ПРОИЗВОДНОЕ СИТАКСЕНТАНА
DERIVATIVES OF SITAXENTHAN

Область техники
[0001] Настоящее изобретение относится к соединению с фталановым кольцом. Более конкретно, оно относится к N-(4-хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)-2-[2-(6-метил-1,3-дигидро-2-бензофуран-5-ил)ацетил]тиофен-3-сульфонамиду и его аналогам.
Предшествующий уровень техники
[0002] Тиенилсульфонамидные соединения известны как антагонисты рецептора эндотелина. Например, ситаксентан, также известный как N-(4-хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)-2-[2-(6-метил-2H-1,3-бензодиоксол-5-ил)ацетил]тиофен-3-сульфонамид, является соединением, которое было представлено на рынке для эффективности при легочной артериальной гипертензии и других состояниях (патентная литература 1).
[0003] Однако структура ситаксентана содержит бензодиоксольное кольцо, и, как правило, соединения с такими бензодиоксольными кольцами превращаются в химически высокореактивные метаболиты при метаболизировании цитохромом P450 (CYP) и, как известно, необратимо ингибируют активность CYP путем инактивации на основе ковалентного связывания с CYP (непатентная литература 1-3). Известно, что ситаксентан как таковой обладает ингибиторной активностью по отношению к CYP, и имеется несколько сообщений о межлекарственных взаимодействиях с клинически используемыми медицинскими препаратами. Для решения этой проблемы разработали соединение с атомом дейтерия, замещающим атом водорода на углероде метилена бензодиоксолильной группы ситаксентана, но такое соединение еще не применяется в коммерческом масштабе, и его эффекты не были удовлетворительными (патентная литература 2). Также известно, что соединения, содержащие дейтерий, как правило, требуют более дорогостоящего получения. Следовательно, для решения этой проблемы необходим способ, при котором не используется дейтерий.
Список литературы
Патентная литература
[0004]
[Патентная литература 1] WO 96/31492.
[Патентная литература 2] WO 2008/124803.
Непатентная литература
[0005]
[Непатентная литература 1] Pharmacological reviews 42, 85, 1990 (Selectivity in the inhibition of Mammalian Cytochrome P-450 by Chemical Agents).
[Непатентная литература 2] Current Drug Metabolism, 6, 413, 2005.
[Непатентая литература 3] Drug Metabolism and Disposition 31, 289, 2003.
Техническая задача
[0006] Целью настоящего изобретения является обеспечение соединения, поддерживающего основной терапевтический эффект ситаксентана и обладающего улучшенным ингибирующим CYP эффектом, а также обладающего структурой, которая не содержит дейтерий.
Решение задачи
[0007] В результате интенсивных исследований авторы настоящего изобретения создали настоящее изобретение. Конкретнее, настоящее изобретение относится к следующему [1]-[19].
[1] Соединение, представленное формулой (1-1) или формулой (1-2), или его фармакологически приемлемая соль:
1
где R представляет собой атом галогена, метильную группу, этильную группу, трифторметильную группу, пентафторэтильную группу, н-пропильную группу или циклопропильную группу,
2
R представляет собой атом водорода, метильную группу, этильную группу, трифторметильную группу, пентафторэтильную группу, н-пропильную группу или циклопропильную группу,
3
1-6
1-6
R представляет собой Cалкильную группу или Cалкоксигруппу, а
M представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из:
,
4
где R представляет собой атом водорода, метильную группу или этильную группу.
[2] Соединение или его фармакологически приемлемая соль согласно [1], где M является группой, представленной следующей формулой:
.
[3] Соединение или его фармакологически приемлемая соль согласно [1], где M является группой, представленной следующей формулой:
.
1
[4] Соединение или его фармакологически приемлемая соль согласно любому из [1]-[3], где R представляет собой атом водорода.
1
[5] Соединение или его фармакологически приемлемая соль согласно [4], где R представляет собой атом хлора.
2
[6] Соединение или его фармакологически приемлемая соль согласно любому из [1]-[5], где R представляет собой метильную группу.
3
1-6
[7] Соединение или его фармакологически приемлемая соль согласно любому из [1]-[6], где R представляет собой Cалкильную группу.
3
[8] Соединение или его фармакологически приемлемая соль согласно [7], где R представляет собой метильную группу.
[9] Соединение или его фармакологически приемлемая соль согласно любому из [1]-[8], которое является соединением, представленным формулой (1-1).
[10] N-(4-хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)-2-[2-(6-метил-1,3-дигидро-2-бензофуран-5-ил)ацетил]тиофен-3-сульфонамид или его фармакологически приемлемая соль.
[11] Фармацевтическая композиция, содержащая соединение или его фармакологически приемлемую соль согласно любому из [1]-[10].
[12] Фармацевтическая композиция согласно [11], которая является антагонистом рецептора эндотелина.
[13] Фармацевтическая композиция согласно [11], которая представляет собой терапевтическое или профилактическое средство для легочной артериальной гипертензии.
[14] Способ блокирования рецептора эндотелина, предусматривающий введение соединения или его фармакологически приемлемой соли согласно любому из [1]-[10] пациенту.
[15] Способ лечения или предотвращения легочной артериальной гипертензии, предусматривающий введение соединения или его фармакологически приемлемой соли согласно любому из [1]-[10] пациенту.
[16] Соединение или его фармакологически приемлемая соль согласно любому из [1]-[10] для применения для антагонизирования рецептора эндотелина.
[17] Соединение или его фармакологически приемлемая соль согласно любому из [1]-[10] для применения для лечения или предотвращения легочной артериальной гипертензии.
[18] Применение соединения или его фармакологически приемлемой соли согласно любому из [1]-[10] для изготовления антагониста рецептора эндотелина.
[19] Применение соединения или его фармакологически приемлемой соли согласно любому из [1]-[10] для изготовления терапевтического или профилактического средства для легочной артериальной гипертензии.
Полезные эффекты настоящего изобретения
[0008] Соединение, представленное формулой (1-1) или (1-2) (далее называемое соединением (1-1) или соединением (1-2), или собирательно называемое соединением (1)), сохраняет основной терапевтический эффект ситаксентана и обладает улучшенным ингибиторным по отношению к CYP эффектом по сравнению с ситаксентаном.
