Новый тип тканеинженерной конструкции на основе политетрафторэтилена с наноструктурированным многофункциональным биосовместимым нерезорбируемым покрытием

Новый тип тканеинженерной конструкции на основе политетрафторэтилена с наноструктурированным многофункциональным биосовместимым нерезорбируемым покрытием

АС. Григорьян 1, Е.В. Киселёва 2, Д.В. Штанский 3, М.Р. Филонов 3, ТК. Хамраев 1,

АК. Топоркова 1, АБ. Гастиев 4, Ш. Фаркашди 5

1 ФГУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Росмедтехнологий», Москва

2 Институт биологии развития им. НК. Кольцова РАН, Москва,

3 ФГУ ВПО Государственный технологический университет «Московский институт стали и сплавов», Москва

4 Российская медицинская академия последипломного образования, Москва

5 Российский университет дружбы народов, Москва

A novel type of a polytetrafluorethylene-based tissue-engineered construction with nanopattered multifunctional biocompatible nonresorbed coating

AS. Grigoryan \ E.V. Kiseleva 2. M.P. Filonov3. D.V. Shtanskij3, T.K. Khamraev \AK. Toporkova 1 ,A,B, Gastiev4, Sh. Farkashdi:

1 Central Research Institute of Stomatology and Maxillo-Facial Surgery of Federal Agency for High-Technology Medical Care, Moscow

2 Russian Academy of Sciences [RAS} Koltzov Institute of Developmental Biology, Moscow

3 The Federal State Educational Institution of the Higher Professional Education «National University of Science and Technology «MISiS». Moscow

4 Russian Medical Academy of Postgraduate Education. Moscow

5 Peoples’ Friendship University of Russia. Moscow

Описана методика получения тканеинженерной конструкции на основе высокопористого политетрафторэтилена (ПТФЭ) с наноструктурированным многофункциональным биосовместимым нерезорбируемым покрытием (МБНП) состава Ti-Ca-P-C-0-N. Показано, что на подложке из ПТФЭ с МБНП происходит активная адгезия и пролиферация мультипотент-ных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани. В условиях остеогенной стимуляции происходит интенсивное коммитирование клеток, позволяющее получить популяцию преостеобластически дифференцированных элементов, что было подтверждено положительной иммуноцитохимической реакцией на остеопонтин и остеонектин. В опытах in vivo на модели экспериментально воспроизведенных критических дефектов свода черепа у кроликов проведена оценка влияния трансплантации тканеинженерных конструкций на основе высокопористого ПТФЭ с МБНП состава Ti-Ca-P-C-0-N, на поверхности которых культивированы аутогенные стромальные клетки из жировой ткани на формирование костного регенерата. Через 3 и 6 мес. после трансплантации под тканеинженерной конструкцией показано формирование костного регенерата, полностью закрывавшего дефект.

Ключевые слова: тканеинженерные конструкции, функциональное покрытие, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани, регенерация костной ткани, краниопластика.

Here we preset a method for tissue engineering construct based on highly porous PTFE with nanostructured multifunctional biocompatible non-degradable coating (MBNC) with composition of Ti-Ca-P-C-O-N. It is shown that scaffolds composed of PTFE with MBNC are suitable for adipose-derived multipotent stromal cells IADMS) active adhesion and proliferation. Under osteogenic stimulation ADMS cells were differentiated to osteogenic lineage, which was confirmed by positive immunohistochemical reaction for osteopontin and osteonectin. Using the experimental model of critical calvarial defects in rabbits we investigated the influence of tissue engineering construct (membrane from highly porous PTFE with MBNC carrying ADMS cells) transplantation on bone defect regeneration. It was shown that under tissue engineering construct the bone defect was completely closed with newly formed bone tissue in 3 and 6 months after transplantation.

Key words: tissue engineering construct, functional coverage, multipotent mesenchymal stromal cells of adipose tissue, bone regeneration, cranioplasty.

