СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ЛЕПРЫ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
METHOD FOR ASSESSING EFFICIENCY OF THE TREATMENT OF LEPROSY WITH POLYMERASE CHAIN REACTION

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике лепры и может быть использовано, в частности, для контроля эффективности антимикобактериального лечения у больных лепрой. Сущность изобретения состоит в том, что с кожи больных лепрой берут скарификаты и биоптаты и далее посредством проведения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с использованием внешних и внутренних праймеров: 5'-GCATGTCTTGTGGTGGAAAGC-3' и 5'-CACCCCACCAACAAGCTGAT-3' и флуоресцентного зонда 5'- (FAM) CATCCTGCACCGCA (RTQ1)-3' проводят идентификацию возбудителя лепры. Способ позволяет оценить эффективность проводимого лечения лепры на основе определения жизнеспособности Mycobacterium leprae в диагностических лабораториях и противолепрозных учреждениях.
Лепра является хроническим инфекционным заболеванием с преимущественным поражением кожи и периферической нервной системы, что часто приводит к серьезным инвалидизирующим осложнениям. Несмотря на значительное снижение распространенности лепры в мире после внедрения комбинированной химиотерапии, частота выявления новых случаев заболевания остается высокой. Кроме того, серьезной проблемой, осложняющей борьбу с лепрой, являются рецидивы заболевания. Возникновение рецидива обычно приводит к повторной госпитализации, увеличивает степень инвалидизации больных и осложняет эпидемическую ситуацию. Одним из факторов риска возникновения рецидивов, несмотря на проводимую противолепрозную терапию, может стать персистирование в организме больного жизнеспособных микобактерий лепры [1, 2].
На сегодняшний день ВОЗ рекомендует при лечении лепры использовать комбинированную антимикобактериальную терапию. Для оценки противолепрозного лечения, кроме клинической картины и гистологического исследования биоптатов кожи руководствуются бактериоскопическим индексом (БИН), с помощью которого при микроскопировании определяют соотношение «гомогенных» /«фрагментированных» / «зернистых» форм кислотоустойчивых микобактерий. Существенными недостатками этого метода, помимо субъективизма оценки и низкой чувствительности, является отсутствие общепринятого стандарта классификации неравномерно окрашенных микобактерий, а, следовательно, отсутствие достоверной оценки эффективности противолепрозной терапии.
Признанным способом определения жизнеспособности М. leprae является экспериментальная модель, предложенная С.С. Shepard в 1960 году [3]. Моделирование заключается в заражении мышей дозированным количеством M.leprae в подушечки лапок мышей и их дальнейшем размножением в месте инокуляции. После завершения эксперимента (период 8-12 месяцев) подсчитывается число микобактерий в лапке по методу Shepard С.С, McRae D.H [4]. По разнице между введенным количеством микобактерий и количеством, оказавшемся в лапке после заражения судят о степени размножения M.leprae.
Из практики медицины известен способ контроля за эффективностью химиотерапии у больных лепрой с помощью серологического исследования, заключающегося в определении уровня антител к различным антигенным детерминантам M.leprae с использованием комплекса серологических реакций в сыворотке крови больных лепрой (Дячина М.Н., Ющенко А.А., Дегтярев О.В., Лукин Ю.В., Ибраимов М.И. Серологический контроль за эффективностью химиотерапии при лепре. Методические рекомендации.Астрахань, 1994, 16 с.)
Недостатками этого способа являются:
- необходимость в параллельном выполнении 5 серологических тестов;
- большого объема сыворотки крови больного, пула сывороток от доноров и больных активной стадией лепры;
- использование в качестве тест-антигенов ультразвуковых дезинтегратов M.leprae и M.avium.
Эти недостатки не дают возможности получения конкретного технического результата - повышение эффективности (точности) способа.
Известен также «Способ прогнозирования эффективности терапии у больных лепрой» (патент №2247374 от 25.02.2005). Сущность способа заключается в том, что в периферической крови определяют цитохимический коэффициент степени накопления липидов в лейкоцитах в условных единицах до начала лечения и через 2-3 или 5-6, 10-12, 20-24 месяца терапии.
