ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СЛИТЫЕ БЕЛКИ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ ЛИЗОСОМНЫХ ФЕРМЕНТОВ, СООТВЕТСТВУЮЩИЕ СОСТАВЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
THERAPEUTIC TARGETED FUSION PROTEINS BASED ON LYSOSOMAL ENZYMES, RELEVANT COMPOSITIONS AND THEIR APPLICATIONS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Настоящее описание в целом относится к терапевтическим слитым белкам на основе лизосомных ферментов, применимым для лечения лизосомных болезней накопления, составам, включающим такие терапевтические слитые белки на основе лизосомных ферментов, и соответствующим способам лечения лизосомных болезней накопления у млекопитающих.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Обычно лизосомные ферменты млекопитающих синтезируются в цитозоле и направляются в ЭР, где они подвергаются гликозилированию N-связанным углеводом высокоманнозного типа. В аппарате Гольджи высокоманнозный углевод на лизосомных ферментах подвергается модификации с присоединением манноза-6-фосфата (M6P), который направляет эти белки в лизосому. Затем M6P-модифицированные ферменты доставляются в лизосому при взаимодействии с любым из двух/обоими рецепторами M6P.
[0003] Более сорока лизосомных болезней накопления (ЛБН) вызваны, напрямую или опосредованно, отсутствием одного или более лизосомных ферментов в лизосоме. Ферментозаместительная терапия при ЛБН активно исследуется. Терапия обычно требует, чтобы белки ЛБН захватывались и доставлялись в лизосомы клетками различных типов M6P-зависимым путем. Один из возможных методов включает очистку белка ЛБН и его модификацию с включением углеводной группы с M6P. Такой модифицированный материал может захватываться клетками с более высокой эффективностью, чем немодифицированные белки ЛБН, в результате взаимодействия с M6P рецепторами на поверхности клеток.
[0004] Ранее была разработана технология таргетинга на основе пептидов, которая обеспечивает более эффективную доставку терапевтических ферментов в лизосомы. Эта запатентованная технология называется независимым от гликозилирования лизосомным таргетингом (GILT), поскольку пептидная метка, которая связана с терапевтическим ферментом, заменяет M6P в качестве группы, которая направляет белок в лизосомы. Детали технологии GILT описаны в публикациях заявок на патент США 2003-0082176, 2004-0006008, 2003-0072761, 2005-0281805, 2005-0244400, патентах США 8,492,337 и 8,563,691 и публикациях международных заявок WO 03/032913, WO 03/032727, WO 02/087510, WO 03/102583, WO 2005/078077, WO 2009/137721 и WO 2014/085621, описания которых настоящим включены посредством отсылки.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] В настоящем описании предложены дополнительные улучшенные композиции, составы и способы эффективного лизосомного таргетинга терапевтических слитых белков на основе технологии GILT. Помимо прочего, в настоящем описании предложены способы и композиции для направленной доставки терапевтических лизосомных ферментов в лизосомы с применением лизосомных направляющих пептидов для лечения лизосомных нарушений накопления. В настоящем описании также предложены способы и композиции для направленной доставки лизосомных ферментов в лизосомы с применением лизосомного направляющего пептида, который обладает уменьшенной или сниженной аффинностью связывания к рецептору IGF-I и/или уменьшенной или сниженной аффинностью связывания к инсулиновому рецептору, и/или устойчив к расщеплению фурином. В настоящем описании также предложены слитые белки направленного действия на основе лизосомных ферментов, содержащие лизосомный фермент и IGF-II и спейсерные пептиды, которые обеспечивают улучшенную продукцию и захват лизосомами слитого белка на основе лизосомного фермента. Примерные лизосомные ферменты, подходящие для включения в терапевтические слитые белки согласно настоящему изобретению, и ассоциированные с ними заболевания, подлежащие лечению такими слитыми белками, представлены в Таблице 1 ниже. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления лизосомный фермент является зрелым ферментом альфа-N-ацетилглюкозаминидазой (Naglu) человека, а лизосомным нарушением накопления является мукополисахаридоз IIIB типа (МПС IIIB, синдром Санфилиппо B).
[0006] В одном аспекте терапевтический слитый белок согласно настоящему описанию включает функциональный фермент α-N-ацетилглюкозаминидазу, который демонстрирует поддающуюся обнаружению ферментную активность и имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности зрелого человеческого белка Naglu, показанного на Фигуре 1 (SEQ ID NO: 1). В другом аспекте описание направлено на фрагмент зрелого человеческого белка Naglu, показанного на Фигуре 1 (SEQ ID NO: 1), который сохраняет поддающуюся обнаружению активность фермента Naglu.
[0007] В другом аспекте терапевтический слитый белок согласно настоящему описанию включает пептидную метку, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности аминокислот 8-67 зрелого человеческого IGF-II. В этом отношении аминокислоты 8-67 зрелого человеческого IGF-II имеют следующую аминокислотную последовательность: LCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE (SEQ ID NO: 2).
[0008] В различных вариантах осуществления терапевтический слитый белок направленного действия согласно настоящему описанию включает пептидную метку, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности аминокислот 8-67 зрелого человеческого IGF-II с заменой аргинина на аланин в аминокислотном положении 37. В этом особенно предпочтительном варианте осуществления пептидная метка имеет следующую аминокислотную последовательность: LCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSARSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE (SEQ ID NO: 3). Замена аргинина на аланин в аминокислотном положении 37, как ранее сообщали, устраняла по меньшей мере один сайт расщепления протеазы фурина (см., например, патент США 8,563,691).
[0009] В другом аспекте терапевтический слитый белок согласно настоящему описанию включает спейсерный пептид, расположенный между лизосомным ферментом и пептидной меткой и связывающий их. В различных вариантах осуществления спейсерный/линкерный пептид имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности жесткого линкерного пептидного из 31 аминокислоты, имеющего следующую аминокислотную последовательность: GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 4). В различных вариантах осуществления спейсерный пептид имеет длину от приблизительно 25-37, 26-36, 27-35, 28-34, 29-33 или 30-32 аминокислот и представляет собой вариант SEQ ID NO: 4, где 1, 2, 3, 4, 5 или 6 определенных аминокислот SEQ ID NO: 4 заменены, добавлены или удалены.
[0010] В еще одном аспекте терапевтический слитый белок согласно настоящему описанию включает: (i) функциональный фермент α-N-ацетилглюкозаминидазу, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности зрелого человеческого белка Naglu, показанного на Фигуре 1 (SEQ ID NO: 1), (ii) пептидную метку, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, и (iii) спейсерный/линкерный пептид, расположенный между ферментом и пептидной меткой, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности жесткого линкерного пептида из 31 аминокислоты, показанного в настоящем описании как SEQ ID NO: 4. В одном варианте осуществления (в настоящем описании указан как BMN001) терапевтический слитый белок согласно настоящему описанию включает: (i) функциональный зрелый фермент α-N-ацетилглюкозаминидазу (Naglu) человека, имеющий аминокислотную последовательность, показанную на Фигуре 1 (SEQ ID NO: 1), (ii) спейсерный/линкерный пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в настоящем описании как SEQ ID NO: 4, и (iii) пептидную метку IGF-II, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. Полная аминокислотная последовательность терапевтического слитого белка BMN001 показана на Фигуре 2 (SEQ ID NO: 5).
[0011] В еще одном аспекте настоящего описания предложены фармацевтические композиции, применимые для лечения лизосомного нарушения накопления у млекопитающего, где указанные композиции включают терапевтический слитый белок согласно настоящему описанию. В различных вариантах осуществления фармацевтическая композиция является составом, который включает: (a) слитый белок, включающий лизосомный фермент или его функциональный фрагмент, пептидную метку, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2, и спейсерный пептид, расположенный между указанным лизосомным ферментом или его функциональным фрагментом и указанной пептидной меткой, где указанный спейсерный пептид обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4; и (b) один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из буферного вещества, изотонического вещества и электролитного вещества. Составы согласно настоящему описанию могут быть жидкими составами, лиофилизированными составами или жидкими составами, которые были восстановлены из предварительно лиофилизированных составов. В различных вариантах осуществления составы согласно настоящему описанию являются стабильными.
[0012] В различных вариантах осуществления составы или композиции веществ согласно настоящему описанию могут включать лизосомный фермент или его функциональный фрагмент, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Составы согласно настоящему описанию могут включать слитый белок, который включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.
[0013] Составы согласно настоящему описанию могут включать слитый белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, буферное вещество, изотоническое вещество, электролитное вещество и вещество, препятствующее адсорбции. В различных вариантах осуществления составы согласно настоящему описанию включают слитый белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, двухосновного натрия фосфата гептагидрат, одноосновного натрия фосфата моногидрат, натрия хлорид и трегалозу. В одном варианте осуществления составы согласно настоящему описанию включают слитый белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, в концентрации от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 35 мг/мл, двухосновного натрия фосфата гептагидрат в концентрации от приблизительно 0,15 мг/мл до приблизительно 0,25 мг/мл, одноосновного натрия фосфата моногидрат в концентрации от приблизительно 0,03 мг/мл до приблизительно 0,05 мг/мл, натрия хлорид в концентрации от приблизительно 0,8 мг/мл до приблизительно 1 мг/мл и трегалозу в концентрации от приблизительно 7% до приблизительно 9%, при этом указанная состав имеет pH от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5. В различных вариантах осуществления состав согласно настоящему описанию включает слитый белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, в концентрации приблизительно 30 мг/мл, двухосновного натрия фосфата гептагидрат в концентрации приблизительно 0,19 мг/мл, одноосновного натрия фосфата моногидрат в концентрации приблизительно 0,04 мг/мл, натрия хлорид в концентрации приблизительно 0,88 мг/мл и трегалозу в концентрации приблизительно 8%, при этом указанная состав имеет pH приблизительно 7,0. Эти составы могут находиться в водной или в сухой/лиофилизированной форме.
[0014] В других вариантах осуществления составы согласно настоящему описанию включают слитый белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, двухосновного натрия фосфата гептагидрат, одноосновного натрия фосфата моногидрат, натрия хлорид, трегалозу и полисорбат 20. В одном варианте осуществления составы согласно настоящему описанию включают слитый белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, в концентрации от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 35 мг/мл, двухосновного натрия фосфата гептагидрат в концентрации от приблизительно 0,15 мг/мл до приблизительно 0,25 мг/мл, одноосновного натрия фосфата моногидрат в концентрации от приблизительно 0,03 мг/мл до приблизительно 0,05 мг/мл, натрия хлорид в концентрации от приблизительно 4,5 мг/мл до приблизительно 5,5 мг/мл, трегалозу в концентрации от приблизительно 3% до приблизительно 5% и полисорбат 20 в концентрации от приблизительно 0,0025% до приблизительно 0,0075%, при этом указанная состав имеет pH от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5. В различных вариантах осуществления состав согласно настоящему описанию включает слитый белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, в концентрации приблизительно 30 мг/мл, двухосновного натрия фосфата гептагидрат в концентрации приблизительно 0,19 мг/мл, одноосновного натрия фосфата моногидрат в концентрации приблизительно 0,04 мг/мл, натрия хлорид в концентрации приблизительно 5 мг/мл, трегалозу в концентрации приблизительно 4% и полисорбат 20 в концентрации приблизительно 0,005%, при этом указанная состав имеет pH приблизительно 7,0. Эти составы могут находиться в водной или в сухой/лиофилизированной форме.
[0015] В различных вариантах осуществления составы согласно настоящему описанию включают двухосновного натрия фосфата гептагидрат, одноосновного натрия фосфата моногидрат, натрия хлорид, калия хлорид, магния хлорида гексагидрат и кальция хлорида дегидрат, и где слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В других вариантах осуществления составы согласно настоящему описанию включают слитый белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, в концентрации от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 35 мг/мл, двухосновного натрия фосфата гептагидрат в концентрации от приблизительно 0,15 мг/мл до приблизительно 0,25 мг/мл, одноосновного натрия фосфата моногидрат в концентрации от приблизительно 0,03 мг/мл до приблизительно 0,05 мг/мл, натрия хлорид в концентрации от приблизительно 8 мг/мл до приблизительно 9 мг/мл, калия хлорид в концентрации от приблизительно 0,15 мг/мл до приблизительно 0,3 мг/мл, магния хлорида гексагидрат в концентрации от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,2 мг/мл и кальция хлорида дигидрат в концентрации от приблизительно 0,15 мг/мл до приблизительно 0,3 мг/мл, при этом указанная состав имеет pH от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5. В различных вариантах осуществления состав согласно настоящему описанию включает слитый белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, в концентрации приблизительно 30 мг/мл, двухосновного натрия фосфата гептагидрат в концентрации приблизительно 0,19 мг/мл, одноосновного натрия фосфата моногидрат в концентрации приблизительно 0,04 мг/мл, натрия хлорид в концентрации приблизительно 8,66 мг/мл, калия хлорид в концентрации приблизительно 0,22 мг/мл, магния хлорида гексагидрат в концентрации приблизительно 0,16 мг/мл и кальция хлорида дигидрат в концентрации приблизительно 0,21 мг/мл, при этом указанная состав имеет pH приблизительно 7,0. Эти составы могут находиться в водной или в сухой/лиофилизированной форме.
[0016] В других аспектах настоящее описание направлено на способы лечения лизосомных болезней накопления у субъектов, страдающих такими заболеваниями, где указанные способы включают этап введения композиции веществ или состава, описанного в настоящей заявке. В различных вариантах осуществления настоящее описание направлено на способ лечения заболевания МПС IIIB у субъекта, страдающего таким заболеванием, где способ включает этап введения терапевтического слитого белка, обладающего активностью фермента Naglu, или включающего его состава, как описано в настоящей заявке. В определенных вариантах осуществления состав вводят интратекально, интрацеребровентрикулярно или непосредственно в СМЖ путем люмбальной пункции, которая может быть неволюметрической или изоволюметрической. Введение терапевтического состава согласно настоящему описанию может производиться в течение от приблизительно 5 минут до приблизительно 240 минут или больше, или от приблизительно 5 минут до приблизительно 10 минут. В некоторых вариантах осуществления введение состава для лечения МПС IIIB могут производить еженедельно, в течение периода продолжительностью по меньшей мере 24 недели, предпочтительно по меньшей мере 48 недель. В одном варианте осуществления введение терапевтически эффективного количества терапевтического слитого белка или состава согласно настоящему описанию приводит к снижению тяжести, интенсивности или частоты, или задержке проявления по меньшей мере одного симптома или признака заболевания МПС IIIB.
[0017] В других аспектах настоящее описание направлено на способ замедления ухудшения или предотвращения ухудшения по меньшей мере одного симптома заболевания МПС IIIB у страдающего им субъекта, где способ включает этап введения субъекту терапевтического слитого белка, обладающего активностью Naglu, или включающего его состава. В различных вариантах осуществления состав вводят интрацеребровентрикулярно, где интрацеребровентрикулярное введение является изоволюметрическим. Введение терапевтического состава согласно настоящему описанию могут производить в течение от приблизительно 5 минут до приблизительно 240 минут или больше, или от приблизительно 5 минут до приблизительно 10 минут. В некоторых вариантах осуществления введение состава для лечения МПС IIIB могут производить еженедельно в течение периода продолжительностью по меньшей мере 24 недели, предпочтительно по меньшей мере 48 недель. Такие способы могут привести к улучшению по меньшей мере одного симптома заболевания МПС IIIB. В различных вариантах осуществления по меньшей мере один симптом заболевания МПС IIIB может быть выбран из группы, состоящей из снижения когнитивной функции, снижения языковой функции, снижения двигательной функции, снижения социально-эмоциональной функции, снижения адаптивной функции, снижения концептуального мышления, снижения распознавания лиц, снижения способности к завершению рассказов, снижения функции/ловкости рук, потери слуха, гиперактивности, агрессивности или нарушений сна.
[0018] В различных аспектах уменьшение уровня ухудшения или предотвращение ухудшения указанного по меньшей мере одного симптома может быть определено путем: (a) определения уровня ухудшения указанного симптома до указанного введения и (b) определения уровня ухудшения указанного симптома после указанного введения; при этом более низкий уровень ухудшения указанного симптома после указанного введения по сравнению с предшествующим введением указывает на снижение указанного уровня ухудшения. Эти способы могут дополнительно включать этапы определения индекса развития (DQ) для указанного субъекта перед введением и определения DQ для указанного субъекта после указанного введения, где более высокий DQ для указанного субъекта после указанного введения по сравнению с предыдущим указанным введением указывает на снижение указанного уровня ухудшения. Таким образом, в различных вариантах осуществления настоящее описание относится к способам стабилизации или уменьшения ухудшения индекса DQ у субъекта, страдающего заболеванием МПС IIIB, где способы включают введение субъекту терапевтического слитого белка или включающего его состава. Индексы развития могут быть определены с помощью средства BSID-III или KABC-II, как описано в настоящей заявке и известно в уровне техники.
[0019] В других аспектах настоящее описание направлено на снижение уровня ухудшения когнитивной функции у субъекта, страдающего заболеванием МПС IIIB, где способ включает этап введения указанному субъекту терапевтически эффективного количества терапевтического слитого белка согласно настоящему описанию или его состава, как описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления слитый белок или его состав могут вводить ИТ, ИЦВ путем или путем люмбальной пункции, где введение может быть изоволюметрическим. Введение терапевтического состава согласно настоящему описанию могут производить в течение от приблизительно 5 минут до приблизительно 240 минут или больше, или от приблизительно 5 минут до приблизительно 10 минут. В различных вариантах осуществления введение состава для лечения МПС IIIB могут производить еженедельно, в течение периода продолжительностью по меньшей мере 24 недели или в течение по меньшей мере 48 недель.
