ОЧИСТКА АНТИТЕЛ С ПОМОЩЬЮ КАТИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
PURIFICATION OF ANTIBODIES WITH CATION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 60/983825, поданной 30 октября 2007, которая во всей своей полноте и во всех целях включена в настоящее описание посредством ссылки.
Предшествующий уровень техники
Область, к которой относится изобретение
В общих чертах, настоящее изобретение относится к очистке белка. В частности, настоящее изобретение относится к способу выделения антитела из композиции, содержащей это антитело и по меньшей мере одно примесное вещество, с помощью катионообменной хроматографии, где перед элюированием нужного антитела с использованием элюирующего буфера с повышенной проводимостью проводят стадию промывки при высоком рН для удаления примесных соединений.
Описание прототипов
Осуществление крупномасштабной и экономически выгодной очистки белков становится все более серьезной проблемой для специалистов по промышленной биотехнологии. Обычно белки продуцируют в клеточной культуре с использованием эукариотических или прокариотических клеточных линий, сконструированных для продуцирования представляющего интерес белка путем встраивания в эти клетки рекомбинантной плазмиды, содержащей ген, кодирующий данный белок. Поскольку обычно используемыми клетками являются живые организмы, то они должны быть культивированы в комплексной культуральной среде, содержащей сахара, аминокислоты и факторы роста, источниками которых обычно являются препараты сыворотки животных. Выделение нужного белка из смеси соединений, содержащихся в среде для культивирования клеток, и его отделение от побочных продуктов самих клеток для очистки, которая была бы достаточной для его введения человеку в терапевтических целях, являются серьезной проблемой для специалистов.
Выбор процедуры очистки белков от клеточного дебриса зависит от участка экспрессии данного белка. Некоторые белки могут секретироваться непосредственно из клеток в окружающую культуральную среду, а другие белки могут оставаться внутри клеток. Что касается последних белков, то первая стадия способа очистки включает лизис клеток, который может быть осуществлен различными методами, включая приложение механических усилий, осмотический шок или обработку ферментами. Такая дизрупция приводит к высвобождению всего содержимого клеток с образованием гомогената и, кроме того, приводит к продуцированию субклеточных фрагментов, которые трудно поддаются удалению из-за их малого размера. Эти фрагменты обычно удаляют путем дифференциального центрифугирования или фильтрации. Аналогичные проблемы, хотя и в меньшей степени, возникают при очистке непосредственно секретирующихся белков, что обусловлено естественной гибелью клеток и высвобождением внутриклеточных белков клеток-хозяев в процессе продуцирования белка.
После получения осветленного раствора, содержащего представляющий интерес белок, его отделение от других белков, продуцируемых клеткой, обычно осуществляют с применением комбинации различных хроматографических методов. Такие методы позволяют разделять смеси белков по их заряду, степени гидрофобности или размеру. В каждом из этих методов применяются несколько различных хроматографических смол, что позволяет точно разработать схему очистки для каждого конкретного белка. Принцип каждого из этих методов разделения заключается в том, что белки могут двигаться вниз по колонке с различными скоростями, в результате чего происходит физическое разделение, которое улучшается по мере их дальнейшего продвижения вниз по колонке, либо эти белки могут селективно связываться со средой для разделения, а затем дифференциально элюироваться различными растворителями. В некоторых случаях, нужный белок отделяют от примесей, если эти примеси специфически связываются с колонкой, а представляющий интерес белок не связывается с этой колонкой, то есть если такой представляющий интерес белок присутствует в «свободнотекучей форме».
Ионообменная хроматография представляет собой хроматографический метод, обычно применяемый для очистки белков. При ионообменной хроматографии, заряженные участки на поверхности растворенного вещества притягиваются под действием противоположно заряженных ионов, присоединенных к хроматографической матрице, при условии, что окружающий буфер имеет низкую ионную силу. Элюирование обычно достигается путем увеличения ионной силы (то есть проводимости) буфера для создания конкуренции за связывание заряженных участков ионообменной матрицы с растворенным веществом. Элюирование растворенного вещества может быть достигнуто другим способом, а именно путем изменения pH и тем самым изменения заряда растворенного вещества. Изменение проводимости или рН может быть плавным (градиентное элюирование) или ступенчатым (постадийное элюирование). В ранее применяемых методах такие изменения были постоянными, то есть pH или проводимость только увеличивали или только снижали.
В патентах США №№ 6339142, 6417355, 6489447 и 7074404 (Basey et al.) описана ионообменная хроматография, применяемая для очистки полипептидов. В патентах США №№ 6127526, 6333398 и 6797814 (Blank, G.) описана очистка белков, таких как анти-HER2 антитела, с помощью хроматографии на белке А. Методы очистки белков, таких как антитела, с помощью ионообменной хроматографии описаны в публикации заявки на патент США № 2004/0082047.
Патент США № 5110913 относится к очистке антитела в водном растворе посредством связывания антитела с ионообменной смолой при первом рН 4,6, промывки при втором рН 5,5 и элюирования антитела при pH 6,5, где ионная сила растворов этих трех стадий остается постоянной. Публикация Zhang и др. относится к анионообменной хроматографии человеческого антитела на Q-мембране (Zhang et al. "Q Membrane Chromatography Application for Human Antibody Purification Process", Poster presented at BioProduction, Oct. 26-27. Munich, Germany, 2004). Другими публикациями, относящимися к очистке белков, являются публикации: Barnthouse et al. J. Biotech. 66:125-136 (1998); Blank et al. Bioseparation 10:65-71 (2001); Follman and Fahrner, J. Chromatog. 1024:79-85 (2004); Iyer et al. BioPharm. 15(1):14-16, 18, 20, 53 (2002); заявка на патент США 2004/0082047A1; EP 333574; EP 460426 Bl; EP 556083; WO 89/05157; WO 92/22653; WO 93/06217; WO 95/22389; WO 96/33208; WO 96/40883; патенты США №№ 4753894; 4966851; 5110913; 5112951; 5115101; 5118796; 5169774; 5196323; 5256769; 5279823; 5429746; 5451662; 5525338; 5677171; 6005081; 6054561; 6127526; 6267958; 6339142; 6417335; 6489447; Adachi et al., Journal of Chromatography. A. 763(l-2):57-63 (Feb 28, 1997); Gagnon, P., Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Tucson: Validated Biosystems, Inc., Chapter 4, pps. 57-86 (1996); Graf et al., Bioseparation 4(1):7-20 (Feb 1994); Mhatre et al., Journal of Chromatography. A. 707(2):225-231 (Jul 21, 1995); Neidhardt et al., Journal of Chromatography. 590(2):255-261 (1992); Protein Purification Applications - A Practical Approach, Harris and Angal, IRL Press, pps.151-156 (1995); Sofer et al. Handbook of Process Chromatography: A Guide to Optimization, Scale-up, and Validation, San Diego: Academic Press pps.65-80 (1997); Tishchenko et al., Journal of Chromatography. B. 706(l):157-166 (Feb 27, 1998).
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к улучшенному способу катионообменной хроматографии антител, в котором проводят стадию промывки при высоком рН для удаления примесных соединений с последующим элюированием нужного продукта антитела. Такой способ, среди прочих других преимуществ, позволяет более эффективно удалять примеси белков яичника китайского хомячка (CHOP).
В своем первом аспекте, настоящее изобретение относится к способу выделения антитела из композиции, содержащей антитело и по меньшей мере одно примесное соединение, где указанный способ включает последовательные стадии:
(a) загрузки композиции на катионообменный материал, где указанная композиция имеет значение первого pH;
(b) промывки катионообменного материала первым промывочным буфером при pH, значение которого превышает значение рН композиции (a), где pH первого промывочного буфера составляет от приблизительно 6,8 до приблизительно 9,0;
(c) промывки катионообменного материала вторым промывочным буфером при pH, значение которого меньше значения рН первого промывочного буфера;
(d) элюирования антитела из катионообменного материала элюирующим буфером, проводимость которого значительно превышает проводимость второго промывочного буфера.
Предпочтительно указанное антитело, такое как ритуксимаб, связывается с человеческим CD20, либо указанное антитело, такое как бевацизумаб, связывается с человеческим фактором роста эндотелия сосудов (VEGF).
В одном из своих предпочтительных вариантов, настоящее изобретение относится к способу выделения антитела, которое связывается с человеческим CD20, из композиции, содержащей антитело и одно или несколько примесных соединений, выбранных из группы, состоящей из белков яичника китайского хомячка (CHOP), элюированного (leached) белка A, ДНК и агрегированного антитела к CD20, где указанный способ включает последовательные стадии:
(a) загрузки композиции на катионообменный материал, где указанная композиция имеет значение pH от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,0;
(b) промывки катионообменного материала первым промывочным буфером при pH от приблизительно 6,8 до приблизительно 9,0;
(c) промывки катионообменного материала вторым промывочным буфером при pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0;
(d) элюирования антитела из катионообменного материала элюирующим буфером, имеющим pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0 и проводимость от приблизительно 10 до приблизительно 100 мСм/см. Предпочтительным анти-CD20 антителом является ритуксимаб.
В другом своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к способу выделения антитела, которое связывается с человеческим фактором роста эндотелия сосудов (VEGF), из композиции, содержащей антитело и одно или несколько примесных соединений, выбранных из группы, состоящей из компонента среды для культивирования клеток, гарамицина, белков яичника китайского хомячка (CHOP), ДНК, вирусной примеси и агрегированного антитела к VEGF, где указанный способ включает последовательные стадии:
(a) загрузки композиции на катионообменный материал, где указанная композиция имеет значение pH от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,0;
(b) промывки катионообменного материала первым промывочным буфером при pH от приблизительно 6,8 до приблизительно 8,0;
(c) промывки катионообменного материала вторым промывочным буфером при pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0;
(d) элюирования антитела из катионообменного материала элюирующим буфером, имеющим pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0 и проводимость от приблизительно 10 до приблизительно 100 мСм/см. Предпочтительным анти-VEGF антителом является бевацизумаб.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей ритуксимаб в буфере, включающем примерно 25 мМ HEPES, при pH приблизительно 7,8.
Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей бевацизумаб в буфере, включающем примерно 25 мМ MOPS, при pH приблизительно 7,0.
Краткое описание чертежей
На фиг.1A и 1B представлены аминокислотные последовательности тяжелой цепи (SEQ ID NO:1) и легкой цепи (SEQ ID NO:2) антитела ритуксимаба. Каждая из каркасных областей (FR1-4) и каждая из гипервариабельных областей (CDR) (CDR1-3) в каждой вариабельной области были идентифицированы как константная последовательность человеческой тяжелой цепи гамма 1 и константная последовательность человеческой легкой цепи каппа. Вариабельная область тяжелой цепи (VH) представлена в SEQ ID NO:3. Вариабельная область легкой цепи (VL) представлена в SEQ ID NO:4. Идентификаторами последовательности для CDR являются: CDR H1 (SEQ ID NO:5), CDR H2 (SEQ ID NO:6), CDR H3 (SEQ ID NO:7), CDR L1 (SEQ ID NO:8), CDR L2 (SEQ ID NO:9) и CDR L3 (SEQ ID NO:10).
