Композиция, содержащая олигомер производного гидроксикоричной кислоты, её применение, устройство, семена, способ повышения толерантности к стрессу растений, способ модулирования содержания пролина в растениях
COMPOSITION CONTAINING OLIGOMER OF HYDROXYCINNAMIC ACID DERIVATIVE, USE THEREOF, DEVICE, SEEDS, METHOD FOR INCREASING TOLERANCE TO PLANT STRESS, METHOD FOR MODULATING PROLINE CONTENT IN PLANTS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к биоактивной композиции для улучшения стрессоустойчивости растений. В частности, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты для улучшения устойчивости растений к абиотическим и биотическим стресс-факторам, повышения выживаемости в неблагоприятных условиях окружающей среды, достижения лучшего роста и обеспечения существенного преимущества в урожае.
Предшествующий уровень техники
Для управления растениеводством повсеместно применяются химические средства, например, удобрения или пестициды, которые обеспечивают эффективную защиту растений, но часто оказывают неблагоприятное воздействие на другие биологические компоненты окружающей среды, приводящее к необратимому нарушению равновесия. Кроме того, эти продукты могут наносить серьезный ущерб здоровью потребителей вследствие присутствия в остаточных количествах в пищевых продуктах. В связи с таким развитием событий возникает необходимость постепенного сокращения использования химических средств в сельском хозяйстве. Сегодня сельское хозяйство все в большей степени уделяет внимание качеству продуктов и также экологическим, гигиеническим и санитарным аспектам. Вследствие этого агротехнические приемы смещаются в направлении сбалансированного управления сельскохозяйственными культурами с целью обеспечения количественных и качественных свойств продукции.
В течение последнего десятилетия исследования альтернативных экологически безопасных технологий получили мощный импульс, и выдвинули широкий разнообразные предложения, включающие агрономические, физические и биологические средства контроля (Verma et al., Biochem Eng Journal. 2007, 37:1-20; Shoresh et al., Annu Rev Phytopathol. 2000, 48:21-43; Bharti et al., J Sci Food Agric. 2013, 93:2154-2161; Yeoh et al., Mol Biol Rep. 2013, 40:147-158). В этом отношении использование биопестицидов и биостимуляторов входят в число самых перспективных вариантов.
Биопестициды - это определенные типы пестицидов, полученные из природных материалов, таких как животные, растения, бактерии и некоторые минералы. Биопестициды подразделяют на три основных класса: (1) В состав микробных пестицидов в качестве действующего вещества входит микроорганизм. Например, грибы, которые борются с сорняками; (2) Инкорпорированные протектанты растений (ИПР) представляют собой пестицидные вещества, которые растения производят из введенного в них генетического материала; и (3) Биохимические пестициды - биоактивные вещества природного происхождения или полученные методом синтеза, которые структурно сходны (и функционально идентичны) своим природным аналогам. К числу наиболее широко используемых биопестицидов относятся элиситоры. В целом, биохимические биопестициды характеризуются нетоксичным механизмом действия, которое может быть пагубным для роста и развития вредителя, его способности к размножению, или для экологии вредителя.
Биостимуляторы растений - это биоактивные вещества и/или микроорганизмы, функция которых после внесения на растения или ризосферу заключается в стимуляции естественных процессов с целью повысить/улучшить усвоение питательных веществ, действенность питательных веществ, устойчивость к абиотическому стрессу и качество сельскохозяйственной культуры. Биостимуляторы способны улучшить качество и увеличить урожайность при меньших затратах, воздействуя на метаболизм растения и при этом уменьшая пагубное влияние химических веществ на окружающую среду.
Биостимуляторы не доставляют непосредственно питательные вещества в растения и не оказывают прямого воздействия на вредителей, но они повышают способность растений сопротивляться различным абиотическим и биотическим стрессам: отсутствию воды, высоким температурам, переувлажнению, засоленности, токсичным минералам или веществам, заболеваниям или вредителям (бактериям, вирусам, грибам, паразитам или вредным насекомым). Эти стрессогенные условия неблагоприятно сказываются на продукции растениеводства. Кроме того, использование биостимуляторов, даже при низких концентрациях действующего ингредиента/начала/вещества может помочь ограничить применение удобрений или пестицидов за счет улучшения роста и общей приспособленности растений. Повышение продуктивности культур с целью сокращения общего количества используемых химикатов представляет большой интерес для сельского хозяйства.
Биостимуляторы растений, в целом, относятся к одной из трех основных категорий: фитогормоны, амины и гуминовые вещества. В соответствии с вышеизложенным, примеры биостимуляторов растений включают композиции, содержащие экстракт водорослей, гуминовую кислоту, аминокислоты, салициловую кислоту, твердые вещества биологического происхождения, гидролизованные белки, силикат и/или синтезированные вещества.
Коричная кислота и ее 4-гидроксизамещенные производные (а именно, п-кумаровая кислота, кофейная кислота, феруловая кислота и синаповая кислота) образуют семейство натуральных продуктов, широко распространенных в растениях и широко известных, как циннаматы (сложные эфиры коричной кислоты). В частности, феруловая кислота, разнообразные диферуловые кислоты и даже триферулаты являются важными компонентами стенки растительной клетки у определенных растений. В клеточной стенке эти соединения этерифицированы до остатков арабинозы в составе глюкуроноарабиноксиланов, преобладающем компоненте гемицеллюлозного матрикса. Например, феруловая кислота считается основным фенольным сшивающим агентом в клеточной стенке травянистых растений, который важен для растяжимости клеточной стенки (Carpita N.С. Аnnu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996, 47:445-476).
Олигомеры коричной кислоты известны в качестве противовоспалительных агентов, ингибиторов эластазы и антиоксидантов. Например, в патенте WO 2010/027594 описано использование таких олигомеров в качестве антикоагулянтов.
Феруловая кислота тоже известна в качестве антиоксиданта. Например, в заявке на патент US 2004/259732 описаны композиции для улучшения урожайности растения, включающие феруловую кислоту и ее производные.
В заявке на патент JP-H-10338603 описана коричная кислота, как вещество, используемое для предотвращения гибели листьев и корней, вызываемой патогенными бактериями. В заявке WO 03/000288 тоже описаны композиции, индуцирующие в растении эндогенные реакции, защищающие от патогенов, и такие композиции содержат феруловую кислоту. В дополнение к этому Li et al. (Biologia Plantarum. 2013, 57(4):711-717) показали, что проростки огурца, которых в течение 2 дней поливали питательной смесью Хогланда, содержащей феруловую кислоту, могут защитить растения стресса, вызванного обезвоживанием.
Однако коричная и феруловая кислота в течение нескольких лет описываются, как фитотоксичные вещества (Turner et al., Journal of Chemical Ecology. 1975, 1(1):41-58; Rasmussen et al., Journal of Chemical Ecology. 1977, 3(2):197-205; Liebl et al, Journal of Chemical Ecology. 1983, 9(8):1027-1043; Blum et al., Journal of chemical ecology. 1984, 10(8):1169-1191), и используются многими растениями в качестве аллелохимических ингибиторов (Einhellig et al., Journal of chemical ecology. 1984, 10(1):161-170; Dos Santos et al., Journal of Chemical Ecology. 2004, 30(6):1203-1212; Yu et al., Journal of Chemical Ecology. 1994, 20(1):21-31; Lehman et al., Journal of Chemical Ecology. 1999, 25(11):2585-2600).
Заявители неожиданно обнаружили, что олигомерные производные гидроксикоричной кислоты стимулируют рост и развитие растения в разнообразных стрессовых условиях, в частности, при неблагоприятных условиях окружающей среды, например, при засухе или минеральном стрессе. Такой эффект готовности к засухам, опосредованный стимуляцией роста, усиливает эффективность использования воды при ряде стрессов, вызываемых засухой, от сезонного, легкого стресса, вызванного недостатком воды, до сильной, продолжительной засухи. Такой диапазон стрессовых ситуаций, вызванных дефицитом воды, обычно сопровождается тепловым стрессом.
Таким образом, настоящее изобретение относится к композиции для улучшения стрессоустойчивости, содержащей, по меньшей мере одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты.
Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты, при этом вышеупомянутая композиция содержит не более 3% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции, предпочтительно, не более 2%, более предпочтительно - не более 1%.
В одном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно производное гидроксикоричной кислоты выбирают из группы, состоящей из феруловой кислоты, п-кумаровой кислоты, кофейной кислоты и синаповой кислоты.
В одном из вариантов осуществления изобретения композиция согласно изобретению дополнительно включает, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость в воде.
Настоящее изобретение также относится к композиции для улучшения стрессоустойчивости растений, содержащей, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты. В одном варианте осуществления изобретения, по крайне мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты согласно изобретению имеет степень полимеризации не менее 2.
В одном варианте осуществления изобретения, указанное, по меньшей мере, одно производное гидроксикоричной кислоты выбирают из группы, состоящей из феруловой кислоты, п-кумаровой кислоты, кофейной кислоты и синаповой кислоты. В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один олигомер феруловой кислоты, предпочтительно, диферуловую кислоту.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит от 0,0001 до 200 ч/млн (частей на миллион) указанного, по меньшей мере, одного олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, предпочтительно, от 0,001 до 100 ч/млн, более предпочтительно от 0,005 до 50 ч/млн.
В одном варианте осуществления изобретения композиция, улучшающая стрессоустойчивость согласно изобретению, содержит не более 3% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции, предпочтительно, не более 2%, более предпочтительно - не более 1%.
