Молекулярно-генетический анализ эпидемически опасных штаммов Vibrio cholerae eltor, изолированных в Сибирском и Дальневосточном регионах России

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 579.843.1:579.253].083.1

Л. В. Миронова, С. В. Балахонов, Л. Я. Урбанович, А. С. Кожевникова, В. С. Половинкина,

Е. С. Куликалова, М. В. Афанасьев

молекулярно-генетический анализ эпидемически опасных штаммов vibrio cholerae eltor, изолированных в сибирском и дальневосточном регионах россии

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора

С целью анализа структурных компонентов генома штаммов V. cholerae eltor (n = 90), изолированных при эпидемических осложнениях по холере на территории Сибири и Дальнего Востока, осуществляли детекцию комплекса биоварспецифических и ассоциированных с патогенностью детерминант в ПЦР, а также определение нуклеотидной последовательности гена ctxB и структуры промоторной области генов ctxAB. В результате токсигенные штаммы V. cholerae eltor были разделены на две группы: первая включает штаммы, изолированные на начальных этапах седьмой пандемии (1970-е годы) - генотип ctxB3+rstRE'+rstRa-rstC+TLC+tbr4, ко второй группе отнесены все эпидемически опасные вибрионы эльтор 1990-х годов выделения, охарактеризованные как атипичные в связи с обнаружением в их геноме ctxB гена классического генотипа (ctxBl). По набору тестируемых генетических маркеров (ctxB, rstR, rstC, TLC, tbr) во второй группе дифференцированы три генотипа, проявляющих определенную территориальную приуроченность. Установленная вариабельность структуры генома атипичных вариантов вибриона эльтор может служить маркером при молекулярно-эпидемиологическом анализе путей заноса и распространения возбудителя холеры и позволяет делать обоснованные предположения о наиболее вероятных направлениях эволюции патогена.

Ключевые слова: Vibrio cholerae, эпидемическая опасность, атипичные варианты вибриона эльтор, генотип, молекулярно-эпидемиологические закономерности

На протяжении седьмой пандемии возбудитель холеры неоднократно претерпевал различного рода эволюционные преобразования, которые привели к появлению в 1992 г. эпидемически значимого варианта V. cholerae новой серогруппы O139, формированию устойчивых к антибактериальным препаратам клонов за счет приобретения детерминант резистентности в составе интегративных конъюгативных элементов, в частности элемента SXT [7, 14]. Новым этапом в развитии текущей пандемии и эволюции возбудителя стало появление в начале 1990-х годов в эндемичных по холере странах атипичных вариантов вибриона эльтор, сочетающих в себе признаки биоваров эльтор и классического: фенотипически указанные варианты, как правило, обнаруживают принадлежность к V. cholerae eltor, тогда как в их геноме одновременно присутствуют маркеры обоих биоваров [17, 21, 26].

Известно, что на генетическом уровне вибрион эльтор отличается от возбудителя классической холеры структурой отдельных генов интегрированного в хромосому профага СТХф (несет ген субъединицы B холерного токсина третьего генотипа - ctxB3, эльторспецифический аллель гена-репрессора rstR), организацией промоторной области генов ctxAB, нуклеотидной последовательностью гена основной структурной субъединицы токсин-корегулируемых пилей адгезии tcpA в составе острова патогенности VPI [10, 12, 15, 19, 22, 23]. Кроме того, V. cholerae eltor содержит фланкирующий профаг СТХф элемент

- профаг RS1ф, а также интактный кластер генов RTX и биоварспецифический аллель гена гемолизина hlyA [9, 24, 27]. Вибрионы классического биовара, в свою очередь обладают геном ctxB классического типа (ctxB1), а также специфическими для указанного биовара аллелями генов rstR, tcpA и hlyA [10, 12, 19, 22, 23].

Характерной особенностью новых атипичных клонов V. cholerae eltor является их способность продуцировать холерный токсин классического типа, обусловленная заменой эльторспецифического гена субъединицы В холерного токсина (ctxB3) на ctxB первого генотипа [17, 21, 26]. Кроме того, часто область RS2 профага СТХф у атипичных штаммов содержит классический аллель гена-репрессора rstR [17, 21, 26]. Вместе с тем отдельные группы новых вариантов патогена содержат в геноме профаг RS1ф, отсутствующий у вибрионов классического биовара [17]. На основании этих различий, а также с учетом копийности и локализации СТХф выделено несколько групп атипичных клонов, которые обнаруживают определенную территориальную приуроченность [17]. Модификации генома вибриона эльтор, касающиеся в первую очередь структуры детерминант вирулентности, привели к повышению патогенного потенциала возбудителя, что вместе с сохранением им высоких адаптационных свойств определило, по всей вероятности, способность атипичных клонов к широкому распространению не только в эндемичных странах, но и к проникновению на свободные от холеры территории [4-6, 17, 26], а в отдельных случаях и к закреплению на новых территориях с развитием беспрецедентных по масштабам эпидемических осложнений [8].

В Сибири и на Дальнем Востоке все зарегистрированные единичные случаи и местные острые вспышки холеры как на начальных этапах седьмой пандемии (1970-е годы), так и позднее (в 1990-е годы) непосредственно обусловлены заносом возбудителя на территорию [2, 3]. Связь осложнений по холере с заносом инфекции из неблагополучных стран, где отмечается циркуляция измененных высокопатогенных клонов холерного вибриона, определяет необходимость комплексного молекулярно-генетического исследования обнаруженных в регионе эпидемически опасных штаммов V cholerae eltor, а также выяснения возможности использования данных ге-нотипирования при проведении эпидемиологического и филогенетического анализов.