Тканевая инженерия — это междисциплинарная область, совмещающая принципы биологии и инженерии для создания биомедицинских (биоинженерных) конструкций, которые восстанавливают (частично или полностью) целостность, поддерживают или улучшают функции поврежденных или утраченных тканей и органов [1 ].

Тканевая инженерия, основанная на использовании мультипотентных стволовых клеток, заключает в себе такие компоненты как: выделение стволовых клеток, выращивание их культуры на носителе (подложке) [2].

В качестве клеточного компонента тканеинженерных конструкций до недавнего времени, в основном,

e-mail: a.k.badis@gmail.com

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010

выступали стромальные клетки костного мозга (СККМ) [3, 4]. Однако клетки с характеристиками СККМ обнаружены также в жировой ткани [5] и других тканях. Клетки стромы жировой ткани (СКЖТ) обладают рядом преимуществ: они доступны для выделения в больших количествах, культивирования и последующей имплантации полученной клеточной массы, их способность к остеогенной дифференцировке в меньшей степени, чем у СККМ, зависит от возраста донора [6—8].

Большинство материалов, которые на современном этапе развития тканевой инженерии предлагается использовать в качестве подложки для тканеинженерных конструкций, относится по своему типу к биоре-зорбируемым. Предполагается, что резорбируемые подложки должны обладать рядом физико-химических и биологических характеристик, оптимизирующих рост культивируемых клеток и вместе с тем регенерацию утраченных тканевых структур при имплантации биоинженерных конструкций.

Однако хирургические вмешательства при пластике костных дефектов из-за широкой вариабельности конкретных условий, подлежащей лечению костной патологии (локализация, характер костной ткани, конфигурация кости и т.д.), требуют от материала подложек, применяемых с этой целью тканеинженерных конструкций, значительно более широкого, а главное гибко меняющегося по необходимости диапазона физико-химических и механических характеристик (скорость резорбции, прочность и т.д.), нежели те, которые могут обеспечить используемые материалы. В связи с этим до сегодняшнего дня проблема разработки и поиска новых типов материалов для подложек тканеинженерных конструкций не потеряла своей актуальности.

Известны попытки культивирования остеогенных клеток на нерезорбируемых имплантационных материалах. Применение этих материалов, в частности, металлов (титан и его сплавы), в качестве подложек позволяет активировать процессы остеогенеза в пе-риимплантатной зоне и повысить остеоинтеграцион-ный потенциал металлических имплантатов [9—11].

В работе ставилась задача исследовать возможность использовать с этой целью высокопористые мембраны из политетрафторэтилена (ПТФЭ) с наноструктурированным многофункциональным биосовместимым нерезорбируемым покрытием (МБНП) элементного состава Ti-Ca-P-C-0-N.

Материал и методы

Осаждение покрытия Ti-Ca-P-C-0-N на ПТФЭ подложки осуществляли путем магнетронного распыления синтезированной методом самораспространяющегося высокотемпературного синтеза композиционной мишени TiC0 5 + Са10(Р04)в(0Н)2 в газовой смеси аргона с азотом, при парциальном давлении азота 14%. В процессе напыления давление в вакуумной камере и температура подложки составляли соответственно 0,2 Па и 120—150°С. Толщина покрытия составляла 0,9—1,1 мкм [12-14].

Метод выделения и культивирования СКЖТ. Аутогенные СКЖТ выделяли из подкожной жировой ткани из паховой области кролика с помощью механического измельчения и ферментативной обработки 0,1% коллагеназой I типа (Worthington, США) с последующей отмывкой и центрифугированием в градиенте плотности Histopaque-1077 (Sigma, США). Клеточный осадок трижды отмывали в среде ДМЕМ (Биолот, Россия). Клетки культивировали в среде ДМЕМ, содержащей

10% сыворотки (HyClone, Новая Зеландия). На 3-ем пассаже культуры СКЖТ пассировали на имплантаты и культивировали в течение 14 сут. в остеогенной среде: среда ДМЕМ, 10% ФТС, 0,01 мкМ 1,25-дигидрок-сивитамин D3 (Sigma, США), 50мкМ аскорбат-2-фос-фат (Sigma, США), ЮмМ в-глицерофосфат (Sigma, США). За сутки до трансплантации, подложки с индуцированными к остеогенной дифференцировке СКЖТ кролика переводили на среду без сыворотки.