Существенными недостатками данного способа являются:
- невозможность длительного хранения биологического материала, что диктует необходимость осуществления способа сразу после забора крови больного;
- возможное влияние на оцениваемый показатель сопутствующей патологии как инфекционной, так неинфекционной природы, что делает необходимым проведение более сложных лабораторных методов исследования.
Все перечисленное в итоге не позволяет получить конкретный технический результат - повышение эффективности (точности) способа.
После открытия полимеразно-цепной реакции (ПЦР) стала очевидной возможность применения данного метода для идентификации возбудителя лепры и его преимущества по сравнению со стандартными методами диагностики. При невозможности культивирования M.leprae на искусственных питательных средах ПЦР позволяет решать вопрос быстрой идентификации M.leprae в тканях. Однако, с помощью ПЦР возможна детекция не только жизнеспособных некультивируемых форм бактерий, но и мертвых клеток, содержащих генетический материал. Методом, исключающим этот недостаток, является сочетание ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ГШР). Отличие жизнеспособных от нежизнеспособных M.leprae имеет большое значение для оценки эффективности проводимой терапии и прогноза развития рецидива заболевания.
3
4
С целью определения жизнеспособности микобактерий в качестве мишени используются рибосомальные гены. Одним из таких генов является 16S рРНК, который содержит не только общие для всех бактерий последовательности, но и специфические для каждого вида. Использование 16S рРНК мишени для ПЦР весьма выгодно, т.к. 16S рРНК - компонент микобактериальных рибосом и экспрессируется в большом количестве копий (от 10 до 10 на клетку). De Wit и Klaster [5] установили, что микобактерий лепры из различных источников имеют идентичные по 16S рРНК межгенные спейсерные области. Поскольку мРНК быстро деградирует после гибели клетки, ее обнаружение позволяет оценить жизнеспособность клетки [7]. Поэтому наиболее перспективными ПЦР-тестами для определения жизнеспособных микобактерий лепры являются те, в которых в качестве праймеров будет использоваться участок, кодирующий 16S рРНК.
Изложенное определяет актуальность предполагаемого изобретения и проведение работы, направленной на разработку метода, позволяющего оценивать жизнеспособность микобактерий лепры и, следовательно, эффективность противолепрозного лечения с использованием полимеразной цепной реакции.
После того, как для детекции жизнеспособности микобактерий туберкулеза была показана перспективность использования ОТ-ПЦР, это наблюдение нашло свое применение и в лепрологии. Haile Y. и Ryon J.J. [8] на основе ОТ-ПЦР разработан метод с колориметрической детекцией M.leprae на микротитровальных платах. В качестве праймеров использовался участок, кодирующий 16S рРНК. Общая чувствительность составляла 91,3%. Метод основан на выделение РНК, амплификации с использованием праймера к 16S рРНК и электрофорезе в агарозном геле с дальнейшей колориметрической гибридизацией.
Недостатками этого способа являются:
-использование в качестве детекции продуктов амплификации помимо электрофореза ДНК-гибридизации, что делает процесс идентификации возбудителя лепры более трудоемким и долгим;
- исследование проводится только у нелеченых больных.
Эти недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат - повышение эффективности (точности) способа.
Известен способ, предложенный Сох et al. [11] и примененный в различных модификациях в работах других авторов [9, 10], при котором для детекции M.leprae использовался метод ОТ-ПЦР с несколькими праймерами, фланкирующими участки гена 16S рРНК в позициях 9-18, 69-91 и 218-239 последовательности ДНК.
Недостатками данного метода являются:
- длительность этапа выделения, включающая, обработку биопсий реагентом TRIzol и экстракцию с использованием протеиназы К;
- применение нескольких пар праймеров;
- использование в качестве детекции продуктов амплификации электрофореза, что увеличивает возможность контаминации образцов. Эти недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат - повышение эффективности (точности) способа.
Также известен способ, предложенный Sharma R., Lavania М., Katoch K. et al. (Development and evalution of real-time RT-PCR asaay for quantitative estimation of viable mycobacterium leprae in clinical samples // Indian J. Lepr. - 2008. - Vol. 80. - P. 315-321), при котором применяется метод ОТ-ПЦР, в качестве праймера используется последовательность к 16S рРНК и амплификация проходит в режиме реального времени «Real time» в течение 45 циклов. Чувствительность теста составляет в пределах 88,9% в кожных скарификатах.
