Перекисное окисление липидов в легочной ткани крыс разного возраста в условиях острого эмоционально-болевого стресса

Нестеров Ю.В.

ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ КРЫС РАЗНОГО ВОЗРАСТА В УСЛОВИЯХ ОСТРОГО ЭМОЦИОНАЛЬНО-БОЛЕВОГО СТРЕССА

На модели острого эмоционально-болевого стресса (электрокожное раздражение) изучена стресс-чувствительность легочной ткани в отношении перекисного окисления липидов у экспериментальных животных разных возрастных групп (неполовозрелые 6-недельные, половозрелые 6-месячные и старые 25-месячные). Выявлены органоспецифичные и возрастные особенности стресс-индуцированного сво-боднорадикального окисления липидов. Показано, что на раннем этапе постнатального онтогенеза легкие обладают большей стресс-устойчивостью к перекисному окислению липидов, значительная активация которого в стрессированной печени имеет место у животных всех возрастных групп.

Проблема стресса и его реализации на уровне отдельных органов по-прежнему остается актуальной для современной физиологии и медицины. Общеизвестно, что ключевым звеном в патогенезе стрессорного повреждения органов и тканей является интенсификация перекисного окисления липидов (ПОЛ) [4, 5, 7]. В то же время остаются малоизученными органоспецифические особенности свободнорадикальных реакций, и в частности стресс-реактивность легочной ткани в отношении ПОЛ. Есть все основания полагать, что ПОЛ и его регуляция должны иметь особое значение для респираторной системы, что связано с большой интенсивностью липидного обмена в легких и тесной зависимостью функций аэрогематического барьера от структуры альвеолярных фосфолипи-дов [3, 6, 18, 20]. Кроме того, легочную ткань из-за многочисленных альвеол и капиллярно-альвеолярных контактов рассматривают как одну из наиболее обширных биологических «мембран» в организме, внешняя поверхность которой постоянно и непосредственно контактирует с кислородом и другими инициаторами ПОЛ [12].

Исследование состава липидов органов и тканей в процессе развития является одной из актуальных задач, принимая во внимание значимость ли-пидных нарушений в патогенезе большого числа заболеваний, в том числе легочной системы. Однако работы, посвященные исследованию возрастной динамики процессов ПОЛ в организме, единичны, и практически отсутствуют данные об онтогенетических особенностях стресс-чувствительности легких к свободнорадикальному окислению липидов.

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы было изучение в эксперименте уровня пе-рекисного окисления липидов в легочной ткани и, для сравнения, в печени в условиях острого стрес-сорного воздействия у животных разного возраста.

Материал и методы исследования

Опыты поставлены на 52 крысах-самцах линии Вистар трех возрастов: неполовозрелых 6-не-

дельных средней массой 84 г (1-я группа), половозрелых 6-месячных средней массой 204 г (2-я группа) и старых 25-месячного возраста средней массой 360 г (3-я группа). Показатели ПОЛ изучались на модели эмоционально-болевого стресса, вызванного электрокожным раздражением (ЭКР) [2]. Животных помещали в камеру с решетчатым металлическим полом куда подавали электрический ток напряжением 30 В в течение 30 мин с интервалами в 30 секунд. Сразу после воздействия животных забивали под нембуталовым наркозом (в дозе 5 мг/100 г массы тела внутрибрюшинно). Контролем служили интактные крысы. Для подтверждения развития стресса изучали показатели стресс-реактивности животных - эозинопеничес-кая проба, содержание адреналина в крови и относительная масса надпочечников (по отношению к массе тела). Количество эозинофильных грануло-цитов в крови определяли после их окрашивания жидкостью Дунгера с последующим подсчетом в камере Горяева [17]. Количество адреналина в крови, забираемой после декапитации, определяли по методу [22] с применением реактива Фолина.

Критериями оценки уровня пероксидного окисления липидов в легочной ткани и печени были содержание в гомогенатах тканей промежуточного и конечного продуктов ПОЛ, а также скорость спонтанного и индуцированного аскорбатзависи-мого ПОЛ. Гидроперекиси липидов (ГПЛ) определяли родановым методом, основанным на получении розовой окраски при взаимодействии ГПЛ с роданистым аммонием в присутствии этанола и соляной кислоты с последующим колориметрическим измерением при X =480 [19]. Определение малонового диальдегида (МДА) и кинетических характеристик процесса ПОЛ проводили тиобар-битуровым методом, основанным на взаимодействии МДА с тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного в розовый цвет триметино-вого комплекса, имеющего максимум поглощения при X=532 [19]. При этом пробы инкубировали при 37°С в присутствии ионов железа и аскорбата, для

