ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ПЕРИНАТАЛЬНОЙ ТКАНИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ: СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
MESENCHYMAL STEM CELLS ORIGINATING FROM PERINATAL TISSUE: METHOD FOR THEIR PRODUCTION AND USE

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Известно, что мезенхимальные стволовые клетки (MSC) являются полезными в регенеративной медицине и инженерии тканей. У взрослых костный мозг, жировая ткань, зубная пульпа и менструальная кровь являются главными источниками MSC. Они также могут быть получены культивированием плацентарных клеток или клеток пуповины в течение 3-4 недель в DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко), дополненной FCS (фетальная телячья сыворотка) ([12], [13], [14]).
in vitro
in vivo
MSC имеют потенциал мезодермальной, эктодермальной и эндодермальной дифференциации. MSC также обладают иммунодепрессивными свойствами. MSC ингибируют или останавливают созревание дендритных клеток и пролиферацию Т-клеток, В-клеток и NK клеток (природные киллеры). Их иммуномодулирующее действие опосредуется цитокинами и хемокинами, которые они секретируют. Несколько групп продемонстрировали то, что MSC в пределах плацентарной ткани демонстрируют пластичность развития в направлении многих линий  и . MSC, происходящие из плацентарной ткани (включающей пуповину, кровь пуповины, плаценту, хорион, амнион и амниотическую жидкость), демонстрируют позитивную экспрессию CD29, CD44, CD73, CD90 и CD105, негативную экспрессию в отношении гематопоэтических поверхностных маркеров CD11b, CD19, CD34 и CD45, и негативную экспрессию в отношении эндотелиального поверхностного маркера CD31. Кроме того, MSC, происходящие из плацентарной ткани, в подходящих условиях (например, полная среда) способны к трансдифференциации в клетки всех трех зародышевых листков.
in vitro
in vivo
ех vivo
Также было показано то, что MSC, происходящие из перинатальной ткани, обладают широкими иммунорегулирующими способностями и способны влиять как на адаптивные, так и на врожденные иммунные ответы. Данные MSC ингибируют пролиферацию и созревание иммунных клеток и подавляют иммунные реакции как , так и , способом, не ограниченным МНС (главный комплекс гистосовместимости). Следовательно, считается, что данные MSC являются гипоиммуногеными, демонстрирующими низкие уровни экспрессии HLA (человеческий лейкоцитарный антиген) класса I, отсутствие экспрессии HLA класса II и отсутствие экспрессии костимулирующих молекул, включающих CD40, CD80 и CD86. В основном, данные MSC могли оказывать широкораспространенные иммуномодулирующие эффекты на клетки как врожденной, так и адаптивной иммунной системы. Также было показано то, что MSC плаценты, размноженные , подавляют активность широкого спектра иммунных клеток, включающих Т-клетки, Т-клетки природные киллеры (NKT), дендритные клетки (DC), В-клетки, нейтрофилы, моноциты, макрофаги и так далее.
Происходящие из человеческой перинатальной ткани MSC также являются безопасными согласно многочисленным отчетам о клинических испытаниях. Оценивали безопасность и исходную эффективность трансфузий MSC, происходящих из пуповины (UC-MSC), в отношении пациентов с обострением хронической печеночной недостаточности (ACLF), ассоциированной с инфекцией вирусом гепатита В (HBV). Данные результаты свидетельствовали о том, что трансфузии MSC являются безопасными в клинических условиях и могут служить в качестве нового терапевтического подхода для пациентов с ACLF, ассоциированной с HBV [1]. Также оценивали безопасность и эффективность человеческих UC-MSC в лечении ревматоидного артрита (RA). Данные результаты показали то, что не наблюдалось серьезных вредных эффектов во время или после инфузии. Кроме того, лечение MSC индуцировало значительную ремиссию заболевания согласно индексу активности заболевания суставов 28 [2]. Ученые оценивали безопасность и возможность внутримиокардиальной инъекции MSC у девяти пациентов вскоре после острого инфаркта миокарда (AMI) на протяжении кратковременного и 5-летнего последующего наблюдения [3]. Данные результаты свидетельствовали о том, что внутримиокардиальная инъекция MSC у пациентов вскоре после AMI является возможной и безопасной вплоть до 5-летнего последующего наблюдения. Проспективное двойное слепое рандомизированное многоцентровое исследование с контролем в виде плацебо для определения безопасности MSC у пациентов с критической ишемией конечностей показало то, что MSC также являются безопасными при внутримышечной инъекции в дозе 2 миллиона клеток/кг массы тела [4]. В каком-либо из мест имплантации MSC не выявляли осложнений в виде новообразований. Hongye Fan et al ([15]) показали то, что пересадка примированных IL1β (интерлейкин-1бета) MSC имеет повышенную терапевтическую эффективность при мышином колите, индуцированном DSS, которая зависит от их повышенных иммунодепрессивных способностей и повышенной способности к миграции. В WO 2014/093948 также раскрыто терапевтическое значение очищенных MSC.
Однако определение MSC всегда было противоречивым, так как нет специфичного или уникального маркера клеточной поверхности, однозначно их идентифицирующего. До настоящего времени MSC определяли с использованием комбинации фенотипических белковых маркеров клеточной поверхности, пластичного, прикрепленного, фибробластоподобного роста и функциональных свойств. Тем не менее, согласно данным маркерам клеточной поверхности, есть несколько разных субпопуляций, и эти разные субпопуляции демонстрируют разные биологические характеристики, биологические функции, и не все являются эффективными в протоколах лечения. Например, некоторые популяции MSC стимулируются IL1β ([12]), тогда как другие популяции не стимулируются (CD106-позитивные MSC в [15]). Кроме того, пролиферация некоторых популяций MSC ингибируется IL4 ([12]), тогда как другие индуцируются к пролиферации в присутствии данного цитокина ([13]). Следовательно, существует срочная необходимость в идентификации популяции функциональных MSC, которые имеют клиническую эффективность, и стандартизации их способа получения. Также важно установить протокол, который можно взаимозаменяемо использовать на каждой плацентарной и внеэмбриональной ткани. Более конкретно, важно идентифицировать способ получения, который дает терапевтически эффективные популяции MSC либо из плацентарной ткани, либо из фрагментов пуповины.
Тем временем, сейчас имеется большая потребность в человеческих MSC для разных терапевтических приложений, но недостаточная доступность на рынке. Следовательно, существует необходимость в способе промышленного масштаба, дающем высокий выход функциональных MSC. Также существует необходимость в эффективной системе культивирования, которая дает оптимальный выход по приемлемой цене, уменьшая, посредством этого, разрыв между спросом и предложением в отношении MSC, полученных из всех плацентарных и внеэмбриональных тканей.
Настоящая заявка удовлетворяет все эти и другие потребности, предлагая оптимальный способ получения и очистки субпопуляций MSC разных происхождений (либо из плацентарной ткани, либо из пуповины), и, в конечном счете, размножения указанной подпопуляции с использованием наименьшего возможного числа пассажей и минимального числа удвоений популяций. Данный способ приводит к выделению из плацентарной ткани и из ткани пуповины высокоэффективных MSC, имеющих способность к дифференциации в направлении разных линий. Этот способ воспроизводимо дает значительное число клеток MSC, которые подходят для клинического применения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
высокая
+
+
5
2
высокая
+
+
В Примере 1 (см. ниже) раскрыт способ получения для генерации происходящих из ткани человеческой плаценты CD106 CD151 Нестин мезенхимальных стволовых клеток (MSC) в промышленном масштабе, обеспечивающий получение выхода MSC по меньшей мере 1×10 клеток/см, которые получают в помещении, соответствующем GMP (надлежащая производственная практика), и которые подходят для аллогенного применения. Указанные происходящие из плацентарной ткани CD106 CD151 Нестин мезенхимальные стволовые клетки (MSC) содержат свыше 95% клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и меньше, чем 2% клеток, которые экспрессируют негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.
Данный способ является полезным для получения клеток, которые можно использовать в испытаниях по пересадке в человеческого субъекта или в животное.
Он включает две следующие общие стадии:
(i) культивирование мезенхимальных стволовых клеток, полученных из биологической ткани или жидкости, в первой культуральной среде, лишенной факторов роста, таким образом, чтобы получить популяцию культивируемых недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток,
и
высокая
+
+
(ii) приведение указанной популяции культивируемых недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток в контакт со второй культуральной средой, содержащей провоспалительные факторы роста или воспалительные медиаторы, генерируя, посредством этого, CD106 CD151 Нестин мезенхимальные стволовые клетки, полезные для трансплантации субъекту, нуждающемуся в этом.
in vitro
высокая
+
+
В первом аспекте данное изобретение относится к способу  получения CD106 CD151 Нестин мезенхимальных стволовых клеток (MSC) в промышленном масштабе, причем указанный способ включает культивирование популяции недифференцированных MSC в культуральной среде, содержащей провоспалительные факторы роста или воспалительные медиаторы.
популяция недифференцированных
Указанная « MSC» может быть получена отбором одноядерных клеток, присутствующих в биологической ткани или жидкости, и выращивания их в первой культуральной среде. Данные одноядерные клетки можно получать любыми традиционными способами, например, ферментативным расщеплением или культивированием экспланта кусков перинатальной ткани [10], или выделением из биологических жидкостей [11].
Культивирование экспланта является особенно предпочтительным способом получения MSC из пуповин в том виде, как раскрыто в Примере 3 ниже.
Типично для данного способа требуется удаление образца из транспортного раствора для разрезания его на отрезки (грубо 2-3 см в длину) для их дезинфекции антибиотиками и противогрибковыми средствами, которые позднее отмываются для выделения эпителиальной мембраны и распределения кусочков указанной мембраны во флаконы для их прикрепления (предпочтительно без среды, при комнатной температуре), перед аккуратным добавлением полной среды на прикрепленные экспланты и выдерживанием их с инкубацией при 37°С в течение нескольких суток. Мигрирующие клетки, в конечном счете, собирают с использованием подходящих инструментов и поддерживают в культуре в подходящей первой среде (см. ниже), пока они не достигают целевой конфлюентности.
первая культуральная среда
Указанная «» может представлять собой любую классическую среду, обычно используемую для благоприятствования росту живых первичных клеток. Предпочтительно она не содержит ни каких-либо факторов роста, ни каких-либо факторов дифференциации.
Специалисту хорошо известно, какие виды культуральных сред можно использовать в качестве «первой культуральной среды». Они представляют собой, например, DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко), DMEM/F12, MEM (минимальная питательная среда), альфа-MEM (α-МЕМ), IMDM (среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков) или RPMI. Предпочтительно указанная первая культуральная среда представляет собой DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) или DMEM/F12 (среда Игла, модифицированная по Дульбекко: питательная смесь F-12).
Более предпочтительно, указанная первая культуральная среда содержит 2-20% или 2-10% фетальной телячей сыворотки. В качестве альтернативы, указанная первая культуральная среда может содержать 1-5% лизата тромбоцитов. Наиболее предпочтительная среда содержит 2-20% или 2-10% фетальной телячей сыворотки и 1-5% лизата тромбоцитов.
Также возможно использовать в качестве первой культуральной среды среду, которая лишена сыворотки или лизата тромбоцитов, при условии, что она содержит другие подходящие агенты, благоприятствующие росту живых первичных клеток.
биологическая ткань
В предпочтительном воплощении указанная «» представляет собой любую часть плацентарной ткани или пуповины. В частности, она может включать или состоять из ворсинок плаценты, амниотической мембраны или хорионической мембраны плаценты. Она также может представлять собой вартонов студень, находящийся в пуповине. Она может включать вены и/или артерии, или быть лишена их.
биологическая жидкость
В другом воплощении указанная «» представляет собой образец крови пуповины, плацентарной крови или амниотической жидкости, которую безвредным способом отобрали у женщины или, в общем, у млекопитающего. Например, данные ткани и жидкости можно получать после родов ребенка или потомства, без каких-либо инвазивных процедур.
Указанная популяция недифференцированных MSC предпочтительно представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток, посеянных на пластмассовую поверхность, которые культивировали в указанной первой культуральной среде, лишенной какого-либо фактора роста, пока клетки не достигали конфлюентности 85-90%.
Данные клетки регулярно фенотипически характеризовали FACS (флуоресцентная сортировка клеток) или любыми традиционными способами для того, чтобы выявлять уровень поверхностных маркеров CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 и HLA-DR.
2
Когда 95% клеток экспрессируют позитивные маркеры поверхности CD73, CD90, CD105 и CD166 и меньше, чем 2% экспрессируют негативные маркеры поверхности CD45, CD34 и HLA-DR, данные клетки трипсинизируют и вновь высевают при низкой плотности, например, при плотности от 1000 до 5000 MSC на см во вторую культуральную среду.
вторая культуральная среда
Предпочтительно указанная «» представляет собой любую классическую среду, обычно используемую для благоприятствования росту живых первичных клеток. Она может быть такой же, как и «первая культуральная среда», или она может быть другой средой, выбранной, например, среди DMEM, DMEM/F12, MEM, альфа-MEM (α-МЕМ), IMDM или RPMI. Более предпочтительно, указанная вторая культуральная среда представляет собой DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) или DMEM/F12 (среда Игла, модифицированная по Дульбекко: питательная смесь F-12).
Даже более предпочтительно, указанная вторая культуральная среда содержит сыворотку или лизат тромбоцитов, например, 2-20% фетальной телячьей сыворотки и/или 1-5% лизата тромбоцитов. Наиболее предпочтительная вторая среда представляет собой DMEM, содержащую 2-20% фетальной телячьей сыворотки и 1-5% лизата тромбоцитов. Также возможно применять в качестве второй культуральной среды среду, которая лишена сыворотки или лизата тромбоцитов, при условии, что она содержит другие подходящие агенты, благоприятствующие росту живых первичных клеток.
При достижении клетками конфлюентности 40-50%, во вторую культуральную среду добавляют провоспалительные факторы роста или воспалительные медиаторы, и клетки культивируют в указанной среде, пока они не достигают конфлюентности 90-95%.
