Влияние арбускулярной микоризы на рост и развитие быстроотзывчивой на микоризацию линии люцерны хмелевидной ( Medicago lupulina L. )

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 581.1; 58.071

А. П. Юрков, Л. М. Якоби, А. П. Кожемяков, М. Ф. Шишова

ВЛИЯНИЕ АРБУСКУЛЯРНОЙ МИКОРИЗЫ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ БЫСТРООТЗЫВЧИВОЙ НА МИКОРИЗАЦИЮ ЛИНИИ ЛЮЦЕРНЫ ХМЕЛЕВИДНОЙ (MEDICAGOLUPULINA L.)*

Арбускулярная микориза (АМ) является самым распространенным растительномикробным симбиозом. Ее формируют 80 % наземных растений с эндомикоризными грибами типа Glomeromycota. АМ обладает высокой полифункциональностью по действию на растение-хозяина. Способность АМ усиливать рост растений, ускорять их развитие, повышать устойчивость к различным неблагоприятным факторам окружающей среды и т. д. обусловливает актуальность исследований по расшифровке механизмов, контролирующих эффективность микоризации.

В связи с этим одна из первоочередных задач заключается в отборе модельной симбиотической системы, представленной высокоэффективным штаммом гриба АМ и отзывчивой на инокуляцию растительной линии. Современные исследования развития микоризного симбиоза проводятся на мутантных растительных линиях сортов Medicago truncatula Gaertn. [21], Pisum sativum L. [8], Lotus japonicus L. [28], Vicia faba L. [10], Phaseolus vulgaris L. [23]. С их помощью выявлены гены растения-хозяина, задействованные на разных этапах становления микоризного симбиоза. Однако эти линии обладают низкой симбиотической эффективностью, в первую очередь по интенсификации фосфатного питания растения-хозяина. Они селектировались при полном минеральном питании либо при низком содержании азота в почве, что обусловлено их первичным использованием в молекулярно-генетических исследованиях бобово-ризобиального симбиоза. И как следствие, отобранные сорта менее отзывчивы и менее вариабельны при микоризации по сравнению с дикорастущими популяциями [2, 7, 15]. В связи с этим существует потребность в новых модельных растениях, отбор которых можно проводить при исследовании популяций, обладающих высокой изменчивостью по симбиотическим признакам [6]. Накопленные данные позволяют сделать заключение, что перспективным видом для отбора модельных линий является люцерна хмелевидная [6].

В связи с этим цель работы заключалась в оценке интенсивности раннего отклика растений люцерны хмелевидной на инокуляцию грибом АМ. Нами были проанализированы такие параметры, как накопление сухой массы надземных частей и корней, число листьев, высота и фаза развития растений, а также содержание P2O5 в надземных частях

* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 08-04-13744-офи-ц, 07-04-01056-а) © А. П. Юрков, Л. М. Якоби, А. П. Кожемяков, М. Ф. Шишова, 2009

и корнях растений, выращенных в условиях низкого уровня доступного для их питания фосфора (Рд) в почве.

Материалы и методы исследования. Объекты исследования. Люцерна хмелевидная (Medicago lupulina) — один из наиболее широко распространенных видов рода Medicago L. (подрод Lupularia (Ser.) Grossh., сем. Leguminosae Endl.), относится к С3-растениям [16]. Диплоид (2n = 16). Используется в сельском хозяйстве как пастбищная культура, либо в качестве сидерата. В результате предварительных экспериментов для настоящего исследования из яровой сортопопуляции ВИК32 люцерны хмелевидной была отобрана быстроотзывчивая на микоризацию линия S9m2 [5]. Для инокуляции растений использован штамм арбускулярного микоризного гриба (АМГ) Glomus intraradices Shenck&Smith — изолят CIAM8 из коллекции лаборатории № 4 ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии. Данный штамм был выделен в 1980-е годы из дерново-подзолистой почвы Ленинградской области и является высокоэффективным штаммом АМГ [6-7]. Гриб является облигатным симбионтом, поэтому в лабораторных условиях поддерживается на плектрантусе (Plectranthus australis L.) согласно методическим разработкам С. Джиа-ниназзи, Х. Шуеп, К. Хэйзелвандтер и Дж. М. Бареа [11].

