ПРОЦЕСС СНИЖЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЭНДОТОКСИНА В ЖЕЛАТИНЕ
PROCESS FOR REDUCTION IN ENDOTOXIN CONTENT IN GELATIN

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Для настоящей заявки испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой США № 62/640394, поданной 8 марта 2018 года, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу снижения содержания эндотоксина в желатине. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу снижения содержания эндотоксина в желатине путем фильтрации желатин-солевого раствора с использованием анионного обмена и обессоливания отфильтрованного желатин-солевого раствора.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Вакцины обычно доставляются парентеральным способом доставки: внутримышечным, внутрикожным или подкожным. Однако мукозальная доставка вакцины (через слизистую щеки, слизистую под языком, слизистую оболочки носа, слизистую полости рта или слизистую влагалища) вызывает все больший интерес в качестве средства индукции местного и отдаленного опосредованного антителами иммунного ответа, а также системного иммунного ответа. Кроме того, мукозальная доставка вакцины посредством твердых дозированных форм (например, буккальная/сублингвальная таблетка, пероральная таблетка или капсулы, вагинальный тампон) обладает рядом преимуществ, таких как возможность массовой иммунизации, а также независимость от холодовой цепи. Кроме того, мукозальная доставка вакцины может быть подходящей для пациентов с боязнью уколов, при этом пациент может самостоятельно вводить вакцину. Буккально-сублингвальный способ введения использовался в течение многих лет для доставки лекарств и небольших молекул в кровоток, однако его применению в качестве средства мукозальной доставки вакцин уделялось мало внимания.
Одним из основных критериев мукозальной доставки вакцины является уровень эндотоксина, присутствующего в фармацевтической композиции. Эндотоксин представляет собой сложный липополисахарид (“LPS”), обнаруженный во внешней мембране грамотрицательных бактерий, который выделяется после гибели или лизиса клетки. Эндотоксин может вызывать физиологические изменения в организме человека и, следовательно, может оказывать влияние на системы органов и нарушать гуморальные и клеточные системы взаимодействия человека. Для парентеральных лекарственных препаратов существует строгое ограничение по содержанию эндотоксина, поскольку организм человека может переносить только незначительное количество эндотоксина в крови.
Тем не менее, обычно существует небольшой фактор безопасности при приеме внутрь буккальных/сублингвальных лекарственных препаратов, которые содержат высокие уровни эндотоксина, потому что в полости рта колонизируются аэробные и анаэробные бактерии. Например, у здорового взрослого человека с хорошей гигиеной полости рта средний уровень эндотоксинов в микрофлоре полости рта соответствует приблизительно 2 единицам эндотоксина (ЕЭ)/мл слюны (1 нг=10 ЕЭ). Таким образом, ежесуточная выработка эндотоксина для здорового взрослого человека с хорошей гигиеной полости рта превышает 1000 ЕЭ/сутки. Однако с точки зрения доставки вакцины, в зависимости от участка слизистой оболочки, эндотоксин может устранить, остановить или усилить иммунный ответ.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Уровень эндотоксина в буккальных/сублингвальных лекарственных препаратах, используемых для вакцинации (в частности против инфекции), может оказывать положительное или отрицательное влияние на иммунный ответ. Кроме того, для осуществления мукозальной доставки часто добавляют вспомогательные вещества для усиления иммунного ответа. Присутствие эндотоксинов может отрицательным или положительным образом маскировать благоприятное воздействие данного вспомогательного вещества. Кроме того, было сделано предположение, что эндотоксин индуцирует толерантность к антигенам на сублингвальном уровне, что может нейтрализовать иммуностимулирующую функцию вспомогательного вещества. Соответственно, лекарственные формы, такие как буккальные/сублингвальные таблетки (используемые для мукозальной доставки вакцины для лечения инфекции), должны иметь низкое содержание эндотоксина.
Множество лекарственные формы используют матричные формообразователи для обеспечения пероральных диспергируемых свойств. Желатин является одним из основных образующих матрикс веществ. Желатин получают в результате гидролиза коллагена в кислотных или щелочных условиях. Поскольку это продукт натурального происхождения, он содержит различные количества эндотоксина. Например, в рыбном желатине уровень эндотоксина может составлять от 6000 до 30 000 ЕЭ/г желатина. Другие желатины могут содержать эндотоксин в количестве, по меньшей мере, около 3000 ЕЭ/г, около 4000 ЕЭ/г, около 5000 ЕЭ/г, около 6000 ЕЭ/г, около 10000 ЕЭ/г, около 12 000 ЕЭ/г, около 14000 ЕЭ/г, около 15000 ЕЭ/г, около 20000 ЕЭ/г, около 25000 ЕЭ/г или около 30000 ЕЭ/г.
Соответственно, для получения лекарственных форм, изготовленных из желатина с низким содержанием эндотоксина, авторы изобретения обнаружили способ, который снижает количество эндотоксина в желатине. Полученный желатин с низким содержанием эндотоксинов можно в дальнейшем использовать в качестве образующего матрикс вещества для создания различных лекарственных форм. Кроме того, желатин с низким содержанием эндотоксина может быть использован во множестве других областей, например, для получения гранул в упаковке типа стик-пакетов и мягких таблеток.
В настоящем документе предусмотрены способы снижения уровня эндотоксина в желатине и получения желатина с низким содержанием эндотоксина. Процесс включает растворение соли в желатиновом растворе и фильтрацию желатин-солевого раствора посредством анионного обмена для снижения уровня эндотоксина. После снижения уровня эндотоксинов в желатин-солевом растворе, желатин-солевой раствор с низким содержанием эндотоксина обессоливают, получая, таким образом, раствор желатина с низким содержанием эндотоксина. Раствор желатина с низким содержанием эндотоксина можно использовать в различных фармацевтических композициях, включая вакцины.
В некоторых вариантах осуществления, способ снижения уровня эндотоксина в желатине включает растворение соли в растворе, содержащем желатин и растворитель, с образованием желатин-солевого раствора, причем содержание эндотоксина в желатине составляет, по крайней мере, 6000 ЕЭ/г; фильтрование желатин-солевого раствора посредством анионообменного адсорбера, в результате чего содержание эндотоксина в фильтрате желатин-солевого раствора составляет меньше, чем 2500 ЕЭ/г; обессоливание фильтрата желатин-солевого раствора с образованием раствора желатина с низким содержанием эндотоксина, в котором содержание эндотоксина составляет меньше, чем 2500 ЕЭ/г. В некоторых вариантах, концентрация соли в желатин-солевом растворе составляет 75-300 мМ. В некоторых вариантах осуществления, концентрация соли желатин-солевого раствора составляет около 145-155 мМ. В некоторых вариантах осуществления, раствор желатина представляет собой 1-20% по массе раствор желатина. В некоторых вариантах осуществления, соль представляет собой хлорид натрия. В некоторых вариантах осуществления, желатин представляет собой рыбный желатин. В некоторых вариантах осуществления, растворение соли в растворе желатина включает нагревание раствора желатина до 50-70°С. В некоторых вариантах осуществления, растворитель представляет собой воду. В некоторых вариантах осуществления, содержание эндотоксина в желатин-солевом растворе и растворе желатина с низким содержанием эндотоксина составляет меньше, чем 1000 ЕЭ/г. В некоторых вариантах осуществления, фильтрование желатин-солевого раствора через анионообменный адсорбер может снизить содержание эндотоксина в растворе, по меньшей мере, на 95%. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, около 85% количества желатина обнаруживается в фильтрате желатин-солевого раствора после фильтрации желатин-солевого раствора через анионообменный адсорбер. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает удаление растворителя из раствора желатина с низким содержанием эндотоксина с образованием желатина с низким содержанием эндотоксина, который имеет содержание эндотоксина меньше, чем 2500 ЕЭ/г.
В некоторых вариантах осуществления, обессоливание фильтрата желатин-солевого раствора осуществляется путем диафильтрации. В некоторых вариантах осуществления, процесс диафильтрации включает разбавление фильтрата желатин-солевого раствора вторым растворителем и фильтрацию разбавленного фильтрата желатин-солевого раствора с образованием раствора разбавленного фильтрата желатина. В некоторых вариантах осуществления, разбавленный фильтрат желатин-солевого раствора фильтруют до тех пор, пока проводимость разбавленного раствора желатинового фильтрата не будет находиться в пределах меньше, чем 25% от проводимости раствора желатина. В некоторых вариантах осуществления, отношение фильтрата желатин-солевого раствора ко второму растворителю составляет 1:1-1:4. В некоторых вариантах осуществления, второй растворитель удаляют из разбавленного раствора желатина в фильтрате с образованием раствора желатина с низким содержанием эндотоксина. В некоторых вариантах осуществления, второй растворитель удаляют из разбавленного раствора желатинового фильтрата до тех пор, пока масса разбавленного раствора желатинового фильтрата не будет составлять меньше 5% от массы фильтрата желатин-солевого раствора. В некоторых вариантах осуществления второй растворитель включает воду.