Краткое описание графических материалов
2+
2+
[0009] На фиг. 1 представлен график, демонстрирующий зависимую от дозы активацию (повышение Ca) посредством лиганда (эндотелин) в клетках EDNRA/293, при этом активация (повышение Ca) показана на вертикальной оси, а концентрация эндотелина (нM) - на горизонтальной оси;
2+
2+
на фиг. 2 представлен график, демонстрирующий зависимое от дозы подавление повышения Ca в клетках EDNRA/293 с помощью ситаксентана, при этом относительное повышение Ca, принимаемое за 100% как значение без ситаксентана, показано на вертикальной оси, тогда как концентрация ситаксентана (нM) показана на горизонтальной оси, а концентрации эндотелина (нM) показаны в правой части графика; и
2+
2+
на фиг. 3 представлен график, демонстрирующий зависимое от дозы подавление повышения Ca в клетках EDNRA/293 с помощью соединения примера 1, при этом относительное повышение Ca, принимаемое за 100% как значение без соединения примера 1, показано на вертикальной оси, тогда как концентрация соединения примера 1 (нM) показана на горизонтальной оси, а концентрации эндотелина (нM) показаны в правой части графика.
Описание вариантов осуществления
[0010] Далее настоящее изобретение будет описываться подробно.
[0011] В описании настоящее изобретение не ограничивается конкретными кристаллическими формами, но может включать в себя любую из кристаллических форм или их смеси, хотя могут существовать кристаллические полиморфы. Настоящее изобретение также предусматривает аморфные формы, а соединения согласно настоящему изобретению включают ангидриды и гидраты. Кроме того, настоящее изобретение также предусматривает так называемый метаболит, который образуется в результате in vivo метаболизма (окисления, восстановления, гидролиза, конъюгации и т.п.) соединения (1-1) или (1-2) в соответствии с настоящим изобретением. Более того, соединение (так называемое пролекарство), которое образует соединение (1-1) или (1-2) в соответствии с настоящим изобретением в результате in vivo метаболизма (окисления, восстановления, гидролиза, конъюгации и т.п.), также предусматривается настоящим изобретением.
[0012] Значения выражений, символов и т.п., применяемых в настоящем описании, объясняются ниже, и настоящее изобретение описывается подробно.
[0013] “CYP” в настоящем описании означает фермент, метаболизирующий лекарственное средство, цитохром P450.
[0014] “Улучшение ингибиторного по отношению к CYP эффекта” или “улучшенный ингибиторный по отношению к CYP эффект” в настоящем описании означает, что степень ингибирования одной или двух из пяти молекул CYP (CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 и 3A4), основных молекул CYP, как правило, лучше, чем у ситаксентана.
[0015] “Сохранение основного терапевтического эффекта” в настоящем описании означает демонстрацию in vitro или in vivo фармакологической активности в доклиническом исследовании, которая, как ожидается, показывает клинический терапевтический эффект, как у ситаксентана. "In vitro фармакологическая активность" означает, например, активность подавления по отношению к рецептору эндотелина A.
50
[0016] “IC” в настоящем описании означает ингибирующую на 50% концентрацию или полуингибирующую концентрацию.
[0017] “Бензодиоксольное кольцо” в настоящем описании означает кольцо или функциональную группу, характеризующуюся следующей структурой:
[0018] “Фталановое кольцо” в настоящем описании означает кольцо или функциональную группу, характеризующуюся следующей структурой:
[0019] "Атом галогена" в настоящем описании означает атом фтора, атом хлора, атом брома или атом йода.
1-6
[0020] "Cалкильная группа" в настоящем описании означает алкильную группу с прямой или разветвленной цепью с 1-6 атомами углерода, и примеры включают метильную группу, этильную группу, 1-пропильную группу, 2-пропильную группу, 2-метил-1-пропильную группу, 2-метил-2-пропильную группу, 1-бутильную группу, 2-бутильную группу, 1-пентильную группу, 2-пентильную группу, 3-пентильную группу, 1-гексильную группу, 2-гексильную группу и 3-гексильную группу.
1-6
[0021] Термин "Cалкоксигруппа", используемый в настоящем описании, означает группу, в которой атом кислорода присоединяется к концу определенной выше "C1-6алкильной группы", и примеры включают в себя метоксигруппу, этоксигруппу, 1-пропилоксигруппу, 2-пропилоксигруппу, 2-метил-1-пропилоксигруппу, 2-метил-2-пропилоксигруппу, 1-бутилоксигруппу, 2-бутилоксигруппу, 1-пентилоксигруппу, 2-пентилоксигруппу, 3-пентилоксигруппу, 1-гексилоксигруппу, 2-гексилоксигруппу и 3-гексилоксигруппу.
[0022] Соединение в соответствии с настоящим изобретением является соединением, представленным формулой (1-1) или формулой (1-2), и предпочтительно является соединением, представленным формулой (1-1).
1
1
[0023] R в соединении, представленном формулой (1-1) или (1-2), представляет собой атом галогена, метильную группу, этильную группу, трифторметильную группу, пентафторэтильную группу, н-пропильную группу или циклопропильную группу, предпочтительно R представляет собой атом галогена и более предпочтительно - атом хлора.
2
2
[0024] R в соединении, представленном формулой (1-1) или (1-2), представляет собой атом водорода, метильную группу, этильную группу, трифторметильную группу, пентафторэтильную группу, н-пропильную группу или циклопропильную группу, и предпочтительно R представляет собой метильную группу.
3
3
1-6
1-6
1-6
[0025] R в соединении, представленном формулой (1-1) или (1-2), представляет собой Cалкильную группу или Cалкоксигруппу, предпочтительно R представляет собой Cалкильную группу и более предпочтительно - метильную группу.
[0026] M в соединении, представленном формулой (1-1) или (1-2), представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из:
,
4
где R представляет собой атом водорода, метильную группу или этильную группу. Связи в показанных выше группах ориентируются по отношению к левому радикалу, связанному с фталановым кольцом, и правому радикалу, связанному с тиофеновым кольцом. M предпочтительно является группой, представленной:
с карбонильным углеродом, связанным с тиофеновым кольцом, и более предпочтительно группой, представленной:
с карбонильным углеродом, связанным с тиофеновым кольцом.
[0027] "Фармакологически приемлемая соль" в настоящем описании конкретно не ограничена, при условии, что образующаяся соль с соединением, представленным формулой (1-1) или (1-2), и является фармакологически приемлемой, и примеры включают в себя соли неорганических кислот, соли органических кислот, соли неорганических оснований, соли органических оснований и кислые или основные соли аминокислот.
[0028] Предпочтительные примеры солей неорганических кислот включают гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, нитраты и фосфаты, и предпочтительные примеры солей органических кислот включают ацетаты, сукцинаты, фумараты, малеаты, тартраты, цитраты, лактаты, стеараты, бензоаты, манделаты, метансульфонаты, этансульфонаты, п-толуолсульфонаты и бензолсульфонаты.
[0029] Предпочтительные примеры солей неорганических оснований включают соли щелочных металлов, такие как соли натрия и соли калия, соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция и соли магния, соли алюминия и соли аммония, и предпочтительные примеры солей органических оснований включают соли диэтиламина, соли диэтаноламина, соли меглюмина и соли N,N'-дибензилэтилендиамина.
