КОМПОЗИЦИИ КЛЕТОК ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНИ
CELL COMPOSITIONS FOR TISSUE REGENERATION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/360,500, поданной 11 июля 2016 г. Содержание указанного выше документа полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки в той же степени, как если бы указанное содержание было полностью изложено в настоящей заявке.
[002] Настоящее изобретение в целом относится к области тканевой инженерии и, в частности, к применению композиций клеток для регенерации ткани и лечения костных дефектов и нарушений.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[003] Тканевая инженерия и регенеративная медицина предлагают перспективные новые способы лечения, помогающие восстанавливать поврежденные органы и ткани. Одним важным аспектом тканевой инженерии является возможность использования собственных клеток индивидуума для его же лечения. При использовании аутологичных клеток риск реакции отторжения ткани или отторжения трансплантата устраняется.
[004] Одной из динамично развивающихся областей тканевой инженерии является лечение костных нарушений и заболеваний. Кость обладает способностью к самовосстановлению в ответ на повреждение. Однако при сложных клинических состояниях нормальная регенерация кости нарушена. Указанные состояния включают большие костные дефекты, вызванные травмой, инфекцией, резекцией опухоли, а также аномалии скелета или случаи, при которых нарушается регенеративный процесс, включая аваскулярный некроз и остеопороз. Терапевтические подходы для восстановления кости включают применение заменителей костного трансплантата и терапевтических молекул.
[005] Рынок регенеративного лечения костной ткани, в частности, костных трансплантатов, представляет собой растущий рынок. Рост данного рынка вызван несколькими аспектами, такими как увеличение количества ортопедических процедур, усиленное старение популяции, увеличение предпочтительного использования заменителей костного трансплантата вместо или в дополнение к процедурам аутотрансплантации, увеличение внедрения заменителей костного трансплантата при ортопедических процедурах и повышение компенсационных выплат за ортопедические процедуры.
[006] Пересадка костной ткани представляет собой хирургическую процедуру, которая приводит к замещению отсутствующей кости. Пересадка костной ткани включает применение аутологичных трансплантатов (т.е. с использованием ткани из другой части тела пациента) или аллогенных трансплантатов (т.е. с использованием ткани другого живого донора, представляющего собой человека, или ткани трупа). Таким образом, требуется фаза получения ткани от пациента или донора.
[007] Получение ткани, как правило, выполняют с помощью хирургической процедуры, обычно включающей взятие ткани из подвздошного гребня, дистального отдела бедренной кости, проксимального отдела большеберцовой кости, малой берцовой кости или из других малых костей. Собранную ткань реструктурируют и трансплантируют в поврежденный участок.
[008] Однако процедуры по получению ткани для трансплантатов связаны со значительными осложнениями и сильным болевым эффектом. Получение ткани для аутологичных трансплантатов или получение ткани от живых доноров для аллогенного трансплантата может также приводить к осложнениям, таким как воспаление, инфекция или даже смерть.
[009] Ограниченные ресурсы и повторяющиеся осложнения в результате получения ткани способствуют разработке альтернативных стратегий для восстановления значительных костных дефектов.
[010] Исследовали применение 3-х мерных (3-D) заменителей костной ткани, таких как костный экстракт, полимерные или минеральные скаффолды, в качестве имплантатов, и для восстановления и регенерации костной ткани применяли пористые биосовместимые скаффолды.
[011] Ранние разработки в сфере восстановления ткани фокусировались в основном на применении аморфного биосовместимого губчатого материала в качестве пористых вкладок для заполнения больших пустот в костной ткани. В патенте США №4,186,448 описано применение пористых ячеистых вкладок, состоящих из полимеров полигидроксикислот, таких как полилактид, для заживления пустот в костной ткани. Также было описано несколько различных способов получения других скаффолдов (см., например, патенты США №5,133,755; 5,514,378; 5,522,895; 5,607,474; 5,677,355; 5,686,091; 5,716,413; 5,755,792; 5,769,899; 5,770,193; 6,333,029; 6,365,149 и 6,534,084).
[012] Было показано, что костный мозг (КМ) содержит популяцию клеток, которые обладают остеогенным потенциалом. В связи с этим альтернативой остеоиндуктивному подходу на основе скаффолда является трансплантация пациентам живых клеток, обладающих указанным потенциалом. Под контролем цитокинов наивные аутологичные и аллогенные клетки КМ успешно обеспечивали заживление переломов или резорбцию костей в экспериментальных моделях и у пациентов, представляющих собой людей. Прогениторные клетки остеогенной линии дифференцировки высевают на биосовместимые (биодеградируемые или не биодеградируемые) скаффолды в присутствии или в отсутствие способствующих росту факторов (см., например, патенты США №6,541,024; 6,544,290; 6,852,330). Трансплантацию страдающим заболеванием пациентам осуществляют после фазы размножения клеток ex vivo на данном скаффолде. При использовании указанного подхода первичные остеогенные клетки или размноженные мезенхимальные стволовые клетки (МСК), нанесенные на керамические скаффолды, были способны обеспечивать регенерацию костной ткани.
[013] Живая кость представляет собой постоянно развивающийся орган, и при нормальном течении процессов жизнедеятельности кости происходит непрерывный процесс ремоделирования. В ходе указанного процесса старая кость замещается новой костью, и данный орган отвечает на меняющиеся требования окружающей среды к его прочности и эластичности. Таким образом, для нормального течения процесса ремоделирования необходимо, чтобы механические нагрузки в процессе резорбции и образования кости были тщательно скоординированы.
[014] В контексте клеток это условие зависит от последовательного функционирования остеокластов (клеток, резорбирующих кость) и остеобластов (клеток, образующих кость). Кроме того, эндотелиальные клетки и предшественники эндотелиальных клеток (ангиобласты) необходимы для формирования новых кровеносных сосудов в развивающейся костной ткани. При этом различные типы клеток, принимающие участие в образовании кости, принадлежат различным линиям дифференцировки. Известно, что остеобласты происходят из мезенхимальных стволовых клеток, тогда как остеокласты (возникающие непосредственно из гематопоэтических стволовых клеток (ГПСК)) и эндотелиальные клетки берут начало от общей колониеобразующей клетки-предшественника. В связи с этим подходы для получения костеподобного материала ех vivo, которые основываются на использовании остеобластов в качестве единственного клеточного компонента, страдают от присущих всем данным подходам недостатков.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[015] В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предложена композиция, содержащая популяцию клеток, характеризующуюся различиями в уровнях экспрессии множества генов, где указанное множество генов выбрано по меньшей мере из двух таблиц, выбранных из Таблиц 1-11, по сравнению с контрольными уровнями экспрессии.
[016] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, композиция также содержит минеральную частицу, где по меньшей мере часть указанной популяции клеток контактирует с указанной минеральной частицей (например, присоединена к ней). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, минеральная частица выбрана из группы, состоящей из минеральной частицы коралла, губчатого вещества кости и компактного вещества кости.
[017] В соответствии с другим аспектом изобретения, предложен способ идентификации популяции клеток, включающий определение уровней экспрессии множества генов в указанной популяции клеток, где различия в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из генов, выбранных по меньшей мере из двух таблиц, выбранных из Таблиц 1-11, по сравнению с контрольными уровнями экспрессии указывают на идентификацию указанной популяции клеток.
[018] В соответствии с другим аспектом изобретения, предложен способ идентификации популяции клеток, подходящей для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту, включающий определение уровней экспрессии множества генов в указанной популяции клеток, где различия в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из генов, выбранных по меньшей мере из двух таблиц, выбранных из Таблиц 1-11, по сравнению с контрольными уровнями экспрессии указывают на то, что указанная популяция клеток подходит для трансплантации.
[019] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов выбрано из одного или более генов из каждой из Таблиц 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов содержит по меньшей мере 50% генов, перечисленных в Таблицах 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов выбрано из генов, перечисленных в таблице, выбранной из Таблицы 1-11.
[020] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток происходит (получена) из клеток, выращенных ex vivo. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток происходит из клеток, выращенных в трехмерной культуре. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток происходит из клеток, полученных из жировой ткани человека (HATDC). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток происходит из клеток HATDC, подвергнутых остеогенной дифференцировке.
[021] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, контрольные уровни экспрессии соответствуют второй популяции клеток, происходящей из клеток, выращенных в двумерной культуре. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, вторая популяция клеток представляет собой популяцию клеток, подвергнутую остеогенной дифференцировке.
[022] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, остеогенную дифференцировку индуцируют одним или более индукторами остеогенеза, выбранными из группы, состоящей из костных морфогенетических белков (BMP): ВМР-2, ВМР-3, BMP-4, ВМР-5, ВМР-6 и ВМР-7.
[023] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, композиция согласно изобретению предназначена для применения для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту.
[024] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, различия в уровнях экспрессии выбраны из увеличения и уменьшения экспрессии независимо для каждого гена.
[025] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, этап определения способа согласно изобретению включает этап получения молекул нуклеиновой кислоты из указанной популяции клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты выбраны из молекул мРНК, молекул ДНК и молекул кДНК. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, молекулы кДНК получены с помощью обратной транскрипции указанных молекул мРНК.
[026] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, этап определения способа согласно изобретению также включает этап гибридизации указанных молекул нуклеиновой кислоты с множеством лигандов, где каждый указанный лиганд способен специфично образовывать комплекс с, связываться с, гибридизоваться с, или количественно выявлять или идентифицировать один ген, выбранный из генов, перечисленных в Таблицах 1-11.
[027] В соответствии с другим аспектом изобретения, предложен набор, содержащий множество лигандов, где каждый указанный лиганд способен специфично образовывать комплекс с, связываться с, гибридизоваться с, или количественно выявлять или идентифицировать один ген, выбранный из множества генов, выбранных по меньшей мере из двух таблиц, выбранных из Таблиц 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, набор предназначен для идентификации популяции клеток, подходящей для трансплантации субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, различия выбраны из увеличения экспрессии, уменьшение экспрессии или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов выбрано из одного или более генов из каждой из Таблиц 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов выбрано из генов, перечисленных в таблице, выбранной из Таблиц 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов выбрано из одного или более генов из каждой из Таблиц 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов содержит по меньшей мере 50% генов, перечисленных в Таблицах 1-11.
[028] Помимо примеров аспектов и вариантов реализации изобретения, описанных выше, возможны дополнительные аспекты и варианты реализации, которые будут понятны при рассмотрении фигур и изучении следующего подробного описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[029] Фигуры 1А-С представляют собой гистограммы, показывающие результаты анализов с помощью количественной ПЦР: (А) ВМР-2, (В) SP7 и (С) ALP, экспрессирующиеся в клетках HADTC, культивируемых в 2D и 3D системах на минеральных частицах, через 0, 1, 2, 3 или 4 дня после индукции остеогенеза по сравнению с необработанными клетками HADTC, культивируемыми в 2D системах;
[030] Фигуры 2А-С представляют собой гистограммы, показывающие результаты анализов с помощью количественной ПЦР: (А) ВМР-2, (В) SP7 и (С) ALP, экспрессирующиеся в клетках HADTC, культивируемых в 2D и 3D системах на минеральных частицах, через 0, 1, 2, 3, или 4 дня после индукции остеогенеза по сравнению с необработанными клетками HADTC, культивируемыми в 2D системах;
[031] Фигуры 3А-С представляют собой гистограммы, показывающие результаты анализов с помощью количественной ПЦР: (А) ВМР-2, (В) SP7 и (С) ALP, экспрессирующиеся в клетках HADTC, культивируемых в 2D и 3D системах на минеральных частицах, через 0, 1, 2, 3 или 4 дня после индукции остеогенеза по сравнению с необработанными клетками HADTC, культивируемыми в 2D системах;
[032] Фигура 4 представляет собой гистограммный анализ, показывающий соотношение компонентов дисперсии;
[033] Фигура 5 представляет собой диаграмму Венна, показывающую количество дифференциально экспрессирующихся генов (DEG), наблюдаемых в каждой группе обработки (А, В, или С), по сравнению с контролем (БЛ);
[034] Фигуры 6А-С представляют собой графики, показывающие значимость различий в экспрессии генов для каждой группы обработки: (А) группа А, (В) группа В и (С) группа С, по сравнению с контролем (БУ), y-ось каждого графика представляет собой отрицательные log10-преобразованные p-значения. Таким образом, p-значение, составляющее 0,01, представлено значением 2 на y-оси, а p-значение, составляющее 0,001, представлено значением 3 на y-оси.
[035] Фигура 7 представляет собой иерархическую кластеризацию (тепловую карту) для групп обработки А, В, С и БУ.
[036] На Фигуре 8 показан сравнительный анализ различий в уровнях экспрессии генов в группах обработки А, В и С по сравнению с контролем (БУ);
[037] На Фигуре 9 показан анализ различий в уровнях экспрессии генов, связанных с дифференцировкой остеобластов, для групп обработки А, В и С по отношению к контрольной группе (БУ);
[038] На Фигурах 10А-В показан анализ различий в уровнях экспрессии генов, связанных с путями ангиогенеза и васкуляриазции, для групп обработки (А) А, (В) В и С по отношению к контрольной группе (БУ);
[039] Фигура 11 представляет собой таблицу (Таблица 11), в которой перечислены примеры дифференциально экспрессирующихся генов (DEG) клеток HADTC, культивируемых в 3D системах, по сравнению с клетками, культивируемыми в 2D системах.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[040] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, предложена композиция, содержащая популяцию клеток, характеризующуюся профилем экспрессии генов, показанным в Таблицах 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток предназначена для трансплантации, имплантации, введения и/или инъекции нуждающемуся в этом пациенту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток происходит из клеток, выращенных ex vivo.
[041] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, предложен способ определения того, является ли композиция подходящей для трансплантации нуждающемуся в этом пациенту. Согласно дополнительным вариантам реализации изобретения, предложена панель генов, применимых для определения того, является ли композиция подходящей для трансплантации нуждающемуся в этом пациенту.
[042] Настоящее изобретение отчасти основывается на открытии того, что популяция клеток согласно изобретению может быть охарактеризована паттерном экспрессии множества генов. Как проиллюстрировано в настоящей заявке, ниже, уровни экспрессии генов, выбранных из Таблиц 1-11, можно использовать для различения клеток (например, клеток, полученных из жировой ткани человека, или клеток HATDC), культивируемых в 3-хмерной (3D) культуре и/или подвергнутых индукции остеогенеза, и других клеток (например, клеток HATDC, культивируемых в 2-мерной (2D) культуре).
[043] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, композиция, содержащая популяцию клеток, описанную в настоящей заявке, также содержит минеральную частицу. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, композиция представляет собой 3-хмерную (3D) композицию для имплантации, применимую в качестве костного трансплантата. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток происходит из клеток, культивируемых в 3D культуре. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетки, культивируемые в 3D культуре, дополнительно подвергают индукции остеогенеза. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, остеогенную дифференцировку индуцируют индуктором остеогенеза (например, костными морфогенетическими белками (BMP): BMP-2, ВМР-3, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6 или ВМР-7). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, остеогенную дифференцировку индуцируют ВМР-2. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, остеогенную дифференцировку индуцируют ВМР-3. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, остеогенную дифференцировку индуцируют ВМР-4. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, остеогенную дифференцировку индуцируют ВМР-5. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, остеогенную дифференцировку индуцируют ВМР-6. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, остеогенную дифференцировку индуцируют ВМР-7.
[044] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток происходит из клеток HATDC, культивируемых в 3D культуре на минеральном скаффолде и подвергнутых индукции остеогенеза.
[045] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно изобретению представляет собой гетерогенную популяцию клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, гетерогенная популяция клеток может иметь разное применение, включая ее адаптирование к комбинированному костно-хрящевому трансплантату для лечения дефектов суставов и/или костному трансплантату на сосудистой ножке. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, композиция, содержащая популяцию клеток, применяется для трансплантации нуждающемуся в этом пациенту. Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция применяется для заполнения промежутка в костной ткани.