провоспалительные факторы роста
Указанные «» типично представляют собой интерлейкины или хемокины, для которых известно, что они имеют провоспалительный эффект. Примеры интерлейкинов, которые можно добавлять во вторую культуральную среду, включают TNFα (фактор некроза опухолей альфа), IL1 (интерлейкин 1), IL4, IL12, IL18 и IFNγ (интерферон гамма). Примеры хемокинов, которые можно добавлять во вторую культуральную среду, включают CXCL8, CXCL10, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CCL2 и CCL5. Можно использовать другие воспалительные медиаторы (такие как противовоспалительные агенты).
В предпочтительном воплощении во вторую культуральную среду, определенную выше, добавляют по меньшей мере два провоспалительных фактора роста. Данные по меньшей мере два провоспалительных фактора роста выбирают в группе, состоящей из TNFα, IL1, IL4, IL12, IL18 и IFNγ. В более предпочтительном воплощении указанные провоспалительные факторы роста выбирают среди IL1, IL4, IL12 и IL18. Даже более предпочтительно они представляют собой IL1 и IL4.
Типичная концентрация фактора(ров) роста, которую можно добавлять к MSC, составляет 1-200 нг/мл, предпочтительно 1-100 нг/мл, более предпочтительно 10-80 нг/мл. Предпочтительно стадия культивирования MSC с фактором(рами) роста длиться в течение по меньшей мере одних суток, более предпочтительно в течение двух суток.
Термин «IL1» в данном документе обозначает любую изоформу интерлейкина 1, в частности, IL1α и IL1β. Изоформы IL1 могут быть разного происхождения, в зависимости от намеченного применения. Например, животный IL1 можно использовать для ветеринарных применений. Предпочтительно во вторую культуральную среду по изобретению добавляют только IL1β. В данном конкретном воплощении концентрация добавленного интерлейкина 1β может составлять 1-100 нг/мл, предпочтительно 1-50 нг/мл, более предпочтительно 10-40 нг/мл.
Ссылка на человеческий IL1бета (IL1β) дается с номером доступа NP_000567.1 (SEQ ID NO: 6, 269 аминокислот). Рекомбинантный белок имеется в продаже согласно условиям GMP (R&D Systems, Thermofisher, Cellgenix, Peprotech).
Термин «IL4» в данном документе обозначает любую изоформу интерлейкина 4. IL4 может быть разных происхождений, в зависимости от намеченного применения. Например, животный IL4 можно использовать для ветеринарных применений.
Ссылка на человеческий IL4 дается с номером доступа ААА59149 (SEQ ID NO: 7, 153 аминокислоты). Рекомбинантный белок имеется в продаже согласно условиям GMP (R&D Systems, Thermofisher, Cellgenix, Peprotech).
Во второй среде по изобретению можно использовать любую смесь разных провоспалительных факторов роста. В частности, предпочтительным воплощением является применение смеси IL1 и IL4, более конкретно IL1β и IL4, как раскрыто в экспериментальной части ниже.
В данном конкретном воплощении добавленный интерлейкин 1β имеет во второй культуральной среде концентрацию, составляющую 1-100 нг/мл, предпочтительно 1-50 нг/мл, более предпочтительно 10-40 нг/мл, и добавленный IL4 имеет концентрацию, составляющую 1-100 нг/мл, предпочтительно 1-50 нг/мл, более предпочтительно 10-40 нг/мл. Предпочтительно стадия культивирования с интерлейкином 1β и IL4 длится в течение по меньшей мере одних суток, более предпочтительно в течение двух суток.
На финальной стадии клетки фенотипически характеризуются любыми традиционными способами для того, чтобы выявить уровень поверхностных маркеров CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 и HLA-DR. Данные маркеры являются хорошо известными в данной области. Все полезные для выявления уровня экспрессии данных маркеров антитела имеются в продаже.
Экспрессия данных маркеров клеточной поверхности может, в частности, оцениваться с использованием хорошо известных технологий, таких как окрашивание клеточной мембраны с использованием биотинилирования или других эквивалентных методик, с последующей иммунопреципитацией с использованием специфичных антител, проточная цитометрия, вестерн-блоттинг, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) или ELISPOT (метод иммуноферментных пятен), микрочипы с антителами или тканевые микрочипы в сочетании с иммуногистохимией. Другие подходящие методики включают FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции) или BRET (резонансный перенос энергии биолюминисценции), микроскопические или гистохимические способы на основе единичных клеток с использованием одной или многих длин волн возбуждения и применение любого из адаптированных оптических способов, таких как электрохимические способы (методики вольтметрии и амперометрии), атомно-силовая микроскопия и способы на основе радиочастоты, например, мультиполярная резонансная спектроскопия, конфокальная и неконфокальная, выявление флуоресценции, люминисценции, хемилюминисценции, поглощения, отражательной способности, коэффициента пропускания и коэффициента двойного преломления или преломления (например, поверхностный плазмонный резонанс, эллипсометрия, способ резонансного зеркала, дифракционное соединение волноводов или интерферометрия), клеточный ELISA, радиоизотопная, магнитно-резонансная визуализация, анализ посредством электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE); ВЭЖХ(высокоэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия); жидкостная хроматография/масс-спектрометрия/масс-спектрометрия (ЖХ-МС/МС).
Предпочтительно уровни маркеров клеточной поверхности оцениваются посредством FACS. Другими словами, способ по изобретению, как правило, требует следующего:
a) сбор одноядерных клеток, содержащихся в перинатальной биологической ткани или жидкости,
b) обеспечение роста указанных одноядерных клеток в первой культуральной среде, пока они не достигнут конфлюентноси 85-90%, предпочтительно на пластмассовой поверхности,
2
c) как только 95% клеток экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 и меньше, чем 2% экспрессируют негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR, посев клеток при плотности от 1000 до 5000 MSC на см во вторую культуральную среду,
d) добавление 1-100 нг/мл воспалительных медиаторов или провоспалительных факторов роста, как только клетки достигнут конфлюентности 40-50%,
е) сбор клеток при достижении ими конфлюентности 90-95%.
Собранные клетки могут быть затем фенотипически охарактеризованы посредством FACS или любых традиционных способов для того, чтобы выявлять уровень поверхностных маркеров CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 и HLA-DR. Указанные первая и вторая культуральные среды были описаны выше.
На стадии d) указанного способа типичная концентрация добавленного(ных) фактора(ров) роста составляет 1-200 нг/мл, предпочтительно 1-100 нг/мл, более предпочтительно 10-80 нг/мл. Предпочтительно стадия культивирования с фактором(рами) роста длится в течение по меньшей мере одних суток, более предпочтительно в течение двух суток.
В конкретном воплощении изобретения концентрация добавленного интерлейкина 1β или IL4 может составлять 1-100 нг/мл, предпочтительно 1-50 нг/мл, более предпочтительно 10-40 нг/мл. Предпочтительно стадия культивирования с интерлейкином 1β и IL4 длится в течение по меньшей мере одних суток, более предпочтительно в течение двух суток.
культуру клеток по изобретению
СD106
CD151
Нестин
MSC по изобретению
MSC по изобретению
высокая
+
+
Конечные отобранные клетки будут представлять собой «» или «» или «». Данная культура клеток типично содержит свыше 60%, предпочтительно от 60 до 70%, предпочтительно свыше 70%, предпочтительно свыше 80%, более предпочтительно свыше 90% и даже более предпочтительно свыше 95% клеток, экспрессирующих CD106. Более того, она содержит свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток, экспрессирующих CD151. Кроме того, она содержит свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток, экспрессирующих нестин. Наконец, она содержит свыше 95%, предпочтительно свыше 96%, предпочтительно свыше 97%, предпочтительно свыше 98% клеток, экспрессирующих позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и содержит меньше, чем 2% клеток, экспрессирующих негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.
Известно, что CD106 (также известный как VCAM-1 - «белок адгезии сосудистого эндотелия 1 типа») имеет три изоформы. NP_001069.1 (именуемый в данном документе SEQ ID NO: 1, 739 аминокислот), NP_542413.1 (именуемый в данном документе SEQ ID NO: 2, 647 аминокислот) и NP_001186763.1 (именуемый в данном документе SEQ ID NO: 3, 677 аминокислот) представляют собой последовательности изоформ a, b и с соответственно. Антитела для выявления уровня экспрессии данного конкретного биомаркера имеются в продаже (например, у Thermofisher, Abeam, OriGen и т.д.). Экспрессия данного маркера на поверхности клеток по изобретению является очень важной, так как он запускает проангиогенные активности, которые являются существенными для их терапевтического применения.
На биомаркер нестин (на него дается ссылка в данном документе как SEQ ID NO: 4, 1621 аминокислота) у человека дается ссылка под номером NP_006608.1. Антитела для выявления уровня экспрессии данного конкретного биомаркера имеются в продаже (например, у Thermofisher, Abeam и т.д.).
На биомаркер CD151 (на него дается ссылка в данном документе как SEQ ID NO: 5, 253 аминокислоты) у человека дается ссылка под номером NP_620599. Антитела для выявления уровня экспрессии данного конкретного биомаркера имеются в продаже (например, у Invitrogen, Sigma-Aldrich, Abeam и т.д.).
В предпочтительном воплощении стадии культивирования (или стадии выращивания) проводятся на пластмассовой поверхности.
Более конкретно, способ по изобретению может включать следующие стадии:
a) возможно раздельный отбор плацентарных тканей от многих доноров;
3
b) возможно промывка плацентарной ткани три раза с использованием 1× PBS, рассечение на 1 мм кубики и повторная промывка ткани кубиков для удаления из данной ткани большей части крови;
c) возможно расщепление плацентарной ткани каждого донора раздельно коллагеназой, центрифугирование расщепленной ткани и сбор одноядерных клеток;
d) посев отобранных одноядерных клеток в культуральную среду;
e) трипсинизация и пассирование клеток, как только они достигают 85-90%-ной конфлюентности;
f) характеризация данных клеток на основе процентной доли клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR;
2
д) посев клеток в культуральную среду, содержащую 90% среды Игла, модифицированной по Дульбекко/нокаут F12 (DMEM/F12-KO), 10% FBS и факторы роста при плотности посева от 1000 до 5000 MSC на см, когда они содержат по меньшей мере 95% позитивных маркеров и самое большее 2% негативных маркеров;
h) добавление 1-100 нг/мл интерлейкина 1β и возможно 1-100 нг/мл IL4, когда они являются конфлюентными на 40-50%;
i) трипсинизация и сбор клеток, как только они достигают конфлюентности 90-95%; и
j) возможно характеризация клеток на основе процентной доли клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.
Раскрытые ниже результаты показывают то, что экспрессия CD106 значительно усиливается на поверхности MSC, полученных способом по изобретению либо из пуповины, либо из плаценты. Данная экспрессия является весьма важной для терапевтического применения клеток, полученных таким образом (см. ниже).
Настоящая заявка, следовательно, также относится к способу увеличения уровня экспрессии CD106 недифференцированных MSC, причем указанный способ включает культивирование популяции недифференцированных MSC в конкретных условиях, тщательно раскрытых выше, причем все подробные воплощения применяются с учетом необходимых изменений.
+
+
В другом аспекте данное изобретение относится к культуре клеток, полученной вышеописанным способом. Данная культура клеток, как правило, содержит выделенные СD106высокая СD151 Нестин MSC, экспрессирующие маркер - молекулу адгезии сосудистого эндотелия 1 типа (VCAM-1) на выявляемо более высоком уровне, чем мезенхимальные своловые клетки, происходящие из костного мозга взрослого, жировой ткани, пуповины или плаценты, которые не находились в контакте с любыми факторами роста во время их получения.
В предпочтительном воплощении культура клеток по изобретению отличается тем, что:
(i) свыше 60%, предпочтительно свыше 70%, более предпочтительно свыше 80% и даже более предпочтительно свыше 90% клеток экспрессируют CD106 на выявляемом уровне, и
(ii) свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток экспрессируют CD151 на выявляемом уровне, и
(iii) свыше 90%, предпочтительно свыше 92%, более предпочтительно свыше 95% клеток экспрессируют нестин на выявляемом уровне, и
(iv) свыше 95%, предпочтительно свыше 96%, предпочтительно свыше 97%, предпочтительно свыше 98% клеток экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне.
В более предпочтительном воплощении указанная культура клеток отличается тем, что она содержит свыше 98% MSC, которые не экспрессируют маркеры CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104 и CD133 на выявляемом уровне. Данные маркеры являются хорошо известными в данной области, и выявляющие их антитела имеются в продаже.
В предпочтительном воплощении культура клеток по изобретению содержит:
- свыше 60%, предпочтительно свыше 70%, более предпочтительно свыше 80% и даже более предпочтительно свыше 90% клеток, экспрессирующих CD106 на выявляемом уровне, и
- свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток, экспрессирующих CD151 на выявляемом уровне, и
- свыше 98%, предпочтительно свыше 99% клеток, экспрессирующих нестин на выявляемом уровне, и
- свыше 95%, предпочтительно свыше 96%, предпочтительно свыше 97%, предпочтительно свыше 98% клеток, экспрессирующих маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166 на выявляемом уровне, и
- меньше, чем 2% клеток, которые экспрессируют маркеры CD45, CD34 и HLA-DR на выявляемом уровне.
экспрессирует маркер на выявляемом уровне
Согласно настоящему изобретению клетка «», если указанный маркер присутствует на ее поверхности на значительном уровне, т.е. если сигнал, ассоциированный с окрашиванием указанного поверхностного маркера (типично полученный с антителом, распознающим указанный маркер, причем указанное антитело, например, связано с флуоресцентным красителем), который измеряется для указанной клетки, превышает сигнал, соответствующий окрашиванию одной клетки, известной как не экспрессирующая указанный маркер. Специалисту хорошо известно как идентифицировать указанные клетки/маркеры, таким образом, что данные протоколы не нужно здесь подробно описывать.
in vitro
in vivo
Результаты, раскрытые в экспериментальной части настоящей заявки, показывают то, что культура клеток, полученная способом по изобретению, способна индуцировать ангиогенез  и . Данные результаты, кроме того, показывают то, что введение указанных клеток индивидам (человеческим или животным субъектам), страдающим от ишемического заболевания или от расстройства системы кровообращения, приводит к выявляемому улучшению одного или более симптомов указанного заболевания или расстройства.
Результаты, раскрытые ниже, также показывают то, что способы по изобретению способны давать клетки, экспрессирующие высокий уровень мембранного белка CD106 / VCAM1. Важно то, что данный белок недавно был ассоциирован с экспрессией проангиогенных цитокинов. Следовательно, CD106+ MSC были выбраны из-за их проангиогенной эффективности и предложены в качестве лечения ишемии задних конечностей ([16], [17]).
