Средство для профилактики образования патологических кожных рубцов
AGENT FOR PREVENTING PATHOLOGICAL SKIN SCARS FORMATION

Предлагаемое изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к хирургии, травматологии, пластической хирургии, дерматологии, косметологии, ветеринарии. Главным предназначением предполагаемого средства является торможение избыточного образования соединительной ткани в области раневого дефекта кожных покровов, за счет чего достигается предотвращение развития патологических кожных рубцов гипертрофического и келоидного типа.
Патологические кожные рубцы являются важной причиной снижения качества жизни для сотен тысяч пациентов с повреждениями кожных покровов. Хотя формирование нормотрофического рубца является физиологическим процессом и играет важную роль в заживлении раны, при неблагоприятных условиях, могут развиваться патологические кожные рубцы (гипетрофические, атрофические и келоидные). Так при избыточной пролиферации фибробластов и чрезмерном образовании тканевого матрикса образуются гипертрофические и келоидные рубцы. Факторами, способствующими их развитию, являются нагноение и заживление раны вторичным натяжением, ожоги, наследственная предрасположенность, сопутствующие нарушения обмена веществ и другие. Такие рубцы могут достигать огромных размеров, причинять физический дискомфорт, ограничивать функциональную активность задействованных частей тела, а также оказывать тяжелое негативное психологическое воздействие на пациента.
Особенности патогенеза гипертрофических и келоидных рубцов объясняют сложности связанные с их устранением, в частности сформировавшаяся рубцовая ткань не только не подвергается инволюции, но зачастую со временем, напротив, продолжает разрастаться.
В связи с этим, на первое место выходит профилактика патологических рубцов при лечении раневых дефектов кожных покровов.
Методы профилактики и лечения гипертрофических кожных рубцов делятся на (Bayat A., McGrouther D.A., Ferguson М.W.J. Skin scarring // BMJ: British Medical Journal. - 2003. - V. 7380. - №. 326. - P. 88-92; Rabello F.В., Souza C.D., Farina  J.A. Update on hypertrophic scar treatment // Clinics. - 2014. - V. 69. - №. 8. - P. 565-573.):
медикаментозные (глюкокортикоиды, ферменты, иммуномодуляторы, препараты, влияющие на образование коллагена, цитостатики, силикон, экстракт лука и комбинированные препараты);
хирургические (иссечение, липофиллинг);
физические и физиотерапевтические (окклюзивные повязки, компрессионная и вакуумная терапия, электрофорез, лазерная терапия, криотерапия, радиотерапия и т.д.);
косметические процедуры, направленные на эстетическую коррекцию и маскировку дефекта.
На российском рынке представлено множество препаратов используемых для профилактики и лечения рубцов: средства для лечения ран и ожогов (инфламистин, эплан, пантенол, левомеколь, солкосерил), ферментные препараты (лидаза, лонгидаза, ферменкол, келофибраза, карипазим), препараты с антипролиферативным эффектом (5-фторурацил, интерфероны), глюкокортикоиды (целестодерм, дексазон, кеналог, дипроспан), средства на основе силикона (дерматикс), комбинированные препараты (скаргуард, дермофибразе, камелокс-гель, контратубекс, медерма).
Известно, что эффективность традиционных методов профилактики и лечения гипертрофических и келоидных рубцов является низкой, частота их рецидивов достигает 50%, а результаты хирургического лечения зачастую не оправдывают ожидания пациентов (Tziotzios С., Profyris С., Sterling J. Cutaneous scarring: pathophysiology, molecular mechanisms, and scar reduction therapeutics: part II. Strategies to reduce scar formation after dermatologic procedures // Journal of the American Academy of Dermatology. - 2012. - V. 66. - №. 1. - P. 13-24).
Средства для лечения ран хорошо зарекомендовали себя именно при применении по прямому показанию, в целом их действие направлено на стимуляцию заживления ран, при этом, они зачастую потенцируют образование коллагеновых волокон и пролиферацию фибробластов, что способствует образованию избыточной соединительной ткани (Marshall С.D., Hu М.S., Leavitt Т., Barnes L.A., Lorenz Н.Р., Longaker М.Т. Cutaneous scarring: Basic science, current treatments, and future directions // Advances in wound care. - 2018. - V. 7. - №. 2. - P. 29-45).
