СПОСОБЫ И РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ И ОЦЕНКИ ГЕНОТОКСИЧНОСТИ

1. Способ обнаружения и количественного определения геномных мутаций, развившихся in vivo у субъекта после воздействия на него мутагена, включающий:
предоставление образца от субъекта, при этом образец содержит двухцепочечные молекулы ДНК;
генерирование считывания последовательности с исправлением ошибок для каждой из множества двухцепочечных молекул ДНК в образце, содержащее:
генерирование набора копий исходной первой цепи молекулы ДНК-адаптер и набора копий исходной второй цепи молекулы ДНК-адаптер;
секвенирование набора копий исходной первой и второй цепей для обеспечения последовательности первой цепи и последовательности второй цепи; и
сравнение последовательности первой цепи и последовательности второй цепи для идентификации одного или более соответствий между последовательностями первой и второй цепи; и
анализ одного или более соответствий для определения мутационного спектра для двухцепочечных молекул ДНК в образце.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно включает вычисление частоты мутанта для целевых двухцепочечных молекул ДНК путем вычисления количества уникальных мутаций в секвенированной дуплексной паре оснований.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что целевые молекулы двухцепочечной ДНК выделяют из печени, селезенки, крови, легкого или костного мозга субъекта.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что субъект подвергается воздействию мутагена за 30 дней или менее до того, как целевые молекулы двухцепочечной ДНК были удалены из субъекта.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что спектр мутации генерируется неконтролируемой иерархической кластеризацией спектра мутаций.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что спектр мутаций представляет собой триплетный спектр мутаций.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генерация считываний с исправлением ошибок для каждой из множества двухцепочечных молекул ДНК включает генерацию считываний с исправлением ошибок одной или более целевых областей генома.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что один или более целевых участков генома является сайтом в геноме, склонным к мутациям.
9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что одна или более целевых областей генома является известным геном-драйвером рака.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что субъект является трансгенным животным, при этом, по меньшей мере некоторые молекулы-мишени двухцепочечной ДНК включают одну или более частей трансгена.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что субъект является нетрансгенным животным, и молекулы-мишени двухцепочечной ДНК содержат эндогенные области генома.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что субъектом является человек, при этом целевые молекулы двухцепочечной ДНК экстрагируют из крови, взятой у человека.
13. Способ генерации мутагенной сигнатуры тестируемого агента, включающий:
ДНК-фрагменты дуплексного секвенирования, экстрагированные из тестируемого субъекта, подвергнутого воздействию тестируемого агента; и
генерирование мутагенной сигнатуры тестируемого агента, включающее:
вычисление частоты мутантов для множества фрагментов ДНК путем вычисления количества уникальных мутаций секвенированной дуплексной пары оснований; и определение мутационного профиля для множества фрагментов ДНК, где мутационный профиль включает тип мутации, контекст тринуклеотида мутации и геномное распределение мутаций.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что дополнительно включает сравнение сигнатуры мутации тестируемого агента с сигнатурами мутаций одного или более известных генотоксинов.
15. Способ по п. 13, отличающийся тем, что сигнатура мутаций тестируемого агента варьируется в зависимости от одного или более из: типа ткани, уровня воздействия тестируемого агента, геномной области и типа субъекта.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что тип субъекта является клеткой человека, растущей в культуре.
17. Способ по п. 13, отличающийся тем, что тестируемое животное подвергают воздействию тестируемого соединения за 30 или менее дней до умерщвления животного.
18. Способ по п. 13, отличающийся тем, что мутагенная сигнатура генерируется путем сопоставления профилей.
19. Способ по п. 13, отличающийся тем, что сигнатура мутаций является триплетной сигнатурой мутаций.
20. Способ по п. 13, отличающийся тем, что дуплексное секвенирование фрагментов ДНК включает дуплексное секвенирование одной или более целевых областей генома.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что одна или более целевых областей генома являются сайтом в геноме, подверженным мутациям.
22. Способ по п. 20, отличающийся тем, что одна или более целевых областей генома является известным геном-драйвера рака.
23. Способ по п. 13, отличающийся тем, что тестируемое животное представляет собой трансгенное животное, при этом по меньшей мере некоторые фрагменты ДНК включают одну или более частей трансгена.
