СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ НАНОЧАСТИЦ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
METHOD OF PRODUCING SURFACE-MODIFIED NANOPARTICLES FOR IMMOBILISING BIOLOGICAL SUBSTANCES

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоорганической химии, а именно к способу ковалентной иммобилизации биомолекул на поверхности наноматериалов, содержащих этерифицированные карбоксильные группы, и его применению при создании иммобилизованных ферментных препаратов. Изобретение может быть использовано в биотехнологии, в том числе в пищевой промышленности.
2
2
В данной области известно большое число технических решений, среди которых наибольшее распространение получили химические способы иммобилизации, заключающиеся в ковалентном связывании биомолекул с предварительно активированным носителем. Предварительная активация носителя предусматривает модификацию его поверхности путем обработки химическими соединениями, имеющими реакционноспособные функциональные группы (NH, -NH-NH, -ОН и др.), посредством которых реализуется химическое присоединение биомолекул. Однако в своей массе эти технические решения обладают рядом недостатков, а именно: использование дорогостоящих материалов и реактивов для иммобилизации, трудоемкость методик.
Известен способ иммобилизации (см. пат. РФ №94024389, МПК C12N 11/00, заявл. 29.06.1994, опубл. 10.06.1996) биообъектов на поверхности стекла (керамики), заключающийся в обработке поверхности носителя раствором алкоксибензоата металла. В качестве растворителя используют полярный апротонный растворитель, в частности тетрагидрофуран, диметоксиэтан. Концентрация раствора составляет 0,05-0,8 моль/л. Раствор алкоксибензоата металла наносят на поверхность центрифугированием или окунанием и сушат на воздухе при температуре 15-30°С. В качестве биообъекта используют глюкозооксидазу, которую в виде 3%-ного раствора наносят на модифицированную поверхность. Степень фиксации составляет 90%. Главными недостатками данного подхода являются низкая плотность функциональных групп на поверхности носителя, что приводит к невысокой эффективности ковалентного связывания, а также трудоемкость процедуры иммобилизации.
Известен также способ получения иммобилизованного протеолитического фермента (см. пат. РФ №1041567, МПК C12N 11/10, опубл. 15.09.1983), предусматривающий растворение содержащего альдегидные группы носителя в буферном растворе и последующее присоединение протеолитического фермента. В качестве носителя используют ксилоуронид, растворенный в 0,1 М трисоксиметиламинометановом буфере (рН 8,5), а присоединение фермента осуществляют при соотношении носитель-фермент 1:1. К основным недостаткам данного способа относятся следующие: дефицитный и дорогостоящий носитель - ксилоуронид, низкая стабильность целевого продукта, необходимость хранения препарата при низкой температуре (0-4°С).
Также известен подход к получению иммобилизованного фермента, заключающийся в следующем (см. пат. РФ №586182, МПК C07G 7/02, заявл. 30.08.1974, опубл. 30.12.1977). Фермент вводят в водную или спиртовую среду вместе с сочетающим агентом - карбодиимидом, используя в качестве носителя карбоксилсодержащий материал, например, полипропиленовую ткань с привитыми группами акриловой кислоты, частично гидролизованный полиэтилентерефталат, в форме тканей, пленок, гранул, волокон и т.д. При этом в случае проведения иммобилизации в водной среде при значениях рН порядка 5 в соответствующем буфере, когда фермент полностью растворим, в качестве сочетающего агента применяют водорастворимые карбодиимиды, например, 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-м-п-толуолсульфонат и т.д. Основной недостаток этого способа иммобилизации связан с низкой удельной активностью полученных препаратов.
