Роль модифицированной экспрессии гена hmg1 в устойчивости трансгенных растений табака к действию ионов меди

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2011. Вып. 3. С. 237-245 Биология

УДК 581.1:58.04:58.084.1

Роль модифицированной экспрессии гена Нтд1 в устойчивости трансгенных растений табака к действию ионов меди *

А. А. Ермошин, М. Г. Малёва, В. В. Алексеева, Н. В. Чукина,

Е. Б. Рукавцова, Я. И. Бурьянов

Аннотация. Исследовано влияние окислительного стресса, вызванного действием ионов меди, на содержание фотосинтетических пигментов в трансгенных растениях табака с гетерологичным геном hmg1, встроенным в различных ориентациях по отношению к промотору. Ген hmg1 играет ключевую роль в цитоплазматическом синтезе изопреноидов растений. Показано, что в листьях смысловых форм трансгенных растений табака с повышенным уровнем экспрессии гена hmg1 происходила меньшая деструкция фотосинтетических пигментов после стрессового воздействия по сравнению с контрольными растениями. В то же время, в трансгенных линиях табака с антисмысловой формой гена hmg1 наблюдалось усиление разрушающего действия стрессора. Полученные результаты указывают на роль изопреноидных соединений мевалонатного пути биосинтеза в защите пигментного комплекса растительных клеток от окислительного стресса, вызванного тяжелыми металлами. Материалы исследования могут быть использованы при создании растений с устойчивостью к действию тяжелых металлов.

Ключевые слова: ген hmg1, мевалоновая кислота, фотосинте-тические пигменты, ионы меди, окислительный стресс, трансгенные растения, ШсоЫаиа tabacum Ь., антисмысловые РНК.

Введение

Устойчивость растений к стрессовым факторам определяется рядом физиологических процессов, среди которых наиболее важными являются функционирование мембранных структур клетки, активность систем антиоксидантной защиты, способных обезвреживать образующиеся

* Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента России МК 881.2010.4, гранта РФФИ № 09-04-00980 и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» ГК № П 1301.

в результате стресса активные формы кислорода (АФК), а также гормональная регуляция антистрессовых программ. Успешность работы всех этих защитных механизмов связана с экспрессией множества генов. При этом значительный интерес как для фундаментальных, так и для прикладных исследований имеет установление роли отдельных генов в реакциях растительных клеток при стрессах. Удобным инструментом в этих исследованиях является методология генетической инженерии растений, позволяющая подавлять или активировать экспрессию единичных генов.

В цитоплазме растений существует ацетатно-мевалонатный путь биосинтеза изопреноидных соединений, через который синтезируются такие вещества как сесквитерпены, стерины мембран, брассиностероиды, цитокинины. Ключевым этапом, лимитирующим синтез этих соединений, является образование мевалоновой кислоты. Реакция катализируется ферментом 3-окси-3-метилглутарил-КоА редуктазой, который кодируется геном Ншд1. Уровень экспрессии этого гена влияет на содержание изопреноидных соединений цитоплазматического пути биосинтеза. Важной функцией стеринов мембран является их участие в стабилизации мембран и формировании ее жесткой структуры, что существенно для устойчивости растений к стрессорам [1, 2]. Как известно, цитокинины и брассиностероиды являются фитогормонами, регулирующими адаптационные программы растений при разных видах стрессового воздействия [3, 4]. Считается, что сесквитерпены могут служить низкомолекулярными антиоксидантами [5].

Целью нашей работы было изучение влияния уровня экспрессии гена 1т,шд1 в реакциях пигментного комплекса трансгенных растений табака на окислительный стресс, вызванный ионами меди (II). Медь — важный микроэлемент, необходимый для нормальной жизнедеятельности растений и функционирования цепи электронного транспорта. Вместе с тем, это тяжелый металл с переменной валентностью, в высоких дозах токсичный для клеток [6]. Загрязнение окружающей среды соединениями меди в настоящее время является серьёзной проблемой для многих промышленных территорий. Избыток соединений меди приводит к несбалансированному образованию АФК и окислительному стрессу растений. В предыдущих исследованиях нами показано, что трансгенные растения табака со смысловой формой встроенного гена 1т,шд1 обладали повышенным уровнем антиоксидантной активности при действии абиотического стресса, вызванного ионами меди [7]. Данная работа является продолжением начатых ранее исследований роли гена 1т,шд1 в реакциях устойчивости растений к тяжелым металлам.

