АНТИТЕЛА ПРОТИВ ГЕПСИНА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTI-HEPSIN ANTIBODIES AND METHODS OF APPLICATION THEREOF

Перекрестная ссылка на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет Предварительной заявки на патент США № 61/253953, поданной 22 октября 2009 года, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится, в общем, к области молекулярной биологии. Более конкретно, изобретение относится к антителам против гепсина и к их применению.
Уровень техники
Гепсин является трансмембранной сериновой протеазой типа II (TTSP), экспрессируемой на поверхности эпителиальных клеток. Этот 417-аминокислотный белок состоит из короткого N-концевого цитоплазматического домена, трансмембранного домена и единственного домена богатого цистеином фагоцитарного рецептора, который плотно упакован с С-концевым доменом протеазы (Somoza et al (2003) Structure 11(9), 1123-1131). Физиологическая функция гепсина до конца не известна. Несмотря на то, что он экспрессируется на очень ранних стадиях эмбриогенеза (Vu et al (1997) J Biol Chem 272 (50), 31315-31320), гепсин-недостаточные мыши были жизнеспособными и развивались нормально (Yu et al (2000) Thromb Haemost 84(5), 865-870; Wu et al (1998) J Clin Invest 101(2), 321-326). Было обнаружено, что гепсин не является незаменимым для регенерации печени и для связанных с коагуляцией физиологических функций (Id.). Недавнее исследование показало, что мыши с нокаутом гепсина имеют нарушенное слуховое восприятие (Guipponi et al. (2007) Am J Pathol 171:608-616). При этом, предполагалось участие гепсина при раке яичников [(Tanimoto et al (1997) Cancer Res 57(14), 2884-2887); WO2001/62271] и раке предстательной железы. Несколько исследований по экспрессии генов идентифицировали ген гепсина как один из наиболее высоко индуцируемых генов при раке предстательной железы (Dhanasekaran et al. (2001) Nature 412, 822-826; Luo et al. (2001) Cancer Res 61 (12), 4683-4688; Magee et al. (2001) Cancer Res 61(15), 5692-5696; Stamey et al. (2001) J Urol 166(6), 2171-2177; Stephan et al. (2004) J Urol 171(1), 187-191; Welsh et al. (20010) Cancer Res 61(16), 5974-5978). Было обнаружено, что в нормальной предстательной железе и в случае доброкачественной гиперплазии уровни РНК гепсина являются низкими, а при раке предстательной железы, особенно в запущенных стадиях, уровни резко повышаются ((Dhanasekaran et al. (2001) Nature 412, 822-826; Luo et al. (2001) Cancer Res 61 (12), 4683-4688; Magee et al (2001) Cancer Res 61(15), 5692-5696; Stamey et al. (2001) J Urol 166(6), 2171-2177; Stephan et al. (2004) J Urol 171(1), 187-191; Welsh et al (20010) Cancer Res 61(16), 5974-5978). Окрашивание белка гепсина моноклональным антителом против гепсина показало, что экспрессия гепсина была максимальной в местах метастазирования в кости и на поздней стадии первичных опухолей (Xuan et al (2006) Cancer Res 66(7), 3611-3619), что согласуется с информацией о том, что увеличенные уровни РНК гепсина коррелируют с более высокими степенями Глеазона и прогрессированием опухоли ((Luo et al. (2001) Cancer Res 61(12), 4683-4688; Magee et al. (2001) Cancer Res 61(15), 5692-5696; Stamey et al. (2001) J Urol 166(6), 2171-2177; Stephan et al. (2004) J Urol 171(1), 187-191; Chen et al. (2003) J Urol 169(4), 1316-1319).
Экспериментальное доказательство роли гепсина при раке предстательной железы появилось на основании исследования Klezovitch et al. (Klezovitch et al. (2004) Cancer Cell 6(2), 185-195), демонстрируя, что на моделях мыши неметастазирующего рака предстательной железы сверхэкспрессия гепсина приводила к прогрессированию и метастазированию первичных опухолей. Удивительно, что сверхэкспрессия гепсина была связана с разрушением базальной мембраны (Id.), что указывает на возможность того, что активность гепсина каким-то образом связана с деградацией компонентов базальной мембраны. In vitro гепсин способен преобразовываться в латентный фактор роста (прогепатоцитарный фактор роста (pro-HGF)) в его активную двухцепочечную форму (HGF), которая индуцировала передачу сигнала рецептора Met (Herter et al. (2005) Biochem J 390 (Pt 1), 125-136; Kirchhofer et al. (2005) FEBS Lett 579(9), 1945-1950; WO2006/014928). Гепсин способен также превращать pro-uPA в его активную форму (Moran et al., (2006) J Biol Chem. 281 (41):30439-46) и расщеплять ламин in vitro (Tripathi et al. (2008) J Biol Chem. 283:30576). Поскольку предполагалось, что HGF/Met-путь участвует в инвазивном росте и метастазировании опухолей, возможно, что сверхэкспрессия гепсина активирует систему HGF/Met при раке предстательной железы (Herter et al. (2005) Biochem J 390 (Pt 1), 125-136; Kirchhofer et al. (2005) FEBS Lett 579(9), 1945-1950; WO2006/014928). Было показано также, что гепсин расщепляет другие субстраты in vitro, в основном связанные с коагуляцией белка (Herter et al., id; Kazama et al. (1995) J Biol Chem 270(1), 66-72). Однако их роль в онкогенезе неизвестна.
Ясно, что остается потребность в средствах, которые имеют клинические признаки, которые являются оптимальными для развития в виде терапевтических средств. Описанное в настоящем описании изобретение удовлетворяет этой потребности и обеспечивает другие преимущества.
Все цитируемые в настоящем описании ссылки, в том числе, заявки на патент и публикации, включены в качестве ссылки в полном объеме.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основывается на идентификации различных гепсин-связывающих агентов (таких как антитела и их фрагменты). Гепсин представляет собой важную и выгодную терапевтическую мишень, и изобретение относится к композициям и к способам, основанным на связывании этих агентов с гепсином. Гепсин-связывающие агенты по настоящему изобретению, описанные в настоящем описании, обеспечивают важные терапевтические и диагностические средства для применения в нацеливании на патологические состояния, связанные с экспрессией и/или активностью путей передачи сигналов гепсина. Таким образом, изобретение относится к способам, композициям, наборам и изделиям, относящимся к связыванию гепсина.
Активный сайт трипсин-подобных сериновых протеаз, таких как гепсин, образован несколькими внутренне мобильными петлями ('доменом активации') (Huber and Bode, 1978). В частности, 220-петля образует часть кармана S1 и может принимать различные конформационные состояния в некоторых сериновых протеазах (Johnson et al., 2005; Shia et al., 2005; Spraggon et al., 2009; Wilken et al., 2004). Однако структуры ко-кристаллов сериновых протеаз с ингибитором активного центра показали правильно образованные активные сайты, наиболее вероятно, вследствие стабилизирующих сил, прилагаемых ингибитором (Arni et al., 1994; Shia et al., 2005; Spraggon et al., 2009). Было разумным предположить, что занятие кармана S1 ингибитором сериновой протеазы может прилагать стабилизирующие силы к гибкости петель активного центра сериновой протеазы, облегчая распознавание антителом активного центра сериновой протеазы. Таким образом, для идентификации антител против гепсина, которые блокируют ферментативную активность гепсина, получали антитела, которые связывают гепсин в комплексе с ингибитором сериновой протеазы, который занимает карман S1, 3,4-дихлоризокумарином (DCI).
Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с гепсином. В одном из аспектов изобретение относится к выделенному антителу, которое связывается с гепсином.
D
В одном из аспектов изобретение относится к выделенному антителу против гепсина, где одновалентная форма (такая как Fab-форма) антитела специфически связывается с гепсином человека с аффинностью связывания приблизительно 10 нМ или лучшей. В некоторых вариантах осуществления антитело специфически связывается с гепсином человека с аффинностью связывания приблизительно 6 нМ или лучшей. Как установлено в данной области, аффинность связывания лиганда с его рецептором может быть определена с использованием любого из разнообразия анализов и выражена в терминах различных количественных величин. Так, в одном из вариантов осуществления аффинность связывания выражена в виде величин K и отражает внутреннюю аффинность связывания (например, с минимизированными эффектами авидности). Обычно и предпочтительно, аффинность связывания измеряют in vitro, независимо от того, в бесклеточной среде или в связанной с клетками среде. Любой из множества анализов, известных в данной области, в том числе, описанных в настоящем описании, может быть использован для получения измерений аффинности связывания, например, Biacore, радиоиммуноанализ (RIA) и ELISA.
В другом аспекте изобретение относится к антителам против гепсина, которые связывают область связывающего домена Кунитца гепсина. В одном из аспектов изобретение относится к выделенному антителу против гепсина, которое конкурирует с доменом Кунитца за связывание с гепсином. В одном из вариантов осуществления указанной последовательностью домена Кунитца является домен Кунитца 1 (KD1) HAI-1 или HAI-1B. В одном из вариантов осуществления последовательностью домена Кунитца является вариантная последовательность KD1, имеющая по меньшей мере приблизительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичность последовательности с KD1 дикого типа HAI-1 человека, где указанная вариантная последовательность имеет по меньшей мере сравнимую способность с KD1 дикого типа в ингибировании активности гепсина. В одном из вариантов осуществления указанная последовательность домена Кунитца является одной или несколькими доменами Кунитца HAI-2. В одном из вариантов осуществления вариантная последовательность домена Кунитца HAI-2 находится между приблизительно 70% и 99%, приблизительно 75% и 98%, приблизительно 80% и 97%, 85% и 95% идентичностью с соответствующими доменом (доменами) Кунитца HAI-2 дикого типа человека, где указанная последовательность имеет по меньшей мере сравнимую способность HAI-2 дикого типа в ингибировании активности гепсина.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителам против гепсина, которые связываются с каталитическим центром гепсина.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителам против гепсина, которые связываются с гепсином вне субсайта s1. В некоторых вариантах осуществления антитела связываются с субсайтом гепсина s2 и/или s3.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителам против гепсина, которые связываются каталитически с инактивированным гепсином.
В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, которые являются устойчивыми к протеолизу гепсина. В некоторых вариантах осуществления эти антитела доступны для гепсина в течение 24 часов при условиях, обеспечивающих расщепление гепсином субстрата гепсина.
В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, которые связывают гепсин, присутствующий в комплексе, содержащем гепсин и ингибитор сериновой протеазы, который связывает субсайт S1 гепсина. В некоторых вариантах осуществления гепсин, присутствующий в комплексе, является инактивированным. В некоторых вариантах осуществления ингибитором сериновой протеазы является 3,4-дихлоризокумарин. (DCI). В некоторых вариантах осуществления ингибитор сериновой протеазы связывает каталитические аминокислотные остатки гепсина Ser195 и His57, посредством чего гепсин инактивируется.
В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, которые связываются специфически с гепсином человека и по существу ингибируют in vivo и/или in vitro ферментативную активность гепсина. В одном из вариантов осуществления ферментативная активность включает расщепление полипептидного субстрата гепсина. В одном из вариантов осуществления этим полипептидным субстратом гепсина является один или несколько из стимулирующего про-макрофаги белка (pro-MSP), pro-uPA, Фактора VII и pro-HGF. Активация гепсином pro-MSP описана в находящейся в процессе одновременного рассмотрения Предварительной заявке на патент США № 61/253990, поданной 22 октября, 2009 года. В одном из вариантов осуществления ферментативная активность включает расщепление синтетического субстрата гепсина. В некоторых вариантах осуществления синтетическим субстратом гепсина является субстрат, показанный в таблице 1.
В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, причем антитела по существу ингибируют каталитическую активность гепсина человека и/или мыши. В некоторых вариантах осуществления одновалентная форма антитела против гепсина ингибирует каталитическую активность гепсина человека с Ki приблизительно (в некоторых вариантах осуществления меньшей или равной) 4 нМ. В некоторых вариантах осуществления одновалентная форма антитела против гепсина ингибирует каталитическую активность гепсина мыши с Ki приблизительно (в некоторых вариантах осуществления, меньшей или равной) 330 нМ.
50
В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, где эти антитела по существу ингибируют расщепление гепсином pro-uPA. В некоторых вариантах осуществления антитела против гепсина ингибируют расщепление гепсином pro-uPA с IC приблизительно 3 нМ или более сильным.
В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, где антитела по существу ингибируют ламинин-зависимую миграцию клеток.
В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, где антитела получены способом, предусматривающим отбор антител, которые связывают комплекс, содержащий (a) гепсин и (b) ингибитор сериновой протезы, который связывает субсайт S1 гепсина. В некоторых вариантах осуществления гепсин, присутствующий в этом комплексе, является инактивированным. В некоторых вариантах осуществления ингибитором сериновой протеазы является 3,4-дихлоризокумарин (DCI). В некоторых вариантах осуществления ингибитор сериновой протеазы связывает каталитические аминокислотные остатки гепсина Ser195 и His 57, посредством чего гепсин инактивируется. В некоторых вариантах осуществления перед отбором (селекцией) антитела, антитело инкубируют с гепсином и ингибитором сериновой протеазы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию отбора антител, которые конкурируют за связывание гепсина с доменом Кунитца. В некоторых вариантах осуществления доменом Кунитца является KD1.
В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, где антитела получают способом, предусматривающим отбор (идентификацию) антител, которые конкурируют с доменом Кунитца за связывание гепсина. В некоторых вариантах осуществления доменом Кунитца является KD1.
В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, которые по существу не расщепляются гепсином. В некоторых вариантах осуществления антитела против гепсина являются по существу устойчивыми к расщеплению гепсином.
Обычно, антитела против гепсина настоящего изобретения являются антагонистическими антителами.
В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, содержащим: последовательности по меньшей мере одного, двух, трех, четырех, пяти и/или шести гипервариабельных областей (HVR), выбранных из группы, состоящей из:
(a) HVR-L1, содержащего последовательность RASQSVSSAVA (SEQ ID NO:1),
(b) HVR-L2, содержащего последовательность SASSLYS (SEQ ID NO:2),
(c) HVR-L3, содержащего последовательность QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO:3),
(d) HVR-H1, содержащего последовательность GFNFSYSYMH (SEQ ID NO:4),
(e) HVR-H2, содержащего последовательность ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:5), и
(f) HVR-H3, содержащего последовательность ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY (SEQ ID NO:6).
В одном из аспектов изобретение относится к антителам против гепсина, содержащим (a) легкую цепь, содержащую (i) HVR-L1, содержащий последовательность RASQSVSSAVA (SEQ ID NO:1); (ii) HVR-L2, содержащий последовательность SASSLYS (SEQ ID NO:2); и (iii) HVR-L3, содержащий последовательность QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO:3); и/или (b) тяжелую цепь, содержащую последовательность, содержащую (i) HVR-H1, содержащий последовательность GFNFSYSYMH (SEQ ID NO:4); (ii) HVR-H2, содержащий последовательность ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:5); и (iii) HVR-H3, содержащий последовательность ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY (SEQ ID NO:6).
В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, содержащему HVR-L1, содержащий последовательность SEQ ID NO:1. В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, содержащему HVR-L2, содержащий последовательность SEQ ID NO:2. В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, содержащему HVR-L3, содержащий последовательность SEQ ID NO:3. В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, содержащему область HVR-H1, содержащую последовательность SEQ ID NO:4. В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, содержащему область HVR-H2, содержащую последовательность SEQ ID NO:5. В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, содержащему область HVR-H3, содержащую последовательность SEQ ID NO:6.
В одном из аспектов антитело против гепсина содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, где каждая, по порядку, содержит последовательность RASQDVN/STAVA (SEQ ID NO:7), SEQ ID NO:2, 3, и/или область тяжелой цепи, содержащую HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая, по порядку, содержит SEQ ID NO:4, 5, 6.
В одном из аспектов антитело против гепсина содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, где каждая, по порядку, содержит последовательность RASQDVN/STAVA (SEQ ID NO:7), SEQ ID NO:1, последовательность SASFLYS (SEQ ID NO:8), SEQ ID NO:3, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая, по порядку, содержит SEQ ID NO:4, 5, 6.
В одном из аспектов антитело против гепсина содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, где каждая, по порядку, содержит SEQ ID NO:7, 8, 3, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая, по порядку, содержит SEQ ID NO:4, 5, 6.
В аминокислотных последовательностях SEQ ID NO:1-6 указана нумерация индивидуальных HVR (т.е., H1, H2 или H3), как показано на фигуре 1, причем нумерация соответствует системе нумерации Кабата, описанной ниже.

Антитела по настоящему изобретению могут содержать любую подходящую каркасную последовательность вариабельного домена, при условии, что активность связывания гепсина является по существу сохраненной. Например, в некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению содержат каркасную консенсусную последовательность тяжелой цепи подгруппы III человека. В одном из вариантов осуществления этих антител, каркасная консенсусная последовательность содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах осуществления этих антител, положение 71 соответствует A, 73 соответствует T и/или 78 соответствует A. В одном из вариантов осуществления эти антитела содержат каркасные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи huMAb4D5-8 (HERCEPTIN, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также упоминаемые в патентах США 6407213 и 5821337 и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-1093). В одном из вариантов осуществления антитела дополнительно содержат каркасную консенсусную последовательность легкой цепи κI человека. В некоторых вариантах осуществления каркасная консенсусная последовательность содержит замену в положении 66. В некоторых вариантах осуществления, положение 66 соответствует G. В одном конкретном варианте осуществления антитела содержат последовательности HVR легкой цепи huMAb4D5-8, описанные в патентах США 6407213 и 5821337). В одном из вариантов осуществления антитела содержат последовательности легкой цепи вариабельного домена huMAb4D5-8 (HERCEPTIN, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также упоминаемые в патентах США 6407213 и 5821337, и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-1093).
В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению изобретение содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательности, описанные на фигурах 2А-В, и последовательности HVR H1, H2 и H3 являются SEQ ID NO:4, 5 и/или 6, соответственно.
В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:14-15, 48 и/или 16, и последовательности HVR H1, H2 и H3 являются SEQ ID NO:4, 5 и/или 6, соответственно. В другом варианте осуществления, каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:14-15, 43 и/или 16 и последовательности HVR H1, H2 и H3 являются SEQ ID NO:4, 5 и/или 6, соответственно.
В одном конкретном варианте осуществления, антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:17-20; 49-51 и 20; 52-54 и 20; и/или 55-57 и 20, соответственно, и последовательности HVR L1, L2 и L3 являются SEQ ID NO:1, 2 и/или 3, соответственно. В другом варианте осуществления, антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:17-18, 58 и/или 20, и последовательности HVR L1, L2 и L3 являются SEQ ID NO:1, 2 и/или 3, соответственно. В другом варианте осуществления антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:17, 18, 19 и/или 20, и последовательности HVR L1, L2 и L3 являются SEQ ID NO:1, 2 и/или 3, соответственно.
В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:14-15, 43 и/или 16, и последовательности HVR H1, H2 и H3 являются SEQ ID NO:4, 5 и/или 6, соответственно, и вариабельный домен легкой цепи, где каркасная последовательность содержит последовательность SEQ ID NO:17-18, 58 и/или 20, и последовательности HVR L1, L2 и L3 являются SEQ ID NO:1, 2 и/или 3, соответственно.
В другом аспекте антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:10, и/или вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:9.
В другом аспекте антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:10, и вариабельный домен легкой цепи.
В другом аспекте антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:9, и вариабельный домен тяжелой цепи.
Некоторые варианты осуществления антител по настоящему изобретению содержат вариабельный домен легкой цепи гуманизированного антитела 4D5 (huMAb4D5-8) (HERCEPTIN, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (также упоминаемого в патентах США 6407213 и Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93), как представлено в SEQ ID NO:11, ниже.
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
Asn
Arg Ala Ser Gln Asp Val  Thr Ala
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
Val Ala
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
Tyr  Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
Arg
Ser  Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
His
Gln Gln  Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO:11)
(остатки HVR подчеркнуты)
В одном из вариантов осуществления последовательность вариабельного домена легкой цепи huMAb4D5-8 модифицирована в одном или нескольких положениях 30, 66 и 91 (Asn, Arg и His, как указано жирным шрифтом/курсивом выше, соответственно). В одном из вариантов осуществления модифицированная последовательность huMAb4D5-8 содержит Ser в положении 30, Gly в положении 66 и/или Ser в положении 91. Таким образом, в одном из вариантов осуществления, антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:45, ниже:
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
Ser
Arg Ala Ser Gln Asp Val  Thr Ala
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
Val Ala
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
Tyr  Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
Gly
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
Ser
Gln Gln  Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO:45)
(остатки HVR подчеркнуты).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу против гепсина, которое конкурирует с любым из вышеупомянутых антител за связывание с гепсином. В одном из аспектов изобретение относится к антителу против гепсина, которое связывается с тем же самым или сходным эпитопом на гепсине, что и вышеупомянутые антитела.
Как известно в данной области и как описано более подробно в настоящем описании ниже, положение/граница аминокислоты, определяющие гипервариабельную область антитела, могут варьироваться в зависимости от контекста и различных определений, известных в данной области (как описано ниже). Некоторые положения в вариабельном домене могут рассматриваться как гибридные гипервариабельные положения, в том смысле, что можно считать, что эти положения находятся в пределах гипервариабельного домена при одном наборе критериев, тогда как можно считать, что они находятся вне гипервариабельного домена при другом наборе критериев. Одно или несколько этих положений могут быть также обнаружены в растянутых гипервариабельных областях (как определено ниже).
2
В некоторых вариантах осуществления антитело является моноклональным антителом. В других вариантах осуществления антитело является поликлональным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, аффинно зрелого антитела, гуманизированного антитела и антитела человека. В некоторых вариантах осуществления антитело является фрагментом антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело является Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab') или scFv.
В одном из вариантов осуществления антитело является химерным антителом, например, антителом, содержащим антиген-связывающие последовательности из донора-не-человека, трансплантированные в гетерологичную последовательность, которая не относится к области человека, человека или гуманизированную последовательность (например, каркасные последовательности и/или последовательности константного домена). В одном из вариантов осуществления, этим донором, не являющимся человеком, является мышь. В следующем варианте осуществления, антиген-связывающая последовательность является синтетической, например, полученной мутагенезом (например, скринингом фагового дисплея и т.д.). В одном конкретном варианте осуществления химерное антитело по настоящему изобретению имеет V-области мыши и С-область человека. В одном из вариантов осуществления V-область мыши легкой цепи слита с легкой цепью каппа человека. В другом варианте осуществления V-область мыши тяжелой цепи слита с С-областью IgG1 человека.
Гуманизированные антитела по настоящему изобретению включают антитела, которые имеют аминокислотные замены в каркасной области (FR), и аффинно зрелые варианты с изменениями в трансплантированных CDR. Замененные аминокислоты в CDR или FR не ограничиваются аминокислотами, присутствующими в донорском или реципиентном антителе. В других вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению дополнительно содержат изменения в аминокислотных остатках в Fc-области, которые приводят к улучшенной эффекторной функции, в том числе повышенной CDC- и/или ADCC-функции и B-клеточном убивании. Другие антитела по настоящему изобретению включают антитела, имеющие специфические изменения, которые улучшают стабильность. В других вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению содержат изменения в аминокислотных остатках в Fc-области, которые приводят к уменьшенной эффекторной функции, например, CDC- и/или ADCC-функции и/или уменьшенному В-клеточному убиванию. В некоторых вариантах осуществления, антитела по настоящему изобретению характеризуются уменьшенным связыванием (например, отсутствием связывания) с фактором комплемента C1q человека и/или Fc-рецептором человека на природных клетках-киллерах (NK). В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению характеризуются уменьшенным связыванием (например, отсутствием связывания) с FcγRI, FcγRIIA и/или FcγRIIIA человека. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению являются антителами класса IgG (например, IgG1 или IgG4) и содержат по меньшей мере одну мутацию в E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 и/или P329 (нумерация согласно EU индексу). В некоторых вариантах осуществления эти антитела содержат мутации L234A/L235A или D265A/N297A.
В одном из аспектов изобретение относится к гепсин-связывающим полипептидам, содержащим любую из антиген-связывающих последовательностей, обеспеченных в настоящем описании, где гепсин-связывающие полипептиды специфически связываются с гепсином, например, с гепсином человека и/или собакоподобной обезьяны и/или мыши.
Антитела по настоящему изобретению связываются (например, специфически связываются) с гепсином и в некоторых вариантах осуществления могут модулировать (например, ингибировать) один или несколько аспектов активности гепсина (например, ферментативную активность гепсина), и/или разрушать любой биологически релевантный гепсин и/или биологический путь полипептидного субстрата гепсина, и/или лечение и/или предотвращение опухоли, клеточно-пролиферативного нарушения или рака; и/или лечение и/или предотвращение нарушения, связанного с экспрессией и/или активностью гепсина (например, увеличенной экспрессии и/или активности гепсина). В некоторых вариантах осуществления антитело против гепсина специфически связывается с полипептидом, состоящим или по существу состоящим из гепсина (например, гепсина человека и/или мыши). В одном из вариантов осуществления ферментативная активность гепсина включает расщепление полипептидного субстрата гепсина. В одном из вариантов осуществления полипептидным субстратом гепсина является один или несколько из стимулирующего про-макрофага белка (pro-MSP), pro-uPA, Фактора VII и pro-HGF.
В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению не является антителом против гепсинам, описанным в Cancer Research, Volume 66, pages 3611-3619, опубликованным в 2006 году (например, антителом 1A12, 85B11, 94A7, A6, A174, A21 и/или A24, описанным на фигуре 4), или выделенным антителом гепсина, описанным в PCT публикациях WO2004/033630 (например, антителом 47A5, 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 и/или 72H6, описанным на странице 93 и на фигурах 15A-D), или выделенным антителом гепсина, описанным в Xuan et al (2006) Cancer Res 66(7), 3611, или антителом гепсина, описанным в WO2007/149932.
В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению не конкурирует за связывание с гепсином человека с антителом против гепсина, описанным в Cancer Research, Volume 66, pages 3611-3619, опубликованным в 2006 году (например, антителом 1A12, 85B11, 94A7, A6, A174, A21 и/или A24, описанным на фигуре 4), или выделенным антителом гепсина, описанным в PCT публикациях WO2004/033630 (например, антителом 47A5, 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 и/или 72H6, описанным на странице 93 и на фигурах 15A-D), или выделенным антителом гепсина, описанным в Xuan et al (2006) Cancer Res 66(7), 3611, или антителом гепсина, описанным в WO2007/149932.
В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению не связывается с тем же самым эпитопом на гепсине человека, что и антитело против гепсина, описанное в Cancer Research, Volume 66, pages 3611-3619, опубликованном в 2006 году (например, антитело 1A12, 85B11, 94A7, A6, A174, A21 и/или A24, описанное на фигуре 4), или выделенное антитело гепсина, описанное в PCT публикациях WO2004/033630 (например, антитело 47A5, 14C7, 46D12, 38E2, 37G10, 31C1, 11C1 и/или 72H6, описанное на странице 93 и на фигурах 15A-D), или выделенное антитело гепсина, описанное в Xuan et al (2006) Cancer Res 66(7), 3611, или антитело гепсина, описанное в WO2007/149932.
В одном из аспектов изобретение относится к композициям, содержащим одно или несколько антител по настоящему изобретению и носитель. В одном из вариантов осуществления носитель является фармацевтически приемлемым.
В другом аспекте изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитело гепсина по настоящему изобретению.
Еще в одном из аспектов изобретение относится к векторам, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.
В следующем аспекте изобретение относится к композициям, содержащим одну или несколько нуклеиновых кислот по настоящему изобретению и носитель. В одном из вариантов осуществления носитель является фармацевтически приемлемым.
В одном из аспектов изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту или вектор по настоящему изобретению. Вектор может быть вектором любого типа, например, рекомбинантным вектором, таким как вектор экспресии. Может быть использовано множество клеток-хозяев. В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин является прокариотической клеткой, например, E. coli. В другом варианте осуществления клетка-хозяин может быть эукариотической клеткой, например, клеткой млекопитающего, такой как Клетка Яичника Китайского Хомячка (CHO).
В следующем аспекте изобретение относится к способам получения антитела по настоящему изобретению. Например, изобретение относится к способам получения антитела против гепсина (которое в данном контексте включает полноразмерное антитело и его фрагменты), предусматривающим культивирование клетки-хозяина, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую гуманизированное антитело, таким образом, что нуклеиновая кислота экспрессируется. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает выделение антитела из культуры клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления антитело извлекают из культуральной среды клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает объединение выделенного антитела с фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом или носителем для приготовления фармацевтической композиции, содержащей гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения антитела против гепсина, предусматривающим отбор антител, которые связывают комплекс, содержащий (а) гепсин и (b) ингибитор сериновой протеазы, который связывает субсайт S1 гепсина. В некоторых вариантах осуществления гепсин, присутствующий в комплексе, является инактивированным. В некоторых вариантах осуществления, ингибитором сериновой протеазы является 3,4-дихлоризокумарин (DCI). В некоторых вариантах осуществления ингибитор сериновой протеазы связывает каталитические аминокислотные остатки гепсина Ser195 и His 57, посредством чего гепсин инактивируется. В некоторых вариантах осуществления перед отбором антитела, антитело инкубируют с гепсином и ингибитором сериновой протеазы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию отбора антител, которые конкурируют за связывание с гепсином с доменом Кунитца. В некоторых вариантах осуществления домен Кунитца является KD1.
В одном из аспектов изобретение относится к изделию, содержащему контейнер; и композиции, содержащейся в этом контейнере, где композиция содержит одно или несколько антител гепсина по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления композиция содержит нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления композиция, содержащая антитело, дополнительно содержит носитель, который в некоторых вариантах осуществления является фармацевтически приемлемым. В одном из вариантов осуществления изделие изобретения дополнительно содержит инструкции для введения этой композиции (например, антитела) индивидууму (такие как инструкции для любого из описанных в настоящем описании способов).
В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему первый контейнер, содержащий композицию, содержащую одно или несколько антител против гепсина по настоящему изобретению; и второй контейнер, содержащий буфер. В одном из вариантов осуществления буфер является фармацевтически приемлемым. В одном из вариантов осуществления, композиция, содержащая антитело, дополнительно содержит носитель, который в некоторых вариантах осуществления является фармацевтически приемлемым. В другом варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции для введения этой композиции (например, антитела) индивидууму.
Путь гексина участвует во множественных биологических и физиологических функциях, включающих, например, активацию пути HGF/c-met, активацию пути MSP/Ron, разрушение/деградацию базальной мембраны и т.д. Эти функции, в свою очередь, часто являются нарушенными в таких нарушениях, как рак. Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования нарушения/деградации базальной мембраны и/или матриксной деградации, предусматривающему приведение в контакт клетки или ткани с антагонистом по настоящему изобретению, посредством чего ингибируется разрушение/деградация базальной мембраны и/или матриксная деградация. Еще в одном из аспектов изобретение относится к способу ингибирования нарушения/деградации базальной мембраны и/или матриксной деградации, предусматривающему введение в клетку, ткань и/или индивиду с состоянием, связанным с аномальными разрушением/деградацией базальной мембраны и/или матриксной деградацией, антагониста по настоящему изобретению, посредством чего ингибируется разрушение/деградация базальной мембраны и/или матриксная деградация.
В одном из аспектов изобретение относится к способу лечения или профилактики нарушения, связанного с увеличенной активностью гепсина, предусматривающему введение индивиду, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антагониста по настоящему изобретению, посредством чего имеет место эффективное лечение или профилактики указанного нарушения. В одном из вариантов осуществления указанным нарушением является рак.
В следующем аспекте изобретение относится к применению антитела против гепсина по настоящему изобретению в приготовлении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения нарушения, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение. В некоторых вариантах осуществления раком, опухолью и/или клеточно-пролиферативным нарушением является рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления раком, опухолью и/или клеточно-пролиферативным нарушением является рак яичника или рак почки.
В одном из аспектов изобретение относится к применению нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в приготовлении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения нарушения, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение. В некоторых вариантах осуществления раком, опухолью и/или клеточно-пролиферативным нарушением является рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления, этими раком, опухолью и/или клеточно-пролиферативным нарушением является рак яичника или рак почки.
В другом аспекте, изобретение относится к применению вектора экспрессии по настоящему изобретению для приготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения нарушения, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение. В некоторых вариантах осуществления, этими раком, опухолью и/или клеточно-пролиферативным нарушением является рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления раком, опухолью и/или клеточно-пролиферативным нарушением является рак яичника или рак почки.
Еще в одном из аспектов изобретение относится к применению клетки-хозяина по настоящему изобретению для приготовления лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения нарушения, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение. В некоторых вариантах осуществления раком, опухолью и/или клеточно-пролиферативным нарушением является рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления, этими раком, опухолью и/или клеточно-пролиферативным нарушением является рак яичника или рак почки.
В следующем аспекте изобретение относится к применению изделия по настоящему изобретению в приготовлении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения нарушения, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение. В некоторых вариантах осуществления этими раком, опухолью и/или клеточно-пролиферативным нарушением является рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления раком, опухолью и/или клеточно-пролиферативным нарушением является рак яичника или рак почки.
