СПОСОБЫ, КОМПОЗИЦИИ И НАБОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А
METHODS, COMPOSITIONS AND KITS FOR DETERMINING HEPATITIS A VIRUS

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Данное изобретение относится к вирусу гепатита A (HAV) и включает способы, композиции и наборы для его определения.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
HAV представляет собой РНК-содержащий вирус, который вызывает нехроническую инфекцию печени и может передаваться с помощью продуктов на основе крови. Донорская плазма, собранная для производства биологических терапевтических средств, подвергается анализу на РНК HAV, и образцы донорской плазмы, которые являются позитивными, отвергаются.
Таким образом, все еще существует потребность в композициях и способах для определения HAV.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте данной заявки обеспечивается изолированная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность или ее комплемент, как представлено в:
5′-GCG CCC GGC GGG GTC ААС ТСС АТ-3′ (SEQ ID NO:1);
5′-AGC CAA GTT ААС ACT GCA AGG-3′ (SEQ ID NO:2); или
5′-TTA GCA TGG AGC TGT AGG AGT СТА AAT TGG GG-3′ (SEQ ID NO:3).
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию, которая включает пару олигонуклеотидных праймеров, включающую прямой праймер, который имеет последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1 и обратный праймер, который имеет последовательность, как представлено в SEQ ID NO:2, где пара праймеров является способной к отжигу целевой последовательности при условиях ПЦР для амплификации целевой последовательности.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ амплификации целевой последовательности, где способ включает:
осуществление ПЦР с целевой последовательностью в качестве матрицы, где осуществление включает обеспечение ПЦР прямым праймером, который включает последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1 и обратным праймером, который включает последовательность, как представлено в SEQ ID NO:2.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ определения HAV в образце, где способ включает:
осуществление ПЦР с матрицей нуклеиновой кислоты в образце при использовании прямого праймера, который включает последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1, и обратного праймера, который включает последовательность, как представлено в SEQ ID NO:2; и
определение ампликона, который образуется с помощью прямого и обратного праймеров, где присутствие ампликона определяет HAV в образце.
В других дополнительных аспектах настоящее изобретение обеспечивает набор, который включает композиции и/или одну или более молекул нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается изолированная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, или ее комплемент.
В одном воплощении настоящее изобретение обеспечивает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, или ее фрагмент, содержащий, по крайней мере, 10 нуклеотидов, например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 27, 29, 30, 31 или 32 нуклеотида.
В других воплощениях изолированные молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением имеют длину не более, чем приблизительно 100 пар оснований, например, не более, чем приблизительно: 100, 90, 80, 70, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 и 10 пар оснований.
В другом воплощении настоящее изобретение обеспечивает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, которая состоит или существенно состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, которая состоит из: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, или ее комплемента.
Термин "молекула нуклеиновой кислоты" в данной заявке включает полимеры, которые состоят из существующих в природе нуклеотидных оснований, Сахаров и ковалентных внутринуклеозидных (скелетных) связей, а также молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат несуществующие в природе части, которые функционируют подобным образом. Кроме того, термин "молекула нуклеиновой кислоты" также включает полимеры, которые являются двухцепочечными, одноцепочечными и включают РНК, ДНК, модифицированную РНК или ДНК, миметики РНК или ДНК, или любую их комбинацию.
В некоторых воплощениях олигонуклеотидные праймеры и зонды могут быть получены из последовательностей нуклеиновой кислоты, раскрытых в данной заявке. В различных воплощениях праймеры и зонды используются в комбинации друг с другом. Настоящее изобретение находит свое применение в разнообразных различных применениях, включая, но без ограничения таковыми исследовательские, медицинские и диагностические применения для HAV. Например, праймеры и зонды могут обеспечиваться для реагентов с целью применения, например, в анализе и/или наборе для определения HAV.
В общем случае, пары праймеров, включающие прямой праймер и обратный праймер могут обеспечиваться для специфической амплификации (например, с помощью ПЦР) целевой нуклеиновой кислоты, фланкированной праймерами для получения продукта амплификации (который также называется "ампликоном"). В этой связи каждый праймер связывается с его комплементарной или существенно комплементарной целевой последовательностью, обеспечивая, таким образом, место для посадки полимеразы и удлинения 3′-конца каждого праймера путем присоединения нуклеотидов, обеспечивая, таким образом, комплементарную копию целевой последовательности.
