СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ОЦЕНКИ УРОВНЯ ИНФИЦИРОВАННОСТИ СТАДА ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
METHOD OF INTEGRATED ASSESSMENT OF INFECTION LEVEL OF LEUKEMIA VIRUS OF HERD OF CATTLE

Изобретение относится к области ветеринарии, может быть использовано для комплексной оценки уровня инфицированности стада вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС-инфекция) при проведении плановых оздоровительных мероприятий, а также при мониторинге оздоровленных и благополучных стад.
Известен способ выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА) в индивидуальных пробах сыворотки и молока (Инструкция по применению набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотке крови и молоке иммуноферментным методом (Вариант №1 - скрининг) разработана ФГУП «Курская биофабрика» и ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. - Утверждена Заместителем Руководителя Россельхознадзора 10 марта 2010 г.).
Недостатком этого способа является использование его только с индивидуальными пробами биоматериала.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому и принятым за прототип является способ выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА), при котором возможно использование сборной пробы молока (Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота. - Москва, 2000 г.).
Однако в данных методических указаниях описан способ исследования индивидуальных проб молока и не приведено данных для использования данного способа на сборных пробах молока: не определено количество индивидуальных проб в сборной пробе, объем индивидуальной пробы и объем сборной пробы для постановки ИФА, не определены особенности учета реакции.
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала способов комплексной оценки уровня инфицированности стада вирусом лейкоза крупного рогатого скота с использованием иммуноферментного анализа (ИФА).
Поставленная задача решается тем, что в способе комплексной оценки уровня инфицированности стада вирусом лейкоза крупного рогатого скота, включающем выявление антител в сборной пробе молока с помощью иммуноферментного анализа, согласно изобретению сборную пробу молока формируют от 10 голов, объем молока от индивидуальных проб составляет 40-100 мкл, объем сборной пробы молока для постановки иммуноферментного анализа - 100 мкл, положительной считают пробу, оптический сигнал которой превышает в три раза сигнал отрицательной контрольной пробы, в благополучных по лейкозу хозяйствах формируют сборную пробу от 20 голов.
Способ осуществляют следующим образом.
На начальном этапе работы определяли оптимальное количество индивидуальных проб молока, используемых для формирования 1 сборной пробы и их объем. Для этого отбирали образцы молока, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) по результатам ИФА, и согласно инструкции определили коэффициент (К).
Пробы молока с высоким содержанием антител имели коэффициент (К) - 12,0±3,2, пробы молока с низким - 3,7±0,8. Коэффициент (К) в индивидуальных пробах определяли для того, чтобы установить в последующем, как он будет изменяться в сборных пробах - насколько уменьшаться или исчезать.
С целью определения оптимального количества уровня антител (по коэффициенту К) (табл.1, 2) в сборной пробе молока произвели разведение положительных индивидуальных проб молоком от заведомо отрицательных в ИФА животных 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 и 1:100.
Для определения влияния объема индивидуальных проб на результат реакции сборной пробы молока для каждого разведения отбирали по 20, 40, 100 и 200 мкл.
Перед постановкой в ИФА сборную пробу тщательно перемешивали и брали по 100 мкл для проведения реакции. Иммуноферментный анализ отобранных сборных проб выполняли в соответствии с наставлением к инструкции.
Таблица 1
Учет результатов постановки ИФА со сборными пробами молока в различных разведениях проб с высоким содержанием специфических антител (по коэффициенту К)
РазведениеОбъем пробы, мкл
1:5
1:10
1:20
1:50
1:100
20
7,28±0,43
6,79±0,34
5,40±0,18
3,40±0,13
2,29±0,23
40
7,05±0,35
6,13±0,29
4,82±0,25
3,05±0,26
1,62±0,12
100
6,29±0,26
5,91±0,42
4,43±0,21
2,98±0,18
1,48±0,13
200
6,04±0,20
5,17±0,33
4,00±0,16
2,54±0,15
1,25±0,05
Из таблицы 1 видно, максимальными объемом и разведением сборной пробы молока, регистрируемые как положительные, являются 40-100 мкл и 1:50.
Таблица 2
Учет результатов постановки ИФА со сборными пробами молока в различных разведениях проб с низким содержанием специфических антител (по коэффициенту К)
РазведениеОбъем пробы, мкл
1:5
1:10
1:20
1:50
1:100
20
3,12±0,26
3,27±0,24
1,92±0,16
1,38±0,12
0,31±0,15
40
3,06±0,17
3,15±0,18
1,85±0,11
1,24±0,06
0,22±0,06
100
2,79±0,24
2,95±0,22
1,48±0,Ю
0,99±0,09
0,18±0,10
200
2,32±0,18
2,01±0,13
1,04±0,08
0,93±0,12
0,11±0,03
Исходя из данных, представленных в таблицах 1 и 2, было установлено, что по мере разведения положительных проб сигнал оптической плотности снижается.
