Корреляция области вариабельного тандемного повтора VcB (VNTR VcB) и гена токсин-корегулируемых пилей (tcpA) у возбудителя холеры: компьютерный анализ

14

ЗНиСО АПРЕЛЬ №4

Для улучшения ситуации по заболеваемости раком легкого в Курской области необходимо совершенствовать качество оказания первичной медицинской помощи в первичном врачебном звене, с целью выявления предраковых заболеваний и рака легких на ранних стадиях в гендерных группах, а также усилить контроль за экологической безопасностью региона.

ЛИТЕРАТУРА

1. Зайцева Н.В. и др. Совершенствование стратегических подходов к профилактике заболеваний, ассоциированных с воздействием факторов среды обитания / Н.В. Зайцева, О.Ю. Устинова, МА Землянова //Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 11 (248). С. 14—19.

2. Злокачественные новообразования в России в 2011 году (заболеваемость и смертность) / Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: ФГБУ «МНИОИ им. ПА Герцена» Минздрава России, 2013. 289 с.

3. Миннибаев Т.Ш. и др. Методические подходы к оценке влияния среды обитания на здоровье населения в районах с разным уровнем экологического благополучия / Т.Ш. Мин-

нибаев, В.Т. Мазаев //Здоровье населения и среда обитания. 2012. № 7 (232). С. 12—15.

4. Ситдикова И.Д. и др. Гигиеническая оценка и управление факторами риска канцерогенной и мутагенной опасности в условиях современного техногенеза / И.Д. Ситдикова, М.К. Иванова //Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 4 (241). С. 11—13.

5. Состояние онкологической помощи населению России в 2012 году / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: ФГБУ «МНИОИ им. ПА Герцена» Минздрава России, 2013. 232 с.

6. Швагер О.В. Канцерогены атмосферного воздуха и онкологическая заболеваемость / О.В. Швагер //Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 12 (249). С. 6—8.

7. Globacan 2008: Country Fast Stat //http://globacan.iarc.fr/ fastsheets/populations/fastsheet.asp?uno=90, свободный доступ 25.09.13.

Контактная информация:

Куденцова Галина Васильевна,

тел.: 8 (4712) 58-81-41, 8 (919) 273-26-44,

e-mail: GV_K@List.ru

Contact information:

Kudentsova Galina,

р^м: 8 (4712) 58-81-41, 8 (919) 273-26-44, e-mail: GV K@List.ru

r-Ь

УДК 579.843.1:575.25:612.017.4:002.5/6

КОРРЕЛЯЦИЯ ОБЛАСТИ ВАРИАБЕЛЬНОГО ТАНДЕМНОГО ПОВТОРА VCB (VNTR VCB) И ГЕНА ТОКСИНКОРЕГУЛИРУЕМЫХ ПИЛЕЙ (TCPA) У ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ: КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ

А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин, И.П. Олейников ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону

Установлена корреляция между наличием гена tcpA и вариабельностью области тандемного повтора VcB (VNTR VcB), находящихся на разных хромосомах возбудителя, с помощью компьютерного анализа локальной базы данных генетических последовательностей холерного вибриона. По результатам компьютерного анализа установлено, что отсутствие локуса VcB связано с утратой большого фрагмента ДНК протяженностью около 6500п.о. Указанный фрагмент отсутствовал у всех штаммов, лишенных локуса VcB. Вариабельная область фланкирована генами gcvTи thrS, между которыми находятся 6 открытых рамок считывания, включаюших гены, кодирующие интегразу и транспозазу, что характерно для мобильных элементов. Ключевые слова: Vibrio cholerae, холера, VNTR, компьютерное моделирование, in silico.

A.S. Vodop'ianov, S.O. Vodop'ianov, B.N. Mishan'kin, LP. Olejnikov  SCIENTIFIC FOUNDATION FOR DEVELOPING PREVENTIVE MEASURES IN INTENSIVE VISUAL WORK  The Federal Government Health Institution «Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute» of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare  The aim of our work was to establish a correlation between the presence of tcpA gene and variable region tandem repeat VcB (VNTR VcB), located on different chromosomes of pathogen, using computer analysis of the local database of genetic sequences of Vibrio cholerae. By computer analysis it was found that the lack of locus VcB associated with the loss of a large DNA fragment length of approximately 6500 bp. This fragment was absent in all strains lacking locus VcB. Variable region flanked gcvT and thrS genes, between which there are six open reading frames, including the integrase and transposase, that is characteristic of mobile elements. Key words: Vibrio cholerae, cholera, VNTR, computer simulation, in silico.

