ВАКЦИНА ИНАКТИВИРОВАННАЯ КОМБИНИРОВАННАЯ ПРОТИВ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ, РОТА-, КОРОНАВИРУСНОЙ БОЛЕЗНЕЙ И ЭШЕРИХИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
INACTIVATED COMBINED VACCINE AGAINST VIRAL DIARRHEA, ROTA-, CORONA-VIRUS DISEASES AND ESCHERICHIOSIS OF CATTLE

Изобретение относится к области вирусологии, биотехнологии и ветеринарии и касается создания новых вакцин, которые могут быть использованы для предупреждения инфекционных болезней крупного рогатого скота, особенно у новорожденных телят, сопровождающихся нарушением функций органов желудочно-кишечного тракта различной степени тяжести.
Болезни желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота (КРС) широко распространены во всех странах мира и наносят колоссальный экономический ущерб. Массовые энтериты и энтероколиты, клинически проявляющиеся диареями, регистрируются у 70-100% новорожденных телят уже к концу первых суток после рождения, а смертность больных телят составляет 15-55% (Павлов Д.К. Заболевания желудочно-кишечного тракта у новорожденных телят. // «Ветеринарная жизнь», июнь, №11, 2006).
Отличительной особенностью этих заболеваний является множественность инфекционных агентов, вызывающих сходные клинические проявления болезни. Смешанные формы инфекционных гастроэнтеритов характеризуются интенсивным развитием клинических признаков и обусловливаются различными ассоциациями энтропатогенных вирусов, таких как вирус диареи КРС, рота- и коронавирусы, вирулентность которых повышается на фоне различных неблагоприятных условий содержания и кормления. Течение вирусных инфекций, как правило, осложняется энтеротоксигенными колибактериями, которые выделяются взрослыми животными и попадают в кишечник новорожденного вместе с непатогенными колибактериями.
Поскольку заражение телят инфекционными возбудителями происходит в первые часы и дни после рождения, основу стратегии специфической профилактики инфекционных желудочно-кишечных болезней составляет активная иммунизация стельных коров с целью обеспечения пассивной защиты потомства.
К настоящему времени известно несколько комбинированных вакцин различной валентности против гастроэнтеритов КРС. Однако их применение не всегда сопровождается положительным эффектом, главным образом, из-за несбалансированности антигенного состава и низкого титра специфических антител в крови стельных коров и в молозиве, выпаиваемом новорожденными телятами.
7,5
8,5
6,5
7,5
50
см3,
50
см3
Известна комбинированная вакцина против вирусных пневмогастроэнтеритов крупного рогатого скота и телят, содержащая адъювант и инактивированные суспензии вирусов инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, ротавирусной и коронавирусной инфекции в титре 10-10 ТЦД/инактивированные суспензии вирусов парагриппа-3 и респираторно-синцитиальной инфекции - в титре 10-10 ТЦД/, взятые в вакцине в объемном соотношении 1:1:1:1:0,5:0,5 соответственно (Патент RU №2261111, A61K 39/295, опубл. 27.09.2005).
Однако известная комбинированная вакцина не обеспечивает иммунологическую защиту животных от инфекционных гастроэнтеритов бактериальной этиологии ввиду отсутствия в вакцине антигенов E.coli. Кроме того, вакцинные штаммы вирусов, входящие в ее состав, не обеспечивают формирование иммунитета по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах, и, как следствие этого, известная вакцина является недостаточно эффективной.
Известна ассоциированная вакцина против диареи телят, содержащая инактивированные этанолом клетки штаммов Escherichia coli 09:К99, Escherichia coli 0138:К88, Escherichia coli ГИСК N 200, Salmonella tuphimurium ГИСК N 195, Salmonella dublin ГИСК N 196, Salmonella enteritidis ГИСК N 197, Proteus vulgaris ГИСК N 198, Proteus mirabilis ГИСК N 199, Klebsiella pneumoniae ГИСК N 201, Klebsiella pneumoniae N ГИСК N 202, фенол, изотонический раствор хлорида натрия и адъювант гидроокись алюминия (Патент RU №2035916, A61K 39/125, опубл. 17.06.93).
Недостатком известной ассоциированной вакцины является невысокая эффективность вследствие неполноты антигенного состава входящих в нее компонентов, поскольку в составе вакцины отсутствуют антигены вирусных возбудителей, вызывающих массовые вспышки диарейных болезней КРС.
Известна также формолтиомерсаловая вакцина против эшерихиоза телят, представляющая собой смесь инактивированных клеток энтеропатогенных штаммов E.coli 08:К43; 09, 015:К-14; 020, 026:К60; 041, 055, 078:К-80; 086:К-61:Н32; 0115, 0117:К-62; 0119, 0141 и 0149 (Ветеринарные препараты. Справочник. - М.: "Колос", 1981, стр.219-224).
Однако известная вакцина не предохраняет животных при смешанных формах инфекционных желудочно-кишечных болезней, т.к. не обладает специфической активностью в отношении основных возбудителей вирусной природы.