Установлено, что оптический сигнал сборных проб в три раза превышающий сигнал отрицательной контрольной пробы, может учитываться как положительный, так как при индивидуальной постановке проб, формировавших такие сборные пробы, в 100% случаев выявлялись положительные пробы молока. При сигнале К<3 (К=2,3±0,29) только в 15% случаев в сборной пробе выявлялись положительные индивидуальные пробы.
Как видно из таблицы 2 (пробы с низким содержанием антител), максимальными значениями были V=100 мкл при разведении 1:10.
При разведении отобранных для опыта проб молока в 10 раз реакция всех сборных проб была положительной. При разведении в 20 и 50 раз результаты некоторых проб с низким содержанием антител были отрицательными или сомнительными; при разведении 1:100 все пробы были отрицательными.
Исходя из того, что часть проб при разведении 1:20 и выше давала отрицательный результат при постановке в ИФА, за рабочее разведение сборных проб было принято 1:10, так как при этом разведении все пробы сохраняли положительный сигнал.
При проведении диагностических исследований животных в благополучных по лейкозу хозяйствах целесообразно формировать сборные пробы молока от 20 животных.
Объемами индивидуальных проб, отбираемых для формирования сборной пробы, были выбраны 40 и 100 мкл, так как при данных объемах индивидуальных проб оптический сигнал сборной пробы дает оптимальный результат при учете реакции.
Пример 1. Провели испытание предложенного способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота в производственных условиях. Было исследовано 417 дойных коров из неблагополучного по лейкозу хозяйства и 352 коровы из благополучного по лейкозу хозяйства. Сборные пробы молока во всех случаях формировали из 10 индивидуальных проб. Объем индивидуальных проб для формирования сборной пробы был взят 100 мкл. Для контроля от всех этих животных молоко было исследовано индивидуально. Результаты представлены в таблицах 3 и 4.
Таблица 3
Сравнительная оценка результатов ИФА-диагностики со сборными пробами молока
ИФА со сборными пробами
Контроль (ИФА с индивидуальными пробами)
Кол-во проб, шт.(кол-во сборных проб, шт.)
417(42)
417
Кол-во положительных сборных проб, шт.
7
-
Всего исследовано в ИФА, гол.
112
417
Всего выявлено инфицированных животных, гол.
12
12
Из таблицы видно, что в ИФА реагировали 7 сборных проб. Пробы молока от животных, входивших в эти сборные пробы, были исследованы индивидуально. При этом было выявлено 12 положительных проб. Результаты совпали с контрольными показателями.
Таблица 4
Сравнительная оценка результатов ИФА-диагностики со сборными пробами молока на благополучном по лейкозу хозяйстве
ИФА со сборными пробами
Контроль (ИФА без сборных проб)
Кол-во проб, шт.(кол-во сборных проб, шт.)
352 (35)
352
Кол-во положительных сборных проб, шт.
0
-
Всего исследовано в ИФА, гол.
35
352
Всего выявлено инфицированных животных, гол.
0
0
Результаты исследований сборных проб молока от коров благополучного по лейкозу хозяйства совпали с контрольными, положительно реагирующих в ИФА животных не выявлено.
Пример 2. Провели испытание предложенного метода постановки ИФА со сборными пробами молока в производственных условиях с формированием сборных проб от 10 и от 20 животных. Было исследовано 219 дойных коров из благополучного по лейкозу хозяйства. Объем индивидуальных проб для формирования сборной пробы был взят 100 мкл. Для контроля от всех этих животных молоко было исследовано индивидуально в ИФА.
Результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5
Сравнительная оценка результатов ИФА-диагностики со сборными пробами молока
ИФА со сборными пробами
Контроль (ИФА с индивидуальными пробами)
n - количество индивидуальных проб в сборной
n=10
n=20
Кол-во проб, шт.(кол-во сборных проб, шт.)
219 (22)
219(11)
219
Кол-во положительных сборных проб, шт.
0
0
-
Всего исследовано в ИФА, гол.
22
11
219
Всего выявлено инфицированных животных, гол.
0
0
0
Из таблицы 5 видно, что в благополучных по лейкозу хозяйствах можно использовать данный способ исследования с формированием сборных проб молока как от 10, так и от 20 индивидуальных проб.
Таким образом, исследование молока в ИФА в виде сборных проб не уступает по эффективности стандартному методу постановки, при этом позволяет оптимизировать процесс проведения исследований. Стоимость диагностических исследований сокращается в 2-3 раза.
Предлагаемый способ диагностики можно использовать как элемент действующих систем оздоровительно-профилактических мероприятий при лейкозе, применяемый на дойном стаде. А также для контроля благополучия дойного стада в оздоровленных и благополучных по лейкозу хозяйствах.