ПРИМЕНЕНИЕ ОСТЕОПОНТИНА В СТОМАТОЛОГИЧЕСКИХ КОМПОЗИЦИЯХ
APPLICATION OF OSTEOPONTINE IN DENTAL COMPOSITIONS

Область техники
Настоящее изобретение относится к стоматологическим композициям. В частности, изобретение касается применения остеопонтина (ОПН) для существенного снижения роста бактериальных бляшек на зубной эмали.
Предшествующий уровень техники
Существует множество проблем, связанных со здоровьем зубов, как косметических, так и терапевтических, таких как образование зубных отложений, рост бактериальных бляшек на зубной эмали, кариес, зубной камень, заболевания периодонта и деминерализация зубов.
Зубные отложения - это комплексная биопленка, которая откладывается на твердых тканях (на зубах) полости рта. Хотя более 500 видов бактерий образуют бляшки, развитие колоний происходит по определенной схеме, включающей прикрепление первоначальных колонистов на слюнной пелликуле и рост за счет постоянного наслаивания новых бактерий. Хорошо известно, что к разряду первоначальных колонистов относятся определенные виды стрептококков. Поэтому важно контролировать процесс прикрепления этих бактерий. Различные адгезины и молекулярные взаимодействия лежат в основе адгезивных реакций и вносят вклад в развитие зубного налета и в заболевания, такие как кариес и заболевания периодонта.
Эмаль зубов состоит из гидроксиапатита. Существует природное равновесие между растворяемым из эмали гидроксиапатитом и гидроксиапатитом, образуемым на или в зубах из веществ, содержащихся в слюне. Если это равновесие смещено в сторону растворения гидроксиапатита, возникает кариогенная ситуация, которую называют деминерализацией.
Известно, что введение ионов фтора в эмаль защищает ее от деминерализации. Поэтому фториды часто включают в зубные пасты. Однако фториды могут привести к флуорозу, особенно если пациент глотает такую зубную пасту или другой стоматологический продукт, или средство гигиены полости рта, что часто происходит, особенно у маленьких детей. Такая проблема также возникает в регионах с высоким содержанием фтора в питьевой воде.
Задачей настоящего изобретения является создание стоматологической композиции, в которую включен природный молочный белок остеопонтин для контроля или замедления роста бактерий на поверхности зубов, в результате чего предотвращается или уменьшается образование зубных отложений и кариеса.
Есть две патентные публикации, где описано применение фракций молочных белков, а именно гидролизатов казеина, фосфопептидов Са (ФПК) и глюкомакропептида (ГМП) из свернутого молока, для восстановления повреждений эмали, где высказывается гипотеза, что они действуют как добавка аморфного фосфата кальция в эмаль.
- В WO 03/059304 описана композиция для ухода за полостью рта, содержащая источник ионов фтора и фракцию фосфопептидов Са (ФПК). Эта композиция стабилизирует фосфат кальция, который добавляют в оральные составы в аморфном виде, а также стабилизирует уровень фтора в оральном составе.
- В WO 00/07454 описано, что при добавлении глюкомакропептида (ГМП) в специальные пищевые составы на основе молока наблюдается антикариогенный эффект у крыс.
В отличие от пептидов ФПК и ГМП, ОПН дает дополнительные возможности для гигиены полости рта, поскольку он способен оказывать биоактивное влияние на прикрепление микроорганизмов на зубную эмаль и соответственно влиять на развитие кариеса. Также как и ФПК и ГМП, ОПН способен оказывать влияние на уровень аморфного фосфата кальция в слюне, который необходим для восстановления зуба.
Таким образом, ОПН выполняет несколько функций в стоматологическом аспекте.
Серьезным преимуществом применения ОПН, например в зубных пастах и полосканиях для рта, является то, что он представляет собой натуральный белковый компонент коровьего молока, поэтому не требует особых клинических испытаний.
Раскрытие изобретения
Авторами изобретения было неожиданно обнаружено, что остеопонтин, содержащийся в оральных композициях, снижает прикрепление бактерий и их рост на поверхности эмали зубов.
Таким образом, изобретение относится к оральным композициям, содержащим остеопонтин, включая зубные пасты, полоскания для рта и жевательную резинку, и т.п.
