КОМБИНАЦИЯ
COMBINATION

Перечень последовательностей
Настоящую заявку подают вместе с перечнем последовательностей в электронной форме. Перечень последовательностей представлен в виде файла под названием 200252_ST25PCT.txt, созданного 19 октября 2015 г., размер которого составляет 65 кБ. Информация из перечня последовательностей в электронной форме включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Область техники
В определенных вариантах осуществления в данном документе представлены способы, соединения и композиции для лечения рака, например, В-клеточной лимфомы, у животного путем введения средства, способного ингибировать экспрессию мРНК или белка STAT3, и иммуномодулирующего средства. В конкретных вариантах осуществления средство, способное ингибировать экспрессию мРНК или белка STAT3, селективно ингибирует экспрессию мРНК или белка STAT3. В конкретных вариантах осуществления комбинированная терапия включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, и средства (такого как антитело), способного ингибировать связывание лиганда PD-L1 с его рецептором. Такие способы, соединения и композиции пригодны для лечения, предупреждения или облегчения В-клеточной лимфомы и других форм рака, которые восприимчивы к ответу при использовании ингибитора иммунных контрольных точек.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Роль иммунной системы, в частности, опосредованной T-клетками цитотоксичности, в контроле опухолей хорошо известна. Растет количество доказательств того, что Т-клетки контролируют рост опухоли и выживаемость у пациентов с раком как на ранних, так и на поздних стадиях заболевания. Однако опухолеспецифические T-клеточные ответы у пациентов с раком трудно сформировать и сохранить.
В T-клеточных сигнальных путях, привлекающих в настоящее время существенное внимание, сигнал передается через антиген 4 цитотоксических T-лимфоцитов (CTLA-4, CD152), лиганд белка программируемой смерти 1 (PD-L1, также известный как B7-H1 или CD274) и OX40 (CD134; TNFRSF4).
CTLA-4 экспрессируется на активированных Т-клетках и служит в качестве коингибитора для удерживания Т-клеточных ответов под контролем после CD28-опосредованной активации Т-клеток. Полагают, что CTLA-4 регулирует амплитуду ранней активации наивных Т-клеток и Т-клеток памяти после вовлечения TCR и является частью центрального ингибиторного пути, который влияет как на противоопухолевый иммунитет, так и на аутоиммунитет. CTLA-4 экспрессируется исключительно на Т-клетках, и экспрессия его лигандов CD80 (B7.1) и CD86 (B7.2) в значительной степени ограничивается антигенпрезентирующими клетками, Т-клетками и другими клетками, опосредующими иммунитет. CTLA-4 принадлежит к классу молекул, известных как белки иммунных контрольных точек. Сообщалось о том, что антагонистические антитела к CTLA-4, которые блокируют сигнальный путь CTLA-4, усиливают активацию Т-клеток. Одно такое антитело, ипилимумаб, было одобрено FDA в 2011 году для лечения метастатической меланомы. Другое антитело к CTLA-4, тремелимумаб, тестировали в испытаниях в фазе III для лечения меланомы на поздней стадии, но в то же время оно существенно не увеличивает общую выживаемость пациентов по сравнению со стандартом лечения (темозоломидом или дакарбазином).
PD-L1 и PD1 принадлежат к классу молекул, известных как белки иммунных контрольных точек. Данные белки представляют собой пары лиганда, связанного с поверхностью клетки, и рецептора, которые у здоровых индивидуумов ослабляют иммунные ответы для предупреждения чрезмерной реакции иммунной системы. Раковые клетки часто перехватывают нормальный механизм действия иммунных контрольных точек PD-L1-PD1 путем сверхэкспрессии лиганда PD-L1, который связывается с PD1 на эффекторных CD8+ T-клетках, предупреждая, таким образом, формирование T-клетками иммунного ответа в отношении опухоли. PD-L1 экспрессируется в широком диапазоне раковых опухолей с высокой частотой. Сверхэкспрессия PD-L1 в опухолях коррелирует с неблагоприятным прогнозом при ряде форм рака (см., например, Hamid and Carvajal. Expert Opin. Biol. Ther. 13(6):847-861, 2013).
in vitro
Антитела, которые блокируют взаимодействие между PD-L1 и его рецептором, способны к ослаблению PD-L1-зависимых эффектов подавления иммунитета и к усилению цитотоксической активности противоопухолевых T-клеток . MEDI4736 (также известный как дурвалумаб) является человеческим моноклональным антителом, направленным против человеческого PD-L1, которое способно блокировать связывание PD-L1 с рецепторами как PD-1, так и CD80.
96
Испытывали терапевтические блокирующие антитела к PD-L1 и PD1, и они продемонстрировали клинически благоприятный эффект в отношении ряда типов опухолей, включая рак легкого, меланому, почечно-клеточную карциному, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак головы и шеи и т.д.; но при этом только меньшая часть пациентов отвечает на данные терапевтические средства (например, см., Brahmer et al., New Engl. J. Med. 366(26):2455-2465, 2012; Harvey. Clinical Pharmacology & Therapeutics (2): 214-223, 2014). Данное отсутствие ответа объяснялось другими механизмами подавления иммунитета, которые преобладают над эффектами в отношении PD1/PD-L1, и рассматриваются комбинированные подходы, которые включают подавление иммунитета (Dolan et al., Cancer Control 21(3)231-237).
OX40 представляет собой рецептор фактора некроза опухоли (TNFR), находящийся главным образом на активированных CD4+ и CD8+ T-клетках, регуляторных Т-клетках (Treg) и естественных клетках-киллерах (NK). Передача сигнала с помощью OX40 на активированных CD4+ и CD8+ Т-клетках приводит к повышенной выработке цитокинов, высвобождению гранзимов и перфоринов и к увеличению пулов эффекторных Т-клеток и Т-клеток памяти. Кроме того, передача сигнала от OX40 в Treg-клетках ингибирует размножение Treg, останавливает индукцию Treg и блокирует супрессорную функцию Treg.
Несмотря на потенциал иммуномодуляторов или ингибиторов иммунных контрольных точек к лечению форм рака, в данной области техники существует потребность в улучшении ответов на данные средства для лечения форм рака.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Как описано ниже, в настоящем изобретении предложены способы лечения рака (например, лимфомы) с помощью иммуномодулятора, такого как ингибитор иммунных контрольных точек, и антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, у субъекта, нуждающегося в этом. Конкретные иммуномодуляторы включают антитело к PD-L1 (или его антигенсвязывающий фрагмент), антитело к PD1 (или его антигенсвязывающий фрагмент), антитело к CTLA-4 (или его антигенсвязывающий фрагмент) и агонист OX40 ((например, белок слияния на основе лиганда OX40 или агонистическое антитело к OX40 или его антигенсвязывающий фрагмент). Субъектом может быть любое млекопитающее. В одном варианте осуществления субъектом является человек. Также представлены комбинированные продукты и наборы, каждый из которых содержит иммуномодулятор и антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, для применения в лечении одного или нескольких типов рака. В конкретных вариантах осуществления антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, является однонитевым антисмысловым олигонуклеотидом (ASO).
Антитела, которые селективно связываются с CTLA-4, PD-L1 или PD-1 или ингибируют связывание с CTLA-4, PD-L1 или PD-1 или их активацию, являются пригодными в способах по настоящему изобретению. Антитела, которые селективно связываются с OX40 и активируют его, являются пригодными в способах по настоящему изобретению.
Антитела к PD-L1 известны из уровня техники. Иллюстративные антитела к PD-L1 включают MEDI4736 (дурвалумаб), MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714 и MDX-1105.
Антитела к PD-1 известны из уровня техники. Иллюстративные антитела к PD-1 включают ниволумаб, пембролизумаб, пидилизумаб и MPDL3280A.
Антитела к CTLA-4 известны из уровня техники. Иллюстративные антитела к CTLA-4 включают тремелимумаб и ипилимумаб, также называемый MDX-010 (или BMS-734016).
Агонисты OX-40 известны из уровня техники. Иллюстративные агонисты OX-40 включают OX40L FP. AZD9150 является антисмысловым олигонуклеотидом и примером антисмыслового соединения,
нацеленного на STAT3.
В одном из вариантов осуществления комбинация включает антисмысловой олигонуклеотид AZD9150 и по меньшей мере один иммуномодулятор, выбранный из группы, состоящей из MEDI4736, MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714, MDX-1105, ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, MPDL3280A, тремелимумаба, ипилимумаба и OX40L FP.
В одном из вариантов осуществления комбинация включает антитело к PD-L1 MEDI4736 и антисмысловой олигонуклеотид AZD9150.
В одном из вариантов осуществления комбинация включает антисмысловой олигонуклеотид AZD9150, антитело к PD-L1 MEDI4736 (дурвалумаб) и антитело к CTLA-4 тремелимумаб.
PD-L1 вовлечен в содействие ускользанию различных раковых опухолей от иммунологического надзора со стороны организма. В связи с этим предполагается, что настоящее изобретение будет оказывать благоприятный эффект при лечении любых форм рака.
Примеры типов рака, для которых предлагается комбинированное лечение, включают рак легкого, в том числе немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак молочной железы, в том числе трижды негативный, рак яичника, в том числе серозный, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, гепатоцеллюлярную карциному (HCC), рак головы и шеи, в том числе плоскоклеточную карциному головы и шеи (HNSCC), и лимфому, в том числе диффузную крупноклеточную В-клеточную карциному (DLBCL).
Определения
th
Если не определено иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют значение, обычно понятное специалисту в данной области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Следующие литературные источники предлагают специалисту общее определение многих терминов, применяемых в настоящем изобретении: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5 Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991), и Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Стандартные методики могут применяться для химического синтеза и химического анализа. В разрешенных случаях все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации, номера доступа в GENBANK и соответствующая информация о последовательностях, получаемая с помощью баз данных, таких как Национальный центр биотехнологической информации (NCBI), и другие данные, упомянутые во всем настоящем раскрытии в данном документе, включены посредством ссылки на часть документа, обсуждаемого в данном документе, а также во всей своей полноте.
Если не указано иное, следующие термины имеют следующие значения.
ʺ2'-Дезоксинуклеозидʺ означает нуклеозид, содержащий 2'-H-фуранозильный сахарный компонент, обнаруживаемый встречающимся в природе в дезоксирибонуклеозидах (ДНК). В определенных вариантах осуществления 2'-дезоксинуклеозид может содержать модифицированное нуклеиновое основание или может содержать нуклеиновое основание РНК (например, урацил).
ʺ2'-Замещенный нуклеозидʺ означает нуклеозид, содержащий заместитель в 2'-положении, отличный от H или OH. Если не указано иное, 2'-замещенный нуклеозид не является бициклическим нуклеозидом.
ʺ5'-Метилцитозинʺ означает цитозин, модифицированный с помощью присоединенной в 5'-положении метильной группы. 5-метилцитозин является модифицированным нуклеиновым основанием.
Применяемый в данном документе термин ʺприблизительноʺ понимают как нахождение в пределах диапазона допустимой погрешности для данной области техники и, как правило, означает в пределах ±10%, как, например, в пределах 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% от указанного значения. Например, если указано, что ʺсоединения осуществляли по меньшей мере приблизительно 70% ингибирование STAT3ʺ, подразумевается, что уровни STAT3 ингибируются в диапазоне от 63% до 77%. Если указано, что соединение применяют в концентрации приблизительно 20 мг/кг, то охватывается диапазон 18-22 мг/кг включительно. Если иное не ясно из контекста, все числовые значения, представленные в данном документе, модифицированы при помощи термина ʺприблизительноʺ.
ʺОдновременное введениеʺ относится к совместному введению двух средств любым образом, при котором фармакологические эффекты их обоих проявляются у пациента в одно и то же время. Одновременное введение не требует, чтобы оба средства вводились в одной и той же фармацевтической композиции, в одной и той же лекарственной форме или посредством одного и того же пути введения. Эффекты обоих средств не обязательно должны проявляться в одно и то же время. Эффекты должны быть перекрывающимися только в течение определенного периода времени и не обязательно должны иметь одинаковую длительность.
ʺСредствоʺ относится к веществу, такому как соединение, антисмысловой олигонуклеотид или антитело (и т.п.), которое способно производить эффект.
ʺЖивотноеʺ относится к человеку или отличному от человека животному, в том числе без ограничения к мышам, крысам, кроликам, собакам, кошкам, свиньям и отличным от человека приматам, в том числе без ограничения к нечеловекообразным обезьянам и шимпанзе.
in vitro
in vivo
т.е.
2
Термин ʺантителоʺ, применяемый в настоящем раскрытии, относится к иммуноглобулину или его фрагменту или производному и охватывает любой полипептид, содержащий антигенсвязывающий участок, независимо от того, получен ли он  или. Данный термин включает без ограничения поликлональные, моноклональные, моноспецифические, полиспецифические, неспецифические, гуманизированные, одноцепочечные, химерные, синтетические, рекомбинантные, гибридные, мутантные и привитые антитела. Для целей настоящего раскрытия термин ʺантителоʺ, если он в других случаях не модифицирован термином ʺинтактноеʺ, как в случае ʺинтактных антителʺ, также включает фрагменты антител, такие как Fab, F(ab'), Fv, scFv, Fd, dAb и другие фрагменты антител, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию,  способность специфично связываться, например, с CTLA-4, PD-L1. Как правило, такие фрагменты будут содержать антигенсвязывающий домен.
Под ʺантителом к CTLA-4ʺ подразумевается антитело, селективно связывающееся с полипептидом CTLA-4. Иллюстративные антитела к CTLA-4 описываются, например, в патентах США №№ 6682736, 7109003, 7123281, 7411057, 7824679, 8143379, 7807797 и 8491895 (там тремелимумаб обозначается 11.2.1), которые включены в данный документ посредством ссылки. Тремелимумаб (патент США № 6682736) является иллюстративным антителом к CTLA-4.
Последовательности тремелимумаба:
VL - SEQ ID NO: 13.
VH - SEQ ID NO: 14.
VH CDR1 - SEQ ID NO: 15; VH CDR2 - SEQ ID NO: 16; VH CDR3 - SEQ ID NO: 17.
VL CDR1 - SEQ ID NO: 18; VL CDR2 - SEQ ID NO: 19; VL CDR3 - SEQ ID NO: 20.
Под ʺантителом к PD-L1ʺ подразумевается антитело, селективно связывающееся с полипептидом PD-L1. Иллюстративные антитела к PD-L1 описаны, например, в WO 2011/066389, US20130034559/US8779108 и US20140356353, которые включены в данный документ посредством ссылки. MEDI4736 является иллюстративным антителом к PD-L1. Последовательности представлены в нижеследующем перечне последовательностей (например, SEQ ID NO: 3-10). Другие антитела к PD-L1 включают BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) и MPDL3280A (Roche).
L
H
H
Термины ʺантигенсвязывающий доменʺ, ʺантигенсвязывающий фрагментʺ и ʺсвязывающий фрагментʺ относятся к части молекулы антитела, которая содержит аминокислоты, отвечающие за специфичное связывание между антителом и антигеном. В тех случаях, когда антиген является крупным, антигенсвязывающий домен может связываться только с частью антигена. Часть молекулы антигена, которая отвечает за специфические взаимодействия с антигенсвязывающим доменом, называется ʺэпитопомʺ или ʺантигенной детерминантойʺ. Антигенсвязывающий домен, как правило, содержит вариабельную область легкой цепи антитела (V) и вариабельную область тяжелой цепи антитела (V), но он, однако, не обязательно должен содержать их обе. Например, так называемый Fd-фрагмент антитела состоит только из V-домена, однако по-прежнему сохраняет некоторую антигенсвязывающую функцию интактного антитела.
Связывающие фрагменты антитела получают с помощью методик рекомбинантной ДНК или с помощью ферментативного или химического расщепления интактных антител. Связывающие фрагменты включают Fab, Fab', F(ab')2, Fv и одноцепочечные антитела. Подразумевается, что у антитела, отличного от "биспецифического" или "бифункционального" антитела, все его связывающие участки являются идентичными. Расщепление антител ферментом папаином приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, известных также как "Fab"-фрагменты, и "Fc"-фрагмента, не обладающего антигенсвязывающей активностью, но обладающего способностью к кристаллизации. Расщепление антител ферментом пепсином приводит к образованию F(ab')2-фрагмента, в котором два плеча молекулы антитела остаются соединенными и содержат два антигенсвязывающих участка. F(ab')2-фрагмент обладает способностью к перекрестному связыванию с антигеном. При использовании в данном документе "Fv" относится к минимальному фрагменту антитела, в котором сохраняются как антигенраспознающий, так и антигенсвязывающий участки. При использовании в данном документе "Fab" относится к фрагменту антитела, который содержит константный домен легкой цепи и домен CHI тяжелой цепи.
Термин ʺmAbʺ относится к моноклональному антителу. Антитела по настоящему изобретению включают без ограничений полные нативные антитела, биспецифические антитела; химерные антитела; Fab, Fab', одноцепочечные фрагменты V-области (scFv), полипептиды слияния и неклассические антитела.
ʺАнтисмысловое соединениеʺ означает олигомерное соединение, которое способно подвергаться гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью посредством образования водородных связей. Примеры антисмысловых соединений включают однонитевые и двунитевые соединения, такие как антисмысловые олигонуклеотиды, siRNA, shRNA, snoRNA, miRNA, меродуплекс (mdRNA) и сателлитные повторы.
ʺАнтисмысловое соединение, нацеленное на STAT3ʺ, означает олигомерное соединение, которое способно подвергаться гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью STAT3 посредством образования водородных связей.
ʺАнтисмысловой олигонуклеотидʺ означает однонитевой олигонуклеотид, имеющий последовательность нуклеиновых оснований, которая позволяет проводить гибридизацию с соответствующей областью или сегментом нуклеиновой кислоты-мишени.
ʺПротивоопухолевая активностьʺ означает любую биологическую активность, которая обуславливает уменьшение или стабилизацию пролиферации или выживания опухолевой клетки. В одном из вариантов осуществления противоопухолевая активность является противоопухолевым иммунным ответом.
ʺБициклический сахарʺ означает фурозильное кольцо, модифицированное путем формирования мостика между двумя атомами. Бициклический сахар является модифицированным сахаром.
Под ʺракомʺ подразумевается заболевание или нарушение, характеризующееся избыточной пролиферацией или сниженным апоптозом. Иллюстративные формы рака, для которых можно применять настоящее изобретение, включают без ограничения формы лейкоза (например, острый лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, острый миелобластный лейкоз, острый промиелоцитарный лейкоз, острый миеломоноцитарный лейкоз, острый моноцитарный лейкоз, острый эритролейкоз, хронический лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз), истинную полицитемию, лимфому (болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, DLBCL), макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей и солидные опухоли, такие как саркомы и карциномы (например, фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, карцинома толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, плоскоклеточная карцинома, базальноклеточная карцинома, аденокарцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальных желез, папиллярная карцинома, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарцинома, медуллярная карцинома, бронхогенная карцинома, почечно-клеточная карцинома, гепатома, карцинома желчных протоков, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильмса, рак шейки матки, рак матки, рак яичка, карцинома легкого, мелкоклеточная карцинома легкого, карцинома мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, мультиформная глиобластома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, невринома слухового нерва, олигодендроглиома, шваннома, менингиома, меланома, нейробластома и ретинобластома).
ʺХимерное антисмысловое соединениеʺ означает антисмысловое соединение, которое имеет по меньшей мере две химически отличных области.
ʺСовместное введениеʺ означает введение индивидууму двух или более фармацевтических средств. Два или более фармацевтических средства могут находиться в одной фармацевтической композиции или находиться в отдельных фармацевтических композициях. Каждое из двух или нескольких фармацевтических средств можно вводить посредством одного и того же или различных путей введения. Совместное введение охватывает параллельное или последовательное введение. В одном из вариантов осуществления совместное введение осуществляют на основании фармакокинетических свойств лекарственных средств таким образом, чтобы пациент в результате был подвергнут воздействию обоих лекарственных средств в одно и то же время.
3
ʺЗатрудненный этилом нуклеозидʺ (также cEt-нуклеозид) означает нуклеозид, содержащий бициклический сахарный компонент, содержащий мостик 4'-CH(CH)-O-2'.
ʺСмежные нуклеиновые основанияʺ означают нуклеиновые основания, непосредственно прилегающие друг к другу.
Под ʺзаболеваниемʺ подразумевается любое состояние или расстройство, при котором происходит нарушение, препятствование или дисрегуляция нормальной функции клетки, ткани или органа. При заболевании, таком как рак (например, рак легкого), нормальная функция клетки, ткани или органа дестабилизируется, что обеспечивает возможность ускользания от иммунологического надзора и/или избегания его.
Под ʺполипептидом CTLA-4ʺ подразумевается полипептид, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к последовательности с № доступа в GenBank AAL07473.1 или ее фрагменту и обладающий ингибиторной активностью в Т-клетках. Последовательность AAL07473.1 раскрыта под SEQ ID NO: 21 в данном документе.
Под термином ʺмолекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CTLA-4ʺ подразумевается полинуклеотид, кодирующий полипептид CTLA-4. Иллюстративный полипептид CTLA-4 представлен под № доступа в GenBank AAL07473.
ʺРазбавительʺ означает ингредиент в композиции, который не обладает фармакологической активностью, но является фармацевтически необходимым или желательным. Например, разбавитель в композиции для инъекции может быть жидкостью, например, физиологическим раствором.
ʺДозаʺ означает определенное количество фармацевтического средства, даваемое за одно введение или в определенный период времени. В определенных вариантах осуществления доза может быть введена в одной, двух или нескольких пилюлях, таблетках или инъекционных формах. Например, в определенных вариантах осуществления, где желательно подкожное введение, для желаемой дозы требуется объем, который трудно приспособить к одной инъекции, поэтому для достижения желаемой дозы можно применять две или более инъекций. В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство вводят с помощью инфузии в течение длительного периода времени или непрерывно. Дозы могут быть указаны как количество фармацевтического средства в час, день, неделю или месяц.
ʺЭффективное количествоʺ означает количество активного фармацевтического средства, достаточное для достижения желаемого физиологического последствия у индивидуума, нуждающегося в средстве. Эффективное количество может варьироваться среди индивидуумов в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, подлежащего лечению, таксономической группы индивидуумов, подлежащих лечению, состава композиции, оценки медицинского состояния индивидуума, а также других значимых факторов.
ʺГэпмерʺ означает химерное антисмысловое соединение, в котором внутренняя область, имеющая множество нуклеозидов, способствующих расщеплению РНКазой H, расположена между внешними областями, имеющими один или несколько нуклеозидов, где нуклеозиды, образующие внутреннюю область, химически отличаются от нуклеозида или нуклеозидов, образующих внешние области. Внутренняя область может называться ʺгэпомʺ, а внешние области могут называться ʺфлангамиʺ.
ʺГибридизацияʺ означает отжиг комплементарных молекул нуклеиновых кислот. В определенных вариантах осуществления комплементарные молекулы нуклеиновых кислот включают в себя антисмысловое соединение и нуклеиновую кислоту-мишень.
