Способ стимулирования регенерации спинного мозга при помощи везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток жировой ткани
METHOD FOR SPINAL CORD REGENERATION STIMULATION BY MEANS OF VESICLES PREPARED FROM MESENCHYMAL STEM CELLS OF ADIPOSE TISSUE

Изобретение относится к области медицины, а именно к методам лечения травматической болезни спинного мозга с применением везикул мезенхимных стволовых клеток. Может быть использовано в нейрохирургии и травматологии для стимулирования регенерации нервной ткани при травматической болезни спинного мозга, когда существует проблема восстановления структуры и функции ткани за счет собственных ресурсов организма, при этом использование изобретения не ограничивается указанной областью.
На дату подачи настоящей заявки проблема лечения травматической болезни спинного мозга остается острой в связи с низкой собственной регенераторной способностью центральной нервной системы. Заявителем выявлен ряд технических решений, направленных на стимулирование регенерации спинного мозга -  фармацевтических, хирургических, физических. Недостатком известных технических решений по сравнению с заявленным техническим решением, по мнению заявителя, является их недостаточная эффективность.
Повышение результативности лечения травматической болезни спинного мозга связывают с клеточной терапией. Стволовые клетки, трансплантируемые в область повреждения спинного мозга, способны замещать собой погибшие клетки, восстанавливая целостность ткани и улучшая функциональные показатели [Boido, M. et al. (2014). Mesenchymal stem cell transplantation reduces glial cyst and improves functional outcome after spinal cord compression. World Neurosurgery, 81(1), 183-190; Carelli, S. et al. (2019). Neuroprotection, Recovery of Function and Endogenous Neurogenesis in Traumatic Spinal Cord Injury Following Transplantation of Activated Adipose Tissue. Cells, 8(4), 329-340]. Достаточно перспективными представляются мезенхимные стволовые клетки (МСК), обладающие иммуномодулирующим, противовоспалительным и антиапоптотическим действием за счет секреции различных нейротрофических факторов и цитокинов (паракринный механизм действия) [Lee, D.K. & Song, S.U (2014). Immunomodulatory mechanisms of mesenchymal stem cells and their therapeutic applications. Cellular immunology, 326, 68-76; Laroni, A. et al. (2015). Mesenchymal stem cells for the treatment of neurological diseases: immunoregulation beyond neuroprotection. Immunology letters, 168(2), 183-190; Samsonraj, R.M. et al. (2017). Concise review: multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem cells translational medicine, 6(12), 2173-2185]. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что МСК могут способствовать регенерации при травматическом повреждении головного и спинного мозга [Bianco, J. et al. (2016). Taking a bite out of spinal cord injury: do dental stem cells have the teeth for it? Cell Mol Life Sci, 73(7), 1413-1437; Mukhamedshina, Y.O. et al. (2018). Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell Application Combined With Fibrin Matrix Promotes Structural and Functional Recovery Following Spinal Cord Injury in Rats. Frontiers in pharmacology, 9, 343-353; Takahashi, A. et al. (2018). Comparison of mesenchymal stromal cells isolated from murine adipose tissue and bone marrow in the treatment of spinal cord injury. Cell transplantation, 27(7), 1126-1139; Mukhamedshina, Y.O. et al. (2019). Mesenchymal stem cells and the neuronal microenvironment in the area of spinal cord injury. Neural Regeneration Research, 14(2), 227-237]. Тем не менее, в отношении стволовых клеток всегда существует вероятность малигнизации [Rosland, G.V., et al. (2009). Long-term cultures of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells frequently undergo spontaneous malignant transformation. Cancer Res, 69(13), 5331-5339], в связи с чем данный подход необходимо применять с осторожностью.
Из исследованного уровня техники заявителем выявлено изобретение по патенту RU 2650638 C1, сущностью является способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, заключающийся в однократном наложении мезенхимальных стволовых клеток, заключенных в матрикс, на область повреждения, отличающийся тем, что мезенхимальные стволовые клетки выделяют из жировой ткани или пульпы зуба, заключают в фибриновый матрикс Tissucol, через 6 недель после травматического процесса спинного мозга наносят несколько продольных надсечек в твердой мозговой оболочке и накладывают мезенхимальные стволовые клетки, заключенные в фибриновый матрикс Tissucol, на область повреждения.
Таким образом, в известном техническом решении описана терапия травм спинного мозга с применением МСК, полученных из жировой ткани и пульпы зуба свиньи и заключенных в фибриновый матрикс Tissucol. Авторами показана эффективность данного вида терапии, проявляющаяся в улучшении двигательной активности и большей сохранности ткани в области травмы в опытной группе по сравнению с контрольной. Недостатками известного технического решения являются:
- вероятность накопления мутаций в геноме МСК вследствие необходимости долговременного культивирования аутологичного материала, что повышает риск их малигнизации;
- применение лишь в промежуточный период травматического процесса спинного мозга с необходимостью повторного оперативного вмешательства.
