ШТАММ Pseudomonas aeruginosa RCAM01139 ДЛЯ РАЗЛОЖЕНИЯ НЕФТИ И ДИЗЕЛЬНОГО ТОПЛИВА
STRAIN Pseudomonas aeruginosa RCAM01139 FOR DECOMPOSITION OF OIL AND DIESEL FUEL

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и дизельное топливо, и которая может быть использована для очистки загрязненных почв.
Известен консорциум штаммов углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas aeruginosa НД К3-1 и Pseudomonas fluorescens НД К3-2 (Патент РФ №2312719, C12N 1/26, В09С 1/10, опубл. 2007), который выделен из образцов почв и подземных вод карстовых полостей, отобранных на территории Пермской обл. и используемый для деструкции нефти и нефтепродуктов.
Следует отметить, что выращивание смеси культур, в данном случае консорциума двух штаммов, возможно при больших материальных и энергозатратах, в сравнении с наращиванием биомассы, состоящей из одной культуры клеток микроорганизмов.
Известен штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa ХР-25 (Патент РФ №2270806, C12N 1/20, C02F 3/34, C12R 1/385, опубл. 2006), который был выделен из фенолзагрязненных почв Стерлитамакского нефтехимического завода путем культивирования почвенного образца в минерализованной среде с последующим отбором наиболее активных форм, и используемый для очистки сточных вод химических предприятий от ароматических соединений.
Из представленных в патенте данных следует, что спектр действия штамма Pseudomonas aeruginosa ХР-25 направлен на утилизацию ароматических соединений, в частности фенола, и не распространяется на другие «тяжелые» фракции углеводородов, а также экотоксикантов, таких как спирты, альдегиды, технические масла, жиры и др.
Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств и получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и дизельного топлива, которые являются единственными источниками углерода и энергии.
Для достижения поставленной задачи предложен штамм Pseudomonas aeruginosa 12-Р, выделенный из образца загрязненной нефтью почвы нефтебазы «Ручьи», Санкт-Петербург. Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под номером RCAM01139.
Выделение штамма осуществлялось путем культивирования исходного образца загрязненной нефтью почвы в жидкой минеральной среде с добавлением углеводородов с последующим рассевом на мясопептонный агар (МПА) для получения изолированных колоний.
th
Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определителе бактерий Bergey (Bergey's. Manual of Systematic Bacteriology. 1986. 8 ed V.2. Baltimore-Londone, William & Wilkins), а также на основании изучения последовательности генов 16S рРНК.
Культивирование в лабораторных условиях производилось на питательных средах следующего состава:
2
4
4
1) Среда Кинг Б (глицерин - 10,0 г/л; пептон - 20,0 г/л; KHPO - 1,5 г/л; MgSO - 1,5 г/л; агар-агар - 15,0 г/л), рН среды ~7,6 до стерилизации.
14
17
2) Минеральная среда с C-C для сохранения практической ценности культуры:
2
4
2
4
4
4
2
4
14
17
(KHPO - 0,5 г/л; KHPO - 0,5 г/л; MgSO - 0,3 г/л; NHHPO - 1,0 г/л; пептон - 2,0 г/л; агар-агар - 15,0; после внесения среды в пробирки до стерилизации наслаиваем ~0,8 мл фракции жидких углеводородов С-С), рН среды 7,1-7,2 до стерилизации.
Условия выращивания: на среде Кинг Б - 72 часа при 28°C, на минеральной среде с углеводородами - 96-120 часов при 28°C.
Хранение штамма производят при периодическом пересеве на свежеприготовленные среды 1 раз в 3 месяца.
По морфологическим признакам штамм характеризуется как грамотрицательная прямая палочка с закругленными концами, размером (0,5-0,7)×(1-3) мкм, хорошо окрашивается всеми анилиновыми красителями. В мазках располагается одиночно, парами или короткими цепочками. Подвижна, имеет один жгутик. Спор не образует, капсулы не имеет, но продуцирует слизь, которая тонким слоем окружает микробную клетку.