Для оценки остеогенной дифференцировки клетки засевали в концентрации 2,5x104 клеток/см2 в 6-лу-ночные планшеты. Затем среду культивирования меняли на остеогенную. Дифференцировку клеток оценивали через 14 сут. по цитохимической окраске на щелочную фосфатазу (NBT/BCIP Stock solution (Roche Diagnostics)), окраске на кальцификацию внеклеточного матрикса ализариновым красным S (Sigma, США) и иммуноцитохимическому окрашиванию на экспрессию остеогенных белков. Антитела против остеокальцина, остеопонтина и остеонектина производства Chemicon (США), визуализация вторичными антителами — Alexa-488 или Alexa-546 (Molecular Probe, США).

Для исследования методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) была проведена процедура фиксации клеток на поверхности пластин ПИФЭ. После удаления фиксирующего раствора образцы промывали фосфатно-солевым буфером и проводили дегидратацию материала, после удаления этанола образцы помещали на 30 мин. в гексаметилдисилазан, после чего высушивали на воздухе. Окончательное высушивание образцов осуществляли методом перехода через критическую точку на аппарате Hitachi CPD-1 (Critical Point Dryer). После чего их фиксировали на предметные столики и напыляли смесью золото-палладий, используя установку Eiko-IВЗ (Ion coater) при следующем режиме: ионный ток — 6 мА, межэлект-родное напряжение — 1,5 kV, что позволяло получать толщину слоя напыления около 25 нм. Изучение объектов проводили на аппарате CamScan S-2 (Cambridge Scanning) в режиме регистрации вторичных электронов при ускоряющем напряжении 20 kV. Захват и обработку видеоизображения на персональном компьютере реализовывали с использованием программно-аппаратного комплекса Microcapture 2.2 (системы для микроскопии и анализа).

Методика экспериментальной операции. Эксперимент проводили на 8 кроликах-самцах породы Шиншилла весом около 2500 г. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало рекомендациям Хельсинкской Декларации и рекомендациям, содержащиеся в Директивах Европейского Сообщества (№86/ 609 ЕС). Под общей анестезией Zoletil («Virbac Sante Animate», Франция) с соблюдением правил асептики, после обработки операционного поля, производили разрез кожи, обнажали свод черепа и с помощью фрезы, при малых оборотах с постоянным охлаждением физиологическим раствором, создавали полнослойный дефект 10410 мм. Затем проводили краниопластику, фиксируя пластины титановыми микровинтами. Животные были разделены на 2 группы по 4 кролика в каждой: основная группа — дефект закрывали тканеинженерной конструкцией с аутогенным СКЖТ, культивированными на мембранах высокопористого ПТФЭ с наноструктурированным МБНП; группа сравнения — дефекты закрывали мембранами без культуры клеток. Мягкие ткани укладывали на место, кожу ушивали узловыми швами vicril 4/0. Рана заживала первичным натяжением.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010

Животных выводили из эксперимента в сроки 3 и 6 мес. Костные фрагменты свода черепа кроликов с имплантатами фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина, затем декалыдинировали в 25% растворе Трилона Б. Декалыдинированные образцы проводили через спирты возрастающих концентраций и заключали в парафин. Срезы готовили с помощью ротационного микротома Microm НМ 355S (Германия) толщиной 6^7 микрон и окрашивали гематоксилином и эозином. Изучение препаратов и микрофотосъёмку производили в оптической цифровой системе Axioplan

2 imaging (Carl Zeiss, Германия).