В другом варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не менее 10% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции, предпочтительно не менее 20%, более предпочтительно не менее 30%.
Еще в одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не менее 70% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции, предпочтительно не менее 75%, более предпочтительно не менее 80%.
Согласно одному варианту осуществления изобретения композиция используется для улучшения стрессоустойчивости растения, причем такой стресс бывает абиотическим или биотическим. В одном варианте осуществления изобретения указанный абиотический стресс выбирают из группы, включающей водный стресс, засуху, осмотический стресс, тепловой стресс, недостаточность питательных веществ и химический стресс, созданный загрязнением почвы, в которой растет указанное растение, металлами или органическими поллютантами, предпочтительно, водный стресс, засуха или осмотический стресс.
Настоящее изобретение также относится к композиции для улучшения стрессоустойчивости растения, как описано выше, дополнительно содержащей, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость в воде.
В одном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость в воде согласно изобретению, выбирают из группы, состоящей из полисахаридов и полиолов. В частном случае осуществления изобретения указанный, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость в воде, является полисахаридом, который выбирают из группы, состоящей из хитозана, хитина, хитин-глюкана, карбоксиметилцеллюлозы, пектина, гемицеллюлозы, предпочтительно, хитозаном.
Другой целью изобретения является распыленная жидкость, содержащая описанную выше композицию.
Настоящее изобретение дополнительно относится к семени или растению, причем указанное семя покрыто описанной выше композицией.
Другой целью изобретения является использование композиции, содержащей, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты, для улучшения стрессоустойчивости растения.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу улучшения стрессоустойчивости растения, заключающемуся в нанесении описанной выше композиции.
Определения
Если не указано иное, все термины в описании изобретения, включая технические и научные термины, имеют значения, понятные для специалиста в области, к которой относится данное изобретение. Определения терминов включены в следующие указания, чтобы лучше понять идеи настоящего изобретения. В тех случаях, когда отдельные термины определены в связи с отдельным аспектом или вариантом осуществления изобретения, это означает, что такой оттенок значения должен применяться ко всему описанию, т.е. также в контексте других аспектов или вариантов осуществления изобретения, если не определено иное.
В настоящем изобретении представленные ниже термины имеют в точности следующие значения:
- Термин «Олигомер» относится к макромолекуле, состоящей из нескольких повторяющихся мономерных единиц, связанных друг с другом. В одном варианте осуществления изобретения олигомеры согласно изобретению состоят из двух, трех, четырех или более мономеров. В одном из вариантов осуществления изобретения олигомеры представляют собой димеры, тримеры, тетрамеры или гомомеры большего размера.
- «Степень полимеризации» относится к числу мономерных единиц в олигомере согласно изобретению. В одном варианте осуществления изобретения степень полимеризации, по меньшей мере, одного олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, составляет не менее 2.
- «Олигоферулат» относится к олигомеру феруловой кислоты, также называемому олигомером ферулата. Димер феруловой кислоты, в частности, представляет собой олигомер, состоящий из двух мономеров феруловой кислоты, соединенных связями. Димер феруловой кислоты может быть также назван диферуловой кислотой или диферулатом.
- «Улучшение» в контексте настоящего изобретение можно заменить на стимулирование, увеличение, усиление и т.п.
- «Устойчивость» относится к способности растения переносить стресс, не испытывая существенных изменений метаболизма, роста, продуктивности и/или жизнеспособности. В одном варианте осуществления изобретения стресс может быть абиотическим или биотическим.
- «Абиотический стресс» относится к стрессу, происходящему в результате влияния неживых факторов на окружающую среду, в которой живет растение.
- «Биотический стресс» относится к стрессу, происходящему в результате повреждения, нанесенного растениям другими живыми организмами, например, бактериями, вирусами, грибами, паразитами, полезными или вредными насекомыми, сорняками и культурными или дикорастущими растениями.
- «ч/млн» означает «частей на миллион, т.е. одна часть на 1000000 частей.
- «Около» перед значением означает плюс/минус 10% от указанного значения.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты.
В контексте настоящего документа термин «производное гидроксикоричной кислоты» означает фенольные или полифенольные соединения, возникающее в результате мевалонатно-шикиматных путей биосинтеза у растений. Такая фенолокислотная группа включает, например, без ограничения, феруловую кислоту, кофейную кислоту, п-кумаровую кислоту, хлоргеновую кислоту, синаповую кислоту, куркумин и розмариновую кислоту. В одном варианте осуществления изобретения производным гидроксикоричной кислоты является моногидроксикоричная кислота, дигидроксикоричная кислота, тригидроксикоричная кислота, метилированная гидроксикоричная кислота или сложный эфир либо конъюгат производного гидроксикоричной кислоты. В одном варианте осуществления изобретения производные гидроксикоричной кислоты согласно изобретению не включают продукты гидролиза.
В одном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в составе композиции согласно изобретению является олигомером моногидроксикоричной кислоты. Примеры моногидроксикоричных кислот включают, не ограничиваясь перечисленным, кумаровые кислоты, такие как, например, п-кумаровая кислота (4- гидроксикоричная кислоты), о-кумаровая кислота (2-гидроксикоричная кислота) и м-кумаровая кислота (3-гидроксикоричная кислота), или смесь этих кислот.
В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в составе композиции согласно изобретению является олигомером дигидроксикоричной кислоты. Примеры дигидроксикоричных кислот включают, не ограничиваясь перечисленным, кофейную кислоту (3,4-дигидроксикоричную кислоту), умбелловую кислоту (2,4-дигидроксикоричную кислоту), 2,3-дигидроксикоричную кислоту, 2,5-дигидроксикоричную кислоту и 3,5-дигидроксикоричную кислоту, или смесь этих кислот.
В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в составе композиции согласно изобретению является олигомером тригидроксикоричной кислоты. Примеры тригидроксикоричных кислот включают, не ограничиваясь перечисленным, 3,4,5-тригидроксикоричную кислоту и 3,4,6-тригидроксикоричную кислоту, или смесь этих кислот.
В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в композиции согласно изобретению является олигомером метилированной кислоты. Примеры метилированных гидроксикоричных кислот включают, не ограничиваясь перечисленным, феруловую килоту (3-метокси-4-гидроксикоричную кислоту), 5-гидроксиферуловую кислоту и синаповую кислоту (3,5-диметокси-4-гидроксикоричную кислоту), или смесь этих кислот.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не менее одного сложного эфира или конъюгата олигомерного производного гидроксикоричной кислоты. Примеры сложных эфиров или конъюгатов производных гидроксикоричной кислоты включают, не ограничиваясь перечисленным, кафтаровую кислоту, цикориевую кислоту, хлоргеновую кислоту и кутаровую кислоту, или смесь этих кислот.
В одном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно производное гироксикоричной кислоты согласно изобретению выбирают из группы, состоящей из феруловой кислоты, кумаровой кислоты, кофейной кислоты и синаповой кислоты или смеси этих кислот. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно производное гироксикоричной кислоты согласно изобретению является феруловой кислотой или кумаровой кислотой или смесью этих кислот. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно производное гироксикоричной кислоты согласно изобретению является феруловой кислотой или п-кумаровой кислотой, или смесью этих кислот.
В одном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты из композиции согласно изобретению выбирают из группы, состоящей из олигомеров феруловой кислоты, олигомеров кумаровой кислоты, олигомеров кофейной сиклоты и олигомеров сигаповой кислоты или из смеси перечисленных олигомеров. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты из композиции согласно изобретению является олигомером феруловой кислоты или олигомером кумаровой кислоты, или смесью этих олигомеров. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты из композиции согласно изобретению является олигомером феруловой кислоты или олигомером п-кумаровой кислоты или смесью этих олигомеров.
В одном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты композиции согласно изобретению имеет степень полимеризации не менее 2.
В одном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты из композиции согласно изобретению 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или выше. Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты из композиции является димером, триммером, тетрамером, пентамером, гексамером, гептамером, октамером, нонамером, декамером или содержит большее число мономеров. В частном случае осуществления изобретения, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты из композиции является димером.
Согласно одному варианту осуществления изобретения, композиция содержит димер феруловой кислоты (также называемый диферуловой кислотой или диферулатом). В одном варианте осуществления изобретения композиция не содержит феруловую кислоту.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит смесь олигомерных производных гидроксикоричной кислоты, имеющих разные степени полимеризации. Например, не ограничиваясь перечисленным, композиция может содержать смесь димеров, триммеров, тетрамеров, гексамеров феруловой кислоты или соответствующих соединений с более высокой степенью полимеризации.
Коричная кислоты и ее производные, в частности, феруловая кислота, являются природными соединениями, которые в больших количествах присутствуют в растениях. Например, концентрация мономерной феруловой кислоты в растениях 2-4-кратно превышает общую концентрацию диферуловых олигомеров (Phytochemistry. 2014, 102:126-136). Известно также, что олигомеры коричной кислоты и ее производные в природных условиях встречаются в гораздо меньших количествах, т.е. в стенках растительных клетках мономерные соединения существенно преобладают над другими формами, например, димерами или тримерами.
Вследствие этого в одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не более 10% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не более приблизительно 9%, 8%, 7%, 6%, 5% или 4% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не более 3% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции, предпочтительно не более 2%, более предпочтительно не более 1%.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не более приблизительно 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% или 0,1% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции.