2
4
4
2
Данный штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими особенностями. Колонии молочного цвета, округлые, выпуклые с ровными краями, на среде Кинг Б (пептон - 20 г/л, KHPO - 1,5 г/л, MgSO×7HO - 1,5 г/л, глицерин - 10 г/л) дает желто-зеленую пигментацию. Pseudomonas aeruginosa 12-Р является аэробом. Хемоорганотроф, растет в широких интервалах температуры от 6 до 45°C, диапазон pH от 4,5 до 9,0. Оптимальная температура роста 37°C, pH 7,2-7,5, но также хорошо растет и при температуре 42°C. К питательным средам нетребовательна, хорошо растет на МПА и мясопептонном бульоне (далее - МПБ). На МПА через сутки образуются довольно крупные (3-5 мм) полупрозрачные колонии молочного цвета с перламутровым оттенком. Центр колонии более темный, чем периферия, края ровные, четкие. На скошенном агаре культура Pseudomonas aeruginosa 12-Р дает тонкий блестящий налет. Характерным свойством ее является появление уже к концу первых суток сине-зеленого окрашивания культуры с последующим проникновением пигмента (пиоцианина) в питательную среду.
2
Данный штамм характеризуется следующими биохимическими характеристиками. Pseudomonas aeruginosa 12-Р обладает слабой сахаролитической активностью: расщепляет только глюкозу с образованием кислоты без газа. Более выражена протеолитическая активность: разжижает желатин и свернутую кровяную сыворотку, гидролизует казеин. Свертывает лакмусовое молоко и затем расщепляет сгусток. Восстанавливает нитраты в нитриты и далее до азота. Не образует индола и HS, дает отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра. Проба на оксидазу положительная. Утилизирует 2-кетоглюконат.
Применение на практике данного штамма обусловливается его физиолого-биохимическими особенностями. Штамм предназначен для ликвидации последствий загрязнения почвы нефтью и дизельным топливом.
Ниже приведены примеры биологического окисления нефти и дизельного топлива загрязненной почвы штаммом Pseudomonas aeruginosa 12-Р.
Подготовленная для опытов садово-огородная почва была расфасована по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый. Загрязнение почвы нефтью и нефтепродуктами осуществлялось непосредственно в стаканах. В качестве нефтяного загрязнителя были выбраны дизельное топливо и два образца нефти, качественный состав которых приведен в Табл.1. Навеска нефтяного загрязнителя в почву вносилась весовым методом и составляла ~30 г, или ~2,0 вес.% на почву. Стаканы с нефтезагрязненной почвой выдерживались в условиях лаборатории с периодическим рыхлением. Это способствовало более равномерному распределению нефтяного загрязнителя в почве и, по возможности, испарению его легких фракций.
В Табл.1 представлены результаты химико-битуминологического анализа средней пробы почв, загрязненных нефтью и дизельным топливом, вес.%. Нефть 1 - нафтеново-ароматическая тяжелая нефть месторождения «Русское». Нефть 2 - метаново-нафтеновая легкая нефть месторождения «Западный Тэбук».
Экспериментальная оценка способности штамма микроорганизмов биодеградировать нефть и дизельное топливо проводилась в лабораторных условиях. В подготовленные почвенные образцы, предварительно расфасованные по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый, и загрязненные нефтью и дизельным топливом вносили культуру микроорганизмов с титром 105-108 кл/мл. Маточную культуру бактерий Pseudomonas aeruginosa 12-Р выращивали на качалке (200 об/мин) при 28°С в течение 48-72 часов в колбах со 100 мл одной из сред следующего состава, вес.%:
1. Пептон - 1%
2
4
КНРО - 0,15%
4
MgSO - 0,15%
Глицерин - 1%
Вода водопроводная - остальное до 100%
рН до стерилизации 7,6
2. Мясопептонный бульон с глюкозой (0,5 вес.%) и сахарозой (0,5 вес %). рН до стерилизации 7,6.
