СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИОФАГА BORDETELLA BRONCHISEPTICA
METHOD OF EXTRACTING BACTERIOPHAGE BORDETELLA BRONCHISEPTICA

Способ относится к областям микробиологии и биотехнологии, а именно к выделению штаммов бактериофагов бактерий Bordetella bronchiseptica.
Известен способ получения бактериофагов (патент США US 7405066 В2. «Бактериофаги и их использование»), заключающийся в получении бактериофагов из лизогенных бактериальных клеток после 7-дневной инкубации при 34°C на среде RCA, содержащего 6 µg мл - 1 фуразолидон. После получения отчетливых негативных колоний, бактериофаги подвергают дополнительной очистке. Согласно описанию изобретения в процессе отбираются штаммы фагов, дефектные по генам, экспрессирующим белковые продукты, необходимые для возникновения лизогенного состояния чувствительных к ним бактериальных клеток.
Выделение бактериофагов указанном в прототипе способом имеет недостатки, связанные с:
- вероятным получением умеренных фагов;
- применением фуразолидона в качестве индуцирующего фактора, который может угнетать рост чувствительных к нему штаммов бактериальных клеток;
- большим количеством манипуляций, трудоемкостью процесса селекции;
- длительными сроками получения штаммов бактериофагов.
Цель изобретения - выделение бактериофагов из бактериальных штаммов Bordetella bronchiseptica, выращенных на плотной агаровой среде, для которых получение бактериофагов другими способами затруднено или невозможно без применения антибактериальных препаратов, а также сокращение сроков их выделения.
Указанная цель достигается тем, что способ выделения бактериофага Bordetella bronchiseptica включает индуцирующее мутагенное воздействие ультрафиолетового излучения с длиной волны 250-260 нм на клетки лизогенных бактериальных культур Bordetella bronchiseptica, выращенных на плотной агаровой среде, причем время облучения ультрафиолетом составляет в 1 день 5-7 мин, во 2 день - 7-10 мин, в 3 день - 7-10 мин, а расстояние от облучаемых клеток лизогенных бактериальных культур Bordetella bronchiseptica до ультрафиолетового излучателя в 1 день составляет 1 метр, во 2 день - 1 метр, в 3 день - 0,5 метра.
Выделение бактериофагов из бактериальных клеток Bordetella bronchiseptica методом индуцирующего мутагенеза с применением ультрафиолетового излучения осуществляется следующим способом.
1 день: посев газоном суточной культуры Bordetella bronchiseptica на мясопептонный агар (МПА), подсушивание в термостате 10-15 мин, облучение бактерий ультрафиолетовыми лучами, длина волны λ которых составляет 250-260 нм с расстояния 1 м, экспозиция 5-7 мин. Далее инкубирование чашек Петри с обработанными бактериями в термостате при 37°C в течение 24 ч.
2 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара, облучение бактерий ультрафиолетовыми лучами (λ=250-260 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат (37°C) на 24 ч.
3 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара, облучение бактерий ультрафиолетовыми лучами (λ=250-260 нм) с расстояния 0,5 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат (37°C) на 24 ч.
4 день: смыв выросших колоний мясопептонным бульоном с чашек Петри, помещение в пробирку со штаммами Bordetella bronchiseptica. Культивирование в термостате в течение 24 ч.
-1
5 день: обработка хлороформом 1 часть хлороформа и 10 частей фаголизата в течение 15 минут, центрифугирование при 3000 мин - 15 мин. Снятие надосадочной жидкости в стерильную пробирку.
После этого проводят исследование полученной суспензии методом нанесения капель на газон изучаемой культуры. Для этого на поверхность МПА в чашках Петри нанести 0,3 мл 18-20-ти часовой культуры Bordetella bronchiseptica, равномерно растереть шпателем по поверхности среды для получения газона. Для подсушивания поставить в термостат на 20 минут. На поверхность подсушенной среды нанести капли исследуемых бактериофагов и наклонить чашки Петри, чтобы капли стекли. Каждый сектор используется для одного бактериофага. В качестве контроля нанести каплю стерильного мясопептонный бульон (МПБ).
6 день: учет результатов. Присутствие бактериофага определить по наличию зон лизиса.
Выбор схемы облучения ультрафиолетовыми лучами бактериальных клеток Bordetella bronchiseptica обусловлен проведенным исследованием, которое доказало эффективность выбранного режима (таблица 1).
Предлагаемый способ выделения бактериофагов из бактериальных клеток Bordetella bronchiseptica, выращенных на плотной агаровой среде методом индуцирующего мутагенеза с применением ультрафиолетового излучения с указанным режимом, отличается от известных тем, что сокращает сроки их выделения и позволяет получать их без применения антибактериальных препаратов из лизогенных бактериальных штаммов Bordetella bronchiseptica, для которых получение бактериофагов другими способами затруднено или невозможно.
Таблица 1
Схема облучения ультрафиолетовыми лучами бактериальных клеток Bordetella bronchiseptica
№п/п
Штаммы
Проведенные опыты
№1
№2
№3
№4
№5
№6
№7
№8
№9
1 день: t=2-4 мин l=1 м 2 день: t=2-4 мин l=1 м 3 день: t=2-4 мин l=1 м
1 день: t=2-4 мин l=0,5 м2 день: t=2-4 мин l=0,5 м 3 день: t=2-4 мин l=0,5 м
1 день: t=15-17 мин l=1,5 м 2 день: t=15-17 мин l=1,5 м 3 день: t=15-17 мин l=1,5 м
1 день: t=15-17 мин l=1 м 2 день: t=15-17 мин l=1 м 3 день: t=15-17 мин l=1 м
1 день: t=12-14 мин l=1 м 2 день: t=12-14 мин l=1 м 3 день: t=12-14 мин l=1 м
1 день: t=12-14 мин l=0,5 м 2 день: t=12-14 мин l=0,5 м 3 день: t=12-14 мин l=0,5 м
1 день: t=9-11 мин l=1 м 2 день: t=11-13 мин l=1 м 3 день: t=11-13мин l=0,5 м
1 день: t=10 мин l=1 м 2 день: t=10 мин l=1 м 3 день: t=10 мин l=0,5 м
1 день: t=5-7 мин l=1 м 2 день: t=7-10 мин l=1 м 3 день: t=7-10 мин l=0,5 м
1
B.br.100 УГСХА
-
-
-
-
-
-
-
-
+
2
В.br.107 УГСХА
-
-
-
-
-
-
-
-
+
3
B.br.110 УГСХА
+
-
-
-
-
-
-
+
+
4
B.br.lll УГСХА
-
-
-
-
-
-
-
-
+
5
B.br.113 УГСХА
-
-
-
-
-
-
-
-
+
6
B.br.118 УГСХА
-
-
-
-
-
-
-
-
-
7
B.br.122 УГСХА
-
-
-
-
-
-
-
-
+
8
B.br.124 УГСХА
-
-
-
-
-
-
-
+
+
9
B.br. 141 УГСХА
-
-
-
-
-
-
-
-
-
10
B.br.183 УГСХА
-
-
-
-
-
-
-
-
+
Примечание к таблице: «t» - время облучения, «l» - расстояние от облучаемой чашки Петри ультрафиолетовой лампы, «-» - отсутствие негативных колоний бактериофагов, «+» - наличие негативных колоний бактериофагов