ЛЕЧЕНИЕ ПАЦИЕНТОВ С ТЯЖЕЛОЙ ФОРМОЙ БОЛЕЗНИ ФОН ВИЛЛЕБРАНДА, ПОДВЕРГАЮЩИХСЯ ПЛАНОВОМУ ХИРУРГИЧЕСКОМУ ВМЕШАТЕЛЬСТВУ, ПУТЕМ ВВЕДЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ФФВ
TREATMENT OF PATIENTS WITH SEVERE VON WILLEBRAND DISEASE UNDERGOING PLANNED SURGICAL INTERVENTION BY ADMINISTRATION OF RECOMBINANT VWF

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/546999, поданной 17 августа 2017 г., и предварительной заявке на патент США № 62/530024, поданной 7 июля 2017 г., которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Заболевания коагуляции крови, такие как болезнь фон Виллебранда (БфВ), как правило, являются результатом дефицита факторов в каскаде реакций коагуляции крови. Болезнь фон Виллебранда (БфВ) относится к группе заболеваний, вызванных дефицитом фактора фон Виллебранда. Фактор фон Виллебранда помогает тромбоцитам слипаться и прилипать к стенке кровеносного сосуда, что необходимо для нормального свертывания крови.
[0003] Болезнь фон Виллебранда (БфВ) - наиболее распространенное наследственное заболевание, связанное с кровотечением, с предполагаемым уровнем распространенности 1% (Veyradier A, et al., Medicine (Baltimore). 2016, 95(11):e3038). Однако, за исключением легких форм заболевания, только около 1/10,000 пациентов действительно нуждаются в лечении. Современное лечение этих коагулопатий включает заместительную терапию с использованием фармацевтических препаратов, содержащих нормальный фактор свертывания крови.
[0004] ФфВ представляет собой гликопротеин, циркулирующий в плазме в виде серии мультимеров размером около от 500 до 20,000 кДа. Полноразмерная кДНК ФфВ была клонирована; про-полипептид соответствует аминокислотным остаткам с 23 по 764 полноразмерного препро-ФфВ (Eikenboom et al. (1995) Haemophilia 1, 77 90). Мультимерные формы ФфВ состоят из полипептидных субъединиц 250 кДа, связанных вместе дисульфидными связями. ФфВ обеспечивает первоначальную адгезию тромбоцитов к субэндотелию поврежденной стенки сосуда, причем более крупные мультимеры проявляют повышенную гемостатическую активность. Мультимеризованный ФфВ связывается с гликопротеином Gp1bα на поверхности тромбоцитов посредством взаимодействия в домене A1 ФфВ, способствуя адгезии тромбоцитов. Другие сайты ФфВ опосредуют связывание со стенкой кровеносного сосуда. Таким образом, ФфВ образует мостик между тромбоцитом и стенкой сосуда, который необходим для адгезии тромбоцитов и первичного гемостаза в условиях высокого напряжения сдвига. Обычно эндотелиальные клетки секретируют крупные полимерные формы ФфВ, а те формы ФфВ, которые имеют более низкую молекулярную массу, возникают в результате протеолитического расщепления. Мультимеры исключительно больших молекулярных масс хранятся в теле Вейбеля-Паллада эндотелиальных клеток и высвобождаются при стимуляции агонистами, такими как тромбин и гистамин.
[0005] Для пациентов с БфВ рекомендуется их лечение с заменой фактора фон Виллебранда (ФфВ), учитывая необходимость длительного гемостаза, особенно при обширном хирургическом вмешательстве (Mannucci PM and Franchini M., Haemophilia, 2017, 23(2):182-187; National Institutes of Health. National Heart, Lung, and Blood Institute. The Diagnosis, Evaluation, and Management of von Willebrand Disease NIH Publication No. 08-5832; December, 2007). Плазмотерапия ФфВ содержит фактор VIII (FVIII) и обладает потенциалом для накопления ФVIII при повторном дозировании. VONVENDI (фактор фон Виллебранда [рекомбинантный], Shire, Westlake Village, CA) является первым и единственным концентратом рекомбинантного ФфВ (ФфВ) (Turecek PL, et al. Hamostaseologie. 2009;29 (suppl 1):S32-38; Mannucci PM, et al. Blood, 2013;122(5):648-657; Gill JC, et al. Blood, 2015;126(17):2038-2046).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
например
[0006] В данном изобретении предложены способы предварительного лечения пациента с тяжелой формой болезни фон Виллебранда перед хирургическим вмешательством путем введения пациенту 20-60 МЕ/кг рекомбинантного Фактора фон Виллебранда (рФфВ) в период от 12 часов до 24 часов,  12 часов, 13 часов, 14 часов, 15 часов, 16 часов, 17 часов, 18 часов, 19 часов, 20 часов, 21 час, 22 часа, 23 часа, 24 часа, от 12 часов до 24 часов, от 14 часов до 24 часов, от 16 до 24 часов, от 18 часов до 24 часов, или от 20 часов до 24 часов до хирургического вмешательства, и без введения Фактора VIII (ФVIII) с рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения способ предварительного лечения дополнительно включает введение субъекту 5-90 МЕ/кг рФфВ за 1 час до операции. В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 70-200 МЕ/кг рФфВ после операции, с или без предварительного лечения, описанного выше. В некоторых случаях хирургическое вмешательство выбирается из группы, состоящей из обширного хирургического вмешательства, малого хирургического вмешательства или челюстно-лицевого хирургического вмешательства.
[0007] В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 35-60 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до обширного хирургического вмешательства. В других вариантах реализации изобретения субъекту вводят 15-90 МЕ/кг рФфВ за 1 час до обширного хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 150-220 МЕ/кг рФфВ после обширного хирургического вмешательства. В некоторых случаях субъекту, подвергающемуся обширному хирургическому вмешательству, вводят суммарную дозу 220-320 МЕ/кг. В некоторых случаях, когда хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства. Выражение «приблизительно равные», как используется в данном документе, относится к дозам, которые имеют концентрации в пределах 1-15%, 2-14%, 3-13%, 4-12%, 5-11%, 6-10%, 7-9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17% 18%, 19%, 20% друг от друга.
[0008] В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 50-60 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до малого хирургического вмешательства. В других вариантах реализации изобретения субъекту вводят 5-50 МЕ/кг рФфВ за 1 час до малого хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 70-150 МЕ/кг рФфВ после малого хирургического вмешательства. В некоторых случаях субъекту, подвергающемуся малому хирургическому вмешательству, вводят суммарную дозу 100-220 МЕ/кг. В некоторых случаях, когда хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух доз рФфВ до хирургического вмешательства, причем первая доза больше, чем вторая доза.
[0009] В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 20-40 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В других вариантах реализации изобретения субъекту вводят 20-50 МЕ/кг рФфВ за 1 час до челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 10-50 МЕ/кг рФфВ во время челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 70-150 МЕ/кг рФфВ после челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В некоторых случаях субъекту, подвергающемуся челюстно-лицевого хирургического вмешательства, вводят суммарную дозу 70-190 МЕ/кг. В некоторых случаях, когда хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства.
[0010] Другие объекты, преимущества и варианты реализации изобретения будут очевидны из подробного описания, представленного ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0011] На Фиг. 1 изображена общая гемостатическая эффективность (основной критерий оценки) у пациентов исследования.
[0012] На Фиг. 2 изображена интраоперационная гемостатическая эффективность (второстепенный критерий оценки) у пациентов исследования.
[0013] На Фиг. 3 представлены исходные персональные данные пациентов и клинические характеристики.
[0014] На Фиг. 4 представлены параметры ФK для ФфВ:РКо (VWF:RCo) (n=11)
[0015] На Фиг. 5А и Фиг. 5B изображены средние Уровни ФфВ:РКо и Эндогенного ФVIII:К (FVIII:C) в Ответ на рФфВ 50±5 МЕ рФфВ:РКо/кг у всех пациентов с БфВ С анализом данных ФK (n=11) (Фиг. 5А), и у подгруппы пациентов с БфВ типа 3 (n=5) (Фиг. 5B).
[0016] На Фиг. 6 представлены последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот ФфВ.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вступление
[0017] В данном изобретении предлагаются способы предварительного лечения пациента с тяжелой формой болезни фон Виллебранда перед хирургическим вмешательством путем введения пациенту 45-60 МЕ/кг рекомбинантного Фактора фон Виллебранда (рФфВ) без введения Фактора VIII с рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых случаях хирургическое вмешательство выбирается из группы, состоящей из обширного хирургического вмешательства, малого хирургического вмешательства или челюстно-лицевого хирургического вмешательства.
[0018] Раскрытие публикации заявки PCT № WO2012/171031 включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.
Определения
[0019] Используемые в контексте данного документа и в прилагаемой формуле изобретения существительные в единственном числе включают соответствующие существительные во множественном числе, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на «антитело» включает в себя множество таких антител, а ссылка на «клетку-хозяина» включает ссылку на одну или более клеток-хозяев и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и так далее. Кроме того, следует отметить, что формула изобретения может быть составлена таким образом, чтобы исключать любой необязательный элемент. Как таковое, это утверждение предназначено для того, чтобы служить предшествующей основой для использования такой исключающей терминологии, как «лишь», «только» и т.п., в связи с перечислением элементов формулы изобретения или использованием «отрицательного» ограничения.
[0020] Прежде чем изобретение будет дополнительно описано, следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретными описанными вариантами реализации изобретения, поскольку они, конечно, могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в данном документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов реализации изобретения и не предназначена для ограничения, поскольку объем данного изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
[0021] Термин «пре-пропептид ФфВ», «препро-ФфВ» или «про-ФфВ» относится к незрелому полипептиду ФфВ, содержащему сигнальный пептид из около 22 аминокислотных остатков, пропептиду ФфВ из около 741 аминокислотных остатков, и зрелой субъединице ффВ содержащей около 2050 аминокислотных остатков. Субъединицы про-ФфВ могут димеризоваться через дисульфидные связи вблизи их карбоксильных концов в эндоплазматической сети с образованием хвостовых димеров, которые затем транспортируются в комплекс Гольджи. В комплексе Гольджи дополнительные дисульфидные связи «голова к голове» образуются вблизи аминоконцов субъединиц, образуя тем самым мультимеры. Протеолитическое расщепление пропептида ФфВ происходит посредством процессинга протеазы фурина, в результате чего образуется зрелый комплекс ФфВ/ФфВ-ПП (VWF/VWF-PP). Когда «р» включена в начале обозначения ФфВ, это относится к рекомбинантной версии. В некоторых вариантах реализации изобретения способы, описанные в данном документе, применяются к рекомбинантному ФфВ (рФфВ).
[0022] Термин «комплекс ФфВ» или «комплекс зр-ФфВ/ФфВ-ПП» относится к нековалентно связанной гетеродимерной структуре, содержащей зрелую субъединицу ФфВ и пропептид ФфВ. Комплекс ФфВ может быть получен как продукт расщепления фурином между пропептидной частью и зрелой частью ФфВ пре-пропептидного ФфВ. Когда «р» включена в начале обозначения ФфВ, это относится к рекомбинантной версии. В некоторых вариантах реализации изобретения способы, описанные в данном документе, применяются к рекомбинантному ФфВ (рФфВ). Использованный в контексте данного документа, «рФфВ» относится к рекомбинантному ФфВ.
[0023] Использованный в контексте данного документа, «рФVIII» относится к рекомбинантному ФVIII.
например
[0024] Термин «рекомбинантный» при использовании со ссылкой, , на клетку или нуклеиновую кислоту, белок или вектор, указывает, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор были модифицированы путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или путем изменения природной нуклеиновой кислоты или белка, или то, что клетка получена из клетки, модифицированной таким образом. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не обнаружены в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, или экспрессируют нативные гены, которые иначе ненормально экспрессируются, недостаточно экспрессируются или вообще не экспрессируются.
[0025] Используемый в контексте данного документа термин «рекомбинантный ФфВ» включает ФфВ, полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения белки ФфВ по данному изобретению могут содержать конструкцию, например, приготовленную, как описано в WO 1986/06096, опубликованной 23 октября 1986 г. и в заявке на патент США № 07/559509, поданной 23 июля 1990 г., на имя Ginsburg et al., которая включена в данный документ посредством ссылки в отношении способов получения рекомбинантного ФфВ. ФфВ в данном изобретении может включать все потенциальные формы, включая мономерные и мультимерные формы. Следует также понимать, что данное изобретение охватывает различные формы ФфВ для использования в комбинации. Например, ФфВ по данному изобретению может включать разные мультимеры, разные производные и как биологически активные производные, так и биологически не активные производные.
[0026] В контексте данного изобретения рекомбинантный ФфВ включает любого представителя семейства ФфВ, например, от млекопитающего, такого как примат, человек, обезьяна, кролик, свинья, грызун, мышь, крыса, хомяк, песчанка, собака, кошачьи и их биологически активные производные. Также включены обладающие активностью мутантные и вариантные белки ФфВ, а также функциональные фрагменты и слитые белки белков ФфВ. Кроме того, ФфВ по данному изобретению может дополнительно содержать метки, которые облегчают очистку, обнаружение или и то и другое. Описанный в данном документе ФфВ может быть дополнительно модифицирован терапевтическим фрагментом или фрагментом, подходящим для визуализации in vitro или in vivo.
например
[0027] Используемый в данном документе термин «полученный из плазмы ФфВ (ппФфВ)» включает все формы белка, обнаруженного в крови, включая зрелый ФфВ, полученный от млекопитающего, обладающий свойством in vivo-стабилизации, , связываться, по меньшей мере, с одной молекулой ФVIII.
[0028] Термин «высоко мультимерный ФфВ» или «высокомолекулярный ФфВ» относится к ФфВ, включающему, по меньшей мере, 10 субъединиц, или 12, 14 или 16 субъединиц, до около 20, 22, 24 или 26 субъединиц или более. Термин «субъединица» относится к мономеру ФфВ. Как известно в данной области техники, обычно димеры ФфВ полимеризуются с образованием мультимеров более крупного порядка (см. Turecek et al., Semin. Thromb. Hemost. 2010, 36(5): 510-521 которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, касающихся мультимерного анализа ФфВ).
например
[0029] Используемый в контексте данного документа термин «фактор VIII» или «ФVIII» относится к любой форме молекулы фактора VIII с типичными характеристиками фактора VIII свертывания крови, независимо от того, является ли она эндогенной для пациента, получена из плазмы крови или получена с использованием технологий рекомбинантной ДНК, включая все модифицированные формы фактора VIII. Фактор VIII (ФVIII) существует в природе и в терапевтических препаратах как гетерогенное распределение полипептидов, возникающих из одного генного продукта (см., , Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:2979-2983 (1986)). Коммерчески доступные примеры терапевтических препаратов, содержащих Фактор VIII, включают препараты, продаваемые под торговыми названиями HEMOFIL M, ADVATE и RECOMBINATE (доступны от Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Ill., U.S.A.).
[0030] В контексте данного документа, «активность ФVIII в плазме» и «активность ФVIII in vivo» используются взаимозаменяемо. Активность ФVIII in vivo, измеренная с использованием стандартных анализов, может представлять собой активность эндогенного ФVIII, активность терапевтически введенного ФVIII (рекомбинантного или полученного из плазмы) или активность как эндогенного, так и введенного ФVIII. Аналогично, «ФVIII плазмы» относится к эндогенному ФVIII или вводимому рекомбинантному или полученному из плазмы ФVIII.
[0031] Используемый в контексте данного документа термин «болезнь фон Виллебранда» относится к группе заболеваний, вызванных дефицитом фактора фон Виллебранда. Фактор фон Виллебранда помогает тромбоцитам слипаться и прилипать к стенке кровеносного сосуда, что необходимо для нормального свертывания крови. Как описано более подробно в данном документе, существует несколько типов болезни фон Виллебранда, включая тип 1, 2А, 2В, 2М и 3.
например
[0032] Термины «выделенный», «очищенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, который по существу или в основном не содержит компонентов, которые обычно сопутствуют ему, как обнаруживается в его естественном состоянии. Чистота и однородность обычно определяются с использованием способов аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или жидкостная хроматография высокого разрешения. ФфВ является по существу очищенным, преобладающим компонентом, присутствующим в приготовлении. Термин «очищенный» в некоторых вариантах реализации изобретения означает, что нуклеиновая кислота или белок дают в основном одну полосу в электрофоретическом геле. В других вариантах реализации изобретения это означает, что нуклеиновая кислота или белок имеет чистоту, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более. «Очистка» или «выделение» в других вариантах реализации изобретения означает удаление по меньшей мере одного загрязняющего компонента из композиции, подлежащей очистке. В этом смысле выделение не требует, чтобы очищенное соединение было гомогенным, , на 100% чистым.
например
например
например
[0033] Используемый в контексте данного документа термин «введение» (и все грамматические эквиваленты) включает внутривенное введение, внутримышечное введение, подкожное введение, пероральное введение, введение в виде суппозитория, местное применение, внутрибрюшинный, внутриочаговый или интраназальный способ введения или имплантацию устройства для медленного высвобождения препарата, , миниосмотического насоса, субъекту. Введение любым путем включает парентеральное и трансмукозальное введение (, пероральное, назальное, вагинальное, ректальное или трансдермальное). Парентеральное введение включает, , внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, внутрикожное, подкожное, внутрибрюшинное, интравентрикулярное и интракраниальное. Другие способы доставки включают, но не ограничиваются ими, использование липосомальных препаратов, внутривенных инфузий, трансдермальных пластырей и т.д.
например
[0034] Термины «терапевтически эффективное количество или доза» или «терапевтически достаточное количество или доза» или «эффективное или достаточное количество или доза» относятся к дозе, которая вызывает терапевтические эффекты, для которых она вводится. Например, терапевтически эффективное количество лекарственного средства, полезного для лечения гемофилии, может представлять собой количество, которое способно предотвратить или ослабить один или более симптомов, связанных с гемофилией. Точная доза будет зависеть от цели лечения и может быть установлена специалистом в данной области с использованием известных способов (см., , Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); и Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
[0035] Используемые в контексте данного документа термины «пациент» и «субъект» используются взаимозаменяемо и относятся к млекопитающему (предпочтительно человеку), которое имеет заболевание или может заболеть.
[0036] Используемый в контексте данного документа термин «около» обозначает приблизительный диапазон плюс или минус 10% от указанного значения. Например, выражение «около 20%» охватывает диапазон 18-22%.
[0037] Используемый в контексте данного документа термин «период полувыведения» относится к периоду времени, в течение которого количество вещества, подвергающегося распаду (или выведению из образца или у пациента), уменьшается вдвое.
Рекомбинантный фактор фон Виллебранда (рФфВ)
[0038] В данном изобретении используются композиции, содержащие фактор фон Виллебранда (рФфВ), для предварительного лечения субъекта с тяжелой БфВ, который подвергается хирургической процедуре, такой как, но не ограничиваясь этим, обширное хирургическое вмешательство, малое хирургическое вмешательство или стоматологическая операция.
[0039] В определенных вариантах реализации изобретения белки ФфВ по данному изобретению могут содержать конструкцию, например, приготовленную, как описано в WO 1986/06096, опубликованной 23 октября 1986 г. и в заявке на патент США № 07/559509, поданной 23 июля 1990 г., на имя Ginsburg et al., которая включена в данный документ посредством ссылки в отношении способов получения рекомбинантного ФфВ. ФфВ, полезный для данного изобретения, включает все потенциальные формы, включая мономерные и мультимерные формы. Одной из особенно полезных форм ФфВ являются гомомультимеры по меньшей мере двух ФфВ. Белки ФфВ могут представлять собой как биологически активные производные, так и иметь биологически не активную форму, в случае когда ФфВ может использоваться исключительно в качестве стабилизатора для ФVIII. Следует также понимать, что данное изобретение охватывает различные формы ФфВ для использования в комбинации. Например, композиция, полезная для данного изобретения, может включать разные мультимеры, разные производные и как биологически активные производные, так и биологически не активные производные.
[0040] При первичном гемостазе ФфВ служит мостиком между тромбоцитами и специфическими компонентами внеклеточного матрикса, такими как коллаген. Биологическая активность ФфВ в этом процессе может быть измерена с помощью различных анализов in vitro (Turecek et al., Semin. Thromb. Hemost. 28: 149-160, 2002). Анализ кофактора ристоцетина основан на агглютинации свежих или фиксированных формалином тромбоцитов, индуцированной антибиотиком ристоцетином в присутствии ФфВ.
например
[0041] Степень агглютинации тромбоцитов зависит от концентрации ФфВ и может быть измерена турбидиметрическим способом, , с использованием агрегометра (Weiss et al., J. Clin. Invest. 52: 2708-2716, 1973; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308, 1975). Второй способ представляет собой анализ связывания коллагена, основанный на способе твердофазного ИФА (Brown et Bosak, Thromb. Res. 43: 303-311, 1986; Favaloro, Thromb. Haemost. 83: 127-135, 2000). Микротитрационный планшет покрыт коллагеном типа I или III. Затем ФфВ связывается с поверхностью коллагена и впоследствии детектируется с помощью меченного ферментом поликлонального антитела. Последним этапом является реакция субстрата, которую можно фотометрически фиксировать с помощью считывающего устройства ИФА. В соответствии с данным документом, специфическая Ристоцетин-Кофакторная активность ФфВ (ФфВ:РКо (VWF:RCo)) по данному изобретению, как правило, описывается в единицах мЕд/мкг ФфВ, измеренных с использованием анализов in vitro.
[0042] Преимущество композиций рФфВ по данному изобретению перед ппФфВ состоит в том, что рФфВ проявляет более высокую специфическую активность, чем ппФфВ. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ по данному изобретению обладает специфической активностью, по меньшей мере, около 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 32,5, 35, 37,5, 40, 42,5, 45, 47,5, 50, 52,5, 55, 57,5, 60. , 62,5, 65, 67,5, 70, 72,5, 75, 77,5, 80, 82,5, 85, 87,5, 90, 92,5, 95, 97,5, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 или более мЕд/мкг.
[0043] РФфВ по данному изобретению является высоко мультимерным, включающим от около 10 до около 40 субъединиц. В дополнительных вариантах реализации изобретения мультимерный рФфВ, полученный с использованием способов согласно данному изобретению, содержит около 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 субъединиц. В дополнительных вариантах реализации изобретения рФфВ присутствует в мультимерах, различающихся по размеру от димеров до мультимеров из более чем 40 субъединиц (>10 миллионов Дальтон). Самые большие мультимеры обеспечивают множество сайтов связывания, которые могут взаимодействовать как с рецепторами тромбоцитов, так и с сайтами повреждения субэндотелиального матрикса, и являются наиболее гемостатически активной формой ФфВ. Применение ADAMTS13 будет расщеплять сверхбольшие мультимеры рФфВ с течением времени, но во время производства (обычно посредством экспрессии в культуре клеток) композиции рФфВ по данному изобретению обычно не подвергаются действию ADAMTS13 и сохраняют свою высоко мультимерную структуру.
[0044] В одном варианте реализации изобретения композиция рФфВ, используемая в описанных в данном документе способах, имеет распределение олигомеров рФфВ, характеризующееся тем, что 95% олигомеров имеют от 6 субъединиц до 20 субъединиц. В других вариантах реализации изобретения композиция рФфВ имеет распределение олигомеров rVWF, характеризующееся тем, что 95% олигомеров имеют диапазон субъединиц, выбранный из вариаций 458-641, приведенных в Таблице 2 WO 2012/171031, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.
например
например
[0045] В одном варианте реализации изобретения композицию рФфВ можно охарактеризовать в соответствии с процентным содержанием молекул рФфВ, которые присутствуют в конкретном мультимере рФфВ высшего порядка или мультимере большего размера. Например, в одном варианте реализации изобретения, по меньшей мере, 20% молекул рФфВ в композиции рФфВ, используемой в описанных в данном документе способах, присутствуют в олигомерном комплексе, состоящем по меньшей мере из 10 субъединиц. В другом варианте реализации изобретения, по меньшей мере, 20% молекул рФфВ в композиции рФфВ, используемой в описанных в данном документе способах, присутствуют в олигомерном комплексе, состоящем по меньшей мере из 12 субъединиц. Еще в других вариантах реализации изобретения композиция рФфВ, используемая в способах, представленных в данном документе, имеет минимальный процент (, имеет по меньшей мере X %) молекул рФфВ, присутствующих в конкретном мультимере рФфВ более высокого порядка или мультимере большего размера (, мультимере по меньшей мере из Y субъединиц) в соответствии с любым из вариаций 134-457, приведенных в Таблицах с 3 по 5, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.
[0046] В соответствии с вышеизложенным, композиция рФфВ, вводимая субъекту (с ФVIII или без него), обычно содержит значительный процент высокомолекулярных (ВМ) мультимеров рФфВ. В дополнительных вариантах реализации изобретения композиция ВМ мультимеров рФфВ содержит по меньшей мере 10-80% декамеров рФфВ или мультимеров высшего порядка. В дополнительных вариантах реализации изобретения композиция содержит около 10-95%, 20-90%, 30-85%, 40-80%, 50-75%, 60-70% декамеров или мультимеров высшего порядка. В дополнительных вариантах реализации изобретения композиция ВМ мультимеров рФфВ содержит по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% декамеров или мультимеров высшего порядка.
[0047] Оценка количества и процентного содержания мультимеров рФфВ может проводиться с использованием способов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, способы с использованием электрофореза и эксклюзионной хроматографии для разделения мультимеров ФфВ по размеру, например, как обсуждалось Cumming et al., (J Clin Pathol. 1993 May; 46(5): 470-473, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров ФфВ). Такие подходы могут дополнительно включать способы иммуноблоттинга (такие как вестерн-блот), в которых гель иммуноблоттируется с радиоактивно меченным антителом против ФфВ с последующим хемилюминесцентным детектированием (см., например, Wen et al., (1993), J. Clin. Lab. Anal., 7: 317-323, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров ФфВ). Дополнительные исследования для ФфВ включают анализы Антигена ФфВ (ФфВ:Аг (VWF:Ag)), Ристоцетин-Кофакторной активности ФфВ (ФфВ:РКо (VWF:RCof)) и Коллаген-Связывающей Активности (ФфВ:КСА (VWF:CBA)), которые часто используются для диагностики и классификации болезни фон Виллебранда. (см., например, Favaloro et al., Pathology, 1997, 29(4): 341-456, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с анализами для ФфВ).
[0048] В дополнительных вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка согласно изобретению стабильны в течение от около 1 до около 90 часов после введения. В еще дополнительных вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка стабильны в течение около 5-80, 10-70, 15-60, 20-50, 25-40, 30-35 часов после введения. В еще дополнительных вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка стабильны в течение по меньшей мере 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 часов после введения. В некоторых вариантах реализации изобретения стабильность мультимеров рФфВ оценивают in vitro.
[0049] В одном варианте реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка, используемые в композициях и способах, представленных в данном документе, имеют период полувыведения по меньшей мере 12 часов после введения. В другом варианте реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка имеют период полувыведения по меньшей мере 24 часа после введения. В еще других вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка имеют период полувыведения, выбранный из вариаций 642-1045, приведенных в Таблице 6 WO 2012/171031, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.
[0050] В конкретных аспектах рФфВ (рекомбинантный или полученный из плазмы), используемый в соответствии с данным изобретением, не модифицируется какими-либо конъюгационными, посттрансляционными или ковалентными модификациями. В конкретных вариантах реализации изобретения рФфВ по данному изобретению не модифицирован водорастворимым полимером, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиалкилен, полисиаловую кислоту, гидроксиэтилкрахмал, поли-углеводный фрагмент, и тому подобное.
[0051] В других аспектах рФфВ (рекомбинантный или полученный из плазмы), используемый в соответствии с данным изобретением, модифицирован посредством конъюгации, посттрансляционной модификации или ковалентной модификации, включая модификации N- или C-концевых остатков, а также модификации выбранных боковых цепей, например, на свободных сульфгидрильных группах, первичных аминах и гидроксильных группах. В одном варианте реализации изобретения водорастворимый полимер связан с белком (напрямую или через линкер) лизиновой группой или другим первичным амином. В одном варианте реализации изобретения белки рФфВ по данному изобретению могут быть модифицированы путем конъюгации водорастворимого полимера, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиалкилен, полисиаловую кислоту, гидроксилэтилкрахмал, поли-углеводородный фрагмент и тому подобное.
nd
[0052] Водорастворимые полимеры, которые можно использовать для модификации рФфВ и/или ФVIII, включают линейные и разветвленные структуры. Конъюгированные полимеры могут быть присоединены непосредственно к коагулятному белку коагуляции по изобретению или, альтернативно, могут быть присоединены через связующий фрагмент. Неограничивающие примеры конъюгации белка с водорастворимыми полимерами можно найти в патентах США № 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192, и 4,179,337, а также в Abuchowski and Davis "Enzymes as Drugs," Holcenberg and Roberts, Eds., pp. 367 383, John Wiley and Sons, New York (1981), и Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2 Ed., Academic Press, Inc. 2008.
nd
3
4
[0053] Конъюгация белков может быть выполнена с помощью ряда хорошо известных в данной области подходов, например, см. Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2 Ed., Academic Press, Inc. 2008. Примеры включают соединение через пептидную связь между карбоксильной группой на одном из коагулянтных белков или водорастворимом полимерном фрагменте и аминогруппой другого белка или фрагмента, или сложноэфирное соединение между карбоксильной группой с одной стороны и гидроксильной группой с другой стороны. Другое соединение, с помощью которого коагулянтный белок по данному изобретению может быть конъюгирован с водорастворимым полимерным веществом, происходит через основание Шиффа между свободной аминогруппой на полимерном фрагменте, реагирующей с альдегидной группой, образованной на невосстанавливающем конце полимера путем окисления периодатом (Jennings and Lugowski, J. Immunol. 1981; 127:1011-8; Femandes and Gregonradis, Biochim Biophys Acta. 1997; 1341; 26-34). Генерируемое основание Шиффа может быть стабилизировано путем специфического восстановления NaCNBH с образованием вторичного амина. Альтернативным подходом является образование концевых свободных аминогрупп на полимере путем восстановительного аминирования NHCl после предварительного окисления. Бифункциональные реагенты могут быть использованы для связывания двух аминогрупп или двух гидроксильных групп. Например, полимер, содержащий аминогруппу, может быть соединен с аминогруппой коагулянтного белка с помощью таких реагентов, как BS3 (Бис(сульфосукцинимидил)суберат/Pierce, Rockford, Ill.). Кроме того, гетеробифункциональные сшивающие реагенты, такие как Sulfo-EMCS ((N-эпсилон-малеимидокапроилокси) сульфосукцинимидный эфир/Pierce), могут быть использованы, например, для связывания аминогрупп и тиоловых групп. В других вариантах реализации изобретения группа, реагирующая с альдегидом, такая как ПЭГ алкоксид плюс диэтилацеталь бромацетальдегида; ПЭГ плюс ДМСО и уксусный ангидрид, а также ПЭГ хлорид плюс феноксид 4-гидроксибензальдегида, сукцинимидильные активные эфиры, активированный дитиокарбонат ПЭГ, 2,4,5-трихлорфенилхлорформиат и P-нитрофенилхлорформиат активированный ПЭГ, могут использоваться в конъюгации коагулянтного белка.
[0054] В некоторых аспектах рФфВ, используемый в способах по данному изобретению, созревал in vitro с фурином. В дополнительных вариантах реализации изобретения фурин представляет собой рекомбинантный фурин.
[0055] В дополнительных аспектах рФфВ, используемый в способах по данному изобретению, получают путем экспрессии в культуре клеток млекопитающих с использованием способов, известных в данной области. В конкретных вариантах реализации изобретения культура клеток млекопитающих содержит клетки CHO. В типовом варианте реализации изобретения рФфВ по данному изобретению содержит белок рФфВ, выделенный из системы экспрессии клеток CHO. В дополнительном варианте реализации изобретения удаление пропептида опосредуется in vitro посредством воздействия фурина на про-ФфВ. В еще одном дополнительном варианте реализации изобретения Фурин, используемый для удаления пропептида, представляет собой рекомбинантный фурин. В еще одном дополнительном варианте реализации изобретения полностью гликозилированные гликаны группы крови ABO отсутствуют.