Из исследованного уровня техники заявителем выявлено изобретение по патенту RU 2620167 C1, сущностью является способ получения средства для стимуляции регенерации поврежденных тканей, включающий культивирование мезенхимных стромальных клеток жировой ткани (МСК ЖТ) человека до 4-5 пассажа в среде, поддерживающей рост недифференцированных мезенхимных клеток человека, отмывку клеток буферным раствором, кондиционирование МСК ЖТ в бессывороточной и лишенной продуктов животного происхождения среде роста, поддерживающей жизнеспособность клеток не менее 70% и пригодной для терапевтического применения, отбор среды культивирования, содержащей продукты секреции МСК ЖТ человека, удаление из нее остатков клеток и очистку от низкомолекулярных компонентов с последующей лиофилизацией очищенной среды культивирования для получения средства, содержащего продукты секреции МСК человека, включающие ключевые факторы роста: VEGF в концентрации не менее 200 пкг/мл, HGF в концентрации не менее 150 пкг/мл, FGF basic в концентрации не менее 0,29 пкг/мл, ангиопоэтин-1 в концентрации не менее 145 пкг/мл, PEDF в концентрации не менее 500 пкг/мл, определяемые методом иммуноферментного анализа при восстановлении лиофилизата в стерильном физиологическом растворе.
Таким образом, в известном техническом решении описано использование продуктов секреции МСК человека для стимулирования регенерации тканей. По сути известный способ предполагает использование среды, в которой росли МСК и в которую секретировали ключевые факторы роста, такие как фактор роста эндотелия сосудов, фактор роста гепатоцитов, основной фактор роста фибробластов и ангиопоэтин 1 типа, а также антиангиогенный фактор, полученный из клеток пигментного эпителия.
Однако, несмотря на удовлетворение критерия безопасности, следует отметить следующие недостатки, снижающие эффективность известной терапии:
- кратковременность эффекта за счет быстрого расщепления инъецируемых продуктов секреции МСК протеазами in vivo;
- необходимость многократного и высокодозного введения для достижения стойкого эффекта.
В последнее время наибольшие перспективы связывают с использованием везикул, полученных из стволовых клеток, в отличие от которых (стволовых клеток) они (везикулы) не имеют способностей к онкологической трансформации. Также их (везикул) неоспоримыми преимуществами являются:
- отсутствие необходимости введения везикул непосредственно в область повреждения, так как они способны проходить гематоэнцефалический барьер;
- содержание и перенос тех же самых факторов, которые содержатся в стволовых клетках [Galieva, L.R. et al. (2019). Therapeutic Potential of Extracellular Vesicles for the Treatment of Nerve Disorders. Frontiers in neuroscience, 13], в том числе и РНК. Ряд исследований доказывает, что использование везикул, полученных из МСК, оказывает большинство положительных эффектов, показанных при трансплантации МСК [Lai, R.C. et al. (2010). Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Res, 4, 214-222; Bruno, S. et al. (2009). Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. J. Am. Soc. Nephrol, 20, 1053-1067; Li, T., et al. (2012). Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells Dev, 22, 845-854].
Из исследованного уровня техники заявителем выявлено изобретение по патенту RU 2605853 C1, сущностью является способ получения лекарственного средства на основе везикул человека для стимуляции ангиогенеза у пациентов с ишемическим повреждением тканей, отличающийся тем, что выращивают клетки человека линии SH-SY5Y на культуральном флаконе, промывают изотоническим буферным раствором, добавляют к клеткам стерильный раствор цитохалазина В, клетки промывают изотоническим буферным раствором, переводят в суспензию, подвергают активному перемешиванию и осуществляют серию центрифугирований с получением заявленного лекарственного средства.
Таким образом, в известном техническом решении описан способ получения лекарственного препарата на основе везикул клеток человека линии SH-SY5Y.
Недостатком известного технического решения является то, что оно направлено на стимуляцию ангиогенеза у пациентов с ишемическим повреждением тканей и не может оказывать влияние на стимулирование регенерации нервной ткани в полной мере.
Из исследованного уровня техники выявлены технические решения, в которых описаны бислойные везикулы (липосомы), являющиеся весьма распространенным типом везикул.
Так, из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту RU 2595872 C2, в котором описано получение бислойных везикул со сшивками между слоями для переноса терапевтических молекул.
Известно изобретение по патенту RU 2627157 C2, сущностью является способ получения искусственных везикул, что предполагает дополнительную их загрузку лекарственными средствами.
Недостатком подобных липосомальных систем доставки является то, что они обладают низкой термодинамической стабильностью, ограниченной ёмкостью и отсутствием векторных свойств [Patil, S.G. et al. (2005). Preparation of liposomes. The Pharma Review, 18 (3), 53-58].
На дату подачи заявки выявлены исследования терапевтического потенциала везикул при травме спинного мозга. Доказана бóльшая эффективность везикул по сравнению с МСК при травме спинного мозга [Wang, L. et al. (2018). Mesenchymal stem cell-derived exosomes reduce A1 astrocytes via downregulation of phosphorylated NFκB P65 subunit in spinal cord injury. Cellular Physiology and Biochemistry, 50(4), 1535-1559]. Показано, что везикулы, полученные из МСК и введенные внутривенно, способны мигрировать в область травмы спинного мозга и оказывать нейрорегенераторный эффект за счет воздействия на М2 макрофаги, ослабления апоптоза клеток и воспалительных процессов [Lankford, K.L. et al. (2018). Intravenously delivered mesenchymal stem cell-derived exosomes target M2-type macrophages in the injured spinal cord. PLoS ONE, 13, e0190358; Huang, J.H. et al. (2017). Systemic administration of exosomes released from mesenchymal stromal cells attenuates apoptosis, inflammation, and promotes angiogenesis after spinal cord injury in rats. J. Neurotrauma, 34, 3388-3396].