24. Способ по п. 13, отличающийся тем, что тестируемое животное является нетрансгенным животным, при этом фрагменты ДНК содержат эндогенные области генома.
25. Способ оценки генотоксического потенциала тестируемого агента, включающий:
(а) получение библиотеки для секвенирования из образца, содержащего множество двухцепочечных фрагментов ДНК, из биологического источника, подвергаемого воздействию тестируемого агента, при этом подготовка библиотеки последовательностей включает лигирование асимметричных молекул адаптера с множеством двухцепочечных фрагментов ДНК для генерации множества молекул ДНК-адаптер;
(б) секвенирование первой и второй цепей молекул ДНК-адаптера для обеспечения считывания последовательности первой цепи и считывания последовательности второй цепи для каждой молекулы ДНК-адаптер;
(в) для каждой молекулы ДНК-адаптер сравнение считывания последовательности первой цепи и считывания последовательности второй цепи, чтобы идентифицировать одно или более соответствий между считываниями последовательностей первой и второй цепи; и
(г) определение мутационной сигнатуры тестируемого агента путем анализа одного или более соответствий между считываниями последовательностей первой и второй цепей для каждой из молекул ДНК-адаптер для определения по меньшей мере одного из: профиля мутаций, типа мутаций, частоты мутанта, распределения типа мутаций и геномного распределения мутаций в образце; и
(д) сравнение мутационной сигнатуры тестируемого агента со множеством мутационных спектров, полученных от известных генотоксинов, определения достаточно ли сходна мутационная сигнатура со спектром мутаций известного генотоксина; или
(е) оценка того, является ли по меньшей мере одним из: частоты мутанта, типа мутаций или распределения типа мутаций выше безопасного порогового уровня; или
(ж) определение того, превышает ли частота мутанта безопасную пороговую частоту мутанта.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что мутационная сигнатура тестируемого агента содержит мутантную частоту выше безопасной пороговой частоты.
27. Способ по п. 25, отличающийся тем, что сигнатура мутаций тестируемого агента содержит профиль мутаций, достаточно сходный с известным профилем мутаций, ассоциированных с раком.
28. Способ по п. 25, отличающийся тем, что биологический источник представляет собой по меньшей мере одно из: клеток, выращенных в культуре, животного, человека, линии клеток человека, трансгенного животного, нетрансгенного животного, образца ткани человека или образца крови человека.
29. Способ по п. 25, отличающийся тем, что биологический источник подвергался воздействию тестируемого агента за 30 или менее дней до экстракции образца, содержащего множество двухцепочечных фрагментов ДНК.
30. Способ по п. 25, отличающийся тем, что сигнатура мутаций является триплетной сигнатурой мутаций.
31. Способ по п. 25, отличающийся тем, что перед сравнением считывания последовательности первой цепи и считывания последовательности второй цепи способ включает сопоставление считывания последовательности первой цепи со считыванием последовательности второй цепи с использованием одного или более из: последовательности адаптера, длины считывания последовательности и информации об исходной цепи.
32. Способ по п. 25, отличающийся тем, что перед подготовкой библиотеки секвенирования способ дополнительно включает воздействие на биологический источник тестируемым агентом.
33. Способ по п. 32, отличающийся тем, что перед воздействием на биологический источник тестируемого агента биологический источник представляет собой или содержит раковую ткань.
34. Способ по п. 32, отличающийся тем, что перед воздействием на биологический источник тестируемого агента биологический источник представляет собой или содержит здоровую ткань.
35. Способ по п. 25, отличающийся тем, что образец представляет собой или содержит образец крови.
36. Способ по п. 25, отличающийся тем, что образец представляет собой или содержит линию раковых клеток.
37. Способ по п. 25, отличающийся тем, что биологический источник включает раковые клетки, и где вещество проверяется на селективную генотоксичность по меньшей мере для части раковых клеток.
38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что вещество представляет собой терапевтическое соединение.
39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что для части злокачественных клеток, которая, как показано, чувствительна к селективной генотоксичности терапевтического соединения, способ дополнительно включает определение одного или более из частот мутанта и спектра мутаций для части раковых клеток до воздействия терапевтического соединения.
