Витальный краситель для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента глаза
VITAL DYE TO CONTRAST INTRAOCULAR STRUCTURES OF THE POSTERIOR SEGMENT OF THE EYE

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмохирургии, и касается нового состава витального красителя для контрастирования заднего сегмента глаза, содержащего в своем компонентном составе трипановый синий (ТВ) и бриллиантовый синий (BBG). Новый витальный краситель по изобретению обладает высокой биологической безопасностью, высокой интраоперационной контрастирующей эффективностью и равномерно распределяется на поверхности сетчатки. Данный краситель прошел регистрационные испытания и разрешен к широкому медицинскому применению на территории РФ (регистрационное удостоверение РУ № РЗН 2016/5246 от 13.01.2017 г., полное наименование медицинского изделия: Раствор окрашивающий для офтальмологической хирургии по ТУ 9393-019-29792921-2015).
Данное изобретение касается красящего состава для окрашивания внутриглазных мембран, а именно, красящего состава, используемого в качестве помощника для окрашивания внутриглазных мембран для безопасного и более полного их удаления без повреждения окружающих тканей.
2
Окрашивание внутриглазных мембран, таких как внутренняя пограничная мембрана (ВПМ), эпиретинальная мембрана (ЭРМ) - один из важных этапов при витреоретинальных вмешательствах при такой патологии глаз, как макулярное отверстие и эпиретиретинальный (эпимакулярный) фиброз. Соответствующая визуализация и идентификация прозрачных внутриглазных структур является одной из основных составляющих успешной витреоретинальной хирургии. На сегодняшний день широко признано, что без хирургического вспомогательного окрашивающего вещества чрезвычайно трудно удалить внутриглазные мембраны из-за их плохой видимости и техника предварительного окрашивания (хромовитрэктомия) общепризнана во всем мире. Способность красителей улучшать визуализацию внутриглазных структур облегчает и повышает безопасность хирургического вмешательства с минимизацией травмирования нейроэпителия сетчатки глаза. Внедрение в витреоретинальную хирургию красителей обеспечивает более точную идентификацию истинных границ патологических мембран и безопасное удаление оптически полупрозрачных тканей с улучшением качества зрения после оперативных вмешательств (Стебнев B.C., Малое В.М. Микроинвазивная хромовитрэктомия 25+Gauge в лечения пациентов с идиопатическими макулярными отверстиями // Саратовский научно-медицинский журнал. 2013. Т. 9, №1. С. 98 100. Стебнев С.Д., Стебнев В.С., Малов В.М Хромовитрэктомия симптоматической витреомакулярной адгезии, осложненной первичным полным макулярным отверстием на ранних стадиях его формирования // Вестник Оренбургского государственного университета 2015 №12 (187). С. 227-230. Haritoglou С. Chromosurgery // The 9th EURETINA Congress. France, Nice, 2009. P. 5-7. Haritoglou C., Schuttauf F., Gandorfer A., Thaler S. An experimental approach towards novel dyes for intraocular surgery // Dev. Ophthalmol. 2008. Vol. 42. P. 141-152. Meyer C. Vital dyes in vitreoretinal surgery - chromovitrectomy // Developments in Ophthalmology. Karger. - 2008. Mieler W. The use corticosteroids and vital dyes in vitreoretinal surgery // The 9th EURETINA Congress. France, Nice, 2009. P. 2-6.). Термин «Хромовитрэктомия» подразумевает использование красителей во время операции для лучшей визуализации таких внутриглазных структур, как задний гиалоид, внутренняя пограничная и эпиретинальные мембраны (Стебнев С.Д., Стебнев B.C., Малов В.М. Хромовитрэктомия симптоматической витреомакулярной адгезии, осложненной первичным полным макулярным отверстием на ранних стадиях его формирования // Вестник Оренбургского государственного университета 2015 №12 (187). С. 227-230.  F., Alpizar-Alvarez N., Wu L. Chromovitrectomy: an Update // J Ophthalmic Vis Res 2014; 9 (2): 251-259. Meyer C. Vital dyes in vitreoretinal surgery - chromovitrectomy // Developments in Ophthalmology. Karger. - 2008.). Взаимодействие между молекулярной структурой красителя и биологической мембраной определяет красящую способность. Основу, или ядро, молекулы красителя, как правило, образует кольчатая структура, к которой присоединены носители цвета - хромофоры. Для усиления цвета, углубления его оттенка и для достижения большей прочности окрашивания к ядру с хромофором должны быть присоединены дополнительные группы - ауксохромы. К ним относятся, прежде всего, гидроксильная группа ОН и аминогруппа NH, которые, не только влияют на окраску, но и вследствие своего кислого или основного характера повышают сродство красителя к окрашиваемому материалу. Витальные красители содержат множество химических структур, включая хромофоры, которые ответственны за окрашивание (Burk S.Е., DaMata А.P., Snyder М.Е., Rosa R.Н. Jr., and Foster R.E. Indocyanine green-assisted peeling of the retinal internal limiting membrane // Ophthalmology, vol. 107, no. 11, pp. 2010-2014, 2000. Engelbrecht N.E., Freeman J., Sternberg Jr P., et al. Retinal pigment epithelial changes after macular hole surgery with indocyanine green-assisted internal limiting membrane peeling // American Journal of Ophthalmology, vol. 133, no. 1, pp. 89-94, 2002. Haritoglou C, Gandorfer A., Gass C.A., Schaumberger M., Ulbig M.W., Kampik A. Indocyanine green-assisted peeling of the internal limiting membrane in macular hole surgery affects visual outcome: a clinicopathologic correlation // Am J Ophthalmol. 2002; 134(6):836-841. Jacobs D.S., Сох Т.А., Wagoner M.D., et al. Capsule staining as an adjunct to cataract surgery: a report from the American Academy of Ophthalmology // Ophthalmology. 2006; 113(4):707-713. Kwok A.K., Li W.W., Pang C.P., et al. Indocyanine green staining and removal of internal limiting membrane in macular hole surgery: histology and outcome // Am J Ophthalmol. 2001; 132(2):178-183. Mester V., Kuhn F. Internal limiting membrane removal in the management of full-thickness macular holes // Am J Ophthalmol. 2000; 129(6): 769-777. Rodrigues E.B., Maia M., Meyer C.H., Penha F.M., Dib E., Farah M.E. Vital dyes for chromovitrectomy // Curr Opin Ophthalmol. 2007; 18(3): 179-187. Rodrigues E.B., Meyer C.H., Farah M.E., et al. Intravitreal staining of the internal limiting membrane using indocyanine green in the treatment of macular holes // Ophthalmologica. 2005; 219(5): 251-262). Хотя хромофоры чрезвычайно важны в органической химии, их идентификация в витальных красителях для хромовитрэктомии не была хорошо изучена. Эта область исследования важна, потому что это может помочь отделить хромофор от других частей молекулы и привести к созданию более безопасных красителей (Maia Mauricio M.D., PHD; Farah Michel Eid, MD, PHD; Rodrigues Eduardo В., MD; Maia , MD;  Octaviano JR., MD; Lima , PHD. Vital Dyes for Staining Intraocular Membranes and Tissues During Vitrectomy // Retina Today I JULY/AUGUST 2010. C. 28-31).
Для улучшения визуализации для хирурга в ходе витреретинальных операций применяют известные окрашивающие растворы, содержащие, в основном, в своем компонентном составе трипановый синий (Trypan blue, ТВ) и/или бриллиантовый голубой (Brilliant Blue G, BBG).
34
24
6
4
14
4
Трипановый синий (Trypan blue, ТВ, Direct Blue 14, Diamine Blue 3B, Niagara Blue 3B) - анионный гидрофильный азокраситель с формулой CHNNaOS и молекулярным весом 960 дальтон. Используется для селективного окрашивания мертвых клеток и тканей. Впервые был синтезирован Паулем Эрлихом в 1904 году и получил свое название благодаря способности убивать трипаносомы. Разведенные водные растворы трипанового синего (Trypan blue) (1:2000 - 1:10000) обладают сравнительно низкой токсичностью. Способность трипанового синего накапливаться в цитоплазме живых клеток в виде гранул и диффузно окрашивать некробиотические элементы дает возможность судить о количестве клеток, сохранивших жизнеспособность.