Одной из постоянных угроз здоровью населения является появление новых генетически измененных вариантов возбудителя холеры, способных вызывать вспышки заболевания в различных регионах мира, подобных эпидемии на острове Гаити в 2010 г. Это делает актуальным проведение работ по изучению механизмов генетической изменчивости холерных вибрионов. В природе циркулирует большое число вибрионов с различными генотипами, однако эпидемическая опасность обусловлена наличием двух генов — холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей (йх + 1ерЛ+), локализованных на первой хромосоме возбудителя [1]. Это диктует необходимость усилий по проведению мероприятий, направленных на мониторинг и предотвращение возможных эпидемических осложнений [2].

Ранее с помощью VNTR-анализа было показано, что наличие локуса шестинуклеотидного вариабельного тандемного повтора VcB строго коррелирует с присутствием гена токсинкорегу-лируемых пилей (tcpA+) [3, 4, 5, 6].

Это наблюдение представляет особый интерес в связи тем, что ген tcpA, продукт которого является рецептором для СТХф фага, находится на первой (большой) хромосоме в составе острова патогенности (Vibrio pathogenicity island, VPI) [7], в то время как локус VcB расположен на второй (малой) хромосоме [8]. Показано, что у атокси-генных штаммов, выделяемых, как правило, из объектов окружающей среды, ген tcpA и соответственно весь остров патогенности VPI отсутствует [7]. Возможно, что причина делеции VPI обусловлена способностью островов патогенности возбудителя холеры к инцизии с последующим форми-

ЗНиСО

iE

r-Ь

рованием внехромосомных замкнутых структур как первого этапа на пути горизонтальной передачи генов [9] с помощью пузырьков наружных мембран (четвертый способ передачи ДНК) [10].

Цель настоящей работы заключалась в установлении корреляции между наличием гена tcpA и вариабельностью области тандемного повтора VCB (VNTR VCB), находящихся на разных хромосомах возбудителя, с помощью компьютерного анализа локальной базы данных генетических последовательностей холерного вибриона.

Первый этап работы заключался в создании локальной базы данных последовательностей ДНК штаммов возбудителя холеры. Необходимость проведения подобного исследования обусловлена еще и нестабильностью работы Genbank в последнее время, что связано с нарастающими финансовыми проблемами правительства США. Из базы Genbank по запросу были скачаны свыше 61 000 последовательностей ДНК. Суммарный объем созданной таким образом локальной базы данных составил свыше 1,8 Гб.

Следующим этапом было создание программного обеспечения для анализа созданной локальной базы данных. На данный момент исследователям доступно большое количество коммерческих и бесплатных программ для сравнения нуклеотидных последовательностей. Однако все они проводят сравнение либо с искомой базовой последовательностью, либо по принципу «все друг с другом», что не вполне подходит для проведения данного исследования. В связи с этим для изучения вариабельности области тандемного повтора

VcB методом компью-

Таблица 1. Результаты виртуальной ПЦР

с праймерами, фланкирующими вариабельную область

Размер Число

виртуального PCR- штаммов с генотипом

фрагмента локуса VcB tcp+ tcp-

6514 1 0

6521 1 0

6526 3 0

6527 1 0

6532 1 0

6538 1 0

6550 2 0

6556 3 0

6568 2 0

6573 1 0

6574 11 0

6586 1 0

6592 1 0

6598 1 0

338 0 3

339 0 51

340 0 1

Всего штаммов 30 55

терного моделирования (ш бШсо) была создана авторская программа «Мангуст 1.0», принципиальной особенностью которой является возможность целенаправленного сравнения двух заранее определенных групп последовательностей по одному заданному признаку.