В исследованиях in vitro с использованием аналога зуба - гладко отполированного диска из гидроксиапатита (ГА), погруженного в раствор ОПН, было показано, что на поверхности гидроксиапатита образуется пленка, которая не удаляется при промывании водой. Когда таким образом обработанные диски приводили в контакт с человеческой слюной, было неожиданно обнаружено, что пленка ОПН существенно уменьшает прикрепление и рост бактерий на поверхности аналога зуба и, следовательно, приводит к значительно более низкому образованию бляшек. Испытания проводили с использованием образцов слюны от пациентов различного возраста и с различной флорой полости рта. Эти результаты показывают возможность применения ОПН в оральных композициях, таких как зубные пасты и полоскания для рта, а также в качестве ингредиента жевательной резинки.
Таким образом, изобретение относится к применению остеопонтина для снижения роста бактериальных бляшек на зубной эмали и к стоматологическим композициям, содержащим остеопонтин.
Термин «остеопонтин» или «ОПН», используемый в данном описании, означает остеопонтин из молока, включая природные фрагменты и пептиды, полученные из ОПН путем протеолитического расщепления молока, или сплайсированные, фосфорилированные или гликолизированные варианты ОПН, полученные методом, описанным в WO 01/49741. Молоко может представлять собой молоко млекопитающих, таких как корова, верблюд, коза, овца, дромадер и лама. Однако предпочтительным является коровье молоко из-за его доступности. Все количества рассчитаны на ОПН натурального коровьего молока, однако их легко скорректировать на его активные фракции или на ОПН из другого источника. ОПН и его производные также можно получить генетическим путем.
Стоматологические композиции могут представлять собой любой продукт для ухода за полостью рта, например зубной порошок, зубной гель, зубной эликсир, спрей для полости рта или жевательную резинку. Остеопонтин (ОПН) представляет собой кислый, высоко фосфорилированный, богатый сиаловой кислотой, кальций-связывающий белок. 1 моль ОПН связывает 28 молей фосфата и около 50 молей кальция. Его изоэлектрическая точка равна примерно 3,0. Этот белок присутствует во многих тканях организма и выполнят роль сигнального и регуляторного белка. Он является активным белком в процессах биоминерализации. ОПН экспрессируется несколькими типами клеток, в том числе клетками костной ткани, клетками гладкой мускулатуры и эпителиальными клетками.
ОПН присутствует в коровьем молоке. Его обычная концентрация составляет 20 мг/л. ОПН легко выделить анионной хроматографией, например, из кислой сыворотки при рН 4,5, как описано в WO 01/497741 А2 или WO 02/28413. Можно легко получить степень чистоты до 90-95%.
В стоматологической композиции содержание ОПН, как правило, составляет от 50 мг до 1500 мг на 1 кг композиции. Однако и меньшие количества также оказывают эффект. Можно использовать и большие количества, однако эффект не будет существенно увеличен. Наиболее полезное содержание - от 100 до 1000 мг ОПН на 1 кг, предпочтительно - от 200 до 500 мг, наиболее предпочтительно - около 350 мг. Предположительно большие количества ОПН не дадут лучших результатов и поэтому не рекомендуются, поскольку ОПН является довольно дорогостоящим продуктом.
Предпочтительные формы композиций, как уже указано выше, представляют собой зубную пасту, зубной гель и зубной порошок. Компоненты таких паст и гелей включают один или более из следующих агентов: стоматологический абразивный агент (от примерно 10 до примерно 50%), сурфактант (от примерно 0,5 до примерно 10%), загуститель (от примерно 0,04 до примерно 0,5%), увлажнитель (от примерно 0,1 до примерно 3%), вкусоароматический агент (от примерно 0,04 до примерно 2%), подсластитель (от примерно 0,1 до примерно 3%), краситель (от примерно 0,01 до примерно 0,5%) и вода (от 2 до 45%). Антикариозные агенты содержат от примерно 0,001 до примерно 13% ОПН.
Понятно, что порошки по существу не содержат воды.