Недостатками известного способа являются:
- использование дорогостоящих готовых зарубежных наборов реагентов;
- увеличение времени осаждения ДНК до 2 часов при -20°;
- клинические образцы исследовались только от больных в активной стадии, что не дает возможности проведения оценку эффективности лечения, то есть обеспечения точности способа.
За прототип предполагаемого изобретения взят способ, предложенный Martinez N.A., Lahiri R., Pittman L.T. et al. (Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR // J. Clin. Microbiol. 2009, 47: 2124-2130), при котором для обнаружения M.leprae применяется метод ПЦР с обратной транскрипцией с использованием в качестве праймеров sodA mRNA, 16S rRNA и RLEP M.leprae.
Общим существенным признаком является то, что в обоих способах для определения эффективности проводимого лечения в качестве праймеров используются последовательности гена 16S рРНК M.leprae.
Сущность способа по прототипу состоит в обнаружении в биоптатах больных лепрой с помощью ОТ-ПЦР жизнеспособной ДНК M.leprae во время и после курса противолепрозного лечения при использовании двух пар праймеров, а именно SodA/RLEP, 16 SrRNA/RLEP.
Недостатками известного способа по прототипу являются:
- длительность экстракции ДНК, состоящая из многих этапов, один из которых (инкубация биопсии с протеиназой К) продолжается до 12 часов;
- использование дорогостоящих готовых зарубежных наборов реагентов;
- применение нескольких пар праймеров;
- исследование только кожных биоптатов от больных лепрой в процессе лечения, тогда как при контроле за эффективностью проводимого специфического лечения необходимо еще подсчитывать и БИН в скарификатах кожи.
Эти недостатки не дают возможности получения конкретного технического результата - повышение эффективности (точности) способа.
Таким образом, перечисленные недостатки не обеспечивают повышение скорости и точности, т.е. эффективности способа.
Целью предполагаемого изобретения является создание способа оценки эффективности, проводимой антимикобактериальной терапии на основе определения жизнеспособности микобактерий лепры с помощью ОТ-ПЦР в режиме Real tame.
Цель достигается путем обнаружения Mycobacterium leprae в скарификатах и биоптатах кожи от больных лепрой с применением отечественных реактивов, сокращением времени проведения реакции, проведение реакции в режиме Real tame. с использованием флуоресцентного зонда, что предотвращает контаминацию.
Сущность способа состоит в следующем:
Для выделения РНК/ДНК из биоптатов и скарификатов кожи применяют модифицированный метод экстракции ДНК, основанный на лизисе нуклеиновых кислот лизирующим раствором, преципитации, с дальнейшей многократной отмывкой полученного препарата ДНК с помощью набора «Проба-НК» (ООО «НПО ДНК-технология», Москва). Комплект реагентов предназначен для получения препарата ДНК/РНК из биологического материала (периферическая кровь, слюна, мокрота, молоко, моча, сперма, секрет предстательной железы, ликвор, соскобы эпителиальных клеток с задней стенки глотки, из уретры, цервикального канала, заднего свода влагалища; мазки и смывы из полости носа и ротоглотки; материал от павших и больных животных).
3
С учетом того, что в инструкции к набору в качестве биологического материала не указаны кожные биоптаты и скарификаты, проводят подготовку клинического материала следующим образом: биоптат получают путем иссечения скальпелем ткани на границе здоровой и пораженной кожи с предварительной местной анестезией. Затем ножницами или скальпелем мелко нарезают образец и помещают полученный биоптат размером 10-25 мм в пробирку, содержащую 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Далее кожный биоптат измельчают с помощью стерильного скальпеля, а затем инъекционных игл, встряхивают на вортексе 1 мин, затем отбирают 100 мкл надосадочной жидкости и переносят в чистую пробирку.