С учетом изложенного целью исследования был анализ структурных компонентов генома штаммов V cholerae eltor, изолированных при эпидемических осложнениях на территории Сибири и Дальнего Вос-

тока, и определение эффективных молекулярных маркеров для генотипирования атипичных вариантов возбудителя холеры.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы. В работе проведено исследование 90 штаммов V. cholerae eltor, изолированных от людей и из объектов окружающей среды во время вспышек и от людей при единичных заносных случаях в Сибири и на Дальнем Востоке в разные периоды седьмой пандемии холеры (табл. 1).

Все штаммы по комплексу культурально-морфо-логических, биохимических, серологических свойств относятся к V cholerae серогруппы O1, фенотипически при изоляции штаммов определена их принадлежность к биовару эльтор. Кроме того, в исследование взято 5 штаммов холерного вибриона классического биовара. В качестве контрольных использованы V. cholerae eltor M-878 и V. cholerae cholerae 569B.

Получение бактериальной ДНК. Штаммы культивировали на 1% пептонной воде и щелочном казеиново-дрожжевом агаре (pH 7,6). Экстракцию ДНК осуществляли посредством термолизиса (при 100°C в течение 30 мин) суспензии 107 микробных клеток в 1 мл, приготовленной из 18-часовой агаровой культуры тестируемых и контрольных штаммов. Концентрацию полученной геномной ДНК устанавливали спектро-фотометрически на NanoVue Plus (GE Health Care, США), в ПЦР использовали 3-5 нг матрицы.

Полимеразная цепная реакция. Детекцию генов ctxAB, tcpA осуществляли в мультиплексной ПЦР [3]. Тип аллелей генов ctxB, rstR, hlyA определяли в ПЦР с аллельспецифическими праймерами [20, 22, 24]. Скрининг присутствия в геноме исследуемых штаммов токсинсвя-занного криптического элемента (TLC), RS1 профага (ген rstC) проводили в ПЦР с одной парой соответствующих праймеров [18, 27]. Параметры реакции оптимизировали в отношении состава и объема амплификационной смеси, а также непосредственно условий термо-циклирования. Определенный расчетным и экспериментальным способом оптимальный диапазон температур отжига праймеров представлен в табл. 2.

Для детекции кластера генов RTX разработан вариант мультиплексной ПЦР, позволяющий одновременно выявлять фрагменты генов rtxA (417 н. п.) и rtxC (263 н. п.). Реакцию проводили в объеме 15 мкл амплификационной смеси (50 мМ KCl, 15 мМ ТрисНС1, 2,5 мМ MgCl2, 0,25 мМ dNTP, по 5 пмоль каждого праймера и 0,6 ед Taq ДНК-полимеразы) по следующей программе: стартовая денатурация 94°С -2 мин; далее 30 циклов: 94°С - 30 с, 55°С - 30 с, 72°С - 40 с; заключительная элонгация 72°С - 2 мин.

Амплификацию участка ДНК

V. cholerae, содержащего ген ctxB, для последующего секвенирования осуществляли по протоколу, предложенному О. Olsvik и соавт. [23].

Для анализа структуры промотора генов ctxAB подобрана система праймеров (А^, АгК), фланкирующих участок ДНК в межгенной области ctxA-zot (ну-клеотидные позиции 1568033-1568432 хромосомы I штамма V. cholerae eltor № 16961 - КС002505), содержащей ToxR-связывающие повторы. Амплификацию осуществляли в реакционной смеси стандартного состава по программе: стартовая денатурация 94°С - 2 мин; 32 цикла: 94°С - 30 с, 57°С - 30 с, 72°С - 30 с; заключительная элонгация 72°С - 2 мин. Контроль наработки и размера продукта ПЦР (400 н. п.) осуществляли посредством электрофореза в 1,5% агарозном геле в присутствии бромида этидия.

Секвенирование. Очистку ампликонов перед секве-нированием проводили добавлением к реакционной смеси 10 ед. экзонуклеазы I и 1 ед. щелочной фос-фатазы с последующей инкубацией в течение 30 мин при 37°С и инактивацией ферментов при температуре 85°С в течение 15 мин.

Нуклеотидную последовательность промоторной области генов ctxB и ctxAB определяли модифици-

Таблица 1

Группы исследованных штаммов V cholerae eltor

Время выделения штаммов, годы Эпидситуация Место выделения штаммов Объект выделения штаммов Количество исследованных штаммов

1970-е Вспышка Омск Человек ООС 5 2

Новосибирск Человек ООС 2 1

Барнаул Человек ООС 3 2

Заносный очаг Красноярск, Томск, Сургут Человек ООС 4 1

1994 Заносный очаг Омск Новосибирск Барнаул Человек 5 1 2

1997 Заносный очаг Иркутск Ачинск Человек 1 2

1999 Вспышка Южно-Сахалинск Человек ООС 12 13

Владивосток Человек ООС 17 11

Заносный очаг Южно-Сахалинск Владивосток Уссурийск Находка Человек 2 1 2 1

Примечание. ООС - объекты окружающей среды.

14

Таблица 2

Нуклеотидные последовательности праймеров, используемых в работе

Ген Нуклеотидная последовательность праймеров 5' ^ 3' Температура отжига, °C Размер ампликона, н. п. Источник данных

ctxAB P1 TGAAATAAAGCAGTCAGGTG [16]

P3 GGTATTCTGCACACAAATCAG 57 777 3,1

tcpA TcpEa GAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACAC [1]

TcpEb GAAAGGACCTTCTTTCACGTTG 57 471 3,1

ctxB (AC-ПЦР) Fw-con ACTATCTTCAGCATATGCACATGG 3,4 2,5 6,25

Rv-cla CCTGGTACTTCTACTTGAAACG 56 186 [20]