[0020] В других аспектах настоящее описание направлено на способы уменьшения или предотвращения накопления ГАГ в одной или более тканях ЦНС субъекта, страдающего лизосомным нарушением накопления, где способы включают введение терапевтически эффективного количества терапевтического слитого белка или состава, описанного в настоящей заявке. В одном варианте осуществления ГАГ представляет собой гепарансульфат, а лизосомным нарушением накопления является МПС IIIB. Как описано в настоящей заявке, введение может быть интрацеребровентрикулярным, которое может быть изоволюметрическим. В различных вариантах осуществления накопление ГАГ уменьшается в лизосомах клеток одной или более тканей ЦНС, включая, например, серое вещество, белое вещество, перивентрикулярную область, оболочки мозга, мягкую и паутинную оболочки мозга, глубокие ткани в коре головного мозга, неокортекс, мозжечок, область хвостатого ядра/скорлупы полосатого тела, молекулярный слой, глубокие области моста или продолговатого мозга, среднего мозга или комбинации двух или более из указанных выше.
[0021] В различных вариантах осуществления терапевтический слитый белок доставляется в нейроны, глиальные клетки, периваскулярные клетки, менингеальные клетки и/или нейроны спинного мозга. В некоторых вариантах осуществления введение терапевтического слитого белка или включающего его состава приводит к уменьшению накопления ГАГ в одной или более целевых тканях головного мозга или нейронах спинного мозга по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, в 1 раз, 1,5 раза или 2 раза или более по сравнению с соответствующим контролем (например, накоплением ГАГ у субъекта до лечения).
[0022] Другие признаки, объекты и преимущества настоящего описания будут ясны из последующего подробного описания. Впрочем, следует понимать, что подробное описание, несмотря на то, что в нем представлены варианты осуществления настоящего описания, приведено лишь в целях иллюстрации, а не ограничения. Различные изменения и модификации в рамках описания будут очевидны специалистам в данной области из подробного описания
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0023] На Фигуре 1 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 1) зрелого человеческого белка Naglu.
[0024] На Фигуре 2 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 5) терапевтического слитого белка BMN001.
[0025] Фигура 3 представляет собой набор графиков, на которых показаны уровни гепарансульфата (ГС) в ткани центральной нервной системы (ЦНС) (верхний график) и спинномозговой жидкости (СМЖ) (нижний график) у контрольных гетерозиготных Naglu собак и гомозиготных Naglu-нулевых собак, пораженных МПС IIIB, получавших растворитель, 12 мг BMN001 или 48 мг BMN001. Данные демонстрируют, что BMN001 снижал уровни ГС у собак с МПС IIIB до уровней, наблюдаемых у здоровых гетерозиготных собак-носителей.
2
[0026] Фигура 4 является графиком уровней ГС в ЦНС по сравнению с уровнями ГС в СМЖ, демонстрирующим сильную корреляцию (r=0,824) между уровнями ГС в этих двух компартементах.
[0027] Фигура 5 является вестерн-блотом мозжечка собак дикого типа, необработанных собак с МПС IIIB и получавших BMN001 собак с МПС IIIB, детектированным антителом, специфичным к собачьему белку LAMP2, демонстрирующим, что уровни LAMP2 у необработанных собак МПС IIIB повышены по сравнению с собаками дикого типа, и что лечение BMN001 снижает LAMP2 до уровней дикого типа у обработанных собак с МПС IIIB.
[0028] Фигура 6 является графиком, на котором показаны уровни гепарансульфата (ГС) в мозжечке контрольных гетерозиготных Naglu собак и гомозиготных Naglu-нулевых собак с МПС IIIB, получавших с растворитель, 12 мг BMN001 или 48 мг BMN001. Данные демонстрируют, что BMN001 снижал уровни ГС в мозжечке собак с МПС IIIB до уровней, наблюдаемых у здоровых гетерозиготных собак-носителей.
[0029] Фигура 7 является графиком, на котором показана средняя диффузионная способность в мозжечке контрольных гетерозиготных Naglu собак и гомозиготных Naglu собак с МПС IIIB, получавших растворитель, 12 мг BMN001 или 48 мг BMN001.
[0030] Фигура 8 является набором изображений МРТ мозжечка собак дикого типа, получавших растворитель, и собак с МПС IIIB, получавших растворитель или BMN001.
[0031] Фигура 9 является гистограммой, на которой показано, что у не подвергавшихся лечению пациентов с МПС IIIB был повышен гепарансульфат (ГС) и МПС IIIB-специфический невосстанавливающий конец (НВК) ГС в спинномозговой жидкости (СМЖ). Штриховые вертикальные линии обозначают средние нормальные значения ГС и НВК (0,05 мг/л и 0,0025 мг/л соответственно) в СМЖ. Эти данные собирали в течение по меньшей мере 24 недель с целью исследовать естественную динамику заболевания. В случае доступности показаны данные ранних и поздних моментов времени в естественной динамике.
[0032] Фигура 10 является набором графиков, на которых показано снижение ГС и НВК в СМЖ двух субъектов, получавших BMN001.
[0033] Фигуры 11A и 11B представляют собой графики, на которых показано влияние трегалозы и комбинации трегалозы-полисорбата 20 на образование агрегатов частиц после воздействия перепада давления на составы, содержащие BMN001, при перекачивании насосом.
[0034] Фигура 12 является графиком, на котором показано влияние трегалозы и комбинации трегалозы-полисорбата 20 на образование агрегатов частиц после воздействия криогенного стресса на составы, содержащие BMN001. Искусственная спинномозговая жидкость (иСМЖ) представляет собой BMN001, изготовленный без трегалозы или полисорбата 20.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0035] При использовании в настоящей заявке "лизосомные болезни накопления" относятся к группе генетических нарушений, которые возникают при дефиците по меньшей мере одного из ферментов (например, кислых гидролаз), которые требуются для расщепления макромолекул до пептидов, аминокислот, моносахаридов, нуклеиновых кислот и жирных кислот в лизосомах. В результате у больных, страдающих лизосомной болезнью накопления, в лизосомах накапливаются определенные вещества. Примеры лизосомных болезней накопления перечислены в Таблице 1.
[0036] При использовании в настоящей заявке термин "лизосомный фермент" относится к любому ферменту, который способен уменьшать уровень накопленных веществ в лизосомах млекопитающего, или который может устранять или облегчать один или более симптомов лизосомной болезни накопления. Лизосомные ферменты, подходящие в рамках настоящего описания, включают нативные или модифицированные лизосомные ферменты и могут быть получены с применением рекомбинантных и синтетических способов или очищены из природных источников. Примеры лизосомных ферментов перечислены в Таблице 1, причем такие лизосомные ферменты могут быть включены в терапевтические слитые белки, описанные в настоящей заявке.
[0037] При использовании в настоящей заявке термин "альфа-N-ацетилглюкозаминидаза человека" относится к предшественнику (т.е. содержащему последовательность нативного сигнального пептида) или процессированной (т.е. не имеющей последовательности нативного сигнального пептида) форме дикого типа человеческой альфа-N-ацетилглюкозаминидазы, или ее функциональному фрагменту или варианту, который способен уменьшать уровни гликозаминогликанов (ГАГ) в лизосомах млекопитающих, или который может устранять или облегчать один или более симптомов МПС IIIB (синдрома Санфилиппо B). В одном варианте осуществления человеческий фермент Naglu, который применяется в настоящей заявке, включает или состоит из аминокислотной последовательности, показанной на Фигуре 1 (SEQ ID NO: 1).
[0038] При использовании в настоящей заявке термин "функциональный", применяемый в отношении лизосомного фермента, слитого белка, включающего лизосомный фермент, или их фрагмента, относится к полипептиду, обладающему способностью к захвату лизосомами млекопитающего и обладающему достаточной ферментной активностью для уменьшения уровня накапливаемого вещества, т.е. гликозаминогликана (ГАГ), в лизосоме млекопитающего.
[0039] При использовании в настоящей заявке термин "спейсер" (также называемый "линкером") относится к последовательности пептида, расположенной между двумя частями белка в слитом белке. Спейсер обычно подбирают так, чтобы он был гибким или вводил определенную структуру, такую как альфа-спираль, между двумя частями белка. Спейсер может иметь различную длину, такую как, например, 10-50, 20-40 или 25-35 аминокислот. Примеры спейсерных последовательностей раскрыты в настоящем описании более подробно.
[0040] При использовании в настоящей заявке термины "улучшают", "увеличивают" или "уменьшают", или соответствующие грамматические эквиваленты, указывают значения, которые относятся к исходному измерению, такому как измерение у того же пациента до начала лечения, описанного в настоящей заявке, или измерение у контрольного пациента (или множества контрольных пациентов) без лечения, описанного в настоящей заявке. "Контрольный пациент" является пациентом, страдающим такой же формой лизосомной болезни накопления (например, МПС IIIB (синдромом Санфилиппо B)), как и подвергаемый лечению пациент, имеет такой же возраст, как и подвергаемый лечению пациент (чтобы гарантировать, что стадии болезни у подвергаемого лечению пациента и контрольного пациента(ов) совпадают).
[0041] При использовании в настоящей заявке термины "облегчает", "облегчение" и их грамматические эквиваленты подразумевают предотвращение, снижение или уменьшение тяжести состояния или симптома заболевания, стабилизацию при ухудшении состояния или симптома заболевания или улучшение состояния или симптома заболевания у субъекта. Улучшение включает, но не требует полного восстановления или полного предотвращения заболевания. В некоторых вариантах осуществления улучшение включает уменьшение уровня накапливаемых веществ в лизосомах тканей, соответствующих лизосомной болезни накопления.
[0042] При использовании в настоящей заявке термины "субъект", "индивид" или "пациент" относятся к человеку или не относящемуся к человеку субъекту-млекопитающему. Подвергаемый лечению индивид (также называемый "пациентом" или "субъектом") является индивидом (плодом, младенцем, ребенком, подростком или взрослым), страдающим лизосомной болезнью накопления, например, МПС IIIB (синдромом Санфилиппо B) (т.е. МПС IIIB (синдромом Санфилиппо B) с манифестацией в младенческом, подростковом или зрелом возрасте, тяжелого/классического типа или ослабленного типа), или с вероятностью развития лизосомной болезни накопления (например, МПС IIIB (синдрома Санфилиппо B)).
[0043] При использовании в настоящей заявке термин "терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" относится к количеству терапевтического слитого белка направленного действия (или содержащего его состава), который оказывает терапевтический эффект в отношении субъекта, подвергаемого лечению, с разумным отношением пользы/риска, применимым к любому медицинскому вмешательству. Терапевтический эффект может быть объективным (т.е. измеряемым с помощью некоторого анализа или маркера) или субъективным (т.е. субъект описывает или ощущает эффект). В частности "терапевтически эффективное количество" относится к количеству терапевтического слитого белка или соответствующей фармацевтической композиции, эффективной для лечения, облегчения или предотвращения определенного заболевания или состояния, или проявления поддающегося обнаружению терапевтического или профилактического действия, например, при облегчении симптомов, связанных с заболеванием, предотвращении или задержке возникновения заболевания, и/или также уменьшении тяжести или частоты симптомов заболевания. Терапевтически эффективное количество обычно вводят согласно схеме применения, которая может включать множество стандартных доз. Для любого конкретного терапевтического слитого белка терапевтически эффективное количество (и/или соответствующая стандартная доза в рамках эффективной схемы применения) может изменяться, например, в зависимости от пути введения, от комбинации с другими фармацевтическими средствами. Кроме того, конкретное терапевтически эффективное количество (и/или стандартная доза) для любого конкретного пациента может зависеть от множества факторов, в том числе нарушения, подвергаемого лечению, и тяжести нарушения; активности конкретного применяемого фармацевтического средства; конкретной применяемой композиции; возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и питания пациента; времени введения, способа введения и/или скорости экскреции или метаболизма конкретного применяемого слитого белка; продолжительности лечения; и подобных факторов, хорошо известных в медицине.
[0044] При использовании в настоящей заявке термин "лечение" (также "лечить" или "лечащий") относится к любому введению терапевтического слитого белка или фармацевтической композиции, включающей указанный терапевтический слитый белок, которые частично или полностью облегчают, улучшают, снимают, ингибируют, задерживают возникновение, уменьшают тяжесть и/или уменьшают число случаев одного или более симптомов или признаков конкретного заболевания, нарушения и/или состояния. Такое лечение может применяться в отношении субъекта, который не демонстрирует признаки соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния, и/или субъекта, который демонстрирует только ранние симптомы заболевания, нарушения и/или состояния.
[0045] Альтернативно или дополнительно, такое лечение может применяться в отношении субъекта, который демонстрирует один или более установленных признаков соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния. Например, лечение может относиться к улучшению кардиального статуса (например, увеличение конечно-диастолического и/или конечно-систолического объемов, или уменьшение, улучшение или предотвращение прогрессирующей кардиомиопатии, которую, как правило, обнаруживают, например, при болезни Помпе) или легочной функции (например, увеличение жизненной емкости при крике по сравнению с исходной емкостью и/или нормализации кислородной десатурации при крике); улучшению неврологического развития и/или моторных навыков (например, увеличение оценки по шкале AIMS); уменьшению уровней накопления (например, гликозаминогликана (ГАГ)) в ткани пациента, пораженного заболеванием; или любой комбинации указанных эффектов. В некоторых вариантах осуществления лечение включает улучшение клиренса ГАГ, особенно при уменьшении или предотвращении нейрональных симптомов, ассоциированных с МПС IIIB (синдромом Санфилиппо B).
[0046] "Стабильная" или "стабилизированная" белоксодержащая композиция является композицией, в которой белковый компонент по существу сохраняет свою физическую, функциональную и/или химическую стабильность при хранении в течение длительного периода времени. Стабильность может быть измерена при выбранной температуре в течение выбранного периода времени. Предпочтительно композиция является стабильной при комнатной температуре (приблизительно 30°C) или при 40°C в течение по меньшей мере 1, 3, 6 или 12 месяцев или больше, стабильной приблизительно при 2-8°C в течение по меньшей мере 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 или 48 месяцев или больше, или стабильной при -30°C, -40°C или -60°С в течение по меньшей мере 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 или 48 месяцев или больше. В одном аспекте степень деградации или агрегации белка при хранении может использоваться в качестве показателя стабильности белка. Таким образом, "стабильная" состав может быть такой, в которой меньше чем приблизительно 20%, более предпочтительно меньше чем приблизительно 10% и наиболее предпочтительно меньше чем приблизительно 5%, 4%, 3%, 2% или 1% белкового компонента присутствует в недеградированной или неагрегированной форме. "Стабильные" составы сохраняют по существу такие же функциональные или терапевтические характеристики, или такую же физическую и/или химическую целостность, как у только что изготовленного состава. Различные аналитические методы для измерения стабильности белка доступны в данной области и рассматриваются, например, в публикациях Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993).
[0047] Под "изоволюметрическим" в отношении интратекального введения фармацевтической композиции в СМЖ субъкта подразумевается, что перед введением указанного объема фармацевтической композиции приблизительно такой же объем СМЖ забирают у субъекта, поддерживая, таким образом, приблизительно такой же объем жидкости в компартементе СМЖ субъекта, подвергаемого лечению.
[0048] При использовании в настоящей заявке термины "приблизительно" и "примерно" используются как эквиваленты. Подразумевается, что любые числа, используемые в настоящей заявке с или без приблизительно/примерно, охватывают любые стандартные колебания, как известно среднему специалисту в соответствующей области техники.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0049] В настоящем описании предложены композиции, составы и способы для эффективного лизосомного таргетинга терапевтических слитых белков на основе технологии GILT. Помимо прочего в настоящем описании предложены способы и композиции для направленной доставки терапевтических лизосомных ферментов в лизосомы с применением лизосомных направляющих пептидов для лечения лизосомных нарушений накопления. В настоящем описании также предложены способы и композиции для направленной доставки лизосомных ферментов в лизосомы с применением лизосомного направляющего пептида, который обладает уменьшенной или сниженной аффинностью связывания с рецептором IGF-I и/или уменьшенной или сниженной аффинностью связывания с инсулиновым рецептором, и/или является устойчивым к расщеплению фурином. В настоящем описании также предложены слитые белки направленного действия на основе лизосомных ферментов, включающие лизосомный фермент и IGF-II, и спейсерные пептиды, которые обеспечивают улучшенную продукцию и захват в лизосомах слитого белка на основе лизосомного фермента. В настоящем описании также предложены составы, которые включают слитый белок направленного действия на основе лизосомного фермента, и их применение для лечения или профилактики лизосомной болезни накопления.
[0050] Различные аспекты настоящего описания подробно описаны в следующих разделах. Использование разделов не подразумевает ограничение настоящего описания. Каждый раздел может относиться к любому аспекту настоящего описания. В настоящей заявке использование "или" означает "и/или", если не указано иное.
Лизосомные ферменты
[0051] Лизосомный фермент, подходящий для включения в терапевтические слитые белки или составы настоящего описания, включает любой фермент, который способен уменьшать уровень накапливаемых материалов в лизосомах млекопитающего, или который может устранять или облегчать один или более симптомов лизосомной болезни накопления. Подходящие лизосомные ферменты включают нативные или модифицированные лизосомные ферменты (и их функциональные фрагменты) и могут быть получены с помощью рекомбинантных или синтетических способов или очищены из природных источников. Примеры лизосомных ферментов перечислены в Таблице 1.