В работе использована методика вегетационного эксперимента, используемого для создания оптимальных условий для развития АМ и позволяющего избежать спонтанного заражения ризобиями и иными симбиотическими микроорганизмами. Перед проращиванием семена очищали от створок, стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 5 мин и промывали стерилизованной водой. Проращивание проводили на влажной стерилизованной фильтровальной бумаге в чашках Петри при температуре +27 °С. Далее проростки высаживали в стерильную почву и выращивали в стерилизованном ультрафиолетом (до постановки опыта) световом боксе с неактивной вентиляцией. Режим смены дня и ночи: 18 и 6 ч соответственно. Температура воздуха +25.. .+27 °С. Агрохимическая характеристика почвы: содержание органического вещества в дерново-подзолистой легкосуглинистой почве составляет 3 %, содержание Рд — 3,9 мг P205 (1,7 мг Р) на 100 г почвы, доступного калия — 3,5 мг K2O (2,9 мг К) на 100 г (вытяжка 0,2 HCl по Кирсанову); Phkci — 6,1

При микроскопическом анализе развития АМ использован метод мацерации и окрашивания [20], а также метод световой микроскопии [27], усовершенствованный специально разработанной в рамках работы компьютерной программой Mycorrhiza 1.0 — первой программы, адаптированной для работы в операционной системе Windows. Она в интерактивном режиме дает оценочное значение показателей микоризации и расчетное число полей зрения, которые необходимо еще проанализировать для достижения заданного уровня точности. Определена встречаемость микоризной инфекции (F) как доля зараженных корней и обилие арбускул в микоризованной части корня (а). Анализ общего содержания фосфора (P2O5) проводился по методу Труога и Мейера [3]. Минимальная биологическая повторность в каждом из исследованных вариантов составила 16 растений. Достоверность различий между вариантами оценивалась по t-критерию при P<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Динамика встречаемости микоризы в корнях люцерны. Проведенный нами микроскопический анализ позволяет заключить, что люцерна хмелевидная формирует с эндомикоризным грибом G. intraradices арум тип арбускулярной микоризы, т. е. гриб образует в кортексе корней растений арбускулы, но не образует кольца гиф, характерных для парис типа АМ. Полученные результаты показали, что микоризация растений яровой люцерны хмелевидной линии S9m2 наступает уже на 7-е сутки от посева (рис. 1). К 14 суткам встречаемость микоризы (F) составила

68,9 ± 4,8 %, а на фазе ветвления и плодоношения этот показатель увеличивается до 81,3 ± 2,6 %, что свидетельствует об интенсивной и ранней микоризации.

По литературным данным известно, что у многих видов бобовых (таких как вика посевная, клевер белый и красный, горох посевной и козлятник восточный) встречаемость микоризы не превышает 60 %.

Они характеризовались более длительным развитием АМ. Так горох посевной мико-ризуется лишь на 20-е сутки от посева при тех же условиях выращивания (Л. М. Якоби,

А. П. Юрков, 2005, неопубликованные данные). Микоризация корней злаковых еще менее интенсивна. Например, по данным Л. Д. Утемовой и Е. В. Зыковой, на 30-е сутки от посева значение F для пшеницы составило около 30 % [4]. В исследованиях Т. Е. Павловска с соавторами показано, что встречаемость микоризы в корнях 30 видов растений (из 21 различного семейства) варьирует от 1,5 % у осоки Сагех НМа Ь. из семейства Сурегасеае до 96,0 % у лядвенца ЬоШз соттсиШш Ь. из семейства Fabaceae [19].

