Дезинтеграция микробных агрегатов для идентификации микроорганизмов в процессах очистки сточных вод

УДК 628.353.3

И. Р. Бурнашева, Т. В. Кирилина, Б. Маниракиза, А. С. Сироткин

ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ МИКРОБНЫХ АГРЕГАТОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПРОЦЕССАХ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД

Ключевые слова: микробные агрегаты, биопленка, дезинтеграция, ультразвуковая обработка, флуоресцентная микроскопия.

Проведены экспериментальные исследования эффективности дезинтеграции микробных агрегатов системы биофильтрации коммунально-бытового стока для дальнейшей идентификации микроорганизмов в их составе. Дезинтеграция биопленок осуществлялась в процессе механического перемешивания и ультразвуковой обработки. Степень дезинтеграции микробных агрегатов оценивалась по результатам простого и флуоресцентного микроскопирования. Определено, что оптимальным условием дезинтеграции биопленок является ультразвуковая обработка их суспензии в течение 3 минут при частоте 40 кГц.

Key words: microbial aggregates, biofilms, disintegration, ultrasonic processing, fluorescent microscopy.

Investigations of the disintegration efficiency of microbial aggregates from the system of domestic waste water biofiltrtion for the further microorganisms identification in their structure were conducted. Disintegration of biofilms was carried out in the processes of mechanical shaking and ultrasonic processing. The level of microbial aggregates disintegration was estimated by the results of light and fluorescent microscopy. It is defined that an optimum condition of biofilms disintegration is ultrasonic processing of their suspension within 3 minutes with a frequency of 40kHz.

Введение

Согласно современным исследованиям 95-99% всех бактерий существуют в природе не в виде свободно плавающих клеток, а в виде специфически организованных биопленок [1]. При этом бактерии составляют от 5 до 35% массы биопленки, остальная часть представлена биополимерным матриксом, который структурирует микробные агрегаты и защищает микроорганизмы от неблагоприятных факторов окружающей среды.

Многочисленные преимущества биопленок перед отдельными, свободно существующими клетками вызывают интерес и активное использование в биотехнологических процессах. Так, в процессах биофильтрации сточных вод основная роль принадлежит микробным клеткам, иммобилизованным на поверхности фильтрующих загрузочных материалов. Использование биопленок в данном случае позволяет достичь высокой концентрации клеток, в том числе медленно растущих бактерий, и обеспечить высокую эффективность очистки.

В сооружениях биологической очистки другого типа - аэротенках формируются микробные агрегаты, называемые активным илом, флоккулы которого следует рассматривать как суспендированные малоструктурированные

биопленки недифференцированного типа, содержащие самоиммобилизованные клетки [2].

Поскольку больший объем иммобилизованной биомассы составляют внеклеточные полимерные вещества, нахождение микроорганизмов в составе микробных агрегатов может обусловливать трудности их исследования и идентификации. Одной из проблем при этом является трудоемкость устранения мешающих веществ в процессе пробоподготовки. Данный факт определяет необходимость исследований состава

биополимерного матрикса и методов его

дезинтеграции.

Целью настоящих исследований являлась оценка эффективности дезинтеграции микробных агрегатов на примере биопленки с использованием механического перемешивания и ультразвуковой обработки проб.

Экспериментальная часть

В качестве объектов исследования в данной работе рассматривались образцы биопленок, отобранных из лабораторной биофильтрационной установки.

В аэрируемый биофильтр подавался модельный раствор коммунально-бытовых сточных вод. В качестве загрузочного материала биофильтра использовался дренажный керамзит с диаметром зерна от 2 до 8 мм. Накопление биомассы осуществлялось в течение 7 суток. По истечении этого времени отбирались пробы для проведения экспериментальных исследований [3,4].

В колбу объемом 750 мл отбирали 300 г керамзита с иммобилизованной на его поверхности биопленкой и добавляли 500 мл воды. Круговыми движениями встряхивали колбу в течение двух минут. Дальнейшие экспериментальные

исследования проводили с суспензией микробных биопленок, смытых с поверхности загрузочного материала.

Дезинтеграцию микробных биопленок осуществляли путем механического перемешивания и методом ультразвуковой обработки.

Дезинтеграцию микробных агрегатов методом ультразвуковой обработки проводили в режимах озвучивания с частотами 40 кГц и 30,4 кГц. Суспензию образцов биопленки подвергали озвучиванию в течение 10 минут. Через 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10 минут отбирали пробы микробной суспензии, параллельно измеряя ее температуру.

