СПОСОБ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОПУЛЯЦИЙ ДРЕВЕСНЫХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ
METHOD OF MOLECULAR-GENETIC IDENTIFICATION OF WOODY PLANT SPECIES POPULATIONS

Изобретение относится к молекулярно-генетической идентификации популяций древесных видов растений.
В настоящее время актуальным является проблема генетической паспортизации и идентификации особей, популяций, видов растений и животных, включая человека. ДНК-идентификация используется во всех развитых странах (Животовский, 2001). Геномы растений значительно больше генома человека и число полностью расшифрованных геномов растений невелико (Зеленин, 2003), поэтому вопросы идентификации вида растения и паспортизации популяций или групп популяций разработаны в значительно меньшей степени (Боронникова, 2008).
В 2006 году в России была разработана методика единовременной инвентаризации объектов единого генетико-селекционного комплекса (ЕГСК) в лесном фонде Российской Федерации с целью идентификации всех объектов ЕГСК, оценки их состояния, сбора информации о структуре ЕГСК, их количественном и качественном составе и других параметров, необходимых для подготовки перспективных планов развития лесного селекционного семеноводства. В качестве формы учета использовался паспорт, основанный на внешних морфологических признаках без записи генетических особенностей объектов ЕГСК (Паленова и др., 2008).
На данный момент остро стоит проблема охраны прав собственности на селекционные достижения, которая тесно связана с возможностью идентификации сортовой и видовой принадлежности растений (Соболев и др., 2006). Ранее для идентификации растений применяли методы, которые базировались на оценке ряда морфологических признаков (Малышев, 2006). Для большинства видов и сортов растений характерно большое разнообразие морфологических признаков. С их помощью в настоящее время оценивают генофонд популяции, уровень изменчивости, генетическое разнообразие и другие показатели (Рамазанова, 2008). По мере создания все большего количества сортов и изучения разных видов растений этих признаков становится недостаточно. Кроме того, морфологические признаки имеют определенные ограничения, связанные с субъективностью в анализе признака. На них оказывает влияние окружающая среда и техника обработки. Некоторые диагностические признаки проявляются только на конкретной стадии развития растения (цветение или созревание плода). По морфологическим признакам также трудно различить растения близкородственного происхождения (Малышев, 2006).
Сложности, связанные с использованием морфологических признаков, приводят к необходимости поиска новых, более удобных и надежных методов идентификации сортов и видов растений. К настоящему времени установлено, что генетические различия между отдельными организмами наиболее полно представлены на уровне ДНК. С помощью современных молекулярных методов эти различия можно обнаружить и использовать для идентификации отдельных линий, сортов и видов растений. Молекулярные методы основаны на применении ДНК-маркеров и являются дальнейшим развитием существующих в настоящее время методов, основанных на применении морфологических или биохимических (белковых) маркеров (Малышев, 2006).
Методы, основанные на использовании ДНК-маркеров, обладают рядом преимуществ по сравнению с другими методами идентификации. Они позволяют в значительно большей степени выявить объективные различия между исследуемыми образцами и, следовательно, существенно повысить разрешающую способность анализа. Молекулярные методы можно применять на любых стадиях развития растений, начиная с семян. Исследованию можно подвергать разные части растения, например, клубни, листья, стебли или другие органы. Результат останется неизменным. ДНК-методы незаменимы в спорных случаях, когда применение традиционных подходов не позволяет достоверно различить исследуемые образцы (Малышев, 2006). Молекулярные методы, основанные на применении ДНК-маркеров, в меньшей степени подвержены генотипической изменчивости и, в большинстве случаев, имеют кодоминантный тип наследования (Рамазанова, 2008).
Данные, полученные с помощью анализа ДНК, являются наиболее объективными для описания сортов и видов растений (Малышев, 2006). На их основе проводится паспортизация сортов и гибридов многих сельскохозяйственных культур - мягкой пшеницы (Сиволап и др., 2000), картофеля, томата, льна и свеклы (Малышев, 2006), сои (Рамазанова, 2008; Брик, Сиволап, 2001) и малины (Соболев и др.2006).
