СПОСОБ БИОРАЗЛОЖЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В СОСТАВЕ РЕАКЦИОННЫХ МАСС, ПОЛУЧАЕМЫХ ПОСЛЕ ХИМИЧЕСКОГО УНИЧТОЖЕНИЯ ВЕЩЕСТВА ТИПА Vx
METHOD FOR BIODECOMPOSITION OF ORGANOPHOSPHORUS COMPOUNDS IN REACTION MASS OBTAINED FROM CHEMICAL DECOMPOSITION OF Vx-TYPE SUBSTANCE

Изобретение относится к области обезвреживания реакционных масс (РМ), получаемых после химического уничтожения фосфорорганического боевого отравляющего вещества (ФОВ) типа Vx, а именно к способу биоразложения остаточных концентраций ФОВ и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции, в составе РМ.
Способ реализуется посредством проведения последовательной обработки разбавленных водных растворов РМ ферментом с активностью органофосфатгидролазы и биокатализатором на основе клеток микроорганизмов-деструкторов С-Р-связи, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта.
Согласно Международной конвенции о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и его уничтожении [ОЗХО, C.N.610, 2005] на территории Российской Федерации должно быть уничтожено 15,5 тыс. т смертельно опасного фосфорорганического отравляющего вещества типа Vx [Белецкая И.П., Новиков С.С., Химическое оружие в России // Вестн. РАН, 1995, Т.65, №2, с.99-111].
Для химического уничтожения запасов вещества типа Vx, извлеченного из боеприпаса, в РФ принята рецептура РД-4М, согласно которой детоксикатором является водный раствор изобутилата калия, который смешивают с ФОВ в массовом соотношении 2:1 и проводят процесс дегазации при начальной температуре процесса 95°С [Уткин А.Ю., Либерман Б.М., Кондратьев В.Б., Капашин В.П., Холстов В.И. Математическое описание процессов детоксикации фосфорорганических отравляющих веществ.// Рос. хим. жур., 2007, т.L1 (2), с. 12-18].
Количество реакционных масс, которое, как ожидается, будет получено при уничтожении вещества типа Vx в РФ при использовании этой рецептуры, составляет 15,25 тыс. т (далее РМ-РД-4М) [Капашин В.П., Назаров В.Д., Голышков Д.В., Комиссаров, Никифоров Г.Е., Судаков А.Ю. Практические аспекты переработки реакционных масс после детоксикации фосфорорганических веществ. // Химическая и биологическая безопасность, 2006, №4, с. 14-20].
Другой способ химического уничтожения вещества типа Vx, проводимый непосредственно в боеприпасе, принятый в РФ, заключается в том, что в боеприпас с ФОВ заливают в количестве 3-7% от объема ФОВ водный раствор, содержащий 13 мас.% моноэтаноламина, 7 мас.% хлорида триэтилбутиламмония, 4 мас.% диоксида углерода, и выдерживают 80-100 сут для химического гидролиза ФОВ [Патент РФ № 2042368 (1995) Способ уничтожения отравляющего вещества; Заявка РФ на патент №2006133269/02 (20.03.2008, Бюл.№8) Способ уничтожения боеприпасов, снаряженных фосфорорганическими отравляющими веществами и имеющих в корпусе технологические резьбовые отверстия]. Количество реакционных масс, которое, как ожидается, будет получено при уничтожении вещества типа Vx в РФ при использовании этой «гидролизной» рецептуры, составляет 10,4 тыс. т (далее РМ-ГД) [Капашин В.П., Назаров В.Д., Голышков Д.В., Комиссаров, Никифоров Г.Е., Судаков А.Ю. Практические аспекты переработки реакционных масс после детоксикации фосфорорганических веществ. // Химическая и биологическая безопасность, 2006, №4, с. 14-20].
Поскольку согласно Международной конвенции о химическом разоружении должно быть уничтожено не только само вещество типа Vx, но и продукты его гидролиза, на основании которых данное ФОВ может быть синтезировано заново, то последующей деградации подлежат образующиеся РМ (РМ-РД-4М и РМ-ГД), содержащие не только остаточные количества неразложившегося ФОВ, но и продукты разложения ФОВ - все фосфорорганические соединения с С-Р связью: диизобутиловый эфир метилфосфоновой кислоты (ДЭМФК), моноизобутиловый эфир метилфосфоновой кислоты (МЭМФК), метилфосфоновая кислота (МФК)): (вещество типа Vx → ДЭМФК → МЭМФК → МФК).
Среди способов разложения фосфорорганических компонентов РМ, получаемых после уничтожения вещества Vx или вещества типа Vx, наиболее эффективными являются биокаталитические способы, поскольку они предполагают проведение биодеградации компонентов РМ в экологически безопасных условиях (без применения сильных химических окислителей и концентрированных щелочных растворов), а также в технологическом плане не требуют применения высоких температур, повышенного давления и использования оборудования, изготовленного из дорогих коррозионностойких материалов.
Основными показателями эффективности реализации тех или иных способов биоразложения фосфорорганических компонентов РМ, по которым можно их было бы сравнивать, являются:
- исходная суммарная концентрация фосфорорганических соединений, присутствующих в разбавленных РМ, подлежащих биоразложению (г/л);
- достигаемое снижение концентрации фосфорорганических компонентов РМ (%),
- продолжительность процесса реализации способа (сут),
- объемы стоков, образующихся после реализации способа (л).
-8
-6
Так известен способ биоразложения остаточных концентраций ФОВ в составе реакционных масс вещества типа Vx [Патент РФ №2296164 (2007) Способ ферментативного гидролиза фосфорорганических боевых отравляющих веществ], основанный на введении полигистидинсодержащего пептида со свойствами органофосфатгидролазы (ОРН) в виде высокоочищенного растворимого препарата (2,5 мг белка на 1 л разбавленного раствора РМ), выделенного из клеток Escherichia coli ЦКМИБХ 29, или в виде клеточного гомогената (9 мг общего белка на 1 л разбавленного раствора РМ) в реакционную массу РМ-РД-4М, разбавленную до концентрации ФОВ 6×10÷7×10 М с целью гидролиза вещества типа Vx. Данный способ обеспечивает 100% ферментативное разложение указанных концентраций ФОВ как компонента РМ в течение 30 мин.
Несмотря на высокую эффективность действия фермента в отношении остаточных количеств самого вещества типа Vx, присутствующего в составе реакционных масс РМ-РД-4М, способ обладает явным недостатком, заключающимся в том, что все остальные фосфорорганические компоненты РМ, являющиеся продуктами разложения Vx и подлежащие обязательному разложению, остаются в реакционной среде неразложившимися.