[0030] Предпочтительные примеры кислых солей аминокислот включают аспартаты и глютаматы, и предпочтительные примеры солей основных аминокислот включают соли аргинина, соли лизина и соли орнитина.
[0031] Соединение, представленное формулой (1-1) или (1-2), можно получить способами, описанными ниже, или можно получить способами, описанными ниже, с улучшениями, выполненными на основе стандартной информации специалистом в данной области. Однако способ получения соединения, представленного формулой (1-1) или (1-2), не ограничивается этим.
[0032] Процесс A
,
1
2
3
где R, R, R и M определены выше.
[0033] Этот процесс является процессом, посредством которого соединение (1-1) или (1-2) получают реакцией конденсации сульфонилхлоридного соединения (3) с аминоизоксазольным соединением (2-1) или (2-2) в присутствии или в отсутствие раствора, в присутствии основания и в присутствии или в отсутствие катализатора.
[0034] Используемый растворитель особо не ограничивается при условии, что он растворяет исходные материалы до определенной степени без ингибирования реакции, и включает, например, тетрагидрофуран и пиридин.
[0035] Используемое основание включает, например, гидрид натрия или пиридин.
[0036] В качестве катализатора можно использовать 4-диметиламинопиридин или подобное.
[0037] Температура реакции варьирует согласно исходным материалам, растворителю и основанию, но в норме составляет 0-120°C и предпочтительно 15-100°C.
[0038] Время реакции варьирует в зависимости от исходных материалов, растворителя и основания, но в норме составляет от 10 минут до 5 дней и предпочтительно от 1 часа до 3 дней.
[0039] Сульфонилхлоридное соединение (3) и аминоизоксазольное соединение (2-1) или (2-2) могут быть коммерческими продуктами, или можно использовать описанные в следующих примерах, или соединения можно синтезировать способами, известными специалистам в данной области (например, из патентов США № 4659369, 4861366, 4753672).
[0040] Процесс B
Если M в соединении (1-1) или (1-2) является группой, представленной:
,
то соединение (1-1) или (1-2) можно получать с помощью нижеприведенного процесса B. На нижеприведенной схеме объясняется способ получения соединения (1-1), а соединение (1-2) можно получать тем же путем с использованием других исходных материалов.
,
1
2
3
1-4
где R, R и R определены выше; а Q представляет собой уходящую группу, содержащую атом галогена, такой как атом брома, атом хлора и атом йода, Cалкансульфонилоксигруппу, такую как метансульфонилоксигруппа и сульфонилоксигруппа, такая как бензолсульфонилоксигруппа и п-толуолсульфонилоксигруппа.
[0041] Соединением (4) и соединением (6) могут быть известные соединения или могут быть соединения, которые могут быть получены традиционными способами специалистом в данной области из известных соединений.
[0042] Процесс B-1
Этот процесс является процессом превращения соединения (4) в соединение (5) с использованием восстанавливающего средства в присутствии растворителя.
[0043] Используемый растворитель особо не ограничивается при условии, что он растворяет исходные материалы до определенной степени без ингибирования реакции, и включает, например, тетрагидрофуран.
[0044] Используемое восстанавливающее средство включает, например, диизобутилалюминия гидрид.
[0045] Температура реакции варьирует согласно исходным материалам, растворителю и основанию, но в норме составляет от -78°C до 100°C и предпочтительно от -78°C до комнатной температуры.
[0046] Время реакции варьирует в зависимости от исходных материалов, растворителя и т.п., но в норме составляет от 10 минут до 5 дней и предпочтительно от 30 минут до 1 дня.
[0047] Процесс B-2
Этим процессом является процесс первоначального превращения формильной группы соединения (5) в дитиан с 1,3-пропандитиолом, затем используется основание для создания анионов в дитиане, а затем реагирование его с соединением (6) с получением соединения (7). Также можно добавлять кислоту Льюиса для получения лучших результатов при превращении в дитиан.
[0048] Используемый растворитель в реакции превращения в дитиан особо не ограничивается при условии, что он растворяет исходные материалы до определенной степени без ингибирования реакции, но включает, например, дихлорметан.
[0049] Кислота Льюиса, используемая в реакции превращения в дитиан, включает, например, бора трифторид диэтилэфират.
[0050] Температура реакции для реакции превращения в дитиан варьирует согласно исходным материалам, растворителю и основанию, но в норме составляет от 0°C до 100°C и предпочтительно является комнатной температурой.
[0051] Время реакции для реакции превращения в дитиан варьирует в зависимости от исходных материалов, растворителя и т.п., но в норме составляет от 10 минут до 5 дней и предпочтительно от 30 минут до 1 дня.
[0052] Используемый растворитель для образования аниона и реакции с соединением (6) особо не ограничивается при условии, что он растворяет исходные материалы до определенной степени без ингибирования реакции, но включает, например, тетрагидрофуран.
[0053] Основание, используемое для образования аниона и реакции с соединением (6), включает, например, н-бутиллития.
[0054] Температура реакции варьирует согласно исходным материалам, растворителю и основанию, но в норме составляет от -78°C до 100°C и предпочтительно от -78°C до комнатной температуры.
[0055] Время реакции варьирует в зависимости от исходных материалов, растворителя и т.п., но в норме составляет от 10 минут до 5 дней и предпочтительно от 30 минут до 1 дня.
[0056] Процесс B-3
Процесс является процессом превращения дитианового кольца соединения (7) в карбонильную группу для получения соединения (1-3) или, другими словами, соединения (1-1), в котором M является группой, представленной:
.
Этот процесс можно выполнять посредством общеизвестной реакции снятия защиты дитианового кольца, например, реакции с окислительным средством, таким как нитрат серебра.
[0057] Используемый растворитель в реакции снятия защиты дитианового кольца особо не ограничивается при условии, что он растворяет исходные материалы до определенной степени без ингибирования реакции, но включает, например, метанол, воду и тетрагидрофуран.
[0058] Окислительное средство, используемое в реакции снятия защиты дитианового кольца, включает, например, нитрат серебра.
[0059] Температура реакции для реакции снятия защиты дитианового кольца варьирует согласно исходным материалам, растворителю и основанию, но в норме составляет от 0°C до 150°C и предпочтительно от комнатной температуры до 100°C.
[0060] Время реакции для реакции снятия защиты дитианового кольца варьирует в зависимости от исходных материалов, растворителя и т.п., но в норме составляет от 30 минут до 5 дней и предпочтительно от 1 дня до 4 дней.
[0061] После завершения реакции в каждом процессе каждого описанного выше способа целевое соединение для каждого процесса можно собрать из реакционной смеси согласно традиционному способу.
