ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛА К CD20 ТИПА II, ОБЛАДАЮЩЕГО ПОВЫШЕННОЙ АНТИТЕЛО-ОБУСЛОВЛЕННОЙ КЛЕТОЧНОЗАВИСИМОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬЮ (ADCC), В СОЧЕТАНИИ С ЦИКЛОФОСФАМИДОМ, ВИНКРИСТИНОМ И ДОКСОРУБИЦИНОМ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕХОДЖКИНСКИХ ЛИМФОМ
USING ANTI-CD20 TYPE II ANTIBODY, HAVING HIGH ANTIBODY-INDUCED CELL-DEPENDENT CYTOTOXICITY (ADCC), COMBINED WITH CYCLOPHOSPHAMIDE, VINCRISTINE AND DOXORUBICIN FOR TREATING NON-HODGKIN LYMPHOMAS

Настоящее изобретение относится к применению антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, прежде всего экспрессирующих CD20 видов рака, в сочетании с химиотерапевтическим средством, выбранным из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин.
Предпосылки создания изобретения
Молекула CD20 (которую обозначают также как характерный для человеческих В-лимфоцитов дифференцировочный антиген или Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с молекулярной массой примерно 35 кДа, локализованный на пре-В- и зрелых В-лимфоцитах (Valentine М.А. и др., J. Biol. Chem. 264(19), 1989, cc.11282-11287; и Einfield D.A. и др., EMBOJ. 7(3), 1988, cc.711-717). CD20 обнаружен на поверхности более 90% В-клеток из периферической крови или лимфоидных органов, и он экспрессируется во время раннего развития пре-В-клеток и сохраняется до дифференцировки в плазматические клетки. CD20 присутствует на поверхности как здоровых, так и злокачественных В-клеток. В частности, при неходжкинских лимфомах (НХЛ) CD20 экспрессируется на поверхности более 90% В-клеток (Anderson K.С. и др., Blood 63(6), 1984, cc.1424-1433), но он не выявлен на гематопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, здоровых плазматических клетках или в других здоровых тканях (Tedder T.F. и др., J. Immunol. 135(2), 1985, cc.973-979).
Состоящая из 85 аминокислот карбоксильная концевая область белка CD20 локализована в цитоплазме. Длина этой области отличается от длины других специфических для поверхности В-клеток структур, таких как тяжелые цепи IgM, IgD и IgG или антигены комплекса гистосовместимости класса II или β-цепи, которые имеют относительно короткие внутрицитоплазматические области, состоящие из 3, 3, 28, 15 и 16 аминокислот соответственно (Komaromy М. и др., NAR 11, 1983, cc.6775-6785). Среди последних 61 аминокислот карбоксильного конца 21 представляют собой кислотные остатки, а только 2 являются основными, что свидетельствует о том, что эта область имеет большой чистый отрицательный заряд (GenBank, регистрационный № NP-690605). Считается, что CD20 может принимать участие в регуляции на ранней(их) стадии(ях) процесса активации и дифференцировки В-клеток (Tedder T.F. и др., Eur. J. Immunol. 16, 1986, cc.881-887) и может функционировать в качестве ион-селективного кальциевого канала (Tedder T.F. и др., J. Cell. Biochem. 14D, 1990, с.195).
Существуют два различных типа антител к CD20, которые существенно отличаются механизмом связывания CD20 и биологической активностью (Cragg M.S. и др., Blood 103, 2004, cc.2738-2743; и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 2003, cc.1045-1052). Антитела типа I, такие, например, как ритуксимаб, обладают сильной опосредуемой комплементом цитотоксичностью, в то время как антитела типа II, такие, например, как тозитумомаб (B1), 11B8, АТ80 или гуманизированные антитела В-Ly1, эффективно инициируют гибель клеток-мишеней посредством независимого от каспазы апоптоза при сопутствующей обработке фосфатидилсерином.
Характерные особенности антител к CD20 типа I и типа II обобщены в таблице 1.
Таблица 1:
Свойства антител к CD20 типа I и типа II
Антитела к CD20 типа I
Антитела к CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I
Эпитоп CD20 типа II
Локализуют CD20 в липидных «плотиках»
Не локализуют CD20 в липидных «плотиках»
Повышенный уровень CDC (в случае IgG1-изотипа)
Пониженный уровень CDC (в случае IgG1-изотипа)
ADCC-активность (в случае IgG1-изотипа)
ADCC-активность (в случае IgG1-изотипа)
Полная связывающая активность
Пониженная связывающая активность
Гомотипическая агрегация
Более сильная гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза при перекрестном сшивании
Сильная индукция клеточной гибели без перекрестного сшивания
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к применению антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, при котором происходит экспрессия CD20, в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, выбранными из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин.
Изобретение относится также к применению антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения пациента, который страдает раком, при котором происходит экспрессия CD20, в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, выбранными из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин.
Изобретение относится также к антителу к CD20 типа II, обладающему повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), которое предназначено для лечения рака, при котором происходит экспрессия CD20, в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, выбранными из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин.
Изобретение относится также к антителу к CD20 типа II, обладающему повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), которое предназначено для лечения пациента, страдающего раком, при котором происходит экспрессия CD20, в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, выбранными из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин.
Предпочтительно лечение с помощью антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), осуществляют в сочетании с циклофосфамидом и винкристином.
В изобретении предложена фармацевтическая композиция, которая содержит как антитело к CD20 типа II, обладающее повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), так и одно или несколько химиотерапевтических средств, выбранных из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин, которую применяют при раке, при котором происходит экспрессия CD20, в частности при В-клеточных неходжкинских лимфомах (НХЛ).
Предпочтительно указанное антитело к CD20 типа II представляет собой подвергнутое гликоинженерии гуманизированное антитело B-Ly1.
Подробное описание изобретения
Понятие «антитело» относится к различным формам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) полные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела и созданные с помощью генной инженерии антитела, такие как моноклональные антитела, химерные антитела или рекомбинантные антитела, а также фрагменты указанных антител, если они сохраняют отличительные признаки антител, предлагаемых в изобретении.
Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в контексте настоящего описания относятся к препарату, содержащему молекулы антитела, которые имеют одинаковый аминокислотный состав. Соответственно понятие «человеческое моноклональное антитело» относится к антителам, обладающим одинаковой специфичностью связывания, которые имеют вариабельную и константную области, полученные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения человеческие моноклональные антитела получают с помощью гибридомы, которая включает В-клетку, полученную из трансгенного животного кроме человека, например, трансгенной мыши, имеющей геном, который содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитые с иммортализованной клеткой.
Предпочтительно указанное антитело к CD20 типа II представляет собой моноклональное антитело.
Понятие «химерное антитело» относится к моноклональному антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, выведенную из одного источника или видов, и по меньшей мере часть константной области, выведенную из другого источника или видов, которое, как правило, получают методами рекомбинантной ДНК. Наиболее предпочтительными являются химерные антитела, содержащие мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Такие мышиные/человеческие химерные антитела являются продуктом экспрессируемых генов иммуноглобулина, содержащих сегменты ДНК, которые кодируют мышиные вариабельные области иммуноглобулина, и сегменты ДНК, которые кодируют человеческие константные области иммуноглобулина. Другими формами «химерных антител», подпадающих под объем настоящего изобретения, являются антитела, в которых класс или подкласс модифицирован или изменен по сравнению с исходным антителом. Такие «химерные» антитела называют также «антителами переключенного класса». Методы получения химерных антител основаны на общепринятых методиках рекомбинантной ДНК и методиках генной трансфекции, и в настоящее время являются хорошо известными в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81, 1984, cc.6851-6855; US 5202238 и US 5204244).
Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых каркасный участок или «гипервариабельные участки» (CDR) модифицированы таким образом, что они содержат CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению с родительским иммуноглобулином. В предпочтительном варианте осуществления изобретения мышиный CDR трансплантируют в каркасный участок человеческого антитела, в результате чего образуется «гуманизированное антитело» (см., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, cc.323-327; и Neuberger M.S. и др., Nature 314, 1985, cc.268-270). Особенно предпочтительными CDR являются CDR, которые содержат последовательности, распознающие антигены, указанные выше для химерных и бифункциональных антител.
Подразумевается, что в контексте настоящего описания понятие «человеческое антитело» включает антитела, имеющие вариабельную и константную области, выведенные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (van Dijk М.А. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, cc.368-374). На основе указанной технологии можно получать человеческие антитела к широкому разнообразию мишеней. Примеры человеческих антител описаны у Kellermann S.A. и др., Curr Opin Biotechnol. 13, 2002, cc.593-597.
Подразумевается, что понятие «рекомбинантное человеческое антитело» в контексте настоящего описания включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют методами рекомбинации, такие как антитела, выделенные из клетки-хозяина, такой как NS0- или СНО-клетка, или из животного (например, из мыши), которое является трансгенным в отношении генов человеческого иммуноглобулина, или антитела, экспрессируемые с помощью рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфектируют клетку-хозяина. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области, выведенные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, в преобразованной форме. Рекомбинантные человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, подвергали in vivo соматической гипермутации. Так, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантного антитела представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей VH- и VL-областей человеческой зародышевой линии и являются родственными им, но могут не встречаться в существующем в естественных условиях in vivo спектре зародышевых линий человеческого антитела.
-9
-10
-10
-12
В контексте настоящего описания понятие «специфически связывается» или «связывается специфически с» относится к антителу, специфически связывающемуся с антигеном CD20. Предпочтительно аффинность к связыванию характеризуется значением KD, составляющим 10 молей/л или менее (например, 10 молей/л), предпочтительно значением KD, составляющим 10 молей/л или менее (например, 10 молей/л). Аффинность связывания определяют с помощью стандартного анализа связывания, например, анализа графиков Скэтчарда, с использованием экспрессирующих CD20 клеток.
