СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ У КРЫС
METHOD OF SIMULATING NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE IN RATS

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной гепатологии, и может быть использовано с целью создания экспериментальной модели жировой болезни печени (неалкогольной) у крыс для последующей разработки новых лечебных подходов к коррекции данного патологического состояния.
Экспериментальные модели жировой болезни печени широко используются для детального изучения факторов, оказывающих влияние на развитие патологических процессов в печени, главным образом особенностей патогенеза и выявления точек приложения действия фармацевтических препаратов для коррекции установленных патологических процессов.
Необходимость разработки адекватной модели неалкогольной жировой болезни печени диктуется высокой распространенностью в популяции, отсутствием надежных лабораторных и неинвазивных инструментальных методов диагностики данного состояния на различных этапах формирования патологического процесса, включая ранние проявления болезни, а также диагностику инициации цепи патогенетических механизмов ее развития в зависимости от ведущего триггерного фактора.
Известен способ моделирования гепатита и цирроза печени путем помещения животных в клетку с резервуаром, заполненным 70%-ным раствором формалина. Животные содержатся в данных условиях в течение 5-7 месяцев [1]. Данный метод, основанный на действии гепатотоксичного соединения, с которым человек и животные не контактирует, имеет целый ряд недостатков: в современной клинической гепатологии ведущее значение имеют метаболические, а не токсические воздействия на орган, что ограничивает роль данного способа моделирования только случаями воспалительного повреждения печени; одновременно происходит выраженное отравляющее воздействие на дыхательную и сердечно-сосудистую системы, оказывающее вторичное поражение печени; длительность моделирования (5-7 месяцев).
Предложены другие методики моделирования гепатопатии: путем однократного интрагастрального введения животному 50%-ного раствора совтола-1 на оливковом масле из расчета 150 мг на 100 г массы тела [2].
В другой модификации указанного метода интрагастрально 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле вводится два раза в неделю в течение месяца из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела и 10%-ный раствор этанола вместо воды для питья [3].
К недостаткам этих способов следует отнести длительность, трудоемкость (неоднократное интрагастральное введение токсического вещества) и сугубо специфическое токсическое воздействие на печень, что редко встречается у человека.
Наиболее приближенным к клиническому течению поражения печени у человека является алиментарный метод моделирования неалкогольной жировой болезни печени, при котором экспериментальные животные ежесуточно в течение 6 месяцев получали 4,25 г топленого говяжьего сала и 0,43 г порошкового холестерина из расчета на 100 г массы животного в дополнение к обычному рациону. Через 30 суток от начала вскармливания у крыс формировался стеатоз, через 90 суток - стеатогепатит, а через 180 суток - фиброз [4].
Данный метод имеет целый ряд существенных недостатков: триггером повреждения печени выступает несвойственный данному биологическому виду пищевой рацион, что не отражает в полной мере патологические процессы, происходящие в организме человека; процесс моделирования занимает длительное время (до 6 месяцев); неоднородность регистрируемых изменений в печени у разных особей в связи с воздействием множества трудноустранимых факторов; трудоемкость кормления животных; дополнительные финансовые расходы на заготовку и приготовление специфического гиперкалорийного корма.
Проведенный патентный поиск и анализ медицинской литературы показали, что в настоящее время отсутствует адекватная модель неалкогольной жировой болезни печени, достаточно легковоспроизводимая, позволяющая получить отчетливые метаболические нарушения, схожие с таковыми у человека, без воздействия трудноконтролируемых экзогенных факторов и в короткие сроки.
Задачей изобретения является создание надежной, быстровоспроизводимой, максимально приближенной к клиническому течению заболевания у человека и не требующей дополнительных финансовых расходов модели неалкогольной жировой болезни печени.
В основе предлагаемой модели неалкогольной жировой болезни печени лежит метод выраженного системного воздействия на метаболизм путем достижения первичного (послеоперационного) гипотиреоза, приводящего к дезорганизации всех видов обмена в организме экспериментального животного.
