Активность генов NOTCH-сигнального пути и NOTCH-зависимых генов в печени крыс после субтотальной резекции

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Активность генов NOTCH-сигнАльного пути и notch-зависимых генов в печени крыс после субтотальной резекции

А.В. Ельчанинов 12, Т.Х. Фатхудинов 12, ЕЮ. Кананыхина 12, И.В. Арутюнян 12, А.В. Макаров 13, Л.А. Князева 3, Г.Б. Большакова 2, Г.Т. Сухих 1

1 Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова, Москва, Россия

2 Научно-исследовательский институт морфологии человека, Москва, Россия

3 Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия

Activity of NOTCH-signaling pathway after subtotal liver resection in rats

A.V. Elchaninov12, T.Kh. Fatkhudinov12, E.Y. Kananykhina 12,1.V. Arutyunyan 12, AV. Makarov12, L.A. Knyazeva 3, G.B. Bolshakova 2, G.T. Sukhikh 1

1 Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Moscow, Russia

2 Scientific Research Institute of Human Morphology, Moscow, Russia

3 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia

NOTCH-сишальный путь имеет ключевое значение в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток млекопитающих. Данные об активности NOTCH-сигнального пути после субтотальной резекции печени у крыс до настоящего времени не опубликованы.

На модели регенерации печени крыс после субтотальной резекции с помощью полимеразной цепной реакции, иммуногистохимического анализа и вестерн-блота изучена экспрессия ряда генов NOTCH-сигнального пути (notchl, notch2), а также NOTCH-зависимых генов: sox9, hesl, yap.

После субтотальной резекции происходило подавление активности генов notchl, notch2, yap и повышение экспрессии генов sox9, hesl.

Снижение экспрессии генов notchl и notch2, по-видимому, является необходимым условием активации пролиферации гепатоцитов. Повышение экспрессии NOTCH-зависимых генов sox9 и hesl скорее свидетельствует о глубокой дедифференцировке гепатоцитов и подготовке к пролиферации, чем трансдифференцировке в холангиоциты.

Ключевые слова: печень, регенерация, NOTCH-сигналинг.

Бведение

NOTCH-клеточный сигнальный путь представляет собой одну из регуляторных систем, которые управляют жизненным циклом, дифференцировкой, пролиферацией клеток у большинства многоклеточных организмов. NOTCH-система состоит из 4-х видов трансмембранных NOTCH-рецепторов (NOTCH-1, -2, -3, -4), 2-х лигандов SERRATE/JAGGED (Jag-1, -2) и 3-х лигандов DELTA-LIKE (Dll-1, -3, -4), а также ряда внутриклеточных белков [1]. Гены 4-х NOTCH-рецепторов экспрессируются в печени взрослых млекопитающих, при этом гены notchl и notch2 преимущественно экспрессируются в гепатоцитах и холангиоцитах, тогда как экспрессия генов notch3 и notch4 обнаружена в клетках стромы [2].

В научной литературе имеется множество сообщений о роли NOTCH-сигналинга в развитии печени. Показано, что активация данного сигнального пути посредством NOTCH1 и NOTCH2 рецепторов в гепа-тобластах приводит к их дифференцировке в направлении холангиоцитов [3]. Подавление экспрессии

e-mail: fatkhudinov@gmail.com

Notch-signaling pathway is critical in the regulation of proliferation and differentiation of mammalian cells. Data on the activity of notch-signaling pathway after liver subtotal resection in rats have not been published yet.

After subtotal liver resection in rat, the expression of notchl, notch2 and notch-targets genes (sox9, hesl, yap) was assessed with the polymerase chain reaction, immunohistochemistry and western blot.

After subtotal liver resection in rat notchl, notch2, yap were downregulated and sox9, hesl upregulated.

Downregulation of notchl and notch2 is a necessary condition for the activation of hepatocyte proliferation. Upregulation of notch-targets genes such as sox9 and hesl it is a probably sign of deep dedifferentiation of hepatocytes and preparing them for proliferation than their transdifferentiation in cholangiocytes.

Key words: liver, regeneration, NOTCH-signaling pathway

NOTCH2 рецептора вызывает гипоплазию внутрипе-ченочных желчных протоков [4].

