Фармакологическая композиция на основе водорастворимых полиметаллокомплексов полигалактуроновой кислоты, стимулирующая процесс кроветворения
PHARMACOLOGICAL COMPOSITION BASED ON WATER-SOLUBLE POLYMETAL COMPLEXES OF POLYGALACTURONIC ACID, STIMULATING HEMATOPOIESIS PROCESS

Изобретение относится к фармацевтической и пищевой промышленности, а именно, к созданию лекарственных препаратов и/или биологически активных добавок (БАД), которые могут быть использованы в качестве источника минеральных веществ при микроэлементозах для лечения и профилактики анемии и оздоровления населения.
Значение микро- и макроэлементов в жизни человека настолько огромно, что требуются препараты с комплексным их содержанием, однако неорганические минералы в силу их токсичности и опасности передозировки, а также низкой биодоступности, для этой цели не пригодны. Академик А.П. Авцын [Авцын А.П. Микроэлементозы человека. М.: Медицина. 1991], объясняя ряд патологических состояний, вызванных дефицитом, избытком, или дисбалансом макро- и микроэлементов в организме, показывает, что нарушение содержания даже одного биометалла влечет за собой тотальную системную разбалансировку минерального обмена.
По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), особую актуальность имеет проблема анемии, вызванная недостаточным поступлением железа или низкой усвояемостью железа вследствие заболеваний ЖКТ, а также при кровопотерях. В группу риска входят женщины детородного возраста и дети младшей возрастной группы - даже в развитых странах они в той или иной степени страдают анемией, или малокровием [Haram K. et al. // Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 2001. Vol. 80. P. 683-688; Miyada Т., Nakajima A., Ebihara K. Iron bound to pectin is utilised by rats. // British Journal of Nutrition. 2011. V. 106, 73-78, Astrid Sigel, Helmut Sigel, and Roland K.O. Sigel // Metal Ions in Life Sciences. 2009, 6, P. 510]. Среди больных анемией отдельную группу составляют лица, страдающие хроническими и инфекционными заболеваниями (больные онкологическими заболеваниями, почечной недостаточностью, ВИЧ-инфекцией, туберкулезом и др.).
В условиях неблагоприятной экологической обстановки, с интенсификацией труда и ростом эмоциональных нагрузок, с ростом числа онкологических заболеваний и увеличением группы людей, страдающих заболеваниями ЖКТ, для поддержания нормальной жизнедеятельности, проблема микроэлементозов и анемии имеет чрезвычайную актуальность.
Вышеперечисленные факторы обуславливают необходимость создания нетоксичных биодоступных противоанемических металлокомплексов на основе органических природных соединений пищевого назначения, а именно, пектиновых полисахаридов с микро- и макроэлементами, а также препаратов на их основе.
Известны нерастворимые в воде комплексы ионов металлов с полигалактуроновой кислотой, обладающие биологическим действием на живой организм - при оральном введении в твердом виде повышающие содержание железа в сыворотке крови [SU 886750 A3, 30.11.1981].
Известна работа венгерских авторов [Е. Kuzmann, V.K. Garg, А.С. de Oliveira, Z. , K. , J. Fodor, Z. May, Z. Homonnay.  study of the effect of pH on Fe valence in iron - poly-galacturonate as a medicine for human anaemia. // Radiation Physics and Chemistry. 2015. Vol. 107. P. 195-198], в которой предложены полигалактуронаты железа, полученные на основе не стандартизованного пектина Grinsted XSS 100, не содержащего сахаров. Начальная степень метилирования пектина составляла 59.4%. Для получения железо- полигалактуронатов пектин предварительно подвергали деметилированию в щелочной среде при действии раствора NaOH, далее к полигалактуронату натрия добавляли сульфат железа (II). В работе приводятся полученные методом мессбауэровской спектроскопии данные о зависимости соотношения Fe(II)/Fe(III) в конечном комплексе от условий получения, в частности от рН раствора.
Недостатком предложенных комплексов является отсутствие растворимости в воде, что ограничивает возможности использования их в фармакологической практике.
Растворимые в воде пектиновые металлокомплексы получены авторами впервые, и растворимость их имеет принципиальное значение для биодоступности и проявления биологической активности.
На сегодняшний день известны следующие нетоксичные водорастворимые пектиновые металлокомплексы, способы получения которых разработаны авторами:
1) натрий-, кальций-, железо- полигалактуронат (ПГNaCaFe) - металлокомплекс на основе полигалактуроната натрия, являющийся перспективным высокоэффективным противоанемическим средством [RU 2281957 С1, 20.08.2006]. ПГNaCaFe содержит в составе микроэлемент железо и макроэлементы - кальций и натрий.
