Адвентивная регенерация вишни в культуре in vitro

В. В. Роговая, Л. Ю. Новикова, Т. А. Гавриленко АДВЕНТИВНАЯ РЕГЕНЕРАЦИЯ ВИШНИ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

В работе проанализирована способность микрорастений вишни к адвентивной регенерации в зависимости от генотипа, типа экспланта, способа культивирования экспланта, состава питательных сред, условий культивирования. Был отработан результативный метод адвентивной регенерации вишни.

Адвентивная регенерация является одним из способов микроклонального размножения растений в культуре in vitro. Почки, возникшие непосредственно из тканей и клеток эксплантов растений, обычно их не образующих, называются адвентивными [1]. Адвентивные (придаточные) почки образуются не из первичных апикальных, а из вторичных, боковых и раневых меристем или в результате дедифференциации клеток (чаще паренхимных) «постоянных» тканей [2]. У многих видов растений их образование может быть индуцировано высоким отношением цитокининов к ауксинам в питательной среде [3].

Регенерация адвентивных побегов, корней или эмбриоидов из соматических растительных клеток экспланта может происходить через непрямую регенерацию — образование каллуса и формирование побегов, или через «прямую» регенерацию, когда клетки экспланта становятся способными к регенерации без формирования каллусных тканей [1]- [4].

Способность микрорастений вишни к адвентивной регенерации может зависеть от генотипа, типа экспланта, способа культивирования экспланта, состава питательных сред, условий культивирования.

Адвентивные побеги могут образовываться на эксплантах листьев, черешков, корней и других органов растений различных видов плодовых и ягодных культур [1], [5]-[18].

Для регенерации побегов плодовых косточковых культур, таких как вишня, черешня, персик, абрикос, из исходных эксплантов (целых листьев и их сегментов) используются различные среды: Мурасиге-Скуга (МС), Ллойда и Мак Коуна (WPM), Драйвера и Куниюки (DKW), Курена и Лепуавра (QL) [7]-[13]. Для экспериментов по адвентивной регенерации вишни и черешни чаще всего используется среда Ллойда и Мак Коуна для древесных растений - Woody Plant Medium (WPM), дополненная различными стимуляторами роста [7], [8], [10]. Из цитокининов в основном используют 6-бензиламинопурин (6-БАП), тидиа-зурон (TDZ), из ауксинов — а-нафтилуксусную кислоту (НУК) [8], [13], ß-индолил-З-масляную кислоту (ИМК) [7], [12], 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) [10]. Важно отметить, что в литературе нет единого мнения ни об эффективности применения определенных типов сред и фитогормонов, ни о типе экспланта, ни о способе культивирования эксплантов для достижения эффективной адвентивной регенерации у косточковых культур.

В настоящее время возрос интерес к методам культуры тканей и клеток в связи с возможностью применения новых клеточных технологий в растениеводстве. Использование методов генной инженерии позволяет решить ряд проблем в селекции растений. Для многих современных сортов растений возможности генной инженерии ограничены как отсутствием эффективных методов регенерации, так и небольшим набором сортов, для которых проведено изучение регенерационной способности в культуре in vitro. Поэтому отбор новых генотипов, способных обеспечить высокую регенерацию в культуре in vitro, является важным этапом в работах по генетической трансформации и клеточной селекции растений.

Род Prunus является одним из наиболее сложных в плане получения эффективной адвентивной регенерации в культуре in vitro. Проблема получения регенерантов у представителей косточковых культур актуальна, но ею занимаются лишь немногие научно-исследовательские учреждения в мире [5], [7]-[13], [15]. В связи с этим цель данной работы состояла в поиске и разработке результативных методов адвентивной регенерации вишни.

Растительный материал. Объектами исследований являлись четыре сорта вишни различного происхождения: два сорта вишни обыкновенной (С. vulgaris Mill.) — Владимирская (номер по каталогу ВИР: к-5331), Еникеевка (к-38000); сорт вишни обыкновенной с доминированием признаков черешни (С. avium (L.) Moench) — Память Учителя (к-10613) и сорт Алмаз (к-34131), созданный на основе межвидовой гибридизации С. vulgaris х С. maackii. Микрорастения этих сортов сохраняются в коллекции in vitro Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства имени Н. И. Вавилова на среде Мурасиге-Скуга (МС), дополненной 6-бензиламинопурином (БАП), в концентрации 0,5 мг/л при 16 часовом фотопериоде и температуре 22 ± 2 °С.