ʺИнгибитор иммунных контрольных точекʺ означает средство, которое ингибирует пути CTLA-4 или PD-1, и конкретные ингибиторы контрольных точек включают в себя антитела, которые ингибируют PD-1, PD-L1 или CTLA-4.
ʺИммуномодулирующее средствоʺ означает средство, которое усиливает иммунный ответ (например, противоопухолевый иммунный ответ). Иллюстративные иммуномодулирующие средства по настоящему изобретению включают антитела, такие как антитело к CTLA-4, антитело к PD-L1, антитело к PD-1 и антигенные фрагменты любого из них, а также агонисты OX-40, в том числе белки, такие как белок слияния на основе лиганда OX40, или их фрагменты. В одном из вариантов осуществления иммуномодулирующее средство является ингибитором иммунных контрольных точек.
ʺИнгибирование STAT3ʺ означает уменьшение экспрессии мРНК и/или уровней белка STAT3 в присутствии антисмыслового соединения, воздействующего на STAT3, в том числе антисмыслового олигонуклеотида, воздействующего на STAT3, по сравнению с экспрессией мРНК и/или уровнями белка STAT3 в отсутствие антисмыслового соединения, воздействующего на STAT3, такого как антисмысловой олигонуклеотид.
ʺИндивидуумʺ означает человека или отличного от человека животного, выбранного для лечения или терапии.
ʺМежнуклеозидная связьʺ относится к химической связи между нуклеозидами.
ʺСоединенные нуклеозидыʺ означают прилегающие нуклеозиды, которые связаны друг с другом.
ʺМодифицированная межнуклеозидная связьʺ относится к замене или любому изменению по сравнению с встречающейся в природе межнуклеозидной связью (т.е. фосфодиэфирной межнуклеозидной связью).
ʺМодифицированное нуклеиновое основаниеʺ относится к любому нуклеиновому основанию, отличному от аденина, цитозина, гуанина, тимидина или урацила. ʺНемодифицированное нуклеиновое основаниеʺ означает пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).
ʺМодифицированный нуклеотидʺ означает нуклеотид, независимо имеющий модифицированный сахарный компонент, модифицированную межнуклеозидную связь или модифицированное нуклеиновое основание. ʺМодифицированный нуклеозидʺ означает нуклеозид, независимо имеющий модифицированный сахарный компонент или модифицированное нуклеиновое основание.
ʺМодифицированный олигонуклеотидʺ означает олигонуклеотид, содержащий модифицированную межнуклеозидную связь, модифицированный сахар и/или модифицированное нуклеиновое основание.
ʺМодифицированный сахарʺ относится к замене или изменению по сравнению с природным сахаром.
ʺВстречающаяся в природе межнуклеозидная связьʺ означает 3'-5'-фосфодиэфирную связь.
ʺНуклеиновая кислотаʺ относится к молекулам, состоящим из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты включают в себя рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), однонитевые нуклеиновые кислоты, двунитевые нуклеиновые кислоты, малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (siРНК) и микроРНК (miRNA).
ʺНуклеиновое основаниеʺ означает гетероциклический компонент, способный к спариванию с основанием другой нуклеиновой кислоты.
ʺПоследовательность нуклеиновых основанийʺ означает порядок расположения смежных нуклеиновых оснований независимо от какой-либо модификации сахара, связи или нуклеинового основания.
ʺНуклеозидʺ означает нуклеиновое основание, соединенное с сахаром.
ʺНуклеотидʺ означает нуклеозид, имеющий фосфатную группу, соединенную ковалентной связью с сахарной частью нуклеозида.
ʺОлигомерное соединениеʺ или ʺолигомерʺ означает полимер из соединенных между собой мономерных субъединиц, который способен к гибридизации по меньшей мере с областью молекулы нуклеиновой кислоты.
ʺОлигонуклеотидʺ означает полимер из соединенных между собой нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным независимо друг от друга.
ʺОбщая выживаемостьʺ означает промежуток времени от начала лечения заболевания, такого как рак, в течение которого пациенты, у которых диагностировано заболевание, остаются в живых. Картину общей выживаемости, как правило, определяют как средние показатели в клиническом испытании с соответствующим размером выборки.
ʺПолипептид OX40ʺ означает полипептид или его фрагмент, характеризующийся по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью аминокислот по отношению к последовательности с № доступа в NCBI NP_003318. ʺOX40ʺ является представителем суперсемейства TNFR-рецепторов, которые экспрессируются на поверхности активированных антигеном CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов млекопитающих. См., например, Paterson et al., Mol Immunol 24, 1281-1290 (1987); Mallett et al., EMBO J 9, 1063-1068 (1990); и Calderhead et al., J Immunol 151, 5261-5271 (1993)). OX40 также упоминается как CD134, ACT-4 и ACT35. Последовательности рецептора OX40 известны из уровня техники и представлены, например, под номерами доступа в GenBank AAB33944 или CAE11757. Иллюстративная аминокислотная последовательность человеческого OX40 раскрыта под SEQ ID NO: 22 в данном документе.
et al
EMBO J
13
ʺЛиганд OX40ʺ означает полипептид или его фрагмент, характеризующийся по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью аминокислот по отношению к последовательности с № доступа в NCBI NP_003317, который специфично связывается с рецептором OX40. См., например, Baum P.R. . . :3992-4001(1994)). Термин ʺOX40Lʺ включает целый лиганд OX40, растворимый лиганд OX40 и белки слияния, содержащие функционально активную часть лиганда OX40, соединенную ковалентной связью со вторым компонентом, например, белковым доменом. В определение OX40L также включены варианты, которые отличаются по аминокислотной последовательности от встречающегося в природе OX40L, но сохраняют способность к специфичному связыванию с рецептором OX40. В определение OX40L дополнительно включены варианты, которые усиливают биологическую активность OX40. Последовательности лиганда OX40 известны из уровня техники и представлены, например, под номером доступа в GenBank NP_003318.
Иллюстративная аминокислотная последовательность лиганда человеческого OX40 раскрыта под SEQ ID NO: 23 в данном документе.
ʺАгонист OX40ʺ означает лиганд OX40, который специфично взаимодействует с рецептором OX40 и увеличивает его биологическую активность. Желательно, чтобы биологическая активность увеличивалась по меньшей мере на приблизительно 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже 100%. В определенных аспектах агонисты OX40, раскрываемые в данном документе, включают OX40-связывающие полипептиды, такие как антитела к OX40 (например, агонистические антитела к OX40), лиганды OX40 или фрагменты или производные этих молекул.
ʺАнтитело к OX40ʺ означает антитело, которое специфично связывается с OX40. Антитела к OX40 включают моноклональные и поликлональные антитела, которые являются специфичными к OX40, и их антигенсвязывающие фрагменты. В определенных аспектах антитела к OX40, описываемые в данном документе, представляют собой моноклональные антитела (или их антигенсвязывающие фрагменты), например, мышиные, гуманизированные или полностью человеческие моноклональные антитела. В одном конкретном варианте осуществления антитело к OX40 представляет собой агонист рецептора OX40, такой как мышиное моноклональное антитело к человеческому OX40 (9B12), описанное в Weinberg et al. J Immunother 29, 575-585 (2006). В других вариантах осуществления антитело, которое специфично связывается с OX40, или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с тем же эпитопом OX40, что и mAb 9B12.
ʺБелок слияния на основе лиганда OX40ʺ означает белок, который специфично связывается с рецептором OX40 и увеличивает иммунный ответ. В одном из вариантов осуществления связывание белка слияния на основе лиганда OX40 с рецептором OX40 усиливает специфический иммунный ответ на опухолевые антигены благодаря интенсификации распознавания T-клетками. Иллюстративные белки слияния на основе лиганда OX40 описаны в патенте США 7959925 под названием ʺTrimeric OX40 Immunoglobulin Fusion Protein and Methods of Useʺ. См., например, патент США 7959925, SEQ ID NO: 8. Данная последовательность воспроизведена в данном документе как SEQ ID NO: 24. Другие белки слияния на основе лиганда OX40 описаны, например, в патенте США 6312700. В одном из вариантов осуществления белок слияния на основе лиганда OX40 повышает опухолеспецифический Т-клеточный иммунитет. В конкретных вариантах осуществления белок слияния на основе лиганда OX40 имеет аминокислотную последовательность, раскрытую под SEQ ID NO: 32, 34 или 36 (такие варианты названы в данном документе как OX40L FP).
ʺПарентеральное введениеʺ означает введение путем инъекции (например, болюсной инъекции) или инфузии. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например, интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение.
ʺПолипептид PD-L1ʺ означает полипептид или его фрагмент, характеризующийся по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью аминокислот по отношению к последовательности с № доступа в NCBI NP_001254635 и обладающий активностью связывания с PD-1 и CD80.
ʺМолекула нуклеиновой кислоты, кодирующая PD-L1ʺ, означает полинуклеотид, кодирующий полипептид PD-L1. Иллюстративная последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей PD-L1, представлена под № доступа в NCBI NM_001267706.
ʺPD-L1-положительныеʺ применительно к иммуногистохимическому анализу означает клетки в образце раковой опухоли, демонстрирующие окрашивание на PD-L1. Уровень положительности, который является биологически значимым, может варьировать в зависимости от типа опухоли и иммунного статуса окружения опухоли.
ʺПептидʺ означает молекулу, образованную путем соединения по меньшей мере двух аминокислот посредством амидных связей. Пептиды относятся к полипептидам и белкам.
ʺФармацевтическая композицияʺ означает смесь веществ, подходящих для введения индивидууму. Например, фармацевтическая композиция может содержать одно или несколько активных фармацевтических средств и стерильный водный раствор. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция демонстрирует активность в анализе свободного поглощения в определенных линиях клеток.
ʺФосфотиоатная связьʺ означает связь между нуклеозидами, где фосфодиэфирная связь модифицирована путем замещения одного из немостиковых атомов кислорода атомом серы. Фосфотиоатная связь (P=S) является модифицированной межнуклеозидной связью.
ʺЧастьʺ означает определенное количество смежных (т.е. соединенных) нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах осуществления часть является определенным количеством смежных нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты-мишени. В определенных вариантах осуществления часть является определенным количеством смежных нуклеиновых оснований антисмыслового соединения.
ʺПредупреждениеʺ относится к задержке или предотвращению начала проявления или развития заболевания, нарушения или состояния в течение периода времени от нескольких минут до неопределенного срока. Предупреждение также означает снижение риска развития заболевания, нарушения или состояния.
ʺВыживаемость без прогрессированияʺ означает промежуток времени во время и после лечения заболевания, такого как рак, в течение которого пациент живет с заболеванием, но его состояние не ухудшается. Картину выживаемости без прогрессирования, как правило, определяют как средние показатели в клиническом испытании с соответствующим размером выборки.
Диапазоны, представленные в данном документе, понимают как сокращенную запись всех значений в пределах диапазона. Например, диапазон от 1 до 50 понимают как включающий любое число, комбинацию чисел или поддиапазон из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50.
Под ʺэталономʺ подразумевают стандарт для сравнения.
Под ʺчувствительнымʺ применительно к терапии подразумевают восприимчивость к лечению.
ʺНуклеиновая кислота, кодирующая переносчик сигнала и активатор транскрипции 3ʺ или ʺнуклеиновая кислота STAT3ʺ означает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую STAT3. Например, в определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота STAT3 включает в себя последовательность ДНК, кодирующую STAT3, последовательность РНК, транскрибированную с ДНК, кодирующей STAT3 (в том числе геномной ДНК, содержащей интроны и экзоны), и последовательность мРНК, кодирующую STAT3. ʺмРНК STAT3ʺ означает мРНК, кодирующую белок STAT3.
ʺОднонитевой олигонуклеотидʺ означает олигонуклеотид, который не гибридизируется с комплементарной нитью.
A
6
-1
8
-1
Под ʺспецифично связывающимсяʺ подразумевают соединение (например,антитело), которое распознает молекулу (например,полипептид) и связывается с ней, но которое практически не распознает другие молекулы и не связывается с ними в образце, например, в биологическом образце. Например, две молекулы, которые специфично связываются, образуют комплекс, который является относительно стабильным в физиологических условиях. Специфичное связывание характеризуется высокой аффинностью и емкостью от низкой до умеренной, в отличие от неспецифичного связывания, которое обычно характеризуется низкой аффинностью и емкостью от умеренной до высокой. Как правило, связывание считается специфичным, если константа аффинности Kпревышает 10 M или, более предпочтительно, превышает 10M. При необходимости неспецифичное связывание можно уменьшить без существенного влияния на специфичное связывание путем изменения условий связывания. Соответствующие условия связывания, такие как концентрация антител, ионная сила раствора, температура, допустимое время связывания, концентрация блокирующего средства (например,сывороточного альбумина, казеина молока) и т.д.,могут быть оптимизированы специалистом в данной области с применением обычных методик.
in vivo
ʺПоддающийся специфичной гибридизацииʺ относится к антисмысловому соединению, характеризующемуся достаточной степенью комплементарности (спаривания между нуклеиновыми основаниями) между антисмысловым олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью для индукции желаемого эффекта при проявлении минимальных эффектов в отношении не являющихся мишенями нуклеиновых кислот или их отсутствии в условиях, в которых желательно специфичное связывание, т.е. в физиологических условиях в случае анализов  и терапевтических методов лечения.
Под ʺсубъектомʺ подразумевается млекопитающее, в том числе без ограничения человек или отличное от человека млекопитающее, такое как корова, лошадь, собака, овца или кошка.
ʺНацеливаниеʺ или ʺнацеленныйʺ означает "направленный на". Применительно к антителу это относится к способности связываться с эталонным белком. Применительно к антисмысловому соединению это относится к его способности специфично гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-мишенью и индуцировать желаемый эффект.
Все из ʺнуклеиновой кислоты-мишениʺ, ʺРНК-мишениʺ, ʺмРНК-мишениʺ и ʺРНК-транскрипта-мишениʺ относятся к нуклеиновой кислоте, на которую способны нацеливаться антисмысловые соединения.
ʺСегмент-мишеньʺ означает последовательность нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелено антисмысловое соединение. ʺ5'-концевой сайт-мишеньʺ относится к наиболее близкому к 5'-концу нуклеотиду сегмента-мишени. ʺ3'-концевой сайт-мишеньʺ относится к наиболее близкому к 3'-концу нуклеотиду сегмента-мишени.
ʺТерапевтически эффективное количествоʺ означает количество фармацевтического средства, которое обеспечивает терапевтически благоприятный эффект для индивидуума.
ʺЛечитьʺ, ʺлечениеʺ, ʺкурс леченияʺ и т.п. относится к введению фармацевтической композиции для уменьшения интенсивности или облегчения заболевания, нарушения или состояния и/или любого симптома, ассоциированного с ними. Будет понятно, что при проведении лечения нарушения или состояния не требуется, чтобы нарушение, состояние или ассоциированные с ними симптомы полностью устранялись, хоть это и не исключается.
ʺНемодифицированный нуклеотидʺ означает нуклеотид, состоящий из встречающихся в природе нуклеиновых оснований, сахарных компонентов и межнуклеозидных связей. В определенных вариантах осуществления немодифицированный нуклеотид является нуклеотидом РНК (т.е. β-D-рибонуклеозидом) или нуклеотидом ДНК (т.е. β-D-дезоксирибонуклеозидом).
Если специально не указывается или не очевидно из контекста, применяемый в данном документе термин "или" понимают как включающий. Если специально не указывается или не очевидно из контекста, применяемые в данном документе формы единственного числа понимают как означающие единственное или множественное число.
В настоящем раскрытии термины "содержит", "содержащий", "заключающий", а также "имеющий" и т.п. могут иметь значение, приписываемое им в патентном законодательстве США, и могут означать "включает", "включающий" и т.п.; аналогично, термин "состоящий по сути из" или "состоит по сути" имеет значение, приписываемое ему в патентном законодательстве США, и является открытым, допускающим наличие не только того, что упоминается, при условии, что основные или новые характеристики того, что упоминается, не изменяются благодаря наличию не только того, что упоминается, но исключает варианты осуществления из предшествующего уровня техники.
Применяемые в данном документе термины ʺопределениеʺ, ʺоценкаʺ, ʺанализʺ, ʺизмерениеʺ и ʺвыявлениеʺ относятся как к количественным, так и к качественным определениям, и поэтому термин ʺопределениеʺ применяется в данном документе взаимозаменяемо с ʺанализомʺ, ʺизмерениемʺ и т.п. Если подразумевается количественное определение, используют фразу ʺопределение количестваʺ анализируемого вещества и т.п. Если подразумевается качественное и/или количественное определение, используют фразу ʺопределение уровняʺ анализируемого вещества или ʺвыявлениеʺ анализируемого вещества.
Термины "выделенный", "очищенный" или "биологически чистый" относятся к материалу, который в различной степени свободен от компонентов, которые обычно сопровождают его, что обнаруживается в его нативном состоянии. "Выделение" означает степень отделения от исходного источника или окружения. "Очистка" означает степень отделения, более высокую, чем при выделении. "Очищенный" или "биологически чистый" белок является в достаточной мере свободным от других материалов, таких как какие-либо примеси, существенно не влияющие на биологические свойства белка или не вызывающие другие неблагоприятные последствия. Это означает, что нуклеиновая кислота или пептид по настоящему изобретению являются очищенными, если они практически не содержат клеточный материал, вирусный материал или культуральную среду при получении с помощью технологий рекомбинантной ДНК или химических исходных соединений или других химических веществ при химическом синтезе. Чистоту и однородность обычно определяют с применением процедур аналитической химии, например, электрофореза в полиакриламидном геле или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Термин "очищенный" может означать, что нуклеиновая кислота или белок дают главным образом одну полосу в геле для электрофореза. В случае белка, который можно подвергать модификациям, например, фосфорилированию или гликозилированию, различные модификации могут приводить к образованию различных выделенных белков, которые можно очищать по отдельности.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Как описано ниже, в настоящем изобретении предложены способы лечения рака (например, рака легкого, такого как немелкоклеточный рак легкого (NSCLC); рака молочной железы, в том числе трижды негативного; рака яичника, в том числе серозного; рака поджелудочной железы; колоректального рака; лимфомы, такой как диффузный крупноклеточный В-клеточный рак легкого (DLBCL) или лимфома Ходжкина; или рака головы и шеи, такого как плоскоклеточная карцинома головы и шеи (HNSCC)) с помощью иммуномодулирующего средства, такого как антитело к PD-L1, такое как MEDI4736, и антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, такого как AZD9150, у субъекта, нуждающегося в этом.
Антитела к PD-L1
Антитела, которые специфично связываются с PD-L1 и ингибируют его, являются пригодными в настоящем изобретении.
in vitro
MEDI4736 является иллюстративным антителом к PD-L1, которое является селективным в отношении полипептида PD-L1 и блокирует связывание PD-L1 с рецепторами PD-1 и CD80. MEDI4736 может ослаблять PD-L1-опосредованное подавление активации T-клеток человека и ингибировать рост опухоли в ксенотрансплантатной модели посредством Т-клеточно-зависимого механизма.
Информацию, касающуюся MEDI4736 (или его фрагментов) для применения в способах, представленных в данном документе, можно найти в патенте США № 8779108, раскрытие которого включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Домен MEDI4736, представляющий собой кристаллизующийся фрагмент (Fc), содержит тройную мутацию в константном домене тяжелой цепи IgG1, которая ослабляет связывание с компонентом C1q системы комплемента и Fcγ-рецепторами, отвечающими за опосредование антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC).
MEDI4736 и его антигенсвязывающие фрагменты для применения в представленных в данном документе способах содержат тяжелую цепь и легкую цепь или вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. В конкретном аспекте MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в способах, представленных в данном документе, содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO:3, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO:4. В конкретном аспекте MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в способах, представленных в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит определенные по Kabat последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 с SEQ ID NO: 5-7, и где вариабельная область легкой цепи содержит определенные по Kabat последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 с SEQ ID NO: 8-10. Средние специалисты в данной области легко смогут идентифицировать CDR, определенные по Chothia, определенные по Abm или определенные согласно другим системам, известным средним специалистам в данной области. В конкретном аспекте MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в способах, представленных в данном документе, содержит последовательности CDR вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела 2.14H9OPT, раскрытые в WO 2011/066389 A1, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Существует множество антител к PD-L1, опубликованных в литературе, которые могут быть предложены в настоящем изобретении, в том числе соединения, находящиеся в разработке и/или в клинических испытаниях, такие как: MEDI4736, MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714 и MDX-1105. Описания патентов, раскрывающие антитела к PD-L1, которые могут быть пригодными в настоящем изобретении, включают WO2007/005874 (BMS/Medarex), WO01/14556 (Dana Farber), US2011/0271358 (Dana Farber), WO2010/036959 (Dana Farber), WO2010/077634 (Genentech), в том числе выданный патент США № 8217149, US2012/0039906 (INSERM), WO2012/145493 (Amplimmune), патент США № 8779108 (MedImmune, в отношении MEDI4726 и 2.7A4), US20140044738 (Amplimmune, в отношении AMP-714) и WO2009/089149 (Университет Джонса Хопкинса). Каждое из этих раскрытий включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Антитела к CTLA-4
2
in vitro
Антитела, которые специфично связываются с CTLA-4 и ингибируют активность CTLA-4, являются пригодными для усиления противоопухолевого иммунного ответа. Информацию, касающуюся тремелимумаба (или его антигенсвязывающих фрагментов) для применения в способах, представленных в данном документе, можно найти в US 6682736 (где он упоминается как 11.2.1), раскрытие которого включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Тремелимумаб (также известный как CP-675,206, CP-675, CP-675206 и тицилимумаб) представляет собой человеческое моноклональное антитело IgG, которое является высокоселективным в отношении CTLA-4 и блокирует связывание CTLA-4 с CD80 (B7.1) и CD86 (B7.2). Было показано, что оно приводит к активации иммунитета , и некоторые пациенты, которых лечили тремелимумабом, продемонстрировали регрессию опухоли.
Тремелимумаб для применения в способах, представленных в данном документе, содержит тяжелую цепь и легкую цепь или вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. В конкретном аспекте тремелимумаб или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в способах, представленных в данном документе, содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности, показанные в данном документе выше, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в данном документе выше. В конкретном аспекте тремелимумаб или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в способах, представленных в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит определенные по Kabat последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, показанные в данном документе выше, и где вариабельная область легкой цепи содержит определенные по Kabat последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, показанные в данном документе выше. Средние специалисты в данной области легко смогут идентифицировать CDR, определенные по Chothia, определенные по Abm или определенные согласно другим системам, известным средним специалистам в данной области. В конкретном аспекте тремелимумаб или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в способах, представленных в данном документе, содержит последовательности CDR вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела 11.2.1, раскрытого в US 6682736, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Другие антитела к CTLA-4 описаны, например, в US 20070243184. В одном из вариантов осуществления антителом к CTLA-4 является ипилимумаб, также называемый MDX-010; BMS-734016.
