БИЦИКЛИЧЕСКИЕ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИЕ СПИРОСОЕДИНЕНИЯ
BICYCLIC HETEROCYCLIC SPIROCOMPOUNDS

Родственные заявки
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США №61/147143, поданной 26 января 2009 г. Содержание этой предварительной заявки включено в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники
[0002] Настоящее изобретение относится к бициклическим гетероциклическим спиросоединениям, являющимся лигандами рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR), и, в частности, действующим как агонисты мускариновых рецепторов, к фармацевтическим композициям, включающим эти соединения, и к способам лечения болезни Альцгеймера, синдрома инсулинрезистентности и диабета 2 типа у млекопитающих.
Уровень техники
[0003] Широкий спектр заболеваний, связанных с нерешенными медицинскими проблемами, обладающих некоторыми общими особенностями патогенеза, в принципе может поддаваться лечению активаторами протеинкиназы С (РКС) и ингибиторами киназы гликогенсинтазы-3β (GSK-3β), соответственно. Три таких болезненных состояния - болезнь Альцгеймера (AD, БА) (неврологическое заболевание центральной нервной системы (ЦНС)), а также синдром инсулинрезистентности (IRS, ИР) и диабет второго типа (T2D, Д2Т) (два взаимосвязанных метаболических заболевания) кратко описаны ниже. Существует тесная связь между ИР/Д2Т и AD (Sima and Li, Rev. Diabetic Stud. 2006,3,161-168).
[0004] БА представляет собой дегенеративное заболевание головного мозга, клинически характеризующееся прогрессирующей потерей памяти, деградацией синапсов, наличием нейритических бляшек, состоящих из β-амилоида (Аβ), наличием нейрофибриллярных клубков (НФК) и деградацией холинергических нейронов в базальных отделах переднего мозга. Аβ представляют собой нейротоксические пептиды. Тау (τ) представляют собой белки, ассоциированные с микротрубочками, необходимые для роста аксонов. Гиперфосфорилированные тау-белки являются токсичными и представляют собой основной компонент парных спиральных филаментов (ПСФ) и НФК. Инсулинрезистентность вызывает хроническое повышение уровня периферического инсулина, снижает активность инсулина и уровень инсулина в головном мозге. ИР и ассоциированные с ней состояния, например, Д2Т и гипертензия, связаны с возрастным нарушением памяти и БА (Sima and Li, Rev Diabetic Stud 2006, 3:161-168).
[0005] В патогенезе БА и ИР/Д2Т участвует ряд киназ. Так, в мозге людей, страдающих БА, снижается количество протеинкиназы С (РКС), и показано, что это снижение коррелирует с развитием нейропатологий. Это подчеркивает значение данной киназы в качестве основной терапевтической мишени при БА (Kurumatani et al Brain Res 1998; 796:209-21).
[0006] Еще одна киназа, GSK-3β, играет важную регуляторную роль во многих клеточных процессах, от сигнального пути "клеточная мембрана-ядро", транскрипции и трансляции генов, организации цитоскелета до регуляции клеточного цикла и продолжительности жизни клетки (Eldar-Finkelman, Trends Molec Med. 2002, 8:126-32; Bhat et al., Neurosignals 2002, 11:251-61; Balaram et al., Cell Mol Life Sci 2006, 63:1226-35). GSK-3β связана с большинством основных нарушений, ассоциированных с БА, таких как гиперфосфорилирование тау-белков при БА, нейротоксичность, вызванная Аβ? и патогенные эффекты мутации пресенилина-1 (PS-1). Активная GSK-3β запускает события передачи сигнала, участвующие в гибели клетки, что указывает на то, что патология БА может быть частично обусловлена нарушениями экспрессии и активности GSK-Зр. Более того, инактивация GSK-3β коррелирует с пониженной секрецией Аβ (Sun et al., NeuroscL Lett. 2002, 321:61-4). В настоящее время существует гипотеза, что GSK-3β представляет собой недостающее звено между β-амилоидом и тау-патологией, что придает GSK-3β важную роль в патогенезе БА [Takashima, J Alzheimers Dis 2006, 9 (3 Suppl), 309-17].
[0007] GSK-3β фосфорилирует гликогенсинтазу и регулирует путь метаболизма глюкозы. Таким образом, GSK-3β является центральным отрицательным регулятором сигнального пути инсулина и может играть роль в инсулинрезистентности (Gasparini et al, Trends Pharmacol Sci 2002: 23: 288-92; Janssens et al, Investig New Drugs 2006; 24: 263-80).
[0008] Таким образом, ингибирование GSK-3β может имитировать действие некоторых гормонов и факторов роста, таких как инсулин, которые используют путь GSK-3β. Эта стратегия может давать возможность обхода дефектного рецептора (например, рецептора инсулина) или иного поврежденного компонента сигнального пути, так что биологический сигнал будет оказывать действие, даже если некоторые предыдущие звенья сигнального каскада дефектны, как при инсулиннезависимом диабете 2 типа [Tanabe et al, PLoS Biol. 2008 (2): е37; Wagman et al, Curr Pharm Design, 2004, 10:1105-1137].
[0009] Стратегии лечения вышеупомянутых заболеваний могут включать использование активаторов РКС и ингибиторов GSK-3β. Лечение в принципе может быть достигнуто путем непрямой (GPCR-опосредованной) или прямой регуляции этих киназ. В случае прямых активаторов РКС или ингибиторов GSK-3β предметом поисков являются высокоэффективные и селективные лиганды. Однако такие терапевтические стратегии вероятно не будут свободны от нежелательных эффектов, поскольку киназы, являющиеся их мишенями, вовлечены во множество процессов и каскадов. Таким образом, прямое воздействие на функцию этих киназ в одном метаболическом пути (и при связанном с ним заболевании) будет изменять их функцию в другом пути и потенциально приведет в серьезным побочным эффектам (зезапланированным побочным эффектам).
[0010] Следовательно, идеальная терапия веществами, которые напрямую воздействуют на эти киназы, должна селективно регулировать отдельно взятый метаболический путь (пути), связанный с болезненным состоянием. Такие киназы можно регулировать извне через GPCR. GPCR преобразовывают сигналы, полученные из внеклеточной среды, в биологические внутриклеточные процессы через пути передачи сигнала. Такие пути передачи сигнала, модулируемые GPCR, представляют собой элегантные системы, с помощью которых клетки и организмы могут усиливать слабые сигналы, генерируя устойчивые ответы. Эти вторичные процессы усиления делают возможной клиническую разработку частичных агонистов, обладающих умеренной эффективностью при связывании и не вызывающих потери чувствительности GPCR-опосредуемого сигнального пути после продолжительного лечения таких хронических болезненных состояний, как БА, ИР и Д2Т.
[0011] Желательно, чтобы потенциальное лекарственное средство для регуляции GPCR обладало селективностью к заданному подтипу GPCR для предотвращения активации других подтипов GPCR. Мускариновые рецепторы (mAChR) являются подклассом GPCR. Клонировано пять генетически различных мускариновых рецепторов человека (Buckley et al. Mol Pharmacol. 1989; 35: 469-76; Hulme et al. Ann Rev Pharmacol Toxicol 1990; 30: 633-73). Мускариновые рецепторы M1, преобладающие в коре, гиппокампе и полосатом теле, играют важную роль в познавательном процессе и в частности, в кратковременной памяти, которая ухудшается при БА. Селективные Мускариновые агонисты M1 можно использовать в лекарственной терапии деменции. Степень дегенерации пресинаптических холинергических окончаний в принципе должна в меньшей степени влиять на терапевтический потенциал таких соединений, чем па ингибиторы холинэстеразы (АХЭ-и), и, таким образом, использование этих соединений может представлять собой более рациональный способ лечения БА, чем использование АХЭ-и, одобренных FDA (обзор: Fisher, Neurotherapentics, 5: 433-42, 2008). Описан ряд бициклических спиросоединений, о некоторых из которых сообщалось, что они являются M1-селективными агонистами (патенты США №№4855290, 4981858, 4900830, 4876260, 5053412, 5407938, 5534520, 5852029, 7049321, 5221675, 7349251).
[0012] Описана связь между тремя главными признаками, характерными для БА: гипофункцией холинергических структур ЦНС, образованием амилоидных пептидных бляшек из Аβ и клубками, содержащими гиперфосфорилированные тау-белки. В данном контексте гипофункцию холинергических структур при БА с пептидом Аβ и фосфорилированием тау-белков связывает порочный круг. Стимуляция мускариновых рецепторов M1 может усилить расщепление белка-предшественника амилоида (АРР) в середине его R-амилоидного участка. В результате этого расщепления образуются секретируемые, нейротрофические и нейропротективные АРР (α-АРР), предотвращающие образование пептида Аβ. Агонисты M1 могут быть важны для предотвращения образования Аβ за счет селективной стимуляции пути процессинга α-секретазы при БА. Более того, стимуляция мускариновых рецепторов M1 может уменьшить гиперфосфорилирование тду-белков (обзор: Fisher, Neurotherapeutics 5:433-42,2008). Таким образом, некоторые из подтипов GPCR, и, в частности, мускариповые рецепторы M1, вовлечены в регуляцию множества функций, как в здоровом состоянии, так и при заболеваниях. РКС может быть активирована несколькими GPCR, включая мускариновый рецептор M1, метаботропные рецепторы и сигнальный путь Wnt, но не ограничиваясь ими (Farias et al., Nenrobiol. Dis. 2004, 47:337-48; Mudher et al., J Neurosci. 2001, 21:4987-95; Ballou et al., J. Biol. Chem. 2001, 44: 40910-916).
[0013] Обычно GPCR могут содержать более одного сайта. В данном контексте подтипы мускариновых рецепторов содержат и ортостерические (основной сайт связывания природного нейромедиатора ацетилхолина), и аллостерическис сайты (могут влиять или не влиять на ортостерический сайт и действие ацетилхолина).
[0014] Многие из патологические компоненты заболеваний ЦНС и ПНС, включая БА и ИР/Д2Т, соответственно, включают компоненты, связанные с окислительным стрессом. Окислительный стресс при БА, вызванный Аβ, может породить цепь событий и порочных кругов, приводящих к блокаде некоторых путей передачи GPCR-индуцированного сигнала, (лучше всего описано для мускаринового рецептора M1) и дальнейшему накоплению нейротоксического Аβ. Антиоксиданты в принципе могут предотвращать возникновение таких порочных кругов (Fisher, Jap. J. Pharmacol. 2000, 84: 101-12; Kelly et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 1996 93:6753-58).
[0015] Окислительный стресс в конечном итоге может быть причиной как начала, так и к последующих осложнений Д2Т. Хотя показано успешное лечение антиоксидаптами диабета в моделях на животных, для демонстрации того, могут ли антиоксиданты быть эффективны при лечении осложнений диабета, требуются новые, более мощные антиоксиданты. Более того, окислительный, по-видимому, стресс является только одним из факторов, приводящих к осложнениям диабета; таким образом, вероятно, что лечение антиоксидантами будет более эффективным в комбинации с другими способами лечения осложнений диабета. В частности, новые метаболические пути, включающие сигнальные пути метаботропных рецепторов (например, сигнальные пути, опосредуемые GPCR) и GSK-3β, могут быть вовлечены в патогенез диабета и должны быть изучены во всесторонней терапевтической стратегии (Maiese et al, Curr Med Chem. 2007 14:1729-38. Review).
Краткое описание изобретения
[0016] В соответствии с вариантами реализации изобретения, предложено спиросоединение формулы I:
где А выбрана из группы, состоящей из , , ,  и
где
во всех структурах атом углерода, обозначенный "С", обозначает спироатом углерода,
1-6
R выбран из группы, состоящей из Н и возможно замещенного C алкила,
n и р независимо выбраны из 0, 1, 2 и 3, при условии, что n+р=1, 2 или 3;
Y представляет собой -О- или -S-;
1
2
3
4
6
1-6
1-6
1-6
2-6
R, R, R, R и R независимо в каждом положении выбраны из Н, возможно замещенного С алкила, возможно замещенного С алкокси, возможно замещенного С гидроксиалкила, возможно замещенного С алкенила и возможно замещенного фенила;
5
8
9
8
1-7
1-6
2-6
2-6
1-6
1-6
3-7
2
R выбран из возможно замещенного С алкила, возможно замещенного Cгидроксиалкила, возможно замещенного С алкенила, возможно замещенного С алкинила, возможно замещенного фенила, возможно замещенного -(С)алкилиыдола, возможно замещенного гетероарила, возможно замещенного C алкилгетероарила, возможно замещенного С циклоалкила, -C(=O)-R, -SO-R и, если А представляет собой , -O-C(=O)-R;
8
9
1-7
1-7
2-7
2-7
2-7
3-7
1-6
2-3
1-6
1-6
2-3
1-6
1-6
2-3
1-6
1-6
2-3
1-6
1-6
2-3
1-6
3
R выбран из возможно замещенного C алкила, возможно замещенного C алкокси, возможно замещенного C гидроксиалкила, возможно замещенного C алкенила, возможно замещенного C алкинила, возможно замещенного С циклоалкила, возможно замещенного арила, возможно замещенного -(С)алкилиндола, возможно замещенного -C алкенилиндола, возможно замещенного -(С)алкоксииндола, возможно замещенного -(С)алкилиндолизина, возможно замещенного -C алкенилиндолизина, возможно замещенного -(С)алкоксииндолизина, возможно замещенного -(С)алкилизоиндола, возможно замещенного -C алкенилизоиндола, возможно замещенного -(С)алкоксиизоиндола, возможно замещенного -(C)алкилиндазола, возможно замещенного -С алкенилиндазола, возможно замещенного -(С)алкоксииндазола, возможно замещенного -(С)алкилбензимидазола, возможно замещенного -C алкенилбензимидазола и возможно замещенного -(C)алкоксибензимидазола; а R представляет собой арил, замещенный по одному или нескольким положениям группой, выбираемой из алкила, галогена, нитрогруппы, аминогруппы, гидроксила и CF, или фармацевтически приемлемая соль указанного соединения.
[0017] В некоторых вариантах реализации изобретения R представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации изобретения и р и n равны 1.
[0018] В некоторых вариантах реализации изобретения А представляет собой . В некоторых вариантах реализации А представляет собой . В некоторых вариантах реализации А представляет собой . В некоторых вариантах реализации А представляет собой . В некоторых вариантах реализации А представляет собой .
1
2
1
2
3
4
[0019] В некоторых вариантах реализации изобретения R представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации R представляет собой метил, а R представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации R представляет собой метил, а каждый из R, Rи R представляет собой Н.
[0020] В некоторых вариантах реализации R представляет собой Н.
[0021] В некоторых вариантах реализации изобретения Y представляет собой S. В некоторых вариантах реализации Y представляет собой О.
5
5
5
5
5
5
5
5
5
3
5
1-3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
[0022] В некоторых вариантах реализации R представляет собой -С(O)-(С)-индол-3-ил. В некоторых вариантах реализации R представляет собой -С(O)-СН-индол-3-ил. В некоторых вариантах реализации R представляет собой -С(O)-СНСН-индол-3-ил. В некоторых вариантах реализации R представляет собой -С(O)-СНСН-(1-метил)-индол-3-ил. В некоторых вариантах реализации R представляет собой -С(O)-СНСН-СН-индол-3-ил. В некоторых вариантах реализации R представляет собой транс-C(O)-CH=СН-индол-3-ил. В некоторых вариантах реализации R представляет собой -SO-4-фторфенил. В некоторых вариантах реализации R представляет собой - С(O)СН(н-пропил). В некоторых вариантах реализации R представляв собой -С(O)-(4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенил). В некоторых вариантах реализации R" представляет собой -С(O)-СНСН. В некоторых вариантах реализации R представляет собой -С(O)-СН(NH)-СН-индол-3-ил. В некоторых вариантах реализации А представляет собой , а R представляет собой -О-С(=O)-CHCH-индол-3-ил.
[0023] В некоторых вариантах реализации изобретения соединения выбирают из:
(1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)пропан-1-она),  ((R)-1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)пропан-1-она),  ((S)-1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)пропан-1-она),  (3-(4-фторбензолсульфонил)-2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]-декана),  (1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-2-иропилпентан-1-она),  (((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-метанона),  (1-(2,8-диметил-1-тиа-3.8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-4-(1Н-индол-3-ил)бутан-1-она),  (1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-2-(1Н-индол-3-ил)этан-1-она),  (1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-пропан-1-она),  (1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)проп-2-ен-1-она),  1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1-метил-индол-3-ил)пропан-1-она,  1-(2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)-пропан-1-она,  ((R)-1-(2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)-пропан-1-она),  ((S)-1-(2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)-пропан-1-она),  (1-(2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-2-пропилпентан-1-она),  (3-(4-фторбензолсульфонил)-2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]-декана),  (1-(2,8-диметил-1-окса-4,8-диазаспиро[4.5]дец-4-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)-пропан-1-она),  (1-(2,8-диметил-1-окса-4,8-диазаспиро[4.5]дец-4-ил)-2-пропилпентан-1-она),  (4-(4-фторбензолсульфонил)-2,8-диметил-1-окса-4,8-диазаспиро[4.5]-декана),  (1',4-диметил-6-(3-индолпропионил)-спиро-(3-окса-6-азабицикло[3.1.0]-гексан-2,4'-пиперидина)) и  (1',4-диметил-6-[3-(4-торбензолсульфонил)]-спиро-(3-окса-6-азабицикло[3.1.0]гексан-2,4'-пиперидина)),  N-(2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)-пропионамида,  N-(2,8-диметил-1-тиа-8-азаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)-пропионамида,  (3E)-2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]декан-3-она-O-[3-(1Н-индол-3-ил)пропаноил]оксима,  (D)-2-амино-1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)-пропан-1-она или их фармацевтически приемлемых солей.
[0024] В соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения также предложено соединение, выбираемое из группы, состоящей из (1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)пропан-1-она), (+)-(1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)пропан-1-она), (-)-(1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)пропан-1-она), 1-(2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)-пропан-1-она, (+)-1-(2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)-пропан-1-она и (-)-1-(2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)-пропан-1-она.
[0025] В соответствии с вариантами реализации изобретения, также предложена фармацевтическая композиция, включающая соединение согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
[0026] В соответствии с вариантами реализации изобретения, также предложен способ лечения болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению.
[0027] В соответствии с вариантами реализации изобретения, также предложен способ лечения синдрома инсулинрезистентности, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению.
[0028] В соответствии с вариантами реализации изобретения, также предложен способ лечения диабета 2 типа, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению.
[0029] В соответствии с вариантами реализации изобретения также предложен способ лечения заболевания или состояния, поддающегося лечению модулятором мускаринового рецептора M1, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из заболеваний головного мозга, опосредуемых амилоидом; расстройств, опосредуемых GSK-3R; аномалий сигнального пути Wnt; повреждения, дисфункции или заболевания, опосредуемого гиперфосфорилированием тау-белка; эндогенных заболеваний, опосредуемых фактором роста; комбинации факторов риска БА и/или одного из вышеупомянутых заболеваний, например, черепно-мозговой травмы, окислительного стресса, свободных радикалов, апоптоза, воспаления, экзогенных или эндогенных токсинов, эксайтотоксинов, генетической предрасположенности, иммунных или аутоиммунных дисфункций или заболеваний (например, волчанки, рассеянного склероза, синдрома Шегрена, синдрома хронической усталости, фибромиалгии); и болезненных состояний, включая нарушения, в которые вовлечена холинергическая дисфункция. В некоторых вариантах реализации заболевание или состояние выбирано из группы, состоящей из БА, деменции с тельцами Леви, церебральной амилоидной ангиопатии (САА), церебрального амилоидоза, лобно-височной деменции, сосудистой деменции, гиперлипидемии, гиперхолестеринемии, лобно-височной деменции, сосудистой деменции, мультиинфарктной деменции (MID), ишемии при инсульте, MID в комбинации с инсультом/ишемией/черепно-мозговой травмой, сочетания MID и БА, сочетания БА и PD, черепномозговой травмы человека, возрастных нарушений памяти, умеренных когнитивных нарушений (MCI), MCI, ведущих к БА, биполярного расстройства, мании, острых состояний спутанности сознания, расстройств с дефицитом внимания, галлюцинаторно-параноидных состояний, эмоциональных расстройств и расстройств внимания, послеоперационного делирия (антихолинергический синдром после общего наркоза), антагонизма неблагоприятных эффектов (например, ксеростомии, аномии, потери и/или спутанности памяти, психоза) трициклических антидепрессантов или некоторых лекарственных средств (например, тригексифенидила), используемых для лечения шизофрении и PD, шизофрении, биполярного расстройства, мании, поздней дискинезии, врожденного дефицита орнитинтранскарбамилазы, оливомостомозжечковой атрофии, абстинентного алкогольного синдрома, хореи Гентингтона, болезни Ниманна-Пика, атаксии Фридрейха, болезни Жилль де ла Туретта и синдрома Дауна.