например
например
например
[0056] В еще дополнительных вариантах реализации изобретения рФфВ используют в способах и композициях по данному изобретению путем экспрессии в подходящей эукариотической системе-хозяине. Примеры эукариотических клеток включают, но не ограничиваются ими, клетки млекопитающих, такие как CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep и HepG2; клетки насекомых,  клетки SF9, клетки SF21, клетки S2 и клетки High Five; и дрожжевые клетки,  клетки Saccharomyces или Schizosaccharomyces. В одном варианте реализации изобретения ФфВ может быть экспрессирован в клетках дрожжей, клетках насекомых, клетках птиц, клетках млекопитающих и тому подобное. Например, в клеточной линии человека, клеточной линии хомяка или клеточной линии мыши. В одном конкретном варианте реализации изобретения клеточная линия представляет собой клеточную линию CHO, BHK или HEK. Как правило, клетки млекопитающих,  клетки СНО из стабильной клеточной линии, можно использовать для экспрессии ФфВ по данному изобретению.
[0057] В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, которая кодирует ФфВ, может представлять собой вектор. Вектор может быть доставлен вирусом или может быть плазмидой. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, может представлять собой специфичный ген или его биологически функциональную часть. В одном варианте реализации изобретения белок представляет собой, по меньшей мере, биологически активную часть ФфВ. Широкий спектр векторов может быть использован для экспрессии ФфВ и может быть выбран из эукариотических векторов экспрессии. Примеры векторов для экспрессии у эукариот включают: (i) для экспрессии в дрожжах, векторы, такие как pAO, pPIC, pYES, pMET, с использованием промоторов, таких как AAOX1, GAP, GAL1, AUG1 и т.д.; (ii) для экспрессии в клетках насекомых, векторы, такие как pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC и т.д., с использованием промоторов, таких как PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh и т.д., и (iii) для экспрессии в клетках млекопитающих, векторы, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV и т.д., и векторы, полученные из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса, ретровирусы и т.д., с использованием промоторов таких как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β-актин.
[0058] В некоторых вариантах реализации данного изобретения последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно содержит другие последовательности, подходящие для контролируемой экспрессии белка, такие как последовательности промотора, энхансеры, TATA-боксы, сайты инициации транскрипции, полилинкеры, сайты рестрикции, поли-A-последовательности, последовательности процессинга белка, селективные маркеры и тому подобное, которые обычно известны специалисту в данной области техники.
[0059] В некоторых вариантах реализации изобретения способы культивирования клеток по изобретению могут включать использование микроносителя. В некоторых вариантах реализации изобретения культуры клеток в соответствии с вариантами реализации изобретения могут быть получены в больших биореакторах в условиях, подходящих для обеспечения больших объемных удельных площадей поверхности культуры для достижения высокой плотности клеток и экспрессии белка. Одним из способов обеспечения таких условий роста является использование микроносителей для культивирования клеток в биореакторах с механическим перемешиванием. Концепция роста клеток на микроносителях была впервые описана van Wezel (van Wezel, A. L., Nature 216:64-5 (1967)) и позволяет прикреплять клетки на поверхности мелких твердых частиц, которые находятся во взвешенном состоянии в среде для выращивания. Эти способы обеспечивают высокое соотношение поверхности к объему и, таким образом, обеспечивают эффективное использование питательных веществ. Кроме того, для экспрессии секретируемых белков в эукариотических клеточных линиях увеличенное соотношение поверхности к объему обеспечивает более высокие уровни секреции и, следовательно, более высокий выход белка в надосадочной жидкости культуры. В конечном итоге, эти способы позволяют легко увеличить масштабы экспрессии эукариотических культур.
[0060] Клетки, экспрессирующие ФфВ, могут быть связаны со сферическим или пористым микроносителем во время роста культуры клеток. Микроноситель может представлять собой микроноситель, выбранным из группы микроносителей на основе декстрана, коллагена, пластика, желатина и целлюлозы и других, как описано в Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). Также возможно выращивать клетки до биомассы на сферических микроносителях и пересевать клетки, когда они достигли конечной биомассы ферментера, и до продуцирования экспрессированного белка на пористом микроносителе или наоборот. Подходящие сферические микроносители могут включать микроносители с гладкой поверхностью, такие как Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 и Cytode™ 3 (GE Healthcare), и макропористые микроносители, такие как Cytopore™. 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1, и Cytoline™ 2 (GE Healthcare).
например
[0061] В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ экспрессируется в клетках, культивируемых в питательной среде для выращивания клеток, которые продуцируют высокомолекулярный рФфВ. Термины «раствор для культивирования клеток», «среда или питательная среда для культивирования клеток» и «надосадочная жидкость клеточной культуры» относятся к аспектам процессов культивирования клеток, обычно хорошо известным в данной области техники. В контексте данного изобретения раствор для культивирования клеток может включать среду для культивирования клеток и надосадочную жидкость клеточной культуры. Среда для культивирования клеток добавляется извне к раствору для культивирования клеток, необязательно вместе с витаминными добавками, чтобы обеспечить питательные вещества и другие компоненты для культивирования клеток, экспрессирующих ФфВ. Надосадочная жидкость клеточной культуры относится к раствору клеточной культуры, содержащему питательные вещества и другие компоненты из среды для культивирования клеток, а также продукты, высвобождаемые, метаболизируемые и/или выделяемые из клеток во время культивирования. В дополнительных вариантах реализации изобретения среда может не содержать животных белков и может быть с определенным химическим составом. Способы приготовления питательных сред, не содержащих животных белков, и с определенным химическим составом известны в данной области техники, например, в публикации патентов США 2008/0009040 и США 2007/0212770, которые оба включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей, и в частности, для всех идей, касающихся сред для культивирования клеток. Термин «не содержащий белка» и родственные термины относятся к белку, который получен из экзогенного источника или отличается от белка клеток в культуре, которые естественным образом выделяют белки во время роста. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит полипептидов. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит сыворотку. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит животных белков. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит животных компонентов. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования содержит белок, , животный белок из сыворотки, такой как эмбриональная телячья сыворотка. В другом варианте реализации изобретения культура содержит рекомбинантные белки, добавленные экзогенно. В другом варианте реализации изобретения белки получены от сертифицированного животного, не содержащего патогенов. Используемый в контексте данного документа термин «с определенным химическим составом» означает, что среда не содержит каких-либо неопределенных добавок, таких как, например, экстракты животных компонентов, органов, желез, растений или дрожжей. Соответственно, каждый компонент среды с определенным химическим составом точно определен. В предпочтительном варианте реализации изобретения среды не содержат животных компонентов и белков.
то есть
[0062] В дополнительных вариантах реализации изобретения после очистки от культуры клеток млекопитающих рФVIII восстанавливают перед введением. В дополнительных вариантах реализации изобретения рФфВ обрабатывают фурином до или после восстановления. В дополнительных вариантах реализации изобретения Фурин представляет собой рекомбинантный фурин. В дополнительных вариантах реализации изобретения рФфВ по изобретению не подвергается воздействию ADAMTS13, в результате чего в композициях рФфВ по изобретению присутствуют ультрабольшие рФфВ ( содержащие 10 или более субъединиц).
[0063] В конкретных аспектах рФфВ, используемый в способах по данному изобретению, содержится в препарате, содержащем буфер, сахар и/или сахарный спирт (включая, но не ограничиваясь ими, трегалозу и маннит), стабилизатор (такой как глицин) и поверхностно-активное вещество (такое как полисорбат 80). В других вариантах реализации изобретения для препаратов, содержащих рФVIII, препарат может дополнительно включать натрий, гистидин, кальций и глутатион.
[0064] В одном аспекте препараты, содержащие рФфВ, лиофилизируют перед введением. Лиофилизация проводится с использованием способов, известных в данной области техники, и должна быть оптимизирована для разрабатываемой композиции [Tang et al., Pharm Res. 21: 191-200. (2004) и Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)].
[0065] Способы приготовления фармацевтических препаратов могут включать одну или более из следующих стадий: добавление стабилизирующего агента, как описано в данном документе, к указанной смеси перед лиофилизацией, добавление по меньшей мере одного агента, выбранного из наполнителя, агента, регулирующего осмолярность, и поверхностно-активного вещества, как описано в данном документе для каждого из них, к указанной смеси до лиофилизации. Лиофилизированный препарат в одном аспекте, по меньшей мере, содержит один или более буфер, наполнитель и стабилизатор. В этом аспекте полезность поверхностно-активного вещества оценивается и выбирается в тех случаях, когда возникает проблема агрегации на стадии лиофилизации или во время восстановления. Подходящий буферный агент включен для поддержания препарата в стабильных зонах рН во время лиофилизации.
[0066] Стандартная практика восстановления для лиофилизированного материала заключается в добавлении объема чистой воды или стерильной воды для инъекций (воды д/и) (обычно эквивалентного объему, удаленному во время лиофилизации), хотя разбавленные растворы антибактериальных агентов иногда используются при производстве фармацевтических препаратов для парентеральное введение [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Соответственно, предложены способы получения восстановленных рекомбинантных композиций ФфВ, включающие стадию добавления раствора для разведения к лиофилизированной рекомбинантной композиции ФфВ по изобретению.
[0067] Лиофилизированный материал может быть восстановлен в виде водного раствора. Могут быть использованы разнообразные водные носители, например, стерильная вода для инъекций, вода с консервантами для многократного использования или вода с подходящими количествами поверхностно-активных веществ (например, водная суспензия, которая содержит активное соединение в смеси с эксципиентами, подходящими для производства водных суспензии). В различных аспектах такими эксципиентами являются суспендирующие агенты, например, но не ограничиваясь этим, карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь; диспергирующие или смачивающие агенты представляют собой природного происхождения фосфатид, например, но не ограничиваясь этим, лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, но не ограничиваясь этим, полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с алифатическими спиртами с длинной цепью например, но не ограничиваясь этим, гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с частичными эфирами, полученными из жирных кислот, и гекситом, такой как полиоксиэтиленсорбитолмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с частичными эфирами, полученными из жирных кислот и гекситоловых ангидридов, например, но не ограничиваясь этим, полиэтилен сорбитанмоноолеат. В различных аспектах водные суспензии также содержат один или более консервантов, например, но не ограничиваясь этим, этил или н-пропил, п-гидроксибензоат.
[0068] В некоторых вариантах реализации изобретения композиции по данному изобретению представляют собой жидкие препараты для введения с использованием шприца или другого сосуда для хранения. В дополнительных вариантах реализации изобретения эти жидкие препараты получают из лиофилизированного материала, описанного в данном документе, восстановленного в виде водного раствора.
[0069] В дополнительном аспекте композиции по изобретению дополнительно содержат один или более фармацевтически приемлемых носителей. Фразы «фармацевтически» или «фармакологически» приемлемые относятся к молекулярным веществам и композициям, которые являются стабильными, ингибируют деградацию белка, такую как образование продуктов агрегации и распада белка, и, кроме того, не вызывают аллергических или других нежелательных явлений при введении с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, как описано ниже. «Фармацевтически приемлемые носители» включают любые и все клинически полезные растворители, дисперсионные среды, оболочки, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты и тому подобное, включая агенты, описанные выше.
Производство Рекомбинантного ФфВ
[0070] Свободный зрелый рекомбинантный фактор фон Виллебранда (рФфВ) по данному изобретению может быть получен рекомбинантно. Специалисту в данной области техники будут понятны полезные способы экспрессии рекомбинантного белка в клетке-хозяине. В некоторых случаях способ включает в себя экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рФфВ, в клетке-хозяине, такой как клетке CHO, и культивирование полученной клетки-хозяина при определенных условиях для получения рФфВ, препро-ФфВ, про-VWF и тому подобное.
[0071] В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, которая кодирует ФфВ, может представлять собой вектор экспрессии. Вектор может быть доставлен вирусом или может быть плазмидой. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, может представлять собой специфичный ген или его биологически функциональную часть. В одном варианте реализации изобретения белок представляет собой, по меньшей мере, биологически активную часть ФфВ. Последовательность нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать другие последовательности, подходящие для контролируемой экспрессии белка, такие как последовательности промотора, энхансеры, TATA-боксы, сайты инициации транскрипции, полилинкеры, сайты рестрикции, поли-A-последовательности, последовательности процессинга белка, селективные маркеры и тому подобное, которые обычно известны специалисту в данной области техники.
[0072] Широкий спектр векторов может быть использован для экспрессии ФфВ и может быть выбран из эукариотических векторов экспрессии. Примеры векторов для экспрессии у эукариот включают: (i) для экспрессии в дрожжах, векторы, такие как pAO, pPIC, pYES, pMET, с использованием промоторов, таких как AAOX1, GAP, GAL1, AUG1 и т.д.; (ii) для экспрессии в клетках насекомых, векторы, такие как pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC и т.д., с использованием промоторов, таких как PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh и т.д., и (iii) для экспрессии в клетках млекопитающих, векторы, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV и т.д., и векторы, полученные из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса, ретровирусы и т.д., с использованием промоторов таких как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β-актин.
[0073] В некоторых аспектах рФфВ, используемый в способах по данному изобретению, получают путем экспрессии в культуре клеток млекопитающих с использованием способов, известных в данной области. В конкретных вариантах реализации изобретения культура клеток млекопитающих содержит клетки CHO. В дополнительных вариантах реализации изобретения рФфВ коэкспрессируется с рекомбинантным Фактором VIII (рФVIII) в той же культуре. В таких вариантах реализации изобретения рФфВ и рФVIII очищают вместе (совместно очищают) или отдельно, используя способы, известные в данной области техники. В других вариантах реализации изобретения рФфВ экспрессируется в культуре, которая не содержит рФVIII.
например
например
например
[0074] В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ экспрессируется и выделяется из подходящей эукариотической системы-хозяина. Примеры эукариотических клеток включают, но не ограничиваются ими, клетки млекопитающих, такие как CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep и HepG2; клетки насекомых,  клетки SF9, клетки SF21, клетки S2 и клетки High Five; и дрожжевые клетки,  клетки Saccharomyces или Schizosaccharomyces. В одном варианте реализации изобретения ФфВ может быть экспрессирован в клетках дрожжей, клетках насекомых, клетках птиц, клетках млекопитающих и тому подобное. Например, в клеточной линии человека, клеточной линии хомяка или клеточной линии мыши. В одном конкретном варианте реализации изобретения клеточная линия представляет собой клеточную линию CHO, BHK или HEK. Как правило, клетки млекопитающих,  клетки СНО из стабильной клеточной линии, можно использовать для экспрессии ФфВ по данному изобретению. В некоторых случаях белок ФфВ экспрессируется и выделяется из системы экспрессии клеток СНО.
[0075] ФфВ может быть получен в системе культивирования клеток или в соответствии с любым способом культивирования клеток, известным специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения культуры клеток могут быть получены в больших биореакторах в условиях, подходящих для обеспечения больших объемных удельных площадей поверхности культуры для достижения высокой плотности клеток и экспрессии белка. Одним из способов обеспечения таких условий роста является использование микроносителей для культивирования клеток в биореакторах с механическим перемешиванием. Концепция роста клеток на микроносителях была впервые описана van Wezel (van Wezel, A. L., Nature 216:64-5) и позволяет прикреплять клетки на поверхности мелких твердых частиц, которые находятся во взвешенном состоянии в среде для выращивания. Эти способы обеспечивают высокое отношение поверхности к объему и, таким образом, обеспечивают эффективное использование питательных веществ. Кроме того, для экспрессии секретируемых белков в эукариотических клеточных линиях увеличенное соотношение поверхности к объему обеспечивает более высокие уровни секреции и, следовательно, более высокий выход белка в надосадочной жидкости культуры. В конечном итоге, эти способы позволяют легко увеличить масштабы экспрессии эукариотических культур.
[0076] Клетки, экспрессирующие ФфВ, могут быть связаны со сферическим или пористым микроносителем во время роста культуры клеток. Микроноситель может представлять собой микроноситель, выбранным из группы микроносителей на основе декстрана, коллагена, пластика, желатина и целлюлозы и других, как описано в Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). Также возможно выращивать клетки до биомассы на сферических микроносителях и пересевать клетки, когда они достигли конечной биомассы ферментера, и до продуцирования экспрессированного белка на пористом микроносителе или наоборот. Подходящие сферические микроносители могут включать микроносители с гладкой поверхностью, такие как Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 и Cytode™ 3 (GE Healthcare), и макропористые микроносители, такие как Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1, и Cytoline™ 2 (GE Healthcare).
[0077] В дополнительном варианте реализации изобретения пропептид ФфВ отщепляется от незрелого ФфВ in vitro посредством воздействия фурина на про-ФфВ. В некоторых вариантах реализации изобретения фурин, используемый для расщепления пропептида, представляет собой рекомбинантный фурин.
например
[0078] В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ экспрессируется в клетках, культивируемых в питательной среде для выращивания клеток, которые продуцируют высокомолекулярный рФфВ. Термины «раствор для культивирования клеток», «среда или питательная среда для культивирования клеток» и «надосадочная жидкость клеточной культуры» относятся к аспектам процессов культивирования клеток, обычно хорошо известным в данной области техники. В контексте данного изобретения раствор для культивирования клеток может включать среду для культивирования клеток и надосадочную жидкость клеточной культуры. Среда для культивирования клеток добавляется извне к раствору для культивирования клеток, необязательно вместе с витаминными добавками, чтобы обеспечить питательные вещества и другие компоненты для культивирования клеток, экспрессирующих ФфВ. Надосадочная жидкость клеточной культуры относится к раствору клеточной культуры, содержащему питательные вещества и другие компоненты из среды для культивирования клеток, а также продукты, высвобождаемые, метаболизируемые и/или выделяемые из клеток во время культивирования. В дополнительных вариантах реализации изобретения среда может не содержать животных белков и может быть с определенным химическим составом. Способы приготовления питательных сред не содержащих животных белков и с определенным химическим составом известны в данной области техники, например, в публикации патентов США 2006/0094104, США 2007/0212770 и США 2008/0009040, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей, и в частности, для всех идей, касающихся сред для культивирования клеток. Термин «не содержащий белка» и родственные термины относятся к белку, который получен из экзогенного источника или отличается от белка клеток в культуре, которые естественным образом выделяют белки во время роста. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит полипептидов. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит сыворотку. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит животных белков. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования не содержит животных компонентов. В другом варианте реализации изобретения среда для культивирования содержит белок, , животный белок из сыворотки, такой как эмбриональная телячья сыворотка. В другом варианте реализации изобретения культура содержит рекомбинантные белки, добавленные экзогенно. В другом варианте реализации изобретения белки получены от сертифицированного животного, не содержащего патогенов. Используемый в контексте данного документа термин «с определенным химическим составом» означает, что среда не содержит каких-либо неопределенных добавок, таких как, например, экстракты животных компонентов, органов, желез, растений или дрожжей. Соответственно, каждый компонент среды с определенным химическим составом точно определен. В предпочтительном варианте реализации изобретения среды не содержат животных компонентов и белков.
6
7
6
7
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
[0079] В некоторых вариантах реализации изобретения культура клеток, экспрессирующих ФфВ, может поддерживаться в течение по меньшей мере около 7 дней или по меньшей мере около 14 дней, 21 дня, 28 дней или по меньшей мере около 5 недель, 6 недель, 7 недель или по меньшей мере около 2 месяцев или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев или дольше. Плотность клеток, при которой поддерживается клеточная культура для производства рекомбинантного белка ФфВ, будет зависеть от условий культивирования и среды, используемой для экспрессии белка. Специалист в данной области легко сможет определить оптимальную плотность клеток для культуры клеток, продуцирующих ФфВ. В одном варианте реализации изобретения культуру поддерживают при плотности клеток от около 0,5х10 до 4х10 клеток/мл в течение длительного периода времени. В других вариантах реализации изобретения плотность клеток поддерживается при концентрации от около 1,0х10 до около 1,0х10 клеток/мл в течение длительного периода времени. В других вариантах реализации изобретения плотность клеток поддерживается при концентрации от около 1,0х10 до около 4,0х10 клеток/мл в течение длительного периода времени. В других вариантах реализации изобретения плотность клеток поддерживается при концентрации от около 1,0х10 до около 4,0х10 клеток/мл в течение длительного периода времени. В еще других вариантах реализации изобретения плотность клеток может поддерживаться при концентрации от около 2,0х10 до около 4,0х10, или от около 1,0х10 до около 2,5х10, или от около 1,5х10 до около 3,5х10, или в любом другом подобном диапазоне, в течение длительного периода времени. После соответствующего времени в клеточной культуре, рФфВ может быть выделен из системы экспрессии с использованием способов, известных в данной области техники.
6
6
6
6
6
6
6
[0080] В конкретном варианте реализации изобретения плотность клеток в стабильной клеточной культуре для продуцирования рФфВ поддерживается при концентрации не более 2,5×10 клеток/мл в течение длительного периода. В других конкретных вариантах реализации изобретения плотность клеток поддерживается на уровне не более 2,0×10 клеток/мл, 1,5×10 клеток/мл, 1,0×10 клеток/мл, 0,5×10 клеток/мл или менее. В одном варианте реализации изобретения плотность клеток поддерживается на уровне от 1,5×10 клеток/мл до 2,5×10 клеток/мл.
[0081] В одном варианте реализации культур клеток, описанных выше, раствор для культивирования клеток содержит добавку к питательной среде, содержащую медь. Такие растворы для культивирования клеток описаны, например, в патенте США № 8852888 и патенте США № 9409971, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, относящихся к способам культивирования клеток и композициям для получения рекомбинантного ФфВ.
См.
[0082] Полинуклеотидная и аминокислотная последовательности препро-ФфВ представлены в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 соответственно и доступны по номерам доступа GenBank NM_000552 (Homo sapiens von Willebrand factor (VWF) mRNA) и NP_000543, соответственно. Аминокислотная последовательность, соответствующая зрелому белку ФфВ, представлена в SEQ ID NO: 3 (соответствует аминокислотам 764-2813 аминокислотной последовательности полноразмерного препро-ФфВ). В некоторых вариантах реализации изобретения ФфВ имеет, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или, по меньшей мере, 100% идентичности относительно последовательности SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ согласно изобретению имеет, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или, по меньшей мере, 100% идентичности относительно последовательности SEQ ID NO:3. , например, патент США № 8597910, публикацию патента США № 2016/0129090, а также Фиг. 6.
et al.
et al.
[0083] Одна форма полезного рФфВ обладает, по меньшей мере, свойством in vivo-стабилизации, например, может связывать, по меньшей мере, одну молекулу Фактора VIII (ФVIII) и, необязательно, имеет профиль гликозилирования, который является фармакологически приемлемым. Его конкретные примеры включают ФфВ без домена A2, таким образом, устойчивый к протеолизу (Lankhof , Thromb. Haemost. 77: 1008-1013, 1997) и фрагмент ффВ от Val 449 до Asn 730, включающий гликопротеин-lb-связывающий домен и сайты связывания для коллагена и гепарина (Pietu , Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989). Определение способности ФфВ стабилизировать, по меньшей мере, одну молекулу ФVIII, в одном аспекте, проводят у млекопитающих с дефицитом ФфВ в соответствии со способами, известными в данной области техники.
например
например
например
например
например
например
[0084] РффВ по данному изобретению может быть получен любым способом, известным в данной области техники. Один конкретный пример раскрыт в WO 86/06096, опубликованном 23 октября 1986 г., и в заявке на патент США № 07/559509, поданной 23 июля 1990 г., которая включена в данный документ посредством ссылки в отношении способов получения рекомбинантного ФфВ. Таким образом, в данной области техники известны способы (i) получения рекомбинантной ДНК с помощью генной инженерии,  посредством обратной транскрипции РНК и/или амплификации ДНК, (ii) введения рекомбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки путем трансфекции, , посредством электропорации или микроинъекции, (iii) культивирования трансформированных клеток, , стабильное или периодическое, (iv) экспрессии ФфВ, , конститутивно или при индукции, и (v) выделение ФфВ, , из культуральной среды или путем сбора трансформированных клеток для получения (vi) очищенного рФфВ, , с помощью анионообменной хроматографии или аффинной хроматографии. В одном аспекте рекомбинантный ФфВ получают в трансформированных клетках-хозяевах с использованием способов рекомбинантной ДНК, хорошо известных в данной области техники. Например, последовательности, кодирующие полипептид, могут быть вырезаны из ДНК с использованием подходящих рестрикционных ферментов. Альтернативно, молекула ДНК, в другом аспекте, синтезируется с использованием способов химического синтеза, таких как фосфорамидитный способ. Кроме того, в еще одном аспекте, используется комбинация этих подходов.
[0085] Изобретение также предоставляет векторы, кодирующие полипептиды по изобретению в соответствующем хозяине. Вектор содержит полинуклеотид, который кодирует полипептид, функционально связанный с соответствующими последовательностями контроля экспрессии. Способы осуществления этого оперативного связывания либо до, либо после того, как полинуклеотид вставлен в вектор, хорошо известны. Последовательности контроля экспрессии включают в себя промоторы, активаторы, энхансеры, операторы, сайты связывания рибосом, старт-сигналы, стоп-сигналы, кап-сигналы, сигналы полиаденилирования и другие сигналы, связанные с контролем транскрипции или трансляции. Полученный вектор, содержащий полинуклеотид, используется для трансформации подходящего хозяина. Эта трансформация может быть выполнено с использованием способов, хорошо известных в данной области техники.
[0086] Любые из большого количества доступных и хорошо известных клеток-хозяев используются в практике данного изобретения. Выбор конкретного хозяина зависит от ряда факторов, признанных в данной области техники, включая, например, совместимость с выбранным вектором экспрессии, токсичность пептидов, кодируемых молекулой ДНК, скорость трансформации, легкость восстановления пептидов, характеристики экспрессии, биобезопасность и стоимость. Баланс этих факторов должен быть достигнут при понимании того, что не все клетки-хозяева одинаково эффективны для экспрессии определенной последовательности ДНК. В рамках этих общих руководящих принципов полезные клетки-хозяева микроорганизмов включают, но не ограничиваются ими, клетки бактерий, дрожжей и других грибов, клетки насекомых, растений, клетки млекопитающих (включая человека) в культуре или других хозяев, известных в данной области техники.
[0087] Трансформированные клетки-хозяева культивируют в обычных условиях ферментации, таким образом экспрессируются желаемые соединения. Такие условия ферментации хорошо известны в данной области техники. В конце, полипептиды очищают от культуральной среды или самих клеток-хозяев способами, хорошо известными в данной области техники.
[0088] В зависимости от клетки-хозяина, используемой для экспрессии соединения по изобретению, углеводные (олигосахаридные) группы необязательно присоединяются к сайтам, которые, как известно, являются сайтами гликозилирования в белках. Как правило, O-связанные олигосахариды присоединяются к остаткам серина (Ser) или треонина (Thr), тогда как N-связанные олигосахариды присоединяются к остаткам аспарагина (Asn), когда они являются частью последовательности Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме пролина. Х предпочтительно представляет собой одну из 19 встречающихся в природе аминокислот, не считая пролина. Структуры N-связанных и O-связанных олигосахаридов и остатков сахара, обнаруженных в каждом типе, различны. Одним типом сахара, который обычно встречается как на N-связанных, так и на O-связанных олигосахаридах, является N-ацетилнейраминовая кислота (называемая сиаловой кислотой). Сиаловая кислота обычно является концевым остатком как N-связанных, так и O-связанных олигосахаридов и, в силу своего отрицательного заряда, в одном аспекте, придает кислотные свойства гликозилированному соединению. Такие сайты могут быть включены в линкер соединений по данному изобретению и предпочтительно гликозилированы клеткой во время рекомбинантной продукции полипептидных соединений (например, в клетках млекопитающих, таких как CHO, BHK, COS). В других аспектах, такие сайты гликозилируются с помощью синтетических или полусинтетических процедур, известных в данной области техники.
[0089] В некоторых вариантах реализации изобретения сиализацию (также называемую сиалилированием) можно проводить на колонке как часть процедур очистки, описанных в данном документе (включая способы анионного обмена, катионного обмена, эксклюзионную хроматографию по размеру и/или иммуноаффинную хроматографию). В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование приводит к повышенной стабильности рФфВ по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование приводит к повышенной стабильности рФфВ в кровотоке (например, после введения субъекту) по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения повышенная стабильность сиалилированного рФфВ приводит к увеличению на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование приводит к увеличению периода полувыведения для рФфВ по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование приводит к увеличению периода полувыведения рФфВ в кровотоке (например, после введения субъекту) по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения увеличенный период полувыведения сиалилированного рФфВ приводит к увеличению на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах реализации изобретения увеличенный период полувыведения сиалилированного рФфВ приводит к рФфВ, который стабилен в кровотоке в течение 1 часа, 2 часов, 3 часов, 4 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов или более (например, после введения субъекту) по сравнению с рФфВ, который не подвергался сиалилированию. В некоторых вариантах сиалилирование увеличивает количество 2,3-сиалилирования и/или 2,6-сиалилирования. В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование усиливают добавлением 2,3-сиалилтрансферазы и/или 2,6-сиалилтрансферазы и CMP-NANA (натриевой соли цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовой кислоты) в качестве дополнительной стадии обработки буфером. В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование усиливают добавлением 2,3-сиалилтрансферазы и CMP-NANA (натриевой соли цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовой кислоты) в качестве дополнительной стадии обработки буфером. В некоторых вариантах реализации изобретения 2,3-сиалилирование усиливают добавлением 2,3-сиалилтрансферазы и CMP-NANA (натриевой соли цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовой кислоты) в качестве дополнительной стадии обработки буфером.
например
[0090] В некоторых вариантах реализации изобретения 2,6-сиалилирование усиливают добавлением 2,6-сиалилтрансферазы и CMP-NANA (натриевой соли цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовой кислоты) в качестве дополнительной стадии обработки буфером. В некоторых вариантах реализации изобретения 2,3-сиалилирование и/или 2,6-сиалилирование усиливают добавлением 2,3-сиалилтрансферазы и/или 2,6-сиалилтрансферазы и CMP-NANA (натриевой соли цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовой кислоты) в качестве дополнительной стадии обработки буфером. В некоторых вариантах реализации изобретения CMP-NANA химически или ферментативно модифицирован для переноса модифицированной сиаловой кислоты в потенциально свободное положение. В некоторых вариантах реализации изобретения сиалилирование выполняют путем нанесения рФфВ на смолу, промывания одним или несколькими буферами, как описано в данном документе, для удаления нежелательных примесей, применения одного или нескольких буферов, содержащих сиалилтрансферазу и CMP-NANA, в условиях, которые допускают дополнительное сиалилирование, и промывания одним или более буферов для истощения избытка реагентов сиалилирования, и элюирования одним или несколькими буферами улучшенного рФфВ (, рФфВ с увеличенным сиалилированием). В некоторых вариантах реализации изобретения процесс сиалилирования выполняют как часть способа катионного обмена, способа анионного обмена, способа эксклюзионной хроматографии по размеру или способа иммуноаффинной очистки, как описано в данном документе.
et al.
et al.
et al.
[0091] Альтернативно, соединения получают синтетическими способами, используя, например, способы твердофазного синтеза. Подходящие способы хорошо известны в данной области техники и включают способы, описанные в Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis  (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; патент США № 3941763; Finn  (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; и Erickson  (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527 '. Твердофазный синтез является предпочтительным способом получения отдельных пептидов, поскольку он является наиболее экономически эффективным способом получения небольших пептидов.
например
[0092] Фрагменты, варианты и аналоги ФфВ могут быть получены в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Фрагменты полипептида могут быть получены с использованием, но не ограничиваясь этим, ферментативного расщепления (, трипсина, химотрипсина), а также с использованием рекомбинантных средств для получения полипептидных фрагментов, имеющих специфическую аминокислотную последовательность. Могут быть получены полипептидные фрагменты, содержащие область белка, обладающую определенной активностью, такую как домен мультимеризации или любой другой идентифицируемый домен ффВ, известный в данной области техники.