Регенерация адвентивных побегов вишни. Изучение способности к адвентивной регенерации различных сортов вишни проводилось с использованием шести вариантов питательных сред, подобранных по литературным источникам (табл. 1).

В качестве эксплантов использовали различные части микрорастений: целые листья, с нанесёнными на них поперечными надрезами вдоль центральной жилки листа

Таблица 1

Питательные среды для адвентивной регенерации вишни

Вариант среды Минеральная основа Фитогормоны, мг/л Агар, г/л Сахар, г/л Ссылки

цитокинины ауксины

I МС 2 БАП 0,1 ИМК 7 30 Г161

II МС 0,1 ТДЗ - 7 30 [17]

III МС 2 БАП 0,5 ТДЗ 0,2 2,4-Д 7 30 [18]

IV МС 1 ТДЗ 0,2 2,4-Д 7 30 [18]

V WPM 2 БАП 1 НУК 7 30 [71

VI WPM 1 ТДЗ 0,05 НУК 4,5 20 [8]

Примечания. WPM — Woody Plant Medium, среда Ллойда и Мак Коуна для древесных растений. ТДЗ — тидиазурон. 2,4-Д — 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота. ИМК — ß-индолил-З-масляная кислота. НУК — а-нафтилуксусная кислота.

(рис. 1,6), черешки листьев и сегменты корней. В опытах использовали верхушечные, полностью сформированные листья микрорастений трёхнедельного возраста (первые три-четыре листа). Листовые экспланты всех типов культивировали двумя способами: абак-сиальной и адаксиальной к среде. В каждую чашку Петри помещали по 20-35 сегментов листьев, по 30 сегментов черешков листьев, по 40-50 сегментов корней и по 10-15 целых листовых эксплантов. Все типы эксплантов культивировали без пересадки на свежие регенера-ционные среды; т. е. регенеранты формировались на исходных средах. Учёт результатов опыта проводили через 1,5 месяца после закладки экспериментов. Эксперименты проводили в двух-трёх по-вторностях, используя по 40-126 эксплантов в каждом варианте опыта для каждого сорта. Полученные данные были проанализированы в программе Statistica 6.0 методом однофакторного дисперсионного анализа (модуль ANOVA).

Микроразмножение и укоренение побегов-регенерантов вишни и перенос их в условия in vivo. Через 1,5 месяца после закладки экспериментов, регенеранты вишни были срезаны с эксплантов и перенесены на среды для микроразмножения: МС + 0,5 мг/л БАП.

Рис. 1. Адвентивная регенерация вишни. Исходные экспланты: а — целые листья микрорастений; б — сегменты листьев; в — формирование адвентивных побегов у сорта Еникеевка из листовых эксплантов на среде V; г — укоренённые растения-регенеранты; д — адаптация растений-регенерантов к условиям in vivo

После этапа микроразмножения побеги-регенеранты вишни длиной от 1 см и более переносили на среду для укоренения: МС с половинным составом солей, дополненной 1 мг/л ИМК, и (или) на среде МС с половинным составом солей без гормонов.

Для переноса укоренённых микрорастений вишни в условия in vivo, использовали индивидуальные прозрачные пластиковые стаканы объёмом 0,5 л (высотой 14 см), наполовину заполненные простерилизованным грунтом (торфяная земля — песок в соотношении 3 : 1).

Экспериментальные результаты и их обсуждение

Регенерация адвентивных побегов вишни. После одной-двух недель культивирования эксплантов на регенерационных средах I, II, V и VI наблюдали разрастание тканей эксплантов и каллусообразование. Начало появления адвентивных почек на исходных листовых эксплантах наблюдалось на 15-20-й день после начала культивирования на средах I, V и VI. На среде II листовые экспланты формировали каллус, но не образовывали регенеранты; на этой среде единичный регенерант сформировался на сегменте корня сорта Память Учителя. На средах III-IV отмечен наиболее высокий процент некротизации эксплантов (40-100%); адвентивной регенерации на этих средах добиться не удалось.

