СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПО УРОВНЮ ЭКСПРЕССИИ мРНК IL-10 И/ИЛИ IL-17 В ПЛАЗМЕ КРОВИ
METHOD FOR DIAGNOSING BREAST CANCER BY LEVEL OF EXPRESSION OF IL-10 AND/OR IL-17 MRNA IN BLOOD PLASMA

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины, онкологии, молекулярной биологии и клинико-лабораторной диагностики и может быть использовано для ранней диагностики рака молочной железы. Способ основан на измерении в плазме крови уровня мРНК IL-10 и/или IL-17 и сравнении уровня представленности мРНК IL-10 и/или IL-17 с уровнем представленности референсных транскриптов. Для осуществления способа используют обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию в «реальном времени». В качестве референсных транскриптов используют мРНК B2m и/или GUSB. Результат исследования считают положительным при разнице уровней представленности мРНК целевого гена и референсного более десяти раз. Изобретение может быть использовано для выявления ранних стадий рака молочной железы. Использование заявленного способа обеспечивает высокочувствительную и объективную количественную характеристику уровня экспрессии мРНК IL-10 и/или IL-17, что позволяет провести раннюю малоинвазивную диагностику рака молочной железы.
Уровень техники
Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным онкологическим заболеванием среди женщин. В 2018 году в мире от рака молочной железы умерло 627000 женщин - это примерно 15% всех случаев смерти от рака среди женщин [1]. Если рассматривать только Европу, женский РМЖ составляет 523000 случаев, являясь первой причиной рака перед 500000 случаев рака толстой кишки [2]. Поэтому раннее выявление и адекватная терапия являются неотъемлемой частью в борьбе с высокой смертностью от этого заболевания во всем мире.
Учитывая растущее число случаев заболеваний РМЖ, ранняя диагностика жизненно важна, особенно на начальных стадиях опухоли. Существенный прогресс в этой области был достигнут с помощью методов скрининга, которые включают ультразвуковое исследование, компьютерную томографию или магнитно-резонансную томографию. Однако в случае небольших злокачественных новообразований эти методы не очень эффективны. Поэтому поиск новых диагностических методов, которые могут помочь в раннем выявлении рака, в настоящее время является актуальной задачей. Лучшее понимание молекулярного и генетического разнообразия РМЖ ведет к индивидуализированному лечению [3]. Самые последние противоопухолевые методы лечения основаны на биологических механизмах. Таким образом, для надлежащего ведения пациента теперь требуется поддержка молекулярной составляющей РМЖ [4]. Онкомаркеры особенно полезны при мониторинге лечения и при обнаружении, локализации или идентификации метастатической стадии рака и раннем обнаружении его рецидива.
В настоящее время во многих научных работах получены данные, демонстрирующие увеличение концентрации внеклеточных молекул рибонуклеиновых кислот (внРНК) благодаря гибели значительного числа клеток при опухолевом процессе [5-7].
мРНК циркулируют в плазме крови (внеклеточная фракция, внРНК) как здоровых, так и больных людей, таким образом, предоставляя возможность для выявления различий в уровне экспрессии генов у разных групп пациентов [8-10].
В настоящее время больше исследований проведено в отношении уровня внРНК в сыворотке и опухолевых тканях, чем в плазме. При этом качественный и количественный анализ внРНК в плазме крови в настоящее время можно считать наиболее перспективным диагностическим методом, поскольку он является сравнительно недорогим и малоинвазивным, а правильный выбор исследуемых генов позволит в ближайшем будущем использовать эти гены как маркеры развития РМЖ на разных стадиях этого заболевания.
Известно, что цитокины, а также гены роста и пролиферации участвуют в процессе опухолеобразования [11-13]. Поэтому анализ экспрессии внРНК генов цитокинов и факторов роста при РМЖ актуален не только для фундаментальных исследований, но и для клинических, одним из которых является диагностика заболевания на ранних стадиях.
Цитокины являются высокоиндуцируемыми секреторными белками, обеспечивающими межклеточную связь в иммунной системе. Они сгруппированы в несколько белковых семейств: факторы некроза опухоли, интерлейкины, интерфероны и колониестимулирующие факторы [11]. Согласно литературным данным, цитокины непосредственно вовлечены в патогенез РМЖ, они играют важную роль в регуляции как индукции, так и защиты при РМЖ [14, 15].
