Экспрессия альфа-субъединицы рецептора к интерлейкину 4 при бронхиальной астме

В. Н. Минеев, Л. Н. Сорокина, М. А. Нёма, А. А. Тотолян, К. А. Сысоев

ЭКСПРЕССИЯ АЛЬФА-СУБЪЕДИНИЦЫ РЕЦЕПТОРА К ИНТЕРЛЕЙКИНУ 4 ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И. П. Павлова

В последнее время появляется все больше новых данных об особенностях функционирования сигнальных систем на уровне рецепторного звена. При бронхиальной астме (БА) одной из важных сигнал-проводящих систем, реализующих аллергический ответ, является система трансдукции цитокинового сигнала, прежде всего интерлейкина-4 (IL-4) как одного из ключевых цитокинов. Следует отметить, что при этом заболевании имеет место сдвиг дифференцировки нативных Т-хелперов в сторону Т-хелперов 2 типа, основным продуцентом которых считается IL-4 [1].

При БА активация IL-4 сигнального пути при формировании ТЬ2-иммунного ответа запускает JAK-STAT сигнальный путь [2, 3]. В результате связывания IL-4 и/или IL-13 с трансмембранным рецептором, состоящим из лиганд-специфичных IL^Ra-цепи и ^-13И,а1-цепи (IL-13Ra1), происходит его олигомеризация и последующая активация с внутренней стороны мембраны Янус-киназ JAK1 и JAK3, которые фосфорилируют STAT6, участвующий в транскрипции. При этом полагают, что активация STAT6 является ключевым звеном в данном сигнальном каскаде [4].

Ранее нами были изучены при БА как экспрессия STAT6 в лимфоцитах периферической крови [4], так и влияние IL-4 на активность этого транскрипционного фактора [5], а также полиморфизм гена белка STAT6 [6].

Целью работы явилась оценка особенностей экспрессии IL-4Ra в лимфоцитах периферической крови при БА.

Материалы и методы. Обследован 121 больной БА (113 больных с аллергическим вариантом, 8 больных с неаллергическим вариантом) с разной тяжестью течения и 16 практически здоровых лиц. Диагноз БА устанавливали в соответствии с классификацией и критериями международного консенсуса по вопросам диагностики и лечения БА (Global Initiative of Asthma — GINA, 2006). Больные получали лечение согласно стандартам (GINA, 2006).

Экспрессию mRNA IL-4Ra оценивали путем проведения RT-PCR (reverse transcrip-tion-PCR) с нуклеиновыми кислотами, выделенными из лимфоцитов периферической крови. ПЦР проводилась в амплификаторе «iCycler» (BIORAD) в следующем режиме: инициация при 95°С в течение 4-х мин., 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, отжига при 60°С в течение 30 с и полимеризации при 70°С в течение 30 с. Завершающую полимеризацию проводили при 72°С в течение 7 мин. Продукт амплификации размером 339 пар оснований подвергали электрофорезу в 1,5% агарозном геле и окраске этидия бромидом. Результат электрофореза после фотографирования в ультрафиолетовом свете анализировали в программе Gel-Pro 3.1. Уровень экспрессии mRNA IL-4Ra оценивали относительно уровня р-актина.

Праймеры для IL-4Ra и р-актина были разработаны на основе известных последовательностей (GenBank). (IL-4Ra 5': 5/-ACACCAATGTCTCCGACACTC-3/ и IL-4Ra 3': 5'© В. Н. Минеев, Л. Н. Сорокина, М. А. Нёма, А. А. Тотолян, К. А. Сысоев, 2010

GGATGACAATGCAGGAAACGC-3'; р-актин-5': 5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3' и р-актин -3': 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3').

Активацию лимфоцитов IL-4 проводили добавлением к суспензии лимфоцитов (выделенных на градиенте плотности по стандартной методике) 10 ng/ml IL-4 (Sigma Aldrich, США) в СО2-инкубаторе в течение 60 мин в среде RPMI-1640. После окончания инкубации лимфоциты помещали на лед, и все дальнейшие процедуры проводили при +4°С. Определение уровня цитокинов проводилось по стандартному протоколу Bio-Plex на проточном флюориметре Bio-Rad-Plex с использованием 3-х наборов: Bio-Plex Human Serum Diluent Kit, 96 well, Bio-Plex Cytokine Reagent Kit, 96 well, Bio-Plex Human Cytokine Th1/Th2 Panel Kit, 96 well.

