COMPOSITIONS AND METHODS FOR SUPPRESSION OF CANCER STEM CELLS
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПОДАВЛЕНИЯ РАКОВЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001]
Настоящая заявка на патент испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/235144, поданной 30 сентября 2015 г., которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
[0002]
50065
Данная заявка включает посредством ссылки перечень последовательностей, поданный с настоящей заявкой в машиночитаемой форме (CRF) в виде текстового файла под названием «Lox1-200WO1_SequenceListing», созданного 28 сентября 2016 года и имеющего размер байт.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003]
Несмотря на то, что в борьбе с некоторыми формами рака (например, лейкозом у детей, болезнью Ходжкина и раком яичек) реализуют ряд эффективных способов лечения, а смертность от некоторых распространенных форм рака (например, молочной железы, предстательной железы) уменьшилась в свете прогресса, достигнутого в просветительской работе с пациентами касательно раннего выявления и предупреждения, выживаемость пациентов со многими формами рака на поздних стадиях за несколько десятилетий значительно не изменилась. В связи с этим, рак все еще является второй по распространенности причиной смерти в Соединенных Штатах.
[0004]
Раковые стволовые клетки (CSC), как предполагает их название, представляют собой подгруппу раковых клеток с характеристиками плюрипотентности и неограниченного самообновления, как у стволовых клеток. Соответственно считается, что эта субпопуляция клеток отвечает за образование опухоли и адаптацию к ее окружению. Некоторые данные в настоящее время указывают на то, что CSC, вероятно, отвечают за устойчивость к лекарственным средствам, метастазирование и рецидив рака, в частности в случаях с минимальным остаточным заболеванием. Действительно, недавние клинические данные показали, что доля клеток рака молочной железы, которые выживали после стандартной терапии, была повышена среди клеток, несущих сигнатуру CSC (Creighton et al., 2009). В аналогичном исследовании пациенты с делецией 5q MDS, как было обнаружено, также имели остаточные популяции злокачественных стволовых клеток в своем костном мозге, несмотря на наступление клинической и цитогенетической ремиссий (Tehranchi et al., 2010). В настоящее время считается, что при многих клинических показаниях, несмотря на начальный терапевтический ответ, сохранение подгруппы устойчивых раковых клеток может приводить к рецидиву и потенциально метастазированию.
[0005]
+
-
+
+
+
+
+
+
+
С момента своего первоначального обнаружения раковые стволовые клетки были обнаружены и подтверждены во многих типах опухолей. После первоначальной идентификации CSC в модели AML (Lapidot et al., 1994), CSC были открыты и подтверждены в ряде гематологических и солидных злокачественных опухолей. Первые данные о CSC в солидных опухолях были получены из рака молочной железы, где CSC, как было обнаружено, характеризовались фенотипом CD44/CD24 поверхностного маркера (Al-Hajj et al., 2003). Также были хорошо описаны CSC в случае рака поджелудочной железы. Несмотря на то, что в разных отчетах CSC поджелудочной железы идентифицируют либо как Epcam/CD44/ CD24 (Li et al., 2007), либо как CD133 (Hermann et al., 2007), в других отчетах сообщалось, что связь тройной положительной сигнатуры Epcam/CD44/CD24 лучше всего прослеживается с онкогенным фенотипом CSC (van Vlerken et al., 2013). В отчетах были идентифицированы CSC при колоректальном раке, а в исследовании выявлено происхождение стволовых клеток у мыши в случаях опухолей кишечника и колоректальных опухолей (Barker et al., 2009). Тем не менее, в уровне техники в данной области не достигнуто согласие относительно фенотипа поверхностного маркера в случаях CSC человека. Несмотря на то, что сообщалось о многих поверхностных маркерах, таких как CD66 (Gemei et al., 2013), LGR5 (Hirsch et al., 2014), CD44 и CD133 (Wang et al., 2012), в данной области отсутствует какое-либо надежное подтверждение того, что любой из этих фенотипов поверхностных маркеров может соответствовать CSC человека, что способствует тому, чтобы с помощью других методик, таких как рост неадгезивных гранул (например, опухолевых сфер), найти практическое применение при обнаружении наличия CSC.
[0006]
Несмотря на то, что традиционные и недавно разработанные противораковые терапевтические средства (например, химиотерапия, лучевая терапия, хирургическое вмешательство) оценивают по их способности уменьшать опухоли, эти терапевтические средства могут быть неэффективными в отношении подавления или уничтожения раковых стволовых клеток, что может привести к рецидиву рака и развитию резистентности. Кроме того, поскольку раковые стволовые клетки связаны с метастазами, терапевтические средства, которые не подавляют или не уничтожают раковые стволовые клетки, могут быть неэффективными при длительном лечении заболевания или в отношении выживаемости пациентов. Поэтому первостепенное значение имеет поиск и разработка новых лекарственных средств, способных целенаправленно воздействовать и устранять популяции CSC, поскольку такие лекарственные средства становятся важным компонентом любой успешной противораковой терапии. Современные исследования показывают, что CSC отвечают за устойчивость к химическому воздействию, метастазирование и в конечном итоге рецидив рака, даже после изначального успешного терапевтического вмешательства. Несмотря на то, что CSC управляются теми же основными путями самообновления, которые управляют плюрипотентностью эмбриональных стволовых клеток, информация о других клеточных путях, которые управляют активностью CSC, все еще ограничена.
[0007]
Соответственно, доступность дополнительных композиций и способов лечения форм рака, в том числе способов ослабления онкогенности рака и подавления или уничтожения раковых клеток, в частности раковых стволовых клеток (например, индуцирующих апоптоз или дифференциацию), будет обеспечивать больше вариантов терапии и обладать потенциалом для лучших клинических результатов, таких как ремиссия заболевания и/или улучшение качества жизни пациента.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008]
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу подавления пролиферации раковой стволовой клетки (CSC), предусматривающему приведение CSC в контакт с ингибитором LOX1 в количестве, эффективном для подавления пролиферации и/или ослабления выживания CSC.
[0009]
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения терапевтически устойчивой формы рака у субъекта, который ранее получал терапию и который нуждается в лечении, предусматривающему введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для подавления или уничтожения раковых стволовых клеток (CSC), присутствующих при терапевтически устойчивой форме рака. В некоторых вариантах осуществления способ может предусматривать введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для индукции дифференциации раковых стволовых клеток (CSC), присутствующих при терапевтически устойчивой форме рака.
[0010]
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения терапевтически устойчивой формы рака у субъекта, который ранее получал терапию и который нуждается в лечении, предусматривающему введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для лечения терапевтически устойчивой формы рака.
[0011]
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака, который предусматривает раковые стволовые клетки (CSC), при этом способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в лечении, ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для целенаправленного воздействия и подавления или уничтожения CSC при раке. В некоторых вариантах осуществления способ может предусматривать введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для индукции дифференциации раковых стволовых клеток (CSC), присутствующих при раке.
[0012]
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака, который предусматривает раковые стволовые клетки (CSC), при этом способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в лечении, ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для лечения рака.
[0013]
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, у которого имеется рекуррентная или рецидивирующая форма рака, предусматривающему введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для подавления или уничтожения CSC при раке. В некоторых вариантах осуществления способ может предусматривать введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для индукции дифференциации раковых стволовых клеток (CSC), присутствующих при рекуррентной или рецидивирующей форме рака.
[0014]
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, у которого имеется рекуррентная или рецидивирующая форма рака, предусматривающему введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для лечения рака.
[0015]
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу предупреждения повторного проявления или рецидива рака, предусматривающему введение субъекту, нуждающемуся в предупреждении повторного проявления или рецидива рака, ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для предупреждения повторного проявления или рецидива рака.
[0016]
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения риска рецидива рака у субъекта, у которого имеется рак, предусматривающему введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для подавления или уничтожения CSC при раке, за счет чего снижается риск рецидива рака у субъекта. В некоторых вариантах осуществления способ может предусматривать введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для индукции дифференциации раковых стволовых клеток (CSC), присутствующих при раке, и для снижения риска рецидива или повторного проявления рака.
[0017]
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу удаления раковой стволовой клетки (CSC), предусматривающему приведение CSC в контакт с ингибитором LOX1 в количестве, эффективном для удаления CSC.
[0018]
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу избирательного уменьшения числа раковых стволовых клеток (CSC) в популяции раковых клеток, предусматривающему приведение популяции раковых клеток в контакт с ингибитором LOX1 в количестве, эффективном для подавления или уничтожения CSC в популяции раковых клеток. В некоторых вариантах осуществления способ может предусматривать введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для индукции дифференциации раковых стволовых клеток (CSC) в популяции раковых клеток и для уменьшения числа CSC.
[0019]
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ ослабления или подавления роста опухоли, предусматривающий приведение опухоли в контакт с ингибитором LOX1 в количестве, эффективном для ослабления или подавления роста опухоли. В связанном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ ослабления или подавления роста опухоли у пациента, предусматривающий введение пациенту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для ослабления или подавления роста опухоли.
[0020]
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ уменьшения размера опухоли, предусматривающий приведение опухоли в контакт с ингибитором LOX1 в количестве, эффективном для уменьшения размера опухоли. В связанном аспекте настоящее изобретение относится к способу уменьшения размера опухоли у пациента, предусматривающему введение пациенту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для уменьшения размера опухоли.
[0021]
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ подавления, ослабления или предупреждения инвазивности или метастазирования опухоли, предусматривающий приведение опухоли в контакт с ингибитором LOX1 в количестве, эффективном для подавления, ослабления или предупреждения инвазивности или метастазирования опухоли. В связанном аспекте настоящее изобретение относится к способу подавления, ослабления или предупреждения инвазивности или метастазирования опухоли у пациента, предусматривающему введение пациенту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для подавления, ослабления или предупреждения инвазивности или метастазирования опухоли.
[0022]
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ подавления, ослабления или предупреждения связанной с химиотерапией кардиотоксичности у нуждающегося в химиотерапии пациента, предусматривающий введение пациенту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для подавления, ослабления или предупреждения связанной с химиотерапией кардиотоксичности. В одном варианте осуществления химиотерапия представляет собой антрациклин, такой как доксорубицин. В одном варианте осуществления ингибитор LOX1 представляет собой антитело к LOX1.
[0023]
Настоящее изобретение также относится к одному или нескольким путям применения ингибитора LOX1 или их комбинации в композиции, включающей терапевтические и фармацевтические композиции. В вариантах осуществления пути применения и композиции предусматривают ингибитор(-ы) в количествах, эффективных для обеспечения осуществления различных способов, раскрытых в данном документе. В вариантах осуществления один или несколько путей применения относятся к путям применения для изготовления лекарственного препарата для лечения (например, уничтожения, устранения, подавления, уменьшения прогрессирования и/или скорости прогрессирования пролиферации клеток, уменьшения прогрессирования и/или скорости прогрессирования болезненного состояния, уменьшения способности самообновления и увеличения количества (например, индуцирования дифференциации)) одной или нескольких из опухолей, раковых стволовых клеток и/или форм рака, описанных в данном документе.
[0024]
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способы диагностики, прогнозирования, количественного определения, обнаружения и/или выявления присутствия раковой стволовой клетки (CSC) в образце, содержащем раковые клетки, где способ предусматривает
приведение образца в контакт со средством, которое связывается с последовательностью нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислотной последовательностью LOX1;
выявление присутствия или отсутствия связывания между средством и последовательностью нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислотной последовательностью LOX1 и
обнаружение присутствия CSC в образце при выявлении связывания между средством и последовательностью нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислотной последовательностью LOX1.
[0025]
В вариантах осуществления данного аспекта способ дополнительно может предусматривать одно или несколько из следующего:
определение количества последовательности нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислотной последовательности LOX1 в образце;
сравнение количества последовательности нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислотной последовательности LOX1 с эталонным уровнем нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислоты LOX1 и/или
обнаружение присутствия CSC в образце, в случае если выявленное количество превышает эталонный уровень.
[0026]
В еще одних дополнительных вариантах осуществления способ может предусматривать средство, содержащее выявляемый фрагмент. В некоторых вариантах осуществления средство может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется по меньшей мере с частью последовательности нуклеиновой кислоты LOX1 (например, mRNA, cDNA и т. д.) в жестких условиях гибридизации. В некоторых вариантах осуществления средство может содержать антитело, которое специфически связывается по меньшей мере с частью аминокислотной последовательности LOX1.
[0027]
В различных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов способы относятся к опухоли, и/или CSC, или популяции CSC, которые экспрессируют LOX1. В дополнительных вариантах осуществления опухоль, и/или CSC, или популяция CSC могут содержать сферообразующие CSC.
[0028]
В различных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов способы относятся к опухоли и/или раку, выбранным из колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака легкого, рака головы и шеи, рака желудка, гепатоцеллюлярной карциномы, рака надпочечников, лейкоза, меланомы, миеломы, рака предстательной железы, рака щитовидной железы и рака молочной железы.
[0029]
Аспекты и вариант осуществления, описанные в данном документе, относятся к способам, которые предусматривают ингибитор LOX1, комбинацию ингибиторов LOX1 и/или других противораковых терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления к ингибитору относится антитело, которое связывает LOX1, низкомолекулярный ингибитор LOX1, siRNA, который гибридизируется с нуклеиновой кислотой, кодирующей LOX1, или любые их комбинации.
[0030]
Вышеуказанные аспекты и варианты осуществления также относятся к способам, путям применения и композициям, которые дополнительно предусматривают дополнительную терапию для лечения или контроля заболеваний, связанных с ангиогенезом, онкогенезом и формами рака, и могут предусматривать терапевтический режим, такой как, например, химиотерапия, лучевая терапия, иммунотерапия или любое другое активное средство или терапия, которые известны из уровня техники.
[0031]
Другие аспекты будут очевидными для специалиста в данной области техники после рассмотрения следующих описания и иллюстративных графических материалов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0032]
С целью иллюстрации настоящего изобретения в графических материалах изображены отдельные аспекты настоящего изобретения. Тем не менее, настоящее изобретение не ограничено точными схемами и средствами из аспектов, изображенных на графических материалах.
[0033]
фигурах 1A-1C
На показано увеличение количества CSC у моделей PDX поджелудочной железы. (A) Результаты H&E окрашивания трех моделей PDX поджелудочной железы, полученных из раковых опухолей поджелудочной железы на поздней стадии или на стадии метастаз. (B) Опухолевые сферы, полученные из моделей PDX, показанных на A. (C) На 4-й день были проанализированы опухолевые сферы в отношении экспрессии обоих поверхностных маркеров, указывающих на наличие CSC поджелудочной железы (CD24 и CD44), а также гены, идентифицированные как поддерживающие состояние CSC (EZH2, BMI1, Sox2 и Nanog).
[0034]
фигуре 2
На показана обобщенная стратегия каскада скрининга, применяемая для идентификации DARPin (дарпинов), способных подавлять CSC. Сначала применяли отрицательный отбор для удаления не представляющих интерес белков, а после этого проводили положительный отбор на опухолевых сферах CSC, полученных из моделей PDX поджелудочной железы. Подтверждают специфичность связывания DARPin с CSC, но не с нормальными клетками, и эти DARPin тестируют в анализах в отношении их способности подавлять CSC и идентифицируют мишень(-и) для DARPin.
[0035]
фигурах 3A-3B
На показано связывание DARPin (STEM0268) с CSC поджелудочной железы, но не с нормальными клетками. (A) STEM0268 связывается с выделенными с помощью FACS (отсортированными по CD24+, CD44+, EpCAM+) CSC поджелудочной железы (правая секция), но не с нормальными эпителиальными клетками поджелудочной железы (левая секция). На вставках показано изображение клеток в более светлом поле, проанализированных с помощью FMAT в отношении связывания. (B) Дорожка 1 представляет собой антитело к EpCAM; дорожка 2 представляет собой антитело к MHC1-AF488; дорожка 3 представляет собой клетки+краситель, определяющий жизнеспособность; дорожка 4 представляет собой E-3-5; дорожка 5 представляет собой DARPin STEM 0268; дорожка 6 представляет собой неокрашенные клетки. STEM0268 не связывается с нормальными клетками бронхиального эпителия или эпителия толстой кишки и проявляет минимальное связывание с клетками эпителия почки.
[0036]
фигурах 4A-4C
На проиллюстрировано, что STEM0268 связывается с раковыми клетками поджелудочной железы и повышен в содержании на CSC. STEM0268 связывается с моделями PDX PA-0165 (A) и PA-0143 (B) по сравнению с двумя контрольными DARPin-Fc. Тем не менее, несмотря на то, что STEM0268 проявляет некоторое связывание со всеми опухолевыми клетками, он проявляет сильно повышенное связыванием с CSC (C).
[0037]
фигурах 5A-5C
выс.
На показано, что STEM0268 подавляет CSC поджелудочной железы. STEM0268 демонстрирует подавление образования сфер как у PA-0143 (A), так и у PA-0165 (B). STEM0268 также подавляет CSC у линии клеток HPAC, что измеряют по количеству EZH2 клеток (контроль=нерелевантный контроль DARPin). В экспериментах, показанных 5A и 5C, также применяли салиномицин (1 мкM) в качестве положительного контроля.
[0038]
фигурах 6A-6C
На изображены эксперименты по идентификации LOX1 в качестве мишени STEM0268. (A) FACS-анализ HEK293, сверхэкспрессирующих различные белки. На средней секции изображено связывание STEM0268 с LOX1-экспрессирующими клетками. Контроли не включали плазмиду и клетки, сверхэкспрессирующие FcγR2b ("Fcgr2b"). Показаны примеры связывания STEM0268 с клетками HEK293, экспрессирующими нецелевые белки (S1PR2 и BMPR1A). (B) ELISA с flag-маркированным рекомбинантным LOX1 человека демонстрирует связывание STEM0268. Контроли включают два DARPin-Fc, которые не связываются с белками человека (контроль 1 и 2), а также антитело к FLAG и только вторичное антитело. (C) Связывание по Octet STEM0268 с рекомбинантным LOX1 человека.
[0039]
фигурах 7A-7C
фигуре 5A
фигуре 5B.
На продемонстрировано подавление CSC ингибитором LOX1 в нескольких моделях. (A) Схожий уровень подавления CSC моноклональным антителом к LOX1, LX5140110, по сравнению с DARPin STEM0268 в моделях PDX поджелудочной железы, использованных на и LX5140110 подавляет CSC в дополнительных линиях клеток поджелудочной железы (B), а также в линиях клеток толстой и прямой кишки (C).
[0040]
фигурах 8A-8B
in vivo
P
На изображено подавление CSC посредством LX5140110 при раке поджелудочной железы. (A) Как и ожидали, LX5140110 приводит к умеренному уменьшению роста PA0143 при специфическом целенаправленном воздействии на небольшой процент CSC в модели опухоли. <0,0001, критерий множественного сравнения Тьюки, LX5140110 по сравнению либо с группой, обработанной средой-носителем, либо с группой, обработанной IgG1. (B) CSC уменьшаются в количестве у PA0143 после обработки посредством LX5140110.
[0041]
фигурах 9A-9B
На продемонстрировано, что комбинация LX5140110 и гемцитабина может подавлять CSC. (A) Рост линии клеток поджелудочной железы Pan02.13 подавляется гемцитабином (GEM). (B) Обработка Pan02.13 гемцитабином приводит к увеличению уровня CSC в Pan02.13, что может быть обращено посредством LX5140110, но не неспецифическим контрольным IgG1.
[0042]
фигурах 10A-10B
На продемонстрировано, что доксорубицин может увеличивать экспрессию LOX1. (A) Клетки эндотелия аорты человека, обработанные доксорубицином, демонстрируют повышенную экспрессию LOX1. Окисленный LDL (oxLDL) использовали в качестве контроля. (B) Кардиомиоциты, обработанные доксорубицином, также демонстрируют повышение экспрессии LOX1.