Определения
[0030] Термины и обозначения сохраняют свое значение в пределах настоящего описания.
[0031] Предполагается, что термин "алкил" включает линейные, разветвленные или циклические углеводородные структуры и их комбинации. Если нет иных ограничений, этот термин относится к алкилам из 20 или меньшего числа атомов углерода. Низшие алкилы относятся к алкильным группам из 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода. Примеры низших алкильных групп включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор- и трет-бутил и т.п. Циклоалкил представляет собой подгруппу алкилов и включает циклические углеводородные группы из 3, 4, 5, 6, 7 и 8 атомов углерода. Примеры циклоалкильных групп включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, норборнил, адамантил и т.п.
1
20
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
[0032] Углеводород C-C (например, C, С, С, C, C, С, С, С, C, С, С, С, С, C, C, C, C, C, C, C) включает алкил, циклоалкил, алкенил, алкинил, арил и их комбинации. Примеры включают бензил, фенетил, циклогексилметил, камфорил и нафтилэтил. Термин "фенилен" относится к орто-, мета- или пара-остаткам формулы:
и
[0033] Термин "алкокси" или "алкоксил" относится к группам из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода линейной, разветвленной, циклической конфигурации и их комбинациям, присоединенным к первичной структуре через атом кислорода. Примеры включают метокси, этокси, пропокси, изопропокси, циклопропокси, циклогексилокси и т.п. "Низший алкокси" относится к группам, содержащим от одного до четырех атомов углерода. В настоящем описании алкокси включает также метилендиокси и этилендиокси, в которых каждый атом кислорода связан с атомом, цепью или кольцом, от которого ответвляется метилендиокси- или этилендиокси-группа, с образованием кольца. Так, например, фенил, замещенный алкокси, может представлять собой, например, или .
[0034] "Оксаалкил" относится к алкильным остаткам, в которых один или несколько атомов углерода (и связанные с ними атомы водорода) заменены атомами кислорода. Примеры включают метоксипропокси, 3,6,9-триоксадецил и т.п. Подразумевается, что термин "оксаалкил" приведен в том значении, которое понимают специалисты в данной области [см. Naming and Indexing of Chemical Substances for Chemical Abstracts, опубликованную American Chemical Society, 1196, но без сокращений 1127(а)], т.е. он относится к соединениям, в которых атом кислорода связан с соседними атомами одинарной связью (с образованием эфирной связи). Аналогично, "тиаалкил" и "азаалкил" относятся к алкильным остаткам, в которых один или несколько атомов углерода замещены атомами серы или азота, соответственно. Примеры включают этиламиноэтил и метилтиопропил.
[0035] "Ацил" относится к группам из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода линейной, разветвленной, циклической конфигурации, насыщенным, ненасыщенным и ароматическим, и их комбинациям, присоединенным к первичной структуре через карбонильную группу. Один или несколько атомов углерода в ацильном остатке могут быть заменены атомами азота, кислорода или серы при условии, что точкой присоединения к первичной структуре остается карбонил. Примеры включают формил, ацетил, пропионил, изобутирил, трет-бутоксикарбонил, бензоил, бензилоксикарбонил и т.п. "Низший ацил" относится к группам, содержащим от одного до четырех атомов углерода.
[0036] "Арил" и "гетероарил" относятся к заместителям в виде ароматических или гетероароматических колец, соответственно. Гетероарил содержит один, два или три гетероатома, выбранных из О, N или S. Оба эти термина относятся к моноциклическим 5- или 6-членным ароматическим или гетероароматическим кольцам, бициклическим 9-или 10-членным ароматическим или гетероароматическим кольцам и трициклическим 13- или 14-членным ароматическим или гетероароматическим кольцам. Ароматические 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14-членные карбоциклические кольца включают, например, бензол, нафталин, индан, тетралин и флуорен, а 5, 6, 7, 8, 9 и 10-членные ароматические гетероциклические кольца включают, например, имидазол, пиридин, индол, тиофен, бензопиранон, тиазол, фуран, бензимидазол, хинолин, изохинолин, хиноксалин, пиримидин, пиразин, тетразол и пиразол.
[0037] "Арилалкил" означает алкильный остаток, присоединенный к арильному кольцу. Примеры включают бензил, фенетил и т.п.
[0038] "Замещенный" алкил, арил, циклоалкил, гетероциклил и т.д. относится к алкилу, арилу, циклоалкилу или гетероциклилу, в которых до трех атомов водорода при каждом остатке заменены атомом галогена, галоалкилом, алкилом, ацилом, алкоксиалкилом, гидроксипроизводным низших алкилов, фенилом, гетероарилом, бензолсульфонилом, гидрокси, низшим алкокси, галоалкокси, карбокси, карбоалкокси (также называемым алкоксикарбонилом), алкоксикарбониламино, карбоксамидо (также называемым алкиламинокарбонилом), циано, карбонилом, ацетокси, нитро, амино, алкиламино, диалкиламино, меркапто, алкилтио, сульфоксидом, сульфоном, сульфониламино, ациламино, амидино, арилом, бензилом, гетероциклилом, фенокси, бензилокси, гетероарилокси, гидроксиимино, алкоксиимино, оксаалкилом, аминосульфонилом, тритилом, амидино, гуанидино, уреидо и бензилокси.
[0039] Термин "галоген" означает фтор, хлор, бром или иод.
[0040] При характеристике некоторых из этих заместителей указано, что некоторые заместители могут объединяться с образованием колец. Если не указано иное, предполагается, что такие кольца могут иметь разную степень ненасыщенности (от полностью насыщенных до полностью ненасыщенных), могут включать гетероатомы и могут быть замещены низшим алкилом или алкокси.
[0041] Термины "способы лечения или предотвращения" означают улучшение, предотвращение или ослабление симптомов и/или эффектов, ассоциированных с описанным заболеванием или состоянием. Термин "предотвращение" в настоящем описании относится к введению лекарственного средства заранее для предотвращения или смягчения острого приступа или, в случае хронического состояния, для уменьшения вероятности наступления или тяжести состояния. Специалист в области медицины (к которой относится настоящий способ) понимает, что термин "предотвращать" не является абсолютным термином. В медицине принято называть профилактическим введением лекарственного средства значительное уменьшение вероятности наступления или тяжести состояния, именно в этом смысле данный термин употребляется в формуле изобретения. В настоящем описании предполагается, что ссылка на "лечение" пациента включает профилактику.
[0042] Текст данного описания содержит ссылки на различные публикации. Каждый из патентов, патентных заявок, патентных публикаций и других публикаций, упомянутых в настоящем документе, полностью включен в него посредством ссылки.
[0043] Термин "млекопитающее" используется в своем словарном значении. Термин "млекопитающее" включает, например, мышей, хомяков, крыс, коров, овец, свиней, коз и лошадей, обезьян, собак, кошек, кроликов, морских свинок и приматов, включая людей.
[0044] Соединения, описанные в настоящем документе, могут содержать один или несколько центров асимметрии и таким образом могут образовывать энантиомеры, диастереоизомеры и другие стереоизомерные формы. Каждый хиральный центр можно определить в терминах абсолютной стереохимии как (R)- или (S)-. Подразумевается, что настоящее изобретение включает все возможные из таких изомеров, а также их смеси, включая рацемические и оптически чистые формы. Оптически активные (R)- и (S)-, (-)- и (+)- или (D)- и (L)-изомеры можно получить, используя хиральные синтоны или хиральные реагенты, или выделить с помощью традиционных методик.
[0045] В настоящем описании, как будет понятно специалисту в данной области, предполагается, что определение "соединения" включает соли, сольваты и комплексы включения этого соединения, а также любые его стереоизомерные фюрмы или смеси любых подобных форм этого соединения в любом соотношении. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения, соединение настоящему изобретению, в том числе в составе фармацевтических композиций, способов лечения и соединений в чистом виде, имеет форму соли. Типичные примеры подходящих солей включают соли, образованные с такими кислотами, как соляная, серная, фосфорная, уксусная, янтарная, лимонная, молочная, яблочная, фумаровая, винная, муравьиная, пальмитинова, бензойная, глутаровая, холевая, памовая, слизевая, D-глутаминовая, D-камфорная, гликолевая, фталевая, лауриновая, стеариновая, олеиновая, салициловая, метансульфоновая, бензолсульфоновая, сорбиновая, пикриновая, коричная и т.п. кислотами.
[0046] Графическое представление рацемических, амбискалемических и скалемических или энантиомерно чистых соединений, использованное в настоящем документе, взято из Maehr J. Chem. Ed, 62. 114-120 (1985): клинья со сплошной и полосатой заливкой используются для обозначения абсолютной конфигурации хирального элемента; волнистые линии, что стереохимическая конфигурация, которую может принимать данная связь, не определена; сплошные и ломаные толстые линии являются геометрическими обозначениями, указывающими показанную относительную конфигурацию, но подразумевающими рацемический характер; а контуры клиньев и пунктирные или прерывистые линии означают энантиомерно чистые соединения неопределенной абсолютной конфигурации. Так, например, предполагается, что формула W охватывает оба чистых энантиомера этой пары:  означает  и , а формула Х представляет четыре диастереоизомера:  означает, , ,  и .
a
а
[0047] Термин "энантиомерный избыток" общеизвестен в данной области и определен для разделения b на +b следующим образом
Термин "энантиомерный избыток" относится к устаревшему термину "оптическая чистота" в том смысле, что оба эти термина являются мерами одного и того же феномена. Значение ее находится в диапазоне от 0 до 100, при этом ноль означает рацемическое состояние, а 100 - чистый, одиночный энантиомер. Соединение, которое в прошлом могли называть на 98% оптически чистым, сейчас более точно описывается как 96% ее; другими словами, 90% ее отражает присутствие в исследуемом материале 95% одного энантиомера и 5% другого.
[0048] Если не указано иное, конфигурацию любой углерод-углеродной двойной связи, представленной в настоящем документе и не являющейся частью кольца, выбирают исключительно с точки зрения удобства, не определяя конкретной конфигурации; таким образом, если не указано иное, углерод-углеродная двойная связь вне кольца, произвольно изображенная в настоящем документе как Е, может представлять собой Z, Е или их смесь в любой пропорции. Аналогично, предполагается, что в описание включены все таутомерные формы.
[0049] Сокращения Me, Et, Ph, Tf, Ts и Ms представляют собой метил, этил, фенил, трифторметансульфонил, толуолсульфонил и метансульфонил, соответственно. Следующие сокращения и термины имеют указанные значения на протяжении всего текста заявки:
абс. = абсолютный
Ас = ацетил
ACN = ацетонитрил
Boc = трет-бутоксикарбонил
Bu = бутил
ц- = цикло
CDI = карбодиимид
конц. = концентрированный
2
2
ДХМ = дихлорметан = метиленхлорид = CHCl
DCC = дициклогексилкарбодиимид
DMAP = 4-N,N-диметиламинопиридин
Et = этил
КФХ = колоночная флэш-хроматография
ГХ = газовая хроматография
HOBt = гидроксибензтриазол
ВЭЖХ = высокоэффективная жидкостная хроматография (или жидкостная хроматография высокого давления)
i- = изо-
ИПС = изопропиловый спирт
Me = метил
Ph или κ = фенил
ppt. = осадок
Pr = пропил
кт = комнатная температура
нас. = насыщенный
втор- = вторичный
трет- = третичный
ТЭА = триэтиламин
ТГФ = тетрагидрофуран
ТСХ = тонкослойная хроматография
TMS = триметилсилил
тозил = р-толуолсульфонил
[0050] Обширный список сокращений, используемых химиками-органиками (т.е. специалистами в данной области) приведен в первом выпуске каждого тома Journal of Organic Chemistry. Этот список, обычно представленный в таблице, озаглавленной "Список стандартных сокращений", включен в настоящий документ посредством ссылки.
[0051] Соединения формулы I являются модуляторами мускариновых рецепторов M1, т.е. они связываются с мускариновыми рецепторами М1 и действуют как агонисты или антагонисты этого рецептора. В некоторых случаях эта регуляция является аллостерической, в некоторых случаях ортостерической, а в некоторых случаях - и аллостерической, и ортостерической.
[0052] Хотя соединения формулы I можно вводить в виде необработанных реагентов, часто предпочтительно использовать их в виде части фармацевтической композиции (также называемой в настоящем документе составом). В соответствии с вариантом реализации настоящего изобретения, в настоящей заявке предложена фармацевтическая композиция, включающая соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль или сольват в совместно с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и, возможно, одним или несколькими другими терапевтическими ингредиентами. Носитель(и) должен быть «приемлемым» в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и физиологически безвредным для реципиента.
[0053] Далее, как установлено выше, термин «соединение» включает также соли соединения, поэтому следует понимать, что независимые пункты формулы изобретения, характеризующие «соединение», следует также относятся к солям соединения. Тем не менее, если в независимом пункте формулы изобретения упоминается «соединение или его фармацевтически приемлемая соль», следует понимать, что пункты формулы изобретения, зависимые от этого независимого пункта, которые относятся к такому соединению, также включают фармацевтически приемлемую соль этого соединения, даже если зависимый пункт не содержит прямого указания этой соли.
[0054] Составы включают составы, пригодные для перорального, парентерального (включая подкожное, внутрикожное, внутримышечное, внутривенное и внутрисуставное), ректального и местного (включая кожное, буккальное, подъязычное и внутриглазное) применения. Наиболее подходящий путь может зависеть от состояния и заболевания у пациента. Составы может быть удобно представлять в дозированной лекарственной форме и можно готовить любым способом, известным в области фармации. Такие способы включают этап смешивания соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата («активного ингредиента») с носителем, который состоит из одного или более вспомогательных ингредиентов. В общем, составы получают путем равномерного и тщательного смешивания активного ингредиента с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями, или и теми и другими, и затем, при необходимости, формовки продукта в виде требуемого препарата (лекарственной формы).
[0055] Составы, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, например, капсул, облаток или таблеток, каждая из которых содержит заранее определенное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии типа «масло в воде» или «вода в масле». Активный ингредиент также может быть представлен в форме болюса, электуария или пасты.
[0056] Таблетка может быть изготовлена путем прессования или формовки, возможно с применением одного или более вспомогательных ингредиентов. Прессованные таблетки можно получить прессованием активного ингредиента в сыпучей форме, например, в виде порошка или гранул, возможно, смешанных со связующим, скользящим веществом, инертным разбавителем, скользящим, поверхностно-активным или диспергирующим агентом, на подходящем оборудовании. Формованные таблетки можно получить формованием порошкообразного соединения, увлажненного инертным жидким разбавителем, в подходящем устройстве. На таблетки может быть нанесено покрытие или насечка, при этом состав таблеток может быть таким, чтобы обеспечивать пролонгированное, отсроченное или контролируемое высвобождение активного ингредиента. Фармацевтические композиции могут включать «фармацевтически приемлемый инертный носитель»; предполагается, что этот термин включает одно или несколько инертных вспомогательных веществ, включая крахмалы, полиолы, гранулирующие агенты, микрокристаллическую целлюлозу, разбавители, скользящие вещества, связующие вещества, дезинтегрирующие агенты и т.п. При желании на таблетированные дозы описанных композиций может быть нанесено покрытие с помощью стандартных водных или неводных методик. «Фармацевтически приемлемый носитель» также охватывает средства, обеспечивающие контролируемое высвобождение лекарства.
[0057] Составы для парентерального введения включают водные или неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферные агенты, бактериостатические агенты и растворы, делающие препарат изотоничным крови предполагаемого реципиента. Составы для парентерального введения также включают водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители. Составы могут быть представлены в контейнерах на одну или несколько доз, например в запаянных ампулах и пузырьках, и могут храниться в сублимированном (лиофилизированном) состоянии, требующем лишь добавления стерильного жидкого носителя, например, физиологического раствора, фосфатного буферного раствора (ФБР) и т.п. непосредственно перед применением. Растворы и суспензии для инъекций, подготовленные для немедленного введения, могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток, описанных ранее.
[0058] Составы для ректального введения могут иметь форму суппозитория со стандартными носителями, например, маслом какао или полиэтиленгликолем.
[0059] Составы для местного применения во рту, например, буккального или подъязычного, включают леденцы, содержащие активный ингредиент во вкусоароматической основе, например, сахарозе и гуммиарабике или трагакантовой камеди, и пастилки, содержащие активный ингредиент в основе, например, желатине и глицерине или сахарозе и гуммиарабике.
[0060] Фармацевтические композиции также могут включать другие терапевтические ингредиенты, агенты для предотвращения слипания, консерванты, подсластители, красители, ароматизаторы, влагопоглотители, смягчители и т.п. Любой из таких необязательных ингредиентов должен быть совместим с соединением формулы I для обеспечения стабильности состава. Композиция может при необходимости содержать другие добавки, включая, например, лактозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, трегалозу, сахарозу, мальтозу, раффинозу, мальтит, мелицитозу, стахиозу, лактит, налагинит, крахмал, ксилит, маннит, миоинозит и т.п., их гидраты и аминокислоты, например, аланин, глицин и бетаин, и пептиды и белки, например, яичный белок.
[0061] Примеры вспомогательных веществ для использования в качестве фармацевтически приемлемых носителей и фармацевтически приемлемых инертных носи гелей и вышеупомянутых дополнительных ингредиентов включают связующие вещества, наполнители, разрыхлители, скользящие вещества, антимикробные агенты и покровные агенты, но не ограничиваются ими.
[0062] Предполагается, что кроме конкретных ингредиентов, упомянутых выше, составы согласно изобретению могут включать другие общепринятые агенты, применяемые в данной области техники в составах рассматриваемого типа; например, составы для перорального введения могут включать ароматизаторы.
[0063] Диапазон дозировок для взрослых людей обычно составляет от 0.005 мг до 10 г/сут перорально. Таблетки или другие лекарственные формы, представленные в виде дискретных единиц, традиционно могут содержать количество соединения формулы I, которое является эффективным в такой дозировке, или в дозировках, кратных содержащейся в; например, дозированные лекарственные формы, содержащие от 5 мг до 500 мг, обычно в диапазоне около 10-200 мг. Точное количество соединения, вводимое пациенту, будет обязан определить лечащий врач. Однако применяемая дозировка будет зависеть от ряда факторов, включая возраст и пол пациента, конкретное заболевание, которое лечат, и его тяжесть.
[0064] Однократная дозированная форма (например, однократная дозированная форма для перорального применения) может включать от, например, 1 до 30 мг, 1 до 40 мг, 1 до 100 мг., 1 до 300 мг, 1 до 500 мг, 2 до 500 мг, 3 до 100 мг, 5 до 20 мг, 5 до 100 мг (например, 1 мг, 2 мг., 3 мг, 4 мг, 5 мг, 6 мг, 7 мг., 8 мг, 9 мг, 10 мг., 11 мг, 12 мг, 13 мг, 14 мг, 15 мг., 16 мг, 17 мг, 18 мг, 19 мг, 20 мг, 25 мг, 30 мг., 35 мг, 40 мг, 45 мг, 50 мг, 55 мг, 60 мг, 65 мг, 70 мг, 75 мг., 80 мг, 85 мг, 90 мг., 95 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг., 450 мг, 500 мг) соединения согласно настоящему изобретению.