Данные о роли NOTCH-сигналинга при регенерации печени в основном касаются регуляции репро-граммирования гепатоцитов в направлении холан-гиоцитов и активации резидентных прогениторных клеток печени. Обнаружено, что при токсическом повреждении печени в гепатоцитах активируется NOTCH-сигнальный путь и начинается экспрессия маркеров холангиоцитов. Подобное явление наблюдается также при искусственной активации экспрессии генов NOTCH-сигнального пути в гепатоцитах [3, 5]. Сходная картина выявлена при активации в гепатоцитах Hippo/Yap-сигнального пути, при этом показано, что ключевой ген этого молекулярного каскада yap также является NOTCH-зависимым геном [6].

Сообщения о роли NOTCH-системы в регенерации печени после резекции немногочислены и противоречивы. В одной из немногих работ указывается, что в течение 4 сут. после резекции 70% массы печени крыс в гепатоцитах и холангиоцитах повышается

синтез белков NOTCH1 и JAGGED1. Подавление экспрессии соответствующих генов с помощью РНК-интерференции вызывает снижение пролиферации гепатоцитов после резекции печени [7]. Однако в другой работе показано, что при инактивации гена notchl у мышей в неоперированной печени наблюдается спонтанная активация пролиферации гепа-тоцитов и узловая гиперплазия без разрастания соединительной ткани. У животных той же линии, но после резекции печени скорость регенерации и уровень пролиферации гепатоцитов были ниже, чем у животных с нормальной экспрессией notchl [8]. Возможно, это связано с тем, что к моменту операции у животных с подавленной экспрессией notchl масса печени уже была увеличена. Резекция печени привела к меньшей редукции массы органа относительно массы всего животного [8]. Таким образом, NOTCH-сигналинг имеет ключевое значение в регуляции пролиферации гепатоцитов при регенерации печени после удаления части органа. Данные об экспрессии гена notch2 и его роли в регенерации печени млекопитающих после резекции отсутствуют.

С точки зрения расширения знаний о фундаментальных механизмах регенерации печени актуальным является изучение особенностей восстановительного процесса в печени после резекции разного объема. Как известно, субтотальная резекция (удаление 80% массы печени) приводит к обратимому блоку митотического цикла гепатоцитов [9]. Поэтому интересным представляется изучение особенностей реализации NOTCH-сигнального пути в данных условиях репаративного процесса.

Эта проблема имеет и прикладное значение, поскольку субтотальная резекция является моделью синдрома «малого остатка органа», который особенно актуален в онкологии и трансплантологии [10]. Пересаживаемая часть донорской печени оказывается слишком малой для поддержания гомеостаза в организме реципиента, что ведет к развитию острой печеночной недостаточности. Подобное состояние развивается и у пациентов, которым произведена достаточно обширная резекция печени в связи с опухолевым процессом [10, 11]. При этом молекулярные механизмы повреждения и недостаточной регенерации печени в условиях синдрома малого остатка органа остаются мало изученными.

Цель работы — изучение экспрессии ряда генов NOTCH-сигнального пути (notchl, notch2), а также NOTCH-зависимых генов (sox9, hesl, yap) на модели регенерации печени крыс после субтотальной резекции.

Материал и методы

Экспериментальная модель

Исследование проводили на крысах Вистар (n = 93) массой тела 300—400 г, полученных из питомника Филиала ИБХ РАН (г. Пущино). Содержание и использование животных осуществляли в соответствии с Приказом министерства здравоохранения СССР № 755 от 12 августа 1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».

Животным экспериментальной группы (n = 83) под наркозом диэтиловым эфиром (МедХимПром, Россия) была проведена субтотальная резекция печени. После вскрытия брюшной полости удаляли срединную, левую боковую и правую верхнюю доли

печени (всего 80% общей массы печени), время операции с 9.00 до 11.00.

Животных выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира через 3, 6, 12, 24, 30, 48, 72 ч., а также через 7 и 10 сут. после резекции печени, по 5—6 животных на каждый срок.

Показателем полноты регенерации печени служило восстановление массы печени, которую оценивали с помощью взвешивания целого органа. Контролем служили интактные крысы, одновозрастные с оперированными животными (n = 10).