[0043]
фигурах 11A-11B
На изображено индуцированное доксорубицином повреждение кардиомиоцитов и способность LX5140110 обращать такое повреждение. (A) Кардиомиоциты, обработанные доксорубицином (DOX), имеют повышенные уровни кальция, что свидетельствует о дисфункции кардиомиоцитов. Такие уровни обращаются с помощью LX5140110. (B) Кардиомиоциты, обработанные посредством DOX, демонстрируют сниженную жизнеспособность, в то время как в случае предварительной обработки посредством LX5140110 они демонстрируют повышенную жизнеспособность клеток.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0044]
Описанное в данном документе настоящее изобретение впервые демонстрирует, что лектиноподобный рецептор 1 окисленных липопротеинов низкой плотности (LOX1) сверхэкспрессируется клетками CSC и является функционально релевантной терапевтической мишенью у CSC. Несмотря на то, что в отчетах отсылали к потенциальной экспрессии LOX1 в некоторых формах рака, в отчетах не выявляли экспрессию и функцию LOX1 с каким-либо фенотипом CSC, что обеспечивает новые и неожиданные способы лечения рака, метастаз рака и, в частности, подавления CSC. Как показано в определенных аспектах и неограничивающих вариантах осуществления, раскрытых в данном документе, новые способы, с помощью которых целенаправленно воздействуют и подавляют активность LOX1, являются пригодными и эффективными против форм рака, которые содержат и проявляют клетки, имеющие фенотип CSC. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления способы и средства, раскрытые в данном документе, можно применять для целенаправленного воздействия на формы рака, содержащие клетки CSC, которые экспрессируют LOX1, в том числе, например, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, гепатоцеллюлярную карциному, рак желудка, рак легкого, рак головы и шеи и рак молочной железы. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает новые стратегии целенаправленного воздействия, которые включают способы и средства, которые подавляют CSC и могут быть использованы для подавления и/или лечения различных форм рака у пациентов, страдающих раком, и улучшения качества жизни.
[0045]
et al.,
et al.,
Chlamydia pneumoniae
et. al., Eur J Clin Invest.
LOX1 представляет собой связанный дисульфидными мостиками трансмембранный белок II типа. Изначально он был идентифицирован в качестве основного рецептора окисленных липопротеинов низкой плотности (oxLDL) (Kume 1997). Рецептор состоит из короткого N-концевого цитоплазматического домена, трансмембранного домена, шеечного домена и лектинового домена типа С (CTLD), при этом вопрос о структуре CTLD был решен (Ohki (2005)). Кроме того, LOX1 может быть расщеплен протеолитическим путем в шеечном домене с высвобождением растворимого LOX1 (sLOX1). LOX1 представляет собой скавенджер-рецептор класса E и связывает множество лигандов, в том числе oxLDL, C-реактивный белок (CRP), фосфатидилсерин, конечные продукты усиленного гликозилирования (AGE), мелкие плотные частицы липопротеинов (sdLDL), окисленные HDL, N4-оксононаноиллизин (ONL), белки теплового шока (hsp), , тромбоциты, лейкоциты и апоптические клетки. Многие из этих лигандов, в частности oxLDL, связаны с атеросклерозом. Множество путей трансдукции сигнала связаны с активацией LOX1, в том числе сигнальные пути RhoA/Rac1, монооксида азота, p38MAPK, протеинкиназы B и C, ERK1/2 и NFκB. См., например, Taye 43(7):740-5 (2013).
[0046]
et al.,
et al.,
et al
et al.,
et al
et al.,
et al
et al
et al.,
et al
Доклинические данные указывают на то, что LOX1 вовлечен в стимуляцию развития сосудистой дисфункции, развития, разрыва бляшек и тромбоза, атеросклероза и воспалительных состояний. См., например, Ulrich-Merzenich (2013). Например, в то время как у нокаутных по LOX1 мышей наблюдался облегченный аортальный атеросклероз и сниженная степень отложения коллагена на стенках сосудов (Mehta (2007)), сверхэкспрессия LOX1 обуславливала усиленное образование бляшек (Inoue ., (2005) и White (2011)) при этом экспрессия LOX1 наблюдалась в промежуточных участках нестабильной бляшки и она связана со скоплением макрофагов, апоптозом и экспрессией MMP-9 (Li ., (2010)). Нейтрализующие LOX1 антитела обеспечивают восстановление индуцируемой ацетилхолином дилатации коронарных артерий (Xu (2007)) и уменьшают утолщение интимы после баллонного повреждения у крыс (Hinagata ., (2006)). Экспрессия LOX1 у людей не является конститутивной, а является динамически индуцируемой провоспалительными стимулами. В атеросклеротической бляшке LOX1 экспрессируется на эндотелиальных клетках, гладкомышечных клетках и макрофагах. Примечательно, что sLOX1 сыворотки был предложен в качестве диагностического критерия нестабильности и разрыва бляшек у пациентов с острым коронарным синдромом (ACS) (Nakamura ., (2010)); для прогнозирования повторного проявления ACS или летального исхода (Kume (1997)); и он связан с увеличенным числом комплексных поражений (Zhao ., (2011)).
[0047]
et al.
et al
et al
et al
В дополнение к вышесказанному было показано, что LOX1 имеет повышенную экспрессию при нескольких типах рака, таких как рак предстательной железы (Fangning Wan (2015)). Также сообщалось, что высокие уровни экспрессии белка в комбинации с высоким индексом массы тела могут служить прогностическим критерием для плохого прогноза при плоскоклеточном немелкоклеточном раке легкого (Long ., (2015)). Также сообщалось, что LOX1 вовлечен в трансформацию линии нормальных клеток эпителия молочной железы (MCF10A) в линию онкогенных клеток путем активации NF-kB и выдвинуто предположение в отношении любого вовлечения в пролиферацию и миграцию клеток (Khaidakov M ., (2011) и Hirsh HA .(2010)). Несмотря на то, что в этих отчетах рассмотрены потенциальные роли, которые LOX1 может играть в нескольких формах рака, полагаем, что представленное в данном документе изобретение является первым доказательством того, что LOX1 играет роль в биологии CSC.
[0048]
Настоящее изобретение включает описание и обзор идентификации LOX1 в качестве новой мишени для CSC. В контексте данного документа определение LOX1 в качестве релевантной мишени CSC рассмотрено с помощью иллюстративных примеров, которые включают фенотипический отбор и анализ моделей ксенотрансплантатов пациентов (PDX), полученных от различных форм рака поджелудочной железы. Модели PDX увеличивали количества CSC путем получения опухолевых сфер и посредством способа скрининга, рассмотренного в примерах, ингибиторы LOX1 можно использовать для подавления CSC (например, подавления пролиферации, индукции дифференциации, индукции апоптоза CSC или иного способа уничтожения или замедления прогрессирования пролиферации CSC).
[0049]
Таким образом, LOX1 играет роль в росте и активности CSC, что является совершенно новым для биологии CSC. В настоящем раскрытии приведены иллюстративные варианты осуществления, демонстрирующие, что CSC, такие как, например, CSC, полученные из моделей рака поджелудочной железы, экспрессируют LOX1 и что, в свою очередь, LOX1 может влиять на самообновление и пролиферацию CSC. Стратегии, которые предусматривают нейтрализацию активности LOX1 с помощью ингибитора LOX1, такого как, например, моноклональное антитело, могут оказывать значительный эффект на подавление CSC, что обеспечивает большой потенциал для терапевтических средств, мишенью который является LOX1, направленных на уменьшение количеств CSC в опухоли.
[0050]
Прежде чем продолжить описание настоящего изобретения более подробно, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными композициями или стадиями способа, поскольку они могут варьироваться. Следует отметить, что используемые в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. Дополнительно, данные термины, а также термины "один или несколько" и "по меньшей мере один" можно использовать в данном документе взаимозаменяемо.
[0051]
Кроме того, выражение "и/или" следует рассматривать как конкретное раскрытие каждого из двух указанных признаков или компонентов с другим или без другого. Таким образом, подразумевается, что термин "и/или", используемое в такой фразе, как "А и/или В", включает "А и В", "А или В", "А" (отдельно) и "В" (отдельно). Аналогично, подразумевается, что термин "и/или", используемое в такой фразе, как "А, В и/или С", охватывает каждый из следующих аспектов: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (отдельно); В (отдельно) и С (отдельно).
[0052]
Если не определено иное, то все используемые в данном документе технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понимает средний специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Например, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press и Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, обеспечивают специалиста общим словарем многих терминов, используемых в настоящем изобретении.
[0053]
Единицы измерения, приставки и символы обозначены в их форме, принятой согласно Международной системе единиц (SI). Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, то аминокислотные последовательности записаны слева направо в направлении от амино- к карбокси-концу. Приведенные в данном документе заголовки не ограничивают различные аспекты настоящего изобретения, которые могут обеспечиваться ссылкой на описание в целом. Соответственно, термины, определяемые непосредственно ниже, более полно определены со ссылкой на описание во всей его полноте.
[0054]
Какие бы аспекты ни описывались в данном документе формулировкой "содержащий", другие аналогичные аспекты, описываемые терминами "состоящий из" и/или "состоящий главным образом из", также предусмотрены.
[0055]
Термины "приблизительно" и "примерно" в контексте настоящего изобретения означают интервал точности, который специалист в данной области техники будет понимать как такой, который все еще обеспечивает технический эффект изучаемой характеристики. Термин обычно охватывает отклонение от указанного числового значения на приблизительно +/- 10% или приблизительно +/- 5%.
[0056]
Определение процента идентичности между двумя последовательностями предпочтительно выполняют с помощью математического алгоритма Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877. Такой алгоритм включен, например, в программы BLASTn и BLASTp у Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410, доступные на веб-сайте NCBI. Определение процента идентичности обычно выполняют с помощью стандартных параметров программ BLASTn и BLASTp.
[0057]
Аминокислоты могут называться в данном документе по их общеизвестным трехбуквенным символам либо по однобуквенным символам, рекомендованным комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аналогично, нуклеотиды могут называться по их общепринятым однобуквенным кодам.
[0058]
Термины "LOX1" и "лектиноподобный рецептор-1 окисленных липопротеинов низкой плотности" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к LOX1 и/или биологически активным фрагментам LOX1. cDNA и аминокислотные последовательности трех изоформ hLOX1 представлены в GenBank с номерами доступа: NP_002534.1, NP_001166103.1 и NP_001166104.1, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[0059]
Термины "ингибировать," "блокировать," "уменьшать" и "подавлять" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к любому статистически значимому снижению биологической активности, в том числе полному блокированию активности. Например, "ингибирование" может относиться к снижению биологической активности LOX1 на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. Следовательно, если термины "ингибирование" или "подавление" применяют для описания, например, эффекта в отношении LOX1-опосредованного пути сигнальной трансдукции в клетке, экспрессирующей LOX1 клеточной поверхности (например, CSC) и в присутствии лиганда LOX1 (например, oxLDL, CRP и AGE), то термины относятся к способности LOX1-связывающего белка, например, антитела к LOX1, подавлять индуцированную LOX1-опосредованным действием сигнальную трансдукцию в клетке на статистически значимом уровне (например, с p-значением равным 0,05, или меньше). В дополнительных аспектах ингибированная или блокированная LOX1-опосредованная биологическая активность обеспечивает программируемую клеточную гибель (т. е. апоптоз). В дополнительных вариантах осуществления ингибированная или блокированная LOX1-опосредованная биологическая активность обеспечивает дифференциацию клеток (например, CSC).
[0060]
Термины "антитело" или "иммуноглобулин", используемые в данном документе взаимозаменяемо, включают целые антитела и любой их антигенсвязывающий фрагмент или отдельные цепи. Типичное антитело содержит по меньшей мере две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (в данном документе сокращенно VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в данном документе сокращенно VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), чередующиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FW). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FW, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Примеры антител по настоящему изобретению включают типичные антитела, scFvs и их комбинации, где, например, scFv ковалентно соединен (например, посредством пептидных связей или посредством химического линкера) с N-концом тяжелой цепи и/или легкой цепи типичного антитела, или встроен в тяжелую цепь и/или легкую цепь типичного антитела.
[0061]
Термин "антитело" может относиться к молекуле иммуноглобулина, которая распознает и специфически связывается с мишенью, такой как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или комбинацией вышеуказанного, посредством по меньшей мере одного антиген-распознающего сайта вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Термин "антитело" включает моноклональные антитела, рекомбинантные антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, биспецифические антитела, мультиспецифические антитела или фрагменты этих антител.
[0062]
Термин "антитело" охватывает интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab')2 и Fv-фрагменты), одноцепочечные Fv (scFv) мутанты, полиспецифические антитела, такие как биспецифические антитела, полученные по меньшей мере из двух интактных антител, химерные антитела, гуманизированные антитела, антитела человека, слитые белки, содержащие антиген-определяющую часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена, при условии, что антитела проявляют необходимую биологическую активность. Антитело может относиться к любому из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM или их подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), исходя из идентичности их константных доменов тяжелой цепи, обозначаемых соответственно как альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю. Разные классы иммуноглобулинов характеризуются разными и хорошо известными структурами субъединиц и пространственными конфигурациями. Антитела могут быть "голыми" или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, радиоизотопы и т. д.
[0063]
Термин "получение последовательности зародышевого типа" означает, что аминокислоты в конкретных положениях в антителе подвергнуты обратной мутации в отношении тех аминокислот, которые находятся в том же положении, что и встречающиеся в зародышевой линии.
[0064]
2
Термин "антигенсвязывающий фрагмент антитела" или "фрагмент антитела, связывающий LOX-1" относится к части интактного антитела и относится к определяющим комплементарность вариабельным областям интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают без ограничения Fab, Fab', F(ab')2 и Fv-фрагменты, линейные антитела, одноцепочечные антитела (например, ScFv) и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антитела. В настоящем изобретении также предусматривают фрагменты антител, связывающие LOX1, где фрагмент антитела представляет собой Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')-фрагмент, Fv-фрагмент, диатело или молекулу одноцепочечного антитела.
[0065]
"Моноклональное антитело" относится к гомогенной популяции антител, вовлеченных в высокоспецифичное распознавание и связывание одной антигенной детерминанты или эпитопа. Этим они отличаются от поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных антигенных детерминант. Термин "моноклональное антитело" охватывает как интактные, так и полноразмерные моноклональные антитела, а также фрагменты антитела (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные (scFv) мутанты, слитые белки, содержащие часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена. Кроме того, "моноклональное антитело" относится к таким антителам, которые получены любым из ряда путей, в том числе без ограничения посредством гибридомы, отбора с помощью фагового дисплея, рекомбинантной экспрессии и с применением трансгенных животных.
[0066]
et al., Nature
et al., Nature
et al., Science
Термин "гуманизированное антитело" относится к антителу, полученному из иммуноглобулина, отличного от иммуноглобулина человека (например, мыши), которое было сконструировано так, чтобы содержание последовательностей, отличных от последовательностей человека (например, последовательностей мыши), было минимальным. Как правило, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека, в которых остатки определяющей комплементарность области (CDR) заменены остатками CDR видов, отличных от человека (например, мыши, крысы, кролика или хомяка), которые характеризуются необходимой специфичностью, аффинностью и функциональной способностью (Jones , 321:522-525 (1986); Riechmann , 332:323-327 (1988); Verhoeyen , 239:1534-1536 (1988)). В некоторых случаях остатки каркасной области (FW) Fv иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками антитела из отличных от человека видов, которые характеризуются необходимой специфичностью, аффинностью и функциональной способностью.
[0067]
Гуманизированные антитела можно дополнительно модифицировать посредством замены дополнительных остатков в каркасной области Fv и/или в замененных, не относящихся к человеческим остатках для усовершенствования и оптимизации специфичности, аффинности и/или функциональной способности антитела. Как правило, гуманизированные антитела будут включать практически все из по меньшей мере одного, и, как правило, двух или трех вариабельных доменов, содержащих все или практически все из CDR-областей, которые соответствуют таковым у иммуноглобулина, отличного от иммуноглобулина человека, тогда как все или практически все из FW-областей являются таковыми из консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может также содержать по меньшей мере часть константной области или домена (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека. Примеры способов, используемых для получения гуманизированных антител, описаны в патентах США №№ 5225539 или 5639641.
[0068]
et al.
et al., J
Molec. Biol.
«Вариабельная область» антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела либо по отдельности, либо в комбинации. Каждые из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей состоят из четырех каркасных областей (FW), соединенных с тремя определяющими комплементарность областями (CDR), также известными как гипервариабельные области. В каждой цепи CDR-области удерживаются в непосредственной близости с помощью FW-областей, и вместе с CDR-областями из другой цепи участвуют в образовании антигенсвязывающего cайта антител. Существует по меньшей мере две методики определения CDR: (1) подход, основанный на межвидовой вариабельности последовательностей (т. е. Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Al-lazikani . 273:927-948 (1997)). Кроме того, для определения CDR в данной области техники иногда используют комбинации этих двух подходов.
[0069]
et al.,
et al.,
Обычно при обозначении остатка в вариабельном домене (примерно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) применяют систему нумерации согласно Kabat (например, Kabat Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), включенная в данный документ посредством ссылки). Нумерация аминокислотных положений согласно Kabat относится к системе нумерации, применяемой к вариабельным доменам тяжелой цепи или вариабельным доменам легкой цепи антител в соответствии с собранными сведениями в Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). При применении данной системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению FW или CDR вариабельного домена или вставке в них. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать вставку из одной аминокислоты (остаток 52a согласно Kabat) после остатка 52 в H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c и т. д. согласно Kabat) после остатка 82 FW тяжелой цепи.
[0070]
J. Mol. Biol.
Нумерацию остатков согласно Kabat можно определить для данного антитела с помощью выравнивания последовательности антитела со ''стандартной'' последовательностью, пронумерованной согласно Kabat, в областях гомологии. В отличие от этого, Chothia ссылается на расположение структурных петель (Chothia and Lesk, 196:901-917 (1987)). Конец петли CDR-H1 согласно Chothia при нумерации с использованием правила нумерации согласно Kabat варьирует от H32 до H34 в зависимости от длины петли (это обусловлено тем, что согласно схеме нумерации Kabat вставки размещаются в H35A и H35B; при этом если не присутствуют ни 35A, ни 35B, то петля заканчивается на 32; если присутствует только 35A, то петля заканчивается на 33; если присутствуют обе 35A и 35B, то петля заканчивается на 34). Определение гипервариабельных областей согласно AbM представляет собой компромисс между определением CDR согласно Kabat и структурных петель согласно Chothia, и применяется в программном обеспечении для моделирования антител AbM от Oxford Molecular.
[0071]
et al., Dev. Comp. Immunol
IMGT (ImMunoGeneTics) предусматривает также систему нумерации для вариабельных областей иммуноглобулинов, в том числе CDR. См., например, Lefranc, M.P. . 27, 55-77(2003), которая включена в данный документ посредством ссылки. Система нумерации IMGT была основана на выравнивании более 5000 последовательностей, данных о структуре и определении характеристик гипервариабельных петель, и она обеспечивает возможность легкого сравнения вариабельных и CDR-областей для всех видов. В соответствии со схемой нумерации IMGT VH-CDR1 находится в положениях 26-35, VH-CDR2 находится в положениях 51-57, VH-CDR3 находится в положениях 93-102, VL-CDR1 находится в положениях 27-32, VL-CDR2 находится в положениях 50-52 и VL-CDR3 находится в положениях 89-97.
[0072]
Описанные последовательности VH CDR, используемые в настоящем описании, соответствуют местоположениям согласно классической нумерации по Kabat, а именно VH-CDR1 согласно Kabat находится в положениях 31-35, VH-CDR2 находится в положениях 50-65 и VH-CDR3 находится в положениях 95-102. VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3 также соответствуют местоположениям согласно классической нумерации по Kabat, а именно положениям 24-34, 50-56 и 89-97 соответственно.
[0073]
Термин "антитело человека" означает антитело, продуцируемое в организме человека, или антитело с аминокислотной последовательностью соответствующей антителу, продуцируемому в организме человека, полученное с использованием любых методик, известных из уровня техники. Это определение антитела человека включает интактные или полноразмерные антитела, их фрагменты и/или антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой и/или легкой цепи человека, как, например, антитело, содержащее полипептиды легкой цепи мыши и тяжелой цепи человека.