ТВ широко используется на протяжении нескольких десятилетий в хирургии переднего сегмента для окрашивания роговичных эндотелиальных клеток (Norn М.S. Vital staining of corneal endothelium in cataract extraction // Acta Ophthalmologica, vol. 49, no. 5, pp. 725-733, 1971.) и передней капсулы хрусталика и на сегодняшний день является наиболее популярным в мире витальным красителем передней капсулы хрусталика. (Melles G. R. J., de Waard P. W. Т., Pameyer J.H., and Beekhuis W.H. Trypan blue capsule staining to visualize the capsulorhexis in cataract surgery // Journal of Cataract and Refractive Surgery, vol. 25, no. 1, pp. 7-9, 1999).
Ophthalmic Technology Assessment Committee Anterior Segment Panel of the American Academy of Ophthalmology опубликовало в 2006 г. анализ литературы капсулярного окрашивания в катарактальной хирургии. Они сообщили о доказательствах уровня III (описание серии случаев и отчеты), что ТВ прост в использовании и прекрасно визуализирует переднюю капсулу хрусталика; кроме того, они нашли существенные данные по безопасности использования ТВ в передней камере глаза (Jermak С.М., Dellacroce J.T., Heffez J., Peyman G.A. Triamcinolone acetonide in ocular therapeutics // Surv Ophthalmol. 2007; 52(5): 503-22).
ТВ имеет следующую форму:
Brilliant Blue G (BBG), также известный как кислотный синий 90 или Кумасси BBG, используется в витреретинальной хирургии для окрашивания ВПМ (Enaida Н., Hisatomi Т., Hata Y. et al. BrilliantblueGselectively stains the internal limiting membrane/brilliant blue G-assisted membrane peeling // Retina, vol. 26, no. 6, pp. 631-636, 2006.  J.,  I., Acksteiner A. et al. Morphological and functional outcome after brilliant blue G-assisted macular hole surgery // Ophthalmologica, vol. 230, no. 2, pp. 81-86, 2013. Pelayes D.E., Kuhn F., Folgar A.M. et al. Staining of the internal limiting membrane with the use of heavy brilliant blue G // Ophthalmic Research, vol. 48, supplement 1, pp. 21-25, 2012. Repetto R., Siggers J.H., and Stocchino A. Mathematical model of flow in the vitreous humor induced by saccadic eye rotations: effect of geometry // Biomechanics and Modeling in Mechanobiology, vol. 9, no. 1, pp. 65-76, 2010. Shimada H., Nakashizuka H., Hattori Т., Mori R., Mizutani Y., and Yuzawa M. Double staining with brilliant blue G and double peeling for epiretinal membranes // Ophthalmology, vol. 116, no. 7, pp. 1370-1376, 2009. Cervera E., Dnaz-Llopis M., Salom D., Udaondo P., and Amselem L. Internal limiting membrane staining using intravitreal brilliant blue G: good help for vitreo-retinal surgeon in training // Archivos de la Sociedad Espanola de Oftalmologia, vol. 82, no. 2, pp. 71-72,2007.).
BBG плохо окрашивает ЭРМ, но в сочетании с ТВ успешно BBG используется для окрашивания и ЭРМ, и ВПМ одновременно, что дает возможность не проводить обмен - жидкость - газ (Mohr A., Bruinsma М., Oellerich S., Frank Н., Gabel D., and Melles G. R. J. Dyes for eyes: hydrodynamics, biocompatibility and efficacy of 'Heavy' (dual) dyes for chromovitrectomy // Ophthalmologica, vol. 230, no. 2, pp. 51-58, 2013. Velez G., Weingarden A.R., Tucker B.A., Lei H., Kazlauskas A., and Young M.J. Retinal pigment epitheliumand  progenitor cell interaction increase  progenitor cell expression of PDGFR and ability to induce proliferative vitreoretinopathy in a rabbit model // Stem Cells International, vol. 2012, Article ID106486, 6 pages, 2012).
BBG имеет следующую формулу:
В настоящее время используются следующие витальные красители, содержащие ТВ и/или BBG:
- MembraneBlue-Dual, DORC, Нидерланды, имеющий состав: 0,125 мг -Бриллиантовый синий G, 0,75 мг - Трипановый синий, ПЭГ - 4% ПЭГ 3350. рН - 7,3-7,6, осмоляльность: 338 мОсм/кг;
- ILM-Blue, DORC, Нидерланды, имеющий состав: 0,125 мг - Бриллиантовый синий G, ПЭГ - 4%. рН - 7,3-7,6, осмоляльность - 338 мОсм/кг;
- RHEX-ID, Appasamy Ocular Devices (Р) LTD. (PHARMA DIVISION), Индия, имеющий состав: трипановый синий - 0,8 мг, хлорид натрия BP - 8,2 мг и водный буферный носитель (данный состав выбран в качестве прототипа);
- Офтальмологический раствор трипанового синего 0,05% "Оптимед", Россия, с показателями рН 7,2±0,3 и осмотическое давление - 260-320 мОсм/кг.
- Vision Blue, DORC, Нидерланды, в шприце по 0,5 мл 0,06% р-р трипанового синего, не требует разведения;
- BlueRhexis, Contacare Ophthalmics and Diagnostics, Индия, препарат трипанового синего в изотонической буферной среде, в 1 мл 0,06% раствора трипанового синего в шприце или флаконе;
В витреоретинальной хирургии наиболее востребованы комбинированные красители, которые, благодаря содержащимся в их составе двум красителям, например, сочетание ТВ и BBG (MembraneBlue-Dual, производитель DORC, Нидерланды) или BBG и Bromphenol Blue (Brilliant Peel, производитель Fluoron, Германия) позволяют одновременно окрашивать и ЭРМ, и ВПМ (Enaida Н., Hisatomi Т., Hata Y. et al. BrilliantblueGselectivery stains the internal limiting membrane/brilliant blue G-assisted membrane peeling // Retina, vol. 26, no. 6, pp. 631-636, 2006. Rodrigues E.B., Maia M., Meyer C.H., Penha F.M., Dib E., Farah ME. Vital dyes for chromovitrectomy // Curr Opin Ophthalmol. 2007; 18(3): 179-187. Стебнев С.Д., Складчикова Н.И. Об эффективности использования комбинированного эндовитреального красителя «Brilliant Peel Dual Dye» в процессе выполнения хромовитрэктомии 27G. Современные технологии в офтальмологии №1 2016. С. 212).
Одним из важных критериев при использовании медицинских изделий в хирургии витреоретинальной патологии является биологическая инертность без усугубления оксидативного стресса и различных токсических реакций.
