СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ Bacillus thuringiensis
METHOD FOR IDENTIFYING BACILLUS THURINGIENSIS BACTERIA

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к способам идентификации подвидов, серотипов, а также вирулентных и авирулентных вариантов штаммов и определения спектра действия бактерии Bacillus thuringiensis.
Ежегодно значительная часть коммерчески важных сельскохозяйственных культур в мире теряется из-за насекомых и других вредителей, при этом экономический ущерб по этой причине исчисляется миллионами долларов. Основная защита посевов от вредителей достигается за счет использования химических пестицидов. Однако неразборчивое использование этих агентов может привести к нарушению естественных защитных агентов растения. Кроме того, из-за их широкого спектра действия химические пестициды могут уничтожать нецелевые организмы, такие как полезные насекомые и паразиты вредных вредителей. Химические пестициды также часто токсичны для животных и людей и, следовательно, представляют опасность для окружающей среды при применении. Кроме того, насекомые и другие организмы часто развивают устойчивость к этим пестицидам, когда подвергаются их воздействию, в результате чего устойчивые штаммы мелких вредных организмов могут стать основными проблемами заражения из-за сокращения количества полезных паразитических организмов.
Это ставит проблему создания биоразлагаемого пестицида, который сочетал бы в себе более узкий спектр активности со способностью поддерживать свою активность в течение продолжительного периода времени, то есть к которому устойчивость развивается гораздо медленнее или не развивается вообще.
Проблема решается за счет создания биопестицидов, которые используют встречающиеся в природе патогены (болезни) для борьбы с инвазиями насекомых, насекомых и сорняков сельскохозяйственных культур и, как правило, менее вредны для нецелевых организмов и окружающей среды в целом по сравнению с химическими пестицидами [Кандыбин Н.В., Патыка Т.И., Ермолова В.П., Патыка В.Ф. Микробиоконтроль численности насекомых и его доминанта Bacillus thuringiensis. Санкт-Петербург, Пушкин, 2009, 245 с].
Биопестициды, как правило, включают бактерию, которая продуцирует вещество, токсичное для заражающего агента (токсин), с бактериальной питательной средой или без нее.
В настоящее время наиболее широко используемым биопестицидами являются препараты на основе бактерии Bacillus thuringiensis (В. thuringuensis), которые является эффективным и экологически безопасным инсектицидом для борьбы с насекомыми-вредителями.
В. thuringuensis представляет собой широко распространенный аэробный и спорообразующий микроорганизм, который во время цикла споруляции образует белки, известные как протоксины или дельта-эндотоксины, которые откладываются в бактерии в виде параспоральных кристаллических включений или как часть оболочки споры.
Патогенность различных чувствительных насекомых, таких как отряды Lepidoptera и Diptera, в основном, обусловлена этими параспоральными кристаллами, которые могут составлять более 20% сухого веса клетки В. thuringuensis во время споруляции. Паспоральные кристаллы активны у насекомого только после приема внутрь. Например, при проглатывании чешуекрылыми насекомыми щелочные рН и протеолитические ферменты в средней кишке активируют кристалл, позволяя высвобождать токсичные компоненты. Эти токсичные компоненты отравляют клетки средней кишки, заставляя насекомое перестать питаться и в конечном итоге погибнуть [СА 1328239, 1988].
В ходе исследований было выяснено, что разные штаммы В. thuringuensis продуцируют более 500 различных токсинов и факторов вирулентности преимущественно белковой природы [Palma, L.; , D.; Berry, С.; Murillo, J.; Caballero, P. Bacillus thuringiensis Toxins:]. При этом наборы токсинов и факторов вирулентности отличаются у различных подвидов, серотипов и конкретных штаммов В. Thuringuensis. Одновременно ситуация с подбором эффективного биопрепарата осложняется возможностью потери генов, кодирующих токсины и факторы вирулентности, что у вирулентных штаммов приводит к отсутствию токсинов и возникновению их авирулентных вариантов, в результате чего препарат на их основе становится малоэффективным [An Overview of Their Biocidal Activity. Toxins 2014, 6, 3296-3325].