например
[0093] Способы получения аналогов полипептидов также хорошо известны. Аналоги аминокислотной последовательности полипептида могут быть аналогами замены, инсерции, добавления или делеции. Аналоги делеции, включая фрагменты полипептида, лишены одного или нескольких остатков нативного белка, которые не являются необходимыми для функциональной или иммуногенной активности. Аналоги инсерции включают добавление, , аминокислот(ты) в неконцевой точке в полипептиде. Этот аналог может включать, например и не ограниваясь этим, инсерцию иммунореактивного эпитопа или просто одного остатка. Аналоги добавления, включая фрагменты полипептида, включают добавление одной или более аминокислот на одном или обоих концах белка и включают, например, слитые белки. Комбинации вышеупомянутых аналогов также рассматриваются.
[0094] Аналоги замены обычно меняют одну аминокислоту дикого типа на другую в одном или нескольких сайтах белка и могут быть предназначены для модуляции одного или нескольких свойств полипептида без полной потери других функций или свойств. В одном аспекте, замены представляют собой консервативные замены. «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену аминокислоты аминокислотой, имеющей боковую цепь или подобный химический характер. Подобные аминокислоты для проведения консервативных замен включают аминокислоты, имеющие кислую боковую цепь (глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту); основную боковую цепь (аргинин, лизин, гистидин); полярную амидную боковая цепь (глутамин, аспарагин); гидрофобную алифатическую боковую цепь (лейцин, изолейцин, валин, аланин, глицин); ароматическую боковую цепь (фенилаланин, триптофан, тирозин); маленькую боковую цепь (глицин, аланин, серин, треонин, метионин); или алифатическую гидроксильную боковую цепь (серин, треонин).
например
[0095] В одном аспекте аналоги являются в основном гомологичными или в основном идентичными рекомбинантному ФфВ, из которого они получены. Аналоги включают те, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторую биологическую активность полипептида дикого типа,  активность свертывания крови.
[0096] Рассматриваемые варианты полипептидов включают, но не ограничиваются ими, полипептиды, химически модифицированные такими способами, как убиквитинирование, гликозилирование, включая полисиалирование (или полисиалилирование), конъюгацию с терапевтическими или диагностическими агентами, введение метки, присоединение ковалентного полимера, такое как пегилирование (дериватизация с полиэтиленгликолем), введение неподдающихся гидролизу связей, и инсерцию или замену химическим синтезом аминокислот, таких как орнитин, которые обычно не встречаются в белках человека. Варианты сохраняют одинаковые или в основном одинаковые связывающие свойства немодифицированных молекул по данному изобретению. Такая химическая модификация может включать прямое или косвенное (например, через линкер) присоединение агента к полипептиду ФфВ. В случае непрямого присоединения предполагается, что линкер может быть гидролизуемым или негидролизуемым.
[0097] Получение аналогов пегилированного полипептида в одном аспекте включает стадии (а) взаимодействия полипептида с полиэтиленгликолем (таким как реакционноспособный сложный эфир или производное альдегида ПЭГ) в условиях, при которых полипептид связывающей конструкции становится связанным с одной или более группами ПЭГ, и (b) получение продукта(ов) реакции. Как правило, оптимальные условия реакции ацилирования определяются на основе известных параметров и желаемого результата. Например, чем больше соотношение ПЭГ: белок, тем больше процентное содержание полипегилированного продукта. В некоторых вариантах реализации изобретения связывающая конструкция имеет один фрагмент ПЭГ на N-конце. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) может быть присоединен к фактору свертывания крови, чтобы, например, обеспечить более длительный период полувыведения in vivo. Группа ПЭГ может иметь любую подходящую молекулярную массу и быть линейной или разветвленной. Средняя молекулярная масса ПЭГ составляет от около 2 килоДальтон («кДа») до около 100 кДа, от около 5 кДа до около 50 кДа или от около 5 кДа до около 10 кДа. В некоторых аспектах группы ПЭГ присоединяются к фактору свертывания крови посредством ацилирования или восстановительного алкилирования через природную или сконструированную функциональную группу в фрагменте ПЭГ (например, альдегидную, амино, тиольную или сложноэфирную группу) с функциональной группой в факторе свертывания крови (например, альдегидной, амино- или сложноэфирной группой) или посредством любого другого способа, известного в данной области техники.
et al.
например
et al.
4
[0098] Способы получения полисиалилированного полипептида описаны в публикации патента США 20060160948, Fernandes et Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: 26-34, 1997, и Saenko , Haemophilia 12:42-51, 2006. Вкратце, раствор коломиновой кислоты (КК), содержащий 0,1 М NaIO, перемешивают в темноте при комнатной температуре для окисления КК. Активированный раствор КК диализируют, , 0,05 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,2 в темноте, и этот раствор добавляют к раствору рФфВ и инкубируют в течение 18 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном встряхивании. Свободные реагенты необязательно отделяют от конъюгата рФфВ-полисиаловой кислоты, например, ультрафильтрацией/диафильтрацией. Конъюгация рФфВ с полисиаловой кислотой достигается с использованием глутаральдегида в качестве сшивающего реагента (Migneault , Biotechniques 37: 790-796, 2004).
[0099] Также предполагается, что в другом аспекте полипептиды пре-ФфВ и про-ФфВ обеспечат терапевтическое преимущество в композициях по настоящему данному изобретению. Например, в патенте США № 7005502 описан фармацевтический препарат, содержащий значительные количества про-ФфВ, который индуцирует образование тромбина in vitro. В дополнение к рекомбинантным, биологически активным фрагментам, вариантам или другим аналогам встречающегося в природе зрелого ФфВ данное изобретение предусматривает использование рекомбинантных биологически активных фрагментов, вариантов или аналогов препро-ФфВ (изложенных в SEQ ID NO:2) или про-ФфВ полипептидов (аминокислотные остатки с 23 по 764 SEQ ID NO:2) в препаратах, описанных в данном документе.
et al.
[00100] Полинуклеотиды, кодирующие фрагменты, варианты и аналоги, могут быть легко получены специалистом в данной области техники для кодирования биологически активных фрагментов, вариантов или аналогов встречающейся в природе молекулы, которые обладают такой же или сходной биологической активностью, что и встречающаяся в природе молекула. В различных аспектах эти полинуклеотиды получают с использованием способов ПЦР, ферментативного расщепления/лигирования молекулы, кодирующей ДНК, и тому подобного. Таким образом, специалист в данной области техники сможет генерировать единичные базовые изменения в цепи ДНК, чтобы привести к измененному кодону и миссенс-мутации, используя любой способ, известный в данной области техники, включая, но не ограничиваясь им, сайт-специфический мутагенез. Используемое в контексте данного документа выражение «умеренно жесткие условия гибридизации» означает, например, гибридизацию при 42°С в 50% формамиде и промывание при 60°С в 0,1 × SSC, 0,1% SDS. Специалистам в данной области технике понятно, что изменение в этих условиях происходит в зависимости от длины и содержания нуклеотидного основания GC в последовательностях, которые должны быть гибридизованы. Стандартные формулы в данной области техники подходят для определения точных условий гибридизации. См. Sambrook , 9.47-9.51 in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).
ФфВ Mультимеры
et al.
et al.
et al.
et al.
[0070] Оценка количества и процентного содержания мультимеров рФфВ может проводиться с использованием способов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, способы с использованием электрофореза и эксклюзионной хроматографии для разделения мультимеров ФфВ по размеру, например, как обсуждалось Cumming , (J Clin Pathol., 1993 May; 46(5): 470-473, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров ФфВ). Такие подходы могут дополнительно включать способы иммуноблоттинга (такие как Вестерн-Блот), в которых гель иммуноблоттируется с радиоактивно меченным антителом против ФфВ с последующим хемилюминесцентным детектированием (см., например, Wen , J. Clin. Lab. Anal., 1993, 7: 317-323, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров ФфВ). Дополнительные анализы для ФфВ включают анализ Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Ристоцетин-Кофакторной активности ФфВ (ФфВ:РКо) и Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КСА), которые часто используются для диагностики и классификации болезни фон Виллебранда. (см., например, Favaloro , Pathology, 1997, 29(4): 341-456; Sadler, JE, Annu Rev Biochem, 1998, 67:395-424; и Turecek , Semin Thromb Hemost, 2010, 36:510-521, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров ФфВ). В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ, полученный с использованием данных способов, включает в себя любой паттерн мультимера, присутствующий в загружаемом образце рФфВ. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ, полученный с использованием данных способов, включает физиологически встречающиеся паттерны мультимеров, а также паттерны ультрабольших ФфВ-мультимеров.
Исследования ФфВ
et al.
[0071] При первичном гемостазе ФфВ служит мостиком между тромбоцитами и специфическими компонентами внеклеточного матрикса, такими как коллаген. Биологическая активность ФфВ в этом процессе может быть измерена с помощью различных исследований in vitro (Turecek , Semin Thromb Hemost, 2010, 36: 510-521).
et al.
et al.
[0072] Анализ Ристоцетин-кофакторной активности ФфВ (ФфВ:РКо) основан на агглютинации свежих или фиксированных формалином тромбоцитов, индуцированной антибиотиком ристоцетином в присутствии ФфВ. Степень агглютинации тромбоцитов зависит от концентрации ФфВ и может быть измерена турбидиметрическим способом, например, с использованием агрегометра (Weiss , J. Clin. Invest., 1973, 52: 2708-2716; Macfarlane , Thromb. Diath. Haemorrh., 1975, 34: 306-308). В соответствии с данным документом, специфическая Ристоцетин-Кофакторная активность ФфВ (ФфВ:РКо) по данному изобретению, как правило, описывается в единицах мЕд/мкг ФфВ, измеренных с использованием анализов in vitro.
[0073] В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ, очищенный в соответствии со способами по данному изобретению обладает специфической активностью, по меньшей мере, около 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 32,5, 35, 37,5, 40, 42,5, 45, 47,5, 50, 52,5, 55, 57,5, 60. , 62,5, 65, 67,5, 70, 72,5, 75, 77,5, 80, 82,5, 85, 87,5, 90, 92,5, 95, 97,5, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 или более мЕд/мкг. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ, используемый в описанных в данном документе способах, обладает специфической активностью от 20 мЕд/мкг до 150 мЕд/мкг. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ обладает специфической активностью от 30 мЕд/мкг до 120 мЕд/мкг. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ обладает специфической активностью от 40 мЕд/мкг до 90 мЕд/мкг. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ обладает специфической активностью, выбранной из вариаций от 1 до 133, приведенных ниже в Таблице 3.
Таблица 3. Типовые варианты реализации изобретения по специфической активности рФфВ обнаруженной в композициях и использованной в способах, представленных в данном документе
(мЕд/мкг)
(мЕд/мкг)
(мЕд/мкг)
(мЕд/мкг)
20
Вар. 1
110
Вар. 35
40-150
Вар. 68
70-120
Вар. 101
22,5
Вар. 2
115
Вар. 36
40-140
Вар. 69
70-110
Вар. 102
25
Вар. 3
120
Вар. 37
40-130
Вар. 70
70-100
Вар. 103
27,5
Вар. 4
125
Вар. 38
40-120
Вар. 71
70-90
Вар. 104
30
Вар. 5
130
Вар. 39
40-110
Вар. 72
70-80
Вар. 105
32,5
Вар. 6
135
Вар. 40
40-100
Вар. 73
80-150
Вар. 106
35
Вар. 7
140
Вар. 41
40-90
Вар. 74
80-140
Вар. 107
37,5
Вар. 8
145
Вар. 42
40-80
Вар. 75
80-130
Вар. 108
40
Вар. 9
150
Вар. 43
40-70
Вар. 76
80-120
Вар. 109
42,5
Вар. 10
20-150
Вар. 44
40-60
Вар. 77
80-110
Вар. 110
45
Вар. 11
20-140
Вар. 45
40-50
Вар. 78
80-100
Вар. 111
47,5
Вар. 12
20-130
Вар. 46
50-150
Вар. 79
80-90
Вар. 112
50
Вар. 13
20-120
Вар. 47
50-140
Вар. 80
90-150
Вар. 113
52,5
Вар. 14
20-110
Вар. 48
50-130
Вар. 81
90-140
Вар. 114
55
Вар. 15
20-100
Вар. 49
50-120
Вар. 82
90-130
Вар. 115
57,5
Вар. 16
20-90
Вар. 50
50-110
Вар. 83
90-120
Вар. 116
60
Вар. 17
20-80
Вар. 51
50-100
Вар. 84
90-110
Вар. 117
62,5
Вар. 18
20-70
Вар. 52
50-90
Вар. 85
90-100
Вар. 118
65
Вар. 19
20-60
Вар. 53
50-80
Вар. 86
100-150
Вар. 119
67,5
Вар. 20
20-50
Вар. 54
50-70
Вар. 87
100-140
Вар. 120
70
Вар. 21
20-40
Вар. 55
50-60
Вар. 88
100-130
Вар. 121
72,5
Вар. 22
30-150
Вар. 56
60-150
Вар. 89
100-120
Вар. 122
75
Вар. 23
30-140
Вар. 57
60-140
Вар. 90
100-110
Вар. 123
77,5
Вар. 24
30-130
Вар. 58
60-130
Вар. 91
110-150
Вар. 124
80
Вар. 25
30-120
Вар. 59
60-120
Вар. 92
110-140
Вар. 125
82,5
Вар. 26
30-110
Вар. 60
60-110
Вар. 93
110-130
Вар. 126
85
Вар. 27
30-100
Вар. 61
60-100
Вар. 94
110-120
Вар. 127
87,5
Вар. 28
30-90
Вар. 62
60-90
Вар. 95
120-150
Вар. 128
90
Вар. 29
30-80
Вар. 63
60-80
Вар. 96
120-140
Вар. 129
92,5
Вар. 30
30-70
Вар. 64
60-70
Вар. 97
120-130
Вар. 130
95
Вар. 31
30-60
Вар. 65
70-150
Вар. 98
130-150
Вар. 131
97,5
Вар. 32
30-50
Вар. 66
70-140
Вар. 99
130-140
Вар. 132
100
Вар. 33
30-40
Вар. 67
70-130
Вар. 100
140-150
Вар. 133
105
Вар. 34
Вар. = Вариация.
см
Hämostaseologie
[0074] РФфВ по данному изобретению является высоко мультимерным, включающим от около 10 до около 40 субъединиц. В дополнительных вариантах реализации изобретения мультимерный рФфВ, полученный с использованием способов согласно данному изобретению, содержит около 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 субъединиц. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ присутствует в мультимерах, различающихся по размеру от димеров до мультимеров из более чем 40 субъединиц (>10 миллионов Дальтон). Самые большие мультимеры обеспечивают множество сайтов связывания, которые могут взаимодействовать как с рецепторами тромбоцитов, так и с сайтами повреждения субэндотелиального матрикса, и являются наиболее гемостатически активной формой ФфВ. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ по данному изобретению содержит ультрабольшие мультимеры (УБМ). В целом, как правило, высокомолекулярные и ультрабольшие мультимеры считаются наиболее эффективными в гемостатическом отношении (., например, Turecek, P., , (Vol. 37): Supplement 1, pages S15-S25 (2017)). В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ составляет от 500 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения любой желаемый паттерн мультимера может быть получен с использованием описанных способов. В некоторых вариантах реализации изобретения, когда используются способы анионного обмена и/или катионного обмена, рН, проводимость и/или противоионная концентрация буферов на одной или более стадии(ях) промывки или градиентных буферов могут быть изменены для получения желаемого паттерна мультимера. В некоторых вариантах реализации изобретения затем применяют способы эксклюзионной хроматографии по размеру, критерии сбора могут быть использованы для получения желаемого паттерна мультимера. В некоторых вариантах реализации изобретения описанный паттерн мультимеров содержит ультрабольшие мультимеры. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют по меньшей мере 10,000 кДа, по меньшей мере 11,000 кДа, по меньшей мере 12,000 кДа, по меньшей мере 13,000 кДа, по меньшей мере 14,000 кДа, по меньшей мере 15,000 кДа, по меньшей мере 16,000 кДа, по меньшей мере 17,000 кДа, по меньшей мере 18,000 кДа, по меньшей мере 19,000 кДа, по меньшей мере 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 10,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 11,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 12,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 13,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 14,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 15,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 16,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 17,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 18,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения ультрабольшие мультимеры составляют от 19,000 кДа до 20,000 кДа. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ, полученный с использованием данных способов, включает в себя любой паттерн мультимера, присутствующий в загружаемом образце рФфВ. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ, полученный с использованием данных способов, включает физиологически встречающиеся паттерны мультимеров, а также паттерны ультрабольших ФфВ-мультимеров.
[0075] В некоторых вариантах реализации изобретения композиция рФфВ, полученная описанным в данном документе способом очистки, имеет распределение олигомеров рФфВ, характеризующееся тем, что 95% олигомеров имеют от 6 субъединиц до 20 субъединиц. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция рФфВ имеет распределение олигомеров rVWF, характеризующееся тем, что 95% олигомеров имеют диапазон субъединиц, выбранный из вариаций 458-641, приведенных в Таблице 4.
Таблица 4. Типовые варианты реализации изобретения по распределению олигомеров рФфВ обнаруженных в композициях и использованных в способах, представленных в данном документе
<b>Субъединицы</b>
<b>Субъединицы</b>
<b>Субъединицы</b>
<b>Субъединицы</b>
2-40
Вар. 458
6-16
Вар. 504
12-20
Вар. 550
20-28
Вар. 596
2-38
Вар. 459
6-14
Вар. 505
12-18
Вар. 551
20-26
Вар. 597
2-36
Вар. 460
6-12
Вар. 506
12-16
Вар. 552
20-24
Вар. 598
2-34
Вар. 461
6-10
Вар. 507
12-14
Вар. 553
20-22
Вар. 599
2-32
Вар. 462
6-8
Вар. 508
14-40
Вар. 554
22-40
Вар. 600
2-30
Вар. 463
8-40
Вар. 509
14-38
Вар. 555
22-38
Вар. 601
2-28
Вар. 464
8-38
Вар. 510
14-36
Вар. 556
22-36
Вар. 602
2-26
Вар. 465
8-36
Вар. 511
14-34
Вар. 557
22-34
Вар. 603
2-24
Вар. 466
8-34
Вар. 512
14-32
Вар. 558
22-32
Вар. 604
2-22
Вар. 467
8-32
Вар. 513
14-30
Вар. 559
22-30
Вар. 605
2-20
Вар. 468
8-30
Вар. 514
14-28
Вар. 560
22-28
Вар. 606
2-18
Вар. 469
8-28
Вар. 515
14-26
Вар. 561
22-26
Вар. 607
2-16
Вар. 470
8-26
Вар. 516
14-24
Вар. 562
22-24
Вар. 608
2-14
Вар. 471
8-24
Вар. 517
14-22
Вар. 563
24-40
Вар. 609
2-12
Вар. 472
8-22
Вар. 518
14-20
Вар. 564
24-38
Вар. 610
2-10
Вар. 473
8-20
Вар. 519
14-18
Вар. 565
24-36
Вар. 611
2-8
Вар. 474
8-18
Вар. 520
14-16
Вар. 566
24-34
Вар. 612
4-40
Вар. 475
8-16
Вар. 521
16-40
Вар. 567
24-32
Вар. 613
4-38
Вар. 476
8-14
Вар. 522
16-38
Вар. 568
24-30
Вар. 614
4-36
Вар. 477
8-12
Вар. 523
16-36
Вар. 569
24-28
Вар. 615
4-34
Вар. 478
8-10
Вар. 524
16-34
Вар. 570
24-26
Вар. 616
4-32
Вар. 479
10-40
Вар. 525
16-32
Вар. 571
26-40
Вар. 617
4-30
Вар. 480
10-38
Вар. 526
16-30
Вар. 572
26-38
Вар. 618
4-28
Вар. 481
10-36
Вар. 527
16-28
Вар. 573
26-36
Вар. 619
4-26
Вар. 482
10-34
Вар. 528
16-26
Вар. 574
26-34
Вар. 620
4-24
Вар. 483
10-32
Вар. 529
16-24
Вар. 575
26-32
Вар. 621
4-22
Вар. 484
10-30
Вар. 530
16-22
Вар. 576
26-30
Вар. 622
4-20
Вар. 485
10-28
Вар. 531
16-20
Вар. 577
26-28
Вар. 623
4-18
Вар. 486
10-26
Вар. 532
16-18
Вар. 578
28-40
Вар. 624
4-16
Вар. 487
10-24
Вар. 533
18-40
Вар. 579
28-38
Вар. 625
4-14
Вар. 488
10-22
Вар. 534
18-38
Вар. 580
28-36
Вар. 626
4-12
Вар. 489
10-20
Вар. 535
18-36
Вар. 581
28-34
Вар. 627
4-10
Вар. 490
10-18
Вар. 536
18-34
Вар. 582
28-32
Вар. 628
4-8
Вар. 491
10-16
Вар. 537
18-32
Вар. 583
28-30
Вар. 629
6-40
Вар. 492
10-14
Вар. 538
18-30
Вар. 584
30-40
Вар. 630
6-38
Вар. 493
10-12
Вар. 539
18-28
Вар. 585
30-38
Вар. 631
6-36
Вар. 494
12-40
Вар. 540
18-26
Вар. 586
30-36
Вар. 632
6-34
Вар. 495
12-38
Вар. 541
18-24
Вар. 587
30-34
Вар. 633
6-32
Вар. 496
12-36
Вар. 542
18-22
Вар. 588
30-32
Вар. 634
6-30
Вар. 497
12-34
Вар. 543
18-20
Вар. 589
32-40
Вар. 635
6-28
Вар. 498
12-32
Вар. 544
20-40
Вар. 590
32-38
Вар. 636
6-26
Вар. 499
12-30
Вар. 545
20-38
Вар. 591
32-36
Вар. 637
6-24
Вар. 500
12-28
Вар. 546
20-36
Вар. 592
32-34
Вар. 638
6-22
Вар. 501
12-26
Вар. 547
20-34
Вар. 593
34-40
Вар. 639
6-20
Вар. 502
12-24
Вар. 548
20-32
Вар. 594
36-38
Вар. 640
6-18
Вар. 503
12-22
Вар. 549
20-30
Вар. 595
38-40
Вар. 641
Вар. = Вариация.
например
например
[0076] В некоторых вариантах реализации изобретения композиция рФфВ, полученная способами, представленными в данном документе документе, может быть охарактеризована в соответствии с процентным содержанием молекул рФфВ, которые присутствуют в конкретном мультимере рФфВ высшего порядка или мультимере большего размера. Например, в одном варианте реализации изобретения, по меньшей мере, 20% молекул рФфВ в композиции рФфВ, используемой в описанных в данном документе способах, присутствуют в олигомерном комплексе, состоящем по меньшей мере из 10 субъединиц. В другом варианте реализации изобретения, по меньшей мере, 20% молекул рФфВ в композиции рФфВ, используемой в описанных в данном документе способах, присутствуют в олигомерном комплексе, состоящем по меньшей мере из 12 субъединиц. Еще в других вариантах реализации изобретения композиция рФфВ, используемая в способах, представленных в данном документе, имеет минимальный процент (, имеет по меньшей мере X %) молекул рФфВ, присутствующих в конкретном мультимере рФфВ высшего порядка или мультимере большего размера (, мультимере по меньшей мере из Y субъединиц) в соответствии с любой из вариаций 134-457, приведенных в Таблицах с 5 по 7.
Таблица 5. Типовые варианты реализации изобретения по процентному содержанию молекул рФфВ, которые присутствуют в конкретном мультимере рФфВ высшего порядка или мультимере большего размера, обнаруженные в композициях и использованные в способах, представленных в данном документе
<b>Минимальное Количество Субъединиц в Мультимере рФфВ</b>
<b>6</b>
<b>8</b>
<b>10</b>
<b>12</b>
<b>14</b>
<b>16</b>
<b>Минимальный Процент Молекул рФфВ</b>
<b>10%</b>
Вар. 134
Вар. 152
Вар. 170
Вар. 188
Вар. 206
Вар. 224
<b>15%</b>
Вар. 135
Вар. 153
Вар. 171
Вар. 189
Вар. 207
Вар. 225
<b>20%</b>
Вар. 136
Вар. 154
Вар. 172
Вар. 190
Вар. 208
Вар. 226
<b>25%</b>
Вар. 137
Вар. 155
Вар. 173
Вар. 191
Вар. 209
Вар. 227
<b>30%</b>
Вар. 138
Вар. 156
Вар. 174
Вар. 192
Вар. 210
Вар. 228
<b>35%</b>
Вар. 139
Вар. 157
Вар. 175
Вар. 193
Вар. 211
Вар. 229
<b>40%</b>
Вар. 140
Вар. 158
Вар. 176
Вар. 194
Вар. 212
Вар. 230
<b>45%</b>
Вар. 141
Вар. 159
Вар. 177
Вар. 195
Вар. 213
Вар. 231
<b>50%</b>
Вар. 142
Вар. 160
Вар. 178
Вар. 196
Вар. 214
Вар. 232
<b>55%</b>
Вар. 143
Вар. 161
Вар. 179
Вар. 197
Вар. 215
Вар. 233
<b>60%</b>
Вар. 144
Вар. 162
Вар. 180
Вар. 198
Вар. 216
Вар. 234
<b>65%</b>
Вар. 145
Вар. 163
Вар. 181
Вар. 199
Вар. 217
Вар. 235
<b>70%</b>
Вар. 146
Вар. 164
Вар. 182
Вар. 200
Вар. 218
Вар. 236
<b>75%</b>
Вар. 147
Вар. 165
Вар. 183
Вар. 201
Вар. 219
Вар. 237
<b>80%</b>
Вар. 148
Вар. 166
Вар. 184
Вар. 202
Вар. 220
Вар. 238
<b>85%</b>
Вар. 149
Вар. 167
Вар. 185
Вар. 203
Вар. 221
Вар. 239
<b>90%</b>
Вар. 150
Вар. 168
Вар. 186
Вар. 204
Вар. 222
Вар. 240
<b>95%</b>
Вар. 151
Вар. 169
Вар. 187
Вар. 205
Вар. 223
Вар. 241
Вар. = Вариация.
Таблица 6. Типовые варианты реализации изобретения по процентному содержанию молекул рФфВ, которые присутствуют в конкретном мультимере рФфВ высшего порядка или мультимере большего размера, обнаруженные в композициях и использованные в способах, представленных в данном документе
<b>Минимальное Количество Субъединиц в Мультимере рФфВ</b>
<b>18</b>
<b>20</b>
<b>22</b>
<b>24</b>
<b>26</b>
<b>28</b>
<b>Минимальный Процент Молекул рФфВ</b>
<b>10%</b>
Вар. 242
Вар. 260
Вар. 278
Вар. 296
Вар. 314
Вар. 332
<b>15%</b>
Вар. 243
Вар. 261
Вар. 279
Вар. 297
Вар. 315
Вар. 333
<b>20%</b>
Вар. 244
Вар. 262
Вар. 280
Вар. 298
Вар. 316
Вар. 334
<b>25%</b>
Вар. 245
Вар. 263
Вар. 281
Вар. 299
Вар. 317
Вар. 335
<b>30%</b>
Вар. 246
Вар. 264
Вар. 282
Вар. 300
Вар. 318
Вар. 336
<b>35%</b>
Вар. 247
Вар. 265
Вар. 283
Вар. 301
Вар. 319
Вар. 337
<b>40%</b>
Вар. 248
Вар. 266
Вар. 284
Вар. 302
Вар. 320
Вар. 338
<b>45%</b>
Вар. 249
Вар. 267
Вар. 285
Вар. 303
Вар. 321
Вар. 339
<b>50%</b>
Вар. 250
Вар. 268
Вар. 286
Вар. 304
Вар. 322
Вар. 340
<b>55%</b>
Вар. 251
Вар. 269
Вар. 287
Вар. 305
Вар. 323
Вар. 341
<b>60%</b>
Вар. 252
Вар. 270
Вар. 288
Вар. 306
Вар. 324
Вар. 342
<b>65%</b>
Вар. 253
Вар. 271
Вар. 289
Вар. 307
Вар. 325
Вар. 343
<b>70%</b>
Вар. 254
Вар. 272
Вар. 290
Вар. 308
Вар. 326
Вар. 344
<b>75%</b>
Вар. 255
Вар. 273
Вар. 291
Вар. 309
Вар. 327
Вар. 345
<b>80%</b>
Вар. 256
Вар. 274
Вар. 292
Вар. 310
Вар. 328
Вар. 346
<b>85%</b>
Вар. 257
Вар. 275
Вар. 293
Вар. 311
Вар. 329
Вар. 347
<b>90%</b>
Вар. 258
Вар. 276
Вар. 294
Вар. 312
Вар. 330
Вар. 348
<b>95%</b>
Вар. 259
Вар. 277
Вар. 295
Вар. 313
Вар. 331
Вар. 349
Вар. = Вариация.
Таблица 7. Типовые варианты реализации изобретения по процентному содержанию молекул рФфВ, которые присутствуют в конкретном мультимере рФфВ высшего порядка или мультимере большего размера, обнаруженные в композициях и использованные в способах, представленных в данном документе
<b>Минимальное Количество Субъединиц в Мультимере рФфВ</b>
<b>30</b>
<b>32</b>
<b>34</b>
<b>36</b>
<b>38</b>
<b>40</b>
<b>Минимальный Процент Молекул рФфВ</b>
<b>10%</b>
Вар. 350
Вар. 368
Вар. 386
Вар. 404
Вар. 422
Вар. 440
<b>15%</b>
Вар. 351
Вар. 369
Вар. 387
Вар. 405
Вар. 423
Вар. 441
<b>20%</b>
Вар. 352
Вар. 370
Вар. 388
Вар. 406
Вар. 424
Вар. 442
<b>25%</b>
Вар. 353
Вар. 371
Вар. 389
Вар. 407
Вар. 425
Вар. 443
<b>30%</b>
Вар. 354
Вар. 372
Вар. 390
Вар. 408
Вар. 426
Вар. 444
<b>35%</b>
Вар. 355
Вар. 373
Вар. 391
Вар. 409
Вар. 427
Вар. 445
<b>40%</b>
Вар. 356
Вар. 374
Вар. 392
Вар. 410
Вар. 428
Вар. 446
<b>45%</b>
Вар. 357
Вар. 375
Вар. 393
Вар. 411
Вар. 429
Вар. 447
<b>50%</b>
Вар. 358
Вар. 376
Вар. 394
Вар. 412
Вар. 430
Вар. 448
<b>55%</b>
Вар. 359
Вар. 377
Вар. 395
Вар. 413
Вар. 431
Вар. 449
<b>60%</b>
Вар. 360
Вар. 378
Вар. 396
Вар. 414
Вар. 432
Вар. 450
<b>65%</b>
Вар. 361
Вар. 379
Вар. 397
Вар. 415
Вар. 433
Вар. 451
<b>70%</b>
Вар. 362
Вар. 380
Вар. 398
Вар. 416
Вар. 434
Вар. 452
<b>75%</b>
Вар. 363
Вар. 381
Вар. 399
Вар. 417
Вар. 435
Вар. 453
<b>80%</b>
Вар. 364
Вар. 382
Вар. 400
Вар. 418
Вар. 436
Вар. 454
<b>85%</b>
Вар. 365
Вар. 383
Вар. 401
Вар. 419
Вар. 437
Вар. 455
<b>90%</b>
Вар. 366
Вар. 384
Вар. 402
Вар. 420
Вар. 438
Вар. 456
<b>95%</b>
Вар. 367
Вар. 385
Вар. 403
Вар. 421
Вар. 439
Вар. 457
Вар. = Вариация.