чего использовали 4-10-5 М раствор соли Мора и 2,6 мМ раствор аскорбиновой кислоты. Концентрацию ГПЛ выражали в ед/0,05 г, МДА - в нмоль/ 0,05 г сырого веса тканей, скорость спонтанного (Сп.ПОЛ) и индуцированного (Аз.ПОЛ) окисления - в нмоль образовавшегося МДА в пробе за час инкубации. Данные обработаны статистически с использованием критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

По эозинопеническому критерию воздействие электрическим током оказалось стресс-реализу-ющим у неполовозрелых и половозрелых 6-месячных крыс, что выражалось в снижении числа эози-нофилов в крови соответственно на 41% (р<0,001) и 16% (р<0,02) по сравнению с контролем. Достоверного изменения этого показателя у старых крыс не выявлено. Анализ крови на содержание адреналина выявил его увеличение после ЭКР -на 34,8% (р<0,05) у 6-месячных, 16,6% (р<0,001) у 25-месячных и 5,9% (р<0,05) у 6-недельных крыс. При этом исходный уровень катехоламина в крови крысят был значительно выше, чем у взрослых животных (р<0,001). Достоверных изменений относительной массы надпочечников выявить не удалось, хотя тенденция к ее увеличению наблюдалась у 2-й и 3-й возрастной группы животных.

Однократное 30-минутное электрораздражение отразилось на интенсивности ПОЛ в легочной ткани 2-й группы животных. Это подтверждалось соответствующими изменениями всех изучаемых параметров. Так, после ЭКР содержание в легких ГПЛ увеличилось по сравнению с контролем в 7 раз, МДА - в 2 раза. Скорость спонтанного ПОЛ повысилась на фоне стресса почти в 2 раза, а индуцированного аскорбатзависимого -

более чем в 3 раза (табл. 1). У старых крыс (3-я группа) острый стресс сопровождался выраженным накоплением в легочной ткани промежуточного продукта пероксидного окисления - ГПЛ, их содержание после стресса увеличилось на 68,8% (р<0,01). Обращает на себя внимание значительно высокий исходный уровень ГПЛ в легких старых крыс, более чем в 6 раз превышающий таковой у крысят (р<0,001) и 6-месячных (р<0,001). Достоверных изменений в содержании МДА и кинетических характеристик ПОЛ у животных этой группы не выявлено, хотя скорость спонтанного и аскорбатзависимого окисления тенденциозно возрастала на 19,4% и 15,2% соответственно. При этом стрессорных изменений этих показателей в легких неполовозрелых крыс выявить не удалось (таблица 1).

В ходе эксперимента обнаружена значительная стресс-индуцированная активация ПОЛ в печени животных. У крыс 2-й возрастной группы содержание МДА в печеночной ткани после ЭКР повышалось с 3,17±0,40 до 5,10±0,38 нмоль/0,05 г (р<0,01), скорость Сп.ПОЛ - с 15,0±2,46 до 37,35±4,95 (р<0,001), а Аз.ПОЛ - с 36,84±7,1 до 74,4±8,43 нмоль МДА/ч (р<0,01). У старых животных эти параметры повышались на фоне стресса соответственно на 58,4% (р<0,01), 104% (р<0,01) и 80,6% (р<0,001). Печень крысят, в отличие от их легких, как и у взрослых животных, ответила на стресс значительным усилением скорости процессов ПОЛ. Концентрация МДА и скорость ее спонтанного нарастания после ЭКР у молодых животных были такими же, как у половозрелых крыс, повышаясь соответственно на 38% (р<0,01) и 92,7% (р<0,001). Скорость индуцированного аскорбатза-висимого ПОЛ увеличивалась на 45,8% (р>0,05). При этом как исходные, так и стрессорные значе-

Таблица 1. Показатели перекисного окисления липидов в легочной ткани в условиях острого эмоционально-болевого стресса у крыс разных возрастных групп

Показатели Н е п о X о в о з р е X ы е П о X о в о з р е X ы е С т а р ы е

Контроль Стресс КонтроХь Стресс КонтроХь Стресс

ГПЛ, ед/0,05 г 0,043±0,013 0,095±0,029 0,048±0,017 0,348±0,067 0,308±0,040 0,52±0,038

Р >0,05 <0,001 <0,01

МДА, нмоХь/0,05 г 2,02±0,30 3,44±1,06 1,46±0,22 2,74±0,50 1,35±0,19 1,22±0,12

Р >0,05 <0,05 >0,5

Сп.ПОЛ, нмоХь МДА/ч 8,35±1,26 6,60±0,92 8,39±1,21 15,79±1,33 5,82±0,54 6,95±0,89

Р >0,05 <0,01 >0,05

Аз.ПОЛ, нмоХь МДА/ч 13,0±4,57 19,4±4,09 7,88±1,10 25,72±6,70 6,63±0,92 7,64±1,12

Р >0,05 <0,05 >0,05

Примечание: р дано в сравнении с контролем.