е
[0065] Дополнительную информацию о фармацевтических композициях и их составлении можно найти, например, в публикации Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20 издание, 2000.
[0066] Агенты можно вводяит, например, путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, подкожной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, местно, подъязычно, внутрисуставно (в суставы), внутрикожно, буккально, через глаза (включая внутриглазное введение), интраназально (в том числе с помощью катетера) или другими путями. Агенты можно вводить перорально, например, в виде таблетки или крахмальной капсулы, содержащей заданное количество активного ингредиента, геля, пилюли, пасты, сиропа, болюса, электуария, кашицы, капсулы, гранулы, раствора или суспензии в водной или неводной жидкости, жидкой эмульсии типа «масло в воде» или «вода в масле», в мицеллярном препарате (см., например, WO 97/11682), в липосомальном препарате (см., например, ЕР 736299, WO 99/59550 и WO 97/13500), в составах, описанных в WO 03/094886 или в какой-либо иной форме. Агенты также можно вводить чрескожно (т.е. с помощью трансдермальных систем резервуарного или матриксного типа, микроигл, тепловой порации, игл для подкожного введения, ионофореза, электропорации, ультразвукового или других форм сонофореза, безыгольного впрыскивания или комбинации любых предыдущих способов (Prausnitz et al. 2004, Nature Reviews Drug Discovery 3:115)). Агенты можно применять местно. Агенты можно наносить на стент. Агенты можно вводить с помощью методик высокоскоростной трансдермальной инъекции частиц, используя препарат частиц гидрогеля, описанный в U.S. 20020061336. Дополнительные препараты частиц описаны в WO 00/45792, WO 00/53160 и WO 02/19989. Пример трансдермального состава, содержащего пластырь и стимулятор всасывания диметилизосорбид, можно найти в WO 89/04179. В WO 96/11705 предложены составы, пригодные для чрескожного применения. Агенты можно вводить в форме суппозитория или других вагинальных или ректальных средств. Агенты можно вводить в трансмембранной леекарственной формее согласно описанию в WO 90/07923. Агенты можно вводить неинвазивным способом в дегидрированных частицах, описанных в патенте США 6485706. Агенты можно вводить в лекарственной форме, покрытой энтеросолюбильной оболочкой, согласно описанию в WO 02/49621. Агенты можно вводить интраназально, используя состав, описанный в патенте США 5179079. Составы, пригодные для парентеральной инъекции, описаны в WO 00/62759. Агенты можно вводить с помощью казеинового состава, описанного в патенте 20030206939 и WO 00/06108. Агенты можно вводить с помощью дисперсных составов, описанных в патенте 20020034536.
[0067] Агенты можно вводить по отдельности или в комбинации с другими подходящими компонентами через дыхательные пути, с использованием нескольких методик, включая интратрахеальное вливание (доставку раствора в легкие с помощью шприца), интратрахеальную липосомную доставку, инсуффляцию (введение порошкообразного состава шприцем или любым другим сходным устройством в легкие) и ингаляцию аэрозоля, но не ограничиваясь ими. Для интраназального применения также можно использовать аэрозоли (например, струйные или ультразвуковые распылители, ингаляторы отмеренных доз (MDI) и ингаляторы сухого порошка (DPI). Аэрозольные составы представляют собой стабильные дисперсные системы или суспензии твердого материала и жидких капель в газообразной среде и могут быть помещены в приемлемые сжатые пропелленты, например, в гидрофторалканы (ГФА, т.е. ГФА-134а и ГФА-227, или их смесь), дихлордифторметан (или другие хлорфторуглеродные пропелленты, например смесь Propellant 11, 12 и/или 14), пропан, азот и т.п. Составы для пульмонального введения могут включать усилители проницаемости, например, жирные кислоты и сахариды, хелатирующие агенты, ингибиторы ферментов (например, ингибиторы протеаз), адъюванты (например, гликохолат, сурфактин, span 85 и нафамостат), консерванты (например, хлорид бензалкония или хлорбутанол) и этанол (обычно до 5 вес.%, но, возможно, до 20 вес.%). Этанол обычно включают в аэрозольные составы, поскольку он может улучшать работу клапана-дозатора и в некоторых случаях также повышать стабильность дисперсной системы. Составы для пульмонального применения могут также включать поверхностно-активные вещества, включая соли желчных кислот, вещества, описанные в патенте США 6524557 и ссылках, приведенных в нем, но не ограничиваясь ими. Поверхностно-активные вещества, описанные в патенте. 6524557, например, соль жирных кислот С8-С16, соль желчной кислоты, фосфолипид или щелочной сахарид являются предпочтительными, поскольку некоторые из них, по сообщениям, улучшают всасывание соединения в составе препарата. В рамках настоящего изобретения также можно использовать сухие порошкообразные составы, включающие терапевтически эффективное количество активного соединения, смешанного с подходящим носителем, и приспособленные для использования в ингаляторе сухого порошка. Усилители всасывания, которые можно добавлять к сухим порошкообразным составам в соответствии с настоящим изобретением, включают вещества, описанные в патенте США 6632456. В WO 02/080884 описаны новые способы поверхностной модификации порошков. Аэрозольные составы могут включать U.S. 5,230,884, U.S. 5,292,499, WO 017/8694, WO 01/78696, U.S. 2003019437, U. S. 20030165436 и WO 96/40089 (включающий растительное масло). Составы с замедленным высвобождением для ингаляции описаны в U.S. 2001003 6481A1, 20030232019A1 и U.S. 20040018243А1, а также в WO 01/13891, WO 02/067902, WO 03/072080 и WO 03/079885. Составы для пульмонального применения, содержащие микрочастицы, описаны в WO 03/015750, U.S. 20030008013 и WO 00/00176. Составы для пульмонального применения, содержащие стабильный стеклообразный порошок, описаны в заявке США 20020141945 и патенте США 6309671. Другие аэрозольные составы описаны в ЕР 1338272А1 WO 90/09781, U. S. 5,348,730, U.S. 6,436,367, WO 91/04011 и U.S. 6,294,153, а в U.S. 6,290,987 описан состав на основе липосом, который можно вводить в виде аэрозоля или иным путем. Порошкообразные составы для ингаляции описаны заявке США 20030053960 и WO 01/60341. Агенты можно вводить интраназально, как описано в заявке США 20010038824.
[0068] Растворы лекарственных средств в буферном растворе и сходных средах часто используют для получения аэрозолей с помощью распылителя (небулайзера). Простейшие распылители работают на принципе Бернулли и для получения распыленных частиц используют поток воздуха или кислорода. Более сложные распылители для получения распыленных частиц используют ультразвук. Оба эти типа общеизвестны в данной области техники и описаны в стандартных справочниках по (фармацевтическому делу, например, в Sprawls' American Pharmacy и Remington's The Science and Practice of Pharmacy. Другие устройства для получения аэрозолей используют сжатые газы, обычно гидрофторуглероды и хлорфторуглероды, которые смешивают с медикаментом и необходимыми вспомогательными веществами в аэрозольной таре; эти устройства также описаны в стандартных справочниках, например Sprawls и Remington.
[0069] Кроме того, следует учесть, что в соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения соединения формулы I можно использовать в комбинации с другими активными агентами. Комбинированную терапию можно осуществлять путем введения двух или более агентов, каждый из которых изготавливают и вводят по отдельности, или введения двух или более агентов в одном составе. Комбинированная терапия также охватывает другие комбинации. Например, два агента могут быть представлены в одном составе и их можно вводить в комбинации с отдельным составом, содержащим третий агент. Хотя в ходе комбинированной терапии можно вводить два и более агента одновременно, этого не требуется. Например, введение первого агента (или комбинации агентов) может предшествовать введению второго агента (или комбинации агентов) на минуты, часы, сутки или недели. Так, два или более агентов можно вводить в течение нескольких минут друг за другом, или в течение 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18 или 24 часов друг за другом, или в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 суток друг за другом или в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель друг за другом. В некоторых случаях возможны и более длительные интервалы. Хотя во многих случаях желательно, чтобы два или более агентов, использующихся в комбинированной терапии, присутствовали в организме пациента в одно и то же время, это не является обязательным. Комбинированная терапия также может включать два или более введений одного или нескольких агентов, используемых в комбинации. Например, если агент Х и агент Y используют в комбинации, можно вводить их последовательно в любой комбинации один или несколько раз, например, в порядке X-Y-X, X-X-Y, Y-X-Y, Y-Y-X, X-X-Y-Y и т.д.
[0070] В Таблице 1 перечислены соединения, являющиеся примерами реализации настоящего изобретения.
[0071] Следует учитывать, что поскольку соединения согласно вариантам реализации настоящего изобретения являются модуляторами мускаринового рецептора M1, их можно использовать для лечения заболеваний млекопитающих, ассоциированных с нарушениями функционирования холинергических систем, или заболеваний, при которых наблюдается дисбаланс функционирования холинергических систем, или заболеваний, сопровождающихся нарушениями активности рецепторов ацетилхолина, из группы, состоящей из сенильной деменции по типу Альцгеймера; болезни Альцгеймера (БА); деменции с тельцами Леви; сочетания болезней Альцгеймера и Паркинсона; мультиинфарктной деменции (MED); лобно-височной деменции; сосудистой деменции; инсульта/ишемии, MID в сочетании с инсультом/ишемией/черепно-мозговой травмой; сочетания MED и БА; черепно-мозговой травмы; возрастных нарушений памяти; умеренных когнитивных нарушений (MCI), MCI, ведущих к БА; когнитивной дисфункции (включая забывчивость, острые состояния спутанности сознания, расстройства с дефицитом внимания, расстройства фокуса и концентрации); галлюцинаторно-параноидных состояний; эмоциональных расстройств и расстройств внимания; расстройств сна; послеоперационного делирия; неблагоприятных эффектов трициклических антидепрессантов; нежелательных эффектов некоторых лекарств, используемых при лечении шизофрении и болезни Паркинсона; ксеростомии, аномии, потери и/или спутанности памяти; психоза; шизофрении, шизофрении, сопутствующей БА, шизофрении с поздним началом, парафрении, шизофрениформных расстройств; тревожных расстройств; биполярных расстройств; мании; стабилизации настроения; когнитивных нарушений после удаления некоторых глиом; поздней дискинезии; окислительного стресса во время кислородной терапии; афазии; постэнцефалитного амнестического синдрома; деменции при СПИДе; нарушений памяти при аутоиммунных заболеваниях, включая волчанку, рассеянный склероз, синдром Шегрена, синдром хронической усталости и фибромиалгию; нарушений памяти при атипичной депрессии или шизофрении; болей, ревматизма, артрита и неизлечимых смертельных заболеваний; ксерофтальмии, вагинальной сухости, сухости кожи; дисфункций иммунитета; нейрокринных расстройств и дисрегуляции приема пищи, включая булимию и анорексию; ожирении; врожденном дефиците орнитинтранскарбамилазы; оливопонтоцеребреллярной атрофии; абстинентного алкогольного синдрома; наркомании, включая синдром отмены и заместительную терапию; хореи Гентингтона; прогрессирующего супрануклеарного паралича; болезни Ниманна-Пика; атаксии Фридрейха; синдрома Туретта; синдрома Дауна; глаукомы; пресбиопии; вегетативных нарушений, включая дисфункции моторики и работы желудочно-кишечного тракта, например, воспалительные заболевания кишечника, синдром раздраженного кишечника, диарею, запор, секрецию желудочной кислоты и язвы; неотложного недержания мочи, астмы, ХОБЛ. Соединения в соответствии с вариантами реализации настоящего изобретения также можно использовать при изготовлении медикаментов для такого лечения.
[0072] Аналогично, следует учитывать, что поскольку соединения согласно вариантам реализации настоящего изобретения являются модуляторами мускаринового рецептора M1, их можно использовать для предотвращения или лечения болезненных состояний центральной или периферической нервной системы, вызванных дисфункцией одного или нескольких нижеперечисленных органов: головного мозга, нервной системы, сердечно-сосудистой системы, иммунной системы, нейрокринной системы, пищеварительной системы или желез внутренней или внешней секреции, глаз, роговицы, легких, простаты или других органов, в которых холинергическая функция опосредована подтипами мускариновых рецепторов, причем указанная дисфункция включает: амилоид-опосредованные расстройства головного мозга; расстройства, опосредованные киназой гликогенсинтазы (ГСК3р); повреждения, дисфункции или заболевания, опосредованные гиперфосфорилированием тау-белков; повреждения, дисфункции или заболевания ЦНС и ПНС, опосредуемые гиперхолестеринемией и/или гиперлипидемией; аномалии сигнального пути Wnt; нарушение нейропластичности; гипергликемию; диабет; эндогенные заболевания, опосредованные факторами роста, или комбинацию дополнительных факторов риска; или болезненные состояния, в которые вовлечен аполипопротеин Е; или нарушения, с которыми связана холинергическая дисфункция, включая: сенильную деменцию по типу Альцгеймера, болезнь Альцгеймера (БА), задержку возникновения симптомов БА у пациента с риском развития БА, деменцию с тельцами Леви, церебральную амилоидную ангиопатию (САА), церебральный амилоидоз, лобно-височную деменцию, сосудистую деменцию, гиперлипидемию, гиперхолестеринемию, мультиинфарктпую деменцию (MID), ишемию при инсульте, MID в комбинации с инсультом/ишемией/черепномозговой травмой, сочетание MID и болезни Альцгеймера, черепномозговую травму человека, возрастные нарушения памяти, умеренные когнитивные нарушения (MCI), MCI, ведущие к БА, биполярное расстройство, манию, шизофрению, неаффективную шизофрению, парафрению, дисфункции иммунитета, нейрокринные расстройства и дисрегуляции приема пищи, включая булимию и анорексию, контроль массы тела, ожирение, воспаление. Соединения в соответствии с вариантами реализации настоящего изобретения также можно использовать при изготовлении медикаментов для такого лечения.
Способы синтеза
[0073] В целом, соединения формулы I можно получить с помощью способов, проиллюстрированных общими схемами реакций, например, как описано ниже, или модификаций этих способов, с использованием легкодоступных исходных материалов, реагентов и традиционных процедур синтеза. В этих реакциях также можно использовать варианты, известные сами по себе, но не упомянутые здесь.
[0074] Процессы получения соединений формулы I представлены ниже. Другие соединения формулы I можно получить аналогично соединениям, синтез которых приведен в качестве примера в настоящем описании. Приведенные ниже процедуры иллюстрируют эти способы. Кроме того, хотя способы синтеза, описанные в настоящем документе, могут привести к получению энантиомеров с конкретными стереохимическими характеристиками, настоящее изобретение охватывает соединение формулы I в форме любого стереоизомера, и получение соединений формулы I в форме иных стереоизомеров, чем описанные в настоящем документе, будет очевидно для специалиста в области химии на основании процедур, представленных в настоящем документе.
5
[0075] Соединения формулы I можно синтезировать из соответствующих спиросоединений, в которых вместо R присутствует Н, как показано на Схеме 1 ниже:
Схема 1
[0076] Реакцию сочетания аминов и 3-индолкарбоновой кислоты можно осуществить через активацию кислой молекулы либо дициклогексилкарбодиимидом (DCC), либо комбинацией DCC и 1-гидроксибензтриазола (НОВТ). Реакцию сочетания аминов и 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензойной кислоты можно осуществить через активацию кислой молекулы комбинацией DCC и 1-гидроксибензтриазола (НОВТ). Реакцию сочетания аминов и вальпроилхлорида или р-фторбензолсульфонилхлорида для получения соответствующего замещенного амина можно осуществить в присутствии основания (триэтиламина или гидрида натрия).
[0077] Аминные соединения-предшественники можно, в свою очередь, получить согласно более подробному описанию ниже. Так, например, 2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]декан можно получить реакцией 4-аминометил-1-метилпиперидин-4-ола с ацетальдегидом в безводном дихлорметане. 2,8-диметил-1-окса-4,8-диазаспиро[4.5]декан можно получить реакцией 1-амино-2-пропанола с 1-метил-4-пиперидоном при нагревании с обратным холодильником. 1',4-диметилспиро[3-окса-6-азабицикло[3.1.0]гексан-2,4'-пиперидин] можно получить, предварительно изготовив оксим 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]декан-3-она из 1-метил-4-пиперидона через 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]декан-3-он согласно процедуре Tsukamoto et. al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 842-852, с последующим восстановлением оксима Red-Al (бис(2-метоксиэтокси)алюмогидридом натрия) и обработкой щелочью, получая на выходе 1',4-диметилспиро[3-окса-6-азабицикло[3.1.0]гексан-2,4'-пиперидин]. 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]дец-3-иламин можно получить, предварительно изготовив оксим 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]декан-3-она из 1-метил-4-пиперидона через 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]декан-3-он согласно процедуре Tsukamoto et. al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 842-852, с последующим восстановлением оксима алюмогидридом лития/хлоридом алюминия. Затем из этих аминов можно получить соединения формулы I с помощью соответствующих реакций взаимодействия.
[0078] При получении соединений формулы I можно использовать способы, общеизвестные среди химиков-органиков, например, способы образования пятичленных колец, замещения в кольце, изменения степени насыщенности/ненасыщенности кольца, взаимопревращения солей и оснований и т.д.. При этих способах синтеза исходные материалы могут содержать хиральный центр, и при использовании рацемического исходного материала конечный продукт обычно представляет собой смесь R- и S-энантиомеров. В качестве альтернативы можно использовать хиральный изомер исходного реагента и, если протокол реакции не вызывает рацемизации этого исходного материала, получать хиральный продукт. Такие протоколы реакции могут включать инверсию хирального центра в процессе синтеза. В случаях, когда получают рацематы или смеси диастереоизомеров, разные стереоизомерные формы можно отделить друг от друга способами, известными в данной области. В качестве альтернативы можно получить конкретный изомер путем стереоспецифического или асимметричного синтеза. По этой причине следует учитывать, что хотя будут описаны типичные способы получения некоторых соединений в соответствии с настоящим изобретением, для получения данных соединений также можно использовать другие способы, известные специалистам.
Примеры
[0079] Чтобы облегчить получение новых соединений в соответствии с вариантами реализации настоящего изобретения, синтезировали несколько жестких бициклических спироструктур:
[0080] 2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]декан получали восстановлением 2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-2-ена цианборгидридом натрия в метаноле.
[0081] 2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]декан получали в результате реакции 4-аминометил-1-метилпиперидин-4-ола с ацетальдегидом в безводном дихлорметане.
[0082] 2,8-диметил-1-окса-4,8-диазаспиро[4.5]декан получали в результате реакции 1-амино-2-пропанола с 1-метил-4-пиперидоном при нагревании с обратным холодильником.
[0083] 1',4-диметилспиро[3-окса-6-азабицикло[3.1.0]гексан-2,4'-пиперидин] получали в несколько стадий. Вначале получали оксим 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]декан-3-она из 1-метил-4-пиперидона через 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]декан-3-он согласно процедуре Tsukamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 842-852. Восстановление оксима Red-Al с последующей обработкой щелочью дало целевое соединение.
4
3
[0084] 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]дец-3-иламин получали в несколько стадий. Вначале получали оксим 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]декан-3-она из 1-ме1ил-4-пиперидона через 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]декан-3-он согласно процедуре Tsukamoto et. al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 842-852. Восстановление оксима LiAlH/AlCl дало целевое соединение.
[0085] 2,8-диметил-1-тиа-8-азаспиро[4.5]дец-3-иламин получали в несколько стадий. Вначале получали оксим 2,8-диметил-1-тиа-8-азаспиро[4.5]декан-3-она из 1-метил-4-пиперидона через 2,8-диметил-1-тиа-8-азаспиро[4.5]декан-3-он. Восстановление оксима Red-Al с последующей обработкой щелочью дало целевое соединение.