В некоторых вариантах осуществления, раствор желатина с низким содержанием эндотоксина получают способом, который включает растворение соли в растворе желатина, содержащем желатин и растворитель, с образованием желатин-солевого раствора, причем содержание эндотоксина в желатине составляет, по меньшей мере, 6000 ЕЭ/г; фильтрование желатин-солевого раствора посредством анионообменного адсорбера, в результате чего содержание эндотоксина в фильтрате желатин-солевого раствора составляет меньше, чем 2500 ЕЭ/г; обессоливание фильтрата желатин-солевого раствора с образованием раствора желатина с низким содержанием эндотоксина, в котором содержание эндотоксина составляет меньше, чем 2500 ЕЭ/г. В некоторых вариантах осуществления, раствор желатина с низким содержанием эндотоксина включает растворитель и желатин, причем желатин имеет содержание эндотоксина меньше, чем 2500 ЕЭ/г.
В некоторых вариантах осуществления, способ получения лекарственной формы для доставки фармацевтически активного ингредиента включает растворение соли в желатиновом растворе, содержащем желатин и растворитель, с образованием желатин-солевого раствора, причем содержание эндотоксина в желатине составляет, по крайней мере, 6000 ЕЭ/г; фильтрование желатин-солевого раствора посредством анионообменного адсорбера, в результате чего содержание эндотоксина в фильтрате желатин-солевого раствора составляет меньше, чем 2500 ЕЭ/г; обессоливание фильтрата желатин-солевого раствора с образованием раствора желатина с низким содержанием эндотоксина, в котором содержание эндотоксина меньше, чем 2500 ЕЭ/г; дозирование композиции, содержащей раствор желатина с низким содержанием эндотоксина, в предварительно изготовленную формочку; и лиофилизацию раствора желатина с низким содержанием эндотоксина с образованием лекарственной формы.
В некоторых вариантах осуществления, лекарственную форму для доставки фармацевтически активного ингредиента получают способом, который включает растворение соли в растворе желатина, содержащем желатин и растворитель, с образованием желатин-солевого раствора, причем содержание эндотоксина в желатине составляет, по крайней мере, 6000 ЕЭ/г; фильтрование желатин-солевого раствора посредством анионообменного адсорбера, в результате чего содержание эндотоксина в фильтрате желатин-солевого раствора составляет меньше, чем 2500 ЕЭ/г; обессоливание фильтрата желатин-солевого раствора с образованием раствора желатина с низким содержанием эндотоксина, содержание эндотоксина в котором составляет меньше, чем 2500 ЕЭ/г; дозирование композиции, содержащей раствор желатина с низким содержанием эндотоксина, в предварительно изготовленную формочку; и лиофилизацию раствора желатина с низким содержанием эндотоксина с образованием лекарственной формы.
Дополнительные преимущества будут очевидны для специалистов в данной области техники из следующего подробного описания. Приведенные в настоящем документе примеры и описания следует рассматривать как иллюстративные, а не ограничивающие объем настоящего изобретения.
Все публикации, включая патентные документы, научные статьи и базы данных, указанные в настоящей заявке, включены в качестве ссылки полностью во всех отношениях в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была индивидуально включена посредством ссылки. Если приведенное в настоящем документе определение противоречит или иным образом не согласуется с определением, приведенным в патентах, заявках, опубликованных заявках и других публикациях, которые включены в настоящем документе посредством ссылки, определение, приведенное в настоящем документе, имеет приоритет над определением, которое включено в настоящий документ посредством ссылки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Приведенные в качестве примера варианты осуществления описаны со ссылкой на прилагаемые фигуры, на которых:
Фигура 1 иллюстрирует блок-схему способа снижения уровня эндотоксина в желатине, описанного в настоящем документе.
Фигура 2 иллюстрирует блок-схему стадии получения желатин-солевого раствора.
Фигура 3 иллюстрирует блок-схему для стадии фильтрации желатин-солевого раствора с использованием анионного обмена для удаления эндотоксина, описанного в настоящем документе.
Фигура 4 представляет собой график, иллюстрирующий экспериментальные результаты влияния концентрации соли в желатин-солевом растворе на удаление эндотоксина.
Фигура 5 иллюстрирует блок-схему стадии обессоливания отфильтрованного желатин-солевого раствора, описанного в настоящем документе.
Фигура 6 представляет собой график зависимости эндотоксина во фракциях проб от суммарного объема желатин-солевого раствора, отфильтрованного, способом, описанным в примере 1.
Фигура 7 представляет собой график зависимости эндотоксина во фракциях образца от суммарного объема желатин-солевого раствора, отфильтрованного способом, описанным в примере 2.
Фигура 8 представляет собой график зависимости эндотоксина во фракциях образца от суммарного объема желатин-солевого раствора, отфильтрованного способом, описанным в примере 3.
Фигура 9А представляет собой схематическое изображение с фотографией полностью смоченной таблетки.
Фигура 9В представляет собой схематическое изображение с фотографией таблетки с твердыми комочками.
Фигура 9С представляет собой схематическое изображение с фотографией таблетки с пленкой матрицы распавшейся композиции, которая образуется на поверхности лиофилизированной таблетки (корка).
На фигурах одинаковые ссылочные номера соответствуют одинаковым компонентам, если не указано иное. Кроме того, фигуры выполнены не в масштабе.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Посредством описанных в настоящем документе способов можно получать желатин с низким уровнем эндотоксина. Затем желатин с низким содержанием эндотоксина можно использовать в различных областях, включая, но этим не ограничиваясь, в качестве образующего матрикс вещества в фармацевтической лекарственной форме. На фиг.1 показана блок-схема способа 100 для снижения уровня эндотоксина в желатине.
Получение желатин-солевого раствора
Первая стадия 101 может включать приготовление желатин-солевого раствора путем растворения соли в желатиновом растворе. На фиг.2 показана блок-схема стадии 101 растворения соли в растворе желатина. Содержание эндотоксина в исходном растворе желатина может быть эквивалентно его содержанию в желатине в растворе. Кроме того, содержание эндотоксина в желатин-солевом растворе также будет сопоставимо с содержанием исходного раствора желатина.
Стадия 101 может включать растворение желатина в растворителе с образованием раствора желатина. Предпочтительно желатин полностью растворяется в растворителе. Растворению желатина в растворителе может способствовать перемешивание и/или нагревание раствора. В некоторых вариантах осуществления, раствор желатина может быть нагрет до около 40-80°С, около 50-70°С, около 55-65°С, около 58-62°С или около 60°С, чтобы способствовать растворению желатина в растворителе. После того как желатин полностью растворился в растворителе, раствор желатина может быть охлажден до комнатной температуры.
В некоторых вариантах осуществления, желатин может представлять собой негелеобразующий желатин, гелеобразующий желатин, включая рыбный желатин, бычий желатин, свиной желатин, куриный желатин или их сочетание. Хотя в примерах, описанных ниже, в качестве типичного желатина используется рыбный желатин, принципы, установленные для описанных в настоящем документе способов, применимы к другим типам желатина и соответствующим сортам желатина, доступным в каждом типе желатина. В некоторых вариантах осуществления, растворителем может быть вода (включая очищенную воду).
Концентрация желатина в растворе желатина может изменяться в зависимости от конечного применения желатина. Таким образом, конкретное количество желатина и конкретное количество применяемого растворителя может изменяться в зависимости от желаемой концентрации желатина. В некоторых вариантах осуществления, концентрация желатина в растворе желатина может составлять около 1-20% по массе, около 2-15% по массе, около 3-12% по массе, около 5-12% по массе, около 8-12% по массе или около 10-12% по массе.
Перед добавлением соли в раствор желатина может быть измерена проводимость раствора желатина. Такое измерение проводимости перед добавлением соли может использоваться при сравнении конечного раствора желатина с низким содержанием эндотоксина после процесса обессоливания. Кроме того, проводимость желатин-солевого раствора также может быть измерена до стадии снижения содержания эндотоксина.
Как показано на фиг.2, желатин может быть полностью растворен в растворителе с образованием раствора желатина. Растворению желатина может способствовать перемешивание и нагревание раствора желатина. Соль может быть растворена в желатиновом растворе с образованием желатин-солевого раствора.
В некоторых вариантах осуществления, соль может представлять собой хлорид натрия, хлорид калия, хлорид лития, хлорид кальция, другие хлористые соли или их сочетания.
Как более подробно описано ниже, авторы изобретения обнаружили, что концентрация соли в желатин-солевом растворе играет важную роль в процессе анионного обмена на стадии 102 для удаления эндотоксина из желатина. В частности, авторы изобретения обнаружили, что осуществление анионного обмена без использования соли в растворе желатина может привести к тому, что желатин закупоривает/забивает фильтры, используемые в процессе анионного обмена на стадии 102.
Кроме того, как показано ниже в описании стадии 102, авторы изобретения обнаружили, что определенная концентрация соли оказывает непосредственное влияние на стадию удаления эндотоксина. Таким образом, концентрация соли в желатин-солевом растворе может составлять около 50-500 мМ, около 75-300 мМ, около 100-200 мМ, около 125-175 мМ, около 140-160 мМ, около 145-155 мМ или около 150 мм.