Исследования безопасности ТВ и BBG при витреохирургии выявили дозозависимый in vitro и in vivo токсический эффект на сетчатку ( С.,  М., Dietlein Т.S. et al. Retinal tolerance to dyes // British Journal of Ophthalmology, vol. 89, no. 9, pp. 1188-1191, 2005. Narayanan, R. Trypan blue: effect on retinal pigment epithelial and neurosensory retinal cells / R. Narayanan, M.C. Kenney, S. Kamjoo [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2005. - №46. - P. 304-309. Narayanan R., Kenney M.C, Kamjoo S., Trinh Т.Н., Seigel G.M., Resende G.P., Kuppermann B.D. Trypan blue: effect on retinal pigment epithelial and neurosensory retinal cells // Invest Ophthalmol Vis Sci 2005; 46: 304-309.), хотя в низких концентрациях красители были нетоксичны и показали хороший профиль безопасности, который обеспечивает значительный анатомический и функциональный послеоперационный результат (Remy М., Thaler S., Schumann R.G. et al. An in vivo evaluation of Brilliant Blue G in animals and humans // British Journal of Ophthalmology, vol. 92, no. 8, pp. 1142-1147, 2008. Mennel, S. Influence of vital dyes on the function of the outer blood-retinal barrier in vitro / S. Mennel, G. Thumann, S. Peter [et al.] // Klin. Monatsbl. Augenheilkd. - 2006. - №223. - P. 568-576). В результатах большинства клинических исследований данных о дефектах пигментного эпителия сетчатки или других симптомах ретинальной токсичности не приводится, однако в ряде исследований показано, что трипановый синий способен оказывать слабое токсическое действие на сетчатку (Teba, F.A. Trypan blue staining in vitreoretinal surgery / F.A. Teba, A. Mohr, C. Eckardt [et al] // Ophthalmology. - 2003. - №110. - P. 2409-2412; Yamakoshi, T. Triamcinolone-assisted removal of internal limiting membrane enhances the effect of vitrectomy for diabetic macular edema / T. Yamakoshi, S. Kachi, J. Sugita [et al] // Ophthalmic Res. - 2009. - Vol. 41, №4. - P. 203-209). В 2015 г. был опубликован отчет о побочном действии BBG 0.05%, который использовался во время PPV с ЭРМ и ВПМ пилингом у пациента с ЭРМ. После инъекции BBG краситель случайно проник в субретинальное пространство в макуле, по-видимому, через ретинальный разрыв, что не было обнаружено во время операции. Послеоперационный осложнения включали кистоидный макулярный отек (на ОСТ ангиографии) и сокращение амплитуды и увеличение времени на ЭРГ. Авторами не было однозначно доказано, что эти функциональные и анатомические изменения были непосредственно вызваны макулярной субретинальной миграцией красителя, но потребность в дальнейших исследованиях, чтобы очертить неблагоприятное воздействие BBG на ретинальную ткань, существуют (Almeida F.P. P., De Lucca А.С., Scott I.U., Jorge R., and Messias A. Accidental subretinal brilliant blue G migration during internal limiting membrane peeling surgery // JAMA Ophthalmology, vol. 133, no. 1, pp. 85-88, 2015). Экспериментальные исследования показали, что ТВ вызывает нейротоксические эффекты на клетки ретинального нервного узла с дозо - и временем контакта зависимостью. Hirasawa и др. провели исследования, может ли ТВ быть захвачен RPE клетками, и нашел, что краситель не был захвачен клетками RPE в их экспериментальном исследовании. (Haritoglou С, Gandorfer A., Schaumberger М. et al. Trypan blue in macular pucker surgery: an evaluation of histology and functional outcome // Retina, vol. 24, no. 4, pp. 582-590, 2004. Jin Y., Uchida S., Yanagi Y., Aihara M., and Araie M. Neurotoxic effects of trypan blue on rat retinal ganglion cells // Experimental Eye Research, vol. 81, no. 4, pp. 395-400, 2005). Это связано с тем, что ТВ мембранонепроницаем и не проникает в клетки. Поэтому, возможно, его можно удалить практически полностью после хромовитрэктомии и это может быть ключевым моментом, чтобы минимизировать его побочные действия (Hirasawa Н, Yanagi Y., Tamaki Y., Inoue Y., Kadonosono K. Indocyanine green and trypan blue: intracellular uptake and extracellular binding by human retinal pigment epithelial cells // Retina 2007; 27: 375-378).
В связи с этим ставится задача гарантированного исключения негативного воздействия ТВ и BBG на ткани глаза.
Настоящее изобретение направлено на достижение технического результата, заключающегося в повышении безопасности витального раствора, обладающего про- и антиоксидантной активностью, за счет усиления биологической инертности для нейтрализации возможных побочных эффектов.
Указанный технический результат достигается тем, что витальный краситель для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента глаза, содержащий в растворе красители ТВ, BBG, хлористый натрий и воду, отличающийся тем, что дополнительно включает в себя динатрий фосфат, дигидрофосфат натрия, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и гиалуронат натрия, а в качестве воды использована дистиллированная вода, при этом все компоненты раствора находятся в следующем соотношении, на 1 мл раствора:
Краситель ТВ - 1,3 мг;
Краситель BBG - 0,2 мг;
Динатрий фосфат - 3,1 мг;
Дигидрофосфат натрия - 0,3 мг;
Натрий хлористый - 7,6 мг;
Полиэтиленгликоль (ПЭГ) - 20 мг;
Гиалуронат натрия - 3 мг;
Дистиллированная вода - до 1 мл.
Указанные признаки являются существенными и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.
Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами исследований, которые наглядно демонстрируют возможность достижения требуемого технического результата.
На фиг. 1 - представлена графическая запись хемилюминесценции (ХЛ) раствора окрашивающего для офтальмологической хирургии согласно изобретения: 1-контроль (буферный раствор и инициатор ХЛ 1 мл сернокислое железо); 2,3,4,5, - к модельной системе добавляли краситель в зависимости от терапевтической дозы исследуемого препарата - 2 - 0,005 мл, 3 - 0,01 мл, 4 - 0,05 мл, 5 - 0,1 мл;
фиг. 2 - представлена графическая запись ХЛ в модельной системе, генерирующей АФК, после добавления раствора окрашивающего для офтальмологической хирургии по изобретению: 6 - контроль, 7 - 0,005 мл; 8 - 0,01 мл, 9 - 0,05 мл, 10 - 0,1 мл;
фиг. 3 - сравнительная характеристика витального красителя согласно изобретения: 11 - контроль, 12 - 0,05 мл витального красителя, 13 - 0,01 мл витального красителя, и витального красителя зарубежного производства: 14 - 0,05 мл Membrane Blue, 15 - 0,1 мл Membrane Blue.
фиг. 4 - препарат после окрашивания разработанным красителем;
фиг. 5 - препарат после окрашивания зарубежным аналогом;
фиг. 6 - фотоснимки, демонстрирующие поведение образца контрольного красителя из таблицы 5 при введении в емкость с раствором;
фиг. 7 - фотоснимки, демонстрирующие поведение аналога MembraneBlue Dual при введении в емкость с раствором;
фиг. 8 - фотоснимки, демонстрирующие поведение образца разработанного красителя при введении в емкость с раствором;
фиг. 9 - сетчатка глаза кролика в норме, окраска по Ван-Гизону (увел. ×400), где: 16 - слой нервных волокон; 17 - слой ганглиозных клеток; 18 - внутренний плексиформный слой; 19 - внутренний ядерный слой; 20 - наружный плексиформный слой; 21 - наружный ядерный слой; 22 - слой фоторецепторов;
фиг. 10 - пигментный эпителий и хориоидея в норме. Окраска гематоксилином и эозином (увел. ×630, где стрелкой (↓)показан пигментный эпителий сетчатки, а цифрой 23 - хориоидея;
фиг. 11 - структура сетчатки глаза на 5 день после введения разработанного красителя, окраска гематоксилином и эозином (увел. ×630), где: 24 - мюллеровские глиоциты; 25 - внутренний сетчатый слой; 26 - внутренний ядерный слой; 27 -наружный ядерный слой; 28 - слой фоторецепторов (палочек и колбочек); стрелкой (↓) показан отек ганглиозного слоя;

фиг. 12 - структура сетчатки на 5 день после введения красителя MembraneBlue Dual, окраска гематоксилином и эозином (увел. ×400), где. 29 - мюллеровские глиоциты; 30 - внутренний сетчатый слой; 31 - внутренний ядерный слой; 32 -наружный ядерный слой; 33 - слой фоторецепторов (палочек и колбочек); стрелкой (↓) показаны макрофаги;
фиг. 13 - структура сетчатки глаза кролика через 14 дней после введения разработанного красителя, окраска гематоксилином и эозином (увел. ×200), где: 34 -внутренний сетчатый слой (должен стоять чуть ниже, стоит на уровне мюллеровских глиоцитов); 35 - внутренний ядерный слой; 36 - наружный ядерный слой; 37 - слой фоторецепторов (палочек и колбочек);

фиг. 14 - структура сетчатки глаза кролика через 14 дней после введения красителя MembraneBlue Dual, окраска гематоксилином и эозином (увел. ×400), где: 38 - ганглиозные нейроны; 39 - внутренний сетчатый слой; 40 - внутренний ядерный слой; 41 - наружный ядерный слой; 42 - слой фоторецепторов (палочек и колбочек); стрелкой (↓) показан отек;
фиг. 15 - структура сетчатки глаза кролика через 30 дней после введения разработанного красителя, окраска гематоксилином и эозином (увел. ×630), где: 43 - ганглиозный слой; 44 - внутренний сетчатый слой; 45 - внутренний ядерный слой; 46 -наружный ядерный слой; 47 - слой фоторецепторов;

фиг. 16 - структура сетчатки глаза кролика через 30 дней после введения красителя MembraneBlue Dual, окраска по Маллори (увел. ×200), где: 48 - ганглиозный слой; 49 - внутренний сетчатый слой; 50 - внутренний ядерный слой; 51 - наружный ядерный слой; 52 - слой фоторецепторов (палочек и колбочек).

