СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ
PRODUCTION METHOD OF AGENT HAVING ANTITUMOUR ACTIVITY

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения средства, обладающего противоопухолевой активностью путем культивирования базидиомицетов в погруженной культуре.
Известно, что метаболиты многих видов базидиомицетов обладают лечебными свойствами, в частности, противоопухолевым действием, включающим прямое ингибирующее действие на пролиферацию и рост клеток опухоли, повышение противоопухолевого иммунитета, антиканцерогенное действие, а также антиоксидантным, противовирусным, гепатопротекторным и иммуномодулирующим действием. В последние годы в России, США, Китае, Японии, Корее ведутся работы по получению лекарственных средств на основе базидиомицетов. Создание новых лекарственных препаратов сдерживается сложной дорогостоящей технологией выращивания базидиомицетов и выделения из них веществ, обладающих стабильными биологическими свойствами, в частности, противоопухолевыми.
Образование базидиомицетами ценных для фармакологии веществ зависит как от используемых видов базидиомицетов, так и от технологии их культивирования, в частности отсостава производственной питательной среды.
Для лечения онкологических заболеваний используют химические вещества, такие как цитостатики, проявляющие высокую токсичность, что ограничивает их применение.
Токсичность противоопухолевых средств, полученных из съедобных или несъедобных (неядовитых) базидиомицетов по литературным данным или отсутствует, или очень низкая (Chang&But, 1986, Suetal., 1987).
В настоящее время большое внимание уделяется разработке технологии культивирования базидиомицетов с целью получения максимального количества мицелия при культивировании в возможно короткий срок.
Известен способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, из мицелия гриба Ganodermalucidum. Мицелий получают путем культивирования Ganodermalucidum в погруженной культуре на питательной среде, содержащей 50 г глюкозы, 20 г пептона, 0,87 г дигидрофосфата калия, 0,5 г сульфата магния, 10 г хлорида железа (П), 7 г хлорида марганца, 10 г сульфата цинка, 4 мг хлорида цинка на 1 л воды, рН среды - 5,5.
Предварительно готовят посевной мицелий. Для этого указанный гриб культивируют при 180 об/мин, 25°С в течение 10 суток. Полученную культуру пересевают в свежую питательную среду в количестве 5% и вновь культивируют в течение 10 суток. Мицелий отделяют от культуральной жидкости, и из него выделяют протеогликанG009 - средство, обладающее противоопухолевой активностью, очищают его и определяют противоопухолевую активность в отношении саркомы 180, привитой самцам мышей (RU 2082755 С1, 19.08.1997).
Недостатком описанного способа является длительный процесс приготовления посевного мицелия (до 20 суток), продолжительный процесс культивирования гриба (7 суток) и сложный процесс выделения средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Известен способ получения препарата, влияющего на тканевый обмен, в том числе обладающего противоопухолевой активностью, предусматривающий глубинное культивирование гриба Pleurotusostreatus 1137 (ВКПМ-F 819) в колбах на среде содержащей пивное сусло 0,65° Б при 26-28°С на роторной качалке с 200 об/мин, длительность процесса до 24 суток, с последующим отделением мицелия от нативного раствора центрифугированием и выделением биологически активных веществ из мицелия экстракцией этанолом при нейтральном или кислом значениях рН. Экстракты упаривают в вакууме до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в водном растворе этанола. Полученные фракции используют для биологических испытаний. Противоопухолевую активность полученного средства исследуют на мышах с трансплантированным асцитным раком молочной железы при однократном введении химических противоопухолевых средств - цитостатиков. Препарат, полученный вышеописанным способом, вводят в дозе 100 мг/кг через 2 часа после трансплантации опухоли, а затем в той же дозе течение 9 суток ежедневно. Средняя продолжительность жизни животных составила 30,8±0,8 суток, а в контроле - 18,0±0,8 суток, т.е.на 71% больше, чем в контроле (RU 2192873 С1, 20.11.2002).
Недостатком описанного способа является длительность процесса культивирования гриба, а также проведение исследования противоопухолевой активности на фоне цитостатиков - токсичных веществ, в связи с чем невозможно судить о самостоятельной противоопухолевой эффективности полученных средств.
Известен способ получения противоопухолевого средства с использованием базидиомицета, предусматривающий приготовление посевного мицелия базидиомицета, приготовление жидкой производственной питательной среды, содержащей источник углерода, в качестве которого используют растительные масла, источник азота - соевую муку, минеральные соли, такие как дигидрофосфат калия, сульфат магния и воду, засев производственной питательной среды приготовленным посевным мицелием, культивирование базидиомицета с последующим отделением биомассы базидиомицета и выделением из нее противоопухолевого средства. При приготовлении производственной питательной среды в известном способе используют 10-25 г/л растительного масла и 16 - 28 г/л соевой муки, при этом выход биомассы составляет 25-40 г/л, а эффективность противоопухолевого средства составляет до 94% торможения роста опухоли в опытах in vivo (Патент RU 2418062, опубл. 10.05.2011).
Недостатком известного способа является высокая стоимость состава производственной питательной среды за счет использования при ее приготовлении дорогостоящего растительного масла.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является снижение себестоимости противоопухолевого средства за счет снижения стоимости производственной питательной среды без снижения эффективности противоопухолевого средства.
Поставленная задача решается за счет того, что в способе включающем приготовление посевного мицелия базидиомицета, приготовление производственной питательной среды, содержащей источники углерода, азота - соевую муку, минеральные соли и воду, засев производственной питательной среды приготовленным посевным мицелием, культивирование базидиомицета с последующим отделением биомассы и выделением из нее противоопухолевого средства, согласно изобретению в качестве источника углерода при приготовлении производственной питательной среды используют подсолнечный жмых холодного отжима в количестве 10-35 г/л, а соевую муку в количесте 5-12 г/л.