Железо - микроэлемент, необходимый для образования гемоглобина (красных кровяных телец), миоглобина (красный пигмент в мышцах) и некоторых ферментов. Витамин С также способствует усвоению железа, железо необходимо для правильного метаболизма витаминов группы В. Железо требуется для мышечных белков и откладывается про запас в почках и печени. В организме среднего взрослого человека весом 70 кг содержится около 4 г железа. Гемоглобин, содержащий основную часть железа, перерабатывается и используется повторно, при замене кровяных клеток каждые 120 дней. Железо, связанное с белком (ферритин) накапливается в организме. При дефиците железа начинается анемия, как правило, железодефицитная анемия (ЖДА) [Авцын А.П. Микроэлементозы человека. М.: Медицина. 1991].
Натрий - это основной ион в жидкостях организма вне клеток (внутри клеток действует калий), необходимый для поддержания водного баланса в организме, рН крови. Натрий требуется для нормальной деятельности желудка, нервной системы и мышц, он помогает сохранять кальций и другие минеральные вещества в крови в растворимом виде.
2
2+
Хлорид кальция (CaCl) - лекарственное средство, восполняющее дефицит Са. Помимо устранения гипокальциемии, кальция хлорид, уменьшает проницаемость сосудов и оказывает противоаллергическое, противовоспалительное, кровоостанавливающее действие. Раствор кальция хлорида используют при аллергических недугах, при осложнениях, вызванных приемом медпрепаратов [Мелентьева Г.А. Глава 5. Вторая группа периодической системы // Фармацевтическая химия. - 2-е изд. - Москва: Медицина, 1976. Т. 1. - 479 с].
Недостатком данного средства является отсутствие комплексного воздействия на систему эритропоэза, т.к. в составе комплекса применяется только железо, но не применяются другие микроэлементы, как кобальт и медь, необходимые для кроветворения.
12
12
12
Кобальт оказывает существенное влияние на процессы кроветворения, необходим для красных кровяных клеток. Кобальт активирует ряд ферментов, усиливает синтез белков, участвует в выработке витамина В и в образовании инсулина. Дефицит витамина В - группы кобальтсодержащих биологически активных веществ, является причиной некоторых видов анемии. Впервые это было обнаружено еще в 1934 году американским врачом - исследователем, лауреатом Нобелевской премии по физиологии и медицине Уильямом Мерфи [Скипский И.М., Радченко В.Г., Шилова Е.Р. Пернициозная анемия. Дополнение к известному. Вестник гематологии. 2008. Т. 4. №4. - С. 36-40]. При дополнительном введении витамина В терапия анемии проходит намного быстрее.
Медь используется большинством клеток в качестве составляющего ферментов, участвующих в выработке энергии (цитохромоксидаза) и в защите клеток от разрушительного действия свободных радикалов (супероксиддисмутаза). Медь связывается с протеинами в крови. Один из протеинов церулоплазмин осуществляет транспорт меди и способствует преобразованию железа в такую форму, которую можно было бы транспортировать в другие ткани. В среднем в организме содержится от 50 до 120 мг меди с основной концентрацией в печени [Авцын А.П. Микроэлементозы человека. М.: Медицина. 1991].
2) Би- и полиметаллические комплексы полигалактуроновой кислоты с использованием трех металлов - микроэлементов Fe, Cu, Co, стимулирующие процесс кроветворения [RU 2219187 С2, 20.12.2003].
Полиметаллокомплексы полигалактуроновой кислоты содержат одновременно все три микроэлемента (железо, кобальт, медь при соотношении 1:1:1), положительно влияющие на функцию кроветворения. Однако применение полиметаллокомплексов с соотношением микроэлементов Fe:Cu:Co=1:1:1 оказало токсическое влияние на организм, согласно которым при дозе 500 мг/кг, в 2-3 раза превышающей терапевтическую, ухудшается функциональное состояние животных, или их способность выполнять тестовую нагрузку в тесте «бег на третбане». Это подтверждается данными [Выштакалюк А.Б., Карасева А.Н., Карлин В.В., Минзанова С.Т., Миронов В.Ф., Коновалов А.И., Зобов В.В., Ланцова А.В., Мустафин И.Г. Токсикологическая оценка натрий-, железо-, кобальт-, медь- полигалактуроната // Токсикологический вестник. - 2006. - №6. - С. 10-15].
Недостатком данного средства является применение в составе полиметаллокомплексов повышенных дозировок меди и кобальта, поскольку физиологическая потребность организма в железе выше (таблица 1). Суточная потребность человека (по данным Института питания АМН России) составляет: в макроэлементе Са - 600-1200 мг, беременным женщинам до 2000 мг; в микроэлементах: Fe - 10-25 мг, Со - 0.1-0.2 мг, Cu - 1-2.0 мг.