Способ моделирования неалкогольной жировой болезни печени осуществляется следующим образом. Лабораторные животные - крысы самки нелинейной породы, массой 140-160 г. Содержание животных и постановка экспериментов проведена в соответствии с требованиями приказов №1179 МЗ СССР от 11.10.1983 года и №267 МЗ РФ от 19.06.2003 года, а также международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Животные были распределены на 2 группы: 1-я (исследовательская - 14 особей), в которой проводилась тотальная тиреоидэктомия; 2-я (группа контроля - 14 особей), в которой проводилась мобилизация щитовидной железы без тиреоидэктомии.
Анестезия производилась путем ингаляции животными паров эфира. Техника операции представлена следующими этапами. После обработки операционного поля производится разрез кожи и разведение краев раны на держалках. Тупым способом разводятся мышцы, обнажается трахея, открывая доступ к щитовидной железе. Далее электрокоагулятором производится коагуляция щитовидных артерий на протяжении 0,5-0,8 см, после чего производится иссечение обеих долей щитовидной железы и перешейка, дополненное обработкой коагулятором ложа органа. Результатом проведенных манипуляций является тотальная тиреоидэктомия, обеспечивающая надежный первичный (послеоперационный) гипотиреоз, не требующая дальнейшего контроля гормонального статуса животного. После завершения вмешательства рана послойно зашивается капроновыми нитями. Контрольным животным производится мобилизации щитовидной железы по описанной выше методике, но без удаления органа.
После завершения хирургического вмешательства животные обеих групп помещаются в клетки и содержатся в стандартных условиях вивария на стандартном рационе.
В послеоперационном периоде гибели и каких-либо связанных с вмешательством заболеваний животных не наблюдалось, после прекращения действия анестезии животные сразу подходили к корму и воде. Ежедневно животные осматривались с оценкой общего состояния и послеоперационного раневого дефекта. Случаев нагноения и расхождения краев раны выявлено не было.
Выведение животных из эксперимента осуществлялось путем передозировки эфирного наркоза в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609 EEC на сроках 4, 8 недель. Производился забор печени животных, а также осмотр области трахеи в непосредственной топографической близости со щитовидной железой после выполненной тиреоидэктомии для исключения возможности регенерации ткани щитовидной железы. На этих сроках трахея имела нормальное строение, роста тиреоидной ткани на ней выявлено не было.
По стандартным методикам осуществлялась гистологическая проводка полученного материала. Далее производилось исследование микропрепаратов ткани печени, окрашенных стандартным (гематоксилин-эозин) и специальными красителями: суданом III - для выявления липидов и пикрофуксином по Ван-Гизон - для выявления соединительной ткани.
У контрольной группы животных на сроках наблюдения от 4 до 8 недель морфологическая структура печени представляется нормальной: печень состоит из долек, которые представляют фрагменты печеночной паренхимы многогранной формы. Каждая долька состоит из балок, образованных двумя рядами печеночных клеток (гепатоцитов), балки радиально располагаются вокруг центральной вены. Между балками проходят синусоидные капилляры. В центре дольки располагается центральная вена, стенки сосудов центральных и портальных трактов тонкие. Гепатоциты имеют полигональную форму, цитоплазма эозинофильная, зернистая, имеется 1-2 ядра. В цитоплазме гепатоцитов содержится гликоген. Синусоидные капилляры внутри долек представляют собой очень мелкие сосуды, стенки их выстланы эндотелием. Лейкоцитарные инфильтраты и соединительнотканные волокна в паренхиме не выявляются.
К 4 неделе наблюдения после тиреоидэктомии анализ гистологических препаратов ткани печени у крыс обнаружил выраженные дистрофические процессы. Во всех препаратах выявлялась белковая дистрофия: цитоплазма гепатоцитов имела грубозернистый, неоднородный вид, ядро в одних случаях имеет плохо различаемую хроматиновую структуру, в других случаях видны лишь тени ядер, окрашенные в голубоватый цвет. Границы между клетками видны неотчетливо. В препаратах, окрашенных суданом III, выявляются пылевидные оранжевые включения в цитоплазме гепатоцитов, расположенные преимущественно перинуклеарно, в большинстве клеток без смещения ядра к периферии. В указанные сроки регистрируются начальные признаки фибротизации: в перипортальной зоне наблюдается усиление пролиферации фибробластов, разрастание соединительной ткани с прорастанием в паренхиму печени по ходу синусоидов.