Таблица 1. Лизосомные болезни накопления и ассоциированные лизосомные болезни накопления
<b>A. Гликогенозы</b>
<b>Название заболевания</b>
<b>Нарушение функции фермента</b>
<b>Накапливаемое вещество</b>
Болезнь Помпе
Кислая α1,4-глюкозидаза
Гликоген α1,4-связанные олигосахариды
<b>B. Гликолипидозы</b>
<b>Название заболевания</b>
<b>Нарушение функции фермента</b>
<b>Накапливаемое вещество</b>
GM1 ганглиозидоз
β-Галактозидаза
GM1 ганглиозиды
Болезнь Тея-Сакса
β-Гексозаминидаза A
GM2 ганглиозид
GM2 ганглиозидоз: AB вариант
GM2 активирующий белок
GM2 ганглиозид
Болезнь Сандхоффа
β-Гексозаминидаза A и B
GM2 ганглиозид
Болезнь Фабри
α-Галактозидаза A
Глобозиды
Болезнь Гоше
Глюкоцереброзидаза
Глюкозилцерамид
Метахроматическая лейкодистрофия
Арилсульфатаза A
Сульфатиды
Болезнь Краббе
Галактозилцерамидаза
Галактоцереброзид
Болезнь Ниманна-Пика, типы A и B
Кислая сфингомиелиназа
Сфингомиелин (СМ)
Болезнь Ниманна-Пика, тип C
Нарушение этерификации холестерина
СМ
Болезнь Ниманна-Пика, тип D
Неизвестно
СМ
Болезнь Фарбера
Кислая церамидаза
Церамид
Болезнь Вольмана
Кислая липаза
Холестериловые эфиры
<b>C. Мукополисахаридозы</b>
<b>Название заболевания</b>
<b>Нарушение функции фермента</b>
<b>Накапливаемое вещество</b>
Синдром Гурлер (МПС IH)
α-L-идуронидаза
Гепарансульфат (ГС) и дерматансульфат (ДС)
Синдром Шейе (МПС IS)
α-L-идуронидаза
ГС и ДС
Гурлер-Шейе (МПС IH/S)
α-L-идуронидаза
ГС и ДС
Синдром Хантера(МПС II)
Идуронатсульфатаза
ГС и ДС
Санфилиппо A (МПС IIIA)
Гепаран-N-сульфатаза
ГС
Санфилиппо B (МПС IIIB)
α-N-ацетилглюкозаминидаза
ГС
Санфилиппо C (МПС IIIC)
Ацетил-КоА-глюкозаминид-ацетилтрансфераза
ГС
Санфилиппо D (МПС IIID)
N-Ацетилглюкозамин-6-сульфатаза
ГС
Моркио A (МПС IVA)
Галактозамин-6-сульфатаза
Кератансульфат (КС)
Моркио B (МПС IVB)
β-Галактозидаза
КС
Марото-Лами (МПС VI)
Арилсульфатаза B
ДС
Синдром Слая (МПС VII)
β-Глюкуронидаза
ДС, ГС и хондроитинсульфат
<b>D. Олигосахаридозы/гликопротеинозы</b>
<b>Название заболевания</b>
<b>Нарушение функции фермента</b>
<b>Накапливаемое вещество</b>
α-Маннозидоз
α-Маннозидаза
Манноза/олигосахариды
β-Маннозидоз
β-Маннозидаза
Манноза/олигосахариды
Фукозидоз
α-L-Фукозидаза
Фукозилолигосахариды
Аспартилглюкозаминурия
N-аспартил-β-глюкозаминидаза
Аспартилглюкозамин аспарагины
Сиалидоз (муколипидоз I)
α-Нейраминидаза
Сиалилолигосахариды
Галактосиалидоз (синдром Гольдберга)
Недостаточность лизосомного белка-стабилизатора
Сиалилолигосахариды
Болезнь Шиндлера
α-N-ацетил-галактозаминидаза
Разные
<b>E. Нарушения транспорта лизосомных ферментов</b>
<b>Название заболевания</b>
<b>Нарушение функции фермента</b>
<b>Накапливаемое вещество</b>
Муколипидоз II (I-клеточная болезнь)
N-ацетилглюкозамин-1-фосфотрансфераза
ГС
Муколипидоз III (псевдополидистрофия Гурлер)
Такой же, как при МЛ II
ГС
<b>F. Нарушения лизосомного мембранного транспорта</b>
<b>Название заболевания</b>
<b>Нарушение функции фермента</b>
<b>Накапливаемое вещество</b>
Цистиноз
Транспортный белок цистина
Свободный цистин
Болезнь Салла
Транспортный белок сиаловой кислоты
Свободная сиаловая кислота и глюкуроновая кислота
Болезнь накопления сиаловой кислоты у детей
Транспортный белок сиаловой кислоты
Свободная сиаловая кислота и глюкуроновая кислота
<b>G. Прочие</b>
<b>Название заболевания</b>
<b>Нарушение функции фермента</b>
<b>Накапливаемое вещество</b>
Болезнь Баттена
Неизвестно
Липофусцины
Нейрональный цероидный липофусциноз у детей
Пальмитоил-протеинтиоэстераза
Липофусцины
Поздний нейрональный цероидный липофусциноз у детей
Трипептидилпептидаза I
Липофусцины
Муколипидоз IV
Неизвестно
Ганглиозиды и гиалуроновая кислота
Просапозин
Сапозины A, B, C или D
[0052] В некоторых вариантах осуществления лизосомный фермент, рассматриваемый в настоящей заявке, имеет аминокислотную последовательность, обладающую от приблизительно 90% до приблизительно 100%, включая 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и 100%, идентичностью последовательности с природной аминокислотной последовательностью человеческого фермента, показанного в Таблице 1, или его зрелой формой, которая при этом все еще кодирует белок, который является функциональным, т.е. способен уменьшать уровень накапливаемых веществ, например ГАГ, в лизосомах млекопитающего, или который может устранять или облегчать один или более симптомов лизосомной болезни накопления. Последовательности вышеуказанных ферментов известны специалистам в данной области и доступны в открытых базах данных, таких как Национальный центр биотехнологической информации, поддерживаемый Национальной медицинской библиотекой США.
[0053] "Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей" в отношении рассматриваемой и референсной аминокислотных последовательностей определяется как процент аминокислотных остатков в рассматриваемой последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в соответствующей референсной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения пропусков, при необходимости, для получения максимального процента идентичности последовательностей и без учета каких-либо консервативных замен в качестве части идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может быть выполнено различными способами, которые известны в уровне техники, например, при использовании общедоступных программ, таких как программы BLAST, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для выполнения выравнивания, включая любые алгоритмы, требуемые для получения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Предпочтительно для определения идентичности аминокислотных последовательностей используется программа WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460- 480 (1996)). В WU-BLAST-2 используется несколько параметров поиска, большинство из которых установлено со значениями по умолчанию. Регулируемые параметры установлены со следующими значениями: длина перекрывания=1, доля перекрывания=0.125, пороговая длина слова (T)=11. Балл HSP (S) и параметры HSP S2 являются динамическими значениями и устанавливаются самой программой в зависимости от состава конкретной последовательности, однако минимальные значения можно регулировать и устанавливать, как указано выше. В других вариантах осуществления % идентичности последовательности двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей может быть определен при использовании средств глобального выравнивания последовательностей Needle (EMBOSS) или Stretcher (EMBOSS), доступных по адресу http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/, при использовании параметров по умолчанию, включенных в них (полностью включенных в настоящую заявку посредством отсылки).
Альфа-N-ацетилглюкозаминидаза
[0054] Альфа-N-ацетилглюкозаминидаза, Naglu, продуцируется в виде молекулы-предшественника, которая процессируется в зрелую форму. Этот процесс обычно проходит с удалением сигнального пептида из 23 аминокислот при перемещении белка в эндоплазматический ретикулум. Как правило, форму предшественника также назавают полноразмерным предшественником или полноразмерным белком Naglu, который содержит 743 аминокислоты. 23 N-концевых аминокислоты удаляются при перемещении белка-предшественника в эндоплазматический ретикулум с образованием процессированной или зрелой формы. Таким образом, предполагается, что 23 N-концевых аминокислоты нативного полноразмерного белка Naglu человека обычно не требуются для белковой активности Naglu. Аминокислотная последовательность зрелой формы белка Naglu человека показана на Фигуре 1 и представлена в SEQ ID NO: 1. Последовательность мРНК Naglu человека описана в GenBank под регистрационным номером NM_000263. В различных вариантах осуществления настоящего описания Naglu является Naglu человка с (аминокислоты 1-743) или без (аминокислоты 24-743) соответствующей сигнальной последовательности. В предпочтительном варианте осуществления лизосомный фермент Naglu, включенный в терапевтический слитый белок, имеет аминокислотную последовательность, показанную на Фигуре 1 (SEQ ID NO: 1). В наиболее предпочтительном варианте осуществления Naglu-содержащий слитый белок имеет аминокислотную последовательность, показанную на Фигуре 2 (SEQ ID NO: 5). В других вариантах осуществления слитый белок содержит функциональный фрагмент зрелого белка Naglu человека, где фрагмент обычно имеет длину по меньшей мере 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 или 700 или более аминокислот.
Мукополисахаридоз III B (синдром Санфилиппо B)
[0055] Одним из примеров лизосомной болезни накопления является заболевание мукополисахаридоз III B (МПС IIIB), также известный как синдром Санфилиппо типа B. МПС IIIB, синдром Санфилиппо B, является редким аутосомно-рецессивным генетическим нарушением, которое характеризуется дефицитом фермента альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (Naglu). В отсутствие этого фермента гликозаминогликаны (ГАГ), например ГАГ гепарансульфат и частично расщепленные молекулы ГАГ, не могут выводиться из тела и накопливаются в лизосомах различных тканей, что приводит к прогрессирующей обширной соматической дисфункции (Kakkis et al., N Engl J Med. 344(3):182-8 (2001)). Было показано, что ГАГ накапливаются в лизосомах нейронов и глиальных клеток с меньшим накоплением вне головного мозга.
[0056] Были определены четыре различных формы МПС III, обозначенные МПС IIIA, B, C и D. Каждая форма представляет собой недостаточность одного из четырех ферментов, участвующих в расщеплении ГАГ гепарансульфата. Все формы включают разные степени аналогичных клинических симптомов, включающих грубые черты лица, гепатоспленомегалию, помутнение роговицы и скелетные деформации. Наиболее заметна, однако, тяжелая и прогрессирующая потеря когнитивных способностей, которая связана не только с накоплением гепарансульфата в нейронах, но и с последующим повышением GM2, GM3 и GD2 ганглиозидов, вызванным накоплением первичных ГАГ (Walkley et al., Ann NY Acad Sci. 845:188-99 (1998)).
[0057] Характерным клиническим симптомом синдрома Санфилиппо B является дегенерация центральной нервной системы (ЦНС), которая приводит к потере или неспособности достичь основных этапов развития. Прогрессирующее ухудшение когнитивных способностей приводит к деменции и преждевременной смерти. Заболевание, как правило, проявляется у маленьких детей, при этом продолжительность жизни больного человека обычно не выходит за пределы позднего подросткового возраста или двадцать с небольшим лет.
[0058] Все заболевания МПС III имеют сходные симптомы, которые обычно проявляются у маленьких детей. Больные дети внешне нормальные, хотя может наблюдаться некоторый легкий лицевой дисморфизм. Контрактуры суставов, гипертрихоз и грубые волосы, характерные для других мукополисахаридоз, обычно отсутствуют до поздней стадии заболевания. После первоначального бессимптомного интервала у пациентов обычно проявляется замедление развития и/или поведенческие нарушения с последующим прогрессирующим снижением интеллекта, приводящим к тяжелой деменции и прогрессирующему моторному нарушению. Приобретение речевых навыков часто замедленое и неполное. Заболевание прогрессирует с увеличением поведенческих нарушений, включая перепады настроения, гиперактивность, деструктивное поведение, агрессивное поведение, извращение вкуса и нарушение сна. Поскольку больные дети имеют нормальную мышечную силу и двигательную функцию, поведенческие расстройства очень сложно контролировать. На конечном этапе болезни дети становятся все более неподвижными и нереагирующими, часто нуждаются в инвалидных колясках, а также начинают испытывать затруднения при глотании и приступы судорог. Продолжительность жизни больного ребенка обычно не выходит за пределы позднего подросткового возраста или двадцать с небольшим лет.
[0059] Фермент альфа-N-ацетилглюкозаминидаза, подходящий для лечения МПС IIIB (синдрома Санфилиппо B), включает нативную альфа-N-ацетилглюкозаминидазу человека, ее функциональный фрагмент или вариант последовательности, который сохраняет способность к захвату лизосомами млекопитающих и способность к гидролизу альфа-1,4-связей в концевом остатке N-ацетил-D-глюкозамина в линейных олигосахаридах, или терапевтический слитый белок направленного действия, который включает человеческий фермент Naglu дикого типа или его функциональный фрагмент. В определенных вариантах осуществления белки, включающие или состоящие из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 5, найдут применение для лечения МПС IIIB.
[0060] Эффективность лечения МПС IIIB с применением терапевтических слитых белков направленного действия, описанных в настоящей заявке, может быть измерена с помощью способов, известных в уровне техники, а также анализа лизосомных и нейронных биомаркеров. Первоначальные эксперименты проводили на животных с нокаутом Naglu (см. Li et al., Proc Natl Acad Sci USA 96:14505-510 (1999)). Нокауты Naglu характеризуются большими количествами гепарансульфата в печени и почках и повышением ганглиозидов в головном мозге.
[0061] Анализы включают анализ активности и биораспределения экзогенного фермента, уменьшение накопления ГАГ в лизосомах, особенно в клетках головного мозга, и активацию астроцитов и микроглии. Уровни различных лизосомных или нейронных биомаркеров включают, без ограничения, ассоциированный с лизосомами мембранный белок 1 (LAMP1), глипикан, ганглиозиды, холестерин, C субъединицу митохондриальной АТФ-синтазы (SCMAS), убиквитин, P-GSK3b, бета-амилоид и фосфо-тау. Анализ выживаемости и поведенческий анализ также проводили с применением способов, известные в данной области.
[0062] В различных вариантах осуществления лечение лизосомной болезни накопления относится к уменьшению лизосомного накопления (например, ГАГ) в различных тканях. В различных вариантах осуществления лечение относится к уменьшению лизосомного накопления в целевых тканях головного мозга, нейронах спинного мозга и/или периферических целевых тканях. В некоторых вариантах осуществления лизосомное накопление уменьшается приблизительно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% или более по сравнению с не подвергавшимся лечению контрольным субъектом. В различных вариантах осуществления лизосомное накопление уменьшено по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше по сравнению с контрольным субъектом.
[0063] В различных вариантах осуществления лечение относится к увеличенной ферментной активности в различных тканях. В различных вариантах осуществления лечение относится к увеличенной ферментной активности в целевых тканях головного мозга, нейронах спинного мозга и/или периферических целевых тканях. В различных вариантах осуществления ферментная активность увеличена приблизительно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% или более по сравнению с контролем. В различных вариантах осуществления ферментная активность увеличена по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше по сравнению с контролем. В различных вариантах осуществления увеличенная ферментативная активность составляет по меньшей мере приблизительно 10 нмоль/ч/мг, 20 нмоль/ч/мг, 40 нмоль/ч/мг, 50 нмоль/ч/мг, 60 нмоль/ч/мг, 70 нмоль/ч/мг, 80 нмоль/ч/мг, 90 нмоль/ч/мг, 100 нмоль/ч/мг, 150 нмоль/ч/мг, 200 нмоль/ч/мг, 250 нмоль/ч/мг, 300 нмоль/ч/мг, 350 нмоль/ч/мг, 400 нмоль/ч/мг, 450 нмоль/ч/мг, 500 нмоль/ч/мг, 550 нмоль/ч/мг, 600 нмоль/ч/мг или больше. В различных вариантах осуществления лизосомным ферментом является Naglu.
Ферментозаместительная терапия
[0064] Ферментозаместительная терапия (ФЗТ) представляет собой терапевтическую стратегию коррекции ферментной недостаточности путем инфузии отсутствующего фермента в кровоток или другую ткань тела пациента. При перфузии ткани пациента кровью фермент захватывается клетками и транспортируется в лизосому, где фермент проявляет активность, устраняя материал, который накапливается в лизосомах вследствие ферментной недостаточности. Чтобы заместительная терапия лизосомным ферментом была эффективной, терапевтический фермент нужно доставлять в лизосомы соответствующих клеток в тканях, в которых проявляется нарушение накопления. Стандартные препараты для заместительной терапии лизосомными ферментами доставляют с применением углеводов, которые обычно присоединены к белку для связывания со специфическими рецепторами на поверхности клеток-мишеней. Один из рецепторов, катион-независимый рецептор M6P (CI-MPR), является наиболее подходящим при направленной доставке лизосомных ферментов для заместительной терапии, поскольку CI-MPR присутствует на поверхности большинства типов клетки.
[0065] Термины "катион-независимый манноза-6-фосфатный рецептор (CI-MPR)", "рецептор M6P/IGF-II", "рецептор CI-MPR/IGF-II", "рецептор IGF-II" или "рецептор IGF2" или соответствующие сокращения используются попеременно в настоящей заявке для обозначения клеточного рецептора, который связывает M6P и IGF-II.
Независимый от гликозилирования лизосомный таргетинг
[0066] Технология независимого от гликозилирования лизосомного таргетинга (GILT) была разработана для направленной доставки терапевтических ферментов в лизосомы. В частности, в технологии GILT вместо M6P применяют пептидную метку для захвата CI-MPR с целью направленной лизосомной доставки. Как правило, метка GILT представляет собой белок, пептид или другую молекулу, которая связывает CI-MPR независимо от манноза-6-фосфата. Преимущество данной технологии состоит в том, что она воспроизводит естественный биологический механизм захвата лизосомных ферментов, но при этом функционирует независимо от манноза-6-фосфата.
[0067] Предпочтительную метку GILT получают из инсулиноподобного фактора роста II человека (IGF-II). Человеческий IGF-II является высокоаффинным лигандом CI-MPR, который также называют рецептором IGF-II. Связывание GILT-меченых терапевтических ферментов с рецептором M6P/IGF-II обеспечивает направленную доставку белка в лизосому по эндоцитозному пути. Этот способ обладает множеством преимуществ по сравнению со способами, включающими гликозилирование, в том числе простотой и рентабельностью, поскольку после выделения белка никакие дополнительные модификации не требуются.