Задачей изобретения является создание нового фармакологического противоанемического водорастворимого средства, устраняющего недостатки, присущие описанным аналогам, содержащего макроэлементы натрий и кальций, и одновременно три микроэлемента - железо, кобальт и медь, ответственные за гем крови, в оптимальном соотношении для лечения и профилактики анемии и оздоровления населения, не оказывающего токсического влияния на организм и расширяющего ассортимент средств указанного назначения.
Технический результат состоит в оптимальном диапазоне соотношения макро- и микроэлементов в заявляемом средстве, стимулирующем в условиях курсового применения в водорастворимой форме процессы кроветворения, при этом не проявляющем токсического действия на общее физическое состояние.
Задача решается, и указанный технический результат достигается новой композицией биоминералов пектина, не имеющей аналогов в медицине и фармации - потенциального противоанемического лекарственного препарата с комплексным (групповым) содержанием микро- и макроэлементов, благотворно действующих на функцию кроветворения, представляющего собой водорастворимую нетоксичную композицию, содержащую натрий-, железо-, кальций- полигалактуронат общей формулы I и натрий-, железо-, кобальт-, медь- полигалактуронат общей формулы II в массовом соотношении 3-12:1.
В обоих указанных металлокомплексах содержание групп COONa составляет 100%.
Способы получения натрий-, кальций-, железо- полигалактуроната (ПГNaCaFe) и натрий-, железо-, кобальт-, медь- полигалактуроната (ПГNaFeCoCu) описаны в [RU 2281957 С1, 20.08.2006] и [RU 2219187 С2, 20.12.2003] соответственно.
Заявляемую композицию получают путем перемешивания компонентов, взятых в необходимом массовом соотношении, на шаровой мельнице.
Указанное соотношение ПГNaCaFe:ПГNaFeCoCu = 3-12:1 является оптимальным, т.к. при введении животным фармакологической композиции в соотношении ПГNaCaFe:ПГNaFeCoCu менее 3:1 (1:1 и 2:1) в отдельных случаях проявляется ухудшение функционального состояния животных (их способность выполнять тестовую нагрузку в тесте «бег на третбане»), а результаты при введении животным фармакологической композиции в соотношении ПГNaCaFe:ПГNaFeCoCu более 12:1 идентичны показателям при введении натрий-, кальций-, железо- полигалактуроната.
Натрий-, кальций-, железо- полигалактуронат (ПГNaCaFe) является основным компонентом предлагаемой фармакологической композиции. Научные основы и технологические аспекты получения, а также физико-химические свойства и биологическая активность ПГNaCaFe подробно описаны в следующих публикациях: [Минзанова С.Т., Миронов В.Ф., Выштакалюк А.Б., Цепаева О.В., Миндубаев А.З., Миронова Л.Г., Зобов В.В., Ленина О.А., Ланцова А.В., Коновалов А.И. Научные основы и технологические аспекты получения полигалактуроната с ионами Са2+ и Fe2+ // Докл. АН. 2009. Т. 429. №2. С. 219-222; Минзанова С.Т., Хаматгалимов А.Р., Рыжкина И.С., Муртазина Л.И., Выштакалюк А.Б., Милюков В.А., Миронов В.Ф. и др. Синтез и физико-химические свойства противоанемических комплексов железа и кальция с полигалактуронатом натрия // Докл. АН, 2016, Т. 467. №4. с. 431-435; Minzanova S.T., Mironov V.F., Vyshtakalyuk А.В., Tsepaeva O.V., Mironova L.G., Mindubaev A.Z., Nizameev I.R., Kholin K.V., Milyukov V.A. Complexation of pectin with macro- and microelements. Antianemicactivity of Na, Fe and Na, Ca, Fe complexes // Carbohydrate Polymers, 2015. №134. P. 524-533. (doi: 10.1016/j.carbpol. 2015.07.034); Выштакалюк А.Б., Зобов B.B., Минзанова С.Т., Ланцова А.В., Миронов В.Ф., Петрова Г.Р., Зиатдинова Ф.Х., Цепаева О.В., Коновалов А.И. Противоанемическая активность водорастворимого натрий-, кальций, -железополигалактуроната // Бюлл. Экспер. Биол. и мед. 2010. №7. С. 51-53].
В рамках мероприятия «Доклинические исследования инновационных лекарственных средств» федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» проведены доклинические исследования лекарственного средства на основе Na-, Са-, Fe- полигалактуроната для лечения анемии. По результатам гематологических исследований антианемической активности Na-, Ca-, Fe- полигалактуроната в дозе 126 мг/кг и его готовой лекарственной формы (1% водный раствор Na-, Ca-, Fe- полигалактуроната) в дозе 2,5 мл/кг на модели постгеморрагической анемии кроликов.
