ПРОТОЧНЫЙ МИКРОДЕЗИНТЕГРАТОР

Область техники
Полезная модель относится к области создания микро-дезинтеграторов для разрушения микроорганизмов, клеток, вирусов, тканей и их комбинаций.
Уровень техники
Диспергирование позволяет получать высокодисперсные, однородные и химически чистые суспензии со средним размером частиц - микроны и доли микрона. Одним из наиболее эффективных способов является ультразвуковое диспергирование, при котором дисперсность продукта увеличивается на несколько порядков по сравнению с диспергированием без применения ультразвука.
На малой мощности ультразвука, энергия поглощается жидкостью и вызывает локальный нагрев суспензии. При повышении энергии ультразвука, силы взаимодействия ультразвука со средой становится все более нелинейными и большее воздействие происходит за счет кавитационных механизмов воздействия. Диспергирование происходит при действии ударных волн, возникающих при схлопывании кавитационных полостей, и начинается при интенсивности ультразвука, превышающей пороговое значение для каждой из применяемых частот. Чем выше частота, тем выше порог кавитации для одной и той же жидкости. С ростом интенсивности скорость диспергирования возрастает.
Ультразвуковое воздействие на жидкости и суспензии, включающие микроорганизмы, клетки, вирусы и фрагменты тканей, позволяет получить достаточное количество ядерных, цитоплазматических или других клеточных материалов для анализа и идентификации микроорганизмов, вирусов и других патогенных материалов в окружающей среде.
Эффективный и быстрый лизис особенно важен для обнаружения микроорганизмов, вызывающих особую озабоченность здравоохранения, таких как простейшие, грибы, грамположительные бактерии и споры.
Эффективность дезинтеграции микроорганизмов в растворах под действием ультразвука зависит от многих параметров и, в первую очередь, от уровня мощности ультразвука, геометрии ультразвукового поля и частоты ультразвука.
Для оптимизации работы механизма кавитации при дезинтеграции в больших объемах растворов, обычно используют частоты в диапазоне от 20 до 50 кГц и большие мощности ультразвука. Известен промышленный ультразвуковой дезинтегратор "проточного типа" УЗГ - 01.10 (http://www.ultra-filter.ru/equipment_ultra/dispergatory.php) с частотой колебания 20 кГц.
Ультразвуковые устройства, используемые в медицинской сфере с малыми объемами растворов, как правило, работают на частотах от 0,8 до 15 МГц при низких плотностях мощности. Известен ультразвуковой дезинтегратор, который встроен в ингалятор «Ингпорт» (http://www.otvet.su/tovar.php?gid=41641). Данный ингалятор работает на частоте 2.64 МГц.
Возникает ряд проблем, связанных с возможностью появления на таких частотах стоячих ультразвуковых волн в камерах для диспергирования. При этом могут наблюдаться процессы, обратные диспергированию - увеличение размеров частиц в узлах переменного давления стоячей волны.
Известна работа (Pashovkin T.N. and Sadikova D.G. Cell Exfoliation, separation, and Concentration in the Field of a Standing Ultrasonic Wave, Accoustical Physics, 2009, Vol.55, No. 4-5, pp.584-593, 2009). В работе изучено формирование стоячих волн в продольном реакторе, в котором ввод суспензии осуществляется с одной стороны реактора и вывод продуктов обработки происходит с другой стороны реактора, при этом вход и выход разделены на расстояние равное длине реактора. За счет стоячих волн образуются зоны с повышенной концентрацией диспергируемого вещества, в которых эффективность разрушения клеточного и иного материала снижена. Известна заявка на патент США № US 2009226994 LEMOR R., GUENTHER С. Method and Device for Acoustic Manipulation of Particles, Cells and Viruses, (2009-09-10), в которой, принцип формирования стоячих волн в продольном микро-реакторе использован для разделения диспергируемых фрагментов по размерам и весу для последующего исследования методами оптической спектроскопии.
Наиболее близким техническим решением является дезинтегратор рассмотренный в патенте США №7,022,505 Chandler et al. Apparatus and method for ultrasonic treatment of a liquid, (2006-04-04). В патенте продольный реактор выполнен в виде цилиндрической трубки с одной стороны которой осуществляется ввод суспензии для дезинтеграции, а с другой осуществляют выход продуктов обработки ультразвуком.
Для того чтобы повысить эффективность, вдоль реактора установлено несколько источников ультразвука, причем источники ультразвука расположены с одной стороны трубки, т.е. асимметрично по отношению к центральной оси реакционного объема. Другим вариантом изобретения является использование продольного полусферического излучателя, расположенного вдоль реактора, выполненного в виде трубки.