В одном из аспектов изобретение относится к применению набора по настоящему изобретению в приготовлении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения нарушения, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное нарушение. В некоторых вариантах осуществления раком, опухолью и/или клеточно-пролиферативным нарушением является рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления раком, опухолью и/или клеточно-пролиферативным нарушением является рак яичника или рак почки.
Изобретение относится к способам и композициям, применимым для модуляции нарушений, связанных с экспрессией и/или передачей сигнала гепсина, таких как увеличенная экспрессия и/или передача сигнала или нежелаемая экспрессия и/или передача сигнала.
Способы по настоящему изобретению могут быть использованы для действия на любое подходящее патологическое состояние. Примерные нарушения описаны в настоящем описании и включают рак, выбранный из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого, рака яичника, рака щитовидной железы, тестикулярного рака, рака эндометрия, рака головы и шеи (например, плоскоклеточной карциномы головы и шеи), рака головного мозга (например, нейробластомы или менингиомы), рака кожи (например, меланомы, базальноклеточной карциномы или плоскоклеточной карциномы), рака мочевого пузыря (например, переходно-клеточного рака), рака молочной железы, рака желудка, колоректального рака (CRC), печеночно-клеточной карциномы, рака шейки матки, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы и рака почки, и рака эндометрия.
В одном из вариантов осуществления клетка, которая является мишенью в способе по настоящему изобретению, является раковой клеткой. Например, раковая клетка может быть клеткой, выбранной из группы, состоящей из клетки рака молочной железы, клетки колоректального рака, клетки рака легкого (например, клетки немелкоклеточного рака легкого), клетки рака щитовидной железы, клетки множественной миеломы, клетки тестикулярного рака, клетки папиллярной карциномы, клетки рака ободочной кишки, клетки рака поджелудочной железы, клетки рака яичника, клетки рака шейки матки, клетки рака центральной нервной системы, клетки остеогенной саркомы, клеткой рака почки, клетки гепатоцеллюлярной карциномы, клетки рака мочевого пузыря (например, клетки переходно-клеточного рака), клетки карциномы желудка, клетки плоскоклеточной карциномы головы и шеи, клетки меланомы, лейкозной клетки, клетки рака эндометрия и клетки аденомы ободочной кишки. В одном из вариантов осуществления клеткой, которая является мишенью в способе по настоящему изобретению, является гиперпролиферативная и/или гиперпластическая клетка. В другом варианте осуществления клеткой, которая является мишенью в способе по настоящему изобретению, является диспластическая клетка. Еще в одном из вариантов осуществления клеткой, которая является мишенью в способе по настоящему изобретению, является метастатическая клетка.
Способы по настоящему изобретению могут также предусматривать дополнительные стадии лечения. Например, в одном из вариантов осуществления, способ дополнительно предусматривает стадию, в которой клетку-мишень и/или ткань-мишень (например, раковую клетку) подвергают лучевой терапии или действию химиотерапевтического средства.
В одном из аспектов изобретение относится к способам, предусматривающим введение эффективного количества антитела против гепсина в комбинации с эффективным количеством другого терапевтического средства (такого как анти-ангиогенное средство, другое антитело, химиотерапевтическое средство, цитотоксическое средство, иммуносупрессивное средство, пролекарство, цитокин, цитотоксическая радиотерапия, кортикостероид, противорвотное средство, раковая вакцина, анальгезирующее средство или ингибирующее рост средство). Например, антитела против гепсина используют в комбинации с противораковым средством или анти-ангиогенным средством для лечения различных опухолевых или неопухолевых состояний.
В зависимости от конкретного ракового показания, подлежащего лечению, комбинированная терапия по настоящему изобретению может быть объединена с дополнительными терапевтическими средствами, такими как химиотерапевтические средства, или дополнительными терапиями, такими как радиотерапия или хирургия. Многие известные химиотерапевтические средства могут быть использованы в комбинированной (комплексной) терапии по настоящему изобретению. Предпочтительно, должны использоваться химиотерапевтические средства, которые являются стандартными для лечения конкретных показаний. Доза или частота каждого терапевтического средства для применения в этой комбинации является, предпочтительно, такой же, или меньшей, чем доза или частота соответствующего средства при его применении без другого средства или других средств.
В другом аспекте изобретение относится к любому из описанных в настоящем описании антител против гепсина, причем это антитело против гепсина содержит детектируемую метку.
in vivo
in vitro
В другом аспекте изобретение относится к комплексу любого из описанных в настоящем описании антител против гепсина и гепсина. В некоторых вариантах осуществления комплекс используют  или . В некоторых вариантах осуществления комплекс содержит раковую клетку. В некоторых вариантах осуществления антитело против гепсина является детектируемо меченым.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
ФИГУРА 1: Последовательности петель HVR тяжелой и легкой цепи антитела против гепсина. На фигуре показаны последовательности HVR тяжелой цепи, H1, H2 и H3, и последовательности HVR легкой цепи, L1, L2 и L3. Нумерация последовательности является следующей:
Клон 25 (HVR-H1 является SEQ ID NO:4; HVR-H2 является SEQ ID NO:5; HVR-H3 является SEQ ID NO:6; HVR-L1 является SEQ ID NO:1; HVR-L2 является SEQ ID NO:2; HVR-L3 является SEQ ID NO:3);
Положения аминокислот нумеруются согласно системе нумерации Кабата, описанной ниже.
ФИГУРЫ 2A, 2B и 3: изображают примерные акцепторные каркасные последовательности человека для применения в практике данного изобретения со следующими идентификаторами последовательностей:
Консенсусные каркасы вариабельной области тяжелой цепи (VH) (ФИГ. 2A, 2B)
консенсусный каркас подгруппы I VH человека минус CDR Кабата (SEQ ID NO:21-23 и 16, соответственно)
консенсусный каркас подгруппы I VH человека минус растянутые гипервариабельные области (SEQ ID NO:24-25, 23 и 16; 24-26 и 16; и 24-25, 27 и 16, соответственно)
консенсусный каркас подгруппы II VH человека минус CDR Кабата (SEQ ID NO:28-30 и 16, соответственно)
консенсусный каркас подгруппы II VH человека минус растянутые гипервариабельные области (SEQ ID NO:31-32, 30 и 16; 31-33 и 16; и 31-32, 34 и 16, соответственно)
консенсусный каркас подгруппы II VH человека минус растянутые
консенсусный каркас подгруппы III VH человека минус CDR Кабата (SEQ ID NO:35-37 и 16, соответственно)
консенсусный каркас подгруппы III VH человека минус растянутые гипервариабельные области (SEQ ID NO:14-15, 37 и 16; 14-15, 38 и 16; и 14-15, 43 и 16, соответственно)
каркас акцептора VH человека минус CDR Кабата (SEQ ID NO:39, 36, 40 и 16, соответственно)
каркас акцептора VH человека минус растянутые гипервариабельные области (SEQ ID NO:14-15, 40 и 16; и 14-15, 41 и 16, соответственно)
каркас акцептора 2 VH человека минус CDR Кабата (SEQ ID NO:39, 36, 42 и 16, соответственно)
каркас акцептора 2 VH человека минус растянутые гипервариабельные области (SEQ ID NO:14-15, 42 и 16; 14-15, 44 и 16; и 14-15, 48 и 16, соответственно)
Консенсусные каркасы вариабельной области легкой цепи (VL) (ФИГ.3)
консенсусный каркас подгруппы I VL каппа человека (SEQ ID NO:17-20, соответственно)
консенсусный каркас подгруппы II VL каппа человека (SEQ ID NO:49-51 и 20, соответственно)
консенсусный каркас подгруппы III VL каппа человека (SEQ ID NO:52-54 и 20, соответственно)
консенсусный каркас подгруппы IV VL каппа человека (SEQ ID NO:55-57 и 20, соответственно)
ФИГУРА 4: изображает последовательности каркасных областей легкой цепи huMAb4D5-8 (SEQ ID NO:17-18, 58 и 20, соответственно, в порядке появления) и тяжелой цепи (SEQ ID NO:14-15, 48 и 16, соответственно, в порядке появления). Цифры над строкой/жирный шрифт указывают положения аминокислот в соответствии с Кабатом.
ФИГУРА 5: изображает модифицированные/вариантные последовательности каркасной области легкой цепи huMAb4D5-8 (SEQ ID NO:17-20, соответственно, в порядке появления) и тяжелой цепи (SEQ ID NO:14-15, 43 и 16, соответственно, в порядке появления). Цифры над строкой/жирный шрифт указывают положения аминокислот в соответствии с Кабатом.
ФИГУРА 6: изображает вариабельную область тяжелой цепи антитела против гепсина mab25 (SEQ ID NO:10) и вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:9).
ФИГУРА 7: Один вариант аминокислотной последовательности нативного гепсина человека.
ФИГУРА 8A и B: Другой вариант аминокислотной последовательности нативного гепсина человека.
ФИГУРА 9: Инактивация гепсина 3,4-дихлоризокумарином (DCI). A. Зависимое от концентрации ингибирование активности фермента в отношении субстрата S2765 после 40-минут инкубирования гепсина с увеличивающимися концентрациями DCI. B. Химическая структура DCI и его потенциальных аддуктов с гепсином в соответствии с (Powers et al., 1989).
ФИГУРА 10: KD1 конкурирует с анти-гепсин-Fab-фагом за связывание с гепсином. Связывание Fab25-фага с гепсином в присутствии увеличивающихся концентраций KD1.
i
o
ФИГУРА 11: Ингибирование ферментативной активности гепсина человека и мыши с использованием Fab25. Гепсин человека (hu) и мыши (mu) инкубировали с Fab25 или контрольным Fab (контр. Fab) в течение 40 минут перед добавлением субстрата S2765. Начальные линейные скорости измеряли на кинетическом микропланшет-ридере и активность фермента выражали в виде дробной активности (v/v).
i
0
ФИГУРА 12: Специфичность Fab25. Fab25 (1 мкМ) инкубировали с гепсином и 9 трипсин-подобными сериновыми протеазами в течение 40 минут перед добавлением синтетических пара-нитроанилидных субстратов (pNA). Начальные линейные скорости измеряли на кинетическом микропланшет-ридере и активность фермента выражали в виде дробной активности (v/v).
i
o
ФИГУРА 13: Ингибирование посредством Fab25 процессинга макромолекулярного субстрата гепсином. A. Ингибирование активации pro-uPA с использованием Fab25. Действие Fab25 на гепсин-опосредуемый процессинг pro-uPA определяли в двухстадийном ферментативном анализе. Начальные линейные скорости измеряли на кинетическом микропланшет-ридере и активность фермента выражали в виде дробной активности (v/v). С использованием калибровочной кривой uPA определяли, что неингибированная степень образования uPA гепсином была равна 0,81±0,22 мкМ uPA/мин (n=3). Ингибирование процессинга субстрата гепсина посредством Fab25 выполняли для 3 известных субстратов: B. фактора VII (FVII); C. pro-HGF и D. pro-MSP. Расщепление Фактора VII гепсином проводили в течение 0,5 ч и 2,0 ч в присутствии или в отсутствие Fab25 и контрольного Fab (контр. Fab), тогда как эксперименты с расщеплением pro-HGF и pro-MSP выполняли в течение 30 минут. Аликвоты реакционной смеси анализировали при помощи ПААГ-ДСН (при восстанавливающих условиях) и гели окрашивали.
ФИГУРА 14: Эффекты целостности Fab25 после пролонгированного экспонирования действию гепсина. CDR-H3-петля в Fab25 содержит три остатка лизина и один остаток аргинина, которые могут потенциально расщепляться гепсином, но протеолитический процессинг Fab25 гепсином не наблюдали при инкубировании в течение 24 часов либо при рН 6,0, либо при pH 8,0. Протеолиз подвергали мониторингу посредством смещения мобильности в геле на 4-20% (масс./об.) полиакриламидном градиентном геле и окрашивали Кумасси бриллиантовым синим.
4
ФИГУРА 15: Ингибирование с использованием Fab25 ламинин-зависимой миграции клеток DU145. A. Клетки DU145 (2×10) в бессывороточной модифицированной Дульбекко среде Игла добавляли в предварительно обработанные верхние камеры вкладышей флуормодуля и давали им мигрировать в течение 5 ч при 37°С. После инкубации, немигрирующие клетки и среды промывали и те клетки, которые мигрировали к нижней части этих фильтров, фиксировали, окрашивали YO-PRO-I и визуализировали с использованием инвертированного микроскопа. Репрезентативные изображения получали из предварительно обработанных фильтров (ламинин, ламинин, инкубированный вместе с гепсином, ламинин, инкубированный вместе с комплексом гепсин:Fab25 или контроль PBS) с фиксированными клетками. B. Измерение относительных единиц флуоресценции (R.F.U) из клеток, окрашенных YO-PRO-субстратами, вычитали для PBS-лунок. Клетки DU145, обработанные гепсин-процессированным ламинином, имели заметное увеличение миграции в сравнении с клетками, которые обрабатывали только ламинином. Отсутствие процессинга ламинином гепсином в присутствии Fab25 делает клетки DU145 менее мигрируемыми.
125
ФИГУРА 16: A. Активация pro-MSP экспрессируемым клеточной поверхностью гепсином в клетках LnCap-34. Клетки LnCap-34, которые стабильно сверхэкспрессируют гепсин, лишали сыворотки и обрабатывали только 125I-pro-MSP или в комбинации с различными ингибиторами в течение 3 часов. Рекомбинантный гепсин (10 нМ) использовали в качестве положительного контроля. Значимое увеличение в pro-MSP-процессинге наблюдали после 3 часов в сравнении с началом этого эксперимента. Ингибиторы KQLR (SEQ ID NO:12), KD1 и антитело против гепсина Fab25 эффективно блокировали активацию pro-MSP. B. Активация pro-HGF экспрессируемым клеточной последовательностью гепсином в клетках LnCap-34. Клетки LnCap-34 обрабатывали I-pro-HGF в присутствии варьируемых концентраций Fab25 (20 нМ - 0,15 нМ) и инкубировали в течение 3 часов. Рекомбинантный гепсин (10 нМ) использовали в качестве положительного контроля. Значимое увеличение в pro-HGF-процессинге наблюдали после 3 часов в сравнении с началом этого эксперимента. Антитело против гепсина Fab25 эффективно блокировало активацию pro-HGF зависимым от концентрации образом.
D
D
eq
ФИГУРА 17: A. Поверхностный плазмонный резонанс использовали для измерения аффинности связывания Ab25 с активным гепсином человека. Серийные разведения гепсина (0,39 нМ - 200 нМ) инъецировали в биосенсорный чип CM5 с захваченным Ab25 в течение 3 минут и диссоциацию подвергали мониторингу в течение 15 минут. Построение этих экспериментальных данных давало скорость диссоциации для равновесия (K) 10,6 нМ. B. Поскольку связывание Ab25 с про-гепсином обнаруживало быструю кинетику, аффинность связывания определяли измерениями аффинности в стационарном состоянии. Серийные разведения про-гепсина (195 нМ - 80 мкМ) инъецировали в биосенсорный чип CM5 с захваченным Ab25 в течение 2 минут. Скорость диссоциации для равновесия (K=5,52 мкМ) определяли анализом в стационарном состоянии из графика R против концентрации про-гепсина.
D
ФИГУРА 18: Калориметрический эксперимент изотермального титрования связывания Fab25 с активным гепсином. Реакция ассоциации является экзотермической и стехиометрия связывания является 1:1, как ожидалось. Константа диссоциации (K) из ITC равна 6,1 нМ, что превосходно коррелирует с предыдущими данными из BIAcore. Энтальпия (ΔΗ) и энтропия (TAS) связывания равны -27,5 ккал/моль и -16,3 ккал/моль, что указывает на то, что это связывание энтальпически возбуждается неблагоприятной энтропией.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Описанное в настоящем описании изобретение относится к антителам против гепсина, которые применимы, например, для лечения или предотвращения патологических состояний, связанных с экспрессией и/или активностью гепсина, например, увеличенной экспрессией и/или активностью или нежелаемой экспрессией и/или активностью. В некоторых вариантах осуществления, антитела по настоящему изобретению используют для лечения опухоли, рака и/или клеточно-пролиферативного нарушения.
В другом аспекте антитела против гепсина по настоящему изобретению находят применение в качестве реагентов для детектирования и/или выделения гепсина, например, детектирования гепсина в различных типах тканей и клеток.
Кроме того, изобретение относится к способам получения и применения антител против гепсина и полинуклеотидов, кодирующих антитела против гепсина.
Основные способы
Описанные или цитируемые в настоящем описании способы и процедуры являются обычно хорошо понятными и обычно применяемыми с использованием общепринятой методологии специалистами с квалификацией в данной области, такие как, например, широко используемые методологии, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. ( 1987)).
Определения
"Выделенное" антитело является антителом, которое было идентифицировано и отделено и/или выделено из компонента его природного окружения. Загрязняющими компонентами его природного окружения являются материалы, которые могут мешать диагностическим или терапевтическим применениям для антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые и небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления антитело будет очищено (1) до более чем 95% по массе антитела, как определено способом Лоури, и наиболее вероятно, до более чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающимися чашками, или (3) до гомогенности согласно электрофорезу в ПААГ-ДСН (электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) при восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием Кумасси синего или, предпочтительно, содержащего серебро красителя. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, так как по меньшей мере один компонент природного окружения антитела не будет присутствовать. Однако, обычно выделенное антитело получают посредством по меньшей мере одной стадии очистки.
"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты является молекулой нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в природном источнике этой нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты является другой, чем эта молекула в форме или обстановке, в которой она обнаруживается в природе. Таким образом, выделенные молекулы нуклеиновых кислот отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты в том виде, в каком она существует в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют нуклеиновую кислоту (например, кодирующую антитело нуклеиновую кислоту), где, например, молекула нуклеиновой кислоты находится в местоположении в хромосоме, отличающемся от местоположения в хромосоме природных клеток.
Термин "нумерация остатков вариабельного домена по Кабату" или "нумерация положений аминокислот по Кабату", и его вариации, относится к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи компиляции антител в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). С использованием этой системы нумерации действительная линейная последовательность аминокислот может содержать меньше аминокислот или может содержать дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или инсертированию в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать единственную вставку аминокислоты (остаток 52а согласно Кабату) после остатка 52 Н2 и инсертированные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82c и т.д. по Кабату) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Эта нумерация остатков по Кабату может быть определена для конкретного антитела сопоставлением в областях гомологии последовательности этого антитела со "стандартной" пронумерованной по Кабату последовательностью.
D
Фраза "по существу сходные" или "по существу одни и те же" обозначает, как используется в данном описании, достаточно высокую степень сходства между двумя цифровыми величинами (обычно одной, связанной с антителом по настоящему изобретению, и другой, связанной со ссылочным/компараторным антителом (сопоставляемым)), так что квалифицированный в данной области специалист может считать, что различие между этими двумя величинами является малым или что не существует биологического и/или статистического различия в контексте биологических характеристик, измеряемых указанными величинами (например, величинами K). Различие между указанными двумя величинами равно, предпочтительно, менее приблизительно 50%, предпочтительно, менее приблизительно 40%, предпочтительно, менее приблизительно 30%, предпочтительно, менее приблизительно 20%, предпочтительно, менее приблизительно 10% как функция этой величины для ссылочного/компараторного (сопоставляемого) антитела.
D
D
-7
-8
-8
-9
-9
-9
-10
"Активность связывания" обычно обозначает силу общей суммы нековалентных взаимодействий между единственным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнером связывания (например, антигеном). Если нет других указаний, как используется в данном описании, "аффинность связывания" относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы Х в отношении партнера Y может быть обычно представлена константной диссоциации (K). Желательно, K равна 1×10, 1×10, 5×10, 1×10, 3×10, 5×10 или даже 1×10 или является более сильной. Аффинность может быть измерена общепринятыми способами, известными в данной области, в том числе способами, описанными в настоящем описании. Антитела с низкой аффинностью связывают антиген медленно и имеют тенденцию легко диссоциироваться, тогда как антитела с высокой аффинности обычно связывают антиген быстрее и имеют тенденцию дольше оставаться связанными. В данной области известно множество способов измерения аффинности, любой из которых может быть использован для целей данного изобретения. Далее описаны конкретные иллюстративные варианты.
D
on
off
D
off
on
125
I25
6
-1
-1
В одном из вариантов, "K" или "величину Kd" в соответствии с этим изобретением измеряют анализом связывания радиоактивно меченого антигена (RIA), выполняемым с Fab-версией представляющего интерес антитела и его антигеном, как описано следующим анализом, который измеряет аффинность связывания в растворе Fab в отношении антигена уравновешиванием Fab с минимальной концентрацией (I)-меченого антигена в присутствии титрованной серии немеченого антигена, затем иммобилизацией связанного антигена на покрытом анти-Fab-антителом планшете (Chen, et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). Для установления условий для этого анализа микротитрационные планшеты (Dynex) покрывают в течение ночи 5 мкг/мл иммобилизующего анти-Fab-антитела (Cappel Labs) в 50 мМ карбонате натрия (pH 9,6), и затем блокируют 2% (масс./об.) бычьим сывороточным альбумином в PBS в течение двух-пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В неадсорбируемом планшете (Nunc #269620), 100 пМ или 26 пМ [I]-антигена смешивают с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, согласующимися с оцениванием анти-VEGF-антитела, Fab-12, в Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Затем представляющей интерес Fab инкубируют в течение ночи; однако, это инкубирование может продолжаться в течение более длительного периода (например, 65 часов) для гарантии достижения равновесия. После этого, эти смеси переносят в улавливающий планшет для инкубирования при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем этот раствор удаляют и планшет промывают восемь раз 0,1% Твин-20 в PBS. После высыхания этих планшетов, добавляют 150 мкл на лунку сцинтиллятора (MicroScint-20; Packard) и эти планшеты считают на гамма-счетчике Topcount (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, которые дают меньшее или равное 20% максимальное связывание, отбирают для использования в анализах конкурентного связывания. Согласно другому варианту, Kd или величину Kd измеряют с использованием анализов плазмонного резонанса при помощи BIAcore™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с чипами с иммобилизованным антигеном CM5 при ~10 единицах реакций (RU). Коротко, биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, в 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инъекцией при скорости потока 5 мкл/мин для достижения приблизительно 10 единиц ответа (реакции) (RU) связанного белка. После инъекции антигена, инъецируют 1 М этаноламин для блокирования непрореагировавших групп. Для измерения кинетики, двухкратные серийные разведения Fab (0,78 нМ - 500 нМ) инъецируют в PBS с 0,05% Твином 20 (PBST) при 25°C при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. В некоторых вариантах осуществления, используют следующие модификации для способа анализа плазмонного резонанса: антитело иммобилизуют на биосенсорных чипах CM5 для достижения приблизительно 400 RU и для кинетических измерений двухкратные разведения белка-мишени (например, гепсина-IIIb или -IIIc) (начиная от 67 нМ) инъецируют в буфер PBST при 25°C со скоростью потока приблизительно 30 мкл/мин. Скорости ассоциации (k) и скорости диссоциации (K) рассчитывают с использованием 1:1 модели связывания Langmuir (BlAcore Evaluation Software version 3.2) с одновременным построением сенсограммы ассоциации и диссоциации. Константа диссоциации для равновесия (K) рассчитывают в виде отношения K/k. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Если скорость ассоциации превышает 10 Mс согласно анализу резонанса поверхностных плазмонов, описанному выше, то эта скорость ассоциации может быть определена с использованием способа флуоресцентного гашения, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности испускаемой флуоресценции (возбуждение = 295 нм; испускание = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C 20 нМ анти-антиген-антитела (Fab-формы) в PBS, pH 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена при измерении в спектрофотометре, оборудованном ограничителем потока, таком как оборудованный ограничителем потока спектрофотометр (Aviv Instruments) или спектрофотометр 8000 серии SLM-Aminco (ThermoSpectronic), снабженный кюветой для перемешивания, содержащей красный краситель.
on
on
off
D
off
on
6
-1
-1
"Скорость ассоциации" или "k" в соответствии с этим изобретением может быть также определена тем же самым способом поверхностного плазмонного резонанса, описанным выше, с использованием BIAcore™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с чипами СМ5 с иммобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (реакции) (RU). Коротко, биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, в 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инъекцией при скорости потока 5 мкл/мин для достижения приблизительно 10 единиц ответа (реакции) (RU) связанного белка. После инъекции антигена, инъецируют 1 М этаноламин для блокирования непрореагировавших групп. Для измерения кинетики, двухкратные серийные разведения Fab (0,78 нМ - 500 нМ) инъецируют в PBS с 0,05% Твином 20 (PBST) при 25°C при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. В некоторых вариантах осуществления, используют следующие модификации для способа анализа плазмонного резонанса: антитело иммобилизуют на биосенсорных чипах CM5 для достижения приблизительно 400 RU и для кинетических измерений двухкратные разведения белка-мишени (например, гепсина-IIIb или -IIIc) (начиная от 67 нМ) инъецируют в буфер PBST при 25°C со скоростью потока приблизительно 30 мкл/мин. Скорости ассоциации (k) и скорости диссоциации (K) рассчитывают с использованием простой 1:1 модели связывания Langmuir (BlAcore Evaluation Software version 3.2) с одновременным построением сенсограммы диссоциации. Константу диссоциации для равновесия (K) рассчитывают в виде отношения K/k. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Однако если скорость ассоциации превышает 10 Mс согласно анализу резонанса поверхностных плазмонов, описанному выше, то эта скорость ассоциации может быть определена с использованием способа флуоресцентного гашения, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности испускаемой флуоресценции (возбуждение = 295 нм; испускание = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C 20 нМ анти-антиген-антитела (Fab-формы) в PBS, pH 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена при измерении в спектрофотометре, оборудованном ограничителем потока, таком как оборудованный ограничителем потока спектрофотометр (Aviv Instruments) или спектрофотометр 8000-series SLM-Aminco (ThermoSpectronic), снабженный кюветой для перемешивания, содержащей красный краситель.
Термин "вектор", как используется в данном описании, предназначен для ссылки на молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним типом вектора является "плазмида", которая является кольцевой двухцепочечной ДНК-петлей, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является фаговый вектор. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные ДНК-сегменты могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они вводятся (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации (ориджин репликации), и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина, и посредством этого реплицируются вдоль всего генома хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называют в настоящем описании "рекомбинантными векторами экспрессии" (или просто "рекомбинантными векторами"). Обычно, векторы экспрессии, используемые в способах рекомбинантных РНК, часто находятся в форме плазмид. В данном описании, "плазмида" и "вектор" могут использоваться взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее обычной используемой формой вектора.
2
2
"Полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота", используемые в настоящем описании взаимозаменяемо, обозначает полимеры нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Эти нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями и/или их аналогами или любым субстратом, который может быть включен в полимер ДНК- или РНК-полимеразой или синтетической реакцией. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если они присутствуют, модификация этой нуклеотидной структуры может быть придана до или после сборки этого полимера. Последовательность нуклеотидов может прерываться ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после синтеза, например, конъюгацией с меткой. Другие типы модификаций включают, например, "кэпы", замены одного или нескольких природных нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как интернуклеотидные модификации с неизмененными связями (например, метилфосфанаты, фосфортриэфиры, фосфоамидаты, карбонаты и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.) и части молекул, содержащие боковые цепи, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), модификации с интеркаляторами (например, акридином, псораленом, и т.д.), модификации, содержащие хелаторы (например, металлы, бор, металлы-окислители и т.д.), модификации, содержащие алкилирующие агенты, модификации с модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотидов. Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, может быть заменена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищена стандартными защитными группами или активирована для получения дополнительных нуклеотидных связей или может быть конъюгирована с твердыми или полутвердыми носителями (подложками). 5'- и 3'-концевой ОН может быть фосфорилирован или замещен аминами или органическими кэппирующими группами из 1-20 атомов углерода. Другие гидроксилы могут быть также дериватизованы присоединением к стандартным защитным группам. Полинуклетиды могут также содержать аналоговые формы рибозного и дезоксирибозного сахаров, которые обычно известны в данной области, в том числе, например, 2'-О-метил-, 2'-О-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидорибоза, аналоги карбоциклических сахаров, альфа-аномерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулезы, ациклические аналоги и аналоги основных нуклеозидов, такие как метилрибозид. Одна или несколько фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают, но не ограничиваются ими, варианты, в которых фосфат заменен P(О)S ("тиоатом"), P(S)S ("дитиоатом"), (О)NR ("амидатом"), P(О)R, P(О)OR', CO или CH ("формацеталем"), в которых каждый R или R' обозначает независимо H или замещенный или незамещенный алкил (1-20 C), необязательно содержащий простую (-О-) эфирную связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все связи в одном полинуклеотиде должны быть идентичными. Предыдущее описание относится ко всем полинуклеотидам, упоминаемым в настоящем описании, в том числе РНК и ДНК.
"Олигонуклеотид", как используется в настоящем описании, относится обычно к коротким, обычно одноцепочечным, обычно синтетическим полинуклеотидам, которые обычно, но необязательно, имеют длину приблизительно 200 нуклеотидов. Термины "олигонуклеотид" и "полинуклеотид" не являются взаимно исключающими. Приведенное выше описание полинуклеотидов равным образом и полностью применимо и к олигонуклеотидам.
"Процентную (%) идентичность аминокислотной последовательности” в отношении пептидной или полипептидной последовательности определяют в виде процента аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными с аминокислотными остатками в конкретной пептидной или полипептидной последовательности, после сопоставления этих последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности без учета любых консервативных замен как части идентичности этой последовательности. Сопоставление для целей определения процентной идентичности аминокислотной последовательности может достигаться различными путями, которые находятся в пределах знаний в данной области, например, с использованием публично доступного программного компьютерного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Квалифицированные в данной области специалисты могут определить подходящие параметры для измерения сопоставления, в том числе любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального сопоставления на протяжении полной длины сравниваемых последовательностей. Однако, для целей, поставленных в настоящем описании, величины идентичности % аминокислотной последовательности получают с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2, где исходный код для программы ALIGN-2 показан в таблице А, ниже. Авторство компьютерной программы ALIGN-2 сравнения последовательности принадлежит Genentech, Inc., и исходный код с пользовательской документацией был зарегистрирован в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован под U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программа ALIGN-2 публично доступна через Genentech, Inc., South San Francisco, California или может быть скомпилирована из исходного кода, обеспеченного, например, в WO2007/001851. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для применения в операционной системе, предпочтительно, цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливаются программой ALIGN-2 и не варьируются.
В ситуациях, в которых ALIGN-2 используется для сравнений аминокислотных последовательностей, % идентичность конкретной аминокислотной последовательности A относительно конкретной, с конкретной или против конкретной аминокислотной последовательности В (которая может быть альтернативно названа как конкретная аминокислотная последовательность А, которая имеет или содержит определенную % идентичность аминокислотной последовательности относительно конкретной, с конкретной или против конкретной аминокислотной последовательности В) рассчитывается следующим образом:
100 ×X/Y
где X является числом аминокислотных остатков, оцениваемых как идентичные совпадения, программой ALIGN-2 сопоставления последовательностей в этом сопоставлении А и В данной программой, и где Y является общим числом аминокислотных остатков в В. Должно быть понятно, что когда длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, % идентичность аминокислотной последовательности А к В не будет равной % идентичности аминокислотной последовательности В к А.
В некоторых вариантах осуществления две или более аминокислотных последовательностей являются по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80% или 90% идентичными. В некоторых вариантах осуществления две или более аминокислотных последовательностей являются по меньшей мере на 95%, 97%, 98%, 99% или даже на 100% идентичными. Если нет иных указаний, все величины идентичности аминокислотных последовательностей, используемые в настоящем описании, получены, как описано в предыдущем абзаце с использованием компьютерной программы ALIGN-2.
Термин "гепсин" относится в данном контексте, если конкретно или контекстуально нет иных указаний, к любому нативному или вариантному полипептиду гепсина. Термин "нативная последовательность" специфически включает природные укороченные формы (например, последовательность внеклеточного домена или последовательность трансмембранной субъединицы), природные вариантные формы (например, альтернативно сплайсированные формы) и природные аллельные варианты. Термин "гепсин дикого типа" обычно относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность природного белка гепсина. Термин "последовательность гепсина дикого типа" обычно относится к аминокислотной последовательности, обнаруживаемой в природном гепсине. В одном из вариантов осуществления нативная последовательность полипептида гепсина содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:46 (см. фигуру 7). В одном из вариантов осуществления полипептид гепсина нативной последовательности содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:47 (см. фигуру 8).