Статистическую обработку материала выполняли с применением пакета программ SPSS for Windows (Statistical Package for Social Sciences, версия 13.0).

Результаты и обсуждение. При сравнении уровней экспрессии mRNA IL-4Ra у больных аллергической (0,19±0,02, n = 113) и неаллергической (0,16±0,08, n = 8) БА существенных различий не обнаружено (р = 0,754). Аналогичные данные получены ранее в других исследованиях, в том числе и при исследованиях бронхиальных биоптатов

[7, 8].

Результаты исследования уровней экспрессии mRNA IL-4Ra практически здоровых лиц и больных БА представлены в табл. 1.

Таблица 1. Уровень экспрессии mRNA IL-4Ra (M±m) в группах практически здоровых

лиц и больных БА

Уровень mRNA IL-4Ra,

Диагноз отношение к уровню mRNA [3-актина Р

Практически здоровые лица (I) 0,07±0,014 Pi_ii = 0,047

п = 16

Вся группа больных БА (II) 0,188 ±0,02 п = 121 Pi-111 = 0,016

Больные Легкое течение (III) 0,250±0,01 п = 22 Pi_iv = 0,09

БА Течение средней тяжести (IV) 0,167± 0,02 п = 86 Pi_v = 0,01

Тяжелое течение (V) 0,224±0,06 п = 13

Примечание: в скобках указан номер группы обследованных больных.

Как видно из таблицы 1, уровень экспрессии шИ^А 1Ь-4Иа у больных БА в 2,7 раза выше, чем у практически здоровых лиц, причем наибольшее и существенное повышение отмечается у больных с легким и тяжелым течением заболевания (р1-ш = 0,016; Р1_у = 0,01 соответственно).

Учитывая, что синтез рецепторного белка зависит от уровня соответствующего агониста (так называемый негативный контроль), нами у части практически здоровых лиц и больных БА были сопоставлены уровни экспрессии шИ^А 1Ь-4Иа с уровнями 1Ь-4 в сыворотке крови (табл. 2).

Из табл. 2 следует, главным образом, то, что у практически здоровых лиц и у больных БА имеется разнонаправленная связь между уровнями экспрессии шИ^А 1Ь-4Иа и уровнями 1Ь-4 в сыворотке крови. Иными словами, при БА выявлена инверсия связи между уровнем агониста и экспрессией соответствующего рецептора (дефектность негативного контроля). Подчеркнем, что ранее нами для БА, прежде всего для ее ал-

Таблица 2. Коэффициенты корреляции Spearman (r) между уровнями экспрессии mRNA IL-4Ra и уровнями IL-4 в сыворотке крови в обследованных группах

Группы обследованных лиц Коэффициент корреляции Spearman (г) Р

Практически здоровые лица, п = 12 -0,513 0,088

Больные БА, п = 36 0,272 0,109

лергического варианта, постулирована проблема дефектности негативного контроля, имеющая, по-видимому, универсальный характер, касающаяся различных рецепторных систем и проявляющаяся на самых различных уровнях регуляции (рецепторном, пострецепторном, клеточном и других) [9]. Вероятно, нарушение эффективности негативного контроля со стороны IL-сигнализации (в данном случае IL-4-сигнализации) является одним из возможных патогенетических механизмов для реализации аллергического воспаления при БА.

Важно, что при анализе корреляционной связи базального уровня экспрессии mRNA IL-4Ra в лимфоцитах периферической крови с изменениями аналогичного показателя в условиях активации их IL-4 у практически здоровых лиц и больных БА при госпитализации в фазе обострения выявлены отрицательные и существенные связи: у практически здоровых лиц коэффициент корреляции Spearman r = -0,964, р = 0,036, n = 4; у больных БА r = -0,692, р < 0,001, n = 26. Существенным отличием указанной корреляции у больных БА в фазе затихающего обострения является обнаружение смены знака коэффициента r (r = 0,511, р = 0,04, n = 10). Факт разнонаправленных корреляционных связей в зависимости от фазы заболевания может свидетельствовать о влиянии той противовоспалительной терапии, которая применяется при БА, главным образом, глюкокортикоидов.

При исследовании у части больных экспрессии mRNA IL-4Ra в динамике на фоне также выявлены интересные факты (табл. 3).