Результаты исследования острой токсичности ПГNaCaFe позволяют отнести препарат к 6 классу относительно безвредных лекарственных веществ [Hodge Н. et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimore, 1975, 427 p.] или к IV классу мало токсичных соединений [ГОСТ 12.1.007-76]. Данные некропсии продемонстрировали, что препарат не вызывает у животных патологических изменений головного мозга, внутренних и эндокринных органов, его однократное введение не сопровождается местно-раздражающим действием в месте введения (слизистая оболочка желудка) и нарушениями гистоструктуры органов и тканей.
Кроме того, препарат обладает дополнительным гепатопротекторным действием, что важно при профилактическом приеме препарата [RU 2635762 С1, 15.11.2017]. Поскольку в состав предлагаемого соединения входят такие ценные биогенные металлы, как кальций и железо, помимо общих эффектов этих металлов препарат за счет соединения полезных свойств металлов с биологическими свойствами пектина обладает и общеукрепляющим действием.
Натрий-, железо-, кобальт-, медь- полигалактуронат (ПГNaFeCoCu) является вторым важным компонентом фармакологической композиции. Основные результаты по способу получения и фармако-токсикологической оценке ПГNaFeCoCu представлены в следующих работах [Карасева А.Н., Миронов В.Ф., Цепаева О.В., Выштакалюк А.Б., Минзанова С.Т., Карлин В.В., Миндубаев А.З. / Полиметаллокомплексы пектиновых полисахаридов и их биологическая активность // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. - 2004. - №4. - С. 33-35; Выштакалюк А.Б., Карасева А.Н., Карлин В.В., Минзанова С.Т., Миронов В.Ф., Коновалов А.И., Тихонова И.В. / Влияние натрий-, железо-, кобальт-, медь- полигалактуроната на функцию кроветворения у лабораторных животных // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. Т. 143. №1. - С. 46-48; Выштакалюк А.Б., Карасева А.Н., Карлин В.В., Минзанова С.Т., Миронов В.Ф., Коновалов А.И., Зобов В.В., Ланцова А.В., Мустафин И.Г. / Токсикологическая оценка натрий-, железо-, кобальт-, медь- полигалактуроната // Токсикологический вестник. - 2006. №6 ноябрь-декабрь. - С. 10-14].
В серии биоиспытаний на лабораторных животных (крысах) и сельскохозяйственных животных (поросятах и свиноматких) доказана выраженная противоанемическая активность ПГNaFeCoCu [Ямаев Э.И. / Фармако-токсикологическая оценка комплексов пектина с биогенными металлами и их применение при анемии поросят // Автореферат на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.04 - ветеринарная фармакология с токсикологией. - Казань, 2004].
Противоанемическое действие заявляемой фармакологической композиции проиллюстрировано на лабораторных животных (крысах) при следующих массовых соотношениях ПГNaCaFe:ПГNaFeCoCu = 3:1, 6:1, 9:1 и 12:1 (далее «фармакологическая композиция в массовом соотношении ПГNaCaFe:ПГNaFeCoCu = 3:1, 6:1, 9:1 и 12:1» будет обозначаться только указанием соответствующего соотношения), которые были получены путем перемешивания на шаровой мельнице в течение 10 минут. Общее количество макро- и микроэлементов в исходных полигалактуронатах составляет 3% масс, из них в Na-, Са-, Fe- полигалактуронате на железо приходится 0.75-1% и на кальций 2-2.5%, в Na-, Fe-, Со-, Cu- полигалактуронате на железо, кобальт и медь приходится по 1%.
Все полученные результаты обработаны методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента по сравнению с контрольной и опытной группами в программе Origin 2017.
Исследование противоанемической активности фармакологической композиции на модели фенилгидразиновой гемолитической анемии проводили в соответствии с методикой, описанной в [Иванкова Ж.Е. / Морфофункциональное состояние эритроцитов и гемоглобина лабораторных животных при анемиях и действии экдистероидсодержащей субстанции серпистен // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология. - Сыктывкар, 2007], на модели постгеморрагической анемии аналогично способу, описанному в [BY 5336 С1, 30.09.2003].
Пример 1. Исследование противоанемической активности фармакологической композиции 3:1 и 9:1 на модели фенилгидразиновой гемолитической анемии
Противоанемическая активность заявляемой композиции исследована на животных с гемолитической анемией, смоделированной путем введения фенилгидразина. Опыт проводился на 21 беспородных лабораторных крысах. Животные по методу аналогов поделены на 5 групп по 4-5 животных в каждой, средняя масса крыс по группам была: 1 группа - 295.0 г, 2 группа - 275.3 г, 3 группа - 316 г, 4 группа - 258.2 г, 5 группа - 290.5 г. Для индуцирования гемолитической анемии животным в течение трех дней подкожно вводили фенилгидразин (ФГ) в дозе 30 мг/кг (3.0% раствор из расчета 0.1 мл на 100 г массы крыс), после чего повторно исследованы гематологические показатели. После моделирования гемолитической анемии, лабораторным животным ежедневно через зонд вводили исследуемые препараты по следующей схеме:
1 группа - контроль (вода без препаратов);
2 группа - противоанемический препарат Тотема в дозе 0.12 мл/кг (содержимое ампулы разбавлено в 8.25 раз, введение в количестве 0.1 мл на 100 г массы животного);
3 группа - комплекс ПГNaCaFe в дозе 60 мг/кг в виде 3% гелеобразного раствора из расчета 0.2 мл на 100 г массы животного;
4 группа - заявляемая фармакологическая композиция 9:1 в дозе 60 мг/кг, способ введения аналогичен 3-й группе;
5 группа - заявляемая фармакологическая композиция 3:1 в дозе 60 мг/кг, способ введения аналогичен 3-й группе.