Патологический ангиогенез является отличительной чертой онкологических и различных ишемических и воспалительных заболеваний, его развитие устанавливает сосудистую сеть для роста опухоли и гематогенного метастазирования [16]. Следовательно, гены, вовлеченные в этот процесс, активно изучаются для разработки диагностических систем и терапевтических подходов к лечению рака и других заболеваний [17]. Цитокины и факторы роста, продуцируемые множеством типов клеток, присутствующих в микросреде солидных опухолей, образуют сложную динамическую сеть, в которой они индуцируют другие цитокины, изменяют экспрессию растворимых и связанных с поверхностью клетки рецепторов цитокинов, стимулируют пролиферацию эндотелиальных клеток [18].
Интерлейкин-10 (IL-10), продуцируемый множеством клеток, представляет собой высокоплейотропный цитокин. Он вовлечен в патогенез и/или развитие аутоиммунных заболеваний и рака, хотя проявляет различные эффекты, которые иногда кажутся противоречивыми. IL-10 необходим для подавления опухолевых медиаторов воспаления [19]; однако IL-10 может играть потенциальную роль в регуляции ангиогенеза опухоли [20]. Однако окончательная роль этого цитокина в заболевании не может быть полностью определена до тех пор, пока не будут выяснены иммунологические условия, регулирующие его функцию [21].
Было показано, что экспрессия IL-10 связана с улучшением выживаемости пациентов с колоректальным раком [22] и РМЖ [23], но с плохой выживаемостью при немелкоклеточном раке легкого [24] и рак желудка [20]. В исследовании [25] были проанализированы подмышечные лимфатические узлы (ALN) у женщин с крупным и местнораспространенным раком груди и обнаружили, что метастатические ALN демонстрируют высокие уровни IL-10.
Интерлейкин-17 (IL-17) - это многогранный цитокин, который играет разнообразную роль как в иммунной защите, так и в иммунопатологии. IL-17 формально называется «IL-17A», но обычно его называют IL-17, поскольку он был первым описанным членом семейства IL-17 [26]. На сегодняшний день семейство IL-17 включает шесть членов (от IL-17A до IL-17F), которые обладают гомологией последовательностей [27]. IL-17, провоспалительный цитокин, секретируется клетками CD4 и CD8. Семейство цитокинов IL-17 глубоко вовлечено в хронические воспалительные заболевания и вызывает интерес как фактор, влияющий на противораковый иммунитет [28]. Несколько других исследований подтверждают роль IL-17 в опухолях при РМЖ [29-32].
Было обнаружено, что повышенные уровни IL-17 в сыворотке связаны с худшим прогнозом у пациентов с колоректальным раком и раком желудка [33]. В исследовании [34] наблюдалась значительная разница в сывороточных уровнях IL-6 и IL-17a между пациентами и контрольной группой, а повышенные уровни этих двух цитокинов в значительной степени ассоциировались с плохим исходом у пациентов с РМЖ и, следовательно, могут использоваться в качестве маркеров прогноза.
Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок известен также способ выявления опухоли молочной железы и дифференцировки злокачественных и доброкачественных образований путем измерения 18S рРНК, RASSF8 и Ki-67 методом метил специфичной ПЦР [35].
Известен патент № RU 2510855 «Способ диагностики вагинитов у беременных женщин по уровню экспрессии мРНК генов интерлейкинов во влагалищных мазках». Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Представлен способ, основанный на измерении во влагалищных соскобах уровня экспрессии мРНК генов интерлейкинов IL1B, IL8, IL10 и IL18 и сравнение его с уровнем представленности мРНК референсных генов.
Известен патент № RU 2607041 «Способ определения степени гноетечения на пародонте по уровню мРНК гена интерлейкина-8 (IL-8) человека». Изобретение относится к области медицины, стоматологии, молекулярной биологии и клинико-лабораторной диагностики и может быть использовано для определения выраженности нагноения (гноетечения) тканей пародонта по наличию в соскобе из пародонтального кармана РНК интерлейкина 8 (IL8). Представлен способ, основанный на измерении в соскобах из области поражения уровня мРНК гена интерлейкина 8 (IL8) и сравнении его с уровнем РНК референсных транскриптов.
