СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ СРЕДСТВ

Полезная модель относится к области медицины, а именно к дезинфектологи, микробиологии, гигиене и может быть использована для оценки эффективности дезинфицирующих средств, предназначенных для обеззараживания поверхностей систем кондиционирования, водоснабжения и водоотведения, покрытых биопленкой, удаление которой перед дезинфекцией затруднено или невозможно.
Как прототип выбран способ определения антимикробной активности дезинфицирующих средств (Абросимова Е. В. Дезинфекция и пред стерилизационная очистка стоматологических инструментов и материалов композиционными средствами на основе четвертично-аммониевых соединений: автореф. дис. на соискание уч. степени канд. мед. наук / Абросимова Е. В. - Волгоград, 2011. - 20 с), в котором для исследований используют тест-поверхность размером 10x10 см из различных материалов, на которую наносят суспензию микроорганизмов, и в процессе подготовки к обработке дезинфицирующим раствором тест-поверхность высушивают, после обработки дезинфицирующим раствором выдерживают время экспозиции, для визуализации результата исследования марлевой салфеткой, смоченной в растворе нейтрализатора, протирают тест-поверхность, салфетку погружают в пробирку с раствором нейтрализатора, промывной жидкостью засевают плотную питательную среду в чашке Петри, а учет результатов проводят после термостатирования в течение 1-2 суток путем подсчета количества колоний, которые выросли.
Признаками, совпадающими с существенными признаками заявляемого способа, являются: использование тест-поверхности для нанесения суспензии микроорганизмов, подготовка тест-поверхности к обработке дезинфицирующим раствором и обработка ее дезинфицирующим средством, выдерживание времени экспозиции, учет результатов путем подсчёта колоний на плотной питательной среде после термостатирования.
Причинами, препятствующими достижению ожидаемого технического результата (повышение точности определения действующей концентрации дезинфицирующего средства и отсутствие ложно-отрицательных результатов), являются: высушивание суспензии микроорганизмов в процессе подготовки тест-поверхности к обработке дезинфицирующим раствором переводит микроорганизмы в состояние сниженной физиологической активности и частичного обезвоживания, увеличивая их чувствительность к дезинфицирующим средствам и, тем самым, искажая результат исследования, визуализация результатов исследования происходит после отмывания тест-поверхности с дальнейшим посевом промывной жидкости, что при незначительном количестве микроорганизмов, остающихся жизнеспособными, может давать ложно-отрицательный результат.
В основу полезной модели поставлена задача усовершенствования способа-прототипа путем замены материала и площади тест-поверхности, метода нанесения микроорганизмов на тест-поверхность, методов подготовки тест-поверхности к обработке дезинфицирующим раствором и визуализации результатов исследования, что позволяет достигнуть ожидаемый технический результат.
Поставленная задача решается тем, что в способе определения антимикробной активности дезинфицирующих средств, включающем использование тест-поверхности для нанесения суспензии микроорганизмов, подготовку тест-поверхности к обработке дезинфицирующим раствором и обработку ее дезинфицирующим раствором, выдерживание времени экспозиции, учет результатов путем подсчета колоний на плотной питательной среде после термостатирования, согласно полезной модели, используют стеклянную тест-поверхность размером 3x7,5 см, на которую наносят плотную питательную среду, а поверх неё - суспензию микроорганизмов, далее выдерживают тест-поверхность при комнатной температуре в течение 10-15 минут и обрабатывают дезинфицирующим средством, после экспозиции выполняют термостатирование тест-поверхности и подсчет колоний на плотной питательной среде, нанесенной поверх тест-поверхности.
Между совокупностью существенных признаков заявляемого способа и техническим результатом, который может быть достигнут, проявляется следующая причинно-следственная связь: уменьшение размера тест-поверхности с 10x10 см до 3x7,5 см позволяет термостатировать одновременно 2 тест-поверхности внутри стандартной чашки Петри диаметром 9 см, что предотвращает высыхание плотной питательной среды, нанесённой поверх тест-поверхности, а нанесение на тест-поверхность сначала плотной питательной среды, а затем нанесение суспензии микроорганизмов не только имитирует биоплёнку, имеющую в своём составе питательные субстраты, но также позволяет изучать эффективность дезинфицирующих растворов на жизнеспособных, а не ослабленных, микроорганизмах, при подготовке тест-поверхности к обработке дезинфицирующим раствором её выдерживают при комнатной температуре в течение 10-15 минут только до удаления избытка влаги с поверхности плотной питательной среды, а не до полного высушивания, что также позволяет не допустить ослабления жизнеспособности микроорганизмов и повышения их чувствительности к дезинфицирующим растворам, и для визуализации результатов исследования выполнение термостатирования самой тест-поверхности с последующим подсчётом колоний на плотной питательной среде, нанесенной поверх тест-поверхности, позволяет исключить этап отмывания тест-поверхности с дальнейшим посевом промывной жидкости, что существенно уменьшает вероятность ложно-отрицательного результата.