Во всех опытных группах вводили одинаковое количество железа, составляющее в расчете на массу тела 0.6 мг/кг в сутки (из расчета 50% дозы 1.3 мг/кг, рекомендуемой для лекарственных препаратов на основе сульфата железа при терапии анемии.
Для определения гематологических показателей забор крови делали из кончика хвоста в капилляры для гемометра Сали, обработанные гепарином. Образцы крови объемом 20 мкл из капилляров сразу выдували в разводящие жидкости объемом 5 мл - для определения гемоглобина в ацетонциангидрин, для определения числа эритроцитов - 0.9% NaCl. Определение показателей осуществляли сразу после разведения образцов крови: гемоглобин - гемоглобинцианидовым методом, число эритроцитов при разведении в 251 раз - путем подсчета в камере Гаряева. Содержание гемоглобина в отдельном эритроците (MCH) определяли путем расчета. Показатели крови исследовали до начала эксперимента, через сутки после последнего введения ФГ, а также через 1, 2, 3 и 5 недель. Результаты представлены в таблицах 2, 3 и 4.
Перед началом опыта были исследованы исходные гематологические показатели. Показано, что трехкратное введение ФГ не привело к статистически достоверному изменению уровня гемоглобина, причем в некоторых группах отмечена тенденция к его повышению, а в некоторых - к снижению, причем наиболее выраженное снижение гемоглобина после введения ФГ выявлено в 4 группе (таблица 2).
Отсутствие выраженного снижения гемоглобина через 24 ч после воздействия гемолитического яда при определении традиционными методами анализа гемоглобина может быть следствием завышения результатов анализа в связи с появлением в циркулирующей крови измененных форм гемоглобина (метгемоглобин, агрегаты молекул гемоглобина, мембраносвязанный гемоглобина) на фоне разрушения эритроцитов [Филиппова О.Н. Механизмы развития гемолитической анемии при экспериментальных метгемоглобинемиях. - Автореферат диссертации. Томск. Лаборатория оперативной полиграфии СГМУ. 2005. - 26 с.], что является особенностью гемолитической фенилгидразиновой анемии.
Особенностью динамики изменения гемоглобина в результате введения ФГ в контрольной группе было его постепенное увеличение ко 2-ой неделе опыта на 16.8% относительно исходных значений (отклонение от исходных значений достоверно при р<0.05 на 2 неделе). Затем наблюдалось снижение гемоглобина к 5-й неделе до уровня исходных значений (увеличение на 2.2% по сравнению с исходным значением). Динамика изменения гемоглобина в группе, получавшей препарат Тотема, не отличалась от контроля (увеличение на 14.2% ко 2-й неделе и 2.4% к 5-й).
Под действием вводимых препаратов металлокомплексов пектина наблюдали более интенсивное увеличение гемоглобина на 1 и 2 неделях при введении ПГNaCaFe (повышение на 13.7 и 17.4% соответственно) и заявляемой композиции 9:1 (повышение на 13.6 и 22.2% соответственно). Причем на 1 неделе опыта в группе, получавшей ПГNaCaFe, различия с контролем были статистически достоверными при р<0.05.
Изменение уровня гемоглобина относительно исходных значений к концу опыта (5 недель) составило: контроль - 102.2%; при введении препарата Тотема - 102.4%; при введении ПГNaCaFe - 104.3%; при введении заявляемой композиции 9:1 - 97.7%; при введении заявляемой композиции 3:1 - 109.3%.
Полученные результаты свидетельствуют о стимулирующем и компенсаторном влиянии заявляемой фармакологической композиции на эритропоэз в период компенсации после воздействия гемолитика.
Причем, увеличение уровня гемоглобина по отношению к исходным значениям при длительном применении было в группах, получавших комплекс ПГNaCaFe и фармакологическую композицию 3:1, а введение заявляемой композиции 9:1 способствует более быстрому повышению гемоглобина по сравнению с контролем и препаратом Тотема уже на 1 и 2 неделе, что обуславливает перспективность композиции 9:1 при необходимости экстренного повышения гемоглобина.
