СПОСОБ ОЦЕНКИ БЕЛОК СИНТЕЗИРУЮЩЕЙ ФУНКЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ ДЛЯ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
METHOD OF ASSESSMENT OF PROTEIN-SYNTHESIZING FUNCTION OF LEUKOCYTES FOR CLINICAL STUDIES

Изобретение относится к области медицины, а именно лабораторной диагностике, и может быть использовано в клинической практике для диагностики белков и пептидов, синтезируемых лейкоцитами.
Известными способами молекулярной диагностики являются иммуноферментный анализ, полимеразно-цепная реакция и различные варианты применения этих методик в комбинации с иммуноблотингом и методами культивирования клеток крови человека для диагностики синтезируемых белков или определения фрагментов ДНК (генов) или РНК, кодирующих синтез белков в клетке. (Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. - М.: Мир, 2002. - 589 с.; Kalendar R., Lee D., Schulman A.H., 2011 Java Web tools for PCR, in silico PCR, and oliginucletide assembly and analysis./ Genomics, 98(2): 137-144. http://pnmerdigital.com/tools; Клиническая лабораторная аналитика. Том II. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории / Под ред. В.В. Меньшикова: М.: Лабинформ-РАМЛД. - 1999. - С.205; Меньшиков В.В. Клиническая лабораторная аналитика. Том I. - Основы клинического лабораторного анализа.- М.: Агат-Мед. - 2002. - 860 с.).
Описанные методы являются недостаточно точными в целях оценки белков, синтезируемых лейкоцитами в условиях очага воспаления и/или условиях тесного межклеточного контакта, дефицита питательных веществ и метаболического стресса.
Для решения данной задачи применяются специальные методики, например метод, примененный в научном исследовании К. Hattar at al (Grandel Amplification of LPS and LTA induced cytokine synthesis in NSCLC/neutrophil cocultures // J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 22198)). Авторы установили роль межклеточной кооперации, стимулирующее влияние продуцируемых цитокинов (ИЛ-8) и тесного межклеточного контакта путем определения матричной РНК, кодирующей синтез цитокинов (ИЛ-6) нейтрофилами в культуре клеток.
Вместе с тем, описанный метод является экономически высокозатратным и трудоемким, что не позволяет применить его в клинической практике для индивидуальной диагностики.
Недостатком другого метода, описанного Туевым А.В., Мишлановым В.Ю. в 2000 году (Патент РФ №2194995 МПК G01N 33/92, опубл. 20.12.2002. «Способ диагностики прогрессирующей стенокардии у больных ишемической болезнью сердца». Приоритет установлен 28.04.00.), является определение только концентрации общего холестерина в супернатанте культуры лейкоцитов, ассоциированного с молекулами белка, что не позволяет осуществлять точную молекулярную диагностику белоксинтезирующей функции лейкоцитов для клинических исследований.
Общим недостатком описанных методов культивирования клеток является длительность периода культивации.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому методу является иммуноферментный анализ белков в сыворотке крови. Безусловным преимуществом метода является точность определения концентрации белков. Однако при воспалении белки и пептиды, определяемые в сыворотке крови, отражают системный уровень иммунного ответа, «включающийся» в ряде ситуаций позднее, чем местный, определяющийся процессами происходящими непосредственно в тканях (Ross R. Atherosclerosis - an inflammatory disease // N. Engl. J. Med. - 1999. - Vol.340. - P.115-126). В связи с этим изучение концентрации белков и пептидов, синтезируемых клетками (лейкоцитами) непосредственно в очаге воспаления, позволяет судить о местном воспалительном ответе и является в ряде ситуаций более ранним маркером патологического процесса.
Изобретение направлено на решение задачи: повышение точности и производительности метода.