Опыты проводились при комнатной температуре (в среднем 18-20°C) в течение 91 суток с периодическим перемешиванием и увлажнением по мере высыхания почвы. Увлажнение производилось стерильной водой; примерно раз в 3 недели увлажнение осуществлялось минеральной средой, содержащей K, Р, N и имеющей рН до стерилизации 7,1-7,2. Почва в контрольных опытах увлажнялась только стерильной водой.
Учет численности живых клеток микроорганизмов в эксперименте проводился общепринятым методом предельных разведений на элективных средах.
Мониторинг происходящих процессов очистки нефтезагрязненной почвы выполнялся по следующим параметрам:
- содержание нефтепродуктов, мг/кг;
- содержание и качественный состав хлороформенного экстракта.
Периодичность отбора почвы на эти виды анализов составляла, как правило, 2 недели; анализ проводился согласно ГОСТ 17.1.4.01-80 и РД 52.18.575-96.
В Табл.2 приведены результаты проведенного мониторинга - содержание нефтепродуктов (НП), вес.% от первоначального содержания в почве при очистке штаммом Pseudomonas aeruginosa 12-P загрязнений, состав которых приведен в Табл.1. Дано в вес.% относительно их исходного содержания в нефтезагрязненной почве.
Таблица 2
Содержание нефтепродуктов (НП) в загрязненной почве в процессе очистки штаммом Pseudomonas aeruginosa 12-P
Загрязнитель
Содержание НП, вес.% от первоначального содержания в почве
Продолжительность очистки, недели
0
2
4
6
8
13
Нефтепродукты
Дизельное топливо
0,0
+2,1
+2,4
-5,4
-41,5
-67,8
Нефть 1
0,0
-22,4
-36,6
-47,0
-57,4
-62,1
Нефть 2
0,0
-15,7
-26,6
-42,8
-59,0
-63,4
Согласно данным Табл.2. за 13 недель продолжительности опытов содержание нефтепродуктов в нефтезагрязненных образцах почвы снижается на 62,1-67,8% от первоначального их содержания. Снижение содержания нефтепродуктов в образцах, загрязненных дизельным топливом, наблюдается с 6 недели, а в образцах, загрязненных нефтью, со 2 недели от начала постановки опытов. Обращает на себя внимание, что окисление нефтепродуктов в дизельном топливе отмечено только после 6 недель продолжения опытов. Объяснением этому может послужить активное окисление дизельного топлива углеводородокисляющими микроорганизмами с новообразованием промежуточных продуктов. В пользу этого свидетельствует высокий титр углеводородокисляющих микроорганизмов в почве, загрязненной дизельным топливом.
В Табл.3 приведены содержание и качественный состав ХБА нефтезагрязненной почвы по образцам Табл.1 через 91 сутки от начала опытов очистки штаммом Pseudomonas aeruginosa 12-P.
Данные качественного состава ХБА - (хлороформенного битумоида α) образцов загрязненной почвы до очистки, представленные в Табл.1, в сравнении с данными по опытным образцам, представленными в Табл. 3, позволяют сделать анализ характера изменения группового и углеводородного состава хлороформенного битумоида α в процессе биологического окисления штаммом Pseudomonas aeruginosa 12-Р.
Согласно результатам анализа содержание ХБА в опытных образцах нефтезагрязненной почвы колеблется в пределах 1,38-1,84% при продолжительности опытов 91 сутки. Резко изменился и качественный состав ХБА опытных образцов почвы, по сравнению с доопытным составом ХБА. Через 91 сутки после начала опытов по утилизации нефтяного загрязнения почвы отмечается снижение наиболее доступных для микроорганизмов его фракций. Наиболее доступной для биоокисления в составе нефтяного загрязнения является фракция масел. Содержание масел снизилось до 40,43% отн. В составе этого загрязнения снизилось содержание асфальтенов, метаново-нафтеновых, моно- и биароматических углеводородов.
Исходя из представленных выше данных, следует, что штамм Pseudomonas aeruginosa 12-Р RCAM01139 характеризуется высокой эффективностью в процессах утилизации нефти и дизельного топлива, и, как следствие, может быть использован для биологической очистки почв от данных загрязнителей.