СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПНЕВМОНИИ
LABORATORY DIAGNOSTIC TECHNIQUE IN PNEUMONIA

Изобретение относится к области медицины, а именно к пульмонологии, и может быть использовано при лабораторной диагностике пневмонии.
По данным ВОЗ, пневмония занимает 4-е место в структуре причин смертности, летальность от нее составляет 5%, а среди лиц пожилого возраста достигает 30% [1].
В настоящее время практикующими врачами допускаются существенные и многочисленные ошибки при постановке диагноза пневмонии на всех этапах оказания медицинской помощи [2], а в ряде случаен правильный диагноз выставляется только при аутопсии [3-6].
В поликлинике диагноз пневмонии при первом врачебном осмотре устанавливается лишь в 10% - 56,2% [7, 8] и более чем в 40% случаев догоспитальная диагностика пневмоний бывает ошибочной [9].
Ошибки диагностики пневмонии возможны как на этапе оказания медицинской помощи бригадами «скорой медицинской помощи» [10], так и в стационарах. В случаях смертельных исходов пневмоний частота ошибочной диагностики составляет от 4,1% [11] до 40% [12].
Таким образом, пневмония в настоящее время остается одним из самых распространенных инфекционно-воспалительных заболеваний, при этом повсеместно она сопряжена с риском развития тяжелых и, нередко, смертельных осложнений, что делает актуальным совершенствование своевременной диагностики данной патологии.
9
Диагноз пневмонии является определенным при наличии у больного рентгенологически подтвержденной очаговой инфильтрации легочной ткани и, по крайней мере, двух клинических признаков из числа следующих: а) острая лихорадка в начале заболевания, б) кашель с мокротой, в) физические признаки (фокус крепитации и/или мелкопузырчатые хрипы, жесткое бронхиальное дыхание, укорочение перкуторного звука), г) лейкоцитоз более 10×10 /л и/или палочкоядерный сдвиг (более 10%) [13].
Известен «Способ определения воспалительного процесса в органах дыхания у детей» (патент РФ №2140080, МПК G01N 33/487, G01N 33/68). Исследуется соотношение содержания миелопероксидазы и катионных белков в нейтрофилах осадка промывной жидкости ротовой полости, при значении показателя 0,84 и выше определяют наличие воспалительного процесса в органах дыхания (при норме от 0,5 до 0,83).
Данный способ трудоемок, редко применяется и не соответствует современным стандартам оценки качества лабораторных исследований (нестандартизованный).
Известен «Способ ранней диагностики вирусной пневмонии» (патент РФ №2440577, МПК G01N 33/48, G01N 33/49), который заключается в том, что у пациента берут венозную кровь в пробирку с цитратом, по классической методике Hiadovec, подсчитывают количество десквамированных эндотелиальных клеток крови (ДЭК) и лейкоцитов крови (Лей.) с последующим расчетом интегрального коэффициента по формуле: К=ДЭК/(ln Лей.). При значении коэффициента >4,0 диагностируют вирусную пневмонию.
Данным способом диагностируется только вирусная пневмония при заболевании гриппом.
Известен «Способ диагностики острых пневмоний у детей» (заявка РФ на изобретение №94003541, МПК А61В 10/00, G01N 33/68), при котором исследуется кровь на белок острой фазы - альфа i - кислый гликопротеин (норма у детей 0,3-0,9 г/л) и при его величине выше 1,2 г/л достоверно ставится диагноз острой пневмонии. Способ применяется для диагностика пневмонии только у детей.
Известен «Способ диагностики острой пневмонии» (заявка RU №93039989, МПК G01N 33/48), заключающийся в подсчете гранулоцитов и лимфоцитов методом фазово-контрастной микроскопии в камере Горяева. Данные показатели крови оценивают по цитолейкограмме и при выявлении четырех связанных гранулоцитов и при уменьшении двойных розеток в 1,3-1,8 раза относительно нормы диагностируют острую пневмонию.
Данный способ является неспецифичным, так как характеризует острый воспалительный процесс любой локализации и не учитывает изменение количества специфичных белков, повышающихся в крови при повреждении легочной ткани.
