторной крысе массой 360-390 г в положении животного на спине с использованием устройства для моделирования тупой травмы печени у мелких лабораторных животных по механизму «удар», при этом центр ударной площадки диаметром 3,5 см располагается на 5 мм  правее  и выше кончика мечевидного отростка, а животное наблюдается сначала в течение 20 минут без инфузионной терапии,  потом с 20 по 60 минуту - с инфузионной поддержкой систолического давления  на уровне 80-90 мм.рт.ст. Предложенный нами алгоритм моделирования травмы печени с формированием посттравматической коагулопатии приближен к реальной ситуации, так как разбит на 3 этапа: до приезда скорой помощи 0-20 минут (без инфузионной терапии), догоспитальный  этап (с инфузионной терапией) 20-60 минут, госпитальный  с 60 минуты (лапаротомия) - чего нет у ближайшего аналога.
Техническая задача:  разработать  модель закрытой  тупой тяжелой травмы печени с коагулопатией у мелких лабораторных животных.
2
удара
Поставленная задача решается с помощью устройства для травмы мелких лабораторных животных по механизму «удар» (http://www.fips.ru/cdfi/fips.dll/ru?ty=29&docid=163861&ki=PM) следующим  способом. В условиях  ксилазин  (5-10 мг/кг  внутримышечно) и тилетамин/золазепам (20-40 мг/кг внутримышечно) анестезии  после  фиксации животного на операционном столике на спине,  выполняется постановка катетера из  фторэтиленпропилена 24G  в левую сонную артерию  и  правую бедренную вену у лабораторной  крысы массой 360-390 г.  По анатомическим ориентирам, а именно правее и выше на 5 мм кончика мечевидного отростка, устанавливается  центр  ударной площадки 3,5 см в диаметре устройства для моделирования тупой травмы печени у  мелких лабораторных животных по механизму «удар». С высоты 28 см от плоскости операционного столика выполняется удар грузом массой 425 г. Энергия удара рассчитывается как потенциальная энергия  E=m*g*h в Дж, где m- масса падающего груза в кг, высота падения груза в м, g – ускорение свободного падения в м/с, и составляет  E= 0,425*9,8*0,28=  1,17 Дж. Учитывая более высокий тромбогенный потенциал у крыс, перед травмой осуществляется забор из сонной артерии в течение 1 минуты  1 мл крови, который симулирует активное кровотечение  из поврежденного крупного венозного сосуда печени и используется для  оценки общего анализа крови (ОАК), уровня лактата, оценки функции тромбоцитов агрегатометрией,  оценки параметров тромбоэластограммы и/или коагулограммы. Через 20 минут пассивного наблюдения измеряется  систолическое давление в левой сонной артерии  для определения степени гипотонии. Промежуток времени от 0 до 20 минут после травмы моделирует этап до приезда скорой помощи, т.е  без инфузионной терапии. С 20 минуты при снижении давления ниже 90 мм.рт.ст. проводят малообъемную инфузию в правую бедренную вену  раствором “Стерофундин”/”Гелофузин” в соотношении 2:1 со скорость 0,3-0,5 мл в минуту с поддержанием систолического давления на уровне 80-90 мм.рт.ст до 60 минуты.  На 60 минуте осуществляется повторно забор из левой сонной артерии крови в объеме 1 мл  с определением вышеперечисленных параметров для оценки развивающейся коагулопатии и симулирующий усиление кровотечения из поврежденных сосудов во время лапаротомии и ревизии органов брюшной полости за счет снижения внутрибрюшного давления.  Выполняется срединная  лапаротомия, оценивается объем гемоперитонеума и протяженность разрывов печени. Модель может быть использована для изучения механизмов тяжелой  тупой закрытой травмы печени с посттравматической коагулопатией и апробации новых способов ее лечения.
Пример
В условиях ксилазин (5-10 мг/кг внутримышечно) и тилетамин/золазепам (20-40 мг/кг внутримышечно) анестезии  после фиксации животного на операционном столике на спине  выполнена постановка катетера из  фторэтиленпропилена 24G  в левую сонную артерию  и  правую бедренную вену у  самца крысы линии Wistar  массой 360 г.  По анатомическим ориентирам, а именно правее и выше на 5 мм кончика мечевидного отростка, установлен центр  ударной площадки 3,5 см в диаметре устройства для моделирования тупой травмы печени у  мелких лабораторных животных по механизму «удар». С высоты 28 см от плоскости операционного столика выполнен удар грузом массой 425 г. Перед травмой осуществлен забор из сонной артерии в течение 1 минуты  1 мл крови. Через 20 минут пассивного наблюдения измерено  систолическое давление в левой сонной артерии, которое составило 70 мм.рт.ст. Начата инфузионная терапия в правую бедренную вену  раствором “Стерофундин”/”Гелофузин” в соотношении 2:1 со скорость 0,3 мл в минуту с поддержанием систолического давления на уровне 80-90 мм.рт.ст до 60 минуты.  Объем инфузионной терапии к 60 минуте составил 6,5 мл. На 60 минуте осуществлен повторно  забор крови в объеме 1 мл. Выполнена срединная  лапаротомия, в брюшной полости  2,1 мл крови, визуализируются множественные разрывы  срединной и хвостатой доли печени  общей протяженностью 7 см с  тромботическими наложениями в ране и уже остановившимся кровотечением.  Диагностирована тяжелая травма печени с общей кровопотерей 3,1 мл, что составило около 10,2 % объема циркулирующей крови. Выполнен забор 12 мл крови,  в результате чего животное выведено из эксперимента ввиду остановки дыхания и сердечной деятельности. Показатели общего анализа крови, глюкозы, лактата, низкочастотной пьезотромбоэластографии (НПТЭГ) и агрегатометрии сравнили перед травмой на 0 минуте  и  на 60 минуте после нее. Показатели активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ), тромбинового времени (ТВ), фибриногена, активность протеина С, плазминогена, антитромбина III, биохимического анализа крови на 60 минуте после травмы сравнили с показателями здоровых крыс.
