СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИМИКРОБНОЙ, ПРОТИВОВИРУСНОЙ И ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, В ЧАСТНОСТИ, В ОТНОШЕНИИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК, ВЕЩЕСТВО, ПОЛУЧЕННОЕ ЭТИМ СПОСОБОМ, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ
METHOD OF OBTAINING SUBSTANCE, POSSESSING ANTIMICROBIAL, ANTIVIRAL AND IMMUNOSTIMULATING ACTIVITY, IN PARTICULAR, WITH RESPECT TO DENDRITE CELLS, SUBSTANCE, THEREOF OBTAINED, AND BASED ON IT PHARMACEUTICAL COMPOSITION

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения из растительного сырья вещества, обладающего антимикробной, противовирусной и иммуностимулирующей активностью в отношении дендритных клеток; вещества, полученного этим способом, и фармацевтической композиции на его основе.
Предшествующий уровень техники
Многие полисахариды растительного происхождения обладают несомненной биологической активностью и широко используются в лечебных целях. [Bhushan Patwardhan and Manish Gautam. Botanical immunodrugs:scope and opportunities. // Reviews • DRUG DISCOVERY TODAY. 2005. Vol. 10. P. 495-502]. По сравнению с бактериальными и синтетическими аналогами полисахариды растений не имеют побочных эффектов и характеризуются низкой токсичностью, что дает им значительные преимущества при разработке иммуномодулирующих, противоопухолевых и ранозаживляющих средств [Schepetkin I.A., Quinn М.Т.
Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulation and therapeutic potential. // Int. Immunopharmacol. 2006. Vol. 6. P. 317-333.].
Роль дендритных клеток в иммунном ответе впервые была изучена Ральфом Штайнманом [Jacques Banchereau & Ralph М. Steinman Dendritic cells and the control of immunity, 1998, 19 MARCH, NATURE, VOL 392: 245-52]. Дендритные клетки играют ключевую роль в управлении иммунным ответом, они поглощают чужеродные антигены и стимулируют Т клеточный ответ. От них зависят результаты вакцинации и ответ иммунной системы на инфекции [Howard CJ, Charleston В, Stephens SA, Sopp P, Hope JC. The role of dendritic cells in shaping the immune response. Anim Health Res Rev. 2004 Dec; 5(2):191-5]. В связи с этим дендритные клетки привлекают пристальное внимание, как мишень для иммуномодулирующих лекарств [Mohty, М.; Gaugler, В.; Mami, N. В.; Olive, D. Regulation of Dendritic Cell Function with Immunomodulatory Drugs Current Medicinal Chemistry - Anti-Inflammatory & Anti-Allergy Agents, Volume 4, Number 2, April 2005, pp. 169-175(7)]
Известен способ получения из растительного сырья полисахаридов, обладающих иммуностимулирующим действием, путем обработки растительного сырья водным раствором формалина, выдерживания в подкисленной воде, с последующей экстракцией пектиновых полисахаридов водным раствором оксалата аммония, обработкой экстракта известным способом и лиофильной сушкой целевого продукта. В качестве растительного сырья используют пресноводные цветковые растения, например, любой вид ряски Lemna spp., предварительно измельченную свежую надземную часть высших растений, например, смолевки обыкновенной Oberna behen(L) (Ru 2149642 C1, A61 35/78, 27.05.2000). Однако полученные пектиновые вещества обладают очень низкой иммуностимулирующей активностью: индекс стимуляции нейтрофилов составлял от 1,09 до 1,12, а макрофагов - от 1,12 до 1,39 и не обладают активности относительно дендритных клеток.
Известно вещество, полученное из делящихся растительных клеток (кукурузы, картофеля, гриба), обладающее противоинфекционным действием и не обладающее гемагглютинирующим действием, названное гамма-плантом (γ-PL) (Л.А. Чекановская, Ru 2028303 C1, С08В 37/00). Описаны физико-химические характеристики биологически активного препарата «Гамма-плант». Вещество представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 900-2000 кД, состоящий из углеводной и белковой частей в процентном массовом отношении 90:10. При этом углеводная часть гамма-планта на 70-80% состоит из глюкозы и 12-18% из уроновых кислот.
К недостаткам известного решения следует отнести митогенную активность вещества, которая может привести к поликлональной активации клеток, что делает опасным использование вещества в качестве лекарства, и отсутствие иммуностимулирующей активности в отношении дендритных клеток и макрофагов.
Известен также способ получения вещества, обладающего иммуностимулирующей, противовирусной и антибактериальной активностью, вещество, полученное этим способом и фармацевтическая композиция на его основе (RU №2195308 А61К 35/78, 27.12.2002). Данный способ получения включает в себя экстракцию измельченного растительного сырья водой, центрифугирование водного экстракта, его концентрирование, осаждение, очистку и сушку целевого продукта. В качестве растительного сырья используют растения семейства Dioscoreaceae, Plantaginaceae, Solanaceae. Осаждение проводят 96% этиловым спиртом в присутствии хлористого натрия. Полученный осадок повторно осаждают солевым или кислым агентом с последующей обработкой выделенного кислого пептидогликана-сырца раствором щелочи или насыщенным раствором соли щелочного металла. Очистку целевого продукта проводят с помощью гель-проникающей хроматографии. Вещество, полученное этим способом, представляет собой водорастворимый кислый пептидогликан с молекулярной массой 1200 кД - 40000 кД и массовым отношением между глюкозой и уроновыми кислотами, равным 1:2-4, пептидная часть молекулы кислого пептидогликана составляет 13±3 мас. %.
К недостаткам известного решения следует отнести сложность выделения (двойное переосаждение с использованием этилового спирта). Известное вещество не обладает иммуностимулирующей активностью в отношении дендритных клеток.
Раскрытие изобретения
Задачей данного изобретения является получение нового вещества растительного происхождения полисахаридной природы из доступного сырья с хорошим выходом, хорошо растворимого в воде и обладающего не только высокой антивирусной и антимикробной активностью, но и иммуностимулирующей активностью, особенно, в отношении дендритных клеток, а также разработка эффективного и технологичного способа его получения, и приготовления фармацевтической композиции на его основе, обладающей высоким фармакологическим действием.
Техническая задача решается за счет того, что разработан способ получения вещества, обладающего антимикробной, противовирусной и иммуностимулирующей активностью в отношении дендритных клеток, заключающийся в том, что измельченное растительное сырье, в качестве которого используют проростки картофеля, подвергают водной экстракции, затем водный экстракт отделяют от осадка, к нему добавляют солевой агент с последующим концентрированием полученного солевого раствора ультрафильтрацией на фильтре с порами пропускания 300 килодальтон (кД), после чего раствор замораживают на сутки, размораживают, фильтруют, полученный при этом осадок удаляют, а из раствора кислым солевым агентом осаждают водорастворимый комплексный биополимер (ВКБП) сырец с последующей обработкой его раствором щелочи, затем щелочной раствор диализуют против дистиллированной воды на фильтре и из полученного раствора с помощью гель - проникающей хроматографии выделяют комплексный биополимер. При этом в качестве солевого агента используют, преимущественно, хлористый натрий, в качестве кислого солевого агента на стадии осаждения используют неорганическую соль, например, хлористый аммоний либо сульфат аммония, а щелочной раствор диализуют против дистиллированной воды на фильтре с порами пропускания 12 кД.
