ORNITHODOROS MOUBATA ИГИБИТОР КОМПЛЕМЕНТА, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОПОСРЕДОВАННЫХ КОМПЛЕМЕНТОМ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПАЦИЕНТА С ПОЛИМОРФИЗМОМ С5 КОМПЛЕМЕНТА
ORNITHODOROS MOUBATA AND COMPLEMENT INHIBITOR FOR TREATING COMPLEMENT-MEDIATED DISEASES OF PATIENT WITH COMPLEMENT C5 POLYMORPHISM

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способам лечения и профилактики опосредованных комплементом заболеваний и расстройств у субъектов с полиморфизмом C5 комплемента.
Все документы, упоминаемые в тексте и перечисленные в конце настоящего описания включены в настоящее описание в виде ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Полиморфизм распространен среди всех, кроме наиболее консервативных генов у большинства видов. Наличие полиморфизма в генах, которые вовлечены в заболевания и расстройства человека, привело к возникновению персонифицированной медицины. Персонифицированная медицина позволяет оказывать индивидуальную медицинскую помощь человеку с использованием множества средств, включая молекулярно-генетический анализ. Медицинские решения, выбор лекарственных средств и/или схемы лечения могут быть адаптированы для конкретного пациента. Диагностическое тестирование и генотипирование можно использовать для выбора подходящей и оптимальной терапии на основе индивидуальной чувствительности субъекта к конкретным лекарственным средствам.
Недавно было обнаружено, что некоторые генетические варианты C5 человека или полиморфизмы C5 приводят к отсутствию ответа на некоторые средства, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента. В одном клиническом испытании экулизумаба в конкретной популяции пациентов в Японии с опосредованным комплементом расстройством пароксизмальной ночной гемоглобинурией (ПНГ), у нескольких пациентов была плохая ответная реакция. У таких пациентов обнаружены полиморфные варианты C5 c.2653C>T (p.Arg885Cys) или c.2654G>A (p.Arg885His). В ситуации такого типа могут быть идентифицированы субпопуляции пациентов, которых невозможно лечить обычными способами или, вероятно, невозможно лечить совсем, если нет альтернативных лекарственных средств, или если все известные лекарственные средства действуют посредством одного и того же механизма.
В данном случае нет доступного альтернативного лечения опосредованных комплементом заболеваний и расстройств, которые в настоящее время лечат, используя экулизумаб. Поэтому существует необходимость в идентификации средств лечения субпопуляции пациентов с полиморфизмами C5, из-за которых в настоящее время их невозможно вылечить.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что белок клещей коверсин (также называемый в данной области и в настоящем описании EV576 и OmCI [25]) можно применять для лечения и профилактики опосредованных комплементом заболеваний и расстройств у субъектов с полиморфизмами C5 комплемента.
Соответственно, изобретение относится к способу лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства, включающему в себя введение субъекту с полиморфизмом C5 комплемента и нуждающемуся в таком введении терапевтически или профилактически эффективного количества средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента.
Изобретение также относится к средству, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, для лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства у субъекта с полиморфизмом C5 комплемента.
Изобретение также относится к способу лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства, включающего в себя стадии:
a) идентификации субъекта с полиморфизмом C5; и
b) идентификации средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у указанного субъекта; и
c) введение указанному субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества указанного средства, идентифицированного на стадии (b).
Изобретение также относится к средству, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, для применения в способе лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства, при этом указанный способ лечения или профилактики включает в себя стадии:
a) идентификации субъекта с полиморфизмом C5; и
b) идентификации средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у указанного субъекта; и
c) введение указанному субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества указанного средства, идентифицированного на стадии (b).
В следующем варианте изобретение относится к способу отбора субъекта с опосредованным комплементом заболеванием или расстройством для лечения первым средством, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у субъекта с полиморфизмом C5, включающему в себя определение эффективности второго средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у указанного субъекта, при этом субъекта отбирают для лечения первым средством, если второе средство проявляет пониженную эффективность у субъекта с полиморфизмом C5.
В следующем варианте изобретение относится к средству, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, для лечения опосредованного комплементом заболевания или расстройства, при этом указанное средство вводят субъекту на основе того, что было определено, что субъект имеет полиморфизм C5.
Комплемент
Система комплемента является важной частью природного механизма защиты организма от проникновения чужеродных агентов, а также вовлечена в процесс воспаления. Более 30 белков в сыворотке и на клеточной поверхности вовлечены в функционирование и регуляцию системы комплемента. Недавно стало очевидным, что в дополнение к ~35 известным компонентам системы комплемента, которые могут быть ассоциированы как с полезными, так и патологическими процессами, сама система комплемента взаимодействует, по меньшей мере, с 85 биологическими путями с такими разнообразными функциями, как ангиогенез, активация тромбоцитов, метаболизм глюкозы и сперматогенез.
Система комплемента активируется в присутствии чужеродных антигенов. Существует три пути активации: (1) классический путь, который активируется комплексами IgM и IgG или благодаря узнаванию углеводов; (2) альтернативный путь, который активируется чужими поверхностями (не имеющими специфичных регуляторных молекул) и бактериальными эндотоксинами; и (3) лектиновый путь, который активируется при связывании связывающего маннозу лектина (MBL) с остатками маннозы на поверхности патогена. Три пути включают в себя параллельные каскады событий, которые приводят к получению активации комплемента посредством образования сходных конвертаз C3 и C5 на клеточных поверхностях, приводящих к высвобождению медиаторов острого воспаления (C3a и C5a) и образованию мембраноатакующего комплекса (MAC). Параллельные каскады, вовлеченные в классический и альтернативный пути, показаны на фигуре 1.
Классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента в настоящем описании совместно называют путями комплемента.
Полиморфизмы C5 комплемента
Сообщалось о нескольких полиморфных вариантах C5 человека [1-5]. Мутации в гене, кодирующем C5, были ассоциированы с различными патологиями, включая недостаточность компонента 5 комплемента, заболевание, при котором у пациентов наблюдают склонность к тяжелым рецидивирующим инфекциям. Дефекты в указанном гене также связывали с подверженностью фиброзу печени и ревматоидному артриту. Полиморфизмы C5 человека включают инсерции, делеции, одиночные аминокислотные замены, сдвиги рамки, укорочения и сочетания указанных изменений.
Некоторые полиморфизмы изменяют взаимодействие C5 с ингибиторами активации путей комплемента. Некоторые другие полиморфизмы изменяют клинически важную активность C5. Представляют интерес полиморфизмы, действующие на Arg885 C5 дикого типа. Двумя полиморфизмами, представляющими особый интерес, являются Arg885Cys (кодируемый c.2653C>T) и p.Arg885His (кодируемый c.2654G>A), которые оба снижают эффективность мАт экулизумаба [4].
Термин «полиморфизм C5» использован в настоящем описании для обозначения любого варианта C5, отличного от C5 дикого типа. У человека C5 дикого типа представляет собой белок C5 с номером доступа NP_001726.2; вариант GI:38016947. Термин «полиморфизм C5» включает инсерции, делеции, одиночные или множественные аминокислотные замены, сдвиги рамки, укорочения и сочетания указанных изменений в белке C5.
Указанные полиморфизмы могут присутствовать в виде либо гетерозиготных, либо гомозиготных полиморфизмов, таких как гетерозиготный C5 по данному полиморфизму, гомозиготный по одному полиморфизму или гетерозиготный по разным полиморфизмам.
Представляющие интерес полиморфизмы включают изменения аминокислотной последовательности C5 дикого типа, которые находятся вблизи эпитопа или в пределах эпитопа для экулизумаба (т.е., 879KSSKC883, включая K879, S880, S881, K882 и/или C883). Например, любое изменение может иметь место в эпитопе для экулизумаба или на расстоянии до 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 аминокислоты к N- или C-концу от эпитопа для экулизумаба.
Предпочтительно аминокислотное изменение не находится в пределах или вблизи сайта связывания коверсина C5. Как полагают, это консервативная область на вершине C5α на дистальном конце высоко консервативного супердомена CUB-C5d-MG8 в C5.
50
50
Особый интерес для настоящего изобретения представляю полиморфизмы C5, которые снижают эффективность одного или нескольких средств, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у субъекта с C5 дикого типа. Под «снижением эффективности» подразумевают, что средство имеет ICдля полиморфного белка C5, которая, по меньшей мере, в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000 или более раз выше, чем IC того же средствв для белка C5 дикого типа.
В предпочтительном варианте полиморфизм C5 снижает эффективность одного или нескольких средств, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, но не снижает эффективность коверсина или его функциональных эквивалентов. В следующем предпочтительном варианте полиморфизм C5 снижает эффективность одного или нескольких моноклональных анти-C5-антител, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у субъекта с C5 дикого типа, но не снижает эффективность других средств, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента за счет связывания с C5 без блокирования сайта связывания конвертазы C5.
50
50
Термин «не снижает эффективность» означает, что ICковерсина или других средств, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента за счет связывания с C5 без блокирования сайта связывания конвертазы C5, для белка C5 дикого типа составляет, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% от ICковерсина или других средств, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента за счет связывания с C5 без блокирования сайта связывания конвертазы C5 для полиморфного белка C5. Термин «не снижает» также охватывает повышение эффективности.
В альтернативном варианте эффективность может быть измерена путем измерения способности средства ингибировать активацию комплемента в сыворотке, взятой у субъекта. Например, активность комплемента в сыворотке указанных субъектов может быть измерена любыми способами, известными в данной области или описанными в настоящей публикации, например, с использованием анализа гемолиза, описанного в публикации [6]. Можно считать, что средство ингибирует активность комплемента у указанного субъекта, если активность комплемента в присутствии средства снижена по сравнению с контролем. Термин «сниженная» в данном контексте означает, что активность комплемент в обработанном образце, снижена, по меньшей мере, на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100% по сравнению с контролем.
В конкретном варианте полиморфизм C5 снижает эффективность средств, представляющих собой моноклональные антитела, в ингибировании активации одного или нескольких путей комплемента. В конкретном варианте полиморфизм C5 снижает эффективность моноклонального антитела экулизумаба в ингибировании активации одного или нескольких путей комплемента. В следующем варианте полиморфизм C5 снижает эффективность средств, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента посредством блокирования сайт связывания конвертазы C5. В следующем конкретном варианте полиморфизм C5 имеет место в положение Arg885. Конкретные полиморфизмы в данном положении включают Arg885Cys или Arg885His.
Полиморфизмы, которые изменяют аффинность связывания C5 с известными моноклональными анти-C5-антителами, такими как экулизумаб, пекселизумаб и/или N19-8, или эффективность пептидных ингибиторов комплемента, таких как ARC1905, также представляют интерес в контексте настоящего изобретения.
Таким образом, в конкретном варианте изобретение относится к способу лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства, включающему в себя введение субъекту с полиморфизмом C5 комплемента и нуждающемуся в таком введении терапевтически или профилактически эффективного количества средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, при этом полиморфизм C5 комплемента снижает эффективность средств, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента посредством блокирования сайта связывания конвертазы C5, но не снижает эффективность средств, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента без блокирования сайта связывания конвертазы C5.
Таким образом, в конкретном варианте изобретение относится к способу лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства, включающему в себя введение субъекту с полиморфизмом C5 комплемента и нуждающемуся в таком введении терапевтически или профилактически эффективного количества средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, при этом полиморфизм C5 комплемента снижает эффективность моноклональных антител, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, но не снижает эффективность коверсина или функциональных эквивалентом данного средства.
В данном конкретном варианте изобретение также относится к терапевтически или профилактически эффективному количеству средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, для лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства у субъекта с полиморфизмом C5 комплемента, при этом полиморфизм C5 комплемента снижает эффективность средство, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента посредством блокирования сайта связывания C5, но не снижает эффективность средств, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента без блокирования сайта связывания C5.