Оценка функции печени

Для оценки восстановления функций печени в сыворотке крови крыс измеряли концентрацию альбумина и активность аланинаминотрансферазы (АЛТ). Концентрацию альбумина (г/дл) определяли с помощью фотометрического теста с бромкрезо-ловым зеленым (Albumin DiaS, Диакон-ДС, Россия), активность АЛТ (Е/л) — фотометрическим тестом (ALAT(GPT Dias), Диакон-ДС, Россия).

Гистологическое исследование

Для гистологического исследования печень фиксировали в 10% забуференном растворе формалина, после стандартной проводки заливали в парафин, далее готовили срезы толщиной 5—7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином.

Для исследования пролиферации гепатоцитов определяли их митотический индекс, выраженный в промилле (%о). Митозы подсчитывали на гистологических срезах печени, окрашенных гематоксилином и эозином на 6000 клеток для каждого животного.

Иммуногистохимическое исследование

На гистологических срезах выявляли экспрессию фактора транскрипции SOX9 (1:100, Abcam, Великобритания), а также цитокератина-19 (CK19, 1:100, Abcam, Великобритания). Иммуногистохимическая реакция была поставлена на парафиновых срезах с использованием иммунопероксидазного метода. Демаскировку антигена проводили путем кипячения срезов в цитратном буфере (pH 6,0). Применяли соответствующие вторые антитела и систему визуализации (Abcam, Великобритания). Срезы докрашивали гематоксилином.

На препаратах подсчитывали SOX9 + и CK19 + -клетки и вычисляли индекс SOX9+-клеток и индекс ^^^клеток как соотношение маркер-позитивных клеток к общему количеству гепатоцитов на поле зрения в процентах (%).

Вестерн-блот анализ

Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии SOX9 и CK19 подтверждали методом вестерн-блот гибридизации. Выделение общего белка из образцов печени крыс проводили с помощью набора MicroRotoforCellLysiskit (BioRad Laboratories Inc., США). Концентрацию общего белка измеряли по методу Брэдфорда, используя набор QuickStartBovine y-GlobulinStandardSet (BioRad Laboratories Inc., США). Перенос белков из геля на PVDF мембрану осуществляли полусухим способом при помощи набора Trans-Blot Turbo™ RTA Mini LF PVDF TransferKit (Bio-Rad Laboratories Inc., США), окрашивали первыми антителами к SOX9, CK19 (1:100, Abcam, Великобритания) или р-тубулину (1:100, Abcam, Великобритания), затем вторыми

антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Immun-StarGoatAnti-Rabbit (GAR)-HRP Conjugate, Bio-Rad Laboratories Inc., США). Проявление блота проводили с помощью набора Clarity™ Western ECL (Bio-Rad Laboratories Inc., США) и системы визуализации ChemiDoc™ (Bio-Rad Laboratories Inc., США). Полученные результаты анализировали в программе ImageLab (Bio-Rad Laboratories Inc., США). В качестве референсного белка использовали тубулин.

Полимеразная цепная реакция

в реальном времени

Для оценки активности всего NOTCH-сигнального пути обычно изучают экспрессию как генов самого сигнального каскада, так и некоторых NOTCH-зависимых генов, чаще всего hes1 и sox9 [5].

С помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) изучали экспрессию генов notch1, notch2, hes1, yap и sox9. При выведении животных из эксперимента фрагменты печени массой 30 мг помещали в раствор RNA-later (QIAGEN, Нидерланды), инкубировали в течение суток при +4°С, хранили при -80°С. В качестве индивидуального контроля использовали ткань удаленных долей печени. Из образцов выделяли тотальную РНК с помощью набора RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN, Нидерланды). Синтез кДНК с матрицы полученной тотальной РНК осуществляли с применением готового набора реактивов MMLV RT kit (Евроген, Россия). Далее с кДНК ставили ПЦР, используя готовые наборы реактивов qPCRmix-HS SYBR, содержащие флуоресцентный интеркалирующий краситель Sybr Green I (Евроген, Россия). Праймеры для ПЦР подбирали с помощью онлайн-приложения Primer-BLAST в соответствии

Таблица 1. Использованные праймеры

с общепринятыми требованиями. Выбранные прай-меры (табл. 1) были синтезированы фирмой Евроген (Россия).