На фиг.2A и 2B представлены аминокислотные последовательности тяжелой цепи (SEQ ID NO:11) и легкой цепи (SEQ ID NO:12) антитела бевацизумаба. Конец каждой вариабельной области показан символом ║. Вариабельная область тяжелой цепи (VH) представлена в SEQ ID NO:13. Вариабельная область легкой цепи (VL) представлена в SEQ ID NO:14. Каждая из трех CDR в каждой вариабельной области подчеркнута. Идентификаторами последовательностей для CDR являются: CDR H1 (SEQ ID NO:15), CDR H2 (SEQ ID NO:16), CDR H3 (SEQ ID NO:17), CDR L1 (SEQ ID NO:18), CDR L2 (SEQ ID NO:19) и CDR L3 (SEQ ID NO:20).
На фиг.3 проиллюстрировано сравнение путем выравнивания белков клетки-хозяина, удаленных с применением улучшенного способа катионообменной хроматографии с использованием ритуксимаба, по сравнению с ранее применяемым способом. Этот новый способ позволяет достичь наилучшего удаления CHOP.
Подробное описание предпочтительного варианта изобретения
Определения
Используемые в данном описании численные интервалы или количества, перед которыми, при их указании, стоит слово «примерно», включают точно определенный интервал или точное численное количество.
Используемая в данном описании «композиция», предназначенная для очистки, включает представляющее интерес антитело и одно или несколько примесных соединений. Указанная композиция может быть «частично очищенной» (то есть она может быть подвергнута одной или нескольким стадиям очистки), либо она может быть получена непосредственно из клетки хозяина или организма, продуцирующего антитело (например, указанная композиция может содержать собранную жидкость для культивирования клеток).
Используемый в данном описании термин «полипептид» обычно означает пептиды и белки, имеющие примерно более чем десять аминокислот. Предпочтительным полипептидом является белок млекопитающего, примерами которого являются: ренин, гормон роста, включая человеческий гормон роста и бычий гормон роста; рилизинг-фактор гормона роста; паратиреоидный гормон; тиреотропный гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевый фактор и фактор фон Виллебранда; факторы, препятствующие свертыванию крови, такие как белок С; натрийуретический фактор предсердия; легочное поверхностно-активное вещество; активатор плазминогена, такой как активатор плазминогена урокиназного типа или активатор плазминогена, присутствующий в моче или в ткани человека (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; фактор некроза опухоли-альфа и бета; энкефалиназа; RANTES (хемокины, регулируемые при активации нормальных Т-клеток и экспрессируемые и секретируемые этими Т-клетками); человеческий макрофагальный воспалительный белок (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как альбумин человеческой сыворотки; мюллеровский ингибирующий фактор; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; пептид, ассоциированный с мышиным гонадотропином; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; IgE; цитотоксический антиген, ассоциированный с Т-лимфоцитами (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы гормонов или факторов роста; белок A или D; ревматоидные факторы; нейротропный фактор, такой как нейротропный фактор костной ткани (BDNF), нейротропин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6) или фактор роста нервных тканей, такой как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как фактор TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-I (IGF-I головного мозга), белки, связывающиеся с инсулиноподобным фактором роста (IGFBP); белки CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD19 и CD20; эритропоэтин; факторы остеогенеза; иммунотоксины; белок морфогенеза кости (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), например M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например IL-1 - IL-10; супероксид-дисмутаза; Т-клеточные рецепторы; белки поверхности мембраны; стимулятор гемолиза; вирусный антиген, такой как, например, фрагмент оболочки вируса ВИЧ; транспортные белки; хоминговые рецепторы; адрессины; регуляторные белки; интегрины, такие как CDl1a, CDl1b, CDl1c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; опухолеассоциированный антиген, такой как рецептор HER2, HER3 или HER4; и фрагменты и/или варианты любых вышеперечисленных полипептидов, а также антитела, включая фрагменты антител, связывающиеся с любым из вышеперечисленных полипептидов. Предпочтительным полипептидом является интактное антитело или фрагмент антитела, который связывается с человеческим CD20, например ритуксимаб; или интактное антитело или фрагмент антитела, например бевацизумаба, который связывается с человеческим фактором роста эндотелия сосудов (VEGF).
«Примесью» является вещество, отличающееся от нужного продукта антитела. Такими примесями являются, но не ограничиваются ими, компоненты клеток-хозяев, такие как белки яичника китайского хомячка (CHOP), элюированный белок A; нуклеиновая кислота; вариант, фрагмент, агрегат или производное нужного антитела; другой полипептид; эндотоксин; вирусные примеси; компоненты среды для культивирования клеток (например, гарамицин; GENTAMYCIN) и т.п.
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
Термин «катионообменный материал» означает твердую фазу, которая является отрицательно заряженной и имеет свободные катионы для обмена с катионами в водном растворе, проходящем поверх твердой фазы или через твердую фазу. Заряд может возникать в результате присоединения одного или нескольких заряженных лигандов к твердой фазе, например, посредством ковалентного связывания. Альтернативно или дополнительно, твердая фаза может иметь естественный заряд (например, как в случае двуокиси кремния, которая имеет суммарный отрицательный заряд). Коммерчески доступными катионообменными материалами являются карбоксиметилцеллюлоза, BAKERBOND ABX™, сульфопропил (SP), иммобилизованный на агарозе (например, SP-SEPHAROSE FAST FLOW, SP-SEPHAROSE FAST FLOW XL или SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE, поставляемые фирмой GE Healthcare), CAPTO S (GE Healthcare), FRACTOGEL-SO3, FRACTOGEL-SE HICAP и FRACTOPREP (EMD Merck), сульфонил, иммобилизованный на агарозе (например, S-SEPHAROSE FAST FLOW от GE Healthcare) и SUPER SP (Tosoh Biosciences). Предпочтительный используемый в данном описании катионообменный материал включает перекрестно-связанные полистиролдивинилбензольные растекающиеся частицы (твердая фаза), покрытые полигидроксилированным полимером, имеющим функциональные сульфопропильные группы (например, хроматографическая смола POROS 50 HS).
Термин «твердая фаза» означает безводную матрицу, с которой могут связываться один или несколько заряженных лигандов. Твердой фазой может быть колонка для очистки (включая, но не ограничиваясь ими, колонки со слоем пониженной плотности и с уплотненным слоем), дисперсная фаза дискретных частиц, мембрана или фильтр и т.п. Примерами веществ, используемых для образования твердой фазы, являются полисахариды (такие как агароза и целлюлоза) и другие механически стабильные матрицы, такие как двуокись кремния (например, стекло с регулируемым размером пор), полистиролдивинилбензол, полиакриламид, керамические частицы и производные любого из вышеуказанных веществ.
Используемый в данном описании термин «загрузка» означает композицию, нанесенную на катионообменный материал. Предпочтительно катионообменный материал уравновешивают уравновешивающим буфером, а затем загружают очищаемую композицию.
«Буфер» представляет собой раствор, который предотвращает изменение рН под действием компонентов его кислотно-основной смеси. Различные буферы, которые могут быть использованы в зависимости, например, от нужного рН данного буфера, описаны в публикации Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975).
«Уравновешивающий буфер» представляет собой буфер, используемый для уравновешивания катионообменного материала с последующей загрузкой композиции, содержащей представляющее интерес антитело и одно или несколько примесных соединений, на катионообменный материал. рН используемого в данном описании уравновешивающего буфера составляет в пределах от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0, а предпочтительно примерно 5,5. Проводимость используемого в данном описании уравновешивающего буфера предпочтительно составляет в пределах от приблизительно 1 до приблизительно 8 мСм/см, более предпочтительно от приблизительно 4 до приблизительно 8 мСм/см, а наиболее предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 8 мСм/см. Уравновешивающий буфер содержит, но необязательно, соль, такую как NaCl, например, в количестве от приблизительно 40 мМ до приблизительно 80 мМ, а предпочтительно приблизительно 60 мМ NaCl.
Используемый в данном описании термин «промывочный буфер» означает буфер, который проходит поверх катионообменного материала после загрузки композиции и перед элюированием представляющего интерес белка. Промывочный буфер может служить для удаления одного или нескольких примесных соединений из катионообменного материала в основном без элюирования нужного продукта антитела. В предпочтительном варианте изобретения используются «первый промывочный буфер» и «второй промывочный буфер».
Используемый в данном описании термин «первый промывочный буфер» означает промывочный буфер, имеющий рН, значение которого превышает значение рН загрузочного и/или уравновешивающего буфера. Первый промывочный буфер может быть использован для элюирования одного или нескольких примесных соединений из катионообменного материала в основном без элюирования представляющего интерес продукта антитела из этого материала. Термин «первый» не должен быть интерпретирован как вариант, исключающий использование одного или нескольких дополнительных промывочных или других буферов в промежутке между использованием загрузочного и первого промывочного буфера. Используемый в данном описании первый промывочный буфер предпочтительно имеет pH в пределах от приблизительно 6,8 до приблизительно 9,0, более предпочтительно от приблизительно 7,0 до приблизительно 8,0, а наиболее предпочтительно примерно 7,0 или 7,8. Проводимость используемого в данном описании первого промывочного буфера предпочтительно составляет в пределах от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мСм/см, еще более предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 3 мСм/см, а наиболее предпочтительно от приблизительно 0,2 до приблизительно 2 мСм/см. Используемый здесь первый промывочный буфер может, но необязательно, в основном не содержать соли (такой как NaCl).
Термин «второй промывочный буфер», используемый в целях осуществления настоящего изобретения, означает промывочный буфер, используемый после применения первого промывочного буфера в целях получения катионообменного материала, используемого для элюирования представляющего интерес антитела. Термин «второй» не должен быть интерпретирован как вариант, исключающий использование одного или нескольких дополнительных промывочных или других буферов в промежутке между использованием первого промывочного буфера и второго промывочного буфера. Используемый в данном описании второй промывочный буфер имеет pH предпочтительно в пределах от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0, более предпочтительно приблизительно 5,5, а наиболее предпочтительно pH 5,5. Проводимость используемого второго промывочного буфера предпочтительно составляет в пределах от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мСм/см, еще более предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 3 мСм/см, а наиболее предпочтительно от приблизительно 0,5 до приблизительно 3,0 мСм/см.