Прототипом предлагаемого технического решения является способ, описанный в автореферате диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Боронниковой СВ. «Молекулярно-генетический анализ генофондов редких и исчезающих видов растений Пермского края»: Автореф. дис. на соиск. уч. степ, док. биол. наук. - Уфа, 2009. С.26-31.
Методика молекулярно-генетической паспортизации редких и нуждающихся в охране травянистых видов растений разработана на примере природных популяций двух видов Adonis vernalis и A. sibirica. Она включает в себя семь этапов: 1 - выбор эффективных стабильных молекулярных маркеров, 2 - сбор материала, 3 - проведение молекулярно-генетического анализа с использованием ПЦР (полимеразной цепной реакции), 4 - анализ выявленных ISSR- и IRAP-маркеров и определение идентификационных (мономорфных и полиморфных), а также составление молекулярно-генетической формулы (5 этап), штрих-кода (6 этап) и генетического паспорта (7 этап).
На первом этапе разработки методики была решена задача выбора эффективных стабильных молекулярных маркеров, позволяющих выявить высокий уровень полиморфизма ДНК, анализировать большую часть генома растений, получить четко воспроизводимые результаты на основании анализа данных молекулярно-генетических исследований двух видов рода Adonis. Всем этим требованиям отвечали ISSR- и IRAP-маркеры.
На втором этапе паспортизации в природных популяциях двух видов рода Adonis собраны фрагменты листьев, из которых выделена ДНК.
На третьем этапе были отобраны наиболее информативные четыре ISSR- и пять IRAP-праймеров, с помощью которых выявлены ISSR- и IRAP-маркеры у двух видов рода Adonis. Проведен ПЦР-анализ выделенных проб ДНК.
На четвертом этапе для двух видов рода Adonis выявлены 10 ISSR- и 17 IRAP-мономорфных фрагментов и 9 ISSR- и 21 IRAP-полиморфных фрагментов ДНК. Четко воспроизводимые при амплификации у особей одного рода фрагменты ДНК названы родовыми, а у особей одного вида - видовыми.
v
IR75
На пятом этапе маркеры ДНК, избранные для паспортизации, представили в виде молекулярно-генетической формулы. Автором предложена новая оригинальная запись фрагмента ДНК с указанием типа фрагмента (родовой, видовой, полиморфный), длины фрагмента и указания праймера нижним индексом, например, As1510-
Недостатки прототипа:
1. В прототипе при составлении молекулярно-генетической формулы используются только идентификационные «родовые», «видовые», «полиморфные» и «уникальные» ДНК-маркеры без учета нуклеотидного состава последовательностей ДНК, что позволяет идентифицировать объекты на надвидовом, видовом, популяционном уровнях только с использованием длин амплифицированных фрагментов ДНК без учета однонуклеотидных замен, делеций, вставок в последовательностях ДНК.
2. Для характеристики популяций травянистых видов растений используются только сочетания полиморфных идентификационных фрагментов ДНК, выявленных методом ПЦР, и не учитываются изменения в последовательностях ДНК, выявленные методом секвенирования.
3. В молекулярно-генетической формуле представлены коды в виде букв и цифр, что не дает представление о точном положении замен или структурных изменений в последовательности ДНК изучаемого объекта.
4. Система разработана только для паспортизации на уровне сорта или популяции травянистых видов растений, то есть относительно генетически гетерогенного материала, и неприменима к относительно генетически гомогенным природным древесным популяциям растений.
5. В предлагаемой системе идентификации используются только полиморфные и не учтены мономорфные молекулярные маркеры, а также другие структурные изменения геномов на молекулярном уровне.