[046] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно изобретению обладает предпочтительными трансплантационными свойствами. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно изобретению характеризуется обеспечением улучшенного результата трансплантации. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, указанный улучшенный результат трансплантации представляет собой вероятность достижения успешной трансплантации (например, приживления трансплантированной популяции клеток у указанного субъекта), составляющую более чем 50%, более чем 55%, более чем 60%, более чем 70%, более чем 75%, более чем 80%, более чем 85%, более чем 90%, более чем 95%, более чем 97%, более чем 98% или более чем 99%.
[047] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, предложен способ определения того, составляет ли вероятность достижения успешной трансплантации композиции клеток (например, приживления трансплантированной популяции клеток у указанного субъекта) более чем 60%, более чем 70%, более чем 75%, более чем 80%, более чем 85%, более чем 90% или более чем 95%.
[048] Термин «субъект» при использовании в настоящей заявке относится к животному, например, млекопитающему, не представляющему собой человека, или к человеку. Субъекты, представляющие собой животных, не являющихся человеком, могут также включать пренатальные формы развития указанных животных, такие как, например, эмбрионы или плоды. Неограничивающие примеры животных, не представляющих собой человека, включают лошадь, корову, верблюда, козу, овцу, собаку, кошку, примата, не представляющего собой человека, мышь, крысу, кролика, хомяка, морскую свинку и свинью. Согласно одному варианту реализации изобретения, субъект представляет собой человека. Субъекты, представляющие собой людей, могут также включать стадию плода. Согласно одному варианту реализации изобретения, нуждающийся в указанном лечении субъект представляет собой субъекта, страдающего переломом кости, повреждением кости, снижением костной массы и/или аномалией костной ткани.
[049] При использовании в настоящей заявке все из терминов «имплантирование» или «имплантация», «трансплантирование» или «трансплантация», «введение» или «ввод», «инъецирование» или «инъекция», «доставление» или «доставка» относятся к процессу обеспечения композиции, описанной в настоящей заявке, в области, подлежащей лечению и, как следует понимать специалистам в данной области техники, имеют одинаковое значение и употребляются в зависимости от свойств композиции и процедуры, используемой для осуществления доставки ткани к указанной области. Указанные термины могут использоваться взаимозаменяемо и никоим образом не ограничивают способ согласно изобретению.
[050] При использовании в настоящей заявке термины «профиль экспрессии генов», «характер экспрессии генов» или «паттерн экспрессии генов» являются взаимозаменяемыми и относятся к паттерну изменения/различия в экспрессии генов, включая повышение или снижение экспрессии, наблюдаемому в гетерогенной популяции клеток согласно изобретению по сравнению с популяциями, происходящими из контрольных клеток (например, клеток, культивируемых в 2D культуре и подвергнутых или не подвергнутых индукции остеогенеза). Профиль или паттерн включает относительный уровень повышения или снижения экспрессии «дифференциально экспрессирующегося гена» (DEG) по сравнению с контролем.
[051] Термины «дифференциально экспрессирующийся ген», «DEG» «дифференциальная экспрессия генов» и их синонимы, которые используются взаимозаменяемо, относятся к гену, экспрессия которого стимулируется или подавляется до более высокого или более низкого уровня в выбранной популяции клеток по сравнению с контролем. Также следует понимать, что дифференциально экспрессирующийся ген может либо активироваться, либо ингибироваться на уровне нуклеиновой кислоты или белка, или может подвергаться альтернативному сплайсингу с получением отличающегося полипептидного продукта. Такие различия могут подтверждаться, например, изменением уровней мРНК, поверхностной экспрессии, секреции или другого распределения полипептида.
[052] При использовании в настоящей заявке «различие уровня экспрессии» и «изменение уровня экспрессии» и их синонимы, которые используются взаимозаменяемо, относятся к значительному различию в экспрессии гена. Термины включают повышение экспрессии генов и/или снижение экспрессии генов.
[053] Термин «значительное различие» в контексте измеряемых уровней экспрессии включает стимуляцию/повышение/увеличение и/или подавление/снижение/уменьшение (или их комбинацию) экспрессии исследуемых генов (таким образом, что экспрессия первого гена исследуемого профиля экспрессии может стимулироваться, тогда как экспрессия второго гена профиля экспрессии может подавляться).
[054] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, на основе данных, перечисленных в Таблицах 1-11 (обозначенных с помощью «+» или «-») определяют, указывает ли увеличение или уменьшение экспрессии конкретного гена на то, что исследуемая популяция подходит для трансплантации. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, указанное значительное различие представляет собой статистически значимое различие, такое как различие в среднем уровне экспрессии, как понятно специалисту в данной области техники. В качестве неограничивающего примера, повышение или снижение по меньшей мере примерно в два раза или, альтернативно, по меньшей мере примерно в три раза по сравнению с контрольным значением связано с конкретной стадией дифференцировки клеток.
[055] Термины «снижение», «подавление» и «уменьшение» используются взаимозаменяемо в настоящей заявке и относятся к статистически значимому снижению уровня экспрессии генов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, снижение относится к снижению по меньшей мере в 1,2, по меньшей мере в 1,3, по меньшей мере в 1,4, по меньшей мере в 1,5, по меньшей мере в 1,6, по меньшей мере в 1,7, по меньшей мере в 1,8, по меньшей мере в 1,9, по меньшей мере в 2, по меньшей мере в 3, по меньшей мере в 4, по меньшей мере в 5, по меньшей мере в 6, по меньшей мере в 7, по меньшей мере в 8, по меньшей мере в 9 или 10 раз. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[056] При использовании в настоящей заявке термины «увеличение», «повышение» и «стимуляция» используются взаимозаменяемо и относятся к статистически значимому повышению экспрессии генов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение относится к повышению по меньшей мере в 1,2, по меньшей мере в 1,3, по меньшей мере в 1,4, по меньшей мере в 1,5, по меньшей мере в 1,6, по меньшей мере в 1,7, по меньшей мере в 1,8, по меньшей мере в 1,9, по меньшей мере в 2, по меньшей мере в 3, по меньшей мере в 4, по меньшей мере в 5, по меньшей мере в 6, по меньшей мере в 7, по меньшей мере в 8, по меньшей мере в 9 или 10 раз. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
Композиция
[057] В соответствии с одним аспектом, предложена композиция, содержащая популяцию клеток, где указанная композиция характеризуется профилем экспрессии генов, показанным в любой из Таблиц 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблиц 1-10. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблиц 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблицы 11.
[058] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, различия в уровнях экспрессии определяют по сравнению с контрольной популяцией. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, контрольная популяция представляет собой популяцию, произошедшую из клеток, культивируемых в двумерной (2D) культуре. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, контрольная популяция происходит из клеток, культивируемых в 2D культуре и подвергнутых индукции остеогенеза.
[059] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из одного или более генов, выбранных из Таблицы 1, одного или более генов, выбранных из Таблицы 2, одного или более генов, выбранных из Таблицы 3, одного или более генов, выбранных из Таблицы 4, одного или более генов, выбранных из Таблицы 5, одного или более генов, выбранных из Таблицы 6, одного или более генов, выбранных из Таблицы 7, одного или более генов, выбранных из Таблицы 8, одного или более генов, выбранных из Таблицы 9, одного или более генов, выбранных из Таблицы 10 и/или одного или более генов, выбранных из Таблицы 11, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов содержит один или более генов из каждой из Таблиц 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов выбрано из генов, перечисленных в таблице, выбранной из Таблиц 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, один или более генов представляют собой по меньшей мере два гена или по меньшей мере 3 гена или по меньшей мере 4 гена. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[060] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблицы 1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблицы 2. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблицы 3. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблицы 4. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблицы 5. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблицы 6. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблицы 7. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблицы 8. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблицы 9. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблицы 10. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генов, выбранных из Таблицы 11.
[061] В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения, множество генов содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 31, по меньшей мере 32, по меньшей мере 33, по меньшей мере 34, по меньшей мере 35, по меньшей мере 36, по меньшей мере 37, по меньшей мере 38, по меньшей мере 39, по меньшей мере 40, по меньшей мере 41, по меньшей мере 42, по меньшей мере 43, по меньшей мере 44, по меньшей мере 45, по меньшей мере 46, по меньшей мере 47, по меньшей мере 48, по меньшей мере 49, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95 различных генов, перечисленных в Таблицах 1-11. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[062] В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения, множество генов содержит не более 2, не более 3, не более 4, не более 5, не более 6, не более 7, не более 8, не более 9, не более 10, не более 11, не более 12, не более 13, не более 14, не более 15, не более 16, не более 17, не более 18, не более 19, не более t 20, не более 21, не более 22, не более 23, не более 24, не более 25, не более 26, не более 27, не более 28, не более 29, не более 30, не более 31, не более 32, не более 33, не более 34, не более 35, не более 36, не более 37, не более 38, не более 39, не более 40, не более 41, не более 42, не более 43, не более 44, не более 45, не более 46, не более 47, не более 48, не более 49, не более 50, не более 55, не более 60, не более 65, не более 70, не более 75, не более 80, не более 85, не более 90, не более 95 различных генов, перечисленных в Таблицах 1-11. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[063] В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения, множество генов содержит не более 2, не более 3, не более 4, не более 5, не более 6, не более 7, не более 8, не более 9, не более 10, не более 11, не более 12, не более 13, не более 14, не более 15, не более 16, не более 17, не более 18, не более 19, не более t 20, не более 21, не более 22, не более 23, не более 24, не более 25, не более 26, не более 27, не более 28, не более 29, не более 30, не более 31, не более 32, не более 33, не более 34, не более 35, не более 36, не более 37, не более 38, не более 39, не более 40, не более 41, не более 42, не более 43, не более 44, не более 45, не более 46, не более 47, не более 48, не более 49, не более 50, не более 55, не более 60, не более 65 генов, перечисленных в Таблице 11. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[064] В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения, множество генов содержит по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50% по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% генов, перечисленных в Таблицах 1-11. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[065] Согласно другому варианту реализации изобретения, множество генов содержит или состоит из всех генов, перечисленных в Таблице 1. Согласно другому варианту реализации изобретения, множество генов содержит или состоит из всех генов, перечисленных в Таблице 2. Согласно другому варианту реализации изобретения, множество генов содержит или состоит из всех генов, перечисленных в Таблице 3. Согласно другому варианту реализации изобретения, множество генов содержит или состоит из всех генов, перечисленных в Таблице 4. Согласно другому варианту реализации изобретения, множество генов содержит или состоит из всех генов, перечисленных в Таблице 5. Согласно другому варианту реализации изобретения, множество генов содержит или состоит из всех генов, перечисленных в Таблице 6. Согласно другому варианту реализации изобретения, множество генов содержит или состоит из всех генов, перечисленных в Таблице 7. Согласно другому варианту реализации изобретения, множество генов содержит или состоит из всех генов, перечисленных в Таблице 8. Согласно другому варианту реализации изобретения, множество генов содержит или состоит из всех генов, перечисленных в Таблице 9. Согласно другому варианту реализации изобретения, множество генов содержит или состоит из всех генов, перечисленных в Таблице 10. Согласно другому варианту реализации изобретения, множество генов содержит или состоит из всех генов, перечисленных в Таблице 11.
Экспрессия генов популяции клеток согласно изобретению
Подавление маркеров МСК
[066] Как проиллюстрировано в разделе «Примеры», ниже, популяция клеток, происходящая из клеток, культивируемых в 3D культуре, характеризуется снижением уровня генов, связанных со стволовыми клетками, выбранных из: ANPEP (CD13), NT5E (CD73), THY1 (CD90) и KLF4 (как указано в Таблице 1b).
[067] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генетических маркеров МСК, перечисленных в Таблице 1, включающих: ANPEP (CD13), NT5E (CD73), THY1 (CD90) и KLF4. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ANPEP (CD13), NT5E (CD73), THY1 (CD90) и KLF4. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется снижением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ANPEP (CD13), NT5E (CD73), THY1 (CD90) и KLF4.
[068] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, снижение уровней экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ANPEP (CD13), NT5E (CD73), THY1 (CD90) и KLF4, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, снижение уровня экспрессии NT5E (CD73) по отношению к контрольной популяции, указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту.
Экспрессия генов, регулирующих пролиферацию и дифференцировку
[069] Как проиллюстрировано в разделе «Примеры», ниже, популяция клеток, происходящая из клеток, культивируемых в 3D культуре, характеризуется различиями в уровнях экспрессии генов, указанных в Таблице 2b. Популяция клеток, происходящая из клеток, культивируемых в 3D культуре, дополнительно характеризуется сниженной экспрессией генов, регулирующих пролиферацию, выбранных из: AURKA, FOS, FGF2, BCL2L1, DDX21, RRAS2, STAT1 и ANXA2. Популяция клеток, происходящая из клеток, культивируемых в 3D культуре, дополнительно характеризуется повышением уровней экспрессии генов, регулирующих дифференцировку, выбранных из: SFRP2, MRAS, NOX4, NOTCH3 и RGCC. Как дополнительно проиллюстрировано в разделе «Примеры», клетки HATDC, выращенные в 2D или 3D культурах и подвергнутые индукции остеогенеза, характеризуются различиями в уровнях экспрессии генов, регулирующих пролиферацию, выбранных из группы, состоящей из: ID1, ID2 и ID3.
[070] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, перечисленных в Таблице 2, включающих: AURKA, FOS, FGF2, BCL2L1, DDX21, RRAS2, STAT1, ANXA2, SFRP2, MRAS, NOX4, NOTCH3 и RGCC. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетка согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: AURKA, FOS, FGF2, BCL2L1, DDX21, RRAS2, STAT1, ANXA2, SFRP2, MRAS, NOX4, NOTCH3 и RGCC, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетка согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: AURKA, FGF2, BCL2L1, ANXA2 и SFRP2, по сравнению с контролем.
[071] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется снижением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: AURKA, FOS, FGF2, BCL2L1, DDX21, RRAS2, STAT1 и ANXA2, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется снижение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: AURKA, FGF2, BCL2L1 и ANXA2, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: SFRP2, MRAS, NOX4, NOTCH3 и RGCC, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии SFRP2 по сравнению с контролем.
[072] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, различия в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: AURKA, FOS, FGF2, BCL2L1, DDX21, RRAS2, STAT1, ANXA2, SFRP2, MRAS, NOX4, NOTCH3 и RGCC, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: SFRP2, MRAS, NOX4, NOTCH3 и RGCC, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, снижение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: AURKA, FOS, FGF2, BCL2L1, DDX21, RRAS2, STAT1 и ANXA2, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии SFRP2, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту.
Экспрессия генов МНС I
[073] Как проиллюстрировано в разделе «Примеры», ниже, популяция клеток, происходящая из клеток, культивируемых в 3D культуре, характеризуется повышением уровней экспрессии генов главного комплекса гистосовместимости I типа (МНС I) по сравнению с контрольной популяцией, культивируемой в 2D культуре (как указано в Таблице 3b).
[074] При использовании в настоящей заявке, термин «МНС» относится к главному комплексу гистосовместимости, вовлеченному в презентацию чужеродных антигенов иммунной системе. При использовании в настоящей заявке термин «HLA» относится к человеческой форме «МНС». Как правило, гены МНС I экспрессируются практически во всех дифференцированных клетках. Известно, что в мезенхимальных стволовых клетках молекулы МНС I класса экспрессируются на низком уровне.
[075] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, перечисленных в Таблице 3, включающих: LA-A, HLA-B, HLA-DMA, HLA-F, HLA-G и HLA-H. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов по сравнению с контрольной популяцией клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, один или более генов выбраны из группы, состоящей из: HLA-A, HLA-B, HLA-DMA, HLA-F, HLA-G и HLA-H. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, один или более генов выбраны из группы, состоящей из: HLA-A, HLA-B, HLA-F, HLA-G и HLA-H. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, различия в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: HLA-A, HLA-B, HLA-DMA, HLA-F, HLA-G и HLA-Н, указывают на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровней экспрессии множества генов, выбранных из группы, состоящей из: HLA-A, HLA-В, HLA-DMA, HLA-F, HLA-G и HLA-H, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровней экспрессии множества генов, выбранных из группы, состоящей из: HLA-A, HLA-B, HLA-F, HLA-G и HLA-H, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту.