фиг. 17 - ультраструктура сетчатки кролика через 5 дней после витрэктомии с использованием комбинированного красителя MembraneBlue Dual, электронная микрофотография (увел, ×6000), где: 53 - отростки Мюллеровых глиоцитов; 54 - ганглиозный нейрон; стрелкой (↑) показана опустошенная часть цитоплазмы;
фиг. 18 - ультраструктура сетчатки кролика через 5 дней после витрэктомии с использованием разработанного красителя, электронная микрофотография (увел, ×6000), где: 55 - ядро ганглиозного нейрона; 56 - вакуолизация митохондрий в цитоплазме; стрелка (↑) - показывает расширение каналов гранулярного эндо плазматического ретикулума;

фиг. 19 - ультраструктура сетчатки кролика через 5 дней после витрэктомии с использованием комбинированного красителя MembraneBlue Dual, электронная микрофотография (увел. ×3000), где стрелкой (↑) показана вакуолизация цитоплазмы нейронов внутреннего ядерного слоя;.
фиг. 20 - ультраструктура сетчатки кролика через 5 дней после витрэктомии с использованием разработанного красителя, электронная микрофотография (увел. ×5000), где стрелкой (↑) показана вакуолизация цитоплазмы нейронов внутреннего ядерного слоя;

фиг. 21 - ультраструктура сетчатки кролика через 14 дней после витрэктомии с использованием комбинированного красителя MembraneBlue Dual, электронная микрофотография (увел. ×3000), где. 57 - отростки Мюллеровых глиоцитов; 58 - ганглиозный нейрон; 59 - опустошенная часть цитоплазмы; стрелкой (↑) показаны вакуоли;
фиг. 22 - ультраструктура сетчатки кролика через 14 дней после витрэктомии с использованием разработанного красителя, электронная микрофотография (увел, ×6000), где: 60 - ядро ганглиозного нейрона; 61 - вакуолизация митохондрий в цитоплазме; расширение отдельных каналов гранулярного 62 - тельца Ниссля; стрелкой (↑) показано расширение отдельных каналов гранулированного эндоплазматического ретикулума;

фиг. 23 - ультраструктура сетчатки кролика через 30 дней после витрэктомии с использованием комбинированного красителя MembraneBlue Dual, электронная микрофотография (увел. ×4000), где: 63 - нейроны внутреннего ядерного слоя; стрелкой (↑) показаны вакуоли в цитоплазме нейрона;
фиг. 24 - ультраструктура сетчатки кролика через 30 дней после витрэктомии с использованием разработанного красителя, электронная микрофотография (увел, ×6000), где: 64 - ядрышко в ядре ганглиозного нейрона; 65 - тельца Ниссля; стрелкой (↑) показан пластинчатый комплекс Гольджи.
Согласно настоящего изобретения рассматривается новый компонентный состав раствора витального красителя для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента, обладающего высокой инертностью и безопасностью при сохранении про- и антиоксидантной активности.
Основанием для создания нового компонентного состава раствора витального красителя является то, что, несмотря на рекламируемую производителями известных витальных красителей на основе ТВ и BBG полную безопасность, на практике выявлялись случаи появления побочных эффектов (Шкворченко Д.О., Кислицына Н.М., Колесник С.В., Колесник А.И., Какунина С.А., Норман К.С., Крупина Е.А. Контрастирующие вещества для хромовитрэктомии. "Офтальмохирургия" №2, 2016 г. Uri Soiberman, Daniel Shai, Anat Loewenstein, and Adiel Barak. Macular Hole Surgery with Internal Limiting Membrane Peeling Facilitated by Membrane-Blue,, versus Membrane-Blue-Dual,,: A Retrospective Comparative Study. Journal of Ophthalmology. Volume 2016. С. 1-6. Anna P. Salvetti, Maria I. , Alun R. Barnard, Harry O. Orlans, Doron G. Hickey, Robert E. MacLaren. Impact of Vital Dyes on Cell Viability and Transduction Efficiency of AAV Vectors Used in Retinal Gene Therapy Surgery: An In Vitro and In Vivo Analysis. Trans Vis Sci Tech. 2017;6(4):4. С 1-12. Veckeneer M, Mohr A, Alharthi E, Azad R, Bashshur ZF, Bertelli E, Bejjani RA, Bouassida B, Bourla D, Crespo IC, Fahed C, Fayyad F, Mura M, Nawrocki J, Rivett K, Scharioth GB, Shkvorchenko DO, Szurman P, Van Wijck FLWong IY, Wong DS, Frank J, Oellerich S, Bruinsma M, Melles GR. Novel 'heavy' dyes for retinal membrane staining during macular surgery: multicenter clinical assessment. Acta Ophthalmol. 2014 Jun; 92(4): 339-44. Kovacevic D, Mance TC, Markusic V. "Brilliant Blue G" and "Membrane Blue Dual" assisted vitrectomy for macular hole. Coll. Antropol. 35 (2011) Suppl. 2: 191-193).
Несмотря на широкое внедрение в клиническую практику различных агентов для контрастирования, подбор оптимального контрастирующего вещества до сих пор остается актуальной проблемой ввиду специфических требований, предъявляемых к нему хирургами: высокая дисперсность, избирательная аффинность к тканям, легкость введения и удаления, возможность удаления через естественные пути оттока, отсутствие побочных эффектов.
В Российской Федерации для интравитреального введения разрешен только 0,15% комбинированный раствор ТВ и BBG, причем зарубежного производства. Поэтому разработка и внедрение эффективных и безопасных витальных красителей продолжает оставаться важной составляющей успеха отечественной офтальмохирургии (Мухамадеев Т.Р., диссертация «Научное обоснование, разработка, комплексная оценка клинической эффективности и безопасности «офтальмохирургической платформы» для катарактальных и витреоретинальных вмешательств», 2016).
Учитывая отечественный и зарубежный опыт, а так же собственные результаты в результате исследований был создан новый витальный краситель для контрастирования внутриглазных структур именно заднего сегмента глаза, который содержит следующие компоненты в следующем соотношении, на 1 мл раствора:
Краситель Trypan blue -1,3 мг;
Краситель BBG - 0,2 мг;
Динатрий фосфат - 3,1 мг;
Дигидрофосфат натрия - 0,3 мг;
Натрий хлористый - 7,6 мг;
Полиэтиленгликоль (ПЭГ) - 20 мг;
Гиалуронат натрия - 3 мг;
Дистиллированная вода - до 1 мл.
Соотношения компонентов на 1 мл раствора получены в результате экспериментального подбора и протестированы испытаниями.
Как уже указывалось, процессы свободнорадикального окисления играют важную роль в патологии заднего сегмента глаза. Сетчатка, являясь тканью с высоким парциальным напряжением кислорода (70 мм. рт. ст.), очень уязвима к оксидативному стрессу, в связи с чем одним из важных критериев при использовании медицинских изделий в хирургии витреоретинальной патологии является биологическая инертность без усугубления оксидативного стресса.
Созданный раствор окрашивающий для офтальмологической хирургии на основе красителя Trypan blue обладает биологической инертностью, безопасностью и про и/или антиоксидантным действием, что позволит в дальнейшем расширить арсенал перспективной отечественной технологической платформы для витреоретинальной хирургии.