[0074]
Термин "химерные антитела" относится к антителам, в которых аминокислотная последовательность молекулы иммуноглобулина получена от двух или более видов. Как правило, вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепей соответствует вариабельной области антител, полученных от одного вида млекопитающих (например, мыши, крысы и т. д.) с необходимой специфичностью, аффинностью и функциональной способностью, в то время как константные области гомологичны последовательностям антител, полученным от другого (обычно человека), во избежание вызывания иммунного ответа у тех видов.
[0075]
et al.
Термины "TM" или "TM-мутант" относятся к мутации в константной области IgG1, которая приводит к подавлению эффекторной функции (например, ADCC) антитела с указанной мутацией. TM-мутант предусматривает комбинацию трех мутаций L234F/L235E/P331S, приводящих к образованию не обладающих эффекторной функцией IgG1 человека (нумерация согласно EU-индексу по Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, D.C.), введенных в тяжелую цепь IgG1.
[0076]
et al.
et al., J. Biol. Chem.
Термины "YTE" или "YTE-мутант" относятся к мутации в Fc IgG1, которая приводит к усилению связывания с FcRn человека и улучшению в отношении времени полужизни в сыворотке антитела с указанной мутацией. TM-мутант предусматривает комбинацию трех мутаций M252Y/S254T/T256E, (нумерация согласно EU-индексу по Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, D.C.), введенных в тяжелую цепь IgG1. См. патент США № 7658921, включенный в данный документ посредством ссылки. Было показано, что мутация YTE увеличивает время полужизни антител в сыворотке примерно в четыре раза по сравнению с таковым для того же антитела дикого типа (Dall'Acqua 281:23514-24 (2006)). См. также патент США № 7083784, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[0077]
Термины "LOX1-связывающий белок", "антитело к LOX1," или "антитело, которое специфично связывает LOX1" относятся к LOX1-связывающему белку, такому как антитело к LOX1, способному связывать LOX1 с достаточной аффинностью, благодаря чему антитело является пригодным в качестве терапевтического средства или диагностического реагента при целенаправленном воздействии на LOX1. Степень связывания антитела к LOX1 с неродственным белком помимо LOX1 составляет менее приблизительно 10% от связывания антитела с LOX1, как измерено, например, с помощью радиоиммунологического анализа (RIA), BIACORE (с применением рекомбинантного LOX1 в качестве анализируемого компонента и антитела в качестве лиганда, или наоборот), кинетического эксклюзионного анализа (KINEXA) или других анализов связывания, известных из уровня техники. В определенных аспектах LOX1-связывающий белок представляет собой полноразмерное антитело или фрагмент антитела, связывающий LOX-1, (которое)который характеризуется константой диссоциации (KD) ≤ 1 нМ, ≤ 0,5 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 10 пМ или ≤ 1 пМ, или в некоторых случаях KD составляет от приблизительно 150 пМ до приблизительно 600 пМ или от приблизительно 400 пМ до приблизительно 600 пМ. В определенных аспектах LOX1-связывающий белок представляет собой полноразмерное антитело или фрагмент антитела, связывающий LOX-1, (которое)который характеризуется константой диссоциации (KD) ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 10 пМ, ≤ 1 пМ или ≤ 0,1 пМ, или в некоторых случаях KD составляет от приблизительно 150 пМ до приблизительно 600 пМ.
[0078]
"Антагонистический" или "блокирующий" LOX1-связывающий белок представляет собой таковой, который подавляет или снижает биологическую активность LOX1. В некоторых аспектах антагонистический LOX1-связывающий белок подавляет способность LOX1 связывать oxLDL, AGE и/или CRP. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок подавляет способность LOX1 связывать oxHDL, HSP60 лейкоциты и/или активированные тромбоциты. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок в значительной степени или полностью подавляет биологическую активность LOX1. Желательно, чтобы биологическая активность LOX1 снижалась на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже 100%. В конкретных аспектах LOX1-связывающий белок представляет собой антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело или фрагмент антитела, связывающий LOX1. В дополнительных аспектах антитело к LOX1 подавляет или снижает биологическую активность LOX1 на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже 100%.
[0079]
D
''Аффинность связывания'', в целом, относится к силе суммы всех нековалентных взаимодействий между одним участком связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, как используется в данном документе, "аффинность связывания" относится к присущей аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y в целом можно представить константой диссоциации (K). Аффинность можно измерить с помощью способов, общеизвестных из уровня техники, в том числе описанных в данном документе. В основном антитела с низкой аффинностью связывают антиген медленно и склонны легко диссоциировать, тогда как антитела с высокой аффинностью обычно связывают антиген быстрее и склонны оставаться в связанном состоянии дольше. Из уровня техники известен ряд способов измерения аффинности связывания, любой из которых можно применять для целей настоящего изобретения.
[0080]
50
50
50
50
50
"Эффективность", как правило, выражают в виде значения IC в нМ или пМ, если не указано иное. IC представляет собой медианную ингибирующую концентрацию молекулы антитела. В функциональных анализах IC представляет собой концентрацию, которая снижает биологический ответ на 50% от его максимума. В исследованиях по связыванию лиганда IC представляет собой концентрацию, которая снижает уровень связывания рецептора на 50% от максимального уровня специфического связывания. IC можно рассчитать способами, известными из уровня техники.
[0081]
Кратность повышения эффективности LOX1-связывающего белка, раскрытого в данном документе (например, антитела, такого как полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и их варианты и производные) по сравнению с эталонным антителом, может быть по меньшей мере приблизительно 2-кратной, по меньшей мере приблизительно 4-кратной, по меньшей мере приблизительно 6-кратной, по меньшей мере приблизительно 8-кратной, по меньшей мере приблизительно 10-кратной, по меньшей мере приблизительно 20-кратной, по меньшей мере приблизительно 30-кратной, по меньшей мере приблизительно 40-кратной, по меньшей мере приблизительно 50-кратной, по меньшей мере приблизительно 60-кратной, по меньшей мере приблизительно 70-кратной, по меньшей мере приблизительно 80-кратной, по меньшей мере приблизительно 90-кратной, по меньшей мере приблизительно 100-кратной, по меньшей мере приблизительно 110-кратной, по меньшей мере приблизительно 120-кратной, по меньшей мере приблизительно 130-кратной, по меньшей мере приблизительно 140-кратной, по меньшей мере приблизительно 150-кратной, по меньшей мере приблизительно 160-кратной, по меньшей мере приблизительно 170-кратной или по меньшей мере приблизительно 180-кратной или больше.
[0082]
"Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность" или "ADCC" относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig, связанный с Fc-рецепторами (FcR), представленными на определенных цитотоксических клетках (например, естественных клетках-киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах), дает возможность данным цитотоксическим эффекторным клеткам специфично связываться с несущей антиген клеткой-мишенью, а затем уничтожать клетку-мишень с помощью цитотоксинов. Специфические антитела IgG с высокой аффинностью, направленные на поверхность клеток-мишеней, "вооружают" цитотоксические клетки и исключительно необходимы для такого уничтожения. Лизис клетки-мишени является внеклеточным, требует непосредственного межклеточного контакта и не вовлекает систему комплемента. Предполагается, что в дополнение к антителам другие белки, содержащие Fc-области, в частности Fc-слитые белки, со способностью специфично связываться с клеткой-мишенью, несущей антиген, будут способны влиять на клеточно-опосредованную цитотоксичность. Для краткости клеточноопосредованная цитотоксичность, возникающая в результате активности Fc-слитого белка, также упоминается в данном документе как ADCC-активность.
[0083]
LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1, в том числе его антигенсвязывающий фрагмент, вариант и производное), полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которые являются "выделенными", представляют собой полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетку или композицию, которые находятся в форме, не встречающейся в природе. Выделенные полипептиды (например, антитела к LOX1, в том числе полноразмерные антитела и фрагменты антител, связывающие LOX1), полинуклеотид, вектор, полинуклеотиды, векторы, клетки или композиции включают таковые, которые были очищены до такой степени, что они больше не находятся в такой форме, в которой они встречаются в природе. В некоторых аспектах выделенные антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция являются практически чистыми.
[0084]
Под "субъектом", или "индивидуумом", или "животным", или "пациентом", или "млекопитающим" подразумевается любой субъект, в частности, субъект-млекопитающее, для которого необходимы диагностика, прогнозирование или терапия. Субъекты-млекопитающие включают людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных, используемых в спорте животных и зоопарковых животных, в том числе, например, людей, отличных от человека приматов, собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс, мышей, лошадей, крупный рогатый скот, медведей и т. д.
A. Способы
[0085]
Настоящее изобретение предусматривает ряд аспектов и вариантов осуществления применительно к способам, которые предусматривают ингибитор LOX1. Как описано в данном документе, эти аспекты и варианты осуществления охватывают различные способы применительно к заболеванию, в том числе способы лечения, способы предупреждения, способы подавления и/или замедления прогрессирования, способы снижения риска рецидива или повторного проявления заболевания, способы целенаправленного воздействия на определенные клеточные популяции и/или уничтожения таковых; способы индуцирования дифференциации и/или ослабления способности самообновления и увеличения количества CSC; способы выявления, диагностики и/или количественного определения определенных клеточных популяций и/или заболеваний, в том числе определения стадии заболевания и способов контроля и/или прогноза заболевания.
[0086]
В вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ подавления пролиферации раковой стволовой клетки (CSC), предусматривающий приведение CSC в контакт с ингибитором LOX1 в количестве, эффективном для подавления пролиферации и/или ослабления выживания CSC. В вариантах осуществления способ предусматривает введение эффективного количества ингибитора LOX1, который является селективным в отношении LOX1. В некоторых вариантах осуществления ингибитор селективно подавляет биохимический каскад LOX1. Термин "селективный" при использовании в связи с терминами "ингибитор" или "подавляет" относится к соединению (например, малой молекуле или биологической молекуле, как описано в данном документе), которое характеризуется повышенной ингибирующей активностью в отношении мишени (например, LOX1), по сравнению с ингибирующей активностью в отношении других биомолекул. В одном варианте осуществления способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества ингибитора LOX1 в комбинации с дополнительным противораковым средством.
[0087]
В вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения терапевтически устойчивой формы рака у субъекта, который ранее получал терапию и который нуждается в лечении, предусматривающему введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для подавления или уничтожения раковых стволовых клеток (CSC) и/или индукции дифференциации в CSC, присутствующих при терапевтически устойчивой форме рака. В одном варианте осуществления предшествующая терапия представляет собой лучевую терапию, хирургическое вмешательство, иммунотерапию, химиотерапию и/или ингибитор тирозинкиназы.
[0088]
В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения терапевтически устойчивой формы рака у субъекта, который ранее получал терапию и который нуждается в лечении, предусматривающему введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для лечения терапевтически устойчивой формы рака. В одном варианте осуществления предшествующая терапия представляет собой лучевую терапию, хирургическое вмешательство, иммунотерапию, химиотерапию и/или ингибитор тирозинкиназы.
[0089]
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения рака, который предусматривает раковые стволовые клетки (CSC), при этом способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в лечении, ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для целенаправленного воздействия и подавления или уничтожения CSC и/или индукции дифференциации в CSC при раке. В одном варианте осуществления способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества ингибитора LOX1 в комбинации с дополнительным противораковым средством.
[0090]
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения рака, который предусматривает раковые стволовые клетки (CSC), при этом способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в лечении, ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для лечения рака. В одном варианте осуществления способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества ингибитора LOX1 в комбинации с дополнительным противораковым средством.
[0091]
В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, у которого имеется рекуррентная или рецидивирующая форма рака, предусматривающему введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для подавления или уничтожения CSC и/или индукции дифференциации в CSC при раке. В одном варианте осуществления способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества ингибитора LOX1 в комбинации с дополнительным противораковым средством.
[0092]
В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, у которого имеется рекуррентная или рецидивирующая форма рака, предусматривающему введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для лечения рака. В одном варианте осуществления способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества ингибитора LOX1 в комбинации с дополнительным противораковым средством.
[0093]
Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу предупреждения повторного проявления или рецидива рака, предусматривающему введение субъекту, нуждающемуся в предупреждении повторного проявления или рецидива рака, ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для предупреждения повторного проявления или рецидива рака. В одном варианте осуществления способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества ингибитора LOX1 в комбинации с дополнительным противораковым средством.
[0094]
В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения риска рецидива рака у субъекта, у которого имеется рак, предусматривающему введение субъекту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для подавления или уничтожения CSC и/или индукции дифференциации в CSC при раке, за счет чего снижается риск рецидива рака у субъекта. В одном варианте осуществления способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества ингибитора LOX1 в комбинации с дополнительным противораковым средством.
[0095]
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу удаления раковой стволовой клетки (CSC), предусматривающему приведение CSC в контакт с ингибитором LOX1 в количестве, эффективном для удаления CSC. В одном варианте осуществления способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества ингибитора LOX1 в комбинации с дополнительным противораковым средством.
[0096]
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу избирательного уменьшения числа раковых стволовых клеток (CSC) в популяции раковых клеток, предусматривающему приведение популяции раковых клеток в контакт с ингибитором LOX1 в количестве, эффективном для подавления или уничтожения CSC и/или индукции дифференциации в CSC в популяции раковых клеток. Таким образом, ингибиторы можно вводить субъекту, нуждающемуся в лечении и/или находящемуся в контакте с некоторым количеством CSC, в количестве, достаточном для препятствования дальнейшей пролиферации CSC. В некоторых вариантах осуществления ингибиторы можно вводить в количестве, эффективном для снижения числа CSC с помощью индуцирования гибели клеток (апоптоза) в популяции CSC. В еще одних вариантах осуществления ингибиторы можно вводить в количестве, эффективном для снижения числа CSC с помощью индуцирования клеточной дифференциации в популяции CSC. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления ингибитор(-ы) предусмотрен(-ы) в количествах, которые могут необязательно индуцировать апоптоз в CSC, однако в количествах, которые являются эффективными для снижения или дерегуляции способности CSC к самообновлению и увеличению клеточной популяции CSC в субъекте или онкогенной ткани с помощью индуцирования дифференциации CSC. Ингибиторы могут быть также предусмотрены в количестве, которое является эффективным для нарушения "ниши" CSC таким образом, что ниша CSC больше неспособна поддерживать CSC и/или регенерацию опухолевой ткани. В одном варианте осуществления способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества ингибитора LOX1 в комбинации с дополнительным противораковым средством.
[0097]
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ ослабления или подавления роста опухоли, предусматривающий приведение опухоли в контакт с ингибитором LOX1 в количестве, эффективном для ослабления или подавления роста опухоли. В связанном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ ослабления или подавления роста опухоли у пациента, предусматривающий введение пациенту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для ослабления или подавления роста опухоли. В одном варианте осуществления способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества ингибитора LOX1 в комбинации с дополнительным противораковым средством.
[0098]
В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ уменьшения размера опухоли, предусматривающий приведение опухоли в контакт с ингибитором LOX1 в количестве, эффективном для уменьшения размера опухоли. В связанном аспекте настоящее изобретение относится к способу уменьшения размера опухоли у пациента, предусматривающему введение пациенту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для уменьшения размера опухоли. В одном варианте осуществления способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества ингибитора LOX1 в комбинации с дополнительным противораковым средством.
[0099]
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ подавления, ослабления или предупреждения инвазивности или метастазирования опухоли, предусматривающий приведение опухоли в контакт с ингибитором LOX1 в количестве, эффективном для предупреждения, ослабления или подавления инвазивности или метастазирования опухоли. В связанном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ подавления, ослабления или предупреждения инвазивности или метастазирования опухоли у пациента, предусматривающий введение пациенту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для предупреждения, ослабления или подавления инвазивности или метастазирования опухоли. В одном варианте осуществления способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества ингибитора LOX1 в комбинации с дополнительным противораковым средством.
[0100]
В вариантах осуществления, предусмотренных настоящим изобретением, способы относятся к опухоли, и/или CSC, или популяции CSC, экспрессирующим LOX1. В дополнительных вариантах осуществления опухоль, и/или CSC, или популяция CSC могут содержать сферообразующие CSC.
[0101]
В различных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов способы относятся к лечению субъекта в отношении опухолевого заболевания и/или ракового заболевания. В некоторых вариантах осуществления рак выбран из форм рака пищеварительной системы или желудочно-кишечного тракта (например, рака анального отверстия; рака желчного протока; рака внепеченочного желчного протока; рака аппендикса; карциноидной опухоли, желудочно-кишечного рака; рака толстой кишки; колоректального рака, в том числе колоректального рака у детей; рака пищевода, в том числе рака у детей; рака желчного пузыря; рака желудка (желудочного рака), в том числе рака желудка у детей; гепатоцеллюлярного рака (например, гепатоцеллюлярной карциномы), в том числе (первичного) гепатоцеллюлярного рака у взрослых и гепатоцеллюлярного рака у детей; рака поджелудочной железы, в том числе рака поджелудочной железы у детей; саркомы, рабдомиосаркомы; рака островковых клеток поджелудочной железы; рака прямой кишки и рака тонкого кишечника); рака легкого (например, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) и мелкоклеточного рака легкого (SCLC)); рака головы и шеи (например, рака губы и ротовой полости; рака ротовой полости, в том числе рака ротовой полости у детей; гипофарингеального рака; рака гортани, в том числе рака гортани у детей; метастатического плоскоклеточного рака шеи со скрытой первичной опухолью; рака рта; рака носовой полости и околоносовых пазух; рака носоглотки, в том числе рака носоглотки у детей; рака ротоглотки; рака паращитовидной железы; рака глотки; рака слюнных желез, в том числе рака слюнных желез у детей; рака горла и рака щитовидной железы); и рака молочной железы.
[0102]
Как обсуждалось выше, обычно выражение "субъект" включает человека и животных, отличных от человека, в частности млекопитающих. В определенных вариантах осуществления аспектов, относящихся к способам лечения субъекта, неограничивающие примеры субъектов включают субъектов-людей, например человека-пациента, страдающего нарушением, например описываемым в данном документе нарушением, таким как рак, или нормального субъекта. В некоторых вариантах осуществления животное или субъект, "отличные от человека", включают всех позвоночных, например, отличных от млекопитающих (таких как куры, амфибии, рептилии), и млекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, домашние и/или сельскохозяйственные животные (такие как овцы, собаки, кошки, коровы, свиньи и т. д.) и грызуны (такие как мыши, крысы, хомяки, морские свинки и т. д.). В определенных вариантах осуществления раскрываемых в данном документе способов субъектом является пациент-человек.
[0103]
Термины "лечение" или "лечить" относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. К субъектам, нуждающимся в лечении, относят тех, у которых уже есть нарушение, а также тех, которые предрасположены к нарушению, или тех, у которых требуется предупредить развитие нарушения. К субъектам, нуждающимся в лечении, относят тех, у которых уже есть нарушение, а также тех, которые предрасположены к нарушению, или тех, у которых требуется предупредить развитие нарушения. При использовании со ссылкой на заболевание или субъекта, нуждающегося в лечении, термины соответственно включают без ограничения приостановление или замедление прогрессирования заболевания, ремиссию заболевания, профилактику симптомов, уменьшение тяжести заболевания и/или симптома или уменьшение продолжительности заболевания по сравнению с субъектом, не получавшим лечение. В вариантах осуществления в способах лечения можно ослаблять один или несколько клинических признаков конкретного заболевания, лечение которого осуществляют. Определенные варианты осуществления, относящиеся к способам лечения заболевания или состояния, ассоциированных с CSC, которые экспрессируют LOX1, а также CSC, имеющими активированный каскад LOX1, предусматривают введение терапевтически эффективных количеств соединения, которое ингибирует LOX1, а также их фармацевтических композиций. В вариантах осуществления способ лечения может относиться к любому способу, с помощью которого предотвращают дальнейшее прогрессирование заболевания и/или симптомов, устраняют заболевание, замедляют или ослабляют дальнейшее прогрессирование заболевания и/или симптомов, или обращают заболевание и/или клинические симптомы, ассоциированные с CSC и формами рака, ассоциированными с CSC, которые экспрессируют LOX1.