"Вариант полипептида гепсина" или его вариации, обозначает полипептид гепсина, обычно активный полипептид гепсина, определенный в настоящем описании, имеющий по меньшей мере приблизительно 80% идентичность аминокислотной последовательности с любой из последовательностей полипептидов гепсина с нативной последовательностью, описанный в настоящем описании. Такие полипептидные варианты гепсина включают, например, полипептиды гепсина, в которых добавлены или из которых делетированы один или несколько аминокислотных остатков, на N- или C-конце нативной аминокислотной последовательности. Обычно, полипептидный вариант гепсина будет иметь по меньшей мере приблизительно 80% идентичность аминокислотной последовательности, альтернативно, по меньшей мере приблизительно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность аминокислотной последовательности в отношении полипептидной последовательности гепсина с нативной последовательностью, описанной в настоящем описании. Обычно, вариантные полипептиды гепсина имеют по меньшей мере приблизительно 10 аминокислот в длину, альтернативно, по меньшей мере приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 или более аминокислот в длину. Необязательно, вариантные полипептиды гепсина будут иметь не более одной консервативной аминокислотной замены в сравнении с последовательностью нативного полипептида гепсина, альтернативно, не более 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных аминокислотных замен в сравнении с последовательностью нативного полипептида гепсина.
"Ингибитор тирозинкиназы" является молекулой, которая ингибирует до некоторой степени тирозиназную активность такой тирозинкиназы, как рецептор гепсина.
Термин "ингибировать" обозначает уменьшение или снижение активности, функции и/или количества в сравнении со ссылочным вариантом.
Термин "экспрессия белка" относится к превращению информации, кодируемой в гене, в мессенджер РНК (мРНК) и затем в белок.
В настоящем описании, образец или клетка, которая "экспрессирует" представляющий интерес белок (такой как гепсин), является образцом или клеткой, в которой мРНК, кодирующая этот белок, или белок, включающий его фрагменты, должны присутствовать в этом образце или клетке.
"Иммуноконъюгат" (взаимозаменяемо называемый "конъюгатом антитело-лекарственное средство" или "ADC") обозначает антитело, конъюгированное с одним или несколькими цитотоксическими средствами, такими как химиотерапевтическое средство, лекарственное средство, ингибирующее рост средство, токсин (например, белковый токсин, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или его фрагменты) или радиоактивным изотопом (т.е. радиоконъюгат).
"Блокирующее" антитело или антитело-"антагонист" является антителом, которое ингибирует или уменьшает биологическую активность антигена, который оно связывает. Предпочтительные блокирующие антитела или антитела-антагонисты полностью ингибируют биологическую активность антигена.
"Голое” антитело является антителом, которое не конъюгировано с гетерологичной молекулой, такой как цитотоксическая молекула или радиоактивная метка.
Антитело, имеющее "биологическую характеристику" сконструированного антитела, является антителом, которое имеет одну или несколько биологических характеристик этого антитела, которые отличают его от других антител, которые связываются с тем же самым антигеном.
Для скрининга на антитела, которые связываются с эпитопом на антигене, связанном представляющим интерес антителом, может быть выполнен рутинный перекрестноблокирующий анализ, такой как анализ, описанный в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988).
1
2
3
4
Для увеличения времени полужизни антител или полипептида, содержащего аминокислотные последовательности по настоящему изобретению, можно присоединить к этому антителу (в частности, фрагменту антитела) связывающий рецептор эпитоп “выживания”, как описано, например, в патенте США 5739277. Например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая связывающий рецептор эпитоп “выживания”, может быть связана в рамке считывания с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептидную последовательность по настоящему изобретению, так что слитый белок, экспрессируемый этой сконструированной молекулой нуклеиновой кислоты содержит связывающий рецептор эпитоп “выживания” и полипептидную последовательность по настоящему изобретению. В данном контексте, термин "связывающий рецептор эпитоп ”выживания”" относится к эпитопу Fc-области молекулы IgG (например, IgG, IgG, IgG или IgG), который является ответственным за увеличение времени полужизни in vivo молекулы IgG (например, Ghetie et al., Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000), Table 1). Антитела с заменами в их Fc-области и увеличенными временами полужизни описаны также в WO00/42072, WO 02/060919; Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004)). В другом варианте осуществления, время полужизни в сыворотке может быть увеличено, например, присоединением других полипептидных последовательностей. Например, антитела или другие полипептиды, используемые в способах по настоящему изобретению, могут быть присоединены к сывороточному альбумину или части сывороточного альбумина, которая связывается с рецептором FcRn или связывающим сывороточный альбумин пептидом, так что сывороточный альбумин связывается с этим антителом или полипептидом, например, такие полипептидные последовательности описаны в WO01/45746. В одном предпочтительном варианте осуществления, этот подлежащий присоединению пептид сывороточного альбумина содержит аминокислотную последовательность DICLPRWGCLW (SEQ ID NO:13). В другом варианте осуществления, время полужизни Fab увеличивается этими способами. См., также, Dennis et al. J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002) в отношении связывающих сывороточный альбумин последовательностей.
"Фрагмент" обозначает часть полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит, предпочтительно, по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более полной длины ссылочной молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида. Фрагмент может содержать 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100, 200, 300, 400, 500, 600 или более нуклеотидов или 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200 или более аминокислот.
Термины "антитело" и "иммуноглобулин" используются взаимозаменяемо в самом широком смысле и включают моноклональные антитела (например, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультивалентные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, пока они проявляют желаемую биологическую активность) и могут также включать некоторые фрагменты антител (как описано более подробно в настоящем описании). Антитело может быть антителом человека, гуманизированным и/или аффинно зрелым антителом.
Термин "вариабельные" относится к тому факту, что некоторые части вариабельных доменов в сильной степени отличаются в последовательности среди антител и используются в связывании и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако, вариабельность не распределена равномерно по вариабельным доменам антител. Она концентрируется в трех сегментах, называемых комплементарность-определяющими областями (CDR) или гипервариабельными областями в вариабельных областях как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных областей называются каркасом (FR). Вариабельные домены природных тяжелых и легких цепей, каждые, содержат четыре FR-области, принимающие в значительной степени β-складчатую конфигурацию, соединенные тремя CDR, которые образуют петли, соединяющие, и в некоторых случаях, образующие часть этой β-складчатой структуры. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости FR-областями и, с CDR из другой цепи, способствуют образованию антиген-связывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие этого антитела в антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности.
2
Расщепление папаином антител продуцирует два идентичных антиген-связывающих фрагмента, называемых "Fab"-фрагментами, каждый с единственным антиген-связывающим сайтом, и оставшийся "Fc"-фрагмент, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает F(ab')-фрагмент, который имеет два антиген-связывающих сайта и все еще способен перекрестно связывать антиген.
"Fv" является минимальным фрагментом антитела, который содержит антиген-узнающий и антиген-связывающий сайт. В двухцепочечных Fv-разновидностях, эта областях состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в тесной, нековалентной связи. В одноцепочечных Fv-разновидностях, один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи могут быть ковалентно связаны гибким пептидным линкером, так что эти легкая и тяжелая цепи могут связываться в "димерную" структуру, аналогичную структуре в двухцепочечных Fv-разновидностях. Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антиген-связывающий сайт на поверхности димера VH-VL. Вместе, эти шесть CDR придают антиген-связывающую специфичность антителу. Однако, даже единственный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфических в отношении антигена) способен распознавать и связывать антиген, хотя и при более низкой аффинности, чем целый связывающий сайт.
2
Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбокси-конце домена СН1 тяжелой цепи, в том числе одного или нескольких цистеинов, из шарнирной области антитела. Fab'-SH является обозначением в настоящем описании для Fab', в котором остаток (остатки) цистеина константных областей несут свободную тиоловую группу. F(ab')-фрагменты антитела первоначально продуцировались в виде пар Fab'-фрагментов, которые имеют шарнирные цистеины между ними. Другие химические связывания фрагментов антител также известны.
"Легкие цепи" антител (иммуноглобулинов) из любого вида позвоночных могут быть отнесены к одному из двух явно отличающихся типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов.
1
2
3
4
1
2
2
В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей, иммуноглобулины могут быть подразделены на различные классы. Имеются пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно подразделены на подклассы (изотипы), например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA и IgA. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называют α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. "Фрагменты антител" включает только часть интактного антитела, где эта часть, предпочтительно, сохраняет по меньшей мере одну, предпочтительно, большинство или все из функций, в норме связанных с этой частью, когда она присутствует в интактном антителе. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab') и Fv; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. В одном из вариантов осуществления, фрагмент антитела содержит антиген-связывающий сайт интактного антитела и, следовательно, сохраняет способность связывания антигена. В другом варианте осуществления, фрагмент антитела, например, фрагмент, который содержит Fc-область, сохраняет по меньшей мере одну из биологических функций, в норме связанных с Fc-областью, когда он присутствует в интактном антителе, такую как связывание FcRn, модуляция времени полужизни, ADCC-функция и связывание комплемента. В одном из вариантов осуществления, фрагментом антитела является моновалентное антитело, которое имеет время полужизни in vivo, по существу сходное с интактным антителом. Например, такой фрагмент антитела может содержать антиген-связывающее плечо, связанное с Fc-последовательностью, способной сообщать стабильность in vivo этому фрагменту.
Термин "гипервариабельная область", "HVR" или "HV," относится в данном контексте к областям вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными в последовательности и/или образуют структурно определенные петли. Обычно, антитела содержат шесть гипервариабельных областей; три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3). Некоторое количество установлений очертаний гипервариабельных областей используются и включены в настоящем описании. Комплементарность-определяющие области Кабата (CDR) основаны на вариабельности последовательностей и наиболее часто используются (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia ссылается вместо этого на местоположение структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Гипервариабельные области AbM представляют компромисс между CDR Кабата и структурными петлями Chothia и используются программой моделирования антител Oxford Molecular's AbM. "Контактные" гипервариабельные области основаны на анализе доступных кристаллических структур комплексов. Остатки из каждого из этих гипервариабельных областей представлены ниже.
Петля
Кабат
AbM
Chothia
Контакт
L1
L24-L34
L24-L34
L26-L32
L30-L36
L2
L50-L56
L50-L56
L50-L52
L46-L55
L3
L89-L97
L89-L97
L91-L96
L89-L96
Н1
H31-H35B
H26-H35B
H26-H32
H30-H35B
(Нумерация Кабата)
H1
H31-H35
H26-H35
H26-H32
H30-H35
(Нумерация Chothia)
H2
H50-H65
H50-H58
H53-H55
H47-H58
H3
H95-H102
H95-H102
H96-H101
H93-H101
Гипервариабельные области могут содержать следующие "растянутые гипервариабельные области": 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в VL и 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (H2) и 93-102, 94-102 или 95-102 (H3) в VH. Остатки вариабельного домена пронумерованы в соответствии с Kabat et al., supra для каждого из этих определений.
Остатки "каркаса" или "FR" являются остатками вариабельного домена, другими чем остатки гипервариабельной области, как определено в настоящем описании.
"Гуманизированные" формы антител, не относящихся к антителам человека (например, мыши) являются химерными антителами, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не относящегося к иммуноглобулину человека. В большей части, гуманизированные антитела являются иммуноглобулинами человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области этого реципиента заменены остатками из гипервариабельной области вида, не относящегося к человеку (донорское антитело), такого как мышь, крыса, кролик или примат (не человек), имеющими желаемые специфичность, аффинность и потенциал. В некоторых случаях, остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками, не являющимися остатками человека. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживаются в реципиентном антителе или в донорском антителе. Эти модификации выполняются для дополнительного улучшения эффективности антитела. Обычно, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобудином человека и все или по существу все эти FR являются FR последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно будет также содержать по меньшей мере часть константной области (Fc), иммуноглобулина человека. В отношении дополнительных деталей см. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). См. также следующие обзорные статьи и цитируемые в них ссылки: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
"Химерные" антитела (иммуноглобулины) имеют часть тяжелой и/или легкой цепи, идентичную с соответствующими последовательностями или гомологичную соответствующим последовательностям в антителах, происходящих из конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть этой цепи (этих цепей) является идентичной с соответствующими последовательностями или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, происходящих из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, пока они проявляют желаемую биологическую активность (Патент США 4,816,567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Гуманизированное антитело, используемое в настоящем описании, является субпопуляцией химерных антител.
"Одноцепочечные Fv"- или "scFv"-фрагменты антител содержат домены VH и VL антитела, где эти домены присутствуют в единой полипептидной цепи. Обычно полипептид scFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет этому scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. В отношении обзора по scFv см. Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
"Антиген" является заданным антигеном, с которым антитело может селективно связываться. Антиген-мишень может быть полипептидом, углеводом, нуклеиновой кислотой, липидом, гаптеном или другим природным или синтетическим соединением. Предпочтительно, антиген-мишень является полипептидом.
Термин "диатела" относится к малым фрагментам антител с двумя антиген-связывающими сайтами, причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH-VL). С использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между этими двумя доменами на одной и той же цепи, эти домены соединяются с комплементарными доменами другой цепи и созданию двух антиген-связывающих сайтов. Диатела описаны более полно, например, в EP 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
"Антитело человека" является антителом, которое имеет аминокислотную последовательность, которая соответствует последовательности антитела, продуцируемого человеком, и/или была изготовлена с использованием любого из способов для получения антител человека, описанных в настоящем описании. Это определение антитела человека специально исключает гуманизированное антитело, содержащее антиген-связывающие остатки, не являющиеся остатками человека.
"Аффинно зрелое" антитело является антителом с одним или несколькими изменениями в одном или нескольких его CDR, которые приводят к улучшению аффинности этого антитела в отношении антигена, в сравнении с исходным антителом, которое не имеет этих изменений. Предпочтительные аффинно зрелые антитела будут иметь наномолярные или даже пикомолярные аффинности в отношении антигена-мишени. Аффино зрелые антитела получают процедурами, известными в данной области. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) описывает созревание аффинности посредством перетасовки доменов VH и VL. Неспецифический мутагенез CDR и/или каркасных остатков описан: Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); и Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
"Эффекторными функциями" антитела называют биологические активности, приписываемые Fc-области (Fc-области с нативной последовательностью или Fc-области с вариантной аминокислотной последовательностью), и они варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора); и активацию В-клеток.
"Антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью" или "ADCC" называют форму цитотоксичности, в которой секретируемый Ig, связанный на Fc-рецепторах (FcR), присутствующих на некоторых цитотоксических клетках (например, природных клетках-киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах) позволяет этим цитотоксическим эффекторным клеткам связываться специфически с несущей антиген клеткой-мишенью и затем убивать эту клетку-мишень цитотоксинами. Эти антитела "вооружают" цитотоксические клетки и являются абсолютно необходимыми для такого убивания. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для оценивания ADCC-активности представляющей интерес молекулы может выполняться анализ ADCC in vitro, такой как анализ, описанный в патентах США с номерами 5500362 или 5821337 или Presta патент США № 6737056. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно, или дополнительно, ADCC-активность представляющей интерес молекулы может оцениваться in vivo, например, в модели животного, такой как модель, описанная в Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
"Эффекторными клетками человека" являются лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно, клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и выполняют ADCC-эффекторную функцию. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; причем предпочтительными являются PBMC и NK-клетки. Эффекторные клетки могут быть выделены из нативного источника, например, из крови.
"Fc-рецептор" или "FcR" описывает рецептор, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является нативная последовательность FcR человека. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывает IgG-антитело (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. FcγRII-рецепторы включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые различаются прежде всего в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит мотив активации на основе тирозина иммунорецептора (ITAM) в его цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит мотив ингибирования на основе тирозина иммунорецептора (ITIM) в его цитоплазматическом домене, (см. обзор M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcR рассматриваются в обзоре Ravetch and Inet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Другие FcR, в том числе FcR, которые будут идентифицированы в будущем, включены в термин "FcR" в настоящем описании. Этот термин включает также неонатальный рецептор, FcRn, который является ответственным за перенос материнских IgG к плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) и регулирует гомеостаз иммуноглобулина. WO 00/42072 (Presta) описывает варианты антител с улучшенным или уменьшенным связыванием с FcR. Содержание этой патентной публикации специально включено в настоящем описании в качестве ссылки. См. также, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).
Способы измерения связывания с FcRn известны (см., например, Ghetie 1997, Hinton 2004). Связывание с FcRn человека in vivo и время полужизни в сыворотке FcRn человека может быть анализировано, например, в трансгенной мыши или трансфицированных клеточных линиях человека, экспрессирующих FcRn человека, или в приматах, которым вводили вариантные полипептиды Fc.
"Комплемент-зависимая цитотоксичность" или "CDC" относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (подходящего подкласса), которые связаны с их родственным антигеном. Для оценивания активации комплемента, может выполняться анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
Полипептидные варианты с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области и увеличенной или уменьшенной способностью связывания C1q описаны в Патенте США № 6194551B1 и WO 99/51642. Содержание этих патентных публикаций специально включены в настоящем описании в качестве ссылки. См. также Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).
Термин "полипептид, содержащий Fc-область" относится к полипептиду, такому как антитело или иммуноадгезин, которые содержат Fc-область. C-концевой лизин (остаток 447 по системе нумерации EU) Fc-области может быть удален, например, во время очистки этого полипептида или рекомбинантной инженерией нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид. Таким образом, композиция, содержащая полипептид, имеющий Fc-область согласно этому изобретению, может содержать полипептиды с удаленным K447, всеми K447 или смесь полипептидов с остатком К447 или без остатка К447.
"Акцепторный каркас человека" для поставленных в настоящем описании целей является каркасом, содержащим аминокислотную последовательность каркаса VL или VH, полученную из консенсусного каркаса иммуноглобулина человека или из консенсусного каркаса человека. Акцепторный каркас человека, "полученный из" каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека, может содержать ту же самую аминокислотную последовательность или может содержать предварительно существующие изменения аминокислотной последовательности. В случае присутствия предварительно существующих изменений аминокислот, присутствуют не более 5 и, предпочтительно, 4 или менее, предпочтительно, 3 или менее предварительно существующих изменений аминокислот. В случае присутствия предварительно существующих изменений аминокислот в VH, предпочтительно, эти изменения находятся только в трех, двух или одном положениях 71H, 73H и 78H; например, аминокислотными остатками в этих положениях могут быть 71A, 73T и/или 78A. в одном из вариантов осуществления, акцепторный каркас VL человека является идентичным в последовательности с каркасной последовательностью VL иммуноглобулина человека или консенсусной каркасной последовательностью человека.
"Консенсусный каркас человека" является каркасом, который представляет наиболее часто встречающийся аминокислотный остаток в отборе каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека. Обычно, отбор последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека производится из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Обычно, подгруппой последовательностей является подгруппа в соответствии с Kabat et al. В одном из вариантов осуществления, VL, подгруппой является подгруппа каппа I в соответствии с Kabat et al. В одном из вариантов осуществления, для VH, этой подгруппой является подгруппа III в соответствии с Kabat et al.
"Консенсусный каркас подгруппы III VH" содержит консенсусную последовательность, полученную из аминокислотных последовательностей в подгруппе III вариабельной области тяжелой цепи по Kabat et al. В одном из вариантов осуществления, консенсусная каркасная аминокислотная последовательность подгруппы III VH содержит по меньшей мере часть или все из каждой из следующих последовательностей:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:14)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:15)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:43)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:16).
"Консенсусный каркас подгруппы I VL" содержит консенсусную последовательность, полученную из аминокислотных последовательностей в подгруппе I вариабельной области легкой цепи каппа по Kabat et al. В одном из вариантов осуществления, консенсусная каркасная аминокислотная последовательность подгруппы I VH содержит по меньшей мере часть или все из каждой из следующих последовательностей:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:17)-L1-WYQQKPGKAPLLIY (SEQ ID NO:18)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:19)-L3-FGQGTKVEIK (SEQ ID NO:20).
В данном контексте, "мутант антитела" или "вариант антитела" относится к варианту аминокислотной последовательности антитела, в котором один или несколько аминокислотных остатков видозависимого антитела были модифицированы. Такие мутанты необязательно имеют меньшие, чем 100%, идентичность или сходство с видозависимым антителом. В одном из вариантов осуществления мутант антитела будет иметь аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 75% идентичность или сходство с аминокислотной последовательностью вариабельного домена либо тяжелой цепи, либо легкой цепи видозависимого антитела, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 90% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95%. Идентичность или сходство в отношении этой последовательности определяется в настоящем описании как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными (т.е. являются теми же самыми остатками) или сходными (т.е. аминокислотными остатками из той же самой группы на основе обычных свойств боковых цепей, см. ниже) с остатками видоспецифического антитела, после сопоставления последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей. Ни одно из N-концевых, C-концевых или внутренних удлинений и ни одна из делеций или инсерций в последовательности антитела вне вариабельного домена не должны рассматриваться как влияющие на идентичность или сходство последовательности.
"Нарушение" или "заболевание" является любым состоянием, которое могло бы получить пользу от лечения веществом/молекулой или способом по настоящему изобретению. Оно включает хронические и острые нарушения или заболевания, включающие патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому нарушению. Неограничивающие примеры нарушений, подлежащих лечению, включают злокачественные и доброкачественные опухоли; карциному, бластому и саркому.
"Лечением" называют как терапевтическое лечение, так и профилактические или превентивные меры. Индивиды, нуждающиеся в лечении, включают индивидов, которые уже имеют доброкачественную, предраковую или неметастазирующую опухоль, а также индивидов, у которых должно предотвращаться появление или рецидив рака.
Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству терапевтического средства для лечения или профилактики заболевания или нарушения у млекопитающего. В случае рака, терапевтически эффективное количество терапевтического средства может уменьшать количество раковых клеток; уменьшать размер первичной опухоли; ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени или, предпочтительно, останавливать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени или, предпочтительно, останавливать) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли и/или ослаблять до некоторой степени один или несколько из симптомов, связанных с этим нарушением. В отношении степени, до которой это лекарственное средство может предотвращать рост и/или убивать существующие раковые клетки, она может быть цитостатической и/или цитотоксической. Для раковой терапии, эффективность in vivo может быть, например, измерена оцениванием продолжительности выживания, времени до прогрессирования заболевания (ТТР), скорости ответной реакции (RR), продолжительности реакции и/или качества жизни.
Термины "рак" и "раковый" относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется как неконтролируемый рост клеток. В это определение включены как доброкачественные, так и злокачественные типы рака. Под "раком ранней стадии" или "опухолью ранней стадии" имеется в виду рак, который не является инвазивным или метастатическим, или классифицируется как рак стадии 0, I или II. Примеры рака включают, но не ограничиваются ими, карциному, лимфому, бластому (в том числе медуллобластому и ретинобластому), саркому (в том числе липосаркому и синовиальную саркому), нейроэндокринные опухоли (в том числе карциноидные опухоли, гастриному и рак островковых клеток (инсулоцитов)), мезотелиому, шванному (в том числе невриному слухового нерва), менингиому, аденокарциному, меланому и лейкозные или лимфоидные злокачественности. Более конкретные примеры таких раков включают плоскоклеточный рак (например, эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легкого, в том числе мелкоклеточный рак легкого (SCLC), немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшной полости, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка, в том числе рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы (в том числе метастазирующий рак молочной железы), рак ободочной кишки, ректальный рак, колоректальный рак, эндометриальную или маточную карциному, карциному слюнных желез, рак почки или ренальный рак, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, гепатоцеллюлярную карциному, анальную карциному, карциному полового члена, тестикулярный рак, эзофагеальный рак, опухоли желчных путей, а также рак головы и шеи и множественную миелому.
Термин "предраковые" относится к состоянию или росту, которые обычно предшествуют раку или перерождаются в рак. "Предраковый" рост будет иметь клетки, которые характеризуются аномальной регуляцией клеточного цикла, пролиферацией или дифференцировкой, которая может быть определена маркерами регуляции клеточного цикла, клеточной пролиферации или дифференцировки.
Под "дисплазией" имеются в виду любые аномальные рост или развитие ткани, органа или клеток. Предпочтительно, дисплазия является дисплазией высокой степени или предраковой.
Под "метастазированием" имеется в виду распространение рака из его первичного местоположения в другие места в теле. Раковые клетки могут отрываться из первичной опухоли, проникать в лимфатические и кровеносные сосуды, циркулировать через кровоток и расти в отдаленном очаге (метастазировать) в нормальных тканях где-нибудь в другом месте в теле. Метастазирование может быть локальным или отдаленным. Метастазирование является последовательным процессом, зависящим от отрывания опухолевых клеток от первичной опухоли, перемещения через кровоток и остановки в отдаленном местоположении. В этом новом местоположении эти клетки устанавливают кровоснабжение и могут расти с образованием угрожающей жизни массы.
Как стимуляторные, так и ингибиторные молекулярные пути в опухолевой клетке регулируют это поведение, и взаимодействия между опухолевой клеткой и клетками-хозяевами в этом отдаленном местоположении также являются существенными.
Под "неметастатическим" подразумевается рак, который является доброкачественным или который остается в первичном местоположении и не проникает в систему лимфатических или кровеносных сосудов или в ткани, другие, чем первичное местоположение. Обычно, неметастатический рак является любым раком, который является раком стадии 0, I или II, и изредка стадии III.
Под "первичной опухолью" или "первичным раком" имеется в виду первоначальный рак, а не метастатическое повреждение, расположенное в других ткани, органе или местоположении в теле индивида.
Под "доброкачественной опухолью" или "доброкачественным раком" имеется в виду опухоль, которая остается локализованной в участке появления и не способна к инфильтрации, инвазии или метастазированию в отдаленное местоположение.
Под "опухолевой массой (отягощенностью опухолью)" имеется в виду количество раковых клеток, размер опухоли или количество рака в теле. Опухолевую массу называют также опухолевой нагрузкой.
Под "количеством опухоли" имеется в виду количество опухолей.
Под "индивидом” имеется в виду млекопитающее, в том числе, но не только, человек или млекопитающее, не являющееся человеком, такое как представители коровьих, лошадиных, собачьих, овечьих или кошачьих. Предпочтительно, этим индивидом является человек.
Термин "противораковая терапия" относится к терапии, применимой в лечении рака. Примеры противораковых терапевтических средств включают, но не ограничиваются ими, например, химиотерапевтические средства, ингибирующие рост средства, цитотоксические средства, средства, используемые в лучевой терапии, антиангиогенные средства, апоптотические средства, антитубулиновые средства и другие средства для лечения рака, анти-CD20-антитела, ингибитор тромбоцитарного фактора роста (например, Gleevec™ (Иматиниба Мезилат)), ингибитор COX-2 (например, целекоксиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), которые связываются с одной или несколькими мишенями ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-бета, BlyS, APRIL, BCMA или VEGF-рецептором (рецепторами), TRAIL/Apo2 и другими биоактивными и органическими химическими агентами, и т.д. Их комбинации также включены в изобретение.
131
125
90
186
Термин "цитотоксическое средство" относится в этом контексте к веществу, которое ингибирует или предотвращает функцию клеток и/или вызывает деструкцию клеток. Предполагается, что этот термин включает радиоактивные изотопы (например, I, I, Y и Re), химиотерапевтические средства и токсины, такие как ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты.
"Химиотерапевтическое средство" является химическим соединением, применимым при лечении рака. Примеры химиотерапевтических средств включают химическое соединение, применимое при лечении рака. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и CYTOXAN циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включающие алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (в том числе синтетический аналог топотекана); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (в том числе его синтетические аналоги адозелезин, карцелезин и бицелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (в том числе синтетические аналоги, KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотные аналоги горчичного газа, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, меклоретамин, гидрохлорид меклоретаминоксида, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацилпроизводное горчичного газа; нитрозмочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности, калихеамицин гамма1I и калихеамицин омега I1 (см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)); динемицин, в том числе динемицин А; бисфосфанаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатин и родственные хромопротеин-ендииновые антибиотические хромофоры), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофиллин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин ADRIAMYCIN (в том числе морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренали, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; заменитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; асеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглуцид; галлия нитрат; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митоквазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраерин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазихон; 2,2',2”-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, T-2-токсин, верракурин A, роридин A и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел TAXOL (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™, не содержащий Кремофора, альбумин-конструированная состоящая из наночастиц форма паклитаксела (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), и доксетаксел TAXOTERE (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; гемцитабин (GEMZAR); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин NAVELBINE; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; иринотекан (Camptosar, CPT-11) (в том числе схема лечения иринотекана с 5-FU и лейковорином; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; комбретастатин; бортезомид VELCADE; леналидомид REVLIMID; лейковорин (LV); оксалиплатин, в том числе схема лечения оксалиплатином (FOLFOX); ингибиторы PKC-альфа, Raf, H-Ras, EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva™)) и VEGF-A, который уменьшает пролиферацию клеток, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых из вышеперечисленных веществ.
В это определение включены также противогормональные средства, которые действуют для регуляции или ингибирования действия гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецептора эстрогена (SERM), в том числе, например, тамоксифен (в том числе тамоксифен NOLVADEX), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен FARESTON; ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, который регулирует продуцирование эстрогена в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглютетимид, мегастрола ацетат MEGASE, экземестан AROMASIN, форместан, фадрозол, ворозол RIVISOR, летрозол FEMARA и анастрозол ARIMIDEX; и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и госерелин; а также троксицитабин (аналог цитозина 1,3-диоксаланнуклеозид); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности, олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, участвующих в отклоняющейся от нормы пролиферации клеток, такие как, например, РКС-альфа, Raf и H-Ras; рибозимы, такие как ингибитор экспрессии VEGF (например, рибозим ANGIOZYME) и ингибитор экспрессии HER2; вакцины, такие как вакцины генной терапии, например, вакцина ALLOVECTIN, вакцина LEUVECTIN и вакцина VAXID; PROLEUKIN rIL-2; ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN; ABARELIX rmRH; Винорелбин и Эсперамицины (см. патент США № 4675187), и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любых из вышеперечисленных веществ.
Термин "пролекарство", как используется в настоящем описании, относится к форме предшественника или производного фармацевтически активного вещества, которая является менее токсичной в отношении опухолевых клеток в сравнении с исходным лекарственным средством и способна ферментативно активироваться или превращаться в более активную исходную форму. См., например, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) и Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Пролекарства по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, фосфатсодержащие пролекарства, тиофосфатсодержащие пролекарства, сульфатсодержащие пролекарства, пептидсодержащие пролекарства, D-аминокислотой модифицированные пролекарства, гликозилированные пролекарства, β-лактамсодержащие пролекарства, необязательно замещенные феноксиацетамидсодержащие пролекарства или необязательно замещенные фенилацетамидсодержащие пролекарства, 5-фторцитозиновые и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут быть превращены в более активное цитотоксическое свободное лекарственное средство. Примеры цитотоксических лекарственных средств, которые могут быть дериватизованы в пролекарство для использования в этом изобретении, включают, но не ограничиваются ими, вышеописанные химиотерапевтические средства.
Под "лучевой терапией" имеется в виду использование направленных гамма-лучей или бета-лучей для индукции достаточного повреждения клетки для ограничения ее способности к нормальному функционированию или для разрушения клетки полностью. Должно быть понятно, что в данной области будут известны многие способы для определения дозы и длительности лечения. Обычные лечения предусматривают однократное введение и диапазон типичных доз 10-200 единиц (Грей) в день.
"Биологический образец" (взаимозаменяемо называемый "образец" или "образец ткани или клеток") включает различные типы образцов, получаемых от индивидуума, и может быть использован в диагностическом анализе или в анализе мониторинга. Это определение включает образцы крови и других жидкостей биологического происхождения, образцы твердых тканей, такие как образцы биопсии или культуры ткани или клеток, полученных из них и их потомства. Это определение включает также образцы, с которыми проводили манипуляции каким-либо образом после их приобретения (изъятия), например, посредством обработки реагентами, солюбилизацией или обогащением в отношении определенных компонентов, таких как белки или полинуклеотиды, или заливкой в полутвердый или твердый матрикс для целей получения срезов. Термин "биологический образец" включает клинический образец, а также включает клетки в культуре, супернатанты клеток, лизаты клеток, сыворотку, плазму, биологическую жидкость и образцы ткани. Источником биологического образца может быть твердая ткань, такая как ткань из свежего, замороженного и/или консервированного органа или образцы ткани или биопсии или аспирата; крови или любых компонентов крови; жидкости тела, такие как цереброспинальная жидкость, амниотическая жидкость, перитонеальная жидкость или интерстициальная жидкость; клетки при любом времени беременности или развития индивидуума. В некоторых вариантах осуществления, биологический образец получают из первичной или метастатической опухоли. Биологический образец может содержать соединения, которые природно не являются примесями этой ткани в природных условиях, такие как консерванты, антикоагулянты, буферы, фиксаторы, нутриенты, антибиотики или т.п.
Для поставленных в настоящем описании целей "срез" образца ткани обозначает отдельную часть или кусочек образца ткани, например, тонкий слой ткани или клеток, полученный срезанием из образца ткани. Понятно, что множественные срезы образцов ткани могут браться и подвергаться анализу в соответствии с данным изобретением. В некоторых вариантах осуществления, один и тот же срез образца ткани анализируют как на морфологическом, так и на молекулярном уровнях или анализируют в отношении как белка, так и нуклеиновой кислоты.
Слово "метка” относится в данном контексте к соединению или композиции, которые конъюгированы или слиты непосредственно или опосредованно с реагентом, таким как зонд нуклеиновой кислоты или антитело, и облегчает детектирование реагента, с которым она конъюгирована или слита. Сама эта метка может быть детектируемой (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки), или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение соединения-субстрата или композиции-субстрата, которые являются детектируемыми.
Композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления и применения
Изобретение включает композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие антитело против гепсина; и полинуклеотиды, содержащие последовательности, кодирующие антитело против гепсина. В данном контексте, композиции, содержат одно или несколько антител, которые связываются с гепсином, и/или один или несколько полинуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие одно или нескольких антител, которые связываются с гепсином. Эти композиции могут дополнительно содержать подходящие носители, такие как фармацевтически приемлемые эксципиенты, включающие буферы, которые хорошо известны в данной области.
Изобретение включает также выделенное антитело и полинуклеотидные варианты. Изобретение включает также по существу чистое антитело и полинуклеотидные варианты.
Изобретение включает также способ лечения нарушения, например, рака предстательной железы, с использованием антитела против гепсина (как описано в настоящем описании или как известно в данной области).
Композиции
2
Антитела против гепсина по настоящему изобретению являются, предпочтительно, моноклональными. В объем настоящего изобретения включены также фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH и F(ab') обеспеченного в настоящем описании антитела против гепсина. Эти фрагменты антител могут быть созданы общепринятыми способами, такими как ферментативное расщепление, или могут быть генерированы рекомбинантными способами. Такие фрагменты антител могут быть химерными или гуманизированными. Эти фрагменты применимы для диагностических и терапевтических целей, представленных ниже.
Моноклональные антитела получают из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие эту популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Таким образом, определение "моноклональные" указывает характер этого антитела как не являющийся смесью дискретных антител.
Моноклональные антитела против гепсина по настоящему изобретению могут быть приготовлены с использованием гибридомного способа, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены способами рекомбинантных ДНК (патент США No. 4816567).
В гибридомном способе, мышь или другого подходящего животного-хозяина, такого как хомячок, иммунизируют для индуцирования лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с белком, используемым для иммунизации. Антитела против гепсина могут быть получены в животных множественными подкожными (sc) или внутрибрюшинными (ip) инъекциями гепсина и адъюванта. Гепсин может быть получен с использованием способов, хорошо известных в данной области, некоторые из которых дополнительно описаны ниже. В одном из вариантов осуществления, животных иммунизируют гепсином, слитым с Fc-частью тяжелой цепи иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления, животных иммунизируют слитым белком гепсин-IgG1. Животных обычно иммунизируют против иммуногенных конъюгатов или производных гепсина слитым белком монофосфориллипид А (MPL)/трегалоза-дикриномиколат (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT), и этот раствор инъецируют внутрикожно во множественные места. Спустя две недели этих животных подвергают повторной иммунизации. Спустя 7-14 дней у животных берут кровь и сыворотку анализируют на титр антител против гепсина. Животных подвергают бустингу, пока титр не будет находиться на плато.
Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты сливают с миеломными клетками с использованием подходящего агента слияния, такого как полиэтиленгликоль, для образования гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая, предпочтительно, содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых, исходных миеломных клеток. Например, если миеломные клетки лишены фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом обычно будет включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (HAT-среду), вещества которой предотвращают рост HGPRT-недостаточных клеток.
Предпочтительными миеломными клетками являются клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильное продуцирование высокого уровня антитела выбранными продуцирующими антитело клетками и являются чувствительными к такой среде, как HAT. Среди них, предпочтительными миеломными клеточными линиями являются миеломные линии мыши, такие как линии, полученные из опухолей мыши MOPC-21 и MPC-11, доступные из Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, и клетки SP-2 или X63-Ag8-653, доступные из American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мышь-человек описаны также для получения моноклональных антител человека (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
Культуральную среду, в которой растут гибридомные клетки, анализируют на продуцирование моноклональных антител, направленных против гепсина. Предпочтительно, специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомными клетками, определяют иммунопреципитацией или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).
Аффинность связывания моноклонального антитела может быть, например, определена анализом Скетчарда Munson et al, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют антитела желаемой специфичности, аффинности и/или активности, эти клоны могут быть субклонированы процедурами лимитирующих разведений и выращены стандартными способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящие культуральные среды для этой цели включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки могут расти in vivo в виде асцитных опухолей в животных.
Моноклональные антитела, секретируемые этими субклонами, подходящим образом отделяют от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки общепринятыми процедурами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, белок А-Сефарозная, гидроксиапатитная хроматография, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.
Антитела против гепсина по настоящему изобретению могут быть получены с использованием комбинаторных библиотек для скрининга на синтетические клоны антител с желаемыми активностью или активностями. В принципе, синтетические клоны антител отбирают скринингом фаговых библиотек, содержащих фаг, который демонстрирует различные фрагменты вариабельной области (Fv) антитела, слитые с белком оболочки фага. Такие фаговые библиотеки подвергают пэннингу аффинной хроматографией против желаемого антигена. Клоны, экспрессирующие Fv-фрагменты, способные связываться с желаемым антигеном, адсорбируются этим антигеном и, следовательно, отделяются от несвязывающихся клонов в этой библиотеке. Затем связывающиеся клоны элюируют из этого антигена, и они могут быть дополнительно обогащены дополнительными циклами адсорбции/элюции антигена. Любое из антител против гепсина по настоящему изобретению может быть получено разработкой подходящей процедуры скрининга антигена для отбора представляющего интерес фагового клона с последующим конструированием полноразмерного клона антитела против гепсина с использованием Fv-последовательностей из представляющего интерес фагового клона и подходящих последовательностей константной области (Fc), описанных в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. Один примерный способ генерирования антител против гепсина описан в разделе “Примеры”.
Антиген-связывающий домен антитела образован из двух вариабельных (V) областей из приблизительно 110 аминокислот, каждый из которых состоит из легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей, обе из которых представляют три гипервариабельные петли или определяющие комплементарность области (CDR). Вариабельные домены могут быть представлены функционально на фаге, каждый в виде одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов, в которых VH и VL ковалентно связаны через короткий гибкий пептид, или в виде Fab-фрагментов, в котором они (каждый из них) слиты с константным доменом и взаимодействуют нековалентно, как описано в Winter et al., Αnn. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). В данном контексте, scFv-кодирующие фаговые клоны и Fab-кодирующие фаговые клоны называют вместе "Fv-фаговыми клонами" или "Fv-клонами".
Репертуары генов VH и VL могут быть клонированы раздельно полимеразной цепной реакцией (PCR) и рекомбинированы случайным образом в фаговых библиотеках, которые затем подвергают поиску на антиген-связывающие клоны, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Библиотеки из иммунизированных источников обеспечивают высокоаффинные антитела против иммуногена без необходимости конструирования гибридом. Альтернативно, не подвергнутый воздействию (наивный) репертуар может быть клонирован для обеспечения единого источника антител человека до широкого диапазона не-аутоантигенов, а также аутоантигенов без какой-либо иммунизации, как описано Griffiths et al, EMBO J, 12: 725-734 (1993). Наконец, не подвергнутые воздействию (наивные) библиотеки могут быть также приготовлены синтетически клонированием неаранжированных сегментов V-гена из стволовых клеток и с использованием ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность, для кодирования высоковариабельных областей CDR3 и для выполнения реаранжировки in vitro, как описано Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
Нитеобразный фаг используют для дисплея фрагментов антител слиянием с минорным белком оболочки pIII. Фрагменты антител могут быть представлены в виде одноцепочечных Fv-фрагментов, в которых домены VH и VL соединены на одной и той же полипептидной цепи гибким полипептидным спейсером, например, как описано Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), или в виде Fab-фрагментов, в которых одна цепь слита с pIII, а другая секретируется в периплазму бактериальной клетки-хозяина, где происходит сборка структуры Fab-белка оболочки, которая становится представленной на поверхности фага, вытеснением некоторых из белков оболочки дикого типа, например, как описано в Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).
Обычно, нуклеиновые кислоты, кодирующие фрагменты генов антител, получают из иммунных клеток, собранных из людей или животных. Если желательной является библиотека с уклоном в пользу анти-гепсин-клонов, индивидуума иммунизируют гепсином для индукции образования гуморального ответа, и клетки селезенки и/или циркулирующие В-клетки других лимфоцитов периферической крови (PBL) извлекают для конструирования библиотеки. В одном предпочтительном варианте осуществления, библиотеку фрагментов генов антител человека с уклоном в пользу анти-гепсин-клонов получают генерированием реакции в виде образования антител против гепсина в трансгенных мышах, несущих набор генов иммуноглобулина человека (и лишенных функциональной системы продуцирования эндогенных антител), так что иммунизация гепсином заставляет В-клетки продуцировать антитела человека против гепсина. Генерирование трансгенных мышей, продуцирующих антитело человека, описано ниже.
Дополнительное обогащение реактивных против антител против гепсина популяций клеток может быть получено с использованием подходящей процедуры скрининга для выделения В-клеток, экспрессирующих гепсин-специфическое мембраносвязанное антитело, например, посредством разделения клеток гепсин-аффинной хроматографией или адсорбцией клеток с флуорхром-меченым гепсином с последующим сортингом клеток с возбуждением флуоресценции (FACS).
Альтернативно, применение клеток селезенки и/или В-клеток или других PBL от неиммунизированных доноров, обеспечивает лучшую презентацию возможного репертуара антител, а также позволяет конструировать библиотеку антител с использованием любого вида животного (человека или не человека), в котором гепсин не является антигенным. Для библиотек, включающих конструирование генов антител in vitro, стволовые клетки собирают из индивидуума для обеспечения нуклеиновых кислот, кодирующих неаранжированные сегменты генов антител. Представляющие интерес иммунные клетки могут быть получены от различных видов животных, таких как человек, мышь, крыса, зайцеобразные (Lagomorpha), волчьи, собачьи, кошачьи, свиные, коровьи, лошадиные и птицы и т.д.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие гены вариабельных сегментов антител (в том числе VH- и VL-сегментов) извлекают из представляющих интерес клеток и амплифицируют. В случае библиотек реаранжированных генов VH и VL, желаемая ДНК может быть получена выделением геномной ДНК или мРНК из лимфоцитов с последующей полимеразной цепной реакцией (PCR) с праймерами, соответствующими 5' - и 3'-концам реаранжированных генов VH и VL, как описано в Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), образуя посредством этого разнообразные репертуары генов V для экспрессии. Гены V могут быть амплифицированы из кДНК и геномной ДНК с обратными праймерами на 5'-конце экзона, кодирующего зрелый V-домен, и прямыми праймерами, размещенными в J-сегменте, как описано в Orlandi et al. (1989) и в Ward et al, Nature, 341: 544-546 (1989). Однако, для амплификации из кДНК, обратные праймеры могут быть также размещены в лидерном экзоне, как описано в Jones et al., Biotechnol, 9: 88-89 (1991), а прямые праймеры в константной области, как описано в Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Для максимизации комплементарности, в эти праймеры может быть включена вырожденность, как описано в Orlandi et al. (1989) или Sastry et al. (1989). Предпочтительно, разнообразие библиотеки максимизируется использованием ПЦР-праймеров, нацеленных на каждое семейство V-генов для амплификации всех доступных аранжировок VH и VL, присутствующих в образце нуклеиновой кислоты иммунной клетки, например, как описано в способе Marks et al, J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991) или как описано в способе Orum et al, Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Для клонирования амплифицированной ДНК в векторы экспрессии редкие сайты рестрикции могут быть введены в ПЦР-праймер в качестве метки на одном конце, как описано в Orlandi et al. (1989), или дополнительной ПЦР-амплификацией с меченым праймером, как описано в Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).
Репертуары синтетически реаранжированных V-генов могут быть получены in vitro из сегментов V-генов. Большинство сегментов VH-генов человека клонировали и секвенировали (как сообщалось в Tomlinson et al., J. Mol. Biol, 227: 776-798 (1992)) и картировали (как сообщалось в Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); эти клонированные сегменты (в том числе все основные конформации петли H1 и H2) могут быть использованы для генерирования разнообразных репертуаров VH-генов с ПЦР-праймерами, кодирующими петли H3 разнообразной последовательности и длины, как описано в Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992). VH-репертуары могут быть также получены со всем разнообразием последовательности, сфокусированным в длинной H3-петле единой длины, как описано в Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Сегменты Vκ и Vλ были клонированы и секвенированы (как сообщалось в Williams и Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) и могут быть использованы для получения синтетических репертуаров легких цепей. Синтетические репертуары V-генов, основанные на диапазоне VH- и VL-складок, и длин L3 и H3, будут кодировать антитела желаемого структурного разнообразия. После амплификации кодирующих V-гены ДНК, сегменты V-генов зародышевой линии могут быть реанжированы in vitro в соответствии со способами Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992).
12
-
-8
D
Репертуары фрагментов антител могут быть сконструированы объединением репертуаров генов VH и VL вместе различными путями. Каждый репертуар может быть создан в различных векторах, и эти векторы рекомбинируются in vitro, например, как описано в Hogrefe et al, Gene, 128: 119-126 (1993), или in vivo комбинаторным инфицированием, например, системой loxP, описанной в Waterhouse et al, Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993). Этот подход рекомбинации in vivo использует двухцепочечную природу Fab-фрагментов для преодоления ограничения размера библиотеки, навязываемого эффективностью трансформации E. coli. “Наивные” репертуары VH и VL клонировали по отдельности, один в фагмиду и другой в фаговый вектор. Затем эти две библиотеки объединяют фаговым инфицированием содержащими фагмиды бактриями, так что каждая клетка содержит отличающуюся комбинацию, и размер библиотеки определяется только количеством присутствующих клонов (приблизительно 10 клонов). Оба вектора содержат сигналы рекомбинации in vivo, так что гены VH и VL рекомбинируются на едином репликоне и упаковываются в вирионы фагов. Эти огромные библиотеки обеспечивают большие количества разнообразных антител хорошей аффинности (K  приблизительно 10 M).
Альтернативно, эти репертуары могут быть клонированы последовательно в один и тот же вектор, например, как описано в Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978-7982 (1991), или собраны вместе при помощи ПЦР и затем клонированы, как описано в Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). ПЦР-сборка может быть также использована для соединения ДНК VH и VL с ДНК, кодирующей гибкий пептидный спейсер, для образования репертуаров одноцепочечных Fv (scFv). Еще в одном способе, используют "ПЦР-сборку в клетке" для объединения генов VH и VL в лимфоцитах при помощи ПЦР и затем клонирования репертуаров связанных генов, как описано в Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20:3831-3837 (1992).
D
-1
6
7
-1
-9
Антитела, продуцируемые “необученными” библиотеками (либо природными, либо синтетическими), могут быть умеренной аффинности (K  приблизительно 10-10 M), но созревание аффинности может быть также имитировано in vitro конструированием и повторным отбором из вторичных библиотек, как описано в Winter et al. (1994), supra. Например, могут быть введены мутации случайным образом in vitro с использованием склонной к ошибкам полимеразы (как сообщалось в Leung et al., Technique, 1:11-15 (1989)) в способе Hawkins et al., J. Mol. Biol, 226: 889-896 (1992) или в способе Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Кроме того, созревание аффинности может выполняться неспецифическим мутагенезом одного или нескольких CDR, например, с использованием ПЦР с праймерами, несущими случайную последовательность, охватывающую представляющий интерес CDR, в выбранных индивидуальных Fv-клонах и скринингом на клоны с более высокой аффинностью. WO 96/07754 (опубликованный 14 марта 1996 года) описывал способ индукции мутагенеза в определяющей комплементарность области легкой цепи иммуноглобулина для создания библиотеки генов легкой цепи. Другим эффективным подходом является рекомбинация доменов VH или VL, выбранных фаговым дисплеем, с репертуарами природных вариантов домена V, полученных из неиммунизированных доноров, и скрининг на более высокую аффинность в нескольких раундах перетасовки цепей, как описано в Marks et al., Biotechnol, 10:779-783 (1992). Этот способ позволяет получать антитела и фрагменты антител с аффинностями в диапазоне 10 M.
Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности гепсина известны в данной области. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая гепсин, может быть сконструирована с использованием аминокислотной последовательности желаемой области гепсина. Как хорошо известно в данной области, имеются две основные сплайсинговые формы гепсина, гепсин IIIb и гепсин IIIc. Последовательности гепсина хорошо известны в данной области и могут включать последовательности, показанные на фигурах 7 и 8.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие гепсин могут быть получены различными способами, известными в данной области. Эти способы включают, но не ограничиваются ими, химический синтез с использованием любого из способов, описанных в Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989), таких как триэфирный, фосфитный, фосфорамидитный и Н-фосфонатный способы. В одном из вариантов осуществления, кодоны, предпочтительные для экспрессионной клетки-хозяина, используют в конструировании кодирующей гепсин ДНК. Альтернативно, ДНК, кодирующая гепсин, может быть выделена из библиотеки геномных ДНК или кДНК.
После конструирования ДНК-молекулы, кодирующей гепсин, ДНК-молекулу функционально связывают с регуляторной последовательностью экспрессии в векторе экспрессии, таком как плазмида, где эта регуляторная последовательность распознается клеткой-хозяином, трансформированным этим вектором. Обычно, плазмидные векторы содержат последовательности репликации и регуляторные последовательности, которые происходят из вида, совместимого с клеткой-хозяином. Вектор обычно несет сайт репликации, а также последовательности, которые кодируют белки, которые способны обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Подходящие векторы для экспрессии в прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах, известны в данной области и некоторые дополнительно описаны в настоящем описании. Могут быть использованы эукариотические организмы, такие как дрожжи, или клетки, полученные из многоклеточных организмов, например, из млекопитающих.
Необязательно, ДНК, кодирующая гепсин, функционально связана с секреторной лидерной последовательностью, приводящей к секреции продукта экспрессии клеткой-хозяином в культуральную среду. Примеры секреторных лидерных последовательностей включают stII, экотин, lamB, герпес GD, lpp, щелочную фосфатазу, инвертазу и альфа-фактор. Подходящим для использования в настоящем описании является также состоящая из 36 аминокислот лидерная последовательность белка А (Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985)).
Клетки-хозяева трансфицируют и, предпочтительно, трансформируют вышеуказанными векторами экспрессии или клонирующими векторами по настоящему изобретению и культивируют в общепринятой питательной среде, модифицированной, соответственно, для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификаци генов, кодирующих желаемые последовательности.
4
Трансфекцией называют принятие вектора экспрессии клеткой-хозяином, независимо от того, экспрессируются ли фактически какие-либо кодирующие последовательности. Многочисленные способы трансфекции известны специалисту с обычной квалификацией в данной области, например, CaPO-преципитация и электропорация. Успешной трансфекцией обычно считается, когда любое указание на функционирование этого вектора имеет место в этой клетке-хозяине. Способы трансфекции хорошо известны в данной области, и некоторые из них дополнительно описаны в настоящем описании.
Трансформация обозначает введение ДНК в организм таким образом, что эта ДНК является реплицируемой, либо в виде внехромосомного элемента, либо в виде хромосомного интегранта. В зависимости от используемой клетки-хозяина, трансформацию выполняют с использованием стандартных способов, подходящих для таких клеток. Способы трансформации хорошо известны в данной области, и некоторые из них дополнительно описаны в настоящем описании.
Прокариотические клетки-хозяева, используемые для получения гепсина, могут культивироваться, как описано, в основном, в Sambrook et al., supra.
Клетки-хозяева млекопитающих, используемые для получения гепсина, могут культивироваться в различных средах, которые хорошо известны в данной области, и некоторые из них описаны в настоящем описании.
Клетки-хозяева, на которые делаются ссылки в этом описании, включают клетки в культуре in vitro, а также клетки, которые находятся в животном-хозяине.
Очистка гепсина может выполняться с использованием принятых в данной области способов, некоторые из которых описаны в настоящем описании.
Очищенный гепсин может быть прикреплен к подходящему матриксу, такому как агарозные гранулы, акриламидные гранулы, стеклянные гранулы, целлюлоза, различные акриловые сополимеры, гидроксилметакрилатные гели, сополимеры полиакриловой и полиметакриловой кислот, найлон, нейтральные и ионные носители и т.п., для применения в разделении аффинной хроматографией клонов фагового дисплея. Прикрепление белка гепсина к матриксу может выполняться способами, описанными в Methods in Enzymology, vol. 44 (1976). Один обычно используемый способ для прикрепления белковых лигандов к полисахаридным матриксам, например, агарозе, декстрану или целлюлозе, включает активацию носителя цианогенгалогенидами и последующее связывание первичных алифатических или ароматических аминов пептидного лиганда с активированным матриксом.
Альтернативно, гепсин может быть использован для покрытия лунок адсорбционных планшетов, экспрессирован на клетках-хозяевах, прикрепленных к адсорбционным планшетам или использован в сортинге клеток или конъюгирован с биотином для улавливания покрытыми стрептавидином гранулами или использован в любом другом известном в данной области способе для пэннинга библиотек фагового дисплея.
Образцы фаговых библиотек контактируют с иммобилизованным гепсином в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере части фаговых частиц с адсорбентом. В норме, эти условия, включающие рН, ионную силу, температуру и т.п. выбирают для имитации физиологических условий. Фаги, связанные с твердой фазой, промывают и затем элюируют кислотой, например, как описано в Barbas et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), или щелочью, например, как описано в Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), или посредством конкуренции за гепсиновый антиген, например, в процедуре, сходной со способом конкуренции за антиген Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Фаги могут быть обогащены в 20-1000 раз в единственном раунде отбора. Кроме того, обогащенные фаги могут выращиваться в бактериальной культуре и подвергаться дополнительным раундам отбора.
Эффективность отбора зависит от многих факторов, в том числе от кинетики диссоциации во время промывания и от того, могут ли множественные фрагменты антител на единственном фаге одновременно вовлекать антиген. Антитела с быстрой кинетикой диссоциации (и слабой аффинностью связывания) могут удерживаться с использованием коротких промываний, мультивалентного фагового дисплея и высокой плотности покрытия антигена в твердой фазе. Эта высокая плотность не только стабилизирует фаг через мультивалентные взаимодействия, но и благоприятствует повторному связывания фага, который диссоциировался. Отбор антител с медленной кинетикой диссоциации (и хорошими аффинностями связывания) может быть стимулирован использованием длительных промывок и одновалентного фагового дисплея, как описано в Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) и в WO 92/09690, и низкой плотностью покрытия антигена, как описано в Marks et al., Biotechnol, 10: 779-783 (1992).
Можно выбирать между фаговыми антителами с различными аффинностями, даже с аффинностями, которые слабо различаются, в отношении гепсина. Однако, неспецифическая мутация выбранного антитела (например, выполняемая в некоторых из способов созревания аффинности, описанных выше), по видимому, приводит к многим мутантам, наиболее связывающимся с антигеном, и малого количества с более высокой аффинностью. С ограничением гепсина, редкий фаг высокой аффинности мог бы выдержать конкуренцию. Для сохранения всех мутантов с более высокой аффинностью, фаги могут быть инкубированы с избыточно биотинилированным гепсином, но с биотинилированным гепсином в концентрации более низкой молярности, чем молярная константа аффинности мишени, в отношении гепсина. Затем эти фаги с высокой аффинностью могут быть захвачены покрытыми стрептавидином парамагнитными гранулами. Такой "равновесный захват" позволяет отбирать антитела в соответствии с их аффинностями связывания, с чувствительностью, которая позволяет выделять мутантные клоны с такой малой, как в два раза более высокой аффинностью из большого избытка фагов с более низкой аффинностью. Условия, используемые в промывании фагов, связанных с твердой фазой, могут также подвергаться манипуляции для дискриминации на основе кинетики диссоциации.
Клоны гепсина могут быть отобраны на основе активности. Fv-клоны, соответствующие таким антителам против гепсина, могут быть отобраны (1) выделением клонов гепсина из фаговой библиотеки, как описано выше, и, необязательно, амплификацией выделенной популяции фаговых клонов выращиванием этой популяции в подходящем бактериальном хозяине; (2) отбором гепсина и второго белка, против которого желаемой является блокирующая активность и не-блокирующая активность, соответственно; (3) адсорбцией анти-гепсин-фаговых клонов для иммобилизации гепсина; (4) использованием избытка второго белка для элюции любых нежелательных клонов, которые узнают гепсин-связывающие детерминанты, которые перекрываются или являются общими со связывающими детерминантами второго белка; и (5) элюцией клонов, которые остаются адсорбированными после стадии (4). Необязательно, клоны с желаемыми блокирующими/не-блокирующими свойствами могут быть дополнительно обогащены повторением процедур отбора, описанных в настоящем описании, один или более раз.
ДНК, кодирующая полученные из гибридом моноклональные антитела, или Fv-клоны фагового дисплея по настоящему изобретению, легко выделяют и секвенируют с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных праймеров, сконструированных для специфической амплификации представляющих интерес кодирующих областей легкой цепи из гибридомы или фаговой ДНК-матрицы). После выделения, ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки COS обезьян, клетки яичника Китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, которые в противном случае не продуцируют белок иммуноглобина, для получения синтеза желаемых моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзорные статьи по рекомбинантной экспрессии в бактериях антитело-кодирующей ДНК включают Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992).
ДНК, кодирующая Fv-клоны по настоящему изобретению, может быть объединена с известными ДНК-последовательностями, кодирующими константные области тяжелой цепи и/или легкой цепи (например, соответствующие ДНК-последовательности могут быть получены из Kabat et al., supra), для образования клонов, кодирующих тяжелые и/или легкие цепи полной или частичной длины. Будет понятно, что константные области любого изотипа могут быть использованы для этой цели, в том числе константные области IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, и что такие константные области могут быть получены от любого человека или вида животного. Fv-клон, полученный из ДНК вариабельного домена одного вида животного (такого как человек), и затем слитый с ДНК константной области другого вида животного с образованием кодирующей последовательности (кодирующих последовательностей) для "гибридной", полноразмерной тяжелой цепи и/или легкой цепи, включен в определение "химерного" и "гибридного" антитела в данном контексте. В предпочтительном варианте осуществления, Fv-клон, полученный из ДНК вариабельной области человека, сливают с ДНК константной области человека для образования кодирующей последовательности (кодирующих последовательностей) для всех тяжелых и/или легких цепей полной или частичной длины человека.
ДНК, кодирующая антитело против гепсина, полученная из гибридомы по настоящему изобретению, может быть также модифицирована, например, заменой кодирующей последовательности для константных доменов тяжелой и легкой цепи человека вместо гомологичных последовательностей мыши, полученных из гибридомного клона (например, как в способе Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). ДНК, кодирующая полученное из гибридомы или Fc-клона антитело или фрагмент, может быть дополнительно модифицирована ковалентным присоединением к кодирующей иммуноглобулин последовательности всей или части кодирующей последовательности для полипептида не-иммуноглобулина. Таким образом получают "химерные" или "гибридные" антитела, которые имеют специфичность связывания полученных из Fv-клона или гибридомного клона антител по настоящему изобретению.
Фрагменты антител
Настоящее изобретение включает фрагменты антител. В некоторых обстоятельствах существуют преимущества использования фрагментов антител, а не целых антител. Меньший размер этих фрагментов позволяет получить более быстрый клиренс и может приводить к улучшенному доступу к солидным опухолям.
2
2
2
Были разработаны различные способы для получения фрагментов антител. Традиционно, эти фрагменты получали посредством протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты могут теперь продуцироваться непосредственно рекомбинантными клетками-хозяевами. Фрагменты антител Fab, Fv и ScFv могут также экспрессироваться в E. coli и секретироваться из E. coli, обеспечивая таким образом легкое получение больших количеств этих фрагментов. Фрагменты могут быть выделены из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Альтернативно, фрагменты Fab'-SH могут быть получены непосредственно из E. coli и химически связаны с образованием F(ab')-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Согласно другому подходу, F(ab')-фрагменты могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Fab- и F(ab')-фрагменты с увеличенным временем полужизни in vivo, содержащие остатки связывающего реутилизирующий рецептор эпитопа, описаны в патенте США № 5869046. Другие способы получения фрагментов антител будут очевидными для квалифицированного специалиста. В других вариантах осуществления предпочтительным антителом является одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv) (см., например, WO 93/16185; патенты США с номерами 5571894 и 5587458). Fv и sFv являются единственными видами с интактными антиген-связывающими активными сайтами, которые лишены константных областей; таким образом, они подходят для уменьшенного неспецифического связывания во время использования in vivo. sFv-слитые белки могут быть сконструированы для получения слияния эффекторного белка либо на амино-, либо на карбокси-конце scFv. См. Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. Фрагмент антитела может быть также "линейным антителом", например, как описано в патенте США № 5641870. Такие линейные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.
Гуманизированные антитела
Настоящее изобретение включает гуманизированные антитела. Различные способы для гуманизации антител, не являющихся антитела человека, известны в данной области. Например, гуманизированное антитело может иметь один или несколько аминокислотных остатков, введенных в них из источника, который не является источником, относящимся к человеку. Эти аминокислотные остатки, не являющиеся аминокислотными остатками человека, часто называют "импортными" остатками, которые обычно берутся из "импортного" вариабельного домена. Гуманизация может по существу выполняться по способу Winter et al., (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al (1988) Science 239: 1534-1536), заменой последовательностями гипервариабельной области соответствующих последовательностей антитела человека. Таким образом, такие "гуманизированные" антитела являются химерными антителами (патент США № 4816567), в которых по существу менее чем интактный вариабельный домен человека, был заменен соответствующей последовательностью из вида, не относящегося к человеку. На практике, гуманизированные антитела являются обычно антителами человека, в которых некоторые остатки гипервариабельной области и, возможно, некоторые FR-области заменены остатками из аналогичных сайтов антител грызунов.
Выбор вариабельных доменов человека, как легких, так и тяжелых, для использования в получении гуманизированных антител, является очень важным для уменьшения антигенности. Согласно так называемому наиболее оптимальному ("best-fit") способу, последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу против всей библиотеки известных последовательностей вариабельного домена человека. Затем последовательность человека, которая является наиболее близкой последовательности грызуна, акцептируется в виде каркаса человека для гуманизированного антитела (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J.Mol. Biol. 196:901. Другой способ использует конкретный каркас, полученный из консенсусной последовательности всех антител человека конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Один и тот же каркас может быть использован для нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623.
Кроме того, важно, чтобы антитела гуманизировались с сохранением высокой аффинности в отношении антигена и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели, согласно одному способу, гуманизированные антитела получают посредством процесса анализа исходных последовательностей и различных умозрительных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов обычно являются доступными и известны квалифицированным в данной области специалистам. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и представляют возможные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатных последовательностей иммуноглобулинов. Просмотр этих дисплеев делает возможным анализ возможной роли этих остатков в функционировании кандидатной последовательности иммуноглобулина, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связываться с антигеном. Таким путем, FR-остатки могут быть отобраны и комбинированы из реципиентных и импортных последовательностей, так что достигается желаемая характеристика антитела, например, увеличенная аффинность в отношении антигена-мишени (антигенов-мишеней). Обычно, остатки гипервариабельной области непосредственно и наиболее существенно участвуют во влиянии на связывание антитела.
Антитела человека
Антитела против гепсина человека по настоящему изобретению могут быть сконструированы комбинированием последовательности (последовательностей) вариабельного домена Fv-клона, выбранного из полученных от человека библиотек фагового дисплея, с известными последовательностями константного домена человека, как описано выше. Альтернативно, моноклональные антитела против гепсина человека по настоящему изобретению могут быть получены гибридомным способом. Линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мышь-человек для получения моноклональных антител человека были описаны, например, Kozbor J. Immunol, 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991).
В настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей), которые способны, после иммунизации, продуцировать полный репертуар антител человека в отсутствие продуцирования эндогенных антител. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена сочленяющей области тяжелой цепи (JH) антитела в химерных и мутантных в отношении зародышевой линии мышах приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенного антитела. Перенос набора генов иммуноглобулина зародышевой линии человека в таких мутантных в отношении зародышевой линии мышей будет приводить к продуцированию антител человека после стимуляции антигеном. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol, 7:33 (1993).
Претасовка генов может быть также использована для получения антител человека из анти тела, не относящегося к человеку, например, грызуна, где антитело человека имеет сходные аффинности и специфичности в отношении исходного антитела, не являющегося антителом человека. Согласно этому способу, который называют “импринтингом эпитопа", каждый фрагмент вариабельной области тяжелой и легкой цепи антитела, не являющегося антителом человека, заменяют репертуаром генов V-домена человека, создавая популяцию химерных нечеловеческая цепь/цепь человека scFv или Fab. Отбор с антигеном приводит к выделению химерных нечеловеческая цепь/цепь человека scFv или Fab, где цепь человека реконструирует антиген-связывающий сайт, разрушенный после удаления соответствующей цепи не человека в первичном клоне фагового дисплея, т.е. эпитоп направляет (запечатлевает) выбор цепи-партнера человека. При повторении этого процесса для замены остальной цепи, не относящейся к человеку, получают антитело человека (см. PCT WO 93/06213, опубликованный 1 апреля 1993 года). В отличие от общепринятой гуманизации антител, не относящихся к антителам человека, трансплантацией CDR, способ обеспечивает полностью антитела человека, которые не имеют остатков FR или CDR, происходящих не из человека.