В данном конкретном варианте изобретение также относится к терапевтически или профилактически эффективному количеству средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, для лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства у субъекта с полиморфизмом C5 комплемента, при этом полиморфизм C5 комплемента снижает эффективность моноклональных антител, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, но не снижает эффективность коверсина или функциональных эквивалентов такого средства.
Таким образом, в следующем конкретном варианте изобретение относится к способу лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства, включающему в себя введение субъекту с полиморфизмом C5 комплемента и нуждающемуся в таком введении терапевтически или профилактически эффективного количества средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, при этом полиморфизм C5 комплемента имеет место в положении Arg885, и при этом средство представляет собой белок, содержащий или состоящий из аминокислот 19-168 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, или функциональный эквивалент такого белка.
В данном конкретном варианте изобретение также относится к терапевтически или профилактически эффективному количеству средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, для лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства у субъекта с полиморфизмом C5 комплемента, при этом полиморфизм C5 комплемента имеет место в положении Arg 885, и при этом средство представляет собой белок, содержащий или состоящий из аминокислот 19-168 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, или функциональный эквивалент такого белка.
Идентификация субъектов для лечения
Настоящее изобретение особенно применимо для субъектов, которые имеют полиморфизм в C5 комплемента. Субъектом может быть любой субъект, который, как уже известно, имеет полиморфизм C5 или у которого предполагается наличие полиморфизма C5. У субъекта может предполагаться наличие полиморфизма C5, например, на основании клинических признаков опосредованного комплементом расстройства, на основании этнического происхождения или наличия в родословной полиморфизмов C5, или на основании неожиданного слабого ответа и/или неожиданно высокого ответа на средство, которое ингибирует один из путей комплемента.
Изобретение может быть применимо для субпопуляции субъектов, у которых наблюдается неожиданно слабый ответ на одно или несколько средств, которые ингибируют один из путей комплемента. В частности, изобретение применимо для субпопуляции субъектов с полиморфизмом C5, который снижает эффективность средств в виде моноклональных антител в ингибировании активации одного или нескольких путей комплемента. В конкретном варианте полиморфизм C5 снижает эффективность моноклонального антитела экулизумаб в ингибировании активации одного или нескольких путей комплемента.
Например, субъекты с двумя полиморфизмами C5 в положении Arg885 (c.2653C>T (p.Arg885Cys) и c.2654G>A (p.Arg885His)) не отвечают на экулизумаб. Однако было показано, что коверсин способен ингибировать расщепление C5 и активацию путей комплемента, даже у таких субъектов. Коверсин взаимодействует с белком комплемента C5 другим образом, отличным от взаимодействия известных анти-C5-мАт, и поэтому предполагается, что коверсин также будет применим для субпопуляций субъектов, которые не отвечают на известные анти-C5-мАт, и для субъектов, которые имеют другие полиморфизмы C5. Коверсин связывается с C5, что приводит к стабилизации общей конформации C5, но не блокирует сайт расщепления конвертазой C5 [7]. Напротив, экулизумаб блокирует сайт связывания конвертазы C5 [8].
Полиморфизмы Arg885Cys и Arg885His особенно преобладают у японцев и ханьцев в Китае. Таким образом, коверсин является средством особенно предпочтительного выбора для субпопуляций указанного этнического происхождения.
Как можно видеть из примеров, такие полиморфизмы не ограничены этническими группами японцев и ханьцев. Субъекты с полиморфизмами C5 также могут быть идентифицированы другими обычными способами, включая молекулярно-генетический анализ гена, кодирующего белок C5, включая секвенирование гена [4]; тестирование способности различных средств ингибировать активацию комплемента у субъекта, как описано в настоящей публикации, или другими способами, известными в данной области; и/или биохимический анализ белка C5 субъекта, включая изоэлектрическое фокусирование и функциональное выявление [9]. В клинических условиях субъект с полиморфизмом C5 может быть идентифицирован на основании неожиданного слабого ответа на средство, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента.
Также предполагается, что коверсин будет применим для субпопуляций субъектов, которые неожиданно оказываются чувствительными к другим средствам, которые ингибируют один из путей комплемента. Например, если полиморфизм повышает аффинность другого средства, такого как экулизумаб, по отношению к белку C5, то может быть сложно правильно дозировать средство. Активация комплемента должна строго контролироваться для предотвращения повреждения собственных тканей организма, и поэтому коверсин может быть более привлекательной альтернативой в такой ситуации.
После идентификации субъекта с полиморфизмом C5 можно идентифицировать средство, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у указанного субъекта. Чтобы идентифицировать средство, которое ингибирует пути комплемента, оценивают активность комплемента в сыворотке субъекта в присутствии и в отсутствие различных средств, которые ингибируют классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, как описано в настоящей публикации. В одном конкретном варианте средством, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у указанного субъекта, является коверсин или его функциональный эквивалент.
Активность комплемента в сыворотке указанных субъектов может быть измерена любыми способами, известными в данной области или описанными в настоящей публикации, например, в анализах гемолиза, описанных в публикации [10], и/или с использованием способа Quidel CH50, который описан в примерах. Можно считать, что средство ингибирует активность комплемента у указанного субъекта, если активность комплемента в присутствии средства понижена по сравнению с контролем. «Понижена» в данном контексте означает, что активность комплемента в обработанном образце понижена, по меньшей мере, на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% по сравнению с контролем.
Таким образом, изобретение относится к способу лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства, включающему в себя стадии:
a) идентификации субъекта с полиморфизмом C5; и
b) идентификации средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у указанного субъекта; и
c) введения указанному субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества указанного средства, идентифицированного на стадии (b).
Изобретение также относится к терапевтически или профилактически эффективному количеству средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, для применения в способе лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства, при этом указанный способ лечения или профилактики включает в себя стадии:
a) идентификации субъекта с полиморфизмом C5; и
b) идентификации средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у указанного субъекта; и
c) введения указанному субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества указанного средства, идентифицированного на стадии (b).
В следующем варианте изобретение относится к средству, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у субъекта с полиморфизмом C5, для лечения опосредованного комплементом заболевания или расстройства, при этом указанное средство вводят субъекту на основании определения того, что субъект имеет полиморфизм C5.
В следующем конкретном варианте изобретение относится к средству, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у субъекта с полиморфизмом C5, для лечения опосредованного комплементом заболевания или расстройства у субъекта, при этом
a) биологический образец от указанного субъекта анализируют в отношении присутствия или отсутствия полиморфизма C5, и
b) терапевтически эффективное количество указанного средства избирательно вводят человеку на основании присутствия полиморфизма C5.
В конкретном варианте субъекта с полиморфизмом C5 идентифицируют по отсутствию ответа на моноклональное антитело, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у субъектов дикого типа. Такую субпопуляцию субъектов называют «не отвечающими на лечение». Не отвечающих на лечение пациентов можно идентифицировать посредством подтверждения того, что активность комплемента в сыворотке составляет, по меньшей мере, 60% от нормальной активности комплемента в сыворотке в присутствии моноклонального антитела, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у субъекта с C5 дикого типа.
Особый интерес для настоящего изобретения представляют субъекты, которые не отвечают на лечение экулизумабом, пекселизумабом, N19-8 и/или ARC1095.
В следующих конкретных вариантах конкретный полиморфизм C5 может быть идентифицирован или подтвержден секвенированием гена, кодирующего C5, или другим молекулярно-генетическим анализом.
В следующем варианте изобретение относится к способу отбора субъекта с опосредованным комплементом заболеванием или расстройством для лечения первым средством, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у субъекта с полиморфизмом C5, включающему в себя определение эффективности у указанного субъекта второго средства, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у субъекта дикого типа, при этом субъекта отбирают для лечения, если второе средство, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у субъекта дикого типа, проявляет пониженную эффективность у субъекта с полиморфизмом C5.
Ингибирование классического пути комплемента, альтернативного пути комплемента и лектинового пути комплемента у указанного субъекта можно измерить посредством измерения способности средства предотвращать активацию комплемента в сыворотке субъекта, как описано в настоящей публикации.
В конкретном варианте изобретение относится к средству, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, для лечения опосредованного комплементом заболевания или расстройства, при этом указанное средство вводят субъекту на основе определения того, что образец от субъекта обладает активностью комплемента, составляющей, по меньшей мере, 60% от нормальной активности комплемента в сыворотке, в присутствии моноклонального анти-C5-антитела, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у субъектов с C5 дикого типа.
В следующем конкретном варианте изобретение относится к средству, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, для лечения опосредованного комплементом заболевания или расстройства у субъекта, при этом
a) биологический образец от указанного субъекта анализируют в отношении присутствия или отсутствия, по меньшей мере, 60% от нормальной активности комплемента в сыворотке в присутствии моноклонального анти-C5-антитела, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у субъектов с C5 дикого типа, и
b) терапевтически эффективное количество указанного средства избирательно вводят человеку на основе наличия, по меньшей мере, 60% от нормальной активность комплемента в сыворотке в присутствии моноклонального анти-C5-антитела, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента у субъектов с C5 дикого типа.
«По меньшей мере, 60% от нормальной активности комплемента в сыворотке в присутствии моноклонального анти-C5-антитела» означает, что активность комплемента в сыворотке у субъекта составляет, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95% или больше от активности комплемента в сыворотке у здорового не подвергаемого лечению контрольного субъекта. Контрольный субъект может иметь C5 дикого типа или может быть тем же самым субъектом до лечения моноклональным анти-C5-антителом.
В некоторых вариантах моноклональным анти-C5-антителом является экулизумаб, пекселизумаб и/или N19-8.
Такие способы можно применять для идентификации субъектов и популяций субъектов, которые чувствительны к лечению коверсином и его функциональными эквивалентами.
Опосредованные комплементом заболевания и расстройства.
Активацию комплемента необходимо строго контролировать, чтобы предотвратить повреждение собственных тканей организма. Было показано, что неспособность контролировать активацию комплемента играет роль в различных заболеваниях включая наряду с прочими острый панкреатит, возрастную макулярную дегенерацию (AMD), атипический гемолитико-уремический синдром (aHUS), болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, аллергический энцефаломиелит, аллотрансплантацию, астму, респираторный дистресс-синдром взрослых, грипп, ожоговые поражения, болезнь Крона, гломерулонефрит, гемолитическую анемию, гемодиализ, врожденный ангионевротический отек, ишемические реперфузионные поражения, полиорганную недостаточность, рассеянный склероз, тяжелую псевдопаралитическую миастению, инфаркт миокарда, пароксизмальную ночную гемоглобинурию (ПНГ), псориаз, ревматоидный артрит, септический шок, системную красную волчанку, инсульт, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (TTP), травматическое поражение головного мозга, синдром пропотевания жидкости из сосудов и отторжение трансплантата и болезнь трансплантат против хозяина (GvHD), а также различные расстройства периферических нервов и респираторные расстройства [11-16].
Расстройства периферических нервов, которые перечислены в публикации 15, включают постинфекционную демиелинизирующую полирадикулонейропатию (синдром Гийена-Барре), синдром Миллера-Фишера, острую воспалительную демиелинизирующую полирадикулонейропатию (AIDP), хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулонейропатию (CIDP), диабетическую нейропатию, уремический прурит, многофокальную моторную нейропатию, парапротеинемическую нейропатию, анти-Hu-нейропатию, димиелинизирующую нейропатию после дифтерии, рассеянный склероз, лучевую миелопатию, гигантоклеточный артериит (темпоральный артериит), поперечный миелит, болезнь мотонейронов, дерматомиозит.
