Способ определения ранозаживляющей активности образцов продуктов сверхкритической экстракции растительного сырья для использования в качестве ранозаживляющих препаратов in vitro
METHOD FOR DETERMINING THE WOUND-HEALING ACTIVITY OF SAMPLES OF PRODUCTS OF SUPERCRITICAL EXTRACTION OF PLANT RAW MATERIALS FOR USE AS WOUND-HEALING DRUGS IN VITRO

Изобретение относится к фармакологии, а именно к способам качественного и количественного определения цитотоксичности и ранозаживляющей активности продуктов сверхкритической экстракции растительного сырья in vitro. Изобретение заключается в разработке способа быстрой оценки цитотоксичности и ранозаживляющей активности сверхкритических растительных экстрактов in vitro без использования лабораторных животных.
В настоящее время в связи с общим увеличением продолжительности жизни людей на земле особо актуальным направлением исследований является создание и изучение препаратов, сохраняющих качество жизни людей старше 35 лет. Например, к подобным средствам относятся антибиотики и препараты, позволяющие бороться с явлениями мультирезистентности (бактерий или опухолевых клеток). Всеми этими характеристиками обладают природные вещества, выделяемые из натурального сырья. Например, терпеновые гликозиды и флавоноиды очень эффективны при борьбе с мультирезистентностью бактерий и грибковых инфекций к антибиотикам. Многие природные полисахариды обладают противомикробными и противовирусными свойствами (при этом не являясь антибиотиками). Гликозаминогликаны являются очень эффективными пробиотиками, и их употребление зачастую более эффективно, чем использование антибиотиков [1]. Сульфатированные полисахариды способствуют разжижению крови человека, что в целом очень положительно влияет на здоровье.
Однако следует отметить, что экстрагирование подобных соединений связано с множеством нерешенных технических проблем. Например, при классических методах экстракции выход готового продукта может быть недостаточным. В связи с этим более перспективно применять для данных целей методы сверхкритической флюидной экстракции. Отрасль сверхкритической экстракции сейчас быстро развивается и представляет большой интерес, поскольку отличается наиболее высокими выходами готовых экстрактов и щадящим режимом экстракции. Новые подходы в этом направлении могут дать конкурентные преимущества при выделении новых веществ и в разработках технологических процессов получения и исследования инновационных лекарственных препаратов и иных веществ подобного типа [2].
В сибирском федеральном округе произрастает уникальная флора, большое количество редких растений и эндемиков региона. Применение технологий экстракции сверхкритическим флюидом позволит, выделить и изучить минорные соединения, которые не позволяли обнаружить прежние методологии извлечения.
Растительное сырье является богатым источником витаминов, незаменимых аминокислот и полиненасыщенных жирных кислот. Также в России, как и в Европе, активно развивается пришедшее с Азии направление функционального питания, как части персонализированной медицины. Этот тренд постепенно вытесняет использование биологически активных добавок. Производство функционального питания позволяет сократить время между разработкой и выходом товара на рынок, упрощает оформление экспорта продукции, а главное способствует развитию культуры питания населения. Кроме того, комплексное потребление полезной пищи обладает синергетическим эффектом и зачастую более эффективно, чем употребление активных ингредиентов по отдельности.
Использование продуктов сверхкритической экстракции растительного сырья позволит решить целый ряд экологических проблем, вызванных массовым использованием химических средств защиты растений. Это обусловливает высокую актуальность поиска альтернативных средств повышения резистентности растений к неблагоприятным факторам (включая возбудителей болезней растений), основанных на действии тритерпеновых кислот в составе экстрактов из хвои, флавоноидов ели, а также брассиностероидов. Дешевыми источниками таких соединений могут оказаться растительные экстракты, полученные с применением сверхкритических флюидных технологий. Поэтому изучение биологически активных соединений растений является важной и актуальной задачей. Решение этой задачи важно для фундаментальной науки и для разработки рецептур высококачественных натуральных продуктов функционального питания.