Биспецифические антител
2
Биспецифические антитела являются моноклональными антителами, предпочтительно, антителами человека или гуманизированными, антителами, которые имеют специфичности связывания в отношении по меньшей мере двух разных антигенов. В данном случае, одна из специфичностей связывания является специфичностью в отношении гепсина, а другая в отношении любого другого антигена. Примерные биспецифические антитела могут связывать два различных эпитопа гепсина. Биспецифические антитела могут быть также использованы для локализации цитотоксических средств к клеткам, которые экспрессируют гепсин. Эти антитела имеют гепсин-связывающее плечо и плечо, которое связывает цитотоксическое средство (например, сапорин, интерферон-α, алкалоид барвинка, цепь рицина А, метотрексат или гаптен радиоактивного изотопа). Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F(ab')-биспецифические антитела).
Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционно, рекомбинантное продуцирование биспецифических антител основывается на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, где две тяжелые цепи имеют разные специфичности (Milstein and Cuello, Nature, 305:537 (1983)). Вследствие случайной сортировки тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, эти гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка этой правильной молекулы, которая обычно выполняется стадиями аффинной хроматографии, является достаточно громоздкой, а выходы этого продукта являются низкими. Сходные процедуры описаны в WO 93/08829, опубликованном 13 мая 1993 года и в Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991).
Согласно другому и более предпочтительному подходу, вариабельные домены антител с желаемыми специфичностями связывания (антитело-антиген-связывающими сайтами) сливают с последовательностями константных доменов. Слияние, предпочтительно, является слиянием с константным доменом иммуноглобулина тяжелой цепи, содержащим по меньшей мере часть шарнирной, CH2- и CH3-областей. Предпочтительно, иметь первую константную область тяжелой цепи (CH1), содержащую сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующий по меньшей мере в одном из этих слияний. ДНК, кодирующие слияния тяжелых цепей иммуноглобулина и, если желательно, легкой цепи иммуноглобулина, инсертируют в отдельные векторы экспрессии и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в пригонке обоюдных пропорций трех полипептидных фрагментов в воплощениях, когда неравные соотношения этих трех полипептидных цепей, используемых в этой конструкции, обеспечивают оптимальные выходы. Однако, можно инсертировать кодирующие последовательности для двух или всех трех цепей полипептида в одном векторе экспрессии, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам или когда эти соотношения не являются особенно значимыми.
В одном предпочтительном варианте осуществления этого подхода, биспецифические антитела состоят из тяжелой цепи гибридного иммуноглобулина с первой специфичностью связывания в одном плече и пары тяжелая цепь-легкая цепь гибридного иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания) в другом плече. Было обнаружено, что эта асимметричная структура облегчает отделение желаемого биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулина, так как присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине этой биспецифической молекулы обеспечивает легкий путь разделения. Этот подход описан в WO 94/04690. В отношении дополнительных деталей генерирования биспецифических антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
H
Согласно другому подходу, поверхность раздела между парой молекул антител может быть сконструирована для максимального процента гетеродимеров, которые извлекают из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная поверхность раздела содержит по меньшей мере часть домена C3 константного домена антитела. В этом способе, одну или несколько малых аминокислотных боковых цепей из поверхности раздела первой молекулы антитела заменяют большими боковыми цепями (например, тирозина или триптофана). Компенсаторные "впадины" идентичного или сходного размера с большой боковой цепью(ями) создают на поверхности раздела второй молекулы антитела заменой больших аминокислотных цепей меньшими молекулами (например, аланина или треонина). Это обеспечивает механизм для увеличения выхода гетеродимера в сравнении с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.
Биспецифические антитела включают поперечно-сшитые или "гетероконъюгатные" антитела. Например, одно из антител в этом гетероконъюгате может быть связано с авидином, другое с биотином. Такие антитела были, например, предложены для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/00373 и EP 03089). Гетероконъюгатные антитела могут быть изготовлены с использованием подходящих способов поперечного связывания. Подходящие сшивающие агенты хорошо известны в данной области и описаны в патенте США № 4676980, вместе с рядом способов поперечного связывания.
2
Способы для индукции биспецифических антител из фрагментов антител были также описаны в литературе. Например, биспецифические антитела могут быть приготовлены с использованием химического связывания. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) описывают процедуру, в которой интактные антитела протеолитически расщепляют для генерирования фрагментов F(ab'). Эти фрагменты восстанавливают в присутствии дитиол-комплексирующего агента арсенита натрия для стабилизации вицинальных дитиолов и предотвращения межмолекулярных дисульфидной связи образований. Затем генерированные Fab'-фрагменты превращают в производные тионитробензоата (TNB). Затем одно из этих Fab'-TNB-производных обратно превращают в Fab'-тиол восстановлением меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого Fab'-TNB-производного с образованием биспецифического антитела. Биспецифические антитела продуцируют с использованием агентов для селективной иммобилизации ферментов.
2
Недавнему прогрессу способствовало прямое открытие Fab'-SH-фрагментов из E. coli, которые могли быть химически связаны с образованием биспецифических антител. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) описывают получение молекулы полностью гуманизированного биспецифического антитела F(ab'). Каждый Fab'-фрагмент отдельно секретировался из E. coli и подвергался прямому химическому связыванию in vitro для образования биспецифического антитела. Образованное таким образом биспецифическое антитело было способно связываться с клетками, сверхэкспрессирующими HER2-рецептор, и нормальными Т-клетками человека, а также запускать литическую активность цитотоксических лимфоцитов человека против опухоли молочной железы (мишени) человека.
Были также описаны различные способы для получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела получали с использованием лейциновых молний. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Пептиды лейциновые молнии из белков Fos и Jun связывали с Fab'-частями двух разных антител слиянием генов. Гомодимеры антитела восстанавливали в шарнирной области с образованием мономеров и затем повторно окисляли для образования гетеродимеров антител. Этот способ может быть также использован для получения гомодимеров антител. Технология "диатела", описанная Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), обеспечила альтернативный механизм для изготовления фрагментов биспецифических антител. Эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), присоединенный к вариабельному домену легкой цепи (VL) линкером, который является слишком коротким для осуществления спаривания между двумя доменами на одной и той же цепи. Таким образом, домены VH и VL одного фрагмента должны были спариваться с комплементарными доменами VL и VH другого фрагмента с образованием посредством этого двух антиген-связывающих сайтов. Сообщалась также другая стратегия получения фрагментов биспецифического антитела с использованием одноцепочечных Fv (scFv) димеров. См. Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994).
Рассматриваются антитела с более чем двумя валентностями. Например, могут быть получены триспецифические антитела. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).
Мультивалентные антитела
Мультивалентное антитело может быть интернализовано (и/или катаболизировано) быстрее, чем бивалентное антитело, клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связываются эти антитела. Антитела данного изобретения могут быть мультивалентными антителами (которые являются другими, чем антитела класса IgM) с тремя или более антиген-связывающими сайтами (например, тетравалентными антителами), которые могут быть легко продуцированы рекомбинантной экспрессией нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи антитела. Мультивалентное антитело может содержать домен димеризации и три или более антиген-связывающих сайтов. Предпочтительный домен димеризации содержит (или состоит из них) Fc-область или шарнирную область. В этом сценарии, антитело будет содержать Fc-область и три или более антиген-связывающих сайтов, расположенных амино-терминально относительно Fc-области. Предпочтительное описанное в настоящем описании мультивалентное антитело содержит (или состоит из них) три - приблизительно восемь, но, предпочтительно, четыре, антиген-связывающих сайтов. Мультивалентное антитело содержит по меньшей мере одну полипептидную цепь (и, предпочтительно, две полипептидные цепи), где эта полипептидная цепь (полипептидные цепи) содержат два или более вариабельных домена. Например, полипептидная цепь (полипептидные цепи) могут содержать VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, где VD1 является первым вариабельным доменом, VD2 является вторым вариабельным доменом, Fc является одной полипептидной цепью Fc-области, X1 и X2 представляют аминокислоту или полипептид и n равен 0 или 1. Например, полипептидная цепь (полипептидные цепи) могут содержать: VH-CH1-гибкий линкер-VH-CH1-цепь Fc-области; или VH-CH1-VH-CH1-цепь Fc-области. Мультивалентное антитело, в данном случае, содержит по меньшей мере два (и предпочтительно, четыре) легкие цепи вариабельного домена полипептида. Описанное в настоящем описании мультивалентное антитело может, например, содержать от приблизительно двух до приблизительно восьми полипептидов вариабельного домена легкой цепи. Рассматриваемые в настоящем описании полипептиды вариабельного домена легкой цепи содержат вариабельный домен легкой цепи и, необязательно, содержат дополнительно CL-домен.
Варианты антител
В некоторых вариантах осуществления обсуждаются модификации аминокислотной последовательности описанных в настоящем описании антител. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотных последовательностей антитела получают введением подходящих нуклеотидных замен в нуклеиновую кислоту этого антитела или пептидным синтезом. Такие модификации включают, например, делеции из остатков, и/или инсерции в остатки и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Любая комбинация делеции, инсерции и замены выполняется для получения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция имеет эти желательные характеристики. Изменения аминокислот могут вводиться в рассматриваемую аминокислотную последовательность антитела во время изготовления этой последовательности.
Один применимый способ для идентификации определенных остатков или областей антитела, которые являются предпочтительными местоположениями для мутагенеза, назван "аланин-сканирующим мутагенезом", описанным Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. В настоящем описании, остаток или группу остатков-мишеней идентифицируют (например, заряженных остатков, таких как arg, asp, his, lys и glu) и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно, аланином или полиаланином) для воздействия на взаимодействие аминокислот с антигеном. Затем местоположения аминокислот, демонстрирующие функциональную чувствительность к этим заменам, усовершенствуют введением дополнительных или других вариантов в сайтах замены или для сайтов замены. Таким образом, хотя сайт для введения вариации аминокислотной последовательности является заданным, природа этой мутации per se не должна быть заданной. Например, для анализа осуществления мутации в конкретном сайте проводят ala-сканирование или неспецифический мутагенез в кодоне-мишени или области-мишени и экспрессируемые иммуноглобулины подвергают скринингу на желаемую активность.
Инсерции аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбоксил-концевые слияния с диапазоном длин от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также инсерций внутри последовательностей одного или множественных аминокислотных остатков. Примеры концевых инсерций включают антитело с N-концевым метионильным остатком или антитело, слитое с цитотоксическим полипептидом. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние N- или С-конца этого антитела с ферментом (например, для ADEPT) или полипептидом, который увеличивает время полужизни в сыворотке антитела.
Гликозилирование полипептидов является обычно N-связанным или О-связанным. N-связанное относится к прикреплению углеводной части молекулы к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серина и аспарагин-Х-треонина, где Х обозначает любую аминокислоту, за исключением пролина, являются последовательностями распознавания для ферментативного присоединения углеводной части молекулы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанным гликозилированием называют присоединение одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, наиболее часто серину или треонину, хотя могут быть также использованы 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Добавление сайтов гликозилирования к антителу удобным образом выполняется изменением аминокислотной последовательности, так что она содержит одну или несколько трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Это изменение может быть также выполнено добавлением одного или нескольких остатков серина или треонина к последовательности исходного антитела или заменой одним или несколькими остатками серина или треонина последовательности исходного антитела (для О-связанных сайтов гликозилирования).
В случае, если это антитело содержит Fc-область, углевод, прикрепленный к ней, может быть изменен. Например, антитела со зрелой углеводной структурой, которая лишена фукозы, прикрепленной к Fc-области антитела, описаны в заявке на патент США № 2003/0157108 (Presta, L.). См. также US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Антитела с двурассечением N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) в углеводе, присоединенном к Fc-области этого антитела, цитируются в WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. и патенте США № 6602684, Umana et al. Антитела по меньшей мере с одним галактозным остатком в олигонуклеотиде, присоединенном к Fc-области антитела, сообщаются в WO 1997/30087, Patel et al. См. также WO 1998/58964 (Raju, S.) и WO 1999/22764 (Raju, S.), относительно антител с измененным углеводом, присоединенным к их Fc-области. См. также US 2005/0123546 (Umana et al.) в отношении антиген-связывающих молекул с модифицированным гликозилированием.
Предпочтительный гликозилированный вариант в настоящем описании содержит Fc-область, в которой углеводная структура, присоединенная к Fc-области, не имеет фукозы. Такие варианты улучшали функцию ADCC. Необязательно, Fc-область дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен, которые дополнительно улучшают ADCC, например, замен в положениях 298, 333 и/или 334 Fc-области (Eu-нумерация остатков). Примеры публикаций, относящихся к "дефукозилированным" или "фукоза-недостаточным" антителам, включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). Примеры клеточных линий, продуцирующих дефукозилированные антитела, включают клетки СНО Lec13, с недостаточным фукозилированием белков (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; и WO 2004/056312 A1, Adams et al., в частности, в примере 11), и клеточные линии с нокаутом, таким как ген альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8, клетки СНО с нокаутом (Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).
Другим типом варианта является вариант с аминокислотной заменой. Эти варианты имеют по меньшей мере один аминокислотный (по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере 4 или более) остаток в молекуле антитела, замененный другим остатком. Представляющие наибольший интерес сайты для мутагенеза с заменами включают гипервариабельные области, но рассматриваются также изменения FR. Консервативные замены показаны в таблице А под заголовком "предпочтительные замены". Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то больше изменений-замен, называемых "примерными заменами" в таблице A, или описанных дополнительно ниже со ссылкой на классы аминокислот, могут вводиться, и продукты могут быть подвергнуты скринингу.
Таблица А
Исходный остаток
Примерные замены
Предпочтительные замены
Ala (A)
Val; Leu; Ile
Val
Arg (R)
Lys; Gln; Asn
Lys
Asn (N)
Gln; His; Asp; Lys; Arg
Gln
Asp (D)
Glu; Asn
Glu
Cys (C)
Ser; Ala
Ser
Gln (Q)
Asn; Glu
Asn
Glu (E)
Asp; Gln
Asp
Gly (G)
Ala
Ala
His (H)
Asn; Gln; Lys; Arg
Arg
Ile (I)
Leu; Val; Met; Ala;Phe; норлейцин
Leu
Leu (L)
Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Ile
Lys (K)
Arg; Gln; Asn
Arg
Met(M)
Leu; Phe; Ile
Leu
Phe (F)
Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Tyr
Pro (P)
Ala
Ala
Ser (S)
Thr
Thr
Thr (T)
Vak; Ser
Ser
Trp (W)
Tyr; Phe
Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe; Thr; Ser
Phe
Val (V)
Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Норлейцин
Leu
Существенные модификации в биологических свойствах антитела выполняются выбором замен, которые значимо отличаются в их действии на поддержание (а) структуры скелета полипептида в области этой замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности этой молекулы в сайте-мишени или (c) основной массы боковой цепи. Природные остатки подразделены на группы на основе общих свойств боковых цепей:
(1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислотные: asp, glu;
(4) основные: his, lys, arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: gly, pro; и
(6) ароматические: trp, tyr, phe.
Неконсервативные замены будут вызывать обмен члена одного из этих классов на члена другого класса.
Один тип варианта с заменами включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельной области исходного антитела (например, гуманизированного антитела или антитела человека). Обычно полученный вариант (полученные варианты), выбранные для дополнительного развития, будут иметь улучшенные биологические свойства относительно исходного антитела, из которого они были генерированы. Подходящий способ для генерирования таких вариантов с заменами включает созревание аффинности с использованием фагового дисплея. Коротко, несколько сайтов гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) мутируют для генерирования всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Генерированные таким образом антитела представляются из частиц нитевидного фага в виде слияния с продуктом гена III M13, упакованного в каждой частице. Затем эти варианы фагового дисплея подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания), как описано в настоящем описании. Для идентификации кандидатных сайтов гипервариабельной области, может выполняться аланин-сканирующий мутагенез для идентификации остатков гипервариабельной области, значимо способствующих связыванию антигена. Альтернативно, или дополнительно, может быть выгодным анализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации контактных точек между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки являются кандидатами на замену согласно разработанным в настоящем описании способам. После генерирования таких вариантов, эту панель вариантов подвергают скринингу, как описано в настоящем описании, и антитела с превосходящими свойствами в одном или нескольких релевантных анализах могут быть отобраны для дополнительного развития.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей антитела, получают различными способами, известными в данной области. Эти способы включают, но не ограничиваются ими, выделение из природного источника (в случае природных вариантов аминокислотных последовательностей) или изготовление посредством олигонуклеотид-опосредованного (или сайт-направленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза, и кассетного мутагенеза полученной ранее вариантной или невариантной версии этого антитела.
Может быть желательным введение одной или нескольких модификаций в Fc-область полипептидов иммуноглобулина по настоящему изобретению с генерированием посредством этого варианта Fc-области. Вариант Fc-области может содержать последовательность Fc-области человека (например, Fc-область IgG1 человека, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащую модификацию аминокислоты (например, замену) в одном или нескольких положениях аминокислот, в том числе модификацию шарнирного цистеина. В соответствии с этим описанием и указаниями в данной области, предполагается, что в некоторых вариантах осуществления антитело, используемое в способах по настоящему изобретению, может содержать одно или несколько изменений в сравнении с антителом-копией дикого типа, например, в Fc-области. Антитела могут тем не менее сохранять по существу те же самые характеристики, требуемые для терапевтического применения, в сравнении с их копией дикого вида. Например, считается, что некоторые изменения могут быть произведены в Fc-области, которые могут приводить к измененному (т.е. либо улучшенному, либо уменьшенному) связыванию C1q и/или измененной комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в W099/51642. См. также Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); патент США № 5648260; патент США № 5624821; и W094/29351, относительно других примеров вариантов Fc-областей. WO00/42072 (Presta) и WO 2004/056312 (Lowman) описывают варианты антител с улучшенным и уменьшенным связыванием с FcR. Содержание этих патентных публикаций особо включено в настоящем описании в качестве ссылки. См., также Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001). Антитела с увеличенным временем жизни и улушенным связыванием с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), который является ответственным за перенос материнских IgG к плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), описаны в US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Эти антитела содержат Fc-область с одной или несколькими заменами в нем, которые улучшают связывание Fc-области с FcRn. Полипептидные варианты с измененными аминокислотными последовательностями и увеличенной или уменьшенной способностью связывания с C1q описаны в патенте США № 6194551B1, W099/51642. Содержания этих патентных публикаций специально включены в настоящем описании в качестве ссылок. См., также Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Производные антител
Антитела по настоящему изобретению могут быть дополнительно модифицированы для содержания дополнительных небелковых частей молекул, которые известны в данной области и легко доступны. Предпочтительно, части, подходящие для дериватизации антитела, являются водорастворимыми полимерами. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, но не ограничиваются ими, полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо статистические полимеры), и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт, и их смеси. Полиэтиленгликоль-пропиональдегид может иметь преимущества в приготовлении вследствие его стабильности в воде. Этот полимер может быть любой молекулярной массы и может быть разветвленным и неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к этому антителу, может варьироваться, и если присоединены более одного полимера, они могут быть одними и теми же молекулами или различными молекулами. Обычно, количество и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, может быть определено на основе рассмотрений, включающих, но не ограничивающихся ими, конкретные свойства или функции подлежащего улучшению антитела, будет ли это антитело использоваться в терапии при определенных условиях, и т.д.
Скрининг на антитела с желаемыми свойствами
Антитела данного изобретения могут быть охарактеризованы в отношении их физических/химических свойств и биологических функций посредством различных анализов, известных в данной области (некоторые из которых описаны в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления, антитела характеризуют в отношении любого одного или нескольких из уменьшения или блокирования связывания гепсина, уменьшения или блокирования активности гепсина, уменьшения или блокирования субстрата гепсина (например, pro-MSP, pro-uPA, Фактора VII, pro-HGF) ниже по пути молекулярной передачи сигнала и/или лечения и/или профилактики опухоли, клеточно-пролиферативного нарушения или рака; и/или лечения или профилактики нарушения, связанного с экспрессией и/или активностью гепсина (такого как увеличенная экспрессия и/или активность гепсина). В некоторых вариантах осуществления, активность гепсина является ферментативной активностью. В одном из вариантов осуществления, ферментативная активность предусматривает расщепление полипептидного субстрата гепсина. В одном из вариантов осуществления, полипептидным субстратом гепсина является один или несколько из стимулирующего про-макрофаги белка (pro-MSP), pro-uPA, Фактора VII и pro-HGF. Активация гепсином pro-MSP описана в находящейся в процессе одновременного рассмотрения и в совместном владении предварительной заявке на патент США № 61/253990, поданной 22 октября 2009 года. В одном из вариантов осуществления, ферментативная активность предусматривает расщепление синтетического субстрата гепсина. В некоторых вариантах осуществления синтетическим субстратом гепсина является субстрат, показанный в таблице 1.
Очищенные антитела могут быть дополнительно охарактеризованы рядом анализов, включающих, но не ограничивающися ими, N-концевое секвенирование, аминокислотный анализ, неденатурирующая гель-фильтрационная жидкостная хроматография высокого давления (HPLC), масс-спектрометрия, ионообменная хроматография и расщепление папаином.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, антитела, продуцируемые в настоящем описании, анализируют на их биологическую активность. В некоторых вариантах осуществления, антитела данного изобретения тестируют на их антиген-связывающую активность. Антиген-связывающие анализы, которые известны в данной области и могут быть использованы в настоящем описании, включают, без ограничения, любые прямые или конкурентные анализы связывания, использующие такие способы, как вестерн-блоты, радиоиммуноанализы, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), "сэндвич"-иммуноанализы, анализы иммунопреципитации, флуоресцентные иммуноанализы и белок А-иммуноанализы. Иллюстративный анализ связывания антигена и другой анализ обеспечены ниже в разделе примеров.
Если желательным является антитело против гепсина, которое ингибирует рост клеток, кандидатное антитело может быть тестировано в анализах in vitro и in vivo, которые измеряют ингибирование роста клеток. Способы испытания роста и/или пролиферации раковой клетки хорошо известны в данной области. Примерные способы для определения роста и/или пролиферации клеток и/или апоптоза включают, например, анализ включения BrdU, MTT, анализ включения [3H]-тимидина (например, TopCount-анализ (PerkinElmer)), анализы жизнеспособности клеток (например, CellTiter-Glo (Promega)), и т.п.
В одном из вариантов осуществления, настоящее изобретение рассматривает антитело, которое обладает эффекторными функциями. В некоторых вариантах осуществления, измеряют Fc-активности этого антитела. Анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo могут проводиться для подтверждения уменьшения/элиминации активностей CDC и/или ADCC. Например, могут проводиться анализы Fc-рецептора (FcR) для гарантии, что это антитело лишено связывания FcγR (следовательно, вероятным является отсутствие ADCC-активности), но сохраняет FcRn-связывающую способность. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемапоэтических клетках суммирована в таблице 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Пример анализа in vitro для оценки активности ADCC представляющей интерес молекулы описан в патентах США с номерами 5500362 или 5821337. Один анализ для детектирования ADCC-активности также приведен в качестве примера в настоящем описании. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно, или дополнительно, ADCC-активность представляющей интерес молекулы может оцениваться in vivo, например, в модели животного, такой как модель животного, описанная в Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Анализы связывания C1q могут также проводиться для подтверждения, что это антитело неспособно связывать C1q и, следовательно, лишено CDC-активности. Для оценивания активации комплемента, может выполняться CDC-анализ, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Определения связывания FcRn и in vivo клиренса/времени полужизни могут также выполняться с использованием способов, известных в данной области.
Векторы, клетки-хозяева и рекомбинантные способы
Для рекомбинантного получения антитела по настоящему изобретению нуклеиновую кислоту, кодирующую его, выделяют и инсертируют в реплицируемый вектор для дополнительного клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии. ДНК, кодирующую антитело, легко выделить и секвенировать с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться специфически с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи этого антитела). Доступны многие векторы. Выбор вектора зависит отчасти от используемой клетки-хозяина. Обычно, предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки либо прокариотического, либо эукариотического (обычно из млекопитающих) происхождения. Будет понятно, что константные области любого изотипа могут быть использованы для этой цели, в том числе константные области IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, и то, что такие константные области могут быть получены от любого человека или вида животного.
а. Индукция антител с использованием прокариотических клеток-хозяев:
i. Конструирование вектора
Полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные компоненты антитела по настоящему изобретению, могут быть получены с использованием стандартных рекомбинантных способов. Желаемые полинуклеотидные последовательности могут быть выделены и секвенированы из продуцирующих антитело клеток, таких как гибридомные клетки. Альтернативно, полинуклеотиды могут быть синтезированы с использованием нуклеотидного синтезатора или способов ПЦР. После получения, последовательности, кодирующие полипептиды, инсертируют в рекомбинантный вектор, способный реплицироваться и экспрессировать гетерологичные полинуклеотиды в прокариотических клетках. Многие векторы, которые являются доступными и известными в данной области, могут быть использованы для цели данного изобретения. Выбор подходящего вектора будет зависеть в основном от размера нуклеиновых кислот, подлежащих инсертированию в этот вектор, и конкретной клетки-хозяина, подлежащей трансформации этим вектором. Каждый вектор содержит различные компоненты, в зависимости от его функции (амплификации или экспрессии гетерологичного полинуклеотида, или того и другого) и его совместимости с конкретной клеткой-хозяином, в котором он находится. Компоненты вектора обычно включают, но не ограничиваются ими, точку начала репликации, ген селектируемого маркера, промотор, сайт связывания рибосом (RBS), сигнальную последовательность, инсерт гетерологичной нуклеиновой кислоты и последовательность терминации транскрипции.
Обычно, плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, которые происходят из вида, совместимого с клеткой-хозяином, используют в связи с этими хозяевами. Вектор обычно несет сайт репликации, а также маркирующие последовательности, которые способны обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Например, E. coli обычно трансформируют с использованием pBR322, плазмиды, полученной из вида E. coli. pBR322 содержит гены, кодирующие устойчивость к ампициллину (Amp) и тетрациклину (Tet), и таким образом обеспечивает легкое средство для идентификации трансформированных клеток. pBR322, ее производные или другие микробные плазмиды или бактериофаг могут также содержать, или могут быть модифицированы, чтобы содержать, промоторы, которые могут быть использованы этим микробным организмом для экспрессии эндогенных белков. Примеры производных pBR322, используемых для экспрессии конкретных антител, описаны подробно в Carter et al., Патент США No. 5648237.
Кроме того, фаговые векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, которые совместимы с микроорганизмом-хозяином, могут быть использованы в качестве трансформирующих векторов в связи с этими хозяевами. Например, бактериофаг, такой как λGΕΜ.ΤΜ.-11, может быть использован в приготовлении рекомбинантного вектора, который может быть использован для трансформации восприимчивых клеток-хозяев, таких как E. coli LE392.
Вектор экспрессии по настоящему изобретению может содержать две или более пар промотор-цистрон, каждая из которых кодирует полипептидные компоненты. Промотор является нетранслируемой регуляторной последовательностью, расположенной в направлении 3'-5' относительно цистрона, который модулирует его экспрессию. Прокариотические промоторы обычно разделяются на два класса, индуцируемые и конститутивные. Индуцируемым промотором является промотор, который инициирует увеличенные уровни транскрипции цистрона под его контролем в ответ на изменения в условиях культуры, например, присутствия или отсутствия нутриента или изменения температуры.
Известно большое количество промоторов, распознаваемых различными потенциальными клетками-хозяевами. Выбранный промотор может быть функционально связан с цистронной ДНК, кодирующей легкую цепь или тяжелую цепь, удалением этого промотора из ДНК-источника посредством расщепления рестрикционными ферментами и инсертированием выделенной последовательности промотора в вектор по настоящему изобретению. Как нативная промоторная последовательность, так и многие гетерологичные промоторы могут быть использованы для управления амплификацией и/или экспрессией генов-мишеней. В некоторых вариантах осуществления, используют гетерологичные промоторы, так как они обычно позволяют получать более высокую транскрипцию и более высокие выходы экспрессируемого гена-мишени в сравнении с нативным промотором полипептида-мишени.
Промоторы, подходящие для использования в прокариотических хозяевах, включают промотор PhoA, системы промоторов β-галактамазы и лактазы, систему промоторов триптофана (trp) и гибридные промоторы, такие как промотор tac или trc. Однако, пригодны также и другие промоторы, которые являются функциональными в бактериях (такие как другие известные бактериальные промоторы или фаговые промоторы). Их нуклеотидные последовательности были опубликованы, что позволяет квалифицированному работнику функционально лигировать их с цистронами, кодирующими легкие и тяжелые цепи-мишени (Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269) с использованием линкеров или адапторов для поставки любых требуемых сайтов рестрикции.
В одном из аспектов настоящего изобретения, каждый цистрон в рекомбинантном векторе содержит компонент сигнальной последовательности секреции, который управляет транслокацией экспрессированных полипептидов через мембрану. Обычно, сигнальная последовательность может быть компонентом вектора или она может быть частью ДНК полипептида-мишени, которая инсертирована в этот вектор. Сигнальная последовательность, выбранная для цели настоящего изобретения, должна быть последовательностью, которая распознается и процессируется (т.е. расщепляется сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не распознают и не процессируют сигнальные последовательности, нативные относительно этих гетерологичных полипептидов, сигнальную последовательность заменяют прокариотической сигнальной последовательностью, выбранной, например, из группы, состоящей из щелочной фосфатазы, пенициллиназы, Ipp или термостабильных лидеров энтеротоксина II (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA и MBP. В одном из вариантов осуществления, сигнальными последовательностями, используемыми в обоих цистронах этой экспрессионной системы, являются сигнальные последовательности STII или их варианты.
В другом аспекте, продуцирование иммуноглобулинов согласно этому изобретению может происходить в цитоплазме клетки-хозяина и, следовательно, не требует присутствия сигнальных последовательностей секреции в каждом цистроне. В этом случае, легкая и тяжелая цепи иммуноглобулина экспрессируются, укладываются и собираются с образованием функциональных иммуноглобулинов в цитоплазме. Некоторые штаммы-хозяева (например, E. coli trxB-штаммы) обеспечивают условия цитоплазмы, которые являются благоприятными для образования дисульфидных связей, делая посредством этого возможными правильную укладку и сборку экспрессируемых субъединиц белков. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).
Прокариотические клетки-хозяева, подходящие для экспрессии антител по настоящему изобретению, включают Archaebacteria and Eubacteria, такие как Грам-отрицательные или Грам-положительные организмы. Примеры используемых бактерий включают Escherichia (например, E. coli), Bacilli (например, B. subtilis), Enterobacteria, Pseudomonas species (например, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla или Paracoccus. В одном из вариантов осуществления, используют грам-отрицательные клетки. В одном из вариантов осуществления, клетки E. coli используют в качестве хозяев для настоящего изобретения. Примеры штаммов E. coli включают штамм W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) и их производные, в том числе штамм 33D3, имеющий генотип W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR (патент США № 5639635). Другие штаммы и их производные, такие как E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E. coliλ 1776 (ATCC 31.537) и E. coli RV308(ATCC 31.608), являются также подходящими. Эти примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими. Способы конструирования производных любой из вышеупомянутых бактерий, имеющих определенные генотипы, известны в данной области и описаны, например, в примерах Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Обычно необходимо выбирать подходящие бактерии, с учетом способности к репликации репликона в клетках бактерии. Например, E. coli, виды Serratia или Salmonella могут быть подходящим образом использованы в качестве хозяина при использовании хорошо известных плазмид, таких как pBR322, pBR325, pACYC177 или pKN410 для подачи этого репликона. Обычно, клетка-хозяин должна секретировать минимальные количества протеолитических ферментов, и может быть желательным включение дополнительных ингибиторов протеаз в эту культуру клеток.
ii. Получение антител
Клетки-хозяева трансформировали вышеописанными векторами экспресии и культивировали в общепринятой питательной среде, модифицированной соответственно для индукции промоторов, отбирая трансформанты, или амплифицируя гены, кодирующие желаемые последовательности.
Трансформация означает введение ДНК в прокариотического хозяина таким образом, что эта ДНК является реплицируемой, либо в виде внехромосомного элемента, либо посредством хромосомного интегранта. В зависимости от используемой клетки-хозяина, трансформацию выполняют с использованием стандартных способов, подходящих для таких клеток. Обработку кальцием с использованием хлорида кальция обычно используют для бактериальных клеток, которые содержат существенные барьеры в виде клеточных стенок. Другой способ трансформации использует полиэтиленгликоль/ДМСО. Еще одним способом является электропорация.
Прокариотические клетки, используемые для продуцирования полипептидов по настоящему изобретению, выращивают в средах, известных в данной области и подходящих для культуры выбранных клеток-хозяев. Примеры подходящих сред включают Бульон Луриа (LB) плюс необходимые питательные добавки. В некоторых вариантах осуществления, среда содержит также агент отбора, выбранный на основе конструкции вектора экспрессии, для селективного позволения роста прокариотических клеток, содержащих вектор экспресии. Например, ампициллин добавляют к среде для выращивания клеток, экспрессирующих устойчивый к ампициллину ген.
Любые необходимые добавки, кроме источников углерода, азота и неорганического фосфата, могут быть включены при подходящих концентрациях, введены по отдельности или в виде смеси с другой добавкой или средой, такой как комплексный источник азота. Необязательно культуральная среда может содержать один или несколько восстанавливающих агентов, выбранных из группы, состоящей из глутатиона, цистеина, цистамина, тиогликоллата, дитиоэритрита и дитиотреитола.