[0104]
В некоторых вариантах осуществления способы могут предусматривать терапевтически эффективное количество средства, которое является достаточным для остановки или замедления прогрессирования рака. В дополнительных вариантах осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, достаточное для уменьшения числа раковых клеток, в том числе CSC у субъекта (т. е. уничтожение раковых клеток, и/или подавление пролиферации раковых клеток, и/или индуцирование дифференциации CSC). Способы контроля пролиферации раковых клеток и прогрессирования рака у субъекта (например, размер опухоли, количество клеток, биохимические маркеры, вторичные показатели и т. д.) описаны в данном документе и могут также включать методики, общеизвестные из уровня техники.
[0105]
Как описано в данном документе, некоторые варианты осуществления предусматривают способ лечения, который предусматривает введение ингибитора LOX1 совместно с лучевой терапией, хирургическим вмешательством, иммунотерапией или другими химиотерапевтическими средствами. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества ингибитора LOX1 в комбинации с дополнительным противораковым средством. Самые разнообразные противораковые (т. е. антинеопластические) средства известны из уровня техники и включают, например, алкилирующие средства, антиметаболиты, природные антинеопластические средства, гормональные антинеопластические средства, ингибиторы ангиогенеза, реагенты дифференциации, химиотерапевтические средства, ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы РНК, антитела или иммунотерапевтические средства, средства генной терапии, низкомолекулярные ингибиторы ферментов, модификаторы биологического отклика и антиметастатические средства. Некоторые неограничивающие примеры этих активных соединений, включая химиотерапевтические средства, общеизвестные из уровня техники, включают, например, гемцитабин (Gemzar), капецитабин (Xeloda), Doxil, цитарабин, дексаметазон, иринотекан (Camptosar), оксалиплатин (Eloxatin), альбуминсвязанный паклитаксел (Abraxane), темозоломид, адриамицин, доксорубицин, эпирубицин, 5-фторурацил, цитозин арабинозид ("Ara-C"), циклофосфамид, тиотепу, бусульфан, цитоксин, таксоиды (например, паклитаксел), токсотер, метотрексат, цисплатин, мелфалан, винбластин, блеомицин, этопозид, ифосфамид, митомицин C, митоксантрон, винкристин, винорелбин, карбоплатин, тенипозид, дауномицин, карминомицин, аминоптерин, дактиномицин, митомицины, мелфалан и другие родственные азотистые иприты и гормональные средства, которые принимают участие в регуляции или подавлении гормонального действия на опухоли, такие как тамоксифен и онапристон.
[0106]
Химиотерапевтические средства имеют много побочных эффектов, одним из которых является токсическое действие на сердце (также называемое кардиотоксичностью). В частности, было показано, что химиотерапевтические средства вызывают повреждение сердца, что может привести к гибели кардиомиоцитов и сердечной недостаточности. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ подавления, ослабления или предупреждения связанной с химиотерапией кардиотоксичности у нуждающегося в химиотерапии пациента, предусматривающий введение пациенту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для подавления, ослабления или предупреждения связанной с химиотерапией кардиотоксичности. В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ обращения связанной с химиотерапией кардиотоксичности у нуждающегося в химиотерапии пациента, предусматривающий введение пациенту ингибитора LOX1 в количестве, эффективном для обращения связанной с химиотерапией кардиотоксичности. В одном варианте осуществления химиотерапия представляет собой антрациклин, такой как доксорубицин.
[0107]
Выражения "введение" или "вводимый", используемые в данном документе, относятся к предоставлению, приведению в контакт и/или доставке соединения или соединений подходящим путем с целью достижения необходимого эффекта. Введение может включать без ограничения пероральное, сублингвальное, парентеральное (например, внутривенную, подкожную, внутрикожную, внутримышечную, внутрисуставную, внутриартериальную, интрасиновиальную, внутригрудинную, интратекальную, внутриочаговую или внутричерепную инъекции), трансдермальное, местное, трансбуккальное, ректальное, вагинальное, назальное, офтальмическое, посредством ингаляции и имплантов.
[0108]
Выражение "совместно введенный", используемое в данном документе, относится к одновременному или последовательному введению нескольких соединений или средств. Первое соединение или средство можно вводить до введения второго соединения или средства, совместно с таковым или после такового.
[0109]
Выражение "приведение в контакт", используемое в данном документе в выражении "приведение клетки в контакт", относится к приведению клетки в контакт непосредственно или опосредованного in vitro, ex vivo или in vivo (т. е. в субъекте, таком как млекопитающее, в том числе люди, мыши, крысы, кролики, кошки и собаки). Приведение клетки в контакт, которое также может включать "осуществление реакции" клетки с ингибирующим соединением или "воздействие" на клетку ингибирующего соединения, может происходить в результате общего введения соединения или средства субъекту или добавления или введения ингибитора в сосуд, содержащий клетку, или ткань, или жидкость, содержащую клетку или ткань. Таким образом, приведение клетки в контакт с ингибитором может относиться к введению ингибитора субъекту, в ткань, или область субъекта, или ткань, которая содержит клетку (например, клетку CSC в локализованной области или системе в субъекте (например, лимфатической, кровеносной и т. д.)), и он может физически не контактировать с целевой клеткой. Приведение в контакт охватывает введение в клетку, ткань, млекопитающее, субъекта, пациента или человека. Кроме того, приведение клетки в контакт предусматривает добавление средства в клеточную культуру. Другие подходящие способы могут предусматривать внесение или введение средства в клетку, ткань, млекопитающего, субъекта или пациента с помощью подходящих процедур и путей введения, описанных в данном документе или иным образом известных из уровня техники.
[0110]
Настоящее изобретение также относится к одному или нескольким путям применения ингибитора LOX1 или комбинации из более чем одного ингибитора LOX1 в композиции, включающей терапевтические и фармацевтические композиции. В вариантах осуществления пути применения и композиции предусматривают ингибитор(-ы) в количествах, эффективных для обеспечения осуществления различных способов, раскрытых в данном документе. В вариантах осуществления один или несколько путей применения относятся к путям применения для изготовления лекарственного препарата для лечения (например, уничтожения, устранения, подавления, уменьшения прогрессирования и/или скорости прогрессирования пролиферации клеток, уменьшения способности самообновления и/или увеличения количества клеток (CSC), уменьшения прогрессирования и/или скорости прогрессирования болезненного состояния), одного из нескольких типов опухолей, раковых стволовых клеток и/или форм рака, описанных в данном документе.
Способы выявления
[0111]
В некоторых аспектах и вариантах осуществления способы, раскрытые в данном документе, предусматривают и/или включают один или несколько способов, пригодных при выявлении, определении и/или количественном определения раковой стволовой клетки (CSC). В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает выявление, обнаружение и/или определение количества LOX1 в биологическом образце, содержащем CSC. В некоторых вариантах осуществления способы предусматривают диагностику, прогнозирование, количественное определение, обнаружение и/или выявление присутствия раковой стволовой клетки (CSC) в образце, содержащем раковые клетки, при этом способ может предусматривать одно или несколько из следующего:
приведение образца в контакт со средством, которое связывается с последовательностью нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислотной последовательностью LOX1;
выявление присутствия или отсутствия связывания между средством и последовательностью нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислотной последовательностью LOX1 и/или
обнаружение присутствия CSC в образце при выявлении связывания между средством и последовательностью нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислотной последовательностью LOX1.
[0112]
В этих способах стадии можно применять отдельно или в любых последовательностях комбинаций друг с другом или другими методиками, общеизвестными из уровня техники. В некоторых вариантах осуществления данного аспекта способ дополнительно может предусматривать одно или несколько из следующего:
определение количества последовательности нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислотной последовательности LOX1 в образце;
сравнение количества последовательности нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислотной последовательности LOX1 с эталонным уровнем нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислоты LOX1 и/или
обнаружение присутствия CSC в образце, в случае если выявленное количество превышает эталонный уровень.
[0113]
В некоторых аспектах и вариантах осуществления способы, раскрытые в данном документе, предусматривают и/или включают один или несколько способов, пригодных при выявлении, определении и/или количественном определения LOX1-положительной раковой стволовой клетки (CSC). В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает выявление, обнаружение и/или определение количества LOX1-положительных CSC в биологическом образце, содержащем CSC. В некоторых вариантах осуществления способы предусматривают диагностику, прогнозирование, количественное определение, обнаружение и/или выявление присутствия LOX1-положительной раковой стволовой клетки (CSC) в образце, содержащем раковые клетки, при этом способ может предусматривать одно или несколько из следующего:
приведение образца в контакт со средством, которое связывается с последовательностью нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислотной последовательностью LOX1;
выявление присутствия или отсутствия связывания между средством и последовательностью нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислотной последовательностью LOX1 и/или
обнаружение присутствия LOX1-положительной CSC в образце при выявлении связывания между средством и последовательностью нуклеиновой кислоты LOX1 или аминокислотной последовательностью LOX1.
[0114]
В еще одних дополнительных вариантах осуществления способ может предусматривать средство, содержащее выявляемый фрагмент. В некоторых вариантах осуществления средство может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется по меньшей мере с частью последовательности нуклеиновой кислоты LOX1 в жестких условиях гибридизации. В некоторых вариантах осуществления средство может содержать антитело, которое специфически связывается по меньшей мере с частью аминокислотной последовательности LOX1.
[0115]
В различных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов способы относятся к опухоли, и/или CSC, или популяции CSC, экспрессирующим LOX1. В дополнительных вариантах осуществления опухоль, и/или CSC, или популяция CSC могут содержать сферообразующие CSC.
[0116]
et al
Cancer Res.
et al
Biochim. Biophys. Acta
3
В дополнение к способам, описанным в данном документе, которые пригодны для выявления, обнаружения и/или количественного определения CSC в образце, эти аспекты и варианты осуществления также могут также предусматривать любой способ и методику, которые доступны специалисту в данной области техники. В качестве неограничивающих примеров, CSC можно обнаруживать, выявлять и выделять с использованием методик, в том числе проточной цитометрии на основе маркеров клеточной поверхности, которые экспрессируются в определенных CSC или являются специфичными для определенных CSC; выявления фенотипов побочных популяций (SP) с помощью исключения красителя (например, Hoechst 33342, как раскрыто у Moserle, L., ., (2008) 68; 5658-5668); способности расти/пролиферировать в виде подвижных сфер в бессывороточной среде (например, раскрытых в данном документе, а также у Ryback, A.P., ., (2011) 1813; 683-694); и определения активности конкретных ферментов, например таких как активность альдегиддегидрогеназы, и уровней маркеров группы polycomb, в том числе маркера гетерохроматина группы polycomb, уровней H3K27me и энхансерного белка группы polycomb zeste 2 (EZH2).
[0117]
TM
Curr Stem Cell Res Ther
В некоторых вариантах осуществления, например, сообщали о повышенной экспрессии и активности альдегиддегидрогеназы (ALDH) в предшественниках клеток рака различных линий (например, гемопоэтических, молочной железы, эндотелиальных, мезенхимальных, нервных), и при этом в связи с различными аспектами и вариантами осуществления данного документа можно применять методики и коммерчески доступные наборы (например, ALDEFLUOR, Stemcell Technologies). Аналогично, несмотря на то, что в настоящее время отсутствуют универсально экспрессируемые маркеры клеточной поверхности для обнаружения CSC, ряд поверхностных маркеров был ассоциирован с CSC и ассоциированными типами опухолей, в том числе, например, ALDH, CD13, CD15, CD24, CD44, CD90, CD117, CD133, CD166, CD326 (см., например, Xia, P., . (2014) Mar; 9(2): 102-11; Shimamura, M., et al., Endocr. J., (2014) 61(5):481-90; Tirino, V., et al., FASEB J., (2013) Jan; 27(1):13-24).
[0118]
В некоторых вариантах осуществления, из-за отсутствия одного или нескольких универсальных поверхностных маркеров для выявления или обнаружения CSC в образце, способы выявления, обнаружения и/или количественного определения предусматривают методики культивирования клеток, включающие сферические культуры и анализы роста, такие как раскрытые в данном документе или иным образом известные из уровня техники.
B. Ингибиторы
[0119]
Способы, пути применения и композиции, описанные в данном документе, предусматривают варианты осуществления в отношении средств, способных подавлять, понижающе регулировать или устранять активность и/или экспрессию LOX1, или любую комбинацию одного или нескольких из этих ингибирующих средств. При условии, что средство обладает ингибирующей функцией (например, ингибирует экспрессию и/или активность LOX1), ингибирующее средство можно выбрать из любого класса соединений. Например, ингибиторы можно выбрать из группы, состоящей из полипептида, который подавляет LOX1, малой молекулы, которая подавляет LOX1, полипептида, который подавляет LOX1, аптамера, который подавляет LOX1, антитела, которое подавляет LOX1, или антисмысловой молекулы или молекулы siRNA, которая подавляет LOX1. Таким образом, ингибиторы, используемые в данном документе, относятся к любому соединению, которое уменьшает, ингибирует, снижает или устраняет экспрессию и/или функцию LOX1, или средства, подходящего для нейтрализации, ослабления или ингибирования экспрессии или функции LOX1. Ингибиторы, описанные в данном документе, могут вызывать действие с помощью механизма, включающего например связывание с LOX1. При связывании, ингибитор может, например, подавлять взаимодействие LOX1 с рецептором или лигандом таким образом, что LOX1 не может активировать рецептор или не может быть активирован лигандом. В других вариантах осуществления средство(-а), способное(-ые) подавлять активность LOX1, может(могут) подавлять хемотаксическую активность, может(могут) связывать белки и снижать биодоступность, или возможны любые их комбинации.
[0120]
В некоторых вариантах осуществления ингибитор может представлять собой полипептид или малую молекулу, способные связываться с LOX1, и может быть обнаружен с помощью любой методики, общепринятой в данной области техники (например, скрининга библиотек низкомолекулярных соединений или полипептидов). Как правило, выражение "малая молекула", используемое в данном документе, относится к малым органическим молекулам, имеющим низкую молекулярную массу. Малая молекула может представлять собой синтетическое соединение, которое, как известно, не встречается в природе, или встречающееся в природе соединение, выделенное из природных источников или известное как встречающееся в них, например таких как клетки, растения, грибы, животные и т. п. В некоторых вариантах осуществления малая молекула может иметь молекулярную массу, составляющую менее 5000 Дальтон, менее 4000 Дальтон, менее 3000 Дальтон, менее 2000 Дальтон, менее 1000 Дальтон или менее 800 Дальтон. В таких вариантах осуществления малая молекула обычно имеет молекулярную массу, составляющую более чем приблизительно 100 Дальтон.
[0121]
То, способна ли малая молекула или полипептид связываться с LOX1, можно определить с помощью любой стандартной методики или анализа, а также методик и анализов, описанных в данном документе. Например, методики могут предусматривать дрожжевой двугибридный анализ или биохимический анализ, такой как, например, анализ с "опусканием", анализ коиммунопреципитации, фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA), количественный анализ радиолигандного связывания, анализ с использованием плазмонного резонанса или любой другой способ, стандартно применяемый в данной области техники. Обычно при применении анализов с "опусканием" или с использованием плазмонного резонанса полезно сливать или иным образом связывать по меньшей мере один из белков с аффинной меткой, такой как HIS-метка, GST-метка, или другим выявляемым фрагментом, обычно применяемым в данной области техники. Способен ли полипептид или любое другое соединение, подлежащее исследованию, подавлять активность LOX1, можно определить с помощью измерения активности мембраносвязанного с полипептида. Соответственно, полипептид способен подавлять активность LOX1.
[0122]
В вариантах осуществления ингибитор может представлять собой "аптамер", который относится к ДНК, РНК или пептидному аптамеру, характеризующемуся специфичностью в отношении LOX1. Полинуклеотидный аптамер содержит в любом месте от приблизительно 10 до приблизительно 300 нуклеотидов в длину. Обычно длина аптамера находится в диапазоне от приблизительно 30 до приблизительно 100 нуклеотидов, и в некоторых вариантах осуществления длина может находиться в диапазоне от приблизительно 10 до 60 нуклеотидов. Аптамеры можно получить с помощью любого известного способа, в том числе синтетических, рекомбинантных способов и способов очистки, и можно применять в отдельности или в комбинации с другими аптамерами, специфичными в отношении LOX1.
[0123]
2
2
В некоторых конкретных вариантах осуществления упомянутых в данном документе способов ингибитор может представлять собой антитело, которое специфически связывает LOX1. В некоторых вариантах осуществления антитело может представлять собой моноклональное или поликлональное антитело, или полиспецифическую антисыворотку. В таких вариантах осуществления антитело может также включать варианты или фрагменты, рассмотренные выше, и в том числе, например, одноцепочечные антитела, диатела, минитела, одноцепочечные Fv-фрагменты (sc(Fv)), sc(Fv) антитела, Fab-фрагменты или F(ab')-фрагменты, при условии, что вариант или фрагмент сохраняет свойства специфического связывания с LOX1.