Исходя из вышеизложенного, изучение и разработка способов оценки активности вторичных метаболитов и растительных полисахаридов является очень важным для развития современной медицины и борьбы с социально значимыми и алиментарно-зависимыми заболеваниями, что доказывается наличие соответствующих патентов [3; 4].
При получении новых соединений методом сверхкритической экстракции из растительного сырья возникает проблема оценки их биологической активности. Следует отметить, что в настоящее время нет патентов непосредственно на способы исследования биосовместимости подобных веществ и оценки их влияния на биологические процессы, в частности, на деление клеток. Нашей задачей являлась разработка способа изучения ранозаживляющей активности и цитотоксичности продуктов сверхкритической экстракции растительного сырья in vitro.
Однако тестирование образцов подобного рода сопряжено с множеством трудностей методического характера. Обычно для исследований ранозаживляющей активности и цитотоксичности прототипов функциональных материалов биомедицинского назначения применяют различные клеточные линии с разными свойствами.
Прототипом разработанного способа оценки цитотоксичности является стандартный метод, описанный в ГОСТ Р ИСО 10993-5-2009 [5]. Однако стандартный метод имеет множество вариаций, и одной из главных трудностей являются расхождение критически важных экспериментальных параметров в уже имеющихся методиках. Такими параметрами являются типы клеточных линий, методы пробоподготовки и инкубирования. Стандартная методика является универсальной и не учитывает важных параметров, необходимых для исследования цитотоксичности и ранозаживляющей активности образцов. При этом каждый исследователь предлагает свои варианты методики, что приводит к расхождению результатов исследований, усложнению повторяемости экспериментов и затруднению мета-анализов. В связи с этим представляется особо актуальным разработка способа для проведения экспериментов по тестированию цитотоксичности растительных экстрактов.
Техническим результатом является возможность быстрой оценки цитотоксичности и ранозаживляющей активности сверхкритических растительных экстрактов in vitro без использования лабораторных животных.
Поставленная задача решается тем, что способ качественного и количественного определения цитотоксичности и ранозаживляющей активности продуктов сверхкритической экстракции растительного сырья для использования в качестве ранозаживляющих препаратов in vitro, включающий подготовку образцов, культивирование клеточной линии и непосредственного проведение тетразолиевого теста, отличается от прототипа тем, что на первом этапе в заявленном способе оценивают общую цитотоксичность образцов и отбирают наименее токсичные из них при помощи тетразолиевого теста, после чего на втором этапе оценивают ранозаживляющую активность методом заживления царапин.
Для оценки общей цитотоксичности используют фибробласты мыши линии NIH/3T3.
Для культивирования клеточной линии используют модифицированную среду F-12, содержащую инактивированную эмбриональную телячью сыворотку, L-глутамин, раствор гентамицина и смесь пенициллин-стрептомицина.
Для оценки ранозаживляющей активности после достижения 70 % конфлюэнтности на дне лунки 24-луночного планшета с помощью стерильного наконечника дозатора на 100 мкл наносят царапину в виде креста, затем в каждую лунку добавляют раствор образцов в полной питательной среде в предварительно рассчитанной с помощью тетразолиевого теста полумаксимальной эффективной концентрации, в качестве контроля используют полную питательную среду без добавления образцов, после инкубации с помощью инвертированного микроскопа рассчитывают площадь царапины по сравнению с контролем.
Разработанный способ включает в себя:
1. Подбор клеточных линий, имеющих медицинское значение и удовлетворительно реагирующего на воздействие образцов.
2. Тип и состав питательной среды, наиболее подходящей для роста клеточной культуры.
3. Параметры пробоподготовки, наиболее подходящие для образцов растительных экстрактов.
4. Параметры культивирования, наиболее подходящие для данной клеточной линии.