Rv-elt CCTGGTACTTCTACTTGAAACA 2,6 3,3 1,0

ctxB (секвенирование) ctxB-F GGTTGCTTCTCATCATCGAACCAC 3,3 1,7 3,1

ctxB-R GATACACATAATAGAATTAAGGAT 55 460 [23]

rstRclas rstRIF CTTCTCATCAGCAAAGCCTCCATC 57 500 8,3

rstA3R TCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTG 11,1 5 7,3

rstRelt rstR2F GCACCATGATTTAAGATGCTC' 56 500 [22]

rstA3R TCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTG 3,6 5,8 4,2

rstC RstCl AACAGCTACGGGCTTATTC 57 238 [27]

RstC2 TGAGTTGCGGATTTAGGC 5,1 2,5 5,2

rtxA rtxAF CTGAATATGAGTGGGTGACTTACG 417 1,0

rtxAR GTGTATTGTTCGATATCCGCT ACG 55 [9]

rtxC rtxCF CGACGAAGATCATTGACGAC 263 0

rtxCR CATCGTCGTTATGTGGTTGC 4,7 0,8 7,3

hlyA 489F GGCAAACAGCGAAACAAATACC 481/738 10,4

744F GAGCCGGCATTCATCTGAAT 60 (eltor) [24]

1184R CTCAGCGGGCTAATACGGTTTA 727

Tlc TlcF GATTGTGCGTCTTGCATTTAGG TlcR GTGAATAAATCAGGTGTAATGTCG 60 2011 [18]

tbr tbrF AATCTGCCCGATATAACTTATC tbtR TTACAAGGATACGCTTACAGTG 57 400 Настоящее исследование

рованным методом F. Sanger с использованием ABI Prism BigDye v.1.1 Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit и ДНК-анализатора ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

Анализ результатов секвенирования и трансляцию аминокислотных последовательностей проводили с применением инструментов программы VectorNTI v. 10.0 (Invitrogen Corp., США). В качестве референс-ных при проведении анализа взяты последовательности штаммов V. cholerae eltor 16961 (NC002505) и V. cholerae cholerae 569B (U25679). Кроме того, анализируемые последовательности ДНК сравнивали с определенными в настоящем исследовании последовательностями ДНК штаммов V. cholerae eltor M-878 и V. cholerae cholerae 569B, используемыми в качестве контрольных.

Кластерный анализ по количеству ToxR-связыва-ющих повторов осуществляли с использованием программы Bionumerix 6.0 (Applied Maths, Бельгия).

Результаты и обсуждение

Учитывая тот факт, что наиболее значимые эволюционные преобразования генома холерного вибриона, повлекшие формирование нового клона возбудителя, произошли в структуре профага СТХф, молекулярно-генетический анализ исследуемой выборки V. cholerae в первую очередь заключался в вы-

явлении особенностей указанного мобильного генетического элемента. Установлено, что 89 (93,7%) из 95 тестируемых штаммов V. cholerae несут в геноме полную последовательность кластера генов холерного токсина с1х.АВ, входящих в состав СТХф. Вместе с тем в исследуемой выборке выявлено 6 штаммов ^АВ~ V. сЫ1егае еког (табл. 3).

К их числу относятся два исходно нетоксигенных штамма, которые при выделении не давали холеро-генный эффект у кроликов-сосунков и не содержали генетических детерминант холерного токсина: один изолирован от хронического вибриононосителя (но-сительство продолжалось в течение 18 мес после установленного факта заболевания и первоначального выделения токсигенного холерного вибриона) в Омске в 1973 г., другой - от вибриононосителя, выявленного в 1999 г. в Южно-Сахалинске при активном обследовании туристов, возвратившихся из Китая. Остальные 4 штамма ^АВ~ определены как спонтанные мутанты, утратившие гены холерного токсина в процессе пассажа на питательных средах в лабораторных условиях, поскольку при исследовании их генотипа на момент изоляции или при ретроспективном тестировании коллекции было установлено присутствие генов холерного токсина.

Определение типа аллеля гена субъединицы В

Таблица 3

Результаты генотипирования V. cholerae

Время Коли- Генотип

Штамм выделения штаммов, годы чество штаммов ctxAB ctxB количество tbr тип алле-ля rstR TLC rstC tcpA эльтор тип алле-ля hlyA rtxA rtxC

V. cholerae eltor 1970-е 17 + ctxB3 4 El + + + El + +

2* - - - El + + + El + +

1** - - - - - - - El + +

1990-е 5 + ctxB1 4 El/Clas + + + El + +

57 + ctxB1 4 El/Clas - + + El + +

2 + ctxB1 4 El + + + El + +

3 + ctxB1 3 El + + + El + +

1* - - - El - + + El + +

1* - - - - - - + El + +

1** - - - - - - - El + +

V. cholerae cholerae 5 + ctxB1 6/7/8 Clas + - - Clas - -

V. cholerae eltor M-878 1 + ctxB3 4 El + + + El + +

V. cholerae cholerae 569B 1 + ctxB1 8 Clas + - - Clas - -

Примечание. * - спонтанные мутанты токсигенных штаммов V. cholerae eltor; ** - исходно нетоксигенные штаммы V. cholerae eltor.

холерного токсина в аллельспецифической ПЦР, характеризующей вариабельность нуклеотидов в позиции 203 гена, показало, что типичный для биовара эльтор ctxB (T203) присутствует лишь у штаммов холерного вибриона, изолированных при эпидемических осложнениях в Сибири в 1970-е годы. CTX<$> остальных токсигенных штаммов V. cholerae eltor (вспышки и заносные очаги 1994, 1997, 1999 гг.) содержит ctxB первого генотипа (C203). В отношении всех нетоксигенных штаммов аллельспецифическая ПЦР с праймерами, выявляющими как аллель ctxB1, так и аллель ctxB3, была отрицательной, что является дополнительным подтверждением отсутствия в их геноме детерминант холерного токсина. При выборочном секвенировании гена ctxB у штаммов первой группы (изолированные в 1970-е годы штаммы V. cholerae eltor и V. cholerae eltor M-878) установлено присутствие тимина в позициях 115 и 203 (соответствует третьему генотипу холерного токсина), а в структуре указанного гена у штммов второй группы (изолированные в 1990-е годы штаммы V. cholerae eltor, V. cholerae cholerae и V. cholerae cholerae 569B) в тех же позициях выявлен цитозин, что соответствует первому генотипу (см. табл. 3; рис. 1). Нуклеотидные последовательности гена ctxB 21 штамма V. cholerae eltor депонированы в GeneBank под регистрационными номерами HM 345946, HM 366176-366179, HM 590453-590461, HM 595735-595740. Выполненная на основании установленной нуклеотидной последовательности гена ctxB трансляция аминокислотной последовательности холерного токсина подтвердила, что его тип у штаммов первой группы специфичен для эльтор (Tyr 39, Ile 68), а у штаммов второй группы - для классического биовара (His 39

