ИНСЕРЦИЯ ТАРГЕТНОГО ГЕНА ДЛЯ УЛУЧШЕННОЙ КЛЕТОЧНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ

1. Способ получения сконструированных иммунных клеток для клеточной иммунотерапии, где способ включает
получение популяции первичных иммунных клеток;
интродукцию в часть указанных первичных иммунных клеток:
I) по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, содержащей экзогенную нуклеотидную или полинуклеотидную последовательность, которую требуется интегрировать в выбранный эндогенный локус для того, чтобы кодировать по меньшей мере одну молекулу, повышающую терапевтический потенциал указанной популяции иммунных клеток;
II) по меньшей мере одного специфического для последовательности реагента, который специфически воздействует на (таргетирует) указанный выбранный эндогенный локус,
в котором указанную экзогенную нуклеотидную или полинуклеотидную последовательность встраивают путем интеграции таргетного гена в указанный эндогенный локус так, чтобы указанная экзогенная нуклеотидная или полинуклеотидная последовательность формирует экзогенную кодирующую последовательность под транскрипционным контролем эндогенного промотора, присутствующего в указанном локусе, где транскрипционная активность указанного эндогенного промотора характеризуется повышающей регуляцией после активации иммунной клетки.
2. Способ по п. 1, в котором указанный специфический для последовательности реагент является реагентом, представляющим собой эндонуклеазу.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором указанную интеграцию таргетного гена осуществляют путем гомологичной рекомбинации или NHEJ в указанных иммунных клетках.
4. Способ по одному из пп. 1-3, в котором указанная молекула, кодируемая указанной экзогенной кодирующей последовательностью, представляет собой РНК-транскрипт, такой как РНКi, или полипептид, такой как функциональный белок.
5. Способ по одному из пп. 1-4, в котором указанная молекула, повышающая уровень терапевтического потенциала указанной популяции первичных иммунных клеток, придает иммунным клеткам устойчивость к лекарственному средству, повышает персистенцию иммунных клеток (in vivo или in vitro) или их безопасность.
6. Способ по п. 5, в котором указанную молекулу, повышающую персистенцию первичных иммунных клеток, выбирают из цитокинового рецептора, белка, придающего устойчивость к лекарственному средству, или секретируемого антитела, направленного против ингибирующих пептидов или белков, такого как антитела к IDO1, к IL10, к PD1, к PDL1, к IL6 или к PGE2.
7. Способ по одному из пп. 1-5, в котором указанная экзогенная последовательность кодирует хемокин или цитокин, такой как IL-2, IL-12 и IL-15.
8. Способ по одному из пп. 1-5, в котором указанная экзогенная последовательность, повышающая терапевтическую активность Т-клетки, кодирует выбранный ингибитор ассоциированных с опухолью макрофагов (ТАМ), такой как нейтрализующий CCR2/CCL2 агент.
9. Способ по одному из пп. 1-5, в котором указанная экзогенная последовательность, повышающая безопасность первичной иммунной клетки, кодирует компонент химерного антигенного рецептора (CAR).
10. Способ по п. 9, в котором указанный CAR представляет собой ингибирующий CAR, принимающий участие в повышении специфичности иммунной клетки в отношении данного типа клеток.
11. Способ по одному из пп. 1-5, в котором указанная экзогенная последовательность, повышающая безопасность первичной иммунной клетки, кодирует цитохром(ы) Р450, CYP2D6-1, CYP2D6-2, CYP2C9, CYP3A4, CYP2C19 или CYP1A2, придающий(ие) указанным иммунным клеткам гиперчувствительность к лекарственному средству, такому как циклофосфамид и/или изофосфамид.
12. Способ по одному из пп. 1-11, в котором указанный эндогенный промотор индуцируется в Т-клетках и его выбирают из CCR7, CD2, CD3, CD4, CD8, CD28, CD45, CD96, CD229/SLAMF3, DNAM-1/CD226, CD25/IL-2 R альфа, L-селектина/CD62L и TIGIT.
13. Способ по одному из пп. 1-11, в котором указанный эндогенный промотор индуцируется в NK-клетках и его выбирают из CD161, CD229/SLAMF3, CD96, DNAM-1/CD226, Fc гамма RII/CD32, Fc гамма RII/RIII (CD32/CD16), Fc гамма RIII (CD16), IL-2 R бета, интегрин альфа 2/CD49b, KIR/CD158, NCAM-1/CD56, NKG2A/CD159a, NKG2C/CD159c, NKG2D/CD314, NKp30/NCR3, NKp44/NCR2, NKp46/NCR1, NKp80/KLRF1, сиглек-7/СВ328 и TIGIT.
14. Способ по одному из пп. 1-11, в котором указанная транскрипционная активность указанного эндогенного промотора является кратковременной после активации иммунных клеток.
15. Способ по одному из пп. 1-11, в котором указанный промотор характеризуется повышающей регуляцией в течение менее чем 12 ч после активации иммунных клеток и его выбирают из Spata6, Itga6, Rcbtb2, Cd1d1, St8sia4, Itgae и Fam214a.