Таблица 3. Уровень экспрессии mRNA IL-4Ra (M±m) в группах тяжелой и нетяжелой БА в фазе затихающего обострения

Диагноз Уровень экспрессии mRNA IL-4Ra, отношение к уровню mRNA [3-актина Р

Тяжелая БА 0,023±0,015

п = 4 0,024

Средней тяжести + 0,239±0,087

легкая БА п = 18

Из табл. 3 видно, что уровень экспрессии шИ^Л 1Ь-4Иа у больных БА с тяжелым течением в фазе затихающего обострения значительно (в 10 раз) ниже и практически сопоставим с таковым уровнем у практически здоровых лиц. Несомненно, что подобная динамика может быть связана с применением у больных БА с тяжелым течением системных парентеральных глюкокортикоидов в достаточно больших дозах.

Подтверждением этого предположения является анализ уровней экспрессии шИ^Л 1Ь-4Ия у больных БА в зависимости от дозы глюкокортикоидов (табл. 4).

Отметим, что известна способность преднизолона подавлять экспрессию генов 1Ь-4, 1Ь-5, в клетках бронхоальвеолярного лаважа [10], в том числе и у больных со

стероид-резистентной БА [11]. Подобный эффект оказывают и топические глюкокорти-коиды (флютиказон пропионат) на клетки слизистой носа при аллергических ринитах [12].

Таблица 4. Уровни экспрессии тЯ^А 1Ь-4Иа

Доза парентеральных глюкокортикоидов (мг) Уровень экспрессии mRNA IL-4Ra, отношение к уровню mRNA [3-актина Р

> = 12,0 0,08 ±0,03

п = 8 0,018

< 12,0 0,20 ±0,03

п = 65

Выявленное нами снижение уровней экспрессии mRNA IL-4Ra в лимфоцитах периферической крови у больных БА, получающих высокие дозы системных парентеральных глюкокортикоидов, возможно, отражает известный факт блокирования ими транскрипции многих цитокинов, особенно в концентрациях, превосходящих физиологический уровень гормона. Любопытно в связи с этим, что при проведении корреляционного анализа у больных БА между уровнями кортизола в плазме крови и уровнями экспрессии mRNA IL-4Ra не было выявлено существенной корреляционной связи (коэффициент Spearman r = 0,057, р = 0,756, n = 32).

В ранее проведенной работе [8] при исследованиях бронхиальных биоптатов не было обнаружено корреляций между уровнями экспрессии mRNA IL-4Ra и функциональными показателями дыхания, что было связано с множественностью эффектов IL-4 и широким представительством рецепторов на различных типах клеток бронхиальных биоптатов.

При проведении корреляционного анализа, учитывающего связи экспрессии mRNA IL-4Ra и показателей функции внешнего дыхания, нами были получены важные корреляции. Так, при обследовании практически здоровых лиц выявлена корреляция уровня экспрессии mRNA IL-4Ra и максимальной объемной скоростью выдоха при 50% ФЖЕЛ (МОС50), r = -0,740, р = 0,036, n = 8.

При обследовании больных БА выявлены множественные корреляции с различными скоростными показателями функции внешнего дыхания: ОФВ1 в % от должного (r = -0,142, р = 0,042, n = 105); отношением ОФВ1 в % к ФЖЕЛ (r = -0,187, р = 0,005, n = 103); МОС50 (r = -0,142, р = 0,042, n = 105); пиковой объемной скоростью выдоха — ПОСвыд. в % от должного после бронхолитика (r = -0,197, р = 0,021, n = 107); МОС75 в % от должного (r = -0,131, р = 0,047, n = 106). Обратим внимание, что все корреляции со скоростными показателями имеют отрицательный знак, что можно трактовать как косвенное указание на возможность опосредованного участия рецепторной активности к IL-4 в патогенезе обструктивных нарушений при БА, хотя это требует дальнейших доказательств.

Как известно, рецептор к IL-4 выявлен на покоящихся T-клетках , B-клетках, макрофагах, тучных клетках, на стромальных клетках костного мозга, клетках печени, мышцах, фибробластах. Учитывая такое широкое представительство рецептора, был проведен корреляционный анализ между уровнем экспрессии mRNA IL-4Ra и содержанием различных клеток в крови и мокроте. Так, было выявлено, что существует существенная корреляционная связь (Speаrmаn) с: абсолютным (r = -0,159, р = 0,019, n = 101) и процентным (r = -0,210, р = 0,035, n = 101) количеством базофилов; процентным содержанием нейтрофилов (r = 0,194, р = 0,005, n = 98) и лимфоцитов (r = -0,227, р = 0,023, n = 100). В связи с этим представляется интересным обнаружение существен-

ной положительной корреляции с уровнем колониестимулирующего фактора грануло-цитов и мононуклеаров (GMCSF) в сыворотке крови (r = 0,854, р = 0,007, n = 8). При этом следует отметить, что IL-4 вместе с этим фактором обеспечивает более активное размножение клеток гранулоцитарного и моноцитарного ростков дифференцировки.