9
2
3
5
По результатам исследования отмечается потребление тромбоцитов (800 vs 618*10/л),  удлинение протромбинового времени в 1.4 раза  (10,7 vs 15,7с), рост интенсивности лизиса сгустка (ИРЛС)  на 30 минуте после достижения максимальной плотности  сгустка (0,42 vs 4,03%), снижение уровня фибриногена (2,24 vs 0,61г/л),  активности протеина С (85 vs 52%), активности антитромбина III (100 vs 87,4 %), плазминогена (90 vs 51%), дисфункция тромбоцитов (агрегация при стимуляции АДФ снизилась на 10%, ретракция на 1%), снижение гемоглобина (150 vs 114 г/л), повышение лактата (1,46 vs  2,75 ммоль/л), уменьшение интенсивности коагуляционного драйва (ИКД, 56,57 vs  39,77 отн. ед.), константы тромбиновой активности (КТА, 40 vs 27,78 отн. ед.) и времени ее достижения (Т, 2,6 vs 3,7 мин.), удлинение времени свертывания (Т, 4,5 vs 8,6 мин.), уменьшение интенсивности полимеризации сгустка (ИПС, 14 vs 11 отн. ед.), укорочение времени образования фибрин-тромбоцитарной структуры и достижения максимальной плотности сгустка (Т, 47 vs  42 мин.), повышение общего билирубина (0,6 vs  2,52 мкмоль/л.), АлАТ (19,2 vs  1829 Ед.), АсАТ (55 vs  1219 Ед.), мочевины (6,55 vs 8,19 ммоль/л.), креатинина (46 vs  66 мкмоль/л.), снижение общего белка (55,3 vs  32,9 г/л.) и уровня глюкозы (7,9 vs  7,18 ммоль/л.). Вывод: у травмированного животного есть признаки тяжелой травмы печени 3-4 степени, травматического шока, полиорганного шокового повреждения и посттравматической коагулопатии с удлинением ПВ, снижением антикоагулянтов в крови, начинающимся потреблением факторов свертывания, гипофибриногенемией, дисфункцией тромбоцитов и гиперфибринолизом.
Для уточнения значимости тех или иных  изменений общего и биохимического анализа крови, показателей системы гемостаза после тяжелой травмы печени по предложенной методике  смоделирована травма у 24 крыс самцов линии Wistar массой 360-390 г и выполнена статистическая обработка данных с помощью  языка программирования R. Было показано, что при моделировании тяжелой закрытой тупой  травмы печени через 60 минут статистически значимо  снижается уровень гемоглобина, количество тромбоцитов и  их способность к ретракции сгустка, отмечается повышение уровня лактата, общего билирубина, АлАТ, АсАТ, мочевины, креатинина, снижается уровень общего белка, фибриногена, активность антитромбина III, активность протеина С и плазминогена, удлиняется протромбиновое и тромбиновое время, а по результатам НПТЭГ: уменьшается интенсивность коагуляционного драйвы (ИКД), повышается интенсивность ретракции и лизиса сгустка (ИРЛС) на 10 и 30 минуте по достижению максимальной плотности сгустка (МА). Средний объем кровопотери к 60 минуте   при этом составил 2,5 мл или 11,6% объема циркулирующей крови (ОЦК) с учетом того, что он у крыс данной линии и весовой категории, равной 378,5±14,21 г (M±sd), составляет около 5,7% от массы тела.  Средняя протяженность разрывов печени составила 4,27 см. По классификации тупой травмы печени у крыс, предложенной Jennifer M. Cox and John E. Kalns в 2010 году, соотнесенной с классификацией травм печени у человека по Moore E. E. 1994 г., полученная травма соответствует 3-4 степени. При морфологическом исследовании внутренних органов у большинства крыс не обнаружено тромбов в микроциркуляторном русле, но отмечается тромбоз мелких внутриорганных сосудов. Таким образом, смоделирована тяжелая закрытая тупая травма печени с развитием травматического шока и ранней посттравматической коагулопатией, критерием которой выступает удлинение ПВ, ТВ, дисфункция и уменьшение количества тромбоцитов, снижение уровня фибриногена, антитромбина III, протеина С, начинающееся потребление факторов свертывания, гиперфибринолиз, появление тромбоза мелких внутриорганных сосудов и развитие полиорганного шокового повреждения.
Технический результат: разработана модель закрытой тупой тяжелой травмы печени с коагулопатией у мелких лабораторных животных.