13
[0086] Если не указано иное, реагенты и растворители использовали в том виде, как они были получены от коммерческих поставщиков. Спектры протонного ядерного магнитного резонанса (ЯМР) получали на спектрометрах Bruker Avance-300 и Bruker-500 при 300 или 500 МГц, соответственно. Спектры представлены в м.д. (5), а константы взаимодействия J представлены в герцах. В качестве внутреннего стандарт использовали тетраметилсилан (ТМС). При представлении данных ЯМР использовали следующие сокращения: s = синглет, d = дублет, t = триплет, q = квартет, m = мультиплет, br = широкий. Спектры ЯМР С htubcnhbhjdfkb на спектрометрах Bruker Avance-300 и Bruker-500. Масс-спектры получали с помощью масс-спектрометра UG 70 USEQ. ГХ-МС-спектры записывали на ГХ-МС/МС-спектрометре Varian Saturan 2000. Инфракрасные (ИК) спектры записывали на спектрофотометре Nicolet 380 FT-IR с приставкой ГНПВО Smart Multi-Bounce ZnSe HATR. Все растворители и реагенты были категории «для анализа». Анализ химической чистоты полученных нами новых химических соединений проводили на ВЭЖХ FINNIGAN Surveyor.
Пример 1: Синтез 2,8-диметил-1-тиа-3.8-диазаспиро[4.5]декана:
2
2
4
3
3
3
3
1
[0087] К перемешиваемому раствору 2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-2-ена (10.4 мл, 60 ммоль) в метаноле (150 мл) при комнатной температуре добавляли бромкрезоловый зеленый (5 мг), и раствор приобретал синюю окраску К перемешиваемому раствору добавляли 4 н. HCl/MeOH, пока цвет раствора не менялся на желтый. Затем однократно добавляли цианборгидрид натрия (3.9 г, 62 ммоль) и перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение 2 ч. В течение этого времени каждый раз, когда цвет реакции менялся на зеленый, добавляли дополнительное количество 4 н. HCl/MeOH, поддерживая желтый цвет раствора. В конце этого периода растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением сине-зеленого масла. К остатку добавляли дихлорметан (100 мл) и промывали смесь 2 н. NaOH (50 мл). Разделяли две фазы и экстрагировали водную фазу дихлорметаном (100 мл). Органические фазы смешивали, высушивали безводным сульфатом магния, фильтровали и выпаривали растворитель при пониженном давлении. Остаток очищали флэш-хроматографией (кремнезем, CHCl/MeOH/NHOH 90/10/1), получая целевое соединение (2.18 г) в виде почти бесцветного масла. ЯМР Н (CDCl, 500 МГц) δ 4.61 (q, J=6.18 Гц, 1Н, CHCH), 3.10 (d, J=12.6 Гц, 1H, CHHNH), 2.74 (d, J=12.6 Гц, 1Н, CHHNH), 2.27-2.19 (m, 1Н), 2.23 (s, 3H, NCH), 2.10 (m, 2H), 1.85-1.70 (m, 5H), 1.46 (d, J=6.18 Гц, 3H, CHCH) ppm.
Пример 2: Синтез 2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспироГ4.5]декана
1
13
3
3
2
3
2
3
3
2
2
3
2
2
3
[0088] К раствору 4-аминометил-1-метилпиперидин-4-ола (2.127 г, 14.77 ммоль) в дихлорметане (15 мл) добавляли безводный сульфат магния (2.9 г). Полученную смесь охлаждали до 0°С и добавляли свежедистиллированный ацетальдегид (835 мкл, 14.78 ммоль). Через 6 ч перемешивания при комнатной температуре смесь фильтровали и выпаривали растворитель при пониженном давлении с получением целевого соединения (2.16 г) в виде почти бесцветной жидкости. ЯМР Н (CDCl, 500 МГц) δ 4.60 (q, J=5.40 Гц, 1Н, CHCH), 3.01 (d, J=12 Гц, 1Н, CHHNH), 2.76 (d, J=12 Гц, 1Н, CHHNH), 2.55-2.31 (m, 4H, CHN), 2.28 (s, 3H, NCH), 1.77-1.58 (m, 4H, CHCO), 1.36 (d, J=5.40 Гц, 3H, СНСН) ppm.; ЯМР С (CDCl, 300 МГц) δ 87.57 (СН), 57.19 (CH), 53.14 (С), 52.96 (СН), 46.15 (СН), 37.28 (CH), 35.73 (СН), 20.32 (СН) ppm.
Пример 3: Синтез 2,8-диметил-1-окса-4,8-диазаспиро[4.5]декана
1
3
3
3
[0089] Смесь 1-амино-2-пропанола (9.2 мл, 1.2 ммоль) и 1-метил-4-пиперидона (11.5 мл, 1.0 ммоль) нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч и оставляли на ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь дистиллировали при пониженном давлении (~ 15 мм рт.ст.). Целевое соединение собирали при 82-95°С. ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 4.02 (m, 1H, OCH), 3.25 (дд, J=11.9, 6.3 Гц, 1Н, CHH), 2.68 (дд, J=11.9, 6.6 Гц, 1H, CHH), 2.4-2.6 (m, 4Н-пиперидин), 2.1 (s, 3H, NCH), 1.65-1.81 (m, 4H-пиперидин), 1.21 (d, J=6.1 Гц, 3H, CHCH) ppm.
Пример 4: Синтез 1',4-диметилспиро-(3-окса-6-азабицикло[3.1.0]гексап-2,4'-пиперидина):
3
4
2
3
3
3
10
18
2
1
[0090] К раствору оксима 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]декан-3-опа (1.5 г, 7.6 ммоль) в безводном ТГФ (39 мл) по каплям добавляли Red-Al (65% раствор в толуоле, 5.4 мл) и перемешивали реакционную смесь в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь охлаждали (вода со льдом) и разлагали поочередным добавлением воды (1.6 мл), 15% водного раствора NaOH (1.6 мл) и воды (4.6 мл). Добавляли тетрагидрофуран (ТГФ) и отфильтровывали твердые частицы на целите. Фильтрат ТГФ концентрировали при пониженном давлении. Маслянистый остаток растворяли в дихлорметане, высушивали и выпаривали. Флэш-хроматографией (кремнезем, CHCl/MeOH/NHOH 60/40/1) остатка получали целевой амин (вероятно, в виде двух изомеров). ЯМР H-(DO/CDCl, 300 МГц) δ 4.13 и 4.06 (два к, J=6.7 и J=6.2 Гц, 1H, два OCH), 2.54-2.33 (m, 6H), 2.27 (s, 3H, NCH), 1.77-1.65 (m, 4H), 1.24 и 1.20 (два д, J=6.7 и J=6.2 Гц, 3H, СН) ppm.; ГХ-МС (ХИ) 6.95 мин - 183 (М+1) и 6.64 мин - 183 (М-H) для CHNO.
Пример 5: Синтез 1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)пропан-1-она (AF710)
2
2
4
3
3
3
3
3
2
2
3
2
2
2
3
2
1
13
[0091] К перемешиваемому раствору 2,8-диметил-1-гиа-3,8-диазаспиро[4.5]декана (2.18 г, 11.7 ммоль) в дихлорметане (230 мл) при комнатной температуре добавляли дициклогексилкарбодиимид (DCC) (3.24 г, 15.7 ммоль) с последующим добавлением 3-индолпропионовой кислоты (2.87 г, 15.2 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Во время реакции выпадал белый твердый осадок. После фильтрации выпаривали растворитель и очищали сырой продукт флэш-хроматографией (кремнезем, CHCl/EtOH/NHOH 90/10/1), получая AF710 (2.5 г, 100% химической чистоты) в виде белого твердого вещества. ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 8.17 (шс, 1Н, NH-индол), 7.60 (d, J=7.81 Гц, 1Н, CHC аром), 7.35 (d, J=8.08 Гц, 1H, CHC аром.), 7.19 (каж. т, J=7.53 Гц, 1Н, CHCH аром), 7.12 (каж. т, J=7.45 Гц, 1Н, CHCH аром), 7.02 (d, J=1.86 Гц, 1Н, CHNH аром), 5.52, 5.09 (2к, J=6.15 и J=6.22 Гц, 1Н, CHCH), 4.62, 3.66 (2д, J=11.76 и J=11.5 Гц, 1Н, CHHMCO), 3.29, 3.08 (2д, J=11.48 и J=12.0 Гц, 1Н, CHHNCO), 3.18-3.11 (m, 2Н), 2.72-2.66 (m, 2H), 2.64-2.46 (m, 2H), 2.26, 2.25 (2 с, 3Н, NCH), 2.32-2.19, 2.12-2.02 (2 м, 2H), 1.87-1.80, 1.68-1.51 (2 м, 4Н), 1.48, 1.43 (2д, J=6.21 и J=6.19 Гц, 3Н, CH-СН) ppm.; ЯМР С (CDCl, 500 МГц) δ 170.58 (С), 136.39 (С), 127.25 (С), 122.19 (СН), 121.80 (СН), 119.52 (СН), 118.73 (СН), 115.17 (С), 111.31 (СН), 57.48, 57.19 (СН), 55.46 (С), 54.55, 54.12 (CH), 53.11, 52.86 (СН), 46.21, 46.15 (СН), 38.05, 37.32 (СН), 36.82, 36.31 (СН), 34.41 (СН), 25.44, 23.47 (СН), 21.04, 20.96 (СН) ppm.
Пример 6: Хиральное разделение AF710A и AF710
В [0092] Разделение AF710 на энантиомеры выполняли с помощью ВЭЖХ на полупрепаративной колонке. 200 мкл раствора AF170 в метаноле (50 мг./мл.) вводили в колонку и элюировали сквозь нее. После элюирования элюент выпаривали досуха.
ВЭЖХ: Модель Merck-Hitachi L-62000A
Детектор: Модель Merck-Hitachi L-4250
Колонка: Chiralcel OJ-H, 250×10 мм
Скорость потока: 4 мл/мин
Температура колонки: комнатная температура
Подвижная фаза: Гексан/этанол 85:15
Концентрация: 50 мг./мл.
Обнаружение при Уф: 255 нм
Первый элюирующийся энантиомер (AF170A): 99% ее; удельное вращение [α]=+60° (С=0.415, метанол)
Второй элюирующийся энантиомер (AF170B): 99% ее; удельное вращение [α]=-56° (С-0.3 03, метанол)
Пример 7: Синтез 3-(4-фторбензолсульфонил)-2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]-декана(АГ716)
2
2
4
3
2
3
2
3
3
2
3
2
3
2
3
2
2
3
2
2
3
1
13
[0093] 2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]декан (573 мг., 3.08 ммоль) растворяли в безводном дихлорметане (2 мл) в атмосфере аргона. Добавляли дистиллированный триэтиламин (644 мкл, 4.62 ммоль) и охлаждали полученный раствор до 0°С. По каплям добавляли раствор р-фторбензолсульфонилхлорида (600 мг., 3.08 ммоль) в безводном дихлорметане (2 мл) с помощью шприца. Реакционной колбе позволяли нагреться до комнатной температуры при перемешивании, после чего начинало осаждаться белое твердое вещество. Через 1 ч перемешивания добавляли дихлорметан (50 мл) и промывали полученный раствор водой (2×10 мл). Органическую фазу высушивали безводным сульфатом магния, фильтровали и выпаривали, получая неочищенную смесь в виде масла. Сырой продукт очищали флэш-хроматографией (кремнезем, CHCl/MeOH/NHOH 93/7/1), получая AF716 (496 мг., 98.8% химической чистоты) в виде грязно-белого порошка. ЯМР H (CDCl, 300 МГц) δ 7.89-7.85 (m, 2H, два CHCSO), 7.27-7.19 (m, 2H, CHCF), 5.02 (q, J=6.12 Гц, 1Н, CH-СН), 3.66 (d, J=11.37 Гц, 1Н, CHHNS), 3.48 (d, J=11.37 Гц, 1Н, CHHNS), 2.72-2.50 (m, 2H, CHNCH), 2.25 (s, 3H, NCH), 2.16-2.07 (m, 2H, CHNCH), 1.95-1.88 (m, 2H, CHCS), 1.55 (d, J=6.12 Гц, 3Н, CHCH), 1.48 (m, 2H, CHCS) ppm.; ЯМР С (CDCl, 300 МГц) δ 166.92 и 163.54 (С), 130.05 (СН), 129.93 (СН), 129.58 (С), 116.60 (СН), 116.30 (СН), 60.76 (С), 60.24 (СН), 54.05 (СН), 53.22 (СН), 46.03 (СН), 37.16 (СН), 37.05 (СН), 25.56 (СН) ppm.
Пример 8: Синтез 1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-2-пропилпентан-1-она (AF717)
2
2
4
3
3
2
3
2
2
2
3
2
2
3
3
2
3
2
2
3
2
2
2
2
3
2
2
3
1
13
[0094] 2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]декан (982 мг., 5.28 ммоль) растворяли в безводном дихлорметане (5 мл) в атмосфере аргона. Добавляли дистиллированный триэтиламин (1.10 мл, 7.92 ммоль) и охлаждали полученный раствор до 0°С. По каплям добавляли вальпроилхлорид (910 мг., 5.60 ммоль) с помощью шприца. Реакционной колбе позволяли нагреться до комнатной температуры при перемешивании, после чего начинало осаждаться белое твердое вещество. Через 4 ч перемешивания добавляли дихлорметан (100 мл) и промывали полученный раствор водой (10 мл). Разделяли две фазы и экстрагировали водную фазу дихлорметаном (2×50 мл). Объединенную органическую фазу высушивали сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали флэш-хроматографией (кремнезем, CHCl/EtOH/NHOH 150/10/1), получая AF717 (521 мг., 99.2% химической чистоты) в виде грязно-белого порошка. ЯМР H (CDCl, 300 МГц) δ 5.53, 5.26 (2к, J=6.12 и J=6.3 Гц, 1Н, CHCH), 4.67, 3.90 (2д, J=12.0 и J=11.35 Гц, 1Н, CHHNCO), 3.48, 3.09 (2д, J=11.35 и J=12.0 Гц, 1Н, CHHNCO), 2.78-2.59 (m, 2H, CHN), 2.53-2.47 (m, 1Н, СНСО), 2.30, 2.19 (2с, 3Н, NCH), 2.15-2.05 (m, 2H, CHN), 2.02-1.84 (m, 2H, CHCS), 1.74-1.61 (m, 4H, CHCHCO), 1.55, 1.50 (2д, J=6.3 и J=6.12 Гц, 3Н, CHCH), 1.44-1.36 (m, 2H, CHCS), 1.34-1.21 (m, 4H, CHCH), 0.93-0.87 (m, 6H, CHCH) ppm.; ЯМР С (CDCl, 300 МГц) δ 174.35, 174.04 (С), 59.13 (С), 57.35, 57.19 (СН), 54.52, 54.06 (СН), 53.13, 52.77 (CH), 46.09 (СН), 43.77, 42.55 (СН), 38.37, 37.58 (CH), 37.04, 36.20 (CH), 35.76, 35.35 (CH), 35.08, 34.77 (CH), 26.01, 23.01 (СН), 21.08, 20.98 (CH), 20.73, 20.56 (СН), 14.27, 14.22 (СН) ppm.
Пример 9: Синтез (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-метанона (AF723)
2
2
4
2
2
4
3
2
3
3
3
3
2
3
3
2
2
2
3
2
2
3
3
1
13
-1
[0095] К перемешиваемому раствору 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензойной кислоты (1.14 г, 4.55 ммоль) в дихлорметане (15 мл) при комнатной температуре в атмосфере аргона добавляли раствор дициклогексилкарбодиимида (985 мг., 4.77 ммоль) в безводном дистиллированном дихлорметане (10 мл). Начинала выпадать в осадок дициклогексилмочевина в виде белого твердого вещества. Добавляли 1-гидроксибензтриазол (645 мг, 4.77 ммоль) и перемешивали полученный раствор при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем добавляли 2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]декан (846 мг, 4.55 ммоль) в дихлорметане (5 мл) и оставляли полученную смесь при комнатной температуре в течение ночи. На следующий день смесь нагревали при 30°С (температура водяной бани) в течение 5 ч и затем оставляли при комнатной температуре еще на 4 сут. Отфильтровывали полученную суспензию и выпаривали растворитель при пониженном давлении. Остаток очищали флэш-хроматографией (кремнезем, CHCl/EtOH/NHOH 140/10/1), получая две фракции: AF723 (224 мг., 99.16% химической чистоты) и смесь AF723 с побочным продуктом (943 мг). Смесь AF723 с побочным продуктом очищали флэш-хроматографией в системе COMBI-flash, используя линейный градиент (кремнезем, CHCl/EtOH/NHOH от 220/10/1 до 140/10/1). После выпаривания и высушивания в вакууме получали AF273 (516 мг., 100% химической чистоты) в виде белого твердого вещества. ЯМР Н (CDCl, 500 МГц) δ 7.27 (s, 2Н, аром СН), 5.55 (m, 1Н, CH-S), 5.44 (s, 1Н, ОН), 4.10 (m, 1Н, CHH-N-CO), 3.40 (m, 1Н, CHH-N-CO), 2.60 (m, 2Н, СН-NCH), 2.28 (m, 1Н, CHH-NCH), 2.25 (s, 3H, NCH), 2.11 (m, 1Н, CHH-NCH), 1.95-1.66 (m, 4H, два CH-CS), 1.60 (d, J=6.15 Гц, 3H, CH-СН), 1.44 (s, 18H, трет-бутил) ppm.; ЯМР С (CDCl, 500 МГц) δ 170.78 (С=0), 155.52 (С), 135.93 (два С), 127.39 (С), 124.30 (два СН), 59.56 (С), 58.00 (СН), 56.40 (СН), 54.23 (СН), 52.82 (CH), 45.88 (СН), 37.68 (СН), 36.50 (СН), 34.28 (С), 30.21 (СН), 23.99 (СН) ppm.; ИК-ПФ (ГНПВО) 2943.89, 1619.92, 1388.67 см; ГХ-МС (ЭИ) 7.31 мин m/z: 419 (M+1).
Пример 10: Синтез 1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-пропап-1-она (AF724)
2
2
4
3
3
2
2
3
3
3
3
3
2
2
3
2
2
2
3
3
1
13
[0096] К перемешиваемому раствору 2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]декана (Пример 1) (0.86 г, 4.62 ммоль) в дихлорметане (90 мл) при комнатной температуре добавляли дициклогексилкарбодиимид (DCC) (1.28 г, 6.2 ммоль) с последующим добавлением пропионовой кислоты (0.41 г, 5.5 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Во время реакции выпадал белый твердый осадок. После фильтрации выпаривали растворитель и очищали сырой продукт флэш-хроматографией (кремнезем, CHCl/MeOH/NHOH 90/10/1) с получением целевого соединения (0.5 г) в виде бесцветного масла. ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 5.51, 5.19 (2к, J=6.15 и J=6.22 Гц, 1Н, CHCH), 4.63, 3.74 (2д, J=11.88 и J=11.57 Гц, 1Н, CHHNCO), 3.44, 3.08 (2д, J=11.55 и J=12.09 Гц, 1Н, CHHNCO), 2.8-2.6 (m, 2Н), 2.5-2.2 (m, 7H, CH, CHCH, NCH), 2.2-2.0 (m, 1H),.2.0-1.8 (m, 3H) 1.52, 1.48 (2д, J=6,30 и J=6.18 Гц, 3H, CH-СН), 1.19-1.12 (m, 3H, СН) ppm.; ЯМР C (CDCl, 300 МГц) δ 171.6 (С), 57.5, 57.2 (СН), 55.5 (С), 54.7, 54.3 (CH), 53.2, 53.0 (CH), 46.3 (СН), 38.4, 37.7 (СН), 37.0, 36.4 (CH), 28.8, 26.8 (CH), 25.6, 23.6 (СН), 9.6, 9.4 (СН) ppm.