[0068] Подробное описание технологии GILT и меток GILT можно найти в публикациях заявок на патент США 2003-0082176, 2004-0006008, 2003-0072761, 2005-0281805, 2005-0244400, патентах США 8,492,337 и 8,563,691 и международных заявках WO 03/032913, WO 03/032727, WO 02/087510, WO 03/102583, WO 2005/078077, WO 2009/137721 и WO 2014/085621, описания которых настоящим включены посредством отсылки.
[0069] В различных вариантах осуществления метка GILT является фурин-устойчивой меткой GILT, аминокислотная последовательность которой показана в настоящей заявке как SEQ ID NO: 3 (см., например, патент США 8,563,691).
Аффинность связывания с инсулиновым рецептором
in vitro
in vivo
[0070] Многие мутеины IGF-II, включая фурин-устойчивые мутеины IGF-II, обладают уменьшенной или сниженной аффинностью связывания с инсулиновым рецептором. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления пептидная метка, подходящая в рамках настоящего описания, обладает уменьшенной или сниженной аффинностью связывания с инсулиновым рецептором по сравнению с аффинностью природного человеческого IGF-II к инсулиновому рецептору. В некоторых вариантах осуществления пептидные метки с уменьшенной или сниженной аффинностью связывания с инсулиновым рецептором, подходящие в рамках настоящего описания, включают пептидные метки, обладающие аффинностью связывания с инсулиновым рецептором, которая более чем в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 12 раз, 14 раз, 16 раз, 18 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз меньше, чем аффинность связывания зрелого человеческого IGF-II дикого типа. Аффинность связывания с инсулиновым рецептором может быть измерена при использовании различных  и  анализов, известных в уровне техники.
Введение терапевтических белков и составов
[0071] В соответствии с настоящим описанием, терапевтический слитый белок согласно настоящему описанию, как правило, вводят пациенту отдельно или в композициях или лекарственных препаратах, содержащих терапевтический белок (например, при производстве лекарственного препарата для лечения заболевания), как описано в настоящей заявке. Композиции могут быть изготовлены с одним или более физиологически приемлемыми носителями или вспомогательными веществами с получением фармацевтической композиции. Носители и композиции могут быть стерильными. Состав должна соответствовать способу введения.
[0072] Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, без ограничения перечисленными, воду, растворы солей (например, NaCl), раствор хлорида натрия, буферизированный раствор хлорида натрия, спирты, глицерин, этанол, гуммиарабик, растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, желатин, углеводы, такие как лактозу, амилозу или крахмал, сахара, такие как маннит, сахарозу или другие, декстрозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, парфюмерное масло, сложные эфиры жирных кислот, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.д., а также их комбинации. Фармацевтические препараты при необходимости могут быть смешаны со вспомогательными веществами (например, смазывающими веществами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими веществами, эмульгаторами, солями для создания осмотического давления, буферными веществами, красителями, вкусовыми и/или ароматическими веществами и т.п.), которые не проявляют нежелательного взаимодействия с действующими соединениями или оказывают нежелательное влияние на их активность.
[0073] Композиция или лекарственное средство при необходимости могут также содержать небольшие количества смачивающих или эмульгирующих веществ или pH-буферных веществ. Композиция может быть жидким раствором, суспензией, эмульсией, таблеткой, пилюлей, капсулой, составом с замедленным высвобождением или порошком. Композиция может быть также изготовлена в виде суппозитория с традиционными связующими веществами и носителями, такими как триглицериды. Состав для приема внутрь может включать стандартные носители, такие как фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, поливинилпирролидона, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и т.д.
[0074] Как правило, компоненты доставляют отдельно или смешивают вместе в стандартном дозированном составе, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметичном контейнере, таком как ампула или пакет с указанием количества действующего компонента. В случае, когда композицию требуется вводить путем инфузии, ее можно дозировать при помощи инфузионного флакона, содержащего стерильную воду для фармацевтического применения, раствор натрия хлорида или декстрозу/воду. В случае, когда композицию вводят путем инъекции, может быть предоставлена ампула со стерильной водой для инъекций или раствор натрия хлорида, чтобы компоненты можно было смешивать перед введением.
[0075] Терапевтический белок может быть включен в состав нейтральных или солевых составов. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные со свободными аминогруппами, такими как соли, полученные из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и соли, образованные со свободными карбоксильными группами, такими как соли, полученные из гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция, трехвалентного железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, новокаина и т.д.
[0076] Терапевтический белок (или композиция или лекарственное средство, содержащее терапевтический белок) вводят любым подходящим путем. В различных вариантах осуществления терапевтический белок вводят внутривенно. В других вариантах осуществления терапевтический белок вводят путем прямого введения в целевые ткани, такие как сердце или мышцу (например, внутримышечно) или нервную систему (например, прямая инъекция в головной мозг, ЦНС, СМЖ; интрацеребровентрикулярно; интратекально). В различных вариантах осуществления терапевтический белок вводят интратекально. Способы интратекального введения терапевтических слитых белков известны в уровне техники (см., например, патенты США 7,442,372 и 9,044,473). В альтернативе терапевтический белок (или композицию или лекарственное средство, содержащее терапевтический белок) могут вводить парентерально, трансдермально или трансмукозально (например, перорально или назально). При необходимости параллельно может использоваться больше чем один путь, например, терапевтический белок вводят внутривенно и интратекально. Параллельное внутривенное и интратекальное введение не должно быть одновременным и может быть последовательным.
[0077] Терапевтический белок (или композиция или лекарственное средство, содержащее терапевтический белок) могут вводить отдельно или в сочетании с другими средствами, такими как антигистаминные средства (например, дифенгидрамин) или иммунодепрессанты или другие иммунотерапевтические средства, которые препятствуют воздействию антител против GILT-меченых лизосомных ферментов. Термин "в сочетании с" указывает, что средство вводят до, приблизительно в одно и то же время или после терапевтического белка (или композиции или лекарственного средства, содержащего терапевтический белок). Например, средство может быть смешано в композиции, содержащей терапевтический белок, и, таким образом, введено одновременно с терапевтическим белком; в альтернативе средство может быть введено одновременно, без смешивания (например, при "поочередной" доставке средства через внутривенный катетер, через который также вводят терапевтический белок, или наоборот). В другом примере средство могут вводить отдельно (например, без смешивания), но в течение небольшого периода времени (например, в течение 24 часов) после введения терапевтического белка.
in vitro
in vivo
in vitro
[0078] Терапевтический белок (или композицию или лекарственное средство, содержащее терапевтический белок) вводят в терапевтически эффективном количестве (т.е. в дозе, величина которой, в случае введения через равные интервалы, является достаточной для лечения заболевания, например, путем облегчения симптомов, связанных с заболеванием, предотвращения или задержки начала заболевания, и/или также снижения тяжести или частоты симптомов заболевания, как описано выше). Доза, которая будет терапевтически эффективной для лечения заболевания, будет зависеть от характера и степени эффектов заболевания и может быть определена с помощью стандартных клинических методов. Кроме того,  или  анализы необязательно могут применяться для содействия в определении оптимальных диапазонов дозы с применением способов, известных в уровне техники. Точная доза, которая будет использоваться, будет также зависеть от пути введения и тяжести заболевания, и должна быть определена согласно решению практикующего специалиста и в зависимости от случая каждого пациента. Эффективные дозы можно экстраполировать на основе кривых зависимости доза-эффект, полученных с помощью систем тестирования  или в моделях на животных. В различных вариантах осуществления величина терапевтически эффективной дозы может составлять, например, приблизительно 0,1-1 мг/кг, приблизительно 1-5 мг/кг, приблизительно 2,5-20 мг/кг, приблизительно 5-20 мг/кг, приблизительно 20-50 мг/кг или приблизительно 20-100 мг/кг, или приблизительно 50-200 мг/кг, или приблизительно 2,5-20 мг/кг массы тела. Эффективная доза для конкретного пациента может изменяться (например, увеличиваться или уменьшаться) с течением времени, в зависимости от потребностей пациента. Например, во время соматического заболевания или стресса, или в случае ухудшения симптомов заболевания, величина дозы может быть увеличена.
[0079] Терапевтически эффективное количество терапевтического белка (или композиции или лекарственного средства, содержащего терапевтический белок) вводят через равные интервалы, в зависимости от характера и степени эффектов заболевания, и на постоянной основе.
[0080] Введение через "интервал" при использовании в настоящей заявке указывает, что терапевтически эффективное количество вводят периодически (в отличие от разовой дозы). Интервал может быть определен с помощью стандартных клинических методов. В некоторых вариантах осуществления терапевтический белок вводят раз в два месяца, раз в месяц, два раза в месяц, раз в три недели, раз в две недели, раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю или ежедневно. Интервал между введениями для одного пациента не должен быть фиксированным интервалом и может изменяться с течением времени, в зависимости от потребностей пациента. Например, во время соматического заболевания или стресса, или если симптомы заболевания ухудшаются, интервал между введениями доз может быть уменьшен.
[0081] При использовании в настоящей заявке термин "раз в два месяца" означает введение один раз в течение двух месяцев (т.е. один раз в два месяца); термин "раз в месяц" означает введение один раз в месяц; термин "раз в три недели" означает введение один раз в течение трех недель (т.е. один раз в три недели); термин "один раз в две недели" означает введение один раз в течение двух недель (т.е. один раз в две недели); термин "раз в неделю" означает введение один раз в неделю; и термин "ежедневно" означает введение один раз в течение суток.
[0082] Настоящее описание дополнительно относится к фармацевтической композиции, включающей терапевтический белок, как описано в настоящей заявке, в контейнере (например, флаконе, бутылке, пакете для внутривенного введения, шприце и т.д.) с этикеткой, содержащей инструкции по применению композиции для лечения мукополисахаридоза типа IIIB (синдрома Санфилиппо B), например, с применением способов, описанных в настоящей заявке.
[0083] В некоторых вариантах осуществления настоящее описание направлено на составы, включающие лизосомный фермент, терапевтический слитый белок направленного действия на основе лизосомного фермента или их функциональный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления такие составы являются жидкими составами, предпочтительно жидкими составами, подходящими для интратекального введения. В других вариантах осуществления состав может быть лиофилизированным составом или может быть жидким составом, который был восстановлен из предварительно лиофилизированного состава.
[0084] В различных вариантах осуществления составы согласно настоящему описанию включают лизосомный фермент, терапевтический слитый белок направленного действия на основе лизосомного фермента или их функциональный фрагмент в диапазоне концентрации от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 300 мг/мл или от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 75 мг/мл, или от приблизительно 5 мг/мл до приблизительно 50 мг/мл, или от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 40 мг/мл, или от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 40 мг/мл, или от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 35 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления лизосомный фермент, слитый белок или их фрагмент могут присутствовать в или до концентрации приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или 300 мг/мл или больше. В различных вариантах осуществления составы согласно настоящему описанию включают лизосомный фермент, терапевтический слитый белок направленного действия на основе лизосомного фермента или их функциональный фрагмент в концентрации приблизительно 30 мг/мл. В различных вариантах осуществления лизосомный фермент, терапевтический слитый белок направленного действия на основе лизосомного фермента или их функциональный фрагмент обладают по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или большей идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной на Фигуре 2 (SEQ ID NO: 5). Более предпочтительно лизосомным ферментом, терапевтическим слитым белком направленного действия на основе лизосомного фермента или их функциональным фрагментом является BMN001, имеющий аминокислотную последовательность, показанную на Фигуре 2 (SEQ ID NO: 5).
[0085] В других вариантах осуществления составы согласно настоящему описанию включают одно или более буферных веществ, пригодных для поддержания pH состава в требуемом диапазоне. В предпочтительных вариантах осуществления pH жидких составов согласно настоящему описанию находится в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 9,0 или от приблизительно 5,5 до приблизительно 8,5, или от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, или от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5, или от приблизительно 6,8 до приблизительно 7,2. Более предпочтительно pH жидких составов согласно настоящему описанию составляет приблизительно 7,0. Различные буферные вещества и их применение в белоксодержащих составах известны в уровне техники, и неограничивающие примеры буферных веществ, которые находят применение в жидких составах согласно настоящему описанию, включают, например, ацетат натрия, лимонной кислоты моногидрат, цитрата натрия дигидрат, одноосновного натрия фосфата моногидрат и двухосновного натрия фосфата гептагидрат и т.п.
[0086] При использовании в составах согласно настоящему описанию концентрация одноосновного натрия фосфата моногидрата предпочтительно изменяется в пределах от приблизительно 0,005 мг/мл до приблизительно 0,1 мг/мл или от приблизительно 0,01 мг/мл до приблизительно 0,1 мг/мл, или от приблизительно 0,02 мг/мл до приблизительно 0,08 мг/мл, или от приблизительно 0,03 мг/мл до приблизительно 0,05 мг/мл. В наиболее предпочтительном варианте осуществления концентрация одноосновного натрия фосфата моногидрата составляет приблизительно 0,04 мг/мл.
[0087] При использовании в составах согласно настоящему описанию концентрация двухосновного натрия фосфата гептагидрата предпочтительно изменяется в пределах от приблизительно 0,005 мг/мл до приблизительно 0,5 мг/мл или от приблизительно 0,01 мг/мл до приблизительно 0,5 мг/мл, или от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 0,4 мг/мл, или от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,4 мг/мл, или от приблизительно 0,15 мг/мл до приблизительно 0,25 мг/мл. В наиболее предпочтительном варианте осуществления концентрация двухосновного натрия фосфата гептагидрата составляет приблизительно 0,19 мг/мл.
[0088] В других вариантах осуществления составы согласно настоящему описанию включают одно или более изотонических веществ, применяемых для поддержания требуемой тоничности и регуляции свойств состава для большего соответствия требованиям введения, в особенности интратекального введения, субъекту. Различные изотонические вещества и их применение в белоксодержащих составах известны в уровне техники, и неограничивающие примеры изотонических веществ, которые находят применение в жидких составах согласно настоящему описанию, включают, например, натрия хлорид, трегалозу, маннит, декстрозу, глюкозу, глицерин, сорбит, ксилит, этанол и т.п. В определенных вариантах осуществления трегалоза используется в диапазоне от приблизительно 3% (в/об) до приблизительно 10% (в/об) или от приблизительно 3% (в/об) до приблизительно 5% (в/об), или от приблизительно 7% (в/об) до приблизительно 9% (в/об). В предпочтительном варианте осуществления трегалоза используется в количестве приблизительно 8% (в/об). В еще одном предпочтительном варианте осуществления трегалоза используется в количестве приблизительно 4% (в/об).
[0089] В различных вариантах осуществления составы содержат антиадсорбирующее вещество (например, для уменьшения адсорбции белкового компонента на стекле или пластике и для уменьшения образования агрегатов и мультимеров). Антиадсорбирующие вещества включают без ограничения бензиловый спирт, Полисорбат 20 и Полисорбат 80. В некоторых вариантах осуществления антиадсорбент присутствует в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,5% или от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5%, или от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%, или от приблизительно 0,5% до приблизительно 1%, или от приблизительно 0,5% до приблизительно 1,5%, или от приблизительно 0,5% до приблизительно 2%, или от приблизительно 1% до приблизительно 2%. В некоторых вариантах осуществления антиадсорбирующим веществом является Полисорбат 20 в диапазоне от приблизительно 0,004% до приблизительно 0,006%. В предпочтительном варианте осуществления Полисорбат 20 используется в количестве 0,005%.
[0090] При использовании в составах согласно настоящему описанию, концентрация натрия хлорида предпочтительно изменяется в пределах от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 20 мг/мл или от приблизительно 2 мг/мл до приблизительно 15 мг/мл, или от приблизительно 5 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл, или от приблизительно 7 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл, или от приблизительно 8 мг/мл до приблизительно 9 мг/мл. В предпочтительном варианте осуществления концентрация натрия хлорида составляет приблизительно 0,88 мг/мл. В другом предпочтительном варианте осуществления концентрация натрия хлорида составляет приблизительно 5 мг/мл.
[0091] В других вариантах осуществления составы согласно настоящему описанию включают одно или более электролитных веществ, применяемых для поддержания уровня основного электролита(ов) в спинномозговой жидкости (СМЖ) субъекта или для имитации естественного состава человеческой СМЖ. Различные электролитные вещества и их применение в белоксодержащих составах известны в уровне техники, и неограничивающие примеры электролитных веществ, которые находят применение в жидких составах согласно настоящему описанию, включают, например, калия хлорид, магния хлорид, магния хлорида гексагидрат, кальция хлорид, кальция хлорида дигидрат и т.п.
[0092] При использовании в составах согласно настоящему описанию, концентрация калия хлорида предпочтительно изменяется в пределах от приблизительно 0,01 мг/мл до приблизительно 1 мг/мл или от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,5 мг/мл, или от приблизительно 0,2 мг/мл до приблизительно 0,8 мг/мл, или от приблизительно 0,15 мг/мл до приблизительно 0,4 мг/мл, или от приблизительно 0,15 мг/мл до приблизительно 0,3 мг/мл. В предпочтительном варианте осуществления концентрация калия хлорида составляет приблизительно 0,22 мг/мл.
[0093] При использовании в составах согласно настоящему описанию, концентрация магния хлорида гексагидрата предпочтительно изменяется в пределах от приблизительно 0,01 мг/мл до приблизительно 1 мг/мл или от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,8 мг/мл, или от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,5 мг/мл, или от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,3 мг/мл, или от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,2 мг/мл. В предпочтительном варианте осуществления концентрация магния хлорида гексагидрата составляет приблизительно 0,16 мг/мл.
[0094] При использовании в составах согласно настоящему описанию, концентрация кальция хлорида дигидрата предпочтительно изменяется в пределах от приблизительно 0,01 мг/мл до приблизительно 1 мг/мл или от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,8 мг/мл, или от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,5 мг/мл, или от приблизительно 0,15 мг/мл до приблизительно 0,4 мг/мл, или от приблизительно 0,15 мг/мл до приблизительно 0,3 мг/мл. В предпочтительном варианте осуществления концентрация кальция хлорида дигидрата составляет приблизительно 0,21 мг/мл.