В одном воплощении пара праймеров включает прямой праймер, который имеет последовательность как представлено в SEQ ID NO:1, и обратный праймер, который имеет последовательность, как представлено в SEQ ID NO:2.
В одном воплощении целевая нуклеиновая кислота представляет собой, по крайней мере, сегмент кДНК, полученный из обратно транскрибированной РНК HAV. Среднему специалисту в данной области техники будет понятно, что РНК может быть обратно транскрибирована при использовании способов (например, обратной транскрипции (RT)), известных в области техники для обеспечения матрицы для амплификации с помощью праймеров.
Например, в некоторых воплощениях полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (RT-PCR) осуществляют при использовании обратной транскриптазы полимеразы и пары специфических для HAV праймеров в соответствии с данным изобретением для амплификации вирусной РНК HAV в образце. Образец может представлять собой культуральный супернатант или образцы плазмы крови, полученной от инфицированного HAV индивидуума. Пара специфических для HAV праймеров в соответствии с данным изобретением является способной к амплификацйии вирусной РНК HAV.
В общем случае, зонд представляет собой олигонуклеотид, который является комплементарным или существенно комплементарным нукелотидной последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Зонды являются полезными для разнообразных применений, включая, но без ограничения таковыми, определение или захват целевой нуклеиновой кислоты или ампликона, который соответствует мишени. Например, зонды, приемлемые для применения в способах определения на основе амплификации, могут быть сконструированы из любой последовательности, которая находиться в и/или которая включает последовательность продукта амплификации, который может быть получен при использовании двух выбранных праймеров.
В одном воплощении зонд включает нуклеотидную последовательность, комплементарную или существенно комплементарную, по крайней мере, части последовательности ампликона, образованного парой праймеров, включающей прямой праймер, который имеет последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1, и обратный праймер, который имеет последовательность, как представлено в SEQ ID NO:2.
В других воплощениях зонд включает нуклеотидную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:3, или ее комплемент.
Квалифицированный специалист в данной области техники будет осведомлен, что изолированные молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, включая праймеры и/или зонды, могут быть получены с помощью стандартных методик молекулярной биологии, описанных в Current Protocols in Molecular Biology (1999. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, ред. John Wiley & Sons, Inc.), или с помощью химического синтеза, или при использовании аналогов нуклеиновой кислоты. Способы, вовлекающие химический синтез, могут быть автоматизированными и коммерчески доступными и могут включать, например, способы на основе фосфодиэфира, фосфотриэстера или фосфорамидата. Патенты США №4,458,066; 4,415,732; и Meth. Enzymol. 1979 68:90 и 109, которые являются введенными в данную заявку в качестве ссылки, раскрывают примеры способов химического синтеза. Химический синтез нуклеиновой кислоты позволяет осуществлять введение неприродных или модифицированных оснований, а также разнообразных остатки для мечения, в молекулу нуклеиновой кислоты. Кроме того, модифицированные структуры скелета, такие, как, например, пептидные связи, фосфоротиоаты, фосфороамидаты, фосфотриэстеры 2′-0-метил РНК, 2′-0-Mt РНК, п-этокси ДНК, и п-этокси 2′-0-Mt РНК также являются легко доступными и известными в области техники. Кроме того, применение способных к перекрестному связыванию зондов в анализах гибридизации нуклеиновой кислоты является известным в области техники. Например, соединения на основе фурокумарина или псоралена, которые являются присоединенными к молекулам нуклеиновой кислоты путем образования аддукта, являются описанными в патенте США №4,826,967 и в патенте США №5,082,934, оба эти источника которые являются введенными в данную заявку в качестве ссылки, описывают способный к фотоактивации нуклеозидный аналог, который включает остаток кумарина, связанный посредством своего фенильного кольца с 1 положением остатка сахара рибозы или дезоксирибозы при отсутствии препятствующего остатка основания.