Пример 11: Синтез 1-(2,8)-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-4-(1Н-индол-3-ил) бутан-1-она (AF725)
2
2
4
3
3
3
3
3
2
2
3
2
2
2
2
2
3
1
13
[0097] К перемешиваемому раствору 2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]декана (Пример 1) (0.97 г, 52 ммоль) в дихлорметане (100 мл) при комнатной температуре добавляли дициклогексилкарбодиимид (DCC) (1.44 г, 6.98 ммоль) с последующим добавлением 3-индолмасляной кислоты (1.26 г, 6.22 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Во время реакции выпадал белый твердый осадок. После фильтрации выпаривали растворитель и очищали сырой продукт флэш-хроматографией (кремнезем, CHCl/MeOH/NHOH 90/10/1) с получением целевого соединения (400 мг) в виде твердого вещества. ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 8.21 (шс, 1Н, NH-индол), 7.60 (d, J=7.75 Гц, 1Н, CHC аром), 7.35 (d, J=8.09 Гц, 1Н, CHC аром), 7.19 (каж. т, J=7.45 Гц, 1Н, CHCH аром), 7.10 (каж. т, J=7.43 Гц, 1Н, CHCH аром), 6.99 (шс, 1Н, CHNH аром), 5.53, 5.08 (2к, J=6.15 и J=6.17 Гц, 1Н, CHCH), 4.65, 3.58 (2д, J=11.96 и J=11.55 Гц, 1Н, CHHNCO), 3.32, 3.08 (2д, J=11.59 и J=12.09 Гц, 1Н, CHHNCO), 2.87-2.80 (m, 2Н), 2.8-2.5 (m, 2H), 2.5-2.18 (m, 3H), 2.27 (s, 3H, NCH), 2.18-2.0 (m, 3H), 2.0-1.58 (m, 4H), 1.48, 1.43 (2д, J=6.17 и J=6.24 Гц, 3H, CH-СН) ppm.; ЯМР С (CDCl 300 МГц) δ 170.99 (С), 136.54 (С), 127.65 (С), 122.13 (СН), 121.69 (СН), 119.38 (СН), 119.09 (СН), 115.77 (С), 111.33 (СН), 57.57, 57.17 (СН), 55.30 (С), 54.67, 54.23 (СН), 53.21, 52.92 (СН), 46.23 (СН), 38.42, 37.56 (СН), 37.04, 36.31 (СН), 34.93, 32.97 (СН), 25.68, 25.52 (СН), 24.72, 24.63 (СН), 23.56 (СН) ppm.
Пример 12: Синтез 1-(2,8)-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-4-(1H-индол-3-ил)этан-1-она (AF726)
2
2
4
3
3
2
3
3
3
2
2
3
2
2
2
2
3
1
13
[0098] К перемешиваемому раствору 2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]декана (Пример 1) (0.97 г, 52 ммоль) в дихлорметане (100 мл) при комнатной температуре добавляли дициклогексилкарбодиимид (DCC) (1.44 г, 6.98 ммоль) с последующим добавлением 3-индолуксусной кислоты (1.09 г, 6.22 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Во время реакции выпадал белый твердый осадок. После фильтрации выпаривали растворитель и очищали сырой продукт флэш-хроматографией (кремнезем, CHCl/МеОН/NHOH 90/10/1) с получением целевого соединения (600 мг) в виде твердого вещества. ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 8.71, 8.66 (2 шс, 1Н, NH-индол), 7.62, 7.59 (2д, J=7.90 и J=8.39 Гц, 1Н, СНС аром), 7.35 (m, 1Н, СНС аром), 7.22-7.08 (m, 1Н, 2СН аром), 7.03 (шс, 1Н, CHNH аром), 5.53, 5.33 (2к, J=6.12 и J=6.22 Гц, 1Н, CHCH), 4.69, 3.88 (2д, J=12.15 и J=11.20 Гц, 1Н, CHHNCO), 3.49 и 3.81 (2 с, 2H, С(O)СН), 3.36, 3.13 (2д, J=11.41 и J=12.19 Гц, 1Н, CHHNCO), 2.8-2.5 (m, 1Н), 2.5-2.05 (m, 2H), 2.25 и 2.19 (2с, 3Н, NCH), 2.05-1.85 (m, 2H), 1.85-1.6 (m, 1Н), 1.52, 1.48 (2д, J=6.15 и J=6.30 Гц, 3Н, CH-СН), 1.45-1.35(m, 1Н), 1.35-1.15 (m, 1Н) ppm.; ЯМР C (CDCl, 300 МГц) δ 169.6 (С), 136.43 (С), 127.19 (С), 122.98, 122.82 (СН), 122.43 (СН), 119.88, 119.81 (СН), 118.79, 118.67 (СН), 111.52 (СН), 108.55 (С), 58.06, 57.58 (СН), 55.66 (С), 54.66, 54.15 (СН), 53.20, 52.76 (СН), 46.27, 46.11 (СН), 38.45, 37.13 (СН). 36.95, 36.13 (СН), 33.96(СН), 31.37 (СН), 25.75, 23.33 (СН) ppm.
Пример 13: Синтез (Е)-1-(2,8)-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)пропенона (AF727)
2
2
4
3
3
3
1
[0099] К перемешиваемому раствору 2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]декана (Пример 1) (0.83 г, 44 ммоль) в дихлорметане (85 мл) при комнатной температуре добавляли дициклогексилкарбодиимид (DCC) (1.23 г, 5.9 ммоль) с последующим добавлением транс-3-индолакриловой кислоты (1.0 г, 5.3 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Во время реакции выпадал белый твердый осадок. После фильтрации выпаривали растворитель и очищали сырой продукт методом флэш-хроматографии (кремнезем, CHCl/MeOH/NHOH 90/10/1) с получением целевого соединения (600 мг) в виде твердого вещества. ЯМР Н (1,1,2,2-дихлорэтан-d2, 300 МГц, 100°С) δ 8.56 (шс, 1Н, NH-индол), 7.94 (d, J=15.3 Гц, 1Н, НС-С), 7.83 (m, 1Н, СНС аром), 7.46 (шс, 1Н, СНС аром), 7.42 (m, 1Н, СН), 7.26 (m, 2H, 2СН аром), 6.71 (d, J=15.3 Гц, 1Н, С=СН), 5.65 (q, J=6.12 Гц, 1Н, CHCH), 4.38 (d, J=11.75 Гц, 1Н, CHHNCO), 3.50 (d, J=11.84 Гц, 1Н, CHHNCO), 3.1-2.8 (m, 2H), 2.8-2.6 (m, 1Н), 2.6-2.3 (m, 2H), 2.46 (s, 3Н, NCH), 2.2-1.9 (m, 2H), 1.9-1.8 (m, 1Н), 1.64 (d, J=6,21 Гц, 3H, CH-СН) ppm.; МС (ЭИ+) m/z 355 (M+), 322, 185, 170.
Пример 14: Синтез 1-(2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)-пропан-1-она (AF711)
2
2
4
3
3
3
3
3
2
2
2
3
2
2
2
3
2
1
13
[00100] К перемешиваемому раствору 2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]декана (991.2 мг., 5.8 ммоль) в дихлорметане (110 мл) при комнатной температуре добавляли дициклогексилкарбодиимид (DCC) (1.61 г, 7.8 ммоль) и 3-индолпропионовую кислоту (1.43 г, 7.6 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Во время реакции выпадало в осадок белое твердое вещество. После фильтрации выпаривали растворитель и очищали сырой продукт методом флэш-хроматографии (кремнезем, CHCl/EtOH/NHOH 90/10/1). После выпаривания и высушивания в вакууме получали AF711 (716 мг., 99.6% химической чистоты) в виде белого твердого вещества. ЯМР Н (CDCl, 500 Мгц) δ 8.50, 8.46 (2 шс, 1Н, NH индол), 7.61 (d, J=7.55 Гц, 1Н, CHC аром), 7.33 (d, J=7.85 Гц, 1H, CHCNH аром), 7.18 (каж. т, J=7.24, 7.85 Гц, 1Н, CHCHC аром), 7.11 (каж. т, J=7.55, 7.24 Гц, 1Н, CHCHC аром), 7.02 (d. J=1.86 Гц, 1Н, CHNH индол), 5.32, 5.15 (2к, J=5.09 и J=5.16 Гц, 1Н, CHCH), 3.99, 3.22 (2д, J=11 и J=9.5 Гц, 1Н, CHHNCO), 3.19 (m, 1Н), 3.13-3.08 (m, 1Н), 3.03, 2.97 (2д, J=9.5 и J=11 Гц, 1Н, CHHNCO), 2.72-2.60 (m, 2H), 2.51-2.20 (m, 4H), 2.25, 2.23 (2 с, 3Н, NCH), 1.78-1.64 (m, 2H), 1.43, 1.31 (2д, J=5.15 и J=5.15 Гц, 3Н, CHCH). 1.39, 1.28 (2 м, 1Н), 1.14 (m, 1Н) ppm.; ЯМР C (CDCl, 500 МГц) δ 170.50, 169.85 (С), 136.30, 136.25 (С), 127.07, 126.99 (С), 121.93 (СН), 121.85 (СН), 119.24 (СН), 118.55, 118.52 (СН), 114.73 (С), 111.20, 111.12 (СН), 84.69, 84.06 (СН), 77.98 (С), 54.18 (СН), 52.18 (CH), 51.86 (CH), 45.89, 45.83 (СН), 36.38 (СН), 34.98 (СН), 32.99, 32.41 (СН), 22.70, 20.50 (СН), 20.96, 20.73 (СН) ppm.
Пример 15: Хиральное разделение AF711 А и AF711 В
[00101] Разделение AF711 на энантиомеры выполняли с помощью ВЭЖХ па цолупрепаративной колонке. 200 мкл раствора AF711 в метаноле (50 мг./мл.) вводили в колонку и элюировали. После элюирования элюент выпаривали досуха.
ВЭЖХ: Модель Merck-Hitachi L-62000A
Детектор: Модель Merck-Hitachi L-4250
Колонка: Chiralcel OJ-H, 250×10 мм
Скорость потока: 4 мл/мин
Температура колонки: комнатная температура
Подвижная фаза: Гексан/этанол/метанол 95:1:4
Концентрация: 50 мг./мл.
Обнаружение при УФ: 300 нм
Первый элюирующийся энантиомер (AF711A): 99% ее (предположительно (-)-энантиомер)
Второй элюирующийся энантиомер (AF711B): 99% ее, удельное вращение [α]=+73.5° (С=0.365, метанол)
Пример 16: Синтез 1-(2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-2-пропилпентан-1 -она (AF712)
2
2
4
3
3
3
3
3
2
3
2
2
2
3
2
2
2
2
3
2
2
3
3
1
13
[00102] 2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]декан (1.52 г, 8.95 ммоль) растворяли в безводном дихлорметане (5 мл) в атмосфере аргона. Добавляли дистиллированный триэтиламин (1.87 мл, 13.42 ммоль) и охлаждали полученный раствор до 0°С. По каплям добавляли вальпроилхлорид (1.46 г, 8.95 ммоль) с помощью шприца. Реакционной колбе позволяли нагреться до комнатной температуры при перемешивании, после чего начинало осаждаться белое твердое вещество. Через 4 ч перемешивания добавляли дихлорметан (100 мл) и промывали полученный раствор водой (10 мл). Разделяли две фазы и экстрагировали водную фазу дихлорметаном (2×50 мл). Объединенную органическую фазу высушивали безводным сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали методом флэш-хроматографии (кремнезем, CHCl/EtOH/NHOH 130/10/1), получая AF712 (389 мг., 98.7% химической чистоты) в виде желтого порошка. ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 5.43 (q, J=5.2 Гц, 1Н, CHCH), 4.13, 3.63 (2д, J=11.35 и J=9.6 Гц, 1Н. CHHNCO), 3.22, 3.00 (2д, J=9.6 и J=11.35 Гц, 1Н, CHHNCO), 2.56-2.38 (m, 5Н), 2.30, 2.29 (2 с, 3Н, NCH), 1.84-1.53 (3м, 6Н), 1.44, 1.43 (2д, J=5.2 Гц, 3Н, CHCH), 1.4-1.19 (m, 6H), 0.90 (каж. т, J=7.11 Гц, 6H, CHCH) ppm.; ЯМР C (CDCl, 300 МГц) δ 173.92, 173.68 (С), 84,75, 84.20 (СН), 78.32, 78.09 (С), 54.24 (СН), 52.34 (CH), 52.02 (CH), 46.03 (СН), 44.34, 43.64 (СН), 35.63 (СН), 35.05 (CH), 34.92 (СН), 32.83 (CH), 23.52, 20.91 (СН), 20.59 (СН), 20.43 (СН), 14.30 (СН), 14.16 (СН) ppm.
Пример 17: Синтез 3-(4-фторбензолсульфонил)-2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]-декана (AF715)
2
2
4
3
2
3
3
3
3
2
2
2
3
2
2
3
1
13
[00103] 2,8-диметил-1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]декан (1.42 г, 8.38 ммоль) растворяли в безводном дихлорметане (5 мл) в атмосфере аргона. Добавляли дистиллированный триэтиламин (1.75 мл, 12.57 ммоль) и охлаждали полученный раствор до 0°С. Добавляли р-фторбензолсульфонилхлорид (1.63 г, 8.37 ммоль) и позволяли реакционной колбе нагреться до комнатной температуры при перемешивании; при этом начинало осаждаться белое твердое вещество. Через 30 мин перемешивания добавляли дихлорметан (90 мл) и промывали полученный раствор водой (2×10 мл). Органическую фазу высушивали безводным сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали. Остаток очищали методом флэш-хроматографии (кремнезем, CHCl/EtOH/NHOH 140/10/1), получая AF715 (1.23 г, 98.7% химической чистоты) в виде грязно-белого порошка. ЯМР H (CDCl, 500 МГц) δ 7.89-7.87 (m, 2H, CHCSO), 7.27-7.22 (m, 2H, CHCF), 5.05 (q, J=5.23, 1H, CHCH), 3.33 (d, J=10.26 Гц, 1H, CHHNS), 3.19 (d, J=10.26 Гц, 1H, CHHNS), 2.52-2.42 (m, 1H), 2.34-2.25 (m, 2H), 2.23 (s, 3H, NCH), 2.18-2.09 (m, 1H), 1.77-1.72 (m, 2H), 1.52 (d, J=5.23 Гц, 3Н, CHCH), 1.25-1.18 (m, 1H), 1.10-1.03 (m, 1H) ppm.; ЯМР C (CDCl, 500 МГц) δ 166.45 и 164.42 (С), 134.0 (С), 130.37 (СН), 130.29 (СН), 116.68 (СН), 116.50 (СН), 86.95 (СН), 66.30 (С), 55.48 (СН), 52.57 (CH), 52.11 (CH), 46.04 (СН), 35.64 (CH), 32.84 (CH), 22.95 (СН) ppm.
Пример 18: Синтез 1-(2,8-диметил-1-окса-4,8-диазаспиро[4.5]дец-4-ил)-3-(1Н-индол-3-ил) пропан-1-она (AF706)
2
2
4
3
2
3
3
3
2
2
2
3
2
2
2
2
3
1
13
[00104] Раствор 2,8-диметил-1-окса-4,8-диазаспиро[4.5]декана (1.09 г, 6.41 ммоль), 3-индолпропионовой кислоты (1.57 г, 8.3 ммоль), дициклогексилкарбодиимида (DCC, 1.78 г, 8.65 ммоль) и диметиламинопиридина (DMAP, 0.78 г, 6.41 ммоль) в дихлорметане (100 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 4 суток. Осадок удаляли фильтрованием и выпаривали растворитель. Флэш-хроматография (кремнезем, CHCl/i-PrOH/NHOH 85/15/1) позволяла получить целевое соединение, которое растирали в порошок в эфире. Полученное белое твердое вещество (AF706), 1.1 г (99.4% химической чистоты) фильтровали и высушивали. ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 8.15 (ш NH), 7.63 (d, J=7.76 Гц, 1H, ArH), 7.38 (d,J=7.98 Гц, 1H, ArH), 7.23 (дт, J=1.12, 7.56 Гц, 1Н, ArH), 7.13 (дт, J=1.07, 7.44 Гц, 1Н, ArH), 7.08 (d, J=2.15 Гц, 1Н, NCHC), 4.05 (m, 1Н, OCH), 3.53 (дд, J=9.0, 5.5 Гц, 1Н, NCNH), 3.13 (m, 3Н), 2.96 (т, J=9.2 Гц, 1Н), 2.80-2.70 (m, 3Н), 2.61-2.70 (m, 2H), 2.23-2.34 (m, 2H, СН-пиперидин), 2.31 (s, 3Н, NCH), 1.37 (m, 1Н, СН-пиперидин), 1.33 (m, 1Н, СН-пиперидин), 1.25 (d, J=6.0 Гц, 3Н, СН) ppm.; ЯМР С (CDCl, 300 МГц) δ 169.66 (С), 136.52 (С), 122.49 (СН), 121.90 (СН), 119.24 (СН), 118.78 (СН), 115.18 (С), 111.41 (СН), 94.16 (С), 69.92 (СН), 53.25 (CH), 52.84 (СН), 52.70 (СН), 45.99 (СН), 37.52 (СН), 33.66 (СН), 30.90 (CH), 20.73 (СН), 18.26 (СН) ppm.
Пример 19: Синтез 1-(2,8-диметил-1-окса-4,8-диазаспиро[4.5]дец-4-ил)-2-пропилпентан-1-она (AF713)
2
2
4
3
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
1
13
-1
[00105] К охлажденному (0°С, водяная баня со льдом) раствору гидрида натрия (60%, 0.6 г, 15 ммоль) в ТГФ (60 мл) добавляли 2,8-димегил-1-окса-4,8-диазаспиро[4.5]декан (2.44 г, 14.3 ммоль) в атмосфере аргона. Охлаждающую баню удаляли и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавляли вальпроилхлорид (2.36 г, 14.5 ммоль) и оставляли реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере аргона на 2.5 ч при перемешивании. Реакционную смесь фильтровали через фильтрующую прокладку из кремнезема. Кремнезем промывали ТГФ (3×150 мл), фильтраты объединяли и выпаривали. Флэш-хроматография (кремнезем, CHCl/EtOH/NHOH 100/10/1) позволяла получить целевое соединение в виде желто-коричневого твердого вещества. Это твердое вещество растворяли в дихлорметане (150 мл) и в перемешиваемый раствор добавляли уголь. Фильтрование и выпаривание позволяли получить грязно-белое вещество AF713 (1.4 г, 97.2% химической чистоты). ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 4.1-4.2 (m, 1Н, OCH), 3.7-3.8 (m, 1Н), 3.0-3.2 (m, 2H), 2.7-2.8 (m, 3Н), 2.3-2.5 (m, 3Н), 2.3 (s, 3Н, NCH), 1.55-1.67 (m, 2H), 1.4-1.52 (m, 1Н), 1.26 (d, J=6 Гц, 3Н, СН), 1.2-1.4 (m, 6Н), 0.89 (шт, J=7.03 Гц, 6Н, 2СН) ppm.; ЯМР С (CDCl, 300 МГц) δ 173.14 (С), 94.22 (С), 69.65 (СН), 53.41 (СН), 52.46 (СН), 52.30 (CH), 45.35 (CH), 45.06 (СН), 35.35 (CH), 35.21 (CH), 32.93 (CH), 30.27 (CH), 20.79 (СН), 20.73 (СН), 18.14 (СН), 14.33 (СН), 14.27 (СН) ppm.; ИК-ПФ (ГНПВО) 1627 см.
