КОМПЛЕКС 3-(2,2,2-ТРИМЕТИЛГИДРАЗИНИЙ) ПРОПИОНАТ-2-ЭТИЛ-6-МЕТИЛ-3-ГИДРОКСИПИРИДИНА ДИСУКЦИНАТ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИГИПОКСИЧЕСКИМ И АДАПТОГЕННЫМ ДЕЙСТВИЕМ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
COMPLEX OF 3-(2,2,2-TRIMETHYLHYDRAZINIUM)PROPIONATE-2-ETHYL-6-METHYL-3-HYDROXYPYRIDINIUM DISUCCINATE POSSESSING ANTIHYPOXIC AND ADAPTOGENIC ACTION, AND METHOD FOR PREPARING IT

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к новому биологически активному соединению - комплексу 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцинат, который обладает антигипоксическим и адаптогенным действием и стабилен при хранении.
Уровень техники
Сукцинат 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина (ЭМГПС) получил широкое применение в медицине в качестве антиоксиданта - антигипоксанта по самым разным показаниям, в первую очередь при сердечно-сосудистых заболеваниях (прединфарктные и постинфарктные состояния, стенокардия и т.п.), заболеваниях головного мозга (заболевания, связанные с нарушением кровообращения, инсульты и т.п.) [Регистр лекарственных средств России - 17-й вып. / Гл. ред. Г.Л.Вышковский. - М.: «РЛС-2009», 2008. - 1440 с]. Мельдоний (3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионата дигидрат, ТМГП ДГ) в основном применяется по тем же показаниям, обладая антигипоксическим эффектом, однако, основной эффект в этом случае связан с ингибированием γ-бутиробетаингидроксилазы и, в конечном итоге, оптимизацией внутриклеточного обмена в условиях гипоксии [Регистр лекарственных средств России - 17-й вып. / Гл. ред. Г.Л.Вышковский. - М.: «РЛС-2009», 2008. - 1440 с]. Очевиден ожидаемый синергизм этих препаратов, по этой причине для лечения ряда патологий предложено их совместное применение [RU 2270025, опубл.: 20.02.2006; RU 2009118345, опубл. 20.11.2010, RU 2284192, опубл.: 27.09.2006; RU 2367388, Опубл.: 20.09.2009; Назарова Л.С. Кардио-респираторные нарушения у больных раком легкого на этапах комбинированного лечения, дисс. на соиск. уч. степ. канд. мед. наук. Томск: НИИ онкол. ТНЦ СО РАМН. 2008].
Однако оба препарата имеют ряд особенностей физико-химических свойств, создающих сложности при разработке готовых лекарственных форм. Так, ЭМГПС достаточно легко окисляется, в особенности в инъекционных растворах, при этом скорость окисления, ведущего к образованию коричневой окраски раствора, зависит от остатка воздуха в ампуле, качества стекла и ряда других параметров до сих пор полностью не выявленных. В результате инъекционный раствор ЭМГПС при хранении окрашивается с разной скоростью в разных ампулах одной серии, что ведет к браковке по показателю «неоднородность» и «цветность» и т.п. Еще больше технологических проблем связано с использованием мельдония - данный препарат является очень неустойчивым гидратом, теряющим воду и изменяющим качество уже при температуре более 25-30°C. С другой стороны, мельдоний очень гигроскопичен и практически неограниченно растворим в воде, это крайне затрудняет изготовление твердых пероральных форм. Субстанция мельдония при хранении очень быстро слеживается и требует в последующем размола. При изготовлении инъекционных форм водный раствор мельдония сильно выщелачивает стекло, при этом практически не обладает буферными свойствами (и даже напротив, оказывает дифференцирующий эффект при изменении pH) - в результате после стерилизации и хранения инъекционный раствор становится щелочным выше допустимого предела. Инъекционные растворы мельдония при контроле качества быстро разрушают pH-чувствительные стеклянные электроды, что также вызывает определенные технологические трудности и ведет к экономическим потерям. Щелочные растворы мельдония (с pH выше 8) при внутримышечной инъекции болезненны и могут вызвать некроз тканей.
Указанные выше факторы и предопределяют значительную цену крайне важных для медицины препаратов ЭМГПС (Мексидол, Мексидант, Мексифин, Медомекси, Мексикор, Мексиприм…) и мельдония (Вазомаг, Идринол, Кардионат, Мидолат, Милдронат…) т.к. цена субстанции этих препаратов в настоящее время невысока. Для получения более технологичных продуктов, обладающих сходной с мельдонием биологической активностью, в патенте WO 2005012233, заявл. 15.07.2004 (приор. 04.08.2003 LV) предложены соли, не образующие кристаллогидраты, и в т.ч. сукцинаты 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионата (1:1), (2:1); но, они, как и мельдоний, достаточно сильно гигроскопичны и склонны к слеживанию. Кроме того, в заявке RU 2005125660, опубл.: 20.02.2007 с целью усиления антигипоксического действия предложены фармацевтические композиции, содержащие ТМГП ДГ и сукцинаты натрия, калия или магния. Однако эти близкие технические решения не позволяют устранить все физико-химические недостатки мельдония и его солей; и, кроме того, сохраняют главный недостаток - влияние лишь на один элемент патологического процесса при гипоксических состояниях - так же как и в случае с ЭМГПС.
Задачей предлагаемого изобретения является получение устойчивого соединения с фармакологическими свойствами ЭМГПС и мельдония, удобного для получения готовых лекарственных форм и комплексно влияющего на организм. Данная задача решается путем синтеза комплекса 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината формулы:
Раскрытие изобретения.