Респираторные расстройства, которые перечислены в публикации 14, включают астму, включая тяжелую и устойчивую к стероидам астму, ХОЗЛ, альвеолиты с образованием иммунных комплексов, включая альвеолиты, вызванные воздействием органической пыли, плесени, аэроаллергенов, минеральной пыли, химических веществ и т.д.. Дополнительные состояния, включенные в определение «респираторные расстройства» включают: легкое фермера, легочную аллергию голубеводов или птицеводов, сенную лихорадку, альвеолит хлебопеков, альвеолит работник металлообрабатывающий промышленности, кондиционную лихорадку, силикоз, пневмокониоз, асбестоз, биссиноз, бериллиоз, мезотелиому, ринит, альвеолит или диффузное фиброзное заболевание легких, вызванное воздействием системных или ингаляционных лекарственных средств и химических агентов, включая без ограничения: блеомицин, митомицин, пенициллины, сульфонамиды, цефалоспорины, аспирин, НПВС, тартразин, ингибиторы ACE, йод-содержащие контрастные среды, неизбирательные β-блокирующие лекарственные средства, суксаметоний, гексаметоний, тиопентон, амидарон, нитрофурантоин, паракват, кислород, цитотоксические средства, тетрациклины, фенитоин, карбамазепин, хлорпропамид, гидралазин, прокаинамид, изониазид, п-аминосалициловую кислоту. Кроме того, термин включает физическое повреждение легкого, включая без ограничения: повреждение раздавливанием, курение и вдыхание горячего газа, поражение ударной волной, лучевое поражение, аспирационный пневмонит, липоидную пневмонию; повреждение легкого, ассоциированное с трансплантацией органов, включая без ограничения: трансплантацию сердца, трансплантацию легкого, трансплантацию костного мозга. Также в определение респираторных расстройств включен криптогенный фиброзирующий альвеолит, аллергические гранулематоз (синдром Черджа-Стросса), граунлематоз Вегенера, облетерирующий бронхиолит, интерстециальный легочный фиброз, кистозный фиброз. Также включены респираторные проявления аутоиммунных и соединительно-тканных заболеваний, включая без ограничения: ревматоидное заболевание, системную красную волчанку, системный склероз, нодозный полиартериит, полимиозит, дерматомиозит, синдром Шегрена, анкилозирующий спондилит, синдром Каплана, синдром Гудпасчера, легочно-альвеолярный протеиноз, идиопатический легочный гемосидероз, гистиоцитоз X, инфильтрацию легких с эозинофилией (PIE), включая без ограничения: простую легочную эозинофилию, пролонгированную легочную эозинофилию, астматическую бронхо-легочную эозинофилию, аллергический бронхо-легочный аспергиллез, аспергиллому, инвазивный аспергиллез, тропическую легочную эозинофилию, гиперэозинофильный синдром, паразитарное заражение и лимфангиолейомиоматоз (LAM).
Особый интерес для настоящего изобретения представляют пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ), болезнь трансплантат против хозяина (GvHD), тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (TTP) и атипический гемолитико-уремический синдром (aHUS).
Средство, применяемое в изобретении.
В одном аспекте изобретения средство может связывать C5 комплемента, включая C5 комплемента от субъектов с полиморфизмами C5 комплемента. Средство может действовать, предотвращая расщепление C5 комплемента C5, включая C5 комплемента от субъектов с полиморфизмами C5 комплемента, конвертазой C5 на C5a комплемента и C5b-9 комплемента. Средство может действовать, снижая уровни C5a у субъекта по сравнению с субъектом, не подвергаемым лечению.
В одном аспекте изобретения средство, которое ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента, связывается с C5 таким образом, что стабилизирует общую конформацию C5, но не блокирует сайт расщепления конвертазой C5. Связывание коверсина с C5 приводит к стабилизации общей конформации C5, но не блокирует сайт расщепления конвертазой.
Белок C5 комплемента, также называемый в настоящем описании C5, расщепляется ферментом конвертазой C5, которая сама образуется из C3a, более раннего продукта альтернативного пути (фигура 1). Продукты такого расщепления включают анафилатоксин C5a и литический комплекс C5b-9, также известный как мембраноатакующий комплекс (MAC). C5a является высоко реакционно-способным пептидом, вовлеченным во многие патологические воспалительные процессы, включая хемотаксис нейтрофилов и эозинофилов, активацию нейтрофилов, повышенную проницаемость капилляров и ингибирование апоптоза нейтрофилов [17].
MAC ассоциирован с другими важными патологическими процессами, включая ревматоидный артрит [18;19], пролиферативный гломерулонефрит [20], идиопатическую мембранную нефропатию [21], протеинурию [22], демиелинизацию после острого повреждения аксонов [23], а также ответственен за острое отторжение трансплантата после ксенотрансплантации [24].
Были разработаны моноклональные антитела и малые молекулы, которые связывают и ингибируют C5, для лечения различных заболеваний [12], в частности ПНГ, псориаза, ревматоидного артрита, системной красной волчанки и отторжения трансплантата. Однако такие моноклональные антитела не связываются с некоторыми белками C5 субъектов с полиморфизмами C5 и поэтому неэффективны у таких субъектов [4].
Напротив, коверсин и его функциональные эквиваленты ингибируют расщепление C5 комплемента как у субъектов с C5 дикого типа, так и у субъектов с полиморфизмами C5.
50
Способность средства связывать C5, включая C5 субъектов с полиморфизмами C5, можно определить стандартными анализами in vitro, известными в данной области, например, с использованием Вестерн-блоттинга после инкубации белка в геле с меченым C5. Предпочтительно средство согласно изобретению связывает C5, C5 дикого типа и/или C5 субъектов с полиморфизмами C5, с IC менее 0,2 мг/мл, предпочтительно менее 0,1 мг/мл, предпочтительно менее 0,05 мг/мл, предпочтительно менее 0,04 мг/мл, предпочтительно менее 0,03 мг/мл, предпочтительно 0,02 мг/мл, предпочтительно менее 1 мкг/мл, предпочтительно менее 100 нг/мл, предпочтительно менее 10 нг/мл, еще более предпочтительно менее 1 нг/мл. Средство не должно иметь одну и ту же аффинность для C5 дикого типа и C5 субъектов с полиморфизмами C5. Оно может проявлять более высокую, более низкую или одинаковую аффинность по отношению к C5 дикого типа и C5 субъектов с полиморфизмами C5.
Способность средства ингибировать активацию комплемента можно определить, измеряя способность средства ингибировать активацию комплемента в сыворотке. Например, активность комплемента в сыворотке можно измерить любыми способами, известными в данной области или описанными в настоящей публикации.
Согласно одному варианту изобретения средство, которое связывает C5, не являеься моноклональным анти-C5-антителом.
Изобретение также относится к способу лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства у субъекта с полиморфизмом C5 комплемента, включающему в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком введении, терапевтически или профилактически эффективного количества средства, которое ингибирует активность эйкозаноидов.
Изобретение также относится к терапевтически или профилактически эффективному количеству средства, которое ингибирует активность эйкозаноидов, для лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства у субъекта с полиморфизмом C5 комплемента.
50
Средство согласно данному аспекту изобретения может инибировать активность лейкотриена B4 (LTB4). В частности, средство согласно данному аспекту изобретения может связывать LTB4. Способность средства связывать LTB4 можно определить стандартными анализами in vitro, известными в данной области, например, Вестерн-блоттингом после инкубации белка в геле с меченым LTB4. Средство согласно изобретению может связывать LTB4 с IC менее 0,2 мг/мл, предпочтительно менее 0,1 мг/мл, предпочтительно менее 0,05 мг/мл, предпочтительно менее 0,04 мг/мл, предпочтительно менее 0,03 мг/мл, предпочтительно 0,02 мг/мл, предпочтительно менее 1 мкг/мл, предпочтительно менее 100 нг/мл, предпочтительно менее 10 нг/мл, еще более предпочтительно менее 1 нг/мл.
В одном аспекте изобретение относится к способу лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства у субъекта с полиморфизмом C5 комплемента, включающему в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком введении, терапевтически или профилактически эффективного количества средства, которое:
a) ингибирует классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента; и/или
b) ингибирует активность эйкозаноидов.
Изобретение также относится к средству, которое ингибирует:
a) классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и лектиновый путь комплемента; и/или
b) активность эйкозаноидов,
для лечения или профилактики опосредованного комплементом заболевания и/или расстройства у субъекта с полиморфизмом C5 комплемента.
Согласно одному варианту данного аспекта изобретения средство связывает все C5, C5 субъектов с полиморфизмами C5 и LTB4. Таким образом, средство согласно данному варианту может действовать, предотвращая расщепление C5 комплемента конвертазой C5 на C5a комплемента и C5b-9 комплемента (MAC), а также ингибируя активность LTB4. Применение средства, которое связывается как с C5, так и с LTB4, имеет особые преимущества. C5 и путь эйкозаноидов, как полагают, вносят вклад в наблюдаемую патологию при многих посредованных комплементом заболеваниях и расстройствах. Таким образом, применяя одно средство, которое ингибирует множество путей, вовлеченных в воспалительные эффекты опосредованных комплементом заболеваний и расстройств, можно достичь усиленного эффекта по сравнению с эффектом, вызываемым средством, которое ингибирует только один путь, вовлеченный в воспалительные эффекты опосредованных комплементом заболеваний и расстройств. Имеются и дополнительные преимущества, связанные с введением одной молекулы.
Предпочтительно средство соглансо изобретению получено из членистоногого гематофага. Термин «членистоногое гематофаг» включает всех членистоногих, которые используют в качестве пищи кровь подходящего хозяина, такие как насекомые, клещи, вши, блохи и микроскопические клещи. Предпочтительно средство получено из клеща, предпочтительно из клеща Ornithodoros moubata.
Согласно одному варианту изобретения средство представляет собой белок, содержащий аминокислоты 19-168 аминокислотной последовательности, показанной на фигуре 2 (SEQ ID NO: 2), или является функциональным эквивалентом такого белка. Средство может представлять собой белок, состоящий из аминокислот 19-168 аминокислотной последовательности, показаной на фигуре 2, или может быть функциональным эквивалентом такого белка.
Согласно альтернативному варианте белок, применяемый согласно данному варианту изобретения, может содержать или состоять из аминокислот 1-168 аминокислотной последовательности, показанной на фигуре 2 (SEQ ID NO: 2), или может представлять собой его функциональный эквивалент. Первые 18 аминокислот последовательности белка, приведенной на фигуре 2, образую сигнальную последовательность, которая не тербуется для активности связывания C5 или связывания LTB4 и, таким образом, необязательно без нее можно обойтись, например, с точки зрения эффективности продукции рекомбинантного белка.
Белок, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную на фигуре 2, также называемый в настоящем описании белком коверсином, выделяют из слюнных желез клеща Ornithodoros moubata. Коверсин является необычным представителем семейства липокалинов и является первым представителем семейства липокалинов, который, как показано, ингибирует активацию комплемента. Белок коверсин ингибирует альтернативный, классический и лектиновый пути комплемента, связывая C5 и предотвращая его расщепление конвертазой C5 на C5a комплемента и C5b-9 комплемента, таким образом ингибируя как действие пептида C5a, так и действие MAC. Белок коверсин также связывает LTB4. Термин «белок коверсин» в используемом в настоящем описании смысле относится к последовательности, приведенной на фигуре 2, с сигнальной последовательностью или без нее.
Белок коверсин и способность такого белка ингибировать активацию комплемента описаны в [25], где белок коверсин был назван «белком OmCI». Также было показано, что белок коверсин эффективен при лечении тяжелой псевдопаралитической миастении [13], респираторных расстройств [14] и расстройств периферической нервной системы [15]. Способность белка коверсина связывать эйкозаноиды, включая LTB4, и его применение для лечения заболеваний, опосредованных лейкотриеном или гироксиэйкозаноидом предложено в [26]. Ни в одной из указанных публикаций не предполагается возможность того, что белок коверсин может быть применим для лечения или профилактики опосредованных комплементом расстройств у субъектов с полиморфизмом C5.