Материалы и методы

Исследование проводили на трансгенных растениях табака ШсоЫаиа ЬаЪасиш Ь. сорта Самсун, содержащих гетерологичный ген Ншд1 из АгаЫйорв18 ЬНаИаиа (Ь.) НеуИп., в прямой (смысловые формы) и обратной

(антисмысловые формы) ориентациях относительно конститутивного вирусного промотора CaMV 35SS [8]. В работе использовали три линии растений со смысловой формой гена hmgl (С1, С2, С4), две линии с антисмысловой формой, в которых для ингибирования гена hmgl применена стратегия антисмысловых РНК (А1 и А2), и контрольную линию табака (К). Растения размножали в асептических условиях на среде MC в термостатной комнате при фотопериоде 16/8 ч (день/ночь) и температуре 25°С. В возрасте один месяц растения пересаживали в закрытый грунт в горшки объемом 7 л. Исследование выполняли на высечках (d=5 мм) листьев среднего яруса растений табака, растущих два месяца в условиях теплицы. Листовые диски инкубировали на поверхности раствора сульфата меди (100 мкМ) или дистиллированной воды в течение 20 ч.

Фотосинтетические пигменты извлекали из гомогенизированных тканей листа холодным 80%-ным ацетоном в присутствии СаСОз. Содержание хлорофиллов a, b и каротиноидов определяли на спектрофотометре «Apel» UV-303 (США), рассчитывая по оптической плотности при 665, 649 и 470 нм по стандартным формулам [9].

Для работы использовали усредненную пробу, полученную из 8-12 листьев, отобранных с 3-4 растений одного возраста. Экстракцию проводили в трех повторностях. На рисунках и в таблице результаты представлены в виде средних значений и ошибки среднего. Достоверность отличий определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Statistica 6.0 или MS Excel 2007.

Результаты и обсуждение

Листовые высечки всех линий после воздействия стрессора фенотипически не отличались между собой, а также от варианта, инкубированного на поверхности воды (не было признаков некроза или хлороза). Анализ содержания фотосинтетических пигментов показал, что растения трансгенных линий и контрольные растения по-разному реагируют на действие ионов меди. При этом реакция трансгенных линий табака зависела от ориентации встроенного гена hmgl относительно промотора.

Известно, что медь является одним из наиболее токсичных тяжелых металлов, оказывающих отрицательное воздействие на пигментный комплекс высших растений даже при небольших концентрациях [6, 10]. В наших опытах ионы меди негативно влияли на пигментные системы контрольных растений, что заключалось в деструкции хлорофиллов (снижение на 8%) и каротиноидов (уменьшение на 14%), по сравнению с эксплантами, инкубированными на поверхности воды (рис. 1 а, б).

В трансгенных растениях с подавлением экспрессии гена hmgl (линии А1 и А2) наблюдали более заметные повреждения пигментного комплекса — деструкция хлорофиллов составляла 11-20%, а каротиноидов — 16-28%.

В смысловых формах растений с повышенным синтезом мевалоната (линии С1, С2, С4) негативное воздействие ионов меди на пигментные комплексы хлоропластов было снижено. Содержание хлорофиллов при стрессе увеличивалось на 5-16%, в сравнении с вариантом, инкубированным на воде, тогда как количество каротиноидов снижалось на 7% в линии С1 или повышалось на 7-17% в линиях С2 и С4, соответственно (рис. 1 а, б).