[0077] В соответствии с вышеизложенным, рФфВ обычно содержит значительный процент высокомолекулярных (ВМ) мультимеров рФфВ. В дополнительных вариантах реализации изобретения композиция ВМ мультимеров рФфВ содержит по меньшей мере 10% - 80% декамеров рФфВ или мультимеров высшего порядка. В дополнительных вариантах реализации изобретения композиция содержит около 10-95%, 20-90%, 30-85%, 40-80%, 50-75%, 60-70% декамеров или мультимеров высшего порядка. В дополнительных вариантах реализации изобретения композиция ВМ мультимеров рФфВ содержит по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% декамеров или мультимеров высшего порядка.
et al.
et al.
[0078] Оценка количества и процентного содержания мультимеров рФфВ может проводиться с использованием способов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, способы с использованием электрофореза и эксклюзионной хроматографии для разделения мультимеров рФфВ по размеру, например, как обсуждалось Cumming et al, (J Clin Pathol. 1993 May; 46(5): 470-473, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров рФфВ). Такие подходы могут дополнительно включать способы иммуноблоттинга (такие как вестерн-блот), в которых гель иммуноблоттируется с радиоактивно меченным антителом против ФфВ с последующим хемилюминесцентным детектированием (см., например, Wen , (1993), J. Clin. Lab. Anal., 7: 317-323, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с оценкой мультимеров рФфВ). Дополнительные анализы для ФфВ включают анализ Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Ристоцетин-Кофакторной активности ФфВ (ФфВ:РКо) и Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КСА), которые часто используются для диагностики и классификации болезни фон Виллебранда. (см., например, Favaloro , Pathology, 1997, 29(4): 341-456, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с анализами для ФфВ).
[0079] В некоторых вариантах реализации изобретения соотношение прокоагулянтной активности рФVIII (МЕ рФVIII:К (rFVIII:C)) к ристоцетин-кофакторной активности рФфВ (МЕ рФфВ:РКо (rVWF:RCo)) для рФфВ, полученного в соответствии со способами по данному изобретению, составляет от 3:1 до 1:5. В дополнительных вариантах реализации изобретения соотношение составляет от 2:1 до 1:4. В дополнительных вариантах реализации изобретения соотношение составляет от 5:2 до 1:4. В дополнительных вариантах реализации изобретения соотношение составляет от 3:2 до 1:3. В еще дополнительных вариантах реализации изобретения соотношение составляет около 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 2:1, 2:3, 2:4, 2:5, 3:1, 3:2, 3:4, или 3:5. В дополнительных вариантах реализации изобретения соотношение составляет от 1:1 до 1:2. В еще дополнительных вариантах реализации изобретния соотношение составляет 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1 или 2:1. В некоторых вариантах реализации изобретния соотношение прокоагулянтной активности рФVIII (МЕ рФVIII:К) к ристоцетин-кофакторной активности рФфВ (МЕ рФфВ:РКо) в композиции, полезной для способа, описанного в данном документе, выбрано из вариантов с 1988 по 2140, приведенных в Таблице 8.
Таблица 8. Типовые варианты реализации изобретения по соотношению прокоагулянтной активности рФVIII (МЕ рФVIII:К) к ристоцетин-кофакторной активности рФфВ (МЕ рФфВ:РКо), обнаруженные в композициях и использованные в способах, представленных в данном документе
<b>(МЕ рФVIII:</b><b>К) к (МЕ рФфВ:</b><b>РКо)</b>
<b>(МЕ рФVIII:</b><b>К) к (МЕ рФфВ:</b><b>РКо)</b>
<b>(МЕ рФVIII:К) к (МЕ рФфВ:</b><b>РКо)</b>
<b>(МЕ рФVIII:К) к (МЕ рФфВ:</b><b>РКо)</b>
4:1
Вар. 1988
3:1-3:5
Вар. 2027
4:3-1:4
Вар. 2065
4:5-2:3
Вар. 2103
3:1
Вар. 1989
3:1-2:3
Вар. 2028
4:3-1:3
Вар. 2066
4:5-3:4
Вар. 2104
2:1
Вар. 1990
3:1-3:4
Вар. 2029
4:3-2:5
Вар. 2067
3:4-1:6
Вар. 2105
3:2
Вар. 1991
3:1-4:5
Вар. 2030
4:3-1:2
Вар. 2068
3:4-1:5
Вар. 2106
4:3
Вар. 1992
3:1-5:6
Вар. 2031
4:3-3:5
Вар. 2069
3:4-1:4
Вар. 2107
1:1
Вар. 1993
3:1-1:1
Вар. 2032
4:3-2:3
Вар. 2070
3:4-1:3
Вар. 2108
5:6
Вар. 1994
3:1-4:3
Вар. 2033
4:3-3:4
Вар. 2071
3:4-2:5
Вар. 2109
4:5
Вар. 1995
3:1-3:2
Вар. 2034
4:3-4:5
Вар. 2072
3:4-1:2
Вар. 2110
3:4
Вар. 1996
3:1-2:1
Вар. 2035
4:3-5:6
Вар. 2073
3:4-3:5
Вар. 2111
2:3
Вар. 1997
2:1-1:6
Вар. 2036
4:3-1:1
Вар. 2074
3:4-2:3
Вар. 2112
3:5
Вар. 1998
2:1-1:5
Вар. 2037
1:1-1:6
Вар. 2075
2:3-1:6
Вар. 2113
1:2
Вар. 1999
2:1-1:4
Вар. 2038
1:1-1:5
Вар. 2076
2:3-1:5
Вар. 2114
2:5
Вар. 2000
2:1-1:3
Вар. 2039
1:1-1:4
Вар. 2077
2:3-1:4
Вар. 2115
1:3
Вар. 2001
2:1-2:5
Вар. 2040
1:1-1:3
Вар. 2078
2:3-1:3
Вар. 2116
1:4
Вар. 2002
2:1-1:2
Вар. 2041
1:1-2:5
Вар. 2079
2:3-2:5
Вар. 2117
1:5
Вар. 2003
2:1-3:5
Вар. 2042
1:1-1:2
Вар. 2080
2:3-1:2
Вар. 2118
1:6
Вар. 2004
2:1-2:3
Вар. 2043
1:1-3:5
Вар. 2081
2:3-3:5
Вар. 2119
4:1-1:6
Вар. 2005
2:1-3:4
Вар. 2044
1:1-2:3
Вар. 2082
3:5-1:6
Вар. 2120
4:1-1:5
Вар. 2006
2:1-4:5
Вар. 2045
1:1-3:4
Вар. 2083
3:5-1:5
Вар. 2121
4:1-1:4
Вар. 2007
2:1-5:6
Вар. 2046
1:1-4:5
Вар. 2084
3:5-1:4
Вар. 2122
4:1-1:3
Вар. 2008
2:1-1:1
Вар. 2047
1:1-5:6
Вар. 2085
3:5-1:3
Вар. 2123
4:1-2:5
Вар. 2009
2:1-4:3
Вар. 2048
5:6-1:6
Вар. 2086
3:5-2:5
Вар. 2124
4:1-1:2
Вар. 2010
2:1-3:2
Вар. 2049
5:6-1:5
Вар. 2087
3:5-1:2
Вар. 2125
4:1-3:5
Вар. 2011
3:2-1:6
Вар. 2050
5:6-1:4
Вар. 2088
1:2-1:6
Вар. 2126
4:1-2:3
Вар. 2012
3:2-1:5
Вар. 2051
5:6-1:3
Вар. 2089
1:2-1:5
Вар. 2127
4:1-3:4
Вар. 2013
3:2-1:4
Вар. 2052
5:6-2:5
Вар. 2090
1:2-1:4
Вар. 2128
4:1-4:5
Вар. 2014
3:2-1:3
Вар. 2053
5:6-1:2
Вар. 2091
1:2-1:3
Вар. 2129
4:1-5:6
Вар. 2015
3:2-2:5
Вар. 2054
5:6-3:5
Вар. 2092
1:2-2:5
Вар. 2130
4:1-1:1
Вар. 2016
3:2-1:2
Вар. 2055
5:6-2:3
Вар. 2093
2:5-1:6
Вар. 2131
4:1-4:3
Вар. 2017
3:2-3:5
Вар. 2056
5:6-3:4
Вар. 2094
2:5-1:5
Вар. 2132
4:1-3:2
Вар. 2018
3:2-2:3
Вар. 2057
5:6-4:5
Вар. 2095
2:5-1:4
Вар. 2133
4:1-2:1
Вар. 2019
3:2-3:4
Вар. 2058
4:5-1:6
Вар. 2096
2:5-1:3
Вар. 2134
4:1-3:1
Вар. 2020
3:2-4:5
Вар. 2059
4:5-1:5
Вар. 2097
1:3-1:6
Вар. 2135
3:1-1:6
Вар. 2021
3:2-5:6
Вар. 2060
4:5-1:4
Вар. 2098
1:3-1:5
Вар. 2136
3:1-1:5
Вар. 2022
3:2-1:1
Вар. 2061
4:5-1:3
Вар. 2099
1:3-1:4
Вар. 2137
3:1-1:4
Вар. 2023
3:2-4:3
Вар. 2062
4:5-2:5
Вар. 2100
1:4-1:6
Вар. 2138
3:1-1:3
Вар. 2024
4:3-1:6
Вар. 2063
4:5-1:2
Вар. 2101
1:4-1:5
Вар. 2139
3:1-2:5
Вар. 2025
4:3-1:5
Вар. 2064
4:5-3:5
Вар. 2102
1:5-1:6
Вар. 2140
3:1-1:2
Вар. 2026
Вар. = Вариация.
[0080] В дополнительных вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка согласно изобретению стабильны в течение от около 1 до около 90 часов после введения. В еще дополнительных вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка стабильны в течение около 5-80, 10-70, 15-60, 20-50, 25-40, 30-35 часов после введения. В еще дополнительных вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка стабильны в течение по меньшей мере 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 часов после введения. В некоторых вариантах реализации изобретения стабильность мультимеров рФфВ оценивают in vitro.
[0081] В одном варианте реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка, используемые в композициях и способах, представленных в данном документе, имеют период полувыведения по меньшей мере 12 часов после введения. В другом варианте реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка имеют период полувыведения по меньшей мере 24 часа после введения. В еще других вариантах реализации изобретения мультимеры рФфВ высшего порядка имеют период полувыведения, выбранный из вариаций 642-1045, приведенных в Таблице 9.
Таблица 9. Типовые варианты реализации изобретения по периоду полувыведения мультимеров рФфВ высшего порядка, обнаруженных в композициях, полученных способами, представленными в данном документе
<b>Часы</b>
<b>Часы</b>
<b>Часы</b>
<b>Часы</b>
по меньшей мере 1
Вар. 642
4-22
Вар. 743
14-78
Вар. 844
24-30
Вар. 945
по меньшей мере 2
Вар. 643
4-20
Вар. 744
14-72
Вар. 845
24-27
Вар. 946
по меньшей мере 3
Вар. 644
4-18
Вар. 745
14-66
Вар. 846
27-90
Вар. 947
по меньшей мере 4
Вар. 645
4-16
Вар. 746
14-60
Вар. 847
27-84
Вар. 948
по меньшей мере 5
Вар. 646
4-14
Вар. 747
14-54
Вар. 848
27-78
Вар. 949
по меньшей мере 6
Вар. 647
4-12
Вар. 748
14-48
Вар. 849
27-72
Вар. 950
по меньшей мере 7
Вар. 648
4-10
Вар. 749
14-45
Вар. 850
27-66
Вар. 951
по меньшей мере 8
Вар. 649
4-8
Вар. 750
14-42
Вар. 851
27-60
Вар. 952
по меньшей мере 9
Вар. 650
4-6
Вар. 751
14-39
Вар. 852
27-54
Вар. 953
по меньшей мере 10
Вар. 651
6-90
Вар. 752
14-36
Вар. 853
27-48
Вар. 954
по меньшей мере 11
Вар. 652
6-84
Вар. 753
14-33
Вар. 854
30-90
Вар. 955
по меньшей мере 12
Вар. 653
6-78
Вар. 754
14-30
Вар. 855
30-84
Вар. 956
по меньшей мере 14
Вар. 654
6-72
Вар. 755
14-27
Вар. 856
30-78
Вар. 957
по меньшей мере 16
Вар. 655
6-66
Вар. 756
14-24
Вар. 857
30-72
Вар. 958
по меньшей мере 18
Вар. 656
6-60
Вар. 757
14-22
Вар. 858
30-66
Вар. 959
по меньшей мере 20
Вар. 657
6-54
Вар. 758
14-20
Вар. 859
30-60
Вар. 960
по меньшей мере 22
Вар. 658
6-48
Вар. 759
14-18
Вар. 860
30-54
Вар. 961
по меньшей мере 24
Вар. 659
6-45
Вар. 760
14-16
Вар. 861
30-48
Вар. 962
по меньшей мере 27
Вар. 660
6-42
Вар. 761
16-90
Вар. 862
30-45
Вар. 963
по меньшей мере 30
Вар. 661
6-39
Вар. 762
16-84
Вар. 863
30-42
Вар. 964
по меньшей мере 33
Вар. 662
6-36
Вар. 763
16-78
Вар. 864
30-39
Вар. 965
по меньшей мере 36
Вар. 663
6-33
Вар. 764
16-72
Вар. 865
30-36
Вар. 966
по меньшей мере 39
Вар. 664
6-30
Вар. 765
16-66
Вар. 866
30-33
Вар. 967
по меньшей мере 42
Вар. 665
6-27
Вар. 766
16-60
Вар. 867
33-90
Вар. 968
по меньшей мере 45
Вар. 666
6-24
Вар. 767
16-54
Вар. 868
33-84
Вар. 969
по меньшей мере 48
Вар. 667
6-22
Вар. 768
16-48
Вар. 869
33-78
Вар. 970
по меньшей мере 54
Вар. 668
6-20
Вар. 769
16-45
Вар. 870
33-72
Вар. 971
по меньшей мере 60
Вар. 669
6-18
Вар. 770
16-42
Вар. 871
33-66
Вар. 972
по меньшей мере 66
Вар. 670
6-16
Вар. 771
16-39
Вар. 872
33-60
Вар. 973
по меньшей мере 72
Вар. 671
6-14
Вар. 772
16-36
Вар. 873
33-54
Вар. 974
по меньшей мере 78
Вар. 672
6-12
Вар. 773
16-33
Вар. 874
33-48
Вар. 975
по меньшей мере 84
Вар. 673
6-10
Вар. 774
16-30
Вар. 875
33-45
Вар. 976
по меньшей мере 90
Вар. 674
6-8
Вар. 775
16-27
Вар. 876
33-42
Вар. 977
2-90
Вар. 675
8-90
Вар. 776
16-24
Вар. 877
33-29
Вар. 978
2-84
Вар. 676
8-84
Вар. 777
16-22
Вар. 878
33-36
Вар. 979
2-78
Вар. 677
8-78
Вар. 778
16-20
Вар. 879
36-90
Вар. 980
2-72
Вар. 678
8-72
Вар. 779
16-18
Вар. 880
36-84
Вар. 981
2-66
Вар. 679
8-66
Вар. 780
18-90
Вар. 881
36-78
Вар. 982
2-60
Вар. 680
8-60
Вар. 781
18-84
Вар. 882
36-72
Вар. 983
2-54
Вар. 681
8-54
Вар. 782
18-78
Вар. 883
36-66
Вар. 984
2-48
Вар. 682
8-48
Вар. 783
18-72
Вар. 884
36-60
Вар. 985
2-45
Вар. 683
8-45
Вар. 784
18-66
Вар. 885
36-54
Вар. 986
2-42
Вар. 684
8-42
Вар. 785
18-60
Вар. 886
36-48
Вар. 987
2-39
Вар. 685
8-39
Вар. 786
18-54
Вар. 887
36-45
Вар. 988
2-36
Вар. 686
8-36
Вар. 787
18-48
Вар. 888
36-42
Вар. 989
2-33
Вар. 687
8-33
Вар. 788
18-45
Вар. 889
36-39
Вар. 990
2-30
Вар. 688
8-30
Вар. 789
18-42
Вар. 890
39-90
Вар. 991
2-27
Вар. 689
8-27
Вар. 790
18-39
Вар. 891
39-84
Вар. 992
2-24
Вар. 690
8-24
Вар. 791
18-36
Вар. 892
39-78
Вар. 993
2-22
Вар. 691
8-22
Вар. 792
18-33
Вар. 893
39-72
Вар. 994
2-20
Вар. 692
8-20
Вар. 793
18-30
Вар. 894
39-66
Вар. 995
2-18
Вар. 693
8-18
Вар. 794
18-27
Вар. 895
39-60
Вар. 996
2-16
Вар. 694
8-16
Вар. 795
18-24
Вар. 896
39-54
Вар. 997
2-14
Вар. 695
8-14
Вар. 796
18-22
Вар. 897
39-48
Вар. 998
2-12
Вар. 696
8-12
Вар. 797
18-20
Вар. 898
39-45
Вар. 999
2-10
Вар. 697
8-10
Вар. 798
20-90
Вар. 899
39-42
Вар. 1000
2-8
Вар. 698
10-90
Вар. 799
20-84
Вар. 900
42-90
Вар. 1001
2-6
Вар. 699
10-84
Вар. 800
20-78
Вар. 901
42-84
Вар. 1002
2-4
Вар. 700
10-78
Вар. 801
20-72
Вар. 902
42-78
Вар. 1003
3-90
Вар. 701
10-72
Вар. 802
20-66
Вар. 903
42-72
Вар. 1004
3-84
Вар. 702
10-66
Вар. 803
20-60
Вар. 904
42-66
Вар. 1005
3-78
Вар. 703
10-60
Вар. 804
20-54
Вар. 905
42-60
Вар. 1006
3-72
Вар. 704
10-54
Вар. 805
20-48
Вар. 906
42-54
Вар. 1007
3-66
Вар. 705
10-48
Вар. 806
20-45
Вар. 907
42-48
Вар. 1008
3-60
Вар. 706
10-45
Вар. 807
20-42
Вар. 908
42-45
Вар. 1009
3-54
Вар. 707
10-42
Вар. 808
20-39
Вар. 909
45-90
Вар. 1010
3-48
Вар. 708
10-39
Вар. 809
20-36
Вар. 910
45-84
Вар. 1011
3-45
Вар. 709
10-36
Вар. 810
20-33
Вар. 911
45-78
Вар. 1012
3-42
Вар. 710
10-33
Вар. 811
20-30
Вар. 912
45-72
Вар. 1013
3-39
Вар. 711
10-30
Вар. 812
20-27
Вар. 913
45-66
Вар. 1014
3-36
Вар. 712
10-27
Вар. 813
20-24
Вар. 914
45-60
Вар. 1015
3-33
Вар. 713
10-24
Вар. 814
20-22
Вар. 915
45-54
Вар. 1016
3-30
Вар. 714
10-22
Вар. 815
22-90
Вар. 916
45-48
Вар. 1017
3-27
Вар. 715
10-20
Вар. 816
22-84
Вар. 917
48-90
Вар. 1018
3-24
Вар. 716
10-18
Вар. 817
22-78
Вар. 918
48-84
Вар. 1019
3-22
Вар. 717
10-16
Вар. 818
22-72
Вар. 919
48-78
Вар. 1020
3-20
Вар. 718
10-14
Вар. 819
22-66
Вар. 920
48-72
Вар. 1021
3-18
Вар. 719
10-12
Вар. 820
22-60
Вар. 921
48-66
Вар. 1022
3-16
Вар. 720
12-90
Вар. 821
22-54
Вар. 922
48-60
Вар. 1023
3-14
Вар. 721
12-84
Вар. 822
22-48
Вар. 923
48-54
Вар. 1024
3-12
Вар. 722
12-78
Вар. 823
22-45
Вар. 924
54-90
Вар. 1025
3-10
Вар. 723
12-72
Вар. 824
22-42
Вар. 925
54-84
Вар. 1026
3-8
Вар. 724
12-66
Вар. 825
22-39
Вар. 926
54-78
Вар. 1027
3-6
Вар. 725
12-60
Вар. 826
22-36
Вар. 927
54-72
Вар. 1028
3-4
Вар. 726
12-54
Вар. 827
22-33
Вар. 928
54-66
Вар. 1029
4-90
Вар. 727
12-48
Вар. 828
22-30
Вар. 929
54-60
Вар. 1030
4-84
Вар. 728
12-45
Вар. 829
22-27
Вар. 930
60-90
Вар. 1031
4-78
Вар. 729
12-42
Вар. 830
22-24
Вар. 931
60-84
Вар. 1032
4-72
Вар. 730
12-39
Вар. 831
24-90
Вар. 932
60-78
Вар. 1033
4-66
Вар. 731
12-36
Вар. 832
24-84
Вар. 933
60-72
Вар. 1034
4-60
Вар. 732
12-33
Вар. 833
24-78
Вар. 934
60-66
Вар. 1035
4-54
Вар. 733
12-30
Вар. 834
24-72
Вар. 935
66-90
Вар. 1036
4-48
Вар. 734
12-27
Вар. 835
24-66
Вар. 936
66-84
Вар. 1037
4-45
Вар. 735
12-24
Вар. 836
24-60
Вар. 937
66-78
Вар. 1038
4-42
Вар. 736
12-22
Вар. 837
24-54
Вар. 938
66-72
Вар. 1039
4-39
Вар. 737
12-20
Вар. 838
24-48
Вар. 939
72-90
Вар. 1040
4-36
Вар. 738
12-18
Вар. 839
24-45
Вар. 940
72-84
Вар. 1041
4-33
Вар. 739
12-16
Вар. 840
24-42
Вар. 941
72-78
Вар. 1042
4-30
Вар. 740
12-14
Вар. 841
24-39
Вар. 942
78-90
Вар. 1043
4-27
Вар. 741
14-90
Вар. 842
24-36
Вар. 943
78-84
Вар. 1044
4-24
Вар. 742
14-84
Вар. 843
24-33
Вар. 944
84-90
Вар. 1045
Вар. = Вариация.
[0082] В некоторых вариантах реализации изобретения про-рФфВ и/или очищенный рФфВ, очищенный в соответствии с данным изобретением, не модифицируется какими-либо конъюгационными, посттрансляционными или ковалентными модификациями. В конкретных вариантах реализации изобретения про-рФфВ и/или очищенный рФфВ по данному изобретению не модифицирован водорастворимым полимером, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиалкилен, полисиаловую кислоту, гидроксиэтилкрахмал, поли-углеводный фрагмент, и тому подобное.
[0083] В некоторых вариантах реализации изобретения про-рФфВ и/или очищенный рФфВ, очищенный в соответствии с данным изобретением, модифицирован посредством конъюгации, посттрансляционной модификации или ковалентной модификации, включая модификации N- или C-концевых остатков, а также модификации выбранных боковых цепей, например, на свободных сульфгидрильных группах, первичных аминах и гидроксильных группах. В одном варианте реализации изобретения водорастворимый полимер связан с белком (напрямую или через линкер) лизиновой группой или другим первичным амином. В некоторых вариантах реализации изобретения про-рФфВ и/или очищенный рФфВ по данному изобретению могут быть модифицированы путем конъюгации водорастворимого полимера, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиалкилен, полисиаловую кислоту, гидроксилэтилкрахмал, поли-углеводородный фрагмент и тому подобное.
nd
[0084] Водорастворимые полимеры, которые можно использовать для модификации про-рФфВ и/или очищенного рФфВ, включают линейные и разветвленные структуры. Конъюгированные полимеры могут быть присоединены непосредственно к коагулятному белку коагуляции по изобретению или, альтернативно, могут быть присоединены через связующий фрагмент. Неограничивающие примеры конъюгации белков с водорастворимыми полимерами можно найти в патентах США № 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192, и 4179337, а также в Abuchowski and Davis “Enzymes as Drugs,” Holcenberg and Roberts, Eds., pp. 367 383, John Wiley and Sons, New York (1981), и Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2 Ed., Academic Press, Inc. 2008.
nd
3
4
[0085] Конъюгация белков может быть выполнена с помощью ряда хорошо известных в данной области подходов, например, см. Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2 Ed., Academic Press, Inc. 2008. Примеры включают соединение через пептидную связь между карбоксильной группой на одном из коагулянтных белков или водорастворимом полимерном фрагменте и аминогруппой другого белка или фрагмента, или сложноэфирное соединение между карбоксильной группой с одной стороны и гидроксильной группой с другой стороны. Другое соединение, с помощью которого коагулянтный белок по данному изобретению может быть конъюгирован с водорастворимым полимерным веществом, происходит через основание Шиффа между свободной аминогруппой на полимерном фрагменте, реагирующей с альдегидной группой, образованной на невосстанавливающем конце полимера путем окисления периодатом (Jennings and Lugowski, J. Immunol. 1981; 127:1011-8; Femandes and Gregonradis, Biochim Biophys Acta. 1997; 1341; 26-34). Генерируемое основание Шиффа может быть стабилизировано путем специфического восстановления NaCNBH с образованием вторичного амина. Альтернативным подходом является образование концевых свободных аминогрупп на полимере путем восстановительного аминирования NHCl после предварительного окисления. Бифункциональные реагенты могут быть использованы для связывания двух аминогрупп или двух гидроксильных групп. Например, полимер, содержащий аминогруппу, может быть соединен с аминогруппой коагулянтного белка с помощью таких реагентов, как BS3 (Бис(сульфосукцинимидил)суберат/Pierce, Rockford, Ill.). Кроме того, гетеробифункциональные сшивающие реагенты, такие как Sulfo-EMCS (N-ε-Малеимидокапроилокси) сульфосукцинимидный эфир/Pierce), могут быть использованы, например, для связывания аминогрупп и тиоловых групп. В других вариантах реализации изобретения группа, реагирующая с альдегидом, такая как ПЭГ алкоксид плюс диэтилацеталь бромацетальдегида; ПЭГ плюс ДМСО и уксусный ангидрид, а также ПЭГ хлорид плюс феноксид 4-гидроксибензальдегида, сукцинимидильные активные эфиры, активированный дитиокарбонат ПЭГ, 2,4,5-трихлорфенилхлорформиат и P-нитрофенилхлорформиат активированный ПЭГ, могут использоваться в конъюгации коагулянтного белка.
[0086] Другой способ измерения биологической активности ФфВ представляет собой анализ связывания коллагена, основанный на способе твердофазного ИФА (Brown et Bosak, Thromb. Res., 1986, 43:303-311; Favaloro, Thromb. Haemost., 2000, 83 127-135). Микротитрационный планшет покрыт коллагеном типа I или III. Затем ФфВ связывается с поверхностью коллагена и впоследствии детектируется с помощью меченного ферментом поликлонального антитела. Последним этапом является реакция субстрата, которую можно фотометрически фиксировать с помощью считывающего устройства ИФА.
[0087] Иммунологические анализы факторов фон Виллебранда (ФфВ: Aг) представляют собой иммуноанализы, которые измеряют концентрацию белка ФфВ в плазме. Они не дают никаких указаний относительно функции ФфВ. Существует ряд способов измерения ФфВ:Aг, и они включают как твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), так и автоматизированный иммуноанализ с латексной агглютинацией (ЛА, (LIA)). Многие лаборатории в настоящее время используют полностью автоматизированный иммуноанализ с латексной агглютинацией. Исторически в лабораториях использовались различные способы, включая электроиммуноанализ по Лореллу 'Ракетный Иммуноэлектрофорез Лорелла', но сегодня они редко используются в большинстве лабораторий.
Наборы
например
[0088] В качестве дополнительного аспекта, изобретение включает наборы, которые содержат одну или более лиофилизированных композиций, упакованных таким образом, который облегчает их использование для введения субъектам. В одном варианте реализации изобретения такой набор включает фармацевтический препарат, описанный в данном документе (, композицию, содержащую терапевтический белок или пептид), упакованный в емкость, такую как герметичный флакон или резервуар, с этикеткой, прикрепленной к емкости или включенной в упаковку, которая описывает применение соединения или композиции при осуществлении способа. В одном варианте реализации изобретения фармацевтический препарат упакован в емкость так, что количество свободного пространства в емкости (например, количество воздуха между жидким препаратом и верхней частью емкости) очень мало. Предпочтительно количество свободного пространства незначительно (например, почти отсутствует). В одном варианте реализации изобретения набор содержит одну емкость, содержащую терапевтическую композицию белка или пептида, и вторую емкость, содержащую физиологически приемлемый раствор для восстановления композиции. В одном аспекте фармацевтический препарат упакован в стандартную лекарственную форму. Набор может дополнительно включать устройство, подходящее для введения фармацевтического препарата в соответствии с конкретным путем введения. Предпочтительно набор содержит этикетку, которая описывает использование фармацевтических препаратов.
рФфВ для способов предварительного лечения пациентов с БфВ, Подвергшихся Хирургическому Вмешательству
[0089] Одним из преимуществ введения рФфВ субъектам с тяжелой формой БфВ для подготовки к хирургическому вмешательству является то, что более высокая специфическая активность рФфВ по сравнению с ппФфВ обеспечивает гибкость в отношении количества вводимого рФфВ и количества повторных дозировок субъекту. Как будет понятно и как будет более подробно обсуждается в данном документе, совместно вводимый ФVIII может быть рекомбинантным или полученным из плазмы.
например
[0090] Однократное или многократное введение рФфВ проводится с учетом уровней дозы и схемы, которые выбирает лечащий врач. Для профилактики или лечения заболевания подходящая дозировка зависит от типа заболевания, которое нужно лечить (, болезнь фон Виллебранда), тяжести и течения заболевания, от того, вводится ли лекарство в профилактических или терапевтических целях, от предшествующей терапии, истории болезни пациента и реакции на препарат, а также мнения лечащего врача.
например
например
[0091] В некоторых аспектах рФфВ вводят субъекту до хирургического вмешательства в диапазоне от 20 до 60 МЕ/кг, , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 20-60, 35-70, 20-40, 35-60, 45-60, 45-55, 45-50, 50-60, 55-60 или 50-55 МЕ/кг. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ вводят от 12 часов до 24 часов, , 12 часов, 13 часов, 14 часов, 15 часов, 16 часов, 17 часов, 18 часов, 19 часов, 20 часов, 21 час, 22 часа, 23 часа, 24 часа, 12 часов и 24 часа, 14 часов и 24 часа, 16 и 24 часа, 18 часов и 24 часа, или 20 часов и 24 часа до хирургического вмешательства. В некоторых аспектах фактор VIII (ФVIII) не вводится вместе с рФфВ до хирургического вмешательства.
например
например
[0092] В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ вводят субъекту в диапазоне 5-90 МЕ/кг, , 5-90, 5-50, 10-90, 15-90, 20-90, 30-90, 40-90 50-90, 60-90, 70-90, 80-90, 5-80, 10-70, 20-60, 30-50, 35-60, 5-50, 5-40, 5-30. 5-20, 10-90, 10-50 или 20-40 МЕ/кг за 1 час до операции. В других вариантах реализации изобретения рФфВ вводят в дозе 70-200 МЕ/кг, , 70-200, 80-200, 90-200, 100-200, 110-200, 120-200, 130-200, 130 -200, 140-200, 150-200, 160-200, 170-200, 180-200, 190-200, 70-170, 80-180, 60-160, 50-150, 40-140, 30, 130, 20-120, 10-110, 70-100 или 70-90 МЕ/кг после операции. В некоторых случаях хирургическое вмешательство выбирается из группы, состоящей из обширного хирургического вмешательства, малого хирургического вмешательства или челюстно-лицевого хирургического вмешательства.
[0093] В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 35-60 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до обширного хирургического вмешательства. В других вариантах реализации изобретения субъекту вводят 15-90 МЕ/кг рФфВ за 1 час до обширного хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 150-220 МЕ/кг рФфВ после обширного хирургического вмешательства. В некоторых случаях субъекту, подвергающемуся обширному хирургическому вмешательству, вводят суммарную дозу 220-320 МЕ/кг.
[0094] В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 50-60 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до малого хирургического вмешательства. В других вариантах реализации изобретения субъекту вводят 5-50 МЕ/кг рФфВ за 1 час до малого хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 70-150 МЕ/кг рФфВ после малого хирургического вмешательства. В некоторых случаях субъекту, подвергающемуся малому хирургическому вмешательству, вводят суммарную дозу 100-220 МЕ/кг.