Известен другой способ биоразложения фосфорорганических компонентов РМ вещества типа Vx [Патент WO 2007/011251 А1 (2007) Способ обезвреживания отравляющих веществ в безопасные нетоксичные продукты], согласно которому проводят первоначальную обработку реакционной массы РМ-ГД, содержащей остаточные концентрации ФОВ и высокие концентрации ди- и моноэфира МФК, смешивая ее в соотношении 1:1-1:3 (по массе) и выдерживая в течение 0,5 ч при рН 8-12 с аминокислотным реагентом, образующим комплексные соединения с фосфорорганическими компонентами РМ, а затем вводят полученные комплексные соединения в среды для культивирования клеток бактерий Streptococcus thermophylus или активного ила. Согласно этому способу в качестве аминокислотного реагента (АКР) применяют индивидуальные аминокислоты или щелочной гидролизат белоксодержащих промышленных отходов, а о биоразложении фосфорорганических компонентов РМ судят по наличию роста бактерий через 1 сутки в исследуемых образцах клеток.
К очевидным недостаткам этого способа следует отнести следующее:
- согласно этому способу фосфорорганические соединения не биоразлагаются под действием АКР, а вступают с ним в реакции образования новых производных, что противоречит основным положениям Международной конвенции о химическом разоружении, требующим уничтожения фосфонатов;
- отсутствуют какие-либо характеристики способа, подтверждающие эффективность биодеградации комплексов аминокислотного реагента с фосфорорганическими компонентами РМ, поскольку только факт наличия роста клеток в среде, содержащей эти комплексы, не свидетельствует об их биоразложении, ввиду того, что помимо образовавшихся комплексов в смесях, вносимых в среды с клетками, могут присутствовать свободные аминокислоты и белки, не вступившие в реакции комплексообразования и которые могут использоваться клетками в качестве источников углерода и азота, необходимых для их роста. При этом клетки могут расти в присутствии токсичных веществ, не подвергая их деструкции или, наоборот, утилизируя их путем прямого встраивания в клеточные структуры. В последнем случае все фосфонаты накапливаются в биомассе клеток микроорганизмов и представляют собой токсичный отход;
- согласно данному способу требуется использование больших количеств АКР или дорогостоящих индивидуальных аминокислот, превышающих объемы самих РМ в 2-3 раза при соблюдении рекомендованных массовых соотношений РМ и АКР, что делает экономическую сторону реализации данного способа малопривлекательной.
Известен способ биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ вещества Vx [Патент США № 6080906 (2000) Demilitarization of chemical munitions; Патент РФ № 2203116 (2003) Способ уничтожения химического ружия; DeFrank J.J., Guelta М., Harvey S., Fry I.J., Earley J.P., Lupton F.S. Biodegradation of hydrolyzed chemical warfare agents by bacterial consortia. // В книге: «Enzymes in Action: Green Solution for Chemical Problems», Netherlands: Kluwer Acad. Publ. (Eds.-B. Zwanenburg et al.), 2000, p. 193-209; Патент США №7001758 (2006) Microbial biodegradation of phodphonates], согласно которому разбавленные реакционные массы обрабатывают в реакторе с иммобилизованным искусственным микробным консорциумом GB2, в который входят бактериальные культуры, представленные множеством различных штаммов: Methylobacterium radiotolerans штамм GB21, Agrobacterium tumefaciens штамм GB2GA, Klebsiella oxytoca штамм GB2CS и GB272, Aureobacterium sp. штаммы GB2, GB23, GB272 и GB292. Применение клеток микроорганизмов в иммобилизованном виде имеет целью использовать их многократно для проведения одного и того же процесса, а также повысить их устойчивость к воздействию различных неблагоприятных факторов, в частности высоких концентраций токсичных субстратов. В качестве носителя для адсорбционной иммобилизации клеток консорциума используют кубические гранулы из вспененного полиуретана с линейным размером 1,27 см, содержащие включенные в полиуретановую матрицу частицы активированного угля. В ходе такой обработки иммобилизованные клетки микроорганизмов с помощью своих внутриклеточных ферментов осуществляют биоразложение остаточных концентраций Vx и эфиров МФК в составе РМ.
Для реализации этого способа применяют РМ вещества Vx, которые получают в результате смешивания Vx и 11% раствора NaOH с небольшим молярным избытком NaOH и их последующего выдерживания при 90°С в течение 6 ч. Образующиеся РМ содержат 20 мкг/л неразложившегося вещества Vx и суммарно фосфорорганических соединений - 400 г/кг.
4
2
4
Для иммобилизации бактерий пористый носитель удерживают в реакторе с помощью полипропиленовых полых цилиндров, и через его слой прокачивают суспензию клеток, составляющих консорциум. Перед использованием иммобилизованных клеток в процессе биоразложения фосфорорганических компонентов РМ проводят их адаптацию к токсичным субстратам. С этой целью в аэробных условиях иммобилизованные клетки культивируют при постоянном перемешивании (150 об/мин) в течение 12 суток при 28°С в среде, не содержащей фосфаты и приготовленной на основе 50 мМ буфера HEPES (рН 7,2), с введением в нее 0,5 г/л КСl, 0,5 г/л (NH)SO, 10 мл/л стандартного раствора микроэлементов Wolin Salts (Sigma, США) и 5 мМ изопропилового эфира метилфосфоновой кислоты (ИПЭМФК).
-8
Исходные РМ для биоразложения разбавляют буфером, имеющим рН 6,0-9,0 в 100-190 раз так, что концентрация вещества Vx составляет 10М, а суммарная концентрация фосфорорганических соединений 2,1-4,0 г/л. В них добавляют источник углерода (глюкозу, или изопропанол, или глицерин, или кукурузный экстракт, или глицерин в смеси с мелассой) в конечной концентрации 20 г/л и подают в реактор с иммобилизованными клетками. Культивирование иммобилизованных клеток в такой среде при 20-25°С в аэробных условиях в течение 15 суток обеспечивает 75%-ное разложение фосфорорганических компонентов РМ. Объем образующихся стоков составляет 1000 л на 1 кг РМ, а общая длительность процесса с учетом необходимой адаптации иммобилизованных клеток к токсичному субстрату - 27 суток.
