Антибактериальная активность тобрамицина в отношении штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных у больных муковисцидозом

Антибактериальная активность тобрамицина в отношении штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных у больных муковисцидозом

П. Переновска, Г. Стоянова, Т. Стратева

Кафедра медицинской микробиологии, Медицинский университет, София, Болгария; Клиника педиатрии, УМБАЛ «Александровска», Медицинский университет, София, Болгария

Antimicrobial activity of tobramycin against Pseudomonas aeruginosa strains isolated from patients with cystic fibrosis

P. Perenovska, G. Stoyanova, T. Strateva

Department of Medical Microbiology, Medical University, Sofia, Bulgaria;

Pediatric Clinic, University Hospital "Alexandrovska", Medical University, Sofia, Bulgaria

Инфекции нижних дыхательных путей у пациентов с муковисцидозом характеризуются упорно рецидивирующим и тяжелым течением. Для лечения заболеваний, вызванных Peudomonas aeruginosa, в последнее время у детей старше 6 лет успешно применяется тобрамицин в ингаляциях. В настоящем исследовании методом E-test (LIOFILCHEM, Италия) определена антибактериальная активность тобрамицина в отношении 40 штаммов P. aeruginosa, выделенных у 25 больных муковисцидозом за период 2005—2009 гг. При этом МПК50 и МПК^ составили соответственно 0,75 и 3,0 мг/мл. Зависимости от возраста пациентов (и длительности колонизации с P. aeruginosa) не установлено. Тобрамицин in vitro показал высокую активность в отношении штаммов P. aeruginosa, выделенных у больных муковисцидозом. Она зависела от морфологии штамма и предшествующего лечения ингаляционным тобрамицином. При назначении ингаляционного лечения в случаях высева среднечувствительных или резистентных штаммов P. Aeruginosa (согласно критериям CLSI) необходимо интерпретировать оценку их чувствительности исходя из критериев MENSURA Group.

Ключевые слова: дети, муковисцидоз, P. aeruginosa, антибактериальная активность, тобрамицин.

In patients with cystic fibrosis, lower respiratory tract infections are characterized by a steadily recurrent and severe course. Recently, inhaled tobramycin has been successfully used to treat Pseudomonas aeruginosa-induced diseases in children aged over 6 years. In this trial, the E-test (Liofllchem, Italy) was employed to determine the antimicrobial activity of tobramycin against 40 P. aeruginosa strains isolated from 25 patients with cystic fibrosis in the period 2005—2009. At the same time MIC50 and MIC90 were 0,75 and 3,0 mg/ml, respectively. No relationship to patient age (and duration of P. aeruginosa colonization) was established. Tobramycin showed high activity in vitro against P. aeruginosa strains isolated from the patients with cystic fibrosis. The activity was related to the morphology of a strain and previous treatment with inhaled tobramycin. When initiating its inhalation treatment in cases of inoculation of moderately susceptible or resistant P. aeruginosa strains (according to the CLSI criteria), it is necessary to interpret their susceptibility test results by following the MENSURA Group criteria.

Key words: children, cystic fibrosis, P. aeruginosa, antimicrobial activity, tobramycin.

Муковисцидоз — аутосомно-рецессивное наследственное заболевание, при котором нарушена секреторная функция всех экзокринных желез. Клинические проявления многообразны, но у большей части больных именно поражение легких определяет продолжительность жизни. У этих пациентов хроническая коллонизация Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus и позднее — Pseudomonas aeruginosa является неизменной компонентой, определяю-

© Коллектив авторов, 2015

Ros Vestn Perinatol Pediat 2015; 1:89-92

Адрес для корреспонденции: Переновска Пенка Илиева — проф., главный педиатр Республики Болгария, зав. клиникой педиатрии Университетской больницы «Александровска»

Стоянова Гергана Петрова — Детская клиника, УМБАЛ «Александровска» Болгария, София 1431, Бул. Г. Софийски, №1