[0095] В предпочтительном варианте осуществления состав согласно настоящему описанию является жидким составом, который включает терапевтический слитый белок направленного действия BMN001, один или более буферных веществ, одно или более изотонических веществ и одно или более электролитных веществ. Более предпочтительно жидкая состав включает BMN001, двухосновного натрия фосфата гептагидрат, одноосновного натрия фосфата моногидрат, натрия хлорид и трегалозу. В одном варианте осуществления жидкая состав включает BMN001 в концентрации от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 35 мг/мл, двухосновного натрия фосфата гептагидрат в концентрации от приблизительно 0,15 до приблизительно 0,25 мг/мл, одноосновного натрия фосфата моногидрат в концентрации от приблизительно 0,02 мг/мл до приблизительно 0,06 мг/мл, натрия хлорид в концентрации от приблизительно 0,8 мг/мл до приблизительно 1 мг/мл и трегалозу в концентрации от приблизительно 7% (в/об) до приблизительно 9% (в/об). В одном предпочтительном варианте осуществления жидкая состав включает BMN001 в концентрации приблизительно 30 мг/мл, двухосновного натрия фосфата гептагидрат в концентрации приблизительно 0,19 мг/мл, одноосновного натрия фосфата моногидрат в концентрации приблизительно 0,04 мг/мл, натрия хлорид в концентрации приблизительно 0,88 мг/мл и трегалозу в концентрации приблизительно 8% (в/об). Предпочтительно жидкая состав имеет приблизительно pH 7,0.
[0096] В другом предпочтительном варианте осуществления состав согласно настоящему описанию является составом, который включает терапевтический слитый белок направленного действия BMN001, одно или более буферных веществ, одно или более изотонических веществ и одно или более электролитных веществ. Более предпочтительно жидкая состав включает BMN001, двухосновного натрия фосфата гептагидрат, одноосновного натрия фосфата моногидрат, натрия хлорид, трегалозу и полисорбат 20. В одном варианте осуществления жидкая состав включает BMN001 в концентрации от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 35 мг/мл, двухосновного натрия фосфата гептагидрат в концентрации от приблизительно 0,15 до приблизительно 0,25 мг/мл, одноосновного натрия фосфата моногидрат в концентрации от приблизительно 0,02 мг/мл до приблизительно 0,06 мг/мл, натрия хлорид в концентрации от приблизительно 4,5 мг/мл до приблизительно 5,5 мг/мл, трегалозу в концентрации от приблизительно 3% (в/об) до приблизительно 5% (в/об) и полисорбат 20 в концентрации от приблизительно 0,004% до приблизительно 0,006%. В одном предпочтительном варианте осуществления жидкая состав включает BMN001 в концентрации приблизительно 30 мг/мл, двухосновного натрия фосфата гептагидрат в концентрации приблизительно 0,19 мг/мл, одноосновного натрия фосфата моногидрат в концентрации приблизительно 0,04 мг/мл, натрия хлорид в концентрации приблизительно 5 мг/мл, трегалозу в концентрации приблизительно 4% (в/об) и полисорбат 20 в концентрации приблизительно 0,005%. Предпочтительно жидкая состав имеет приблизительно pH 7,0.
[0097] В различных вариантах осуществления составы могут включать консервант. Консерванты включают, без ограничения перечисленными, м-крезол и бензиловый спирт. В некоторых вариантах осуществления консервант присутствует в концентрации приблизительно 0,4%±0,2% или приблизительно 1%±0,5%, или приблизительно 1,5%±0,5%, или приблизительно 2,0%±0,5%. В некоторых вариантах осуществления настоящего описания состав не содержит консервант.
[0098] В различных вариантах осуществления составы включают стабилизатор. Неограничивающие примеры стабилизаторов включают глицерин, тиоглицерин, метионин и аскорбиновую кислоту, а также их соли. В некоторых вариантах осуществления, в случаях, когда стабилизатором является тиоглицерин или аскорбиновая кислота или ее соль, стабилизатор присутствует в концентрации от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%. В других вариантах осуществления, в случаях, когда стабилизатором является метионин, стабилизатор присутствует в концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5% или от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,2%. В других вариантах осуществления, когда стабилизатором является глицерин, стабилизатор присутствует в концентрации от приблизительно 5% до приблизительно 100% (чистый).
[0099] В различных вариантах осуществления композиции содержат антиоксидант. Примеры антиоксидантов включают, без ограничения перечисленными, метионин и аскорбиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления молярное отношение антиоксиданта к белку составляет от приблизительно 0,1:1 до приблизительно 15:1 или от приблизительно 1:1 до приблизительно 15:1, или от приблизительно 0,5:1 до приблизительно 10:1, или от приблизительно 1:1 до приблизительно 10:1, или от приблизительно 3:1 до приблизительно 10:1.
[0100] В составах могут использоваться фармацевтически приемлемые соли, в том числе, без ограничения перечисленными, соли неорганических кислот (например, гидрохлорид, гидробромид, фосфат, сульфат), соли органических кислот (например, ацетат, пропионат, малонат, бензоат, мезилат, тозилат) и соли аминов (например, изопропиламина, триметиламина, дициклогексиламина, диэтаноламина). Подробное описание фармацевтически приемлемых солей можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, (Easton, Pennsylvania (1990)).
[0101] Примеры других рецептурных добавок и композиций, применяемых для интратекальной или ИЦВ доставки, описаны в заявке WO2013/096899, которая включена в настоящую заявку посредством отсылки.
[0102] Составы согласно настоящему описанию являются стабильными и могут храниться в течение длительных периодов времени без неприемлемого изменения качества, активности или чистоты. В одном аспекте состав является стабильным при температуре приблизительно 5°C (например, 2-8°C) в течение по меньшей мере 1 месяца, например по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев или больше. В другом аспекте состав является стабильным при температуре меньше или равной приблизительно -20°C в течение по меньшей мере 6 месяцев, например по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев, по меньшей мере 36 месяцев или больше. В другом аспекте состав является стабильным при температуре меньше или равной приблизительно -40°C в течение по меньшей мере 6 месяцев, например, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев, по меньшей мере 36 месяцев или больше. В другом аспекте состав является стабильным при температуре меньше или равной приблизительно -60°C в течение по меньшей мере 6 месяцев, например по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев, по меньшей мере 36 месяцев или больше.
[0103] Подходящие составы согласно настоящему описанию включают жидкие, лиофилизированные или восстановленные лиофилизированные составы. В различных аспектах составы согласно настоящему описанию содержатся в контейнере, который в одном аспекте может включать одну дозированную форму состава. Примеры контейнеров включают, например, ампулы, флаконы, бутылки, картриджи, емкости и предварительно наполненные шприцы.
Интратекальное введение фармацевтически приемлемых лекарственных форм
[0104] В различных вариантах осуществления фермент, слитый белок на основе фермента или состав, содержащий их, вводят путем прямого введения в центральную нервную систему субъекта, например в спинномозговую жидкость субъекта. В некоторых аспектах описания фермент вводят интратекально, например, в поясничную область или в большую цистерну, или интравентрикулярно (или интрацеребровентрикулярно (ИЦВ)) в полость желудочка мозга. Способы введения лизосомного фермента или слитого белка, включающего функциональный лизосомный фермент, интратекально или интрацеребровентрикулярно, описаны в патентах США 7,442,372, 9,044,473 и 9,089,566, полностью включенных в настоящую заявку посредством отсылки.
[0105] Специалистам в данной области известны устройства, которые могут применяться для выполнения интратекального введения терапевтической композиции. Например, терапию можно проводить при использовании резервуара Оммайя, который обычно применяют для интратекального введения лекарственных средств при канцероматозе мозговых оболочек (Ommaya et al., Lancet 2: 983-84 (1963)). В частности, в этом способе вентрикулярную трубку вводят через отверстие, сформированное в переднем роге, и подсоединяют к резервуару Оммайя, установленному под кожу волосистой части головы, и подкожно прокалывают резервуар для интратекальной доставки определенного фермента для заместительной терапии, который введен в резервуар. Другие устройства для интратекального введения терапевтических композиций человеку описаны в патенте США 6,217,552, включенном в настоящую заявку посредством отсылки. В альтернативе композицию могут вводить интратекально, например, путем однократной инъекции или непрерывной инфузии. Следует понимать, что дозированное лечение может осуществляться в форме введения однократной дозы или множества доз.
[0106] При использовании в настоящей заявке термин "интратекальное введение" включает доставку фармацевтической композиции непосредственно в спинномозговую жидкость субъекта с помощью методов, включающих латеральную церебровентрикулярную инъекцию (т.е. интрацеребровентрикулярно) через фрезевое отверстие или цистернальную или люмбальную пункцию и т.п. (описанные в публикациях Lazorthes et al., Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 (1991) и Ommaya et al., Cancer Drug Delivery 1:169-179 (1984), содержание которых включено в настоящую заявку посредством отсылки). Термин "поясничная область", как предполагается, включает область между третьим и четвертым поясничными (в пояснице) позвонками и, более включительно, область L2-S1 позвоночника.
[0107] Термин "большая цистерна", как предполагается, включает доступ к полости вокруг и ниже мозжечка через отверстие между черепом и верхним отделом позвоночника. Термин "желудочек мозга", как предполагается, включает полости в головном мозге, которые соединяются с центральным каналом спинного мозга. Введение фармацевтической композиции в соответствии с настоящим описанием в любой из вышеуказанных участков может быть выполнено путем непосредственной инъекции композиции или при помощи инфузионных насосов. Для инъекции композиция согласно настоящему описанию может быть изготовлена в форме жидких растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или фосфатный буфер. Кроме того, фермент может быть включен в твердую форму и растворен или ресуспендирован непосредственно перед применением. Также включены лиофилизированные формы. Инъекция может быть, например, в форме болюсной инъекции или непрерывной инфузии (например, при использовании инфузионных насосов) фермента.
[0108] В различных вариантах осуществления согласно настоящему описанию фермент вводят путем латеральной церебровентрикулярной инъекции в мозг субъекта. Инъекция может быть сделана, например, через фрезевое отверстие, сделанное в черепе субъекта. В другом варианте осуществления слитый белок на основе фермента и/или другую фармацевтическую композицию вводят через хирургически введенный катетер в желудочек мозга субъекта. Например, инъекция может быть сделана в боковые желудочки, которые больше, хотя также может быть сделана инъекция в третий и четвертый желудочки меньшего размера.
[0109] В различных вариантах осуществления фармацевтические композиции, применяемые в настоящем описании, вводят путем инъекции в большую цистерну или поясничную область субъекта. В другом варианте осуществления способа согласно настоящему описанию фармацевтически приемлемая состав обеспечивает долговременную доставку, например "замедленное высвобождение", фермента или другой фармацевтической композиции, применяемой в настоящем описании, субъекту в течение по меньшей мере одной, двух, трех, четырех недель или больше после введения фармацевтически приемлемого состава субъекту.
[0110] В различных вариантах осуществления терапевтический слитый белок доставляют в одну или более поверхностных или неглубоких тканей головного или спинного мозга. Например, в различных вариантах осуществления терапевтический слитый белок доставляют в одну или более поверхностных или неглубоких тканей большого мозга или спинного мозга. В некоторых вариантах осуществления целевые поверхностные или неглубокие ткани головного мозга или спинного мозга расположены в пределах 4 мм от поверхности головного мозга. В некоторых вариантах осуществления целевые поверхностные или неглубокие ткани головного мозга выбраны из тканей мягкой мозговой оболочки, тканей кортикального слоя мозга, гиппокампа, пространства Вирхова-Робена, кровеносных сосудов в пространстве ВР, гиппокампа, участков гипоталамуса на нижней поверхности головного мозга, зрительных нервов и путей, обонятельной луковицы и проекций, и их комбинаций.
[0111] В некоторых вариантах осуществления терапевтический слитый белок доставляют в одну или более глубоких тканей большого мозга или спинного мозга. В некоторых вариантах осуществления целевые поверхностные или неглубокие ткани большого мозга или спинного мозга расположены ниже 4 мм (например, 5 мм, 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм или 10 мм) (или внутри) относительно поверхности головного мозга. В некоторых вариантах осуществления целевые глубокие ткани большого мозга включают кортикальный слой головного мозга. В некоторых вариантах осуществления целевые глубокие ткани большого мозга включают одно или более из промежуточного мозга (например, гипоталамуса, таламуса, преталамуса, субталамуса и т.д.), заднего мозга, чечевицеобразного ядра, базальных ганглиев, хвостатого ядра, скорлупы, миндалевидного тела, бледного шара и их комбинаций.
[0112] В различных вариантах осуществления целевая поверхностная или неглубокая ткань спинного мозга содержит мягкую оболочку мозга и/или пути белого вещества. В различных вариантах осуществления целевая глубокая ткань спинного мозга содержит серое вещество спинного мозга и/или эпендимные клетки. В некоторых вариантах осуществления терапевтический слитый белок доставляют в нейроны спинного мозга.
[0113] В различных вариантах осуществления терапевтический слитый белок доставляют в одну или более тканей мозжечка. В некоторых вариантах осуществления одна или более целевых тканей мозжечка выбраны из группы, состоящей из тканей молекулярного слоя, тканей слоя из клеток Пуркинье, тканей слоя из гранулярных клеток, ножек мозжечка и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления терапевтические средства (например, ферменты) доставляют в одну или более глубоких тканей мозжечка, включающих, без ограничения перечисленными, ткани слоя из клеток Пуркинье, тканей слоя из гранулярных клеток, глубокой ткани белого вещества мозжечка (например, глубокой относительно слоя из гранулярных клеток) и глубокой ткани ядер мозжечка.
[0114] В различных вариантах осуществления терапевтический слитый белок доставляют в одну или более тканей ствола головного мозга. В некоторых вариантах осуществления одна или более целевых тканей ствола головного мозга включают ткань белого вещества ствола головного мозга и/или ткань ядер ствола головного мозга.
[0115] В различных вариантах осуществления терапевтический слитый белок доставляют в различные ткани головного мозга, включающие, без ограничения перечисленными, серое вещество, белое вещество, перивентрикулярные области, мягкую и паутинную оболочку мозга, оболочки мозга, новую кору головного мозга, мозжечок, глубокие ткани в коре головного мозга, молекулярный слой, область хвостатого ядра/скорлупы, средний мозг, глубокие области варолиевого моста или продолговатого мозга и их комбинации.
[0116] В различных вариантах осуществления терапевтический слитый белок доставляют в различные клетки в головном мозге, включающие, без ограничения перечисленными, нейроны, глиальные клетки, периваскулярные клетки и/или менингеальные клетки. В некоторых вариантах осуществления терапевтический белок доставляют в олигодендроциты глубоких тканей белого вещества.
[0117] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления для лечения заболевания МПС IIIB у пациента, для уменьшения уровня ухудшения по меньшей мере одного симптома (в том числе ухудшения когнитивных способностей) МПС IIIB у пациента или для уменьшения или предотвращения накопления ГАГ в одной или более тканях ЦНС пациента, страдающего заболеванием МПС IIIB, приблизительно 30 мг, 100 мг или 300 мг терапевтического слитого белка или приблизительно от 30 мг до 300 мг, от 30 мг до 200 мг или от 30 мг до 100 мг терапевтического слитого белка вводят один раз в неделю ИЦВ (изоволюметрически) в течение периода времени продолжительность по меньшей мере приблизительно 24, предпочтительно 48 недель.
Наборы для применения в способах согласно настоящему описанию
[0118] Средства, применяемые в способах согласно настоящему описанию, могут быть предоставлены в наборе, который может дополнительно включать инструкции по применению. Такой набор будет включать лизосомный фермент или слитый белок, как описано в настоящей заявке, включающий фермент для применения в лечении лизосомной болезни накопления и молекулу для направленной доставки в лизосомы, обычно в дозе и лекарственной форме, подходящих для введения реципиенту. В различных вариантах осуществления набор может включать одно или более устройств для доставки фермента интратекально.
[0119] Набор согласно настоящему описанию может включать инструкции по интратекальному введению терапевтических композиций согласно настоящему описанию, в дополнение к терапевтическим композициям. В некоторых вариантах осуществления наборы согласно настоящему описанию могут включать катетер(ы), насос(ы) или другие устройства для интратекального введения ферментозаместительной терапии, которые предварительно наполняют терапевтическими композициями согласно настоящему описанию. Например, предусмотрены катетеры, предварительно наполненные 0,001-0,01 мг, 0,01-0,1 мг, 0,1-1,0 мг, 1,0-10 мг, 10-100 мг или больше терапевтического слитого белка, включающего лизосомный фермент и молекулу для направленной доставки в лизосомы, такие как Naglu и пептидную метку IGF-II, в фармацевтически приемлемой лекарственной форме. Примерные катетеры могут включать катетеры для одноразового применения, которые можно утилизировать после применения.
[0120] В некоторых вариантах осуществления наборы согласно настоящему описанию могут включать один или более следующих компонентов: удлинительная магистраль (например, Smiths Medical PN:536040), встроенный фильтр (например, Smiths Medical PN:FS116), порт-система с иглой (например, Smiths Medical PN:21-2737-24), шприц (например, Becton Dickinson PN:309604) или игла для шприца (например, Becton Dickinson PN:305196).
Способы лечения синдрома Санфилиппо B
[0121] Интратекальное (например, ИЦВ или люмбальное) введение фермента Naglu или его слитого белка (включающего BMN001) в СМЖ пациента может применяться для профилактики или лечения одного или более симптомов или негативного последствия заболевания МПС IIIB у людей. В этом отношении ожидается, что интратекальное введение терапевтически эффективного количества фермента Naglu или его слитого белка (включающего BMN001) приведет к улучшению по меньшей мере одного симптома или негативного последствия заболевания МПС IIIB, замедления или уменьшения прогрессии по меньшей мере одного симптома или негативного последствия МПС IIIB, или стабилизации ухудшения по меньшей мере одного симптома или негативного последствия МПС IIIB. В этом отношении известные симптомы или негативные последствия заболевания МПС IIIB у людей включают, например, поддающееся определению ухудшение одного или более следующего: когнитивной функции, языковой функции, двигательной функции, социально-эмоциональной функции, адаптивной функции, концептуального мышления, распознавания лиц, способности к завершению рассказов, образного мышления и функции/ловкости рук.