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции, предпочтительно от приблизительно 0,03% до приблизительно 0,3%, более предпочтительно от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,1%, еще более предпочтительно от приблизительно 0,07% до приблизительно 0,09%.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не более 10% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не более приблизительно 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, или 4% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не более 3% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции, предпочтительно не более 2%, более предпочтительно не более 1%.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не более приблизительно 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2% или 0,1% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции.
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции, предпочтительно от приблизительно 0,03% до приблизительно 0,3%, более предпочтительно от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,1%, еще более предпочтительно от приблизительно 0,07% до приблизительно 0,09%.
В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению по существу не содержит мономерного производного гидроксикоричной кислоты.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению не содержит мономерного производного гидроксикоричной кислоты. Соответственно, в частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению не содержит феруловой кислоты, кумаровой кислоты, кофейной кислоты или синаповой кислоты.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не менее 30% олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция содержит не менее 35% олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции, предпочтительно не менее 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65%.
В другом варианте осуществления изобретения, композиция содержит не менее 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция содержит не менее 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты, и, по меньшей мере, одно мономерное производное гидроксикоричной кислоты, при этом отношение, по меньшей мере, одного олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, к, по меньшей мере, одному мономерному производному гидроксикоричной кислоты составляет не менее 2. Другими словами, в одном варианте осуществления изобретения содержание олигомерного производного гидроксикоричной кислоты в композиции не менее чем вдвое превышает содержание мономерного производного гидроксикоричной кислоты.
В частном случае осуществления изобретения отношение, по меньшей мере, одного олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, к, по меньшей мере, одному мономерному производному гидроксикоричной кислоты составляет не менее 5 или 10, в одном варианте осуществления изобретения отношение, по меньшей мере, одного олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, к, по меньшей мере, одному мономерному производному гидроксикоричной кислоты составляет не менее 15, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 или более.
В одном варианте осуществления изобретения отношение олигомерного производного гидроксикоричной кислоты к мономерному производному гидроксикоричной кислоты в композиции согласно изобретению составляет не менее 30:1, предпочтительно не менее 31:1, более предпочтительно не менее 32:1. В одном варианте осуществления изобретения отношение олигомерного производного гидроксикоричной кислоты к мономерному производному гидроксикоричной кислоты в композиции согласно изобретению составляет приблизительно 30:1, приблизительно 31:1 или 32:1.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не менее 30% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции, предпочтительно не менее 35%, более предпочтительно не менее 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65%.
В другом варианте осуществления изобретения, композиция содержит не менее 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция содержит не менее 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не менее 30% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция содержит не менее 35% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции, предпочтительно не менее 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65%.
В другом варианте осуществления изобретения, композиция содержит не менее 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция содержит не менее 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не более приблизительно 3% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции, и не менее 70% олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, предпочтительно димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции.
В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не более приблизительно 1% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции, и не менее 75% олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, предпочтительно димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции.
В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции, предпочтительно от приблизительно 0,03% до приблизительно 0,3%, более предпочтительно от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,1%, еще более предпочтительно от приблизительно 0,07% до приблизительно 0,09%; и не менее 80% олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, предпочтительно димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции, предпочтительно не менее 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% или более.
В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит от приблизительно 0,07% до приблизительно 0,09% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции; и не менее 80% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания компонентов композиции, предпочтительно не менее 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% или более.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не более приблизительно 3% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции, и не менее 70% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции.
В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит не более приблизительно 1% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции, и не менее 75% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции.
В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции, предпочтительно от приблизительно 0,03% до приблизительно 0,3%, более предпочтительно от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,1%, еще более предпочтительно от приблизительно 0,07% до приблизительно 0,09%; и не менее 80% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции, предпочтительно не менее 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%о, 90% или более.
В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит от приблизительно 0,07% до приблизительно 0,09% мономерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции; и не менее 80% димерного производного гидроксикоричной кислоты, выраженных в процентах от общего содержания олигомерных производных гидроксикоричной кислоты в композиции, предпочтительно не менее 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% или более.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению представляет собой водную композицию.
Эффективная концентрация олигомерного производного гидроксикоричной кислоты в композиции согласно изобретению будет варьировать в зависимости от типа олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, обрабатываемой культуры, силы стрессового воздействия (например, засухи), желаемого результата и стадии жизненного цикла растительных культур, в числе других факторов.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации от 0,0001 до 200 ч/млн (частей на миллион), предпочтительно от 0,001 до 100 ч/млн, более предпочтительно от 0,005 до 50 ч/млн.
В другом варианте осуществления изобретения, композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации от 1 до 200 ч/млн, предпочтительно от 5 до 100 ч/млн, более предпочтительно от 10 до 50 ч/млн. В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации приблизительно 15 или 16 ч/млн. В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации около 50 ч/млн.
В другом варианте осуществления изобретения, композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации от 0,0001 до 10 ч/млн, предпочтительно от 0,001 до 5 ч/млн, более предпочтительно от 0,005 до 2.5 ч/млн.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации от 0,0001 до 200 мг/л, предпочтительно от 0,001 до 100 мг/л, более предпочтительно от 0,005 до 50 мг/л. В другом варианте осуществления изобретения, композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации от 1 до 200 мг/л, предпочтительно от 5 до 100 мг/л, более предпочтительно от 10 до 50 мг/л. В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации около 15 или 16 мг/л. В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации около 50 мг/л. В другом варианте осуществления изобретения, композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации от 0,0001 до 10 мг/л, предпочтительно от 0,001 до 5 мг/л, более предпочтительно от 0,005 до 2.5 мг/л.
-8
-2%
-7
-2%
-7
-3%
-4
-2
-4
-2
-3
-3
-3
-3
-3
-8
-3
-7
-4%
-7
-4%
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации от 1.10 до 2.10, предпочтительно от 1.10 до 1.10, более предпочтительно от 5.10 до 5.10. В другом варианте осуществления изобретения, композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации от 1.10 до 2.10%, выраженной в весовых процентах относительно общей массы композиции, предпочтительно от 5.10 до 1.10%, более предпочтительно от 1.10 до 5.10%. В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации около 1.5.10 или 1.6.10%, выраженной в весовых процентах относительно общей массы композиции. В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации около 5.10%, выраженной в весовых процентах относительно общей массы композиции. В другом варианте осуществления изобретения, композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации от 1.10 до 1.10%, выраженной в весовых процентах относительно общей массы композиции, предпочтительно от 1.10 до 5.10, более предпочтительно от 5.10 до 2.5.10.
Композиция согласно изобретению может дополнительно содержать компонент рецептуры, выбранный из группы, включающей: разбавители, буферные агенты, поверхностно-активные вещества (диспергирующие вещества, противовспенивающие или пеногасящие вещества, лиофилизирующий агент, усилители проникновения с адъювантом осаждения или смачивающие агенты), противозамерзающие агентоы (мочевина, этиленгликоль, пропиленгликоль или глицерол), консерванты (сорбат калия, парабен или производные парабена, 1,2-бензотиазол-3(2Н)-он или эфирные масла), абсорбирующие агенты (включая отходы кукурузы(?) или древесные опилки), загустители (включая глины или ксантановую камедь), адгезивные вещества (включая латекс, силикон или алкоксилированный алкил), адъювант для защиты растений, или смесь перечисленных агентов.
Согласно одному варианту осуществления изобретения, композиция согласно изобретению дополнительно содержит разбавитель. В контексте данного документа термин «разбавитель» означает водный или неводный раствор, который используют для разбавления по меньшей мере, одного олигомерного производного гидроксикоричной кислоты, содержащегося в композиции. Примеры разбавителей включают, не ограничиваясь перечисленным, воду, солевой раствор, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, этанол, масло и т.п.
Согласно одному варианту осуществления изобретения, композиция согласно изобретению дополнительно содержит буферный агент. В контексте данного документа термин «буферный агент» означает водный раствор, содержащий смесь кислот и оснований, которая используется для стабилизации рН композиции. Примеры буферных агентов включают, не ограничиваясь перечисленным, трис (тригидроксиметиламинометан), фосфат, карбонат, ацетат, цитрат, гликолят, лактат, борат, тартрат, каркодилат, этаноламин, глицин, имидазол и т.п.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению имеет кислый рН. В контексте данного документа термин «кислый рН» означает значение рН меньше или равное 7. В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению имеет рН меньше или равный 6. В одном частном случае осуществления изобретения, композиция согласно изобретению имеет рН около 5.5.
Согласно одному варианту осуществления изобретения, композиция согласно изобретению дополнительно содержит органическую кислоту. В контексте данного документа термин «органическая кислота» означает органическое вещество с кислотными свойствами. Предпочтительной органической кислотой является карбоновая кислота. Примеры органических кислот включают, не ограничиваясь перечисленным, молочную кислоту, янтарную кислоту, яблочную кислоту и лимонную кислоту. В одном частном случае осуществления изобретения, композиция согласно изобретению содержит молочную кислоту.
Изобретение также относится к описанной выше композиции, дополнительно содержащей не менее одного агента, улучшающего растворимость, предпочтительно, агента, улучшающего растворимость в воде.
В контексте данного документа термин «агент, улучшающий растворимость в воде», означает вещество, которое делает растворимым или лучше растворимым в воде, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты согласно изобретению.