Известна ассоциированная вакцина против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят, содержащая инактивированные культуральные суспензии штаммов Bovine rotavirus "III-1", Bovine coronaviras "CM-1", Bovine Herpesvirus "ТКА-ВИЭВ-В2" с титрами соответственно 107,0-107,8 ТЦД50/мл, 105,0-105,8 ТЦД50/мл, 107,6-108,0, инактивированные суспензии клеток штаммов Ecsherichia coli, синтезирующих адгезины К99 и А20, с концентрацией 100 - 120 млрд.м.к. в 1 мл физиологического раствора, и гель гидроокиси алюминия (Патент RU №2145236, A61K 39/295, опубл. 10.02.2000).
Основным недостатком ассоциированной вакцины является низкая антигенная и иммуногенная активность вакцинных штаммов, а также отсутствие иммунитета к эшерихиозу, протекающему в формах колидиареи и колиэнтеротоксемии.
Наиболее близким аналогом является вакцина инактивированная комбинированная против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят «Комбовак-К», которая изготавливается из штаммов трех вирусов: рота-, корона- и вирусной диареи, протективных антигенов эшерихий; соматических 09, 078, 0115; капсульных полисахаридных К 80, К 30; адгезивных антигенов 99, F-41, термостабильных и термолабильных инактивированных энтеротоксинов и предназначена для профилактики вызываемых ими заболеваний (Инструкция по применению вакцины инактивированной комбинированной против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят «Комбовак-К», утвержденная Департаментом ветеринарии 30.03.2007 г.).
Недостатком известной комбинированной вакцины является относительно невысокий титр инфекционной активности входящих в ее состав вирусных суспензий, в результате чего в прививной дозе не обеспечивается необходимое количество протективных антигенов против указанных болезней.
Задачей изобретения является разработка безопасной комбинированной (поливалентной) вакцины, содержащей сбалансированные в антигенном и иммуногенном отношении вирусные и бактериальные антигены, которая позволит создать напряженный иммунитет против наиболее значимых возбудителей болезней, сопровождающихся поражением органов желудочно-кишечного тракта, и обеспечить, таким образом, сохранность молодняка и продуктивность взрослых животных.
Еще одной задачей является получение новых производственных штаммов вирусов ВД, РВ и KB, обладающих широким антигенным спектром, высокой антигенной и иммуногенной активностью не только в нативном виде, но и после инактивации, стабильно сохраняющих свои свойства, и пригодных для создания инактивированных комбинированных вакцин различной валентности.
Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала комбинированных вакцин против инфекционных болезней, сопровождающихся поражением органов желудочно-кишечного тракта, а также в повышении стабильности, антигенной и иммуногенной активности комбинированной вакцины и создании напряженного и длительного иммунитета у привитых животных и родившихся телят против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота.
Технический результат изобретения достигается за счет использования в составе вакцины новых производственных штаммов вирусов вируса диареи, рота- и коронавирусов КРС с широким антигенным спектром, а также за счет создания синергетической композиции поливалентной вакцины при объединении новых производственных штаммов вирусов с известными вакцинными штаммами эшерихий.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Предлагаемая инактивированная комбинированная вакцина против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличается тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь инактивированной суспензии штамма вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336, семейства Flaviviridae, рода Pestivirus; инактивированной суспензии штамма ротавируса ГКВ №2337, семейства Reoviridae, рода Rotavirus; инактивированной суспензии штамма коронавируса ГКВ №2338, семейства Coronaviridae, рода Coronavirus; инактивированной суспензии клеток бактерий Escherichia coli серовариантов О9:К30, О78:К80, О115, О141:К99 и О101:F41, в эффективном количестве.
Термин «эффективное количество» означает количество активного вещества, которое при введении коровам и/или телятам обеспечивает индукцию специфического иммунного ответа достаточного уровня в организме животных с последующим предупреждением от заболевания и симптомов заболевания, подлежащих профилактике.
Входящие в состав комбинированной вакцины штамм вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336, семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, штамм ротавируса ГКВ №2337, семейства Reoviridae, рода Rotavirus и штамм коронавируса ГКВ №2338, семейства Coronaviridae, рода Coronavirus, являются новыми производственными штаммами и впервые используются в составе вакцинных препаратов.
Термин «производственный штамм» означает вакцинный штамм, изученный по своим биологическим свойствам, стабильный при хранении и пересевах, безвредный после инактивирования или аттенуирования для животного, хорошо адаптированный к системе культивирования, обладающий высокой антигенной и иммуногенной активностью, как для чувствительной лабораторной модели, так и для естественно восприимчивых животных, а также характеризующийся широким антигенным спектром, доминирующим над эпизоотическими штаммами возбудителя.
Производственный штамм вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2336 и характеризуется следующими признаками и свойствами.
Источник происхождения.
Источником получения нового производственного штамма вируса диареи ГКВ №2336 является вирусный штамм СТ-89 (авторское название), выделенный в 1989 г. из содержимого кишечника телят с признаками диареи в культуре клеток почки новорожденного теленка, который прошел 82 последовательных пассажа в перевиваемой культуре клеток МДВК.
Морфологические свойства.
Штамм ГКВ №2336 относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus. При электронном микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования вируссодержащего культурального материала обнаружены вирионы, характерные для вируса диареи КРС, размером 40-60 нм и состоящие из нуклеокапсида икосаэдрической симметрии и наружной липопротеидной оболочки.