В настоящее время обнаружено, что белок коверсин неожиданно является эффективным при лечении и профилактике опосредованных комплементом расстройств у субъектов с полиморфизмом C5. Данные, представленные в настоящем описании, демонстрируют, что у субъекта с полиморфизмом Arg885His ингибирование активности комплемента in vitro устойчиво к экулизумабу (в лучшем случае ингибирование комплемента на 30% или 30-80%), но полностью чувствительно к коверсину, с ингибированием на 100% при всех исследованных концентрациях.
Таким образом, экулизумаб не полностью ингибирует активность комплемента в сыворотке пациентов с полиморфизмом Arg885His, и такие пациенты не получают клинической пользы от терапевтического лечения экулизумабом. Полученные данные показывают, что ингибирование комплемента при лечении связанных с комплементом расстройств (например, при лечении ПНГ) экулизумабом не подходит для того, чтобы увидеть клиническую пользу. Напротив, было показано, что коверсин сохраняет нормальную эффективность в снижении активности комплемента в сыворотке пациентов с таким полиморфизмом и проявлял эффективность в исследованных случаях (смотри примеры 2, 3 и 4). Полученные данные свидетельствуют, что ингибирование комплемент, которое наблюдается, например, при использовании коверсина, обусловливает клиническую пользу, например, клиническую пользу можно наблюдать в том случае, когда ингибирование комплемента находится на уровне, который может быть достигнут при применении коверсина.
Согласно следующему варианту осуществления изобретения средство может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок коверсин или его функциональный эквивалент. Например, можно применять генную терапию для получения эндогенной продукции белка коверсина соответствующими клетками у субъекта, либо in vivo, либо ex vivo. Другим способом является введение «голой ДНК», при котором терапевтический ген непосредственно инъецируют в кровообращение или в мышечную ткань.
Предпочтительно такая молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит из оснований 55-507 нуклеотидной последовательности, показанной на фигуре 2 (SEQ ID NO: 1). Такая нуклеотидная последовательность кодирует белок коверсин, показанный на фигуре 2, без сигнальной последовательности. Первые 54 основания нуклеотидной последовательности, показанной на фигуре 2, кодируют сигнальную последовательность, которая не требуется для ингибирующей комплемент активности или активности в связывании LTB4. Альтернативно молекула нуклеиновой кислоты может содержать или состоять из оснований 1-507 последовательности нуклеиновой кислоты, показанной на фигуре 2, которая кодирует белок с сигнальной последовательностью.
50
50
Было показано, что белок коверсин связывается с C5 и предотвращает его расщепление конвертазой C5 в сыворотке крыс, мышей и человека с IC приблизительно 0,02 мг/мл. Предпочтительны функциональные эквиваленты белка коверсина, которые сохраняют способность связывать C5 с IC менее 0,2 мг/мл, предпочтительно менее 0,1 мг/мл, предпочтительно менее 0,05 мг/мл, предпочтительно менее 0,02 мг/мл, предпочтительно менее 1 мкг/мл, предпочтительно менее 100 нг/мл, предпочтительно менее 10 нг/мл, еще предпочтительно менее 1 нг/мл.
Также было показано, что белок коверсин связывает LTB4. Функциональные эквиваленты белка коверсин также могут сохранять способность связывать LTB4 с аффинностью, сходной с аффинностью белка коверсина.
В одном аспекте термин «функциональный эквивалент» использован в настоящей публикации для описания гомологов и фрагментов белка коверсина, которые: a) сохраняют свою способность связывать C5, либо C5 дикого типа, либо C5 субъекта с полиморфизмом C5, и предотвращать расщепление C5 комплемента конвертазой C5 на C5a комплемента и C5b-9 комплемента; и/или b) сохраняют свою способность связывать LTB4.
Термин «функциональный эквивалент» также относится к молекулам, которые структурно сходны с белком коверсином или которые содержат сходную или идентичную третичную структуру, особенно в окружении активного участка или активных участков белка коверсина, который связывается с C5, либо с C5 дикого типа, либо с C5 субъекта с полиморфизмом C5, и/или LTB4, таким как синтетические молекулы. Аминокислоты в коверсине, которые, вероятно, требуются для связывания LTB4, описаны в [26].
s,
Подразумевается, что термин «гомолог» включает указание парологов и ортологов последовательности коверсина, которая конкретно приведена на фигуре 2, включая, например, последовательность белка коверсина других видов клещей, включая Rhipicephalus appendiculatus, R. sanguineus, R. bursa, A. americanum, A. cajennense, A. hebraeum, Boophilus microplus, B. annulatus, B. decoloratus, Dermacentor reticulatus, D. andersoni, D. marginatus, D. variabilis, Haemaphysalis inermis, Ha. leachii, Ha. punctata, Hyalomma anatolicum anatolicum, Hy. dromedarii, Hy. marginatum marginatum, Ixodes ricinus, I. persulcatus, I. scapularis, I. hexagonus, Argas persicus, A. reflexus, Ornithodoros erraticus, O. moubata moubata, O. m. porcinus и O. savignyi. Также подразумевается, что термин «гомолог» включает эквивалентную последовательность белка коверсина видов комаров, включая виды родов Culex, Anopheles и Aedes, в частности, Culex quinquefasciatuAedes aegypti и Anopheles gambiae; видов блох, таких как Ctenocephalides felis (кошачьи блохи); слепней; москитов; мошек; мух це-це; вшей; микроскопических клещей; пиявок и плоских червей. Считают, что нативный белок коверсин существует у O. moubata в других трех формах размером около 18 кД, и подразумевается, что термин «гомолог» включает такие альтернативные формы коверсина.
(http://www.sanger.ac.uk/software/pfam)
Способы идентификации гомологов последовательности коверсина, приведенной на фигуре 2, будут очевидны для специалистов в данной области. Например, гомологи можно идентифицировать посредством поиска гомологии в базах данных о последовательностях, как общедоступных, так и частных. Удобно использовать общедоступные базы данных, хотя в раной мере будут применимы частные или коммерчески доступные базы данных, особенно если они содержат данные, не представленные в общедоступных база данных. Базы первичных данных представляют собой сайты депонирования данных о первичных нуклеотидных или аминокислотных последовательностях, и они могут быть общедоступными или коммерчески доступными. Примеры общедоступных баз первичных данных включают базу данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), базу данных EMBL (http://www.ebi.ac.uk/), базу данных DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/), базу данных о белках SWISS-PROT (http://expasy.hcuge.ch/), базы данных PIR (http://pir.georgetown.edu/), TrEMBL (http://www.ebi.ac.uk/), TIGR (смотри http://www.tigr.org/tdb/index.html), базу данных NRL-3D (http://www.nbrfa.georgetown.edu), базу данных об белках Protein Data Base (http://www.rcsb.org/pdb), базу данных NRDB (ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README), базу данных OWL (http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/) и вторичные базы данных PROSITE (http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html), PRINTS (http://iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html), Profiles (http://ulrec3.unil.ch/software/PFSCAN_form.html), Pfam , Identify (http://dna.stanford.edu/identify/) и Blocks (http://www.blocks.fhcrc.org). Примеры коммерчески доступных баз данных или частных баз данных включают PathoGenome (Genome Therapeutics Inc.) и PathoSeq (ранее Incyte Pharmaceuticals Inc.).
Обычно считают, что идентичность более чем на 30% между двумя полипептидами (предпочтительно на протяжении конкретной области, такой как активный участок) является показателем функциональной эквивалентности и, следовательно, показателем того, что два белка являются гомологичными. Предпочтительно белки, которые являются гомологами, имеют степень идентичности последовательности с последовательностью белка коверсина, показанной на фигуре 2 (SEQ ID NO:2) более 60%. Более предпочтительные гомологи имеют степени идентичности более 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99%, соответственно, с последовательностью белка коверсина, приведенной на фигуре 2 (SEQ ID NO:2). Процент идентичности, который указан в настоящем описании, определяют, используя BLAST, версию 2.1.3, и используя параметры по умолчанию, определенные NCBI (the National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [матрица Blosum 62; штраф за открытие пробела=11 и штраф за удлинение пробела=1].
Функциональные эквиваленты последовательности белка коверсина, приведенной на фигуре 2, включают мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции по сравнению с последовательностью дикого типа, например, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 или больше аминокислот, при условии, что такие мутанты сохраняют способность связывать C5 дикого типа и/или C5 субъектов с полиморфизмом C5. Таким образом, мутанты включают белки, содержащие консервативные аминокислотные замены, которые не влияют на функцию и активность белка нежелательным образом. Также предполагается, что указанные термин включает природные биологические варианты (например, аллельные варианты или географические варианты в пределах вида, из которого получают белки коверсины). Мутанты с улучшенной способностью связывать C5 дикого типа и/или C5 субъектов с полиморфизмом C5 и/или LTB4 также могут быть сконструированы посредством получения систематических и направленных мутаций конкретных остатков в последовательности белка.
Фрагменты белка коверсина и гомолога белка коверсина также охвачены термином «функциональные эквиваленты», при условии, что такие фрагменты сохраняют способность связывать C5 дикого типа и/или C5 субъектов с полиморфизмом C5 и/или LTB4. Фрагменты могут включать, например, полипептиды, полученные из последовательности белка коверсина, которые имеют длин менее 150 аминокислот, менее 125 аминокислот, менее 100 аминокислот, менее 75 аминокислот, менее 50 аминокислот или даже 25 аминокислот или менее, при условии, что такие фрагменты сохраняют способность связываться с C5 комплемента дикого типа и/или C5 субъектов с полиморфизмом C5 и/или LTB4. Фрагменты могут включать, например, полипептиды, полученные из последовательности белка коверсина, которые имеют длину, по меньшей мере, 150 аминокислот, по меньшей мере, 125 аминокислот, по меньшей мере, 100 аминокислот, по меньшей мере, 75 аминокислот, по меньшей мере, 50 аминокислот или, по меньшей мере, 25 аминокислот, при условии, что такие фрагменты сохраняют способность связываться с C5 комплемента дикого типа и/или C5 субъектов с полиморфизмом C5 и/или LTB4.
Любой функциональный эквивалент или его фрагмент предпочтительно сохраняет картину остатков цистеина, которые встречаются в коверсине. Например, указанный функциональный эквивалент содержит шесть остатков цистеина, которые расположены относительно друг друга на расстоянии 32 аминокислот, 62 аминокислот, 28 аминокислот, 1 аминокислоты и 21 аминокислот, и которые распределены от амино-конца к карбоксильному концу последовательности, соответствующей аминокислотам 1-168 аминокислотной последовательности, показанной на фигуре 2 (SEQ ID NO:2). Примеры фрагментов белка коверсина представлены в виде SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14. ДНК, кодирующие соответствующие фрагменты, представлены в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13.
В такие фрагменты включены не только фрагменты белка коверсина O. moubata, который специально представлен в настоящем описании на фигуре 2, но также фрагменты гомологов такого белка, которые описаны выше. Такие фрагменты гомологов обычно будут иметь более чем 60% идентичность с фрагментами последовательности белка коверсина, приведенной на фигуре 2, хотя более предпочтительные фрагменты гомологов будут иметь степень идентичности более чем 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99%, соответственно, с фрагментами последовательности белка коверсина на фигуре 2. Конечно, фрагменты могут быть улучшены посредством рационального конструирования с использованием систематического получения мутаций и фрагментации последовательности дикого типа с последующими соответствующими анализами активности. Фрагменты могут проявлять сходную или более высокую аффинность по отношению к C5, либо к C5 дикого типа, либо к полиморфному варианту, либо к обоим, и/или к LTB4, чем коверсин.