Экспрессия маркеров адипоцитов
[076] Как проиллюстрировано в разделе «Примеры», ниже, популяция клеток, происходящая из клеток, культивируемых в 3D культуре, характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генетических маркеров адипоцитов по сравнению с контрольной популяцией, культивируемой в 2D культуре (как указано в Таблице 4b).
[077] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, перечисленных в Таблице 4, включающих: PPARG, DLK1, ACSL1, АЕВР1 и Sox9, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: PPARG, DLK1, ACSL1, АЕВР1 и Sox9, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется отличающимся уровнем экспрессии АЕВР1.
[078] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется снижением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: PPARG и ACSL1, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется снижением уровней экспрессии PPARG и ACSL1 по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровней экспрессии множества генетических маркеров адипоцитов, выбранных из группы, состоящей из: DLK1, АЕВР1 и Sox9, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии АЕВР1.
[079] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, различия в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: PPARG, DLK1, ACSL1, АЕВР1 и Sox9, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: DLK1, АЕВР1 и Sox9, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии АЕВР1 по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, снижение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: PPARG и ACSL1, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту.
Экспрессия маркеров остеобластов
[080] Как проиллюстрировано в разделе «Примеры», ниже, популяция клеток, происходящая из клеток, культивируемых в 3D культуре, характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генетических маркеров остеобластов по сравнению с контрольной популяцией, культивируемой в 2D культуре (как указано в Таблице 5b).
[081] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генетических маркеров остеобластов, перечисленных в Таблице 5, включающих: ВМР2, BMPR2, SP7, ALP (щелочную фосфатазу), POSTN, FGFR3, Msx1 (Нох7), Msx2 (Нох8), DLX5, KAZALD1, СА12, BMPER и FBN2. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ВМР2, BMPR2, SP7, ALP (щелочная фосфатаза), POSTN, FGFR3, Msx1 (Нох7), Msx2 (Нох8), DLX5, KAZALD1, СА12, BMPER и FBN2, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ВМР2, ALP (щелочной фосфатазы), POSTN, Msx1 (Нох7), Msx2 (Нох8), СА12, BMPER и FBN2, по сравнению с контролем.
[082] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется снижением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: BMPER и FBN2, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется снижением уровней экспрессии BMPER и FBN2, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется снижением уровня экспрессии FBN2 по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ВМР2, BMPR2, SP7, ALP (щелочной фосфатазы), POSTN, FGFR3, Msx1 (Нох7), Msx2 (Нох8), DLX5, KAZALD1 и СА12, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется индукцией уровней экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ВМР2, ALP, POSTIN, MSX1, MSX2 и СА12, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ВМР2, SP7 и ALP (щелочной фосфатазы), по сравнению с контролем.
[083] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, различия в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ВМР2, BMPR2, SP7, ALP (щелочной фосфатазы), POSTN, FGFR3, Msx1 (Нох7), Msx2 (Нох8), DLX5, KAZALD1, СА12, BMPER и FBN2, по сравнению с контрольной популяцией указывают на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, различия в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ВМР2, ALP (щелочной фосфатазы), POSTN, Msx1 (Нох7), Msx2 (Нох8), СА12 и FBN2, по сравнению с контрольной популяцией указывают на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ВМР2, BMPR2, SP7, ALP (щелочной фосфатазы), POSTN, FGFR3, Msx1 (Нох7), Msx2 (Нох8), DLX5, KAZALD1, СА12, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту.
[084] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ВМР2, ALP (щелочной фосфатазы), POSTN, Msx1 (Нох7), Msx2 (Нох8) и СА12, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, снижение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: BMPER и FBN2, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, снижение уровня экспрессии FB2, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту.
Экспрессия генетических маркеров остеохондральных предшественников и гипертрофических хондроцитов
[085] Как проиллюстрировано в разделе «Примеры», ниже, популяция клеток, происходящая из клеток, культивируемых в 3D культуре, характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генетических маркеров остеохондральных предшественников и/или гипертрофических хондроцитов по сравнению с контрольной популяцией, культивируемой в 2D культуре (как указано в Таблице 6b).
[086] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генетических маркеров остеохондральных предшественников и/или гипертрофических хондроцитов, перечисленных в Таблице 6, включающих: Sox9, MGP, COL10A1, COL9A2, ММР13, GSN, CBFB, ВАРХ1 (NKX3-2), RUNX1, RUNX2 и СОМР. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: Sox9, MGP, COL10A1, COL9A2, ММР13, GSN, CBFB, BAPX1 (NKX3-2), RUNX1, RUNX2 и СОМР, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ММР13, RUNX1 и RUNX2, по сравнению с контролем.
[087] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: Sox9, MGP, COL10A1, COL9A2, ММР13, GSN, CBFB, ВАРХ1 (NKX3-2), RUNX1, RUNX2 и СОМР, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ММР13, RUNX1 и RUNX2, по сравнению с контролем.
[088] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, различия в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: Sox9, MGP, COL10A1, COL9A2, ММР13, GSN, CBFB, BAPX1 (NKX3-2), RUNX1, RUNX2 и СОМР, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: Sox9, MGP, COL10A1, COL9A2, ММР13, GSN, CBFB, BAPX1 (NKX3-2), RUNX1, RUNX2 и СОМР, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ММР13, RUNX1 и RUNX2, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту.
Экспрессия генетических маркеров ВКМ
[089] Как проиллюстрировано в разделе «Примеры», ниже, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии множества генетических маркеров внеклеточного матрикса (ВКМ) по сравнению с контрольной популяцией, культивируемой в 2D культуре (как указано в Таблице 7b).
[090] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генетических маркеров ВКМ, перечисленных в Таблице 7, включающих: BGN, LAMA4, LAMA2, LTBP3, DPT, EFEMP2, PLOD1, TNC, DCN, FBLN2, NDNF и SULF1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: BGN, LAMA4, LAMA2, LTBP3, DPT, EFEMP2, PLOD1, TNC, DCN, FBLN2, NDNF и SULF1, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: BGN, LAMA4, LAMA2, DPT, PLOD1, DCN и NDNF, по сравнению с контролем.
[091] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: BGN, LAMA4, LAMA2, LTBP3, DPT, EFEMP2, PLOD1, TNC, DCN, FBLN2, NDNF и SULF1, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: BGN, LAMA4, LAMA2, DPT, PLOD1, DCN и NDNF, по сравнению с контролем.
[092] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, различия в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: BGN, LAMA4, LAMA2, LTBP3, DPT, EFEMP2, PLOD1, TNC, DCN, FBLN2, NDNF и SULF1, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: BGN, LAMA4, LAMA2, LTBP3, DPT, EFEMP2, PLOD1, TNC, DCN, FBLN2, NDNF и SULF1, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: BGN, LAMA4, LAMA2, DPT, PLOD1, DCN и NDNF, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту.
Экспрессия генов, кодирующих структурные белки
[093] Как проиллюстрировано в разделе «Примеры», ниже, популяция клеток, происходящая из клеток, культивируемых в 3D культуре, характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов структурных белков по сравнению с контрольной популяцией, культивируемой в 2D культуре (как указано в Таблице 8b).
[094] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов структурных белков, перечисленных в Таблице 8, включающих: ММР14, ММР2, ММР23В, ММР3, ММР7, COL16A1, COL24A1, COL6A2, COL7A1, COL8A2, ADAMTS2 и PCOLCE. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов структурных белков, выбранных из группы, состоящей из: ММР14, ММР2, ММР23В, ММР3, ММР7, COL16A1, COL24A1, COL6A2, COL7A1, COL8A2, ADAMTS2 и PCOLCE, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов структурных белков, выбранных из группы, состоящей из: ММР14, ММР2, ММР23В, ММР3, COL6A2, COL7A1, COL8A2 и PCOLCE, по сравнению с контролем.
[095] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии одного или более генов структурных белков, выбранных из группы, состоящей из: ММР14, ММР2, ММР23В, ММР3, ММР7, COL16A1, COL24A1, COL6A2, COL7A1, COL8A2, ADAMTS2 и PCOLCE, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии одного или более генов структурных белков, выбранных из группы, состоящей из: ММР14, ММР2, ММР23В, ММР3, COL6A2, COL7A1, COL8A2 и PCOLCE, по сравнению с контролем.
[096] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, различия в уровнях экспрессии одного или более генов структурных белков, выбранных из группы, состоящей из: ММР14, ММР2, ММР23В, ММР3, ММР7, COL16A1, COL24A1, COL6A2, COL7A1, COL8A2, ADAMTS2 и PCOLCE, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более генов структурных белков, выбранных из группы, состоящей из ММР14, ММР2, ММР23В, ММР3, ММР7, COL16A1, COL24A1, COL6A2, COL7A1, COL8A2, ADAMTS2 и PCOLCE, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более генов структурных белков, выбранных из группы, состоящей из: ММР14, ММР2, ММР23В, ММР3, COL6A2, COL7A1, COL8A2 и PCOLCE, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту.
Экспрессия связанных с ангиогенезом и васкулогенезом генов
[097] Как проиллюстрировано в разделе «Примеры», ниже, популяция клеток, происходящая из клеток, культивируемых в 3D культуре, характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более связанных с сосудами генетических маркеров по сравнению с контрольной популяцией, культивируемой в 2D культуре (как указано в Таблице 9b).
[098] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более связанных с ангиогенезом и васкулогенезом генов, перечисленных в Таблице 9, содержащих: ТВХ2, ТВХ3, ANG, ANGPT2, ANGPTL2, TRO, EDNRA, ЕРНА2, F2R, PGF, CTHRC1, PTGDS, АЕВР1, IL8 (Cxcl8), IL11, HEY1, ЕСМ1, MFGE8 и SRPX2 и UNC5B. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ТВХ2, ТВХ3, ANG, ANGPT2, ANGPTL2, TRO, EDNRA, ЕРНА2, F2R, PGF, CTHRC1, PTGDS, АЕВР1, IL8 (Cxcl8), IL11, HEY1, ЕСМ1, MFGE8 и SRPX2 и UNC5B, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ANGPT2, ANGPTL2, TRO, PTGDS, АЕВР1, IL8 (Cxcl8) и ЕСМ1, по сравнению с контролем.
[099] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ТВХ2, ТВХ3, ANG, ANGPT2, ANGPTL2, TRO, EDNRA, ЕРНА2, F2R, PGF, CTHRC1, PTGDS, АЕВР1, IL8 (Cxcl8), IL11, HEY1, ЕСМ1, MFGE8 и SRPX2 и UNC5B, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ANGPT2, ANGPTL2, TRO, PTGDS, АЕВР1, IL8 (Cxcl8) и ЕСМ1, по сравнению с контролем.
[0100] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, различия в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ТВХ2, ТВХ3, ANG, ANGPT2, ANGPTL2, TRO, EDNRA, ЕРНА2, F2R, PGF, CTHRC1, PTGDS, АЕВР1, IL8 (Cxcl8), IL11, HEY1, ЕСМ1, MFGE8 и SRPX2 и UNC5B, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ТВХ2, ТВХ3, ANG, ANGPT2, ANGPTL2, TRO, EDNRA, ЕРНА2, F2R, PGF, CTHRC1, PTGDS, AEBP1, IL8 (Cxcl8), IL11, HEY1, ECM1, MFGE8 и SRPX2 и UNC5B, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ANGPT2, ANGPTL2, TRO, PTGDS, АЕВР1, IL8 (Cxcl8) и ЕСМ1, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту.
Экспрессия конкретных предшествующих генов-регуляторов
[0101] Как проиллюстрировано в разделе «Примеры», ниже, популяция клеток, происходящая из клеток, культивируемых в 3D культуре, характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более предшествующих генов-регуляторов по сравнению с контрольной популяцией, культивируемой в 2D культуре (как указано в Таблице 10b).
[0102] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более предшествующих генов-регуляторов, перечисленных в Таблице 10, включающих: TGFB3, BAMBI, IGFBP2 и IGFBP5. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более предшествующих генов-регуляторов, выбранных из группы, состоящей из: TGFB3, BAMBI, IGFBP2 и IGFBP5, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более предшествующих генов-регуляторов, выбранных из группы, состоящей из: TGFB3, IGFBP2 и IGFBP5, по сравнению с контролем.
[0103] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии одного или более предшествующих генов-регуляторов, выбранных из группы, состоящей из: TGFB3, BAMBI, IGFBP2 и IGFBP5, по сравнению с контролем. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется повышением уровня экспрессии одного или более предшествующих генов-регуляторов, выбранных из группы, состоящей из: TGFB3, IGFBP2 и IGFBP5, по сравнению с контролем.
[0104] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, различия в уровнях экспрессии одного или более предшествующих генов-регуляторов, выбранных из группы, состоящей из: TGFB3, BAMBI, IGFBP2 и IGFBP5, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более предшествующих генов-регуляторов, выбранных из группы, состоящей из: TGFB3, BAMBI, IGFBP2 и IGFBP5, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, повышение уровня экспрессии одного или более предшествующих генов-регуляторов, выбранных из группы, состоящей из: TGFB3, IGFBP2 и IGFBP5, по сравнению с контрольной популяцией указывает на то, что популяция клеток подходит для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту.
[0105] Как проиллюстрировано в разделе «Примеры», ниже, популяция клеток, происходящая из клеток, культивируемых в 3D культуре, характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов по сравнению с контрольной популяцией, культивируемой в 2D культуре (как указано в Таблице 11).
[0106] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере 2-кратным изменением уровня экспрессии одного или более генов, перечисленных в Таблице 11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере 3-кратным изменением уровня экспрессии одного или более генов, перечисленных в Таблице 11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере 3-кратным снижением уровня экспрессии одного или более генов, перечисленных в Таблице 11, включающих: CLDN1, SFRP1, BCYRN, CDCA7, FLJ21986, ODC1, OSR1, LOC100130516 и ROR1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере 3-кратным снижением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: CLDN1, SFRP1, BCYRN, CDCA7, FLJ21986, ODC1, OSR1, LOC100130516 и ROR1.
[0107] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере 3-кратным увеличением уровня экспрессии одного или более генов, перечисленных в Таблице 11, включающих: ALOX15B, НЕРН, FNDC1, C14ORF132, PFKFB4, GABARAPL1, CRISPLD2, C13ORF15, SLC6A10P, JAM2, NBL1, OGN, ASS1, SSPN, ALOX15B, ТМЕМ90В, FLJ35258, ТМЕМ16А, CRLF1, CD24, СМТМ8, ARHGEF19, OMD, BTBD11CYGB, C1QTNF5, MARCKSL1, INSC, АТР1В1, CPE, NBL1, ENC1, APCDD1L, SEZ6L2, SLC7A8, ISLR, АТР1В1, TSPAN7, SAMD11, АТР1В1, ALDOC, RGS2, DYNC1I1, RASL11B, EYA2, DIO2, CRYAB, KLK4, MXRA5, СА9, Н19, PENK, RARRES2, KANK4, PTGES и ANKRD38. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере 3-кратным повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: ALOX15B, НЕРН, FNDC1, C14ORF132, PFKFB4, GABARAPL1, CRISPLD2, C13ORF15, SLC6A10P, JAM2, NBL1, OGN, ASS1, SSPN, ALOX15B, ТМЕМ90В, FLJ35258, ТМЕМ16А, CRLF1, CD24, СМТМ8, ARHGEF19, OMD, BTBD11CYGB, C1QTNF5, MARCKSL1, INSC, АТР1В1, CPE, NBL1, ENC1, APCDD1L, SEZ6L2, SLC7A8, ISLR, АТР1В1, TSPAN7, SAMD11, АТР1В1, ALDOC, RGS2, DYNC1I1, RASL11B, EYA2, DIO2, CRYAB, KLK4, MXRA5, СА9, Н19, PENK, RARRES2, KANK4, PTGES и ANKRD38. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере 4-кратным повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: FLJ35258, ТМЕМ16А, CRLF1, CD24, СМТМ8, ARHGEF19, OMD, BTBD11CYGB, C1QTNF5, MARCKSL1, INSC, ATP1B1, CPE, NBL1, ENC1, APCDD1L, SEZ6L2, SLC7A8, ISLR, ATP1B1, TSPAN7, SAMD11, ATP1B1, ALDOC, RGS2, DYNC1I1, RASL11B, EYA2, DIO2, CRYAB, KLK4, MXRA5, CA9, H19, PENK, RARRES2, KANK4, PTGES и ANKRD38. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере 5-кратным повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: SLC7A8, ISLR, АТР1В1, TSPAN7, SAMD11, АТР1В1, ALDOC, RGS2, DYNC1I1, RASL11B, EYA2, DIO2, CRYAB, KLK4, MXRA5, СА9, Н19, PENK, RARRES2, KANK4, PTGES и ANKRD38.