Из исследованного уровня техники заявителем выявлено изобретение по патенту WO 2019186558 (A1), сущностью является фармацевтическая композиция, содержащая внеклеточные везикулы, нагруженные ингибитором экзогенной фосфатазы и гомолога тензина (PTEN). Способ лечения нейронного повреждения или повреждения у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества внеклеточных везикул, нагруженных ингибитором экзогенной фосфатазы и гомолога тензина (PTEN).
Таким образом, в известном техническом решении описано использование для терапии травмы спинного мозга фармацевтической композиции, содержащей внеклеточные везикулы, загруженные ингибитором экзогенной фосфатазы и гомолога тензина (PTEN). В качестве источника получения внеклеточных везикул применяют адгезивные клетки, экспрессирующие мезенхимальные маркеры, и полученные из тканей зуба.
При этом, несмотря на показанные авторами положительные результаты восстановления функций спинного мозга и мочевого пузыря, имеют место следующие недостатки известного способа:
- метод выделения естественных везикул в известном способе сложен технологически, занимает много времени и требует специального дорогостоящего оборудования, что значительно осложняет его промышленную применимость;
- меньшая доступность для клинического применения в связи с недостаточным количеством материала и трудностью получения мезенхимных стволовых клеток из тканей зуба;
- доклинические исследования по оценке эффективности применения предлагаемой фармацевтической композиции были проведены на модели полной перерезки спинного мозга крыс. Данная модель не воспроизводит клиническую картинку травматической болезни спинного мозга, соответственно, судить об эффективности применения указанной в известном способе фармацевтической композиции не представляется возможным.
Наиболее близким к заявленному техническому решению, выбранным заявителем в качестве прототипа, по совпадающей совокупности признаков и назначению является способ, описанный в патенте US 2019328792 A1, сущностью является фармацевтическая композиция, содержащая внеклеточные везикулы, полученные из МСК. При этом способ получения фармацевтической композиции включает: культивирование МСК в культуральной среде и выделение внеклеточных везикул, полученных из МСК, из культуральной среды. Способ лечения дефекта кости, дефекта сухожилия или повреждения спинного мозга, где указанный способ включает введение фармацевтической композиции в травматическую и/или нарушенную область.
Таким образом, в известном техническом решении описан способ, согласно которому фармацевтическую композицию, содержащую внеклеточные везикулы, полученные из МСК, используют для лечения дефекта кости, дефекта сухожилия или повреждения спинного мозга.
Недостатком прототипа является:
- фармацевтическая композиция содержит преимущественно различные костные морфогенные белки (BMP), что направлено на стимуляцию формирования кости и хряща у пациентов с костными и сухожильными дефектами и не может в полной мере оказывать влияние на стимулирование регенерации нервной ткани;
- известный способ лечения преимущественно направлен на лечение повреждения позвоночника и в меньшей степени травмы спинного мозга. Несмотря на продекларированную в описании прототипа возможность применения внеклеточных везикул, полученные из МСК, для восстановления повреждения спинного мозга, указанное предположение не подтверждено доказательной базой, не основано на опыте применения in vivo и не несет в себе сведения о достижении заявленных технических результатов.
Основываясь на изложенном анализе исследованного уровня техники по научно-технической литературе и патентным базам данных, на дату представления заявочных материалов заявителем не выявлены технические решения по исследованию эффективности везикул мезенхимных стволовых клеток при травме спинного мозга в условиях раздельного или комбинированного применения: наложения на область повреждения везикул мезенхимных стволовых клеток, заключенных в фибриновый матрикс и/или внутривенного введения везикул мезенхимных стволовых клеток и/или интратекального введения в острый и/или промежуточный и/или хронический периоды.
Целью и техническим результатом заявленного технического решения является повышение эффективности стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга путем раздельного или комбинированного использования (наложение на область повреждения в составе фибринового матрикса, внутривенное и интратекальное введение), а также в различные посттравматические периоды (острый, промежуточный, хронический) эффективного количества лекарственного средства на основе везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток, в клинических условиях, а именно - более полное восстановление структуры и функций спинного мозга человека и повышение доступности способа лечения, заключающегося в возможности применения аутологичного или аллогенного клеточного материала.
Цель достигается:
1) посредством использования заявленного способа стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, заключающегося в однократном наложении эффективного количества лекарственного средства на основе везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток, заключенных в фибриновый матрикс в острый и/или промежуточный и/или хронический периоды травматического процесса спинного мозга;
2) посредством однократного и/или многократного внутривенного и/или интратекального введения эффективного количества лекарственного средства на основе везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток и растворенных в физиологическом растворе (0,9% NaCl) в острый и/или промежуточный и/или хронический периоды травматического процесса спинного мозга.