Аналогично было исследовано влияние фармакологической композиции на изменение числа эритроцитов (таблица 3) и содержание гемоглобина в эритроците (таблица 4) при фенилгидразиновой анемии. Исходные значения числа эритроцитов и содержания гемоглобина в отдельном эритроците (МСН) не различались между группами.
После 3-х дневного введения ФГ, у крыс наблюдалось значительное снижение числа эритроцитов более чем вдвое (различия во всех группах с исходными значениями статистически достоверны при р<0.001). То есть, воздействие гемолитического яда в наибольшей степени проявилось по отношению к количеству циркулирующих эритроцитов. Выявленные изменения свидетельствуют о развитии выраженной анемии (таблица 3). При этом данные таблицы показывают, что введение фармакологической композиции 3:1 позволяет сохранить число эритроцитов на уровне 58,5% к исходному значению (по сравнению с контролем 41,7%, Тотема 34,5%, ПГNaCaFe 39,5%, заявляемая композиция 9:1 - 38,4%). Указанный факт свидетельствует о меньшем токсическом действии фенилгидразина в группе, получавшей фармакологическую композицию 3:1.
Через 3 недели опыта число эритроцитов в контрольной группе составляло 88.1%, а через 5 недель - 92.9% от исходного уровня, то есть данный показатель полностью не восстанавливался.
К концу опыта (5 недель по окончании введения ФГ) различия числа эритроцитов с исходным уровнем во всех группах было статистически не достоверным. В группах, получавших ПГNaCaFe и фармакологическую композицию 9:1 и 3:1, в конце опыта (5 недель) число эритроцитов составляло 101.2, 97.7 и 98.8% по сравнению с исходным уровнем, то есть, данный показатель восстановился через 5 недель. Все исследуемые полигалактуронаты показали преимущества по действию на функцию кроветворения при фенилгидразиновой анемии по сравнению с препаратом Тотема, т.к. под его влиянием различий с контрольной группой не наблюдалось. Превышение числа эритроцитов на 5 неделе по сравнению с контролем в 4 и 5 группах было, соответственно, на 4.8 и 5.9% к исходным значениям.
Под действием ФГ значительно изменялись и параметры отдельного эритроцита: более чем вдвое увеличивалось МСН (различия с исходными значениями статистически достоверны при р<0.001) (таблица 4). Выявленные изменения свидетельствуют о смещении эритропоэза в сторону образования более юных, незрелых форм клеток, полихроматофилов с повышенным содержанием гемоглобина, либо с циркуляцией в крови измененных форм гемоглобина, в том числе мембраносвязанного.
Исследование динамики изменения МСН показало, что данный показатель почти восстанавливается к 5 неделе опыта во всех группах, тем не менее, в контрольной группе превышал исходные значения на 9.3% (таблица 4).
Под действием пектиновых комплексов на 3 неделе в группах, получавших комплекс ПГNaCaFe и фармакологическую композицию 9:1 и 3:1, МСН был ниже соответствующего контроля на 21.5, 22.2 и 17.0% к исходному соответственно. Причем в группах, получавших комплекс ПГNaCaFe и композицию 9:1, различия были статистически достоверными при р<0.001 и р<0.01 соответственно (таблица 4). То есть, комплекс ПГNaCaFe и фармакологическая композиция 9:1 являются наиболее эффективными. На 5 неделе опыта превышение уровня МСН по отношению к исходным значениям составляло: в контроле 9.3%, в группе, получавшей Тотему, - 11.1%, комплекс ПГNaCaFe - 9.3%, фармакологическая композиция 9:1 - 6.5% и композиция 3:1 - 9.1%.
Таким образом, эффективность фармакологической композиции 9:1 оказалась наиболее высокой, т.к. к концу опыта показатели крови наиболее соответствуют нормативным исходным значениям.
Пример 2. Исследование противоанемической активности фармакологической композиции 6:1, 9:1 и 12:1 на модели постгеморрагической анемии
Эксперимент был проведен на 15 самцах крыс линии Sprague Dawley в возрасте 6-7 месяцев. Животные были разделены на 4 группы: контрольная группа состояла из трех крыс, другие группы - из четырех.
Во время эксперимента животных содержали на рационе, составленном из продуктов с пониженным содержанием железа. Содержание железа в железодефицитном рационе, определенное в компонентах рациона атомно-абсорбционным методом и рассчитанное на 100 г рациона, составляло примерно 0.51 мг/100 г корма, что в 4.5 раз ниже, чем в стандартном рационе. Для моделирования постгеморрагической анемии, у животных делали кровопускание из кончика хвоста в течение трех дней объемом по 1% от массы тела, или 15-17% от общего объема кровотока, суммарный объем кровопотери составлял 45-50% от объема кровотока. Аналогичный способ моделирования анемии описан для кроликов в [BY 5336 С1, 30.09.2003]. До начала опыта (1-й день кровопускания) были исследованы исходные морфологические показатели крови и веса.