[0124]
Иллюстративные LOX1-связывающие белки представлены в приведенной ниже таблице 1 и описаны в международной заявке на патент № PCT/EP2015/072644, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Таблица 1. Иллюстративные LOX1-связывающие белки
<b>ID связывающего белка</b>
<b>Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO)</b>
<b>Lox514</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDGETIYAQKFQG (SEQ ID NO:5)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:29)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140011</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWEYAYDQKFQG (SEQ ID NO:6)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWEYAYDQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:19)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140014</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDYTIRVGQKFQG (SEQ ID NO:7)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDYTIRVGQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:20)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140016</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWQTHTAQKFQG (SEQ ID NO:8)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWQTHTAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:21)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140038</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWTIHVDQKFQG (SEQ ID NO:9)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWTIHVDQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:22)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140094</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWQYHVSQKFQG (SEQ ID NO:10)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWQYHVSQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:23)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSMYRFG (SEQ ID NO:34)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSMYRFGFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:36)
<b>LX5140108</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWSNHVSQKFQG (SEQ ID NO:11)
VH CDR3
STGRQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:15)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWSNHVSQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTSTGRQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:24)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140110</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDFKYHTHQKFQG (SEQ ID NO:2)
VH CDR3
VWGTQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:3)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDFKYHTHQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCALVWGTQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:4)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140092</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWKYHLSQKFQG (SEQ ID NO:12)
VH CDR3
PNGTHQGGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:17)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWKYHLSQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGTHQGGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:26)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33)
<b>LX5140092_D</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWKYHLSQKFQG (SEQ ID NO:12)
VH CDR3
PDGTHQGGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:16)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWKYHLSQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPDGTHQGGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:25)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO:32)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:33
<b>LX5140093</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWAYHQAQKFQG (SEQ ID NO:13)
VH CDR3
PNGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:14)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWAYHQAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPNGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:27)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSHRAWA (SEQ ID NO:35)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSHRAWAFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:37
<b>LX5140093_D</b>
VH CDR1
ELSMH (SEQ ID NO:1)
VH CDR2
GFDPEDWAYHQAQKFQG (SEQ ID NO:13)
VH CDR3
PDGQQGKGVRGWDYYYGMDV (SEQ ID NO:18)
VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDWAYHQAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPDGQQGKGVRGWDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:28)
VL CDR1
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO:30)
VL CDR2
GNSNRPS (SEQ ID NO:31)
VL CDR3
QSYDSSHRAWA (SEQ ID NO:35)
VL
QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSHRAWAFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:37
<b>Lox696</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGNWNYDAFDI (SEQ ID NO:44)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:54)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
SSYTSSSTNWV (SEQ ID NO:61)
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:70)
<b>LX6960067_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GVSLQELYTGYADSVKG (SEQ ID NO:42)
VH CDR3
EGSWNYDAFDI (SEQ ID NO:45)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGVSLQELYTGYADSVKGRFTVSGDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGSWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:48)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
LGRTWSSTNWV (SEQ ID NO:62)
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCLGRTWSSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:65)
<b>LX6960071_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGNWNYDAFDI (SEQ ID NO:44)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMDSLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:49)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
MGGMGRSTNWV (SEQ ID NO:57)
VL
QSALTQPASVSGSPGQPITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCMGSMGRSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:66)
<b>LX6960073_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGSWNYDALDI (SEQ ID NO:46)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTSDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNGLRAEDTAVYYCAREGSWNYDALDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:50)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSKRPS (SEQ ID NO:56)
VL CDR3
MGGMGRSTNWV (SEQ ID NO:57)
VL
QSALTQPASVSGSPGQPITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCMGGMGRSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:67)
<b>LX6960086_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSPDRYMDDSVKG (SEQ ID NO:43)
VH CDR3
EGNWNYDAFDI (SEQ ID NO:44)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSPDRYMDDSVKGRFTISRDNAQNSLYLQMDSLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:51)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
LGRTWSSTNWV (SEQ ID NO:62)
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCLGRTWSSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:65)
<b>LX6960094_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGNWNYDAFDI (SEQ ID NO:44)
VL
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:54)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
AQRTVSSTNWV (SEQ ID NO:64)
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCAQRTVSSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:68)
<b>LX6960101_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGNWNYDAFDV (SEQ ID NO:47)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNGLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDVWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:52)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
MGGMGRSTNWV (SEQ ID NO:57)
VL
QSALTQPASVSGSPGQPITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCMGGMGRSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:67)
<b>LX6960102_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGNWNYDAFDI (SEQ ID NO:44)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:54)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
MGGMGRSTNWV (SEQ ID NO:57)
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:70)
<b>LX6960116_ngl1</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGNWNYDAFDI (SEQ ID NO:44)
VH
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGNWNYDAFDIWGRGTTVTVSS (SEQ ID NO:54)
VL CDR1
TGTSNDVGGYNYVS (SEQ ID NO:59)
VL CDR2
DVSNRPS (SEQ ID NO:60)
VL CDR3
SSYTSSSTNWV (SEQ ID NO:61)
VL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSNDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCMGSMGRSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:69)
<b>LX6960073_gl</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGSWNYDALDI (SEQ ID NO:40)
VH
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTSDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNGLRAEDTAVYYCAREGSWNYDALDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:53)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSKRPS (SEQ ID NO:56)
VL CDR3
MGGMGRSTNWV (SEQ ID NO:57)
VL
QSALTQPASVSGSPGQPITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCMGGMGRSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:58)
<b>LX6960073_G82bS_gl</b>
VH CDR1
DYAMH (SEQ ID NO:38)
VH CDR2
GISWNSGSIGYADSVKG (SEQ ID NO:39)
VH CDR3
EGSWNYDALDI (SEQ ID NO:40)
VH
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTSDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGSWNYDALDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:41)
VL CDR1
TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:55)
VL CDR2
DVSKRPS (SEQ ID NO:56)
VL CDR3
MGGMGRSTNWV (SEQ ID NO:57)
VL
QSALTQPASVSGSPGQPITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCMGGMGRSTNWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:58
[0125]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит последовательность VH, которая предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонной последовательностью VH под SEQ ID NO:4. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0126]
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VH под SEQ ID NO:4. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0127]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит последовательность VL, которая предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонной последовательностью VL под SEQ ID NO:33. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0128]
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VL под SEQ ID NO:33. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0129]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH, выбранную из VH, содержащей VH-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1, VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2, 5-12 или 13 и VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3, 14-17 или 18; и VL легкой цепи, выбранную из VL, содержащей VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:30, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:31 и VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:32, 34 или 35. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0130]
Способы также относятся к выделенному LOX1-связывающему белку, содержащему последовательности VH и VL, каждая из которых предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонными VH и VL LOX1-связывающих белков, раскрытых в данном документе. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0131]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок имеет VH, содержащую SEQ ID NO:4, 19-28 или 29, и VL, содержащую SEQ ID NO:33, 36 или 37. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0132]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит набор определяющих комплементарность областей (CDR): вариабельной области тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 и вариабельной области легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где набор CDR предусматривает в общей сложности 18 или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18) аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонным набором CDR, или идентичен ему, в котором (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:5; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:31; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:32. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0133]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит набор CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:31; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:32. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0134]
Способы также относятся к выделенному LOX1-связывающему белку, содержащему вариабельную область тяжелой цепи (VH), характеризующуюся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью VH, раскрытой в данном документе, и/или вариабельную область легкой цепи (VL), характеризующуюся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью VL, раскрытой в данном документе (например, последовательности VH и VL, раскрытые в таблице 1). В дополнительных аспектах выделенных LOX1-связывающий белок содержит VH, характеризующуюся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:4, и/или VL, характеризующуюся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:33. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0135]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), характеризующуюся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности, и вариабельную область легкой цепи (VL), характеризующуюся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с VH и VL, выбранными из группы, состоящей из (a) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:4 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (b) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:29 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (c) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:41 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:58; и (d) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:54 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:70. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0136]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH, характеризующуюся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности и VL, характеризующуюся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с VH и VL, выбранными из группы, состоящей из (a) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:19 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (b) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:20 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (c) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:21 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (d) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:22 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (e) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:23 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (f) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:24 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (g) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:25 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (h) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:26 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33; (i) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:27 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:37; (j) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:28 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:37; (k) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:48 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:65; (l) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:49 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:66; (m) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:50 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:67; (n) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:51 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:65; (o) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:54 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:68; (p) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:52 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:67; (q) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:54 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:69; (r) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:53 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:58; и (s) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:41 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:58. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0137]
В дополнительных аспектах способы по данном документу могут предусматривать выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2. В других аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:5-12 или 13. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:3, 14-17 или 18 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 3, 14-17 или 18 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2, 5-12 или 13. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 3, 14-17 или 18 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2, 5-12 или 13 и VH-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0138]
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VLH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:32. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:32 и VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:31. В других аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:32, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:31 и VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:30. В других аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:32, 34 или 35, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:31. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:32, 34 или 35, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:31 и VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:30. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0139]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит одну, две или три VH-CDR, как например, VH-CDR1, которая предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:1 или идентична ей, VH-CDR2, которая предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:2, 5-12 или 13 или идентична ей, VH-CDR3, которая предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:3, 14-17 или 18 или идентична ей.
[0140]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит одну, две или три VL-CDR, как например, VL-CDR1, которая предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:30 или идентична ей, VL-CDR2, которая предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:31 или идентична ей, VH-CDR3, которая предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:32, 34 или 35 или идентична ей.
[0141]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит последовательность VH, которая предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонной последовательностью VH под SEQ ID NO:41. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0142]
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VH под SEQ ID NO:41. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающие белки, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающих белков.
[0143]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит последовательность VL, которая предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонной последовательностью VL под SEQ ID NO:58. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0144]
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VL под SEQ ID NO:58. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0145]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH, выбранную из VH, содержащей VH-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:38, VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:39, 42 или 43 и VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:40, 44-46 или 47; и VL легкой цепи, выбранную из VL, содержащей VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:55 или 59, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:56 или 60 и VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:57, 61-63 или 64.
[0146]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок имеет VH, содержащую последовательность под SEQ ID NO:41, 48-53 или 54, и VL, содержащую последовательность под SEQ ID NO:58, 65-69 или 70. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0147]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит набор из определяющих комплементарность областей (CDR): вариабельной области тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, вариабельной области легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где набор CDR предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонным набором CDR, или идентичен ему, в котором (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:38; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:39; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:44; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:55; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0148]
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит набор из определяющих комплементарность областей (CDR): вариабельной области тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, вариабельной области легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где набор CDR предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонным набором CDR, или идентичен ему, в котором (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:38, (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:39; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:40; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:55; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:56; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:57. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0149]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит набор CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где (a) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:38; (b) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:39; (c) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:40; (d) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:55; (e) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:56; и (f) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:57. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0150]
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:40. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:40 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:39. В других аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:40 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:42 или 43. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:40, 44-46 или 47 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:39. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 40, 44-46 или 47 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:39, 42 или 43. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 40, 44-46 или 47 и VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 39, 42 или 43 и VH-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:38. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0151]
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VLH-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:57. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:57 и VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:56. В других аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:57, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:56 и VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:55. В других аспектах LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:57, VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:56 или 60 и VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:55 или 59. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0152]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит одну, две или три VH-CDR, как например, VH-CDR1, которая предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:38 или идентична ей, VH-CDR2, которая предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:39,42 или 43 или идентична ей, VH-CDR3, которая предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:40, 44-46 или 47 или идентична ей. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0153]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит одну, две или три VL-CDR, как например, VL-CDR1, которая предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO: 55 или 59 или идентична ей, VL-CDR2 которая предусматривает в общей сложности одну, две или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO:56 или 60 или идентична ей, или VH-CDR3, которая предусматривает в общей сложности одну, две, три, четыре или меньше аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO: 57, 61-63 или 64 или идентична ей. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0154]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит набор CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR3 и VL-CDR3, описанные в таблице 1. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0155]
В некоторых дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), описанные в таблице 1. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0156]
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью G F D P E D HX HX HX HX HX HX Q K F Q G (Gly Phe Asp Pro Glu Asp HX HX HX HX HX HX Gln Lys Phe Gln Gly), где HX представляет собой Gly, Trp, Tyr или Phe; HX представляет собой Glu, Thr, Gln, Ser, Lys или Ala; HX представляет собой Thr, Tyr, Ile или Asn; HX представляет собой Ile, Ala, Arg или His; HX представляет собой Tyr, Val, Thr, Leu или Gln и HX представляет собой Ala, Asp, Gly, Ser или His (SEQ ID NO:71).
[0157]
7
8
9
10
11
12
7
8
9
10
11
12
7
8
9
10
11
12
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью HX HX G HX HX HX HX G V R G W D Y Y Y G M D V (HX HX Gly HX HX HX HX Gly Val Arg Gly Trp Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp), где HX представляет собой Pro, Ser или Val; HX представляет собой Asn, Thr, Trp или Asp; HX представляет собой Gln, Arg или Thr; HX представляет собой Gln или His; HX представляет собой Gly или Gln; HX представляет собой Lys или Gly (SEQ ID NO:72).
[0158]
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
В других аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью Q S Y D S LX LX LX LX LX LX (Gln Ser Tyr Asp Ser LX LX LX LX LX LX), где LX представляет собой Ser или Met; LX представляет собой Leu, Tyr или His; LX представляет собой Ser или Arg; LX представляет собой Gly, Ala или аминокислота отсутствует; LX представляет собой Trp или Phe; и LX представляет собой Val, Gly или Ala (SEQ ID NO:73).
[0159]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит набор определяющих комплементарность областей (CDR): вариабельную область тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 и вариабельную область легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где (a) VH-CDR1 содержит аминокислотную последовательность: E L S M H (SEQ ID NO: 1); (b) VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность: G F D P E D HX HX HX HX HX HX Q K F Q G, где HX1 выбрана из группы, состоящей из G, W, Y и F, HX2 выбрана из группы, состоящей из E, T, Q, K, A и S, HX3 выбрана из группы, состоящей из T, Y, I и N, HX4 выбрана из группы, состоящей из I, A, R и H, HX5 выбрана из группы, состоящей из Y, V, T, L и Q, и HX6 выбрана из группы, состоящей из A, D, G, S и H (SEQ ID NO: 71); (c) VH-CDR3 содержит аминокислотную последовательность: HX HX G HX HX HX HX G V R G W D Y Y Y G M D V, где HX7 выбрана из группы, состоящей из P, S и V, HX8 выбрана из группы, состоящей из N, W, D и T, HX9 выбрана из группы, состоящей из Q, R и T, HX10 выбрана из группы, состоящей из Q и H, HX11 выбрана из группы, состоящей из G и Q, и HX12 выбрана из группы, состоящей из K и G (SEQ ID NO: 72); (d) VL-CDR1 содержит аминокислотную последовательность: T G S S S N I G A G Y D V H (SEQ ID NO: 30); (e) VL-CDR2 содержит аминокислотную последовательность: G N S N R P S (SEQ ID NO: 31); и (f) VL-CDR3 содержит аминокислотную последовательность: Q S Y D S LX LX LX LX LX LX, где LX1 выбрана из группы, состоящей из M и S, LX2 выбрана из группы, состоящей из L, Y и H, LX3 выбрана из группы, состоящей из S и R, LX4 выбрана из группы, состоящей из A и G, или она пропущена (аминокислота отсутствует), LX5 выбрана из группы, состоящей из W и F, и LX6 выбрана из группы, состоящей из V, G и A (SEQ ID NO: 73).
[0160]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR2 с аминокислотной последовательностью G HX S HX HX HX HX HX HX HX HX HX D S V K G (Gly HX Ser HX HX HX HX HX HX HX HX HXAsp Ser Val Lys Gly), где HX представляет собой Ile или Val; HX представляет собой Trp или Leu; HX представляет собой Asn или Gln; HX представляет собой Ser или Glu; HX представляет собой Gly, Leu или Pro; HX представляет собой Ser, Tyr или Asp; HX представляет собой Ile, Thr или Arg; HXпредставляет собой Gly или Tyr; HX представляет собой Tyr или Met; и HX представляет собой Ala или Asp (SEQ ID NO:74).
[0161]
11
12
13
11
12
13
11
12
13
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VH-CDR3 с аминокислотной последовательностью E G HX W N Y D A HX D HX (Glu Gly HX Trp Asn Tyr Asp Ala HX Asp HX), где HX представляет собой Asn или Ser; HX представляет собой Phe или Leu; и HX представляет собой Ile или Val (SEQ ID NO:75).
[0162]
1
1
1
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR1 с аминокислотной последовательностью T G T S LX D V G G Y N Y V S (Thr Gly Thr Ser LX Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser), где LX представляет собой Ser или Asn (SEQ ID NO:76).
[0163]
2
2
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR2 с аминокислотной последовательностью D V S LX R P S (Asp Val Ser X4 Arg Pro Ser), где LX представляет собой Asn или Lys (SEQ ID NO:77).
[0164]
3
4
5
6
7
8
3
4
5
6
7
8
3
4
5
6
7
8
В дополнительных аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит VL-CDR3 с аминокислотной последовательностью LX LX LX LX LX LX S T N W V (LX LX LX LX LX LX Ser Thr Asn Trp Val), где LX представляет собой Ser, Leu, Met или Ala; LX представляет собой Ser, Gly, или Gln; LX представляет собой Tyr, Arg, Ser или Gly; LX представляет собой Thr или Met; LX представляет собой Ser, Trp, Gly или Val; и LX представляет собой Ser или Arg (SEQ ID NO:78).
[0165]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
1
2
3
4
5
6
7
8
В некоторых аспектах выделенный LOX1-связывающий белок содержит набор определяющих комплементарность областей (CDR): вариабельную область тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 и вариабельную область легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где (a) VH-CDR1 содержит аминокислотную последовательность: D Y A M H (SEQ ID NO: 38); (b) VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность: G HX S HX HX HX HX HX HX HX HX HX D S V K G, где HX1 выбрана из группы, состоящей из I и V, HX2 выбрана из группы, состоящей из W и L, HX3 выбрана из группы, состоящей из N и Q, HX4 выбрана из группы, состоящей из S и E, HX5 выбрана из группы, состоящей из G, L и P, HX6 выбрана из группы, состоящей из S, Y и D, HX7 выбрана из группы, состоящей из I, T и R, HX8 выбрана из группы, состоящей из G и Y, HX9 выбрана из группы, состоящей из M и Y, и HX10 выбрана из группы, состоящей из A и D (SEQ ID NO:74); (c) VH-CDR3 содержит аминокислотную последовательность: E G HX W N Y D A HX D HX, где HX11 выбрана из группы, состоящей из N и S, HX12 выбрана из группы, состоящей из F и L, и HX13 выбрана из группы, состоящей из I и V (SEQ ID NO:75); (d) VL-CDR1 содержит аминокислотную последовательность: T G T S LX D V G G Y N Y V S, где LX1 выбрана из группы, состоящей из N и S (SEQ ID NO:76); (e) VL-CDR2 содержит аминокислотную последовательность: D V S LX R P S, где LX2 выбрана из группы, состоящей из N и K (SEQ ID NO:77); и (f) VL-CDR3 содержит аминокислотную последовательность: LX LX LX LX LX LX S T N W V, где LX3 выбрана из группы, состоящей из L, M, A и S, LX4 выбрана из группы, состоящей из S, Q и G, LX5 выбрана из группы, состоящей из Y, S, G и R, LX6 выбрана из группы, состоящей из T и M, LX7 выбрана из группы, состоящей из S, W, G и V, и LX8 выбрана из группы, состоящей из S и R (SEQ ID NO:78).
[0166]
В некоторых аспектах набор CDR LOX1-связывающего белка, раскрытый в данном документе, представлен в пределах каркасных областей антитела или других белковых остовов, известных из уровня техники. Иллюстративные каркасные области антитела включают каркасные области зародышевого типа, такие как VH1-24 (DP-5), JH6, VH3-09 (DP-31) и JH3 в случае каркасной области тяжелой цепи антитела, и Vλ1e (DPL-8), Vλ2a2 (DPL-11) и JL3 в случае каркасной области легкой цепи антитела и/или любые подходящие каркасные области, хорошо известные специалисту в данной области техники.
[0167]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок содержит одну или несколько каркасных областей из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и/или вариабельной области легкой цепи (VL), которые являются каркасными областями зародышевого типа. Каркасные области домена тяжелой цепи могут быть выбраны из каркасных областей VH1-24 (DP-5), JH6, VH3-09 (DP-31), JH3 и/или любых подходящих каркасных областей или белковых остовов, хорошо известных из уровня техники. Каркасные области легкой цепи могут быть выбраны из каркасных областей Vλ1e (DPL-8), Vλ2a2 (DPL-11) и JL3 и/или любых подходящих каркасных областей или белковых остовов, хорошо известных из уровня техники. Одна или несколько CDR могут быть взяты из LOX1-связывающих белков, раскрытых в данном документе (например, LOX1-связывающего белка, описанного в таблице 1), и встроены в подходящую каркасную область и/или белковый остов.
[0168]
В дополнительных аспектах в настоящем изобретении предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, который связывается с тем же эпитопом LOX1, что и антитело, содержащее VH и VL под SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:33 соответственно.
[0169]
В других аспектах способы, раскрытые в данном документе, предусматривают LOX1-связывающие белки (например, антитела, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые конкурируют или перекрестно конкурируют за связывание с LOX1 с антителом, содержащим последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33. В конкретном аспекте LOX1-связывающий белок способен конкурентно подавлять связывание с LOX1 антитела, содержащего VH под SEQ ID NO:4 и VL под SEQ ID NO:33.
[0170]
Также предусмотрены способы, предусматривающие LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX1, и их варианты и производные), которое может связываться с LOX1 с большей аффинностью, чем LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), содержащий VH под SEQ ID NO:29 и VL под SEQ ID NO:33. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0171]
В дополнительных аспектах способы предусматривают выделенный LOX1-связывающий белок, который связывается с тем же эпитопом LOX1, что и антитело, содержащее VH и VL под SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:58 соответственно.
[0172]
В других аспектах способы предусматривают LOX1-связывающие белки (например, антитела, такие как полноразмерные антитела к LOX1 и фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые конкурируют или перекрестно конкурируют за связывание с LOX1 с антителом, содержащим последовательность VH под SEQ ID NO:41 и последовательность VL под SEQ ID NO:58. В конкретном аспекте LOX1-связывающий белок способен конкурентно подавлять связывание с LOX1 антитела, содержащего VH под SEQ ID NO:41 и VL под SEQ ID NO:58.
[0173]
Также предусмотрены способы, предусматривающие LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1 и фрагмент антитела, связывающий LOX1, и его варианты и производные), которое может связываться с LOX1 с большей аффинностью, чем полноразмерное антитело, содержащее VH под SEQ ID NO:54 и VL под SEQ ID NO:70. В настоящем изобретении также предусматривают нуклеиновые кислоты, кодирующие LOX1-связывающий белок, векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, трансформированные данными нуклеиновыми кислотами и векторами, а также способы получения и применения LOX1-связывающего белка.