Исходя из вышеизложенного, задача идентификации штаммов В. thuringuensis и оценка их свойств для применения в конкретном препарате является важной для биотехнологии и сельского хозяйства в контексте борьбы с контаминацией используемых в производстве штаммов, а также поддержания штаммов, обладающих свойствами, перспективными для использования на их основе эффективных биологических препаратов. Однако, то, что морфологические и биохимические отличая вегетативных культур В. thuringiensisue надежно выявляются лишь на стадии споровой культуры после длительной инкубации штаммов, создает значительные трудности для быстрой идентификации подвидов, серотипов, определяющих специфичность их воздействия на вредителей, а также вирулентных и авирулентных вариантов штаммов В. thuringiensis, определяющих эффективность такого воздействия.
Для быстрой идентификация подвидов предложено осуществлять секвенирование некоторых локусов, например, локуса, кодирующего В-субъединицу ДНК-гиразы [Adang M.J., Crickmore N., Jurat-Fuentes J.L. Diversity of Bacillus thuringiensis Crystal Toxins and Mechanism of Action. Advances in Insect Physiology, 2014, 47, 39-87], однако этот метод не позволяет отличить вирулентные и авирулентные штаммы и пригоден не для всех серотипов.
Наиболее близкой к заявляемому изобретению является методология идентификации В. thuringiensis с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами, специфичными к генам, кодирующими определенные токсины. [Frederiksen K., Rosenquist Н.,  K., Wilcks A. Occurrence of Natural Bacillus thuringiensis Contaminants and Residues of Bacillus thuringiensis-Based Insecticides on Fresh Fruits and Vegetable. Applied and Environmental Microbiology May 2006, 72 (5), 3435-3440].
Способ включал в себя выделение геномной ДНК кипячением бактериальной колонии в течение 10 минут в ТЕ-буфере (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) с последующим центрифугированием и выделением супернатанта. Для выделения плазмидной ДНК использовали набор QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN, Hilden, Germany). После сбора клетки инкубировали в буфере, содержащем лизоцим (20 мг/мл), в течение 90 мин при 37°С
Метод исследования кристаллических включений методом фазово-контрастной микроскопии использовался по методике [Rosenquist, Н., L. Smidt, S.R. Andersen, G.В. Jensen, and A. Wilcks. 2005. Occurrence and significance of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis in ready-to-eat food. FEMS Microbiol. Lett. 250:129-136].
Исследования кристаллических включений осуществлялиметодом фазово-контрастной микроскопии ПЦР-анализы были проведены для выявления различных групп инсектицидных генов токсина из В. thuringiensis. Были использованы четыре основных набора праймеров, детектирующих cry-1, cry-3, cry-11 и cyt1A, Условия ПЦР были следующими: одна стадия денатурации 10 минут при 94°С, программа пошагового цикла, установленная на 30 циклов (с циклом, состоящим из денатурации при 94°С в течение 40 с, отжига при 52°С в течение 40 с. и удлинение при 72°С в течение 1,5 мин) и окончательное удлинение при 72°С в течение 7 мин. ПЦР для cry-3, cry-11 и cyt1A состояла из 10 мкл Eppendorf MasterMix 2,5 × (Eppendorf, Гамбург, Германия), 20 пмоль каждого праймера и 5 мкл ДНК. Условия ПЦР были такими же, как для cry-1, но с температурами отжига 48°С для cry-3 и 51°С для cry-11 и cyt1A.
Способ позволяет различать многие серотипы и некоторые штаммы В. thuringiensis, однако требует проведения подбора праймеров, обеспечения эффективного выделения геномной ДНК, и не всегда дает возможность однозначно идентифицировать исследуемый штамм, так как позволяет работать лишь с несколькими генами
Задачей изобретения является разработка способа более быстрой и универсальной идентификации подвидов, серотипов, штаммов В. thuringiensis, а также определения их вирулентных и авирулентных вариантов.
Технический результат достигается созданием способа, включающего в себя лизис бактериальных клеток, анализ внутриклеточных компонентов и их идентификация путем сопоставления полученных результатов с аналогичными данными, полученными при аналогичном исследовании известных модификаций клеток В. thuringiensis, в котором полученный в ходе лизиса тотальный белковый лизат подвергают гель-электрофорезу на полиакриламидном геле, гель подвергают окрашиванию кумасси бриллиантовым синим и отмывают, а идентификацию проводят по характеру распределения полос на геле, используя для сопоставления не менее от одной полосы в зоне 80-160 кДа и не менее двух полос в зоне 15-40 кДа и при необходимости дополнительно не менее двух минорных полос в зоне 40-80 кДа.