6. Для составления молекулярно-генетической формулы популяций травянистых видов растений предложено отбирать от 10 до 12 молекулярных маркеров (4 родовых молекулярных маркера, то есть общих и для двух изучаемых видов этого рода; 4 видовых, то есть специфических для двух изучаемых видов этого рода; от 1 до 4 полиморфных амплифицированных фрагментов ДНК, сочетания которых специфичны для исследуемых популяций), что не характеризует популяцию или сорт на нуклеотидном уровне.
7. В штрихкоде применено традиционное обозначение родовых идентификационных фрагментов ДНК толстой линией, видовых - линией средней толщины, полиморфных фрагментов - тонкой линией, но никак не отражены изменения в структуре нуклеотидной последовательности.
Задачей создания изобретения является устранение недостатков прототипа, а также возможность с высокой точностью устанавливать тождество различных объектов, наглядно отразить изменения в структуре нуклеотидной последовательности.
Поставленная задача решается с помощью существенных признаков, указанных в формуле изобретения, таких как способ молекулярной генетической идентификации древесных видов растений, которые генетически более гомогенны по сравнению с травянистыми видами растений, характеризуется тем, что в молекулярно-генетическую формулу и штрихкод помимо идентификационных фрагментов ДНК разного размера, амплифицированных в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР), вносят и другие структурные изменения геномов, такие как делеции, дупликации, однонуклеотидные замены (SNP - Single Nucleotide Polymorphism), выявленные при сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей после секвенирования геномной ДНК.
Для характеристики природных популяций древесных видов растений используют сочетания как полиморфных идентификационных фрагментов ДНК, выявленных методом ПЦР, так и изменения в последовательностях ДНК, выявленных методом секвенирования.
Для молекулярно-генетической идентификации популяций и форм у древесных видов растений берут данные анализа нуклеотидных последовательностей ДНК помимо идентификационных фрагментов ДНК, выявленных в результате ПЦР таких как мономорфные, с помощью которых осуществляют идентификация до рода и вида, и полиморфные, сочетания которых используют у травянистых растений для идентификации популяций.
Помимо указания в молекулярно-генетической формуле краткого обозначения рода или вида приводят однонуклеотидные замены, делеции или другие структурные изменения нуклеотидной последовательности ДНК с указанием используемых для их выявления праймеров или гена, а также положения замен или структурных изменений в последовательности.
Для молекулярно-генетической формулы используют от 14 до 16 элементов, из которых 12 являются идентификационными фрагментами ДНК, а сочетания остальных элементов характеризируют популяцию или форму на нуклеотидном уровне.
Используют четыре штрихкода для характеристики рода, четыре - для характеристики вида, от 1-х до 4-х - для характеристики популяции или формы, как при сочетании идентификационных последовательностей ДНК разного размера, так и сочетаний небольшой протяженности делеции, дупликации и однонуклеотидных замен.
В штрихкоде помимо традиционных обозначений родовых идентификационных фрагментов ДНК толстой линией, видовых - линией средней толщины, полиморфных фрагментов - тонкой линией, а изменения в структуре нуклеотидной последовательности обозначают пунктирной линией.
Вышеперечисленная совокупность существенных признаков позволяет получить следующий технический результат - с высокой точностью устанавливать тождество различных объектов, наглядно отразить изменения в структуре нуклеотидной последовательности.
Предлагаемый способ иллюстрируется следующим примером, см. Фиг.1. Молекулярно-генетический штрих-код популяции Р. tremula {Pt I): POPt - фрагменты ДНК, общие для видов Р.tremula и Р.balsamifera; Ptv - фрагменты ДНК, характерные для Р.tremula; Ptp - полиморфные фрагменты ДНК.