На сроке 8 недель сохраняется белковая дистрофия гепатоцитов, выявляются клетки паренхимы органа с разрушенным ядром, нарушена типичная балочная структура ткани печени, имеет место пылевидная жировая дистрофия, при этом в некоторых клетках цитоплазма полностью заполнена липидами, отмечается разрушение ядра - кариопикноз и кариолизис. Выявляется морфологическая картина по типу хронического гепатита: полиморфно-клеточная инфильтрация портальных трактов с разрастанием соединительной ткани.
Характерно, что, начиная с 4 недель, в гепатоцитах не обнаруживается гликоген.
Таким образом, морфологическое исследование ткани печени свидетельствует, что в эксперименте удалось получить модель неалкогольной жировой болезни печени, характеризующейся сочетанием белковой, жировой дистрофии, признаками стеатогепатита и стеатофиброза. Стадийность патологического процесса в печени экспериментальной модели в точности повторяет таковую у человека - через стадии стеатоза, стеатогепатита, фиброза.
Современные представления о патогенезе неалкогольной жировой болезни печени, рассматриваемой в рамках метаболического синдрома, исходят из «теории двух толчков» и «теории множественных параллельных толчков» [5, 6]. Ведущее значение в обеих теориях имеют следующие механизмы:
1) избыточное поступление свободных жирных кислот в гепатоциты на фоне сниженной мощности β-окисления с отложением в цитоплазме гепатоцитов триглицеридов с формированием стеатоза;
2) оксидативный стресс, вызванный разобщением окисления и фосфорилирования и приводящий к активации перекисного окисления липидов на фоне воздействия большого числа эндо- и экзогенных факторов, что в конечном счете приводит к развитию стеатогепатита;
3) при сохранении действия триггерного фактора происходит трансформация клеток Ито в фибробласты с формированием фиброза, а в более поздних стациях - и цирроза печени [7, 8, 9].
Щитовидная железа является ведущим органом в координации метаболических процессов, реализует регуляторное влияние посредством йодсодержащих гормонов - тироксина (Т4), рассматриваемого как прогормон, и трийодтиронина (Т3). Механизм биологического действия Т3 реализуется через связывание с ядерными рецепторами (TR) α и β на уровне генома, хотя известно и их негеномное влияние (на мембрану клетки, цитоплазму и митохондрии). Это приводит к ряду эффектов: повышается потребность тканей в кислороде, стимулируется метаболизм белков, жиров и углеводов, повышается функциональная активность сердечно-сосудистой и центральной нервной систем [10]. При выключении тиреоидной функции щитовидной железы развивается первичный гипотиреоз, характеризующийся выраженными дисметаболическими процессами в организме млекопитающих: снижается уровень глюкозы в крови и процесса глюконеогенеза в печени, снижается захват и утилизация глюкозы клетками (что лежит в основе инсулинорезистентности), замедляется липолиз (в первую очередь, β-окисление свободных жирных кислот), повышается содержание ЛПНП, триглицеридов и снижается уровень ЛПВП, стимулируется образование и отложение жира в тканях и органах [10, 11]. При гипотиреозе замедляются анаболизм и активируются катаболизм белков, в том числе транспортных и структурных, что приводит к повышению восприимчивости клеток к внешним влияниям (нарушение трансмембранного обмена между клеткой и тканевой жидкостью), кроме того, наблюдается снижение чувствительности тканей к воздействию катехоламинов, что потенцирует, приводит к вторичному разбалансированию обменных процессов.
Гепатоцит - клетка, в которой происходит объединение обмена белков, липидов и углеводов, поэтому печень, с одной стороны, является «органом-мишенью», а с другой - органом, который потенцирует и в определенной мере детерминирует вторичные дисметаболические процессы.
Представленные данные указывают на общность патобиохимических процессов, лежащих в основе патогенеза неалкогольной жировой болезни печени и нарушениях обменных процессов, наблюдаемых при синдроме гипотиреоза.
Поскольку изменения морфофункциональных характеристик печени во многом носят общепатологический, эволюционно устоявшийся, однонаправленный и однотипный характер, и принципиально не отличаются у представителей разных видов класса млекопитающих, то моделирование неалкогольной жировой болезни печени у крыс посредством первичного (послеоперационного) гипотиреоза является обоснованным методом изучения патологических процессов, максимально приближенным по своим характеристикам к проявлениям их у человека, и соответственно пригодным для выработки подходов к их коррекции.