Аналоги и миметики нуклеиновой кислоты имеют подобные химические структуры в качестве нативных молекул нуклеиновой кислоты, но с уникальными модификациями. Аналоги нуклеиновой кислоты, такие, как заблокированные нуклеиновые кислоты (LNA), пептидные нуклеиновые кислоты (PNA), и морфолино, улучшают способность традиционных молекул нуклеиновой кислоты обходить ограничения, которые ассоциируются с химией стандартных нуклеиновых кислот (Karkare S и Bhatnagar D. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006 71:575-586). Такие аналоги нуклеиновых кислот значительно расширяют и улучшают способности к определению и идентификации родственных последовательностей нуклеиновых кислот.
В некоторых аспектах изолированная молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включает один или более гетерологичных нуклеотидов. Термин "гетерологичные нуклеотиды" в данной заявке относится к нуклеотиду или нуклеотидам, которые не являются природной частью изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, но таким, которые естественным образом или искусственно присоединены к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты.
Примеры последовательностей гетерологичных нуклеиновых кислот включают, но без ограничения таковыми, последовательность вектора, последовательность, которая является комплементарной последовательности оснований зонда очистки, и последовательность, которая включает один или более сайтов рестрикционных ферментов.
В одном воплощении один или более гетерологичных нуклеотидов включают последовательность, которая является комплементарной последовательности оснований зонда очистки. Зонд очистки может быть присоединен к твердой основе, такой, как, например, матрица, или в свободном от частиц растворе. Не ограничивающие примеры твердых основ включают нитроцеллюлозу, нейлон, стекло, полиакрилат, смешанные полимеры, полистирол, силан полипропилен, и частицы, притягиваемые магнитом. Например, зонд очистки, который может включать последовательность ДНК или РНК, может быть меченным с помощью меток амина или биотина при использовании кросслинкера. Такие меченные биотином или амином зонды очистки потом используются для стратегий иммобилизации и определения, которые позволяют осуществлять in vitro взаимодействия нуклеиновая кислота: нуклеиновая кислота или белок: нуклеиновая кислота. Таким образом, отжиг гетерологичного сегмента изолированной молекулы нуклеиновой кислоты с его комплементарной последовательностью оснований зонда очистки может облегчать очистку образца молекул, которые отжигают сегмент специфической для вируса последовательности изолированной молекулы нуклеиновой кислоты. Патент США №6,534,273,который является введенным в данную заявку в качестве ссылки, описывает способ захвата целевой молекулы нуклеиновой кислоты в образце твердой основой.
В одном воплощении изолированные молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретение, например, соединяются с твердым основанием, таким, как те, что описаны выше.
n
n
n
n
n
n
В некоторых воплощениях один или более гетерологичных нуклеотидов включают одну или более повторяющуюся последовательность оснований, например, одну или более повторяющуюся последовательность оснований, которая является комплементарной одной или более повторяющейся последовательности оснований зонда очистки. Повторяющаяся последовательность оснований может представлять собой регулярно повторяющуюся последовательность оснований, такую, как те, которые сформированы, например, гомополимерами нуклеиновой кислоты полиаденина (A), политимина (T), полицитозина (C), полигуанина (G), и полиуридина (U). Повторяющиеся последовательности могут также включать смешанные полимеры, такие, как повторы AT ([AT]), и тому подобное.
m
Количество оснований повторяющейся последовательности оснований одного или более гетерологичных нуклеотидов изолированной молекулы нуклеиновой кислоты может быть равным, большим или меньшим, чем число оснований оснований повторяющейся последовательности оснований зонда очистки. Длина комплементарных повторяющихся последовательностей может определять точку плавления (T) гетерологичного комплекса сегмента зонда очистки. В одном воплощении повторяющаяся последовательность оснований гетерологичного сегмента является большей, чем комплементарная последовательность повторяющихся оснований зонда очистки. В другом воплощении повторяющаяся последовательность оснований гетерологичного сегмента или зонда очистки может составлять, по крайней мере, приблизительно 5 оснований в длину, например, от приблизительно 5 до приблизительно 40, от приблизительно 10 до приблизительно 30 или от приблизительно 15 до приблизительно 20, и так далее.