Следовательно, в третьем аспекте изобретение относится к применению указанных клеток в качестве лекарственного средства для лечения индивида, страдающего от ишемического заболевания или от расстройства системы кровообращения. Другими словами, данное изобретение относится к применению указанных клеток для изготовления лекарственного средства, предназначенного для применения в лечении субъектов, страдающих от ишемического заболевания или от расстройства системы кровообращения. Лекарственное средство по изобретению также может наноситься на сосудистую капиллярную сеть кожи и может включать дерматологические и косметические применения.
Клетками по изобретению можно лечить любое млекопитающее. Указанное млекопитающее может представлять собой домашнее животное (собака, кошка, лошадь и т.д.) или животное - крупный рогатый скот (овца, коза, корова и т.д.). Для специалиста очевидно то, что, когда животное подлежит лечению согласно способу по изобретению, исходные недифференцированные MSC будут получены из биологического образца из того же самого вида животного (аллогенный трансплантат) или из аналогичного вида (гетерологичный трансплантат), и факторы роста, которые используются во второй культуральной среде, будут соответствовать факторам роста того же самого вида животных. Например, если лечению подлежит кошка, тогда исходные MSC будут получены из перинатальной ткани или биологической жидкости кошки, и IL1β кошки (рекомбинантный или нерекомбинантный) будет добавлен во вторую культуральную среду, возможно наряду с IL4 кошки.
В предпочтительном воплощении указанное млекопитающее представляет собой человека. В данном случае исходные MSC будут получены из перинатальной ткани или из биологической жидкости, полученной от женщины, и человеческий IL1β (рекомбинантный или нерекомбинантный, например, SEQ ID NO: 6) будет добавлен во вторую культуральную среду, возможно наряду с человеческим IL4 (например, SEQ ID NO: 7).
in situ
С данной целью культуру клеток по изобретению можно пересаживать или наносить местно указанному субъекту любыми традиционными способами. В данном случае настоящее изобретение направлено на способ лечения субъекта, страдающего от ишемического заболевния, расстройства системы кровообращения, иммунопатологии, повреждения органа или нарушения функции органа, причем указанный способ включает стадию пересадки описанной выше культуры клеток указанному субъекту. Данная пересадка может осуществляться с использованием имплантированного резервуара или посредством инъецирования клеток в мышцу , или посредством внутривенных инъекций, или посредством любой подходящей системы доставки. Данное применение также может осуществляться местно, посредством прямого приведения в контакт клеток с кожей или слизистой оболочкой, или посредством нанесения клеток на кожу или на любую слизистую оболочку устройством, или посредством доставки клеток на кожу или слизистую оболочку любой подходящей системой доставки.
Предпочтительно указанное заболевание или расстройство выбрано в группе, состоящей из следующих: сахарный диабет типа I, диабет типа II, GVHD (болезнь «трансплантат против хозяина»), апластическая анемия, рассеянный склероз, мышечная дистрофия Дюшенна, ревматоидный артрит, мозговой инсульт, идиопатический легочный фиброз, дилатационная кардиомиопатия, остеоартрит, цирроз, печеночная недостаточность, почечная недостаточность, окклюзионное заболевание периферических артерий, критическая ишемия конечностей, заболевание периферических сосудов, сердечная недостаточность, диабетическая язва или любое дегенеративное заболевание, синехия, эндометриальное расстройство или фиброзное расстройство желудочно-кишечного тракта, такое как анальный свищ. Более предпочтительно указаное заболевание или расстройство представляет собой окклюзионное заболевание периферических артерий, критическую ишемию конечностей, заболевание периферических сосудов или диабетическую язву. В конкретном воплощении указаное заболевание или расстройство представляет собой заболевание кожи или слизистой оболочки, включающее диабетическую язву, язву, травму, ожог, ожог горячей жидкостью, рану или проблему с заживлением раны, пролежень, бородавку и т.д. (но не ограничивающееся ими).
Культура клеток по изобретению может, в частности, использоваться в дерматологическом препарате, целью которого является лечение патологий кожи, таких как ожоги, раны, язвы, шрамы, бородавки, или других заболеваний, таких как синехия или фиброзные расстройства желудочно-кишечного тракта (например, анальный свищ).
В другом конкретном воплощении указанное заболевание или расстройство представляет собой анальный свищ или повреждение эндометрия.
Настоящей заявкой охватываются другие применения. В частности, возможно применение MSC по изобретнию для дерматологических или косметических целей, например, для регенерации клеток кожи или слизистой оболочки, улучшения внешнего вида кожи или слизистой оболочки, исправления дефекта кожи или слизистой оболочки или для лечения ожоговой области кожи или слизистой оболочки.
Для того чтобы увеличить эффективность и облегчить введение лекарственного средства по изобретению, культуру клеток по изобретению можно смешивать с любым агентом, композицией агентов или другим биологически совместимым веществом или устройством. Культура клеток по изобретению также может быть инкапсулирована или включена в любую подходящую систему доставки или биосовместимое вещество. Данные клетки или препарат, содержащий данные клетки, может быть нанесен с использованием медицинского устройства, такого как, например, эндоскоп, стент или шприц. Он также может быть нанесен местно посредством приведения клеток в контакт с кожей или слизистой.
Настоящее изобретение также нацелено на медицинское устройство, содержащее культуру клеток по изобретению. Под термином «медицинское устройство» в данном документе охватывается любой прибор, аппарат, инструмент, машина, приспособление, имплант, реактив для введения терапевтической композиции. В контексте данного изобретения указанное медицинское устройство представляет собой, например, пластырь, стент, эндоскоп или шприц.
Настоящее изобретение также нацелено на систему доставки, содержащую культуру клеток по изобретению. Под термином «система доставки» в данном документе охватывается любая система (среда или носитель) для введения пациенту фармацевтического продукта. Она может представлять собой систему пероральной доставки или систему с контролируемым высвобождением. В контексте данного изобретения указанная система доставки представляет собой, например, липосомы, пролипосомы, микросферы, микро- или нановезикулы из биополимеров, липидов или наночастиц.
В предпочтительном воплощении изобретения клетки по изобретению включаются в гидрогель или другое биосовместимое вещество или эксципиент. Указанный гидрогель может включать, в частности, гидрогель альгината натрия, гидрогель гиалуроновой кислоты, гидрогель хитозана, гидрогель коллагена, гидрогель НРМС (гидроксипропилметилцеллюлоза), гидрогель поли-L-лизина, гидрогель поли-L-глутаминовой кислоты, гидрогель поливинилового спирта (PVA), гидрогель полиакриловой кислоты, гидрогель полиметакриловой кислоты, гидрогель полиакриламида (РАМ) и гидрогель поли-N-акриламида (PNAM).
Настоящее изобретение также относится к гидрогелю, содержащему MSC по изобретению и возможно другое биосовместимое вещество или эксципиент. Альгинатный гидрогель является предпочтительным в данном документе, такой как альгинатный гидрогель, описанный в CN 106538515.
биосовместимые вещества
В контексте настоящего изобретения «» представляют собой вещества, классически используемые в биомедицинских приложениях. Они представляют собой, например, металлы (такие как нержавеющая сталь, сплавы кобальта, сплавы титана), керамику (оксид алюминия, двуокись циркония, фосфаты кальция), полимеры (силиконы, поли(этилен), поли(винилхлорид), полиуретаны, полилактиды) или природные полимеры (альгинат, коллаген, желатин, эластин и т.д.). Данные вещества могут быть синтетическими или природными. Биосовместимые эксципиенты являются хорошо известными в данной области и, следовательно, не нуждаются в подробном описании.
Данный гидрогель может использоваться для косметических или терапевтических целей.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической или ветеринарной композиции, содержащей культуру клеток по изобретению, а также ее применению для лечения заболеваний и расстройств, упомянутых выше. Оно также касается дерматологической или косметической композиции, содержащей культуру клеток по изобретению.
Данная фармацевтическая, ветеринарная или косметическая копозиция может дополнительно содержать другие биосовместимые агенты (например, гидрогель), как описано выше.
6
Указанная композиция предпочтительно содержит по меньшей мере примерно от 1 до 5×10 клеток.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Для того чтобы данное раскрытие можно было легко понять и воплотить на практике, теперь будет сделана ссылка на типичные воплощения и иллюстрированные графические материалы. Данные графические материалы вместе с подробным описанием ниже служат для дополнительной иллюстрации воплощений и объяснения разных принципов и преимуществ согласно настоящему раскрытию.
Фиг. 1
высокая
+
+
На  описана диаграмма, показывающая как может быть получена субпопуляция CD106 CD151 Нестин MSC по изобретению.
Фиг. 2
На  показана морфология MSC, прикрепленных к культуральным флаконам, в плаценте согласно Примеру 1.
Фиг. 3
высокая
+
+
высокая
+
+
На  показана адипогенная и остеогенная дифференциация клеток CD106 CD151 нестин MSC. Данные результаты показывают то, что субпопуляция CD106 CD151 Нестин MSC способна к адипогенной и остеогенной дифференциации в подходящей среде. Белые стрелки подчеркивают липидные капельки и сильно минерализованную область.
Фиг. 4
На  показано патологическое исследование посредством ангиографии: репрезентативные ангиограммы, полученные в послеоперационные сутки 21.
Фиг. 5
На  показано патологическое исследование посредством LDPI: репрезентативные изображения LDPI, полученные в послеоперационные сутки 0 и сутки 21. На приведенной сверху панели область все еще поражена через 3 недели после трансплантации, как показано белой стрелкой. На нижних панелях черные стрелки подчеркивают область, подвергающуюся перфузии, через 3 недели после трансплантации.
Фиг. 6
высокая
+
+
высокая
+
+
высокая
+
+
На  показаны результаты инфузии MSC, происходящих из плаценты, для пациентов с диабетом. В данное клиническое испытание включили всего 15 пациентов с диабетом (11 мужчин и 4 женщины). На (А) показано снижение средней потребности в инсулине после 3-кратного лечения CD106 CD151 Нестин MSC, происходящими из перинатальной ткани, в данной группе из 15 пациентов, которое было статистически значимым (Р меньше 0,001). На (В) показано то, что лечение CD106 CD151 Нестин MSC перинатального происхождения также значимо улучшало уровень гликозилированного гемоглобина у пациентов с диабетом (Р меньше 0,001). Данные результаты показывают то, что CD106 CD151 Нестин MSC перинатального происхождения могут быть хорошим выбором для пациентов с диабетом.
Фиг. 7.
высокая
+
+
высокая
+
+
На (А) показан уровень асцитов, определенный с использованием ультразвукового исследования, перед инфузией CD106 CD151 Нестин MSC у пациента, страдающего от декомпенсированного цирроза. И на (В) показан уровень асцитов, определенный с использованием ультразвукового исследования, через один месяц после введения CD106 CD151 Нестин MSC. На (С) показано то, что функции печени указанного пациента значимо улучшались. Экспрессия СА125 снижалась до нормального уровня. Кроме того, общий белок, альбумин, глобулин в сыворотке также значимо увеличивались.
На Фиг. 8
показана оценка скорости перфузии в мышиной NOD/SCID модели ишемии задних конечностей после наложения лигатуры на артерию и инъекции разных доз MSC пуповины по изобретению или солевого раствора, или VEGF (фактор роста эндотелия сосудов).
ПРИМЕРЫ
Для простоты и иллюстративных целей настоящее изобретение описывается посредством ссылки на его типичные воплощения. Однако обычному специалисту в данной области будет очевидно то, что настоящее изобретение может воплощаться на практике без ограничения данными конкретными подробностями. В других случаях хорошо известные способы не были подробно описаны таким образом, чтобы без необходимости не затруднять понимание настоящего изобретения.
1. Способ получения MSC по изобретению из плацентарной ткани
Способ по изобретению был осуществлен посредством следующего:
a)
раздельный отбор человеческой плацентарной ткани от многих матерей-доноров;
b)
3
промывка данной плацентарной ткани три раза с использованием 1× PBS, рассечение на 1 мм кубики и повторная промывка ткани кубиков для удаления из данной ткани большей части крови;
c)
расщепление плацентарной ткани каждого донора раздельно коллагеназой, центрифугирование расщепленной ткани и сбор одноядерных клеток;
d)
посев данных одноядерных клеток в культуральную среду;
e)
трипсинизация и пассирование клеток, как только они достигают 85-90%-ной конфлюентности;
f)
характеризация данных клеток на основе процентной доли клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR;
g)
2
посев клеток в культуральную среду, содержащую 90% среды Игла, модифицированной по Дульбекко/нокаут F12 (DMEM/F12-KO), 10% FBS и факторы роста при плотности посева от 1000 до 5000 MSC на см, когда они содержат по меньшей мере 95% позитивных маркеров и самое большее 2% негативных маркеров;
h)
высокая
+
+
получение CD106 CD151 Нестин MSC, содержащих свыше 80% клеток, которые экспрессируют CD106, 98% для CD151, 98% для нестина и 95% клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и меньше, чем 2% клеток, которые экспрессируют негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR (для трансплантационного применения), и добавление 20 нг/мл IL1β (предоставленного Peprotech) и 20 нг/мл IL4 (предоставленного Peprotech), когда они являются конфлюентными на 40-50%;
i)
трипсинизация и сбор клеток, как только они достигают конфлюентности 90-95%;
j)
характеризация клеток на основе процентной доли клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.
5
2
6
Данный способ обеспечивал получение субпопуляции MSC плацентарного происхождения с выходом по меньшей мере 1×10 клеток/см MSC (5×10 MSC во флаконах Т75, когда они являются конфлюентными на 90%), которые могут использоваться в аллогенных введениях. Данные культуры клеток содержали свыше 95% клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и меньше, чем 2% клеток, которые экспрессируют негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR.
высокая
+
+
Человеческие происходящие из перинатальной ткани CD106 CD151 Нестин MSC были фибробластоподобными, и они очень хорошо растут на пластмассовом флаконе (ср. с Фиг. 2).