«Элюирующий буфер» используется для элюирования представляющего интерес антитела из твердой фазы. Используемый в данном описании элюирующий буфер имеет проводимость, значение которой в основном превышает значение проводимости второго промывочного буфера, что позволяет нужному продукту антитела элюироваться из катионообменного материала. Предпочтительно величина проводимости элюирующего буфера в основном превышает величину проводимости загрузочного буфера и каждого из предыдущих буферов, а именно уравновешивающего буфера, первого промывочного буфера и второго промывочного буфера. Термин «в основном превышающее значение» проводимости означает, что, например, буфер имеет проводимость, величина которой по меньшей мере в 2, 3, 4, 5 или 6 раз превышает величину проводимости (мСм/см) сравниваемой композиции или сравниваемого буфера. В одном из вариантов изобретения значение рН элюирующего буфера в основном равно значению рН уравновешивающего и/или второго промывочного буфера. рН используемого в данном описании элюирующего буфера предпочтительно составляет в пределах от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0, более предпочтительно приблизительно 5,5, а наиболее предпочтительно 5,5. Проводимость используемого элюирующего буфера, предпочтительно составляет в пределах от приблизительно 10 до приблизительно 100 мСм/см, более предпочтительно от приблизительно 12 до приблизительно 30 мСм/см, а наиболее предпочтительно от приблизительно 12 до приблизительно 20 мСм/см. Увеличение проводимости может быть достигнуто путем добавления в элюирующий буфер соли, такой как хлорид натрия, ацетат натрия и хлорид калия. Элюирующий буфер предпочтительно содержит от приблизительно 100 до приблизительно 300 мМ NaCl, а более предпочтительно от приблизительно 150 до приблизительно 200 мМ NaCl, например приблизительно 175 мМ NaCl или приблизительно 160 мМ NaCl.
«Регенерирующий буфер» может быть использован в целях регенерации катионообменного материала для его повторного использования. Регенерирующий буфер имеет значения проводимости и/или рН, необходимые для удаления, в основном всех примесей и представляющего интерес антитела из катионообменного материала.
-1
-1
Термин «проводимость» означает способность водного раствора проводить электрический ток, проходящий между двумя электродами. В растворе ток возникает при транспорте ионов. Поэтому водный раствор, содержащий повышенное количество ионов, будет иметь более высокую проводимость. Основной единицей измерения проводимости является Сименс (или Ом), Ом (мСм/см), и она может быть измерена с использованием приборов для измерения проводимости, таких как различные модели измерителей проводимости Orion. Поскольку электролитическая проводимость представляет собой способность ионов, присутствующих в растворе, проводить электрический ток, то проводимость данного раствора может быть изменена путем изменения концентрации ионов в данном растворе. Так, например, для получения желаемой величины проводимости может быть изменена концентрация забуферивающего вещества и/или концентрации соли (например, хлорида натрия, ацетата натрия или хлорида калия) в растворе. Для достижения желаемой величины проводимости предпочтительно изменяют концентрацию соли в различных буферах.
Термин «очистка» антитела, то есть выделение антитела из композиции, содержащий антитело и одну или несколько примесей, означает повышение степени чистоты антитела в данной композиции путем удаления (полного или частичного) по меньшей мере одного примесного вещества из данной композиции. «Стадия очистки» может представлять собой часть всего процесса очистки, приводящей к образованию «гомогенной» композиции. Используемый здесь термин «гомогенный» относится к композиции, содержащей по меньшей мере примерно 70 масс.%, предпочтительно по меньшей мере примерно 80 масс.%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 90 масс.%, а еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95 масс.% представляющего интерес антитела по массе всей композиции.
Термин «связывание» молекулы с катионообменным материалом означает обработку молекулы катионообменным материалом в соответствующих условиях (при соответствующих значениях pH и/или проводимости), при которой данная молекула обратимо иммобилизуется в катионообменном материале или на катионообменном материале благодаря ионным взаимодействиям между молекулой и заряженной группой или заряженными группами указанного катионообменного материала.
Термин «промывка» катионообменного материала означает пропускание соответствующего буфера через катионообменный материал или поверх этого катионообменного материала.
Термин «элюирование» молекулы (например, антитела или примесей) из катионообменного материала означает удаление молекулы из этого материала.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, используемым очищаемым антителом является рекомбинантное антитело. «Рекомбинантное антитело» представляет собой антитело, продуцированное в клетке-хозяине, которая была трансформирована или трансфецирована нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело, или которая продуцирует антитело в результате гомологичной рекомбинации. Используемые в данном описании термины «трансформация» и «трансфекция» являются взаимозаменяемыми и означают способ введения нуклеиновой кислоты в клетку. После трансформации или трансфекции нуклеиновая кислота может интегрироваться в геном клетки-хозяина, либо она может существовать в виде внехромосомного элемента. Термин «клетка-хозяин» включает клетку в клеточной культуре in vitro, а также клетку животного-хозяина. Методы рекомбинантного продуцирования полипептидов описаны в патенте США № 5534615, который, например, во всей своей полноте включен в настоящее описание в качестве ссылки.
«Вариант» или «вариант аминокислотной последовательности» исходного полипептида представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности исходного полипептида. Вообще говоря, вариант имеет последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, а наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% идентична последовательности нативного полипептида. Процент идентичности последовательностей определяют методом, описанным, например, Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1382-1386 (1983), с использованием версии алгоритма, описанного Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), после выравнивания последовательностей на максимальную гомологию. Варианты аминокислотных последовательностей полипептида могут быть получены путем введения соответствующих нуклеотидных замен в ДНК, кодирующую полипептид, или путем пептидного синтеза. Такими вариантами являются, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотной последовательности представляющего интерес полипептида. Для получения конечной конструкции могут быть введены любые комбинации делеций, инсерций и замен при условии, что такая конечная конструкция будет обладать нужными свойствами. Аминокислотные замены могут также приводить к изменению посттрансляционного процессинга полипептида, такому как изменение числа или положения сайтов гликозилирования. Другими посттрансляционными модификациями являются гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильных, треонильных или тирозильных остатков, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)). Методы получения вариантов аминокислотных последовательностей полипептидов описаны, например, в патенте США № 5534615, который во всей своей полноте включен в настоящее описание в качестве ссылки.
Используемый в данном описании термин «антитело» употребляется в самом широком смысле и, в частности, охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии что они обладают нужной специфичностью связывания.
Используемое в данном описании антитело направлено против представляющего интерес «антигена». Предпочтительно антигеном является ценный с биологической точки зрения полипептид, и введение антитела млекопитающему, страдающему каким-либо заболеванием или расстройством, может давать терапевтический эффект у данного млекопитающего. Однако рассматриваются также антитела, направленные против неполипептидных антигенов (таких как опухолеассоциированные гликолипидные антигены; см. патент США 5091178). Если антиген представляет собой полипептид, то таким антигеном может быть трансмембранная молекула (например, рецептор) или лиганд, такой как фактор роста. Репрезентативными антигенами являются полипептиды, обсуждаемые выше. Предпочтительными молекулами-мишенями для антител, входящих в объем настоящего изобретения, являются полипептиды CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 и CD34; члены семейства рецепторов HER, такие как рецептор EGF (HER1), рецептор HER2, HER3 или HER4; клеточно-адгезивыне молекулы, такие как интегрины LFA-I, Macl, pl50,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM и av/b3, включая их α- или β-субъединицы (например, анти-CD11a, анти-CD18 или анти-CDl1b антитела); факторы роста, такие как VEGF; IgE; антигены группы крови; рецептор flk2/flt3; рецептор, ответственный за ожирение (OB); рецептор mpl; CTLA-4; полипептид C и т.п. Растворимые антигены или их фрагменты, необязательно конъюгированные с другими молекулами, могут быть использованы в качестве имунногенов для продуцирования антител. Для трансмембранных молекул, таких как рецепторы, фрагменты этих рецепторов (например, внеклеточный домен рецептора) могут быть использованы в качестве имунногена. Альтернативно, клетки, экспрессирующие трансмембранную молекулу, могут быть использованы в качестве имунногена. Такие клетки могут происходить от природного источника (например, раковых клеточных линий), либо такими клетками могут быть клетки, трансформированные рекомбинантными методами в целях экспрессии трансмембранной молекулы.