Для анализа экспрессии генов применяли метод определения порогового цикла (Ct) и вычисляли относительную экспрессию гена по методу Pfaffl [12] с учетом рекомендаций Vandesompele [13]. В качестве эндогенного контроля использовали гены actin-в, b2m, gapdh.

Статистический анализ

Полученные данные анализировали с применением программы SigmaStat 3.5 (SystatSoftwareInc, США). Сравнение двух выборочных долей проводили с помощью z-критерия. Полученные относительные экспрессии сравнивали с помощью U-критерия Манна — Уитни. При сравнении более двух групп использовали ANOVA on Ranks. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Восстановление массы и функции печени

После выполнения субтотальной резекции печени масса органа у выживших животных (табл. 2) постепенно нарастала и через 10 сут. после операции масса печени у животных экспериментальной группы не отличалась от массы печени интактных крыс (p>0,05, рис. 1А).

Кроме того, к этому же сроку концентрация альбумина и активность АЛТ в сыворотке крови оперированных крыс не отличалась от показателей животных контрольной группы (p>0,05, рис. 1Б, В). Таким образом, регенерация печени крыс после субтотальной резекции происходит за 10 сут., что согласуется с данными других исследователей [9, 11].

Ген 5'-праймер 3'-праймер

Notch1 AGTGGCCAACGGCACTGAA CATTGGCCAGAGGTGTCAG

Notch2 CAACGGCACAGGCTACTGC GAGGTCGAGTATTGGCAGTC

Hes1 CTCTGAGCACAGAAAGTCATC TTCATGCACTCGCTGAAGCC

Yap CTTCGCAAGCTGCCCGACT GGGATCTCAAAGGAAGAC TG

Sox9 AGAGGCCACCGAACAGACT TGCTCAGCTCACCGATGT C

actp GAGATTACTGCCCTGGCTCC GCTCAGTAACAGTCCGCCTA

b2m CTCGCTCGGTGACCGTGAT GGACAGATCTGACATCTCGA

gapdh GCGAGATCCCGCTAACATCA CCCTTC CACGATGCCAAAGT

Таблица 2. Смертность животных после субтотальной резекции печени

Время после Кол-во погибших Кол-во выживших Кол-во прооперированных

операции животных животных животных

3 ч. 0 5 5

6 ч. 0 6 6

12 ч. 0 5 5

24 ч. 1 5 6

30 ч. 2 6 8

48 ч. 5 6 11

72 ч. 5 5 10

5 сут. 4 6 10

7 сут. 5 6 11

10 сут. 5 6 11

Общее количество 27 56 83

животных

А

Б

В

3 сут 7 сут Альбумин

10 сут

3 сут 7 сут

Е/л

500

1

450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

Г

12 •

МИ,%0

АЛТ

3 сут 7 сут

10 сут

10 сут

1 сут 2 сут Зсут 5 сут 7 сут 10 сут

Рис. 1. Показатели регенерации и функционального состояния печени крыс после субтотальной резекции: А — масса печени крыс после субтотальной гепатэктомии (к — масса печени животных контрольной группы); Б — активность АЛТ в сыворотке крови крыс; В — концентрация альбумина в сыворотке крови крыс; Г — митотический индекс гепатоцитов; * — различия при сравнении с контролем статистически значимы, р<0,05

Митотическая активность гепатоцитов

В первые сут. после резекции наблюдалось полное отсутствие делящихся гепатоцитов в оперированной печени (рис. 1Г). Наибольших значений митотический индекс гепатоцитов достигал через 48—72 ч. и через 7 сут. после субтотальной резекции (рис. 1Г).

Экспрессия генов NOTCH-сигнального пути

и NOTCH-зависимых генов

При изучении активности генов NOTCH-сигнального пути было обнаружено, что гены notchl и notch2 в печени экспериментальных животных экспрессировались на более низком уровне, чем в контроле (рис. 2А, Б). Активность notchl у животных экспериментальной группы была ниже по сравнению с контролем через 12, 48ч., а также в период 3— 10 сут. после операции (рис. 2А), активность notch2 была снижена в период 0,5—12 ч. после резекции печени (рис. 2Б).

Для оценки активности NOTCH-сигнального пути была изучена экспрессия NOTCH-зависимых генов: hesl, sox9 и yap.