Заявленный способ оценки цитотоксичности и ранозаживляющей активности растительных экстрактов in vitro реализован в процессе научного исследования, посвященного тестированию данных образцов. Следует отметить, что оценка цитотоксичности и ранозаживляющей активности растительных экстрактов in vitro проводится в два этапа. На первом этапе оценивается общая цитотоксичность представленных на исследование препаратов и отбор наименее токсичных, на втором - их ранозаживляющая активность. Реализация данного способа состояла в следующем.
Для исследования цитотоксичности образцов использовались клетки линии NIH/3T3. Эта линия представляет собой делящиеся фибробласты мыши. Фибробласты секретируют белки коллагена, которые используются для поддержания структурной основы многих тканей. Дермальные фибробласты производят компоненты соединительной ткани и внеклеточного матрикса, которые влияют на регенерацию эпидермиса и способствуют заживлению ран. Поэтому клетки этой линии часто используют для биотестирования ранозаживляющих препаратов. В данном исследовании цитотоксичность образца изучалась методом МТТ-теста. Это метод определения жизнеспособности клеточных культур. Его действие основано на способности живых клеток превращать растворимый желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ) в нерастворимые пурпурно-синие внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана (МТТ-ф). Нежизнеспособные клетки такой способностью не обладают. Интенсивность превращения МТТ в МТТ-ф отражает общий уровень дегидрогеназной активности исследуемых клеток и модулируется активностью сопряженных ферментных систем, например, дыхательной цепи переноса электронов и т.д. Микротетразолиевый тест широко используется в оценке воздействия на клетки токсикантов, фармакологических препаратов, неблагоприятных факторов окружающей среды, позволяя оценить токсичность исследуемых препаратов in vitro [6].
Подготовка питательной среды:
Для культивирования использовалась модифицированная питательная среда F-12. Модификация питательной среды состояла в добавлении к 450 мл готовой среды 50 мл предварительно инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 300 мг L-глутамина, 50000 ЕД смеси пенициллин-стрептомицина, а также раствора гентамицина в соотношении 1 мкл/1 мл готовой среды. Такой состав питательной среды обеспечивает стабильный рост клеточной линии и предотвращает контаминацию культуры. Инактивация эмбриональной телячьей сыворотки осуществлялась выдерживанием ее на водяной бане при 57°C в течение 20 мин с последующим фильтрованием через бактериальный фильтр мембранного типа с диаметром пор 0,22 мкм.
Подготовка клеточной линии:
1. Клетки размораживали, поместив ампулы в водяную баню при 37°C на 1-2 мин. После этого пипетировали все содержимое ампулы в стерильную пробирку емкостью 15 мл. Затем медленно добавили 1 мл подогретой до 37°C предварительно подготовленной питательной среды.
3
2
2
2. Ресуспендировали осадок клеток в полной питательной среде для достижения концентрации клеток 5×10 клеток/см. После этого клетки поместили в культуральные сосуды площадью 75 см с 15 мл среды по 500 тыс. клеток в каждый.
2
3. Инкубировали клетки в инкубаторе с влажностью 37°C, 5% CO. Когда клетки прикрепились ко дну сосуда (в течение 48 часов), слили супернатант и заменили его свежей, предварительно нагретой (37°C) средой. При этом выполнили не менее двух пассажей перед использованием клеток в тестах.
4. Клетки культивировали с инкубаторе до достижения конфлюэнтности 60-70%. При этом не допускали полной конфлюэнтности клеток.
5. Среду аспирировали из культуральных сосудов и промывали клетки теплым раствором 1X PBS.
6. Добавили 5 мл раствора трипсин-ЭДТА и инкубировали при 37°C в течение 2 минут. Чтобы избежать комкования, не встряхивали клетки, ударяя по колбе или тряся ее, пока они не отделятся. Как только клетки отделились от подложки, перенесли суспензию клеток в сосуд с 6-8 мл полной питательной среды, чтобы инактивировать трипсин.
3
2
7. Центрифугировали клетки при 1200 об/мин в течение 3 минут (4°C) и ресуспендировали клетки в соответствующих объемах среды. Добавили соответствующие аликвоты клеточной суспензии в культуральные сосуды (примерно 5×10 клеток/см). Меняли среду примерно каждые 3 дня.