[0122] Для количественной оценки терапевтического эффекта введенного фермента или его слитого белка могут применяться любые из множества известных и стандартно используемых нейрокогнитивных тестов для получения индекса развития (DQ). В одном варианте осуществления оценка DQ является оценкой DQ когнитивной функции.
[0123] В одном варианте осуществления согласно настоящему описанию оценка DQ для пациента может быть получена при использовании шкалы развития младенцев Бейли, 3-й редакции (BSID-III) (Bayley, Bayley Scales of Infant and Toddler Development (Bayley-III). Technical Manual. Third ed. San Antonio: Psychological Corp., 2006, включенной в настоящую заявку посредством отсылки). Тест BSID-III представляет собой средство, состоящее из 5 сфер развития или доменов (когнитивная функция, речь, моторика, социально-эмоциональная и адаптивная функция), предназначенное для оценки развития у детей возрастом 1-42 месяца. В некоторых вариантах осуществления оценку доменов социально-эмоциональной и адаптивной функции теста BSID-III не используют. В одном варианте осуществления для определения оценки DQ используется только когнитивный домен.
[0124] В некоторых вариантах осуществления когнитивный домен BSID-III может быть основной сферой исследования. Когнитивная шкала применяется индивидуально квалифицированным исследователем и охватывает развитие важных навыков, таких как скорость обработки информации, решение задач и игра. Важно то, что когнитивные оценки не требуют устного ответа субъекта; в результате данный тест особенно полезен для оценки когнитивной функции при таких состояниях, как МПС IIIB, при котором присутствуют затруднения с экспрессивной речью. Первичные оценки по одному домену могут быть преобразованы в оценку по шкале, которая затем может быть преобразована в комплексную оценку, охватывающую несколько доменов. Средние первичные оценки, связанные с разным возрастом, также позволяют получать возрастные эквивалентные оценки и DQ.
[0125] В некоторых вариантах осуществления также могут быть применены домены речи и моторики BSID-III. Домен речи состоит из 2 субтестов (рецептивная коммуникация и экспрессивная коммуникация), и домен моторики состоит из 2 субтестов (мелкая моторика и крупная моторика).
[0126] В другом варианте осуществления согласно настоящему описанию оценка DQ для пациента может быть получена при использовании батареи тестов Кауфманов для детей, 2-й редакции (KABC-II) (Kaufman et al., Kaufman Assessment Battery for Children. Second Edition ed. Pearson Assessment, Inc. 2004, включенной в настоящую заявку посредством отсылки). Тест KABC-II представляет собой клинический инструмент (психологический диагностический тест) для оценки когнитивного развития. Как и BSID, KABC может применяться для получения эквивалентных возрасту оценок и, следовательно, DQ. Поскольку многие части теста являются невербальными, он особенно подходит для оценки функции у детей, которые могут испытывать затруднения при слуховой и вербальной коммуникации, которые являются состояниями, характерными для совокупности больных МПС IIIB. Кроме того, тест был переведен на многие языки во всем мире. Субтесты, которые входят в невербальный индекс Кауфманов, включают следующее: концептуальное мышление, распознавание лиц, способность к завершению рассказов, треугольники, образное мышление и движения рук. В дополнение к субтестам невербального индекса субтесты кластера знаний (загадки, экспрессивный словарь и вербальные знания) могут быть применены к субъектам, которые обладают навыками речи.
[0127] В некоторых вариантах осуществления алгоритм, используемый для определения, какой тест из BSID-III или KABC-II следует использовать для определения показателя DQ, описан в Delaney et al., JIMD Rep. 13:129-137 (2014).
[0128] Результаты теста BSID-III (или когнитивного субтеста из него) или невербального индекса KABC-II используют для определения показателя DQ для субъектов до лечения или во время или после лечения терапевтическим ферментом или его слитым белком. В частности, при использовании описанных выше тестов BSID-III или KABC-II субъекту присваивают "возрастной эквивалентный рейтинг" (в месяцах) в зависимости от их результатов в используемом тесте. Затем рассчитывается оценка DQ путем деления "возрастного эквивалентного рейтинга" на фактический возраст субъекта (в месяцах) и умножения на 100. В качестве иллюстрации, субъект с МПС IIIB, имеющий фактический возраст 60 месяцев, которому присвоен "возрастной эквивалентный рейтинг" 48 месяцев по его/ее результатам в используемом тесте, будет иметь DQ, рассчитанный следующим образом: (48 разделить на 60)×100=80. С другой стороны, полноценно функционирующий субъект возрастом 60 месяцев, которому присвоен "возрастной эквивалентный рейтинг" 60 месяцев, будет иметь DQ (60 разделить на 60)×100=100. Поскольку со временем когнитивная функция, речевая функция, моторная функция, социально-эмоциональная функция, адаптивная функция, концептуальное мышление, распознавание лиц, способность к завершению рассказов, образное мышление и/или функция/ловкость рук у пациентов с МПС IIIB, как правило, ухудшаются, ожидается, что оценки DQ у больных МПС IIIB, не подвергавшихся лечению, со временем будут снижаться. Цель настоящего описания состоит в снижении наблюдаемого ухудшения DQ, стабилизации динамики DQ или улучшении динамики DQ путем введения описанного в настоящей заявке терапевтического белка. Благоприятный эффект от введения терапевтического слитого белка согласно настоящему изобретению или содержащего его состава можно определить при определении оценки DQ у субъекта до лечения и сравнении с оценкой DQ у субъекта после лечения.
[0129] Далее настоящее описание будет дополнительно и более подробно описано посредством следующих примеров. Впрочем, примеры включены в целях иллюстрации, а не для ограничения.
ПРИМЕР 1 - РАЗРАБОТКА СОСТАВА
[0130] Слитые белки лизосомных ферментов (включающие слитые белки на основе зрелой альфа-N-ацетилглюкозаминидазы [Naglu] человека) включают метки GILT и спейсеры, раскрытые в публикациях заявок на патент США 2003-0082176, 2004-0006008, 2003-0072761, 2004-0005309, 2005-0281805, 2005-0244400, патентах США 8,492,337 и 8,563,691 и публикациях международных заявок WO 03/032913, WO 03/032727, WO 02/087510, WO 03/102583, WO 2005/078077, WO 2009/137721 и WO 2014/085621, описания которых включены в настоящую заявку посредством отсылки.
in vivo
[0131] В одном особенно предпочтительном варианте осуществления (указанном в настоящей заявке как BMN001) слитый белок Naglu/IGF-II, включающий функциональный зрелый человеческий фермент Naglu, слитый через жесткий линкер с фурин-устойчивым пептидом IFG-II, состоящим из аминокислот 8-67 зрелого человеческого IGF-II и имеющим замену аргинина на аланин в аминокислотном положении 37, был получен и включен в состав для применения в исследованиях безопасности и эффективности. Пептидный линкер, применяемый в BMN001, имеет аминокислотную последовательность, показанную в настоящей заявке как SEQ ID NO: 4. Полная аминокислотная последовательность терапевтического слитого белка BMN001 показана на Фигуре 2 (SEQ ID NO: 5).
[0132] Для определения вспомогательных веществ и связанных с ними условий изготовления лекарственных форм, которые можно было бы применять для жидкого состава BMN001, подходящей для клинического применения у человека путем интратекального введения, проводили различные исследования. Во-первых, склонность BMN001 к агрегации в жидкой лекарственной форме при различных значениях рН исследовали следующим образом. Первоначально BMN001 вводили в жидкую композицию, содержащую цитратный буфер с рН 5,0 или 6,5, или искусственную жидкую человеческую СМЖ при рН 6,0, 6,5, 7,0 и 8,0 и проводили анализ статического светорассеяния для измерения склонности BMN001 к агрегации при разных уровнях рН и при повышении температуры. Результаты этих анализов показали, что BMN001 более склонен к агрегации с повышением температуры при более низком рН (рН 5,0-6,0), чем при более высоком, более нейтральном рН (около 7,0). Кроме того, анализы с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), проведенные на жидких составах BMN001 при 25°C различных pH, демонстрируют значительно более высокий процент агрегированного мультимерного BMN001 при pH ниже 6,5, по сравнению с менее кислотными, более нейтральными значениями рН в диапазоне от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5. Наконец, анализы SEC, проведенные на жидких составах BMN001 при различном рН, подвергнутых 10 циклам замораживания/оттаивания, продемонстрировали значительно более высокий процент агрегированного мультимерного BMN001 при рН ниже 6,5 по сравнению с менее кислотными, более нейтральными значениями рН в диапазоне около 7,0. Эти комбинированные данные указывают, что использование рН в диапазоне от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5, предпочтительно около 7,0, может быть эффективным для клинической жидкого состава BMN001.
[0133] Затем, жидкие составы, включающие разные концентрации BMN001, тестировали для определения влияния концентрации слитого белка на образование агрегатов/мультимеров в течение 5 циклов замораживания/оттаивания. В этих экспериментах жидкие составы, содержащие 1, 5, 15 или 24 мг/мл BMN001 получали при pH 5,0, 6,0, 7,0 и 8,0. После пяти циклов замораживания/оттаивания относительный процент агрегата/мультимера к мономеру обычно был выше в составах с более низкой концентрацией белка, чем в составах, содержащих высокую концентрацию слитого белка. Кроме того, образование агрегатов/мультимеров обычно происходило более часто при более кислотном pH, чем при нейтральном pH. Добавление 2% трегалозы предотвращало агрегацию слитого белка по сравнению с такой же лекарственной формой без трегалозы. Эти результаты указывают, что жидкие составы, включающие по меньшей мере приблизительно 24 мг/мл слитого белка BMN001, предпочтительны для лекарственных форм, содержащих более низкую концентрацию слитого белка. Эти неожиданные результаты, демонстрирующие, что жидкие составы с более высокой концентрацией белка (т.е. приблизительно 30 мг/мл) и обычно имеющие более низкий относительный процент образования агрегатов/мультимеров, обеспечивают значительное преимущество для интратекального введения людям, поскольку такое введение довольно чувствительно к суммарному объему вводимой жидкости. Фактически, составы согласно настоящему описанию, включающие BMN001-содержащие составы, имеющие концентрацию белка по меньшей мере 24 мг/мл, в том числе составы, имеющие концентрацию белка приблизительно 30 мг/мл, могут с успехом применяться для интратекального введения пациентам.
[0134] Затем различные вспомогательные вещества для лекарственных форм исследовали на их способность предотвращать вызванное перемешиванием или замораживанием/оттаиванием образование агрегатов BMN001 при измерении с помощью анализа статического светорассеяния. Были подготовлены жидкие составы, включающие идентичные количества BMN001, которые содержали одно из следующего: (i) 180 мМ N-ацетилглюкозамина, (ii) 222 мМ глюкозы, (iii) 234 мМ сахарозы, (iv) 212 мМ трегалозы, (v) 220 мМ сорбита, (vi) 200 мМ глутаминовой кислоты, (vii) 200 мМ глутамина, (viii) 200 мМ аргинина, (ix) 200 мМ гистидина, (x) 200 мМ глицина, (xi) 0,1% в/об полисорбата 20 или (xii) 0,1% в/об полоксамера 188. Результаты этих исследований продемонстрировали, что добавление одной или более аминокислот приводило к дестабилизации жидкого состава, о чем свидетельствовало увеличенное образование агрегатов/мультимеров, вызванное перемешиванием или замораживанием/оттаиванием. С другой стороны, добавление одного или более сахаров/полиолов приводило к уменьшению относительного количества образовавшихся агрегатов/мультимеров, вызванное перемешиванием или замораживанием/оттаиванием.
[0135] На основе исследований по разработке состава, описанных выше, и дополнительных экспериментов, не описанных в настоящей заявке, была разработан окончательный вариант жидкого состава BMN001 для применения в последующем клиническом исследовании у человека, как описано ниже. Клинический состав BMN001, применяемый в клинических исследованиях у человека, описанных в Примере 3 ниже, состоял из следующих компонентов: (i) 30 мг/мл слитого белка BMN001, (ii) 0,19 мг/мл двухосновного натрия фосфата гептагидрата, (iii) 0,04 мг/мл одноосновного натрия фосфата моногидрата, (iv) 8,66 мг/мл натрия хлорида, (v) 0,22 мг/мл калия хлорида, (vi) 0,16 мг/мл магния хлорида гексагидрата и (vi) 0,21 мг/мл кальция хлорида дигидрата. Этот клинический состав BMN001 был приготовлен с конечным pH 7,0. Клинический состав BMN001 может быть расфасован во флакон из прозрачного боросиликатного стекла, укупоренного пробкой из бромбутилкаучука с фторполимерным покрытием, закрытой алюминиевым колпачком, и храниться в замороженном виде приблизительно при -40°C до размораживания для применения.
ПРИМЕР 2 - BMN001 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СИНДРОМА САНФИЛИППО B (ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)
[0136] Доклинические исследования проводили, как описано в настоящей заявке, и продемонстрировали перспективы терапевтической эффективности без значимого риска связанной с BMN001 токсичности для пациентов с болезнью МПС IIIB.
[0137] Доклинические исследования, описанные в настоящей заявке, были разработаны для подтверждения эффективности долговременной ИЦВ инфузии для лечения больных МПС IIIB. Основные показатели фармакодинамики (ФД), явления со стороны сердечно-сосудистой системы (CV) и исследования безопасности для ЦНС, ФК, распределение в ЦНС и токсичность BMN001, вводимого ИЦВ путем, определяли в исследовании с введением однократной дозы на здоровых животных (яванских макаках) и исследовании с повторным введением четырех доз на здоровых животных и в моделях заболевания МПС IIIB (мышь с нокаутом Naglu [KO], WT и NAGLU-нулевая собака (Ellinwood et al., J. Inherit. Metab. Dis. 26(5):489-504 (2003) и яванский макак). Эти виды были выбраны из-за высокой гомологии аминокислотной последовательности NAGLU, экспрессии CI-MPR и идентичности аминокислотной последовательности. Модели заболевания на животных также демонстрируют некоторые главные особенности заболевания МПС IIIB у человека, включающие накопление определенных веществ в лизосомах, гибель нейронов, ухудшение функции и уменьшение продолжительности жизни с аналогичным относительным временным ходом прогрессии заболевания. Они также отображают некоторые неврологические признаки, включающие тремор и атаксию, которые могут использоваться для функционального отслеживания исходной патологии ЦНС и потенциально могут использоваться для мониторинга ответа на лечение. Таким образом, такие модели обеспечивают ценное понимание в отношении фармакологического ослабления прогрессирования заболевания с применением клинически переводимых конечных результатов.
50
захват
in vitro
[0138] Основные оценки ФД для BMN001 проводили в анализах связывания рецептора IGF2, фибробластах больного МПС IIIB и двух доступных моделях МПС IIIB на животных, NAGLU-нокаутной (KO) мыши и незрелой NAGLU-нулевой собаке, и продемонстрировали высокую фармакологическую активность BMN001. Анализ связывания рецептора IGF2 разных партий BMN001, используемых в этих исследованиях, показал среднюю расчетную IC 0,28 нМ. Клеточный захват BMN001  и клеточный период полувыведения определяли в фибробластах больного МПС IIIB. Лизосомная K BMN001 была определена как концентрация, при которой захват в лизосому составлял половину от максимального уровня, и составила 3,7-6,4 нМ (среднее 5,3 нМ) с лизосомный периодом полувыведения приблизительно 9,5 дней.
[0139] В модели заболевания МПС IIIB на мышах ИЦВ введение BMN001 вызывало регрессию патологии заболевания. Исследования с введение повторной дозы у этих мышей показали равномерное распределение BMN001 в ткани ЦНС. Первичная оценка ФД продемонстрировала воздействие BMN001 как на биохимические, так и на гистологические показатели. ИЦВ введение BMN001 мышам Naglu-KO привело к уменьшению лизосомного накопления (т.е. накопления GAG/гепарансульфата) с сопутствующим улучшением гистологических и иммунно-гистологических индексов лизосомной функции. В частности, при оценке через 24 часа после введения последней дозы BMN001, лечение привело к заметному росту активности фермента Naglu и сопутствующему уменьшению активности бета-гексозаминидазы и уровней суммарного гепарансульфата и LAMP-2. Активность Naglu обнаруживали в тканях мозга, не только в коре, гиппокампе, зубчатой извилине и таламусе, но также и в удаленных дистальных положениях, включающих миндалевидное тело, перирирнальную кору и гипоталамус. Также наблюдали значительные уменьшения уровней CD68, SCMAS, бета-амилоида, p-Tau, P-GSK3бета и глипикана 5. Уровни гепарансульфата, Naglu-специфичных НВК и бета-гексозаминидазная активность продолжали уменьшаться через 7, 14 и 28 дней после введения последней дозы.
[0140] У NAGLU-нулевых собак ФД эффекты BMN001, наблюдаемые через 6 месяцев после ИЦВ введения, включали уменьшение лизосомного накопления материала в спинномозговой жидкости (СМЖ) и сохранение двигательной функции. Дополнительные оцениваемые фармакодинамические показатели, включающие когнитивную функцию и задержку прогрессирования заболевания, в настоящее время оцениваются следующим образом. В шести независимых группах, включающих по 4 собаки, у которых ранее вызвали иммунотолерантность, каждые две недели делали ИЦВ инфузию между возрастами 4 и 18 месяцев следующим образом:
Группа 1 (здоровые NAGLU+ собаки) -только растворитель для ИЦВ ввдения (10 мл/кг);
Группа 2 (здоровые NAGLU+ собаки) - BMN001 (12 мг/кг);
Группа 3 (здоровые NAGLU+ собаки) - BMN001 (12 мг/кг, с повышением до 48 мг/кг в дозе 3);
Группа 4 (NAGLU-нулевые собаки) - только растворитель для ИЦВ ввдения (10 мл/кг);
Группа 5 (NAGLU-нулевые собаки) - BMN001 (12 мг/кг);
Группа 6 (NAGLU-нулевые собаки) - BMN001 (12 мг/кг, с повышением до 48 мг/кг в дозе 3).