Сущностью заявленного технического решения является способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, включающий введение эффективного количества лекарственного средства на основе везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток жировой ткани. Способ по п. 1, отличающийся тем, что лекарственное средство вводят путем наложения на область повреждения в составе фибринового матрикса. Способ по п. 1, отличающийся тем, что лекарственное средство вводят внутривенно. Способ по п. 1, отличающийся тем, что лекарственное средство вводят интратекально. Способ по п. 1, отличающийся тем, что введение лекарственного средства является комбинированным: путем наложения на область повреждения в составе фибринового матрикса и внутривенно; интратекально и внутривенно. Способ по п. 1, отличающийся тем, что введение лекарственного средства осуществляют в острый период после травматического повреждения спинного мозга. Способ по п.1, отличающийся тем, что введение лекарственного средства осуществляют в промежуточный период после травматического повреждения спинного мозга. Способ по п.1, отличающийся тем, что введение лекарственного средства осуществляют в хронический период после травматического повреждения спинного мозга. Способ по п. 1, отличающийся тем, что введение лекарственного средства осуществляют многократно в различные посттравматические периоды: острый и/или промежуточный и/или хронический.
Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг.1 - Фиг.4.
На Фиг.1 представлены результаты поведенческого теста «ВВВ» в баллах (ось Y) на протяжении 60 суток эксперимента (ось Х) по Примеру 3 (Изучение влияния на нейрорегенерацию введения везикул мезенхимных стволовых клеток на модели дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы: нанесение везикул, заключенных в фибриновый матрикс, и внутривенное введение), где:
ВВВ – показатель восстановления двигательной функции,
ТСМ – травма спинного мозга,
Тissucol – применяемый вариант фибринового матрикса,
MVs – микровезикулы,
Красные точки – показатели 1 контрольной группы (ТСМ без терапии),
Салатовые точки – показатели 2 контрольной группы (ТСМ+Tissucol),
Зеленые точки – показатели 1 опытной группы (ТСМ+Tissucol+5 мкг MVs),
Голубые точки – показатели 2 опытной группы (ТСМ+Tissucol+10 мкг MVs),
Фиолетовые точки – показатели 3 опытной группы (ТСМ+10 мкг MVs).
На Фиг.2 представлены результаты морфометрического анализа (% сохранной ткани, ось Y) в эпицентре травмы и на расстоянии 5 мм в ростральном и каудальном направлении от эпицентра (ось Х) по Примеру 3 (Изучение влияния на нейрорегенерацию введения везикул мезенхимных стволовых клеток на модели дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы: нанесение везикул, заключенных в фибриновый матрикс, и внутривенное введение), где:
k - каудальное направление от эпицентра травмы,
p - ростральное направление от эпицентра травмы,
LS Means - средние оценки, полученные методом наименьших квадратов,
Красные ромбы - показатели 1 контрольной группы (ТСМ без терапии),
Салатовые ромбы - показатели 2 контрольной группы (ТСМ+Tissucol),
Зеленые ромбы - показатели 1 опытной группы (ТСМ+Tissucol+5 мкг MVs),
Голубые ромбы - показатели 2 опытной группы (ТСМ+Tissucol+10 мкг MVs),
Фиолетовые ромбы - показатели 3 опытной группы (ТСМ+10 мкг MVs).
На Фиг.3 приведена Таблица 1, в которой представлены первичные и вторичные антитела, используемые для проточной цитофлуориметрии, необходимой для оценки экспрессии мезенхимальных маркеров в получаемой культуре клеток, где:
CD 73, CD34, CD45 - первичные антитела,
Thy-1 (CD90) конъюгированные с РЕ/Су5, CD 44 конъюгированные с APC/Cy7, CD 29 конъюгированные с РЕ, Stro-1 конъюгированные с PerCP-Cy5.5 - первичные антитела, конъюгированные с флуоресцентной меткой,
IgG против мыши конъюгированные с Alexa 546 - вторичные антитела.
На Фиг.4 представлены результаты поведенческого теста «PTIBS» в баллах (ось Y) на протяжении 12 недель эксперимента (ось Х) по Примеру 4 (Изучение влияния на нейрорегенерацию введения везикул мезенхимных стволовых клеток на модели дозированной контузионной травмы спинного мозга свиньи: интратекальное введение), где:
PTIBS - показатель восстановления двигательной функции,
ТСМ - травма спинного мозга,
MVs - микровезикулы,
Красная линия - показатели опытной группы (ТСМ+300 мкг MVs),
Синяя линия - показатели контрольной группы (ТСМ).
Далее заявителем приведено описание осуществления заявленного способа.
Заявленный способ стимулирования регенерации спинного мозга реализуется путем: наложения эффективного количества лекарственного средства на основе везикул (далее - везикул), полученных из мезенхимных стволовых клеток и заключенных в фибриновый матрикс, на область повреждения; введения везикул внутривенно; введения везикул интратекально - в острый и/или промежуточный и/или хронический периоды. В качестве фибринового матрикса могут выступать коммерческие препараты (например, Tissucol (Baxter), EVICEL (J&J Medical Devices), которые заявители покупают у официальных представителей фирмы производителя для последующего применения в составе предлагаемой терапии.
Эффективность заявленного способа иллюстрируется на Фиг.1 и Фиг.4, где представлены результаты поведенческого теста.
На Фиг.1 показано, что в группах с наложением везикул в количестве 5 и 10 мкг, заключенных в фибриновый матрикс, и в группе с внутривенным введением везикул в количестве 10 мкг, показатели функционального восстановления выше, чем в контрольных группах с отсутствием введения или с наложением только фибринового матрикса.