В связи с этим для оценки качества и биологической активности раствора окрашивающего для офгальмохирургии авторами была использована методика железоиндуцированной хемилюминесценции полученного раствора, по которой оценивают состояние свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности свободнорадикального окисления. Для этого были проведены исследования по определению интенсивности реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) и акивных форм кислорода (АФК) заявленного раствора в биологически активных веществах.
При оценке качества витального красителя регистрируют железоиндуцируемую хемилюминесценцию модельной системы, оценивают состояние свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности (ОАО) окрашивающего раствора в модельных системах in vitro с использованием прибора «Хемилюминометр ХЛ-003». Для определения сохранности антиокислительных свойств исследуемого раствора в биологической среде оценивают его влияние и на перекисное окисление липидов (ПОЛ).
Для этого исследуемый препарат разводят в физиологическом растворе так, чтобы концентрация была сопоставима с терапевтической дозой. Отбирают от 0,005 до 0,1 мл и добавляют в тест-системы, в которых инициируют реакции СРО образование активных форм кислорода и свободно-радикальное перекисное окисление липидов - процессы, наиболее часто встречающиеся в организме.
2
4
2
4
6
8
7
3
2
4
2
-5
-5
В качестве первой модельной системы для оценки состояния свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности (ОАО) используют 20 мл фосфатного буфера (KHPO - 20mM, KCl - 105 тМ), с цитратом (50 гаМ) и люминолом (10 М). Состав буфера. 2,72 г КНРO, 7,82 г KCL, цитрата натрия CHON*5,5HO на 1 литр дистиллированной воды. Величину рН получаемого раствора доводят до 7,45 ед. титрованием насыщенным раствором КОН и добавляют ОД мл маточного раствора люминола (10 М). Образование АФК инициируют введением 1 мл 50 mM раствора сернокислого железа (FeSO7HO). Перед измерением свечения исследуемый объем помещают в светоизолированную камеру прибора и ведут запись хемилюминесценции (ХЛ) при комнатной температуре в течение 5 минут. В готовый буфер добавляют витальный краситель в зависимости от терапевтической дозы, свечение индуцируют добавлением раствора сернокислого железа.
Исследования проводят на хемилюминометре ХЛ -003, настроенном по программе: «Мешалка - быстро», «Термостат - выключен», «Время измерения - 5 минут». Прибор ХЛ-003 на дисплее компьютера выводит кривые записи хемилюминесценции, отражающие интенсивность процессов свечения изучаемого препарата, зависящую, в свою очередь, от скорости реакций свободнорадикального окисления липидов.
А в качестве второй модели для оценки сохранности антиокислительных свойств исследуемого раствора в биологической среде и его влияния и на перекисное окисление липидов (ПОЛ) использовали фосфатный буфер и добавление путем титрования в соотношении 1:5 куриного желтка и исследуемый препарат. Введение ионов железа в желтковую среду приводит к окислению ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов, развивается хемилюминесценция, по интенсивности которой судят о процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ), сходными по составу к липидам крови (Клебанов Г.И., 1988).
Помимо кинетических характеристик оценивают наиболее информативные параметры ХЛ: светосумму свечения по интенсивности излучения и амплитуду максимального свечения (I max). Интенсивность данных параметров модельной системы без добавления образцов принимают за 100%, проводили не менее 6 измерений в каждом объеме образца.
Изобретение иллюстрируется графиком на фиг. 1. где представлена запись хемилюминесценции отечественного витального красителя согласно настоящего изобретения: 1- контроль (буферный раствор и инициатор ХЛ 1 мл сернокислое железо); 2,3,4,5, - к модельной системе добавляли краситель в зависимости от терапевтической дозы исследуемого препарата - 2 - 0,005 мл; 3 - 0,01 мл, 4 - 0,05 мл, 5 - 0,1 мл.
Определяли светосумму и максимальную светимость при железоиндуцированной хемилюминесценции. Результаты средних значений светосуммы и максимальной интенсивности свечения приведены в таблице 1 (показатели хемилюминесценции витальных красителей отечественного и зарубежного производства при комнатной температуре).
Из таблицы 1 видно, что под действием витального красителя согласно изобретения I мах. уменьшились интегральные параметры люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) в модельной системе - в 1,1 - 1,6 раза, в индуцированной - в среднем 1,4 раза, что свидетельствует о подавлении генерации АФК.
Антиоксидантные свойства витального красителя сохранялись и в биологической среде, что нашло отражение в уменьшении медленной вспышки при добавлении его в модельную систему, содержащую липиды куриного желтка (фиг. 2).
На представленных графических записях хемилюминесценции видно, как уменьшаются показатели медленной вспышки при добавлении в данную модельную систему витального красителя (фиг. 1), т.е. антиокислительные свойства препарата сохранялись и в биологической среде (фиг. 2).
Антиоксидантный эффект был дозозависимым - с повышением концентрации красителя происходило пропорциональное снижение интенсивности хемилюминесценции.
В качестве контрольного сравнения использовали вышеуказанную методику для зарубежного аналога - Раствор окрашивающий для офтальмохирургии MembraneBlue Dual (D.O.R.C. International, Нидерланды), зарегистрированный на территории РФ и разрешенный к применению в медицинской практике (№ ФСЗ 2011/09078 от 24 февраля 2011 года). На фиг. 3 представлена сравнительная характеристика витального красителя согласно изобретения в дозах 0,05 мл (кривая 12) и 0,01 (кривая 13) по отношению к кривой 11, принимаемой за 100% в части интенсивности этого параметра в модельной системе без добавления образцов. Кривые 14 - 0,05 мл MembraneBlue Dual, 15-0,1 мл MembraneBlue Dual показывают тот же параметр витального красителя зарубежного производства компании DORC, Нидерланды.
Оценка проводилась по параметрам светосуммы свечения и максимальной светимости по отношению к модельной системе. Как видно, заявленный раствор витального красителя для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента глаза обладает высокой контрастирующей эффективностью и высокой антиокислительной активностью, превышающей аналогичные параметры рекомендованных к применению зарубежных образцов. Данные параметры заявленного витального красителя прямо указывают на высокую безопасность витального раствора, обладающего про- и антиоксидантной активностью, за счет усиления биологической инертности, что приводит к уменьшению возможных побочных эффектов.
Собственные данные. Полученные данные свидетельствуют о высокой антиокислительной активности. Раствор окрашивающий для офтальмохирургии согласно изобретения значительно подавляет свечение модельной системы, генерирующей АФК.
Для уменьшения возможного побочного влияния ТВ и BBG в состав включены специальные добавки, увеличивающие плотность и вязкость красящего раствора -ПЭГ (полиэтиленгликоль) и гиалуронат натрия.
ПЭГ (полиэтиленгликоль), благодаря способности растворять гидрофобные, гидрофильные вещества, позволяет смешивать жидкость с субстанциями, которые не смешиваются между собой и повышать плотность раствора, тем самым уменьшая его растекание по поверхности.
Гиалуронат натрия - полисахарид, состоящий из повторяющихся дисахаридных цепочек, соединенных гликозидными мостиками. Повышает вязкость красящего раствора и в комбинации с ПЭГ позволяет добиться оптимальных красящих свойств раствора при меньшей концентрации красителей ТВ и BBG в нем, т.е. повысить безопасность красящего раствора.
Кроме того, повышенная плотность и вязкость красящего раствора благодаря ПЭГ и гиалуронату натрия позволяют хирургу селективно вводить в стекловидную полость раствор красителя на необходимые для окрашивания области сетчатки без растекания раствора по всей поверхности и исключая дополнительный этап в операции обмен жидкость - воздух. Благодаря этому быстрее и удобнее можно достичь оптимального окрашивания при введении меньшего количества раствора.
