БИОТОПЛИВНЫЙ ЭЛЕМЕНТ НА ОСНОВЕ ТЕРМОРАСШИРЕННОГО ГРАФИТА И МЕМБРАННЫХ ФРАКЦИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS

В последнее время особое внимание уделяется разработке альтернативных источников энергии. Биотопливные элементы (БТЭ) относятся к такого рода устройствам; в БТЭ осуществляется превращение химической энергии органических соединений (углеводов, спиртов) в электрическую энергию в процессе биологической трансформации.
При формировании БТЭ на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов или ферментов важен выбор носителя - материала электрода. Терморасширенный графит (ТРГ) является углеродным материалом с высокой удельной площадью поверхности. Такое свойство может обеспечивать высокую плотность бактерий при сорбции. ТРГ обладает также высокой электропроводностью, может долгое время находиться в эксплуатации [http://www.sealur.ru/pdf/useful/reports/grafit.pdf (Белова М.Ю. Графит, ИГ и ТРГ)].
В микробных и ферментных БТЭ используются медиаторы электронного переноса, которые перехватывают образовавшиеся электроны с донорного сайта фермента и переносят на анод. Тем не менее, для ряда ферментов показан также и безмедиаторный перенос электронов. Так, прямой перенос электронов был показан для PQQ(пирролохинолинхинон)-зависимых дегидрогеназ в составе ферментных биосенсоров и биотопливных элементов [Tkac J., Svitel J., Vostiar I., Navratil M., Gemeiner, P. Membrane-bound dehydrogenases from Gluconobacter sp.: Interfacial electrochemistry and direct bioelectrocatalysis // Bioelectrochemistry. 2009. V. 76. P. 53-62].
Ниже перечислены аналоги предлагаемого БТЭ. Впервые прямой перенос электронов для PQQ-зависимой фруктозодегидрогеназы бактерий Gluconobacter был показан Ikeda с соавт. [Ikeda Т., Matsushita F., Senda M. Amperometric fructose sensor based on direct bioelectrocatalysis // Biosensors & Bioelectronics. 1991. V. 6. P. 299-304]. Фруктозодегидрогеназа была иммобилизована на электродах, изкотовленных на основе углеродной пасты. Был показан отклик на фруктозу без добавления медиаторов электронного переноса.
В работе [Becky L. Treu, Shelley D. Minteer.Isolation and purification of PQQ-dependent lactate dehydrogenase from Gluconobacter and use for direct electron transfer at carbon and gold electrodes // Bioelectrochemistry. 2008. V. 74. P. 73-77] показан прямой перенос электронов для биотопливной ячейки на основе PQQ-зависимой лактатдегидрогеназы Gluconobacter sp.33, адсорбированной на золотом электроде (измерения выполняли по трехэлектродной схеме), а также в экспериментах с использованием электродов, полученных методом матричной печати (лактатдегидрогеназу вносили в измерительную ячейку в виде раствора).
В качестве прототипа использована электрохимическая ячейка, использующая в качестве рабочего электрода графитовый стержень с иммобилизованной PQQ-зависимой алкогольдегидрогеназой штамма Gluconobacter sp.33 [Ramanavicius Α., Kausaite Α., Ramanaviciene Α. Potentiometric study of quinohemoprotein alcohol dehydrogenase immobilized on the carbon rod electrode // Sensors and Actuators B: Chemical. 2006. V. 113. №1. P. 435-444]. Для данного фермента показано прямое электрохимическое окисление этилового спирта, в результате которого энергия химической реакции превращается в электрический потенциал. Алкогольдегидрогеназа (АДГ) иммобилизована на графитовом стержне путем кросс-сшивки глутаровым альдегидом. Максимальный потенциал, генерируемый иммобилизованной АДГ при незамкнутой цепи, составил - 115 мВ в двухэлектродной ячейке при использовании в качестве электрода сравнения графитового стержня с неактивной АДГ. Трехэлектродная схема была использована для регистрации амперометрического сигнала при +400 мВ по отношению к электроду сравнения.
Таким образом, существующие разработки основаны на использовании очищенных ферментов бактерий Gluconobacter. В качестве носителя использованы графитовые и золотые электроды.
Актуальной задачей является исследование возможности использования в качестве биоматериала БТЭ мембранных фракций микробных клеток, содержащих дегидрогеназы. Использование мембранных фракций (МФ) как более доступного и недорогого биоматериала может являться альтернативой использованию очищенных ферментов. В качестве носителя использован ТРГ - графитовый материал, обладающий высокой электропроводностью и высокой сорбционной способностью.
В отличие от вышеуказанного прототипа в предлагаемой модели используются мембранные фракции бактериального штамма Gluconobacter oxydans ВКМ В-1280. В качестве материала электрода используется ТРГ.
