ГЕН АХМ1554, КОДИРУЮЩИЙ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИН, И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
AXM1554 GENE ENCODING DELTA-ENDOTOXIN AND METHODS FOR ITS APPLICATION

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США №62/241/220, поданной 14 октября 2015 года, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки в полном ее объеме.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Предусмотрены новые гены, которые кодируют пестицидные белки. Данные белки и последовательности нуклеиновой кислоты, которые их кодируют, применимы в получении пестицидных составов и в получении трансгенных растений, устойчивых к вредителям.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Bacillus thuringiensis представляет собой грамположительную спорообразующую почвенную бактерию, характеризующуюся способностью продуцировать кристаллические включения, которые особенно токсичны для определенных отрядов и видов насекомых, но безвредны для растений и других нецелевых организмов. По этой причине композиции, включающие в свой состав штаммы Bacillus thuringiensis или их инсектицидные белки, могут быть использованы в качестве экологически приемлемых инсектицидов для контроля сельскохозяйственных насекомых-вредителей или насекомых-переносчиков различных заболеваний человека или животных.
Кристаллические (Cry) белки (дельта-эндотоксины) Bacillus thuringiensis обладают мощной инсектицидной активностью против преимущественно чешуекрылых, полужесткокрылых, двукрылых и личинок жесткокрылых. Данные белки также продемонстрировали активность против отрядов вредителей Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga и Acari, а также других отрядов беспозвоночных, таких как Nemathelminthes, Platyhelminthes и Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.) Данные белки исходно классифицировали на CryI и CryV, основываясь главным образом на их инсектицидной активности. Основными классами были Lepidoptera-специфичные (I), Lepidoptera- и Diptera-специфичные (II), Coleoptera-специфичные (III), Diptera-специфичные (IV), а также специфичные к нематодам (V) и (VI). Дополнительно данные белки классифицировали на подсемейства; белкам с высокой степенью родства в каждом семействе присвоили классифицирующие буквы, такие как Cry1A, Cry1B, Cry1C, и т.д. Белкам с еще большей степенью родства в каждом классе были присвоены такие названия, как Cry1C1, Cry1C2 и т.д.
Номенклатура для генов Cry была описана на основе гомологии аминокислотных последовательностей, а не специфичности к целевому насекомому (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). В этой классификации каждому токсину присваивается уникальное название, включающее первичный ранг (арабская цифра), вторичный ранг (заглавная буква), третичный ранг (строчная буква) и четвертичный ранг (другая арабская цифра). В первичном ранге римские цифры были заменены на арабские цифры. Белки с менее чем 45% идентичностью последовательностей имеют разные первичные ранги, а критерии для вторичного и третичного рангов составляют 78% и 95% соответственно.
Кристаллический белок не проявляет инсектицидную активность до тех пор, пока он не будет поглощен и растворен в средней кишке насекомого. Поглощенный протоксин гидролизуется протеазами в пищеварительном тракте насекомого до активной токсической молекулы. ( and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Данный токсин связывается с апикальными рецепторами щеточной каемки в средней кишке целевых личинок и встраивается в апикальную мембрану, приводя к образованию ионных каналов или пор, что вызывает гибель личинок.
Дельта-эндотоксины обычно имеют пять консервативных доменов последовательности и три консервативных структурных домена (см., например, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). Первый консервативный структурный домен состоит из семи альфа-спиралей и вовлечен во встраивание в мембрану и образование пор. Домен II состоит из трех бета-листов, расположенных в конфигурации греческого ключа, а домен III состоит из двух антипараллельных бета-листов в форме «рулета с вареньем» (de Maagd et al., 2001, выше). Домены II и III вовлечены в распознавание и связывание рецепторов, и поэтому считаются детерминантами специфичности токсина.
Помимо дельта-эндотоксинов, существуют еще несколько известных классов пестицидных белков-токсинов. Токсины VIP1/VIP2 (см., например, патент США №5770696) представляют собой бинарные пестицидные токсины, которые проявляют высокую активность в отношении насекомых посредством механизма, в который, как полагают, вовлечен опосредованный рецепторами эндоцитоз с последующей клеточной токсификацией, аналогично механизму действия других бинарных токсинов («А/В»). Токсины А/В, такие как VIP, С2, CDT, CST, или вызывающий отек и летальный токсины В. anthracis первоначально взаимодействуют с целевыми клетками через специфическое опосредованное рецептором связывание компонентов «В» в виде мономеров. Эти мономеры затем образуют гомогептамеры. Затем гептамер-рецепторный комплекс «В» действует как платформа для стыковки, которая впоследствии связывает и обеспечивает транслокацию ферментного компонента (компонентов) «А» в цитозоль посредством опосредованного рецептором эндоцитоза. Только внутри цитозоля клетки компоненты «А» ингибируют нормальную функцию клеток, например, путем ADP-рибозилирования G-актина или увеличения внутриклеточных уровней циклического ADP (сАМР). См. Barth et al. (2004) Microbiol Mol Biol Rev 68:373-402.
Интенсивное применение инсектицидов на основе В. thuringiensis уже привело к возникновению устойчивости полевых популяций капустной моли Plutella xylostella (Ferre and Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533). Наиболее распространенным механизмом устойчивости является снижение связывания токсина с его специфическим рецептором (рецепторами) в средней кишке. Это может также способствовать возникновению перекрестной устойчивости к другим токсинам, которые имеют один и тот же рецептор (Ferre and Van Rie (2002)).
В связи с ущербом, который могут нанести насекомые, и с целью улучшения урожайности путем контроля насекомых-вредителей, существует постоянная потребность в поиске новых форм пестицидных токсинов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предусмотрены композиции и способы придания пестицидной активности бактериям, растениям, растительным клеткам, тканям и семенам. Композиции включают в себя молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие последовательности для пестицидных и инсектицидных полипептидов, векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, и клетки-хозяева, содержащие векторы. Композиции также включают в себя пестицидные полипептидные последовательности и антитела к этим полипептидам. Нуклеотидные последовательности могут быть использованы в конструкциях ДНК или кассетах экспрессии для трансформации и экспрессии в организмах, в том числе в микроорганизмах и растениях. Нуклеотидные или аминокислотные последовательности могут быть синтетическими последовательностями, которые были разработаны для экспрессии в организме, в том числе без ограничения в микроорганизме или растении. Композиции также содержат бактерии, растения, растительные клетки, ткани и семена, содержащие нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению.
В частности, предусмотрены выделенные или рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют пестицидный белок. Кроме того, охвачены аминокислотные последовательности, соответствующие пестицидному белку. В частности, в настоящем изобретении предусмотрена выделенная или рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:4-11, или нуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO:1-3, а также их биологически активные варианты и фрагменты. Также охвачены нуклеотидные последовательности, которые комплементарны нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению или которые гибридизуются с последовательностью по настоящему изобретению или ее комплементарной последовательностью. Также предусмотрены векторы, клетки-хозяева, растения и семена, содержащие нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению или нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности по настоящему изобретению, а также их биологически активные варианты и фрагменты.
Предусмотрены способы получения полипептидов по настоящему изобретению и применения данных полипептидов для контроля или уничтожения чешуекрылых, полужесткокрылых, жесткокрылых, нематод или двукрылых вредителей. Также рассмотрены способы и наборы для выявления нуклеиновых кислот и полипептидов по настоящему изобретению в образце.
Композиции и способы по настоящему изобретению применимы для получения организмов с повышенной устойчивостью или переносимостью в отношении вредителей. Данные организмы и композиции, содержащие организмы, являются востребованными для целей сельского хозяйства. Композиции по настоящему изобретению также применимы для создания измененных или улучшенных белков, которые характеризуются пестицидной активностью, или для выявления присутствия пестицидных белков или нуклеиновых кислот в продуктах или организмах.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении описаны композиции и способы регулирования устойчивости или переносимости в отношении вредителей в организмах, в частности в растениях или растительных клетках. Под «устойчивостью» подразумевают, что вредитель (например, насекомое) погибает при поглощении полипептидов по настоящему изобретению или другом контакте с ними. Под «переносимостью» подразумевают нарушение или снижение движения, кормления, размножения или других функций вредителя. Способы предусматривают трансформирование организмом с помощью нуклеотидной последовательностью, кодирующей пестицидный белок по настоящему изобретению. В частности, нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению применимы для получения растений и микроорганизмов, которые обладают пестицидной активностью. Таким образом, предусматриваются трансформированные бактерии, растения, растительные клетки, растительные ткани и семена. Композиции представляют собой пестицидные нуклеиновые кислоты и белки Bacillus или других видов. Последовательности находят применение в конструировании векторов экспрессии для последующей трансформации представляющих интерес организмов, в качестве зондов для выделения других гомологичных (или частично гомологичных) генов, и в создании измененных пестицидных белков посредством известных в данной области способов, таких как обмен доменов или шаффлинг в ДНК, например с представителями семейств эндотоксинов Cry1, Cry2 и Cry9. Белки находят применение в осуществлении контроля или уничтожения популяций вредителей, таких как чешуекрылые, полужесткокрылые, жесткокрылые, двукрылые и нематоды, а также для получения композиций с пестицидной активностью.
Под «пестицидным токсином» или «пестицидным белком» подразумевают токсин, который характеризуется токсической активностью против одного или нескольких вредителей, в том числе без ограничения представителей отряда Lepidoptera, Diptera и Coleoptera или типа Nematoda, или белок, который характеризуется гомологией с таким белком. Пестицидные белки были выделены из организмов, в том числе, например, Bacillus sp., Clostridium bifermentans и Paenibacillus popilliae. Пестицидные белки включают в себя аминокислотные последовательности, полученные из полноразмерных нуклеотидных последовательностей, раскрытых в данном документе, и аминокислотные последовательности, которые короче, чем полноразмерные последовательности, или вследствие использования альтернативного нижележащего сайта инициации, или вследствие обработки, в результате которой получают более короткий белок, характеризующийся пестицидной активностью. Обработка может происходить в организме, в котором белок экспрессируется, или во вредителе после поглощения белка.
Пестицидные белки охватывают дельта-эндотоксины. Дельта-эндотоксины включают в себя белки, идентифицированные как от cry1 до cry72, cyt1 и cyt2, а также Cyt-подобный токсин. В настоящее время существует более 250 известных видов дельта-эндотоксинов с широким спектром специфичностей и токсичностей. Для полного перечня см. Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, а в отношении регулярных обновлений см. Crickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature," на www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.
Таким образом, в данном документе предусмотрены новые выделенные или рекомбинантные нуклеотидные последовательности, которые придают пестицидную активность. Данные нуклеотидные последовательности кодируют полипептиды, характеризующиеся гомологией с известными дельта-эндотоксинами или бинарными токсинами. Также предусмотрены аминокислотные последовательности пестицидных белков. Белок, полученный в результате трансляции указанного гена, обеспечивает на клеточном уровне контроль или уничтожение вредителей, которые его поглощают.
Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, а также их варианты и фрагменты
Один аспект настоящего изобретения относится к выделенным или рекомбинантным молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие пестицидные белки и полипептиды или их биологически активные части, а также молекулы нуклеиновой кислоты, подходящие для применения в качестве зондов гибридизации для идентификации молекул нуклеиновых кислот, кодирующих белки с областями гомологии последовательности. В данном документе также охвачены нуклеотидные последовательности, способные к гибридизации с нуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению в жестких условиях, как определено данном документе в другой его части. Используемый в данном документе термин «молекула нуклеиновой кислоты» предназначен для обозначения молекул ДНК (например, рекомбинантной ДНК, кДНК или геномной ДНК) и молекул РНК (например, мРНК) и аналогов ДНК или РНК, созданных с применением нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть однонитевой или двухнитевой, но предпочтительно представляет собой двухнитевую ДНК. Термин «рекомбинантный» охватывает полинуклеотиды или полипептиды, которые были изменены относительно нативного полинуклеотида или полипептида таким образом, что полинуклеотид или полипептид отличается (например, химическим составом или структурой) от встречающегося в природе. В другом варианте осуществления «рекомбинантный» полинуклеотид не содержит внутренних последовательностей (то есть интронов), которые встречаются в природе в геномной ДНК организма, из которого получен полинуклеотид. Типичным примером такого полинуклеотида является так называемая комплементарная ДНК (кДНК).
Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота (или ДНК) используется в данном документе для обозначения нуклеиновой кислоты (или ДНК), которая больше не находится в ее природной среде, например, находится in vitro, или в рекомбинантной бактериальной клетке, или в растительной клетке-хозяин. В некоторых вариантах осуществления выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота не содержит последовательностей (предпочтительно последовательностей, кодирующих белок), которые в природе фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательности, расположенные на 5-' и 3'-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. Для целей настоящего изобретения термин «выделенная», если он используется для обозначения молекул нуклеиновой кислоты, исключает выделенные хромосомы. Например, в различных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая дельта-эндотоксин, может содержать менее приблизительно 5 т.о., 4 т.о., 3 т.о., 2 т.о., 1 т.о., 0,5 т.о. или 0,1 т.о. нуклеотидных последовательностей, которые в природе фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой получена нуклеиновая кислота. В различных вариантах осуществления дельта-эндотоксиновый белок, который практически не содержит клеточного материала, включает в себя препараты белка, имеющие менее приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (по сухой массе) белка, отличного от дельта-эндотоксина (также называемого в данном документе «контаминирующим белком»). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота по настоящему изобретению содержит одну или несколько нуклеотидных замен относительно SEQ ID NO:1 или ее вариант или фрагмент.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие белки по настоящему изобретению, включают в себя последовательность, изложенную в SEQ ID NO:1-3, а также ее варианты, фрагменты и комплементарные ей последовательности. Под «комплементарной последовательностью» подразумевают нуклеотидную последовательность, которая в достаточной степени комплементарна указанной нуклеотидной последовательности, так что она может гибридизоваться с указанной нуклеотидной последовательностью с образованием тем самым стабильного дуплекса. Соответствующие аминокислотные последовательности пестицидных белков, кодируемых данными нуклеотидными последовательностями, изложены в SEQ ID NO:4-11.
Молекулы нуклеиновой кислоты, которые представляют собой фрагменты данных нуклеотидных последовательностей, кодирующих пестицидные белки, также охвачены настоящим изобретением. Под «фрагментом» подразумевают часть нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок. Фрагмент нуклеотидной последовательности может кодировать биологически активную часть пестицидного белка, или может представлять собой фрагмент, который может использоваться в качестве гибридизационного зонда или праймера для ПЦР с применением способов, описанных ниже. Молекулы нуклеиновой кислоты, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок, содержат по меньшей мере приблизительно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 смежных нуклеотидов или не более количества нуклеотидов, присутствующих в полноразмерной нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок, раскрытый в данном документе, в зависимости от предполагаемого применения. Под «смежными» нуклеотидами подразумевают нуклеотидные остатки, которые непосредственно прилегают друг к другу. Фрагменты нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению будут кодировать фрагменты белка, которые сохраняют биологическую активность пестицидного белка и, следовательно, сохраняют пестицидную активность. Таким образом, биологически активные фрагменты полипептидов, описанные в данном документе, также охвачены настоящим изобретением. Выражение «сохраняет активность» подразумевает, что фрагмент будет характеризоваться по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 70%, 80%, 90%, 95% или больше от пестицидной активности пестицидного белка. В одном варианте осуществления пестицидная активность представляет собой активность в отношении жесткокрылых. В другом варианте осуществления пестицидная активность представляет собой активность в отношении чешуекрылых. В другом варианте осуществления пестицидная активность представляет собой активность в отношении нематод. В другом варианте осуществления пестицидная активность представляет собой активность в отношении двукрылых. В другом варианте осуществления пестицидная активность представляет собой активность в отношении полужесткокрылых. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны из уровня техники. См., например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США №5743477, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.
Фрагмент нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок, который кодирует биологически активную часть белка по настоящему изобретению, кодирует по меньшей мере примерно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 смежных аминокислот или не больше общего количества аминокислот, присутствующих в полноразмерном пестицидном белке по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления фрагмент представляет собой фрагмент, полученный путем протеолитического расщепления. Например, фрагмент, полученный путем протеолитического расщепления, может иметь N-концевое или С-концевое усечение из по меньшей мере приблизительно 100 аминокислот, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150 или приблизительно 160 аминокислот по сравнению с SEQ ID NO:4-11. В некоторых вариантах осуществления фрагменты, охваченные в данном документе, являются результатом удаления С-концевого домена кристаллизации, например, путем протеолиза или путем вставки стоп-кодона в кодирующую последовательность.
В различных вариантах осуществления нуклеиновая кислота по настоящему изобретению содержит вырожденную нуклеиновую кислоту из любой из SEQ ID NO:1-3, где указанная вырожденная нуклеотидная последовательность кодирует ту же самую аминокислотную последовательность, как и любая из SEQ ID NO:4-11.
Предпочтительные пестицидные белки по настоящему изобретению кодируются нуклеотидной последовательностью, которая в достаточной степени идентична нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO:1-3, или пестицидные белки, которые в достаточной степени идентичны аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO:4-11 Под «в достаточной степени идентичным» подразумевают аминокислотную или нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 60% или 65% идентичностью последовательности, приблизительно 70% или 75% идентичностью последовательности, приблизительно 80% или 85% идентичностью последовательности, приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью последовательности по сравнению с эталонной последовательностью при использовании одной из программ выравнивания, описанных в данном документе, с использованием стандартных параметров. Специалисту в данной области будет понятно, что эти значения могут быть соответствующим образом скорректированы для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, с учетом вырожденности кодонов, подобия аминокислот, места расположения рамки считывания и т.п.
Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения. Процент идентичности между этими двумя последовательностями представляет собой показатель количества идентичных положений, общих для последовательностей (то есть, процент идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающихся положений) × 100). В одном варианте осуществления две последовательности имеют одинаковую длину. В другом варианте осуществления процентную идентичность вычисляют по всей эталонной последовательности (то есть последовательности, раскрытой в данном документе как любая из SEQ ID NO:1-11). Процент идентичности между двумя последовательностями может быть определен с использованием методик, аналогичных описанным ниже, с введением гэпов или без введения гэпов. Как правило, при вычислении процентной идентичности подсчитывают точные соответствия. Гэп, т.е. положение в выравнивании, в котором остаток присутствует в одной последовательности, но отсутствует в другой, рассматривают как положение с неидентичными остатками.
Определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием математического алгоритма. Неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм согласно публикации Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, модифицированный как описано в Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Такой алгоритм внедрен в программы BLASTN и BLASTX Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Поиск нуклеотидов BLAST может быть выполнен с помощью программы BLASTN, балл = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных пестицидоподобным молекулам нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Поиск нуклеотидов BLAST может быть выполнен с помощью программы BLASTX, балл = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных пестицидоподобным молекулам белка по настоящему изобретению. Для получения выравнивания с введением гэпов для целей сравнения можно использовать Gapped BLAST (в BLAST 2.0), как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Альтернативно для выполнения повторного поиска можно использовать PSI-Blast, который выявляет отдаленные взаимосвязи между молекулами. См. Altschul et al. (1997) выше. При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast могут быть задействованы стандартные параметры соответствующих программ (например, BLASTX и BLASTN). Выравнивание также может выполняться вручную путем подбора.
Другим неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). С помощью ClustalW сравнивают последовательности и выравнивают всю последовательность аминокислот или ДНК, и таким образом могут быть получены данные о консервативности последовательности всей аминокислотной последовательности. Алгоритм ClustalW используют в нескольких коммерчески доступных пакетах программного обеспечения для анализа ДНК/аминокислот, таких как модуль ALIGNX в программном пакете Vector NTI (Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния). После выравнивания аминокислотных последовательностей при помощи ClustalW можно провести оценку процента идентичности аминокислот. Неограничивающим примером программного обеспечения, применимого для анализа выравниваний ClustalW, является GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) позволяет оценивать подобие и идентичность аминокислот (или ДНК) между несколькими белками. Другим неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм согласно публикации Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Такой алгоритм встроен в программу ALIGN (версия 2.0), которая входит в пакет программного обеспечения GCG Wisconsin Genetics, версия 10 (доступна от Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., Сан-Диего, Калифорния, США). При использовании программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей может быть использована таблица весов замен остатков РАМ 120, штраф за продление гэпа 12 и штраф за введение гэпа 4.
Если не указано иное, GAP версии 10, в которой используется алгоритм согласно публикации Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, будет использоваться для определения идентичности или подобия последовательности с использованием следующих параметров: % идентичности и % сходства для нуклеотидной последовательности с использованием штрафа за открытие гэпа 50 и удлинение гэпа 3 и матрицы замен nwsgapДНК.cmp; % идентичности или % сходства для аминокислотной последовательности с использованием штрафа за открытие гэпа 8 и удлинение гэпа 2 и оценочной программой BLOSUM62. Также могут быть использованы эквивалентные программы. Под «эквивалентной программой» подразумевают любую программу для сравнения последовательностей, с помощью которой для любых двух последовательностей получают выравнивание, имеющее идентичные совпадения нуклеотидных остатков и идентичный процент идентичности последовательности по сравнению с соответствующим выравниванием, полученным с помощью GAP версии 10.
