АНТИ-TIM3 АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTI-TIM3 ANTIBODIES AND METHODS FOR USING THEM

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к анти-TIM3 антителам и к способам их применения.
Предпосылки создания изобретения
TIM3 - белок человека, принадлежащий к суперсемейству иммуноглобулинов и к семейству TIM-белков. У людей, и сходным образом у мышей, TIM3 экспрессируется на Т-клетках, а также на фагоцитах, например, макрофагах и дендритных клетках. Связывание TIM3 с белковым лигандом (например, галектином-9) может ингибировать ответ Th1 через механизм индукции апоптоза, и, следовательно, приводит к индукции периферийной толерантности. Снижение экспрессии TIM3 человека с помощью малой интерферирующей РНК (siRNA) или ингибирование TIM3 человека блокирующим антителом увеличивает секрецию интерферона альфа CD4-положительными Т-клетками, поддерживая ингибирующую роль TIM3 в Т-клетках человека. В фагоцитах TIM3 также функционирует в качестве рецептора для распознавания апоптозных клеток. Анализ клинических образцов от пациентов с аутоиммунными заболеваниями не показывает экспрессии TIM3 в CD4-положительных клетках. В частности, в клонах Т-клеток, полученных из спинномозговой жидкости пациентов с рассеянным склерозом, уровень экспрессии TIM-3 был ниже, а уровень секреции IFN-гамма был выше, чем у клонов, полученных от нормальных здоровых людей (Koguchi с соавт., J Exp Med. 203, 2006, сс. 1413-1418).
Имеются сообщения о связи TIM3 с аллергическими заболеваниями или астмой (WO 96/27603 и WO 2003/063792).
Согласно анализу на микрочипах гематопоэтических стволовых клеток при остром миелоидном лейкозе (acute myeloid leukemia - AML) и нормальных гематопоэтических стволовых клеток, TIM3 экспрессируется на стволовых клетках AML, и поэтому анализ предполагает участие TIM3 в случаях злокачественных заболеваний крови (Majeti с соавт., PNAS, 106, 2009, 3396-3401 и WO 2009/091547).
К примерам анти-TIM3 моноклональных антител относят моноклональное антитело крысы против TIM3 человека (клон 344823, фирма R&D Systems) и моноклональное антитело мыши против TIM3 человека (клон F38-2E2, фирма R&D Systems). В WO 0201/06490 описывают анти-TIM3 антитела, которые проявляют быструю интернализацию, а также их иммуноконъюгаты для лечения рака и уменьшения воспаления. В US 2012/189617 описывают анти-TIM3 антитела, которые проявляют повышенную эффекторную активность, например, антителозависимую клеточную цитотоксичность (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC) для заболеваний, связанных с клетками, экспрессирующими TIM3 человека.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение предусматривает анти-TIM3 антитела и способы их применения.
Одним из объектов настоящего изобретения является выделенное антитело, которое связывается с TIM3, причем антитело:
- индуцирует интернализацию TIM3 (по данным анализа FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3 (ATCCCCL-155™)), по меньшей мере, на 45% после 120 мин при 37°С.
Другим объектом настоящего изобретения является анти-TIM3 антитело, которое:
- конкурирует за связывание с TIM3 с анти-Tim3-антителом, включающим VH SEQ ID NO: 7 и VL SEQ ID NO: 8,
- связывается с TIM3 человека и макака крабоеда,
- проявляет иммуноконъюгирующую цитотоксическую активность в отношении клеток, экспрессирующих TIM3,
- индуцирует высвобождение интерферона гамма.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-TIM3 антителом по настоящему изобретению является моноклональное антитело.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-TIM3 антителом по настоящему изобретению является антитело человека, гуманизированное или химерное антитело.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-TIM3 антителом по настоящему изобретению является фрагмент антитела, который связывается с TIM3.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-TIM3 антителом по настоящему изобретению является Fab-фрагмент.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-TIM3 антитело по настоящему изобретению включает:
A) (а) домен VH, включающий гипервариабельные области (HVR) (i) HVR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и (iii) HVR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Б) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и (iii) HVR-H3 Содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
B) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Г) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 и (iii) HVR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, или
Д) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 23, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, или
Е) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 31, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, или
Ж) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38 и (iii) HVR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 39, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (ii) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, или
З) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46 и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 47, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49. и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, или
И) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54 и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 55, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, или
К) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62 и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 63, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66.
Настоящее изобретение также предусматривает выделенное антитело, которое связывается с TIM-3 человека, причем антитело содержит (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
Настоящее изобретение также предусматривает выделенное антитело, которое связывается с TIM3 человека, причем антитело включает
i) последовательность VH SEQ ID NO: 79 и последовательность VL SEQ ID NO: 80, или
ii) последовательность VН SEQ ID NO: 81 и последовательность VL SEQ ID NO: 82.
Настоящее изобретение также предусматривает выделенное антитело, которое связывается с TIM3 человека, причем антитело включает (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 39, и (б) домен VL, содержащий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42.
Настоящее изобретение также предусматривает выделенное антитело, которое связывается с TIM3 человека, причем антитело включает
i) последовательность VH SEQ ID NO: 83 и последовательность VL SEQ ID NO: 84, или
ii) последовательность VH SEQ ID NO: 85 и последовательность VL SEQ ID NO: 86.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-TIM3 антитело по настоящему изобретению является антителом IgG1 полной длины.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-TIM3 антитело по настоящему изобретению является антителом IgG1 полной длины с мутациями L234A, L235A и P329G (нумерация по индексу EU по Kabat).
Другим объектом настоящего изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по настоящему изобретению.
Другим объектом настоящего изобретения является иммуноконъюгат, включающий антитело по настоящему изобретению и цитотоксический агент.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в таком иммуноконъюгате цитотоксическим агентом является экзотоксин A Pseudomonas или аматоксин.
Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтический состав, включающий антитело по настоящему изобретению или иммуноконъюгат по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Другим объектом настоящего изобретения является антитело по настоящему изобретению или иммуноконъюгат по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
Другим объектом настоящего изобретения является антитело по настоящему изобретению или иммуноконъюгат по настоящему изобретению для применения в лечении рака.
Другим объектом настоящего изобретения является применение антитела по настоящему изобретению или иммуноконъюгата по настоящему изобретению при получении лекарственного средства.
Другим объектом настоящего изобретения является применение антитела по настоящему изобретению или иммуноконъюгата по настоящему изобретению при получении лекарственного средства для лечения рака.
Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения больного раком индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по настоящему изобретению или иммуноконъюгата по настоящему изобретению.
Анти-TIM3 антитела по настоящему изобретению проявляют очень ценные свойства, например, быструю и сильную интернализацию на TIM3-экспрессирующих раковых клетках, сильную цитотоксическую активность в качестве иммуноконъюгата (например, при конъюгации с экзотоксинами Pseudomonas или аматоксинами). В связи с этим они применимы для лечения различных онкологических заболеваний, особенно рака крови, например, лейкозов и лимфом. Кроме того, они показывают интенсивное выделение иммуностимулирующих цитокинов в реакции смешанных лимфоцитов (Mixed Lymphocyte Reaction - MLR), что делает их применимыми для иммуностимулирующего лечения рака. Кроме того, версии гуманизированных антител проявляют улучшенную завязываемость при наличии связывающей специфичности с CD4-Т-клеткам по сравнению с исходными антителами.
Краткое описание фигур
Фиг. 1А. Определение методом сортировки клеток по флуоресценции (FACS - fluorescence activated cell sorting) зависимости от времени интернализации анти-TIM3 антитела Tim3_0022 (сокращенное обозначение «TIM3 Ab(022)»), интернализованного на экспрессирующих TIM3 человека (huTIM3) клетках rec CHOK1, после инкубирования при 37°C.
Фиг. 1Б. Результаты интернализации, полученные методом FACS, показывают, что Fab-фрагмент анти-TIM3 антитела Tim3_0022 (сокращенное обозначение антитела «TIM3 Ab(022)»), интернализуется на экспрессирующих TIM3 человека (обозначение «huTIM3») клетках rec CHOK1 после инкубирования при 37°C с кинетикой, схожей с кинетикой IgG полного формата.
Фиг. 2А. Связывание анти-TIM3 антител с клетками RPMI-8226 (обозначение антитела «клон 0016» относится к антителу Tim3_0016, «клон 0018» относится к варианту антитела Tim3_0016 (антитело Tim3_0018), «клон 0022» относится к антителу Tim3_00122, и т.д.).
Фиг. 2Б. Связывание анти-TIM3 антител с клетками Пфейффера (обозначение антитела «клон 0016» относится к антителу Tim3_0016, «клон 0018» относится к варианту антитела Tim3_0016 (антитело Tim3_0018), «клон 0022» относится к антителу Tim3_00122, и т.д.).
Фиг. 3. Уровень экспрессии TIM-3 на образцах клеток от разных пациентов с AML, полученные методом FACS с применением анти-TIM-3 моноклональных антител (mAb).
Фиг. 4. Прямое сравнение связывания TIM3-антител с разными мононуклеарными клетками периферической крови (моноцитами, клетками NK, Т-клетками, CD4 Т-клетками):
Фиг. 4А: % положительных клеток, с которыми связывается вариант Tim3_0016 (антитело Tim3_0018) и гуманизированные версии.
Фиг. 4Б: Средняя интенсивность флуоресценции - связывание варианта Tim3_0016 (антитело Tim3_0018) и гуманизированных версий с разными мононуклеарными клетками периферической крови.
Фиг. 4В: % положительных клеток, с которыми связывается Tim3_0028, а также химерные и гуманизированные версии.
Фиг. 4Г: Средняя интенсивность флуоресценции - связывание Tim3_0028, а также химерных и гуманизированных версий, с разными мононуклеарными клетками периферической крови.
Подробное описание вариантов осуществления настоящего изобретения
I. Определения
Понятие «акцепторный каркас человека» по настоящему изобретению представляет собой каркас, содержащий аминокислотную последовательность каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), производных от каркаса иммуноглобулина человека или каркаса консенсусной последовательности человека, согласно описанному ниже. Акцепторный каркас человека, «производный от» каркаса иммуноглобулина человека или каркаса консенсусной последовательности человека, может содержать одну и ту же аминокислотную последовательность или может включать изменения аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения количество аминокислотных изменений составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность акцепторного каркаса VL идентична последовательности каркаса VL иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркаса человека, (обозначить зародышевые линии, если это необходимо)
-8
-8
-13
-9
-13
Понятия «анти-TIM3 антитело» и «антитело, которое связывается с TIM3» относятся к антителу, которое способно связывать TIM3 с такой аффинностью, что антитело становится применимым в качестве диагностического и/или терапевтического агента, нацеливающегося на TIM3. В одном варианте осуществления настоящего изобретения степень связывания анти-TIM3 антитела с неродственным белком, не являющимся TIM3, составляет примерно менее 10% от связывания антитела с TIM3 по данным измерения, например, методом поверхностного плазмонного резонанса (например, BIACORE). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий белок, который связывается с TIM3 человека, имеет величину KD аффинности для связывания с TIM3 человека ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10 М или менее, например от 10 М до 10 М, например, от 10 М до 10 М). В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения соответствующее значение KD аффинности определяют методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием внеклеточного домена (Extracellular domain - ECD) TIM3 человека (TIM3-ECD) для аффинности TIM3.
Понятие «антитело» в контексте настоящего изобретения используют в самом широком смысле, охватывая разные структуры антител, включая, но ими не ограничиваясь, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют требуемую антигенсвязывающую активность.
2
Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличающейся от интактного антитела тем, что она представляет часть исходного антитела, связывающую антиген, с которым связывается исходное антитело. К примерам фрагментов антитела относят, но ими перечень не ограничивается, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'), диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) мультиспецифичные антитела, сформированные из фрагментов антител.
Понятие «антитело, которое связывает тот же эпитоп», что и контрольное антитело, относится к антителу, которое блокирует связывание контрольного антитела с его антигеном в конкурентном исследовании на 50% или более, и, напротив, контрольное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в конкурентном исследовании на 50% или более. Пример конкурентного исследования предусмотрен в настоящем изобретении.
Понятие «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит от определенного источника или вида, хотя оставшаяся часть тяжелой и/или легкой цепи происходит от другого источника или вида.
1
2
3
4
1
2
Понятие «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, расположенной на тяжелой цепи антитела. Имеется пять больших классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, причем некоторые из них могут быть дополнительно поделены на подклассы (изотипы), например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA и IgA. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие разным классам иммуноглобулинов, называют α, δ, ε, γ и μ, соответственно.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
Понятие «цитотоксический агент» в контексте настоящего изобретения относится к веществу, которое ингибирует или предупреждает осуществление клеточной функции и/или вызывает гибель клеток или их деструкцию. К цитотоксическим агентам относят, но ими перечень не ограничивают, радиоактивные изотопы (например, At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические агенты или лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды винка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркаляторы), ингибиторы роста, ферменты и их фрагменты, например, нуклеотические ферменты, антибиотики, токсины, например, низкомолекулярные токсины или токсины с энзиматической активностью бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, включая фрагменты и/или их варианты, а также различные противоопухолевые или противораковые агенты, описываемые ниже.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения понятие «цитотоксический агент» относится к экзотоксину А Pseudomonas (или его вариантам), описанным в WO 2005052006, WO 2007016150, WO 2007014743, WO 2007031741, WO 200932954, WO 201132022, WO 2012/154530 и WO 2012/170617, Liu с соавт., PNAS, 109, 2012, сс. 11782-11787, Mazor с соавт., PNAS, 111, 2014, сс. 8571-8576, Alewine с соавт., Mol Cancer Ther., 2014, сс. 2653-2661 В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения понятие «экзотоксин A Pseudomonas» означает аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 69 или SEQ ID NO: 70 (их получение также описано Mazor с соавт., PNAS, 111, 2014, сс. 8571-8576, Alewine с соавт., Mol Cancer Ther., 2014, сс. 2653-2661).
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения понятие «цитотоксический агент» означает аматоксин (или его варианты) согласно описанию, например, WO 2010/115630, WO 2010/115629, WO 2012/119787, WO 2012/041504 и WO 2014135282, предпочтительные варианты описаны в WO 2012/041504 (например, конъюгированные через 6' С-атом аминокислоты 4 аматоксина, особенно через атом кислорода, связанный с 6' С-атомом аминокислоты аматоксина, где TIM3 антитело соединено линкером через молекулу мочевины) и WO 2014135282.
Понятие «эффективное количество» агента, например фармацевтического состава, относят к такому количеству, которое в определенных дозах и на протяжении определенного времени, позволяет достичь требуемого терапевтического или профилактического результата.
Понятие «Fc-область» по настоящему изобретению применяют для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит, по меньшей мере, часть константной области. Это понятие включает нативные последовательности Fc-областей и вариантов Fc-областей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Fc-область тяжелой цепи IgG человека располагается от Cys226 или от Pro230 до С-конца тяжелой цепи. Однако, C-концевой лизин (Lys447) Fc-области может быть или может отсутствовать. Если не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или в константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой индексом EU, в соответствии с описанием Kabat с соавт. в кн.: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Bethesda MD, 1-3, 1991, cc. 91-3242.
Понятие «каркасный участок (Framework - FR)» относят к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельной области. (hypervariable region - HVR). FR вариабельного домена в целом состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно возникают в следующей последовательности в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Понятия «антитело полной длины», «интактное антитело» и «целое антитело» в контексте настоящего изобретения применяют взаимозаменяемо по отношению к антителу, имеющему в существенной степени схожую структуру со структурой нативного антитела или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc-область согласно описанному в настоящем изобретении.
Понятия «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток- хозяев» в контексте настоящего изобретения применяют взаимозаменяемо и относят к клеткам, в которые интродуцируют экзогенную нуклеиновую кислоту, в том числе к потомству таких клеток. К клеткам-хозяевам относят «трансформантов» и «трансформированные клетки», к которым относят первично трансформированные клетки и полученное от них потомство, независимо от числа пассажей. По составу нуклеиновых кислот потомство может быть полностью идентично исходным клеткам, но может также содержать мутации. Мутантное потомство, имеющее ту же функцию или биологическую активность, которую искали или отбирали в первоначально трансформированных клетках, также относят к данным понятиям.
Понятие «антитело человека» является антителом, аминокислотная последовательность которого соответствует последовательности антитела, вырабатываемого в организме человека или происходящего от клеток человека, или происходящее от другого источника, в котором задействован спектр антител человека или другие последовательности, кодирующие антитела человека. Такое понятие «антитело человека» исключает гуманизированное антитело, содержащее не связанные с человеческим антигеном остатки.
Понятие «консенсусный каркас человека» означает каркас, в который входят наиболее часто встречающиеся остатки аминокислот при выборе последовательностей каркасных областей VL или VH иммуноглобулина человека. Обычно выбор последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека производят из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Обычно подгруппа последовательностей представляет подгруппу по системе Kabat с соавт. в кн.: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Bethesda MD, 1-3, 1991, cc. 91-3242. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения для VL выбор производят из подгруппы каппа I (по Kabat с соавт., 1991, см. ссылку выше). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения для VH выбор производят из подгруппы III (по Kabat с соавт., 1991, см. ссылку выше).
Понятие «гуманизированное антитело» относится к химерному антителу, включающему аминокислотные остатки из гипервариабельных областей (HVR) и аминокислотные остатки из FR человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированное антитело может включать по существу все, по меньшей мере, из одного, обычно двух, вариабельных доменов, в которых все или в существенной степени все из HVR (например, CDR) соответствуют тем HVR из антитела, не являющегося антителом человека, и всем или практически всем из FR, соответствующим FR антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно может включать, по меньшей мере, часть константной области антитела, производной от антитела человека. Понятие «гуманизированная форма» антитела, например, антитела не человека, а другого вида, относится к антителу, которое претерпело гуманизирование.
Понятие «гипервариабельная область (hypervariable region - HVR») в контексте настоящего изобретения относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, последовательность которых гипервариабельна («область, определяющая комплементарность (complementarity determining region - CDR»)), и/или которые формируют структурно выраженные петли («гипервариабельные петли»), и/или содержат остатки контакта с антигеном («антигенные контакты»). Обычно антитела включают шесть HVR - три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). К примерам HVR по настоящему изобретению относятся:
(а) гипервариабельные петли, происходящие из аминокислотных остатков 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia, Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917),
(б) CDR, происходящие из аминокислотных остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (Н3) (Kabat с соавт. в кн.: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Bethesda MD, 1-3, 1991).
(в) антигенные контакты, происходящие из аминокислотных остатков 27с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum с соавт., J. Mol. Biol. 262, 1996, cc. 732-745), и
(г) комбинации (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).
Если не указано иначе, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) в настоящем изобретении нумеруют по Kabat с соавт.(ссылка приведена выше).
Понятие «иммуноконъюгат» означает антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичными молекулами, в том числе цитотоксический агент, но не только его. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгатом является анти-TIM3 антитело по настоящему изобретению, конъюгированное с одним или несколькими цитотоксическими агентами (предпочтительно с экзотоксином A Pseudomonas или с аматоксином).
Понятия «индивидуум» или «субъект» означает млекопитающее. К млекопитающим относятся, но ими перечень не ограничивается, домашние животные (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматы (например, люди и другие приматы, например, обезьяны), кролики и грызуны (например, мыши и крысы). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения индивидуумом или субъектом является человек.
Понятие «выделенное» антитело означает антитело, которое отделено от компонентов его естественной окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело очищают до чистоты больше чем 95% или 99%, что подтверждают, например, методами электрофореза (например, методом SDS-PAGE), изоэлектрического фокусирования (isoelectric focusing - IEF), капиллярного электрофореза или хроматографически (например, ионообменной или обратно фазовой ВЭЖХ). Обзор по методам контроля чистоты антител см., например, Flatman с соавт., J. Chromatogr. В 848, 2007, сс. 79-87.
Понятие «выделенная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая отделена от компонентов ее естественной окружающей среды. Выделенная нуклеиновая кислота представляет молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно или локализована на хромосоме, отличающейся от природной хромосомной локализации.
Понятие «выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая анти-TIM3 антитело» относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим тяжелую и легкую цепи антитела (или их фрагменты), в том числе указанную молекулу (молекулы) такой нуклеиновой кислоты в едином векторе или в разных векторах, и такая молекула (молекулы) нуклеиновой кислоты присутствуют в одном или нескольких локализациях в клетке-хозяине.
Понятие «моноклональное антитело» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, полученному от популяции в значительно степени гомогенных антител, т.е. отдельных антител, составляющих популяцию, которые идентичны и/или связывают один и тот же эпитоп, исключая возможные варианты антител, например, содержащие природные мутации или возникающие при получении моноклонального антитела, такие варианты обычно присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлонального антитела, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклонального антитела направлено против одного детерминанта на антигене. Таким образом, определение модифицированного «моноклонального» антитела указывает на характер антитела, получаемого из высоко гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться в качестве получения антитела каким-либо определенным методом. Например, моноклональные антитела по настоящему изобретению могут быть получены разными методами, включая, но ими не ограничиваясь, метод гибридом, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы с использованием трансгенных животных, содержащих целый локус иммуноглобулина человека или его часть, указанные методы и другие методы получения моноклональных антител описаны в настоящем изобретении.
Понятие «голое антитело» означает антитело, которое не конъюгировано с гетерологичной частью молекулы (например, с цитотоксической частью молекулы) или радиометкой. Голое антитело может находиться в фармацевтическом составе, (включить, если в предшествующем уровне есть иммуноконъюгаты).