В других воплощениях один или более гетерологичных нуклеотидов включают оперативно связанную последовательность контроля. В одном воплощении последовательность контроля представляет собой последовательность энхансера или промотора, которая специфически узнается РНК полимеразой, которая связывается с этой последовательностью и инициирует транскрипцию для получения РНК транскриптов. Неограничивающие примеры промоторов, которые узнаются РНК полимеразой, включают промоторы, такие, как Т3, Т7 или SP6. Таким образом, изолированная молекула нуклеиновой кислоты может использоваться в разнообразных анализах на основе нуклеиновой кислоты, в том числе анализах, которые используют РНК полимеразу для получения множественных транскриптов РНК, таких, как, например, анализ на основе опосредованной транскрипцией амплификации (ТМА), как описывается в Nature 350:91-92 (1991); патенте США №5,399,491, оба эти источника являются введенными в данную заявку в качестве ссылки.
3
6
7
9
12
18
2
125
131
35
14
32
33
3
В одном воплощении изолированные последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением являются меченными, например, меченными радиоактивно, хемилюминисцентно, флуоресцентно или с помощью инфракрасных красителей, или с помощью усиленного поверхностью сигнала комбинационного рассеяния света или плазменной резонансной частицы (PRP). Например, модификации нуклеотидов включают прибавление акридина или его производных, Акридита™, амина, биотина, BHQ-1™, BHQ-2™, BHQ-3™, боратных дНТФ, углеродных спейсеров (например, С, С, C, C, С или C), каскадного голубого, холестерола, кумарина или его производных, Су3, Су3.5, двойного биотина, EDANS, 6-FAM, флуоресцеина, 3′-глицерила, HEX, IAEDANS, инвертированного dA, инвертированного dG, инвертированного dC, инвертированного dG, IRD-700, IRD-800, JOE, La Jolla Blue, кластеров металла, таких, как наночастицы золота, фенилборной кислоты, фосфата псоралена, 3′- или 5′-фосфорилирования, пирена, 3′ рибоаденозина, 3′ рибогуанозина, 3′ рибоцитидина, (LC)Red640, (LC)Red705, родамина, ROX, тиола (SH), спейсеров, TAMRA, ТЕТ, AMCA-S, SE, BODIPY, Marina Blue, Oregon Green, Pacific Blue, QSY7™, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Rhodol Green, тетраметилродамина, Texas Red, Uni-Link NH-модификатора, радиоактивных меток (например, I, I, S, C, P, P, H) и наночастиц. Разнообразные методики мечения являются известными среднему специалисту в данной области техники.
Метки могут присоединяться непосредственно или опосредованно к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты. Мечение нуклеиновой кислоты может осуществляться путем ковалентного присоединения способной к определению группы (метки), например, во внутреннем или терминальном положении. Квалифицированному специалисту в данной области техники является известным, что существуют разнообразные пути для дериватизации олигонуклеотидов с реактивными группами, которые позволяют осуществить присоединение метки. Является доступным ряд подходов для непосредственного присоединения меток к молекулам нуклеиновой кислоты и для биотинилирования зондов так, что радиоактивные, флуоресцентные, хемилюминисцентные, ферментативные или электронно плотные метки могут присоединяться с помощью авидина. Неограничивающие примеры ссылок, где описываются метки и способы для мечения нуклеиновых кислот включают патент США №4,605,735; патент США №4,757, 141; патент США №6,965,020; Nucl. Acids Res. 5:363 (1978); Nucl. Acids Res. 13:1529 (1985); Nucl. Acids Res. 15:3131 (1987); Nucl. Acids Res. 15:6455 (1987); Nucl. Acids Res. 13:4485 (1985); Nucl. Acids Res. 15:4837 (1987); и Anal. Biochem. 169:1-25 (1988), которые являются введенными в данную заявку в качестве ссылки для их раскрытия, касающегося мечения нуклеиновых кислот.
В некоторых воплощениях изолированные молекулы нуклеиновой кислоты являются меченными для способов определения при использовании резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). FRET вовлекает применение двух красителей, донорного и акцепторного красителя. FRET может определяться либо с помощью флуоресценции акцепторного красителя ("сенсибилизированная флуоресценция"), если указанный акцептор сам по себе является флуоресцентным, или путем гашения флуоресценции донорного красителя, если указанный акцептор представляет собой гасящий нефлуоресцентный краситель. FRET может быть отсроченной, если донорный краситель высвобождает свою флуоресценцию в течение определенного периода времени. Этот процесс именуется как "TR-FRET" или "FRET с временным разрешением". Донорный и акцепторный красители могут также быть одинаковыми, в случае чего FRET определяется с помощью получаемой деполяризации флуоресценции. Красители могут быть также ковалентно связанными с образованием тандемного флуоресцентного красителя или тандемного красителя или тандемного конъюгата. Например, единичный донорный краситель потом является способным возбуждать два акцепторных красителя одновременно, что приводит к эмиссии света с различными длинами волн. Предпочтительным является, когда профиль длины волны эмиссии донора будет, по крайней мере, частично перекрываться с профилем длины волны поглощения акцептора.
