СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
WAY OF INTESTINE DYSBACTERIOSIS PREVENTION DURING EXPERIMENT

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для профилактики дисбактериоза кишечника у экспериментальных животных (белых крыс) как во время эксперимента, так и во время содержания животных в экспериментально-биологических клиниках (вивариях).
В доступной научной и патентной литературе способов профилактики дисбактериоза кишечника в эксперименте на лабораторных животных не обнаружено.
Изобретение направлено на решение задачи: создание способа профилактики дисбактериоза кишечника у экспериментальных животных, возникающего вследствие неправильного кормления животных.
Несмотря на относительную устойчивость кишечного микробиоценоза крыс, в нем могут возникать нарушения под действием различных, чаще экзогенных факторов: нарушения режима питания, замены в рационе одних продуктов другими, недостатка витаминов в рационе. Имеющийся дисбаланс кишечной микрофлоры оказывает негативное влияние на результаты эксперимента.
Технический результат: предупреждение развития дисбактериоза кишечника у экспериментальных животных с целью разработки способа профилактики кишечного дисбактериоза у людей.
Указанная задача достигается путем профилактического применения у экспериментальных животных (белых лабораторных крыс) в течение 14 дней препарата «Ультрасорб» из расчета 3 г/сут, смешивая его с кормом. Биологически активная добавка «Ультрасорб» выпускается ЗАО «Ягодное», г.Киров, д. Югрино. Данный продукт используется в качестве профилактического средства практически здоровыми людьми при воздействии неблагоприятных экологических и производственных факторов, при повышенном риске формирования дисбактериоза, онкологических заболеваний, сахарного диабета, иммунной недостаточности. Также он применяется отдельно или как компонент функционального питания при заболеваниях желудочно-кишечного тракта (стоматиты, дисбактериоз, острые кишечные инфекции, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, гастриты, холециститы, гепатиты, энтериты, колиты), при нарушениях обмена веществ (атеросклероз, ожирение, сахарный диабет, гипергликемия), при алкогольной интоксикации и алкогольной патологии, при воспалительной патологии кожи микробного и аллергического происхождения, в комплексной терапии вторичной иммунной недостаточности. Основным компонентом «Ультрасорба» являются ферментированные нерастворимые и растворимые пищевые волокна, наличие которых способствует нормализации кишечной микрофлоры.
Способ осуществляют следующим образом. Препарат «Ультрасорб» после механического измельчения в ступке добавляют в корм экспериментальных животных (белых лабораторных крыс) в количестве 0,1 (10%) суточного объема пищи (30 г/сутки на животное по существующим нормам) - 3 г/сутки. Курс профилактического применения препарата «Ультрасорб» составляет 14 дней.
Эксперимент выполнен на 10 животных - самцах и самках беспородных белых крыс массой 168,2±26,5 г, четырехмесячного возраста, содержащихся в стандартных условиях вивария. Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. До начала эксперимента животные находились на обычном рационе вивария в соответствии с нормами, утвержденными приказом Министра здравоохранения СССР от 10 марта 1966 г. №163 и Приказом Минздрава СССР от 10.10.83 №1179 (пункт 4.1):
- Комбикорм-концентрат гранулированный - 50,0 г;
- Творог обезжиренный - 6,0 г;
- Морковь - 20,0 г;
- Зелень из проращенного овса - 15,0 г;
- Итого кормов в рационе, г - 91,0.
После регистрации исходных показателей в рацион животных в качестве компонента функционального питания был включен «Ультрасорб». Курс дачи животным «Ультрасорба» составил 14 суток.
Во время эксперимента дважды - в начале эксперимента и спустя 14 суток - проводили исследование кала на дисбактериоз.
Первичный посев разведения фекалий осуществляли на дифференциально-диагностические среды: бифидобактерии - на среде Блаурокка, лактобациллы - на среде МРС-2, энтеробактерии - на среде Эндо, стафилококки - на желточно-солевом агаре, энтерококки - на молочно-солевом агаре с полимиксином, плесневые грибы - на среде Сабуро с последующей характеристикой выделенных бактерий по стандартным методикам. Подобный спектр анализируемых микроорганизмов объяснялся тем, что при дисбиотических состояниях в кишечном биоценозе в первую очередь изменяется содержание данных микроорганизмов. Количество микроорганизмов выражали в десятичных логарифмах (lg) колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г сырой массы фекалий.
Результаты экспериментов были подвергнуты статистической обработке с помощью программного пакета Biostat. Вычисляли среднее арифметическое стандартное отклонение. Достоверность полученных различий определяли при помощи критерия Уилкоксона. При определении фоновых показателей полученные данные сравнивались со средними популяционными колебаниями. При определении спустя 14 суток после включения в рацион животных «Ультрасорба» - с исходными показателями.