TM
Примерами используемых в данном описании антител, подвергаемых очистке, являются, но не ограничиваются ими, анти-HER2 антитела, включая трастузумаб (HERCEPTIN) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), патент США № 5725856) и пертузумаб (OMNITARG) (WO 01/00245); анти-CD20 антитела (см. ниже); анти-IL-8 антитела (St John et al., Chest, 103:932 (1993) и публикация международной патентной заявки № WO 95/23865); антитела против VEGF или рецептора VEGF, включая гуманизованные и/или аффинно-зрелые анти-VEGF антитела, такие как гуманизованное анти-VEGF антитело бевацизумаб huA4.6.1 (AVASTIN) и ранибизумаб (LUCENTIS) (Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), публикации международных патентных заявок № WO 96/30046 и WO 98/45331, опубликованные 15 октября 1998); анти-PSCA антитела (WO 01/40309); анти-CD11a антитела, включая эфализумаб (RAPTIVA) (патент США № 5622700, WO 98/23761, Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), и Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); антитела, связывающиеся с IgE, включая омализумаб (XOLAIR) (Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993), и публикация международной патентной заявки No. WO 95/19181; патент США № 5714338, выданный 3 февраля 1998, или патент США № 5091313, выданный 25 февраля 1992, заявка WO 93/04173, опубликованная 4 марта 1993, или международная заявка № PCT/US98/13410, поданная 30 июня 1998, патент США № 5714338); анти-CD18 антитела (патент США № 5622700, выданный 22 апреля 1997, или заявка WO 97/26912, опубликованная 31 июля 1997); антитела против рецептора Apo-2 (заявка WO 98/51793, опубликованная 19 ноября 1998); антитела против тканевого фактора (TF) (Европейский патент № 0420937 Bl, выданный 9 ноября 1994); антитела против α4-α7-интегринов (заявка WO 98/06248, опубликованная 19 февраля 1998); анти-EGFR антитела (например, химерное или гуманизованное антитело 225, цетуксимаб, ERBUTIX, описанное в заявке WO 96/40210, опубликованной 19 декабря 1996); анти-CD3 антитела, такие как OKT3 (патент США № 4515893, выданный 7 мая 1985); анти-CD25 или анти-Tac антитела, такие как CHI-621 (SIMULECT) и ZENAPAX (см. патент США № 5693762, выданный 2 декабря 1997); анти-CD4 антитела, такие как антитело cM-7412 (Choy et al. Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)); анти-CD52 антитела, такие как CAMPATH-1H (ILEX/Berlex) (Riechmann et al. Nature 332:323-337 (1988)); антитела против Fc-рецептора, такие как антитело M22, направленное против FcγRI, как описано в публикации Graziano et al. J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995); антитела против канцероэмбрионального антигена (CEA), такие как hMN-14 (Sharkey et al. Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995)); антитела против эпителиальных клеток молочной железы, включая антитела huBrE-3, hu-Mc 3 и CHL6 (Ceriani et al. Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); и Richman et al. Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)); антитела, которые связываются с клетками карциномы толстой кишки, такие как C242 (Litton et al. Eur. J. Immunol. 26(1):1-9 (1996)); анти-CD38 антитела, например, AT 13/5 (Ellis et al. J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); анти-CD33 антитела, такие как Hu M195 (Jurcic et al. Cancer Res. 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)) и CMA-676 или CDP771; антитела против EpCAM, такие как 17-1A (PANOREX); анти-GpIIb/IIIa антитела, такие как абциксимаб или Fab-фрагмент c7E3 (REOPRO); антитела против RSV, такие как MEDI-493 (SYNAGIS); антитела против CMV, такие как PROTOVIR; антитела против ВИЧ, такие как PRO542; антитела против вируса гепатита, такие как антитело против Hep B, OSTAVIR; антитело CA 125 OvaRex; идиотипическое антитело против эпитопа GD3 BEC2; анти-αvβ3 антитело (например, VITAXIN; Medimmune); антитело против почечно-клеточной карциномы человека, такое как ch-G250; ING-1; антитело против человеческого 17-1An (3622W94); антитело против человеческой опухоли прямой и ободочной кишки (A33); антитело R24 против человеческой меланомы, направленное против ганглиозида GD3; антитело против человеческой плоскоклеточной карциномы (SF-25); антитело против антигена человеческих лейкоцитов (HLA), такое как Smart ID10 и анти-HLA DR антитело Oncolym (Lym-1); анти-CD37 антитело, такое как TRU 016 (Trubion); анти-IL-21 антитело (Zymogenetics/Novo Nordisk); антитело против B-клеток (Impheron); MAb против B-клеток (Immunogen/Aventis); 1D09C3 (Morphosys/GPC); LymphoRad 131 (HGS); анти-Lym-1 антитело, такое как Lym-1Y-90 (USC) или анти-Lym-1 Oncolym (USC/Peregrine); LIF 226 (Enhanced Lifesci.); анти-BAFF антитело (см., например, WO 03/33658); антитело против рецептора BAFF (см., например, WO 02/24909); анти-BR3 антитело; анти-Blys антитело, такое как белимумаб; LYMPHOSTAT - BTM; ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen); гомиликсима (Idec 152; Biogen Idec); антитело против рецептора IL-6, такое как атлизумаб (ACTEMRA™; Chugai/Roche); анти-IL-15 антитело, такое как HuMax-Il-15 (Genmab/Amgen); антитело против хемокинового рецептора, такое как анти-CCR2 антитело (например, MLN1202; Millieneum); антитело против комплемента, такое как анти-C5 антитело (например, экулизумаб, 5Gl.1; Alexion); перорально вводимый препарат человеческого иммуноглобулина (например, IgPO; Protein Therapeutics); анти-IL-12 антитело, такое как ABT-874 (CAT/Abbott); тенеликсимаб (BMS-224818; BMS); анти-CD40 антитела, включая S2C6 и их гуманизованные варианты (WO 00/75348) и TNX 100 (Chiron/Tanox); анти-TNF-α антитела, включая cA2 или инфлексимаб (REMICADE), CDP571, MAK-195, адалимумаб (HUMIRA™), ПЭГилированный фрагмент анти-TNF-α антитела, такой как CDP-870 (Celltech), D2E7 (Knoll), поликлональное анти-TNF-α антитело (например, PassTNF; Verigen); анти-CD22 антитела, такие как LL2 или эпратузумаб (LYMPHOCIDE; Immunomedics), включая эпратузумаб Y-90 и эпратузумаб I-131, анти-CD22 антитело Abiogen (Abiogen, Italy), CMC 544 (Wyeth/Celltech), комботокс (UT Soutwestern), BL22 (NIH) и LympoScan Tc99 (Immunomedics). Предпочтительно антителом, которое подвергают очистке в соответствии с настоящим изобретением, является «оголенное» интактное антитело, связывающееся с человеческим CD20, или «оголенное» интактное антитело, связывающееся с человеческим VEGF.
Человеческий антиген «CD20», или «CD20», представляет собой не-гликозилированный фосфопротеин размером примерно 35 кДа, обнаруживаемый на поверхности более чем 90% B-клеток периферической крови или лимфоидных органов. CD20 присутствует как на нормальных В-клетках, так и на злокачественных В-клетках, но он не экспрессируется на стволовых клетках. Другими названиями CD20, встречающимися в литературе, являются «B-лимфоцит-рестриктирущий антиген» и «Bp35». Антиген CD20 описан, например, в публикации Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:1766 (1985).
Используемый здесь термин «антитело-антагонист, направленное против CD20» означает антитело, которое при его связывании с CD20 на B-клетках разрушает В-клетки или истощает их количество у индивидуума и/или ингибирует одну или несколько B-клеточных функций, например, путем подавления или предотвращения гуморального ответа, вырабатываемого этими В-клетками. Антитело-антагонист предпочтительно обладает способностью истощать В-клетки (то есть снижать уровни В-клеток в кровотоке) у индивидуума, которому вводят такое антитело. Такое истощение может быть достигнуто посредством различных механизмов, таких как антитело-зависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC), ингибирование пролиферации В-клеток и/или индуцирование гибели В-клеток (например, посредством апоптоза).
Используемый в данном описании термин «истощение В-клеток» означает снижение уровней В-клеток у животного или человека в основном после введения им лекарственного средства или антитела, по сравнению с уровнем В-клеток до введения. Истощение В-клеток может быть частичным или полным. Уровни В-клеток могут быть измерены хорошо известными методами, такими как методы, описанные в публикации Reff et al., Blood 83:435-445 (1994) или в патенте США No. 5736137 (Anderson et al.). Так, например, млекопитающему (например, здоровому примату) могут быть введены различные дозы антитела или иммуноадгезина, после чего могут быть определены концентрации В-клеток периферической крови, например, FACS-методом, который позволяет проводить подсчет В-клеток.
Примерами анти-CD20 антител являются: «C2B8», которое в настоящее время называется «ритуксимабом» («RITUXAN») (патент США № 5736137); меченное иттрием-90 мышиное антитело 2B8, называемое «Y2B8» или «Ibritumomab Tiuxetan» (ZEV ALIN), которое является коммерчески доступным и поставляется фирмой IDEC Pharmaceuticals, Inc. (патент США № 5736137; антитело 2B8, депонированное в ATCC под регистрационным номером HBl1388 22 июня 1993); мышиное IgG2a «Bl», также называемое «тозитумомабом», которое может быть, но необязательно, помечено 131I с получением антитела «131I-B1» или 131I-меченного антитела «тозитумомаба» (BEXXAR™), являющегося коммерчески доступным и поставляемого фирмой Corixa (см. также патент США № 5595721); мышиное моноклональное антитело «1F5» (Press et al. Blood 69(2):584-591 (1987)) и его варианты, включая антитело 1F5, имеющее «встроенные каркасные области» или гуманизованное 1F5 (WO 2003/002607, Leung, S.; ATCC-депозит HB-96450); мышиное антитело 2H7 и химерное антитело 2H7 (патент США № 5677180); гуманизованное антитело 2H7 (WO 2004/056312, Lowman et al., и заявки, указанные ниже); антитело 2F2 (HuMax-CD20), полностью человеческое высокоаффинное антитело, направленное против молекулы CD20 в мембране В-клеток (Genmab, Denmark; см., например, публикации Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8:503-510 (2003), и Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003); WO 2004/035607; US 2004/0167319); человеческие моноклональные антитела, представленные в WO 2004/035607 и US 2004/0167319 (Teeling et al.); антитела, имеющие сложные сахарные цепи, связанные с N-гликозидом и присоединенные к Fc-области, как описано в заявке на патент США 2004/0093621 (Shitara et al.); моноклональные антитела и антиген-связывающие фрагменты, связывающиеся с CD20 (WO 2005/000901, Tedder et al.), такие как HB20-3, HB20-4, HB20-25 и MB20-11; CD20-связывающие молекулы, такие как антитела серии AME, например антитела AME 33, представленные в WO 2004/103404 и US 2005/0025764 (Watkins et al., Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME); CD20-связывающие молекулы, такие как молекулы, описанные в заявке на патент США 2005/0025764 (Watkins et al.); антитело A20 или его варианты, такие как химерное или гуманизованное антитело A20 (cA20, hA20, соответственно) или IMMU-106 (US 2003/0219433, Immunomedics); CD20-связывающие антитела, включая дефицитные по эпитопу Leu-16, 1H4 или 2B8, необязательно конъюгированные с IL-2, как описано в US 2005/0069545 A1 и WO 2005/16969 (Carr et al.); биспецифическое антитело, которое связывается с CD22 и CD20, например hLL2xhA20 (WO 2005/14618, Chang et al.); моноклональные антитела L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl или NU-B2, поставляемые фирмой International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)); 1H4 (Haisma et al. Blood 92:184 (1998)); конъюгат «антитело против CD20 - ауристатин Е» (Seattle Genetics); анти-CD20-IL2 антитело (EMD/Biovation/City of Hope); анти-CD20 MAb, используемое в терапии (EpiCyte); и анти-CD20 антитело TRU 015 (Trubion). Предпочтительными анти-CD20 антителами, используемыми в настоящем изобретении, являются химерные, гуманизованные или человеческие анти- CD20 антитела, а более предпочтительно ритуксимаб, гуманизованное 2H7, человеческое анти-CD20 антитело 2F2 (Hu-Max-CD20) (Genmab) и гуманизованное антитело A20 или IMMUN-106 (Immunomedics).
Используемые в данном описании термины «ритуксимаб», «RITUXAN» и «C2B8» означают рекомбинантное химерное антитело, которое связывается с человеческим антигеном CD20 и которое описано в патенте США № 5736137, Anderson et al. Такое антитело предпочтительно содержит тяжелую цепь, содержащую CDR H1 (SEQ ID NO:5), CDR H2 (SEQ ID NO:6), CDR H3 (SEQ ID NO:7), и легкую цепь, где указанная легкая цепь предпочтительно содержит CDR L1 (SEQ ID NO:8), CDR L2 (SEQ ID NO:9) и CDR L3 (SEQ ID NO:10); при этом предпочтительно тяжелая цепь содержит вариабельную область (VH) тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую SEQ ID NO:4; а наиболее предпочтительно указанное антитело содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO:1 (содержащую или не содержащую C-концевой лизиновый остаток), и легкую цепь, где указанная легкая цепь предпочтительно содержит SEQ ID NO:2. Эти термины включают все вариантные формы, описанные в публикации Moorhouse et al. J. Pharm Biomed. Anal. 16:593-603 (1997).