Агонисты OX40
+
+
+
Агонисты ОХ40 взаимодействуют с рецептором OX40 на CD4 Т-клетках во время или вскоре после примирования антигеном, что в результате приводит к увеличению ответа CD4 Т-клеток на антиген. Взаимодействие агониста OX40 с рецептором OX40 на антиген-специфичных CD4 T-клетках может увеличивать пролиферацию T-клеток по сравнению с ответом на антиген в отдельности. Повышенный ответ на антиген может сохранятся в течение определенного периода времени значительно дольше, чем при отсутствии агониста OX40. Таким образом, стимуляция посредством агониста OX40 усиливает антиген-специфический иммунный ответ благодаря интенсификации распознавания T-клетками антигенов, например, опухолевых клеток. Агонисты OX40 описаны, например, в патентах США №№ 6312700, 7504101, 7622444 и 7959925, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Способы применения таких агонистов в лечении рака описаны, например, в WO/2013/119202 и в WO/2013/130102, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
et al. J Immunother
Агонисты OX40 включают без ограничения OX40-связывающие молекулы, например, связывающие полипептиды, например, лиганд OX40 (ʺOX40Lʺ) или его OX40-связывающий фрагмент, вариант или производное, такие как растворимые внеклеточные домены лигандов и белки слияния на основе OX40L, а также антитела к OX40 (например, моноклональные антитела, такие как гуманизированные моноклональные антитела) или их антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное. Примеры моноклональных антител к OX40 описаны, например, в патентах США №№ 5821332 и 6156878, раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В определенных вариантах осуществления моноклональное антитело к OX40 представляет собой 9B12 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, как описано в Weinberg A.D. 29, 575-585 (2006), которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В определенных вариантах осуществления различных аспектов, раскрытых в данном документе, агонист OX40 является гуманизированным антителом к OX40 или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим VH антитела и VL антитела, где VL содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичную эталонной аминокислотной последовательности: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSKLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGSALPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 25) или DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSKLHSGVPSRFSGSGSRTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGSALPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 26).
В одном из вариантов осуществления гуманизированное антитело к OX40 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH антитела и VL антитела, где VL содержит аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSKLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGSALPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 25), а VH содержит аминокислотную последовательность QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVYGGSFSSGYWNWIRKHPGKGLEYIGYISYNGITYHNPSLKSRITINRDTSKNQYSLQLNSVTPEDTAVYYCARYKYDYDGGHAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 27).
В определенных других вариантах осуществления гуманизированное антитело к OX40 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь антитела или ее компонент и легкую цепь антитела или ее компонент, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, раскрытую под SEQ ID NO: 28 в данном документе, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, раскрытую под SEQ ID NO: 29 в данном документе.
В других вариантах осуществления антитело, которое специфично связывается с OX40, или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с тем же эпитопом OX40, что и mAb 9B12.
Иллюстративное гуманизированное антитело к OX40 описано в Morris et al., Mol Immunol. May 2007; 44(12): 3112-3121 и имеет последовательность, раскрытую под SEQ ID NO: 30 в данном документе.
et al. J Immunother
9B12 представляет собой мышиный IgG1, mAb к OX40, направленное против внеклеточного домена человеческого OX40 (CD134) (Weinberg A.D. 29, 575-585 (2006)). Его выбрали из панели моноклональных антител к OX40 ввиду его способности вызывать агонистический ответ для передачи сигнала от OX40, стабильности и ввиду высокого уровня его выработки гибридомой. Дли применения в клинической практике mAb 9B12 уравновешивают фосфатно-солевым буферным раствором, pH 7,0, и его концентрацию доводят до 5,0 мг/мл путем диафильтрации.
Ann Rev Immunol 28
in vivo
"Лиганд OX40" ("OX40L") (также по-разному называемый членом 4 суперсемейства лигандов-факторов некроза опухоли, gp34, гликопротеином-1 с TAX-опосредованной активацией транскрипции и CD252) находится в основном на антигенпрезентирующих клетках (APC), и его экспрессия может индуцироваться на активированных B-клетках, дендритных клетках (DC), клетках Лангерганса, плазмацитоидных DC и макрофагах (Croft, M., (2010) :57-78). Другие клетки, в том числе активированные Т-клетки, NK-клетки, тучные клетки, эндотелиальные клетки и гладкомышечные клетки, могут экспрессировать OX40L в ответ на действие воспалительных цитокинов (Id.). OX40L специфично связывается с рецептором OX40. Человеческий белок описан в патенте США 6156878. Мышиный OX40L описан в патенте США 5457035. OX40L экспрессируется на поверхности клеток и содержит внутриклеточный, трансмембранный и внеклеточный рецептор-связывающий домен. Функционально активная растворимая форма OX40L может быть получена путем удаления внутриклеточных и трансмембранных доменов, как описано, например, в патентах США №№ 5457035; 6312700; 6156878; 6242566; 6528055; 6528623; 7098184 и 7125670, раскрытия которых включены в данный документ во всех отношениях. Функционально активной формой OX40L является форма, которая сохраняет способность специфично связываться с OX40, иными словами, которая обладает "рецептор-связывающим доменом" для OX40. Примером являются аминокислоты 51-183 человеческого OX40L. Способы определения способности молекулы или производного OX40L специфично связываться с OX40 обсуждаются ниже. Способы получения и применения OX40L и его производных (таких как производные, которые содержат OX40-связывающий домен) описаны в патентах США №№ 6156878; 6242566; 6528055; 6528623; 7098184 и 7125670, где также описываются белки, содержащие растворимую форму OX40L, соединенную с другими пептидами, такими как Fc-области иммуноглобулинов человека ("Ig"), которые можно получать для облегчения очистки лиганда OX40 от культивируемых клеток или для повышения стабильности молекулы после введения млекопитающему (см. также патенты США №№ 5457035 и 7959925 оба из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).
Применяемый в данном документе термин "OX40L" включает целый лиганд OX40, растворимый лиганд OX40 и функционально активные части лиганда OX40. В определение OX40L также включены варианты лиганда OX40, которые отличаются по аминокислотной последовательности от встречающихся в природе молекул лиганда OX40, но которые сохраняют способность специфично связываться с рецептором OX40. Такие варианты описаны в патентах США №№ 5457035; 6156878; 6242566; 6528055; 6528623; 7098184 и 7125670. В близком варианте осуществления применяют мутантную форму OX40L, утратившую способность специфично связываться с OX40, например, содержащую аминокислоты 51-183, в которых фенилаланин в положении 180 рецептор-связывающего домена человеческого OX40L был замещен аланином (F180A).
Агонисты OX40 включают в себя белок слияния, в котором один или несколько доменов OX40L соединены ковалентной связью с одним или несколькими дополнительными белковыми доменами. Иллюстративные белки слияния на основе OX40L, которые можно применять в качестве агонистов OX40, описаны в патенте США № 6312700, раскрытие которого включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В одном из вариантов осуществления агонист OX40 включает в себя полипептид слияния на основе OX40L, который подвергается самосборке в мультимерный (например, тримерный или гексамерный) белок слияния на основе OX40L. Такие белки слияния описаны, например, в патенте США № 7959925, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Мультимерный белок слияния на основе OX40L демонстрирует повышенную эффективность в усилении антиген-специфического иммунного ответа у субъекта, в частности, у субъекта-человека, благодаря его способности к спонтанной сборке в высокостабильные тримеры и гексамеры.
В другом варианте осуществления агонист OX40, способный к сборке в мультимерную форму, включает в себя полипептид слияния, содержащий в направлении от N-конца к C-концу: домен иммуноглобулина, где домен иммуноглобулина включает в себя Fc-домен, тримеризационный домен, где тримеризационный домен включает в себя суперспиральный тримеризационный домен, и рецептор-связывающий домен, где рецептор-связывающий домен представляет собой домен, связывающийся с рецептором OX40, например, OX40L или его OX40-связывающий фрагмент, вариант или производное, где белок слияния способен к самосборке в тримерный белок слияния. В одном из аспектов агонист OX40, способный к сборке в мультимерную форму, способен связываться с рецептором OX40 и стимулировать по меньшей мере одну OX40-опосредованную активность. В определенных аспектах агонист OX40 содержит внеклеточный домен лиганда OX40.

Тримеризационный домен агониста OX40, способный к сборке в мультимерную форму, служит для содействия самосборке отдельных молекул полипептида слияния на основе OX40L в тримерный белок. Таким образом, полипептид слияния на основе OX40L с тримеризационным доменом подвергается самосборке в тримерный белок слияния на основе OX40L. В одном из аспектов тримеризационный домен представляет собой домен "изолейциновую застежку" или другую суперспиральную полипептидную структуру. Иллюстративные суперспиральные тримеризационные домены включают тримеризационные домены TRAF2 (№ доступа в GENBANK Q12933, аминокислоты 299-348); тромбоспондина 1 (№ доступа PO7996, аминокислоты 291-314); матрилина-4 (№ доступа O95460, аминокислоты 594-618); CMP (матрилина-1) (№ доступа NP-002370, аминокислоты 463-496); HSF1 (№ доступа AAX42211, аминокислоты 165-191) и кубилина (№ доступа NP-001072, аминокислоты 104-138). В определенных конкретных аспектах тримеризационный домен включает в себя тримеризационный домен TRAF2, тримеризационный домен матрилина-4 или их комбинацию.
OX40L FP является белком слияния на основе лиганда человеческого OX40 и IgG4P, который специфично связывается с человеческим рецептором OX40, являющимся представителем суперсемейства TNFR, и запускает передачу сигнала от него. OX40L FP может иметь нуклеиновую кислоту, раскрытую под любым из SEQ ID NO: 31, 33 и 35, и соответствующую кодируемую аминокислотную последовательность, раскрытую под SEQ ID NO: 32, 34 и 36 соответственно. OX40L FP также раскрыт в PCT/US2015/032598, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. OX40L FP состоит из трех различных доменов: (1) внеклеточных рецептор-связывающих доменов (RBD) лиганда человеческого OX40, которые образуют гомотримеры и связываются с рецептором OX40; (2) тримеризационных доменов "изолейциновых застежек", полученных из TNFR-ассоциированного фактора 2, которые стабилизируют гомотримерную структуру RBD лиганда OX40, и (3) доменов, представляющих собой кристаллизующиеся гамма-фрагменты (Fcγ) человеческого IgG4, которые способствуют кластеризации Fcγ-рецепторов белком слияния при связывании с рецепторами OX40 и содержат замену серина на пролин в положении 228 (согласно EU-нумерации) в шарнирных областях (IgG4P) для содействия стабильности двух наборов гомотримеров RBD лиганда OX40. Fc-домен IgG4P слит непосредственно с тримеризационным доменом "изолейциновой застежкой", полученным из аминокислотных остатков 310-349 человеческого фактора 2, ассоциированного с рецептором фактора некроза опухоли (TRAF2). С C-концом домена TRAF2 слиты аминокислотные остатки 51-183 внеклеточного рецептор-связывающего домена (RBD) человеческого OX40L (название гена TNFSF4). Домен TRAF2 стабилизирует гомотримерную структуру RBD OX40L, обеспечивая возможность связывания с OX40 и его активации, тогда как Fc-домен IgG4P придает стабильность в сыворотке крови, обеспечивает димеризацию тримеров OX40L и способствует кластеризации Fcγ-рецепторов гексамерным белком слияния. Один такой OX40L FP имеет последовательности, раскрытые под SEQ ID NO: 31 и 32. Один вариант OX40L FP обладает мутацией по типу замены фенилаланина (F) на аланин (A) по аминокислоте, соответствующей положению 180 в OX40L (SEQ ID NO:33 и 34). Другой вариант OX40L FP имеет замещение домена IgG4P Fc-доменом человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 35 и 36). В конкретных вариантах осуществления агонистом OX40 для применения в настоящем изобретении является один из вариантов OX40L FP.
В конкретных вариантах осуществления агонист OX40 для применения в настоящем изобретении был модифицирован для увеличения его периода полувыведения из сыворотки крови. Например, период полувыведения агониста OX40 из сыворотки крови можно увеличить путем конъюгирования с гетерологичной молекулой, такой как сывороточный альбумин, Fc-область антитела или PEG. В определенных вариантах осуществления агонисты OX40 можно конъюгировать с другими терапевтическими средствами или токсинами с образованием иммуноконъюгатов и/или белков слияния. В определенных вариантах осуществления агонист OX40 можно составить таким образом, чтобы облегчить введение и содействовать стабильности активного средства.
Производные
Антитела для применения в настоящем изобретении (например, антитела к CTLA-4, антитела к PD-L1, антитела к PD-1, антитела к OX40) могут включать в себя варианты таких последовательностей, которые сохраняют способность к специфичному связыванию с их мишенями. Такие варианты могут быть получены из последовательности данных антител специалистом в данной области с применением методик, хорошо известных из уровня техники. Например, аминокислотные замены, делеции или добавления можно производить в FR и/или в CDR. Тогда как изменения в FR обычно предназначены для улучшения стабильности и иммуногенности антитела, изменения в CDR, как правило, предназначены для увеличения аффинности антитела в отношении его мишени. Варианты FR также включают в себя встречающиеся в природе аллотипы иммуноглобулинов. Такие повышающие аффинность изменения можно определить эмпирически с помощью обычных методик, которые включают изменение CDR и тестирование аффинности антитела в отношении его мишени. Например, консервативные аминокислотные замены можно выполнить в любой из раскрытых CDR. Различные изменения можно выполнить в соответствии со способами, описанными в Antibody Engineering, 2nd ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck, 1995. Они включают без ограничений изменения нуклеотидных последовательностей путем замены другими кодонами, которые кодируют функционально эквивалентный аминокислотный остаток в последовательности, с получением таким образом ʺмолчащегоʺ изменения. Например, неполярные аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.
et al.
Производные и аналоги антител по настоящему изобретению можно получить с помощью различных методик, хорошо известных из уровня техники, в том числе с помощью рекомбинантных и синтетических способов (Maniatis (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., и Bodansky (1995) The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed., Spring Verlag, Berlin, Germany). Аналогичные методики перетасовывания или комбинаторные методики также раскрыты у Stemmer (Nature (1994) 370: 389-391), который описывает методику применительно к гену β-лактамазы, но отмечает, что данный подход можно применять для получения антител.
et al.
Можно получать новые VH- или VL-области, несущие одну или несколько последовательностей, полученных из последовательностей, раскрытых в данном документе, путем применения случайного мутагенеза одного или нескольких выбранных генов VH и/или VL. Одна из таких методик, ПЦР с внесением ошибок, описана у Gram (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89: 3576-3580).
et al.
et al.
Другой способ, который можно применять, представляет собой мутагенез генов VH или VL, направленный на CDR. Такие методики раскрыты у Barbas (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1994) 91: 3809-3813) и Schier (J. Mol. Biol. (1996) 263: 551-567).
Подобным образом, одну или несколько или все три CDR можно трансплантировать в репертуар VH или VL-доменов, которые затем подвергают скринингу в отношении антигенсвязывающего фрагмента, специфичного к CTLA-4 или PD-L1.
Часть вариабельного домена иммуноглобулина будет содержать по меньшей мере одну CDR, по существу в соответствии с изложенным в данном документе, и необязательно промежуточные каркасные области из scFv-фрагментов, как изложено в данном документе. Данная часть может содержать по меньшей мере приблизительно 50% любой или обеих из FR1 и FR4, при этом такие 50% представляют собой С-концевые 50% FR1 и N-концевые 50% FR4. Дополнительные остатки на N-конце или C-конце значительной части вариабельного домена могут представлять собой остатки, которые обычно не относятся к встречающимся в природе областям вариабельных доменов. Например, конструирование антител с помощью методик рекомбинантной ДНК может приводить к введению N- или C-концевых остатков, кодируемых линкерами, вводимыми для облегчения клонирования или других стадий манипуляции. Другие стадии манипуляции включают введение линкеров для присоединения вариабельных доменов к дополнительным белковым последовательностям, в том числе константным областям тяжелой цепи иммуноглобулина, другим вариабельным доменам (например, при получении диател) или белковым меткам, что более подробно обсуждается ниже.
Специалист в данной области поймет, что антитела для применения в настоящем изобретении могут содержать антигенсвязывающие фрагменты, содержащие только одну CDR из одного из VL- или VH-домена. Каждый из одноцепочечных специфических связывающих доменов можно применять для скрининга в отношении комплементарных доменов, способных образовывать двухдоменный специфический антигенсвязывающий фрагмент, способный, например, к связыванию с CTLA-4 и PD-L1.
Антитела для применения в настоящем изобретении, описанные в данном документе, можно соединять с другой функциональной молекулой, например, с другим пептидом или белком (альбумином, другим антителом и т.д.). Например, антитела можно соединять с помощью химической сшивки или рекомбинантными способами. Антитела можно также соединить с одним из ряда небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем или полиоксиалкиленами, таким образом, как изложено в патентах США №№ 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337. Антитела можно модифицировать химическим путем посредством ковалентного конъюгирования с полимером, например, для увеличения их периода полувыведения из кровотока. Иллюстративные полимеры и способы их присоединения также показаны в патентах США №№ 4766106; 4179337; 4495285 и 4609546.
et al.
et al.
et al.
et al.
Антитела также можно изменять с получением профиля гликозилирования, который отличается от нативного профиля. Например, можно удалить один или несколько углеводных компонентов и/или добавить к исходному антителу один или несколько участков гликозилирования. Добавление участков гликозилирования к раскрытым в данном документе антителам можно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала консенсусные последовательности участков гликозилирования, известные из уровня техники. Другим способом увеличения числа углеводных компонентов в антителах является химическое или ферментативное присоединение гликозидов к аминокислотным остаткам антитела. Такие способы описаны в WO 87/05330 и в Aplin (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306. Удаление каких-либо углеводных компонентов из антител можно осуществлять химическим или ферментативным путем, например, как описано в Hakimuddin (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52, и Edge (1981) Anal. Biochem., 118: 131, и в Thotakura (1987) Meth. Enzymol., 138: 350. Антитела также можно метить с помощью детектируемой или функциональной метки. Детектируемые метки включают в себя радиоактивные метки, такие как 131I или 99Tc, которые также можно присоединять к антителам с помощью традиционных химических способов. Детектируемые метки также включают в себя ферментные метки, такие как пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза. Детектируемые метки дополнительно включают в себя химические компоненты, такие как биотин, который можно выявлять посредством связывания со специфическим когнатным детектируемым компонентом, например, меченым авидином.
et al.
et al.
Антитела, в которых последовательности CDR лишь незначительно отличаются от изложенных в данном документе, охвачены объемом настоящего изобретения. Как правило, аминокислоту заменяют родственной аминокислотой, имеющей аналогичный заряд, гидрофобные или стереохимические характеристики. Такие замены будут находиться в пределах обычной квалификации специалиста. В отличие от CDR, в FR можно производить более существенные изменения без отрицательного влияния на свойства связывания антитела. Изменения в FR включают без ограничения гуманизацию имеющих нечеловеческое происхождение или конструирование определенных каркасных остатков, которые имеют важное значение для контакта с антигеном или для стабилизации участка связывания, например, изменение класса или подкласса константной области, изменение конкретных аминокислотных остатков, которое может изменить эффекторную функцию, такую как связывание с Fc-рецептором, например, как описано в патентах США №№ 5624821 и 5648260 и в Lund (1991) J. Immun. 147: 2657-2662 и Morgan (1995) Immunology 86: 319-324, или изменение вида, из которого происходит константная область.
Специалисту в данной области будет понятно, что модификации, описанные выше, не являются всеобъемлющими, и что множество других модификаций будет очевидно специалисту в данной области в свете идей настоящего раскрытия.
Антисмысловые соединения, воздействующие на STAT3, в том числе антисмысловые олигонуклеотиды
Антисмысловые соединения, нацеленные на STAT3, в том числе антисмысловые олигонуклеотиды, которые специфично связываются с мРНК или белком STAT3 и ингибируют их экспрессию, являются пригодными в настоящем изобретении.
Антисмысловые олигонуклеотиды, ингибирующие STAT3, известны из уровня техники.
В WO2000/061602 и WO2005/083124 (оба от Isis Pharmaceuticals Inc.) раскрывается множество антисмысловых олигонуклеотидов, ингибирующих STAT3, которые могут быть предложены в настоящем изобретении.
CTA
AGC
В WO2012/135736 (Isis Pharmaceuticals Inc.) также раскрывается множество антисмысловых олигонуклеотидов, ингибирующие STAT3, которые могут быть предложены в настоящем изобретении. Антисмысловые олигонуклеотиды, подходящие для применения в вариантах осуществления, представленных в данном документе, включают без ограничения SEQ ID NO: 9-426, 430-442, 445-464, 471-498, 500-1034 и 1036-1512, описанные в WO2012/135736. Один из них, идентифицированный в данном документе как ISIS 481464, является молекулой, также известной как AZD9150. Он представляет собой молекулу гэпмера с конфигурацией 3-10-3, при этом центральный "гэп"-сегмент содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, фланкированных с обеих сторон (в 5'- и 3'-направлениях) "флангами", каждый из которых содержит по три нуклеозида. Каждый нуклеозид в 5'-концевом "фланговом" сегменте и каждый нуклеозид в 3'-концевом "фланговом" сегменте имеет cET-модификацию сахара. Все межнуклеотидные связи в каждом гэпмере являются фосфотиоатными (P=S) связями. Все цитозиновые остатки в гэпмере являются 5'-метилцитозиновыми остатками. Полная последовательность нуклеиновых оснований 16-мерного AZD9150/ISIS481464 представляет собой TTTGGATGTC (раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 2). "Фланговые" сегменты подчеркнуты. AZD9150 является комплементарным по отношению к нуклеиновым основаниям 3016-3031 в последовательности STAT3 с № доступа в GENBANK NM 139276.2, включенной в данный документ под SEQ ID NO:1.
В WO 2014/070868 (Isis Pharmaceuticals Inc.) раскрыты конкретные дозировки AZD9150 и способы лечения конкретных форм рака с их помощью.
AZD9150 в настоящее время тестируют в клинических испытаниях в фазе I, и в его отношении был продемонстрирован клинический ответ при DLBCL и HCC в переносимых дозах.
Другие антисмысловые соединения, нацеленные на STAT3, раскрыты, например, в
WO2008109494, в котором раскрываются меродуплексные молекулы рибонуклеиновой кислоты (mdRNA), воздействующие на STAT3, и в US20100298409, в котором раскрываются молекулы siРНК, воздействующие на STAT3.