Для взятия скарификатов на пораженных участках кожи, а также с кожи надбровных дуг, мочек ушных раковин, подбородка, дистальных отделов конечностей скальпелем делают небольшой разрез (глубиной 1-2 мм). Стерильным одноразовым зондом проводят по коже на месте разреза. Зонд помещают в пробирку, содержащую 0,5 мл стерильного физиологического раствора, и аккуратно перемешивают, после чего зонд отжимают о стенки пробирки и извлекают. Пробирку закрывают и встряхивают на вортексе 1 мин. Далее пробирки центрифугируют при 13000 об/мин в течение 10 мин и удаляют надосадочную жидкость, оставляя в пробирке примерно 100 мкл (осадок + жидкая фракция).
На данном этапе используют только наконечники с маркировкой «RNAase free» и «DNAase free». В пробирку, маркированную «K-», вносят 100 мкл стерильного физиологического раствора.
Далее экстракцию ДНК проводят согласно инструкции, прилагаемой к комплекту реагентов «ПРОБА-НК» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
Проведение реакции обратной транскрипции: маркируют необходимое количество пробирок объемом 0,5 мл с учетом пробирок «K-». Размораживают содержимое пробирок «ОТ-буфера» и «праймеры ОТ-RANDOM + дНТФ» из комплекта реагентов для обратной транскрипции (ООО «НПФ ДНК-технология», Москва) при комнатной температуре, затем встряхивают пробирки на вортексе в течение 3-5 сек и осаждают капли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 сек. В отдельной пробирке готовят ОТ-смесь путем смешивания 2,0×(N+1) мкл «ОТ-буфера», l,0×(N+l) мкл «Праймеров OT-RANDOM + дНТФ» и 0,5×(N+1) мкл обратной транскриптазы, где (N+1) - количество анализируемых на наличие РНК образцов с учетом «K-» (N) с запасом на 1 образец. Далее по 3,5 мкл ОТ-смеси вносят в промаркированные пробирки. Переносят пробирки в рабочую зону, предназначенную для выделения РНК; вносят в пробирки по 16,5 мкл соответствующего образца РНК (или образца «K-»); встряхивают на вортексе 3-5 сек и центрифугируют при 1000 об/мин 3-5 сек; термостатируют при 40°С в течение 30 мин, затем при 95°С - 5 мин; осаждают конденсат при 13000 об/мин 30 сек. Препарат кДНК готов для постановки ПЦР.
2
Выделенные 5 мкл ДНК добавляют в амплификационную смесь, содержащую 50 мМ KCl, 10 мМ Трис HCl (рН8,8), 6,25 мМ MgCl, Taq ДНК-полимеразу (5 ед/мкл), смесь dNTP, концентрация каждого нуклеотида 25 мМ, глицерол, Tween 20, 0,5 мкл (10 пкмоль/мкл) каждого праймера, 0,1 мкл (10 пкмоль/мкл) зонда и 13,9 мкл деионизированной воды (общий объем 25 мкл). Количество амплификационной смеси рассчитывают с учетом «K-» (N) и одного образца. Затем вносят в пробирку 20 мкл минерального масла.
Последовательность праймеров и зонда к 16S рРНК M.leprae:
ML16S rRNATaq-F: 5'-GCATGTCTTGTGGTGGAAAGC-3'
ML16S rRNATaq-R: 5'-CACCCCACCAACAAGCTGAT-3'
ML16S rRNATaq probe: (FAM) 5'-CATCCTGCACCGCA-3' (RTQ1)
Использование в предлагаемом способе флуоресцентного зонда позволяет проводить ПЦР в реальном времени и избежать контаминации. Отработанный нами режим амплификации представляет из себя следующее:
Амплификацию и учет результатов проводят на термоциклере «ДТ-96 Real time» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
2
Таким образом, способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции включает выделение ДНК/РНК из биопсий и скарификатов кожи с предварительной гомогенизацией с применением ОТ-ПЦР «Real time» с использованием внешних и внутренних праймеров 5'-GCATGTCTTGTGGTGGAAAGC-3' и 5'-CACCCCACCAACAAGCTGAT-3', флуоресцентного зонда (FAM) 5'-CATCCTGCACCGCA-3' (RTQ1) и режима амплификации: 95°С - 5 мин, 60°С - 50 сек - 1 цикл; 95°С - 15 сек, 62°С - 40 сек - 40 циклов; в Трис HCl буфере с KCl и MgCl, твином и глицеролом для определения жизнеспособности M.leprae.
