"IL-6-АНТИТЕЛА И ИХ СЛИТЫЕ КОНСТРУКЦИИ И КОНЪЮГАТЫ

1. Выделенное антагонистическое антитело, которое специфично связывается с IL-6, конъюгированное с полимером.
2. Выделенное антагонистическое антитело к IL-6, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит тяжелую цепь, которая имеет последовательность по меньшей мере одной из SEQ ID NO: 7-13, 19-27, 89, 90, 256-262, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит легкую цепь, которая имеет последовательность по меньшей мере одной из SEQ ID NO: 91-93, 28-30.
3. Выделенное антагонистическое антитело к IL-6, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую 3 определяющие комплементарность области: определяющую комплементарность область (CDR) 1 (CDR1) VH, CDR2 VH и CDR3 VH, имеющие аминокислотную последовательность из CDR, перечисленных в SEQ ID NO: 256, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы CDR, перечисленных в SEQ ID NO: 91-93.
4. Выделенное антагонистическое антитело, которое связывается с IL-6, при этом указанное антитело содержит по меньшей мере одну из следующих мутаций согласно нумерации EU: L234A, L235A и G237A.
5. Выделенное антагонистическое антитело, которое связывается с IL-6, при этом указанное антитело содержит:
H
H
CDR1, представляющую собой CDR1 в SEQ ID NO: 172;
H
H
CDR2, представляющую собой CDR2 в SEQ ID NO: 173;
H
H
CDR3, представляющую собой CDR3 в SEQ ID NO: 174;
L
L
CDR1, представляющую собой CDR1 в SEQ ID NO: 199;
L
L
CDR2, представляющую собой CDR2 в SEQ ID NO: 200;
L
L
CDR3, представляющую собой CDR3 в SEQ ID NO: 201;
по меньшей мере одну из следующих мутаций (нумерация EU): L234A, L235A и G237A; и
по меньшей мере одну из следующих мутаций (нумерация EU): Q347C или L443C.
6. Выделенное антагонистическое антитело по любому из пп.1-5, характеризующееся тем, что указанное антитело связывает IL-6 человека с аффинностью от примерно 10 пМ до примерно 1 нМ.
7. Выделенное антагонистическое антитело по любому из пп.1-6, характеризующееся тем, что константный домен тяжелой цепи дополнительно содержит остаток цистеина, введенный методом рекомбинантных ДНК.
8. Выделенное антагонистическое антитело по любому из пп.1-7, характеризующееся тем, что указанный остаток цистеина выбран из группы, состоящей из Q347C и L443C (нумерация EU).
9. Выделенное антагонистическое антитело по любому из пп.1-8, характеризующееся тем, что остаток цистеина представляет собой L443C (нумерация EU).
10. Слитый белок, содержащий выделенное антагонистическое антитело по любому из пп.1-9 и ловушку VEGF (фактора роста эндотелия сосудов).
11. Слитый белок по п.10, характеризующийся тем, что указанная ловушка VEGF расположена либо
1. на N-конце тяжелой цепи, содержащей IL-6 VH; либо
2. между шарнирной областью и после CH1-домена тяжелой цепи, содержащей IL-6 VH.
12. Слитый белок по п.11, характеризующийся тем, что ловушка VEGF расположена на N-конце тяжелой цепи, содержащей IL-6 VH.
13. Слитый белок по п.11, характеризующийся тем, что ловушка VEGF расположена между шарнирной областью и после CH1-домена тяжелой цепи, содержащей IL-6 VH.
14. Слитый белок по п.10, характеризующийся тем, что VEGF-связывающий домен содержит домен 2 VEGFR1 и домен 3 VEGFR2.
15. Слитый белок по п.14, характеризующийся тем, что VEGF-связывающий домен состоит из последовательности SEQ ID NO: 114.
16. Слитый белок по п.14, характеризующийся тем, что VEGF-связывающий домен действует как ловушка VEGF и предотвращает связывание VEGF с рецепторами VEGF, экспрессируемыми клетками.