У животных в начале исследования в кишечнике определялись следующие микроорганизмы: бифидобактерии, лактобактерии, энтеробактерии, лактозонегативные энтеробактерии, энтерококки, стафилококки, грибы, бациллы.
Табл. 1
Количественная характеристика микроорганизмов, вегетирующих в биотопе толстой кишки крыс до начала эксперимента, lg КОЕ на 1 г сырой массы фекалий (M±m).
Микроорганизмы
Опытная группа
Пределы колебаний популяционных величин для животных данного вида*
Bifidobacteria (M±m)
6,4±1,8
8,0-9,0
Lactobacillus (M±m)
7,2±1,7
8,3-9,6
Enterobacteriacea (M±m)
5,6±0,5
5,3-6,4
Enterobacteriacea (лактозонегативные) (M±m)
5,6±0,5
**
Enterococcus spp (М±m)
8,0
**
Staphylococcus spp (М±m)
5,8±0,8
4,5-7,1
Candida spp (M±m)
1,8±1,1
**
Saccharomyces spp (M±m)
2,4±1,5
**
Bacillus spp (M±m)
2,4±1,5
**
* данные С.Ю. Батищева с соавт. Вопросы питания. - 2002. - №3. - Т.71. - С.36-39.
** данных, характеризующих пределы колебаний популяционных величин микроорганизмов в содержимом толстой кишки крыс, в литературе не найдено
Анализ содержания защитной микрофлоры (бифидобактерий и лактобацилл) показал, что в начале эксперимента количество как бифидобактерий, так и лактобацилл в биотопе толстой кишки крыс было несколько меньше средней популяционной величины (табл.1). До начала эксперимента содержание микроорганизмов, относящихся к семейству Enterobacteriacea, в биотопе толстой кишки экспериментальных животных составляло 5,6±0,5 lg КОЕ/г при средней популяционной величине 5,3-6,4 lg KOE/г. При этом содержание лактозонегативных энтеробактерий было высоким: их концентрация была сопоставима с концентрацией всех энтеробактерий - 5,6±0,5 lg КОЕ/г, то есть в составе энтеробактерий отмечалось явное преобладание лактозонегативных форм. Как известно, увеличение популяции лактозонегативных энтеробактерий является показателем дисбиотических изменений. Дополнительно в кишечном биоценозе крыс определялись грибы, бациллы, дрожжи.
Табл. 2
Количественная характеристика микроорганизмов, вегетирующих в биотопе толстой кишки крыс через 14 дней от начала эксперимента, lg КОЕ на 1 г сырой массы фекалий (M±m).
Микроорганизм
Содержание бактерий в кале животных, КОЕ/г, lg Исходные данные
Содержание бактерий в кале животных, КОЕ/г, lg Спустя 14 от начала эксперимента
Bifidobacteria (M±m)
6,4±1,8
6,8±1,1
Lactobacillus (M±m)
7,2±1,7
8,2±0,5
Enterobacteriacea (M±m)
5,6±0,5
5,0±1,0
Enterobacteriacea (лактозонегативные) (M±m)
5,6+0,5
0*
Enterococcus spp (M±mm)
8,0
8,0
Staphylococcus spp (M±m)
5,8±0,8
5,2±0,5
Candida spp (M±m)
1,8±1,1
0*
Saccharomyces spp (M±m)
2,4±1,5
0*
Bacillus spp (M±m)
2,4±1,5
2,0±1,2
* - р<0,05 по отношению к исходным показателям
Как видно из табл.2, спустя 14 суток после включения в рацион питания животных «Ультрасорба» содержание лактобацилл в биотопе толстой кишки крыс достигла средней популяционной величины и составила 8,2±0,5 lg KOE/г. Концентрация бифидобактерий за период наблюдения также имела тенденцию к увеличению, хотя и менее выраженную.
Через 14 дней дачи животным «Ультрасорба» отмечалось снижение концентрации энтеробактерий (5,0±1,0 lg КОЕ/г) и исчезновение лактозонегативных энтеробактерий. Таким образом, под влиянием «Ультрасорба» произошло изменение популяции энтеробактерий в плане нормализации показателей.
У животных, получавших «Ультрасорб» в качестве компонента функционального питания, произошло также снижение концентрации бактерий, относящихся к роду Staphylococcus. Так, в начале эксперимента концентрация стафилококков в толстой кишке крыс составляла 5,8±0,8 КОЕ/г при норме - 4,5-7,1 КОЕ/г, после дачи «Ультрасорба» - 5,2±0,5 КОЕ/г. Проведенный курс приема «Ультрасорба» также способствовал санации толстой кишки экспериментальных животных от плесневых грибов и дрожжей, тенденции к снижению концентрации бацилл.