[0141] Уровни гепарансульфата (ГС) измеряли в ткани ЦНС, СМЖ и ткани мозжечка у собак из групп 1, 4, 5 и 6. Как показано на Фигуре 3, BMN001 дозозависимо снижал уровни ГС в ткани ЦНС и в СМЖ у собак с МПС IIIB, причем доза 48 мг/кг снижала ГС до уровней дикого типа. Уровни ГС в ЦНС и СМЖ в каждой группе собак оценивали и сравнивали. Как показано на Фигуре 4, присутствует сильная корреляция уровней ГС в этих двух компартементах головного мозга, что демонстрирует способность BMN001 однородно уменьшать ГС в головном мозге.
[0142] Также исследовали влияние лечения BMN001 на уровни LAMP2. Образцы гомогената ткани мозжечка (18 мкг белка/дорожка) дикого типа, необработанных больных МПС IIIB собак и больных МПС IIIB собак, получавших BMN001, подвергали электрофорезу и блоттингу в невосстанавливающих условиях, затем связывали с немеченым AC17 и детектировали HRP-конъюгированным вторичное антителом против IgG мыши. Лизаты LAMP2-экспрессирующих или контрольных клеток CHO-K1 включали в блоты в качестве контроля (5 мкг белка/дорожка). Для оценки общего количества белка, нанесенного на каждую дорожку, блоты гомогената мозжечка отмывали и повторно детектировали β-актин. Как показано на Фигуре 5, необработанные больные МПС IIIB собаки имели высокий уровень LAMP2 по сравнению с собаками дикого типа. Однако лечение BMN001 снижало уровни LAMP2 у больных МПС IIIB собак до уровней, наблюдаемых у собак дикого типа.
[0143] Также исследовали влияние BMN001 на атрофию мозжечка. Как видно на Фигуре 6, BMN001 вызывал значимое уменьшение ГС в мозжечке в обеих дозах. Кроме того, обе дозы BMN001 уменьшали деградацию белого вещества мозжечка согласно измерению с помощью диффузионно-тензорной визуализации (DTI) (Фигура 7). Уменьшение атрофии мозжечка при воздействии BMN001 также четко наблюдали на изображениях МРТ собак дикого типа и получавших BMN001 собак с МПС IIIB (Фигура 8).
[0144] В отдельном исследовании здоровые незрелые яванские макаки весом приблизительно 1-2 кг рандомизированно распределяли в одну из пяти групп введения доз следующим образом:
Группа 1 - только растворитель для ИЦВ введения (5 минут, изоволюметрическое ИЦВ 2,5 мл, 0,5 мл/мин);
Группа 2-30 мг BMN001 (5 минут, изоволюметрическое ИЦВ 2,5 мл, 0,5 мл/мин);
Группа 3-73 мг BMN001 (5 минут, изоволюметрическое ИЦВ 2,5 мл, 0,5 мл/мин);
Группа 4-73 мг BMN001 (240 минут, неизоволюметрическое ИЦВ 2,5 мл, 0,88 мл/ч); и
Группа 5-200 мг/кг BMN001 (5 минут, неизоволюметрическое в/в, 3 мл/мин).
in vivo
[0145] Через 48 часов после введения дозы животных усыпляли и забирали определенные ткани ЦНС. Образцы поверхностных и глубоких тканей, относительно желудочка, из семи областей головного мозга и трех областей спинного мозга собирали для исследований биораспределения. Эти исследования продемонстрировали, что ИЦВ путь доставки обеспечивал прямое замещение фермента ЦНС с превосходящим биораспределением в ЦНС по сравнению с биораспределением при в/в введении, и что быстрое введение BMN001 после изоволюметрического удаления СМЖ является безопасным и хорошо переносится . Наконец, сопоставимое и распространенное распределение BMN001 в поверхностных и в глубоких тканях ЦНС наблюдали при быстром (т.е. в течение приблизительно 5 минут) изоволюметрическом введении или медленном (т.е. в течение приблизительно 240 минут) неизоволюметрическом введении.
[0146] Показатели сердечно-сосудистой, дыхательной функции и параметры фармакологической безопасности для ЦНС оценивали в исследованиях токсичности на обезьянах с введением однократной дозы и еженедельным повторным введением дозы. Параметры фармакологической безопасности для ЦНС и сердечно-сосудистой системы оценивали в исследованиях с повторным введением дозы раз в две недели на WT собаках и NAGLU-нулевых собаках. В этих исследованиях не было получено никаких данных, указывающих на присутствие побочного действия, связанного с BMN001, в отношении ЦНС, сердечно-сосудистой или дыхательной систем. После ИЦВ введения не наблюдали связанной с BMN001 токсичности для ЦНС или системной органной токсичности или токсичности, связанной с усиленным фармакологическим действием, такой как быстрое выведение накопленного лизосомального материала накопления. Кроме того, не наблюдали никакой системной токсичности, в том числе гипогликемии, наблюдаемой после повторного в/в введения BMN001.
[0147] Для клинических исследований, проведенных у людей, эквивалентные дозы для человека рассчитывали на основе пропорционального вычисления по массе головного мозга. Человеческий мозг достигает примерно 75% от массы у взрослого человека в возрасте 2 года и 100% от массы у взрослого человека в возрасте 5 лет. С учетом того, что масса мозга взрослого человека составляет 1400 г и с учетом прогрессирующей атрофии мозга у пациентов с МПС IIIB, устанавливали среднюю массу 1000 г для целевой популяции пациентов. Это дает 10-кратный коэффициент масштабирования, исходя из средней массы мозга яванского макака 100 г. Таким образом, профиль безопасности и эффективности BMN001, оцениваемый в текущей доклинической программе, подтверждает безопасность ИЦВ введения BMN001 в дозах до 730 мг (в зависимости от массы мозга) при введении путем 4-часовой инфузии или изоволюметрического болюса еженедельно в целевой популяции пациентов детского возраста.
ПРИМЕР 3 - BMN001 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СИНДРОМА САНФИЛИППО B
(КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НА ЛЮДЯХ)
[0148] Это - исследование фазы 1/2, впервые проводимое у человека, многоцентровое, многонациональное, открытое, с повышением дозы у пациентов с диагнозом МПС IIIB. Состав BMN001, изготовленную, как описано в Примере 1 выше, вводили еженедельно путем ИЦВ инфузии и оценивали субъектов на предмет нейрокогнитивной функции, поведения, сна, качества жизни (как субъективное, так и оцениваемое членами семьи/лицом, осуществляющим уход), особенностей визуализации и биохимические маркеры бремени болезни. Главные цели исследования состоят в оценке безопасности и переносимости BMN001, вводимого субъектам с МПС IIIB с помощью ИЦВ резервуара и катетера, и в оценке воздействия BMN001 на когнитивную функцию у пациентов с МПС IIIB при оценке с использованием применимого индекса развития (DQ). Для оценки воздействия лечения на когнитивную функцию, данные, полученные от исследуемых пациентов при лечении в данном исследовании, сравнивали с результатами связанного наблюдательного исследования симптомологии прогрессирующего МПС IIIB, проведеннного ранее в той же группе субъектов (т.е. исследование естественного развития болезни).
[0149] Текущее клиническое исследование фазы 1/2 у человека состоит из 2 частей. В Части 1, периоде повышения дозы, каждый из 3 пациентов (ранее не зарегистрированных в исследовании естественного развития болезни) получал по меньшей мере 4 еженедельных дозы BMN001 при 3 возрастающих уровнях дозы (30 мг, 100 мг и 300 мг), пока не была установлена максимальная переносимая тестируемая доза (MTTD). В Части 2, периоде постоянной дозы, до 30 пациентов, ранее зарегистрированных в исследовании естественного развития болезни, начинали курс лечения с еженедельным введение BMN001 при MTTD, который продолжался в течение 48 недель. 3 участника из Части 1 также были переведены в Часть 2, проходили оценку исходных показателей Части 2 и продолжали еженедельно введение в течение еще 48 недель при MTTD, установленной в Части 1.
[0150] Схема инфузии включает изоволюметрическое удаление 10 мл СМЖ с последующей ИЦВ доставкой суммарного объема 10 мл BMN001 в течение периода времени продолжительностью от приблизительно 5 минут до приблизительно 10 минут. Высокая скорость введения лекарственного средства была выбрана для этого исследования, чтобы удовлетворить некоторые потребности группы пациентов с МПС IIIB; в частности, эти пациенты часто имеют выраженные поведенческие проблемы, которые могут сделать более длительные периоды инфузии логистически сложными. Быстрая интравентрикулярная доставка больших объемов (например, 10-12 мл) терапевтических средств после удаления изоволюметрических количеств СМЖ является частью обычной практики в детской онкологии. Впрочем, ИЦВ доставка в течение более длительного периода времени также может использоваться. В этом отношении однократное ИЦВ введение BMN001 (которое может быть или может не быть изоволюметрическим) может осуществляться в течение периода времени по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210 или 240 минут или больше.
[0151] Процедуры исследования, выполненные на начало исследования в Части 1, а также на начало исследования и в недели 12, 24, 36 и 48 в Части 2, включают Шкалу адаптивного поведения Вайнленд, 2-е издание (VABS-II), или шкалы развития младенцев Бейли, 3-е издание (BSID-III), или батарею тестов Кауфманов для детей, 2-е издание (KABC-II), и шкалу оценки поведения Санфилиппо (SBRS). Дополнительные процедуры исследования, которые должны выполняться в рамках Части 1 и Части 2, а также в недели 24 и 48 в Части 2, включают опросник для определения качества жизни детей (ITQOL) или форму для опроса родителей по определению состояния здоровья детей (CHQ-PF50), опросник для определения поведения детей в отношении сна (CSHQ), Индекс оценки родительского стресса, Модуль воздействия на семью Опросника для определения качества жизни детей™ (PEDSQL™), МРТ (под наркозом) головного мозга и живота, а также оценку слухового вызванного потенциала ствола мозга (BAER).
[0152] В общей сложности три субъекта получали по меньшей мере 8 доз 30 мг BMN001 раз в неделю (QW) и по меньшей мере 3 дозы 100 мг QW. В рамках этого исследования субъектов контролировали в течение по меньшей мере 24 недель до начала лечения, чтобы понять естественное течение прогрессии заболевания. Исходные уровни гепарансульфата (ГС) и МПС IIIB-специфического невосстанавливающего конца ГС (NRE) измеряли в спинномозговой жидкости (СМЖ) для каждого пациента до и после лечения. Как показано на Фигуре 9, перед лечением три субъекта (A, B и C) имели чрезвычайно высокие уровни ГС и NRE по сравнению с небольными (здоровыми) контролями. Тем не менее, лечение BMN001 вызывало выраженное и долговременное снижение ГС и NRE у субъектов A и B (Фигура 10) (субъект C был зарегистрирован в исследовании позже, и данные пока недоступны). BMN001 хорошо переносили без серьезных побочных эффектов, связанных с лечением.
[0153] Эти результаты демонстрируют, что BMN001 можно безопасно вводить в вентрикулярное пространство путем изоволюметрической болюсной инфузии, и что такой метод лечения приводит к заметному фармакодинамическому ответу в ЦНС пациентов с МПС IIIB.
ПРИМЕР 4 - ПЕРЕРАБОТКА СОСТАВА BMN001
[0154] Физический стресс лекарственных форм, содержащих BMN001, как установили, вызывал образование агрегатов и/или мультимеров активного слитого белка. Агрегаты и/или мультимеры нежелательны в фармацевтических продуктах, поскольку они с высокой вероятностью могут снижать эффективную концентрацию лекарственного средства, могут вызвать забивание встроенных фильтров в процессе введения и могут вызывать нежелательный иммунный ответ на фармацевтический продукт. Таким образом, была проведена дополнительная работа для определения лекарственных форм, которые были устойчивы к агрегации и/или образованию мультимеров в ответ на физический стресс. С этой целью различные вспомогательные вещества исследовали на их влияние на образование агрегатов/мультимеров (см. Таблицу 2). Составы, содержащие каждое из этих вспомогательных веществ, подвергали физическому стрессу - рециркуляционному перекачиванию насосом - и измеряли агрегацию с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и статического светорассеяния (SLS).
ТАБЛИЦА 2: Вспомогательные вещества, протестированные на уменьшение агрегации
ВСПОМОГАТЕЛЬНОЕ ВЕЩЕСТВО
КОНЦЕНТРАЦИЯ
ТИП
ЭНДОГЕННЫЙ
СНИЖЕННАЯ АГРЕГАЦИЯ
N-ацетилглюкозамин (GlcNAc)
4% в/об (180 мМ)
Продукт NAGLU
Да
Да
Глюкоза
4% в/об (222 мМ)
Сахар
Да
Да
Сахароза
8% в/об (234 мМ)
Сахар
Нет
Да
Трегалоза
8% в/об (212 мМ)
Сахар
Нет
Да
Сорбит
4% в/об (220 мМ)
Сахароспирт
Нет
Да
Аргинин
Аминокислота
Да
Нет
Гистидин
Аминокислота
Да
Нет
Глицин
Аминокислота
Да
Нет
Глутаминовая кислота
Аминокислота
Да
Нет
Глутамин
Аминокислота
Да
Нет
Полисорбат 20
0,1% в/об
Детергент
Нет
Да
Полоксамер 188
0,1% в/об
Детергент
Нет
Да
Лецитин
0,0001% в/об
Фосфолипид
Да
Нет
[0155] Как показано в Таблице 2, N-ацетилглюкозамин, глюкоза, сахароза, трегалоза, сорбит, полисорбат 20 и полоксамер 188, как было обнаружено, уменьшали образование агрегатов/мультимеров. Из них трегалоза и полисорбат 20 были выбраны в качестве основных кандидатных вспомогательных веществ для дальнейшей работы.
[0156] Составы, содержащие различные концентрации трегалозы и/или полисорбата 20, были изготовлены с основой, содержащей двухосновного натрия фосфата гептагидрат, одноосновного натрия фосфата моногидрат и натрия хлорид. Затем их тестировали на способность уменьшать образование агрегатов/мультимеров при рециркуляционном перекачивании насосом, четырех циклах перекачивания насосом и периодическом замораживании/оттаивании (20 циклов при -40°C/25°C). Кроме того, каждый состав тестировали на стабильность при повышенных температурах 40°C и 25°C. Для каждого условия агрегацию измеряли по количеству видимых и невидимых невооруженным глазом частиц, мутности раствора (OD550), однородности размера частиц и процентному содержанию мультимеров. Как показано на Фигурах 11А и 11B, трегалоза дозозависимо уменьшала образование частиц. Кроме того, комбинация трегалозы и полисорбата 20 оказала наиболее сильное влияние на уменьшение образования частиц. Подобные результаты наблюдали при измерении образования частиц после каждого из четырех проходов через насос, причем комбинация трегалозы и полисорбата 20 показала наибольшее уменьшение количества частиц (Таблицы 3 и 4).
ТАБЛИЦА 3: Содержание частиц в мл после каждого прохода через насос, трегалоза или полисорбат 20.
Состав
До
Проход 1
Проход 2
Проход 3
Проход 4
Без трегалозыБез PS20*
50520
49853
138709
239257
385098
0,005% PS20
55128
51523
74063
88344
118344
8% трегалозы
43643
25034
76281
172005
269737
4% трегалозы
28511
15703
87551
190998
387826
*PS20 - полисорбат 20.
ТАБЛИЦА 4: Содержание частиц в мл после каждого прохода через насос, трегалоза или полисорбат 20.
Состав
До
Проход 1
Проход 2
Проход 3
Проход 4
Без трегалозыБез PS20*
2188
9207
151514
353469
528347
0,005% PS20
3549
3558
125017
212017
276984
8% трегалозы0,005% PS20
2961
2669
40200
88129
122931
*PS20 - полисорбат 20.
[0157] После определения аддитивного или синергического воздействия комбинации трегалозы и полисорбата 20 на ингибирование образования частиц в ответ на перекачивание насосом, тестировали ряд комбинаций трегалозы/полисорбата 20. Как показано в Таблице 5, увеличение количества трегалозы или полисорбата 20 в комбинации уменьшало количество образованных частиц, причем наибольшее уменьшение наблюдали в комбинации с наиболее высоким содержанием трегалозы и полисорбата 20 (8% трегалозы и 0,005% полисорбата 20). Комбинация трегалозы и полисорбата 20 также была более эффективной при уменьшении содержания агрегатов, образовавшихся после двадцати циклов замораживания/оттаивания, чем трегалоза или полисорбат 20 по отдельности (Фигура 12). Как обобщено в Таблице 6, вспомогательные вещества трегалоза и трегалоза в комбинации с полисорбатом 20 эффективно уменьшали образование агрегатов и мультимеров BMN001 по сравнению с исходным составом.
ТАБЛИЦА 5: Влияние различных комбинаций трегалозы/полисорбата 20 на образование частиц (частиц на мл).
Состав
До
Проход 1
Проход 2
Проход 3
Проход 4
Без трегалозыБез PS20*
5214
2871
30688
94475
185233
4% трегалозы 0,0025% PS20
3701
2369
17674
40193
80759
4% трегалозы 0,005% PS20
7610
1238
7032
16271
28738
8% трегалозы 0,00125% PS20
8105
4357
46255
81841
116240
8% трегалозы 0,0025% PS20
7420
9788
14931
33415
51841
8% трегалозы 0,005% PS20
3281
1426
11109
11109
20386
*PS20 - полисорбат 20.