Таким образом, обнаружен положительный эффект повышенной экспрессии гена hmgl на устойчивость пигментного комплекса к окислительному стрессу, вызванному ионами меди. В листьях трансгенных растений табака со смысловой формой гена hmgl негативное влияние ионов меди было выражено в меньшей степени и даже наблюдали стимулирование биосинтеза пигментов. Подавление экспрессии данного гена приводило к более сильной деструкции фотосинтетических пигментов в трансгенных линиях, чем в контроле.

Рис. 1. Содержание фотосинтетических пигментов в листьях трансгенных растений табака при инкубации на воде (белый цвет) и после обработки 100 мкМ сульфатом меди в течение 20 ч (серый цвет). а — содержание суммы хлорофиллов (a + b); б — содержание каротиноидов - Различия между вариантами на воде и на сульфате меди достоверны при р < 0, 05

*

Важным показателем устойчивости пигментного комплекса к стрессу является не только содержание пигментов в тканях листа, но и их

соотношение. Например, для хлорофиллов, отношение a/b достаточно постоянно и составляет 2,0-2,5 [9]. Изменение данного параметра может свидетельствовать о нарушении в работе фотосистем I и II (ФС I и II). Для листьев всех линий исследованных растений этот показатель в нормальных условиях (на воде) достоверно не менялся (таблица). При стрессе соотношение хлорофиллов a/b в контроле и в линиях С1, С2, С4 так же достоверно не менялось и составляло 2,1-2,16. Между тем, в линиях А1 и А2 этот показатель достоверно снижался, что может свидетельствовать о негативном влиянии подавления синтеза мевалоната на работу ФС I и ФС II под действием ионов меди.

Таблица 1

Соотношение фотосинтетических пигментов в листьях трансгенных

растений табака

Линия Хлорофилл a/b Хлорофиллы/каротиноиды

вода 100 мкМ CuSO4 вода 100 мкМ CuSO4

Контроль 2, 2О і О, ОБ 2, ^ і 0, ОТ б, 4б і 0, 1Б б, 92 і 0, 21

А1 2, ll і 0,02 l, 9б і 0, Об * б, б1 і 0,1Б Т, 00 і 0, 29

А2 2, ОЗ і О, О4 l, 93 і 0, 09 * б, Т2 і 0,1Б Т, 4Б і 0, 2б

С1 2, ll і 0, ll 2, ll і 0, Об б, ТБ і О, 29 б, ТТ і 0,14

С2 2, l8 і 0, ОБ 2, ll і 0, 02 Т, 22 і О, ОБ Т, 1б і 0, 04

С4 2, l0 і 0,03 2,09 і 0, ОБ Т, 01 і 0, ОБ б, 90 і 0,12

* — Различия между вариантами на воде и на сульфате меди достоверны при р < < О, ОБ.

Известно, что соотношение фотосинтетических пигментов — хлорофиллов и каротиноидов так же является достаточно стабильным показателем. Под действием ионов меди в контрольных растениях произошло незначительное увеличение данного индекса (с б,4б до б,92). Отношение хлорофиллов к каротиноидам для линий со смысловой формой гена hmgl не изменилось (таблица). В линиях растений с подавленным синтезом мевалоната увеличение этого параметра было более сильным (в среднем на 9%). Эти данные могут свидетельствовать о том, что линии А1, А2, а также контроль подвергались более сильному стрессу, чем линии С1, С2, С4 (таблица). В контрольной и антисмысловых линиях растений деструкция каротиноидов происходила значительно сильнее, чем хлорофиллов, что может указывать на их расходование в качестве антиоксидантов для тушения АФК, образующихся в ответ на действие ионов меди.