Адвентивные побеги чаще всего появлялись в верхушечной зоне целых листовых эксплантов и преимущественно на базальных сегментах листа микрорастений. В вариантах опыта, где в качестве эксплантов использовались целые листья (с поперечными надрезами вдоль центральной жилки листа, культивируемые адаксиальной поверхностью к среде), регенеранты появлялись на адак-сиальной поверхности листовой пластинки и росли внутрь регенерационной среды. В опытах по адвентивной регенерации из листовых эксплантов наблюдалась единичная и множественная регенерация побегов. Один листовой экс-плант мог иметь несколько зон — от одной до трёх, в каждой зоне — от одного до шести растений-регенерантов.

Влияние сред и типа эксплантов на способность сортов вишни к адвентивной регенерации. В результате изучения способности микрорастений вишни к адвентивной регенерации на разных средах были выявлены существенные различия между вариантами опытов — частота регенерации на среде VI для всех сортов была значительно выше, чем на средах I и II (табл. 2, рис. 2). Наиболее высокая частота адвентивной регенерации отмечена у изученных сортов вишни на среде VI для сортов Алмаз, Владимирская, Память Учителя, Ени-кеевка (13,8; 7,5; 16,0; 32,1% соответственно), при использовании в опыте целых листовых эксплантов (табл. 3). Низкий процент адвентивной регенерации (0,5-5,4%) отмечен для трёх сортов: Владимирская, Память Учителя, Алмаз на среде V, при использовании в опыте сегментов листьев. Исключение составил сорт Еникеевка, который имел одинаково высокую регенерацию на обеих средах: V и VI, когда в эксперименте были использованы целые листовые экспланты (табл. 3, рис. 1,е) и низкую регенерацию в случае культивирования сегментов листьев на тех же средах. На среде I адвентивная регенерация отмечена только у сорта Еникеевка (2,7% при использовании в качестве эксплантов целых листьев и 1,5% — при использовании в качестве эксплантов сегментов листьев) (табл. 3).

Таблица 2

Оценка влияния среды на эффективность адвентивной регенерации сортов вишни по результатам однофакторного дисперсионного анализа

Вариант среды Процент регенерации х ± m - х 95% доверительный интервал, процент регенерации Число измерений

от до

I (МС+БАП) 0,57 ± 1,44 -2,303 3,449 22

II (МС+ТДЗ) 0,09 ± 1,69 -3,278 3,466 16

V (WPM+БАП) 4,84 ± 1,95 0,947 8,736 12

VI (WPM+ТДЗ) 11,44 ± 1,80* 7,830 15,041 14

Примечание. * — существенные различия (уровень значимости p < 0,05).

Тип среды; LS Means Current effect: F(3, 60)=9,3530, p=,00004 Effective hypothesis decomposition Vertical bars denote 0,95 confidence intervals

I

!

! I

с

Рис. 2. Оценка влияния среды на эффективность адвентивной регенерации сортов вишни по результатам однофакторного дисперсионного анализа

Существенное влияние на адвентивную регенерацию вишни оказывал тип экспланта. При использовании целых листовых эксплантов и сегментов листьев адвентивная регенерация побегов отмечена у всех изученных сортов. Низкий (0-0,9%) уровень адвентивной регенерации отмечен при использовании в качестве эксплантов сегментов корней на средах II, VI. При использовании черешков листьев регенерации не получено ни для одного сорта. Во второй повторно-сти опыта на среде V у трех сортов — Алмаз, Владимирская, Еникеевка — было отмечено образование адвентивных корней при использовании листовых эксплантов. Наиболее высокая частота регенерации была получена для всех сортов при использовании в качестве эксплантов целых листьев, культивируемых адаксиальной поверхностью к среде, по сравнению с другими типами эксплантов (табл. 4, рис. 3).