[0062] Например, если целой реакционной смесью является жидкость, то реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры или охлаждают на льду по необходимости и нейтрализуют кислотой, щелочью, добавляют окисляющее средство или восстанавливающее средство по необходимости, органический растворитель, не смешивающийся с водой и не реагирующий с целевым соединением, такой как этилацетат, и отделяют слой, содержащий целевое соединение. Затем добавляют растворитель, не смешивающийся с водой и не реагирующий с целевым соединением, слой, содержащий целевое соединение, промывают и слой отделяют. Более того, если слоем является органический слой, то целевое соединение можно собрать путем сушки с агентом для сушки, таким как безводный сульфат магния или безводный сульфат натрия, и отгонки растворителя. Если слоем является водный слой, то целевое соединение можно собрать электрической деминерализацией, а затем слой лиофилизировать.
[0063] Кроме того, если цельной реакционной смесью является жидкость и если возможно, целевое соединение можно собирать только отгонкой веществ, отличных от целевого соединения (таких как растворитель или реагент), при нормальном давлении или пониженном давлении.
[0064] Кроме того, если только целевое соединение осаждают как твердое вещество или если цельная реакционная смесь, описанная выше, является жидкостью и только целевое соединение осаждают в ходе сбора, целевое соединение можно далее собирать путем сбора сначала фильтрацией, промыванием целевого соединения, собранного фильтрацией с соответствующим органическим или неорганическим растворителем, и сушкой так, что исходную жидкость обрабатывают способом, подобным таковому в случае, когда цельная реакционная смесь, описанная выше, является жидкостью.
[0065] Кроме того, если только реагент или катализатор присутствуют как твердое вещество, или цельная реакционная смесь, описанная выше, является жидкостью, и только реагент или катализатор осаждают в виде твердого вещества в ходе сбора, и целевое соединение растворяют в растворе, целевое соединение можно собирать отгонкой сначала реагента или катализатора, промыванием отфильтрованного реагента или катализатора соответствующим органическим или неорганическим растворителем, объединением полученных в результате смывом с исходной жидкостью и обработкой полученной в результате смеси способом, подобным таковому в случае, когда цельная реакционная смесь, описанная выше, является жидкостью.
[0066] В частности, если вещества, отличные от целевого соединения, которые объединяют в реакционной смеси, не ингибируют реакцию в следующем этапе, реакционную смесь также можно использовать в следующем этапе как есть без особого выделения целевого соединения.
[0067] Перекристаллизацию, различные способы хроматографии и дистилляцию можно осуществлять при необходимости для улучшения чистоты целевого соединения, собранного вышеописанным способом.
[0068] Как правило, если собранное целевое соединение является твердым веществом, то чистоту целевого соединения можно повысить с помощью перекристаллизации. При перекристаллизации можно использовать отдельный растворитель или смесь множества растворителей, не вступающие в реакцию с целевым соединением. Особым образом, целевое соединение сначала растворяют в одном или нескольких растворителях, не реагирующих с целевым соединением при комнатной температуре или при нагревании. Полученную в результате смесь охлаждают ледяной водой или подобным образом, или взбалтывают, или оставляют стоять при комнатной температуре, так что целевое соединение может кристаллизоваться из смеси.
[0069] Чистоту собранного целевого соединения можно повысить различными хроматографическими способами. Как правило, можно использовать слабокислые силикагели, такие как Silica gel 60, изготовленный Merck KGaA (70-230 меш или 340-400 меш), и BW-300, изготовленный Fuji Silysia Chemical Ltd. (300 меш). Если целевое соединение является основным и абсорбируется на вышеуказанных силикагелях слишком сильно, также можно применять NH силикагели, такие как покрытый пропиламином силикагель, изготовленный Fuji Silysia Chemical Ltd. (200-350 меш), и одноразовая среднего давления препаративная наполненная колонка, изготовленная Yamazen Corporation (Hi-Flash Amino). Если целевое соединение является биполярным или должно элюироваться более полярным растворителем, таким как метанол, например, можно применять NAM-200H или NAM-300H, изготовленные NAM Laboratory, или YMC GEL ODS-A, изготовленный YMC Co. Ltd. Также можно применять одноразовые среднего давления препаративные наполненные колонки, как описано выше, которые предварительно заполнены наполнителями и изготовлены Yamazen Corporation, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Biotage AB или W. R. Grace & Co. (Hi-Flash). Целевое соединение, чью чистоту повышают, можно получить путем элюирования целевого соединения одним или несколькими растворителями, которые не вступают в реакцию с целевым соединением, с применением данных силикагелей и отгонки растворителя(ей).
[0070] Если собранное целевое соединение является жидкостью, то чистоту целевого соединения можно повысить с помощью способа перегонки. При перегонке целевое соединение можно отогнать, воздействуя на него пониженным давлением при комнатной температуре или при нагревании.
[0071] Типичные примеры способа получения соединения (1-1) или (1-2) описаны выше. Все соединения - сырьевые материалы и различные реагенты при получении соединения (1-1) или (1-2), которые могут образовывать соли или сольваты, такие как гидраты, варьируют в зависимости исходного материала, используемого растворителя или подобного, и не имеют особых ограничений, при условии, что они не ингибируют реакцию. Также используемый растворитель варьирует в зависимости от исходного материала, реагента или подобного, и не имеет особых ограничений, при условии, что он не ингибирует реакцию и очевидно растворяет исходный материал до некоторой степени. Если соединение (1-1) или (1-2) получают в свободной форме, его можно превратить в соль, которая может быть образована соединением (1-1) или (1-2) или сольватом соединения или соли традиционными способами.
[0072] Если соединение (1-1) или (1-2) получают в виде соли или сольвата, его можно превратить в свободную форму соединений (1-1) или (1-2) традиционными способами.
[0073] Различные изомеры, полученные для соединения (1-1) или (1-2) (такие как геометрические изомеры, оптические изомеры, ротамеры, стереоизомеры и таутомеры), можно очистить и выделить с использованием общепринятых средств разделения, например перекристаллизации, образования диастереомерной соли, ферментативного разделения и различных хроматографических способов (такие как тонкослойная хроматография, колоночная хроматография и газовая хроматография).
[0074] Соединение (1-1) или (1-2) или его фармакологически приемлемую соль можно составлять традиционными способами, и примеры дозированных форм включают в себя пероральные составы (такие как таблетки, гранулы, порошки, капсулы и сиропы), инъекции (для внутривенного введения, внутримышечного введения, подкожного введения и интраперитонеального введения) и наружные составы (такие как составы для трансдермального поглощения (такие как мази и пластыри), офтальмологические препараты, назальные препараты и суппозитории).
[0075] Эти твердые составы, такие как таблетки, капсулы, гранулы и порошки, как правило, могут содержать 0,001-99,5 вес. %, предпочтительно 0,01-90 вес. % или т.п. соединения (1-1) или (1-2) или его фармакологически приемлемой соли.
