Способ увеличения выживаемости клеток человеческого эндотелия
METHOD FOR INCREASING THE SURVIVAL OF HUMAN ENDOTHELIAL CELLS

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии.
Появление информации о том, что эритропоэтическое действие и цитопротективные эффекты эритропоэтина реализуются через разные рецепторы (гомодимерный и гетеродимерный), привело исследователей к идее поиска коротких молекул, имитирующих спираль B эритропоэтина для получения пептидов с цито- и эндотелиопротективными свойствами.
В исследовании, опубликованном Michael Brines et al. показано, что 11-членный пептид pHBSP (QEQLERALNSS (Pyr-Glu-Gln-Leu-Glu-Arg-Ala-Leu-Asn-Ser-Ser)) имитирует особенности трехмерной структуры спирали B эритропоэтина и оказывает тканезащитные эффекты без гемопоэтической активности [Brines M., Patel N.S., Villa P., Brines C., Mennini T., De Paola M., Erbayraktar Z., Erbayraktar S., Sepodes B., Thiemermann C., Ghezzi P., Yamin M., Carla C. Hand, Qiao-wen Xie, Coleman T., Cerami F. Nonerythropoietic, tissue-protective peptides derived from the tertiary structure of erythropoietin // Proc Natl Acad Sci USA. 2008. №105(31). Р. 10925-10930].
С учетом возможных областей применения дополнительным положительным свойством у подобных производных эритропоэтина является наличие у них антиагрегантной активности. Путем присоединение к исходному 11-членному пептиду pHBSP (QEQLERALNSS) трипептидов с заданными свойствами RGD (Arg-Gly-Asp) и KGD (Lys-Gly-Asp) [Preclinical study of innovative peptides mimicking the tertiary structure of the α-helix B of erythropoietin / I.V. Golubev, V.V. Gureev, M.V. Korokin [et al.] //  Research Results in Pharmacology. – 2020. – Vol. 6, Iss. 2. – P. 85-96. https://doi.org/10.3897/rrpharmacology.6.55385] были получены пептиды с выраженной антиагрегантной активностью с сохранением цитопротективных свойств [Ivan V. Golubev, Vladimir V. Gureev, Liliya V. Korokina, Oleg S. Gudyrev, Tatiana G. Pokrovskaia, Olga N. Pokopeiko, … Mikhail V. Korokin. (2020). The anti-aggregation activity of new 11-amino acid of erythropoietin derivate containing tripeptide motifs. http://doi.org/10.5281/zenodo.4264989]. Однако такой способ получения приводит к удлинению полипептидной цепи, а значит и размера молекулы. Это может приводить к нарушению их транспорта через тканевые барьеры. Кроме этого, возрастает стоимость производства, так как увеличивается количество стадий.
Другим путем получения пептидов с выраженной антиагрегантной активностью и сохранением цитопротективных свойств может быть модификация аминокислотного состава без изменения общего числа аминокислот. После скрининга полипептидных соединений были получены полипептидные соединение с аминокислотной последовательностью UEHLERALNSS (EP-11-1) и UEQLERALNTS (EP-11-3) обладающие антиагрегантной активностью. У последних полипептидная цепочка содержит такое же количество аминокислотных остатков, как и у исходного пептида, что является преимуществом. Однако, изменения аминокислотного состава приводит к изменению пространственного строения полипептида, что обуславливает как появление новых свойств, так и потерю старых. Поэтому полученные ранее данные позволяют сделать предположение о наличии у представленных полипептидных соединений цитопротективной активности, но не делают наличие ее для специалиста очевидной в явном виде.
Прототипом заявленного решения является способ увеличение выживаемости клеток человеческого эндотелия с помощью производных пептида pHBSP (QEQLERALNSS) с лабораторными шифроми Pα-B1 -  Pα-B4 полученных путем присоединения к последнему трипептидных мотивов RGD (Arg-Gly-Asp) и KGD (Lys-Gly-Asp) с заданными свойствами [Preclinical study of innovative peptides mimicking the tertiary structure of the α-helix B of erythropoietin / I.V. Golubev, V.V. Gureev, M.V. Korokin [et al.] //  Research Results in Pharmacology. – 2020. – Vol. 6, Iss. 2. – P. 85-96. https://doi.org/10.3897/rrpharmacology.6.55385]. В данном способе увеличение выживаемости клеток человеческого эндотелия производится полипептидами с более длинной полипептидной цепочкой по отношению к исходному пептиду, а значит результаты не удовлетворительные.
Задачей изобретения является способ увеличения выживаемости клеток человеческого эндотелия, включающий использование полипептидов производных pHBSP с 11-членной аминокислотной последовательностью обладающих антиагрегантным действием.
Техническим результатом изобретения является эффективный способ увеличения выживаемости клеток человеческого эндотелия, включающий использование полипептидных соединений с аминокислотной последовательностью UEHLERALNSS и UEQLERALNTS.