Другими предпочтительными композициями согласно изобретению являются зубные эликсиры, включая спреи для полости рта. Компоненты таких эликсиров и спреев включают один или более из следующих агентов: вода (от примерно 45 до примерно 95%), этанол (от примерно 0 до примерно 25%), увлажнитель (от примерно 0 до примерно 50%), сурфактант (от примерно 0,01 до примерно 7%), вкусоароматический агент (от примерно 0,04 до примерно 2%), подсластитель (от примерно 0,1 до примерно 3%), краситель (от примерно 0,001 до примерно 0,5%), антикариозный агент, содержащий ОПН, (от примерно 0,001 до примерно 1%) и агент против зубного камня (от примерно 0,1 до примерно 13%).
Третий аспект изобретения представляет композиции жевательной резинки различных составов.
Краткое описание графических материалов
На чертеже представлена зависимость адсорбции ОПН на поверхности диска из гидроксиапатита при различных температурах. Символ R означает, что поверхность промывали буфером, а символ SDS означает, что поверхность промывали додецилсульфатом натрия.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Дополнительно изобретение проиллюстрировано следующими примерами и экспериментами.
Пример 1
Предпосылки
Задача этого исследования заключалась в подтверждении следующих двух положений:
- ОПН стабильно связывается с гидроксиапатитной поверхностью. Образованную пленку нельзя удалить промывкой водой или буфером.
- ОПН влияет на прикрепление бактерий к поверхности аналога зуба.
Способность ОПН предотвращать образование отложений (бляшек) была исследована in vitro с использованием аналога зубной эмали - гладко отполированных дисков из гидроксиапатита (ГА). Диски погружали в раствор ОПН и затем инкубировали со слюной. Рост бактерий на подложке оценивали путем подсчета бактерий в различных образующих бляшки бактериальных штаммах на факультете онтодологии в Университете г.Мальмо, Швеция.
В качестве контроля покрытых ОПН поверхностей гидроксиапатита использовали не покрытые и покрытые БСА (бычий сывороточный альбумин) диски из гидроксиапатита.
Эти исследования проводили с хорошо охарактеризованными образцами слюны от 6 доноров, как описано ниже.
Материалы и методы
Реактивы
Остеопонтин (ОПН) с хроматографической чистотой около 95% был приготовлен фирмой Arla Foods amba. Бычий сывороточный альбумин (БСА) был приобретен у фирмы Sigma-Aldrich. Додецилсульфат натрия (SDS) был приобретен у фирмы Sigma (St. Louis, МО, USA, L-6026). Все другие реактивы имели аналитическую степень чистоты, качество воды соответствовало Milli-Q. Предварительную обработку подложек и эксперименты по адсорбции проводили в фосфатном буфере, содержащем 0,04 М фосфата и 0,05 М хлорида натрия при рН 7. Всю стеклянную посуду, наконечники пипеток и т.п. стерилизовали в автоклаве. Растворы белков, которые использовали в экспериментах, стерилизовали путем фильтрации (размер пор до 0,22 мкм).
Образцы слюны
Стимулированную слюну для экспериментов собирали после жевания куска парафина. За два часа до взятия образцов доноры не принимали пищи и питья.
Подложки
Диски из гидроксиапатита диаметром 10 мм были приобретены в Swedish Ceramic Institute, Гетеборг. Диски полировали с обеих сторон так, чтобы их можно было чистить ультразвуком. До начала экспериментов подложки (диски) обрабатывали слабым раствором детергента и тщательно промывали водой. Подложки хранили в 70% этаноле до момента использования, перед которым их промывали водой и сушили потоком азота. После сушки подложки, которые использовали для измерений методом эллипсометрии, очищали плазмой при низком давлении воздуха (10-30 Па) с использованием радиочастотного прибора с тлеющим разрядом (Harrick PDC 3XG, Harrick Scientific Corp., Ossing, New York).
Образование бактериальной пленки
Поверхности подложек предварительно выдерживали 1 час в растворе белка при 37°С. Затем их промывали буфером и инкубировали 40 часов при 37°С. Во время предварительной обработки и инкубации применяли перемешивание. После инкубации диски из гидроксиапатита промывали буфером.