ТАБЛИЦА 6: Результаты по воздействию вспомогательных веществ на снижение образования агрегатов и мультимеров (процентное снижение)
Состав
Снижение образования агрегатов в модели перекачивания
Снижение образования агрегатов при замораживании/ оттаивании
Снижение образования мультимеров при замораживании/ оттаивании
8% трегалозы
32%
30%
100%
8% трегалозы и 0,005% PS20
90%
100%
100%
8% трегалозы и 0,0025% PS20
75%
100%
100%
8% трегалозы и 0,001% PS20
40%
100%
100%
4% трегалозы 0,005% PS20
88%
100%
100%
4% трегалозы 0,0025% PS20
57%
100%
100%
[0158] По результатам этих исследований вспомогательных веществ два дополнительных состава были определены для применения в клинических исследованиях. Состав, содержащий BMN001 в концентрации приблизительно 30 мг/мл, двухосновного натрия фосфата гептагидрат в концентрации приблизительно 0,19 мг/мл, одноосновного натрия фосфата моногидрат в концентрации приблизительно 0,04 мг/мл, натрия хлорид в концентрации приблизительно 0,88 мг/мл и трегалозу в концентрации приблизительно 8% (в/об), при pH приблизительно 7,0. И состав, содержащий BMN001 в концентрации приблизительно 30 мг/мл, двухосновного натрия фосфата гептагидрат в концентрации приблизительно 0,19 мг/мл, одноосновного натрия фосфата моногидрат в концентрации приблизительно 0,04 мг/мл, натрия хлорид в концентрации приблизительно 5 мг/мл, трегалозу в концентрации приблизительно 4% (в/об) и полисорбат 20 в концентрации приблизительно 0,005%, при pH приблизительно 7,0.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
[0159] Специалистам в данной области будут известны, или они сумеют установить при помощи не более чем стандартных экспериментов, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления, описанных в настоящем документе. Объем настоящего изобретения не ограничивается приведенным выше описанием, и изложен в прилагаемой формуле изобретения. Следует понимать, что формы единственного числа (артикли "a", "an" и "the" в оригинальном тексте), используемые в настоящем документе в описании и в формуле изобретения, если прямо не указано обратное, включают в себя множественные ссылки. Пункты формулы или фразы в описании, которые включают "или" между одним или более членами группы, считаются удовлетворенными, если один, больше одного или все члены группы присутствуют, используются или относятся к определенному продукту или процессу, если не указано иное, или если иное не следует из контекста. Описание изобретения включает варианты осуществления, в которых только один член группы присутствует, применяется или иным образом относится к данному продукту или процессу. Описание изобретения также включает в себя варианты осуществления, в которых больше одного или все члены группы присутствуют, применяются или иным образом относятся к данному продукту или процессу. Кроме того, следует понимать, что описание охватывает варианты, комбинации и перестановки, в которых одно или более ограничений, элементов, пунктов, описательных терминов и т.д. из одного или более пунктов формулы включены в другой пункт формулы, зависимый от одного и того же независимого пункта (или, в соответствующем случае, любого другого пункта формулы), если не указано иное, или если специалисту в данной области не будет очевидно, что возникнет противоречие или несоответствие. Когда элементы представлены в виде списков, например, в группе Маркуша или в подобном формате, следует понимать, что каждая подгруппа элементов также раскрыта, и при этом любой элемент(ы) может быть исключен из группы. Следует понимать, что в общем случае, когда описание или аспекты описания указаны как содержащие конкретные элементы, признаки и т.д., некоторые варианты осуществления или аспекты настоящего описания состоят или по существу состоят из таких элементов, признаков и т.д. Для простоты такие варианты осуществления в настоящем документе не были прямо изложены в каждом конкретном случае. Следует также понимать, что любой вариант осуществления настоящего описания, например, любой вариант осуществления, присутствующий в предшествующем уровне техники, может быть в прямой форме исключен из формулы изобретения, независимо от того, указано ли конкретное исключение в настоящем описании.
[0160] Также следует понимать, что если прямо не указано обратное, в любых способах, заявленных в настоящем документе, которые включают больше чем одно действие, порядок действий в способе не обязательно должен быть ограничен порядком, в котором перечислены действия в способе, однако описание включает варианты осуществления, в которых порядок ограничен таким образом. Кроме того, в случаях, когда в пунктах формулы указана композиция, описание охватывает способы применения композиции и способы получения композиции. В случаях, когда в пунктах формулы указана композиция, следует понимать, что описание охватывает способы применения композиции и способы получения композиции.
[0161] Все публикации и патентные документы, процитированные в настоящей заявке, полностью включены посредством отсылки в такой же степени, как если бы в настоящий документ было включено содержание каждой отдельной публикации или патентного документа.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  BIOMARIN PHARMACEUTICAL INC.
<120>  ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СЛИТЫЕ БЕЛКИ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ
ЛИЗОСОМНЫХ ФЕРМЕНТОВ, СООТВЕТСТВУЮЩИЕ СОСТАВЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  30610/50493 PC
<150>  US 62/299,188
<151>  2016-02-24
<150>  US 62/428,221
<151>  2016-11-30
<160>  5
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  720
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ
<223>  Белок Naglu
<400>  1
Asp Glu Ala Arg Glu Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Val Ala Arg Leu
1               5                   10                  15
Leu Gly Pro Gly Pro Ala Ala Asp Phe Ser Val Ser Val Glu Arg Ala
20                  25                  30
Leu Ala Ala Lys Pro Gly Leu Asp Thr Tyr Ser Leu Gly Gly Gly Gly
35                  40                  45
Ala Ala Arg Val Arg Val Arg Gly Ser Thr Gly Val Ala Ala Ala Ala
50                  55                  60
Gly Leu His Arg Tyr Leu Arg Asp Phe Cys Gly Cys His Val Ala Trp
65                  70                  75                  80
Ser Gly Ser Gln Leu Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Ala Val Pro Gly
85                  90                  95
Glu Leu Thr Glu Ala Thr Pro Asn Arg Tyr Arg Tyr Tyr Gln Asn Val
100                 105                 110
Cys Thr Gln Ser Tyr Ser Phe Val Trp Trp Asp Trp Ala Arg Trp Glu
115                 120                 125
Arg Glu Ile Asp Trp Met Ala Leu Asn Gly Ile Asn Leu Ala Leu Ala
130                 135                 140
Trp Ser Gly Gln Glu Ala Ile Trp Gln Arg Val Tyr Leu Ala Leu Gly
145                 150                 155                 160
Leu Thr Gln Ala Glu Ile Asn Glu Phe Phe Thr Gly Pro Ala Phe Leu
165                 170                 175
Ala Trp Gly Arg Met Gly Asn Leu His Thr Trp Asp Gly Pro Leu Pro
180                 185                 190
Pro Ser Trp His Ile Lys Gln Leu Tyr Leu Gln His Arg Val Leu Asp
195                 200                 205
Gln Met Arg Ser Phe Gly Met Thr Pro Val Leu Pro Ala Phe Ala Gly
210                 215                 220
His Val Pro Glu Ala Val Thr Arg Val Phe Pro Gln Val Asn Val Thr
225                 230                 235                 240
Lys Met Gly Ser Trp Gly His Phe Asn Cys Ser Tyr Ser Cys Ser Phe
245                 250                 255
Leu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Ile Phe Pro Ile Ile Gly Ser Leu Phe
260                 265                 270
Leu Arg Glu Leu Ile Lys Glu Phe Gly Thr Asp His Ile Tyr Gly Ala
275                 280                 285
Asp Thr Phe Asn Glu Met Gln Pro Pro Ser Ser Glu Pro Ser Tyr Leu
290                 295                 300
Ala Ala Ala Thr Thr Ala Val Tyr Glu Ala Met Thr Ala Val Asp Thr
305                 310                 315                 320
Glu Ala Val Trp Leu Leu Gln Gly Trp Leu Phe Gln His Gln Pro Gln
325                 330                 335
Phe Trp Gly Pro Ala Gln Ile Arg Ala Val Leu Gly Ala Val Pro Arg
340                 345                 350
Gly Arg Leu Leu Val Leu Asp Leu Phe Ala Glu Ser Gln Pro Val Tyr
355                 360                 365
Thr Arg Thr Ala Ser Phe Gln Gly Gln Pro Phe Ile Trp Cys Met Leu
370                 375                 380
His Asn Phe Gly Gly Asn His Gly Leu Phe Gly Ala Leu Glu Ala Val
385                 390                 395                 400
Asn Gly Gly Pro Glu Ala Ala Arg Leu Phe Pro Asn Ser Thr Met Val
405                 410                 415
Gly Thr Gly Met Ala Pro Glu Gly Ile Ser Gln Asn Glu Val Val Tyr
420                 425                 430
Ser Leu Met Ala Glu Leu Gly Trp Arg Lys Asp Pro Val Pro Asp Leu
435                 440                 445
Ala Ala Trp Val Thr Ser Phe Ala Ala Arg Arg Tyr Gly Val Ser His
450                 455                 460
Pro Asp Ala Gly Ala Ala Trp Arg Leu Leu Leu Arg Ser Val Tyr Asn
465                 470                 475                 480
Cys Ser Gly Glu Ala Cys Arg Gly His Asn Arg Ser Pro Leu Val Arg
485                 490                 495
Arg Pro Ser Leu Gln Met Asn Thr Ser Ile Trp Tyr Asn Arg Ser Asp
500                 505                 510
Val Phe Glu Ala Trp Arg Leu Leu Leu Thr Ser Ala Pro Ser Leu Ala
515                 520                 525
Thr Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala
530                 535                 540
Val Gln Glu Leu Val Ser Leu Tyr Tyr Glu Glu Ala Arg Ser Ala Tyr
545                 550                 555                 560
Leu Ser Lys Glu Leu Ala Ser Leu Leu Arg Ala Gly Gly Val Leu Ala
565                 570                 575
Tyr Glu Leu Leu Pro Ala Leu Asp Glu Val Leu Ala Ser Asp Ser Arg
580                 585                 590
Phe Leu Leu Gly Ser Trp Leu Glu Gln Ala Arg Ala Ala Ala Val Ser
595                 600                 605
Glu Ala Glu Ala Asp Phe Tyr Glu Gln Asn Ser Arg Tyr Gln Leu Thr
610                 615                 620
Leu Trp Gly Pro Glu Gly Asn Ile Leu Asp Tyr Ala Asn Lys Gln Leu
625                 630                 635                 640
Ala Gly Leu Val Ala Asn Tyr Tyr Thr Pro Arg Trp Arg Leu Phe Leu
645                 650                 655
Glu Ala Leu Val Asp Ser Val Ala Gln Gly Ile Pro Phe Gln Gln His
660                 665                 670
Gln Phe Asp Lys Asn Val Phe Gln Leu Glu Gln Ala Phe Val Leu Ser
675                 680                 685
Lys Gln Arg Tyr Pro Ser Gln Pro Arg Gly Asp Thr Val Asp Leu Ala
690                 695                 700
Lys Lys Ile Phe Leu Lys Tyr Tyr Pro Arg Trp Val Ala Gly Ser Trp
705                 710                 715                 720
<210>  2
<211>  60
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ
<223>  АК 8-67 из IGF-II
<400>  2
Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp
1               5                   10                  15
Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser
20                  25                  30
Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu
35                  40                  45
Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu
50                  55                  60
<210>  3
<211>  60
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Пептидная метка
<400>  3
Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp
1               5                   10                  15
Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Ala Arg Ser
20                  25                  30
Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu
35                  40                  45
Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu
50                  55                  60
<210>  4
<211>  31
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Пептидный линкер
<400>  4
Gly Ala Pro Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Ala Pro
1               5                   10                  15
Ala Pro Thr Pro Ala Pro Ala Gly Gly Gly Pro Ser Gly Ala Pro
20                  25                  30
<210>  5
<211>  811
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ
<223>  Терапевтический слитый белок BMN001
<400>  5
Asp Glu Ala Arg Glu Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Val Ala Arg Leu
1               5                   10                  15
Leu Gly Pro Gly Pro Ala Ala Asp Phe Ser Val Ser Val Glu Arg Ala
20                  25                  30
Leu Ala Ala Lys Pro Gly Leu Asp Thr Tyr Ser Leu Gly Gly Gly Gly
35                  40                  45
Ala Ala Arg Val Arg Val Arg Gly Ser Thr Gly Val Ala Ala Ala Ala
50                  55                  60
Gly Leu His Arg Tyr Leu Arg Asp Phe Cys Gly Cys His Val Ala Trp
65                  70                  75                  80
Ser Gly Ser Gln Leu Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Ala Val Pro Gly
85                  90                  95
Glu Leu Thr Glu Ala Thr Pro Asn Arg Tyr Arg Tyr Tyr Gln Asn Val
100                 105                 110
Cys Thr Gln Ser Tyr Ser Phe Val Trp Trp Asp Trp Ala Arg Trp Glu
115                 120                 125
Arg Glu Ile Asp Trp Met Ala Leu Asn Gly Ile Asn Leu Ala Leu Ala
130                 135                 140
Trp Ser Gly Gln Glu Ala Ile Trp Gln Arg Val Tyr Leu Ala Leu Gly
145                 150                 155                 160
Leu Thr Gln Ala Glu Ile Asn Glu Phe Phe Thr Gly Pro Ala Phe Leu
165                 170                 175
Ala Trp Gly Arg Met Gly Asn Leu His Thr Trp Asp Gly Pro Leu Pro
180                 185                 190
Pro Ser Trp His Ile Lys Gln Leu Tyr Leu Gln His Arg Val Leu Asp
195                 200                 205
Gln Met Arg Ser Phe Gly Met Thr Pro Val Leu Pro Ala Phe Ala Gly
210                 215                 220
His Val Pro Glu Ala Val Thr Arg Val Phe Pro Gln Val Asn Val Thr
225                 230                 235                 240
Lys Met Gly Ser Trp Gly His Phe Asn Cys Ser Tyr Ser Cys Ser Phe
245                 250                 255
Leu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Ile Phe Pro Ile Ile Gly Ser Leu Phe
260                 265                 270
Leu Arg Glu Leu Ile Lys Glu Phe Gly Thr Asp His Ile Tyr Gly Ala
275                 280                 285
Asp Thr Phe Asn Glu Met Gln Pro Pro Ser Ser Glu Pro Ser Tyr Leu
290                 295                 300
Ala Ala Ala Thr Thr Ala Val Tyr Glu Ala Met Thr Ala Val Asp Thr
305                 310                 315                 320
Glu Ala Val Trp Leu Leu Gln Gly Trp Leu Phe Gln His Gln Pro Gln
325                 330                 335
Phe Trp Gly Pro Ala Gln Ile Arg Ala Val Leu Gly Ala Val Pro Arg
340                 345                 350
Gly Arg Leu Leu Val Leu Asp Leu Phe Ala Glu Ser Gln Pro Val Tyr
355                 360                 365
Thr Arg Thr Ala Ser Phe Gln Gly Gln Pro Phe Ile Trp Cys Met Leu
370                 375                 380
His Asn Phe Gly Gly Asn His Gly Leu Phe Gly Ala Leu Glu Ala Val
385                 390                 395                 400
Asn Gly Gly Pro Glu Ala Ala Arg Leu Phe Pro Asn Ser Thr Met Val
405                 410                 415
Gly Thr Gly Met Ala Pro Glu Gly Ile Ser Gln Asn Glu Val Val Tyr
420                 425                 430
Ser Leu Met Ala Glu Leu Gly Trp Arg Lys Asp Pro Val Pro Asp Leu
435                 440                 445
Ala Ala Trp Val Thr Ser Phe Ala Ala Arg Arg Tyr Gly Val Ser His
450                 455                 460
Pro Asp Ala Gly Ala Ala Trp Arg Leu Leu Leu Arg Ser Val Tyr Asn
465                 470                 475                 480
Cys Ser Gly Glu Ala Cys Arg Gly His Asn Arg Ser Pro Leu Val Arg
485                 490                 495
Arg Pro Ser Leu Gln Met Asn Thr Ser Ile Trp Tyr Asn Arg Ser Asp
500                 505                 510
Val Phe Glu Ala Trp Arg Leu Leu Leu Thr Ser Ala Pro Ser Leu Ala
515                 520                 525
Thr Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala
530                 535                 540
Val Gln Glu Leu Val Ser Leu Tyr Tyr Glu Glu Ala Arg Ser Ala Tyr
545                 550                 555                 560
Leu Ser Lys Glu Leu Ala Ser Leu Leu Arg Ala Gly Gly Val Leu Ala
565                 570                 575
Tyr Glu Leu Leu Pro Ala Leu Asp Glu Val Leu Ala Ser Asp Ser Arg
580                 585                 590
Phe Leu Leu Gly Ser Trp Leu Glu Gln Ala Arg Ala Ala Ala Val Ser
595                 600                 605
Glu Ala Glu Ala Asp Phe Tyr Glu Gln Asn Ser Arg Tyr Gln Leu Thr
610                 615                 620
Leu Trp Gly Pro Glu Gly Asn Ile Leu Asp Tyr Ala Asn Lys Gln Leu
625                 630                 635                 640
Ala Gly Leu Val Ala Asn Tyr Tyr Thr Pro Arg Trp Arg Leu Phe Leu
645                 650                 655
Glu Ala Leu Val Asp Ser Val Ala Gln Gly Ile Pro Phe Gln Gln His
660                 665                 670
Gln Phe Asp Lys Asn Val Phe Gln Leu Glu Gln Ala Phe Val Leu Ser
675                 680                 685
Lys Gln Arg Tyr Pro Ser Gln Pro Arg Gly Asp Thr Val Asp Leu Ala
690                 695                 700
Lys Lys Ile Phe Leu Lys Tyr Tyr Pro Arg Trp Val Ala Gly Ser Trp
705                 710                 715                 720
Gly Ala Pro Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Ala Pro
725                 730                 735
Ala Pro Thr Pro Ala Pro Ala Gly Gly Gly Pro Ser Gly Ala Pro Leu
740                 745                 750
Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg
755                 760                 765
Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Ala Arg Ser Arg
770                 775                 780
Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu
785                 790                 795                 800
Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu
805                 810
<---