Механическое перемешивание как способ

дезинтеграции был выбран в качестве метода сравнения, практикуемого в лабораторных исследованиях. Так, проводилось перемешивание суспензии микробных агрегатов в объеме 50 мл в течение 3 часов на магнитной мешалке ПЭ - 6100. Перемешивание суспензии в данном случае происходило с помощью вращающегося с частотой от 120 до 1500 об/ мин в магнитном поле якоря [5].

После дезинтеграции пробы микробной суспензии подвергались окрашиванию красителем сафранином и последующему светлопольному микроскопированию. Параллельно проводилось окрашивание проб микробных суспензий красителем 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для специфического окрашивания микробных клеток и их микроскопирования на флуоресцентном микроскопе Axio Imager D2 (Carl Zeiss, Germany).

Результаты и их обсуждение

Оценка степени дезинтеграции микробных агрегатов механическим перемешиванием

Результаты микроскопирования образцов биопленок после механического перемешивания на магнитной мешалке свидетельствуют об отсутствии эффекта дезинтеграции микробных агрегатов. Микрокартина образцов биопленки, отобранных по истечении 3 часов перемешивания, существенно не отличается от исходной

Рис. 1 - Микрофотографии образцов биопленок до и после механического перемешивания, краситель - сафранин, кратность увеличения х400

Оценка степени дезинтеграции микробных агрегатов ультразвуковой обработкой

Результаты микроскопирования образцов биопленок, обработанных ультразвуком при частоте 40 кГц представлены на рисунке 2 и 3. Исходная биопленка представлена в виде единого агрегата. Ультразвуковая обработка микробной биопленки в течение 30 секунд наглядно демонстрирует уменьшение плотности хлопка. По истечении 1 минуты озвучивания ультразвуком наблюдаются отдельные хлопки меньших размеров; по истечении 2 минут - размеры плотных хлопков уменьшаются и появляются единичные клетки. Согласно полученным результатам при 3-х минутном озвучивании наблюдается большее количество единичных клеток на фоне рыхлых по плотности хлопков (рис.2).

В результате 4-х и 5-ти минутного озвучивания ультразвуком в пробах были отмечены практически только единичные клетки. В образцах суспензий

после 10 минут ультразвуковой обработки видны единичные непрокрашенные клетки, что, вероятно, связано с разрушением клеточных стенок микроорганизмов, вследствие повышения температуры выше 45 0С [6].

Рис. 2 - Микрофотографии образцов биопленок до и после ультразвуковой обработки (40 кГц), краситель - метиленовый синий, кратность увеличения х1000

Окраска микробных образцов биопленки после ультразвуковой обработки при 40 кГц красителем БЛР1, подтверждает полученные результаты и выводы, сделанные при простом окрашивании клеток сафранином. В отличие от сафранина БЛР1 проникает через плазматическую мембрану клетки и связываются с двухцепочечной ДНК, обеспечивая специфическое окрашивание бактериальных клеток, что позволяет идентифицировать биологическую природу окрашенного объекта [7].

исходная Н

проба НЗмнн

Рис. 3 - Микрофотографии образцов биопленок до и после ультразвуковой обработки (40 кГц), краситель - БЛР1, кратность увеличения х1000

При этом согласно полученным результатам микроскопирования микробных суспензий после ультразвуковой обработки при частоте 30,4 кГц в течение 10 минут была выявлена малая эффективность дезинтеграции.

Рекомендации по проведению ультразвуковой дезинтеграции микробных агрегатов

В процессе экспериментальных исследований были выявлены некоторые закономерности, на основании которых сформулированы следующие рекомендации:

1. После обработки ультразвуком микробной биопленки в суспензии рекомендуется незамедлительное приготовление микробных препаратов во избежание повторного коагулирования клеток. Так, выявлено, что результаты микроскопирования образцов микробных биопленок, окрашенных по истечении 24 часов после ультразвуковой дезинтеграции (10 минут, 40 кГц) не коррелируют с результатами

окрашивания образцов, окрашенных в течение 1 часа после ультразвуковой обработки при тех же условиях. Коагуляция клеток в условиях моделирования структуры внеклеточных полимерных веществ в микробных агрегатах вызвана действием Ван-дер-ваальсовых,

электростатических и водородных сил [8].

