Штамм ассоциативных бактерий Flavobacterium sp. 72, активный азотфиксатор и продуцент физиологически активных веществ, используемый для повышения урожайности риса
FLAVOBACTERIUM SP_ 72 ASSOCIATIVE BACTERIA STRAIN, ACTIVE NITROGEN FIXATOR AND PRODUCER OF PHYSIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES USED TO INCREASE RICE YIELD

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, биотехнологии, микробиологической промышленности и сельскому хозяйству, а именно к микробиологическим средствам оптимизации минерального питания растений путем предпосевной обработки семян эффективными ростстимулирующими бактериями, способными приживаться в ризосфере злаковых растений, в частности риса, формируя ассоциативный симбиоз.
Для снижения антропогенной нагрузки на затопляемые почвы рисовых полей необходимо внедрение биологических элементов в агротехнологии выращивания культуры риса. Эффективным приемом оптимизации питания растений, обеспечивающим повышение урожайности и качества полученной продукции, является предпосевная обработка семян ассоциативными штаммами микроорганизмов.
Известен ряд штаммов, выделенных из ризоферы и ризопланы риса, которые используются в сельском хозяйстве для стимуляции роста и повышения продуктивности зерновых культур.
Известен выделенный из ризопланы риса штамм Enterobacter aerogenes 30Ф (А.с. SU 1356454 A1, C12N 1/20, C05F 11/08), являющийся несимбиотическим азотфиксатором под рис и позволяющий увеличивать его урожай. Штамм также показал высокую эффективность в посевах зерновых культур и является основой микробного препарата Ризоэнтерин, рекомендованного для предпосевной обработки семян ячменя (Литивинцева Т.А. Эффективность применения ризоэнтерина на посевах пивоваренного ячменя // Агрохимический вестник, 2007. - №5. - С. 37-38).
Известен штамм Agrobacterium (Rhizobium) radiobacter 204, выделенный из почвы ризосферы риса и используемый для предпосевной обработки семян риса и пшеницы с целью повышения урожайности (А.с. 1621433, C05F 11/08, C12N 1/20, 15.10.1990). Штамм Agrobacterium (Rhizobium) radiobacter 204 - азотфиксатор, ростстимулятор, является биоагентом микробного препарата Диазофит (ризоагрин), рекомендованного для обработки семян пшеницы, риса и других зерновых культур (Завалин А. А. Биопрепараты, удобрения и урожай. М.: Изд-во ВНИИА, 2005. - 302 с.; Мельничук Т., Каменева I, Ярошенко С. Застосування мiкробних препаратiв при вирощуваннi пшеницi  в умовах Степу/ Науково-практичний щорiчник. Посiбник  хлiбороба, 2013. - Т. 1. - С. 209-210).
Известен штамм азотфиксирующих бактерий Alcaligenes paradoxus 060207, который выделен из ризосферы риса, выращиваемого в монокультуре без минеральных удобрений, и используется для производства бактериального удобрения под рис и пшеницу (Патент UA №17694, C05F 11/08, C12N 1/20, опубл. 31.10.1997, бюл. №5).
Причинами, препятствующими достижению повышения продуктивности агроценоза монокультуры риса, является снижение азотфиксирующей активности известных штаммов вследствие высокой пестицидной нагрузки на почву. Агрохимикаты препятствуют приживаемости полезных форм микроорганизмов в ризосфере растений, а именно штаммов, являющихся основой микробных препаратов, тем самым, снижают потенциальную функциональность системы «ассоциативные бактерии - растения риса».
Известен штамм ассоциативных бактерий Phyllobacterium ifriqiyense 6, который был выделен из апикальной части корней риса сорта Хазар, выращиваемого в монокультуре, и депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ФГБНУ ВНИИСХМ, г. Санкт-Петербург) под регистрационным номером RCAM 04327. Штамм адаптирован к условиям юга России, является активным азотфиксатором, ростстимулятором, повышает продуктивность риса (Патент RU 2649362 C1, C12N 1/20, C01N 63/02, C12R 1/01, опубл. 02.04.2018, бюл. №10). Однако, несмотря на высокую степень ассоциативности, через 25 суток вегетации в ризосфере бактеризованных растений численность Phyllobacterium ifriqiyense 6 составляла 97 тыс. колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г. почвы, что может быть обусловлено тем, что Phyllobacterium ifriqiyense не являются типичными представителями ризосферы растений риса и почв, предназначенных для выращивания данной культуры.