Флуоресцентные красители, которые могут использоваться, включают, но не ограничены таковыми, BODIPY FL, Cy3, Cy3.5, Cy5.RTM., Cy5.5, EDANS, FAM, флуоресцеин, HEX, IAEDANS, JOE, Oregon Green, (LC)Red640, (LC)Red705, ROX, TAMRA, TET, тетраметилродамин и Texas Red.
Гасящие красители включают, но без ограничения таковыми, BHQ-1™, BHQ-2™, BHQ-3™, DABCYL, металлические кластеры, такие, как наночастицы золота и QSY7™.
Пары донор/акцептор, которые могут использоваться, включают, но без ограничения таковыми, FAM/BHQ-1, TET/BHQ-1, JOE/BHQ-1, HEX/BHQ-1, Oregon Green/BHQ-1, TAMRA/BHQ-2, ROX/BHQ-2, Cy3/BHQ-2, Cy3.5/BHQ-2, Texas Red/BHQ-2, Texas Red/BHQ-2, Cy5/BHQ-3, Cy5.5/BHQ-3 флуоресцеин/тетраметилродамин, флуоресцеин/флуоресцеин, флуоресцеин/QSY7, флуоресцеин/LC RED640, флуоресцеин/LC Red705 IAEDANS/флуоресцеин, EDANS/DABCYL и BODIPY FLI/BODIPY FL.
В одном воплощении настоящее изобретение обеспечивает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, или ее комплемент, где молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает способную к определению метку.
В некоторых воплощениях способная к определению метка соответствует паре донор/акцептор, приемлемой для определения при использовании FRET.
В других воплощениях пара донор/акцептор представляет собой FAM/BHQ-1.
В дополнительных воплощениях настоящее изобретение обеспечивает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:3, где молекула нуклеиновой кислоты включает FAM на 5′ конце и BHQ-1 на 3′ конце.
В других воплощениях молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут обеспечиваться для одновременного применения двух или более зондов при использовании энергии переноса донор-акцептор, посредством чего, например, получают молекулярные маяки, которые обладают различно окрашенными флуорофорами, что позволяет осуществлять анализы, которые одновременно определяют различные мишени в той же реакции. Например, мультиплексные анализы могут содержать ряд наборов праймеров, при этом каждый набор позволяет осуществлять амплификацию уникальной последовательности гена из различных HAV, и может присутствовать соответствующий ряд молекулярных маяков, каждый из которых содержит последовательность зонда, специфическую для одного из ампликонов, при этом каждый является меченным с помощью флуорофора различного цвета. Цвет полученной флуоресценции, в случае присутствия такового, идентифицирует HAV в образце, и ряд циклов амплификации, которые являются необходимыми для получения способной к определению флуоресценции, обеспечивает количественную меру числа присутствующих целевых организмов. Если в образце присутствует более одного типа HAV, то идентифицируют возникающие цвета флуоресценции, которые присутствуют.
В других аспектах настоящее изобретение обеспечивает композицию, которая включает одну или более изолированных молекул нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых воплощениях композиция представляет собой забуференный раствор. В других воплощениях композиция является лиофилизированной.
В одном воплощении композиция включает пару праймеров, которые имеют последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2.
В одном из воплощений композиция дополнительно включает зонд, который имеет последовательность, как представлено в SEQ ID NO:3, или ее комплемент.
В другом воплощении композиция, которая обеспечивается, включает первую, вторую и/или третью пару праймеров, где первая пара праймеров имеет последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2. В одном воплощении композиция дополнительно включает первый, второй и/или третий зонд, где первый, второй и/или третий зонд каждый включает способную к определению метку, приемлемую для применения в мультиплексной ПЦР в реальном времени.