Известно, что мельдоний образует стабильные ионные пары с некоторыми красителями, что применяют в качестве «реакции подлинности»; к примеру, в ФС 42-2961-93 используют образование комплекса 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионата (ТМГП) с бромтимоловым синим. Оказалось, что сукцинат ТМГП образует прочный комплекс с ЭМГПС, обладающий индивидуальным дифракционным спектром и ИК-спектром, а также существенно отличающийся от индивидуальных солей поведением при термическом анализе (температура плавления, экзо- и эндоэффекты) (см. пример 1). Данный комплекс сохраняется и в водных растворах, о чем свидетельствует УФ-спектр (см. пример 1). Для солей 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина (ЭМГП) в целом типично, что максимум поглощения при 225 нм характерен для непротонированного пиридинового цикла; для солей с сильными кислотами (соляной, серной) данный максимум изчезает; для солей с органическими кислотами (уксусной, янтарной) в данной области наблюдается «плечо», характеризующее определенную степень гидролиза соли. Для предлагаемого комплекса наблюдается выраженный максимум при 225 нм, что связано с образованием прочной водородной связи с протоном азота пиридинового цикла, с перераспределением электронной плотности в пиридиновом цикле к уровню, близкому к непротонированному пиридиновому циклу (см. пример 1), хотя pH водных растворов предлагаемого комплекса при равной молярной концентрации несколько ниже, чем для ЭМГПС (для 0,01 М растворов соответственно 4,17 и 4,59).
Необычным и подтверждающим образование стабильного комплекса является также неожиданная для солей ЭМГП устойчивость его водных растворов к окислению - при хранении 10%-ного раствора в контакте с воздухом и без предохранения от света образец остается бесцветным, в то время как эквимолярный по концентрации раствор сукцината ЭМГП приобретает темно-коричневую окраску. Данное явление, по нашему мнению, также доказывает существование комплекса в т.ч. и в растворах; вероятно, структура протонированного аддукта (ЭМГП×ТМГП) удерживается наличием прочных водородных связей, что препятствует атаке радикалов ОН•, ООН• в процессе окисления на чувствительные к окислению центры оксипиридиновой структуры:
Заявляемый комплекс 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцинат удобен для приготовления твердых лекарственных форм, т.к. обладает благоприятными физико-химическими свойствами - хорошей сыпучестью, незначительной гигроскопичностью по сравнению с мельдонием. Водные растворы комплекса не выщелачивают стекло, не окисляются и не окрашиваются при хранении, что позволяет получать качественные и стабильные при хранении инъекционные формы.
Исследование биологической активности комплекса 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината обнаружило, что он значительно менее токсичен, чем ЭМГПС, и как антигипоксант более активен в эквивалентной дозе, нежели индивидуальные ЭМГПС и мельдоний (см. пример 13). При этом обнаружено также адаптогенное действие комплекса 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината (см. пример 17).
Заявляемый комплекс может быть получен взаимодействием эквимолярных количеств ЭМГПС, янтарной кислоты и ТМГП ДГ, при этом реакция легко и быстро проходит даже в отсутствии растворителя, однако при этом высвобождаются 2 моля воды и образуется концентрированный раствор («сироп»), который кристаллизуется сравнительно медленно и требует сушки под вакуумом. Более удобно использовать не содержащие воды реагенты (ЭМГПС и сукцинат ТМГП; или ЭМГП, янтарная кислота и сукцинат ТМГП; или ЭМГП, янтарная кислота и ТМГП), которые легко взаимодействуют в условиях механохимического воздействия. При этом и в первом и во втором случае образуется стабильная кристаллическая модификация, не изменяющаяся при хранении со следующими параметрами:
Угол 2θ, °
Межплоскостное расстояние d, Å
Интенсивность, с<sup>-1</sup>
Относительная интенсивность, %
11.2942
7.8280
523.33
40.36
12.5284
7.0595
556.67
42.93
13.3364
6.6335
536.67
41.39
14.2629
6.2046
243.33
18.77
15.9527
5.5510
326.67
25.19
16.2642
5.4454
133.33
10.28
17.1699
5.1601
176.67
13.62
17.5796
5.0408
126.67
9.77
17.8419
4.9672
233.33
17.99
19.1735
4.6252
233.33
17.99
19.5455
4.5380
833.33
64.27
19.8408
4.4711
543.33
41.90
20.7198
4.2834
1296.67
100.00
21.2173
4.1840
153.33
11.83
21.9306
4.0495
646.67
49.87
22.6669
3.9196
316.67
24.42
23.2765
3.8183
466.67
35.99
23.8739
3.7241
456.67
35.22
24.2570
3.6662
690.00
53.21
24.5044
3.6297
880.00
67.87
25.7518
3.4567
500.00
38.56
26.5811
3.3507
363.33
28.02
26.8792
3.3142
313.33
24.16
28.1029
3.1726
140.00
10.80
28.6456
3.1137
210.00
16.20
29.7913
2.9965
106.67
8.23
30.5538
2.9234
100.00
7.71
31.7791
2.8135
190.00
14.65
32.7890
2.7291
116.67
9.00
33.5788
2.6667
93.33
7.20
34.9325
2.5664
236.67
18.25
35.7622
2.5087
156.67
12.08
36.0112
2.4919
110.00
8.48
36.9890
2.4283
120.00
9.25
38.1490
2.3571
170.00
13.11
Спектр рентгеновской дифракции порошка измеряли в условиях:
- дифрактометр Thermo ARL X'TRA, детектор полупроводниковый;
- излучение CuKα, вольтаж 45 кВ, интенсивность 35 мА;
- съемка в режиме θ-2θ;
- диапазон измерения - от 10 до 60°;
- прирост между каждым измерением - 0,02°;
- временной шаг измерения - 0,3 с;
- отклоняющая щель трубки - 2,0 мм;
- рассеивающая щель трубки - 4,0 мм;
- рассеивающая щель детектора - 0,5 мм;
- эталонная щель детектора - 0,3 м;
- отсутствие внутреннего сигнала;
- данные эксперимента обрабатывались при помощи программного обеспечения WinXRD 2.0.