Проверку специфичности проводят на кожных биоптатах, полученных от больных лепрой. Кроме того, специфичность оценивается на музейных штаммах микобактерий: M.avium, M.kansasii, M.scrofulaceum, M.marinum, M.vaccae, M.intracellulare, M.clegg, M.duvalii, M.phlei, M.gastri, M.gordonae, M.lufu, M.smegmatis, M.bovis, M.paratuberculosis, M. Кедровский. Все изоляты исследовались в пределах 100 клеток в образце. Ни один из изолятов не показал реактивности в ПЦР. Для характеристики чувствительности предлагаемой тест-системы проведено сравнительное изучение выявления микобактерий лепры с помощью предлагаемого способа и стандартным бактериоскопическим методом. Результаты представлены в таблице1.
Курс комбинированной специфической терапии больных лепрой длится 6 месяцев (Приказ МЗ РФ от 29.12.2012 г №1681). После окончания курса терапии у больных проводят повторные лабораторные исследования Для изучения возможности использования данной тест-системы в оценке эффективности противолепрозного лечения исследованы кожные скарификаты и биоптаты от 6 больных лепрой в процессе курса специфической терапии (табл. 2).
Как видно из данной таблицы у некоторых больных микобактерий лепры обнаруживаются и после окончания курса лечения, что наиболее наглядно выявляется в ПЦР. Это дает основание для продолжения специфической терапии. В работах индийских ученых ранее [2] было показано, что в 3,3% случаев у больных с высоким БИН жизнеспособные M.leprae сохраняются и после 12 месяцев лечения.
В качестве примеров оценки эффективности лечения лепры с помощью ОТ-ПЦР приводятся выписки из историй болезни больных лепрой.
Пример 1. Больная Р. 1967 г. р. ИБ №28, жительница г. Астрахани, проходила обследование в «НИИЛ» Предварительный диагноз: Лепра, погранично-лепроматозная форма, активная стадия.
Поступила в клинику «НИИЛ» 23.09.2015 г. При поступлении на коже груди и живота имелись поверхностные инфильтраты без четких границ, местами сливающиеся между собой красноватого цвета. В поясничном отделе инфильтрация красновато-синюшного цвета с переходом на ягодицы. На правой ягодице отмечались лепромы диаметром до 0,3-0,5 см, эластичной консистенции. На кистях и стопах поверхностная инфильтрация красновато-синюшного цвета, сухость и шелушение ладоней и подошв, а также разреженность бровей. Для обследования и подтверждения диагноза 23.09.2015 г. у пациентки взяты биопсия и скарификаты кожи для проведения бактериоскопического, гистологического исследований и постановки ПЦР. Биоптат взят с кожи правой ягодицы путем иссечения скальпелем ткани на границе здоровой и пораженной кожи с предварительной местной анестезией. Затем скальпелем мелко нарезан образец и помещен полученный биоптат размером 10-25 мм в пробирку, содержащую 0,5 мл транспортной среды. Скарификаты взяты скарификатором с помощью небольших разрезов (глубиной 1-2 мм) с кожи левой надбровной дуги, левой мочки уха, правого предплечья, поясничного отдела спины слева и справа, наружной поверхности правой ягодицы для бактериоскопического исследования, а стерильными одноразовыми зондами для ПЦР. Зонды с исследуемым материалом с пораженных участков кожи помещены в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл и аккуратно перемешаны со стерильным физиологическим раствором (0,5 мл), после чего зонды отжаты о стенки пробирки и извлечены. После встряхивания пробирки на вортексе в течение 1 мин и центрифугирования при 13000 об/мин в течение 10 мин удалена надосадочную жидкость, оставив в пробирке примерно 100 мкл (осадок + жидкая фракция). Далее экстракция ДНК проведена согласно инструкции, прилагаемой к комплекту реагентов «ПРОБА-НК» (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва).