В других воплощениях композиция включает пару праймеров, которая имеет последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2, и зонд, который имеет последовательность, как представлено в SEQ ID NO:3, или ее комплемент.
В одном воплощении композиция включает, в дополнение к одной или более молекуле нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, такие дополнительные реагенты, как ДНК полимераза, кофакторы, и дезоксирибонуклеозид-5′-трифосфаты в приемлемых концентрациях для обеспечения амплификации целевой нуклеиновой кислоты. В качестве примера, в некоторых воплощения, где композиция представляет собой ПЦР раствор, минимальное количество ДНК полимеразы может составлять, по крайней мере, приблизительно 0,5 единиц/100 мкл раствора, например, от приблизительно 05 до приблизительно 25 единиц/100 мкл раствора и от приблизительно 7 до приблизительно 20 единиц/100 мкл раствора. Другие количества могут быть для данной реакции амплификации и системы. "Единица" может быть определена как количество ферментативной активности, которое является необходимым для введения 10 нмолей общего количества нуклеотидов (дНТФ) в удлиняющуюся цепь нуклеиновой кислоты в течение 30 минут при 74°С. В качестве другого примера, в других воплощениях количество каждого праймера, используемого в пмплификации, может составлять, по крайней мере, приблизительно 0,075 мкмолей, например, от приблизительно 0,075 до приблизительно 2 мкмолей, но другие количества могут быть для данной реакции амплификации и системы. В качестве еще одного примера, в некоторых воплощениях количество каждого дНТФ в растворе может составлять от приблизительно 0,25 до приблизительно 3,5 ммолей, но другие количества могут быть приемлемыми для данной реакции амплификации и системы.
В других аспектах настоящее изобретение обеспечивает способ амплификации целевой последовательности, соответствующей HAV. Например, осуществление ПЦР с помощью целевой последовательности и, по крайней мере, прямого праймера и обратного праймера, каждый из которых является способным к отжигу целевой последовательности при приемлемых условиях ПЦР, может обеспечиваться для амплификации целевой последовательности.
В одном воплощении настоящее изобретение обеспечивает способ амплификации целевой последовательности, где способ включает: осуществление ПЦР с целевой последовательностью в качестве матрицы, где осуществление включает обеспечение ПЦР прямым праймером, который включает последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1, и обратным праймером, который включает последовательность, как представлено в SEQ ID NO:2. В одном воплощении целевая последовательность соответствует кДНК, полученной из РНК образца, включающего HAV.
В других аспектах настоящее изобретение обеспечивает способ определения HAV в образце. Например, образец может включать РНК HAV, или образец может представлять собой образец, в котором определяют присутствие или отсутствие HAV.
В одном воплощении настоящее изобретение обеспечивает способ определения HAV в образце, где способ включает:
а. осуществление ПЦР с матрицей нуклеиновой кислоты в образце при использовании прямого праймера, который включает последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1, и обратный праймер, который включает последовательность, как представлено в SEQ ID NO:2; и
b. определение ампликона, который образуется с помощью прямого и обратного праймеров, где присутствие ампликона определяет HAV в образце.
В одном воплощении матрица представляет собой кДНК, полученную из РНК образца, включающего HAV.
Этап определения может осуществляться с помощью ряда методик, известных среднему специалисту в данной области техники. В одном воплощении ампликон может определяться при использовании зонда, который является меченным для определения и может быть непосредственно или опосредованно гибридизоваться с ампликоном. Зонд может быть растворимым или присоединяться к твердой основе.
В одном воплощении зонд включает способную к определению метку, соответствующую паре донор/акцептор, для определения при использовании FRET, где зонд включает последовательность, как представлено в SEQ ID NO:3, или ее комплементы. Например, в некоторых воплощениях пара донор/акцептор представляет собой FAM/BHQ-1.