Лучшие результаты достигаются при проведении гель-электрофореза на 10% полиакриламидном геле при напряжении 180в в течении 1 часа, проведении отмывки геля после окрашивания кумасси бриллиантовым синим раствором, содержащим 20% этанол и 10% уксусную кислоту в течении 1-3 часов.
Для повышения точности результатов при необходимости гель-электофорез может быть дополнен масс-спектрометрией белков для чего полученные при гель-электрофорезе полосы выделяют из геля, подвергают обработке трипсином и разделяют при помощи обращеннофазной жидкостной хроматографии на фракции, состав каждой из которых идентифицируют при помощи тандемной времяпролетной или электроспрейной масс-спектрометрии.
Способ осуществляется следующим образом. Жидкую или чашечную культуру В. thuhngiensis (не менее 50 и не более 200 мкг клеток на один эксперимент) лизируют кипячением в 4-кратном объеме буферного раствора, содержащего 50 мМ ТрисНСl, 2% бета-меркаптоэтанол, 2% глицерин, 2% додецил-сульфат натрия. Из полученных проб берут образцы объемом не менее 5 и не более 20 мкл и наносят на 10% полиакриламидный гель, после чего проводят белковый форез (напряжение 180 в, ток стабилизирован по напряжению, 1 час). Гель окрашивают кумасси бриллиантовым синим при комнатной температуре от 1 до 24 часов, после чего производят отмывку геля раствором, содержащим 20% этанол и 10% уксусную кислоту не менее 1 и не более 3 часов.
Первичное типирование до серотипов производят по характеру распределения полос на геле. Оценивают, прежде всего, две группы полос: верхнюю 80-160 кДа (килодальтон) и нижнюю 15-40 кДа. В верхней группе полос у различных серотипов выявляются от одной до трех полос разного веса, в нижней от двух до четырех полос и сопоставляют с результатами гель-электрофореза известных штаммов в тех же условиях. Для большинства серотипов комбинация полос верхней и нижней группы позволяет отличить их между собой.
При близости гель-хроматограмм нескольких образцов для идентификации могут дополнительно анализироваться две-четыре полосы из средней группы 40-80 кДа
Как правило, для обеспечения надежной оценки спектра действия идентифицируемого штамма достаточно идентифицировать две полосы из верхней группы, три полосы из нижней, и две полосы из средней.
Как показали проведенные эксперименты вирулентные и авирулентные варианты одного и того же штамма имеют полосы одного веса, однако авирулентный вариант лишен некоторых из них. В частности, для серотипа is-raelensis наблюдается отсутствие у авирулентного варианта двух наиболее тяжелых полос из верхней группы, что позволяет надежно отличить его от вирулентного.
В случае серотипов или штаммов «двойников», имеющих идентичные наборы полос на геле, точность метода может быть значительно повышена за счет использования масс-спектрометрии белков. Для этого полосы выделяют из геля и подвергают обработке трипсином, получая пептидные фракции. Полученные пептидные смеси разделяют при помощи обращено-фазной жидкостной хроматографии на не менее 10 и не более 384 фракций, состав каждой из которых идентифицируют при помощи тандемной времяпролетной или электроспрейной масс-спектрометрии.
На выходе получают набор уникальных пиков, совокупность которых характеризует каждый конкретный белок, а совокупность белков - штамм. За счет использования масс-спектрометрии точность метода повышается таким образом, что позволят отличить конкретные штаммы, даже относящиеся к одному и тому же подвиду и серотипу. Оценка спектра действия идентифицируемого штамма производится по конкретным масс-спектрометрически идентифицированным белкам. Полученный спектр действия анализируется путем сопоставления имеющейся в базах данных информации о функциональной активности идентифицированных белков, отнесенных к токсинам или же факторам вирулентности.
Сущность изобретения иллюстрируется следующими иллюстративными материалпми.