Понятие «нативное антитело» означает природные молекулы иммуноглобулина разной структуры. Например, нативные антитела IgG являются гетеротетрамерными гликопротеинами массой примерно 150000 Да, состоящими из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые связаны дисульфидной связью. От N- к С-концу каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (VH), также называемую вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, затем тремя константными доменами (CH1, СН2 и СН3). Сходным образом от N- к С-концу каждая легкая цепь содержит вариабельную область (VL), также называемую вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, затем константным легким доменом (CL). Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), основанных на аминокислотной последовательности ее константного домена.
Понятие «листок-вкладыш» применяют для обозначения инструкций, которые обычно включают в коммерческие упаковки лекарственных средств для обеспечения информацией о назначениях, применении, дозах, способе введения, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или возможных побочных эффектах от применения лекарственных средств.
Понятие «процент идентичности аминокислотной последовательности (%)» применительно к контрольной полипептидной последовательности выражают в виде процента аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны по аминокислотным остаткам в контрольной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и интродукции гэпов, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и не рассматривают какие-либо консервативные замещения в качестве части идентичности последовательностей. Выравнивание для определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто разными способами, известными специалистам в данной области, например, используя общедоступное компьютерное обеспечение, например, BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (фирма DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, в том числе какие-либо алгоритмы, требуемые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения процент идентичности аминокислотных последовательностей определяют, используя для сравнения компьютерную программу ALIGN-2. Компьютерная программа сравнения последовательностей ALIGN-2 разработана фирмой Genentech, причем исходная программа подана с документацией в Бюро по защите авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, и зарегистрирована под номером U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программу ALIGN-2 предоставляет фирма Genentech, Южный Сан-Франциско, Калифорния, или она может быть скомпилирована из исходного кода. Программу ALIGN-2 следует скомпилировать для использования в операционной системе UNIX, включая цифровую систему UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливают программой ALIGN-2 и не изменяют.
В ситуациях, когда ALIGN-2 используют для сравнения аминокислотных последовательностей, процент идентичности данной аминокислотной последовательности А в отношении, вместе или против данной аминокислотной последовательности Б (которая в противоположном варианте может быть представлена как данная аминокислота последовательность А, которая имеет определенный процент идентичности аминокислотной последовательности в отношении, вместе или против данной аминокислотной последовательности Б) рассчитывают следующим образом:
100 раз фракция X/Y
где X означает количество аминокислотных остатков, определенных в качестве идентичных совпадений с помощью программы выравнивания последовательности ALIG-2 для выравнивания последовательностей А и Б, где Y означает общее количество аминокислотных остатков в Б. Следует учитывать, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности Б, процент идентичности аминокислотной последовательности А относительно Б не будет равным проценту идентичности аминокислотной последовательности Б по отношению к А. Если специально не указано иначе, все величины процентов аминокислотной идентичности в настоящем изобретении определяют в соответствии с описанием в предыдущем параграфе, используя компьютерную программу ALIGN-2.
Понятие «фармацевтический состав» относится к препарату, который находится в такой форме, которая позволяет проявить биологическую активность содержащегося в нем действующего ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, которые неприемлемо токсичны для субъекта, которому могут вводить состав.
Понятие «фармацевтический приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, не являющемуся действующим ингредиентом, который не токсичен для субъекта. К фармацевтически приемлемым носителям относят, но ими перечень не ограничивают, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
Понятие «TIM3» в контексте настоящего изобретения относят к какому-либо нативному белку Т-клеточного иммуноглобулин и домена 3 муцина (также называемому клеточным рецептором 2 вируса гепатита A (hepatitis A virus cellular receptor 2 (HAVcr-2)), молекуле повреждения почки-3 (kidney injury molecule-3 - KIM-3), TIM-3, Tim3 или Tim-3) от какого-либо позвоночного животного, в том числе от млекопитающего, например, от приматов (например, людей) и грызунов (например, мышей и крыс), если не указано иначе. Понятие охватывает «полную длину» непроцессированного TIM3, а также какую-либо форму TIM3, полученную в результате процессинга в клетке. Понятие также охватывает природные варианты TIM3, например, сплайсированные варианты или аллельные варианты. Аминокислотная последовательность примера TIM3 человека представлена в виде SEQ ID NO: 77. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена (Extracellular Domain - ECD) TIM3 представлена в виде SEQ ID NO: 78.
TIM3 является белком человека, который принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов и к семейству белков TIM. У людей, подобно тому, что наблюдают у мышей, TIM3 экспрессируется на Т-клетках, а также на фагоцитарных клетках, например, на макрофагах и дендритных клетках. Связывание TIM3 с белковым лигандом (например, галектином-9) может ингибировать Th1-ответ через механизм индукции апоптоза и, следовательно, приводить к индукции периферийной толерантности. Снижение экспрессии TIM-3 человека с помощью siRNA или ингибирование TIM3 человека блокирующим антителом увеличивает секрецию интерферона альфа из CD4-положительных Т-клеток, поддерживая ингибирующую роль TIM3 в Т-клетках человека. В фагоцитах TIM3 также функционирует в качестве рецептора распознавания апоптозных клеток. Анализ клинических образцов от пациентов с аутоиммунными заболеваниями не показал экспрессии TIM3 в CD4-положительных клетках. В частности, в клонах Т-клеток, полученных из спинномозговой жидкости пациентов с рассеянным склерозом, уровень экспрессии TIM3 ниже, а уровень секреции IFN- выше, чем у клонов, полученных от нормальных здоровых индивидуумов (Koguchi с соавт., J Exp Med. 203, 2006, сс. 1413-1418).
Имеются сообщения о связи TIM-3 с аллергическими заболеваниями или астмой ((WO 96/27603 и WO 2003/063792).
Согласно анализу на микрочипах гематопоэтических стволовых клеток при остром миелоидном лейкозе (acute myeloid leukemia - AML) и нормальных гематопоэтических стволовых клеток, TIM3 экспрессируется на стволовых клетках AML, и поэтому анализ предполагает участие TIM3 в злокачественных нарушениях кроветворения (Majeti с соавт., PNAS, 106, 2009, сс. 3396-3401, WO 2009/091547).
К примерам анти-TIM3 моноклональных антител относятся моноклональное антитело крысы против TIM3 человека (клон 344823, фирма R&D Systems) и моноклональное антитело мыши против TIM3 человека (клон F38-2E2, фирма R&D Systems).
В контексте настоящего изобретения понятие «лечение» (и грамматические вариации, например, «лечить» или «подвергаемый лечению») относится к клиническому вмешательству для изменения естественного состояния индивидуума, подвергаемого лечению, и может быть осуществлено или для профилактики, или в ходе развития клинической патологии. К желательным последствиям лечения относят, но ими перечень не ограничивают, предотвращение возникновения или рецидива заболевания, ослабление симптомов заболевания, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазов, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или ослабление состояние больного, ремиссию или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению применяют для отсрочки развития заболевания или для снижения прогрессирования заболевания.
Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, которая участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, каждый домен включает четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (HVR). (См., например, Kindt с соавт. в кн.: «Kuby Immunology», 6-е изд., W.H. Freeman и Co., Нью-Йорк, 2007, с. 91). Один домен VH или VL может быть достаточным для антигенсвязывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связывают определенный антиген, могут быть выделены с использованием домена VH или VL из антитела, которое связывает антиген для скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH, соответственно (см., например, Portolano с соавт., J. Immunol. 150, 1993, сс. 880- 887, Clackson с соавт., Nature 352, 1991, сс. 624-628).
Понятие «вектор» в контексте настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной размножать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Понятие включает вектор в качестве самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, инкорпорированный в геном клетки-хозяина, в которую они интродуцированы. Определенные векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы в контексте настоящего изобретения называют «векторами экспрессии».
II. Композиции и методы
Один из объектов настоящего изобретение основывается, в частности, на выяснении того обстоятельства, что выбранные анти-TIM3 антитела по настоящему изобретению связываются с определенными эпитопами TIM3, проявляя сильную и быструю интернализацию и/или высокий уровень цитотоксической активности против раковых клеток в качестве иммуноконъюгата и/или проявляя высвобождение иммуностимулирующего цитокина (например, интерферона гамма). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают антитела, которые связываются с TIM3. Антитела по настоящему изобретению применяют, например, для диагностики или лечения рака.
А. Примеры анти-TIM3 антител
В одном из объектов осуществления настоящего изобретения предусматривают антитела, связывающиеся с TIM3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, которое:
• Индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3 (АТСС CCL-155™)), по меньшей мере, на 45% через 120 мин при 37°C (см. пример 6).
• В одном из объектов настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3 (АТСС CCL-155™)), по меньшей мере, на 50% через 120 мин при 37°C (см. пример 6).
• В одном из объектов настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3 (АТСС CCL-155™)), по меньшей мере, на 55% через 120 мин при 37°C (см. пример 6).
• В одном из объектов настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3 (АТСС CCL-155™)), по меньшей мере, на 60% через 240 мин при 37°C (см. пример 6).
• В одном из объектов настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3 (АТСС CCL-155™)), по меньшей мере, на 65% через 240 мин при 37°C (см. пример 6).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, которое:
• конкурирует за связывание с TIM3 с анти-Tim3 антителом, включающим VH и VL Tim3_0016,
• связывается с TIM3 человека или макака крабоеда,
• проявляет в качестве иммуноконъюгата цитотоксическую активность на TIM3-экспрессирующих клетках (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат обладает относительной величиной IC50 цитотоксической активности в качестве конъюгата с экзотоксином А Pseudomonas на клетках RPMI-8226, равной 0,1 или меньше (см. измерение в примере 11),
• индуцирует высвобождение интерферона гамма (анализ MLR, см. пример 5).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (г) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, или HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (д) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (е) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, или HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, или HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (e) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три VH HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (iii) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, содержащий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности VL HVR, выбранные из (i) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, или HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, или HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и (в) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, содержащий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, или HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, или HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, содержащий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает (а) домен VH, содержащий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, содержащий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает (а) домен VH, содержащий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, содержащий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое анти-TIM3 антитело включает
i) последовательность VH SEQ ID NO: 7 и последовательность VL SEQ ID NO: 8,
ii) последовательность VH SEQ ID NO: 9 и последовательность VL SEQ ID NO: 10,
iii) или гуманизированный вариант последовательности VH и VL антитела по пунктам i) или ii).
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения такое анти-TIM3 антитело включает
i) последовательность VH SEQ ID NO: 79 и последовательность VL SEQ ID NO: 80, или
ii) последовательность VH SEQ ID NO: 81 и последовательность VL SEQ ID NO: 82.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, которое связывается с TIM3 антителом человека, причем антитело включает VH последовательность SEQ ID NO: 79 и VL последовательность SEQ ID NO: 80.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, которое связывается с TIM3 антителом человека, причем антитело включает VH последовательность SEQ ID NO: 81 и VL последовательность SEQ ID NO: 82.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (г) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (г) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три VH HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (iii) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и (б) домен VL, включающий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности VL HVR, выбранные из (i) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (ii) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (iii) HVR-L3, представляющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и (iii) HVR-Н3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и (б) домен VL, содержащий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое анти-TIM3 антитело включает
i) последовательность VH SEQ ID NO: 19 и последовательность VL SEQ ID NO: 20,
ii) или гуманизированный вариант VH и VL антитела по пункту i).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (г) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, (д) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и (е) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В одном из объектов настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, включающий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три VH HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и (iii) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (б) домен VL, содержащей, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности VL HVR, выбранные из (i) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, (ii) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 и (iii) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (б) домен VL, содержащую (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое анти-TIM3 антитело включает:
i) последовательность VH SEQ ID NO: 27 и последовательность VL SEQ ID NO: 28,
ii) или гуманизированный вариант VH и VL антитела по пункту i).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, (г) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, (д) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (е) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
В одном из объектов настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три VH HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и (iii) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и (б) домен VL, включающий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности VL HVR, выбранные из (i) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, (ii) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 и (iii) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, включающий (i) HVR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 31, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое анти-TIM3 антитело включает
i) последовательность VH SEQ ID NO: 35 и последовательность VL SEQ ID NO: 36,
ii) или гуманизированный вариант VH и VL антитела по пункту i).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42.
В одном из объектов настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (e) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три VH HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и (iii) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и (б) домен VL, включающий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности VL HVR, выбранные из (i) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (ii) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41 и (в) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 39, и (б) домен VL, содержащий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое анти-ТIМ3 антитело включает:
i) последовательность VH SEQ ID NO: 43 и последовательность VL SEQ ID NO: 44,
ii) или гуманизированный вариант VH и VL антитела по пункту i).
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения такое анти-TIM3 антитело включает:
i) последовательность VH SEQ ID NO: 83 и последовательность VL SEQ ID NO: 84, или
ii) последовательность VH SEQ ID NO: 85 и последовательность VL SEQ ID NO: 86.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, связывающееся с антителом TIM3 человека, включает последовательность
VH SEQ ID NO: 83 и последовательность VL SEQ ID NO: 84.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, связывающееся с антителом TIM3 человека, включает последовательность
VH SEQ ID NO: 85 и последовательность VL SEQ ID NO: 86.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, (г) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, (д) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и (е) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50.
В одном из объектов настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три VH HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, и (iii) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, и (б) домен VL, включающий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности VL HVR, выбранные из (i) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, (ii) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 и (в) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, включающий (i) HVR-Н1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 47, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое анти-TIM3 антитело включает:
i) последовательность VH SEQ ID NO: 51 и последовательность VL SEQ ID NO: 52,
ii) или гуманизированный вариант VH и VL антитела по пункту i).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, (б) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, (в) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, (г) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, (д) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и (е) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58.
В одном из объектов настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три VH HVR последовательности, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, и (iii) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, и (б) домен VL, включающий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности VL HVR, выбранные из (i) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57 и (в) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 55, и (б) домен VL, содержащий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое анти-TIM3 антитело включает:
i) последовательность VH SEQ ID NO: 59 и последовательность VL SEQ ID NO: 60,
ii) или гуманизированный вариант VH и VL антитела по пункту i).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66.
В одном из объектов настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело, включающее (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, (б) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, (в) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, (г) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, (д) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, и (е) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности VH HVR, выбранные из (i) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, и (iii) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, и (б) домен VL, содержащий, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две или все три последовательности VL HVR, выбранные из (i) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65 и (iii) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, включающее (а) домен VH, содержащий (i) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, и (iii) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 63, и (б) домен VL, содержащий (i) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, и (iii) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое анти-TIM3 антитело включает:
i) последовательность VH SEQ ID NO: 67 и последовательность VL SEQ ID NO: 68,
ii) или гуманизированный вариант VH и VL антитела по пункту i).
В каком-либо из приведенных выше вариантов осуществления настоящего изобретения анти-TIM3 антитело гуманизировано. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-TIM3 антитело, подобно антителам в приведенных выше вариантах осуществления настоящего изобретения, содержит области HVR и дополнительно содержит акцепторный каркасный участок человека, например, каркасный участок иммуноглобулина человека или каркасный участок консенсусной последовательности человека. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-TIM3 антитело, подобно антителам в приведенных выше вариантах осуществления настоящего изобретения, содержит области HVR и дополнительно содержит VH и VL, содержащие такие HVR.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-TIM3 антитело. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-TIM3 антитело, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 7 и последовательность VL SEQ ID NO: 8, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-TIM3 антитело, содержащее VH-последовательность SEQ ID NO: 9 и последовательность VL SEQ ID NO: 10, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-TIM3 антитело, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 19 и VL-последовательность SEQ ID NO: 20, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-TIM3 антитело, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 27 и последовательность VL SEQ ID NO: 28, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-TIM3 антитело, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 35 и последовательность VL SEQ ID NO: 36, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-TIM3 антитело, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 43 и последовательность VL SEQ ID NO: 44, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-TIM3 антитело, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 51 и последовательность SEQ ID NO: 52, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-TIM3 антитело, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 59 и последовательность VL SEQ ID NO: 60, или антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-TIM3 антитело, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 67 и последовательность VL SEQ ID NO: 68.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-TIM3 антитело, включающее последовательность VH SEQ ID NO: 7 и последовательность VL SEQ ID NO: 8.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, которое конкурирует за связывание с TIM3 человека с анти-TIM3 антителом, включающим последовательность VH SEQ ID NO: 7 и последовательность VL SEQ ID NO: 8 (что определено в конкурентном исследовании, описанном в примере 4, на клетках RPMI-8226 (АТСС CCL-155™)).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело (например, антитело, которое связывается с TIM3 человека), включающее:
A) (a) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Б) (a) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
B) (a) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Г) (a) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, или
Д) (a) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, или
Е) (a) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, или
Ж) (a) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, или
З) (a) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, или
И) (a) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, или
К) (a) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, и (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело (например, антитело, которое связывается с TIM3 человека), включающее:
А) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Б) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
В) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Г) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, или
Д) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 23, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, или
Е) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 31, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, или
Ж) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 39, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, или
З) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 47, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, или
И) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 55, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, или
К) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 63, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело (например, антитело, которое связывается с TIM3 человека), которое:
А1)
i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 7 и последовательность VL SEQ ID NO: 8,
ii) включает последовательность VH SEQ ID NO: 9 и последовательность VL SEQ ID NO: 10,
iii) или гуманизированный вариант VH и VL антитела по пунктам i) или ii),
или А2)
i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 79 и последовательность VL SEQ ID NO: 80, или
ii) включает последовательность VH SEQ ID NO: 81 и последовательность VL SEQ ID NO: 82.
или Б)
i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 19 и последовательность VL SEQ ID NO: 20,
ii) или гуманизированные варианты VH и VL антитела по пункту i),
или В)
i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 27 и последовательность VL SEQ ID NO: 28,
ii) или гуманизированные варианты VH и VL антитела по пункту i),
или Г)
i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 35 и последовательность VL SEQ ID NO: 36,
ii) или гуманизированные варианты VH и VL антитела по пункту i),
или Д)
i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 43 и последовательность VL SEQ ID NO: 44,
ii) или гуманизированные варианты VH и VL антитела по пункту i),
или Е)
i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 51 и последовательность VL SEQ ID NO: 52,
ii) или гуманизированные варианты VH и VL антитела по пункту i),
или Ж1)
i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 59 и последовательность VL SEQ ID NO: 60,
ii) или гуманизированные варианты VH и VL антитела по пункту i),
или Ж2)
i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 83 и последовательность VL SEQ ID NO: 84, или
ii) включает последовательность VH SEQ ID NO: 85 и последовательность VL SEQ ID NO: 86.
или З)
i) включает последовательность VH SEQ ID NO: 67 и последовательность VL SEQ ID NO: 68,
ii) или гуманизированные варианты VH и VL антитела по пункту i).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело (например, антитело, которое связывается с TIM3 человека), включающее:
A) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Б) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
B) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Г) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, или
Д) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 23, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, или
Е) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 31, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, или
Ж) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 39, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, или
З) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 47, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, или
И) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 55, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, или
К) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 63, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66,
причем антитело отличается независимо одним или несколькими из следующих свойств: анти-TIM3 антитело
- индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 45% через 120 мин при 37°C (см. пример 6)
- В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 50% через 120 мин при 37°C (см. пример 6)
- В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 55% через 120 мин при 37°C (см. пример 6)
- В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 60% через 240 мин при 37°C (см. пример 6)
- В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 65% через 240 мин при 37°C (см. пример 6).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело (например, антитело, которое связывается с TIM3 человека), включающее:
А) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Б) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
В) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Г) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, или
Д) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 23, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, или
Е) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 31, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, или
Ж) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 39, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, или
З) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 47, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, или
И) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 55, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, или
К) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 63, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66,
причем антитело отличается независимо по одному или нескольким из следующих свойств: анти-TIM3 антитело:
- индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 45% через 120 мин при 37°C (см. пример 6)
- В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 50% через 120 мин при 37°C (см. пример 6)
- В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 50% через 120 мин при 37°C (см. пример 6)
- В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 60% через 240 мин при 37°C (см. пример 6)
- В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 65% через 240 мин при 37°C (см. пример 6)
- конкурирует за связывание с TIM3 с анти-Tim3 антителом, включающим VH SEQ ID NO: 7 и VL of SEQ ID NO: 8
- связывается с TIM3 человека и макака крабоеда
- проявляет в качестве иммуноконъюгата цитотоксическую активность в отношении TIM3-экспрессирующих клеток (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгаты имеют относительную величину IC50 цитотоксической активности как у конъюгата экзотоксина А из Pseudomonas на клетках RPMI-8226, которая составляет 0,1 или менее (по данным измерения в примере 11)
- индуцирует высвобождение интерферона гамма (в исследовании реакции смешанных лимфоцитов (Mixed Lymphocyte Reaction - MLR) согласно описанию в примере 5).
2
Другим объектом настоящего изобретения является анти-TIM3 антитело по какому-либо из описанных выше вариантов его осуществления, которое является моноклональным антителом, в том числе химерным, гуманизированным антителом или антителом человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-TIM3 антителом является фрагмент антитела, например, Fv, Fab, Fab', scFv, диатело или F(ab'). В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело является антителом полной длины, например, интактным IgG1 или IgG4 антителом - представителем другого класса или изотипа антител, указанных в настоящем изобретении.
