СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИТЕЛЬНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) С ЦЕЛЬЮ ИНДИКАЦИИ БРУЦЕЛЛ В ПАТМАТЕРИАЛЕ
METHOD FOR PREPARING ANTIBODY ERYTHROCYTE DIAGNOSTICUM FOR INDIRECT HEMAGGLUTINATION TEST (IHT) FOR PURPOSES OF BRUCELLA INDICATION IN PATHOLOGIC MATERIAL

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению эритроцитарного бруцеллезного антительного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации, с целью индикации бруцелл в патматериале.
Известен «Способ получения эритроцитарного антительного диагностикума для индикации бруцелл в испытуемом материале», суть которого заключается в следующем. Для сенсибилизации эритроцитов используют позитивные бруцеллезные сыворотки крови, разведенные физиологическим раствором поваренной соли 1:80-1:100 или буферно-физиологическим раствором, инактивированным при 64°C в течение 20 минут, с оптимальной pH - 6,4-7,0.
Оптимальными параметрами условий сенсибилизации эритроцитов позитивными сыворотками крови являются следующие: 1 объем предварительно оттитрованной концентрации раствора амидола смешивают с 2 объемами 20%-ной взвеси фиксированных эритроцитов и 1 объемом позитивной бруцеллезной сыворотки крови в разведении 1:100, при инкубации в водяной бане при температуре 55°С в течение 25-30 минут, с периодическим встряхиванием через каждые 5-10 минут.
Сенсибилизированные эритроциты отмывают одним из стабилизаторов (нормальной лошадиной или кроличьей сыворотками), разведенных 1:100-1:500, на центрифуге при 1500-2000 об/мин в течение 5-10 минут двукратно, после чего суспендируют до 0,75%-ной концентрации изотоническим раствором поваренной соли и используют для постановки РНГА с целью индикации бруцелл: Ш.А. Барамова, автореф. дисс., к.в.н., 1988.
Недостатком данного способа является слабая активность диагностикума, изготовленного этим способом в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при индикации бруцелл в исследуемом материале. Кроме того, данный диагностикум в отдельных случаях спонтанно агглютинируются в РНГА нормальной кроличьей сывороткой, используемой в качестве стабилизатора для разведения исследуемых патматериалов, где отсутствуют бруцеллы. Поэтому мы решили разработать способ получения высокоактивного и специфичного бруцеллезного антительного эритроцитарного диагностикума для РНГА, лишенного указанных недостатков.
Целью изобретения является повышение активности и специфичности бруцеллезного антительного эритроцитарного диагностикума для РНГА. Эта цель достигается тем, что сенсибилизация эритроцитов барана (стабилизированных по Вайнбаху в нашей модификации) с помощью конъюгата амидола проводится по параметрам концентрации ингредиентов, рН, ионной силы среды, температуры и экспозиции.
Максимальная чувствительность и специфичность в РНГА получаются при следующих соотношениях ингредиентов: осадок от 2 объемов 40%-ной взвеси эритроцитов барана, 1 объем 0,43-0,44%-го раствора свежеприготовленного амидола и 1,0-1,5 объема позитивной сыворотки крови, разведенной 1:50-1:100 на 0,85%-ном растворе NaCl, pH - 7,0-7,2 в отсутствие фосфата буфера, инактивированного при 60°С в течение 30 минут, смесь перемешивают и выдерживают в водяной бане 28-32 минуты при 55-56°С, периодически встряхивая через каждые 5-6 минут.
Отмывание сенсибилизированных эритроцитов осуществляется 0,85%-ным раствором NaCl, содержащим нормальную кроличью сыворотку в разведении 1:50-1:100 или лошадиную сыворотку в разведении 1:220-1:250, инактивированные при 60°C в течение 30 минут, pH - 7,0-7,2. По окончании центрифугирования взвеси эритроцитов вносят в физиологический раствор с целью получения 2,5%-ной концентрации эритроцитов.
Предварительно активность и специфичность изготовленных антительных диагностикумов проверяют в РНГА, при исследовании единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК в предельных разведениях.
Проводили испытание антительного диагностикума, в сравнении с аналогичным препаратом, предложенным Ш.А. Барамовой.
Активность и специфичность антительного диагностикума, изготовленного по разработанному нами способу (антительный диагностикум Прикаспийского зонального НИВИ), проверяли в сравнении с аналогичным препаратом, предложенным Ш.А. Барамовой (прототип).
Для испытания диагностикума в РНГА исследовали единый бруцеллезный антиген для РА, РСК и РДСК (табл.1).
Таблица-1
Результаты проверки активности диагностикумов в РНГА
Метод формалинизации эритроцитов
Концентрация амидола (%)
0,24
0,27
0,30
0,32
0,34
0,36
0,38
0,40
0,43
0,44
Выявлено бруцелл (тыс.м.к. в 1 мл)
По Вайнбаху в нашей модификации
с диагностикумом Прикасп. ЗНИВИ
366,2
183,1
91,5
45,7
22,8
11,4
5,7
2,8
1,43
1,43
с аналогом
366,2
183,1
91,5
45,7
22,8
-
-
-
-
-
Как видно из данных, приведенных в таблице 1, разработанный нами диагностикум чувствительнее в 15,9 раза, в сравнении с аналогом.
Испытание антительного диагностикума в сравнении с аналогичным препаратом, изготовленным по методике Ш.А.Барамовой
Для испытания антительных диагностикумов в РНГА исследовали суспензии лимфоузлов и органов у здорового крупного рогатого скота (20 голов) и 30 - овец. Результаты проверки специфичности указанных диагностикумов представлены в таблице 2.