Наиболее близким является «Способ диагностики стафилококковой пневмонии у детей», авторское свидетельство №1225527 (А61В 10/00, G01N 33/48), при котором определяют уровень предшественника сурфактанта - фосфатидилхолина в сыворотке крови методом тонкослойной хроматографии и при значении этого показателя более 49,6% от всех фосфолипидов сыворотки крови диагностируют гнойную пневмонию у детей.
Данный способ является трудоемким, применяется дорогостоящее научно-фундаментальное оборудование, которое не используется в клинико-биохимических лабораториях лечебно-профилактических учреждений, определяется наличие только стафилококковой деструкции легких у детей.
Легочный сурфактант представляет собой поверхностно-активное вещество, состоящее из фосфолипидов (в том числе фосфатидилхолина), белков (в том числе сурфактантного белок А и сурфактантного белка D) и полисахаридов.
Сурфактантный белок А и сурфактантный белок D, являясь компонентами легочного сурфактанта, синтезируются альвеолоцитами второго типа и клетками Клара и могут принимать участие в патогенезе клинических состояний, характеризующихся повышенным воспалением слизистой или повреждением паренхимы легких [14].
Задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала способов лабораторной диагностики пневмонии.
Поставленная цель достигается тем, что в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) исследуют уровень сурфактантного белка А и/или сурфактантного белка D и при значении уровня сурфактантного белка А более 49,56 ng/ml или уровня сурфактантного белка D более 234,39 ng/ml диагностируют пневмонию.
Способ осуществляется следующим образом.
У пациента проводят забор венозной крови, в сыворотке которой определяют содержание сурфактантного белка А и/или сурфактантного белка D методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого подготовленный образец сыворотки крови пациента вместе с контрольными калибраторами и стандартами сурфактантного белка А и/или сурфактантного белка D инкубируют в микропланшете с моноклональными антителами при 37°C в течение 2 часов. После промывки в ячейки микропланшета добавляют меченные биотином поликлональные антитела и инкубируют в течение 1 часа. Затем инкубируют с конъюгатом и тетраметилбензидином. Реакцию останавливают добавлением кислотного раствора. Детекция результата на иммуноферментном анализаторе при 450 нм.
При уровне сурфактантного белка А более 49,56 ng/ml или уровне сурфактантного белка D более 234,39 ng/ml диагностируется пневмония. При этом в качестве диагностически значимых уровней сурфактантного белка А и D использованы 95% отрезные точки их распределения у лиц контрольной группы.
Предлагаемый способ диагностирования пневмонии был разработан на основе исследования результатов содержания сурфактантного белка А и сурфактантного белка D в сыворотке крови группы больных военного госпиталя в г. Новосибирска.
В исследовании участвовало 87 пациентов военного госпиталя: из них 64 человека - с клинико-рентгенологически подтвержденным диагнозом пневмонии (опытная группа) и 23 человека - с отсутствием рентгенологически подтвержденной инфильтрации легочной ткани и с отсутствием клинических проявлений воспалительного процесса в легких (группа контроля).
Материал исследования - сыворотка крови. Забор крови проводился в первые сутки пребывания в стационаре. Содержание сурфактантного белка А и сурфактантного белка D в сыворотке крови определяли с использованием тест-систем «Human Surfactant Protein A (SP-A) Elisa» и «Human Surfactant Protein D (SP-D) Elisa» (Bio Vendor, Czech Republic) для иммуноферментного анализа (ИФА). Все измерения проводили на ИФА анализаторе «Multiscan EX» (Финляндия).
Возраст пациентов, принявших участие в исследовании, не имел достоверных различий (р=0,286), средний возраст пациентов опытной группы (19,797±0,220 лет), а средний возраст контрольной группы (20,261±0,384 лет).