Снижение содержания эндотоксина путем фильтрации желатин-солевого раствора с использованием анионного обмена
После приготовления желатин-солевого раствора, эндотоксин может быть удален из желатина на стадии 102. На фиг.3 показана блок-схема стадии 102 фильтрации желатин-солевого раствора с использованием анионного обмена (“AEX”). Авторы изобретения обнаружили, что с использованием принципов анионообменной хроматографии эндотоксин может быть удален из раствора желатина. Анионообменная хроматография относится к методу разделения молекул на основе их заряда. В частности, в анионообменной хроматографии используется положительно заряженная ионообменная смола со сродством к молекулам, имеющим суммарные отрицательные поверхностные заряды. Молекулы эндотоксина имеют чистые отрицательные поверхностные заряды. Таким образом, эндотоксин может связываться с положительно заряженной ионообменной смолой и удаляться из желатин-солевого раствора.
Как указано выше, авторы изобретения обнаружили, что в процессе снижения содержания эндотоксина раствор желатина без соли может закупоривать/забивать фильтры анионообменного устройства. Без ограничения какой-либо теорией, авторы изобретения полагают, что соль в растворе желатина может модифицировать заряд на молекуле желатина до достаточного уровня, тем самым снижая адгезию желатина к анионообменному устройству. Таким образом, желатин-солевой раствор может проходить через анионообменное устройство в качестве фильтрата, при этом эндотоксины задерживаются устройством.
Анионообменный фильтр может быть в форме мембранного адсорбера (например, коммерчески доступного Sartobind Q от компании Sartorius Stedim, Mustang E от компании Pall Life Sciences) или в форме смолы (например, коммерчески доступной смолы Fractogel EMD TMAE Hicap (M) Resin и Eshmuno Q Resin от компании Merk Millipore). Кроме того, мембранные адсорберы доступны в различных размерах. Например, Sartobind Q имеет несколько размеров, включая соответствующий расходу фильтра 1 мл, 7 мл, 75 мл, 159 мл, 1,2 л и 5 л. Выбор размера адсорбера может быть основан на объеме, который подлежит фильтрации, момента проникновения эндотоксина для обрабатываемого раствора и/или различных условиях обработки.
Хотя эндотоксин может связываться с положительно заряженной ионообменной смолой в анионообменном устройстве, авторы изобретения обнаружили, что концентрация соли в желатиновом растворе может оказывать значительное влияние на удаление эндотоксина через анионообменное устройство. Чтобы определить влияние концентрации соли на удаление эндотоксина, авторы изобретения получали 10% по массе раствор рыбного желатина в очищенной воде с различными концентрациями хлорида натрия и отфильтровывали их, используя Nartobind Q 1 мл Nano с расходом фильтра 1 мл. Затем авторы изобретения определяли содержание эндотоксина, а также содержание желатина в желатин-солевом растворе до и после фильтрации. Результаты влияния концентрации соли на удаление эндотоксина в желатин-солевом растворе показаны в следующей таблице 1 и на фигуре 4.
Таблица 1
<b>Раствор до/после фильтрации</b>
<b>Содержание эндотоксина (ЕЭ/г)</b>
<b>Содержание желатина (% по массе)</b>
(10% желатин)
7000
10,5; 10,4
До фильтрации(10% Желатин+150 мМ NaCl)
4140
10,3; 10,3
<u>После фильтрации</u>(10% Желатин+150 мМ NaCl)
191
10,1; 10,1
До фильтрации(10% Желатин+250 мМ NaCl)
5760
10,0; 10,2
<u>После фильтрации</u>(10% Желатин+250 мМ NaCl)
464
10,6; 10,7
До фильтрации(10% Желатин+300 мМ NaCl)
4610
10,3; 10,6
<u>После фильтрации</u>(10% Желатин+300 мМ NaCl)
441
10,5; 10,4
Как показано в приведенной выше таблице 1 и на фиг.4, авторы изобретения обнаружили, что в случае, когда концентрация соли в растворе рыбный желатин-NaCl составляет около 150 мМ, фильтр может обеспечить самое большое снижение содержания эндотоксина в растворе. В случае, когда концентрация соли намного выше, чем 150 мМ, может удаляться меньше эндотоксина. Кроме того, в случае, когда концентрация соли намного ниже 150 мМ, это может привести к тому, что желатин закупорит/заблокирует анионообменное устройство.
После снижения содержания эндотоксина, может быть измерена проводимость фильтрата желатин-солевого раствора. В некоторых вариантах осуществления, на стадии снижения содержания эндотоксина, в растворе желатина может снизиться содержание эндотоксина, по меньшей мере, на около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%, около 98% или около 99%.
В некоторых вариантах осуществления, уровень эндотоксина в фильтрате желатин-солевого раствора может составлять меньше, чем около 3000 ЕЭ/г, около 2500 ЕЭ/г, около 2000 ЕЭ/г, около 1500 ЕЭ/г, около 1000 ЕЭ/г, около 750 ЕЭ/г, около 500 ЕЭ/г, около 250 ЕЭ/г, около 200 ЕЭ/г, около 150 ЕЭ/г или около 100 ЕЭ/г. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, около 85%, около 90%, около 95%, около 98% или около 99% исходного содержания желатина сохраняется после стадии снижения содержания эндотоксина. Это можно оценить путем сравнения концентрации желатина до и после анионообменной фильтрации.
Обессоливание отфильтрованного желатин-солевого раствора
После того как содержание эндотоксина было снижено в желатин-солевом растворе, соль, добавленную на этапе 101, необходимо удалить или уменьшить ее содержание на стадии 103. На фиг.5 показана блок-схема стадии обессоливания отфильтрованного желатин-солевого раствора, описанного в настоящем документе. Одним из способов, с помощью которого соль может быть удалена из желатин-солевого раствора, является диафильтрация. Диафильтрация представляет собой процесс, который включает удаление соли из раствора, исходя из молекулярного размера с использованием проницаемых для микро-молекул фильтров. Чтобы облегчить диафильтрацию, желатин-солевый раствор можно дополнительно разбавить водой для снижения его вязкости; в частности, в случае, когда раствор имеет высокое содержание желатина. Потом добавленная вода может быть удалена на стадии концентрирования. В некоторых вариантах осуществления, соль может быть удалена без разбавления желатин-солевого раствора водой, и поэтому последующая стадия концентрирования не требуется; например, для желатин-солевого раствора с более низким содержанием желатина.
Отфильтрованный желатин-солевой раствор может быть введен в систему диафильтрации. Примеры систем диафильтрации включают, но ими не ограничиваются, систему поперечноточной фильтрации Sartoflow Advanced от компании Sartorius Stedim, систему KMPi TFF от компании Spectrum Labs (Repligen) или систему Cogent M1 TFF от компании Merck. Масса отфильтрованного желатин-солевого раствора и проводимость могут быть измерены до проведения диафильтрации.
В некоторых вариантах осуществления, фильтрат желатин-солевого раствора, полученный на стадии снижения содержания эндотоксина, может быть разбавлен растворителем. В некоторых вариантах осуществления, растворителем может быть вода (включая очищенную воду). Отношение фильтрата желатин-солевого раствора к растворителю может составлять около 1:1-1:6, около 1:1-1:5, около 1:1-1:4, около 1:1-1:3, около 1:1-1:2 или около 2:1-1:1. В некоторых вариантах осуществления, отношение фильтрата желатин-солевого раствора к растворителю может зависеть от концентрации желатина в фильтрате желатин-солевого раствора. Смесь желатин-солевого раствора и растворителя может быть перемешана и/или нагрета для обеспечения перемешивания в достаточной степени.
В начале диафильтрации может быть определена проводимость смеси. Кроме того, проводимость может непрерывно контролироваться, а смесь может непрерывно перемешиваться в течение всего процесса диафильтрации. Диафильтрация может быть остановлена, когда проводимость смеси достигает относительно такое же или сопоставимое значение проводимости для исходного раствора желатина перед добавлением соли на стадии 101. Относительно такое же или сопоставимое значение может быть в случае, когда значение составляет меньше, чем около 25%, около 20%, около 15%, около 10%, около 5%, около 2% или около 1% от исходного значения.
После удаления соли, разбавленный раствор желатина может подвергаться концентрированию. Процесс концентрирования может обеспечить удаление избытка растворителя, добавленного во время разбавления перед диафильтрацией. Процесс концентрирования может быть осуществлен посредством системы для концентрирования. Примеры систем для концентрирования включают, но ими не ограничиваются, систему поперечноточной фильтрации Sartoflow Advanced от компании Sartorius Stedim, системы KMPi TFF от компании Spectrum Labs (Repligen) или систему Cogent M1 TFF от компании Merck. Концентрирование разбавленного раствора желатина может быть остановлено в случае, когда масса разбавленного раствора желатина достигает относительно такой же или сопоставимой массы предварительно разбавленного фильтрата желатин-солевого раствора. Относительно такое же или сопоставимое значение может быть в случае, когда значение составляет меньше, чем около 25%, около 20%, около 15%, около 10%, около 5%, около 2или около 1% от исходного значения.