Настоящее изобретение также охватывает вариантные молекул нуклеиновой кислоты. «Варианты» нуклеотидных последовательностей, кодирующих пестицидные белки, включают в себя последовательности, которые кодируют пестицидные белки, описанные в данном документе, но которые отличаются консервативно из-за вырожденности генетического кода, а также из-за того, что они в достаточной степени идентичны, как обсуждалось выше. Встречающиеся в природе аллельные варианты можно идентифицировать с использованием хорошо известных методик молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методик гибридизации, как описано ниже. Вариантные нуклеотидные последовательности также включают в себя синтетически полученные нуклеотидные последовательности, которые были получены, например, с использованием сайт-направленного мутагенеза, но которые также кодируют пестицидные белки, раскрытые в настоящем изобретении, как обсуждается ниже. Вариантные белки, охваченные настоящим изобретением, являются биологически активными, то есть они продолжают обладать требуемой биологической активностью нативного белка, а именно пестицидной активностью. Под выражением «сохраняет активность» подразумевается, что вариант будет характеризоваться по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 70% или по меньшей мере приблизительно 80% пестицидной активностью нативного белка. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны из уровня техники. См., например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США №5743477, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.
Специалист в данной области также будет понимать, что изменения могут быть введены путем проведения мутации нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению, что тем самым приводит к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемых пестицидных белков без изменения биологической активности белков. Таким образом, вариантные выделенные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть созданы путем введения одной или нескольких нуклеотидных замен, присоединений или делеций в соответствующую нуклеотидную последовательность, раскрытую в данном документе, таким образом, что одно или несколько из аминокислотных замен, присоединений или делеций вводятся в кодируемый белок. Мутации могут быть введены с помощью стандартных методик, таких как сайт-направленный мутагенез и опосредованный ПЦР мутагенез. Такие вариантные нуклеотидные последовательности также охвачены настоящим изобретением.
Например, консервативные аминокислотные замены могут быть проведены в пределах одного или нескольких прогнозированных несущественных аминокислотных остатков. «Несущественный» аминокислотный остаток представляет собой остаток, который может быть изменен в последовательности дикого типа пестицидного белка без изменения биологической активности, тогда как «существенный» аминокислотный остаток требуется для биологической активности. «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой такую замену, в которой аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком, имеющим подобную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков с подобными боковыми цепями были определены в данной области. Данные семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).
Дельта-эндотоксины обычно имеют пять консервативных доменов последовательности и три консервативных структурных домена (см., например, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). Первый консервативный структурный домен состоит из семи альфа-спиралей и вовлечен во встраивание в мембрану и образование пор. Домен II состоит из трех бета-листов, расположенных в конфигурации греческого ключа, а домен III состоит из двух антипараллельных бета-листов в форме «рулета с вареньем» (de Maagd et al., 2001, выше). Домены II и III вовлечены в распознавание и связывание рецепторов, и поэтому считаются детерминантами специфичности токсина.
Аминокислотные замены могут быть выполнены в неконсервативных участках, которые сохраняют функцию. Как правило, такие замены не проводят по консервативным аминокислотным остаткам или по аминокислотным остаткам, находящимся в консервативном мотиве, где такие остатки являются существенными для активности белка. Примеры остатков, которые являются консервативными и которые могут быть существенными для активности белка, включают, например, остатки, которые идентичны у всех белков, приведенных в выравнивании подобных или родственных токсинов, с последовательностями по настоящему изобретению (например, остатки, которые идентичны в выравнивании гомологичных белков). Примеры остатков, которые являются консервативными, но в которых могут допускаться консервативные аминокислотные замены при сохранении активности, включают в себя, например, остатки, которые имеют только консервативные замены между всеми белками, приведенными в выравнивании подобных или родственных токсинов, с последовательностями по настоящему изобретению (например, остатки, которые имеют только консервативные замены между всеми белками, входящими в состав выравненных гомологичных белков). Однако специалист в данной области понимает, что функциональные варианты могут иметь незначительные консервативные или неконсервативные изменения в консервативных остатках.
Альтернативно вариантные нуклеотидные последовательности могут быть получены путем введения мутаций случайным образом по всей длине или части кодирующей последовательности, например, путем насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты могут быть подвергнуты проверке относительно способности придавать пестицидную активность с целью идентификации мутантов, сохраняющих активность. После мутагенеза кодируемый белок может быть экспрессирован рекомбинантно, и активность белка может быть определена с использованием стандартных методик анализа.
С помощью способов, таких как ПЦР, гибридизация и т.п., могут быть идентифицированы соответствующие пестицидные последовательности, причем такие последовательности характеризуются значительной идентичностью с последовательностями по настоящему изобретению (например, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, 80%, 85% 90%, 95% или более идентичностью последовательности во всей соответствующей последовательности) и характеризуются пестицидной активностью или придают таковую. См., например, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) and Innis, et al (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).
32
В способе гибридизации всю или часть пестицидной нуклеотидной последовательности можно использовать для скрининга кДНК или геномных библиотек. Способы конструирования таких кДНК и геномных библиотек обычно известны в данной области и раскрыты в Sambrook and Russell, 2001 выше. Так называемые гибридизационные зонды могут представлять собой геномные фрагменты ДНК, фрагменты кДНК, фрагменты РНК или другие олигонуклеотиды, при этом они могут быть мечены детектируемой группой, такой как Р, или любым другим детектируемым маркером, таким как другие радиоизотопы, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. Зонды для гибридизации могут быть получены путем мечения синтетических олигонуклеотидов на основе известной кодирующей пестицидный белок нуклеотидной последовательности, раскрытой в данном документе. Дополнительно могут быть использованы вырожденные праймеры, разработанные на основе консервативных нуклеотидов или аминокислотных остатков в нуклеотидной последовательности или кодируемой аминокислотной последовательности. Зонд обычно содержит участок нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с по меньшей мере приблизительно 12, по меньшей мере приблизительно 25, по меньшей мере приблизительно 50, 75, 100, 125, 150, 175 или 200 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок по настоящему изобретению или его фрагмент или вариант. Способы получения зондов для гибридизации в общем известны в данной области и раскрыты в Sambrook and Russell, 2001 выше, включенной в данный документ посредством ссылки.
Например, полная пестицидная последовательность, раскрытая в данном документе, или одна или несколько ее частей, может быть использована в качестве зонда, способного специфически гибридизоваться с соответствующими последовательностями белка, подобного пестицидным, и информационными РНК. Для достижения специфической гибридизации в различных условиях такие зонды включают в себя последовательности, которые являются уникальными и предпочтительно имеют длину из по меньшей мере приблизительно 10 нуклеотидов или по меньшей мере приблизительно 20 нуклеотидов. Такие зонды могут быть использованы для амплификации соответствующих пестицидных последовательностей из выбранного организма или образца с помощью ПЦР. Данная методика может быть использована для выделения дополнительных кодирующих последовательностей из требуемого организма или в качестве диагностического анализа для определения присутствия кодирующих последовательностей в организме. Методики гибридизации включают скрининг гибридизационный скрининг высеянных на чашки библиотек ДНК (либо бляшек, либо колоний, см., например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
Таким образом, в настоящем изобретении охвачены зонды для гибридизации, а также нуклеотидные последовательности, способные гибридизоваться со всей или частью нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению (например, по меньшей мере с приблизительно 300 нуклеотидами, по меньшей мере приблизительно 400, по меньшей мере приблизительно 500, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 или не более чем полноразмерной нуклеотидной последовательностью, раскрытой в данном документе). Гибридизация таких последовательностей может быть проведена в жестких условиях. Под «жесткими условиями» или «жесткими условиями гибридизации» подразумевают условия, при которых зонд будет гибридизоваться с его целевой последовательностью в большей для выявления степени, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере в 2 раза по сравнению с фоном). Жесткие условия зависят от последовательности и будут отличаться при различных обстоятельствах. Контролируя жесткость условий гибридизации и/или условий промывки, можно идентифицировать целевые последовательности, которые на 100% комплементарны зонду (гомологичное зондирование). Альтернативно жесткость условий может быть скорректирована с обеспечением некоторого несоответствия в последовательностях с целью обнаружения более низких степеней подобия (гетерологичное зондирование). Как правило, зонд имеет менее приблизительно 1000 нуклеотидов, предпочтительно менее 500 нуклеотидов в длину.
Как правило, жесткими условиями будут те, при которых концентрация соли составляет менее приблизительно 1,5 М ионов Na, как правило приблизительно 0,01-1,0 М концентрация ионов Na (или других солей) при рН 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°C для коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°C для длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты путем добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. Типичные условия низкой жесткости подразумевают гибридизацию с буферным раствором, содержащим от 30 до 35% формамида, 1 М NaCl, 1% SDS (додецилсульфат натрия), при 37°C и промывку в 1X-2Х SSC (20Х SSC = 3,0 М NaCl/0,3 М тринатрий цитрата) при температуре от 50 до 55°C. Типичные условия умеренной жесткости подразумевают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0 М NaCl, 1% SDS при 37°C и промывку в 0,5Х-1X SSC при температуре от 55 до 60°C. Типичные условия высокой жесткости подразумевают гибридизацию в 50% формамиде, 1 М NaCl, 1% SDS при 37°C и промывку в 0,1X SSC при температуре от 60 до 65°C. Необязательно промывочные буферы могут содержать от приблизительно 0,1% до приблизительно 1% SDS. Продолжительность гибридизации обычно составляет менее приблизительно 24 часов, как правило, от приблизительно 4 до приблизительно 12 часов.
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
Как правило, специфичность является ключевым моментом пост-гибридизационных промывок, критическими факторами которых являются ионная сила и температура конечного промывочного раствора. Для гибридов ДНК-ДНК T можно примерно вывести из уравнения Meinkoth-Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: T=81,5°C+16,6(log M)+0,41(%GC)-0,61(% форм.)-500/L; где M представляет собой молярность моновалентных катионов, % GC представляет собой процентное содержание гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % форм. представляет собой процентное содержание формамида в гибридизационном растворе, a L - это длина гибрида в парах оснований. T представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% комплементарной целевой последовательности гибридизуется с идеально совпадающим зондом. T снижается приблизительно на 1°C для каждого 1% несоответствия; таким образом, T, гибридизацию и/или условия промывки можно корректировать для гибридизации с последовательностями требуемой идентичности. Например, если желательны последовательности с ≥90% идентичностью, то T можно уменьшить на 10°C. Как правило, жесткие условия выбирают так, чтобы они были на приблизительно 5°C ниже температуры точки плавления (T) для конкретной последовательности и ее комплементарной последовательности при определенной ионной силе и рН. Однако в условиях строгой жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 1, 2, 3 или 4°C ниже температуры точки плавления (T); при условиях умеренной жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 6, 7, 8, 9 или 10°C ниже термической точки плавления (T); в условиях низкой жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 11, 12, 13, 14, 15 или 20°C ниже термической точки плавления (T). Специалисту обычной квалификации будет понятно, что с использованием уравнения, композиций для гибридизации и промывки и требуемой T, по сути, описывают варианты жесткости гибридизационных и/или промывочных растворов. Если требуемая степень несовпадений приводит к T менее 45°C (водный раствор) или 32°C (раствор формамида), предпочтительно повысить концентрацию SSC таким образом, что можно использовать более высокую температуру. Исчерпывающее руководство по гибридизации нуклеиновых кислот представлено в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); и Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Смотри Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
Выделенные белки, а также их варианты и фрагменты
Пестицидные белки также охвачены настоящим изобретением. Под термином «пестицидный белок» подразумевают белок, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO:4-11. Также предусмотрены и могут быть использованы для осуществления способов по настоящему изобретению фрагменты, биологически активные части и их варианты. Термин «выделенный белок» или «рекомбинантный белок» используют для обозначения белка, который больше не находится в его естественной среде, например находится in vitro или в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-хозяин. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок представляет собой вариант SEQ ID NO: 2-5, где вариант содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, делецию или вставку по сравнению с SEQ ID NO:2-5.
«Фрагменты» или «биологически активные части» включают полипептидные фрагменты, содержащие аминокислотные последовательности, которые в достаточной степени идентичны аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO:4-11, и которые проявляют пестицидную активность. Биологически активная часть пестицидного белка может представлять собой полипептид, который содержит, например, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 или больше аминокислот в длину. Такие биологически активные части могут быть получены с помощью рекомбинантных методик и оценены в отношении пестицидной активности. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны из уровня техники. См., например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США №5743477, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Используемый в данном изобретении фрагмент содержит по меньшей мере 8 смежных аминокислот из SEQ ID NO:4-11. Однако настоящее изобретение охватывает и другие фрагменты, такие как любой фрагмент в белке длиной более приблизительно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 или больше аминокислот.
Под «вариантами» подразумевают белки или полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 60, 65, 70, 75, 80, 85, %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности из любой из SEQ ID NO:4-11. Варианты также включают полипептиды, кодируемые молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1-3 или комплементарной ей последовательностью в жестких условиях. Варианты включают полипептиды, которые отличаются аминокислотной последовательностью вследствие мутагенеза. Вариантные белки, охваченные настоящим изобретением, являются биологически активными, то есть они продолжают обладать требуемой биологической активностью нативного белка, то есть сохраняют пестицидную активность. В некоторых вариантах осуществления варианты характеризуются улучшенной активностью по сравнению с нативным белком. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны из уровня техники. См., например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США №5743477, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.
Бактериальные гены, такие как гены axmi по настоящему изобретению, зачастую содержат множественные инициирующие кодоны метионина в непосредственной близости от начала открытой рамки считывания. Часто инициация трансляции в одном или нескольких из данных стартовых кодонов приводит к получению функционального белка. Эти стартовые кодоны могут включать в себя кодоны ATG. Однако такие бактерии, как Bacillus sp., также распознают кодон GTG как стартовый кодон, а белки, которые инициируют трансляцию на кодонах GTG, содержат метионин в первой аминокислоте. В редких случаях трансляция в бактериальных системах может инициироваться на кодоне TTG, хотя в этом случае TTG кодирует метионин. Кроме того, не часто определяется априори, какой из этих кодонов в природных условиях используется в бактерии. Таким образом, понятно, что использование одного из альтернативных кодонов метионина может также приводить к получению пестицидных белков. Данные пестицидные белки охвачены настоящим изобретением и могут быть использованы в способах по настоящему изобретению. Понятно, что при экспрессии в растениях для правильной трансляции будет необходимым заменить альтернативный стартовый кодон на ATG.
В различных вариантах осуществления настоящего изобретения пестицидные белки включают в себя аминокислотные последовательности, полученные из полноразмерных нуклеотидных последовательностей, раскрытых в данном документе, и аминокислотные последовательности, которые короче полноразмерных последовательностей вследствие использования альтернативного нижележащего сайта инициации. Таким образом, нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению и/или векторы, клетки-хозяева и растения, содержащие нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению (и способы получения и использования нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению), могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:5-11.
Антитела к полипептидам по настоящему изобретению или к их вариантам или фрагментам также охвачены настоящим изобретением. Способы получения антител хорошо известны из уровня техники (см., например, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк; патент США №4196265).
Таким образом, один аспект изобретения касается антител, одноцепочечных антигенсвязывающих молекул или других белков, которые специфично связываются с одной или несколькими молекулами белка или пептида по настоящему изобретению и их гомологами, слитыми белками или фрагментами. В особенно предпочтительном варианте осуществления антитело специфично связывается с белком, имеющим аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO:4-11, или его фрагментом. В другом варианте осуществления антитело специфически связывается с белком слияния, содержащим аминокислотную последовательностью, выбранную из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO:4-11, или его фрагментом. В различных вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с белком по настоящему изобретению или слитым белком, содержащим белок по настоящему изобретению, является не встречающимся в природе антителом.
Антитела по настоящему изобретению могут использоваться для количественного или качественного определения молекул белка или пептида по настоящему изобретению или для определения посттрансляционных модификаций белков. Считается, что используемые в данном документе антитело или пептид «специфически связываются» с молекулой белка или пептида по настоящему изобретению, если такое связывание конкурентно не ингибируется за счет присутствия несвязанных молекул.
Антитела по настоящему изобретению могут входить в состав набора, применимого для выявления молекул белка или пептида по настоящему изобретению. В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен способ выявления молекулы белка или пептида по настоящему изобретению (в частности, белка, кодируемого аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ IDNO:4-11, в том числе их вариантов или фрагментов, которые способны специфически связываться с антителом по настоящему изобретению), предусматривающий приведение в контакт образца с антителом по настоящему изобретению и определение того, содержит ли образец молекулу белка или пептида по настоящему изобретению. Способы применения антител для выявления представляющих интерес белка или пептида известны в данной области.
Измененные или улучшенные варианты
Известно, что последовательности ДНК пестицидного белка могут быть изменены с помощью различных способов и результатом этих изменений могут быть последовательности ДНК, которые кодируют белки с помощью аминокислотных последовательностей, отличающихся от тех, которые кодируют пестицидный белок по настоящему изобретению. Данный белок может быть изменен различными способами, в том числе с помощью аминокислотных замен, делеций, усечений и вставок одной или нескольких аминокислот из SEQ ID NO:4-11, в том числе до приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 65, приблизительно 70, приблизительно 75, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 105, приблизительно 110, приблизительно 115, приблизительно 120, приблизительно 125, приблизительно 130, приблизительно 135, приблизительно 140, приблизительно 145, приблизительно 150, приблизительно 155 или больше аминокислотных замен, делеций или вставок. Способы таких манипуляций в целом известны в данной области. Например, варианты аминокислотной последовательности пестицидного белка могут быть получены путем осуществления мутаций в ДНК. Этого также можно достичь посредством одной из нескольких форм мутагенеза и/или направленной эволюции. В некоторых аспектах изменения, закодированные в аминокислотной последовательности, не будут существенно влиять на функцию белка. Такие варианты будут обладать требуемой пестицидной активностью Однако понятно, что посредством применения таких методик в композициях по настоящему изобретению способность пестицидного белка придавать пестицидную активность может быть улучшена. Например, можно экспрессировать пестицидный белок в клетках-хозяевах, которые проявляют высокие уровни ошибочного встраивания основания в ходе репликации ДНК, как, например, XL-1 Red (Stratagene, Ла-Холья, Калифорния). После размножения в таких штаммах можно выделить ДНК (например, путем получения плазмидной ДНК или путем амплификации посредством ПЦР и клонирования полученного фрагмента ПЦР в вектор), культивировать пестицидный белок с мутациями в не мутагенном штамме, и идентифицировать подвергнутые мутации гены с пестицидной активностью, например путем проведения анализа с проверкой пестицидной активности. Как правило, белок смешивают и используют в анализах со скармливанием. См., например Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Такие анализы могут включать приведение в контакт растений с одним или несколькими вредителями и определение способности растения выживать и/или вызывать гибель вредителей. Примеры мутаций, которые приводят к повышенной токсичности, можно найти в Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.
Альтернативно изменения могут быть осуществлены в последовательность многих белков на амино- или карбоксильном конце без существенного влияния на активность. Они могут включать вставки, делеций или изменения, вводимые с помощью современных молекулярных способов, таких как ПЦР, в том числе ПЦР-амплификации, с помощью которых изменяют или расширяют последовательность, кодирующую белок, за счет включения аминокислотных кодирующих последовательностей в олигонуклеотидах, используемых в ПЦР-амплификации. Альтернативно добавленные белковые последовательности могут включать в себя целые белок-кодирующие последовательности, такие как те, которые обычно используют в данной области для получения слитых белков. Такие слитые белки часто используют для (1) повышения экспрессии представляющего интерес белка, (2) введения связывающего домена, придания ферментативной активности введения или эпитопа для облегчения или очистки белка, выявления белка, или других экспериментальных применений, известных в данной области, (3) нацеливание на секрецию или трансляцию белка в субклеточных органеллах, таких как периплазматическое пространство грамотрицательных бактерий или эндоплазматический ретикулум эукариотических клеток, причем из которых последнее часто приводит к гликозилированию белка.
Вариантные нуклеотидные и аминокислотные последовательности по настоящему изобретению также охватывают последовательности, полученные в результате мутагенных процедур и процедур, приводящих к рекомбинации, таких как шаффлинг в ДНК. При такой процедуре можно использовать один или несколько различных участков, кодирующих пестицидный белок, для создания нового пестицидного белка, характеризующегося требуемым свойствами. Таким образом, библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов получают из популяции родственных последовательностей полинуклеотидов, содержащих участки последовательности, которые характеризуются существенной идентичностью последовательности и могут быть подвергнуты гомологичной рекомбинации in vitro или in vivo. Например, при использовании данного подхода, последовательности мотивов, кодирующих представляющий интерес домен, могут быть подвергнуты шаффлингу между пестицидным геном по настоящему изобретению и другими известными пестицидными генами для получения нового гена, кодирующего белок с улучшенным свойством, представляющим интерес, например повышенной инсектицидной активностью. Стратегии для такой перестановки в ДНК известны из уровня техники. См., например, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; и патент США №№5605793 и 5837458.