[0174]
В некоторых аспектах предусмотренное в данном документе антитело к LOX1, предусмотренное в рассмотренных в данном документе способах, представляет собой антитело мыши, антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, биспецифическое антитело, полиспецифическое антитело или любую их комбинацию. В некоторых аспектах антитело к LOX1 представляет собой Fv-фрагмент, Fab-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fab'-фрагмент, dsFv-фрагмент, scFv-фрагмент или sc(Fv)2-фрагмент.
[0175]
Настоящее изобретение включает способы, предусматривающие LOX1-связывающий белок (например, выделенное антитело к LOX1, такое как полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX1, и их варианты и производные), который может связываться с молекулами LOX1 у разных видов. В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок связывается с LOX1 человека (hLOX1) и LOX1 яванского макака (cynoLOX1). В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок связывается с LOX1 человека (hLOX1) и LOX1 кролика. В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок связывается с hLOX1, cynoLOX1 и LOX1 кролика. В некоторых аспектах предусмотренный в данном документе LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1) специфично связывается с LOX1 (например, hLOX1, cynoLOX1 и/или LOX1 кролика) и не связывается с одним или несколькими из CLEC-7A, CLEC-1A, CLEC-4L, CLEC-1B, SR-A1 и/или SR-B3. См., например, международную заявку на патент № PCT/EP2015/072644.
[0176]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок (например, выделенное антитело к LOX1 или его варианты и производные) дополнительно содержит TM-мутантную тяжелую цепь IgG1 человека, где вариабельная область тяжелой цепи (VH) содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% или 100% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:4, 19-28 или 29.
[0177]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок (например, выделенное антитело к LOX1 или его варианты и производные) дополнительно содержит TM-мутантную тяжелую цепь IgG1 человека, где вариабельная область тяжелой цепи (VH) содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% или 100% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:41, 48-53 или 54.
[0178]
В некоторых аспектах LOX1-связывающий белок (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное) включает в дополнение к вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL), и необязательно константной области тяжелой цепи, или их фрагментам, константную область или его фрагмент. В некоторых аспектах константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой каппа/лямбда-цепи, например, константную область каппа-цепи человека или константную область лямбда-цепи человека. Согласно конкретному аспекту константная область легкой цепи представляет собой константную область каппа-цепи человека.
[0179]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное) содержит вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит константную область каппа-цепи человека, например, VL содержит аминокислотную последовательность VL, характеризующуюся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33, 36 или 37. В определенных аспектах в настоящем изобретении предусматривают LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), дополнительно содержащий TM-мутантную тяжелую цепь IgG1 человека и легкую каппа-цепь человека, где вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL) содержит SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:58; или SEQ ID NO:54 и SEQ ID NO:70 соответственно.
[0180]
В дополнительных аспектах LOX1-связывающий белок (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное) содержит вариабельную область легкой цепи (VL), которая дополнительно содержит константную область каппа-цепи человека, например, легкая цепь может содержать аминокислотную последовательность легкой цепи, характеризующуюся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичностью последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:58, 65-69 или 70. В определенных аспектах в настоящем изобретении предусматривают LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), дополнительно содержащий TM-мутантную тяжелую цепь IgG1 человека и легкую каппа-цепь человека, где вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL) содержит SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:48 и SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:49 и SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:50 и SEQ ID NO:67, или SEQ ID NO:53 и SEQ ID NO:58 соответственно.
[0181]
on
off
5
-1
-1
6
-1
-1
5
-1
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим выделенный LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX1, и его вариант и производное), где LOX1-связывающий белок обладает по меньшей мере одним свойством, выбранным из группы, состоящей из следующего: (a) он снижает или подавляет связывание oxLDL, С-реактивного белка (CRP) и/или конечных продуктов усиленного гликозилирования (AGE) с LOX1, что определяют с помощью любого подходящего анализа; (b) он подавляет или подавляет передачу сигнала с участием RhoA/Rac1, монооксида азота (NO), p38MAPK, протеинкиназы B и C, ERK1/2 и/или NFκB в эндотелиальной клетке, экспрессирующей LOX1 клеточной поверхности, что определяют с помощью любого подходящего анализа; (c) он снижает или подавляет активность каспазы-8, каспазы-9 и/или BAX в эндотелиальной клетке, экспрессирующей LOX1 клеточной поверхности, что определяют с помощью любого подходящего анализа, в том числе анализа, раскрытого в данном документе; (d) он связывается с LOX1 с однонуклеотидным полиморфизмом K167N, что определяют с помощью любого подходящего анализа; (e) он снижает или подавляет интернализацию oxLDL, что определяют с помощью любого подходящего анализа; (f) он снижает или подавляет индуцируемую oxLDL передачу сигнала LOX1, что определяют с помощью любого подходящего анализа; (g) он связывается с LOX1 с константой диссоциации (KD) от приблизительно 150 пМ до приблизительно 600 пМ (например, приблизительно 400 пМ), что определяют с помощью BIACORE или KinExA; (h) связывается с LOX1 с коэффициентом K от приблизительно 1×10 M сдо приблизительно 6×10 M с (например, приблизительно 5×10 M с), что определяют с помощью BIACORE; и (i) он связывается с LOX1 с коэффициентом K от приблизительно 1×10 с до приблизительно 3×10 с (например, приблизительно 2,3×10 с), что определяют с помощью BIACORE.
[0182]
В определенных вариантах осуществления в дополнение к или в качестве альтернативы к вышеуказанным выявленным свойствам LOX1-связывающий белок имеет по меньшей мере одно свойство, выбранное из группы, состоящей из (a) уничтожения CSC; (b) устранения CSC; (c) подавления CSC; (d) уменьшения прогрессирования и/или скорости прогрессирования пролиферации CSC; (e) уменьшения прогрессирования и/или скорости прогрессирования болезненного состояния, связанного с CSC; (f) уменьшения способности самообновления и увеличения количества CSC; и/или (g) индукции дифференциации CSC.
[0183]
D
D
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-13
-14
-15
-8
-10
В определенных аспектах LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное) может специфично связываться с LOX1, например, LOX1 человека (hLOX1) и/или LOX1 яванского макака (cynoLOX1) и их антигенными фрагментами, с константой диссоциации или K менее 10 M, или менее 10 M, или менее 10 M, или менее 10 M, или менее 10 M, или менее 10 M, менее 10 M, менее 10 M, менее 10 M или менее 10 M, что измеряют, например, с помощью KINEXA или BIACORE. В одном аспекте антитело к LOX1 может связываться с hLOX1 и cynoLOX1 с K от менее приблизительно 1×10 M до приблизительно 1×10 M, что измеряют с помощью BIACORE.
[0184]
off
off
off
-3
-1
-3
-1
-3
-1
-3
-1
-4
-1
-4
-1
-5
-1
-5
-1
-6
-1
-6
-1
-7
-1
-8
-1
-8
-1
-9
-1
-9
-1
-10
-1
-4
-1
В другом аспекте LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное) может связываться с LOX1 с Kменее 1×10 с или менее 2×10 с. В других аспектах LOX1-связывающий белок связывается с LOX1 с K менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с или менее 10 с, что измеряют, например, с помощью KINEXA или BIACORE. В одном аспекте антитело к LOX1 может связываться с hLOX1 и cynLOX1 с Kот 1 до 10 ×10 с, что измеряют с помощью BIACORE.
[0185]
on
on
5
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
6
-1
-1
7
-1
-1
7
-1
-1
8
-1
-1
9
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
В другом аспекте LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное) может связываться с LOX1, например, LOX1 человека (hLOX1) и/или LOX1 яванского макака с константой скорости ассоциации, или коэффициентом k, составляющим по меньшей мере 10 M с, по меньшей мере 5×10 M с, по меньшей мере 10 M с, по меньшей мере 5×10 M с, по меньшей мере 10 M с, по меньшей мере 5×10 M с или по меньшей мере 10 M с, или по меньшей мере 10 M с, что измеряют, например, с помощью KINEXA или BIACORE. В одном аспекте антитело к LOX1 может связываться с hLOX1 и cynLOX1 с коэффициентом k от приблизительно 1 ×10 M сдо приблизительно 20 ×10 M с, что измеряют с помощью BIACORE.
[0186]
Как упоминалось выше, LOX1-связывающий белок (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX1, и его вариант и производное), содержащий аминокислотную последовательность VH и/или VL, которая связывает LOX1, может характеризоваться по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с последовательностью, изложенной в данном документе (см., например, таблицу 1). В некоторых аспектах аминокислотная последовательность(-и) VH и/или VL, которая(-ые) связывает(-ют) LOX1, предусматривает(-ют) 15 или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15) аминокислотных добавлений, замен (например, консервативных замен) или делеций по сравнению с последовательностью, изложенной в данном документе. В некоторых аспектах аминокислотная последовательность(-и) VH и/или VL, которая(-ые) связывает(-ют) LOX1, предусматривает(-ют) 8 или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) аминокислотных добавлений, замен (например, консервативных замен) или делеций по сравнению с последовательностью, изложенной в данном документе. В дополнительных аспектах аминокислотная последовательность VH и/или VL, которая связывает LOX1, предусматривает 5 или меньше (например, 1, 2, 3, 4 или 5) аминокислотных добавлений, замен (например, консервативных замен) или делеций по сравнению с последовательностью, изложенной в данном документе. LOX1-связывающий белок (например, антитело к LOX1 или его фрагмент), содержащий области VH и VL с определенным процентом сходства с областью VH или областью VL или предусматривающий одну или несколько замен, делеций и/или вставок (например, консервативных замен), можно получить с помощью мутагенеза (например, сайт-направленного или ПЦР-опосредованного мутагенеза) молекул нуклеиновых кислот, кодирующих области VH и/или VL, описанные в данном документе, с последующей проверкой кодируемого измененного антитела в отношении связывания с LOX1 и, необязательно, проверкой в отношении сохранения функции с применением функциональных анализов, описанных в данном документе, или известного из уровня техники анализа, который можно легко модифицировать с целью проверки в отношении сохранения функции.
[0187]
et al.,
D
on
off
Аффинность или авидность LOX1-связывающего белка, такого как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX-1, и его вариант и производное), для LOX1 можно определять экспериментально с применением любого подходящего способа, известного из уровня техники, например, проточной цитометрии, фермент-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA) или радиоиммунологического анализа (RIA), или кинетических анализов (например, анализа KINEXA или BIACORE). С легкостью можно применять анализы в формате прямого связывания, а также анализы в формате конкурентного связывания. (См., например, Berzofsky "Antibody-Antigen Interactions" в Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); и способы, описанные в данном документе). Измеряемая аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может варьироваться в различных условиях (например, концентрация солей, pH, температура). Таким образом, измерения аффинности и других параметров связывания LOX1 (например, K или Kd, K, K) проводят со стандартизированными растворами LOX1-связывающих белков и LOX1 и стандартизированным буфером, известным из уровня техники.
[0188]
В настоящем изобретении также предусматривают LOX1-связывающий белок, такой как антитело к LOX1 (например, полноразмерное антитело к LOX1, фрагмент антитела, связывающий LOX1, и его вариант и производное), описанный в данном документе (см., например, таблицу 1), где антитело конъюгировано с гетерологичным средством. В некоторых аспектах указанное средство представляет собой противомикробное средство, терапевтическое средство, пролекарство, пептид, белок, фермент, липид, модификатор биологического ответа, фармацевтическое средство, лимфокин, гетерологичное антитело или фрагмент антитела, детектируемую метку или полиэтиленгликоль (PEG). Гетероконъюгатные LOX1-связывающие белки можно получить так, как более подробно рассмотрено в международной заявке на патент № PCT/EP2015/072644, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[0189]
Curr. Opin. Biotech
et al., Protein Science
et al., Curr. Opin. Biotechnol
FEBS J
FEBS J
В определенных аспектах LOX1-связывающий белок не является антителом к LOX1. Ряд способов идентификации и получения полипептидов, не являющихся антителами, которые связываются с высокой аффинностью с белком-мишенью, известны из уровня техники. См., например, Skerra, . 18:295-304 (2007), Hosse 15:14-27 (2006), Gill . 17:653-658 (2006), Nygren, . 275:2668-76 (2008) и Skerra, . 275:2677-83 (2008), каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В определенных аспектах для идентификации/получения LOX1-связывающего белка можно применять технологию фагового дисплея. В определенных аспектах полипептид содержит белковый остов типа, выбранного из группы, состоящей из анкирина, белка A, липокалина, домена фибронектина, домена анкирина с консенсусными повторами и тиоредоксина.
[0190]
В некоторых аспектах способы могут предусматривать ингибиторы LOX1 (например, LOX1-связывающие белки, в том числе антитела к LOX1, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые связываются с тем же эпитопом, что и один или несколько LOX1-связывающих белков, раскрытых в данном документе (см., например, таблицу 1). Термин "эпитоп", применяемый в данном документе, относится к детерминанте целевого белка, способной связываться с антителом согласно настоящему изобретению. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно обладают специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание с первыми, но не с последними, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. Такие антитела можно идентифицировать на основании их способности перекрестно конкурировать (например, конкурентно подавлять связывание со статистической значимостью) с антителами, содержащими последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33, и/или антителами, содержащими последовательность VH под SEQ ID NO:41 и последовательность VL под SEQ ID NO:58, в стандартных анализах на основе связывания антигена или анализах активности.
[0191]
Способы, предусматривающие ингибиторы LOX1, также предусматривают LOX1-связывающие белки, такие как антитела к LOX1 (например, полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые связывают тот же эпитоп, что и выделенный LOX1-связывающий белок, раскрытый в данном документе (см., например, таблицу 1).
[0192]
Способность исследуемого LOX1-связывающего белка подавлять связывание, например, антитела, содержащего последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33, и/или антитела, содержащего последовательность VH под SEQ ID NO:41 и последовательность VL под SEQ ID NO:58, демонстрирует, что исследуемый LOX1-связывающий белок может конкурировать с этим антителом за связывание с LOX1; такой LOX1-связывающий белок может, в соответствии с теорией, не имеющей ограничительного характера, связываться с этим же или родственным (например, структурно подобным или пространственно близким) эпитопом LOX1, что и LOX1-связывающие белки (например, антитела к LOX1, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), с которыми он конкурирует. В одном аспекте LOX1-связывающий белок связывает тот же эпитоп на LOX1, что и антитело, содержащее последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33. В другом аспекте LOX1-связывающий белок связывает тот же эпитоп на LOX1, что и антитело, содержащее последовательность VH под SEQ ID NO:41 и последовательность VL под SEQ ID NO:58.
[0193]
В одном аспекте в настоящем изобретении предусматривают LOX1-связывающие белки (например, антитела, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые конкурируют за связывание с LOX1 с антителом, содержащим последовательность VH под SEQ ID NO:4 и последовательность VL под SEQ ID NO:33. В другом аспекте в настоящем изобретении предусматривают LOX1-связывающие белки (например, антитела, такие как полноразмерные антитела к LOX1, фрагменты антител, связывающие LOX1, и их варианты и производные), которые конкурируют за связывание с LOX1 с антителом, содержащим последовательность VH под SEQ ID NO:41 и последовательность VL под SEQ ID NO:58.
[0194]
В других вариантах осуществления ингибитор может представлять собой антисмысловую молекулу, содержащую полинуклеотид, который является комплементарным по меньшей мере части mRNA LOX1. В некоторых вариантах осуществления антисмысловая молекула является подходящей для применения в способе, в котором подавляют трансляцию mRNA в клетке. Антисмысловая молекула может содержать ДНК, РНК, или как ДНК, так и РНК, а также химически модифицированные нуклеиновые кислоты. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления антисмысловая молекула может быть однонитевой или двухнитевой. Антисмысловая молекула может содержать от приблизительно 10 до приблизительно 500 нуклеотидов, и в некоторых вариантах осуществления длина может составлять любое число, например, находиться в диапазоне от приблизительно 11 до приблизительно 200 нуклеотидов, от приблизительно 12 до приблизительно 100 нуклеотидов, от приблизительно 13 до приблизительно 75 нуклеотидов, от приблизительно 14 до приблизительно 50 нуклеотидов, от приблизительно 15 до приблизительно 40 нуклеотидов, от приблизительно 16 до приблизительно 30 нуклеотидов или от приблизительно 17 до приблизительно 25 нуклеотидов. Специалисту в данной области техники будет понятно, что этими диапазонами представлены иллюстративные варианты осуществления.
[0195]
В некоторых вариантах осуществления ингибитор может содержать молекулу siRNA, которая ослабляет или ингибирует экспрессию LOX1. В некоторых вариантах осуществления молекула siRNA может представлять собой однонитевую или двухнитевую молекулу siRNA, которая содержит последовательность, способную гибридизоваться с mRNA LOX1, и индуцировать РНК-интерференцию или другой антисмысловой механизм, который ослабляет или ингибирует экспрессию белка. Молекулы siRNA могут содержать любую последовательность, которая способствует тому, чтобы молекула siRNA индуцировала РНК-интерференцию, приводящую к ослаблению или ингибированию экспрессии белка LOX1. Длина молекулы siRNA может в некоторых вариантах осуществления составлять от приблизительно 10 до 100, от 12 до 80, от 14 до 60, от 16 до 50, от 17 до 40 нуклеотидов. Соответственно, длина siRNA находится в диапазоне, варьирующем от 18 до 30 нуклеотидов, и в определенных вариантах осуществления от приблизительно 18 до приблизительно 26 нуклеотидов.
[0196]
В вариантах осуществления, предусматривающих ингибирующую молекулу нуклеиновой кислоты, такие ингибиторы могут связываться с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты LOX1 в жестких условиях связывания. Термины "жесткие условия", "жесткие условия связывания" или "жесткие условия гибридизации" относятся к условиям, при которых полинуклеотид будет гибридизоваться с целевой последовательностью, в более высокой поддающейся выявлению степени, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере в 2 раза по сравнению с фоном). Один неограничивающий пример жестких условий предусматривает таковые, в которых выполняют гибридизацию в 50% формамиде, 1 M NaCl, 1% SDS при 37°C, и промывку в 0,1x SSC при 60-65°C.
[0197]
Принимая во внимание полинуклеотидную последовательность LOX1, ингибирующая молекула нуклеиновой кислоты может быть сконструирована с помощью мотивов и нацелена на область, которая, как можно предполагать, является эффективной в отношении ингибирующей активности, с помощью стандартных методик в данной области техники.
[0198]
Альтернативно или дополнительно можно применять любые дополнительные способы, которые пригодны для определения активности LOX1 и которые доступны специалисту в данной области техники. Как рассмотрено выше, ингибиторы, пригодные в различных аспектах и вариантах осуществления, описанных в данном документе, могут подавлять активность LOX1 по меньшей мере на 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% при сравнении с контролем. В конкретных вариантах осуществления ингибиторы являются эффективными в подавлении активности LOX1 по меньшей мере на 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70%. В других вариантах осуществления ингибиторы могут подавлять активность LOX1 по меньшей мере на значение от 85% до приблизительно 100%, по меньшей мере от 90% до приблизительно 100%, по меньшей мере от 95% до приблизительно 100% или на приблизительно 100%.
[0199]
В вариантах осуществления ингибиторы можно комбинировать в композиции, которая содержит одно или несколько дополнительных активных средств, подходящих для лечения или предупреждения опухолевого заболевания и/или рака. Некоторые неограничивающие примеры этих активных соединений включают химиотерапевтические средства, общеизвестные из уровня техники, такие как, например, гемцитабин (Gemzar), капецитабин (Xeloda), Doxil, цитарабин, дексаметазон, иринотекан (Camptosar), оксалиплатин (Eloxatin), альбуминсвязанный паклитаксел (Abraxane), темозоломид, адриамицин, доксорубицин, эпирубицин, 5-фторурацил, цитозин арабинозид ("Ara-C"), циклофосфамид, тиотепу, бусульфан, цитоксин, таксоиды (например, паклитаксел), токсотер, метотрексат, цисплатин, мелфалан, винбластин, блеомицин, этопозид, ифосфамид, митомицин C, митоксантрон, винкристин, винорелбин, карбоплатин, тенипозид, дауномицин, карминомицин, аминоптерин, дактиномицин, митомицины, мелфалан и другие родственные азотистые иприты и гормональные средства, которые принимают участие в регуляции или подавлении гормонального действия на опухоли, такие как тамоксифен и онапристон.