Результаты

Результаты культивирования клеток на имплантатах. Было показано, что адгезия и заселение поверхности имплантата клетками культуры происходит лишь в образцах с наноструктурированным МБНП, при его отсутствии клеток на поверхности имплантата не обнаружено. С помощью люминесцентной и СЗМ показано, что через 14 сут. после культивирования в остеогенной среде поверхность имплантатов была заселена многоотростчатыми фибробластоподобными клетками (рис. 1).

Для оценки остеогенной дифференциации СКЖТ культивировали на пластике в остеогенной индукционной среде. Через 14 сут. культивирования в остеогенной среде СКЖТ кролика на пластике образуют многослойные участки, при этом усиливается экспрессия щелочной фосфатазы — положительная окраска на щелочную фосфатазу (рис. 2), однако внеклеточный матрикс еще не подвергается кальцификации (негативная реакция с ализариновым красным S). Имму-ноцитохимический анализ экспрессии специфических белков остеогенеза выявил, что клетки находятся на начальных стадиях дифференцировки, поскольку обнаруживалась экспрессия остеопонтина и остеонекти-на (рис. 3), а экспрессии позднего маркера дифференцировки остеокальцина не наблюдалось.

Таким образом, гибридные имплантаты из высокопористого ПТФЗ с наноструктурированным МБНП могут служить основой для создания биоинженерных конструкций с мультипотентными клетками, в том числе СКЖТ, для регенерации дефектов костной ткани.

Апробация тканеинженерных конструкций из ПТФЗ с МБНП в опытах in vivo. На следующем этапе работы исследовали остеорегенераторный потенциал биоин-женерной конструкции на модели экспериментально воспроизведенных критических дефектов теменной кости у кроликов. В работе использовали аутогенные СКЖТ кроликов.

Гистологическое исследование показало, что в сроки 3 и 6 мес. у кроликов основной группы под тканеинженерными конструкциями с аутогенными СКЖТ образовывалась новая костная ткань, прикрывающая дефекты кости на всём их протяжении, а так же местами обширные участки жировой и фиброзной ткани (рис. 4а). Костные структуры, прикрывающие дефект черепа, были непрерывны. В поры ПТФЗ интенсивно прорастала клеточноволокнистая соединительная ткань, содержащая кровеносные сосуды (рис. 46). На значительном протяжении поры ПТФЗ содержали новообразованные костные трабекулы (рис. 4в). В группе сравнения под гибридными имплантатами без клеток в костных дефектах формировалась фиброзная соединительная ткань (рис. 4г).

Рис. 1. Фибробластоподобные клетки на хорошо развитой поверхности имплантата с наноструктурированным покрытием [основная группа). СЭМ

Рис. 2. Результаты цитохимической реакции на щелочную фосфатазу в СКЖТ:

А - недифференцированные клетки;

Б - 14 сут. остеогенной дифференцировки. Цитохимическая окраска ЫВТ/ВОР; [масштабный отрезок - 100 рм)

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010

Рис. 3. Результаты иммуноцитохимических реакций: А на остеопонтин; Б на остеокальцин. Докраска ядер Dapi; [масштабный отрезок - 50 рм)

Рис. 4. Результаты опытов in vivo:

А [основная группа наблюдений) в дефекте свода черепа сформирована новая костная ткань [1);

имеются участки фиброзной [2) и жировой [3) тканей; над регенератом располагается мембрана ПТФЭ с МБНП;

Б [основная группа наблюдений) в поры ПТФЭ прорасли соединительнотканные тяжи с сосудами [*);

В [основная группа наблюдений) костное вещество в порах ПТФЭ с МБНП [1); 2 - новая костная ткань, закрывающая костный дефект;

Г [группа сравнения) под гибридным имплантатом в костном дефекте фиброзная соединительнотканная пластинка [одинарные стрелки). Окраска - гематоксилин и эозин. У в.: А х100; Б хЗОО; В хЗОТ; Г х25