В другом воплощении один или более из праймеров, которые используются для амплификации целевой нуклеиновой кислоты, могут быть меченными, например, с помощью специфического связывающего остатка. Полученный продукт удлинения праймера, в который был встроен меченный праймер, может захватываться зондом. Определение амплифицированного целевого продукта, который гибридизуется с зондом, может быть достигнуто путем определения присутствия меченного зонда или меченного амплифицированного целевого объекта при использовании приемлемого оборудования для определения и процедур, которые являются хорошо известными в данной области техники
В других воплощениях один или более из праймеров, которые используются для амплификации целевой нуклеиновой кислоты, являются меченными с помощью биотина, и биотинилированные амплифицированные целевые нуклеиновые кислоты гибридизуются с зондами, присоединенными к твердой основе. Связанные целевые продукты потом определяют путем контакта их с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза в присутствии окислителя, такого, как перекись водорода, и приемлемой композиции, образующей краситель.
Другие методики являются известными среднему специалисту в данной области техники для определения и включают, но без ограничения таковыми, способы, вовлекающие Саузерн-блоттинг, дот-блот методики или определение на основе неизотопного захвата с помощью меченного зонда.
В других воплощениях настоящее изобретение обеспечивает способ определения HAV в образце, где способ включает:
а. осуществление одиночной ПЦР при использовании образца, где смесь ПЦР содержит прямой праймер, который включает последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1, и обратный праймер, который включает последовательность, как представлено в SEQ ID NO:2; и
b. определение ампликона, который образуется с помощью прямого и обратного праймеров, где присутствие ампликона определяет HAV в образце.
В одном воплощении этап определения включает введение в смесь ПЦР олигонуклеотидного зонда, который включает способную к определению метку, соответствующую паре донор/акцептор, приемлемой для определения при использовании FRET, где зонд включает последовательность, как представлено в SEQ ID NO:3, или ее комплемент. Например, в некоторых воплощениях пара донор/акцептор представляет собой FAM/BHQ-1.
Таким образом, молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться самостоятельно или в комбинации с различными методами для амплификации и/или определения HAV. В соответствии с этим, в некоторых воплощениях композиции, способы и наборы в соответствии с настоящим изобретением обеспечивают анализ ПЦР, анализ ПЦР в реальном времени, и/или мультиплексный анализ ПЦР в реальном времени, где в зависимости от типа анализа, он может включать один, два, три или более наборов праймеров и зондов в той же смеси ПЦР. Например, в некоторых воплощениях мультиплексный анализ ПЦР в реальном времени может определять различные генотипы HAV при использовании одного анализа. В этой связи праймеры и зонды являются способными к взаимодействию только с их специфической мишенью, а не с другими праймерами и зондами, присутствующими в смеси (например, не образуют праймер-димеры), обеспечивая, таким образом, эффективную амплификацию мишени и определение в ПЦР, например, мультиплексной ПЦР.
В других аспектах праймеры/зонды в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться в количественных способах. Количественная оценка HAV может, например, представлять собой полуколичественные или количественные способы, такие, как те, что известны среднему специалисту в данной области техники.
В одном воплощении результаты полуколичественной RT-ПЦР могут быть получены путем взятия образцов реакционной смеси RT-ПЦР после чего осуществляют дот-блоттинг анализ.
В другом воплощении количественные процедуры могут использовать конкурентные или неконкурентные методики RT-ПЦР.
Неконкурентная RT-ПЦР может включать, например, совместную амплификацию целевой РНК HAV со второй молекулой РНК при концентрациях реагента и условиях, которые являются такими, что не существует конкуренции между мишенью и стандартом, и с помощью которых они не разделяет ни сайты узнавания праймера, ни какую-либо внутреннюю последовательность.
В конкурентной RT-ПЦР внутренний стандарт имеет тот же праймер узнавания и внутренние последовательности, что и первичная цель, что приводит к конкуренции за реагенты. Обе они могут быть амплифицированы с той же или существенно с той же эффективностью, а их ампликоны могут различаться путем прибавления сайта для рестрикционного фермента к стандарту, путем варьирования их размера и т.д. Например, в некоторых воплощениях серии ПЦР пробирок, содержащих целевую РНК HAV, соединяли с серийными разведениями известного количествам копий внутреннего стандарта. Чем выше концентрация внутреннего стандарта, тем более вероятно, что праймеры будут связываться с ним и амплифицировать его, предпочтительнее, чем мишень. Сравнение интенсивностей окрашенных бромидом этидия стандартного и целевого ампликонов, например, полученных в результате гель-электрофореза, позволяет осуществлять количественную оценку мишени.