и Tre 68). Эти результаты дают основание отнести изолированные при эпидемических осложнениях в регионе в 1990-е годы V. cholerae eltor к атипичным вариантам, фенотипически демонстрирующим принадлежность к биовару эльтор, но содержащим ген холерного токсина, характерный для классического биовара возбудителя.

Следующий этап изучения генетических особенностей профага СТХф заключался в анализе структуры промоторной области генов ctxAB (PctxAB), локализующейся на участке ctxAB-zot. Известно, что PcxcAB содержит тандемные повторяющиеся геп-тамерные последовательности (5'-TTTTGAT-3'), с которыми связывается один из активаторов экспрессии генов холерного токсина - регуляторный белок ToxR, на основании чего указанные повторы обозначены как ToxR-связывающие (ToxR-binding repeats - tbr) [12, 19]. Число их вариабельно для разных биоваров: в составе СТХфи присутствует 3-4 копии повтора, в СТХфс1 - 7-8. Секвенирова-ние промоторной области генов ctxAB в настоящем исследовании показало, что практически все токси-генные вибрионы эльтор независимо от места, времени и источника выделения несут 4 копии тандем-ных повторяющихся последовательностей. Исключение составляют лишь изолированные в заносных очагах в Иркутске и Ачинске в 1997 г. от больных холерой штаммы V. cholerae eltor, у которых при анализе хроматограмм промоторной области генов ctxAB выявлено наличие трех повторов (рис. 2). У взятых в исследование штаммов классического биовара обнаружена вариабельность структуры PctAB: в геноме двух штаммов (в том числе одного контрольного - V. cholerae cholerae 569B) присутствует 8, а

о и и и и и и U и и и U и u и о и и

у- 1- 1- I- н 1- 1- 1- н I- 1- 1- 1- 1- 1- y- H

t- 1- 1- к 1- I- 1- 1- t- 1- 1- h- t- 1- 1- 1- H

h- 1— (— h- h- н- i— h- ь- l— h- b- 1— (— h- h-

у- к f- h- — 1— f— H f— к f- y—

со  о o h- о о о О и о o о и о о y- y— 1— 1

о о; i t i о: i •t i о: i t i о: о: t •i X i

CN о" i i i i i < i <£ < •x < i x i

и (J Q О о (_) Q (j о о Q и O О (J Q о О

CD СЗ CD CD CD СЗ CD CD CD СЗ CD CD CD CD CD CD CD CD

н 1- 1- H t- 1- 1- 1- i- н- 1- 1- H H 1- 1- H t-

CD CD CD CD CD CD ш CD CD сз C3 CD CD CD и CD CD CD

(3 СЗ CD CD CD CD CD CD CD СЗ CD CD CD CD CD CD CD CD

1- 1- t- 1- 1- l- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1-

< < < < < < < < < < < < < < < < < <

< < < < < < < < < < < < < < < < < <

CD CD m CD CD CD CD CD CD CD CD <3 CD CD CD <3 CD CD

о • СП . < i i X X X i X <t X X X i X X X

< < •I < < < <c < < < •I < < < < < < <

у- 1- 1- t- i- 1- 1- н l- 1- 1- H 1- 1- t-

у- y- 1- K K t- 1- K 1— 1- 1- У— h- y- 1- У— У—

у- 1- 1- t— t- 1- 1- У- I— 1- 1- y- У— y- 1- У—

у- 1- 1- h- H 1- 1- 1- H н- 1- 1- 1- y- y- 1- 1- y-

о o u О U U u u о о U o o u u u o o

< i < i < < < < i < < < i < < i i <

у- 1- 1- 1- i- y- 1- t- 1- 1— У- 1- y- y- i- h- 1-

у- 1- 1- 1- i- i- 1- i- 1- f— 1- i- 1- H 1- i- 1- 1-

го  < I •I < i < < < o: < < < i < < •i < c

—1. о u о a u О о о a о u и u u u о a u

у- 1- 1- h- H- 1- i- 1- h- У- 1- y- H- 1- 1- y- H

< i i < < < < < < < i < < < i i < <

у- 1- 1- H h- 1- i- 1- H У- 1- y- H y- 1- 1- H y-

о u G О O u u o О о u o и u CJ o о o

CD C3 CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD

CD C3 CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD

1- 1- 1- 1- 1- b- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1-

< i < < < < < < < < < < < < < < < <

о . cd CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD a CD CD CD a CD CD

< < < < < < i < i I < < i < i < < <c

CD C3 C3 CD CD CD CD CD CD CD CD я CD CD CD CD CD CD

•I i i X i i X X < i X i X i X

(3 C3 CD CD CD CD CD CD CD CD CD ilD a CD CD CD CD

i •I i o: i < i o: < i i < i •i i o:

< i I < i < i i i i x X i < •X <£

< i < i <c i < < < < < < < < i < X <C

< i X < •i i X < X X X X X X i X X i

с i i < с i i < < < X < X < i X X С

о ID  cd C3 CD CD CD И CD CD CD a CD CD CD CD CD CD CD CD

. cd C3 CD C3 CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD

1- 1- 1- 1- 1- b- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- b- 1- 1- 1-