К недостатку изобретения можно отнести тот факт, что 98% лизис достигается либо при дополнительном использовании микрошариков, которые вводят в объем лизируемой суспензии, либо при высокой температуре от 101 до 106 градусов Цельсия.
Анализ уровня техники показал, что существует необходимость в разработке простого и надежного устройства для дезинтеграции фрагментов биологически активных микроорганизмов, спор, вирусов, грибов и других патогенных материалов для последующей их идентификации и изучения.
Технической задачей настоящей полезной модели является создание устройства способного обеспечить быстрое и эффективное лизирование биологического материала в микрореакторе объемом от 5 до 10 мкл при температуре жидкости менее 96 градусов.
Другой технической задачей является разработка конструкции кюветы дезинтегратора, обеспечивающей эффективную дезинтеграцию без дополнительных включений, например микрошариков, которые будут мешать дальнейшим этапам выявления в лизируемой смеси фрагментов микроорганизмов, клеток, спор, относящихся к патогенным микроорганизмам.
Задача, на решение которой направлено полезная модель, заключается в усовершенствовании конструкции реактора, за счет устранения геометрической протяженности реакционного объема и снижения температуры нагрева общего объема за счет концентрации мощности ультразвукового воздействия в небольшой зоне реактора в области, прилегающей к границе жидкость-воздух, в которой происходит максимально интенсивная кавитационная обработка суспензии.
Технический результат достигается тем, что в дезинтеграторе, содержащем основание с закрепленным на нем ультразвуковым преобразователем и кожухом термостата установлена сферическая кювета в верхней части которой, закреплены микрокапилляр для ввода суспензии и микрокапилляр для вывода продукта дезинтеграции, при этом раствор суспензии всегда находится в контакте с газовой средой с образованием поверхности раздела жидкость-воздух, а нижнее отверстие микрокапилляра для вывода продукта соприкасается с границей раздела жидкость-воздух.
Таким образом, сущность полезной модели заключается в том, что проточный микро-дезинтегратор для диспергирования биологических материалов, содержит основание с закрепленным на нем ультразвуковым преобразователем и сопряженным с кожухом термостата, кювету, установленную в термостате, насос, обеспечивающий прокачку эмульсии через кювету, ультразвуковой генератор. При этом дезинтегратор дополнительно содержит первый микрокапилляр для ввода суспензии в нижнюю часть кюветы и второй микрокапилляр для вывода продукта дезинтеграции, вход которого соприкасается с границей раздела эмульсия-воздух в кювете.
Следующий аспект полезной модели состоит в том, что ультразвуковой преобразователь выполнен в виде сферической или параболической поверхности и размещен по отношению входа второго микрокапилляра таким образом, что обеспечивает возможность концентрации звуковых волн в фокальной области прилегающей ко входу второго микрокапилляра.
Дополнительным аспектом полезной модели является то, что нижняя часть кюветы имеет сферическую или параболическую форму и имеет объем от 5 до 15 мкл.
Дополнительным аспектом полезной модели является то, что частота ультразвуковых колебаний лежит в пределах от 1 до 5 Мгц., предпочтительно 2,64 Мгц.
Дополнительным аспектом полезной модели является то, что скорость протока эмульсии через кювету лежит в пределах от 0,1 мкл/сек. до 50 мкл/сек.
Дополнительным аспектом полезной модели является то, что суспензия содержит биологический материал, входящий в группу, состоящую из, микроорганизмов, клеток, вирусов, тканей, ядерных, цитоплазматических клеток и их комбинаций
Перечень фигур
Сущность полезной модели и примеры применения устройства поясняется чертежами.
Фиг.1 - Блок схема устройства.
2
Фиг.2 - Изменение площади магнитных частиц на различных микрофотографиях:  - исходная суспензия, с наличием крупных агрегатов МЧ,  - суспензия, прокачанная через камеру, без ультразвука,  - суспензия, прокачанная через камеру с ультразвуковым воздействием (однородные мелкие частицы). Частота ультразвука - 2.64 МГц, интенсивность в фокальной области - 16 Вт/см.
Фиг.3 Примеры изменений размеров магнитных частиц в суспензии после ультразвукового диспергирования (С и Д). А и Б - частицы в исходной суспензии
Фиг.4 Примеры распределения магнитных частиц по размерам: А - исходная суспензия частиц, Б - суспензия частиц после обработки ультразвуком.