Используемый в данном описании термин «человеческий VEGF» означает фактор роста человеческих васкулярных эндотелиальных клеток, состоящий из 165 аминокислот, и родственные факторы роста васкулярных эндотелиальных клеток, состоящие из 121, 189 и 206 аминокислот, описанные в публикации Leung et al., Science 246:1306 (1989), и Houck et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991), а также природные аллельные и процессированные формы указанных факторов роста.
Настоящее изобретение относится к анти-VEGF антителам-антагонистам, которые способны ингибировать одну или несколько биологических активностей VEGF, например его митогенную или ангиогенную активность. Антагонисты VEGF действуют посредством предотвращения связывания VEGF с клеточным рецептором, либо посредством нарушения функций или уничтожения клеток, активированных VEGF, либо путем предотвращения активации васкулярных эндотелиальных клеток после связывания VEGF с клеточным рецептором. Все указанные аспекты действия антагонистов VEGF рассматриваются как эквивалентные рассматриваемым здесь аспектам настоящего изобретения.
В настоящем описании, термины «бевацизумаб», «AVASTIN», «F(ab)-12» и «анти-VEGF rhuMAb» означают рекомбинантное гуманизованное моноклональное антитело, которое связывается с антигеном, таким как человеческий фактор роста васкулярных эндотелиальных клеток (VEGF) (анти-VEGF rhuMAb), как описано в патенте США № 7169901, Presta et al. Такое антитело, предпочтительно содержит тяжелую цепь, включающую CDR Hl (SEQ ID NO:15), CDR H2 (SEQ ID NO:16), CDR H3 (SEQ ID NO:17), и легкую цепь, где указанная легкая цепь предпочтительно содержит CDR Ll (SEQ ID NO:18), CDR L2 (SEQ ID NO:19) и CDR L3 (SEQ ID NO:20); а наиболее предпочтительно тяжелая цепь содержит вариабельную область (VH) тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO:13, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую SEQ ID NO:14; а предпочтительно указанное антитело содержит тяжелую цепь, включающую SEQ ID NO:11 (содержащую или не содержащую C-концевой лизиновый остаток), и легкую цепь, где указанная легкая цепь предпочтительно содержит SEQ ID NO:12. Эти термины включают все вариантные формы, образующиеся в процессе продуцирования рекомбинантного продукта антитела.
Используемый здесь термин «моноклональное антитело» означает антитело, полученное от популяции, в основном гомогенных антител, то есть отдельные антитела, входящие в такую популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются в высокой степени специфичными и направлены против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от стандартных препаратов антител (поликлональных), которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Определение «моноклональный» указывает на тип антитела, полученного в основном от гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как указание на какой-либо конкретный метод продуцирования антитела. Так, например, моноклональные антитела, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным Kohler et al., Nature 256:495 (1975), либо они могут быть получены методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). В другом варианте изобретения, «моноклональные антитела» могут быть выделены из фаговых библиотек антител, полученных методами, описанными в публикации McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). В публикациях Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), и Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991), описано выделение мышиных и человеческих антител, соответственно, с использованием фаговых библиотек. В более поздних публикациях описаны методы продуцирования высокоаффинных (в наномолярном интервале) человеческих антител путем перестановки цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также методы комбинаторного инфицирования и рекомбинантные методы in vivo, применяемые в качестве стратегии для конструирования очень крупных фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, эти методы являются практически осуществимой альтернативой традиционным гибридомным методам продуцирования моноклональных антител, применяемым для выделения моноклональных антител. Альтернативно, в настоящее время появилась возможность получать трансгенных животных (например, мышей), которые, после их иммунизации, будут обладать способностью продуцировать полный набор человеческих антител, но при этом без продуцирования эндогенного иммуноглобулина. Так, например, было показано, что гомозиготная делеция гена области стыка тяжелой цепи антител (JH) у химерных мышей и у мышей с мутированной зародышевой линией приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенных антител. Введение массива генов иммуноглобулина зародышевой линии человека таким мышам с мутантной зародышевой линией будет приводить к продуцированию человеческих антител после введения данного антигена. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); и Duchosal et al. Nature 355:258 (1992).
Используемые в данном описании «моноклональные антитела», в частности, включают «химерные антитела» (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, происходящим от конкретных типов или принадлежащим к конкретному классу или подклассу антител, тогда как остальная(ые) часть(и) цепи(ей) идентична(ы) или гомологична(ы) соответствующим последовательностям антител, происходящим от конкретных типов или принадлежащим к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии что они обладают желаемой биологической активностью (патент США № 4816567 и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
Используемый в данном описании термин «гипервариабельная область» означает аминокислотные остатки антитела, ответственные за связывание с антигеном. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки «комплементарность-определяющей области» или «CDR» (то есть остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки «гипервариабельной петли» (то есть остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Остатками «каркасной области» или «FR» являются остатки вариабельного домена, отличающиеся от определенных здесь остатков гипервариабельной области.
«Гуманизованные» формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, содержащие минимальную последовательность, происходящую от нечеловеческого иммуноглобулина. По большей части, гуманизованные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области нечеловеческого антитела (антитела-донора), такого как мышиное антитело, крысиное антитело, кроличье антитело или антитело приматов, не являющихся человеком, где указанные антитела обладают желаемой специфичностью, аффинностью и активностью. В некоторых случаях, Fv-остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизованные антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют в антителе-реципиенте или в донорном антителе. Такие модификации вводят для дополнительного улучшения свойств антитела. В общих чертах, гуманизованное антитело содержит в основном все, или по меньшей мере один, а обычно два варибельных домена, в которых все или, по существу, все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям нечеловеческого иммуноглобулина, а все или, по существу, все области FR представляют собой области человеческой последовательности иммуноглобулина. Гуманизованное антитело также содержит, но необязательно, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно, человеческого иммуноглобулина.
Выбор человеческих вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей, используемых для получения гуманизованных антител, имеет очень важное значение для снижения антигенности. В соответствии с так называемым методом “подгонки” последовательность вариабельного домена антитела грызунов скринируют по всей библиотеке известных последовательностей вариабельных доменов человеческого антитела. Затем идентифицируют человеческую последовательность, которая имеет наибольшее сходство с последовательностью грызунов, и присутствующую в ней человеческую каркасную область (FR) используют для создания гуманизованного антитела (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)).
В другом методе используют конкретную каркасную область, происходящую от консенсусной последовательности всех человеческих антител конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Та же самая каркасная область может быть использована для получения нескольких различных гуманизованных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151:2623 (1993)).
Кроме того, важно, чтобы гуманизованные антитела сохраняли высокую аффинность связывания с антигеном и другие благоприятные биологические свойства. Для достижения этой цели, в соответствии с предпочтительным способом, гуманизованные антитела получают путем анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизованных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизованных последовательностей. Трехмерные иммуноглобулиновые модели являются общедоступными и хорошо известны специалистам. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и представляют вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей-кандидатов иммуноглобулинов. Исследование этих представлений позволяет проанализировать вероятную роль данных остатков в функционировании последовательностей-кандидатов иммуноглобулина, то есть остатков, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с его антигеном. Таким образом, остатки FR могут быть отобраны из последовательностей реципиента и “импортных” последовательностей и объединены, в результате чего может быть получено желаемое антитело с нужными свойствами, такими как повышенная аффинность по отношению к антигену(ам)-мишени(ям). Вообще говоря, остатки гипервариабельной области (CDR) непосредственно влияют на связывание с антигеном и в основном участвуют в таком связывании.
«Фрагменты антител» содержат часть полноразмерного антитела, а в основном его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примерами фрагментов антител являются Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты; диантитела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифические антитела, происходящие от фрагментов антитела. Для получения фрагментов антител были разработаны различные методы. Традиционно, эти фрагменты образуются в результате протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако такие фрагменты могут продуцироваться непосредственно рекомбинантными клетками-хозяевами. Так, например, фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Альтернативно, Fab'-SH-фрагменты могут быть непосредственно выделены из E.coli и химически связаны с образованием F(ab')2-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). В другом варианте изобретения, F(ab')2 получают с использованием «лейциновой молнии» GCN4 для стимуляции сборки молекулы F(ab')2. В соответствии с другим подходом F(ab')2-фрагменты могут быть непосредственно выделены из рекомбинантной культуры клеток-хозяев. Другие методы продуцирования фрагментов антител хорошо известны специалистам.
В других вариантах изобретения, выбранным антителом является одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv). См. WO 93/16185. «Одноцепочечные Fv-фрагменты» или «sFv-фрагменты» антитела включает домены VH и VL антитела, где указанные домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Вообще говоря, полипептид Fv также содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который обеспечивает образование scFv со структурой, необходимой для связывания с антигеном. Описание scFv можно найти в публикации Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg & Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).
Термин “диантитела” означает небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, где указанные фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH-VL). Если линкер является слишком коротким для образования пары между двумя доменами на одной и той же цепи, то домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два антигенсвязывающих сайта. Диантитела более подробно описаны, например, в ЕР 404097; в WO93/11161 и в работе Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6444-6448 (1993).
Термин «линейные антитела», используемый в описании настоящей заявки, означает антитела, описанные в публикации Zapata et al. Polypeptide Eng. 8(10):1057-1062 (1995). Вкратце, эти антитела содержат пару тандемных Fd-сегментов (VH-CH1-VH-CH1), образующих пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.