[0095] В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводят 20-40 МЕ/кг рФфВ в период от 12 часов до 24 часов до челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В других вариантах реализации изобретения субъекту вводят 20-50 МЕ/кг рФфВ за 1 час до челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 10-50 МЕ/кг рФфВ во время челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В другом варианте реализации изобретения субъекту вводят 20-50 МЕ/кг рФфВ после челюстно-лицевого хирургического вмешательства. В некоторых случаях субъекту, подвергающемуся челюстно-лицевого хирургического вмешательства, вводят суммарную дозу 70-190 МЕ/кг.
[0096] Композиции рФфВ могут содержаться в фармацевтических препаратах, как описано в данном документе. Такие препараты можно вводить перорально, местно, трансдермально, парентерально, путем ингаляционного спрея, вагинально, ректально или путем интракраниальной инъекции. Используемый в контексте данного документа термин парентеральный включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрацистернальные инъекции или способы инфузии. Предполагается также введение внутривенной, внутрикожной, внутримышечной, интрамаммарной, интраперитонеальной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилегочной инъекции и/или хирургичесая имплантация в конкретном месте. Как правило, композиции в основном не содержат пирогенов, а также других примесей, которые могут быть вредными для реципиента.
th
например
[0097] В одном аспекте препараты по изобретению вводят путем начальной разовой дозы с последующей непрерывной инфузией для поддержания терапевтических циркулирующих уровней лекарственного продукта. В качестве другого примера, заявляемое соединение вводят в виде однократной дозы. Специалисты в данной области техники легко оптимизируют эффективные дозировки и схемы введения, определенные надлежащей медицинской практикой и клиническим состоянием отдельного пациента. Путь введения может быть, но не ограничивается этим, внутривенным, интраперитонеальным, подкожным или внутримышечным введением. Частота дозирования зависит от фармакокинетических параметров агентов и пути введения. Оптимальный фармацевтический препарат определяется специалистом в данной области техники в зависимости от пути введения и желаемой дозы. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 страницы 1435-1712, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и, в частности, для всех идей, связанных с препаратами, путями введения и дозировками для фармацевтических продуктов. Такие препараты влияют на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость выведения in vivo вводимых агентов. В зависимости от пути введения подходящая доза рассчитывается в зависимости от веса тела, участка поверхности тела или размера органа. Подходящие дозировки могут быть определены путем использования установленных анализов для определения уровня доз в крови в сочетании с соответствующими данными о зависимости между дозой и эффектом. Окончательный режим дозирования определяется лечащим врачом с учетом различных факторов, которые изменяют действие лекарств, , специфическая активность лекарства, тяжесть повреждения и реакция пациента, возраст, состояние, масса тела, пол и диета пациента, тяжесть любой инфекции, время введения и другие клинические факторы. В качестве примера, типичная доза рекомбинантного ФфВ по данному изобретению составляет приблизительно 50 МЕ/кг, что равно 500 мкг/кг. По мере проведения исследований будет появляться дополнительная информация относительно соответствующих уровней дозировки и продолжительности лечения различных заболеваний и состояний.
th
rd
th
[0098] Практика данного изобретения может использовать, если не указано иное, обычные способы и описания органической химии, полимерной технологии, молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие обычные способы включают синтез полимерной матрицы, гибридизацию, лигирование и обнаружение гибридизации с использованием метки. Конкретные иллюстрации подходящих способов можно получить обратившись к приведенному ниже примеру. Однако, конечно, также могут быть использованы другие эквивалентные обычные процедуры. Такие обычные способы и описания можно найти в стандартных лабораторных руководствах, таких как Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, и Molecular Cloning: A Laboratory Manual (все из Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4 Ed.) Freeman, Highly stabilized York, Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3 Ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y. и Berg et al. (2002) Biochemistry, 5 Ed., W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y., каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.
[0099] Следует отметить, что используемые в контексте данного документа и в прилагаемой формуле изобретения существительные в единственном числе включают соответствующие существительные во множественном числе, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на «полимеразу» относится к одному агенту или смесям таких агентов, а ссылка на «способ» включает ссылку на эквивалентные стадии и способы, известные специалистам в данной области техники, и так далее.
[00100] Следует отметить, что используемые в контексте данного документа и в прилагаемой формуле изобретения существительные в единственном числе включают соответствующие существительные во множественном числе, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на «полимеразу» относится к одному агенту или смесям таких агентов, а ссылка на «способ» включает ссылку на эквивалентные стадии и способы, известные специалистам в данной области техники, и так далее.
[00101] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится это изобретение. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки с целью описания и раскрытия устройств, композиций, препаратов и способов, которые описаны в публикации и которые могут использоваться в связи с данным изобретением.
[00102] Когда предоставляется диапазон значений, подразумевается, что каждое промежуточное значение, с точностью до десятой доли нижнего предела, если в контексте явно не указано иное, между верхним и нижним пределом этого диапазона и любым другим установленным или промежуточным значением в указанном диапазоне находится в пределах изобретения. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться в меньшие диапазоны, также охватываемые изобретением, с учетом любого специально исключенного предела в указанном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие оба этих включенных пределов, также включены в изобретение.
[00103] В вышеприведенном описании изложены многочисленные конкретные детали, чтобы обеспечить более полное понимание данного изобретения. Однако для специалиста в данной области техники будет очевидно, что данное изобретение может быть осуществлено без одной или более этих конкретных деталей. В других случаях общеизвестные признаки и процедуры, хорошо известные специалистам в данной области техники, не были описаны во избежание затруднения понимания изобретения.
[00104] Хотя данное изобретение описано, прежде всего, со ссылкой на конкретные варианты реализации изобретения, также предполагается, что другие варианты реализации изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения данного описания, и предполагается, что такие варианты реализации изобретения должны содержаться согласно способу по данному изобретению.
Лиофилизированные Препараты ФфВ
[00105] Данный способ также предусматриваеи препараты рФфВ для использования в способах лечения, представленных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения композицию рФфВ используют для производства фармацевтической композиции. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ может быть приготовлен в виде лиофилизированного препарата.
et al.
et al.
[00106] В некоторых вариантах реализации изобретения композиции, содержащие полипептид ФфВ по изобретению, лиофилизируют после очистки и перед введением субъекту. Лиофилизация проводится с использованием способов, известных в данной области техники, и должна быть оптимизирована для разрабатываемой композиции (Tang , Pharm Res. 21:191-200, (2004) и Chang , Pharm Res. 13:243-9 (1996)).
[00107] Цикл лиофилизации, в одном аспекте, состоит из трех этапов: замораживание, первичное высушивание и вторичное высушивание (A. P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)). На стадии замораживания раствор охлаждают, чтобы инициировать образование льда. Кроме того, эта стадия вызывает кристаллизацию наполнителя. Лед испаряется на стадии первичного высушивания, которая проводится путем понижения давления в камере ниже давления паров льда, с использованием вакуума и подачи тепла для ускорения сублимации. В конечном итоге, адсорбированную или связанную воду удаляют на стадии вторичного высушивания при пониженном давлении в камере и при повышенной температуре хранения. Процесс производит материал, известный как лиофилизированная масса. После этого лиофилизированную массу можно восстановить либо стерильной водой, либо подходящим раствором для разведения для инъекций.
например
[00108] Цикл лиофилизации не только определяет конечное физическое состояние эксципиентов, но также влияет на другие параметры, такие как время восстановления, внешний вид, стабильность и конечное содержание влаги. Структура композиции в замороженном состоянии проходит через несколько преобразований (, стеклование, смачивание и кристаллизацию), которые происходят при определенных температурах, и структуру можно использовать для понимания и оптимизации процесса лиофилизации. Температура стеклования (Tс и/или Tс') может предоставить информацию о физическом состоянии растворенного вещества и может быть определена с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК (DSC)). Tс и Tс' являются важным параметром, который необходимо учитывать при разработке цикла лиофилизации. Например, Tс' важна для первичного высушивания. Кроме того, в высушенном состоянии, температура стеклования предоставляет информацию о температуре хранения конечного продукта.
Фармацевтические Препараты и Эксципиенты В Целом
например
[00109] Эксципиенты представляют собой добавки, которые либо придают, либо усиливают стабильность и доставку лекарственного продукта (, белка). Независимо от причины их включения эксципиенты являются неотъемлемым компонентом препарата и поэтому должны быть безопасными и хорошо переносимыми пациентами. Для белковых лекарственных средств выбор эксципиентов особенно важен, поскольку они могут влиять как на эффективность, так и на иммуногенность лекарственного средства. Следовательно, белковые препараты должны быть разработаны с соответствующим выбором эксципиентов, которые обеспечивают подходящую стабильность, безопасность и конкурентоспособность.
[00110] Лиофилизированный препарат в одном аспекте, по меньшей мере, содержит один или более буфер, наполнитель и стабилизатор. В этом аспекте полезность поверхностно-активного вещества оценивается и выбирается в тех случаях, когда возникает проблема агрегации на стадии лиофилизации или во время восстановления. Подходящий буферный агент включен для поддержания препарата в стабильных зонах рН во время лиофилизации. Сравнение эксципиентов, рассматриваемых для жидких и лиофилизированных белковых препаратов, приведено в Таблице 10.
Таблица 10: Эксципиенты лиофилизированных белковых препаратов
<b>Эксципиент</b>
<b>Функция в лиофилизированном препарате</b>
Буфер
Поддержание рН препарата во время лиофилизации и восстановления
Агент, регулирующий тоничность /стабилизатор
Стабилизаторы включают крио- и лиопротекторыПримеры включают полиолы, сахара и полимерыКриопротекторы защищают белок от повреждающего действия замораживанияЛиопротектанты стабилизируют белки в лиофилизированном состоянии
Наполнитель
Используется для улучшения внешнего вида препарата и предотвращения сдуванияОбеспечивает структурную прочность лиофилизированной массыПримеры включают маннит и глицин
Поверхностно-активное вещество
Используется, если агрегация во время процесса лиофилизации является проблемойМожет служить для снижения времени восстановленияПримеры включают полисорбат 20 и 80
Антиоксидант
Обычно не используется, молекулярные реакции в лиофилизированной массе значительно замедляются
Ионы металлов/хелатирующий агент
Могут включаться в препарат, если только конкретный ион металла включен в качестве кофактора или если металл необходим для активности протеазыХелатирующие агенты обычно не нужны в лио препаратах
Консервант
Только для многодозовых препаратовОбеспечивает защиту от роста микроорганизмов в препаратахОбычно включается в восстановитель (например, бактериостатическую воду для инъекций (bWFI))
[00111] Основной проблемой при разработке препаратов для белков является стабилизация продукта от стрессов производства, доставки и хранения. Роль эксципиентов в препаратах заключается в обеспечении стабилизации от этих стрессов. Эксципиенты также используются для снижения вязкости белковых препаратов с высокой концентрацией, чтобы обеспечить их доставку и повысить удобство для пациента. В целом, эксципиенты могут быть классифицированы на основе механизмов, с помощью которых они стабилизируют белки от различных химических и физических стрессов. Некоторые эксципиенты используются для смягчения последствий определенного стресса или для регулирования конкретной восприимчивости специфического белка. Другие эксципиенты оказывают более общее влияние на физическую и ковалентную стабильность белков. Описанные в данном документе эксципиенты организованы либо по химическому типу, либо по их функциональной роли в препаратах. Краткое описание режимов стабилизации приводится при обсуждении каждого типа эксципиента.
например
[00112] Учитывая приведенные в данном документе указания и рекомендации, специалисты в данной области техники будут знать, какое количество или диапазон эксципиента может быть включено в любой конкретный препарат для получения биофармацевтического препарата по изобретению, который способствует сохранению стабильности биофармацевтического средства (, белка). Например, количество и тип соли, которая должна быть включена в биофармацевтический препарат по изобретению, выбирается на основе желаемой осмоляльности (например, изотонической, гипотонической или гипертонической) конечного раствора, а также количества и осмоляльности других компонентов, которые могут быть включены в препарат.
[00113] Например, включение около 5% сорбитола позволяет достичь изотоничности, тогда как для достижения изотоничности необходимо около 9% эксципиента сахарозы. Выбор количества или диапазона концентраций одного или нескольких эксципиентов, которые могут быть включены в биофармацевтический препарат по изобретению, приведен в качестве примера выше со ссылкой на соли, полиолы и сахара. Однако специалистам в данной области техники будет понятно, что соображения, описанные в данном документе и далее иллюстрируемые со ссылкой на специфические эксципиенты, в равной степени применимы ко всем типам и комбинациям эксципиентов, включая, например, соли, аминокислоты, другие агенты, регулирующие тоничность, поверхностно-активные вещества, стабилизаторы, наполнители, криопротекторы, лиопротекторы, антиоксиданты, ионы металлов, хелатообразующие агенты и/или консерванты.
например
[00114] Кроме того, если конкретный эксципиент указан в молярной концентрации, специалисты в данной области техники поймут, что эквивалентный процент (%) мас./об. (, (граммы вещества в пробе раствора/мл раствора) X 100%) раствора также рассматривается.
например
например
например
et al.
[00115] Конечно, специалист в данной области техники должен понимать, что концентрации эксципиентов, описанные в данном документе, имеют взаимозависимость в пределах конкретного препарата. Например, концентрация наполнителя может быть снижена там, где, , существует высокая концентрация белка или где, , существует высокая концентрация стабилизирующего агента. Кроме того, специалист в данной области техники должен признать, что для поддержания изотоничности конкретного препарата, в котором нет наполнителя, концентрация стабилизирующего агента должна быть соответственно отрегулирована (, будет использовано «тонизирующее» количество стабилизатора). Общие эксципиенты известны в данной области техники и могут быть найдены в Powell , Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311.
Фармацевтические Буферы и Буферные Агенты
et al.
[00116] Стабильность фармакологически активного белкового препарат обычно максимальна в узком диапазоне pH. Этот диапазон рН оптимальной стабильности должен быть выявлен на ранних стадиях исследований перед приготовлением препарата. Несколько подходов, таких как исследования стабильности способом «ускоренного старения» и калориметрические скрининговые исследования, полезны в этой области (Remmele R.L. Jr., , Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)). Как только приготовление препарата завершено, белок должен быть изготовлен и храниться в течение всего срока годности. Следовательно, буферные агенты почти всегда используются для контроля pH в препарате.
[00117] Буферная емкость буферных частиц максимальна при pH, равном pKa, и уменьшается по мере увеличения или уменьшения pH от этой величины. Девяносто процентов буферной емкости находится в пределах одной единицы pH от ее pKa. Буферная емкость также увеличивается пропорционально с увеличением концентрации буфера.
et al.
et al.
[00118] При выборе буфера необходимо учитывать несколько факторов. Прежде всего, необходимо определить вид буфера и его концентрацию на основе его pKa и желаемого pH препарата. Не менее важно обеспечить совместимость буфера с белком и другими эксципиентами препарата и не катализировать какие-либо реакции деградации. Третьим важным аспектом, который следует учитывать, является ощущение жжения и раздражения, которое буфер может вызывать при введении. Например, известно, что цитрат вызывает жжение при инъекции (Laursen T, , Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). Вероятность жжения и раздражения выше у лекарственных средств, которые вводятся подкожным (п/к) или внутримышечным (в/м) способами, когда раствор лекарственного средства остается на месте в течение относительно более длительного периода времени, чем при введении в/в способом, когда при введении препарат быстро растворяется в крови. Для препаратов, которые вводят путем прямой в/в инфузии, необходимо контролировать общее количество буфера (и любого другого компонента препарата). Нужно быть особенно осторожным в отношении ионов калия, вводимых в форме калий-фосфатного буфера, который может вызывать у пациента реакции со стороны сердечно-сосудистой системы (Hollander-Rodriguez JC, , Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)).
[00119] Буферы для лиофилизированных препаратов требуют дополнительного рассмотрения. Некоторые буферы, такие как фосфат натрия, могут кристаллизоваться из аморфной фазы белка во время замораживания, что приводит к сдвигам рН. Другие распространенные буферы, такие как ацетат и имидазол, могут сублимироваться или испаряться во время процесса лиофилизации, тем самым сдвигая рН препарата во время лиофилизации или после восстановления.
[00120] Буферная система, присутствующая в композициях, выбирается таким образом, чтобы она была физиологически совместимой и поддерживала желаемый уровень pH фармацевтического препарата. В одном варианте реализации изобретения pH раствора составляет от 2,0 до 12,0. Например, pH раствора может составлять 2,0, 2,3, 2,5, 2,7, 3,0, 3,3, 3,5, 3,7, 4,0, 4,3, 4,5, 4,7, 5,0, 5,3, 5,5, 5,7, 6,0, 6,3, 6,5, 6,7, 7,0, 7,3, 7,5, 7,7, 8,0, 8,3, 8,5, 8,7, 9,0, 9,3, 9,5, 9,7, 10,0, 10,3, 10,5, 10,7, 11,0, 11,3, 11,5, 11,7 или 12,0.
[00121] Буферное соединение для поддержания рН может присутствовать в любом количестве, подходящем для поддержания рН препарата на заданном уровне. В одном варианте реализации изобретения концентрация буферного раствора для поддержания рН составляет от 0,1 до 500 мМ (1 М). Например, предполагается, что буферный агент для поддержания рН составляет по меньшей мере 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 или 500 мМ.
[00122] Типовые буферные агенты для поддержания рН, используемые для буферизации препарата, как изложено в данном документе, включают, но не ограничиваются ими, органические кислоты, глицин, гистидин, глутамат, сукцинат, фосфат, ацетат, цитрат, трис, ГЭПЭС и аминокислоты или смеси аминокислот, включая, но не ограничиваясь этим, аспартат, гистидин и глицин. В одном варианте реализации изобретения буферный агент представляет собой цитрат.
Фармацевтические Стабилизаторы и Наполнители
et al.
[00123] В одном аспекте к данным фармацевтическим препаратам добавлен стабилизатор (или комбинация стабилизаторов), чтобы предотвратить или уменьшить вызванную хранением агрегацию и химическую деградацию. Белесоватый или мутный раствор при восстановлении указывает на то, что белок выпал в осадок или, по крайней мере, агрегировал. Термин «стабилизатор» означает эксципиент, способный предотвращать агрегацию или физическую деградацию, включая химическую деградацию (например, автолиз, дезамидирование, окисление и т.д.) в водном состоянии. Рассматриваемые стабилизаторы включают, но не ограничиваются ими, сахарозу, трегалозу, маннозу, мальтозу, лактозу, глюкозу, рафинозу, целлобиозу, гентиобиозу, изомальтозу, арабинозу, глюкозамин, фруктозу, маннит, сорбит, глицин, аргинин HCl, поли-гидрокси соединения, включая полисахариды, такие как декстран, крахмал, гидроксиэтилкрахмал, циклодекстрины, N-метилпирролиден, целлюлозу и гиалуроновую кислоту, хлорид натрия (Carpenter , Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)). В данных препаратах стабилизатор вводят в концентрации около 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 или 1000 мМ. В одном варианте реализации данного изобретения маннит и трегалоза используются в качестве стабилизирующих агентов.
[00124] При желании в препараты также включают соответствующие количества наполнителей и агентов, регулирующих осмоляльность. Наполнители включают, например, но не ограничиваясь ими, маннит, глицин, сахарозу, полимеры, такие как декстран, поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза, лактоза, сорбит, трегалоза или ксилит. В одном варианте реализации изобретения наполнитель представляет собой маннит. Наполнитель вводится в концентрации около 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 или 1000 мМ.
Фармацевтические Поверхностно-Активные Вещества
[00125] Белки имеют высокую склонность к взаимодействию с поверхностями, что делает их восприимчивыми к адсорбции и денатурации на границах раздела воздух-жидкость, флакон-жидкость и жидкость-жидкость (силиконовое масло). Было обнаружено, что этот путь деградации обратно зависит от концентрации белка и приводит либо к образованию растворимых и нерастворимых белковых агрегатов, либо к снижению количества белка в растворе в результате адсорбции на поверхности. В дополнение к адсорбции на поверхности емкости поверхностно индуцированная деградация усугубляется физическим перемешиванием, что может происходить при транспортировке и обращении с продуктом.
например
например
[00126] Поверхностно-активные вещества обычно используются в белковых препаратах для предотвращения поверхностно индуцированной деградации. Поверхностно-активные вещества представляют собой амфипатические молекулы со способностью вытеснения конкурирующих белков в межфазных положениях. Гидрофобные части молекул поверхностно-активного вещества занимают межфазные позиции (, воздух/жидкость), в то время как гидрофильные части молекул остаются ориентированными к основному растворителю. При достаточных концентрациях (обычно около критической мицеллярной концентрации детергента) поверхностный слой молекул поверхностно-активного вещества служит для предотвращения адсорбции молекул белка на границе раздела. Таким образом, поверхностно индуцированная деградация сводится к минимуму. Поверхностно-активные вещества, рассматриваемые в данном документе, включают, но не ограничиваются этим, сложные эфиры жирных кислот и сорбитанполиэтоксилатов, , полисорбат 20 и полисорбат 80. Они отличаются только длиной алифатической цепи, которая придает гидрофобный характер молекулам C-12 и C-18 соответственно. Соответственно, полисорбат-80 является более поверхностно-активным и имеет более низкую критическую мицеллярную концентрацию, чем полисорбат-20.
[00127] Детергенты также могут влиять на термодинамическую конформационную стабильность белков. В данном случае снова, эффекты данного детергентного эксципиента будут специфичными для белка. Например, было показано, что полисорбаты снижают стабильность некоторых белков и увеличивают стабильность других. Детергентная дестабилизация белков может быть объяснена тем, что гидрофобные хвосты молекул детергента могут вступать в специфическое связывание с белком в частично или полностью развернутом состоянии. Эти типы взаимодействий могут вызвать сдвиг в конформационном равновесии в сторону более развернутого состояния белка (например, увеличение воздействия гидрофобных участков молекулы белка в дополнение к связывающему полисорбату). Альтернативно, если нативное состояние белка имеет некоторые гидрофобные поверхности, связывание детергента с нативным состоянием может стабилизировать эту конформацию.
[00128] Другим аспектом полисорбатов является то, что они по своей природе подвержены окислительной деградации. Часто, в качестве исходного вещества, они содержат достаточное количество пероксидов, чтобы вызвать окисление боковых цепей белковых остатков, особенно метионина. Потенциал окислительного повреждения в результате добавления стабилизатора подчеркивает тот факт, что в препаратах следует использовать самые низкие эффективные концентрации эксципиентов. Для поверхностно-активных веществ эффективная концентрация для данного белка будет зависеть от механизма стабилизации.
[00129] Поверхностно-активные вещества также добавляют в соответствующих количествах для предотвращения явления агрегации на поверхности во время замораживания и высушивания (Chang, B, J. Pharm. Sci. 85:1325, (1996)). Таким образом, типовые поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются этим, анионные, катионные, неионные, цвиттер-ионные и амфотерные поверхностно-активные вещества, включая поверхностно-активные вещества, полученные из аминокислот, встречающихся в природе. Анионные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, лаурилсульфат натрия, диоктилсульфосукцинат натрия и диоктилсульфонат натрия, хенодезоксихолевую кислоту, натриевую соль N-лауроилсаркозина, натриевую соль додецилсульфата лития, натриевую соль 1-октансульфоновой кислоты, гидрат холата натрия, деоксилат натрия и натриевую соль гликодезоксихолевой кислоты. Катионные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, хлорид бензалкония или хлорид бензетония, моногидрат цетилпиридиния хлорида и бромид гексадецилтриметиламмония. Цвиттер-ионные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 и SB3-12. Неионные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, дигитонин, Тритон Х-100, Тритон х-114, ТВИН-20 и ТВИН-80. Поверхностно-активные вещества также включают, но не ограничиваются ими, лауромакрогол 400, полиоксил 40 стеарат, полиоксиэтилен гидрогенизированное касторовое масло 10, 40, 50 и 60, глицеринмоностеарат, полисорбат 40, 60, 65 и 80, соевый лецитин и другие фосфолипиды, такие как диолилфосфатидилхолин (DOPC), димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) и (диолеилфосфатидилглицерин) DOPG; эфир сахарозы и жирных кислот, метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу. Поэтому композиции, содержащие эти поверхностно-активные вещества, либо по отдельности, либо в виде смеси в различных соотношениях, дополнительно представляются. В одном варианте реализации данного изобретения поверхностно-активное вещество представляет собой ТВИН-80. В данные препараты поверхностно-активное вещество вводят в концентрации от около 0,01 до около 0,5 г/л. В представленных препаратах концентрация поверхностно-активного вещества составляет 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 г/л.
Фармацевтические Соли
[00130] Соли часто добавляют для увеличения ионной силы препарата, что может быть важно для растворимости белка, физической стабильности и изотоничности. Соли могут влиять на физическую стабильность белков различными способами. Ионы могут стабилизировать нативное состояние белков путем связывания с заряженными остатками на поверхности белка. Альтернативно, соли могут стабилизировать денатурированное состояние путем связывания с пептидными группами вдоль основной цепи белка (-CONH-). Соли также могут стабилизировать нативную конформацию белка путем экранирования отталкивающих электростатических взаимодействий между остатками в молекуле белка. Соли в белковых препаратах могут также экранировать электростатические взаимодействия между белковыми молекулами, которые могут приводить к агрегации и нерастворимости белка. В представленных препаратах концентрация соли находится в пределах 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 и 500 мМ.
Другие Распространенные Эксципиенты: Фармацевтические Аминокислоты
et al.
et al.
et al.
[00131] Аминокислоты нашли универсальное применение в белковых препаратах в качестве буферов, наполнителей, стабилизаторов и антиоксидантов. Таким образом, в одном аспекте гистидин и глутаминовая кислота используются для буферизации белковых препаратов в диапазоне рН 5,5-6,5 и 4,0-5,5 соответственно. Имидазольная группа гистидина имеет pKa=6,0, а карбоксильная группа боковой цепи глутаминовой кислоты имеет pKa 4,3, что делает эти аминокислоты пригодными для буферизации в их соответствующих диапазонах pH. Глутаминовая кислота особенно полезна в таких случаях. Гистидин обычно содержится в коммерческих белковых препаратах, и эта аминокислота обеспечивает альтернативу цитрату, буферу, который как известно вызывает чувство жжения при инъекции. Интересно отметить, что гистидин также обладает стабилизирующим эффектом в отношении агрегации при использовании в высоких концентрациях как в жидких, так и в лиофилизированных формах (Chen B, , Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). Гистидин также изучался другими исследователями в отношении снижения вязкости препарата с высокой концентрацией белка. Однако в том же исследовании авторы наблюдали увеличение агрегации и обесцвечивания в гистидинсодержащих препаратах во время исследований замораживания-оттаивания антитела в емкостях из нержавеющей стали. Еще одно предостережение в отношении гистидина заключается в том, что он подвергается фотоокислению в присутствии ионов металлов (Tomita M, , Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)). Использование метионина в качестве антиоксиданта в препаратах кажется многообещающим; было обнаружено, что он эффективен против ряда окислительных стрессов (Lam XM, , J Pharm ScL, 86(11): 1250-5 (1997)).
[00132] В различных аспектах предложены препараты, которые включают одну или более аминокислот: глицин, пролин, серин, аргинин и аланин, которые как было показано, стабилизируют белки по механизму преимущественного исключения. Глицин также является обычно используемым наполнителем в лиофилизированных препаратах. Было показано, что аргинин является эффективным средством в ингибировании агрегации и применяется как в жидких, так и в лиофилизированных препаратах.
[00133] В представленных препаратах концентрация аминокислот находится в пределах 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 и 500 мМ. В одном варианте реализации данного изобретения аминокислота представляет собой глицин.
Другие Общие Компоненты Эксципиента: Фармацевтические Антиоксиданты
[00134] Окисление белковых остатков возникает из целого ряда различных источников. Помимо добавления специфических антиоксидантов, предотвращение окислительного повреждения белка включает в себя тщательный контроль ряда факторов на протяжении всего процесса производства и хранения продукта, таких как атмосферный кислород, температура, воздействие света и химическое загрязнение. Следовательно, изобретение предусматривает использование фармацевтических антиоксидантов, включая, но не ограничиваясь ими, восстанавители, акцепторы кислорода/свободных радикалов или хелатирующие агенты. Антиоксиданты в терапевтических белковых препаратах, в одном аспекте, являются водорастворимыми и остаются активными в течение всего срока годности продукта. Восстанавливающие агенты и акцепторы кислорода/свободных радикалов работают путем удаления активных форм кислорода в растворе. Хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА, эффективны, связывая примеси микроэлементов, которые способствуют образованию свободных радикалов. Например, ЭДТА использовалась в жидком препарате кислотного фактора роста фибробластов для ингибирования катализируемого ионами металла окисления остатков цистеина.
et al.
et al.
[00135] В дополнение к эффективности различных эксципиентов для предотвращения окисления белка, возможность самих антиоксидантов вызывать другие ковалентные или физические изменения белка вызывает беспокойство. Например, восстанавливающие агенты могут вызвать нарушение внутримолекулярных дисульфидных связей, что может привести к перетасовке дисульфидов. Было показано, что в присутствии ионов переходных металлов аскорбиновая кислота и ЭДТА способствуют окислению метионина в ряде белков и пептидов (Akers MJ, and Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editors. Pharmaceutical Science. Taylor and Francis, UK (1999)); Fransson J.R., /. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, , Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). Сообщалось, что тиосульфат натрия снижает уровни метионинового окисления, вызванного светом и температурой, в rhuMab HER2; однако образование аддукта тиосульфат-белок также сообщалось в этом исследовании (Lam XM, Yang JY, , J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997)). Выбор подходящего антиоксиданта производится в соответствии с конкретными стрессами и чувствительностью белка. Антиоксиданты, рассматриваемые в определенных аспектах, включают, но не ограничиваются ими, восстанавливающие агенты и акцепторы кислорода/свободных радикалов, ЭДТА и тиосульфат натрия.
Другие Распространенные Компоненты Эксципиента: Фармацевтические Ионы Металлов
например
[00136] В целом, ионы переходных металлов нежелательны в белковых препаратах, поскольку они могут катализировать физические и химические реакции деградации белков. Однако конкретные ионы металлов включаются в препараты, когда они являются кофакторами белков, и в препараты суспензий белков, где они образуют координационные комплексы (, цинковая суспензия инсулина). Недавно было предложено использование ионов магния (10 -120 мМ) для ингибирования изомеризации аспарагиновой кислоты в изоаспарагиновую кислоту (WO 2004039337).
+2
+2
+2
+2
+2
+2
+2
+2
+2
+2
+2
+2
+3
+3
et al.
et al.
et al.
[00137] Двумя примерами, в которых ионы металлов придают стабильность или повышенную активность в белках, являются дезоксирибонуклеаза человека (рчДНКаза, Pulmozyme) и Фактор VIII. В случае рчДНКаза ионы Ca (до 100 мМ) повышали стабильность фермента через специфический сайт связывания (Chen B, , / Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)). Фактически, удаление ионов кальция из раствора с ЭГТК вызывало увеличение дезамидирования и агрегации. Однако этот эффект наблюдался только с ионами Ca ; другие двухвалентные катионы Mg, Mn и Zn как было обнаружено, дестабилизируют рчДНКазу. Подобные эффекты наблюдались в Факторе VIII. Ионы Ca и Sr стабилизировали белок, тогда как другие, такие как Mg, Mn и Zn, Cu и Fe, дестабилизировали фермент (Fatouros, A., , Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997). В отдельном исследовании с Фактором VIII значительное увеличение скорости агрегации наблюдалось в присутствии ионов Al (Derrick TS, , /. Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004)). Авторы отмечают, что другие вспомогательные вещества, такие как буферные соли, часто загрязнены ионами Al и иллюстрируют необходимость использования эксципиентов соответствующего качества в лекарственных препаратах.