Полученное вещество, обладает антимикробной, противовирусной и иммуностимулирующей активностью в отношении дендритных клеток, и представляет собой комплексный биополимер, содержащий полисахаридную, пептидную и липидную части.
Полисахаридная часть молекулы составляет 40-60% и имеет следующую структуру:
где m=3 - 5, каждый второй остаток α-L-Rhap несет заместитель R,
где R - моносахаридные или олигосахаридные остатки β-D-галактопиранозы, несущие, в свою очередь, моносахаридные или олигосахаридные остатки α-L-арабинофуранозы, при массовом соотношении между рамнозой и галактуроновой кислотой от 1:6 до 1:4.
Пептидная часть молекулы кислого комплексного биополимера составляет от 4 до 20%. Липидная часть молекулы представлена жирными кислотами и составляет от 2 до 7%. При этом молекулярная масса вещества составляет 500-17000 кД. Создана фармацевтическая композиция, обладающая антимикробной, противовирусной и иммуностимулирующей активностью в отношении дендритных клеток, характеризующаяся тем, что она содержит созданное активное вещество в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
Описание фигур
Фиг. 1.
13
2
Типичный для ВКБП ЯМР С спектр 3-5% раствора в DO при 55°C. Прибор DRX 600 MHz NMR Spectrometer фирмы Bruker (Германия).
13
1
По данным ЯМР C и Н ПМР спектров, а также по данным двумерных спектров COSY, TOCSY, ROESY и HSQC были сделаны отнесения химических сдвигов полисахаридной части молекулы водорастворимого кислого комплексного биополимера (таблица 3) и на основании этого выведена структурная формула полисахаридной части ВКБП
Фиг. 2.
1
2
Типичный для ВКБП Н ПМР спектр 3-5% раствора в DO при 55°C. Прибор DRX 600 MHz NMR Spectrometer фирмы Bruker (Германия) (внутренний стандарт - ТМСП). Также использован для построения структурной формулы ВКБП.
Фиг. 3.
1
13
Структурная формула полисахаридной части ВКБП. Спектры расшифрованы с применением двумерных гомоядерных спектров COSY. TOCSY. ROESY и гетероядерного спектра Н/С HMQS/
где: m=3-5, каждый второй остаток α-L-Rhap несет заместитель R,
где R - моносахаридные или олигосахаридные остатки β-D-галактопиранозы, несущие, в свою очередь, моносахаридные или олигосахаридные остатки α-L-арабинофуранозы, при массовом соотношении между рамнозой и галактуроновой кислотой от 1:6 до 1:4.
Фиг. 4.
Влияние ВКБП на сортированные дендритные клетки селезенки мыши. А - чистота сортированных дендритных клеток. В - гистограмма экспрессии CD80, С - гистограмма экспрессии CD86, черная линия - инкубация с ВКБП, серая линия - контроль (инкубация без добавления ВКБП), прерывистая линия - изотипический контроль для ВКБП, точечная линия - изотипический контроль для инкубации без ВКБП. D - нормированные данные по увеличению экспрессии CD80 и CD86 под влиянием ВКБП. Приведены средние значения и стандартные отклонения по 3 экспериментам. Достоверность отличия *Р<0.05.
Фиг. 5.
ВКБП индуцирует выработку цитокинов IL-6, МСР-1, TNF-α макрофагами мыши in vitro. А - TNF-alpha (1) и IL-6 (2), В - МСР-1, ось абсцисс - ВКБП, мкг/мл, ось ординат - пг/мл. Приведены средние значения и стандартные отклонения по 3 экспериментам.
Фиг. 6.
ВКБП индуцирует выработку NO в культуре макрофагов мыши in vitro.
Фиг. 7.
neg
high
neg
hlgh
ВКБП усиливает экспрессию CD86 и CD69 на дендритных клетках человека. А - анализ методом проточной цитометрии, выделение миелоидных дендритных клеток (mDC) как LinlCDllcCD123HLA-DR, В - гистограммы экспрессии CD86 и CD69 на популяции mDC дендритных клеток человека.
Фиг. 8.
Фармацевтическая композиция ВКБП в изотоническом растворе хлорида натрия (А), в изотоническом растворе хлорида натрия с глюкозой (В) и в растворе Рингера (С) индуцирует продукцию цитокинов МСР-1 (1) и IL-6 (2) в организме мышей. Ось абсцисс - часы после введения препарата, ось ординат - концентрация (пг/мл) цитокина в культуральной жидкости. Приведены средние значения и стандартные отклонения по 3 мышам.
Фиг. 9.
5
-4
ВКБП обладает противовирусным действием в отношении вируса ЦМВ. Клетки ФЛЭЧ в концентрации 2×10 кл/мл инкубировали в течение 5 суток в присутствии 10 БОЕ/кл цитомегаловируса и различных концентраций ВКБП. Определяли количество ЦМВ-инфицированных бляшек иммунопероксидазным методом с использованием моноклональных антител к белкам вируса. Ингибирующее действие определяли путем вычисления процентного отношения количества инфицированных клеток (бляшек) в опытной культуре, предварительно обработанной тестируемым веществом, к количеству бляшек в культуре контрольных необработанных клеток.
Предлагаемый способ получения вещества, обладающего высокой антимикробной, противовирусной и иммуностимулирующей активностью в отношении дендритных клеток, заключается в том, что измельченное растительное сырье, в качестве которого используют проростки картофеля, подвергают водной экстракции, затем водный экстракт центрифугируют, добавляют солевой агент, с последующим концентрированием полученного солевого раствора ультрафильтрацией на фильтре с порами пропускания 300 кД, после чего раствор замораживают на сутки, размораживают, фильтруют, полученный при этом осадок удаляют, а из раствора кислым солевым агентом осаждают комплексный биополимер-сырец с последующей обработкой его раствором щелочи, затем щелочной раствор диализуют против дистиллированной воды на фильтре с порами пропускания 12 кД, и из полученного раствора методом гель-проникающей хроматографии выделяют комплексный биополимер с молекулярной массой 500-17000 кД.
В качестве солевого агента используют, преимущественно, хлористый натрий, а в качестве кислого солевого агента на стадии осаждения используют кислую неорганическую соль.
Отличительной особенностью способа от известного (RU №2195308 А61К 35/78) является проведение стадии концентрирования путем ультрафильтрации именно солевого раствора, в частности, содержащего NaC(, водного экстракта на фильтре с порами пропускания 300 кД, проведение дополнительной стадии замораживания раствора, полученного после ультрафильтрации, а также проведение стадии осаждения только кислым солевым агентом и проведение дополнительной стадии диализа перед хроматографической очисткой.