Подразумевается, что понятие «молекула нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего описания относится к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно она представляет собой двухцепочечную ДНК.
«Константные области» не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но они участвуют в эффекторных функциях (таких как ADCC, связывание комплемента и CDC).
Понятия «вариабельная область» (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)) в контексте настоящего описания обозначает каждую из пар легких и тяжелых цепей, которые принимают непосредственное участие в связывании антитела с антигеном. Вариабельные области человеческих легкой и тяжелой цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждая область содержит четыре каркасных участка (FR), последовательности которых в значительной степени являются консервативными, соединенные тремя «гипервариабельными участками» (или определяющими комплементарность участками, CDR). Каркасные участки адаптированы к β-складчатой конформации, и CDR могут образовывать петли, соединяющие β-складчатую структуру. CDR в каждой цепи поддерживают свою трехмерную структуру с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из другой цепи антигенсвязывающий центр. CDR3-участки тяжелой и легкой цепи антитела играют наиболее важную роль в специфичности/аффинности к связыванию антител, предлагаемых в изобретении, и поэтому они представляют собой еще один объект изобретения.
Понятия «гипервариабельный участок» или «антигенсвязывающий центр антитела» в контексте настоящего описания относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из «определяющих комплементарность участков» или «CDR». «Каркасные» или «FR»-участки представляют собой участки вариабельной области, отличные от остатков гипервариабельного участка, как он определен в настоящем описании. Таким образом, легкая и тяжелая цепи антитела содержат в направлении от N- к С-концу следующие участки: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR3 тяжелой цепи представляет собой участок, который прежде всего вносит основной вклад в связывание с антигеном. CDR- и FR-участки определяют согласно стандартной номенклатуре Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1991) и/или как участки из «гипервариабельной петли».
Понятия «CD20» и «антиген CD20» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо, и они включают любые варианты, изоформы и видовые гомологи человеческого CD20, которые в естественных условиях экспрессируются клеткой или экспрессируются на клетках, трансфектированных геном CD20. Связывание антитела, предлагаемого в изобретении, с антигеном CD20 опосредует уничтожение клеток, экспрессирующих CD20 (например, опухолевой клетки), путем инактивации CD20. Уничтожение клеток, экспрессирующих CD20, может происходить посредством одного или нескольких из следующих механизмов: индукция клеточной гибели/апоптоза, ADCC и CDC.
Синонимами CD20, принятыми в данной области, являются антиген CD20 В-лимфоцитов, поверхностный антиген В-лимфоцитов B1, Leu-16, Bp35, BM5, и LF5.
Понятие «антитело к CD20», предлагаемое в изобретении, относится к антителу, которое специфически связывается с антигеном CD20. В зависимости от характеристик связывания и биологической активности антитела к CD20 в отношении антигена CD20 можно различать два типа антител к CD20 (антитела к CD20 типа I и типа II) согласно Cragg M.S. и др., Blood 103, 2004, cc.2738-2743; и Cragg M.S. и др., Blood 101, 2003, cc.1045-1052 (см. таблицу 2).
Таблица 2:
Свойства антител к CD20 типа I и типа II
Антитела к CD20 типа I
Антитела к CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I
Эпитоп CD20 типа II
Локализуют CD20 в липидных «плотиках»
Не локализуют CD20 в липидных «плотиках»
Повышенный уровень CDC (в случае IgG1-изотипа)
Пониженный уровень CDC (в случае IgG1-изотипа)
ADCC-активность (в случае IgG1-изотипа)
ADCC-активность (в случае IgG1-изотипа)
Полная связывающая активность
Пониженная связывающая активность
Гомотипическая агрегация
Более сильная гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза при перекрестном сшивании
Сильная индукция клеточной гибели без перекрестного сшивания
Одним из основных свойств антител к CD20 типа I и типа II является их механизм связывания. Так, антитела к CD20 типа I и типа II можно классифицировать по соотношению способностей указанного антитела к CD20 и ритуксимаба связывать CD20 на Raji-клетках (клетки линии африканской лимфомы Беркитта) (АТСС № CCL-86).
Антитела к CD20 типа II характеризуются тем, что соотношение способностей указанного антитела к CD20 и ритуксимаба связывать CD20 на Raji-клетках (АТСС № CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5. Примерами указанных антител к CD20 типа II являются, например, тозитумомаб (B1 IgG2a), гуманизированное антитело В-Ly1 изотипа IgG1 (химерное гуманизированное антитело изотипа IgG1 описано в WO 2005/044859), 11В8 IgG1 (описано в WO 2004/035607) и АТ80 IgG1. Предпочтительным антителом к CD20 типа II является моноклональное антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и гуманизированное антитело В-Ly1 (описанное в WO 2005/044859).
Антитела к CD20 типа I в отличие от антител типа II характеризуются тем, что соотношение способностей указанного антитела к CD20 и ритуксимаба связывать CD20 на Raji-клетках (АТСС № CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2, предпочтительно от 0,9 до 1,1. Примерами указанных антител к CD20 типа I являются, например, ритуксимаб, 1F5 IgG2a (ECACC, гибридома; Press O.W. и др., Blood 69/2, 1987, cc.584-591), HI47 IgG3 (ECACC, гибридома), 2С6 IgG1 (описано в WO 2005/103081), 2F2 IgG1 (описано в WO 2004/035607 и WO 2005/103081) и 2Н7 IgG1 (описано в WO 2004/056312).
«Соотношение способностей антитела к CD20 и ритуксимаба связывать CD20 на Raji-клетках (АТСС № CCL-86)» определяют методом прямой иммунофлуоресценции (измеряют среднюю интенсивность флуоресценции (MFI)) с помощью устройства FACSArray (фирма Becton Dickinson), используя указанное антитело к CD20, конъюгированное с Cy5, и ритуксимаб, конъюгированный с Cy5, на Raji-клетках (АТСС № CCL-86), согласно методу, описанному в примере 2, и рассчитывают следующим образом:
<mrow><mfrac><mrow><mi>M</mi><mi>F</mi><mi>I</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>а</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mtext> </mtext><mi>C</mi><mi>D</mi><mn>20</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mi>M</mi><mi>F</mi><mi>I</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>р</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>у</mi><mi>к</mi><mi>с</mi><mi>и</mi><mi>м</mi><mi>а</mi><mi>б</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>⋅</mo><mfrac><mrow><mi>у</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>в</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>ь</mi><mtext> </mtext><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>м</mi><mi>е</mi><mi>ч</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>р</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>у</mi><mi>к</mi><mi>с</mi><mi>и</mi><mi>м</mi><mi>а</mi><mi>б</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mi>у</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>в</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>ь</mi><mtext> </mtext><mi>C</mi><mi>y</mi><mo>−</mo><mi>м</mi><mi>е</mi><mi>ч</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>а</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mo>−</mo><mi>C</mi><mi>D</mi><mn>20</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac></mrow>
Соотношение способности связывать CD20 на Raji-клетках (АТСС № CCL-86) =
MFI обозначает среднюю интенсивность флуоресценции. «Уровень Cy5-мечения» в контексте настоящего описания означает количество меченных Cy5 молекул на молекулу антитела.
Как правило, для указанных антител к CD20 типа II характерно соотношение способностей указанного антитела к CD20 и ритуксимаба связывать CD20 на Raji-клетках (АТСС № CCL-86), составляющее от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5.
Указанное антитело к CD20 типа II, предлагаемое в изобретении, обладает повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC).