Функциональный эквивалент, применяемый согласно изобретению, может представлять собой слитый белок, полученный, например, клонированием полинуклеотида, кодирующего белок коверсин, в рамке с кодирующими последовательностями для гетерологичной последовательности белка. Термин «гетерологичный» при использовании в настоящем описании предназначен для обозначения любого полипептида, отличного от белка коверсина или его функционального эквивалента. Примерами гетерологичных последовательностей, которые могут входить в состав растворимых слитых белков, либо на N-, либо на C-конце, являются следующие последовательности: внеклеточные домены связывающегося с мембранами белка, константные области иммуноглобулинов (Fc-область), домены мультимеризации, домены внеклеточных белков, сигнальные последовательности, последовательности для экспорта или последовательности, позволяющие осуществлять очистку с использованием аффинной хроматографии. Многие из таких гетерологичных последовательностей коммерчески доступны в экспрессирующих плазмидах, так как такие последовательности обычно включают в слитые белки, чтобы обеспечить дополнительные свойства без значительного нарушения специфичной биологической активности слитого с ним белка [27]. Примерами таких дополнительных свойств являются более длительное время полужизни в жидкостях организма, внеклеточная локализация или более легкая процедура очистки, которая обеспечивается меткой, такой как гистидин, GST, FLAG, авидин или HA-метка.
Белок коверсин и его функциональные эквиваленты могут быть получены в рекомбинантной форме в результате экспрессии в клетке-хозяине. Такие способы экспрессии хорошо известны специалистам в данной области и подробно описаны в [28] и [29]. Рекомбинантные формы белка коверсина и его функциональных эквивалентов предпочтительно негликозилированы.
Белки и фрагменты согласно настоящему изобретению также могут быть получены с использованием обычных способов химии белка. Например, белковые фрагменты могут быть получены посредством химического синтеза. Способы создания слитых белков являются стандартными в данной области и буду известны считающему специалисту. Например, большинство общих молекулярно-биологических, микробиологических способов, способов получения рекомбинантной ДНК и иммунологических способов можно найти в публикациях [28] или [30].
Способы введения.
Коверсин и его функциональные эквиваленты не требуют, чтобы введение осуществлял медицинский работник, и такие молекулы быстро всасываются. Многие рекомбинантные антитела всасываются очень медленно и в результате их необходимо инфузировать в течение длительных периодов времени (например, внутривенно). Таким образом, также требуется, чтобы введение таких молекул осуществлял медицинский работник. Таким образом, наряду с преимуществом, обусловленным более высокой эффективностью в ингибировании активации путей комплемента у субъектов с полиморфизмом C5, коверсин также обладает преимуществом, обусловленным более простым введением, чем введение других средств, таких как антитела, подобные экулизумабу.
Субъектом, которому вводят средство при практическом осуществлении изобретения, предпочтительно является млекопитающее, предпочтительно человек. Субъект может быть взрослым, ребенком или грудным ребенком. Субъект, которому вводят средство, также может страдать от опосредованного комплементом заболевания или расстройства. В частности, может быть известно или может предполагаться, что у субъект имеет полиморфизм C5 комплемента.
Средство вводят в терапевтически или профилактически эффективном количестве. Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству средства, необходимого для лечения опосредованного комплементом заболевания или расстройства, которое определено в настоящем описании. Термин «профилактически эффективное количество», используемый в настоящем описании, относится к количеству средства, необходимого для профилактики опосредованного комплементом заболевания или расстройства, которое определено в настоящем описании. Предпочтительно доза средства достаточна для максимального связывания доступного C5, насколько это возможно, у субъекта, более предпочтительно всего доступного C5. Альтернативно доза средства может быть достаточной для максимального, насколько это возможно, связывания LTB4 у субъекта, более предпочтительно всего доступного LTB4. В некоторых аспектах доза средства достаточна для максимального, насколько это возможно, связывания доступного C5 и LTB4, например, всего доступного C5 и LTB4. Доза вводимого средства является, по меньшей мере, двукратной молярной дозой, необходимой для связывания всего доступного C5 и/или LTB4 у субъекта. Доза вводимого средства может быть 2,5-кратной, 3-кратной или 4-кратной молярной дозой, необходимой для связывания всего доступного C5 и/или LTB4 у субъекта. Предпочтительной является доза, составляющая от 0,0001 мг/кг (масса лекарственного средства к массе пациента) до 20 мг/кг, предпочтительно от 0,001 мг/кг до 10 мг/кг, предпочтительно от 0,01 мг/кг до 2 мг/кг, предпочтительно от 0,1 мг/кг до 1 мг/кг; альтернативно от 0,2 мг/кг до 0,8 мг/кг; альтернативно от 0,3 мг/кг до 0,7 мг/кг; альтернативно от 0,4 мг/кг до 0,6 мг/кг; например 0,14 мг/кг или 0,57 мг/кг. Терапевтически или профилактически эффективное количество может быть дополнительно определено относительно ингибирования терминального комплемента, например, количество, которое означает, что активность терминального комплемента уменьшена, по меньшей мере, на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92,93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% по сравнению с активностью терминального комплемента в отсутствие лечения. Дозу и частоту можно корректировать, чтобы поддержать активность терминального комплемента на требуемом уровне, который может составлять, например, 10% или меньше, например, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% или меньше по сравнению с активностью терминального комплемента в отсутствие лечения.
Частота, с которой надо вводить дозы, будет зависеть от времени полужизни входящего в нее средства. В том случае, когда средство представляет собой белок коверсин или его функциональный эквивалент, дозу можно вводить в виде непрерывной инфузии, в виде болюсных доз или на ежедневной основе, на основе схемы введения два раза в день или каждые два, три, четыре дня, пять, шесть, семь, 10, 15 или 20 дней или больше. Как указано в настоящем описании, особым преимуществом белка коверсина и его функциональных эквивалентов является относительная простота и быстрота, с которой их можно вводить, и тот факт, что для введения не требуются медицинский персонал.
Можно вводить однократные или множественные дозы. Например, можно вводить, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6, 7, или 8 доз. Одним из вариантов являются однократные дозы. Точная доза и частота введения доз также зависят от состояния пациента во время введения. Факторы, которые могут быть приняты во внимание при определении дозы, включают необходимость в лечении или профилактике, тяжесть заболевания у пациента, общее состояние здоровья пациента, возраст, массу, пол, питание, время и частоту введения, сочетания лекарственных средств, реакционную чувствительность и переносимость или ответ пациента на терапию. Точное количество можно определить в рутинном эксперименте, но в конце концов решение принимает лечащий врач.
Схема дозирования также может быть в форме схему с начальной «нагрузочной дозой» с последующими одной или несколькими «поддерживающими дозами». В общем, нагрузочная доза будет больше, чем поддерживающая доза. Нагрузочная доза может быть в 2, 5, 10 или больше раз выше, чем поддерживающая доза. нагрузочную дозу можно вводить в виде однократной дозы или в виде одной или нескольких доз в конкретный период времени. Обычно нагрузочная доза будет представлять собой 1, 2, 3, 4 или 5 доз, вводимых в один 24-часовой период. Поддерживающая доза обычно будет представлять собой более низкую дозу, которую повторяют через регулярные интервалы, например, каждые 3, 4, 6, 8, 12, 24 или 48 часов. Точная схема может быть определена посредством рутинного экспериментирования, но в конце концов решение принимает лечащий врач.
Нагрузочная доза может составлять от 0,0001 мг/кг (масса лекарственного средства относительно массы пациента) до 20 мг/кг, и поддерживающая доза может составлять от 0,0001 мг/кг до 20 мг/кг; альтернативно нагрузочная доза составляет от 0,001 мг/кг до 10 мг/кг, и поддерживающая доза составляет от 0,001 мг/кг до 10 мг/кг, альтернативно нагрузочная доза составляет от 0,01 мг/кг до 2 мг/кг, и поддерживающая доза составляет от 0,01 мг/кг до 2 мг/кг; альтернативно нагрузочная доза составляет от 0,1 мг/кг до 1 мг/кг, и поддерживающая доза составляет от 0,1 мг/кг до 1 мг/кг; альтернативно нагрузочная доза составляет от 0,1 мг/кг до 1 мг/кг, и поддерживающая доза составляет от 0,05 мг/кг до 0,5 мг/кг; альтернативно нагрузочная доза составляет от 0,2 мг/кг до 0,8 мг/кг, и поддерживающая доза составляет от 0,1 мг/кг до 0,4 мг/кг; альтернативно нагрузочная доза составляет от 0,3 мг/кг до 0,7 мг/кг, и поддерживающая доза составляет от 0,1 мг/кг до 0,3 мг/кг; альтернативно нагрузочная доза составляет от 0,4 мг/кг до 0,6 мг/кг, и поддерживающая доза составляет от 0,1 мг/кг до 0,2 мг/кг, например, в том случае, когда нагрузочная доза составляет 0,57 мг/кг, поддерживающая доза составляет 0,14 мг/кг.
Нагрузочная доза может составлять от 0,0001мг/кг (масса лекарственного средства относительно массы пациента) до 20 мг/кг, и поддерживающая доза может составлять от 0,0001 мг/кг до 20 мг/кг; альтернативно поддерживающая доза может составлять от 0,001 мг/кг до 10 мг/кг, альтернативно поддерживающая доза может составлять от 0,01 мг/кг до 2 мг/кг; альтернативно поддерживающая доза может составлять от 0,1 мг/кг до 1 мг/кг; альтернативно поддерживающая доза может составлять от 0,1 мг/кг до 0,8 мг/кг; альтернативно поддерживающая доза может составлять от 0,1 мг/кг до 0,6 мг/кг; альтернативно поддерживающая доза может составлять от 0,1 мг/кг до 0,4 мг/кг; альтернативно поддерживающая доза может составлять от 0,1 мг/кг до 0,2 мг/кг.
Нагрузочная доза может составлять от 0,0001мг/кг (масса лекарственного средства относительно массы пациента) до 20 мг/кг, и поддерживающая доза может составлять от 0,0001 мг/кг до 20 мг/кг; альтернативно нагрузочная доза может составлять от 0,001 мг/кг до 10 мг/кг, альтернативно нагрузочная доза может составлять от 0,01 мг/кг до 2 мг/кг; альтернативно нагрузочная доза может составлять от 0,1 мг/кг до 1 мг/кг; альтернативно нагрузочная доза может составлять от 0,1 мг/кг до 1 мг/кг; альтернативно нагрузочная доза может составлять от 0,2 мг/кг до 0,8 мг/кг; альтернативно нагрузочная доза может составлять от 0,3 мг/кг до 0,6 мг/кг; альтернативно нагрузочная доза может составлять от 0,4 мг/кг до 0,6 мг/кг. Средство обычно можно вводить вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Термин «фармацевтически приемлемый носитель» в используемом в настоящем описании смысле включает гены, полипептиды, антитела, липосомы, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты и неактивные вирусные частицы или фактически любое другое средство при условии, что носитель сам по себе не индуцирует токсические эффекты или не вызывает продукцию антител, которые опасны для индивидуума, получающего фармацевтическую композицию. Фармацевтически приемлемые носители дополнительно могут содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор соли, глицерин, этанол, или вспомогательные вещества, такие как увлажнители или эмульгаторы, вещества для забуферивания pH и тому подобные. Таким образом, используемый фармацевтический носитель будет варьировать в зависимости от пути введения. Носители могут обеспечивать возможность приготовления фармацевтических композиций в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий, помогающих приему средства пациентом. Всестороннее обсуждение фармацевтически приемлемых носителей доступно в публикации [31].
Cредство может быть доставлено любым путем введения. Средство может быть доставлено местно или системно. Средство может быть доставлено парентеральным путем (например, путем инъекции, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно или доставлено в интерстициальное пространство ткани). Композиции также могут быть введены в место поражения. Другие способы введения включают пероральное и легочное введение, суппозитории и трансдермальные или чрезкожные аппликации, иглы и гипоспреи.
Предпочтительно средство доставляют посредством подкожной инъекции. В некоторых вариантах доставку осуществляют используя подкожную инъекцию один раз в сутки, например, в начальной нагрузочной дозе от 0,0001 мг/кг (масса лекарственного средства относительно массы пациента) до 20 мг/кг, с последующими поддерживающими дозами один раз в сутки от 0,0001 мг/кг до 20 мг/кг, или в других дозах, описанных в настоящей публикации. Альтернативно средство может быть доставлено посредством подкожной инъекции каждые два дня.
