Способ получения биоинженерного трансплантата для пластики дефекта передней брюшной стенки
METHOD FOR OBTAINING A BIOENGINEERED GRAFT FOR PLASTY OF AN ANTERIOR ABDOMINAL WALL DEFECT

Изобретение относится к медицине, а именно к герниологии и тканевой инженерии и может быть использовано в абдоминальной хирургии для лечения грыж белой линии живота. Метод заключается в изготовлении трансплантата путем химической погружной децеллюляризации кадаверного апоневроза передней брюшной стенки свиньи.
В настоящее время, несмотря на многообразие синтетических материалов, используемых в хирургии, альтернативы сеткам из полипропилена в герниологии нет. Популярность материала обусловлена рядом положительных свойств полипропиленовой нити, таких как биоинертность, монофиламентность, несмачиваемость и отсутствие эффекта «фитиля», а также экономической доступностью полипропиленовых эндопротезов. Сообщения в научно-медицинской литературе об осложнениях эндопротезирования ставит перед исследователями задачу поиска новых пути решения проблемы [Касымов А.А., Мусаев А.И. Пластика брюшной стенки при рецидивах послеоперационных вентральных грыжах. 2016; 1: 61-63].
Биологические эндопротезы не нашли широкого применения в клинике, прежде всего из-за риска развития реакции тканевой несовместимости.
Таким образом, существует потребность в новых материалах для имплантатов при хирургическом лечении грыж. Такие материалы не должны оказывать токсического воздействия, не вызывать реакции воспаления и чувство инородного тела, а также обеспечивать формирование качественной рубцовой ткани.
С целью исключения реакций отторжения, генерируемых иммунной системой, биологические каркасы должны быть лишены чужеродных организму пациента включений, то есть децеллюляризированы, но при этом сохранять исходную структуру ткани и внеклеточного матрикса (ВКМ). В настоящее время результаты исследований по созданию естественных каркасов методом децеллюляризации известны для трахеи, пищевода, сердца, легких, скелетной мышцы, диафрагмы, кожи [Сотниченко А.С, Губарева Е.А., Куевда Е.В., Гуменюк И.С.К вопросу о морфологических критериях децеллюляризации органов и тканей. 2017; 19: 65-69]. Ссылки на смежные изобретения Известен способ обработки тканей для реконструктивной сердечнососудистой хирургии [Патент РФ №2499611, 27.11.2013], включающий предварительную инкубацию тканей до имплантации в физиологическом солевом растворе с ЭДТА, с последующей обработкой неионным липофильным детергентом моногидратом дезоксихолата натрияи с последующей отмывкой неионного детергента, в котором предварительную инкубацию биоматериалов выполняют в течение 4-6 часов в физиологическом растворе, содержащем 0,5-2 мМ ЭДТА и органический буфер HEPES при рН 7.0. Инкубацию с моногидратом дезоксихолата натрия выполняют в течение 30-48 часов при 37°С, используя физиологический раствор, а отмывку ткани от дезоксихолата выполняют в физиологическом растворе хлористого натрия, HEPES (рН 7,8) и 15-25% этилового спирта, в течение 8 суток при 37°С с 2-х кратной сменой среды каждые сутки на свежую, с последующей отмывкой от этилового спирта в течение суток.
Недостатком этого способа является то, что в тканях перикарда остается не только серозный, но и фиброзный слои и, следовательно, сохраняется возможность фиброзной гиперплазии с одной из сторон биоматериала, что впоследствии может способствовать резорбции материала и снижению тем самым его биосовместимости и долговечности.
Существует способ проведения децеллюляризации кожи свиньи [Патент РФ, №2694543, 09.11.2018], заключающийся в деэпителизации путем многократного замораживания-оттаивания лоскута кожи и обработки его гипертоническим раствором натрия хлорида с последующим помещением в разбавленный 1:9 фосфатный буфер Серенсена. На втором этапе используют 2% раствора дезоксихолата натрия в течение 48 часов со сменой раствора каждые 12 часов и обработкой 2% раствором дезоксихолата натрия в комбинации с панкреатической липазой в течение 9 часов со сменой раствора каждые 3 часа. Далее элиминировали из образцов ДНК при помощи раствора ДНК-азы 0,1 мг/мл, приготовленного с использованием трис-HCl буфера рН 6,8 с добавлением 10 мМ магния (II) сульфата и 1,9 мМ кальция (II) хлорида и инкубировали их в емкости без перемешивания при температуре 37°С в течение 9 часов с трехкратной сменой раствора.
Недостатком способа является длительность проведения децеллюляризации и многократные циклы заморозки и разморозки, создающие угрозу бактериальной контаминации каркаса.
