СПОСОБ ОЦЕНКИ АДРЕНОРЕАКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ
METHOD FOR DETERMINING ERYTHROCYTE ADRENAL RESPONSIVENESS

Изобретение относится к области биологии и медицины (гематологии) и может быть использовано для количественной оценки адренореактивности эритроцитов (АРЭ) у здоровых людей и больных, патологические изменения у которых вызваны повышенной активностью адреноэргических механизмов вегетативной регуляции.
Известно несколько способов оценки АРЭ:
-5
-13
-9
а) по изменению скорости оседания эритроцитов по Панченкову Т.П. под влиянием in vitro β-адреноблокатора - пропранолола в диапазоне концентраций от 10 до 10 мм/ч [патент РФ 2120632, кл. G01N 33/48, G01N 15/05, опубл. 20.10.1998]. В зависимости от степени выраженности изменения исходной АРЭ в венозной крови, авторы выделяли следующие виды адренозависимой скорости оседания эритроцитов (СОЭ): 60-80% от контрольного уровня - умеренная (нормальная), более 80% - сниженная, а менее 60% - повышенная. В дальнейшем этот метод авторами был модифицирован. Упрощенный вариант методики предполагает использование капиллярной крови, пропранолола только в одной концентрации, равной 10 г/мл.
б) предложенный И.Л. Голендой автоматизированный метод выявления β-адренореактивности эритроцитов по изменению параметров кинетики их кислотного гемолиза при внесении в пробы крови пропранолола. Показано, что реакция на пропранолол различается у лиц с преобладанием адренэргического или холинэргического звеньев вегетативной регуляции, зависит от возраста и пола (Голенда И.Л., Голенда А.М и др. Кинетический способ исследования адренорецепторов в эритроцитах // Физиология человека. 1994. Т.20, №3. с.151-155; Иванов В.И., Голенда И.Л. Возрастная динамика картины крови и кислотного гемолиза по данным автоматизированного экспресс-анализа в условиях г.Кемерово // Физиология человека. 1996. Т.22, №6. с.76-81; Голенда И.Л., Казин Э.М. и др. Поиск взаимосвязей между параметрами кинетики кислотного гемолиза эритроцитов и функциональным состоянием организма // Физиология человека. 1996. Т.22, №4. с.130-136).
в) основанный на определении осмотической резистентности эритроцитов на фоне действия адренэргических средств (Соминский В.Н., Окунь К.В., Севастьянова Н.А. Повышение осмотической резистентности эритроцитов под влиянием пропранолола // Лабораторное дело. 1981, №9. с.525-527). Согласно данным этих авторов β-адреномиметические средства (адреналин, алупент), связываясь с β-адренорецепторами эритроцитов человека in vitro, снижают их осмотическую резистентность. β-адреноблокатор пропранолол блокирует эффекты адреналина и инвертирует действие алупента, одновременно оказывая выраженное собственное влияние на осмотическую резистентность эритроцитов, повышая ее. Авторы метода обнаружили возрастание адренореактивности при инфаркте миокарда. Об этом свидетельствует тот факт, что повышение осмотической резистентности эритроцитов под влиянием пропранолола у больных инфарктом миокарда было более существенным, чем у здоровых (Соминский В.Н., Бердышева Л.В., Блума Р.К., Калниня И.Э., Окунь К.В., Селиванова Г.П., Манухин Б.Н. Использование эритроцитов для прижизненной оценки функционального состояния адренорецепторов // Физиологический журнал СССР. 1989. Т.75, №2. с.189-193).
Однако способ имеет следующие недостатки: сложность клинической оценки гемолиза; необходимость специального оборудования (ФЭК-56М, термостат, ротационный встряхиватель, центрифуга); отсутствие нормативных значений; противоречит данным анализа кислотной резистентности (Голенда И.Л., Голенда A.M., Галлеев А.Р., Иванов В.И., Никулина Т.В. Кинетический способ исследования адренорецепторов в эритроцитах // Физиология человека. 1994. Т.20. №3. с.151-155).
-9
г) наиболее близким по технической сущности является способ оценки адренореактивности эритроцитов по изменению скорости оседания эритроцитов капиллярной крови [патент РФ 2138805, кл. G01N 33/48, опубл. 27.09.1999], определяемой по Панченкову Т.П., под влиянием β-адреноблокатора обзидана, добавляемого in vitro в исследуемую цитратную кровь (при условии, что исходная СОЭ выше 10 мм/ч), причем используют капиллярную кровь и β-адренозависимую СОЭ определяют в присутствии одной концентрации обзидана - 10 г/мл. При нормальной адренореактивности эритроцитов добавление обзидана приводит к снижению СОЭ. При β-адренозависимой СОЭ, составляющей 85-95% от контрольной величины СОЭ, адренореактивность эритроцитов оценивается как умеренная (нормальная), более 95% - как сниженная, а менее 85% - как повышенная. Способ используется при диагностике гестоза, угрозе преждевременных родов, выборе их патогенетического лечения и контроле его эффективности. Указанный метод позволяет определить степень готовности организма к родам, прогнозировать течение родового акта и формировать группу риска по развитию слабости родовой деятельности. Преимуществами данного способа являются простота выполнения, наглядность и объективность, использование капиллярной крови. Способ не требует специального оборудования и реактивов, что делает его доступным для применения в широкой клинической практике. Достоинством предлагаемого способа является быстрота получения результатов (в течение 1 часа), что позволяет, в частности, использовать данный метод для определения тактики ведения родов.