Еще одним объектом настоящего изобретения является анти-TIM3 антитело по какому-либо из описанных выше вариантов его осуществления, которое может включать какой-либо из признаков, отдельно или в комбинации, согласно описанию приведенных ниже разделов 1-7.
1. Аффинность антител
-8
-8
-13
-9
-13
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают константу диссоциации KD ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10 М или менее, например, от 10 М до 10 М, например, от 10 М до 10 М).

6
-1
-1
on
off
off
on
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения определяют KD, используя метод поверхностного плазмонного резонанса BIACORE при 25°C с чипами СМ5 с иммобилизацией ~10 единиц ответа (response units - RU). Вкратце, биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (чип СМ5, фирма BIACORE, Inc.) активируют N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимидгидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) по инструкциям производителя. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до концентрации 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед впрыскиванием со скоростью тока 5 мкл/мин для достижения примерно 10 единиц ответа присоединенного белка. После инъекции антигена впрыскивают 1 М этаноламин для блокирования непрореагировавших групп. Для измерения кинетики впрыскивают двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в ФСБ с 0,05% поверхностно-активным веществом полисорбатом 20 (polysorbate 20 (TWEEN-20™) surfactant - PBST) при 25°C со скоростью тока примерно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (k или ka) и диссоциации (k или kd) рассчитывают, используя простую модель связывания Лэнгмюра один-к-одному (программное обеспечение BIACORE Evaluation Software version 3.2) путем одновременной установки сенсограм ассоциации и диссоциации. Константу уравнения диссоциации KD рассчитывают в виде соотношения kd/ka (k/k). См., например, Chen с соавт., J. Mol. Biol. 293, 1999, сс. 865-881. Если скорость кассации превышает 10 М сек по данным описанного выше поверхностного плазмонного резонанса, тогда скорость ассоциации может быть определена путем использования метода гашения флуоресценции, который измеряет повышение или снижение интенсивности флуоресцентной эмиссии (возбуждение = 295 нм, эмиссия = 340 нм, 16 нм полоса пропускания) при 25°C 20 нМ антитела против антигена (форма Fab) в ФСБ, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена по результатам измерения в спектрофотометре, например, спектрофотометре с остановкой потока (фирма Aviv Instruments) или спектрофотометре 8000-series SLM-AMINCO™ (фирма ThermoSpectronic) с кюветой с перемешиванием.
2. Фрагменты антител
2
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматриваемым антителом является фрагмент антитела. К фрагментам антитела относятся, но ими перечень не ограничивается, фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, scFv и другие фрагменты, описанные ниже. См. обзор по фрагментам антител Hudson с соавт., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134. По фрагментам scFv см., например, обзор Plueckthun в кн.: «The Pharmacology of Monoclonal Antibodies», Т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer- Verlag, New York, 1994, сс. 269-315, а также WO 93/16185, US 5571894 и 5587458. Обсуждение фрагментов Fab и F(ab'), содержащих остатки эпитопов по связыванию рецепторов реутилизации и имеющих повышенный in vivo период полужизни, см. в US 5869046.
Диантитела являются фрагментами антител с двумя сайтами связывания антигена, которые могут быть бивалентными или биспецифичными. См., например, ЕР 0404097, WO 1993/01161, Hudson с соавт., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134, Holliger с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, сс. 6444-6448. Триантитела и тетраантитела также описаны Hudson с соавт., Nat. Med. 9, 20039, сс. 129-134.
Однодоменные антитела являются фрагментами антител, включающими полностью или часть вариабельного домена тяжелой цепи и полностью или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения однодоменным антителом является однодоменное антитело человека (фирма Domantis, Waltham, Массачусетс, см., например, US 6248516 В1).
Фрагменты антител могут быть получены разными методами, включая, но ими не ограничиваясь, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получение с помощью рекомбинантных клеток хозяев (например, Е. coli или фага) по описанию настоящего изобретения.
3. Химерные и гуманизированные антитела
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматриваемым антителом является химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в US 4816567, Morrison с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc. 6851-6855. В одном из примеров химерное антитело включает вариабельную область, не являющуюся вариабельной областью человека (например, вариабельная область мыши, крысы, хомяка, кролика или примата (но не человека), например, обезьяны), и константную область человека. В другом примере химерное антитело является антителом «переключения класса», причем замещающий класс или подкласс отличается от класса исходного антитела. К химерным антителам относят их антиген-связывающие фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химерным антителом является гуманизированное антитело. Обычно антитело, не являющееся антителом человека, является гуманизированным антителом для уменьшения иммуногенности для людей, но в то же время оно сохраняет специфичность и аффинность исходного антитела, не являющегося антителом человека. Обычно гуманизированное антитело включает один или несколько вариабельных доменов, в которых гипервариабельные области (HVR), например, CDR, (или их части) происходят от антитела, не являющегося антителом человека, и FR (или их части), производные от последовательностей антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно также может включать, по меньшей мере, часть константной области антитела человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения некоторые остатки FR в гуманизированном антителе замещают соответствующими остатками антитела, не являющегося антителом человека (например, антитела, от которого происходят остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности.
Гуманизированные антитела и способы их получения рассматривают, например, в работах Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13, 2008, сс. 1619-1633, Riechmann с соавт., Nature 332, 1988, сс. 323-329, Queen с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, сс. 10029-10033, US 5821337, US 7527791, US 6982321, US 7087409, Kashmiri с соавт., Methods 36, 2005, сс. 25-34 (описание пересадки SDR (a-CDR)), Padlan с соавт., Mol. Immunol. 28, 1991, сс. 489-498 (описание «перекладки»), Dall'Acqua с соавт., Methods 36, 2005, сс. 43-60 (описание «перетасовки»), Osbourn с соавт., Methods 36, 2005, сс. 61-68, Klimka с соавт., Br. J. Cancer 83, 2000, сс. 252-260 (описание подхода «направленного отбора» к перетасовки FR).
Каркасные области антител человека, которые могут применять для гуманизации, включают, но ими перечень не ограничивается: каркасные области (framework region - FR), отобранные методом «наилучшего соответствия» (см., например, Sims, с соавт., J. Immunol. 151, 1993, сс. 2296-2308), каркасные области, производные от консенсусной последовательности антител человека определенной подгруппы вариабельных областей легкой и тяжелой цепей (см., например, Carter с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, сс. 4285-4289, Presta с соавт., J. Immunol. 151, 1993, сс. 2623-2632), зрелые каркасные области (с соматическими мутациями) человека или каркасные области зародышевых линий человека (см., например, Almagro с соавт., Front. Biosci. 13, 2008, сс. 1619-1633), и каркасные области, полученные от скрининга библиотек FR (см., например, Baca с соавт., J. Biol. Chem. 272, 1997, сс. 10678-10684, Rosok с соавт., J. Biol. Chem. 271, 19969, сс. 22611-22618).
4. Антитела человека
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, которое является антителом человека. Антитела человека могут быть получены разными методами, известными в данной области. Антитела человека в основном описаны в работах van Dijk и Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 2001, сс. 368-374, и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20, 2008, cc. 450-459.
U
AB
ELOCI
OUSE
Антитела человека могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано для получения интактных антител человека или интактных антител с вариабельными областями человека в ответ на антигенный вызов. Такие животные обычно содержат все или часть локусов иммуноглобулина человека, которые заменяют эндогенные локусы иммуноглобулина, или присутствуют внехромосомно, или интегрированы случайным образом в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей эндогенные локусы иммуноглобулина обычно инактивированы. Обзор методов получения антител человека от трансгенных животных см. Lonberg, Nat. Biotech. 23, 2005, сс. 1117-1125. См. также US 6075181 и US 6150584, в которых описывают технологию XENOMOUSE™, US5770429, в котором описывают технологию HM, US 7041870, в котором описывают технологию K-М MOUSE, и публикацию патентной заявки US 2007/0061900, в которой описывают технологию VM). Вариабельные области человека от интактных антител, продуцируемых такими животными, могут быть дополнительно модифицированы, например, путем комбинирования с другой константной областью человека.
Антитела человека также могут быть получены с помощью гибридомных методов. Описаны линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для получения моноклональных антител человека. (См., например, Kozbor, J. Immunol, 133, 1984, сс. 3001-3005, Brodeur с соавт. В кн.: "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)), изд-во Marcel Dekker, Нью-Йорк, 1987, сс. 51-63, Boerner с соавт., J. Immunol. 147, 1991, сс. 86-95). Антитела человека, полученные с помощью технологии гибридом В-клеток человека, также Li с соавт., Proc. Natl. Акад. Sci. USA 103, 2006, сс. 3557-3562. Дополнительные методы, например, включают описанные в US 7188926 (описание получения моноклональных IgM антител человека из клеточных линий гибридом) и Ni, Xiandai Mianyixue 26, 2006, сс. 265-268 (описание внутривидовых гибридом типа человек-человек). Технология гибридом человека (технология Trioma) также описана Vollmers и Brandlein, Histology and Histopathology 20, 2005, сс. 927-937, и Vollmers и Brandlein, Experimental and Clinical Pharmacology 27, 2005, cc. 185-191.
Антитела человека также могут быть получены путем выделения последовательностей вариабельного домена клона Fv, выбранного из библиотек фагового дисплея, производных от антител человека. Такие последовательности вариабельных доменов затем могут быть объединены с требуемым константным доменом человека. Ниже описаны методы отбора антител человека из библиотек антител.
5. Антитела, производные от библиотек
Антитела по изобретению могут быть получены путем скрининга комбинаторных библиотек для поиска антител с требуемой активностью или активностями. Например, в данной области известно множество способов создания библиотек фагового дисплея и их скрининга для получения антител, обладающих требуемыми характеристиками связывания. Такие методы рассматривают, например, в публикации Hoogenboom с соавт., Molecular Biology 178, 2001, сс. 1-37, а также описаны, например, McCafferty с соавт., Nature 348, 1990, сс. 552-554, Clackson с соавт., Nature 352, 1991, сс. 624-628, Marks с соавт., J. Mol. Biol. 222, 1992, сс. 581-597, Marks и Bradbury, Methods in Molecular Biology 248, 2003, сс. 161-175, Sidhu с соавт., J. Mol. Biol. 338, 2004, cc. 299-310, Lee с соавт., J. Mol. Biol. 340, 2004, cc. 1073-1093, Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2004, cc. 12467-12472, Lee с соавт., J. Immunol. Методы 284, 2004, cc. 119-132.
В некоторых методах фагового дисплея репертуары генов VH и VL отдельно клонируют полимеразной цепной реакцией (ПЦР) и беспорядочно рекомбинируют в фаговых библиотеках, которые затем могут быть подвергнуты скринингу на антигенсвязывающий фаг (Winter с соавт., Ann. Rev. Immunol. 12, 1994, сс. 433-455). Фаг обычно отображает фрагменты антител или в виде одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv), или в виде Fab-фрагментов. Библиотеки из иммунизированных источников обеспечивают высокоаффинные антитела к иммуногену без необходимости создания гибридом. В другом варианте исходный репертуар может быть клонирован (например, от человека), чтобы обеспечить единый источник антител к широкому спектру собственных, а также чужих, антигенов без какой-либо иммунизации (Griffiths с соавт., EMBO J. 12, 1993, сс. 725-734). Наконец, библиотеки исходного материала также могут быть синтезированы путем клонирования неперестроенных сегментов V-гена из стволовых клеток и с использованием ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность для кодирования сильно варьируемых областей CDR3 и для осуществления перегруппировки in vitro (Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol. 227, 1992, cc. 381-388). Фаговые библиотеки антител человека описаны в US 5750373, US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936, US 2009/0002360.
Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек антител человека, считают антителами человека или фрагментами антител человека.
6. Мультиспецифичные антитела
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, которое является мультиспецифичным антителом, например, биспецифичным антителом. Мультиспецифичные антитела являются моноклональными антителами, которые обладают связывающей специфичностью в отношении, по меньшей мере, двух разных сайтов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения одна связывающая специфичность относится к TIM3, а другая - к какому-либо другому антигену. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифичные антитела могут связывать два разных эпитопа TIM3. Биспецифичные антитела также можно применять для локализации цитотоксических агентов на клетках, которые экспрессируют TIM3. Биспецифичные антитела можно получать в виде антител полной длины или в виде фрагментов антител.
Методы получения мультиспецифичных антител включают, но ими перечень не ограничивается, рекомбинантную совместную экспрессию двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, обладающих разной специфичностью (см. Milstein и Cuello, Nature 305, 1983, сс. 537-540, WO 93/08829, Traunecker с соавт., EMBO J. 10, 1991, сс. 3655-3659), и конструирование «выступ-во-впадину» (см., например, US 5731168). Мультиспецифичные антитела также можно получить путем конструирования с использованием эффекта электростатического взаимодействия для получения антитела Fc-гетеродимерных молекул (WO 2009/089004), перекрестного сшивания двух или нескольких антител или фрагментов (см., например, US 4676980, Brennan с соавт., Science 229, 1985, сс. 81-83), используя лейциновые молнии для получения биспецифичных антител (см., например, Kostelny с соавт., J. Immunol. 148, 1992, сс. 1547-1553, используя методику «диател» для получения фрагментов биспецифических антител (см., например, Holliger с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс. 6444-6448), применение димеров одноцепочечных Fv (sFv) (см, например, Gruber с соавт., J. Immunol. 152, 1994, сс. 5368-5374), получение триспецифичных антител, подобных описанному, например, Tutt с соавт., J. Immunol. 147, 1991, сс. 60-69).
Сконструированные антитела с тремя или несколькими функциональными сайтами связывания антигена включают также «антитела-осьминоги», предусмотренные в настоящем изобретении (см., например, US 2006/0025576).
В настоящем изобретении антитела или фрагменты также предусматривают «Fab двойного действия (Dual Acting Fab - DAF)», включающие сайт связывания антигена с IL-1-бета, а также другой отличный антиген (см., например, US 2008/0069820).
В настоящем изобретении антитела или фрагменты также предусматривают мультиспецифичные антитела, описанные в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, WO 2010/145793, WO2011/117330, WO2012/025525, WO2012/025530, WO 2013/026835, WO 2013/026831, WO 2013/164325, или WO 2013/174873.
5. Варианты антител
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают варианты аминокислотных последовательностей антител. Например, может потребоваться улучшить связывающее сродство и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела могут быть получены путем интродукции соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем синтеза пептида. К таким модификациям относятся, например, делеции, и/или инсерции, и/или замещения остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Какая-либо комбинация делеции, инсерции и замещения может быть произведена для достижения в итоге конструкции, предусматривая, что итоговая конструкция обладает требуемыми свойствами, например, связыванием антигена.
а) Варианты замещения, инсерции и делеции
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают одно или несколько замещений аминокислот. Исследуемые сайты, в которых есть заинтересованность в осуществлении мутагенеза по типу замещений, включают области HVR и FR. Консервативные замещения показаны в таблице под заголовком «Предпочтительные замещения». Более значимые изменения, предусмотренные в табл. 1 в разделе «Примеры замещений» и, согласно описанному ниже, в соответствии с классами аминокислот с учетом боковых цепей. Аминокислотные замещения могут быть интродуцированы в исследуемое антитело, и продукты исследуют на наличие требуемой активности, например, сохраняющимся/улучшенным связыванием антигена, пониженной иммуногенностью или улучшенными ADCC или CDC.
Аминокислоты могут быть сгруппированы, исходя из общих свойств боковых цепей:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile,
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin,
(3) кислые: Asp, Glu,
(4) основные: His, Lys, Arg,
(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro,
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замещения приводят к обмену представителя одного класса на представителя другого класса.
К одному из вариантов замещения относят замещения одного или нескольких остатков гипервариабельных областей исходного антитела (например, гуманизированного антитела или антитела человека). Обычно возникающие варианты (вариант), которые выбирают для дальнейшего исследования, могут иметь модификации (т.е. улучшения) относительно исходного антитела и/или в значительной степени сохраняют определенные биологические свойства исходного антитела. Типичным вариантом замещения является аффинное вызревшее антитело, которое может быть без осложнений получено, например, с использованием методов аффинного созревания на основе фагового дисплея, например, согласно описанию настоящего изобретения. Вкратце, вызывают мутации одного или нескольких остатков HVR и варианты антител подвергают скринингу методом фагового дисплея для выявления определенной биологической активности (например, связывающего сродства, т.е. аффинности).
Изменения (например, замещения) могут быть произведены в HVR, например, для усиления аффинности антитела. Такие изменения могут быть осуществлены в «горячих точках» в HVR, т.е. в остатках, кодируемых кодонами, которые подвержены мутированию с высокой частотой в ходе соматического мутационного процесса (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207, 2008, cc. 179-196), и/или в остатках, которые контактируют с антигеном, с получаемым вариантом VH или VL, которые тестируют на связывающую аффинность. Аффинные мутации путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек описаны, например, Hoogenboom с соавт., Methods in Molecular Biology 178, 2002, cc. 1-37. В некоторых вариантах вызревания аффинности по настоящему изобретению, разнообразие интродуцируют в изменяемые гены, выбранные для вызревания, каким-либо из различных методов (например, ПЦР с внесением ошибок, стратегией перестановки цепей или направленным мутагенезом). Затем создают вторичную библиотеку. Такую библиотеку в дальнейшем подвергают скринингу для идентификации каких-либо вариантов антител с требуемой аффинностью. Другой способ внедрения разнообразия включает HVR-направленные подходы, при которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, сразу 4-6). Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, могут быть специфически идентифицированы, например, используя аланин-сканирующий мутагенез или моделирование. В частности, часто нацеливаются на CDR-H3 и CDR-L3.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения замещения, вставки или делеции могут возникать в пределах одного или нескольких HVR, если такие изменения существенно не уменьшают способность антитела связывать антиген. Например, консервативные изменения (например, консервативные замены по настоящему изобретению), которые существенно не уменьшают аффинность, могут быть произведены в HVR. Такие изменения могут, например, быть вне HVR «горячих точек» или SDR. В некоторых вариантах настоящего изобретения в приведенных выше вариантах последовательностей VH и VL, приведенных выше, каждая HVR либо не изменяется, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замещений.
Полезным методом идентификации остатков или областей антитела, которые могут быть целью мутагенеза, является «аланин-сканирующий мутагенез» (Cunningham и Wells, J.A., Science 244, 1989, сс. 1081-1085). В этом методе остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженных остатков, например, arg, asp, his, lys и glu) идентифицируют и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином), чтобы определить, есть ли воздействие на взаимодействие антитела с антигеном. Дальнейшие замещения могут быть введены в местах локализации аминокислот, демонстрирующих функциональную чувствительность к первоначальным замещениям. В другом варианте или дополнительно определяют кристаллическую структуру комплекса антиген- антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки могут стать мишенью или могут быть элиминированы в качестве кандидатов для замещения. Варианты могут быть подвергнуты скринингу, чтобы определить, обладают ли они требуемыми свойствами.
Инсерции в аминокислотных последовательностях включают амино- и/или карбокси-концевые гибридизации, длина которых составляет от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также инсерции внутрь последовательности одиночных или многих аминокислотных остатков. К примерам концевых инсерций относят антитело с N-концевым остатком метионина. Другие варианты инсерций в молекулу антитела включают гибридизацию с N- или С-конца антитела фермента (например, для ADEPT) или полипептида, который увеличивает период полужизни антитела в сыворотке.
б) Варианты Fc-области
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в антителе по настоящему изобретения в Fc-области может быть произведена одна или несколько модификаций, за счет которых получают вариант Fc-области. Вариант Fc-области может включать последовательность Fc-области (например, Fc-области IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), включающую аминокислотную модификацию (например, замещение) по одному или нескольким положениям аминокислот.
К антителам с пониженной эффекторной функцией относят те антитела, в которых в Fc-области замещен один или несколько остатков из числа 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (US 6737056). К таким Fc-мутантам относятся те мутанты, у которых замещены остатки в двух или нескольких положениях аминокислот 265, 269, 270, 297 и 327, включая Fc-мутант «DANA» с замещением остатков 265 и 297 на аланин (US 7332581).
Описаны некоторые варианты антител с усиленным или ослабленным связыванием с FcR (см., например, US 6737056, WO 2004/056312, Shields с соавтю, J. Biol. Chem. 276, 2001, сс. 6591-6604).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения таким антителом является IgG1 с мутациями L234A и L235A или с мутациями L234A, L235A и P329G. В другом варианте осуществления настоящего изобретения IgG4 с мутациями S228P и L235E или S228P, L235E или P329G (нумерация по индексу EU в соответствии с описанием Kabat с соавт. в кн.: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, Bethesda Мэриленд, 1991).
Антитела с повышенной полужизнью и улучшенным связыванием с неонатальным рецептором Fc (FcRn), который ответственен за перенос материнских IgG плоду (Guyer с соавт., J. Immunol. 117, 1976, 587-593, Kim с соавт., J. Immunol. 24, 1994, сс. 2429-2434), описаны в US 2005/0014934. Эти антитела включают Fc-область с одним или несколькими замещениями, которые улучшают связывание Fc-области с FcRn. К таким вариантам Fc относят те, которые имеют замещения по одному или нескольким остаткам в Fc-области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замещение в Fc-области остатка 434 (US 7371826).
См. также Duncan и Winter, Nature 322, 1988, сс. 738-740, US 5648260, US 5624821, WO 94/29351, в которых приводят другие примеры вариантов Fc-области.