В одном варианте осуществления изобретения агент, улучшающий растворимость, предпочтительно агент, улучшающий растворимость в воде, выбирают из группы, состоящей из положительно или отрицательно заряженного биополимера, полисахаридов и полиолов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения агент, улучшающий растворимость, предпочтительно агент, улучшающий растворимость в воде, является полисахаридом или сульфатированным полисахаридом. В одном варианте осуществления изобретения полисахарид или сульфатированный полисахарид положительно заряжен.
В одном варианте осуществления изобретения агент, улучшающий растворимость, предпочтительно агент, улучшающий растворимость в воде, является полисахаридом, который выбирают из группы, состоящей из хитозана, хитина, хитин-глюкана, карбоксиметилцеллюлозы, пектина, гемицеллюлозы. В частном случае осуществления изобретения агент, улучшающий растворимость, предпочтительно агент, улучшающий растворимость в воде, является хитозаном или хитин-глюканом.
В одном варианте осуществления изобретения агент, улучшающий растворимость, предпочтительно агент, улучшающий растворимость в воде, является полиолом, который выбирают из группы, состоящей из маннитола и сорбитола.
Согласно одному варианту осуществления изобретения композиция содержит диферуловую кислоту (диферулат) и полисахарид, предпочтительно, катионный полисахарид. Согласно предпочтительнмоу варианту осуществления изобретения композиция содержит диферуловую кислоту (диферулат) и хитозан.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость, в концентрации от 0,01 до 10%, выраженной в весовых процентах относительно общей массы композиции, предпочтительно от 0,05 до 5%, более предпочтительно от 0,1 до 2%. В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость, в концентрации около 0,4%. В одном частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость, в концентрации около 0,5%.
В другом варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость, в концентрации от 100 до 100000 ч/млн, предпочтительно от 500 до 50000 ч/млн, более предпочтительно от 1000 до 20000 ч/млн. В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость, в концентрации около 4000 ч/млн. В другом частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость, в концентрации около 5000 ч/млн.
-6
-3
-6
-3%
-5
-4
-5
-4
В другом варианте осуществления изобретения, композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость, в концентрации от 1.10 до 2.10%, предпочтительно от 5.10 до 1.10, более предпочтительно от 1.10 до 5.10%. В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость, в концентрации от 5.10 до 2,5.10%.
В другом варианте осуществления изобретения, композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость, в концентрации от 0,01 до 20 ч/млн, предпочтительно от 0,05 до 10 ч/млн, более предпочтительно от 0,1 до 5 ч/млн. В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость, в концентрации от 0,5 до 2,5 ч/млн.
Согласно одному варианту осуществления изобретения олигомерные производные гидроксикоричной кислоты получают "in situ" путем катализируемой ферментами полимеризации олигомерного производного гидроксикоричной кислоты в присутствии описанного выше агента, улучшающего растворимость. В этом случае агент, улучшающий растворимость, выполняет также функцию матрицы, контролирующей реакцию полимеризации. В частном случае осуществления изобретения агентом, улучшающим растворение и выполняющим функцию матрицы, является хитозан, и ферментом является лакказа.
Согласно одному варианту осуществления изобретения, композиция согласно изобретению может дополнительно содержать биостимулирующий агент, регуляторы роста растений или гормоносодержащие продукты, известные специалистам и применяемые для улучшения стрессоустойчивости растений, например, гуминовую кислоту, фульвовые кислоты, фукоидан, антитранспиранты, олигосахариды и т.п.
Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции для улучшения устойчивости растений в неблагоприятных условиях окружающей среды, содержащей, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты. В одном варианте осуществления изобретения неблагоприятные условия окружающей также названы стрессом.
В одном варианте осуществления изобретения стрессом, устойчивость к которому улучшается при использовании композиции согласно изобретению, является анабиотический стресс или биотический стресс.
В контексте данного документа термин «устойчивость» можно заменить на сопротивляемость или защиту, предохранение, поддержку, силу, выносливость, стойкость, жизнеспособность, способность к восстановлению, противоборство и т.п.
Согласно одному варианту осуществления изобретения, абиотический стресс может быть водным стрессом, засухой, осмотическим стрессом, тепловым стрессом, недостаточностью питательных веществ и химическим стрессом, созданным металлами или органическими поллютантами в почве, в которой растет указанное растение. В предпочтительном варианте осуществления изобретения абиотический стресс выбирают из группы, включающей водный стресс, засуху и осмотический стресс.
Засухоустойчивость (сопротивляемость засухе) - обобщенное понятие, соответствующее различным типам реакций, включающих засухоустойчивость (избегание обезвоживания), переносимость засухи и восстановление (восстановление после засухи). В данном случае понятие распространяется также на нерегулярный дождь и временное отсутствие воды (например, связанное с изменениями окружающей среды, вызванными глобальным потеплением).
В одном варианте осуществления изобретения композиция, содержащая, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты, используется для улучшения устойчивости растения к водному стрессу. В другом варианте осуществления изобретения композиция, содержащая, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты, используется для улучшения устойчивости растения к засухе. В другом варианте осуществления изобретения композиция, содержащая, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты, используется для улучшения устойчивости растения к осмотическому стрессу.
В одном варианте осуществления изобретения композиция для улучшения устойчивости растения к водному стрессу, содержит диферулат. В другом варианте осуществления изобретения композиция для улучшения устойчивости растения к засухе, содержит диферулат. В другом варианте осуществления изобретения композиция для улучшения устойчивости растения к осмотическому стрессу, содержит диферулат.
Согласно другому варианту осуществления изобретения, биотический стресс может быть вызван бактериями, вирусами, грибами, паразитами, полезными насекомыми, вредными насекомыми, сорняками, культурными растениями или дикорастущими растениями.
В одном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в композиции согласно изобретению, не используется как антиоксидант.
В одном варианте осуществления изобретения растением согласно изобретению является однодольное растение. В другом варианте осуществления изобретения растением согласно изобретению является двудольное растение.
В одном варианте осуществления изобретения растение согласно изобретению выбирают из группы, включающей хлопчатник, лен, виноградную лозу, фруктовые, овощные культуры, большинство садовых и лесных культур, таких как: Rosaceae sp., Ribesioidae sp., Juglandaceae sp., Betulaceae sp., Anacardiaceae sp., Fagaceae sp., Moraceae sp., Oleaceae sp., Actinidaceae sp., Lauraceae sp., Musaceae sp., Rubiaceae sp., Theaceae sp., Sterculiceae sp., Rutaceae sp., Solanaceae sp., Vitaceae sp.Liliaceae sp., Asteraceae sp., Umbelliferae sp., Cruciferae sp., Chenopodiaceae sp., Cucurbitaceae sp., Papilionaceae sp., such as Graminae sp., Fabacae sp., и также генетически модифицированные гомологи этих культур.
В одном варианте осуществления изобретения растение является продовольственной культурой, которую выбирают из группы, состоящей из пшеницы, риса, кукурузы, сои, картофеля, ячменя, овса, шпорчатой фасоли и проса. В другом варианте осуществления изобретения растение является овощной культурой, которую выбирают из группы, состоящей из томата, редиса, кресса, огурца, капусты, арбуза, дыни, капусты, китайской капусты, лука-шалота, лука, моркови, цукини и Arabidopsis thaliana. В другом варианте осуществления изобретения растение является плодовой культурой, которую выбирают из группы, состоящей из яблони, груши, финиковой пальмы, персика, киви, винограда, апельсина, хурмы, сливы, абрикоса, банана и мандарина. В другом варианте осуществления изобретения растение является культурой специального назначения, которую выбирают из группы, состоящей из горчицы, женьшеня, табака, хлопчатника, кунжута, сахарного тростника, арахиса и рапса. В другом варианте осуществления изобретения растение является цветочной культурой, которую выбирают из группы, состоящей из розы, герберы, гладиолуса, гвоздики, хризантемы, лилия и тюльпана. В другом варианте осуществления изобретения растение является кормовой культурой, которую выбирают из группы, состоящей из райграса, красного клевера, ежи сборной, люцерны и овсяницы тростниковой.
В одном варианте осуществления изобретения растение выбирают из группы, состоящей из томата, редиса, пшеницы, кресса, горчицы, сои и Arabidopsis thaliana. В частном случае осуществления изобретения растением является томат. В другом варианте осуществления изобретения растением является редис. В другом варианте осуществления изобретения растением является пшеница. В другом варианте осуществления изобретения растением является кресс. В другом варианте осуществления изобретения растением является горчица. В другом варианте осуществления изобретения растением является соя. В другом варианте осуществления изобретения растением является Arabidopsis thaliana.
Другой целью изобретения является использование описанной в настоящем документе композиции, содержащей, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты, для улучшения стрессоустойчивости растения. В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению используется в качестве биостимулятора для улучшения стрессоустойчивости растения. В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению является композицией-биостимулятором для улучшения стрессоустойчивости растения. В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению используется в качестве биопестицида для улучшения стрессоустойчивости растения. В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению является биопестицидной композицией для улучшения стрессоустойчивости растения.
Композиция согласно изобретению может быть получена в виде препаративной формы, такой как, например, эмульсия, масло, гидрат, порошок, гранулы, таблетки, аэрозоль, суспензия и т.п.. В одном варианте осуществления изобретения в препаративную форму при необходимости могут быть включены эмульгирующий агент, суспендирующий агент, лиофилизирующий агент, пропиточный агент, смачивающий агент, загущающий агент и/или стабилизатор. В одном варианте осуществления изобретения препаративная форма согласно изобретению может быть получена известным специалисту способом.