Антигенные свойства.
Штамм ГКВ №2336 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.
Введение морским свинкам штамма ГКВ №2336 вируса диареи КРС ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам вируса ВД (табл.1).
Табл.1
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2336 вируса ВД
Штамм/изолят вируса ВД для РН
Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2336 вируса ВД, M±m
ГКВ №2336
374,8±31,6
СТ-89
107,6±24,5
Изолят №865
168,9±21,3
Изолят№1204
337,7±26,8
Изолят №663
174,8±22,4
Имеет тесное антигенное родство с вирусами классической чумы свиней и пограничной болезни овец.
Биотехнологические характеристики.
7,5
8,5
3
50
Штамм ГКВ №2336 хорошо размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и в культуре клеток МДВК. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 10-10ТЦД/см.
Рекомендуемый способ хранения.
В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°C.
Периодичность освежения.
Один раз в три года в культуре клеток МДВК.
Дополнительные сведения о штамме.
Штамм ГКВ №2336 не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB) и в тест-системе ПЦР.
Реактогенность - штамм ГКВ №2336 реактогенными свойствами не обладает.
Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).
Патогенность - выражена.
Контагиозность - выражена.
Онкогенность - отсутствует.
Производственный штамм ротавируса крупного рогатого скота ГКВ №2337 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2337 и характеризуется следующими признаками и свойствами.
Источник происхождения.
Источником для получения нового производственного штамма ротавируса КРС является вирусный штамм К-88 (авторское название), выделенный в 1988 г. из содержимого кишечника теленка с выраженной диареей, который прошел 69 последовательных пассажей в перевиваемых культурах клеток КРС.
Морфологические свойства.
Штамм ГКВ №2337 относится к семейству Reoviridae, роду Rotavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ротавирусной инфекции КРС: вирион представляет собой образование округлой формы диаметром 60-80 нм, напоминающий вид колеса.
Антигенные свойства.
Штамм ГКВ №2337 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.
Введение морским свинкам штамма ГКВ №2337 ротавируса КРС ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам ротавируса КРС (табл.2).
Табл.2
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2337ротавируса КРС
Штамм/изолят ротавируса для РН
Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2337 ротавируса, M±m
ГКВ №2337
824,3±46,1
К-88
406,2±36,0
Изолят №2810
238,8±26,4
Изолят №Р-47
219,4±24,2
Изолят №Р-56
351,7±34,2
Имеет антигенное родство с ротавирусами, выделенными от других видов животных.
Биотехнологические характеристики.
50
3
Штамм хорошо размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и в культуре клеток МДВК. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 7,5-8,5 lg ТЦД/см.
Рекомендуемый способ хранения.
В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°C.
Периодичность освежения.
Один раз в три года в культуре клеток МДВК.
Дополнительные сведения о штамме.
Штамм ГКВ №2337 не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB) и в ИФА.
Реактогенность - штамм ГКВ №2337 реактогенными свойствами не обладает.
Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).
Патогенность - выражена.
Контагиозность - выражена.
Онкогенность - отсутствует.
Производственный штамм коронавируса крупного рогатого скота ГКВ №2338 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2338 и характеризуется следующими признаками и свойствами.
Источник происхождения.
Источником получения нового производственного штамма коронавируса КРС является вирусный штамм КВ-90 (авторское название), выделенный в 1990 г. из содержимого кишечника теленка с выраженной диареей в культуре клеток почки эмбриона коровы, который прошел 48 последовательных пассажей в перевиваемых культурах клеток КРС.
Морфологические свойства.
Штамм ГКВ №2338 относится к семейству Coronaviridae, роду Coronavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя коронавирусной инфекции КРС: вирион представляет собой образование округлой или овальной формы диаметром 80-100 нм с булавовидными выступами длиной 12-24 нм, образующие подобие солнечной короны. Геном вируса представлен однонитевой, фрагментированной РНК.
Биотехнологические характеристики.
50/
3
Штамм ГКВ №2338 хорошо размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и культуре клеток МДВК. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 6,5-7,5 lg ТЦДсм.
Антигенные свойства.
Штамм ГКВ №2338 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.
Введение морским свинкам штамма ГКВ №2338 коронавируса КРС ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам коронавируса КРС (табл.3).
Табл.3
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2338 коронавируса КРС
Штамм/изолят коронавируса для РН
Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2338 коронавируса, M±m
ГКВ №2338
247,3±41,8
КВ-90
187,4±36,6
Изолят №456
81,5±12,8
Изолят №128
59,7±6,7
Рекомендуемый способ хранения.
В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.
Периодичность освежения: один раз в три года в культуре клеток МДВК.
Дополнительные сведения о штамме: штамм не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью корона-клона.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).
Патогенность - выражена.
Контагиозность - выражена.
Онкогенность - отсутствует.
6,5
3
50
В составе комбинированной вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота инактивированные вирусные суспензии штаммов ГКВ №2336, ГКВ №2337 и ГКВ №2338 содержатся с титром инфекционной активности каждого вируса не менее 10ТЦД в 1 см вакцины.