[0108] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере 6-кратным повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: АТР1В1, TSPAN7, SAMD11, АТР1В1, ALDOC, RGS2, DYNC1I1, RASL11B, EYA2, DIO2, CRYAB, KLK4, MXRA5, СА9, Н19, PENK, RARRES2, KANK4, PTGES и ANKRD38. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере 7-кратным повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: DIO2, CRYAB, KLK4, MXRA5, СА9, Н19, PENK, RARRES2, KANK4, PTGES и ANKRD38. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере 8-кратным повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: MXRA5, СА9, H19, PENK, RARRES2, KANK4, PTGES и ANKRD38. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению характеризуется по меньшей мере 10-кратным повышением уровня экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: PENK, RARRES2, KANK4, PTGES и ANKRD38.
Изменение экспрессии после индукции остеогенеза
[0109] Как проиллюстрировано в разделе «Примеры», ниже (Таблица 12), было обнаружено, что в клетках HATDC, подвергнутых индукции остеогенеза, наблюдается изменение уровней экспрессии генов АТОН8, CGB1, СМТМ4, FOXO, ID1, ID2, ID3, NEBL, OSR1, PRRX2, SAMD11, SLC16A3 и SMAD9.
[0110] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток, происходящая из клеток, подвергнутых индукции остеогенеза, характеризуется различиями в уровнях экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: АТОН8, CGB1, СМТМ4, FOXO, ID1, ID2, ID3, NEBL, OSR1, PRRX2, SAMD11, SLC16A3 и SMAD9. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток, происходящая из клеток, подвергнутых индукции остеогенеза, характеризуется увеличение экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: АТОН8, CGB1, СМТМ4, FOXO, ID1, ID2, ID3, NEBL, PRRX2, SAMD11, SLC16A3 и SMAD9. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, гетерогенная популяция клеток, происходящая из клеток, подвергнутых индукции остеогенеза, характеризуется снижением уровня экспрессии гена OSR1.
Способ идентификации композиции, подходящий для трансплантации
[0111] В соответствии с одним аспектом, предложен способ определения пригодности композиции клеток для трансплантации, включающий определение уровней экспрессии множества генов или их продуктов в указанной композиции, где значительное различие уровней экспрессии множества генов по сравнению с контролем указывает на то, что композиция подходит для трансплантации.
[0112] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов выбрано из генов, перечисленных в Таблицах 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов выбрано из одного или более генов из каждой из Таблиц 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов выбрано из генов, перечисленных в таблице, выбранной из Таблиц 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов выбрано из генов, перечисленных в любой из Таблиц 1-11.
[0113] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, контрольная популяция представляет собой популяцию, произошедшую из клеток, культивируемых в двумерной (2D) культуре. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, контрольная популяция происходит из клеток, культивируемых в 2D культуре и подвергнутых индукции остеогенеза.
[0114] Термины «определение», «измерение», «оценивание» и «анализирование» используются взаимозаменяемо и включают как количественное, так и качественное определение. Указанные термины относятся к любой форме измерения и включают определение наличия или отсутствия характеристики, свойства или признака. Оценивание может быть относительным или абсолютным.
[0115] В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения, множество генов содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 31, по меньшей мере 32, по меньшей мере 33, по меньшей мере 34, по меньшей мере 35, по меньшей мере 36, по меньшей мере 37, по меньшей мере 38, по меньшей мере 39, по меньшей мере 40, по меньшей мере 41, по меньшей мере 42, по меньшей мере 43, по меньшей мере 44, по меньшей мере 45, по меньшей мере 46, по меньшей мере 47, по меньшей мере 48, по меньшей мере 49, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95 различных генов, перечисленных в Таблицах 1-10. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения. В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения, множество генов содержит не более 2, не более 3, не более 4, не более 5, не более 6, не более 7, не более 8, не более 9, не более 10, не более 11, не более 12, не более 13, не более 14, не более 15, не более 16, не более 17, не более 18, не более 19, не более t 20, не более 21, не более 22, не более 23, не более 24, не более 25, не более 26, не более 27, не более 28, не более 29, не более 30, не более 31, не более 32, не более 33, не более 34, не более 35, не более 36, не более 37, не более 38, не более 39, не более 40, не более 41, не более 42, не более 43, не более 44, не более 45, не более 46, не более 47, не более 48, не более 49, не более 50, не более 55, не более 60, не более 65, не более 70, не более 75, не более 80, не более 85, не более 90, не более 95 различных генов, перечисленных в Таблицах 1-11. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[0116] Множество генов, описанных в настоящей заявке, необязательно включает любую подкомбинацию и/или комбинацию, характеризующуюся по меньшей мере одним другим маркером, например, другие известные гены.
Определение экспрессии генов
[0117] Экспрессия генов представляет собой транскрипцию ДНК в матричную РНК с помощью РНК-полимеразы. Термин «экспрессия» при использовании в настоящей заявке относится к биосинтезу генного продукта, включая транскрипцию и/или трансляцию указанного генного продукта. Таким образом, экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты может относиться к транскрипции фрагмента нуклеиновой кислоты (например, транскрипции, приводящей к получению мРНК или другой функциональной РНК) и/или трансляции РНК в белок-предшественник или зрелый белок (полипептид).
[0118] «Увеличение экспрессии/Стимуляция» относится к гену, для которого наблюдалась более высокая экспрессия (например, более высокий уровень мРНК) в одном образце (например, образце, подходящим для трансплантации) по сравнению с другим (например, контрольным образцом). «Уменьшение экспрессии/Подавление» относится к гену, для которого наблюдалась более низкая экспрессия (например, более низкий уровень мРНК) в одном образце (например, образце, подходящем для трансплантации) по сравнению с другим образцом (например, контрольным образцом).
[0119] Согласно варианту реализации изобретения, экспрессию генов измеряют на белковом уровне. Примеры способов измерения количества/уровня белка в образце включают, но не ограничиваются указанными: Вестерн-блот, иммуноблот, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноферментные «сэндвич»-анализы, радиоиммуноанализ (РИА), иммунопреципитацию, поверхностный плазмонный резонанс (ППР), хемилюминесценцию, флуоресцентную поляризацию, фосфоресценцию, иммуногистохимический (ИГХ) анализ, времяпролетную матрично-активированную лазерную десорбцию/ионизацию (ВП-МАЛДИ) с масс-спектрометрией, микроцитометрию, микроматричный анализ, использование матрицы с антителами, микроскопию (например, электронную микроскопию), проточную цитометрию и анализы на основе протеомики.
[0120] Согласно другому варианту реализации изобретения, экспрессию генов измеряют на уровне нуклеиновой кислоты (мРНК, кДНК).
[0121] Термин «нуклеиновая кислота» хорошо известен в данной области техники. «Нуклеиновая кислота» при использовании в настоящей заявке в целом относится к молекуле (т.е. цепи) ДНК, РНК или ее производному или аналогу, содержащему нуклеиновое основание. Нуклеиновое основание содержит, например, природное пуриновое или пиримидиновое основание, встречающееся в ДНК (например, аденин «А», гуанин «G», тимин «Т» или цитозин «С») или РНК (например, A, G, урацил «U» или С). Термины «полинуклеотид», «полинуклеотидная последовательность», «последовательность нуклеиновой кислоты» и «молекула нуклеиновой кислоты» используются взаимозаменяемо в настоящей заявке.
[0122] Многочисленные методы выявления и количественной оценки можно применять для определения уровня экспрессии множества нуклеиновых кислот, включая: ПЦР, ПЦР в реальном времени; количественную ПЦР в реальном времени; амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); метод Нозерн-блоттинга; матричную гибридизацию; амплификацию нуклеиновой кислоты/метод «разветвленной» нуклеиновой кислоты; метод тканевых матриц (МТМ); лигазную цепную реакцию (ЛЦР); методы высокоэффективного секвенирования или секвенирования нового поколения (СНП), такие как РНК-секвенирование, метод гибридизации in situ и процесс амплификации с последующим выявлением с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или времяпролетной МАЛДИ/масс-спектрометрии, но не ограничиваясь указанными.
[0123] Согласно вариантам реализации изобретения, всю или часть нуклеиновой кислоты можно амплифицировать и выявлять с помощью методов, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее варианты, включая, но не ограниваясь указанными, количественную ПЦР (кПЦР), ПЦР с обратной транскрипцией и ПЦР в реальном времени (включая применение в качестве способа измерения исходного количества копий мРНК для каждой последовательности в образце). В таких способах используются один или два праймера, комплементарные частям нуклеиновой кислоты, где указанные праймеры используются для инициации синтеза нуклеиновой кислоты. Заново синтезированные нуклеиновые кислоты необязательно можно метить и выявлять непосредственно или путем гибридизации с полинуклеотидом согласно изобретению. Заново синтезированные нуклеиновые кислоты можно подвергать контакту с полинуклеотидами (содержащими последовательности) в условиях, позволяющих их гибридизацию. Дополнительные способы выявления экспрессии экспрессирующихся нуклеиновых кислот включают анализы с защитой от РКНазы, включая методы жидкофазной гибридизации и гибридизацию in situ клеток.
[0124] Как будет понятно специалисту в данной области техники, выявление экспрессии нуклеиновых кислот можно осуществлять путем выявления экспрессии любой подходящей части или фрагмента указанных нуклеиновых кислот или полноразмерных нуклеиновых кислот. Предпочтительно, части являются достаточно большими для того, чтобы содержать последовательности, уникальные по отношению к другим последовательностям, экспрессирующимся в образце. Более того, специалисту в данной области техники будет понятно, что любая цепь нуклеиновой кислоты может выявляться в качестве индикатора экспрессии указанной нуклеиновой кислоты. Это указано, поскольку нуклеиновые кислоты экспрессируются в виде молекул РНК в клетках, которые можно превращать в молекулы кДНК для удобства обработки и выявления. Полученные молекулы кДНК могут иметь как последовательности экспресируемой РНК, так и последовательности ее комплементарной цепи. Таким образом, может выявляться либо цепь последовательности РНК, либо комплементарная ей цепь. Безусловно, также возможно выявлять экспрессируемую РНК без ее превращения в кДНК.
[0125] Согласно варианту реализации изобретения, способ включает осуществление обратной транскрипции молекул мРНК, присутствующих в образце, и амплифицирование кДНК-мишени и одной или более контрольных молекул кДНК с применением праймеров гибридизации для молекул кДНК.
[0126] Общая методика, используемая для измерения копийности РНК, представляет собой количественную ПЦР с обратной транскрипцией, где за обратной транскрипцией (ОТ) следует количественная ПЦР (кПЦР) в реальном времени. Можно использовать коммерчески доступные системы для проведения количественной ПЦР, например, «Real Time PCR System» от компании Applied Biosystems, LightCycler от компании Roche, iCycler от компании BioRad и другие. Обратная транскрипция приводит сначала к получению ДНК-матрицы на основе РНК. Указанная одноцепочечная матрица называется кДНК. кДНК-матрицу затем амплифицируют на количественном этапе, во время которого флуоресценция, испускаемая меченными зондами гибридизации или интеркалирующими красителями, меняется по мере прогрессирования процесса амплификации ДНК. Количественная ПЦР измерят увеличение или уменьшение числа копий исходной РНК и использовалась для попытки определения изменения экспрессии генов в опухолевой ткани по сравнению с аналогичными здоровыми тканями (Nolan Т, et al. Nat Protoc 1:1559-1582, 2006; Paik S. The Oncologist 12:631-635, 2007; Costa C, et al. Transl Lung Cancer Research 2:87-91, 2013).
[0127] Массовое параллельное секвенирование, которое стало возможным благодаря методам секвенирования нового поколения (NGS), представляет собой другой способ приближения к количественной оценке РНК-транскриптов в образце ткани, и РНК-секвенирование представляет собой метод, использующий данный способ. На сегодняшний день это самое мощное аналитическое средство, используемое для транкриптомных анализов, включая анализ различий в уровнях экспрессии гена между различными физиологическими состояниями или изменения, которые происходят в ходе развития или при прогрессировании заболевания. В частности, РНК-секвенирование можно использовать для исследования таких феноменов, как изменения экспрессии генов, события альтернативного сплайсинга, аллель-специфичная экспрессия генов и гибридные транскрипты, включая события слияния генов, появление новых транскриптов и «редактирование» РНК.
[0128] При использовании в настоящей заявке, термины «амплификация» или «амплифицирование» означают один или более способов, известных в данной области техники для копирования нуклеиновой кислоты-мишени, например, генов, перечисленных в Таблицах 1-11, с увеличением, таким образом, числа копий выбранной последовательности нуклеиновой кислоты. Амплификация может быть экспоненциальной или линейной. Согласно конкретному варианту реализации изобретения, нуклеиновая кислота-мишень представляет собой РНК.
[0129] При использовании в настоящей заявке термин «нуклеиновая кислота» является широким термином и относится к сегментам хромосомы, сегментам или частям ДНК, кДНК и/или РНК. Нуклеиновая кислота может происходить или быть получена из образца нуклеиновой кислоты, изначально выделенного из любого источника (например, выделена, очищена, амплифицирована, клонирована или обратно транскрибирована из образца ДНК или РНК).
[0130] При использовании в настоящей заявке, термин «олигонуклеотид» относится к короткому полимеру, состоящему из дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов или любой их комбинации. Длина олигонуклеотидов составляют в целом между примерно 10 и примерно 100 нуклеотидов. Длина олигонуклеотидов, как правило, составляет от 15 до 70 нуклеотидов, при этом олигонуклеотиды длиной от 20 до 26 нуклеотидов являются наиболее распространенными. Олигонуклеотид может применяться в качестве праймера или зонда. Олигонуклеотид является «специфичным» в отношении нуклеиновой кислоты, если указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 50% идентичен по последовательности части указанной нуклеиновой кислоты при выравнивании указанного олигонуклеотида и нуклеиновой кислоты. Олигонуклеотид, специфичный в отношении нуклеиновой кислоты, представляет собой олигонуклеотид, который при подходящих условиях гибридизации или отмывки способен гибридизоваться с интересующей мишенью и по существу не гибридизоваться с не интересующими нуклеиновыми кислотами. Более высокий уровень идентичности по последовательности является предпочтительным и включает идентичность по последовательности, составляющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%.
[0131] При использовании в настоящей заявке термин «фрагмент» в контексте нуклеиновой кислоты относится к последовательности нуклеотидных остатков, которая содержит по меньшей мере примерно 5 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 7 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 9 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 11 нуклеотидов или по меньшей мере примерно 17 нуклеотидов. Фрагмент, как правило, содержит менее чем примерно 300 нуклеотидов, менее чем примерно 100 нуклеотидов, менее чем примерно 75 нуклеотидов, менее чем примерно 50 нуклеотидов или менее чем примерно 30 нуклеотидов. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, фрагменты можно использовать в полимеразной цепной реакции (ПЦР) или разичных методах гибридизации для идентификации или амплификации идентичных или родственных молекул ДНК.