40. Способ по п. 25, отличающийся тем, что тестируемый агент включает пищу, лекарственный препарат, вакцину, косметическое вещество, промышленную добавку, промышленный побочный продукт, нефтяной дистиллят, тяжелый металл, бытовой очиститель, частицы в воздухе, побочный продукт производства, загрязнитель, пластификатор, моющее средство, излучающий радиацию продукт, табачный продукт, химический материал или биологический материал.
41. Способ определения экспозиции субъекта к генотоксическому агенту, включающий сравнение спектра мутаций ДНК субъекта со спектрами мутации известных мутагенных соединений, и идентификацию мутационных спектров известных мутагенных соединений, наиболее сходных со спектром мутаций ДНК субъекта.
42. Способ по п. 41, отличающийся тем, что спектр мутаций ДНК субъекта оценивается дуплексным секвенированием.
43. Способ по п. 41, отличающийся тем, что спектр мутаций ДНК субъекта генерируется из ДНК, выделенной из крови пациента.
44. Способ по п. 41, отличающийся тем, что спектр мутаций ДНК субъекта представляет собой триплетный спектр мутаций.
45. Способ по п. 41, отличающийся тем, что дополнительно включает секвенирование ДНК субъекта для генерации спектра мутаций ДНК субъекта.
46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что секвенирование ДНК субъекта включает секвенирование одного или более известных генов-драйверов рака.
47. Набор, который можно использовать для дуплексного секвенирования с двухцепочечными полинуклеотидами с исправлением ошибок, для идентификации генотоксинов, набор, включающий:
по меньшей мере, один набор праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР) и по меньшей мере один набор молекул адаптера, при этом праймеры и молекулы адаптера могут быть использованы в экспериментах по дуплексному секвенированию с исправлением ошибок; и
инструкции по способам использования набора при проведении дуплексного секвенирования с исправление ошибок ДНК, выделенной из образца субъекта, чтобы определить, подвергался ли субъект воздействию по меньшей мере одного генотоксина.
48. Набор по п. 47, отличающийся тем, что реагент содержит фермент репарации ДНК.
49. Набор по п. 47, отличающийся тем, что каждая из молекул адаптера в наборе молекул адаптера содержит по меньшей мере одну последовательность идентификатора одной молекулы (SMI) и по меньшей мере один элемент, определяющий цепь.
50. Набор по п. 47, отличающийся тем, что дополнительно содержит компьютерный программный продукт, реализованный на машиночитаемом носителе данных для непрерывного хранения информации, который при выполнении на компьютере выполняет этапы определения считывания дуплексного секвенирования с исправлением ошибок со считыванием для одной или более двухцепочечных молекул ДНК в образце с определением частоты мутантов, спектра мутаций и/или триплетного спектра по меньшей мере одного генотоксина с использованием считывания дуплексного секвенирования с исправлением ошибок.
51. Набор по п. 50, отличающийся тем, что компьютерный программный продукт дополнительно определяет механизм действия генотоксина при мутации ДНК субъекта; и терапевтическое или профилактическое лечение, подходящее для введения субъекту на основе механизма действия генотоксина.
52. Способ диагностики и лечения субъекта, подвергшегося воздействию генотоксина, включающий:
а) определение того, подвергался ли субъект воздействию генотоксина, путем:
i) получения биологического образца от субъекта;
ii) обеспечения дуплексных считываний секвенирования с исправлением ошибок для множества последовательностей двухцепочечной ДНК, экстрагированных из образца;
iii) определения частоты мутантов, спектра мутаций и/или триплетного спектра мутаций последовательностей ДНК;
iv) определения того, являются ли частота мутанта, спектр мутаций и/или триплетный спектр мутаций показательными для субъекта, подвергшегося воздействию генотоксина;
б) если субъект подвергался воздействию генотоксина, то обеспечивается профилактическое и/или терапевтическое лечение для предотвращения или ингибирования начала заболевания или расстройства, связанного с генотоксином.