г) Сконструированные варианты антител с цистеином
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения может потребоваться сконструировать варианты антител с замещениями цистеином, например, «тиоMAb», в которых один или несколько остатков антитела замещено остатками цистеина. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения замещенные остатки находятся в доступных сайтах антитела. При замещении таких остатков на цистеин реакционноспособные тиольные группы расположены в доступных участках антитела и могут быть использованы для конъюгации антитела с другими частями молекул, например, частями молекул лекарственных средств или с частями молекул лекарственных средств, связанных линкером, для создания иммуноконъюгата согласно описанному ниже. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения какой-либо один или несколько из приводимых ниже остатков могут быть замещены в Fc-области на цистеин: V205 (нумерация по Kabat) в легкой цепи, А118 (нумерация EU) тяжелой цепи и S400 (нумерация EU) тяжелой цепи. Сконструированные варианты антител с замещениями цистеином могут быть сконструированы согласно описанию, приведенному, например, в US7521541.
д) Производные антител
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотренное в нем антитело может быть дополнительно модифицировано, чтобы содержать в молекуле дополнительные небелковые части, которые известны в данной области и доступны. К частям молекулы, применимым для получения производных антитела, относят, но ими перечень не ограничивается, водорастворимые полимеры. Примерами водорастворимых полимеров являются, но ими перечень не ограничивается, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или случайные сополимеры), декстран или поли(n-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры оксида пролипропилена/оксида этилена, пропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущества при получении благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь какую-либо молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может изменяться, и, если присоединено более одного полимера, они могут быть одинаковыми или разными молекулами. Обычно число и/или тип полимеров, используемых для получения производных, могут быть определены, исходя из определенных свойств или функций антитела, подлежащего улучшению, но не только на этом основании, причем производное антитело может быть применено для лечения определенных состояний.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают конъюгаты антитела и небелковой части молекулы, которая может быть избирательно нагрета под воздействием облучения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения небелковой частью молекулы являются карбоновые нанотрубки (Kam с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2005, cc. 11600-11605). Облучение может быть какой-либо длиной волны, например, волнами с длинами волн, не повреждающими здоровые клетки, но которые нагревают небелковую часть молекулы до температуры, при которой клетки, расположенные проксимально к антителу с небелковой частью молекулы, погибают.
Б. Методы рекомбинации и композиции
Антитела могут быть получены методами рекомбинации и применением композиций, например, по описанию в US 4816567. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую описанное в настоящем изобретении анти-TIM3 антитело. Такая нуклеиновая кислота может кодировать последовательность аминокислоты, включающую VL и/или последовательность аминокислоты, включающую VH антитела (например, легких или тяжелых цепей антитела). В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают один или несколько векторов (например, векторов экспрессии), включающих указанную нуклеиновую кислоту. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают клетку-хозяина, включающую такую нуклеиновую кислоту. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин включает (например, трансформирована): (1) вектор, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует последовательность аминокислоты, включающую VL антитела, и последовательность аминокислоты, включающую VH антитела, или (2) первый вектор, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует последовательность аминокислоты, включающую VL антитела, и второй вектор, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует последовательность аминокислоты, включающую VH антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин является эукариотической, например, клеткой яичника китайского хомячка (Chinese Hamster Ovary - СНО) или лимфоидной клеткой (например, клетки Y0, NS0, Sp20). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают способ получения анти-TIM3 антитела, причем способ включает культивирование клетки-хозяина, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело по настоящему изобретению, в условиях, пригодных для экспрессии антитела, и необязательно выделение антитела из клетки-хозяина (или культуральной среды клетки-хозяина).
Для получения рекомбинантов анти-TIM3 антитела, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, согласно описанному выше, выделяют и инсертируют в один или несколько векторов для последующего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такая нуклеиновая кислота может быть легко выделена и секвенирована с помощью рутинных методов (например, используя олигонуклеотидные зонды, способные специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела).
К соответствующим клеткам для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, относят прокариотические или эукариотические клетки по настоящему изобретению. Например, антитела могут быть получены в бактериях, в частности, когда не требуются гликозилирование и эффекторная функция Fc. Для экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактериях, см., например, US 5648237, US 5789199 и US 5840523. (См. также описание Charlton в кн.: «Methods in Molecular Biology», под ред. Lo (ред.), изд-во Humana Press, Totowa, Нью-Джерси, Т. 248, 2003, сс. 245-254). После экспрессии антитело может быть выделено из бактериальной биомассы в растворимую фракцию и может быть дополнительно очищено.
Помимо прокариот, эукариотические микроорганизмы, например, мицелиальные грибы или дрожжи, пригодны для клонирования кодирующих антитело векторов и их экспрессии, в том числе штаммы мицилиальных грибов и дрожжей, у которых метаболические пути гликозилирования «гуманизированы», в результате чего получают антитело с частично или полностью гликозилированной структурой человека. См. Gerngross, Nat. Biotech. 22, 2004, сс. 1409-1414, Li с соавт., Nat. Biotech. 24, 2006, сс. 210-215.
Клетки-хозяева, применимые для экспрессии гликозилированного антитела, также производны от многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). К примерам клеток беспозвоночных относятся клетки насекомым, также могут быть применены клетки растений. Выявлены многочисленные штаммы бакуловируса, которые могут быть применены вместе с клетками насекомых, в частности для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
В качестве хозяев также могут использовать клетки растений (см., например, US 5959177, US 6040498, US 6420548, US 7125978 и US 6417429 (описание методики PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях)).
-
В качестве хозяев также могут использовать клетки позвоночных. Например, могут быть полезны линии клеток млекопитающих, которые адаптированы для роста в суспензии. Другим примером клеток-хозяев млекопитающих, которые можно использовать, являются линии клеток почки обезьяны CV1, трансформированные вирусом SV40 (COS-7), линия эмбриональных клеток почки человека (293 или клетки 293, описанные, например, в работе Graham с соавт., J. Gen Virol. 36, 1977, сс. 59-74), клетки почки детеныша хомяка (baby hamster kidney cells - BHK), клетки канальцев семенников мыши (клетки ТМ4, описанные, например, Mather в Reprod. 23, 1980, сс. 243-252), клетки почки обезьяны (CV1), клетки почки зеленой африканской мартышки (VERO-76), клетки карциномы шейки матки человека (HELA), клетки почки собаки (MDCK), клетки печени серой крысы (BRL 3А), клетки легких человека (W138), клетки печени человека (Hep G2), клетки опухоли молочной железы мыши (mouse mammary tumor - ММТ 060562), клетки TRI, описанные, например, Mather с соавт., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 1982, сс. 44-68, клетки MRC 5, клетки FS4. К другим клеткам-хозяевам млекопитающих относятся клетки яичника китайского хомячка (Chinese Hamster Ovary - СНО), включая клетки DHFRCHO (Urlaub с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1980, сс. 4216-4220), и линии клеток миеломы, например, Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор по определенным линиям клеток млекопитающих, пригодных для получения антител, см., например, Yazaki и Wu в кн.: «Methods in Molecular Biology», под ред. Lo (ред.), изд-во Humana Press, Totowa, Нью-Джерси, Т. 248, 2004, сс. 255-268).
В. Исследования
Анти-TIM3 антитела, предусмотренные в настоящем изобретении, могут быть идентифицированы, подвергнуты скринингу или могут быть описаны их физические/химические свойства и/или биологические активности различными методами, известными в данной области.
1. Изучение связывания и другие исследования
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения исследуют антитело по настоящему изобретению для определения активности по связыванию антигена, например, известными методами, например, ферментсвязанным иммуносорбентным анализом (ELISA), вестерн-блоттингом и др.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения исследование конкуренции могут проводить для идентификации антитела, которое конкурирует с Tim3_0016 (последовательность VH SEQ ID NO: 7 и последовательность VL SEQ ID NO: 8) за связывание с TIM3 (или, в другом варианте, с Tim3_0016 вариантом антитела Tim3_0018 с идентичными 6 HVR). Так, в одно из вариантов осуществления настоящего изобретения, предусматривают антитело, которое конкурирует за связывание с TIM3 с анти-TIM3 человека антителом, включающим все 3 HVR последовательности VH SEQ ID NO: 7 и все 3 HVR последовательности VL SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения такое конкурирующее антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), который связывается анти-TIM3 антителом Tim3_0016. Подробные примеры методов картирования эпитопа, с которым связывается антитело, описаны в кн.: «Methods in Molecular Biology», 1966, под ред. Morris, Т. 66, изд-во Humana Press, Totowa, Нью-Джерси.
В типичном конкурентном исследовании иммобилизованный TIM3(-ECD) инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с TIM3 (например, анти-ТIМ3-антитело aTim3_0016), и второе немеченое антитело, которое тестируют на способность конкурировать с первым антителом за связывание с TIM3. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный TIM3 инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не второе немеченое антитело. После инкубирования в условиях, разрешающих связывание первого антитела с TIM3, удаляют избыточное несвязанное антитело и измеряют количество метки, связанной с иммобилизованным TIM3. Если количество метки, связанной с иммобилизованным TIM3, существенно уменьшается в исследуемом образце относительно контрольного образца, то это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с TIM3. См. Harlow и Lane, в кн.: «Antibodies: A Laboratory Manual», глава 14, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 1988. Другое характерное исследование конкуренции описано в примере 4.
2. Исследование активности
Одна из задач, решаемая в настоящем изобретении, заключается в разработке методов для идентификации анти-TIM3 антител, которые имеют биологическую активность. Биологической активностью может быть, например, интернализация рецептора TIM3, высвобождение цитокина, цитотоксическая активность (в виде иммуноконъюгатов, конъюгированных с токсином), перекрестная реактивность по связыванию макака крабоеда, а также связывание с разными типами клеток. Также предусматривают такую биологическую активность in vivo и/или in vitro.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению тестируют на биологическую активность, описанную, например, в примерах 5-15.
Г. Иммуноконъюгаты (Только рак или модифицировать для мишени)
Настоящее изобретение также предусматривает иммуноконъюгаты, включающие анти-TIM3 антител по настоящему изобретению, конъюгированное с одним или несколькими цитотоксическими агентами, например, химиотерапевтическими агентами или лекарственными средствами, агентами ингибирования роста, токсинами (например, белковыми токсинами, ферментативно активными токсинами бактерий, грибков, растений или животных или их фрагментами) или радиоактивными изотопами.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгатом является конъюгат антитела - лекарственного средства (antibody-drug conjugate - ADC), в котором антитело конъюгировано с одним или несколькими лекарственными средствами, к которым относятся, но которыми перечень не ограничивается, майтанзиноид (см. US 5208020, US 5416064 и ЕР 0425235 В1), ауристатин, например, часть лекарственного средства представляет монометил-ауристатин DE и DF (ММАЕ и MMAF) (см. US 5635483, US 5780588 и US 7498298), доластатин, калихеамицин или его производные (см. US 5712374, US 5714586, US 5739116, US 5767285, US 5770701, US 5770710, US 5773001 и US 5877296, Hinman с соавт., Cancer Res. 53, 1993, сс. 3336-3342, Lode с соавт., Cancer Res 58, 1998, сс. 2925-2928), антрациклины, например, дауномицин или доксорубицин (см. Kratz с соавт., Curr. Med. Chem. 13, 2006, сс. 477-523, Jeffrey с соавт., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16, 2006, cc. 358-362, Torgov с соавт., Bioconjug. Chem. 16, 2005, c. 717-721, Nagy с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2000, cc. 829-834, Dubowchik с соавт., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12, 2002, cc. 1529-1532, King с соавт., J. Med. Chem. 45, 2002, cc. 4336-4343 и US 6630579), метотрексат, виндезин, таксаны, например, доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел и ортатаксел, трихотецин и СС1065.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат включает антитело по настоящему изобретению, конъюгированное с энзиматически активным токсином или его фрагментом, включая, но ими перечень не ограничивается, цепочку А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепочку экзотоксина А (из Pseudomonas aeruginosa), цепочку рицина А, цепочку арбина А, цепочку модессина А, альфасарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII, и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Saponaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецины.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат включает антитело по настоящему изобретению, конъюгированное с экзотоксином А из Pseudomonas (или с его вариантами). Экзотоксин А из Pseudomonas (Pseudomonas exotoxin А - РЕ) является бактериальным токсином, обладающим цитотоксической активностью, которая может быть эффективной для разрушения или подавления роста нежелательных клеток, например, раковых клеток. В связи с этим РЕ можно применять для лечения или предупреждения заболеваний, например, рака. В данной области техники известно несколько деиммунизированных экзотоксинов Pseudomonas (РЕ). Версии с делетированным доменом II (например, РЕ24) могут быть менее иммуногенными и могут вызывать побочные эффекты, выраженные слабее (например, синдром капиллярной утечки и гепатотоксичность), по сравнению с версией РЕ38, которая содержит домен II. В вариантах РЕ24 могут применять различные расщепляемые фурином линкеры. Такие деиммунизированные экзотоксины Pseudomonas (РЕ) описаны, например, в WO 2005052006, WO 2007016150, WO 2007014743, WO 2007031741, WO 200932954, WO 201132022, WO 2012/154530 и WO 2012/170617. Понятие «экзотоксин А из Pseudomonas» в контексте настоящего изобретения относится к экзотоксину дикого типа и к деиммунизированным экзотоксинам из Pseudomonas (РЕ). В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения понятие «экзотоксин А из Pseudomonas» относится к деиммунизированному варианту РЕ24, описанному, например, в WO 2009/32954, WO 2011/32022, WO 2012/154530, WO 2012/170617, Liu с соавт., PNAS 109, 2012, сс. 11782-11787, Mazor с соавт., PNAS 111, 2014, сс. 8571-8576, Alewine с соавт., Mol Cancer Ther., 2014, сс. 2653-2661. В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения понятие «экзотоксин А из Pseudomonas» включает аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 69 или SEQ ID NO: 70 (их получение также описано в публикациях Mazor с соавт., PNAS, 111, 2014, сс. 8571-8576, и Alewine с соавт., Mol Cancer Ther, 2014, сс. 2653-2661.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат включает антитело по настоящему изобретению, конъюгированное с аматоксином или его вариантами. Аматоксины (α-аманитин, β-аманитин, аманин) являются циклическими пептидами, состоящими из 8 аминокислот. Они могут быть выделены из гриба Amanita phalloides (бледная поганка) или получены синтезом из отдельных блоков. Аматоксины специфически ингибируют ДНК-зависимую РНК-полимеразу II клеток млекопитающих, и благодаря транскрипции и биосинтезу белка происходит поражение клеток. Ингибирование транскрипции в клетке вызывает остановку роста и пролиферацию. Несмотря на отсутствие ковалентной связи, комплекс между аманитином и РНК-полимеразой II очень прочный (KD=3 нМ). Отсоединение аманитина от фермента является очень медленным процессом, что делает невозможным восстановление поврежденной клетки. Если в клетке ингибирование транскрипции длится слишком долго, клетка подвергается запрограммированной гибели (апоптозу), что показано в культурах клеток Jurkat, инкубированных с α-аманитином, или, с гораздо большей эффективностью, в клетках Jurkat, инкубированных с проницаемым для мембран олеатом о-метил-α-аманитина. В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения понятие «аматоксин» применяют по отношению к альфа-аманитину или к его варианту, что описано, например, в WO 02010/115630, WO 2010/115629, WO 2012/119787, WO 2012/041504 и WO 2014135282, предпочтительные варианты описаны в WO 2012/041504 (например, конъюгированы через 6'С-атом четвертой аминокислоты аматоксина, особенно через атом кислорода, связанный с 6'С-атомом четвертой аминокислоты аматоксина, и где антитело против TIM3 соединено через линкер с молекулой мочевины) и в WO 2014135282.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
99m
123
123
131
111
19
13
15
17
В другом варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат включает антитело по настоящему изобретению, конъюгированное с радиоактивным атомом для формирования радиоконъюгата. Разнообразие радиоактивных изотопов допустимо для получения радиоконъюгатов. Примерами являются At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu. Когда радиоконъюгат применяют для обнаружения, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например TC или I, или спиновую метку для ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также называемого магнитно-резонансной визуализацией), например, I, I, In, F, С, N, О, гадолиний, марганец или железо.
14
Конъюгаты антитела и цитотоксического агента могут быть получены с использованием различных агентов, соединяющих бифункциональные белки, например, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионата (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC), иминотиолана (IT), бифункциональных производных имидоэфиров (например, диметиладипимидата HCl), активных сложных эфиров (например, дисукцинимидилсубирата), альдегидов (например, глутарового альдегида), бис-азидо соединений (например, бис-(p-азидобензоил)гександиамина), производных бис-диазония (например, бис-(р-диазонийбензоил)этилендиамина), диизоцианатов (например, толуол-2,6-диизоцианата) и бис-активных соединений фтора (например, 1,5-дифтор-2, 4-динитробензола). Например, иммунотоксин рицина может быть получен по описанию Vitetta с соавт., Science 238, 1987, сс. 1098-1104. 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) с меткой С является примером хелатирующего агента для конъюгации радионуклеотида с антителом. См. WO 94/11026. Линкер может быть «расщепляемым линкером», облегчающим высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, можно применять кислото-лабильный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, фотолабильный линкер, диметильный линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari с соавт., Cancer Res., 52, 1992, сс. 127-131, US 5208020).
Иммуноконъюгаты или ADC в прямой форме рассматривают в настоящем изобретении, но также применяют конъюгаты, полученные с помощью сшивающих реагентов, к которым относятся, но которыми перечень не ограничивается, коммерческие продукты BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC, сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат) (например, от фирмы Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс, США).
Е. Методы и композиции для диагностики и обнаружения
В различных вариантах осуществления настоящего изобретения какие-либо из анти-TIM3 антител, предусмотренных в настоящем изобретении, применимы для детекции TIM3 в биологическом образце. Понятие «детекция» в контексте настоящего изобретения относится как к количественному, так и к качественному обнаружению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биологический образец включает клетки или ткани, например, стволовые раковые клетки от больных AML.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело для применения в способе диагностики или обнаружения. В другом объекте предусматривают способ детекции наличия TIM3 в биологическом образце. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения способ предусматривает контакт биологического образца с анти-TIM3 антителом согласно описанию настоящего изобретения в условиях, допускающих связывание анти-TIM3 антитела TIM3, и выяснение, действительно ли формируется комплекс между анти- анти-TIM3 антителом и TIM3. Такой способ может быть осуществлен in vitro или in vivo. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-TIM3 антитело применяют для отбора субъектов, которых можно лечить анти-TIM3 антителом, например, где TIM3 является биомаркером для выбора пациентов.
К расстройствам, которые могут быть диагностированы с применением антитела по настоящему изобретению, относятся онкологические заболевания, включая такие формы рака крови, как AML или множественная миелома (multiple myelomas - MM).
32
14
125
3
131
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают меченые анти-TIM3 антитела. К меткам относят, но ими перечень не ограничивается, метки или части молекулы, которые выявляют непосредственно (например, флуоресцентные, хромофорные, электронноплотные, хемолюминесцентные и радиоактивные метки), а также части молекул, например, ферменты или лиганды, которые обнаруживают по косвенным признакам, например, по ферментативной реакции или по молекулярному взаимодействию. Примерами меток являются, но ими перечень не ограничивается, радиоизотопы Р, С, I, Н и I, флуорофоры, например, хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люцифераза светлячка и бактериальная люцифераза (US 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидаза хрена (horseradish peroxidase - HRP), щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, неконъюгированные сахариды, например, глюкооксидаза, галактозооксидаза и глюкоза-6-фосфат-дегидрогеназа, гетероциклические оксидазы, например, уриказа и ксантиноксидаза, соединенные с ферментом, который использует перекись водорода для окисления предшественника красителя, например, HRP, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы и другие.
Е. Фармацевтические составы
е

Фармацевтические составы анти-TIM3 антитела по настоящему изобретению получают путем перемешивания антитела, обладающего требуемой степенью чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 изд., под ред. Osol, 1980), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители обычно нетоксичны для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают, но ими перечень не ограничивается, следующие носители: буферы, например, фосфатный, цитратный и других органических кислот, антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин, консерванты (например, октадецилдиметилбензиламмоний хлорид, гексаметоний хлорид, бензалконий хлорид, бензетоний хлорид, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкильные парабены, например, метильный или пропильный парабен, катехол, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и m-крезол), низкомолекулярные полипептиды (менее примерно 10 остатков), белки, например, сывороточный альбумин, желатин, иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, например, поли(винилпирролидон), аминокислоты, например, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин, моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу, или декстрины, хелатирующие агенты, например, EDTA, сахара, например, сахароза, маннит, трегалоза или сорбит, солеобразующие противоионы, например, натрий, комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок), и/или неионные поверхностно активные вещества, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ). В настоящем изобретении также предусматривают фармацевтически приемлемые носители, например, дисперсии интерстициальных лекарственных средств, например, растворимые нейтрально активные гликопротеины гиалуронидазы (soluble neutral-active hyaluronidase glycoproteins - sHASEGP), например, растворимые PH-20 гликопротеины гиалуронидазы человека, например, rhuPH20 (продукт HYLENEX, фирма Baxter International). Некоторые примеры sHASEGP и способы применения, включая rhuPH20, описаны в US 2005/0260186 и US 2006/0104968. В одном из объектов sHASEGP комбинируют с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, например, с хондроитиназами.
Примеры лиофилизированных составов антител описаны в US 6267958. К водным составам антител относят композиции, описанные в патентах US 617586 и WO 2006/044908, причем последние составы включают гистидин-ацетатный буфер.