Эллипсометрия
2
После взаимодействия ОПН с белками слюны на подложках из гидроксиапатита проводили эллипсометрию, которая является оптическим методом определения изменений в поляризации света после отражения от поверхности (3). В качестве измерительного прибора использовали тонкопленочный эллипсометр Rudolph 436 (Rudolph Research, Fairfieid, N.J.) с ксеноновой лампой с фильтром 4015 Å, работающий в режиме, как описано Landgren and Jönsson (1993). Для определения эллипсометрических углов Δ и ψ для непокрытой подложки устанавливали прибор в положение наименьшей интенсивности. Для оценки изменений Δ и ψ после адсорбции рассчитывали толщину и показатель рефракции адсорбированной пленки белка согласно McCrackin с соавт. (4), исходя из предположения, что пленка является однородной. Рассчитывали адсорбированную массу, Г (мг/м), согласно Cuypers с соавт. (5). Как показано этими авторами, адсорбированная масса при небольшой степени покрытия поверхности может быть определена более точно, чем толщина и показатель рефракции пленки, поэтому именно этот параметр представлен в данных экспериментах. Использовали соотношение между молярной массой и молярной преломляющей силой и парциальным удельным объемом, равное 4,1 г/мл и 0,75 мл/г соответственно. Эти значения обычно используются для белков и ранее применялись в ряде исследований в отношении адсорбции компонентов слюны (см. ссылки 6, 7). Диски, обработанные, как описано выше в разделе «Подложки», помещали в кювету эллипсометра, содержащую буфер. Кювету термостатировали при 37°С, если не указано иначе, раствор перемешивали магнитной мешалкой. После того, как значения эллипсометрических углов стали стабильными, добавляли слюну в конечной концентрации 10 об. %. Адсорбцию измеряли 1 час, затем промывали кювету непрерывным потоком буфера 12 мл/мин в течение 5 минут. Затем проводили десорбцию в течение 25 минут. Это является стандартной методикой образования пелликулы. Для получения данных об адгезивных свойствах проводили эксперименты с добавлением SDS. В стандартном эксперименте добавляли SDS в концентрации 17 мМ [двойная ККМ (критическая концентрация мицеллообразования) в воде и примерно 9-кратная ККМ в буфере], после этого через 5 минут после добавления SDS окончательно промывали буфером.
Методики микробиологических анализов
Культуральная среда
Основными агаровыми средами для выделения микроорганизмов являлись кровяной агар (8), агар Mitis Salivarius (MSA, Difco Lab.), агар Mitis Salivarius-бацитрацин (MSB) (9), агар Candida Selective согласно Nickerson (Merck), агар Mac Conkey (Difco Lab) и среда Staphylococcus 110 (Difco Lab).
Методики культивирования для образцов слюны.
Образцы слюны транспортировали в обычной среде VMGII (для поддержания жизнеспособности), перемешивали 24 часа, разбавляли и инокулировали в среды кровяного агара, MSA и MSB. Кровяной агар инкубировали в анаэробной камере (10% водорода, 10% диоксида углерода в азоте) 4 дня, а агар MSA в атмосфере 5% диоксида углерода 2 дня. Подсчитывали общее количество колонеобразующих единиц (CFU) в чашках с агаром с помощью стереомикроскопа.
Удаление микроорганизмов с дисков.
Микроорганизмы, прикрепленные к дискам, удаляли с помощью ультразвука в приборе Sonics Vibracell микронаконечником с частотой 10 импульсов в минуту. Эффективность удаления клеток с помощью ультразвука была подтверждена отсутствием микробного роста.
Методики культивирования для десорбированных образцов.
Десорбированные образцы перемешивали, разбавляли и инокулировали в следующие среды: кровяной агар, MSA, агар Candida Selective, агар Mac Conkey и среда Staphylococcus 110. Кровяной агар инкубировали в анаэробной камере (10% водорода, 10% диоксида углерода в азоте) 5 дней, агар MSA в атмосфере 5% диоксида углерода 2 дня, а агар Candida Setective, агар Mac Conkey и среду Staphylococcus 110 инкубировали аэробно 2 дня. Подсчитывали общее количество колонеобразующих единиц (CFU) в чашках с агаром с помощью стереомикроскопа. CFU на MSA анализировали, обращая внимание на морфологию, размер и количество различных типов колоний. Клетки представителей колоний каждого морфологического типа окрашивали по Граму и инкубировали в кровяном агаре для последующей идентификации. Для дополнительной характеристики изоляты, растущие на MSA, оставляли при -79°С в снятом молоке (10% порошка снятого молока в дистиллированной воде (масс./об.); Oxoid Lab. L31, Hampshire. UK).