17. Конъюгат, содержащий (a) любое из выделенных антагонистических антител по пп.1-9 и (b) полимер, при этом указанный полимер ковалентно присоединен к антителу.
18. Конъюгат по п.17, характеризующийся тем, что полимер включает полимер, содержащий фосфорилхолин.
x
y
19. Конъюгат по п.17, характеризующийся тем, что полимер содержит цвиттерионный мономер, при этом указанный цвиттерионный мономер выбран из группы, состоящей из HEMA-фосфорилхолина, ПЭГ, биосовместимых жирных кислот и их производных, гидроксиалкилкрахмала (HAS), гидроксиэтилкрахмала (HES), полиэтиленгликоля (ПЭГ), поли(Gly-Ser) (HAP), гиалуроновой кислоты (HA), гепарозановых полимеров (HEP), флексимеров, декстрана, полисиаловых кислот (PSA), Fc-доменов, трансферрина, 25 альбумина, эластиноподобных пептидов (ELP), полимеров XTEN, полимеров пролин-аланин-серин (ПАС), полиамидных (ПА) полимеров, связывающих альбумин пептидов, пептидов CTP и FcRn-связывающих пептидов.
20. Конъюгат, содержащий слитый белок по любому из пп.10-16 и полимер, при этом указанный полимер ковалентно присоединен к слитому белку.
21. Конъюгат по п.20, характеризующийся тем, что полимер включает полимер, содержащий фосфорилхолин.
x
y
22. Конъюгат по п.20, характеризующийся тем, что полимер содержит цвиттерионный мономер, при этом указанный цвиттерионный мономер выбран из группы, состоящей из HEMA-фосфорилхолина, ПЭГ, биосовместимых жирных кислот и их производных, гидроксиалкилкрахмала (HAS), гидроксиэтилкрахмала (HES), полиэтиленгликоля (ПЭГ), поли(Gly-Ser) (HAP), гиалуроновой кислоты (HA), гепарозановых полимеров (HEP), флексимеров, декстрана, полисиаловых кислот (PSA), Fc-доменов, трансферрина, 25 альбумина, эластиноподобных пептидов (ELP), полимеров XTEN, полимеров ПАС, ПА-полимеров, связывающих альбумин пептидов, пептидов CTP и FcRn-связывающих пептидов.
23. Конъюгат по любому из пп.17-22, характеризующийся тем, что полимер содержит мономеры 2(метакрилоилокси)этил-(2-(триметиламмоний)этил)фосфата (MPC).
24. Конъюгат по любому из пп.17-22, характеризующийся тем, что полимер имеет пиковую молекулярную массу от 300000 до 1750000 Дальтон, измеренную путем эксклюзионной хроматографии с многоугловым светорассеянием (далее в настоящем описании – «SEC-MALS»).
25.Конъюгат по любому из пп.17-24, характеризующийся тем, что полимер имеет пиковую молекулярную массу от 500000 до 1000000 Дальтон, измеренную путем SEC-MALS.
26. Конъюгат по любому из п.22, характеризующийся тем, что полимер имеет пиковую молекулярную массу от 600000 до 800000 Дальтон, измеренную путем SEC-MALS.
27. Конъюгат по любому из пп.17-26, характеризующийся тем, что полимер содержит 2 или более ответвлений.
28. Конъюгат по любому из пп.17-27, характеризующийся тем, что полимер содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 ответвлений.
29. Конъюгат по п.28, характеризующийся тем, что полимер содержит 9 ответвлений.
30. Конъюгат по любому из пп.17-29, характеризующийся тем, что антитело представляет собой IgG.
31. Конъюгат по п.30, характеризующийся тем, что полимер ковалентно связан с сульфгидрильной группой остатка цистеина в тяжелой цепи IgG.
32. Конъюгат по любому из пп.17-31, характеризующийся тем, что антитело содержит остаток цистеина в положении 347 или 443 (нумерация EU).