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель, состоит в создании устройства биотопливного типа для выработки электрической энергии на основе мембранных фракций штамма Gluconobacter oxydans ВКМ В-1280, не использовавшихся ранее в аналогичных устройствах.
Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой полезной модели, заключается в том, что предлагаемый БТЭ позволяет исследовать как безмедиаторное ферментативное окисление субстратов, так и биокаталитическое окисление при внесении медиатора электронного транспорта.
Сущность полезной модели заключается в том, что БТЭ основан на использовании мембранных фракций штамма Gluconobacter oxydans ВКМ В-1280 (Всероссийская коллекция микроорганизмов ИБФМ РАН). МФ выделяли в соответствии с методикой [Indzhgiya Ε., Ponamoreva О., Alferov V., Reshetilov Α., Gorton, Lo. Interaction of ferrocene mediators with Gluconobacter oxydans immobilized whole cells and membrane fractions in oxidation of ethanol // Electroanalysis. 2012. V 24. №4. P. 924 - 930]. ΜΦ иммобилизовали включением в гель хитозана на ТРГ-электрод: смешивали 20 мкл МФ, разбавленных в 2 раза буферным раствором, и 20 мкл 2%-го хитозана, растворенного в 1%-й уксусной кислоте [Wang X., Gu H., Yin F., Tu Y. A glucose biosensor based on Prussian blue/chitosan hybrid film // Biosensors and Bioelectronics. 2009. V. 24. №5. P. 1527-1530]. 20 мкл полученной смеси наносили на электрод, подсушивали при комнатной температуре 30 мин.
Электроды формировали из ТРГ с использованием пресса. Диаметр электрода составлял 10 мм, толщина - 0.2 мм. Регистрировали циклические вольт-амперные характеристики (ЦВА) и зависимость потенциала от времени системы, состоящей из трех электродов: измерительный (рабочий) электрод, полученный из ТРГ-материала, электрод сравнения - Ag/AgCl, противоэлектрод - платиновый. Схема измерения представлена на фиг. 1, где 1 - рабочий электрод, 2 - электрод сравнения (Ag/AgCl), 3 - вспомогательный (платиновый) электрод. Компонентами реакционной смеси являлись 30 мМ калий-натрий-фосфатный буфер, pH 6.0, этанол (10 мМ). Скорость сканирования потенциала составляла 3 мВ/с. В ряде экспериментов в качестве медиатора использовали 2,6-дихлорофенолиндофенол (ДХФИФ). Измерения выполнены на гальванопотенциостате VersaSTAT 4 (Ametek Inc.).
На фиг. 2 представлены зависимости изменения потенциала от времени, записанные на биоаноде с иммобилизованными МФ, при добавлении в рабочий электролит этанола. Видно, что при внесении этанола в электролит, стационарный потенциал биоанода сдвигается в область отрицательных значений потенциала. Через 1200 с после добавления этанола изменение потенциала составило около 50 мВ.
На фиг. 3 приведены ЦВА, записанные на биоаноде в буферном растворе и при добавлении этанола для ТРГ-электрода с МФ.
восст
ок
Другим вариантом сопряжения биохимической и электрохимической реакций является медиаторный способ. В качестве редокс медиатора был использован ДХФИФ, являющийся эффективным акцептором электронов в различных биохимических процессах. Кроме того, стандартный редокс потенциал пары ДХФИФ/ДХФИФ=+0.217 В, что позволяет проводить биоэлектрохимическую реакцию окисления субстрата (в настоящей работе этанола) при достаточно отрицательных значениях потенциала электрода в аэробных условиях. При добавлении в буферный раствор ДХФИФ и этанола для биоанода, модифицированного МФ, изменение потенциала составило 120 мВ (через 600 с после добавления этанола, данные не приведены).
На фиг. 4 приведена ЦВА для биоанода с иммобилизованными МФ в буферном растворе, содержащим этанол и ДХФИФ.
На фиг. 5 приведена калибровочная зависимость значений потенциала при различных концентрациях этанола для ТРГ-электрода с МФ. Регистрировали зависимость E(t) при внесении этанола в течении 1000 с, измеряли амплитуду сигнала (мВ). Максимальное значение измеряемого потенциала достигали при 10 мМ этанола, дальнейшее увеличение концентрации не приводило к росту значения потенциала.
Таким образом, создана модель БТЭ на основе биоанода из терморасширенного графита с иммобилизованными мембранными фракциями бактерий G. oxydans, являющимися биоэлектрокатализаторами. В качестве топлива использовали этиловый спирт. Мембранные фракции, нанесенные на электрод включением в гель хитозана, позволяют осуществить прямое биоэлектрокаталитическое окисление этанола на электроде, генерируемый потенциал составляет 50 мВ. Редокс медиатор - 2,6-дихлорофенолиндофенол - усиливает скорость биоэлектрохимической реакции в 2.4 раза (генерируемый потенциал в присутствии ДХФИФ составляет 120 мВ).