Основными недостатками этого способа биоразложения фосфорорганических компонентов РМ вещества Vx являются:
- неполное разложение фосфорорганических компонентов РМ (эфиров МФК и самой МФК), в результате которого 25% веществ остается неразложившимися, возникающее вследствие ингибирующего воздействия на клетки остаточных концентраций самого ФОВ, присутствующего в РМ;
- необходима длительная (12 суток) предварительная адаптация иммобилизованных клеток к токсичным субстратам (в данном случае - моноэфиру МФК);
- необходим контроль и поддержание постоянства сложного состава многокомпонентного микробного иммобилизованного консорциума с целью обеспечения заявленной эффективности его действия;
- частицы активированного угля, введенные в состав носителя, согласно данным разработчиков биокатализатора, сорбируют из среды эфиры МФК, в результате чего значительное их количество остается связанными с носителем и не подвергается разложению клетками.
Для повышения эффективности процесса биодеградации фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток микроорганизмов целесообразно первоначально проводить удаление из состава РМ остаточных концентраций ФОВ, которые являются высокотоксичными для клеток.
2
2
Известен способ биоразложения фосфорорганических компонентов в составе РМ вещества Vx, основанный на комбинированном использовании химического разложения (под действием сильного окислителя и ультрафиолетового облучения) и биоразложения их остаточных количеств под действием клеток, иммобилизованных аналогично тому методу, что описан в предыдущем способе [Патент США №6498281 (2002) Treatment of chemical hydrolysates]. Для реализации способа используются РМ Vx, полученные при разбавлении ФОВ 4%-ным раствором NaOH при температуре 90°С в течение 12 ч и суммарно содержащие 280 г/кг фосфорорганических компонентов, подлежащих разложению. Первоначально РМ разбавляют водой в 200 раз так, что на последовательную обработку окислителем и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие остаточные концентрации вещества Vx (концентрация не известна) и 1,4 г/л фосфорорганических соединений. Полученные растворы РМ обрабатывают в течение 6-8 ч сильным окислителем (30% НО), смешивая его с разбавленными РМ при соблюдении мольного соотношения между оксидантом и фосфорорганическими соединениями 3:1. Таким образом, объем РМ при смешивании с окислителем увеличивается еще на 2%. Обработку РМ с окислителем комбинируют с ультрафиолетовым облучением этой смеси при следующей его интенсивности: 1 кВт на 0,2-0,3 г фосфорсодержащих соединений. На втором этапе реализации способа химически обработанные разбавленные РМ с разложившимися остаточными количествами ФОВ и эфирами МФК до МФК разбавляют еще в 140 раз и подают для биоразложения накопившейся МФК в реактор с иммобилизованным консорциумом, состав которого был указан в описании предыдущего способа [Патент США №6080906 (2000) Demilitarization of chemical munitions]. Биоразложение фосфорорганических компонентов в составе разбавленных РМ иммобилизованными клетками проводят при постоянной аэрации среды и поддержании рН в интервале 7,0-8,0. Данный способ обеспечивает 99%-ное удаление всех фосфорорганических компонентов из РМ вещества Vx в течение 8 сут. По окончании процесса объемы стоков составляют 28560 л с 1 кг РМ, а общая длительность процесса с учетом необходимой адаптации иммобилизованных клеток к токсичному субстрату - 20 суток.
Этот способ биоразложения фосфорорганическими компонентами в составе РМ вещества Vx обладает несколькими существенными недостатками:
- способ характеризуется всеми теми же недостатками, что и предыдущий описанный способ биоразложения РМ, связанными с используемым многокомпонентным иммобилизованным консорциумом, то есть длительная его адаптация к токсичным субстратам, необходимость контроля и поддержания постоянства его состава;
- способ характеризуется высокой степенью разбавления исходных реакционных масс, а именно, в 28560 раз, что сопровождается накоплением огромных количеств сточных вод, содержащих 1% неразложившихся фосфорорганических соединений, вследствие чего их последующая утилизация делает процесс чрезвычайно дорогим;
- способ предусматривает применение на первой стадии разложения жесткого ультрафиолетового облучения и введения в среду сильнейшего окислителя в виде концентрированного раствора перекиси водорода, требующего соблюдения дополнительных мер предосторожности для обслуживающего персонала и защитных противокоррозионных мер для применяемого оборудования.
Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по способу реализации процесса биоразложения фосфорорганических компонентов РМ вещества типа Vx, основанному на комбинированном использовании химического разложения остаточных концентраций ФОВ в составе РМ и последующего биоразложения всех фосфорорганических компонентов РМ под действием иммобилизованных клеток бактерий, принято за прототип.
Задачей предлагаемого изобретения является способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ, образующихся при химической детоксикации фосфорорганического нейротоксина.
Поставленная задача решается посредством проведения последовательной обработки разбавленных водных растворов РМ полигистидинсодержащим полипептидом с активностью органофосфатгидролазы и клетками индивидуальных культур микроорганизмов-деструкторов С-Р-связи, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта.
6
Согласно заявляемому способу разложение остаточных количеств вещества типа Vx в составе РМ проводят в отличие от прототипа не под действием сильного окислителя и ультрафиолетового облучения, а под действием фермента (полигистидинсодержащего полипептида со свойствами органофосфатгидролазы - His-OPH), выделенного из штамма бактерий Escherihia coli ЦКМИБХ 29 [Патент РФ № 2255975 (2005) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы]. Замена химической обработки, известной из прототипа, на биохимическую (ферментом) - в заявляемом способе - позволяет существенно сократить затраты на обеспечение безопасных условий труда и технически упростить саму технологическую операцию.
6
Фермент His-OPH, используемый в предлагаемом способе для гидролиза остаточных концентраций ФОВ в составе РМ, обладает самой высокой каталитической эффективностью действия по отношению к Vx среди других известных на сегодняшний день ферментов [Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов. // Успехи биол. химии, 2004, Т.44, с.307-340]. Также известна высокая эффективность его действия при разложении ФОВ, взятых не в виде чистых веществ, а в составе РМ ФОВ [Патент РФ № 2296164 (2007) Способ ферментативного гидролиза боевых отравляющих веществ].