Прокариотические клетки-хозяева культивируют при подходящих температурах. Для роста E. coli, например, предпочтительная температура находится в диапазоне от приблизительно 20°C до приблизительно 39°C, более предпочтительно, от приблизительно 25°C до приблизительно 37°C, даже более предпочтительно, при приблизительно 30°C. рН среды может быть любым рН в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 9, в зависимости в основном от организма хозяина. Для E. coli, рН равен, предпочтительно, от приблизительно 6,8 до приблизительно 7,4 и, более предпочтительно, приблизительно 7,0.
Если в векторе экспрессии по настоящему изобретению используют индуцируемый промотор, экспрессия белка индуцируется при условиях, подходящих для активации этого промотора. В одном из аспектов настоящего изобретения, промоторы PhoA используют для регуляции транскрипции полипептидов. Таким образом, трансформированные клетки-хозяева культивируют в фосфат-лимитированной среде для индукции. Предпочтительно, фосфат-лимитированной средой является среда C.R.A.P (см., например, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Могут быть использованы различные другие индукторы, в соответствии с конструкцией используемого вектора, как известно в данной области.
В одном из вариантов осуществления, экспрессируемые полипептиды данного изобретения секретируются в периплазму и извлекаются из периплазмы клеток-хозяев. Извлечение белка обычно включает разрушение микроорганизма, обычно такими способами, как осмотический шок, обработка ультразвуком или лизис. После разрушения клеток остатки клеток или целые клетки могут быть удалены центрифугированием или фильтрованием. Эти белки могут быть дополнительно очищены, например, аффинной хроматографией на смоле. Альтернативно, белки могут быть перенесены в культуральную среду и выделены в ней. Клетки могут быть удалены из этой культуры и культуральный супернатант фильтруют и концентрируют для дополнительной очистки полученных белков. Экспрессируемые полипептиды могут быть дополнительно выделены и идентифицированы с использованием обычных известных способов, таких как электрофорез в полиакриламидном геле (электрофорез в ПААГ) и Вестерн-блот-анализ.
В одном из аспектов настоящего изобретения, продуцирование антитела проводят в большом количестве с использованием ферментационного процесса. Различные крупномасштабные процедуры ферментации с подпиткой доступны для получения рекомбинантных белков. Крупномасштабные ферментации имеют объем по меньшей мере 1000 литров, предпочтительно, объем приблизительно 1000-100000 литров. Эти ферментеры используют перемешивающие импеллеры для распределения кислорода и нутриентов, в частности, глюкозы (предпочтительного источника углерода/энергии). Ферментацией малого масштаба называют обычно ферментацию в ферментере, который имеет объемную емкость не более приблизительно 100 литров и может находиться в диапазоне от приблизительно 1 литра до приблизительно 100 литров.
В одном процессе ферментации индукция экспрессии белка обычно инициируется после того как клетки были выращены в подходящих условиях до желаемой плотности, например, OD550 приблизительно 180-220, при которой клетки находятся в ранней стационарной фазе. Могут быть использованы различные индукторы, в соответствии с используемой конструкцией вектора, как известно в данной области и описано выше. Клетки могут выращиваться в течение более коротких периодов перед индукцией. Клетки обычно индуцируют в течение приблизительно 12-50 часов, хотя может быть использовано более короткое время индукции.
Для улучшения выхода продукции и качества полипептидов по настоящему изобретению различные условия ферментации могут быть модифицированы. Например, для улучшения правильной сборки и укладки секретируемых полипептидов антител дополнительные векторы, сверхэкспрессирующие белки-шапероны, такие как Dsb-белки (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD и/или DsbG) или FkpA (пептидилпролил-цис,транс-изомераза с активностью шаперона), могут быть использованы для котрансформации прокариотических клеток-хозяев. Было показано, что белки-шапероны способствуют правильной укладке и растворимости гетерологичных белков, продуцируемых в бактериальных клетках-хозяевах. Chen et al., (1999) J. Biol. Chem. 274: 19601-19605; Georgiou et al., U.S. Patent No. 6083715; Georgiou et al., U.S. Patent No. 6027888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm and Pluckthun, (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al., (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210.
Для минимизации протеолиза экспрессированных гетерологичных белков (в частности, белков, которые являются протеолитически чувствительными), для данного изобретения могут быть использованы некоторые штаммы-хозяева, недостаточные в отношении протеолитических ферментов. Например, штаммы-хозяева могут быть модифицированы для осуществления генетической мутации (генетических мутаций) в генах, кодирующих известные бактериальные протеазы, такие как Протеаза III, OmpT, DegP, Tsp, Протеаза I, Протеаза Mi, Протеаза V, Протеаза VI и их комбинации. Некоторые протеаза-недостаточные штаммы E. coli являются доступными и описаны, например, в Joly et al., (1998), supra; Georgiou et al., U.S. Patent No. 5264365; Georgiou et al., U.S. Patent No. 5508192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
В одном из вариантов осуществления, штаммы E. coli, недостаточные в отношении протеолитических ферментов и трансформированные плазмидами, сверхэспрессирующими один или несколько белков-шаперонов, используются в качестве клеток-хозяев в системе экспрессии по настоящему изобретению.
iii. Очистка антител
Могут быть использованы стандартные способы очистки белков, известные в данной области. Следующие процедуры являются примерами подходящих процедур очистки: фракционирование на иммуноаффинных или ионообменных колонках, осаждение этанолом, обращенно-фазовая ВЖХ, хроматография на силикагеле или катионообменной смоле, такой как ДЭАЭ, хроматофокусирование, электрофорез в ПААГ-ДСН, осаждение сульфатом аммония и гель-фильрация с использованием, например, Сефадекса G-5.
В одном из аспектов Белок А, иммобилизованный на твердой фазе, используют для иммуноаффинной очистки полноразмерных продуктов антитела по настоящему изобретению. Белок А является белком клеточной стенки 41 кД из Staphylococcus aureas, который связывается с высокой аффинностью с Fc-областью антител. Lindmark et al., (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. Твердой фазой, на которой иммобилизован Белок А, является, предпочтительно, колонка, имеющая стеклянную поверхность или поверхность из диоксида кремния, более предпочтительно, стеклянная колонка с контролируемыми порами или колонка из кремниевой кислоты. В некоторых применениях, эта колонка была покрыта реагентом, таким как глицерин, в попытке предотвращения неспецифического прикрепления примесей.
В качестве первой стадии очистки, препарат, полученный из культуры клеток, как описано выше, наносят на твердую фазу с иммобилизованным Белком А для специфического связывания представляющего интерес антитела с Белком А. Затем эту твердую фазу промывают для удаления примесей, неспецифически связанных с этой твердой фазой. Наконец, представляющее интерес антитело извлекают из этой твердой фазы элюцией.
b. Генерирование антител с использованием эукариотических клеток-хозяев:
Компоненты вектора обычно включают, но ими не ограничиваются, одно или несколько из следующего: сигнальную последовательность, точку начала репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции.
(i) Компонент сигнальной последовательности
Вектор для применения в эукариотической клетке-хозяине может также содержать сигнальную последовательность или другой полипептид, имеющий специфический сайт расщепления на N-конце зрелого белка или представляющего интерес полипептида. Гетерологичная сигнальная последовательность, выбранная предпочтительно, является последовательностью, которая распознается и процессируется (т.е., расщепляется сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином. В экспрессии клеток млекопитающих, доступны сигнальные последовательности млекопитающих, а также вирусные секреторные лидеры, например, сигнал gD простого герпеса.
ДНК для такой области-предшественника лигирована в рамке считывания с ДНК, кодирующей это антитело.
(ii) Точка начала репликации
Обычно точка начала репликации не является необходимой для векторов экспрессии млекопитающих. Например, точка начала репликации SV40 может быть обычно использован только вследствие того, что он содержит ранний промотор.
(iii) Компонент ген селекции
Векторы экспрессии и клонирующие векторы могут содержать ген отбора, также называемый селектируемым маркером. Характерные гены отбора кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (b) дополняют ауксотрофные недостаточности, в случае необходимости, или (с) поставляют критические нутриенты, недоступные из комплексных сред.
Один пример схемы отбора использует лекарственное средство для задержки роста клетки-хозяина. Клетки, которые успешно трансформируются гетерологичным геном, продуцируют белок, придающий устойчивость к лекарственному средству и, следовательно, выживают в схеме отбора. Примеры такого доминантного отбора используют лекарственные средства неомицин, микофеноловую кислоту и гигромицин.
Другим примером подходящих селектируемых маркеров для клеток млекопитающих являются маркеры, которые способны идентифицировать клетки, компетентные в принятии нуклеиновой кислоты антитела, такие как DHFR, тимидинкиназа, металлотионеин-I и -II, предпочтительно, гены металлотионеина приматов, аденозиндеаминаза, орнитиндекарбоксилаза и т.д.
Например, клетки, трансформированные геном отбора DHFR, сначала идентифицируют культивированием трансформантов в культуральной среде, которая содержит метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR. Подходящей клеткой-хозяином, когда используют DHFR дикого типа, является линия клеток яичника Китайского хомячка (CHO), недостаточная в отношении DHFR-активности (например, ATCC CRL-9096).
Альтернативно, клетки-хозяева (в частности, хозяева дикого типа, которые содержат эндогенный DHFR), трансформированные или котрансформированные последовательностями ДНК, кодирующей антитело, белок DHFR дикого типа и другой селектируемый маркер, такой как аминогликозид-3'-фосфотрансфераза (APH), могут быть отобраны выращиванием клеток в среде, содержащей агент отбора для селектируемого маркера, такой как аминогликозидный антибиотик, например, канамицин, неомицин или G418. См. Патент США № 4965199.
(iv) Промоторный компонент
Векторы экспрессии и клонирующие векторы обычно содержат промотор, который распознается организмом-хозяином и функционально связан с нуклеиновой кислотой полипептида антитела. Промоторные последовательности для эукариотов известны. Фактически все эукариотические гены имеют AT-богатую область, расположенную приблизительно на 25-30 оснований в направлении 3'-5' от сайта, в котором инициируется транскрипция. Другая последовательность, обнаруженная на 70-80 оснований слева от старта транскрипции многих генов, является областью CNCAAT, где N может быть любым нуклеотидом. На 3'-конце большинства эукариотических генов находится последовательность AATAAA, которая может быть сигналом для добавления поли А-хвоста к 3'-концу кодирующей последовательности. Все эти последовательности подходящим образом инсертируют в эукариотические векторы экспрессии.
Транскрипция полипептидов антител из векторов в клетках-хозяевах млекопитающих регулируется, например, промоторами, получаемыми из геномов вирусов, таких как полиомавирус, вирус оспы птиц, аденовирус (такой как Аденовирус 2), бычий папилломавирус, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и обезьяний вирус 40 (SV40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например, промотора актина или промотора иммуноглобулина, из промоторов белков теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев.
Ранний и поздний промоторы вируса SV40 удобным образом получают в виде фрагмента рестрикции SV40, который также содержит вирусную точку начала репликации SV40. Немедленно ранний промотор цитомегаловируса человека подходящим образом получают в виде фрагмента рестрикции HindIII E. Система для экспрессии ДНК в хозяевах-млекопитающих с использованием бычьего папилломавируса в качестве вектора описана в Патенте США № 4419446. Одна модификация этой системы описана в Патенте США № 4601978. Альтернативно, длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса может быть использован в качестве промотора.
(v) Компонент энхансерный элемент
Транскрипция ДНК, кодирующей полипептид антитела по настоящему изобретению, высшими эукариотами часто увеличивается инсертированием энхансерной последовательности в этот вектор. Многие энхансерные последовательности известны в настоящее время из генов млекопитающих (глобина, эластазы, альбумина, α-фетопротеина и инсулина). Однако, обычно будет применяться энхансер из вируса эукариотических клеток. Примеры включают энхансер SV40 на поздней стороне точки начала репликации (п.о. 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне точки начала репликации и энхансеры аденовируса. См также Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) в отношении энхансерных элементов для активации эукариотических промоторов. Энхансер может быть сплайсирован в вектор в положении 5' или 3' относительно кодирующей полипептид антитела последовательности, но предпочтительно, расположен в сайте 5' от этого промотора.
(vi) Компонент терминации транскрипции
Векторы экспрессии, используемые в эукариотических клетках-хозяевах, будут обычно содержать также последовательности для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доступны из 5', и иногда 3', нетранслируемых областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслируемой части мРНК, кодирующей антитело. Одним применимым компонентом терминации транскрипции является область полиаденилирования бычьего гормона роста. См.W094/11026 и описанный в нем вектор экспрессии.
(vii) Отбор (селекция) и трансформация клеток-хозяев
Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии ДНК в векторах, описанных в настоящем описании, включают описанные в настоящем описании высшие эукариотические клетки, в том числе клетки-хозяева позвоночных. Размножение клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) стало рутинной процедурой. Примерами используемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия CV1 почки обезьяны, трансформированная SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линия эмбриональной почки человека (клетки 293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); клетки почки baby-хомячка (BHK, ATCC CCL10); клетки яичника Китайского хомячка/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки Африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки рака шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени буффало-крысы (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4 и линия клеток гепатомы человека (Hep G2).
Клетки-хозяева трансформируют описанными выше векторами экспресии или клонирующими векторами для получения антител и культивируют в общепринятых питательных средах, модифицированных, соответственно, для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности.
(viii) Культивирование клеток-хозяев
Клетки-хозяева, используемые для продуцирования антитела по настоящему изобретению, могут быть культивированы в различных средах. Для культивирования этих клеток-хозяев подходят коммерчески доступные среды, такие как Ham's F10 (Sigma), Минимальная Эссенциальная Среда (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла ((DMEM), Sigma). Кроме того, любая из сред, описанных в Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980), патентах США с номерами 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 или 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195 или патенте США № 30985, может быть использована в качестве культуральной среды для клеток-хозяев. Любая из этих сред может быть дополнена в случае необходимости гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальция, магния и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как лекарственное средство GENTAMYCIN™), микроэлементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне), и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые добавки могут быть также включены в подходящих концентрациях, которые будут известны квалифицированным в данной области специалистам. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п. являются условиями, используемыми ранее с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии, и будут очевидными специалисту с обычной квалификацией в данной области.
(ix) Очистка антитела
При использовании рекомбинантных способов, антитело может быть продуцировано внутриклеточно или непосредственно секретировано в среду. Если антитело продуцируется внутриклеточно, в качестве первой стадии, состоящие из частиц остатки, либо клеток-хозяев, либо лизированных фрагментов, удаляют, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Если антитело секретируется в среду, супернатанты из таких систем экспрессии обычно сначала концентрируют с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрирования белков, например, ультрафильтрационной установки Amicon или Millipore Pellicon. Ингибитор протеаз, такой как PMSF, может быть включен в любой из предыдущих стадий для ингибирования протеолиза и антибиотики могут быть включены для предотвращения роста случайных примесей.
Композиция антитела, приготовленная из этих клеток, может быть очищена с использованием, например, хроматографии с гидроксиапатитом, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, причем аффинная хроматография является предпочтительным способом очистки. Пригодность белка А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа любого Fc-домена иммуноглобулина, который присутствует в этом антителе. Белок А может быть использован для очистки антител, которые основаны на тяжелых цепях γ1, γ2 или γ4 человека (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Белок G рекомендуется для всех изотипов мыши и для γ3 человека (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). Матриксом, к которому прикрепляется аффинный лиганд, является наиболее часто агароза, но доступны и другие матриксы. Механически стабильные матриксы, такие как стекло или поли(стиролдивинил)бензол с контролируемыми порами делают возможным большие скорости потока и более короткие периоды времени процессинга, чем те, которые могут быть достигнуты с агарозой. Когда это антитело содержит CH3-домен, для очистки используется смола Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ). Другие способы для очистки белков, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовая ВЖХ, хроматография на силикагеле, хроматография на гепарин-SEPHAROSE™, хроматография на анионно- или катионнообменной смоле (такой как колонка с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, электрофорез в ПААГ-ДСН и осаждение сульфатом аммония, также являются доступными в зависимости от получаемого антитела.
После любой из стадий предварительной очистки, смесь представляющего интерес антитела и загрязнителей может быть подвергнута гидрофобной хроматографии при низком рН с использованием буфера для элюции при рН между приблизительно 2,5-4,5, предпочтительно, выполняемой при низкой концентрации соли (например, приблизительно 0-0,25 М соли).
Иммуноконъюгаты
Изобретение относится также к иммуноконъюгатам (взаимозаменяемо называемые "конъюгатами антитело-лекарственное средство" или "ADC"), содержащим любое из антител против гепсина, описанным в настоящем описании, конъюгированное с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство, лекарственное средство, ингибирующее рост средство, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат).
Применение конъюгатов антитело-лекарственное средство для локальной доставки цитотоксических или цитостатических средств, т.е. лекарственных средств для убивания или ингибирования опухолевых клеток при лечении рака (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26: 151-172; U.S. Patent No. 4975278), делает возможной нацеленную доставку лекарственной части к опухолям и внутриклеточное накапливание в них, где системное введение этих неконъюгированных лекарственных средств может приводить к неприемлемым уровням токсичности для нормальных клеток, а также опухолевых клеток, подлежащих элиминации (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). В связи с этим максимальная эффективность с минимальной токсичностью является желаемой терапией. Сообщалось, что как поликлональные антитела, так и моноклональные антитела используются в этих стратегиях (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). Используемые в этих способах лекарственные средства включают даунорубицин, доксорубицин, метотрексат и виндезин (Rowland et al., (1986) supra). Токсины, используемые в конъюгатах антитело-токсин, включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, токсины с малой молекулой, такие как гелданамицин (Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтансиноиды (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), и калихеамицин (Lode et al., (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al., (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Эти токсины могут выполнять их цитотоксические и цитостатические действия при помощи механизмов, включающих связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы. Некоторые цитотоксические лекарственные средства имеют тенденцию быть неактивными или менее активными при конъюгировании с большими антителами или лигандами белковых рецепторов.
111
90
ZEVALIN (ибритумомаб тиуксетан, Biogen/Idec) является конъюгатом антитело-радиоизотоп, состоящим из моноклонального антитела мыши IgG1-каппа, направленного против антигена CD20, обнаруживаемого на поверхности нормальных и злокачественных В-лимфоцитов, и радиоизотопа In или Y, связанного с тиомочевинной-линкером-хелатором (Wiseman et al., (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al., (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Хотя ZEVALIN имеет активность против B-клеточной не-ходжкинской лимфомы (NHL), введение приводит к тяжелым и продолжительным цитопениям у большинства пациентов. MYLOTARG™ (гемтуцумаб озогамицин, Wyeth Pharmaceuticals), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из антитела huCD33, связанного с калихеамицином, был одобрен в 2000 году для лечения острого миелоидного лейкоза посредством инъекции (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; Патенты США с номерами 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Кантузумаб мертанзин (Immunogen, Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из антитела huC242, связанного через дисульфидный линкер SPP с майтансиноидной лекарственной частью молекулы, DM1, продвигается в испытания Фазы II для лечения раков, которые экспрессируют CanAg, таких как рак ободочной кишки, рак поджелудочной железы, желудочный рак и другие. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из моноклонального антитела против простата-специфического мембранного антигена (PSMA), связанного с майтансиноидной лекарственной частью молекулы, DM1, находится в разработке для потенциального лечения раков предстательной железы. Пептиды ауристатина, ауристатин Е (АЕ) и монометилауристатин (MMAE), синтетические аналоги доластатина, конъюгировали с химерными моноклональными антителами cBR96 (специфическими в отношении Lewis Y на карциномах) и cAC10 (специфическими в отношении CD30 на гематологических злокачественностях) (Doronina et al., (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784), и они находятся в терапевтической разработке.
212
131
13l
90
186
14
Химиотерапевтические средства, применимые в получении иммуноконъюгатов, описаны в настоящем описании (например, выше). Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые могут быть использованы, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модеккина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, WO 93/21232, опубликованный 28 октября 1993 года. Доступны различные радионуклиды для получения радиоконъюгированных антител. Примеры включают Bi, I, In, Y и Re. Конъюгаты антитела и цитотоксического средства получают с использованием различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат.HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные фторсоединения (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин может быть получен, как описано в Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Меченая углеродом-14 (С) 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатообразующего агента для конъюгации радионуклида с антителом. См. W094/11026.
Конъюгаты антитела и одного или нескольких токсинов с малой молекулой, таких как калихеамицин, майтансиноиды, доластатины, ауростатины, трихотецен и CC1065, и производные этих токсинов, которые имеют активность токсина, также обсуждаются в настоящем описании.
i. Майтансин и майтансиноиды
В некоторых вариантах осуществления, иммуноконъюгат содержит антитело (полноразмерное или фрагменты) по настоящему изобретению, конъюгированные с одним или несколькими молекулами майтансиноидов.
Майтансиноиды являются митотическими ингибиторами, которые действуют ингибированием полимеризации тубулина. Майтансин был впервые выделен из западно-африканского кустарника Maytenus serrata (патент США № 3896111). Затем было обнаружено, что некоторые микробы также продуцируют майтансиноиды, такие как майтансинол и С-3-эфиры майтансинола (патент США № 4151042). Синтетический майтансинол и его производные и аналоги описаны, например, в Патентах США с номерами 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663 и 4371533.
Майтансиноидные лекарственные части являются привлекательными лекарственными частями в конъюгатах антитело-лекарственное средство, так как они: (i) относительно доступны для получения с использованием ферментации или химической модификации, дериватизации продуктов ферментации, (ii) поддаются дериватизации функциональными группами, подходящими для конъюгации через не-дисульфидные линкеры с антителами, (iii) стабильны в плазме и (iv) эффективны против большого разнообразия линий опухолевых клеток.
5
Иммуноконъюгаты, содержащие майтансиноиды, способы их получения и их терапевтическое применение описаны, например, в патентах США с номерами 5208020, 5416064 и Европейском патенте EP 0425235 B1, описания которых специально включены в настоящее описание в качестве ссылки. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) описали иммуноконъюгаты, содержащие майтансиноид, названный DM1, связанный с моноклональным антителом C242, направленным против колоректального рака человека. Было обнаружено, что конъюгат является высокотоксичным против культивируемых клеток рака ободочной кишки и обнаруживал противоопухолевую активность в анализе роста опухоли in vivo. Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) описывают иммуноконъюгаты, в которых майтансиноид был конъюгирован через дисульфидный линкер с антителом А7 мыши, которое связывается с антигеном на клеточной линии рака ободочной кишки или с другим моноклональным антителом мыши TA.1, которое связывает онкоген HER-2/neu. Цитотоксичность конъюгата TA.1-майтансиноид тестировали in vitro на линии раковых клеток молочной железы SK-BR-3, которая экспрессирует 3×10 поверхностных антигенов HER-2 на клетку. Конъюгат лекарственного средства достигал степени цитотоксичности, сходной со свободным майтансиноидным лекарственным средством, которая могла быть увеличена увеличением количества молекул майтансиноида на молекулу антитела. Конъюгат A7-майтансиноид показал низкую системную цитотоксичность у мышей.
Конъюгаты антитело-майтансиноид получают химическим связыванием антитела с молекулой майтансиноида без значимого уменьшения биологической активности ни антитела, ни молекулы майтансиноида. См., например, патент США № 5208020 (описание которого включено в настоящем описании специально посредством ссылки). Среднее из 3-4 молекул майтансиноида, конъюгированных на молекулу антитела, показало эффективность в усилении цитотоксичности клеток-мишеней без отрицательного действия на функцию или растворимость этого антитела, хотя можно было ожидать, что даже одна молекула конъюгата токсин/антитело увеличит цитотоксичность в сравнении с применением “голого” антитела. Майтансиноиды хорошо известны в данной области и могут быть синтезированы известными способами или выделены из природных источников. Подходящие майтансиноиды описаны, например, в патенте США № 5208020 и в других патентных и непатентных публикациях, цитируемых в настоящем описании выше. Предпочтительными майтансиноидами являются майтансинол и аналоги майтансинола, модифицированные в ароматическом кольце или в других положениях молекулы майтансинола, такие как сложные эфиры майтансинола.
Имеются многие связывающие группы, известные в данной области, для получения конъюгатов антитело-майтансиноид, в том числе, например, связывающие группы, описанные в патенте США № 5208020 или Европейском патенте 0425235 B1, Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) и Заявке на патент США № 10/960602, поданной 8 октября 2004 года, описания которых включены в настоящем описании специально посредством ссылки. Конъюгаты антитело-майтансиноид, содержащие линкерный компонент SMCC, могут быть получены, как описано в заявке на патент США № 10/960602, поданной 8 октября 2004 года. Эти связывающие группы включают дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотолабильные группы, фотолабильные группы, пептидазолабильные группы или эстеразолабильные группы, как описано в вышеуказанных патентах, причем дисульфидные и тиоэфирные группы являются предпочтительными. В настоящем описании описаны и иллюстрированы дополнительные связывающие группы.
Конъюгаты антитела и майтансиноида могут быть получены с использованием разнообразных бифункциональных связывающих белок агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат.HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные фторсоединения (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Особенно предпочтительные связывающие агенты включают N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) и N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP) для обеспечения дисульфидной связи.
Линкер может быть присоединен к молекуле майтансиноида в различных положениях, в зависимости от типа этой связи. Например, сложноэфирная связь может быть образована реакцией с гидроксильной группой с использованием общепринятых способов связывания. Эта реакция может осуществляться в положении С-3, имеющем гидроксильную группу, положении С-14, модифицированном гидроксиметилом, положении С-15, модифицированном гидроксильной группой, и положении С-20, имеющем гидроксильную группу. В предпочтительном варианте осуществления, эта связь образуется в положении С-3 майтансиноида или аналога майтансиноида.
ii. Ауристатины и доластатины
В некоторых вариантах осуществления, иммуноконъюгат содержит антитело по настоящему изобретению, конъюгированное с доластатинами или пептидными аналогами и производными доластатина, ауристатинами (патенты США с номерами 5635483 и 5780588). Было показано, что доластатины и ауристатины препятствуют динамике микротрубочек, гидролизу GTP и ядерному и клеточному делению (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) и имеют противораковую (патент США № 5663149) и противогрибковую активность (Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Доластатиновая или ауристатиновая лекарственная часть может быть присоединена к антителу через N (амино)-конец или С (карбоксил)-конец пептидной лекарственной части молекулы (WO 02/088172).
Примерные варианты ауристатина включают N-конец-связанные монометилауристатиновые лекарственные части DE и DF, описанные в "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", патенте США № 10/983340, поданном 5 ноября 2004 года, описание которого специально включено в настоящем описании в качестве ссылки в полном виде.
Обычно, лекарственные части на основе пептидов могут быть приготовлены образованием пептидной связи между двумя или несколькими аминокислотами и/или пептидными фрагментами. Такие пептидные связи могут быть получены, например, в соответствии с синтезом в жидкой фазе (см. E. Schroder and K. Liibke, "The Peptides," volume 1, pp. 76-136, 1965, Academic Press), который хорошо известен в области химии пептидов. Ауристатиновые/доластатиновые лекарственные части молекул могут быть получены согласно способам: патентов США с номерами 5635483 и 5780588; Pettit et al., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al., (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al., Synthesis, 1996, 719-725; и Pettit et al., (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863. См. также Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", патент США № 10/983340, поданный 5 ноября 2004 года, включенный в настоящем описании посредством ссылки в полном виде (описывающий, например, линкеры и способы получения монометилвалинсоединений, таких как MMAE и MMAF, конъюгированых с линкерами).
iii. Калихеамицин
1
2
3
1
1
I
I
I
I
I
В других вариантах осуществления, иммуноконъюгат содержит антитело по настоящему изобретению, конъюгированное с одной или несколькими молекулами калихеамицина. Семейство калихеамицинов антибиотиков способно продуцировать разрывы двухцепочечной ДНК при суб-пикомоляоных концентрациях. В отношении получения конъюгатов семейства калихеамицинов см. патенты США с номерами 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296 (все, принадлежащие American Cyanamid Company). Структурные аналоги калихеамицина, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются ими, γ , α , α , N-acetyl-y , PSAG и θ  (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) и вышеупомянутые патенты США, принадлежащие American Cyanamid). Другим противоопухолевым лекарственным средством, с которым может быть конъюгировано антитело, является QFA, который представляет собой антифолат. Как калихеамицин, так и QFA, имеют внутриклеточные сайты действия и не пересекают легко плазматическую мембрану. Таким образом, клеточное поглощение этих агентов посредством антитело-опосредованной интернализации в значительной степени усиливает их цитотоксические действия.
Другие цитотоксические средства
iv.
Другие противоопухолевые средства, которые могут быть конъюгированы с антителами по настоящему изобретению, включают BCNU, стептозоицин, винкристин и 5-фторурацил, семейство агентов, известных вместе как комплекс LL-E33288, описанный в патентах США с номерами 5053394 и 5770710, а также как эсперамицины (патент США № 5877296).
Pseudomonas aeruginosa
Aleurites fordii
Phytolaca americana
Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые могут быть использованы, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из ), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модеккина, альфа-сарцин, белки , диантиновые белки, белки  (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, WO 93/21232, опубликованный 28 октября 1993 года.
Настоящее изобретение дополнительно рассматривает иммуноконъюгат, образуемый между антителом и соединением с нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
99m
123
Для селективной деструкции опухоли это антитело может содержать высокорадиоактивный атом. Различные радиоактивные изотопы доступны для получения радиоконъюгированных антител. Примеры включают At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu. При использовании этого конъюгата для детектирования, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, tc или I, или спиновую метку для визуализации при помощи ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известного как визуализация при помоши магнитного резонанса, mri), такую как иод-123 опять, иод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
99m
123
186
188
111
Радиоактивные или другие метки могут быть включены в конъюгат известными способами. Например, пептид может быть биосинтезирован или может быть синтезирован химическим синтезом аминокислот с использованием подходящих предшественников аминокислот, включающих, например, фтор-19 вместо водорода. Такие метки, как tc или I, Re, Re и In, могут быть присоединены через остаток цистеина в этом пептиде. Иттрий-90 может быть присоединен через остаток лизина. Способ IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 может быть использован для включения иода-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) описывает подробно другие способы.
14
Конъюгаты антитела и цитотоксического средства могут быть получены с использованием различных связывающих бифункциональный белок агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат.HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные фторсоединения (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин может быть получен, как описано в Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Меченая углеродом-14 (С) 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатообразующего средства для конъюгации радионуклида с антителом. См. W094/11026. Линкером может быть "расщепляемый линкер", облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, могут быть использованы кислотолабильный линкер, пептидазо-чувствительный линкер, фотолабильный линкер, диметил-линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); патент США 5208020).
Соединения по настоящему изобретению особо рассматривают, но не ограничиваются ими, ADC, полученные с использованием сшивающих агентов: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, из Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A). См. страницы 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
v. Получение конъюгатов антитело-лекарственное средство
В конъюгатах антитело-лекарственное средство (ADC) по настоящему изобретению, антитело (Ab) конъюгировано с одной или несколькими лекарственными частями (D), например, от приблизительно 1 до приблизительно 20 лекарственными частями на антитело, через линкер (L). ADC формулы I могут быть получены несколькими путями, использующими реакции, условия и реагенты органической химии, известные квалифицированным в данной области специалистам, включающие: (1) реакцию нуклеофильной группы антитела с бивалентным линкерным реагентом с образованием Ab-L, через ковалентную связь, с последующей реакцией с лекарственной частью D; и (2) реакцию нуклеофильной группы лекарственной части с бивалентным линкерным реагентом с образованием D-L, через ковалентную связь, с последующей реакцией с нуклеофильной группой антитела. Дополнительные способы получения ADC описаны в настоящем описании.
p
Ab-(L-D)
Линкер может состоять из одного или нескольких линкерных компонентов. Примерные линкерные компоненты включают 6-малеимидокапроил ("MC"), малеимидопропаноил ("MP"), валин-цитруллин ("val-cit"), аланин-фенилаланин ("ala-phe"), p-аминобензилоксикарбонил ("PAB"), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат ("SPP"), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат ("SMCC”) и N-сукцинимидил-(4-иодацетил)аминобензоат ("SIAB"). Дополнительные линкерные компоненты известны в данной области и некоторые описаны в настоящем описании. См. также "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", патент США № 10/983340, поданный 5 ноября 2004 года, содержание которого включено в настоящем описании в качестве ссылки в полном виде.
В некоторых вариантах осуществления, линкер может содержать аминокислотные остатки. Примерные аминокислотные линкерные компоненты включают дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид. Примерные дипептиды включают: валин-цитруллин (vc или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe). Примерные трипептиды включают глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly). Аминокислотные остатки, которые содержат аминокислотный линкерный компонент, включают природные аминокислоты, а также минорные аминокислоты и не встречающиеся в природе аналоги аминокислот, такие как цитруллин. Аминокислотные линкерные компоненты могут быть сконструированы и оптимизированы в их селективности в отношении ферментативного расщепления конкретными ферментами, например, опухолеассоциированной протеазой, катепсином В, С и D, или плазминовой протеазой.