Каждое из этих раскрытий включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Определенные варианты осуществления
В одном аспекте в настоящем изобретении представлен способ, включающий введение иммуномодулирующего средства и антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, пациенту, нуждающемуся в этом. В одном из вариантов осуществления средства ((i) антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент и (ii) антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3)) вводят одновременно, раздельно или последовательно.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлен способ лечения, который включает введение (i) по меньшей мере одного иммуномодулирующего средства и (ii) антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, пациенту, нуждающемуся в этом. В одном из вариантов осуществления средства вводят одновременно, раздельно или последовательно.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлено иммуномодулирующее средство и антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, для применения в лечении пациента, нуждающегося в этом. В одном из вариантов осуществления два средства вводят одновременно, раздельно или последовательно.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлено по меньшей мере одно иммуномодулирующее средство и антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, для применения в лечении пациента, нуждающегося в этом. В одном из вариантов осуществления средства вводят одновременно, раздельно или последовательно.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлено иммуномодулирующее средство для применения в лечении пациента, нуждающегося в этом, где указанного пациента также подвергают лечению с помощью антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3. В одном из вариантов осуществления средства вводят одновременно, раздельно или последовательно.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлено антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, для применения в лечении пациента, нуждающегося в этом, где указанного пациента также подвергают лечению с помощью иммуномодулирующего средства. В одном из вариантов осуществления средства вводят одновременно, раздельно или последовательно.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлено применение иммуномодулирующего средства в изготовлении лекарственного препарата для лечения пациента, страдающего от рака, и этого пациента также подвергают лечению с помощью антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлено применение иммуномодулирующего средства в изготовлении лекарственного препарата для лечения пациента, страдающего от рака, где иммуномодулирующее средство вводят одновременно, раздельно или последовательно с антисмысловым соединением, нацеленным на STAT3, пациенту, нуждающемуся в этом.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлено применение антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, в изготовлении лекарственного препарата для лечения пациента, страдающего от рака, и этого пациента также подвергают лечению с помощью иммуномодулирующего средства.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлено применение антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, в изготовлении лекарственного препарата для лечения пациента, страдающего от рака, где антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, вводят одновременно, раздельно или последовательно с иммуномодулирующим средством.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлено применение (i) иммуномодулирующего средства и (ii) антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, в изготовлении лекарственного препарата для лечения пациента, страдающего от рака. В одном из вариантов осуществления два средства (антисмысловое соединение и иммуномодулирующее средство) вводят одновременно, раздельно или последовательно.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлено иммуномодулирующее средство для применения в лечении пациента, страдающего от рака, и этого пациента также подвергают лечению с помощью антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлено иммуномодулирующее средство для применения в лечении пациента, страдающего от рака, где иммуномодулирующее средство вводят одновременно, раздельно или последовательно с антисмысловым соединением, нацеленным на STAT3.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлено антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, для применения в лечении пациента, страдающего от рака, и этого пациента также подвергают лечению с помощью иммуномодулирующего средства.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлено антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, для применения в лечении пациента, страдающего от рака, где антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, вводят одновременно, раздельно или последовательно с иммуномодулирующим средством.
В одном аспекте в настоящем изобретении представлены: (i) иммуномодулирующее средство и (ii) антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3; для применения в лечении пациента, страдающего от рака, где каждое из иммуномодулирующего средства и антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, вводят пациенту одновременно, раздельно или последовательно.
В различных аспектах, раскрытых в данном документе, при ссылке на лечение пациента с помощью иммуномодулирующего средства также охватывается лечение с помощью более чем одного иммуномодулирующего средства.
В конкретных вариантах осуществления любых аспектов, раскрытых в данном документе, иммуномодулирующее средство является ингибитором иммунных контрольных точек.
В конкретных вариантах осуществления любых аспектов, раскрытых в данном документе, иммуномодулирующее средство является антителом к PD-L1 или его антигенсвязывающим фрагментом.
В конкретных вариантах осуществления любых аспектов, раскрытых в данном документе, иммуномодулирующее средство является антителом к PD-1 или его антигенсвязывающим фрагментом.
В конкретных вариантах осуществления любых аспектов, раскрытых в данном документе, иммуномодулирующее средство является антителом к CTLA-4 или его антигенсвязывающим фрагментом.
В конкретных вариантах осуществления любых аспектов, раскрытых в данном документе, иммуномодулирующее средство является агонистом OX-40. В конкретных вариантах осуществления агонист OX-40 выбран из агонистического антитела к OX40 или его антигенсвязывающего фрагмента, лиганда OX40 или его фрагмента или производного или белка слияния на основе лиганда OX40.
В конкретных вариантах осуществления любых аспектов, раскрытых в данном документе, иммуномодулирующее средство выбрано из группы, состоящей из MEDI4736, MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714, MDX-1105, ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, MPDL3280A, тремелимумаба, ипилимумаба и OX40L FP.
В одном из вариантов осуществления любых аспектов, раскрытых в данном документе, STAT3 является человеческим STAT3, поэтому в комбинациях и способах лечения и т.п. используют антисмысловое соединение, нацеленное на человеческий STAT3.
Определенные аспекты обращены к комбинации антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, и одного или нескольких иммуномодулирующих средств. В определенных вариантах осуществления такая комбинация антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, и одного или нескольких иммуномодулирующих средств содержит AZD9150 и одно или несколько средств, выбранных из антитела к PD-L1, антитела к PD1 и антитела к CTLA-4, а также агониста OX-40. В определенных вариантах осуществления такая комбинация содержит AZD9150 в качестве антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, и одно или несколько иммуномодулирующих средств, выбранных из группы, состоящей из MEDI4736, MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714, MDX-1105, ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, MPDL3280A, тремелимумаба, ипилимумаба и OX40L FP.
В конкретных вариантах осуществления любого из первого или второго путей медицинского применения или аспектов способа лечения, раскрытых в данном документе, два или более иммуномодулирующих средств можно вводить в комбинации с антисмысловым соединением, нацеленным на STAT3. Например, комбинированное лечение может предусматривать применение ASO, воздействующего на STAT3, антитела к PD-L1 и антитела к CTLA-4, как, например, AZD9150, MEDI4736 и тремелимумаба. Одна из альтернатив предусматривает применение ASO, воздействующего на STAT3, антитела к PD-L1 и агониста OX40, как, например, AZD9150, MEDI4736 и OX40L FP. Другая альтернатива будет предусматривать применение ASO, воздействующего на STAT3, антитела к PD-L1 и антитела к CTLA-4, как, например, AZD9150, MEDI4736 и тремелимумаба.
В конкретных вариантах осуществления любого из первого или второго путей медицинского применения или аспектов способа лечения, раскрытых в данном документе, иммуномодулирующее средство является антителом к PD-L1 или его антигенсвязывающим фрагментом, выбранными из MEDI4736, MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714 и MDX-1105 или антигенсвязывающего фрагмента любого из них.
В конкретных вариантах осуществления любого из первого или второго путей медицинского применения или аспектов способа лечения, описанных выше, предусматривающих применение антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, антитело к PD-L1 представляет собой MEDI4376 или его антигенсвязывающий фрагмент.
В конкретных вариантах осуществления любого из первого или второго путей медицинского применения или аспектов способа лечения, описанных выше, предусматривающих применение антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент блокируют связывание PD-L1 с рецепторами PD-1 и CD80.
В конкретных вариантах осуществления любого из первого или второго путей медицинского применения или аспектов способа лечения, описанных выше, антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, вводят пациенту перед иммуномодулирующим средством. В конкретных вариантах осуществления продолжительность времени между введением антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, и иммуномодулирующего средства составляет по меньшей мере 10 минут, 1 час, 2 часа, 6 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 5 дней, 7 дней, 10 дней или 14 дней. В конкретном варианте осуществления пациенту сначала вводят антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, а затем позже вводят иммуномодулирующее средство в другой момент времени и во время другого визита. Другой визит в данном контексте может означать, что медицинский работник, который выдает или вводит иммуномодулирующее лекарственное средство пациенту, делает это во время визита, отличного от визита, когда было предоставлено/введено антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3. Очевидно, что место визита не имеет значения. Пациент может нанести визит медицинскому работнику или наоборот.
В конкретных вариантах осуществления любого из первого или второго путей медицинского применения или аспектов способа лечения, описанных выше, иммуномодулирующее средство вводят пациенту перед антисмысловым соединением, нацеленным на STAT3.
В конкретных вариантах осуществления продолжительность времени между введением (i) иммуномодулирующего средства и (ii) антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, составляет по меньшей мере 10 минут, 1 час, 2 часа, 6 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 5 дней, 7 дней, 10 дней или 14 дней.
В каждом из различных первого или второго путей медицинского применения или аспектов способа лечения, описанных выше, антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, может быть антисмысловым олигонуклеотидом.
В конкретных вариантах осуществления любого из первого или второго путей медицинского применения или аспектов способа лечения, описанных выше, антисмысловым соединением, нацеленным на STAT3, может быть AZD9150.
В определенных вариантах осуществления антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, не ингибирует STAT1, STAT4 или STAT6.
В определенных вариантах осуществления у пациента имеется рак. В одном из вариантов осуществления у пациента имеется рак, выбранный из рака головы и шеи (в том числе плоскоклеточной карциномы (HNSCC)), лимфомы (в том числе диффузной крупноклеточной В-клеточной карциномы (DLBCL) или лимфомы Ходжкина), рака молочной железы (в том числе трижды негативного), рака яичника (в том числе серозного), рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака легкого (в том числе немелкоклеточного рака легкого (NSCLC)) и гепатоцеллюлярной карциномы (HCC).
В определенных вариантах осуществления раковые клетки экспрессируют PD-L1.
В определенных вариантах осуществления у пациента, нуждающегося в этом, было идентифицировано наличие рака, который является положительным по PD-L1. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более клеток из опухолевых клеток пациента являются положительными по PD-L1 при оценке с применением иммунохимического анализа.
В одном из вариантов осуществления рак легкого представляет собой мелкоклеточный рак легкого или немелкоклеточный рак легкого (например, плоскоклеточную карциному, аденокарциному, крупноклеточную карциному, аденосквамозную карциному и саркоматоидную карциному).
В одном из вариантов осуществления рак головы и шеи представляет собой HNSCC.
В одном из вариантов осуществления лимфома представляет собой DLBCL.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлен способ лечения, включающий введение MEDI4736 или его антигенсвязывающих фрагментов и AZD9150 пациенту, у которого идентифицировано наличие рака. В одном из вариантов осуществления данного конкретного аспекта рак выбран из HNSCC, DLBCL, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака яичника, NSCLC и HCC.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлен способ лечения, включающий введение приблизительно 0,5-20 мг/кг/неделя MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и приблизительно 0,3-5 мг/кг/неделя AZD9150 пациенту, у которого идентифицировано наличие рака. В конкретном варианте осуществления в дополнение к AZD9150 и MEDI4736, пациенту также вводят приблизительно 1-10 мг/кг/неделя тремелимумаба. В определенных вариантах осуществления вес тела субъекта рассчитывают как идеальный вес тела с применением формулы Девина (Pai, M.P. and Paloucek, F.P. Ann. Pharmacol. 2000. 34: 1066-1069): для мужчин (в кг)=50+2,3 кг/дюйм свыше 5 футов; для женщин (в кг)=45,5+2,3 кг/дюйм свыше 5 футов.
В определенных вариантах осуществления ввиду наблюдаемых эффектов лечения иммуномодулирующее средство и/или антисмысловые соединения, нацеленные на STAT3, можно вводить в дозе, более низкой, чем доза этого же средства при применении в качестве монотерапии. В определенных вариантах осуществления представленное в данном документе антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, вводят субъекту в диапазоне от приблизительно 0,3 до 5 миллиграммов антисмыслового соединения на килограмм веса тела субъекта в неделю (0,3-5 мг/кг/неделя). Такие диапазоны доз являются неожиданно низкими для лечения рака. Для сравнения, в исследовании в фазе 1 в отношении LY2275796, антисмыслового олигонуклеотида, нацеленного на кэп-связывающий белок фактор инициации эукариот 4E (eIF-4E), пришли к выводу, что максимальная переносимая доза (MTD) и биологически эффективная доза (BED) LY2275796 составляет 1000 мг в режиме нагрузочных и поддерживающих доз, однако, даже в дозе 1000 мг не наблюдался ответ опухоли (Hong D.S. et al., Clin Cancer Res. 2011 17(20):6582-91). В определенных вариантах осуществления иммуномодулирующее средство вводят субъекту в диапазоне от приблизительно 1 до 20 миллиграммов соединения, представляющего собой антитело, на килограмм веса тела субъекта в неделю (1-20 мг/кг/неделя).
В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов или любого аспекта настоящего изобретения, описанных в общих чертах в данном документе, предусматривающих применение антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента, антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из MEDI4736, MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714 и MDX-1105 или антигенсвязывающего фрагмента любого из них.
В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов или любого аспекта настоящего изобретения, описанных в общих чертах в данном документе, предусматривающих применение антитела к PD1 или его антигенсвязывающего фрагмента, антитело к PD1 или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба и MPDL3280A.
В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов или любого аспекта настоящего изобретения, описанных в общих чертах в данном документе, предусматривающих применение антитела к CTLA-4 или его антигенсвязывающего фрагмента, антитело к CTLA-4 или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из тремелимумаба и ипилимумаба.
В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов или любого аспекта настоящего изобретения, описанных в общих чертах в данном документе, предусматривающих применение агониста OX040, агонист OX-40 представляет собой OX40L FP.
В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов или любого аспекта настоящего изобретения, описанных в общих чертах в данном документе, антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, представляет собой AZD9150.
В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота STAT3, с которой могут гибридизироваться антисмысловые соединения, имеет любую из последовательностей, изложенных под № доступа в GENBANK NM_139276.2 (включенных в данный документ под SEQ ID NO: 1), или является комплементарной по отношению к последовательности с № доступа в GENBANK NT_010755.14 с усечением нуклеотидов от 4185000 до 4264000 (упомянутой под SEQ ID NO: 2 в WO2012/135736). В определенных вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид, подходящий для применения в данном документе, включает без ограничения SEQ ID NO: 9-426, 430-442, 445-464, 471-498, 500-1034 и 1036-1512, описанные в WO2012/135736. В определенных вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид для применения в настоящем изобретении включает в себя модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных нуклеозидов, имеющий последовательность нуклеиновых оснований, содержащую часть из по меньшей мере 12 смежных нуклеиновых оснований, комплементарных части нуклеиновых оснований 3008-3033 такой же длины в SEQ ID NO: 1, и где последовательность нуклеиновых оснований является комплементарной по отношению к SEQ ID NO: 1. В определенных вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид представляет собой AZD9150.
CTA
AGC
Информацию, касающуюся AZD9150 (также известного как ISIS 481464) для применения в способах, представленных в данном документе, можно найти в WO2012/135736, и, в частности, в примере 1, раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. AZD9150 является однонитевым модифицированным олигонуклеотидом, содержащим десять соединенных дезоксинуклеозидов ("гэп"-сегмент), 5'-концевой "фланговый" сегмент, состоящий из 3 соединенных нуклеозидов, и 3'-концевой "фланговый" сегмент, состоящий из 3 соединенных нуклеозидов. "Гэп"-сегмент расположен между 5'-концевым "фланговым" сегментом и 3'-концевым "фланговым" сегментом, и каждый нуклеозид каждого "флангового" сегмента содержит затрудненный этилом нуклеозид. Каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида является фосфотиоатной связью, и каждый цитозин олигонуклеотида является 5'-метилцитозином. Полная последовательность нуклеиновых оснований 16-мерного AZD9150 представляет собой TTTGGATGTC (раскрыта в данном документе под SEQ ID NO: 2) с подчеркнутыми "фланговыми" сегментами. В определенных вариантах осуществления антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, является соединением, содержащим модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 12 смежных нуклеиновых оснований из последовательности нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 2.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на STAT3, состоит из однонитевого модифицированного олигонуклеотида.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида, нацеленного на STAT3, является модифицированной межнуклеозидной связью.
В определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида, нацеленного на STAT3, является фосфотиоатной межнуклеозидной связью.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида, нацеленного на STAT3, содержит модифицированный сахар.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один модифицированный сахар модифицированного олигонуклеотида, нацеленного на STAT3, является бициклическим сахаром.
2
3
В определенных вариантах осуществления бициклический сахар модифицированного олигонуклеотида, нацеленного на STAT3, содержит мостик 4'-CH-O-2' или мостик 4'-CH(CH)-O-2'.
2
2
3
3
В определенных вариантах осуществления модифицированный сахар модифицированного олигонуклеотида, нацеленного на STAT3, содержит группу 2'-O(CH)-OCH или группу 2'-O-CH.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида, нацеленного на STAT3, содержит модифицированное нуклеиновое основание. В определенных вариантах осуществления указанное модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5'-метилцитозин.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на STAT3, содержит
5'-концевой "фланг", состоящий из 1-5 соединенных нуклеозидов;
3'-концевой "фланг", состоящий из 1-5 соединенных нуклеозидов;
"гэп" между 5'-концевым "флангом" и 3'-концевым "флангом", состоящий из 8-12 соединенных 2'-дезоксинуклеозидов; и
где по меньшей мере один из 5'-концевого "фланга" и 3'-концевого "фланга" содержит по меньшей мере один бициклический нуклеозид или 2'-замещенный нуклеозид.
В определенных вариантах осуществления антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая, будучи записанной в направлении от 5' к 3', содержит последовательность, обратно комплементарную сегменту-мишени нуклеиновой кислоты-мишени, на который оно нацелено.
Понятно, что последовательность, изложенная под каждым из SEQ ID NO, содержащимся в данном документе, применительно к антисмысловой молекуле/соединению является независимой от какой-либо модификации сахарного компонента, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. В силу этого антисмысловые соединения, определенные под SEQ ID NO, могут независимо содержать одну или несколько модификаций сахарного компонента, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания.
Модификации
Нуклеозид является комбинацией основания и сахара. Часть нуклеозида, представляющая собой нуклеиновое основание (также известное как основание), как правило, является компонентом, представляющим собой гетероциклическое основание. Нуклеотиды представляют собой нуклеозиды, которые дополнительно содержат фосфатную группу, соединенную ковалентной связью с сахарной частью нуклеозида. У данных нуклеозидов, которые содержат пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть соединена с 2'-, 3'- или 5'-гидроксильным компонентом сахара. Олигонуклеотиды образуются посредством ковалентной связи прилегающих нуклеозидов друг с другом с образованием линейного полимерного олигонуклеотида. В структуре олигонуклеотида фосфатные группы обычно называют формирующими межнуклеозидные связи олигонуклеотида.
Модификации антисмысловых соединений охватывают замены или изменения в межнуклеозидных связях, сахарных компонентах или нуклеиновых основаниях. Модифицированные антисмысловые соединения зачастую предпочтительнее, чем нативные формы, благодаря своим желательным свойствам, таким как, например, повышенное поглощение клетками, повышенное сродство к нуклеиновым кислотам-мишеням, увеличенная стабильность в присутствии нуклеаз или увеличенная ингибиторная активность.
Нуклеозиды, модифицированные химическим путем, можно также использовать для увеличения сродства связывания укороченного или усеченного антисмыслового олигонуклеотида в отношении его нуклеиновой кислоты-мишени. Следовательно, с более короткими антисмысловыми соединениями, которые имеют такие нуклеозиды, модифицированные химическим путем, часто можно получить сравнимые результаты.
Модифицированные межнуклеозидные связи
Встречающаяся в природе межнуклеозидная связь РНК и ДНК является 3'-5'-фосфодиэфирной связью. Антисмысловые соединения, имеющие одну или несколько модифицированных, т.е. не встречающихся в природе, межнуклеозидных связей, часто выбирают, предпочитая их антисмысловым соединениям, имеющим встречающиеся в природе межнуклеозидные связи, благодаря своим желательным свойствам, таким как, например, повышенное поглощение клетками, повышенное сродство к нуклеиновым кислотам-мишеням и увеличенная стабильность в присутствии нуклеаз.
Олигонуклеотиды, имеющие модифицированные межнуклеозидные связи, содержат межнуклеозидные связи, в которых сохраняется атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, которые не имеют атома фосфора. Типичные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи включают без ограничения фосфодиэфирные, фосфотриэфирные, метилфосфонатные, фосфорамидатные и фосфотиоатные. Хорошо известны способы получения фосфорсодержащих и не содержащих фосфор связей.
В определенных вариантах осуществления антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту STAT3, содержат одну или несколько модифицированных межнуклеозидных связей. В определенных вариантах осуществления модифицированные межнуклеозидные связи являются фосфотиоатными связями. В определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь антисмыслового соединения является фосфотиоатной межнуклеозидной связью.
Модифицированные сахарные компоненты
1
12
см.
см.
см.
Антисмысловые соединения, представленные в данном документе, могут необязательно содержать один или несколько нуклеозидов, в которых была модифицирована сахарная группа. Такие нуклеозиды с модифицированным сахаром могут придавать антисмысловым соединениям повышенную стабильность к действию нуклеаз, увеличенное сродство связывания или некоторое другое благоприятное биологическое свойство. В определенных вариантах осуществления нуклеозиды содержат компонент, модифицированный химическим путем, представляющий собой рибофуранозное кольцо. Примеры химических модификаций рибофуранозных колец включают без ограничения добавление замещающих групп (в том числе 5'- и 2'-замещающих групп); формирование мостика между негеминальными атомами кольца с образованием бициклических нуклеиновых кислот (BNA); замещение атома кислорода рибозильного кольца на S, N(R) или C(R1)(R)2 (R=H, C-C-алкил или защитная группа) и их комбинации. Примеры сахаров, модифицированных химическим путем, включают 2'-F-5'-метилзамещенный нуклеозид ( международную PCT-заявку WO 2008/101157 в отношении других раскрытых 5', 2'-бисзамещенных нуклеозидов), замещение атома кислорода рибозильного кольца на S с дополнительной заменой в 2'-положении ( опубликованную заявку на патент США US2005/0130923) или, в качестве альтернативы, 5'-замену в BNA ( международную PCT-заявку WO 2007/134181, где LNA замещена, например, 5'-метильной или 5'-винильной группой).
3
2
3
1
10
3
2
3
2
2
1
10
Примеры нуклеозидов, имеющих модифицированные сахарные компоненты, включают без ограничения нуклеозиды, содержащие замещающие группы 5'-винильную, 5'-метильную (R или S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH и 2'-O(CH)2OCH. Заместитель в 2'-положении может быть также выбран из аллила, амино, азидо, тио, O-аллила, O-C-C-алкила, OCF, O(CH)2SCH, O(CH)2-O-N(Rm)(Rn) и O-CH-C(=O)-N(Rm)(Rn), где каждый из Rm и Rn независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный C-C-алкил.
Конъюгированные антисмысловые соединения
Антисмысловые соединения могут быть соединены ковалентными связями с одним или несколькими компонентами или коньюгантами, которые повышают активность, степень распределения в клетках или поглощение клетками получаемых в результате антисмысловых олигонуклеотидов. Типичные конъюгантные группы включают холестериновые компоненты и липидные компоненты. Дополнительные конъюгантные группы включают углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолиевую кислоту, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители.