И если в большинстве имеющихся программ сначала проводят сравнение ну-клеотидных последовательностей, а только потом, исходя из выявленных различий, осуществляют разделение на кластеры (группы), то разработанная программа «Мангуст 1.0» действует по обратному принципу: сначала исследователем проводится самостоятельная группировка последовательностей, а потом

Рис. Участок второй хромосомы штаммов Vibrio cholerae 2010EL-1786 tcpA+

программа выявляет отличия между заранее заданными группами.

В данном случае — между последовательностями, имеющими и не имеющими в своем составе локус УсВ. Таким образом, задачей данного этапа было нахождение участка ДНК второй хромосомы, который есть у всех УсВ-позитивных штаммов, но при этом отсутствуют у штаммов, лишенных локуса УсВ.

Важной особенностью разработанной программы является возможность работы с неполными сиквенсами. На данный момент имеются полностью собранные геномы только семи токси-генных штаммов холерного вибриона, в то время как геномы атоксигенных штаммов представлены в виде набора контигов различной длины. Причем часть из них перекрывается и частично дублирует друг друга. На один штамм в среднем приходится от 200 до 400 контигов. Созданная программа работает с учетом этих требований и позволяет учитывать возможное дублирование участков ДНК.

По результатам компьютерного анализа при помощи созданной программы «Мангуст 1.0» удалось установить, что отсутствие локуса УсВ связано с утратой большого фрагмента ДНК протяженностью около 6500 п.о. Указанный фрагмент отсутствовал у всех штаммов, лишенных локуса УсВ. Для проверки этого предположения посредством виртуальной ПЦР [3], нами были сконструированы прямой и обратный праймеры, фланкирующие гипотетическую область различий (рис.). При наличии локуса УсВ получаемый амплификат должен иметь расчетный размер порядка 6500 п.о. В случае делеции фрагмента ДНК, содержащего локус УсВ, размер получаемого амплификата был бы порядка 340 п.о. Виртуальная ПЦР с данными фланкирующими праймерами была проведена с 85 геномными последовательностями штаммов холерного вибриона из созданной нами базы данных (табл. 1).

При исследовании при помощи компьютерного анализа последовательностей ДНК 30 1срА+

IG

ЗНиСО АПРЕЛЬ №4

Таблица 2. Открытые рамки считывания генов, находящиеся внутри вариабельной области

Обозначение Размер (п.о.) Ген

CDS 23 972 phage Integrase *

CDS 24 9В1 ISVch5 transposase

CDS 25 1242 hypothetical protein

CDS 26 531 uropathogenic specific protein *

CDS 27 б72 hypothetical protein

CDS 28 351 hypothetical protein

*— установлены по сходству последовательностей с последовательностями штамма Vibrio cholerae MJ-1236

штаммов был получен виртуальный амплификат размером, варьирующим от 6 514 до 6 598 п.о., что указывало на наличие полноценного фрагмента VcB. Незначительная вариация длины ампликона обусловлена разным количеством шестинуклео-тидных тандемных повторов в локусе VcB. В то же время 51 tcpA- штамм с виртуальными фланкирующими праймерами формировал фрагмент размером 339 п.о., у четырех штаммов размер фрагмента отличался всего на один нуклеотид. Этот результат прямо указывал на отсутствие крупного фрагмента ДНК второй хромосомы у всех tcpA-штаммов. Кроме того, подобное строгое вырезание «как по шаблону» фрагмента, содержащего локус VCB, у самых различных штаммов свидетельствует о наличии гипотетического механизма, обеспечивающего столь точную специфическую инцизию.

Для установления функции белков, находящихся в вариабельной области, было проведено сравнительное изучение фрагмента второй хромосомы недавно депонированного штамма 2010EL-1786, который содержал полноценный локус VcB. Выбор указанной последовательности обусловлен высоким процентом идентифицированных белков у данного штамма.

Установлено, что вариабельная область фланкирована генами gcvT и thrS (рис.), между которыми находятся 6 открытых рамок считывания (табл. 2). Обращает внимание, что среди них есть гены, кодирующие интегразу (phage Integrase, CDS 23) и транспозазу (IS5 transposase, CDS 24), что характерно для мобильных элементов [9]. В этом случае кодируемый геном CDS 26 «уропатогенный специфический протеин» можно рассматривать в качестве нового потенциального фактора патоген-ности, действующего синергидно пилям ТСР.

