СПОСОБ ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДАВНОСТИ НАСТУПЛЕНИЯ ИНФАРКТА МИОКАРДА
METHOD FOR PATHOMORPHOLOGICAL DETERMINATION OF PRESCRIPTION OF MYOCARDIAL INFARCTION

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии.
Известно, что точное установление срока давности инфаркта миокарда имеет большое значение для патологоанатома.
Известен способ макроскопической диагностики ранних сроков инфаркта миокарда, основанный на взаимодействии теллурита калия с дегидрогеназами тканей. Вне зоны инфаркта теллурит калия окрашивает миокард в серый или черный цвет, при этом зона некроза остается неокрашенной, за счет разрушения указанных ферментов в зоне инфаркта миокарда (Пальцев М.А., Аничков Н.М. Патологическая анатомия. В 2-х т., Т.2, Ч.1. - М.: Медицина, 2001. - С.82).
Недостатком известного способа является отсутствие возможности дифференцированного определения срока наступления инфаркта миокарда. Известный способ позволяет выявить только некротическую стадию инфаркта миокарда (срок от 2-х часов до 3-х суток), поскольку после наступления стадии организации активность дегидрогеназ в ткани постепенно восстанавливается.
Кроме того, применение данного способа затрудняет получение качественных образцов для гистологического и иммуногистологического исследования и снижает качество документирования морфологических изменений в миокарде за счет того, что красители стойко окрашивают ткань в серый цвет. При дальнейшем обязательном исследовании материала эта окраска мешает окрашиванию стандартными красителями.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ диагностики ишемического некроза сердечной мышцы (Пат. 2094806 Российская Федерация, МПК G01N 33/68, G01N 33/50, Способ диагностики некроза в гистологических срезах / Козлов Д.В.; заявитель и патентообладатель Новокузнецк, гос. ин-т усовершенствования врачей, - №94005367/14; заявл. 14.02.1994; опубл. 27.10.1997).
Известный способ осуществляют следующим образом. Фрагменты сердечной мышцы фиксируют 15% водным нейтральным раствором формалина в течение суток при комнатной температуре. В последующем материал подвергают парафиновой заливке, после чего готовят гистологические срезы, которые депарафинируют обработкой в трех порциях о-ксилола и последующим прогреванием в термостате при 37°С в течение 3 часов. Обезвоживание срезов достигают 3-х минутной обработкой в каждой из четырех порций этанола (абсолютный, 96% 70% и 56%). Далее срезы на 5 минут переводят в 0,05 М забуференный физиологический раствор с рН 7,6. Блокирование эндогенной пероксидазы осуществляют свежим раствором 3% перекиси водорода в течение 10 минут, промывают забуференным физиологическим раствором 5 минут. Далее срезы выдерживают под каплей 5%-ного раствора лошадиного сывороточного альбумина. После этого избыток альбумина стряхивают и аккуратно обтирают предметные стекла вокруг срезов. На последние наносят каплю афинно-очищенных кроличьих первичных антител против ассоциированного с беременностью альфаз-гликопротеина в концентрации 8 мкг/мл. Инкубацию срезов осуществляют в течение 30 минут при 37°С во влажной камере, после чего дважды отмывают забуференным физиологическим раствором. Инкубируют гистологические срезы во вторичных биотинилированных антителах в разведении 10 мкг на 1 мл забуференного физиологического раствора в течение 30 минут, после чего отмывают забуференным физиологическим раствором 5 минут. Затем обрабатывают срезы комплексом авидин-пероксидаза в течение 30 минут и отмывают забуференным физиологическим раствором. Иммунологическое проявление осуществляют в 0,03% растворе субстрата на основе диаминобензидина (ДАБ хромогена) в течение 10 мин. Реакцию останавливают ополаскиванием срезов в двух порциях дистиллированной воды. Ядра клеток докрашивают гематоксилином в течение 3 мин. Далее срезы проводят через свежие спирты восходящей концентрации (56% 70% 96%, абсолютный этанол) и три порции о-ксилола, затем заключают в бальзам.
При исследовании готовых микропрепаратов отмечают четкое окрашивание очагов ишемического некроза сердечной мышцы в зоне инфаркта миокарда. Очаг некроза имеет коричневый цвет, а остальные ткани - желто-серую окраску.