2
2
Фиг.5. Зависимость ультразвукового гемолиза эритроцитов человека от времени ультразвукового воздействия. Частота ультразвука - 0.88 МГц. Разведение 1:100. Где мощность воздействия составляет: Фиг.5А 0.4 Вт/см, Фиг.5Б 1,0 Вт/см
Фиг.6 Зависимость времени гемолиза эритроцитов человека от интенсивности ультразвука. Где: фиг.6А Частота - 0.88 МГц.; Разведение 1:100. Фиг.6Б Частота - 2.64 МГц. Разведение 1:100
Описание
Структурная блок-схема устройства приведена на фиг.1. Дезинтегратор состоит из основания 7 на котором установлена термостатирующая рубашка 6
Внутри термостатируемого объема размещена кювета 1 снабженная первым микрокапилляром 3 для ввода суспензии 2 и вторым микрокапилляром 4 для вывода продукта дезинтеграции через выход 18. Микрокапилляры 3, 4 закреплены в верхней части 5 кюветы 1 и опущены внутрь кюветы 1 таким образом, что первый микрокапилляр 3, для ввода суспензии, опущен к основанию кюветы 1, а вход второго микрокапилляра 4, для вывода продукта дезинтеграции, контактирует с границей суспензии и воздуха. На основании 7 размещен ультразвуковой преобразователь 8, который имеет форму параболической или сферической поверхности и генерирует звуковые сигналы, максимальная интенсивность которых находится в фокальной области 19. Расстояние между кюветой 1 и поверхностью преобразователя 8 выбирается таким образом, чтобы положение фокальной области 19 ультразвукового излучения параболического преобразователя совпадало с границей перехода жидкость-газ и располагалось в непосредственной близости от входа второго микрокапилляра 4.
Дезинтегратор работает следующим образом. Исследуемый материал суспензии 2 загружают в емкость 17, выход которой связан с входом насоса 16. Насос перекачивает суспензию в объем кюветы 1 через первый микрокапилляр 3. Включается ультразвуковой генератор 13, выход 12 которого подключается к верхней рабочей обкладке 9, а выход 11 подключается к нижней рабочей обкладке 10 ультразвукового преобразователя 8. Механическая энергия, с ультразвуковой частотой распространяющаяся в жидкой среде, вызывает в последней кавитационный процесс, сопровождающийся образованием и "захлопыванием" кавитационных пузырьков вместе с интенсивным перемешиванием, что обеспечивает эффективную дезинтеграцию среды, включающей биологически активные компоненты. За счет применения параболической формы излучателя ультразвук создает максимальное воздействие на зону прилегающую ко входу микрокапилляра 4 осуществляя максимальную кавитационную обработку жидкой фазы и эффективную дезинтеграцию частиц, размещенных в суспензии 2.
В рамках данной полезной модели на фиг.1 рассматривается вариант кюветы 1 выполненной в форме сферической колбы с объемом от 5 до 10 мкл. Данный вариант включает, но не ограничивает других форм кювет. Нижняя часть кювет может иметь сферическую или параболическую формы, а верхняя часть кюветы может быть выполнена в виде сферической, параболической, кубической, трапециидальной или пирамидальной формы.
Частота ультразвуковых колебаний может лежать в пределах от 1 до 5 Мгц. Для объема кюветы 5 мкл более предпочтительно использовать частоту 2,64 Мгц.
2
2
В целом, интенсивность ультразвука в фокальной области, необходимая для достижения эффективной кавитации возрастает с частотой для дезинтеграции микроорганизмов, спор, вирусов и других биологических материалов. Для кюветы объемом в 5 мкл. предпочтительная интенсивность ультразвука лежит в пределах от 10 Вт/см до 50 Вт/см.
Кювета может быть изготовлена из химически инертного материала включая, но не ограничивая: металл, стекло и пластик. Более предпочтительно использовать стеклянные кюветы, как обладающие технологичностью их производства и хорошими эксплуатационными свойствами.
Скорость протока эмульсии через кювету выбирается из условий проведения эксперимента и лежит в пределах от 0,1 мкл/сек. до 50 мкл/ сек. Скорость зависит от объема кюветы и требований условий дезинтеграции. Для объема кюветы в 5 мкл предпочтительная скорость прокачки эмульсии составляет 1 мкл/сек. Таким образом, объем кюветы сменится полностью за 5 сек. В некоторых случаях эксперимента устройство может обеспечить импульсную подачу эмульсии. Периодические потоки могут быть реализованы в тех случаях, когда непрерывное течение эмульсии нежелательно.
Жидкость, используемая для формирования суспензии может быть однофазной жидкостью или может включать в свой состав кроме воды и другие типы растворителей.