Составы
Иммуномодулирующее(иммуномодулирующие) средство(средства) и антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту STAT3, можно использовать в фармацевтических композициях путем объединения соединения(соединений) с подходящим фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Фармацевтически приемлемый разбавитель включает фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Подходящие примеры носителей включают физиологический раствор, полиэтиленгликоль, этанол, растительные масла, изопропилмиристат и т.д., но не ограничены ими.
Remington
s Pharmaceutical Sciences
Приемлемые носители или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтической области и описаны, например, в ', Mack Publishing Co., A.R Gennaro edit., 1985.
Фармацевтические композиции, содержащие иммуномодулирующее средство и/или антисмысловые соединения, охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, которые при введении животному, в том числе человеку, способны предоставить ему (непосредственно или опосредованно) их биологически активный метаболит или остаток.
В определенных вариантах осуществления два средства (иммуномодулирующее средство и антисмысловое соединение, воздействующее на STAT3) составляют по отдельности.
В соответствии с одним аспектом представлена фармацевтическая композиция, содержащая иммуномодулирующее средство и антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, а также один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей.
Средства по настоящему изобретению могут быть составлены для парентерального введения (например, путем инъекции, например, болюсной инъекции или непрерывной инфузии) и могут присутствовать в виде единичных дозированных форм в ампулах, в предварительно заполненных шприцах, емкостях для инфузии малого объема или в многодозовых контейнерах с добавленным консервантом. Композиции могут иметь такие формы, как растворы, суспензии или эмульсии в масляных или водных средах, например, растворы в водном полиэтиленгликоле. Примеры масляных или неводных носителей, разбавителей или сред включают пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла (например, оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (например, этилолеат). Композиции могут также содержать другие вспомогательные средства для составления, такие как смачивающие, эмульгирующие или суспендирующие, консервирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. В качестве альтернативы, активный компонент может находиться в форме порошка, полученного путем асептического выделения стерильного твердого вещества или путем лиофилизации из раствора для разбавления перед применением посредством подходящей среды, например, стерильной апирогенной воды.
В одном из вариантов осуществления антитело к PD-L1 MEDI4736 составлено при 50 мг/мл в 26 мМ гистидина/гистидина-HCl, 275 мМ дигидрата трегалозы, 0,02% (вес/объем [вес/об.]) полисорбата 80, pH 6,0. Продукт может затем поставляться в виде лиофилизированного порошка от белого до грязно-белого цвета в прозрачных стеклянных флаконах (например, флаконе 10R), например, закрытых с помощью эластомерной пробки и дополнительного укупорочного средства в виде колпачка с откидной крышкой. Каждый флакон содержит 200 мг (номинально) активного продукта. MEDI4736 затем восстанавливают с применением асептических методик посредством 4,0 мл стерильной воды для инъекций (WFI) с получением конечной концентрации 50 мг/мл. Восстановленный раствор затем разбавляли посредством 0,9% (вес/об.) физиологического раствора для IV инфузии с применением, например, шприцев или мешков.
Режимы лечения
В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов средство для лечения вводят каждые 1, 2, 3 или 4 недели. В различных вариантах осуществления пациенту сначала вводят одну нагрузочную дозу или серию нагрузочныхдоз иммуномодулирующего средства (например, антитела к PD-L1 MEDI4736). Это может предусматривать многократное дозирование средства на ранней стадии лечения (в фазе нагрузки), например, в дни 1, 3 и 5 недели 1.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что при обработке пациента вначале с помощью ингибитора STAT3, а затем позже с помощью иммуномодулятора достигают лучших результатов в борьбе против рака. В различных вариантах осуществления пациенту сначала вводят одну нагрузочную дозу или серию нагрузочныхдоз антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту STAT3 (например, AZD9150). Это может предусматривать многократное дозирование средства на ранней стадии лечения, например, в дни 1, 3 и 5 недели 1.
Целью фазы нагрузочных доз является более быстрое достижение устойчивого состояния или эффективного уровня средства (измеряемого в крови) перед "поддерживающей" фазой лечения, например, за одну неделю.
Предварительная обработка с помощью селективного ингибитора STAT3 может также служить для обеспечения увеличения количества CD45+ клеток, инфильтрирующих опухоль, и, возможно, также для уменьшения количества макрофагов, инфильтрирующих опухоль, что обеспечивает большую восприимчивость окружения опухоли к эффективному лечению с помощью иммуномодулирующего средства.
В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов пациенту вводят от приблизительно 1 мг/кг до 20 мг/кг включительно иммуномодулирующего средства и от приблизительно 1 мг/кг до 15 мг/кг включительно антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту STAT3.
В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов, предусматривающих применение MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента, вводят от приблизительно 2 мг/кг до 10 мг/кг включительно MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и от приблизительно 1 мг/кг до 3 мг/кг включительно AZD9150. В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов, предусматривающих применение MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента, вводят приблизительно 1 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 1 мг/кг AZD9150, вводят приблизительно 1 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 2 мг/кг AZD9150, вводят приблизительно 1 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 3 мг/кг AZD9150, вводят приблизительно 1 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 10 мг/кг AZD9150, вводят приблизительно 3 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 1 мг/кг AZD9150; вводят приблизительно 3 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 2 мг/кг AZD9150; вводят приблизительно 3 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 3 мг/кг AZD9150; вводят приблизительно 3 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 10 мг/кг AZD9150; вводят приблизительно 10 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 1 мг/кг AZD9150; вводят приблизительно 10 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 2 мг/кг AZD9150; вводят приблизительно 10 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 3 мг/кг AZD9150; вводят приблизительно 10 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 10 мг/кг AZD9150, вводят приблизительно 15 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 1 мг/кг AZD9150; вводят приблизительно 15 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 2 мг/кг AZD9150; вводят приблизительно 15 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 3 мг/кг AZD9150 или вводят приблизительно 15 мг/кг MEDI4736 и приблизительно 10 мг/кг AZD9150. В определенных вариантах осуществления вес тела субъекта рассчитывают как идеальный вес тела с применением формулы Девина.
В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов способ обуславливает увеличение общей выживаемости (например, увеличение, составляющее несколько недель, месяцев или лет) по сравнению с введением иммуномодулирующего средства (например, MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента) либо AZD9150 в отдельности. В частности, увеличение выживаемости составляет более чем приблизительно 4-6 недель, 1-2 месяца, 3-4 месяца, 5-7 месяцев, 6-8 месяцев или 9-12 месяцев. В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов введение иммуномодулирующего средства (например, MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента) повторяют приблизительно каждые 4 недели. В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов введение AZD9150 повторяют приблизительно каждые 4 недели. В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов введение AZD9150 повторяют приблизительно каждые 12 недель. В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов введение AZD9150 проводят приблизительно каждые 4 недели за семь введений, а затем каждые 12 недель. В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов введение иммуномодулирующего средства (например, MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента) осуществляют путем внутривенной инфузии. В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов введение AZD9150 осуществляют путем внутривенной инфузии. В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов AZD9150 и MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент вводят одновременно или в разные моменты времени. В различных вариантах осуществления любых упомянутых выше аспектов AZD9150 и MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент вводят с интервалом в двадцать четыре, сорок восемь или семьдесят два часа, с интервалом в 1, 2 или 3 недели или с интервалом в 1, 2 или 3 месяца.
Также рассматривают комбинации, включающие три средства. В конкретных вариантах осуществления любых аспектов, раскрытых в данном документе, в комбинации и/или методах лечения применяют AZD9150, MEDI4736 и тремелимумаб. Конкретная дозировка для данных средств включает AZD9150 при 2 мг/кг или 3 мг/кг, MEDI4736 при 5 мг/кг, 10 мг/кг или 20 мг/кг и тремелимумаб при 1 мг/кг или 2 мг/кг.
Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из подробного описания и из формулы изобретения.
В определенных аспектах пациенту, у которого обнаружены рак/опухоль, вводят: (i) по меньшей мере одно иммуномодулирующее средство и (ii) антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3; в фармацевтически эффективных количествах.
В определенных аспектах пациенту, у которого обнаружены рак/опухоль, вводят: (i) MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент и (ii) AZD9150 в фармацевтически эффективных количествах. В конкретном варианте осуществления данного аспекта пациенту также вводят тремелимумаб или его антигенсвязывающий фрагмент. MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент и AZD9150 можно вводить только один раз или нечасто, по-прежнему обеспечивая при этом благоприятный эффект для пациента. В дополнительных аспектах пациенту вводят дополнительные последующие дозы. Последующие дозы можно вводить с различными интервалами времени в зависимости от возраста, веса, клинической оценки, опухолевой нагрузки пациента и/или других факторов, в том числе от мнения лечащего врача.
Каждый из интервалов между дозами иммуномодулирующего средства (например, MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и/или тремелимумаба или его антигенсвязывающего фрагмента) и антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3 (например AZD9150), может составлять одну, две, три, четыре, пять или шесть недель. Каждый из интервалов между дозами MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и AZD9150 может составлять четыре недели в течение шести циклов, а затем двенадцать недель. В определенных аспектах MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент вводят приблизительно в два раза чаще, чем AZD9150. В определенных аспектах MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент вводят приблизительно в шесть раз чаще, чем AZD9150. В определенных аспектах AZD9150 вводят приблизительно в два раза чаще, чем MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент. В определенных аспектах AZD9150 вводят приблизительно в шесть раз чаще, чем MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления пациенту можно вводить по меньшей мере три дозы, по меньшей мере четыре дозы, по меньшей мере пять доз, по меньшей мере шесть доз, по меньшей мере семь доз, по меньшей мере восемь доз, по меньшей мере девять доз, по меньшей мере десять доз или по меньшей мере пятнадцать или более доз каждого средства. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство (например, MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент) вводят в течение двухнедельного периода лечения, в течение четырехнедельного периода лечения, в течение шестинедельного периода лечения, в течение восьминедельного периода лечения, в течение двенадцатинедельного периода лечения, в течение двадцатичетырехнедельного периода лечения или в течение годичного или большего периода лечения. В некоторых вариантах осуществления AZD9150 вводят в течение двухнедельного периода лечения, четырехнедельного периода лечения, в течение восьминедельного периода лечения, в течение двенадцатинедельного периода лечения, в течение двадцатичетырехнедельного периода лечения или в течение годичного или большего периода лечения.
Количество (i) иммуномодулирующего средства и (ii) антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, подлежащее введению отдельному пациенту, может зависеть от различных параметров, таких как возраст, вес, клиническая оценка, опухолевая нагрузка пациента, и/или других факторов, в том числе от мнения лечащего врача. Количество иммуномодулирующего средства (например, антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента) и антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту STAT3 (например, AZD9150), подлежащее введению пациенту, можно определить на основании комплексных клинических испытаний средств в группе пациентов.
В определенных вариантах осуществления, предусматривающих применение антитела к PD-L1 MEDI4736, пациенту вводят одну или несколько доз MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 0,3 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят одну или несколько доз MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 1 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят одну или несколько доз MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 3 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят одну или несколько доз MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 10 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят одну или несколько доз MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 15 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят одну или несколько доз MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 20 мг/кг. В определенных вариантах осуществления все дозы MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента вводят с интервалом по меньшей мере в одну неделю, как, например, qw, 2qw, 3qw, 4qw, 8qw и 12qw. В определенных вариантах осуществления вес тела субъекта рассчитывают как идеальный вес тела с применением формулы Девина.
В определенных вариантах осуществления, предусматривающих применение антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, известного как AZD9150, пациенту вводят одну или несколько доз AZD9150, где доза составляет приблизительно 0,3 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят одну или несколько доз AZD9150, где доза составляет приблизительно 1 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят одну или несколько доз AZD9150, где доза составляет приблизительно 3 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят одну или несколько доз AZD9150, где доза составляет приблизительно 10 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят одну или несколько доз AZD9150, где доза составляет приблизительно 15 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят одну или несколько доз AZD9150, где доза составляет приблизительно 20 мг/кг. В определенных вариантах осуществления все дозы AZD9150 вводят с интервалом по меньшей мере в одну неделю. В определенных вариантах осуществления все дозы AZD9150 вводят с интервалом в 2 недели (2QW). В определенных вариантах осуществления все дозы AZD9150 вводят с интервалом в 3 недели (3QW). В определенных вариантах осуществления все дозы AZD9150 вводят с интервалом в 4 недели (4QW). В определенных вариантах осуществления все дозы AZD9150 вводят с интервалом в 8 недель (8QW). В определенных вариантах осуществления все дозы AZD9150 вводят с интервалом в 12 недель (12QW).
В определенных вариантах осуществления, предусматривающих применение антитела к CTLA-4 тремелимумаба или ипилимумаба или антигенсвязывающего фрагмента любого из них, пациенту вводят одну или несколько доз антитела к CTLA-4 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 1 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят одну или несколько доз антитела к CTLA-4 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 3 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят одну или несколько доз антитела к CTLA-4 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 10 мг/кг.
В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере две дозы антитела к CTLA-4 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 1 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере две дозы антитела к CTLA-4 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 3 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере две дозы антитела к CTLA-4 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 10 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере две дозы вводят с интервалом в приблизительно четыре недели. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере две дозы вводят с интервалом в приблизительно двенадцать недель.
В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере три дозы антитела к CTLA-4 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 1 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере три дозы антитела к CTLA-4 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 3 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере три дозы антитела к CTLA-4 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 10 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере три дозы вводят с интервалом в приблизительно четыре недели. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере три дозы вводят с интервалом в приблизительно двенадцать недель.
В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере две дозы MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 1 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере две дозы MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 3 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере две дозы MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 10 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере две дозы MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 15 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере две дозы MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента, где доза составляет приблизительно 20 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере две дозы AZD9150, где доза составляет приблизительно 1 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере две дозы AZD9150, где доза составляет приблизительно 2 мг/кг. В определенных вариантах осуществления пациенту вводят по меньшей мере две дозы AZD9150, где доза составляет приблизительно 3 мг/кг. В определенных вариантах осуществления вес тела субъекта рассчитывают как идеальный вес тела с применением формулы Девина.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере две дозы вводят с интервалом в приблизительно четыре недели. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере две дозы вводят с интервалом в приблизительно двенадцать недель.
В определенных вариантах осуществления введение средств, таких как MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент и/или AZD9150, в соответствии со способами, представленными в данном документе, осуществляют посредством парентерального введения. Например, один или оба средства можно вводить посредством внутривенной инфузии или посредством подкожной инъекции. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют посредством внутривенной инфузии.
Эффективное лечение с помощью комбинации иммуномодулятора (такого как антитело к CTLA-4, антитело к PD-L1, антитело к PD-1 и агонист OX40) и антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3 (такого как AZD9150), включает, например, снижение скорости прогрессирования рака, замедление или стабилизацию роста опухоли или метастазов, уменьшение размеров опухоли и/или регрессию опухоли в месте локализации первичной опухоли либо в одном или нескольких метастазах. В некоторых аспектах снижение темпов или замедление роста опухоли может быть статистически значимым. Снижение темпов роста опухоли можно измерять путем сравнения с ростом опухоли пациента на исходном уровне, с ожидаемым ростом опухоли, с ожидаемым ростом опухоли по данным из большой группы пациентов или с ростом опухоли в контрольной группе. В других вариантах осуществления с помощью способов по настоящему изобретению увеличивают выживаемость.
Клинический ответ на введение иммуномодулятора (такого как антитело к CTLA-4, антитело к PD-L1, антитело к PD-1 и агонист OX40) и антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3 (такого как AZD9150), можно оценить с помощью диагностических методик, известных клиницистам, в том числе без ограничения сканирующей магнитно-резонансной томографии (MRI), рентгенографии, сканирующей компьютерной томографии (CT), анализа по методу проточной цитометрии или сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS), гистологического исследования, макропатологического исследования и биохимического анализа крови, включая без ограничения изменения, выявляемые с помощью ELISA, RIA и хроматографии.
С помощью способов, представленных в данном документе, можно уменьшать темпы роста раковой опухоли или замедлять его. В некоторых случаях снижение темпов или замедление может быть статистически значимым. Снижение темпов роста опухоли можно измерять путем сравнения с ростом опухоли пациента на исходном уровне, с ожидаемым ростом опухоли, с ожидаемым ростом опухоли по данным из большой группы пациентов или с ростом опухоли в контрольной группе.
В определенных вариантах осуществления путем введения дозы антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, и иммуномодулирующего средства уменьшают размер опухоли или объем опухоли у субъекта. В определенных вариантах осуществления путем введения дозы антисмыслового соединения и иммуномодулирующего средства продлевают выживание субъекта. В определенных вариантах осуществления путем введения дозы антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, и иммуномодулирующего средства лечат рак, такой как В-клеточная лимфома, у субъекта. В определенных вариантах осуществления способ является эффективным для лечения рака и приемлемо переносимым субъектом.
В определенных вариантах осуществления ответ опухоли измеряют с применением иммунозависимых критериев ответа (irRc). В определенных вариантах осуществления ответ опухоли измеряют с применением критериев оценки ответа солидных опухолей (RECIST).
В определенных вариантах осуществления ответ опухоли поддается выявлению в неделю 7 или после нее, как, например, в неделю 13, в неделю 25, в неделю 41, в неделю 52.
В определенных вариантах осуществления пациент достигает контроля над заболеванием (DC). Контролем над заболеванием может быть полный ответ (CR), частичный ответ (PR) или стабилизация заболевания (SD).
"Полный ответ" (CR) относится к исчезновению всех очагов, независимо от того, поддаются ли они измерению, и отсутствию новых очагов. Подтверждение можно получить с помощью повторной последующей оценки не ранее чем через четыре недели с даты первого документального подтверждения. Новые не поддающиеся измерению очаги исключают CR.
"Частичный ответ" (PR) относится к уменьшению опухолевой нагрузки на ≥ 30% по сравнению с исходным уровнем. Подтверждение можно получить с помощью последующей повторной оценки через по меньшей мере 4 недели с даты первого документального подтверждения.
"Стабилизация заболевания" (SD) указывает на то, что не может быть установлено уменьшение опухолевой нагрузки менее чем на 30% по сравнению с исходным уровнем и не может быть установлено увеличение на 20% или более по сравнению с наиболее низким уровнем.
В определенных вариантах осуществления путем введения иммуномодулирующего средства и антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, можно увеличить выживаемость без прогрессирования (PFS).
В определенных вариантах осуществления путем введения иммуномодулирующего средства и антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, можно увеличить общую выживаемость (OS).
В определенных вариантах осуществления путем введения MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и AZD9150 можно увеличить выживаемость без прогрессирования (PFS).
В определенных вариантах осуществления путем введения MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и AZD9150 можно увеличить общую выживаемость (OS).
В некоторых вариантах осуществления пациент ранее получал лечение по меньшей мере одним химиотерапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления пациент ранее получал лечение по меньшей мере двумя химиотерапевтическими средствами. Химиотерапевтическим средством может быть, например, без ограничения, вемурафениб, гефитиниб, эрлотиниб, афатиниб, цетуксимаб, карбоплатин, бевацизумаб и/или пеметрексед.
В некоторых вариантах осуществления рак является рефрактерным или резистентным по меньшей мере к одному химиотерапевтическому средству. В некоторых вариантах осуществления рак является рефрактерным или резистентным по меньшей мере к двум химиотерапевтическим средствам. Рак может быть рефрактерным или резистентным к одному или нескольким из, например, без ограничения, вемурафениба, гефитиниба, эрлотиниба, афатиниба, цетуксимаба, карбоплатина, бевацизумаба и/или пеметрекседа.
et al. Am. J. Clin. Oncol. 5
В некоторых вариантах осуществления пациент имеет показатель общего состояния 0, 1 или 2 согласно Восточной объединенной онкологической группе (ECOG) (Oken MM, : 649-55 (1982)) перед введением MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и AZD9150.
Как представлено в данном документе, MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент также может снижать уровни свободного (растворимого) PD-L1. Свободный (растворимый) PD-L1 относится к PD-L1, который не является связанным (например, с MEDI4736). В некоторых вариантах осуществления уровни sPD-L1 являются сниженными и/или не поддающимися выявлению после введения MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и AZD9150. В некоторых вариантах осуществления путем введения MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и AZD9150 снижают скорость увеличения уровней свободного (растворимого) PD-L1 по сравнению, например, со скоростью увеличения уровней свободного (растворимого) PD-L1 до введения.
Лечение пациента, у которого имеется рак, с применением как (i) иммуномодулирующего средства, такого как MEDI4736, или его антигенсвязывающего фрагмента; так и (ii) антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, такого как AZD9150 (т.е. совместная терапия), как представлено в данном документе, может привести к аддитивному и/или синергическому эффекту. Применяемый в данном документе термин "синергический" относится к комбинации терапевтических средств (например, к комбинации MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и AZD9150), которая является более эффективной, чем аддитивные эффекты отдельных терапевтических средств.
Синергический эффект комбинации терапевтических средств (например, комбинации MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и AZD9150) может сделать возможным применение более низких доз одного или нескольких терапевтических средств и/или менее частое введение указанных терапевтических средств пациенту с раком. Возможность использования более низких доз терапевтических средств и/или менее частого введения указанных терапевтических средств позволяет снизить токсичность, ассоциированную с введением указанных терапевтических средств субъекту, без снижения эффективности указанных терапевтических средств при лечении рака. Кроме того, синергический эффект может в результате приводить к улучшению эффективности терапевтических средств при контроле, лечении или облегчении рака. Благодаря синергическому эффекту комбинации терапевтических средств можно избежать неблагоприятных или нежелательных побочных эффектов, ассоциированных с применением любого отдельного терапевтического средства, или снизить их. Синергический эффект комбинации терапевтических средств может также проявляться в виде уменьшения опухолевой массы (или регрессии опухоли). Синергический эффект комбинации терапевтических средств может также проявляться в виде устойчивого снижения скорости роста опухоли.
При совместной терапии иммуномодулирующее средство (такое как MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент) может быть необязательно включено в ту же фармацевтическую композицию, что и антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3 (такое как AZD9150), или может быть включено в отдельную фармацевтическую композицию. В этом последнем случае фармацевтическая композиция, содержащая иммуномодулирующее средство, подходит для введения перед введением фармацевтической композиции, содержащей антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, одновременно с ним или после него. В определенных случаях иммуномодулирующее средство вводят в перекрывающиеся моменты времени с антисмысловым соединением, нацеленным на STAT3, в отдельной композиции.
Наборы
В другом аспекте в настоящем изобретении представлены наборы для лечения рака, содержащие: (i) антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3 (такое как AZD9150); и (ii) иммуномодулирующее средство (такое как антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент). В одном из вариантов осуществления набор содержит терапевтическую композицию, содержащую иммуномодулирующее средство (такое как антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент) и антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3 (такое как AZD9150), каждое из которых находится в единичной лекарственной форме. В определенных вариантах осуществления антисмысловым соединением, нацеленным на STAT3, может быть AZD9150, и/или иммуномодулирующее средство может быть выбрано из группы, состоящей из MEDI4736, MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714, MDX-1105, ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, MPDL3280A, тремелимумаба, ипилимумаба и OX40L FP.