Провели три независимых эксперимента (эксперимент 1, эксперимент 2 и эксперимент 3). Добавляли 20 нг/мл и интерлейкина 1 (β), и 4, когда клетки были на 40-50% конфлюентными (см. Фиг. 1). В данный момент MSC составляют свыше 95% клеток, которые экспрессируют позитивные маркеры CD73, CD90, CD105 и CD166, и меньше, чем 2% клеток, которые экспрессируют негативные маркеры CD45, CD34 и HLA-DR. После этого MSC поддерживали в растущем состоянии до тех пор, пока 90% клеток не были конфлюентными (см. Таблицы 1 и 2 ниже), на практике - на протяжении примерно 2 суток.
Примечательно то, что экспрессия белка клеточной поверхности MSC CD106, CD151 и нестина значительно возрастала после добавления интерлейкина 1 и 4.
В ТАБЛИЦЕ 1 показана экспрессия CD11b, CD19, CD29, CD31, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, CD151, нестина и HLA-DR на MSC, происходящих из плацентарной ткани, перед добавлением интерлейкина 1 и 4, полученных в Примерах 1, 2 и 3 с плацентой. Данные результаты показывают то, что MSC, происходящие из плаценты, имеют классические маркеры клеточной поверхности, совсем как MSC, происходящие из костного мозга и жировой ткани.
высокая
+
+
В ТАБЛИЦЕ 2 показана экспрессия CD11b, CD19, CD29, CD31, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, CD151, нестина и HLA-DR на MSC, происходящих из ткани плаценты, после добавления интерлейкина 1 и 4 в Экспериментах 1, 2 и 3. Данные результаты показывают то, что белковые маркеры CD106 и нестин значимо возрастали через 48 часов после добавления IL-1 и IL-4 в полной среде. Тем временем, клетки CD106 CD151 Нестин все еще имеют классический фенотипический маркер клеточной поверхности MSC.
высокая
+
+
Данные субпопуляции могут секретировать дополнительные факторы роста, цитокины, иммуномодулирующие факторы и факторы воспаления (см. Таблицу 3). Данные CD106 CD151 Нестин MSC будут, следовательно, иметь лучший потенциал иммуномодуляции и ангиогенеза.
В Таблице 3 показаны связанные уровни экспрессии факторов роста, секретированных в истощенную питательную среду, определенные посредством кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция). Данные результаты показывают то, что MSC, происходящие из ткани плаценты, имеют большую экспрессию или секрецию белка IL-6, IL-8, IL-10, HGF, ANG, ММР2, VEGF-A и TGF-β через 48 часов после добавления IL-1 и IL-4 в полной среде.
2. Способ получения MSC по изобретению из тканей пуповины
В настоящем примере использовали следующие реактивы:
Выделение клеток способом эксплантов
2.1.
Пуповину удаляли из транспортного раствора и нарезали на отрезки длиной 2-3 см. Для того чтобы избежать загрязнения прилипшими клетками крови, отбрасывали каждый отрезок пуповины, содержащий кровяной сгусток, который не мог быть удален. Данные отрезки затем дезинфицировали в сосуде с антибиотиками и противогрибковыми средствами, содержащем αМЕМ плюс 1 г/л ванкомицина плюс 1 г/л амоксициллина плюс 500 мг/л амикацина плюс 50 мг/л амфотерицина В, в течение 30 мин при комнатной температуре (RT). Антибиотики немедленно растворяли в стерильной воде для инъекции.
2
Отрезки пуповины удаляли из сосуда и быстро промывали в 1× PBS при RT. Эпителиальную мембрану слегка надрезали, не трогая сосуды. Каждый отрезок затем измельчали на кусочки 0,5 см толщины и размещали на дне 150 см пастмассового флакона с крышкой. От 6 до 10 отрезков на флакон размещали с кругом свободного пространства радиусом по меньшей мере 1 см вокруг каждого кусочка и оставляли прикрепляться в течение 15 мин без среды при RT.
2
После прикрепления аккуратно добавляли полную среду (αМЕМ плюс 5% CPL плюс 2 U/мл гепарина) с сохранением прикрепления эксплантов ко дну флакона. Данные флаконы затем инкубировали при 37°С, 90%-ной влажности и 5% CO.
Культуральную среду заменяли через 5-7 суток.
В сутки 10 после выделения миграцию клеток из эксплантов контролировали посредством инвертированной микроскопии. Если круг прикрепившихся клеток был видимым вокруг большинства эксплантов, их аккуратно удаляли, вытаскивая из флакона через крышку с использованием пары стерильных одноразовых пинцетов.
Начиная с данной стадии, конфлюентность клеток визуально проверяли через сутки, и, при необходимости, осуществляли замену среды на сутки 17.
При достижении клетками 70-90%-ной конфлюентности или в С20 (сутки 20) среду удаляли, и клетки промывали 30 мл 1× PBS на флакон. Клетки затем удаляли с использованием Trypzean, собирали со старой средой и центрифугировали 10 мин при 2500 об./мин. Супернатант отбрасывали, и затем суспендировали клетки в криоконсервирующем растворе, состоящем из αМЕМ плюс 100 мг/мл HSA (человеческий сывороточный альбумин) плюс 10% DMSO (диметилсульфоксид), и криоконсервировали.
Выделение клеток ферментативным способом
2.2.
Пуповину удаляли из транспортного раствора и нарезали на отрезки длиной 2-3 см. Для того чтобы избежать загрязнения прилипшими клетками крови, отбрасывали каждый отрезок, содержащий кровяной сгусток, который не мог быть удален. Данные отрезки затем дезинфицировали в сосуде с антибиотиками и противогрибковыми средствами, содержащем αDMEM плюс 1 г/л ванкомицина плюс 1 г/л амоксициллина плюс 500 мг/л амикацина плюс 50 мг/л амфотерицина, в течение 30 мин при комнатной температуре (RT). Антибиотики немедленно растворяли в стерильной воде для инъекции.
Пуповину затем разрезали на маленькие кусочки, погружали в ферментативную смесь, содержащую 2,7 мг/мл коллагеназы типа I и 0,7 мг/мл гиалуронидазы, инкубировали в течение 3 ч при 37°C с легким встряхиванием, с последующим добавлением 2,5% трипсина и дополнительной инкубацией в течение 30 мин.
2
Расщепленную суспензию разводили 1:2 средой для уменьшения вязкости суспензии и пропускали через нейлоновую сетку для получения суспензии одиночных клеток. Клетки центрифугировали при 300 g в течение 20 мин и высевали при плотности 10000 клеток/см с использованием свежей среды.
Культуральную среду заменяли через 5-7 суток и каждые 7 суток после этого.
При достижении клетками 70-90%-ной конфлюентности или в С20 среду удаляли, и клетки промывали 30 мл 1× PBS на флакон. Клетки затем удаляли с использованием Trypzean, собирали со старой средой и центрифугировали 10 мин при 2500 об./мин. Супернатант отбрасывали, и затем суспендировали клетки в криоконсервирующем растворе, состоящем из αМЕМ плюс 100 мг/мл HSA плюс 10% DMSO, и криоконсервировали.
Оттаивание и культивирование клеток
2.3.
Клетки оттаивали, следуя классическому протоколу. Вкратце, криопробирки удаляли из жидкого азота и быстро погружали в водную баню с температурой 37°С.Как только в пробирке не оставалось льда, клетки разводили в предварительно нагретой (37°С) полной среде (αМЕМ плюс 0,5% (об./об.) ципрофлоксацина плюс 2 U/мл гепарина плюс 5% (об./об.) LP) и быстро центрифугировали (300 g, RT, 5 мин).
После центрифугирования клетки суспендировали в предварительно нагретой полной среде и оценивали на число и жизнеспособность (трипановый синий / гемоцитометр Mallassez).
2
2
Клетки высевали в два 75 см пластмассовых культуральных флакона в полную среду и инкубировали (90%-ная влажность, 5% CO , 37°С).
Стимулирование клеток
2.4.
После нескольких суток размножения клетки проверяли на конфлюентность. Когда конфлюентность достигала 30-50%, старую среду отбрасывали и заменяли либо свежей полной средой для нестимулированного состояния, либо свежей средой, дополненной 10 нг/мл IL-1β и 10 нг/мл IL-4.
Клетки затем инкубировали в течение по меньшей мере 2 суток перед экспериментами с использованием проточной цитометрии.
Сбор клеток и анализ проточной цитометрией
2.5.
После 2-3 суток размножения/стимулирования клетки проверяли на конфлюентность. Если конфлюентность составляла вплоть до 80%, клетки собирали. Вкратце, старую среду отбрасывали, и клетки промывали 1× DPBS. Добавляли трипсин EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), и клетки инкубировали 5 мин при 37°С. Трипсин нейтрализовали по меньшей мере 2× объемом среды, и клеточную суспензию отбирали и оценивали на число и жизнеспособность клеток.
6
Для эксперимента с проточной цитометрией требовалось 1×10 клеток, которые центрифугировали и ресуспендировали в 1× DPBS плюс 0,4% HSA.
Клетки метили на CD73, CD90, CD105, CD106, CD151 и CD31, CD34, CD45, HLA-DR согласно следующему протоколу:
1. Клетки оценивали на жизнеспособность и количество.
2. Необходимый объем суспензии для получения 20000 клеток/пробирку для мечения помещали в 15 мл пропиленовую пластмассовую пробирку.
3. Данную пробирку центрифугировали 5 мин при 300 g и 4°С.
4. Клетки ресуспендировали с использованием 1× DPBS плюс 0,4% HSA (разведенные в 10 раз 4 мг/мл HSA в 1× DPBS). Необходимый объем составлял 500 мкл на пробирку для мечения.
Проводили внеклеточное окрашивание на маркеры CD106 и CD151, как рекомендовано изготовителем FACS и поставщиками антител. Проводили внутриклеточное окрашивание на нестин. Для внутриклеточного окрашивания использовали раствор для фиксации/пермеабилизации, именуемый «набор BD Cytofix/Cytoperm».
Если клетки не анализировали сразу после окрашивания, стадию фиксации проводили приведением клеток в контакт с раствором 1× DPBS / 0,5% формальдегида.
После мечения клетки промывали 1× DPBS плюс 0,4% HSA и пермеабилизировали для мечения нестина.
Меченые клетки анализировали цитометром Accuri С6+ BD Biosciences, и результаты анализировали с использованием программы BD Accuri С6 Plus.
Результаты
2.6.
Несколько партий MSC, происходящих из пуповины (от HB-COR001 до COR005-MSC), было получено культивированием MSC пуповины, выделенных посредством способов эксплантов, описанных выше (2.1.), при условиях, раскрытых в пункте 2.4. выше. Для пуповины 3 и 5 (COR003 и COR005) сопутствующе получали две популяции MSC (MSC1 и MSC2) посредством повторения стадий по изобретению отдельным способом.
Экспрессию CD106 на поверхности указанных клеток измеряли проточной цитометрией.
Все протестированные партии MSC демонстрировали резкое увеличение (больше 60%) уровней экспрессии CD106 (см. Таблицу 4).
3. Влияние протокола выделения на экспрессию CD106 MSC, происходящими из пуповины
Мезенхимальные стволовые клетки выделяли из пуповины с использованием двух разных способов, раскрытых выше (см. 2.1. и 2.2.): посредством выделения эксплантов и посредством ферментативного расщепления.
Все клетки культивировали в одинаковой культуральной среде (αМЕМ плюс 5% лизата тромбоцитов (LP)), стимулировали во время пассажа 3 согласно способу по изобретению и отбирали через 2 суток после стимуляции. Измеряется жизнеспособность клеток, и клетки подсчитывали.
Затем измеряли экспрессию нескольких фенотипических маркеров, включая CD106, посредством проточной цитометрии.
Все MSC, каким бы ни был способ выделения или условия стимуляции, экспрессировали фенотипические маркеры классическим образом: свыше 95% являются позитивными в отношении CD73, CD90, CD105, тогда как они были негативными в отношении CD31, CD34, CD45 и HLA-DR.
В отношении и CD151+, и нестина свыше 95% также были позитивными, независимо от способа стимуляции или выделения.
Без стимуляции MSC, выделенные ферментативным расщеплением, экспрессировали более высокие уровни CD106 до стимуляции (53%), чем MSC, выделенные с использованием способов с эксплантами (20%). Однако они были менее чувствительными к стимуляции без воспалительной смеси: наблюдали меньшее увеличение CD106 (увеличение плюс 4% по сравнению с увеличением плюс 60%).
Способ с эксплантами, следовательно, является предпочтительным способом по изобретению для MSC, происходящих из пуповины.
4. Эффекты стимуляции комбинацией IL1-IL4 по сравнению со стимуляцией одним IL1 или IL4 на уровни CD106 мезенхимальных стволовых клеток пуповины
Мезенхимальные стволовые клетки выделяли из двух пуповин посредством выделения эксплантов (см. 2.1.).
Все клетки культивировали в одинаковой культуральной среде (αМЕМ плюс 5% лизата тромбоцитов (LP)), стимулировали во время пассажа 4 согласно способу по изобретению смесью 10 нг/мл IL-1b и 10 нг/мл IL-4 или каждым интерлейкином по отдельности (10 нг/мл каждого) и собирали через 2 суток после стимуляции. Измеряется жизнеспособность клеток, и клетки подсчитывали.
Затем измеряли экспрессию нескольких фенотипических маркеров, включая CD106, посредством проточной цитометрии.
Все MSC, независимо от условий стимуляции, экспрессировали фенотипические маркеры классическим образом: свыше 95% являются позитивными в отношении CD73, CD90, CD105, тогда как они были негативными в отношении CD31, CD34, CD45 и HLA-DR. Свыше 95% также были CD151+ позитивными, независимо от стимуляции.
В том, что касается маркера CD106, увеличение экспрессии, наблюдаемое с использованием стимуляции комбинацией IL1 и IL4, в 3-5 раз выше, чем увеличение экспрессии, наблюдаемое со стимуляцией одним интерлейкином (см. Таблицу 7).