Инактивацию вирусных суспензий осуществляют любым известным способом, например путем добавления формалина или димера этиленимина (ДЭИ).
8,5-9,0
3
7,0-7,5
3
8,5-9,0
3
7,5-8,5
3
6,5-7,0
3
7,5-8,5
3
8,5-9,0
3
7,0-7,5
3
50
50
50
50
50
50
50
50
В составе предлагаемой вакцины вирусные суспензии штаммов могут быть использованы в любых сочетаниях по объему в зависимости от титра инфекционной активности вирусных суспензий, например, при титре инфекционной активности штаммов ГКВ №2236, ГКВ №2337 - 10 ТЦД/см и штамма ГКВ №2338 -10 ТЦД/см вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 2:1:1 (смесь №1); или при титре инфекционной активности штамма ГКВ №2336 - 10 ТЦД/см, штамма ГКВ №2337 - 10 ТЦД/см, штамма ГКВ №2338 - 10 ТЦД/смвирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 1:1:1 (смесь №2); или при титре инфекционной активности штамма ГКВ №2336 - 10 ТЦД/см, штамма ГКВ №2337 - 10 ТЦД/см и штамма ГКВ №2338 - 10 ТЦД/см вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 4:1:1 (смесь №3). При этом следует отметить, что увеличение или уменьшение объема одного из компонентов не оказывает значительного влияния на антигенную активность готовой вакцины.
Используемые для изготовления эшерихиозного компонента комбинированной вакцины штаммы Escherichia coli серовариантов О9:К30, О78:К80, О115, О141:К99 и O101:F41, продуцирующие антигены: соматические О9, О78, О115; капсульные полисахаридные К 80, К 30 и адгезивные К 99, F-41 известны и используются в различных сочетаниях при изготовлении вакцин и сывороток против эшерихиоза животных (см., например, авторское свидетельство SU №1149467, патенты РФ №№2043771, 2043772, 2070819, 2053792, 2222592 и др.). Однако нами было установлено, что при объединении известных штаммов эшерихий с новыми производственными штаммами вирусов в предлагаемой по изобретению комбинации наблюдается образование синергетической композиции, проявляемой в увеличении напряженности и длительности иммунитета к вирусному и эшерихиозному компонентам вакцины.
3
В составе предлагаемой вакцины инактивированные суспензии клеток бактерий штаммов Escherichia coli серовариантов О9:К30, О78:К80, О115, О141:К99 и O101:F41 содержатся в равных соотношениях с конечной концентрацией не менее 20 млрд микробных клеток в 1 см вакцины.
Инактивацию суспензий клеток эшерихий осуществляют любым известным способом, например путем добавления формалина, содержащего не менее 37% формальдегида.
Согласно изобретению комбинированная вакцина также содержит одну или более приемлемую в ветеринарии целевую добавку.
Термин "целевая добавка" означает любые приемлемые в ветеринарии фармацевтические компоненты, которые традиционно используются для обеспечения сохранности антигенов в процессе технологической переработки, приготовления конечной рецептурной формы или последующего хранения и тому подобное.
В качестве целевой добавки комбинированная вакцина может содержать растворитель, адъювант, солюбилизирующий агент, разбавитель, консервант, стабилизатор, антибактериальное и противогрибковое средства, изотонический агент, агент, задерживающий всасывание, и тому подобное. Разбавители могут включать дистиллированную воду, физиологический раствор, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические агенты могут включать, наряду с другими, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают альбумин, сахарозу, желатозу, обезжиренное молоко и т.д.
Адъюванты включают вещества, неспецифически усиливающие иммунный ответ к антигенам, и могут быть минерального происхождения - гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия, алюминиево-калиевые квасцы; растительного происхождения - сапонин (Квил-А); адъюванты на основе минеральных и неминеральных масел; синтетический адъювант - мурамилдипептид и др.
В качестве целевой добавки предлагаемая вакцина преимущественно содержит адъювант, например гидрат окиси алюминия или смесь гидрата окиси алюминия с сапонином. При необходимости в качестве целевой добавки предлагаемая вакцина может содержать консервант мертиолят натрия в количестве 1:10000.
Хотя специалист в данной области может легко определить количество и концентрацию адъювантов и добавок, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к композициям, включающим предпочтительно от 20 до 30 об.% адъюванта.
В предпочтительном варианте вакцина содержит 6%-ный гель гидрата окиси алюминия в количестве 20 об.% и сапонин в количестве 0,05 об.%, что соответствует 12 г гидрата окиси алюминия и 500 мг сапонина в 1 л вакцины.
Нижеследующие примеры рецептур являются чисто иллюстративными и не ограничивают рамки настоящего изобретения.
Вакцина инактивированная комбинированная вакцина против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота представляет собой жидкость светло-красного цвета, при хранении образуется рыхлый белый осадок, легко разбивающийся в гомогенную взвесь при встряхивании.
Вакцина стабильна и сохраняет исходную активность при температуре 2-8°C не менее 18 месяцев (срок наблюдения).
3
Комбинированную вакцину вводят стельным животным двукратно с интервалом 14-21 сут, первый раз - за 50-60 сут до отела, второй раз не позднее 30 дней до отела. Вакцину вводят внутримышечно взрослым животным в дозе 3 см.