Полученный препарат РНК сразу использован для постановки реакции обратной транскрипции, для которой проведена маркировка необходимого количества пробирок объемом 0,5 мл с учетом пробирок «K-». Содержимое пробирок «ОТ-буфера» и «праймеров OT-RANDOM + дНТФ» из комплекта реагентов для обратной транскрипции (ООО «НПО ДНК-технология», Москва) разморожено при комнатной температуре и после встряхивания на вортексе в течение 3-5 сек капли осаждены при 1000 об/мин в течение В отдельной пробирке приготовлена ОТ-смесь путем смешивания 2,0 мкл × (N+1) «ОТ-буфера», 1,0 мкл × (N+1) «Праймеров OT-RANDOM + дНТФ» и 0,5 мкл × (N+1) обратной транскриптазы, где (N+1) - количество анализируемых на наличие РНК образцов с учетом «К-» (N) с запасом на 1 образец. Далее по 3,5 мкл ОТ-смеси внесено в промаркированные пробирки, которые затем перенесены в рабочую зону, предназначенную для выделения РНК. Далее в пробирки внесено по 16,5 мкл соответствующего образца РНК (или образца «К-»), которые после встряхивания на вортексе 3-5 сек и центрифугирования при 1000 об/мин 3-5 сек термостатированы при 40°С в течение 30 мин, затем при 95°С в течение 5 мин, конденсат осажден при 13000 об/мин 30 сек.
2
Полученный препарат ДНК в количестве 5 мкл использован для постановки ПЦР, добавляя в амплификационную смесь, содержащую 50 мМ KCl, 10 мМ Трис HCl (рН 8,8), 6,25 мМ MgCl, Taq ДНК-полимеразу (5ед/мкл), смесь dNTP, концентрация каждого нуклеотида 25 мМ, глицерол, Tween 20; 0,5 мкл (10 пкмоль/мкл) каждого праймера, 0,1 мкл (10 пкмоль/мкл) зонда. Общий объем доведен до 25 мкл деионизированной водой. Количество амплификационной смеси рассчитано с учетом «К-». Затем в пробирки внесены по 20 мкл минерального масла.
Далее образцы поставлены в термоциклер «ДТ-96» с программой амплификации: 95°С - 5 мин, 60°С - 50 сек - 1 цикл; 95°С - 15 сек, 62°С - 40 сек - 40 циклов, 10°С - хранение.
Во всех пробах у больной Р. с помощью ОТ-ПЦР обнаружены M.leprae. При бактериоскопическом исследовании у больной во всех скарификатах выявлены микобактерий лепры, БИН=3,67. В гистологическом исследовании биоптата кожи отмечалось истончение эпидермиса, в сетчатом слое дермы множественные гранулемы, состоящие из гистиоцитов и лепрозных клеток, содержащих большое количество преимущественно гомогенных микобактерий; гранулемы находились вокруг нервных пучков и придатков кожи, частично разрушенных. Таким образом, результаты как стандартных методов исследования по выявлению микобактерий лепры (бактериоскопического и гистологического), так и ПЦР анализа у больной Р. полностью совпали. Это позволило с учетом клинических данных поставить диагноз: Лепра, лепроматозный тип, активная стадия.
После постановки диагноза больной назначено антимикобактериальное лечение по схеме ВОЗ. В процессе лечения для оценки его эффективности через 6 и 9 месяцев у больной повторно взяты скарификаты (6 мест) и биоптаты кожи с тех же мест, что и до начала лечения и проведены исследования (табл. 3).
До лечения во всех 6 скарификатах, как методом бактериоскопии, так и ОТ-ПЦР обнаруживались микобактерий лепры. Через 6 месяцев после начала лечения в скарификатах с левой мочки уха, правого предплечья и наружной поверхности правой ягодицы результаты бактериоскопии и ОТ-ПЦР оставались положительными, кроме того M.leprae идентифицировалась с помощью ОТ- ПЦР и в скарификате с поясничного отдела позвоночника справа. Через 9 месяцев результаты бактериоскопии и ОТ-ПЦР совпали в двух скарификатах (левой мочки уха и правого предплечья), в то время как при ПЦР анализе M.leprae идентифицировалась еще и в скарификате с наружной поверхности правой ягодицы. Больной продолжена комбинированная антимикобактериальная терапия.