[0132] При использовании в настоящей заявке «праймер» для амплификации представляет собой олигонуклеотид, который специфично гибридизуется с нуклеотидной последовательностью-мишенью или маркерной нуклеотидной последовательностью. 3' нуклеотид праймера должен быть идентичен последовательности-мишени или маркерной последовательности в соответствующем положении нуклеотида для оптимального удлинения праймера с помощью полимеразы. При использовании в настоящей заявке «прямой праймер» представляет собой праймер, который гибридизуется с антисмысловой цепью двуцепочечной ДНК (дцДНК). «Обратный праймер» гибридизуется со смысловой цепью дцДНК.
[0133] При использовании в настоящей заявке «нуклеиновая кислота-мишень» относится к сегментам хромосомы, полноразмерному гену, содержащему или не содержащему межгенную последовательность, сегментам или частям гена, содержащим или не содержащим межгенную последовательность, или последовательностям нуклеиновых кислот, к которым сконструированы зонды или праймеры. Нуклеиновые кислоты-мишени могут происходить из геномной ДНК, кДНК или РНК. При использовании в настоящей заявке нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой нативную ДНК или продукт ПЦР-амплификации.
[0134] Предполагается, что способы выявления, описанные выше, иллюстрируют возможные варианты реализации настоящего изобретения на практике и не ограничивают объем настоящего изобретения. Предполагается, что другие методы на основе последовательностей для выявления присутствия нуклеиновой кислоты в образце субъекта могут применяться согласно изобретению.
Набор для определения экспрессии генов
[0135] В соответствии с некоторыми аспектами, набор, панель или микроматрица предназначены для определения того, подходит ли композиция, содержащая популяцию клеток, для трансплантации нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, предложен набор, панель или микроматрица, содержащая множество лигандов, где каждый указанный лиганд способен специфично образовывать комплекс, связываться, гибридизоваться или количественно выявлять или идентифицировать один ген, выбранный из генов, перечисленных в Таблицах 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество лигандов независимо способны выявлять или идентифицировать множество генов, выбранных из генов, перечисленных в Таблицах 1-11. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество лигандов независимо способны выявлять или идентифицировать множество генов, выбранных из генов, перечисленных в таблице, выбранной из Таблицы 1-11. Множество генов, описанное в настоящей заявке, необязательно включает любую подкомбинацию и/или комбинацию, характеризующуюся по меньшей мере одним другим маркером, например, другие известные гены. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, множество генов выбрано из одного или более генов, выбранных из Таблицы 1, одного или более генов, выбранных из Таблицы 2, одного или более генов, выбранных из Таблицы 3, одного или более генов, выбранных из Таблицы 4, одного или более генов, выбранных из Таблицы 5, одного или более генов, выбранных из Таблицы 6, одного или более генов, выбранных из Таблицы 7, одного или более генов, выбранных из Таблицы 8, одного или более генов, выбранных из Таблицы 9, одного или более генов, выбранных из Таблицы 10, и/или одного или более генов, выбранных из Таблицы 11, или их комбинации.
[0136] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, набор, панель или микроматрица содержит по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 50, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 или 1000 различных лигандов. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, набор, панель или микроматрица содержит не более 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 50, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 или 1000 различных лигандов. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[0137] Термин «микроматрица» относится к упорядоченному распределению на субстрате поддающихся гибридизации элементов матрицы, предпочтительно - полинуклеотидных зондов.
[0138] Согласно конкретным вариантам реализации изобретения, один или более алгоритмов или компьютерных программ можно использовать для сравнения количественно определенного уровня экспрессии каждого гена в исследуемом образце с заранее определенным пороговым уровнем (или рядом заранее определенных пороговых уровней). Альтернативно, могут быть обеспечены одна или более инструкций для осуществления человеком необходимых этапов вручную. Алгоритмы для определения и сравнительного анализа паттернов включают, но не ограничиваются указанными, анализ главных компонентов, линейный анализ Фишера, алгоритмы нейронных сетей, генетические алгоритмы, распознавание образов нечеткой логики и т.д. После завершения анализа полученную информацию можно, например, выводить на экран, переводить на центральный компьютер или хранить на накопительной устройстве для последующего извлечения.
Гетерогенные популяции клеток
[0139] В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения, популяция клеток согласно настоящему изобретению представляет собой гетерогенную популяцию клеток.
[0140] При использовании в настоящей заявке, термин «популяция клеток» относится к группе, состоящей по меньшей мере из двух клеток, экспрессирующих сходный или различные фенотипы. Согласно неограничивающим примерам, популяция клеток может содержать по меньшей мере примерно 10, по меньшей мере примерно 100, по меньшей мере примерно 200, по меньшей мере примерно 300, по меньшей мере примерно 400, по меньшей мере примерно 500, по меньшей мере примерно 600, по меньшей мере примерно 700, по меньшей мере примерно 800, по меньшей мере примерно 900, по меньшей мере примерно 1000 клеток, экспрессирующих сходный или различные фенотипы. При использовании в настоящей заявке, термин «гетерогенная популяция клеток» относится к группе по меньшей мере из двух клеток, где по меньшей мере часть клеток экспрессирует различные фенотипы.
[0141] При использовании в настоящей заявке, термин «мезенхимальная стволовая клетка» или «МСК» относится к клетке, способной давать начало клеткам, дифференцированным во множество мезенхимальных линий, в частности, в направлении остеобластов, адипоцитов, миобластов и хондробластов. В целом, мезенхимальные стволовые клетки также обладают одним или более из следующих свойств: способность претерпевать асинхронное или симметричное удвоение, то есть удвоение, при котором две дочерние клетки после деления могут иметь различные фенотипы; высокая способность к самообновлению и клональной регенерации ткани, в которой они присутствуют; например, негематопоэтические клетки костного мозга. «Прогениторные клетки» отличаются от стволовых клеток тем, что они, как правило, не обладают высокой способностью к самообновлению.
[0142] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, популяция клеток представляет собой гетерогенную популяцию клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, гетерогенная популяция клеток содержит по меньшей мере 10% клеток, по меньшей мере 20% клеток, по меньшей мере 30% клеток, по меньшей мере 50% клеток, по меньшей мере 50% клеток, по меньшей мере 60% клеток, по меньшей мере 70% клеток, по меньшей мере 80% клеток или по меньшей мере 90% клеток, имеющих указанный профиль экспрессии, описанный в настоящей заявке.
[0143] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, гетерогенная популяция клеток содержит два или более типа клеток, выбранных из группы, состоящей из: мезенхимальных стволовых клеток, остеопрогениторных клеток и остеогенных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, 30-70% клеток гетерогенной популяции клеток представляет собой остеопрогениторные клетки. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, 40-60% клеток гетерогенной популяции клеток представляет собой остеопрогениторные клетки. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, 50-60% клеток гетерогенной популяции клеток представляет собой остеопрогениторные клетки.
[0144] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, гетерогенная популяция клеток происходит из клеток, подвергнутых индукции остеогенеза.
[0145] Термин «остеогенный» или «остеогенез» относится к пролиферации клеток кости и росту костной ткани (т.е. синтезу и накоплению нового костного матрикса) из недифференцированных мезенхимальных стволовых клеток и клеток остеобластной линии дифференцировки. Остеогенез также относится к дифференцировке или транс-дифференцировке прогениторных клеток или клеток-предшественников в костные клетки (т.е. остеобласты). Прогениторные клетки или клетки-предшественники могут представлять собой плюрипотентные стволовые клетки, включая, например, мезенхимальные стволовые клетки. Прогениторные клетки или клетки-предшественники могут представлять собой клетки, предварительно коммитированные к дифференцировке в направлении остеобластов (например, пре-остеобластные клетки), или клетки, которые предварительно не коммитированые к дифференцировке в направлении остеобластов (например, пре-адипоциты или миобласты).
[0146] Термин «дифференцировка» при использовании в настоящей заявке относится к развитию клетки от первичной стадии к стадии образования зрелой клетки, которая связана с экспрессией характерного набора антигенных маркеров клеточной поверхности. Дифференцировка представляет собой процесс развития, в результате которого клетки приобретают специализированный фенотип, например, приобретают одну или более характеристик или функций, отличных от других типов клеток. В некоторых случаях дифференцированный фенотип относится к фенотипу клетки, которая находится на крайней стадии созревания в некотором пути развития («терминально дифференцированная клетка»).
[0147] Термин «индукция остеогенеза (остеогенная индукция)» относится к индукции или стимуляции остеогенной дифференцировки.
[0148] Согласно одному варианту реализации изобретения, гетерогенная популяция клеток происходит из клеток, которые подвергались индукции остеогенеза в течение периода, составляющего по меньшей мере 24 часа. Согласно другому варианту реализации изобретения, гетерогенная популяция клеток происходит из клеток, которые подвергались индукции остеогенеза в течение периода, составляющего по меньшей мере 48 часов. Согласно другому варианту реализации изобретения, гетерогенная популяция клеток происходит из клеток, которые подвергались индукции остеогенеза в течение периода, составляющего по меньшей мере 72 часа. Согласно другому варианту реализации изобретения, гетерогенная популяция клеток происходит из клеток, которые подвергались индукции остеогенеза в течение периода, составляющего по меньшей мере 96 часов.
[0149] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, индукция остеогенной дифференцировки клеток достигается с помощью одного или более индукторов остеогенеза, выбранных из группы, состоящей из: BMP-2, ВМР-3, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6 и ВМР-7.
[0150] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетки обрабатывают по меньшей мере 25 нанограммами/миллилитр одного или более индукторов остеогенеза для получения гетерогенной популяции клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, клетки обрабатывают по меньшей мере 50 нанограммами/миллилитр одного или более индукторов остеогенеза для получения гетерогенной популяции клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, клетки обрабатываются по меньшей мере 75 нанограммами/миллилитр одного или более индукторов остеогенеза для получения гетерогенной популяции клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, клетки обрабатывают по меньшей мере 100 нанограммами/миллилитр одного или более индукторов остеогенеза для получения гетерогенной популяции клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, клетки обрабатывают по меньшей мере 150 нанограммами/миллилитр одного или более индукторов остеогенеза для получения гетерогенной популяции клеток.
[0151] В качестве неограничивающего примера, гетерогенная популяция клеток происходит из клеток, подвергнутых культуральным условиям остеогенной дифференцировки, включающим: остеогенную культуральную среду для дифференцировки, состоящую из одной или более из следующих молекул в предпочтительной концентрации: дексаметазон (10-200 нМ), натрий бета-глицерофосфат (5-25 мМ), 1,25 дигидроксихолесальциферол (кальцитриол: 1-50 нМ), L-аскорбиновая кислота-2-фосфат (0,05-500 мМ) и индуктор остеогенеза (10 нг/мл-10 мкг/мл).
[0152] Согласно другому варианту реализации изобретения, клетки обрабатывают 150 нанограммами/миллилитр одного или более индукторов остеогенеза в течение 48 часов для получения гетерогенной популяции клеток.
[0153] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетки происходят из стволовых клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, стволовые клетки представляют собой мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, МСК представляют собой аутологичные МСК. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, МСК представляют собой аллогенные МСК. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, аутологичные МСК происходят из аутологичной жировой ткани человека и называются клетками, полученными из жировой ткани человека (HATDC). Согласно другому варианту реализации изобретения, клетки, полученные из жировой ткани человека (HATDC), представляют собой клетки, полученные из жировой ткани в результате процедуры липосакции.
[0154] При использовании в настоящей заявке термин «клетки, полученные из жировой ткани человека (HATDC)», относится к гетерогенной популяции клеток, берущих начало из стромально-сосудистого компартмента жировой ткани, который можно применять в качестве альтернативного источника клеток для множества различных способов клеточной терапии. При использовании в настоящей заявке клетки HATDC содержат гетерогенную популяцию клеток, содержащую множество стволовых клеток, произошедших из жировой ткани (ASC) (CD34- CD45- CD11b-, CD19, HLA-DR-, CD105+, CD73+, CD90+), мезенхимальных клеток, мезенхимальных стволовых клеток, гладкомышечных клеток сосудов (положительных на гладкомышечный альфа-актин, десмин, h-кальдесмон, тяжелую цепь гладкомышечного миозина), адипогенных, хондрогенных и остеогенных клеток с любой комбинацией остеопрогениторов, остеобластов, остеоцитов, хондробластов, хондроцитов и остеокластов, а также эндотелиальных прогениторных клеток (ЕРС) (CD31+ CD34+ CD45- CD144+ CD146+ CD102), гематопоэтических прогениторных клеток (НРС - CD34+) и зрелых эндотелиоцитов (ЭЦ, CD31+ CD34+ CD45- CD90- CD144+ CD146+ CD105+).
2
[0155] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетки культивируют в 3-мерной (3D) культуре перед индукцией остеогенеза. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетки культивируют в 3D культуре на минеральном скаффолде. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетки культивируют в 3D культуре в биореакторе или системе динамического роста. Согласно другому варианту реализации изобретения, клетки согласно изобретению поддерживают и растят при 37°С в инкубаторе для тканевых культур в присутствии 5% СО в условиях увлажнения.
[0156] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, композицию, содержащую гетерогенную популяцию клеток, трансплантируют нуждающемуся в этом пациенту. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетки гетерогенной популяции клеток трансплантируемой композиции, которые были получены ex vivo, подвергают in vivo воздействию индукторов остеогенеза, доступных в области трансплантации (например, в кости). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетки гетерогенной популяции клеток дополнительно дифференцируют в зрелые остеобласты in vivo.
[0157] При использовании в настоящей заявке термин «ех vivo» относится к процессу, при котором клетки удаляют из живого организм и наращивают вне указанного организма. При использовании в настоящей заявке термин «in vivo» относится к любому процессу, который происходит внутри живого организма.
[0158] Согласно другому варианту реализации изобретения, предложен набор, содержащий: минеральную частицу, содержащую присоединенную к ней 3D культуру клеток, и инструкции по получению гетерогенной популяции клеток согласно изобретению из предложенной 3D культуры клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, 3D культура клеток содержит клетки HATDC. Согласно другому варианту реализации изобретения, инструкции включают рекомендуемые условия для индукции остеогенеза клеток HATDC, культивируемых в 3D культуре на минеральном скаффолде, для получения композиции согласно изобретению. Согласно другому варианту реализации изобретения, набор дополнительно обеспечивает по меньшей мере один индуктор остеогенеза и/или остеогенную культуральную среду для дифференцировки.
Многослойная культура клеток
[0159] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, многослойная культура клеток представляет собой гетерогенную культуру клеток, состоящую по меньшей мере из двух типов клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, многослойная культура клеток представляет собой гетерогенную культуру клеток, состоящую по меньшей мере из трех типов клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, многослойная культура клеток представляет собой гетерогенную культуру клеток, состоящую по меньшей мере из четырех типов клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, многослойная культура клеток содержит клетки, полученные из жировой ткани человека (HATDC), прошедшие период индукции остеогенеза в течение 48 часов.
[0160] Согласно другому варианту реализации изобретения, многослойная культура клеток содержит нижний слой клеток и верхний слой клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, многослойная культура клеток содержит нижний слой клеток, средний слой клеток и верхний слой клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, многослойная культура клеток представляет собой 3D (трехмерную) культуру клеток (в различие от одного слоя клеток, который называется 2D (двумерной) культурой клеток). Согласно другому варианту реализации изобретения, 3D культура клеток состоит из клеток и внеклеточного матрикса. Согласно другому варианту реализации изобретения, 3D культуру клеток растят на поверхности минеральной частицы, как описано в настоящей заявке. Согласно другому варианту реализации изобретения, 3D культура клеток состоит из биологического материала. Согласно другому варианту реализации изобретения, 3D культура клеток из 2 или более слоев клеток присоединена к минеральной частице. Согласно другому варианту реализации изобретения, 3D культура клеток из 2 или более клеточных слоев функционально присоединена к минеральной частице.
[0161] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, многослойная культура клеток или 3D культура клеток содержит по меньшей мере 2 слоя клеток, где по меньшей мере 10% клеток одного слоя контактирует по меньшей мере с 10% клеток другого слоя. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, многослойная культура клеток или 3D культура клеток содержит по меньшей мере 3 слоя клеток.