Стратева Таня Василева — кафедра микробиологии, Медицинский университет

Болгария, София 1431, ул. Здраве, №2

щей прогрессирование болезни. Патогномоничными микроорганизмами считают P. aeruginosa и другие грамотрицательные неферментирующие глюкозу бактерии, Burkholderia cepacia и Burkholderia gladioli c мукоидным морфотипом, который определяет их полирезистентность [1, 2]. Инфицирование P. aerugi-nosa прогностически неблагоприятно, ведет к более тяжелому течению муковисцидоза, прогрессирующему ухудшению функции легких [3, 4]. Большинство клиницистов считают, что антимикробная терапия улучшает функцию легких, увеличивает продолжительность и качество жизни больных, особенно при проведении агрессивного лечения антимикробными лекарствеными средствами уже при первом обнаружении P. aeruginosa. Важным элементом терапии му-ковисцидоза в последнее десятилетие стало ингаляционное применение антибиотиков, так как таким путем создается высокое концентрация препаратов в очаге

инфекции (в легких) при уменьшении их системного действия. Раствор тобрамицина для ингаляционного применения показан для длительного лечения хронических легочных инфекций, вызванных Peudomo-nas aeruginosa, у больных муковисцидозом в возрасте 6 лет и старше. Тобрамицин применяют вне периода обострения [5]. Ингаляционное лечение тобрами-цином в дополнение к стандартной антимикробной терапии муковисцидоза значительно улучшает показатель ОФВ1 (объем форсированного выдоха за 1 с), уменьшает обсемененность мокроты P. aeruginosa, уменьшает частоту госпитализаций и необходимость внутривенного применения антимикробных средств [4]. Следует отметить, что при традиционной оценке антибактериальной чувствительности выделение чувствительных, среднечувствительных и резистентных штаммов, ориентировано на парентеральное и/или пероральное применение препаратов и не адаптировано для ингаляционного их применения. В случае последнего при оценке чувствительности следует исходить из критериев, предложенных MENSURA Group: чувствительные — при минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотика <64 мг/мл; резистентные — при МПК >128 мг/мл [6, 7].

Цель: исследовать in vitro антибактериальную активность тобрамицина в отношении штаммов P. aeruginosa, выделенных у больных муковисцидозом, инфицированных или хронически колонизированных этим микроорганизмом, а также проанализировать связь активности антибиотика с морфотипом выделенного штамма и предшествующей терапией с включением тобрамицина.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Бактериологическое исследование. За период 4 лет из мокроты 25 пациентов (15 девочек и 10 мальчиков) с муковисцидозом выделено 40 штаммов P. aeruginosa. Бактериологическое выделение проводили на кровяном и шоколадном агаре, среде Сабуро и агаре Мак-Конки путем культивирования в течение 18—24 ч при температуре 35—37°С. Очень вязкую мокроту предварительно помещали в термостат (37°С) с панкретином. Антибактериальную активность тобрамицина в отношении всех выделенных штаммов P. аeruginosa оценивали путем определения МПК методом high range (<0,064 — >1024 мг/мл) E-test (LIOFILCHEM, Италия).

Критерии отбора клинически значимых штаммов: обнаружение P. aeruginosa в мокроте в течение предыдущих 12 мес; возраст пациента >6 лет; снижение ОФВ1 в пределах (>25% и <75%). Больных с обострением легочной инфекции в исследование не включали. В соответствии с международными согласительными документами по муковисцидозу (Cystic Fibrosis Foundation, Consensus Conference, 1994) диагностическими критериями обострения считали наличие не менее 3 из 11 следующих признаков: усиление кашля, увеличение количества мокроты, фебриль-ная лихорадка, потеря массы тела, пропуск занятий в школе или работы, снижение физической активности, затрудненное дыхание, появление в легких аускультативных и рентгенологических изменений, снижение ОФВр анемия [8].

РЕЗУЛЬТАТЫ

По возрасту пациенты распределялись следующим образом: 6—10 лет — 9 детей, 11—15 лет — 17, 16— 20 лет — 7, старше 20 лет — 7 больных. Распределение выделенных штаммов P. aeruginosa в соответствии с мукоидным/немукоидным морфотипом составило 19/21. Ранее в лечении тобрамицин использовался у 21 больного.

