Способ выявления активности врожденного иммунитета
METHOD FOR DETECTING ACTIVITY OF INNATE IMMUNITY

Изобретение относится к медицине, в частности к способам выявления активности врожденного иммунитета, и может быть использовано для выбора способа лечения вирусных заболеваний и злокачественных новообразований и прогнозирования его эффективности.
Известны способы выявления активности врожденного иммунитета, включающий введение в образец крови стимулирующего агента и последующей количественной оценке активности врожденного иммунитета (https://meduniver.com/Medical/Physiology/1994.html; http://www.med24info.com/books/immunologiya/4-8-1-z-ocenka-sostoyaniya-vrozhdennogo-immuniteta-23222.html).
Известные способы достаточны сложны и требуют значительных временных затрат и/или дорогостоящих реактивов и оборудования.
Технический результат от использования предлагаемого способа выявления активности врожденного иммунитета заключается в его упрощении, снижении временных затрат и удешевлении процесса его реализации, а также расширении арсенала средств для решения поставленной задачи.
16
5,28
9,18
12,17
Указанный технический результат достигается тем, что в способе выявления активности врожденного иммунитета, включающем введение в образец крови стимулирующего агента и последующей количественной оценке активности врожденного иммунитета, в качестве стимулирующего агента используют натриевую соль сополимера (1→4)-6-0-карбоксиметил-β-D-глюкозы, (1→4)-β-D-глюкозы, (2→24)2,3,14,15,21,24,29,32-октагидрокси-23-(карбоксиметоксиметил)-7,10-диметил-4,13-ди(2-пропил)-19,22,26,30,31-пентаоксагенацикло [23,3,2,2OOO] дотриактонта 1,3,5(28),6,6(27),9(18),10,12(17),13,15-декаена с молекулярной массой Mm=28000-30000 и структурной формулой:
а
b
с
d
где a:b:c:d=(2-3):(1-2):(70-65):(27-30) на 100 исходных ангидроглюкозных единиц целлюлозы,
производят количественную оценку уровня изменения активности гена USP18 и в случае возрастания его активности делают вывод об активности врожденного иммунитета.
Способ осуществляют следующим образом.
Цельную кровь испытуемых разводят в питательной среде. В разведенную кровь добавляют индуктор интерферона с указанными химической и структурной формулами. Для контроля используют разведенную кровь без добавления препарата. Полученные растворы инкубируют в термостате и центрифугируют. Осадки лизируют. Выделяют суммарную РНК, производят реакцию обратной транскрипции и полученную комплементарную ДНК (кДНК) используют для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени со специфическими парами праймеров. Регистрируют уровни флюоресценции, интеркалирующего в ДНК красителя. Определяют уровень изменения активности генов относительно контроля.
В случае выявления возрастания уровня активности гена USP18 делают вывод об активности врожденного иммунитета. Подтверждением активности врожденного иммунитета является наблюдаемое при этом возрастание уровня активности генов ISG15 и Р53(TP33) или одного из них.
Пример
В исследовании приняли участие 14 пациентов, ранее не принимавших лечение, в возрасте от 32 до 72 лет. Диагноз: фолликулярная лимфома (ФЛ). Всех пациентов обследовали после поступления в стационар согласно правовым аспектам оказания медицинской помощи с получением от них информированного письменного согласия.
Кровь забрали в стерильных условиях из локтевой вены утром натощак в вакуумную пробирку с цитратом натрия для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени. Все исследования выполняли в день забора крови.
Цельную кровь испытуемых развели в 3 раза в среде RPMI-1640 с глютамином, содержащей 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (ЭТС) и антибиотики. Разведенную кровь разлили по 1,8 мл и добавили по 200 мкл индуктора интерферона для получения растворов с концентрацией 0,5 и 0,05 мг/мл, в контрольный образец добавили 200 мкл среды RPMI-1640. Пробы инкубировали в термостате в течение 2 часов. Затем образцы центрифугировали при 1000 об/мин 10 минут. Осадки лизировали с помощью лизирующего буфера и выделили РНК с помощью готового набора «РНК-экстран».