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010

Заключение

Таким образом, как показали опыты на кроликах с дефектами свода черепа под тканеинженерными конструкциями из высокопористого ПТФЭ с наноструктурированным МБНП состава ТнСа-Р-С -О-Ы фиксированными над костными дефектами формируется полноценный костный регенерат, закрывающий на всём протяжении указанные дефекты. Это свидетельствует о высоком остеоиндукционном потенциале, которым обладают гибридные имплантаты указанного типа (биоинженерные конструкции). Приведенные данные свидетельствуют о том, что уровень коммитирования клеток, который достигается при описанном методе культивирования СКЖТ, позволяет получить популяцию преостеобластически дифференцированных клеток, обладающую мощным остеогенетическим потенциалом, достаточным для восстановления костной ткани в

объёмах критических костных дефектов свода черепа, костная ткань которого, как известно, обладает относительно низким регенерационным потенциалом.

Таким образом, гибридные имплантаты, обладающие, как показали наши исследования, высокой биосовместимостью и остеоинтеграционным потенциалом могут служить успешной альтернативой известным титановым пластинам и конструкциям из производных акриловых смол, широко применяемым в настоящее время в клинической практике черепно-челюстно-лицевой хирургии.

Появление нового отечественного конкурентно-способного материала из высокопористого ПТФЭ с наноструктурированным МБНП и композиций для хирургического лечения обширных дефектов свода черепа и плоских костей лицевого скелета чрезвычайно актуально.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Langer R., Vacanti J.P. Tissue engineering. Science 1993; 260C5110]: 920-6.

2. Antonov E.N., Bagratashvili V.N., Whitaker M.J., Barry J.J.A. et al. Three-dimensional bioactive and biodegradable scaffolds fabricated by surface-selective laser sintering. Advanced Mat. 2DD5; 17[23: 327—30.

3. Mankani М. H., Kuznetsov S. A., Shannon B. et al. Canine Cranial Reconstruction Using Autologous Bone Marrow Stromal Cells. Am. J. Pat. 2006; 168[21: 547-50.

4. Zhou S., Greenberger J.S., Epperly M.W. et al. Age-related intrinsic changes in human bone-marrow-derived mesenchymal stem cells and their differentiation to osteoblasts. Aging Cell 2008; 7[31: 335—43.

5. Киселёва E.B., Васильев A.B. Мультипотентные клетки стромы жировой ткани. В кн.: Биология стволовых клеток и клеточные технологии / под ред. М.А. Пальцева. М.: Медицина 2009; 2: 124— 62.

6. Zuk Р.А., Zhu М., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002; 13И1): 4279— 95.

7. Dudas J.R., Marra K.G., Cooper G.M. et al. The osteogenic potential of adipose-derived stem cells for the repair of rabbit calvarial defects. Ann. Plast. Surg. 2006; 56: 543—8.

8. Van Harmelen V., Рціігід K., Hauner H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the

omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabol. 2004; 53(51: 632-7.

9. Frosch K.H., Drengk A., Krause P. et al. Stem cell-coated titanium implants for the partial joint resurfacing of the knee. Biomat. 2006; 27 [121: 2542-9.

10. Maeda М., Hirose М., Ohgushi H., Kirita T. In vitro Mineralization by Mesenchymal Stem Cells Cultured on Titanium Scaffolds. J. Biochem. [Jap] 2007; 141 [51: 729-36.

11. Фролова E.H., Мальгинов H.H., Григорьян А.С. и др. Заживление костного дефекта в челюсти кроликов под влиянием ксеногенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, культивированных на титановых носителях. Рос. стомат. журнал 2008; 3: 12-4.

12. Левашов Е.А., Штанский Д.В., Глушанкова Н.А., Решетов И.В. Биосовместимые многокомпонентные наноструктурные покрытия для медицины. Патент РФ № 2281122 от 10.08.2006.

13. Григорьян А.С., Филонов М.Р., Штанский Д.В., Селезнева И.И., Топоркова А.К. Новый тип имплантационного материала на основе политетрафторэтилена с металлическими и керамическими покрытиями. Стоматология 2007; спецвыпуск: 20—26.