Общая антибактериальная активность тобрамицина в отношении выделенных респираторных штаммов P. aeruginosa

МПК50 и МПК90 составили соответственно 0,75 и 3,0 мг/мл (табл. 1). Согласно критериям MENSURA Group, 95% штаммов характеризовались как «чувствительные» к тобрамицину. В соответствии со значениями, принятыми Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2007), чувствительность к антибиотику была ниже — 92,5%.

Сравнительная антибактериальная активность тобрамицина в отношении выделенных респираторных штаммов P. aeruginosa в зависимости от их морфотипа и предшествующего применения тобрамицина

Определенная in vitro антибактериальная активность тобрамицина (МПК50 и МПК90) была выше в отношении немукоидных штаммов в сравнении с мукоидными. Активность также была выше в от-

Таблица. Антибактериальная активность тобрамицина в отношении выделенных респираторных штаммов P. aeruginosa

CLSI MENSURA

МПК диапазон, МПК50, мг/ МПК90, мг/ Количество штамов, абс.

мг/мл мл мл S <4 мг/мл IRS 6 мг/мл >8 мг/мл <64 мг/мл R >128 мг/мл

<0,064 — >1024 0,75 3,00 37

Примечание. S — чувствительные; I — среднечувствительные; R — резистентные штаммы.

Переновска П.И. и соавт. Антибактериальная активность тобрамицина в отношении штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных у больных муковисцидозом

ношении штаммов P. aeruginosa у пациентов, ранее не применявших тобрамицин (рис. 1, 2).

Связь между антибактериальной чувствительностью к тобрамицину и длительностью колоницации/инфекцирования P. aeruginosa у пациентов с муковисцидозом

Не установлено значимых различий в распределении МПК, МПК50 и МПК90 на тобрамицин у штаммов, выделенных у пациентов четырех возрастных групп (рис. 3). Штаммы P. аeruginosа, выделенные из мокроты у пациентов старше 20 лет, с длительной колонизацией характеризовались низкими МПК (ниже 3 мг/мл).

Рис. 1. Распределение МПК штаммов P. aeruginosa разных морфотипов.

Рис. 2. Распределение МПК штамов P. aeruginosa, изолированных у пациентов с муковисцидозом, леченных с применением тобрамицина (Т) и без такового.

Рис. 3. Распределение МПК в зависимости от возраста пациентов.

ОБСУЖДЕНИЕ

E-test метод для определения МПК антимикробных лекарственных средств, основанный на концентрационном градиенте, дает четкие результаты и является легким для выполнения. Применение «high range tobramycin» стрипов при исследовании штаммов P. aeruginosa у пациентов с муковисцидозом гарантирует четкую оценку их чувствительности к стратегическим антибиотикам, так как нередко имеет место полирезистентность. Тестовые концентрации хорошо соотносятся с реальным уровнем антибиотика в бронхиальном секрете при ингаляционном применении тобрамицина [9].

Количество чувствительных к тобрамицину штаммов в настоящей работе (95%) идентично данным проведенного недавно исследования в Университетской больнице Мадрида (Испания) при применении критериев MENSURA Group [7]. Процент резистентности выделенных нами штаммов P. aeruginosa к тестированному антибиотику в соответствии с CLSI-стандарта-ми (МПК >8 мг/мл) сходен с данными в отношении респираторных штаммов у пациентов с муковисци-дозом, полученными из 17 больниц в Англии в 2000 г. (соответственно 5% и 10,1%) [10].