Отметим также и очень высокое обилие арбускул в микоризе (а) — более 80 % на протяжении всего раннего периода развития АМ (до 49 суток от посева). Возможно, это определяется облигатномикотрофным статусом сортопопуляции ВИК32 люцерны хмелевидной по отношению к АМГ, который был показан нами ранее [6]. Облигатность растения-хозяина выражается в признаках карликовости — мелкие листовые пластинки, отсутствие бокового ветвления, низкорослость растений без микоризы при нормальном развитии растений с АМ, выращенных на почве с низким уровнем Рд. Причинами обли-гатности растения-хозяина являются 3 фактора отзывчивости растений на микоризацию: 1) генотип растения-хозяина; 2) генотип гриба АМ и 3) условия окружающей среды, а именно низкое содержание доступного для питания растений фосфора в почве, который выступает лимитирующим фактором для отзывчивости растений яровой люцерны [24].

Отклик на микоризацию по показателям продуктивности. Основная физиологическая функция микоризы связана с усвоением труднорастворимого фосфора. Хорошо известно, что фосфор имеет огромное физиологическое значение, в том числе в связи с активным участием в регуляции энергетического статуса растительной клетки посредством формирования макроэргических связей. Последние данные позволяют сделать вывод и о лидирующей роли фосфатов в регуляции углеводного обмена клетки. Концентрация фосфатов в цитоплазме является основным регуляторным звеном интенсивности оттока ассимилятов из хлоропластов, а следовательно, поддержания интенсивности работы фото-синтетического аппарата клетки [1. С. 67].

В настоящем исследовании было показано, что отклик на микоризацию по содержанию фосфора в надземных частях микоризованных растений наступает не позднее 14 суток от посева (рис. 2, а). Аналогичный отклик фиксируется по содержанию фосфора

Сутки от посадки

Рис. 1. Встречаемость микоризы в корнях растений люцерны хмелевидной

к

>5

О

с?

В-

§

и

1.4

1.2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

м- а м+

1 ~

/ Ж. Г Й

ай В

111 1 III

3,0

а 2,5

1 )Й8

I 2,0

^ >йа О й 1,5 № &

%

&

§

О

14/ 21 28 35

Сутки от посадки

1,0

0,5

0,0

/Л I

ПНР I 1

111111111 *

414 / 21 28 35

Сутки от посадки

Рис. 2. Содержание Р205 в сухой надземной массе (а) и корнях (б) растений люцерны хмелевидной «М+» и «М -» — растения с/без микоризы соответственно (то же для рис. 3-5).

в корнях растений с АМ (рис. 2, б). Значительное превышение содержания фосфора в надземных частях и корнях растений с АМ в сравнении с его содержанием у растений без АМ сохранилось до конца эксперимента. В среднем превышение было 3-4-кратным, что согласуется с литературными данными для многих видов растений [12, 22].

Слабая способность немикоризованных растений к поглощению фосфора объясняется тем, что в отсутствии АМ у поверхности корня и корневых волосков, где происходит активное поглощение неорганического Рд, образуется зона истощения с низким содержанием этого элемента радиусом в 1-2 мм [25]. Растение-хозяин без помощи АМГ способно получать из ризосферы только 8 % Рд (Н2РО4-, в меньшей степени НРО42-), который, в свою очередь, составляет лишь около 20 % от суммарного содержания почвенного фосфора [13, 22]. Развитие внекорневого мицелия существенно увеличивает радиус зоны поглощения макроэлемента (до 15 см) [25]. У грибов АМ выявлены гены, кодирующие белки-транспортеры фосфора, одни из которых обеспечивают перенос фосфора из почвы в гифу, а другие — перенос из внутрикорневой гифы или арбускулы к мембране клеток кортекса, где работают белки-транспортеры растительного происхождения [14]. Наряду с этим развитие АМ интенсифицирует экспрессию генов, кодирующих растительные белки-транспортеры фосфора, задействованные в зоне «периарбускулярное пространство — клетка растения-хозяина» [25].