Наиболее близким к заявляемому изобретению - прототипом - является изобретение, описывающее ковалентную иммобилизацию биомолекул на поверхности полимерных материалов, содержащих этерифицированные карбоксильные группы (см. пат. РФ №2321574, МПК С07В 43/06, заявл. 06.04.2006, опубл. 10.04.2008). Данный способ основан на решении проведения модификации поверхности биочипа путем двухстадийной обработки, причем одна из стадий осуществляется в газовой фазе. Это позволяет снизить вероятность отслаивания модифицирующего слоя от поверхности носителя и увеличить количество иммобилизованных биообъектов. На первой стадии обработки поверхности чипа проводят аминолиз поверхностных сложноэфирных групп полимера, для чего подложку обрабатывают в газовой фазе аминосиланом (аминопропилтриэтоксисилан, аминопропилтриметоксисилан). На второй стадии формируют большое количество функциональных групп, необходимых для иммобилизации биомолекул, путем проведения совместной поликонденсации соответствующего силана с триалкоксисилановыми фрагментами.
На заключительном этапе формирования чипа выбирают способ нанесения и иммобилизации биомолекул на модифицированную поверхность подложки и проводят иммобилизацию.
Основным недостатком данного решения следует считать тот факт, что ковалентная иммобилизация описана только для органических полимерных носителей, таких как полиметилметакрилат, поливинилхлорид, поликарбонат, по-либутилметакрилат, сополимеры бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол и акрилонитрил.
Задачей технического решения является упрощение процедуры иммобилизации ферментных препаратов и улучшение их физико-химических характеристик.
3
4
Технический результат достигается за счет использования в качестве матрицы наночастиц FeO, а также недорогих и доступных реактивов. Совокупность предложенных операций позволяет получать иммобилизованные ферментные препараты, отличающиеся от известных аналогов рядом признаков, прежде всего удельной активностью фермента, оптимальными значениями рН и температур.
3
4
Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц FeO для иммобилизации биологических веществ включает выполнение следующих операций. На первом этапе осуществляется получение наночастиц магнетита, содержащих на поверхности электрофильные сложноэфирные группы, путем взаимодействия полиметилметакрилата, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля. Вторая стадия заключается в формировании на поверхности наночастиц слоя аминопропилтриэтоксисисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Полученные наночастицы служат для последующей иммобилизации ферментов с использованием конденсирующего агента карбодиимида.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
3
4
3
4
3
3
3
3
Смесь полиметилметакрилата, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля нагревают при перемешивании в атмосфере азота до 220°С, после чего к смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле, через несколько минут образовавшиеся наночастицы FeO со сложноэфирными группами отделяют центрифугированием. Полученные магнитные наночастицы защищены от агрегации в силу межчастичных взаимодействий и влияния среды, а также модифицированы и пригодны для иммобилизации биологических веществ посредством конденсирующего агента. Вторая стадия заключается в формировании на поверхности наночастиц слоя аминопропилтриэтоксисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Следует отметить, что на второй стадии присутствие воды в системе должно быть ограничено, поскольку ее наличие приводит к гидролизу аминопропилтриэтоксисилана и образованию олигомерных силанов. Поэтому в отдельной камере объемом 50 см наночастицы (5,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (1 см) при атмосферном давлении и температуре 70°С в течение 60 минут. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 1 см и высушивают на воздухе. Далее частицы (5,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол:вода 1:1) в течение двух часов при температуре 50°С. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы FeO несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц с концентрацией 5 мг/см в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,8).
3
4
3
4
Далее 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в 0,1М фосфатном буфере в течение двух часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 0,025М фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 0,1М фосфатного буфера. На следующей стадии растворяют 500 мкг α-химотрипсина в 500 мкл 0,1М фосфатного буфера и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии наночастиц в 0,1М фосфатном буфере при температуре 30°С в течение двух часов. По окончании иммобилизации наночастицы промывают 0,025М фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 0,1М фосфатного буфера. Физико-химические характеристики химотрипсина, иммобилизованного на наночастицах FeO, представлены в табл.1. В качестве контроля в данном случае используют химотрипсин, иммобилизованный на немодифицированных наночастицах FeO адсорбционным способом.