Известен патент № RU 2417263 «Способ диагностики воспалительного процесса при раннем ревматоидном артрите». Изобретение относится к области медицины, биологии и биотехнологии и может быть использовано в качестве дополнительного метода обследования пациентов при ранней диагностике воспалительного процесса при раннем ревматоидном артирите. Сущность способа заключается в том, что из периферической крови или синовиальной жидкости выделяют РНК. Далее на основе количественного определения экспрессии мРНК генов цитокинов иитерлейкин-2 (ИЛ-2), интерлейкин-4 (ИЛ-4) и интерлейкин-10 (ИЛ-10) или интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерлейкин-4 (ИЛ-4), интерлейкин-6 (ИЛ-6), интерлейкин-8 (ИЛ-8), интерлейкин-17 (ИЛ-17), интерлейкин-1β (ИЛ-1β), а также на основе количественного определения интерферона-гамма (IFNG) и фактора некроза опухолей (TNF) методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции по флоуресценции непосредственно во время реакции оценивают баланс цитокинов. По флоуресценции непосредственно во время реакции оценивают баланс цитокинов. В дальнейшем рассчитывают парный баланс экспрессии различных цитокинов исходя из функциональной взаимосвязи. Применение изобретения снижает ошибку определения, связанную с индивидуальными особенностями экспрессии контрольного гена.
Известен патент № RU 2517082 «Метод прогноза эффективности иммунотерапии на основании оценки уровня экспрессии мРНК цитокинов в ткани рака почки». Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения чувствительности рака почки к иммунотерапии после проведения нефрэктомии, включающий верификацию диагноза, проведение нефрэктомии рака почки, забор опухолевой и нормальной ткани почки для определения уровня экспрессии цитокинов IL-4, IL-6, IL-10, TGFP и расчет соотношения уровня экспрессии цитокинов в опухолевой и нормальной ткани почки. При превышении уровня экспрессии цитокинов в опухолевой ткани почки над нормальной терапию считают показанной. Изобретение позволяет эффективно определять чувствительность рака почки к иммунотерапии на основании данных экспрессии цитокинов в опухолевой ткани.
Известен патент № US 9687522 «Способы лечения субъекта, страдающего аутоиммунным заболеванием, с использованием прогнозирующих биомаркеров клинического ответа на терапию глатирамера ацетатом при рассеянном склерозе». Способ лечения субъекта, страдающего аутоиммунным заболеванием, фармацевтической композицией, содержащей глатирамера ацетат и фармацевтически приемлемый носитель, включающий этапы введения терапевтического количества фармацевтической композиции субъекту с определением, является ли субъект респондентом глатирамера ацетата или гипо- / нереагирующий на глатирамера ацетат путем измерения значения биомаркера, выбранного из группы, состоящей из концентрации IL-10, концентрации IL-17, концентрации IL-18, концентрации TNF-α, концентрации BDNF, концентрации каспазы-1, Соотношение IL-10/IL-18 и соотношение IL-10/IL-17 в крови субъекта и сравнение измеренного значения с эталонным значением для биомаркера для идентификации субъекта как человека, отвечающего на глатирамера ацетат, или гипогликемии глатирамера ацетата. - / не отвечающими продолжение введения, если субъект идентифицирован как субъект, отвечающий на глатирамера ацетат, или изменение лечения субъекта, если субъект идентифицирован как субъект, не отвечающий на глатирамера ацетат.
Известен патент № RU 2566288 «Способ диагностики предрасположенности к прогрессированию атеросклероза у больных с хронической ишемической болезнью сердца по концентрации интерлейкина-10 и интерлейкина-17 в периферической крови». Изобретение относится к медицине, в частности, к кардиологии, а именно может быть использовано для определения предрасположенности больных хронической ишемической болезнью сердца к прогрессированию атеросклероза. Для этого в образце периферической венозной крови определяют концентрацию интерлейкина-10 (ИЛ-10) и интерлейкина-17 (ИЛ-17). При отношении концентрации ИЛ-10 и ИЛ-17 менее 1,5 судят о высоком риске прогрессирования атеросклероза. Использование данного лабораторного метода позволяет выявить высокий риском прогрессирования атеросклероза.