Совокупность особенностей предложенного способа и осуществление указанной выше последовательности операций позволило получить новое вещество, хорошо растворимое в воде, с хорошим выходом и обладающее иммуностимулирующей активностью в отношении дендритных клеток и сильно выраженной противовирусной и антимикробной активностью. Полученное новое вещество (его изученная часть) - это водорастворимый кислый комплексный биополимер с молекулярной массой 500-17000 кД, содержащий полисахаридную, пептидную и липидную части, где полисахаридная часть составляет 40-60%, пептидная часть составляет от 4 до 20%, липидная часть составляет от 2 до 7% и содержит жирные кислоты, в основном, пальмитиновую кислоту.
13
13
1
1
По данным ЯМР С (типичный ЯМР С спектр - фигура 1) и Н ПМР спектроскопии (типичный Н ПМР спектр - фигура 2), а также по данным двумерных спектров COSY, TOCSY, ROESY и HSQC были сделаны отнесения химических сдвигов полисахаридной части молекулы ВКБП (таблица 3) и определена следующая структурная формула ВКБП, приведенная на фигуре 3, а именно:
где: m=3-5, а каждый второй остаток α-L-Rhap несет заместитель R,
где R - моносахаридные или олигосахаридные остатки β-D-галактопиранозы, несущие, в свою очередь, моносахаридные или олигосахаридные остатки α-L-арабинофуранозы, при массовом соотношении между рамнозой и галактуроновой кислотой от 1:6 до 1:4.
Проведение стадии ультрафильтрации именно солевого раствора (NaCl) водного экстракта на фильтре с порами пропускания 300 кД позволило устранить нековалентное взаимодействие внутри полимеров и мономеров водного экстракта, тем самым более тщательно удалить многочисленные низкомолекулярные (меньше 300 кД) примеси и выделить более чистыми полимерные вещества с молекулярной массой выше 300 кД.
При дополнительном введении стадии замораживания-оттаивания удалось очистить кислый комплексный биополимер от неактивных, труднорастворимых полимеров, например, глюканов, что в дальнейшем позволило получить комплексный биополимер, не содержащий глюкозу, и тем самым повысить его чистоту и гомогенность, а соответственно и активность.
Осаждение полимеров проводили в одну стадию, без спиртового высаживания и в качестве солевого агента использовали кислую неорганическую аммониевую соль. Предложенная нетрадиционная ультрафильтрация на стадии концентрирования и дополнительная стадия замораживания-оттаивания позволили также исключить спиртовое высаживание.
Осаждение кислым солевым агентом и удаление осадка после замораживания-оттаивания позволило выделить кислый комплексный биополимер-сырец, отделив его от многочисленных сопутствующих примесей - полисахаридов, белков и иных полимеров с молекулярной массой выше 300 кД.
При очистке целевого продукта с помощью гель-проникающей хроматографии на колонках с TSK HW-75F или TSK HW-65F собирают целевой продукт с молекулярной массой от 500 кД до 17000 кД.
Вещество (ВКБП), полученное настоящим способом новое по своим структурным частям, является комплексным биополимером, содержащим полисахаридную, пептидную и липидную части, и отличается от известного кислого пептидогликана (патент RU №2195308 А61К 35/78, 27.12.2002), при этом имеет следующие характерные признаки:
1. Полисахаридная часть не содержит глюкозу. В полисахаридную часть молекулы входят галактуроновая кислота как главный моносахарид, галактоза, арабиноза, рамноза (см. структурную формулу на фигуре 3).
Массовое отношение между рамнозой и галактуроновой кислотой, по данным ЯМР спектров, составляет от 1:6 до 1:4, тогда как для известного кислого пептидогликана (патент RU №2195308 А61К 35/78) это отношение составляет около от 1:12 до 1:8,5.
2. Пептидная часть молекулы ВКБП составляет 4-20 мас. %, тогда как для известного кислого пептидогликана (патент RU №2195308 А61К 35/78) она составляла 13+3%.
3. Липидная часть молекулы состоит из жирных кислот.Количество жирных кислот в образце составляет 2-7%, преимущественно, пальмитиновая кислота (С-16). Известный же пептидогликан (патент RU №2195308 А61К 35/78) не содержит липидной части.
Кроме изученных структурных частей, новое вещество (ВКБП) содержит неизвестные новые химические структурные элементы, которые и составляют остальное процентное содержание вещества.
4. Новое вещество (ВКБП), полученное по описанному выше способу, обладает такими свойствами, как иммуностимулирующая активность в отношении дендритных клеток, высокая антимикробная и противовирусная активность. Вещество характеризуется хорошей растворимостью в воде, что позволило создать фармацевтическую композицию из заявленного вещества с использованием фармацевтически приемлемых носителей или наполнителей, взятых в эффективном количестве.
5. Способ позволяет получать целевой продукт с хорошим выходом.
Примеры осуществления заявленного изобретения
Пример 1.
Получение вещества ВКБП.
5 кг проростков картофеля (партия №1) измельчают, прибавляют 10 литров воды и экстрагируют при комнатной температуре при перемешивании в течение 2 часов. Смесь отжимают с помощью механического пресса. К водному экстракту прибавляют 500 г. хлористого натрия, растворяют его и раствор концентрируют до объема 1 литр путем ультрафильтрации на фильтре 300 кД.
Раствор замораживают на сутки. После размораживания и фильтрации проводят осаждение комплексного биополимера кислым солевым агентом -хлористым аммонием. Для этого к 1 литру концентрата прибавляют 1 литр насыщенного солевого раствора хлористого аммония. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, к нему прибавляют 50 мл дистиллированной воды и при перемешивании прикапывают 25% раствор аммиака до полного растворения осадка. Раствор диализуют против дистиллированной воды через мембрану с порами пропускания 12 кД.
Полученный раствор наносят на колонку TSK HW-75F. Колонку элюируют дистиллированной водой. Собирают высокомолекулярный пик с молекулярной массой от 500 кД до 17000 кД. Раствор концентрируют на роторном испарителе и сушат лиофильно. Выход целевого продукта (ВКБП) составляет 640 мг.
Количество кислых сахаров определяют по цветной реакции с 3,5-диметилфенолом в концентрированной серной кислоте (A.I. Usov, M.I. Bilan, N.G. Klochkova. - Botanica Marina, 1995, 38, 43-51). Количество кислых сахаров, составляет 30,3%.
Количество нейтральных сахаров определяют методом ГЖХ в виде их ацетатов полиолов (P. Albersheim. - Methods Enzymol., 1987, 118, 3-40). Количество нейтральных сахаров в ВКБП составляет 26,9%.
Количество пептида определяют методом Лоури с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта (О.Н. Lowry, N.J. Rosenbrough et al., J. Biol. Chem., 1951, 193, 265-275). Количество пептида, в ВКБП составляет 19,5%.