Протекторное действие экспрессии гена hmgl в трансгенных растениях табака со смысловой формой гена может быть связано с увеличением «жесткости» мембран за счёт возрастания в них количества стеринов, что обнаружено нами ранее [В, 11]. При воздействии на эти растения

гербицида параквата происходило увеличение в них синтеза сесквитерпенов, что также является ответной реакцией на окислительный стресс (Орлова И.В., неопубликованные данные). Важным фактором устойчивости растений табака со смысловой копией гена hmgl служит их повышенный антиоксидантный статус в условиях стресса, что выявлено нами ранее [7]. Кроме того, можно предположить, что в этих растениях увеличилось содержание фитогормонов изопреноидной природы, а именно брассиностероидов и цитокининов, обладающих иммуномодулирующим и стрессопротекторным действием [3, 4]. Изменение содержания стеринов в мембранах клеток таких растений также могло привести к модификации их чувствительности к действию гормонов [1].

Заключение

Изучено влияние гена hmgl, играющего ключевую роль в цитоплазматическом синтезе изопреноидов, на пигментный комплекс трансгенных растений табака с модифицированной экспрессией этого гена в ответ на действие ионов меди (II).

Показано, что обработка листовых высечек раствором сульфата меди (100 мкМ) в течение 20 ч негативно сказывалась на пигментном комплексе контрольных листьев табака. Происходила деструкция хлорофиллов и снижение содержания каротиноидов.

При использовании стратегии антисмысловых РНК происходило подавление экспрессии гена hmgl и снижение синтеза мевалоната в клетках трансгенных линий табака А1 и А2. Это привело к более заметным изменениям пигментного комплекса при стрессе — большей деструкции хлорофиллов и каротиноидов, изменению соотношений хлорофилов a/b и хлорофиллы/каротиноиды.

Усиление биосинтеза мевалоната за счёт введения дополнительной копии гетерологичного гена hmgl под контролем сильного вирусного промотора в смысловых линиях растений снижало негативное действие ионов меди на пигментный комплекс, а также стимулировало биосинтез пигментов.

Наблюдаемые явления можно объяснить изменением содержания стеринов в мембране, о чём свидетельствуют полученные нами ранее данные. Кроме того, можно предположить наличие модификаций в синтезе сесквитерпенов, играющих антиоксидантную роль в клетках, а также в содержании фитогормонов брассиностероидов и цитокининов, синтез которых начинается с мевалоновой кислоты.

Список литературы

1. Пасешниченко B.A. Терпеноиды и стероиды в жизни растений // Успехи

биологической химии. 1991. T.32. C.197-221.

2. Hall J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance // J.

Exp. Bot. 2002. V.53. P.1-11.

3. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и её регуляция. Уфа: Гилем, 2001. 160 с.

4. Khripach V., Zhabinskii V., de Groot A. Twenty years of brassinosteroids: steroidal plant hormones warrant better crops for the XXI century // Ann. Bot. 2000. V.86, №3. P.441-447.

5. A unified mechanism of action for volatile isoprenoids in plant abiotic stress / C.E. Vickers [et al.] // Nat. Chem. Biol. 2009. V.5, №5. P.283-290.

6. Copper toxicity in leaves of Elodea canadensis Michx. / P. Malec [et al.] // Bull. Environ. Contamination a. Toxicology. 2009. V.82. P.627-632.

7. Реакции трансгенных растений табака с геном hmgl на биотический и

абиотический стрессы / А.А. Ермошин [и др.] // Физиолого-биохимические основы продукционного процесса у культивируемых растений: матер.

Всероссийского симпозиума с международным участием, посвященного 85-летию со дня рождения В.А. Кумакова. Саратов, 2010. С.30-32.

8. Фенотипические изменения трансгенных растений табака с антисмысловой формой гена hmgl / В.А. Поройко [и др.] // Генетика. 2000. Т.36. С.1200-1205.

9. Гавриленко В.Ф. Большой практикум по фотосинтезу. М.: Издательский центр «Академия», 2003. 256 с.

10. Khripach V., Zhabinskii V., de Groot A. Twenty years of brassinosteroids: steroidal plant hormones warrant better crops for the XXI century // Ann. Bot. 2000. V.86, №3. P.441-447.

11. Малева М.Г., Некрасова Г.Ф., Безель В.С. Реакция гидрофитов на загрязнение среды тяжелыми металлами // Экология. 2004. №4. С.266-272.