8. Питательную среду меняли на свежую за день до пересева в 24-луночные планшеты. Затем в день посева в планшет подготовили клеточную суспензию в полной питательной среде. В каждую лунку внесли 100 тыс. клеток в полной среде.
2
9. Инкубировали клетки в течение 24 часов ± 2 часа (37 °C ± 1 °C, влажность 90% ± 10%, 5,0% ± 1,0% CO/воздух), чтобы клетки образовали менее половины (< 50%) конфлюэнтного монослоя. Этот инкубационный период обеспечивает восстановление клеток, их прилипание и переход к экспоненциальной фазе роста.
Подготовка раствора МТТ:
Порошок МТТ растворяли в 1Х PBS до концентрации 5 мг/мл, аликвотировали и хранили при -20°C в качестве рабочего раствора.
Проведение эксперимента по оценке цитотоксичности in vitro:
1. Аккуратно аспирировали всю среду из планшета. Затем в каждую лунку внесли 1 мл раствора соответствующего образца в полной питательной среде. Концентрация образцов подбиралась экспериментально и составляла 10; 1; 0,1 и 0,01 мг/мл. Значение концентрации могло сдвигаться в ту или иную сторону в зависимости от обнаруженной активности каждого конкретного вещества. В качестве контроля использовался рост клеток в полной питательной среде без добавления образцов.
2. Поместили планшет с клетками в инкубатор на 48 часов.
3. Аспирировали всю среду из планшета и промыли каждую лунку один раз 500 мкл PBS.
2
4. Аспирировали раствор PBS и добавили 500 мкл раствора МТТ в каждую лунку, затем поместили планшеты в инкубатор на 4 часа (37°C ± 1°C, влажность 90% ± 10%, 5,0% ± 1,0% CO/воздух).
5. Удалили раствор МТТ осторожным отсасыванием.
6. Добавили 500 мкл ДМСО в каждую лунку и поместили планшет на шейкер при 500 об/мин на 10 мин для растворения кристаллов формазана.
7. Переместили 100 мкл раствора ДМСО из каждой лунки в 5 лунок 96-луночного планшета.
50
8. Измерили поглощение на длине волны 620 нм с помощью ИФА-ридера Tecan Infinite F50. Чем меньше значение поглощения по сравнению с контролем, тем меньшее количество клеток выжило после контакта с соответствующим образцом, следовательно, цитотоксичность образца больше. На основании данных поглощения строился калибровочный график и рассчитывалась полумаксимальная эффективная концентрация для каждого образца (EC).
Проведение эксперимента по оценке ранозаживляющей активности in vitro:
На втором этапе исследования проводилось изучение ранозаживляющей активности образцов, показавших наименьшую цитотоксичность. Для этого использовался метод царапин.
50
2
Подготовка питательных сред и клеточной линии в данном методе осуществлялась аналогично предыдущему. Отличие заключалось в том, что после достижения 70% конфлюэнтности на дне лунки 24-луночного планшета с помощью стерильного наконечника пипетки на 100 мкл создавалась царапина в виде креста. Затем клетки промывали 1Х раствором PBS PBS для удаления дебриса. После этого в каждую лунку добавлялся раствор образцов в полной питательной среде в концентрации EC. В качестве контроля использовалась полная питательная среда без добавления образцов. Инкубация осуществлялась в течение 48 часов (37°C ± 1°C, влажность 90% ± 10%, 5,0% ± 1,0% CO/воздух). После инкубации с помощью инвертированного микроскопа в режиме фазового контраста считывалась площадь царапины по сравнению с контролем. Полученные фотографии обрабатывались с использованием программного продукта ImageJ.
Пример конкретного осуществления изобретения.