Пример 20: Синтез 4-(4-фторбензолсульфонил)-2,8-диметил-1-окса-4,8-диазаспиро[4.5]-декана (AF714)
2
b
4
3
2
3
2
3
3
2
2
2
3
2
2
2
1
13
[00106] В охлажденный (0°С, водяная баня со льдом) раствор гидрида натрия (60%, 0.6 г, 15 ммоль) в ТГФ (60 мл) добавляли 2,8-диметил-1-окса-4,8-диазаспиро[4.5]декан (2.49 г, 14.6 ммоль) в атмосфере аргона. Охлаждающую баню удаляли и перемешивали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 40 мин. Добавляли 4-фторбензолсульфонилхлорид (2.84 г, 14.6 ммоль) и оставляли реакционную смесь при комнатной температуре в атмосфере аргона на ночь при перемешивании. Реакционную смесь фильтровали через фильтрующую прокладку из кремнезема, которую промывали тетрагидрофураном (ТГФ, 2×150 мл). Фильтраты объединяли и выпаривали. Флэш-хроматография (кремнезем, CHCl/EtOH/NHOH 100/10/1) позволяла получить целевое соединение в виде желто-коричневого твердого вещества. Это твердое вещество перекристаллизовывали из горячего i-PrOH. AF714 получали в виде белого твердого вещества (1.3 г, 99.8% химической чистоты). ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 7.88 (m, 2H, 2H-Ar), 7.20 (m, 2H, 2H-Ar), 4.21 (m, 1H, OCH), 3.69 (дд. J=5.4, 8.4 Гц, 1H, NCHH), 2.91 (т, J=8.8 Гц, 1H, NCHH), 2.72 (m, 2H, CH-пиперидин), 2.63 (m, 1H, СН-пиперидин), 2.43 (m, 1H, CH-пиперидип), 2.28 (s, 3H, NCH), 2.25 (m, 2H, СН-пиперидин), 1.72 (m, 1H, СН-пиперидин), 1.43 (m, 1H, СН-пиперидин), 1.28 (d, J=6 Гц, 3Н, СН); ЯМР С (CDCl, 300 МГц) δ 166.58 и 163.20 (С), 137.02 (С), 129.95 (С), 129.83 (С), 116.34 (С), 116.04 (С), 96.29 (С), 70.42 (СН), 53.49 (СН), 52.96 (СН), 52.79 (СН), 45.85 (СН), 35.88 (CH), 34.89 (CH), 18.08 (CH) ppm.
Пример 21: Синтез 1',4-диметил-6-(3-индолпропионил)-спиро-(3-окса-6-азабицикло[3.1.0]-гексан-2,4'-пиперидина) (AF718C)
2
2
4
3
2
2
2
3
2
2
3
3
2
2
3
2
2
2
2
3
21
27
3
2
1
13
-1
[00107] Раствор 3-индолпропионовой кислоты (1.63 г, 8.6 ммоль) и дициклогексилкарбодиимида (DCC, 1.86 г, 9.06 ммоль) в дихлорметане (50 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Добавляли 1-гидроксибензтриазол (НОВТ, 1.22 г, 9.06 ммоль) и продолжали перемешивание в течение следующих 30 мин. Добавляли 1',4-диметилспиро-3-окса-6-азабицикло[3.1.0]гексан-2,4'-пиперидин (1.57 г, 8.6 ммоль) и перемешивали реакционную смесь в течение ночи при комнатной температуре. Добавляли дихлорметан (100 мл) и промывали реакционную смесь водой (2×20 мл). Органические фракции объединяли, высушивали и концентрировали при пониженном давлении. Флэш-хроматография (кремнезем, CHCl/EtOH/NHOH 100/20/1) остатка позволяла получить AF718C (200 мг., 99.3% химической чистоты) в виде белого твердого вещества. ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 8.08 (ш NH), 59 (d, J=7.72 Гц, 1Н, ArH), 7.36 (d, J=7.91 Гц, 1Н, ArH), 7.21 (дт, J=1.19, 7.45 Гц, 1Н, ArH), 7.13 (дт, J=1.13, 7.40 Гц, 1Н, ArH), 6.98 (d, J=2.24 Гц, 1Н, NCHC), 4.15 (q, J=6.77 Гц, 1Н, ОСН), 3.12 (т, J 7.25 Гц, 2Н, СН), 2.92 (d, J=4.7 Гц, 1Н, NCH), 2.85 (d, J=4.7 Гц, 1Н, NCH), 2.85-2.74 (m, 2H, CH), 2.4-2.2 (m, 4H, 2СН-пиперидин), 2.25 (s, 3H, NCH), 1.76-1.67 (m, 2Н, CH-пиперидин), 1.66-1.56 (m, 2Н, СН-пиперидин), 1.12 (d, J=6.8 Гц, 3H, СН) ppm.; ЯМР С (CDCl, 300 МГц) δ 184.40 (С), 136.26 (С), 122.16 (СН), 121.67 (СН), 119.53 (СН), 118.65 (СН), 114.93 (С), 111.23 (СН), 78.69 (С), 74.50 (СН), 53.08 (СН), 52.08 (СН) 47.14 (СН), 46.25 (СН), 45.95 (СН), 37.90 (СН), 36.02 (CH), 33.39 (CH), 20.93 (CH), 20.77 (СН) ppm.; ИК-ПФ (ГНПВО) 1676 см; МС (ХИ) 354 (М+1) для CHNO.
Пример 22: Синтез 1',4-диметил-6-[3-(4-фторбензолсульфонил)]-спиро-(3-окса-6-азабицикло[3.1.0]гексан-2,4'-пиперидина) (AF721)
1
13
3
3
3
3
2
2
3
2
2
3
[00108] Раствор 4-фторбензолсульфонилхлорида (1.04 г, 5.3 ммоль) в безводном дихлорметане (5 мл) добавляли к раствору амина [см. синтез AF718C часть (а), 0.97 г, 5.3 ммоль] и безводного триэтиламина (1.1 мл, 8 ммоль) в безводном дихлорметан (12 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Добавляли дихлорметан (50 мл) и промывали реакционную смесь водой (10 мл). Органическую фазу высушивали и концентрировали при пониженном давлении. Флэш-хроматография остатка позволяла получить AF721 (масло, 0.8 г). ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 8.01-7.95 (m, 2Н, 2СН), 7.28-7.16 (m, 2Н, 2CH), 4.24 (q, J=6.83 Гц, 1Н, ОСН), 3.54-3.48 (два д, J=5.38 и J=5.38 Гц, 2Н, 2CH), 2.53-2.3 (m, 4H), 2.23 (s, 3H, NCH), 2.16-1.73 (m, 4H), 1.25 d, J=6.84 Гц, 3H, СН) ppm.; ЯМР С (CDCl, 300 МГц) δ 167,5 и 164.1 (CF), 134.2 (С), 130.7 (СН), 130.6 (СН), 116.6 (СН), 116.3 (СН), 79.6 (С), 75.0 (СН), 52.8 (СН), 52.2 (CH), 50.9 (СН), 49.9 (СН), 46.0 (СН), 36.3 (СН), 33.1 (CH), 20.9 (СН) ppm.
Пример 23: Синтез 1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1-метилиндол-3-ил)пропан-1-она (AF732)
2
2
4
3
3
3
2
3
3
3
2
2
3
2
2
2
2
3
3
1
13
[00109] К раствору дициклогексилкарбодиимида (DCC) (1.3 г, 6.3 ммоль) в дихлорметане (50 мл) при комнатной температуре добавляли 3-(1-метилипдол-3-ил)пропановую кислоту (1.18 г, 5.8 ммоль) и раствор 2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]декана (1.2 г, 6.4 ммоль) в дихлорметане (50 мл). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч. Во время реакции выпадал белый твердый осадок. После фильтрации выпаривали растворитель и очищали сырой продукт методом флэш-хроматографии (кремнезем, CHCl/EtOH/NHOH 100/10/1) с получением целевого соединения (0.7 г) в виде бесцветного масла. ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 7.60 (d, J=7.82 Гц, 1Н, СНС аром), 7.35-7.2 (m, 2Н, 2СНС аром), 7.23 (дт, J=1.06, 7.45 Гц, 1Н, CHCH аром), 6.90 (s, 1Н, CHNH аром), 5.54, 5.07 (2к, J=6.16 и J=6.25 Гц, 1Н, CHCH), 4.63, 3.68 (2д, J=12.0 и J=11.5 Гц, 1Н, CHHNCO), 3.75, 3.74 (2с, 3Н, NCH), 3.32 (d, J=11.5 Гц, 0.6Н, CHHNCO), 3.17-3.05 (m, 2.4H), 2.8-2.4 (м), 2.68 [т, J=7.6 Гц, С(O)СН], 2.28, 2.26 (2 с, 3Н, NCH), 2.3-2.2 (м), 2.1-2.0 (м), 2.0-1.8 (м), 1.7-1.4 (м), 1.48. 1,43 (2д, J=6.18 и J=6.26 Гц, 3Н, CH-СН) ppm.; ЯМР С (CDCl, 300 МГц) δ 170.6 (С), 137.1 (С), 126.8 (С), 126.7 (СН), 121.8 (СН), 119.0 (СН), 118.9 (СН), 113.7 (С), 109.4 (СН), 59.0 (С), 57.5, 57.2 (СН), 54.6, 54.2 (СН), 53.2, 52.9 (СН), 46.3, 46.2 (СН), 38.1, 37.4 (СН), 36.9, 36.6 (СН), 36.4, 34.7 (СН), 32.7 (СН), 25.5, 23.5 (СН), 21.0, 20.9 (СН) ppm.
Пример 24: Синтез 1-(2,8)-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)пропионамида (AF730)
[00110] Синтез 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]дец-3-иламина: Раствор оксима 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]декан-3-она (1.24 г, 6.3 ммоль, приготовленный согласно процедуре Tsukamoto et. al. Chem. Pharma. Bull. 1995, 43, 842-852) в безводном ТГФ (30 мл) по каплям добавляли к суспензии алюмогидрида лития (1.13 г, 30 ммоль) и хлорида алюминия (0.2 г, 1.5 ммоль) в безводном ТГФ (50 мл). Реакционную смесь перемешивали в 10 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь охлаждали (лед) и гасили реакцию добавлением воды (3 мл), 15% водного раствора NaOH (3 мл) и воды (7 мл). Твердое вещество фильтровали через целит и концентрировали фильтрат ТГФ in vacuo. Остаток в виде масла растворяли в дихлорметане (200 мл) и высушивали раствор сульфатом натрия. Растворитель удаляли, а неочищенный амин использовали на следующем этапе.
2
2
4
2
2
4
3
3
3
2
2
3
2
2
3
3
3
3
3
2
3
2
2
2
3
1
13
[00111] К перемешиваемому раствору дициклогексилкарбодиимида (DCC) (1.49 г, 7 ммоль) в дихлорметане (100 мл) при комнатной температуре добавляли раствор 2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]дец-3-иламина (все вещество, полученное на предыдущем этапе) в дихлорметане (20 мл) с последующим добавлением 3-индолпропионовой кислоты (1.3 г, 6.9 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Во время реакции выпадал белый твердый осадок. После фильтрования растворитель выпаривали и очищали сырой продукт методом флэш-хроматографии (кремнезем, градиент от CHCl/MeOH/NHOH 140/10/1 до CHCl/MeOH/NHOH 100/10/1), получая белое твердое вещество AF730 в виде смеси двух геометрических изомеров (изомер I/изомер II 1:2). ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 8.07 (шс, 1Н, NH-индол), 7.61 (d, J=7.81 Гц, 1Н, CHC аром), 7.36 (d, J=8.0 Гц, 1H, CHC аром, изомер II), 7.35 (d, J=7.9 Гц, 1Н, CHC аром, изомер I), 7.20 (m, 1Н, CHCH аром), 7.15 (m, 1Н, CHCH аром), 7.02 (m, 1Н, CHNH аром), 5.36 (d, J=8.85 Гц, 1Н, NH изомер I), 5.18 (d, J=8.0 Гц, 1Н, NH изомер II), 4.35 (m, 1Н, CH изомер 1), 4.04 (m, 1Н, CH изомер II), 3.93 (m, 1Н, CHCH изомер I), 3.48 (m, 1Н, CHCH изомер II), 3.13 (т, J=7.0 Гц, 2Н, COCHCH), 2.58 (m, 2Н, СОСН), 2.4 (m, 2Н, СН), 2.29 (m, 2H, СН), 2.25 (s, 3Н, NCH изомер II), 2.23 (s, 3Н, NCH изомер I), 2.10 (дд, J=12.9, 8.2 Гц, 1Н, CHHCH изомер II), 1.96 (дд, J=13.6, 7.1 Гц, 1Н, CHHCH изомер I), 1.7-1.4 (2 м), 1.4-1.2 (2 м), 1.15 (d, J=6.1 Гц, 3Н, CH-СН изомер II), 0.97 (d, J=6.3 Гц, 3Н, CH-СН изомер I) ppm.; ЯМР С (CDCl, 300 МГц) δ 172.9, 172.5 (С), 136.6, 136.5 (С), 127.2, 127.1 (С), 122.2, 122.1 (CH), 119.6, 119.5 (CH), 118.8 (CH), 114.6, 114.5 (С), 111.6, 111.5 (CH), 78.2, 74.5 (CH), 55.5 (CH), 53.0 (С), 52.9, 52.7 (СН), 46.6, 46.2 (СН), 38,7, 38.5 (СН), 37.7, 37.6 (СН), 21.8, 21.7 (СН), 19.7, 15.0 (СН) ppm.
2
2
4
2
2
4
3
3
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
3
3
1
1
[00112] Геометрические изомеры (200 мг) разделяли методом флэш-хроматографии в системе Combi-Flash Companion (Isco, Inc) (HP 40-золотая колонка с кремнеземом, линейный градиент от CHCl/MeOH/NHOH 120/10/1 до CHCl/МеОН/NHOH 90/10/1). AF730 I (менее полярный изомер): ЯМР H (CDCl, 300 МГц) δ 8.09 (шс, 1Н, NH-индол), 7.61 (d, J=7.80 Гц, 1Н, CHC аром), 7.35 (d, J=8.0 Гц, 1Н, CHC аром), 7.19 (дт, J=1.1, 7.4 Гц, 1Н, CHCH аром), 7.12 (дт, J=1.01, 7.4 Гц, 1Н, CHCH аром), 7.03 (d, J=2.2 Гц, 1Н, CHNH аром), 5.36 (d, J=8.6 Гц, 1Н, NH), 4.35 (m, 1Н, CH), 3.93 (дк, J=6.3, 6.3 Гц, 1Н, CHCH), 3.13 (т, J=7.1 Гц, 2Н, COCHCH), 2.58 (m, 2Н, СОСН), 2.5-2.1 (m, 4H, 2СН), 2.24 (s, 3Н, NCH), 1.96 (дд, J=13.6, 7.1 Гц, 1Н, CHHCH), 1.7-1.4 (2 м, 2Н), 1.4-1.3 (m, 2Н),1.31 (дд, J=13.6, 2.7 Гц, 1Н, CHHCH), 0.97 (d, J=6.3 Гц, 3Н, CH-СН) ppm. AF730 II (более полярный изомер): ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 8.1 (шс, 1Н, NH-индол), 7.60 (d, J=7.82 Гц, 1Н, CHC аром), 7.36 (d, J=8.0 Гц, 1Н, CHC аром), 7.20 (дт, J=1.1, 7.5 Гц, 1Н, CHCH аром), 7.12 (дт, J=1.1, 7.4 Гц, 1Н, CHCH аром), 7.01 (d, J=2.2 Гц, 1Н, CHHH аром), 5.19 (d, J=8.30 Гц, 1Н, NH), 4.03 (m, 1Н, СН), 3.46 (m, 1Н, CHCH), 3.13 (т, J=7.1 Гц, 2Н, COCHCH), 2.57 (т, J=7.1 Гц, 2Н, СОСН), 2.5-2.3 (m, 2Н, СН), 2.3-2.1 (m, 2Н, СН), 2.24 (s, 3Н, NCH), 2.10 (дд, J=12.9, 8.2 Гц, 1Н, CHHCH), 1.7-1.4 (2 м, 4Н), 1.26 (дд, J=12.7. 7.6 Гц, 1Н, CHHCH), 1.15 (d, J=6.1 Гц, 3Н, CH-СН) ppm.
Пример 25: N-(2,8-диметил-1-тиа-8-азаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)пропионамид (AF731)
4
4
3
3
3
2
1
[00113] Синтез 2,8-диметил-1-тиа-8-азаспиро[4.5]декан-3-она. В трехгорлую круглодонную колбу, оснащенную термометром, делительной воронкой и осушительным патроном с хлоридом кальция, помещали 60% гидрид натрия в минеральном масле (8.74 г, 0.218 моль) и безводный эфир (300 мл). К этой перемешиваемой охлажденной суспензии при 5-10°С добавляли раствор этилтиоацетата (28.4 г, 95%, 0.200 моль) в безводном эфире с последующим медленным добавлением метанола (100 мл) при этой же температуре. Затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение часа. Растворители удаляли при пониженном давлении, а к осадку добавляли безводный диметилсульфоксид (170 мл). Полученный раствор охлаждали до 15°С и добавляли этил(1-метил-4-пиперидинилиден)ацетат (40 г, 0.22 моль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух суток, затем переносили в ледяную воду (600 мл). Затем реакционную смесь подкисляли концентрированной соляной кислотой и защелачивали (рН 8) бикарбонатом натрия. Затем реакционную смесь экстрагировали дихлорметаном (4×450 мл) и промывали объединенные экстракты концентрированным солевым раствором (2×400 мл), высушивали (MgSO) и удаляли растворители, получая масло (59.40 г), содержавшее некоторое количество диметилсульфоксида. К части вышеупомянутого продукта (27.6 г) добавляли соляную кислоту (1.3 н., 200 мл) и нагревали полученный раствор с обратным холодильником в течение 11 часов, после чего экстрагировали гексаном (3×75 мл), который выбрасывали. Водную фазу защелачивали (рН 13) 35% водным раствором гидроксида натрия, затем экстрагировали дихлорметаном (3×120 мл), объединенные экстракты промывали концентрированным солевым раствором (2×80 мл), высушивали (MgSO) и выпаривали растворитель, получая масло (9.2 г), которое очищали хроматографией на колонке с силикагелем. Элюирование метанол/дихлорметан/гидроксидом аммония 4/96/1 позволяло получить кетон (7.0 г, выход в два этапа 37.9%). ЯМР H (CDCl) δ 1.40 (d, J=7.0 Гц, СНС), 1.75-2.15 (m, 4H), 2.20-2.80 (m, 4H), 2.32 (s, CHN), 2.57 и 2.65 (2д, J=17.2 Гц, CHC=О), 3.59 (q, J=7.0 Гц, CHS).
[00114] (б) Синтез оксима 2,8-диметил-1-тиа-8-азаспиро[4.5]декан-3-она.
пл
3
3
3
2
3
3
2
2
2
3
2
2
3
3
3
2
3
3
2
2
3
2
2
2
1
13
+
+
1
13
Раствор 2,8-диметил-1-тиа-8-азаспиро[4.5]декан-3-она (0.669 г, 3.36 ммоль) в метаноле (9 мл) добавляли к раствору хлоргидрата гидроксиламина (0.270 г, 3.88 ммоль) и ацетата натрия (0.320 г, 3.90 ммоль) в воде (1.5 мл). Смесь нагревали при 80°С в течение 2 часов. Растворители удаляли при пониженном давлении, а остаток хроматографировали на колонке с силикагелем. Элюирование метанол/дихлорметан/гидроксидом аммония [5/94/1] позволяло получить вначале оксим анти-конфигурации (0.267 г), а затем смесь двух изомеров (сын- и анти-) этого оксима (0.316 г) (81% выход). Анти-изомер кристаллизовали из этилацетата, t 148-149°С. ЯМР Н (CDCl, анти-изомер) δ 1.46 (d, J=6.6. СНС), 1.73-1.96 (m, 3Н), 2.05 (m, 1H), 2.15-2.40 (m, 1H), 2.32 (s, CHN), 2.47 (m, 1H), 2.70 (m, 2H), 2.78 и 2.86 (2д, J=17.4 Гц, CHC-N), 3.99 (q, J=6.6 Гц, CHS), 10.1 (шс, -NOH). ЯМР C (CDCl анти-изомер) δ 19.7 (СН), 38.2 (СН), 38.9 (СН), 42.5 (СН), 42.8 (шс, СН), 45.9 (СН), 52.3 (С), 53.1 (СН), 53.4 (СН), 163.7 (С). ГХ-МС m/z 215 (M+1), 197 (М-ОН), 96. ЯМР H (CDCl, син-изомер, рассчитано путем вычитания ЯМР-спектра анти-изомера из ЯМР-спектра смеси син- и анти-изомеров) δ 1.48 (d, J=6.8, СНС), 1.60-1.73 (m, 1H), 1.74-1.95 (m, 2H), 1.95-2.25 (m, 2H), 2.31 (s, СНН), 2.44 (m, 1H), 2.54 и 2.77 (2д, J=14.5 Гц, СНС=N), 2.60-2,90 (m, 2H), 4.37 (q, J=6.7 Гц, CHS), 10.2 (шс, NOH). ЯМР С (CDCl, син-изомер) δ 21.0 (СН), 37.9 (СН), 38.2 (CH), 38.4 (СН), 46.0 (СН), 46.6 (шс, (CH),), 51.7 (С), 52.6 (CH), 53.8 (CH), 163.8 (С).