Сразу после кровопускания крысам перорально вводили фармакологическую композицию 6:1, 9:1, 12:1 в виде 3%-х водных растворов в объеме 2 мл на 100 г массы тела животного. Препараты продолжали вводить после прекращения кровопускания в течение 30 дней.
Схема эксперимента была следующая:
1 группа (контроль) - получала дистиллированную воду в объеме 2 мл/кг массы животного;
2 группа - фармакологическая композиция 6:1 (60 мг/кг);
3 группа - фармакологическая композиция 9:1 (60 мг/кг);
4 группа - фармакологическая композиция 12:1 (60 мг/кг).
Морфологические показатели крови были определены на каждый день кровопускания, а также в динамике наблюдения - на 1, 3, 7, 10 опыта при каждом заборе крови на гематологическом анализаторе Mythic 18 Vet (Orphee, Швейцария), использующий кондуктометрический и спектрофотометрический методы. Образцы крови брали из надреза кончика хвоста в одноразовые пробирки для капиллярной крови марки «ЭДТА». Для анализа использовали три основных показателя - число эритроцитов RBC, концентрация гемоглобина, гематокрит.
В результате кровопускания в течение 3-х дней и специальной диеты с пониженным содержанием железа, у крыс во всех группах наблюдается анемия, характеризующаяся снижением показателей числа эритроцитов, концентрации гемоглобина и гематокрита (таблицы 5-7).
После второго кровопускания во всех трех опытных группах были более высокие значения концентрации гемоглобина, числа эритроцитов и гематокрита по сравнению с контрольной группой (таблицы 5-7), что свидетельствует о замедлении наступления состояния анемии. По отношению к исходному уровню концентрация гемоглобина составляла 60.9, 72.6, 75.6, 67.4% в группах контроль, фармакологическая композиция 6:1, 9:1 и 12:1 соответственно (таблица 5); число эритроцитов составляло 69.7, 77.1, 79.0 и 75.0% соответственно (таблица 6), гематокрит - 67.2, 74.4, 79.6 и 73.8% соответственно (таблица 7). Повышение уровня гемоглобина, числа эритроцитов и гематокрита в контрольной группе после третьего кровопускания было обусловлено защитной реакцией организма, связанной с запуском эндогенных механизмов стимуляции эритропоэза на фоне пониженного количества циркулирующих эритроцитов и связанной с этим гипоксией.
После прекращения кровопускания отмечается возрастание исследованных показателей крови во всех группах. В контроле отмечается восстановление за счет эндогенных механизмов восстановления клеток крови. По увеличению показателей в сравнении с контролем можно оценить стимулирующее влияние исследуемой фармакологической композиции на кроветворную функцию организма животных.
На 10-й день наблюдалось наиболее выраженное повышение всех трех исследованных показателей крови под действием фармакологической композиции во всех трех исследованных соотношениях (таблицы 5-7), что свидетельствует о ее стимулирующем влиянии на восстановление клеток крови, или эритропоэз, у животных при острой кровопотере и на фоне кормления железодефицитным рационом.
Уровень гемоглобина по отношению к исходному уровню на 10 день после кровопотери в группах животных был, соответственно, 74.3% в контроле, 89.9, 87.6 и 89.2% при введении фармакологической композиции 6:1, 9:1 и 12:1 (таблица 5). Число эритроцитов по отношению к исходному уровню составило 80.4% в контроле и 94.3, 88.6 и 89.8% при введении фармакологической композиции 6:1, 9:1 и 12:1 (таблица 6). Гематокрит на 10-й день по отношению к исходным показателям составил 82.9% в контроле и 96.4, 94.9 и 94.1% при введении фармакологической композиции 6:1, 9:1 и 12:1 (таблица 7).
Пример 3. Исследование влияния фармакологической композиции 9:1 на физическую работоспособность лабораторных животных (тест «бег на третбане»)
Были проведены исследования по оценке способности лабораторных животных, получавших фармакологическую композицию, выполнять тестовую нагрузку в тесте «Бег на третбане». Методика исследования была следующей. Тест на физическую работоспособность (тест «Бег на третбане», 30 мин., 1 км/час) проводили на мышах массой 24-26 г. Исследуемые вещества (натрий-, железо-, кобальт-, медь- полигалактуронат и фармакологическая композиция 9:1 в трех разных дозах (150, 300 и 500 мг/кг) испытывали на мышах, предварительно тренированных в течение 1 недели к бегу на третбане. Вещества в соответствующих дозах вводили животным в питьевую воду в течение 4 недель. В течение экспериментального периода тест проводили 1-2 раза в неделю при заданных параметрах. Функциональные нагрузки в тесте «Бег на третбане» делает животных более чувствительными к химическому воздействию [Бобков Ю.Г. и др. Фармакологическая коррекция утомления. - М.: Медицина, 1984. - 208 с.; Рылова М.Л. Методы исследования хронического действия вредных факторов среды в эксперименте. - М.: Медицина, 1964. - С. 94-102]. Данный интегральный тест позволяет выявить возможные побочные и токсические эффекты лекарственных веществ, проявляющиеся в снижении физической работоспособности и невозможности животных выполнять тестовую нагрузку на третбане.