После диафильтрации остается раствор желатина с пониженным содержанием эндотоксина. Кроме того, концентрация или содержание желатина в этом полученном обессоленном растворе желатина с низким содержанием эндотоксина может иметь относительно такую же или сходную концентрацию/содержание желатина, что и отфильтрованный желатин-солевой раствор после стадии снижения содержания эндотоксина. Относительно такое же или сопоставимое значение может быть в случае, когда значение составляет меньше, чем около 25%, около 20%, около 15%, около 10%, около 5%, около 2%, or about 1% от исходного значения. Раствор желатина с низким содержанием эндотоксина может иметь содержание эндотоксина меньше, чем около 3000 ЕЭ/г, около 2500 ЕЭ/г, около 2000 ЕЭ/г, около 1500 ЕЭ/г, около 1000 ЕЭ/г, около 750 ЕЭ/г, около 500 ЕЭ/г, около 250 ЕЭ/г, около 200 ЕЭ/г, около 150 ЕЭ/г или около 100 ЕЭ/г. Таким образом, содержание эндотоксина, после стадии его удаления, может сохраняться в процессе диафильтрации.
В некоторых вариантах осуществления, сохраняется, по меньшей мере, около 85%, около 90%, около 95%, около 98% или около 99% исходного содержания желатина после стадии обессоливания. Это можно оценить путем сравнения концентрации желатина до и после диафильтрации. В некоторых вариантах осуществления, сохраняется, по меньшей мере, около 85%, около 90%, около 95%, около 98% или около 99% исходного желатина после двух стадий: снижение содержания эндотоксина и обессоливание.
В некоторых вариантах осуществления, растворитель в растворе желатина с пониженным содержанием эндотоксина может быть удален. Например, раствор желатина с пониженным содержанием эндотоксина может быть впоследствии высушен до твердого желатина с низким содержанием эндотоксина. Этот желатин с низким содержанием эндотоксина может быть в форме порошка и может использоваться в качестве исходного вещества для различных применений, включая фармацевтический препарат. В некоторых вариантах осуществления, уровень эндотоксина в желатине с низким содержанием эндотоксина может составлять меньше, чем около 3000 ЕЭ/г, около 2500 ЕЭ/г, около 2000 ЕЭ/г, около 1500 ЕЭ/г, около 1000 ЕЭ/г, около 750 ЕЭ/г, около 500 ЕЭ/г, около 250 ЕЭ/г, около 200 ЕЭ/г, около 150 ЕЭ/г или около 100 ЕЭ/г.
Использование в фармацевтических композициях
Растворы желатина с низким содержанием эндотоксина можно использовать в различных фармацевтических композициях. Например, растворы желатина или желатина с низким содержанием эндотоксина, полученные в настоящем документе, можно использовать в лекарственных формах, описанных в патентах США № 4371516; 4305502; и 4758598 и патентах Великобритании № 1548022 и 211423, которые включены в настоящее изобретение посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления, процесс производства растворяющейся лекарственной формы для доставки фармацевтически активного ингредиента (“API”) может включать стадии: (а) дозирование композиции, содержащей желатин, в предварительно изготовленную формочку; и (b) лиофилизация композиции с образованием растворяющейся лекарственной формы.
Используемый в настоящем документе термин “дозированный” относится к размещению заранее определенной аликвоты раствора или суспензии. Используемый в настоящем документе термин “предварительно изготовленная формочка” относится к любому подходящему контейнеру или полости, в которой может быть размещен водный раствор или суспензия, которые впоследствии подвергаются лиофилизизации; в некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, предварительно изготовленная формочка представляет собой блистерную упаковку с одним или несколькими блистерными ячейками.
Композиция на стадии (а) может включать формирующее матрицу вещество. Формирующее матрицу вещество может представлять собой любое обычное негелеобразующее формирующее матрицу вещество. Подходящие негелеобразующие формирующие матрицу вещества включают, без ограничения, негелеобразующие желатины (включая желатин с низким содержанием эндотоксина, полученный в соответствии с описанным выше способом), модифицированные крахмалы, пуллулан, негелеобразующий рыбный крахмал, мальтодекстрины, низкомолекулярные декстраны, крахмал эфиры, целлюлозные смолы с низкой и средней молекулярной массой и их сочетания. Формирующее матрицу вещество также может представлять собой любое обычное гелеобразующее формирующее матрицу вещество. Подходящие гелеобразующие формирующее матрицу вещества включают, без ограничения, гелеобразующий желатин (включая желатин с низким содержанием эндотоксина, полученный в соответствии с описанным выше способом), карагенановые камеди, гиалуроновую кислоту, пектины, крахмалы, карбоксиметилцеллюлозу натрия, агар, геллановую камедь, гуаровую камедь, трагакантан, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, карбомер, полоксамер, полиакриловую кислоту, поливиниловый спирт, альгинаты и поли(гликолевая кислота) и их сочетания. В некоторых вариантах осуществления, формирующее матрицу вещество может представлять собой сочетание негелеобразующего формирующего матрицу вещества и гелеобразующего формирующего матрицу вещества. Специалист в данной области техники, при необходимости, может легко определить подходящие количества этих формирующих матрицу веществ.
Композиция на стадии (а) обычно находится в форме раствора или суспензии. Соответственно, растворитель также присутствует в композиции. Подходящий растворитель может быть легко выбран специалистом в данной области техники, когда известен конечный состав композиции, то есть фармацевтически активный ингредиент, эксципиент и т.д., которые должны присутствовать. Предпочтительные растворители включают этанол, изопропанол, другие низшие алифатические спирты и воду и, более предпочтительно, воду.
6
8
6
Композиция на стадии (а) может также содержать дополнительный фармацевтически приемлемое вещество или наполнитель. Такие дополнительные фармацевтически приемлемые вещества или наполнители включают, без ограничения, сахара, такие как маннит, декстроза и лактоза, неорганические соли, такие как хлорид натрия и силикаты алюминия, желатины млекопитающих, рыбный желатин, модифицированные крахмалы, консерванты, антиоксиданты, поверхностно-активные вещества загустители, красители, ароматизаторы, модификаторы рН, подсластители, вещества, исправляющие вкус лекарственного средства, и их сочетания. Подходящие красители включают красные, черные и желтые оксиды железа, и красители FD&C, такие как FD&C голубой №2 и FD&C красный №40, и их сочетания. Подходящие ароматизаторы включают корригенты со вкусом и запахом мяты, малины, лакрицы, апельсина, лимона, грейпфрута, карамели, ванили, вишни и винограда и их сочетания. Подходящие модификаторы рН включают лимонную кислоту, винную кислоту, фосфорную кислоту, соляную кислоту, малеиновую кислоту и гидроксид натрия и их сочетания. Подходящие подсластители включают аспартам, ацесульфам К и тауматин и их сочетания. Подходящие вещества, исправляющее вкус лекарственного средства, включают бикарбонат натрия, ионообменные смолы, соединения включения циклодекстрина, адсорбаты или микроинкапсулированные активные вещества и их сочетания. Специалист в данной области техники может, при необходимости, легко определить подходящие количества этих различных дополнительных эксципиентов. Маннит, который представляет собой органическое соединение с формулой (CH(OH)) и который обычно известен специалистам в данной области, является предпочтительным дополнительным фармацевтически приемлемым веществом.
Композиция стадии (а) может также содержать фармацевтически активный ингредиент. Используемый в настоящем документе термин “фармацевтически активный ингредиент” относится к лекарственному средству, которое можно использовать в диагностике, устранении, ослаблении, лечении или профилактике заболевания. Любой фармацевтически активный ингредиент может быть использован для решения задач настоящего изобретения. Очевидно, специалист в данной области техники легко поймет, что некоторые фармацевтически активные ингредиенты являются более подходящими для использования с негелеобразующим формирующим матрицу веществом композиции стадии (а), чем, например, с гелеобразующим формирующим матрицу веществом стадии (b). Подходящие фармацевтически активные ингредиенты включают, без ограничения: анальгетики и противовоспалительные средства, антациды, антигельминтные средства, антиаритмические средства, антибактериальные средства, антикоагулянты, антидепрессанты, противодиабетические средства, противодиарейные средства, противоэпилептические средства, противогрибковые средства, средства против подагры, антигипертензивные средства, средства против малярии, средства против мигрени, антимускариновые средства, средства против опухоли и иммунодепрессанты, антипротозойные средства, противоревматические средства, антитиреоидные средства, противовирусные препараты, анксиолитические средства, седативные средства, снотворные и нейролептики, бета-адреноблокаторы, инотропные средства, кортикостероиды, средства от кашля, цитотоксические средства, противозастойные или противоотечные средства, диуретики, ферменты, антипаркинсонические средства, средства для лечения желудочно-кишечного тракта, антагонисты гистаминовых рецепторов, средства, регулирующие повышенный уровень липидов, местные анестетики, нервномышечные вещества, нитраты и антиангинальные средства, питательные вещества, опиоидные анальгетики, пероральные вакцины, белки, пептиды и рекомбинантные лекарственные средства, половые гормоны и контрацептивы, спермициды и стимуляторы; и их сочетания. Перечень конкретных примеров этих активных ингредиентов можно найти в патенте США № 6709699, который включен в настоящее описание посредством ссылки. Фармацевтически активный ингредиент, в случае его присутствия, присутствует в композиции стадии (а) в количестве, которое необходимо для проявления требуемого физиологического эффекта, определяемого клиническими исследованиями. Специалист в данной области может легко определить подходящее количество активного ингредиента для включения в лекарственную форму, изготовленную в соответствии с настоящим изобретением.