«Мультиспецифические антитела» обладают специфичностью связывания по меньшей мере с двумя различными эпитопами, где указанные эпитопы обычно происходят от различных антигенов. Такие молекулы обычно связываются только с двумя антигенами (то есть биспецифические антитела, BsAbs), однако в объем настоящего изобретения также входят антитела, обладающие дополнительными специфичностями, такие как триспецифические антитела. Примерами BsAb являются антитела, в которых одна ветвь направлена против антигена опухолевых клеток, а другая ветвь направлена против цитотоксической молекулы-стимулятора, то есть такие антитела, как анти-FcγRI/анти-CD15 антитела, анти-p185HER2/FcγRIII (CD16) антитело, анти-CD3 антитело/антитело против злокачественных B-клеток (ID10), анти-CD3/анти-pl85HER2 антитела, анти-CD3/анти-p97 антитела, анти-CD3 антитело/антитело против почечно-клеточной карциномы, анти-CD3/анти-OVCAR-3 антитело, анти-CD3/L-Dl (антитело против карциномы толстой кишки), анти-CD3 антитело/антитело против аналога меланоцит-стимулирующего гормона, антитело против EGF/анти-CD3 антитело, анти-CD3/анти-CAMAl антитело, анти-CD3/анти-CD19 антитело, анти-CD3/MoV18 антитело, антитело против адгезивной молекулы нервных клеток (NCAM)/анти-CD3 антитело, антитело против фолат-связывающего белка (FBP)/анти-CD3 антитело, антитело против всех ассоциированных с карциномой антигенов (AMOC-31)/анти-CD3 антитело; BsAb с одной ветвью, которая специфически связывается с опухолевым антигеном, и с одной ветвью, которая связывается с токсином, где указанными антителами являются антитело против сапорина/анти-Id-1 антитело, анти-CD22 антитело/антитело против сапорина, анти-CD7 антитело/антитело против сапорина, анти-CD38 антитело/антитело против сапорина, анти-CEA антитело/антитело против цепи рицина А, идиотипическое антитело против интерферона-α(IFN-α)/антигибридомное антитело, анти-CEA антитело/антитело против винкаалкалоидов; BsAb для пролекарств, активированных конвертирующим ферментом, такие как анти-CD30 антитело/антитело против щелочной фосфатазы (которые катализируют превращение пролекарства, такого как фосфат митомицина, в митомициновый спирт); BsAb, которые могут быть использованы в качестве фибринолитических средств, такие как антитело против фибрина/антитело против тканевого активатора плазминогена (tPA), антитело против фибрина/антитело против активатора плазминогена урокиназного типа (uPA); BsAb, используемые для нацеливания иммунных комплексов на рецепторы клеточной поверхности, такие как антитело против липопротеина низкой плотности (ЛНП)/антитело против Fc-рецептора (например, FcγRI или FcγRIII); BsAb, используемые для лечения инфекционных заболеваний, такие как анти-CD3 антитело/антитело против вируса простого герпеса (HSV), комплекс «антитело против T-клеточного рецептора:анти-CD3 антитело»/антитело против вируса гриппа, анти-FcγR антитело/антитело против ВИЧ; BsAb, используемые для детектирования опухолей in vitro или in vivo, такие как анти-CEA/анти-EOTUBE антитело, анти-CEA/анти-DPTA антитело, анти-p185HER2 антитело/антитело против гаптена; BsAb, используемые в качестве вакцинных адъювантов; и BsAb, используемые в качестве диагностических средств, такие как антитело против кроличьего IgG/антитело против ферритина, антитело против пероксидазы хрена (ПХ)/антигормональное антитело, антитело против соматостатина/антитело против вещества P, анти-ПХ антитело/анти-ФИТЦ антитело, анти-CEA антитело/антитело против β-галактозидазы. Примерами триспецифических антител являются анти-CD3/анти-CD4/анти-CD37 антитела, анти-CD3/анти-CD5/анти-CD37 антитела и анти-CD3/анти-CD8/анти-CD37 антитела. Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F(ab')2-фрагментов биспецифических антител).
Рассматриваются также антитела с более чем двумя валентностями. Так, например, могут быть получены триспецифические антитела. Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991).
Используемое в данном описании «оголенное антитело» представляет собой антитело, которое не является конъюгированным с цитотоксической группой или с радиоактивной меткой.
Используемое в данном описании «интактное антитело» представляет собой антитело, которое содержит две антигенсвязывающие области и Fc-область. Предпочтительно интактное антитело имеет функциональную Fc-область.
Термин «лечение» означает как терапевтическое, так и профилактическое лечение, или превентивные меры. Индивидуумами, нуждающимися в лечении, являются индивидуумы, у которых уже диагностировано данное расстройство, а также индивидуумы, у которых такое расстройство должно быть предупреждено.
Термин «расстройство» означает любое состояние, на благоприятное течение которого может повлиять лечение описанным в данном описании очищенным антителом. Такими расстройствами являются хронические и острые расстройства и заболевания, а также патологические состояния, к которым могут иметь предрасположенность млекопитающие, страдающие рассматриваемым расстройством.
Используемый в данном описании термин «метка» означает детектируемое соединение или детектируемую композицию, которые непосредственно или опосредованно конъюгированы с данным антителом. Сама метка может быть также детектируемой (например, радиоактивные изотопы или флуоресцентные метки), либо, в случае ферментативной метки, она может катализировать химическую модификацию соединения-субстрата или композиции, которые являются детектируемыми.
Используемый в данном описании термин «цитотоксический агент» означает вещество, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает деструкцию клеток. Этот термин включает радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические агенты и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины, происходящие от бактерий, грибов, растений или животных, или их фрагменты.
Способы осуществления настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к способам выделения антитела из композиции (например, водного раствора), содержащей антитело и одно или несколько примесных соединений. Такой композицией является в основном композиция, полученная посредством рекомбинантного продуцирования антитела, однако такая композиция может быть получена посредством продуцирования антитела методом пептидного синтеза (или другими методами синтеза), либо такое антитело может быть выделено из природного источника антитела. Предпочтительно антитело, такое как ритуксимаб, связывается с человеческим антигеном CD20, либо антитело, такое как бевацизумаб, связывается с человеческим антигеном VEGF.
Рекомбинантное продуцирование антител
Для рекомбинантного продуцирования антитела, нуклеиновую кислоту, кодирующую такое антитело, выделяют и встраивают в реплицирующийся вектор для последующего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии. ДНК, кодирующая такое антитело, может быть легко выделена и секвенирована стандартными методами (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, обладающих способностью специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела). Многие векторы являются доступными. Компонентами векторов обычно являются, но не ограничиваются ими, один или несколько из нижеследующих компонентов, таких как сигнальная последовательность, ориджин репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции (описанные, например, в патенте США 5534615, который, в частности, включается в настоящее описание в качестве ссылки).
Клетками-хозяевами, подходящими для клонирования или экспрессии ДНК в описанных в данном описании векторах, являются клетки прокариотов, дрожжей или высших эукариотов. Подходящими прокариотами, используемыми для этих целей, являются эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные микроорганизмы, например энтеробактерии, такие как Escherichia, например E.coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например Salmonella typhimurium, Serratia, например Serratia marcescans и Shigella, а также Bacilli, такие как B. subtilis и B.licheniformis (например, B.licheniformis 41Р, описанная в DD266710, опубликованной 12 апреля 1989), Pseudomonas, такие как P.aeruginosa и Streptomyces. Одним из предпочтительных клонирующих хозяев E.coli является штамм E.coli 294 (АТСС 31446), хотя могут быть использованы и другие штаммы, такие как E.coli В, E.coli Х1776 (АТСС 31537) и E.coli W3110 (ATCC 27325). Эти примеры приводятся в иллюстративных целях и не ограничивают объем изобретения.
Помимо прокариотов, подходящими клонирующими или экспрессирующими хозяевами для антитело-кодирующих векторов являются эукариотические микробы, такие как нитчатые грибы или дрожжи. Из низших эукариотических микроорганизмов-хозяев наиболее часто используемыми являются Saccharomyces cerevisiae или обычные пекарские дрожжи. Однако в настоящем изобретении используются различные общедоступные и ценные бактерии другого рода и вида, и различные их штаммы, такие как Schizosaccharomyces pombe; клетки-хозяева Kluyveromyces, такие как K.lactis, K.fragilis (ATCC 12424), K.bulgaricus (ATCC 16045), K.wickeramii (ATCC 24178), K.waltii (ATCC 56500), K.drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans и K.marxianus; yarrowia (EP402226); Pichia pastoris (ЕР183070); Candida; Trichoderma reesia (EP244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; нитчатые грибы, такие как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, и клетки-хозяева Aspergillus, такие как A. nidulans и A.niger.
Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии гликозилированного антитела, происходят от многоклеточных организмов. Примерами клеток беспозвоночных являются клетки растений и насекомых. Были идентифицированы различные бакуловирусные штаммы и варианты, а также соответствующие пермиссивные клетки-хозяева насекомых, таких как Spodoptera frugiperda (гусеница совки), Aedes aegypti (желтолихорадочный комар), Aedes albopictus (белопятнистый комар), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori (тутовый шелкопряд). В настоящее время имеется ряд доступных вирусных штаммов, которые могут быть использованы для трансфекции, например, вариант L-1 Autographa californica NPV и штамм Bm-5 Bombyx mori NPV, и такие вирусы могут быть использованы в качестве вируса согласно изобретению, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. В качестве клеток-хозяев могут быть также использованы клетки растительных культур хлопчатника, кукурузы, картофеля, сои, петунии, томатов и табака.
Однако самый большой интерес представляют клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (тканевой культуре) становится рутинной процедурой. Примерами обычно используемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются, но не ограничиваются ими, клетки CV1 почек обезьяны, трансформированные SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); клетки почек человеческого эмбриона (клетки 293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); клетки почек детеныша хомячка (ВНК, АТСС CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); мышиные клетки Сертоли (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почек обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почек африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почек собак (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени лабораторной крысы Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (HepG2, HB 8065); опухолевые клетки мышиной молочной железы (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annal N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC5; клетки FS4 и клетки человеческой гепатомы (HepG2). В большинстве случаев, для экспрессии антител предпочтительными являются клетки СНО, и такие клетки могут быть преимущественно использованы для продуцирования антител, очищенных в соответствии с настоящим изобретением.
Клетки-хозяева трансформируют вышеописанными экспрессионными или клонирующими векторами для продуцирования антител и культивируют в подходящих питательных средах, модифицированных, если это необходимо, для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности.
ТМ
Клетки-хозяева, используемые для продуцирования антитела согласно изобретению, могут быть культивированы в различных средах. Средами, подходящими для культивирования клеток-хозяев, являются коммерчески доступные среды, такие как среда Хэмса F10 (Sigma), минимальная поддерживающая среда ((МЕМ)(Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла ((DMEM), Sigma). Кроме того, в качестве культуральной среды для культивирования клеток-хозяев может быть использована любая среда, описанная в публикации Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), в патентах США №№ 4767704, 4657866, 4927762, 4560655 или 5122469; а также в WO 90103430; WO 87/00195 или в патенте США Re. № 30985. В любую из этих сред могут быть добавлены, если это необходимо, гормоны и/или другие факторы роста (такие как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), соли (такие как хлорид натрия и фосфат кальция и магния), буферы (такие как HEPES), нуклеотиды (такие как аденозин и тимидин), антибиотики (такие как гарамицин; гентамицин), микроэлементы (определенные как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярных дозах), и глюкоза или эквивалентный источник энергии. Могут быть также включены любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях, известные специалистам в данной области. Условиями культивирования, такими как температура, рН и т.п., являются условия, которые обычно используются для экспрессии выбранных клеток-хозяев и известны среднему специалисту в данной области.