Если иммуномодулирующим средством является антитело к PD-L1, оно может быть выбрано из MEDI4736, MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714 и MDX-1105 или антигенсвязывающего фрагмента любого из них.
В некоторых вариантах осуществления набор содержит стерильный контейнер, в котором находится одна или несколько терапевтических композиций; такие контейнеры могут представлять собой коробки, ампулы, бутыли, флаконы, пробирки, пакеты, саше, блистерные упаковки или другие подходящие формы контейнеров, известные в данной области техники. Такие контейнеры могут быть изготовлены из пластмассы, стекла, ламинированной бумаги, металлической фольги или других материалов, подходящих для хранения лекарственных препаратов.
При необходимости набор дополнительно содержит инструкции по введению иммуномодулирующего средства (например, антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента) и антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3 (например, AZD9150), субъекту, у которого имеется рак. В конкретных вариантах осуществления инструкции включают по меньшей мере одно из следующего: описание терапевтического(терапевтических) средства(средств); схему дозирования и введения для лечения или предупреждения рака или его симптомов; меры предосторожности; предупреждения; показания; противопоказания; информацию о передозировке; побочные реакции; фармакологические свойства у животных; клинические исследования и/или справочные материалы. Инструкции могут быть напечатаны непосредственно на контейнере (при его наличии) или быть представлены в виде этикетки, прикрепленной к контейнеру, или в виде отдельного листка, брошюры, карточки или буклета, поставляемых внутри контейнера или вместе с ним.
В другом аспекте представлен продукт, содержащий антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, и иммуномодулирующее средство, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении рака.
В таком продукте антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, представляет собой или может представлять собой AZD9150, и/или иммуномодулирующее средство представляет собой MEDI4736, MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714, MDX-1105, ниволумаб, пембролизумаб, пидилизумаб, MPDL3280A, тремелимумаб, ипилимумаб и OX40L FP или может быть выбрано из них.
В другом варианте осуществления в таком продукте антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, представляет собой или может представлять собой AZD9150, и/или антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой MEDI4736, MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714 и MDX-1105 или антигенсвязывающий фрагмент любого из них или могут быть выбраны из них.
При практическом применении настоящего изобретения используют, если не указано иное, традиционные методики молекулярной биологии (в том числе рекомбинантные методики), микробиологии, клеточной биологии, биохимии, иммуногистохимии и иммунологии, которые полностью находятся в пределах компетенции специалиста в данной области. Такие методики в полном объеме поясняются в литературе, такой как ʺMolecular Cloning: A Laboratory Manualʺ, второе издание (Sambrook, 1989); ʺOligonucleotide Synthesisʺ (Gait, 1984); ʺAnimal Cell Cultureʺ (Freshney, 1987); ʺMethods in Enzymologyʺ, ʺHandbook of Experimental Immunologyʺ (Weir, 1996); ʺGene Transfer Vectors for Mammalian Cellsʺ (Miller and Calos, 1987); ʺCurrent Protocols in Molecular Biologyʺ (Ausubel, 1987); ʺPCR: The Polymerase Chain Reactionʺ, (Mullis, 1994); ʺCurrent Protocols in Immunologyʺ (Coligan et al., 1991). Эти методики применимы для получения полинуклеотидов и полипептидов по настоящему изобретению и в силу этого могут рассматриваться при производстве и практическом применении настоящего изобретения. Особенно пригодные методики для конкретных вариантов осуществления будут обсуждаться в следующих разделах.
Следующие примеры и фигуры приведены для того, чтобы обеспечить средних специалистов в данной области полным раскрытием и описанием того, как создавать и применять различные аспекты настоящего изобретения, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения считают своим изобретением.
Подписи к фигурам
Фигура 1 Лейкоциты, инфильтрирующие опухоль, в опухолях из CT-26 мышей, обработанных с помощью ASO, воздействующего на muSTAT3 (% от общего количества живых клеток по сравнению с контролем со средой).
Фигура 2 Объемы опухолей из CT-26 (среднее значение +/- SEM (2a) и для отдельных мышей (2b) и (2c)) после обработки с помощью ASO, воздействующего на мышиный STAT3, в качестве отдельного средства и в комбинации с антителом, нацеленным на PD-L1.
Фигура 3 Объемы опухолей из CT-26 после обработки с помощью ASO, воздействующего на мышиный STAT3, в качестве отдельного средства и в комбинации с Ab к PD-L1, Ab к CTLA-4 или белком слияния на основе лиганда OX40.
Фигура 4 Объемы опухолей из CT-26 после обработки с помощью AZD9150, Ab к PD-L1 или Ab изотипического
контроля в качестве отдельных средств или с помощью комбинации AZD9150 и Ab к PD-L1.
Фигура 5 Лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, в опухолях из CT-26 мышей, обработанных с помощью селективного ингибитора JAK1 (% от общего количества живых клеток по сравнению с контролем со средой).
Фигура 6 Объемы опухолей из CT-26 после обработки с помощью AZ-JAK1, Ab к PD-L1 или комбинации двух видов обработки. Среднее значение ± SEM.
Фигура 7 Уровни мРНК STAT3 в образцах опухолей и крови от мышей, несущих опухоли из CT-26, после обработки с помощью ASO, воздействующего на STAT3, Ab к PD-L1 или комбинации двух видов обработки. Среднее значение +/- SEM для 4 образцов из каждой группы обработки.
Примеры
Пример 1. Доклинические исследования, демонстрирующие, что ингибирование STAT3 с применением ASO у мышей укрепляет иммунную систему
Применяемые антисмысловые олигонуклеотиды
Оба применяемых ASO представляют собой гэпмеры 3-10-3 с химической структурой cET и фосфотиоатными связями, все основания представляют собой 2'-дезоксинуклеозиды. "Фланговые" части подчеркнуты.
ASO, воздействующий на мышиный STAT3
GAA
CCA
: ATTCATTCTT (SEQ ID NO: 11)
Контрольный ASO
GGC
TCA
: TACTACGCCG (SEQ ID NO: 12)
Олигонуклеотиды могут быть синтезированы в соответствии со стандартными методиками, такими как описанные у Seth et al. (J Med Chem. 52(1): 10-13, 2009).
5
Мышиные клетки опухоли толстой кишки CT-26 (5×10/мышь) имплантировали подкожно самкам мышей BALB/c. Мышей произвольно распределяли в группы по 8 особей (по весу тела) и обрабатывали с помощью среды PBS, ненацеленного контрольного антисмыслового олигонуклеотида (ASO) (SEQ ID NO: 12) либо ASO, нацеленного на мышиный STAT3 (SEQ ID NO: 11), при 50 мг/кг. Все ASO составляли в PBS и дозировали подкожно при 50 мг/кг, QD, по схеме 5 дней применения/2 дня отдыха, начиная через 2 дня после имплантации опухоли. В 12 и 26 дни после начала дозирования выбирали 4 мышей из каждой группы, и опухоли отбирали и обрабатывали для анализа по методу проточной цитометрии. Клетки из опухолей, отобранных в день 12 (неделю 2), объединяли перед анализом по причине малого размера опухоли, тогда как опухоли, отобранные в день 26 (неделю 4), анализировали по отдельности. CD45+ клетки оценивали количественно в недели 2 и 4. Макрофаги оценивали количественно в неделю 4. Различные клетки идентифицировали и оценивали количественно посредством иммунного окрашивания и анализа по методу проточной цитометрии с применением проточного цитометра BD FACS Canto II и программного обеспечения FlowJo.
При практическом применении настоящего изобретения используют, если не указано иное, традиционные методики клеточной биологии, иммуногистохимии и иммунологии, которые полностью находятся в пределах компетенции специалиста в данной области. Такие методики в полном объеме поясняются в литературе, такой как ʺHandbook of Experimental Immunologyʺ (Weir, 1996) и ʺCurrent Protocols in Immunologyʺ (Coligan et al., 1991).
Обработка с помощью ASO, воздействующего на STAT3, приводила к изменениям в инфильтрате из иммунных клеток в опухоли по сравнению с мышами, обработанными с помощью среды и контрольного ASO (фигура 1). Увеличение общего количества инфильтрата из иммунных клеток (CD45+ лейкоцитов) в группе обработки с помощью ASO, воздействующего на мышиный STAT3, по сравнению с группами обработки с помощью среды и контрольного ASO наблюдали в недели 2 (149%) и 4 (353%). Уровни макрофагов (CD45+ F4/80+) были более низкими (65% уменьшение) в опухолях в неделю 4.
Повышение уровня CD45+ клеток, инфильтрирующих опухоль, в сочетании с уменьшением уровня макрофагов, инфильтрирующих опухоль, указывает на иммуномодуляцию и усиление противоопухолевого иммунного ответа, ассоциированного с обработкой с помощью ASO, воздействующего на STAT3.
Пример 2. Предварительная обработка по сравнению с одновременной обработкой с помощью ASO, воздействующего на мышиный STAT3, в комбинации с обработкой с помощью антитела к PD-L1 обеспечивает повышенную противоопухолевую активность
5
2
Мышиные клетки опухоли толстой кишки CT-26 (5×10/мышь) имплантировали подкожно самкам мышей BALB/c. Мышей обрабатывали с помощью среды PBS, ASO, воздействующего на мышиный STAT3 (такого же, какой применялся в примере 1), антитела к PD-L1 (антитела к мышиному PD-L1, клона 10F.9G2, крысиного изотипа IgG2b, приобретенного у BioXCell, Вест-Лебанон, Нью-Гэмпшир), Ab изотипического контроля (крысиного IgG2b, продукта LTF-2, приобретенного у BioXCell, Вест-Лебанон, Нью-Гэмпшир) либо комбинации ASO, воздействующий на мышиный STAT3+антитело к PD-L1. Виды обработки с помощью ASO начиналась до произвольного распределения в группы обработки (день 2 после имплантации) либо в момент произвольного распределения (день 9 после имплантации). К моменту произвольного распределения объем опухолей у мышей, получавших обработку с помощью ASO, значимо не отличался от объема опухолей у мышей, которые не получали обработку с помощью ASO. В каждой группе обработки было по десять мышей. ASO составляли в PBS и дозировали подкожно. Ab также составляли в PBS и дозировали внутрибрюшинно. В ходе эксперимента длину и ширину опухоли измеряли с помощью штангенциркуля, а объем опухоли рассчитывали с применением формулы объем=(длина x ширина)* π/6.
Как показано на фигуре 2a, обработка с помощью контрольного Ab не оказывала значительного эффекта на рост опухоли. Обработка с помощью ASO, воздействующего на мышиный STAT3, и Ab к PD-L1 в качестве отдельных средств оказывала незначительный эффект на рост опухоли. Обработка с помощью комбинации ASO, воздействующий на STAT3+Ab к PD-L1 характеризовалась большей противоопухолевой активностью, чем виды обработки отдельными средствами.
Если обработка с помощью ASO, воздействующего на STAT3, начиналась до обработки с помощью Ab к PD-L1 (обработка с помощью ASO начиналась в день 2, а обработка с помощью Ab начиналась в день 9), то регрессию опухоли наблюдали у 6/10 мышей (60%), тогда как если оба вида обработки начинались в день 9, то регрессию опухоли наблюдали только у 1/10 мышей (10%). На фигуре 2a показано среднее значение +/- SEM. На фигуре 2b показаны отдельные животные для комбинации при одновременном дозировании. На фигуре 2c показаны отдельные животные для комбинации при предварительном дозировании ASO.
Данные результаты указывают на то, что начало обработки с помощью ASO, воздействующего на STAT3, до обработки ингибитором контрольных точек обеспечивает большую противоопухолевую активность. Таким образом, обеспечение текущей реализации иммуностимулирующих эффектов обработки с помощью ASO, воздействующего на STAT3, к моменту обработки ингибитором контрольных точек, по-видимому, является благоприятным.
Пример 3. Дополнительная обработка с помощью ASO, воздействующего на мышиный STAT3, повышает противоопухолевую активность антител, нацеленных на PD-L1 и CTLA-4, и белка слияния на основе лиганда OX40 в сингенных мышиных моделях опухолей
Применяемые ингибиторы контрольных точек или иммуностимуляторы
Антитела к мышиному CTLA-4: клон 9D9, мышиный изотип IgG2b. Приобретены у BioXCell, Вест-Лебанон, Нью-Гэмпшир.
Антитела к мышиному PD-L1: клон 10F.9G2, крысиный изотип IgG2b. Приобретены у BioXCell, Вест-Лебанон, Нью-Гэмпшир.
Мышиный белок слияния на основе лиганда OX40 (mIgG1FcmTF2mOX40L или OX40FP) был продуктом собственного производства. Последовательности ДНК и аминокислотные последовательности представлены под SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38 соответственно.
Противоопухолевую эффективность ASO, воздействующего на мышиный STAT3, в комбинации с антителами, нацеленными на PD-L1 или CTLA-4, или с белком слияния на основе лиганда OX40 оценивали в трех сингенных мышиных моделях опухолей: CT-26 (колоректальный рак), 4T1 (рак молочной железы) и A20 (лимфома). Подробности имплантации опухоли и схемы обработки для каждой модели находятся в таблице ниже. Схема дозирования QDx5/неделя для ASO, воздействующего на STAT3 (такого же ASO, какой применялся в примере 1), представляла собой 5 дней обработки с последующими 2 днями без обработки. Схема дозирования 2X/неделя для антител представляла собой 2 обработки/неделя, равномерно распределенные в течение недели (например, понедельник и четверг или вторник и пятница и т.д.). Обработка с помощью ASO начиналась до произвольного распределения в группы обработки. К моменту произвольного распределения объем опухолей у мышей, получавших обработку с помощью ASO, значимо не отличался от объема опухолей у мышей, которые не получали обработку с помощью ASO. В каждой группе обработки было по десять мышей.
CT-26
4T1
A20
Имплантация
0,5 миллиона клеток подкожно в правый бок
0,4 миллиона клеток в жировую подушку молочной железы
1 миллион клеток подкожно в правый бок
Объем опухоли к моменту произвольного распределения
Среднее значение: 147 мм<sup>3</sup>Диапазон: 58-248 мм<sup>3</sup>
Среднее значение: 123 мм<sup>3</sup>Диапазон: 70-182 мм<sup>3</sup>
Среднее значение: 218 мм<sup>3</sup>Диапазон: 122-277 мм<sup>3</sup>
Схема обработки с помощью ASO
Начало за 7 дней до обработки с помощью Ab или FP, QDx5/неделя в течение 4 недель, дозирование SC
Начало за 5 дней до обработки с помощью Ab или FP, QDx7/неделя в течение 1 недели, затем QDx5/неделя в течение 3 недель, дозирование SC
Начало за 4 дня до обработки с помощью Ab или FP, QDx5/неделя в течение 3 недель, дозирование SC
Произвольное распределение (дни после имплантации)
7
5
13
Схема дозирования для антител к PD-L1 и CTLA-4 (начало через день после произвольного распределения)
2X/неделя в течение 3 недель, дозирование IP
2X/неделя в течение 1 недели, дозирование IP
2X/неделя в течение 2 недель, дозирование IP
Схема дозирования для белка слияния на основе OX40 (начало через день после произвольного распределения)
2X/неделя в течение 1 недели, дозирование IP
2X/неделя в течение 1 недели, дозирование IP
2X/неделя в течение 1 недели, дозирование IP
2
ASO, воздействующий на мышиный STAT3, составляли в PBS и дозировали подкожно. Ab и FP также составляли в PBS и дозировали внутрибрюшинно. В ходе эксперимента длину и ширину опухоли измеряли с помощью штангенциркуля, а объем опухоли рассчитывали с применением формулы объем=(длина x ширина)* π/6.
Результаты показаны на фигуре 3. При применяемых в данном эксперименте дозах и схемах Ab к PD-L1 и к CTLA-4, FP на основе лиганда OX40 и ASO, нацеленный на мышиный STAT3, характеризовались противоопухолевой активностью отдельных средств от слабой до умеренной. Дополнительная обработка с помощью ASO, воздействующего на мышиный STAT3, значительно повышала противоопухолевую активность обработки с помощью антитела и FP во многих случаях. В определенных случаях эффект, по-видимому, является синергическим. Добавление ASO, воздействующего на мышиный STAT3, к Ab к PD-L1, Ab к CTLA-4 или FP на основе лиганда OX40 приводило к незначительной остановке роста или регрессии опухоли в моделях CT-26 и A20. В модели 4T1 комбинация ASO, воздействующего на мышиный STAT3, и антитела к CTLA-4 приводила к регрессии опухоли. В дополнение, комбинированная обработка приводила к долгосрочным полным ответам (отсутствию поддающихся измерению опухолей через несколько недель после окончания лечения) у некоторых отдельных мышей, в том числе у 30% (3/10) мышей при использовании комбинации ASO, воздействующий на мышиный STAT3+Ab к CTLA-4 в моделях CT-26, 4T1 и A20; у 20% (2/10) при использовании комбинации с PD-L1 в модели A20 и у 50% (5/10) при использовании комбинации с OX40 в модели A20.
Повышенная противоопухолевая активность при комбинированной обработке по сравнению с отдельными средствами в данных моделях указывает на потенциал обработки с помощью антисмысловой молекулы, нацеленной на STAT3, к повышению активности применяемых ингибиторов контрольных точек или иммуностимуляторов, в том числе средств, нацеленных на PD-L1, CTLA-4 и OX40, в нескольких типах опухолей. Активность комбинации согласуется с механизмом, посредством которого обработка с помощью ASO, воздействующего на STAT3, приводит к увеличению количества инфильтрата из иммунных клеток с противоопухолевой активностью в опухоли (пример 1), что обеспечивает усиление ингибирования роста опухоли при блокировании иммунных контрольных точек посредством обработки с помощью терапевтических средств, нацеленных на PD-L1 и CTLA-4, или при применении иммуностимуляторов, таких как агонисты OX40.
Пример 4. У мышей, несущих опухоли из CT-26, не наблюдается противоопухолевая активность при использовании контрольных ASO и контрольных антител
Эксперимент с CT-26 в примере 3 включал обработку с помощью контрольного ASO (AZD9150) и антитела изотипического контроля (крысиного IgG2b, продукта LTF-2, приобретенного у BioXCell, Вест-Лебанон, Нью-Гэмпшир) в качестве отрицательных контролей. Молекулу ASO AZD9150, нацеленную на человеческий STAT3, можно применять в качестве контроля в мышиных моделях опухоли, поскольку она не обладает перекрестной реактивностью с мышиными последовательностями STAT3. Как показано на фигуре 4 и в отличие от активности ASO, нацеленного на мышиный STAT3, описанной в примерах 2 и 3, обработка с помощью контрольного ASO не приводила к повышению активности антитела к PD-L1. Эти результаты согласуются с активностью ASO, воздействующего на мышиный STAT3, и антител к PD-L1, будучи обусловленными целевой активностью этих средств.
Пример 5. Ингибирование STAT3 с помощью низкомолекулярного ингибитора JAK1 подавляет иммунную систему
5
3
Мышиные клетки опухоли толстой кишки CT-26 (5×10/мышь) имплантировали подкожно самкам мышей BALB/c. Через десять дней после имплантации мышей произвольно распределяли в группы по 4 особи при среднем объеме опухоли 122 мм и обрабатывали с помощью селективного низкомолекулярного ингибитора JAK1 (AZ-3;Woessner et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 54: 931, 2013) либо среды. AZ-3 в дальнейшем в данном документе упоминается как AZ-JAK1. AZ-JAK1 составляли в воде и дозировали перорально при 100 мг/кг, BID, в течение 11 дней. В день 11 опухоли отбирали и обрабатывали для анализа по методу проточной цитометрии. Опухоли из каждой группы объединяли перед анализом для обеспечения выявления популяций клеток с низким процентным содержанием с помощью проточной цитометрии. Количественно оценивали CD45+ лейкоциты, CD4+ и CD8+ T-клетки, CD11c+ MHCII+ дендритные клетки и CD11b+ Gr1+ миелоидные супрессорные клетки.
Обработка с помощью селективного ингибитора JAK1 приводила к уменьшению количества T-клеток, дендритных клеток и миелоидных супрессорных клеток (фигура 5), что указывало на то, что обработка обеспечивала обширное подавление иммунитета в отличие от обработки с помощью ASO, воздействующего на STAT3 (фигура 1). Данные указывают на то, что селективное ингибирование STAT3 с помощью антисмыслового олигонуклеотида, нацеленного на STAT3, может усиливать противоопухолевый иммунный ответ, тогда как ингибирование JAK1, при котором ингибируется передача сигнала с помощью некоторых STAT, в том числе STAT3, а также STAT 1, 4 и 6, обеспечивает обширное подавление иммунитета.
Пример 6. Ингибирование JAK1 противодействует противоопухолевой активности Ab к PD-L1 и к CTLA-4 у мышей, несущих развившиеся опухоли из CT-26
5
3
2
Мышиные клетки опухоли толстой кишки CT-26 (5×10/мышь) имплантировали подкожно самкам мышей BALB/c. В день 14 после имплантации мышей произвольно распределяли в группы по 10 особей (по объему опухоли) и обрабатывали с помощью среды PBS, селективного низкомолекулярного ингибитора JAK1 (AZ-JAK1) при 100 мг/кг BID, антитела к PD-L1 (клона 10F.9G2) при 2,5 мг/кг дважды в неделю, антитела к CTLA-4 (клона 9D9) при 1 мг/кг дважды в неделю либо комбинаций AZ-JAK1+Ab к PD-L1 или AZ-JAK1+Ab к CTLA-4. AZ-JAK1 составляли в воде и дозировали перорально. Антитела составляли в PBS и дозировали внутрибрюшинно. Средний размер опухоли в начале обработки составлял ~ 140 мм. В ходе эксперимента длину и ширину опухоли измеряли с помощью штангенциркуля, а объем опухоли рассчитывали с применением формулы объем=(длина x ширина)* π/6.
Результаты показаны на фигуре 6. Обработка с помощью антитела к PD-L1 и антитела к CTLA-4 в качестве отдельных средств приводила к ингибированию роста опухоли. Обработка с помощью AZ-JAK1 приводила к незначительному увеличению средней скорости роста опухоли по сравнению с контролем со средой. Добавление AZ-JAK1 к Ab к PD-L1 или к Ab к CTLA-4 противодействовало противоопухолевой активности антител, в результате чего скорость роста опухоли была аналогичной таковой для отдельного средства AZ-JAK1. Все виды обработки хорошо переносились без значительных внешних признаков в течение курса лечения. Средний вес мыши в конце обработки был большим, чем вес в начале обработки во всех группах.