Присутствие в составе заявленного раствора витального красителя ПЭГи гиалуроната натрия может приводить к транзиторному повышению внутриглазного давления и отеку роговицы в послеоперационном периоде, обычно не требующие дополнительных лечебных манипуляций и использования дополнительной медикаментозной терапии с учетом того, что раствор вводится кратковременно для окрашивания и легко удаляется из с помощью аспирации и относится к медицинским изделиям кратковременного применения. Исследования показали, что контакт витального красителя происходит в ходе операции, длительность контакта кратковременна, не более 60 секунд, вводится однократно в ходе операции.
2
4
Динатрий фосфат (вместе с дигидрофосфатом натрия) образуют буферную основу раствора витального красителя. Это неорганическое соединение, кислая соль щелочного металла натрия и ортофосфорной кислоты с формулой NaHPO, бесцветные кристаллы, хорошо растворимые в воде. В составе с дистиллированной водой придает раствору буферные и водоудерживающие свойства, регулирует кислотность раствора. Используется для поддержания минерального баланса и кислотно-щелочного равновесия по отношению к крови.
Дигидрофосфат натрия также, как и динатрий фосфат, придает раствору в составе буфера водоудерживающие свойства, сохраняя кислотность раствора в необходимых значениях, аналогичных рН плазмы крови человека.
Натрий хлористый, ионы натрия и хлора которого являются важнейшими неорганическими компонентами внеклеточной жидкости, поддерживает соответствующее осмотическое давление раствора. Раствор натрия хлорида изотоничен к плазме крови человека и поэтому быстро выводится из сосудистого русла, лишь временно увеличивая объем циркулирующей жидкости. Так же обеспечивает дезинтоксикационную функцию.
Заявленный раствор окрашивающий для офтальмологической хирургии вводится в заполненную сбалансированным изотоническим раствором полость стекловидного тела и не требует перед введением процедуры замены воздух -жидкость. Под тяжестью собственного веса за счет вязкостных добавок ПЭГ и гиалуроната натрия раствор немедленно погружается на глазное дно, окрашивая только внутриглазные мембраны - ВПМ, ЭРМ. Время экспозиции - 10-20 секунд, после чего краситель вымывается с помощью аспирации. В результате на фоне непрокрашенной сетчатки четко визуализируются внутриглазные мембраны, что облегчает их удаление, сокращает время операции и повышает безопасность хирургических манипуляций.
Раствор окрашивающий для офтальмологической хирургии представляет собой раствор насыщенного синего цвета. Благодаря полиэтиленгликолю и гиалуроновой кислоте может быть введен в заполненный изотоническим раствором глаз и сразу же опускается как когезивный шар к дну глаза и окрашивает только предназначенную для окраски ткань без растекания по всей поверхности.
рН 7,3-7,6.
Осмотическое давление 300-330 мОсм/кг.
Динамическая вязкость не более 70 мПа⋅с.
Для анализа безопасности и эффективности разработанного витального красителя были проведены исследования стабильности его физико-химических показателей и токсикологическая методами колориметрии, хемилюминесценции, электроретинографии, световой и электронной микроскопии.
Санитарно-химические испытания и токсикологические испытания.
Данные испытания проводили с целью определения соответствия разработанных красителей требованиям химической безопасности (отсутствие вредного действия на организм химических соединений, которые могут мигрировать из исследуемого изделия, контролируемое с помощью совокупности санитарно-химических и токсикологических показателей) и биологической безопасности (отсутствие в исследуемом изделии биологических факторов, таких как живые микроорганизмы, их споры, токсичные продукты их метаболизма, контролируемое с помощью показателей стерильности (проверка отсутствия жизнеспособных микробов) и пирогенности (проверка допустимых концентраций липополисахаридов). Испытания проводились в соответствии с требованиями ГОСТ Р 52770 «Изделия медицинские. Требования безопасности. Методы санитарно-химических и токсикологических испытаний», ГОСТ ISO 10993 "Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий», «Сборник руководящих методических материалов по токсиколого-гигиеническим исследованиям полимерных материалов и изделий на их основе медицинского назначения», М3 СССР, 1987; МУ 1.1.037-95 Биотестирование продукции из полимерных и других материалов.; ГОСТ 31214 «Изделия медицинские. Требования к образцам и документации, представляемым на токсикологические, санитарно-химические испытания, испытания на стерильность и пирогенность», ГН 2.3.3.972-00 «ПДК химических веществ выделяющихся из материалов, контактирующих с пищевыми продуктами», ГОСТ EN 556-1-2011 "Стерилизация медицинских изделий. Требования к медицинским изделиям категории стерильные. Часть 1. Требования к медицинским изделиям, подлежащим финишной стерилизации".
В задачу санитарно-химических исследований разработанных красителей входили идентификация, определение концентрации потенциально опасных соединений и сопоставление их с допустимыми уровнями. При токсикологическом исследовании изучали воздействие образцов разработанных красителей на организм экспериментальных животных. Результаты испытаний представлены в таблице 2 (Результаты санитарно-химических и токсикологических испытаний разработанных красителей).
Технические испытания.
Технические испытания были проведены с целью оценки технических, функциональных характеристик разработанных красителей. Их результаты приведены в таблице 3.
Колориметрическая оценка.
Оценку окрашивающей способности витального красителя проводили с использованием методики цветоделения с помощью Red-Green-Blue анализа (Wilfram L. Fritz Digital image analysis of trypan blue and fluorescein staining of anterior lens capsules and intraocular lenses // J Cataract Refract Surg 2002; 28:1034-1038 © 2002 ASCRS and ESCRS).
Для колорометрической оценки окрашивания витреомакулярных мембран использовались прокрашенные и удаленные в ходе оперативного витреретинального вмешательства у пациентов внтриглазные мембраны.
В качестве окрашивающих агентов использовались разработанный витальный краситель и зарубежный аналог (MembraneBlue Dual) соответственно. Фотосъемка полученных препаратов проводилась с помощью камеры Nikon D750 при одинаковых настройках: ~ 1/30 сек, ISO 800, WB 5000K. Для сравнительного анализа окрашивающей способности красителей был использован комплексный подход с использованием методики цветоделения с помощью Red-Green-Blue анализа и статистических методов. Был произведен анализ фотоснимков в программе Adobe Creative Cloud по трем составляющим замера цвета: значений Red, Green, Blue, с помощью которых можно оценить степень окрашивающей способности. Соотношение параметров RGB 230-230-230 соответствует белому цвету, после применения красителей цветовая гамма меняется (фиг. 4 и 5). Изменение этих трех соотношений позволяет количественно проанализировать степень окрашивающей способности. Интенсивность окраски передней капсулы оценивали по комплексному изменению показателей цветности RGB: R - интенсивность красного цвета, G - интенсивность зеленого цвета, В - интенсивность голубого цвета. Чем больше один из показателей цвета, тем выше интенсивность окрашивания (таблица 4 - сравнение средних показателей цвета R, G, В).
Полученные данные демонстрируют аналогичные показатели цвета RGB между двумя красителями. Результат сравнения по критерию Манна-Уитни показал отсутствие статистически значимых различий (Р>0,05) между исследуемыми красителями отсутствие статистически значимых различий (Р>0,05) между исследуемыми красителями.
Оценка когезивности.

Оценка когезивности витального красителя была проведена для определения вязкостных свойств красителя, поскольку эта характеристика важна при проведении окрашивания витреоретинальных структур - повышенная вязкость и плотность красителя помогает добиться более целевого прокрашивавния и минимизировать растекание красителя по всей сетчатки. Для определения эффективности когезивных свойств была проведена сравнительная оценка поведения разработанного витального красителя и зарубежного аналога (MembraneBlue Dual) при введении в физиологический раствор при статических условиях состояния жидкости. В качестве контроля использовали водный раствор красителя аналогичной концентрации без вязкостных добавок.
Красители в объеме 0,5 мл с помощью дозатора вливались в прозрачные стеклянные емкости, заполненные 0,5 л физиологического раствора. С помощью цифровой камеры была проведена видеозапись и для оценки использованы три снимка: в начале введения красителя, в процессе введения (5-я секунда введения) и после введения через 10 секунд.
Физико-химические характеристики испытуемых красителей и контрольного раствора приведены в таблице 5.