[0076] При изготовлении перорального твердого состава таблетки, гранулы, порошки и капсулы можно получать путем добавления разбавителей, связующих средств, разрыхлителей, смазочных средств, красителей или подобного к соединению (1-1) или (1-2) или его фармакологически приемлемой соли при необходимости и обработки традиционными способами. Таблетки, гранулы, порошки, капсулы и т.п. также можно покрывать пленкой при необходимости.
[0077] Примеры разбавителей включают в себя лактозу, кукурузный крахмал и микрокристаллическую целлюлозу, примеры связующих средств включают в себя гидроксипропилцеллюлозу и гидроксипропилметилцеллюлозу, а примеры разрыхлителей включают в себя карбоксиметилцеллюлозу кальция и кроскармеллозу натрия.
[0078] Примеры смазочных средств включают в себя стеарат магния и стеарат кальция, а примеры красителей включают в себя оксид титана.
[0079] Примеры средств для пленочного покрытия включают в себя гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и метилцеллюлозу.
[0080] Очевидно, что любые описанные выше наполнители не ограничиваются этими примерами.
[0081] При изготовлении инъекций (внутривенного введения, внутримышечного введения, подкожного введения и интраперитонеального введения) их можно изготавливать путем добавления регуляторов pH, буферов, суспендирующих средств, солюбилизаторов, антиоксидантов, консервантов (антисептиков), средств регулирования тоничности или подобные к соединению (1-1) или (1-2) или его фармакологически приемлемой соли при необходимости и обработки традиционными способами. Лиофилизированный состав, подлежащий разбавлению перед применением, также можно получать лиофилизацией. Эти инъекции можно вводить, например, внутривенно, подкожно и внутримышечно.
[0082] Примеры регуляторов pH и буферов включают в себя органические кислоты или неорганические кислоты и/или их соли, примеры суспендирующих средств включают в себя метилцеллюлозу, полисорбат 80 и карбоксиметилцеллюлозу натрия, примеры солюбилизаторов включают в себя полисорбат 80 и полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат, примеры антиоксидантов включают в себя α-токоферол, примеры консервантов включают в себя метилпарагидроксибензоат и этилпарагидроксибензоат, а примеры средств регулирования тоничности включают в себя глюкозу, хлорид натрия и маннит; однако очевидно, что наполнители не ограничиваются этими примерами.
[0083] Эти инъекции как правило, могут содержать 0,000001-99,5 вес. %, предпочтительно 0,00001-90 вес. % или т.п. соединения (1-1) или (1-2) или его фармакологически приемлемой соли.
[0084] При изготовлении наружных составов составы трансдермального поглощения (такие как мази и пластыри), офтальмологические препараты, назальные препараты, суппозитории и т.п. можно изготавливать путем добавления описанных выше основных материалов и, при необходимости, эмульгаторов, консервантов, регуляторов pH, красителей и т.п. к соединению (1-1) или (1-2) или его фармакологически приемлемой соли и обработки традиционными способами.
[0085] Различные сырьевые материалы, традиционно используемые для фармацевтических препаратов, квазилекарств, косметических средств и т.п., можно использовать в качестве основных материалов, и примеры включают в себя сырьевые материалы, такие как животные и растительные масла, минеральные масла, сложноэфирные масла, воски, высшие спирты и очищенная вода.
[0086] Эти инъекции как правило, могут содержать 0,000001-99,5 вес. %, предпочтительно 0,00001-90 вес. % или т.п. соединения (1-1) или (1-2) или его фармакологически приемлемой соли.
[0087] Дозировка медицинского препарата согласно настоящему изобретению, как правило, варьирует в зависимости от симптома, возраста, пола, веса или подобного, но является приемлемой, если эта дозировка достаточна для получения желаемого эффекта. Например, для взрослого используют дозировку от приблизительно 0,1 до 5000 мг (предпочтительно от 0,5 до 1000 мг, более предпочтительно от 1 до 600 мг) в сутки одной дозой в течение одних или нескольких суток или поделенной на 2-6 доз в течение одних суток.
[0088] Соединение (1-1) или (1-2) можно использовать в качестве химического зонда для захвата целевых белков в биоактивные низкомолекулярные соединения. В частности, соединение (1-1) или (1-2) можно превращать в зонд для аффинной хроматографии, фотоаффинный зонд или подобное путем введения группы-метки, линкера или подобного во фрагмент, отличный от структурного фрагмента, необходимого для экспрессии активности соединения методикой, описанной в J. Mass Spectrum. Soc. Jpn., Vol. 51, No. 5, 2003, pp. 492-498, или в WO 2007/139149, или в подобном.
[0089] Примеры группы-метки, линкера или т.п., используемого в химическом зонде, включают в себя группы, показанные в группе, состоящей из приведенных далее (1)-(5).
(1) Группы-метки для белков, такие как фотоаффинные группы-метки (например, бензоильная группа, бензофеноновая группа, азидогруппа, карбонильная азидогруппа, диазиридиновая группа, еноновая группа, диазогруппа и нитрогруппа) и хемоаффинные группы (например, кетонная группа, в который α-углеродный атом заменен атомом галогена, карбамоильная группа, сложноэфирная группа, алкилтиогруппа, акцептор Михаэля, такой как α,β- ненасыщенные кетоны и сложные эфиры и оксирановая группа),
(2) расщепляемые линкеры, такие как -S-S-, -O-Si-O-, моносахаридные (такие как глюкозная группа и галактозная группа) или дисахаридные (такие как лактоза) и олигопептидные линкеры, расщепляемые ферментативной реакцией,
(3) группы-метки для фишинга, такие как биотин и 3-(4,4-дифтор-5,7-диметил-4H-3a,4a-диаза-4-бора-s-индацен-3-ил)пропионильная группа,
125
32
3
14
(4) детектируемые маркеры, такие как меченные радиоактивным изотопом группы, такие как I, P, H и C; флуоресцентные группы-метки, такие как флуоресцеин, родамин, дансил, умбеллиферон, 7-нитрофуразанил и 3-(4,4-дифтор-5,7-диметил-4H-3a,4a-диаза-4-бора-s-индацен-3-ил)пропионильная группа; хемилюминесцентные группы, такие как люциферин и люминол; и ионы тяжелых металлов, такие как ионы металлов-лантаноидов и ионы радия; или
(5) группы, связанные с твердофазными носителями, такими как стеклянные шарики, стеклянные пластины, титровальные микропланшеты, агарозные гранулы, агарозные слои, полистирольные гранулы, полистирольные слои, полиамидные гранулы и полиамидные слои.
[0090] Зонды, полученные путем введения групп-меток или подобных, выбранных из группы, состоящей из вышеприведенных (1)-(5), в соединение (1) согласно способу, описанному в вышеприведенных документах, или подобному, можно использовать в качестве химических зондов для идентификации меченых белков, применимых для поиска новых целей лекарственного средства, например.