Недостатком известного способа, как и аналогичного, является отсутствие возможности точного определения срока давности инфаркта миокарда, поскольку способ-прототип позволяет идентифицировать только некротическую его стадию.
К недостаткам известного способа следует отнести и то, что период полувыведения комплексов ассоциированного с беременностью альфа2-гликопротеина с протеиназами не превышает 2 минут. Следовательно, уже через полчаса практически все комплексы ферментов с ассоциированным с беременностью альфа2-гликопротеином достигают органов-мишеней, в частности печени, где и метаболизируются. Вне кровеносных сосудов это распределение имеет иные характеристики, поскольку высокая молекулярная масса комплексов препятствует их поступлению в кровеносные сосуды (Зорин Н.А. Ассоциированный с беременностью АЛЬФА-2-ГЛИКОПРОТЕИН. НОВОСТИ "Вектор-Бест", N 9, Сентябрь, 1998. Цит. По ссылке http://www.vector-best.ru/nvb/st9_5.htm 29.04.12 г.). Следовательно, выявление комплексов в пограничной зоне инфаркта миокарда ограничено очень коротким сроком; выявление комплексов возможно только в зоне некроза, т.е. вне зон сохранного кровоснабжения.
Задачей заявляемого изобретения является разработка способа определения срока давности инфаркта миокарда при патоморфологических исследованиях.
Техническим результатом предлагаемого способа является определение срока давности инфаркта миокарда от 2-х часов до 30 суток.
Технический результат достигается тем, что способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда включает фиксацию образца ткани, помещение его в парафин, изготовление срезов, их депарафинизацию и прогревание, отмывание в буферном растворе, инкубирование во влажной камере с реагентом и обработку проявляющим агентом, дегидратацию и заключение в среду.
Основным отличительным приемом заявляемого способа является то, что в качестве реагента используют антитела к матриксной металлопротеазе 9 в разведении 1:100-1:250.
Отличительным приемом предлагаемого способа также является и то, что инкубацию с реагентом проводят при температуре +25°С и относительной влажности 100%. Длительность инкубации составляет 60 минут.
Отличия заявляемого способа заключаются и в том, что при микроскопическом выявлении в препарате ярко окрашенных нейтрофилов в сосудах периинфарктной зоны и ярко окрашенных нейтрофилов в зоне инфаркта устанавливают срок давности инфаркта от 2-х часов до 1-х суток, при выявлении дегрануляции нейтрофилов и яркой окраски внеклеточного матрикса в зоне инфаркта - от 1-х до 2-х суток, а при выявлении окрашенных клеток фибробластического ряда в пограничной зоне инфаркта - от 3-х до 30-ти суток.
Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».
Заявляемый способ обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно - обеспечение возможности определения при патоморфологических исследованиях срока давности инфаркта миокарда от 2-х часов до 30 суток при одновременном снижении трудоемкости и длительность исследования.
Так, авторами заявляемого способа установлено, что используемые первичные антитела связываются с веществами, синтезируемыми нейтрофилами, фиброкластами, а также с веществами во внеклеточном матриксе в строго определенные временные промежутки после развития инфаркта миокарда. Поэтому использование при иммуногистохимическом окрашивании гистологических препаратов, в качестве первичных антител к матриксной металлопротеазе 9, позволило авторам заявляемого способа дифференцировать сроки давности наступления инфаркта миокарда при патоморфологическом исследовании.
Преимуществом предлагаемого способа является также то, что он позволяет выявить не только некротическую стадию инфаркта миокарда, но и стадию организации, что определяет его сильную сторону по сравнению с прототипом.
Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».
Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами. Это дает основание считать, что заявляемое техническое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».
Сущность заявляемого способа поясняется примером конкретного выполнения. Приведенный ниже пример служит для иллюстрации, но не ограничивает данное изобретение.
Пример
Объектом исследования явился патологоанатомический материал 30 больных, погибших от острого инфаркта миокарда. Во всех случаях диагностирован первичный острый трансмуральный инфаркт миокарда. Средний возраст - 63.7 года. Мужчин - 18, женщин - 12. По срокам наступления инфаркта больные распределились следующим образом: 16 больных погибли в срок до 3-х суток; 14 больных - в сроки от 3-х суток до 1 месяца.