4
Как видно из табл. 3 в процессе лечения отмечалось снижение БИН и процента положительных образцов как в бактериоскопическом исследовании, так и в ПЦР-анализе, что свидетельствует об эффективности проводимой антимикобактериальной терапии. В тоже время обнаружение более высокого процента микобактерий лепры с помощью ОТ-ПЦР во время лечения демонстрирует его более высокую чувствительность. Кроме того, по результатам бактериоскопического исследования невозможно определить жизнеспособность возбудителя, в то время как ОТ-ПЦР анализ на 16S рРНК позволяет детектировать жизнеспособные микобактерий лепры. Нами была использована модель Shepard С.С. [3] для подтверждения жизнеспособности микобактерий лепры. Материалом от больной Р. были заражены 20 мышей линии СВА дозированным количеством M.leprae (10 на мышь). Через 12 месяцев после заражения макроскопических изменений в лапах не отмечалось. При ПЦР анализе на 16S рРНК M.leprae обнаружены, а при микроскопическом исследовании у всех животных отмечалось размножение M.leprae, что подтверждалось увеличением их числа в месте инокуляции больше, чем на порядок по сравнению с введенным количеством. Таким образом, обнаружение жизнеспособных M.leprae с помощью общепринятого в лепрологии метода Shepard С.С. с использованием заражения экспериментальных животных предусматривает длительные сроки исследования - до 12 и более месяцев, в то время как с помощью ПЦР анализа возможно детектирование жизнеспособных микобактерий лепры в кратчайшие сроки.
Полученные результаты подтверждают, что предлагаемый способ идентификации микобактерий лепры можно использовать для контроля эффективности лечения лепры на основе оценки жизнеспособности M.leprae.
Пример 2. Больной Л. 1967 г.р., житель Астраханской области, ИБ №3364, проходил обследование в «НИИЛ». Предварительный диагноз: Лепра, лепроматозный тип, рецидив заболевания.
Поступил в клинику «НИИЛ» 18.01.2016 г. для обследования и дальнейшего лечения. При поступлении на коже задне-наружной поверхности бедра и в области правой ягодицы имелось гипопигментное пятно со сниженной болевой, тактильной и температурной чувствительностью без четких границ, размерами 25,0×12,0 см. В области кожи лба, латеральной орбитальной области с обеих сторон, а также подбородка и спины имелась невыраженная инфильтрация. Отмечалась разреженность бровей. Для подтверждения рецидива заболевания 20.01.2016 г. у пациента взяты скарификаты (5 мест) кожи: с правой надбровной дуги, левой мочки уха, подбородка, верхней трети бедра справа, правой области ягодицы и биопсия с кожи правого бедра. Взятие материала и постановка ОТ-ПЦР проводились так, как описано выше.
В скарификатах с левой мочки уха и области ягодицы справа, а также в биоптате больного при проведении ОТ-ПЦР идентифицированы M.leprae. При бактериоскопическом исследовании у больного только в скарификате с области ягодицы справа обнаружены микобактерий лепры, БИН=0,25. В гистологическом исследовании биоптата кожи у обследуемого отмечалось истончение эпидермиса, с умеренным акантозом, папилломатозом и гиперкератозом; умеренный фиброз дермы с очажками периваскулярной полиморфной лимфогистиоцитарной инфильтрацией, в сетчатом слое гранулемы из гистиоцитов и лепрозных клеток.
Таким образом, с учетом клинических данных, бактериоскопического, гистологического и ОТ-ПЦР исследований больному был поставлен диагноз: Лепра, лепроматозный тип, рецидив заболевания.
После постановки диагноза больному назначено противорецидивное лечение. Для оценки эффективности лечения через 6 и 9 месяцев у больного повторно взяты скарификаты (5 мест) с тех же мест, что и до начала лечения и проведены исследования (табл.4).
Через 6 месяцев после начала лечения только в ОТ-ПЦР анализе в одном скарификате обнаруживались микобактерий, бактериоскопия была отрицательной. Больному было продолжено лечение и через 9 месяцев как в ОТ-ПЦР исследовании, так и при бактериоскопии микобактерий лепры не выявлялись. Больной выписан под амбулаторное наблюдение.