Примеры
[0091] Соединение (1-1) или (1-2) можно получать, например, способами, описанными в следующих примерах, и эффекты соединения (1-1) или (1-2) можно подтверждать способами, описанными в следующих примерах тестов. Однако эти примеры являются иллюстративными, и настоящее изобретение особо не ограничивается конкретными примерами.
[0092] [Пример 1] N-(4-хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)-2-[2-(6-метил-1,3-дигидро-2-бензофуран-5-ил)ацетил]тиофен-3-сульфонамид
Смесь N-(4-хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)-2-{2-[(6-метил-1,3-дигидро-2-бензофуран-5-ил)метил]-1,3-дитиан-2-ил}тиофен-3-сульфонамида, описанного в примере получения 1-7 (300 мг, 0,55 ммоля), метанола (20 мл), воды (2 мл) и нитрата серебра (940 мг, 5,5 ммоля) перемешивали в течение 3 дней при 55°C. Реакционной смеси позволяли остыть до комнатной температуры, добавляли тетрагидрофуран (40 мл) и соляной раствор (1 мл) при этой температуре и смесь фильтровали через целит. Фильтрат экстрагировали путем добавления этилацетата (200 мл), воды (100 мл) и насыщенного водного раствора лимонной кислоты (1 мл). Органический слой промывали соляным раствором, сушили над безводным сульфатом магния и отгоняли растворитель при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (метанол:этилацетат = 1:9), а затем дополнительно очищали тонкослойной хроматографией с силикагелем (метанол:этилацетат = 1:32) с получением титульного соединения (45 мг, выход 18%).
1
6
H-ЯМР спектр (ДМСО-d) δ (м.д.): 1,99 (3H, с), 2,13 (3H, с), 4,89 (2H, с), 4,92 (2H, с), 4,95 (2H, с), 7,07 (1H, с), 7,09 (1H, с), 7,42 (1H, д, J=5,1 Гц), 7,77 (1H, д, J=5,1 Гц).
[0093] [Пример получения 1-1] 3-[(4-Хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)сульфамоил]тиофен-2-карбоновая кислота
К смеси гидрида натрия (60%, 2,1 г, 52 ммоля) и тетрагидрофурана (20 мл) добавляли смесь 4-хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-амина (3,0 г, 23 ммоля) и тетрагидрофурана (20 мл) при 0°C, а затем перемешивали при данной температуре в течение 30 минут. Метил 3-(хлорсульфонил)тиофен-2-карбоксилат (5,3 г, 22 ммоля) добавляли при данной температуре к реакционной смеси, которую затем перемешивали в течение 1 часа при 0°C, а затем перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре. Добавляли гексан (100 мл) при комнатной температуре к реакционной смеси и осажденное твердое вещество собирали фильтрацией. К твердому веществу добавляли метанол (20 мл), а затем 2 N водный раствор гидроксида натрия (20 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 5 часов при комнатной температуре. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и к осадку добавляли ледяную воду (20 мл), а затем 2 N водный раствор хлористоводородной кислоты (20 мл). Осажденное твердое вещество собирали фильтрацией с получением титульного соединения (2,5 г, выход 35%).
1
6
H-ЯМР спектр (DMSO-d) δ (м.д.): 2,16 (3H, д, J=1,8 Гц), 7,45 (1H, дд, J=1,3, 5,3 Гц), 7,95 (1H, дд, J=0,9, 5,3 Гц).
[0094] [Пример получения 1-2] 3-[(4-Хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)сульфамоил]-N-метокси-N-метилтиофен-2-карбоксамид
К смеси 3-[(4-хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)сульфамоил]тиофен-2-карбоновой кислоты (2,5 г, 7,8 ммоля), описанной в примере получения 1-1, и тетрагидрофурана (25 мл) добавляли 1,1’-карбонилдиимидазол (2,0 г, 12 ммоль) при комнатной температуре, а затем перемешивали при той же температуре в течение 30 минут. К реакционной смеси последовательно добавляли имидазол (1,1 г, 16 ммоль) и N,O-диметилгидроксиламина гидрохлорид (1,2 г, 12 ммоль) при комнатной температуре, а затем перемешивали при той же температуре в течение 5 часов. Добавляли 1 N водный раствор хлористоводородной кислоты (50 мл) к реакционной смеси, которую затем экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали соляным раствором, сушили над безводным сульфатом натрия и отгоняли растворитель при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (хлороформ:метанол = 9:1) с получением титульного соединения (1,5 г, выход 53%).
1
3
H-ЯМР спектр (CDCl) δ (м.д.): 2,23 (3H, с), 3,45 (3H, с), 3,74 (3H, с), 7,47 (1H, д, J=5,3 Гц), 7,53 (1H, д, J=5,3 Гц).
[0095] [Пример получения 1-3] N-(4-Хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)-2-формилтиофен-3-сульфонамид
К смеси 3-[(4-хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)сульфамоил]-N-метокси-N-метилтиофен-2-карбоксамида, описанного в примере получения 1-2, (8,0 г, 22 ммоля) и тетаргидрофурана (160 мл) по каплям добавляли диизобутилалюминия гидрид (46 мл, 48 ммоль, 1,0 M раствор н-гексана) при -78°C, а затем перемешивали при 0°C в течение 30 минут. Насыщенный водный раствор хлорида аммония по каплям добавляли при 0°C к реакционной смеси, которой затем позволяли постепенно нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа при этой температуре. Реакционную смесь фильтровали через целит и добавляли воду к фильтрату, который затем экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали соляным раствором и отгоняли растворитель при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле NH (этилацетат:метанол = 30:1) с получением титульного соединения (5,1 г, выход 75%).
1
6
H-ЯМР спектр (DMSO-d) δ (м.д.): 1,97 (3H, с), 7,35 (1H, д, J=5,1 Гц), 7,97 (1H, д, J=5,1 Гц), 10,52 (1H, д, J=1,1 Гц).
[0096] [Пример получения 1-4] 5,11-Диоксатрицикло[7.3.0.0ˆ{3,7}]додека-1,3(7),8-триен
К смеси 1,2,4,5-тетракис-(бромметил)-бензола (150 г, 0,33 ммоля) и 1,4-диоксана (2 л) добавляли 55% водный раствор гидроксида тетрабутиламмония (640 мл) при комнатной температуре, а затем перемешивали при 90°C в течение 6 часов. Реакционной смеси позволяли остыть до комнатной температуры и экстрагировали этилацетатом после добавления 2 N водного раствора хлористоводородной кислоты (2 л). Органический слой промывали соляным раствором, сушили над безводным сульфатом натрия и отгоняли растворитель при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (этилацетат:гексан = 1:9) с получением титульного соединения (35 г, выход 63%).