[0162] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, по меньшей мере 10% клеток одного слоя в многослойной культуре клеток или 3D культуре клеток контактирует по меньшей мере с 10% клеток другого слоя в той же многослойной культуре или 3D культуре клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, по меньшей мере 20% клеток одного слоя в многослойной культуре клеток или 3D культуре клеток контактирует по меньшей мере с 20% клеток другого слоя в той же многослойной культуре или 3D культуре клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, по меньшей мере 30% клеток одного слоя в многослойной культуре клеток или 3D культуре клеток контактирует по меньшей мере с 30% клеток другого слоя в той же многослойной культуре или 3D культуре клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, по меньшей мере 40% клеток одного слоя в многослойной культуре клеток или 3D культуре клеток контактирует по меньшей мере с 40% клеток другого слоя в той же многослойной культуре или 3D культуре клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, по меньшей мере 50% клеток одного слоя в многослойной культуре клеток или 3D культуре клеток контактирует по меньшей мере с 50% клеток другого слоя в той же многослойной культуре или 3D культуре клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, по меньшей мере 60% клеток одного слоя в многослойной культуре клеток или 3D культуре клеток контактирует по меньшей мере с 60% клеток другого слоя в той же многослойной культуре или 3D культуре клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, термин «контактирует» относится к физическому контакту. Согласно другому варианту реализации изобретения, термин «контактирует» относится к межклеточному взаимодействию.
[0163] Согласно другому варианту реализации изобретения, фраза «3D культура клеток» или «3D культура» относится к культуре, в которой клетки подвергаются условиям, совместимым с клеточным ростом, позволяющим указанным клеткам расти более чем в один слой. Согласно другому варианту реализации изобретения, клетки в 3D культуре клеток удерживаются в сложной сети нанометровых волокон внеклеточного матрикса, позволяющих создавать различное локальное микроокружение. Согласно другому варианту реализации изобретения, внеклеточные лиганды в составе ВКМ опосредуют не только прикрепление к базальной мембране, но также доступ к различным кровеносным и лимфатическим сосудам. Согласно другому варианту реализации изобретения, клетки в 3D культуре клеток подвергаются воздействию кислорода, гормонов и питательных веществ. Согласно другому варианту реализации изобретения, 3D культура клеток характеризуется межклеточными взаимодействиями и взаимодействиями клетка-ВКМ.
Скаффолд
[0164] Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция также содержит остеокондуктивные частицы. При использовании в настоящей заявке «остеокондуктивный» относится к способности вещества служить в качестве подходящей матрицы или вещества, вдоль которого может расти костная ткань. В качестве неограничивающего примера, один или более типов остеокондуктивных частиц представляют собой остеокондуктивные керамические частицы, выбранные из группы, состоящей из: карбоната кальция, гидроксиапатита (НА), деминерализованного костного материала, измельченного костного трансплантата, кортикально-губчатого аллтрансплантата, кортикально-губчатого аутотрансплантата, кортикально-губчатого ксенотрансплантата, трикальций фосфат, коралловый минерал и сульфатом кальция.
[0165] Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция также содержит минеральную частицу. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица представляет собой скаффолд, содержащий 3D культуру клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица является биосовместимой. Согласно другому варианту реализации изобретения, клетки могут присоединяться к минеральной частице. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица способствует росту прикрепленных клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральные частицы представлены в виде пульверизированной композиции. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральные частицы представлены в виде микропульвилизированной композиции. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральные частицы содержат выступы и впадины, которые обеспечивают больше сайтов прикрепления клеток. При использовании в настоящей заявке «рост» или «наращивание» относится к процессу клеточной пролиферации по существу с отсутствием дифференцировки клеток. Растущие клетки поддерживают, таким образом, свои способности клеточного обновления, т.е. увеличения популяции клеток (например, по меньшей мере в 2 раза), при этом такое увеличение не сопровождающееся дифференцировкой.
[0166] Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица представляет собой костное волокно. Согласно другому варианту реализации изобретения, костное волокно согласно изобретению имеет поверхность с усиленной способностью связывать клетки. Согласно другому варианту реализации изобретения, костное волокно согласно изобретению происходит из костной ткани. Согласно другому варианту реализации изобретения, костную ткань разрезают продольно или по направлению волокон указанной костной ткани для получения костного волокна.
[0167] Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица представляет собой костный скаффолд, содержащий 3D культуру клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица представляет собой костную минеральную частицу. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица представляет собой измельченное минерализованное компактное вещество кости. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица представляет собой измельченное минерализованное губчатое вещество кости. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица представляет собой минерализованную частицу губчатого вещества. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица представляет собой минерализованную частицу коркового вещества. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица представляет собой минеральную частицу коралла. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица состоит из минералов. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица содержит фосфат кальция. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица содержит производное фосфата кальция. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица содержит сульфат кальция. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица содержит производное сульфата кальция. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица содержит гидроксиапатит кальция. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица содержит силикат. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица содержит производное сульфата кальция. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица содержит силикат-модифицированный минерал гидроксиапатит. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица содержит бета-трикальций фосфат. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральная частица содержит любую комбинацию минералов, известных специалисту в данной области техники.
[0168] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, скаффолд также содержит белки внеклеточного матрикса, такие как фибронектин, ламинин, фибриноген и коллаген. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, минеральная частица покрыта белками внеклеточного матрикса.
[0169] Согласно другому варианту реализации изобретения, диаметр минеральной частицы составляет по меньшей мере 50 микрон. Согласно другому варианту реализации изобретения, диаметр минеральной частицы составляет по меньшей мере 100 микрон. Согласно другому варианту реализации изобретения, диаметр минеральной частицы составляет в диапазоне от 50 микрон до 2000 микрон. Согласно другому варианту реализации изобретения, диаметр минеральной частицы составляет в диапазоне от 100 микрон до 1000 микрон. Согласно другому варианту реализации изобретения, диаметр минеральной частицы составляет в диапазоне от 200 микрон до 2000 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, размер минеральной частицы составляет от 1 сантиметра до 15 сантиметров (см) в длину. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, размер минеральной частицы составляет от 5 см до 15 сантиметров (см) в длину. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, размер минеральной частицы составляет вплоть до 15 сантиметров в длину.
[0170] Согласно другому варианту реализации изобретения, 3D культуру клеток, присоединенную к минеральным частицам, растят и/или поддерживают в присутствии культуральной среды для клеток в течение периода, составляющего 5 дней, до индукции остеогенной дифференцировки. Согласно другому варианту реализации изобретения, 3D культуру клеток, присоединенную к минеральным частицам, растят и/или поддерживают в присутствии культуральной среды для клеток в течение периода, составляющего от 4 до 6 дней, до индукции остеогенной дифференцировки. Согласно другому варианту реализации изобретения, 3D культуру клеток, присоединенную к минеральным частицам, растят и/или поддерживают в присутствии культуральной среды для клеток в течение периода, составляющего от 2 до 21 или, альтернативно, от 4 до 21 или, альтернативно, от 2 до 16 или, альтернативно, от 3 до 16 или, альтернативно, от 4 до 16 или, альтернативно, от 1 до 10 или, альтернативно, от 2 до 10 или, альтернативно, от 3 до 10 или, альтернативно, от 4 до 10 или, альтернативно, от 1 до 6 или, альтернативно, от 2 до 6 или, альтернативно, от 3 до 5 или, альтернативно, от 3 до 6 или, альтернативно, от 4 до 6 дней до индукции остеогенной дифференцировки.
Посев клеток
Посев клеток, мигрирующих из ткани
[0171] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, посев клеток осуществляют путем поддержания контакта между жировой тканью и минеральными частицами при конкретном отношении ткани к минеральным частицам в течение заранее определенного периода времени для возможности миграции и прикрепления клеток к указанным минеральным частицам. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, жировую ткань сохраняют интактной или, альтернативно, диссоциируют механическим путем (например, измельчают до маленьких фрагментов ткани).
[0172] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, контакт между жировой тканью и скаффолдом поддерживают в течение времени, необходимого для облегчения миграции клеток HATDC из жировой ткани на скаффолд и заселения поверхности скаффолда. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, для облегчения миграции клеток HATDC и заселения поверхности минерального скаффолда требуется по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 дней инкубирования в контакте. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, период посева составляет по меньшей мере 3 дня. Согласно другому варианту реализации изобретения, период посева составляет по меньшей мере 4 дня. Согласно другому варианту реализации изобретения, период посева составляет по меньшей мере 5 дня. Согласно другому варианту реализации изобретения, период посева составляет по меньшей мере 6 дня. Согласно другому варианту реализации изобретения, период посева составляет по меньшей мере 7 дня. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, контакт между жировой тканью и скаффолдом поддерживают в течение 3-7 дней. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, контакт между жировой тканью и скаффолдом поддерживают в течение 3-10 дней. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, контакт между жировой тканью и скаффолдом поддерживают в течение 5-10 дней.
[0173] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение жировой ткани к скаффолду составляет 1 микролитр ткани на 1 миллиграмм скаффолда и называется здесь и далее отношением 1:1. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, указанное отношение варьирует от 10:1 до 1:10, от 9:1 до 1:9, от 8:1 до 1:8, от 7:1 до 1:7, от 6:1 до 1:6,е5е5, от 4:1 до 1:4, от 3:1 до 1:3 или от 2:1 до 1:2 соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение жировой ткани к скаффолду варьирует от 3:1 до 1:2 соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение жировой ткани к скаффолду варьирует от 2:1 до 1:4 соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, указанное отношение варьирует от 2:1 до 1:3, от 2:1 до 1:2, от 3:1 до 1:4, от 1:1 до 1:4, от 1:1 до 1:2 или от 2:1 до 1:1 соответственно. Каждый возможный вариант представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, отношение между жировой тканью и скаффолдом составляет 1:1. В качестве неограничивающего примера, 1 миллилитр жировой ткани контактируют с 1 граммом минерального скаффолда.
[0174] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, для достижения контакта между жировой тканью и скаффолдом жировую ткань и скаффолд сначала смешивают в присутствии среды (например, среды без чужеродных компонентов (xeno-free»). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, контакт между жировой тканью и скаффолдом обеспечивают при воздействии среды и кислорода. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, приведение в контакт жировой ткани и скаффолда дает возможность физического контакта по меньшей мере части жировой ткани по меньшей мере с частью скаффолда. В качестве неограничивающего примера, контакт можно обеспечивать в сосуде, биореакторе, планшете. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, суммарная толщина жировой ткани, контактирующей с минеральными частицами, частично покрыта средой. В качестве неограничивающего примера, ткань, суммарная толщина которой составляет 1-2 миллиметра, поддерживается в среде, уровень которой составляет 1-2 миллиметра. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, культуральная среда представляет собой ростовую среду без чужеродных компонентов (xeno-free). При использовании в настоящей заявке термин «без чужеродных компонентов (xeno-free)» означает условия культивирования клеток, не содержащие какую-либо клетку или клеточный продукт видов, отличных от видов культивируемых клеток. Согласно другим вариантам реализации изобретения, среда дополнена сывороткой. Неограничивающие примеры сывороток включают: эмбриональную телячью сыворотку (FCS), сыворотку человека группы АВ и аутологичную сыворотку или тромбоцитарный лизат.
Посев клеток, которые были изначально получены из ткани
[0175] Согласно другим вариантам реализации изобретения, посев клеток осуществляют путем поддержания конкретной концентрации клеток в присутствии минеральных частиц при конкретном отношении клеток к минеральным частицам в течение заранее определенного периода времени для возможности прикрепления клеток к минеральным частицам.
[0176] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, период прикрепления составляет по меньшей мере 1 час. Согласно другому варианту реализации изобретения, период прикрепления составляет по меньшей мере 2 часа. Согласно другому варианту реализации изобретения, период прикрепления составляет по меньшей мере 3 часа. Согласно другому варианту реализации изобретения, период прикрепления составляет по меньшей мере 4 часа. Согласно другому варианту реализации изобретения, период прикрепления составляет по меньшей мере 5 часов. Согласно другому варианту реализации изобретения, период посева составляет по меньшей мере 10 часов. Согласно другому варианту реализации изобретения, период посева составляет вплоть до 7 дней.
2
3
2
6
2
4
2
4
3
[0177] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, по меньшей мере 1×10 клеток, описанных в настоящей заявке, высевают на 1 миллиграмм (мг) минеральных частиц. Согласно другому варианту реализации изобретения, по меньшей мере 1×10 клеток, описанных в настоящей заявке, высевают на 1 мг минеральных частиц. Согласно другому варианту реализации изобретения, по меньшей мере от 1×10 до 1×10 клеток, описанных в настоящей заявке, высевают на 1 мг минеральных частиц. Согласно другому варианту реализации изобретения, по меньшей мере от 1×10 до 1×10 клеток, описанных в настоящей заявке, высевают на 1 мг минеральных частиц. Согласно другому варианту реализации изобретения, по меньшей мере от 5×10 до 5×10 клеток, описанных в настоящей заявке, высевают на 1 мг минеральных частиц. Согласно другому варианту реализации изобретения, по меньшей мере 3,5×10 клеток, описанных в настоящей заявке, высевают на 1 мг минеральных частиц.
3
3
3
3
[0178] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетки, описанные в настоящей заявке, высевают в концентрации по меньшей мере 1×10 клеток на 1 миллилитр культуральной среды. Согласно другому варианту реализации изобретения, клетки, описанные в настоящей заявке, высевают в концентрации по меньшей мере 10×10 клеток на 1 миллилитр культуральной среды. Согласно другому варианту реализации изобретения, клетки, описанные в настоящей заявке, высевают в концентрации по меньшей мере 50×10 клеток на 1 миллилитр культуральной среды. Согласно другому варианту реализации изобретения, клетки, описанные в настоящей заявке, высевают в концентрации по меньшей мере 100×10 клеток на 1 миллилитр культуральной среды. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, культуральная среда представляет собой ростовую среду без чужеродных компонентов (среду без чужеродных компонентов (xeno-free)). Согласно другим вариантам реализации изобретения, среда дополнена сывороткой, такой как эмбриональная телячья сыворотка (FCS), сыворотка человека группы АВ и аутологичная сыворотка или тромбоцитарный лизат.
Биологические компоненты
[0179] Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит альбумин. Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит белок внеклеточного матрикса (ВКМ). Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит фибрин. Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит фибронектин. Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит коллаген I типа. Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит ламинин. Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит витронектин.
[0180] Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит костный морфогенетический белок (BMP). Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит инсулинподобный фактор роста. Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит интерлейкин 1, интерлейкин 6, фактор некроза опухоли (TNF), лиганд рецептора-активатора ядерного фактора каппа-В (RANKL) или любую их комбинацию. Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция содержит аутологичную мультиклеточную 3D культуру клеток, суспендированную в среде, содержащей человеческий сывороточный альбумин (HSA). Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция, описанная в настоящей заявке, также содержит противовоспалительный агент. Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция, описанная в настоящей заявке также содержит антибиотик.
[0181] Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит биосовместимое связующее вещество. Согласно другому варианту реализации изобретения, биосовместимое связующее вещество представляет собой одно или более веществ, выбранных из группы, состоящей из адгезивного вещества на основе фибрина, фибриногена, тромбина, адгезивного белка мидий, шелка, эластина, коллагена, казеина, желатина, альбумина, кератина, хитина и хитозана. Согласно другому варианту реализации изобретения, биосовместимое связующее вещество представляет собой одно или более веществ, выбранных из группы, состоящей из крахмала, полимолочной кислоты, полигликолевой кислоты, сополимера молочной и гликолевой кислоты, полидиоксанона, поликапролактона, поликарбоната, сложного полиоксоэфира, полиаминокислоты, полиангидрида, полигидроксибутилата, полигидроксивалерата, сополимера пропиленгликоля и фумаровой кислоты, поликарбоната на основе тирозина, поливинилпирролидона, целлюлозы, этилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы.
[0182] Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит витамины. Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит глюкозамин. Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит цитокин. Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит факторы роста.