Повышение активности Ab к PD-L1 или к CTLA-4 при добавлении ASO, воздействующего на STAT3 (фигуры 2 и 3), по сравнению с противодействием активности антител при добавлении ингибитора JAK1 (фигура 6) указывает на дифференциальный эффект, который зависит от механизма ингибирования STAT3 (селективное снижение уровня белка STAT3 при обработке с помощью ASO, воздействующего на STAT3, по сравнению с ингибированием передачи сигнала, опосредованной несколькими STAT, в том числе STAT 1, 3, 4 и 6, при обработке ингибитором JAK1).
Стимуляция иммунитета и противоопухолевая активность при обработке с помощью ASO, воздействующего на STAT3 (фигуры 1-3), по сравнению с подавлением иммунитета и с противодействием активности Ab к PD-L1 и к CTLA-4 при использовании AZ-JAK1 (фигуры 5 и 6) указывают на то, что активность комбинации при обработке с помощью ASO, воздействующего на STAT3+Ab PD-L1 зависит от прямого селективного ингибирования STAT3 и не может быть воссоздана (и в действительности подвергается противодействию) в других подходах к ингибированию передачи сигнала с помощью JAK/STAT, таких как ингибирование JAK1.
Пример 7. Данные, демонстрирующие нокдаун STAT3 в опухолях из CT-26 и крови при обработке с помощью ASO, воздействующего на STAT3
Для подтверждения нокдауна мРНК STAT3 с помощью ASO, нацеленного на STAT3, мышей, несущих подкожные опухоли из CT-26, обрабатывали средой, ASO, воздействующим на мышиный STAT3 (таким же ASO, какой применялся в примере 1; QD, 50 мг/кг в течение 3,5 недели), Ab к PD-L1 (антителом к мышиному PD-L1: клон 10F.9G2, крысиный изотип IgG2b; 2X/неделя, 2,5 мг/кг в течение 3,5 недели) или комбинацией ASO, воздействующего на STAT3, и Ab к PD-L1, и образцы крови и опухоли собирали в конце эксперимента и анализировали в отношении уровня мРНК STAT3. В каждой группе обработки собирали образцы от 4 мышей и обрабатывали для анализа по методу qRT-PCR. Кровь собирали в реактив PAXgene, и РНК получали в соответствии с указаниями к набору (Qiagen, номер по каталогу 762164). Опухоли собирали в RNAlater (Qiagen) и обрабатывали для получения РНК в соответствии с указаниями к набору (Qiagen, номер по каталогу 74104) для анализа по методу qRT-PCR. Уровень мРНК STAT3, измеренный с помощью qRT-PCR, нормализовали по количеству мРНК GAPDH в каждом образце. Наборы праймер/зонд были приобретены у ABI: № по каталогу 4331182 для мышиного STAT3, № по каталогу 4352339E для мышиного GAPDH.
Нокдаун мРНК STAT3 в крови и опухоли после обработки с помощью ASO, воздействующего на STAT3, составлял соответственно 53% и 70% (фигура 7). Мыши с нокдауном мРНК STAT3, обработанные с помощью Ab к PD-L1+ASO, воздействующего на STAT3, значимо не отличались от мышей, обработанных с помощью ASO, воздействующего на STAT3, в отдельности.
Пример 8. Изменения в экспрессии генов у пациентов с DLBCL, обработанных с помощью AZD9150
Биоптаты опухоли отбирали в клиническом испытании в фазе I у пациентов с раком, которых обрабатывали с помощью AZD9150, до начала обработки и на 4-6 неделях после начала обработки. Пациенты получали три нагрузочные дозы по 2 или 3 мг/кг AZD9150 в течение первой недели в дни 1, 3 и 5, а затем после этого еженедельные дозы. Девять наборов биоптатов были получены от пациентов с диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой, два были получены от пациентов с фолликулярной лимфомой, и один был получен от пациента с немелкоклеточным раком легкого. Биоптаты фиксировали в формалине и заливали в парафин, и из них получали срезы. РНК выделяли из шести пятимикронных срезов из каждого биоптата и подвергали анализу профиля экспрессии генов Nanostring с помощью набора штрих-кодов nCounter для применения в иммунологии человека, в котором представлено 594 гена, связанных с иммунитетом. Необработанные данные калибровали в соответствии с Veldman-Jones et al., (Cancer Research. 75:2587, 2015) и анализировали на наличие изменений, появившихся в процессе обработки, по сравнению с исходным уровнем в образцах до обработки. Создавали тепловую карту, на которой была представлена неконтролируемая кластеризация наибольших и наиболее статистически значимых изменений экспрессии генов при DLBCL. Среди генов, экспрессия которых повышалась под действием AZD9150, пять из шести генов составляли ʺгенную сигнатуру интерферона-гаммаʺ, которая, как сообщается, коррелирует с клинически благоприятным эффектом пембролизумаба, терапевтического антитела, нацеленного на PD1 (Plimack et al, J Clin Oncol 33, 2015 (suppl; abstr 4502). Этими пятью генами ʺгенной сигнатуры интерферона-гаммаʺ, экспрессия которых повышалась под действием AZD9150, были STAT1, IFN-гамма, CXCL9, CXCL10 и IDO. Эти данные указывают на иммуномодуляцию в микроокружении опухоли после обработки пациентов с помощью AZD9150 и свидетельствуют о том, что обработка с помощью AZD9150 может делать опухоли пациентов в большей степени отвечающими на терапию, направленную на ось PD(L)1.
Пример 9. Предполагаемые испытания комбинаций
Планируются клинические испытания комбинации MEDI4736 и AZD9150 при плоскоклеточной карциноме головы и шеи (SCCHN) и диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфоме (DLBCL) для установления безопасных доз комбинации и тестирования на превосходство показателей клинического ответа по сравнению с любым из терапевтических средств в отдельности. Показания выбирали на основании проявления в предыдущих клинических испытаниях клинических ответов на монотерапию с помощью MEDI4736 при SCCHN и на терапию c помощью AZD9150 или антитела к PD1 при DLBCL.
AZD9150 составляют в физиологическом растворе и вводят посредством инфузии в дни 1, 3, 5 лечения и после этого один раз в неделю. MEDI4736 составляют в физиологическом растворе и вводят посредством внутривенной инфузии один раз в две недели, начиная в одно и то же время с первым введением AZD9150 либо через 1, 2 или более недель после введения AZD9150 для обеспечения возможность прохождения фазы нагрузочных доз AZD9150.
Пример 9а. Испытание в отношении плоскоклеточной карциномы головы и шеи (SCCHN)
Субъекты в данном исследовании должны быть в возрасте 18 лет или старше и иметь гистологически или цитологически подтвержденную SCCHN по меньшей мере с одним поддающимся измерению очагом согласно руководству "Критерии оценки ответа солидных опухолей (RECIST)" версии 1.1.
План испытания в отношении SCCHN
Исследование являлось открытым исследованием в фазе 1/2 в отношении комбинации антитела к PD-L1 (MEDI4736) и ASO, воздействующего на STAT3 (AZD9150), по сравнению с AZD9150 в отдельности для установления доз, безопасности и превосходящей эффективности комбинации по сравнению с монотерапией с применением критериев RECIST.
Фаза 1a. Для установления безопасности и доз для фазы 1b небольшая когорта субъектов (например, 6 человек) будет получать комбинации AZD9150 в количестве до 3 мг/кг (начиная от 3 мг/кг и снижая при наличии проблем безопасности) и 3 или 10 мг/кг MEDI4736.
Фаза 1b. До пятидесяти пациентов будут получать дозы AZD9150+MEDI4736, установленные в фазе 1a, и до пятидесяти пациентов будут получать AZD9150 в отдельности в той же дозе, которая применяется в комбинации. Показатель ответа на монотерапию с помощью MEDI4736 в предыдущем клиническом испытании в отношении MEDI4736 при SCCHN будет применяться в качестве другого объекта сравнения с комбинированной терапией.
Для всех субъектов будут получены исходные уровни экспрессии PD-L1 в опухоли для установления корреляции с клиническими ответами. В дополнение, некоторые популяции циркулирующих лейкоцитов (например, супрессорные клетки миелоидного происхождения, MDSC) будут отслеживаться путем иммунофенотипирования для оценки корреляции с клиническим ответом.
Успех определяется как превосходящий показатель ответа или благоприятный эффект в отношении выживаемости для комбинации AZD9150 и MEDI4736 по сравнению с любым лекарственным средством в рекомендуемой для монотерапии дозе во всей группе пациентов либо в определяемой биомаркерами подсовокупности.
Пример 9b. Испытание в отношении диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (DLBCL)
Субъекты в данном исследовании должны быть в возрасте 18 лет или старше и иметь гистологически или цитологически подтвержденную DLBCL по меньшей мере с одним поддающимся измерению очагом согласно критериям Международной рабочей группы (IWG). Пациенты, подходящие для участия в исследовании, должны быть перенесшими неудачную аутологичную трансплантацию стволовых клеток (ASCT) или должны были ранее находиться по меньшей мере на двух режимах поликомпонентной химиотерапии и не являться кандидатами на ASCT.
План испытания в отношении DLBCL
Исследование являлось открытым исследованием в фазе 1/2 в отношении комбинации антитела к PD-L1 (MEDI4736) и AZD9150 по сравнению с MEDI4736 в отдельности для установления доз, безопасности и превосходящей эффективности комбинации по сравнению с монотерапией с применением критериев IWG.
Фаза 1a. Для установления безопасности и доз для фазы 1b небольшая когорта субъектов (например, 6 человек) будет получать комбинации AZD9150 в количестве до 3 мг/кг (начиная от 3 мг/кг и снижая при наличии проблем безопасности) и 3 или 10 мг/кг MEDI4736.
Фаза 1b. Не более пятидесяти пациентов будут получать дозы AZD9150+MEDI4736, установленные в фазе 1a, и не более пятидесяти пациентов будут получать MEDI4736 в отдельности в той же дозе, которая применяется в комбинации. Показатель ответа на монотерапию с помощью AZD9150 в предыдущем клиническом испытании в отношении AZD9150 при DLBCL будет применяться в качестве другого объекта сравнения с комбинированной терапией.
Для всех субъектов будут получены исходные уровни экспрессии PD-L1 в опухоли для установления корреляции с клиническими ответами. В дополнение, некоторые популяции циркулирующих лейкоцитов (например, супрессорные клетки миелоидного происхождения, MDSC) будут отслеживаться путем иммунофенотипирования для оценки корреляции с клиническим ответом.
Успех определяется как превосходящий показатель ответа или благоприятный эффект в отношении выживаемости для комбинации AZD9150 и MEDI4736 по сравнению с любым лекарственным средством в рекомендуемой для монотерапии дозе во всей группе пациентов либо в определяемой биомаркерами подсовокупности.
Другие варианты осуществления
Из вышеприведенного описания будет очевидным, что в настоящее изобретение, описанное в данном документе, можно вносить изменения и модификации для его приспособления к различным способам применения и условиям. Такие варианты осуществления также находятся в пределах объема следующей формулы изобретения.
Изложение перечня элементов в любом определении переменной в данном документе включает определения такой переменной в качестве любого отдельного элемента или комбинации (или подкомбинации) перечисленных элементов. Изложение варианта осуществления в данном документе включает такой вариант осуществления в качестве любого отдельного варианта осуществления или в комбинации с любыми другими вариантами осуществления или их частями.
Все патенты и публикации, упоминаемые в данном описании, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждый независимый патент или публикация были конкретно и отдельно указаны как включенные посредством ссылки.
В следующих дополнительных аспектах представлены:
1. Способ лечения, включающий введение (i) антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента и (ii) антисмыслового соединения, нацеленного на STAT3, пациенту, нуждающемуся в этом.
2. Способ согласно аспекту 1, где антитело к PD-L1 выбрано из MEDI4736, MPDL3280A, BMS936559, 2.7A4, AMP-714 и MDX-1105.
3. Способ согласно аспекту 2, где антитело к PD-L1 представляет собой MEDI4736.
4. Способ согласно аспекту 1, где антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, не ингибирует STAT1, STAT4 или STAT6.
5. Способ согласно аспекту 1, где антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, представляет собой антисмысловой олигонуклеотид.
6. Способ согласно аспекту 1 или аспекту 5, где антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, представляет собой AZD9150.
7. Способ согласно аспекту 1, где у пациента имеется рак.
8. Способ согласно аспекту 7, где рак выбран из рака легкого, в том числе немелкоклеточного рака легкого (NSCLC); рака молочной железы, в том числе трижды негативного; рака яичника, в том числе серозного; рака поджелудочной железы; колоректального рака; гепатоцеллюлярной карциномы (HCC); рака головы и шеи, в том числе плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC); и лимфомы, в том числе диффузной крупноклеточной В-клеточной карциномы (DLBCL).
9. Способ согласно аспекту 8, где раковые клетки экспрессируют PD-L1.
10. Способ согласно аспекту 1, где у пациента, нуждающегося в этом, было идентифицировано наличие рака, который является положительным по PD-L1.
11. Способ согласно любому из предыдущих аспектов, где антитело к PD-L1 представляет собой MEDI4736, а антисмысловое соединение, нацеленное на STAT3, представляет собой AZD9150.
12. Способ согласно аспекту 11, где пациенту, нуждающемуся в этом, вводят от приблизительно 1 мг/кг до 20 мг/кг MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и от приблизительно 1 мг/кг до 10 мг/кг AZD9150.
13. Способ согласно аспекту 12, где средство для лечения вводят каждую неделю, каждые 2 недели, каждые 3 недели или каждые 4 недели.
14. Способ согласно любому из аспектов 1-13, где вводят приблизительно 1 мг/кг MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и приблизительно 3 мг/кг AZD9150 на дозу.
15. Способ согласно любому из аспектов 1-14, где способ обуславливает увеличение выживаемости без прогрессирования и/или общей выживаемости по сравнению с введением MEDI4736 либо AZD9150 в отдельности.
16. Способ согласно любому из аспектов 2-15, где введение MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента осуществляют путем внутривенной инфузии.
17. Способ согласно любому из аспектов 4-16, где введение AZD9150 осуществляют путем внутривенной инфузии.
18. Способ согласно любому из аспектов 2-15, где AZD9150 и MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент вводят одновременно или в разные моменты времени.
19. Набор для лечения рака, при этом набор содержит MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент и AZD9150.
20. Фармацевтическая композиция, которая содержит MEDI4736 или его антигенсвязывающий фрагмент и AZD9150 вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.
21. Фармацевтическая композиция согласно аспекту 20, где фармацевтическая композиция составлена для обеспечения дозы от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и дозы от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг AZD9150.
22. Фармацевтическая композиция согласно аспекту 21, где фармацевтическая композиция составлена для обеспечения дозы приблизительно 1 мг/кг MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента и дозы приблизительно 3 мг/кг AZD9150.
23. Способ модуляции инфильтрирующих иммунных клеток у теплокровного животного, такого как человек, который включает введение указанному животному эффективного количества MEDI4736 или его антигенсвязывающего фрагмента перед эффективным количеством AZD9150, после него или одновременно с ним.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  AstraZeneca AB
<120>  КОМБИНАЦИЯ
<130>  200252-WO-PCT
<160>  38
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  4978
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
ggtttccgga gctgcggcgg cgcagactgg gagggggagc cgggggttcc gacgtcgcag       60
ccgagggaac aagccccaac cggatcctgg acaggcaccc cggcttggcg ctgtctctcc      120
ccctcggctc ggagaggccc ttcggcctga gggagcctcg ccgcccgtcc ccggcacacg      180
cgcagccccg gcctctcggc ctctgccgga gaaacagttg ggacccctga ttttagcagg      240
atggcccaat ggaatcagct acagcagctt gacacacggt acctggagca gctccatcag      300
ctctacagtg acagcttccc aatggagctg cggcagtttc tggccccttg gattgagagt      360
caagattggg catatgcggc cagcaaagaa tcacatgcca ctttggtgtt tcataatctc      420
ctgggagaga ttgaccagca gtatagccgc ttcctgcaag agtcgaatgt tctctatcag      480
cacaatctac gaagaatcaa gcagtttctt cagagcaggt atcttgagaa gccaatggag      540
attgcccgga ttgtggcccg gtgcctgtgg gaagaatcac gccttctaca gactgcagcc      600
actgcggccc agcaaggggg ccaggccaac caccccacag cagccgtggt gacggagaag      660
cagcagatgc tggagcagca ccttcaggat gtccggaaga gagtgcagga tctagaacag      720
aaaatgaaag tggtagagaa tctccaggat gactttgatt tcaactataa aaccctcaag      780
agtcaaggag acatgcaaga tctgaatgga aacaaccagt cagtgaccag gcagaagatg      840
cagcagctgg aacagatgct cactgcgctg gaccagatgc ggagaagcat cgtgagtgag      900
ctggcggggc ttttgtcagc gatggagtac gtgcagaaaa ctctcacgga cgaggagctg      960
gctgactgga agaggcggca acagattgcc tgcattggag gcccgcccaa catctgccta     1020
gatcggctag aaaactggat aacgtcatta gcagaatctc aacttcagac ccgtcaacaa     1080
attaagaaac tggaggagtt gcagcaaaaa gtttcctaca aaggggaccc cattgtacag     1140
caccggccga tgctggagga gagaatcgtg gagctgttta gaaacttaat gaaaagtgcc     1200
tttgtggtgg agcggcagcc ctgcatgccc atgcatcctg accggcccct cgtcatcaag     1260
accggcgtcc agttcactac taaagtcagg ttgctggtca aattccctga gttgaattat     1320
cagcttaaaa ttaaagtgtg cattgacaaa gactctgggg acgttgcagc tctcagagga     1380
tcccggaaat ttaacattct gggcacaaac acaaaagtga tgaacatgga agaatccaac     1440
aacggcagcc tctctgcaga attcaaacac ttgaccctga gggagcagag atgtgggaat     1500
gggggccgag ccaattgtga tgcttccctg attgtgactg aggagctgca cctgatcacc     1560
tttgagaccg aggtgtatca ccaaggcctc aagattgacc tagagaccca ctccttgcca     1620
gttgtggtga tctccaacat ctgtcagatg ccaaatgcct gggcgtccat cctgtggtac     1680
aacatgctga ccaacaatcc caagaatgta aactttttta ccaagccccc aattggaacc     1740
tgggatcaag tggccgaggt cctgagctgg cagttctcct ccaccaccaa gcgaggactg     1800
agcatcgagc agctgactac actggcagag aaactcttgg gacctggtgt gaattattca     1860
gggtgtcaga tcacatgggc taaattttgc aaagaaaaca tggctggcaa gggcttctcc     1920
ttctgggtct ggctggacaa tatcattgac cttgtgaaaa agtacatcct ggccctttgg     1980
aacgaagggt acatcatggg ctttatcagt aaggagcggg agcgggccat cttgagcact     2040
aagcctccag gcaccttcct gctaagattc agtgaaagca gcaaagaagg aggcgtcact     2100
ttcacttggg tggagaagga catcagcggt aagacccaga tccagtccgt ggaaccatac     2160
acaaagcagc agctgaacaa catgtcattt gctgaaatca tcatgggcta taagatcatg     2220
gatgctacca atatcctggt gtctccactg gtctatctct atcctgacat tcccaaggag     2280
gaggcattcg gaaagtattg tcggccagag agccaggagc atcctgaagc tgacccaggt     2340
agcgctgccc catacctgaa gaccaagttt atctgtgtga caccaacgac ctgcagcaat     2400
accattgacc tgccgatgtc cccccgcact ttagattcat tgatgcagtt tggaaataat     2460
ggtgaaggtg ctgaaccctc agcaggaggg cagtttgagt ccctcacctt tgacatggag     2520
ttgacctcgg agtgcgctac ctcccccatg tgaggagctg agaacggaag ctgcagaaag     2580
atacgactga ggcgcctacc tgcattctgc cacccctcac acagccaaac cccagatcat     2640
ctgaaactac taactttgtg gttccagatt ttttttaatc tcctacttct gctatctttg     2700
agcaatctgg gcacttttaa aaatagagaa atgagtgaat gtgggtgatc tgcttttatc     2760
taaatgcaaa taaggatgtg ttctctgaga cccatgatca ggggatgtgg cggggggtgg     2820
ctagagggag aaaaaggaaa tgtcttgtgt tgttttgttc ccctgccctc ctttctcagc     2880
agctttttgt tattgttgtt gttgttctta gacaagtgcc tcctggtgcc tgcggcatcc     2940
ttctgcctgt ttctgtaagc aaatgccaca ggccacctat agctacatac tcctggcatt     3000
gcacttttta accttgctga catccaaata gaagatagga ctatctaagc cctaggtttc     3060
tttttaaatt aagaaataat aacaattaaa gggcaaaaaa cactgtatca gcatagcctt     3120
tctgtattta agaaacttaa gcagccgggc atggtggctc acgcctgtaa tcccagcact     3180
ttgggaggcc gaggcggatc ataaggtcag gagatcaaga ccatcctggc taacacggtg     3240
aaaccccgtc tctactaaaa gtacaaaaaa ttagctgggt gtggtggtgg gcgcctgtag     3300
tcccagctac tcgggaggct gaggcaggag aatcgcttga acctgagagg cggaggttgc     3360
agtgagccaa aattgcacca ctgcacactg cactccatcc tgggcgacag tctgagactc     3420
tgtctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaagaaa cttcagttaa cagcctcctt ggtgctttaa     3480
gcattcagct tccttcaggc tggtaattta tataatccct gaaacgggct tcaggtcaaa     3540
cccttaagac atctgaagct gcaacctggc ctttggtgtt gaaataggaa ggtttaagga     3600
gaatctaagc attttagact tttttttata aatagactta ttttcctttg taatgtattg     3660
gccttttagt gagtaaggct gggcagaggg tgcttacaac cttgactccc tttctccctg     3720
gacttgatct gctgtttcag aggctaggtt gtttctgtgg gtgccttatc agggctggga     3780
tacttctgat tctggcttcc ttcctgcccc accctcccga ccccagtccc cctgatcctg     3840
ctagaggcat gtctccttgc gtgtctaaag gtccctcatc ctgtttgttt taggaatcct     3900
ggtctcagga cctcatggaa gaagaggggg agagagttac aggttggaca tgatgcacac     3960
tatggggccc cagcgacgtg tctggttgag ctcagggaat atggttctta gccagtttct     4020
tggtgatatc cagtggcact tgtaatggcg tcttcattca gttcatgcag ggcaaaggct     4080
tactgataaa cttgagtctg ccctcgtatg agggtgtata cctggcctcc ctctgaggct     4140
ggtgactcct ccctgctggg gccccacagg tgaggcagaa cagctagagg gcctccccgc     4200
ctgcccgcct tggctggcta gctcgcctct cctgtgcgta tgggaacacc tagcacgtgc     4260
tggatgggct gcctctgact cagaggcatg gccggatttg gcaactcaaa accaccttgc     4320
ctcagctgat cagagtttct gtggaattct gtttgttaaa tcaaattagc tggtctctga     4380
attaaggggg agacgacctt ctctaagatg aacagggttc gccccagtcc tcctgcctgg     4440
agacagttga tgtgtcatgc agagctctta cttctccagc aacactcttc agtacataat     4500
aagcttaact gataaacaga atatttagaa aggtgagact tgggcttacc attgggttta     4560
aatcataggg acctagggcg agggttcagg gcttctctgg agcagatatt gtcaagttca     4620
tggccttagg tagcatgtat ctggtcttaa ctctgattgt agcaaaagtt ctgagaggag     4680
ctgagccctg ttgtggccca ttaaagaaca gggtcctcag gccctgcccg cttcctgtcc     4740
actgccccct ccccatcccc agcccagccg agggaatccc gtgggttgct tacctaccta     4800
taaggtggtt tataagctgc tgtcctggcc actgcattca aattccaatg tgtacttcat     4860
agtgtaaaaa tttatattat tgtgaggttt tttgtctttt tttttttttt ttttttttgg     4920
tatattgctg tatctacttt aacttccaga aataaacgtt atataggaac cgtaaaaa       4978
<210>  2
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический олигонуклеотид (AZD9150)
<400>  2
ctatttggat gtcagc                                                       16
<210>  3
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  VL MEDI4736; последовательность 77 из PCT/US2010/058007
<400>  3
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro
85                  90                  95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  4
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  VH MEDI4736; последовательность 72 из PCT/US2010/058007
<400>  4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  5
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  CDR1 VH MEDI4736; последовательность 73 из PCT/US2010/058007
<400>  5
Arg Tyr Trp Met Ser
1               5
<210>  6
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  CDR2 VH MEDI4736; последовательность 74 из PCT/US2010/058007
<400>  6
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  7
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  CDR3 VH MEDI4736; последовательность 75 из PCT/US2010/058007
<400>  7
Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  8
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  CDR1 VL MEDI4736; последовательность 78 из PCT/US2010/058007
<400>  8
Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  9
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  CDR2 VL MEDI4736; последовательность 79 из PCT/US2010/058007
<400>  9
Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>  10
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  CDR3 VL MEDI4736; последовательность 80 из PCT/US2010/058007
<400>  10
Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr
1               5
<210>  11
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<223>  Синтетический олигонуклеотид (ASO, воздействующий на мышиный STAT3)
<400>  11
gaaattcatt cttcca                                                       16
<210>  12
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<223>  Синтетический олигонуклеотид (контрольный ASO для мышей)
<400>  12
ggctactacg ccgtca                                                       16
<210>  13
<211>  139
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  VL тремелимумаба
<400>  13
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
1               5                   10                  15
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys
20                  25                  30
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln
35                  40                  45
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
50                  55                  60
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
65                  70                  75                  80
Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
85                  90                  95
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
100                 105                 110
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
115                 120                 125
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130                 135
<210>  14
<211>  167
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  VH тремелимумаба
<400>  14
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
1               5                   10                  15
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
20                  25                  30
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn
35                  40                  45
Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
50                  55                  60
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu
85                  90                  95
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115                 120                 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130                 135                 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165
<210>  15
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  CDR1 VH тремелимумаба
<400>  15
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
1               5                   10
<210>  16
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  CDR2 VH тремелимумаба
<400>  16
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1               5                   10                  15
<210>  17
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  CDR3 VH тремелимумаба
<400>  17
Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5                   10                  15
<210>  18
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  CDR1 VL тремелимумаба
<400>  18
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp
1               5                   10
<210>  19
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  CDR2 VL тремелимумаба
<400>  19
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>  20
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  CDR3 VL тремелимумаба
<400>  20
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1               5
<210>  21
<211>  223
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  Полипептид CTLA-4 - № доступа в GenBank AAL07473.1
<400>  21
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1               5                   10                  15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20                  25                  30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35                  40                  45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50                  55                  60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65                  70                  75                  80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85                  90                  95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100                 105                 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115                 120                 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130                 135                 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145                 150                 155                 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165                 170                 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180                 185                 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195                 200                 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210                 215                 220
<210>  22
<211>  277
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  Полипептид OX40
<400>  22
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20                  25                  30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35                  40                  45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50                  55                  60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65                  70                  75                  80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85                  90                  95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100                 105                 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115                 120                 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130                 135                 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145                 150                 155                 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165                 170                 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180                 185                 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195                 200                 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210                 215                 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225                 230                 235                 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245                 250                 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260                 265                 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210>  23