Полученные нами результаты свидетельствуют, что линия S9m2 сортопопуляции ВИК32 люцерны хмелевидной характеризуется не только интенсивным, но и быстрым откликом на микоризацию по содержанию фосфора в надземных частях и корнях растений. Он выявляется уже на этапе становления АМ у растений люцерны — не позднее 14-х суток от посадки, в то время как рядом авторов показано, что для ежевики Rubus fruticosus, как и для злаков отклик по данному показателю наступает приблизительно на 30-е сутки от посадки [4, 9], т. е. значительно позже.

Усиление фосфатного питания люцерны в ходе развития АМ может служить причиной значительного ускорения прироста биомассы растений. Нами показано, что отклик на микоризацию по накоплению сухой массы надземных частей растений наступает на 21-е сутки от посадки (рис. 3, а), а корней — на 28-е сутки (рис. 3, б). Как видно из полученных результатов, накопление массы надземных частей растений начинается после становления

Рис. 3. Сухая масса надземных частей (а) и корней (б) растений люцерны хмелевидной

АМ, когда согласно данным С. Е. Смит, Ф. А. Смит и И. Якобсен симбиотрофное поступление фосфора в растение начинает преобладать над собственным питанием растения-хозяина [25]. Это подтверждается полученными нами данными по накоплению фосфора в растениях люцерны, отклик по которому был на неделю раньше отклика по биомассе (см. рис. 2).

Накопление биомассы надземных частей растений люцерны при развитии АМ косвенным образом указывает на стимуляцию образования листьев — основного органа фотосинтеза высших растений. Нами было установлено, что первый округлый лист у растений люцерны формируется на 8-е сутки от посева. Различия по скорости развития листьев у растений с АМ и без нее на данный срок отсутствуют. Достоверные отличия по числу листьев проявляются между вариантами на 14-е сутки. К этому сроку у контрольных растений без АМ образовался 1-й настоящий лист, а у растений с АМ уже раскрывается второй (рис. 4). Экспоненциальный рост числа листьев у микоризованных растений наступает с 28-х суток от посева. У контрольных растений такого роста не происходит. У последних наблюдается только однократное резкое возрастание числа листьев (с 4 до 9) при выходе в фазу начала ветвления и бутонизации на 42-е сутки. Можно предположить, что увеличение числа листьев отражает интенсификацию фотосинтетических процессов у растения, вступающего в симбиотические взаимоотношения с грибом АМ. Сходный вывод был сделан С. Немек и Дж. С. В. Ву [17], И. Паради и соавторы [18], показавшими, что АМ оказывает действие на содержание хлорофилла, площадь листовой поверхности и скорость фиксации СО2, а также обнаружившими, что АМ усиливает приток продуктов фотосинтеза в корни, где они могут использоваться микосимбионтом.

Результатом усиления фосфатного обмена у растений люцерны, а также повышения эффективности работы ассимиляционного аппарата стало ускорение развития микоризованных растений люцерны в сравнении с развитием растений без АМ (рис. 5). Уже на 21-е сутки у микоризованных растений наблюдалась фаза начала стеблевания при развитии только 2-го настоящего листа у контрольных растений. Положительный отклик по высоте стебля достоверно наблюдался не позднее 28-х суток от посева. Высота микоризованных растений на 28-е сутки составляла 3-6 см. В варианте без микоризы растения люцерны перешли к этапу стеблевания только на 35-е сутки. В длину растения не превышали 1 см.

в+п

Рис. 4. Средние значения числа листьев у растений люцерны хмелевидной

21 \28/ 35

Сутки от посадки

Рис. 5. Высота стебля и фаза развития растений линии S9m2 люцерны хмелевидной Над столбцами указаны фазы развития: «пл» — фаза первого листа, «вл» — второго листа, «тл» — третьего листа, «нст» — начало стеблевания, «ст» — стеблевание, «в+ц» — ветвление и цветение, «нв+б» — начало ветвления и бутонизация, «в+п» — ветвление и плодо-

ношение.