Таким образом, применение «Ультрасорба» в качестве компонента функционального питания у животных, находящихся на стандартном рационе, оказывает благоприятное влияние на нормализацию количественных и качественных характеристик кишечного биоценоза, что делает возможным его применение для предупреждения развития у экспериментальных животных дисбактериоза кишечника.
Примеры конкретного выполнения.
4
5
6
6
8
6
6
Пример 1. Самка белой крысы, массой 154 г, в течение 14 суток находилась на стандартном пищевом рационе вивария, после чего в стерильных условиях был взят образец фекалий, подвергнутый исследованию на дисбактериоз. В составе кишечного биоценоза животного определялись следующие микроорганизмы: бифидобактерии - в концентрации 10 КОЕ/г, лактобациллы - 10 КОЕ/г, энтеробактерии - 10 КОЕ/г, в том числе лактозонегативные энтеробактерии - 10 КОЕ/г, энтерококки - в концентрации 10 КОЕ/г, стафилококки - 10 КОЕ/г, дрожжи - 10 КОЕ/г и бациллы
6
- 10 КОЕ/г. После регистрации исходных показателей в рацион питания животного на 14 суток был включен «Ультрасорб», который животному давали в смеси с кормом в количестве 3 г/сут.
5
8
5
8
5
Спустя 14 суток анализ кала на дисбактериоз у животного был взят повторно. В кишечном биоценозе определялись: бифидобактерии - в количестве 10 КОЕ/г, лактобациллы - 10 КОЕ/г, энтеробактерии - 10 КОЕ/г, лактозонегативные энтеробактерии не определялись, энтерококки - 10 КОЕ/г, стафилококки - 10 КОЕ/г, грибы и бациллы не выявлены.
7
7
5
5
8
7
Пример 2. Самец белой крысы, массой 180 г, в течение 14 суток находился на стандартном пищевом рационе вивария, после чего в стерильных условиях был взят образец фекалий, подвергнутый исследованию на дисбактериоз. В составе кишечного биоценоза животного определялись следующие микроорганизмы: бифидобактерии - в концентрации 10 КОЕ/г, лактобациллы - 10 КОЕ/г, энтеробактерии - 10 КОЕ/г, в том числе лактозонегативные энтеробактерии - 10 КОЕ/г, энтерококки - в концентрации 10 КОЕ/г, стафилококки - 10 КОЕ/г, грибы и бациллы не выявлены. После регистрации исходных показателей в рацион питания животного на 14 суток был включен «Ультрасорб», который животному давали в смеси с кормом в количестве 3 г/сут.
8
8
6
8
5
Спустя 14 суток анализ кала на дисбактериоз у животного был взят повторно. В кишечном биоценозе определялись: бифидобактерии - в количестве 10 КОЕ/г, лактобациллы - 10 КОЕ/г, энтеробактерии - 10 КОЕ/г, лактозонегативные энтеробактерии не определялись, энтерококки - 10 КОЕ/г, стафилококки - 10 КОЕ/г, грибы и бациллы не выявлены.
7
7
5
5
8
6
6
Пример 3. Самка белой крысы, массой 155 г, в течение 14 суток находилась на стандартном пищевом рационе вивария, после чего в стерильных условиях был взят образец фекалий, подвергнутый исследованию на дисбактериоз. В составе кишечного биоценоза животного определялись следующие микроорганизмы: бифидобактерии - в концентрации 10 КОЕ/г, лактобациллы - 10 КОЕ/г, энтеробактерии - 10 КОЕ/г, в том числе лактозонегативные энтеробактерии - 10 КОЕ/г, энтерококки - в концентрации 10КОЕ/г, стафилококки - 10 КОЕ/г, бациллы - 10 КОЕ/г, грибы не выявлены. После регистрации исходных показателей в рацион питания животного на 14 суток был включен «Ультрасорб», который животному давали в смеси с кормом в количестве 3 г/сут.
8
8
4
8
6
5
Спустя 14 суток анализ кала на дисбактериоз у животного был взят повторно. В кишечном биоценозе определялись: бифидобактерии - в количестве 10 КОЕ/г, лактобациллы - 10 КОЕ/г, энтеробактерии - 10 КОЕ/г, лактозонегативные энтеробактерии не выявлялись, энтерококки - 10 КОЕ/г, стафилококки - 10 КОЕ/г, бациллы - 10 КОЕ/г.