Наиболее близким аналогом данного изобретения является патент РФ №2451937 «Способ диагностики рака молочной железы по уровню РНК интерлейкинов IL8 и/или IL18 в плазме крови», где для диагностики рака молочной железы используют измерения уровня мРНК интерлейкинов IL-8 и IL-18 в плазме крови. Изобретение относится к области медицины, онкологии и молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики рака молочной железы. Отличительным признаком изобретения является использование соотношения уровня РНК интерлейкинов IL-8 и/или IL-18 в сравнении с уровнем референсного транскрипта в плазме крови для диагностики рака молочной железы. Диагностическим маркером является соотношение представленности в плазме крови пациента РНК IL-8 и/или РНК IL-18 и любого другого транскрипта (или группы транскриптов), не меняющих уровень представленности в плазме крови при опухолеобразовании, например, ABL, HPRT или IL 1b. Для осуществления способа используют обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию в «реальном времени». Результат исследования считают положительным при разнице уровней представленности РНК IL8 и HPRT более десяти раз. Использование заявленного способа позволяет осуществлять раннюю диагностику рака молочной железы. Патент не описывает применения ПЦР в реальном времени для диагностики рака молочной железы путем соотношения уровня мРНК IL-10 и/или IL-17 с уровнем референсных генов, таких как B2m и/или GUSB, не содержит описания метода определения мРНК IL-10 и/или IL-17 и последовательностей праймеров и зондов. Поэтому заявляемое изобретение не нарушает прав интеллектуальной собственности, описанной в патенте РФ №2451937.
Таким образом, в настоящее время в РФ нет действующих аналогов заявляемого изобретения.
Описание (раскрытие) изобретения
Предложен способ диагностики опухолей человека путем оценки уровня представленности отдельных мРНК в плазме крови (внеклеточной фракции).
Техническим результатом изобретения является ранняя диагностика рака молочной железы на основе оценки и сопоставления уровня представленности мРНК IL-10 и/или IL-17 с уровнем мРНК В2 т и/или GUSB в плазме периферической крови.
В плазме крови больных РМЖ (даже на ранних стадиях заболевания, например, на стадии T1N0M0) существенно возрастает относительное количество мРНК IL-10 и/или IL-17. Так, относительное количество мРНК IL-10 и/или IL-17 существенно превышает относительное количество мРНК этих цитокинов в плазме крови здоровых индивидов при нормировке по уровню мРНК стабильно представленных транскриптов (См. фигуру 1. Фиг.1 - Уровень экспрессии мРНК исследуемых генов относительно нормировочных генов (B2m, GUSB) в плазме крови больных РМЖ и женщин контрольной группы ). Кроме того, у больных с метастазирующим раком уровень мРНК IL-10 и/или IL-17 в плазме периферической крови выше, чем у больных с ранним раком молочной железы (стадия T1N0M0).
Уровень представленности внеклеточных РНК цитокинов при развитии РМЖ может служить дополнительно исследуемым параметром при диагностике и оценке степени прогрессии заболевания. В частности, уровень мРНК IL-10 и/или IL-17 позволяет проводить раннюю диагностику РМЖ, делая ее малоинвазивной, а также позволяет осуществлять мониторинг течения заболевания.
Для оценки уровня представленности исследуемых мРНК в плазме периферической крови можно использовать биохимические, генетические, молекулярно-биологические и иные методы, а также их сочетания.
В частности, для оценки уровня представленности исследуемых РНК в плазме периферической крови можно использовать методы обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) и полимеразной цепной реакции (ПЦР). В том числе метод полимеразной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции в режиме «реального времени».
Для клинической диагностики можно использовать определение уровня представленности в плазме крови пациента мРНК IL-10 и/или IL-17 относительно любого другого мРНК гена (или группы мРНК генов), не меняющих уровень представленности в плазме крови при опухолеобразовании.