Экономический и экологический эффект дает использование в качестве реагентов промышленно доступных ЭМГП, янтарной кислоты и дегидратированного ТМГП ДГ, в этом случае исключаются стадии синтеза сукцинатов ЭМГП и ТМГП, имеющие низкий выход и связанные с образованием труднорегенерируемых смесей изопропанола и ацетона. Механохимический синтез проводят аналогично RU 2442774, опубл. 20.02.2012, используя в качестве «смачивателя», инертный апротонный растворитель (алифатический кетон, простой эфир или алифатический углеводород), который летуч, малотоксичен и легко удаляется из продукта. В качестве алифатического кетона используют ацетон или метилэтилкетон, в качестве простого эфира - диэтиловый эфир, тетрагидрофуран или диоксан, в качестве алифатического углеводорода - гексан, гептан или петролейный эфир.
При изучении заявляемого комплекса в остром и субхроническом токсикологических экспериментах подтверждена его биобезопасность и низкая токсичность (см. примеры 14, 15, 16).
Таким образом, получено новое соединение - комплекс 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцинат формулы:
устойчивый в водных растворах, обладающий антигипоксическим и адаптогенным действием при низкой токсичности, предложены способы его получения и охарактеризована кристаллическая структура заявленного соединения.
Предлагаемое соединение может найти применение в медицине и ветеринарии в качестве активного, малотоксичного, безопасного и стабильного при хранении антигипоксанта, в т.ч. для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний и других заболеваний, имеющих в основе гипоксические состояния, ишемию тканей и т.п., а также в качестве адаптогена в животноводстве и птицеводстве.
Краткое описание чертежей.
На Фиг.1 показан ИК-спектр комплекса 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината.
На Фиг.2 показан УФ-спектр комплекса 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината,
где 1 - 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат;
2 - комплекс 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината.
На Фиг.3 показана дифрактограмма комплекса 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината.
На Фиг.4 представлены результаты термического анализа комплекса 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината (навеска 200 мг).
Осуществление изобретения
Пример 1. (Синтез из ЭМГПС, янтарной кислоты и ТМГП ДГ)
В колбу роторно-пленочного испарителя (РПИ) помещают 255,27 г ЭМГПС (1 моль), 118,09 г янтарной кислоты (1 моль), 182,26 ТМГП ДГ (1 моль), массу перемешивают при вращении колбы (частота вращения 60 об/мин) и подогревают до 45-50°C; при этом образуется вязкая жидкость. Содержимое колбы выливают на фторопластовый поддон и сушат под вакуумом 0,9 ата при 30-35°C до постоянного веса. Затвердевший продукт размалывают в шаровой мельнице, дополнительно сушат при 20 -25°C под вакуумом в течение 5 часов. Получают 519, 6 г (1 моль) продукта, имеющего выраженную кристалличность. Выход 100% от теории. Элементный анализ:
Вычислено, %: С 58.00, Н 8.20, N 9.22, О 24.58
Найдено, %: С 57.47, Н 8.33, N 9.18, О 25.02
10% раствора
pH =4,08
0,01 М раствора
pH =4,17
-1
ИК-спектр (в KBr), см: см. Фиг.1.
3
2
3
2
-
3440 (валентн -ОН); 3045,44 (NH, мельд.); 2360÷2780 (валентн. -ОН, ассоцииров. группа); 2922,49 (валент.-СН, -СН); 1705,47 (-C=O, карбон. к-ты); 1637,00, 1571,42 (-C=O, мельд.); 1385,30 (деформ. -CH, -CH-); 1306,22 (-C-O-, карбон. к-ты); 1218,47 (деформ. -OH); 1185,68 (валентн. -CO в COO, соли карбон, кислот); 849,12 (деформ. Ar-H).
max
min
max
min
max
УФ-спектр (в воде): λ=195 нм, λ=214 нм, λ=224 нм, λ=245 нм, λ=295 нм (см. Фиг.2).
Растворимость: очень легко растворим (ГФ XII, стр.92).
Результаты рентгенофазового анализа: см. Фиг.3.
Угол 2θ,°
Межплоскостное расстояние d, Å
Интенсивность, с<sup>-1</sup>
Относительная интенсивность, %
11.2942
7.8280
523.33
40.36
12.5284
7.0595
556.67
42.93
13.3364
6.6335
536.67
41.39
14.2629
6.2046
243.33
18.77
15.9527
5.5510
326.67
25.19
16.2642
5.4454
133.33
10.28
17.1699
5.1601
176.67
13.62
17.5796
5.0408
126.67
9.77
17.8419
4.9672
233.33
17.99
19.1735
4.6252
233.33
17.99
19.5455
4.5380
833.33
64.27
19.8408
4.4711
543.33
41.90
20.7198
4.2834
1296.67
100.00
21.2173
4.1840
153.33
11.83
21.9306
4.0495
646.67
49.87
22.6669
3.9196
316.67
24.42
23.2765
3.8183
466.67
35.99
23.8739
3.7241
456.67
35.22
24.2570
3.6662
690.00
53.21
24.5044
3.6297
880.00
67.87
25.7518
3.4567
500.00
38.56
26.5811
3.3507
363.33
28.02
26.8792
3.3142
313.33
24.16
28.1029
3.1726
140.00
10.80
28.6456
3.1137
210.00
16.20
29.7913
2.9965
106.67
8.23
30.5538
2.9234
100.00
7.71
31.7791
2.8135
190.00
14.65
32.7890
2.7291
116.67
9.00
33.5788
2.6667
93.33
7.20
34.9325
2.5664
236.67
18.25
35.7622
2.5087
156.67
12.08
36.0112
2.4919
110.00
8.48
36.9890
2.4283
120.00
9.25
38.1490
2.3571
170.00
13.11
пл.
Результаты термического анализа: Т=60°C, при 150°C разл. (см. Фиг.4).