На Фиг.4 показано, что в группах с интратекальным введением везикул показатель двигательной активности был достоверно выше, чем в контрольной группе без терапии.
На Фиг.2 представлены результаты морфометрического анализа в эпицентре травмы и на расстоянии 5 мм в ростральном и каудальном направлении от эпицентра. Показано, что в опытных группах с наложением везикул в количестве 10 мкг, заключенных в фибриновый матрикс, и с внутривенным введением такого же количества везикул, процент сохранной ткани больше по сравнению с остальными группами. Достоверная разница наблюдалась между двумя вышеназванными группами и группой с травмой без наложения и введения чего-либо.
Ниже заявителем приведены примеры конкретного выполнения заявленного способа.
Пример 1. Получение мезенхимных стволовых клеток из жировой ткани и оценка экспрессии в них мезенхимальных маркеров.
1а) Получение МСК из жировой ткани крысы.
Мезенхимные стволовые клетки забирают из аллогенного материала - жировой ткани крысы.
Для забора жировой ткани крысы выполняют антисептическую обработку операционного поля в области живота. Хирургические манипуляции на крысах проводят после их наркотизирования путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma) (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г). Жировую ткань (аллогенный материал) собирают в асептических условиях в операционной в стерильный контейнер с 0,9% NaCL. Жировую ткань гомогенизируют, промывают центрифугированием с 0,9% NaCL в течение 10 мин при 1500 оборотах/мин. Затем инкубируют в 0,2% растворе коллагеназы из панкреаса краба (Биолот) при 37°С в течение 1 часа при постоянном помешивании (на качающейся платформе). Затем гомогенат центрифугируют и ферментативный раствор декантируют. Клеточный осадок ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS, ПанЭко) и центрифугируют, как описано выше, для удаления остаточных ферментов. Полученные клетки культивируют в среде α-MEM с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина (все получено из ПанЭко).
Для проведения проточной цитофлуориметрии и оценки экспрессии мезенхимальных маркеров полученные клетки отмывают от трипсина и питательной среды в растворе фосфатно-солевого буфера (PBS, ПанЭко) методом центрифугирования 2 раза по 3 мин при 500 g. Далее клетки инкубируют с первичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре (Таблица на Фиг.3). Отмывают клетки и инкубируют со вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре (Таблица на Фиг.3). Таблица на Фиг.3 иллюстрирует применяемые первичные и вторичные антитела, необходимые для проведения проточной цитофлуориметрии и оценки экспрессии мезенхимальных маркеров полученных клеток. Далее клетки фиксируют в 10% растворе формалина в течение 30 минут и отмывают в растворе PBS методом центрифугирования 2 раза по 3 мин при 500 g. Результаты анализируют при помощи проточного цитофлуориметра FACS Aria III (BD Biosciences).
Необходимость экспрессии CD90 и CD73 считается преимущественной и более 90-95% клеток в популяции мезенхимных стволовых клеток должны экспрессировать данные поверхностные маркеры [Dominici, M. et al (2006). Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 8(4), 315-317.]. Проведенный анализ экспрессии поверхностных мезенхимальных маркеров в первичной культуре показывает следующий уровень экспрессии CD90 и CD73 - 99.9±0.17% и 94±0.5%, соответственно. Уровень экспрессии других мезенхимальных маркеров в полученной культуре клеток составляет: CD44 - 98.4±2.9%, CD29 - 88±4%, Stro-1 - 93.2±12.8%. Во всех полученных культурах клеток экспрессия CD34 и CD45 установлена ниже порогового <2%.
1б) Получение МСК из жировой ткани свиньи.
Получение мезенхимных стволовых клеток из жировой ткани свиньи проводят аналогично Примеру 1а, за исключением того, что для получения мезенхимных стволовых клеток забирают аутологичный материал - жировую ткань свиньи.
Проведенный анализ экспрессии поверхностных мезенхимальных маркеров в первичной культуре показывает следующий уровень экспрессии: CD90 - 94.5±3.7%, CD73 - 92±2.5%, CD44 - 86.7±8.9% и CD29 - 63±9.5%. Во всех полученных культурах клеток экспрессия CD34 и CD45 установлена ниже порогового <2%.
Пример 2. Получение везикул из мезенхимных стволовых клеток.
Полученные по Примеру 1а или 1б клетки культивируют до плотности монослоя 90-95%. После этого питательную среду удаляют, клетки промывают в DPBS и переводят в суспензию путем обработки 0,25% раствором трипсина. Инактивацию трипсина проводят добавлением среды DMEM, содержащей 10% телячью сыворотку. Для удаления остатков сыворотки клетки промывают DPBS. Далее клетки инкубируют в среде DMEM без сыворотки, содержащей 10 мкг/мл цитохалазина B (Sigma-Aldrich) в течение 30 мин (37°C, 5% CO2). После инкубации суспензию клеток подвергают активному перемешиванию на вортексе в течение 60 сек и осаждают центрифугированием (50 g в течение 10 минут). Полученный супернатант подвергают двум последующим этапам центрифугирования (100 g в течение 10 минут и 8000 g в течение 15 минут) и далее фильтрации. Полученный осадок, который содержит везикулы, ресуспензируют в физиологическом растворе. Полученный продукт - везикулы мезенхимных стволовых клеток - является лекарственным средством, который используют для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга (Пример 3, Пример 4).