1
3
H-ЯМР спектр (CDCl) δ (м.д.): 5,10 (8H, с), 7,08 (2H, с).
[0097] [Пример получения 1-5] (6-Метил-1,3-дигидро-2-бензофуран-5-ил)метанол
К смеси порошка лития (15 г, 2,1 моля), 4,4’-ди-трет-бутилбифенила (5,0 г, 0,021 моля) и тетрагидрофурана (200 мл) добавляли смесь 5,11-диоксатрицикло[7.3.0.0ˆ{3,7}]додека-1,3(7),8-триена (35 г, 0,21 моля), описанного в примере получения 1-4, и тетрагидрофурана (100 мл) при -78°C, а затем перемешивали при этой температуре в течение 4 часов. К реакционной смеси добавляли воду (10 моль) при этой температуре и тщательно перемешивали. Реакционной смеси позволяли нагреться до комнатной температуры и экстрагировали этилацетатом после добавления 2 N водного раствора хлористоводородной кислоты (500 мл). Органический слой промывали соляным раствором, сушили над безводным сульфатом натрия и отгоняли растворитель при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (этилацетат:гексан = 3:7) с получением титульного соединения (10 г, выход 30%).
1
6
H-ЯМР спектр (DMSO-d) δ (м.д.): 2,24 (3H, с), 4,48 (2H, д, J=5,3 Гц), 4,96 (4H, с), 5,10 (1H, т, J=5,3 Гц), 7,07 (1H, с), 7,29 (1H, с).
[0098] [Пример получения 1-6] 5-(Хлорметил)-6-метил-1,3-дигидро-2-бензофуран
Триэтиламин (1,7 мл, 12 ммоль) добавляли при охлаждении на льду к смеси (6-метил-1,3-дигидро-2-бензофуран-5-ил)метанола, описанного в примере получения 1-5, (1,0 г, 6,1 ммоля) и дихлорметана (10 мл), а затем добавляли метансульфонилхлорид (470 мкл, 6,1 ммоля) при этой температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. Добавляли воду к реакционной смеси, которую затем экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали соляным раствором, сушили над безводным сульфатом магния и отгоняли растворитель при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (этилацетат:гептан = 1:10) с получением титульного соединения (680 мг, выход 61%).
1
3
H-ЯМР спектр (CDCl) δ (м.д.): 2,44 (3H, с), 4,63 (2H, с), 5,08 (4H, с), 7,09 (1H, с), 7,20 (1H, с).
[0099] [Пример получения 1-7] N-(4-Хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)-2-{2-[(6-метил-1,3-дигидро-2-бензофуран-5-ил)метил]-1,3-дитиан-2-ил}тиофен-3-сульфонамид
К смеси N-(4-хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)-2-формилтиофен-3-сульфонамида, описанного в примере получения 1-3, (4,9 г, 16 ммоль) и дихлорметана (100 мл) успешно добавляли эфират трехфтористого бора (8,1 мл, 64 ммоль) и 1,3-пропандитиол (1,9 мл, 19 ммоль) при охлаждении на льду, а затем перемешивали при комнатной температуре в течение 90 минут. Добавляли при охлаждении на льду воду к реакционной смеси, которую затем экстрагировали дихлорметаном. Органический слой промывали соляным раствором и отгоняли растворитель при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией с силикагелем (этилацетат) с получением N-(4-хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)-2-(1,3-дитиан-2-ил)тиофен-3-сульфонамида в виде неочищенного продукта. К смеси неочищенного N-(4-хлор-3-метил-1,2-оксазол-5-ил)-2-(1,3-дитиан-2-ил)тиофен-3-сульфонамида и тетрагидрофурана (50 мл) по каплям добавляли н-бутиллитий (9,7 мл, 16 ммоль, 1,6 M раствор н-гексана) при -78°C, а затем перемешивали в течение 20 минут при внутренней температуре -35°C. Реакционную смесь охлаждали до -78°C и добавляли 5-(хлорметил)-6-метил-1,3-дигидро-2-бензофуран, описанный в примере получения 1-6, (960 мг, 5,3 ммоля) при этой температуре и перемешивали в течение 1 часа при 0°C. Реакционную смесь охлаждали до -78°C и добавляли смесь уксусной кислоты (0,90 мл, 16 ммоль) и тетрагидрофурана (7 мл) при этой температуре. Реакционную смесь постепенно возвращали до комнатной температуры, добавляли воду и водный раствор лимонной кислоты при этой температуре и смесь экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали соляным раствором и отгоняли растворитель при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (этилацетат:гептан = 4:1) с получением титульного соединения (1,6 г, выход 54%).
1
6
H-ЯМР спектр (DMSO-d) δ (м.д.): 1,68-1,76 (1H, м), 2,01-2,05 (1H, м), 2,15 (3H, с), 2,20 (3H, с), 2,80-2,85 (4H, м), 3,73 (2H, с), 4,79 (2H, с), 4,90 (2H, с), 6,64 (1H, с), 7,02 (1H, с), 7,44 (1H, д, J=5,5 Гц), 7,54 (1H, д, J=5,5 Гц).
[0100] Тестовый пример 1
Эффекты блокирования рецептора эндотелина A (EDNRA) ситаксентаном и соединением примера 1
[0101] Участок гена, кодирующий белок EDNRA, полученный от человека (номер гена NM_001957.2), трансфицировали в клетки HEK-293 (почка эмбриона человека, № ATCC CRL-1573) с ретровирусным вектором лейкоза мышей для получения клеточной линии, стабильно экспрессирующей EDNRA (клетки EDNRA/293). В качестве культуральной среды использовали DMEM (среду Игла, модифицированную Дульбекко), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой, пенициллином и стрептомицином.
[0102] За день до измерения клетки EDNRA/293 инокулировали на 384-луночный планшет при 5000 клеток/лунка. В день измерения в каждую лунку добавляли флуоресцентный реагент для измерения кальция (Calcium4, Molecular Device), растворенный в сбалансированном буферном растворе Хэнкса, и позволяли отстаиваться в течение приблизительно 1 часа. Ситаксентан и соединение примера 1, полученные при предварительно определенных конечных концентрациях (далее называемые образцами), затем добавляли в некоторые из лунок и позволяли отстаиваться в течение приблизительно 1 часа для обеспечения воздействия образцов на клетки EDNRA/293.
[0103] Эндотелин, лиганд EDNRA (активатор) вносили в лунки, необработанные образцами, и достигнутую в результате реакцию активации (повышение кальция) выявляли с помощью устройства для измерения (FDSS7000, Hamamatsu Photonics) с получением зависимой от дозы реакции активации, как показано на фиг. 1. При дозах 1 нM или больше реакция активации практически подавлялась. По этой причине дозы эндотелина, используемого для выявления в подавлении реакций ниже, устанавливали на уровне 0,03, 0,1 или 0,3 нM.