Согласно одному варианту осуществления изобретения композиция или препаративная форма согласно изобретению могут быть нанесены на растения с использованием различных средств: распылителей, пульверизаторов, капельного орошения, погружения, пропитывания, дражирования, орошения и обработки маслом, не ограничиваясь перечисленным.
Согласно одному варианту осуществления изобретения композицию или препаративную форму согласно изобретению вносят в жидкой форме. Примеры жидких форм внесения включают, не ограничиваясь перечисленным: распыление на наземные части растения, распыление на дерн, бороздовое распыление, погружение сеянцев, пропитывание сеянцев, погружение корней, пропитывание корней, пропитывание стеблей, пропитывание клубней, пропитывание плодов, пропитывание почвы, капельное орошение почвы и почвенные инъекции.
Согласно другому варианту осуществления изобретения композицию или препаративную форму согласно изобретению вносят в сухом виде. Примеры сухих форм внесения включают, не ограничиваясь перечисленным, гранулы, микрогранулы, порошки, пеллеты, палочки, хлопья, кристаллы и крошки.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению адаптирована для нанесения на растение. В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению адаптирована для распыления на растение. В другом варианте осуществления изобретения, композиция согласно изобретению адаптирована для покрытия частей растения. В частном случае осуществления изобретения композиция согласно изобретению является композицией для нанесения покрытия, предпочтительно, композицией для нанесения покрытия на семена.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению должна быть нанесена на растение. В одном варианте осуществления изобретения композицию можно наносить на надземные органы растения, например, на листья и стебли. В другом варианте осуществления изобретения композиция может быть внесена на подземные органы растения, например, на корни. В другом варианте осуществления изобретения композиция может быть нанесена на семена.
В одном варианте осуществления изобретения композицию согласно изобретению следует нанести на растение перед посадкой. В одном варианте осуществления изобретения композицией покрывают семена растений перед посевом.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению может быть нанесена без каких-либо добавок или в разбавленном виде.
В одном варианте осуществления изобретения концентрация композиции согласно изобретению зависит от способа внесения. В одном варианте осуществления изобретения композицию согласно изобретению делают менее концентрированной, когда композицию адаптируют для распыления на растение, по сравнению ситуациями, когда композиция предназначена для нанесения покрытия, предпочтительно, когда композиция предназначена для нанесения покрытия на семена. В контексте данного документа термин «менее концентрированная» означает, что когда композицию адаптируют для распыления на растение, композиция является, по меньшей мере, в 2 раза менее концентрированной по сравнению с композицией, которую используют для нанесения покрытий, в частности, композицией для нанесения покрытия на семена, предпочтительно, не менее чем в 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз менее концентрированной.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации от 0,0001 до 10 ч/млн, предпочтительно от 0,001 до 5 ч/млн, более предпочтительно от 0,005 до 2.5 ч/млн, когда композиция адаптирована для распыления на растение. В другом варианте осуществления изобретения, композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты в концентрации от 1 до 200 ч/млн, предпочтительно от 5 до 100 ч/млн, более предпочтительно от 10 до 50 ч/млн, когда композиция предназначена для нанесения покрытия, предпочтительно, когда композиция предназначена для нанесения покрытия на семена.
В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость, в концентрации от 0,01 до 20 ч/млн, предпочтительно от 0,05 до 10 ч/млн, предпочтительно от 0,1 до 5 ч/млн, более предпочтительно от 0,5 до 2.5 ч/млн, когда композиция адаптирована для распыления на растение. В другом варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению содержит по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость, в концентрации от 0,01 до 10%, выраженном в весовых процентах относительно общей массы композиции, предпочтительно от 0,05 до 5%, более предпочтительно от 0,1 до 2%, когда композиция предназначена для нанесения покрытия, предпочтительно, когда композиция предназначена для нанесения покрытия на семена.
Другой целью изобретения является аппарат для мелкодисперсного разбрызгивания композиции согласно изобретению в условиях разбрызгивания, подходящих для распыления на растение. В одном варианте осуществления изобретения аппарат представляет собой распылитель, содержащий описанную выше композицию согласно изобретению. В одном варианте осуществления изобретения распылителем согласно изобретению может быть аэрозольный распылитель. В контексте данного документа, аэрозольный распылитель - это распылитель, используемый вместе с контейнером, который может содержать жидкости под давлением, например, банка, бутыль или резервуар.
В одном варианте осуществления изобретения распылитель согласно изобретению может применяться вручную. Примеры применения распылителя вручную включают, не ограничиваясь перечисленным, бутыли с ручным насосом для опрыскивания и опрыскиватель на конце шланга. В другом варианте осуществления изобретения распылитель согласно изобретению может быть использован механически. Примеры механического использования распылителя, не ограниваясь перечисленным, самоходный опрыскиватель для пропашных культур.
В одном варианте осуществления изобретения распылитель согласно изобретению является распылителем для внесения на надземные части растения. В одном варианте осуществления изобретения композиция согласно изобретению является распыляемой композицией.
Другой целью изобретения является покрытие семян растения описанной выше композицией. Настоящее изобретение включает описанные выше семена описанных выше растений с улучшенной стрессоустойчивостью.
Настоящее изобретение относится также к способу улучшения стрессоустойчивости растения, заключающимся в нанесении на растение описанной выше композиции.
Настоящее изобретение относится также к способу улучшения стрессоустойчивости растения, заключающимся в нанесении на растение композиции, содержащей, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикоричной кислоты, предпочтительно диферуловую кислоту.
В одном варианте осуществления изобретения способ согласно изобретению заключается в нанесении на растение композиции, содержащей, по меньшей мере, одно олигомерное производное гидроксикорической кислоты и, по меньшей мере, один агент, улучшающий растворимость, предпочтительно хитозан.
В одном варианте осуществления изобретения способ согласно изобретению заключается в нанесении на растение композиции согласно изобретению. В одном варианте осуществления изобретения композиция наносится на надземные части растения, предпочтительно листья и/или стебли. В другом варианте осуществления изобретения композиция наносится на надземные части растения, предпочтительно, корни. В другом варианте осуществления изобретения способ согласно изобретению заключается в покрытии семян растения до посева.
Согласно одному варианту осуществления изобретения, растение может быть дополнительно обработано для устойчивости к стрессу любым известным специалисту способом.
Другой целью изобретения является способ стимуляции роста растения, заключающийся в нанесении на соответствующее растение композиции согласно изобретению.
2
2
2
2
2
2
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу индукции фенилаланин-аммиак-лиазной (ФАЛ) активности и/или образования пероксида (НО), заключающийся в нанесении на соответствующее растение композиции согласно изобретению. ФАЛ - критически важный фермент с регуляторной активностью в отношении фенилпропаноидного пути, затрагивающего предшественников вторичных метаболитов в растении и тем самым играющего ключевую роль в ряде взаимодействий между растением и патогеном (Morrison and Buxton, Crop Sci. 1993, 33:1264-1268). HO образуется во время одной или нескольких реакций окислительного взрыва во время проявления устойчивости в разнообразных взаимодействиях между растением-хозяином/патогенном и участвует в стимуляции реакции сверхчувствительности - механизма, используемого для предотвращения распространения инфекции микробными патогенами (Apel and Hirt, Annu Rev Plant Biol. 2004, 55:373-399). Таким образом, повышение активности ФАЛ и образования НО играют важную роль в устойчивости растений к биотическому стрессу.
Другой целью изобретения является способ модуляции содержания пролина (Pro) в растении, заключающийся в нанесении в нанесении на соответствующее растение композиции согласно изобретению. Накопление пролина - распространенный физиологический ответ, наблюдаемый у многих растений в ответ на самые разнообразные стрессы. Считается, что накопление пролина имеет адаптивное значение для стрессоустойчивости растения, трансгенные подходы подтвердили благоприятный эффект повышенного образования пролина во время стресса. Кроме того, полагают, что баланс между биосинтезом и разложением пролина также имеет существенное значение для определения осмопротекторых и связанных с развитием функций пролина (Verbruggen and Hermans, Amino Acids. 2008, 35:753-759). Вследствие этого, модулируя содержание пролина в растении, можно улучшить устойчивость растения к разнообразным стрессам, как биотическим, так и абиотическим.
Настоящее изобретение также относится к способу повышения содержания воды в растении, предпочтительно после засушливого периода, заключающемуся в нанесении композиции согласно изобретении на указанное растение.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу повышения скорости восстановления растения после восполнения запасов воды, например, после эпизодической засухи или при дождевых осадках после длительного засушливого периода, заключающемуся в нанесении композиции согласно изобретении на указанное растение.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - ВЭЖХ-хроматограмма раствора олигоферулатов, полученного в результате ферментативной реакции с использованием лакказы.
Фиг. 2 - график, показывающий количество пролина влистях томата через 24 часа после внесения олигоферулатов в различных концентрациях на надземные части растения. Показаны средние значения +/- СО (n=3).
Фиг. 3 - график, показывающий процент прорастания семян редиса через 72 часа после 30-минутной обработки олигоферулатами (3 повторности по 20 семян/повторность). Показаны средние значения +/- СО (n=3).
Фиг. 4 - график, показывающий сырую массу проростков редиса через 72 часа после прорастания семян, подвергнутых 30-минутной обработке олигоферулатами (3 повторности по 20 семян/повторность). Показаны средние значения +/- СО (n=3).