33. Конъюгат по п.32, характеризующийся тем, что полимер ковалентно связан с сульфгидрильной группой остатка цистеина в положении 347 или 443 (нумерация EU).
34. Конъюгат по любому из пп.17-33, характеризующийся тем, что антитело дополнительно конъюгировано с полимером с образованием биоконъюгата и при этом указанный биоконъюгат имеет пиковую молекулярную массу от примерно 350000 до 1900000 Дальтон.
35. Конъюгат по любому из пп.17-34, характеризующийся тем, что коэффициент полидисперсности (PDI) равен или меньше 1,5.
36. Конъюгат по любому из пп.17-35, характеризующийся тем, что полимер содержит 9 ответвлений и полимер имеет молекулярную массу от примерно 600000 до примерно 900000 Да.
37. Конъюгат по любому из пп.17-36, содержащий следующую структуру:
Формула (17),
где:
каждая тяжелая цепь анти-IL-6 антитела обозначена буквой H и каждая легкая цепь анти-IL-6 антитела обозначена буквой L;
полимер связан с антителом через сульфгидрильную группу C443 (нумерация EU); указанная связь изображена на одной из тяжелых цепей;
PC представляет собой , где волнистая линия показывает точку присоединения к остальной части полимера,
где: X=a) OR, где R=H, метил, этил, пропил, изопропил, b) H или c) любой галогенид, включая Br; и
n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются одинаковыми или разными так, что сумма n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 и n9 равна 2500 плюс или минус 15%, при этом, если конъюгат содержит ловушку VEGF, указанная ловушка VEGF слита a) с N-концом тяжелой цепи или b) между шарнирной областью и Fab-областью (после CH1-домена) тяжелой цепи.
38. Конъюгат по п.37, характеризующийся тем, что если указанный конъюгат содержит ловушку VEGF, он содержит домен 2 VEGFR1, а затем домен 3 VEGFR2 в таком порядке.
39. Выделенная линия клеток, продуцирующая выделенное антагонистическое антитело по любому из пп.1-9 или слитый белок по любому из пп.10-16.
40. Выделенная линия клеток по п.39, характеризующаяся тем, что указанная линия клеток выбрана из группы, состоящей из CHO, k1SV, XCeed, CHOK1SV и GS-KO.
41. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая выделенное антагонистическое антитело по любому из пп.1-9 или слитый белок по любому из пп.10-16.
42. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.41.
43. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п.42.
44. Способ получения антитела-антагониста IL-6 или его слитого белка, при этом указанный способ включает культивирование линии клеток, которая рекомбинантно продуцирует выделенное антагонистическое антитело по любому из пп.1-9 или слитый белок по любому из пп.10-16, в условиях, в которых продуцируется антитело, и извлечение антитела.
45. Фармацевтическая композиция, содержащая выделенное антагонистическое антитело по любому из пп.1-9 или слитый белок по любому из пп.10-16 и/или конъюгат по любому из пп.17-38 и фармацевтически приемлемый носитель.
46. Фармацевтическая композиция по п.45, характеризующаяся тем, что указанная композиция представляет собой жидкость и имеет уровень эндотоксинов ниже примерно 0,2 ЕЭ/мл.
47. Фармацевтическая композиция по п.46, характеризующаяся тем, что указанная композиция представляет собой жидкость и имеет уровень эндотоксинов ниже примерно 2,0, 1, 0,5 или 0,2 ЕЭ/мл.
48. Способ лечения или профилактики заболевания у нуждающегося в этом пациента, включающий введение пациенту выделенного антитела-антагониста по любому из пп.1-9 или слитого белка по любому из пп.10-16 и/или конъюгата по любому из пп.17-38.
49. Способ лечения или профилактики заболевания у нуждающегося в этом пациента, включающий идентификацию пациента с гиперактивностью IL-6 и/или VEGF и введение указанному пациенту выделенного антитела-антагониста по любому из пп.1-9 или слитого белка по любому из пп.10-16 и/или конъюгата по любому из пп.17-38.