В предпочтительном варианте средство доставляют посредством подкожной инъекции один раз в сутки в начальной нагрузочной дозе 0,4 мг/кг-0,6 мг/кг (например, 0,57 мг/кг) с последующими поддерживающими дозами один раз в сутки 0,1 мг/кг-0,2 мг/кг (например, 0,14 мг/кг).
Средство можно вводить отдельно или в виде части схему лечения, также включающей в себя введение других лекарственных средств, используемых в настоящее время для лечения пациентов с опосредованным комплементом заболеванием или расстройством.
Средство можно вводить одновременно, последовательно или раздельно с другим лекарственным средством (средствами). Например, средство можно вводить до или после введения другого лекарственного средства (средств). В частности, средство можно вводить после того, как не удалось лечить предыдущим лекарственным средством опосредованное комплементом заболевание или расстройство. В конкретном варианте средство можно вводить после моноклонального анти-C5-антитела.
В конкретных вариантах:
(i) опосредованным комплементом заболеванием является пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ);
(ii) полиморфизм C5 комплемента по остатку Arg885;
(iii) средством для лечения является белок коверсин или фрагменты или гомологи белка коверсин, при условии, что такие фрагменты сохраняют способность связывать C5 дикого типа и/или C5 субъектов с полиморфизмом C5;
(iv) средство доставляют подкожно.
В некоторых вариантах подкожную инъекцию осуществляют один раз в сутки в начальной нагрузочной дозе 0,4 мг/кг-0,6 мг/кг (масса лекарственного средства относительно массы пациента) с последующими поддерживающими дозами один раз в сутки 0,1 мг/кг-0,2 мг/кг; более предпочтительно в начальной нагрузочной дозе 0,57 мг/кг (масса лекарственного средства относительно массы пациента) с последующими поддерживающими дозами 0,14 мг/кг один раз в сутки.
В конкретных вариантах:
(i) опосредованным комплементом заболеванием является болезнь трансплантат против хозяина (GvHD);
(ii) полиморфизм C5 комплемента по остатку Arg885;
(iii) средством для лечения является белок коверсин или фрагменты или гомологи белка коверсин, при условии, что такие фрагменты сохраняют способность связывать C5 дикого типа и/или C5 субъектов с полиморфизмом C5;
(iv) средство доставляют подкожно.
В некоторых вариантах подкожную инъекцию осуществляют один раз в сутки в начальной нагрузочной дозе 0,4 мг/кг-0,6 мг/кг (масса лекарственного средства относительно массы пациента) с последующими поддерживающими дозами один раз в сутки 0,1 мг/кг-0,2 мг/кг; более предпочтительно в начальной нагрузочной дозе 0,57 мг/кг (масса лекарственного средства относительно массы пациента) с последующими поддерживающими дозами 0,14 мг/кг один раз в сутки.
В конкретных вариантах:
(i) опосредованным комплементом заболеванием является тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (TTP);
(ii) полиморфизм C5 комплемента по остатку Arg885;
(iii) средством для лечения является белок коверсин или фрагменты или гомологи белка коверсин, при условии, что такие фрагменты сохраняют способность связывать C5 дикого типа и/или C5 субъектов с полиморфизмом C5;
(iv) средство доставляют подкожно.
В некоторых вариантах подкожную инъекцию осуществляют один раз в сутки в начальной нагрузочной дозе 0,4 мг/кг-0,6 мг/кг (масса лекарственного средства относительно массы пациента) с последующими поддерживающими дозами один раз в сутки 0,1 мг/кг-0,2 мг/кг; более предпочтительно в начальной нагрузочной дозе 0,57 мг/кг (масса лекарственного средства относительно массы пациента) с последующими поддерживающими дозами 0,14 мг/кг один раз в сутки.
В конкретных вариантах:
(i) опосредованным комплементом заболеванием является атипический гемолитико-уремический синдром (aHUS);
(ii) полиморфизм C5 комплемента по остатку Arg885;
(iii) средством для лечения является белок коверсин или фрагменты или гомологи белка коверсин, при условии, что такие фрагменты сохраняют способность связывать C5 дикого типа и/или C5 субъектов с полиморфизмом C5;
(iv) средство доставляют подкожно.
В некоторых вариантах подкожную инъекцию осуществляют один раз в сутки в начальной нагрузочной дозе 0,4 мг/кг-0,6 мг/кг (масса лекарственного средства относительно массы пациента) с последующими поддерживающими дозами один раз в сутки 0,1 мг/кг-0,2 мг/кг; более предпочтительно в начальной нагрузочной дозе 0,57 мг/кг (масса лекарственного средства относительно массы пациента) с последующими поддерживающими дозами 0,14 мг/кг один раз в сутки.
Различные аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения далее буду описаны более подробно с помощью примера. Будет понятно, что может быть осуществлена модификация подробного варианта, не выходя за рамки объема изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР:
На Фиг. 1 показана схематичная диаграмма классического и альтернативного путей активации комплемента. Ферментные компоненты, темно-серый. Анафилотоксины заключены в рамки в виде звезды.
На Фиг. 2 показана первичная последовательность коверсина. Сигнальная последовательность подчеркнута. Остатки цистеина выделены жирным шрифтом. Номера нуклеотидом и аминокислот указаны справа.
На Фиг. 3 показаны количества тромбоцитов в пиках и самых низких точках от пациента, которого лечили, как описано в примере 2.
На Фиг. 4 показано тестирование in vitro сыворотки пациента, описанного в примере 4, в анализе CH50 после впрыскивания разных доз коверсина и экулизумаба (выражено в процентах от контроля). Показана активность комплемента в процентах в сыворотке от пациента, описанного в примере 4, по сравнению с контрольной сывороткой в присутствии экулизумаба или коверсина. Обозначения: Ecu, впрыскивание экулизумаба; Cov, впрыскивание коверсина. NC3, нормальная контрольная сыворотка; R2, сыворотка пациента.
На Фиг. 5 показано тестирование in vitro сыворотки от пациента, описанного в примере 4, в анализе CH50 после впрыскивания разных доз коверсина и экулизумаба. Показана активность комплемента в единицах эквивалентов CH50/мл в сыворотке от пациента, описанного в примере 4, по сравнению с контрольной сывороткой в присутствии экулизумаба или коверсина. Обозначения: Ecu, впрыскивание экулизумаба; Cov, впрыскивание коверсина. NC3, нормальная контрольная сыворотка; R2, сыворотка пациента.
На Фиг. 6 показано тестирование in vitro сыворотки от пациента, описанного в примере 3, в анализе CH50 после впрыскивания разных доз коверсина и экулизумаба (выражено в процентах от контроля). Показана активность комплемента от пациента, описанного в примере 3, в процентах по сравнению с контрольной сывороткой в присутствии экулизумаба или коверсина. Обозначения: Ecu, впрыскивание экулизумаба; Cov, впрыскивание коверсина. NC, нормальная контрольная сыворотка; BJ1, повтор 1 с использованием сыворотки пациента; BJ2, повтор 2 с использованием сыворотки пациента.
На Фиг. 7 показано тестирование in vitro сыворотки от пациента, описанного в примере 3, в анализе CH50 после впрыскивания разных доз коверсина и экулизумаба. Показана активность комплемента в единицах эквивалентов CH50/мл для пациента, описанного в примере 3, в присутствии экулизумаба или коверсина. Обозначение: Ecu, впрыскивание экулизумаба; Cov, впрыскивание коверсина. BJ1 и BJ2 названы Pat 1a и Pat 1b.
На Фиг. 8 представлена молекулярная модель, показывающая положение эпитопа экулизумаба и вероятного сайта связывания коверсина.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Ингибирование in vitro активности C5.
50
Активность терминального комплемента измеряли в сыворотке 4-летнего пациента мужского пола европеоидной расы, у которого обнаружен редкий генетический полиморфизм в гене, кодирующем C5 комплемента (c.2654G>A (p.Arg885His)), используя анализ гемолиза CH Quidel.
Ферментный иммуноанализ Quidel Microvue CH50 Eq (№ в каталоге A018) использовали для измерения in vitro общей активности классического пути в сыворотке человека. http://www.quidel.com/sites/quidel.com/files/product/documents/a018_microvue_ch50_eq_english_1.pdf.
Набор обеспечивает прямое измерение образования терминального комплекса комплемента (TCC) в стандартных условиях. Измерение CH50 с использованием набора состоит из 3 стадий:
1. Активация классического пути комплемента в неразбавленной сыворотке, приводящая к образованию TCC.
2. Разбавление сыворотки и добавление в лунки для микроанализа, покрытые антителом, которое улавливает TCC.
3. Количественная оценка улавливаемого TCC с использованием анти-TCC-антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP).
Интенсивность окраски при добавлении субстрата пропорциональна концентрации TCC, присутствующего в каждой реакционной смеси. Используя стандартную кривую для набора (определяемую во время каждого анализа), результаты анализа выражают в единичных эквивалентах CH50 на миллилитр (CH50 ед. экв./мл).
Линейный диапазон для набора составляет 30-310 ед. экв./мл.
Согласно данным производителей предел отсечения, определенный для нормы на основании данных, полученных для образцов от 234 человек, составляет 70 CH50 ед. экв./мл.
После лечения экулизумабом у пациента сохранялось 70% активности комплемента по сравнению с активностью комплемента в сыворотке нормального контроля с C5 дикого типа.
Впрыскивание в сыворотку, взятую после введения экулизумаба, 30, 60 и 120 мкг/мл коверсина приводило к нерегистрируемым уровням активности комплемента.
Таким образом, у пациента, не отвечающего на лечение экулизумабом, коверсин сохранял нормальную эффективность.
Пример 2 - Исследование случая
Пациент европеоидной расы мужского пола 4-летнего возраста с массой 13,6 кг получил первичный диагноз: хроническая гранулематозная болезнь, и был подвергнут трансплантации стволовых клеток в октябре 2013 года. Затем у пациента развилось обширное желудочно-кишечное кровотечение вследствие тромбоцитопении, и он в настоящее время ежедневно получает переливание тромбоцитов. Диагноз: либо болезнь трансплантат против хозяина (GvHD), либо тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (TTP).
Лечение экулизумабом, инфликсимабом и ритуксимабом было безуспешным.
У пациента был обнаружен редкий генетический полиморфизм в гене, кодирующем C5 комплемента (c.2654G>A (p.Arg885His)), ранее описанный только у японцев и ханьцев в Китае.
Анализы in vitro активности комплемента в сыворотке, которые описаны выше, показали, что активность комплемента составляла ~70% гемолитической активности по сравнению с нормальным контролем после лечения экулизумабом. Напротив, впрыскивание в сыворотку коверсина в концентрации 30, 60 и 120 мкг/мл снижало гемолитическую активность до нерегистрируемых уровней.
После идентификации чувствительности к ингибированию путей комплемента коверсином было начато следующее лечение:
Коверсин посредством подкожной инъекции согласно следующей схеме:
начальная нагрузочная доза: 0,57 мг/кг=7,8 мг (0,7 мл);
затем поддерживающая доза: 0,14 мг/кг=1,9 мг (0,2 мл) каждые 24 часа.
Сыворотку будут брать ежедневно для определения активности комплемента, и дозу и/или частоту будут корректировать, чтобы поддерживать активность терминального комплемента на уровне 10% или меньше по сравнению с нормальной контрольной сывороткой.
Также будет проведено наблюдение за следующими результатами:
a) изменение в минимальных количеств тромбоцитов;
b) изменение LDH в сыворотке;
50
c) активность терминального комплемента, измеренная в анализе гемолиза Quidel CH.
Пример 3 - Результаты исследования случая.