В одном воплощении способ может вовлекать введение в образцы РНК HAV перед RT известных количеств конкурирующих агентов, способных к RT-ПЦР-амплификации, которые предпочтительно представляют собой синтетические молекулы РНК HAV.
В другом воплощении настоящее изобретение обеспечивает количественный ПЦР анализ в реальном времени, например, ПЦР анализ конечной точки, после которого осуществляют определение при использовании последовательности зонда, описанной в данной заявке, путем Саузерн-блоттинга, дот блоттинга, флуоресцентного или колориметрического определения или других известных качественных или количественных способов для определения нуклеиновой кислоты.
В других аспектах настоящее изобретение обеспечивает набор, который содержит изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, включающий праймеры и зонды в соответствии с настоящим изобретением. Набор может быть усовершенствован при использовании последовательностей нуклеиновой кислоты, раскрытых в данной заявке. Эти последовательности могут использоваться в качестве праймеров в реакциях амплификации нуклеиновой кислоты, и/или в качестве зондов в способе гибридизации нуклеиновой кислоты. Такие наборы являются полезными для определения присутствия нуклеиновой кислоты HAV в образце. Компоненты в наборах могут быть либо получены коммерчески, либо получены с помощью хорошо известных в области техники способов. Кроме того, компоненты набора могут находиться в растворе или быть лиофилизированными, как это является приемлемым. В одном воплощении компоненты находятся в том же компартменте, а в другом воплощении компоненты находятся в различных компартментах. В некоторых воплощениях набор дополнительно включает инструкции для применения.
В одном воплощении набор включает прямой праймер, обратный праймер и зонд, где прямой праймер включает последовательность нуклеиновой кислоты прямого праймера, как представлено в (SEQ ID NO:1), где обратный праймер включает последовательность нуклеиновой кислоты обратного праймера, как представлено в (SEQ ID NO:2), и где зонд включает последовательность нуклеиновой кислоты зонда, как представлено в (SEQ ID NO:3), или ее комплемент.
Следующие примеры обеспечиваются только в качестве иллюстрации.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Определение HAV с помощью RT-ПЦР
Для определения присутствия РНК HAV в образце плазмы осуществляли анализ RT-ПЦР.
Использовали праймеры и зонд для определения, которые имеют следующие последовательности:
Прямой праймер: 5′-GCG CCC GGC GGG GTC ААС ТСС АТ-3′ (SEQ ID NO:1);
Обратный праймер: 5′-AGC CAA GTT ААС ACT GCA AGG-3′ (SEQ ID NO:2);
Зонд: 5′-TTA GCA TGG AGC TGT AGG AGT СТА AAT TGG GG-3′ (SEQ ID NO:3).
Зонд метили с помощью FAM на 5′ конце и BHQ-1 на 3′ конце.
2
Готовили мастер микс для RT-ПЦР (ММХ), которая включала следующие компоненты: Invitrogen 2 × ПЦР реакционная смесь; 400 мкМ дНТФ; 4,0 мМ MgCl; 1 × ROX стандартного красителя (0,5 мкМ); 400 нМ прямого праймера; 400 нМ обратного праймера; 50 нМ зонда; 100 нМ зонда внутреннего контроля; 1 мкл/50 мкл реакционной смеси для ПЦР от Invitrogen SSIII одностадийная обратная транскриптаза (RT) и смесь Taq ДНК полимеразы (Invitrogen, Carlsbad, CA).
ММХ соединяли с вирусной РНК, изолированной из образцов плазмы, содержащей вирус, при использовании способа экстракции вируса, известного из уровня техники. Объединенную смесь РНК HAV/ММХ подвергали одностадийной ПЦР, где обратную транскрипцию, амплификацию кДНК и определение осуществляли в той же пробирке, при использовании коммерчески доступного инструмента для RT-ПЦР (Applied Biosystems 7300). Условия проведения циклического температурного воздействия являются представленными в Таблице 1:
Таблица 1:
Условия проведения циклического температурного воздействия ПЦР.
Температура
Время
Циклы
55°С
30 минут
1
95°С
3 минуты
1
95°С
15 секунд
45
56°С
1 минута
После осуществления ПЦР амплификации полученные сигналы подвергали анализу при использовании аппаратуры с программным обеспечением. Результаты показали кривые активной амплификации.