о o o u O O O O O U O U O O O o O O

СЗ C3 CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD

< < « < < i < < < I < < < < < I < X

у- y- 1- H- K f- 1- 1- y- 1- y- 1- 1- У— У- 1- H- У—

и o o u u CJ O U u CJ L> CJ U U L> u <J и

ь- 1- 1- 1- h- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- У- 1- i- I—

i—l U o o u О o o o u o O o u o O o O о

1С) • у- 1- 1- 1- 1- t- 1- 1- h- 1- 1- 1- h- H- 1- 1- 1- У-

•н. i i < < < i i < < < i < < < i •i < <

< I < < < < < < < < < < < < < < < <

СЗ cd <5 CD CD CD tD CD CD CD CD о CD a О CD CD

< I •I < s < < < < < •I I < < < •I < X

о о о О о и U О U О u о О о (J о О и

I •I •i < о: < < i < I < i a: i •i •i < •i

h- 1- 1- 1- i- 1- l- 1- 1- 1- h- I- i- 1- 1- I- 1-

< < < < < < < < < < < < < < < < < <

у- y- 1- I- н 1- 1- H y- >- y- y- y- y- У- y-

сз C3 CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD C3 CD CD CD CD CD

•н. о о О О О О О О О О CJ О о О О О О О

1— 1- V- 1- 1— 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1-

1— y- l- 1— 1— h- l- K K h- H- H- h- У— h- У- K y—

1— ь- 1- 1— 1— 1- 1- h- K h- 1- 1- y- y— b- h- y—

у- 1- 1- h- к H- 1- h- K У- 1- 1- y- y- 1- 1- У- y—

< I < < < < < < < < i < < < < < < <

у- y- 1- I- н 1- H I- 1- y- y- 1- y- У- y-

< i < < < < < < < < i < < < < < < <

СЗ СЗ CD CD CD CD CD C3 CD CD и <5 CD CD И CD CD CD

о со  < «С X i i < < X X X i X i X i i

. I < X i X X < X < i X i X i X i 4

I- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- t- 1- h- 1- 1- i- l- [-

< < < < < i < < < < < « < < < < < <

СЗ cd CD a СЗ CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD

1- 1- 1- h- I- 1- 1- 1- I- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- H 1-

< i X X i I i X i X i i X X

< i i X X X i I i X < i X X i i X X

•I < x X X < < i i X i X X i X X

У- 1- i- 1- 1- i- 1- 1- y- 1- i- h- 1- 1- i- 1- y-

(—1 IM  о o o O О O o u CJ O o O a O O o o u

•н. СЗ C3 CD CD СЗ CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD

о о О О О О О О О О о О О О О О О о

< i < i i < < < < < < < i < < < i <

у- 1- h- I- 1- 1- 1- 1- 1- l- 1- 1- 1- H- 1-

К) т- 1" r r T г r r T •r T r T T r r •r T •r.

о о K и о о o и о о о u о о y- h- -

ч. a. 4. 4. о 1 1 4. <c <x •0. o. 4. a. 4. 1 4.

1- 1- 1- 1- 1- t- 1- 1- 1- 1- 1- h- 1- 1- 1- i- 1-

< I < < < < i < < < < < < < < < < <

< < < < < < i < < < < < < < < < < <

-н. < < < < < < < < < < < < < < < < < X

о о a и и О о и о о и и О о О a U О

со cd CO cd CO о CO о со о CO СЭ CO <=> ОD О со о CO CD CO CD CO CD CO о со о CO CD CO CD CO о CO о

т— r_ т— r_ r~

ш .-.-. го -aCO CO CO CO Ш CO ю го -rr (M го o CO CD CD СП 00 см in ГО ГО •J:• m CJ CO со r^ CO Ш ID Ю

т T LO UD V т T т т T T T T т T — — —

ft ft CO j>: О A CO о л л ft A л л л ft ft ft ft ft ft ft л

Рис. 1. Нуклеотидная последовательность гена ctxB штаммов V. ско1егае еНог.

Генотип сХВЗ (Т115, Т203) - V. ско1егае еког И-441 (Омск, 1972 г.), И-561 (Барнаул, 1973 г.), И-574 (Новосибирск, 1973 г.), референс-штамм V. ско1егае еНог N 16961 (ЫС002505, локус Vc1456); генотип сХВ1 (С115, С203) - V. ско1егае еНог И-1181 (Новосибирск, 1994 г.), И-1184 (Омск, 1994 г.), И-1187 (Барнаул, 1994 г.), И-1263 (Иркутск, 1997 г.), И-1264 (Ачинск, 1997 г.), И-1298, И-1300, И-1310 (Южно-Сахалинск, 1999 г.), И-1335, И-1336 (Уссурийск, 1999 г.), И-1324, И-1334, И-1345 (Владивосток, 1999 г.), референс-штамм V. ско1егае еНог 569В (и25679).

в двух других - 6 и 7 ToxR-связывающих повторов (см. табл. 3). Выявленное сходство структуры областей PctAB у атипичных V. cholerae eltor и типичных представителей биовара эльтор свидетельствует об их близком генетическом родстве и может использоваться как один из маркеров при характеристике атипичных клонов.