Обмен доменами или перестановка доменов является еще одним механизмом получения измененных пестицидных белков. Можно осуществлять обмен доменов между пестицидными белками, что приводит к получению гибридных или химерных токсинов с улучшенной пестицидной активностью или другим спектром целевых свойств. Способы получения рекомбинантных белков и их проверка в отношении пестицидной активности хорошо известны в данной области (см., например, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990; J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).
В еще одном варианте осуществления вариантные нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности могут быть получены с использованием одного или нескольких из допускающей ошибки ПЦР, олигонуклеотид-направленного мутагенеза, сборочной ПЦР, мутагенеза с помощью ПЦР с имитацией полового размножения, мутагенеза in vivo, кассетного мутагенеза, рекурсивного множественного мутагенеза, экспоненциального множественного мутагенеза, сайт-специфического мутагенеза, генной перестройки, сайт-насыщающего мутагенеза в гене, пермутационного мутагенеза, искусственной перестройки с лигированием (SLR), рекомбинации, рекурсивной рекомбинации последовательности, мутагенеза с модифицированной фосфоротиоатом ДНК, мутагенеза с урацилсодержащей матрицей, дуплексного мутагенеза с разрывами, мутагенеза с точечной репарацией ошибок спаривания, мутагенеза с дефицитом репарации у штамма-хозяина, химического мутагенеза, радиоактивного мутагенеза, делеционного мутагенеза, мутагенеза с рестрикцией-селекцией, мутагенеза с рестрикцией-очисткой, синтеза искусственного гена, множественного мутагенеза, создания мультимерных химерных нуклеиновых кислот и им подобных.
Векторы
Пестицидная последовательность по настоящему изобретению может быть предусмотрена в кассете экспрессии для экспрессии в представляющей интерес клетке-хозяине, например, растительной клетке или микроорганизме. Под «кассетой экспрессии для растения» подразумевают конструкцию ДНК, которая способна приводить к экспрессии белка из открытой рамки считывания в растительной клетке. Как правило, она содержит промотор и кодирующую последовательность. Часто такие конструкции также содержат 3'-нетранслируемый участок. Такие конструкции могут содержать «сигнальную последовательность» или «лидерную последовательность» для облегчения котрансляционного или посттрансляционного транспорта пептида в определенные внутриклеточные структуры, такие как хлоропласт (или другие пластиды), эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи.
Под «сигнальной последовательностью» подразумевают последовательность, которая как известно или предположительно приводит к котрансляционному или посттрансляционному переносу пептида через клеточную мембрану. У эукариот это обычно подразумевает секрецию в аппарат Гольджи с некоторым гликозилированием в результате. Инсектицидные токсины бактерий часто синтезируются в виде протоксинов, которые протеолитически активируются в кишечнике целевого вредителя (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сигнальная последовательность расположена в нативной последовательности или может быть получена из последовательности по настоящему изобретению. Под «лидерной последовательностью» подразумевают любую последовательность, которая в ходе трансляции приводит к образованию аминокислотной последовательности, достаточной для инициирования котрансляционного транспорта пептидной цепи в субклеточную органеллу. Таким образом, она включает в себя лидерные последовательности, нацеливающиеся на перенос и/или гликозилирование путем поступления в эндоплазматический ретикулум, поступления в вакуоли, пластиды, в том числе хлоропласты, митохондрии и им подобные. Таким образом, в данном документе также предусмотрен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по настоящему изобретению, которая функционально связана с гетерологичной лидерной или сигнальной последовательностью.
Под «вектором для трансформации растения» подразумевают молекулу ДНК, которая необходима для эффективной трансформации растительной клетки. Такая молекула может состоять из одной или нескольких кассет экспрессии для растений и может быть организована в более чем одну «векторную» молекулу ДНК. Например, бинарные векторы представляют собой векторы для трансформации растений, в которых используют два несмежных ДНК-вектора для кодирования всех необходимых цис- и транс-действующих функций для трансформации растительных клеток (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). «Вектор» относится к конструкции нуклеиновой кислоты, предназначенной для переноса между различными клетками-хозяевами. «Вектор экспрессии» относится к вектору, который характеризуется способностью встраивать, интегрировать и экспрессировать гетерологичные последовательности ДНК или фрагменты в чужеродной клетке. Кассета будет содержать 5'- и/или 3'-регуляторные последовательности, функционально связанные с последовательностью по настоящему изобретения. Под «функционально связанным» подразумевают функциональную связь между промотором и второй последовательностью, в которой промоторная последовательность инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. Как правило, функционально связанные означает, что последовательности нуклеиновых кислот, будучи связанными, являются смежными и, если это необходимо, соединены с двумя кодирующими белок участками, смежными в одной и той же рамке считывания. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность функционально связана с гетерологичным промотором, способным управлять экспрессией указанной нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине, такой как микробная клетка-хозяин или растительная клетка-хозяин. Кассета может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный ген, которым должен быть контрасформирован организм. Альтернативно дополнительный ген (гены) может быть предусмотрен в нескольких кассетах экспрессии.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению функционально связана с гетерологичным промотором, способным к управлению экспрессией указанной нуклеотидной последовательности в клетке, например в микробной клетке-хозяине или растительной клетке-хозяине. «Промотор» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая осуществляет функцию для управления транскрипцией нижележащей кодирующей последовательности. Промотор вместе с другими последовательностями нуклеиновой кислоты, регулирующими транскрипцию и трансляцию (также называемыми «контрольными последовательностями»), необходим для экспрессии представляющей интерес последовательности ДНК.
Такая кассета экспрессии предусматривается со множеством сайтов рестрикции для встраивания пестицидной последовательности для того, чтоб находиться под контролем транскрипции регуляторными участками.
Кассета экспрессии будет включать в себя в направлении транскрипции 5'-3', участок инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), последовательность ДНК по настоящему изобретению и участок терминации трансляции и транскрипции (т.е. терминирующий участок), которые являются функциональными в растении. Промотор по отношению к растению-хозяину и/или последовательности ДНК по настоящему изобретению может быть нативным, или аналогичным, или чужеродным, или гетерологичным. Кроме того, промотор может быть природной последовательностью или альтернативно синтетической последовательностью. Если промотор является «нативным» или «гомологичным» по отношению к растению-хозяин, предполагают, что промотор находится в нативном растении, в которое вводят промотор. Когда промотор является «чужеродным» или «гетерологичным» по отношению к последовательности ДНК по настоящему изобретению, предполагают, что промотор не является нативным или встречающимся в природе промотором для функционально связанной последовательности ДНК по настоящему изобретению. Промотор может быть индуцируемым или конститутивным. Он может быть встречающимся в природе, может состоять из частей различных встречающихся в природе промоторов или может быть частично или полностью синтетическим. Руководство для конструирования промоторов представлено в исследованиях структуры промотора, в таких как Harley and Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15:2343-2361. Кроме того, расположение промотора относительно начала транскрипции может быть оптимизировано. См., например, Roberts et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:760-764. Многие подходящие для применения в растениях промоторы хорошо известны в данной области.
Например, подходящие для использования в растениях конститутивные промоторы включают: промоторы из вирусов растений, такие как промотор каулимовируса хлоротической полосатости арахиса (PClSV) (патент США №5850019); 35S промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV) (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); промоторы генов метилтрансферазы вируса хлореллы (патент США №5563328) полноразмерный транскрипционный промотор вируса мозаики листьев инжира (FMV) (патент США №5378619); промоторы таких генов, как ген актина риса (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171 и патент США №5641876); ген убиквитина (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 and Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730 и патент США №5510474); ген гистона Н3 маиса (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-285 и Atanassova et al. (1992) Plant J. 2(3):291-300); ALS3 Brassica napus (заявка PCT WO 97/41228); ген малой субъединицы рибулозо-бискарбоксилазы/оксигеназы растений (RuBisCO); цирковируса (AU 689 311) или вируса мозаики прожилок листа кассавы (CsVMV, патент США №7053205); и промоторы различных генов Agrobacterium (см. патент США №№4771002; 5102796; 5182200 и 5428147).
Подходящие для применения в растениях индуцируемые промоторы включают: промотор из системы АСЕ1, которая контролируется медью (Mett et al. (1993) PNAS 90:4567-4571); промотор гена In2 маиса, который контролируется бензолсульфонамидными антидотами гербицидов (Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 and Gate et al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38); и промотор репрессора Tet из Tn10 (Gate et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Другим индуцируемым промотором для применения в растениях является промотор, который реагирует на индуцирующее средство, на которое обычно в растении отсутствует соответствующая реакция. Иллюстративным индуцируемым промотором данного типа является индуцируемый промотор из гена стероидного гормона, транскрипционная активность которого индуцируется глюкокортикостероидным гормоном (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421), или недавняя заявка о химерном активаторе транскрипции, XVE, для применения в индуцируемой растительной системе экспрессии на основе эстрогенового рецептора, активируемой эстрадиолом (Zuo et al. (2000) Plant J., 24:265-273). Другие индуцируемые промоторы для применения в растениях описаны в патентных документах ЕР 332104, PCT WO 93/21334 и PCT WO 97/06269, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Также могут быть использованы промоторы, состоящие из частей других промоторов, а также частично или полностью синтетические промоторы. См., например, Ni et al. (1995) Plant J. 7:661-676 и PCT WO 95/14098, в кототорых описаны такие промоторы для применения в растениях.
В одном варианте осуществления по настоящему изобретению для экспрессии пестицидных белков по настоящему изобретению может быть использована последовательность промотора, специфичная для конкретных участков или тканей растений, например промоторы, специфичные для семян (Datla, R. et al., 1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296), в частности промотор напина (ЕР 255378 A1), промотор фазеолина, промотор глютенина, промотор гелиантинина (WO 92/17580), промотор альбумина (WO 98/45460), промотор олеозина (WO 98/45461), промотор SAT1 или промотор SAT3 (PCT/US 98/06978).
Можно также использовать индуцируемый промотор, преимущественно выбранный из промотора фенилаланин-аммиачной лиазы (PAL), HMG-CoA-редуктазы (HMG), хитиназы, глюканазы, ингибитора протеиназы (PI), семейства генов PR1, промоторов нопалинсинтазы (nos) и vspB (патент США №5670349, таблица 3), промотора HMG2 (патент США №5670349), промотора яблочной бета-галактозидазы (ABG1) и промотора яблочной аминоциклопропанкарбоксилатсинтазы (АСС-синтазы) (WO 98/45445). В конструкциях по настоящему изобретению могут быть использованы несколько промоторов, в том числе последовательно.
Промотор может содержать или может быть модифицирован с тем, чтоб содержать один или несколько энхансерных элементов. В некоторых вариантах осуществления промотор может включать в себя множество энхансерных элементов. Промоторы, содержащие энхансерные элементы, обеспечивают более высокие уровни транскрипции по сравнению с промоторами, которые их не содержат. Подходящие для применения в растениях энхансерные элементы включают в себя энхансерный элемент PClSV (патент США №5850019), энхансерный элемент CaMV 35S (патент США №5106739 и 5164316) и энхансерный элемент FMV (Maiti et al. (1997) Transgenic Res. 6:143-156); активатор трансляции вируса табачной мозаики (TMV), описанный в заявке WO 87/07644, или вируса гравировки табака (TEV), описанный Carrington & Freed 1990, J. Virol. 64: 1590-1597, например, интроны, такие как интрон маиса adhl или интрон 1 актина риса. См. также PCT WO 96/23898, WO 2012/021794, WO 2012/021797, WO 2011/084370 и WO 2011/028914.
Часто такие конструкции могут содержать 5'- и 3'-нетранслируемые участки. Такие конструкции могут содержать «сигнальную последовательность» или «лидерную последовательность» для облегчения котрансляционного или посттрансляционного переноса пептида, представляющего интерес, в определенные внутриклеточные структуры, такие как хлоропласт (или другой вид пластид), эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи, или для его выделения. Например, конструкцию можно сконструировать так, чтобы она содержала сигнальный пептид для облегчения переноса пептида в эндоплазматический ретикулум. Под «сигнальной последовательностью» подразумевают последовательность, которая как известно или предположительно приводит к котрансляционному или посттрансляционному переносу пептида через клеточную мембрану. У эукариот это обычно подразумевает секрецию в аппарат Гольджи с некоторым гликозилированием в результате. Под «лидерной последовательностью» подразумевают любую последовательность, которая в ходе трансляции приводит к образованию аминокислотной последовательности, достаточной для инициирования котрансляционного транспорта пептидной цепи в субклеточную органеллу. Таким образом, она включает в себя лидерные последовательности, нацеливающиеся на перенос и/или гликозилирование путем поступления в эндоплазматический ретикулум, поступления в вакуоли, пластиды, в том числе хлоропласты, митохондрии и им подобные. Также может быть предпочтительным конструирование кассеты экспрессии для растения, содержащей интрон, с тем, чтобы для экспрессии требовался мРНК-процессинг интрона.
Под «3'-нетранслируемым участком» подразумевают полинуклеотид, расположенный по ходу транскрипции кодирующей последовательности. Сигнальные последовательности полиаденилирования и другие последовательности, кодирующие регуляторные сигналы, способные оказывать воздействие на добавление полиадениловой кислоты, простирающейся к 3'-концу предшественника мРНК, представляют собой 3'-нетранслируемые участки. Под «5'-нетранслируемым участком» подразумевают полинуклеотид, расположенный против хода транскрипции кодирующей последовательности.
Другие вышележащие или нижележащие нетранслируемые элементы включают в себя энхансеры. Энхансеры представляют собой полинуклеотиды, которые действуют с повышением экспрессии промоторного участка. Энхансеры хорошо известны в данной области и включают в себя без ограничения энхансерный участок SV40 и энхансерный элемент 35S.
Участок терминации может быть нативным относительно участка инициации транскрипции, может быть нативным относительно функционально связанной последовательности ДНК, представляющей интерес, может быть нативным относительно растения-хозяина, или может быть получен из другого источника (то есть быть чужеродным или гетерологичным относительно промотора, представляющей интерес последовательности ДНК, растения-хозяин или любой их комбинации). Подходящие участки терминации доступны из Ti-плазмиды A. tumefaciens, например участки терминации октопин-синтазы и нопалин-синтазы. См. также Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; и Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
При необходимости ген (гены) можно оптимизировать для повышения экспрессии в трансформированной клетке-хозяине (синтетическая последовательность ДНК). То есть, гены для улучшенной экспрессии могут быть синтезированы с применением кодонов, предпочтительных для клеток-хозяев, или могут быть синтезированы с применением кодонов с предпочтительной для хозяина частотой использования кодонов. Экспрессия открытой рамки считывания синтетической последовательности ДНК в клетке приводит к продуцированию полипептида по настоящему изобретению. Синтетические последовательности ДНК могут быть применимы для простого удаления нежелательных сайтов рестрикционной эндонуклеазы, для облегчения стратегий клонирования ДНК, для изменения или устранения любой потенциальной неравномерной частоты встречаемости кодонов, для изменения или улучшения содержания GC, для удаления или изменения альтернативных рамок считывания и/или для изменения или удаления сайтов распознавания сплайсинга интрона/экзона, сайтов полиаденилирования, последовательностей Шайна-Дальгарно, нежелательных промоторных элементов и им подобных, которые могут присутствовать в последовательности нативной ДНК. Обычно содержание GC в гене будет поышено. См., например, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 для обсуждения предпочтительного для хозяина использования кодонов. Способы синтеза генов, предпочтительных для растений, известны из уровня техники. См., например, патенты США №№5380831 и 5436391, публикацию патента США №20090137409, а также Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, включенные в объем данного документа посредством ссылки.
Также существует возможность использования синтетических последовательностей ДНК для внесения других улучшений в последовательности ДНК, таких как введение интронной последовательности, создание последовательности ДНК, которая экспрессируется как слитый белок с последовательностями целевых органелл, такими как транзитные пептиды хлоропласта, нацеливающие пептиды апопласта/вакуоли или пептидные последовательности, которые приводят к удержанию полученного пептида в эндоплазматическом ретикулуме. Таким образом, в одном варианте осуществления пестицидный белок нацелен на хлоропласт для экспрессии. Следовательно, если пестицидный белок непосредственно не вводят в хлоропласт, то кассета экспрессии будет дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую транзитный пептид для направления пестицидного белка в хлоропласты. Такие транзитные пептиды известны из уровня техники. См., например, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; и Shah et al. (1986) Science 233:478-481.
Пестицидный ген, который подлежит нацеливанию на хлоропласт, может быть оптимизирован для экспрессии в хлоропласте с учетом различий в частоте использования кодонов между ядром растения и этой органеллой. Таким образом, представляющие интерес нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы с использованием предпочтительных для хлоропластов кодонов. См., например, патент США №5380831, включенный в данный документ посредством ссылки.
Трансформация растения
В способах по настоящему изобретению предусматривают введение нуклеотидной конструкции в растение. Под «введением» подразумевают предоставление растению нуклеотидной конструкции таким образом, что конструкция получает доступ к внутренней части клетки растения. В способах по настоящему изобретению не требуется применения конкретного способа введения нуклеотидной конструкции в растение, а необходимо только чтобы нуклеотидная конструкция получала доступ во внутреннюю часть по меньшей мере одной клетки растения. Способы введения нуклеотидных конструкций в растения известны в данной области, включая без ограничения способы стабильной трансформации, способы транзиентной трансформации и опосредованные вирусами способы.
Под «растением» подразумевают целые растения, органы растений (например, листья, стебли, корни и т.д.), семена, растительные клетки, пропагулы, эмбрионы и их потомство. Растительные клетки могут быть дифференцироваными или недифференцироваными (например, каллюс, клетки в суспензионной культуре, протопласты, клетки листа, клетки корня, клетки флоэмы, пыльца).
«Трансгенные растения», или «трансформированные растения», или «стабильно трансформированные» растения, или клетки, или ткани относятся к растениям, в растительную клетку которых встроили или интегрировали экзогенные последовательности нуклеиновой кислоты или фрагменты ДНК. Данные последовательности нуклеиновой кислоты включают в себя последовательности, которые являются экзогенными или не присутствуют в нетрансформированной растительной клетке, а также последовательности, которые могут быть эндогенными или присутствовать в нетрансформированной растительной клетке. Термин «гетерологичные» обычно относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, которые не являются эндогенными относительно клетки или части нативного генома, в которых они присутствуют, и были добавлены в клетку путем инфекции, трансфекции, микроинъекции, электропорации, микропроекции или им подобного.
Трансгенные растения по настоящему изобретению экспрессируют одну или несколько новых последовательностей токсинов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления белок или нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению преимущественно совмещены в растениях с другими генами, кодирующими белки или РНК, которые придают полезные агрономические свойства таким растениям. Среди генов, которые кодируют белки или РНК, придающие полезные агрономические свойства трансформированным растениям, можно упомянуть последовательности ДНК, кодирующие белки, которые придают переносимость в отношении одного или нескольких гербицидов, и другие, которые придают переносимость в отношении определенных насекомых, а также те, которые придают переносимость в отношении определенных заболеваний, ДНК, кодирующие РНК, которые обеспечивают контроль в отношении нематод или насекомых, и им подобные. Такие гены, в частности, описаны в опубликованных заявках на патент PCT WO 91/02071 и WO 95/06128 и в патенте США №7923602 и публикации заявки на патент США №20100166723, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Среди последовательностей ДНК, кодирующих белки, которые у трансформированных растительных клеток и растений придают переносимость в отношении определенных гербицидов, можно упомянуть ген bar или PAT или ген Streptomyces coelicolor, описанный в WO 2009/152359, который придает переносимость в отношении глюфосинатных гербицидов, ген, кодирующий подходящий EPSPS, который придает переносимость в отношении гербицидов, для которых EPSPS является мишенью, таких как глифосат и его соли (патент США №4556060, патент США №4766061, патент США №5099445, патент США №4940835, патент США №5188642, патент США №497908, патент США №5145783, патент США №5310667, патент США №5312910, патент США №5627061, патент США №6633435), ген, кодирующий глифосат-N-ацетилтрансферазу (например, патент США №8222489, патент США №8088972, патент США №8044261, патент США №8021857, патент США №8008547, патент США №7999152, патент США №7998703, патент США №7863503, патент США №7714188, патент США №7709702, патент США №6666644, патент США №7666643, патент США №7531339, патент США №7527955 и патент США №7405074), ген, кодирующий глифосатоксидоредуктазу (например, патент США №5463175), или ген, кодирующий белок с переносимостью ингибитора HPPD (например, гены переносимости ингибитора HPPD, описанные в WO 2004/055191, WO 199638567, патенте США №6791014, WO 2011/068567, WO 2011/076345, WO 2011/085221, WO 2011/094205, WO 2011/068567, WO 2011/094199, WO 2011/094205, WO 2011/145015, WO 2012/056401 и WO 2014/043435).