1
1
#
#
+
+
3
3
3
2
2
2
2
3
2
2
[00115] (в) Синтез 2,8-диметил-1-тиа-8-азаспиро[4.5]дец-3-иламина: К перемешиваемой суспензии алюмогидрида лития (1.00 г, 26.35 ммоль) и хлорида алюминия (0.110 г, 0.825 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (45 мл) в атмосфере азота при комнатной температуре медленно добавляли раствор оксима 2,8-диметил-1-тиа-8-азаспиро[4.5]декан-3-она (1.24 г, 5.79 ммоль). Перемешивание при комнатной температуре продолжали в течение трех суток. Затем реакционную смесь охлаждали (водяная баня со льдом) и медленно добавляли воду (3.0 мл), затем водный раствор гидроксида натрия (15%, 4.0 мл) и затем воду (4.0 мл). Осадок фильтровали и промывали небольшим количеством дихлорметана. Объединенные фильтрат и смыв выпаривали, получая масло, которое очищали хроматографией на колонке с силикагелем при элюировании 10% метанолом-89% дихлорметаном-1% гидроксидом аммония, получая амин в виде масла (0.430 г, 37% выход). Данные ЯМР Н показали, что продукт состоял из двух пар диастереоизомеров, причем одна пара присутствовала в большем количестве, чем другая. В нижеприведенных данных * обозначает изомеры, присутствовавшие в большем количестве, # обозначает изомеры, присутствовавшие в меньшем количестве. ЯМР H (CDCl) δ 1.25 (d, J=6.9 Гц, CHC), 1.31* (d, J=6.4 Гц, СНС), 1.60-2.08 (m, 4H), 1.72 (m, один из CHCNH), 2.08-2.45 (m, 2H), 2.18 (дд, один из CHCNH), 2.29 (s, CHN), 2.67 (m, 2H), 3.00* (m, CHS), 3.10 (m, CHNH), 3.37 (m, CHS); ГХ-МС m/z 201 (M+1), 184 (M-NH).
1
1
#
#
#
#
#
3
3
3
3
3
[00116] (г) Синтез N-(2,8-диметил-1-тиа-8-азаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)-пропионамида (AF731) К перемешиваемому раствору 2,8-диметил-1-тиа-8-азаспиро[4.5]дец-3-иламина (0.375 г, 1.872 ммоль) в дихлорметане (20 мл) при комнатной температуре добавляли раствор 1,3-дициклогексилкарбодиимида (0.520 г, 2.52 ммоль) в дихлорметане (8 мл), а затем раствор 3-индолпропионовой кислоты (0.458 г, 2.42 ммоль) в дихлорметане (15 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение трех суток. Образовавшееся твердое вещество фильтровали и промывали небольшим количеством дихлорметана, объединенные фильтрат и смыв выпаривали, получая пену, которую очищали колоночной хроматографией на силикагеле. Элюирование смесью растворителей 5-7% метанола в дихлорметане, содержавшей 1% гидроксид аммония, позволяло вначале получить продукт в виде смеси изомеров (325 мг., 46.7% выход), а затем непрореагировавший амин (90 мг). Данные ЯМР Н показали, что продукт состоял из двух пар диастереоизомеров, причем одна пара присутствовала в большем количестве, чем другая. В нижеприведенных данных * обозначает изомеры, присутствовавшие в большем количестве, # обозначает изомеры, присутствовавшие в меньшем количестве. ЯМР Н (CDCl) δ 0.99* (d, J=6.9, СНС), 1.19* (d, J=6.6, СНС), 1.53 и 2.05 (2m, CHCHNH), 1.60-2.18 (m, 4H), 2.18-2.85 (m, 2H), 2.28 (s, CH), 2.30* (s, CHN), 2.59 (m, 2H), 2.95* (m, CHS), 3.13 (т, 2H), 3.50 (m, CHS), 4.24* (m, CHN), 4.51 (m, CHN), 5.28* (d, J=8.7 Гц, NHCO), 5.55 (d, J=8.4 Гц, NHCO), 7.03* (d, J=2.3 Гц, 1Н Ar), 7.04 (d, J=2.4 Гц, 1H Ar), 7.11 (т, 1H Ar), 7.20 (m, 1H Ar), 7.38 (d, J=8.0 Гц, 1H Ar), 7.60 (d, J=7.8 Гц, 1H Ar), 8.22 (шс, NH индол).
Пример 26: (3E)-2,8-диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]декан-3-он-O-[3-(1H-индол-3-ил)пропаноил]оксим (AF733)
2
2
4
2
2
4
3
3
2
2
2
3
3
3
2
2
3
2
2
2
2
2
3
1
13
[00117] К раствору 3-индолпропионовой кислоты (0.22 г, 1.2 ммоль) в безводном ТГФ (10 мл) в атмосфере аргона добавляли карбонилдиимидазол (CDI) (0.19 г, 1.2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 0.5 ч при комнатной температуре, затем добавляли оксим диметил-1-окса-8-азаспиро[4.5]декан-3-она (0.23 г, 1.2 ммоль, полученный согласно процедуре Tsukamoto et. al. Chem. Pharma. Bull. 1995, 43, 842-852). Реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре, а затем в течение 8 ч при 45°С. Реакционную смесь охлаждали до комнатной теспературы, добавляли дихлорметан (80 мл) и промывали смесь водой (10 мл). Разделяли две фазы и экстрагировали водную фазу дихлорметаном (30 мл). Органические фазы смешивали, высушивали безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Остаток очищали методом флэш-хроматографии в системе Combi-Flash Companion (Isco, Inc) (HP 12-золотая колонка с кремнеземом, CHCl/МеОН/NHOH 90/10/1), а затем дополнительной методом флэш-хроматографии в системе Combi-Flash Companion (Isco, Inc) (HP 12-золотая колонка с кремнеземом, CHCl/MeOH/NHOH 120/10/1). Остаток растирали в эфире, получая AF733 (104 мг) в виде белого твердого вещества. ЯМР Н (CDCl, 300 МГц) δ 8.17 (шс, 1Н, NH-индол), 7.60 (d, J=7.73 Гц, 1Н, CHC аром), 7.35 (d, J=7.98 Гц, 1Н, CHC аром), 7.19 (каж. т, J=7.76 Гц, 1Н, CHCH аром), 7.12 (каж. т, J=7.43 Гц, 1Н, CHCH аром), 7.04 (d, J=2.11 Гц, 1Н, СЯМН аром), 5.56 (q, J=6.3 Гц, 1Н, CHCH), 3.18 (т, J=7.37 Гц, 2Н, СН), 2.83 (т, J=7.41 Гц, 2Н, СОСН), 2.40 (АВк, J=18.6 Гц, 2Н, СН), 2.5-2.3(m, 4H), 2.28 (s, 3Н, NCH), 1.74 (2 м, 3Н), 1.5 (т, 1Н), 1.43 (d, J=6.36 Гц, 3Н, CH-СН) ppm.; ЯМР С (CDCl, 300 МГц) δ 173.4 (С), 171.0 (С), 136.5 (С), 127.3 (С), 122.2 (СН), 122.1 (СН), 119.5 (СН), 118.8 (СН), 114.5 (С), 111.4 (СН), 78.7 (С), 72.5 (СН), 52.5 (CH), 52.2 (СН), 46.1 (СН), 40.0 (СН), 37.4 (CH), 34.4 (CH), 33.7 (СН), 20.9 (СН), 19.5 (СН) ppm.
Пример 27: Синтез (D)-2-амино-1-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-3-(1Н-индол-3-ил)-пропан-1-она (AF728)
2
2
4
[00118] 1) К перемешиваемому раствору 2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]декана (0.97 г, 5.2 ммоль) в дихлорметане (100 мл) при комнатной температуре добавляли дициклогексилкарбодиимид (DCC) (1.44 г, 6.98 ммоль) с последующим добавлением N-Boc-D-триптофана (1.88 г, 6.2 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч. Во время реакции выпадал белый твердый осадок. После фильтрации выпаривали растворитель и очищали сырой продукт методом флэш-хроматографии (кремнезем, CHCl/MeOH/NHOH 90/10/1), получая трет-бутиловый эфир (R)-3-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-2-(1Н-индол-3-илметил)-3-оксопропионовой кислоты (1.1 г) в виде твердого вещества.
2
2
4
3
3
2
3
3
3
1
[00119] 2) К перемешиваемому раствору трет-бутилового эфира (R)-3-(2,8-диметил-1-тиа-3,8-диазаспиро[4.5]дец-3-ил)-2-(1Н-индол-3-илметил)-3-оксопропионовой кислоты (0.9 г, 2.1 ммоль) в дихлорметане (20 мл) при комнатной температуре добавляли трифторуксусную кислоту (ТФУК, 1.2 мл, 16.2 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре до полного удаления защитной группы Boc. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (20 мл), обрабатывали смолой Amberlyst А-21 (20 г; описана в Srinivasan et al., Mol. Diversity 9 (2005) 4, 291-293) в течение 1 часа, фильтровали и промывали дихлорметаном (20 мл). Объединенные фильтраты выпаривали и очищали сырой продукт методом флэш-хроматографии (кремнезем, CHCl/MeOH/NHOH 90/10/1) с получением целевого соединения (0.1 г) в виде твердого вещества. ЯМР H (CDCl, 300 МГц) δ 8.14 (шс, 1Н, NH-индол), 7.62 (d, J=7.65 Гц, 1Н, СНС аром), 7.38 и 7.37 (2д, J=7.96 Гц и J=7.88 Гц, 1Н, СНС аром), 7.22 (каж. т, J=7.0 Гц, 1Н, CHCH аром), 7.10 (каж. дт, J=1.0, 7.4 Гц, 1Н, CHCH аром), 7.09 и 7.06 (двад, J=2.28 Гц и J=2.25 Гц 1Н, CZ/NH аром), 5.48, 4.98 (2к, J=6.2 и J=6.3 Гц, 1Н, CHCH), 4.42, 3.69 (2д, J=12.0 и J=11.6 Гц, 1Н, CHHNCO), 3.98 и 3.92 (2 т, J=7.3 и J=7.05 Гц, 1Н, CHCH), 3.12 (m, 2H, CHCH), 2.80 (d, J=11.4 Гц, 0.72Н, CHHNCO), 2.6 (m, 2H), 2.3-2.2 (m, 1Н), 2.26 и 2.25 (2с, 3Н, NCH), 2.15-2.0 (m, 1Н), 1.52, 1.38 (2д, J=6.3 и J=6.2 Гц, 3Н, CH-СН) ppm.
Биологические тесты
[00120] Биологическую активность соединений формулы I оценивали, используя различные варианты тестов.
2+
2+
2+
2+
2+
2+
[00121] Анализ мобилизации внутриклеточных ионов кальция (Са) в культурах клеток, стабильно трансфицированных GPCR (например, подтипов mAChR) мог обеспечть информацию и об активности (агонистической или антагонистической) тестируемого соединения, и о его селективности по отношению к рецепторам конкретного подтипа. Уровни свободного внутриклеточного Сав живых клетках определяли путем мониторинга флуоресценции флуоресцентного индикатора Са, Fluo-4 NW (Molecular Probes, № по каталогу 36206). Этот способ подходит для получения характеристики фармакологических свойств и функционирования GPCR. Измерения Са выполняли на устройстве считывания планшетов NOVOstar с инжектором и пипеточным дозатором (BMG Labtechnologies, Оффенбург, Германия). За сутки до эксперимента собирали клетки, стабильно трансфицированные одним из подтипов мускариновых рецепторов М1-М5, и промывали их культуральной средой (среда Игла, модифицированная по Дульбекко, Gibco, Великобритания) с добавкой 10% эмбриональной бычьей сыворотки, раствора заменимых аминокислот в минимальной среде (GIBCO, Великобритания), глутамина, пенициллина, стрептомицина, амфотерицина и G418 (Biological Industries, Израиль) и равномерно высевали на 96-луночные планшеты с черными стенками и оптически прозрачным дном (Nunc, Рочестер, штат Нью-Йорк, США) из расчета плотности 40000 клеток/лунку. В день эксперимента клетки давали сплошное покрытие. Ростовую среду удаляли и осторожно добавляли 80 мкл загрузочного буфера, содержащего 2.5 мМ пробенецида (4-дипропилсульфамоил)бензойной кислоты); загрузочный буфер готовили согласно руководству из комплекта для анализа кальция FLUO-4 NW. Планшеты с клетками инкубировали при 37°С в течение 30 минут, затем при комнатной температуре в течение следующих 30 минут. Для оценки действия тестируемых соединений на внутриклеточный Са(Са-i) в некоторых экспериментах для устранения внеклеточного источника кальция использовали ЭГТА [этиленгликольтетрауксусную кислоту]. ЭГТА (10 мкл 50 мМ раствора в HBSS (буферном солевом растворе Хэнка) автоматически добавляли в каждую лунку с помощью инжекторной системы NOVOstar с последующим встряхиванием в течение 0.5 минуты (ширина 1 мм, 600 об/мин) и затем инкубировали в течение следующих 10 минут. Затем с помощью автоматизированного пипеточного дозатора NOVOstar в отдельные лунки последовательно добавляли HBSS отдельно или тестируемые соединения, растворенные в HBSS (10 мкл). Интенсивность флуоресценции измеряли с интервалом 0.5 секунды в течение 25 секунд в каждой лунке при длине волны возбуждения 485 нм (полоса пропускания 10 нм) и эмиссии при 520 нм (полоса пропускания 10 нм) при отсечке в области 515 нм.
[00122] Для оценки селективности по отношению к подтипу mAChR, в частности к мускариновым рецепторам M1 по сравнению с мускариновыми рецепторами М3 и М5, выполняли калибровку теста с помощью лигандов, обладающих смешанной активностью, например, M1-агонистической и М3-антагонистической или М1-агонистической и М5-антагонистической, соответственно. Это позволяло устранить эффекты, обусловленные резервами различных рецепторов при анализе на основе клеток.
[00123] Согласно наблюдениям, соединения AF710, AF710B, AF711, AF711A, AF718C, AF721, AF730, AF730 I, AF730 II и AF733 являлись частичными агонистами мускаринового рецептора M1, и показатели их сравнительной агонистической активности при концентрации 100 мкМ по сравнению с карбохолином (полный мускариновый агонист, 100%) образовывали ряд AF733 (90%) > AF7301 (745) > AF710B (66%) > AF711A (45%) > AF718C (43%) > AF710 (40%) > AF730 (40%) > AF730 II (36%) > AF711 (19%) > AF721 (13%) (см. Таблицу). Агонистические эффекты этих агонистов блокировались селективным антагонистом M1 пирензепином. Обнаружено, что AF710B был высокоселективен по отношению к мускариновому рецептору M1 и не показывал обнаружимой агонистической активности по отношению к подтипам мускариновым рецепторам М2-М5, соответственно.
[00124] Соединения AF706, AF712-AF716, AF726 и AF727 (100 мкМ) демонстрировали антагонистическую активность по отношению к M1 mAChR, что доказывалось сдвигом концентрационной кривой карбохолина вправо (Таблица).
[00125] Ортостерический или аллостерический характер агонистической мускариновой активности по отношению к M1 можно было оценить в присутствии или в отсутствие аллостерического модулятора M1 бруцина (Sur et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 2003, 100:13674-13679). Предварительное инкубирование с бруцином (100 мкМ) культур клеток, стабильно трансфицированных мускариновым рецептором M1, или клеток яичника китайского хомячка, стабильно трансфицированных и мускариновым рецептором M1, и белком-предшественником амилоида человека 695, вызывало мощный усиливающий эффект повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция, индуцированного ортостерическими агонистами, например, карбохолином, что демонстрировалось сдвигом их кривых «концентрация-ответ» влево, соответственно. Бруцин не оказывал такого действия ни на AF710, ни на AF710B, и вызывал слабое ингибирование эффектов AF710B; при совместном рассмотрении эти результаты показывают, что AF710 или AF710B не взаимодействуют с ортостерическим сайтом мускаринового рецептора M1 и, таким образом, являются аллостерическими агонистами. См. Фиг.1 А и Б.
[00126] В тесте с использованием 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий-бромида (МТТ) измеряют изменения, происходящие внутри клеток, включая активацию митохондрий, которая является характерным признаком процесса, в конечном итоге ведущего к гибели клетки (Fagarasan et al., Mol. Psychiat. 1996,1:398-403). Этот анализ является специфичным ранним индикатором механизма гибели клеток, опосредованного β-амилоидом (Shearman et al., PNAS USA 1994, 91:1470-74). Этот анализ использовали для оценки соединений формул I и II. Клетки феохромоцитомы крыс (PC 12) высевали на 96-луночные планшеты из расчета плотности 10000 клеток/лунку и поддерживали на среде Игла, модифицированной по Дульбекко (Gibco, Cat. 21969) с добавкой 5% эмбриональной бычьей сыворотки (Biological Industries, Cat. 04-121-1 А), 10% термоинактивированной лошадиной сыворотки (Gibco Cat. 26050), 200 мМ 1-глутамина (Biological Industries, Кат. №03-020-1С), 10000 ед./мл. пенициллина (Biological Industries, Cat 03-031-1C) и 50 мг./мл. амфотерицина В (Biological Industries, Кат. №01-029-1C). На следующий день среду заменяли бессывороточной средой и обрабатывали клетки 5 мкМ β-амилоидом 25-35 (Н-1192.0001, Bachem) в присутствии или в отсутствие тестируемого соединения. Соединения тестировали в течение 6 часов, соответственно, при диапазоне конечных концентраций от 0.1 нМ до 100 мкМ. В качестве эталонного антиоксиданта использовали 3-индолпропионовую кислоту β-IPA, Cat. 220027, Sigma Aldrich). 3-IPA, AF710 и AF711 защищали клетки от токсического действия, вызванного Аβ25-35 (пептид, включающий последовательность аминокислот (АК) 25-35 из бета-амилоида, который включает 40-42 аминокислоты) в диапазоне концентраций (10 мкМ-1 нМ). Эти результаты показали, что AF710 и AF711 обладают антиоксидантными свойствами.