6
6
2+
2+
В заявляемом способе His-OPH может быть использован для разложения остаточных концентраций вещества типа Vx в растворимой форме (в виде клеточного гомогената) или в иммобилизованной форме, предназначенной для разложения фосфорорганических нейротоксинов в проточной системе [Патент РФ №2315103 (2008) Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах]. Иммобилизацию His-ОРН проводят известным способом на пористом носителе, поверхность которого модифицирована металл-хелатирующими лигандами (остатками иминодиуксусной кислоты) и заряжена ионами двухвалентных металлов (Cu или Со). В качестве пористого носителя используется криогель полиакриламида, полученный при полимеризации мономеров, представляющих собой различные производные акриламида (например, поли-N,N-диметилакриламид, полиоксиэтилметакрилат, поли-N,N-изопропилакриламид, поли-2-оксиэтилпропилакриламид), проводимой при низких температурах. Замораживание растворов мономеров с добавлением сшивающих агентов позволяет получить монолит с трехмерной структурой, для которой характерно наличие большого количества пор размером 10-100 мкм [Plieva, F.M., Savina, I.N., Deraz, S., Andersson, J., Galaev, I.Yu., Mattiasson, В., Characterization of supermacroporous monolithic polyacrylamide based matrices designed for chromatography of bioparticles. // J.Chromatog. 5, 2004, V.807(1), р.129-137]. При этом носитель представляет собой единый монолит, а не отдельные гранулы, что снижает диффузионные проблемы при его использовании в проточном реакторе.
6
-3
Используемый способ иммобилизации фермента обеспечивает возможность его многократной регенерации и использования для гидролиза ФОВ в составе РМ, что существенно улучшает экономическую сторону данного процесса. Фермент His-OPH в иммобилизованном виде характеризуется длительным периодом функционирования (до 170 сут) при обеспечении полного разложения остаточных концентраций ФОВ, исходно присутствующих в РМ (до 3×10 М).
Согласно заявляемому способу для проведения ферментативного гидролиза остаточных концентраций ФОВ в составе реакционных масс вещества типа Vx их разбавляют в 10-100 раз, в зависимости от примененного способа химического уничтожения вещества типа Vx и соответствующего ему химического состава РМ (РМ-ГД или РМ-РД-4М), одной из перечисленных сред: водопроводной водой, 50 мМ карбонатным буфером (рН 10), 100 мМ карбонатным буфером (рН 10,5), 200 мМ карбонатным буфером (рН 10,5).
6
6
-6
-3
Собственно ферментативный гидролиз остаточных концентраций ФОВ проводят путем внесения растворимой формы His-OPH в разбавленные РМ и экспонирования полученной смеси при комнатной температуре в течение времени, необходимого для разложения концентрации вещества типа Vx, присутствующего в РМ, или прокачиванием с помощью перистальтического насоса разбавленных РМ через колонный реактор, заполненный иммобилизованным ферментом His-OPH. Скорость протока и время удерживания раствора разбавленных РМ в реакторе с иммобилизованным ферментом зависят от концентрации ФОВ, присутствующей в составе РМ. Согласно применяемым способам химического уничтожения ФОВ остаточная концентрация вещества типа Vx в составе РМ может варьироваться от 3×10 М (РД-4М) до 3×10 М (РМ-ГД).
Для биоразложения фосфорорганических компонентов (эфиров МФК и самой МФК) в составе растворов РМ, получаемых после ферментативной обработки, в заявляемом способе применяют иммобилизованные в криогель поливинилового спирта (ПВС) клетки бактерий или мицелиальных грибов, способных разрушать С-Р связь и утилизировать фосфаты, являющиеся продуктами разложения МФК.
Для иммобилизации в заявляемом способе используются клетки индивидуальных культур, а не консорциум микроорганизмов, как в аналоге и прототипе, что должно обеспечить получение образца иммобилизованных клеток с хорошо воспроизводимыми свойствами и упростить контроль их состояния в процессе биоразложения фосфорорганических компонентов РМ, поскольку требуется мониторинг метаболической активности только одной культуры, а не нескольких культур одновременно.
Для иммобилизации заявляемый способ предлагает использование индивидуальных культур бактерий или мицелиальных грибов, способных разрушать С-Р связь в молекулах МФК и ее эфиров: Pseudomonas species 78Г [Патент РФ №2154103 (2000) Штамм Pseudomonas species 78Г, предназначенный для деградации продуктов деструкции фосфорорганических отравляющих веществ]; Escherichia coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH [Патент РФ № 2255975 (2005) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы], Escherichia coli DH5α/pTrcTE-OPH [Патент РФ № 2232807 (2004) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTrcTE-OPH и продуцент фермента органофосфатгидролазы], Chryseomonas luteola [Кравцов И.С., Янов С.Н., Дармов И.В., Ковтун А.Л. Выделение из окружающей среды микроорганизмов, способных разлагать фосфонаты. // Химическая и биологическая безопасность, 2006, №6(30), с.3-9], Comamonas teastosteroni В-1241 (ВКМ), Sinorhizobium meliloti В-1010 (ВКМ), Pseudomonas stutzeri В-1199 (ВКМ), Aspergillus awamory F-9 (ВКПМ), Aspergillus terreus F-394 (ВКПМ), Mucor circinelloides F-1226 (BKM).
6
Применение этих клеток в иммобилизованном виде способствует повышению их устойчивости к воздействию токсичных компонентов РМ ФОВ и продуктов их деструкции, а также позволяет создавать высокие концентрации клеток в реакторе для эффективного биоразложения фосфорорганических соединений, присутствующих в растворах РМ, полученных после их обработки ферментом His-OPH. Иммобилизация клеток также позволяет многократно использовать их в периодическом режиме культивирования для реализации процесса деструкции эфиров МФК и МФК. Иммобилизованные клетки характеризуются длительным периодом функционирования (до 60 сут) при обеспечении разложения фосфорорганических соединений на 99%.
При использовании иммобилизованных клеток индивидуальных культур из реакционной среды последовательно удаляются продукты биоразложения РМ (при разложении эфира МФК образуется МФК, которая разлагается до остатков фосфорной кислоты и усваивается клетками). При использовании консорциумов все эти последовательные превращения осуществляются разными клетками микроорганизмов, при этом продукты жизнедеятельности одних клеток являются субстратами для других. Диффузия метаболитов одних клеток к другим клеткам в качестве субстратов, биодоступность таких субстратов для пространственно разобщенных клеток существенно влияют на скорость процесса разложения фосфорорганических веществ в целом. В случае высокоактивных монокультур все эти процессы осуществляются одними и теми же клетками, что в целом позволяет избавиться от массообменных проблем, присутствующих в консорциумах, и существенно увеличить эффективность биоразложения фосфорорганических веществ.
Применение в качестве носителя клеток криогеля поливинилового спирта (ПВС), формируемого при замораживании-оттаивании раствора полимера, обусловлено высокой пористостью гелевой матрицы, обеспечивающей незатрудненную диффузию субстратов и продуктов, соответственно, к и от иммобилизованных клеток, а также хорошими эксплуатационными характеристиками криогеля на основе ПВС [Лозинский В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии, 2002, т.71(6), с.559-585]. Иммобилизация клеток микроорганизмов в заявляемом способе осуществляется методом их включения в макропористую матрицу, а не методом сорбции, как в аналоге и прототипе. Включение клеток в матрицу по сравнению с сорбционной иммобилизацией обеспечивает их более надежное удерживание в носителе при использовании в процессе биоразложения компонентов РМ, что позволяет вести процесс с интенсивным перемешиванием и подачей воздуха в реактор с иммобилизованными клетками для улучшения их метаболической активности и повышения эффективности биодеструкции.