Ферментные препараты разрушают волокна коллагена в рубцовой ткани, при этом они не оказывают значимого влияния на продукцию тканевого матрикса и пролиферацию фибробластов (Парамонов Б.А., Турковский И.И., Антонов С.Ф., Климова О. В., Семенов Д.П., Бондарев С.В. Разрушение избыточного внеклеточного матрикса как составляющая лечения патологических рубцов кожи (оценка в опытах in vitro) // Вестник эстетической медицины. - 2009. - Т. 8. - №. 3. - С. 69-73). Также ферментные препараты используют для обработки ран при глубоких ожогах, что способствует их раннему рубцеванию (Schulz A., Fuchs Р.С., Rothermundt I., Hoffmann A., Rosenberg L., Shoham Y.,  H., Schiefer J. Enzymatic debridement of deeply burned faces: Healing and early scarring based on tissue preservation compared to traditional surgical debridement // Burns. - 2017. - V. 43. - №. 6. - P. 1233-43).
Экстракт лука и комбинированные препараты на его основе также не всегда эффективны, поскольку механизм их действия мало влияет на ключевое звено рубцеобразования - пролиферацию фибробластов и миофибробластов (Chung V.Q., Kelley L., Marra D., Jiang S.B. Onion Extract Gel Versus Petrolatum Emollient on New Surgical Scars: a Prospective Double-Blinded Study // Dermatologic surgery. - 2006. - V. 32. - №. 2. - P. 193-197).
Препараты на основе силикона моделируют эффект окклюзионной повязки, благодаря чему ограничивают образование гипертрофических и келоидных рубцов, но для применения на раневой поверхности они непригодны. В случае формирования обширных патологических рубцов препараты силикона являются малоэффективными (Rabello F.В., Souza С.D., Farina  J.A. Update on hypertrophic scar treatment // Clinics. - 2014. - V. 69. - №. 8. - P. 565-573).
Перспективным направлением в лечении гипертрофических и келоидных кожных рубцов является использование препаратов обладающих антипролиферативной активностью, таких как, 5-фторурацил, митомицин С, блеомицин, метотрексат, глюкокортикоиды, интерфероны. За счет антиметаболической и антипролиферативной активности данных препаратов достигается торможение пролиферации фибробластов и падение выработки тканевого матрикса, что приводит к уменьшению выраженности формирующегося кожного рубца (Viera М.Н., Amini S., Valins W., Berman В. Innovative therapies in the treatment of keloids and hypertrophic scars // The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. - 2010. - V. 3. - №. 5. - P. 20-22; Wang X.Q., Liu Y.K., Wang Z.Y, Jun W., Jiang Y.Z., Chun Q., Lu S.L. Antimitotic drug injections and radiotherapy: a review of the effectiveness of treatment for hypertrophic scars and keloids // The International Journal of Lower Extremity Wounds. - 2008. - V. 7. - №. 3. - P. 151-159.).
Однако, вышеуказанные препараты с антипролиферативной активностью, несмотря на достаточно высокую эффективность, имеют обширный перечень противопоказаний и обладают тяжелыми побочными эффектами, что сводит их применение для профилактики образования рубцов к минимуму.
Ближайшим аналогом предлагаемого средства для профилактики образования патологических кожных рубцов, является использование такого препарата с антимитотической активностью, как 5-фторурацил (Bijlard Е., Steltenpool S., Niessen F.В. Intralesional 5-fluorouracil in keloid treatment: a systematic review // Acta dermato-venereologica. - 2015. - V. 95. - №. 7. - P. 778-782).
Однако, несмотря на достаточно высокую эффективность 5-фторурацила при лечении гипертрофических и келоидных рубцов, данный препарат обладает многочисленными побочными эффектами - аллергические реакции: покраснение и зуд кожных покровов, бронхоспазм, крапивница, анафилактический шок. Со стороны желудочно-кишечного тракта: тошнота, рвота, снижение аппетита, диарея, язвенный стоматит, нарушение функции печени, кровотечения из желудочно-кишечного тракта (рвота кровью, каловые массы черного цвета). Гематурия. Больных также могут беспокоить головные боли, нарушение зрения и светобоязнь. Пациент может быть дезориентирован и эйфоричен. Часто больные, получающие фторурацил, предъявляют жалобы на нарушение вкуса, избыточное слезоотделение. При осмотре отмечаются явления нистагма, дизартрии, неврита зрительного нерва. Возможно развитие катаракты. При проявлении побочного действия на коже могут быть заметны симптомы дерматита, очаги гиперпигментации, алопеции, кровоизлияния. Иногда развивается ладонно-подошвенная эритродизестезия. В общем анализе крови отмечаются снижение количества эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов, уменьшение концентрации гемоглобина. Действие на сердечно-сосудистую систему проявляется симптомами стенокардии, ишемии миокарда, тромбофлебита. Могут быть обратимые (временные) нарушения репродуктивной функции, такие как аменорея и азооспермия.
