ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫЙ ИНГИБИТОР ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ 1 ЧЕЛОВЕКА
OLIGODEOXYRIBONUCLEOTIDE INHIBITOR OF HUMAN DNA-METHYLTRANSFERASE 1

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано в медицине. Изобретение предназначено для селективного ингибирования активности фермента ДНК-метилтрансферазы 1 человека (Dnmt1) как в реакциях in vitro, так и в клетках человека с гиперэкспрессией Dnmt1, например в некоторых видах раковых клеток.
В настоящее время известные специфические ингибиторы Dnmt1 можно разделить на две группы: нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы [Delpu Y, Cordelier P, Cho WC, Torrisani J.DNA methylationandcancerdiagnosis // Int J MolSci. 2013 Jul 18;14(7):15029-58]. К первой группе относятся модифицированные аналоги цитидина, которые встраиваются во вновь синтезированную цепь ДНК и/или РНК и ковалентно связываются с ферментом Dnmt1, что приводит к снижению числа активных молекул. Типичные представители этой группы: 5-аза-цитидин (Vidaza), 5-аза-2′-дезоксицитидин (Dacogen) и 1-(β-D-рибофуранозил)-2(1Н)-пиримидинон (Зебуларин). Эти три нуклеозидных ингибитора показали свою эффективность и допущены к лечению острого миелоидного лейкоза и миелодиспластического синдрома, однако они крайне токсичны и обладают сильным мутагенным эффектом [Robak T.Newnucleoside-analogsforpatientswithhematologicalmalignancies. ExpertOpin. Investig. Drugs. 2011;20:343-359]. Кроме того, механизм их воздействия на систему метилирования ДНК может активировать прометастатические гены [Chik F., Szyf M.Effectsofspecific DNMT genedepletiononcancercelltransformation-andbreastcancercellinvasion; towardselective DNMT inhibitors. Carcinogenesis. 2011;32:224-232] и остается нерешенным вопрос их метаболизма в здоровых клетках.
Группа ненуклеозидных ингибиторов более обширна. В нее входят, например, флавоноиды, гидралазин, производные прокаина, антисмысловые олигонуклеотиды и синтетические олигонуклеотиды - аналоги природных субстратов Dnmt1, обладающие большей аффинностью, чем природные субстраты или необратимо связывающиеся с ферментом [Knox J.D., Araujo F.D., Bigey P., Slack A.D., Price G.B., Zannis-Hadjopoulos M., Szyf M. 2000.Inhibition of DNA methyltransferase inhibits DNA replication. J. Biol. Chem. 275, 17986-17990. Stewart D.J., Donehower R.C., Eisenhauer E.A., Wainman N., Shah A.K., Bonfils C., MacLeod A.R., Besterman J.M., Reid G.K. 2003. A phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of the DNA methyltransferase 1 inhibitor MG98 administered twice weekly. Ann. Oncol. 14, 766-774. Flynn J., Fang J.Y., Mikovits J.A., Reich N.O. 2003. A potent cell-active allosteric inhibitor of murine DNA cytosine C5 methyltransferase.J. Biol. Chem. 278, 8238-8243]. Перечисленные ингибиторы отличаются по механизмам действия, но одна общая черта - отсутствие этапа встройки в ДНК, а следовательно, существенно сниженный токсический и мутагенный эффекты, что делает их, наряду с хорошими ингибирующими свойствами, перспективными для терапии онкопатологий.
Известен ингибитор-аналог «Modulators of DNA cytosine-5 methyltransferase and methods for use thereof» (патент США на изобретение №7138384 (B1), МПК А61К 38/00, опубл. 21.11.2006), имеющий  двуцепочечную структуру, содержащую  в своем составе метилцитозины. Длины и последовательности указанных известных запатентованных структур и в предлагаемой заявке на изобретение имеют существенные отличия.
Применение данного ингибитора для подавления активности ДНК-метилтрансферазы 1 возможно, однако эффективность данного процесса значительно ниже, чем при использовании предлагаемого нами ингибитора. Указанные недостатки связаны с тем, что имеется в  наличии только одна модификация сайта узнавания фермента, а также отсутствует защита сахарофосфатного остова от действия нуклеаз клетки.
Известен другой ингибитор-аналог  «OLIGONUCLEOTIDE INHIBITORS OF DNA METHYLTRANSFERASES AND THEIR USE IN TREATING DISEASES»   (Международная заявка №WO2014011573  (A2), МПК А61К 38/55, опубл. 16.01.2014 г.), представляющий собой  самокомплементарный олигонуклеотид, образующий шпильку и имеющий  сайт узнавания метилтрансферазы CpG, а также метилцитозин в сайте узнавания и защиту сахарофосфатного остова от действия нуклеаз клетки.