Среди последовательностей ДНК, кодирующих подходящую EPSPS, которые придают переносимость в отношении гербицидов с EPSPS в качестве мишени, более конкретно упоминается ген, который кодирует растительную EPSPS, в частности EPSPS маиса, в частности EPSPS маиса, которая содержит две мутации, в частности мутацию в положении аминокислоты 102 и мутацию в положении аминокислоты 106 (WO 2004/074443), и которая описана в заявке на патент США №6566587, далее именуемой EPSPS маиса с двойной мутацией или 2mEPSPS, или ген, который кодирует EPSPS, выделенный из Agrobacterium и который описывают с помощью идентификатора последовательности ID No 2 и идентификатора последовательности ID No 3 в патенте США №5633435, также названный СР4.
Среди последовательностей ДНК, кодирующих подходящую EPSPS, которые придают переносимость в отношении гербицидов с EPSPS в качестве мишени, более конкретно упоминается ген, который кодирует EPSPS GRG23 из Arthrobacter globiformis, в том числе мутанты GRG23 АСЕ1, GRG23 АСЕ2 или GRG23 АСЕ3, в частности мутанты или варианты GRG23, как описано в WO 2008/100353, такие как GRG23(ace3)R173K под SEQ ID No. 29 в WO 2008/100353.
В случае последовательностей ДНК, кодирующих EPSPS, и более конкретно, кодирующих вышеуказанные гены, последовательности, кодирующей указанные ферменты, преимущественно предшествует последовательность, кодирующая транзитный пептид, в частности «оптимизированный транзитный пептид», описанный в патентах США №№5510471 или 5633448.
Типичные признаки переносимости в отношении гербицидов, которые могут быть совмещены с последовательностью нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, дополнительно включают в себя по меньшей мере один ингибитор ALS (ацетолактатсинтазы) (WO 2007/024782); мутантный ген ALS/AHAS Arabidopsis (патент США №6855533); гены, кодирующие 2,4-D-монооксигеназы, придающие переносимость 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты) посредством метаболизирования (патент США №6153401); и гены, кодирующие монооксигеназы дикамбы, придающие переносимость дикамбы (3,6-дихлор-2-метоксибензойной кислоты) посредством метаболизирования (патент США №2008/0119361 и патент США №2008/0120739).
В различных вариантах осуществления нуклеиновая кислота по настоящему изобретению пакетирована в один или несколько генов переносимости гербицидов, в том числе один или несколько генов переносимости гербицида-ингибитора HPPD и/или один или несколько генов переносимости глифосата и/или глюфосината.
Среди последовательностей ДНК, кодирующих белки, которые касаются свойств переносимости в отношении насекомых, более конкретно упоминаются белки Bt, широко описанные в литературе и хорошо известные специалистам в данной области. Также будут упомянуты белки, экстрагированные из бактерий, таких как Photorhabdus (WO 97/17432 и WO 98/08932).
Среди последовательностей ДНК, кодирующих представляющие интерес белки, которые придают новые свойства переносимости в отношении насекомых, более конкретно упоминаются белки Bt Cry или VIP, широко описанные в литературе и хорошо известные специалистам в данной области. Они включают в себя белок Cry1F или гибриды, полученные из белка Cry1F (например, гибридные белки Cry1A - Cry1F, описанные в патентах США №6326169; США №6281016; США №6218188, или их токсические фрагменты), белки типа Cry1A или их токсические фрагменты, предпочтительно белок Cry1Ac или гибриды, полученные из белка Cry1Ac (например, гибридный белок Cry1Ab - Cry1Ac, описанный в патенте США №5880275), или белки Cry1Ab или Bt2 или их инсектицидные фрагменты, описанные в ЕР 451878, белки Cry2Ae, Cry2Af или Cry2Ag, описанные в WO 2002/057664, или их токсические фрагменты, белок Cry1A.105, описанный в WO 2007/140256 (SEQ ID №7), или его токсический фрагмент, белок VIP3Aa19 с номером доступа ABG20428 в NCBI, белок VIP3Aa20 с номером доступа ABG20429 в NCBI (SEQ ID №2 в WO 2007/142840), белки VIP3A, продуцируемые в трансформантах хлопка СОТ202 или СОТ203 (WO 2005/054479 и WO 2005/054480 соответственно), белки Cry, описанные в WO 2001/47952, белок VIP3Aa или его токсический фрагмент, описанные в Estruch et al. (1996), Proc Natl Acad Sci USA. 28; 93(11):5389-94 и патенте США №6291156, инсектицидные белки из штаммов видов Xenorhabdus (как описано в WO 98/50427), Serratia (в частности из S. entomophild) или Photorhabdus, такие как Тс-белки из Photorhabdus, как описано в WO 98/08932 (например, Waterfield et al., 2001, Appl Environ Microbiol. 67(ll):5017-24; Ffrench-Constant and Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5):828-33). Также в объем данного документа включены любые варианты или мутанты любого из этих белков, отличающиеся некоторыми (1-10, предпочтительно 1-5) аминокислотами от любой из вышеуказанных последовательностей, в частности последовательность их токсического фрагмента, или которые слиты с транзитным пептидом, таким как пластидный транзитный пептид или другой белок или пептид.
В различных вариантах осуществления нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть совмещена в растениях с одним или несколькими генами, придающими требуемые признак, такой как переносимость гербицидов, переносимость насекомых, переносимость засухи, контроль нематод, эффективность использования воды, эффективность использования азота, улучшенная питательная ценность, устойчивость к болезням, улучшенный фотосинтез, улучшенное качество волокна, переносимость стресса, улучшенное размножение и им подобные.
В частности, применимые трансгенные объекты, которые могут быть совмещены с генами по настоящему изобретению в растениях одного того же вида (например, путем скрещивания или путем трансформации растения, содержащего другой трансгенный объект с химерным геном по настоящему изобретению), включают в себя трансформант 531/PV-GHBK04 (хлопок, контроль в отношении насекомых, описанный в WO 2002/040677), трансформант 1143-14А (хлопок, контроль насекомых, не депонированный, описанный в WO 2006/128569); трансформант 1143-51 В (хлопок, контроль насекомых, не депонированный, описанный в WO 2006/128570); трансформант 1445 (хлопок, переносимость гербицидов, не депонированный, описанный в US-A 2002-120964 или WO 2002/034946), трансформант 17053 (рис, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-9843, описанный в WO 2010/117737); трансформант 17314 (рис, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-9844, описанный в WO 2010/117735); трансформант 281-24-236 (хлопок, контроль насекомых - переносимость гербицидов, депонированный как РТА-6233, описанный в WO 2005/103266 или US-A 2005-216969); трансформант 3006-210-23 (хлопок, контроль насекомых - переносимость гербицидов, депонированный как РТА-6233, описанный в US-A 2007-143876 или WO 2005/103266); трансформант 3272 (кукуруза, качественный признак, депонированный как РТА-9972, описанный в WO 2006/098952 или US-A 2006-230473); трансформант 33391 (пшеница, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-2347, описанный в WO 2002/027004), трансформант 40416 (кукуруза, контроль насекомых - переносимость гербицидов, депонированный как РТА-11508 в АТСС, описанный в WO 11/075593); трансформант 43А47 (кукуруза, контроль насекомых - переносимость гербицидов, депонированный как РТА-11509 в АТСС, описанный в WO2011/075595); трансформант 5307 (кукуруза, контроль в отношении насекомых, депонированный как РТА-9561 в АТСС, описанный в WO 2010/077816); трансформант ASR-368 (полевица, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-4816 в АТСС, описанный в US-A 2006-162007 или WO 2004/053062); трансформант В16 (кукуруза, переносимость гербицидов, не депонированный, описанный в US-A 2003-126634); трансформант BPS-CV127-9 (соя, переносимость гербицидов, депонированный под №41603 в NCDVIB, описанный в WO 2010/080829); трансформант BLR1 (масличный рапс, восстановление мужской стерильности, депонированный как 41193 в NCIMB, описанный в WO 2005/074671), трансформант СЕ43-67В (хлопок, контроль насекомых, депонированный как DSM АСС2724, описанный в US-A 2009-217423 или WO 2006/128573); трансформант CE44-69D (хлопок, контроль насекомых, не депонированный, описанный в US-A 2010-0024077); трансформант CE44-69D (хлопок, контроль насекомых, не депонированный, описанный в WO 2006/128571); трансформант СЕ46-02А (хлопок, контроль насекомых, не депонированный, описанный в WO 2006/128572); трансформант СОТ102 (хлопок, контроль насекомых, не депонированный, описанный в US-A 2006-130175 или WO 2004/039986); трансформант СОТ202 (хлопок, контроль насекомых, не депонированный, описанный в US-A 2007-067868 или WO 2005/054479); трансформант СОТ203 (хлопок, контроль насекомых, не депонированный, описанный в WO 2005/054480); трансформант DAS21606-3/1606 (соя, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-11028, описанный в WO 2012/033794), трансформант DAS40278 (кукуруза, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-10244 в АТСС, описанный в WO 2011/022469); трансформант DAS-44406-6/pDAB8264.44.06.1 (соя, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-11336, описанный в WO 2012/075426), трансформант DAS-14536-7/pDAB8291.45.36.2 (соя, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-11335, описанный в WO 2012/075429), трансформант DAS-59122-7 (кукуруза, контроль насекомых - переносимость гербицидов, депонированный как РТА 11384 в АТСС, описанный в US-A 2006-070139); трансформант DAS-59132 (кукуруза, контроль насекомых - переносимость гербицидов, не депонированный, описанный в WO 2009/100188); трансформант DAS68416 (соя, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-10442 в АТСС, описанный в WO 2011/066384 или WO 2011/066360); трансформант DP-098140-6 (кукуруза, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-8296 в АТСС, описанный в US-A 2009-137395 или WO 08/112019); трансформант DP-305423-1 (соя, качественный признак, не депонированный, описанный в US-A 2008-312082 или WO 2008/054747); трансформант DP-32138-1 (кукуруза, гибридизационная система, депонированный как РТА-9158 в АТСС, описанный в US-A 2009-0210970 или WO 2009/103049); трансформант DP-356043-5 (соя, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-8287 в АТСС, описанный в US-A 2010-0184079 или WO 2008/002872); трансформант ЕЕ-1 (баклажан, контроль насекомых, не депонированный, описанный в WO 07/091277); трансформант FI117 (кукуруза, переносимость гербицидов, депонированный как 209031 в АТСС, описанный в US-A 2006-059581 или WO 98/044140); трансформант FG72 (соя, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-11041, описанный в WO 2011/063413), трансформант GA21 (кукуруза, переносимость гербицидов, депонированный как 209033 в АТСС, описанный в US-A 2005-086719 или WO 98/044140); трансформант GG25 (кукуруза, переносимость гербицидов, депонированный как 209032 в АТСС, описанный в US-A 2005-188434 или WO 98/044140); трансформант GHB119 (хлопок, контроль насекомых - переносимость гербицидов, депонированный как РТА-8398 в АТСС, описанный в WO 2008/151780); трансформант GHB614 (хлопок, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-6878 в АТСС, описанный в US-A 2010-050282 или WO 2007/017186); трансформант GJ11 (кукуруза, переносимость гербицидов, депонированный как АТСС 209030, описанный в US-A 2005-188434 или WO 98/044140); трансформант GM RZ13 (сахарная свекла, устойчивость к вирусам, депонированный как 41601 в NCIMB, описанный в WO 2010/076212); трансформант Н7-1 (сахарная свекла, переносимость гербицидов, депонированный как 41158 в NCIMB или 41159 в NCIMB, описанный в US-A 2004-172669 или WO 2004/074492); трансформант JOPLIN1 (пшеница, переносимость заболеваний, не депонированный, описанный в US-A 2008-064032); трансформант LL27 (соя, переносимость гербицидов, депонированный как 41658 в NCIMB, описанный в WO 2006/108674 или US-A 2008-320616); трансформант LL55 (соя, переносимость гербицидов, депонированный как 41660 в NCIMB, описанный в WO 2006/108675 или US-A 2008-196127); трансформант LLcotton25 (хлопок, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-3343 в АТСС, описанный в WO 2003/013224 или US-A 2003-097687); трансформант LLRICE06 (рис, переносимость гербицидов, депонированный как 203353 в АТСС, описанный в патенте США №6468747 или WO 2000/026345); трансформант LLRice62 (рис, переносимость гербицидов, депонированный как 203352 в АТСС, описанный в WO 2000/026345), трансформант LLRICE601 (рис, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-2600 в АТСС, описанный в US-А 2008-2289060 или WO 2000/026356); трансформант LY038 (кукуруза, качественный признак, депонированный как РТА-5623 в АТСС, описанный в US-A 2007-028322 или WO 2005/061720); трансформант MIR162 (кукуруза, контроль насекомых, депонированный как РТА-8166, описанный в US-A 2009-300784 или WO 2007/142840); трансформант MIR604 (кукуруза, контроль насекомых, не депонированный, описанный в US-A 2008-167456 или WO 2005/103301); трансформант MON15985 (хлопок, контроль насекомых, депонированный как РТА-2516 в АТСС, описанный в US-А 2004-250317 или WO 2002/100163); трансформант MON810 (кукуруза, контроль насекомых, не депонированный, описанный в US-А 2002-102582); трансформант MON863 (кукуруза, контроль насекомых, депонированный как РТА-2605 в АТСС, описанный в WO 2004/011601 или US-A 2006-095986); трансформант MON87427 (кукуруза, контроль опыления, депонированный как РТА-7899 в АТСС, описанный в WO 2011/062904); трансформант MON87460 (кукуруза, переносимость стресса, депонированный как РТА-8910 в АТСС, описанный в WO 2009/111263 или US-А 2011-0138504); трансформант MON87701 (соя, контроль насекомых, депонированный как РТА-8194 в АТСС, описанный в US-A 2009-130071 или WO 2009/064652); трансформант MON87705 (соя, качественный признак переносимость гербицидов, депонированный как РТА-9241 в АТСС, описанный в US-A 2010-0080887 или WO 2010/037016); трансформант MON87708 (соя, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-9670 в АТСС, описанный в WO 2011/034704); трансформант MON87712 (соя, урожайность, депонированный как РТА-10296, описанный в WO 2012/051199), трансформант MON87754 (соя, качественный признак, депонированный как РТА-9385 в АТСС, описанный в WO 2010/024976); трансформант MON87769 (соя, качественный признак, депонированный как РТА-8911 в АТСС, описанный в US-A 2011-0067141 или WO 2009/102873); трансформант MON88017 (кукуруза, контроль насекомых - переносимость гербицидов, депонированный как РТА-5582 в АТСС, описанный в US-A 2008-028482 или WO 2005/059103); трансформант MON88913 (хлопок, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-4854 в АТСС, описанный в WO 2004/072235 или US-A 2006-059590); трансформант MON88302 (масличный рапс, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-10955, описанный в WO 2011/153186), трансформант MON88701 (хлопок, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-11754, описанный в WO 2012/134808), трансформант MON89034 (кукуруза, контроль насекомых, депонированный как РТА-7455 в АТСС, описанный в WO 07/140256 или US-А 2008-260932); трансформант MON89788 (соя, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-6708 в АТСС, описанный в US-A 2006-282915 или WO 2006/130436); трансформант MS 11 (масличный рапс, контроль опыления - переносимость гербицидов, депонированный как РТА-850 в АТСС или РТА-2485, описанный в WO 2001/031042); трансформант MS8 (масличный рапс, контроль в отношении опыления - переносимость гербицидов, депонированный как РТА-730 в АТСС, описанный в WO 2001/041558 или US-A 2003-188347); трансформант NK603 (кукуруза, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-2478 в АТСС, описанный в US-A 2007-292854); трансформант РЕ-7 (рис, контроль насекомых, не депонированный, описанный в WO 2008/114282); трансформант RF3 (масличный рапс, контроль опыления - переносимость гербицидов, депонированный как РТА-730 в АТСС, описанный в WO 2001/041558 или US-A 2003-188347); трансформант RT73 (масличный рапс, переносимость гербицидов, не депонированный, описанный в WO 2002/036831 или US-A 2008-070260); трансформант SYHT0H2/SYN-000H2-5 (соя, переносимость гербицидов, депонированный как РТА-11226, описанный в WO2012/082548), трансформант Т227-1 (сахарная свекла, переносимость гербицидов, не депонированный, описанный в WO 2002/44407 или US-A 2009-265817); трансформант Т25 (кукуруза, переносимость гербицидов, не депонированный, описанный в US-A 2001-029014 или WO 2001/051654); трансформант Т304-40 (хлопок, контроль насекомых - переносимость гербицидов, депонированный как РТА-8171 в АТСС, описанный в US-А 2010-077501 или WO 2008/122406); трансформант Т342-142 (хлопок, контроль насекомых, не депонированный, описанный в WO2006/128568); трансформант ТС 1507 (кукуруза, контроль насекомых - переносимость гербицидов, не депонированный, описанный в US-A 2005-039226 или WO 2004/099447); трансформант VIP1034 (кукуруза, контроль насекомых - переносимость гербицидов, депонированный как РТА-3925 в АТСС, описанный в WO 2003/052073), трансформант 32316 (кукуруза, контроль насекомых - переносимость гербицидов, депонированный как РТА-11507, описанный в WO 2011/084632), трансформант 4114 (кукуруза, контроль насекомых - переносимость гербицидов, депонированный как РТА-11506, описанный в WO 2011/084621), трансформант EE-GM3/FG72 (соя, переносимость гербицидов, номер доступа в АТСС № РТА-11041) необязательно пакетирован с трансформантом ЕЕ-GM1/LL27 или трансформантом EE-GM2/LL55 (WO 2011/063413 А2), трансформант DAS-68416-4 (соя, переносимость гербицидов, номер доступа в АТСС № РТА-10442, WO 2011/066360 A1), трансформант DAS-68416-4 (соя, переносимость гербицидов, номер доступа в АТСС № РТА-10442, WO 2011/066384 А1), трансформант DP-040416-8 (кукуруза, контроль насекомых, номер доступа в АТСС № РТА-11508, WO 2011/075593 A1), трансформант DP-043A47-3 (кукуруза, контроль насекомых, номер доступа в АТСС № РТА-11509, WO 2011/075595 А1), трансформант DP-004114-3 (кукуруза, контроль насекомых, номер доступа в АТСС № РТА-11506, WO 2011/084621 А1), трансформант DP-032316-8 (кукуруза, контроль насекомых, номер доступа в АТСС № РТА-11507, WO 2011/084632 А1), трансформант MON-88302-9 (масличный рапс, переносимость гербицидов, номер доступа в АТСС № РТА-10955, WO 2011/153186 A1), трансформант DAS-21606-3 (соя, переносимость гербицидов, номер доступа в АТСС № РТА-11028, WO 2012/033794 A2), трансформант MON-87712-4 (соя, качественный признак, номер доступа в АТСС № РТА-10296, WO 2012/051199 A2), трансформант DAS-44406-6 (соя, пакетированная переносимость гербицидов, номер доступа в АТСС № РТА-11336, WO 2012/075426 A1), трансформант DAS-14536-7 (соя, пакетированная переносимость гербицидов, номер доступа в АТСС № РТА-11335, WO 2012/075429 A1), трансформант SYN-000H2-5 (соя, переносимость гербицидов, номер доступа в АТСС № РТА-11226, WO 2012/082548 A2), трансформант DP-061061-7 (масличный рапс, переносимость гербицидов, номер депонирования не доступен, WO 2012071039 A1), трансформант DP-073496-4 (масличный рапс, переносимость гербицидов, номер депонирования не доступен, US 2012131692), трансформант 8264.44.06.1 (соя, пакетированная переносимость гербицидов, номер доступа № РТА-11336, WO 2012075426 A2), трансформант 8291.45.36.2 (соя, пакетированная переносимость гербицидов, номер доступа № РТА-11335, WO 2012075429 A2), трансформант SYHT0H2 (соя, номер доступа в АТСС № РТА-11226, WO 2012/082548 А2), трансформант MON88701 (хлопок, номер доступа в АТСС № РТА-11754, WO 2012/134808 A1), трансформант KK179-2 (люцерна, номер доступа в АТСС №РТА-11833, WO 2013/003558 A1), трансформант pDAB8264.42.32.1 (соя, пакетированная переносимость гербицидов, номер доступа в АТСС № РТА-11993, WO 2013/010094 A1), трансформант MZDT09Y (кукуруза, номер доступа в АТСС № РТА-13025, WO 2013/012775 A1).
Трансформацию растительных клеток можно осуществлять с помощью одной или нескольких методик, известных в данной области. Пестицидный ген по настоящему изобретению может быть модифицирован с получением или усилением экспрессии в растительных клетках. Как правило, конструкция, которая экспрессирует такой белок, будет содержать промотор для управления транскрипции гена, а также 3'-нетранслируемый участок для обеспечения терминации транскрипции и полиаденилирования. Структура таких конструкций хорошо известна в данной области. В некоторых случаях может быть полезной разработка гена таким образом, чтобы полученный пептид секретировался или иным образом нацеливался внутри растительной клетки. Например, ген можно сконструировать так, чтобы он содержал сигнальный пептид для облегчения переноса пептида в эндоплазматический ретикулум. Также может быть предпочтительным конструирование кассеты экспрессии для растения, содержащей интрон, с тем, чтобы для экспрессии требовался мРНК-процессинг интрона.