С помощью ПЦР-РВ было выявлено, что активность гена sox9 повышалась через 24 ч. после субтотальной резекции печени (рис. 2В). Помимо повышенной экспрессии гена sox9, с помощью ПЦР-РВ была обнаружена повышенная экспрессия другого NOTCH-зависимого гена hesl, активность которого была выше, чем у животных контрольной группы через 3 и 6 ч. после субтотальной резекции (рис. 2Г).

Кроме классических NOTCH-зависимых генов была изучена экспрессия гена yap, который является не только NOTCH-зависимым геном, но и входит в Hippo-сигналинг, регулирующий дифференцировку гепатоцитов и холангиоцитов [6]. Через 30 мин., 7 и 10 сут. после субтотальной резекции было обнаружено статистически значимое снижение активности yap (p<0,05). Повышение экспрессии гена yap ни на одном сроке выявлено не было (рис. 2Д).

Иммуногистохимический анализ показал увеличение количества клеток, экспрессирующих SOX9 в печени после субтотальной резекции через 2 и 7 сут. после операции. На этих сроках в печени появлялось большое количество SOX9+ гепатоцитов, при этом у животных контрольной группы белок SOX9 в печени определялся исключительно в ядрах холангиоцитов

(рис. 3А, Б). При определении содержания SOX9 в регенерирующей печени методом вестерн-блота была обнаружена сходная динамика. Наибольшее количество белка SOX9 в печени было выявлено через 2 и 7 сут. после операции (рис. 3В).

NOTCH-сигнальный путь предположительно регулирует трансдифференцировку гепатоцитов в холангиоциты [3, 5]. Исходя из этого, мы изучили экспрессию белка цитокератина 19 — маркера холангиоцитов. CK19 экспрессировался исключительно в клетках в составе эпителия желчных протоков (рис. 3Г). Доля CK19+ клеток в печени оперированных животных увеличивалась по сравнению с контролем на 2—3 сут. после операции, однако эти колебания были минимальны (рис. 3Д). При изучении экспрессии CK19+ в регенерирующей печени методом ве-стерн-блота достоверных различий между группами выявлено не было (рис. 3Е).

Таким образом, мы обнаружили, что на разных сроках после субтотальной резекции в печени крыс происходит подавление экспрессии генов notchl, notch2, yap и активация таких NOTCH-зависимых генов как sox9 и hesl.

обсуждение

Изучению роли NOTCH-сигнального пути при развитии печени млекопитающих посвящено множество работ, в которых показана ключевая роль данного молекулярного каскада в дифферен-цировке холангиоцитов [3, 5]. Участию NOTCH-сигнального пути в репарации печени посвящено значительно меньше работ, которые, прежде всего, касаются восстановительных процессов при токсическом повреждении печени [5]. В этих исследованиях получены доказательства возможности трансдифференцировки гепатоцитов в направлении холангиоцитов и ключевой роли активации NOTCH-сигнального пути и связанных с ним генов в данном процессе. Нами получены данные, свидетельствующие о подавлении активности генов notchl и notch2 NOTCH-сигналинга при регенерации печени крыс после субтотальной резекции (удаление 80% тканей печени). При этом сниженная экспрессия notchl предшествовала активной пролиферации гепатоцитов, а подавление notch2 совпадало по времени с периодом наибольшей митотической активности гепатоцитов (рис. 1, 2).

А

. I

ф

Notchl

1

Б

ai ?

Notch2

контроль  эксперимент

0,5ч Зч 6ч 12ч 24ч 30ч 48ч Зсут 5сут 7сут Юсут

12ч 24ч 30ч 48ч Зсут 5сут 7суг Юсут

В

ai

Sox9

Г

ai 'г >>

jjê^jéjl

Д

Hesl

ШУйШ

0,5ч Зч 6ч 12ч 24ч 30ч 48ч Зсут 5сут 7сут Юсут

Рис. 2. Экспрессия генов NOTCH-сигнального пути: А - notchl; Б — notch2; В — sox9; Г — hesl;

Д — yap.

Белые столбцы — у животных контрольной группы, синие столбцы — у животных экспериментальной группы; * — различия при сравнении с контролем статистически значимы, p<0,05

0.5ч Зч 6ч 12ч 24ч 30ч 48ч Зсут 5сут 7сут Юсут

А Ш

Б

Г

ШШЕШШЗШ в •___ к/ • » *

-*• Л >~t

й^у'ШИ! д

•л.• - *

» •» • - •tfJW'1• • в -

в ..» Т< » V , -

. /-?:'-••• з©:

•S© 2.5 О4-

О) 2.0

g »

CD

Ч 0,5

Е

: • * .