Таблица-2
Результаты проверки специфичности антительных диагностикумов в РНГА
Материал (суспензия)
Количество голов
Исследовано органов и лимфоузлов
Прикасп. ЗНИВИ вРНГА
Аналог в РНГА
пол.
отр.
пол.
отр.
Из органов и лимфоузлов здорового кр. рог. скота
20
200
200
1
199
Из органов и лимфоузлов овец
30
150
150
2
148
Как видно из таблицы 2, при исследовании в РНГА антительным эритроцитарным диагностикумом, изготовленным по разработанному нами способу (антительный диагностикум Прикасп. ЗНИВИ), со всеми органами и лимфоузлами суспензий здоровых животных получен отрицательный результат, что показывает его высокую специфичность, тогда как по аналогу получен в 3 случаях положительный результат, т.е. прототип в отдельных случаях дает неспецифические реакций с суспензией здоровых животных.
Кроме того, аналог в отдельных случаях спонтанно агглютинируется в РНГА нормальной кроличьей сывороткой, используемой в качестве стабилизатора для разведения исследуемого патматериала для выявления возбудителя бруцеллеза, особенно, когда pH среды - 6,4, как это рекомендует Ш.А. Барамова.
Оказалось, что удлинение времени сенсибилизации эритроцитов до 32 минут привело к повышению чувствительности индикации возбудителя бруцеллеза, а с повышением температуры выше 28-32°C, при длительности контакта эритроцитов с позитивной сывороткой более 40-60 минут, развивалась спонтанная гемагглютинация (табл.3).
Таблица-3
Результаты индикации оптимальных параметров температуры и экспозиции сенсибилизации эритроцитов позитивной сыворотки крови (диагн. Прикасп. ЗНИВИ)
Разведение позитивной бруцеллезной сыворотки (сенситина)
Температура при экспозиции (мин.)
45°C
50°C
55-56°C
60°C
28
32
40
28
32
40
28
32
40
28
32
40
1:40
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1:50
-
-
-
-
-
-
Дв
Дв
Спонтанная гемагглютинация
1:100
-
-
-
Дс
Дс
Дч
Дв
Дв
-//-
-//-
-//-
-//-
1:150
-
-
-
Дч
Дч
Спонтанная гемагглютинация
-//-
-//-
-//-
-//-
Примечание:
Дс - диагностикум, показавший в РНГА слабую чувствительность;
Дч - диагностикум чувствительный, но с недостаточно высоким титром;
Дв - диагностикум высокочувствительный;
Спонт. гемаггл. - диагностикум, показавший в РНГА спонтанную гемагглютинацию;
- диагностикум, показавший в РНГА отрицательный результат.
Многие исследователи (Чернышева М.Н. (1970), Садыков С.Ж. (1974), Абуталипов А. (1982), Ромахов В.А. (1992) и др.) для выявления бруцеллезного антигена а патматериале использовали реакцию нейтрализации антител (РНАт) и бактериологический метод. Поэтому мы решили провести сравнительное испытание диагностической эффективности антительного бруцеллезного диагностикума для РНГА (Прикасп. ЗНИВИ), реакции нейтрализации антител (РНАт) и бактериологического метода.
С этой целью был подвергнут исследованию патологический материал от больного бруцеллезом крупного рогатого скота (7 голов), овец (11 голов), молоко, инфицированное возбудителем этой болезни (5 проб) и водопроводная вода, инфицированная бруцеллами (вакцинным штаммом B.abortus 19) (3 пробы). Результаты исследований представлены в таблице 4.
Таблица-4
Результаты сравнительного испытания различных методов для индикации бруцеллезного антигена в исследуемом материале
Материал
Исследова-но проб
Выявлен бруцеллезный антиген
бактериологическим методом
РНАт
РНГА с антительным диагностикумом (ПЗНИВИ)
пол.
отр.
пол.
отр.
пол.
отр.
Экстракт органов и лимфоузлов кр. рог. скота
7
5
2
6
1
7
-
Экстракт из органов и лимфоузлов от овец
11
10
1
10
1
11
-
Молоко, инфицированное бруцеллами
5
4
1
4
1
5
-
Водопроводная вода, инфицированная бруцеллами
3
3
-
3
3
Всего
26
22
4
23
3
26
-
Проведенными исследованиями установлены специфичность и высокая чувствительность антительного эритроцитарного диагностикума для выявления бруцеллезного возбудителя в патматериале, молоке и других объектах внешней среды.
При сравнительном испытании антительного эритроцитарного бруцеллезного диагностикума для РНГА с РНАт установлено, что антительный диагностикум чувствительнее в 22 раза. Кроме того, РНГА с антительным диагностикумом проста в постановке, РНАт является более сложной трехкомпонентной реакцией (положительная сыворотка + бруцеллезный антиген + эритроцитарный бруцеллезный антиген).
Бруцеллезный антительный диагностикум для РНГА по диагностической ценности и быстроте получения результатов превосходит также бактериологический метод исследования.
ЛИТЕРАТУРА
Абуталипов А. Сравнительная диагностическая эффективность РИФ, РНАт и бактериологического метода при бруцеллезе. Вестник с/х науки Казахстана, 1982, №5, с.75-77.
Ромахов В.А. Дисс. д.в.н. в форме научного доклада, 1992.
Садыков С.Ж. Диагностическая эффективность РНГА и РНАт при бруцеллезе, «Ветеринария», 1974, №6, с. 107-108.
Чернышева М.И. с соавт. Сухой эритроцитарный диагностикум для реакции пассивной гемагглютинации и РНАт при бруцеллезе, ЖМЭИ, 1970, №12, с. 171 и др.