Пример 3. Изучение влияния на нейрорегенерацию введения лекарственного средства на основе везикул мезенхимных стволовых клеток на модели дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы: нанесение везикул, заключенных в фибриновый матрикс и внутривенное введение.
Эксперименты проводятся на взрослых самках крыс Wistar (вес 250-300 г; Лаборатория Пущино), животные содержатся в прозрачных пластиковых клетках (12 ч дневной цикл) со свободным доступом к еде и воде. Хирургические манипуляции на крысах проводят под общим наркозом с использованием изофлурана (1.3%) и золетила (20 мг/кг, Virbac Sante Animale). После проведения ламинэктомии, всем животным наносят дозированную контузионную травму спинного мозга (ТСМ) средней степени тяжести (2,5 м/с) на уровне Th8 при помощи прибора Impact One Stereotaxic Impactor (Leica).
Животные были разбиты на 3 опытные и 2 контрольные группы по 15 особей в каждой группе, введение лекарственного средства на основе везикул (далее - везикул) проводилось сразу после травмы (в острый период):
- животным 1 опытной группы (ТСМ+Tissucol+5 мкг MVs) сразу после травмы наносят 5 мкг везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток (МСК) по Примеру 1а и заключенных в фибриновый матрикс Tissucol (Baxter);
- животным 2 опытной группы (ТСМ+Tissucol+10 мкг MVs) по аналогии с предыдущей группой наносят 10 мкг везикул, заключенных в фибриновый матрикс;
- животным 3 опытной группы (ТСМ+10 мкг MVs) внутривенно вводят 10 мкг везикул, полученных из МСК по Примеру 1а;
- животным 1 контрольной группы (ТСМ) терапию везикулами не проводят;
- животным 2 контрольной группы (ТСМ+Tissucol) на область повреждения спинного мозга наносят фибриновый матрикс без заключения в него везикул.
После операции все крысы получают ежедневные внутримышечные дозы гентамицина (25 мг/кг) в течение 7 дней.
Для оценки эффективности восстановления двигательной функции использовали поведенческую шкалу «ВВВ» [Basso, D. et al. (1995). A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of neurotrauma, 12(1), 1-21]. «ВВВ» представляет собой 20-бальную шкалу, где наименьший балл «0» соответствует отсутствию движений в конечностях и поддержания веса тела, а наибольший балл «20» соответствует нормальной ходьбе с поддержанием веса тела. Для осуществления теста «ВВВ» применяют метод открытого поля. Исходные показатели для каждого животного получают за три дня до операции. Чтобы оценить различия в функциональном восстановлении, поведенческую оценку во всех группах проводят перед нанесением травмы, затем на 7 день, а затем каждый второй день. Двигательную активность оценивают одновременно два наблюдателя, которые не являются осведомленными о принадлежности животных к той или иной экспериментальной группе. Окончательные баллы получают путем усреднения двух баллов, присуждаемых наблюдателями.
Электрофизиологические исследования проводили на интактных крысах, а затем на 30 и 60 сутки после ТСМ. У исследуемых животных регистрируют М-ответ и Н-ответ икроножной мышцы при стимуляции седалищного нерва. В качестве активного и референтного электрода используют монополярные игольчатые электроды. Активный электрод вводится в середину мышечного брюшка, референтный в область мышечно-сухожильного перехода. Электрическая стимуляция седалищного нерва осуществляется прямоугольными одиночными стимулами длительностью 0,2 мс. Для стимуляции используют пару монополярных игольчатых электродов, введенных подкожно в области выхода седалищного нерва из таза.
После регистрации М- и Н-ответов проводят транскраниальную электрическую стимуляцию коры головного мозга при помощи подкожных игольчатых электродов для регистрации двигательных вызванных потенциалов (ДВП). Регистрирующие электроды остаются в передней большеберцовой или икроножной мышце. Стимуляцию коры производят игольчатыми электродами, введенными под кожу скальпа до контакта с костью черепа. Катод располагается по средней линии на 0,5 см каудальнее межглазничной линии, анод по средней линии у затылочной кости. Используют стимул длительностью от 0,04 до 0,1 мс, интенсивностью от 20 до 500 В.
Для оценки состояния задних столбов спинного мозга применяют оценку соматосенсорных вызванных потенциалов (ССВП). Регистрацию проводят при помощи подкожных монополярных игольчатых электродов: с поясничного уровня с расположением активного электрода на уровне верхнепоясничных позвонков, референтного электрода на уровне среднегрудных позвонков; с коры головного мозга при положении катода над вертексом, анода над передней частью головы. Осуществляют электрическую стимуляцию хвоста при помощи кольцевидных электродов и накожным стимулирующим электродом стимулами длительностью 0,2 мс, частотой 3 Гц. Интенсивность стимула подбирают по сокращениям хвоста (используют наименьший стимул, вызывающий сокращение мышцы).
Через 60 суток после проведения операции и проведения терапии, выделяют спинной мозг предварительно перфузированных 4% формалином животных. Криостатные поперечные срезы спинного мозга на протяжении 5 мм от эпицентра травмы в ростральном и каудальном направлении окрашивают при помощи азур-эозина. Окрашенные срезы заключают в витрогель и изучают при помощи светового сканирующего микроскопа APERIOCS2 (Leica).