Композиция стадии (а) может быть получена любым обычным способом, который включен в настоящий документ посредством ссылки. Наиболее типично, формирующее матрицу вещество, растворитель и необязательные ингредиенты могут быть смешаны вместе при заданной температуре с образованием раствора. В некоторых вариантах осуществления, формирующее матрицу вещество и растворитель могут представлять собой раствор желатина с низким содержанием эндотоксина, приготовленный в соответствии с описанным выше процессом. Любые необязательные ингредиенты могут быть смешаны с раствором желатина. Затем раствор может охлаждаться и при этом может добавляться активный ингредиент.
Аналогичным образом, дозирование, описанное на стадии (а), может быть выполнено любым известным способом или устройством, включая последовательное дозирование, описанное в WO 2011/115969.
На стадии (b), композиции, дозированные на стадии (а), подвергаются лиофильной сушке с образованием растворяющейся лекарственной формы. Как правило, дозированные композиции в предварительно изготовленных формочках замораживают любыми способами, известными в данной области, например, пропуская их через туннель с жидким азотом, предпочтительно в течение от одной до около десяти минут. Специалист в данной области техники легко поймет, с какой скоростью необходимо их пропускать через туннель. Затем дозированные композиции в предварительно изготовленных формочках могут быть лиофилизированы при низком давлении (то есть в вакууме).
Лекарственные формы по настоящему изобретению представляют собой растворяющиеся лекарственные формы и, соответственно, обладают явным преимуществом более быстрого распада. Способ введения может быть пероральным, вагинальным или назальным, хотя предпочтительным является пероральный. После помещения в полость рта и контакта со слюной, лекарственная форма может распадаться в течение от 1 до 180 секунд, от 1 до 120 секунд, от 1 до 60 секунд, предпочтительно от 1 до 30 секунд, более предпочтительно в течение от около 1 до около 10 секунд и наиболее предпочтительно меньше, чем за 5 секунд.
В некоторых вариантах осуществления, лекарственные формы могут иметь меньше, чем около 200 EU/лекарственная форма, меньше, чем около 150 ЕЭ/лекарственная форма; меньше, чем около 125 ЕЭ/лекарственная форма; меньше, чем около 100 ЕЭ/лекарственная форма; меньше, чем около 90 ЕЭ/лекарственная форма; меньше, чем около 75 ЕЭ/лекарственная форма; или меньше, чем около 50 ЕЭ/лекарственная форма.
Примеры
Прежде всего, все сосуды и лаборатории, используемые для изготовления желатин-солевого раствора, должны быть, в соответствии с требованиями, очищены и продезинфицированы для минимизации биологической нагрузки и/или введения дополнительного эндотоксина.
Пример 1
Количество рыбного желатина, содержащего около 7000 ЕЭ/г желатина, добавляли к некоторому количеству очищенной воды и полностью растворяли (путем нагревания до около 60°С для облегчения растворения желатина) с получением 10% по массе раствора рыбного желатина. Затем раствор охлаждали до комнатной температуры и отбирали контрольный образец для определения проводимости. Даее к раствору желатина добавляли некоторое количество хлорида натрия (“NaCl”) с получением концентрации NaCl 150 мМ в растворе желатин-NaCl. Затем измеряли проводимость раствора желатин-NaCl.
Перед удалением эндотоксина, предварительно подготавливали анионообменное устройство (фильтр Sartobind Q Single Sep mini с пропускной способность 7 мл). Подготовку перед использованием анионообменного устройства и связанной с ним системы трубок проводили в соответствии с процедурой предварительной обработки. Для очистки и дезинфекции системы использовали 1М раствор гидроксида натрия (“NaOH”) с последующей промывкой системы 1М раствором NaCl для удаления раствора NaOH. Адсорбер заполняли раствором желатина-NaCl для удаления 1М раствора NaCl, использованного для подготовки к использованию. Используя перистальтический насос, затем загружали раствор желатин-NaCl и пропускали через 7 мл фильтр Sartobind Q Single Sep mini. Насос настраивали на поддержание постоянного давления для подачи раствора через адсорбер с минимальным повышением обратного давления. Отфильтрованный раствор желатин-NaCl собирали в чистый контейнер и измеряли проводимость этого отфильтрованного раствора.
Около 435 г раствора желатин-NaCl (фракциями по 30 г) фильтровали через 7 мл фильтр Sartobind Q Single Sep mini. Способность к связыванию и момент проникновения через фильтр в отношении эндотоксина оценивали путем сбора фракций фильтрата через регулярные промежутки времени и оценивали содержание эндотоксина и аналитическоесодержание желатина. Результаты обобщенно приведены в следующей таблице 2 и на фиг.6.
ТАБЛИЦА 2
<b>Суммарная масса отфильтрованного раствора желатина (г) </b>
<b>Содержание эндотоксина (ЕЭ/г)</b>
<b>Содержание желатина в образце (% по массе)</b>
<b>Стадия 101: Приготовление раствора желатина.</b>
10% раствор желатина
0
Не испытан
Не испытан
10% раствор желатина с 150 мМ NaCl
0
6440
10,3; 10,3
<b>Стадия 102: Снижение содержания эндотоксина</b>
Заполнение
30
N/A
N/A
Отфильтрованная фракция 1
60
<100
10/5; 10,2
Отфильтрованная фракция 2
90
Не испытан
Не испытан
Отфильтрованная фракция 3
120
112
10,6; 10,4
Отфильтрованная фракция 4
150
Не испытан
Не испытан
Отфильтрованная фракция 5
180
122
10,4; 10,5
Отфильтрованная фракция 6
210
Не испытан
Не испытан
Отфильтрованная фракция 7
240
129
10,4; 10,4
Отфильтрованная фракция 8
270
Не испытан
Не испытан
Отфильтрованная фракция 9
300
144
10,3; 10,5
Отфильтрованная фракция 10
330
Не испытан
Не испытан
Отфильтрованная фракция 11
360
138
10,7; 10,5
Отфильтрованная фракция 12
390
Не испытан
Не испытан
Отфильтрованная фракция 13
420
Не испытан
Не испытан
Отфильтрованная фракция 14
435
149
10,6; 10,6
В таблице 2 показано, что содержание эндотоксина в желатине снижается с помощью фильтрующего устройства Sartobind Q. Данные также показывают выход на плато/стабилизацию уровня эндотоксина после фильтрации 300 г (после фракции 9) раствора, при этом устройство, в конечном итоге, было заблокировано на фракции 14, когда, вследствие блокирования адсорбера, было собрано только 15 мл. Это указывает на то, что в испытываемом адсорбере было достигнуто равновесное состояние в момент, когда было отфильтровано около 300 г желатин-солевого раствора. Вместо проникновения эндотоксина, продолжающееся накопление эндотоксина на фильтрующем устройстве привело, в конечном итоге, к блокированию устройства.
Образец желатин-солевого раствора до фильтрования и после фильтрования также анализировали методом УФ-спектроскопии, и анализ показывал аналогичное содержание в образце, подтверждая, что желатин не удалялся в процессе фильтрации.
Пример 2
Количество рыбного желатина, содержащего около 14 600 ЕЭ/г желатина, добавляли к некоторому количеству очищенной воды и полностью растворяли (путем нагревания до приблизительно 60°С для облегчения растворения желатина), получая 12% по массе раствор рыбного желатина. Затем раствор охлаждали до комнатной температуры и отбирали контрольный образец для измерения проводимости. Далее к раствору желатина добавляли некоторое количество хлорида натрия (“NaCl”) с получением концентрации NaCl 150 мМ в растворе желатин-NaCl. Затем определяли проводимость раствора желатин-NaCl.
Перед удалением эндотоксина, предварительно подготавливали анионообменное устройство (75 мл капсула Sartobind Q). Подготовку перед использованием анионообменного устройства и связанной системы трубок проводили в соответствии с процедурой предварительной обработки. 1М раствор гидроксида натрия (“NaOH”) использовали для очистки и дезинфекции системы с последующей промывкой системы 1М раствором NaCl для удаления раствора NaOH. Адсорбер заполняли раствором желатина-NaCl для удаления 1М раствора NaCl, использованного для подготовки перед использованием. Используя перистальтический насос, раствор желатина-NaCl затем загружали и пропускали через 75 мл Sartobind Q. Насос настраивали на поддержание постоянного давления для подачи раствора через адсорбер с минимальным повышением обратного давления. Отфильтрованный раствор желатина-NaCl собирали в чистый контейнер и измеряли проводимость этого отфильтрованного раствора.