Состав по настоящему изобретению также может включать более одного активного ингредиента при необходимости лечения определенного заболевания, предпочтительно из числа тех, которые имеют дополнительные активности, которые не оказывают неблагоприятного воздействия друг на друга. Например, может быть желательным дополнительное обеспечение [[список препаратов, которые могут быть объединены с анти-TIM3 антителом]]. Такие активные ингредиенты соответствующим образом содержатся в комбинации в количествах, которые являются эффективными для намеченной цели.
е
Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или межфазной полимеризации, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлы или желатина и поли-(метилметакрилатными) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарств (например, в липосомах, микросферах из альбумина, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методы описаны в кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences», 16 изд., под ред. Osol, 1980.
Можно приготовить препараты с замедленным высвобождением. Соответствующими примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, причем матрицы находятся в виде формованных изделий, например пленок или микрокапсул.
Составы, используемые для введения in vivo, обычно стерильны. Стерильность может быть легко достигнута, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
Ж. Терапевтические способы и композиции
Какие-либо из предусмотренных в настоящем изобретении анти-TIM3 антител (или антигенсвязывающих белков) или иммуноконъюгатов анти-TIM3 антител (или антигенсвязывающих белков), конъюгированных с цитотоксическим агентом, можно применять в терапевтических методах.
В одном из объектов предусматривают анти-TIM3 антитело или иммуноконъюгат анти-TIM3 антитела с цитотоксическим агентом для применения в качестве лекарственного средства. В других объектах анти-TIM3 антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом, для применения в лечении рака. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают применение анти-TIM3 антитела или иммуноконъюгатов анти-TIM3 антитела с цитотоксическим агентом для применения в способе лечения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело или иммуноконъюгат анти-TIM3 антитела с цитотоксическим агентом для применения в способе лечения индивидуума с онкологическим заболеванием, включающем введение индивидууму эффективного количества анти-TIM3 антитела или иммуноконъюгат анти-TIM3 антитела с цитотоксическим агентом.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело или иммуноконъюгат анти-TIM3 антитела, конъюгированный с цитотоксическим агентом для применения в индукции апоптоза в раковых клетках или для ингибирования пролиферации раковых клеток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело или иммуноконъюгат анти-TIM3 антитела, конъюгированный с цитотоксическим агентом, для применения в способе индукции апоптоза в раковых клетках или ингибирования пролиферации раковых клеток у индивидуума, включающем введение индивидууму эффективного анти-TIM3 антитела или иммуноконъюгата анти-TIM3 антитела, конъюгированного с цитотоксическим агентом для индукции апоптоза в раковых клетках или для ингибирования пролиферации раковых клеток.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело для применения в качестве иммуностимулирующего агента или для стимуляции секреции IFN гамма. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-TIM3 антитело для применения в способе иммуностимуляции или стимуляции секреции IFN гамма у индивидуума, включающем введение индивидууму эффективного анти-TIM3 антитела для имуностимуляции или стимуляции секреции IFN гамма.
Понятие «индивидуум» в каком-либо из приведенных выше вариантов осуществления настоящего изобретения предпочтительно относится к человеку. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают применение анти-TIM3 антитела или иммуноконъюгата анти-TIM3 антитела, конъюгированного с цитотоксическим агентом, для получения лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения лекарственное средство предназначено для лечения рака. В другом варианте осуществления настоящего изобретения лекарственное средство предназначено для способа лечения рака, включающего введение индивидууму, больному раком, эффективного количества лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения лекарственное средство предназначено для индукции апоптоза в раковых клетках или ингибирования пролиферации раковых клеток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения лекарственное средство предназначено для применения в способе индукции апоптоза в раковых клетках или ингибирования пролиферации раковых клеток у индивидуума, больного раком, включающем введение индивидууму эффективного количества лекарственного средства для индукции апоптоза в раковых клетках или ингибирования пролиферации раковых клеток. «Индивидуумом» в каком-либо из указанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения может быть человек.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают способ лечения рака. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает введение больному раком индивидууму эффективного количества анти-TIM3 антитела. В каком-либо из вариантов осуществления настоящего изобретения «индивидуумом» может быть человек.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают способ индукции апоптоза в раковых клетках или ингибирования пролиферации раковых клеток у индивидуума, больного раком. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает введение индивидууму эффективного количества анти-TIM3 антитела или иммуноконъюгата анти-TIM3 антитела, конъюгированного с цитотоксическим соединением для индукции апоптоза в раковых клетках или для ингибирования пролиферации раковых клеток у индивидуума, больного раком. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения «индивидуумом» является человек.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают фармацевтические составы, включающие какие-либо из анти-TIM3 антител по настоящему изобретению, например, для применения в каком-либо из указанных выше терапевтических способах. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтический состав включает какое-либо из анти-TIM3 антител по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Антитела по настоящему изобретению (и какой-либо дополнительный терапевтический агент) могут вводить каким-либо приемлемым способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное введение, и, при потребности в местном применении, внутрь раны. К парентеральным введениям относят внутримышечные, внутривенные, внутриартериальные, внутрибрюшинные или подкожные введения. Дозирование может быть осуществлено каким-либо приемлемым путем, например, инъекциями, например, внутривенными или подкожными инъекциями, в зависимости от того, осуществляют ли введение кратковременно или постоянно. В настоящем изобретении рассматривают различные схемы дозирования, включая, но, не ограничиваясь ими, однократное или множественное введение в различные моменты времени, болюсные введения и пульсовую инфузию.
Антитела по настоящему изобретению могут быть переработаны, дозированы и введены в соответствии с квалифицированной медицинской практикой. В этом контексте учитывают конкретное подвергаемое лечению заболевание, вид млекопитающего, клиническое состояние пациента, причину заболевания, место для доставки агента, способ введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Антитело может быть необязательно переработано в состав вместе с одним или несколькими агентами, которые в настоящее время используют для предотвращения или лечения определенного заболевания. Эффективное количество таких дополнительных агентов зависит от количества присутствующего в составе антитела, типа расстройства или лечения и других факторов, рассмотренных выше. Обычно их применяют в тех же дозах и вводят теми же способами, что и описанные в настоящем изобретении, или примерно от 1 до 99% дозировок, описанных в настоящем изобретении, или в какой-либо дозировке и способом, который эмпирически/клинически определяют в качестве допустимого.
Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая доза антитела по настоящему изобретению (при использовании отдельно или в сочетании с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими агентами) может зависеть от типа заболевания, подвергаемого лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, независимо от того, вводят ли антитело в профилактических или терапевтических целях, от предшествующей терапии, истории болезни пациента и реакции на антитело, а также от частоты посещения лечащего врача. Антитело соответствующим способом вводят пациенту однократно или в течение серии введений. В зависимости от типа и тяжести заболевания доза антитела примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,5-10 мг/кг) может быть исходной дозой для введения пациенту, будь то, например, одно или несколько введений или непрерывная инфузия. Обычная суточная доза может варьировать примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. Для повторных введений на протяжении нескольких суток или более длительно в зависимости от состояния, обычно лечение проводят до тех пор, пока не произойдет желаемое подавление симптомов болезни. Одна примерная доза антитела может находиться в диапазоне примерно от 0,05 мг/кг до примерно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту можно вводить одну или несколько доз, составляющих примерно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или какую-либо их комбинацию). Такие дозы можно вводить с перерывами, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получал примерно от двух до примерно двадцати или, например, около шести доз антитела). Можно вводить начальную более высокую нагрузочную дозу, за которой вводят одну или несколько более низких доз. Рекомендуемый режим дозирования включает введение начальной нагрузочной дозы примерно 4 мг/кг с последующей еженедельной поддерживающей дозой примерно 2 мг/кг антитела. Однако могут быть полезны другие режимы дозировки. Прогресс этой терапии легко подвергается мониторингу обычными методами и исследованиями.
Очевидно, что какой-либо из указанных выше составов или терапевтических способов может быть осуществлен с применением иммуноконъюгата по настоящему изобретению вместо добавления к анти-TIM3 антитела.
III. Получение продуктов
В другом объекте настоящего изобретения предусматривают получение продуктов, полезных для лечения, предупреждения и/или диагностики описанных выше расстройств. Получаемые продукты включают контейнер и этикетку или инструкцию по применению, которую вкладывают в контейнер или прилагают к нему. К подходящим контейнерам относят, например, бутыли, флаконы, шприцы, мешки для внутривенного введения и др. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, например, из стекла или пластика. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией эффективна в лечении, предупреждении и/или диагностике состояния и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может быть мешочком для внутривенного введения или флаконом, имеющим пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере, один активный агент в композиции является антителом по настоящему изобретению. Этикетка или вкладыш информируют, что композиция применима для лечения состояния выбора. Кроме того, этикетка продукта может включать (а) первый контейнер с композицией и (б) второй контейнер с композицией, причем состав включает дополнительный цитотоксический или иной терапевтический агент. Продукт по настоящему изобретению может дополнительно включать вкладыш, указывающий, что композицию можно применять для лечения определенного состояния. В другом варианте или дополнительно продукт также может включать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, например, бактериостатическую воду для инъекций (bacteriostatic water for injection - BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Продукт также может включать другие материалы, ценные для пользователя и с коммерческой точки зрения, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Очевидно, что какой-либо из указанных выше продуктов может включать иммуноконъюгат по настоящему изобретению вместо анти-TIM антитела или дополнительно к нему.
Описание аминокислотных последовательностей
SEQ ID NO: 1 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0016
SEQ ID NO: 2 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0016
SEQ ID NO: 3 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0016
SEQ ID NO: 4 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0016
SEQ ID NO: 5 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0016
SEQ ID NO: 6 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0016
SEQ ID NO: 7 вариабельный домен VH тяжелой цепи, Tim3_0016
SEQ ID NO: 8 вариабельный домен VL легкой цепи, Tim3_0016
SEQ ID NO: 9 вариабельный домен VH тяжелой цепи, Tim3_0016 вариант (0018)
SEQ ID NO: 10 вариабельный домен VL легкой цепи, Tim3_0016 вариант (0018)
SEQ ID NO: 11 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0016_HVR-Ll вариант 1_NQ
(удаление сайта гликозилирования путем мутации по типу замены N на Q)
SEQ ID NO: 12 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0016_HVR-Ll вариант 2_NS
(удаление сайта гликозилирования путем мутации по типу замены N на S)
SEQ ID NO: 13 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0021
SEQ ID NO: 14 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0021
SEQ ID NO: 15 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0021
SEQ ID NO: 16 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0021
SEQ ID NO: 17 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0021
SEQ ID NO: 18 HVR-L3, легкой цепи Tim3_0021
SEQ ID NO: 19 вариабельный домен VH тяжелой цепи, Tim3_0021
SEQ ID NO: 20 вариабельный домен VL легкой цепи, Tim3_0021
SEQ ID NO: 21 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0022
SEQ ID NO: 22 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0022
SEQ ID NO: 23 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0022
SEQ ID NO: 24 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0022
SEQ ID NO: 25 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0022
SEQ ID NO: 26 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0022
SEQ ID NO: 27 вариабельный домен VH тяжелой цепи, Tim3_0022
SEQ ID NO: 28 вариабельный домен VL легкой цепи, Tim3_0022
SEQ ID NO: 29 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0026
SEQ ID NO: 30 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0026
SEQ ID NO: 31 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0026
SEQ ID NO: 32 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0026
SEQ ID NO: 33 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0026
SEQ ID NO: 34 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0026
SEQ ID NO: 35 вариабельный домен VH тяжелой цепи, Tim3_0026
SEQ ID NO: 36 вариабельный домен VL легкой цепи, Tim3_0026
SEQ ID NO: 37 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0028
SEQ ID NO: 38 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0028
SEQ ID NO: 39 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0028
SEQ ID NO: 40 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0028
SEQ ID NO: 41 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0028
SEQ ID NO: 42 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0028
SEQ ID NO: 43 вариабельный домен VH тяжелой цепи, Tim3_0028
SEQ ID NO: 44 вариабельный домен VL легкой цепи, Tim3_0028
SEQ ID NO: 45 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0030
SEQ ID NO: 46 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0030
SEQ ID NO: 47 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0030
SEQ ID NO: 48 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0030
SEQ ID NO: 49 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0030
SEQ ID NO: 50 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0030
SEQ ID NO: 51 вариабельный домен VH тяжелой цепи, Tim3_0030
SEQ ID NO: 52 вариабельный домен VL легкой цепи, Tim3_0030
SEQ ID NO: 53 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0033
SEQ ID NO: 54 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0033
SEQ ID NO: 55 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0033
SEQ ID NO: 56 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0033
SEQ ID NO: 57 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0033
SEQ ID NO: 58 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0033
SEQ ID NO: 59 вариабельный домен VH тяжелой цепи, Tim3_0033
SEQ ID NO: 60 вариабельный домен VL легкой цепи, Tim3_0033
SEQ ID NO: 61 HVR-H1 тяжелой цепи, Tim3_0038
SEQ ID NO: 62 HVR-H2 тяжелой цепи, Tim3_0038
SEQ ID NO: 63 HVR-H3 тяжелой цепи, Tim3_0038
SEQ ID NO: 64 HVR-L1 легкой цепи, Tim3_0038
SEQ ID NO: 65 HVR-L2 легкой цепи, Tim3_0038
SEQ ID NO: 66 HVR-L3 легкой цепи, Tim3_0038
SEQ ID NO: 67 вариабельный домен VH тяжелой цепи, Tim3_0038
SEQ ID NO: 68 вариабельный домен VL легкой цепи, Tim3_0038
SEQ ID NO: 69 пример экзотоксина A Pseudomonas вариант 1 (пример деиммунизированного PE24)
SEQ ID NO: 70 пример экзотоксина A Pseudomonas вариант 2 (пример деиммунизированного PE24)
SEQ ID NO: 71 константная область легкой цепи каппа человека
SEQ ID NO: 72 константная область легкой цепи лямбда человека
SEQ ID NO: 73 константная область тяжелой цепи человека, производная от IgG1,
SEQ ID NO: 74 константная область тяжелой цепи человека, производная от IgG1, с мутациями L234A и L235A
SEQ ID NO: 75 константная область тяжелой цепи человека, производная от IgG1, с мутациями L234A, L235A и P329G
SEQ ID NO: 76 константная область тяжелой цепи человека, производная от IgG4,
SEQ ID NO: 77 пример последовательности TIM3 человека
SEQ ID NO: 78 внеклеточный домен TIM3 человека (Extracellular Domain - ECD)
SEQ ID NO: 79 гуманизированная версия VH Tim3_0016 варианта (0018) (= Tim3-0433)
SEQ ID NO: 80 гуманизированная версия VL Tim3_0016 варианта (0018) (= Tim3-0433)
SEQ ID NO: 81 гуманизированная версия VH Tim3_0016 варианта (0018) (= Tim3-0434)
SEQ ID NO: 82 гуманизированная версия VL Tim3_0016 варианта (0018) (= Tim3-0434)
SEQ ID NO: 83 гуманизированная версия VH Tim3-0028 (= Tim3-0438)
SEQ ID NO: 84 гуманизированная версия VL Tim3-0028 (= Tim3-0438)
SEQ ID NO: 85 гуманизированная версия VH Tim3-0028 (= Tim3-0443)
SEQ ID NO: 86 гуманизированная версия VL Tim3-0028 (= Tim3-0443)
Ниже приведены аминокислотные последовательности доменов VH и VL, включающие отмеченные гипервариабельные области (HVR) ((HVR) выделены жирным шрифтом, буквы подчеркнуты), анти-TIM3 антител Tim3-0016, Tim3-0016 вариант (0018) и их гуманизированных версий Tim3-0433 и Tim3-0434, Tim3-0021, Tim3-0022, Tim3-0026, Tim3-0028 и их гуманизированных версий Tim3-0438 and Tim3-0443, Tim3-0030, и Tim3-0033, Tim3-0038:
VH Tim3_0016:
VL Tim3_0016:
VH Tim3_0018(= VL Tim3_0016 вариант):
VL Tim3_0018 (= VL Tim3_0016 вариант):
VH гуманизированная версия Tim3_0016 вариант (0018) (= Tim3-0433)
VL гуманизированная версия Tim3_0016 вариант (0018) (= Tim3-0433)
VH гуманизированная версия Tim3_0016 вариант (0018) (= Tim3-0434)
VL гуманизированная версия Tim3_0016 вариант (0018) (= Tim3-0434
VH Tim3_0021:
VL Tim3_0021:
VH Tim3_0022:
VL aTim3_0022:
VH Tim3_0026:
VL Tim3_0026
VH Tim3_0028:
VL Tim3_0028:
VH гуманизированная версия Tim3-0028 (= Tim3-0438)
VL гуманизированная версия Tim3-0028 (= Tim3-0438)
VH гуманизированная версия Tim3-0028 (=Tim3-0443)
VL гуманизированная версия Tim3-0028 (=Tim3-0443)
VH aTim3_0030:
VL aTim3_0030:
VH aTim3_0033:
VL aTim3_0033:
VHaTim3_0038:
VL aTim3_0038:
Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения:
1. Выделенное антитело, связывающееся с TIM3, которое:
- Индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3 (ATCC CCL-155™)), по меньшей мере, на 45% через 120 мин при 37°C (см. пример 6).
- В одном из объектов настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3 (АТСС CCL-155™)), по меньшей мере, на 50% через 120 мин при 37°C (см. пример 6).
- В одном из объектов настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3 (АТСС CCL-155™)), по меньшей мере, на 55% через 120 мин при 37°C (см. пример 6).
- В одном из объектов настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3 (АТСС CCL-155™)), по меньшей мере, на 60% через 240 мин при 37°C (см. пример 6).
- В одном из объектов настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3 (АТСС CCL-155™)), по меньшей мере, на 65% через 240 мин при 37°C (см. пример 6).
2. Анти-TIM3 антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 1, которое:
- конкурирует за связывание с TIM3 с анти-Tim3 антителом, включающим VH и VL Tim3_0016,
- связывается с TIM3 человека и макака крабоеда,
- проявляет в качестве иммуноконъюгата цитотоксическую активность на ТIM3-экспрессирующих клетках (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат обладает относительной величиной IC50 цитотоксической активности в качестве конъюгата с экзотоксином А Pseudomonas на клетках RPMI-8226, равной 0,1 или меньше (см. измерение в примере 11),
- индуцирует высвобождение интерферона гамма (анализ MLR).
3. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 1, которое является антителом человека, гуманизированным или химерным антителом.
4. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 1, которое является фрагментом антитела, связывающимся с TIM3.
5. Фрагмент антитела по варианту осуществления настоящего изобретения 1, которое является Fab-фрагментом.
6. Анти-TIM3 антитело по какому-либо из предшествующих вариантов осуществления настоящего изобретения, включающее:
A) (a) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Б) (а) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
B) (а) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Г) (a) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, или
Д) (а) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, или
Е) (а) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, или
Ж) (а) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, или
З) (a) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, или
И) (а) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, или
К) (а) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66.
7. Выделенное антитело, связывающееся с TIM3 человека, которое включает
(а) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
8. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 7, включающее:
i) последовательность VH SEQ ID NO: 79 и последовательность VL SEQ ID NO: 80, или
ii) последовательность VH SEQ ID NO: 81 и последовательность VL SEQ ID NO: 82.
9. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 7, включающее последовательность VH SEQ ID NO: 79 и последовательность VL SEQ ID NO: 80.
10. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 7, включающее последовательность VH SEQ ID NO: 80 и последовательность VL SEQ ID NO: 82.
11. Связывающееся с TIM3 человека выделенное антитело, включающее (а) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (б) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, (в) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, (г) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (д) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (е) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42.
12. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 11, включающее:
i) последовательность VH SEQ ID NO: 83 и последовательность VL SEQ ID NO: 84, или
ii) последовательность VH SEQ ID NO: 85 и последовательность VL SEQ ID NO: 86.
13. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 11, включающее последовательность VH SEQ ID NO: 83 и последовательность VL SEQ ID NO: 84.
14. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 11, включающее последовательность VH SEQ ID NO: 85 и последовательность VL SEQ ID NO: 86.
15. Анти-TIM3 антитело по какому-либо из предшествующих вариантов осуществления настоящего изобретения, включающее:
А) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Б) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
В) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Г) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, или
Д) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 23, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, или
Е) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 31, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, или
Ж) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 39, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, или
З) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 47, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, или
И) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 55, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, или
К) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 63, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66.
16. Связывающееся с TIM3 человека выделенное антитело, включающее (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
17. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 16, включающее:
i) последовательность VH SEQ ID NO: 79 и последовательность VL SEQ ID NO: 80, или
ii) последовательность VH SEQ ID NO: 81 и последовательность VL SEQ ID NO: 82.
18. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 16, включающее последовательность VH SEQ ID NO: 79 и последовательность VL SEQ ID NO: 80.
19. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 16, включающее последовательность VH SEQ ID NO: 81 и последовательность VL SEQ ID NO: 82.
20. Связывающееся с TIM3 человека выделенное антитело, включающее (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 39, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42.
21. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 20, включающее:
i) последовательность VH SEQ ID NO: 83 и последовательность VL SEQ ID NO: 84, или
ii) последовательность VH SEQ ID NO: 85 и последовательность VL SEQ ID NO: 86.
22. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 20, включающее последовательность VH SEQ ID NO: 83 и последовательность VL SEQ ID NO: 84.
23. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 20, включающее последовательность VH SEQ ID NO: 85 и последовательность VL SEQ ID NO: 86.