Заявляемый способ в сравнении с прототипом, даёт возможность изучать эффективность дезинфицирующих растворов на микроорганизмах, не ослабленных высушиванием, позволяет повысить точность определения и избежать получения ложно-отрицательных результатов.
Способ выполняют следующим образом.
3
9
Стерильной мерной пробиркой отмеряют 3 см сваренной или растопленной плотной питательной среды, приготовленной согласно рецептуре, рекомендованной для используемого штамма микроорганизмов и наносят на тест-поверхность - стерильное предметное стекло 30x75 мм и выдерживают до застывания. На поверхность среды наносят 0,1 мл суточной бульонной культуры микроорганизмов, разведенной по стандарту мутности 10 международных единиц, что соответствует 0,93x10 клеток в мл, после чего тест-поверхность оставляют на 15 минут при комнатной температуре для удаления избытка влаги с поверхности среды. Установленную на подставку тест-поверхность обрабатывают дезинфицирующим раствором. После экспозиции остаток дезинфицирующего раствора удаляют путем орошения стерильным физиологическим раствором хлорида натрия. В целях повышения достоверности результата, оценку эффективности дезинфицирующих средств проводят одновременно на двух тест-поверхностях. Для предотвращения высыхания тест-поверхности укладывают по две штуки в чашку Петри, которую термостатируют при температуре 37°С в течение 1-2 суток в зависимости от вида микрофлоры. Учет результатов проводят путем подсчета колоний на питательной среде.
Для объективной оценки эффективности заявляемого способа была проведена оценка эффективности дезинфицирующего средства "Сурфаниос", произведенного ООО "Дезант", Украина; свидетельство о государственной регистрации дезинфицирующего средства №05.03.02-08/66 от 01.12.2011. В прототипе как нейтрализатор применяется раствор 0,5% лаурилсульфата натрия (сульфонол, ТУ 07510508. 135-98, производство ООО "Югсинтез", Днепропетровск). Также проводился контроль стерильности среды и ростовых качеств тест-культуры. Во всех случаях время воздействия дезинфицирующего средства на микрофлору, то есть экспозиция, составляла 15 минут.
Результаты оценки эффективности дезинфицирующего средства "Сурфаниос" по воздействию на музейные культуры Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus приведены в таблице 1.
Как видно из представленных данных, моделирование условий биоплёнки предъявляет к дезинфицирующему средству более жесткие требования. При проведении исследований способом-прототипом, "Сурфаниос" проявлял бактерицидный эффект в отношении Escherichia coli и Staphylococcus aureus до 0,25% разведения включительно.
Единичные колонии отмечались в 0,2% разведении. В отношении Pseudomonas aeruginosa дезинфектант показал более высокую эффективность - рост микрофлоры угнетался до концентрации 0,2% включительно, а единичные колонии регистрировались начиная с 0,15% разведения. При применении более низких концентраций, до 0,125% отмечался сплошной рост.
При использовании заявляемого способа определения антимикробной активности дезинфицирующих средств, дезинфицирующее средство закономерно демонстрировало меньшую эффективность. Рост Staphylococcus aureus угнетался до концентрации 0,325% включительно. При применении 0,3% раствора наблюдались колонии, которые поддавались подсчету и переходили в сплошной рост при концентрации 0,25%. В отношении Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa бактерицидный эффект сохранялся до концентрации 0,25% включительно. При использовании 0,2% раствора дезинфицирующего средства отмечалось число колонии, которые поддавались подсчету и переходили в сплошной рост при использовании 0,15% концентрации средства "Сурфаниос".
Таким образом, данный способ наглядно продемонстрировал, что для уничтожения биопленок Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus на объектах, которые, в силу ряда причин, предварительно невозможно от них очистить, например, в некоторых узлах систем водоснабжения, водоотведения и кондиционирования, необходимо использовать "Сурфаниос" в концентрации 0,325% и более. Используя для данной цели способ ближайшего аналога, мы могли бы сделать ошибочный вывод о достаточности 0,25% концентрации данного дезинфицирующего средства, что привело бы к недостаточной эффективности дезинфекционных мероприятий.
Способ определения антимикробной активности дезинфицирующих средств, который заявляется, весьма эффективен, так как позволяет более точно оценить эффективность их применения и экономически выгоден, поскольку нейтрализатор дезинфицирующего средства не требуется, а расход питательных сред снижается в 38 раз. Для описанных выше сравнительных исследований семи концентраций дезинфицирующего средства на три тестовые культуры было затрачено 4,94 литра питательной среды. Из них на исследования способом ближайшего аналога - 4,81 литров, заявляемым способом - 0,13 литра, что наглядно демонстрирует экономическую эффективность заявляемого способа. Данный способ может найти широкое применение в бактериологических лабораториях.