[0183] Согласно другому варианту реализации изобретения, предложено, что композиция также содержит гиалуроновую кислоту. Согласно другому варианту реализации изобретения, термин «гиалуроновая кислота (ГК)» является синонимом гиалуронана или гиалуроната натрия. Согласно другому варианту реализации изобретения, гиалуроновая кислота представлена в композиции, содержащей физиологический буфер. Согласно другому варианту реализации изобретения, гиалуроновая кислота имеет молекулярную массу от 200,000 до 850,000 Дальтон.
[0184] Согласно другому варианту реализации изобретения, гиалуроновая кислота представляет собой композицию для суспендирования гетерогенной популяции клеток, нанесенной или присоединенной к минеральным частицам. Согласно другому варианту реализации изобретения, гиалуроновая кислота представляет собой композицию, содержащую от 0,5 мг до 50 мг гиалуроновой кислоты на 1 мл раствора (содержащего буфер). Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция гиалуроновой кислоты для суспендирования клеток, нанесенных или присоединенных к минеральным частицам, представляет собой композицию, содержащую от 0,5 мг до 5 мг гиалуроновой кислоты на 1 мл раствора (содержащего буфер). Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция гиалуроновой кислоты для суспендирования клеток, нанесенных или присоединенных к минеральным частицам, представляет собой композицию, содержащую от 5 мг до 20 мг гиалуроновой кислоты на 1 мл раствора (содержащего буфер). Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция гиалуроновой кислоты для суспендирования клеток, нанесенных или присоединенных к минеральным частицам, представляет собой композицию, содержащую от 10 мг до 30 мг гиалуроновой кислоты на 1 мл раствора (содержащего буфер). Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция гиалуроновой кислоты для суспендирования клеток, нанесенных или присоединенных к минеральным частицам, представляет собой композицию, содержащую от 10 мг до 25 мг гиалуроновой кислоты на 1 мл раствора (содержащего буфер). Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция гиалуроновой кислоты для суспендирования клеток, нанесенных или присоединенных к минеральным частицам, представляет собой композицию, содержащую от 0,05% до 5% гиалуроновой кислоты по массе. Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция гиалуроновой кислоты для суспендирования клеток, нанесенных или присоединенных к минеральным частицам, представляет собой композицию, содержащую от 0,1% до 1% гиалуроновой кислоты по массе. Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция гиалуроновой кислоты для суспендирования клеток, нанесенных или присоединенных к минеральным частицам, представляет собой композицию, содержащую от 0,1% до 0,5% гиалуроновой кислоты по массе.
[0185] Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция гиалуроновой кислоты для суспендирования клеток, нанесенных или присоединенных к минеральным частицам, представляет собой раствор. Согласно другому варианту реализации изобретения, композиция гиалуроновой кислоты для суспендирования клеток, нанесенных или присоединенных к минеральным частицам, представляет собой гель.
Процесс получения композиции для восстановления кости
[0186] Композицию согласно настоящему изобретению можно получать с использованием нескольких альтернативных процессов. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, процесс включает культивирование клеток в 3D культуре. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, процесс включает культивирование клеток в 2D культуре перед их культивированием в 3D культуре.
[0187] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетки сначала выделяют из образца ткани. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, указанное выделение включает удаление плазмы, центрифугирование и/или инкубирование в присутствии коллагеназы. Согласно другим вариантам реализации изобретения, клетки мигрируют непосредственно из ткани на скаффолд. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, ткань представляет собой жировую ткань. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, клетки представляют собой стволовые клетки. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, стволовые клетки происходят из клеток, полученных из жировой ткани человека.
[0188] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, выделенные клетки сначала культивируют и наращивают в 2D системе (например, на флаконе). Затем клетки, выращенные в 2D системе, культивируют и наращивают ex vivo в стерильных условиях на минеральных частицах с использованием среды, позволяющей прикрепление и рост адгезивных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, среда представляет собой среду без чужеродных компонентов (xeno-free). Согласно другим вариантам реализации изобретения, среда дополнена сывороткой. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, культуральную среду, поддерживающую изначальный рост и фазу наращивания указанных клеток, можно необязательно замещать на другую композицию для культивирования клеток, поддерживающую дифференцировку указанных клеток и формирование кости.
[0189] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, обеспечивают контакт между тканью и скаффолдом, где указанный контакт способствует миграции клеток из жировой ткани на скаффолд и их прикреплению клеток к указанному скаффолду, обеспечивая, таким образом, скаффолд, заселенный клетками. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способ также включает этап культивирования и наращивания клеток скаффолда, заселенного указанными клетками, таким образом, чтобы обеспечить возможность наращивания клеток. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способ включает предварительный этап отделения жировой ткани от других клеток, таких как эритроциты. При использовании в настоящей заявке термин «предварительный» относится к этапу, осуществляемому до обеспечения контакта между тканью и скаффолдом. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, разделение обеспечивают путем проведения отмывки жировой ткани, например, в солевом растворе (например, изотоническом растворе, фосфатно-солевом буфере (ФСБ) или ростовой среде для клеток) с последующим центрифугированием, приводящем к получению осадка, содержащего эритроциты, остатки клеток и т.д. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, способ также включает этап отделения жировой ткани от скаффолда и клеток HATDC, присоединенных к нему. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, контакт между жировой тканью и скаффолдом, населенным клетками HATDC, можно нарушить, например, путем смешивания, приводящего к осаждению скаффолда, населенного клетками HATDC, и плавающей жировой ткани. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, разделение достигается путем удаления жировой ткани. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, не осажденную жировую ткань удаляют путем промывания (например, средой). В качестве неограничивающего примера, разделение можно достигать путем аспирации жидкости (например, с помощью пипетки) и смешивания (например, с помощью вортекса) жировой ткани и скаффолда, приводящего к получению осажденного скаффолда, заселенного клетками HATDC, и плавающей жировой ткани, которую можно легко удалить.
[0190] Согласно другому варианту реализации изобретения, 3D гетерогенная популяция клеток, присоединенная к минеральной частице, происходит из 3D культуры клеток, присоединенной к минеральным частицам, подвергнутой культивированию в проточной биореакторной системе. Согласно другому варианту реализации изобретения, 3D гетерогенная популяция клеток, присоединенная к минеральной частице, происходит из 3D культуры клеток, дополнительно подвергнутой остеогенной дифференцировке. Согласно другому варианту реализации изобретения, 3D культуру клеток подвергают остеогенной дифференцировке в течение 48 часов или, альтернативно, по меньшей мере 24 часов или, альтернативно, по меньшей мере 48 часов или, альтернативно, по меньшей мере 72 часов или, альтернативно, по меньшей мере 96 часов.
[0191] Согласно другому варианту реализации изобретения, ростовая среда (среда для клеток) дополнена факторами роста и цитокинами, такими как, например, один или более из трансформирующего фактора роста бета (TGF-бета), инсулинподобного фактора роста 1 (IGF-1), остеогенного белка 1 (ОР-1), членов семейства факторов роста фибробластов (FGF), таких как FGF-2, FGF-9 и FGF-10, и членов семейства костных морфогенетических белков (BMP), таких как ВМР-2, ВМР-3, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6 и ВМР-7.
[0192] Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральную частицу, покрытую 3D культурой гетерогенной популяции клеток, трансплантируют нуждающемуся в этом субъекту. Согласно другому варианту реализации изобретения, минеральную частицу, покрытую 3D культурой гетерогенной популяции клеток, трансплантируют в заранее определенный участок утраты или промежутка в костной ткани.
[0193] Согласно другому варианту реализации изобретения, настоящее изобретение обеспечивает композицию для имплантации согласно изобретению вместе со шприцом. Согласно другому варианту реализации изобретения, настоящее изобретение обеспечивает: шприц, 3D гетерогенную популяцию клеток согласно изобретению, нанесенную или присоединенную к минеральным частицам, и полужидкую среду (например, гиалуроновую кислоту). Согласно другому варианту реализации изобретения, настоящее изобретение обеспечивает набор, содержащий: шприц, суспензию, содержащую 3D гетерогенную популяцию клеток, нанесенную или присоединенную к минеральным частицам, где указанные минеральные частицы суспендированы в полужидкой среде.
[0194] Согласно другому варианту реализации изобретения, фармацевтическую композицию для заполнения промежутка в кости получают путем простого смешивания полужидкой среды (например, гиалуроновой кислоты) и 3D гетерогенной популяции клеток, присоединенной к минеральным частицам согласно изобретению. Согласно другому варианту реализации изобретения, фармацевтическую композицию для заполнения промежутка в кости получают путем простого смешивания полужидкой среды и суспензии, содержащей 3D гетерогенную популяцию клеток, нанесенную или присоединенную к минеральным частицам, где указанные минеральные частицы суспендированы в культуральной среде для клеток.
[0195] Согласно другому варианту реализации изобретения, набор для заполнения промежутка в кости включает первую часть, которая содержит эффективное количество полужидкой среды, и вторую часть, которая содержит эффективное количество суспензии, содержащей 3D гетерогенную популяцию клеток, нанесенную или присоединенную к минеральным частицам, где указанные минеральные частицы суспендированы в среде для культивирования клеток. Согласно другому варианту реализации изобретения, набор предназначен для инъекции, и первая и вторая части могут быть представлены в виде раствора и раздельно помещаться в независимые упаковки (такие как пластиковые бутылки или стеклянные бутылки типа ампул). Согласно другому варианту реализации изобретения, каждая упаковка может содержать множество доз, но предпочтительно содержит одну дозу первой или второй части. Согласно другому варианту реализации изобретения, до инъецирования две части помещают в шприц для инъекций в соответствии с информацией в инструкции (включающей такую информацию, как способ работы с набором, коэффициент смешивания растворов и т.д.) для применения лекарственной формы. Согласно другому варианту реализации изобретения, до инъецирования две части помещают в устройство для смешивания внутри или вне шприца. Согласно другому варианту реализации изобретения, до инъекции две части смешивают с помощью устройства для смешивания внутри шприца или вне шприца.
[0196] Термин «полужидкий» относится к материалам, имеющим гелеподобную консистенцию, в качестве неограничивающего примера, таким как по существу размерно-устойчивым при комнатной температуре, но обладающим определенной степенью упругости и гибкости, как правило, благодаря остаточному содержанию растворителя.
[0197] Предполагается, что описание различных вариантов реализации настоящего изобретения предложены для иллюстрации и не являются исчерпывающими и не ограничивают описанные варианты реализации. Многие модификации и вариации в пределах объема и сущности описанных вариантов реализации будут понятны специалисту в данной области техники. Терминология, используемая в настоящей заявке, была выбрана для наилучшего объяснения принципов вариантов реализации изобретения, практического применения или технического преимущества по сравнению с методами, представленными на рынке, или для понимания вариантов реализации изобретения, описанных в настоящей заявке, другими специалистами в данной области техники.
[0198] Следует понимать, что в обсуждении такие наречия, как «по существу» и «примерно», модифицирующие условие или параметр зависимости признака или признаков варианта реализации изобретения, означают, что указанное условие или параметр определен в допустимых пределах, приемлемых для реализации указанного варианта для его предполагаемого применения, если иное не указано. Если иное не указано, считается, что слово «или» в заявке и формуле изобретения является инклюзивным, а не эксклюзивным «или» и означает по меньшей мере один из или любую комбинацию объединяемых им элементов.
[0199] Следует понимать, что употребление предметов в единственном числе при использовании выше и где-либо в другом месте в настоящей заявке относится к «одному или более» перечисленных компонентов. Специалисту в данной области техники будет понятно, что употребление предметов в единственном числе включает множественное число указанных предметов, если иное специально не указано.
[0200] Для лучшего понимания идей настоящего изобретения и без ограничения объема указанных идей, все номера, выражающие количества, проценты или соотношения, и другие числовые значения, используемые в заявке и формуле изобретения, следует воспринимать как модифицированные во всех примерах термином «примерно», если иное не указано. Соответственно, если не указано противоположное, числовые параметры, изложенные далее в настоящей заявке и прилагаемой формуле изобретения, представляют собой приближенные значения, которые могут варьировать в зависимости от желаемых свойств, которых пытаются достичь. По крайней мере каждый числовой параметр должен толковаться с учетом по меньшей мере количества указанных значимых чисел и с применением стандартных методов округления.
[0201] В описании настоящей заявки и формуле изобретения каждый из глаголов «содержит», «включает» и «имеет» и родственные им слова используются для указания того, что объект или объекты указанного глагола необязательно представляют собой полный список компонентов, элементов или частей субъекта или субъектов глагола. Предполагается, что другие термины при использовании в настоящей заявке определяются в соответствии с их общеизвестными значениям в данной области техники.
[0202] Следует понимать, что определенные признаки настоящего изобретения, которые для ясности описаны в контексте раздельных вариантов реализации изобретения, также могут обеспечиваться в связи с единственным вариантом реализации. Напротив, различные признаки согласно изобретению, которые для краткости описаны в контексте единственного варианта реализации изобретения, также могут быть представлены раздельно или в любой подходящей подкомбинации или в любом другом описанном варианте реализации изобретения, если применимо. Не следует считать, что конкретные признаки, описанные в контексте различных вариантов реализации изобретения, являются обязательными признаками указанных вариантов реализации, если только указанный вариант реализации не является неработоспособным без указанных элементов.
[0203] Дополнительные объекты, преимущества и новые признаки настоящего изобретения будут понятны специалисту в данной области техники при проверке следующих далее примеров, не ограничивающих настоящее изобретение. Кроме того, каждый из различных вариантов реализации и аспектов настоящего изобретения, описанных в настоящей заявке выше и заявленных в разделе формулы изобретения ниже, имеет экспериментальное подтверждение в следующих далее примерах.
ПРИМЕРЫ
[0204] В целом, номенклатура, используемая в настоящей заявке, и лабораторные методики, используемые согласно настоящему изобретению, включают молекулярные, биохимические, микробиологические методы и методы рекомбинантой ДНК. Указанные методы подробно описаны в литературе. См., например, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); методы, изложенные в патентах США №4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 и 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); доступные иммунологические анализы подробно описаны в патентной и научной литературе. См., например, патенты США №3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 и 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, М. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, В., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol.1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); все из которых включены в настоящую заявку посредством ссылки. Другие общие ссылки приводятся в тексте настоящего документа.
Материалы и способы:
Схема экспериментов
[0205] Клетки культивировали в четырех различных условиях (обозначенных как группы обработки: БУ, А, В и С), указанные различные условия суммированы в Таблице 13. Каждый эксперимент повторяли три раза.
[0206] Группа БУ представляет собой 2D культуру, которую поддерживали на протяжении 4 пассажей, и уровни экспрессии генов в указанной группе использовали в качестве базовых уровней экспрессии генов. Клетки HATDC культивировали в 2D системе в среде без чужеродных компонентов (xeno-free) на протяжении 2-4 пассажей. ВМР2 не добавляли к среде. При использовании в настоящей заявке термин «пассаж» относится к методу культивирования клеток, при котором выращиваемые в культуре клетки в сосуде для тканевых культур, достигшие или приближенные к конфлюентному состоянию, удаляют из указанного сосуда, разбавляют свежей культуральной средой (т.е. разводят в отношении 1:5) и помещают в новый сосуд для тканевых культур, чтобы обеспечить возможность их продолжительного роста и выживания.
[0207] Группа А: клетки HATDC культивировали в 2D системе в среде без чужеродных компонентов (xeno-free). После 1-3 пассажей клетки пересевали в 2D систему и через 1-2 дня после посева (0 день) в ростовую среду добавляли один или более индукторов остеогенеза и клетки культивировали в течение дополнительных двух дней (2 день, группа А).
[0208] Группа В: клетки HATDC культивировали во флаконах (2D) со средой без чужеродных компонентов (xeno-free) в течение 1-2 пассажей. Затем клетки высевали в 3D систему на кортикальный скаффолд с использованием среды без чужеродных компонентов (xeno-free). Через 4-5 дней после посева к клеткам в 3D системе добавляли один или более индукторов остеогенеза для индукции остеогенной дифференцировки и культивировали клетки в течение дополнительных двух дней (2 день, группа В) до их сбора.