Обычно такую «кассету экспрессии для растения» встраивают в «вектор для трансформации растения». Этот вектор для трансформации растения может состоять из одного или нескольких векторов ДНК, необходимых для достижения трансформации растения. Например, общепринятой практикой в данной области является применение векторов для трансформации растения, которые состоят из более чем одного смежного сегмента ДНК. Данные векторы часто упоминаются в данной области как «бинарные векторы». Бинарные векторы, а также векторы с хелперными плазмидами чаще всего используются для опосредованной Agrobacterium трансформации, где размер и сложность сегментов ДНК, необходимых для достижения эффективной трансформации, довольно велики, и предпочтительным является разделение функций на отдельные молекулы ДНК. Бинарные векторы, как правило, содержат плазмидный вектор, который содержит цис-действующие последовательности, необходимые для переноса Т-ДНК (такие как левый пограничный участок и правый пограничный участок), селектируемый маркер, который сконструирован так, чтобы он мог экспрессироваться в растительной клетке, и «ген, представляющий интерес» (ген, сконструированный так, чтобы он мог экспрессироваться в растительной клетке, для которой требуется получение трансгенных растений). Также в этом плазмидном векторе присутствуют последовательности, необходимые для репликации бактерий. Цис-действующие последовательности устроены таким образом, чтобы обеспечить эффективный перенос в растительные клетки и экспрессию в них. Например, селектируемый маркерный ген и пестицидный ген расположены между левым и правым пограничными участками. Часто второй плазмидный вектор содержит трансдействующие факторы, которые опосредуют перенос Т-ДНК из Agrobacterium в клетки растений. Данная плазмида часто содержит функции вирулентности (vir-гены), которые позволяют инфицировать растительные клетки посредством Agrobacterium и переносить ДНК путем расщепления в пограничных последовательностях и vir-опосредованного переноса ДНК, как это понятно из уровня техники (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Для трансформации растений можно использовать несколько типов штаммов Agrobacterium (например, LBA4404, GV3101, ЕНА101, ЕНА105 и т.д.). Второй плазмидный вектор не является необходимым для трансформации растений другими способами, такими как микропроекция, микроинъекция, электропорация, трансфекция с использованием полиэтиленгликоля и т.д.
В целом способы трансформации растений включают перенос гетерологичной ДНК в целевые растительные клетки (например, незрелые или зрелые эмбрионы, суспензионные культуры, недифференцированный каллюс, протопласты и т.д.) с последующим применением максимального порогового уровня соответствующего отбора (в зависимости от селектируемого маркерного гена) для восстановления трансформированных растительных клеток из группы клеток нетрансформированной клеточной массы. Эксплантаты, как правило, переносят на свежую порцию той же самой питательной среды и культивируют в соответствии со стандартной методикой. Впоследствии трансформированные клетки после размещения на среде для регенерации, дополненную средством для отбора с максимально пороговым уровнем, дифференцируются в побеги. Затем побеги переносят в селективную среду для корнеобразования для восстановления укорененных побегов или саженцев. Затем трансгенный саженец вырастает в зрелое растение и продуцирует фертильные семена (например Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Эксплантаты, как правило, переносят на свежую порцию той же самой питательной среды и культивируют в соответствии со стандартной методикой. Общее описание методик и способов получения трансгенных растений можно найти в Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 и Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Поскольку трансформированный материал содержит множество клеток, то в любой части исследуемого целевого каллюса, или ткани, или группы клеток присутствуют как трансформированные, так и нетрансформированные клетки. Благодаря возможности уничтожать нетрансформированные клетки и обеспечивать пролиферацию трансформированных клеток, можно получать трансформированные растительные культуры. Часто возможность удаления ^трансформированных клеток является лимитирующим фактором для быстрого восстановления трансформированных растительных клеток и успешного получения трансгенных растений.
Протоколы трансформации, а также протоколы для введения нуклеотидных последовательностей в растения могут варьироваться в зависимости от подвергнутых трансформации типа растения или растительной клетки, т.е. однодольные или двудольные. Получение трансгенных растений может быть осуществлено посредством одного из нескольких способов, в том числе без ограничения микроинъекции, электропорации, прямого переноса генов, введения гетерологичной ДНК Agrobacterium в растительные клетки (опосредованная Agrobacterium трансформация), бомбардировки растительных клеток гетерологичной чужеродной ДНК, осажденной на частицах, баллистического ускорения частиц, трансформации с применением аэрозольного пучкового инжектора (опубликованная заявка США №20010026941, патент США №4945050, международная публикация № WO 91/00915, опубликованная заявка США №2002015066), трансформации Led и различных других, несвязанных с частицами прямых или опосредованных способов переноса ДНК.
Способы трансформации хлоропластов хорошо известны в из уровня техники. См., например, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. Способ основан на доставке с помощью генной пушки ДНК, содержащей селектируемый маркер, и нацеливании ДНК на пластидный геном посредством гомологичной рекомбинации. Кроме того, трансформация пластиды может быть осуществлена путем трансактивации молчащего, переносимого с помощью пластиды трансгена посредством тканеспецифической экспрессии закодированной в ядре и направляемой в пластиду РНК-полимеразы. О такой системе сообщают в McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.
После интеграции гетерологичной чужеродной ДНК в растительные клетки в дальнейшем используют максимальный пороговый уровень соответствующего отбора в среде для уничтожения нетрансформированных клеток, а также разделения и пролиферации предположительно трансформированных клеток, которые при регулярном переносе в свежую среду выживают в ходе такой обработки с целью отбора. Путем непрерывного пассажирования и провоцирования с помощью соответствующего отбора, проводят идентификацию и пролиферацию клеток, трансформированных с помощью плазмидного вектора. Затем для подтверждения присутствия в геноме трансгенного растения интегрированного гетерологичного гена, представляющего интерес, могут быть использованы молекулярные и биохимические способы.
Клетки, которые были трансформированы, могут быть выращены в растения в соответствии с традиционными способами. См., например, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Затем данные растения можно выращивать, а также опылять либо таким же трансформированным штаммом, либо отличающимися штаммами, с получением гибрида, характеризующегося конститутивной экспрессией требуемой фенотипической характеристики. Два или более поколений могут быть выращены с гарантией того, что экспрессия требуемой фенотипической характеристики стабильно сохраняется и наследуется, а затем для обеспечения экспрессии требуемой фенотипической характеристики должны быть собраны семена. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрены трансформированные семена (также называемые «трансгенными семенами»), содержащие нуклеотидную конструкцию по настоящему изобретению, например, кассету экспрессии по настоящему изобретению, стабильно встроенную в их геном.
Оценка трансформации растений
После введения гетерологичной чужеродной ДНК в растительные клетки, трансформацию или интеграцию гетерологичного гена в геноме растения подтверждают различными способами, такими как анализ нуклеиновых кислот, белков и метаболитов, связанных с интегрированным геном.
Анализ с помощью ПЦР является быстрым способом скрининга трансформированных клеток, тканей или побегов в отношении присутствия введенного гена на ранней стадии перед высадкой в почву (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). ПЦР осуществляют с применением олигонуклеотидных праймеров, специфичных к гену, представляющему интерес, или к фону вектора на основе Agrobacterium и т.д.
32
Трансформацию растений можно подтверждать при помощи Саузерн-блоттинга геномной ДНК (Sambrook and Russell, 2001, выше). Как правило, полную ДНК экстрагируют из трансформанта, расщепляют соответствующими рестрикционными ферментами, фракционируют в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозу или нейлоновую мембрану. Затем мембрану или «блот» исследуют, например, при помощи мечения радиоактивным изотопом Р фрагмента ДНК для того, чтоб подтвердить интеграцию введенного гена в геном растения, в соответствии со стандартными методиками (Sambrook and Russell, 2001, выше).
В нозерн-блоттинге РНК выделяют из специфических тканей трансформанта, фракционируют в агарозном геле, содержащем формальдегид, и пропускают через нейлоновый фильтр в соответствии со стандартными процедурами, которые обычно используют в данной области (Sambrook and Russell, 2001, выше). Экспрессию РНК, кодируемой пестицидным геном, затем проверяют посредством гибридизации фильтра с радиоактивным зондом, полученным из пестицидного гена, с помощью способов, известных в данной области (Sambrook and Russell, 2001, выше).
Для подтверждения присутствия белка, кодируемого пестицидным геном, с трансгенными растениями могут быть проведены вестерн-блоттинг, биохимические анализы и им подобные с помощью стандартных процедур (Sambrook and Russell, 2001, выше) с использованием антител, которые связываются с одним или несколькими эпитопами, присутствующими на пестицидном белке.
Пестицидная активность в растениях
В другом аспекте настоящего изобретения можно получать трансгенные растения, экспрессирующие пестицидный белок, который характеризуется пестицидной активностью. Способы, описанные выше в качестве примера, могут быть использованы для получения трансгенных растений, но каким именно образом получают трансгенные растительные клетки - не является ключевым для этого изобретения. Способы, известные или описанные в данной области, такие как опосредованная Agrobacterium трансформация, биолистическая трансформация и способы, не связанные с частицами, могут использоваться на усмотрение экспериментатора. Растения, экспрессирующие пестицидный белок, могут быть выделены с помощью традиционных способов, описанных в данной области, например, путем трансформации каллюса, отбора трансформированного каллюса и регенерации фертильных растений из такого трансгенного каллюса. В таком способе можно использовать любой ген в качестве селектируемого маркера до тех пор, пока его экспрессия в растительных клетках дает возможность идентифицировать или отбирать трансформированные клетки.
Для применения в растительных клетках был разработан ряд маркеров, таких как ген устойчивости к хлорамфениколу, аминогликозиду G418, гигромицину и им подобные. Другие гены, которые кодируют продукт, вовлеченный в метаболизм хлоропластов, также могут быть использованы в качестве селектируемых маркеров. Например, гены, которые обеспечивают устойчивость к растительным гербицидам, таким как глифосат, бромоксинил или имидазолинон, могут быть особенно полезны. О таких генах сообщалось в (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (нитрилазный ген устойчивости к бромоксинилу); и Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (ген AHAS устойчивости к имидазолинону). Кроме того, описанные в данном документе гены применимы в качестве маркеров для оценки трансформации бактериальных или растительных клеток. Способы выявления присутствия трансгена в растении, органе растения (например, листьях, стеблях, корнях и т.д.), семени, растительной клетке, пропагуле, эмбрионе или их потомстве хорошо известны в данной области. В одном варианте осуществления присутствие трансгена выявляют путем проверки пестицидной активности.
Фертильные растения, экспрессирующие пестицидный белок, могут быть подвергнуты проверке в отношении пестицидной активности, и растения, проявляющие оптимальную активность, отбирают для дальнейшего выращивания. Способы анализа пестицидной активности доступны из уровня техники. Как правило, белок смешивают и используют в анализах со скармливанием. См., например Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.
Настоящее изобретение может быть использовано для трансформации любых видов растений, в том числе без ограничения однодольных и двудольных растений. Примерами растений, представляющих интерес, являются без ограничения кукуруза (маис), сорго, пшеница, подсолнечник, томаты, крестоцветные, виды перца, картофель, хлопок, рис, соя, сахарная свекла, сахарный тростник, табак, ячмень и рапс масличный, Brassica sp., люцерна, рожь, просо, сафлор, виды арахиса, сладкий картофель, кассава, кофе, кокос, ананас, цитрусовые, какао, чай, банан, авокадо, инжир, гуава, манго, олива, папайя, кешью, макадамия, миндаль, овес, овощи, декоративные растения и хвойные деревья.
Овощи включают без ограничения томаты, салат-латук, зеленые бобы, лимскую фасоль, горох и представителей рода Curcumis, таких как огурец, канталупа и мускусная дыня. Декоративные растения включают без ограничения азалию, гортензию, гибискус, розы, тюльпаны, нарциссы, петунии, гвоздику, пуансеттию и хризантему. Предпочтительно растениями по настоящему изобретению являются культурные растения (например, маис, сорго, пшеница, подсолнечник, томаты, крестоцветные, перец, картофель, хлопок, рис, соя, сахарная свекла, сахарный тростник, табак, ячмень, масличный рапс и т.д.)
Применение в пестицидном контроле
Общие способы применения штаммов, содержащих нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению или ее вариант, в контроле вредителей или в разработке других организмов в качестве пестицидных средств известны в данной области. См, например патент США №5039523 и ЕР 0480762 А2.
Для защиты сельскохозяйственных культур и продуктов от вредителей могут быть использованы штаммы Bacillus, содержащие нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению или ее вариант, или микроорганизмы, которые были генетически изменены с тем, чтобы содержать пестицидный ген и белок по настоящему изобретению. В одном аспекте настоящего изобретения целые, т.е. нелизированные клетки продуцирующего токсин (пестицид) организма обрабатывают реагентами, которые продлевают активность токсина, продуцируемого в клетке, в условиях, когда клетку используют в окружающей среде целевого вредителя (вредителей).
Альтернативно пестицид получают путем введения пестицидного гена в клетку-хозяина. Экспрессия пестицидного гена приводит, прямо или опосредованно, к внутриклеточному продуцированию и сохранению пестицида. В одном аспекте настоящего изобретения указанные клетки затем обрабатывают при условиях, которые продлевают активность токсина, продуцируемого в клетке, в случае, когда клетку используют в окружающей среде целевого вредителя (вредителей). Полученный продукт сохраняет токсичность токсина. Указанные естественным образом инкапсулированные пестициды могут затем быть составлены в соответствии с общепринятыми методиками для внесения в окружающую среду, в которой размещается целевой вредитель, например, почву, воду и листву растений. См., например, ЕРА 0192319 и ссылки, приведенные в указанном документе. Альтернативно можно составлять клетки, экспрессирующие ген по настоящему изобретению, таким образом, чтобы обеспечить внесение полученного материала в качестве пестицида.
Активные ингредиенты по настоящему изобретению обычно вносят в виде композиций, при этом внесение на посевной участок или растение, подлежащее обработке, можно выполнять одновременно или последовательно совместно с другими соединениями. Такими соединениями могут быть удобрения, средства для уничтожения сорняков, криопротекторные средства, поверхностно-активные вещества, детергенты, пестицидные мыла, масла для внесения в период покоя, полимеры и/или составы с медленным высвобождением или биоразлагаемым носителем, которые обеспечивают длительное высвобождение дозы в целевой области после однократного внесения состава. Они также могут представлять собой селективные гербициды, химические инсектициды, вируциды, микробициды, амебициды, пестициды, фунгициды, бактериоциды, нематоциды, моллюскоциды или смеси нескольких данных препаратов, если это необходимо, совместно с другими приемлемыми для сельского хозяйства носителями, поверхностно-активными веществами или вспомогательными средствами, способствующими внесению, используемыми в области составления. Подходящие носители и адъюванты могут быть твердыми или жидкими и представлять собой вещества, обычно используемые в технологии составления, например, природные или искусственные минеральные вещества, растворители, диспергаторы, увлажняющие средства, вещества для повышения клейкости, связующие вещества или удобрения. Таким образом составы могут быть подготовлены в виде съедобных «приманок» или изготовлены в «ловушки» для вредителей, чтобы обеспечить поедание или поглощение пестицидного состава целевым вредителем.
Способы внесения активного ингредиента по настоящему изобретению или агрохимической композиции по настоящему изобретению, которая содержит по меньшей мере один из пестицидных белков, продуцируемых бактериальными штаммами по настоящему изобретению, предусматривают нанесение на листья, дражирование семян и внесение в почву. Количество внесений и нормы внесения зависят от интенсивности заражения соответствующим вредителем.
Композицию можно составить в виде порошка, дуста, пеллеты, гранулы, аэрозоля, эмульсии, коллоида, раствора или им подобных и ее можно получить посредством таких традиционных способов, как высушивание, лиофилизация, гомогенизация, экстракция, фильтрация, центрифугирование, осаждение или концентрирование культуры клеток, содержащих полипептид. Во всех таких композициях, которые содержат по меньшей мере один такой пестицидный полипептид, полипептид может присутствовать в концентрации от приблизительно 1% до приблизительно 99% по весу.
С помощью способов по настоящему изобретению такие вредители как чешуекрылые, полужесткокрылые, двукрылые или жесткокрылые могут быть уничтожены или их количество может быть уменьшено на данной территории, или способы могут быть применены с профилактической целью в отношении окружающей среды для предотвращения заражения восприимчивым вредителем. Предпочтительно вредитель поглощает или контактирует с пестицидно эффективным количеством соответствующего полипептида. Под «пестицидно эффективным количеством» подразумевают количество пестицида, способное привести к смерти по меньшей мере одного вредителя или заметно снизить его рост, кормление или нормальное физиологическое развитие. Это количество будет варьировать в зависимости от таких факторов, как например: конкретные целевые вредители, подлежащие контролю, конкретная окружающая среда, местоположение, растение, культура или сельскохозяйственный участок, подлежащий обработке, условия окружающей среды и способ, скорость, концентрация, стабильность и количество внесения пестицидно эффективной композиции на основе полипептида. Составы могут также варьировать в зависимости от климатических условий, экологических соображений и/или частоты внесения и/или степени тяжести заражения вредителями.
Описанные пестицидные композиции могут быть получены путем составления или бактериальной клетки, суспензии кристаллов и/или спор, или выделенного белкового компонента с требуемым приемлемым для сельского хозяйства носителем. Композиции могут быть составлены при помощи подходящего способа до введения, например их лиофилизируют, подвергают сухой заморозке, высушивают или помещают в водный носитель, среду или подходящий разбавитель, такой как физиологический раствор или другой буфер. Композиции могут быть составлены в форме дуста, или гранулированного материала, или суспензии в масле (растительном или минеральном), или водной эмульсии, или эмульсии масло/вода, или в виде смачиваемого порошка или в сочетании с любым другим материалом-носителем, подходящим для применения в сельском хозяйстве. Подходящие для сельского хозяйства носители могут быть твердыми или жидкими и хорошо известны в данной области. Термин «приемлемый для сельского хозяйства носитель» охватывает все вспомогательные вещества, инертные компоненты, диспергаторы, поверхностно-активные вещества, вещества для повышения клейкости, связующие вещества и т.д., которые, как правило, применяют в технологии составления пестицидов; при этом они хорошо известны специалистам в области составления пестицидов. Составы могут быть смешаны с одним или несколькими твердыми или жидкими адъювантами и получены различными способами, например, путем смешивания до получения гомогенной структуры, измельчения и/или растирания пестицидной композиции с подходящими адъювантами с применением традиционных методик составления. Подходящие композиции и способы внесения описаны в патенте США №6468523, включенном в данный документ посредством ссылки.
Термин «вредитель» включает без ограничения насекомых, грибы, бактерии, нематоды, микроскопических клещей, клещей и им подобных. Насекомые-вредители включают насекомых, выбранных из отрядов Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera и т.д., в частности Coleoptera, Lepidoptera и Diptera.
Отряд Coleoptera включает в себя подотряды Adephaga и Polyphaga. Подотряд Adephaga включает в себя надсемейство Caraboidea и Gyrinoidea, весь подотряд Polyphaga включает в себя надсемейства Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea и Curculionoidea. Надсемейство Caraboidea включает в себя семейства Cicindelidae, Carabidae и Dytiscidae. Надсемейство Gyrinoidea включает в себя семейство Gyrinidae. Надсемейство Hydrophiloidea включает в себя семейство Hydrophilidae. Надсемейство Staphylinoidea включает в себя семейства Passalidae и Staphylinidae. Надсемейство Cantharoidea включает в себя семейства Cantharidae и Lampyridae. Надсемейство Cleroidea включает в себя семейства Cleridae и Dermestidae. Надсемейство Elateroidea включает в себя семейства Elateridae и Buprestidae. Надсемейство Cucujoidea включает в себя семейство Coccinellidae. Надсемейство Meloidea включает в себя семейство Meloidae. Надсемейство Tenebrionoidea включает в себя семейство Tenebrionidae. Надсемейство Scarabaeoidea включает в себя семейства Passalidae и Scarabaeidae. Надсемейство Cerambycoidea включает в себя семейство Cerambycidae. Надсемейство Chrysomeloidea включает в себя семейство Chrysomelidae. Надсемейство Curculionoidea включает в себя семейства Curculionidae и Scolytidae.
Отряд Diptera включает в себя подотряды Nematocera, Brachycera и Cyclorrhapha. Подотряд Nematocera включает в себя семейства Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae и Cecidomyiidae. Подотряд Brachycera включает в себя семейства Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae и Dolichopodidae. Подотряд Cyclorrhapha включает в себя секции Aschiza и Aschiza. Секция Aschiza включает в себя семейства Phoridae, Syrphidae и Conopidae. Секция Aschiza включает в себя подсекции Acalyptratae и Calyptratae. Подсекция Acalyptratae включает в себя семейства Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae и Drosophilidae. Подсекция Calyptratae включает в себя семейства Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae и Sarcophagidae.
Отряд Lepidoptera включает в себя семейства Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae и Tineidae.