Тип среды

Таблица 3

Оценка эффективности адвентивной регенерации у сортов вишни

на средах I, II, V, VI

Сорт Процент регенерации

Среда I

листья (адакс.) сегменты литьев (адакс.) сегменты корней листья (адакс.) сегменты листьев (адакс.) сегменты корней листья (адакс.) сегменты листьев (абакс.) сегменты корней листья (адакс.) сегменты листьев (абакс) сегменты корней

Владимирская 0 0 0 0 0 0 0 0,5 (0-2) 0 7,5 (3-13) 1,9 (0-7) 0

Енике-евка 2,7

Память Учителя 0 0 0 0 0 0,8 (0-3) 0 0,7 (0-3) 0 16 (9-25) 0 0

Алмаз - - - - - - 4,8 (0,4-13) 5,4 (2-10) 0 13,8 (8-21) 13,9 (7-23) 0

Примечания. Способ культивирования листовых эксплантов: (адакс.) — адаксиаль-ной поверхностью на среду, (абакс.) — абаксиальной поверхностью на среду. (-) — данные отсутствуют.

Таблица 4

Оценка влияния типа экспланта на адвентивную регенерацию вишни по результатам однофакторного дисперсионного анализа

Тип экспланта Процент регенерации х ± т - х 95% доверите процент льный интервал, регенерации Число измерений

от до

Лист адакс. 6,85 ± 1,06* 4,743 8,953 27

Лист абакс. 0,00 ± 3,19 -6,314 6,314 3

Сегменты адакс. 0,29 ± 1,43 -2,530 3,117 15

Сегменты абакс. 2,65 ± 1,43 -0,170 5,477 15

Сегменты корня 0,11 ± 1,03 -1,920 2,141 29

Черешки 0,00 ± 0,99 -1,964 1,964 31

Примечание. * — существенные различия (уровень значимости р < 0,05).

Укоренение и акклиматизация адвентивных растений-регенерантов вишни. В результате проведённых экспериментов было получено 87 регенеран-тов четырёх сортов вишни, из них 46% микропобегов были способны к укоренению (рис. 1,г). Наиболее высокий процент укоренения побегов-регенерантов вишни отмечен для сорта Алмаз (61%).

Type expl; LS Means Current effect: F(5, 114)=6,0605, p=,00005 Effective hypothesis decomposition Vertical bars denote 0,95 confidence intervals

сегмент ада сегмент аба черешки

Тип экспланта

Рис. 3. Оценка влияния типа экспланта на адвентивную регенерацию вишни по результатам однофакторного дисперсионного анализа

В настоящее время осуществляется перенос адвентивных растений-реге-нерантов из стерильных условий в тепличные (рис. 1Д). Адвентивные растения-регенеранты, прошедшие период адаптации к нестерильным условиям, будут перенесены в теплицу для дальнейшего сравнительного изучения регенерантов и контрольных растений, полученных методом микроразмножения пазушными почками. В результате данной работы была изучена способность к адвентивной регенерации сортов вишни различного происхождения в зависимости от состава сред, типа эксплантов, способа и условий культивирования. Сравнительное изучение будет проведено с использованием комплекса методов: анализа морфологических признаков; цитологического анализа числа хромосом и использование молекулярно-генетических методов (ЯДРО анализ). Такой комплексный подход позволит в дальнейшем оценить генетическую стабильность адвентивных регенерантов вишни.

* * *

По результатам проведённых исследований можно сделать следующие выводы:

• Эффективность адвентивной регенерации вишни как способа микрокло-нального размножения растений зависит от состава питательных сред, сортовых особенностей, т. е. генотипа растений и типа экспланта.

• Наиболее высокая частота адвентивной регенерации у изученных сортов вишни отмечена на среде VI (WPM + 1 мг/л ТДЗ + 0,05 мг/л НУК), при исполь-

зовании целых листовых эксплантов, помещенных адаксиальной поверхностью на среду.

• Использование в качестве эксплантов черешков листьев и сегментов корней не является результативным для адвентивной регенерации вишни; в этих экспериментах частота регенерации не превышает 1%.