Решение указанной задачи достигается путем применения метода иммуноферментного анализа, при котором белки и/или пептиды определяют после предварительного 20-часового культивирования лейкоцитов, выделенных из венозной крови, в присутствии фактора некроза опухоли-альфа с последующим разрушением клеточных мембран лизирующим раствором и 50-кратным разведением образцов при определении концентрации альфа-дефензинов, а при изучении содержания С-реактивного белка без разведения, рекомендованного для определения сывороточной концентрации фирмой производителем тест-системы, с целью достижения оптимального соотношения антигена и моноклональных антител (конъюгата).
Вышеперечисленная совокупность существенных признаков позволяет получить следующий технический результат - повышение точности и производительности метода.
Способ осуществляют следующим образом.
Лейкоциты выделяют из венозной крови с помощью системы Vacutainer BD, содержащей декстрозу, или методом отстаивания в растворе полиглюкина. Клеточную суспензию отмывают физиологическим раствором натрия хлорида, затем питательной средой Игла-МЕМ. Осуществляют подсчет количества клеток и доводят их концентрацию до 50000 в 1 мкл, что обеспечивает тесный клеточный контакт при культивировании лейкоцитов. Суспензию лейкоцитов в количестве 400 мкл помещают в стерильные пенициллиновые флаконы, закрывают резиновыми пробками. Культивирование клеточной суспензии, обогащенной лейкоцитами, осуществляется в среде Игла-МЕМ в течение 20 часов при 37°C, при добавлении фактора некроза опухоли -альфа в концентрации 0,005 мкг/мл. После культивирования клеточные мембраны лейкоциты разрушают, применяя лизирующий раствор. Проводят ресуспендирование, центрифугирование образцов. Затем молекулярную диагностику осуществляют методом иммуноферментного анализа, например, используя наборы фирмы Hycult Biotech для определения концентрации дефензинов-альфа (1-3) и/или наборы фирмы Biomerica для определения С-реактивного белка. При этом для повышения чувствительности методики и достижения оптимального соотношения антигена и моноклональных антител (конъюгата) в случае определения концентрации СРБ разведение биологического материала не применяется, в отличие от рекомендованного 100-кратного при изучении в сыворотке крови, а при определении содержания альфа-дефензинов образцы разводятся в 50 раз.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Проведено обследование 15 практически здоровых лиц среднего возраста 43,4±45 года. Среди них мужчины составили 37%, а женщины 63%. У всех обследуемых с использованием метода иммуноферментного анализа определялось содержание дефензинов (наборы фирмы Hycult Biotech) и C-реактивного белка (наборы фирмы Biomerica) в сыворотке крови и в супернатантах, содержащих лизаты лейкоцитарных культур по описанной методике с оптимального разведением образцов. Определены средние значения дефензинов и C-реактивного белка в сыворотке крови и в супернатантах, содержащих лизаты лейкоцитарных культур (см. табл.1).
Таблица 1
Содержание дефензинов и С-реактивного белка в сыворотке крови и супернатантах, содержащих лизаты лейкоцитарных культур у здоровых лиц
Показатель
Единицы измерения
Среднее значение в сыворотке±SD
Среднее значение в супернатантах лейкоцитарных культур ±SD
Дефензин-альфа
нг/мл
0,16±0,09
115,9±56,3
C-реактивный белок
мкг/л
10,3±5,6
1,8±1,1
Приведенные данные свидетельствуют о том, что C-реактивный белок и дефензины, синтезированные лейкоцитами в культуре in vitro, могут быть определены описанным выше методом.
Пример 2. Больной П., 47 лет, обследован через 1 месяц после операции коронарного шунтирования по поводу окклюзирующего атеросклероза передней нисходящей и огибающей коронарных артерий с наложением 2-х аутовенозных шунтов. Клинически отмечается положительная динамика, заключающаяся в исчезновении симптоматики стенокардии после оперативного лечения, исчезновении болей, связанных с стернотомией, отсутствие местных воспалительных изменений со стороны послеоперационного шва передней грудной стенки, заживлением послеоперационных ран голени. Методом иммуноферментного анализа с использованием набора фирмы Hycult Biotech определена концентрация дефензинов-альфа в сыворотке крови - 0,23 нг/мл, в супернатантах, содержащих лизаты лейкоцитарных культур (предложенным методом) - 104,12 нг/мл. С помощью наборов фирмы Biomerica определена концентрация C-реактивного белка в сыворотке крови - 44,7 мкг/л, в супернатантах лейкоцитарных культур (предложенным методом) - 2,5 мкг/л.