Таблица 1
Физико-химические параметры иммобилизованного химотрипсина
Способ иммобилизации
Содержание белка в иммобилизован-ном препарате, мкг/мг носителя
Удельная активность фермента, ед./мг белка
Удельная активно-сть фермента, % от нативного
Оптимум, рН
Температурный оптимум, °С
Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>
14,5
30,5
76,3
7,5-9,0
40
Контрольный опыт
9,8
22,5
56,3
7,4-9,0
35
Пример 2
3
4
3
4
3
4
3
4
3
Получение наночастиц FeO с поверхностными сложноэфирными группами и их модификацию силаном осуществляют аналогично примеру 1. Затем готовят суспензию наночастиц (5 мг/см) в 200 мМ фосфатном буфере (рН 7,0). В качестве иммобилизуемого протеолитического фермента используют термолизин. Для его иммобилизации 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в 200 мМ фосфатном буфере в течение двух часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 200 мМ фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 200 мМ фосфатного буфера. Затем подготавливают раствор термолизина, растворив 1000 мг фермента в 1000 мкл 200 мМ фосфатного буферного раствора, который инкубируют с 500 мкл суспензии наночастиц в 200 мМ фосфатном буфере при температуре 45°С в течение трех часов. По окончании иммобилизации наночастицы FeO промывают 200 мМ фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 200 мМ фосфатного буфера (рН 7,0). Физико-химические характеристики термолизина, иммобилизованного на наночастицах FeO, представлены в табл.2. В качестве контроля используют термолизин, иммобилизованный на немодифицированных наночастицах FeO адсорбционным способом.
Таблица 2
Физико-химические параметры иммобилизованного термолизина
Способ иммобилизации
Содержание белка в иммобилизо-ванном препарате, мкг/мг носителя
Удельная активно-сть фермента, ед./мг белка
Удельная активно-сть фермента, % от нативного
Оптимум, рН
Температурный оптимум, °С
Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>
21,5
38,9
76,4
6,9-8,6
45
Контрольный опыт
13,2
24,0
47,2
7,6-8,2
30
Пример 3
3
4
3
4
3
4
3
Для получения наночастиц FeO со сложноэфирными группами на поверхности и их модификации силаном осуществляют последовательность операций, аналогичную примеру 1, после чего готовят суспензию наночастиц (5 мг/см) в 100 мМ фосфатном буфере (рН 6,8). Иммобилизуемым объектом является протеолитический фермент эластаза. 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в 100 мМ фосфатном буфере в течение двух часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 100 мМ фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 100 мМ фосфатного буфера. На следующем этапе иммобилизации растворяют 1000 мг эластазы в 1000 мкл 100 мМ фосфатного буфера и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии модифицированных наночастиц в 100 мМ фосфатном буфере при температуре 40°С в течение четырех часов. По окончании иммобилизации наночастицы промывают 100 мМ фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 100 мМ фосфатного буфера (рН 6,8). Физико-химические характеристики эластазы, иммобилизованной на наночастицах FeO, представлены в табл.3. В качестве контроля используют эластазу, иммобилизованную на немодифицированных наночастицах FeO адсорбционным способом.
Таблица 3
Физико-химические параметры иммобилизованной эластазы
Способ иммобилизации
Содержание белка в иммобилизо-ванном препарате, мкг/мг носителя
Удельная активность фермента, ед./мг белка
Удельная активно-сть фермента, % от нативного
Оптимум рН
Температурный оптимум, °С
Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>
11,3
5,8
70,7
6,5-7,2
35
Контрольный опыт
7,7
4,5
54,8
6,8-7,1
28
3
4
Таким образом, иммобилизация протеолитических ферментов на поверхности модифицированных наночастиц FeO позволяет получить гетерогенные ферментные препараты с высокой удельной активностью по сравнению с известными способами иммобилизации ферментов на органических полимерных носителях. Преимущества данного изобретения перед прототипом следующие:
- обеспечение возможности использования в качестве носителя для иммобилизации наночастиц, обладающих рядом преимуществ перед макрообъектами;
- повышение удельной активности иммобилизованных препаратов;
- оптимизация условий функционирования иммобилизованных препаратов;
- упрощение технологии получения иммобилизованных препаратов.