Жирные кислоты определяют методом ГЖХ в виде метиловых эфиров жирных кислот, полученных метанолизом полисахарида 1М HCl в метаноле (100°C, 5 ч). В качестве внутреннего стандарта прибавляют метиловый эфир лауриновой кислоты (С-12). Количество жирных кислот в образце составляет 7%, преимущественно пальмитиновая кислота (С-16).
По ПМР спектру рассчитываем отношение Rhap:GalpA как 1:6 (химический сдвиг 5,67 и 1,60).
Анализ молекулярной массы проводят методом гель-проникающей хроматографии: колонка d=10 mm, L=500 mm, наполнитель - Toyopearl HW75F, жидкая фаза - 0,05% азид натрия в воде деионизированной, скорость элюции 0,6 мл/мин, RI-детектор Gilson 131. Калибровка построена на основе стандартных декстранов 500 кД, 1500 кД, 3000 кД, 17000 кД (Polymer Standards Service GmbH, Германия). В указанных условиях хроматографии молекулярная масса ВКБП лежит в диапазоне от 500 до 17000 кД.
В таблице 1 представлены данные о выходе и составе ВКБП, полученного из четырех партий ростков картофеля способом, описанным в данном примере.
Пример 2. Получение вещества ВКБП
Этот пример аналогичен примеру 1, но в качестве солевого агента используют хлористый калий.
Выход целевого продукта составляет 575 мг. Количество кислых сахаров составляет 19,6%, нейтральных сахаров - 22,0%, пептида (по методу Лоури) - 4,2%, жирных кислот - 2,1%. По ПМР спектру рассчитываем соотношение Rhap:GalpA как 1:5 (химический сдвиг 5,66 и 1,60).
Процедура выделения целевого продукта повторяется еще на трех партиях ростков картофеля.
В таблице 2 представлены данные о выходе и составе ВКБП, полученного из четырех партий ростков картофеля способом, описанным в данном примере.
Пример 3. Получение вещества ВКБП
Этот пример аналогичен примеру 1, но после размораживания и фильтрации осаждение ВКБП проводят кислым солевым агентом -сульфатом аммония.
Выход целевого продукта составляет 509 мг. Количество кислых сахаров составляет 19,6%, нейтральных сахаров - 20,5%, пептида (по методу Лоури) - 5,1%, жирных кислот - 5,6%. По ПМР спектру рассчитываем соотношение Rhap:GalpA как 1:4 (химический сдвиг 5,66 и 1,60).
Пример 4. Получение вещества ВКБП
Этот пример аналогичен примеру 1.. Выпавший осадок после солевого высаживания отделяют центрифугированием, растворяют путем прибавления 50 мл дистиллированной воды и при перемешивании прикапывают 10% раствор щелочи (гидроксида натрия) до полного растворения осадка. Раствор диализуют против дистиллированной воды через мембрану с порами пропускания 12 кД.
Выход целевого продукта составляет 593 мг. Количество кислых сахаров составляет 26,6%, нейтральных сахаров - 20,3%, пептида (по методу Лоури) - 6,7%, жирных кислот - 8,4%. По ПМР спектру рассчитываем соотношение Rhap:GalpA как 1:6 (химический сдвиг 5,66 и 1,60).
Пример 5.
Структурный анализ полисахаридной части ВКБП.
13
2
ЯМР С спектры растворов ВКБП концентрации 3-5% в DO снимали на приборе DRX 600 MHz NMR Spectrometer фирмы Bruker (Германия) при 55°C (внутренний стандарт-ТМСП). При снятии двумерных спектров COSY, TOCSY, ROESY и HSQC использовали стандартные методики фирмы Bruker.
Отнесение химических сдвигов проводили согласно справочным данным (Advances in carbohydrate chemistry and biochemistry, vol. 42, 1984, p.193-225), и последним литературным данным в области ЯМР спектроскопии полисахаридов.
13
13
1
1
По данным ЯМР С (типичный ЯМР С спектр - фигура 1) и Н ПМР спектроскопии (типичный Н ПМР спектр - фигура 2), а также по данным двумерных спектров COSY, TOCSY, ROESY и HSQC были сделаны отнесения химических сдвигов полисахаридной части молекулы ВКБП (таблица 3). В таблице 3 представлены химические сдвиги фрагментов полисахаридной части молекулы ВКБП.
ВКБП имеет полисахаридную часть со структурой, приведенной на фигуре 3.
где: m=3-5, каждый второй остаток α-L-Rhap несет заместитель R,
где R - моносахаридные или олигосахаридные остатки β-D-галактопиранозы, несущие, в свою очередь, моносахаридные или олигосахаридные остатки α-L-арабинофуранозы, при массовом соотношении между рамнозой и галактуроновой кислотой от 1:6 до 1:4.
Пример 6. Приготовление фармацевтической композиции ВКБП
Фармацевтическую композицию создают путем смешивания сухого лиофилизированного препарата ВКБП с фармацевтическими изотоническими растворами. Концентрации активного вещества ВКБП были использованы в диапазоне от 0,3 мкг/мл до 3000 мкг/мл. В качестве изотонических растворов используют физиологический раствор (0,9 г хлорида натрия на 100 мл воды для инъекций), фармацевтический изотонический раствор хлорида натрия с глюкозой (состав: 9,0 г хлорида натрия; 50,0 г глюкозы в 1000 мл воды для инъекций), фармацевтический раствор Рингера (состав: натрия хлорид 8,6 г, кальция хлорид 0,33 г калия хлорид 0,3 г в 1000 мл мл воды для инъекций).
Навеску каждой соли и в конце активное вещество последовательно полностью растворяют в примерно 90 мл воды для инъекций и доводят вес раствора до 100 г водой для инъекций.
Растворы стерилизуют путем фильтрования через фильтр 0,22 мкм.
В примерах 7-9 показано, что ВКПБ в фармацевтической композиции оказывает активирующее действие на дендритные клетки и макрофаги мыши и человека, повышая экспрессию поверхностных ко-стимуляторных молекул и стимулируя выработку цитокинов.
В примерах 10-12 показано, что фармакологическая композиция ВКПБ стимулирует выработку цитокинов в организме животного.
В примере 13 показано, что фармакологическая композиция ВКПБ обладает антимикробным действием.
В примере 14 показано, что фармакологическая композиция ВКПБ обладает противовирусным действием.
Пример 7.
ВКБП оказывает иммуностимулирующее действие на дендритные клетки, выделенные из селезенки мыши.
Фармацевтическую композицию создают путем растворения 0,015 г ВКБП в 100 мл физиологического раствора (0,9 г хлорида натрия на 100 мл воды для инъекций).