5. Эффект неоваскуляризации MSC СD106
CD151
Нестин
плацентарного происхождения у диабетических мышей
высокая
+
+
высокая
+
+
высокая
+
+
высокая
+
+
Данный пример сосредоточен на эффекте терапевтической неоваскуляризации MSC СD106 CD151 Нестин плацентарного происхождения. Он дает глубокое понимание их потенциала для клинического применения в качестве терапии на основе клеток, в сочетании с инъекцией инсулина для лечения критической ишемии задних конечностей при диабете. Результаты авторов изобретения показали, что MSC СD106 CD151 Нестин, происходящие из плаценты, участвуют в ангиогенезе и терапевтической васкуляризации для того, чтобы улучшать ишемическое состояние и восстановить перфузию кровотоком посредством прямой дифференциации в сосудистые клетки. Кроме того, MSC СD106 CD151 Нестин, происходящие из плаценты, улучшали ишемическое повреждение и функциональное восстановление у диабетических крыс.
Иммунодефицитных самцов голых крыс в возрасте шести недель приобретали у Vital River Laboratories (поставщик Charles River Laboratories в Китае). Диабет индуцировали одной внутрибрюшинной инъекцией стрептозотоцина (70 мг/кг в растворе цитратного буфера, готовится только непосредственно перед инъекцией) после голодания в течение ночи. Каждую неделю измеряли уровни глюкозы в плазме натощак, и крыс с уровнем глюкозы плазмы от 11 мМ до 15 мМ считали диабетическими. Соответствующих по возрасту и массе голых крыс, получающих внутрибрюшинную инъекцию цитратного буфера, использовали в качестве недиабетических контролей (гликемия от 5,5 до 8 мМ).
Через две недели диабетических голых крыс анестезировали (60 мг/кг пентобарбитала внутрибрюшинно), и левую бедренную артерию перекрывали наложением на нее лигатуры из шелка 3-0. Данную лигатуру накладывали в 0,5 см проксимально к раздвоению сафенной и подколенной артерий. Использовали липиодол (1,5 мл/кг) для индукции внутрисосудистой эмболии. Имитацию лигатуры наносили на левую бедренную артерию, оставляя левую заднюю конечность неишемической.
высокая
+
+
После установления модели ишемии хирургическая недостаточность конечности была очевидной, так как данная конечность больше не могла выдерживать какой-либо вес, и лапа была опухшей и красной. С течением времени данное ишемическое повреждение в разной степени улучшалось во всех группах. Восстановление функции конечности значительно возрастало в подпопуляции MSC СD106 CD151 Нестин (Фиг. 4).
высокая
+
+
Более конкретно, гистологичекие данные на Фиг. 4 показывают, что плотность капилляров возрастала в группах с пересадкой клеток по сравнению с группой PBS. Кроме того, большее число капилляров наблюдали в группах с пересадкой клеток подпопуляции MSC СD106 CD151 Нестин у диабетических крыс и недиабетических крыс по сравнению с группой PBS.
Фиг. 5
высокая
+
+
На  показано функциональное доказательство индуцированных ишемией изменений с использованием васкуляризации LDPI. На данном изображении показано, что кровоток был полностью заблокирован в левой задней лапе в сутки хирургического вмешательства; на это указывает глубокий темный цвет. Через три недели перфузия кровотоком в некоторой степени восстанавливалась во всех группах, но не возвращалась к нормальной в группе PBS, где отношение ишемической/неишемической перфузии достигало только 52%. Восстановление перфузии в группах с пересадкой клеток было значимо большим. Данное отношение составляло 81% в группе P-MSC предшествующего уровня техники (Р меньше 0,05 по сравнению с группой PBS) и 86% для группы подпопуляции MSC СD106 CD151 Нестин (Р меньше 0,01 по сравнению с группой PBS).
Восстановление перфузии в обоих субпопуляциях MSC было значимо большим. Следовательно, данные результаты выявили то, что MSC улучшают перфузию кровотоком, и что MSC по изобретению являются более эффективными в этом. На самом деле, MSC по изобретению показали значительное улучшение в восстановлении кровотока как у диабетических, так и у недиабетических крыс.
Данные результаты выявили то, что MSC по изобретению более эффективно улучшают перфузию кровотоком, чем MSC предшествующего уровня техники. Данный пример показывает то, что введение MSC по изобретению является многообещающим новым подходом против диабетической критической ишемии конечностей.
6. Терапевтический эффект MSC СD106
CD151
Нестин
, происходящих из плаценты, в отношении пациентов с диабетом
высокая
+
+
высокая
+
+
Данный пример сосредоточен на терапевтическом эффекте MSC СD106 CD151 Нестин происходящих из плаценты, в отношении пациентов, страдающих от диабета. Он дает глубокое понимание их потенциала для клинического применения в качестве терапии диабета на основе клеток.
Всего 15 пациентов с диабетом (11 мужчин и 4 женщины) были включены в данное клиническое исследование. Критериями включения были пациенты с диабетом 2 типа с диагнозом, поставленным с ноября 2013 г. по ноябрь 2014 г. в Tianjin General Hospital. Данные пациенты находились в возрасте от 30 до 85 лет, продолжительность диабета 3 года или более, требовали инсулин для оптимального гликемического контроля в дозе 0,7 U/кг/сутки или более в течение по меньшей мере 1,5 лет, имели инсулиновую дисфункцию, плохо контролируемые флуктуации уровня глюкозы в крови при лечении на основе инсулина и желание участвовать в данном исследовании. Данные 15 пациентов находились в возрасте от 42 до 67 лет с медианным возрастом 59 лет; продолжительность диабета составляла от 3 лет до 17 лет с медианой 8 лет; ежесуточная потребность в инсулине составляла от 38 единиц до 90 единиц со средним значением 58,7 единиц. Каждые три месяца одновременно осуществляли проверку пробой на толерантность к глюкозе, анализом высвобождения инсулина, анализом стимуляции С-пептидом и определением гликозилированного гемоглобина. Проводили анализы функции сердца, печени и почки. На протяжении лечения наблюдали неблагоприятные явления и побочные эффекты. Оно считалось эффективным, если ежесуточная потребность в инсулине уменьшалась на 50% или более после лечения, и данный эффект длился больше, чем 3 месяца.
6
6
Пациенты получали три внутривенные инфузии MSC, происходящих из плаценты (P-MSC), по изобретению с одномесячным интервалом инфузии. Общее количество P-MSC, введенных для каждого пациента, составляло (1,0-1,5)×10/кг со средним значением 1,25×10/кг. В то же самое время, пациенты продолжали применять инсулин и корректировали дозу инсулина согласно уровням глюкозы в крови. В том, что касается осложнений, сохраняли исходное общее лечение. Всех пациентов наблюдали после терапии в течение по меньшей мере 6 месяцев.
Данное клиническое испытание показало уменьшение средней потребности в инсулине после 3 введений MSC, происходящих из плаценты, по изобретению в данной группе из 15 пациентов, которое было статистически значимым (Р меньше 0,001). Инъекционная дозировка инсулина для пациентов с диабетом уменьшалась почти на половину после введения MSC, происходящих из плаценты, по изобретению (по сравнению со средней дозировкой инсулина, принимаемой на протяжении 6 месяцев до введения MSC) (Фиг. 6А).
Данное клиническое испытание показало то, что лечение MSC, происходящими из плаценты, по изобретению значимо снижало уровень гликозилированного гемоглобина пациентов с диабетом (Р меньше 0,001) (Фиг. 6Б).
Эти данные подтверждают то, что MSC по изобретению можно использовать для лечения пациентов с диабетом.
7. Терапевтический эффект MSC, происходящих из плаценты, по изобретению в отношении пациентов с апластической анемией
Данный пример сосредоточен на терапевтическом эффекте MSC, происходящих из плаценты, по изобретению в отношении пациентов с апластической анемией, и он дает глубокое понимание их потенциала для клинического применения в качестве терапии апластической анемии на основе клеток.
Апластическая анемия, главным образом, рассматривается в качестве иммуноопосредованного синдрома недостаточности костного мозга (ВМ), отличающегося гипоплазией и панцитопенией с жирным ВМ и пониженным ангиогенезом. Предыдущие исследования продемонстрировали то, что приобретенная апластическая анемия проявляется ненормальностями HSC (гематопоэтическая стволовая клетка)/НРС (гематопоэтическая клетка-предшественник) и гематопоэтического микроокружения. Множество доказательств намекали на то, что апластическая анемия может представлять собой синдром отличающийся расстройствами стволовых клеток/клеток-предшественников, включая HSC/HPC и MSC. MSC поддерживают гематопоэз и регулируют почти все функции иммунных клеток для поддержания гематопоэтического и иммунного гомеостаза. MSC могут модулировать функции главных иммунных клеток, включая Т-клетки, В-клетки, моноциты, DC (дендритные клетки), NKT и нейтрофилы [5]. MSC обладают примечательными иммунодепрессивными свойствами в отношении Th1, Th17 и CTL. MSC ингибируют пролиферацию Т-клеток, секрецию IFN-γ и TNF-α клетками Th1, при стимулировании продукции IL-10 клетками Th2 и размножения клеток Treg. Однако недавние исследования показали то, что MSC от пациентов с апластической анемией имеют плохую пролиферацию и неполную иммунодепрессию MLR, РНА-индуцированную активацию Т-клеток и высвобождение IFN-γ [6,7]. Недавнее исследование авторов изобретения показало то, что MSC от пациентов с апластической анемией были ослабленными в подавлении пролиферации и клоногенного потенциала Т-клеток CD4+, при стимулировании размножения клеток Treg. Также обнаружили то, что MSC были дефектными в подавлении продукции TNF-α и IFN-γ клетками CD4+. Однако не было значимого различия в регуляции продукции IL-4, IL-10 и IL-17 [8]. Кроме того, исследование авторов изобретения также показало то, что MSC от пациентов с апластической анемией демонстрировали нарушенную морфологию, пониженную пролиферацию и клоногенный потенциал, и усиленный апоптоз по сравнению с BM-MSC от здоровых контролей. MSC от пациентов с апластической анемией были чувствительными к индукции к дифференциации в адипоциты, но более сложными для дифференциации в остеобласты. В соответствии с ненормальными биологическими характеристиками, большое число генов, вовлеченных в клеточный цикл, деление клетки, пролиферацию, хемотаксис и гематопоэтическую клеточную линию, демонстрировали заметно пониженную экспрессию в MSC от этих пациентов с апластической анемией. Наоборот, больше генов, связанных с апоптозом, адипогенезом и иммунным ответом демонстрировали повышенную экспрессию в MSC от пациентов с апластической анемией. Профиль экспрессии генов MSC дополнительно подтвердил ненормальные биологические свойства и предоставил значимое доказательство возможного механизма разрушения микроокружения ВМ при апластической анемии [9].
MSC представляют собой многообещающего терапевтического кандидата для лечения апластической анемии из-за следующих двух важных фактов:
i) в общем, поддерживающая гематопоэз и мощная иммунодепрессивная способоность MSC и
ii) различие биологических характеристик и функциональная недостаточность, наблюдаемая в MSC, происходящих от пациентов с апластической анемией.
7
7
В клиническом испытании 6-летнюю девочку с перемежающейся лихорадкой, продолжающейся в течение больше, чем месяца, лечили MSC. Апластическая анемия была подтверждена после того, как две биопсии костного мозга выявили гипоклеточность. После лечения циклоспорином и станозололом в течение почти 6 месяцев не было улучшения в фенотипе периферической крови. Пересадка гематопоэтических стволовых клеток не была хорошим выбором, так как было очень сложно найти соответствующего донора. Следовательно, данному пациенту ввели внутривенную инфузию 1×10 MSC, происходящих из плаценты, по изобретению. Фенотип периферической крови значимо улучшался после 1-ой пересадки MSC. Однако данный пациент все еще зависел от переливания продуктов крови, включая переливание эритроцитов и тромбоцитов. Через 6 месяцев данный пациент 2-ой раз получил внутривенную инъекцию 1×10 MSC по изобретению. Фенотип периферической крови значительно улучшался и практически достигал нормального уровня через 12 месяцев после 2-ой инъекции. Кроме того, данный пациент был полностью независимым от переливания продуктов крови через 12 месяцев после 2-ой инъекции (Таблица 8). Эти данные подтверждают, что MSC, происходящие из плаценты, по изобретению можно использовать для клинического лечения пациентов с апластической анемией.
8. Терапевтический эффект MSC, происходящих из плаценты, по изобретению в отношении пациентов с заболеваниями печени
Данный пример сосредоточен на терапевтическом эффекте происходящих из плаценты MSC, полученных согласно способу по изобретению (т.е. с обработкой IL1 и IL4), введенных пациентам, страдающим от заболеваний печени. Он дает глубокое понимание их потенциала для клинического применения в качестве терапии заболеваний печени на основе клеток.
7
В данном клиническом испытании было подтверждено то, что 40-летний мужчина страдал от алкоголического гепатита в течение больше, чем десяти лет. Было подтверждено, что у данного пациента два года назад был декомпенсированный цирроз, хотя он и принимал традиционное лечение. Поскольку отсутствует хороший выбор для лечения декомпенсированного цирроза, данный пациент добровольно принимал внутривенную инъекцию 4×10 MSC по изобретению.
В данном клиническом испытании результаты ультразвуковой проверки показали уровень асцитов 9,7 см до введения MSC (см. Фиг. 7А). Однако уровень асцитов снижался до 3,6 см через один месяц после введения MSC (см. Фиг. 7Б). Кроме того, данные результаты показали то, что функции печени пациента с декомпенсированным циррозом значительно улучшались после введения MSC. Кроме того, экспрессия СА125 в сыворотке снижалась до нормального уровня согласно клиническим контролям.
Данные результаты демонстрирут превосходную клиническую реакцию у пациентов с декомпенсированным циррозом, которых лечили MSC по изобретению.
Кроме того, общий белок, альбумин, глобулин в сыворотке также значительно возрастали с достижением нормального уровня согласно клиническим референсным значениям (Фиг. 7 В). Данные результаты показали, что синтетическая и метаболическая функция печени пациента улучшались через один месяц после внутривенной инъекции MSC.
Следовательно, MSC, происходящие из плаценты, по изобретению представляют собой очень хороший цитотерапевтический выбор против заболеваний печени.
9. Ангиогенный потенциал клеток по изобретению, полученных из пуповины
Проангиогенный потенциал MSC по изобретению дополнительно анализировали в мышиной модели ишемии задних конечностей.