Для подтверждения полученных данных компьютерного анализа о сцепленности локуса VcB и пилей TCP, необходимо проведение исследований in vitro с использованием репрезентативной коллекции штаммов возбудителя холеры с различными генотипами и уровнем патогенности.

Таким образом, по данным проведенного ком- ^ пьютерного анализа между областью вариабельного тандемного повтора VcB и геном токсинко- ^ регулируемых пилей (tcpA), находящихся на разных хромосомах холерного вибриона, существует реальная коррелятивная связь. Ч|

ЛИТЕРАТУРА =

<~Ь

1. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae //Nature. 2000. Vol. 406 (6795). P. 477—483.

2. Водопьянов С.О. и др. Испытание метода ПЦР в работе индикационной лаборатории мобильного комплекса СПЭБ при исследовании экспериментальных проб на холеру / С.О. Водопьянов, А.С. Водопьянов, И.П. Олейников, Р.В. Писанов, А.Б. Мазрухо //Здоровье населения и среда обитания. 2011. № 8 (221). С. 43—45.

3. Водопьянов А.С. и др. Алгоритм компьютерного VNTR-типирования на основе неполных сиквенсов ДНК штаммов Vibrio cholerae, выделенных на Гаити в 2010 году / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин, И.П. Олейников //Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 3 (240). С. 28—31.

4. Мишанькин Б.Н. и др. Мультилокусное VNTR-типирова-ние культур холерных вибрионов, выделенных в г. Казани во время вспышки холеры летом 2001 года / Б.Н. Мишанькин, А.С. Водопьянов, Ю.М. Ломов //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2003. № 6. С. 11.

5. Мазрухо А.Б. и др. Результаты мониторинга за холерными вибрионами в акватории Таганрогского залива Азовского моря в 2011—2012 гг. / А.Б. Мазрухо, В.Д. Кругликов, Е.В. Монахова, Э.А. Москвитина, И.С. Шестиалтынова, О.А. Подойницына, А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, Р.В. Писанов, Д.А. Зубкова, Т.А. Кудрякова, М.И. Ежова, Н.Н. Ускова, М.В. Скачко //Эпидемиология и инфекционные болезни. 2013. № 6. С. 39—42.

6. Ежова М.И. и др. Холерные вибрионы О1 серогруппы, выделенные из водных объектов Ростова-на-Дону в ходе мониторинга в 2008—2012 гг. / М.И. Ежова, В.Д. Кругликов, А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, И.С. Шестиалтынова, И.П. Олейников, Н.Б. Непомнящая, О.А. Подойницына //Проблемы особо опасных инфекций. 2013. № 4. С. 56—59.

7. Karaolis D.K., Lan R., Kaper J.B., Reeves P.R. Comparison of Vibrio cholerae pathogenicity islands in sixth and seventh pandemic strains//Infection end immunity. 2001. V. 69. № 3. P. 1947—1952.

8. Водопьянов А.С. и др. Вариабельные тандемные повторы, выявленные при компьютерном анализе генома Vibrio cholerae / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, М.Б. Ми-шанькин, И.Ю. Сучков, Б.Н. Мишанькин //Биотехнология. 2001. № 6. C. 85—88.

9. Murphy R., Boy E.F. Three pathogenicity islands of Vibrio cholerae can excise from the chromosome and form circular intermediates. //J. Bacteriology. 2008. Vol. 190. No. 2. P. 636— 647.

10. Mashburn—Warren L.M., Whiteley M. Specal delivery: vesicle trafficking in prokaryotes //Mol. Microbiol. 2006. Vol. 61. N 4. P. 839—846.

Контактная информация:

Водопьянов Алексей Сергеевич, тел.: 8 (863) 240-22-66, 8 (903) 402-07-02, e-mail: alexvod@gmail.com Contact nformation:

Vodop'ianov Alexey,

phone: 8 (863) 240-22-66, 8 (903) 402-07-02, e-mail: alexvod@gmail.com