16. Способ по одному из пп. 1-11, в котором указанный промотор характеризуется повышающей регуляцией в течение менее чем 24 ч после активации иммунных клеток и его выбирают из IL3, IL2, Ccl4, IL21, Gp49a, Nr4a3, Lilrb4, Cd200, Cdkn1a, Gzmc, Nr4a2, Cish, Ccr8, Lad1 и Crabp2.
17. Способ по одному из пп. 1-11, в котором указанный промотор характеризуется повышающей регуляцией в течение более чем 24 ч после активации иммунных клеток и его выбирают из Gzmb, Tbx21, Plek, Chek1, Slamƒ7, Zbtb32, Tigit, Lag3, Gzma, Wee1, IL12rb2, Eea1 и Dtl.
18. Способ по одному из пп. 1-17, в котором химерный антигенный рецептор (CAR) или модифицированный TCR независимо экспрессируется в трансфектированных иммунных клетках.
19. Способ по п. 18, в котором активность указанного эндогенного промотора зависит от указанного CAR, который экспрессируется в трансфектированных иммунных клетках.
20. Способ по одному из пп. 1-19, в котором указанный специфический представляющий собой эндонуклеазу реагент интродуцируют с помощью электропорации в виде полипептида или мРНК, которая транслируется в клетке.
21. Способ по одному из пп. 1-20, в котором указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, содержащую указанную кодирующую последовательность, включают в ДНК-вектор, предпочтительно вирусный вектор, такой как AAV-вектор.
22. Способ по п. 21, в котором нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный специфический для последовательности реагент, представляющий собой эндонуклеазу, и указанную экзогенную нуклеиновую кислоту обе включают в указанный ДНК-вектор.
23. Способ по одному из пп. 1-22, в котором перед или после экзогенной последовательности, которую интродуцируют в иммунную клетку, помещают последовательность, кодирующую 2А-пептид, для обеспечения транскрипции указанной экзогенной кодирующей последовательности вместе по меньшей мере с одной частью эндогенного гена.
24. Способ по одному из пп. 1-23, в котором интродуцируют экзогенную последовательность, обладающую способностью инактивировать экспрессию по меньшей мере одной эндогенной геномной последовательности, исходно присутствующей в указанном гене.
25. Способ по п. 24, в котором указанная эндогенная геномная последовательность, подлежащая инактивации, кодирует супрессорные цитокины, киназы или их рецепторы, такие как TGFb, TGFbR, IL-10, IL-10R, GCN2 или PRDM1.
26. Способ по п. 24, в котором указанная эндогенная геномная последовательность, подлежащая инактивации, кодирует белок, действующий в качестве иммунной контрольной точки, такой как PD1, PDL1, CTLA4, TIM3 или LAG3.
27. Способ по п. 24, в котором указанная эндогенная геномная последовательность, подлежащая инактивации, экспрессирует фермент, который активирует пролекарство, такой как DCK, HPRT или GGH.
28. Способ по одному из пп. 1-27, в котором указанная иммунная клетка представляет собой первичную Т-клетку или NK-клетку.
29. Сконструированная иммунная клетка, которую можно получать с помощью способа по одному из пп. 1-28.
30. Сконструированная иммунная клетка, которая содержит экзогенную кодирующую последовательность под транскрипционным контролем промотора эндогенного гена, в которой указанный промотор эндогенного гена является чувствительным к активации указанной иммунной клетки, предпочтительно характеризуется повышающей регуляцией.
31. Сконструированная иммунная клетка по одному из пп. 29-30, в которой указанный эндогенный ген выбирают из перечисленных в таблице 6.
32. Сконструированная иммунная клетка по одному из пп. 29-31, где указанная иммунная клетка представляет собой первичную Т-клетку или NK-клетку.
33. Сконструированная иммунная клетка по одному из пп. 29-32, где указанная первичная клетка наделена химерным антигенным рецептором.
34. Сконструированная иммунная клетка по одному из пп. 29-33, где указанная клетка экспрессирует первую экзогенную последовательность, кодирующую CAR в локусе TCR, нарушая тем самым экспрессию TCR, и экспрессирует вторую экзогенную кодирующую последовательность под транскрипционной активностью эндогенного локуса, выбранного из PD1, CD25, CD71 или CD69.
35. Сконструированная иммунная клетка по п. 33 или 34, в котором указанный транскрипционный контроль указанного промотора эндогенного гена является чувствительным к сигналу активации указанного химерного антигенного рецептора (CAR).
36. Терапевтически эффективная популяция иммунных клеток, содержащая по меньшей мере 30%, предпочтительно 50%, более предпочтительно 80% клеток по одному из пп. 29-35.
37. Популяция иммунных клеток по п. 36, в которой более 50% указанных иммунных клеток представляют собой TCR-негативные Т-клетки.
38. Популяция иммунных клеток по одному из пп. 36 и 37, в которой более 50% указанных иммунных клеток представляют собой CAR-позитивные клетки.
39. Фармацевтическая композиция, содержащая сконструированную иммунную клетку или популяцию иммунных клеток по одному из пп. 29-38.
40. Фармацевтическая композиция по п. 39, предназначенная для применения для лечения рака.