Характерными представителями микробоценоза ризосферы и ризопланы различных растений являются бактерии рода Flavobacterium. (Оразова М.Х., Полянская Л.М., Звягинцев Д.Г. Гетерогенность корня как среда местообитания микроорганизмов //Микробиология. - 1994. - Т. 63. - №4. - С. 706-714.). Известен микробный препарат Флавобактерин (на основе штамма Flavobacterium sp.), подавляющий развитие фитопатогенных микроорганизмов как на самом семени, так и при попадании его в почву. (Завалин А.А., Алметов Н.С. Применение биопрепаратов и биологический азот в земледелии Нечерноземья. - М.: Издательство ВНИИА, 2009. - 152 с.; Лактионов Ю.В. Новые технологии возделывания озимых культур, основанные на использовании микробиологических препаратов ризоагрин и флавобактерин производства ФГУП «ЭКОС» Россельхозакадемии (г. Санкт-Петербург) // Главный агроном. - 2011. - №8. - С. 20-21). Недостатком препарата является его нестабильная эффективность в посевах риса, выращиваемого в условиях длительного затопления, при которых создаются специфические условия для почвенных микроорганизмов.
В основу изобретения поставлена задача получения штамма почвенных бактерий с комплексом полезных для растений свойств, способных к образованию ассоциативного симбиоза с растениями риса, выращиваемого в монокультуре и проявляющих адаптационный потенциал к затопляемым условиям на темно-каштановых почвах юга России, обеспечивающего повышение урожайности культуры.
Поставленная задача решена путем выделения из микробоценоза апикальной части корней риса, выращиваемого в монокультуре, штамма ассоциативных бактерий Flavobacterium sp. 72, обладающего способностью фиксировать азот атмосферы и продуцировать физиологически активные вещества. Использование штамма Flavobacterium sp. 72 обеспечивает прибавку урожая риса на 25-30%.
Существенным преимуществом штамма Flavobacterium sp. 72 является его способность формировать ассоциативный симбиоз с Oriza sativa L., так как селекция штамма осуществлялась по принципу ассоциативности к конкретному виду растений (именно рису, выращиваемому в условиях периодического затопления). Штамм является факультативным анаэробом с высоким адаптационным потенциалом к интенсивному возделыванию данной культуры. Также к преимуществам штамма можно отнести его распространенность (численное представительство). При выделении изолятов с высокой степенью ассоциативности с растениями обилие данного вида в эпифитном микробоценозе риса составило 13,4%, а частота встречаемости - 30%.
Штамм выделен из эпифитного микробоценоза апикальной части корня риса по усовершенствованной методике (Шерстобоев М.К., Мельничук Т.М., Мельник Л.I. Методичнi аспекта вивчення асоцiативностi бактерiй до рослин пшеницi та ячменю // Сiльскогосподарська мiкробiологiя: Мiжвiд. темат. наук. зб. - Чернiгiв, 2006. - Вип. 3. - С. 34-42) на капустной среде (среда №19).
Состав среды №19:
Капустный отвар - 1 л
Кукурузный экстракт - 1,25 мл/л
сусло пивное - 25 мл/л
агар-агар - 20 г/л
рН 7,0-7,2
В качестве субстрата для выделения использовали лугово-каштановую почву рисовых чеков, где монокультура риса 10 лет (Крым, Красноперекопский район).
Идентификация штамма произведена на основании морфологических и биохимических признаков согласно определителю Берги 1984 г. и методическим рекомендациям (Возняковская Ю.М., Попова Ж.П. Методические рекомендации по идентификации неспоровых бактерий, доминирующих в ризосфере растений. Ленинград, 1985 г.).
Клетки бактерий имеют вид палочек. Споры не образуют, неподвижны. Колонии на агаризованных средах ризоидной формы, диаметром до 3 мм, плоские, блестящие, оранжевые, гладкие, края неровные. Культура использует минеральный и органический азот, желатин не разжижает; слабый рост на средах с углеводами (лактоза, арабиноза) с подкислением; способен гидролизовать крахмал; при 37°С рост отсутствует; каталазоположительны; факультативный анаэроб. Температурный интервал роста штамма 22-30°С. Оптимальная температура для роста и размножения данного штамма 25-28°С, он стабильно хранится на капустной агаризованной среде при температуре +4°С, рН 6,9-7,2. Периодичность пересева 1 раз в 6 месяцев.
Генетическая идентификация произведена в 2016 году в ФГБНУ ВНИИСХМ г. Санкт-Петербург (при поддержке гранта №16-34-50060 Идентификация и характеристика симбиотических свойств ростстимулирующих бактерий ризосферы риса).
На основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA нововыделенный штамм идентифицирован как Flavobacterium sp. и депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ФГБНУ ВНИИСХМ, г. Санкт-Петербург) под регистрационным номером RCAM 04328 от 21.10.2016 г. Ближайшими родственниками заявляемого штамма являются: Flavobacterium pectinovorum strain NBRC 15945 (Identity - 98,52%), Flavobacterium pectinovorum strain DSM 6368 (Identity - 98,45%), Flavobacterium saccharophilum strain NBRC 15944 (Identity - 98,17%).
Ассоциативный симбионт имеет нуклеотидную последовательность SEQIDNO: 1.
Штамм Flavobacterium sp. 72 характеризуется высокой технологичностью, т.к. хорошо растет в регламентированных для производства биопрепаратов средах, набирает высокий титр, который сохраняется длительное время. При глубинном культивировании в течение трех суток в кукурузно-мелассной среде при 220 об/мин титр бактерий достигал 18 млрд КОЕ/мл - достаточный для обработки семян риса и других зерновых культур из расчета оптимальной нагрузки на одно семя.
Исследования, проведенные с целью изучения механизма действия штамма Flavobacterium sp. 72, подтвердили его способность фиксировать азот атмосферы и продуцировать физиологически активные вещества ауксиновой природы.
2
4
Потенциальная азотфиксирующая активность культуры была определена методом ацителен-редукции на газовом хроматографе «Chrom-5» с пламенно-ионизационным детектором и составила 22,1 СН нМоль/мл/час.
-5
Flavobacterium sp. 72 в концентрациях 1:10 и 1:100 стимулировал увеличение длинны колеоптелей пшеницы за одни сутки на 44 и 32% соответственно в сравнении с контролем и на 33 и 22% соответственно в сравнении с аутентичным раствором (ИУК 10), что свидетельствует о фитостимулирующих свойствах данного штамма (табл. 1)
Количественный и качественный анализ ауксинов в культуральной жидкости Flavobacterium sp. 72, проведенный методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, выявил продукцию индолил-3-молочной кислоты (ИМК), индолил-3-карбоновой кислоты (ИКК), индолилуксусной кислоты (ИУК) (таблица 2).
Эффект стимуляции установлен на растениях риса в условиях вегетационного опыта 2014 года (таблица 3). Показано, что бактеризация семян способствует росту растения и развитию корней риса. При этом штамм Flavobacterium sp. 72 увеличивает длину побега на 40,5% относительно контроля и на 15,6% относительно референтного штамма A. radiobacter 204, длину корня на 103,5% и 12,3%, воздушно-сухую массу на 76,2% и 68,2% соответственно. При этом повышается содержание хлорофиллов в листьях растений на 25,7 и 9,1% соответственно в сравнении с контролем и референтным штаммом A. radiobacter 204. На фиг. 1 представлена диаграмма содержания хлорофилла в листьях растений риса в фазу цветения.
Штамм бактерий Flavobacterium sp. 72 формирует активные ассоциации с растениями риса и при интродукции с семенами в почву приживается в ризосфере растений. Так, через 25 суток вегетации риса количество Flavobacterium sp. 72 составляло 687 тыс. колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 грамме ризосферной почвы, что превышало численность Phyllobacterium ifriqiyense 6 в 7 раз.
Обработка семян перед посевом штаммом Flavobacterium sp. 72 способствовала повышению численности диазотрофов в ризосфере риса в фазы кущения, цветения и созревания соответственно на 46,9%, 42,9% и 26,5% относительно контролей (таблица 4).
2
Установлено повышение биологической активности в ризосфере риса. Эмиссия СО в варианте с обработкой семян Flavobacterium sp. 72 в фазу кущения увеличивалась на 53% к контролю и на 76,9% и 64,3% - соответственно к референтам штаммам A. radiobacter 204 и P. ifriqiyense 6 (таблица 5). В фазу созревания этот показатель превышал контроль на 40% и штаммы-референты соответственно на 16,7% и 27,3%.
Обработка семян перед посевом обеспечила прибавку урожая риса в среднем за три года на 40% и превышала референтный штамм на 9,6% (таблица 6).
При изучении способности Flavobacterium sp. 72 мобилизовать питательные элементы в почве отмечено, что штамм приводил к снижению содержания водорастворимых форм Al, однако повышал содержание Fe, Cu и Mn в лугово-каштановой почве. При интродукции в темно-каштановую слабосолонцеватую почву обнаружено повышение содержания водорастворимого Al и Mn.