Другие Распространенные Компоненты Эксципиента: Фармацевтические Консерванты
et al.
[00138] Консерванты необходимы при разработке многоразовых парентеральных препаратов, которые включают более одного извлечения из одной эмкости. Их основная функция заключается в подавлении роста микробов и обеспечении стерильности продукта в течение всего срока годности или срока использования лекарственного препарата. Обычно используемые консерванты включают, но не ограничиваются этим, бензиловый спирт, фенол и м-крезол. Хотя консерванты имеют долгую историю применения, разработка белковых препаратов, которые включают консерванты, может быть сложной задачей. Консерванты почти всегда оказывают дестабилизирующее действие (агрегацию) на белки, и это стало основным фактором, ограничивающим их использование в многодозовых белковых препаратах (Roy S, , J Pharm ScL, 94(2): 382-96 (2005)).
[00139] На сегодняшний день большинство белковых препаратов были разработаны только для одноразового использования. Тем не менее, когда возможны многодозовые препараты, они имеют дополнительное преимущество, заключающееся в обеспечении удобства для пациентов и увеличении конкурентоспособности препарата. Хорошим примером является гормон роста человека (hGH), где разработка препаратов содержащих консерванты привела к коммерциализации более удобных, многоразовых шприц-ручек. В настоящее время на рынке доступно по меньшей мере четыре таких шприц-ручки, содержащих препараты hGH с консервантами. Нордитропин (Norditropin, жидкий, Novo Nordisk), Нутропин AQ (Nutropin AQ, жидкий, Genentech) и Генотропин (лиофилизированный - двухкамерный картридж, Pharmacia & Upjohn) содержат фенол, в то время как Соматропин (Somatropin (Eli Lilly)) содержит м-крезол.
et al.
[00140] При разработке содержащих консерванты лекарственных форм препарата необходимо учитывать несколько аспектов. Эффективная концентрация консерванта в лекарственном препарате должна быть оптимизирована. Это требует тестирования данного консерванта в лекарственной форме с диапазонами концентраций, которые придают антимикробную эффективность без ущерба для стабильности белка. Например, три консерванта были успешно проверены при разработке жидкого препарата для рецептора интерлейкина-1 (Тип I) с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Консерванты были ранжированы по степени их влияния на стабильность при концентрациях, обычно используемых в зарегистрированных препаратах (Remmele RL Jr., , Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)).
[00141] Разработка жидких препаратов, содержащих консерванты, является более сложной задачей, чем лиофилизированные препараты. Лиофилизированные лекарственные продукты могут быть лиофилизированы без консерванта и восстановлены раствором для разведения, содержащим консервант, во время использования. Это сокращает время, в течение которого консервант находится в контакте с белком, значительно минимизируя связанные с этим риски стабильности. При использовании жидких препаратов эффективность и стабильность консерванта должны поддерживаться в течение всего срока годности препарата (- 18-24 месяца). Важно отметить, что эффективность консерванта должна быть продемонстрирована в конечном препарате, содержащем активное лекарственное средство и все эксципиенты.
[00142] Некоторые консерванты могут вызывать реакции в месте инъекции, что является еще одним фактором, который необходимо учитывать при выборе консерванта. В клинических испытаниях, которые были сосредоточены на оценке консервантов и буферов в Нордитропине, наблюдалось снижение восприятия боли в препаратах, содержащих фенол и бензиловый спирт, по сравнению с препаратом, содержащим м-крезол (Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-103 (2004)). Интересно, что среди обычно используемых консервантов бензиловый спирт обладает анестезирующими свойствами (Minogue SC, and Sun DA., AnesthAnalg., 100(3): 683-6 (2005)). В различных аспектах использование консервантов обеспечивает преимущество, которое перевешивает любые побочные эффекты.
Способы Приготовления Фармацевтических Препаратов
[00143] Данное изобретение также предусматривает способы приготовления фармацевтических препаратов.
[00144] Данные способы дополнительно включают одну или более из следующих стадий: добавление стабилизирующего агента, как описано в данном документе, к указанной смеси перед лиофилизацией, добавление к указанной смеси перед лиофилизацией по меньшей мере одного агента, выбранного из наполнителя, агента, регулирующего осмоляльность, и поверхностно-активного вещества, согласно тому как указано для каждого из них в данном документе.
[00145] Стандартная практика восстановления для лиофилизированного материала заключается в добавлении объема чистой воды или стерильной воды для инъекций (воды д/и) (обычно эквивалентного объему, удаленному во время лиофилизации), хотя разбавленные растворы антибактериальных агентов иногда используются при производстве фармацевтических препаратов для парентеральное введение (Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Соответственно, предлагаются способы получения восстановленных композиций рФфВ, включающие стадию добавления раствора для разведения к лиофилизированной композиции рФфВ по изобретению.
[00146] Лиофилизированный материал может быть восстановлен в виде водного раствора. Разнообразные водные носители, например, стерильная вода для инъекций, вода с консервантами для многократного использования или вода с подходящими количествами поверхностно-активных веществ (например, водная суспензия, которая содержит активное соединение в смеси с эксципиентами, подходящими для производства водных суспензии). В различных аспектах такими эксципиентами являются суспендирующие агенты, например, но не ограничиваясь этим, карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь; диспергирующие или смачивающие агенты представляют собой природного происхождения фосфатид, например, но не ограничиваясь этим, лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, но не ограничиваясь этим, полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с алифатическими спиртами с длинной цепью например, но не ограничиваясь этим, гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с частичными эфирами, полученными из жирных кислот, и гекситом, такой как полиоксиэтиленсорбитолмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с частичными эфирами, полученными из жирных кислот и гекситоловых ангидридов, например, но не ограничиваясь этим, полиэтилен сорбитанмоноолеат. В различных аспектах водные суспензии также содержат один или более консервантов, например, но не ограничиваясь этим, этил или н-пропил, п-гидроксибензоат.
Типовой Препарат рФфВ для Введения
[00147] В некоторых вариантах реализации изобретения данные способы предусматривают улучшенный препарат, который позволяет получить конечный продукт с высокой эффективностью (высокой концентрацией рФфВ и повышенной долгосрочной стабильностью), чтобы уменьшить объем для терапии (от 100 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл). В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 100 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 500 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 1000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 2000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 3000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 4000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 5000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 6000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 7000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 8000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл. В некоторых вариантах реализации изобретения концентрация рФфВ в препарате для введения составляет от около 9000 МЕ/мл до 10000 МЕ/мл.
например
[00148] В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения содержит одно или более цвиттер-ионных соединений, включая, например, такие аминокислоты, как Гистидин, Глицин, Аргинин. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения сожержит компонент с амфипатической характеристикой, имеющий минимум одну гидрофобную и одну гидрофильную группу, включая, например, полисорбат 80, октилпиранозид, дипептиды и/или амфипатические пептиды. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения содержит невосстанавливающий сахар или сахарный спирт или дисахариды, включая, например, сорбит, маннит, сахарозу или трегалозу. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения содержит нетоксичную водорастворимую соль, включая, например, хлорид натрия, что приводит к физиологической осмоляльности. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения имеет рН в диапазоне от 6,0 до 8,0. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения имеет рН около 6,0, около 6,5, около 7, около 7,5 или около 8,0. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения содержит один или более двухвалентных катионов, которые стабилизируют рФфВ, включая, например, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ и/или их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения содержит от около 1 до около 50 мМ Глицина, от около 1 до около 50 мМ Гистидина, от около нуля до около 300 мМ хлорида натрия (, менее чем 300 мМ натрия), от около 0,01% до около 0,05% полисорбата 20 (или полисорбата 80) и от около 0,5% до около 20% (мас./мас.) сахарозы с рН около 7,0 и имеет физиологическую осмолярность в момент введения.
[00149] В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения может быть лиофилизирован. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения является стабильным и может храниться в жидком состоянии при температуре от около 2°C до около 8°C, а также при температуре от около 18°C до около 25°C. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения является стабильным и может храниться в жидком состоянии при температуре от около 2°C до около 8°C. В некоторых вариантах реализации изобретения препарат для введения является стабильным и может храниться в жидком состоянии при температуре от около 18°C до около 25°C.
Введение препарата/Дозирование
[00150] Для введения композиций человеку или тестируемым животным в одном аспекте композиции содержат один или более фармацевтически приемлемых носителей. Фразы «фармацевтически» или «фармакологически» приемлемые относятся к молекулярным веществам и композициям, которые являются стабильными, ингибируют деградацию белка, такую как образование продуктов агрегации и распада белка, и, кроме того, не вызывают аллергических или других нежелательных явлений при введении с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, как описано ниже. «Фармацевтически приемлемые носители» включают любые и все клинически полезные растворители, дисперсионные среды, оболочки, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты и тому подобное, включая агенты, описанные выше.
[00151] Фармацевтические препараты вводят перорально, местно, трансдермально, парентерально, путем ингаляционного спрея, вагинально, ректально или путем интракраниальной инъекции. Используемый в контексте данного документа термин парентеральный включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрацистернальные инъекции или способы инфузии. Предполагается также введение внутривенной, внутрикожной, внутримышечной, интрамаммарной, интраперитонеальной, интратекальной, ретробульбарной и/или внутрилегочной инъекции в конкретном месте. Как правило, композиции в основном не содержат пирогенов, а также других примесей, которые могут быть вредными для реципиента.
[00152] Согласно данному изобретению рФфВ вводят в отсутствие Фактора VIII (ФVIII). В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00153] В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ до хирургического вмешательства, как обсуждается в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения рФфВ вводят по меньшей мере за 12 часов, по меньшей мере 13 часов, по меньшей мере 14 часов, по меньшей мере 15 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 17 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 19 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 21 час, по меньшей мере 22 часа, по меньшей мере 23 часа или по меньшей мере 24 часа до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00154] В некоторых вариантах реализации изобретения 35-60 МЕ/кг рФфВ вводят по меньшей мере за 12 часов, по меньшей мере 13 часов, по меньшей мере 14 часов, по меньшей мере 15 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 17 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 19 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 21 час, по меньшей мере 22 часа, по меньшей мере 23 часа или по меньшей мере 24 часа до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения 50-60 МЕ/кг рФфВ вводят по меньшей мере за 12 часов, по меньшей мере 13 часов, по меньшей мере 14 часов, по меньшей мере 15 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 17 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 19 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 21 час, по меньшей мере 22 часа, по меньшей мере 23 часа или по меньшей мере 24 часа до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения 20-40 МЕ/кг рФфВ вводят по меньшей мере за 12 часов, по меньшей мере 13 часов, по меньшей мере 14 часов, по меньшей мере 15 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 17 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 19 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 21 час, по меньшей мере 22 часа, по меньшей мере 23 часа или по меньшей мере 24 часа до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00155] В некоторых вариантах реализации изобретения около 50-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 55-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50-55 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50 МЕ/кг, около 52 МЕ/кг, около 54 МЕ/кг, около 56 МЕ/кг, около 58 МЕ/кг или около 60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00156] В некоторых вариантах реализации изобретения около 35-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35-55 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50-60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг, около 40 МЕ/кг, около 45 МЕ/кг, около 50 МЕ/кг, около 55 МЕ/кг или около 60 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до хирургического вмешательства и хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00157] В некоторых вариантах реализации изобретения около 20-40 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40 МЕ/кг рФфВ вводят в период от 12 часов до 24 часов до указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00158] В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает второй этап предварительного лечения введения рФфВ за 1 час до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 5-50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 5 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 10 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 15 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00159] В некоторых вариантах реализации изобретения около 15-90 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 15 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 55 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 60 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 65 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 70 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 75 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 80 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 85 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 90 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, причемв случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00160] В некоторых вариантах реализации изобретения около 20-50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25-50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30-50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25-40 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40-50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50 МЕ/кг рФфВ вводят за 1 час до хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00161] В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает введения рФфВ во время хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 10-50 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20-50 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30-50 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40-50 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20-40 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30-40 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения 10 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 15 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50 МЕ/кг рФфВ вводят во время указанного хирургического вмешательства и указанное хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00162] В некоторых вариантах реализации изобретения около 70-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 90-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 110-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 120-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 140-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 150-200 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 160-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180-200 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180-190 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 190-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 190-210 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 200-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 210-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 80 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 90 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 100 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 110 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 120 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 130 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 140 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 160 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 170 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 190 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 200 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 210 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения около 220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00163] В некоторых вариантах реализации изобретения около 70-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 80-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 90-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 100-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 110-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 120-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 130-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 100-140 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 90-140 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 140-150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 70 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 80 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 90 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 100 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 110 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 120 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 130 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 140 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух доз рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых реализации изобретения, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух доз рФфВ до хирургического вмешательства, причем первая доза больше, чем вторая доза. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00164] В некоторых вариантах реализации изобретения около 150-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 160-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 170-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180-210 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 190-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 190-210 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 200-220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 150 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 160 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 170 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 180 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 190 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 200 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 210 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 220 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения, в случаях если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00165] В некоторых вариантах реализации изобретения около 20-50 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25-50 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30-50 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25-40 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30-40 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40-50 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45-50 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 20 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 25 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 30 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 35 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 40 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 45 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения около 50 МЕ/кг рФфВ вводят после хирургического вмешательства, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00166] В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 100-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 110-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 120-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 130-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 140-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 150-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 160-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 170-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 180-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 190-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 180-210 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 190-210 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 200-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 210-220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 100 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 110 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 120 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 130 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 140 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 150 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 160 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 170 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 180 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 200 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 210 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00167] В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 220-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 230-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 240-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 250-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 260-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 270-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 280-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 280-310 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 290-310 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 290-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 300-320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 300-310 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 220 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 230 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 240 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 250 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 260 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 270 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 280 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 290 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 300 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 310 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 320 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00168] В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 70-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 80-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 90-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 100-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 110-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 120-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 130-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 140-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 150-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 160-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 170-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 180-190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 70 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 80 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 90 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 100 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 110 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 120 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 130 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 140 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 150 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 160 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 170 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 180 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения вводят суммарную дозу около 190 МЕ/кг рФфВ, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00169] В некоторых вариантах реализации изобретения, в случаях если хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения дозировка представляет собой дозировку, указанную выше. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят. В некоторых вариантах реализации изобретения, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух доз рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых реализации изобретения, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух доз рФфВ до хирургического вмешательства, причем первая доза больше, чем вторая доза. В некоторых вариантах реализации изобретения дозировка представляет собой дозировку, указанную выше. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят. В некоторых вариантах реализации изобретения, в случае если хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство, предварительное лечение включает введение по меньшей мере двух приблизительно равных доз рФфВ до хирургического вмешательства. В некоторых вариантах реализации изобретения дозировка представляет собой дозировку, указанную выше. В некоторых вариантах реализации изобретения ФVIII не вводят.
[00170] Обычно на БфВ Типа 1 указывают <30 МЕ/дл ФфВ:РКо, <30 МЕ/дл ФфВ:Аг, низкий или нормальный ФVIII, и >0,5-0,7 МЕ/дл Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг. На БфВ Типа 2А указывают <30 МЕ/дл ФфВ:РКо, <30-200 МЕ/дл ФфВ:Аг, низкий или нормальный ФVIII, и <0,5-0,7 МЕ/дл Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг. На БфВ Типа 2В указывают <30-200 МЕ/дл ФфВ:РКо, <30 МЕ/дл ФфВ:Аг, низкий или нормальный ФVIII, и <0,5-0,7 МЕ/дл Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг. На БфВ Типа 2М указывают <30 МЕ/дл ФфВ:РКо, <30-200 МЕ/дл ФфВ:Аг, низкий или нормальный ФVIII, и <0,5-0,7 МЕ/дл Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг. На БфВ Типа 2N указывают 30-2000 МЕ/дл ФфВ:РКо, 30-200 МЕ/дл ФфВ:Аг, очень низкий ФVIII, и >0,5-0,7 МЕ/дл Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг. На БфВ Типа 3 указывают <3 МЕ/дл ФфВ:РКо, <3 МЕ/дл ФфВ:Аг, крайне низкий (<10 МЕ/дл) ФVIII, и Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг не применимо. На норму указывают 50-200 МЕ/дл ФфВ:РКо, 50-200 МЕ/дл ФфВ:Аг, нормальный ФVIII, и >0,5-0,7 МЕ/дл Соотношение ФфВ:РКо/ФфВ:Аг. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект имеет БфВ Типа 3. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект имеет тяжелую БфВ типа 1. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект имеет тяжелую БфВ типа 2.
Хирургические Вмешательства
[00171] Хирургическое вмешательство в соответствии со способами данного изобретения может быть обширным хирургическим вмешательством или малым хирургическим вмешательством.
например
[00172] Как правило, обширное хирургическое вмешательство включает любую инвазивную оперативную процедуру, при которой выполняется более обширная резекция, , вводится в полость тела, удаляются органы или изменяется нормальная анатомия. Как правило, если мезенхимальный барьер открыт (например, плевральная полость, брюшина, оболочки головного мозга), хирургическое вмешательство считается обширным. В некоторых вариантах реализации изобретения обширное хирургическое вмешательство представляет собой операцию, при которой ожидаемая кровопотеря превышает 500 мл, характерны значительные перемещения жидкости и, как правило, необходима по меньшей мере одна ночь в больнице. Типовые обширные хирургические вмешательства включают, но не ограничиваются ими, бариатрические операции/шунтирование желудка, миотомию перегородки, панкреатэктомию, восстановление расслоения грудной аорты, эзофагэктомию, цистэктомию мочевого пузыря, коронарную реваскуляризацию, хирургическое лечение остеомиелита позвоночника, хирургическое восстановление желудочков сердца, краниэктомию, лапароскопические операции (кроме холецистэктомии и перевязки маточных труб), открытую резекция органов, замену крупных суставов, мастэктомию с реконструкцией, и/или спинальную, торакальную, сосудистую и/или интракраниальную хирургию. Дополнительные примеры обширных хирургических вмешательств включают, но не ограничиваются ими, остеотомию верхней или нижней челюсти, ларингэктомию, резекцию большой доброкачественной или злокачественной опухоли и/или диссекцию лимфатического узла, требующую поведения ночи в больнице (с или без реконструктивной хирургии), мастэктомию с немедленной реконструкцией ткани (с или без биопсии лимфатического узла или подмышечной диссекции), лапароскопическое или открытое восстановление или резекцию (например, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, печени, поджелудочной железы, селезенки, надпочечников или печени), открытую холецистэктомию, удаление крупных инцизионных, эпигастральных или вентральных грыж, гистероскопическую резекциюя или абляцию, гистерэктомию и/или операцию на придатках, лапароскопию при обширном эндометриозе, хирургию брюшного или трансвагинального тазового дна, интракраниальную хирургию, спинальную ламинэктомия и/или спондилосиндес, замену коленного сустава, замену тазобедренного сустава, замену плечевого сустава, замену локтевого сустава, удаление или проверку импланта на предмет инфекции или неисправности, ампутацию, реконструкцию свободного лоскута (пластическая хирургия), панникулэктомию, медиастиноскопия, резекцию легкого, резекция пищевода, массивную резекцию средостения (торакоскопическую или открытую), пластику хиатальной грыжи (торакоскопическую или открытую), резекцию опухоли мочевого пузыря (трансуретральную или открытую), резекцию опухоли предстательной железы (трансуретральную или открытую), резекцию почки (лапароскопическую или открытую), резекцию мочеточника (лапароскопическую или открытую), резекцию яичка (транскротальную или брюшную), операцию периферического артериального шунтирования, удаление аневризмы аорты (эндоваскулярное или открытое) и/или эндартерэктомию сонной артерии.
например
например
[00173] Малое хирургическое вмешательство представляет собой любую инвазивная оперативную процедуру, при которой производиться резекция только кожи или слизистых оболочек и соединительной ткани, , венесекция сосудов для установки катетера, имплантация помп в подкожную клетчатку. Малое хирургическое вмешательство обычно включает любую процедуру, которая может быть безопасно выполнена в амбулаторных условиях, без использования общей анестезии или потребности в респираторной помощи. В некоторых вариантах реализации изобретения малое хирургическое вмешательство представляет собой операцию, при которой ожидаемая кровопотеря составляет менее 500 мл, минимальное перемещение жидкости и, как правило, проводится на амбулаторной основе (дневной хирургический стационар/выписка в тот же день). Такие амбулаторные хирургические вмешательства могут включать, но не ограничиваются ими, операцию по удалению катаракты, операцию на молочных железах без реконструкции, лапароскопическую холецистэктомию и перевязку маточных труб, а также большинство кожных, поверхностных, эндоскопических и артроскопических процедур. Дополнительные примеры малых хирургических вмешательств включают, но не ограничиваются ими, удаление зуба, удаление миндалин, аденоидэктомию, септопластику, турбинэктомию, ринопластику, биопсию тканей глотки, биопсию гортани, незначительное иссечение лазером или другими средствами, операцию на среднем ухе, мастоидэктомию, кохлеарную имплантацию, эндоскопическую операцию пазухи носа, небольшие резекции доброкачественных и злокачественных образований (выполненные амбулаторно; , нижней челюсти, бранхиогенной кисты, опухоли язычка мягкого неба), тиреоидэктомию, люмпэктомию молочной железы (с или без биопсии лимфатического узла или подмышечной диссекции), мастэктомию (с или без биопсии лимфатического узла или подмышечной дессекции), удаление паховой грыжи (лапароскопическим или открытым доступом), удаление пупочной грыжи (лапароскопическим или открытым доступом), лапароскопическую холецистэктомия, геморроидэктомию, дилатацию, кюретаж, диагностическую гистероскопию, лапароскопию, термическую баллонную аблацию эндометрия, перевязку маточных труб, лечение эндометриоза, ограниченное лапароскопией, вставку трансвагинальной ленты, дискэктомию, удаление катаракты, большинство офтальмологических процедур, артроскопическую хирургию (включая восстановление ACL), стандартное удаление имплантов (не из-за инфекции), операцию на сухожилиях, бунионэктомию, раскрытие запястного канала, освобождение контрактуры Дюпюитрена, операцию на крупных сухожилиях, операцию на мелких сухожилиях, небольшие ротационные лоскуты и кожные трансплантаты, удаление базалиомы, иссечение липомы, маммопластику и другие операции по поводу доброкачественных новообразований молочной железы, косметическую хирургия молочной железы, бронхоскопию, цистоскопию, уретероскопию, реноскопию на предмет камня, реноскопию на предмет сужения канала, реноскопию с целью биопсии, удаление гидроцеле, удаление варикоцеле, вазэктомию, циркумцизию, и/или удаление варикозно измененных вен.
[00174] Стоматологические операции включают, но не ограничиваются ими, различные стоматологические процедуры и операции на полости рта, включая, например, удаление зубов.
[00175] В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой обширное хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах реализации изобретения хирургическое вмешательство представляет собой челюстно-лицевое хирургическое вмешательство.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: Гемостатическая эффективность и безопасность рФфВ
[00176] В данном исследовании оценивали гемостатическую эффективность и безопасность рФфВ с или без ADVATE (антигемофильного фактора [рекомбинантного]), Baxalta US Inc., Westlake Village, CA (рФVIII) у пациентов с тяжелой формой БфВ, подвергающихся плановому хирургическому вмешательству.
Способы
[00177] Фаза 3, открытое, неконтролируемое, нерандомизированное исследование в 14 местах в 10 странах (NCT02283268) у пациентов ≥18 лет, у которых была тяжелая форма БфВ и которые должны были подвергнуться плановому хирургическому вмешательству. Пациенты наблюдались в течение 14 дней после операции.
Лечение
[00178] За 12-24 ч до операции рФфВ 40-60 МЕ/кг рФфВ:РКо вводили внутривенно для повышения уровней эндогенного ФVIII:К до ≥30 МЕ/дл (малое хирургическое вмешательство/стоматологическая операция) или ≥60 МЕ/дл (обширное хирургическое вмешательство). Уровни ФVIII:К оценивали в течение 3 часов после начала операции. Если были достигнуты целевые уровни ФVIII:С, только рФфВ вводили за 1 ч до операции для достижения пиковых уровней, описанных в Таблице 2. Если были достигнуты целевые уровни ФVIII:С, только рФфВ вводили за 1 ч до операции для достижения пиковых уровней, описанных в Таблице 2. Интраоперационные и послеоперационные дозы были установлены индивидуально для поддержания целевых минимальных уровней в соответствии с фармакокинетическими (ФK) и фармакодинамическими (ФД) результатами, а также интенсивностью и продолжительностью гемостатической проблемы.
Таблица 2. Целевые уровни ФфВ:РКо и ФVIII:К: Рекомендации для Предотвращение Сильного Кровотечения Во Время и После Хирургического Вмешательства
Тип Хирургического Вмешательства
Целевой Пиковый Уровень в Плазме ФфВ:РКо (МЕ/дл)
Целевой Пиковый Уровень в Плазме ФVIII:К* (МЕ/дл)
Расчет Дозы рффВ (МЕ ФфВ:РКо Требуется)†
Малое/Стоматологическое
50-60
40-50
ΔФфВ:РКо × ВТ (кг)/ПВ‡
Обширное
100
80-100
ΔФфВ:РКо × ВТ (кг)/ПВ‡
ВС=вес тела; ФVIII:К=активность фактора VIII; ПВ=постепенное восстановление; рФфВ=рекомбинантный фактор фон Виллебранда; ФфВ:РКо=ристоцетин-кофакторная активность фактора фон Виллебранда.
*Для достижения рекомендуемых целевых пиковых уровней в плазме ФVIII:К может потребоваться дополнительный рФVIII.
†Вводился в пределах 1 ч до операции.
‡Если ПВ не было доступно, допускали, что ПВ составляет 2,0 МЕ/дл на МЕ/кг.
ΔФфВ:РКо=целевая пиковая концентрация ФфВ:РКо - исходная концентрация ФфВ в плазме:РКо.
Исследование
[00179] Общая гемостатическая эффективность (первичный результат) оценивалась исследователем через 24 часа после последней периоперационной инфузии или по завершении исследования, в зависимости от того, что наступило раньше (Таблица 3). Интраоперационная гемостатическая эффективность была оценена хирургом (Таблица 3), наряду с фактической интраоперационной и прогнозируемой кровопотерей. Оценки безопасности включали нежелательные явления (НЯ) и антитела против рФфВ, рФVIII, белков яичника китайского хомячка (CHO), мышиного иммуноглобулина G (IgG) и рФурина.
Таблица 3. Общая* и Интраоперационная† Шкала Оценки Гемостатической Эффективности
Оценка
Исследование
Отлично
Гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без рФVIII, был таким же хорошим или лучшим, чем ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта
Хорошо
Гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без рФVIII, был вероятно таким же хорошим, как ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта
Удовлетворительно
Гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без рФVIII был явно менее оптимальным для типа выполняемого хирургического вмешательства, но сохранялся без необходимости замены концентрата рФфВ
Неудовлетворительно
Пациент перенес неконтролируемое кровотечение, которое было результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильную дозировку, необходимость замены концентрата рФфВ
рФVIII=рекомбинантный фактор VIII; рФфВ=рекомбинантный фактор фон Виллебранда.
*Согласно оценке исследователя.
†Согласно оценке хирурга.
Статистика
[00180] Описательный анализ включал точечные оценки и ДИ с доверительной вероятностью 90% для числа пациентов с гемостатической эффективностью, оцененной как «отлично/хорошо» с использованием теста Клоппера-Пирсона. ФK/ФД и безопасность были обобщены с использованием описательной статистики.
Результаты
Пациенты
Таблица 4. Исходные Персональные Данные Пациентов и Клинические Характеристики
<b>Параметр </b>
<b>Кол-во=15</b>
<b>Пол, кол-во (%)</b>
<b>Мужской </b>
7 (46,7)
<b>Женский </b>
8 (53,3)
<b>Средний возраст (диапазон), лет </b>
40 (20-70)
<b>Средний вес (диапазон), кг </b>
73,5 (52,0-127,2).
<b>Средний ИМТ (диапазон), кг/м</b><sup><b>2</b></sup>
25,6 (17,1-38,0).
<b>Тип БфВ, кол-во (%)</b>
<b>1 </b>
3 (20,0)
<b>2A </b>
2 (13,3)
<b>2B </b>
1 (6,7)
<b>2M </b>
1 (6,7)
<b>3 </b>
8 (53,3)
<b>Классификация хирургического вмешательства, кол-во (%)</b>
<b>Обширное </b>
10 (66,7)
<b>Малое </b>
4 (26,7)
<b>Стоматологическое </b>
1 (6,7)
<b>Среднее (SD) ФVIII:К, МЕ/дл</b>
<b>Все типы БфВ (кол-во=11) </b>
20,6 (23,7)
<b>БфВ Типа 3 (кол-во=5) </b>
1,8 (1,1)
<b>Среднее (SD) ФфВ:РКо, МЕ/дл</b>
<b>Все типы БфВ (кол-во=11) </b>
9,7 (11,0)
<b>БфВ Типа 3 (кол-во=5) </b>
<8 (0,0)
ИМТ=индекс массы тела; ФVIII:К=активность фактора VIII; БфВ=болезнь фон Виллебранда; ФфВ:РКо=ристоцетин-кофакторная активность фактора фон Виллебранда.
[00181] Общая гемостатическая эффективность была оценена как «отличная» или «хорошая» для всех 15 пациентов (ДИ с доверительной вероятностью 90%: 81,9-100,0) (Фигура 1).
Эффективность
[00182] Общая гемостатическая эффективность была оценена как «отличная» или «хорошая» для всех 15 пациентов (ДИ с доверительной вероятностью 90%: 81,9-100,0) (Фигура 1).
[00183] Интраоперационная гемостатическая эффективность была оценена как «отлично» или «хорошо» для всех 15 пациентов (ДИ с доверительной вероятностью 90%: 81,9-100,0) (Фигура 2). Среди 8 пациентов с БфВ типа 3 общая и интраоперационная гемостатическая эффективность были оценены как «отлично» для 7 пациентов и «хорошо» для 1 пациента. Средняя ± SD фактическая интраоперационная кровопотеря по сравнению с прогнозируемой кровопотерей составляла 70 ± 45% и была оценена как «отлично» для 13 пациентов и «хорошо» для 2 пациентов.
ЭКСПОЗИЦИЯ
[00184] Пациенты получили в общей сложности 104 инфузии рФфВ для предотвращения или лечения кровотечения, вызванного хирургическим вмешательством; средняя суммарная доза рФфВ при хирургическом вмешательстве составила 220,4 МЕ/кг (диапазон 63,8-648,4 МЕ/кг) (Таблица 4). 93 (89,4%) инфузий только рФфВ: 15 (за 12-24 ч до операции), 12 (за 1 ч до операции) и 66 (после операции). 11 (10,6%) инфузий рФфВ с рФVIII: 3 (за 1 ч до операции), 1 (во время операции) и 7 (после операции). 5 пациентов получили 11 инфузий рФфВ с рФVIII, и 6 из 7 послеоперационных инфузий рФфВ с рФVIII были у 1 пациента.
[00185] Из 10 пациентов, подвергшихся обширному хирургическому вмешательству, 7 (70%) не нуждались в совместном введении с рФVIII.
Таблица 5. Средняя Экспозиция рФфВ В Общем и по Классификации Хирургического Вмешательства
Классификация Хирургического Вмешательства
Малое (кол-во=4)
Обширное (кол-во=10)
Стоматологическое (кол-во=1)
Всего (Кол-во=15)
Среднее общее количество инфузий* (диапазон)
3 (2-4)
7,5 (4-15)
5
6 (2-15)
Средняя экспозиция (диапазон), д
3 (2-4)
6,5 (4-15)
4
6 (2-15)
Средняя доза за 12-24 ч до операции (диапазон), МЕ/кг
57,2 (55,0-59,9)
49,3 (37,4-57,6).
36,1 55,0
(36,1-59,9)
Средняя доза за 1 ч до операции (диапазон), МЕ/кг
39,3 (8,0-46,4)
37,6 (15,7-82,7)
18,1
35,8 (8,0-82,7).