При 60°C образец плавится со значительным эндотермическим эффектом, потери массы не наблюдается. После завершения плавления, при 100°C имеется экзоэффект, хотя образец при этом остается жидким, потери массы при этом также не наблюдается. Начиная со 150°C наблюдается депрессия массы, при 170°C масса образца быстро уменьшается, при этом процесс при 170-190°C слабо экзотермический, со 190°C наблюдается эндотермический процесс и снижение массы несколько замедляется; при 230°C происходит выраженный экзотермический процесс и продукт практически полностью газифицируется (масса пека менее 5% после полного разложения образца).
Пример 2. (Синтез из ЭМГПС и сукцината 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионата)
В колбу роторно-пленочного испарителя помещают 255,27 г ЭМГПС (1 моль), 264, 31 г сукцината 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионата (1 моль), добавляют 50 мл ацетона. В колбу вносят фторопластовые шары и перемешивают массу при вращении колбы (частота вращения 60 об/мин) в течение 2-х часов при комнатной температуре. Полученную сыпучую массу выгружают на фторопластовый поддон и сушат до постоянного веса и отсутствия запаха ацетона. Получают 519,6 г продукта (выход 100,0% от теории) со следующими параметрами:
Элементный анализ:
Вычислено, %: С 58.00, Н 8.20, N 9.22, О 24.58
Найдено, %: С 58.20, Н 8.21, N 9.20, О 24.39
-1
ИК спектр, см: 3440; 3045,44; 2360÷2780; 2922,49; 1705,47; 1637,00, 1571,42; 1385,30; 1306,22; 1218,47; 1185,68; 849,12.
Результаты рентгенофазового анализа, °: 11.29; 12.53; 13.34; 14.26; 15.95; 16.26; 17.17; 17.84; 19.17; 19.55; 19.84; 20.72; 21.22; 21.93; 22.67; 23.28; 23.87; 24.26; 24.50; 25.75; 26.58; 26.88; 28.10; 28.65; 29.79; 30.55; 31.78; 32.79; 33.58; 34.93; 35.76; 36.99; 38.15
Пример 3. (Синтез из ЭМГП, янтарной кислоты и сукцината ТМГП)
В колбу роторно-пленочного испарителя помещают 137,18 г 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина (1 моль), 264, 31 г сукцината 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионата (1 моль) и 118,09 г янтарной кислоты (1 моль). В колбу помещают фторопластовые шары и 50 мл диэтилового эфира; включают привод и вращают колбу 1 час при комнатной температуре. После этого, не прекращая перемешивание, подают вакуум 0,9 ата; через 30 мин вакуум убирают, колбу снимают и выгружают содержимое на сито. После просеивания получают 512,5 г белого кристаллического порошка (выход 98,6% от теории, потери при просеивании) со следующими параметрами:
Элементный анализ:
Вычислено, %: С 58.00, Н 8.20, N 9.22, O 24.58
Найдено, %: С 57.98, Н 8.21, N 9.19, О 24.62
-1
ИК спектр, см: 3440; 3045,44; 2360÷2780; 2922,49; 1705,47; 1637,00, 1571,42; 1385,30; 1306,22; 1218,47; 1185,68; 849,12.
Результаты рентгенофазового анализа, °: 11.29; 12.53; 13.34; 14.26; 15.95; 16.26; 17.17; 17.84; 19.17; 19.55; 19.84; 20.72; 21.22; 21.93; 22.67; 23.28; 23.87; 24.26; 24.50; 25.75; 26.58; 26.88; 28.10; 28.65; 29.79; 30.55; 31.78; 32.79; 33.58; 34.93; 35.76; 36.99; 38.15
Пример 4. (Синтез из ЭМГП, янтарной кислоты и сукцината ТМГП)
В колбу роторно-пленочного испарителя помещают 137,18 г 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина (1 моль), 264, 31 г сукцината 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионата (1 моль) и 118,09 г янтарной кислоты (1 моль); добавляют 30 мл ацетона. В колбу помещают фторопластовые шары и перемешивают массу при вращении колбы (частота вращения 60 об/мин). Масса вначале слипается, через 30 мин затвердевает и превращается в порошок. Процесс проводят в течение 3 часов при комнатной температуре; после этого массу с шарами выгружают на поддон, сушат до отсутствия запаха и затем просеивают. После просеивания получают 518,5 г белого кристаллического порошка (выход 99,8% от теории, потери при просеивании) со следующими параметрами:
Элементный анализ:
Вычислено, %: C 58.00, H 8.20, N 9.22, O 24.58
Найдено, %: C 57.68, H 8.24, N 9.18, O 24.90
-1
ИК спектр, см: 3440; 3045,44; 2360÷2780; 2922,49; 1705,47; 1637,00, 1571,42; 1385,30; 1306,22; 1218,47; 1185,68; 849,12.
Результаты рентгенофазового анализа, °: 11.29; 12.53; 13.34; 14.26; 15.95; 16.26; 17.17; 17.84; 19.17; 19.55; 19.84; 20.72; 21.22; 21.93; 22.67; 23.28; 23.87; 24.26; 24.50; 25.75; 26.58; 26.88; 28.10; 28.65; 29.79; 30.55; 31.78; 32.79; 33.58; 34.93; 35.76; 36.99; 38.15
Пример 5. (Синтез из ЭМГП, янтарной кислоты и дегидратированного ТМГП ДГ)
182,22 г (1 моль) ТМГП ДГ сушат при 80°C и вакууме 2 мм рт.ст до теоретической потери веса, соответствующей полной дегидратации (2-3 часа); при прекращении изменения массы проверяют влагу по Фишеру (должно быть менее 0,1%). Крупнокристаллический порошок становится мучнисто-белым тонким порошком, при этом не обладающий существенной гигроскопичностью (изменение влаги по Фишеру при контакте с воздухом происходит очень медленно до образования моногидрата, который более гигроскопичен и быстро абсорбирует влагу из воздуха).