C применением техники рекомбинантных ДНК антитело может быть продуцировано внутри клеток или в периплазматическом пространстве, либо оно может быть непосредственно секретировано в среду. Если в первой стадии антитело продуцируется внутри клеток, то затем клеточный дебрис или клетки-хозяева или их лизированные фрагменты (например, образованные в результате гомогенизации) удаляют, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации. Если антитело секретируется в среду, то супернатанты таких экспрессионных систем могут быть концентрированы с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрирования белков, например устройства для ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon.
Способ проведения катионообменной хроматографии согласно изобретению

В предпочтительном варианте изобретения, композицией, подвергаемой очистке описанным в данном описании способом, является рекомбинантно продуцированное антитело, а предпочтительно интактное антитело, экспрессируемое рекомбинантной культурой клеток-хозяев яичника китайского хомячка (СНО). Указанную композицию подвергают, но необязательно, по меньшей мере одной стадии очистки, а затем катионообменной хроматографии. Указанная композиция содержит представляющее интерес антитело и одно или несколько примесных соединений, таких как белки яичника китайского хомячка (CHOP); элюированный белок A; нуклеиновая кислота; вариант, фрагмент, агрегат или производное нужного антитела; другой полипептид; эндотоксин; вирусная примесь; компонент среды для культивирования клеток (например, гарамицин; GENTAMYCIN) и т.п.
ТМ
Примерами дополнительных процедур очистки, которые могут быть осуществлены до, во время или после проведения катионообменной хроматографии, являются фракционирование на гидрофобной хроматографической колонке (например, на фенил-сефарозе), преципитация этанолом, изоэлектрическое фокусирование, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на двуокиси кремния, хроматография на гепарин-сефарозеТМ, анионообменная хроматография, другая катионообменная хроматография, ионообменная хроматография смешанного типа, хроматофокусирование, электрофорез в ДСН-ПААГ, преципитация сульфатом аммония, хроматография на гидроксиапатитах, гель-электрофорез, диализ, хроматография, индуцирующая образование заряда гидрофильного вещества, и аффинная хроматография (например, проводимая с использованием белка А, G-белка, антитела или специфического субстрата, лиганда или антигена, используемых в качестве реагента для захвата).
В соответствии с настоящим изобретением схема очистки методом катионообменной хроматографии обычно включает следующие последовательные стадии: (1) уравновешивания катионообменного материала; (2) загрузки очищаемой композиции на катионообменный материал; (3) первой стадии промывки; (4) второй стадии промывки и (5) элюирования представляющего интерес антитела.
При включении в схему катионообменной очистки по меньшей мере двух стадий промывки, где по меньшей мере первая стадия была проведена при высоком pH (примерно 6,8 или выше), эффективность такой очистки может быть значительно повышена. В частности, при осуществлении первой стадии промывки, проводимой с использованием промывочного буфера, имеющего значение pH от приблизительно 6,8 до приблизительно 9,0 (например, примерно от 7,0 до 8,0), например приблизительно 7,8 или 7,0, примеси, описанные выше, удаляются более эффективно, чем при стандартном более низком рН в пределах от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,5. В результате содержание белка клеток-хозяев в данной композиции, включающей антитело, элюированное из катионообменного материала, обычно составляет менее чем примерно 200 м.д., и эта величина ниже величины, достигаемой при проведении одной стадии промывки при рН примерно 5-5,5 и составляющей примерно 500 м.д.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, катионообменный материал содержит свободнотекучие частицы перекрестно-связанного полистиролдивинилбензола (твердая фаза), покрытые полигидроксилированным полимером, имеющим функциональные сульфопропильные группы, например, таким материалом является колонка с POROS 50 HS, поставляемая фирмой Applied Biosystems.
Обычно, уравновешивающий буфер пропускают поверх катионообменного материала или через указанный катионообменный материал, а затем на этот материал загружают композицию, включающую представляющее интерес антитело и одно или нескольких примесных соединений. В предпочтительном варианте изобретения, уравновешивающий буфер имеет pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0, например приблизительно pH 5,5. Один репрезентативный уравновешивающий буфер содержит 19 мМ MES, 60 мМ NaCl, pH 5,50. Другой репрезентативный уравновешивающий буфер содержит 23 мМ MES, 60 мМ NaCl, pH 5,50.
После уравновешивания водный раствор, содержащий представляющее интерес антитело и одно или несколько примесных соединений, загружают на катионообменный материал. рН загрузки может составлять, но необязательно, в пределах от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,0, например приблизительно pH 5,0 или приблизительно 5,5. В предпочтительном варианте изобретения осуществляют загрузку пула кондиционированного продукта предыдущей стадии очистки. В одном из вариантов изобретения, на катионообменный материал загружают пул белка А предыдущей стадии хроматографической очистки на белке А при рН 5,0. В другом варианте изобретения, на катионообменный материал загружают кондиционированный пул Q-SEPHAROSE, pH 5,5. Репрезентативная плотность загрузки составляет в пределах от приблизительно 10 до приблизительно 100 г/л смолы, предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 60 г/л смолы, а наиболее предпочтительно от приблизительно 15 до приблизительно 45 г/л смолы. Результатом проведения данной стадии загрузки является связывание представляющего интерес антитела с катионообменным материалом.
После загрузки, катионообменный материал промывают в первой стадии промывки первым промывочным буфером. В процессе промывки промывочный буфер пропускают поверх катионообменного материала. Состав промывочного буфера обычно подбирают так, чтобы из смолы элюировалось по возможности как можно больше примесей, но так, чтобы при этом не осуществлялось элюирование значительного количества представляющего интерес антитела. рН первого промывочного буфера в основном превышает рН уравновешивающего буфера и/или загруженной композиции, например, примерно в 2-3 раза. pH первого промывочного буфера предпочтительно составляет в пределах от приблизительно 6,8 до приблизительно 9,0, предпочтительно от приблизительно 6,8 до приблизительно 8,0, например приблизительно 7,8 или 7,0. Примерами буферов, которые оказывают забуферивающее действие в указанных пределах значений рН, являются, но не ограничиваются ими, HEPES, MES, ацетат натрия, трис/HCl, гидрохлорид триэтаноламина/NaOH, бицин/HCl, трицин/HCl и т.п. Предпочтительный первый промывочный буфер содержит (1) 25 мМ HEPES, pH 7,8, или (2) 25 мМ MOPS, pH 7,0, или состоит из указанных компонентов.
В соответствии с этим настоящее изобретение относится к композиции, содержащей рекомбинантное химерное анти-CD20 антитело, такое как ритуксимаб, в 25 мМ HEPES, pH 7,8. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантному гуманизованному анти-VEGF антителу, такому как бевацизумаб, в 25 мМ MOPS, pH 7,0. Такие композиции, помимо других преимуществ, могут быть получены в виде промежуточных композиций, используемых для очистки этих продуктов.
В настоящем изобретении в основном осуществляют по меньшей мере одну дополнительную или вторую стадию промывки, проводимую с использованием второго промывочного буфера. pH второго промывочного буфера предпочтительно ниже рН первого промывочного буфера, например, примерно в 2-3 раза. Так, например, pH второго промывочного буфера может составлять от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0. рН второго промывочного буфера предпочтительно составляет приблизительно 5,5. Примерами буферов, обладающих забуферивающими свойствами при рН в данном интервале значений, являются, но не ограничиваются ими, MES, уксусная кислота/ацетат натрия или NaOH, NaH2PO3/Na2HPO4, бис-трис/HCl. Предпочтительным буфером для второй промывки является MES, pH 5,5. В одном из вариантов изобретения второй промывочный буфер содержит или состоит из 19 мМ MES, 10 мМ NaCl, pH 5,50. В другом варианте изобретения второй промывочный буфер содержит или состоит из 23 мМ MES, 10 мМ NaCl, pH 5,50.
Хотя могут быть проведены дополнительные стадии промывки, однако перед элюированием нужного антитела предпочтительно проводить только первую и вторую стадии промывки. Примеси, описанные выше, удаляют из катионообменного материала в процессе проведения первой и/или второй стадии промывки. Предпочтительно большая часть примесей удаляется в первой стадии промывки.
После проведения вышеуказанной(ых) стадии(й) промывки нужное антитело элюируют из катионообменного материала. Элюирование антитела может быть достигнуто путем увеличения проводимости или ионной силы. Желательно, чтобы проводимость элюирующего буфера превышала значение примерно 10 мСм/см. Увеличение проводимости может быть достигнуто путем включения в элюирующий буфер относительно высокой концентрации соли. Репрезентативными солями, используемыми для этой цели, являются, но не ограничиваются ими, ацетат натрия, хлорид натрия (NaCl) и хлорид калия (KCl). В одном из вариантов изобретения, элюирующий буфер содержит от приблизительно 100 до приблизительно 300 мМ NaCl. Элюирующий буфер в основном имеет значение рН, приблизительно равное значению рН второго промывочного буфера. Предпочтительный элюирующий буфер содержит 19 мМ MES, 160 мМ NaCl, pH 5,5. Другой предпочтительный элюирующий буфер содержит 23 мМ MES, 175 мМ NaCl, pH 5,5. Такое элюирование предпочтительно осуществляют ступенчато (в отличие от градиентного элюирования).
Хотя после стадии элюирования проводят, но необязательно, стадию регенерации, однако в соответствии с предпочтительным вариантом изобретения эта стадия не является обязательной.
Хотя предусматривается проведение дополнительных стадий, однако предпочтительно, чтобы описанный способ катионообменной очистки состоял только из нижеследующих стадий: уравновешивания (например, с использованием уравновешивающего буфера, имеющего рН примерно 5,5), загрузки композиции, содержащей антитело и примесь(и) (например, где рН загружаемой композиции составляет примерно 5,0 или 5,5), первой стадии промывки для элюирования примесей (например, с использованием первого промывочного буфера при рН примерно 7,8 или первого промывочного буфера при рН примерно 7,0), второй стадии промывки (например, с использованием второго промывочного буфера при рН примерно 5,5), и элюирования (например, с использованием элюирующего буфера, имеющего рН примерно 5,5, и повышенную проводимость по сравнению с проводимостью буфера в каждой из предыдущих стадий элюирования антитела).
При необходимости, препарат антитела, полученный описанным в данном описании способом катионообменной хроматографии, может быть подвергнут дополнительным стадиям очистки. Другие репрезентативные стадии очистки описаны выше.
Если это необходимо, то антитело может быть конъюгировано, но необязательно, с одной или несколькими гетерологичными молекулами. Гетерологичной молекулой может быть, например, молекула, увеличивающая время полужизни антитела в сыворотке (например, полиэтиленгликоль, ПЭГ), либо такой молекулой может быть метка (например, фермент, флуоресцентная метка и/или радионуклид) или цитотоксическая молекула (например, токсин, химиотерапевтическое лекарственное средство или радиоактивный изотоп и т.п.).