2
2
4
-
+
+
5
Для опытов были использованы лабораторные мыши линии BALB/c, самки весом 18-20 г, полученные из питомника «Столбовая». Мышей умерщвляли в камере с СО. В асептических условиях извлекали и измельчали селезенку, мононуклеарные клетки выделяли на фиколле 1,09 г/см (1500 об/мин, при 15°C, 25 мин), затем дважды отмывали центрифугированием (1200 об/мин, при 4°C, 10 мин) в фосфатном солевом буфере (10 мМ NaHPO, 137 мМ NaCl, и 2,7 мМ KCl), дополненном 0,5% БСА, 1% глюкозы, 10 mM HEPES, pH 7.3-7.5 (полный ФСБ). Выделенные мононуклеарные клетки селезенки ресуспензировали в полном ФСБ и окрашивали смесью антител CD19 FITC, I-A РЕ, CD11c PerCP-Cy5-5 (BD Biosciences) в течение 20 мин при 4°C, отмывали полным ФСБ, ресуспензировали в этом же растворе в концентрации 20-30 млн/мл. Дендритные клетки сортировали на приборе BD FACSAria™ II Cell Sorter (BD Biosciences) по сочетанию маркеров CD19, CD11c, I-A. Чистота сортированных дендритных клеток составляла 97-99%. (фигура 4). Выделенные дендритные клетки суспензировали в полной культуральной среде (RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, ЭТС, 2 мМ L-глютамина, заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ β-меркаптоэтанола, 100 ЕД/мл пеницллина и 100 ЕД/мл стрептомицина) в концентрации 10 клеток в 1 мл и вносили в лунки 96-луночной панели по 20000 клеток в 200 мкл среды на лунку в дуплетах.
2
В опытные культуры дендритных клеток вносили ВКБП в концентрации 10 мкг/мл. В контрольные культуры дендритных клеток вносили соответствующий объем физиологического раствора. Культуры инкубировали в течение 20 часов (37°C, 5% СО). После окончания инкубации содержимое лунок промывали полным ФСБ, переносили в центрифужные микропробирки, центрифугировали 1200 об/мин в течение 8 мин. К осадку добавляли смесь антител CD80 FITC и CD86 АРС, инкубировали 20 мин при 4°C, отмывали полным ФСБ, и клетки ресуспензировали в 200 мкл этого же раствора с добавлением 2 мкг/мл DAPI. Экспрессию CD80 и CD86 на дендритных клетках анализировали на приборе BD FACSAria™ II Cell Sorter (BD Biosciences). Результаты экспериментов (табл. 4) свидетельствуют, что под влиянием ВКБП на поверхности дендритных клеток достоверно (р<0.05) увеличивается экспрессия костимуляторных молекул CD80 и CD86, необходимых для представления дендритными клетками антигенов Т клеткам с последующей активацией последних. Повышение экспрессии костимуляторных молекул CD80 и CD86 на дендритных клетках мыши под влиянием ВКБП представлено в таблице 4.
Примечание. Приведены средние значения и стандартные отклонения по трем образцам, нормированные на соответствующие средние значения по трем контрольным образцам. Контрольные образцы дендритных клеток инкубировали в полной культуральной среде без каких-либо стимулирующих лигандов.
Пример 8.
ВКБП активирует экспрессию костимуляторной молекулы CD86, продукцию цитокинов IL-12, IL-6, МСР-1, TNF-α и выработку NO дендритными клетками и макрофагами мыши костномозгового происхождения.
Фармацевтическую композицию создают путем растворения 0,015 г ВКБП в 100 мл физиологического раствора (0,9 г хлорида натрия на 100 мл воды для инъекций).
Повышение экспрессии молекул CD86 на поверхности дендритных клеток мыши при воздействии ВКБП.
2
Для опытов были использованы лабораторные мыши линии BALB/c, самки весом 18-20 г, полученные из питомника «Столбовая». Мышей умерщвляли в камере с CO, В асептических условиях из бедренных костей мыши с помощью полного ФСБ и шприца с иглой G25 вымывали костный мозг.Клетки суспензировали в полном ФСБ, осаждали в центрифуге (1200 об/мин 10 мин), эритроциты лизировали гипотоническим шоком, добавляя 9 мл стерильной дистиллированной воды на 15 сек, останавливали лизис добавлением 1 мл 10-кратного раствора Хэнкса, затем 20 мл раствора полного ФСБ. Клетки осаждали, суспензировали в полном ФСБ. Подсчет концентрации и жизнеспособности клеток осуществляли методом проточной цитометрии с использованием калибровочных шариков и красителя пропидиум иодид (2 мкг/мл) на приборе BD FACSAria™ II Cell Sorter (BD Biosciences).
10 млн клеток костного мозга в 10 мл полной культуральной среды (DMEM, дополненная 10% ЭТС, 2 мМ L-глютамина, заменимыми аминокислотами, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ β-меркаптоэтанола, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина) с добавлением 10 нг/мл GM-CSF (GIBCO) культивировали в 90 мм чашках Петри в течение 9 дней.
Замену среды (с добавлением GM-CSF) производили на 3-й и 6-ой дни после начала культивирования. На 9-й день из культуры собирали фракцию неадгезионных клеток, осаждали центрифугированием (1200 об/мин, 10 мин), суспензировали в полном ФСБ, определяли концентрацию и жизнеспособность клеток методом проточной цитометрии с использованием калибровочных шариков и красителя пропидиум йодид (2 мкг/мл) на приборе BD FACSAria™ II Cell Sorter (BD Biosciences). Дендритные клетки идентифицировали методом проточной цитометрии по экспрессии на клеточной поверхности молекул CD11c и МНС класса II. Содержание дендритных клеток в использованных суспензиях составляло 70-80%.
2
Дендритные клетки в концентрации 1 млн в 1 мл полной культуральной среды DMEM помещали в лунки 24-луночной панели для культивирования (Nunclon). В три лунки панели вносили ВКБП в концентрации 10 мкг/мл. Отрицательным контролем служили три лунки с дендритными клетками без добавления каких либо эффекторов. Через 18 часов инкубации при 37°C в атмосфере 5% CO клетки переносили в центрифужные пробирки, содержимое лунок промывали полным ФСБ и переносили в те же пробирки, клетки осаждали центрифугированием при 1200 об/мин, 10 мин. Клеточный осадок окрашивали смесью меченых флуорохромом моноклональных антител CD11c-PE и CD86-APC (BD Biosceinces), клетки анализировали на проточном питометре BD FACSAria™ II Cell Sorter (BD Biosciences). Результаты исследования показали (табл. 5), что под влиянием ВКБП в дендритных клетках мыши в 5,9 раз повысилась экспрессия костимуляторных молекул CD86, необходимых для выполнения этими клетками антиген-презентирующей функции и активации Т клеток. Повышение экспрессии ко-стимуляторных молекул CD86 на дендритных клетках мыши под влиянием ВКБП представлено в таблице 5.
Примечание. Приведены средние значения и стандартные отклонения по трем образцам, нормированные на соответствующие средние значения в контрольных образцах. Контрольные дендритные клетки инкубировали в полной культуральной среде без каких-либо стимулирующих лигандов.