Нематоды включают в себя паразитические нематоды, такие как корневая нематода, цистообразующая нематода и ранящие нематоды, в том числе Heterodera spp., Meloidogyne spp. и Globodera spp., в частности, представители цистообразующих нематод включают без ограничения Heterodera glycines (соевая цистообразующая нематода); Heterodera schachtii (свекловичная нематода); Heterodera avenae (злаковая цистообразующая нематода); и Globodera rostochiensis и Globodera pallida (картофельные цистообразующие нематоды). Ранящие нематоды включают в себя виды рода Pratylenchus.
Чешуекрылые вредители (включающие виды, которые обозначаются как клопы, равнокрылые или полужесткокрылые) включают в себя без ограничения виды рода Lygus, такие как западный полевой клоп (Lygus hesperus), клоп травяной (Lygus lineolaris) и зеленый полевой клоп {Lygus elisus); тли, такие как тля персиковая зеленая (Myzus persicae), тля хлопковая (Aphis gossypii), тля вишневая или черная вишневая тля (Myzus cerasi), соевая тля (Aphis glycines Matsumura); бурая рисовая цикадка (Nilaparvata lugens) и рисовая зеленая цикадка (Nephotettix spp.); а также щитники, такие как зеленый щитник (Acrosternum hilare), коричневый мраморный щитник (Halyomorpha halys), овощной зеленый щитник (Nezara viridula), рисовый клоп-щитник (Oebalus pugnax), щитник красноногий (Pentatoma rufipes), европейский щитник (Rhaphigaster nebulosa) и настоящий щитник Troilus luridus.
Насекомые-вредители по настоящему изобретению для основных культур включают: маис: Ostrinia nubilalis, мотылек кукурузный; Agrotis ipsilon, совка-ипсилон; Helicoverpa zea, совка кукурузная; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Diatraea grandiosella, огневка кукурузная юго-западная; Elasmopalpus lignosellus, огневка кукурузная стеблевая; Diatraea saccharalis, огневка тростниковая; Diabrotica virgifera, западный кукурузный жук; Diabrotica longicornis barberi, блошка длинноусая; Diabrotica undecimpunctata howardi, блошка 11-точечная Говарда; виды рода Melanotus, проволочники; Cyclocephala borealis, северный масковый хрущ (личинка хруща); Cyclocephala immaculata, южный хрущ (личинка хруща); Popillia japonica, японский жук; Chaetocnema pulicaria, блошка стеблевая маисовая; Sphenophorus maidis, долгоносик кукурузный; Rhopalosiphum maidis, тля кукурузная листовая; Anuraphis maidiradicis, тля кукурузная корневая; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus sanguinipes, кобылка мексиканская; Hylemya platura, личинка мухи ростковой; Agromyza parvicornis, кукурузные моли-пестрянки; Anaphothrips obscrurus, трипе злаковый; Solenopsis milesta, муравей-вор; Tetranychus urticae, обыкновенный паутинный клещ; сорго: Chilo partellus, огневка сорговая; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Spodoptera cosmioides; Spodoptera eridania; Helicoverpa zea, совка кукурузная; Elasmopalpus lignosellus, огневка кукурузная стеблевая; Feltia subterranea, совка хлопковая; Phyllophaga crinita, личинка хруща; виды родов Eleodes, Conoderus и Aeolus, проволочники; Oulema melanopus, пьявица красногрудая; Chaetocnema pulicaria, блошка стеблевая маисовая; Sphenophorus maidis, долгоносик кукурузный; Rhopalosiphum maidis; тля кукурузная листовая; Sipha flava, тля желтая сахарного тростника; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Contarinia sorghicola, галлица сорговая; Tetranychus cinnabarinus, красный паутинный клещ; Tetranychus urticae, обыкновенный паутинный клещ; пшеница: Pseudaletia unipunctata, совка одноточечная; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Elasmopalpus lignosellus, огневка кукурузная стеблевая; Agrotis orthogonia, совка прямоугольная; Elasmopalpus lignosellus, огневка кукурузная стеблевая; Oulema melanopus, пьявица красногрудая; Hypera punctata, слоник листовой бобовый; Diabrotica undecimpunctata howardi, блошка 11-точечная Говарда; русская пшеничная тля; Schizaphis graminum, злаковая тля; Macrosiphum avenae, тля листовая; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus differentialis, кобылка отличительная; Melanoplus sanguinipes, кобылка мексиканская; Mayetiola destructor, гессенская муха; Sitodiplosis mosellana, галлица злаковая оранжевая; Meromyza americana, личинка американской меромизы; Hylemya coarctata, муха озимая; Frankliniella fusca, табачный трипе; Cephus cinctus, пилильщик хлебный американский; Aceria tulipae, луковичный клещ тюльпанов; подсолнечник: Suleima helianthana, листовертка подсолнечниковая; Homoeosoma electellum, огневка подсолнечниковая; zygogramma exclamationis, совка подсолнечниковая восклицательная; Bothyrus gibbosus, жук морковный; Neolasioptera murtfeldtiana, галлица семян подсолнечника; хлопок: Heliothis virescens, хлопковая совка; Helicoverpa zea, коробочный червь; Spodoptera exigua, совка малая; Pectinophora gossypiella, розовый коробочный червь; Anthonomus grandis, долгоносик хлопковый; Aphis gossypii, тля хлопковая; Pseudatomoscelis seriatus, слепняк хлопковый; Trialeurodes abutilonea, окаймленнокрылая белокрылка; Lygus lineolaris, клоп травяной; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus differentialis, кобылка отличительная; Thrips tabaci, трипе луковый; Franklinkiella fusca, трипе табачный; Tetranychus cinnabarinus, красный паутинный клещ; Tetranychus urticae, обыкновенный паутинный клещ; рис: Diatraea saccharalis, огневка тростниковая; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Spodoptera cosmioides; Spodoptera eridania; Helicoverpa zea, совка кукурузная; Colaspis brunnea, коласпис виноградный; Lissorhoptrus oryzophilus, долгоносик рисовый водяной; Sitophilus oryzae, долгоносик рисовый; Nephotettix nigropictus, рисовая цикадка; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Acrosternum hilare, зеленый щитник; Chilu suppressalis, огневка азиатская стеблевая; соя: Pseudoplusia includens, соевая совка; Anticarsia gemmatalis, совка бархатных бобов; Plathypena scabra, совка клеверная; Ostrinia nubilalis, мотылек кукурузный; Agrotis ipsilon, совка-ипсилон; Spodoptera exigua, совка малая; Spodoptera cosmioides; Spodoptera eridania; Heliothis virescens, хлопковая совка; Helicoverpa zea, коробочный червь; Epilachna varivestis, зерновка бобовая мексиканская; Myzuspersicae, тля персиковая зеленая; Empoasca fabae, цикадка картофельная; Acrosternum hilare, зеленый щитник; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus differentialis, кобылка отличительная; Hylemya platura, личинка мухи ростковой; Sericothrips variabilis, соевый трипе; Thrips tabaci, луковый трипе; Tetranychus turkestani, клещик паутинный атлантический; Tetranychus urticae, обыкновенный паутинный клещ; ячмень: Ostrinia nubilalis, мотылек кукурузный; Agrotis ipsilon, совка-ипсилон; Schizaphis graminum, злаковая тля; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Acrosternum hilare, зеленый щитник; Euschistus servus, коричневый щитник; Euschistus heros, неотропический коричневый щитник; Delia platura, муха ростковая; Mayetiola destructor, гессенская муха; Petrobia latens, петробия многоядная; рапс масличный:, Brevicoryne brassicae, тля капустная; Phyllotreta cruciferae, блошка крестоцветная; Mamestra configurata, берта совка; Plutella xylostella, моль капустная; виды рода Delia, корневые личинки.
Способы повышения урожайности растений
Предусмотрены способы повышения урожайности растений Способы предусматривают обеспечение растения или растительной клетки, экспрессирующих полинуклеотид, кодирующий пестицидную полипептидную последовательность, раскрытую в данном документе, и выращивание растения или его семени в поле, зараженном (или восприимчивым к заражению) вредителем, в отношении которого указанный полипептид проявляет пестицидную активность. В некоторых вариантах осуществления полипептид проявляет пестицидную активность против вредителя, относящегося к чешуекрылым, жесткокрылым, двукрылым, полужесткокрылым или нематодам, и при этом указанное поле заражено вредителем, относящимся к чешуекрылым, полужесткокрылым, жесткокрылым, двукрылым или нематодам. Как определено в данном документе, «урожайность» растения относится к качеству и/или количеству биомассы, производимой растением. Под «биомассой» подразумевают любой измеряемый продукт растительного происхождения. Повышение производства биомассы представляет собой любое улучшение урожайности измеряемого растительного продукта. Повышение урожайности растения имеет ряд коммерческих применений. Например, повышение биомассы листьев растений может повышать урожайность листовых овощей для потребления человеком или животными. Кроме того, повышение биомассы листьев может быть использовано для повышения производства фармацевтических или промышленных продуктов растительного происхождения. Повышение урожайности может предусматривать любое статистически значимое повышение, в том числе без ограничения повышение по меньшей мере на 1%, повышение по меньшей мере на 3%, повышение по меньшей мере на 5%, по повышение меньшей мере на 10%, повышение по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 100% или более повышение урожайности по сравнению с растением, не экспрессирующим пестицидную последовательность. В конкретных способах урожайность растений повышается как результат улучшенной устойчивости к вредителям растения, экспрессирующего пестицидный белок, описанный в данном документе. Экспрессия пестицидного белка приводит к сниженной способности вредителя к заражению или поеданию.
Растения также можно обрабатывать одной или несколькими химическими композициями, в том числе одним или несколькими гербицидами, инсектицидами или фунгицидами. Иллюстративные химические композиции включают: гербициды для фруктовых/овощных культур: атразин, бромацил, диурон, глифосат, линурон, метрибузин, симазин, трифторалин, флуазифоп, глюфосинат, галосульфурон Gowan, паракват, пропизамид, сетоксидим, бутафенацил, галосульфурон, индазифлам; инсектициды для фруктовых/овощных культур: алдикарб, Bacillus thuriengiensis, карбарил, карбофуран, хлорпирифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, цифлутрин/бета-цифлутрин, эсфенвалерат, лямбда-цигалотрин, ацехиноцил, бифеназат, метоксифенозид, новалурон, кромафенозид, тиаклоприд, динотефуран, флуакрипирим, спиродиклофен, гамма-цигалотрин, спиромезифен, спиносад, ринаксипир, циазипир, трифлумурон, спиротетрамат, имидаклоприд, флубендиамид, тиодикарб, метафлумизон, сульфоксафлор, цифлуметофен, цианопирафен, клотианидин, тиаметоксам, спиноторам, тиодикарб, флоникамид, метиокарб, эмамектин-бензоат, индоксакарб, фенамифос, пирипроксифен, фенбутатин-оксид; фунгициды для фруктовых/овощных культур: аметоктрадин, азоксистробин, бентиаваликарб, боскалид, каптан, карбендазим, хлорталонил, медь, циазофамид, цифлуфенамид, цимоксанил, ципроконазол, ципродинил, дифеноконазол, диметоморф, дитианон, дитианон, фенгексамид, флуазинам, флудиоксонил, фторпиколид, фторпирам, флуоксастробин, флуксапироксад, фолпет, фосетил, ипродион, ипроваликарб, изопиразам, крезоксим метил, манкозеб, мандипропамид, металаксил/мефеноксам, метирам, метрафенон, миклобутанил, пенконазол, пентиопирад, пикоксистробин, пропамокарб, пропиконазол, пропинеб, проквиназид, протиоконазол, пираклостробин, пириметанил, квиноксифен, спироксамин, сера, тебуконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин; гербициды для злаковых растений: 2,4-Д, амидосульфурон, бромоксинил, карфентразон-этил, хлоротолурон, хлорсульфурон, клодинафоп-пропаргил, клопиралид, дикамба, диклофоп-метил, дифлуфеникан, феноксапроп, флорасулам, флукарбазон-NA, флуфенацет, флупиросульфурон-М, флуропиксир, флуртамон, глифосат, йодосульфурон, иоксинил, изопротурон, МСРА, мезосульфурон, метсульфурон, пендиметалин, пиноксаден, пропоксикарбазон, просульфокарб, пироксулам, сульфосульфурон, тифенсульфурон, тралкоксидим, триасульфурон, трибенурон, трифлуралин, тритосульфурон; фунгициды для злаковых растений: азоксистробин, биксафен, боскалид, карбендазим, хлорталонил, цифлуфенамид, ципроконазол, ципродинил, димоксистробин, эпоксиконазол, фенпропидин, фенпропиморф, флуопирам, флуоксастробин, флуквинконазол, флуксапироксад, изопиразам, крезоксим-метил, метконазол, метрафенон, пентиопирад, пикоксистробин, прохлораз, пропиконазол, проквиназид, протиоконазол, пираклостробин, квиноксифен, спироксамин, тебуконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин; инсектициды для злаковых растений: диметоат, лямбда-цигалотрин, дельтаметрин, альфа-циперметрин, В-цифлутрин, бифентрин, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динотефуран, хлорпирифос, пиримикарб, метиокарб, сульфоксафлор; гербициды для маиса: атразин. алахлор, бромоксинил, ацетохлор, дикамба, клопиралид, (S-)диметенамид, глюфосинат, глифосат, изоксафлутол, (S-)метолахлор, мезотрион, никосульфурон, примисульфурон, римсульфурон, сулкотрион, форамсульфурон, топрамезон, темботрион, сафлуфенацил, тиенкарбазон, флуфенацет, пироксасульфон; инсектициды для маиса: карбофуран. хлорпирифос, бифентрин, фипронил, имидаклоприд, лямбда-цигалотрин, тефлутрин, тербуфос, тиаметоксам, клотианидин, спиромезифен, флубендиамид, трифлумурон, ринаксипир, дельтаметрин, тиодикарб, β-цифлутрин, циперметрин, бифентрин, луфенурон, тебупиримфос, этипрол, циазипир, тиаклоприд, ацетамиприд, динотефуран, авермектин; фунгициды для маиса: азоксистробин, биксафен, боскалид, ципроконазол, димоксистробин, эпоксиконазол, фенитропан, флуопирам, флуоксастробин, флуксапироксад, изопиразам, метконазол, пентиопирад, пикоксистробин, пропиконазол, протиоконазол, пираклостробин, тебуконазол, трифлоксистробин; гербициды для риса бутахлор. пропанил, азимсульфурон, бенсульфурон, цигалофоп, даимурон, фентразамид, имазосульфурон, мефенацет, оксазикломефон, пиразосульфурон, пирибутикарб, хинклорак, тиобенкарб, инданофан, флуфенацет, фентразамид, галосульфурон, оксазикломефон, бензобициклон, пирифталид, пеноксулам, биспирибак, оксадиаргил, этоксисульфурон, претилахлор, мезотрион, тефурилтрион, оксадиазон, феноксапроп, пиримисульфан; инсектициды для риса: диазинон. фенобукарб, бенфуракарб, бупрофезин, динотефуран, фипронил, имидаклоприд, изопрокарб, тиаклоприд, кромафенозид, клотианидин, этипрол, флубендиамид, ринаксипир, дельтаметрин, ацетамиприд, тиаметоксам, циазипир, спиносад, спиноторам, эмамектин-бензоат, циперметрин, хлорпирифос, этофенпрокс, карбофуран, бенфуракарб, сульфоксафлор; фунгициды для риса: азоксистробин, карбендазим, карпропамид, диклоцимет, дифеноконазол, эдифенфос, феримзон, гентамицин, гексаконазол, гимексазол, ипробенфос (IBP), изопротиолан, изотианил, касугамицин, манкозеб, метоминостробин, оризастробин, пенцикурон, пробеназол, пропиконазол, пропинеб, пироквилон, тебуконазол, тиофанат-метил, тиадинил, трициклазол, трифлоксистробин, валидамицин; гербициды для хлопка: диурон, флуометурон, MSMA, оксифлуорфен, прометрин, трифлуралин, карфентразон, клетодим, флуазифоп-бутил, глифосат, норфлуразон, пендиметалин, пиритиобак натрия, трифлоксисульфурон, тепралоксидим, глюфосинат, флумиоксазин, тидиазурон; инсектициды для хлопка: ацефат, алдикарб, хлорпирифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, ацетамиприд, эмамектин-бензоат, имидаклоприд, индоксакарб, лямбда-цигалотрин, спиносад, тиодикарб, гамма-цигалотрин, спиромезифен, пиридалил, флоникамид, флубендиамид, трифлумурон, ринаксипир, бета-цифлутрин, спиротетрамат, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, динотефуран, флубендиамид, циазипир, спиносад, спиноторам, гамма-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-yl)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5Н)-он, тиодикарб, авермектин, флоникамид, пиридалил, спиромезифен, сульфоксафлор; фунгициды для хлопка: азоксистробин, биксафен, боскалид, карбендазим, хлорталонил, медь, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробин, эпоксиконазол, фенамидон, флуазинам, флуопирам, флуоксастробин, флуксапироксад, ипродион, изопиразам, изотианил, манкозеб, манеб, метоминостробин, пентиопирад, пикоксистробин, пропинеб, протиоконазол, пираклостробин, квинтозен, тебуконазол, тетраконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин; гербициды для сои: алахлор, бентазон, трифлуралин, хлоримурон-этил, хлорансулам-метил, феноксапроп, фомесафен, флуазифоп, глифосат, имазамокс, имазаквин, имазетапир, (S-)метолахлор, метрибузин, пендиметалин, тепралоксидим, глюфосинат; инсектициды для сои: лямбда-цигалотрин. метомил, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динотефуран, флубендиамид, ринаксипир, циазипир, спиносад, спиноторам, эмамектин-бензоат, фипронил, этипрол, дельтаметрин, β-цифлутрин, гамма- и лямбда-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5Н)-он, спиротетрамат, спинодиклофен, трифлумурон, флоникамид, тиодикарб, бета-цифлутрин; фунгициды для сои: азоксистробин, биксафен, боскалид, карбендазим, хлорталонил, медь, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробин, эпоксиконазол, флуазинам, флуопирам, флуоксастробин, флутриафол, флуксапироксад, изопиразам, ипродион, изотианил, манкозеб, манеб, метконазол, метоминостробин, миклобутанил, пентиопирад, пикоксистробин, пропиконазол, пропинеб, протиоконазол, пираклостробин, тебуконазол, тетраконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин; гербициды для сахарной свеклы: хлоридазон. десмедифам, этофумезат, фенмедифам, триаллат, клопиралид, флуазифоп, ленацил, метамитрон, квинмерак, циклоксидим, трифлусульфурон, тепралоксидим, квизалофоп; инсектициды для сахарной свеклы: имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, тиаклоприд, ацетамиприд, динотефуран, дельтаметрин, β-цифлутрин, гамма-/лямбда-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5Н)-он, тефлутрин, ринаксипир, циаксипир, фипронил, карбофуран; гербициды для канолы: клопиралид, диклофоп, флуазифоп, глюфосинат, глифосат, метазахлор, трифлуралин этаметсульфурол, квинмерак, квизалофоп, клетодим, тепралоксидим; фунгициды для канолы: азоксистробин, биксафен, боскалид, карбендазим, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробин, эпоксиконазол, флуазинам, флуопирам, флуоксастробин, флусилазол, флуксапироксад, ипродион, изопиразам, мепикват-хлорид, метконазол, метоминостробин, паклобутразол, пентиопирад, пикоксистробин, прохлораз, протиоконазол, пираклостробин, тебуконазол, тиофанат-метил, трифлоксистробин, винклозолин; инсектициды для рапса: карбофуран. тиаклоприд, дельтаметрин, имидаклоприд, клотианидин, тиаметоксам, ацетамиприд, динотефуран, В-цифлутрин, гамма- и лямбда-цигалотрин, тау-флувалериат, этипрол, спиносад, спиноторам, флубендиамид, ринаксипир, циазипир, 4-[[(6-хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5Н)-он.
Способы введения гена по настоящему изобретению в другое растение
Также в данном документе предусмотрены способы введения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в другое растение. Нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или ее фрагмент можно вводить в другое растение путем повторяющейся селекции, обратного скрещивания, племенного размножения, направленного отбора, массового отбора, мутационной селекции и/или улучшенного отбора по генетическому маркеру.
Таким образом, в одном варианте осуществления в способах по настоящему изобретению предусматривают скрещивание первого растения, содержащего нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, со вторым растением для получения потомства растений F1, и отбор потомства растений F1, которое содержит нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. В способах может дополнительно предусматриваться скрещивание отобранного потомства растений с первым растением, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, с получением потомства растений от обратного скрещивания и отбор потомства растений от обратного скрещивания, которое содержит нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Способы оценки пестицидной активности приведены в данном документе в другой его части. В способах могут дополнительно предусматриваться повторение этих стадий один или несколько раз подряд с получением отобранных второго или более дальнего потомства растений от обратного скрещивания, которое содержит нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.
В способе по настоящему изобретению можно применять любой способ разведения, предусматривающий отбор растений с требуемым фенотипом. В некоторых вариантах осуществления растения F1 могут подвергаться самоопылению для получения сегрегационного поколения F2. Затем отдельные растения можно подвергать отбору по требуемому фенотипу (например, пестицидной активности) в каждом поколении (F3, F4, F5 и т.д.) до тех пор, пока признаки не станут гомозиготными или зафиксированными в племенной популяции.