14. Григорьян А.С., Филонов М.Р., Кулаков А.А. и др. Способ получения имплантационного материала на основе пористого политетрафторэтилена и материал, полученный этим способом. Патент РФ №2325191 от 16.02.2007.

Поступила 11,06,2010

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010

А

..

Therakos

йЙРОй-€ЯКЄ

t 1ИГ1ГЧН І ІІІ lipfHIC.It'lltill іШр№ф1іирИ.1Ь»І)ІП (jlOIOfjirpt* 14

L'VARXTS

' >ИГГрі11ШрН0раЛІіН U ІІ 4|юіофС|1С} ЦрВДСТ|ШЛМЯ CoGofii четд,

ОСПОПаННЫЙ IIП СЙРГСТїНІНИ ЛСИюферСіа IP ООіуЧСІГИІ ЛЄНШЩТТОВ_

І1|К Ll.upil ІПЛІмІІО UUpjOOTilJ 1ЛЫГХ фоіі>СЄІ 1C І іЙі'І.Ї Л Ш ІОрг Л-t

4 К*цстпнслі псораленомJ.). и.тряфргйл енлвьїм cdvrfqtv дншшшід А і120 4Ш нчі

Обляг г к ї ї р и мене нині

JtalCIMC (ЧІНМНГЦЧКІСІІХ. JI> ііЧіМЧуаіНі.іЛ. /ІіфЧЛІ AlWtl-ltf КПК

II ГІ(ИІ.ІІІіфср!ІІІІ.ІЛІМІ.ІСІІЛІІІ ЛІ.

* ur^iwu ! ч. чПШІМЯ ІіІгіі|ніч,І

* уші ii<iji«;iiiiLr рсйш ііг 11 rpui к п. ти їй і пропік яМіїна і РТІIX)

Прі'.НИІіріНІІІк'НІК UfllifMfClllltl ispi ЇНвЙИ (ШЛЕ ГриЛСНійНПіаІИІГ щ

- №ісрц,купниі

- ЛИШИТИ

рОіаїтоИ.ШММ 8|ТЦт гіСіїргіл І

(>L4Hrt‘ лііиі' і її t'lic і гм bt:

Гк ши&снлсгь Дли мццни а:

* ЧІПмряш№ая СНСіїЧИ рдЄ*0.ПіМХ МіГіЄрН№И*№

* ІІЄК іннслін; рИСМ м і ШртЦНПИ iMUti.MM

* мсклргнктм риска яф»#«ішг

* нIt> і Ht4Mh.it!ліс ЬіИІфаіЯ тнпуП:і«І№Я diffllttun ї:.ійнМ

ч котріміі шичеиия и сііетсмс

W н і (‘HI jit цміриц 111 і.|інір,і л BOilipfUfkrlHt i.jMipLl rMiillfll: -

* № іИ(Ж»№t І* H ШСМСІ 1114 1№рЙ>сС1 ptf n I ipUEttCCJ И 1СЧСНSIC НрОИСДурЫ

* ПрІГ НіДИЦИ III Ml IL-1 II Ll|l?1 'МІГ 111 ‘I i.4 1-І» ІЛ li'KlipL'llh.l fliffCMU 4I||J I1L' I pil 1LTI

llpKlni а II piiftuіv II лйґ.пгліімііііиш:

* удооиое нстюлмоидине .ni оператора

* KOHCipVKIUIH ВШШрЛТЛ И I i.'.i' \Ll. IILWV ЧаїСріІЛЛОИ Hi'k ЛЮЧІІСР HLF ІШІЖІІОіЛІї OIIHHSKII Сірії ШфуїКС

* ОДИОКріШІЛІ ІІСНСП’ї 11 к пн к

» шчнан ain омлтн інші и процедуры;

» find рос її ЕкЗйУШснОс іпн.іечснНс компоненти процедурною набора иос.іс ілпсріпсі inn ііроііоури