Другим функционально значимым и представляющим интерес для генотипирования структурным элементом профага СТХф является последовательность RS2, несущая гены rstA, rstB, rstR, контролирующие репликацию, интеграцию профага и репрессию транскрипции rstA соответственно [27]. Вариабельность нуклеотидной последовательности rstR используется в качестве одного из признаков для дифференциации биоваров на уровне генома. При анализе гена rstR нами установлено, что все исследуемые токсигенные изоляты V. cholerae eltor 70-х годов XX в. несут только его эльторспецифический аллель. Часть атипичных штаммов также содержит только rstREl, тогда как другая часть характеризуется присутствием одновременно двух аллелей гена-репрессора - классического и эльтор. Вместе с тем следует отметить, что нуклео-тидная последовательность эльторспецифического гена rstR области RS2 идентична гену rstR, входящему в состав RS^. Соответственно обнаружение rstRE1 может свидетельствовать о присутствии в геноме как СТХф эльтор-типа, так и профага RS^. При этом известно, что в отличие от области RS2 профаг RS^ несет ген-антирепрессор rstC, подавляющий экспрессию гена rstR. Все взятые нами в исследование токси-генные штаммы вибриона эльтор оказались положительными в отношении гена rstC, что подтверждает присутствие в их геноме профага RS1. Вибрионы классического биовара лишены указанного мобильного генетического элемента. В геноме авирулентных V. cholerae eltor гены rstR и rstC отсутствуют, тогда как спонтанные мутанты оказались вариабельными по этим признакам (см. табл. 3).

Наряду с указанными выше мобильными генетическими детерминантами, токсигенные холерные вибрионы обычно содержат в геноме последовательность, являющуюся спутником профага CTX, обозначенную как токсинсвязанный криптический элемент (toxin-linked cryptic element - TLC) [25] и имеющий, по всей вероятности, также фаговое происхождение [13]. В исследуемой выборке все штаммы ctxAB+ начала седьмой пандемии холеры, изолированные при эпидемических осложнениях в Сибири, а также токсигенные изоляты начала 1990-х годов (1994 и 1997 гг.) и V. cholerae cholerae содержат TLC, в то время как токсигенные штаммы 1999 г. выделения лишены указанного генетического элемента (см. табл. 3).

Детекция локализованного в составе острова пато-генности VPI-I гена tcpA показала положительный ам-плификационный ответ у всех токсигенных штаммов вибриона эльтор, а также в геноме утративших профаг СТХф спонтанных мутантов. Исходно нетоксигенные штаммы ctxAB' от вибриононосителей характеризуются отсутствием указанного гена. Отрицательный

Рис. 2. Структура генов промоторной области ctxAB (PclxAB) V. cholerae.

а - нуклеотидная последовательность PctxAB штаммов V. cholerae eltor, содержащих четыре ToxR-связывающих повтора (5'-TTTTGAT-3'): И-561 (1973 г.), И-1181, И-1184, И-1187 (1994 г.), И-1298, И-1300, И-1335, И-1345 (1999 г.); б - нуклеотидная последовательность PctxAB штаммов V. cholerae eltor, содержащих три ToxR-связывающих повтора (5'TTTTGAT-3'): И-1263, И-1264 (1997 г.); в - UPGMA - дендрограмма, построенная по результатам секвенирования промоторной области генов ctxAB исследованных штаммов V. cholerae.

результат на наличие эльторспецифического аллеля гена tcpA получен и с ДНК V. cholerae cholerae.

Характерные для биовара эльтор генетические детерминанты - эльторспецифический аллель гена hlyA и гены rtxA, rtxC присутствуют во всех штаммах V. cholerae eltor независимо от их эпидемической значимости, места и времени выделения. Вибрионы классического биовара демонстрируют наличие специфического для классического биовара аллеля гена hlyA (ампликон 727 н. п.) и отсутствие амплификаци-онного сигнала при детекции генов кластера RTX.

Проведенное исследование структурных особенностей генома V. cholerae eltor показало, что авиру-лентные изоляты от вибриононосителей содержат отдельные генетические маркеры биовара эльтор (hlyA, rtxA, rtxC), но при этом наряду с отсутствием детерминант основных генетических элементов, определяющих эпидемическую опасность возбудителя - про-

фага СТХф и острова патогенности VPI-1, лишены и дополнительных ассоциированных с патогенностью маркеров - профага RS^ и элемента TLC.

Спонтанные мутанты, для которых установлена утрата генов холерного токсина при пассаже на питательных средах, характеризуются отсутствием и других структурных элементов профага CTX. Так, отрицательный результат амплификации фрагмента области ctxA-zot позволяет предположить наличие у них протяженной делеции, захватывающей и промо-торную область генов ctxAB. При этом отсутствие в геноме одного из штаммов обоих аллелей гена rstR, гена rstC и TLC свидетельствует об утрате не только СТХф, но и функционально и пространственно связанных с ним мобильных генетических элементов -RS^ и TLC. Остальные штаммы этой группы сохранили исходные ассоциированные с патогенностью детерминанты (RS^ и TLC). Интерес представляет спонтанный мутант штамма, изолированного во время вспышки 1999 г. В его геноме выявлен только эльторспецифический аллель гена rstR, тогда как все остальные выделенные при эпидемических осложнениях 1999 г. штаммы несут оба аллеля указанного гена. Результаты исследования штамма на наличие rstC указывают на сохранение в нем профага RS^, а выявленный ген rstREl, очевидно, является составной частью этого профага. Обнаружение сцепленной делеции генов ctxBl и ertRCl, которая, наиболее вероятно, могла произойти при полной утрате CTXф, служит подтверждением инфицирования изолятов 1999 г. профагом, несущим детерминанты классического биовара. В пользу полной утраты CTXф спонтанными мутантами свидетельствует и отсутствие в их геноме еще одного структурного элемента профага - гена токсина проницаемости zot (данные не представлены).