[0209] Группа С: жировую ткань помещали на минеральный скаффолд в среде без чужеродных компонентов (xeno-free), и клетки HATDC мигрировали на частицы скаффолда. Через 10-12 дней после посева к клеткам добавляли один или более индукторов остеогенеза для индукции остеогенной дифференцировки и культивировали клетки в течение дополнительных двух дней.
[0210] Клетки HADTC, культивируемые в 2D, собирали на 0 день (до индукции с помощью ВМР2) и на 2 день после индукции остеогенеза (2 день). Клетки HADTC, культивируемые в 3D (группы В и С) собирали через 2 дня после индукции остеогенеза (2 день).
[0211] Индукцию остеогенеза вызывали одним или более индукторами остеогенеза, такими как ВМР-2, ВМР-3, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6 и ВМР-7
Приготовление образцов РНК:
[0212] РНК экстрагировали с помощью автоматической станции Qiacube с использованием набора RNeasy mini (Qiagen). Качество всех образцов тотальной РНК оценивали с помощью системы TapeStation (Agilent). Значение РНК во всех образцах составляло >9,5. РНК амплифицировали с получением биотинилированной кРНК путем транскрипции in vitro с использованием набора для мечения TargetAmp Nano для матрицы Illumina BeadChips (Epicentre). Биотинилированные молекулы кРНК гибридизовали с матрицей HumanHT-12 v4 Expression BeadChip (Illumina) в соответствии с протоколом анализа прямой гибридизации (Direct Hybridization assay, Illumina Inc.). Гибридизованные матрицы окрашивали стрептавидином с использованием конъюгата стрептавидин-Cy3 (GE Healthcare Amersham), сканировали с помощью сканнера Illumina HiScan и изображения импортировали в программу GenomeStudio (Illumina) для контроля качества (QC). Затем данные импортировали в программу JMP Genomics (SAS) для статистического анализа и в приложение IPA для анализа обогащения сетей.
Микроматрица
[0213] Для микроматричного анализа применяли набор HumanHT-12 v4 Expression BeadChip (Illumina), направленный на выявление более 47,000 зондов. Исходные полученные данные включали более 47,000 зондов. После log2-преобразования и отфильтровывания вариантов с низкой экспрессией и низкой вариабельностью между образцами оставалось примерно 9,000 зондов для статистического анализа.
Статистический анализ:
[0214] Исходные данные экспрессии генов экспортировали из программы GenomeStudio и импортировали в программу JMP Genomics v7 (SAS Institute Inc, Сагу, NC). Контроль качества и анализ в программе JMP Genomics осуществляли на log2-преобразованных данных после отфильтровывания не экспрессирующихся генов (p-значение для выявления <0,01) и транскриптов со слабой дисперсией между образцами (дисперсия <5%). Распределение данных показало сходную экспрессию, таким образом указанные данные не нормировали. Данные анализировали с применением однофакторного дисперсионного анализа. Дифференциально экспрессирующиеся гены (DEG) определяли как транскрипты со статистически значимым уровнем при скорректированном p-значении ≤0,05 с использованием уровня ложноположительных результатов (FDR), различие которых представляло собой по меньшей мере двукратное изменение. Анализ данных осуществляли с применением следующего программного обеспечения: (1) GeneAnalytics, LifeMap sciences, (2) анализ путей Ingenuity (IPA 8,0), Ingenuity, Qiagen.
ПРИМЕР 1
Экспрессия эндогенных ВМР-2, SP7, ALP по результатам анализа с помощью количественной ПЦР в реальном времени
[0215] Для оценки остеогенного потенциала клеток в 3D системах (группы С и D) и 2D системе (группа А) проверяли уровни экспрессии ранних остеогенных маркеров (эндогенный костный морфогенетический белок (ВМР2), Ostrix (SP7) и щелочная фосфатаза (ALP)). Сначала в группах А, В и С индуцировали остеогенную дифференцировку путем добавления 150 нг/мл ВМР2 к среде без чужеродных компонентов (xeno-free) в течение двух дней. Затем образцы РНК, полученные из групп А, В и С, анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Уровни экспрессии анализировали по сравнению с уровнями экспрессии в контрольной группе (группа БУ). Эксперимент повторяли три раза для различных источников биологического материала (обозначенных AD153, AD154 и AD160), результаты представлены на Фигурах 1, 2 и 3 соответственно.
[0216] После индукции остеогенеза оценивали уровни экспрессии ранних остеогенных маркеров ВМР-2 (Фигуры 1А, 2А и 3А), SP7 2 (Фигуры 1B, 2В и 3В) и ALP 2 (Фигуры 1С, 2С и 3С).
[0217] Предыдущие исследования показали, что эндогенная экспрессия ВМР2 играет существенную роль и важна для остеогенной дифференцировки помимо экзогенного ВМР2. Результаты показывают повышение эндогенного ВМР2 в клетках 3D-HADTC, стимулированных экзогенным ВМР2 (Фигуры 1С, 2С и 3С). уровень эндогенного ВМР2 был повышен в среднем (для трех используемых источников) в 3,02±0,76 раз на 3 день дифференцировки.
[0218] Следует отметить, что экспрессия всех исследуемых генов: ВМР2, SP7 и ALP, была выше в 3D системах после обработки ВМР2 по сравнению с 2D системами с обработкой или без обработки ВМР2 (Фигуры 1А-С, 2А-С и 3А-С). Данные результаты указывают на повышенный потенциал клеток HADTC, выращенных в 3D системах, дифференцироваться в остеобласты по сравнению с клетками HADTC, выращенными в 2D системе.
ПРИМЕР 2
Микроматричный анализ
[0219] Сначала определяли компонент дисперсии путем анализа различий между разными группами обработки (системами) и между повторными экспериментами для различных биологических источников (AD153, AD154 и AD160).
[0220] Результаты показали, что примерно 66% суммы дисперсии обеспечивается различиями между группами обработки, и дополнительные ~18% дисперсии обеспечиваются различиями между повторными экспериментами для различных биологических источников (Фигура 4).
[0221] Для каждой группы обработки (А, В, С) оценивали уровни экспрессии генов по сравнению с базовыми уровнями (BL) и дифференциально экспрессирующиеся гены (DEG) представляли на диаграмме Венна (Фигура 5). Дифференциально экспрессирующиеся гены представляют собой гены, для которых наблюдается по меньшей мере 2-кратное изменение (FC>=2) по сравнению с базовым уровнем. Как показано на Фигуре 5, 31 ген дифференциально экспрессируется в группе А по сравнению с базовыми уровнями (БУ). Кроме того, более чем для 500 генов наблюдается дифференциальная экспрессия в группах В или С по сравнению с базовыми уровнями (БУ). Следует отметить, что 376 DEG являются общими для групп В и С по сравнению с базовыми уровнями (БУ). 362 из 376 DEG являются общими только для групп В и С, и 14 DEG являются общими для групп обработки А, В и С по сравнению с базовыми уровнями (БУ). Указанные результаты показали, что рост клеток в 3D системах влияет на клетки больше чем индукция остеогенеза (с помощью одного или более индукторов остеогенеза в течение 2 дней). Более того, повышение и снижение уровня DEG по сравнению с базовыми уровнями (БУ) является более значительным для групп В и С, чем для группы А (Фигура 6).
[0222] Более того, тепловая карта, показанная на Фигуре 7, демонстрирует, что группы обработки А и БУ сходны и значительно отличаются от групп обработки В и С, которые являются сходными.
[0223] Микроматричный анализ показал, что при наращивании клеток HATDC в 3D условиях происходит значительное изменение профиля экспрессии генов. Напротив, при наращивании идентичных клеток в 2D условиях с использованием такой же среды и условий индукции остеогенеза (ВМР2, 2 дня) профиль экспрессии генов очень сходен с базовым контрольным уровнем (условия 2D в отсутствие ВМР2) и сильно отличается от профиля экспрессии генов, наблюдаемого в 3D условиях (группы В и С).
ПРИМЕР 3
Результаты микроматричного анализа
[0224] Результаты микроматричного анализа оценивали и группировали DEG в разные кластеры. Результаты показали, что только 14 DEG были общими для групп обработки, подвергнутых индукции остеогенеза с помощью одного или более индукторов остеогенеза (группы А, В и С), по сравнению с базовыми уровнями (БУ) (Таблица 12).
[0225] Было обнаружено, что в клетки HATDC, которые подвергали индукции остеогенеза в течение 48 часов, наблюдалось изменение уровней экспрессии генов АТОН8, CGB1, СМТМ4, FOXO, ID1, ID2, ID3, NEBL, OSR1, PRRX2, SAMD11, SLC16A3 и SMAD9. В частности, после индукции остеогенеза (группы А, В и С) наблюдалось повышение уровня экспрессии генов АТОН8, CGB1, СМТМ4, FOXO, ID1, ID2, ID3, NEBL, PRRX2, SAMD11, SLC16A3 и SMAD9 по сравнению с клетками HATDC, которые не повергали остеогенной обработке (БУ). Уровень экспрессии гена OSR1 в клетках HATDC, подвергнутых индукции остеогенеза (группы А, В и С), был снижен по сравнению с клетками HATDC, которые не подвергали индукции остеогенеза (БУ).
[0226] На Фигуре 8 показано сравнение дескрипторов, связанных с каноническими путями (слева), предшествующими регуляторами (посередине), и функциональный анализ генов с повышенным или пониженным уровнем в различных исследованных условиях роста. Три варианта обработки сравнивали с помощью инструмента IPA-анализа. Каждый показанный дескриптор соответствует множеству связанных DEG, уровень которых повышен или понижен по сравнению с базовой обработкой (БУ). Общий эффект всех связанных DEG на дескриптор суммируется и демонстрируется в указанных тепловых картах. Результаты показывают, что 3D условия роста (группы обработки В и С) значительно влияют на перечисленные дескрипторы, тогда как 2D условия роста (группа обработки А) оказывают незначительный эффект по сравнению с базовым уровнем (БУ).
Маркеры стволовых клеток
[0227] Уровень экспрессии маркеров плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, включая CD13, CD73, CD90 и KLF4, был снижен в клетках HATDC, выращенных в 3D системах (группы В и С) по сравнению с контролем (BL) (Таблицы 1 и 1b). Данные результаты указывают на то, что у клеток HATDC, выращенных в 3D системе, происходит усиленная дифференцировка.
Маркеры пролиферации, дифференцировки и апоптоза
[0228] У клеток HATDC, выращенных в 3D системах, наблюдается пониженная пролиферация и усиленная дифференцировка. Результаты микроматричного анализа показали, что у клеток HATDC, выращенных в 3D системах, наблюдалась повышенная экспрессия клеточных маркеров AURKA, FOS, FGF2 (bFGF), BCL2L1, DDX21, RRAS2, STAT1 и ANXA2. Кроме того, что у клеток HATDC, выращенных в 3D системах, наблюдалась повышенная экспрессия клеточных маркеров, включая: SFRP2, ID1, ID2, ID3, MRAS, NOX4, NOTCH3 и RGCC (Таблицы 2 и 2b).
Белки МНС I
[0229] Антигены главного комплекса гистосовместимости (МНС) экспрессируются почти во всех дифференцированных клетках. Указанные белки вовлечены в презентацию чужеродных антигенов иммунной системе. Известно, что в МСК молекулы МНС I класса экспрессируются на низком уроне.
[0230] Экспрессия генов МНС I стимулируется в клетках HATDC, выращенных в 3D системах, по сравнению с клетками HATDC, выращенными в 2D системах, что указывает на усиленную дифференцировку указанных клеток в 3D системах (Таблицы 3, 3b).
Маркеры адипоцитов
[0231] Уровень генетических маркеров зрелых адипоцитов (например, PPARG) был снижен, поскольку клетки были уже коммитированы к дифференцировке в костную ткань (Таблицы 4, 4b). Однако ранние маркеры адипоцитов повышены в 3D системе (например, DLK1, SOX9, Таблицы 4, 4b). Указанные результаты могут указывать на то, что при подходящих условиях роста клетки, выращенные в 3D системах, обладают потенциалом дифференцироваться в адипоциты, также как и в клетки костной ткани.
Маркеры остеобластов
[0232] Генетические маркеры этого кластера критичны для дифференцировки остеобластов (например, эндогенный ВМР2, SP7 и ALP), которая усилена в 3D условиях по сравнению с 2D условиями.
[0233] Результаты показали повышение маркеров, таких как ВМР2, SP7 и ALP. Указанные результаты дополнительно подтверждаются результатами количественной ПЦР в реальном времени (Фигуры 1А-С, 2А-С и 3А-С). Другие важные маркеры костной дифференцировки, наблюдаемые в 3D условиях, представляют собой POSTN, FGFR3 и DLX5. Стимуляция Msx1 и Msx2 указывает на процесс развития, а также на то, что процесс костной дифференцировки происходит в клетках нервного гребня (Таблицы 5, 5b).
[0234] Результаты, полученные после IPA-анализа (см. анализ пути Ingenuity -http://www.ingenuity.com/products/ipa), показывают, что при 3D условиях роста (группы В и С) наблюдалось более 30 DEG, вовлеченных в дифференцировку остеобластов, тогда как в группе А (клетки, выращенные в 2D системе и подвергнутые индукции остеогенеза) не наблюдалось DEG, вовлеченных в указанный путь.
Генетические маркеры остеохондральных предшественников и/или гипертрофических хондроцитов
[0235] Маркеры остеокластов являются специфичными для развития хряща и хондроцитов, остеохондральных предшественников и гипертрофических хондроцитов. Данные генетические маркеры указывают на то, что в механизм костной дифференцировки вовлечен процесс эндохондрального окостенения (Таблицы 6, 6b). Специфичные маркеры представляют собой COL10A1, ММР13 и СОМР.
Маркеры ВКМ и структурных белков
[0236] Генетические маркеры ВКМ (Таблицы 7, 7b) и структурных белков (Таблицы 8, 8b) указывают на усиленную дифференцировку клеток в 3D услоыиях. Более того, некоторые белки ВКМ образуют гипертрофические хондроциты во время процесса эндохондрального окостенения. Основные маркеры ВКМ представляют собой гены TNC и DPT.
Ангиогенные и васкулогенные гены
[0237] Ангиогенные и васкуларогенные генетические маркеры вносят вклад в процессы ангиогенеза и васкулогенеза. Некоторые из них представляют собой факторы роста или цитокины, такие как PGF и IL8. Другие представляют собой специфичные медиаторы формирования кровеносных сосудов, такие как ANG, ANGPT2 и ANGPTL2. Как правило, во время интенсивного остеогенеза, главным образом за счет процесса эндохондрального окостенения, ангиогенез усиливается.
[0238] Результаты показывают, что многие ангиогенные факторы индуцированы в 3D условиях по сравнению с 2D условиями роста (Таблицы 9, 9b). Более того, результаты IPA-анализа показали значительную стимуляцию сигнальных путей ангиогенеза и васкулогенеза (Фигура 8, справа, обозначено пунктирными стрелками), вовлекающую 96 (группа В) и 105 (группа С) связанных DEG (Фигура 10В). Напротив, в 2D условиях роста (группа А) указанные процессы не индуцируются (Фигура 8, справа, обозначено пунктирными стрелками, и Фигура 10А).
Экспрессия предшествующих регуляторов
[0239] Результаты показывают, что уровень предшествующих регуляторов повышен в 3D условиях по сравнению с 2D условиями роста (Таблицы 10, 10b).
Дополнительные DEG, уровни экспрессии которых значительно изменены
[0240] В Таблице 11b показаны DEG, для которых наблюдается по меньшей мере 3-кратное изменение (см. Фигуру 11).
[0241] Несмотря на то, что изобретение было описано в соответствии с конкретными вариантами его реализации, специалисту в данной области техники будут понятны многие альтернативы, модификации и вариации указанных вариантов реализации. Таким образом, настоящее изобретение включает все такие альтернативы, модификации и вариации в пределах сущности и широкого объема прилагаемой формулы изобретения.