Пример 1. Крысе весом 148 г под эфирным наркозом выполнена тотальная тиреоидэктомия с протяженным прошиванием и коагуляцией артерий щитовидной железы, дополненным обработкой коагулятором ложа органа. Через 4 недели животное выводили из эксперимента. При гистологическом исследовании с помощью стандартного и специальных красителей выявлены белковая и пылевидная жировая дистрофия, начальные признаки фибротизации.
Пример 2. Крысе весом 145 г под эфирным наркозом выполнена тотальная тиреоидэктомия с протяженным прошиванием и коагуляцией артерий щитовидной железы, дополненным обработкой коагулятором ложа органа. Через 8 недель животное выводили из эксперимента. При гистологическом исследовании с помощью стандартного и специальных красителей выявлены нарушения нормальной балочной структуры, жировая дистрофия, в некоторых гепатоцитах цитоплазма полностью заполнена липидами, отмечается кариопикноз и кариолизис, полиморфно-клеточная инфильтрация портальных трактов с разрастанием соединительной ткани.
Пример 3. Крысе весом 149 г под эфирным наркозом выполнена мобилизация щитовидной железы, без удаления органа с последующим послойным зашиванием раны. Через 4 недели животное выводили из эксперимента. При гистологическом исследовании с помощью стандартного и специальных красителей морфологическая структура печени представлялась нормальной: признаков дистрофии, нарушения балочной структуры выявлено не было.
Таким образом, к достоинствам предлагаемой модели неалкогольной жировой болезни печени можно отнести: надежность, относительно простоту воспроизведения и экономическую выгоду (не требуется заготовка и приготовление специфического гиперкалорийного корма в течение продолжительного эксперимента).
Список литературы
1. Пат. Ru 94026117. Способ создания модели гепатита и цирроза печени млекопитающих. Бояринов Г.А., Смирнов В.П., Кауров Я.В. и др., опубл. 27.08.1996.
2. Пат. Ru 2188457. Способ моделирования токсической гепатопатии. Мышкин В.А., Ибатуллина Р.Б., Волкова Е.С. и др., опубл. 27.08.2002
3. Пат. Ru 2197018. Способ моделирования цирроза печени. Мышкин В.А., Ибатуллина Р.Б., Савлуков А.И. и др., опубл. 20.01.2003.
4. Пат. RU 2394281. Способ моделирования неалкогольного стеатогепатита у крыс. Караман Ю.К., Новгородцева Т.П., Бивалькевич Н.В. и др., опубл. 10.07.2010.
5. Балукова Е.В. Неалкогольная жировая болезнь печени и риск кардиоваскулярных событий // Русский медицинский журнал. - 2013. -  Т. 21. - №13. - С. 737-740.
6. Ягмур В.Б. Неалкогольная жировая болезнь печени: современный взгляд на патогенез, диагностику и лечение // Гастроэнтерология. - 2013. - Т. 49. - №3. - С. 138-147.
7. Хухлина О.С. Особенности патоморфологических и метаболических параметров фиброза печени у больных с алкогольной и неалкогольной жировой болезнью печени // Сучасна гастроентерологя. - 2005. - №5 (25). - С. 34-40.
8. Ильченко Л.Ю., Винницкая Е.В. Повреждение клеточных мембран при алкогольном и неалкогольном стеатогепатитах и их коррекция // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2002. - №1. - С. 64-65.
9. Crespo J., Cayon A., Fernandez-Gil P. et al. Gene expression of tumor necrosis factor and TNF-receptors, p55 and p75, in nonalcoholic steatohepatitis patients // Hepatology. - 2001. - Vol. 34. - P. 1158-1163.
10. Захарова С.М., Савельева Л.В., Фадеева М.И. Ожирение и гипотиреоз // Ожирение и метаболизм. - 2013. - №2 (35). - С. 54-58.
11. Подзолков А.В., Фадеев В.В / Гипотиреоз, субклинический гипотиреоз, высоконормальный уровень ТТГ // Клиническая и экспериментальная тиреоидология. - 2009. - Т. 5. - №2. - С. 4-16.