C. Фармацевтические композиции и составы
[0200]
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает фармацевтические композиции. Такие фармацевтические композиции могут представлять собой композиции, содержащие ингибитор LOX1 или любую комбинацию из более чем одного ингибитора LOX1. Эти фармацевтические композиции также могут представлять собой композиции, содержащие фармацевтически приемлемый наполнитель. В отдельных аспектах фармацевтические композиции по настоящему изобретению используются в качестве лекарственного препарата.
[0201]
В определенных аспектах ингибиторы, раскрытые в данном документе, могут быть составлены с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или стабилизатором в виде фармацевтических композиций. В отдельных аспектах такие фармацевтические композиции являются подходящими для введения человеку или животному, отличному от человека, посредством любого одного или нескольких путей введения с использованием способов, известных из уровня техники. Как будет понятно специалисту в данной области техники, путь и/или способ введения будет варьироваться в зависимости от необходимых результатов. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает один или несколько нетоксичных материалов, которые не препятствуют эффективности биологической активности активных ингредиентов. Фармацевтически приемлемые носители нужно выбирать так, чтобы они были подходящими в плане требуемого или необходимого способа введения, растворимости и/или стабильности.
[0202]
in vivo
st
При использовании для введения составы по настоящему изобретению должны быть стерильными. Составы по настоящему изобретению можно стерилизовать различными способами стерилизации, в том числе стерилизацией фильтрованием, излучением и т. д. В одном аспекте состав является простерилизован фильтрацией с использованием предварительно простерилизованного фильтра на 0,22 микрона. Стерильные композиции для инъекций могут быть составлены в соответствии со стандартной фармацевтической практикой, описанной в "Remington: The Science & Practice Pharmacy", 21ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005).
[0203]
В вариантах осуществления данного аспекта терапевтические композиции могут быть составлены для конкретных путей введения, таких как пероральное, назальное, легочное, местное (включая трансбуккальное и сублингвальное), ректальное, вагинальное и/или парентеральное введение. Фразы "парентеральное введение" и "вводимый парентерально", используемые в данном документе, относятся к способам введения, отличным от энтерального и местного введения, обычно с помощью инъекции, и включают без ограничения внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсульную, интраорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекции и инфузии. Составы по настоящему изобретению, которые пригодны для местного или трансдермального введения, включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и средства для ингаляции. Ингибиторы и другие активные средства можно смешивать в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут потребоваться (патент США № 7378110; № 7258873; № 7135180; заявка на патент США № 2004-0042972 и № 2004-0042971).
[0204]
Составы в целях удобства могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, и могут быть получены любым способом, известным в области фармации. Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению можно изменять таким образом, чтобы получить количество активного ингредиента, которое эффективно для достижения требуемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, которое не является токсичным для пациента (например, "терапевтически эффективное количество"). Выбранный уровень дозировки будет зависеть от разнообразных фармакокинетических факторов, включающих активность конкретных используемых композиций, путь введения, время введения, скорость экскреции конкретного используемого соединения, длительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, используемые в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и анамнез пациента, лечение которого осуществляют, и подобные факторы, хорошо известные в области медицины.
[0205]
Изобретение аналогично предусматривает, что можно также получать составы, подходящие для применения в диагностике и исследованиях. Концентрацию активного средства в таких составах, а также присутствие или отсутствие наполнителей, можно выбирать, исходя из конкретной задачи запланированного применения.
D. Наборы
[0206]
Другой аспект настоящего изобретения относится к набору. В одном аспекте набор содержит любое из вышеописанных ингибиторов, реагентов, композиций или фармацевтических композиций, а также инструкции или маркировку, указывающие на соответствующее применение или введение. Необязательно набор может также включать один или нескольких контейнеров, и/или шприцов, или других устройств для облегчения доставки или применения. Настоящее изобретение предполагает, что в набор можно поместить все компоненты или любое подмножество компонентов для проведения анализов с целью исследований, анализов с целью диагностики и/или введения терапевтически эффективных количеств. Аналогично, набор может включать инструкции для получения конъюгата, например, с помощью образования ковалентной связи между ингибитором по настоящему изобретению и терапевтическим или диагностическим фрагментами в подходящих условиях для образования конъюгата. В качестве дополнительного примера в способе терапии набор для применения может содержать раствор, содержащий фармацевтический состав на основе ингибитора(-ов) LOX1, или лиофилизированный препарат на основе одного или нескольких ингибиторов, а также инструкции для введения композиции пациенту, нуждающемуся в этом, и/или для восстановления лиофилизированного продукта.
[0207]
Настоящее изобретение также охватывает готовый упакованный и маркированный фармацевтический продукт. Это готовое изделие включает соответствующую стандартную лекарственную форму в соответствующей емкости или контейнере, таком как стеклянный флакон или другой контейнер, который герметично запечатан. В случае дозированных форм, подходящих для парентерального введения, активный компонент является стерильным и подходящим для введения в виде раствора, не содержащего частиц. В определенных аспектах состав является подходящим для внутривенного введения, например для внутривенной инфузии человеку или животному.
[0208]
В конкретном аспекте составы по настоящему изобретению составлены в отдельных однодозовых флаконах в виде стерильной жидкости. Иллюстративные контейнеры включают без ограничения флаконы, бутыли, предварительно наполненные шприцы, пакеты для IV, блистерные упаковки (содержащие одну или несколько пилюль). Необязательно, совместно с таким контейнером(-ами) может прилагаться уведомление в форме, предписанной государственным органом, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, и при этом уведомление отражает разрешение органа в отношении производства, применения или продажи для диагностики и/или введения человеку.
[0209]
Как и в случае любого фармацевтического продукта, упаковочный материал и контейнер разработаны для защиты стабильности продукта во время хранения и транспортировки. Кроме того, продукты по настоящему изобретению включают инструкции для применения или другой информационный материал, который советует врачу, специалисту или пациенту, как правильно предупредить или лечить рассматриваемое заболевание или нарушение. Другими словами, готовое изделие включает инструктирующие средства, которые указывают или предлагают режим дозирования, включая без ограничения действующие дозы, процедуры мониторинга и т. д., а также другую информацию о мониторинге.
[0210]
Набор для диагностических анализов может содержать раствор, содержащий ингибитор LOX1, раскрытый в данном документе, или альтернативно или дополнительно реагенты для выявления присутствия LOX1. Различные реагенты можно метить согласно способам, известным из уровня техники и описанным в данном документе, включая без ограничения метки, такие как низкомолекулярные флуоресцентные маркеры, белки, такие как биотин, GFP или другие флуоресцентные белки, или эпитопные последовательности, такие как his или myc. Аналогично, основные антитела, используемые для выявления LOX1, могут быть включены в набор. Первичные антитела могут быть направлены на последовательности LOX1 или на метки, маркеры или эпитопы, которыми мечены LOX1. В свою очередь, первичные антитела могут быть мечены для выявления или, если требуется, дополнительного усиления сигнала, при этом первичные антитела могут быть выявлены по вторичным антителам, которые также могут быть включены в набор.
[0211]
Также предусматриваются наборы для применения в исследованиях. Например, такие наборы могут иметь сходство с наборами, предназначенными для диагностического или терапевтического применений, однако дополнительно включают маркировку, уточняющую, что данный набор и его применение ограничиваются только исследовательскими целями.
Метки, конъюгаты и фрагменты
[0212]
Настоящее изобретение относится к способам, композициям и наборам, предусматривающим реагенты, которые могут быть конъюгированы с метками для диагностических целей и других анализов, где одна или несколько целевых молекул могут быть связаны и выявлены с помощью этого меченого реагента(-ов). Метки включают без ограничения хромофор, флуорофор, флуоресцентный белок, фосфоресцентный краситель, тандемный краситель, частицу, гаптен, фермент и радиоактивный изотоп.
[0213]
В определенных аспектах реагенты конъюгированы с флуорофором. Выбор флуорофора, присоединяемого к реагенту(-ам), будет определять свойства поглощения и испускания флуоресценции конъюгированной молекулой. Физические свойства флуорофорной метки, которую можно применять, включают без ограничения спектральные характеристики (поглощение, испускание и стоксов сдвиг), интенсивность, длительность, поляризацию флуоресценции и скорость обесцвечивания или их комбинацию. Все эти физические свойства можно использовать для того, чтобы отличить один флуорофор от другого, и за счет этого обеспечить возможность мультиплексного анализа. Другие подходящие свойства флуоресцентной метки могут включать клеточную проницаемость и низкую токсичность, например, если мечение мишени(-ей) необходимо проводить в клетке или организме (например, живом животном).
[0214]
В определенных аспектах фермент представляет собой метку и конъюгирован с реагентом. Ферменты могут представлять собой подходящие метки, поскольку можно получить усиление выявляемого сигнала, приводящее к повышению чувствительности анализов. Сам фермент не вызывает выявляемой ответной реакции, а действует путем разрушения субстрата, в случае если он вступает в контакт с соответствующим субстратом, так что превращаемый субстрат испускает флуоресцентный, колориметрический или люминесцентный сигналы. Ферменты усиливают выявляемый сигнал, поскольку один фермент в реактиве для мечения может приводить к превращению нескольких субстратов в поддающийся выявлению сигнал. Субстрат для фермента выбирают так, чтобы получить предпочтительный поддающийся измерению продукт, например, колориметрический, флуоресцентный или хемилюминесцентный. Такие субстраты широко используются в данной области, и хорошо известны специалисту в данной области техники, и включают, например, оксидоредуктазы, такие как пероксидаза хрена, и субстрат, такой как 3,3'-диаминобензидин (DAB); ферменты фосфатазы, такие как кислая фосфатаза, щелочная, и субстрат, такой как 5-бром-6-хлор-3-индолилфосфат (BCIP); гликозидазы, такие как бета-галактозидаза, бета-глюкуронидаза или бета-гликозидаза, и субстрат такой как 5-бром-4-хлор-3-индолил бета-D-галактопиранозид (X-gal); дополнительные ферменты включают гидролазы, такие как холинэстеразы и пептидазы, оксидазы, такие как глюкозооксидаза и цитохромоксидазы, и редуктазы, для которых известны подходящие субстраты.
[0215]
Ферменты и их соответствующие субстраты, которые инициируют хемилюминесценцию, являются подходящими для некоторых анализов. Они включают без ограничения природные и рекомбинантные формы люцифераз и экворинов. Также пригодны инициирующие хемилюминесценцию субстраты для фосфатаз, гликозидаз и оксидаз, такие как те, которые содержат стабильные диоксетаны, люминол, изолюминол и сложные эфиры акридиния.
[0216]
В другом аспекте в качестве меток также используются гаптены, такие как биотин. Биотин является пригодным, поскольку он может функционировать в ферментной системе с дополнительным усилением выявляемого сигнала, и он может функционировать в качестве маркера для использования в аффинной хроматографии в целях выделения. В целях выявления используют конъюгат фермента, который характеризуется аффинностью к биотину, такой как авидин-HRP. Затем добавляют субстрат для пероксидазы с целью получения выявляемого сигнала.
[0217]
Гаптены также предусматривают гормоны, встречающиеся в природе, и синтетические лекарственные средства, загрязнители, аллергены, эффекторные молекулы, факторы роста, хемокины, цитокины, лимфокины, аминокислоты, пептиды, промежуточные химические соединения, нуклеотиды и т. п.
[0218]
В определенных аспектах флуоресцентные белки могут быть конъюгированы с реагентом(-ами) в качестве метки. Примеры флуоресцентных белков включают зеленый флуоресцентный белок (GFP) и фикобилипротеины и их производные. Флуоресцентные белки, в частности фикобилипротеин, особенно пригодны при получении реагентов для мечения на основе тандемных красителей. Эти тандемные красители содержат флуоресцентный белок и флуорофор для целей получения большего стоксового сдвига, при котором спектр испускания смещен дальше от длины волны спектра поглощения флуоресцентного белка.
[0219]
121
123
125
131
14
35
3
111
112
113
115
99
99
201
68
67
103
99
135
18
153
177
159
149
140
175
166
90
47
186
188
142
105
97
В определенных аспектах метка представляет собой радиоактивный изотоп. Примеры подходящих радиоактивных материалов включают без ограничения йод (I, I, I, I), углерод (C), серу (S), тритий (H), индий (In, In, mIn, mIn,), технеций (Tc, mTc), таллий (Ti), галлий (Ga, Ga), палладий (Pd), молибден (Mo), ксенон (Xe), фтор (F), SM, Lu, Gd, Pm, La, Yb, Ho, Y, Sc,Re, Re, Pr, Rh иRu.
[0220]
В некоторых аспектах лекарственные средства или токсины могут быть конъюгированы с реагентом(-ами). Например, реагент может быть конъюгирован с цитотоксическим лекарственным средством. В этом примере реагент может связываться с LOX1 или комплексом LOX1 и лиганда или рецептора, а затем цитотоксическое лекарственное средство доставляется в клетку. В некоторых вариантах осуществления комплекс реагент-конъюгат может быть интернализирован в клетке, которая высвобождает цитотоксическое лекарственное средство в клетку. Можно конъюгировать любое цитотоксическое лекарственное средство, известное из уровня техники. Некоторые конъюгаты антител уже одобрены FDA и в настоящее время проходят клинические испытания.
[0221]
Примеры, которые следуют далее, представлены с целью обеспечения дополнительной иллюстрации некоторых из аспектов и вариантов осуществления, раскрытых выше. Примеры не следует подразумевать как каким-либо образом ограничивающие широту трактовки объема настоящего изобретения или прилагаемой формулы изобретения.
Примеры
ПРИМЕР 1. Создание популяций клеток с увеличенными количествами раковых стволовых клеток
[0222]
3
В качестве источника раковых стволовых клеток (CSC) для скрининга применяли три ксенотрансплантата опухоли поджелудочной железы, полученные от пациента (PDX). Опухоли на поздних стадиях и метастатические опухоли применяли для лучшего представления популяции пациента, наблюдаемой в клинике. Иссеченные опухоли измельчали на куски размером 2 мм и разделяли в среде DMEM/F12, содержащей 200 единиц/мл коллагеназы IV (Worthington Biologics), с механическим разрушением каждые 10-15 минут до полного разделения ткани. Затем клетки промывали 2X в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) и пропускали через сетчатый фильтр с размером ячейки 40 микрон. Повышали содержание CSC путем высевания разделенных опухолевых клеток в 6-луночные планшеты со сверхнизкой адгезией в среде для мезенхимальных стволовых клеток (MSCGM, Lonza). Клетки культивировали в течение 4 дней, затем собирали, разделяли с помощью аккутазы и замораживали в среде Cryostar 5. Суспензии клеток объединяли с получением 80 миллионов клеток, необходимых для пэннинга и скрининга.
[0223]
фигура 1A
фигура 1В
фигуре 1С
Увеличение количества раковых стволовых клеток, полученных из PDX поджелудочной железы.
Для увеличения количества CSC опухоли PDX поджелудочной железы из трех различных моделей, приобретенных у Jackson Laboratories (), разделяли на отдельные клетки и высевали в неадгезивные безсывороточные условия культивирования. Это приводило к образованию опухолевых сфер (), которые, как было показано ранее, имели увеличенные количества CSC. Увеличение количества CSC определяли с помощью qPCR генов EZH2, BMI1, SOX2 и Nanog, которые известны как играющие важную роль в биологии стволовых клеток, а также CD24 и CD44, которые являются поверхностными маркерами, которые можно применять для определения CSC поджелудочной железы. На показано 40-300-кратное увеличение генной экспрессии всех генов стволовости при сравнении всех опухолевых клеток со сферами, собранными на 4-й день после посева. Затем сферы разделяли на отдельные клетки для применения с целью фенотипических отборов с применением сконструированной библиотеки белков с анкириновыми повторами "DARPin" (Molecular Partners) (см. пример 2).
[0224]
qPCR сфер CSC относительно всех опухолевых клеток.
Во время посева 300000 клеток каждой разделенной модели PDX подвергали быстрой заморозке для применения в качестве популяции "всей опухоли". После инкубации в течение 4 дней сферы собирали центрифугированием при 800 об./мин. Затем сферы разделяли с помощью аккутазы и промывали 2x в HBSS. Затем триста тысяч клеток в сфере CSC подвергали быстрой заморозке для сравнения со всей опухолью. РНК получали из замороженных осадков с применение мини-набора RNeasy Plus (Qiagen) согласно инструкциям изготовителя. РНК количественно определяли с применением Nanodrop. РНК обратно транскрибировали с применением Superscript II (Life Technologies) в реакционной смеси, содержащей 10 нг РНК. Полученную cDNA амплифицировали с применением набора Taqman PreAmp Master Mix согласно инструкциям изготовителя. После предварительной амплификации реакционную смесь разводили 1:20 и 5 мкл использовали в реакции qPCR Taqman (Life Technologies) и прогоняли на приборе для ПЦР в режиме реального времени Fast Dx Real-Time PCR.
ПРИМЕР 2. Идентификация связующих средств с улучшенным связыванием с раковыми стволовыми клетками
[0225]
et al
Protein Eng Des Sel
Для идентификации DARPin, которые связываются с популяциями с увеличенными количествами CSC поджелудочной железы, проводили клеточный пэннинг фагового дисплея. Библиотека DARPin, лицензия на использование которой была получена у Molecular Partners, была подвергнута отбору по аффинности на клетках сфер, сформированных у 3 моделей PDX (Lloyd C Modelling the human immune response: performance of a 1011 human antibody repertoire against a broad panel of therapeutically relevant antigens 2009).
[0226]
фигуре 2
фигура 3A
фигуре 3А
фигура 3B
фигура 4A
фигура 4B
фигура 4C
Идентификация DARPin с увеличенным связыванием с CSC поджелудочной железы.
Обзор проведения общего скрининга показан на . Библиотеку DARpin сначала подвергали отрицательному отбору в отношении рекомбинантных белков, антитела к которым авторам настоящего изобретения не было необходимости выделять. После отрицательного отбора для пэннинга использовали CSC с увеличенными количествами сфер PDX поджелудочной железы. После отборов DARPin элюировали с использованием трипсина, а после этого с использованием TEA. Элюированные DARPin оценивали в отношении связывания как с отсортированными CSC (CD24+CD44+EpCAM+ клетками) из модели PDX поджелудочной железы PA-0165, так и с нормальными клетками эпителия поджелудочной железы. STEM0268 связывался с CSC, количество которых было увеличено с помощью проточно-цитометрического сортинга из опухолей PA-0165, но не с нормальными клетками эпителия поджелудочной железы (), что определяли с помощью технологии флуорометрического анализа в микрообъеме (FMAT). На вставке на показаны изображения клеток в светлом поле. DARPin (10 мкг/мл) также подвергали скринингу в отношении связывания с другими линиями нормальных клеток эпителия (бронхиального, толстой кишки и почечного) с помощью флуоресцентной сортировки клеток (FACS). STEM0268 демонстрировал незначительное связывание с клетками почечного эпителия, но не связывание с клетками бронхиального эпителия и эпителия толстой кишки (). Связывание дополнительно исследовали с помощью FACS-анализа, в котором STEM0268 демонстрировал связывание как с моделью PDX PA-0165, так и с моделью PDX PA-0143 (соответственно и ) и демонстрировал значительное увеличение связывания со сферами, полученными из линии клеток HPAC (), по сравнению с клетками, выращенными в стандартных условиях культивирования тканей.