На основании установленных особенностей структуры генома исследованные токсигенные штаммы V. cholerae eltor разделили на две группы. К первой относятся изолированные при эпидемических осложнениях на начальных этапах седьмой пандемии (1970-е годы) штаммы, которые характеризуются однородностью анализируемых локусов (генотип ctxB3+rstREl+rstRarstC+TLC+tbr4) и соответствуют по генетической структуре прототип-ному штамму биовара эльтор. Вторую группу составляют все изолированные в 1990-е годы штаммы, охарактеризованные как атипичные варианты вибриона эльтор с гибридным геномом, поскольку несут одновременно генетические маркеры эльтор

Таблица 4 Генотипы атипичных штаммов V cholerae eltor

Генотип

Структура генома

I

II

III

ctxBl+rstREl+rstRCl+rstC+TLC+tbr4 ctxßl+rstREl+rstRCl+rstC+TLC+tbr„

ctxBl+rstREl+rstRCl-rstC+TLC+tbr4 ctxßl+rstREl+rstRCl-rstC+TLC+tbr,

и классического биовара. В геноме этих штаммов выявлен ген субъединицы B холерного токсина классического типа (ctxBl). При этом общим для всех атипичных V. cholerae eltor оказалось присутствие эльторспецифического элемента - RS19, который целесообразно также использовать в качестве одного из маркеров при генетической характеристике указанных вариантов вибриона, так как есть данные о циркуляции в эндемичных странах вариабельных по этому признаку клонов [17]. По ряду других тестируемых детерминант генетическая структура ctxBl вибрионов эльтор оказалась гетерогенна, что послужило основой дифференциации их на три генотипа (табл. 4).

Первый генотип характеризуется присутствием обоих аллелей гена rstR, токсинсвязанного криптиче-ского элемента и четырех тандемных повторов в про-моторной области генов ctxAB. Ко второму генотипу относятся штаммы, также обладающие классическим и эльтор-аллелями гена-репрессора rstR, с четырьмя повторами в промоторной области генов ctxAB, но лишенные элемента TLC. Третий генотип отличается от предыдущих присутствием только эльторспеци-фического аллеля rstR с сохранением TLC. С учетом особенностей структуры промоторной области генов ctxAB этот генотип дифференцируется на два подтипа: а - с четырьмя ToxR-связывающими повторами и б - содержащий лишь 3 повтора в промоторной области генов ctxAB.

Сопоставляя результаты генотипирования с данными эпидемиологического анализа, выявили определенные молекулярно-эпидемиологические закономерности. Установлено, что к первому генотипу относятся штаммы, выделенные в 1994 г. в Омске, Новосибирске, Барнауле от прибывших из Турции туристов. Все V. cholerae eltor второго генотипа изолированы в 1999 г. при эпидемических осложнениях на Дальнем Востоке, ассоциированных с заносом инфекции из Китая. Третий генотип, подтип а, включает штаммы, выделенные от вернувшихся из Индии шоп-туристов (Омск, Барнаул, 1994 г.), подтип б - изоляты в установленных в 1997 г. в Иркутске и Ачинске заносных очагах (занос из Казахстана).

Обнаруженные закономерности территориальной приуроченности различных генотипов V. cholerae eltor играют важную роль при выяснении происхождения и глобальных путей распространения эпидемически значимых атипичных клонов возбудителя холеры.

Кроме того, анализ структурных особенностей генома атипичных штаммов в динамике дает основание для суждения о наиболее вероятных направлениях эволюционной дивергенции измененных клонов патогена. В настоящее время обсуждаются различные гипотезы относительно механизмов формирования атипичных клонов: в частности, рассматриваются версии об их появлении в результате фаговой конверсии исходно нетоксигенных штаммов [11] или в результате утраты вибрионами эльтор профага СТХфЕ1 с последующим приобретением нетоксигенным производным профага СТХф

классического типа [26]. Обнаружение в данном исследовании вариантов ctxBl+rstREl+rstRCl-, а также идентичность структуры промоторной области генов ctxAB атипичных штаммов таковой прототип-ного штамма V. cholerae eltor не исключает вероятности того, что новый клон вибрионов формировался посредством последовательных генетических преобразований CTX профага типа эльтор, которые и привели в конечном счете к появлению вариантов ctxBl+rstREl+rstRCl+.

Таким образом, вариабельные биоварспецифи-ческие и ассоциированные с патогенностью генетические детерминанты (ctxB, rstR, rstC, TLC, tbr) могут использоваться в качестве маркеров для ге-нотипирования V. cholerae eltor с целью выяснения эпидемиологических и эволюционных закономерностей появления и распространения атипичных клонов. Вместе с тем гетерогенность генетической структуры возбудителя холеры на современном этапе развития седьмой пандемии, продолжающиеся эволюционные преобразования его генома с селекцией высокопатогенных клонов диктуют необходимость дальнейшей разработки и внедрения эффективных схем генотипирования V. cholerae для совершенствования системы эпидемиологического надзора за холерой и реконструкции филогенетических событий в процессе становления новых вариантов возбудителя.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы "Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)" (ГК № 61-Д/3).

Сведения об авторах: фКУз ИркутскНИпчИ Сибири и ДВ Роспотребнадзора

Миронова Лилия Валерьевна - вед. науч. сотр. лаб. холеры, канд. мед. наук, e-mail: mironova-lv@yandex.ru

Балахонов С. В. - директор института, д-р мед. наук, проф.

Урбанович Л. Я. - зав. лаб. холеры, д-р мед. наук Кожевникова А. С. - мл. науч. сотр. лаб. холеры Половинкина В. С. - науч. сотр. биохимического отдела

Куликалова Е. С. - науч. сотр. лаб. холеры, канд. мед.

наук

Афанасьев Максим Владимирович - ст. науч. сотр. лаб. холеры, канд. биол. наук, e-mail: afanasev_max@ mail.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Водопьянов С. О., Мишанькин М. Б., Олейников И. П. и др. // Холера и патогенные для человека вибрионы: Проблемная комиссия Межведомств. науч. совета по сан.-эпидемиол. охране территории РФ. - Ростов н/Д., 1999. - Вып. 12. - С. 50-55.

2. Марамович А. С., Урбанович Л. Я., Миронова Л. В., Куликалова Е. С. // Журн. микробиол. - 2006. - № 6. - С. 63-71.