Под «антителом, обладающим повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC) или «антителом с повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC)» понимают антитело, характеристики которого описаны выше, обладающее повышенной ADCC при определении с помощью любого пригодного метода, известного обычным специалистам в данной области. Один из приемлемых анализов in vitro ADCC предусматривает, что:
1) в анализе используют клетки-мишени, для которых известно, что они экспрессируют антиген-мишень, распознаваемый антигенсвязывающей областью антитела;
2) в качестве эффекторных клеток в анализе используют мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС), выделенные из крови произвольно выбранного здорового донора;
3) анализ осуществляют согласно следующему протоколу:
6
I) выделяют РВМС с помощью стандартных процессов центрифугирования в градиенте плотности и суспендируют из расчета 5×10 клеток/мл в RPMI-среде для культивирования клеток;
51
5
II) выращивают клетки-мишени с помощью стандартных методов культивирования тканей, собирают клетки на экспоненциальной фазе роста, жизнеспособность которых превышает 90%, отмывают в RPMI-среде для культивирования клеток, метят Cr (100 мкКи), отмывают дважды в среде для культивирования клеток и ресуспендируют в среде для культивирования клеток с плотностью 10 клеток/мл;
III) осуществляют трансфекцию, используя по 100 мкл указанной выше конечной суспензии клеток-мишеней на каждую лунку 96-луночного титрационного микропланшета;
IV) осуществляют серийное разведение антитела от 4000 до 0,04 нг/мл в среде для культивирования клеток и добавляют по 50 мкл образовавшихся растворов антитела к клеткам-мишеням в 96-луночном титрационном микропланшете, оценивают в трех повторностях антитело в различных концентрациях, покрывающих весь диапазон указанных выше концентраций;
V) для контроля максимального высвобождения (MR) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащие меченые клетки-мишени, вносят по 50 мкл 2%-ного (VN) водного раствора неионогенного поверхностно-активного вещества (Nonidet, фирма Sigma, Сент-Люис) вместо раствора антитела (пункт IV, выше);
VI) для контроля спонтанного высвобождения (SR) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащие меченые клетки-мишени, вносят по 50 мкл RPMI-среды для культивирования клеток вместо раствора антитела (пункт IV, выше);
VII) затем 96-луночный титрационный микропланшет центрифугируют при 50×g в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°С;
2
VIII) добавляют по 50 мкл суспензии РВМС (пункт I, выше) в каждую лунку для обеспечения соотношения эффекторная клетка:клетка-мишень 25:1, и планшеты помещают в инкубатор в атмосферу, содержащую 5% CO, на 4 ч при 37°С;
IX) собирают бесклеточный супернатант из каждой лунки и количественно оценивают высвободившуюся в эксперименте радиоактивность (ER) с помощью гамма-счетчика;
X) рассчитывают процент удельного лизиса для каждой концентрации антитела с помощью формулы (ER-MR)/(MR-SR)×100, где ER представляет собой среднюю радиоактивность (см. пункт IX, выше), определенную для указанной концентрации антитела, MR представляет собой среднюю радиоактивность (см. пункт IX, выше), определенную для MR-контролей (см. пункт V, выше), а SR представляет собой среднюю радиоактивность (см. пункт IX, выше), определенную для SR-контролей (см. пункт VI, выше);
4) определяют «повышенный уровень ADCC» или по повышению максимального процента удельного лизиса, обнаруженного в указанном выше диапазоне концентраций антитела, и/или по снижению концентрации антитела, требуемой для достижения половины от максимального процента специфического лизиса, обнаруженного в указанном выше диапазоне концентраций антитела. Повышение уровня ADCC определяют относительно уровня ADCC, измеренного с помощью описанного выше анализа, опосредуемого таким же антителом, полученным с использованием такого же типа клеток-хозяев, с использованием таких же стандартных методов очистки, приготовления форм и хранения, которые хорошо известны специалистам в данной области, но которое не получено с использованием клеток-хозяев, сконструированных так, что они сверхэкспрессируют GnTIII.
Указанную «повышенную (повышенный уровень) ADCC» можно получать путем гликоинженерии указанных антител, что означает повышение встречающихся в естественных условиях опосредуемых клеткой эффекторных функций моноклональных антител путем инженерии их олигосахаридного компонента согласно методу, описанному у Umana, P. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180 и в US 6602684.
51
51
Понятие «комплементзависимая цитотоксичность (CDC)» относится к лизису человеческих опухолевых клеток-мишеней антителом, предлагаемым в изобретении, в присутствии комплемента. CDC предпочтительно оценивают путем обработки препарата экспрессирующих CD20 клеток антителом к CD20, предлагаемым в изобретении, в присутствии комплемента. Считается, что имеет место CDC, если антитело при его использовании в концентрации 100 нМ индуцирует лизис (гибель клеток) 20% или более опухолевых клеток в течение 4 ч. Анализ предпочтительно осуществляют с помощью меченных Cr или Eu опухолевых клеток и оценивают высвобождение Cr или Eu. В качестве контроля опухолевые клетки-мишени инкубируют с комплементом без антитела.
Как правило, антитела к CD20 типа II изотипа IgG1 характеризуются наличием CDC-активности. Антитела к CD20 типа II обладают пониженной CDC (в случае изотипа IgG1) по сравнению с антителами типа I изотипа IgG1. Предпочтительно антитела к CD20 типа II представляют собой антитела изотипа IgG1.
Антитело «ритуксимаб» (референс-антитело; пример антитела к CD20 типа I) представляет собой созданное с помощью генетической инженерии химерное человеческое/мышиное содержащее человеческую гамма-1 константную область моноклональное антитело к человеческому антигену CD20. Химерное антитело содержит человеческие гамма-1 константные области и идентифицировано под названием «С2В8» в US 5736137 (Anderson K.С. и др.), выданном 17 апреля 1998 г. на имя фирмы IDEC Pharmaceuticals Corporation. Ритуксимаб разрешен для лечения пациентов, страдающих рецидивирующей или рефракторной, низкой степени злокачественности или фолликулярной, CD20-позитивной, В-клеточной неходжкинской лимфомой. Изучение механизма действия в опытах in vitro продемонстрировало, что ритуксимаб обладает зависимой от человеческого комплемента цитотоксичностью (CDC) (Reff M.E. и др., Blood 83(2), 1994, сс.435-445). Кроме того, он обладает выраженной активностью в анализах по оценке антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичности (ADCC).
Понятие «гуманизированное антитело В-Ly1» относится к гуманизированному антителу В-Ly1, описанному в WO 2005/044859 и WO 2007/031875, которое получали из мышиного моноклонального антитела к CD20 В-Ly1 (вариабельная область мышиной тяжелой цепи (VH): SEQ ID NO:1; вариабельная область мышиной легкой цепи (VL): SEQ ID NO:2- см. Poppema S. и Visser L., Biotest Bulletin 3, 1987, cc.131-139;) путем химеризации с человеческой константной областью из IgG1 и последующей гуманизации (см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Эти «гуманизированные антитела В-Ly1» описаны подробно в WO 2005/044859 и WO 2007/031875.
Предпочтительно «гуманизированное антитело В-Ly1» имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из SEQ ID NO:3 - SEQ ID No.20 (B-HH2 - B-HH9 и B-HL8 - B-HL17, которые описаны в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Наиболее предпочтительными являются SEQ. ID NO:3, 4, 7, 9, 11, 13 и 15 (B-HH2, В-НН3, В-НН6, В-НН8, B-HL8, B-HL11 и B-HL13, которые описаны в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Предпочтительно «гуманизированное антитело В-Ly1» имеет вариабельную область легкой (VL), которая представлена в SEQ ID NO:20 (B-KV1 WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Кроме того, гуманизированное антитело В-Ly1 предпочтительно представляет собой антитело изотипа IgG1. Указанные гуманизированные антитела В-Ly1, предлагаемые в изобретении, созданы с помощью гликоинженерии (GE) в Fc-области согласно методам, описанным в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, у Umana P. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180 и WO 99/154342. Указанные «созданные с помощью гликоинженерии гуманизированные антитела В-Ly1» имеют измененную схему гликозилирования в Fc-области, предпочтительно имеют пониженный уровень фукозных остатков. Предпочтительно по меньшей мере 40% или более (в одном из вариантов осуществления изобретения от 40% до 60%, в другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере 50%, а в еще одном варианте осуществления по меньшей мере 70% или более) олигосахаридов Fc-области являются нефукозилированными. Кроме того, олигосахариды Fc-области предпочтительно являются бисекционными.
Олигосахаридный компонент может оказывать существенное влияние на свойства, имеющие отношение к эффективности терапевтического гликопротеина, включая стабильность, устойчивость к воздействию протеаз, взаимодействия с иммунной системой, фармакокинетические параметры и специфическую биологическую активность. Указанные свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия олигосахаридов, но также от их специфических структур. Можно сделать определенные обобщения, касающиеся зависимости структуры олигосахарида и функции гликопротеина. Например, некоторые структуры олигосахарида опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из кровотока в результате взаимодействий со специфическими связывающими углеводы белками, а другие могут связываться антителами и запускать нежелательные иммунные реакции (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol. 14, 1996, cc.975-981).
Клетки млекопитающих являются предпочтительными хозяевами для производства терапевтических гликопротеинов благодаря их способности гликозилировать белки с получением наиболее приемлемой для применения на человеке формы (dimming D.A. и др., Glycobiology 1, 1991, cc.115-130; Jenkins N. и др., Nature Biotechnol. 14, 1996, cc.975-981). Бактерии очень редко гликозилируют белки, и подобно другим типам обычных хозяев, таких как клетки дрожжей, нитчатых грибов, насекомых и растений, обеспечивают схемы гликозилирования, ассоциированные с быстрым клиренсом из кровотока, нежелательными иммунными взаимодействиями и в некоторых случаях пониженной биологической активностью. Среди клеток млекопитающих клетки яичника китайского хомячка (СНО) нашли наиболее широкое применение в течение двух последних десятилетий. Помимо обеспечения приемлемых схем гликозилрования эти клетки позволяют устойчиво получать генетически стабильные, высокопродуктивные клональные клеточные линии. Их можно культивировать, достигая высокой плотности, в простых биореакторах с использованием бессывороточных сред, и на их основе можно разрабатывать безопасные и воспроизводимые биопроцессы. Другими обычно применяемыми клетками животных являются клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки мышиной миеломы NSO и SP2/0. В последние годы изучали также возможность производства в трансгенных животных (Jenkins N. и др.. Nature Biotechnol. 14, 1996, cc.975-981).
Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных положениях в константных областях тяжелой цепи, при этом каждый изотип характеризуется различной организацией N-связанных углеводных структур, которые оказывают различное действие на сборку, секрецию и функциональную активность белка (Wright А. и Monison S. L., Trends Biotech. 15, 1997, cc.26-32).Структура присоединенного N-связанного углевода значительно варьируется в зависимости от степени процессирования и может включать имеющие высокое содержание маннозы, множество разветвлений, а также биантенные сложные олигосахариды (Wright А. и Morrison S. L., Trends Biotech. 15, 1997, cc.26-32). Как правило, имеет место гетерогенный процессинг структур коровых олигосахаридов, присоединенных в конкретном сайте гликозилирования, в результате чего даже моноклональные антитела существует в виде нескольких гликоформ. Было установлено также, что основные различия в гликозилировании антител имеют место между клеточными линиями, и даже небольшие различия требуют выращивания данной клеточной линии в других условиях культивирования (Lifely M. R. и др., Glycobiology 5(8), 1995, cc.813-22).