Однако в  международной заявке в структуре олигонуклеотида применяются аналоги цитидина: азацитидин и зебуларин, а длины и последовательности этих структур существенно отличаются  от предлагаемой авторами настоящей заявки. Применение данных ингибиторов для подавления активности ДНК-метилтрансферазы 1 возможно, однако эффективность данного процесса существенно  ниже, чем при использовании предлагаемого  в настоящей заявке ингибитора.
Наиболее близким аналогом к заявляемому объекту изобретения является селективный ингибитор GC-boxmet [Flynn J., Fang J.Y., Mikovits J.A., Reich N.O. 2003.A potent cell-active allosteric inhibitor of murine DNA cytosine C5 methyltransferase. J. Biol. Chem. 278, 8238-8243] (прототип). Он представляет собой олигодезоксирибонуклеотидную структуру 5′-CTGGATCCTTGCCC(5mC)GCCCCTTGAATTCCC-3' и показал хороший ингибирующий потенциал на мышиной Dnmt1 и бактериальной ДНК-метилтрансферазеSssI. К недостаткам прототипа относятся:
1. Одноцепочечная структура менее аффинна, чем двуцепочечная ДНК.
2. Высокая биодоступность для экзо- и эндонуклеаз рестрикции.
3. Относительно низкая ингибирующая активность в отношении человеческой Dnmt1.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение более высокой ингибирующей активности олигодезоксирибонуклеотидного ингибитора путем повышения аффинности к Dnmt1 человека и модификации его для придания устойчивости к эндо- и экзонуклеазам в живых клетках.
Указанный технический результат достигается получением олигодезоксирибонуклеотидного ингибитора ДНК-метилтрансферазы 1 человека, характеризующегося тем, что он имеет самокомплементарную структуру (5′→3′):
5′GAATGGATCCGCTCTAACTGCCCCCAGTTAGAG(5mC)AGATCCATTC3′, которая образует двуцепочечную шпильку, имеет неспаренную СА пару в сайте узнавания фермента ДНК-метилтрансферазы 1 человека 5′-CG-3/3′-A(5mC)-5′ и содержит в своем составе тиофосфаты вместо фосфатов, где 5mC-5-метилцитозин (для повышения сродства к ферменту и защиты от нуклеазной активности в живой клетке).
Определяющими отличительными признаками предлагаемого изобретения по сравнению с прототипом, являются:
1. Образование самокомплементарной двуцепочечной шпильки.
2. Наличие неспаренной С:А пары в сайте узнавания фермента Dnmt1 5′-CG-3/3′-A(5mC)-5′
3. Замена всех фосфатов на тиофосфаты.
Выше указанные отличительные признаки позволяют повысить ингибирующую активность олигодезоксирибонуклеотидного ингибитора путем повышения аффинности к Dnmt1 человека и модификации его для придания устойчивости к эндо- и экзонуклеазам в живых клетках.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность олигодезоксирибонуклеотидного ингибитора ДНК-метилтрансферазы 1, образующая двуцепочечную шпильку. На фиг. 2 приведены зависимости активности фермента Dnmt1 (А) от концентрации заявляемого ингибитора (I). На фиг. 3 показана зависимость количества живых клеток HeLa (фиг. 3, а), CaSki (фиг.3, б) и L-68 (фиг. 3, в) от концентрации заявляемого ингибитора.
Пример 1. Синтез олигодезоксирибонуклеотидного ингибитора. Олигонуклеотидный ингибитор был синтезирован стандартным амидофосфинным методом на автоматическом синтезаторе с использованием фосфорамидитов фирмы "Glen Research" (США) [Beaucage S.L., Caruthers М.Н. Deoxynucleoside phosphoramidites - A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Lett.,22, 1859-1862, (1981)]. Затем проводилась реакция окисления фосфатов до фосфотиоатов с использованием реактива Beaucage ("Glen Research", США) как сульфирующего агента [Iyer R. P., Egan W., Regan J. В., Beaucage S. L. 3H-l,2-Benzodithiole-3-one 1,1-dioxide as an improved sulfurizing reagent in the solid-phase synthesis of oligodeoxyribonucleoside phosphorothioates // J. Am. Chem. Soc. 1990. 112. №3. 1253-1254]. Окончательная очистка проводилась при помощи ВЭЖХ. Концентрацию олигонуклеотида определяли спектрофотометрически, молярный коэффициент экстинкции рассчитывали на основании нуклеотидной последовательности. Шпилечную ДНК-структуру получали отжигом олигонуклеотида при повышении температуры до 85°C и постепенном ее снижении до +25°C. "Шпилька" образуется из-за особенностей последовательности олигонуклеотида, разные концы которого имеют большое сродство друг к другу. Полученный олигодезоксирибонуклеотидный ингибитор ДНК-метилтрансферазы имеет нуклеотидную последовательность (см. приложение), образующую двуцепочечную шпильку.
