НОСИТЕЛЬ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК

Полезная модель относится к биотехнологии, а более конкретно к технологическим процессам культивирования животных и растительных клеток на искусственных носителях, получения клеточной биомассы, образцов тканей и производства биологически активных веществ для их использования в медицине, ветеринарии, фармакологии, вирусологии, клеточной биологии, животноводстве и растениеводстве.
Методы клеточной биологии находят все большее распространение в различных областях современных фундаментальных и прикладных исследований. Одним из наиболее используемых является метод культивирования клеток человека, животных и растений. В настоящее время можно культивировать клетки практически всех тканей и органов человека, животных и растений. Культивирование клеток становится основой современных наукоемких технологий в биотехнологии и медицине, например, в биотехнологии - получение биологически активных веществ растительного и животного происхождения, вакцин, диагностикумов; в медицине - заместительная клеточная терапия, позволяющая восстанавливать поврежденные ткани путем трансплантации нормальных здоровых клеток человека, выращенных in vitro, производство моноклональных антител из гибридомных клеток. В наши дни в промышленных масштабах в биореакторах с помощью клеток животных и человека налажено производство многочисленных вакцин и диагностикумов, производство инсулина, интерферона, фактора свертывания крови, эритропоэтина, ферментов, и др. препаратов. С развитием метода культур тканей увеличивается число областей, где используется данный метод.
Выращивание фрагментов органов и тканей с определенными свойствами для нужд медицины, получение клеточной биомассы для производства биомедицинской продукции, накопление каллусной ткани для микроклонального размножения растений является сложным процессом, требующим обеспечения и поддержания в течение длительного времени условий, необходимых для роста клеток. Одной из важных задач является правильный выбор носителя (субстрата). Клетки, размещенные на носителе, живут в организме значительно дольше, чем клетки, просто введенные в ткань, эффективность трансплантации при этом возрастает. Для создания носителей используют разные материалы: графит, полимеры, керамику, металлы и их сплавы, в частности, пористый никелид титана, нержавеющую сталь, кобальт-хромовые сплавы. При всех своих достоинствах, эти материалы могут вызывать сильное воспаление и некроз клеток, ионы никеля обладают канцерогенной активностью, а ионы хрома проникают в клетки и повреждают ДНК. Кроме того, к субстрату предъявляются комплексные требования по биосовместимости, способности выдерживать внешние воздействия, связанные со стерилизацией, температурными и влажностными условиями в которых происходит рост клеток, а также воздействию различного рода облучений (рентгеновского, ультрафиолетового и др.), которые используются в экспериментальных и технологических работах. Поэтому задача создания эффективных носителей для роста клеток является на сегодняшний день весьма актуальной.
Известен носитель для роста клеток, описанный в патенте США №7358029 (2008 г., кл. C12N 5/00), который выполнен из комбинации гидрофобных и гидрофильных полимерных смол, т.е. органических полимеров на основе углерода. В качестве таких смол могут быть использованы полиакриламиды, в том числе модифицированные ультрафиолетовым облучением. Носитель изготавливается в виде пластины или гранул размером более 1 мм.
Недостатками известного носителя является недостаточно высокая биосовместимость используемых в составе материала носителя смол: как известно, все полимеры претерпевают процессы деструкции с выделением низкомолекулярных продуктов, воздействующих на рост клеточных структур, что не обеспечивает адекватность получаемых биологических материалов, особенно в условиях, сопряженных с внешними воздействиями при росте клеток. Кроме того, относительно невысокая температурная стабильность и низкая прочность полимеров создают сложности при использовании известного носителя, т.к. требуют поддержания жестко контролируемых условий при стерилизации и условий роста клеток для недопущения деструкции полимера.
Задачей полезной модели является создание носителя, обладающего хорошей биосовместимостью, в сочетании с высокой термической стабильностью и устойчивостью к воздействию внешних факторов.
Поставленная задача решается тем, что носитель для культивирования клеток выполнен из наноструктурного углеодного композиционного материала с содержанием углерода более 98%масс, состоящего из углеродных волокон, связанных наноструктурным углеродным связующим, полученным термическим разложением газообразных углеводородов. Объемное содержание углеродных волокон в материале носителя составляет 20-50%об.
Содержание углерода в носителе менее 98%масс. нецелесообразно, т.к. высокое содержание других элементов в этом случае приводит к понижению термической устойчивости материала и возможности выделения из него низкомолекулярных веществ.
Носители с содержанием углеродных волокон менее 20%об. не обладают достаточной прочностью, получение материалов с содержанием углеродных волокон более 50%об. технологически сложно.
Является предпочтительным наличие в носителе пористости 4-15% об., которая повышает адгезию клеток на носителе, а также обеспечивает возможность передачи через пористую структуру питательной среды, необходимой для культивирования клеток.