-ГН * J. Й

сут, СК19

1 сут 2 суг 3 суг

S0X9 pTub "

5 сут 7 сут Юсут 2 сут 3 сут 7 сут 10сут

1сут 2суг Зсут

5сут 7сут Юсут к 2сут Зсут 7сут 10сут

Рис. 3. Экспрессия БОХ9 и цитокератина 19 в печени крыс после субтотальной резекции печени: А — клетки печени, продуцирующие белок БОХ9; Б — количество клеток печени (%), экспрессирующих БОХ9; В — содержание белка БОХ9 в печени оперированных крыс по данным вестерн-блота и денситометрического анализа вестерн-блота; Г — клетки печени, экспрессирующие белок цитокератин 19; Д — количество клеток печени (%), экспрессирующих цитокератин 19; Е — содержание белка цитокератина 19 в печени оперированных крыс по данным вестерн-блота и денситометрического анализа вестерн-блота. А, Г — иммуногистохимическое исследование, докраска гематоксилином. Ув.: А, Г х400; * — различия при сравнении с контролем статистически значимы, р<0,05

Таким образом, полученные нами данные согласуются с работами, в которых показано, что активация пролиферации гепатоцитов возможна только в условиях подавленной активности ЫОТСН-сигналинга [7, 8]. Несмотря на подавление генов по^Ы и поЬоЬ2 в печени после субтотальной резекции, мы обнаружили повышение экспрессии 1МОТСН-зависимых генов Ьев1 и вох9. Возможно, это связано с тем, что ген эох9 является не только 1МОТСН-зависимым, но также WNT-зависимым, и, кроме того, его экспрессия повышается под влиянием ТЭРЬ, Г0И0 [3, 14]. В свою очередь, показано, что активация гена вох9 вызывает увеличение экспрессии Нев1 [14]

БОХ9 — транскрипционный фактор, который играет важную роль в гистогенезе ряда тканей млекопитающих [15]. В постнатальном периоде онтогенеза БОХ9 экспрессируется многими малодифференциро-ванными клетками, например сперматогониями, эпи-телиоцитами дна кишечных крипт и др., поэтому

SOX9 рассматривают как маркер прогениторных клеток [16]. При этом считают, что SOX9 участвует в поддержании клетки в малодифференцированном состоянии [15]. Хорошо известно, что гепатоциты перед вступлением в митотический цикл претерпевают некоторую дедифференцировку и начинают экс-прессировать ряд маркеров гепатобластов, например а-фетопротеин [17]. Возможно, экспрессия SOX9 в гепатоцитах отражает более глубокую дедиффе-ренцировку после субтотальной резекции по сравнению с той, которая происходит при резекции печени меньшего объема. На связь экспрессии SOX9 в гепа-тоцитах и пролиферации указывает совпадение или предшествование периодов увеличенной экспрессии SOX9 и пиков митотического индекса гепатоцитов. Кроме того, роль SOX9 в пролиферации показана на линии клеток легочной аденокарциномы A549. Обнаружено, что при трансфекции геном sox9 у клеток данной линии in vitro повышается пролиферативная активность, способность к миграции и инвазии [18].

Вероятно, дедифференцировкой гепатоцитов перед вступлением в митотический цикл объясняется и увеличение экспрессии гена Ьев1, который также участвует в поддержании недифференцированного состояния клеткой [19, 20].

Однако, несмотря на обнаружение экспрессии маркеров незрелых клеток в печени после субтотальной резекции, нам не удалось обнаружить активации альтернативных путей регенерации печени (активации прогениторных клеток, трансдифференцировки гепатоцитов в холангиоциты). Об том свидетельствует распределение СК19 + , которые располагались исключительно в составе желчных протоков, как и у животных контрольной группы, а также отсутствие в тканях печени оперированных животных клеток с промежуточным между гепатоцитом и холангиоци-том фенотипом. На отсутствие трансдифференцировки гепатоцитов в холангиоциты также указывает сниженная экспрессия генов по^Ы, поЬоЬ2 и уар1, которые обычно активизированы при данном процессе [5, 6].