24. Анти-TIM3 антитело по какому-либо из предшествующих вариантов осуществления настоящего изобретения, включающее:
А) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Б) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
В) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или
Г) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, или
Д) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 23, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, или
Е) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 31, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, или
Ж) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 39, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, или
З) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 47, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, или
И) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 55, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, или
К) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 63, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66,
причем антитело отличается независимо одним или несколькими из следующих свойств: анти-TIM3 антитело
- Индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 45% через 120 мин при 37°С (см. пример 6).
- В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 50% через 120 мин при 37°С (см. пример 6).
- В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 55% через 120 мин при 37°С (см. пример 6).
- В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 60% через 240 мин при 37°С (см. пример 6).
- В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 65% через 240 мин при 37°С (см. пример 6).
- конкурирует за связывание с TIM3 с анти-Tim3 антителом, включающим VH SEQ ID NO: 7 и VL SEQ ID NO: 8.
- связывается с TIM3 человека и макака крабоеда,
- проявляет в качестве иммуноконъюгата цитотоксическую активность на TIM3-экспрессирующих клетках (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат обладает относительной величиной IC50 цитотоксической активности в качестве конъюгата с экзотоксином А Pseudomonas на клетках RPMI-8226, равной 0,1 или меньше (см. измерение в примере 11),
- индуцирует высвобождение интерферона гамма (анализ в реакции смешанных лимфоцитов (Mixed Lymphocyte Reaction - MLR, см. пример 5).
25. Связывающееся с TIM3 человека выделенное антитело, включающее (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6,
причем антитело отличается независимо одним или несколькими из следующих свойств: анти-TIM3 антитело
- индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 45% через 120 мин при 37°С (см. пример 6),
- в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 50% через 120 мин при 37°С (см. пример 6),
- в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 55% через 120 мин при 37°С (см. пример 6),
- в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 60% через 240 мин при 37°С (см. пример 6),
- в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 65% через 240 мин при 37°С (см. пример 6),
- конкурирует за связывание с TIM3 с анти-Tim3 антителом, включающим VH SEQ ID NO: 7 и VL SEQ ID NO: 8.
- связывается с TIM3 человека и макака крабоеда,
- проявляет в качестве иммуноконъюгата цитотоксическую активность на TIM3-экспрессирующих клетках (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат обладает относительной величиной IC50 цитотоксической активности в качестве конъюгата с экзотоксином А Pseudomonas на клетках RPMI-8226, равной 0,1 или меньше (см. измерение в примере 11),
- индуцирует высвобождение интерферона гамма (анализ в реакции смешанных лимфоцитов (Mixed Lymphocyte Reaction - MLR, см. пример 5).
26. Связывающееся с TIM3 человека выделенное антитело, включающее Ж) (а) домен VH, включающий (i) HVR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, (iii) HVR-H3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 39, и (б) домен VL, включающий (i) HVR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, (ii) HVR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, и (iii) HVR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42,
причем антитело отличается независимо одним или несколькими из следующих свойств: анти-TIM3 антитело
- индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 45% через 120 мин при 37°С (см. пример 6),
- в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 50% через 120 мин при 37°С (см. пример 6),
- в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 55% через 120 мин при 37°С (см. пример 6),
- в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 60% через 240 мин при 37°С (см. пример 6),
- в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело индуцирует интернализацию TIM3 (исследуют методом FACS на клетках RPMI8226, экспрессирующих TIM3), по меньшей мере, на 65% через 240 мин при 37°С (см. пример 6),
- конкурирует за связывание с TIM3 с анти-Tim3 антителом, включающим VH SEQ ID NO: 7 и VL SEQ ID NO: 8.
- связывается с TIM3 человека и макака крабоеда,
- проявляет в качестве иммуноконъюгата цитотоксическую активность на ТIM3-экспрессирующих клетках (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат обладает относительной величиной IC50 цитотоксической активности в качестве конъюгата с экзотоксином А Pseudomonas на клетках RPMI-8226, равной 0,1 или меньше (см. измерение в примере 11),
- индуцирует высвобождение интерферона гамма (анализ в реакции смешанных лимфоцитов (Mixed Lymphocyte Reaction - MLR, см. пример 5).
27. Антитело по одному из предшествующих вариантов осуществления настоящего изобретения, которое является IgG1 антителом полной длины.
28. Антитело по одному из предшествующих вариантов осуществления настоящего изобретения, которое является IgG1 антителом полной длины с L234A, L235A и P329G (нумерация по индексу EU по Kabat).
29. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по какому-либо из предшествующих вариантов осуществления настоящего изобретения.
30. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту по вариантов осуществления настоящего изобретения 29.
31. Способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по варианту осуществления настоящего изобретения 30 таким образом, что образуется антитело.
32. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 31, дополнительно включающий выделение антитела из клетки-хозяина.
33. Иммуноконъюгат, включающий антитело по вариантам осуществления настоящего изобретения 1-28 и цитотоксический агент.
34. Иммуноконъюгат по варианту осуществления настоящего изобретения 33, в котором цитотоксическим агентом является экзотоксин A Pseudomonas или аматоксин.
35. Фармацевтический состав, включающий антитело по вариантам осуществления настоящего изобретения 1-28 и фармацевтически приемлемый носитель.
36. Антитело по вариантам осуществления настоящего изобретения 1-28 или иммуноконъюгат по вариантам осуществления настоящего изобретения 33 или 34 для применения в качестве лекарственного средства.
37. Антитело по вариантам осуществления настоящего изобретения 1-28 или иммуноконъюгат по вариантам осуществления настоящего изобретения 33 или 34 для лечения рака.
38. Применение антитела по вариантам осуществления настоящего изобретения 1-28 или иммуноконъюгат по вариантам осуществления настоящего изобретения 33 или 34 для получения лекарственного средства.
39. Применение по варианту осуществления настоящего изобретения 38, в котором лекарственное средство предназначено для лечения рака.
40. Способ лечения больного раком индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по варианту осуществления настоящего изобретения 1 или конъюгата по варианту осуществления настоящего изобретения 33.
V. Примеры
Ниже приведены примеры способов и композиций по настоящему изобретению. Очевидно, что различные другие варианты осуществления настоящего изобретения могут быть осуществлены, с учетом представленного выше описания.
Хотя для лучшего понимания настоящее изобретение подробно изложено с применением иллюстраций и примеров, описание и примеры не следует рассматривать в качестве ограничения объема настоящего изобретения. Сущность патентной и научной литературы, цитируемой в настоящем изобретении, приведена в виде ссылок.
Пример 1а. Выработка анти-TIM3 антител
Иммунизация мышей
Мышей NMRI иммунизируют генетически, используя плазмидный экспрессирующий вектор, кодирующий TIM3 человека полной длины, путем внутрикожного применения 100 мкг ДНК вектора (плазмида 15304_hTIM3-fl) с последующей электропорацией (2 прямоугольных импульса 1000 В/см, длительность 0,1 мсек, интервал 0,125 сек, затем 4 прямоугольных импульса 287,5 В/см, длительность 10 мсек, интервал 0,125 сек. Мыши получают 6 последовательных иммунизации на 0, 14, 28, 42, 56, 70 и 84 сутки. Кровь берут на 36, 78 и 92 сутки и получают сыворотку, используемую для определения титра методом ELISA (см. ниже). Животных с наивысшими титрами отбирают для ревакцинации на 96 сутки путем внутривенной инъекции 50 мкг химеры рекомбинантного TIM3 человека и Fc человека, и моноклональные антитела выделяют гибридомным методом путем гибридизации спленоцитов с клетками линии миеломы на 3 сутки после ревакцинации.
Определение титров в сыворотке (ELISA)
Химеру рекомбинантного TIM3 человека и Fc человека иммобилизуют в 96-луночном планшете NUNC Maxisorp при концентрации 0,3 мкг/мл, 100 мкл/лунку, в ФСБ, после чего: блокируют планшет 2% кротеином С в ФСБ, 200 мкл/лунку, применяют серийные разведения антисыворотки, в повторах, в 0,5% кротеине С в ФСБ, 100 мкл/лунку, выявляют с помощью HRP-конъюгированного антитела козы против мыши (фирма Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071, 1/16 000). На всех стадиях планшеты инкубируют в течение 1 ч при 37°С. В интервалах между всеми стадиями планшеты промывают 3 раза 0,05% Tween 20 в ФСБ. Сигнал получают добавлением реактива ВМ Blue POD Substrate soluble (фирма Roche), 100 мкл/лунку и останавливают добавлением 1 М НС1, 100 мкл/лунку. Показание по поглощению снимают при 450 нм против 690 нм в качестве контроля. Титр определяют как разбавление антисыворотки, приводящее к полумаксимальному сигналу.
Пример 16. Описание анти-Tim3 антител
ELISA для Tim3
В планшеты наносят Nunc-Maxi Sorp Streptavidine (фирма MicroCoat, номер в каталоге 11974998/МС1099) по 25 мкл/лунку Tim3-ECD-His-Biotin (биотинилированного с помощью лигазы BirA) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч при перемешивании в режиме 400 об./мин. После промывки (3×90 мкл/лунку буфером PBST) 25 мкл образцов aTim3 или разведенного (серийные разведения 1:2) контрольного антитела aTim3 F38-2E2 (фирма Biolegend) добавляют и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. После промывки (3×90 мкл/лунку буфером PBST) добавляют 25 мкл/лунку антитело овцы против POD мыши (фирма GE, номер в каталоге NA9310V) в разведении 1:9000 и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч при перемешивании в режиме 400 об./мин. После промывки (4×90 мкл/лунку буфером PBST) вносят 25 мкл/лунку субстрата ТМВ (фирма Calbiochem, номер в каталоге CL07) и инкубируют до оптической плотности 1,5-2,5. Реакцию останавливают добавлением 25 мкл/лунку раствора 1 н HCL. Измерение проводят при 370/492 нм.
Полученные методом ELISA суммарные результаты приводят в виде величин ЕС50 [нг/мл] в табл. 2 внизу.
Пример: Клеточный метод ELISA для TIM3
Линию прикрепляющихся клеток СНО-K1, стабильно трансфецированных плазмидой 15312_hTIM3-fl_pUC_Neo, кодирующей TIM3 человека полной длины, и отобранных с помощью антибиотика G418 (на плазмиде маркер устойчивости к неомицину), высевают в концентрации 1,2×10Е6 клеток/мл в 384-луночные плоскодонные планшеты и выращивают в течение ночи.
На следующие сутки добавляют 25 мкл/лунку образца TIM3 или контрольного антитела aTim3 F38-2E2 Azide free (фирма Biolegend, номер в каталоге 354004) инкубируют в течение 2 ч при 4°С (чтобы избежать интернализации). После промывки 3×90 мкл/лунку PBST (BIOTEK Washer: Prog. 29, 1×90) клетки быстро фиксируют, удаляя остаточный буфер и добавляя 50 мкл/лунку 0,05% глутаральдегида: разведение 1:500 25% глутаральдегида (фирма Sigma, номер в каталоге G5882) в 1×ФСБ-буфере, после чего инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки 3×90 мкл/лунку PBST (BIOTEK Washer: Prog. 21, 3×90 GreinLysin) вносят 25 мкл/лунку второго антитела для детекции (антитело овцы против POD мыши, фрагмент F(ab')2, связанный с POD хрена, фирма GE NA9310) с последующим инкубированием в течение 2 ч при комнатной температуре в режиме 400 об./мин. После промывки (3×90 мкл/лунку PBST, фирма BIOTEK Washer: Prog. 21, 3×90 GreinLysin) добавляют 25 мкл/лунку раствора субстрата тетраметилбензидина (tetramethylbenzidine - ТМВ, (фирма Roche, номер в каталоге 11835033001) и инкубируют до оптической плотности 1,5-2,5. Затем реакцию останавливают добавлением 25 мкл/лунку раствора 1 н HCL. Измерение проводят при 370/492 нм.
Результаты клеточного метода ELISA приводят в виде «ЕС50 CHO-Tim3»-величин [нг/мл] в табл. 2 ниже.
*нет возможности определить, скорее всего, из-за отсутствия связывания или слабого связывания.
Описание BIAcore Tim3-антител
D
Исследование методом поверхностного плазменного резонанса (surface plasmon resonance - SPR) применяют для определения кинетических параметров связывания между несколькими связующими Tim3 мыши, а также коммерческими контролями связывания Tim3 человека. Для этого антитело против IgG мыши иммобилизуют путем аминного связывания с поверхностью сенсорного чипа СМ5 (BIAcore). Затем образцы захватывают и с ними связывают мономерный Tim3-ECD человека/макака крабоеда (hu/cy), а также Fc-меченый димер Tim3-ECD человека. Поверхность сенсорного чипа регенерируют после каждого цикла анализа. Константу равновесия К рассчитывают, используя простую модель связывания Лэнгмюра один-к-одному.
Примерно 12000 единиц ответа (RU) 30 мкг/мл антитела против IgG мыши (фирма GE Healthcare, номер в каталоге BR-1008-38) связывают с пятнами 1, 2, 4 и 5 проточных кювет 1-4 (пятна 1, 5 активны, пятна 2, 4 являются контролем) на сенсорном чипе СМ5 BIAcore B4000 при рН 5,0, используя набор для соединения аминов (фирма GE Healthcare).
Буфер HBS-EP + (0,01 М HEPES, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05 об. % поверхностно активного вещества Р20, рН 7,4) используют для образца и в качестве подвижного буфера. Температуру проточной кюветы устанавливают на 25°С, температуру компартмента для образца устанавливают на 12°С. Систему заполняют подвижным буфером.
Образцы впрыскивают в течение 30 сек в концентрации 200 мкг/мл и связывают с пятнами 1 и 5 каждой проточной кюветы, допуская параллельное измерение восьми образцов. Затем полный набор разных (мономерных макака крабоеда, мономерных человека и huFc гибридизированных димерных Tim3-ECD человека) концентраций (см. табл. X) впрыскивают поверх каждого образца в течение 240 сек с последующим временем диссоциации 30/1800 сек (см. табл. 1). Каждый цикл анализа (захват образца, пятна 1 и 5 - впрыскивание Tim3 ECD) затем регенерируют с помощью длительного введения на протяжении 30 сек глицина-HCl рН 1,7. Скорость тока устанавливают на 30 мкл/мин на протяжении всего пробега.

В итоге данные с двойным контролем рассчитывают, используя простую модель связывания Лэнгмюра один-к-одному (программное обеспечение BIAcore В4000 Evaluation Software BIACORE Evaluation Software). Получаемые показатели аффинности к мономерным Tim3 человека (huTim3), макака крабоеда (cyTim3) и к huFc гибридизированному димерному Tim3 человека (huTim3Fc) показаны в табл. 2 и 3. Аффинность с димером hu Tim3 наиболее вероятно подвержено авидности и поэтому, несомненно, сильнее, чем сродство с мономерным huTim3.
*нет возможности определить, скорее всего, из-за отсутствия связывания или слабого связывания.
Определение аффинности с Tim3 через SPR (химерный TIM3-0016 вариант (0018) и гуманизированные версии)
Белок А иммобилизуют аминной связью с поверхностью сенсорного чипа СМ5 (фирма Biacore). Затем образцы захватывают и с ними связывают мономерный Tim3-ECD человека (huTim3-ECD). Поверхность сенсорного чипа регенерируют после каждого цикла анализа. В итоге константу равновесия и кинетику констант скорости рассчитывают по полученным результатам, используя простую модель связывания Лэнгмюра один-к-одному.
Примерно 2000 единиц ответа (RU) 20 мкг/мл белка А соединяют с пятнами 1, 2, 4 и 5 всех проточных кювет сенсорного чипа СМ5 в приборе Biacore B4000, используя набор для соединения аминов (фирма GE Healthcare).
Буфер HBS-EP + (0,01 М HEPES, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05 об. % поверхностно активного вещества Р20, рН 7,4) используют для образца и в качестве подвижного буфера. Температуру проточной кюветы устанавливают на 25°С, температуру компартмента для образца устанавливают на 12°С. Систему заполняют подвижным буфером.
Различные образцы впрыскивают в течение 30 сек в концентрации 10 нМ и последовательно связывают с пятнами 1 и 5 во всех подвижных кюветах. Затем полный набор разведении мономерного Tim3-ECD человека (600 нМ, 200 нМ, 66,7 нМ, 2×22,2 нМ, 7,4 нМ, 2,5 нМ и 2×0 нМ) последовательно впрыскивают поверх каждого образца в течение 300 сек. После каждого впрыскивания антигена время диссоциации составляет 12 сек/1000 сек, и осуществляют две стадии регенерации по 30 сек раствором глицин-HCl рН 1,5, причем последняя из них включает период стабилизации после впрыскивания 20 сек.

D
В итоге данные с двойным контролем устанавливают, используя простую модель связывания Лэнгмюра один-к-одному (программное обеспечение BIACORE Evaluation Software). Полученные величины K показаны в табл. 36.
Определение аффинности с Tim3 методом поверхностного плазменного резонанса (surface plasmon resonance - SPR) ((химерное TIM3-0028 и гуманизированные версии))
IgG против Fc человека иммобилизуют аминной связью с поверхностью сенсорного чипа СМ5 (фирма Biacore). Затем образцы захватываются и связываются с huTim3-ECD. Поверхность сенсорного чипа регенерируют после каждого цикла анализа. Константу равновесия и константы кинетической скорости в итоге рассчитывают, используя простую модель связывания Лэнгмюра один-к-одному.
Примерно 25000 единиц ответа (RU) 20 мкг/мл IgG против Fc человека (фирма GE Healthcare, номер в каталоге BR-1008-39) соединяют на пятнах 1, 2, 4 и 5 всех проточных кювет сенсорного чипа СМ5 на приборе Biacore B4000, используя набор для соединения аминов (фирма GE Healthcare).
Буфер HBS-EP + (0,01 М HEPES, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05 об. % поверхностно активного вещества Р20, рН 7,4) используют для образца и в качестве подвижного буфера. Температуру проточной кюветы устанавливают на 25°С, температуру компартмента для образца устанавливают на 12°С. Систему заполняют подвижным буфером.
2
Разные образцы впрыскивают в течение 30 сек в концентрации 10 нМ и последовательно связывают с пятнами 1 и 5 в проточных кюветах. Затем полный набор разведении мономерного Tim3-ECD человека (600 нМ, 200 нМ, 66,7 нМ, 2×22,2 нМ, 7,4 нМ, 2,5 нМ, 2×0 нМ) последовательно впрыскивают поверх каждого образца в течение 300 сек. Каждое впрыскивание антигена сопровождается периодом диссоциации длительностью 12 сек/700 сек и двумя стадиями регенерации длительностью 30 сек раствором 3 М MgCl, из которых последняя осуществляет «особую промывку после впрыскивания» подвижным буфером.

D
В итоге данные с двойным контролем устанавливают, используя простую модель связывания Лэнгмюра один-к-одному (программное обеспечение BIACORE Evaluation Software). Полученные величины K показаны в табл. 3б.
Таблица 3б. Связывающие аффинности, определяемые по значениями BIAcore-KD, полученным методом поверхностного плазменного резонанса (surface plasmon resonance - SPR).
Пример 2. Выработка производных анти-Tim3 антител
Производные химерных антител
Химерные антитела Tim3 получают амплификацией вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антител против TIM3 мыши Tim3-0016, Tim3-0016 вариант (0018), Tim3-0021, Tim3-0022, Tim3-0026, Tim3-0028, Tim3-0030 и Tim3-0033, Tim3-0038 методом ПЦР и их клонирования в тяжелой цепи в векторах экспрессии в качестве гибридных белков с каркасами IgG1 человека/ СН1-шарнир-СН2-СН3 человека с мутациями LALA и PG (лейцин 234 на аланин, лейцин 235 на аланин, пролин 329 на глицин), аннулируя эффекторные функции, и в легкой цепи в векторах экспрессии в качестве гибридных белков C-kappa человека. Затем плазмиды LC и НС совместно трансфецируют в клетки НЕК293 и очищают через 7 суток из супернатантов стандартными методами очистки антител.
Удаление сайта гликолизации NYT: модификация 1 положения HVR-L1 в Tim3-0016, Tim3_0016 варианте (обозначаемых 0018 или Tim3_0018) путем замещения N на Q или S
Мутации в вариабельной области легкой цепи Tim3_0016 и Tim3_0016 вариант (0018) получают мутагенезом in vitro, используя набор "Quick Change Lightning Site-directed Mutagenesis Kit" фирмы Agilent по инструкциям производителя. Этим методом аспарагин (N) в мотиве NYT сайта гликозилирования в легкой цепи HVR-L1 (SEQ ID NO: 4) замещают глутамином (Q) (в результате получают SEQ ID NO: 11=Tim3_0016_HVR-L1 вариант 1_NQ) или, в другом варианте, аспарагин (N) замещают серином (S) (в результате получают SEQ ID NO: 12=Tim3_0016_HVR-L1 вариант 2_NS). В обоих случаях мотив NYT сайта гликозилирования успешно модифицирован. Плазмиды LC и НС, кодирующие варианты, затем одновременно впрыскивают в клетки HEK293 и через 7 суток антитела выделяют из супернатантов стандартными методами очистки.
Полученные мутанты тестируют методом ELISA в отношении Tim3 человека, методом ELISA в отношении Tim3 макака крабоеда методом клеточного ELISA на прикрепленных клетках СНО-K1, экспрессирующих Tim3 человека полной длины.