3
2
Сущность изобретения состоит в следующем. Носитель, предлагаемый в данном техническом решении, практически полностью состоит из углерода. Экспериментально установленная нами высокая биосовместимость носителя позволяет культивировать на нем различные типы клеток. Высокая химическая инертность - абсолютная устойчивость углеродного носителя в кислотах, щелочах, органических средах - позволяет клеткам формировать трехмерные тканеподобные структуры, гарантируя отсутствие воздействия на рост клеток каких-либо химических компонентов, выделяющихся на поверхности субстрата под воздействием внешних факторов или продуктов метаболизма клеток. Сам носитель имеет гетерогенную структуру, которая сформирована углеродными волокнами и углеродной связкой, связывающей углеродные волокна в единый композит. Содержание углеродных волокон в носителе 20-50%об. Структура связующего сформирована графитоподобными фрагментами размером менее 30 нм. Следует отметить, что структура углерода в углеродных волокнах и углеродной связке различна. Это связано с особенностями их получения. Углеродные волокна являются продуктом высокотемпературной обработки (карбонизации и последующей графитации) полимеров (полиакрилонитрил, вискоза и др.), тогда как углеродное связующее сформировано путем высокотемпературного разложения газообразных углеводородов. Различные методы получения обеспечивают различие в содержании углеродных атомов с разной гибридизацией валентных электронов (sp, sp, sp) в структуре волокон и связующего. Гетерогенная структура материала обеспечивает хорошую адгезию растущих клеток на поверхности материала. Это связано с возможностью клеток к локализации на поверхности тех или иных фрагментов структуры, а также на границе раздела углеродных фаз. Адгезия дополнительно усиливается в случае применения носителей с пористостью 4-15%об. Кроме того, пористость носителя может быть использована для подачи растущим клеткам необходимой питательной среды.
Следует отметить высокую термическую стойкость носителя. Он способен выдерживать температуру более 2000°С. Это позволяет многократно использовать носитель в различных процессах, обеспечивая гарантированное удаление предыдущих биологических продуктов обработкой при высоких температурах.
Следующий пример характеризует сущность предлагаемого изобретения:
Носитель для культивирования клеток имеет форму круглой пластины (диска) диаметром 20 мм и толщиной 3 мм. Носитель состоит из углеродных волокон (объемное содержание 28%об.) и наноструктурного углеродного связующего. Пористость носителя - 8%об. Носитель получен путем сборки заготовки из углеродных жгутов в четырех направлениях (три из которых лежат в одной плоскости и образуют угол 60° друг по отношению к другу, а четвертое - ортогонально первым трем) и последующего формирования в заготовки углеродного связующего. Формирование связующего проводят из газообразных углеводородов - метана - при температуре 1000°С до обеспечения указанной выше пористости. Определенный методом дифракции рентгеновских лучей размер графитоподобных фрагментов (областей когерентого рассеяния рентгеновский лучей) составляет 5 нм.
2
2
Носитель использовали для культивирования человеческих фибробластов. Образцы стерилизовали автоклавированием при 121°С в течение 20 мин и помещали в полистироловые чашки Петри диаметром 35 мм (“Nunc”, Дания). В чашки вносили суспензию фибробластов с концентрацией 105 кл/мл в среде DMEM (“Gibco”, Англия) с 10% сыворотки плода коровы (“Gibco”, Англия), 50 мкг/мл гентамицина и инкубировали в СО-инкубаторе с содержанием CO 5% в течение 5 суток до формирования конфлуентного монослоя в контроле.
По окончании инкубации из чашек удаляли питательную среду, клетки отмывали 0,15М NaCl и фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида в течение 10 мин при температуре +4°С. После фиксации клетки трижды отмывали дистиллированной водой и в течение 10 мин инкубировали в растворе бромистого этидия. Клетки изучали в ультрафиолете с помощью люминесцентного микроскопа Leica DM1000.
Было показано, что фибробласты равномерно распределяются по всей поверхности, легко прикрепляются к субстрату и, проникая в микропоры, образуют трехмерные структуры. Фибробласты сохраняли жизнеспособность на протяжении всего периода культивирования.
После этого носитель обрабатывали в среде аргона при температуре 800°С, что позволило полностью удалить клеточный детрит. Носитель повторно использовали для культивирования фибробластов по описанной выше методике и было показано, что обработка не сказалась на его свойствах.
Таким образом, применение предлагаемой полезной модели обеспечивает возможность эффективного культивирования клеток различного типа, использовать носитель для формирования тканеподобных трехмерных клеточных структур, а также легко удалять выросшие клетки ферментативным путем и производить стерилизацию носителя путем высокотемпературных воздействий. Последнее важно для обеспечения экологии и безопасности здоровья.