Недостатком данного метода является то, что он ориентирован на диагностику адренореактивности только при патологии беременности и направлен на раннюю диагностику для предостережения развития тромбозов у рожениц и ограничен в использовании у здоровых людей.
-14
-6
Проведенные нами в течение 10 лет исследования на выборке более чем 500 человек показали, что у здоровых людей при воздействии на эритроциты in vitro адреналина в дозах от 10 до 10 ммоль/л выявляются разнонаправленные изменения СОЭ разной степени выраженности.
Задачей нашей работы является возможность использования метода количественной оценки адренореактивности эритроцитов для: 1) изучения реологического поведения эритроцитов у здоровых людей, и в первую очередь у мужчин, так как значения СОЭ не лимитированы величиной 10 мм/ч; 2) прогнозирования стрессоустойчивости организма с целью предупреждения срыва в гемостатическом потенциале; 3) выявления группы лиц, потенциально способных к развитию стрессорной реакции, использование такого подхода может оказаться полезным для спортсменов, участвующих в спортивных состязаниях, и студентов, сдающих экзамены; 4) прогнозирования лечебного эффекта ингибиторов у людей с заболеваниями сердечно-сосудистой системы.
Цель предлагаемого изобретения - разработка способа количественной оценки адренореактивности эритроцитов, а также обоснование разнонаправленности колебаний СОЭ.
-5
-7
-9
-11
-13
-6
Поставленная цель достигается в предлагаемом способе оценки адренореактивности эритроцитов по изменению скорости оседания эритроцитов под действием адреналина in vitro в концентрациях 10; 10; 10; 10; 10 ммоль/л венозной крови человека на фоне блокады их β-адренорецепторов обзиданом, добавляемого в исследуемую цитратную венозную кровь, причем концентрация обзидана составляет 10 моль/л, выделяют различные типы реагирования в зависимости от направленности отклонений СОЭ от исходного уровня: в сторону повышения - как агрегационный, снижения - как антиагрегационный, при отсутствии заметного отклонения - как ареактивный; рассчитывают количественную оценку изменений адренореактивности эритроцитов в абсолютных единицах отклонения СОЭ от исходного значения, представленную в виде средних значений АРЭ, средние значения АРЭ рассчитывают по отклонениям во всем диапазоне концентраций адреналина, оценка функционального состояния эритроцитов проводится по степени выраженности АРЭ с учетом знака: плюс при снижении величины СОЭ, минус при увеличении; прогнозирование ингибирующего действия блокаторов β-адренорецепторов оценивают по разности между контрольной и опытными пробами в присутствии и отсутствии обзидана.
-5
-13
-5
-7
-9
-11
-13
-6
Описание способа. Готовят раствор адреналина в диапазоне концентраций от 10 до 10 ммоль/л на физ. растворе (0,9%-ном растворе хлорида натрия). Из пробирки для определения АРЭ без ингибитора цитратную кровь (венозная кровь) разливают по 0,5 мл в 6 пробирок (всего 3 мл крови). Для определения контрольной СОЭ в одну пробирку добавляют 0,05 мл физ. раствора, а для проведения адренозависимой СОЭ в остальные 5 пробирок с кровью добавляют по 0,05 мл раствора адреналина соответствующей концентрации (10; 10; 10; 10; 10 ммоль/л). Полученную смесь из каждой пробирки набирают в капилляры Панченкова в объеме 0,1 мл. Затем ставят капилляры в штатив и производят измерение скорости оседания эритроцитов через 1 час. Для изучения АРЭ под действием ингибитора β-адренорецепторов - обзидана проводят предварительную апробацию наиболее эффективной дозы. Конечная концентрация обзидана в эксперименте составила 10 моль/л, время инкубации 10 мин при комнатной температуре. Анализ АРЭ в присутствии обзидана проводят по той же схеме, что и в исходных пробах.