6
[00127] Исследования секреции α-АРР с последующим инкубированием с тестируемыми соединениями выполняли в соответствии с описанием в Raring, et al. J. Newochem., 1998, 71:2094-103. Клетки яичника китайского хомячка (CFIO), дважды трансфицированные человеческим АРР695 и мускариновым рецептором M1 человека, или клетки феохромоцитомы крысы (PC 12), стабильно траисфицированные мускариновым рецептором M1 крыса, высевали на 6-луночные планшеты из расчета плотности 2×10 клеток/лунку. Спустя сутки клетки дважды промывали бессывороточной средой и обрабатывали тестируемым соединением в диапазоне концентраций от 0.1 нМ до 100 мкМ. На каждом планшете одну лунку использовали в качестве контроля (без обработки) и одну лунку - в качестве положительного эталона, где клетки обрабатывали 1 или 100 мкМ карбохолина (CCh) (максимальный ответ). Через 1 час кондиционированную среду собирали в охлажденные пробирки Eppendorf, содержавшие смесь ингибиторов протеаз (0.1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF); 5 мкг/мл лейпептина; 5 мкг/мл пепстатина и 5 ед/мл апротинина) для определения выхода αАРР. Белковые компоненты каждого образца концентрировали с помощью пробирок Centricon (Amicon, Беверли, штат Массачусетс, США). После определения белка (Bio-Rad protein assay) равные количества белка (30 мкг белка/дорожку) загрузили в 4-12% NuPage Novex Bis-Tris Gels (Invitrogen, штаг Калифорния, США) и подвергли электрофорезу. После завершения электрофореза провели блоттинг гелей на ПВДФ-мембранах Immuno-Blot (0.2 мкм, Bio-Rad Lab, штаг Калифорния, США) с помощью устройства полусухого переноса Hoefer semi-dry transfer units (Semi-Phor, Hoefer Scientific Inst. Сан-Франциско, штаг Калифорния, США). Затем мембраны блокировали сухим молоком 5% жирности, растворенным в фосфатно-солевом буфере Дульбекко без кальция и магния (DPBS; Gibco, Cat 14200) с 0.1% Tween-20 (Sigma, Cat P5927). Дорожки с АРР из клеток СНО, дважды трансфицированных человеческим АРР695 и M1 mAChR, обработали антителами против белка бета-амилоида (1:1000, моноклональные антитела 6Е10, МАВ1560, Chemicon) и кроличьими антителами к IgG мыши, меченными пероксидазой (1:5000; Jackson Immuno Research, штат Пенсильвания, США). Дорожки с АРР из клеток РС12, стабильно трансфицированных мускариновым рецептором M1, обработали антителами прошв белка-пердшественника болезни Альцгеймера (1:4000, моноклональные антитела 22С11, Boehringer Mannheim) и кроличьими антителами к IgG мыши, меченными пероксидазой (1:20000; Jackson Immuno Research, штат Пенсильвания, США). После интенсивной промывки мембраны обработали Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences, штат Массачусетс, США) и затем экспонировали на пленку SuperRX (Fuji Medical X-ray film, Токио, Япония). Количественное определение общего АРР в дорожках выполняли программой Scion Image (NTH, Бетесда, США). Контрольные и CCh образцы анализировали параллельно, таким образом выполняя обобщение данных различных экспериментов.
[00128] AF710 усиливал выход αАРР в трансфицированных клетках СНО и РС12 даже в диапазоне концентраций от 0.1 нМ до 1 мкМ. Повышенные уровни αАРР, наблюдавшиеся в трансфицированных клетках РС12, не отмечены в клетках РС12, не подвергавшихся трансфекции.
[00129] По сравнению с необработанными контрольными клетками максимальная секреция АРР в дважды трансфицированных клетках СНО усиливалась в следующем порядке: AF710B (0.01 мкМ 225%) > AF710 (0.1 мкМ 175%) > AF710A (1 мкМ 125%).
[00130] Обнаружение уровней GSK-3β осуществляли с помощью вестерн-блоттинга в клетках культуры феохромоцитомы крысы (РС12), стабильно трансфицированных M1 mAChR и обработанных тестируемыми соединениями (+/- Аβ 25-35, 20 мкМ), используя протокол, аналогичный описанному в Fang et al., Mol. Cell. Biol. 2002, 22:2099-110), но с помощью антител, селективных к Phospho-GSK3p (Ser 9), т.е. неактивной форме GSK-3β (see Doble et al., J. Cell. Sci. 2003, 116:1175-86), приобретенных в Cell Signaling Technology, США. Эти антитела не обнаруживали нефосфорилированную GSK-3β (вплоть до 1 мкг) и не обладали кросс-реактивностью с GSK-3α. Anti-GSK-3 (Santa Cruz Biotechnology) представляют собой моноклональные антитела, независимые от фосфорилирования и реагирующие и с GSK-3α, и с GSK-3β. В тех же экспериментах исследовали состояние фосфорилирования тау-белка с помощью моноклональных антител против Tau-1 (Chemicon, CAT Number MAB3420), распознающих нефосфорилированный эпитоп тау-белка. Присутствие Аβ25-35 (20 мкМ) приводило к 40-50% уменьшению окрашивания по Phospho-GSK3β (Ser 9), который являлся меткой неактивной формы GSK-3β. Это указывало на повышенное присутствие активной формы. AF710B (100 мкМ-10 нМ) ингибировал сверхактивацию GSK-3β, индуцированную Аβ25-35 (20 мкМ). В тех же экспериментах Аβ25-35 (20 мкМ) на 40-60% понижал окрашивание Tau-1, а AF710B (100 мкМ-10 нМ) восстанавливал эти эффекты до уровня контроля. При совместном рассмотрении эти результаты показали, что AF710B снижал сверхактивацию GSK-3β и гиперфосфорилирование тау-белков.
3
3
-9
-4
3
2
H
L
H
L
[00131] Исследование связывания выполняли с использованием гомогенатов головного мозга крыс (коры, богатой мускариновым рецептором M1), согласно описанию в Fisher et al., J. Pharmacol. Exptl. Therap. 1991,257:392-403. Кору больших полушарий головного мозга вырезали, помещали на лед, очищали, взвешивали и переносили в 20 мМ трис-HCl буфер, 2 мМ ЭДТА, рН 7.4. Ткань гомогенизировали в буфере (1:10 масса/объем) с помощью гомогенизатора Polytron; после цикла заморозки при -70°С/разморозки гомогенаты центрифугировали при 35000 g и 4°С в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в трис-буфере в соотношении 1:6 (масса/объем). Гомогенаты делили на аликвоты по 1 мл и хранили до использования при -70°С. Профиль связывания тестируемого соединения с mAChR в мембранах коры головного мозга крыс изучали с помощью селективного антагониста M1 [H]-пирензепина ([H]PZ с удельной радиоактивностью 86 Ки/ммоль, приобретенного в Perkin-Elmer, штат Массачусетс, США). Различные концентрации тестируемого соединения (например, из расчета конечных концентраций 10-10 М) вводили пипеткой в стеклянные пробирки 13×100 мм, содержавшие [H]PZ (в конечных концентрациях, менявшихся между 4-6 нМ в каждом отдельно взятом эксперименте), 20 мМ трис/Mn буфер, рН 7.4, содержавший 1 мМ ЭДТА и 2 мМ MnCl и мембраны коры головного мозга (разбавленные согласно указаниям выше) из расчета общего конечного объема 0.2 мл. Общее и неспецифическое связывание определяли в отсутствие конкурирующего лиганда или в присутствии 10 мкМ атропина, соответственно. Все анализы выполняли в три повтора при 25°С в течение 1 часа. В конце инкубационного периода пробирки погружали в баню со льдом и фильтровали их содержимое. Связавшийся материал захватывали предварительно пропитанными (0.5% полиэтиленимином в течение 1 часа) фильтрами GF/B 317×57 мм (Whatman, Tamar, Иерусалим, Израиль) с помощью системы Brandel (M-24R, Гейтерсберг, штат Мэриленд, США). Затем фильтры высушивали и помещали во флаконы. Добавляли сцинтилляционную жидкость (Biodegradable Counting Scintillant, Amersham, штат Иллинойс, США) и измеряли радиоактивность с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика PerkinElmer Tricarb 2800. Кривые конкуренции, значения K, K рассчитывали с помощью программного обеспечения Graphpad Prism версии 3.0. В ходе этого исследования получили кривую связывания AF710B с двумя сайтами M1 mAChR мембран коры головного мозга крыс, при разнице величины показателя связывания между двумя сайтами на пять порядков, причем для сайта с большим сродством связывания получили значение K=0.23 нМ (37%), а для сайта с меньшим сродством связывания - значение K=34.5 мкМ (63%).
[00132] Для AF710B провели высокопроизводительный анализ про4зиля с использованием обширной коллекции из 80 трансмембранных и растворимых рецепторов, ионных каналов и переносчиков моноаминов. Этот анализ был специально разработан для получения информации, касающейся не только потенциальных ограничений потенциальных лекарственных средств, но и для идентификации перасчетной активности. Полученные результаты показали, что AF710B связывался с мускариновыми рецепторами M1 и М2 и с другими рецепторами. При дальнейшем расширении этого исследования выполнили функциональное изучение большинства из эгих рецепторов. Было обнаружено, что mAChR M1-опосредованное влияниее AF710B на идущие ниже по каскаду нейрохимические показатели (например, αАРР, GSK-3β, may-белки) обнаруживалось при концентрациях на 3-5 порядков величины ниже, чем при взаимодействиях с другими GPCR.
[00133] Исследование острой токсичности на крысах: AF710B (1, 10 и 50 мг/кг) и неактивную среду для контроля перорально вводили через желудочный зонд группам крыс, состоявшим из 3 самцов+3 самок/дозу и оценивали возможные токсические или другие явные эффекты. В день введения дозы проводили тщательные клинические обследования и делали периодические записи во время первых 4 часов после введения дозы и в конце соответствующего рабочего дня. С этого времени животных наблюдали и записывали клинические симптомы по меньшей мере раз в сутки в течение всего 14-дневного периода наблюдения. Наблюдения включали изменения кожи, шерстяного покрова, глаз, слизистых, появление секретов и выделений (например, диарею) и вегетативную активность (например, слезоотделение, слюноотделение, пилоэрекцию, размер зрачка, необычную картину дыхания). Кроме того, оценивали изменения походки, позы и реакции на манипуляции, а также наличие аномальною поведения, дрожи, судорог, оцепенения и комы. Среди тестируемых и обработанных контрольной средой животных не было зарегистрировано смертей до запланированной эвганазии, проведенной через 14 суток после однократного перорального зондового введения. Среди тестируемых и обработанных контрольной средой животных не наблюдали патологических реакций, связанных с обработкой, ни в соответствующий день введения дозы, ни во время всего 14-дневного периода наблюдения, за исключением небольших изменений моторной активности и легкой одышки, отмеченных через 5 минут после введения дозы у одного самца крысы, получившего тестируемое соединение в дозе 50 мг/кг, и полностью прошедших через 100 минут после введения. Принимая во внимание последовательный способ, использованный в данном исследовании, и с целью по возможности стандартизовать все значения массы тела и прибавки в весе, для каждою животного и группы рассчитали соответствующее процентное изменение массы тела по сравнению с датой введения дозы. Во всех группах, получивших тестируемое соединение, не было выявлено статистически значимых отличий от группы, получившей контрольную среду, за исключением статистически значимого снижения (р<0.05) среднего процентного изменения массы тела в одной из групп самок крыс (уровень дозы 10 мг/кг), отмеченного через 7 суток после введения дозы. Всех животных после запланированного умервщления подвергли полному подробному вскрытию и макроскопическому патологическому обследованию. При вскрытии всех животных подвергли тщательному обследованию, включая обследование внешней поверхности тела, всех отверстий, полости черепа, грудной и брюшной полостей и их содержимого. У всех тестируемых и обработанных контрольной средой животных во время их запланированного вскрытия, проведенного через 14 суток после однократного перорального зондового введения, не было выявлено макроскопически обнаружимых патологических показателей. Максимально переносимую дозу (МПД) тестируемого соединения AF710B рассчитали, исходя из однократного перорального зондового введения крысам.
[00134] Тригексифенидил является селективным мускариновым антагонистом M1, проходящим через гематоэнцефалический барьер и вызывающим нарушения памяти и обучения (Bymaster et al, J Pharmacol Exp. Ther. 267: 16-24, 1993; Roldan et al., Neurosci. Lett. 230: 93-96,1997; Kimura et al., Brain Res. 834: 6-12, 1999). Следовательно, систематическое введение этого соединения является полезным фармакологическим инструментом при исследовании роли мускариновых рецепторов M1 головного мозга в процессах обучения и памяти. В нижеописанных экспериментах использовали наивных крыс Wistar. Задача пассивного избегания (ПИ) состоит из фазы обучения (приобретения навыка) и фазы удержания в памяти. При процедуре обучения каждую крысу помещали отдельно в небольшой освещенный отсек; после 60 с ознакомления/адаптации открывали дверь в большой отсек и измеряли время задержки до выхода (начальная задержка). Сразу после входа в темный отсек дверь закрывали и через решетчатый пол подавали неизбегаемый электрошок на ноги (0.6 мА в течение 3 с). Для начальной задержки использовали пороговое значение 180 с.Животных, которые не выполнили переход (не переступили порог) в течение 180 с, исключали из эксперимента. После пробного обучения крысу возвращали в ее клетку. Удержание в памяти задачи пассивного избегания измеряли через 24 часа путем повторного помещения крысы в освещенный отсек; через промежуток для адаптации 60 с дверь открывали и измеряли задержку до повторного перехода в темный отсек. Для задержки при удержании в памяти использовали пороговое значение 300 с. Животных, которые не переступили порог в течение 300 с, убирали из аппарата и записывали для них время задержки 300 с. Крыс разделили на две группы. Одну группу (N=40) обработали тригексифенидилом (5 мг/кг, п/к), а вторую группу (N=30) обработали бидистиллированной водой (БДВ, 1 мл/кг, п/к) за 30 минут до электрошока. В каждой группе крыс разделили на 4 подгруппы для лечения (N=9-11 для группы, обрабатываемой тригексифенидилом и N=7-8 для группы, обрабатываемой БДВ): животным одной подгруппы вводили БДВ (10 мл/кг, п/о), а животным трех подгрупп вводили AF710B (0.01, 0.03 и 0.1 мг/кг, п/о) за 60 минут до электрошока. Между тригексифенидилом и лечением было обнаружено значимое взаимодействие (F(2/63)=4.0, р<0.023). Задержка при удержании в памяти для тригексифенидильных крыс, которых лечили БДВ (54.22±14.60 с) была значительно короче, чем для контрольных крыс, которых лечили БДВ (242.00±30.60 с) (р<0.001). Однако задержка при удержании в памяти для тригексифенидильных крыс, которых лечили AF710B в количестве 0.01 мг/кг (252.50±32.30 с) и 0.03 мг/кг (178.82±32.70 с), была значительно длиннее, чем для тригексифенидильных крыс, которых лечили БДВ (р<0.01-0.001). Задержка при удержании в памяти для тригексифенидильных крыс, которых лечили AF710B в количестве 0.1 мг/кг (122.00±34.60 с) не отличалась от задержки для тригексифенидильных крыс, которых лечили БДВ. Таким образом, было обнаружено, что AF710B эффективен даже в дозах 0.01 мг/кг, п/о (0.028 мкмоль/кг, п/о).
[00135] Для оценки вероятности транспорта соединений формулы I в ЦНС для соединений, показанных в Таблице 1, рассчитали коэффициенты распределения. Коэффициенты распределения представляют собой измерения липофильности и могут быть выражены в виде значений «lg P», где lg P представляет собой десятичный логарифм коэффициента распределения октанол-вода или буфер. Значения lg P можно определить экспериментально, в том числе с помощью ВЭЖХ-способов, или вычислить с помощью способов прогнозирующего расчета. Чем выше значение lg P, тем выше липофильность и, следовательно, жирорастворимость рассматриваемого химической структуры. Вещества с высоким значением lg P лучше растворяются в жирах и маслах, чем в воде. Это усиливает их способность проходить через липидные (на основе жиров) мембраны в организме путем пассивной диффузии, таким образом повышая их потенциал для всасывания. Многие лекарства обладают значением lg P между 1 и 4, что делает их пригодными для пероральных способов доставки. Таким образом, lg P предоставляет общий критерий для оценки того, может ли лекарство быстро достичь ЦНС или нет. Значение lg P для соединений, показанных в Таблице 1, рассчитанное с помощью веб-приложения, доступного на сайте «Molinspiration» (www.molmspiration.com/cgi-bin/properties, Molinspiration Calculation Services), пакета для расчета свойств молекул, во всех случаях составило величину между 1 и 4.
Таблица 1
<img file="00000074.tif" he="31" wi="67" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=357.5LgP=3.36*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup>:Агонист M1 при концентрации 100 мкМ по сравнению с карбохолином (полный мускариновый агонист, 100%):AF710 (40%)AF710B (66%)AF710A (антагонист, K<sub>d</sub>=31 мкМ)
<img file="00000075.tif" he="34" wi="37" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=344.5LgP*=2.64Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup>:AF716 (антагонист M1, K<sub>d</sub>=7.7 мкМ)
<img file="00000076.tif" he="34" wi="37" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=312.5LgP=4.14*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup>Антагонист M1 mAChR при концентрации 100 мкМ, ингибируют действие карбохолина со 100% до <25%
<img file="00000077.tif" he="36" wi="32" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=418.6LgP=5.18*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup>Антагонист M1 mAChR при концентрации 100 мкМ, ингибирующий действие карбохолина со 100% до <50%
<img file="00000078.tif" he="32" wi="28" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=242.4LgP=1.77*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup>Антагонист M1 mAChR при концентрации 100 мкМ, ингибирующий действие карбохолина со 100% до <50%
<img file="00000079.tif" he="33" wi="53" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=371.6LgP=3.63*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup>Антагонист M1 mAChR при концентрации 100 мкМ, ингибирующий действие карбохолина со 100% до <50%
<img file="00000080.tif" he="36" wi="50" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=343.5LgP=2.85*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup> антагонист, K<sub>d</sub>=84.7 мкМ
<img file="00000081.tif" he="36" wi="53" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=355.5LgP=3.21*Действие на мускариновый рецептор М1<sup>#</sup> ангагонист, K<sub>d</sub>=8.7 мкМ
<img file="00000082.tif" he="29" wi="41" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=371.5LgP=3.43*
<img file="00000083.tif" he="36" wi="48" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=341.5LgP=2.82*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup>.Агонист M1 при концентрации 100 мкМ по сравнению с карбохолином (полный мускариновый агонист, 100%):AF711 (19%); AF711A (45%); AF711B (антагонист, K<sub>d</sub>=42 мкМ)
<img file="00000084.tif" he="34" wi="38" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=296.5LgP=3.60*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup> антагонист, K<sub>d</sub>=22.6 мкМ
<img file="00000085.tif" he="33" wi="34" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=328.5LgP=2.10*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup> антагонист, K<sub>d</sub>=2.5 мкМ
<img file="00000086.tif" he="34" wi="53" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=341.5LgP=2.82*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup> антагонист, K<sub>d</sub>=39.7 мкМ
<img file="00000087.tif" he="34" wi="38" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=296.5LgP=3.60*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup> антагонист, K<sub>d</sub>=112.7 мкМ
<img file="00000088.tif" he="32" wi="42" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=328.4LgP=2.1*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup> антагонист, K<sub>d</sub>=9.7 мкМ
<img file="00000089.tif" he="34" wi="54" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=353.5LgP=2.67*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup> Агонист M1 при концентрации 100 мкМ по сравнению с карбохолином (полный мускариновый агонист, 100%):AF718C (43%)
<img file="00000090.tif" he="34" wi="42" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=340.4LgP=1.95*Агонист M1 при концентрации 100 мкМ по сравнению с карбохолином (полный мускариновый агонист, 100%):AF721 (13%)
<img file="00000091.tif" he="36" wi="53" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=355.5LgP=2.85*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup>:Агонист M1 при концентрации 100 мкМ по сравнению с карбохолином (полный мускариновый агонист, 100%):AF730 (40%) AF730 I (74%) AF730 II (36%)
<img file="00000092.tif" he="31" wi="50" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=371.5LgP=3.39*
<img file="00000093.tif" he="31" wi="57" img-content="undefined" img-format="tif" />
M<sub>r</sub>=369.5LgP=3.53*Действие на мускариновый рецептор M1<sup>#</sup>Агонист M1 при концентрации 100 мкМ по сравнению с карбохолином (полный мускариновый агонист, 100%):AF733 (90%)
* Рассчитано с помощью веб-приложения, доступного на сайте «Molinspiration», пакета для расчета свойств молекул (Molinspiration Calculation Services, www.molinspiration.com/cgi-bin/properties).
Действие на мускариновый рецептор M1 оценивали на основе мобилизации внутриклеточных ионов Са, согласно описанию выше. Мускариновый рецептор M1 представляет собой специфический GPCR.
[00136] Настоящее изобретение не ограничено соединениями, описанными в вышеприведенных примерах, и при использовании процедур, изложенных в вышеприведенных схемах синтеза, можно также получить многие другие соединения, находящиеся в рамках настоящего изобретения. Получение дополнительных соединений формулы I с использованием этих способов должно быть очевидным для специалиста в области химии.
[00137] Настоящее изобретение подробно описано с конкретными ссылками на некоторые варианты его реализации, однако для специалиста понятно, что в рамках настоящего изобретения можно реализовать их измененные варианты и модификации.