Одним из путей достижения значительного повышения эффективности при сохранении простого процесса получения и, который, по-видимому, может обеспечить отсутствие значительных нежелательных побочных действий, является усиление встречающихся в естественных условиях обусловленных клеткой эффекторных функций моноклональных антител путем конструирования их олигосахаридного компонента согласно методу, описанному у Umana P. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180; и US 6602684. Антитела IgG1-типа, которые наиболее часто применяют в иммунотерапии рака, представляют собой гликопротеины, имеющие консервативный N-связанный сайт гликозилирования на Asn297 в каждом СН2-домене. Два сложных биантенных олигосахарида, присоединенных к Asn297, располагают между СН2-доменами, формируя обширный контакт с полипептидным каркасом, и их присутствие является важным для того, чтобы антитело могло осуществлять эффекторные функции, такие как антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC) (Lifely M.R. и др., Glycobiology 5, 1995, cc.813-822; Jefferis R. и др., Immunol. Rev. 163, 1998, cc.59-76; Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol. 15, 1997, cc.26-32).
Ранее было установлено, что сверхэкспрессия β(1,4)-N-ацетилглюкозаминтрансферазы III («GnTIII»), т.е. гликозилтрансферазы, катализирующей образование бисекционных олигосахаридов, значительно повышает in vitro ADCC-активность антинеобластомного химерного моноклонального антитела (chCE7), продуцируемого сконструированными СНО-клетками (см. Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180; и WO 99/154342, полное содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки). Антитело chCE7 принадлежит к большому классу неконъюгированных моноклональных антител, которые обладают высоким уровнем аффинности и специфичности в отношении опухолей, но обладают слишком низкой эффективностью для их клинического применения при производстве в стандартных применяемых в промышленности индустриальных клеточных линиях, в которых отсутствует фермент GnTIII (Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180). В этом исследовании впервые было продемонстрировано, что значительное повышение ADCC-активности можно достигать путем создания продуцирующих антитела клеток, которые экспрессируют GnTIII, что приводит также к повышению относительного содержания ассоциированных с константной областью (Fc) бисекционных олигосахаридов, включая бисекционные нефукозилированные олигосахариды, по сравнению с уровнями, характерными для встречающихся в естественных условиях антител.
Подразумевается, что понятие «экспрессия антигена CD20» относится к значительному уровню экспрессии антигена CD20 в клетке, предпочтительно на клеточной поверхности Т- или В-клетки, более предпочтительно В-клетки, из опухоли или рака соответственно, предпочтительно из опухоли, не относящейся к плотным опухолям. Пациентов, которые имеют «рак, при котором происходит экспрессия CD20», можно выявлять с помощью стандартных анализов, известных в данной области. Например, экспрессию антигена CD20 оценивают иммуногистохимическим (ИГХ) методом, FACS или путем выявления с помощью ПЦР соответствующей мРНК.
Понятие «рак, при котором происходит экспрессия CD20» в контексте настоящего описания относится ко всем видам раковых клеток, для которых характерна экспрессия антигена CD20. Указанный рак, при котором происходит экспрессия CD20, может представлять собой, например, лимфомы, лимфолейкозы, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCL), бронхоальвеолярно-клеточный рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичника, ректальный рак, рак анальной области, рак желудка, гастральный рак, рак ободочной кишки, рак молочной железы, карциному фаллопьевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркому мягкой ткани, рак мочеиспускательного канала, рак пениса, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечно-клеточную карциному, карциному почечных лоханок, мезотелиому, печеночно-клеточный рак, билиарный рак, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), опухоль позвоночника, глиому ствола головного мозга, мультиформную глиобластому, астроцитомы, шваномы, эпендимомы, мебуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденому гипофиза, в том числе устойчивые варианты любого из указанных выше видов рака или комбинации одного или нескольких из указанных выше видов рака.
В контексте настоящего описания рак, при котором происходит экспрессия CD20, предпочтительно относится к лимфомам (предпочтительно В-клеточным неходжкинским лимфомам (НХЛ)) и лимфолейкозам. Указанные лимфомы и лимфолейкозы включают, например, а) фолликулярные лимфомы, б) мелкоклеточные с нерасщепленными ядрами лимфомы/лимфому Беркитта (включая эндемическую лимфому Беркитта, спорадическую лимфому Беркитта и не-беркиттовскую лимфому), в) лимфомы маргинальной зоны (включая экстранодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны (лимфомы лимфоидной ткани слизистых оболочек, MALT), нодальную В-клеточную лимфому марганальной зоны и лимфому маргинальной зоны селезенки), г) лимфому из клеток зоны мантии (MCL), д) крупноклеточную лимфому (включая В-клеточную диффузную крупноклеточную лимфому (DLCL), диффузную смешанно-клеточную лимфому, иммунобластную лимфому, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, ангиоцентрическую лимфому-легочную В-клеточную лимфому), е) волосковоклеточный лейкоз, ж) лимфоцитарную лимфому, Вальденстрема макроглобулинемию, з) острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL)/мелкоклеточный лимфолейкоз (SLL), В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, и) неоплазмы из плазматических клеток, миеломы из плазматических клеток, множественную миелому, плазмацитому, к) болезнь Ходжкина.
Более предпочтительно рак, при котором происходит экспрессия CD20, представляет собой В-клеточные неходжкинские лимфомы (НХЛ)). Особенно предпочтительно рак, при котором происходит экспрессия CD20, представляет собой лимфому из клеток зоны мантии (MCL), острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL), В-клеточную диффузную крупноклеточную лимфому (DLCL), лимфому Беркитта, волосковоклеточный лейкоз, фолликулярную лимфому, множественную миелому, лимфому маргинальной зоны, пост-трансплантационное лимфопролиферативное нарушение (PTLD), ассоциированную с ВИЧ лимфому, Вальденстрема макроглобулинемию или первичную лимфому ЦНС.
Понятие «метод лечения» или его эквивалент применительно, например, к раку относится к процедуре или курсу лечения, которую/который разрабатывают с целью снижения или устранения некоторого количества раковых клеток в организме пациента или для облегчения симптомов рака. «Метод лечения» рака или другого пролиферативного нарушения не обязательно подразумевает, что раковые клетки или другие нарушения должны быть фактически элиминированы, что количество клеток или уровень нарушения фактически должны быть снижены, или что другие симптомы рака или другого нарушения фактически должны быть облегчены. Часто метод лечения рака можно осуществлять даже с небольшой вероятностью успеха, но он с учетом истории болезни пациента и оцененной перспективы хирургического вмешательства, тем не менее, как предполагается, может оказывать общее благоприятное воздействие.
Одним из вариантов осуществления изобретения является лечение с помощью антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), в сочетании с циклофосфамидом и винкристином.
Другим вариантом осуществления изобретения является лечение с помощью антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), в сочетании с доксорубицином.
Другим вариантом осуществления изобретения является лечение с помощью антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), в сочетании с циклофосфамидом.
Другим вариантом осуществления изобретения является лечение с помощью антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), в сочетании с циклофосфамидом, винкристином и доксорубицином.
Понятия «совместное применение», «совместное введение» или «введение «в сочетании (комбинации)» в контексте настоящего описания имеют одинаковое значение и относятся к введению указанного антитела к CD20 типа II и указанных химиотерапевтических средств в виде одной индивидуальной препаративной формы или в виде двух различных препаративных форм. Совместное применение может быть одновременным или последовательным в любом порядке, при этом предпочтительно существует период времени, в течение которого два (или все) действующие вещества одновременно проявляют свое биологическое действие. Указанное антитело к CD20 типа II и указанные химиотерапевтические средства совместно вводят либо одновременно, либо последовательно (например, внутривенно (i.v.) с помощью постоянной инфузии (одной для антитела и, как правило, еще одной для химиотерапевтических средств; или химиотерапевтические средства вводят орально). Когда оба терапевтических агента совместно вводят последовательно, то вводимую дозу применяют либо в один и тот же день в виде двух различных введений, либо один из агентов вводят в день 1, а второй совместно применяемый агент вводят в день 2-7, предпочтительно день 2-4. Таким образом, понятие «последовательно» означает в пределах 7 дней после введения дозы первого антитела, предпочтительно в пределах 4 дней после введения дозы первого антитела; а понятие «одновременно» означает в одно и тоже время. Понятие «совместное применение» касательно поддерживающих доз антитела к CD20 типа II и химиотерапевтических средств означает, что поддерживающие дозы можно совместно вводить одновременно, если цикл лечения обоих лекарственных средств пригоден для этого, например, каждую неделю. Или химиотерапевтические средства вводят, например, каждый первый-третий день, а антитело к CD20 типа II вводят каждую неделю. Или поддерживающие дозы применяют совместно последовательно либо в один день, либо в пределах нескольких дней.
Очевидно, что антитела вводят пациенту в «терапевтически эффективном количестве» (или просто в «эффективном количестве»), которое представляет собой количество соответствующего соединения или комбинации, вызывающее биологический или медицинский ответ ткани, системы, животного или человека, ожидаемый исследователем, ветеринаром, лечащим врачом или другим клиницистом.