Иммобилизация биомассы бактериальных клеток или спор осуществляется путем ее суспендирования в растворе ПВС с последующей криогенной обработкой (замораживанием, выдерживанием в замороженном состоянии и размораживанием), что приводит к формированию прочного полимерного криогеля, содержащего включенные в его матрицу клетки. Известный способ иммобилизации клеток микроорганизмов в криогель ПВС предусматривает формирование криогеля ПВС с одновременным включением клеток бактерий или спор мицелиальных грибов в матрицу носителя.
Иммобилизацию мицелиальных грибов проводят согласно известному способу [Патент РФ №2253677 (2005) Иммобилизованный биокатализатор, способ его получения и способ получения молочной кислоты с использованием этого биокатализатора], включая в матрицу носителя споры с последующим их культивированием в богатой питательной среде с целью их проращивания и получения в матрице носителя иммобилизованного развитого метаболически активного мицелия.
Для иммобилизации монокультуры бактерий клетки выращивают на богатых питательных средах, известных для данных культур, с целью накопления метаболически активной биомассы, которую концентрируют (сгущают) перед включением в матрицу полимерного носителя. Иммобилизацию бактериальных клеток проводят путем смешивания биомассы клеток с раствором ПВС до получения однородной массы, которую распределяют с помощью дозирующего устройства (шприц, дозатор, др.) в различные емкости, далее в них полученную смесь клеток с раствором полимера замораживают, выдерживают в замороженном состоянии и проводят размораживание.
Применяемые для реализации способа иммобилизованные клетки, в отличие от прототипа, не нуждаются в специальной адаптации перед их использованием для разложения МФК или ее эфиров, входящих в РМ разного химического состава.
6
Собственно биоразложение МФК и её эфиров с помощью иммобилизованных клеток, а также потребление образующихся фосфатов в качестве источника фосфора иммобилизованными клетками осуществляется в растворах РМ, полученных после обработки их ферментом His-OPH, и состоит в том, что полимерные гранулы с включенными в них клетками вносятся в реактор, где при рН среды 7,5-9,0 проводится аэробный процесс биоразложения фосфорорганических компонентов РМ и утилизации их в качестве источника фосфора в присутствии источника углерода, в качестве которого используют общеупотребимые в микробиологическом производстве глюкозу, глицерин и др.
Существенными отличиями заявляемого изобретения от прототипа, предназначенного для биоразложения фосфорорганических соединений в РМ вещества Vx, является новые, ранее не известные сочетания, последовательность и условия выполнения технических операций, направленных на биоразложение фосфорорганических компонентов РМ вещества типа Vx с разным химическим составом, соответствующим примененному химическому способу уничтожения ФОВ, сочетающие в себе биохимический гидролиз остаточных концентраций неразложившегося ФОВ под действием растворимого или иммобилизованного фермента и биоразложение МФК и ее эфиров, содержащих С-Р связь, под действием клеток индивидуальных культур бактерий или мицелиальных грибов, иммобилизованных методом включения в макропористый криогель ПВС.
Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие заявляемое техническое решение.
6
Пример 1. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-ГД, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 100 раз растворов реакционных масс в присутствии иммобилизованного фермента His-OPH и клеток Pseudomonas species 78Г, иммобилизованных в криогель ПВС.
-5
Для реализации способа используют РМ-ГД, содержащие вещество типа Vx (1 г/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 990 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 100 раз 200 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 3,75×10 М вещества типа Vx и 9,9 г/л фосфорорганических соединений.
6
2+
Иммобилизацию фермента His-OPH проводят согласно известному методу [Патент РФ № 2315103 (2008) Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах], используя в качестве пористого носителя криогель поли-N,N-диметилакриламида, поверхность которого модифицирована остатками иминодиуксусной кислоты и заряжена ионами Cu.
4
4
4
2
Иммобилизацию клеток бактерий Pseudomonas sp. 78Г проводят следующим образом: 8,4 г биомассы клеток, полученной после отделения от среды роста, исходно содержащей 20 г/л глюкозы, 4,0 г/л дрожжевого экстракта, 3,0 г/л (NH)SO, 5 мг/л ZnSO×4HO (рН 6,8-7,0), центрифугированием (20 мин, 8000 об/мин), смешивают с 167,6 г 8%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе физиологического раствора (0,9% NaCl), при комнатной температуре до получения однородной массы. Эту суспензию далее распределяют в лунки 96-луночных иммунологических планшетов по 0,1 мл, которые помещают в морозильную камеру при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии 17 ч и проводят размораживание при +8°С. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул цилиндрической формы используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.
Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx препаратом иммобилизованного фермента проводят, прокачивая с помощью перистальтического насоса через колонный реактор (30 мл), заполненный иммобилизованным ферментом, растворы РМ со скоростью 0,25 мл/ч при комнатной температуре. Обработка растворов РМ иммобилизованным ферментом в течение 120 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx. Иммобилизованный фермент способен функционировать в заданных условиях до 140 сут.
Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток Pseudomonas sp. 78Г проводят в течение 120 ч в аэробном реакторе (1 л) в периодическом режиме культивирования при 28°С, рН 8,0 и непрерывным перемешиванием среды (180 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 20 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода глюкозу (15 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 99% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 60 сут.
По окончании процесса объемы стоков составляют 2000 л с 1 кг РМ-ГД, а общая длительность процесса биоразложения - 10 суток.
6
Пример 2. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-РД-4М, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 10 раз растворов реакционных масс в присутствии иммобилизованного фермента His-OPH и клеток Е. coli DH5α/рТvсТЕ-ОРН, иммобилизованных в криогель ПВС.
-7
Для реализации способа используют РМ-РД-4М, содержащие вещество типа Vx (1 мг/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 320 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 10 раз водопроводной водой. Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 3,75×10 М вещества типа Vx и 32 г/л фосфорорганических соединений.
6
2+
Иммобилизацию фермента His-OPH проводят согласно известному методу [Патент РФ №2315103 (2008) Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах], используя в качестве пористого носителя криогель полиоксиэтилметакрилата, поверхность которого модифицирована остатками иминодиуксусной кислоты и заряжена ионами Cu.