Усиление продукции цитокина IL-12 в дендритных клетках мыши под влиянием ВКБП.
2
Дендритные клетки костномозгового происхождения получали путем культивирования клеток костного мозга в присутствии 10 нг/мл GM-CSF в течение 9 дней, как описано выше в данном примере. В лунки 24-луночной панели для культивирования клеток (Nunclon) вносили по 1 мл полной среды DMEM, содержащей 2 млн дендритных клеток в 1 мл. В две лунки вносили 10 мкг ВКБП, в две другие лунки, служившие отрицательным контролем, вносили соответствующий объем физиологического раствора. Планшет инкубировали 18 часов в СО-инкубаторе, затем добавляли brefeldin-A в конечной концентрации 5 мкМ и инкубировали еще 6 часов.
После окончания инкубации в лунки заливали по 2 мл холодного полного ФСБ, тщательно пипетировали и переносили в 4,5-миллилитровые пробирки BD Biosceinces. Клетки осаждали центрифугированием (10 мин, 1200 об/мин), к клеточному осадку приливали 1 мл полного ФСБ, суспензировали и переносили в микропробирки объемом 1,2 мл. Клетки осаждали центрифугированием (10 мин, 1200 об/мин). К клеточному осадку 50 мкл приливали смесь антител I-A FITC и CD11c PerCP-Cy5-5 (BD Biosciences), инкубировали 20 мин в темноте при 4°C, отмывали полным ФСБ. Осадок встряхивали и приливали 100 мкл раствора FixPerm (BD Biosciences), инкубировали 20 мин, дважды отмывали раствором PermWash (BD Biosciences). Осадок клеток суспензировали в 50 мкл PermWash, делили на две аликвоты по 20 мкл, добавляли антитела IL-12 РЕ (BD Biosciences), инкубировали 30 мин. Клетки дважды отмывали раствором PermWash, суспензировали в 200 мкл полного ФСБ и анализировали на проточном цитофлуориметре BD FACSAria™ II Cell Sorter (BD Biosciences). В таблице 6 представлены полученные результаты исследования, показывающие, что под влиянием ВКБП в дендритных клетках достоверно повышается выработка цитокина IL-12, в частности, в 4,3 раза (р<0.01) увеличивается содержание клеток, синтезирующих IL-12. Повышение продукции IL-12 дендритными клетками мыши под влиянием ВКБП представлено в таблице 6.
Усиление секреции макрофагами цитокинов IL-6, МСР-1, TNF-α и выработки NO под влиянием ВКБП.
2
Макрофаги костномозгового происхождения получали путем инкубации костного мозга в присутствии 10 нг/мл GM-CSF в течение 9 дней, как описано выше в данном примере. На 9-й день из культуры собирали фракцию адгезионных клеток, осаждали центрифугированием (1200 об/мин, 10 мин), суспензировали в полном ФСБ, определяли концентрацию и жизнеспособность клеток методом проточной цитометрии с использованием калибровочных шариков и красителя пропидиум йодид (2 мкг/мл) на приборе BD FACSAriaTM II Cell Sorter (BD Biosciences). В лунки 24-луночной панели для культивирования (Nunclon) вносили по 1 млн макрофагов в 1 мл полной среды DMEM. ВКБП вносили в концентрации 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл в триплетах. В три лунки, служившие отрицательным контролем, вносили соответствующий объем физиологического раствора. Панель инкубировали 24 часа в СО-инкубаторе. После окончания инкубации отбирали пробы культуральной среды для определения концентрации цитокинов и NO. Концентрацию цитокинов ФНО-α, IL-6, МСР-1 измеряли на приборе BD FACSAria™ II (BD Biosciences) с помощью набора BD™ Cytometric Bead Array, Mouse Inflammation Kit (BD Biosciences), согласно инструкции фирмы-производителя. Концентрацию цитокинов рассчитывали с помощью программы FCAP Array™ Software v1 (BD Biosciences).
Как показано на фигуре 5, ВКБП значительно стимулирует выработку цитокинов ФНО-α, IL-6 и МСР-1. В частности, под влиянием ВКБП концентрация IL-6 в культуральной среде выросла в 186 раз, МСР-1 - в 8 раз, TNF-α - в 54 раза.
3
4
2
Выработку оксида азота (NO) оценивали по накоплению нитрита натрия в культуральной среде с использованием реакции Грисса (L.C.Green, 1982). Реактив Грисса готовили непосредственно перед проведением реакции, смешивая в равных объемах раствор А (0,1% раствор дигидрохлорида нафтилэтилендиамина в воде) и раствор Б (1% раствор сульфаниламида в 5% НРО). Для определения концентрации нитрита натрия культуральную жидкость (50 мкл) вносили в лунки плоскодонного 96-луночного планшета (Медполимер), в каждую лунку добавляли по 150 мкл реактива Грисса. Реакционную смесь инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре Dynex MRX при длине волны λ=545 нм. В качестве контроля использовали реакционную смесь, которая, вместо культуральной жидкости, содержала эквивалентный объем полной среды для культивирования клеток. В качестве стандартных образцов для построения калибровочной кривой использовали двукратные разведения NaNO в полной среде для культивирования клеток.
Результаты экспериментов показали, что под влиянием ВКБП макрофаги активно производят NO. По данным, представленным на фигуре 6, можно заключить, что ВКБП стимулирует выработку NO в 10 раз.
Пример 9.
ВКБП активирует экспрессию CD69 и CD86 на дендритных клетках человека
Фармацевтическую композицию создают путем растворения 0,015 г ВКБП в 100 мл физиологического раствора (раствор (0,9 г хлорида натрия на 100 мл воды для инъекций).
Цельную кровь от здоровых доноров забирали в пробирки Vacutainer с гепарином (Becton-Dickinson), разводили 1:1 в среде RPMI-1640 и инкубировали 18 часов в присутствии 10 мкг/мл ВКБП. По окончании инкубации образцы крови окрашивали смесью антител: Lin1-FITC (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56), CD123 РЕ, HLA-DR АРС-Н7, CD11c BD Horizon, CD69 АРС, CD86 PerCP Су5.5. (BD Biosciences) в течение 20 мин, затем приливали 1 мл BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences) для удаления эритроцитов и фиксирования белых клеток крови. Образцы анализировали на проточном цитометре BD FACS Aria П.
Результаты исследования представлены в таблицах 7 и 8, а также на фигуре 7. Они свидетельствуют, что под влиянием ВКБП на миелоидных дендритных клетках человека в 2 раза возрастает экспрессия костимуляторной молекулы CD86 (р<0.05) и активационной молекулы CD69 (р<0.05). Повышение экспрессии костимуляторной молекулы CD86 на дендритных клетках человека при действии ВКБП представлено в таблице 7.
Повышение экспрессии активационной молекулы CD69 на дендритных клетках человека при действии ВКБП представлено в таблице 8.