50. Способ по п.49, характеризующийся тем, что заболевание представляет собой глазное нарушение.
51. Способ по п.50, характеризующийся тем, что указанное глазное нарушение представляет собой по меньшей мере одно из: влажной формы дегенерации желтого пятна или неоваскулярной дегенерации желтого пятна, влажной формы возрастной дегенерации желтого пятна или неоваскулярной возрастной дегенерации желтого пятна, сухой формы возрастной дегенерации желтого пятна, венозной, артериальной окклюзии или другой окклюзии кровеносных сосудов глаза и/или сетчатки с отеком сетчатки или без него, переднего и заднего увеита, отека желтого пятна при увеите, диабетической ретинопатии, непролиферативной диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, непролиферативного диабетического отека желтого пятна, офтальмологического воспалительного заболевания - склерита и внутриглазных опухолей.
52. Способ по любому из пп.49-51, характеризующийся тем, что выделенное антитело, слитый белок или конъюгат вводят не чаще одного раза в месяц.
53. Способ по любому из пп.49-51, характеризующийся тем, что выделенное антитело, слитый белок или конъюгат вводят не чаще одного раза в два месяца.
54. Способ по любому из пп.49-51, характеризующийся тем, что выделенное антитело, слитый белок или конъюгат вводят не чаще одного раза в три месяца.
55. Способ по любому из пп.49-54, характеризующийся тем, что выделенное антитело, слитый белок или конъюгат вводят с частотой от одного раза в год до одного раза в два месяца.
56. Слитый белок, содержащий IL-6 VH, IL-6 VL, IL-6 Fc, ловушку VEGF, при этом указанная ловушка VEGF слита с IL-6 одним из следующих способов:
1. c N-концом тяжелой цепи, содержащей IL-6 VH; или
2. между шарнирной областью и после CH1-домена тяжелой цепи, содержащей IL-6 VH.
57. Слитый белок по п.56, характеризующийся тем, что, если конъюгат содержит ловушку VEGF, он содержит домен 2 VEGFR1, а затем домен 3 VEGFR2 в таком порядке.
58. Слитый белок по любому из предыдущих пунктов, содержащий мутацию в положении 94 в последовательности ловушки VEGF.
59. Слитый белок по любому из предыдущих пунктов, содержащий мутацию в положении 95 в последовательности ловушки VEGF.
60. Слитый белок по любому из предыдущих пунктов, содержащий мутации T94I и/или H95I в последовательности ловушки VEGF.
61. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6, где указанный двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 содержит слитую конструкцию ловушка-антитело из анти-IL6 антитела и анти-VEGF ловушки (VEGFR1/2), причем двойной ингибитор содержит по меньшей мере одну точечную мутацию в последовательности VEGFR для уменьшения расщепления белка VEGFR.
62. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по п.61, характеризующийся тем, что молекулярная масса указанного двойного ингибитора VEGFR-анти-IL-6 составляет 1,0 МДа.
63. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по п.61, характеризующийся тем, что указанный двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 обеспечивает терапию воспалительных заболеваний сетчатки.
64. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по п.61, содержащий константную область тяжелой цепи, константную область легкой цепи, антигенсвязывающий фрагмент, кристаллизующийся фрагмент (Fc), рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи.
65. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по п.64, характеризующийся тем, что последовательности вариабельной области тяжелой цепи анти-IL-6 выбраны из опций SEQ ID NO: 7-13, 89, 90 и/или 256-262.
66. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по любому из пп.64-65, характеризующийся тем, что последовательности ловушки VEGF выбраны из по меньшей мере одной из SEQ ID NO: 145, 15, 16 или 17.
67. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по любому из пп.64-66, характеризующийся тем, что линкерная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 18.
68. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по любому из пп.64-67, характеризующийся тем, что последовательность тяжелой цепи для анти-IL-6 молекул выбрана из по меньшей мере одной из SEQ ID NO: 19-27 или содержит по меньшей мере последовательность в одной из SEQ ID NO: 89, 90, 256-262.
69. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по любому из пп.64-68, характеризующийся тем, что последовательность легкой цепи для анти-IL-6 молекул содержит по меньшей мере 1, 2 или 3 CDR легкой цепи из по меньшей мере одной из SEQ ID NO: 76-84.
70. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по любому из пп.64-69, характеризующийся тем, что последовательность тяжелой цепи для анти-IL-6 молекулы содержит по меньшей мере 1, 2 или 3 CDR тяжелой цепи из по меньшей мере одной из SEQ ID NO: 49-75.
71. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по любому из пп.64-70, содержащий последовательность VEGFR-Fc из по меньшей мере одной из SEQ ID NO: 85-88.
72. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по любому из пп.64-71, содержащий одну или более последовательностей в любых одной или более из SEQ ID NO: 7-13, 145, 15-17, 18-84.
73. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по п.72, содержащий IL-6 VH, IL-6 VL, IL-6 Fc, ловушку VEGF и линкер.
74. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по п.73, характеризующийся тем, что IL-6 VH содержит последовательность из последовательности IL6 VH в любой из SEQ ID NO: 19-27, 31-39, 89, 90 или 256-262.
75. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по п.73 или 74, характеризующийся тем, что IL-6 VL содержит последовательность из последовательности IL6 VL в любой из SEQ ID NО: 28-30 или 91-93.
76. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по любому из пп.73-75, характеризующийся тем, что Fc содержит последовательность из последовательности Fc в любой из SEQ ID NO: 40-48.
77. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по любому из пп.73-76, характеризующийся тем, что ловушка VEGF содержит последовательность из последовательности ловушки VEGF в любой из SEQ ID NO: 145, 15, 16 или 17.
78. Белковая конструкция, содержащая:
по меньшей мере 3 CDR тяжелой цепи;
по меньшей мере 3 CDR легкой цепи;
последовательность ловушки VEGF; и
линкерную последовательность, при этом каждая из указанных последовательностей выбрана из соответствующей последовательности на фиг.18-25.
79. Слитый белок, содержащий IL-6 VH, IL-6 VL, IL-6 Fc и ловушку VEGF, при этом указанный слитый белок изменяет пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека (ЭКПВЧ).
80. Слитый белок по п.79, характеризующийся тем, что изменение пролиферации ЭКПВЧ ингибирует пролиферацию, опосредуемую VEGF/IL6.
80. Слитый белок, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 263 и по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 117, при этом указанный слитый белок дополнительно конъюгирован с полимером.
81. Слитый белок по п.80, характеризующийся тем, что указанный слитый белок по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 263 и по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 117.
82. Слитый белок по п.80 или 81, характеризующийся тем, что указанный белок содержит по меньшей мере а) SEQ ID NO: 172, 173, 174, 199, 200 и 201 или b) замены 1, 2 или 3 аминокислот в SEQ ID NO: 172, 173, 174, 199, 200 и/или 201, при этом указанная замена представляет собой консервативную замену.
83. Антитело по любому из пп.1-9, характеризующееся тем, что указанное антитело содержит а) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 169 и 170 или b) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 169 и по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 170.
84. Слитый белок по любому из пп.10-16, 56-60 или 79-81, характеризующийся тем, что указанный слитый белок содержит а) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 169 и 170 или b) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 169 и по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 170.
85. Конъюгат по любому из пп.17-38, характеризующийся тем, что указанный конъюгат содержит а) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 169 и 170 или b) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 169 и по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 170.
86. Двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 по любому из пп.61-77, характеризующийся тем, что указанный двойной ингибитор VEGFR-анти-IL-6 содержит а) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 169 и 170 или b) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 169 и по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 170.
87. Белок по п.78, характеризующийся тем, что указанный белок содержит а) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 169 и 170 или b) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 169 и по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 170.