Иммобилизацию клеток бактерий Е. coli DH5α/pTrcTE-OPH проводят следующим образом: 4,3 г биомассы клеток бактерий, полученной после отделения от среды роста, исходно содержащей 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl (рН 6,8), 47,7 мг/л изопропил-β-D-тиогалактопиранозида, центрифугированием (10 мин, 10000 об/мин), перемешивают с 171,7 г 10%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе 50 мМ Na-карбонатного буфера (рН 10), при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную смесь выливают ровным слоем на противень с бортами высотой 3 см для получения гелевых блоков высотой 0,5 см, замораживают при -15°С, выдерживают в замороженном состоянии 15 ч и проводят размораживание при +10°С. Размороженные гелевые блоки разрезают на кубические гранулы с линейным размером 4 мм. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул кубической формы используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.
Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx препаратом иммобилизованного фермента проводят, прокачивая с помощью перистальтического насоса через колонный реактор (60 мл), заполненный иммобилизованным ферментом, растворы РМ со скоростью 0,50 мл/ч при комнатной температуре. Обработка растворов РМ иммобилизованным ферментом в течение 120 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx. Иммобилизованный фермент способен функционировать в заданных условиях до 120 сут.
Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток Е. coli DH5α/pTrcTE-OPH проводят в течение 120 ч в аэробном реакторе (1 л) в периодическом режиме культивирования при 28°С, рН 8,0 и непрерывным перемешиванием среды (180 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 100 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода глюкозу (12 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 60 сут.
По окончании процесса объемы стоков составляют 1000 л с 1 кг РМ-РД-4М, а общая длительность процесса биоразложения - 10 суток.
6
Пример 3. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-ГД, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 100 раз растворов реакционных масс в присутствии растворимой формы фермента His-OPH и клеток Е. coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH, иммобилизованных в криогель ПВС.
-5
Для реализации способа используют РМ-ГД, содержащие вещество типа Vx (1 г/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 990 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 100 раз 100 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 3,75×10 М вещества типа Vx и 9,9 г/л фосфорорганических соединений.
2
4
2
4
2
2
Иммобилизацию клеток бактерий Е. coli SG13009[pREP4]/pTES-His-ОРН проводят следующим образом: 11 г биомассы клеток бактерий, полученной после отделения от среды культивирования, исходно содержащей 12 г/л триптона, 24 г/л дрожжевого экстракта, 4 г/л глицерина, 6,95 г/л KHPO, 12,54 г/л KHPO×3HO, 2,37 мг/л CoCl (рН 6,8-7,0), 23,8 мг/л изопропил-β-D-тиогалактопиранозида, центрифугированием (15 мин, 8500 об/мин) смешивают с 869 г 13%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе стерильной водопроводной воды, при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в лунки иммунологических 96-луночных планшетов со сферическим дном по 0,2 мл. Замораживание осуществляют при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии - 28 ч и проводят размораживание при +4°С. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул с полусферической формой, используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.
Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx растворимым препаратом фермента проводят путем внесения препарата в количестве 30 мл в разбавленный раствор РМ (270 мл). Обработка растворов РМ растворимой формой фермента в течение 116 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx.
Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток Е. coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH проводят в течение 100 ч в аэробном реакторе (10 л) в периодическом режиме культивирования при 28°С, рН 8,0 и непрерывным перемешиванием среды (180 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 20 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода глюкозу (15 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 50 сут.
По окончании процесса объемы стоков составляют 2220 л с 1 кг РМ-ГД, а общая длительность процесса биоразложения - 9 суток.
6
Пример 4. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-РД-4М, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 20 раз растворов реакционных масс в присутствии растворимой формы фермента His-OPH и клеток Comamonas teastosteroni В-1241, иммобилизованных в криогель ЛВС.
-7
Для реализации способа используют РМ-РД-4М, содержащие вещество типа Vx (1 мг/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 320 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 20 раз 100 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 1,9×10М вещества типа Vx и 16 г/л фосфорорганических соединений.
Иммобилизацию клеток бактерий С. teastosteroni В-1241 проводят следующим образом: 7,5 г биомассы клеток бактерий, полученной после отделения от среды культивирования, исходно содержащей 10 г/л триптона, 20 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л хлорида натрия, центрифугированием (15 мин, 7000 об/мин) смешивают с 74,2 г 10%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе физиологического раствора, при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в лунки иммунологических 96-луночных планшетов с плоским дном по 0,3 мл. Замораживание осуществляют при -10°С, выдерживают в замороженном состоянии 20 ч и проводят размораживание при +8°С. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде цилиндрических гранул используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.
Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx растворимым препаратом фермента проводят путем внесения препарата в количестве 50 мл в разбавленный раствор РМ (950 мл). Обработка растворов РМ растворимой формой фермента в течение 12 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx.
Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток С.teastosteroni В-1241 проводят в течение 96 ч в аэробном реакторе (100 л) в периодическом режиме культивирования при 25°С, рН 7,5 и непрерывным перемешиванием среды (200 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 40 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенный в качестве источника углерода глицерин (20 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 50 сут.
По окончании процесса объемы стоков составляют 800 л с 1 кг РМ-РД-4М, а общая длительность процесса биоразложения - 4,5 суток.
6
Пример 5. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-ГД, образующихся при химической детоксикации ФОБ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 80 раз растворов реакционных масс в присутствии иммобилизованного фермента His-OPH и клеток Pseudomonas stutzeri В-1199, иммобилизованных в криогель ПВС.
-5
Для реализации способа используют РМ-ГД, содержащие вещество типа Vx (1 г/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 990 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 80 раз 200 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 4,68×10 М вещества типа Vx и 12,4 г/л фосфорорганических соединений.
6
2+
Иммобилизацию фермента His-OPH проводят согласно известному методу [Патент РФ №2315103 (2008) Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах], используя в качестве пористого носителя криогель поли-N,N-диметилакриламида, поверхность которого модифицирована остатками иминодиуксусной кислоты и заряжена ионами Cu.
4
Иммобилизацию клеток бактерий Р. stutzeri В-1199 проводят следующим образом: 23,2 г биомассы клеток, полученной после отделения от среды роста, исходно содержащей 100 мл/л мясопептонного бульона, 2,0 г/л дрожжевого экстракта, 3,0 г/л NHCl, (pH 6,5-7,0), центрифугированием (10 мин, 8000 об/мин), смешивают с 456,8 г 9%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе 50 мМ Na-фосфатно-карбонатного буфера (pH 8,0), при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в прямоугольную металлическую форму с бортами высотой 1 см для получения гелевых блоков высотой 0,3 см. Замораживание осуществляют при -15°С, выдерживают в замороженном состоянии 15 ч и проводят размораживание при +5°С. Размороженный биокатализатор, имеющий форму гелевого пласта, разрезают и получают кубические гранулы с размером 0,5×0,5×0,5 см. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул кубической формы используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.
Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx препаратом иммобилизованного фермента проводят, прокачивая с помощью перистальтического насоса через колонный реактор (250 мл), заполненный иммобилизованным ферментом, растворы РМ со скоростью 1,25 мл/ч при комнатной температуре. Обработка растворов РМ иммобилизованным ферментом в течение 200 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx. Иммобилизованный фермент способен функционировать в заданных условиях до 170 сут.
Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток Р. stutzeri В-1199 проводят в течение 130 ч в аэробном реакторе (20 л) в периодическом режиме культивирования при 26°С, рН 8,0 и непрерывным перемешиванием среды (160 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 30 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенный в качестве источника углерода глицерин (10 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 99% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 45 сут.
По окончании процесса объемы стоков составляют 2400 л с 1 кг РМ-ГД, а общая длительность процесса биоразложения - 13,5 суток.
6
Пример 6. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-РД-4М, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 30 раз растворов реакционных масс в присутствии растворимой формы фермента His-OPH и клеток Sinorhizobium meliloti В-1010, иммобилизованных в криогель ЛВС.
-7
Для реализации способа используют РМ-РД-4М, содержащие вещество типа Vx (1 мг/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 320 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 30 раз 100 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 1,25×10 М вещества типа Vx и 10,7 г/л фосфорорганических соединений.
4
2
4
3
4
2
4
3
Иммобилизацию клеток бактерий S. meliloti В-1010 проводят следующим образом: 6,4 г биомассы клеток бактерий, полученной после отделения от среды культивирования, исходно содержащей 15 г/л пептона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л MgSO×7HO, 0,5 г/л NaCl, 1 г/л NHCl, 2 г/л NaHCO, центрифугированием (20 мин, 6000 об/мин) смешивают с 55,6 г 12%-ного раствора ПВС, приготовленного на минимальной питательной среде (1 г/л MgSO×7HO, 0,5 г/л NaCl, 1 г/л NHCl, 2 г/л NaHCO), при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в лунки иммунологических 96-луночных планшетов с плоским дном по 0,25 мл. Замораживание осуществляют при -18°С, выдерживают в замороженном состоянии в течение 30 ч и проводят размораживание при +6°С. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде цилиндрических гранул используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.
Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx растворимым препаратом фермента проводят путем внесения препарата в количестве 100 мл в разбавленный раствор РМ (900 мл). Обработка растворов РМ растворимой формой фермента в течение 120 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx.
Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток S. meliloti В-1010 проводят в течение 120 ч в аэробном реакторе (100 л) в периодическом режиме культивирования при 25°С, рН 7,5, в среде, представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 25 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода мелассу (15 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 40 сут.
По окончании процесса объемы стоков составляют 833 л с 1 кг РМ-РД-4М, а общая длительность процесса биоразложения - 10 суток.
6
Пример 7. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-ГД, образующихся при химической детоксикации ФОБ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 50 раз растворов реакционных масс в присутствии растворимой формы фермента His-OPH и клеток Chryseomonas luteola, иммобилизованных в криогель ПВС.
-5
Для реализации способа используют РМ-ГД, содержащие вещество типа Vx (1 г/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 990 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 50 раз 50 мМ карбонатным буфером (рН 10,0). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 7,5×10 М вещества типа Vx и 19,8 г/л фосфорорганических соединений.
Иммобилизацию клеток бактерий С.luteola проводят следующим образом: 78 г биомассы клеток бактерий, полученной после отделения от среды культивирования, исходно содержащей 10 г/л триптона, 20 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л хлорида натрия, центрифугированием (15 мин, 7000 об/мин) смешивают с 700 г 15%-ного раствора ПВС, приготовленного на водопроводной воде, при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в Чашки Петри по 25 мл. Замораживание осуществляют при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии в течение 10 ч и проводят размораживание при +3°С. Полученный образец криогеля ПВС с иммобилизованными клетками разрезают на гранулы в виде параллелепипеда со сторонами 0,5×0,6×0,5 см и используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.
Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx растворимым препаратом фермента проводят путем внесения препарата в количестве 100 мл в разбавленный раствор РМ (500 мл). Обработка растворов РМ растворимой формой фермента в течение 130 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx.
Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток С.luteola проводят в течение 110 ч в аэробном реакторе (100 л) в периодическом режиме культивирования при 22°С, рН 8,0 и непрерывным перемешиванием среды (250 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 40 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода глюкозу (18 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 60 сут.
По окончании процесса объемы стоков составляют 2400 л с 1 кг РМ-РД-4М, а общая длительность процесса биоразложения - 10 суток.
6
Пример 8. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-РД-4М, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 80 раз растворов реакционных масс в присутствии иммобилизованного фермента His-OPH и клеток Mucor circinelloides F-1226, иммобилизованных в криогель ПВС.
-8
Для реализации способа используют РМ-РД-4М, содержащие вещество типа Vx (1 мг/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 320 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 80 раз 50 мМ карбонатным буфером (рН 10,0). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 4,7×10 М вещества типа Vx и 4 г/л фосфорорганических соединений.
6
2+
Иммобилизацию фермента His-OPH проводят согласно известному методу [Патент РФ №2315103 (2008) Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах], используя в качестве пористого носителя криогель поли-2-оксиэтилпропиламида, поверхность которого модифицирована остатками иминодиуксусной кислоты и заряжена ионами Со.
8
4
2
4
4
2
4
2
2
4
Иммобилизацию клеток мицелиального гриба М. circinelloides F-1226 проводят следующим образом: к 100 г 10%-ного водного раствора ПВС добавляют 1 мл суспензии спор мицелиального гриба М. circinelloides с концентрацией 1×10 спор/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем выливают ровным слоем толщиной 0,3 см на противень, который помещают в морозильную камеру при -13°С, где выдерживают в замороженном состоянии 18 ч, а далее проводят размораживание при +4°С. Получают криогель ПВС в виде листового материала (100 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба, который с помощью шнекового экструдера и резака измельчают на гранулы произвольной формы с линейным размером не более 0,25 см. Полученные гранулы помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей солодовое сусло (100 г/л), (NH)SO (3,0 г/л), MgSO×7HO (0,25 г/л), ZnSO×7HO (0,1 г/л); NaCl (2,0 г/л), KHPO (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 52 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.
Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx препаратом иммобилизованного фермента проводят, прокачивая с помощью перистальтического насоса через колонный реактор (40 мл), заполненный иммобилизованным ферментом, растворы РМ со скоростью 0,85 мл/ч при комнатной температуре. Обработка растворов РМ иммобилизованным ферментом в течение 47 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx. Иммобилизованный фермент способен функционировать в заданных условиях до 150 сут.
Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток Mucor circinelloides F-1226 проводят в течение 169 ч в аэробном реакторе (2 л) в периодическом режиме культивирования при 24°С, рН 7,0 и непрерывным перемешиванием среды (200 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 10 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенное в качестве источника углерода солодовое сусло (10 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 99% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 30 сут.
По окончании процесса объемы стоков составляют 800 л с 1 кг РМ-ГД, а общая длительность процесса биоразложения - 9 суток.
6
Пример 9. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-ГД, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 60 раз растворов реакционных масс в присутствии растворимой формы фермента His-OPH и клеток Aspergillus terreus F-394, иммобилизованных в криогель ПВС.
-5
6
4
2
4
4
2
4
2
2
4
Для реализации способа используют РМ-ГД, содержащие вещество типа Vx (1 г/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 990 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 60 раз 200 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 6,25×10 М вещества типа Vx и 16,5 г/л фосфорорганических соединений. Иммобилизацию клеток мицелиального гриба A. terreus F-394 проводят следующим образом: к 30 г 11%-ного водного раствора поливинилового спирта добавляют 3 мл суспензии спор мицелиального гриба A. terreus с концентрацией 5×10 спор/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования сферических гранул диаметром 1,5±0,2 мм. Гранулирование проводят с помощью криогрануляционной установки [Патент РФ №2036095 (1992) Устройство для формирования сферических гранул из материала на основе водных систем] известным методом. Замораживание гранул осуществляют при -20°С, выдерживают их в замороженном состоянии 16 ч и проводят размораживание при +8°С. Полученные гранулы криогеля ПВС (33 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей глюкозу (120 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л), (NH)SO (3,0 г/л), MgSO×7HO (0,25 г/л), ZnSO×7HO (0,25 г/л); NaCl (5,0 г/л), KHPO (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 40 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул сферической формы используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.
Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx растворимым препаратом фермента проводят путем внесения препарата в количестве 100 мл в разбавленный раствор РМ (300 мл). Обработка растворов РМ растворимой формой фермента в течение 120 ч обеспечивает 98% разложение вещества типа Vx.
Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток A. terreus F-394 проводят в течение 144 ч в аэробном реакторе (50 л) в периодическом режиме культивирования при 26°С, рН 7,2 и непрерывным перемешиванием среды (210 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 35 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода глюкозу (20 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 50 сут.
По окончании процесса объемы стоков составляют 2800 л с 1 кг РМ-РД-4М, а общая длительность процесса биоразложения - 11 суток.
6
Пример 10. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-РД-4М, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 90 раз растворов реакционных масс в присутствии растворимой формы фермента His-OPH и клеток Aspergillus awamory F-9, иммобилизованных в криогель ПВС.
-8
Для реализации способа используют РМ-РД-4М, содержащие вещество типа Vx (1 мг/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 320 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 90 раз 200 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 4,17×10 М вещества типа Vx и 3,56 г/л фосфорорганических соединений.
5
4
2
4
4
2
4
2
2
4
Иммобилизацию клеток мицелиального гриба A. awamory F-9 проводят следующим образом: к 50 г 12%-ного водного раствора ПВС добавляют 5 мл суспензии спор мицелиального гриба A. awamory с концентрацией 1×10спор/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем разливают в 96-луночные иммунологические плашки с плоским дном (по 0,25 мл в лунку) для формирования гранул криогеля ПВС. Замораживание гранул осуществляют при -15°С, выдерживают их в замороженном состоянии 20 ч и проводят размораживание гранул при 4°С. Полученные гранулы криогеля ПВС (55 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей глюкозу (100 г/л), дрожжевой экстракт (8 г/л), (NH)SO (3,5 г/л), MgSO×7HO (0,2 г/л), ZnSO×7HO (0,2 г/л); NaCl (3,0 г/л), KHPO (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 30°С в течение 52 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул цилиндрической формы используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.
Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx растворимым препаратом фермента проводят путем внесения препарата в количестве 100 мл в разбавленный раствор РМ (900 мл). Обработка растворов РМ растворимой формой фермента в течение 48 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx.
Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток A. awamory F-9 проводят в течение 108 ч в аэробном реакторе (50 л) в периодическом режиме культивирования при 27°С, рН 6,8 и непрерывным перемешиванием среды (200 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 10 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода глюкозу (15 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 50 сут.
По окончании процесса объемы стоков составляют 990 л с 1 кг РМ-РД-4М, а общая длительность процесса биоразложения - 6,5 суток.
6
Пример 11. Пример многократного использования иммобилизованного ферментного препарата His-OPH и образцов иммобилизованных клеток микроорганизмов для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ.
6
На Фиг.1 представлена зависимость остаточной активности иммобилизованного ферментного препарата His-OPH, многократно используемого согласно тому, как описано в Примерах №1 (○), №2 (), №5 () и №8 (×), от времени его применения для обработки растворов РМ вещества типа Vx.
На Фиг.2 представлена динамика биоразложения фосфорорганических соединений в среде, содержащей ферментативные гидролизаты РМ, при многократном применении образца иммобилизованных клеток бактерий Pseudomonas sp. 78Г (), полученного и использованного, как описано в Примере 1, и образца иммобилизованных клеток мицелиального гриба Aspergillus awamory F-9, полученного и использованного, как описано в Примере 10 ().
Представленные данные подтверждают возможность длительного использования иммобилизованных препаратов фермента и клеток микроорганизмов для биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, содержащихся в РМ, получаемых после химического уничтожения ФОВ.
Существенным техническим результатом заявляемого изобретения является способ для биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и других фосфорорганических компонентов РМ вещества типа Vx, позволяющий увеличить суммарные концентрации разлагаемых веществ при 99% степени их разложения в РМ с разным химическим составом, сократить время, необходимое для проведения биоразложения, как минимум, в 1,5 раза по сравнению с прототипом, уменьшить объемы образующихся стоков, как минимум, в 10 раз и увеличить экономическую привлекательность процесса при длительном сроке функционирования клеток микроорганизмов (до 60 сут) и фермента (до 170 сут) в иммобилизованной форме.