Вакцина апробирована на крупном рогатом скоте в неблагополучных хозяйствах. Эта апробация подтверждает безвредность препарата и его противоэпизоотическую эффективность, проявляемую в усилении иммунизирующей активности компонентов инактивированной вакцины. Вакцинация повышает иммунитет у матерей и защищает потомство в период эмбрионального развития и в постнатальный период. При этом индуцируемый иммунный ответ характеризовался высокой специфичностью по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах.
Защитный уровень антител у животных, привитых данной вакциной, сохранялся не менее 8 мес у взрослых животных, колостральный иммунитет у новорожденных телят - до 1,5 месяцев.
Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.
Пример 1. Получение инактивированной комбинированной вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза КРС.
Вакцину готовят из новых производственных штаммов вируса диареи ГКВ №2336, ротавируса ГКВ №2337, коронавируса ГКВ №2338 (вирусный компонент) и любых известных вакцинных штаммов бактерий Escherichia coli серовариантов О9:К30, О78:К80, О115, О141:К99 и O101:F41 (эшерихиозный компонент).
Технологический процесс состоит из следующих основных стадий: стадии получения вирусного компонента, стадии получения эшерихиозного компонента, объединение полученных вирусного и эшерихиозного компонентов, добавление адъюванта, смешивание всех компонентов вакцины с последующей расфасовкой готового продукта.
A. Стадия получения вирусного компонента комбинированной вакцины.
Изготовление вирусного компонента комбинированной вакцины включает раздельные этапы получения вирусных суспензий из посевных материалов штаммов вируса диареи ГКВ №2336, ротавируса ГКВ №2337 и коронавируса ГКВ №2338; определения инфекционной активности каждой вирусной суспензии, инактивацию вируссодержащих культуральных жидкостей каждого штамма и их объединение.
Стадия получения вирусных суспензий согласно изобретению основывается на системе посевных материалов (seed lot system), при которой последовательные серии продукции получают из главного посевного материала (master seed lot) при определенном количестве пересевов (пассажей). В текущем производстве рабочий посевной материал (working seed lot) готовится из главного посевного материала. Готовый продукт производят из рабочего посевного материала, при этом число пересевов из главного посевного материала не должно превышать значения, установленного при клинических испытаниях вакцин, исходя из требований безопасности и эффективности.
Процесс получения системы посевных материалов каждого штамма вируса включает несколько этапов:
- приготовление культуры клеток;
- проведение пассажей вируса;
- получение вирусной суспензии;
- промежуточный контроль штамма вируса;
- лиофилизация, замораживание или инактивация штамма вируса;
- контроль штамма вируса.
3
Все используемые для изготовления комбинированной вакцины штаммы вирусов выращивают в перевиваемой культуре клеток почки теленка МДВК. Для культивирования штаммов ротавируса ГКВ №2337 и коронавируса ГКВ №2338 в поддерживающую среду добавляют трипсин в концентрации 5 мкг/см.
50
3
Накопление вирусов в культуре клеток оценивают по цитопатическому эффекту. Титр вирусов вычисляют по методу Рида и Менча и выражают в lg ТЦД /см.
6,5
9,0
3
50
При достижении титра вирусов до значений 10-10 ТЦД/см полученный вируссодержащий материал каждого штамма очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.
6,5
3
50
Далее суспензии вирусов инактивируют раствором формалина, содержащим не менее 37% формальдегида. Полноту инактивации оценивают по отсутствию размножения вирусов в чувствительной культуре клеток в течение четырех пассажей. Инактивированные суспензии вирусов объединяют с таким расчетом, чтобы в каждой серии титр инфекционной активности каждого из штаммов составлял не менее 10 ТЦД/см.
8,5-9,0
3
7,0-7,5
3
8,5-9,0
3
7,5-8,5
3
6,5-7,0
3
7,5-8,5
3
8,5-9,0
3
7,0-7,5
3
50
50
50
50
50
50
50
50
При этом при титре инфекционной активности штаммов ГКВ №2336, ГКВ №2337 - 10 ТЦД/см и штамма ГКВ №2338 - 10 ТЦД/смвирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 2:1:1 (смесь №1); или при титре инфекционной активности штамма ГКВ №2336 - 10ТЦД/см, штамма ГКВ №2337 - 10 ТЦД/см, штамма ГКВ №2338 - 10 ТЦД/см вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 1:1:1 (смесь №2); или при титре инфекционной активности штамма ГКВ №2336 - 10 ТЦД/см, штамма ГКВ №2337 - 10 ТЦД/см и штамма ГКВ №2338 - 10 ТЦД/см вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 4:1:1 (смесь №3).
Б. Стадия получения эшерихиозного компонента комбинированной вакцины.
Берут штаммы бактерий Escherichia coli серовариантов О9:К30, О78:К80, О115, О141:К99 и O101:F41, которые в соответствии с их антигенной формулой продуцируют соматические антигены О9, О78, О115; капсульные полисахаридные антигены К 80, К 30 и адгезивные антигены К 99, F-41.
Выращивание штаммов эшерихий включает в себя подготовку матриксной расплодки с последующим высевом ее в реактор.