[0227]
Связывание DARPin с опухолевыми клетками поджелудочной железы, нормальными клетками эпителия и CSC
. Линии клеток рака поджелудочной железы приобретали у АТСС. Нормальные клетки эпителия поджелудочной железы приобретали у Cell Systems и поддерживали в соответствии с инструкциями изготовителя. Клетки почечного эпителия, гепатоциты и клетки эпителия толстого кишечника приобретали у ScienCell Research Laboratories и поддерживали в соответствии с инструкциями изготовителя. Как кардиомиоциты, так и клетки бронхиального эпителия человека приобретали у PromoCell и культивировали согласно инструкциям изготовителя. Линии клеток сначала отсоединяли с помощью 0,05% трипсина или агломераты опухоли PDX поджелудочной железы разделяли согласно такому же протоколу, который описан выше. Клетки промывали в буфере для проточной цитометрии, состоящем из 1x HBSS, 2% бычьего сывороточного альбумина и 0,5 мМ EDTA. Ресуспендированные клетки подсчитывали и переносили в лунки 96-луночного планшета с U-образным дном с плотностью не более 200000 клеток на лунку. Затем клетки инкубировали с клонами DARPin в концентрации 2 мкг/мл в течение 1 часа при 4°C. Клетки промывали в буфере для проточной цитометрии и ресуспендированные клетки красили конъюгированным с APC козьим вторичным антителом, специфичным в отношении Fc-фрагмента человека, в течение 30 минут при 4°C в темноте. Клетки промывали и ресуспендировали в буфере для проточной цитометрии, содержащем DAPI для окрашивания, определяющего жизнеспособность. Образцы считывали на проточном цитометре LSRII и данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo.
[0228]
Скрининг в отношении активности DARPin в отношении CSC
Stem Cells Transl Med
. DARPin, демонстрировавшие предпочтительные паттерны связывания, подвергали скринингу в отношении их способности подавлять образование сфер, с применением одной из моделей PDX поджелудочной железы (PA-0143), которая была использована для отборов. Вкратце, после разделения опухолевых клеток их высевали в 96-луночные планшеты со сверхнизкой адгезией, содержащие MSCGM с 50 мкг/мл DARPin. Все DARPin тестировали в трех повторностях. Спустя 4 дня считывали планшеты и идентифицировали ингибирующие молекулы как демонстрирующие ингибирующую активность, превышающую по меньшей мере 1 стандартное отклонение (SD) от среднего значения в необработанных и контрольных обработанных DARPin лунках. Также проводили второй анализ на основе экспрессии EZH2 в CSC. Ранее авторами настоящего изобретения было продемонстрировано, что при раке поджелудочной железы CSC можно идентифицировать на основании высокой экспрессии у них EZH2 и триметилирования гистона 3 по лизину 27 (Van Vlerken L et al. 2013 EZH2 is required for breast and pancreatic cancer stem cell maintenance and can be used as a functional cancer stem cell reporter 2(1):43-52). Анализ EZH2 с применением клеток HPAC проводили как описано выше с включением 50 мкг/мл DARPin. Положительными считали DARPin, ингибировавшие по меньшей мере 1 SD от среднего значения у необработанных и контрольных лунок.
ПРИМЕР 3. Ингибитор раковых стволовых клеток
[0229]
фигура 5A
фигура 5B
фигуре 5C
STEM0268 подавляет раковые стволовые клетки
выс.
выс.
et al.
. Для определения, способен ли STEM0268 подавлять CSC, авторы настоящего изобретения тестировали его способность подавлять образование опухолевых сфер у моделей PDX поджелудочной железы. Вкратце, клетки разделяли с применением 200 единиц/мл коллагеназы IV, высевали, промывали, подсчитывали и ресуспендировали в количестве 30000 клеток/мл в MSCGM (Lonza) и высевали в 6-луночный планшет с сверхнизкой адгезией. В соответствующие лунки добавляли антитела в количестве 50 мкг/мл. После инкубирования в течение 4 дней сферы собирали, разделяли и повторно высевали аналогичным образом с получением вторичных сфер и оценивали способность CSC к самообновлению. STEM0268 демонстрировал 27% подавление у PA-0143 по сравнению с необработанной или контрольной моделью DARPin-Fc () и 25% подавление у модели PA-0165 (). Также измеряли способность STEM0268 уменьшать количество EZH2 клеток, которые ранее были продемонстрированы авторами настоящего изобретения как имеющие признаки CSC поджелудочной железы (Van Vlerken L et al. 2013), в линии клеток HPAC. Как продемонстрировано на , STEM0268 уменьшал количество EZH2 клеток на 43% по сравнению с контролем DARPin-Fc (P<0,005). Салиномицин (1 мкМ) служил положительным контролем в обоих этих экспериментах (Gupta PB 2009). Эти эксперименты совместно демонстрируют, что STEM0268 может подавлять CSC у моделей PDX поджелудочной железы.
ПРИМЕР 4. Идентификация LOX1 в качестве мишени для подавления раковых стволовых клеток
[0230]
фигуре 6A
фигура 6B
фигура 6C
Идентификация мишени для DARPin
. Для идентификации мишени STEM0268 авторы настоящего изобретения проводили скрининг библиотеки клеток HEK293 со сверхэкспрессией белка как описано выше (Yao et al.). Вкратце, плазмидную библиотеку, состоящую из 4319 векторов экспрессии у млекопитающих (каждый из которых кодирует уникальный мембранный белок), индивидуально трансфицировали в клетки HEK293T. Белок STEM0268 разводили в культуральной среде, смешивали с конъюгированным с AlexaFluor647 вторичным антителом к Fc IgA человека и добавляли к трансфицированным клеткам. Клетки инкубировали с белком в течение ночи при 37°C, а затем связывание измеряли с помощью конфокальной микроскопии. Положительные совпадения при микроскопическом анализе затем подвергали скринингу с помощью FACS. На показаны результаты FACS-связывания STEM0268 с клетками, сверхэкспрессирующими LOX1. Fc-гамма-рецептор 2b (Fcgr2b) применяли в качестве положительного контроля для связывания с DARPin-Fc. Показаны примеры FACS-связывания STEM0268 с другими не являющимися мишенью белками (S1PR2 и BMPR1A). Для подтверждения такой идентификации мишени для STEM0268 проводили ELISA с применением flag-маркированного рекомбинантного LOX1 человека (rhLOX1). STEM0268 действительно связывался с rhLOX1 (). Ни один из контрольных DARPin-Fc не связывался, а антитело к FLAG также было способно обнаруживать flag-маркированный rhLOX1. Способность STEM0268 связываться с LOX1 дополнительно подтверждали с помощью Octet-анализа ().
[0231]
фигура 7A
фигура 7B
фигура 7C
LX5140110 подавляет раковые стволовые клетки.
Для дополнительного подтверждения способности ингибитора LOX1 подавлять образование сфер CSC сравнивали LOX1-специфическое моноклональное антитело (mAb), LX5140110, которое содержит VL, содержащую SEQ ID NO: 33, и VH, содержащую SEQ ID NO: 4 (см., например, таблицу 1), со STEM0268 в отношении его способности подавлять образование сфер в моделях PDX поджелудочной железы. LX5140110 подавлял образование сфер как в модели PA-0165, так и в модели PA-0143 () в схожей степени, что и STEM0268. Кроме того, LX5140110 был способен подавлять CSC из многих линий клеток поджелудочной железы () и толстой и прямой кишки ().
[0232]
фигура 8A
фигура 8B
in vivo
in vivo
Prkdc
Il2rg
P
scid
tm1Wjl
3
Проводили исследование с PA-0143 для определения способности LX5140110 подавлять CSC . PDX-опухоли PA-0143 пересевали путем троакарной имплантации фрагментов опухолей 6-8-недельным мышам NSG (NOD.Cg-/SzJ) и обеспечивали рост до ~300 мм, после чего их рандомизировали и обрабатывали подкожными инъекциями либо контрольного mAb IgG1, либо LX5140110 в количестве 30 мг/кг два раза в неделю в течение 2 недель (). LX51401110 лишь незначительно уменьшал рост опухоли в модели PA-0143 по сравнению как с обработанным средой-носителем, так и с контрольным неспецифическим IgG1, которые также вводили дозой 30 мг/кг (<0,001, критерий множественных сравнений Тьюки), что и ожидалось, поскольку LOX1, по-видимому, экспрессируется преимущественно на CSC, которые представляют собой лишь небольшой процент опухоли. Через двадцать четыре часа после последней дозы антител опухоли удаляли у подгруппы мышей и анализировали в отношении процентного содержания CSC. LX5140110 демонстрировал значительное снижение CSC по сравнению с контролем в виде среды-носителя ().
[0233]
фигура 9А,
фиг. 9B
Комбинации LX5140110 и химиотерапии приводят к улучшенной эффективности в отношении опухолевых клеток
Р
. Принимая во внимание, что химиотерапевтические средства и даже некоторые нацеленные терапевтические средства могут увеличивать количество CSC, несмотря на уменьшения опухолевой массы, комбинированные подходы с применением CSC-специфичной целенаправленной терапии в комбинации с данными средствами становятся привлекательным подходом для лечения пациентов с раком. Поскольку LX5140110 воздействует на CSC специфически, авторами настоящего изобретения была предпринята попытка рассмотреть комбинированные эффекты текущего стандарта химиотерапии для лечения рака поджелудочной железы, гемцитабина и LX5140110. Сначала тестировали способность гемцитабина подавлять Pan02.13. Клетки Pan02.13 высевали в стандартных условиях культивирования тканей со 100 нг/мл гемцитабина и без него в плоскодонный планшет, покрытый культурой ткани (n=10). При 100 нг/мл имело место значимое уменьшение количеств клеток (<0,001, двухсторонний Т-критерий Стьюдента). Для определения эффектов обработок на CSC Pan02.13 обрабатывали в стандартных условиях культивирования тканей в течение 4 дней либо посредством 50 мкг/мл LX5140110, либо посредством контрольного антитела и со 100 нг/мл гемцитабина (GEM) или без него, а затем анализировали в отношении процентного содержания CSC с помощью проточной цитометрии. Процентное содержание CSC (EpCAM+CD24+CD44+) определяли для каждого условия обработки. Клетки сначала гейтировали по отдельным жизнеспособным клеткам с использованием рассеяния и DAPI. Для гейтирования использовали контроли по типу флуоресценции образцов с комбинацией антител без одного (FMO), при этом EpCAM+ популяцию анализировали в отношении экспрессии CD44 и CD24. Частота CSC среди жизнеспособных клеток приведена на . В этих условиях и в этот момент времени LX5140110 демонстрировал небольшое уменьшение количества CSC. Как уже было сказано, гемцитабин увеличивал количества CSC, и на это увеличение количества не оказывало влияние включение неспецифического IgG1. Однако обработка посредством LX5140110 не только подавляла это увеличение, но также немного уменьшала процентное содержание CSC от исходных уровней (0,62% относительно 0,81% для контрольного IgG1 без гемцитабина).
[0234]
фигуре 10А
фигура 10B
Подавление LOX1 может уменьшить индуцированное химиотерапией повреждение кардиомиоцитов.
Несмотря на то, что комбинация химиотерапии и нацеленных терапевтических средств против CSC вероятно будет пригодна в клинических условиях, известно, что многие химиотерапевтические средства помимо противоопухолевой активности обладают непреднамеренными вредными побочными эффектами. Одним из таких побочных эффектов является повреждение сердца, которое может привести к гибели кардиомиоцитов и сердечной недостаточности. Было показано, что LOX1 играет главную роль в опосредованном доксорубицином повреждении кардиомиоцитов (см. Spallarossa et al., Biochemical and Biophysical Research Communications (2005) 335 188-196. Yokoyama et al., (2016) PLoS ONE 11(5): e0154994. doi:10.1371/journal.pone.0154994). Сначала авторы настоящего исследования исследовали экспрессию LOX1 в ответ на обработку доксорубицином клеток эндотелия аорты человека (HAEC) и кардиомиоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток. Окисленный LDL (Ox-LDL) является общеизвестным лигандом LOX1 и был добавлен в качестве контроля, поскольку в предыдущих отчетах было продемонстрировано увеличение LOX1 в ответ на Ox-LDL в клетках сердечной мышцы крыс (Spallarossa et al., (2005)). Сорок тысяч клеток высевали в 96-луночный планшет и обрабатывали только средой или средой, содержащей 5 мкМ доксорубицина, в течение 24 часов. Затем клетки соскабливали и лизировали посредством 1X RIPA-буфера, содержащего ингибиторы протеаз, на льду в течение 1 ч. Буфер для внесения добавляли к каждому образцу с последующим нагреванием в течение 10 мин. при 90°С. На дорожку 4-12% бис-трис-градиентного геля загружали двенадцать микролитров образца. Гели прогоняли в течение 40 мин. при 200 В в буфере MOPS. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану с помощью iBlot. Мембрану блокировали в течение ночи раствором казеина. Добавляли LX5140110 в количестве 1 мкг/мл в казеиновом блокирующем буфере к мембране и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Мембрану промывали 3 раза по 5 мин. каждый посредством TBST-буфера. Конъюгированное с HRP антитело к Fc человека добавляли в разведении 1:5000 в казеиновом блокирующем буфере и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Мембрану дважды промывали посредством TBST по 10 мин. каждый с последующим конечным промыванием TBS-буфером в течение 15 мин. На 1 мин. добавляли хемилюминесцентный субстрат Supersignal ELISA Pico. Мембрану экспонировали на пленку и проявляли. Как показано на , белок LOX1 был повышен в количестве как в обработанных посредством Ox-LDL, так и в обработанных посредством DOX клетках эндотелия аорты, которые являются первыми, с кем сталкиваются химиотерапевтические средства в сердце. Что интересно, авторами настоящего изобретения также было обнаружено увеличение экспрессии LOX1 в кардиомиоцитах, обработанных посредством 5 мкM DOX ().
[0235]
фигуре 11А
фигура 11B
TM
Затем авторами настоящего изобретения была предпринята попытка определить, может ли подавление LOX1 блокировать опосредованное доксорубицином повреждение кардиомиоцитов. Кардиомиоциты Cytivia приобретали у GE Healthcare и высевали согласно инструкциям изготовителя с заменой бычего фибронектина на человеческий фибронектин. Обеспечивали прикрепление клеток в течение 4 дней, а затем меняли среду. Через 5-7 дней среду удаляли и клетки предварительно инкубировали с указанной концентрацией LX5140110 в течение 4 часов перед добавлением 5 мкМ доксорубицина (DOX). После добавления DOX клетки инкубировали в течение дополнительных 24 часов. После инкубации среду удаляли и клетки красили посредством DAPI (в разведении 1:4000 1 мг/мл), TOTO-3 (1 мкл раствора красителя на 1 мл среды) и 5 мкM Fluo-4. Клетки инкубировали в течение 1 часа при 37°C, а затем визуализировали на Image on GE IN Cell Analyzer. Жизнеспособность определяли путем получения количества клеток, исключающих красители DAPI и TOTO-3, в то время как Fluo-4 использовали для определения значений концентрации кальция. Известно, что кардиомиоциты демонстрируют увеличение содержания кальция при индуцированной эндотоксином дисфункции сердца. (Thompson et al., Pediatric Research (2000) 47: 669-676). Как показано на , концентрация кальция увеличивалась примерно в 2,5 раза в кардиомиоцитах, инкубированных с 5 мкМ DOX, по сравнению с необработанными контролями, которые демонстрировали дисфункцию кардиомиоцитов. (Важно отметить, что LX5140110 был способен подавлять накопление кальция в результате обработки DOX. Более того, DOX приводил к уменьшенной жизнеспособности кардиомиоцитов (), которая и в этот раз обращалась ингибитором LOX1, LX5140110.
ОБСУЖДЕНИЕ
[0236]
Данные в вышеуказанных примерах демонстрируют ранее не обнаруженную и неожиданную функцию LOX1 помимо ее известной роли в здоровье сердечно-сосудистой системы. В частности, исследования, представленные в данном документе, демонстрируют, что в отношении рака LOX1 выполняет специфическую роль в функции CSC, представляя результат, о котором ранее не сообщалось. В нескольких иллюстративных примерах результаты демонстрируют, что в моделях рака поджелудочной железы и колоректального рака LOX1 сверхэкспрессируется у CSC и выполняет функциональную роль в активности CSC, поскольку экзогенное введение ингибиторов LOX1 (DARPin и mAb) моделям PDX обеспечивало прямое подавление CSC. Более того, данные в приведенных выше примерах демонстрируют, что ингибиторы LOX1 могут подавлять индуцированное химиотерапией увеличение CSC и делают применение их в комбинации привлекательным клиническим подходом. Кроме того, в приведенных выше примерах авторы настоящего изобретения представляют доказательства того, что ингибиторы LOX1 также могут защищать от индуцированного химиотерапией повреждения сердца, которое является серьезной проблемой для пациентов, проходящих лечение данными лекарственными средствами.
[0237]
На важную функцию CSC в лечении рака указывает множество доклинических и клинических доказательств, таким образом, виды лечения, целенаправленно воздействующие на эту популяцию опухолевых клеток, могут иметь высокую ценность. Описанная в данном документе работа указывает не только на новую и важную роль LOX1 в поддержании уровня CSC, но и свидетельствует о том, что нейтрализация LOX1 может быть пригодной стратегией для подавления функции CSC и что подавление CSC путем блокирования LOX1 может обеспечить уникальные и эффективные терапевтические средства для улучшения жизни пациентов.
Включение посредством ссылки
[0238]
Все публикации и патенты, упомянутые в данном документе, настоящим включены в данный документ посредством ссылки в полном их объеме, как если бы каждая отдельная публикация или патент были конкретно и индивидуально указаны как включенные посредством ссылки.
[0239]
Хотя обсуждались конкретные аспекты настоящего изобретения, вышеуказанное описание носит иллюстративный, а не ограничительный характер. Многие варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники после рассмотрения настоящего описания и приведенной ниже формулы изобретения. Полный объем настоящего изобретения должен определяться со ссылкой на пункты формулы изобретения вместе с полным объемом их эквивалентов, и описанием вместе с такими вариантами.
Избранные ссылки
Al-Hajj et al., (2003). Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 3983-3988.
Barker et al., (2009). Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature 457, 608-611.
Creighton et al., (2009). Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 13820-13825.
Gemei et al., (2013). CD66c is a novel marker for colorectal cancer stem cell isolation, and its silencing halts tumor growth in vivo. Cancer 119, 729-738.
Cell
Gupta PB et al.,2009 Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening  138(4):645-59.
Tumor Biology
Fangning Wan et al., Oxidized low-density lipoprotein is associated with advanced-stage prostate cancer. 2015 36 (5):3573-82.
Hermann et al., (2007). Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell stem cell 1, 313-323.
Cardiovasc. Res.
Hinagata et al.,  69:263-71 (2006).
Hirsh et al., A common gene network link cancer with lipid metabolism and diverse human diseases. 2010 Cancer Cell 17:348-61).
Hirsch et al., (2014). LGR5 positivity defines stem-like cells in colorectal cancer. Carcinogenesis 35, 849-858.
Circ. Res.
Inoue et al.,  97:176-84 (2005).
Khaidakov et al. Oxidized LDL receptor 1 (OLR1) as a possible link between obesity, dyslipidemia and cancer. 2011 PLOSOne 6(5):e20277.
Kume et al., 70th Scientific Sessions of the American Heart Association Ser. 96, 1997.
Lapidot et al., (1994). A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature 367, 645-648.
Li et al., (2007). Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer research 67, 1030-1037.
Cir. Cardio. Imaging
Li et al.,  3:464-72 (2010).
Oncotarget
Long et al. Combination of body mass index and oxidized low density lipoprotein receptor 1 in prognosis prediction of patients withsquamous non-small cell lung cancer. 2015  advance publications, см.онлайн-публикации на www.impactjournals.com/oncotarget/.
Circ. Res.
Mehta et al.,  100:1634-1642 (2007).
J. Pharm. Biomed. Anal.
Nakamura et al.,  51:158-163 (2010).
et al., Structure
Ohki  13:905-917 (2005).
Tehranchi et al. (2010). Persistent Malignant Stem Cells in del(5q) Myelodysplasia in Remission. New England Journal of Medicine 363, 1025-1037.
Expert Opin Ther Targets.
Ulrich-Merzenich et al., 17(8):905-19 (2013).
Stem Cells Transl Med
Van Vlerken L et al. 2013 EZH2 is required for breast and pancreatic cancer stem cell maintenance and can be used as a functional cancer stem cell reporter  2(1):43-52.
Wang et al.,(2012). Evaluation of CD44 and CD133 as cancer stem cell markers for colorectal cancer. Oncology reports 28, 1301-1308.
Cardiovascular pathology
White et al., 20:369-73 (2011).
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.
Xu et al.,  27(4) 871-877 (2007).
Clin. Cardiol.
Zhao et al.,  34:172-177 (2011).