С помощью разработанного способа изучена цитотоксичность и ранозаживляющая активность прототипа лекарственной формы, представляющего собой тонкие гидрофильные пленки, изготовленные методом заливки в формы с последующим испарением растворителя. Компонентами прототипа лекарственной формы являлись бетулин, мирамистин и инертные вспомогательные вещества. Бетулин (3β, 28-дигидрокси-20 (29) - лупен или луп-20 (29) - ен-3β, 28-диол) - это природный пентациклический тритерпеноид лупанового ряда. Это вещество содержится в березовой коре, коре орешника, календуле и других лекарственных растениях. В качестве положительного контроля использовался образец того же состава, но без добавления мирамистина. В качестве отрицательного контроля использовалась стандартная для данной клеточной линии полная питательная среда. Для эксперимента использовались растворы образца в полной питательной среде с концентрациями 7 мг/мл; 0,7 мг/мл; 0,07 мг/мл; 0,007 мг/мл; 0,0007 мг/мл; 0,00007 мг/мл и 0,000007 мг/мл. Продолжительность инкубации клеток с образцом составляла 48, 72 и 120 ч.
В результате проведенного эксперимента выявлено, что представленный на исследование образец прототипа лекарственной формы обладает цитотоксичностью. Установлено, что уровень его цитотоксичности выше такового у полной питательной среды (р < 0,05). Эффект наблюдался только при концентрации образца 7 мг/мл. Если принять количество живых клеток в образце отрицательного контроля за 100%, то образец снизил их количество на 50%.
Напротив, образец положительного контроля в рабочей концентрации показал не только отсутствие какой-либо цитотоксичности, но и значительное усиление пролиферации фибробластов, что можно определить по увеличению оптической плотности на 90%. Это подтверждено статистически (р < 0,05). Следует отметить, что эффект так же наблюдался только при концентрации образца 7 мг/мл, тогда как при других концентрациях увеличение пролиферации не отличалось от контроля.
Также установлено, что наибольшие эффекты обоих образцов фиксировались при продолжительности инкубации 48 ч. При инкубации продолжительностью 72 ч во всех культурах обнаружено много погибших клеток, а при продолжительности инкубации в 120 ч все результаты не отличались от отрицательного контроля (р > 0,05).
В результате первого этапа эксперимента выявлено, что образец прототипа лекарственной формы обладает цитотоксичностью в отношении фибробластов. При этом образец аналогичного состава наоборот, ускоряет пролиферацию фибробластов.
На втором этапе исследования проводилось изучение ранозаживляющей активности образцов методом царапин. Для эксперимента использован раствор образцов с концентрацией 7 мг/мл. Продолжительность инкубации составляла при этом 48 часов. В качестве отрицательного контроля использовалась полная питательная среда без добавления образцов.
В результате второго этапа эксперимента выявлено, что под действием образца положительного контроля площадь царапины уменьшилась на 62% по сравнению с отрицательным контролем (р < 0,05). Также установлено, что образец с добавлением мирамистина напротив, замедлил заживление царапины по сравнению с отрицательным контролем на 25% (р < 0,05).
Литература
1. Кубин Н.Д., Волкова О.В., Шкарупа Д.Д. Неантибактериальные методы профилактики и лечения рецидивирующих инфекций нижних мочевых путей. // Вестник урологии. - 2021. - Т. 9. - № 3. - С. 92-106.
2. Максудов Р.Н., Тремасов Е.Н., Егоров А.Г., Мазо А.Б. Сверхкритическая экстракция семян масличных культур // Вестник Казанского технологического университета. 2010. №2.
3. Патент WO2017123110A1. 20.17.20217.
4. Патент WO2009031934A1. 12.03.2009.
5. ГОСТ Р ИСО 10993-5-2011 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: Методы. 01.01.2013.
6. Tan J.M. [et al.]. Characterization of Betulinic Acid-Multiwalled Carbon Nanotubes Modified with Hydrophilic Biopolymer for Improved Biocompatibility on NIH/3T3 Cell Line. // Polymers (Basel). - 2021. - Vol. 13. - № 9. - P. 1362.