После дегидратации получают 146,2 г ТМГП (1 моль) с влагой 0,1% (по Фишеру). Этот порошок перегружают в колбу РПИ, туда же загружают 236,18 г янтарной кислоты (2 моль) и 137,18 г перекристаллизованного ЭМГП (1 моль). В колбу помещают фторопластовые шары и 100 мл гексана; включают привод и перемешивают массу при вращении колбы (частота вращения 60 об/мин) в течение 3 часов при комнатной температуре. Вначале масса агломерируется, затем рассыпается в порошок. По завершении процесса продукт сушат на фторопластовом поддоне до постоянного веса и отсутствия запаха гексана и затем просеивают. После просеивания получают 517,9 г белого кристаллического порошка (выход 99,7% от теории, потери при просеивании) со следующими параметрами:
Элементный анализ:
Вычислено, %: C 58.00, H 8.20, N 9.22, O 24.58
Найдено, %: C 58.32, H 8.24, N 9.17, O 24.27
-1
ИК спектр, см: 3440; 3045,44; 2360÷2780; 2922,49; 1705,47; 1637,00, 1571,42; 1385,30; 1306,22; 1218,47; 1185,68; 849,12.
Результаты рентгенофазового анализа, °: 11.29; 12.53; 13.34; 14.26; 15.95; 16.26; 17.17; 17.84; 19.17; 19.55; 19.84; 20.72; 21.22; 21.93; 22.67; 23.28; 23.87; 24.26; 24.50; 25.75; 26.58; 26.88; 28.10; 28.65; 29.79; 30.55; 31.78; 32.79; 33.58; 34.93; 35.76; 36.99; 38.15
Пример 6.
Синтез проводят аналогично примеру 5, но в качестве «смачивателя» берут 100 мл гептана. Получают 518,8 г белого кристаллического порошка, выход 99,8% от теории.
-1
ИК спектр, см: 3440; 3045,44; 2360÷2780; 2922,49; 1705,47; 1637,00, 1571,42; 1385,30; 1306,22; 1218,47; 1185,68; 849,12.
Результаты рентгенофазового анализа, °: 11.29; 12.53; 13.34; 14.26; 15.95; 16.26; 17.17; 17.84; 19.17; 19.55; 19.84; 20.72; 21.22; 21.93; 22.67; 23.28; 23.87; 24.26; 24.50; 25.75; 26.58; 26.88; 28.10; 28.65; 29.79; 30.55; 31.78; 32.79; 33.58; 34.93; 35.76; 36.99; 38.15
Пример 7.
Синтез проводят аналогично примеру 5, но в качестве «смачивателя» берут 50 мл петролейного эфира (с пределами выкипания 50-70°C). Получают 518,6 г кристаллического порошка с едва заметным кремовым оттенком, выход 99,8% от теории.
-1
ИК спектр, см: 3440; 3045,44; 2360÷2780; 2922,49; 1705,47; 1637,00, 1571,42; 1385,30; 1306,22; 1218,47; 1185,68; 849,12.
Результаты рентгенофазового анализа, °: 11.29; 12.53; 13.34; 14.26; 15.95; 16.26; 17.17; 17.84; 19.17; 19.55; 19.84; 20.72; 21.22; 21.93; 22.67; 23.28; 23.87; 24.26; 24.50; 25.75; 26.58; 26.88; 28.10; 28.65; 29.79; 30.55; 31.78; 32.79; 33.58; 34.93; 35.76; 36.99; 38.15
Пример 8.
Синтез проводят аналогично примеру 5, но в качестве «смачивателя» берут 40 мл метилэтилкетона. После завершения синтеза массу отделяют от шаров, сушат под вакуумом 10-15 мм рт.ст. сначала 2 часа при комнатной температуре, затем 3 часа при 30°C до отсутствия запаха метилэтилкетона. Получают 516,2 г кристаллического порошка практически белого цвета, выход 99,3% от теории.
-1
ИК спектр, см: 3440; 3045,44; 2360÷2780; 2922,49; 1705,47; 1637,00, 1571,42; 1385,30; 1306,22; 1218,47; 1185,68; 849,12.
Результаты рентгенофазового анализа, °: 11.29; 12.53; 13.34; 14.26; 15.95; 16.26; 17.17; 17.84; 19.17; 19.55; 19.84; 20.72; 21.22; 21.93; 22.67; 23.28; 23.87; 24.26; 24.50; 25.75; 26.58; 26.88; 28.10; 28.65; 29.79; 30.55; 31.78; 32.79; 33.58; 34.93; 35.76; 36.99; 38.15
Пример 9.
Синтез проводят аналогично примеру 3, но в качестве «смачивателя» берут 50 мл тетрагидрофурана. Получают 515,3 г белого с едва заметным желтоватым оттенком кристаллического порошка, выход 99,2% от теории.
-1
ИК спектр, см: 3440; 3045,44; 2360÷2780; 2922,49; 1705,47; 1637,00, 1571,42; 1385,30; 1306,22; 1218,47; 1185,68; 849,12.
Результаты рентгенофазового анализа, °: 11.29; 12.53; 13.34; 14.26; 15.95; 16.26; 17.17; 17.84; 19.17; 19.55; 19.84; 20.72; 21.22; 21.93; 22.67; 23.28; 23.87; 24.26; 24.50; 25.75; 26.58; 26.88; 28.10; 28.65; 29.79; 30.55; 31.78; 32.79; 33.58; 34.93; 35.76; 36.99; 38.15
Пример 10.
Синтез проводят аналогично примеру 3, но в качестве «смачивателя» берут 50 мл диоксана. После завершения синтеза массу отделяют от шаров, выгружают на фторопластовый поддон и сушат под вакуумом 0,98 ата при 30-35°C до постоянной массы и отсутствия запаха диоксана. Получают 516,8 г белого с желтоватым оттенком кристаллического порошка, выход 99,5% от теории.