В частности, можно использовать определение уровня представленности в плазме крови пациента мРНК генов IL-10 и/или IL-17 относительно уровня представленности мРНК одного из генов «домашнего хозяйства» (например, B2m и/или GUSB)
На основании экспериментальных данных при сравнении пациентов с РМЖ и условно-здоровых пациентов без признаков воспалительных заболеваний методами ОТ-ПЦР и ПЦР «в реальном времени» были получены и проанализированы результаты определения уровня представленности мРНК генов IL-10 и/или IL-17 относительно референсных мРНК генов β2-микроглобулина (B2m) человека и/или β-глюкуронидаза (GUSB).
Уровень экспрессии мРНК измеряли в относительных единицах, определяемых методом ΔΔCt с применением нормировочных генов [36].
Осуществление (реализация) изобретения
Образцы венозной крови необходимо забирать в пробирки с ЭДТА. Процедуру экстракции нуклеиновых кислот желательно начинать не позднее, чем через 2 часа с момента забора крови. Для получения плазмы пробирки с кровью центрифугируют при 3000g в течение 20 мин). После центрифугирования верхнюю фракцию переносят в новую пробирку.
Выделение РНК проводят согласно прилагающейся инструкции, используя коммерческий набор реагентов «ПРОБА-НК» производства ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия), затем выделенную РНК в объеме 16,5 мкл немедленно используют для постановки обратной транскрипции.
Метод обратной транскрипции использовали для получения препарата кДНК. Ингредиенты набора «ОТ-буфер», «Смесь праймеров ОТ и dNTP» и «Ревертазу» - реакционную смесь для проведения обратной транскрипции готовили согласно инструкции производителя по следующей прописи в стерильной пробирке объемом 1,5 мл:
1. ОТ-буфер - 2×(N+1) мкл;
2. «Праймеры+dNTP» - (N+1) мкл;
3. Ревертаза MuMLV 2 ед./мкл - 0,5×(N+1) мкл,
где N - количество анализируемых образцов с учетом отрицательного контроля. Капли со стенок пробирок собирали центрифугированием в течение 3-5 сек.
В пробирки, содержащие по 16,5 мкл препарата подготовленной РНК, добавляли по 3,5 мкл смеси для обратной транскрипции. При постановке отрицательного контроля использовали пробирку, содержащую 16,5 мкл очищенной воды. Перемешивали реакционные смеси 5-7-кратным пипетированием. Пробирки инкубировали при 40°С в течение 30 мин, затем останавливали реакцию прогреванием при 95°С в течение 5 мин. Капли со стенок пробирок собирали центрифугированием в течение 3-5 сек. Полученный препарат кДНК можно хранить при -20°С, либо можно использовать в качестве матрицы сразу для постановки ПЦР-РВ. В качестве матрицы для проведения одной ПЦР-реакции использовали 5 мкл полученного препарата, разбавленного в 2 раза.
Для определения уровня представленности исследуемых мРНК (например, IL-10 и/или IL-17) используют метод ПЦР «в реальном времени» в стандартных условиях с праймерами, специфичными к последовательности определяемых РНК. Для исключения коамплификации геномной ДНК желательно расположить праймеры на стыках зкзонов. Желательно, чтобы длины продуктов амплификации всех анализируемых генов отличались друг от друга незначительно и находились в диапазоне 100-300 п.н. Проявку накопления продуктов реакции можно вести как с помощью интеркалирующих красителей, так и с использованием флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов (зондов). Нормированные значения, соответствующие уровню представленности транскриптов каждого гена, можно рассчитывать с помощью метода ΔΔCt или аналогичного.
Для проведения ПЦР использовали следующие олигонуклеотидные праймеры и зонды:
где BHQ1 означает присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FAM - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т на 5'-конце пробы; на основании полученных пороговых циклов (Ct) вычисляют уровень экспрессии генов.
Пробирки (приготовленные как описано выше) устанавливали в детектирующий термоциклер ДТ-прайм (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва) и проводили реакцию со следующими параметрами циклирования:
Программа амплификации:
Для каждой реакции программное обеспечение термоциклера автоматически вычисляло величину порогового цикла Ct.