Данный пример демонстрирует высокое диагностическое значение определения C-реактивного белка в культуре лейкоцитов и показывает, что у больного ишемической болезнью сердца, перенесшего операцию коронарного шунтирования 1 месяц назад, имеющего положительную клиническую динамику и исчезновение острых воспалительных изменений в области послеоперационных швов, концентрация C-реактивного белка, синтезируемого лейкоцитами в условиях in vitro, соответствует средним значениям, полученным в группе практически здоровых лиц, а концентрация C-реактивного белка в сыворотке крови уменьшается медленно и остается умеренно повышенной. Концентрация дефензинов в сыворотке и культуре лейкоцитов значимо не отличалась от уровня здоровых лиц (см. пример 1). Подобная особенность концентрации противомикробных пептидов может быть маркером минимальной активности воспаления, что подтверждается клинически благополучным течение послеоперационного периода.
9
Пример 3. Больной М., 50 лет, обследован через 1 месяц после операции коронарного шунтирования по поводу окклюзирующего атеросклероза передней межжелудочковой, огибающей и правой коронарных артерий с наложением 4-х аутовенозных шунтов. На 2 неделе послеоперационного периода появилась одышка, субфибрильная лихорадка. Пациент отмечал болевой синдром связанный со стернотомией, наблюдались признаки местного воспаления в области послеоперационной раны. При проведении ультразвукового исследования плевральных полостей в синусах выявлен уровень жидкости. Отмечался умеренный лейкоцитоз 8,8·10 и высокая СОЭ - 56 мм/час. На 4 неделе послеоперационного периода пациент был госпитализирован в кардиологическое отделение, где верифицирован посткардиотомный синдром.
В сыворотке крови и супернатантах, содержащих лизаты лейкоцитарных культур (по предложенной методике), была выявлена высокая концентрация C-реактивного белка - 103 мкг/л и 8,4 мкг/л соответственно. При относительно не высоком содержании сывороточных дефензинов - 0,29 нг/мл отмечен их высокий уровень в супернатантах лейкоцитарных культур (по предложенной методике) - 178,9 нг/мл. Оценка содержания изучаемых пептидов позволяет говорить об активном системном и местном воспалительном процессе, что коррелирует с неблагоприятным течением послеоперационного периода у данного пациента.
Представленные данные подтверждают высокое диагностическое значение предлагаемого метода и позволяют считать, что белки и пептиды, синтезированные лейкоцитами в условиях тесного межклеточного контакта in vitro имеют патогенетическое и высокое клиническое значение.
Предлагаемый способ отличается от известного следующими признаками.
Сроки культивирования лейкоцитов сокращены до 20 часов, для стимуляции синтеза белка применяется фактор некроза опухоли-альфа, определение белков или пептидов, синтезированных лейкоцитами, осуществляют иммуноферментным методом после предварительного разрушения мембран лейкоцитов лизирующим раствором, для повышения чувствительности методики и достижения оптимального соотношения антигенного материала и моноклональных антител (конъюгата) в случае определения концентрации СРБ разведение биологического материала не применяется, в отличие от рекомендованного фирмой производителем тест-системы 100-кратного при изучении в сыворотке крови, а при изучении содержания альфа-дефензинов образцы разводятся в 50 раз.
Данное описание и примеры рассматриваются как материал, иллюстрирующий изобретение, сущность которого и объем патентных притязаний определены в нижеследующей формуле изобретения, совокупностью существенных признаков и их эквивалентами.