Установлено, что все полученные мутанты проявляют даже большее функциональное связывание с TIM3 человека (human), TIM3 макака крабоеда (cyno) или TIMR человека на клетках СНО по сравнению с исходными антителами Tim3_0016 или Tim3_0016 антитела вариант Tim3_0018, соответственно.
Гуманизированные производные антител
Гуманизирование доменов VH и VL анти-Тim3-0016 варианта мыши (0018) и анти-Tim3_0028
На основе аминокислотной последовательности доменов VH и VL а) анти-Tim3 антитела Tim3_0016 варианта (0018) (с аминокислотными последовательностями шести HVR, где в легкой цепи HVR-L1 варианта 2_NS (удаление сайта гликозилирования с помощью мутации по замене N на S) применяют (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 12, 5 и 6) гуманизированные варианты анти-Tim3 антитела Tim3-0433 и Tim3-0434 и на основе аминокислотной последовательностей доменов VH и VL в б) анти-Tim3-антителе Tim3_0028 (с аминокислотными последовательностями шести HVR (SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 и 42) гуманизированные варианты анти-Tim3 антител Tim3-0438 и Tim3-0443.
Гуманизированные аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей в результате обратной трансляции переводят на ДНК и полученную кДНК синтезируют (GenArt), а затем клонируют в векторах экспрессии тяжелой цепи в качестве гибридных белков с каркасами IgG1 человека / СН1-шарнир-СН2-СН3 человека с мутациями LALA и PG (лейцин 234 на аланин, лейцин 235 на аланин, пролин 329 на глицин), аннулируя эффекторные функции, или в векторах экспрессии легкой цепи в качестве гибридных белков с С-каппа человека. Плазмиды LC и НС затем совместно трансфецируют в клетки HEK293 и через 7 суток выделяют из супернатанта стандартными методами очистки антител. Получаемые гуманизированные Tim3-антитела обозначают следующим образом:
Пример 3. Нанесение флуоресцентной метки на очищенное моноклональное антитело
Нанесение флуоресцентной метки на очищенные моноклональные антитела, полученные от гибридом, проводят с помощью набора для нанесения метки на моноклональные антитела Alexa Fluor 488 (фирма Invitrogen) по инструкциям производителя. После нанесения метки для каждого антитела подтверждают положительный результат по нанесению метки с помощью Alexa Fluor 488 (в настоящем изобретении обозначение набора «Alexa-488», фирма BD Biosciences) для TIM-3-экспрессирующих клеток RPMI-8226 и клеток Пфейффера.
Пример 4. Классификация групп связывающих эпитопов путем изучения конкуренции на основе метода FACS
Связь эпитопов между выработанными анти-TIM3 антителами и шестью анти-TIM3 контрольными антителами исследуют для определения конкурентного связывания методом, основанным на FACS. Контрольными TIM3 антителами являются следующие: антитела 4177 и 8213 по описанию в US 2012/189617, антитела 1.7Е10 и 27.12Е12, описанные в WO 2013/06490, антитело 344823 (клон 344823, фирма R&D Systems) и антитело F38-2E2 (клон F38-2E2, фирмы BioLegend и R&D Systems). Вкратце, для исследуемого антитела создают условия, позволяющие взаимодействовать и связываться с TIM-3-экспрессирующими клетками RPMI-8226 (АТСС  CCL-155™), и затем оценивают методом жидкостной цитометрии, чтобы установить, может ли другое анти-TIM-3 антитело также может связываться с TIM-3-экспрессирующими клетками.
Вкратце, клетки RPMI-8226, экспрессирующие TIM3 человека, инкубируют с реактивом BD human Fc Block в течение 10 мин при комнатной температуре и окрашивают двумя разными способами, чтобы исключить влияние различия в аффинности на связывание:
1) с описанным очищенным анти-TIM3 (10 мкг/мл в окрашивающем буфере BD в течение 0,5 ч при 4°С), которое конъюгируют с Alexa*488 по инструкциям производителя (молекулярные зонды А-20181) в среднем с 2,7 флуорофорами на антитело. Затем добавляют а) без метки (1-4) контрольные рекомбинантные анти-TIM3 антитела или контроль изотипа (10 мкг/мл) и инкубируют в течение 0,5 ч при 4°С в буфере BD SB и потом промывают BD SB с окрашенными РЕ-мечеными анти-huFcγ антителами (JIR, 109-116-098, 1:200, 0,5 ч при 4°С в буфере BD SB) или б) добавляют РЕ-меченые (5-6) доступные контрольные анти-TIM3 антитела или соответствующие контроли изотипов (10 мкг/мл) в течение 0,5 ч при 4°С в буфере BD SB. После промывания и центрифугирования сигналы MFI от окрашенных клеток RPMI-8226 исследуют жидкостной цитометрией на приборе BD Biosciences FACSCanto.
Результаты по картированию групп эпитопов, основанные на методе FACS, показывают, что Tim3_0016 и Tim3_0016 вариант Tim3_0018 не проявляют конкуренции при связывании с каким-либо из исследуемых анти-TIM-3 контрольных антител, что означает, что такие антитела распознают новый эпитоп, отличный от эпитопов, которые распознавали все ранее описанные TIM3 контрольные антитела, несмотря на то, что Tim3_0022, Tim3_0026, Tim3_0028 и Tim3_0038 в разной степени конкурируют за связывание с поверхностью, экспрессирующей TIM3 на клетках JRPMI-8226 с разными конкурентами.
Пример 5. Воздействие антител против TIM-3 человека на выработку цитокина в реакции смешанных лимфоцитов (Mixed Lymphocyte Reaction-MLR)
Реакцию смешанных лимфоцитов применяют для демонстрации эффекта блокирования метаболического пути TIM3 эффекторных клеток лимфоцитов. Т-клетки в исследовании тестируют для активации и секреции IFN-гамма при наличии или в отсутствие моноклональных антител против TIM3.
Лимфоциты человека выделяют из периферической крови здорового донора методом центрифугирования в градиенте плотности, используя пробирки Leukosep (фирма Greiner Bio One, номер в каталоге 227 288). Вкратце, гепаринизированную кровь разводят в трехкратном объеме ФСБ и аликвоты по 25 мл разведенной крови наносят слоем в пробирки Leukosep объемом 50 мл. После центрифугирования в режиме 800 g в течение 15 мин при комнатной температуре (без торможения) фракции, содержащие лимфоциты, собирают, промывают в ФСБ и применяют непосредственно в функциональном исследовании или ресуспендируют в среде для заморозки (10% ДМСО, 90% ФСТ) в концентрации 1,0Е + 07 клеток/мл и хранят в жидком азоте. Соотношение 1:1 мишень/иммуноотвечающая клетка применяют в исследовании MLR (т.е. каждая культура MLR содержит - 2,0Е + 05 МКПК от каждого донора в общем объеме 200 мкл. Анти-TIM3 моноклональные антитела Tim3_0016, Tim3_0016 вариант (Tim3_0018), Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0026, Tim3_0028, Tim3_0030, Tim3_0033, Tim3_0038 и F38-2E2 (фирма BioLegend), добавляют к каждой культуре в разных концентрациях. Ни антитело, ни антитело - контроль изотипа, не применяют в качестве отрицательного контроля, a rec hu IL-2 (20 ЕД/мл) применяют в качестве положительного контроля. Клетки культивируют в течение 6 суток при 37°С. Через 6 суток по 100 мкл среды берут от каждой культуры для определения цитокина. Уровни IFN-гамма измеряют, используя набор OptEIA ELISA kit (фирма BD Biosciences).
Результаты показаны в табл. 6 (секреция/высвобождение IFN-гамма). Анти-TIM-3 моноклональные антитела индуцируют активацию Т-клеток и секрецию IFN-гамма в зависимости от концентрации. Анти-TIM3 антитела Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0028, и Tim3_0038 снижают высвобождение воспалительного цитокина IFN-гамма) в большей степени, чем антитело F38-2E2. Tim3_0016, Tim3_0016 вариант (Tim3_0018), Tim3_0033 и Tim3_0038 демонстрируют схожее высвобождение при сравнении с антителом F38-2E2. Напротив, культуры, содержащие контрольное антитело изотипа, не показывают повышения секреции IFN-гамма.
Таблица 6а. Процент индуцированного анти-Tim3 антителом высвобождения IFN-гамма при сравнении с rec hu IL-2 (20 EU/мл) (=100%) в качестве положительного контроля и при отсутствии антитела в качестве отрицательного контроля.
В последующих экспериментах измеряют величины ЕС50 указанных ниже химерных и гуманизированных антител (получение которых описано выше) в комбинации с 0,1 мкг/мл анти-PDl моноклонального антитела: химерного chi_Tim3_018 антитела и его гуманизированных версий Tim3-433 и Tim3-434, химерного chi_Tim3_028 антитела и его гуманизированных версий Tim3-438 и Tim3-443 с разными смесями лимфоцитов доноров (D2 и D3, или D1 и D5, соответственно). Результаты показывают в табл. 6б.
Пример 6. Интернализация анти-TIM-3 антител на TIM-3-экспрессирующих клетках
TIM-3-специфические антитела, описанные в настоящем изобретении, могут быть интернализованы на TIM-3-экспрессирующих клетках, включая TIM-3-экспрессирующие клетки лимфомы, множественной миеломы и AML. Например, показано, что описанные TIM-3-специфические антитела и их фрагменты интернализуются на rec TIM3 СНО клетках, стабильно экспрессирующих TIM-3 человека, что было установлено методами клеточного ферментсвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA), жидкостной цитометрии (FACS) и конфокальной микроскопии.
4
2
Например, стабильно Tim3-трансфецированные клетки СНО-K1 (клон 8) (4×10 клеток/лунку/100 мкл) высевают в 98-луночный планшет МТР, используя свежую культуральную среду. После присоединения клеток в течение ночи среду для культуры клеток удаляют, добавляют исследуемые антитела к клеткам (10 мкг/мл в среде для культуры клеток) и инкубируют в течение 0,5 ч при 4°С. В качестве контроля применяют коммерческое антитело мыши против антитела человека (TIM3 МАВ 11Е365 (US Biological, T5469-92P). После промывки (дважды средой для культуры клеток) и центрифугирования клетки инкубируют в течение 3 ч при а) 4°С или б) 37°С в 200 мкл среды для культуры клеток. Интернализацию обычно проводят при 37°С, но не при 4°С, когда предусматривают другой контроль для реакции. Затем клетки фиксируют 100 мкл/лунку 0,05% глутаральдегидом (фирма Sigma, номер в каталоге G5882) в 1×ФСБ в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем трижды промывают порциями 200 мкл ФСБ-Т и добавляют второе антитело овцы против POD мыши (фирма Horseradish (POD-связанный F(ab’)-фрагмент, GE NA9310)) в течение 1 ч при комнатной температуре. После последней промывки (3×ФСБ-Т), добавляют субстрат ТМВ (фирма Roche, номер в каталоге 11835033001) в течение 15 мин и окраску останавливают, используя 1 н HCl. В итоге оптическую плотность определяют измерением при 450/620 нм в ридере ELISA. Процедура клеточной ELISA применяют для оценки средней пропускной способности к интернализации тестируемых антител, которые очищают от супернатантов гибридом.
Процент интернализации рассчитывают следующим образом:
Результаты показаны на фиг. 1А и Б (интернализация). Почти все исследуемые анти-TIM3 моноклональные антитела сходным образом хорошо интернализованы в стабильные Тim3-трансфецированные клетки СНО-K1 после 3 ч инкубирования при 37°С (данные не представлены).
Определение величин ЕС50 интернализации (зависящих от времени), а также сравнение кинетики интернализации в зависимости от моно- или бивалентности, оценивают методом FACS для отбора кандидатов.
5
Вкратце, стабильно экспрессирующие TIM3 человека клетки СНО-K1 высевают (4×10 клеток/лунку/50 мкл) в 98-луночные планшеты с V-образным дном МТР в свежую культуральную среду и инкубируют с активными ингредиентами Redimune NF Liquid в течение 10 мин при комнатной температуре для блокирования неспецифического связывания. Затем вносят 50 мкл/лунку отобранного очищенного анти-TIM3 (10 мкг/мл в среде для культуры клеток) и инкубируют в течение 1 ч при 4°С. После промывания (средой для культуры клеток) и центрифугирования клетки инкубируют в течение 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 и 24 ч при а) 4°С или б) 37°С в 200 мкл среды для культуры клеток. Затем клетки промывают ФСБ/1%БСА и добавляют второе антитело Alexa Fluor 488-козье антитело-анти-IgG мыши, F(ab)2, в течение 1 ч при 4°С. После промывания и центрифугирования добавляют 125 мкл фиксирующего раствора CellFix (фирма BD Bioscience, 1:1000) и сигналы MFI от окрашенных клеток исследуют жидкостной цитометрией на приборе BD Biosciences FACSCanto.
Процент интернализации определяют следующим образом:
Пример оценки зависящей от времени интернализации анти-TIM3 антител Tim3_0016. Tim3_0016 вариант (Tim3_0018). Tim3_0021. Tim3_0028. Tim3_0030. Tim3_0033. Tim3_0038 на клетках RPMI-8226 (ATCC  CCL-155™):
В настоящем изобретении описанные анти-TIM3 антитела быстро интернализуются на высоком уровне на TIM3-экспрессирующих клетках RPMI-8226 (ATCC  CCL-155™). Эксперименты проводят согласно описанному выше с TIM3-экспрессирующими клетками RPMI-8226 (ATCC  CCL-155™) вместо клеток rеc CHOK1, экспрессирующих huTIM-3. Результаты показаны в табл. 7. В качестве контрольных антител TIM3 применяют следующие антитела: антитело 8213, описанное в US 2012/189617, антитело 27.12Е12, описанное в WO 2013/06490. Tim3_0016, Tim3_0016 вариант (Tim3_0018), Tim3_0038 применяют в качестве химерных версий IgG1 человека.
Из полученных результатов следует, что антитела по настоящему изобретению быстро интернализируются с высоким процентом на клетках RPMI-8226 (ATCC  CCL-155™) по сравнению с контрольными антителами.
Пример 7. Связывание анти-TIM-3 антител с моноцитами человека, экспрессирующими TIM-3
Моноциты CD14+ выделяют из обработанной антикоагулянтом периферической крови здоровых доноров центрифугированием в градиенте плотности, используя Ficoll-Paque (фирма GE Healthcare) (см. раздел «General Protocols» в кн.: «User Manuals» или посетите сайт www.miltenyibiotec.com/protocols), с последующим положительным отбором с помощью микрогранул с антителами NHP CD 14 MicroBeads. Сначала на клетки CD14+ наносят магнитную метку CD 14 MicroBeads. Затем суспензию клеток загружают в колонку MACS, которую помещают в магнитное поле сепаратора MACS. Клетки CD14+ после нанесения магнитной метки остаются в колонке. Клетки без метки проходят сквозь колонку, эта фракция истощена в отношении клеток CD14+. После удаления колонки из магнитного поля, оставшиеся намагниченные CD14+ клетки можно элюировать в виде фракции положительных клеток. После центрифугирования в режиме 200 g в течение 10 мин при комнатной температуре моноциты собирают и используют непосредственно в исследовании по связыванию или ресуспендируют в среде для замораживания (10% ДМСО, 90% ФСТ) в количестве 1,0Е + 07 клеток/мл и хранят в жидком азоте.
5
Из литературы известно, что моноциты конститутивно экспрессируют на своей поверхности TIM3. 1×10 CD14+ выделенных моноцитов человека (50 мкл/лунку) вносят в 98-луночные планшеты с V-образным дном МТР в свежую культуральную среду и инкубируют с активными ингредиентами Redimune NF Liquid в течение 15 мин при комнатной температуре для блокирования несецифического связывания. Затем вносят по 50 мкл/лунку выявленных анти-TIM3 моноклональных антител или контрольных анти-TIM3 моноклональных антител 344823 (фирма R&D) и F38-2E2 (фирма BioLegend) (10 мкг/мл в среде для культуры клеток) и инкубируют в течение 1 ч при 4°С. Затем клетки промывают ФСБ/1% БСА и вносят второе РЕ-меченое антитело козы против F(ab')2 мыши (фирма Jackson Lab, номер в каталоге 115-006-072) в течение 1 ч при 4°С. После промывания и центрифугирования сигналы MFI от окрашенных клеток исследуют жидкостной цитометрией на приборе BD Biosciences FACSCanto.
Специфическое связывание рассчитывают следующим образом:
Результаты приводят в табл. 8 (связывание с моноцитами макака крабоеда). TIM3 клоны Tim3_0016, Tim3_0018, Tim3_0020, Tim3_0028 и Tim3_0038 связываются с моноцитами человека от разных доноров даже лучше, чем контрольные моноклональные анти-TIM-3 антитела.
Пример 8. Связывание анти-TIM-3 антител с выделенными моноцитами макака крабоеда. экспрессирующими TIM-3
Моноциты CD14+ выделяют из обработанной антикоагулянтом периферической крови макака крабоеда (фирма Covance) центрифугированием в градиенте плотности, используя Ficoll-Paque (фирма GE Healthcare) (см. раздел «General Protocols» в кн.: «User Manuals» или посетите сайт www.miltenyibiotec.com/protocols), с последующим положительным отбором с помощью микрогранул с антителами NHP CD14 MicroBeads. Сначала на клетки CD14+ наносят магнитную метку CD14 MicroBeads. Затем суспензию клеток загружают в колонку MACS, которую помещают в магнитное поле сепаратора MACS. Клетки CD14+ после нанесения магнитной метки остаются в колонке. Клетки без метки проходят сквозь колонку, эта фракция истощена в отношении клеток CD14+. После удаления колонки из магнитного поля, оставшиеся намагниченные CD14+ клетки можно элюировать в виде фракции положительных клеток. После центрифугирования в режиме 200 g в течение 10 мин при комнатной температуре моноциты собирают и используют непосредственно в исследовании по связыванию или ресуспендируют в замораживающей среде (10% ДМСО, 90% ФСТ) в количестве 1.0Е + 07 cells/мл и хранят в жидком азоте.
5
Из литературы известно, что моноциты конститутивно экспрессируют на своей поверхности TIM3. 1×10 CD14+ выделенных моноцитов макака крабоеда (50 мкл/лунку) вносят в 98-луночные планшеты с V-образным дном МТР в свежую культуральную среду и инкубируют с активными ингредиентами Redimune NF Liquid в течение 15 мин при комнатной температуре для блокирования неспецифического связывания. Затем вносят 50 мкл/лунку Alexa 488-меченого анти-TIM3 (10 мкг/мл в среде для культур клеток) и инкубируют в течение 1 ч при 4°С. После промывания и центрифугирования сигналы MFI от окрашенных клеток исследуют жидкостной цитометрией на приборе BD Biosciences FACSCanto.
Специфическое связывание рассчитывают следующим образом:
Результаты приводят в табл. 9 (связывание с моноцитами макака крабоеда). TIM3 клоны Tim3_0016, Tim3_0018, Tim3_0026, Tim3_0028 и Tim3_0030 связываются с моноцитами макака крабоеда от разных доноров этого вида обезьян.
Пример 9. Связывание анти-TIM-3 антител с линиями клеток NHL и ММ, экспрессирующих TIM-3
5
Связывающую способность выявленных анти-TIM3 антител и двух клонов анти-TIM3 контрольных антител (1) 4177 и (2) 8213 (фирма Kyowa) исследуют методом FACS. Вкратце, TIM3-экспрессирующие В-клетки лимфомы человека (например, клетки Пфейффера) и клетки множественной миеломы (например, клетки RPMI-8226) инкубируют с реактивом BD human Fc Block в течение 10 мин при комнатной температуре для блокирования неспецифического связывания. 2×10 клеток (50 мкл/лунку) вносят в 98-луночные планшеты с V-образным дном МТР и вносят 50 мкл/лунку Alexa 488-меченого анти-TIM3 (10 мкг/мл в окрашивающем буфере BD) и инкубируют в течение 1 ч при 4°С. После промывания и центрифугирования сигналы MFI от окрашенных клеток исследуют жидкостной цитометрией на приборе BD Biosciences FACSCanto.
Специфическое связывание рассчитывают следующим образом:
Результаты приводят на фиг. 2А и 2Б (связывание с клетками RPMI-8226 Пфейффера).
Пример 10. Цитотоксическая активность анти-TIM-3 антител на TIM-3-экспрессирующих клетках NHL и ММ
TIM3-специфические антитела, конъюгированные с экзотоксином А Pseudomonas (РЕ 24), эффективно уничтожают TIM3-экспрессирующие клетки.
3
4
Цитоксическую активность описанных анти-TIM3 антител и одного коммерчески доступного анти-TIM3 контрольного антитела клона 11Е365 (фирма US Biological) исследуют методом Promega CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, описанным выше. Вкратце, к 5×10 (50 мкл/лунку в 98-луночном МТР, в трех повторах) рекомбинантных клеток СНО K1, стабильно экспрессирующих TIM-3 человека, или 2×10 В-клеток лимфомы человека (50 мкл/лунку в 98-луночном МТР, в трех повторах), экспрессирующих TIM3 (показано на клетках Пфейффера), или клеток множественной миеломы (показано на клетках RPMI-8226) добавляют в концентрации 25 мкл/лунку серийных разведении 1:5 описанных анти-TIM3 антител при наивысшей концентрации 10 мкг/мл или соответствующих сред для необработанных клеток или контроля изотипа к нецелевым обработанным клеткам. Диапазоны концентраций для обработки составляют от 10 мкг/мл до 1 нг/мл в трех повторах. Все антитела применяют в качестве версий полной длины Feγ мыши. Для конъюгации экзотоксина Pseudomonas 10 мкг/мл фрагмент Feγ мыши специфичные Fab, конъюгированные с РЕ 24, добавляют и инкубируют в течение 3 суток при 37°С. Циклогексимид, известный в качестве ингибитора синтеза белка у эукариот, применяют в качестве положительного контроля. Жизнеспособность обработанных клеток измеряют методом Promega CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay.