* Наличие b_H4ii*t3 .ЗДИИШ, IEU кшороч фишпрут* ПСІ Мі{юр»ШЩ й ІІрОТСІ&ІІІПІІ НроЦСССИ

іш Ьіа£з<зРе,

СИЄ ТЕЛІП I.ІИ ІіиДСЛгНІШ СІННЛІЖІЛХ К'ЛеіОК St/pax [*• И iwS .1 Fe-tfr*. IIІ нен Li u p 11 ! |l

* ( 'амая сопрсчеипіч. ном Timm їм сне і єна. по эволякмпм выделят* с гполоцые клетки ні пуі к»ілн нон л периферії 'ідокой іфодн. j тисад in imeniofD моїщ

* 11. IlM'I ІІІІ.1 Я СЗІСТСШ ДЛЯ пмстроіі ЯІТіИЦтіЧЕСІЩіЛ ^НІраГійТКИ кроні І L' НЫШКНМ ypiHI*lL‘Vi ЖН'ШКІІОСОІЇНИСТИ КЛеТКЖ после ll[HUkMV]i|J

* Scjhx ігоімкнсг пропадгп* опрлйопл кроли и рамкйл К пропшипії

* 1 Ірині піп лоіЧстщія Scp.i\ оспанаи ил ссплрлкнн нелі рифу піровап нем. ПШЫ.1.3НКМ1КЧ1 pj І.ІС.ІЯГІ, ктепшненгы Kjpoettl В t!LKfТВСГіГІ ИІІИ С ИЛ IL1DTHрегью и

размерами

* Система npcjiiaiFiJftciia лдя применеінія в клеточной терапии, ще исошд>лныо получение t*npc.jejL4iHU \ ко^шонсиоаа кропн

+ Обршогта крошг IL1H сс кхучпопсегтов np<Hicxo;un в зак рыт он етсріпьиоГі системе

* Компоненты: кроїш іч^лпринтгся н ааилнршыс мешки и шювы дли /иЛІ.Пі’НІЛіЛО IKIIO.lb’JORUHLIH {крнокинссріїіиіііл, І і-ірл.1 ЦІ I Mill I jIL' in VtlTO, riepe,ii[iMiitHC h;hhll4i гу и лр.)

t *

> ш ’Р — W у щ

м * Т.1 * _ -а*  +

ft «Г* • и Г -и

lEann niruiic ГбшмсЛгпшн TwrrrwiKiim Эмпвамин! Ігетрячи

имерн ІІ.ІЙГЧМ ЬіП>'Є4ШІ iplllpiMLil

ИНН

Ipll Tpowitn

Л HІ П^ІИІII I1I|»FI|I-II II №114И ГІГСТСЧИ LIH \ p.I IH'IIII'H riBUIHHLIlL KT.ICIIIIf VI

ЖИ іким її ні і с - ША Ptrtihf t#(T httffMgrСША),

LІІСКЧІІІ P-1L44II I.IPI.I 11J 162ft оГфіІ ПШН f 5 INI IOBUX КЛЛПХ

« Ннію» стиічіНпіі їн<сріиііизіішіга црпінсм

-Ни ікігіі рік-mi ^иліиїїи ЛII Ції IU аині uGjpaiciiіірсмі хрлнйин

її іі[н)і]щічіш эачечмжнмннл

- ПпіІНІНЛШ ,И|1лчаШ1Ирф(Н1111М<к премією СЇІ«РІ|ІИ*ГІ II|4'^IU (Mfioi

ікрсошиї^і

Спнікеїіііе lirj[іііI II№ чч'ніру.ичиіііле . Me іреіїуеіен fttnwuwo kuciii4cl іii*i дьюароц .lib \]шилніік І о,util унеісма Ru*Arehhp ишсияеі Л. 7 и.юа]>оц |