Задачи:
1) Повышение эффективности профилактики образования патологических кожных рубцов.
2) Снижение себестоимости профилактики образования патологических кожных рубцов.
3) Предотвращение побочных эффектов при профилактике образования патологических кожных рубцов.
4) Расширение базы препаратов для профилактики образования патологических кожных рубцов.
Сущностью предлагаемого изобретения является средство для профилактики образования патологических кожных рубцов, отличающееся тем, что образуется при получении суспензии D-аспарагина в смеси полиэтиленгликоля-400 и полиэтиленгликоля-1500, состоит из, масс, %:
- D-аспарагин - 0,1-0,5,
- Полиэтиленгликоль-400 - 77,75-77,95
- Полиэтиленгликоль-1500 - 21,75-21,95
Разброс массовых долей D-аспарагина (активного компонента) обусловлен различием требований, предъявляемых к фармакологической активности средства. С ростом содержания D-аспарагина, обладающего антипролиферативными свойствами, увеличивается эффективность профилактики рубцов, однако, при увеличении его концентрации выше 0,5 масс, %, наблюдается выраженное увеличение сроков заживления раны. Однако, при снижении содержания D-аспарагина ниже 0,1 масс, %, наблюдается, выраженное уменьшение противорубцовых свойств средства. Таким образом, оптимальной концентрацией D-аспарагина в средстве для профилактики патологических кожных рубцов является 0,1-0,5 масс, %. Разброс массовых долей полиэтиленгликоля-400 и полиэтиленгликоля-1500 обусловлен изменением содержания D-аспарагина.
Техническим результатом изобретения являются простота изготовления; дешевизна и доступность ингредиентов, отсутствие выраженных побочных эффектов, наличие специфического механизма действия у активного компонента средства, что позволяет повысить эффективность профилактики патологических кожных рубцов. При использовании изобретения значительно сокращается количество новообразованных коллагеновых волокон в составе формирующегося кожного рубца, а также уменьшается его площадь, в среднем в 3,4 раза. Указанные эффекты наблюдаются на 28-е и 60-е сутки от нанесения раны, соответственно.
Таким образом, применение средства на основе предлагаемой комбинации компонентов - D-аспарагина, полиэтилегликоля-400 и полиэтиленгликоля-1500 перспективно для разработки нового способа профилактики образования патологических кожных рубцов.
Основными компонентами средства для профилактики образования патологических кожных рубцов являются D-аспарагин, полиэтилегликоль-400 и полиэтиленгликоль-1500.
D - аспарагин - брутто формула: C4H8N203, химическое название - правовращающий стереоизомер моноамида аспарагиновой кислоты. D-аспарагин представляет собой белый кристаллический порошок, без запаха, растворимый в воде. У млекопитающих D-аспарагиновая кислота является одним из метаболитов аминокислотного обмена, определяется в незначительном количестве (в сравнении с ее левовращающим изомером), в том в числе, в коже и ее придатках (Armstrong D.W. D-amino acid levels in human physiological fluids // Chirality. - 1993. - V. 5. - №. 5. - P. 375-378).
В основе антипролиферативного эффекта D-аспарагина лежит ингибирование специфических трансаминаз и лактат-дегидрогеназы ( A. et al. Biological role of D-amino acid oxidase and D-aspartate oxidase. Effects of D-amino acids // Journal of Biological Chemistry. - 1993. - V. 268. - №. 36. - P. 26941-26949). Важным механизмом антипролиферативного эффекта D-аминокислот является торможение ими белкового синтеза, за счет аминоацилирования тРНК D-аминокислотами, что подтверждается значительным его угнетением при инактивации либо низкой экспрессии D-аминоацил-тРНК дезацилазы (Yamane Т., Miller D. L., Hopfield J.J. Discrimination between D-and L-tyrosyl transfer ribonucleic acids in peptide chain elongation // Biochemistry. - 1981. - V. 20. - №. 25. - P. 7059-7064).