3
3
Для приготовления матриксной расплодки эшерихий культуру каждого штамма засевают с полужидкого агара в объеме 1-2 см в отдельный флакон, содержащий 80-100 см бульона Хоттингера. Посевы культивируют 8-10 часов при температуре 37±1°C. Выросшие культуры проверяют на чистоту макроскопически и микроскопией мазков, окрашенных по Граму. Чистые культуры засевают каждую отдельно в 10-литровые бутыли с бульоном Хоттингера, наполненные не более чем на половину объема, и выращивают в течение 8-10 часов при температуре 37-38°C, периодически встряхивая. Проверенную на чистоту роста матровую расплодку каждого штамма засевают в отдельный реактор в количестве 5-10% от объема среды, добавляют 40%-ный раствор глюкозы до 0,2%-ной концентрации к объему среды и выращивают в течение 10-14 часов при температуре 37±1°C при непрерывной аэрации и перемешивании (подача воздуха под давлением 0,1-0,2 атм 50 л в час). Допускается совместное выращивание штаммов серологических вариантов О9:К30 и О78:К80 с учетом их колициногенности. Матровые расплодки штаммов смешивают в равных соотношениях.
Штаммы О115, О101:F41 и О141:К99 выращивают в отдельных реакторах. Изменение состава групп не допускается.
После окончания выращивания определяют концентрацию микробных тел в культуре, pH и чистоту культуры.
-1
3
-1
Выращенные в реакторах культуры штаммов О101:F41 и О141:К99 сепарируют в сепараторе АСГ - ЗМ с частотой вращения 4500-5000 мин, бактериальную массу ресуспендируют в реакторе в фосфатно-мочевинном буфере до концентрации 80-100 млрд микробных тел в 1 см и прогревают при температуре 60-65°C в течение 20 минут. Супернатанты отделяют от бактериальных клеток путем центрифугирования при частоте вращения 10000-15000 мин и проверяют на содержание адгезивных антигенов F41 и К99 в реакции диффузной преципитации.
3
Далее полученные культуры объединяют в равных соотношениях, добавляют формалин, разведенный физиологическим раствором 1:1, с таким расчетом, чтобы его концентрация в культуре была 0,3%. Инактивацию культур проводят в течение 15-16 суток при температуре 37±1°C. Полученную смесь инактивированных суспензий клеток концентрируют до получения бакмассы с содержанием 100-200 млрд микробных клеток в 1 см.
В. Стадия объединения вирусного и эшерихиозного компонентов комбинированной вакцины.
Инактивированные суспензии вирусов, приготовленные на стадии А, смешивают в установленном соотношении в зависимости от титра инфекционной активности вирусной суспензии каждого штамма (смесь №1), тщательно перемешивают. Затем добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 20% от общего объема, добавляют сапонин в концентрации 500 мг/л и консервант мертиолят натрия в концентрации 1:10000 тщательно перемешивают.
К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов эшерихий, приготовленной на стадии Б, добавляют мертиолят натрия в концентрации 1:10000 в качестве консерванта, затем смешивают с 6%-ным ГОА (20% от общего объема), тщательно перемешивают.
50
3
Смешивают вирусную и бактериальную части препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 6,5 lg ТЦД, эшерихий - не менее 20 млрд м.кл. в 1 см.
Вариант 2.
Инактивированные суспензии вирусов, приготовленные на стадии А, смешивают в установленном соотношении в зависимости от титра инфекционной активности вирусной суспензии каждого штамма (смесь №2), тщательно перемешивают. Затем добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 20% от общего объема, добавляют сапонин в концентрации 500 мг/л и консервант мертиолят натрия в концентрации 1:10000, тщательно перемешивают.
50
3
К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов эшерихий, приготовленной на стадии Б, добавляют 6%-ный ГОА (20% от общего объема) и тщательно перемешивают. Смешивают вирусную и бактериальную части препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 6,5 lg ТЦД, эшерихий - не менее 20 млрд м.кл. в 1 см.
Вариант 3.
Инактивированные суспензии вирусов, приготовленные на стадии А, смешивают в установленном соотношении в зависимости от титра инфекционной активности вирусной суспензии каждого штамма (смесь №3), тщательно перемешивают. Затем добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 30% от общего объема, тщательно перемешивают.
К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов эшерихий, приготовленной на стадии Б, добавляют 6%-ный ГОА (30% от общего объема) и тщательно перемешивают.
50
3
Смешивают вирусную и бактериальную части препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 6,5 lg ТЦД, эшерихий - не менее 20 млрд м.кл. в 1 см.
Полученные варианты инактивированной комбинированной вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота имеет компонентный состав, приведенный в табл.4
Табл.4
Содержание ингредиентов в жидкой смеси, об.%
Ингредиент
Титр, lg ТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
Содержание в жидкой смеси, об.%
Вариант 1
Вариант 2
Вариант 3
Вирус ВД
7,5-8,5
40
8,5-9,0
30
20
Ротавирус
7,5-8,5
20
8,5-9,0
15
10
Коронавирус
6,5-7,0
20
7,0-7,5
15
10
Суспензия клеток штаммов эшерихий
-
19,94
19,94
10,0
ГОА (6%-й гель)
-
20
20
30
Сапонин
-
0,05
0,05
-
Мертиолят натрия
-
0,01
0,01
-
Пример 2. Оценка антигенной активности комбинированной вакцины на экспериментальных моделях.