В частности, при сравнении уровня экспрессии в плазме крови пациента мРНК IL-10 и/или IL-17 относительно уровня экспрессии мРНК B2m и/или GUSB результат исследования считают положительным (развитие опухоли зарегистрировано) при достоверной разнице (р<0.01) уровней экспрессии мРНК IL-10 и/или IL-17 в группе больных относительно группы здоровых людей. Результат исследования считают отрицательным (развитие опухоли не зарегистрировано) при отсутствии достоверной разницы (р<0.01) экспрессии мРНК IL-10 и/или IL-17 в группе больных относительно группы здоровых людей. Конкретные показатели разницы полученных значений для исследуемых мРНК (например, IL-10 и/или IL-17) могут отличаться от приведенных в примере вследствие различий в методиках и для каждой конкретной методики должны быть подобраны экспериментально.
Перечень нуклеотидных последовательностей
SEQ ID NO 1
TTG САА ААС САА АСС АСА AGA С
SEQ ID NO 2
СТС GAA GCA TGT TAG GCA GGT
SEQ ID NO 3
TCC TGA CTG GGG TGA GGG CCA
SEQ ID NO 4
AAC CGA ТСС АСС TCA CCT TGG
SEQ ID NO 5
GGA TCT CTT GCT GGA TGG GGA
SEQ ID NO 6
TGC CGC CAC TTG GGC TGC АТС
Список использованных источников
1. WHO. Breast cancer. WHO (2018). // https://www.who.int/cancer/prevention/diagnosis-screening/breast-canc.
2. Ferlay J., Colombet M., Soerjomataram I., Dyba Т., Randi G., Bettio M. et al. Cancer incidence and mortality patterns in europe: Estimates for 40 countries and 25 major cancers in 2018. // Eur. J. Cancer. - 2018. - Vol 103. - P. 356-387.
3. Perou С.M., Sorlie Т., Eisen M.В., van de Rijn M., Jeffrey S.S., Rees C.A. et al. Molecular portraits of human breast tumours. // Nature. - 2000. - Vol 406, №6797. - P. 747-752. doi: 10,1038 / 35021093.
4. Cardoso F., Senkus E., Costa A., Papadopoulos E., Aapro M., Andre F. et al. 4th ESO-ESMO international consensus guidelines for advanced breast cancer (ABC 4) dagger. // Ann. Oncol. - 2018. - Vol 29, №8. - P. 1634-1657. doi: 10.1093/annonc/mdy192.
5. Seiden M.V., Kantoff P.W., Krithivas K., Propert K. et al. Detection of circulating tumor cells in men with localized prostate cancer. // J Clin Oncol. - 1994. - Vol 12. - №12. - P. 2634-2639.
6. Silva J. M., Dominguez G., Silva J., Garcia J. M., Sanchez A., Rodriguez O. et al. Detection of epithelial messenger RNA in the plasma of breast cancer patients is associated with poor prognosis tumor characteristics. // Clin. Cancer Res. - 2001. - Vol 7. - №9. - P. 2821 - 2825.
7. Rykova E.Y., Skvortsova Т.E., Hoffmannet A.L. et al. Breast cancer diagnostics based on extracellular DNA and RNA circulating in blood. // Biochem. Suppl. Ser. В Biomed. Chem. - 2008 - Vol 2. - №2. - P. 208 - 213.
8. Турчанинова M.А., Ребриков Д.В. Профиль РНК цитокинов в плазме крови при нормальном физиологическом состоянии организма. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009. - Т. 24. - №2. - С. 68-71. [Turchaninova MA Rebrikov DV Profil RNK tsitokinov v plazme krovi pri normalnom fiziologicheskom sostoianii organizma. // Molekuliarnaia genetika mikrobio-logiia i virusologiia 2009. - Vol 24. - №2. - P. 68-71. (In Russ.)].
9. Турчанинова M.А., Мещеряков А.А., Рахманкулова З.П., Ребриков Д.В. Внеклеточные РНК плазмы крови как диагностический маркер опухолей молочной железы. // Биоорг.химия. - 2011 - Т. 37. - №3 - С. 393-398. [Turchaninova MA, Meshcheriakov АА, Rakhmankulova ZP, Rebrikov DV. Vnekletochnye RNK plazmy krovi kak diagnosticheskii marker opukholei molochnoi zhelezy. // Bioorg khimiia. - 2011. - Vol 37 - №3. - P. 393-398. (In Russ.)].