Материал и методы
6
6
Двенадцать 8-недельных мышей NOD/SCID (Laboratoire Janvier) анестезировали смесью кетамина и ксилазина. Затем накладывали лигатуру на левую проксимальную и дистальную части бедренной артерии левой ноги (шелковая хирургическая нить 6.0, Ethicon, Issy-Les-Moulineaux, Франция), и часть между наложенными лигатурами вырезали. Мышам, которые демонстрируют больше, чем 80% ишемии после хирургического вмешательства, внутримышечно инъецировали в икроножную мышцу ишемической конечности 2 дозы MSC по изобретению, полученных согласно протоколам, раскрытым в пункте 2.4 выше (0,5×10 клеток на животное в группе 2, 0,05×10 клеток на животное в группе 3). Инъекцию физиологического раствора использовали в контрольной группе 1. В контрольной группе 4 также инъецировали дозу 20 нг/мл VEGF/мышь.
6
6
Схему инъекции, а также дозу получали для намеченного клинического применения клеток, и доза, введенная животным, была больше чем в 10 раз выше предложенной дозы для клинического испытания фазы I/II у человека (которая составляет примерно 25×10 клеток/кг, что означает примерно 0,5×10 клеток/мышь (средняя масса мыши равна 20 г)).
Кровоток задней конечности измеряли с использованием лазерной сканирующей доплеровской установки (лазерная доплеровская перфузионная система, Perimed PeriScan PIM III). Среднюю перфузию ишемических и неишемических конечностей определяли до и после ишемии, и каждые 7 суток до 21 суток после ишемии. Изменения частоты лазера, зависимые от кровотока, визуализировали с использованием разных цветных пикселей. Изображения анализировали для количественного измерения кровотока с использованием программы для анализа перфузии крови (LPDIwin). Процентную долю перфузии выражали как отношение ишемической к неишемической задней конечности.
Окрашивание срезов мышцы задней конечности гематоксилином-эозином
Мышей умерщвляли в конце эксперимента (С21). Икроножные мышцы задней конечности препарировали и окрашивали для визуализации распределения ядер клеток в мышечном волокне. Мышцы, выделенные из ишемической задней конечности, фиксировали в парафине и окрашивали гематоксилином/эозином.
Результаты
3
3
На Фиг. 8 показан средний показатель повторной перфузии после ишемии задней конечности у мышей, обработанных разными инъекциями: 0,9% NaCl (негативный контроль - n равно 8), 20 нг/мл VEGF (позитивный контроль - n равно 6), 50×10 клеток MS (n равно 9) и 500×10 клеток MS (n равно 7).
6
Данные результаты продемонстрировали то, что введение высоких доз MSC по изобретению у мышей после наложения лигатуры на бедренную артерию приводило к большим показателям повторной перфузии по сравнению с носителем (NaCl) или одним введенным VEGF. 100%-ный показатель повторной перфузии наблюдали уже через 7 суток после инъекции клеток для мышей, получающих наивысшую дозу клеток (0,5×10 клеток). Имело место статистически значимое различие с другими группами.
6
Также вероятен эффект доза-ответ, поскольку в данном предварительном эксперименте наивысшая доза клеток (0,5×10 клеток), по-видимому, достигает лучшего показателя перфузии, чем меньшая в 10 раз доза.
Данные результаты подтверждают реальную ангиогенную активность MSC по изобретению в улучшении перфузии крови в данной мышиной модели CLI.
Результаты, наблюдаемые при окрашивании гематоксилином-эозином (данные не показаны):
В нормальных, неишемических мышцах ядра клеток распределяются на периферии мышечного волокна.
В ишемических мышцах мышей из групп 1 (0,9% NaCl) и 4 (20 нг/мл VEGF) через 21 сутки после индукции ишемии клетки демонстрируют очень мало ядер на периферии мышечного волокна, так как они все еще регенерируют.
6
В ишемических мышцах мышей из группы 3 (0,05×10 клеток MSC или 50000) через 21 сутки после индукции ишемии 50% мышечных волокон являются регенерировавшими и демонстрируют ядра не периферии волокна. Регенерация происходит быстрее, чем в группах 1 и 4.
6
В ишемических мышцах мышей из группы 2 (0,5×10 клеток MSC или 500000) через 21 сутки после индукции ишемии 100% мышечных волокон являются регенерировавшими и демонстрируют ядра не периферии волокна. Профиль окрашивания мышцы является идентичным нормальной неишемической мышце. В данном эксперименте доза 500000 клеток обеспечивает полную регенерацию мышцы.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
Human mesenchymal stem cell transfusion is safe and improves liver function in acute-on-chronic liver failure patients.
1
Stem cells translational medicine
1. Shi М, Zhang Z, Xu R, Lin H, Fu J, Zou Z, Zhang A, Shi J, Chen L, Lv S et ah  2012, (10):725-731.
et al
Stem cells and development
Human umbilical cord mesenchymal stem cell therapy for patients with active rheumatoid arthritis: safety and efficacy.
22
2. Wang L, Wang L, Cong X, Liu G, Zhou J, Bai B, Li Y, Bai W, Li M, Ji H :  2013, (24):3192-3202.
et al
Journal of cardiovascular translational research
Intramyocardial injection of autologous bone marrow-derived ex vivo expanded mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction patients is feasible and safe up to 5 years of follow-up.
6
3. Rodrigo SF, van Ramshorst J, Hoogslag GE, Boden H, Velders MA, Cannegieter SC, Roelofs H, Al Younis I, Dibbets-Schneider P, Fibbe WE :  2013, (5):816-825.
A double blind randomized placebo controlled phase I/II study assessing the safety and efficacy of allogeneic bone marrow derived mesenchymal stem cell in critical limb ischemia.
11
Journal of translational medicine
4. Gupta PK, Chullikana A, Parakh R, Desai S, Das A, Gottipamula S, Krishnamurthy S, Anthony N, Pherwani A, Majumdar AS:  2013, :143.
Mesenchymal stem cells in immunoregulation.
84
Immunology and cell biology
5. Chen X, Armstrong MA, Li G:  2006, (5):413-421.
et al
Experimental hematology
T-cell suppression mediated by mesenchymal stem cells is deficient in patients with severe aplastic anemia.
33
6. Bacigalupo A, Valle M, Podesta M, Pitto A, Zocchi E, De Flora A, Pozzi S, Luchetti S, Frassoni F, Van Lint MT :  2005, (7):819-827.
Poor potential of proliferation and differentiation in bone marrow mesenchymal stem cells derived from children with severe aplastic anemia.
89
Annals of hematology
7. Chao YH, Peng CT, Harn HJ, Chan CK, Wu KH:  2010, (7):715-723.
et al
Results in immunology
Impaired immunomodulatory ability of bone marrow mesenchymal stem cells on CD4(+) T cells in aplastic anemia.
2
8. Li J, Lu S, Yang S, Xing W, Feng J, Li W, Zhao Q, Wu H, Ge M, Ma F :  2012, :142-147.
et al
PloS one
Differential gene expression profile associated with the abnormality of bone marrow mesenchymal stem cells in aplastic anemia.
7
9. Li J, Yang S, Lu S, Zhao H, Feng J, Li W, Ma F, Ren Q, Liu B, Zhang L :  2012, (11):e47764.
Mesenchymal Stem Cells Maintain Long-Term In Vitro Sternness During Explant Culture.
Tissue Engineering Part C: Methods.
10. Anna Otte, Vesna Bucan, Kerstin Reimers, and Ralf Hass.  November 2013,19(12): 937-948
Isolation and proliferation of umbilical cord tissue derived mesenchymal stem cells for clinical applications.
Cell Tissue Bank
11. Van Pham, P., Truong, N.C., Le, P.TB. et al.  (2016) 17: 289
Biological characteristics of human placental mesenchymal stem cells and their proliferative response to various cytokines.
Cells Tissues Organs
12. Dong Li et al,  2007; 186:169-179.
Phenotypic and functional characterization of mesenchymal stem/multipotent Stromal cells from Decidua Basalis of human term placenta.
Stem cells international
13. Abomaray F.M. et al, , volume 2016, Article ID5184601
Comparaison of the expression of immunomodulatory factors in cultures of mesenchymal stromal cells from human extraembryonic tissues
Cell Technologies in Biology and Medicine,
14. Savilova A.M. et al, .  №4, February 2015
Pre-treatment with IL-1β enhances the efficacy of MSC transplantation in DSS-induced colitis.
Cellular and Molecular Immunology
15. Hongye Fan et al,  (2012), 9, 473-481
New insights into the heterogeneity and functional diversity of human mesenchymal stem cells.
Bio-medical Materials and Engineering
16. Han Z.C., et al,  28 (2017) S29-S45
VCAM-1+ placenta chorionic villi-derived mesenchymal stem cells display potent pro-angiogenic activity.
Stem Cell research & therapy
17. Du W. et al,  (2016) 7:49
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  HEALTH AND BIOTECH FRANCE
<120>  ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ ПЕРИНАТАЛЬНОЙ ТКАНИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ
КЛЕТКИ: СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  B373499 D36728
<150>  PCT/IB/2016/001936
<151>  2016-12-12
<160>  7
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  739
<212>  ПРТ
<213>  homo sapiens
<220>
<221>  прочий_признак
<223>  изоформа CD106 у человека
<400>  1
Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp
1               5                   10                  15
Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Phe Lys Ile Glu Thr Thr Pro Glu
20                  25                  30
Ser Arg Tyr Leu Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Ser Leu Thr Cys Ser
35                  40                  45
Thr Thr Gly Cys Glu Ser Pro Phe Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp
50                  55                  60
Ser Pro Leu Asn Gly Lys Val Thr Asn Glu Gly Thr Thr Ser Thr Leu
65                  70                  75                  80
Thr Met Asn Pro Val Ser Phe Gly Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr
85                  90                  95
Ala Thr Cys Glu Ser Arg Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Ile
100                 105                 110
Tyr Ser Phe Pro Lys Asp Pro Glu Ile His Leu Ser Gly Pro Leu Glu
115                 120                 125
Ala Gly Lys Pro Ile Thr Val Lys Cys Ser Val Ala Asp Val Tyr Pro
130                 135                 140
Phe Asp Arg Leu Glu Ile Asp Leu Leu Lys Gly Asp His Leu Met Lys
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Phe Leu Glu Asp Ala Asp Arg Lys Ser Leu Glu Thr Lys
165                 170                 175
Ser Leu Glu Val Thr Phe Thr Pro Val Ile Glu Asp Ile Gly Lys Val
180                 185                 190
Leu Val Cys Arg Ala Lys Leu His Ile Asp Glu Met Asp Ser Val Pro
195                 200                 205
Thr Val Arg Gln Ala Val Lys Glu Leu Gln Val Tyr Ile Ser Pro Lys
210                 215                 220
Asn Thr Val Ile Ser Val Asn Pro Ser Thr Lys Leu Gln Glu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Ser Val Thr Met Thr Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro Glu Ile
245                 250                 255
Phe Trp Ser Lys Lys Leu Asp Asn Gly Asn Leu Gln His Leu Ser Gly
260                 265                 270
Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ala Met Arg Met Glu Asp Ser Gly Ile
275                 280                 285
Tyr Val Cys Glu Gly Val Asn Leu Ile Gly Lys Asn Arg Lys Glu Val
290                 295                 300
Glu Leu Ile Val Gln Glu Lys Pro Phe Thr Val Glu Ile Ser Pro Gly
305                 310                 315                 320
Pro Arg Ile Ala Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Met Leu Thr Cys Ser
325                 330                 335
Val Met Gly Cys Glu Ser Pro Ser Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp
340                 345                 350
Ser Pro Leu Ser Gly Lys Val Arg Ser Glu Gly Thr Asn Ser Thr Leu
355                 360                 365
Thr Leu Ser Pro Val Ser Phe Glu Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr
370                 375                 380
Val Thr Cys Gly His Lys Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Leu
385                 390                 395                 400
Tyr Ser Phe Pro Arg Asp Pro Glu Ile Glu Met Ser Gly Gly Leu Val
405                 410                 415
Asn Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Val Pro Ser Val Tyr Pro
420                 425                 430
Leu Asp Arg Leu Glu Ile Glu Leu Leu Lys Gly Glu Thr Ile Leu Glu
435                 440                 445
Asn Ile Glu Phe Leu Glu Asp Thr Asp Met Lys Ser Leu Glu Asn Lys
450                 455                 460
Ser Leu Glu Met Thr Phe Ile Pro Thr Ile Glu Asp Thr Gly Lys Ala
465                 470                 475                 480
Leu Val Cys Gln Ala Lys Leu His Ile Asp Asp Met Glu Phe Glu Pro
485                 490                 495
Lys Gln Arg Gln Ser Thr Gln Thr Leu Tyr Val Asn Val Ala Pro Arg
500                 505                 510
Asp Thr Thr Val Leu Val Ser Pro Ser Ser Ile Leu Glu Glu Gly Ser
515                 520                 525
Ser Val Asn Met Thr Cys Leu Ser Gln Gly Phe Pro Ala Pro Lys Ile
530                 535                 540
Leu Trp Ser Arg Gln Leu Pro Asn Gly Glu Leu Gln Pro Leu Ser Glu
545                 550                 555                 560
Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ser Thr Lys Met Glu Asp Ser Gly Val
565                 570                 575
Tyr Leu Cys Glu Gly Ile Asn Gln Ala Gly Arg Ser Arg Lys Glu Val
580                 585                 590
Glu Leu Ile Ile Gln Val Thr Pro Lys Asp Ile Lys Leu Thr Ala Phe
595                 600                 605
Pro Ser Glu Ser Val Lys Glu Gly Asp Thr Val Ile Ile Ser Cys Thr
610                 615                 620
Cys Gly Asn Val Pro Glu Thr Trp Ile Ile Leu Lys Lys Lys Ala Glu
625                 630                 635                 640
Thr Gly Asp Thr Val Leu Lys Ser Ile Asp Gly Ala Tyr Thr Ile Arg
645                 650                 655