Количество применяемых для совместного введения антитела к CD20 типа II и химиотерапевтических средств и время совместного применения должны зависеть от типа (вид, пол, возраст, вес и т.д.) и состояния пациента, подлежащего лечению, и серьезности заболевания или состояния, подлежащего лечению. Указанное антитело к CD20 типа II и указанные химиотерапевтические средства можно совместно вводить пациенту один раз или в виде серий обработок. В зависимости от типа и серьезности заболевания начальная возможная доза при совместном введении обоих лекарственных средств пациенту может составлять примерно от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) указанного антитела к CD20 типа II и от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) указанных химиотерапевтических средств. Если введение является внутривенным, то продолжительность начальной инфузии указанного антитела к CD20 типа II или указанных химиотерапевтических средств может быть более пролонгированной по сравнению с продолжительностью последующих инфузии, например, составлять примерно 90 мин в случае начальной инфузии и примерно 30 мин в случае последующих инфузии (если начальная инфузия хорошо переносилась).
Предпочтительная доза указанного антитела к CD20 типа II может составлять от примерно 0,05 до примерно 30 мг/кг. Так, пациенту можно совместно вводить одну или несколько доз, составляющих примерно 0,5, 2,0, 4,0, 10 или 30 мг/кг (или любую их комбинацию). Предпочтительная доза указанных химиотерапевтических средств может составлять от 0,01 до примерно 30 мг/кг, например, от 0,1 до 10,0 мг/кг в случае бортезомиба. В зависимости от типа (вид, пол, возраст, вес и т.д.) и состояния пациента и типа антитела к CD20 и химиотерапевтических средств доза и схема введения указанного антитела к CD20 может отличаться от дозы химиотерапевтических средств. Например, указанное антитело к CD20 можно вводить, например каждые 1-3 недели, а указанные химиотерапевтические средства можно вводить ежедневно или каждые 2-10 дней. Можно вводить также начальную более высокую ударную дозу с последующим введением одной или нескольких более низких доз.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения лекарственное средство можно применять для предупреждения или снижения метастазов или дальнейшего их распространения у пациента, страдающего раком, при котором происходит экспрессия CD20. Лекарственное средство можно применять для удлинения продолжительности жизни указанного пациента, удлинения продолжительности жизни до прогрессирования болезни у указанного пациента, удлинения продолжительности ответа, что приводит к статистически значимому и клинически заметному улучшению состояния обработанного пациента при оценке по продолжительности жизни, продолжительности жизни до прогрессирования болезни, уровня ответа или продолжительности ответа. В предпочтительном варианте осуществления изобретения лекарственное средство можно применять для повышения уровня ответа у группы пациентов.
Можно применять комбинацию антитела к CD20 типа II и химиотерапевтических средств для лечения рака, при котором происходит экспрессия CD20. Указанные молекулы могут присутствовать в комбинации в количествах, эффективных в отношении поставленной цели. Таким образом, согласно одному из вариантов осуществления изобретения вводят антитело к CD20 типа II, обладающее повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, выбранными из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин, один дополнительный кортикостероид, предпочтительно преднизон.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения лечение комбинацией антитела к CD20 типа II и химиотерапевтических средств осуществляют без дополнительного использования кортикостероидов.
Описанное выше применение кортикостероидов в качестве химиотерапевтических режимов, как правило, хорошо охарактеризовано в области терапии рака, и согласно настоящему описанию рассматривается их применение для мониторинга толерантности и эффективности и для контроля с некоторой регулировкой путей введения и доз. Например, фактические дозы химиотерапевтических средств и кортикостероидов можно варьировать в зависимости от ответа культивируемых клеток пациента, который определяют с помощью методов гистокультур. Как правило, доза должна быть снижена по сравнению с количеством, применяемым в отсутствии других дополнительных агентов.
Типичные дозы эффективных химиотерапевтических средств и/или кортикостероидов могут находиться в диапазонах, рекомендованных производителем, и если это установлено по ответам in vitro или ответам на созданных на животных моделях, их концентрацию или количество можно снижать примерно вплоть до 10 раз. Так, фактическая должна зависеть от решения лечащего врача, состояния пациента и эффективности терапевтического метода, основанного на оценки чувствительности in vitro первичных культур злокачественных клеток или образца ткани в гистокультуре, или ответов, обнаруженных на соответствующих созданных на животных моделях.
В контексте настоящего изобретения ионизирующее эффективное количество ионизирующего излучения и/или радиофармацевтических средств можно применять в дополнение к комбинированному лечению рака, при котором происходит экспрессия CD20, с использованием антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), химиотерапевтических средств. Источник излучения может быть внутренним или внешним относительно пациента, подлежащего лечению. Когда источник является внешним относительно пациента, то терапию называют наружной лучевой терапией (EBRT). Когда источник излучения является внутренним относительно пациента, то лечение обозначают как брахитерапия (ВТ). Радиоактивные атомы, которые можно применять согласно настоящему изобретению, можно выбирать из группы, включающей (но, не ограничиваясь только ими) радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, йод-123, йод-131 и индий-111. Можно также метить антитело соответствующими радиоактивными изотопами. Предпочтительно комбинированную терапию с использованием антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), и химиотерапевтического средства, применяют без ионизирующего излучения.
Лучевая терапия является стандартным средством лечения для контроля нерезектабельных или неоперабельных опухолей и/или метастазов опухолей. Улучшенные результаты были получены, когда лучевую терапию объединяли с химиотерапией. Лучевая терапия основана на принципе, что высокая доза излучения, поставляемая к области-мишени, может приводить к гибели репродуктивных клеток, как в опухоли, так и в здоровых тканях. Схема введения излучения, как правило, определяют в понятиях абсорбированной дозы излучения (Гр), времени и фракционирования, и ее должен тщательно подбирать онколог. Количество излучения, полученное пациентом, должно зависеть от различных обстоятельств, но двумя наиболее важными являются локализация опухоли относительно других имеющих решающее значение структур или органов в организме, и степень распространения опухоли. Типичный курс лечения пациента, подвергающегося лучевой терапии, представляет собой схему лечения в течение периода времени, составляющего от 1 до 6 недели, при этом дозу от 10 до 80 Гр вводят пациенту в виде однократной суточной фракционированной дозы, составляющей от 1,8 до 2,0 Гр, 5 дней в неделю. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения имеет место синергизм, когда опухоли у больных людей подвергают комбинированной терапии, предлагаемой в изобретении, и излучению. Другими словами, ингибирование роста опухолей с помощью агентов, входящих в комбинацию, предлагаемую в изобретении, повышается при объединении с излучением, необязательно в сочетании с дополнительными химиотерапевтическими или противораковыми средствами. Параметры вспомогательной лучевой терапии описаны, например, в WO 99/60023.
Антитела к CD20 типа II вводят пациенту с помощью известных методов с использованием внутривенного введения в виде болюса или постоянной инфузии в течение определенного периода времени, с помощью внутримышечного, внутрибрюшинного, спинномозгового, подкожного, внутрисуставного, интрасиновиального или подоболочечного путей введения. Предпочтительным является внутривенное или подкожное введение антител.
Химиотерапевтические средства вводят пациенту с помощью известных методов, например, с использованием внутривенного введения в виде болюса или постоянной инфузии в течение определенного периода времени, с помощью внутримышечного, внутрибрюшинного, спинномозгового, подкожного, внутрисуставного, интрасиновиального, подоболочечного или перорального путей введения. Предпочтительным является внутривенное, подкожное или пероральное введение химиотерапевтических средств.
Изобретение относится также к набору, содержащему антитело к CD20 типа II, обладающее повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), и одно или несколько химиотерапевтических средств, выбранных из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин, для комбинированной терапии пациента, страдающего раком, при котором происходит экспрессия CD20. В предпочтительном варианте осуществления изобретения контейнеры набора могут содержать также фармацевтически приемлемый носитель. Набор может включать также стерильный разбавитель, который предпочтительно хранят в отдельном дополнительном контейнере. Набор может включать также листовку-вкладыш в упаковке, которая содержит напечатанные инструкции по применению комбинированной терапии для лечения рака, при котором происходит экспрессия CD20, предпочтительно В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ).
Понятие «листовка-вкладыш в упаковке» относится к инструкциям, которые обычно включают в поступающие в продажу упаковки терапевтических продуктов, которые могут содержать информацию о показаниях, применении, дозе, введении, противопоказаниях и/или мерах предосторожности при применении указанных терапевтических продуктов.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения контейнеры изделия могут содержать также фармацевтически приемлемый носитель. Изделие может включать также стерильный разбавитель, который предпочтительно хранят в отдельном дополнительном контейнере.
В контексте настоящего описания понятие «фармацевтически приемлемый носитель» включает любой и все материалы, пригодные для фармацевтического введения, включая растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, придающие изотоничность и замедляющие абсорбцию агенты и другие материалы и соединения, которые являются пригодными для физиологического введения. За исключением случая, когда они не совместимы с действующим веществом, любые общепринятые среды или агенты применяют в композициях, предлагаемых в изобретении. В композиции можно включать также дополнительные действующие вещества.
Фармацевтические композиции:
Фармацевтические композиции можно получать обработкой антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), и/или химиотерапевтических средств, выбранных из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин, предлагаемых в изобретении, в сочетании с фармацевтически приемлемыми неорганическими или органическими носителями. В качестве носителей, например, для таблеток, таблеток с покрытием, драже и твердых желатиновых капсул, можно применять лактозу, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновые кислоты или их соли и т.п. Пригодными носителями для мягких желатиновых капсул являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и жидкие полиолы и т.п. Однако в зависимости от природы действующего вещества, как правило, для мягких желатиновых капсул носители не требуются. Приемлемыми носителями для приготовления растворов и сиропов являются, например, вода, полиолы, глицерин, растительное масло и т.п. Приемлемыми носителями для суппозиториев являются, например, встречающиеся в естественных условиях или гидрогенизированные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и т.п.