Цитотоксическую активность рассчитывают следующим образом:
Результаты представлены в табл. 10 (цитотоксическая активность анти-TIM3 моноклональных антител на TIM-3-экспрессирующем рекомбинанте, NHL и ММ линиях клеток в сэндвич-формате).
Все исследуемые клоны TIM3 обладают высоким уровнем активности (IC50 в диапазоне 0,01-0,2 нМ) на рекомбинантных клетках СНО K1, стабильно экспрессирующих TIM-3 человека, и клетках Пфейффера, экспрессирующих на высоких и умеренных уровнях TIM-3, и еще большей цитотоксической активностью, чем сильно интернализирующееся контрольное анти-TIM-3 антитело клон 11Е365, фирма US Biological. Клоны TIM3 0016, 0018, 0021, 0022, 0033 и 0038 также проявляют большую активность на клетках RPMI-8226, экспрессирующих в пять раз более низкий уровень TIM-3 по сравнению с рекомбинантными СНО TIM-3 клетками.
Пример 11. Сравнение цитотоксической активности описанных анти-TIM3 антител относительно двух анти-TIM3 контрольных антител 1.7.Е10 и 27-12Е12 (по описанию WO 2013/06490).
Цитотоксическую активность описанных анти-TIM3 антител и двух анти-TIM3 контрольных антител 1.7.Е10 и 27-12Е12 по описанию WO 2013/06490 исследуют методом Promega CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, описанным выше. Все антитела применяют в формате IgG1 человека полной длины, включающего часть Fc гамма человека. В этом эксперименте конъюгацию экзотоксина Pseudomonas осуществляют через Fcγ-фрагмент человека специфичных Fab, конъюгированных с РЕ 24 (10 мкг/мл), которые добавляют и инкубируют в течение 5 суток при 37°С. Результаты представлены в табл. 11.
«-» - данные отсутствуют
Все исследуемые клоны TIM3 обладают высоким уровнем активности (диапазон IC50 0,02-0,08 нМ) на клетках Пфейффера и клетках RPMI-8226, экспрессирующих TIM-3, и еще большей цитотоксической активностью, чем сильно интернализирующееся контрольное анти-TIM-3 антитело клон 27-12Е12. Все антитела сравнивают с конъюгатами экзотоксина Pseudomonas (PE24), используя тот же экзотоксин Pseudomonas в тех же условиях.
Пример 12. Цитотоксическая активность конструкций Fab-PE24 описанных анти-TIM3 антител на линиях клетках MM, NHL и AML (экспрессирующих TIM3, но не PSMA).
3
3
Цитотоксическую активность исследуют методом Promega CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, описанным выше. Серийные разведения 1:5 Fab-фрагментов описанных анти-TIM3 антител, непосредственно конъюгированных с PE24 с наивысшей концентрацией 50 мкг/мл, или соответствующие среды к необработанным клеткам или несвязывающему анти-PSMA Fab-PE24 контролю к нецелевым необработанным клеткам инкубируют с 7,5×10 клетками Пфейффера или 2×10 клетками RPMI-8226 (50 мкл/лунку в 98-луночном планшете МТР) в течение 4 суток при 37°С. Диапазоны обработки от 50 мкг/мл до 8 нг/мл в трех повторах. Циклогексимид применяют в качестве положительного контроля.
Результаты представлены в табл. 12. (Цитотоксическая активность Fab-РЕ24 конструкций описанных анти-TIM3 антител на линиях клеток MM, NHL и AML).
Таблица 12: Цитотоксическая активность Fab-PE24 конструкций описанных анти-TIM3 антител на разных линиях клеток ММ, NHL и AML (RPMI-8226, Karpas-299, CMK, TF-1, MOLM-13)
«-» - данные отсутствуют
Все исследованные конструкции Fab-PE24 описанных анти-TIM3 антител высоко активны (диапазон IC50 от 1 до 10 нМ) на клетках ММ (RPMI-8226) и NHL (Karpas-299), экспрессирующих умеренный уровень TIM3, и проявляют существенную цитотоксическую активность в отношении линий клеток AML (CMK, TF-1, MOLM-13), экспрессирующих очень низкие уровни TIM3.
Пример 13. Цитотоксическая активность иммуноконъюгатов (конъюгаты экзотоксина A Pseudomonas (Fab-PE24 конструкции) описанного анти-TIM3 на первичных лейкозных стволовых клетках/клетках-предшественниках AML от рецидивирующих/неподдающихся лечению пациентов
Клетки CD34+ из периферической крови рецидивирующих/неподдающихся лечению пациентов получают от фирмы AllCells, LLC, Alameda, Калифорния.
*Р/НПЛ - рецидивирующий/неподдающийся лечению пациент
«-» - данные отсутствуют
После подтверждения чистоты и жизнеспособности всех образцов (чистота в диапазоне 84-94% и жизнеспособность в диапазоне 95-99%) уровень экспрессии TIM-3 оценивают методом FACS согласно описанию в примере 7, используя анти-TIM3 моноклональное антитело 344823 (фирма R&D). (См. фиг. 3).
Все исследуемые (4/4) первичные лейкозные стволовые/прогениторные клетки (CD34+) AML образцы от рецидивирующих/неподдающихся лечению пациентов демонстрируют гомогенную экспрессию TIM3 на разных уровнях.
4
Для оценки цитотоксической активности конструкций Fab-PE24 описанных анти-TIM3 клонов 0016 и 0022 на первичных CD34+ AML клетках инкубируют 1×10 клеток (50 мкл/лунку в 98-луночных планшетах МТР, в трех повторах) в серийных разведениях 1:5 Fab-фрагментов с наивысшей концентрацией 50 мкг/мл, или соответствующих сред для необработанных клеток, или несвязанных анти-PSMA Fab-PE24 контроля к нецелевым обработанным клеткам в течение 3 суток при 37°С. Циклогексимид применяют в качестве положительного контроля. Цитотоксическую активность исследуют методом Promega CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay согласно описанию в примере 12.
Результаты показаны в табл. 14. (Цитотоксическая активность конструкций Fab-PE24 описанных анти-TIM3 антител на первичных клетках CD34+ AML).
«-» - данные отсутствуют
Конструкции Fab-PE24 анти-TIM3 антител Tim3_0016 и Tim3_0022 высоко активны на (2/4) образцах первичных клеток AML (PB0142 и РВ0135) (диапазон IC50 от 30 до 116 нМ) и проявляют существенную цитотоксическую активность на всех (4/4) первичных лейкозных стволовых/прогениторных (CD34+) AML клетках, экспрессирующих разные уровни TIM-3.
Пример 14. Сравнение активности Fab-PE24 конструкций выбранных анти-TIM3 антител на линиях клеток NHL и ММ
Оценку цитотоксической активности соединенных с сортазой конструкций Fab-PE24 выделенных описанных анти-TIM3 антител исследуют методом Promega CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay согласно описанию в примере 12.
Результаты представлены в табл. 15. (Цитотоксическая активность конструкций Fab-PE24 выбранных анти-TIM3 антител на клетках NHL и ММ).
«-» - данные отсутствуют
Высокий цитотоксический потенциал показывают конструкции Fab-PE24 всех выбранных описанных анти-TIM3 антител (IC50 диапазон 0,3-5 нМ) на клетках NHL (на клетках Пфейффера) и MM (RPMI-8226), экспрессирующих умеренный уровень TIM-3.
Наивысшая цитотоксическая активность установлена для конструкций Fab-PE24 описанных анти-TIM3 антител Tim3_ 0016 и Tim3_ 0038.
Пример 15. Сравнение цитотоксической активности конструкции Fab-PE24 против конъюгата суммарного IgG-аматоксина того же клона описанного анти-TIM-3 антитела на клетках Пфейффера
Оценку цитотоксической активности конъюгированной конструкции Fab-PE24 описанного анти-TIM3 клона 0016 против суммарного IgG того же клона, конъюгированного с аматоксином (согласно описанию WO 2012/041504 (конъюгированным через 6' С-атом аминокислоты 4 аматоксина, особенно через атом кислорода, связанный с 6' С-атомом аминокислоты аматоксина, и где TIM3 антитело соединено через линкер с молекулой мочевины) исследуют методом Promega CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay по описанию в примере 12.
Результаты показаны в табл. 16. (Цитотоксическая активность конструкции Fab-PE24 относительно конъюгата суммарного IgG-аматоксина анти-TIM3 клона 0016 на клетках NHL).
Таблица 16: Цитотоксическая активность конструкции Fab-PE24 относительно конъюгата суммарного IgG-аматоксина анти-TIM3 клона 0016 на клетках NHL
«-» - данные отсутствуют
Цитотоксическая активность аманитин-конъюгированного анти-TIM-3 клона 0016 (IC50 0,8 нМ) сопоставима с цитотоксической активностью конструкции Fab-PE24 того же клона (IC50 0,3 нМ) на клетках NHL (на клетках Пфейффера), экспрессирующих умеренный уровень TIM3.
Пример 15. Прямое сравнение связывания TIM3 антител с разными мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК)
Анализ связывания
+
+
+
-
+
Свеже выделенные МКПК или трехсуточные поликлонально активированные (связанное с планшетом анти-CD3 и растворимое анти-С028 антитела, по 1 мкг/мл каждого, оба от фирмы BD Pharmingen) CD4 Т-клетки окрашивают Alexa 647-непосредственно конъюгированного анти-TIM-антитела Tim3-0018, Tim3-0028 или их химеризованные или гуманизированные версии в течение 1 ч при 4°С. Затем клетки промывают для элиминации несвязанного антитела и окрашивают для проявления поверхностных маркеров в течение 30 мин при 4°С для выделения моноцитов (CD14 (фирма BD Pharmingen)), клетки NK(CD16 (фирма eBioscience), CD56 (фирма BioLegend) и CD3) и Т-клетки (CD3 (фирма eBioscience)) перед фиксацией с помощью BD Cell Fix. Клетки приобретают на фирмах LSRFortessa, BD Biosciences.
Результаты показаны на фиг. 4А-4Г (на фигурах используют следующие обозначения: для Tim3-0018: 0018 (aTIM-3), для гуманизированного Tim3-0018 версии Tim3-0434: 0434(h0018), для Tim3-0028: 0028 (aTIM-3), для химерного Tim3-0028: chi0028, для гуманизированного Tim3-0028 версии Tim3-0438:0438(h0028)). Эти данные показывают, что гуманизированные антитела обладают повышенными связываемостью и связывающей специфичностью в отношении CD4 Т-клеток при сравнении с исходными антителами.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ
<120>  АНТИ-TIM3 АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  32411
<150>  EP14192175.9
<151>  2014-11-06
<150>  EP15188056.4
<151>  2015-10-02
<160>  86
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  1
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met
1               5
<210>  2
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  2
Leu Asn Asp
1
<210>  3
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  3
Asn Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp
1               5
<210>  4
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  4
Ser Ser Ser Val Asn Tyr
1               5
<210>  5
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  5
Asp Ala Phe
1
<210>  6
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  6
Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
1               5
<210>  7
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  7
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20                  25                  30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Leu Asn Asp Asp Val Phe Phe Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Gln Ile Ala Ser Val Val Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Val Arg Ala Asn Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  8
<211>  106
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  8
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Thr
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Asp Ala Phe Lys Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Thr Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  9
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  9
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20                  25                  30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Leu Asn Asp Asp Val Phe Phe Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Arg Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Gln Ile Ala Ser Val Val Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Val Arg Ala Asn Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Ile Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  10
<211>  106
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  10
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Thr
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Asp Ala Phe Lys Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Thr Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  11
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  11
Ser Ser Ser Val Gln Tyr
1               5
<210>  12
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  12
Ser Ser Ser Val Ser Tyr
1               5
<210>  13
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  13
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
1               5
<210>  14
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  14
Ser Asp Ser
1
<210>  15
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  15
Gly Tyr Tyr Ala Trp Tyr Tyr Phe Asp
1               5
<210>  16
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  16
Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn
1               5
<210>  17
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  17
Tyr Ala Ser
1
<210>  18
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  18
Ser Asn Ser Trp Pro Leu
1               5
<210>  19
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Gln Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Leu His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Tyr Tyr Ala Trp Tyr Tyr Phe Asp Cys Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  20
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  20
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn
20                  25                  30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser His Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Lys Phe Ser Gly
50                  55                  60
Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Phe Asn Ser Val Glu Thr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  21
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  21
Gly Asp Ser Ile Ala
1               5
<210>  22
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  22
Tyr Ser Gly
1
<210>  23
<211>  4
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  23
Asp Tyr Phe Asp
1
<210>  24
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  24
Arg Gln Asp Val Arg Lys Asn
1               5
<210>  25
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  25
Tyr Thr Ser
1
<210>  26
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  26
Tyr Asp Asn Leu Pro Phe
1               5
<210>  27
<211>  114
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  27
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Ala Ser Ala
20                  25                  30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Gln Asn Gln Tyr Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val
85                  90                  95
Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Leu Thr Val
100                 105                 110
Ser Ser
<210>  28
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Arg Gln Asp Val Arg Lys Asn
20                  25                  30
Ile Gly Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Trp Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Asn Ile Asn Asn Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
100                 105
<210>  29
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  29
Gly Tyr Thr Phe Thr
1               5
<210>  30
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  30
Glu Thr Tyr
1
<210>  31
<211>  4
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  31
Gly Tyr Pro Ala
1
<210>  32
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  32
Ser Arg Thr Ile Leu His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr
1               5                   10
<210>  33
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  33
Lys Val Ser
1
<210>  34
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  34
Asp Ser His Val Pro Phe
1               5
<210>  35
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  35
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Lys Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Thr Glu Thr Tyr Glu Pro Thr Phe Gly Ala Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys
85                  90                  95
Gly Gly Gly Gly Tyr Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Ile
100                 105                 110
Val Ser Ala
115
<210>  36
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  36
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Thr Ile Leu His Ser
20                  25                  30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Asp
85                  90                  95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  37
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  37
Gly Phe Asn Ile Lys Thr Thr
1               5
<210>  38
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  38
Ala Asp Asp
1
<210>  39
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  39
Phe Gly Tyr Val Ala Trp Phe Ala
1               5
<210>  40
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  40
Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr
1               5
<210>  41
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  41
Tyr Ala Ser
1
<210>  42
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  42
His Tyr Ser Ser Pro Tyr
1               5
<210>  43
<211>  119
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  43
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Thr Thr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Arg Asp Phe Gly Tyr Val Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Phe Ser Ala
115
<210>  44
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  44
Asn Ile Val Met Thr Pro Thr Pro Lys Phe Leu Pro Val Ser Ser Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Val
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  45
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  45
Gly Tyr Pro Phe Ser Glu Tyr
1               5
<210>  46
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  46
Glu Thr Gly
1
<210>  47
<211>  4
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  47
Gly Tyr Pro Ala
1
<210>  48
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  48
Ser Arg Ser Ile Val His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr
1               5                   10
<210>  49
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  49
Lys Val Ser
1
<210>  50
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  50
Asp Ser His Val Pro
1               5
<210>  51
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  51
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Ser Glu Tyr
20                  25                  30
Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35                  40                  45
Val Tyr Val Asn Thr Glu Thr Gly Gln Pro Ile Val Gly Asp Asp Phe
50                  55                  60
Arg Gly Arg Phe Val Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Gly Gly Gly Gly Tyr Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ala
115
<210>  52
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  52
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Asp
85                  90                  95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  53
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  53
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
1               5
<210>  54
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  54
Ala Thr Gly
1
<210>  55
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  55
Tyr Pro His Tyr Tyr Ala Met Asp
1               5
<210>  56
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  56
Ser Glu Asn Ile Phe Ser Asn
1               5
<210>  57
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  57
Ser Ala Thr
1
<210>  58
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  58
Phe Tyr Lys Ile Pro Phe
1               5
<210>  59
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  59
Gln Gly Gln Met His Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20                  25                  30
Phe Ile Ser Trp Leu Lys Gln Lys Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Trp Ile Tyr Ala Ala Thr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Thr Asn Lys Ala Gln Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Ala Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg His Ala Gly Tyr Pro His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  60
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Phe Ser Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Thr Asn Leu Gly Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Tyr Lys Ile Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  61
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  61
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
1               5
<210>  62
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  62
Glu Asp Gly
1
<210>  63
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  63
His Gly Tyr Val Gly Trp Phe Ala
1               5
<210>  64
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  64
Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr
1               5
<210>  65
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  65
Gly Ala Ser
1
<210>  66
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  66
Ser Tyr Ser Tyr Pro Trp
1               5
<210>  67
<211>  119
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  67
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Pro Leu Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Leu Ile Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Ile Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ser Arg Asp His Gly Tyr Val Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210>  68
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  68
Asn Val Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ile Met Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Tyr
20                  25                  30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Arg Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Phe Arg
100                 105
<210>  69
<211>  219
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  пример экзотоксина А Pseudomonas вариант 1(пример деиммунизированного PE24)
<400>  69
Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser
1               5                   10                  15
Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His
20                  25                  30
Ala Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr
35                  40                  45
Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Ala Ala Arg
50                  55                  60
Ser Gln Asp Leu Ala Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp
65                  70                  75                  80
Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala
85                  90                  95
Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Ala Ser
100                 105                 110
Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu
115                 120                 125
Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Ala
130                 135                 140
Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr
145                 150                 155                 160
Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala
165                 170                 175
Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser
195                 200                 205
Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
210                 215
<210>  70
<211>  219
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  пример экзотоксина А Pseudomonas вариант 2(пример деиммунизированного PE24)
<400>  70
Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser
1               5                   10                  15
Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His
20                  25                  30
Ala Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr
35                  40                  45
Ala Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg
50                  55                  60
Ser Gln Asp Leu Arg Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp
65                  70                  75                  80
Pro Ala His Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg
85                  90                  95
Gly Arg Ile Ala Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Ala Ser
100                 105                 110
Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu
115                 120                 125
Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg
130                 135                 140
Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Glu Glu Thr
145                 150                 155                 160
Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala
165                 170                 175
Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser
195                 200                 205
Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
210                 215
<210>  71
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo Sapiens
<400>  71
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210>  72
<211>  105
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo Sapiens
<400>  72
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35                  40                  45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50                  55                  60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65                  70                  75                  80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85                  90                  95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100                 105
<210>  73
<211>  330
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo Sapiens
<400>  73
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  74
<211>  330
<212>  БЕЛОК
<213>  homo sapiens
<400>  74
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  75
<211>  330
<212>  БЕЛОК
<213>  homo sapiens
<400>  75
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  76
<211>  327
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo Sapiens
<400>  76
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210>  77
<211>  280
<212>  БЕЛОК
<213>  homo sapiens
<400>  77
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
1               5                   10                  15
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
20                  25                  30
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
35                  40                  45
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn
50                  55                  60
Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile
85                  90                  95
Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys
100                 105                 110
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro
115                 120                 125
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu
130                 135                 140
Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn
145                 150                 155                 160
Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala
165                 170                 175
Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Gly Leu
180                 185                 190
Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe Lys Trp Tyr Ser His
195                 200                 205
Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile Ser Leu Ala Asn Leu
210                 215                 220
Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu Gly Ile Arg Ser Glu
225                 230                 235                 240
Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr Glu Val Glu Glu Pro
245                 250                 255
Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln Gln Pro Ser Gln Pro
260                 265                 270
Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro
275                 280
<210>  78
<211>  181
<212>  БЕЛОК
<213>  homo sapiens
<400>  78
Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
1               5                   10                  15
Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
20                  25                  30
Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
35                  40                  45
Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn
50                  55                  60
Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile
85                  90                  95
Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys
100                 105                 110
Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro
115                 120                 125
Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu
130                 135                 140
Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn
145                 150                 155                 160
Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala
165                 170                 175
Thr Ile Arg Ile Gly
180
<210>  79
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  гуманизированная версия VH Tim3_0016 вариант (0018) (= Tim3-0433)
<400>  79
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20                  25                  30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Leu Asn Asp Asp Val Phe Phe Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Val Arg Ala Asn Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  80
<211>  106
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  гуманизированная версия VL Tim3_0016 варианта (0018) (= Tim3-0433)
<400>  80
Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Asp Lys Val Asn Ile Ala Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Thr
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Asp Ala Phe Lys Leu Ala Pro Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  81
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  гуманизированная версия VH Tim3_0016 вариант (0018) (= Tim3-0434)
<400>  81
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20                  25                  30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Trp Leu Asn Asp Asp Val Phe Phe Asn Pro Ala
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Val Arg Ala Asn Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  82
<211>  106
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  гуманизированная версия VL Tim3_0016 вариант (0018) (= Tim3-0434)
<400>  82
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Thr
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Asp Ala Phe Lys Leu Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  83
<211>  119
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  гуманизированная версия VH Tim3-0028 (= Tim3-0438)
<400>  83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Thr Thr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Arg Asp Phe Gly Tyr Val Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  84
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  гуманизированная версия VL Tim3-0028 (= Tim3-0438)
<400>  84
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  85
<211>  119
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  гуманизированная версия VH Tim3-0028 (= Tim3-0443)
<400>  85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Thr Thr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Arg Asp Phe Gly Tyr Val Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Phe Ser Ser
115
<210>  86
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  гуманизированная версия VL Tim3-0028 (= Tim3-0443)
<400>  86
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<---