На фиг. 6-8 представлены фотоснимки, демонстрирующие поведение всех трех образцов красителей из таблицы 5 при введении их в емкость с раствором.
Как видно по фотоснимкам, контрольный краситель без вязкостных добавок быстро диспергируется при введении в раствор, в отличие от аналога и разработанного красителя, которые показали одинаковый нисходящий поток на дно заполненных раствором емкостей без значительного распространения по всей поверхности дна емкости и ясно продемонстрировали положительный эффект более плотных и более вязких растворов. На первых секундах введения видно, что разработанный краситель более целенаправленно распределяется по дну емкости, чем аналог. Это связано с наличием в нем дополнительного вязкостного вещества - гиалуроната натрия, который даже при низких концентрациях придает ему свойства вязкоупругого геля. Благодаря дополнительным свойствам (вязкость, псевдопластичность) в разработанном красителе удалось снизить концентрацию красящих компонентов на 14,3%, тем самым, повысить безопасность его для интраокулярных структур, сохранив при этом хорошие красящие свойства, что было в дальнейшем подтверждено экспериментально.
Электроретинографическая оценка
Исследование безопасности и эффективности заявленного раствора было проведено на 12 глазах 6 кроликов породы Шиншилла двух экспериментальных групп. Витрэктомия проводилась на отечественной офтальмохирургической системе «Оптимед Профи». Для премедикации использовался 0,1 мл 0,1% раствора атропина сульфата подкожно. За 30 минут до операции вводили внутримышечно 2% раствор ксилозина гидрохлорида из расчета 1-2 мг на 1 кг веса. Непосредственно перед операцией для общей анестезии внутримышечно вводили «Золетил 100» из расчета 15 мг на 1 кг веса животного.
На одном глазу каждого кролика была проведена витрэктомия с использованием инструментов калибра 25G. Транссклерально через плоскую часть цилиарного тела на меридианах 2, 10 и 12 часов устанавливали порты, выполняли витрэктомию с максимально полным удалением стекловидного тела и отделением задней гиалоидной мембраны. Затем в витреальную полость вводили 0,1 мл соответствующего красителя: в первой группе (n=3) - заявленный новый краситель; во второй группе - краситель MembraneBlue Dual (D.O.R.С, Нидерланды) и следили за равномерным его распределением по поверхности сетчатки. После экспозиции в течение 10 секунд краситель полностью удаляли с использованием рефлюксного инструмента. Тампонаду витреальной полости выполняли физиологическим раствором. По окончании операции на область портов накладывали герметичные швы, субконъюнктивально вводили 0,1 мл раствор ванкомицина, в конъюнктивальную полость закапывали 1-2 капли 0,5% моксифлоксацина.
Парный глаз каждого кролика оставался интактным, и его показатели использовались в качестве контроля. После операции в течение 5 дней в конъюнктивальную полость животных закапывали антибактериальные препараты и НПВС.
Операция и послеоперационный период у всех животных проходили без осложнений.
Оценку функционального состояния нейрорецепторных элементов сетчатки кроликов исследовали путем регистрации ЭРГ до операции в интактном состоянии и через 5 и 14 дней после операции. ЭРГ регистрировали портативной электрофизиологической установкой «Нейро-ЭРГ» (ООО «Нейрософт», г. Иваново, Россия). В качестве активного электрода использовали ретинографический электрод «крючок», закрепляя его за нижнее веко. Референтный и заземляющий электроды располагали на ушах кролика. Место положения активного референтного и заземляющего электродов сохранялось без изменений в ходе всего эксперимента. Перед исследованием с помощью введения 1% раствора тропикамида достигался медикаментозный мидриаз. Сопротивление под электродами не превышало 5 кОм. Световую стимуляцию проводили в условиях темновой адаптации с использованием мини-ганцфельдсферы, позволяющей получить равномерный засвет сетчатки. Частота стимуляции 0,5 Гц, полоса пропускания усилителя 2-200 Гц. Проводили 3 последовательные регистрации на каждом глазу для проверки стабильности регистрируемого ответа. При анализе использовали усредненную запись ЭРГ. Условия стимуляции и форма кривой соответствовали смешанному палочко-колбочковому ответу сетчатки.
Угнетение электрической активности сетчатки на 5 сутки после операции носило транзиторный характер, что свидетельствует о сохранности ее нейрорецепторных элементов. Восстановление основных волн ЭРГ до 60-70% относительно контроля говорит о положительной динамике в восстановлении функционального состояния сетчатки к 14 суткам. Результаты исследования подтверждают данные, полученные и другими авторами при проведении экспериментальной витрэктомии с трипановым синим [Heilweil, G. Normal physiological and pathophysiological effects of trypan blue on the retinas of albino rabbits / G. Heilweil, I. Komarowska, Б. Zemel [et al] // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2010. - Vol. 51(8). - P. 4187-4194. Kwok, A.K. The effects of indocyanine green and endoillumination on rabbit retina: an electroretinographic and histological study / A.K. Kwok, T.Y. Lai, C.K. Yeung [et al.] // Br J Ophthalmol. - 2005. - Vol. 89. - P. 897-900. Veckeneer, M. Ocular toxicity study of trypan blue injected into the vitreous cavity of rabbit eyes / M. Veckeneer, K. Overdam, J. Monzer [et al.] // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. - 2001. - Vol. 239. - P. 698-704].
Морфологические исследования.
Гистологические исследования проводили на 5, 14 и 30 сутки эксперимента. Животных выводили из эксперимента посредством воздушной эмболии. Глаза энуклеировали через 20 мин после смерти. Контролем служили интактные парные глаза кроликов, образцы для микроскопических исследований готовили параллельно в идентичных условиях.
По гистологическим препаратам оценивали состояние сетчатки - преретинальное скопление макрофагов, вакуолизацию слоя нервных волокон, дефекты в наружных и внутренних слоях сетчатки, изменения в пигментном эпителии сетчатки (ПЭС).
Для гистологического исследования энуклеированные глаза фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 3-5 суток. Фиксированную ткань обезвоживали в спиртах восходящей крепости (70°, 96°, 100°), и заливали в парафин. Затем выполняли серийные срезы на микротоме LEICA, окрашивали гематоксилином и эозином, по методу Ван Гизона и Маллори. Микроскопию и фотографирование гистологических препаратов осуществляли с использованием светового микроскопа LSM 5 PASCAL фирмы «Carl Zeiss» (Германия).
(
Для электронно-микроскопического исследования образцы ткани фиксировали в растворе 2% глютарового альдегида на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,2-7,4) в течение 2 часов, отмывали в трех порциях того же буфера. Затем фиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия (приготовленном на фосфатном буфере Миллонига, рН 7,2-7,4) - 1 час. Обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и абсолютном ацетоне. Заливку проводили в эпон-812 по общепринятой методике Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. Мир. Москва. 1975: 324. [Uikli В. Elektronnaya mikroskopiya dlya nachinayushchih. Mir. Moskva. 1975: 324. (in Russ)]*. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-III (Швеция), контрастировали 2% водным раствором у ран ил ацетата и раствором цитрата свинца по Рейнольдсу [Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. of Cell Biology. 1963; 17: 208-212]. Срезы изучали на электронном микроскопе JEM-CX II(Япония) при увеличении от 2 500 до 15 ООО. Результаты гистологических исследований.
Морфологически сетчатка глаза кроликов интактной группы была представлена 11 слоями и включала мембрану Бруха, которая гистогенетически относится как к сосудистой оболочке (хориоидее), так и к сетчатой оболочке глаза; пигментный эпителий сетчатки; слой фоторецепторов, палочек и колбочек; наружную пограничную мембрану; наружный ядерный слой; наружный плексиформный (сетчатый) слой; внутренний ядерный слой; внутренний плексиформный (сетчатый) слой; слой ганглиозных клеток; слой нервных волокон, формирующих зрительный нерв; внутреннюю пограничную мембрану, которую формируют внутренние ножки радиальных глиоцитов (Мюллеровских клеток), пронизывающих всю сетчатку до межфоторецепторного матрикса (фиг. 9).