2. При ультразвуковой обработке необходимо учитывать, что в процессе озвучивания температура суспензии повышается. Согласно полученным данным за 1 минуту обработки при частоте 40 кГц температура повышается в среднем на 50С. Известно, что жизнедеятельность микроорганизмов ограничена температурными границами. В активном иле преобладают мезофилы [8]. Температурный диапазон, в котором они развиваются, варьируется в пределах от 10 до 450С [6]. Обработка микробной суспензии ультразвуком более чем в течение 3 минут сопровождается повышением температуры до максимально допустимых, в результате чего наступает гибель микробных клеток, обусловленная денатурацией белков клетки [6].

Таким образом, при выборе частоты ультразвуковой обработки, необходимо учитывать требуемую жизненную активность

микроорганизмов после озвучивания.

3. Результаты микроскопирования образцов биопленки после ультразвуковой обработки зависят от начальной концентрации биомассы в исследуемой системе. Выявлено, что при исходной концентрации биомассы, равной 5,6 г/дм3, ультразвуковая обработка в течение 10 минут не позволяет идентифицировать отдельные клетки микроорганизмов. Исходная проба с концентрацией биомассы 0,21 г/дм3 изначально представлена рыхлыми хлопьями, и подвергать её ультразвуковой обработке нецелесообразно. Это связано с низкой плотностью клеток в несформировавшейся биопленке.

Заключение

1. Подтверждена неэффективность

дезинтеграции микробных агрегатов в процессе

механического перемешивания в широком диапазоне скорости перемешивания (от 120 до 1500 об/ мин).

2. Выявлено, что ультразвуковое озвучивание с частотой 30,4 кГц обеспечивает недостаточно высокую степень дезинтеграции микробных агрегатов для дальнейшего микроскопирования микробных клеток.

3. Показано, что ультразвуковое озвучивание с частотой 40 кГц в течение 3 минут может быть эффективно использовано для дезинтеграции микробных агрегатов с дальнейшей идентификацией нативных отдельных клеток путем их молекулярно-биологического анализа и специфического микроскопирования.

Литература

1. Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Биопленка - «город микробов» или аналог многоклеточного организма? // Микробиология. 2007. Т.76. №2. С.149-163

2. Плакунов В.К. Микробные биопленки: перспективы использования при очистке сточных вод // Вода: Химия и Экология. 2008.№2.с.11-13.»

3. А.С. Сироткин, И.У. Абитаева, Т.В. Лапшина, Т.В. Кирилина, Р.З. Агзамов, Вестник Казанского технологического университета, т.16, №6, 124-128

4. Сироткин А.С., Кирилина Т.В., Семенова Е.Н., Халилова А.А. Биофильтрация сточных вод :учебное пособие/КНИТУ.- Казань.2014. -172с.

5. Руководство по эксплуатации магнитной мешалки ПЭ-6100

6. Влияние факторов окружающей среды на микроорганизмы [Электронный ресурс]. - Режим доступа:http://biologylib.ru/books/item/ГО0/s00/z0000015/st 008.shtml

7. Брюханов А.Л., Рыбак К.В., Нетрусов А.И. Молекулярная микробиология: Учебник для вузов. — М.: Издательство Московского университета, 2012. — 480 с.

8. Сироткин А.С., Шагинурова Г.И., Ипполитов К,Г. Агрегация микроорганизмов: флокулы, биопленки, микробные гранулы. - Казань: Изд-во Академии наук Республики Татарстан «ФЭН», 2007. - 160 с.

© И. Р. Бурнашева, магистрант кафедры промышленной биотехнологии КНИТУ, merek-@mail.ru; Т. В. Кирилина, к.т.н., доцент кафедры промышленной биотехнологии КНИТУ, tvkirilina@gmail.com; Б. Маниракиза, магистрант кафедры промышленной биотехнологии КНИТУ, benmanirakiza@yahoo.fr; А. С. Сироткин, д.т.н., профессор, заведующий кафедрой промышленной биотехнологии КНИТУ, asirotkin66@gmail.com.

© I. R. Burnasheva, Master-Student of Department of Industrial Biotechnology, KNRTU, merek-@mail.ru; T. V. Kirilina, PhD of Engineering Sciences, Associate Professor of the Department of Industrial Biotechnology, KNRTU, tvkirilina@gmail.com; B. Manirakiza, Master-Student of Department of Industrial Biotechnology, KNRTU, benmanirakiza@yahoo.fr; A. S. Sirotkin, Doctor of Engineering Sciences, Professor, Head of the Department of Industrial Biotechnology, KNRTU, asirotkin66@gmail.com.