Идентификация стрептококковых изолятов
Грамположительные, каталаза-отрицательные кокки считались стрептококками, и эти изоляты будут идентифицированы на уровне вида и подвида на основании характеристик, описанных ранее (10).
Результаты и обсуждение
Исследование взаимодействия белков
2
Для исследования взаимодействия между ОПН и гидроксиапатитом, а также между ОПН и слюной, проводили эллипсометрический анализ. На черетеже представлено влияние температуры на адсорбцию. На чертеже видно, что адсорбция ОПН на поверхности гидроксиапатита является практически линейной. Большее количество ОПН адсорбируется при более высокой температуре (37°С), хотя после промывки наблюдалась некоторая десорбция при 37°С при нагрузке поверхности 1 мг/м. Для моделирования химического эффекта чистки зубов добавляли SDS на 5 минут в кювету, затем промывали буфером. После этой стадии очистки не было существенных различий в адсорбированном количестве при двух температурах.
Полученные результаты показывают, что ОПН создает покрытие поверхности дисков из гидроксиапатита, которое является стабильным, хотя после промывки водой и обработки SDS наблюдалось некоторое уменьшение толщины пленки.
Образование бактериальной пленки
Представленные в таблицах 1 и 2 подсчеты бактерий, десорбированных путем слабой обработки ультразвуком, показали для дисков из гидроксиапатита, обработанных растворами ОПН с концентрациями 0,1 мг/мл и 1 мг/мл соответственно, значительное влияние такой обработки на прикрепление бактерий как в чашках с кровяным агаром, так и с агаром MSA, для всех доноров слюны. Диски из гидроксиапатита, обработанные БСА или слюной, показали большее количество бактерий на поверхности. Общее количество колонеобразующих единиц было в 10-1000 раз меньше на дисках, обработанных растворами ОПН, по сравнению с контрольными дисками (обработанными БСА или слюной). Образцы стимулированной слюны показали разнообразные микробные композиции, которые считают типичными для микрофлоры слюны. Наиболее интересным открытием было то, что на дисках, обработанных ОПН, было значительно меньше колоний стрептококков, чем на контрольных дисках.
Таблица 1
Бактериальный анализ целых дисков, отполированных с обеих сторон и инкубированных в стимулированной слюне, после различных обработок. Количество колонеобразующих единиц на чашках с кровяным агаром, инкубированных анаэробно
Предварительная обработка
БСА
Слюна
ОПН 0,1 мг/мл
ОПН1 мг/мл
Донор
ME
33,000
6,800
102
0
К
12,600
5,200
280
48
Вr
45,200
71,400
8,800
4,800
ML
19,900
41,00
7,100
13,800
Be
6,700
1,280
3,400
Таблица 2
Бактериальный анализ целых дисков, отполированных с обеих сторон и инкубированных в стимулированной слюне, после различных обработок. Количество колонеобразующих единиц на чашках с агаром Mitis Salivarious (MSA), инкубированных анаэробно.
Предварительная обработка
БСА
Слюна
ОПН 0,1 мг/мл
ОПН 1 мг/мл
Донор
ME
19
50
15
0
К
9,400
44
11
1
Вr
1,220
2,140
480
960
ML
2,190
360
30
90
Be
120
120
30
70
Заключение
Полученные результаты ясно показывают, что предварительная обработка дисков из гидроксиапатита остеопонтином оказывает влияние на количество бактерий после инкубации в стимулированной слюне. Антиадгезивный эффект практически не зависит от концентрации ОПН в растворе в исследованном диапазоне от 0,1 до 1 мг/мл, в который были погружены аналоги зубов. Для получения мономолекулярного слоя требуется небольшое количество ОПН. Важно отметить, что к дискам, покрытым ОПН, было прикреплено значительно меньше стрептококков, чем к контрольным дискам.