Полученные результаты подтверждают, что предлагаемый способ определения жизнеспособности M.leprae можно использовать для контроля эффективности антимикобактериального лечения у больных лепрой. Предлагаемый способ идентификации M.leprae прост в исполнении, значительно дешевле импортных тест-систем, выполняется на отечественном оборудовании и отличается повышенной чувствительностью.
Предполагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня исследований по данному вопросу не обнаружено способа, которому присущи признаки, идентичные всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Способ оценки эффективности лечения лепры с помощью ОТ-ПЦР имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие со всеми отличительными признаками предполагаемого изобретения.
Таким образом, предполагаемое изобретение решает основную задачу - повышение эффективности способа, а именно оценку эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для определения жизнеспособности Mycobacterium leprae. Предполагаемое изобретение позволяет получить результат в течение 4-5 часов, что значительно сокращает время интерпретации эффективности проводимого лечения и позволяет своевременно его скорректировать. Предлагаемый способ подразумевает использование не только биопсийного материала, но и скарификатов кожи, что значительно расширяет его возможности для оценки эффективности специфического лечения. Предлагаемый способ позволяет решать поставленную задачу с использованием только одной пары праймеров и при использовании реактивов только отечественного производства.
Авторами предложен новый, никем ранее незаявленный способ оценки эффективности лечения лепры с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для определения жизнеспособности Mycobacterium leprae.
Предлагаемый способ может быть рекомендован к клиническому использованию в противолепрозных учреждениях, в диагностических лабораториях, в лечебных учреждениях для контроля за эффективностью противолепрозного лечения.
Использованные источники
1. Santos A.R., Balassiano V., Oliveira M.L. et al. Detection of Mycobacterium leprae DNA by polymerase chain reaction in the blood of individuals, eight years after completion of anti-leprosy therapy // Mem.Inst.Oswaldo Cruz. - 2001. - Vol. 96. - P. 1129-1133.
2. Ebenezer G.J., Daniel S., Norman G. et al. Are viable Mycobacterium leprae present in lepromatous patients after completion of 12 months and 24 months multi-drug therapy // Indian J. Lepr. - 2004. - Vol. 76 (3). - P. 199-206.
3. Shepard С.С. The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads of mice // J. Exp. Med. - 1960. - Vol. 112. - P. 445-454.
4. Shepard С.C, McRae D.H. A method for counting acid-fast bacteria // Int. J. Lepr - 1968. - Vol. 36. - P. 78-82.
5. De Wit M.Y., Klatser P.R. Purification and characterization of a 36 kDa antigen of Mycobacterium leprae // J. Gen. Microbiol. - 1988. - Vol. 134. - P. 1541-1548.
6. Martinez N.A., Lahiri R., Pittman L.T. et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viabi lity by use of real-time PCR // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47. - P. 2124-2130.
7. Kurabachew M., Wondimu A., Ryon J.J. Reverse transcription-PCR detection of Mycobacterium leprae in clinical specimens // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36. - P. 1352-1356.
8. Haile Y and Ryon J.J. Colorimetric microtitre plate hybridization assay for the detection of Mycobacterium leprae 16S rRNA in clinical specimens. Lepr. Rev. 2004, 75: 40-49.
9. Hirawati, Katoch K., Chauhan D.S. et al. Detection of M.leprae by reverse transcription-PCR in biopsy specimens from leprosy cases: a preliminary study // J. Commun. Dis. - 2006. - Vol. 38 (3). - P. 1129-1133.
10. Phetsuksiri В., Rudeeaneksin J., Supapkul P. et al. (A simplified reverse transcriptase PCR for rapid detection of Mycobacterium leprae in skin specimens // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2006. - P. 319-328.
11. Cox R.A., Kempsell K., Fairclough L. at al. The 16s ribosomal RNA of Mycobacterium leprae contains a unique sequence which can be used for identification by the polymerase chain reaction // J. Med. Microbiol. - 1991. - Vol. 35. - P. 284-290.