Приблизительно 3000 г раствора желатин-NaCl фильтровали через фильтр 75 мл Sartobind Q. Способность к связыванию и точку проникновения через фильтр в отношении эндотоксина определяли путем сбора фракций фильтрата через регулярные промежутки времени и определяли содержание эндотоксина и содержание желатина в образце. Результаты обобщенно приведены в следующей таблице 3 и на фиг.7.
ТАБЛИЦА 3
<b>Суммарная масса отфильтрованного раствора желатина (г)</b>
<b>Проводимость (мС/см)</b>
<b>Содержание эндотоксина (ЕЭ/г желатина)</b>
<b>Содержание желатина в образце (% по массе)</b>
<b>Стадия 101: Приготовление раствора желатина</b>
12% раствор желатина
0
(0,8 -0,9)*
14600
Не испытан
12% раствор желатина с 150 мM NaCl До фильтрации
0
Не испытан
13600
12,4; 12,2
<b>Стадия 102: Снижение содержания эндотоксина</b>
Заполнение
224
-
-
-
Перед фильтрованием фракция 1
312
-
-
-
Отфильтрованная фракция 1*
335
-
<100
12,1;12,3
Перед фильтрованием фракция 2
588
-
-
-
Отфильтрованная фракция 2*
611
-
Не испытан
Не испытан
Перед фильтрованием фракция 3
937
-
-
-
Отфильтрованная фракция 3*
960
-
148
12,4; 12,6
Перед фильтрованием фракция 4
1230
-
-
-
Отфильтрованная фракция 4*
1253
-
Не испытан
Не испытан
Перед фильтрованием фракция 5
1623
-
-
-
Отфильтрованная фракция 5*
1648
-
188
12,2; 12,2
Перед фильтрованием фракция 6
1905
-
-
-
Отфильтрованная фракция 6*
1927
-
Не испытан
Не испытан
Перед фильтрованием фракция 7
2184
-
-
-
Отфильтрованная фракция 7*
2203
-
175
12,2; 12,3
Перед фильтрованием фракция 8
2419
Отфильтрованная фракция 8*
2437
-
Не испытан
Не испытан
Перед фильтрованием фракция 9
2604
Отфильтрованная фракция 9*
2617
-
158
12,3; 12,3
<b>Общая собранная на фильтре фракция (фракция 1-9)</b>
188
-
-
-
<b>Общий отфильтрованный раствор желатина (исключая фракции 1-9)</b>
2429
13,4
119; < 100
Не испытан
*Собранные фракции образцов составляли приблизительно 20 г каждая.
В таблице 3 показано, что 75 мл Sartobind Q обладает способностью снижать уровень эндотоксина в партии желатина с начальным уровнем эндотоксина, эквивалентным 14600 ЕЭ/г желатина, до меньше, чем 200 ЕЭ/г желатина. Таким образом, может быть отфильтровано около 2,5 кг 12% по массе желатин-солевого раствора с использованием 75 мл капсулы, при этом уровень эндотоксина начинает выходить на плато/стабилизироваться после того, как было отфильтровано около 1,6 кг (после фракции 5) 12% по массе желатин-солевого раствора, предполагая, что положение равновесия было достигнуто. Точка проникновения не наблюдалась.
Анализ желатина в растворе не показал существенного изменения содержания в образце между растворами желатина до и после фильтрования, подтверждая отсутствие потерь желатина в адсорбере с анионообменной мембраной.
Пример 3
Количество рыбного желатина, содержащего приблизительно 14 600 ЕЭ/г желатина, добавляли к количеству очищенной воды и полностью растворяли (при нагревании до приблизительно 60°С для облегчения растворения желатина) с получением 12% по массе раствора рыбного желатина. Затем раствор охлаждали до комнатной температуры и отбирали контрольный образец для измерения проводимости. Потом к раствору желатина добавляли некоторое количество хлорида натрия (“NaCl”) с получением концентрации NaCl 150 мМ в растворе желатин-NaCl. Затем измеряли проводимость раствора желатин-NaCl.
Перед удалением эндотоксина предварительно подготавливали анионообменное устройство (75 мл капсула Sartobind Q). В соответствии с процедурами предварительной обработки. 1М раствор гидроксида натрия (“NaOH”) использовали для очистки и дезинфекции системы с последующей промывкой системы 1М раствором NaCl для удаления раствора NaOH. Адсорбер заполняли раствором желатина-NaCl с удалением 1М раствора NaCl, используемого для подготовки перед использованием. Затем, используя перистальтический насос, загружали раствор желатина-NaCl и пропускали через 75 мл Sartobind Q. Насос настраивали на поддержание постоянного давления для подачи раствора через адсорбер с минимальным повышением обратного давления. Отфильтрованный раствор желатина-NaCl собирали в чистый контейнер и измеряли проводимость этого отфильтрованного раствора.
Приблизительно 5000 г раствора желатин-NaCl фильтровали через фильтр 75 мл Sartobind Q. Для исследования отбирали пятнадцать (15) из отфильтрованных фракций, каждая массой приблизительно 20 г. Между последовательными фракциями, отфильтровывали приблизительно 300 г раствора желатина.
Первые 2000 г отфильтрованного желатин-солевого раствора переносили в систему диафильтрации (Sartorius Sartoflow Advanced) для удаления соли с помощью процессов диафильтрации и концентрирования. Систему диафильтрации настраивали в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Затем, для очистки и дезинфекции системы, осуществляли подготовку перед использованием системы диафильтрации в соответствии с инструкциями по эксплуатации. Для очистки и дезинфекции системы использовали 1М раствор NaOH с последующей промывкой системы очищенной водой для удаления раствора NaOH. Перед использованием систему диафильтрации промывали потоком чистой воды для проверки того, что фильтр с перекрестным током (кассета) является чистым и соответствует требованиям. Потом, перед началом диафильтрации, оптимизировали установочные параметры (давление и расход).
Отфильтрованный желатин-солевой раствор загружали в резервуар системы диафильтрации. Регистрировали массу раствора, который был загружен в резервуар, и измеряли проводимость загруженного раствора с использованием датчика проводимости. Загруженный отфильтрованный желатин-солевой раствор разбавляли очищенной водой (с соотношением фильтрованный желатин-солевой раствор:вода 2:1 или 1:1 или 1:2 или 1:3 или 1:4 в зависимости от концентрации желатина). Смесь перемешивали для проверки того, что смесь хорошо перемешана.
Затем систему диафильтрации настраивали для концентрирования разбавленного обессоленного раствора желатина путем удаления избытка воды, добавляемого для разбавления, до тех пор, пока масса обессоленного желатинового раствора не становилась такой же, как у отфильтрованного желатин-солевого раствора до разбавления. При завершении, систему диафильтрации очищали, и затем осуществляли промывку током чистой воды после использования для проверки чистоты фильтра с перекрестным током (кассета).
Фильтрацию оставшегося желатин-солевого раствора (около 3000 г) продолжали до конца. Способность к связыванию и точку проникновения через фильтр в отношении эндотоксина определяли путем сбора фракций фильтрата через регулярные промежутки времени и определяли содержание эндотоксина и аналитическое содержание желатина. Результаты обобщенно приведены в следующей таблице 4 и на фиг.8.
ТАБЛИЦА 4
<b>Суммарная масса отфильтрованного раствора желатина (г)</b>
<b>Проводимость (мС/см)</b>
<b>Содержание эндотоксина (ЕЭ/г желатина)</b>
<b>Содержание желатина в образце (%)</b>
<b>Step 101: Приготовление раствора желатина</b>
12% раствор желатина
0
(~-0,9)*
14,600
12% раствор желатина с 150 мM NaCl
0
13,2
14000
12,4; 12,6
<b>Стадия 202: Снижение содержания эндотоксина</b>
Загрузка
(224)
-
N/A
N/A
Перед фильтрованием фракция 1
524
-
-
-
Отфильтрованная фракция 1*
540
134
12,6; 12,6
Перед фильтрованием фракция 2
840
-
-
-
Отфильтрованная фракция 2*
857
-
Не испытан
Не испытан
Перед фильтрованием фракция 3
1157
-
-
-
Отфильтрованная фракция 3*
1177
-
269
Не испытан
Перед фильтрованием фракция 4
1476
-
-
-
Отфильтрованная фракция 4*
1494
Не испытан
Не испытан
Перед фильтрованием фракция 5
1794
-
-
-
Отфильтрованная фракция 5*
1810
-
697
12,4; 12,4
Перед фильтрованием фракция 6
2110
-
-
-
Отфильтрованная фракция 6*
2127
-
Не испытан
Не испытан
*Собранный отфильтрованный раствор желатина переносили для диафильтрации (~ суммарный объем 2л)
Перед фильтрованием фракция 7
2427
-
-
-
Отфильтрованная фракция 7
2449
-
3780
Не испытан
Перед фильтрованием фракция 8
2748
-
-
-
Отфильтрованная фракция 8
2771
-
Не испытан
Не испытан
Перед фильтрованием фракция 9
3071
-
-
-
Отфильтрованная фракция 9
3092
-
Не испытан
12,3, 12,5
Перед фильтрованием фракция 10
3392
-
-
Отфильтрованная фракция 10
3412
-
Не испытан
Не испытан
Перед фильтрованием фракция 11
3712
-
Отфильтрованная фракция 11
3732
-
3480
Не испытан
Перед фильтрованием фракция 12
4032
Отфильтрованная фракция 12
4051
Не испытан
Не испытан
Перед фильтрованием фракция 13
4351
Отфильтрованная фракция 13
4366
2160
12,9; 12,4
Перед фильтрованием фракция 14
4666
Отфильтрованная фракция 14
4690
Не испытан
Не испытан
Перед фильтрованием фракция 15
4990
Отфильтрованная фракция 15
5002
1010
12,3; 12,4
Стадия 103: Удаление NaCl
* собранный отфильтрованный желатин/до диафильтрации
N/A
-
Не испытан
Не испытан
* собранный отфильтрованный раствор желатина/после фильтрации
N/A
1,2
405
11,6; 11,4
*Проводимость определяется как отдельный эталонный образец.