Естественные науки

ния этих показателей в печени в 2-5 раз превышали таковые в легочной ткани.

Таким образом, острый стресс эмоционально-болевой модальности вызывает значительное усиление перекисного окисления липидов в ткани легких только взрослых крыс, причем более выраженное у животных 6-месячного возраста.

Литературные данные дают основание считать, что активация свободнорадикального окисления и нарушение соотношения в системе перекисное окисление/антиоксиданты имеют важное значение в обеспечении адаптационных реакций на повреждающие воздействия окружающей среды [8, 10, 11]. Показано, что именно в острую фазу адаптации интенсифицируются процессы ПОЛ и происходят изменения в активности антиоксидантов - угнетение активности супероксиддисмутазы, неоднозначная направленность и индивидуальные различия в каталазной активности [23]. И только с увеличением сроков адаптации отмечается мобилизация этих ферментов, направленная на поддержание сбалансированности между интенсивностью генерации продуктов ПОЛ и активностью антиоксидан-тной системы (АОС) организма. Обнаружено также нарушение соотношения активности про- и ан-тиоксидантных систем сердца в процессе развития экспериментального стресса у крыс [9]. Авторы полагают, что стресс реализует свое действие на липидный обмен путем активации выброса кате-холаминов, которые увеличивают содержание в тканях цАМФ, что в свою очередь ведет к повышению активности липаз, проявлению разрушающего действия на мембраны лизофосфолипидов и активацию ПОЛ.

Можно полагать, что интенсификация перекис-ного окисления липидов в легких при остром электрокожном раздражении приводит к возникновению относительной недостаточности функции внутриорганной антиоксидантной системы.

По наблюдениям некоторых авторов, процессы перекисного окисления липидов имеют возрастные особенности. Так, показано, что у старых крыс существенно снижена по сравнению с молодыми активность супероксиддисмутазы в мозге, тогда как уровень диеновых коньюгатов и ПОЛ не изменяются. Не изменяется с возрастом в мозге и антиокислительная активность (АОА). В печени старых животных отмечено увеличение концентрации шиффовых оснований и продуктов пе-рекисного окисления белков и значительное снижение активности супероксиддисмутазы, при этом уровень диеновых коньюгатов и общая АОА в печени с возрастом не изменяются. В сыворот-

ке крови с возрастом увеличивается содержание продуктов ПОЛ и перекисного окисления белков [1]. Обнаружено также, что эмоционально-болевой стресс приводит к активации спонтанного и индуцированного ПОЛ в микросомах печени, более выраженной у взрослых животных по сравнению со старыми крысами [14]. Эти данные свидетельствуют как о существенном изменении с возрастом активности свободнорадикальных процессов в организме животных, так и об органных особенностях их динамики.

Проведенный нами анализ стресс-реактивности легких на модели острого эмоционально-болевого воздействия показал ареактивность неполовозрелых, 6-недельных крыс в отношении ПОЛ. Правильнее будет определить это как недостаточную зрелость реактивности к действующему фактору на данном этапе онтогенеза, что, несомненно, связано с возрастными особенностями нейро-гормонально-метаболических механизмов регуляции.

Важное значение в адаптации организма к условиям окружающей среды имеет гипоталамо-ги-пофизарно-адренокортикальная система (ГГАКС). Ее адекватная реакция на действие экстремальных факторов обеспечивает повышение общей резистентности организма и возможна лишь благодаря слаженному взаимодействию всех звеньев системы, которое в свою очередь зависит от их функциональной зрелости [13]. Главной причиной активации свободнорадикального окисления при стрессе считают выброс катехоламинов. Их введение животному активирует ПОЛ, ингибиру-ет активность супероксиддисмутазы и повреждает клеточные мембраны. Полагают, что активация ПОЛ и повреждение, например, кардиомиоцитов катехоламинами реализуется через гиперстимуляцию ß -адренорецепторов и через образование активной формы кислорода при аутоокислении адреналина [10, 16].