У млекопитающих уровень D-аспарагиновой кислоты поддерживается за счет его инактивации ферментом D-аспартат-оксидазой (Wolosker Н.,  A., Snyder S.Н. D-aspartate disposition in neuronal and endocrine tissues: ontogeny, biosynthesis and release // Neuroscience. - 2000. - V. 100. - №. 1. - P. 183-189).
D-аспарагин способен затормозить пролиферацию незрелых клеток, из-за низкой экспресии в них ферментов его обезвреживающих ( A. et al. Biological role of D-amino acid oxidase and D-aspartate oxidase. Effects of D-amino acids // Journal of Biological Chemistry. - 1993. - V. 268. - №. 36. - P. 26941-26949).
Применение D-аспарагина тормозит пролиферацию клеток глии и, за счет этого, уменьшает выраженность глиозной трансформации после острого повреждения спинного мозга у крыс (Трофименко А.И. Влияние D-аспарагина на формирование глиального рубца при остром повреждении спинного мозга в эксперименте у крыс // Современные проблемы науки и образования. - 2017. - №3.; URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26420; Chitanava Т. The Influence of D-Asparagine on the Glial Cicatrix Formation in Experimental Spinal Stroke // American Journal of Clinical and Experimental Medicine. - V.5. - №3. - 2017. - P. 93-96. doi: 10.11648/j.ajcem.20170503.15).
Использование предлагаемого средства для профилактики патологических кожных рубцов в эксперименте на крысах, основано на антипролиферативных свойствах D-аспарагина, за счет его применения достигается эффективное торможение формирования патологического рубца.
D-аспарагин является естественным метаболитом в организме млекопитающих и, в отличие от таких антипролиферативных препаратов как, 5-фторурацил, митомицин-С, метотрексат, блеомицин, глюкокортикоиды, он практически лишен тяжелых побочных эффектов (за исключением реакций индивидуальной непереносимости).
Полиэтиленгликоль-400 - брутто формула НО(C2H4O)nH, молекулярная масса - 380-420 г/моль. Полиэтиленгликоль-400 представляет собой прозрачную, с легким желтоватым оттенком, хорошо растворимую в воде и неполярных растворителях вязкую жидкость, с температурой плавления -18°С. Является хорошим солюбилизатором и связующим веществом, благодаря чему является популярной добавкой в косметическую продукцию и лекарственные формы для местного применения. Обладает выраженным осмотически-активным и противовоспалительным действием, ввиду чего, используется как добавка в средства для лечения ран, которые применяются в 1-ю фазу раневого процесса.
Полиэтиленгликоль-1500 - брутто формула НО(C2H4O)nH, молекулярная масса - 1305-1595 г/моль. Полиэтиленгликоль-400 представляет собой твердое при комнатной температуре вещество в виде белых, восковых чешуек, хорошо растворим в воде и неполярных растворителях. Является широко распространенной добавкой в косметическую продукцию, где используется в виде мягкой гидрофильной основы. Обладает антибактериальным, дегидратирующим, противовоспалительным, некролитическим действием. При сочетании с полиэтиленгликолем-400 позволяет создавать стабильные гелевые, кремовые и мазевые основы разной консистенции.
Средство для профилактики образования патологических кожных рубцов получают путем растворения 0,1-0,5 г порошка D-аспарагина в 99,5-99,9 г основы, предварительно полученной путем сплавления 78 частей полиэтиленгликоля-400 и 22 частей полиэтиленгликоля-1500. Процесс проводят при 52°С и постоянном перемешивании в стакане верхнеприводной мешалки до получения вязкой гомогенной жидкости. Затем разливают полученную смесь в приготовленную тару, охлаждают ее до +4°С, в итоге получают мазь белесоватого цвета, далее средство готово к применению.
Средство апробировано на 80 белых нелинейных самцах крыс средней массой - 250±35 гр. Все потенциально болезненные оперативные вмешательства сопровождались использованием золетил-ксилазинового наркоза по следующей схеме: золетил 20 мг/кг в/м («Virbac», Франция), ксиланит 6 мг/кг в/м (ООО «НИТА-ФАРМ», Россия).