Рекомендуется перед приготовлением производственной питательной средыподсолнечный жмых холодного отжима измельчить до размера частиц не более 0,1 мм. Нежелательно увеличение содержания измельченного жмыха в питательной среде более 35 г/л, что обусловлено изменением реологических свойств среды, приводящего к нарушению массообменных процессов и, как следствие, снижению интенсивности накопления биомассы базидиомицета.
Соевая мука может быть использована как генетически модифицированных, так и не модифицированных сортов сои.
Целесообразно из минеральных солей использовать дигидрофосфат калия сульфат магния.
Для культивирования следует использовать базидиомицет, выбранный из группы Flammulinavelutipes (Curt.:Fr.) Singer, Hericiumerinaceus (Bull.:Fr.).
После культивирования базидиомицета следуетотделять мицелий из погруженной культуры фильтрованием, экстрагировать его дистиллированной водой в соотношении 90-360 г/л воды в процессе автоклавирования при 1,2-1,5 атм в течение 1,5-2,5 часов, в водный экстракт мицелия базидиомицета можно добавлять 2-6 объемов этанола, выпавший осадок отделять, высушивать и использовать в качестве противоопухолевого средства.
К полученному противоопухолевому средству могут быть добавлены различные фармацевтические добавки, такие, как витамины, микроэлементы, антиоксиданты, совместимые противоопухолевые средства.
Противоопухолевое средство может быть изготовлено в виде таблеток, капсул, напитка, и может быть использовано как перорально, так и в виде микроклизм.
Дозировка противоопухолевого средства зависит от заболевания, возраста пациента, его веса, состава средства. В пересчете на содержание полисахаридов предпочтительная дозировка для лабораторных животных может быть 1-3 мг полисахаридов на кг массы, для человека - 0,08-0,25 мг/кг.
Технический результат заявленного изобретениясостоит в том, что оно позволяет решить две важные задачи: снизить себестоимость производственной питательной среды за счет замены растительных масел отходом маслоперерабатывающей промышленности - подсолнечным жмыхом холодного отжима и снижения количества соевой муки с 16-28 г/л до 5 - 12 г/л, а также улучшить экологическую ситуацию за счет использования отходов производства пищевой промышленности. При этом настоящее изобретение позволяет получать противоопухолевое средство без снижения его эффективности.
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, которые не охватывают весь объем притязаний, но и не ограничивают его.
Пример 1. Приготовление посевного мицелия базидиомицетов.
Готовят стерильные жидкие питательные среды, состав которых представлен в таблице 1, и засевают мицелием базидиомицетов, выращенным на агаровой питательной среде.
Выращивание посевного мицелия F. velutipes и Hericiumerinaceus осуществляют на ротационной качалке при температуре 26°С, скорости вращения качалки 220 об/мин, в течение 6 суток.
Таблица 1
Составы сред для получения посевного мицелия базидиомицетов.
Вид базидиомицета
Источники питания, г/л воды
Глюкоза
Соевая мука
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
MgSO<sub>4</sub>
F. velutipes
22
8
2,5
0,24
H.erinaceus
19
10
3,0
0,4
Пример 2. Погруженное культивирование базидиомицета F. velutipes.
Подсолнечный жмых измельчают до размера частиц не более 0,1 мм. Для погруженного культивирования готовят производственную питательную среду, содержащую следующие компоненты, г/л:
измельченный подсолнечный жмых
35
соевая мука
5
дигидрофосфат калия
1,5
магния сульфат
1,5
вода
до 1 л
Производственную питательную среду стерилизуют при 1,2 атм в течение 30 мин, охлаждают и засевают посевным мицелием базидиомицета F. velutipes, полученным по примеру 1. Культивирование осуществляют при температуре 26°С в колбах на ротационной качалке при 200 об/мин, в течение 5 суток.
Погруженную культуру фильтруют, отделяют мицелий. Выход воздушно-сухой биомассы (влажность 6%) составляет 40 г/л. Из мицелия осуществляют выделение противоопухолевого средства. Для этого экстрагируют мицелий дистиллированной водой (в соотношении 250 мл воды на 1 г мицелия) в процессе автоклавирования при 1,2 атм в течение 1,5 часов. В полученный водный экстракт мицелия базидиомицета добавляют 3 объема этанола, выпавший осадок отделяют, высушивают и используют в качестве противоопухолевого средства. Противоопухолевую активность полученного средства определяли по методу, описанному в патенте RU 2418062, опубл. 10.05.2011. Торможение роста опухоли в опытах in vivo составляет 90%.
Пример 3. Погруженное культивирование базидиомицета F. velutipes.
Погруженное культивирование проводили как в примере 2, но содержание в производственной питательной среде измельченного подсолнечного жмыха составляло 20 г/л, а соевой муки 8 г/л.
Выход воздушно-сухой биомассы (влажность 6%) составляет 38 г/л.
Торможение роста опухоли в опытах in vivo составляет 92%.
Пример 4. Погруженное культивирование базидиомицета Н.еrinaceus.
Погруженное культивирование проводили как в примере 2, но содержание в производственной питательной среде измельченного подсолнечного жмыха составляло 10 г/л, а соевой муки 12 г/л.
Выход воздушно-сухой биомассы (влажность 6%) составляет 36 г/л.
Торможение роста опухоли в опытах in vivo составляет 89%. Таким образом, поставленная задача решена. Снижена себестоимость производственной питательной среды и самого противоопухолевого средства без снижения его эффективности, улучшается экологическая обстановка за счет утилизации отходов производства пищевой промышленности.