Кроме того, в состав фармацевтических композиций входят консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, подслащивающие вещества, красители, корригенты, соли для изменения осмотического давления, буферы, маскирующие вещества или антиоксиданты. Они могут содержать также другие терапевтически эффективные субстанции.
Одним из вариантов осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая как антитело к CD20 типа II, обладающее повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), так и одно или несколько химиотерапевтических средств, выбранных из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин, в частности, для применения при раке, при котором происходит экспрессия CD20.
Указанная фармацевтическая композиция может содержать также один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.
Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, которую применяют, в частности, при раке, содержащей (I) в качестве первого агента антитело к CD20 типа II, обладающее повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), в эффективном количестве, и (II) в качестве второго агента одно или несколько химиотерапевтических средств, выбранных из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин, в эффективном количестве. Указанная композиция необязательно содержит фармацевтически приемлемые носители и/или эксципиенты.
Фармацевтические композиции, содержащие только антитело к CD20 типа II, обладающее повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), которые применяют согласно настоящему изобретению, приготавливают для хранения путем смешения антитела, имеющего требуемую степень чистоты, необязательно в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. Osol А.Е., 16-е изд., 1980), в форме лиофилизированных препаративных форм или водных растворов. Пригодные носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов и применяемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмонийхлорид; гексаметонийхлорид; бензалконийхлорид, бензетонийхлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и мета-крезол); низкомолекулярые (состоящие менее чем примерно из 10 остатков) полипептиды; белки, такие сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; образующие соли противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или подиэтиленгликоль (ПЭГ).
Фармацевтические композиции химиотерапевтических средств, выбранных из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин, зависят от их фармацевтических свойств; например, в случае небольших химических соединений, такие, например, как бортезомиб, можно применять следующую препаративную форму:
а) Препаративная форма в виде таблетки (мокрая грануляция):
№№
Ингредиенты
Мг/таблетку
1.
Соединение формулы (I)
5
25
100
500
2.
Лактоза безводная DTG
125
105
30
150
3.
Sta-Rx 1500
6
6
6
30
4.
Микрокристаллическая целлюлоза
30
30
30
150
5.
Стеарат магния
1
1
1
1
Всего
167
167
167
831
Процесс получения:
1. Смешивают ингредиенты 1, 2, 3 и 4 и гранулируют с использованием очищенной воды.
2. Сушат гранулы при 50°С.
3. Пропускают гранулы через пригодное размалывающее устройство.
4. Добавляют ингредиент 5 и перемешивают в течение 3 мин; сжимают с помощью пригодного пресса.
б) Препаративная форма в виде капсулы:
№№
Ингредиенты
Мг/капсулу
1.
Соединение формулы (I)
5
25
100
500
2.
Водная лактоза
159
123
148
---
3.
Кукурузный крахмал
25
35
40
70
4.
Тальк
10
15
10
25
5.
Стеарат магния
1
2
2
5
Всего
200
200
300
600
Процесс получения:
1. Смешивают ингредиенты 1, 2 и 3 в пригодном миксере в течение 30 мин.
2. Добавляют ингредиенты 4 и 5 и перемешивают в течение 3 мин.
3. Заполняют соответствующую капсулу.
Согласно другому варианту осуществления изобретения фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, предпочтительно представляют собой две различные препаративные формы, одна из которых включает указанное антитело к CD20 типа II, обладающее повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), а вторая химиотерапевтические средства, выбранные из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин. Действующие вещества можно включать в микрокапсулы, полученные, например, методом коацервации или межрасовой полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозы, или в желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы для введения лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Указанные методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. Osol А.Е., 16-е изд., 1980.
Можно приготавливать препараты с замедленным высвобождением. Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобные полимеров, содержащих антитело, указанные матрицы имеют форму изделий определенной конфигурации, например, пленок или микрокапсул. Примерами матриц с замедленным высвобождением являются сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (US 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата, неразложимый этиленвинилацетат, разложимые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и леупролидацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота.
Препаративные формы, предназначенные для введения in vivo, должны быть стерильными. Для этой цели можно применять фильтрацию через стерльные фильтрующие мембраны.
Настоящее изобретение относится также в способу лечения рака, заключающемуся в том, что вводят пациенту, который нуждается в таком лечении, (I) в качестве первого агента антитело к CD20 типа II, обладающее повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), в эффективном количестве, и (II) в качестве второго агента одно или несколько химиотерапевтических средств, выбранных из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин, в эффективном количестве.
Настоящее изобретение относится также в способу лечения рака, заключающемуся в том, что вводят пациенту, который нуждается в таком лечении, (I) в качестве первого агента антитело к CD20 типа II, обладающее повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), в эффективном количестве, и (II) в качестве второго агента одно или несколько химиотерапевтических средств, выбранных из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин, в эффективном количестве.
В контексте настоящего описания понятие «пациент» предпочтительно относится к человеку, который нуждается в лечении с использованием антитела к CD20 типа II (например, пациент, страдающих раком, при котором происходит экспрессия CD20), для любой цели, и наиболее предпочтительно к человеку, который нуждается в указанном лечении рака или предракового состояния или повреждения. Однако понятие «пациент» можно относить также к животным кроме человека, предпочтительно млекопитающим, таким как среди прочего собаки, кошки, лошади, коровы, свиньи, овцы и приматы кроме человека.
Изобретение относится также к антителу к CD20 типа II, обладающему повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), предназначенному для лечения рака, при котором происходит экспрессия CD20, в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, выбранными из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин.
Изобретение относится также к антителу к CD20 типа II, обладающему повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), предназначенному для лечения пациента, страдающего раком, при котором происходит экспрессия CD20, в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, выбранными из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин.
Изобретение относится также к антителу к CD20 типа II, обладающему повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), и одному или нескольким химиотерапевтическими средствам, выбранным из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин, для применения с целью лечения рака, при котором происходит экспрессия CD20.
Изобретение относится также к антителу к CD20 типа II, обладающему повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), и одному или нескольким химиотерапевтическими средствам, выбранным из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин, для применения с целью лечения пациента, страдающего раком, при котором происходит экспрессия CD20.
Предпочтительно указанное антитело к CD20 типа II, обладающее повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), представляет собой полученное с помощью гликоинженерии гуманизированное антитело B-Ly1.
Предпочтительно рак, при котором происходит экспрессия CD20, представляет собой В-клеточную неходжкинскую лимфому (НХЛ).
Приведенные ниже примеры, перечень последовательностей и чертежи представлены с целью пояснения настоящего изобретения, истинный объем которого представлен в прилагаемой формуле изобретения. Очевидно, что в представленные процедуры можно вносить модификации без отклонения от сущности изобретения.
Описание перечня последовательностей:
SEQ ID NO:1 аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) мышиного моноклонального антитела к CD20 B-Ly1.
SEQ ID NO:2 аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) мышиного моноклонального антитела к CD20 B-Ly1.
SEQ ID NO:3-19 аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) гуманизированных антител B-Ly1 (B-HH2- В-НН9, B-HL8 и B-HL10-B-HL17).
SEQ ID NO:20 аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи (VL) гуманизированного антитела B-Ly1 B-KV1.
Описание чертежей:
На чертежах показано:
на фиг.1 - а) данные о синергетическом противоопухолевом действии совместной обработки антителом к CD20 типа II, обладающим повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC) (В-HH6-B-KV1 GE), в сочетании с циклофосфамидом и винкристином и
б) сравнение с данными, полученными при совместной обработке антителом к CD20 типа I (ритуксимаб) в сочетании с циклофосфамидом и винкристином, на клеточной линии человеческой В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ) WSU-DLCL2.
3
На оси ординат отложены средние значения объема опухолей [мм]+/-IQR; на оси абсцисс отложены дни после инъекции опухолевых клеток. Обозначения: А) наполнитель (окружности), Б) циклофосфамид (25 мг/кг) и винкристин (0,25 мг/кг) один раз в неделю (кресты). В) ритуксимаб (30 мг/кг) один раз в неделю (треугольники), Г) созданное с помощью гликоинженерии гуманизированное В-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) (30 мг/кг) один раз в неделю (квадраты), Д) ритуксимаб (30 мг/кг) с циклофосфамидом (25 мг/кг) и винкристином (0,25 мг/кг) один раз в неделю (ромбы) и Е) созданное с помощью гликоинженерии гуманизированное B-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) (30 мг/кг) с циклофосфамидом (25 мг/кг) и винкристином (0,25 мг/кг) один раз в неделю (знак плюс);
на фиг.2 - данные о средней интенсивности флуоресценции (MFI, слева на оси ординат) антитела к CD20 типа I (Cy5-ритуксимаб = белый прямоугольник) и антитела к CD20 типа II (Cy5 - созданное с помощью гликоинженерии гуманизированное В-Ly1 B-HH6-B-KV1 GE = черный прямоугольник) с использованием Raji-клеток (АТСС № CCL-86); соотношение способности к связыванию антитела к CD20 типа I (ритуксимаб) и антитела к CD20 типа II (В-HH6-B-KV1 GE) в сравнении с ритуксимабом (отложено справа на оси ординат);
на фиг.3 - а) данные о синергетическом противоопухолевом действии совместной обработки антителом к CD20 типа II, обладающим повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC) (В-HH6-B-KV1 GE), в сочетании с доксорубицином и
б) сравнение с данными, полученными при совместной обработке антителом к CD20 типа I (ритуксимаб) в сочетании с доксорубицином, на клеточной линии человеческой фолликулярной неходжкинской лимфомы (НХЛ) RL.