12. Исследование влияния гетерологичного гена hmgl на мезоструктуру листа и устойчивость трангенных растений табака к Pseudomonas syringae / А.А. Ермошин [и др.] // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2011. №2(14). С.46-55.

Ермошин Александр Анатольевич (ermosh@e1.ru), аспирант, ассистент, кафедра физиологии и биохимии растений, Уральский Федеральный университет им. Б.Н. Ельцина, Институт естественных наук, Екатеринбург.

Малёва Мария Георгиевна (maria.maleva@mail.ru), к.б.н., ассистент, кафедра физиологии и биохимии растений, Уральский Федеральный университет им. Б.Н. Ельцина, Институт естественных наук, Екатеринбург.

Чукина Надежда Владимировна (nady_dicusar@mail.ru), к.б.н., ассистент, кафедра физиологии и биохимии растений, Уральский Федеральный университет им. Б.Н. Ельцина, Институт естественных наук, Екатеринбург.

Алексеева Валерия Витальевна (lera@fibkh.serpukhov.su), к.б.н., научный сотрудник, лаборатория биотехнологии растений, Филиал УРАН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Пущино.

Рукавцова Елена Борисовна (ruk@fibkh.serpukhov.su), д.б.н., старший научный сотрудник, лаборатория биотехнологии растений, Филиал УРАН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Пущино.

Бурьянов Ярослав Иванович (chepurnovama@rambler.ru), д.б.н., профессор, зав. лабораторией, лаборатория биотехнологии растений, Филиал УРАН института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина, Ю.А. Овчинникова, Пущино.

The role of modified expression of hmgl gene in resistance of transgenic tobacco plants to copper ions

A. A. Ermoshin, M.G. Maleva, V. V. Alekseeva, N.V. Chukina,

E. B. Rukavtsova, Ya. I. Buryanov

Abstract. The influence of oxidative stress caused by copper ions on the content of photosynthetic pigments was studied in transgenic tobacco plants with heterologous hmg1 gene in different orientations towards the promoter. The hmg1 gene plays a key role in isoprenoid biosynthesis in plant cytoplasm. It was shown that in leaves of sense forms of transgenic tobacco plants with higher level of hmgl gene expression less destruction of photosynthetic pigments occurred after stress compared with the control plants. At the same time in transgenic lines of tobacco plants with antisense form of the hmgl gene destructive stress effect was increased. The results indicate a role of mevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis in protection of the pigment complex of plant cells from oxidative stress caused by heavy metals. The study may be useful in obtaining of plants with resistance to heavy metals.

Keywords: hmg1 gene, mevalonic acid, photosynthetic pigments, copper ions, oxidative stress, transgenic plants, Nicotiana tabacum L., antisense RNA.

Ermoshin Alexander (ermosh@e1.ru), postgraduate student, assistant, department of plant physiology and biochemistry, Yeltsin Ural Federal University, Institute of Natural Sciences, Ekaterinburg.

Maleva Maria (maria.maleva@mail.ru), candidate of biological sciences, assistant, department of plant physiology and biochemistry, Yeltsin Ural Federal University, Institute of Natural Sciences, Ekaterinburg.

Chukina Nadezhda (nady_dicusar@mail.ru), candidate of biological sciences, assistant, department of plant physiology and biochemistry, Yeltsin Ural Federal University, Institute of Natural Sciences, Ekaterinburg.

Alekseeva Valeriya (lera@fibkh.serpukhov.su), candidate of biological sciences, research assistant, plant biotechnology laboratory, Branch of Shemyakin & Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAS, Pushchino.

Rukavtsova Elena (ruk@fibkh.serpukhov.su), doctor of biological sciences, senior research assistant, plant biotechnology laboratory, Branch of Shemyakin & Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAS, Pushchino.

Buryanov Yaroslav (chepurnovama@rambler.ru), doctor of biological sciences, professor, head of laboratory, plant biotechnology laboratory, Branch of She-myakin & Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAS, Pushchino.

Поступила 21.09.2011