Крысы были разделены на 4 группы: группа №1 (сравнения 1, n=20) - воспроизведена модель обширного раневого дефекта, использовано средство без D-аспарагина. Группа №2 (опытная 1, n=20) - воспроизведена модель обширного раневого дефекта, использовано средство с D-аспарагином. Группа №3 (сравнения 2, n=20) - воспроизведена модель послеоперационного рубца, использовано средство без D-аспарагина. Группа №4 (опытная 2, n=20) - воспроизведена модель послеоперационного рубца, использовано средство с D-аспарагином.
Описание техники моделирования обширного раневого дефекта: предварительно введенным в состояние хирургического наркоза крысам, выбривают шерсть на спине, в зоне планируемого раневого дефекта. Затем с помощью хирургических ножниц вырезают участок кожи размерами 2×2 см, дно сформированной раны иссекают, а ее края, во избежание закрытия дефекта, подшивают к нижележащим мышцам черной шелковой нитью USP 6/0.
Описание техники моделирования послеоперационного рубца: предварительно введенным в состояние хирургического наркоза крысам, выбривают шерсть на спине, в зоне планируемого раневого дефекта. Затем, с помощью хирургического скальпеля, вдоль средней линии выполняют разрез кожи длиной 3 см. Затем, в середине разреза, накладывают один простой узловой шов с использованием черной шелковой нити USP 6/0.
У крыс из групп №1 и №3 применяют смесь полиэтиленгликоля-400 и полиэтиленгликоля-1500 без активного компонента (D-аспарагин), а в группах №2 и №4 применяют средство для профилактики образования патологических кожных рубцов на основе смеси полиэтиленгликоля-400 и полиэтиленгликоля-1500 с активным компонентом (D-аспарагин). При этом средство для профилактики образования патологических кожных рубцов наносится на рану тонким слоем, 1 раз в сутки, ежедневно, в период с 3-х по 5-е сутки от нанесения раны.
2
2
В группах №1 и №2 проводили фотосъемку области раневого дефекта на 60-е сутки от момента нанесения раневого дефекта. Далее, на основе полученных изображений, проводят определение границ и расчет площади кожного рубца. В группах №3 и №4 на 28 сутки, у предварительно введенных в состояние наркоза крыс, проводят забор кожи (на границе интактная кожа/рубец) для последующего гистологического исследования. Затем полученные образцы помещают в цинк-формалиновый фиксатор с сульфатом цинка (Kierman J.A. Histological and histochemical methods. Theory and practice. - London: Scion Publishing Ltd. - 2008. - 606 p). Затем выполняют проводку в парафин с использованием изопропанола и минерального масла. Изготавливают парафиновые блоки, проводят их нарезку на микротоме МПС-2 (СССР) на срезы с толщиной 10 мкм и изготавливают микропрепараты. Проводят окрашивание полученных микропрепаратов по Маллори. Готовые микропрепараты фотографируют с помощью окулярной камеры «Levenhuk 230» (США) на микроскопе Микромед-6 (Россия). Для анализа сделанных фотографий применяют программу «Image J» (National Institute of Health, США). Статистическую обработку полученных данных осуществляют с помощью программного обеспечения «MS Excel 2016» (Microsoft, США) и «Statistica 10.0» (StatSoft Inc., США). Проверку нормальности распределения количественных признаков в исследуемых группах проводят с использованием критерия Шапиро-Уилка. Полученные результаты выражают в виде Me (Q1-Q3), где Me - медиана, Q1 - нижний и Q3 - верхний квартили. Для оценки статистически значимых различий при парных сравнениях двух независимых групп используют критерий Манна-Уитни. Критический уровень значимости (p-value) при проверке статистических гипотез принимают равным 0,05. На окрашенных по Маллори микропрепаратах кожи, полученных от крыс из группы №3 (сравнения 2) и группы №4 (опытная 2) на 28-е сутки от нанесения раны выявлено полное закрытие области раневого дефекта многослойным плоским ороговевающим эпителием (фиг. 1 и фиг. 2). В группе №3 (сравнения 2) на фотографии виден дезорганизованный, без четкой дифференциации на слои эпидермис, в левой части окрашенные синим, беспорядочно расположенные пучки коллагеновых волокон, единичные волосяные фолликулы, а справа на фотографии видна окрашенная фуксином, созревшая плотная волокнистая соединительная ткань, с беспорядочным расположением волокон и большим количеством тонкостенных полнокровных сосудов (патологический рубец) (фиг. 1). В группе №4 (опытная 2) на фотографии виден эпидермис, прослеживается его послойное строение, придатки кожи не видны, выявляются небольшие участки эпидермиса с дезорганизованной структурой. В дерме видны окрашенные синим пучки нативных коллагеновых волокон, которые располагаются параллельно ее расположению, а также единичные участки плотной волокнистой соединительной ткани (фиг. 2). При исследовании фотографий кожных покровов крыс полученных на 60-е сутки после заживления ран было установлено, что площадь кожного рубца в группе №1 (сравнения 1) составила 279 мм (245-300), а в группе №2 (опытная 1) - 81 мм (56-115). Таким образом, площадь кожного рубца в группе №2 (опытная 1) в сравнении с группой №1 (сравнения 1), была в 3,4 раза меньше, различия статистически достоверны р≤0,001.