Фиг. 5 - график, показывающий процент прорастания семян редиса через 4 суток после обработки 0,05 мМ раствором олигоферулатов, 0,1% раствром хитозана или раствором, содержащим 0,05 мМ олигоферулатов и 0,1% хитозана (далее раствор называется «олигоферулатной композицией») с последующим диспергированием на чашках, содержащих 50 мл 125 мМ маннитола для того чтобы имитировать условия осмотического стресса.
Фиг. 6 - фотография, показывающая контрольные (слева) и обработанные олигоферулатной композицией (обработанные, справа) растения пшеницы после 7-дневной имитации стресса, вызванного засухой (А) и через 1 сутки после восполнения запасов влаги (В).
Фиг. 7 - гистограмма, показывающая свежую массу контрольных проростков пшеницы и проростков, обработанных олигоферулатной композицией (обработанные) после 7 суток в условиях имитации вызванного засухой стресса и последующего восполнения запасов влаги в течение 1 суток. Показаны средние значения +/- СО (n=3). Анализы ANOVA продемонстрировали статические значимое различие (Р<0,05) между растениями, обработанными олигоферулатной композицией, и растениями, обработанными контрольным раствором.
Фиг. 8 - график, показывающий кривую зависимости доза-эффект для активности ФАЛ в клеточных суспензия Arabidopsis thaliana через 24 ч после внесения композиции, содержащей олигоферулаты. Данные выражали, как ответ каждого образца, разделенный на ответ, индуцированный контрольной обработкой (водой) в этом эксперименте (R/R контроль).
2
2
Фиг. 9 - график, показывающий кривую зависимости доза-эффект для накопления НО в клеточных суспензиях Arabidopsis thaliana через 24 ч после внесения композиции, содержащей олигоферулаты.
Фиг. 10 - гистограмма, показывающая количество пролина в листьях томата через 24 часа после внесения на надземные части растения различных препаративных форм. Показаны средние значения +/- СО (n=3). Анализы ANOVA продемонстрировали статические значимое различие (Р<0,05) между растениями, обработанными препаративной формой и контрольным раствором, содержащим Твин 80.
Фиг. 11 - график, показывающий динамику содержания пролина в листьях пшеницы после опрыскивания надземных частей растения препаративной формой, содержащей олигоферулаты.
Примеры
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, не ограничивающими объем притязаний.
Пример 1. Получение олигомеров феруловой кислоты при использовании фермента лакказы
Раствор 5 мМ феруловой кислоты в метаноле (50 мл) добавили к 180 мл этилацетата. После перемешивания добавили 200 мл раствора лакказы 1 Е/мл (Sigma-38429, Лакказа, полученная из трутовика разноцветного) в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5.0), и проводили реакцию при температуре 25°С в течение 24 часов, при перемешивании на орбитальном шейкере со скоростью 150 об/мин.
После прекращения реакции органическую фазу отделяли с помощью делительной воронки, и водную фазу дважды промывали этилацетатом. Все экстракты, содержащие этилацетат, выпаривали при сниженном давлении на роторном испарителе.
Анализ методом ВЭЖХ
Анализ методом ВЭЖХ собращенной фазой выполняли на колонке Waters Symmetry С-18 (46×250 мм), в сепарационном модуле Waters Alliance 2695, соединенном с УФ-детектором Waters при длине волны 320 нм. Подвижная фаза представляла собой смесь ацетонитрил/1% уксусная кислота (30:70), скорость потока подвижной фазы - 1 мл/мин, разделение выполняли при комнатной температуре. Перед вводом проб образцы фильтровали через фильтры Sartorious (0,45 мкм).
На ВЭЖХ-хроматограмме образца присутствует очень маленький пик феруловой кислоты (FA; ФК) по сравнению с пиками, соответствующими олигоферулатам (oligoFA) (Фиг. 1).
2
В целях количественной оценки готовили стандартные растворы феруловой кислоты (W518301 Aldrich) с разными концентрациями с использованием метанола в качестве растворителя; растворы вводили в хроматограф в 3 повторностях, и измеряли коэффициент чувствительности детектора для построения калибровочной кривой. После построения графика зависимости площади пика (при времени удерживания =4 мин) от концентрации феруловой кислоты в диапазоне концентраций от 0,005 до 0,1 мг/мл была установлена хорошая линейная зависимость и коэффициент корреляции r=0,9991. Уравнение линейной регрессии: у=2Е+08х-113942.
Исходя из допущения о сходном коэффициенте чувствительности детектора к детектируемым олигоферулатам (oligoFA) и мономеру феруловой кислоты (FA), отношение олигоферулаты : феруловая кислота в продукте реакции составляет 32:1. Однако в норме коэффициент чувствительности детектора к олигоферулатам ниже, чем к феруловой кислоты. Поэтому отношение олигоферулаты : феруловая кислота в продукте реакции должно быть даже выше 32:1.
Масс-спектрометрический анализ
3
Для того чтобы точно определить молекулярную массу полученных олигоферулатов, проводили масс-спектрометрический анализ следующим образом: 1 мкл исследуемого раствора наносили по капле на мишень спектрометра, после высыхания на пятно исследуемого раствора наносили 1 мкл матричного раствора ДГБ/CHCN; и после высыхания регистрировали спектр на масс-спектрометре Bruker Ultraflex (Bruker Daltonik, Бремен, Германия) в отражательном режиме, используя внешнюю калибровку и работая в режиме детекции положительно заряженных ионов. Состав полученных олигоферулатов показан в Таблице 1.
Таблица 1. Установленный состав ионов олигоферулатов, полученных в результате ферментативной реакции с использованием лакказы на спектре MALDI-TOF-MS
*m/z отражает значение массы, разделенное на номер зарада ионов.
Пример 2. Получение олигомеров феруловой кислоты с использованием фермента пероксидазы
Раствор 50 мИ феруловой кислоты в метаноле (200 мл) добавляли к смеси, содержащей 400 мл метанола, 80 мл 0,3% пероксида водорода и 600 мл мМ фосфатного буфера (рН 7.0). После перемешивания добавляли 10 мл раствора 1% пероксидазы хрена (245.7 Е/мг, AMRESCO INC) в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7.0) и проводили реакцию в течение 24 часов при 25°С при перемешивании на орбитальном шейкере со скоростью 150 об/мин. После завершения реакции, реакционную смесь фильтровали, и осадок дважды промывали метанолом. Метанольный фильтрат метанола и растворимую фазу реакции выпаривали при сниженном давлении на роторном испарителе.
Продукты реакции повторно растворяли в метаноле, и проводили анализ методом ТСХ на пластинах, покрытых силикагелем (MERCK 60, GF-254), используя в качестве подвижной фазы смесь бензол : диоксан : уксусная кислота (25:7:1, отношения объемов). Дополнительно проводили анализ ВЭЖХ-ОФ, используя колонку Waters Symmetry С-18 (46×250 мм) в сепарационном модуле Waters Alliance 2695, соединенном с УФ-детектором Waters при длине волны 320 нм. Подвижная фаза представляла собой смесь ацетонитрил/1% уксусная кислота (30:70), скорость потока подвижной фазы - 1 мл/мин, разделение выполняли при комнатной температуре. Перед вводом проб образцы фильтровали через фильтры Sartorious (0,45 мкм).
Пример 3. Опрыскивание надземных частей растений томата олигомерами ферулата дозозависимо увеличивает содержание пролина в томатах
Материалы и методы
Растения томата, сорт «накопитель» выращивали в течение 3 недель в почве в контролируемых условиях (свето-темновой цикла 16 ч/8 ч, соответственно, при 24°С). Листья томата опрыскивали препаративной формой, содержащей диферулат в возрастающих концентрациях и 0,01% Твин 80% (Полисорбат 80) в качестве эмульгатора, до тех пор, пока жидкость не начинала стекать с листьев. В качестве контроля использовали 0,01% раствор Твина 80. Через 24 часа собирали истинные листья растений, обработанные при опрыскивании, и измельчали их в жидком азоте.
Содержание пролина (Pro) в листьях томатов оценивали по методике Bates et al. (Plant and Soil. 1973, 39:205-207) на основании реакции пролина с нингидрином. Образцы свежих листьев массой 500 мг гомогенизировали в 5 мл водной сульфосалициловой кислоты и центрифугировали в течение 5 мин при 22000g. Надосадочную жидкость фильтровали через фильтры Sartorious (0,45 мкм).
К 1 мл фильтрата добавляли 1 мл нингидринового реактива (2.5 г нингидрина в 100 мл раствора, содержащего ледяную уксусную кислоту, дистиллирвоанную воду и 85% ортофосфорную кислоту в соотношении 6:3:1) и кипятили на водяной бане при 100°С в течение 1 ч. Сразу после этого снимали показания при длине волны 546 нм. Концентрацию пролина определяли по стандартной кривой, используя пролин (Sigma) и рассчитывали для свежей массы листьев (моль пролина/г свежей массы). Результаты
Результаты, представленные на Фигуре 2, показывают, что олигомеры диферулата в низких концентрациях позволяют контролировать содержание пролина в растениях, и наблюдается положительная линейная корреляция с внесенными дозами (зависимость доза-эффект).
Анализы ANOVA демонстрируют статистически значимое различие (р<0,05) между растениями, обработанными препаративной формой, и растениями, обработанными контрольным раствором, содержащим Твин 80.
Известно, что накопление пролина в растениях выполняет одновременно осмопротекторную и антиоксидантную функции, результаты показывают, что олигомеры диферулата усиливают осмопротекцию и защиту от окислительного повреждения растения.
