СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, РАЗМНОЖЕНИЯ И ОЧИСТКИ ВИРУСОВ

1. Способ очистки вирусов гриппа из культуры клеток, включающий:
(f) осветление вирусного урожая путем фильтрации прямого потока (DFF), по крайней мере, через одну мембрану, которая имеет размер пор от приблизительно 1,2 микрометров до приблизительно 0,45 микрометров;
(g) концентрацию путем ультрафильтрации тангенциального потока (UF) и замену буфера путем диафильтрации (DF) после этапа (а) при использовании мембраны, имеющей отсечение молекулярного веса (MWCO) 500 кДа;
(h) очистку путем аффинной колоночной хроматография после этапа (b);
(i) концентрацию путем UF и/или замену буфера путем DF после этапа (с) при использовании мембраны, имеющей отсечение молекулярного веса (MWCO) 500 кДа; и
(j) стерилизацию после этапа (d) путем DFF, по крайней мере, через одну
мембрану, которая имеет размер пор от приблизительно 0,45 микрометров до приблизительно 0,22 микрометров,
10
где общее извлечение очищенных вирусов составляет, по крайней мере, 30%, и где очищенные вирусы включают менее чем 0,1 нг HCD, и менее чем 0,3 мкг НСР на 7,0±0,5 log БОЕ вируса.
2. Способ по п. 1, где сахарозу и фосфатный буфер прибавляют к вирусному урожаю до получения заключительной концентрации, в пределах 10% вариации, 218 мМ сахарозы, 11 мМ фосфатного буфера pH 7,0-7,4, перед этапом (а).
3. Способ по п. 1, где буфер обмена на этапе (b) включает, в пределах 10% вариации, 218 мМ сахарозы, 11 мМ фосфатного буфера pH 7,0-7,4.
4. Способ по п. 1, 2 или 3, где этапы (а) и (b) объединяют.
5. Способ по п. 1, 2 или 3, где этап (b) осуществляют при трансмембранном давлении (ТМР) от приблизительно 10 фунтов на кв. дюйм до приблизительно 20 фунтов на кв. дюйм, а скорость потока составляет от приблизительно 35 литров на метр в час (LMH) до приблизительно 50 LMH.
6. Способ по п. 1, 2 или 3, где этап (b) приводит к 5Х концентрации и замене по крайней мере 5 диаобъемов буфера.
7. Способ по п. 1, 2 или 3, где как концентрацию путем UF, так и замену буфера путем DF, осуществляют на этапе (d), что приводит, по крайней мере, к 2Х концентрации и замене по крайней мере 8 диаобъемов буфера.
8. Способ по п.п. 1, 2 или 3, где буфер обмена на этапе (d) включает, в пределах 10% вариации, 200 мМ сахарозы, 100 мМ фосфатного буфера pH 7,0-7,4.
10
10
9. Способ по п. 1, 2 или 3, где от 8,0 log БОЕ до 11 log БОЕ вирусов гриппа загружают на мл аффинной среды на этапе (с).
10
10. Способ по п. 9, где 9, 5 log БОЕ вирусов гриппа загружают на мл аффинной среды на этапе (с).
11. Способ по п. 1, 2, 3 или 10, где этап (с) дополнительно включает обработку неспецифической эндонуклеазой.
10
12. Способ по п. 11, где очищенные вирусы включают менее чем 0,0050 нг неспецифической эндонуклеазы на 7,0±0,5 log БОЕ вируса.
13. Способ по п. 1, 2, 3, 10 или 12, где сбор вируса осуществляют через 48 часов после инфицирования из клеток, инфицированных посредством внесения вируса в количестве 2000 БОЕ/мл.
2
14. Способ по п. 1, 2, 3, 10 или 12, где этап (е) осуществляют при скорости потока 25 л/мл.
10
15. Вирусы гриппа, очищенные с помощью способа по любому из п.п. 1-14 и включающие менее чем 0,1 нг HCD и менее чем 0,3 мкг НСР на7,0±0,5 log БОЕ вируса, где вирусы гриппа являются очищенными от культуры клеток млекопитающих.
10
16. Очищенные вирусы гриппа по п. 15, где очищенные вирусы включают менее чем 0,0050 нг неспецифической эндонуклеазы на 7,0±0,5 log БОЕ вируса.
17. Очищенные вирусы гриппа по п. 15 или 16, где клетки млекопитающих представляют собой MDCK клетки.
18. Иммуногенная композиция, включающая полипептиды вируса гриппа по п. 15, 16 или 17.