1. Тестирование двигательной функции при помощи поведенческой шкалы «ВВВ».
В ходе обработки полученных данных было показано, что в опытных группах с применением везикул показатель двигательной активности был выше (см. Фиг. 1, зеленые, голубые, фиолетовые точки), чем в контрольных (см. Фиг. 1 красные, салатовые точки). В частности, наибольший средний показатель выявлен в группе ТСМ+10 мкг MVs (3 опытная группа, фиолетовые точки), где показатель восстановления двигательной функции (ВВВ) возрастает более чем в 2 раза (статистически достоверные различия были обнаружены при Р<0,05) по сравнению с соответствующим показателем у крыс контрольной группы (ТСМ без терапии, красные точки).
2. Морфометрия области повреждения спинного мозга
В ходе анализа площади сохранной ткани и суммарной площади патологических полостей, а также применения регрессионной модели было установлено (см. Фиг. 2), что при наложении 10 мкг везикул, заключенных в фибриновый матрикс (2 опытная группа, ТСМ+Tissucol+10 мкг MVs, голубые ромбы) и внутривенном введении 10 мкг везикул (3 опытная группа, ТСМ+10 мкг MVs, фиолетовые ромбы) процент сохранной ткани был выше (статистически достоверные различия были обнаружены при Р<0,05) по сравнению с соответствующим показателем у крыс контрольной группы (ТСМ без терапии, красные ромбы).
3. Исследование электрофизиологических изменений
В ходе проведенных экспериментов было выяснено, что во всех группах отсутствовали различия по параметрам М-ответа, что указывало на сохранность поясничного отдела спинного мозга и седалищного нерва у экспериментальных животных. Тем самым можно сделать вывод о локальности и частично однородности повреждения спинного мозга в разных экспериментальных группах.
Был обнаружен более высокий процент регистрации ДВП в опытных группах с применением терапии микровезикулами, чем в контрольных, что может указывать на их положительное влияние на проводимость двигательных путей спинного мозга. Также на лучшую проводимость по двигательным путям спинного мозга указывают большие значения амплитуды в опытных группах с применением терапии микровезикулами по сравнению с контрольными группами. Амплитуда ДВП отражает количество аксонов двигательного пути проводящих импульс от коры на периферию. Таким образом, можно сделать вывод о том, что большая амплитуда свидетельствует либо о выживании большего числа аксонов, либо о меньшей выраженности блока проведения (лучшая сохранность, либо восстановление миелина) по двигательным путям в опытных группах с применением терапии микровезикулами.
В группах с применением везикул (ТСМ+Tissucol+10 мкг MVs и ТСМ+10 мкг MVs) обнаружена тенденция к снижению амплитуд ДВП тех ответов, которые имелись на 30 стуки и сохранились к 60 суткам. Данные процессы можно объяснить течением травматической болезни спинного мозга и возможностью введения везикул в отсроченные периоды течения заболевания - промежуточный и хронический периоды, что подтверждает заявленную формулу изобретения.
Пример 4. Изучение влияния на нейрорегенерацию введения лекарственного средства на основе везикул мезенхимных стволовых клеток на модели дозированной контузионной травмы спинного мозга свиньи: интратекальное введение в острый, промежуточный и хронический периоды.
Эксперименты проводятся на половозрелых самках вьетнамских вислобрюхих свиней (вес 9-12 кг, возраст 3-4 месяца), животные содержатся в отдельных загонах со стандартным суточным режимом, в соответствии с зоогигиеническими и ветеринарно-санитарными требованиями. Хирургические манипуляции на свиньях проводят после их наркотизирования с использованием интубационного наркоза, соответствующей предоперационной подготовкой и адекватным обезболиванием. Премедикацию осуществляют ксилазином (в/м, 0,6 mg/kg) и кетамином (5 mg/kg). После индукции пропофолом (2-6 mg/kg) проводят эндотрахеальную интубацию с поддержкой изофлюраном (1,3 %) в течении всего хода операции. После проведения ламинэктомии, всем животным наносят дозированную контузионную травму вертикально падающим металлическим стержнем весом 50 г с высоты 40 см с последующей компрессией 100 г грузом в течение 5 минут.
Животные были разбиты на опытную и контрольную группы по 5 особей в каждой группе.
Введение лекарственного средства на основе везикул (далее - везикул) проводилось многократно, как в острый (через 1 неделю после травмы), промежуточный (через 3 и 6 недель после травмы) и хронический (через 8 недель после травмы) периоды:
- животным опытной группы (ТСМ+300 мкг MVs) через 1, 3, 6 и 8 недель после травмы вводят интратекально по 300 мкг везикул, полученных из МСК по Примеру 1б;
- животным контрольной группы (ТСМ) терапию везикулами не проводят.
После операции все свиньи получают ежедневные внутримышечные дозы цефазолина (25 мг/кг) в течение 5 дней.