Учитывая способность штамма продуцировать ауксины, а также с целью расширения спектра культур для интродукции штамма исследовали его влияние на посевные свойства пшеницы и перспективной для Крыма культуры рыжик посевной. Стимулирующий эффект Flavobacterium sp. 72 установлен на проростках озимой пшеницы разных сортов. Обработка семян пшеницы суспензией штамма Flavobacterium sp. 72 способствует повышению их всхожести у сорта Станичная на 2%, Виктория - 4,3%, Васса - 1%.
Исследуемый штамм ассоциативных бактерий способствует увеличению длины корней озимой пшеницы сортов Станичная, Виктория и Краснодарская 99 на 15,8, 46,0 и 13,2% соответственно. В вариантах с обработкой семян штаммом Flavobacterium sp. 72 также отмечена стимуляция длины проростков пшеницы на 10-33% в зависимости от сорта (таблица 7).
Выявлена стимуляция роста корней и проростков масличной культуры рыжик посевной при обработке ассоциативным штаммом бактерий Flavobacterium sp. 72 на 29,4% и 4,1%, соответственно (таблица 8).
Таким образом, в результате решения технической задачи, выделен штамм ассоциативных бактерий Flavobacterium sp. 72, способный фиксировать азот атмосферы и продуцировать фитогормоны ауксиновой природы. Предпосевная обработка семян штаммом Flavobacterium sp. 72 способствует стимуляции роста, увеличению суммы хлорофиллов в листьях и повышению урожая зерна риса, а так же повышению биологической активности в ризосфере растений. Предпосевная обработка семян суспензией штамма ассоциативных бактерий Flavobacterium sp. 72 способствует стимуляции роста не только риса, но и пшеницы, а также масличной культуры рыжик посевной, что дает возможность расширить спектр сельскохозяйственных культур для применения штамма.
--->
Перечень последовательностей
<110>  Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма» (ФГБУН «НИИСХ Крыма»)
Flavobacterium
<120>  Штамм ассоциативных бактерий  sp. 72, активный азотфиксатор и продуцент физиологически активных веществ, используемый для повышения урожайности риса
<140>  RU 2019127586
<141>  2019-08-30
<160> 1
<210>  1
<211>  1424
<212>  DNA
Flavobacterium
<213>   sp.
<400>  1
gcttaacaca tgcaagtcga ggggtatggt tcttcggaac cagagaccgg cgcacgggtg   60
cgtaacgcgt atgcaatcta ccttttacag agggatagcc cagagaaatt tggattaata  120
cctcatagta taacatgacc gcatggtcga gttattaaag tcacaacggt aaaagatgag  180
catgcgtccc attagctagt tggtaaggta acggcttacc aaggctacga tgggtagggg  240
tcctgagagg gagatccccc acactggtac tgagacacgg accagactcc tacgggaggc   300
agcagtgagg aatattggac aatgggcgca agcctgatcc agccatgccg cgtgcaggat   360
gacggtccta tggattgtaa actgctttta tacgagaaga aacactccga cgtgtcggag   420
cttgacggta tcgtaagaat aaggatcggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg   480
gaggatccaa gcgttatccg gaatcattgg gtttaaaggg tccgtaggcg gtttggtaag   540
tcagtggtga aagcccatcg ctcaacggtg gaacggccat tgatactgcc agacttgaat   600
tattaggaag taactagaat atgtagtgta gcggtgaaat gcttagagat tacatggaat   660
accaattgcg aaggcaggtt actactaatt gattgacgct gatggacgaa agcgtgggta   720
gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatggatact agctgttgga   780
agcaatttca gtggctaagc gaaagtgata agtatcccac ctggggagta cgttcgcaag   840
aatgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc   900
gatgatacgc gaggaacctt accaaggctt aaatgtagat tgaccggttt ggaaacagat   960
ctttcgcaag acaatttaca aggtgctgca tggttgtcgt cagctcgtgc cgtgaggtgt  1020
caggttaagt cctataacga gcgcaacccc tgttgttagt tgccagcgag tcaagtcggg  1080
aactctaaca agactgccag tgcaaactgt gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca  1140
cggcccttac gcccttgggc tacacacgtg ctacaatggc cggtacagag agcagccact  1200
gggcgaccag gagcgaatct ataaaaccgg tcacagttcg gatcggagtc tgcaactcga  1260
ctccgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgg atatcagcca tgatccggtg aatacgttcc  1320
cgggccttgt acacaccgcc cgtcaagcca tggaagctgg gggtgcctga agtcggtgac  1380
cgcaaggagc tgcctagggt aaaactggta actagggcta agtc     1424
<---