Пример 4. Обработка семян редиса олигоферулатами повышает скорость прорастания семян и рост проростков Материалы и методы
Семена редиса {Raphanus sativus), сорт Ronde rode, инкубировали в течение 30 минут в растворе олигоферулатов (15 ч/млн) или воде (Контроль). Для каждого варианта обработки опыт повторяли трижды, используя по 20 семян на повторность. Затем семена высушивали и помещали в термостат при 30°С для оптимального прорастания в воде в отсутствие стрессов. Через 3 дня подсчитывали проросшие семена, проростки редиса собирали и взвешивали.
Результаты
Результаты показывают, после обработки семян редиса олигоферулатами процент проросших семян был приблизительно на 15% выше, чем в контрольном варианте, где семена инкубировали в воде (контроль - 62% проросших семян, семена, обработанные олигоферулатами - 77% проросших семян; Фигура 3).
Аналогично, скорость роста проростков редиса из семян, обработанных олигоферулатами, была приблизительно на 14% выше скорости роста проростков из необработанных семян (контроль - свежая масса 0,49 г, проростки из обработанных олигоферулатами семян - свежая масса 0,56 г; Фигура 4).
Эти результаты показывают, что лигоферулаты способны модифицировать поведение растений, даже в нестрессовых условиях.
Пример 5. Обработка семян редисаолигоферулатами или композицией, содержащей олигоферулаты и хитозан, для улучшения прорастания растения в стрессовых условиях.
Материалы и методы
Семена редиса (Raphanus sativus), сорт Ronde rode, инкубировали в течение 5 минут в воде (контроль), 0,05 М растворе олигоферулатов, 0,1% растворе хитозана или растворе, содержащем 0,1% хитозана и 0,05 мМ олигоферулатов (далее этот раствор называется «олигоферулатная композиция»). После высушивания семена с нанесенным покрытием диспергировали на чашках, содержащих 50 мл 125 мМ маннитола, для того чтобы создать условия осмотического стресса. Чашки запечатывали пленкой Parafilm М, чтобы не допустить высыхания, и оставляли для инкубации при 30°С.Через 4 дня подсчитывали проросшие семена и рассчитывали процент прорастания.
Результаты
Результаты показывают, что предварительная обработка семян редиса раствором, содержащим только олигоферулаты, значимо увеличивает процент проросших семян редиса в стрессовых условиях (семена, обработанные олигоферулатами - 52% проросших семян, контроль - 23% проросших семян (Фиг. 5).
Диаметрально противоположные результаты были получены для семян редиса, обработанных только хитозаном, процент прорастания которых были сходным с процентом прорастания контрольных семян (семена, обработанные хитозаном - 21% проросших семян) (Фиг. 5).
С другой стороны семена, предварительно обработанные олигоферулатами и хитозаном олигоферулатной композицией) демонстрируют очень существенное повышение процента прорастания по сравнению с контролем - 68% проросших семян (Фиг. 5).
Эти результаты выявляют, что обработка олигоферулатами и даже лучше олигоферулатной композицией (олигоферулатами и хитозаном) способствует прорастанию семян по сравнению с контролем или обработкой только хитозаном.
Пример 6. Покрытие семян олигоферулатной композицией индуцирует устойчивость растений пшеницы к вызванному засухой стрессу.
Материалы и методы
Семена растений пшеницы были покрыты композицией, содержащей 0,005%) диферулата и 0,5% хитозана (далее называемой «олигоферулатной композицией»), или водой (в качестве контроля). После высыхания в горшки были высеяны по 6 семян пшеницы (3 горшка с каждым вариантом обработки), и растения пшеницы выращивали в течение 3 дней в почве в контролируемых условиях (свето-темновой цикл 16 ч/8 ч, соответственно, при 24°С). В этот момент полив приостановили, и далее воду не добавляли, чтобы имитировать ситуацию вызванного засухой стресса. После семи суток в описанных условиях полив возобновили, воспроизводя ситуацию эпизодической засухи или дождевых осадков после длительного периода засухи. Способность растений к восстановлению оценивали на следующий день, на основании общей свежей массы растений пшеницы.
Результаты
Результаты показывают, что сильный стресс, вызванный засухой, необратимо повредил тканевый аппарат необработанных растений (контроль, Фиг. 6А и 6В слева и Фиг. 7), тогда как растения, обработанные олигоферулатной композицией, продемонстрировали примечательно высокий уровень восстановления (обработанные, Фиг. 6А и 6В справа, и Фиг. 7).
Таким образом, олигоферулатные композиции могут помогать растениям лучше реагировать на эпизодическую засуху или перебои в поливе, что исключительно полезно для практического растениеводства в меняющихся климатических условиях.
Пример 7. Покрытие семян композицией, содержащей олигомеры гидроксикоричной кислоты и хитозан, индуцирует устойчивость растений пшеницы к стрессу, вызванному засухой.
Материалы и методы
Получали олигомеры феруловой кислоты, кофейной кислоты и кумаровой кислоты, используя хитозан в качестве матрицы, контролирующей полимеризацию, и лакказу, полученную из трутовика разноцветного (Sigma-38429), в качестве катализатора. Каждая реакционная смесь содержала 50 мл 50 мМ гидроксикоричной кислоты в метаноле, 10 г хитозана, 15 Е лакказы и 450 мл фосфатного буфера (50 мМ, рН 7.0). Реакции осуществляли в течение 4 ч при 30°С в реакторе, оснащенном магнитной мешалкой, в атмосферных условиях. Олигомеры, сополимеризованные с хитозаном, извлекали путем фильтрования реакционной среды под вакуумом и промывали большим количеством фосфатного буфера (50 мМ, рН 7.0) для полного удаления следов адсорбированного фермента.
Семена редиса покрывали раствором, содержащим каждый олигомер гидроксикоричной кислоты, сополимеризованный с хитозаном, в концентрации 0,35%. После высыхания семена редиса высевали и выращивали в течение 3 недель в контролируемых условиях свето-темновой цикл 16 ч/8 ч, соответственно, при 24°С). В этот момент полив приостановили, и далее воду не добавляли, чтобы имитировать ситуацию вызванного засухой стресса. После одной недели в описанных условиях полив возобновили и оценивали способность растений к восстановлению на основании свежей массы растений редиса.
Результаты
Результаты представлены в Таблице 2.
* показаны средние значения +/- СО
Результаты показывают, что покрытие семян композицией, содержащей олигомеры феруловой кислоты, кофейной кислоты и кумаровой кислоты значимо увеличивает свежую массу растения в условиях, воспроизводящих вызванный засухой стресс. Растения из семян, предварительно обработанных такими композициями, более устойчивы к вызванному засухой стрессу по сравнению с необработанными растениями.
Таким образом, эти результаты демонстрируют, что композиции, содержащие олигомерные производные гидроксикоричной кислоты, могут применяться для улучшения устойчивости растений к абиотическому стрессу.
Пример 8. Смесь олигоферулата и хитозана индуцирует защитную реакцию растения в выращенных in vitro клетках Arabidopsis thaliana
2
2
Суспензии культур растительных клеток широко используются в исследованиях патологии растений в качестве полезного инструмента для скрининга соединений, выполняющих функцию элиситоров разнообразных защитных реакций растений на инфицирование патогенами. В число таких реакций входит активация ФАЛ и накопление НО - двух широко используемых маркеров активации устойчивости растений к биотическим стрессам. Материалы и методы
2
2
Клеточные суспензии Arabidopsis thalianastram L-MM1 были выращены на среде Murashige и Skoog (4.43 г/л), содержащей сахарозу (30 г/л), альфа-нафталинуксусную кислоту (0,5 мкг/мл) (NAA) и Кинетин (0,05 мкг/мл), рН 5.7. культуры поддерживали в условиях светового-темнового фотопериода (6 ч / 8 ч) при 25°С, шейкере со скоростью 100 об/мин. Каждые 7 суток клетки разбавляли 10-кратно свежей средой. Для проведения этих анализов биологической активности готовили композицию, содержащую 0,005% олигоферулатов и 0,5% хитозана (далее называемая «олигоферулатной композицией»), фильтровали ее через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях добавляли к 3 мл 3-дневной суспензии культивируемых клеток и инкубировали в течение 24 часов при 24°С и легком перемешивании. В качестве контроля использовали воду. Для того чтобы собрать клетки (для измерения активности ФАЛ) и надосадочную жидкость (для измерения НО), реакционную смесь центрифугировали в течение 5 минут при 4°С при максимальном относительном центробежном ускорении 100 g.
Активность ФАЛ
После центрифугирования клетки гомогенизировали при 4°С в 1 мл 0,1 М боратного буфера (рН 8.8), содержащего g 2 мМ меркаптоэтанола. Гомогенат центрифугировали в течение 10 минут при 4000 об/мин и 4°С. Активность ФАЛ (ЕС 4.3.1.5) определяли в 0,125 мл надосадочной жидкости в присутствии 1.37 мл 0,1 М боратного буфера (рН 8.8) с добавлением 60 мМ L-фенилаламина, в соответствии с описанием в публикации Beaudoin-Eagan and Thorpe (Plant Physiol. 1985; 78(3):438-41). Концентрацию белка в экстрактах определяли методом Бредфорда (Bio-Rad).