Задача достигается тем, что перед внесением в культуральную среду перекиси водорода (H2O2), производили ее предварительную инкубацию с исследуемыми полипептидами с аминокислотной последовательностью: UEHLERALNSS и UEQLERALNTS в концентрациях 5 мкг/мл, 30 мкг/мл и 50 мкг/мл.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ
Исследование выполнено с применение первичной культуры клеток эндотелиоцитов человека (HUVEC) (Sigma-Aldrich (Merck)). Эндотелиальные клетки культивировали в среде ДMEM с добавлением 20мМ буфера HEPES, 5 ЕД/мл гепарина, 200 мкг/мл E CG F (Sigma-Aldrich), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) при 37°C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 [Антипова  Т.А.,  Николаев  С.В.,  Крыжановский  С.А.,  Пекельдина  Е.С.  Research of neuroprotective properties of TrkA-receptor agonist GK-2 on model of oxidative stress in human vascular endothelial cells (HUVEC)  //  Фармакокинетика  и  фармакодинамика.  –  2019.  –  No  1.  –   С. 18–21. DOI: 10.24411/2587-7836-2019-10035].
Клетки рассеивали в 96-луночные планшеты, покрытые желатином, с плотностью 5 тыс. клеток на лунку. Через 24 ч инкубации вносили исследуемые пептиды (EP-11-1, EP-11-3) в концентрациях 5 мкг/мл, 30 мкг/мл и 50 мкг/мл.
Через 3 часа после внесения пептидов в лунки планшета добавляли перекись водорода (H2O2) в конечной концентрации 200 мкМ. Спустя 24 ч культуральную среду, содержащую H2O2, заменяли на нормальную.
Жизнеспособность клеток измеряли с использованием MTT-теста. Принцип  метода основан на способности сукцинатдегидрогеназы, фермента мембраны митохондрий, восстанавливать желтую соль 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ) до кристаллов формазана фиолетового цвета, накапливающихся в результате этой реакции в цитоплазме живых клеток. Таким образом, по интенсивности накопления кристаллов формазана в цитоплазме судили об уровне митохондриального дыхания клетки, что является показателем ее жизнеспособности. Количество образуемого формазана в клеточном монослое пропорционально соотносится с количеством живых клеток в исследуемом образце.
По окончании эксперимента среду отбирали, в лунки планшета добавляли раствор 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (MTT, Sigma) в PBS (Sigma), содержащем 0,9 мМ CaCl2 и 0,5 мМ MgCl2, из расчета 10 мг МТТ на лунку. После 4-часовой инкубации при 37°C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 планшет откручивали при 600g на центрифуге R4810 (Eppendorf, Германия). Супернатант аккуратно отсасывали.
Для растворения образовавшихся кристаллов формазана использовали ДМСО, 250 мкл/лунку. После полного растворения кристаллов 150 мкл, не затрагивая слой клеток на желатине, переносили в новый планшет. Оптическую плотность раствора формазана в ДМСО измеряли на спектрофотометре Multiscan EX при длине волны 570 нм. По изменению оптической плотности судили о цитопротекторной активности пептидов. Оценку результатов теста МТТ проводили путем сопоставления оптической плотности в опытных и контрольных лунках. Количество жизнеспособных клеток высчитывали по формуле
ж
N = AU опыт / AU контроль * 100%
Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом по Данну (ANOVA). Данные представлены в виде m. ± s.d. Данные считались достоверными при p ≤ 0,05.
ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Для моделирования окислительного стресса использовали перекись водорода Н2О2 (200 мкМ), которая согласно литературным данным стимулирует программируемую гибель клеток – апоптоз, сопровождающуюся рядом биохимических и морфологических изменений в клетке: конденсация хроматина, фрагментация ДНК, повышение проницаемости мембран, сжатие клетки [Mu P, Liu Q, Zheng R. Biphasic regulation of H2O2 on angiogenesis implicated NADPH oxidase. Cell Biology International. 2010;34(10):1013–1020].
При анализе оптической плотности среды, с культурой клеток  HUVEC, на фоне оксидативного стресса и внесения изучаемых пептидов обнаружено, что оба исследуемые соединения обладают выраженным цитопротективным действием, статистически значимо увеличивая митохондриальную активность и выживаемость клеток в клеточной культуре (таблица 1).
Таблица 1
ж)
На Фигуре представлено количество жизнеспособных клеток (N в экспериментальных группах с внесением инновационных пептидов в концентрациях 5, 30 и 50 мкг/мл.
Таким образом, предварительное добавление в культуральную среду пептида с аминокислотной последовательностью UEHLERALNSS (образец EP-11-1) или пептида с аминокислотной последовательностью UEQLERALNTS (образец EP-11-3) значительно увеличивало количество выживших клеток в условии оксидативного стресса.