-1
ИК спектр, см: 3440; 3045,44; 2360÷2780; 2922,49; 1705,47; 1637,00, 1571,42; 1385,30; 1306,22; 1218,47; 1185,68; 849,12.
Результаты рентгенофазового анализа, °: 11.29; 12.53; 13.34; 14.26; 15.95; 16.26; 17.17; 17.84; 19.17; 19.55; 19.84; 20.72; 21.22; 21.93; 22.67; 23.28; 23.87; 24.26; 24.50; 25.75; 26.58; 26.88; 28.10; 28.65; 29.79; 30.55; 31.78; 32.79; 33.58; 34.93; 35.76; 36.99; 38.15
Пример 11. (Изучение стабильности водных растворов предлагаемого соединения и ЭМГПС)
Для изучения стабильности растворов заявляемого соединения и известного ЭМГПС готовят одномолярные растворы в дистиллированной воде. Определяют оптическую плотность растворов на 450 нм относительно воды. Исходные растворы обоих соединений мало отличаются от воды (оптическая плотность 0,01 для заявляемого соединения и 0,02 - для ЭМГПС). Растворы в количестве 50 мл помещают в мерные колбы на 100 мл, закрытые пришлифованными стеклянными пробками. Образцы хранят в нормальных условиях без предохранения от света, через каждые 6 месяцев определяют оптическую плотность растворов и содержание сукцината 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина методом ВЭЖХ. Результаты приведены в Таблице 1, из которой видно, что раствор заявляемого соединения в течение 3 лет не подвергся изменениям, в то время, как ЭМГПС окислился с образованием окрашенных соединений и снижением содержания основного вещества.
Таблица 1
Стабильность водных растворов заявляемого соединения и ЭМГПС
Время хранения
ЭМГПС
Заявляемое соединение
Оптическая плотность, 450 нм
Содержание, г/100 мл
Оптическая плотность, 450 нм
Содержание, г/100 мл
Исходный
0,02
2,55
0,01
5,20
6 месяцев
0,38
2,51
0,02
5,20
1 год
0,88
2,15
0,02
5,20
1,5 года
1,28
1,88
0,02
5,20
2 года
Не определяется, коричневый
0,99
0,03
5,19
2,5 года
Не определяется, коричневый
0,86
0,03
5,18
3 года
Не определяется, коричневый
0,54
0,04
5,17
Пример 12. (Стабильность инъекционной формы заявляемого соединения в сравнении с мельдонием)
В емкость, снабженную мешалкой, вносят 900 мл воды для инъекций, 100 г заявляемого соединения и перемешивают до полного растворения. Раствор фильтруют через стерилизующий фильтр, разливают по 5 мл в ампулы из стекла НС-3, стерилизуют. После стерилизации проверяют механические включения; кондиционные ампулы упаковывают в групповую упаковку и хранят в нормальных условиях. Аналогично готовят 10% раствор мельдония. В процессе хранения проверяют pH, наличие механических примесей, органолептические свойства раствора (запах). Из Таблицы 2 видно, что инъекционный раствор заявляемого соединения не изменил указанных параметров, в то время как в растворе мельдония увеличилось значение pH (особенно после стерилизации), в части ампул появились механические включения и инъекционный раствор приобрел сильный «рыбный» запах.
Таблица
Стабильность инъекционной формы заявляемого соединения и мельдония
Время хранения
Мельдоний
Заявляемое соединение
pH
Механические включения, % ампул
pH
Механические включения, % ампул
Исходный
7,5
0
4,2
0
После термической стерилизации
8,4
28
4,2
0
1 год
8,5
38
4,2
0
2 года
8,6
42
4,2
0
3 года
8,8
62
4,2
1,2
Пример 13. (Исследование антигипоксической активности 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината)
Мерой оценки чувствительности животных к острой гипобарической гипоксии служило время жизни на «высоте». С этой целью вычисляли коэффициент эффективности защиты (КЭЗ), составлявший отношение жизни в опыте ко времени жизни в контроле.
Материалы и методы:
Препараты 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидрокси-пиридина дисукцинат, мельдоний и ЭМГПС вводили крысам в дозах 65 мг/кг, 20 мг/кг и 30 мг/кг внутрижелудочно (через зонд) и внутримышечно. В опыте всего было использовано 70 животных, по 10 голов в каждой группе, 10 интактных. Тестирование проводили на 14 день после начала эксперимента (после первого введения препарата).
Каждое животное «поднимали» на критическую высоту (11,5 тыс.м) со скоростью 165 м/сек, где оно находилось до агонального состояния.
Результаты:
Согласно результатам проведенных исследований по выявлению влияния препаратов на устойчивость организма крыс к острой гипобарической гипоксии (см. Таблицу 3) установлено, что все препараты при различных способах введения (пероральном и внутримышечном) на 14-й день исследования оказали высокую антигипоксическую активность. Она проявлялась в существенном продлении жизни экспериментальных животных на «высоте» в сравнении с их аналогами в контрольных группах. Внутримышечное введение 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината достоверно повышало резистентность животных к острой гипобарической гипоксии, что выразилось в увеличении времени жизни на «высоте». Коэффициент эффективности защиты (КЭЗ) для 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината составил 11, что превысило показатели для других препаратов более, чем в 2 раза (КЭЗ для ЭМГПС - 5,4, для мельдония - 3,5).