Пример 10.
Фармацевтическая композиция ВКБП стимулирует выработку цитокинов in vivo.
Фармацевтическую композицию создавали путем смешивания сухого лиофилизированного препарата ВКБП с фармацевтическим изотоническим раствором хлорида натрия (0,005 г ВКБП, 0,9 г хлорида натрия на 100 мл воды для инъекций). Раствор фильтровали через фильтр 0,22 мкм и вводили внутрибрюшинно с помощью одноразового инсулинового шприца в количестве 10 мкг в 0,2 мл на мышь.
Опыты проводили на лабораторных мышах самцах (СВА × C57B1/6)F1 весом 20 г, полученных из питомника «Столбовая». В качестве контроля использовали мышей, которым вводили 0,2 мл соответствующего изотонического раствора без добавки ВКБП. Во всех группах было по 5 мышей. Мышей забивали через 1, 3 и 6 часов. В качестве срока «0» использовали мышей до введения препарата. Для получения перитонеального экссудата в брюшную полость мыши вводили 3 мл холодного изотонического раствора (0,9% хлорид натрия), после массирования собирали перитонеальный экссудат. Образцы центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин для удаления клеток, собирали надосадочную жидкость для определения концентрации цитокинов. Концентрацию цитокинов IL-6 и МСР-1 измеряли с помощью набора BD™ Cytometric Bead Array, Mouse Inflammation Kit (BD Biosciences) на приборе BD FACSAria™ II Cell Sorter (BD Biosciences), согласно инструкции фирмы-производителя. Расчет концентрации цитокинов делали с помощью программы FCAP Array™ Software v1 (BD Biosciences).
Результаты исследования показали, что фармацевтическая композиция ВКБП с изотоническим раствором хлорида натрия, введенная парентерально в организм мыши, вызывает значительную стимуляцию продукции цитокинов IL-6 и МСР-1, с пиковыми значениями 220 пг/мл и 600 пг/мл соответственно, через 3 часа после введения (фиг. 8А).
Пример 11.
Пример 11 аналогичен примеру 10, но фармацевтическую композицию создавали путем смешивания сухого лиофилизированного препарата ВКБП с фармацевтическим изотоническим раствором хлорида натрия с глюкозой (состав: 9,0 г хлорида натрия; 50,0 г глюкозы в 1000 мл воды для инъекций) Результаты исследования показали, композиция ВКПБ с изотоническим раствором хлорида натрия с добавлением глюкозы дала повышение уровня цитокинов IL-6 до 295 пг/мл и МСР-1 до 714 пг/мл (фиг. 8В)
Пример 12.
Пример 12 аналогичен примеру 10, но фармацевтическую композицию создавали путем смешивания сухого лиофилизированного препарата ВКБП с фармацевтическим раствором Рингера (состав: натрия хлорид 8,6 г, кальция хлорид 0,33 г калия хлорид 0,3 г в 1000 мл мл воды для инъекций).
Результаты исследования показали, что фармацевтическая композиция ВКБП с изотоническим раствором Рингера дала повышение уровня цитокинов IL-6 до 292 пг/мл и МСР-1 до 666 пг/мл (фиг. 8С).
Пример 13.
ВКБП обладает антимикробным действием.
В модели гнойного бактериального абсцесса у морских свинок исследовали усиление противомикробной защиты животных с помощью фармацевтической композиции, содержащей ВКБП в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель, в частности, фармацевтический NaCl. Фармацевтическую композицию создавали путем растворения стерильного лиофилизата во флаконах, содержащего 5 мкг ВКБП в 1 мл инъекционного изотонического раствора хлорида. Экспериментальные гнойные раны у подопытных морских свинок массой 100-150 г. создавали по следующей методике. В процессе эксперимента контролировали не только состояние экспериментальной гнойной раны, но и общее состояние животных, их подвижность и аппетит.
Животные были разделены на две экспериментальные группы -основную и контрольную, по 10 животных в каждой группе. Для создания экспериментального раневого абсцесса всем животным под общим обезболиванием (кетамин + реланиум) в межлопаточной области выбривали шерсть. Затем иссекали участок кожи площадью 2 см с сохранением подлежащей подкожно-жировой клетчатки. Мягкие ткани на дне и по краям раны сдавливали зажимом Кохера в течение 3-4 минут. Под раздавленную мягкую ткань вводили 1 мл взвеси суточной культуры, содержащей 2 млрд. микробных тел патогенных бактерий, являющихся наиболее частыми возбудителями раневой инфекции в хирургической практике - Staphylococcus aureus (штамм 150) и Escherichia coli (штамм 20). Через 2-3 дня после инокуляции инфекции начинали лечение и мониторинг гнойного воспаления в ране.
Животных контрольной и опытной групп лечили стандартными процедурами, принятыми при лечении местных гнойных ран в клинической хирургической практике. Спустя 3 дня после инфицирования раны, в асептических условиях проводили удаление некротизированных мягких тканей (некрэктомия). Кожу вокруг раны обрабатывали 3% раствором йода, а саму рану промывали 3% раствором перекиси водорода. Затем на раневую поверхность накладывали марлевые повязки с мазью «Левомеколь». Повязки меняли ежедневно.
Животные основной группы получали по 5 мкг ВКБП внутримышечно в 1,3 и 5 дни лечения. Животным контрольной группы вводили внутримышечно 1 мл 0.9% NaCl.
Мониторинг раневого процесса у животных контрольной и опытной групп показал достоверное ускорение заживления гнойных ран у животных, получавших инъекции ВКБП. Через 2 дня после создания раны и ее инфицирования у всех животных, независимо от варианта лечения, наряду с местными признаками гнойного процесса, наблюдали адинамию и вялость, увеличение потребления жидкости, снижение потребления твердой пищи, то есть общие проявления серьезного гнойного воспалительного процесса. Местно - рана была покрыта струпом, возвышавшимся над отечными и покрасневшими участками окружающей рану кожи. При надавливании на струп из раны сочился гной. Струп можно было снять легко, без кровотечения. После удаления струпа открывались мягкие ткани, представляющие собой отечную, местами некротизированную, подкожную жировую клетчатку, пропитанную гноем с элементами фибриновых сгустков. Спустя 3 дня от начала лечения, животные основной группы были более подвижными по сравнению с животными контрольной группы. Животные обеих групп ели мало, но выпивали повышенное количество воды. Местные отек и гиперемия кожи вокруг раны несколько уменьшились. Дно раны было покрыто гнойно-фибриновым налетом. У животных, получавших ВКБП, отек и покраснение краев раны были менее выраженными. Планиметрия площади поверхности ран не позволяла выявить достоверных различий между опытной и контрольной группами. Через 5 дней после начала лечения у животных, получавших инъекции ВКБП, улучшились подвижность и аппетит. Еще более уменьшились отек и гиперемия прилежащих к ране тканей. На дне раны у 7 из 10 животных опытной группы и у 4 из 10 животных контрольной группы (различия между группами достоверны, р<0,05) появились островки розовых грануляций. Площадь раны в обеих группах сократилась вдвое, по сравнению с исходной, достоверного различия между группами по площади ран в этот день наблюдения не выявлялось. Через 7 дней от начала лечения животные основной группы были активными, аппетит полностью восстановился, потребление воды оставалось несколько выше, чем у здоровых особей. Местно - раны полностью очистились, у большинства животных они были заняты бледно-розовыми грануляциями. Площадь ран сократилась до 31% от исходного размера. Раны животных контрольной группы тоже очистились, были покрыты грануляциями, но продолжали выделять большое количество экссудата серозно-слизистой консистенции. Отека и гиперемии кожи вокруг ран не определялось. Площадь ран составляла 38% от исходной площади ран и была достоверно больше (р<0.05), чем у животных опытной группы. На 9-й день лечения раны у животных, леченых ВКБП, были полностью выполнены розовыми грануляциями, сократились до 13% от исходного размера, а у животных контрольной группы - до 18% (р<0,05). При этом у половины животных контрольной группы поверхность ран была покрыта грязно-серыми фибринозными наслоениями и кровоточила при прикосновении. Через 15 дней после начала лечения в группе, лечившейся ВКБП, произошла практически полная эпителизация ран. В контрольной группе животных эпителизация ран завершилась на два дня позже, то есть через 17 дней после начала лечения.