Нуклеофильные группы антител включают, но не ограничиваются ими: (i) N-концевые аминные группы, (ii) аминные группы боковых цепей, например, лизина, (iii) тиоловые группы боковой цепи, например, цистеина, и (iv) гидроксил сахара или аминогруппы, где антитело является гликозилированным. Аминные, тиоловые и гидроксильные группы являются нуклеофильными и способны реагировать с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных частях молекул или линкерных реагентах, включающими (i) активные сложные эфиры, такие как сложные эфиры NHS, сложные эфиры HOBt, галогенформиаты и галогенангидриды кислот; (ii) алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегиды, кетоны, карбоксил и малеимидные группы. Некоторые антитела имеют восстанавливаемые межцепочечные дисульфиды, т.е. цистеиновые мостики. Антитела могут быть сделаны реактивными для конъюгации с линкерными реагентами обработкой восстанавливающим агентом, таким как DTT (дитиотреитол). Таким образом, каждый цистеиновый мостик будет образовывать, теоретически, два реакционноспособных тиоловых нуклеофила. Дополнительные нуклеофильные группы могут быть введены в антитела посредством реакции лизинов с 2-иминотиоланом (реагентом Траута), приводящей к превращению амина в тиол. Реакционноспособные тиоловые группы могут быть введены в это антитело введением одного, двух, трех, четырех или более остатков цистеина (например, получением мутантных антител, содержащих один или несколько неприродных цистеиновых аминокислотных остатков).
Конъюгаты антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению могут быть также получены модификацией антитела для введения электрофильных частей, которые могут реагировать с нуклеофильными заместителями на линкерном реагенте или лекарственном средстве. Сахара гликозилированных антител могут быть окислены, например, периодатными окисляющими реагентами с образованием альдегидных или кетонных групп, которые могут реагировать с аминогруппой линкерных реагентов или лекарственных частей. Полученные иминные группы оснований Шиффа могут образовывать стабильную связь или могут восстанавливаться, например, боргидридными реагентами с образованием стабильных аминных связей. В одном из вариантов осуществления, реакция углеводной части гликозилированного антитела либо с галактозооксидазой, либо с мета-периодатом натрия, может давать карбонильную (альдегидную или кетонную) группу в этом белке, которая может взаимодействовать с подходящими группами на лекарственном средстве (Hermanson, Bioconjugate Techniques). В другом варианте осуществления, белки, содержащие N-концевые остатки серина или треонина, могут взаимодействовать с мета-периодатом натрия, приводя к продуцированию альдегида вместо первой аминокислоты (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; патент США № 5362852). Такой альдегид может взаимодействовать с лекарственной частью или линкерным нуклеофилом.
Подобным образом, нуклеофильные группы на лекарственной части включают, но не ограничиваются ими: амин, тиол, гидроксил, гидразид, оксим, гидразин, тиосемикарбазон, гидразинкарбоксилат и арилгидразидные группы, способные реагировать с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных частях молекул и линкерных реагентах, включающих: (i) активные сложные эфиры, такие как сложные эфиры NHS, сложные эфиры HOBt, галогенформиаты и галогенангидриды кислот; (ii) алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегиды, кетоны, карбоксил и малеимидные группы.
Альтернативно, слитый белок, содержащий антитело и цитотоксическое средство, может быть получен, например, рекомбинантными способами или пептидным синтезом. Длина ДНК может включать соответствующие области, кодирующие две части этого конъюгата либо смежные друг с другом, либо разделенные областью, кодирующей линкерный пептид, который не нарушает желаемые свойства конъюгата.
Еще в одном из вариантов осуществления, антитело может быть конъюгировано с "рецептором" (таким как стрептавидин) для использования в предварительном нацеливании на опухоль, где этот конъюгат антитело-рецептор вводят индивидууму с последующим удалением несвязанного конъюгата из кровотока с использованием очищающего агента и затем введением "лиганда" (например, авидина), который конъюгирован с цитотоксическим средством (например, радионуклидом).
Способы применения антител против гепсина
Настоящее изобретение описывает применение антитела гепсина в виде части специфической схемы лечения, предназначенной для обеспечения благоприятного действия от активности этого терапевтического средства. Настоящее изобретение особенно применимо в лечении различных типов рака на различных стадиях.
Термин рак охватывает совокупность пролиферативных нарушений, включающих, но не ограничивающися ими, предраковые опухоли, доброкачественные опухоли и злокачественные опухоли. Доброкачественные опухоли остаются локализованными в месте возникновения и не способны к инфильтрации, инвазии или метастазированию в отдаленные участки. Злокачественные опухоли будут инвазировать и разрушать другие ткани около них. Они могут также приобрести способность к отрыванию от их первоначального места и распространению к другим частям тела (метастазированию), обычно через кровоток или через лимфатическую систему, где локализуются лимфатические узлы. Первичные опухоли классифицируются по типу тканей, из которых они возникают; метастатические опухоли классифицируются по типу ткани, из которой получены раковые клетки. Со временем, эти клетки злокачественной опухоли становятся отклоняющимися от нормы и менее похожими на нормальные клетки. Это изменение в виде раковых клеток называют опухолевой стадией, и раковые клетки описывают как являющиеся хорошо-дифференцированными (низкая стадия), умеренно-дифференцированными, слабо-дифференцированными или недифференцированными (высокая стадия). Хорошо-дифференцированные клетки являются клетками нормального вида и похожими на нормальные клетки, из которых они происходят. Недифференцированные клетки являются клетками, которые стали такими отклоняющимися от нормы, что уже невозможно определить происхождение этих клеток.
Системы классификации по стадиям (системы стадирования) рака описывают, насколько далеко этот рак распространился анатомически, и пытаются помещать пациентов со сходными прогнозом и лечением в одну и ту же группу стадирования. Несколько тестов могут выполняться для помощи определения стадии рака, включающие биопсию и некоторые тесты визуализации, такие как рентген грудной клетки, маммограмма, сканирование кости, компьютерно-томографическое (СТ) сканирование и MRI-сканирование. Тесты крови и клиническое оценивание также используются для оценивания общего здоровья пациента и детектирования, распространился ли рак в определенные органы.
Для стадирования рака, American Joint Committee on Cancer сначала помещает рак, в частности, солидные опухоли, в буквенную категорию с использованием системы классификации TNM. Раки обозначают буквой T (размер опухоли), N (пальпируемые узлы) и/или M (метастазы). T1, T2, T3 и T4 описывают увеличивающийся размер первичного повреждения; N0, N1, N2, N3 указывает прогрессивно продвинутое участие узлов; и M0 и M1 отражает присутствие или отсутствие отдаленных метастазов.
Во втором способе стадирования, также известном как Overall Stage Grouping или Roman Numeral Staging, раки разделяют на стадии 0-IV, включающие размер первичных повреждений, а также присутствие узлового распространения и отдаленные метастазы. В этой системе, случаи группируют на четыре стадии, обозначаемые римскими цифрами I-IV, или классифицируют как “рецидивирующие". Для некоторых раков, стадию 0 называют "in situ" или "Tis", например, внутрипротоковая карцинома in situ или дольчатый рак in situ для раков молочной железы. Аденомы высокой стадии могут быть классифицированы как стадия 0. В целом, раки стадии I являются малыми локализованными раками, которые обычно являются излечимыми, тогда как стадия IV обычно представляет неоперабельный или метастатический рак. Раки стадии II и III обычно являются локально продвинутыми и/или проявляют участие локальных лимфатических узлов. Обычно, цифры более высокой стадии указывают на более экстенсивное заболевание, включающее больший размер опухоли и/или распределение этого рака к местам вблизи лимфатических узлов, и/или органам, соседних с первичной опухолью. Эти стадии точно определены, но это определение является разным для каждого типа рака и известно квалифицированному в данной области специалисту.
Многие регистры рака, такие как NCI's Surveillance, Epidemiology, и End Results Program (SEER), используют суммарное стадирование. Эта система используется для всех типов рака. Она группирует случаи рака в пять основных категорий:
In situ
обозначает ранний рак, который присутствует только в слое клеток, в которых он начинается.
Локализованный
обозначает рак, который ограничен органом, в котором он начался, без признаков распространения.
Региональный
обозначает рак, который распространился за пределы первоначального (первичного) места до места вблизи лимфатических узлов или органов и тканей.
Отдаленный
обозначает рак, который распространился из первичного участка к отдаленным органам или отдаленным лимфатическим узлам.
Неизвестный
используется для описания случаев, для которых нет достаточной информации для указания стадии.
Кроме того, обычным для рака является рецидив спустя месяцы или годы после удаления первичной опухоли. Рак, который рецидивирует после ликвидации всей видимой опухоли, называют рецидивирующим заболеванием. Заболевание, которое рецидивирует в зоне первичной опухоли, является локально рецидивирующим, а заболевание, которое рецидивирует в виде метастазов, называют отдаленным рецидивом.
Опухоль может быть солидной опухолью или не-солидной опухолью или опухолью мягкой ткани. Примеры опухолей мягкой ткани включают лейкоз (например, хронический миелогенный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз взрослых, острый миелогенный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз зрелых В-клеток, хронический лимфоцитарный лейкоз, полилимфоцитарный лейкоз или волосатоклеточный лейкоз или лимфома (например, не-Ходжкинская лимфома, Т-клеточная лимфома кожи или лимфома Ходжкина). Солидная опухоль включает любой рак тканей тела, других, чем кровь, костный мозг или лимфатическая система. Солидные опухоли могут быть дополнительно подразделены на опухоли, происходящие из эпителиальных клеток, и опухоли, не происходящие из эпителиальных клеток. Примеры солидных опухолей эпителиальных клеток включают опухоли желудочно-кишечного тракта, ободочной кишки, молочной железы, предстательной железы, легкого, почки, печени, поджелудочной железы, яичника, головы и шеи, полости рта, желудка, двенадцатиперстной кишки, тонкой кишки, толстой кишки, ануса, желчного пузыря, губы, носоглотки, кожи, матки, мужских половых органов, мочевых органов, мочевого пузыря и кожи. Примеры солидных опухолей неэпителиального происхождения включают саркомы, опухоли головного мозга и опухоли костей. Другие примеры опухолей описаны в разделе “Определения”.
В некоторых вариантах осуществления, пациента подвергают диагностическому тесту, например, до и/или во время и/или после терапии. Обычно, если выполняется диагностический тест, образец может быть взят у пациента, нуждающегося в терапии. Если этот индивид имеет рак, этим образцом может быть образец опухоли или другой биологический образец, такой как биологическая жидкость, включающая, без ограничений, кровь, мочу, слюну, асцитную жидкость или производные, такие как сыворотка крови и плазма крови, и т.п.
Биологический образец может быть в настоящем описании фиксированным образцом, например, фиксированным формалином, залитым в парафин (FFPE) образцом или замороженным образцом.
Различные способы для определения экспрессии мРНК или белка включают, но не ограничиваются ими, анализ экспрессии гена, полимеразную цепную реакцию (PCR), включающую количественную ПЦР реального времени (qRT-PCR), анализ микроматриц, серийный анализ экспрессии генов (SAGE), MassARRAY, анализ экспрессии генов массивным параллельным секвенированием сигнатур (MPSS), протеомику, иммуногистохимию (IHC), и т.д. Предпочтительно, мРНК определяют количественно. Такой анализ мРНК, предпочтительно, выполняют с использованием способа полимеразной цепной реакции (ПЦР) или с использованием анализа микроматриц. При использовании ПЦР, одной предпочтительной формой ПЦР является количественная ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR). В одном из вариантов осуществления, экспрессия одного или нескольких вышеупомянутых генов считается положительной экспрессией, если она находится при медиане или выше, например, в сравнении с другими образцами того же самого типа опухоли. Уровень медианной экспрессия может определяться по существу одновременно с измерением экспрессии гена или может быть определен заранее.
Стадии репрезентативного протокола для анализа экспрессии генов с использованием фиксированных залитых в парафин тканей в качестве источника РНК, в том числе выделения, очистки мРНК, удлинения праймеров и амплификации, приведены в различных опубликованных журнальных статьях (например: Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). Коротко, один репрезентативный способ начинается нарезанием толстых срезов приблизительно 10 микрограммов залитых в парафин образцов ткани опухоли. Затем РНК экстрагируют и белок и ДНК удаляют. После анализа концентрации РНК, могут быть включены стадии репарации РНК и/или амплификации, если необходимо, и РНК обратно-транскрибируют с использованием геноспецифических промоторов с последующей ПЦР. Наконец, данные анализируют для идентификации наилучшей опции (наилучших опций), доступных пациенту на основе характерного паттерна экспрессии генов, идентифицированных в испытанном образце опухоли.
Детектирование экспрессии генов и белка может выполняться непосредственно или опосредованно.
Можно определять экспрессию или амплификацию гепсина при раке (непосредственно или опосредованно). Для этого доступны различные диагностические/прогностические анализы. В одном из вариантов осуществления, сверхэкспрессию гепсина можно анализировать при помощи IHC. Залитые в парафин срезы тканей из биопсии опухоли могут быть подвергнуты IHC-анализу и предоставлять критерии интенсивности окрашивания белка гепсина следующим образом:
Оценка 0
наблюдается отсутствие окрашивания или окрашивание мембраны равно менее 10% опухолевых клеток.
Оценка 1+
слабое/едва различимое окрашивание мембраны детектируется в более чем 10% опухолевых клеток. Клетки окрашиваются только в части их мембраны.
Оценка 2+
слабое-умеренное окрашивание полной мембраны наблюдается в более чем 10% опухолевых клеток.
Оценка 3+
умеренное-сильное окрашивание полной мембраны наблюдается в более чем 10% опухолевых клеток.
В некоторых вариантах осуществления, опухоли с оценками 0 или 1+ для оценивания сверхэкспрессии гепсина, могут характеризоваться как не сверхэкспрессирующие гепсин, тогда как опухоли с оценками 2+ или 3+ могут характеризоваться как сверхэкспрессирующие гепсин.
Альтернативно, или дополнительно, FISH-анализы могут проводиться на фиксированной формалином, залитой в парафин ткани опухоли для определения присутствия и/или степени (если требуется) амплификации или транслокации гепсина в опухоли.
Активация гепсина может быть определена непосредственно (например, фосфо-ELISA-тестированием или другими способами детектирования фосфорилированного рецептора) или опосредованно (например, детектированием активированных расположенных в направлении 5'-3' компонентов пути передачи сигнала, детектированием димеров рецептора (например, гомодимеров, гетеродимеров), детектированием профилей экспрессии генов и т.п.
Способы детектирования мутаций нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области. Часто, хотя и необязательно, нуклеиновую кислоту в образце амплифицируют для обеспечения желаемого количества материала для определения, присутствует ли мутация. Способы амплификации хорошо известны в данной области. Например, амплифицированный продукт может включать или может не включать всю последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, если продукт амплификации содержит положения в аминокислотной нуклеиновой кислоте, где предполагается мутация.
Образец, содержащий нуклеиновую кислоту-мишень, может быть получен способами, хорошо известными в данной области, которые являются подходящими для конкретного типа и местоположения этой опухоли. Для получения репрезентативного кусочка ткани опухоли часто используют биопсию. Альтернативно, опухолевые клетки могут быть получены опосредованно в форме тканей/жидкостей, о которых известно или предполагается, что они содержат представляющие интерес опухолевые клетки. Например, образцы раковых повреждений легкого могут быть получены резекцией, бронхоскопией, аспирацией тонкой иглой, с использованием щеточки для бронхов или из мокроты, плевральной жидкости или крови. Мутантные гены или продукты генов могут быть детектированы из опухоли или из других образцов тела, таких как моча, мокрота или сыворотка. Те же самые способы, обсуждаемые выше, для детектирования мутантных генов-мишеней или продуктов генов в образцах опухолей могут использоваться для других образцов тела. Раковые клетки отторгаются из опухолей и появляются в таких образцах тела. Посредством скрининга таких образцов тела может быть получен простой ранний диагноз для таких заболеваний, как рак. Кроме того, прогрессирование терапии может подвергаться мониторингу более легко тестированием таких образцов тела на мутантные гены-мишени или продукты генов.
Способы для обогащения препарата ткани опухолевыми клетками известны в данной области. Например, ткань может быть выделена из парафиновых или криостатных срезов. Раковые клетки могут быть также отделены от нормальных клеток проточной цитометрией или микродиссекцией (микропрепаровкой) лазерным улавливанием. Эти, а также другие способы отделения опухолевых от нормальных клеток, хорошо известны в данной области. Если ткань опухоли высоко загрязнена нормальными клетками, детектирование мутаций может быть более трудным, хотя известны способы минимизации загрязнения и/или ложных позитивных/негативных результатов, некоторые из них описаны в настоящем описании ниже. Например, образец может также оцениваться на присутствие биомаркера (в том числе мутации), о котором известно, что он является связанным с представляющей интерес опухолевой клеткай, но не с соответствующей нормальной клеткой, или vice versa.
В некоторых случаях, рак действительно сверхэкспрессирует или не сверхэкспрессирует гепсин. Сверхэкспрессия гепсина может быть определена в диагностическом или прогностическом анализе оцениванием увеличенных уровней гепсина, присутствующего на клетке (например, при помощи иммуногистохимического анализа; IHC). Альтернативно, или дополнительно, можно измерить уровни гепсин-кодирующей нуклеиновой кислоты в этой клетке, например, с использованием флуоресцентной гибридизации in situ (FISH; см. WO98/45479, опубликованный в октябре 1998 года), блоттинга по Саузерну или способов полимеразной цепной реакции (ПЦР), таких как количественная ПЦР реального времени (RT-PCR). Наряду с вышеуказанными анализами, квалифицированному в данной области специалисту доступны различные анализы in vivo. Например, можно подвергнуть клетки внутри тела пациента действию антитела, которое необязательно помечено детектируемой меткой, например, радиоактивным изотопом, и связывание этого антитела с клетками в пациенте может быть оценено, например, наружным сканированием на радиоактивность или анализом биопсии, взятой из пациента, ранее подвергнутого действию этого антитела.
Химиотерапевтические средства
Комбинированная терапия по настоящему изобретению может дополнительно включать один или несколько химиотерапевтических средств. Эта комбинированная терапия включает совместное введение или одновременное введение, с использованием раздельных составов или единственного фармацевтического состава, и последовательного введения в любом порядке, в котором, предпочтительно, имеется период времени, когда оба активных агента (или все активные агенты) одновременно проявляют их биологические активности.
Химиотерапевтическое средство, при его введении, обычно вводят в дозах, известных для этого, или необязательно пониженных вследствие объединенного действия этих лекарственных средств или отрицательных побочных действий, приписываемых введению антиметаболитного химиотерапевтического средства. Приготовление и схемы введения для таких химиотерапевтических средств могут использоваться в соответствии с инструкциями изготовителя или в соответствии с эмпирическим определением квалифицированным специалистом-практиком.
Различные химиотерапевтические средства, которые могут быть комбинированы, описаны в настоящем описании.
Состав, дозы и введения
Терапевтические средства, используемые в настоящем изобретении, будут получаться, дозироваться и вводиться в соответствии с хорошей медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в этом контексте включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретного индивида, проходящего лечение, клиническое состояние индивидуального пациента, причину нарушения, сайт доставки агента, способ введения, схему введения, взаимодействие между лекарственными средствами объединяемых агентов и другие факторы, известные врачам-практикам.
th
Терапевтические составы получают с использованием стандартных способов, известных в данной области, смешиванием активного ингредиента, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences (20 edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). Приемлемые носители включают солевой раствор или буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту; полипептиды низкой молекулярной массы (менее приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагины, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие средства, такие как ЭДТА; сахароспирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или PEG.
Необязательно, но предпочтительно, этот препарат содержит фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно, хлорид натрия, и, предпочтительно, в приблизительно физиологических концентрациях. Необязательно, препараты по настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый консервант. В некоторых вариантах осуществления, концентрация консерванта находится в диапазоне 0,1-2,0%, обычно об/об. Подходящие консерванты включают консерванты, известные в областях фармацевтики. Предпочтительными консервантами являются бензиловый спирт, фенол, м-крезол, метилпарабен и пропилпарабен. Необязательно, препараты по настоящему изобретению могут включать фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество в концентрации 0,005-0,02%.
Описанный в настоящем описании препарат может также содержать более одного активного соединения, необходимого для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно, с дополняющими активностями, которые не действуют вредным образом друг на друга. Такие молекулы подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемых целей.
Активные ингредиенты могут быть также инкапсулированы в микрокапсуле, приготовленной, например, способами коацервации или межфазной полимеризации, например, в гидроксиметилцеллюлозной или желатиновой микрокапсуле и поли(метилметакрилат)ной микрокапсуле, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие способы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
Могут быть приготовлены препараты пролонгированного действия. Подходящие примеры препаратов пролонгированного действия включают полупроницаемые матриксы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем эти матриксы находятся в форме сформованных изделий, например, пленок или микрокапсулы. Примеры матриксов пролонгированного высвобождения включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролидацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как полимеры, такие как этиленвинилацетат и молочная кислота-гликолевая кислота позволяют высвобождение молекул в течение более 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Когда инкапсулированные антитела остаются в теле в течение продолжительного времени, они могут денатурироваться или агрегироваться в результате подвергания действию влаги при 37°С, приводя к потере биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. В зависимости от участвующего механизма могут быть придуманы рациональные стратегии для стабилизации. Например, если обнаружено, что механизмом агрегации является образование межмолекулярной связи S-S посредством тио-дисульфидного взаимодействия, стабилизация может быть достигнута модификацией сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислотных растворов, контролированием влажности, использованием подходящих добавок и развитием специфических композиций полимерного матрикса.
ex vivo
Терапевтические агенты по настоящему изобретению вводят пациенту-человеку в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение в виде болюса или непрерывная инфузия на протяжении некоторого периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, внутрисуставным, интрасиновиальным, подоболочечным, пероральным, местным или ингаляционным способами. Для терапевтических применений могут быть также использованы стратегии ex vivo. Стратегии  включают трансфекцию или трансдукцию клеток, полученных от индивида с полинуклеотидом, кодирующим антагонист гепсина. Затем эти трансфицированные или трансдуцированные клетки возвращают индивиду. Клетки могут быть любыми из широкого диапазона типов, включающих, без ограничения, гемопоэтические клетки (например, клетки костного мозга, макрофаги, моноциты, дендритные клетки, Т-клетки или В-клетки), фибробласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты или мышечные клетки.
Например, если антагонистом гепсина является антитело, антитело вводят любым подходящим способом, включающим парентеральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное и интраназальное введение и, если желательно, для локального иммуносупрессивного лечения, введение через повреждение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное или подкожное введение. Кроме того, антитело вводят удобным образом импульсной инфузией, в частности, с уменьшающимися дозами антитела. Предпочтительно, введение доз осуществляется инъекцией, наиболее предпочтительно, внутривенной или подкожной инъекциями, в зависимости отчасти от того, является ли это введение кратковременным или продолжительным.
В другом примере, соединение-антагонист гепсина вводят локально, например, прямыми инъекциями, когда это разрешено нарушением или местоположением опухоли, и эти инъекции могут периодически повторяться. Антагонист гепсина может доставляться системно индивиду или непосредственно в опухолевые клетки, например, к опухоли или к ложу опухоли после хирургического иссечения этой опухоли, для предотвращения или уменьшения локального рецидива или метастазирования.
Введение терапевтических агентов в комбинации обычно проводят на протяжении определенного периода времени (обычно минут, часов, дней или недель в зависимости от выбранной комбинации). Комбинированная терапия предназначена для включения введения этих терапевтических агентов последовательным образом, т.е. когда каждый терапевтический агент вводят в другое время, а также введения этих терапевтических агентов, или по меньшей мере двух из этих терапевтических агентов, по существу одновременно.
Терапевтический агент может вводиться одним и тем же способом или различными способами. Например, антитело против гепсина в этой комбинации может вводиться внутривенной инъекцией, тогда как химиотерапевтический агент в этой комбинации может вводиться перорально. Альтернативно, например, оба из этих терапевтических агентов могут вводиться перорально или оба терапевтических агента могут вводиться внутривенной инъекцией, в зависимости от конкретных терапевтических агентов. Последовательность, в которой вводят эти терапевтические агенты, также варьируется в зависимости от конкретных агентов.
В зависимости от типа и тяжести заболевания, приблизительно 1 мкг/кг - 100 мг/кг каждого терапевтического агента являются кандидатной дозой для введения пациенту, независимо от того, например, вводят ли их одним или несколькими отдельными введениями или непрерывной инфузией. Обычная суточная доза может находиться в диапазоне от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторяемых введений на протяжении нескольких дней или более длительных, в зависимости от состояния, лечение пролонгируется, пока рак не вылечивается, как измерено описанными в настоящем описании способами. Однако, могут быть применимы и другие схемы введения доз.
Данная заявка обсуждает введение антитела против гепсина с использованием генной терапии. См., например, WO96/07321, опубликованный 14 марта 1996 года в отношении применения генной терапии для индукции внутриклеточных антител.
Изделие
В другом аспекте настоящее изобретение относится к изделию, содержащему материалы, применимые для лечения, профилактики и/или диагноза описанных выше нарушений. Изделие включает контейнер и ярлык или вкладыш упаковки на этом контейнере или в ассоциации с этим контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть выполнены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая является единственным содержимым контейнера, или, при объединении с другой композицией (другими композициями), эффективными для лечения, профилактики и/или диагноза этого состояния, может иметь стерильное отверстие для доступа (например, этот контейнер может быть мешком для внутривенного раствора или флаконом, имеющим пробку, протыкаемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере один активный агент в композиции является антителом по настоящему изобретению. Ярлык или вкладыш упаковки указывает, что эта композиция используется для лечения выбранного состояния, такого как рак. Кроме того, это изделие может содержать (a) первый контейнер с композицией, содержащейся в нем, где эта композиция содержит антитело по настоящему изобретению; и (b) второй контейнер с композицией, содержащейся в нем, где эта композиция содержит дополнительное цитотоксическое средство. Изделие в этом варианте осуществления может дополнительно содержать вкладыш упаковки, указывающий, что первая и вторая композиция антитела может быть использована для лечения конкретного состояния, например, рака. Альтернативно, или дополнительно, изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекции (BWFI), забуференный фосфатом солевой раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие материалы, желаемые с коммерческой точки зрения и с точки зрения пользователя, включающие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Далее следуют примеры способов и композиций по настоящему изобретению. Понятно, что могут практиковаться различные другие варианты осуществления, при условии общего описания, обеспеченного в настоящем описании.
ПРИМЕРЫ
Материалы и способы
Реагенты и белки:
Синтетические пара-нитроанилидные субстраты S2765 (=DiaPharma FXa субстрат), S2266, S2288, S2366, S2444 были из DiaPharma (Westchester, OH), Chromozym TH из Roche Diagnostics (Indianapolis, IN), Spectrozyme flXa (#299) и Spectrozyme FVIIa из American Diagnostica (Greenwich, CT). 3,4-дихлоризокумарин, BSA и Tween-20 были из Sigma-Aldrich.
Плазмин и фактор XIa были из Haematologic Technologies Inc. (Essex Junction, VT), калликреин плазмы из Calbiochem (La Jolla, CA), Фактор VII и Фактор XIIa из Enzyme Research (South Bend, IN), активатор плазминогена урокиназного типа (uPA) из American Diagnostica, про-uPA из Fitzgerald Industries Int. (Concord, MA). Ламинин крысы был из Millipore (Temecula, CA). Гепсин (человека), матриптаза, марапсин, активатор фактора роста гепатоцитов (HGFA), про-фактор роста гепатоцитов (pro-HGF), ингибитор 1 домена Кунитца (KD1), полученный из HGFA-ингибитора-1 (HAI-1) и HAI-2 были экспрессированы рекомбинантно и очищены, как описано ранее (Kirchhofer et al., 2003; Kirchhofer et al., 2005; Li et al., 2009; Moran et al., 2006; Peek et al., 2002; Shia et al., 2005). В качестве контрольных антител авторы использовали анти-HGFA-Fab или IgG (Fab40, Fab58, Fab75, IgG75), индуцированные с использованием фагового дисплея антител (Ganesan et al., 2009; Wu et al., 2007).
2
2
Фаг-помощник M13-К07 был из New England Biolabs. Планшеты Maxisorp immunoplates plates были из Nalgen NUNC International (Naperville, IL). Стрептавидин Dynabeads MyOne был из Invitrogen (Carlsbad, CA). Субстрат пероксидазы 3,3',5,5'-тетраметилбензидин/HO (TMB) был из Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc. NeutrAvidin и Стрептавидин были из Pierce Biotechnology, Inc.
Клонирование, экспрессия и очистка простазина
33
321
8
: Внеклеточный домен простазина человека (Ala-Leu), несущий С-концевую flag-метку, экспрессировали с использованием экспрессионной системы бакуловируса с клетками T. ni. После 72 часов инкубирования супернатант собирали и осветленную среду наносили на колонку с анти-Flag-M2-антитело-агарозой (Sigma). Связанный белок элюировали 100 мМ глицином, рН 3,0 и сразу же нейтрализовали 1 М Tris рН 8,0. Полученную зимогенную форму простазина активировали рекомбинантной матриптазой при комнатной температуре в течение 16 часов. После этого, активированный двухцепочечный простазин очищали удалением (His)-меченой ("His8", описанной в виде SEQ ID NO:59) матриптазы на колонке Ni-NTA. Простазин дополнительно очищали гель-фильтрационной (size-exclusion) хроматографией с использованием колонки S-200.
Клонирование, экспрессия и очистка гепсина мыши
45
416
: Внеклеточный домен гепсина мыши (Ser-Pro), несущий С-концевую His-метку, экспрессировали с использованием экспрессионной системы бакуловируса с клетками T. ni, при сходных условиях для гепсина человека (Moran et al., 2006). После 72 часов инкубирования супернатант собирали и осветленную среду наносили на колонку Ni-NTA (Qiagen), которую предварительно уравновешивали с буфером, содержащим 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 300 мМ NaCl. Связанный белок элюировали буфером, содержащим 50 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 300 мМ NaCl и 250 мМ имидазол.
Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантных MSP и KD1:
Рекомбинантный MSP экспрессировали в клетках яичника Китайского хомячка, как описано (Wahl et al., 1997). KD1 экспрессировали и очищали, как описано (Shia et al., 2005).
Конструирование библиотеки для фагового дисплея Fab:
10
Библиотеку, названную библиотекой YSGX, конструировали, как описано ранее, с использованием фагмиды фагового дисплея Fab (pF1359) (Lib D в (Fellouse et al., 2007)). Разнообразие этой библиотеки равно приблизительно 2×10.
Отбор и характеристика представленных фагом анти-гепсин-Fab:
l3
2
2
3
4
Для экспериментов с фаговым дисплеем авторы использовали биотинилированный гепсин (=биотин-гепсин) и биотинилированный гепсин в комплексе с 3,4-дихлоризокумарином (DCI) (=биотин-гепсин:DCI). Гепсин биотинилировали с использованием набора Сульфо-NHS-LC-Биотин (Pierce, каталог #21327) в соответствии с инструкциями изготовителя. Некоторую часть биотинилированного гепсина использовали для образования комплекса биотин-гепсин:DCI инкубированием с 100 мкМ DCI и поддержанием этой концентрации DCI во время последующих экспериментов с пэннингом. Прежние эксперименты с DCI показывали, что 40-минутное экспонирование гепсина 25-50 мкМ DCI полностью ингибировало активность гепсина в ферментативных анализах с субстратом S2765. Для первого раунда пэннинга, 10 мкг биотин-гепсин или биотин-гепсин:DCI инкубировали с 1 мл библиотеки YSGX при концентрации 1×10 б.о.е/мл при 4°C в течение 1,5 ч в отсутствие или присутствии 100 мкМ DCI, соответственно. Фаг, который связывался с мишенью, улавливали в течение 15 минут с использованием 100 мкл Dynabeads MyOne-Стрептавидина. Связанный фаг элюировали 0,1 М HCl, сразу же нейтрализовали и затем амплифицировали по стандартному протоколу (Sidhu et al., 2000). От второго раунда далее, 2 мкг биотин-гепсин или биотин-гепсин:DCI инкубировали с 400 мкл амплифицированного фага при 4°С в течение 1,5 часов без 100 мкМ DCI или с 100 мкМ DCI, соответственно. Фаг, который связывался с биотин-гепсин или биотин-гепсин-DCI, улавливали в течение 15 минут с Maxisorp иммунопланшетами (NUNC), покрытыми NeutrAvidin или стрептавидином (альтернативно между раундами), и блокировали блокирующим буфером (PBS, 0,5% (масс/об) BSA). После пяти раундов отбора, фаги получали из индивидуальных клонов, выращенных в 96-луночном формате, и культуральные супернатанты разводили в три раза в PBS, 0,5% (масс./об.) BSA, 0,1% (об/об) Твин 20 (PBT-буфере). Разведенные супернатанты фагов инкубировали в течение 1 часа с биотин-гепсин или биотин-гепсин:DCI, которые были иммобилизованы на покрытых Neutravidin 384-луночных иммунопланшетах Maxisorp (NUNC). Планшеты промывали шесть раз PBS, 005% (об./об.) Твином 20 (PT-буфером) и инкубировали 30 минут с конъюгатом пероксидаза хрена/анти-M13-антитело (1:5000 разведение в PBT-буфере) (Pharmacia). Эти планшеты промывали шесть раз РТ-буфером и дважды PBS, проявляли в течение 15 минут с субстратом 3,3',5,5'-тетраметилбензидин/HO пероксидазы (Kirkegaard & Perry Laboratories), гасили 1,0 М HPO и абсорбцию измеряли спектрофотометрически при 450 нм.