10. Тыщик E.А., Кометова В.В., Родионов В.В., Ребриков Д.В. Оценка представленности внеклеточных РНК изоформ VEGF в плазме крови пациенток с раком молочной железы. // Вестник РГМУ. - 2017. - №4. - С. 26 - 30. [Tyshchik ЕА. Kometova W, Rodionov W, Rebrikov DV. Otsenka predstavlennosti vnekletochnykh RNK izoform VEGF v plazme krovi patsientok s rakom molochnoi zhelezy. // Vestnik RGMU. - 2017 - №4 - P. 26-30. (In Russ.)].
11. Esquivel-Velazquez M. et al. The role of cytokines in breast cancer development and progression. // J. Interf. Cytokine Res. - 2015. - Vol 35 - №1. - P. 1-16.
12. Ma Y., Ren Y., Dai Z.J., Wu C.J., Ji Y.H., Xu J. IL-6, IL-8 and TNF-α levels correlate with disease stage in breast cancer patients. // Adv Clin Exp Med. - 2017. - Vol 26 - №3. - P. 421-426.
13. Nicolini A, Carpi A, Rossi G. Cytokines in breast cancer. // Cytokine Growth Factor Rev. - 2006. - Vol 17 - №5. - P. 325-337.
14. Bertazza L., Mocellin S. The dual role of tumor necrosis factor (TNF) in cancer biology. // Curr. Med. Chem. - 2010. -Vol 17 - №29. - P. 3337 -3352.
15. Jones V.S. Huang R.Y., Chen L.P., Chen Z.S., Fu L., Huang R.P. Cytokines in cancer drug resistance: cues to new therapeutic strategies. // Biochim. biophys. acta-rev. cancer. - 2016. - Vol 1865 - №2. - P. 255-265.
16. Carmeliet P., Jain R.K., Angiogenesis in cancer and other diseases. // Nature. - 2000 - Vol 407 - №6801. - P. 249-257.
17. Welti J., Loges S., Dimmeler S., Carmeliet P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. // J. Clin. Invest. - 2013. - Vol 123 - №8. - P. 3190-3200.
18. Leek R.D., Harris A.L., Lewis С.E. Cytokine networks in solid human tumors: regulation of angiogenesis. // J. Leukoc. Biol. - 1994. - Vol 56 - №4 - P. 423-435.
19. Dennis K.L., Blatner N. R., Gounari F., Khazaie K. Current status of interleukin-10 and regulatory T cells in cancer. // Curr Opin Oncol. - 2013. -Vol 25, №6. - P. 637-645. doi: 10.1097/CCO.0000000000000006.
20. Sakamoto Т., Saito H, Tatebe S., Tsujitani S., Ozaki M., Ito H, Ikeguchi M. Interleukin-10 expression significantly correlates with minor CD8+ T cell infiltration and high microvessel density in patients with gastric cancer. // Int J Cancer. - 2006. - Vol 118, №8. - P. 1909-1914. doi: 10.1002/ijc.21598.
21. Mannino M.H., Zhu Z., Xiao H., Bai Q., Wakefield M.R., Fang Y. The paradoxical role of IL-10 in immunity and cancer. // Cancer Lett. - 2015. - Vol 367, №2. - P. 103-107. doi: 10.1016/j.canlet.2015.07.009.
22. Toiyama Y., Miki C, Inoue Y., Minobe S., Urano H., Kusunoki M. Loss of tissue expression of interleukin-10 promotes the disease progression of colorectal carcinoma. // Surg Today. - 2010. - Vol 40, №1. - P. 46-53. doi: 10.1007/s00595-009-4016-7.
23. Li Y., Yu H., Jiao S., Yang J. Prognostic value of IL-10 expression in tumor tissues of breast cancer patients. // Xi bao yu fen zi mian yi xue za zhi. - 2014. - Vol 30, №5. - P. 517-520 (article Chinese).