На фиг. 1 представлен характер распределения белковых полос на геле, образуемых лизатами эталонных штаммов и природных изолятов В. thuringiensis, где М - маркер молекулярного веса белков, вес в килодальтонах (кДа) обозначен цифрами слева. «И» - эталонный штамм В. thuringiensisvar.is-raelensis, «Т» - эталонный штамм В. thuringiensisvar. thuringiensis, «Д» - эталонный штамм В. thuringiensisvar. darmstadiensis, 1-9 природные изоляты В. thuringiensis, типирование которых производится данным методом, «А» - белки верхней группы (70-260 кДа), «Б» - белки средней группы (40-70 кДа), «В» - белки нижней группы (15-40 кДа).
На фиг. 2 приведен характер распределения белковых полос на геле, образуемых лизатами эталонных штаммов и природных изолятов В. thuringiensis, где М - маркер молекулярного веса белков, вес в килодальтонах (кДа) обозначен цифрами слева. «И» - эталонный штамм В. thuringiensisvar. is-raelensis, «Т» - эталонный штамм В. thuringiensisvar. thuringiensis, «Д» - эталонный штамм В. thuringiensisvar. darmstadiensis, 10-17 природные изоляты В. thuringiensis, идентификация которых производится данным методом, «А» - белки верхней группы (70-260 кДа), «Б» - белки средней группы (40-70 кДа), «В» - белки нижней группы (15-40 кДа).
На фиг. 3 показаны полосы белков на геле, образуемых лизатами эталонного штамма и природного изолята В. thuringiensis var. israelensis и использованные для идентификации белков с помощью масс-спектрометрического анализа. Прямоугольниками выделены взятые для анализа полосы. Обозначены названия идентифицированных белков. М - маркер молекулярного веса белков, вес в килодальтонах (кДа) обозначен цифрами слева. «И» - эталонный штамм В. thuringiensis var. israelensis, «9» - природный изолят В. thuringiensis, типирование которого производено данным методом, «А» - белки верхней группы (70-260 кДа), «Б» - белки средней группы (40-70 кДа), «В» - белки нижней группы (15-40 кДа).
Промышленная применимость заявляемого способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Исследуемые культуры природных изолятов В. thuringiensis, которые были выращены в течение 5 суток на чашках Петри среде Т3 [Travers R.S., Martin P.A.W., Reichelderfer C.F. Selective Process for Efficient Isolation of Soil Bacillus spp. Applied and Enviromental Microbiology, 1987, 53(6), 1263-1266.], в количестве 100±50 мкг клеток кипятили 10 мин в буферном растворе, содержащем 50 мМ Трис HCl, 2% бета-меркаптоэтанол, 2% глицерин, 2% додецил-сульфат натрия. После кипячения 10 мкл лизата наносили на 10% полиакриламидный гель и осуществляли белковый форез (напряжение 180 в, ток стабилизирован по напряжению, 1 час). Гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим, выдерживая при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего производили отмывку геля раствором, содержащим 20% этанол и 10% уксусную кислоту. Белки, распределенные в геле по молекулярному весу, при окраске кумасси бриллиантовым синим формировали характерный рисунок в виде полос. Полученные полосы, образуемые лизатами природных изолятов (на фиг. 1 обозначены цифрами 1-9), сопоставляли с полосами геля, на который нанесены белковые лизаты эталонных штаммов В. thuringiensis, относящиеся к серотипам israelensis (на фиг. 1 обозначен «И»), thuringiensis (Т), darmstadiensis (D). Отмечено полное совпадение полос верхней и нижней групп у природных изолятов с эталонными штаммами, что позволило идентифицировать до серотипа изоляты 1, 4, 6 как В. thuringiensis var. darmstadiensis, изоляты 2, 3, 5, 7, 8 как В. thuringiensis var. thuringiensis и изолят 9 как В. thuringiensis var. israelensis.