Таблица 3
Показатели эффективности защиты препаратов при острой гипобарической гипоксии у крыс
Способ введения
ВЖ в контрольной группе, сек
Экспериментальная группа
ВЖ на 14-й день эксперимента
КЭЗ*
Внутрижелудочно
62,5±7,2
ЭМГПС
247±18,9
3,9
мельдоний
468,5±59,97
7,4
Заявляемый комплекс
335±36,38
5,3
Внутримышечно
62,5±7,2
ЭМГПС
338±67,3
5,4
мельдоний
220±30,15
3,5
Заявляемый комплекс
691,5±114,6
11,0
* - <maths num="1"><math display="block"><mrow><mfrac><mrow><mi>К</mi><mi>о</mi><mi>э</mi><mi>ф</mi><mi>ф</mi><mi>и</mi><mi>ц</mi><mi>и</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mtext> </mtext><mi>э</mi><mi>ф</mi><mi>ф</mi><mi>е</mi><mi>к</mi><mi>т</mi><mi>и</mi><mi>в</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>и</mi><mtext> </mtext><mi>з</mi><mi>а</mi><mi>щ</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>ы</mi></mrow><mrow><mi>В</mi><mi>р</mi><mi>е</mi><mi>м</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mi>ж</mi><mi>и</mi><mi>з</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mtext> </mtext><mi>в</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>е</mi></mrow></mfrac></mrow></math><img file="00000004.tif" he="13" wi="81" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
ВЖ - время жизни на «высоте» (до появления атонального дыхания)
Пример 14. (Острая токсичность 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината в сравнении с острой токсичностью ЭМГПС)
Материалы и методы:
Изучение острой токсичности 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината и ЭМГПС проводили на белых беспородных мышах-самцах массой 18-20 г при внутрижелудочном (с помощью желудочного зонда) и внутрибрюшинном введении в форме водного раствора препарата в различных дозировках. Оценка острой токсичности производилась по методу Литчфилда и Уилкинсона.
Результаты:
Установлено, что LD50 (в/ж)>16000 мг/кг, что позволяет отнести данный препарат к 4 классу опасности (малоопасные вещества) по ГОСТ 12.1.007-76.
Результаты определения параметров острого токсического действия препаратов при внутрибрюшинном и внутрижелудочном способе введения представлены в Таблице 4. Из результатов опыта видно, что предлагаемый комплекс 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцинат существенно менее токсичен, нежели известный препарат с близкими показаниями ЭМГПС. При этом при внутрижелудочном введении проявление токсичности обнаружить не удалось, тогда как для ЭМГПС в этом случае LD50 6200 мг/кг (токсическое влияние в основном на ткань головного мозга).
Таблица 4
Параметры острой токсичности при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введении (мыши) заявляемого комплекса и ЭМГПС
Способ введения
Препарат
LD0
LD16
LD50
LD84
LD100
Внутрибрюшинно
Заявляемый комплекс
940
1500
2700
3600
4700
ЭМГПС
210
365
475
620
860
Внутрижелудочно
Заявляемый комплекс
Животные не гибнут при дозе более 16000 мг/кг
ЭМГПС
1600
1900
6200
8400
9800
Пример 15. (Оценка раздражающего действия 3-(2,2,2-триметилгидразиний) про-пионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината)
Материалы и методы:
Раздражающее действие 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината оценивали на белых беспородных крысах обоего пола, массой 230-250 г в возрасте 2,5 месяца. Препарат вводили животным внутрь в форме водной суспензии в дозе 270,0 мг/кг.
После введения препарата следили за поведением и реакциями животных. Убой крыс провели через 6; 24 и 48 часов после введения препарата. На каждый срок убоя использовали по 3 крысы.
Результаты:
Визуальный осмотр слизистых оболочек глотки, пищевода, желудка, тонкого и толстого отделов кишечника крыс, получавших препарат в дозе 270,0 мг/кг, не выявил патологических признаков: кровоизлияний, изъязвлений и других повреждений пищеварительного тракта.
Таким образом, пероральное введение препарата в дозе 270,0 мг/кг не вызывает местного раздражающего действия слизистых оболочек пищеварительного тракта.
Пример 16. (Субхроническая токсичность 3-(2,2,2-триметилгидразиний) про-пионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината)
Материалы и методы:
Субхронический эксперимент проводили на половозрелых нелинейных крысах-самцах изначальной массой 212,0±7,6 г в течение 30 дней. Крыс содержали в виварии НЦБМТ РАМН в пластиковых клетках при естественном освещении и температуре 20-22°C, кормили брикетированными комбикормами. Животные были взяты в эксперимент после 7 дней карантина. Группы формировались методом случайной выборки. В каждой группе было по 6 животных. Опытным животным в течение месяца вводили подкожно 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцинат в дозах 1/10 и 1/100 от LD50, что составило, соответственно, 270 мг/кг (1 группа) и 27 мг/кг (2 группа). Крысы контрольной группы находились в аналогичных условиях, что и опытные животные. В течение всего опыта вели наблюдение за состоянием животных в динамике по интегральным и функциональным показателям основных органов и систем, в том числе физиологическим, гематологическим и биохимическим.
После завершения эксперимента было проведено вскрытие животных с последующим определением:
- местного раздражающего действия;
- макроскопической картины вскрытия.
Заключение:
Изученный препарат не оказывал существенного влияния на динамику массы тела, потребление сухого и влажного корма и воды, общее состояние и поведение животных.
Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что при 30-дневном воздействии комплекса 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината отсутствовали существенные различия в подопытных группах и в контроле со стороны показателей периферической крови (см. Таблицу 5), биохимических показателей крови, характеризующих обмен веществ и функции жизненно важных органов (см. Таблицу 6), а также со стороны состояния выделительной системы (см. Таблицу 7).