У пациентов опытной группы был зарегистрирован достоверно больший уровень (р=0,002) сурфактантного белка A (SP-A) в сыворотке крови, равный 56,75±7,33 ng/ml, по сравнению с пациентами контрольной группы, в которой зарегистрирован уровень сурфактантного белка А 38,0±2,19 ng/ml, а также определялся достоверно больший уровень (р=0,045) сурфактантного белка D (SP-D) в сыворотке крови, равный 260,04±6,23 ng/ml, по сравнению с пациентами контрольной группы, в которой зарегистрирован уровень сурфактантного белка D 198,45±5,33 ng/ml, что позволяет использовать увеличенный уровень SP-A или SP-D в сыворотке крови в качестве диагностического маркера пневмонии.
Определение содержания уровня сурфактантного белка А и сурфактантного белка D в сыворотке крови занимает непродолжительное время исследования - около 4 часов, техническое выполнение несложно и может проводиться одним врачом-лаборантом.
Клинические характеристики
Пример 1. Мужчина А., 20 лет заболел остро. Предъявляет жалобы на продуктивный кашель, повышение температуры тела до 38°C и боли в правой половине грудной клетки при кашле в течение последних 3-х суток. При осмотре состояние средней степени тяжести. Кожные покровы обычной окраски, t=37,7°C. Грудная клетка правильной формы. При аускультации легких выслушиваются мелкопузырчатые хрипы в проекции нижней доли правого легкого, здесь же определяется притупление перкуторного звука. Ч.Д.Д. 18 в минуту. АД 120/70 мм рт.ст. Ч.С.С. ритмичная, 85 в минуту.
По заявленному способу в первые сутки пребывания в стационаре определено содержание SP-A и SP-D в сыворотке крови, составившее 55 ng/ml и 310 ng/ml соответственно, что указывает на наличие пневмонии. После рентгенологического исследования выставлен диагноз пневмонии.
Диагноз, установленный на основании заявляемого способа, подтвердился.
Пример 2. Мужчина Б., 19 лет считает, что заболел 7 дней назад, когда после факта переохлаждение появился продуктивный кашель, боль в горле при глотании. Через 4 дня ухудшилось общее самочувствие, появилась лихорадка t=38°C. Применение отхаркивающих, жаропонижающих препаратов оказалось без эффекта. При поступлении в стационар состояние средней тяжести. Бледность кожных покровов, гиперемия зева. Т тела 38,2°C. Грудная клетка правильной формы. При аускультации легких высушиваются мелкопузырчатые хрипы в нижних отделах с обеих сторон, здесь же - притупление перкуторного звука. Ч.Д.Д. 20 в минуту. АД 110/65 мм рт.ст. Ч.С.С. ритмичная, 110 в минуту.
По заявленному способу в первые сутки пребывания в стационаре определено содержание SP-A и SP-D в сыворотке крови, составившее 74 ng/ml и 475 ng/ml соответственно, что указывает на наличие пневмонии. После рентгенологического исследования выставлен диагноз пневмонии.
Диагноз, установленный на основании заявляемого способа, подтвердился.
Пример 3. Мужчина В., 22 лет направлен в стационар с подозрением на пневмонию. При поступлении предъявляет жалобы на малопродуктивный приступообразный кашель, «хрипы» в груди, повышение температуры тела до 37,8°C на протяжении последних 5 дней. Пациент указывает на наличие стажа курения (7 лет). При осмотре определяется гиперемия лица, видимые слизистые обычной окраски, t=37,5°C. Грудная клетка правильной формы. При аускультации легких высушиваются разнотональные сухие хрипы на выдохе диффузно с обеих сторон. Перкуторный звук легочный. Ч.Д.Д. 22 в минуту. АД 115/75 мм рт.ст. Ч.С.С. ритмичная, 105 в минуту.
По заявленному способу в первые сутки пребывания в стационаре определено содержание SP-A и SP-D в сыворотке крови, составившее 40 ng/ml и 154 ng/ml соответственно, что указывает на отсутствие пневмонии.
При рентгенологическом исследовании не выявлено признаков инфильтрации легочной ткани, диагноз пневмонии не подтвердился.
Отсутствие пневмонии, установленное на основании заявляемого способа, подтвердилось.