Биологический материал, используемый для дезинтеграции входит в группу, состоящую из микроорганизмов, клеток, вирусов, тканей, ядерных, цитоплазматических клеток и их комбинаций
Примеры
Следующие эксперименты, иллюстрирующие возможности дезинтегратора, приведены ниже. Данные примеры включают, но не ограничивают области использования дезинтегратора.
Пример. 1 Результаты эффективности диспергирования
Результаты диспергирования оценивали посредством анализа изображений суспензии магнитных частиц до и после прохождения суспензии через ультразвуковой микродиспергатор.
Изображения получали с помощью микроскопа Люмам-И3 с длиннофокусным объективом (х40) и видеокамерой, подключенной к компьютеру. После введения изображений в компьютер была проведена их обработка с использованием программы ImageJ. На фиг.2 показаны значения суммарной площади поверхности, занятой частицами. Видно, что после ультразвукового диспергирования последняя значительно увеличилась, что свидетельствует о переходе частиц из конгломератов в более мелкие агрегаты и отдельные микросферы. На серии снимков, представленных на фиг.3 качественно хорошо виден эффект обработки: исчезают большие агрегаты и проявляются многочисленные отдельные частицы
Увеличение площади частиц после ультразвукового диспергирования связано с тем, что на исходных изображениях часть частиц большого конгломерата не видна из-за того, что они находится друг над другом. Кроме того, видно, что потери частиц при проведении диспергирования не происходит. Таким образом, ультразвуковое диспергирование позволяет быстро и эффективно разбивать в микрообъеме твердые частицы, не подвергая последние избыточному перегреву. Данные представленные на фиг.4 показывают изменение гистограммы распределения слипшихся магнитных частиц до и после обработки ультразвуком в проточном режиме через сферическую кювету в фокальной области ультразвукового поля. Как видно из гистограмм, обработка ультразвуком приводит к исчезновению частиц больших размеров и к существенному сдвигу среднего размера агрегатов в сторону меньших значений.
Пример.2 Ультразвуковой гемолиз эритроцитов.
2
2
2
При попадании вирусных частиц в клетки необходимо их разрушить для попадания вирусных частиц в анализируемую среду. Одним из методов разрушения клеток является ультразвуковая дезинтеграция клеток. В данном примере ультразвук использован для гемолиза эритроцитов человека. Эритроциты донорской крови переводились в физиологический раствор с добавлением гепарина в разбавлении 1:100. Воздействие ультразвуком проводили на частотах 0.88 МГц и 2.64 МГц в диапазоне интенсивностей 0.05-1.0 Вт/см. На Фиг.5 представлена зависимости ультразвукового гемолиза эритроцитов человека от времени ультразвукового воздействия для разных значений мощности, где фиг 5А мощность 0,4 Вт/см фиг.5Б мощность 1,0 Вт/см. Частота ультразвука - 0.88 МГц. Разведение 1:100.
Регистрацию изменения оптической плотности проводили по коэффициенту пропускания. Это связано с тем, что исходно суспензия эритроцитов рассеивает значительное количество проходящего через суспензию света. При разрушении эритроцитов рассеивающая способность уменьшается, вплоть до исчезновения при полном разрушении эритроцитов. Скорость гемолиза при этом характеризует механическую прочность мембран эритроцитов. Это же характерно и для любых типов клеток.
2
2
2
2
SATA
На Фиг.6 приведены динамики изменения коэффициента пропускания при гемолизе эритроцитов под действием ультразвука различной интенсивности. Видно, что время полного гемолиза при интенсивности 0.4 Вт/см равное 30 сек существенно уменьшается (до 7 сек) при воздействии ультразвука с интенсивностью 1 Вт/см. Динамика этого изменения приведена на фиг.6А., где приведена зависимость времени гемолиза эритроцитов человека от интенсивности ультразвука. Частота - 0.88 МГц. Повышение частоты приводит при интенсивности 1 Вт/см к увеличению времени полного гемолиза эритроцитов с 7 до 12-15 сек. Динамика этого изменения приведена на фиг.6Б, где представлена зависимость ультразвукового гемолиза эритроцитов человека от времени ультразвукового воздействия при частоте ультразвука - 2.64 МГц, интенсивности (I=1.0 Вт/см. и при разведении 1:100.
Промышленная воспроизводимость
Приведенные данные говорят о возможности полного гемолиза в протоке через камеру диспергирования при условии существенного повышения интенсивности ультразвука. Показано, что диспергатор, описанный в полезной модели, позволяет более, чем на порядок уменьшить исходные размеры частиц в диспергируемых суспензиях и получать суспензии, приближающиеся к монодисперсным, без потери исходного количества частиц.