Таблица 5
Состояние периферической крови крыс на 30 день эксперимента
Показатели крови
Группы животных
1 группа
2 группа
Контроль
Эритроциты, М/мкл
8,4±0,25
8,3±0,5
7,9±0,3
Гемоглобин, г/л
130,8±0,45
120,7±1,20
120,8±0,21
Лейкоциты, Т/мкл
12,3±1,0
11,5±1,3
9,32±099
Тромбоциты Т/мкл
716,5±55,9
695,0±41,3
670±46,3
Таблица 6
Биохимические показатели крови крыс после введения 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината
Показатели
1 группа
2 группа
Контроль
Глюкоза, mmol/l
5,7±0,04
6,2±0,01
5,5±0,04
АЛТ, U/l
65,1±4,59
74,5±2,7
74,3±2,65
ACT, U/l
164,1±3,96
184,4±6,52
176,0±9,79
ЩФ, U/l
261±34,7
284,7±10,6
263,2±9,37
Холестерин, мг/дл
26,0±2,31
34,2±1,1
34,7±1,2
Таблица 7
Показатели мочи крыс при воздействии 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината
Показатели
1 группа
2 группа
Контроль
Диурез за 18 ч., мл
22,7±1,15
21,6±0,1
22,9±1,1
Ph мочи
6,8±0,002
6,85±0,002
6,9±0,01
Плотность мочи, г/см<sup>3</sup>
1,005±0,0001
1,007±0,0001
1,01±0,0001
Белок, мг/100 мл
0,8±0,67
1,7±1,1
2,5±1,25
Не отмечено влияния препарата на частоту дыхания, ректальную температуру, спонтанную двигательную активность, поисковые реакции и эмоциональное состояние подопытных животных.
При макроскопическом исследовании не выявлено признаков местного раздражающего действия на слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта и каких-либо патологических изменений внутренних органов.
При определении массы внутренних органов подопытных животных не выявлено достоверного отклонения от контрольной группы (см. Таблицу 8).
Таблица 8
Влияние 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината на относительную массу внутренних органов крыс
Группа животных
Масса органов
сердце
печень
легкие
почки
селезенка
мозг
1 группа
3,90±0,23
37,5±1,65
8,30±0,68
7,10±0,36
2,90±0,32
6,10±0,22
2 группа
3,60±0,11
33,80±0,96
8,50±0,59
9,40±0,42
3,40±0,29
7,10±0,56
Контроль
4,50±0,25
36,90±2,63
8,50±0,36
8,50±0,22
3,50±0,15
6,20±0,32
Пример 17. (Влияния 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината на привес птиц и некоторые показатели иммунокомпетентных органов)
Изучение влияния 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината на организм продуктивной птицы (цыплят-бройлеров) проводили, добавляя препарат в стандартный рацион в суточных дозах 10 мг/кг с первого дня жизни (2-я группа) и с 14-суточного возраста (3-я группа). Определяли привес птицы изменение иммунокомпетентных органов. 1-я опытная группа (контрольная) получала стандартный рацион без добавки препарата.
Тимус, клоакальная бурса и селезенка являются главными органами в организме птицы, ответственными за формирование иммунной защиты. В эксперименте изучали весовые изменения этих органов у интактных цыплят-бройлеров в возрастном аспекте, а также при использовании 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината. Абсолютная масса тимуса в суточном возрасте у цыплят равнялась в контроле 0,26 г, в первой опытной группе - 0,24 г, во второй - 0,29 г.
Нами было установлено, что у всех цыплят с возрастом абсолютная масса тимуса увеличивалась. Если в суточном возрасте не установлена разница по абсолютной массе тимуса между интактным и опытным поголовьем, то во все последующие возрастные периоды масса тимуса у опытных цыплят была большей по сравнению с контролем. В двухнедельном возрасте масса тимуса у опытных цыплят первой группы превосходила данный показатель в контроле на 0,24 г, во второй опытной группе - на 0,31 г. В 32-дневном возрасте различия составляли: в первой опытной группе - на 1,62 г, во второй - на 2,49 г.
Максимальный прирост абсолютной массы тимуса у цыплят и контрольных и опытных групп отмечен в период с 14 до 32-дневного возраста.
Проведенные нами исследования показали, что после вылупления у интактных цыплят абсолютная масса бурсы в контрольной группе равнялась 0,117±0,01 г, в первой опытной - 0,116±0,04 г, во второй 0,118±0,02 г. На протяжении всего периода выращивания у интактных цыплят абсолютная масса бурсы увеличивалась, достигая максимальных размеров в 32 дня: в контроле - 1,23±0,02 г, в первой опытной группе - 1,27±0,06 и во второй - 1,32±0,01 г.
Прослеживая изменения абсолютной массы селезенки цыплят, отмечено, что к моменту вылупления у цыплят в контрольной группе ее масса соответствовала 0,03 г, в опытных - 0,02 г. У интактных бройлеров селезенка продолжала увеличиваться до 32-дневного возраста до 2,32 г, в первой опытной - до 2,44 г, во второй - 2,56 г.
3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцинат не оказал существенного влияния на изменения массы селезенки цыплят.
Таким образом, применение цыплятам-бройлерам 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат-2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина дисукцината оказывает положительное действие на прирост (см. Таблицу 9), сохранность птицы и гемопоэз (см. Таблицу 10), что можно охарактеризовать как выраженный адаптогенный эффект.
Таблица 9
Изменение привеса птиц
Время, сут
Масса, г
Контроль
2 группа
3 группа
1
40,07±1,89
39,77±1,68
40,36±1,57
14
438,44±18,1
487,17±15,4
509,7±16,2
35
2122,6±21,3
2182,5±33,4
2261,3±29,7
Таблица 10
Изменение основных параметров гемопоэза у птиц
Возраст цыплят, дн
Эритроциты, ×10<sup>12</sup>/л
Гемоглобин, г/л
Лейкоциты, ×10<sup>9</sup>/л
Контрольная группа
1
1,89±0,06
71,2±0,05
27,1±0,8
14
1,93±0,02
75,4±0,1
31,1±1,1
32
2,2±0,01
75,3±0,06
35,9±1,0
2 опытная группа
1
2,02±0,02
72,6±0,06
29,1±0,7
14
2,04±0,01
76,8±0,03
31,2±0,5
32
2,34±0,03*
77,7±0,11*
37,3±0,4
3 опытная группа
1
1,97±0,21
71,2±0,4
25,5±0,4
14
2,18±0,21*
76,1±0,6
30,5±0,2*
32
2,42±0,41*
88,1±0,9*
38,1±03*
* - Р<0,05