Lys Ala Gln Leu Lys Asp Ala Gly Val Tyr Glu Cys Glu Ser Lys Asn
660                 665                 670
Lys Val Gly Ser Gln Leu Arg Ser Leu Thr Leu Asp Val Gln Gly Arg
675                 680                 685
Glu Asn Asn Lys Asp Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Leu Val Leu Tyr Phe
690                 695                 700
Ala Ser Ser Leu Ile Ile Pro Ala Ile Gly Met Ile Ile Tyr Phe Ala
705                 710                 715                 720
Arg Lys Ala Asn Met Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Val Glu Ala Gln Lys
725                 730                 735
Ser Lys Val
<210>  2
<211>  647
<212>  ПРТ
<213>  homo sapiens
<220>
<221>  прочий_признак
<223>  изоформа b CD106 человека
<400>  2
Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp
1               5                   10                  15
Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Phe Lys Ile Glu Thr Thr Pro Glu
20                  25                  30
Ser Arg Tyr Leu Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Ser Leu Thr Cys Ser
35                  40                  45
Thr Thr Gly Cys Glu Ser Pro Phe Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp
50                  55                  60
Ser Pro Leu Asn Gly Lys Val Thr Asn Glu Gly Thr Thr Ser Thr Leu
65                  70                  75                  80
Thr Met Asn Pro Val Ser Phe Gly Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr
85                  90                  95
Ala Thr Cys Glu Ser Arg Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Ile
100                 105                 110
Tyr Ser Phe Pro Lys Asp Pro Glu Ile His Leu Ser Gly Pro Leu Glu
115                 120                 125
Ala Gly Lys Pro Ile Thr Val Lys Cys Ser Val Ala Asp Val Tyr Pro
130                 135                 140
Phe Asp Arg Leu Glu Ile Asp Leu Leu Lys Gly Asp His Leu Met Lys
145                 150                 155                 160
Ser Gln Glu Phe Leu Glu Asp Ala Asp Arg Lys Ser Leu Glu Thr Lys
165                 170                 175
Ser Leu Glu Val Thr Phe Thr Pro Val Ile Glu Asp Ile Gly Lys Val
180                 185                 190
Leu Val Cys Arg Ala Lys Leu His Ile Asp Glu Met Asp Ser Val Pro
195                 200                 205
Thr Val Arg Gln Ala Val Lys Glu Leu Gln Val Tyr Ile Ser Pro Lys
210                 215                 220
Asn Thr Val Ile Ser Val Asn Pro Ser Thr Lys Leu Gln Glu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Ser Val Thr Met Thr Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro Glu Ile
245                 250                 255
Phe Trp Ser Lys Lys Leu Asp Asn Gly Asn Leu Gln His Leu Ser Gly
260                 265                 270
Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ala Met Arg Met Glu Asp Ser Gly Ile
275                 280                 285
Tyr Val Cys Glu Gly Val Asn Leu Ile Gly Lys Asn Arg Lys Glu Val
290                 295                 300
Glu Leu Ile Val Gln Ala Phe Pro Arg Asp Pro Glu Ile Glu Met Ser
305                 310                 315                 320
Gly Gly Leu Val Asn Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Val Pro
325                 330                 335
Ser Val Tyr Pro Leu Asp Arg Leu Glu Ile Glu Leu Leu Lys Gly Glu
340                 345                 350
Thr Ile Leu Glu Asn Ile Glu Phe Leu Glu Asp Thr Asp Met Lys Ser
355                 360                 365
Leu Glu Asn Lys Ser Leu Glu Met Thr Phe Ile Pro Thr Ile Glu Asp
370                 375                 380
Thr Gly Lys Ala Leu Val Cys Gln Ala Lys Leu His Ile Asp Asp Met
385                 390                 395                 400
Glu Phe Glu Pro Lys Gln Arg Gln Ser Thr Gln Thr Leu Tyr Val Asn
405                 410                 415
Val Ala Pro Arg Asp Thr Thr Val Leu Val Ser Pro Ser Ser Ile Leu
420                 425                 430
Glu Glu Gly Ser Ser Val Asn Met Thr Cys Leu Ser Gln Gly Phe Pro
435                 440                 445
Ala Pro Lys Ile Leu Trp Ser Arg Gln Leu Pro Asn Gly Glu Leu Gln
450                 455                 460
Pro Leu Ser Glu Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ser Thr Lys Met Glu
465                 470                 475                 480
Asp Ser Gly Val Tyr Leu Cys Glu Gly Ile Asn Gln Ala Gly Arg Ser
485                 490                 495
Arg Lys Glu Val Glu Leu Ile Ile Gln Val Thr Pro Lys Asp Ile Lys
500                 505                 510
Leu Thr Ala Phe Pro Ser Glu Ser Val Lys Glu Gly Asp Thr Val Ile
515                 520                 525
Ile Ser Cys Thr Cys Gly Asn Val Pro Glu Thr Trp Ile Ile Leu Lys
530                 535                 540
Lys Lys Ala Glu Thr Gly Asp Thr Val Leu Lys Ser Ile Asp Gly Ala
545                 550                 555                 560
Tyr Thr Ile Arg Lys Ala Gln Leu Lys Asp Ala Gly Val Tyr Glu Cys
565                 570                 575
Glu Ser Lys Asn Lys Val Gly Ser Gln Leu Arg Ser Leu Thr Leu Asp
580                 585                 590
Val Gln Gly Arg Glu Asn Asn Lys Asp Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Leu
595                 600                 605
Val Leu Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Ile Ile Pro Ala Ile Gly Met Ile
610                 615                 620
Ile Tyr Phe Ala Arg Lys Ala Asn Met Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Val
625                 630                 635                 640
Glu Ala Gln Lys Ser Lys Val
645
<210>  3
<211>  677
<212>  ПРТ
<213>  homo sapiens
<220>
<221>  прочий_признак
<223>  изоформа c CD106 человека
<400>  3
Met Pro Gly Lys Met Val Val Ile Leu Gly Ala Ser Asn Ile Leu Trp
1               5                   10                  15
Ile Met Phe Ala Ala Ser Gln Ala Phe Lys Ile Glu Thr Thr Pro Glu
20                  25                  30
Ser Arg Tyr Leu Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Ser Leu Thr Cys Ser
35                  40                  45
Thr Thr Gly Ser Phe Pro Lys Asp Pro Glu Ile His Leu Ser Gly Pro
50                  55                  60
Leu Glu Ala Gly Lys Pro Ile Thr Val Lys Cys Ser Val Ala Asp Val
65                  70                  75                  80
Tyr Pro Phe Asp Arg Leu Glu Ile Asp Leu Leu Lys Gly Asp His Leu
85                  90                  95
Met Lys Ser Gln Glu Phe Leu Glu Asp Ala Asp Arg Lys Ser Leu Glu
100                 105                 110
Thr Lys Ser Leu Glu Val Thr Phe Thr Pro Val Ile Glu Asp Ile Gly
115                 120                 125
Lys Val Leu Val Cys Arg Ala Lys Leu His Ile Asp Glu Met Asp Ser
130                 135                 140
Val Pro Thr Val Arg Gln Ala Val Lys Glu Leu Gln Val Tyr Ile Ser
145                 150                 155                 160
Pro Lys Asn Thr Val Ile Ser Val Asn Pro Ser Thr Lys Leu Gln Glu
165                 170                 175
Gly Gly Ser Val Thr Met Thr Cys Ser Ser Glu Gly Leu Pro Ala Pro
180                 185                 190
Glu Ile Phe Trp Ser Lys Lys Leu Asp Asn Gly Asn Leu Gln His Leu
195                 200                 205
Ser Gly Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ala Met Arg Met Glu Asp Ser
210                 215                 220
Gly Ile Tyr Val Cys Glu Gly Val Asn Leu Ile Gly Lys Asn Arg Lys
225                 230                 235                 240
Glu Val Glu Leu Ile Val Gln Glu Lys Pro Phe Thr Val Glu Ile Ser
245                 250                 255
Pro Gly Pro Arg Ile Ala Ala Gln Ile Gly Asp Ser Val Met Leu Thr
260                 265                 270
Cys Ser Val Met Gly Cys Glu Ser Pro Ser Phe Ser Trp Arg Thr Gln
275                 280                 285
Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gly Lys Val Arg Ser Glu Gly Thr Asn Ser
290                 295                 300
Thr Leu Thr Leu Ser Pro Val Ser Phe Glu Asn Glu His Ser Tyr Leu
305                 310                 315                 320
Cys Thr Val Thr Cys Gly His Lys Lys Leu Glu Lys Gly Ile Gln Val
325                 330                 335
Glu Leu Tyr Ser Phe Pro Arg Asp Pro Glu Ile Glu Met Ser Gly Gly
340                 345                 350
Leu Val Asn Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Val Pro Ser Val
355                 360                 365
Tyr Pro Leu Asp Arg Leu Glu Ile Glu Leu Leu Lys Gly Glu Thr Ile
370                 375                 380
Leu Glu Asn Ile Glu Phe Leu Glu Asp Thr Asp Met Lys Ser Leu Glu
385                 390                 395                 400
Asn Lys Ser Leu Glu Met Thr Phe Ile Pro Thr Ile Glu Asp Thr Gly
405                 410                 415
Lys Ala Leu Val Cys Gln Ala Lys Leu His Ile Asp Asp Met Glu Phe
420                 425                 430
Glu Pro Lys Gln Arg Gln Ser Thr Gln Thr Leu Tyr Val Asn Val Ala
435                 440                 445
Pro Arg Asp Thr Thr Val Leu Val Ser Pro Ser Ser Ile Leu Glu Glu
450                 455                 460
Gly Ser Ser Val Asn Met Thr Cys Leu Ser Gln Gly Phe Pro Ala Pro
465                 470                 475                 480
Lys Ile Leu Trp Ser Arg Gln Leu Pro Asn Gly Glu Leu Gln Pro Leu
485                 490                 495
Ser Glu Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ser Thr Lys Met Glu Asp Ser
500                 505                 510
Gly Val Tyr Leu Cys Glu Gly Ile Asn Gln Ala Gly Arg Ser Arg Lys
515                 520                 525
Glu Val Glu Leu Ile Ile Gln Val Thr Pro Lys Asp Ile Lys Leu Thr
530                 535                 540
Ala Phe Pro Ser Glu Ser Val Lys Glu Gly Asp Thr Val Ile Ile Ser
545                 550                 555                 560
Cys Thr Cys Gly Asn Val Pro Glu Thr Trp Ile Ile Leu Lys Lys Lys
565                 570                 575
Ala Glu Thr Gly Asp Thr Val Leu Lys Ser Ile Asp Gly Ala Tyr Thr
580                 585                 590
Ile Arg Lys Ala Gln Leu Lys Asp Ala Gly Val Tyr Glu Cys Glu Ser
595                 600                 605
Lys Asn Lys Val Gly Ser Gln Leu Arg Ser Leu Thr Leu Asp Val Gln
610                 615                 620
Gly Arg Glu Asn Asn Lys Asp Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Leu Val Leu
625                 630                 635                 640
Tyr Phe Ala Ser Ser Leu Ile Ile Pro Ala Ile Gly Met Ile Ile Tyr
645                 650                 655
Phe Ala Arg Lys Ala Asn Met Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Val Glu Ala
660                 665                 670
Gln Lys Ser Lys Val
675
<210>  4
<211>  1621
<212>  ПРТ
<213>  homo sapiens
<220>
<221>  прочий_признак
<223>  Нестин у человека
<400>  4
Met Glu Gly Cys Met Gly Glu Glu Ser Phe Gln Met Trp Glu Leu Asn
1               5                   10                  15
Arg Arg Leu Glu Ala Tyr Leu Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Glu Gln
20                  25                  30
Asn Glu Leu Leu Ser Ala Glu Leu Gly Gly Leu Arg Ala Gln Ser Ala
35                  40                  45
Asp Thr Ser Trp Arg Ala His Ala Asp Asp Glu Leu Ala Ala Leu Arg
50                  55                  60
Ala Leu Val Asp Gln Arg Trp Arg Glu Lys His Ala Ala Glu Val Ala
65                  70                  75                  80
Arg Asp Asn Leu Ala Glu Glu Leu Glu Gly Val Ala Gly Arg Cys Gln
85                  90                  95
Gln Leu Arg Leu Ala Arg Glu Arg Thr Thr Glu Glu Val Ala Arg Asn
100                 105                 110
Arg Arg Ala Val Glu Ala Glu Lys Cys Ala Arg Ala Trp Leu Ser Ser
115                 120                 125
Gln Val Ala Glu Leu Glu Arg Glu Leu Glu Ala Leu Arg Val Ala His
130                 135                 140
Glu Glu Glu Arg Val Gly Leu Asn Ala Gln Ala Ala Cys Ala Pro Arg
145                 150                 155                 160
Cys Pro Ala Pro Pro Arg Gly Pro Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Glu
165                 170                 175
Glu Leu Ala Arg Arg Leu Gly Glu Ala Trp Arg Gly Ala Val Arg Gly
180                 185                 190
Tyr Gln Glu Arg Val Ala His Met Glu Thr Ser Leu Gly Gln Ala Arg
195                 200                 205
Glu Arg Leu Gly Arg Ala Val Gln Gly Ala Arg Glu Gly Arg Leu Glu
210                 215                 220
Leu Gln Gln Leu Gln Ala Glu Arg Gly Gly Leu Leu Glu Arg Arg Ala
225                 230                 235                 240
Ala Leu Glu Gln Arg Leu Glu Gly Arg Trp Gln Glu Arg Leu Arg Ala
245                 250                 255
Thr Glu Lys Phe Gln Leu Ala Val Glu Ala Leu Glu Gln Glu Lys Gln
260                 265                 270
Gly Leu Gln Ser Gln Ile Ala Gln Val Leu Glu Gly Arg Gln Gln Leu
275                 280                 285
Ala His Leu Lys Met Ser Leu Ser Leu Glu Val Ala Thr Tyr Arg Thr
290                 295                 300
Leu Leu Glu Ala Glu Asn Ser Arg Leu Gln Thr Pro Gly Gly Gly Ser
305                 310                 315                 320
Lys Thr Ser Leu Ser Phe Gln Asp Pro Lys Leu Glu Leu Gln Phe Pro
325                 330                 335
Arg Thr Pro Glu Gly Arg Arg Leu Gly Ser Leu Leu Pro Val Leu Ser
340                 345                 350
Pro Thr Ser Leu Pro Ser Pro Leu Pro Ala Thr Leu Glu Thr Pro Val
355                 360                 365
Pro Ala Phe Leu Lys Asn Gln Glu Phe Leu Gln Ala Arg Thr Pro Thr
370                 375                 380
Leu Ala Ser Thr Pro Ile Pro Pro Thr Pro Gln Ala Pro Ser Pro Ala
385                 390                 395                 400
Val Asp Ala Glu Ile Arg Ala Gln Asp Ala Pro Leu Ser Leu Leu Gln