Эти корреляционные связи отражают, вероятно, тот известный факт, что по своей природе IL-4 является плейотропным регулятором, взаимодействующим с самыми разнообразными типами клеток. Корреляционная связь с базофилами представляет отдельный интерес, учитывая, что эта клетка является аналогом тканевой тучной клетки, занимающей одно из центральных мест в аллергической реакции.

Таким образом, нами выявлены при БА особенности экспрессии а-субъединицы рецептора к IL-4 , которые коррелируют с основными клиническими особенностями заболевания (тяжесть течения, показатели функции внешнего дыхания, характеризующие обструктивный синдром, применение глюкокортикоидов), что, по-видимому, достаточно прямо указывает на возможную патогенетическую роль экспрессии этого рецептора на претрансляционном уровне.

Работа в 2008 г. частично поддержана грантом по итогам конкурса научных работ молодых ученых СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова на «Стипендию года» за 2007 г., а также грантом Правительства Санкт-Петербурга для студентов и аспирантов 2009 г.

Литература

1. Фрейдлин И. С., Тотолян А. А. Иммунные механизмы аллергических реакций / Общ. аллер-я. Т. 1. Под ред. Г. Б. Федосеева. СПб.: Нордмед-Издат, 2001. С. 169-381.

2. Минеев В. Н., Сорокина Л. Н. Современные представления о JAK-STAT системе как новой сигнальной системе и ее нарушениях при иммунной патологии (Часть I) // Аллергология. 2005. №4. С. 38-44.

3. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н. Современные представления о JAK-STAT системе как новой сигнальной системе и ее нарушениях при иммун. патологии: механизмы негативной регуляции (Часть II) // Аллергология. 2006. №1. С. 49-55.

4. Минеев В. Н., Сорокина Л. Н. Экспрессия STAT6 в лимфоцитах периферической крови больных аллергической бронхиальной астмой // Медицинская иммунология. 2007. Т. 9, №4-5.

С. 405-410.

5. Минеев В.Н., Сорокина, Л.Н., Нёма М. А. Влияние IL-4 на активность транскрипционного фактора STAT6 в лимфоцитах периферической крови больных бронхиальной астмой // Мед. иммунология. 2009. Т. 11, №2-3. С. 177-184.

6. Минеев В. Н., Сорокина, Л. Н., Нёма М. А. Полиморфизм гена белка STAT6 и бронхиальная астма // Казанский мед. ж. 2009. Т. 90, №1, С. 102-109.

7. Humbert M., Durham S. R., Ying S. et al. IL-4 and IL-5 mRNA and protein expression in bronchial biopsies from patients with atopic and nonatopic asthma: evidence against «intrinsic» asthma being a distinct immunopathologic entity // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1996. Vol. 154. P. 1497-1504.

8. Kotsimbos T. C., Ghaffar O., Minshall E. M. et al. Expression of the IL-4 receptor a-subunit is increased in bronchial biopsy specimens from atopic and nonatopic asthmatic subjects // J. Allergy Clin. Immunol. 1998. Vol. 102. P. 859-866.

9. Минеев В. Н. Концепция бронхиальной астмы как мембрано-рецепторной патологии // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2005. № 3. С. 68-85.

10. Robinson D., Hamid Q.,Y ing S. et al. Prednisolone treatment in asthma is associated with modulation of bronchoalveolar lavage cell interl.-4, interl.-5, and interferon-г cytokine gene expression // Am. J. Respir. Dis. 1993. Vol. 148. P. 401-406.

11. Leung D. Y. M., Martin R. J., Szefler S. J. et al. Dysregulation of IL-4, IL-5, and IFN-g gene expression in ster.-resistant asthma // J. Exp. Med. 1995. Vol. 181. P. 33-40.

12. Masuyama K., Jacobson M. R., Rak S. et al. Topical glucocorticoid (fluticasone propionate) inhibits cells expressing cytokine mRNA for interleukin-4 in the nasal mucosa in allergen-induced rhinitis // Immunology. 1994. Vol. 82. P. 192-199.

Статья поступила в редакцию 22 января 2010 г.