Далее тенденция сохранялась: высота контрольных растений на 42-е и 49-е сутки была ниже высоты растений в варианте с АМ.

В условиях низкого содержания фосфора в почве ветвление растений без микоризы

снижено или отсутствует. Эти условия стали определяющим фактором для быстрого перехода этих растений от бутонизации к плодоношению (с 42-х по 49-е сутки).

Суммируя полученные результаты, следует заключить, что растения с АМ характеризуются более высоким содержанием фосфора как в надземных частях, так и в корнях (отклик на микоризацию не позднее 14-х суток от посадки). Это приводит к накоплению биомассы, оцениваемому по сухому весу (к 21-м суткам), а также к быстрому и интенсивному развитию листьев (отклик на микоризацию не позже 21-х суток). Такой ростовой отклик на микоризацию способствует ускорению фазы развития растений.

Литература

1. Медведев С. С. Физиология растений. СПб., 2004.

2. Проворов Н. А. Соотношение симбиотрофного и автотрофного питания азотом у бобовых растений: генетико-селекционные аспекты // Физиол. растений. 1996. Т. 43, № 1. С. 127-135.

3. Соколов А. В. Агрохимические методы исследования почв. М., 1975.

4. УтемоваЛ. Д., ЗыковаЕ. В. Эндомикоризы бобовых и их динамика // Микориза и другие формы консортивных связей в природе. Пермь, 1985. С. 48-54.

5. Юрков А. П., Семенов Д. Г. Неинвазивное спектрофотометрическое исследование фотосинте-тической эффективности арбускулярной микоризы люцерны хмелевидной // Уч. зап. РГГМУ 2008. № 7. С. 101-110.

6. Юрков А. П., Якоби Л. М., Степанова Г. В., Дзюбенко Н. И., Проворов Н. А., Кожемяков А. П., Завалин А. А. Эффективность инокуляции форм люцерны хмелевидной грибом арбускулярной микоризы Glomus intraradices и внутрипуляционная изменчивость растений по показателям продуктивности и ми-коризообразования // Сельскохозяйственная биология. 2007. № 5. С. 67-74.

7. Якоби Л. М., Кукалев А. С., Ушаков К. В., Цыганов В. Е., Проворов Н. А., Борисов А. Ю., Тихонович И. А. Полиморфизм форм гороха посевного по эффективности симбиоза с эндомикоризным грибом Glomus sp. в условиях инокуляции ризобиями // Сельскохозяйственная биология. 2000. № 3. C. 94-102.

8. Borisov A. Y., Barmicheva E. M., Jacobi L. M., Tsyganov V E., Voroshilova V A., Tikhonovich I. A. Pea (Pisum sativum L.) mendelian genes controlling development of nitrogen-fixing nodules and arbuscular mycor-rhiza // Czech J. Genet. Plant Breed. 2000. Vol. 36. P. 106-110.

9. Carreon-Abud Y., Soriano-Bello E., Martinez-Trujillo M. Role of arbuscular mycorrhizal fungi in the uptake of phosphorus by micropropagated blackberry (Rubus fruticosus var. brazos) plants // First International Meeting on Microbial Phosphate Solubilization. 2007. Vol. 102. P. 161-165.

10. Duc G., Trouvelot A., Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S. First report of non-mycorrhizal plant mutants (Myc-) obtained in pea (Pisum sativum L.) and fababean (Vicia faba L.) // Plant Sci. 1989. Vol. 60. P. 215-222.

11. Gianinazzi S., Schüepp H., Haselwandter K., Barea J. M. Mycorrhizal technology in agriculture: from genes to bioproducts. Basel, 2002.