В литературе идет дискуссия, являются ли штаммы P. aeruginosa мукоидного фенотипа (продуцирующие слайм) более устойчивыми к антибактериальным средствам, по сравнении с немукоидными. Большинство авторов считают, что резистентность мукоидных штаммов выше [11, 12]. T. Mah и соавт. установили, что формируемый в респираторном тракте биофильм является проницаемым барьером для антимикробных средств, но, с другой стороны, существуют специфические генетические механизмы, которые обусловливают резистентность слаймпродуцирующих (муко-идных) P. aeruginosa. Авторы открыли генетическую детерминанту (ndvB локус), кодирующую высокий уровень резистентности среди образующих биофильм штаммов. Локус ndvB ответствен за синтез периплаз-менных глюканов, которые препятствуют контакту тобрамицина с бактериальной стенкой. Недавно в P. aeruginosa идентифицирован новый эфлюкс-на-сос, участвующий в формировании биофильмспеци-фической резистентности к некоторым антибиотикам, включая тобрамицин [13].

Несмотря на то что мукоидные P. aeruginosa традиционно связывают с более высокой резистентностью к антибиотикам, опубликовано достаточное число научных сообщений, которые описывают большую чувствительность мукоидных P. aeruginosa у пациентов с муковисцидозом по сравнению с немукоидными штаммами [14—16]. Более низкая антибактериальная активность тобрамицина в отношении штаммов P. ae-ruginosa, выделенных у пациентов с муковисцидозом, ранее леченных прерывистыми курсами тобрамици-на (с циклом по 28 дней), не является неожиданной.

5 8 Ü 7 3 6

В

я 5

2 4

6 3

TS 3

Ü 2

5 1

¡¡т о

Немукоияные(й=19): МПК5и=0.75 мг/мл, МПК.,,^2 мг/мл  Мукоияные (й=21): МПК5о=1 мг/мл, МПК9о=4 мг/мл

II II 1 II 1 III II II 1

<0.064 0.19 0.25 0.38

0.5 0.75 1 1.5

МПК, мг/мл

2

6 >1024

Без предшествующего лечения с применением Т (и=21): МПК50=0.75 мг/мл, МПК90=1.5 мг/мл После лечения с применением Т (я=19): MnKj0=1.5 мг/мл, Mм^=6 мг/мл

H 7

g 6

а 5

¡5 4

0 3

1 2

Е 1

s

В 0

ira

I

Ф £ 4

МШ, мг/мл

Ö 9

8

6-10 лет (я=9): МПК50=0.75 мг/мл, МПК90=1 мг/мл

11-15 лет (я=17): МП^^ мг/мл, Mn^0>1024 мг/мл

16-20 лет (я=7): МП^^ мг/мл, МПК90=2 мг/мл

Старше20 лет (я=7): МПК50=0.75 мг/мл, МПК^! мг/мл

1II II Uli 1 II

У J1

МПК, мг/мл

Я 2

Такие же результаты получили J. Burns и соавт. [17]. В настоящем исследовании установлена трансформация немукоидных штаммов в мукоидные у 7 пациентов, леченных в течение 1—2 лет тобрамицином в ингаляциях. Недавно доказано, что субингибирующие концентрации амминогликозидов индуцируют образование биофильма у P. aeruginosa [18]; идентифицирован ген ARR (aminoglycoside response regulator), кодирующий биофильм-специфическую аминогли-козидную резистентность. В отличие от низких МПК у наших пациентов старше 20 лет, 35,8% исследованных штаммов P. aeruginosa, выделенных у взрослых пациентов в Университетской больнице во Фрайбурге, оказались нечувствительными к тобрамицину (МПК>4 мг/мл) по критериям CLSI [16]. Основная причина необычно высокой чувствительности к антибиотику среди изолатов P. aeruginosa этой возрастной группы — антибактериальная политика в Болгарии (до 2008 г. больные с муковисцидозом старше 18 лет не получали тобрамицин).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тобрамицин показал in vitro высокую активность в отношении респираторных штаммов P. Aeruginosa, выделенных у пациентов с муковисцидозом. Антибактериальная активность тобрамицина зависела от морфотипа штамма и предшествующего лечения с применением тобрамицина. Не установлено связи между возрастом пациентов и чувствительностью выделенных штаммов P. aeruginosa к антибиотику. При определении показаний к применению тобрамицина у больных с муковисцидозом «среднечувствитель-ные или резистентные к тобрамицину по критериям CLSI» штаммы P. aeruginosa следует переоценить, исходя из критериев, предложенных MENSURA Groupe. Стандарты CLSI для определения антибактериальной чувствительности применимы только для внутривенно вводимого тобрамицина, применяемого при лечении нетяжелых инфекционных обострений у пациентов с муковисцидозом.