2
2
Измерение содержания HO
2
2
Концентрацию НО в надосадочной жидкости измеряли с помощью набора Amplex Red hydrogen peroxide / Набора для анализа пероксидазы (Molecular Probes), следуя инструкциям поставщика.
Результаты
Активность ФАЛ
Результаты показывают, что активность ФАЛ дозозависимо возрастает в соответствии с концентрацией олигоферулатов в композиции (Фиг. 8). Таким образом, содержащиеся в композиции олигоферулаты индуцируют активность ФАЛ в растении, что является маркером активации устойчивости растений. Следовательно, эти результаты демонстрируют активацию устойчивости растений при применении олигоферулатов.
2
2
Измерение содержания HO
2
2
2
2
2
2
Результаты показывают, что НО дозозависимо накапливается в растении в соответствии с концентрацией олигоферулатов в композиции (Фиг. 9). Таким образом, содержащиеся в композиции олигоферулаты индуцируют накопление НО в растении. Поскольку накопление НО является маркером активации устойчивости растений, эти результаты демонстрируют стимуляцию рещистенстности растений олигоферулатами согласно изобретению.
2
2
Активность ФАЛ и накопление НО являются маркерами широко встречающегося у растений механизма устойчивости, обеспечивающего защиту от самых разнообразных стрессовых условий, вызываемых патогенном. Следовательно, эти результаты показывают, что композиция согласно изобретению улучшает устойчивости растений к биотическому стрессу.
Пример 9. Опрыскивание надземных частей растений томатов олигоферулатами индуцирует накопление пролина, тогда как другие антиоксиданты на это неспособны.
Материалы и методы
Тест на антиоксидантную активность
50
Антиоксидантную активность олигоферулатов, полученных в соответствии с описанием в Примере 1, феруловой кислоты (W518301, Sigma-Aldrich), галловой кислоты (27645, Sigma-Aldrich) и аскорбиновой кислоты (А0278, Sigma-Aldrich) определяли методом, основанным на захвате стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) (Brand Williams et al, Food Sci Technol-Lebens Wissens Technol. 1995; 28:25-30), и выражали результаты через ИК (концентрацию антиоксиданта, уменьшающую содержание свободного радикала ДФПГ• приблизительно на 50%). Этот метод часто используют для прогнозирования антиоксидантной активности различных соединений.
Биологическая активность
Растения томата, сорт «накопитель», выращивали в течение 3 недель в почве в контролируемых условиях (свето-темновой цикла 16 ч/8 ч, соответственно, при 24.5°С). Через 24 часа собирали обработанные при опрыскивании истинные листья и измельчали в жидком азоте. Препаративными формами, содержащими галловую кислоту, аскорбиновую кислоту, феруловую кислоту или олигоферулаты в одинаковой концентрации (5 ч/млн), и 0,01% Твин 80 (Полисорбат 80) at 0,01% в качестве эмульгатора опрыскивали листья томатов, пока жидкость не начинала стекать. В качестве контроля использовали 0,01% раствор Твин 80.
Содержание пролина (Pro) в листьях томатов оценивали по методике Bates et al. (Plant and Soil. 1973, 39:205-207) на основании реакции пролина с нингидрином. Образцы свежих листьев массой 500 мг гомогенизировали в 5 мл 3% водной сульфосалициловой кислоты и центрифугировали в течение 5 мин при 22000g. Надосадочную жидкость фильтровали через фильтры Sartorious (0,45 мкм). К 1 мл фильтрата добавляли 1 мл нингидринового реактива (2.5 г нингидрина в 100 мл раствора 15, содержащего ледяную уксусную кислоту, дистиллированную воду и 85% ортофосфорную кислоту в соотношении 6:3:1) и кипятили на водяной бане при 100°С в течение 1 ч. Сразу после этого снимали показания при длине волны 546 нм. Концентрацию пролина определяли по стандартной кривой, используя пролин (Sigma) и выражали относительными значениями по сравнению с содержанием пролина в растениях, подвергнутых контрольной обработке, как R/R контроль.
Результаты
Тест на антиоксидантную активность
50
50
50
50
Показано, что галловая кислота обладает более высокой антиоксидантной активностью (ИК=2 мкг/мл), далее в порядке убывания следовала аскорбиновая кислота (ИК=5 мкг/мл), тогда как феруловая кислота (ИК=25 мкг/мл) и олигоферулаты (ИКС of 35 мкг /мл) прдемонстрировали более низкую антиоксидантную активность.
Биологическая активность
Результаты показывают, что из всех соединений, которыми опрыскивали растения томатов, лишь препаративная форма, содержащая олигоферулаты, обладала способностью индуцировать накопление пролина в растениях (Фиг. 10).
Эти результаты в совокупности демонстрируют, что биологическая активность олигомеров феруловой кислоты в растениях не связана с их антиоксидантной активностью.
Пример 10. Опрыскивание надземных частей пшеницы композицией, содержащей олигоферулаты, индуцирует накопление осмопротекторов (пролина)
Материалы и методы
Растения пшеницы, сорт Хомеро, выращивали в течение 2 недель в почве в контролируемых условиях (свето-темновой цикл 16 ч/8 ч, соответственно, при 24.5°С). Листья пшеницы опрыскивали препаративной формой, содержащей 0,01% Твин 80 (Полисорбат 80) в качестве эмульгатора и композицию, содержащую хитозан (5 мг/л) и олигоферулаты (0,15 мг/л), пока жидкость не начинала стекать. В качестве контроля использовали раствор, содержащий только 0,01% Твин 80 (Полисорбат 80).
Каждые 24 часа собирали истинные листья растений, обработанных (и контрольных) спреем и измельчали их в жидком азоте. Таким образом была построена кривая зависимости «время-эффект» для накопления пролина, индуцированного опрыскиванием надземных частей пшеницы препаративной формой, содержащей олигоферулаты.
Содержание пролина (Pro) в листьях пшеницы оценивали по методике Bates et al. (Plant and Soil. 1973, 39:205-207) на основании реакции пролина с нингидрином. Концентрацию пролина определяли по стандартной кривой, используя пролин (Sigma) и выражали относительными значениями по сравнению с содержанием пролина в растениях, подвергнутых контрольной обработке, как R/R контроль.
Результаты
Результаты показывают, что накопление пролина в листьях пшеницы сильно зависит от времени, прошедшего после внесения на надземные части растения (Фиг. 11). Полумаксимальное накопление пролина наблюдалось на 5-й день после внесения. Максимальное накопление пролина достигалось на 7-й день и затем сразу снижалось.
Эти результаты демонстрируют, что внесение олигоферулатов на растение индуцирует повышение содержания пролина в растении. У многих растений накопление пролина является распространенной физиологической реакцией на разнообразные стрессы, включая биотические и абиотические стрессы. Таким образом, внесение олигоферулатов согласно изобретению приводит к накоплению пролина в растении, тем самым улучшая стрессоустойчивость растения.
Пример 11. Опрыскивание надземных частей растения томата олигомерами ферулово кислоты, кумаровой кислоты и кофейной кислоты индуцирует накопление пролина
Материалы и методы
Для получения олигомеров кофейной кислоты и кумаровой кислоты использовали методику, описанную в Примере 1 для получения олигомеров феруловой кислоты. Вкратце, к 180 мл этилацетата добавляли раствор, содержащий 5 мМ каждого (производного?) гидроксикоричной кислоты в метаноле (50 мл). После перемешивания добавили 200 мл раствора лакказы 1 Е/мл (Sigma-38429, Лакказа, полученная из трутовика разноцветного) в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5.0), и проводили реакцию при температуре 25°С в течение 24 часов, при перемешивании на орбитальном шейкере со скоростью 150 об/мин. В конце органическую фазу отделяли с помощью делительной воронки, и водную фазу дважды промывали этилацетатом. Все экстракты, содержащие этилацетат, выпаривали при сниженном давлении на роторном испарителе, чтобы получить олигомерные производные гидроксикоричной кислоты в порошкообразной форме.
Растения томата, сорт «накопитель», выращивали в течение 3 недель в почве в контролируемых условиях (свето-темновой цикла 16 ч/8 ч, соответственно, при 24.5°С). Через 24 часа собирали обработанные при опрыскивании истинные листья и измельчали в жидком азоте. Листья томатов опрыскивали препаративными формами, содержащими олигомеры феруловой, кумаровой и кофейной кислот в одинаковых концентрациях (5 ч/млн) и 0,01% Твин 80 (Полисорбат 80) в качестве эмульгатора, пока жидкость не начинала стекать. В качестве контроля использовали 0,01% раствор Твина 80. Содержание пролина (Pro) в листьях томатов оценивали по методике Bates et al. (Plant and Soil. 1973, 39:205-207) на основании реакции пролина с нингидрином Концентрацию пролина определяли по стандартной кривой, используя пролин (Sigma) и выражали в мкмоль пролина / г свежей массы.
Результаты
Результаты представлены в Таблице 3.
Таблица 3. Содержание пролина в растениях томата через 7 дней после опрыскивания надземных частей растения различными олигомерами гидроксикоричной кислоты
Как показано в Примере 10, олигомеры феруловой кислоты индуцируют увеличение содержания пролина в растении. Кроме того, применение других производных гидроксикоричной кислоты, а именно, олигомеров кумаровой кислоты и олигомеров кофейной кислоты, тоже приводило к накоплению пролина в растении.
Таким образом, эти результаты демонстрируют, что олигомерные производные гидроксикоричной кислоты способны модулировать содержание пролина в растении, тем самым улучшая стрессоустойчивость растений.