12. Hahn M., Mendgen K. Signal and nutrient exchange at biotrophic plant-fungus interfaces // Current opinion in plant biology. 2001. Vol. 4. P. 322-327.

13. HarnettD. C., Wilson G. W.T. The role of mycorrhizas in plant community structure and dynamics: lessons from grasslands // Plant and Soil. Vol. 244. 2002. P. 319-331.

14. Karandashov V., Bucher M. Symbiotic phosphate transport in arbuscular mycorrhizas // Trends in Plant Science. 2005. Vol. 10, N 1. P. 22-29.

15. Martennson A., Rydberg I. Variability among pea varieties for infection with arbuscular mycorrhizal fungi // Swedish J. Agric. Res. 1994. Vol. 24. P. 13-19.

16. Medrano H., Escalona J. M., Bota J., Gulias J., Flexas J. Regulation of photosynthesis of C3 plants in response to progressive drought: stomatal conductance as a reference parameter // Ann. Bot. 2002. Vol. 89, N 7. P. 895-905.

17. Nemec S., Vu J. C. V Effects of soil phosphorus and Glomus intraradices on growth, nonstructural carbohydrates and photosynthetic activity of Citrus aurantium // Plant Soil. 1990. Vol. 128. P. 257-263.

18. Paradi I., Bratek Z., Lang F. Influence of arbuscular mycorrhiza and phosphorus supply on polyamine content, growth and photosynthesis of Plantago lanceolata // Biologia Plantarum. 2003. Vol. 46, N 4. P. 563-569.

19. Pawlowska T. E., Blaszkowski J., RühlingÂ. The mycorrhizal status of plants colonizing a calamine spoil mound in southern Poland // Mycorrhiza. 1996. Vol. 6. P. 499-505.

20. Phillips J. M., Hayman D. S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection // Transact. British Mycor. Soc. 1970. Vol. 55. P. 158-161.

21. Sagan M., Morandi D., Tarenghi E., Duc G. Selection of nodulation and mycorrhizal mutants in the model plant Medicago truncatula (Gaertn.) after y-ray mutagenesis // Plant Sci. 1995. Vol. 111. P. 63-71.

22. Schachtman D. P., Read R. J., Ayling S. M. Phosphorus uptake by plants: from soil to cell // Plant Physiol. 1998. Vol. 116. P. 447-453.

23. Shirtliffe S. J., Vessey J. K. A nodulation (Nod+ / Fix-) mutant of Phaseolus vulgaris L. has nodule like structures lacking peripheral vascular bundles (Pbv-) and is resistant to mycorrhyzal infection (Myc-) // Plant Sci. 1996. Vol. 118. P. 209-220.

24. Smith S. E., Read D. R. Mycorrhizal Symbiosis (2nd edition). San Diego, 1997.

25. Smith S. E., Smith F. A., Jakobsen I. Mycorrhizal fungi can dominate phosphate supply to plants irrespective of growth responses // Plant Physiol. 2003. Vol. 133. P. 16-20.

26. Staehelin C., Charon C., Boller T., Crespi M., Kondorosi A. Medicago truncatula plants overexpressing the early nodulin gene enod40 exhibit accelerated mycorrhizal colonization and enhanced formation of arbuscules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98, N 26. P. 15366-15371.

27. Trouvelot A., Kough J. L., Gianinazzi-Pearson V. Mesure du taux de mycorhization VA d’un système radiculaire. Recherche de méthodes ayant une signification fonctionnelle // Recherche de méthodes d’estimation ayant une signification fonctionnelle. Dijon, 1-5 July 1985: Proceedings of the 1st ESM. Paris, 1986. P. 217-221.

28. WegelE., SchauserL., SandalN., StougaardJ., Parniske M. Mycorrhiza mutants of Lotus japonicus define genetically independent steps during symbiotic infection // MPMI. 1998. Vol. 11, N 9. P. 933-936.