-9
3
3
3
4
3
Пример 2. Ингибирование Dnmtl invitro. Реакции метилирования ДНК проводили при 37°C. Реакционная смесь содержала 50 мМТрис-HCl, pH 7.8, 1 mMEDTA, 1 мМ DTT, 5% глицерин и 0.1 мг/мл БСА. Концентрации фермента Dnmt1 человека, AdoMet, ДНК субстрата ((инозинсодержащего полимера поли(dI-dC)•поли(dI-dC) длиной 1755 п.н. (“GE Healthcare”, Великобритания)) и олигонуклеотидного ингибитора составляли 0.05 е.а./мкл (~ 10 М), 10 мкМ, 1 мкМ (в пересчете на сайты) и 1 мкМ соответственно. Реакции запускали добавлением раствора Dnmt1 к смеси радиоактивно меченного тритием [H-CH]AdoMet (“GE Healthcare”, Великобритания) и субстратной ДНК (с ингибитором или без) до конечного объема 20 мкл. Смешиваемые растворы предварительно прогревали до 37°С. Время реакции составляло 3 ч. Аликвоты реакционных смесей объемом 18 мкл наносили на диски анионо-обменных фильтров DE-81 (“Whatman”, Великобритания). Фильтры промывали трижды раствором 0,02 М NHHCO, дважды водой и один раз 75%-ным этанолом, после чего фильтры высушивали и считали их Н-радиоактивность в толуольном сцинтилляторе на счетчике Mark III (“SearleAnalytic”, США).
50
max
50
n
Предварительную оценку субстратных и ингибиторных свойств проводили на основе сравнения степеней метилирования ДНК-метилтрансферазой Dnmt1 субстрата поли(dI-dC)•поли(dI-dC) (D), синтетического олигонуклеотидного ингибитора (B) и их смеси с субстратом (C). Процент ингибирования реакции метилирования поли(dIdC)•поли(dIdC) в смесях вычисляли следующим образом: 100% × (1 - (C - B) / D). Зависимости активности Dnmt1 (A) от концентрации ингибитора (I), представленные на фиг. 2, анализировали с помощью программы для нелинейного регрессионного анализа Origin 8.0 (“OriginLab”), вычисляя 50%-ные ингибирующие концентрации (IC) согласно стандартному выражению: A = A / (1 + ([I] / IC)), где n - коэффициент Хилла.
50
Эксперимент показал, что сам ингибитор не подвержен метилированию и вызывает 82% ингибирование реакции при данных условиях. Вычисленное значение IC составило 144±7 нМ.
50
50
Пример 3. Ингибирование Dnmt1 in vivo. Для оценки цитотоксической активности олигодезоксирибонуклеотидного ингибитора использовали следующую стандартную методику. Монослой культуры клеток L-68, HeLa и CaSki выращивали в лунках плоскодонных 96-луночных планшетов. После замены среды на свежую без сыворотки КРС и антибиотиков в культуральную среду добавляли серийные разведения исследуемого ингибитора или контрольного олигонуклеотида без ингибирующего эффекта, смешанных с трансфецирующим агентом (Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США)) в подобранной пропорции. После инкубирования в течение 4 часов, среду меняли на ростовую с сывороткой и культивировали в течение 24-х часов. После этого, среду удаляли, а монослой прокрашивали витальным красителем нейтральным красным, который включается только в жизнеспособные клетки и не окрашивает погибшие. После удаления красителя и отмывки лунок добавляли лизирующий буфер. Количество красителя, адсорбированного живыми клетками монослоя, измеряли спектрофотометрически по интенсивности поглощения на длине волны 540 нм. В качестве контролей использовали лунки планшета, в которые вносили контрольный олигонуклеотид, а также лунки без ингибитора, но с добавленным Lipofectamine'ом. Учет результатов проводили с использованием планшетного спектрофотометра Emax (MolecularDevices, США). 50%-ную токсическую концентрацию (TC) препаратов рассчитывали при помощи программы Origin 8.0 (“OriginLab”) по формуле такой же, как и для IC. Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами.
50
На фиг. 3 показана зависимость количества живых клеток HeLa (фиг. 3а), CaSki (фиг. 3б) и L-68 (фиг. 3в) от концентрации ингибитора. Полученные значения TC составили 236±10 нМ для клеток HeLa, 118±3 нМ для клеток CaSki и >10000 нМ для клеток L-68. Половинная токсическая концентрация для контролей составила 4 и >50 мкМ для Lipofectamin'а и контрольного олигонуклеотида соответственно.