53. Способ определения порогового уровня безопасного воздействия генотоксина и обеспечения лечения, включающий:
а) определение порогового уровня безопасного воздействия генотоксина;
б) определение того, подвергался ли субъект воздействию генотоксина на уровне, превышающем пороговый уровень безопасного воздействия, путем:
i) получения биологического образца от субъекта;
ii) обеспечения дуплексного считывания секвенирования с исправлением ошибок для множества последовательностей двухцепочечной ДНК, экстрагированных из биологического образца;
iii) определения частоты мутантов, спектра мутаций и/или триплетного спектра мутаций последовательностей ДНК;
iv) определения того, являются ли частота мутантов, спектр мутаций и/или триплетный спектр мутаций индикаторами того, что субъект подвергался воздействию специфического генотоксина;
v) вычисления уровня экспозиции субъекта к генотоксину на основе частоты мутанта, спектра мутаций и/или триплетного спектра мутаций; и
в) если субъект подвергался воздействию, превышающему пороговый уровень безопасного воздействия генотоксина, затем проводится профилактическое и/или терапевтическое лечение для предотвращения или ингибирования начала заболевания или расстройства, связанного с генотоксином.
54. Система для обнаружения и идентификации мутагенных событий и/или событий повреждения нуклеиновых кислот, возникающих в результате генотоксического воздействия на образец, включающая:
компьютерную сеть для передачи информации, относящейся к данным секвенирования и данным генотоксичности, при этом информация включает одно или более из: необработанных данных секвенирования, данных дуплексного секвенирования, информации об образце и информации о генотоксине;
клиентский компьютер, связанный с одним или более пользовательских вычислительных устройств и находящийся в связи с компьютерной сетью;
базу данных, подключенную к компьютерной сети, для хранения множества профилей генотоксинов и записей результатов пользователей;
модуль дуплексного секвенирования, связанный с компьютерной сетью и сконфигурированный для получения необработанных данных о секвенировании и запросов от клиентского компьютера для генерации данных дуплексного секвенирования, считывания групп последовательностей из семейств, представляющих исходную двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, и сравнения репрезентативных последовательностей из отдельных цепей между собой для генерирования данных дуплексного секвенирования; и
модуль генотоксина, связанный с компьютерной сетью и сконфигурированный для сравнения данных дуплексного секвенирования с информацией эталонной последовательности для идентификации мутаций и генерации данных генотоксина, включающих по меньшей мере одно из: частоты мутанта, спектра мутаций и триплетного спектра мутаций.
55. Система по п. 54, отличающаяся тем, что профили генотоксина содержат спектр мутаций генотоксина из множества известных генотоксинов.
56. Машиночитаемый носитель данных для непрерывного хранения информации, содержащий инструкции, которые при выполнении одним или более процессорами выполняют способ по любому из пп. 1-46 и 52-53 для определения, подвергается ли субъект воздействию по меньшей мере одного генотоксина, и/или определения идентичности по меньшей мере одного генотоксина.
57. Машиночитаемый носитель данных для непрерывного хранения информации по п. 56, отличающийся тем, что дополнительно включает вычисление спектра мутаций, частоты мутантов и/или триплетного спектра мутаций обнаруженного агента, из чего определяют идентичность по меньшей мере одного генотоксина.
58. Компьютерная система для выполнения способа по любому из пп. 1-46 и 52-53 для определения, подвергается ли субъект воздействию и/или идентичности по меньшей мере одного генотоксина, причем система содержит: по меньшей мере, один компьютер с процессором, память, базу данных и постоянный машиночитаемый носитель данных, содержащий инструкции для процессора(ов), где упомянутый процессор(ы) сконфигурирован для выполнения упомянутых инструкций для выполнения операций, содержащих способы любого из пп. 1-46 и 52-53.