Для оценки эффективности восстановления двигательной функции используют поведенческие шкалы «PTIBS» и «PNM» [Lee, J. H. et al. (2013). A novel porcine model of traumatic thoracic spinal cord injury. Journal of Neurotrauma, 30, 142-159; Navarro, R. et al. (2012). Chronic Spinal Compression Model in Minipigs: A Systematic Behavioral, Qualitative, and Quantitative Neuropathological Study. Journal of neurotrauma, 29, 499-513]. «PTIBS» представляет собой 10-бальную шкалу, где наименьший балл «1» соответствует отсутствию движений в конечностях, крестец и колени не отрываются от пола, а наибольший балл «10» соответствует нормальной ходьбе с поддержанием веса тела. «PNM» представляет собой 14-бальную шкалу, где наименьший балл «0» соответствует полной параплегии с отсутствием движения в обеих нижних конечностях и хвосте, а наибольший балл «14» соответствует способности самопроизвольного вставания на задние конечности с устойчивым передвижением, последовательным подошвенно-копытным шагом и согласованной координацией передних и задних конечностей.
1. Тестирование двигательной функции при помощи поведенческой шкалы «PTIBS» и «PNM».
В ходе обработки полученных данных было показано, что в опытной группе с применением везикул показатель двигательной активности по поведенческой шкале «PTIBS» был достоверно выше (Р<0,05) с 9 недели эксперимента (см. Фиг. 4 красная линия), чем в контрольной (см. Фиг. 1 синяя линяя). Также наибольший средний показатель двигательной активности по поведенческой шкале «PNM» был выявлен в опытной группе с применением везикул, где данный показатель возрастает в 2,5 раза (Р<0,05) по сравнению с соответствующим показателем у свиней контрольной группы (ТСМ без терапии).
Количество лекарственного средства на основе везикул должно быть эффективным, то есть таким, при котором достигается стойкий терапевтический эффект, при этом эффективное количество зависит от многих факторов - периода и тяжести посттравматического процесса, способов введения везикул, веса реципиента и др. Эффективное количество подбирается опытным путем индивидуально в каждом конкретном случае.
Таким образом, основываясь на результатах исследования, представляется возможным сделать вывод о том, что заявленный способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, заключающийся в наложении эффективного количества лекарственного средства на основе везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток, заключенных в матрикс, на область повреждения, и/или введенных внутривенно, и/или введенных интратекально в - острый и/или промежуточный и/или хронический периоды после травмы позволяет эффективно стимулировать посттравматическую регенерацию спинного мозга, что проявляется в виде улучшения показателя восстановления двигательной функции, что подтверждено функциональным тестированием (как на модели с крысами, так и свиньями) и электрофизиологическими методами, а также увеличения сохранности ткани.
Улучшение указанных выше структурных и функциональных показателей свидетельствует о позитивном влиянии применяемой терапии на посттравматическую регенерацию спинного мозга и обеспечении более полного восстановления структур спинного мозга, ответственных за выполнение двигательной и чувствительной функций.
При этом, исходя из изложенного выше, заявитель делает логический вывод, что, поскольку заявленный технический результат достигнут на примерах раздельного использовании вариантов наложения и введения лекарственного средства на основе везикул мезенхимных стволовых клеток, то для усиления терапевтического эффекта при тяжелой степени травматического повреждения спинного мозга заявленный технический результат может быть достигнут и даже усилен при комбинированном использовании всех вариантов введения лекарственного средства:
- введение лекарственного средства может быть осуществлено путем одновременного наложения на область повреждения в составе фибринового матрикса и/или внутривенного и/или интратекального введения;
- введение лекарственного средства может быть осуществлено многократно в различные посттравматические периоды: острый и/или промежуточный и/или хронический.
Таким образом, заявителем впервые:
• разработан способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга, заключающийся в наложении на область повреждения эффективного количества лекарственного средства на основе везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток и заключенных в фибриновый матрикс и/или во внутривенном введении и/или введенных интратекально в различные периоды после травмы - острый и/или промежуточный и/или хронический;
• показан нейрорегенераторный (электрофизиологические показатели, функциональное и структурное восстановление) эффект терапии, заключающейся в наложении на область повреждения эффективного количества лекарственного средства на основе везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток и заключенных в фибриновый матрикс, и/или во внутривенном введении, и/или введенных интратекально в различные периоды после травмы - острый и/или промежуточный и/или хронический.
Заявленное техническое решение позволяет обеспечить реализацию поставленных целей и заявленных технических результатов, а именно повышение эффективности стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга за счет возможности раздельного или комбинированного использования (наложение на область повреждения в составе фибринового матрикса, внутривенное и интратекальное введение), а также в различные посттравматические периоды (острый, промежуточный, хронический) эффективного количества лекарственного средства на основе везикул, полученных из мезенхимных стволовых клеток, в клинических условиях, а именно - более полное восстановление структуры и функций спинного мозга человека, и повышение доступности способа лечения, заключающегося в возможности применения аллогенного клеточного материала.
Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как на дату предоставления заявочных материалов заявителем из исследованного уровня техники не выявлена заявленная совокупность признаков с идентичными заявленному техническому решению признаками.
Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, т.к. совокупность заявленных признаков обеспечивает получение неочевидных для специалиста технических результатов.
Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «промышленная применимость», предъявляемого к изобретениям, т.к. было апробировано на практике при проведении доклинических исследований, в результате которых были реализованы все цели и технические результаты, поставленные в заявленном техническом решении, а именно - реализовано более полное восстановление структуры и функций спинного мозга.