3
На оси ординат отложены средние значения объема опухолей [мм]+/-IQR; на оси абсцисс отложены дни после инъекции опухолевых клеток. Обозначения: А) наполнитель (знак плюс). Б) доксорубицин (3 мг/кг) один раз в неделю (кресты). В) ритуксимаб (30 мг/кг) один раз в неделю (треугольники), Г) созданное с помощью гликоинженерии гуманизированное B-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) (30 мг/кг) один раз в неделю (квадраты), Д) ритуксимаб (30 мг/кг) с доксорубицином (3 мг/кг) один раз в неделю (ромбы) и Е) созданное с помощью гликоинженерии гуманизированное B-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) (30 мг/кг) с доксорубицином (3 мг/кг) один раз в неделю (окружности); на фиг.4 - а) данные о синергетическом противоопухолевом действии совместной обработки антителом к CD20 типа II, обладающим повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC) (В-HH6-B-KV1 GE), в сочетании с циклофосфамидом и
б) сравнение с данными, полученными при совместной обработке антителом к CD20 типа I (ритуксимаб) в сочетании с циклофосфамидом на клеточной линии человеческой фолликулярной неходжкинской лимфомы (НХЛ) RL.
3
На оси ординат отложены средние значения объема опухолей [мм]+/-IQR; на оси абсцисс отложены дни после инъекции опухолевых клеток. Обозначения:
А) наполнитель (окружности), Б) циклофосфамид (50 мг/кг) один раз в неделю (кресты). В) ритуксимаб (30 мг/кг) один раз в неделю (треугольники), Г) созданное с помощью гликоинженерии гуманизированное B-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) (30 мг/кг) один раз в неделю (квадраты), Д) ритуксимаб (30 мг/кг) с циклофосфамидом (50 мг/кг) один раз в неделю (ромбы) и Е) созданное с помощью гликоинженерии гуманизированное B-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) (30 мг/кг) с циклофосфамидом (50 мг/кг) один раз в неделю (знак плюс).
Экспериментальные процедуры
Пример 1
Противоопухолевая активность совместной обработки антителом к CD20 типа II, обладающим повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC) (B-HH6-B-KV1 GE), в сочетании с циклофосфамидом и винкристином
Тестируемые агенты:
Антитело к CD20 типа II B-HH6-B-KV1 GE (гуманизированное В-Ly1, созданное с помощью гликоинженерии B-HH6-B-KV1, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875) получали в виде маточного раствора (концентрация 9,4 мг/мл) от фирмы GlycArt, Шлирен, Швейцария. Буфер для антитела включал гистидин, трегалозу и полисорбат 20. Раствор антитела разводили соответствующим образом в ЗФР из маточного раствора перед инъекциями.
Ритуксимаб получали от фирмы Hoffmann La Roche, Базель.
Циклофосфамид и винкристин покупали в виде предназначенной для клинического применения препаративной формы у фирмы Baxter Oncology GmbH, Галле, Германия или Медак, фирма Gesellschaft fur klinische Spezialpraparate mbH, Гамбург, Германия соответственно. Разведения приготавливали из восстановленного маточного раствора.
Клеточные линии и условия культивирования:
2
Клетки человеческой В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ) линии WSU-DLCL2 любезно предоставлены фирмой Hoffmann-La Roche, Inc., Нутлей, шт. Нью-Джерси, США. Опухолевую линию клеток, как правило, культивировали в среде RPMI (фирма РАА, Laboratories, Австрия), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (фирма РАА Laboratories, Австрия) и 2 мМ L-глутамином, при 37°С в насыщенной влагой атмосфере с 5% СО. Для трансплантации использовали клетки, полученные с помощью 4 пассажей. Клетки инъецировали совместно с Матригелем.
Животные:
Самок мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) с врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров, возраст которых при их поступлении составлял 7-8 недель (покупали у фирмы Charles River, Сульцфельд, Германия), содержали в среде, в которой отсутствовали конкретные патогены, с суточным циклом 12 ч света/12 ч темноты согласно прилагаемому руководству (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был проверен и утвержден местным органом государственного управления. После выдерживания полученных животных в карантине части животных давали пройти акклиматизацию в течение 1 недели в новых условиях окружающей среды и подвергали обследованию. Постоянный мониторинг состояния здоровья проводили на регулярной основе. Животные имели свободный доступ к корму (Provimi Kliba 3337) и воде (подкисленная до рН 2,5-3).
Мониторинг:
У животных ежедневно контролировали клинические симптомы и выявляли нежелательные явления. Данные мониторинга веса тела в течение всего эксперимента фиксировали дважды в неделю после определения стадии, и объем опухоли определяли с помощью кронциркуля.
Обработка животных:
Обработку животных начинали в день произвольного разделения на группы через 9 дней после трансплантации. Созданное с помощью гликоинженерии гуманизированное антитело к CD20 типа II B-HH6-B-KV1 GE или ритуксимаб водили в виде индивидуальных агентов i.v. q7d в дни опыта 9, 15, 23, 30, 37, 44, 51 и 58 в указанной дозе 30 мг/кг. Соответствующий наполнитель вводили в эти же дни. Циклофосфамид и винкристин вводили i.v. один раз в неделю в дни 9, 15, 23, 30, 37, 44, 51 и 58 в дозе 25 мг/кг или 0,25 мг/кг соответственно. В группах, которые подвергали комбинированной терапии, оба антитела вводили через 24 ч после химиотерапевтических средств в дни 10, 16, 24, 31, 38, 45, 52 и 59.
Оценка ингибирования роста опухолей in vivo:
В день 35 после трансплантации клеток обнаружено значительное ингибирование роста опухолей по сравнению с контрольной группой, составляющее 73%, 85%, 66%, 94% или 90% у животных, которым вводили ритуксимаб, антитело к CD20 B-HH6-B-KV1 GE, химиотерапевтическое средство, комбинацию химиотерапевтических средств и антитела к CD20 или комбинацию химиотерапевтических средств и ритуксимаба соответственно. В конце эксперимента существенное более высокое ингибирование роста опухолей обнаружено в группе, обработанной комбинацией химиотерапевтических средств/антитела к CD20 B-HH6-B-KV1 GE по сравнению с группой, которую обрабатывали комбинацией химиотерапевтических средств/ритуксимабом.
В конце эксперимента в день 64 после трансплантации клеток действие различных вариантов обработок оценивали на основе значения замедления роста опухолей (Т-С, где Т обозначает медианное время (в днях), необходимое для достижения размера опухолей в обработанных группах 1500 мм, а С обозначает медианное время (в днях) достижения такого размера опухолей в контрольной группе). Результаты обобщены в следующей таблице:
Таблица 3:
Замедление роста опухолей в обработанных группах по сравнению с контрольной группой (в днях)
Группа
Соединение (доза)
Значение Т-С (дни)
2
ритуксимаб (30 мг/кг)
13
3
антитело к CD20 B-HH6-B-KV1 GE (30 мг/кг)
19
4
циклофосфамид (25 мг/кг) винкристин (0,25 мг/кг)
14
5
циклофосфамид (25 мг/кг) винкристин (0,25 мг/кг) антитело к CD20 B-HH6-B-KV1 GE (30 мг/кг)
38
6
циклофосфамид (25 мг/кг) винкристин (0,25 мг/кг) ритуксимаб (30 мг/кг)
28
Пример 2
Определение соотношения способности к связыванию с CD20 на Raji-клетках (АТСС № CCL-86) антитела к CD20 типа II и ритуксимаба
5
Raji-клетки (АТСС № CCL-86) поддерживали в культуре в среде RPMI-1640 (фирма PanBiotech GmbH, каталожный № PO4-18500), содержащей 10% FCS (фирма Gibco, каталожный №10500-064). Антитело к CD20 типа II В-НН6-В-KV1 GE (созданное с помощью гликоинженерии гуманизированное антитело В-Ly1) и ритуксимаб метели с помощью сложного моно-NHS-эфира Cy5 (фирма Amersham GE Healthcare, каталожный № PA 15101) согласно инструкциям производителя. Для конъюгированного с Су5 ритуксимаба обнаружен уровень мечения, составляющий 2,0 молекулы Су5 на антитело. Для конъюгированного с Cy5 B-HH6-B-KV1 обнаружен уровень мечения, составляющий 2,2 молекулы Cy5 на антитело. Для определения способности к связыванию и сравнения способностей к связыванию и механизма связывания обоих антител создавали кривые связывания (путем титрации конъюгированного с Cy5 ритуксимаб и конъюгированного с Cy5 B-HH6-B-KV1 GE) методом прямой иммунофлуоресценции с использованием клеточной линии лимфомы Беркитта Raji (АТСС № CCL-86). Анализировали среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) в виде значений ЕС50 (50% от максимальной интенсивности) для конъюгированного с Су5 ритуксимаба и конъюгированного с Cy5 B-HH6-B-KV1 GE соответственно. 5×10 клеток на образец окрашивали в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки отмывали в культуральной среде. Для исключения погибших клеток использовали окрашивание йодидом пропидия (PI). Измерения осуществляли с помощью устройства FACSArray (фирма Becton Dickinson), для оценки окрашивания йодидом пропидия (PI) использовали устройство Far Red A, а для оценки Cy5 устройство Red-A. На фиг.2 представлены данные о средней интенсивности флуоресценции (MFI), характеризующие связывание, которые выражены в виде значений ЕС50 (50% от максимальной интенсивности) для меченного с помощью Cy5 B-HH6-B-KV1 GE (черные прямоугольники) и меченного с помощью Cy5 ритуксимаба (белые прямоугольники).