Наш подход заключается в количественной оценке АРЭ с учетом как направленности ответной реакции, так и степени ее выраженности. АРЭ определяли в абсолютных величинах отклонения СОЭ от исходного значения для каждой концентрации адреналина. Окончательный результат представляли в виде средней величины отклонений СОЭ во всем диапазоне концентраций адреналина. Поскольку СОЭ может отклоняться в присутствии адренорецепторов как в сторону повышения (со знаком минус), так и понижения СОЭ (со знаком плюс), при подсчете средних величин учитывали также их знак. В соответствие с направленностью сдвигов мы выделили 3 типа АРЭ, названные нами:
1. антиагрегационный - если средние отклонения СОЭ от исходного уровня имели положительный знак, то есть после внесения адреналина значения СОЭ были ниже значения, чем в контроле (позитивный).
2. агрегационный - при котором средние отклонения СОЭ от уровня исходной пробы при различной концентрации адреналина имели отрицательный знак, то есть после внесения адреналина значения СОЭ были выше, чем в контроле (негативный).
3. арективный - при отсутствии заметного отклонения СОЭ при внесении адреналина в различной концентрации.
Количественное выражение АРЭ позволяет изучать ее взаимосвязи (методами корреляционного, факторного и регрессионного анализа) с другими показателями, характеризующими функциональные резервы организма, для выяснения роли и вклада нарушений реологического поведения эритроцитов в общую картину состояния организма.
Для оценки степени выраженности АРЭ выделили 3 уровня реактивности: при слабовыраженной антиагрегационной реакции СОЭ под влиянием различных доз адреналина снижалась от исходного значения от 1,1 до 3,0 мм/ч; при умеренной - 3,1-6,0 мм/ч; сильной - 6,1-9,0 мм/ч. Соответственно, увеличение СОЭ при сильновыраженной агрегационной реакции происходит от 1,1 до 5,0 мм/ч; умеренной - 5,1-10,0 мм/ч; сильной - 10,1-15,0 мм/ч.
-6
-5
-7
-9
-11
-13
-6
Пример 1. Испытуемый 1. Проведено определение СОЭ крови по Панченкову Т.П. Контрольная СОЭ составила 5 мм/ч. Значения АРЭ при определении изменения СОЭ под влиянием обзидана концентрации 10 моль/л при концентрации адреналина 10; 10; 10; 10; 10 ммоль/л составляют 2, 2, 1, 2, 2 соответственно. Зависимость значения АРЭ от концентрации адреналина при постоянной концентрации обзидана, равной 10 моль/л, представлена в рис.1.
-6
На рисунке 1 изображена зависимость от концентрации адреналина при постоянной концентрации обзидана, равной 10 моль/л, по оси абсцисс откладывается значение АРЭ, а по оси ординат концентрация адреналина.
Средний балл АРЭ составляет +3,2, тип АРЭ антиагрегационный, степень выраженности сильная (+3), т.е. агрегация эритроцитов в присутствии адреналина снижается.
-5
-7
-9
-11
-13
-6
-6
Пример 2. Испытуемая 2. Контрольная СОЭ составляет 8 мм/ч; после инкубации с различными концентрациями адреналина 10; 10; 10; 10; 10 ммоль/л значения АРЭ составляют 9, 10, 11, 12, 12, соответственно. Зависимость значения АРЭ от концентрации адреналина при постоянной концентрации обзидана, равной 10 моль/л, представлена в рис.2. На рисунках 1 и 2 изображена графическая зависимость адренореактивности эритроцитов (АРЭ) от концентрации адреналина при постоянной концентрации обзидана, равной 10 моль/л. По оси абсцисс откладываются значения АРЭ в мм/ч, а по оси ординат - концентраций адреналина С в ммоль/л.
Средний балл АРЭ составляет -2,8, тип АРЭ агрегационный, степень выраженности умеренная (-2). Реологическое поведение эритроцитов ухудшается в сторону роста их агрегации.
Действие адреноблокатора обзидана рассчитывали по разнице между средними величинами АРЭ до и после воздействия адреналина при отсутствии или в присутствии обзидана.
Предлагаемый способ оценки адреноактивности эритроцитов является более информативным для анализа частоты встречаемости АРЭ по степени выраженности разных типов при изучении динамики состояния крови в ходе трудовой и спортивной деятельности, учебного процесса и при оценке влияния наследственных факторов.
Предлагаемый метод количественной регистрации и оценки АРЭ может использоваться у здоровых людей для прогнозирования стрессоустойчивости организма с целью предупреждения срыва в гемостатическом потенциале. Прежде всего, это касается контингента лиц, деятельность которых сопровождаются активизацией симпато-адреналовой системы, вызывающий выход в кровь повышенных концентраций адреналина. В частности, использование такого подхода может оказаться полезным для спортсменов, участвующих в спортивных состязаниях, и студентов, сдающих экзамены. Данный метод позволяет выявить группу лиц, потенциально способных к развитию стрессорной реакции. Количественная оценки выраженности на действие in vitro блокатора β-адренорецепторов позволяет прогнозировать лечебный эффект ингибиторов у людей с заболеваниями сердечно-сосудистой системы.