Таким образом, аппликация средства для профилактики образования патологических кожных рубцов на рану с 3-х по 5-е сутки от ее нанесения на 28-е сутки проявляется значительным сокращением количества дезорганизованных коллагеновых волокон в составе рубца, а к 60-м суткам - уменьшением площади кожного рубца в среднем в 3,4 раза. Полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности средства для профилактики образования патологических кожных рубцов в эксперименте у крыс.
Пример 1. Самец белой лабораторной нелинейной крысы массой - 274 гр. был введен в наркоз с использованием следующих препаратов: золетил 20 мг/кг в/м («Virbac», Франция), ксиланит 6 мг/кг в/м (ООО «НИТА-ФАРМ», Россия). Далее, у животного на спине в области операционного поля сбрили шерсть, обработали кожу спиртовым раствором йода и 70% спиртом. Затем, с помощью хирургического скальпеля, вдоль средней линии выполнили разрез кожи длиной 3 см. Затем, в середине разреза, наложили один простой узловой шов с использованием черной шелковой нити USP 6/0. При этом средство для профилактики образования патологических кожных рубцов на основе 0,1 г. D-аспарагина, 77,95 г. полиэтиленгликоля-400 и 21,95 г. полиэтиленгликоля-1500 наносили на рану тонким слоем, 1 раз в сутки, ежедневно, в период с 3-х по 5-е сутки от нанесения раны. На 28 сутки эксперимента, у предварительно введенного в состояние наркоза самца крысы, выполнили забор кожи (на границе интактная кожа/рубец). Затем полученные образцы поместили в цинк-формалиновый фиксатор с сульфатом цинка. Далее выполнили проводку в парафин с использованием изопропанола и минерального масла. Изготовили парафиновые блоки, провели их нарезку на микротоме МПС-2 (СССР) на срезы с толщиной 10 мкм и приготовили микропрепараты. Окрасили полученные микропрепараты по Маллори. Готовые микропрепараты сфотографировали с помощью окулярной камеры «Levenhuk 230» (США) на микроскопе Микромед-6 (Россия). Для анализа сделанных фотографий применяли программу «Image J» (National Institute of Health, США). На окрашенных по Маллори микропрепаратах кожи, полученных на 28-е сутки от нанесения раны выявлено полное закрытие области раневого дефекта многослойным плоским ороговевающим эпителием. Виден эпидермис, прослеживается его послойное строение, придатки кожи не видны, выявляются небольшие участки эпидермиса с дезорганизованной структурой. В дерме видны окрашенные синим пучки нативных коллагеновых волокон, которые располагаются параллельно ее расположению, а также единичные участки плотной волокнистой соединительной ткани (фиг. 2).