Затем соотношение способностей к связыванию с CD20 на Raji-клетках (АТСС № CCL-86) рассчитывали с помощью следующей формулы:
<mtable columnalign="left"><mtr><mtd><mfrac><mrow><mi>M</mi><mi>F</mi><mi>I</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>а</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mtext> </mtext><mi>C</mi><mi>D</mi><mn>20</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mi>M</mi><mi>F</mi><mi>I</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>р</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>у</mi><mi>к</mi><mi>с</mi><mi>и</mi><mi>м</mi><mi>а</mi><mi>б</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>⋅</mo><mfrac><mrow><mi>у</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>в</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>ь</mi><mtext> </mtext><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>м</mi><mi>е</mi><mi>ч</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>р</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>у</mi><mi>к</mi><mi>с</mi><mi>и</mi><mi>м</mi><mi>а</mi><mi>б</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mi>у</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>в</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>ь</mi><mtext> </mtext><mi>C</mi><mi>y</mi><mo>−</mo><mi>м</mi><mi>е</mi><mi>ч</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>а</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mtext> </mtext><mi>C</mi><mi>D</mi><mn>20</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac></mtd></mtr><mtr><mtd><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi>M</mi><mi>F</mi><mi>I</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>B</mi><mo>−</mo><mi>H</mi><mi>H</mi><mn>6</mn><mo>−</mo><mi>B</mi><mo>−</mo><mi>K</mi><mi>V</mi><mn>1</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mi>M</mi><mi>F</mi><mi>I</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>р</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>у</mi><mi>к</mi><mi>с</mi><mi>и</mi><mi>м</mi><mi>а</mi><mi>б</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>⋅</mo><mfrac><mrow><mi>у</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>в</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>ь</mi><mtext> </mtext><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>м</mi><mi>е</mi><mi>ч</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>р</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>у</mi><mi>к</mi><mi>с</mi><mi>и</mi><mi>м</mi><mi>а</mi><mi>б</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mi>у</mi><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>в</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>ь</mi><mtext> </mtext><mi>C</mi><mi>y</mi><mn>5</mn><mo>−</mo><mi>м</mi><mi>е</mi><mi>ч</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>B</mi><mo>−</mo><mi>H</mi><mi>H</mi><mn>6</mn><mo>−</mo><mi>B</mi><mo>−</mo><mi>K</mi><mi>V</mi><mn>1</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac></mtd></mtr><mtr><mtd><mo>=</mo><mfrac><mrow><mn>207</mn></mrow><mrow><mn>433</mn></mrow></mfrac><mo>⋅</mo><mfrac><mrow><mn>2.2</mn></mrow><mrow><mn>2.0</mn></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>0,44</mn></mtd></mtr></mtable>
Соотношение способностей к связыванию с CD20 на Raji-клетках (АТСС № CCL-86) =
Таким образом, для антитела B-HH6-B-KV1 GE, которое является типичным представителем антител к CD20 типа II, обнаружена более низкая способность к связыванию по сравнению с ритуксимабом.
Пример 3
Противоопухолевая активность совместной обработки антителом к CD20 типа II, обладающим повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC) (B-HH6-B-KV1 GE), в сочетании с доксорубицином
Тестируемые агенты:
Антитело к CD20 типа II B-HH6-B-KV1 GE (гуманизированное В-Ly1, созданное с помощью гликоинженерии B-HH6-B-KV1, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875) получали в виде маточного раствора (концентрация 9,4 мг/мл) от фирмы GlycArt, Шлирен, Швейцария. Буфер для антитела включал гистидин, трегалозу и полисорбат 20. Раствор антитела разводили соответствующим образом в ЗФР из маточного раствора перед инъекциями.
Ритуксимаб получали от фирмы Hoffmann La Roche, Базель.
Доксорубицин покупали в виде предназначенной для клинического применения препаративной формы у фирмы Hexal, Хольцкирхен, Германия Разведения приготавливали из восстановленного маточного раствора.
Клеточные линии и условия культивирования:
2
Клетки человеческой фолликулярной неходжкинской лимфомы линии RL были любезно предоставлены Д-ром Charles Dumontet, INSERM 590, Лион, Франция. Опухолевую линию клеток, как правило, культивировали в среде RPMI (фирма РАА, Laboratories, Австрия), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (фирма РАА Laboratories, Австрия) и 2 мМ L-глутамином, при 37°С в насыщенной влагой атмосфере с 5% СО. Для трансплантации использовали клетки, полученные с помощью 2 пассажей.
Животные:
Самок SCID-мышей с врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров, возраст которых при их поступлении составлял 7-8 недель (покупали у фирмы Charles River, Сульцфельд, Германия), содержали в среде, в которой отсутствовали конкретные патогены, с суточным циклом 12 ч света/12 ч темноты согласно прилагаемому руководству (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был проверен и одобрен местным органом государственного управления. После выдерживания полученных животных в карантине части животных давали пройти акклиматизацию в течение 1 недели в новых условиях окружающей среды и подвергали обследованию. Постоянный мониторинг состояния здоровья проводили на регулярной основе. Животные имели свободный доступ к корму (Provimi Kliba 3337) и воде (подкисленная до рН 2,5-3).
Мониторинг:
У животных ежедневно контролировали клинические симптомы и выявляли нежелательные явления. Данные мониторинга веса тела в течение всего эксперимента фиксировали дважды в неделю после определения стадии, и объем опухоли определяли с помощью кронциркуля.
Обработка животных:
Обработку животных начинали в день произвольного разделения на группы через 14 дней после трансплантации. Созданное с помощью гликоинженерии гуманизированное антитело к CD20 типа II B-HH6-B-KV1 GE или ритуксимаб водили в виде индивидуальных агентов i.v. q7d в дни опыта 14, 21, 28, 36 и 42 в указанной дозе 30 мг/кг или 60 мг/кг. В эти же дни вводили соответствующий наполнитель или доксорубицин, который вводили i.v. один раз в неделю в дозе 3 мг/кг. В группах, которые подвергали комбинированной терапии, доксорубицин водили i.v. один раз в неделю в дни 15, 22, 29, 37 и 43 в дозе 3 мг/кг, а ритуксимаб вводили i.v. один раз в неделю в эти же дни в дозе 30 мг/кг группе, которую подвергали комбинированной терапии.
Пример 4
Противоопухолевая активность совместной обработки антителом к CD20 типа II, обладающим повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC) (B-HH6-B-KV1 GE), в сочетании с циклофосфамидом в отношении клеток линии RL
Тестируемые агенты:
Антитело к CD20 типа II B-HH6-B-K.V1 GE (гуманизированное В-Ly1, созданное с помощью гликоинженерии B-HH6-B-KV1, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875) получали в виде маточного раствора (концентрация 9,4 мг/мл) от фирмы GlycArt, Шлирен, Швейцария. Буфер для антитела включал гистидин, трегалозу и полисорбат 20. Раствор антитела приготавливали соответствующим образом путем разведения в ЗФР маточного раствора перед инъекциями.
Антитело к CD20 типа I ритуксимаб получали в виде маточного раствора (концентрация 10 мг/мл) от фирмы Hoffmann La Roche, Базель, Швейцария. Буфер содержал полисорбат 80, хлорид натрия и цитрат натрия.
Циклофосфамид покупали в виде предназначенной для клинического применения препаративной формы у фирмы Baxter Oncology GmbH, Галле, Германия или Медак, фирма Gesellschaft fur klinische Spezialpraparate mbH, Гамбург, Германия соответственно. Разведения приготавливали из восстановленного маточного раствора.
Клеточные линии и условия культивирования:
Клетки человеческой фолликулярной неходжкинской лимфомы линии RL культивировали стандартным образом в среде RPMI, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и антибиотиками. Клетки линии RL выращивали в суспензии до образования кластеров. Клетки на стадии экспоненциального роста инъецировали подкожно SCID-мышам.
Животные:
Опыты проводили на животных, которые представляли собой 6-недельных самок SCID-мышей, полученных от фирмы Charles River (Арбресль, Франция), которые имели IPSOS-статус. Животных содержали по меньшей мере в течение 1 недели перед инъекцией RL-клеток. В садках размещали по 5 животных.
Мониторинг:
У животных ежедневно контролировали клинические симптомы и выявляли нежелательные явления. Данные мониторинга веса тела в течение всего эксперимента фиксировали дважды в неделю после определения стадии, и объем опухоли определяли с помощью кронциркуля. Критерии исключения животных из опыта соответствовали предписанным и утвержденным местным комитетом по проведению экспериментов на животных (Experimental Animal Committee).
Обработка животных:
Обработку животных начинали в день произвольного разделения на группы через 31 день после трансплантации. Созданное с помощью гликоинженерии гуманизированное антитело к CD20 типа II B-HH6-B-KV1 GE, наполнитель или ритуксимаб вводили животным i.v. один раз в неделю в дозе 30 мг/кг (день 31, 38, 45 и 52). Циклофосфамид инъецировали в эти же дни в дозе 50 мг/кг. Разведения антител приготавливали из маточного раствора непосредственно перед применением.
Оценка ингибирования роста опухолей in vivo:
В день 66 после трансплантации клеток обнаружено значительное ингибирование роста опухолей, составляющее 54%, 85% или 91% у животных, которым вводили комбинации ритуксимаба и циклофосфамида, антитела к CD20 B-HH6-B-KV1 GE и ритуксимаба или антитела к CD20 B-HH6-B-KV1 GE и циклофосфамида. Таким образом, совместная обработка антителом к CD20 В-HH6-B-KV1 GE и циклофосфамидом обеспечивала более высокий уровень противоопухолевого действия по сравнению с обработкой только циклофосфамидом.