3. Миронова Л. В. Молекулярно-генетические и эпидемиологические аспекты патогенности холерного вибриона (по материалам Сибири и Дальнего Востока): Дис. ... канд. мед. наук. - Иркутск, 2004.

4. Миронова Л. В., Балахонов С. В., Урбанович Л. Я. и др. // Сборник материалов пробл. комиссии координац. науч. совета по

сан.-эпидемиол. охране территории РФ «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов н/Д., 2010. - Вып. 23. - С. 86-89.

5. Савельев В. Н., Васильева О. В., Савельева И. В. и др. // Сборник материалов пробл. комиссии координац. науч. совета по сан.-эпидемиол. охране территории РФ «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов н/Д., 2010. - Вып. 23. - С. 81-86.

6. СмирноваН. И., Заднова С. П., Шашкова А. В., Кутырев В. В. // Молекул. генетика. - 2011. - № 3. - С. 11-18.

7. Burrus V., Quezada-Calvillo R., Marrero J., Waldor M. K. // Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - Vol. 72, N 4. - P. 3054-3057.

8. Chin C.-S, Sorenson J., Harris J. B. et al. // N. Engl. J. Med. - 2011.

- Vol. 364. - P. 33-42.

9. Chow K. H, Ng T. K, Yuen K. Y, Yam W. C. // J. Clin. Microbiol. -2001. - Vol. 39, N 7. - P. 2594-2597.

10. DavisB. M., KimseyH. H., Chang W., WaldorM. K. // J. Bacteriol. -1999. - Vol. 181, N 21. - P. 6779-6787.

11. Faruque S. M., Tam V. C., Chowdhury N. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2007. - Vol. 104, N 12. - P. 5151-5156.

12. HalderK., DasB., Nair G. B., BhadraR. K. // Microbiology. - 2010.

- Vol. 156. - P. 99-107.

13. Hassan F., Kamruzzaman M., Mekalanos J. J., Faruque S. M. // Nature. - 2010. - Vol. 467, N 7318. - P. 982-985.

14. Johnson J. A., Salles C. A., Panigrahi P. et al. // Infect. and Immun.

- 1994. - Vol. 62, N 5. - P. 2108-2110.

15. Karaolis D. K. R., Lan R., Kaper J. B., Reeves P. R. // Infect. and Immun. - 2001. - Vol. 69, N 3. - P. 1947-1952.

16. Koch W. H., Payne W. L., WentzB. A., Clbula T. A. // Appl. Environ. Microbiol. - 1993. - Vol. 59, N 2. - P. 556-560.

17. Lee J. H., Choi S. Y., Jeon Y. S. et al. // J. Microbiol. - 2009. - Vol. 47, N 6. - P. 783-788.

18. Maiti D., Das B., Saha A. et al. // Microbiology. - 2006. - Vol. 152.

- P. 3633-3641.

19. Miller V., Mekalanos J. J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - Vol. 81. -P. 3471-3475.

20. MoritaM., Ohnishi M., Arakawa E. et al. // Microbiol. Immunol. -2008. - Vol. 52. - P. 314-317.

21. Nair G. B., Faruque S. M., Bhuiyan N. A. et al. // J. Clin. Microbiol.

- 2002. - Vol. 40, N 9. - P. 3296-3299.

22. Nusrin S., Khan G. Y., Bhuiyan N. A. et al. // J. Clin. Microbiol. -2004. - Vol. 42, N 12. - P. 5854-5856.

23. Olsvik O., Wahlberg J., Petterson B. et al. // J. Clin. Microbiol. -1993. - Vol. 31, N 1. - P. 22-25.

24. Rivera I. N. G., Chun J., Huq A. et al. // Appl. Environ Microbiol. -2001. - Vol. 67, N 6. - P. 2421-2429.

25. Rubin E. J., Lin W., Mekalanos J. J., Waldor M. K. // Mol. Microbiol. - 1998. - Vol. 28, N 6. - P. 1247-1254.

26. SafaA., Nair G. B, KongR. Y. C. // Trends Microbiol. - 2010. - Vol. 18, N 1. - P. 46-54.

27. Waldor M. K., Rubin E. J., Pearson G. D. et al. // Mol. Microbiol. -1997. - Vol. 24, N 5. - P. 917-926.

Поступила 03.11.11

MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF THE EPIDEMICAL STRAINS OF THE VIBRIO CHOLERAE EL TOR ISOLATED FROM THE SIBERIAN AND MARITIME REGIONS OF RUSSIA

L. V. Mironova, S. V. Balakhonov, L. Y. Urbanovich, A. S. Kozhevnikova, V. S. Polovinkina, E. S. Kulikalova, and M. V. Afanas'ev

Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East, Irkutsk, Russia

The detection of the biotype-specificity, pathogenicity determinants, and sequencing of the ctxB gene and the ctxAB promoter was carried out for analysis of the Vibrio cholerae El Tor strains genome structure. The strains (n = 90) were isolated during cholera epidemic outbreaks in Siberia and the Far East.

All toxigenic Vibrio cholerae El Tor strains were divided into two groups: the first group included strains isolated during 1970s: they had the genotype ctxB3+rstREl+rstRCl-rstC+TLC+tbr4. All epidemic dangerous El Tor biotype strains isolated in 1990s belonged to the second group. The strains were characterized as atypical variants because of classical genotype (ctxBl) ctxB gene harboring. The second group fell into three genotypes according to the set of genetic markers (ctxB, rstR, rstC, TLC, tbr).

It was suggested that the set of genetic determinants could be used as a marker for epidemiological analysis of spreading of atypical ET strains. The comparative analysis of genome structure enables to suggest possible ways of pathogen evolution. Key words: Vibrio cholerae, epidemic dangerous, Vibrio El Tor atypical variants, genotype, molecular epidemiological regularities