450
Одноточковый фаговый конкурентный ELISA использовали для идентификации представленных фагом Fab, которые связываются с тем же эпитопом гепсина, с которым связывается KD1. Индивидуальные клоны выращивали в 96-луночном формате и культуральные супернатанты разводили в пять раз в РВТ-буфере с 200 нМ KD1 или без KD1 и инкубировали с комплексом биотин-Гепсин, который был иммобилизован на покрытых NeutrAvidin 384-луночных иммунопланшетах Maxisorp (NUNC) в течение 1 часа. Планшет промывали и связанный фаг детектировали с использованием анти-M13-HRP, как описано выше. Для каждого клона рассчитывали отношение A в отсутствие 200 нМ KD1 : в присутствии 200 нМ KD1. Любые клоны с отношением выше 2 считались клонами, нацеленными на эпитоп, сходный с KD1. Такие клоны подвергали подробному конкурентному ELISA фагов с KD1, в котором использовали ряд концентраций KD1 (старт от 10 мкМ, серийное разведение 1:3) для конкуренции с представленным фагом Fab, связанным с Гепсином.
Экспрессия и очистка анти-гепсин-Fab и IgG25:
4
2
4
2
4
В основном, во всей этой заявке, IgG-форма антитела 25 обозначается с префиксом Ab и Fab-форма антитела 25 обозначается с префиксом Fab. Стоп-кодон вводили между тяжелой цепью и геном 3 на фагмиде, кодирующей Fab25. Полученную фагмиду трансформировали в штамм E. coli 34B8. Единственная колония выросла в течение ночи при 37°С в 30 мл LB-среды, дополненной 50 мкг/мл карбенициллина. Пять мл культуры инокулировали в 500 мл полной среды C.R.A.P. (для приготовления 1 литра: 3,57 г (NH)SO, 0,71 г Na-цитрат-2HO, 1,07 г KC1, 5,36 г дрожжевого экстракта, 5,36 г Hycase SF. Добавьте до 872 мл деионизованной воды. Доведите рН до 7,3 с использованием KOH. Автоклавируйте. Охладите до 55°C и добавьте 110 мл 1 М MOPS pH 7,3, 11 мл 50% глюкозы и 7 мл 1 М MgSO), дополненную карбенициллином (50 мкг/мл) и выращивайте при 30°C в течение 24 часов. Белок Fab25 очищали с использованием белок А-агарозной смолы.
Вариабельный домен легкой цепи и тяжелой цепи отобранных Fab клонировали в плазмиду на основе pRK5 с константным доменом легкой цепи или тяжелой цепи человека (IgG1 человека) для транзиторной экспрессии в клетках яичника Китайского хомячка (СНО). Белок IgG25 очищали с использованием белок А-агарозной хроматографии.
Ферментативный анализ с синтетическими субстратами:
2
i
0
50
i
app
Fab25, IgG25, контрольный Fab или контрольный IgG инкубировали с гепсином (1 нМ гепсином для человека и 2 нМ гепсином для мыши) в Hepes-буфере (20 мМ Hepes, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl, 0,01% Тритон X-100) в течение 40 минут при комнатной температуре. Для экспериментов с 3,4-дихлоризокумарином (DCI), гепсин (1 нМ) инкубировали с DCI в Hepes-буфере, содержащем 0,5% ДМСО, в течение 40 минут. Добавляли S2765 (конечная концентрация 0,2 мМ) и линейные скорости увеличения оптической плотности при 405 нм измеряли на кинетическом микропланшет-ридере (Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Данные выражали в виде дробной активности фермента (ν/ν) и подгоняли к программе подгонки четырех параметрических регрессионных кривых (Kaleidagraph Version 3.6, Synergy Software) для определения величин IC. Величины являются средней величиной ± SD трех независимых экспериментов. Величины К  для Fab25 и IgG25 рассчитывали подгонкой этих данных к уравнению для систем ингибирования тесного связывания (Morrison, 1969; Olivero et al., 2005).
i
0
Для испытания специфичности Fab25, панель 9 трипсин-подобных сериновых протеаз инкубировали с 1 мкМ Fab25 в течение 40 минут в Hepes-буфере. Добавляли подходящие хромогенные субстраты и линейные скорости увеличения оптической плотности при 405 нм измеряли на кинетическом микропланшет-ридере. Используемые концентрации каждого фермента и хромогенного субстрата были следующие: 1 нМ Гепсин - 0,5 мМ S2765, 0,5 нМ матриптаза - 0,5 мМ S2765, 5 нМ простазин - 0,5 мМ S2765, 2 нМ плазмин - 0,5 мМ S2366, 2 нМ калликреин плазмы - 0,5 мМ S2366, 0,5 нМ Фактор XIa - 0,5 мМ S2366, 5 нМ FXIIa - 0,5 мМ S2288, 5 нМ uPA - 0,5 мМ S2444, 50 нМ марапсин - 0,2 мМ Spectrozyme FVIIa, 10 нМ HGFA - 0,2 мМ Spectrozyme FVIIa. Данные выражали в виде дробной активности фермента (v/v), и они были средней величиной ± SD 3 независимых экспериментов.
Панель коммерчески доступных субстратов pNA, все из которых имеют остаток P1 Arg, использовали для испытания ингибирования гепсина посредством Fab25. Этими 8 субстратами были S2765, S2266, S2288, S2366, S2444, Хромозим TH, Спектрозим fIXa и Спектрозим FVIIa. Этот анализ проводили, как описано выше, за исключением того, что концентрация Fab25 и контрольного Fab была фиксирована при 100 нМ. Концентрация субстратов была 0,5 мМ. Эти данные выражали в виде процентного ингибирования неингибированной активности (без Fab), и они являются средним ± SD четырех независимых экспериментов.
Ферментативные анализы с макромолекулярными субстратами:
2
i
0
50
Для измерения гепсин-опосредованной активации pro-uPA, Fab25 серийно разводили в буфере HBSA (20 мМ Hepes, pH 7,5, 150 нМ NaCl, 5 мМ CaCl, 0,5 мг/мл BSA) и инкубировали с гепсином в течение 35 минут при комнатной температуре. Ферментативную реакцию начинали добавлением pro-uPA. Концентрации гепсина и pro-uPA в реакционной смеси были 0,5 нМ и 100 нМ, соответственно. При 45-секундных интервалах аликвоты 50 мкл переносили в 96-луночный планшет, содержащий 150 мкл на лунку стоп-реагента HAI-2 (667 нМ). После добавления S2444 (0,5 мМ) линейные скорости увеличения оптической плотности при 405 нм измеряли на кинетическом микропланшет-ридере. Данные выражали в виде дробной активности фермента (ν/ν) и подгоняли к программе подгонки четырех параметрических регрессионных кривых (Kaleidagraph) для определения величин IC.
Для анализов активации Фактора VII гепсин инкубировали с Fab25 или контрольным Fab в течение 5 минут в Hepes-буфере перед добавлением фактора VII. Концентрации в этой реакционной смеси были: 50 нМ гепсин, 500 нМ Fab и 8 мкМ фактор VII. После 0,5 ч и 2 ч инкубации при 37°C, брали аликвоты и анализировали электрофорезом в ПААГ/ДСН (4-20% градиентный гель, InVitrogen) при восстанавливающих условиях. Гели окрашивали SimplyBlue™ (InVitrogen).
In vitro протеолитический процессинг Fab25 гепсином:
Fab25 (3 мкМ) инкубировали с 10 нМ гепсином в течение 24 часов при комнатной температуре либо в буфере с низким рН (100 мМ Mes pH 6,0, 150 мМ NaCl), либо в буфере с высоким рН (50 мМ Трис-HCl pH 8,0, 150 мМ NaCl). Реакцию останавливали добавлением 20 мкл 2X-буфера для образцов (с β-меркаптоэтанолом/без β-меркаптоэтанола) и кипятили при 95°C в течение 5 минут. Протеолиз подвергали мониторингу по смещению мобильности в геле на 4-20% (масс/об) полиакриламидном градиентном геле, окрашенном Кумасси бриллиантовым синим.
Анализ миграции клеток:
2
Анализы миграции клеток выполняли, как описано ранее (Tripathi et al., 2008), с использованием 24-луночных, имеющих размер пор 8,0 мкм проницаемых подложек FluoroBlok™ (BD Biosciences, Bedford, MA). Нижнюю сторону фильтров покрывали либо необработанным, либо обработанным ламинином крысы (1 мкг/мл). Ламинин коинкубировали с гепсином или комплексом гепсин-Fab25 или забуференным фосфатом солевым раствором (PBS) в течение ночи при 4°С. Затем вкладыши блокировали superblock-буфером в течение 1 часа. Клетки рака предстательной железы человека DU145 трипсинизировали, ресуспендировали в бессывороточной среде, промывали дважды бессывороточной средой и клетки (20000) высевали в верхнюю камеру вкладышей. После 5-часовой инкубации в 5% СО и при 37°С клетки, остающиеся на верхнем фильтре, осторожно соскребали с использованием ватного тампона на стержне и эти вкладыши осторожно промывали PBS. Клетки, которые мигрировали в нижнюю камеру, фиксировали 500 мкл Метанола в течение 30 минут, сушили на воздухе в течение 20 минут и окрашивали 500 мкл 10 мкМ YO-PRO-I (Invitrogen, Carlsbad, CA) в течение 10 минут. Этот планшет промывали PBS и флуоресценцию измеряли в планшет-ридере (Spectramax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) с использованием длины волны возбуждения 485 нм и длины волны испускания 555 нм. Затем планшеты визуализировали с использованием инвертированного микроскопа (IX81, Olympus), соединенного с CCD-камерой с объективом 10х.
Связывание Fab5 с гепсином:
Систему Octet-RED со стрептавидиновыми SBC-биосенсорными кончиками приобретали из ForteBio (Menlo Park, CA). Перед началом этого эксперимента сенсорные кончики предварительно увлажняли в течение 15 минут при 25°C в буфере, содержащем 50 мМ Hepes pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,05% Твин-20. Биотинилированный гепсин (7,5 мкг/мл) улавливали на этом стрептавидиновом сенсоре в течение 5 минут с перемешиванием при 1000 об/мин. Эти сенсоры кратковременно промывали в буфере перед погружением их в лунки с образцами, содержащими Fab25 (2-кратное серийное разведение, начинающееся с 200 нМ) и буферный контроль. Ассоциацию подвергали мониторингу в течение 10 минут и диссоциация происходила в течение 30 минут. Эти данные подгоняли к модели связывания 1:1 с использованием программы анализа Octet-RED.
Pro-MSP-активация экспрессируемого клеточной поверхностью гепсина в клетке LnCap:
125
Клетки LnCaP-34 получали, как описано (Moran et al., 2006), для стабильной сверхэкспрессии гепсина, приводящей к 5-кратно увеличенной экспрессии гепсина клеточной поверхностью и 3-кратно увеличенной ферментативной активности гепсина в сравнении с клетками LnCaP-17, которые экспрессируют только эндогенный гепсин при относительно низких уровнях, в сравнении с родительскими клетками LnCaP. Сливающиеся клетки LnCaP-17 и LnCap-34, культивируемые в 24-луночных планшетах, промывали бессывороточной средой RPMI-1640 и инкубировали либо отдельно, либо с разными анти-гепсин-ингибиторами (1 мкМ антитело против гепсина Fab25/1 мкМ KD1/1 мкМ Ac-KQLR-cmk ("KQLR", представленный SEQ ID NO:12)) в бессывороточной среде RPMI-1640 в течение 15 минут при 37°С перед добавлением I-меченого pro-MSP (25 мкг/мл). После инкубирования в течение 3 часов брали аликвоты и анализировали электрофорезом в ПААГ/ДСН (4-20% градиентный гель) (Invitrogen, Carlsbad, CA) с последующим экспонированием на рентгеновских пленках.
Pro-HGF-активация экспрессируемого клеточной поверхностью гепсина в клетке LnCap:
125
Конфлюентные клетки LnCap-34, культивируемые в 24-луночных планшетах, промывали бессывороточной средой RPMI-1640 и инкубировали либо отдельно, либо с рекомбинантным гепсином (10 нМ) или с разными концентрациями Fab25 (20 нМ - 0,15 нМ) в бессывороточной среде RPMI-1640 в течение 15 минут при 37°C перед добавлением I-меченого pro-HGF (25 мкг/мл). После инкубирования в течение 3 часов при 37°C брали аликвоты и анализировали электрофорезом в ПААГ/ДСН (4-20% градиентный гель) (Invitrogen, Carlsbad, CA) с последующим экспонированием на рентгеновских пленках.
Связывание Ab25 с гепсином посредством поверхностного плазмонного резонанса:
a
d
D
d
a
max
eq
D
Измерения поверхностного плазмонного резонанса выполняли на приборе BIAcore™-3000 (GE Health Care, NJ) для определения аффинности связывания Ab25. Антитела кролика против IgG человека химически иммобилизовали (аминосочетанием) на биосенсорных чипах CM5 и Ab25 улавливали с получением приблизительно 350 единиц ответа (реакции) (RU). Для измерений кинетики, двухкратные серийные разведения активного гепсина (1 нМ - 500 нМ) инъецировали в буфере HBS-P при 25°C со скоростью потока 30 мкл/мин. Скорости ассоциации (k) и скорости диссоциации (k) получали с использованием простой один-к-одному (1:1) модели связывания Лангмуира (BIA-оценивание), и константы диссоциации для равновесия (K) рассчитывали (k/k). Вследствие быстрой кинетики, измерение стационарного состояния использовали для определения аффинности про-гепсина с Ab25. Двухкратное серийное разведение про-гепсина (195 нМ - 100 мМ) инъецировали на сенсорный чип захваченного антитела (Ab25) для достижения максимального связывания (R) и для достижения равновесия стационарного состояния. Величины R рассчитывали и строили в виде графика индивидуально в зависимости от С (концентрации прогепсина) с использованием BIA-оценивания для определения K.
Изотермальная титрационная калориметрия:
200
А
TC-эксперименты выполняли на приборе ITC (GE healthcare). Fab25 и гепсин очищали раздельно на гель-фильтрационной хроматографической колонке (Superdex S200, GE healthcare), с использованием буфера, содержащего 50 мМ HEPES pH 7,5 и 150 мМ NaCl. Ячейку образца (204 мкл) загружали гепсином (14 мкМ), и концентрация Fab25 в этом шприце была 138 мкМ. Титрационный эксперимент обычно состоит из 20 инъекций, каждая с объемом 2 мкл и продолжительностью 180 секунд, с 3-минутным интервалом между добавлениями. Скорость перемешивания была равна 1000 об/мин. Необработанные данные интегрировали, корректировали на неспецифические теплоты, нормализовали в отношении концентрации и анализировали согласно модели связывания 1:1, предполагающей единственный набор идентичных сайтов связывания. (Эту изотермальную титрационную кривую регистрировали и анализировали с использованием программы ORIGIN, обеспечиваемой с прибором ITC.) Данные интегрировали для получения титрационной кривой; и, с использованием нелинейной подгонки методом наименьших квадратов, константу связывания К, теплоту связывания (ΔН) и стехиометрию связывания извлекали из этой кривой.
Результаты/обсуждение
Для идентификации антител против гепсина, которые блокируют ферментативную активность гепсина, авторы использовали сортинг раствора в зависимости от биотинилированного гепсина без ингибитора (биопсин-гепсин) и против биотинилированного гепсина в комплексе с DCI (биотин-гепсин:DCI). DCI является по механизму действия ингибитором сериновых протеаз, который занимает карман S1 образованием ковалентных моноацил- или диацил-аддуктов с каталитическими Ser195 и His57 (нумерация химотрипсиногенов) (фиг. 9A) (Powers et al., 1989). Молекулярная модель комплекса гепсин:DCI, основанная на кристаллической структуре комплекса factor-D:DCI (PDB код 1DIC) (Cole et al., 1998), показала, что ароматическое кольцо ингибитора DCI может занимать карман S1. Прежние открытия авторов изобретения (Wu et al., 2007) показали, что блокирующие функцию анти-HGFA-антитела, полученные из Fab-фаговых библиотек авторов не занимают карман S1. Таким образом, гепсин-связанный DCI может не препятствовать связыванию антитела, но может проявлять благоприятные влияния на конформацию активного центра, благоприятствуя взаимодействиям с антителом. Активный центр трипсин-подобных сериновых протеаз образован несколькими внутренне-мобильными петлями ('доменом активации') (Huber and Bode, 1978). В частности, 220 петель образуют часть кармана S1 и могут принимать различные конформационные состояния в некоторых сериновых протеазах (Johnson et al., 2005; Shia et al., 2005; Spraggon et al., 2009; Wilken et al., 2004). Только апо-структуры обнаруживали такие необычные конформации петель, тогда как структуры ко-кристаллов с ингибитором активного центра обнаруживали активные центры, наиболее вероятно, вследствие стабилизирующих сил, прилагаемых этим ингибитором (Ami et al., 1994; Shia et al., 2005; Spraggon et al., 2009). Апо-структура гепсина неизвестна, и все опубликованные структуры гепсина являются структурами ко-кристалла с ингибитором активного центра (Herter et al., 2005; Somoza et al., 2003). Таким образом, авторы аргументировали, что занятие кармана S1 DCI может прилагать стабилизирующие силы в отношении гибкости потенциальных петель, благоприятствуя распознаванию антитела. Ферментативные анализы показали, что концентрации DCI более 20 мкМ приводили к полному ингибированию гепсина после 40-минутного периода инкубирования (фиг. 9). Таким образом, эксперименты по сортингу фагов против комплекса биотинилированный гепсин:DCI проводили в присутствии 100 мкМ DCI.
Одну минимальную синтетическую библиотеку антител с ограниченным химическим разнообразием в определяющих комплементарность областях (CDR), названную YSGX-библиотекой (Fellhouse et al, 2007), использовали для поиска на ингибирующее антитело против гепсина посредством сортинга растворов, в которых комплекс биотин-гепсин или биотин-гепсин:DCI инкубировали с представленной фагом Fab-библиотекой. Пэннинг против комплекса биотин-гепсин:DCI приводил к одному гепсин-связывающему клону, названному HpsFab25 (также называемому "Fab25"), который становился доминантным после 5 раундов селекции (отбора). HVR-последовательности Fab25 показаны на фигуре 1. CDR-H3 HpsFab25 является очень длинным (21 остаток) и HpsFab25 содержал три остатка лизина.
Эксперименты ELISA выполняли для тестирования, ингибируется ли связывание Fab25 KD1, ингибитором гепсина, который связывается с активным центром гепсина. Как показано на фигуре 10, KD1 ингибировал связывание Fab25-фага с гепсином зависимым от концентрации образом, что позволяет предположить, что Fab25 связывался с областью активного центра или вблизи от него, и, следовательно, может препятствовать активности фермента.
i
i
app
app
Способность Fab25 ингибировать активность гепсина человека и мыши тестировали с использованием синтетического субстрата гепсина, S2765. Как показано на фигуре 11, Fab25 ингибировал активность гепсина человека и мыши зависимым от концентрации образом, достигая полного ингибирования при наивысших испытанных концентрациях. Рассчитанная K  была равна 4,1±1,0 нМ (n=3) для гепсина человека и 329±51 нМ (n=3) для гепсина мыши. Дополнительные эксперименты с IgG25 показали, что он ингибирует гепсин с К 11,3±1,7 нМ (n=3), контрольный IgG не имел действия (данные не показаны). Эти результаты показали, что Fab25 ингибировал гепсин человека приблизительно в 80 раз более сильно, чем гепсин мыши. Это предполагает, что сайт связывания антител не является полностью консервативным в гепсине мыши. Поскольку домен протеазы гепсина мыши не имеет ни инсерций, ни делеций в сравнении с гепсином человека, уменьшенная эффективность Fab25 была, вероятно, обусловлена изменениями в аминокислотах, которые являются важными для взаимодействия с Fab25.
D
Активность связывания Fab25 с гепсином человека определяли при помощи анализа Octet RED. K была равна 2,55 +/- 0,45 нМ.
i
app
Специфичность Fab25 испытывали запросом, ингибировал ли он ферментативную активность панели трипсин-подобных сериновых протеаз. Панель трипсин-подобных протеаз включала некоторые ближайшие гомологи домена протеазы гепсина, такие как калликреин плазмы, простатин, марапсин и плазмин. Результаты (фигура 12) продемонстрировали, что Fab25 имел исключительную специфичность в отношении гепсина, так как он не влиял на ферментативную активность испытанных сериновых протеаз при концентраци, которая была в 250 более высокой, чем определенная величина K  для гепсина.
50
Определяли действие Fab25 на гепсин-опосредованный процессинг pro-uPA и Фактора VIII. Как показано на фигуре 13А, Fab25 ингибировал активность гепсина в отношении pro-uPA с величиной IC 3,3±0,4 нМ (n=3), которая была сравнима с его эффективностью в pNA-анализе (таблица 1). При концентрациях Fab более 100 нМ это ингибирование было полным и сравнимым с сильным ингибированием в анализе активации фактора VII (фигура 13В). Фактор VII является относительно слабым субстратом для гепсина, требующим высоких концентраций гепсина в этом анализе (50 нМ). Таким образом, даже хотя использовали Fab25 при 500 нМ, это приводило к относительно низкому отношению Fab25:гепсин (10:1) в сравнении с экспериментами активации pro-uPA (отношения до 600:1), которое может объяснить, что ингибирование во время продолжительного 2-часового эксперимента не было полным.
Гепсин преимущественно расщепляет субстраты после P1 Arg (Herter et al., 2005), но также распознает субстраты с P1 Lys (Moran et al., 2006). Таким образом, авторы рассматривали возможность, что гепсин может расщеплять петлю CDR-H3 Fab, которая содержала три остатка Lys и была необычно длинной. Прецедент известен из недавних исследований на анти-матриптаза-антителе Е2, которое подвергали расщеплению матриптазой после Р1-Arg остатка в длинной петле CDR-H3 (Farady et al., 2008). Таким образом, Fab25 подвергали воздействию гепсином в течение пролонгированных периодов времени при разных рН-условиях. Fab25 мигрировал в виде полосы 50 кДа при невосстанавливающих условиях и в виде полосы 25 кДа при восстанавливающих условиях, и не удалось идентифицировать продукты деградации низкой молекулярной массы (фигура 14). Таким образом, Fab25 был устойчивым к протеолизу гепсином при экспонировании гепсину в течение прологированных периодах времени. Этот вывод согласуется с предположением авторов изобретения, что комплекс биотин-гепсин:DCI способствовал селекции представленного фагом Fab, который связывается вне кармана S1.
Недавно было установлено, что ламинин является субстратом для гепсина (Tripathi et al). Это исследование также предположило, что расщепление ламинина гепсином может физиологически усиливать миграцию линии клеток DU145 рака предстательной железы. Авторы испытывали, ингибировал ли Fab25 ламинин-зависимую миграцию клеток DU145. Результаты этого эксперимента (фигура 15) продемонстрировали, что Fab25 эффективно нейтрализовал протеолитическую активность гепсина и, следовательно, блокировал процессинг его субстрата ламинина.
Авторы также использовали способность Fab25 ингибировать активность гепсина против панели синтетических субстратов. Результаты, показанные в таблице 1, демонстрировали, что Fab25 ингибировал гепсин-опосредуемое расщепление всех pNA-субстратов на >90%. Поскольку эти pNA-субстраты занимают S1-S3-субсайты на гепсине, можно сделать вывод, что это антитело в сильной степени препятствует взаимодействиям с субстратом в этих субсайтах. Открытие, что, несмотря на химическое разнообразие Р2 и Р3-положений субстратов pNA, ингибирование было равно >90% для всех субстратов, доказывает сильное действие антитела в сайтах S2 и/или S3, а не едва различимые влияния в этих сайтах. Остается выяснить, являются или не являются эти эффекты аллостерическими по характеру или управляют стерическими препятствиями. Кроме того, поскольку Fab25 был отобран против DCI-ингибированного гепсина, нет вероятности того, что Fab может ингибировать гепсин занятием кармана S1.
Таблица 1. Ингибирование посредством Fab25 активности гепсина в отношении панели синтетических субстратов. Гепсин инкубировали с 100 нМ Fab25 или контрольного Fab в течение 40 минут перед добавлением 8 различных pNA-субстратов. Начальные линейные скорости измеряли на кинетическом микропланшет-ридере и активность фермента выражали в виде процента активности гепсина без присутствия Fab.
<b>Таблица 1</b>
Субстрат
Fab25<sup>a</sup>(% от контроля)<sup>b</sup>
Контрольный Fab<sup>a</sup>(% от контроля)<sup>b</sup>
S2765
2,2±0,7
100,4±2,3
S2266
3,0±1,3
97,3±3,9
S2288
2,5±0,8
98,5±1,9
S2366
3,4±0,5
99,9±2,7
S2444
1,7±0,9
99,5±1,8
Хромозим TH
8,4±1,2
99,0±4,6
Спектрозим FIXa
-1,6±2,1
112,1±8,5
Спектрозим FVIIa
3,4±0,8
101,8±4,8
<sup>а</sup> 100 нМ Fab в реакционной смеси
<sup>b</sup> контролем был гепсин, с ферментативной активностью без Fab
Было показано, что Fab25 стойко ингибирует активность гепсина на >90% во всех функциональных анализах, использующих синтетические и макромолекулярные субстраты.
125
Протеолитический процессинг pro-MSP нативно экспрессируемым гепсином на клеточной поверхности подвергали мониторингу на клеточной линии LnCap-34 (Moran et al., 2006). Клетки LnCap-34, экспрессирующие гепсин, способны к процессингу I-pro-MSP (фиг. 16). Протеолитическая активность процессинга pro-MSP была в основном обусловлена гепсином, так как все три ингибитора гепсина (Ac-KQLR-хлорметилкетон ("KQLR", представленный SEQ ID NO:12), KD1 и Fab25), эффективно блокировали протеолитическое расщепление.
Частичный перечень ссылок
Ami, R.K., K. Padmanabhan, K.P. Padmanabhan, T.P. Wu, and A. Tulinsky. 1994. Structure of the non-covalent complex of prothrombin kringle 2 with PPACK-thrombin. Chem Phys Lipids. 67-68:59-66.
Cole, L.B., J.M. Kilpatrick, N. Chu, and Y.S. Babu. 1998. Structure of 3,4-dichloroisocoumarin-inhibited factor D. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 54:711-7.
Farady, C.J., P.F. Egea, E.L. Schneider, M.R. Darragh, and C.S. Craik. 2008. Structure of an Fab-protease complex reveals a highly specific non-canonical mechanism of inhibition. J Mol Biol. 380:351-60.
Fellouse, F.A., K. Esaki, S. Birtalan, D. Raptis, V.J. Cancasci, A. Koide, P. Jhurani, M. Vasser, C. Wiesmann, A.A. Kossiakoff, S. Koide, and S.S. Sidhu. 2007. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J Mol Biol. 373:924-40.
Ganesan, R., C. Eigenbrot, Y. Wu, W.C. Liang, S. Shia, M.T. Lipari, and D. Kirchhofer, 2009. Unravelling the allosteric mechanism of serine protease inhibition by an antibody. Structure, submitted.
Herter, S., D.E. Piper, W. Aaron, T. Gabriele, G. Cutler, P. Cao, A.S. Bhatt, Y. Choe, C.S. Craik, N. Walker, D. Meininger, T. Hoey, and R.J. Austin. 2005. Hepatocyte growth factor is a preferred in vitro substrate for human hepsin, a membrane-anchored serine protease implicated in prostate and ovarian cancers. Biochem J. 390: 125-36.
Huber, R., and W. Bode. 1978. Structural basis of the activation and action of trypsin. Acc. Chem. Res. 11: 114-122.
Johnson, D.J., T.E. Adams, W. Li, and J. A. Huntington. 2005. Crystal structure of wild-type human thrombin in the Na+-free state. Biochem J. 392:21-8.
Kirchhofer, D., M. Peek, W. Li, J. Stamos, C. Eigenbrot, S. Kadkhodayan, J.M. Elliott, R.T. Corpuz, R.A. Lazarus, and P. Moran. 2003. Tissue expression, protease specificity, and Kunitz domain functions of hepatocyte growth factor activator inhibitor-1B (HAI-1B), a new splice variant of HAI-1. J Biol Chem. 278:36341-9.
Kirchhofer, D., M. Peek, M.T. Lipari, K. Billeci, B. Fan, and P. Moran. 2005. Hepsin activates pro-hepatocyte growth factor and is inhibited by hepatocyte growth factor activator inhibitor-1B (HAI-1B) and HAI-2. FEBS Lett. 579:1945-50.
Li, W., D.M. Danilenko, S. Bunting, R. Ganesan, S. Sa, R. Ferrando, T.D. Wu, G.A. Kolumam, W. Ouyang, and D. Kirchhofer. 2009. The Serine Protease Marapsin Is Expressed in Stratified Squamous Epithelia and Is Up-regulated in the Hyperproliferative Epidermis of Psoriasis and Regenerating Wounds. J Biol Chem. 284:218-28.
Moran, P., W. Li, B. Fan, R. Vij, C. Eigenbrot, and D. Kirchhofer. 2006. Pro-urokinase-type plasminogen activator is a substrate for hepsin. J Biol Chem. 281:30439-46.
Morrison, J.F. 1969. Kinetics of the reversible inhibition of enzyme-catalysed reactions by tight-binding inhibitors. Biochim Biophys Acta. 185:269-86.
Olivero, A.G., C. Eigenbrot, R. Goldsmith, K. Robarge, D.R. Artis, J. Flygare, T. Rawson, D.P. Sutherlin, S. Kadkhodayan, M. Beresini, L.O. Elliott, G.G. DeGuzman, D.W. Banner, M. Ultsch, U. Marzec, S.R. Hanson, C. Refino, S. Bunting, and D. Kirchhofer. 2005. A selective, slow binding inhibitor of factor VIIa binds to a nonstandard active site conformation and attenuates thrombus formation in vivo. J Biol Chem. 280:9160-9.
Peek, M., P. Moran, N. Mendoza, D. Wickramasinghe, and D. Kirchhofer. 2002. Unusual proteolytic activation of pro-hepatocyte growth factor by plasma kallikrein and coagulation factor XIa. J Biol Chem. 277:47804-9.
Powers, J.C., C.M. Kam, L. Narasimhan, J. Oleksyszyn, M.A. Hernandez, and T. Ueda. 1989. Mechanism-based isocoumarin inhibitors for serine proteases: use of active site structure and substrate specificity in inhibitor design. J Cell Biochem. 39:33-46.
Shia, S., J. Stamos, D. Kirchhofer, B. Fan, J. Wu, R.T. Corpuz, L. Santell, R.A. Lazarus, and C. Eigenbrot. 2005. Conformational lability in serine protease active sites: structures of hepatocyte growth factor activator (HGFA) alone and with the inhibitory domain from HGFA inhibitor-1B. J Mol Biol. 346:1335-49.
Sidhu, S.S., H.B. Lowman, B.C. Cunningham, and J.A. Wells. 2000. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328:333-63.
Somoza, J.R., J.D. Ho, C. Luong, M. Ghate, P. A. Sprengeler, K. Mortara, W.D. Shrader, D. Sperandio, H. Chan, M.E. McGrath, and B.A. Katz. 2003. The structure of the extracellular region of human hepsin reveals a serine protease domain and a novel scavenger receptor cysteine-rich (SRCR) domain. Structure. 11: 1123-31.
Spraggon, G., M. Hornsby, A. Shipway, D.C. Tully, B. Bursulaya, H. Danahay, J.L. Harris, and S.A. Lesley. 2009. Active site conformational changes of prostasin provide a new mechanism of protease regulation by divalent cations. Protein Sci. 18:1081-94.
Tripathi, M., S. Nandana, H. Yamashita, R. Ganesan, D. Kirchhofer, and V. Quaranta. 2008. Laminin-332 is a substrate for hepsin, a protease associated with prostate cancer progression. J Biol Chem.
Wilken, C., K. Kitzing, R. Kurzbauer, M. Ehrmann, and T. Clausen. 2004. Crystal structure of the DegS stress sensor: How a PDZ domain recognizes misfolded protein and activates a protease. Cell. 117:483-94.
Wu, Y., C. Eigenbrot, W.C. Liang, S. Stawicki, S. Shia, B. Fan, R. Ganesan, M.T. Lipari, and D. Kirchhofer. 2007. Structural insight into distinct mechanisms of protease inhibition by antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A. 104:19784-9.
Xuan, J. A., D. Schneider, P. Toy, R. Lin, A. Newton, Y. Zhu, S. Finster, D. Vogel, B. Mintzer, H. Dinter, D. Light, R. Parry, M. Polokoff, M. Whitlow, Q. Wu, and G.Parry. 2006. Antibodies neutralizing hepsin protease activity do not impact cell growth but inhibit invasion of prostate and ovarian tumor cells in culture. Cancer Res. 66:3611-9.
Хотя вышеупомянутое изобретение было описано в некоторых деталях посредством иллюстрации и примера для целей ясности понимания, эти описания и примеры не должны пониматься как ограничивающие объем настоящего изобретения.