2
2
Известен способ получения бесклеточного матрикса амниотической мембраны для последующей реконструкции дефектов тканей в качестве покрытия с сохранными структурными компонентами внеклеточного матрикса [Патент РФ, №2020124830, 13.07.2021], включающий донорскую плаценту переносят в ламинарно-потоковый шкаф II класса биологической опасности, отделяют внутреннюю плодную амниотическую оболочку от хориона, при этом из одной плаценты выделяют примерно 300 смамниотической мембраны. Выделенные фрагменты амниона площадью 50 см тщательно отмывают от крови в фосфатно-солевом буферном растворе с добавлением 250 ЕД/мл пенициллина и 250 мкг/мл стрептомицина троекратно в течение суток, через каждые 3 часа проводят замену раствора. Затем выделенные фрагменты амниотической мембраны площадью 50 см2 подвергают детергентно-ферментативной децеллюляризации , используя при этом: (1) 0,5% дезоксихолат натрия + 0,5% TritonX100 - 24 ч, 400 об/мин; (2) 0,05% Трипсин-ЭДТА - 1 ч, 200 об/мин; (3) DMEM, 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицина - 24 ч, 400 об/мин; (4) 300 ЕД/мл ДНКазы I, 40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl - 16 ч, 400 об/мин; (5) PBS, 1% пенициллина-стрептомицина - 48 ч, 400 об/мин. Далее матрикс анализируют на наличие/отсутствие ядер клеток или теней ядер, сохранность основных компонентов внеклеточного матрикса (коллаген, ламинин, фибронектин) и уровень остаточной геномной ДНК. Недостатком данного способа является сложность протокола децеллюляризации и получения первичного материала.
Технический результат, на который направлено изобретение – устранение рисков тканевой несовместимости и возникновения послеоперационных осложнений при пластике дефектов передней брюшной стенки.
Эксперимент проводился в соответствии с правилам лабораторной практики Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.), со строгим соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986).
С целью получения биоинженерного трансплантата была выполнена погружная децеллюляризация кадаверного участка апоневроза передней брюшной стенки свиньи, полученного при аутопсии. Для этого был использован следующий протокол децеллюляризации. Тканевой материал при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере со скоростью 140 оборотов в минуту обработали 2 об.% раствором додецилсульфата натрия (SDS) в дистиллированной воде с добавлением 45-50 mM этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) для инактивации внутриклеточных ферментов, выделяющихся при разрушении клеток.
Обработку выполняли не менее 3 часов, так как при меньшей продолжительности децеллюляризации в гистологических препаратах апоневроза ПБС были обнаружены сохраненные фиброциты. Для сохранения физических свойств материала, таких, как плотность, и прочность, снижения степени обсемененности процесс децеллюляризации выполняли при низкой температуре. Материал помещали в термостат, и в течение 15-20 минут снижали температуру до 10-8 0 С. После процесс децеллюляризации длился 3 часа. Затем материал промывали дистиллированной водой, содержали в стерильных пробирках при температуре 8-10° С не менее 3 часов с 1 об.% раствором Triton X-100 в дистиллированной воде с 20-25 mM EDTA в фосфатном буфере (PBS), перемешивая на орбитальном шейкере со скоростью 140 оборотов в минуту. Качество полученного биоинженерного каркаса определяли методами гистологического исследования (фиг. 1).
Определение биомеханических параметров на растяжение осуществляли с помощью планшетного динамометра.
Работа была выполнена на крысах линии Wistar обоего пола, весом 250 - 300 г., достигших 4 - 5-месячного возраста. Пластику грыжевых ворот передней брюшной стенки выполняли под общей анестезией. Первым этапом имитировали грыжевой дефект ПБС крысы. Вторым этапом имплантировали биоинженерный трансплантат при помощи одиночных узловых швов.
Через 4-6 месяцев после операции крыс выводили из эксперимента и производили забор биологического материала для гистологического исследования (фиг. 2).
Было выполнено сравнительное исследование, в котором мы приготовляли трансплантаты четырьмя способами (см. таблицу). Для определения качественных свойств биоматериалов были исследованы степень бактериальной обсемененности трансплантата после децеллюляризации, растяжимость и плотность.
Из данных таблицы следует, что предлагаемый способ обработки апоневроза для получения биотрансплантата имеет как минимум в два раза меньшую степень бактериальной обсемененности, на 30-40% большую степень растяжимости, на 57-66% большую плотность, в сравнении с материалами, полученными другими способами.
Описание к фигурам
Фиг. 1. Гистологическое исследование апоневроза передней брюшной стенки живота свиньи (окраска гематоксилин-эозином). Увеличение х40: а) до децеллюляризации; б) после децеллюляризации.
1 - соединительнотканные волокна;
2 - фиброциты.
Фиг. 2. Гистологическое исследование тканей передней брюшной стенки крысы через 5 месяцев после имплантации биоинженерного трансплантата (окраска гематоксилин-эозином, увеличение х10)
1 - соединительнотканные волокна;
2 - фиброциты,
3 - гранулематозное воспаление,
4 - шовный материал.