Средняя интраоперационная доза (диапазон), МЕ/кг
0
0
18,1
18,1
Средняя послеоперационная доза (диапазон), МЕ/кг
79,3 (42,8-115,9)
214,8 (47,7-533,3)
36,1
189,8 (36,1-533,3)
Средняя суммарная доза при хирургическом вмешательстве (диапазон), МЕ/кг
119,9 (63,8-217,3)
307,6 (125,2-648,4)
108,4
220,4 (63,8-648,4)
рФфВ=рекомбинантный фактор фон Виллебранда
*Общее количество предоперационных инфузий, предоперационных начальных нагрузочных доз, предоперационных дополнительных нагрузочных доз, интраоперационных доз и послеоперационных доз.
Безопасность
[00186] 6 пациентов сообщили о 12 возникающих при лечении НЯ; ни одино не считается связанным с лечением. У пациентов были серьезные НЯ (дивертикулит и тромбоз глубоких вен [ТГВ]; каждое имело место у 1 пациента); ни одно явление не было сочтено связанным с фактор-заместительной терапией.
[00187] Серьезный ТГВ произошел в послеоперационный день 8 (первоначально сообщалось о несерьезном ТГВ в послеоперационный день 4). Явление было бессимптомным и наблюдалось после профилактического дуплексного сканирования. Явление было оценено как маловероятно связанное с рФфВ и не связанное с рФVIII или процедурами исследования; причинно связанное с обширной операцией пациента (полная замена тазобедренного сустава) и текущим ожирением в анамнезе. Послеоперационные уровни ФVIII:К никогда не превышали 150 МЕ/дл. Событие привело к размещению кавального фильтра и впоследствии разрешилось без осложнений. Не было серьезных аллергических реакций; нейтрализующих антител против рФVIII, белков CHO, мышиного IgG или рФурина.
[00188] Один пациент с БфВ типа 3, у которого было интраоперационное переливание эритроцитарной массы во время обширной операции по замене коленного сустава, дал положительный результат на связывающие антител против ффВ на 7-й день после операции.
[00189] Параметры ФK для ФфВ:РКо для пациентов, которые прошли ФK-анализ (n=11), представлены на Фиг. 4. Средние концентрации ФфВ:РКо, ФфВ:Аг и коллаген-связывающей ФфВ (ФфВ:КС) достигли пиковых уровней к 30 мин и постепенно снижались в течение 72 ч после инфузии (Фиг. 4).
[00190] Введение только рФфВ привело к существенной быстрой стабилизации уровней эндогенного ФVIII:К через 6-12 ч после инфузии, при этом пиковые уровни ФVIII:К были достигнуты к 24 ч среди всех обследованных пациентов (n=11; Фиг. 5А), а также в подгруппе пациентов с БфВ типа 3 (n=5) (Фиг. 5B). В целом, пациенты достигли среднего значения ФVIII:К > 60 МЕ/дл к 6 ч после инфузии (Фиг. 5А), и пациенты с более высоким исходным уровнем ФVIII:К (например, с БфВ типа 1 или типа 2) смогли достичь целевых уровней быстрее. Несмотря на то, что средние уровни ФVIII:К составляли <2 МЕ/дл в начале исследования, введение только рФфВ позволило пациентам с БфВ типа 3 быстро достичь целевых уровней ФфВ:РКо и ФVIII:К, при этом уровень ФVIII:К >60 МЕ/дл достигался к 12 ч после инфузии (Фиг. 5B).
Выводы
[00191] В этом хирургическом исследовании общая и интраоперационная гемостатическая эффективность была оценена как «отличная» или «хорошая» для всех 15 пациентов. При обширных операциях общая гемостатическая эффективность была «отличной» у 7 пациентов и «хорошей» у 3 пациентов, а интраоперационная эффективность была «отличной» у 8 пациентов и «хорошей» у 2 пациентов. Почти 90% инфузий для достижения интраоперационного и послеоперационного гемостаза были сделаны только с рФфВ; 70% обширных операций были проведены только с рФфВ. РффВ нацелен на первичную дисфункцию БфВ и позволяет врачам сосредоточиться на достижении оптимальной эффективности, не заботясь о накоплении ФVIII. Эти данные подтверждают безопасное и эффективное использование рФфВ при обширных и малых хирургических вмешательствах.
ПРИМЕР 2: Рекомбинантный Фактор Фон Виллебранда У Пациентов С Тяжелой Формой Болезни Фон Виллебранда, Подвергающихся Хирургическому Вмешательству
[00192] В этом примере представлены результаты исследования, посвященного лечению пациентов с тяжелой формой Болезни Виллебранда (БфВ), подвергающихся хирургическому вмешательству.
КРИТЕРИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ:
Первичные Критерии Эффективности:
[00193] Общая Гемостатическая Эффективность, Оцененная Исследователем (Врачом Гематологом) [Сроки: 24 часа после последней периоперационной инфузии или при посещении по завершению исследования на День 14 (± 2 дня), в зависимости от того, что наступит раньше). Гемостатическая эффективность оценивалась по шкале отлично - хорошо - удовлетворительно - неудовлетворительно.
Отлично: Интра- и послеоперационный гемостаз, достигнутый с использованием рФфВ с ADVATE или без него, был таким же хорошим или лучшим, чем ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.
Хорошо: Интра- и послеоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с ADVATE или без него, вероятно, был таким же хорошим, как ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.
Удовлетворительно: Интра- и послеоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без ADVATE был явно меньше оптимального для типа хирургического вмешательства, но сохранялся без необходимости замены концентрата рФфВ.
Неудовлетворительно: Участник перенес неконтролируемое кровотечение, которое было результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильную дозировку, необходимость замены концентрата рФфВ.
Вторичные Критерии Эффективности:
[00194] №1: Интраоперационная Фактическая и Прогнозируемая Кровопотеря согласно Оценке Врача-Хирурга [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]. Прогнозируемая кровопотеря была оценена врачом-хирургом до операции на основе гемостатически нормального пациента того же пола, возраста, роста и сопутствующих заболеваний, что и участник. Фактическая кровопотеря была оценена исходя из расчетной кровопотери, включая потери в марлевые тампоны, салфетки и отсасывание во время операции, согласно записи анестезиолога.
[00195] №2: Интраоперационная Фактическая Кровопотеря По Сравнению С Прогнозируемой Кровопотерей [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]. Фактическая кровопотеря относительно прогнозируемой кровопотери была рассчитана как [Фактическая кровопотеря (мл)], деленная на [Прогнозируемая Кровопотеря (мл) умноженная на 100].
[00196] №3: Оценка Интраоперационной Фактической и Прогнозируемой Кровопотери согласно Оценке Врача-Хирурга [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]
Гемостатическая эффективность оценивалась по шкале отлично - хорошо - удовлетворительно - неудовлетворительно.
Отлично: Интраоперационная кровопотеря была меньше или равна максимальной кровопотере, ожидаемой для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта (≤ 100%).
Хорошо: Интраоперационная кровопотеря была на 50% больше максимальной ожидаемой кровопотери для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта (101-150%). Удовлетворительно: Интраоперационная кровопотеря составляла более 50% от максимальной ожидаемой кровопотери для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта (> 150%).
Неудовлетворительно: Неконтролируемое кровотечение, которое явилось результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильное дозирование, что требует изменения режима замены фактора свертывания крови.
[00197] №4: Оценка Интраоперационной Гемостатической Эффективности согласно Оценке Врача-Хирурга [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]
Гемостатическая эффективность оценивалась по шкале отлично - хорошо - удовлетворительно - неудовлетворительно.
Отлично: Интраоперационный гемостаз, достигнутый с использованием рФфВ с ADVATE или без него, был таким же хорошим или лучшим, чем ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.
Хорошо: Интраоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с ADVATE или без него, вероятно, был таким же хорошим, как ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.
Удовлетворительно: Интраоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без ADVATE был явно меньше оптимального для типа хирургического вмешательства, но сохранялся без необходимости замены концентрата рФфВ.
Неудовлетворительно: Участник перенес неконтролируемое кровотечение, которое было результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильную дозировку, необходимость замены концентрата рФфВ.
[00198] №5: Суточная Интра- и Послеоперационная Скорректированная по Весу Доза РФфВ С ADVATE Или Без Него [Сроки: Ежедневно, от дня операции до послеоперационного Дня 14 (± 2 дня)]
[00199] №6: Возникновение Нежелательных Явлений [Сроки: От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)]. Оценивались нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (НЯВЛ) и серьезные нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (СНЯВЛ).
[00200] №7: Возникновение Тромботических Явлений [Сроки: От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)]. Нежелательные явления, возникшие в ходе лечения (НЯВЛ) и серьезные нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (СНЯВЛ) оценивались на наличие тромботических явлений.
например
т.е.
[00201] №8: Возникновение Тяжелых Аллергических Реакций (, Анафилаксии) [Сроки: От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования ( через 14 (± 2) дней после операции)]. Нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (НЯВЛ) и серьезные нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (СНЯВЛ) оценивались на наличие тяжелых аллергических реакций.
[00202] №9: Число Участников, Которые Вырабатывали Ингибирующие и Суммарные Связывающие Антитела к Фактору Фон Виллебранда (Ффв) и Ингибирующие Антитела к Фактору VIII (ФVIII) [Сроки: Тестирование проводилось на протяжении всего исследования во время скрининга, до ФК инфузии, до операции, после операции в случае сильного кровотечения или необъяснимого кровотечения, на день 7 после операции и при посещении по завершению исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)]. Участников лечили рекомбинантным Фактором фон Виллебранда (рФфВ) с ADVATE или без него.
[00203] №10: Число Участников, Которые Вырабатывали Антитела к Белкам Яичника Китайского Хомяка (СНО), Мышиному Иммуноглобулину G (IgG) или Рекомбинантному Фурину (рФурину) [Сроки: Тестирование проводилось на протяжении всего исследования во время скрининга, до ФК инфузии, до операции, после операции в случае сильного кровотечения или необъяснимого кровотечения, на день 7 после операции и при посещении по завершению исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)]. Участников лечили рекомбинантным Фактором фон Виллебранда (рФфВ) с ADVATE или без него.
[00204] №11: Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме от Времени от 0 до 72 Часов После Инфузии (AUC 0-72 Ч/Доза) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Площадь под кривой зависимости концентрации в плазме/время от 0 до 72 часов после инфузии была рассчитана с использованием линейного правила трапеции. Для расчета AUC(0-72ч) уровни через 72 часа были линейно интерполированы/экстраполированы из 2 ближайших точек времени отбора проб. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак (VWF:Ac)), Коагулянтной Активности ФVIII (ФVIII:К)
[00205] №12: Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме От Времени от 0 до Бесконечности (AUC 0-∞/Доза) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Площадь под кривой зависимости концентрации в плазме/время от 0 до бесконечности и площадь под первым моментом этой кривой от 0 до бесконечности рассчитывали как сумму AUC или AUMC от времени 0 до времени последней возможной количественной оценки концентрации плюс поправка хвоста распределения рассчитанного как Ct/λz и Ct/λz(t+1/λz) соответственно, где Ct - последняя возможная количественная оценка концентрации, t - время последней возможной количественной оценки концентрации, а λz - константа скорости распределения в конечной фазе. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак (VWF:Ac)), Коагулянтной Активности ФVIII (ФVIII:К)
[00206] №13: Фармакокинетика: Среднее Время Удержания (СВУ) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Среднее время удержания рассчитывалось как площадь под первым моментом фармакокинетической кривой от 0 до бесконечности, деленная на площадь под кривой зависимости от времени от 0 до бесконечности минус Т/2, где Т - продолжительность инфузии. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)
[00207] №14: Фармакокинетика: Клиренс (Кл) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Клиренс рассчитывали как дозу (МЕ/кг), деленную на площадь под кривой зависимости от времени от 0 до бесконечности. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)
[00208] №15: Фармакокинетика: Постепенное Восстановление (ПВ) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Постепенное восстановление рассчитывали как (Cмакс минус Cдо инфузии), деленное на дозу (МЕ/кг), где кг относится к массе тела на момент введения дозы, а Cмакс - наблюдаемая максимальная концентрация перед коррекцией для значений до инфузии. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)
[00209] №16: Фармакокинетика: Период Полувыведения (T1/2) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Конечный период полувыведения (T1/2) рассчитывали как ln2/λz, где λz - константа скорости терминальной элиминации, рассчитанная в WinNonlin NCA с использованием, по меньшей мере, трех количественных оценок концентрации. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)
[00210] №17: Фармакокинетика: Объем Распределения в Равновесном Состоянии (ОбРС) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.] Эта оценка требовалась только для пациентов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. ОбРС был рассчитан как клиренс, умноженный на среднее время удержания. ФK-анализ проводили для следующих аналитов: Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)
Критерии Отбора
[00211] Возраст, Соответствующий Критериям Включения в Исследование: 18 лет и старше; Пол, Соответствующий Критериям Включения в Исследование: Все
Критерии Включения:
[00212] Диагноз тяжелая форма болезни фон Виллебранда (БфВ), как указано ниже, и когда запланировано плановое хирургическое вмешательство:
1. Тип 1 (Ристоцетин кофакторная актривность Фактора фон Виллебранда (ФфВ:РКо) <20 МЕ/дл), или
2. Тип 2A (подтвержденный по паттерну мультимеров), Тип 2B (согласно генотипу), Тип 2N (ФVIII:К<10% и наличие в истории болезни генетических факторов), Тип 2M, или
3. Тип 3 (Антиген Фактора фон Виллебранда (ФфВ:Аг) ≤ 3 МЕ/дл)
[00213] БфВ в анамнезе с необходимостью заместительной терапии с концентратом Фактором фон Виллебранда (ФфВ) для контроля кровотечения.
[00214] В случае БфВ типа 3 (Антиген ФфВ/ФфВ:Аг ≤ 3 МЕ/дл), когда участник имеет в истории болезни по меньшей мере 20 дней экспозиции концентратов фактора свертывания ФфВ/ФVIII (включая криопреципитат или свежезамороженную плазму).
[00215] В случае БфВ типа 1 или типа 2, когда участник имеет в истории болезни по меньшей мере 5 дней экспозиции препарата или подвергся обширному хирургическому вмешательству, требующего концентратов фактора свертывания ФфВ/ФVIII (включая криопреципитат или свежезамороженную плазму).
[00216] Участник должен быть не моложе 18 лет.
[00217] Если участница является женщиной с детородным потенциалом, то она предъявляет отрицательный тест на беременность.
[00218] Если необходимо, участник соглашается применять адекватные средства контрацепции в течение всего периода исследования.
[00219] Участник готов и способен соблюдать требования протокола.
Отдельные Критерии Исключения:
например
[00220] Диагностирована псевдо БфВ или другое наследственное или приобретенное нарушение коагуляции (, качественные и количественные нарушения тромбоцитов или повышенное протромбиновое время [ПТВ (PT)] / международное нормализованное отношение [МНО (INR)] > 1,4).
[00221] Наличие в анамнезе или присутствие при скрининге ингибитор ФфВ.
[00222] Наличие в анамнезе или присутствие ингибитора фактора VIII (ФVIII) с титром ≥ 0,4 БЕ (по Бетезда-анализу модифицированного по Неймегену) или ≥ 0,6 БЕ (по Бетезда-анализу).
[00223] Наличие известной гиперчувствительности к любому из компонентов исследуемых препаратов, таким как белкам мыши или хомяка.
[00224] В истории болезни имеются иммунологические нарушения, за исключением сезонного аллергического ринита/конъюнктивита, легкой астмы, пищевой аллергии или аллергии на животных.
[00225] В истории болезни имеется тромбоэмболическое событие.
3
[00226] ВИЧ-положительный участник с абсолютным количеством клеток CD4<200/мм.
[00227] Количество тромбоцитов < 100 000/мл.
например
[00228] Диагностировано серьезное заболевание печени, о чем свидетельствует любое из следующего: сывороточная аланинаминотрансфераза (АЛТ) в 5 раз выше верхнего предела нормы; гипоальбуминемия; портальная гипертензия (, наличие спленомегалии неизвестной этиологии, варикозное расширение вен пищевода в анамнезе) или цирроз печени, классифицируемый как субкомпенсированный (класс В) и декомпенсированный (класс С).
[00229] Диагностирована почечная недостаточность с уровнем креатинина в сыворотке ≥ 2,5 мг/дл.
например
[00230] Участник получал иммуномодулирующее лекарственное средство, исключая местное лечение (, мази, назальные спреи), в течение 30 дней до подписания информированного согласия.
[00231] Участница была беременна или кормила грудью на момент получения информированного согласия.
[00232] Участник принимал участие в другом клиническом исследовании, включающем исследуемый препарат (ИП (IP)), отличный от рФфВ с ADVATE или без него, или исследуемое устройство в течение 30 дней до включения, или планировал участвовать в другом клиническом исследовании с использованием ИП или исследуемого устройства в течение курса данного исследования. Тем не менее, подходящие пациенты, участвующие в профилактическом исследовании рФфВ (071301), могут быть включены в исследование.
[00233] Наличие прогрессирующей смертельной болезни и/или если продолжительность жизни участника составляет менее 3 месяцев.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
[00234] Включение в исследование проводилось в 14 исследовательских центрах в 10 странах (США, Австралия, Тайвань, Германия, Россия, Испания, Украина, Великобритания, Италия, Турция).
Таблица 6:
Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Таблица 6:
Участник: Общее Исследование
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>НАЧАЛИ </b>
<b>15</b>
<b>ЗАВЕРШИЛИ </b>
<b>14</b>
<b>НЕ ЗАВЕРШИЛИ</b>
<b>1</b>
<b>ДОСРОЧНОЕ ИСКЛЮЧЕНИЕ СУБЪЕКТОВ</b>
<b>1</b>
Таблица 7:
Исходные Измерения:
<b> Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) </b>
<b>Все Участники, которые Прошли Исследование </b>[Единицы измерения: Участники]
<b> 15 </b>
<b>Возраст </b>[Единицы измерения: Годы]Медиана (Полный Диапазон)<b></b>
<b> 40,0 </b><b> (от 20,0 до 70,0) </b>
<b>Пол: Женский, Мужской </b>[Единицы измерения: Участники]Количество Участников<b></b>
<b>Женщин </b>
<b> 8</b>  53,3%<b></b>
<b>Мужчин </b>
<b> 7</b>  46,7%<b></b>
Первичный Результат: Результат №1
Таблица 8:
Критерии Эффективности
[00235] 1. Первичный: Общая Гемостатическая Эффективность, Оцененная Исследователем (Врачом Гематологом) [Сроки: 24 часа после последней периоперационной инфузии или при посещении по завершению исследования на День 14 (± 2 дня), в зависимости от того, что наступило раньше).
Таблица 9: Первичный Результат №1
<b>Тип Измерения</b>
Первичный
<b>Название Измерения</b>
Общая Гемостатическая Эффективность, Оцененная Исследователем (Врачом Гематологом)
<b>Описание Измерения</b>
Гемостатическая эффективность оценивалась по шкале отлично - хорошо - удовлетворительно - неудовлетворительно.Отлично: Интра- и послеоперационный гемостаз, достигнутый с использованием рФфВ с ADVATE или без него, был таким же хорошим или лучшим, чем ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.Хорошо: Интра- и послеоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с ADVATE или без него, вероятно, был таким же хорошим, как ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.Удовлетворительно: Интра- и послеоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без ADVATE был явно меньше оптимального для типа хирургического вмешательства, но сохранялся без необходимости замены концентрата рФфВ.Неудовлетворительно: Участник перенес неконтролируемое кровотечение, которое было результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильную дозировку, необходимость замены концентрата рФфВ.
<b>Сроки Исследования</b>
24 часа после последней периоперационной инфузии или при посещении по завершению исследования на День 14 (± 2 дня), в зависимости от того, что наступит раньше
Результат №1, Описание Выборки
[00236] Количество участников, подвергшихся обширному, малому хирургическому вмешательству или челюстно-лицевого хирургического вмешательства, и количество участников с болезнью фон Виллебранда типа 1, 2А, 2В, 2М и 3 суммируется до общего числа участников, которые прошли исследование. Для анализа использовался полный набор данных анализа, включая всех участников, которые получили исследуемый препарат и имели по меньшей мере 1 оценку гемостатической эффективности.
Таблица 10:
Результат №1, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
<b>Малое Хирургическое Вмешательство</b>
Все участники, которые перенесли малое хирургическое вмешательство.
<b>Обширное Хирургическое Вмешательство</b>
Все участники, которые перенесли обширное хирургическое вмешательство.
<b>Стоматологическая Операция</b>
Все участники, которые перенесли челюстно-лицевое хирургическое вмешательство.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 1</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 1.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2A</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2A.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2B</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2B.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2M</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2M.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 3</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 3.
Таблица 11:
Результат №1, Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Малое Хирургическое Вмешательство</b>
<b>Обширное Хирургическое Вмешательство</b>
<b>Стоматоло</b><b>гическая Операция</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 1</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2A</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2B</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2M</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 3</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b> 15 </b>
<b> 4 </b>
<b> 10 </b>
<b> 1 </b>
<b> 3 </b>
<b> 2 </b>
<b> 1 </b>
<b> 1 </b>
<b> 8 </b>
<b>Общая Гемостатическая Эффективность, Оцененная Исследователем (Врачом Гематологом) </b>[Единицы измерения: Участники]Количество Участников<b></b>
<b>Отлично </b>
<b> 11</b>  73,3%<b></b>
<b> 4</b> 100,0%<b></b>
<b> 7</b>  70,0%<b></b>
<b> 0</b>   0,0%<b></b>
<b> 2</b>  66,7%<b></b>
<b> 1</b>  50,0%<b></b>
<b> 1</b> 100,0%<b></b>
<b> 0</b>   0,0%<b></b>
<b> 7</b>  87,5%<b></b>
<b>Хорошо </b>
<b>4</b>  26,7%
<b>0</b>   0,0%
<b>3</b>   30,0%
<b>1 </b>100,0%
<b>1</b>  33,3%
<b>1</b>  50,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>1 </b>100,0%
<b>1</b>  12,5%
<b>Удовлетворительно </b>
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>Неудовлетворительно </b>
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
Вторичный Результат: Результат №2
[00237] 2. Вторичный: Интраоперационная Фактическая и Прогнозируемая Кровопотеря согласно Оценке Врача-Хирурга [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]
Таблица 12: Первичный Результат №2
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Интраоперационная Фактическая и Прогнозируемая Кровопотеря согласно Оценке Врача-Хирурга
<b>Описание Измерения</b>
Прогнозируемая кровопотеря была оценена врачом-хирургом до операции на основе гемостатически нормального пациента того же пола, возраста, роста и сопутствующих заболеваний, что и участник.Фактическая кровопотери была оценена исходя из расчетной кровопотери, включая потери в марлевые тампоны, салфетки и отсасывание во время операции, согласно записи анестезиолога.
<b>Сроки Исследования</b>
День 0 (по окончанию операции)
Результат №2, Описание Выборки
[00238] Для прогнозируемой кровопотери количество участников, которые прошли исследование, составило 14, так как для одного участника (включенного в группу, сообщившую о хирургическом вмешательстве) прогнозируемая кровопотеря не была оценена. Для анализа использовался полный набор данных анализа, включая всех участников, которые получили исследуемый препарат и имели по меньшей мере 1 оценку гемостатической эффективности.
Таблица 13:
Результат №2, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
<b>Малое Хирургическое Вмешательство</b>
Все участники, которые перенесли малое хирургическое вмешательство.
<b>Обширное Хирургическое Вмешательство</b>
Все участники, которые перенесли обширное хирургическое вмешательство.
<b>Стоматологическая Операция</b>
Все участники, которые перенесли челюстно-лицевое хирургическое вмешательство.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 1</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 1.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2A</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2A.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2B</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2B.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2M</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2M.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 3</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 3.
Таблица 26:
Результат №2, Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Малое Хирургическое Вмешательство</b>
<b>Обширное Хирургическое Вмешательство</b>
<b>Стоматологическая Операция</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 1</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2A</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2B</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2M</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 3</b>
Участники, которые Прошли Исследование
15
4
10
1
3
2
1
1
8
Интраоперационная Фактическая и Прогнозируемая Кровопотеря согласно Оценке Врача-Хирурга
[Единицы измерения: мл]
Среднее (Стандартное Отклонение)
Фактическая кровопотеря
Участники, которые Прошли Исследование
15
4
10
1
3
2
1
1
8
Фактическая кровопотеря
94,3 (177,88)
0,0 (0,00)
127,0 (209,27)
145,0 [1]
115,0 (103,32)
42,5 (53,03)
50,0 [1]
50,0 [1]
110,6 (240,87)
Прогнозируемая кровопотеря
Участники, которые Прошли Исследование
14
4
9
1
3
1
1
1
8
Прогнозируемая кровопотеря
106,1 (161,82)
2,5 (5,00)
152,8 (186,33)
100,0 [1]
100,0 (100,00)
10,0 [1]
50,0 [1]
50,0 [1]
134,4 (206,46)
[1] Стандартное отклонение рассчитать невозможно, так как был проанализирован только один участник.
Статистический Анализ Не Предоставлен Для Интраоперационной Фактической И Прогнозируемой Кровопотери согласно Оценке Врача-Хирурга
Вторичный Результат: Результат №3
[00239] 3. Вторичный: Интраоперационная Фактическая Кровопотеря По Сравнению С Прогнозируемой Кровопотерей [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]
Таблица 14: Результат №3
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Интраоперационная Фактическая Кровопотеря По Сравнению С Прогнозируемой Кровопотерей
<b>Описание Измерения</b>
Фактическая кровопотеря относительно прогнозируемой кровопотери была рассчитана как [Фактическая кровопотеря (мл)], деленная на [Прогнозируемая Кровопотеря (мл) умноженная на 100].
<b>Сроки Исследования</b>
День 0 (по окончанию операции)
Результат №3, Описание Выборки
[00240] Количество участников, которые прошли исследование, составило 11, так как для 3 участников фактическая и прогнозируемая кровопотеря были равны нулю, а для 1 участника прогнозируемая кровопотеря не была оценена. Следовательно, «фактическая кровопотеря относительно прогнозируемой кровопотери» не может быть рассчитана. Полный набор данных анализа был использован для анализа данного критерия эффективности.
Таблица 15:
Результат №3, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
<b>Малое Хирургическое Вмешательство</b>
Все участники, которые перенесли малое хирургическое вмешательство.
<b>Обширное Хирургическое Вмешательство</b>
Все участники, которые перенесли обширное хирургическое вмешательство.
<b>Стоматологическая Операция</b>
Все участники, которые перенесли челюстно-лицевое хирургическое вмешательство.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 1</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 1.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2A</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2A.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2B</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2B.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2M</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2M.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 3</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 3.
Таблица 16:
Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Малое Хирургическое Вмешательство</b>
<b>Обширное Хирургическое Вмешательство</b>
<b>Стоматологическая Операция</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 1</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2A</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2B</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2M</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 3</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b> 11 </b>
<b> 1 </b>
<b> 9 </b>
<b> 1 </b>
<b> 2 </b>
<b> 1 </b>
<b> 1 </b>
<b> 1 </b>
<b> 6 </b>
<b>Интраоперационная Фактическая Кровопотеря По Сравнению С Прогнозируемой Кровопотерей </b>[Единицы измерения: Процент]Среднее (Стандартное Отклонение)<b></b>
<b> 69,6 (44,77) </b>
<b> 0,0 </b><sup><b>[1] </b></sup>
<b> 68,9 (34,48) </b>
<b> 145,0 </b><sup><b>[1] </b></sup>
<b> 122,5 (31,82) </b>
<b> 50,0 </b><sup><b>[1] </b></sup>
<b> 100,0 </b><sup><b>[1] </b></sup>
<b> 100,0 </b><sup><b>[1] </b></sup>
<b> 45,0 (38,92) </b>
[1] Стандартное отклонение рассчитать невозможно, так как был проанализирован только один участник.
Статистический Анализ Не Предоставлен Для Интраоперационной Фактической Кровопотери Относительно Прогнозируемой Кровопотери
Вторичный Результат: Результат №4
[00241] 4. Вторичный: Оценка Интраоперационной Фактической и Прогнозируемой Кровопотери согласно Оценке Врача-Хирурга [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]
Таблица 17: Результат №4
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Оценка Интраоперационной Фактической и Прогнозируемой Кровопотери согласно Оценке Врача-Хирурга
<b>Описание Измерения</b>
Гемостатическая эффективность оценивалась по шкале отлично - хорошо - удовлетворительно - неудовлетворительно.Отлично: Интраоперационная кровопотеря была меньше или равна максимальной кровопотере, ожидаемой для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта (≤ 100%).Хорошо: Интраоперационная кровопотеря была на 50% больше максимальной ожидаемой кровопотери для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта (101-150%). Удовлетворительно: Интраоперационная кровопотеря составляла более 50% от максимальной ожидаемой кровопотери для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта (> 150%).Неудовлетворительно: Неконтролируемое кровотечение, которое явилось результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильное дозирование, что требует изменения режима замены фактора свертывания крови.
<b>Сроки Исследования</b>
День 0 (по окончанию операции)
Таблица 18:
Результат №4, Описание Выборки
Количество участников, подвергшихся обширному, малому хирургическому вмешательству или челюстно-лицевого хирургического вмешательства, и количество участников с болезнью фон Виллебранда типа 1, 2А, 2В, 2М и 3 суммируется до общего числа участников, которые прошли исследование. Для анализа использовался полный набор данных анализа, включая всех участников, которые получили исследуемый препарат и имели по меньшей мере 1 оценку гемостатической эффективности.
Таблица 19:
Результат №4, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
<b>Малое Хирургическое Вмешательство</b>
Все участники, которые перенесли малое хирургическое вмешательство.
<b>Обширное Хирургическое Вмешательство</b>
Все участники, которые перенесли обширное хирургическое вмешательство.
<b>Стоматологическая Операция</b>
Все участники, которые перенесли челюстно-лицевое хирургическое вмешательство.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 1</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 1.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2A</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2A.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2B</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2B.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2M</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2M.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 3</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 3.
Таблица 20:
Результат №4, Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Малое Хирургическое Вмешательство</b>
<b>Обширное Хирургическое Вмешательство</b>
<b>Стоматологическая Операция</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 1</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2A</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2B</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2M</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 3</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b> 15 </b>
<b> 4 </b>
<b> 10 </b>
<b> 1 </b>
<b> 3 </b>
<b> 2 </b>
<b> 1 </b>
<b> 1 </b>
<b> 8 </b>
<b>Оценка Интраоперационной Фактической и Прогнозируемой Кровопотери согласно Оценке Врача-Хирурга </b>[Единицы измерения: Участники]Количество Участников<b></b>
<b>Отлично </b>
<b>13</b>  86,7%
<b>4</b> 100,0%
<b>8</b>   80,0%
<b>1 </b>100,0%
<b>3</b> 100,0%
<b>1</b>  50,0%
<b>1 </b>100,0%
<b>1 </b>100,0%
<b>7</b>  87,5%
<b>Хорошо </b>
<b>2</b>  13,3%
<b>0</b>   0,0%
<b>2</b>  20,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>1</b>  50,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>1</b>  12,5%
<b>Удовлетворительно </b>
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>Неудовлетворительно </b>
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
Статистический Анализ Не Предоставлен Для Интраоперационной Фактической И Прогнозируемой Оценки Кровопотери согласно Оценке Врача-Хирурга
Вторичный Результат: Результат №5
[00242] 5. Вторичный: Оценка Интраоперационной Гемостатической Эффективности согласно Оценке Врача-Хирурга [Сроки: День 0 (по окончанию операции)]
Таблица 21: Результат №5
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Оценка Интраоперационной Гемостатической Эффективности согласно Оценке Врача-Хирурга
<b>Описание Измерения</b>
Гемостатическая эффективность оценивалась по шкале отлично - хорошо - удовлетворительно - неудовлетворительно.Отлично: Интраоперационный гемостаз, достигнутый с использованием рФфВ с ADVATE или без него, был таким же хорошим или лучшим, чем ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.Хорошо: Интраоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с ADVATE или без него, вероятно, был таким же хорошим, как ожидалось для типа хирургического вмешательства, выполняемого у гемостатически нормального субъекта.Удовлетворительно: Интраоперационный гемостаз, достигнутый с помощью рФфВ с или без ADVATE был явно меньше оптимального для типа хирургического вмешательства, но сохранялся без необходимости замены концентрата рФфВ.Неудовлетворительно: Участник перенес неконтролируемое кровотечение, которое было результатом неадекватного терапевтического ответа, несмотря на правильную дозировку, необходимость замены концентрата рФфВ.