Показано, что в контрольной группе, не получавшей препарата ПГNaFeCoCu, все мыши безотказно выполняли тест в течение трех недель (таблица 8). Для ПГNaFeCoCu выявлен дозозависимый эффект: при дозах 150 и 300 мг/кг снижения физической работоспособности не происходит - из всех мышей, взятых в опыт (5 при дозе 150 мг/кг и 11 при дозе 300 мг/кг), все выполняли тестовую нагрузку в течение 4 недель исследования, выбывших животных нет (таблица 8). При более высокой дозе (500 мг/кг) через 2-3 недели потребления вещество начинает снижать физическую работоспособность, т.к. 31.25% животных (5 из 16) выбывали из опыта по причине отказа от выполнения тестовой нагрузки в разные промежутки времени.
В группах животных, получавших фармакологическую композицию в соотношении ПГNaCaFe:ПГNaFeCoCu менее 3:1 (1:1 и 2:1), наблюдались отдельные случаи выбывания животных при выполнении тестовой нагрузки.
В таблице 9 приведены результаты выполнения тестовой нагрузки животными, получавшими фармакологическую композицию 9:1. Из данных таблицы следует, что при введении композиции в дозах 150, 300 и 500 мг/кг все животные (5 при дозе 150 мг/кг, 11 при дозе 300 мг/кг и 5 при дозе 500 мг/кг) выполняли тестовую нагрузку, выбывших животных нет. Из этого следует, что препарат не оказывает каких-либо побочных эффектов на физическую работоспособность животных, т.е. является более безопасным по сравнению с исходным веществом ПГNaFeCoCu (соотношение Fe:Cu:Со = 1:1:1).
Аналогично, в группах животных, получавших фармакологическую композицию 3:1, 6:1, и 12:1, при выполнении тестовой нагрузки выбывших животных не было.
Таким образом, заявлено новое водорастворимое стимулирующее процессы кроветворения средство, расширяющее арсенал известных средств указанного назначения, - фармакологическая композиция, содержащая натрий-, железо-, кальций- полигалактуронат и натрий-, железо-, кобальт-, медь- полигалактуронат в массовом соотношении 3-12:1, в котором реализуется заявленный технический результат - оптимальный диапазон соотношения макро- и микроэлементов, стимулирующий в условиях курсового применения в водорастворимой форме процессы кроветворения, при этом не проявляющий токсического действия на общее физическое состояние.
Заявляемая фармакологическая композиция в указанном массовом соотношении натрий-, железо-, кальций- полигалактуроната и натрий-, железо-, кобальт-, медь- полигалактуроната, равном 3-12:1, содержит макроэлементы натрий и кальций, и одновременно три микроэлемента - железо, кобальт и медь, ответственные за гем крови, в оптимальном количестве. Фармако-токсикологическая оценка фармакологической композиции показала полное восстановление исследованных гематологических показателей крови во всех группах, получавших данный препарат при различном соотношении металлов, существенное улучшение кроветворной функции по сравнению с контрольной группой и более высокую эффективность по сравнению с препаратом Тотема. Результаты выполнения тестовой нагрузки животными, получавшими фармакологическую композицию 3-12:1, показали, что она не оказывает каких-либо побочных эффектов на физическую работоспособность животных.
Принципиальное отличие предлагаемой фармакологической композиции заключается в комплексном воздействии на систему эритропоэза, т.к. в составе имеются три микроэлемента, как железо, кобальт и медь, необходимые для кроветворения; в водорастворимости (биодоступности); а также в том, что макро- и микроэлементы связаны не с неорганическими токсичными анионами как в неорганических минералах, а с органическими ионами природного нетоксичного вещества пектина - натуральной пищевой добавки, используемой в производстве йогуртов, сметаны, перспективных для детей и для взрослых. Кроме того, пектиновые полисахариды позволяют решить проблему адресной доставки макро- и микроэлементов в кишечник, где происходит их всасывание, снижая ульцерогенный побочный эффект на желудок. Необходимо отметить, что пектиновые биополимеры обладают иммуномодулирующим, детоксикационным, радиопротекторным действием, что может обеспечить дополнительный терапевтический эффект предлагаемого лекарственного средства.