Второе растение может представлять собой растение, имеющее требуемый признак, такой как переносимость гербицидов, переносимость насекомых, переносимость засухи, контроль нематод, эффективность использования воды, эффективность использования азота, улучшенная питательная ценность, устойчивость к болезням, улучшенный фотосинтез, улучшенное качество волокна, переносимость стресса, улучшенное размножение и им подобные. Второе растение может представлять собой элитный трансформант, как описано в данном документе в другой его части.
В различных вариантах осуществления части растений (целые растения, органы растений (например, листья, стебли, корни и т.д.), семена, растительные клетки, пропагулы, эмбрионы и т.п.) могут быть выращены в результате скрещивания и или размножены, или собраны для последующего использования (например, продукты питания, корм, биотопливо, масло, мука, шрот и т.д.).
Способы получения растительного продукта
Настоящее изобретение также относится к способу получения товарного продукта, предусматривающему выращивание и/или измельчение зерен из культуры, содержащей нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, для получения товарного продукта. Важные в агрономическом и коммерческом плане продукты и/или композиции химически связанных веществ включают в том числе без ограничения корм для животных, товары и растительные продукты и побочные продукты, предназначенные для применения в качестве продуктов питания для потребления человеком или для применения в композициях и товарах, предназначенных для человека, в частности, продукты из переработанного семени/зерна, в том числе полуфабрикаты, полученные из таких зерен/семян, где указанный продукт представляет собой или содержит цельные или переработанные семена или зерно, корм для животных, кукурузный или соевый шрот, кукурузную или соевую муку, кукурузу, кукурузный крахмал, соевый шрот, соевую муку, хлопья, концентрат соевого белка, изоляты соевого белка, текстурированный концентрат соевого белка, косметические средства, средства по уходу за волосами, масло соевых бобов, натто, темпе, гидролизованный соевый белок, взбитые сливки, шортенинг, лецитин, съедобные цельные соевые бобы (сырые, жареные или в виде эдамаме), соевый йогурт, соевый сыр, тофу, юбу, а также вареное, шлифованное, пропаренное, запеченное или бланшированное зерно и им подобное, включены в объем настоящего изобретения, если эти продукты и композиции химически связанных веществ содержат определяемые количества нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей, изложенных в данном документе, как диагностические для любого растения, содержащего такие нуклеотидные последовательности.
Следующие примеры предложены в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения.
Экспериментальные примеры
Пример 1. Обнаружение новых пестицидных генов Pseudomonas putida
Новые пестицидные гены идентифицировали в бактериальном штамме АТХ83556 с применением следующих стадий:
- Получение общей ДНК из штамма. Общая ДНК содержит как геномную ДНК, так и внехромосомную ДНК. Внехромосомная ДНК содержит смесь нескольких или всего из следующего: плазмиды разного размера; фаговых хромосом; других неописанных внехромосомных молекул.
- Секвенирование ДНК. Полную ДНК секвенировали с помощью способов секвенирования нового поколения.
- Идентификация предполагаемых генов, кодирующих токсин, посредством анализа гомологии и/или других вычислительных анализов.
- При необходимости последовательность гена, представляющего интерес, оптимизируют посредством одной из нескольких стратегий ПЦР или клонирования (например, TAIL-PCR).
*Белки, кодируемые от нисходящего сайта инициации, относятся к Axmi554.
2
4
2
4
4
2
4
Описанный в данном документе ген, кодирующий токсин, амплифицируют с помощью ПЦР из рАХ980, и продукт ПЦР клонируют в вектор экспрессии рАХ916 Bacillus или другой подходящий вектор посредством способов, хорошо известных в данной области. Полученный штамм Bacillus, содержащий вектор с геном axmi, культивировали на традиционной питательной среде, такой как среда CYS (10 г/л бакто-казитона, 3 г/л дрожжевого экстракта, 6 г/л KHPO, 14 г/л KHPO, 0,5 мМ MgSO, 0,05 мМ MnCl, 0,05 мМ FeSO) до тех пор, пока при микроскопическом исследовании споруляция не была явной. Готовили образцы и исследовали их в отношении биологической активности.
Пример 2. Анализы пестицидной активности
Нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению можно исследовать в отношении их способности продуцировать пестицидные белки. Способность пестицидного белка действовать как пестицид в отношении вредителя часто оценивают с помощью нескольких способов. Одним из способов, хорошо известных в данной области, является проведение анализа со скармливанием. В таком анализе со скармливанием вредителя подвергают воздействию образцом, содержащем или проверяемые соединения, или контрольные образцы. Часто это выполняют путем помещения исследуемого материала или такого материала с в соответствующем разбавлении на материал, который будет поглощен вредителем, например в искусственную питательную среду. Исследуемый материал может состоять из жидкости, твердого вещества или суспензии. Исследуемый материал может быть нанесен на поверхность, а затем высушен. Альтернативно исследуемый материал можно смешивать с жидкой искусственной питательной средой, а затем распределять в камере для анализа. Камера для анализа может представлять собой, например, чашку, лоток или лунку микротитрационного планшета.
Анализы с сосущими вредителями (например, тлей) могут предусматривать отделение исследуемого материала от насекомого при помощи перегородки, желательно часть которой может проколоть сосущее насекомое сосущим ротовым аппаратом для обеспечения поглощения проверяемого материала. Часто исследуемый материал смешивают со стимулятором поедания, таким как сахароза, для обеспечения лучшего поглощения проверяемого соединения.
Другие типы анализов могут включать микроинъекцию исследуемого материала в ротовой аппарат или кишечник вредителя, а также развитие трансгенных растений с последующим исследованием способности вредителя питаться таким трансгенным растением. Исследование растения может включать в себя выделение частей растения, которые обычно потребляются, например, при помощи небольших клеток, прикрепленных к листу, или выделение целых растений в клетки, содержащие насекомых.
Другие способы и подходы к анализу вредителей известны в из уровня техники и могут быть найдены, например, в Robertson and Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. Альтернативно анализы представляют собой анализы, в целом описанные в журналах Arthropod Management Tests и Journal of Economic Entomology, или одобренные в ходе обсуждения с представителями Энтомологического общества Америки (ESA).
В некоторых вариантах осуществления участки ДНК, кодирующие участок токсина в пестицидных белках, описанных в данном документе, клонируют в вектор экспрессии pMAL-C4x Е. coli за геном malE, кодирующим мальтоза-связывающий белок (МВР). Такие слияния в пределах рамки считывания приводят к экспрессии слитых белков MBP-Axmi в Е. coli.
Для экспрессии в Е. coli BL21*DE3 трансформируют индивидуальными плазмидами. Отдельные колонии инокулируют в среде LB, дополненной карбенициллином и глюкозой, и выращивают в течение ночи при 37°C. На следующий день свежую среду инокулируют 1% ночной культуры и колонии выращивают при 37°C до логарифмической фазы. Затем культуры индуцируют при помощи 0,3 мМ IPTG в течение ночи при 20°C. Каждый клеточный осадок суспендируют в 20 мМ буфере Tris-Cl, рН 7,4+200 мМ NaCl+1 мМ DTT + ингибиторы протеазы и обрабатывают ультразвуком. Для подтверждения экспрессии слитых белков можно использовать анализ посредством SDS-PAGE.
Затем полностью свободные от клеток экстракты пропускают через амилозную колонку, подсоединенную к аппарату для жидкостной экспресс-хроматографии белков (FPLC) для аффинной очистки белков слияния MBP-axmi. Связанные слитые белки элюируют из смолы при помощи 10 мМ раствора мальтозы. Затем очищенные слитые белки расщепляют либо с помощью фактора Ха, либо трипсина для удаления аминоконцевой метки МВР из белка Axmi. Расщепление и растворимость белков можно определить с помощью SDS-PAGE
Пример 3. Экспрессия и очистка
Axmi554.1 и Axmi554.2 экспрессировали и анализировали в отношении биологической активности. Оптимизированные гены Е. coli (SEQ ID NO: 2 и 3, соответственно кодирующие аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID NO: 4 и 5 соответственно) синтезировали для экспрессии и клонировали в вектор экспрессии pMalC4X. Клоны подтверждали при помощи секвенирования. С использованием pGen554-1 и pGen554-2 трансформировали компетентные клетки Bl21 для экспрессии белков. Отдельную колонию из каждой свежетрансформированной культуры в чашке инокулировали в среде LB и выращивали при 37°C до логарифмической фазы и индуцировали при помощи 1 мМ IPTG при 18°C в течение 18 часов. Очищенные Axmi554.1 и Axmi554.2 предоставляли для анализа биологической активности в отношении выбранных насекомых-вредителей в соответствии со стандартным протоколом. Результаты представлены в таблицах 1-4.
Пример 4. Введение генов с помощью векторов для экспрессии в растениях
Кодирующие области по настоящему изобретению связаны с соответствующими промоторными и терминаторными последовательностями для экспрессии в растениях. Такие последовательности хорошо известны в данной области и могут включать в себя промотор актина риса или промотор убиквитина маиса для экспрессии в однодольных, промотор UBQ3 Arabidopsis или промотор 35S CaMV для экспрессии в двудольных растениях и терминаторы nos или PinII. Способы получения и подтверждения конструкций промотор-ген-терминатор также хорошо известны в данной области.
В одном аспекте настоящего изобретения конструируют и получают синтетические последовательности ДНК. Данные синтетические последовательности характеризовались измененной нуклеотидной последовательностью по сравнению с исходной последовательностью, но кодируют белки, которые, по сути, идентичны исходной последовательности.
В другом аспекте настоящего изобретения модифицированные версии синтетических генов сконструированы таким образом, что полученный пептид нацелен на органеллу растения, такую как эндоплазматический ретикулум или апопласт. В данной области известны последовательности пептидов, которые, как известно, приводят к нацеливанию слитых белков на органеллы растения. Например, N-концевой участок гена кислой фосфатазы из люпина белого Lupinus albus (GENBANK ID GI:14276838, Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606), как известно из уровня техники, приводит к нацеливанию гетерологичных белков в эндоплазматический ретикулум. Если полученный слитый белок также содержит последовательность запоминания эндоплазматического ретикулума, содержащую пептид N-конец-лизин-аспарагиновая кислота-глутаминовая кислота (то есть мотив «KDEL», SEQ ID NO:11) на С-конце, то слитый белок будет нацелен на эндоплазматический ретикулум. Если слитый белок лишен на С-конце последовательности, нацеливающейся на эндоплазматический ретикулум, белок будет нацеливаться на эндоплазматический ретикулум, но в конечном итоге он будет секвестрирован в апопласте.
Таким образом, данный ген кодирует слитый белок, который содержит тридцать одну N-концевую аминокислоту гена кислой фосфатазы из люпина белого Lupinus albus (GENBANK ID GI: 14276838, Miller et al., 2001, выше), слитые с N-концом аминокислотной последовательности по настоящему изобретению, а также последовательность KDEL (SEQ ID NO:11) на С-конце. Таким образом, полученный в результате белок предположительно будет нацелен на эндоплазматический ретикулум растения после экспрессии в растительной клетке.
Кассеты экспрессии растений, описанные выше, совмещают с подходящим селектируемым маркером растений для облегчения отбора трансформированных клеток и тканей и лигируют в векторы трансформации растений. Они могут включать в себя бинарные векторы для трансформации, опосредованной Agrobacterium, или простые плазмидные векторы для аэрозольной или биолистической трансформации.
Пример 5. Трансформация сои
Трансформацию сои осуществляют с применением способов, хорошо известных в из уровня техники, таких как описанное применение трансформации эксплантатов из половины семени сои, опосредованной Agrobacterium tumefaciens, с применением, по сути, способа, описанного в Paz et al. (2006), Plant cell Rep.25:206. Трансформанты идентифицируют с применением темботриона в качестве маркера для отбора. Наблюдали появление зеленых побегов, и данный показатель фиксировали как переносимость гербицида изоксафлутола или темботриона. Трансгенные побеги, характеризующиеся переносимостью, проявляют нормальную зеленую окраску по сравнению с побегами сои дикого типа, не обработанными изоксафлутолом или темботрионом, в то время как побеги сои дикого типа, обработанные таким же количеством изоксафлутола или темботриона, будут полностью бесцветными. Это указывает на то, что присутствие белка HPPD обеспечивает переносимость в отношении гербицидов-ингибиторов HPPD, таких как изоксафлутол или темботрион.
Зеленые побеги с переносимостью переносят на среду для корнеобразования или прививают. Укорененные саженцы после акклиматизационного периода переносят в теплицу. Затем растения, содержащие трансген, опрыскивают гербицидами-ингибиторами HPPD, например, темботрином в норме внесения 100 г AI/га или мезотрионом в норме внесения 300 г AI/га, с добавлением аммония сульфата и сложного метилового эфира масла семян рапса. Через десять дней после нанесения оценивают симптомы, связанные с нанесением гербицида, и сравнивают с симптомами, наблюдаемыми у растений дикого типа при тех же условиях.
Пример 6. Укоренение и отбор растений хлопчатника ТО.
Трансформацию хлопка осуществляют с применением способов, хорошо известных из уровня техники, особенно предпочтительного способа, описанного в публикации патента PCT WO 00/71733. Регенерировавшие растения переносят в теплицу. После периода акклиматизации достаточно подросшие растения опрыскивают гербицидами-ингибиторами HPPD, например темботрионом, эквивалентно 100 или 200 г AI/га с добавлением аммония сульфата и сложного метилового эфира масла семян рапса. Через семь дней после опрыскивания оценивают симптомы, обусловленные обработкой гербицидом, и сравнивают с симптомами, наблюдаемыми у растений хлопка дикого типа, подвергнутых такой же обработке в тех же условиях.
Пример 7. Трансформация клеток маиса с применением генов, кодирующих пестицидные белки, описанных в данном документе
Початки маиса лучше всего собирать через 8-12 дней после опыления. Эмбрионы выделяли из початков, и эти эмбрионы размером 0,8-1,5 мм являлись предпочтительными для применения в трансформации. Эмбрионы помещали щитком вверх на чашки в подходящую инкубационную среду, такую как среда DN62A5S (3,98 г/л солей N6; 1 мл/л (1000х базового раствора) витаминов N6; 800 мг/л L-аспарагина; 100 мг/л миоинозитола; 1,4 г/л L-пролина; 100 мг/л казаминовых кислот; 50 г/л сахарозы; 1 мл/л (1 мг/мл маточного раствора) 2,4-Д). Однако среды и соли, отличные от DN62A5S, также являются подходящими и известны в данной области. Эмбрионы инкубировали в течение ночи при 25°C в темноте. Однако инкубация эмбрионов в течение ночи не является необходимой per se.
Полученные эксплантаты переносили на квадратные ячейки (30-40 на чашку), переносили на осмотическую среду на приблизительно 30-45 минут, затем переносили на пластину с пучковым ускорителем (см., например, публикацию PCT № WO/0138514 и патент США №5240842).
Конструкциям ДНК, разработанным в соответствии с генами по настоящему изобретению, в растительных клетках придавали ускорение в растительную ткань с использованием аэрозольного пучкового ускорителя, применяя условия, по сути, как описано в публикации PCT № WO/0138514. После воздействия пучком эмбрионы инкубировали в течение приблизительно 30 мин на осмотической среде и помещали в среду для инкубации в течение ночи при 25°C в темноте. Чтобы избежать чрезмерного повреждения облученных эксплантатов, их инкубировали по меньшей мере за 24 часа до переноса в среду для восстановления. Эмбрионы затем распределяли в среде для периода восстановления на приблизительно 5 дней, при 25°C в темноте, а затем переносили в среду для отбора. Эксплантаты инкубировали в среде для отбора в течение срока до восьми недель в зависимости от природы и характеристик используемого конкретного отбора. После периода отбора полученный каллюс переносили на среду для созревания эмбрионов на срок, пока не наблюдается образование зрелых соматических эмбрионов. Полученные зрелые соматические эмбрионы затем помещали в условия слабого освещения и процесс регенерации инициировали с помощью способов, известных в данной области. Полученные побеги подвергали укоренению на среде для корнеобразования, и полученные растения переносили в емкости для рассады и размножали в качестве трансгенных растений.
Показатель рН раствора доводили до рН 5,8 с помощью 1 н. КОН/1 н. KCl, добавляют гельрит (Sigma) с концентрацией до 3 г/л и среду подвергали автоклавированию. После охлаждения до 50°C добавляли 2 мл/л маточного раствора с концентрацией нитрата серебра 5 мг/мл (Phytotechnology Labs).
Пример 8. Трансформация генов по настоящему изобретению в растительных клетках при помощи onocpegoBsamoiiAgrobacterium трансформации
Початки лучше всего собирать через 8-12 дней после опыления. Эмбрионы выделяли из початков, и эти эмбрионы размером 0,8-1,5 мм являлись предпочтительными для применения в трансформации. Эмбрионы помещали щитком вверх на чашки в подходящую инкубационную среду и инкубировали в течение ночи при 25°C в темноте. Однако инкубация эмбрионов в течение ночи не является необходимой per se. Эмбрионы в течение приблизительно 5-10 минут приводили в контакт со штаммом Agrobacterium, содержащим соответствующие векторы для опосредованного Ti-плазмидой переноса, а затем высевали на среду для совместного культивирования на период приблизительно 3 дня (22°C в темноте). После совместного культивирования эксплантаты переносили в среду для периода восстановления на приблизительно 5-10 дней (при 25°C в темноте). Эксплантаты инкубировали в среде для отбора в течение срока до восьми недель в зависимости от природы и характеристик используемого конкретного отбора. После периода отбора полученный каллюс переносили на среду для созревания эмбрионов на срок, пока не наблюдается образование зрелых соматических эмбрионов. Полученные зрелые соматические эмбрионы затем помещали в условия слабого освещения и процесс регенерации инициировали как известно в данной области.
Пример 9. Трансформация риса
Незрелые семена риса, содержащие эмбрионы на соответствующей стадии развития, собирали из донорских растений, выращенных в тщательно контролируемых условиях в теплице. После стерилизации семян незрелые эмбрионы вырезали и подвергали предварительной индукции на твердой среде в течение 3 дней. После предварительной индукции эмбрионы погружали на несколько минут в суспензию Agrobacterium, содержащую требуемые векторы. Затем эмбрионы совместно культивировали на твердой среде, содержащей ацетосирингон, и инкубировали в темноте в течение 4 дней. Эксплантаты затем переносили в первую селективную среду, содержащую фосфинотрицин в качестве средства для отбора. Примерно через 3 недели щитки с развающимся каллюсом разрезали на несколько мелких кусочков и переносили на ту же самую селективную среду. Последующие субкультивирования проводили примерно каждые 2 недели. При каждом субкультивировании активно растущие каллюсы разрезали на более мелкие кусочки и инкубировали на второй селективной среде. Через несколько недель каллюсы с отчетливой устойчивостью к фосфинотрицину переносили в селективную среду для регенерации. Полученные саженцы культивировали на среде МС с половинной концентрацией компонентов для полного роста в длину. Растения в конечном итоге переносили в почву и выращивали в теплице.
Все публикации и патентные заявки, упомянутые в описании, указывают на уровень квалификации специалистов в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Все публикации и патентные заявки включены в данный документ посредством ссылки в том же объеме, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была специально и отдельно указана для включения посредством ссылки.