Пациента, описанного в примере 2, лечили коверсином в течение примерно 6 недель. В первый день лечения получаемую пациентом дозу рассчитывали так, чтобы удалить циркулирующий C5 (0,57 мг/кг) и затем использовали 50% такой дозы до конца второй недели. Затем пациент получал такую же дозу через день в течение двух недель, и затем половинную дозу от указанной в течение следующих двух недель. Следует отметить, что доза, начиная с третьей недели и далее, вероятно была недостаточной, чтобы полностью контролировать активность терминального комплемента.
Клинически у пациента наблюдалась стабилизация в течение периода, когда он получал полную дозу. Основным последствием его заболевания, которое предположительно представляло тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (TTP) было тяжелое уменьшение количества тромбоцитов, по поводу которого он получал две единицы тромбоцитов каждый день в течение нескольких месяцев. После 7 дней лечения коверсином остаточные количества тромбоцитов (примерно через 12 часов после переливания тромбоцитов) начинали увеличиваться, достигая 98000 на 14 день, наибольшее количество, которое было зарегистрировано в течение всего периода болезни.
В указанный момент его потребность в переливании тромбоцитов была уменьшена до одной единицы в сутки (смотри фигуру 3).
Доза была снижена в начале третьей недели и остаточные количества тромбоцитов упали ниже 50000 и не восстанавливались в течение остального периода его болезни. Повышение остаточного количества тромбоцитов и уменьшенная потребность в переливании тромбоцитов рассматривалась медицинским персоналом как четкое свидетельство положительного ответа на коверсин. Ухудшение после снижения дозы, по-видимому, подтверждает такой положительный ответ.
Последняя доза коверсина была дана через 6 недель, и состояние пациента быстро ухудшилось и он умер от перфорации тонкой кишки спустя еще 2 недели.
Пример 4 - Исследование случая
У пациент мужского пола в возрасте от сорока до пятидесяти лет диагностирована ПНГ и его лечили экулизумабом в течение примерно года без адекватного клинического ответа. Генетический анализ подтвердил гетерозиготный полиморфизм C5 в положении c.2654, но не было известно, к какому сдвигу аминокислоты это приводит, хотя известно, что этот не pArg885His.
Пример 5 - Активность терминального комплемента в сыворотке пациентов.
Реагенты и образцы.
Подготовка образца: Сыворотку получали, собирая кровь в пробирки из бесцветного стекла или в пробирки SST Vacutainer (или эквивалентные) и давали возможность свернуться в течение 1 часа, затем центрифугировали при 1500 g в течение 10 минут. Сыворотку сразу же отделяли (избегая контаминации какими-либо клетками крови) и хранили в криопробирках с завинчивающейся крышкой (аликвоты приблизительно по 0,5 мл) при -70°C.
Коверсин: Замороженный раствор 10,9 мг/мл при -70°C. Разбавляют 10 мкл в 90 мкл нормальной контрольной сыворотки или сыворотки пациента, получая конечную концентрацию 1,09 мг/мл. Разбавляют 10 мкл в 90 мкл аутологичной сыворотки, получая конечную концентрацию 109 мкг/мл. Делают двукратные разведения в аутологичной сыворотке, чтобы достичь конечной концентрации в диапазоне: 0,4-54,5 мкг/мл.
Экулизумаб: Замороженный раствор 10 мг/мл. Разбавляют 10 мкл в 90 мкл нормальной контрольной сыворотки или сывороткой пациента, получая конечную концентрацию 1 мг/мл. Разбавляют 10 мкл в 90 мкл аутологичной сыворотки, получая конечную концентрацию 100 мкг/мл. Делают двукратные разведения в аутологичной сыворотке, достигая конечной концентрации в диапазоне: 0,4-50 мкг/мл.
Буфер: Фосфатно-солевой буфер (0,01 М фосфатный буфер, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорид натрия, pH 7,4).
Способы.
Коверсин, экулизумаб или буфер (контроль) впрыскивали в сыворотку согласно способу, описанному выше, достигая диапазона конечных концентраций. Затем их анализировали в отношении активности эквивалента CH50, используя набор Quidel CH50 и лунки в двух повторах.
Результаты.
Вычисляют значения CH50 на основании калибровочной кривой, предоставляемой вместе с набором. Результаты изображают на графике в виде не подвергнутых обработке значений CH50 против концентрации ингибитора C5.
Вычисляют результат CH50 для каждой концентрации ингибитора C5 в виде процента CH50 для концентрации по сравнению с соответствующим контрольным буфером. Откладывают на графике результаты CH50 в процентах против концентрации ингибитора.
Повторяют эксперимент в другие дни, чтобы получить 3 измерения для каждого пациента и одного нормального контроля. При этом получают оценку вариабельности в экспериментах.
Повторяют эксперимент в другие дни в отдельных экспериментах на 6 разных нормальных контролях. При этом получают оценку чувствительности субъектов (и избегают риска, возникающего при использовании одного субъекта, который может иметь неизвестную мутацию или полиморфизм C5).
Наивысшую доза каждого лекарственного средства добавляли в сыворотку и затем двукратно серийно разбавляли в цельной сыворотке. Использовали один повтор для каждой дозы лекарственного средства.
Наивысшая доза экулизумаба составляла 50 мкг/мл, затем 25, 12,5, 6,3, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 и 0 мкг/мл. Наивысшая доза коверсина составляла 54,5 мкг/мл, затем 27,3, 13,1, 6,6, 3,3, 1,7, 0,9 и 0 мкг/мл.
После серийного разведения сыворотку активировали и анализировали согласно инструкциям для набора Quidel CH50.
CH50 ед. экв./мл вычисляли в сравнении со стандартами в наборе и откладывали на графике против концентрации лекарственного средства для каждого из трех образцов сыворотки и лечения двумя лекарственными средствами. Результаты также откладывали на графике в виде процента значения CH50 только от соответствующего контрольного буфера.
Нормальную сыворотку человека и сыворотку пациентов, полученную в исследованиях случаев, тестировали в отношении активности терминального комплемента в присутствии экулизумаба и коверсина, как описано выше.
Как показано на фигурах 6 и 7, в отсутствие какого-либо лекарственного средства значения CH50 исходного уровня для образца нормальной сыворотки человека (среднее 78,1 CH50 ед. экв./мл) и двух образцов сыворотки пациента, полученных от пациента, описанного в примерах 2 и 3 исследований случаев (среднее 82,4 и 60,6 CH50 ед. экв./мл) были в пределах (нормальный контроль и BJ 2) или немного ниже (BJ 1) нормального диапазона для человека >70 CH50 ед. экв./мл.
Коверсин ингибировал как нормальную человека, так и сыворотку от пациента с полиморфизмом p.Arg885His в равной мере хорошо. Менее 5% CH50 (ед. экв./мл) исходного уровня наблюдали при концентрациях коверсина приблизительно 15 мкг/мл.
Экулизумаб ингибировал нормальную сыворотку человека при ожидаемой дозе, при этом менее 5% CH50 (ед. экв./мл) исходного уровня наблюдали при концентрациях приблизительно 45 мкг/мл. В дозах выше 25 мкг/мл экулизумаб ингибировал активность комплемента, измеряемого с использованием набора Quidel CH50, сходным образом в случае нормальной сыворотки человека и сыворотки от пациента с полиморфизмом p.Arg885His. Однако он полностью не ингибировал сыворотку от пациента, при этом приблизительно 20% CH50 исходного уровня сохранялось при наивысшей тестируемой дозе экулизумаба (60 мкг/мл).
Сыворотку от пациента, описанного в примере 4, также тестировали параллельно с нормальной сывороткой человека. Как показано на фигурах 4 и 5, в отсутствие какого-либо лекарственного средства значения CH50 исходного уровня для образцов нормальной сыворотки человека и образцов сыворотки от пациента были в пределах нормального диапазона для человека >70 CH50 ед. экв./мл.
Коверсин ингибировал как нормальную сыворотку человека, так и сыворотку от пациента с аминокислотной заменой в Arg885 в равной мере хорошо. Менее 5% CH50 (ед. экв./мл) исходного уровня наблюдали при концентрациях коверсина приблизительно 15 мкг/мл.
Экулизумаб ингибировал нормальную сыворотку человека при ожидаемой дозе, при этом было достигнуто менее 5% CH50 (ед. экв./мл) исходного уровня. Подобно сыворотке пациента, описанного в примере 2, эклизумаб в дозах выше 25 мкг/мл ингибировал активность комплемента сходным образом в нормальной сыворотке человека и в сыворотке от пациента, описанного в примере 4, но полностью не ингибировал сыворотку от пациента, описанного в примере 4, при этом оставалось приблизительно 10% CH50 исходного уровня при наивысшей тестируемой дозе экулизумаба (50 мкг/мл).
Экулизумаб не полностью ингибировал активность комплемента в сыворотке от двух пациентов (пример 2 и пример 4), которые не получали пользу от терапевтического лечения экулизумабом. Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что ингибирование комплемента при лечении ПНГ должно быть выше, чем в данном случае, чтобы наблюдать терапевтическую пользу.
Используя рекомбинантную экспрессию, Nishimura с соавторами (2014) показали, что полиморфизм C5 p.Arg885His, наблюдаемый у пациента в примере 2, полностью исключает связывание экулизумаба с C5. Частичное ингибирование комплемента сыворотки пациента, описанного в примере 2, экулизумабом, показанное в настоящем исследовании (фигуры 6 и 7) вполне понятно, так как пациент в примере 2 и все другие индивидуумы с полиморфизмом, идентифицированные до настоящего времени, являются гетерозиготными с нормальной копией C5 и копией p.Arg885His C5. Если обе копии будут полностью экспрессироваться, экулизумаб будет полностью ингибировать 50% белка C5, присутствующего у таких индивидуумов. Тот факт, что наблюдали только 20% остаточной активности CH50, может отражать факт того, что пациент в примере 2 получал свежие препараты крови каждый день, что вероятно повышало отношение нормального C5 к C5 p.Arg885His, тем самым снижая относительное количество C5 p.Arg885His, не ингибируемого экулизумабом.
Экулизумаб, по-видимому, ингибирует сыворотку пациента в примере 4 в большей степени, чем сыворотку пациента в примере 2, хот некоторая остаточная активность комплемента сохранялась даже при наивысшей дозе экулизумаба. Возможным объяснением является тот факт, что аминокислотное изменение в Arg885 является консервативным изменением, которое оказывает менее выраженный эффект на связывание экулизумаба, чем p.Arg885His.
Напротив, коверсин является в равной мере эффективным ингибитором нормальной сыворотки человека и сывороток от двух пациентов, которые не полностью ингибируются экулизумабом. Полное ингибирование коверсином понятно, так как он, вероятно, связывается с другим участком на C5, чем экулизумаб. Кроме того, было показано, что коверсин является в равной мере эффективным ингибитором C5 у широкого круга видов млекопитающих, включая человека, макак-крабоедов, свиней, крыс, мышей, кроликов и морских свинок. Полученные данные показывают, что связывание коверсина с C5 гораздо более толерантно к различиям в аминокислотной последовательности C5, чем в случае экулизумаба, который способен ингибировать только C5 человека. Коверсин следует рассматривать в качестве средства лечения пациентов, которые могут получить пользу от ингибирования C5, но которые получают небольшую или не получают пользы при терапевтическом лечении в результате ведения экулизумаба вследствие полиморфизмов в C5, которые предотвращают или снижают аффинность взаимодействия при связывании между экулизумабом и C5.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
[1] Pfarr N, et al. J Immunol. 174(7):4172-7. (2005) Erratum in: J Immunol.;182(8): 5152.
[2] Delgado-Cerviño E, Fontán G, López-Trascasa M. Mol Immunol. 42(1): 105-11. (2005).
[3] Halangk J, et al., J Hepatol. 49(3): 339-45 (2008).
[4] Nishimura, J et a;., New Engl J. Med., 30;7: 632-639 (2014).
[5] Wang X, Fleischer DT, Whitehead WT, Haviland DL, Rosenfeld SI, Leddy JP, Snyderman R, Wetsel RA. J Immunol. 154(10): 5464-71, (1995).