Реакцию обратной транскрипции (ОТ) провели с помощью готового набора для проведения ОТ от «Синтол» с универсальным праймером «random 6» согласно инструкции. Полученные кДНК хранили при - 70°С.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени провели на амплификаторе CFX-96 с готовой двукратной смесью SsoAdvanced SYBR Green Supermix (Bio-Rad, США) в микропробирках (0,2 мл) с оптически проницаемыми крышками (SSI, США). При этом использовали готовые структуры олигонуклеотидных праймеров, ранее рассчитанные в программе Primer 3 Blast NCBI GB и апробированные к исследованным видам мРНК: Р53(ТР53) [Шувалов А.Н., Соколова Т.М., Шаповал И.М., Ершов Ф.И. Модуляция транскрипции клеточных генов препаратом иммуномакс: активация генов интерферонов и интерлейкинов. Иммунология. 2014; 35(1): 16-20], IFN-α2 [Соколова Т.М., Шувалов А.Н., Колодяжная Л.В., Оспельникова Т.П., Ершов Ф.И. Механизмы действия препарата «Кагоцел» в клетках человека. Сообщение 1. Регуляция транскрипции генов системы интерферона и апоптоза. В кн.: Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н., ред. Интерферон - 2011. М.; 2012: 389-401], IFN-λ1, ISG13 [Соколова Т.М., Кособокова Е.Н., Шувалов А.Н., Шаповал И.М., Косоруков B.C., Ершов Ф.И. Активность генов системы интерферона в клетках аденокарциномы толстого кишечника htc116: регуляция рекомбинантными интерферонами альфа2 из бактериальных и растительных продуцентов. Российский биотерапевтический журнал. 2013; 12(3): 39-44], USP18 [Hashemi SMA, Sarvari j, Fattahi MR, Dowran R, Ramezani A, Hosseini SY. Comparison of ISG15, IL28B and USP18 mRNA levels in peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis В virus infected patients and healthy individuals. Gastroenterol Hepatol Bed Bench 2019; 12(1):38-45] глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) [Li L.D., Sun H.F., Liu X.X., Gao S.P., Jiang H.L., Hu X., et al. Down-regulation of NDUFB9 promotes breast cancer cell proliferation, metastasis by mediating mitochondrial metabolism. PLoS One. 2015; 10(12): e0144441. DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0144441].
Далее в боксе для проведения ПЦР смешали 2 мкл специфических пар праймеров (прямой и обратный) с 3 мкл кДНК (разведенной в 3 раза) и 5 мкл 2-кратной смеси SsoAdvanced SYBR Green Supermix. Каждую пробу исследовали в 2-3 повторах. Программа ПЦР: 96°С - 2 мин (1 цикл), далее 50-55 циклов 94°С - 10 с, 55-60°С - 20 с, 72°С - 30 с. Программа плавления в конечной точке 65-95°С, шаг 0,5°С - 10 с. Ген «домашнего хозяйства» GAPDH был использован как стабильный референс-нормализатор генной экспрессии. Специфичность ДНК-продуктов устанавливали по Т-плавления. Изменения активности генов (кратность стимуляции - КС) оценили относительно контроля, принятого равным 1, используя программное обеспечение для расширенного статистического анализа данных «CFX Maestro» к амплификатору CFX-96.
В результате оценки было установлено, что у 9-и пациентов средняя КС гена USP18 составила 6,69, КС гена ISG15 - 6,04, КС гена Р53(TP53) - 9,84 (выявлена активность врожденного иммунитета). У 5-и пациентов средняя КС гена USP18 составила 0,78, КС гена ISG15 - 0,64, КС гена P53(TP53) - 0,52 (активность врожденного иммунитета не выявлена).
Эти результаты могут быть использованы для выбора способа лечения вирусных заболеваний и злокачественных новообразований и прогнозирования его эффективности.