Таким образом, после субтотальной резекции происходило подавление активности экспрессии генов по^Ы и поЬоЬ2 1\1ОТСН-сигнального пути, что, видимо, является необходимым условием активации пролиферации гепатоцитов. Экспрессия таких ЫОТСИ-зависимых генов как вох9 и Ьев1 после субтотальной резекции в печени, повышалась, возможно, под влиянием других регуляторных каскадов и скорее свидетельствует о более глубокой дедиффе-ренцировке гепатоцитов по сравнению с той, которая наблюдается при резекции печени меньшего объема, чем об их трансдифференцировке в холангиоциты.

Благодарности

Данная работа была выполнена при финансовой поддержке РФФИ (Соглашение 14-04-01224 от 26 декабря 2013 г.) и гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых (№ 14.120.14.6233 от 3 февраля 2014 г.).

ЛИТЕРАТУРА:

1. Ortica S., Tarantino N., Aulner N. et al. The 4 Notch receptors play distinct and antagonistic roles in the proliferation and hepatocytic differentiation of liver progenitors. FASEB J. 2014; 28(2): 603-14.

2. Morell C.M., Fiorotto R., Fabris L. et al. Notch signalling beyond liver development: emerging concepts in liver repair and oncogenesis. Clin. Res. Hepatol. Gastroenterol. 2013; 37(5): 447-54.

3. Jeliazkova P., Jors S., Lee M. et al. Canonical Notch2 signaling determines biliary cell fates of embryonic hepatoblasts and adult hepatocytes independent of Hes1. Hepatology 2013; 57(6): 2469-79.

4. Zong Y., Panikkar A., Xu J. et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development 2009; 136(10): 1727-39.

5. Yanger K., Zong Y., Maggs L.R. et al. Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration. Genes Dev. 2013; 27(7): 719-24.

6. Yimlamai D., Christodoulou C., Galli G.G. et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell 2014; 157(6): 1324-38.

7. Kohler C., Bell A.W., Bowen W.C. et al. Expression of Notch-1 ond its ligand Jagged-1 in rat liver during liver regeneration. Hepatology 2004; 39(4): 1056-65.

8. Croquelois A., Blindenbacher A., Terracciano L. et al. Inducible inactivation of Notch1 causes nodular regenerative hyperplasia in mice. Hepatology 2005; 41(3): 487-96.

9. Романова Л.К. Регуляция восстановительных процессов. Москва: Издательство Московского Университета; 1984.

10. Dahm F., Georgiev P., Clavien P.A. Small-for-size syndrome after partial liver transplantation: definition, mechanisms of disease and clinical implications. Am. J. Transplant. 2005; 5(11): 2605-10.

11. Sowa J.P., Best J., Benko T. et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 2008; 14(46): 7093-100.

12. Pfaffl M.W. A New Mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001; 29(9): e45.

13. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F. et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002; 3(7): RESEARCH0034.

14. Kawaguchi Y.J. Sox9 and programming of liver and pancreatic progenitors. Clin. Invest. 2013; 123(5): 1881-6.

15. Lefebvre V., Dumitriu B., Penzo-Méndez A. et al. Control of cell fate and differentiation by Sry-related high-mobility-group box (Sox) transcription factors. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2007; 39(12): 2195-214.

16. Furuyama K., Kawaguchi Y., Akiyama H. et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, liver, exocrine pancreas and intestine. Nat. Genet. 2011; 43 (1): 34-41.

17. Michalopoulos G.K., De Frances M.C. Liver regeneration. Science 1997; 276(5309): 60-6.

18. Wang X., Ju Y., Zhou M.I. et al. Upregulation of Sox9 promotes cell proliferation, migration and invasion in lung adenocarcinoma. Oncol. Lett. 2015; 10(2): 990-4.

19. Kageyama R., Ohtsuka T., Kobayashi T. Roles of Hes genes in neural development. Dev. Growth Differ. 2008; 50 Suppl 1: S97-103.

20. Antoniou A., Raynaud P., Cordi S. et al. Intrahepatic bile ducts develop according to a new mode of tubulogenesis regulated by the transcription factor SOX9. Gastroenterology 2009; 136(7): 2325-33.

Поступила: 28.03.2016