Пример 4. Мужчина Г., 18 лет направлен в стационар с подозрением на пневмонию. Из жалоб - повышение температуры тела до 37,5-37,7°C, заложенность носа, продуктивный кашель с желтой мокротой до 50 мл в сутки на протяжении последних 6 дней. Прием жаропонижающих, антибактериальных препаратов в течение 3 дней не привел к улучшению состояния. При осмотре кожные покровы и видимые слизистые обычной окраски, t=37,2°C. Грудная клетка правильной формы. При аускультации легких дыхание жесткое, ослабление дыхания справа в подлопаточной области. Перкуторный звук - легочный. Ч.Д.Д. 18 в минуту. АД 120/80 мм рт.ст. Ч.С.С. ритмичная, 90 в минуту.
По заявленному способу в первые сутки пребывания в стационаре определено содержание SP-A и SP-D в сыворотке крови, составившее 37 ng/ml и 126 ng/ml соответственно, что указывает на отсутствие пневмонии.
При рентгенологическом исследовании не выявлено признаков инфильтрации легочной ткани, диагноз пневмонии не подтвердился.
Отсутствие пневмонии, установленное на основании заявляемого способа, подтвердилось.
Таким образом, сурфактантный белок А и сурфактантный белок D могут быть использованы в качестве маркеров повреждения легочной ткани, в частности, при диагностике пневмонии.
Данный способ позволяет своевременно диагностировать пневмонию, не травматичен, позволяет создать на своей основе тест-систему для ее раннего выявления в амбулаторных условиях и на этапе скорой помощи.
Литература
1. Дворецкий Л.И. Ключевые вопросы диагностики внебольничной пневмонии. Взгляд терапевта // Russian electronic journal of radiology. 2013. 3 (3). 14-18.
2. Никонова Е.В. Черняев А.Л. Чучалин А.Г. Клинико-диагностические аспекты пневмоний // Пульмонология. 1997. 1. 60-63.
3. Никонова Е.В., Черняев А.Л. Тактика ведения и ошибки в диагностике пневмоний у умерших больных // 6-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания. Сборник резюме. М., 1996. 149 с.
4. British Thoracic Society for the management of community-acquired pneumonia in adults. Thorax. 2001. 4. (56). 1-64.
5. Fok M.C., Kanji Z., Mainra R., Boldt М. Characterizing and developing strategics for the treatment of community-acquired pneumonia at a community hospital // Can. Respir. J. 2002. 9. (4). 247-252.
6. Laurichcsse H., Gebaud L., Baud O. et al. Hospitalization decision for ambulatory patients with community-acquired pneumonia: a prospective study with general practitioners in France // Infection. 2001. 29. (6). 320-325.
7. Багрова Л.О., Просекова Т.Ю., Белых В.Н. Ошибки диагностики пневмоний на догоспитальном этапе // 13-й Национальный конгресс по болезням органов дыхания. Сборник резюме. М., 2003. 193 с.
8. Черемисина И.А., Черняев А.Л., Ковальский Г.Б. и др. Пневмонии и их диагностика в стационарах Санкт-Петербурга по данным аутопсий // Пульмонология. 1997. 1. 13-18.
9. Дворецкий Л.И., Яковлев С.В. Ошибки антибактериальной терапии инфекций дыхательных путей в амбулаторной практике // Лечащий врач. 2003. 8. 48-54.
10. Тетенев. Ф.Ф. Как научиться профессиональному комментарию клинической картины // Томск, 2005. 176 с.
11. Лазарева Я.В. Компьютерная томография в диагностике пневмонии и пневмонических форм туберкулеза // Пульмонология. 1999. 4. 67-71.
12. Христолюбова Е.И. Ошибки диагностики и лечения внебольничных пневмоний: Автореф. дис.… канд. мед. наук. Томск, 2006.
13. Внебольничная пневмония у взрослых: практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике. Пособие для врачей. Москва, 2010. 106 с.
14. Eisner M.D., Parsons P., Matthay M.A. et al. Plasma surfactant protein levels and clinical outcomes in patients with acute lung injury // Thorax 2003. 58. 983-988.