24. Hatanaka H., Abe Y., Kamiya Т., Morino F., Nagata J., Tokunaga T. et al. Clinical implications of interleukin (IL)-10 induced by non-small-cell lung cancer. // Ann Oncol. - 2000. - Vol 11, №7. - P. 815-819.
25. Kaewkangsadan V., Verma C., Eremin J.M., Cowley G., Ilyas M., Eremin O. Tumour-draining axillary lymph nodes in patients with large and locally advanced breast cancers undergoing neoadjuvant chemotherapy (NAC): The crucial contribution of immune cells (effector, regulatory) and cytokines (Th1, Th2) to immune-mediated tumour cell death induced by NAC. // BMC Cancer. - 2018. - Vol 18, №1: 123. doi: 10.1186/s12885-018-4044-z.
26. Rouvier E., Luciani M.F., Mattei M.G., Denizot F., Golstein P. CTLA-8, cloned from an activated T cell, bearing AU-rich messenger RNA instability sequences, and homologous to a herpesvirus saimiri gene. // J Immunol. - 1993. - Vol 150, №12. - P. 5445-5456.
27. Patel D.D., Kuchroo V.K. Th17 cell pathway in human immunity: lessons from genetics and therapeutic interventions. // Immunity. - 2015. - Vol 43, №6. - P. 1040-1051. doi: 10.1016/j.immuni.2015.12.003.
28. Amatya N., Garg A.V., Gaffen S. L. 11-17 signaling: The yin and the yang. // Trends Immunol. - 2017. - Vol 38, №5. - P. 310 - 322. doi: 10.1016/j.it.2017.01.006.
29. Cochaud S., Giustiniani J., Thomas C., Laprevotte E., Garbar C., Savoye A.M. et al. Il-17a is produced by breast cancer tils and promotes chemoresistance and proliferation through erk1/2. // Sci. Rep. - 2013. - Vol 3: 3456. doi: 10,1038/srep03456.
30. Du J.W., Xu K.Y., Fang L.Y., Qi X.L. Interleukin-17, produced by lymphocytes, promotes tumor growth and angiogenesis in a mouse model of breast cancer. // Mol. Med. Rep. - 2012. - Vol 6, №5. - P. 1099-1102. doi: 10.3892/mmr.2012.1036.
31. Merrouche Y., Fabre J., Cure H., Garbar C., Fuselier C., Bastid J. et al. Il-17e synergizes with egf and confers in vitro resistance to egfr-targeted therapies in tnbc cells. // Oncotarget. - 2016. - Vol 7, №33. - P. 53350-53361. doi: 10.18632 / oncotarget. 10804.
32. Nam J.S., Terabe M., Kang M.J., Chae H., Voong N., Yang Y.A. et al. Transforming growth factor beta subverts the immune system into directly promoting tumor growth through interleukin-17. // Cancer Res. - 2008. - Vol 68, №10. - P. 3915-3923. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-08-0206.
33. Gonda K., Shibata M., Ujiie D., Ashizawa M., Kikuchi Т., Okayama H. et al. Correlation of IL-17 with immune suppression involving MDSC, malnutrition, and prognosis in patients with gastric and colorectal cancer. // Journal of Clinical Oncology. - 2018. - Vol 36, №5 suppl. - P. 83-83.
34. Kaur R.P., Vasudeva K., Singla H., Benipal R.P.S., Khetarpal P., Munshi A. Analysis of pro- and anti-inflammatory cytokine gene variants and serum cytokine levels as prognostic markers in breast cancer. // J Cell Physiol. - 2018. - Vol 233, №12. - P. 9716-9723. doi: 10.1002/jcp.26901.
35. Рытова E. Ю. Циркулирующие внеклеточные ДНК и РНК крови в диагностике опухолей молочной железы. // Биоорганическая химия. - 2008 - Т.54 - №1. - С. 94-103. [Rytova Е. Yu. Circulating extracellular DNA and RNA of blood in the diagnosis of breast tumors. // Bioorg khimiia. - 2008. - Vol 54 - №1. - P. 94-103. (In Russ.)].
36. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 22DDCT Method. // Methods. - 2001. - Vol 25 - №4. - P. 402-408.