Для определения антигенной и иммуногенной активности комбинированной вакцины по изобретению в качестве экспериментальной модели используют лабораторных животных, при этом для оценки антигенной активности вирусных компонентов вакцины используют морских свинок массой 350-400 г, для определения антигенной активности адгезивных антигенов E.coli - кроликов массой 3-3,5 кг, для оценки иммуногенной активности по отношению к соматическим антигенам E.coli - белых беспородных мышей массой 18-20 г.
Формируют группы по 10 животных в каждой: 3 опытные группы и 1 контрольную (морские свинки), 3 опытные группы и 1 контрольную (кролики).
3
3
3
3
Морских свинок опытных групп иммунизируют исследуемой вакциной в дозе 0,25 см; 0,5 см и 1,0 см соответственно, кроликов - в дозе 1,0 см. При этом вакцину вводят морским свинкам внутримышечно, кроликам - подкожно. Животных контрольных групп не иммунизируют.
На 21 сутки после инъекции вакцины у всех животных берут кровь и отделяют сыворотку, которую затем исследуют на наличие специфических антител.
50
Антигенную активность вирусного компонента вакцины оценивают по уровню вирус-специфических антител к вирусам ВД, РВ и КВ. Титр антител определяют в реакции нейтрализации (PH), которую проводят в 96-луночных планшетах по стандартной методике методом двукратных разведений испытуемой сыворотки против рабочей дозы каждого вируса 100 ТЦД/лунка.
Вируснейтрализующий титр исследуемой сыворотки выражают как предельное ее разведение, ингибирующее развитие ЦПД вируса в 50% зараженных культур клеток.
Антигенную активность адгезивных антигенов E.coli в вакцине оценивают в реакции агглютинации (РА) по титру антител в сыворотке крови вакцинированных кроликов.
3
Для оценки иммуногенной активности вакцины по отношению к соматическим антигенам E.coli формируют 2 группы белых мышей по 20 животных в каждой. Животных контрольной группы иммунизируют двукратно с интервалом 10 сут. Вакцину вводят подкожно в дозе 0,1 см. Животных контрольной группы не иммунизируют.
Через 16-18 сут. после повторной инъекции вакцины мышей заражают внутрибрюшинно оттитрованной летальной дозой двух штаммов E.coli серогрупп О78 и О115. На штамм каждой серогруппы используют 10 вакцинированных и 10 контрольных животных.
Иммуногенную активность вакцины по отношению к соматическим антигенам E.coli оценивают по количеству выживших животных в опытной группе.
Результаты исследования представлены в табл.5, которые свидетельствуют, что по антигенной активности комбинированная вакцина против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота превосходит существующие аналоги.
Так, предлагаемая вакцина уже через 21 сутки после иммунизации обеспечивает выработку специфических антител ко всем вирусным компонентам препарата в высоком титре: к вирусу ВД - 1:222,9, к ротавирусу - 1:294,0, к коронавирусу - 1:207,9; к адгезивным антигенам эшерихий - от 1:540,5 до 1:720,0, иммуногенная активность вакцины составляет 90-100%.
Животные контрольной группы на протяжении всего опыта были серонегативны к вирусам ВД, РВ, KB и эшерихиям.
Табл.5
Антигенная активность комбинированной вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота на экспериментальных моделях
Группа жив-х
Титр антител в сыворотке крови морских свинок
Номер серии
Титр антител в сыворотке крови кроликов к адгезив. АГ
Иммуногенная активность вакцины, % выживших б/м
Доза препарата, см<sup>3</sup>
Титр вируснейтрализующих антител, M±m
ВД
РВ
KB
O78
O115
I
0,25
28,8±2,1
35,2±8,7
86,4±5,7
1
540,5±25,4
90
90
II
0,5
222,9±23,2
294,0±28,5
207,9±24,5
2
720,0±68,3
100
100
III
1,0
104,0±14,8
157,6±16,4
181,0±19,2
3
695,5±42,2
90
100
контроль
-
0
0
0
0
0
0
Пример 3. Оценка стабильности комбинированной вакцины в процессе хранения.
Испытание стабильности комбинированной вакцины, полученной по примеру 1, проводят на экспериментальных животных - морских свинках и кроликах. При этом для оценки стабильности антигенной активности вирусных компонентов вакцины используют морских свинок, эшерихиозного компонента - кроликов и белых мышей.
3
3
Для этого вакцину вводят через 6, 12 и 18 мес. хранения при температуре 4°C однократно: морским свинкам в дозе 0,5 см, кроликам в дозе 1,0 см. Через 21 сут после вакцинации сыворотку крови животных отбирают для исследования.
Стабильность вирусного компонента вакцины оценивают в РН, эшерихиозного - в РА по отсутствию снижения титра антител ниже установленного уровня (1:16 и 1:200 соответственно) при хранении вакцины при +4°C в течение 18 месяцев.
Результаты испытания представлены в табл.6.