• Результаты проведённых исследований позволяют рекомендовать сорт Еникеевка, имеющий относительно высокую частоту адвентивной регенерации (33%), для использования в опытах по генетической трансформации вишни.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ

1. Сорокина И. К., Старичкова Н. И., Решетникова Т. Б., Гринь Н. А. Основы биотехнологии растений. Культура растительных клеток и тканей: Учебное пособие. 2002. С. 45.

2. Батыгина Т. Б., Васильева В. Е. Размножение растений: Учебник. СПб., 2002. С. 232.

3. ЛутоваЛ. А. Биотехнология высших растений: Учебник. СПб., 2003. С. 227.

4. De Klerk G.-J. Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. Regeneration of roots, shoots and embryos: physiological, biochemical and molecular aspects // Biologia Plantarum. Vol. 39. № 1. 1997. Р. 53-66.

5. Долгов С. В., Фирсов А. П., Бурьянов Л. И. Разработка методов регенерации и генетической трансформации вишни Cerasus vulgaris // Новые методы биотехнологии растений. Пущино, 1993. С. 18.

6. Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур / Под ред. В. Е. Перфильева: Методические рекомендации / ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И. В. Мичурина, 1996. С. 73.

7. Tang H., Ren Z., Reustle G., Krczal G. Plant regeneration from leaves of sweet and sour cherry cultivars // Scientia Horticulturae. 2002. Vol. 93. P. 235-244.

8. Bhagwat B., David Lane W. In vitro shoot regeneration from leaves of sweet cherry (Prunus avium) «Lapins» and «Sweetheart» // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Netherlands. 2004. Vol. 78. P. 173-181.

9. Gentile A., Monticelli S., Damiano C. Adventitious shoot regeneration in peach [Prunus persica (L.) Batsch] // Plant Cell Reports. 2002. Vol. 20. P. 1011-1016.

10. Takashina T., Nakano H., Kato R. Efficient plant regeneration culture from leaf explants of in vitro-grown sweet cherry // Acta Horticulturae: XXVI International Horticultural Congress: Genetics and Breeding of Tree Fruits and Nuts. Р. 622.

11. Burgos L., Alburquerque N. Ethylene inhibitors and low kanamycin concentrations improve adventitious regeneration from apricot leaves // Plant Cell Reports. 2003. Vol. 21. P. 11671174.

12. Hammatt N., Grant N. J. Shoot regeneration from leaves of Prunus serotina Ehrh. (black cherry) and P. avium L. (wild cherry) // Plant Cell Reports. 1998. Vol. 17. P. 526-530.

13. Grant Neil J., Hammatt Neil. Adventitious shoot development from wild cherry (Prunus avium L.) leaves // New Forests. Netherlands. 2000. Vol. 20. P. 287-295.

14. James D. E., Pоssеу A. J., Mal^tm S. B. Organogenesis in callus derived from stem and leaf tissues of apple and cherry rootstocks // Plant Cell Tissue Organ Cult. 1984.Vol. 3. № 4.

15. Jones O. P., Jacqueline A. Gayner and Watkins R. Plant regeneration from callus tissue cultures of the cherry rootstook Colt (Prunus avium x P. pseudocerasus) and the apple rootstook M. 25 (Malus pumila) // The Journal of Horticultural Science. England, 1984. Vol. 59. № 4. P. 463-467.

16. Graham J., Lasi L., Millam S. Genotipe-specific regeneration from a number of Rubus cultivars // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1997. Vol. 48. P. 167-173.

17. Сковородников Д. Н. Особенности клонального микроразмножения in vitro и ускорение селекции новых ремонтантных форм малины. // Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Брянск, 2004. С. 20.

ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ

18. Passey A. J., Barrett K. J., James D. J. Adventitious shoot regeneration from seven commercial strawberry cultivars (Fragaria x ananassa Duch.) using a range of expiant types // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Netherlands. 2003. Vol. 21. P. 397-401.

V. Rogovaia, L. Novikova, T. Gavrilenko IN VITRO ADVENTITIOUS REGENERATION OF SOUR CHERRY

The ability of sour cherry micro-plants towards adventitious regeneration has been studied depending on the genotype, explant type and culturing conditions. The efficient method for adventitious shoot regeneration of sour cherry has been developed.