В целом, сравнение динамики гнойного раневого процесса, вызванного St. aureus и E. coli показал, что инъекционное введение ВКБП в дозе 5 мкг внутримышечно способствовало более быстрому очищению ран от инфекции, более раннему началу грануляционного процесса и, наконец, более быстрой эпителизации и полному заживлению ран.
Пример 14.
Изучение противовирусной активности ВКБП в модели цитомегаловирусной инфекции in vitro.
Фармацевтическую композицию создают путем растворения 0,3 г ВКБП в 100 мл раствора Рингера (состав: натрия хлорид 8,6 г, кальция хлорид 0,33 г калия хлорид 0,3 г в 1000 мл мл воды для инъекций).
В работе использовался референс-штамм цитомегаловируса (ЦМВ, штамм AD169). Для определения инфекционной активности ЦМВ использовали высокочувствительные клетки - диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), полученные из коллекции культур тканей НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России. Для культивирования клеток ФЛЭЧ использовали среду DMEM с добавлением 10% ЭТС, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина. Результаты предварительных экспериментов по изучению цитотоксичности ВКБП показали, что в концентрациях 3000 мкг/мл, 300 мкг/мл, 30 мкг/мл, 3 мкг/мл и 0,3 мкг/мл препарат не оказывает цитотоксического действия на клетки ФЛЭЧ в течение 7 суток воздействия.
5
-4
2
Для определения противовирусной (против ЦМВ) активности ВКБП на монослой клеток ФЛЭЧ в 48-луночных культуральных панелях с концентрацией 2×10 кл/мл вносили среду без сыворотки, содержащую исследуемое вещество в различных концентрациях (конечная концентрация 300 мкг/мл, 30 мкг/мл, 3 мкг/мл и 0,3 мкг/мл.), и инкубировали в течение 1 часа. Затем сюда же, не отбирая исследуемого вещества, вносили цитомегаловирус с инфекционной множественностью 10 БОЕ/кл и инкубировали 1 час при 37°C. Монослой клеток промывали и вносили полную культуральную среду. Клетки инкубировали при температуре 37°C в атмосфере 5% СО в течение 5 суток. В качестве контролей использовали клетки, зараженные той же дозой вируса, но не обработанные исследуемым веществом. Каждую концентрацию вещества исследовали в 3-х повторах.
50
50
Количество ЦМВ-инфицированных бляшек определяли иммунопероксидазным методом с использованием моноклональных антител к белкам ЦМВ. Определение дозы ВКБП, ингибирующей ЦМВ, производили путем вычисления процентного отношения количества инфицированных клеток (бляшек) в опытной культуре, предварительно обработанной тестируемым веществом, к количеству бляшек в культуре контрольных необработанных клеток. Далее определяли концентрацию вещества, которая соответствует 50% ингибированию бляшкообразующей способности ЦМВ (ингибирующая доза, ИД). Расчет ИД проводили с помощью статистического пакета Probit Analysis (версия 1.0; автор - Александр Полехин).
При использовании ВКБП в концентрации 300 мкг/мл отмечалось подавление бляшкообразования на 63,3% относительно контроля, при концентрации 30 мкг/мл - на 41,1%, при концентрации 3 мкг/мл - на 16,7%.
50
(фигура 9). Проведенный расчет показал, что ИД составляет 18 мкг/мл (95% интервал 8-48 мкг/мл).
В результате можно заключить, что ВКБП является нетоксичным соединением в отношении клеток ФЛЭЧ и обладает противовирусным эффектом в отношении ЦМВ-инфекции.
13
1
Все представленные примеры доказывают, что получено новое вещество представляющее собой водорастворимый кислый комплексный биополимер (ВКБП) с молекулярной массой 500 кД -17000 кД и содержащее полисахаридную, пептидную и липидную части. По данным ЯМР С и Н ПМР-спектроскопии расшифрована структура полисахаридной части ВКБП. Вещество, полученное предложенным способом, является новым и имеет следующие характерные признаки:
- Полисахаридная часть ВКБП не содержит глюкозу. В полисахаридную часть молекулы входят галактуроновая кислота как главный моносахарид, галактоза, арабиноза, рамноза. Массовое отношение между рамнозой и галактуроновой кислотой, по данным ЯМР спектроскопии, составляет от 1:6 до 1:4.
- Пептидная часть ВКБП составляет 4-20 мас. %
- Липидная часть молекулы составляет 2-7%, состоит из жирных кислот, преимущественно, пальмитиновой кислоты.
Представленные выше биологические испытания (Примеры 6-14) доказывают, что новое вещество ВКБП, полученное по предложенному способу, обладает иммуностимулирующей активностью в отношении дендритных клеток и макрофагов, высокой антимикробной и противовирусной активностями. Вещество характеризуется хорошей растворимостью в воде, что позволяет создавать фармацевтические композиции с использованием фармацевтически приемлемых носителей или наполнителей в эффективном количестве.
Таким образом, задача данного изобретения, а именно получение нового вещества растительного происхождения полисахаридной природы из доступного сырья с хорошим выходом, хорошо растворимого в воде и обладающего не только высокой антивирусной и антимикробной активностью, но и иммуностимулирующей активностью в отношении дендритных клеток, а также разработка эффективного и технологичного способа его получения, и приготовления фармацевтической композиции на его основе, обладающей высоким фармакологическим действием) решена.
Промышленная применимость
Данное изобретение соответствует критерию промышленного применения. Все химические операции адаптированы к промышленным условиям получения и очистки нового биологически активного полимера.