ЛИТЕРАТУРА

1. Стратева Т. Pseudomonas aeruginosa — феномен на бак-териална резистентност. Съвременна медицина 2007; 2: 25-40.

2. Ratjen F., Döring G. Cystic fibrosis (seminar). Lancet 2003; 361: 681-689.

3. Henry R.L., Mellis C.M, Petrovic L. Mucoid Pseudomonas aeruginosa is a marker of poor survival in cystic fibrosis. Pediat Pulmonol 1992; 12: 158-161.

4. Ramsey B.W., Pepe M.S., Quan J.M. et al. Intermittent administration of inhaled tobramycin in patients with cystic fibrosis. N Engl J Med 1999; 340: 23-30.

5. Canton R, Cobos N, de Gracia J. et al. Antimicrobial therapy for pulmonary pathogenic colonization and infection by Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis patients. Clin Microbiol Infect 2005; 11: 9: 690-703.

6. CLSI (2007). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 17th informational supplement. CLSI M100-S17. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne P. A. www.microbiolab-bg.com>CLSI.pdf

7. Morosini M.I, Garcia-Castillo M, Loza E. et al. Breakpoints for predicting Pseudomonas aeruginosa susceptibility to inhaled tobramycin in cystic fibrosis patients: use of high-range Etest strips. J Clin Microbiol 2005; 43: 9: 4480-4485.

8. Cystic Fibrosis Foundation. 1994. Microbiology and infectious disease in cystic fibrosis. Consensus Conference: Concepts in Care. Vol. 5, section 1. Bethesda, MD: Cystic Fibrosis Foundation. www.cysticfibrosis.org.uk/

9. Geller D.E., Pitlick W.H., Nardella P.A. et al. Pharmacokine-tics and bioavailability of aerosolized tobramycin in cystic fi-brosis. Chest 2002; 122: 219-226.

10. Pitt T.L., Sparrow M, Stefanidou M. Survey of resistance of Pseudomonas aeruginosa from UK patients with cystic fibrosis to six commonly prescribed antimicrobial agents.

Thorax 2003; 58: 9: 794-796.

11. Govan J.R., Deretic V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol Rev 1996; 60: 3: 539-574.

12. Mah T.F., Pitts B, Pellock B. et al. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antimicrobial resistance. Nature 2003; 426: 6964: 306-310.

13. Zhang L, Mah T.F. Involvement of a novel efflux system in biofilm-specific resistance to antibiotics. J Bacteriol 2008; 190: 13: 4447-4452.

14. Ciofu O., Fussing V, Bagge N. et al. Characterization of pared mucoid/non-mucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from Danish cystic fibrosis patients: antibiotic resistance, ß-lactamase activity and ribotyping. J Antimicrob Chemother 2001; 48: 3: 391-396.

15. Shawar R.M., MacLeod D.L., Garber R.L. et al. Activities of tobramycin and six other antibiotics against Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43: 12: 2877-2880.

16. Schülin T. In vitro activity of the aerosolized agents colistin and tobramycin and five intravenous agents against Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in southwestern Germany. J Antimicrob Chemother 2002; 49: 2: 403-406.

17. Burns J.L., Van Dalfsen J.M., Shawar R..M. et al. Effect of chronic intermittent administration of inhaled tobramycin on respiratory microbial flora in patients with cystic fibrosis. J Infect Dis 1999; 179: 5: 1190-1196.

18. Hoffman L.R., D'Argenio D.A., MacCoss M.J. et al. Aminogly-coside antibiotics induce bacterial biofilm formation. Nature 2005; 436: 7054: 1171-1175.

Поступила 06.04.14