[0104] Если реакцию активации (повышение кальция), которая возникала при внесении 0,03, 0,1 или 0,3 нM эндотелина в отдельные лунки, обработанные образцами, выявляли с помощью устройства для измерения (FDSS7000, Hamamatsu Photonics), и ситаксентан, и соединение примера 1 блокировали реакцию активации, как показано на фиг. 2 и фиг. 3.
[0105] Тестовый пример 2
Ингибиторные CYP эффекты
Ингибиторные СYP эффекты ситаксентана и соединения примера 1 тестировали двумя следующими способами.
[0106] Поскольку зависимое от времени ингибирование CYP ситаксентаном можно оценить путем тестирования усиления ингибирования после предварительной инкубации с раствором, содержащим кофермент, и микросомальную фракцию из печени человека, содержащую CYP, проводили тест зависимого от времени ингибирования для соединения примера 1 в качестве способа 1. Также тестировали конкурентное ингибирование CYP в качестве способа 2.
[0107] Способ 1
Способности зависимого от времени ингибирования ситаксентана и соединения примера 1 оценивали в отношении пяти ферментов CYP (CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 и 3A4).
2
+
[0108] Тестируемое вещество добавляли в раствор фермента (содержащий микросомы печени человека (0,2 мг/мл), 100 мM Kpi и 0,1 мM EDTA) и предварительно инкубировали в течение 30 минут при 37°C в присутствии или при отсутствии кофермента. Устанавливали окончательную концентрацию тестируемого вещества на уровне 0,1, 0,2, 0,4, 0,5, 1, 2, 10 или 50 мкM. В качестве кофермента использовали систему образования NADPH (60 мM раствор MgCl, содержащий 3,6 мM β-NADP, 90 мM глюкозо-6-фосфат и 1 единица/мл глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, инкубировали в течение 5 минут для образования NADPH). После предварительной инкубации часть реакционного раствора собирали, разбавляли в 10 раз путем смешивания с раствором модельного субстрата и системой образования NADPH, а затем инкубировали в течение 10 минут при 37°C. Добавляли равное количество смешанного раствора ацетонитрила и метанола (1:1, содержащего 0,05 мкM декстрофана или 0,05 мкM пропранолола в качестве внутреннего стандарта) для завершения реакции и метаболиты модельного субстрата в реакционном растворе измеряли посредством LC-MS/MS. Модельные субстраты и метаболиты модельного субстрата для каждого фермента CYP показаны в таблице 1. Подобный тест также выполняли без добавления тестируемого вещества в качестве контрольного теста. Отношение к количеству метаболитов модельного субстрата в контрольном тесте давало остаточную активность. Оценивали отношение остаточной активности в присутствии NADPH к остаточной активности при отсутствии NADPH и отношение 80% или менее определяли как «+», тогда как отношение выше 80% определяли как «-». Результаты представлены в таблице 2.
[0109] Из сравнения результатов ситаксентана и соединения примера 1 можно увидеть, что зависимое от времени ингибирование снижалось посредством превращения бензодиоксольного кольца во фталановое кольцо.
[0110]
[Таблица 1]Модельные субстраты и метаболиты модельного субстрата для каждого фермента CYP
Изоформа CYP
Модельный субстрат
Концентрация субстрата (мкM)
Метаболит модельного субстрата
CYP1A2
Фенацетин
50
Ацетаминофен
CYP2C9
Толбутамид
500
4-Гидрокситолбутамид
CYP2C19
S-Мефенитоин
200
4’-Гидроксимефенитоин
CYP2D6
Буфуралол
50
1’-Гидроксибуфуралол
CYP3A4
Мидазолам
30
1’-Гидроксимидазолам
[0111]
[Таблица 2]Эффект предварительного инкубирования с микросомами печени человека и тестируемым веществом на активность CYP(среднее, n=2)
Тестируемое вещество
Концен-трация (мкM)
CYP1A2
CYP2C9
CYP2C19
CYP2D6
CYP3A4
Ситаксентан
10
-
+
+
-
+
50
+
+
+
+
+
Пример 1
10
-
-
-
-
-
50
-
-
-
-
+
[0112] Способ 2
Ингибирующую способность на основе конкурентного ингибирования пяти ферментов CYP (CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 и 3A4) оценивали с использованием ситаксентана и соединения примера 1.
50
50
[0113] Тестируемое вещество добавляли при итоговой концентрации 1 или 10 мкM в раствор фермента (содержащий микросому печени человека (0,2 мг/мл), 100 мM Kpi и 0,1 мM EDTA), содержащий раствор модельного субстрата, и инкубировали в течение 10 минут при 37°C в присутствии системы образования NADPH. Добавляли равное количество смешанного раствора ацетонитрила и метанола (1:1, содержащего 0,05 мкM декстрофана или 0,05 мкM пропранолола в качестве внутреннего стандарта) для прекращения реакции и метаболиты модельного субстрата в реакционном растворе измеряли посредством LC-MS/MS. Модельный субстрат и метаболит модельного субстрата для каждого фермента CYP показаны в таблице 3. Подобный тест выполняли без добавления тестируемого вещества в качестве контрольного теста. Определяли степень ингибирования по количеству метаболитов модельного субстрата с добавлением и без добавления тестируемого вещества при каждой концентрации тестируемого вещества и значение IC вычисляли по степени ингибирования (способ вычисления согласно Xenobiotica, 1999, 29(1), 53-75). Оценку «++» давали, если ICсоставляла 1 мкM или менее, «+», если она составляла 1-10 мкM, и «-», если она была более 10 мкM. Результаты показаны в таблице 4.
[0114] Из сравнения результатов ситаксентана и соединения примера 1 можно увидеть, что способность ингибирования ослабевала из-за превращения бензодиоксольного кольца во фталановое кольцо.
[0115]
[Таблица 3]Модельные субстраты и метаболиты модельного субстрата для фермента CYP
Изоформа CYP
Модельный субстрат
Концентрация субстрата (мкM)
Метаболит модельного субстрата
CYP1A2
Фенацетин
10
Ацетаминофен
CYP2C9
Толбутамид
100
4-Гидрокситолбутамид
CYP2C19
S-Мефенитоин
40
4’-Гидроксимефенитоин
CYP2D6
Буфуралол
10
1’-Гидроксибуфуралол
CYP3A4
Мидазолам
3
1’-Гидроксимидазолам
[0116]
[Таблица 4]Эффект тестируемого вещества на ферменты CYP (n=2)
Тестируемое вещество
CYP1A2
CYP2C9
CYP2C19
CYP2D6
CYP3A4
Ситаксентан
-
++
+
-
+
Пример 1
-
++
-
-
-