Наиболее темный наружный ядерный слой был представлен многочисленными плотными рядами тел фоторецепторных нейронов, а более светлый внутренний ядерный слой состоял из тел биполярных, горизонтальных, амакриновых нейронов и радиальных мюллеровских глиоцитов.
Крупные светлые нейроны с округлыми ядрами в один ряд составляли слой ганглиозных клеток. Сенсорная часть (слой палочек и колбочек) прилежала к пигментному эпителию, от которого она легко отделялась при гистологической проводке. На фиг. 10 показаны клетки пигментного эпителия, лежащие на мембране Бруха, по другую сторону лежит сосудистая оболочка - хориоидея.
Как видно, на гистологических срезах контрольных образцов отсутствовали патоморфологические изменения (дистрофия, некроз) во всех слоях сетчатой оболочки.
На следующем этапе изучали изменения морфологии сетчатки глаза кроликов на 5 сутки, 14 и 30 сутки после витрэктомии и интравитреального применения красителей.
На 5 сутки обнаружены умеренно выраженные морфологические изменения в обеих экспериментальных группах (фиг. 11). Слои сетчатки хорошо просматривались, кроме пигментного эпителия (при гистологической проводке данный слой отделился от фоторецепторного слоя). Нейроны ганглиозного слоя содержали крупные ядра с одним темным плотным ядрышком, в цитоплазме тельца Ниссля выявлялись в виде базофильных включений. Вокруг многих ганглиозных нейронов определялись признаки отека в виде оптических светлых расширений. Кроме того, цитоплазма ножек радиальных мюллеровских глиоцитов была уплотнена. В стекловидном теле вдоль внутренней глиальной мембраны местами обнаруживались небольшие скопления крупных макрофагов (фиг. 12). В отдельных макрофагах в цитоплазме были хорошо видны темные гранулы - фаголизосомы, вероятно с частицами введенного красителя.
Через 14 дней после введения красителей в обеих группах морфологические изменения были практически такие же, как на предыдущем сроке эксперимента. Все слои сетчатки глаза хорошо просматривались на гистологических препаратах, кроме пигментного эпителия (фиг. 13). Описанные патоморфологические признаки не прогрессировали. Отечность ганглиозного слоя и нейронов внутреннего ядерного слоя сохранялась и была выражена примерно в той же степени (фиг. 14).
На фиг. 15 и 16 представлены гистологические изменения сетчатки через 30 дней после введения красителя. Как видно, степень выраженности патоморфологических изменений уменьшалась. Все слои сетчатой оболочки глаза кроликов этой группы имели четкие очертания. Сохранялись признаки умеренно выраженного отека вокруг отдельных ганглиозных нейронов, а также гидропической дистрофии нейронов внутреннего ядерного слоя, но они были менее выражены, чем на предыдущем сроке эксперимента (фиг. 16). В отдельных участках отек в ганглиозном слое почти полностью исчезал. Ганглиозные нейроны были с крупными светлыми ядрами и с одним четким округлым небольшим ядрышком в них. В цитоплазме ганглиозных клеток можно было увидеть значительное количество базофильных включений -телец Ниссля.
Исчезали признаки отека и в области наружной глиальной мембраны на уровне фоторецепторного слоя. Местами структура сетчатки полностью напоминала структуру сетчатки глаза интактных кроликов (фиг. 16). На таких участках во всех слоях сетчатки признаки отека полностью отсутствовали. Клетки пигментного эпителия сетчатки имели обычную структуру без каких-либо особенностей.
Таким образом, проведенные гистологические исследования роговиц и сетчатки глаз кроликов показали в обеих выявили стадийный характер патоморфологических изменений с явными признаками обратимости обнаруженных сдвигов в сравнительно короткий восстановительный период после оперативного вмешательства и применения красителей. Также не исключено, что выявленные изменения могли возникнуть из-за операционной травмы, которая неизбежно имеет место при выполнении оперативных вмешательств.
Результаты электронно-микроскопических исследований.
Через 5 дней после операции в обеих группах выявляли умеренно выраженные изменения. Под плотной полосой внутренней глиальной мембраны хорошо просматривались широкие ножки Мюллеровых глиоцитов. Цитоплазма глиальных элементов выглядела несколько уплотненной. В ганглиозном слое большинство ганглиозных нейронов с крупными округлыми ядрами содержали в цитоплазме значительное количество рибосом и полирибосом, множество вытянутых каналов гранулярного эндоплазматического ретикулума, которые формировали скопления - тельца Ниссля, пластинчатый комплекс Гольджи, округлые митохондрии с тонкими кристами.
Отдельные ганглиозные нейроны проявляли признаки отека в виде светлых вакуолей на месте митохондрий, расширения каналов гранулярного эндоплазматического ретикулума, разрежения цитоплазмы, слабого расширения перинуклеарного пространства (фиг. 17 и 18).
Также во внутреннем ядерном слое местами выявлялись признаки гидропической дистрофии в виде вакуолизации цитоплазмы отдельных нейронов (фиг. 19 и 20). На образцах с красителем MembraneBlue Dual в некоторых нейронах часть органелл подвергалась более выраженной деструкции, и цитоплазма в этих зонах казалась полностью опустошенной.
Многочисленные фоторецепторные нейроны в наружном ядерном слое сетчатки имели обычное строение и лежали плотными рядами в обеих группах исследуемого материала.

Через 14 дней после хромовитрэктомии с использованием красителя MembraneBlue Dual в сетчатке кроликов на ультраструктурном уровне признаки отека в отдельных слоях были более выраженными, чем на предыдущие 5 сутки, в отличие от образцов с разработанным красителем, где ультраструктурные изменения были примерно такие же, как на предыдущем сроке эксперимента (фиг. 21 и 22).
Внутренний сетчатый слой в обеих группах был с признаками стека клеточных отростков. Наружный сетчатый слой был нешироким, синапсы в нем определялись редко. В 1-й группе на ультраструктурном уровне хорошо определялись признаки отека слоя фоторецепторных нейронов, во 2-й группе данные изменения не наблюдались.
Через 30 дней после операции в обеих группах в сетчатке кроликов степень выраженности описанных выше патологических изменений уменьшилась. Структура сетчатой оболочки была близка к таковой интактных глаз кроликов. Признаки отека почти во всех слоях сетчатки исчезали. Наружная глиальная мембрана и ножки глиальных элементов под ней выглядели типично для нормы. Ганглиозный слой формировали крупные нейроны с крупными светлыми округлыми ядрами.
Тела Мюллеровских глиоцитов между нейронами внутреннего ядерного слоя выглядели интактными. Наружный сетчатый слой сетчатки лишь местами содержал признаки слабого отека отростков нейронов в виде вакуолизации митохондрий. Типичные для сетчатки синапсы в данном слое определялись.
Фоторецепторные нейроны в наружном ядерном слое сетчатки лежали плотными рядами и имели интактную структуру. Во внутренних сегментах фоторецепторных нейронов отечные участки также не выявлялись.
В некоторых нейронах внутреннего ядерного слоя выявлялись вакуолизированные митохондрии, но большая часть нейронов имела типичную для них ультраструктуру (фиг. 23 и 24). В цитоплазме определялись органеллы без каких-либо изменений.
Наружные сегменты фоторецепторных нейронов состояли из множества сдвоенных мембран, формирующих типичные многочисленные диски, которые охватывались длинными апикальными отростками клеток пигментного эпителия сетчатки, фагоцитируя отработанные диски.
Анализ результатов морфологических исследований показал стадийный обратимый характер патоморфологических изменений в структурах сетчатки глаз кроликов после экспериментальной витрэктомии с использованием красителей.
Таким образом, проведенные экспериментальные исследования и выявленные изменения и их характер позволяют предположить об их связи с собственно операционной травмой в процессе витрэктомии, нежели со специфическим действием компонентов красителей на ретинальные структуры
Полученные результаты полностью подтверждают заявленные показатели нового витального красителя.
Настоящее изобретение промышленно применимо, опробовано в экспериментах и показало возможность достижения заявленного технического результата.