В молекулярно-генетическую формулу и штрихкод помимо идентификационных фрагментов ДНК разного размера, амплифицированных в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР), вносят и другие структурные изменения геномов, такие как делеции, дупликации, однонуклеотидные замены (SNP - Single Nucleotide Polymorphism), выявленные при сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей после секвенирования геномной ДНК. Предложен уникальный способ молекулярной идентификации древесных видов растений на примере природных популяций двух видов Populus tremula L. и Populus balsamifera L. Она включает в себя восемь этапов: 1 - выбор эффективных стабильных молекулярных маркеров, 2 - сбор материала, 3 - проведение молекулярно-генетического анализа с использованием ПЦР (полимеразной цепной реакции), 4 - анализ выявленных ISSR-маркеров и определение идентификационных (мономорфных и полиморфных), проведение секвенцовой реакции и электрофореза в секвенаторе, а также анализ полученных данных после секвенирования (5 этап), составление молекулярно-генетической формулы (6 этап), штрих-кода (7 этап) и генетического паспорта (8 этап).
Данный способ можно использовать для идентификации древесных видов растений на самом точном нуклеотидном уровне. В связи с высокой актуальностью использования осины, а также высокой востребованностью идентификации древесины для экспорта за границу, имеет место задача точной идентификации вида растений и происхождения древесины, что возможно как для лиственных, так и хвойных древесных видов растений только с использованием современных молекулярно-генетических методов. Возникшие проблемы могут быть решены применением молекулярных ДНК-маркеров на основе. Эти маркеры используются на всех фазах развития растения. Для выделения ДНК подходит любой растительный материал - кора, корневые отростки, листья, почки, цветки, пыльца, и даже гербарий. Пробы ДНК хранятся длительное время и многократно применяются для анализа.
r
X11
v
X9
p
M27
Первыми буквами названия рода (POP) обозначили (см. Фиг) родовые идентификационные фрагменты ДНК с указателем г от rod нижним индексом, например, POP860. Видовые идентификационные фрагменты обозначены как Pt и Pb с указанием v от vid, например, Pt950. Полиморфные фрагменты ДНК мы предлагаем обозначить индексом p от polimorph, например, Pt660. Как родовые, так и видовые фрагменты ДНК являются мономорфными и установлены с использованием ISSR-метода. Полиморфные фрагменты ДНК (при их различных сочетаниях) позволили составитьуникальную генетическую формулу популяции. Для паспортизации популяций видов рода Populus было отобрано по 4 родовых и видовых фрагментов ДНК, а также от одного до четырех полиморфных фрагментов ДНК, сочетания которых специфичны для исследуемых популяций. Это минимальное число фрагментов ДНК, с помощью которых удалось провести паспортизацию. Гетерогенные природные популяции можно охарактеризовать разными сочетаниями полиморфных фрагментов ДНК. Также приводятся однонуклеотидные замены, делеции или другие структурные изменения нуклеотидной последовательности ДНК с указанием гена, а также положения замены или структурных изменений в последовательности.
Новый способ составления и записи молекулярно-генетической формулы заключается в том, что наравне с выявлением идентификационных маркеров ДНК при помощи ПЦР-анализа для древесных видов растений в молекулярно-генетическую формулу и штрихкод вносятся данные о новых структурных изменениях, выявленных при сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей после секвенирования геномной ДНК.
Новый способ записи содержит полную информацию об идентификационном молекулярном маркере, включая краткое обозначение вида или рода растения, точное положение замен или других структурных изменений в последовательности ДНК с указанием гена, положения в гене, в котором обнаружена замена, и используемых для их выявления праймеров.
Основным достижением предлагаемого способа является механизм обобщения данных молекулярно-генетического анализа посредством выявления идентификационных маркеров одновременно несколькими инновационными методами анализа геномов, такими как ПНР и секвенирование последовательностей ДНК, идентификация объектов на самом точном нуклеотидном уровне, а также запись результатов в виде модифицированных молекулярно-генетической формулы и штрихкода.
Молекулярно-генетическая идентификация имеет важное значение, поскольку позволяет на научной основе и с высокой точностью устанавливать тождество различных объектов (например, ввозимой древесины из России в Китай), для получения точной информации о легальности продажи данного древесного сырья.
Таким образом, предлагаемый «Способ молекулярно-генетической идентификации популяций древесных видов растений» позволяет проводить идентификацию объектов на самом точном нуклеотидном уровне.