Пример 2. Самец белой лабораторной нелинейной крысы массой - 286 гр. был введен в наркоз с использованием следующих препаратов: золетил 20 мг/кг в/м («Virbac», Франция), ксиланит 6 мг/кг в/м (ООО «НИТА-ФАРМ», Россия). Далее, у животного на спине в области операционного поля сбрили шерсть, обработали кожу спиртовым раствором йода и 70% спиртом. Затем, с помощью хирургического скальпеля, вдоль средней линии выполнили разрез кожи длиной 3 см. Затем, в середине разреза, наложили один простой узловой шов с использованием черной шелковой нити USP 6/0. При этом средство для профилактики образования патологических кожных рубцов на основе 0,5 г. D-аспарагина, 77,75 г. полиэтиленгликоля-400 и 21,75 г. полиэтиленгликоля-1500 наносили на рану тонким слоем, 1 раз в сутки, ежедневно, в период с 3-х по 5-е сутки от нанесения раны. На 28 сутки эксперимента, у предварительно введенного в состояние наркоза самца крысы, выполнили забор кожи (на границе интактная кожа/рубец). Затем полученные образцы поместили в цинк-формалиновый фиксатор с сульфатом цинка. Далее выполнили проводку в парафин с использованием изопропанола и минерального масла. Изготовили парафиновые блоки, провели их нарезку на микротоме МПС-2 (СССР) на срезы с толщиной 10 мкм и приготовили микропрепараты. Окрасили полученные микропрепараты по Маллори. Готовые микропрепараты сфотографировали с помощью окулярной камеры «Levenhuk 230» (США) на микроскопе Микромед-6 (Россия). Для анализа сделанных фотографий применяли программу «Image J» (National Institute of Health, США). На окрашенных по Маллори микропрепаратах кожи, полученных на 28-е сутки от нанесения раны выявлено полное закрытие области раневого дефекта многослойным плоским ороговевающим эпителием. Виден эпидермис, четко прослеживается его послойное строение, придатки кожи отсутствуют, выявляются единичные участки эпидермиса с дезорганизованной структурой. В дерме видны окрашенные синим пучки нативных коллагеновых волокон, которые располагаются параллельно ее расположению, а также незначительные очажки плотной волокнистой соединительной ткани.
2
Пример 3. Самец белой лабораторной нелинейной крысы массой - 256 гр. был введен в наркоз с использованием следующих препаратов: золетил 20 мг/кг в/м («Virbac», Франция), ксиланит 6 мг/кг в/м (ООО «НИТА-ФАРМ», Россия). Далее, у животного на спине в области операционного поля сбрили шерсть, обработали кожу спиртовым раствором йода и 70% спиртом. Затем с помощью хирургических ножниц вырезали участок кожи размерами 2×2 см, дно сформированной раны иссекли, а ее края, во избежание закрытия дефекта, подшили к нижележащим мышцам черной шелковой нитью USP 6/0. При этом средство для профилактики образования патологических кожных рубцов на основе 0,1 г. D-аспарагина, 77,95 г. полиэтиленгликоля-400 и 21,95 г. полиэтиленгликоля-1500 наносили на рану тонким слоем, 1 раз в сутки, ежедневно, в период с 3-х по 5-е сутки от нанесения раны. Провели фотосъемку области раневого дефекта на 60-е сутки от момента нанесения раны. Далее, на основе полученных изображений, определили границы и рассчитали площадь кожного рубца. При исследовании фотографий кожных покровов крысы полученных на 60-е сутки после моделирования обширного раневого дефекта было установлено, что площадь кожного рубца - 86 мм.
2
Пример 4. Самец белой лабораторной нелинейной крысы массой - 279 гр. был введен в наркоз с использованием следующих препаратов: золетил 20 мг/кг в/м («Virbac», Франция), ксиланит 6 мг/кг в/м (ООО «НИТА-ФАРМ», Россия). Далее, у животного на спине в области операционного поля сбрили шерсть, обработали кожу спиртовым раствором йода и 70% спиртом. Затем с помощью хирургических ножниц вырезали участок кожи размерами 2×2 см, дно сформированной раны иссекли, а ее края, во избежание закрытия дефекта, подшили к нижележащим мышцам черной шелковой нитью USP 6/0. При этом средство для профилактики образования патологических кожных рубцов на основе 0,5 г. D-аспарагина, 77,75 г. полиэтиленгликоля-400 и 21,75 г. полиэтиленгликоля-1500 наносили на рану тонким слоем, 1 раз в сутки, ежедневно, в период с 3-х по 5-е сутки от нанесения раны. Провели фотосъемку области раневого дефекта на 60-е сутки от момента нанесения раны. Далее, на основе полученных изображений, определили границы и рассчитали площадь кожного рубца. При исследовании фотографий кожных покровов крысы полученных на 60-е сутки после моделирования обширного раневого дефекта было установлено, что площадь кожного рубца - 75 мм.
Таким образом, применение средства для профилактики образования патологических кожных рубцов на основе D-аспарагина, полиэтиленгликоля-400 и полиэтиленгликоля-1500 у крыс накожно с 3-х по 5-е сутки от нанесения раны по данным гистологического исследования, проведенного на 28-е сутки от ранения, приводит к значительному уменьшению образования рубцовой ткани в области повреждения. При этом на 60-е сутки площадь кожного рубца у крыс получавших данное средство была в 3,4 раза меньше, по отношению к группе сравнения.