Образцы ткани из зоны инфаркта миокарда и пограничной к ней зоне фиксировали 10% раствором нейтрального формалина и заливали в парафиновые блоки по общепринятой методике (Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. - С.13-15, 52-59).
Затем готовили срезы толщиной 5 мкм, которые монтировали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Депарафинировали препараты вначале в толуоле - 5 минут, а затем последовательно в спиртах 100°, 96°, 90°, 70° и 50° по 1 минуте. После чего препараты выдерживали в дистиллированной воде в течение 10 минут.
Для демаскирования антигенов препараты помещали в цитратный буфер (рН6.0) и нагревали 8 минут в микроволновой печи мощностью 800W при 100% мощности, а затем 10 минут при 60% мощности. После чего препараты охлаждали до 25°С в цитратном буфере (рН6.0) и промывали дистиллированной водой 2 раза по 5 минут. Образец ткани обводили гидрофобным карандашом Dako Pen (Dako, Code S2002).
Для инактивации эндогенной пероксидазы на каждый препарат наносили по 50 мкл 3%-ной перекиси водорода и выдерживали в течение 5 минут. После чего отмывали Трис-буфером (рН7.6) дважды по 5 минут. Затем наносили 50 мкл 0.4% раствора казеина, инкубировали 5 минут, отмывали Трис-буфером (рН7.6) 2 раза по 5 минут.
Далее на каждый препарат наносили первичные антитела - антитела к ММР9 rabbit monoclonal antibody IgG (Epitomics, Clone ID: EP1254, Cat. N2551-1, Lot YG 11300 IP) в рабочем разведении 1:100-1:250 и инкубировали во влажной камере при температуре 25°С и 100% влажности в течение 1 часа. Потом отмывали Трис-буфером (рН7.6) 2 раза по 5 минут. Затем на препараты наносили по 50 мкл раствора, содержащего 10% сыворотку в Трис-буфере (рН7.6), инкубировали во влажной камере при температуре +25°С в течение 30 минут. Отмывали Трис-буфером (рН7.6) 2 раза по 5 минут. Затем наносили вторичные антитела Novolink Polymer (Novocastra, REF=7112, Lot 711236), меченные пероксидазой, по 50 мкл, инкубировали во влажной камере при температуре +25°С 30 минут. Отмывали Трис-буфером (рН7.6) 2 раза по 5 минут. Добавляли по 50 мкл субстратной смеси, содержащей 50 мкл 1.74% 3'3'-диаминобензидина в 1 мл 0.05% перекиси водорода (Novocastra, REF=RE7105, Lot 710550), выдерживали 5 минут. Отмывали водой. Срезы докрашивали 0.02% раствором гематоксилина 30 секунд. Отмывали водой. Дегидратировали последовательно в спиртах 70°, 90°, 96°, 100° по 1 минуте. Затем в толуоле 5 минут. Помещали в заключающую среду Permanent Slide Mounting Medium (Novocastra, REF=7137, Lot 713708) под покровные стекла. Микроскопическое исследование проводили с использованием светового микроскопа Nikon 80L
Установлено, что при летальных исходах, развившихся в течение нескольких часов после развития инфаркта миокарда, регистрировали ярко окрашенные нейтрофилы в сосудах периинфарктной зоны (Фиг.1, позиция А), а также ярко окрашенные нейтрофилы в зоне инфаркта (Фиг.1, позиция В).
В срок давности инфаркта от 1-х до 2-х суток фиксировали дегрануляцию нейтрофилов, потерю окраски цитоплазмы нейтрофилов. Параллельно с этим была зафиксирована яркая окраска внеклеточного матрикса в зоне инфаркта, что отражает выделение ММР-9 из нейтрофилов в ткани (Фиг.2, позиция С). В случае летальных исходов в более поздние сроки (3-30 суток) отмечали окраску клеток фибробластического ряда в пограничной зоне. При этом максимальная выраженность окраски отмечена на 7-14 сутки (Фиг.3, позиция D).
Авторы отмечают хорошую воспроизводимость предлагаемого способа - при окрашивании серийных срезов в разных партиях достигнуты идентичные результаты окрашивания.
Таким образом, предлагаемый способ позволять четко дифференцировать срок давности наступления инфаркта миокарда при патоморфологическом исследовании. Данный способ может быть использован в медицине, а именно в патологической анатомии.