Таблица 4 демонстрирует, что 75 мл Sartobind Q обладает способностью снижать уровень эндотоксина в партии желатина с уровнем эндотоксина, эквивалентным 14/600 ЕЭ/г желатина, до меньше, чем 1000 ЕЭ/г желатина в отношении приблизительно первых 2 кг 12% по массе желатин-солевого раствора. Уровень эндотоксина сохранялся при прохождении этого материала через систему диафильтрации. В отношении следующих 3 кг желатин-солевого раствора, который был отфильтрован, уровень эндотоксина продолжал повышаться с последующим снижением. Это свидетельствует о проникновении эндотоксина после того, как было отфильтровано 2 килограмма с использованием 75 мл Sartobind Q.
Что касается содержания желатина, то в отфильтрованных образцах с пониженным содержанием эндотоксина не было обнаружено существенных различий в количестве желатина по сравнению с образцами до фильтрования. Это подтвердило (как и в предыдущих примерах), что желатин не связывался с анионообменной мембраной адсорбера во время фильтрации. Для образца после диафильтрации, образец показал сопоставимое содержание желатина в образце. Кроме того, измерения проводимости обессоленного образца показали значение проводимости, сопоставимое со значением образца до обработки солью, подтверждая эффективность проведения процесса обессоливания.
Пример 4
Для примера 4, была изготовлена партия лиофилизированных таблеток на основе водного раствора рыбного желатина со сниженным содержанием эндотоксина с использованием трех стадий, описанных на фиг.2, 3 и 5. Использованная в примере 4 очищенная вода имела уровень эндотоксина меньше, чем 0,1 ЕЭ/мл.
Водный раствор рыбного желатина и хлорида натрия, 3 кг, содержащего 9% по массе рыбного желатина и 150 мМ NaCl, получали способом, показанным на фиг.2 и в прилагаемых параграфах. Рыбный желатин добавляли в очищенную воду и полностью растворяли (с помощью нагревания до приблизительно 60°С), получая раствор рыбного желатина. Раствор охлаждали до комнатной температуры и к раствору рыбного желатина добавляли NaCl. Измеряли уровень эндотоксина в полученном желатин-солевом растворе, и он составлял 1100 ЕЭ/г.
Для снижения уровня эндотоксина в желатин-солевом растворе, раствор фильтровали через анионообменное устройство (75 мл капсула Sartobind Q), что показано со ссылкой на фиг.3 и прилагаемые параграфы. Перед фильтрацией, капсулу Sartobind Q и связанную систему трубок очищали и дезинфицировали путем прокачки через систему 1М раствора гидроксида натрия с использованием перистальтического насоса. Потом через систему прокачивали очищенную воду для удаления раствора гидроксида натрия. Далее систему подготавливали путем прокачивания через систему 1М раствора NaCl, и потом части желатин-солевого раствора для удаления раствора NaCl. Эту часть желатин-солевого раствора отбраковывали.
Для снижения содержания эндотоксина, оставшуюся часть желатин-солевого раствора отфильтровывали через фильтр Sartobind Q. Полученный фильтрат желатин-солевого раствора составлял примерно 2,3 кг. Затем фильтрат желатин-солевого раствора перенесили в систему диафильтрации (Sartorius Sartoflow Advanced) для удаления соли с помощью процессов диафильтрации и концентрирования, описанных на фиг.5 и в прилагаемых параграфах.
Перед началом процесса обессоливания/концентрирования, систему диафильтрации очищали и дезинфицировали с использованием 1М раствора NaOH с последующей промывкой очищенной водой. Перед использованием систему промывали потоком чистой воды. Затем систему настраивали на оптимальное давление и скорость потока с использованием фильтра с перекрестным током (кассета) с границей разделения 10 кДа.
-1
Затем систему диафильтрации настраивали для диафильтрации при постоянном объеме. Проводимость раствора контролировали, и процесс диафильтрации останавливали, когда проводимость достигала целевого значения, которое в этом примере составляло менее 0,5 мС/см. Затем систему диафильтрации настраивали на концентрирование отфильтрованного обессоленного раствора желатина до целевой концентрации желатина, составляющей 12% по массе (диапазон 10-14%). При завершении, в полученном растворе желатина (отфильтрованный-обессоленный/концентрированный) измеряли содержание желатина и эндотоксина. Полученный раствор имел содержание желатина 11% по массе и уровень эндотоксина 83 ЕЭ/г. Собирали около 1,8 кг полученного раствора желатина.
В следующей таблице 5 обобщенно представлено производство лиофилизированных таблеток с желатином с низким содержанием эндотоксина из примера 5.
Таблица 5
<b>Ингредиент</b>
<b>% по массе</b>
<b>Количество в мг на аликвоту 500 мг для дозирования</b>
<b>Количество в мг после сублимационной сушки</b>
Буферный раствор (для моделирования жидкой вакцинной композиции)
25%
125 мг
~2,6 мг**
Рыбный желатин с низким содержанием эндотоксина (в целевом 12% по массе рыбном желатиновом растворе)
50%
250 мг (содержит 30 мг рыбного желатина)
30 мг**
маннит
8%
40 мг
40 мг
Трегалоза
0,75%
3,75 мг
3,74 мг
Модификатор pH
в достаточном количестве для достижения значения pH в диапазоне 6,5-7,8
~1,3 мг
~0,04 мг**
Вода (для приготовления водной матричной смеси)
в достаточном количестве для достижения 100%
~73,5 мг
Вода удалена
**после удаления воды в процессе сублимационной сушки
В этом примере для изготовления лиофилизированных таблеток приготавливали имитирующую вакцинную композиционную смесь массой 1 кг. Композиционная смесь содержала 50% по массе отфильтрованного раствора рыбного желатина с пониженным содержанием эндотоксинов (т.е. при изготовлении использовали 0,5 кг отфильтрованного раствора рыбного желатина, полученного описанным выше способом). Композицию получали путем добавления и растворения маннита и трегалоза в отфильтрованном растворе рыбного желатина при температуре от 13 до 17ºC. Значение pН доводили до целевого значения 7,4 с использованием модификатора рН (например, 3% раствор NaOH). Затем добавили имитирующую жидкую вакцинную композицию (в данном случае буферный раствор) и проверяли, что значение рН все еще находится в пределах установленного диапазона. Затем добавили воду, чтобы довести объем до размера партии.
Композицию дозировали по массе (влажная доза) в ячейки предварительно сформированных блистерных упаковок. В этом случае аликвоту 500 мг дозировали в каждую ячейку в предварительно сформированном блистере. После дозирования, блистерные упаковки пропускали через туннель для замораживания жидкого азота, где вода в смеси замораживалась в блистерных ячейках. При выходе из морозильного туннеля, продукт хранили в замороженном виде в холодильных шкафах перед лиофилизацией. Необходимое время выдержки в замороженном состоянии (также называемое временем отжига) применяли к замороженным таблеткам для отжига таблеток. В этом случае время выдержки составляло 6 часов. Затем замороженные таблетки помещали на полки лиофилизатора, где кристаллы льда удаляли из замороженных таблеток путем сублимации при низком давлении. Полученные лиофилизированные таблетки имели очень высокую пористость, которая обеспечивает быстрый распад. Этот распад характеризуется временем дисперсии (время увлажнения и распада), определяемым внутрилабораторным исследованием. Исследовали образцы пяти полученных лиофилизированных таблеток, и установили, что это время, обычно, составляет меньше 10 секунд. Результаты обобщенно представлены в таблице 6. В некоторых вариантах осуществления, время дисперсии, не превышающее 60 секунд, также считается приемлемым для продукта, в случае, когда требуется более медленный профиль дисперсии/распада таблетки. Полученные лиофилизированные таблетки также оценивали на содержание эндотоксина. Было установлено, что оно в среднем составляет меньше 75 ЕС на таблетку.