Пример 2: Для типирования по полосам средней группы ряд белковых проб, полученных из эталонных штаммов и природных изолятов В. thuringiensis по методике примера 1. Отмечено, что при более длительном окрашивании геля (в течение 2 часов) в растворе кумасси бриллиантового синего происходит более четкое проявление полос из средней группы, что дает возможность использовать их для идентификации. Так, эталонный штамм В. israelensis (на фиг. 2 обозначен «И») дает одну полосу, В. thuringiensis (Т) - две полосы, В. darmstadiensis (D) - три полосы. Отмечено совпадение рисунка полос средней группы у природных изолятов, обозначенных 10-17, с эталонами, что позволяет типировать изоляты 10 и 11 как В. thuringiensis var. thuringiensis, 12 и 15 как В. thuringiensis var. israelensis, 13 и 14, а также 16 и 17 как В. thuringiensis var. darmstadiensis. По полосам верхней и нижней групп также наблюдается соответствие изолятов конкретным эталонам.
-3
Пример 3. Для уточнения данных типирования изолятов, полученных при сравнении распределения полос (пример 1), демонстрируемых их лизатам с лизатами эталонов был применен масс-спектрометрический анализ белков. Была проведена идентификация двух белковых белковых полос из верхней группы изолята 9 (фиг. 3), типированного как В. thuringiensis var. israelensis. Полосы были выделены из геля, подвергнуты обработке трипсином (10 нг/мкл, 5 ч), полученные пептидные смеси, были разделены при помощи обращеннофазной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила (2-90%) в течение 45 мин. на 384 фракции, состав которых идентифицирован при помощи тандемной времяпролетной масс-спектрометрии. Результаты масс-спектрометрической идентификации показали, что верхняя полоса, расположенная в районе 140 кДа представляет собой белок Cry4 Ва (масс-спектрометрический индекс protein score 21, р<0,05, вычисленная масса 127684 Да, соответствует положению белка на геле), а нижняя, расположенная в районе примерно 70 кДа - белок Cry11Aa (protein score 149, р<0,05, вычисленная масса 72304 Да, соответствует положению белка на геле). Наличие белков из групп Cry4 Ви Cry11A, являющихся типичными для В. thuringiensis var. Israelensis токсинами, оказывающими поражающее действие на двукрылых [Palma, L.; , D.; Berry, С.; Murillo, J.; Caballero, P. Bacillus thuringiensis Toxins: An Overview of Their Biocidal Activity. Toxins 2014, 6, 3296-3325.], не только подтверждает результаты анализа распределения полос, но и позволяет определить возможный спектр инсектицидной активности данного изолята, что было подтверждено опытами на личинках комара Aedes aegypti. Так, ларвицидная активность изолята 9 для личинок A. Aegypti составила в ЛК50 0,17×10 %.
Пример 4. Для доказательства соответствия идентификации изолятов по характеру распределения полос на геле их генотипу, было проведено секвенирование гена ДНК-гиразы В, которое позволяет надежно установить подвид исследуемого штамма В. thuringiensis [Chen ML, Tsen HY. Discrimination of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis with 16S rRNA and gyrB gene basedPCR primers and sequencing of their annealing sites. J Appl Microbiol. 2002; 92(5):912-9.]. Из природных изолятов 1-9 была выделена геномная ДНК и было проведено секвенирование с праймерами, комплементарными гену gyrB. Принадлежность изолятов к подвидам осуществлялась с помощью сравнения последовательности гена gyrB природных изолятов с последовательностями этого гена у эталонных штаммов. Далее изоляты 1-9 были идентифицированы до подвида по характеру распределения полос верхней и нижней группы на геле, путем сравнения с контрольными эталонами (см. Пример 1). Полученные данные показали (Таблица 1), что результаты генетической идентификации изолятов 1-9 полностью соответствуют идентификации этих изолятов по характеру распределения полос на геле. Таким образом, разработанный нами метод позволяет быстро и эффективно идентифицировать до подвида природные изоляты В. thuringiensis.
Предлагаемый метод позволяет быстро и надежно идентифицировать серотипы, подвиды, штаммы, разделять вирулентные и авирулентные варианты, а также оценивать их спектр действия в отношении различных групп насекомых и других беспозвоночных. К преимуществам метода относится относительная быстрота (без проведения масс-спектрометрии анализ проводится менее чем за 5 часов), отсутствие необходимости разрабатывать индивидуальные нуклеотидные последовательности для конкретных штаммов, небольшое количество биологического материала, необходимого для анализа (50-200 мкг), высокая точность идентификации (до штамма), возможность легкого разделения вирулентных и авирулентных вариантов одних и тех же штаммов.