<211>  183
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  Лиганд OX40
<400>  23
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20                  25                  30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35                  40                  45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50                  55                  60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65                  70                  75                  80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85                  90                  95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100                 105                 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115                 120                 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130                 135                 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145                 150                 155                 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165                 170                 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210>  24
<211>  410
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<223>  Белок на основе лиганда OX40; соответствует SEQ ID NO: 8 в патенте США 7959925
<400>  24
Leu Ala Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1               5                   10                  15
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20                  25                  30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35                  40                  45
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50                  55                  60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85                  90                  95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
100                 105                 110
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115                 120                 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
130                 135                 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145                 150                 155                 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165                 170                 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
180                 185                 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
195                 200                 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210                 215                 220
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Leu Leu Gly Gly Gly Ser Ile Lys Gln
225                 230                 235                 240
Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu
245                 250                 255
Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg Gly His Gly
260                 265                 270
Gly Gly Ser Asn Ser Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Phe Gln Ser
275                 280                 285
Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu
290                 295                 300
Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val
305                 310                 315                 320
Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe
325                 330                 335
Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro
340                 345                 350
Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala
355                 360                 365
Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn
370                 375                 380
Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile
385                 390                 395                 400
His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
405                 410
<210>  25
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  VL гуманизированного антитела к OX40
<400>  25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  26
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  VL гуманизированного антитела к OX40
<400>  26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  27
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  VH гуманизированного антитела к OX40
<400>  27
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20                  25                  30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  28
<211>  451
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  Тяжелая цепь гуманизированного антитела к Ox40
<400>  28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20                  25                  30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340                 345                 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435                 440                 445
Pro Gly Lys
450
<210>  29
<211>  214
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  Легкая цепь гуманизированного антитела к OX40
<400>  29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  30
<211>  412
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  Гуманизированное антитело к OX40
<400>  30
Ala Pro Leu Ala Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Leu Leu Gly Gly Gly Ser Ile
225                 230                 235                 240
Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His
245                 250                 255
Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg Gly
260                 265                 270
His Gly Gly Gly Ser Asn Ser Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Phe
275                 280                 285
Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe
290                 295                 300
Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn
305                 310                 315                 320
Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly
325                 330                 335
Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu
340                 345                 350
Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met
355                 360                 365
Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr
370                 375                 380
Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile
385                 390                 395                 400
Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
405                 410
<210>  31
<211>  1206
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<223>  Последовательность ДНК, кодирующая huIgG4FcPTF2OX40L (открытая рамка считывания в направлении от 5' к 3')
<400>  31
gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggacct       60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag      120
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt taattggtac      180
gtggacggcg tggaagtgca taacgccaag accaagccca gagaggagca gttcaacagc      240
acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa      300
tacaagtgca aggtctccaa caagggcctg cctagcagca tcgagaagac catcagcaag      360
gccaagggcc agccacggga gccccaggtc tacaccctgc cacctagcca agaggagatg      420
accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg gtgaaaggct tctatcccag cgatatcgcc      480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg      540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtactcc agactgaccg tggacaagtc cagatggcag      600
gagggcaacg tcttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag      660
aagtccctga gcctgagcct gggcaaggac caggataaga tcgaggctct gtcctccaag      720
gtgcagcagc tggaacggtc catcggcctg aaggacctgg ccatggctga cctggaacag      780
aaagtgctgg aaatggaagc ctccacacag gtgtcacaca gatacccccg gatccagtcc      840
attaaggtgc agttcaccga gtacaagaaa gagaagggct ttatcctgac ctcccagaaa      900
gaggacgaga tcatgaaggt gcagaacaac tccgtgatca tcaactgcga cgggttctac      960
ctgatctccc tgaagggcta cttcagccag gaagtgaaca tctccctgca ctaccagaag     1020
gacgaggaac ccctgttcca gctgaagaaa gtgcggagcg tgaactccct gatggtggcc     1080
tctctgacct acaaggacaa ggtgtacctg aacgtgacca ccgacaacac ctccctggac     1140
gacttccacg tgaacggcgg cgagctgatc ctgatccacc agaaccctgg cgagttctgc     1200
gtgctg                                                                1206
<210>  32
<211>  402
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  Аминокислотная последовательность huIgG4FcPTF2OX40L (от N- к C-концу)
<400>  32
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1               5                   10                  15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20                  25                  30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35                  40                  45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50                  55                  60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85                  90                  95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100                 105                 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115                 120                 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130                 135                 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165                 170                 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195                 200                 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210                 215                 220
Leu Ser Leu Gly Lys Asp Gln Asp Lys Ile Glu Ala Leu Ser Ser Lys
225                 230                 235                 240
Val Gln Gln Leu Glu Arg Ser Ile Gly Leu Lys Asp Leu Ala Met Ala
245                 250                 255
Asp Leu Glu Gln Lys Val Leu Glu Met Glu Ala Ser Thr Gln Val Ser
260                 265                 270
His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr
275                 280                 285
Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile
290                 295                 300
Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr
305                 310                 315                 320
Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu
325                 330                 335
His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg
340                 345                 350
Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val
355                 360                 365
Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val
370                 375                 380
Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys
385                 390                 395                 400
Val Leu
<210>  33
<211>  1206
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<223>  Последовательность ДНК, кодирующая huIgG4FcPTF2OX40L (открытая рамка считывания в направлении от 5' к 3')
<400>  33
gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggacct       60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag      120
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt taattggtac      180
gtggacggcg tggaagtgca taacgccaag accaagccca gagaggagca gttcaacagc      240
acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa      300
tacaagtgca aggtctccaa caagggcctg cctagcagca tcgagaagac catcagcaag      360
gccaagggcc agccacggga gccccaggtc tacaccctgc cacctagcca agaggagatg      420
accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg gtgaaaggct tctatcccag cgatatcgcc      480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg      540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtactcc agactgaccg tggacaagtc cagatggcag      600
gagggcaacg tcttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag      660
aagtccctga gcctgagcct gggcaaggac caggataaga tcgaggctct gtcctccaag      720
gtgcagcagc tggaacggtc catcggcctg aaggacctgg ccatggctga cctggaacag      780
aaagtgctgg aaatggaagc ctccacacag gtgtcacaca gatacccccg gatccagtcc      840
attaaggtgc agttcaccga gtacaagaaa gagaagggct ttatcctgac ctcccagaaa      900
gaggacgaga tcatgaaggt gcagaacaac tccgtgatca tcaactgcga cgggttctac      960
ctgatctccc tgaagggcta cttcagccag gaagtgaaca tctccctgca ctaccagaag     1020
gacgaggaac ccctgttcca gctgaagaaa gtgcggagcg tgaactccct gatggtggcc     1080
tctctgacct acaaggacaa ggtgtacctg aacgtgacca ccgacaacac ctccctggac     1140
gacttccacg tgaacggcgg cgagctgatc ctgatccacc agaaccctgg cgaggcctgc     1200
gtgctg                                                                1206
<210>  34
<211>  1206
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  Аминокислотная последовательность huIgG4PFcTF2OX40L F180A (от N- к C-концу)
<400>  34
Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Gly Thr Ala Cys Gly Gly Cys Cys
1               5                   10                  15
Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr Thr Gly
20                  25                  30
Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Thr Thr Cys
35                  40                  45
Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala Gly Cys Gly
50                  55                  60
Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys
65                  70                  75                  80
Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys
85                  90                  95
Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala
100                 105                 110
Cys Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly
115                 120                 125
Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly
130                 135                 140
Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly
145                 150                 155                 160
Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly Thr Thr Thr Ala Ala Thr Thr Gly
165                 170                 175
Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly
180                 185                 190
Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Thr Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala
195                 200                 205
Ala Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala
210                 215                 220
Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys
225                 230                 235                 240
Ala Cys Cys Thr Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr
245                 250                 255
Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr
260                 265                 270
Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly
275                 280                 285
Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Cys Ala
290                 295                 300
Ala Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala
305                 310                 315                 320
Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Ala Gly Cys
325                 330                 335
Ala Gly Cys Ala Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala
340                 345                 350
Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly
355                 360                 365
Cys Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys
370                 375                 380
Cys Ala Gly Gly Thr Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys
385                 390                 395                 400
Cys Ala Cys Cys Thr Ala Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala
405                 410                 415
Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly
420                 425                 430
Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys
435                 440                 445
Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala
450                 455                 460
Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys Cys
465                 470                 475                 480
Gly Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala
485                 490                 495
Ala Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Ala
500                 505                 510
Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys
515                 520                 525
Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala
530                 535                 540
Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Thr
545                 550                 555                 560
Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Cys Thr Gly
565                 570                 575
Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Thr Cys Cys Ala
580                 585                 590
Gly Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala
595                 600                 605
Cys Gly Thr Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Cys
610                 615                 620
Gly Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Cys
625                 630                 635                 640
Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Cys
645                 650                 655
Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys
660                 665                 670
Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly
675                 680                 685
Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Thr Ala Ala Gly Ala Thr Cys Gly Ala
690                 695                 700
Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly
705                 710                 715                 720
Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys
725                 730                 735
Gly Gly Thr Cys Cys Ala Thr Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala
740                 745                 750
Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr
755                 760                 765
Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly
770                 775                 780
Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys
785                 790                 795                 800
Cys Thr Cys Cys Ala Cys Ala Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Ala
805                 810                 815
Cys Ala Cys Ala Gly Ala Thr Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala
820                 825                 830
Thr Cys Cys Ala Gly Thr Cys Cys Ala Thr Thr Ala Ala Gly Gly Thr
835                 840                 845
Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys
850                 855                 860
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Gly Cys Thr
865                 870                 875                 880
Thr Thr Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Cys Cys Cys Ala
885                 890                 895
Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys
900                 905                 910
Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys Ala
915                 920                 925
Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Ala
930                 935                 940
Cys Thr Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Thr Thr Cys Thr Ala Cys
945                 950                 955                 960
Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Gly
965                 970                 975
Gly Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala
980                 985                 990
Ala Gly Thr Gly Ala Ala Cys Ala  Thr Cys Thr Cys Cys  Cys Thr Gly
995                 1000                 1005
Cys Ala  Cys Thr Ala Cys Cys  Ala Gly Ala Ala Gly  Gly Ala Cys
1010                 1015                 1020
Gly Ala  Gly Gly Ala Ala Cys  Cys Cys Cys Thr Gly  Thr Thr Cys
1025                 1030                 1035
Cys Ala  Gly Cys Thr Gly Ala  Ala Gly Ala Ala Ala  Gly Thr Gly
1040                 1045                 1050
Cys Gly  Gly Ala Gly Cys Gly  Thr Gly Ala Ala Cys  Thr Cys Cys
1055                 1060                 1065
Cys Thr  Gly Ala Thr Gly Gly  Thr Gly Gly Cys Cys  Thr Cys Thr
1070                 1075                 1080
Cys Thr  Gly Ala Cys Cys Thr  Ala Cys Ala Ala Gly  Gly Ala Cys
1085                 1090                 1095
Ala Ala  Gly Gly Thr Gly Thr  Ala Cys Cys Thr Gly  Ala Ala Cys
1100                 1105                 1110
Gly Thr  Gly Ala Cys Cys Ala  Cys Cys Gly Ala Cys  Ala Ala Cys
1115                 1120                 1125
Ala Cys  Cys Thr Cys Cys Cys  Thr Gly Gly Ala Cys  Gly Ala Cys
1130                 1135                 1140
Thr Thr  Cys Cys Ala Cys Gly  Thr Gly Ala Ala Cys  Gly Gly Cys
1145                 1150                 1155
Gly Gly  Cys Gly Ala Gly Cys  Thr Gly Ala Thr Cys  Cys Thr Gly
1160                 1165                 1170
Ala Thr  Cys Cys Ala Cys Cys  Ala Gly Ala Ala Cys  Cys Cys Thr
1175                 1180                 1185
Gly Gly  Cys Gly Ala Gly Gly  Cys Cys Thr Gly Cys  Gly Thr Gly
1190                 1195                 1200
Cys Thr  Gly
1205
<210>  35
<211>  1200
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<223>  Последовательность ДНК, кодирующая huIgG1TF2OX40L (открытая рамка считывания в направлении от 5' к 3')
<400>  35
gataagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgaac tgctgggcgg accttccgtg       60
ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc      120
tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac      180
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagtacaa ctccacctac      240
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag      300
tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgcc cccatcgaaa agaccatctc caaggccaag      360
ggccagcccc gggaacccca ggtgtacaca ctgcccccta gccgggaaga gatgaccaag      420
aaccaggtgt ccctgacctg tctcgtgaag ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa      480
tgggagtcca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc      540
gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg acagtggaca agtcccggtg gcagcagggc      600
aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc      660
ctgtccctga gccccggcaa ggaccaggat aagatcgagg ctctgtcctc caaggtgcag      720
cagctggaac ggtccatcgg cctgaaggac ctggccatgg ctgacctgga acagaaagtg      780
ctggaaatgg aagcctccac acaggtgtca cacagatacc cccggatcca gtccattaag      840
gtgcagttca ccgagtacaa gaaagagaag ggctttatcc tgacctccca gaaagaggac      900
gagatcatga aggtgcagaa caactccgtg atcatcaact gcgacgggtt ctacctgatc      960
tccctgaagg gctacttcag ccaggaagtg aacatctccc tgcactacca gaaggacgag     1020
gaacccctgt tccagctgaa gaaagtgcgg agcgtgaact ccctgatggt ggcctctctg     1080
acctacaagg acaaggtgta cctgaacgtg accaccgaca acacctccct ggacgacttc     1140
cacgtgaacg gcggcgagct gatcctgatc caccagaacc ctggcgagtt ctgcgtgctg     1200
<210>  36
<211>  400
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<223>  Аминокислотная последовательность huIgG1FcTF2OX40L (от N- к C-концу)
<400>  36
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly Lys Asp Gln Asp Lys Ile Glu Ala Leu Ser Ser Lys Val Gln
225                 230                 235                 240
Gln Leu Glu Arg Ser Ile Gly Leu Lys Asp Leu Ala Met Ala Asp Leu
245                 250                 255
Glu Gln Lys Val Leu Glu Met Glu Ala Ser Thr Gln Val Ser His Arg
260                 265                 270
Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys
275                 280                 285
Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys
290                 295                 300
Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile
305                 310                 315                 320
Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr
325                 330                 335
Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val
340                 345                 350
Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu
355                 360                 365
Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly
370                 375                 380
Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
385                 390                 395                 400
<210>  37
<211>  1248
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<223>  Последовательность ДНК, кодирующая мышиную конструкцию mIgG1mTF2mOX40L (открытая рамка считывания в направлении от 5' к 3')
<400>  37
gtgcctagag attgcggctg caagccctgc atctgcaccg tgcccgaggt gtccagcgtg       60
ttcatcttcc cacccaagcc caaggacgtg ctgaccatca ccctgacccc caaagtgacc      120
tgcgtggtgg tggacatcag caaggacgac cccgaggtgc agttcagttg gttcgtggac      180
gacgtggaag tgcacaccgc ccagacccag cccagagagg aacagttcaa cagcaccttc      240
agaagcgtgt ccgagctgcc catcatgcac caggactggc tgaacggcaa agaattcaag      300
tgcagagtga acagcgccgc cttccctgcc cccatcgaga aaaccatcag caagaccaag      360
ggcagaccca aggcccccca ggtgtacacc atccccccac ccaaagaaca gatggccaag      420
gacaaggtgt ccctgacctg catgatcacc gatttcttcc cagaggacat caccgtggaa      480
tggcagtgga acggccagcc cgccgagaac tacaagaaca cccagcccat catggacacc      540
gacggcagct acttcgtgta cagcaagctg aacgtgcaga agtccaactg ggaggccggc      600
aacaccttca cctgtagcgt gctgcacgag ggcctgcaca accaccacac cgagaagtcc      660
ctgagccaca gccccggcaa gcggctggac caggacaaga tcgaggccct gagcaacaag      720
gtgcagcagc tggaacggtc tatcggcctg aaggacctgg ctatggccga cctggaacag      780
aaagtgtctg agctggaagt gtccaccagc agccccgcca aggaccctcc catccagaga      840
ctgagaggcg ccgtgaccag atgcgaggac ggccagctgt tcatcagcag ctacaagaac      900
gagtaccaga ccatggaagt gcagaacaac agcgtggtca tcaagtgcga cggcctgtac      960
atcatctacc tcaagggcag cttcttccag gaagtgaaga tcgacctgca cttcagagag     1020
gaccacaacc ccatcagcat ccccatgctg aacgacggca gacggatcgt gttcaccgtg     1080
gtggctagcc tggccttcaa ggacaaagtg tatctgaccg tgaacgcccc cgacaccctg     1140
tgcgagcatc tgcagatcaa cgacggcgag ctgatcgtgg tgcagctgac ccccggctac     1200
tgtgcccctg agggcagcta ccacagcacc gtgaaccagg tgcccctg                  1248
<210>  38
<211>  416
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<223>  Аминокислотная последовательность мышиной конструкции mIgG1FcmTF2mOX40L (от N- к C-концу)
<400>  38
Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu
1               5                   10                  15
Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr
20                  25                  30
Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys
35                  40                  45
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val
50                  55                  60
His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
65                  70                  75                  80
Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser
130                 135                 140
Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro
165                 170                 175
Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val
180                 185                 190
Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu
195                 200                 205
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser
210                 215                 220
Pro Gly Lys Arg Leu Asp Gln Asp Lys Ile Glu Ala Leu Ser Asn Lys
225                 230                 235                 240
Val Gln Gln Leu Glu Arg Ser Ile Gly Leu Lys Asp Leu Ala Met Ala
245                 250                 255
Asp Leu Glu Gln Lys Val Ser Glu Leu Glu Val Ser Thr Ser Ser Pro
260                 265                 270
Ala Lys Asp Pro Pro Ile Gln Arg Leu Arg Gly Ala Val Thr Arg Cys
275                 280                 285
Glu Asp Gly Gln Leu Phe Ile Ser Ser Tyr Lys Asn Glu Tyr Gln Thr
290                 295                 300
Met Glu Val Gln Asn Asn Ser Val Val Ile Lys Cys Asp Gly Leu Tyr
305                 310                 315                 320
Ile Ile Tyr Leu Lys Gly Ser Phe Phe Gln Glu Val Lys Ile Asp Leu
325                 330                 335
His Phe Arg Glu Asp His Asn Pro Ile Ser Ile Pro Met Leu Asn Asp
340                 345                 350
Gly Arg Arg Ile Val Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Ala Phe Lys Asp
355                 360                 365
Lys Val Tyr Leu Thr Val Asn Ala Pro Asp Thr Leu Cys Glu His Leu
370                 375                 380
Gln Ile Asn Asp Gly Glu Leu Ile Val Val Gln Leu Thr Pro Gly Tyr
385                 390                 395                 400
Cys Ala Pro Glu Gly Ser Tyr His Ser Thr Val Asn Gln Val Pro Leu
405                 410                 415
<---