Таблица 6
Время увлажнения таблетки
Время распада таблетки
Диапазон (n=5)секунды
Среднее время (n=5) секунды
Диапазон (n=5)секунды
Среднее время (n=5) секунды
< 2 - < 4
< 3
< 5 -< 7
< 6
Способы измерения
Измерение проводимости
: проводимость раствора измеряется с помощью измерителя проводимости. Измеритель проводимости определяет количество заряженных частиц или ионов в растворе. Ионы, отвечающие за проводимость, возникают в электролитах при растворении в воде. Соли (например, хлорид натрия), кислоты и основания являются электролитами. Значение проводимости пропорционально концентрации электролитов. Датчик проводимости калибруется с использованием калибровочного раствора проводимости. Затем измеряется проводимость растворов. В настоящем изобретении соль добавляется к раствору желатина на стадии 101 и затем удаляется на стадии 103 путем обессоливания. Для завершения процесса обессоливания, проводимость обессоленного раствора желатина должна быть сопоставима с исходным раствором желатина (перед добавлением соли). Желатин имеет некоторые остаточные ионы, поэтому проводимость измеряется для раствора желатина (без соли) с определением исходной проводимости. Затем это значение проводимости используется для настройки системы диафильтрации. Диафильтрация раствора осуществляется до тех пор, пока проводимость не достигнет этого исходного значения. При достижении значения, начинается процесс концентрации и проводимость сохраняется.
Измерение содержания эндотоксина:
Содержание эндотоксина в растворе определяется в соответствии с фармакопейным методом “EP2.6.14/USP<81> Bacterial Endotoxins - Method D Chromogenic Kinetic.” Тест на бактериальные эндотоксины (BET) используется для обнаружения или количественного определения эндотоксинов грамотрицательных бактерий с использованием лизата амебоцитов мечехвоста (Limulus polyphemus или Tachypleus tridentatus). Метод, используемый для этого теста, является хромогенным методом, основанным на появлении окрашивания после расщепления синтетического пептид-хромогенного комплекса. Практически, образец продукта подготавливают с получением концентрации образца, составляющей 10 мг/мл, и с использованием ранее заданного разведения (1:1000), исследованного на содержание эндотоксина с использованием стандартной кривой в целях сравнения.
Измерение содержания желатина в образце
: УФ-спектроскопический анализ использовали для определения содержания желатина в растворах, описанных в настоящем документе. Калибровочную кривую содержания желатина в образце строили путем измерения УФ-поглощения калибровочных образцов (диапазон концентраций от 0,006 до 0,26 мг/мл) при длине волны 220 нм. Отмеряли соответствующее количество исследуемых образцов, помещали в мерный сосуд объемом 100 мл и доводили до объема деионизированной водой так, чтобы теоретическая концентрация этих растворов составляла около 0,05 мг/мл. УФ-поглощение образцов измеряли при 220 нм, на основании чего определяли фактическую концентрацию желатина в мг/мл. Исходя из этого значения, определяли процентное содержание желатина в исследуемых образцах.
Измерение концентрации соли:
Концентрация соли может быть определена посредством проводимости (то есть с использованием измерителя проводимости). Калибровочный график может быть получен путем измерения проводимости солевого раствора для диапазона концентраций соли. Желатин может иметь некоторое количество остаточных электролитов; соответственно, исходная концентрация может составлять, например, ~0,8-1 мС/см. При добавлении соли к желатиновому раствору, можно измерить проводимость (которая будет отнесена к остаткам электролитов+добавленная соль. Например, ~13 мС/см). Удаление добавленной соли можно контролировать в процессе диафильтрации, пока ее количество снова не достигнет исходного значения. На этом этапе можно предположить, что вся добавленная соль удалена.
Концентрация соли или проводимость могут быть измерены при приготовлении раствора желатина; после добавления соли в раствор желатина с образованием желатин-солевого раствора; и на протяжении всего процесса диафильтрации.
Измерение характеристик дисперсии (исследование
):
in vitro
in vitro
Характеристики дисперсии (исследование ): исследованию подвергается минимум 5 таблеток. Сначала подготавливают химический стакан, содержащий около 200 мл очищенной воды при 20 ± 0,5°С. Затем каждую таблетку извлекают из блистерной упаковки и помещают на поверхность воды. За время принимается промежуток времени, необходимый каждой таблетке для полного увлажнения или распада. Увлажнение соответствует промежутку времени, необходимому для полного увлажнения таблетки. Увлажнение таблетки может происходить на отдельных участках, которые, в конечном итоге, сливаются вместе, при этом вся таблетка становится увлажненной. Исследование дисперсии считается завершенным, когда центральная часть таблетки представляет собой увлажненную массу. Таким образом, время увлажнения определяется с момента увлажнения центральной части таблетки, поскольку это самая толстая часть таблетки. Время увлажнения регистрируется для каждой из пяти таблеток. Максимальное время для каждого исследования составляет 60 секунд. Время, превышающее это значение, может записываться просто как “больше, чем 60 секунд”. Распад соответствует промежутку времени, необходимому для того, чтобы таблетка распалась. Это время может быть определено с начала распада таблетки по краям. Время распада регистрируется для каждой из пяти таблеток. Максимальное время для каждого исследования составляло 60 секунд. Время, превышающее это значение, может регистрироваться как “больше, чем 60 секунд”. В отдельных случаях таблетка не будет полностью увлажняться или полностью распадаться в течение этого времени. Иногда в таблетке могут присутствовать твердые комочки; в других случаях поверхность таблетки может вообще не увлажняться. Кроме того, таблетка целиком может быть покрыта твердой коркой. В случае возникновения этих явлений, об этом в описании делается запись с указанием на “твердые комочки” или “оставшуюся корку”, в зависимости от конкретного случая. Образование “твердых комочков” и/или “корки” может указывать на разрушение микроструктуры в процессе лиофилизации. На фиг. 9А-С показано упрощенное представление трех возможных недисперсных состояний с видом сбоку и видом сверху таблеток, так, как они выглядят в воде. На фотографиях, на фиг.9A-C, показаны некоторые типичные таблетки по аналогичным категориям. Критерий для исследования дисперсионных характеристик заключается в том, что 5 таблеток могут полностью увлажняться и/или распадаться в пальпируемую массу без присутствия твердых комков и корки в течение 60 секунд или меньше. В некоторых вариантах осуществления, лекарственные формы, описанные в настоящем документе, могут полностью увлажняться и/или распадаться в пальпируемую массу без присутствия твердых комков и/или корки в течение 60 секунд или меньше.
Определения
Если не указано иное, вся специальная терминология, обозначения и другие технические и научные термины или терминология, используемая в настоящем документе, имеют те же самые значения, которые обычно понимает рядовой специалист в данной области техники, к которой относится заявленный объект изобретения. В некоторых случаях, термины с общепринятыми значениями определены в настоящем документе для ясности и/или справочных целей, причем включение таких определений в настоящем документе не обязательно должно истолковываться как представляющее существенную разницу от того, что обычно понимается в данной области техники.
Указание на “около”, применительно к значениям или параметрам в настоящем документе, включает (а также описывает) отклонения, которые относятся к этому значению или параметру как таковые. Например, описание, относящееся к “около X”, включает описание “X”. Кроме того, указание на фразы “меньше чем”, “больше чем”, “максимум”, “по крайней мере”, “меньше или равно”, “больше или равно” или другие подобные фразы, за которыми следует перечень значений или параметров, предназначено для применения фразы к каждому значению или параметру в перечне значений или параметров. Например, утверждение, что раствор имеет концентрацию, по меньшей мере, около 10 мМ, около 15 мМ или около 20 мМ, означает, что раствор имеет концентрацию, по меньшей мере, около 10 мМ, по меньшей мере, около 15 мМ или, по крайней мере, около 20 мм.
Используемые в настоящем документе формы единственного числа предназначены также для включения форм множественного числа, если контекст явно не указывает на иное. Также следует принять во внимание, что термин “и/или”, используемый в настоящем документе, относится и охватывает все возможные сочетания одного или нескольких связанных перечисленных элементов. Кроме того, следует принять во внимание, что термины “включает”, “включающий”, “содержит” и/или “содержащий”, при использовании в настоящем документе, определяют наличие заданных признаков, целых чисел, стадий, операций, элементов, компонентов и/или единиц, но не исключают наличие или добавление одного или нескольких других признаков, целых чисел, стадий, операций, элементов, компонентов, единиц и/или их групп.
В настоящей заявке, в тексте и на фигурах, описано несколько числовых диапазонов. Описанные числовые диапазоны по существу включают любой диапазон или значение в описанных числовых диапазонах, включая конечные точки, даже в том случае, если в описании точное не указано ограничение диапазона, поскольку настоящее изобретение может осуществляться в отношении всех описанных числовых диапазонов.
Вышеприведенное описание представлено с целью обеспечить возможность специалисту в данной области техники осуществлять и использовать изобретение, и предоставляется в контексте конкретного применения и его требований. Специалистам в данной области техники будут очевидны различные модификации предпочтительных вариантов осуществления, а общие принципы, определенные в настоящем документе, могут применяться к другим вариантам осуществления и применениям без отклонения от сущности и объема изобретения. Таким образом, настоящее изобретение не ограничивается представленными вариантами осуществления, но должно охватывать самый широкий объем в соответствии с принципами и признаками, раскрытыми в настоящем документе.