405                 410                 415
Thr Gln Gly Gly Arg Lys Gln Ala Pro Glu Pro Leu Arg Ala Glu Ala
420                 425                 430
Arg Val Ala Ile Pro Ala Ser Val Leu Pro Gly Pro Glu Glu Pro Gly
435                 440                 445
Gly Gln Arg Gln Glu Ala Ser Thr Gly Gln Ser Pro Glu Asp His Ala
450                 455                 460
Ser Leu Ala Pro Pro Leu Ser Pro Asp His Ser Ser Leu Glu Ala Lys
465                 470                 475                 480
Asp Gly Glu Ser Gly Gly Ser Arg Val Phe Ser Ile Cys Arg Gly Glu
485                 490                 495
Gly Glu Gly Gln Ile Trp Gly Leu Val Glu Lys Glu Thr Ala Ile Glu
500                 505                 510
Gly Lys Val Val Ser Ser Leu Gln Gln Glu Ile Trp Glu Glu Glu Asp
515                 520                 525
Leu Asn Arg Lys Glu Ile Gln Asp Ser Gln Val Pro Leu Glu Lys Glu
530                 535                 540
Thr Leu Lys Ser Leu Gly Glu Glu Ile Gln Glu Ser Leu Lys Thr Leu
545                 550                 555                 560
Glu Asn Gln Ser His Glu Thr Leu Glu Arg Glu Asn Gln Glu Cys Pro
565                 570                 575
Arg Ser Leu Glu Glu Asp Leu Glu Thr Leu Lys Ser Leu Glu Lys Glu
580                 585                 590
Asn Lys Glu Leu Leu Lys Asp Val Glu Val Val Arg Pro Leu Glu Lys
595                 600                 605
Glu Ala Val Gly Gln Leu Lys Pro Thr Gly Lys Glu Asp Thr Gln Thr
610                 615                 620
Leu Gln Ser Leu Gln Lys Glu Asn Gln Glu Leu Met Lys Ser Leu Glu
625                 630                 635                 640
Gly Asn Leu Glu Thr Phe Leu Phe Pro Gly Thr Glu Asn Gln Glu Leu
645                 650                 655
Val Ser Ser Leu Gln Glu Asn Leu Glu Ser Leu Thr Ala Leu Glu Lys
660                 665                 670
Glu Asn Gln Glu Pro Leu Arg Ser Pro Glu Val Gly Asp Glu Glu Ala
675                 680                 685
Leu Arg Pro Leu Thr Lys Glu Asn Gln Glu Pro Leu Arg Ser Leu Glu
690                 695                 700
Asp Glu Asn Lys Glu Ala Phe Arg Ser Leu Glu Lys Glu Asn Gln Glu
705                 710                 715                 720
Pro Leu Lys Thr Leu Glu Glu Glu Asp Gln Ser Ile Val Arg Pro Leu
725                 730                 735
Glu Thr Glu Asn His Lys Ser Leu Arg Ser Leu Glu Glu Gln Asp Gln
740                 745                 750
Glu Thr Leu Arg Thr Leu Glu Lys Glu Thr Gln Gln Arg Arg Arg Ser
755                 760                 765
Leu Gly Glu Gln Asp Gln Met Thr Leu Arg Pro Pro Glu Lys Val Asp
770                 775                 780
Leu Glu Pro Leu Lys Ser Leu Asp Gln Glu Ile Ala Arg Pro Leu Glu
785                 790                 795                 800
Asn Glu Asn Gln Glu Phe Leu Lys Ser Leu Lys Glu Glu Ser Val Glu
805                 810                 815
Ala Val Lys Ser Leu Glu Thr Glu Ile Leu Glu Ser Leu Lys Ser Ala
820                 825                 830
Gly Gln Glu Asn Leu Glu Thr Leu Lys Ser Pro Glu Thr Gln Ala Pro
835                 840                 845
Leu Trp Thr Pro Glu Glu Ile Asn Gln Gly Ala Met Asn Pro Leu Glu
850                 855                 860
Lys Glu Ile Gln Glu Pro Leu Glu Ser Val Glu Val Asn Gln Glu Thr
865                 870                 875                 880
Phe Arg Leu Leu Glu Glu Glu Asn Gln Glu Ser Leu Arg Ser Leu Gly
885                 890                 895
Ala Trp Asn Leu Glu Asn Leu Arg Ser Pro Glu Glu Val Asp Lys Glu
900                 905                 910
Ser Gln Arg Asn Leu Glu Glu Glu Glu Asn Leu Gly Lys Gly Glu Tyr
915                 920                 925
Gln Glu Ser Leu Arg Ser Leu Glu Glu Glu Gly Gln Glu Leu Pro Gln
930                 935                 940
Ser Ala Asp Val Gln Arg Trp Glu Asp Thr Val Glu Lys Asp Gln Glu
945                 950                 955                 960
Leu Ala Gln Glu Ser Pro Pro Gly Met Ala Gly Val Glu Asn Glu Asp
965                 970                 975
Glu Ala Glu Leu Asn Leu Arg Glu Gln Asp Gly Phe Thr Gly Lys Glu
980                 985                 990
Glu Val Val Glu Gln Gly Glu Leu  Asn Ala Thr Glu Glu  Val Trp Ile
995                 1000                 1005
Pro Gly  Glu Gly His Pro Glu  Ser Pro Glu Pro Lys  Glu Gln Arg
1010                 1015                 1020
Gly Leu  Val Glu Gly Ala Ser  Val Lys Gly Gly Ala  Glu Gly Leu
1025                 1030                 1035
Gln Asp  Pro Glu Gly Gln Ser  Gln Gln Val Gly Ala  Pro Gly Leu
1040                 1045                 1050
Gln Ala  Pro Gln Gly Leu Pro  Glu Ala Ile Glu Pro  Leu Val Glu
1055                 1060                 1065
Asp Asp  Val Ala Pro Gly Gly  Asp Gln Ala Ser Pro  Glu Val Met
1070                 1075                 1080
Leu Gly  Ser Glu Pro Ala Met  Gly Glu Ser Ala Ala  Gly Ala Glu
1085                 1090                 1095
Pro Gly  Pro Gly Gln Gly Val  Gly Gly Leu Gly Asp  Pro Gly His
1100                 1105                 1110
Leu Thr  Arg Glu Glu Val Met  Glu Pro Pro Leu Glu  Glu Glu Ser
1115                 1120                 1125
Leu Glu  Ala Lys Arg Val Gln  Gly Leu Glu Gly Pro  Arg Lys Asp
1130                 1135                 1140
Leu Glu  Glu Ala Gly Gly Leu  Gly Thr Glu Phe Ser  Glu Leu Pro
1145                 1150                 1155
Gly Lys  Ser Arg Asp Pro Trp  Glu Pro Pro Arg Glu  Gly Arg Glu
1160                 1165                 1170
Glu Ser  Glu Ala Glu Ala Pro  Arg Gly Ala Glu Glu  Ala Phe Pro
1175                 1180                 1185
Ala Glu  Thr Leu Gly His Thr  Gly Ser Asp Ala Pro  Ser Pro Trp
1190                 1195                 1200
Pro Leu  Gly Ser Glu Glu Ala  Glu Glu Asp Val Pro  Pro Val Leu
1205                 1210                 1215
Val Ser  Pro Ser Pro Thr Tyr  Thr Pro Ile Leu Glu  Asp Ala Pro
1220                 1225                 1230
Gly Pro  Gln Pro Gln Ala Glu  Gly Ser Gln Glu Ala  Ser Trp Gly
1235                 1240                 1245
Val Gln  Gly Arg Ala Glu Ala  Leu Gly Lys Val Glu  Ser Glu Gln
1250                 1255                 1260
Glu Glu  Leu Gly Ser Gly Glu  Ile Pro Glu Gly Pro  Gln Glu Glu
1265                 1270                 1275
Gly Glu  Glu Ser Arg Glu Glu  Ser Glu Glu Asp Glu  Leu Gly Glu
1280                 1285                 1290
Thr Leu  Pro Asp Ser Thr Pro  Leu Gly Phe Tyr Leu  Arg Ser Pro
1295                 1300                 1305
Thr Ser  Pro Arg Trp Asp Pro  Thr Gly Glu Gln Arg  Pro Pro Pro
1310                 1315                 1320
Gln Gly  Glu Thr Gly Lys Glu  Gly Trp Asp Pro Ala  Val Leu Ala
1325                 1330                 1335
Ser Glu  Gly Leu Glu Ala Pro  Pro Ser Glu Lys Glu  Glu Gly Glu
1340                 1345                 1350
Glu Gly  Glu Glu Glu Cys Gly  Arg Asp Ser Asp Leu  Ser Glu Glu
1355                 1360                 1365
Phe Glu  Asp Leu Gly Thr Glu  Ala Pro Phe Leu Pro  Gly Val Pro
1370                 1375                 1380
Gly Glu  Val Ala Glu Pro Leu  Gly Gln Val Pro Gln  Leu Leu Leu
1385                 1390                 1395
Asp Pro  Ala Ala Trp Asp Arg  Asp Gly Glu Ser Asp  Gly Phe Ala
1400                 1405                 1410
Asp Glu  Glu Glu Ser Gly Glu  Glu Gly Glu Glu Asp  Gln Glu Glu
1415                 1420                 1425
Gly Arg  Glu Pro Gly Ala Gly  Arg Trp Gly Pro Gly  Ser Ser Val
1430                 1435                 1440
Gly Ser  Leu Gln Ala Leu Ser  Ser Ser Gln Arg Gly  Glu Phe Leu
1445                 1450                 1455
Glu Ser  Asp Ser Val Ser Val  Ser Val Pro Trp Asp  Asp Ser Leu
1460                 1465                 1470
Arg Gly  Ala Val Ala Gly Ala  Pro Lys Thr Ala Leu  Glu Thr Glu
1475                 1480                 1485
Ser Gln  Asp Ser Ala Glu Pro  Ser Gly Ser Glu Glu  Glu Ser Asp
1490                 1495                 1500
Pro Val  Ser Leu Glu Arg Glu  Asp Lys Val Pro Gly  Pro Leu Glu
1505                 1510                 1515
Ile Pro  Ser Gly Met Glu Asp  Ala Gly Pro Gly Ala  Asp Ile Ile
1520                 1525                 1530
Gly Val  Asn Gly Gln Gly Pro  Asn Leu Glu Gly Lys  Ser Gln His
1535                 1540                 1545
Val Asn  Gly Gly Val Met Asn  Gly Leu Glu Gln Ser  Glu Glu Val
1550                 1555                 1560
Gly Gln  Gly Met Pro Leu Val  Ser Glu Gly Asp Arg  Gly Ser Pro
1565                 1570                 1575
Phe Gln  Glu Glu Glu Gly Ser  Ala Leu Lys Thr Ser  Trp Ala Gly
1580                 1585                 1590
Ala Pro  Val His Leu Gly Gln  Gly Gln Phe Leu Lys  Phe Thr Gln
1595                 1600                 1605
Arg Glu  Gly Asp Arg Glu Ser  Trp Ser Ser Gly Glu  Asp
1610                 1615                 1620
<210>  5
<211>  253
<212>  ПРТ
<213>  homo sapiens
<220>
<221>  прочий_признак
<223>  человеческий CD151
<400>  5
Met Gly Glu Phe Asn Glu Lys Lys Thr Thr Cys Gly Thr Val Cys Leu
1               5                   10                  15
Lys Tyr Leu Leu Phe Thr Tyr Asn Cys Cys Phe Trp Leu Ala Gly Leu
20                  25                  30
Ala Val Met Ala Val Gly Ile Trp Thr Leu Ala Leu Lys Ser Asp Tyr
35                  40                  45
Ile Ser Leu Leu Ala Ser Gly Thr Tyr Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Leu
50                  55                  60
Val Val Ala Gly Thr Val Val Met Val Thr Gly Val Leu Gly Cys Cys
65                  70                  75                  80
Ala Thr Phe Lys Glu Arg Arg Asn Leu Leu Arg Leu Tyr Phe Ile Leu
85                  90                  95
Leu Leu Ile Ile Phe Leu Leu Glu Ile Ile Ala Gly Ile Leu Ala Tyr
100                 105                 110
Ala Tyr Tyr Gln Gln Leu Asn Thr Glu Leu Lys Glu Asn Leu Lys Asp
115                 120                 125
Thr Met Thr Lys Arg Tyr His Gln Pro Gly His Glu Ala Val Thr Ser
130                 135                 140
Ala Val Asp Gln Leu Gln Gln Glu Phe His Cys Cys Gly Ser Asn Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gln Asp Trp Arg Asp Ser Glu Trp Ile Arg Ser Gln Glu Ala Gly
165                 170                 175
Gly Arg Val Val Pro Asp Ser Cys Cys Lys Thr Val Val Ala Leu Cys
180                 185                 190
Gly Gln Arg Asp His Ala Ser Asn Ile Tyr Lys Val Glu Gly Gly Cys
195                 200                 205
Ile Thr Lys Leu Glu Thr Phe Ile Gln Glu His Leu Arg Val Ile Gly
210                 215                 220
Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Cys Val Gln Val Phe Gly Met Ile Phe
225                 230                 235                 240
Thr Cys Cys Leu Tyr Arg Ser Leu Lys Leu Glu His Tyr
245                 250
<210>  6
<211>  269
<212>  ПРТ
<213>  homo sapiens
<220>
<221>  прочий_признак
<223>  человеческий IL1бета
<400>  6
Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser
1               5                   10                  15
Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met
20                  25                  30
Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile
35                  40                  45
Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala
50                  55                  60
Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro
65                  70                  75                  80
Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe
85                  90                  95
Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala
100                 105                 110
Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp
115                 120                 125
Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala
130                 135                 140
Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met
145                 150                 155                 160
Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu
165                 170                 175
Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp
180                 185                 190
Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys
195                 200                 205
Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn
210                 215                 220
Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr
225                 230                 235                 240
Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly
245                 250                 255
Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
260                 265
<210>  7
<211>  153
<212>  ПРТ
<213>  homo sapiens
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<223>  человеческий IL4
<400>  7
Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln
20                  25                  30
Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys
35                  40                  45
Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr
50                  55                  60
Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr
65                  70                  75                  80
Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln
85                  90                  95
Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg
100                 105                 110
Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala
115                 120                 125
Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met
130                 135                 140
Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
145                 150
<---