[6] Jakowski et al., Clin Diagn Lab Immunol. 6(1): 137-139 (1999).
[7] Freslund et al., Nature Immunology 9, 753-760 (2008).
[8] Zuber et al. Nature Reviews Nephrology 8, 643-657.
[9] Hobart, M. J., et al., Annals of Human Genetics 45.1 (1981): 1-4.
[10] Jakowski et al., Clin Diagn Lab Immunol. 6(1): 137-139 (1999).
[11] Sahu et al., Immunopharmacology, 49:133-148 (2000).
[12] Ricklin D & Lambris J, Nature Biotechnology, 25: 1265-1275 (2007).
[13] WO 2007/028968.
[14] WO 2008/029169.
[15] WO 2008/029167.
[16] WO 2011/083317.
[17] Guo, R.F. and P.A. Ward, Annu Rev Immunol, 2005, 23: p. 821-52.
[18] Neumann, E., et al., Arthritis Rheum, 2002. 46(4): p. 934-45.
[19] Williams, A.S., et al., Arthritis Rheum, 2004, 50(9): p. 3035-44.
[20] Quigg, R.J., Curr Dir Autoimmun, 2004. 7: p. 165-80.
[21] Papagianni, A.A., et al., Nephrol Dial Transplant, 2002, 17(1): p. 57-63.
[22] He, C., et al., J Immunol, 2005. 174(9): p. 5750-7.
[23] Mead, R.J., et al., J Immunol, 2002. 168(1): p. 458-65.
[24] Nakashima, S., et al., J Immunol, 2002. 169(8): p. 4620-7/
[25] WO 2004/106369.
[26] WO 2009/098454.
[27] Terpe K, Appl Microbiol Biotechnol, 60: 523-33, 2003.
et al
[28] Sambrook  (2000).
[29] Fernandez & Hoeffler (1998).
et al.
[30] Ausubel (1991).
[31] Remington's Pharmaceutical Sciences; Mack Pub. Co., N.J. 1991.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>   VOLUTION IMMUNO PHARMACEUTICALS SA
<120>   СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ
<130>   P064023WO
<141>   2015-05-28
<160>   14
<170>   SeqWin2010, version 1.0
<210>   1
<211>   507
<212>   ДНК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   1
atgctggttt tggtgaccct gattttctcc ttttctgcga acatcgcata tgctgacagc  60
gaaagcgact gcactggaag cgaacctgtt gacgccttcc aagctttcag tgagggcaaa  120
gaggcatatg tcctggtgag gtccacggat cccaaagcga gggactgctt gaaaggagaa  180
ccagccggag aaaagcagga caacacgttg ccggtgatga tgacgtttaa gaatggcaca  240
gactgggctt caaccgattg gacgtttact ttggacggcg caaaggtaac ggcaaccctt  300
ggtaacctaa cccaaaatag ggaagtggtc tacgactcgc aaagtcatca ctgccacgtt  360
gacaaggtcg agaaggaagt tccagattat gagatgtgga tgctcgatgc gggagggctt  420
gaagtggaag tcgagtgctg ccgtcaaaag cttgaagagt tggcgtctgg caggaaccaa  480
atgtatcccc atctcaagga ctgctag                                      507
<210>   2
<211>   168
<212>   БЕЛОК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   2
Met Leu Val Leu Val Thr Leu Ile Phe Ser Phe Ser Ala Asn Ile Ala
1               5                   10                  15
Tyr Ala Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala
20                  25                  30
Phe Gln Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser
35                  40                  45
Thr Asp Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu
50                  55                  60
Lys Gln Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr
65                  70                  75                  80
Asp Trp Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val
85                  90                  95
Thr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp
100                 105                 110
Ser Gln Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro
115                 120                 125
Asp Tyr Glu Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val
130                 135                 140
Glu Cys Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln
145                 150                 155                 160
Met Tyr Pro His Leu Lys Asp Cys
165
<210>   3
<211>   453
<212>   ДНК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   3
gacagcgaaa gcgactgcac tggaagcgaa cctgttgacg ccttccaagc tttcagtgag  60
ggcaaagagg catatgtcct ggtgaggtcc acggatccca aagcgaggga ctgcttgaaa  120
ggagaaccag ccggagaaaa gcaggacaac acgttgccgg tgatgatgac gtttaagaat  180
ggcacagact gggcttcaac cgattggacg tttactttgg acggcgcaaa ggtaacggca  240
acccttggta acctaaccca aaatagggaa gtggtctacg actcgcaaag tcatcactgc  300
cacgttgaca aggtcgagaa ggaagttcca gattatgaga tgtggatgct cgatgcggga  360
gggcttgaag tggaagtcga gtgctgccgt caaaagcttg aagagttggc gtctggcagg  420
aaccaaatgt atccccatct caaggactgc tag                               453
<210>   4
<211>   150
<212>   БЕЛОК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   4
Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln
1               5                   10                  15
Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp
20                  25                  30
Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln
35                  40                  45
Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp
50                  55                  60
Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln
85                  90                  95
Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr
100                 105                 110
Glu Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys
115                 120                 125
Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr
130                 135                 140
Pro His Leu Lys Asp Cys
145                 150
<210>   5
<211>   450
<212>   ДНК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   5
agcgaaagcg actgcactgg aagcgaacct gttgacgcct tccaagcttt cagtgagggc  60
aaagaggcat atgtcctggt gaggtccacg gatcccaaag cgagggactg cttgaaagga  120
gaaccagccg gagaaaagca ggacaacacg ttgccggtga tgatgacgtt taagaatggc  180
acagactggg cttcaaccga ttggacgttt actttggacg gcgcaaaggt aacggcaacc  240
cttggtaacc taacccaaaa tagggaagtg gtctacgact cgcaaagtca tcactgccac  300
gttgacaagg tcgagaagga agttccagat tatgagatgt ggatgctcga tgcgggaggg  360
cttgaagtgg aagtcgagtg ctgccgtcaa aagcttgaag agttggcgtc tggcaggaac  420
caaatgtatc cccatctcaa ggactgctag                                   450
<210>   6
<211>   149
<212>   БЕЛОК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   6
Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala
1               5                   10                  15
Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro
20                  25                  30
Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp
35                  40                  45
Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala
50                  55                  60
Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser
85                  90                  95
His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu
100                 105                 110
Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys
115                 120                 125
Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro
130                 135                 140
His Leu Lys Asp Cys
145
<210>   7
<211>   447
<212>   ДНК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   7
gaaagcgact gcactggaag cgaacctgtt gacgccttcc aagctttcag tgagggcaaa  60
gaggcatatg tcctggtgag gtccacggat cccaaagcga gggactgctt gaaaggagaa  120
ccagccggag aaaagcagga caacacgttg ccggtgatga tgacgtttaa gaatggcaca  180
gactgggctt caaccgattg gacgtttact ttggacggcg caaaggtaac ggcaaccctt  240
ggtaacctaa cccaaaatag ggaagtggtc tacgactcgc aaagtcatca ctgccacgtt  300
gacaaggtcg agaaggaagt tccagattat gagatgtgga tgctcgatgc gggagggctt  360
gaagtggaag tcgagtgctg ccgtcaaaag cttgaagagt tggcgtctgg caggaaccaa  420
atgtatcccc atctcaagga ctgctag                                      447
<210>   8
<211>   148
<212>   БЕЛОК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   8
Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe
1               5                   10                  15
Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys
20                  25                  30
Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp Asn
35                  40                  45
Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala Ser
50                  55                  60
Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser His
85                  90                  95
His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu Met
100                 105                 110
Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys Arg
115                 120                 125
Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro His
130                 135                 140
Leu Lys Asp Cys
145
<210>   9
<211>   444
<212>   ДНК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   9
agcgactgca ctggaagcga acctgttgac gccttccaag ctttcagtga gggcaaagag  60
gcatatgtcc tggtgaggtc cacggatccc aaagcgaggg actgcttgaa aggagaacca  120
gccggagaaa agcaggacaa cacgttgccg gtgatgatga cgtttaagaa tggcacagac  180
tgggcttcaa ccgattggac gtttactttg gacggcgcaa aggtaacggc aacccttggt  240
aacctaaccc aaaataggga agtggtctac gactcgcaaa gtcatcactg ccacgttgac  300
aaggtcgaga aggaagttcc agattatgag atgtggatgc tcgatgcggg agggcttgaa  360
gtggaagtcg agtgctgccg tcaaaagctt gaagagttgg cgtctggcag gaaccaaatg  420
tatccccatc tcaaggactg ctag                                         444
<210>   10
<211>   147
<212>   БЕЛОК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   10
Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys Ala
20                  25                  30
Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp Asn Thr
35                  40                  45
Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala Ser Thr
50                  55                  60
Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr Leu Gly
65                  70                  75                  80
Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser His His
85                  90                  95
Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu Met Trp
100                 105                 110
Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys Arg Gln
115                 120                 125
Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro His Leu
130                 135                 140
Lys Asp Cys
145
<210>   11
<211>   441
<212>   ДНК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   11
gactgcactg gaagcgaacc tgttgacgcc ttccaagctt tcagtgaggg caaagaggca  60
tatgtcctgg tgaggtccac ggatcccaaa gcgagggact gcttgaaagg agaaccagcc  120
ggagaaaagc aggacaacac gttgccggtg atgatgacgt ttaagaatgg cacagactgg  180
gcttcaaccg attggacgtt tactttggac ggcgcaaagg taacggcaac ccttggtaac  240
ctaacccaaa atagggaagt ggtctacgac tcgcaaagtc atcactgcca cgttgacaag  300
gtcgagaagg aagttccaga ttatgagatg tggatgctcg atgcgggagg gcttgaagtg  360
gaagtcgagt gctgccgtca aaagcttgaa gagttggcgt ctggcaggaa ccaaatgtat  420
ccccatctca aggactgcta g                                            441
<210>   12
<211>   146
<212>   БЕЛОК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   12
Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe Ser Glu
1               5                   10                  15
Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys Ala Arg
20                  25                  30
Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp Asn Thr Leu
35                  40                  45
Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala Ser Thr Asp
50                  55                  60
Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser His His Cys
85                  90                  95
His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu Met Trp Met
100                 105                 110
Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys Arg Gln Lys
115                 120                 125
Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro His Leu Lys
130                 135                 140
Asp Cys
145
<210>   13
<211>   438
<212>   ДНК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   13
tgcactggaa gcgaacctgt tgacgccttc caagctttca gtgagggcaa agaggcatat  60
gtcctggtga ggtccacgga tcccaaagcg agggactgct tgaaaggaga accagccgga  120
gaaaagcagg acaacacgtt gccggtgatg atgacgttta agaatggcac agactgggct  180
tcaaccgatt ggacgtttac tttggacggc gcaaaggtaa cggcaaccct tggtaaccta  240
acccaaaata gggaagtggt ctacgactcg caaagtcatc actgccacgt tgacaaggtc  300
gagaaggaag ttccagatta tgagatgtgg atgctcgatg cgggagggct tgaagtggaa  360
gtcgagtgct gccgtcaaaa gcttgaagag ttggcgtctg gcaggaacca aatgtatccc  420
catctcaagg actgctag                                                438
<210>   14
<211>   145
<212>   БЕЛОК
<213>   Ornithodoros moubata
<400>   14
Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gln Ala Phe Ser Glu Gly
1               5                   10                  15
Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp Pro Lys Ala Arg Asp
20                  25                  30
Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gln Asp Asn Thr Leu Pro
35                  40                  45
Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp Ala Ser Thr Asp Trp
50                  55                  60
Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala Thr Leu Gly Asn Leu
65                  70                  75                  80
Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp Ser Gln Ser His His Cys His
85                  90                  95
Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro Asp Tyr Glu Met Trp Met Leu
100                 105                 110
Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val Glu Cys Cys Arg Gln Lys Leu
115                 120                 125
Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln Met Tyr Pro His Leu Lys Asp
130                 135                 140
Cys
145