Табл.6
Изменение антигенной активности комбинированной вакцины в процессе хранения
Время хранения
Титр антител в сыворотке крови вакцинированных лабораторных животных к возбудителю
ВД
РВ
KB
Эшерихии
При изгот.
222,9±23,2
294,0±28,5
207,9±24,5
720,0±68,3
6 мес.
207,9±24,5
274,4±18,6
128,0±16,9
649,8±52,7
12 мес.
157,6±16,4
181,0±16,7
90,5±13,4
527,8±34,1
18 мес.
119,4±21,2
111,4±14,5
59,7±10,9
324,9±25,6
Пример 4. Производственное испытание экспериментальных серий комбинированной вакцины в опытах на коровах.
Испытание проводят на стельных коровах и нетелях в хозяйствах с высоким уровнем желудочно-кишечных болезней новорожденных телят, неблагополучных по вирусной диарее, рота-, коронавирусной болезням и эшерихиозу крупного рогатого скота.
При этом животных делят на 2 группы: опытную и контрольную, по 20 голов в каждой группе.
3
Животным опытной группы комбинированную вакцину, полученную по примеру 1, вводят внутримышечно в дозе 3,0 см двукратно с интервалом 14-21 сут, второй раз не позже, чем за 30 суток до отела.
В контрольной группе животных не вакцинируют.
Для определения напряженности и продолжительности иммунитета у всех животных берут кровь до вакцинации и через 1, 2, 4, 6, 8 и 12 месяцев после вакцинации.
Эффективность вакцинации оценивают по уровню вируснейтрализующих антител в сыворотке крови коров и к эшерихиям - по уровню антител в РА к адгезивным антигенам эшерихий.
Результаты испытаний представлены в табл.7.
Табл.7
Оценка активности вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота в опыте на коровах
Сроки исследований, месяцев после вакцинации
Титр антител в сыворотке крови к возбудителю
ВД
РВ
KB
E.coli
Опытная группа
До вакцинации
18,9±6,4
23,6±2,9
29,0±5,6
61,7±15,1
1
476,7±30,1
961,3±46,2
1351,6±44,0
649,8±34,6
2
512,0±21,3
1229,0±61,4
1792,6±69,1
492,5±31,2
4
494,5±32,3
684,1±38,1
749,6±48,2
373,2±28,9
6
247,3±41,8
394,0±28,9
430,5±38,1
324,9±24,7
8
163,1±14,5
238,8±36,4
349,7±35,6
282,8±18,3
12
76,8±20,2
82,9±22,6
100,4±21,2
162,5±15,8
Контрольная группа
-
17,5±3,9
16,2±8,9
32,9±14,7
83,2±21,4
Результаты исследования показывают, что иммунизация коров комбинированной вакциной по изобретению вызывает формирование выраженного иммунного ответа ко всем антигенам, входящим в состав вакцины, продолжительностью не менее 8 месяцев.
Пример 5. Оценка колострального иммунитета у новорожденных телят.
В экспериментах используют 7-14-дневных телят, рожденных от коров, иммунизированных комбинированной вакциной по изобретению, контролем служат телята аналогичного возраста, полученные от невакцинированных коров.
Все опытные и контрольные телята своевременно получают молозиво от своих матерей в течение первых двух часов после рождения и содержатся в одинаковых условиях.
Оценку колострального иммунитета проводят путем определения титра вирус-специфических антител в сыворотке крови всех опытных и контрольных животных и к эшерихиям по уровню антител к адгезивным антигенам эшерихий. Результаты испытания представлены в табл.8.
Табл.8
Оценка колострального иммунитета вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота в опыте на телятах
Возраст новорожденных телят, недель
Титр антител в сыворотке крови к возбудителю
ВД
РВ
KB
E.coli
Опытная группа
1
494,5±32,3
1097,5±36,6
1260,7±34,8
527,8±38,2
2
238,9±23,4
749,6±31,2
803,4±25,1
373,2±28,9
4
163,1±21,4
461,4±28,6
476,7±30,1
114,9±11,2
6
107,6±24,1
100,4±16,9
84,4±18,5
57,4±14,5
Контрольная группа
1
19,5±5,9
21,2±8,5
29,9±10,2
0
2
0
0
12,4±8,6
0
4
0
0
0
0
6
0
0
0
0
В результате исследования установлено, что вакцинация стельных коров исследуемой вакциной обеспечивает создание колострального иммунитета у телят, полученных от вакцинированных животных и получавших своевременно молозиво от своих матерей. Формирование колострального иммунитета подтверждается высокими титрами специфических антител к вирусным и эшерихиозному, которые сохранялись на протяжении всего срока наблюдения.
Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют, что инактивированная комбинированная вакцина против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота в соответствии с изобретением имеет определяющее преимущество перед другими известными вакцинами по спектру специфической защиты и эффективности действия для восприимчивой группы животных, длительности напряженного иммунитета, безвредности для стельных животных, по стабильности сохранения биологических свойств, в т.ч. антигенной и иммуногенной активности на протяжении 18 месяцев (срок наблюдения). Вакцина экологически безопасна, не вызывает диссеминации патогенных агентов во внешнюю среду.