59. Компьютерная система по п. 58, отличающаяся тем, что дополнительно содержит сетевую компьютерную систему, включающую:
а. проводную или беспроводную сеть;
б. множество пользовательских электронных вычислительных устройств, способных принимать данные, полученные в результате использования набора, содержащего реагенты, для экстракции, амплификации и получения полинуклеотидной последовательности образца субъекта и для передачи полинуклеотидной последовательности через сеть на удаленный сервер; и
в. удаленный сервер, содержащий процессор, память, базу данных и машиночитаемый носитель данных для непрерывного хранения информации, содержащий инструкции для процессора(ов), где упомянутый процессор(ы) сконфигурирован для выполнения упомянутых инструкций для выполнения операций, содержащих способы любого из пп. 1-46 и 52-53; и
г. при этом указанный удаленный сервер способен обнаруживать и идентифицировать мутагенные события и/или события повреждения нуклеиновых кислот, возникающие в результате генотоксического воздействия на образец.
60. Компьютерная система по п. 59, отличающаяся тем, что база данных и/или сторонняя база данных, доступная через сеть, дополнительно содержит множество записей, включающих один или более профилей генотоксина известных генотоксинов, профиль генотоксина по меньшей мере одного образца субъекта, при этом профиль генотоксина содержит мутацию или сайт повреждения ДНК.
61. Машиночитаемый носитель данных для непрерывного хранения информации, содержимое которого побуждает по меньшей мере один компьютер выполнять способ для предоставления данных дуплексного секвенирования для молекул двухцепочечной нуклеиновой кислоты в образце из анализа скрининга генотоксичности, способ, включающий:
прием необработанных данных последовательности от пользовательского вычислительного устройства; и
создание набора данных для конкретного образца, содержащего множество необработанных считываний последовательностей, полученных из множества молекул нуклеиновой кислоты в образце;
группирование считываний последовательностей из семейств, представляющих исходную двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, где группирование основано на общей последовательности идентификатора одной молекулы;
сравнение считывания последовательности первой цепи и считывания последовательности второй цепи из исходной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты для идентификации одного или более соответствий между считываниями последовательностей первой и второй цепи; и
предоставление данных дуплексного секвенирования для двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты в образце.
62. Машиночитаемый носитель по п. 61, отличающийся тем, что дополнительно содержит идентификацию некомплементарности положений нуклеотидов между сравниваемыми считываниями первой и второй последовательностей, при этом способ дополнительно содержит:
выявления и устранения или игнорирования ошибок процесса в положениях некомплементарности; и
в положениях некомплементарности, которые не идентифицированы как ошибки процесса, идентификация оставшихся положений некомплементарности, как сайтов возможного повреждения ДНК in vivo, осуществляется в результате воздействия генотоксина.
63. Машиночитаемый носитель данных для непрерывного хранения информации, содержимое которого побуждает по меньшей мере один компьютер выполнять способ обнаружения и идентификации мутагенных событий, возникающих в результате генотоксического воздействия на образец, при этом способ включает:
сравнение данных дуплексных последовательностей с информацией эталонной последовательности;
идентификацию мутаций в данных дуплексной последовательности, где мутация идентифицируется как область несогласия с эталонной информацией;
определение частоты мутанта в данных дуплексной последовательности;
генерирование мутационного спектра из данных дуплексной последовательности;
генерирование триплетного спектра мутаций из данных дуплексной последовательности;
и сравнение спектра мутаций и/или спектра триплетных мутаций с множеством известных наборов данных генотоксинов.
64. Машиночитаемый носитель данных для непрерывного хранения информации, содержимое которого побуждает по меньшей мере один компьютер выполнять способ обнаружения и идентификации канцерогена или воздействия канцерогена у субъекта, при этом способ включает:
идентификацию вариантов последовательности в целевой геномной области с использованием данных дуплексного секвенирования, полученных из образца от субъекта;
вычисление частоты вариантных аллелей (VAF) тестируемого образца и контрольного образца;
определение, является ли VAF в тестируемой группе выше, чем в контрольной группе;
в образцах, имеющих более высокий VAF, определение, является ли вариант последовательности не-синглетным;
в образцах, имеющих более высокий VAF, определение, является ли вариант последовательности мутацией-драйвером; и
характеристика образцов, имеющих не-синглетную мутацию и/или мутацию-драйвер как подозрение на канцероген.
65. Машиночитаемый носитель по п. 64, отличающийся тем, что дополнительно включает оценку порога безопасности для канцерогена и/или определение риска, связанного с развитием заболевания или расстройства, связанного с генотоксином, после воздействия на субъект.