Несмотря на то, что настоящее изобретение для обеспечения ясности и облегчения его понимания довольно подробно описано с иллюстрациями и примерами, понятно, что в него могут быть внесены определенные изменения и модификации в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  БАЙЕР КРОПСАЙЕНС ЛП
БАЙЕР КРОПСАЙЕНС АГ
<120>  ГЕН AXMI554, КОДИРУЮЩИЙ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИН, И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  APA15-6006WO
<150>  62/241,220
<151>  2015-10-14
<160>  13
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  846
<212>  ДНК
<213>  Pseudomonas putida
<400>  1
atgtgttgct acttactaag gaaggtaaaa atgagcacag ttgatttgga tgcaatcttc       60
aagcgctacg gtgattggtg gtgcaagcaa aatggaggga agtgtgatcg catgaatcct      120
gttcagccgg gctatgagca gcataggttg attgtgtcca acgaacatat cgagtactac      180
ggaaacccta acaaggttgt tgtgccacag atcgcgtctc agcaagtttt ggttaactct      240
acttcagtgg agcagtctca gtccgtgagg ttttccaaga ctacgtcgag cacatttacg      300
tggtctctgc aagaaggtat caagcttggg atgtccgtta cctataaggt gggtgtcgcc      360
cctatcatgt cggcggaaac cactattagt ggcgaactga gcttctcgag cacgcaaaca      420
aacacacaga cagagaccaa aacttgggag gttgctcagc ctgtcattgt ccctgctaag      480
actcaagttc aatccgtttt ggtaattgat gaaagtcgcg tcactcaaaa gtttcacaat      540
aagtttacgt tgagtggcag cgtttgtagt aatagcccaa gtaagatcaa tggtcactat      600
ttctggttcc actcggtctc ggatatattt aataagtttc ctcagccggg ctttaccgtg      660
cgcagtgggc aggtttttta cgagggcgat ggtagctttg acggggtcgc ggggattgga      720
acccgactgg aactcaccga aagtccaatt ggtgatccat caaaagtcct gaagacttat      780
agtgtaattc ctgtagtacc aggcgccggg gtagcaaggc tggctgatat ggtcgatgag      840
actgct                                                                 846
<210>  2
<211>  846
<212>  ДНК
<213>  Pseudomonas putida
<400>  2
atgtgctgct acctgctgcg taaagtcaaa atgtcaacgg tggacctgga tgctatcttc       60
aaacgctatg gtgattggtg gtgtaaacag aacggcggta aatgcgatcg tatgaatccg      120
gtgcagccgg gctatgaaca acatcgcctg attgttagta acgaacacat cgaatattac      180
ggtaacccga ataaagtggt tgtcccgcag attgccagcc agcaagtcct ggtgaattca      240
acctcggtgg aacagagcca gagcgtgcgt ttttccaaaa ccacgagctc taccttcacg      300
tggtcactgc aggaaggcat caaactgggc atgtcggtta cctacaaagt tggcgtcgct      360
ccgattatgt ccgcggaaac cacgatctcc ggtgaactgt catttagttc cacccagacg      420
aacacccaaa cggaaaccaa aacgtgggaa gtggcccagc cggtgattgt tccggcaaaa      480
acccaggtcc aatctgtcct ggtgatcgat gaaagtcgcg tgacccagaa atttcataac      540
aaattcacgc tgagtggctc cgtttgttca aactcgccga gcaaaatcaa cggtcattac      600
ttctggttcc actctgtgag tgacatcttt aataaattcc cgcagccggg tttcaccgtt      660
cgtagcggtc aagtctttta cgaaggcgat ggttctttcg acggcgttgc tggcattggt      720
acccgcctgg aactgacgga atcgccgatc ggtgatccga gcaaagtcct gaaaacctat      780
tctgtgattc cggtggttcc gggtgcgggt gttgcccgtc tggcagatat ggtcgacgaa      840
acggca                                                                 846
<210>  3
<211>  816
<212>  ДНК
<213>  Pseudomonas putida
<400>  3
atgagcacgg tggacctgga cgctatcttc aaacgctacg gcgactggtg gtgtaaacaa       60
aatggtggca aatgtgaccg catgaatccg gtgcagccgg gctatgaaca acatcgtctg      120
attgttagta acgaacacat cgaatattac ggtaacccga ataaagtggt tgtcccgcag      180
attgccagcc agcaagtcct ggtgaattca acctcggtgg aacagagcca gagcgtgcgc      240
ttttccaaaa ccacgagctc taccttcacg tggtcactgc aggaaggcat caaactgggc      300
atgtcggtta cctacaaagt tggcgtcgct ccgattatgt ccgcggaaac cacgatctcc      360
ggtgaactgt catttagttc cacccagacg aacacccaaa cggaaaccaa aacgtgggaa      420
gtggcccagc cggtgattgt tccggcaaaa acccaggtcc aatctgtcct ggtgatcgat      480
gaaagtcgtg tgacccagaa atttcataac aaattcacgc tgagtggctc cgtttgctca      540
aactcgccga gcaaaatcaa cggtcattac ttctggttcc actctgtgag tgacatcttt      600
aataaattcc cgcagccggg tttcaccgtt cgtagcggtc aagtctttta cgaaggcgat      660
ggttctttcg acggcgttgc tggcattggt acccgcctgg aactgacgga atcgccgatc      720
ggtgatccga gcaaagtcct gaaaacctat tctgtgattc cggtggttcc gggtgcgggt      780
gttgcccgcc tggcagatat ggtcgacgaa acggca                                816
<210>  4
<211>  282
<212>  БЕЛОК
<213>  Pseudomonas putida
<400>  4
Met Cys Cys Tyr Leu Leu Arg Lys Val Lys Met Ser Thr Val Asp Leu
1               5                   10                  15
Asp Ala Ile Phe Lys Arg Tyr Gly Asp Trp Trp Cys Lys Gln Asn Gly
20                  25                  30
Gly Lys Cys Asp Arg Met Asn Pro Val Gln Pro Gly Tyr Glu Gln His
35                  40                  45
Arg Leu Ile Val Ser Asn Glu His Ile Glu Tyr Tyr Gly Asn Pro Asn
50                  55                  60
Lys Val Val Val Pro Gln Ile Ala Ser Gln Gln Val Leu Val Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Ser Val Glu Gln Ser Gln Ser Val Arg Phe Ser Lys Thr Thr Ser
85                  90                  95
Ser Thr Phe Thr Trp Ser Leu Gln Glu Gly Ile Lys Leu Gly Met Ser
100                 105                 110
Val Thr Tyr Lys Val Gly Val Ala Pro Ile Met Ser Ala Glu Thr Thr
115                 120                 125
Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ser Ser Thr Gln Thr Asn Thr Gln Thr
130                 135                 140
Glu Thr Lys Thr Trp Glu Val Ala Gln Pro Val Ile Val Pro Ala Lys
145                 150                 155                 160
Thr Gln Val Gln Ser Val Leu Val Ile Asp Glu Ser Arg Val Thr Gln
165                 170                 175
Lys Phe His Asn Lys Phe Thr Leu Ser Gly Ser Val Cys Ser Asn Ser
180                 185                 190
Pro Ser Lys Ile Asn Gly His Tyr Phe Trp Phe His Ser Val Ser Asp
195                 200                 205
Ile Phe Asn Lys Phe Pro Gln Pro Gly Phe Thr Val Arg Ser Gly Gln
210                 215                 220
Val Phe Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp Gly Val Ala Gly Ile Gly
225                 230                 235                 240
Thr Arg Leu Glu Leu Thr Glu Ser Pro Ile Gly Asp Pro Ser Lys Val
245                 250                 255
Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Val Ala
260                 265                 270
Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala
275                 280
<210>  5
<211>  272
<212>  БЕЛОК
<213>  Pseudomonas putida
<400>  5
Met Ser Thr Val Asp Leu Asp Ala Ile Phe Lys Arg Tyr Gly Asp Trp
1               5                   10                  15
Trp Cys Lys Gln Asn Gly Gly Lys Cys Asp Arg Met Asn Pro Val Gln
20                  25                  30
Pro Gly Tyr Glu Gln His Arg Leu Ile Val Ser Asn Glu His Ile Glu
35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Asn Pro Asn Lys Val Val Val Pro Gln Ile Ala Ser Gln
50                  55                  60
Gln Val Leu Val Asn Ser Thr Ser Val Glu Gln Ser Gln Ser Val Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Lys Thr Thr Ser Ser Thr Phe Thr Trp Ser Leu Gln Glu Gly
85                  90                  95
Ile Lys Leu Gly Met Ser Val Thr Tyr Lys Val Gly Val Ala Pro Ile
100                 105                 110
Met Ser Ala Glu Thr Thr Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ser Ser Thr
115                 120                 125
Gln Thr Asn Thr Gln Thr Glu Thr Lys Thr Trp Glu Val Ala Gln Pro
130                 135                 140
Val Ile Val Pro Ala Lys Thr Gln Val Gln Ser Val Leu Val Ile Asp
145                 150                 155                 160
Glu Ser Arg Val Thr Gln Lys Phe His Asn Lys Phe Thr Leu Ser Gly
165                 170                 175
Ser Val Cys Ser Asn Ser Pro Ser Lys Ile Asn Gly His Tyr Phe Trp
180                 185                 190
Phe His Ser Val Ser Asp Ile Phe Asn Lys Phe Pro Gln Pro Gly Phe
195                 200                 205
Thr Val Arg Ser Gly Gln Val Phe Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp
210                 215                 220
Gly Val Ala Gly Ile Gly Thr Arg Leu Glu Leu Thr Glu Ser Pro Ile
225                 230                 235                 240
Gly Asp Pro Ser Lys Val Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val
245                 250                 255
Pro Gly Ala Gly Val Ala Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala
260                 265                 270
<210>  6
<211>  245
<212>  БЕЛОК
<213>  Pseudomonas putida
<400>  6
Met Asn Pro Val Gln Pro Gly Tyr Glu Gln His Arg Leu Ile Val Ser
1               5                   10                  15
Asn Glu His Ile Glu Tyr Tyr Gly Asn Pro Asn Lys Val Val Val Pro
20                  25                  30
Gln Ile Ala Ser Gln Gln Val Leu Val Asn Ser Thr Ser Val Glu Gln
35                  40                  45
Ser Gln Ser Val Arg Phe Ser Lys Thr Thr Ser Ser Thr Phe Thr Trp
50                  55                  60
Ser Leu Gln Glu Gly Ile Lys Leu Gly Met Ser Val Thr Tyr Lys Val
65                  70                  75                  80
Gly Val Ala Pro Ile Met Ser Ala Glu Thr Thr Ile Ser Gly Glu Leu
85                  90                  95
Ser Phe Ser Ser Thr Gln Thr Asn Thr Gln Thr Glu Thr Lys Thr Trp
100                 105                 110
Glu Val Ala Gln Pro Val Ile Val Pro Ala Lys Thr Gln Val Gln Ser
115                 120                 125
Val Leu Val Ile Asp Glu Ser Arg Val Thr Gln Lys Phe His Asn Lys
130                 135                 140
Phe Thr Leu Ser Gly Ser Val Cys Ser Asn Ser Pro Ser Lys Ile Asn
145                 150                 155                 160
Gly His Tyr Phe Trp Phe His Ser Val Ser Asp Ile Phe Asn Lys Phe
165                 170                 175
Pro Gln Pro Gly Phe Thr Val Arg Ser Gly Gln Val Phe Tyr Glu Gly
180                 185                 190
Asp Gly Ser Phe Asp Gly Val Ala Gly Ile Gly Thr Arg Leu Glu Leu
195                 200                 205
Thr Glu Ser Pro Ile Gly Asp Pro Ser Lys Val Leu Lys Thr Tyr Ser
210                 215                 220
Val Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Val Ala Arg Leu Ala Asp Met
225                 230                 235                 240
Val Asp Glu Thr Ala
245
<210>  7
<211>  172
<212>  БЕЛОК
<213>  Pseudomonas putida
<400>  7
Met Ser Val Thr Tyr Lys Val Gly Val Ala Pro Ile Met Ser Ala Glu
1               5                   10                  15
Thr Thr Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ser Ser Thr Gln Thr Asn Thr
20                  25                  30
Gln Thr Glu Thr Lys Thr Trp Glu Val Ala Gln Pro Val Ile Val Pro
35                  40                  45
Ala Lys Thr Gln Val Gln Ser Val Leu Val Ile Asp Glu Ser Arg Val
50                  55                  60
Thr Gln Lys Phe His Asn Lys Phe Thr Leu Ser Gly Ser Val Cys Ser
65                  70                  75                  80
Asn Ser Pro Ser Lys Ile Asn Gly His Tyr Phe Trp Phe His Ser Val
85                  90                  95
Ser Asp Ile Phe Asn Lys Phe Pro Gln Pro Gly Phe Thr Val Arg Ser
100                 105                 110
Gly Gln Val Phe Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp Gly Val Ala Gly
115                 120                 125
Ile Gly Thr Arg Leu Glu Leu Thr Glu Ser Pro Ile Gly Asp Pro Ser
130                 135                 140
Lys Val Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly
145                 150                 155                 160
Val Ala Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala
165                 170
<210>  8
<211>  160
<212>  БЕЛОК
<213>  Pseudomonas putida
<400>  8
Met Ser Ala Glu Thr Thr Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ser Ser Thr
1               5                   10                  15
Gln Thr Asn Thr Gln Thr Glu Thr Lys Thr Trp Glu Val Ala Gln Pro
20                  25                  30
Val Ile Val Pro Ala Lys Thr Gln Val Gln Ser Val Leu Val Ile Asp
35                  40                  45
Glu Ser Arg Val Thr Gln Lys Phe His Asn Lys Phe Thr Leu Ser Gly
50                  55                  60
Ser Val Cys Ser Asn Ser Pro Ser Lys Ile Asn Gly His Tyr Phe Trp
65                  70                  75                  80
Phe His Ser Val Ser Asp Ile Phe Asn Lys Phe Pro Gln Pro Gly Phe
85                  90                  95
Thr Val Arg Ser Gly Gln Val Phe Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp
100                 105                 110
Gly Val Ala Gly Ile Gly Thr Arg Leu Glu Leu Thr Glu Ser Pro Ile
115                 120                 125
Gly Asp Pro Ser Lys Val Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val
130                 135                 140
Pro Gly Ala Gly Val Ala Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala
145                 150                 155                 160
<210>  9
<211>  282
<212>  БЕЛОК
<213>  Pseudomonas putida
<400>  9
Met Cys Cys Tyr Leu Leu Arg Lys Val Lys Met Ser Thr Val Asp Leu
1               5                   10                  15
Asp Ala Ile Phe Lys Arg Tyr Gly Asp Trp Trp Cys Lys Gln Asn Gly
20                  25                  30
Gly Lys Cys Asp Arg Met Asn Pro Val Gln Pro Gly Tyr Glu Gln His
35                  40                  45
Arg Leu Ile Val Ser Asn Glu His Ile Glu Tyr Tyr Gly Asn Pro Asn
50                  55                  60
Lys Val Val Val Pro Gln Ile Ala Ser Gln Gln Val Leu Val Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Ser Val Glu Gln Ser Gln Ser Val Arg Phe Ser Lys Thr Thr Ser
85                  90                  95
Ser Thr Phe Thr Trp Ser Leu Gln Glu Gly Ile Lys Leu Gly Met Ser
100                 105                 110
Val Thr Tyr Lys Val Gly Val Ala Pro Ile Met Ser Ala Glu Thr Thr
115                 120                 125
Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ser Ser Thr Gln Thr Asn Thr Gln Thr
130                 135                 140
Glu Thr Lys Thr Trp Glu Val Ala Gln Pro Val Ile Val Pro Ala Lys
145                 150                 155                 160
Thr Gln Val Gln Ser Val Leu Val Ile Asp Glu Ser Arg Val Thr Gln
165                 170                 175
Lys Phe His Asn Lys Phe Thr Leu Ser Gly Ser Val Cys Ser Asn Ser
180                 185                 190
Pro Ser Lys Ile Asn Gly His Tyr Phe Trp Phe His Ser Val Ser Asp
195                 200                 205
Ile Phe Asn Lys Phe Pro Gln Pro Gly Phe Thr Val Arg Ser Gly Gln
210                 215                 220
Val Phe Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp Gly Val Ala Gly Ile Gly
225                 230                 235                 240
Thr Arg Leu Glu Leu Thr Glu Ser Pro Ile Gly Asp Pro Ser Lys Val
245                 250                 255
Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Val Ala
260                 265                 270
Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala
275                 280
<210>  10
<211>  282
<212>  БЕЛОК
<213>  Pseudomonas putida
<400>  10
Met Cys Cys Tyr Leu Leu Arg Lys Val Lys Met Ser Thr Val Asp Leu
1               5                   10                  15
Asp Ala Ile Phe Lys Arg Tyr Gly Asp Trp Trp Cys Lys Gln Asn Gly
20                  25                  30
Gly Lys Cys Asp Arg Met Asn Pro Val Gln Pro Gly Tyr Glu Gln His
35                  40                  45
Arg Leu Ile Val Ser Asn Glu His Ile Glu Tyr Tyr Gly Asn Pro Asn
50                  55                  60
Lys Val Val Val Pro Gln Ile Ala Ser Gln Gln Val Leu Val Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Ser Val Glu Gln Ser Gln Ser Val Arg Phe Ser Lys Thr Thr Ser
85                  90                  95
Ser Thr Phe Thr Trp Ser Leu Gln Glu Gly Ile Lys Leu Gly Met Ser
100                 105                 110
Val Thr Tyr Lys Val Gly Val Ala Pro Ile Met Ser Ala Glu Thr Thr
115                 120                 125
Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ser Ser Thr Gln Thr Asn Thr Gln Thr
130                 135                 140
Glu Thr Lys Thr Trp Glu Val Ala Gln Pro Val Ile Val Pro Ala Lys
145                 150                 155                 160
Thr Gln Val Gln Ser Val Leu Val Ile Asp Glu Ser Arg Val Thr Gln
165                 170                 175
Lys Phe His Asn Lys Phe Thr Leu Ser Gly Ser Val Cys Ser Asn Ser
180                 185                 190
Pro Ser Lys Ile Asn Gly His Tyr Phe Trp Phe His Ser Val Ser Asp
195                 200                 205
Ile Phe Asn Lys Phe Pro Gln Pro Gly Phe Thr Val Arg Ser Gly Gln
210                 215                 220
Val Phe Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp Gly Val Ala Gly Ile Gly
225                 230                 235                 240
Thr Arg Leu Glu Leu Thr Glu Ser Pro Ile Gly Asp Pro Ser Lys Val
245                 250                 255
Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Val Ala
260                 265                 270
Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala
275                 280
<210>  11
<211>  282
<212>  БЕЛОК
<213>  Pseudomonas putida
<400>  11
Met Cys Cys Tyr Leu Leu Arg Lys Val Lys Met Ser Thr Val Asp Leu
1               5                   10                  15
Asp Ala Ile Phe Lys Arg Tyr Gly Asp Trp Trp Cys Lys Gln Asn Gly
20                  25                  30
Gly Lys Cys Asp Arg Met Asn Pro Val Gln Pro Gly Tyr Glu Gln His
35                  40                  45
Arg Leu Ile Val Ser Asn Glu His Ile Glu Tyr Tyr Gly Asn Pro Asn
50                  55                  60
Lys Val Val Val Pro Gln Ile Ala Ser Gln Gln Val Leu Val Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Ser Val Glu Gln Ser Gln Ser Val Arg Phe Ser Lys Thr Thr Ser
85                  90                  95
Ser Thr Phe Thr Trp Ser Leu Gln Glu Gly Ile Lys Leu Gly Met Ser
100                 105                 110
Val Thr Tyr Lys Val Gly Val Ala Pro Ile Met Ser Ala Glu Thr Thr
115                 120                 125
Ile Ser Gly Glu Leu Ser Phe Ser Ser Thr Gln Thr Asn Thr Gln Thr
130                 135                 140
Glu Thr Lys Thr Trp Glu Val Ala Gln Pro Val Ile Val Pro Ala Lys
145                 150                 155                 160
Thr Gln Val Gln Ser Val Leu Val Ile Asp Glu Ser Arg Val Thr Gln
165                 170                 175
Lys Phe His Asn Lys Phe Thr Leu Ser Gly Ser Val Cys Ser Asn Ser
180                 185                 190
Pro Ser Lys Ile Asn Gly His Tyr Phe Trp Phe His Ser Val Ser Asp
195                 200                 205
Ile Phe Asn Lys Phe Pro Gln Pro Gly Phe Thr Val Arg Ser Gly Gln
210                 215                 220
Val Phe Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Phe Asp Gly Val Ala Gly Ile Gly
225                 230                 235                 240
Thr Arg Leu Glu Leu Thr Glu Ser Pro Ile Gly Asp Pro Ser Lys Val
245                 250                 255
Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ile Pro Val Val Pro Gly Ala Gly Val Ala
260                 265                 270
Arg Leu Ala Asp Met Val Asp Glu Thr Ala
275                 280
<210>  12
<211>  4
<212>  БЕЛОК
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  endoplasmic reticulum targeting peptide
<400>  12
Lys Asp Glu Leu
1
<210>  13
<211>  819
<212>  ДНК
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  synthetic gene encoding Axmi554
<400>  13
atgagcactg tggatttgga tgccatcttc aagagatatg gagattggtg gtgcaagcag       60
aatggaggaa aatgtgacag gatgaaccct gtgcaacctg gatatgagca gcacaggttg      120
attgtttcca atgagcacat tgaatattat ggaaatccaa acaaggtggt ggttcctcag      180
attgcttctc agcaagtgct ggtcaactca acttctgtgg agcaaagcca aagtgtgagg      240
ttctccaaga caacaagctc aaccttcact tggagcttgc aagaaggaat caagctgggg      300
atgagtgtca cctacaaggt tggagttgct ccaatcatga gtgctgaaac aacaatttct      360
ggagagttga gcttctcttc aacccaaacc aacacccaaa cagaaaccaa gacatgggaa      420
gtggctcaac cagtgattgt tcctgccaag acccaagtgc aaagtgtgct ggtgattgat      480
gaaagcagag tgacccagaa gttccacaac aagttcaccc tctctggaag tgtttgcagc      540
aattctccaa gcaagatcaa tggccattac ttctggttcc attctgtttc agacatcttc      600
aacaagtttc ctcaacctgg cttcactgtg aggagtggcc aagtttttta tgaaggagat      660
ggaagttttg atggagttgc tggaattgga acaaggttgg agctgacaga aagcccaatt      720
ggagatcctt caaaggtgct gaagacatat tctgtgattc cagtggttcc tggtgctgga      780
gtggcaaggc ttgctgacat ggtggatgaa actgcttga                             819
<---