По нашему мнению, ареактивность легких неполовозрелых животных в отношении ПОЛ при однократном стрессорном воздействии может быть связана с незрелостью различных звеньев ГГАКС, в частности с недостаточным выбросом катехола-минов, связанным с быстрым истощением их запасов в надпочечниках и низким уровнем их ре-синтеза во время стресс-реакции. В пользу этого указывают и наши данные о намного меньшем по сравнению со взрослыми крысами стрессорном уровне адреналина в крови крысят. Также важное значение имеет и недостаточная реактивность органов-мишеней на более ранних этапах онтогене-

за. Известно, что количество рецепторов и их чувствительность к стресс-реализующим гормональным факторам в периферических органах и тканях гораздо ниже в раннем возрасте [21]. Низкая концентрация адренорецепторов на постсинаптичес-ких мембранах в органах, с одной стороны, и не до конца сформированная система внутриклеточных посредников и их метаболизма, с другой, может

обусловливать отсутствие стрессорного ответа на органном уровне у неполовозрелых животных. Наконец, определенную роль может играть более высокий антиоксидантный статус организма неполовозрелых крыс в сравнении со взрослыми. Последнее имеет особое значение в обеспечении резистентности легких к действию экстремальных, стресс-индуцирующих факторов.

Список использованной литературы:

1. Анисимов В.Н., Арутюнян A.B., Опарина Т.И. Возрастные изменения активности свободнорадикальных процессов в тканях и сыворотке крови крыс // Физиол. журнал им. И.М. Сеченова. - 1999. - Т. 85, №4. - С. 502-507.

2. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. - М.: Высшая школа, 1991.

3. Верболович В.П., Петренко Е.П., Подгорный Ю.К. Свободнорадикальные реакции сурфактантнов легкого и ферментативные анти-оксиданты // Сурфактанты легкого в норме и патологии. - Киев: Наука думка, 1983. - С. 98-109.

4. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972.

5. Владимиров Ю.А. Роль нарушения свойств липидного слоя мембран в развитии патологических процессов // Патол. физиол. и эксперим. Терапия. - 1989, №4. - С. 7-18.

6. Дубилей П.В., Уразаева З.В., Хамитов Х.С. Барьерная функция легких и обеспечение гомеостаза. - Казань: Из-во Казанского унта, 1987.

7. Журавлев А.И. Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. - М.: Наука, 1982.

8. Козлов Ю.П. Свободнорадикальное окисление липидов в биомембранах в норме и патологии // Биоантиокислители. - М., 1975. - Т. 1. - С. 5-14.

9. Маркова Е.А, Мисула И.Р. Изменения активности перекисного окисления липидов в миокарде взрослых и старых крыс при стрессе // Патол. физиол. и эксперим. терапия. - 1994, №3. - С. 37-38.

10. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. - М.: Медицина, 1984.

11. Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г. Адаптация к стрессовым ситуациям и физическим нагрузкам. - М.: Медицина, 1988.

12. Мотавкин П.А., Гельцер Б.И. Клиническая и экспериментальная патофизиология легких. М.: Наука, 1998.

13. Ордян Н.Э., Пивина С.Г., Ракицкая В.В., Шаляпина В.Г. «Критические периоды» постнатального онтогенеза в формировании активности гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы // Тез. докл. V Всеросс. конф. «Нейроэндокринология-2000». -С.-Петербург, 2000. - С. 99-100.

14. Парамонтова Г.И., Губский Ю.Н., Горюшко А.Г. и др. Влияние стресса на пероксидное окисление липидов и физико-химическое состояние мембран эндоплазматического ретикулума печени взрослых и старых крыс // Украинский биохим. журнал. - 1996. - т. 68, №5. - С. 47-53.

15. Петрина С.Н., Юшина Л.В. Роль липидов в адаптационных реакциях организма на экстремальные воздействия // Патол. физиол. и эксперим. терапия. - 1989, №3. - С. 51-55.

16. Петрович Ю.А., Гуткин Д.В. Свободнорадикальное окисление и его роль в патогенезе воспаления, ишемии и стресса // Патол. физиол. и эксперим. терапия. - 1986, №5. - С. 85-92.

17. Ронин В.С., Старобинец Г.М. Руководство к практическим занятиям по методам клинических лабораторных исследований. - М.: Высшая школа, 1989.

18. Симбирцев С.А., Беляков Н.А., Ливчак М.Я. Изолированное легкое. - Л.: Медицина, 1983.

19. Строев Е.А., Макарова В.Г. Практикум по биологической химии. - М.: Высшая школа, 1986.

20. Сыромятникова Н.В., Гончарова В.А., Котенко Т.В. Метаболическая активность легких. - Л.: Медицина, 1987.

21. Угрюмов М.В. Нейроэндокринная регуляция в онтогенезе. - М.: Наука, 1989.

22. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. - М.: Просвещение, 1975.

23. Шаназаров А.С., Махновский В.П. Значение реакций перекисного окисления липидов в изменении устойчивости организма к гипоксии // Известия АН КиргССР. Хим.-технол. и биол. науки. - 1987, №1. - С. 85-89.