- lb.пічне рпрскіїннх нроіраччішч швдрткРЕнашнгН

* lie h 'I I.IL HOC 11. H I. J11J111J

- Полузакрытая сікчеча ігокраниіеі иосіеоетипе jiwta iwjmpqropa *\

• Неі(¥гник бееиі'рсйоГїноіи цитати нпиицдег радчспітЛміиечк обрд'кц я слуисошлкчснкн икігтріРксгва

- Ilapawrpu 24-\ -ъжешот ичпраія: л \и[иатеиш пч-’іу пііМ яклкі>і;иот п

еейя:

Монітірнні уроінія жндкоіо щога І Іаршїк jV\M ЛЖТу«*

U) номер jl'EH oiiepnrop.L \р.і имі ні і і 11_ н я бале .іаіНЕІЛХ

И її і с іі pupniLii и н і.і ні прсі і рам чиї 14 іі за ми ражннате. н-

- Мнтпшпгпгрует те.ч|тфат>'рпъ]с колеоаииі

- Оійтствург маті ручного перенося oupauu ilj нрої рішшіою іаморшилівтелл в lliki.ip ,lth хранения

к'рінімні іі'лін-р на 25 mli

- I JoClOKIIHhlil геомегричеекни p.LiMCp іЧ'ір&ІН.і

- Boctl pin ! IkVll 1MU11 процесс таморочкн . LIH KiIHVLIU is еднщнш

- Hi I iMurfflUK'H. рсчиїш Іігро ч.пнтй UICI.LIKH llil хранение II ІШІЛ^ІіЄННИ OOfUlHOB

- СннЖаеіси нфиягпюстъ ошибку сяйЦнший е Человеческим фіікіором С иеісм» > и рил if-пни пира шлм

- І ктиДЛЬЮВШЕНС илрнх-ко.и HCOH?t£Un UUIiri'mil при HepCMCltR’HlIU обрії HU Огчст но opmay:

Иеюрня tn5pit ни»

Іінпеішірн іацнА

График іаморвжнкшні u \ p |

Is

Рйгиплііме ид і гриз ім і iu іо,іі.цііімр<тшмія сімшші.ц к,тстнк

Цр(цшіи);

Комплекты if Ч'ШЇГО їли рп МкГНВИрОПЛНКЯ KML-ЧОКІІ LUK'pU tfciix енсіемлх

- СЧ'ІІСрГН НРС I Г» IVYT1.1llhllp.'ІІ.1ІІ114 11ЧІПІКІ PllPlL'er m КЛЄ10К

N К-клегокг т-клепж

C'ellCfro E>{ 4ТЯ КуН.ТЯЙИрОГмїИІІ jl-|Г|р1ШП.1Ч ' If fi«i

Бютииоронршмі! ере 1Ы С.'еИСЇго:

* St'f  M Л ІЯ KV’J I h Г Hill IptiBJH ІІЯ ге Чі і Jl 11  I IPlL'CKIIX lipor eilll I upilk-\ к-іеіок, NK-iLietitK, Т-«шеіірі

* IK Lis ку:iiiTii inіропаннл ;ll' іі. ірн і них ь. il- і иї.

К>.ініуралі»ние чешки Vurl.tFe

І сделаны н t I 'l-j P Tcltonk

С ЧІМ г ГО НІН IП к II1114

Д ія у&е.тичеиля тсмопо і інчесии, прогпісГторіШі жлетокг N К-клеток. Г-клеток И ЛСНЛріГТІІЬІХ k.LCIUK

'Ікс кл ю І ЙВАНІ її реле т йн н і е-1 ь 1)00 мНииоиашюишр ЧСЛІШІІНСКІНГ ТШШЛООІИМ

MockKiL v.i. И інша Фриіко.д.і кора, 15.

+7<4тШк1442

Б-пііііі

dr_fecIo Pffvfinhacmollnc.ro . gcrmlmcnkod VM61 сіл 111 шь. ги, іісип у J о уіішу ід dclrux.org

\т\\Л m t-stp mcel Is. г и