TM
TM
Терапевтический препарат, содержащий антитело, конъюгированное, но необязательно, с гетерологичной молекулой, может быть получен путем необязательного смешивания антитела, имеющего нужную степень чистоты, с фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизованных композиций или водных растворов. «Фармацевтически приемлемые» носители, наполнители или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензэтония; фенолоспирт, бутиловый спирт или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (имеющие менее чем примерно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы «Zn-белок»); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN, PLURONICS или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Активные ингредиенты могут быть также заключены в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или межфазной полимеризации, например, в микрокапсулы на основе гидроксиметилцеллюлозы или желатина, и в микрокапсулы на основе полиметилметакрилата, соответственно, а также они могут быть включены в коллоидальные системы для доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Препарат, применяемый для введения in vivo, должен быть стерильным. Это может быть легко достигнуто путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
Могут быть также получены препараты с пролонгированным высвобождением. Подходящими примерами препаратов с пролонгированным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих вариант антитела, где указанные матрицы получают в виде сформованных изделий, например пленок или микрокапсул. Примерами матриц с пролонгированным высвобождением являются полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемый сополимер этилена-винилацетата, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOTTM (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота.
Очищенное антитело, описанное в настоящей заявке, или композиция, содержащая указанное антитело и фармацевтически приемлемый носитель, могут быть использованы в различных диагностических, терапевтических или других целях, в которых, как известно, применяются такие антитела и композиции. Так, например, указанное антитело может быть использовано для лечения расстройства у млекопитающего путем введения данному млекопитающему терапевтически эффективного количества такого антитела. В случае анти-CD20 антитела, такого как ритуксимаб, оно может быть использовано для истощения В-клеток, лечения лимфомы (например, неходжкинской лимфомы, НХЛ) или лейкоза (например, хронического лимфоцитарного лейкоза, ХЛЛ), а также аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (РА), рассеянный склероз (РС), волчанка и т.п. В случае антитела, которое связывается с VEGF, такого как бевацизумаб, указанное антитело может быть использовано для ингибирования ангиогенеза, лечения рака, лечения дегенерации желтого пятна и т.п.
Нижеследующие примеры приводятся в иллюстративных целях и не ограничивают объема изобретения. Описание всех работ, цитируемых в настоящей заявке, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Пример 1
Очистка анти-CD20 антитела
В данном примере описан улучшенный способ катионообменной хроматографии, применяемый для очистки анти-CD20 антитела, то есть ритуксимаба. Ритуксимаб используется для лечения НХЛ, ХЛЛ, РА, РС и т.п. Структура молекулы ритуксимаба описана в патенте 5736137, Anderson et al. (который во всей своей полноте включен в настоящее описание в качестве ссылки), а также представлена в настоящей заявке на фиг.1A-1B. Ритуксимаб является коммерчески доступным и поставляется компанией Genentech, Inc.

Катионообменная хроматография применяется для дополнительного снижения уровней CHOP, ДНК, элюированного белка A, гарамицина (GENTAMYCIN), агрегатов ритуксимаба и возможно присутствующих вирусов. Ритуксимаб связывается с колонкой в условиях загрузки. Затем колонку промывают, элюируют, регенерируют/подвергают санитарной обработке и хранят до ее использования. Для обработки всей партии аффинного пула может быть проведено множество циклов. Катионообменный пул может быть оставлен на хранение при комнатной температуре вплоть до 30°С в течение периода времени до 3 дней или при 5°С в течение периода времени до 7 дней.

Катионообменную смолу (POROS 50 HS, Applied Biosystems) упаковывают в колонку с высотой слоя 17-33 см. Перед загрузкой аффинного пула катионообменную колонку очищают от раствора для хранения уравновешивающим буфером. После уравновешивания в колонку загружают аффинный пул. В этих условиях продукт связывается с колонкой. После этого колонку промывают промывочным буфером 1, а затем промывочным буфером 2. Ритуксимаб элюируют с колонки с использованием элюирующего буфера с высокой ионной силой.
Сравнение условий, при которых осуществляют способ согласно изобретению, с условиями проведения стандартного (контрольного) способа приводится в нижеследующей таблице.
Таблица 1Сравнение буферов, используемых в способах катионообменной хроматографии для очистки ритуксимаба
Фаза
Состав буферов (стандартный способ)
Состав буферов (способ, описанный в примере)
Предварительное уравновешивание
20 мМ MES, 500 мМ NaCl, рН 5,50
-
Уравновешивание
20 мМ MES, 60 мМ NaCl, рН 5,50
19 мМ MES, 60 мМ NaCl, рН 5,50
Загрузка
Кондиционированный пул белка А, рН 5,00, Плотность загрузки ≤50 г/л смолы
Кондиционированный пул белка А, рН 5,00, Плотность загрузки ≤50 г/л смолы
Промывка 1
20 мМ MES, 60 мМ NaCl, рН 5,50
25 мМ HEPES, рН 7,80
Промывка 2
-
19 мМ MES, 10 мМ NaCl, рН 5,50
Элюирование
20 мМ MES, 160 мМ NaCl, рН 5,50
19 мМ MES, 160 мМ NaCl, рН 5,50
Регенерация
20 мМ MES, 500 мМ NaCl, рН 5,50
-
Санитарная обработка
0,5н. NaOH
0,5н. NaOH
Хранение
0,1н. NaOH
0,1н. NaOH
Желательные значения pH, проводимости и интервалов молярности для загрузочного буфера и других буферов в способе очистки ритуксимаба приводятся в нижеследующей таблице.
Описанный в примерах способ очистки ритуксимаба является более надежным для удаления белков клеток-хозяев благодаря возможности удаления большего количества белков клеток-хозяев в стадиях промывки, что приводит к снижению уровней белков клеток-хозяев в пуле продукта (в пуле элюирования) и облегчает удаление примесей в последующей стадии. На фиг.3 проиллюстрированы преимущества способа согласно изобретению в отношении удаления белков клеток-хозяев.
Пример 2
Очистка анти-VEGF антитела
В этом примере описан способ катионообменной хроматографии, применяемый для очистки рекомбинантного гуманизованного антитела против фактора роста эндотелия сосудов (анти-VEGF rhuMAb), такого как бевацизумаб. Структура молекулы бевацизумаба описана в патенте США 7169901, Presta et al., который во всей своей полноте включен в настоящее описание в качестве ссылки. См. также фиг.2A-2B, представленные в настоящем изобретении. Бевацизумаб является коммерчески доступным и поставляется фирмой Genentech, Inc.
,

В этом примере систематизированы исследования по разработке стадии катионного обмена в улучшенном способе очистки бевацизумаба. В этих исследованиях была проведена оценка трех катионообменных смол: CM SEPHAROSE FAST FLOW SP SEPHAROSE FAST FLOW и POROS 50HS. Способы катионообменной очистки, осуществляемые с использованием этих трех смол, оценивали по следующим параметрам: эффективность данного способа (удаление примесей, удаление ретровирусов и выход данной стадии), качество продукта, надежность такого способа и адаптация такого способа для его применения во всех современных отраслях промышленности. Исходя из данных, полученных в этих исследованиях, был сделан вывод, что смола POROS 50HS обладает превосходными свойствами и высокой надежностью в данном способе, а поэтому она была выбрана в качестве катионообменной смолы для осуществления улучшенного способа очистки.
Катионообменная хроматография представляет собой конечную стадию хроматографии в данном способе очистки. Она служит для удаления компонентов среды для культивирования клеток (гарамицина), примесей, происходящих от клеток-хозяев (CHOP и ДНК), и агрегированных форм бевацизумаба. Такая стадия хроматографии также позволяет удалять вирусы.

Хроматографическая колонка функционирует в режиме связывания и элюирования, и такую хроматографию осуществляют при температуре окружающей среды. В этой колонке используется катионообменная смола (POROS 50HS). Указанная смола состоит из пористого слоя носителя на основе полистиролдивинилбензола, связанного с отрицательно заряженной функциональной группой. Колонку отделяют от материала для хранения путем промывки уравновешивающим буфером. Отфильтрованный от вирусов пул может быть разведен 0,3 объема воды для инъекции (WFI) так, чтобы это удовлетворяло предельному значению проводимости ≤5,5 мСм/см. Затем отфильтрованный от вирусов пул загружают на уравновешенную колонку. Данный продукт связывается со смолой. После загрузки колонку промывают буфером с высоким pH для продувки загрузочного материала через колонку и удаления примесей CHOP. Затем колонку промывают буфером с низкой концентрацией соли для снижения pH и приготавливают колонку для элюирования. Продукт элюируют путем ступенчатого элюирования максимум 7 колоночными объемами буфера с высокой концентрацией соли. После элюирования колонку и носитель подвергают санитарной обработке дезинфицирующим раствором (0,5н. NaOH), а затем оставляют на хранение в специальном растворе для хранения (0,1н. NaOH) до их применения.
В нижеследующей таблице описаны условия проведения способа очистки бевацизумаба, описанного в настоящем изобретении.
Таблица 3Способ очистки бевацизумаба
Фаза
Буфер/раствор
Параметры способа
Скорость потока (см/час)
Высота слоя (см)
N/A
30
N/A
Уравновешивание
23 мМ MES/60 мМ NaCl, рН 5,5, конд. 6,9 мСм/см
4 колоночных объема (КО)
100
Загрузка
Кондиционированный отфильтрованный от вируса пул (VF), рН 5,5±0,2, конд. ≤5,5 мСм/см
15-45 г бевацизумаба/литр смолы
100
Промывка 1
25 мМ MOPS, рН 7,0
3 КО
100
Промывка 2
23 мМ MES/10 мМ NaCl, рН 5,5, конд. 1,5 мСм/см
3 КО
100
23 мМ MES/175 мМ NaCl, рН 5,5, конд. 18 мСм/см
7 КО
100
Элюирование
Исходный пул
OD280≥0,5
N/A
Конечный пул
OD280≤1,0
N/A
Санитарная обработка
0,5н. NaOH
3-6 КО
50-100
Хранение
0,1н. NaOH
3-6 КО
50-100
Желаемые значения pH, проводимости и интервалов молярности для загрузочного буфера и других буферов в способе очистки бевацизумаба приводятся в нижеследующей таблице.
Было обнаружено, что способ согласно изобретению является гораздо более эффективным, чем стандартный способ очистки бевацизумаба, в котором используется первый промывочный буфер с рН 5,5. Описанный в данном описании новый способ позволяет получать пулы с более низкими уровнями CHOP, и достичь более высокого постадийного выхода, и в целом является более надежным способом для его применения в промышленности.