<b>Сроки Исследования</b>
День 0 (по окончанию операции)
Таблица 22: Результат №5, Описание Выборки
Количество участников, подвергшихся обширному, малому хирургическому вмешательству или челюстно-лицевого хирургического вмешательства, и количество участников с болезнью фон Виллебранда типа 1, 2А, 2В, 2М и 3 суммируется до общего числа участников, которые прошли исследование. Для анализа использовался полный набор данных анализа, включая всех участников, которые получили исследуемый препарат и имели по меньшей мере 1 оценку гемостатической эффективности.
Таблица 23: Результат №5, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
<b>Малое Хирургическое Вмешательство</b>
Все участники, которые перенесли малое хирургическое вмешательство.
<b>Обширное Хирургическое Вмешательство</b>
Все участники, которые перенесли обширное хирургическое вмешательство.
<b>Стоматологическая Операция</b>
Все участники, которые перенесли челюстно-лицевое хирургическое вмешательство.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 1</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 1.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2A</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2A.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2B</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2B.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2M</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 2M.
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 3</b>
Все участники с Болезнью фон Виллебранда Типа 3.
Таблица 24:
Результат №5, Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Малое Хирургическое Вмешательство</b>
<b>Обширное Хирургическое Вмешательство</b>
<b>Стоматологическая Операция</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 1</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2A</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2B</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 2M</b>
<b>Болезнь фон Виллебранда Типа 3</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b> 15 </b>
<b> 4 </b>
<b> 10 </b>
<b> 1 </b>
<b> 3 </b>
<b> 2 </b>
<b> 1 </b>
<b> 1 </b>
<b> 8 </b>
<b>Оценка Интраоперационной Гемостатической Эффективности согласно Оценке Врача-Хирурга </b>[Единицы измерения: Участники]Количество Участников<b></b>
<b>Отлично </b>
<b>13</b>  86,7%
<b>4</b> 100,0%
<b>8</b>   80,0%
<b>1 </b>100,0%
<b>3</b> 100,0%
<b>1</b>  50,0%
<b>1 </b>100,0%
<b>1 </b>100,0%
<b>7</b>  87,5%
<b>Хорошо </b>
<b>2</b>  13,3%
<b>0</b>   0,0%
<b>2</b>  20,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>1</b>  50,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>1</b>  12,5%
<b>Удовлетворительно </b>
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>Неудовлетворительно </b>
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
<b>0</b>   0,0%
Статистический Анализ Не Предоставлен для Интраоперационной Оценки Гемостатической Эффективности согласно Оценке Врача-Хирурга
Вторичный Результат: Результат №6
[00243] 6. Вторичный: Суточная Интра- И Послеоперационная Скорректированная по Весу Доза РФфВ С ADVATE или Без него [Сроки: Ежедневно, от дня операции до послеоперационного Дня 14 (± 2 дня)]
Таблица 25: Результат №6
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Суточная Интра- и Послеоперационная Скорректированная по Весу Доза РФфВ С ADVATE или Без него
<b>Описание Измерения</b>
Текст не введен.
<b>Сроки Исследования</b>
Ежедневно, от дня операции до послеоперационного Дня 14 (± 2 дня)]
Таблица 25:
Результат №6, Описание Выборки
Количество участников, которые прошли исследование, было различным для временных точек в зависимости от индивидуального лечения. Для анализа использовался полный набор данных анализа, включая всех участников, которые получили исследуемый препарат и имели по меньшей мере 1 оценку гемостатической эффективности.
Таблица 40:
Результат №6, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Таблица 26:
Результат №6, Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>15</b>
<b>Суточная Интра- И Послеоперационная Скорректированная по Весу</b><b>Доза РФфВ С ADVATE или Без него</b>[Единицы измерения: МЕ/кг]Медиана (Межквартильный Размах)
<b>интраоперационный период</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>1</b>
<b>интраоперационный период</b>
<b>18,1</b><b>(от 18,1 до 18,1)</b>
<b>послеоперационный день 1</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>3</b>
<b>послеоперационный день 1</b>
<b>23,5</b><b>(от 16,9 до 47,2)</b>
<b>послеоперационный день 2</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>11</b>
<b>послеоперационный день 2</b>
<b>42,3</b><b>(от 23,2 до 50,6)</b>
<b>послеоперационный день 3</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>12</b>
<b>послеоперационный день 3</b>
<b>28,6</b><b>(от 20,6 до 48,9)</b>
<b>послеоперационный день 4</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>9</b>
<b>послеоперационный день 4</b>
<b>33,9</b><b>(от 23,2 до 44,3)</b>
<b>послеоперационный день 5</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>7</b>
<b>послеоперационный день 5</b>
<b>31,5</b><b>(от 18,8 до 47,2)</b>
<b>послеоперационный день 6</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>5</b>
<b>послеоперационный день 6</b>
<b>23,2</b><b>(от 18,8 до 23,6)</b>
<b>послеоперационный день 7</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>5</b>
<b>послеоперационный день 7</b>
<b>23,8</b><b>(от 23,6 до 50,8)</b>
<b>послеоперационный день 8</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>7</b>
<b>послеоперационный день 8</b>
<b>33,9</b><b>(от 23,6 до 53,6)</b>
<b>послеоперационный день 9</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>3</b>
<b>послеоперационный день 9</b>
<b>23,6</b><b>(от 16,3 до 53,6)</b>
<b>послеоперационный день 10</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>3</b>
<b>послеоперационный день 10</b>
<b>23,6</b><b>(от 16,3 до 34,8)</b>
<b>послеоперационный день 11</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>3</b>
<b>послеоперационный день 11</b>
<b>23,6</b><b>(от 16,3 до 53,6)</b>
<b>послеоперационный день 12</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>4</b>
<b>послеоперационный день 12</b>
<b>29,3</b><b>(от 20,1 до 44,2)</b>
<b>послеоперационный день 13</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>1</b>
<b>послеоперационный день 13</b>
<b>16,3</b><b>(от 16,3 до 16,3)</b>
<b>послеоперационный день 14</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>2</b>
<b>послеоперационный день 14</b>
<b>25,5</b><b>(от 16,3 до 34,8)</b>
<b>послеоперационный день 15</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование</b>
<b>1</b>
<b>послеоперационный день 15</b>
<b>16,3</b><b>(от 16,3 до 16,3)</b>
Статистический анализ не предоставлен для суточной Интра- и Послеоперационной Скорректированной по Весу Дозы рФфВ с ADVATE или Без него
Вторичный Результат: Результат №7
[00244] 7. Вторичный: Возникновение Нежелательных Явлений [Сроки: От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции)].
Таблица 27: Результат №7
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Возникновение Нежелательных Явлений
<b>Описание Измерения</b>
Оценивались нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (НЯВЛ) и серьезные нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (СНЯВЛ).
<b>Сроки Исследования</b>
От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (<i>т.е.</i> через 14 (± 2) дней после операции)
Таблица 28:
Результат №7, Описание Выборки
Набор данных анализа безопасности, включая всех участников, которые получили какое-либо количество исследуемого препарата, был использован для анализа данного критерия эффективности.
Таблица 29:
Результат №7, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Таблица 30:
Измеренные Значения
<b> Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) </b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>15</b>
<b>Возникновение Нежелательных Явлений </b>[Единицы измерения: Нежелательные Явления]
<b>Нежелательные Явлений, Возникшие в ходе Лечения (НЯВЛ) </b>
<b>12</b>
<b>Тяжелые НЯВЛ </b>
<b>1</b>
<b>НЯВЛ, связанные с рФфВ </b>
<b>0</b>
<b>НЯВЛ, связанные с ADVATE </b>
<b>0</b>
<b>НЯВЛ, связанные как с рФфВ, так и с ADVATE </b>
<b>0</b>
<b>Серьезные Нежелательные Явления, Возникшие в ходе Лечении (СНЯВЛ). </b>
<b>2</b>
<b>СНЯВЛ, связанные с рФфВ </b>
<b>0</b>
<b>СНЯВЛ, связанные с ADVATE </b>
<b>0</b>
<b>СНЯВЛ, связанные как с рФфВ, так и с ADVATE </b>
<b>0</b>
<b>НЯВЛ, которые привели к досрочному завершению терапии с помощью рФфВ </b>
<b>0</b>
<b>СНЯВЛ, которые привели к досрочному завершению терапии с помощью ADVATE </b>
<b>0</b>
<b>НЯВЛ, которые привели к досрочному завершению исследования </b>
<b>0</b>
<b>НЯВЛ, которые привели к смерти </b>
<b>0</b>
<b>НЯВЛ, связанные с процедурой, предусмотренной исследованием </b>
<b>0</b>
<b>СНЯВЛ, связанные с процедурой, предусмотренной исследованием </b>
<b>0</b>
Статистический анализ не предоставлен для случаев Возникновения Нежелательных Явлений
Вторичный Результат: Результат №8
т.е.,
[00245] 8. Вторичный: Возникновение Тромботических Явлений [Сроки: От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования ( через 14 (± 2) дней после операции)].
Таблица 31: Результат №8
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Возникновение Тромботических Явлений
<b>Описание Измерения</b>
Нежелательные явления, возникшие в ходе лечения (НЯВЛ) и серьезные нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (СНЯВЛ) оценивались на наличие тромботических явлений.
<b>Сроки Исследования</b>
От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (<i>т.е.</i> через 14 (± 2) дней после операции)
Таблица 32:
Результат №8, Описание Выборки
Набор данных анализа безопасности, включая всех участников, которые получили какое-либо количество исследуемого препарата, был использован для анализа данного критерия эффективности.
Таблица 33:
Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Таблица 34:
Результат №8, Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>15</b>
<b>Возникновение Тромботических Явлений </b>[Единицы измерения: Нежелательные Явления]
<b>Тромботические НЯВЛ </b>
<b>2</b>
<b>Тромботические СНЯВЛ </b>
<b>1</b>
Статистический анализ не предоставлен для случаев Возникновения Тромботических Явлений
Вторичный Результат: Результат №9
например
т.е.,
[00246] 9. Вторичный: Возникновение Тяжелых Аллергических Реакций (, Анафилаксии) [Сроки: От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования ( через 14 (± 2) дней после операции)].
Таблица 35: Результат №9
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Возникновение Тяжелых Аллергических Реакций (<i>например</i>, Анафилаксии)
<b>Описание Измерения</b>
Нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (НЯВЛ) и серьезные нежелательные явления, возникшие в ходе лечении (СНЯВЛ) оценивались на наличие тяжелых аллергических реакций.
<b>Сроки Исследования</b>
От первой инфузии исследуемого препарата до завершения исследования (<i>т.е.</i> через 14 (± 2) дней после операции)
Таблица 36:
Результат №9, Описание Выборки
Набор данных анализа безопасности, включая всех участников, которые получили какое-либо количество исследуемого препарата, был использован для анализа данного критерия эффективности.
Таблица 37:
Результат №9, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Таблица 38:
Результат №9, Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>15</b>
<b>Возникновение Тяжелых Аллергических Реакций (</b><b><i>например</i></b><b>, Анафилаксии) </b>[Единицы измерения: Нежелательные Явления]
<b>Тяжелые Аллергические Реакции НЯВЛ </b>
<b>0</b>
<b>Тяжелые Аллергические Реакции СНЯВЛ </b>
<b>0</b>
Статистический анализ не представлен для случаев Возникновения Тяжелых Аллергических Реакций (
например,
Анафилаксии)
Вторичный Результат: Результат №10
[00247] 10. Вторичный: Число Участников, Которые Вырабатывали Ингибирующие и Суммарные Связывающие Антитела к Фактору Фон Виллебранда (Ффв) и Ингибирующие Антитела к Фактору VIII (ФVIII) [Сроки: Тестирование проводилось на протяжении всего исследования во время скрининга, до ФК инфузии, до операции, после операции в случае сильного кровотечения или необъяснимого кровотечения, на день 7 после операции и при посещении по завершению исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции).]
Таблица 39:
Результат №10, Описание Выборки
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Число Участников, Которые Вырабатывали Ингибирующие и Суммарные Связывающие Антитела к Фактору Фон Виллебранда (Ффв) и Ингибирующие Антитела к Фактору VIII (ФVIII)
<b>Описание Измерения</b>
Участников лечили рекомбинантным Фактором фон Виллебранда (рФфВ) с ADVATE или без него.
<b>Сроки Исследования</b>
Тестирование проводилось на протяжении всего исследования во время скрининга, до ФК инфузии, до операции, после операции в случае сильного кровотечения или необъяснимого кровотечения, на день 7 после операции и при посещении по завершению исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции).
Таблица 40:
Результат №10, Описание Выборки
Набор данных анализа безопасности, включая всех участников, которые получили какое-либо количество исследуемого препарата, был использован для анализа данного критерия эффективности.
Таблица 41:
Результат №10, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Таблица 55:
Результат №10, Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>15</b>
<b>Число Участников, Которые Вырабатывали Ингибирующие и Суммарные Связывающие Антитела к Фактору Фон Виллебранда (Ффв) и Ингибирующие Антитела к Фактору VIII (ФVIII) </b>[Единицы измерения: Участники]Количество Участников<b></b>
<b>Выработка Ингибирующих Антител Против ФфВ </b>
<b>0</b>
<b>Выработка Суммарных Связывающих Антител Против ФфВ </b>
<b>1</b>
<b>Выработка Ингибирующих Антител Против ФфВ </b>
<b>0</b>
Статистический анализ не предоставлен для Числа Участников, Которые Вырабатывали Ингибирующие и Суммарные Связывающие Антитела к Фактору Фон Виллебранда (Ффв) и Ингибирующие Антитела к Фактору VIII (ФVIII)
Вторичный Результат: Результат №11
[00248] 11. Вторичный: Число Участников, Которые Вырабатывали Антитела к Белкам Яичника Китайского Хомяка (СНО), Мышиному Иммуноглобулину G (IgG) или Рекомбинантному Фурину (рФурину) [Сроки: Тестирование проводилось на протяжении всего исследования во время скрининга, до ФК инфузии, до операции, после операции в случае сильного кровотечения или необъяснимого кровотечения, на день 7 после операции и при посещении по завершению исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции).]
Таблица 42: Результат №11
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Число Участников, Которые Вырабатывали Антитела к Белкам Яичника Китайского Хомяка (СНО), Мышиному Иммуноглобулину G (IgG) или Рекомбинантному Фурину (рФурину)
<b>Описание Измерения</b>
Участников лечили рекомбинантным Фактором фон Виллебранда (рФфВ) с ADVATE или без него.
<b>Сроки Исследования</b>
Тестирование проводилось на протяжении всего исследования во время скрининга, до ФК инфузии, до операции, после операции в случае сильного кровотечения или необъяснимого кровотечения, на день 7 после операции и при посещении по завершению исследования (т.е. через 14 (± 2) дней после операции).
Таблица 43:
Результат №11, Описание Выборки
Набор данных анализа безопасности, включая всех участников, которые получили какое-либо количество исследуемого препарата, был использован для анализа данного критерия эффективности.
Таблица 44:
Результат №11, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Таблица 59:
Результат №11, Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) </b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>15</b>
<b>Число Участников, Которые Вырабатывали Антитела к Белкам Яичника Китайского Хомяка (СНО), Мышиному Иммуноглобулину G (IgG) или Рекомбинантному Фурину (рФурину) </b>[Единицы измерения: Участники]Количество Участников<b></b>
<b>0</b>
Статистический анализ не представлен для Числа Участников, Которые Вырабатывали Антитела к Белкам Яичника Китайского Хомяка (СНО), Мышиному Иммуноглобулину G (IgG) или Рекомбинантному Фурину (рФурину)
Вторичный Результат: Результат №12
[00249] 12. Вторичный: Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме от Времени от 0 до 72 Часов После Инфузии (AUC 0-72 Ч/Доза) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]
Таблица 45: Результат №12
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме от Времени от 0 до 72 Часов После Инфузии (AUC 0-72 Ч/Доза)
<b>Описание Измерения</b>
Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Площадь под кривой зависимости концентрации в плазме/время от 0 до 72 часов после инфузии была рассчитана с использованием линейного правила трапеции. Для расчета AUC(0-72ч) уровни через 72 часа были линейно интерполированы/экстраполированы из 2 ближайших точек времени отбора проб.ФK-анализ проводили для следующих аналитов:Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак (VWF:Ac)), Коагулянтной Активности ФVIII (ФVIII:К)
<b>Сроки Исследования</b>
Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.
Таблица 46:
Результат №12, Описание Выборки
Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.
Таблица 47:
Результат №12, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Таблица 48:
Результат №12, Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме от Времени от 0 до 72 Часов После Инфузии (AUC 0-72 Ч/Доза) </b>[Единицы: часы*МЕ/дл]Среднее Геометрическое (Геометрический Коэффициент Вариации)<b></b>
<b>ФфВ:РКо </b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>ФфВ:РКо </b>
<b>31,91</b><b>(37,5%)</b>
<b>ФфВ:Аг </b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>ФфВ:Аг </b>
<b>57,08</b><b>(25,6%)</b>
<b>ФфВ:КС </b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>ФфВ:КС </b>
<b>63,91</b><b>(29,4%)</b>
<b>ФфВ:Ак </b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>ФфВ:Ак </b>
<b>54,61</b><b>(28,1%)</b>
<b>ФVIII:К </b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>5</b>
<b>ФVIII:К </b>
<b>67,49</b><b>(31,1%)</b>
Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме от Времени от 0 до 72 Часов После Инфузии (AUC 0-72 Ч/Доза)
Вторичный Результат: Результат №13
[00250] 13. Вторичный: Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме От Времени от 0 до Бесконечности (AUC 0-∞/Доза) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]
Таблица 49: Результат №13
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме От Времени от 0 до Бесконечности (AUC 0-∞/Доза)
<b>Описание Измерения</b>
Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Площадь под кривой зависимости концентрации в плазме/время от 0 до бесконечности и площадь под первым моментом этой кривой от 0 до бесконечности рассчитывали как сумму AUC или AUMC от времени 0 до времени последней возможной количественной оценки концентрации плюс поправка хвоста распределения рассчитанного как Ct/λz и Ct/λz(t+1/λz) соответственно, где Ct - последняя возможная количественная оценка концентрации, t - время последней возможной количественной оценки концентрации, а λz - константа скорости распределения в конечной фазе.ФK-анализ проводили для следующих аналитов:Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак (VWF:Ac)), Коагулянтной Активности ФVIII (ФVIII:К)
<b>Сроки Исследования</b>
Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.
Таблица 50:
Результат №13, Описание Выборки
Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.
Таблица 51:
Результат №13, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Таблица 52:
Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>Фармакокинетика: Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме От Времени от 0 до Бесконечности (AUC 0-∞/Доза) </b>[Единицы: часы*МЕ/дл]Среднее Геометрическое (Геометрический Коэффициент Вариации)<b></b>
<b>ФфВ:РКо </b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>ФфВ:РКо </b>
<b>34,43</b><b>(43,3%)</b>
<b>ФфВ:Аг </b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>ФфВ:Аг </b>
<b>68,87</b><b>(31,5%)</b>
<b>ФфВ:КС </b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>ФфВ:КС </b>
<b>71,82</b><b>(34,1%)</b>
<b>ФфВ:Ак </b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>ФфВ:Ак </b>
<b>61,90</b><b>(32,2%)</b>
<b>ФVIII:К </b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>3</b>
<b>ФVIII:К </b>
<b>75,00</b><b>(30,9%)</b>
Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики Площадь Под Кривой Зависимости Концентрации в Плазме От Времени от 0 до Бесконечности (AUC 0-∞/Доза)
Вторичный Результат: Результат №14
[00251] 14. Вторичный: Фармакокинетика: Среднее Время Удержания (СВУ) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]
Таблица 53: Результат №14
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Фармакокинетика: Среднее Время Удержания (СВУ)
<b>Описание Измерения</b>
Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Среднее время удержания рассчитывалось как площадь под первым моментом фармакокинетической кривой от 0 до бесконечности, деленная на площадь под кривой зависимости от времени от 0 до бесконечности минус Т/2, где Т - продолжительность инфузии.ФK-анализ проводили для следующих аналитов:Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)
<b>Сроки Исследования</b>
Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.
Таблица 54:
Результат №14, Описание Выборки
Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.
Таблица 55:
Результат №14, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Таблица 56:
Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>Фармакокинетика: Среднее Время Удержания (СВУ) </b>[Единицы измерения: Часы]Среднее Геометрическое (Геометрический Коэффициент Вариации)<b></b>
<b>ФфВ:РКо </b>
<b>22,69</b><b>(41,3%)</b>
<b>ФфВ:Аг </b>
<b>37,92</b><b>(28,4%)</b>
<b>ФфВ:КС </b>
<b>29,35</b><b>(31,1%)</b>
<b>ФфВ:Ак </b>
<b>29,75</b><b>(28,6%)</b>
Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики Среднее Время Удержания (СВУ)
Вторичный Результат: Результат №15
[00252] 15. Вторичный: Фармакокинетика: Клиренс (Кл) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]
Таблица 57: Результат №15
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Фармакокинетика: Клиренс (Кл)
<b>Описание Измерения</b>
Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Клиренс рассчитывали как дозу (МЕ/кг), деленную на площадь под кривой зависимости от времени от 0 до бесконечности.ФK-анализ проводили для следующих аналитов:Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)
<b>Сроки Исследования</b>
Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.
Таблица 58:
Результат №15, Описание Выборки
Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.
Таблица 59:
Результат №15, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Таблица 60:
Измеренные Значения
<b> Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ) </b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b> 11 </b>
<b>Фармакокинетика: Клиренс (Кл) </b>[Единицы измерения: дл/час/кг]Среднее Геометрическое (Геометрический Коэффициент Вариации)<b></b>
<b>ФфВ:РКо </b>
<b> 0,02904 </b><b> (43,3%) </b>
<b>ФфВ:Аг </b>
<b> 0,01452 </b><b> (31,5%) </b>
<b>ФфВ:КС </b>
<b> 0,01392 </b><b> (34,1%) </b>
<b>ФфВ:Ак </b>
<b> 0,01616 </b><b> (32,2%) </b>
Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики Клиренс (Кл)
Вторичный Результат: Результат №16
[00253] 16. Вторичный: Фармакокинетика: Постепенное Восстановление (ПВ) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]
Таблица 61: Результат №16
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Фармакокинетика: Постепенное Восстановление (ПВ)
<b>Описание Измерения</b>
Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Постепенное восстановление рассчитывали как (Cмакс минус Cдо инфузии), деленное на дозу (МЕ/кг), где кг относится к массе тела на момент введения дозы, а Cмакс - наблюдаемая максимальная концентрация перед коррекцией для значений до инфузии.ФK-анализ проводили для следующих аналитов:Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)
<b>Сроки Исследования</b>
Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.
Таблица 77:
Результат №16, Описание Выборки
Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.
Таблица 62:
Результат №16, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Таблица 63:
Результат №16, Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>Фармакокинетика: Постепенное Восстановление (ПВ) </b>[Единицы измерения: МЕ/дл]Среднее (Стандартное Отклонение)<b></b>
<b>ФфВ:РКо </b>
<b>1,961 (0,45445)</b>
<b>ФфВ:Аг </b>
<b>1,991 (0,38395)</b>
<b>ФфВ:КС </b>
<b>2,780 (0,56640)</b>
<b>ФфВ:Ак </b>
<b>2,635 (0,38050)</b>
Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики Постепенное Восстановление (ПВ)
Вторичный Результат: Результат №17
[00254] 17. Вторичный: Фармакокинетика: Период Полувыведения (T1/2) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]
Таблица 64: Результат №17
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Фармакокинетика: Период Полувыведения (T1/2)
<b>Описание Измерения</b>
Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. Конечный период полувыведения (T1/2) рассчитывали как ln2/λz, где λz - константа скорости терминальной элиминации, рассчитанная в WinNonlin NCA с использованием, по меньшей мере, трех количественных оценок концентрации.ФK-анализ проводили для следующих аналитов:Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)
<b>Сроки Исследования</b>
Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.
Таблица 65:
Результат №17, Описание Выборки
Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.
Таблица 66:
Результат №17, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>Фармакокинетика: Период Полувыведения (T1/2) </b>[Единицы измерения: Часы]Среднее Геометрическое (Геометрический Коэффициент Вариации)<b></b>
<b>ФфВ:РКо </b>
<b>16,52</b><b>(42,7%)</b>
<b>ФфВ:Аг </b>
<b>26,88</b><b>(26,5%)</b>
<b>ФфВ:КС </b>
<b>21,07</b><b>(33,2%)</b>
<b>ФфВ:Ак </b>
<b>22,19</b><b>(28,5%)</b>
Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики: Период Полувыведения (T1/2)
Вторичный Результат: Результат №18
[00255] 18. Вторичный: Фармакокинетика: Объем Распределения в Равновесном Состоянии (ОбРС) [Сроки: Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.]
Таблица 67:
Результат №18
<b>Тип Измерения</b>
Вторичный
<b>Название Измерения</b>
Фармакокинетика: Объем Распределения в Равновесном Состоянии (ОбРС)
<b>Описание Измерения</b>
Эта оценка была необходима только для субъектов, подвергающихся обширному хирургическому вмешательству. Субъекты получали ФK инфузию в дозе 50±5 МЕ/кг рФфВ:РКо в течение 42 дней до операции. ОбРС был рассчитан как клиренс, умноженный на среднее время удержания.ФK-анализ проводили для следующих аналитов:Ристоцетин-Кофакторной Активности ФфВ (ФфВ:РКо), Активности Антигена ФфВ (ФфВ:Аг), Коллаген-Связывающей Активности ФфВ (ФфВ:КС), Активности ФфВ, измеренной тест системой INNOVANCE VWF Ac (ФфВ:Ак)
<b>Сроки Исследования</b>
Измерения ФК проводились в течение 30 минут до инфузии и после инфузии через 30 (± 5) минут, 60 (± 5) минут, 6 (± 1) часов, 12 (± 1) часов, 24 (± 2) часа, 48 (± 2) часов и 72 (± 2) часа.
Таблица 68:
Результат №18, Описание Выборки
Набор данных анализа ФK, включая всех участников, которые прошли оценку ФK с данными, собранными в соответствующие временные точки, был использован для анализа данного критерия эффективности.
Таблица 69:
Результат №18, Исследуемые Группы
<b>Описание</b>
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
Участники, подвергшиеся хирургическому вмешательству и получавшие Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)
Результат №18, Измеренные Значения
<b>Рекомбинантный Фактор фон Виллебранда (рФфВ)</b>
<b>Участники, которые Прошли Исследование </b>
<b>11</b>
<b>Фармакокинетика: Объем Распределения в Равновесном Состоянии (ОбРС) </b>[Единицы измерения: дл/кг]Среднее Геометрическое (Геометрический Коэффициент Вариации)<b></b>
<b>ФфВ:РКо </b>
<b>0,6591</b><b>(28,8%)</b>
<b>ФфВ:Аг </b>
<b>0,5506</b><b>(18,4%)</b>
<b>ФфВ:КС </b>
<b>0,4086</b><b>(24,0%)</b>
<b>ФфВ:Ак </b>
<b>0,4806</b><b>(21,5%)</b>
Статистический анализ не представлен для Фармакокинетики: Объем Распределения в Равновесном Состоянии (ОбРС)
[00256] Приведенные выше примеры представлены для того, чтобы дать специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание того, как изготавливать и использовать варианты реализации композиций, систем и способов по изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели считают своим изобретением. Предполагается, что модификации вышеописанных способов реализации изобретения, очевидные для специалистов в данной области техники, находятся в пределах объема следующей формулы изобретения. Все патенты и публикации, упомянутые в описании, указывают уровни квалификации специалистов в области техники, к которой относится изобретение. Все ссылки, цитируемые в этом раскрытии, включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была включена посредством ссылки во всей своей полноте в отдельности.
[00257] Все заголовки и обозначения разделов используются только для ясности и в справочных целях и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие. Например, специалисты в данной области техники оценят полезность комбинирования различных аспектов из разных заголовков и разделов, в зависимости от ситуации, в соответствии со смыслом и объемом изобретения, описанного в данном документе.
[00258] Все ссылки, цитируемые в данном документе, тем самым включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте и для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были конкретно и индивидуально указаны для включения в качестве ссылки во всей своей полноте для всех целей.
[00259] Многие модификации и варианты данной заявки могут быть сделаны без отклонения от его сущности и объема, как будет очевидно для специалистов в данной области техники. Конкретные варианты реализации изобретения и примеры, описанные в данном документе, предлагаются только в качестве примера, и применение должно быть ограничено только условиями прилагаемой формулы изобретения, а также полным объемом эквивалентов, на которые имеет право заявленная формула.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Baxalta Incorporated
Baxalta GmbH
Chapman, Miranda
Ewenstein, Bruce
Ploder, Bettina
<120>  ЛЕЧЕНИЕ ПАЦИЕНТОВ С ТЯЖЕЛОЙ ФОРМОЙ БОЛЕЗНИ ФОН  ВИЛЛЕБРАНДА ПОДВЕРГАЮЩИХСЯ ПЛАНОВОМУ ХИРУРГИЧЕСКОМУ ВМЕШАТЕЛЬСТВУ ПУТЕМ ВВЕДЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ФФВ
<130>  008073-5186-US
<140>  US 16/030,653
<141>  2018-07-09
<150>  US 62/530,024
<151>  2017-07-07
<150>  US 62/546,999
<151>  2017-08-17
<160>  3
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  8833
<212>  ДНК
<213>  Искусственная Последовательность
<220>
<223>  препро-ффВ
<400>  1
agctcacagc tattgtggtg ggaaagggag ggtggttggt ggatgtcaca gcttgggctt       60
tatctccccc agcagtgggg actccacagc ccctgggcta cataacagca agacagtccg      120
gagctgtagc agacctgatt gagcctttgc agcagctgag agcatggcct agggtgggcg      180
gcaccattgt ccagcagctg agtttcccag ggaccttgga gatagccgca gccctcattt      240
gcaggggaag atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt      300
gccagggacc ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct      360
tttcggaagt gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg      420
cagttacctc ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca      480
gaatggcaag agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt      540
tgtcaatggt accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg      600
gctgtatcta gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt      660
ggccaggatc gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa      720
gacctgcggg ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga      780
agggaccttg acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga      840
acagtggtgt gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat      900
gcagaagggc ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg      960
ccaccctctg gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg     1020
tgctgggggg ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca     1080
ggagggaatg gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc     1140
tggtatggag tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat     1200
caatgaaatg tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct     1260
ggatgaaggc ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta     1320
ccctcccggc acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg     1380
gatctgcagc aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc acaggtcaat cacacttcaa     1440
gagctttgac aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga     1500
ttgccaggac cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga     1560
cgctgtgtgc acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa     1620
actgaagcat ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac gtccagctcc ccctcctgaa     1680
aggtgacctc cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga     1740
cctgcagatg gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc     1800
cgggaagacc tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac     1860
cccctctggg ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg     1920
ggactgccag gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac     1980
caggttctcc gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg     2040
tgccgtcagc ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga     2100
cggccgcgag tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg     2160
cgtgcgcgtc gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt     2220
gtacctgcag tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga     2280
ggaatgcaat gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga     2340
gaggggggac tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca     2400
gccagaagac atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca     2460
ctgtaccatg agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct     2520
gtctcatcgc agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc     2580
cgctgacaac ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct     2640
ggagtgcatg agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca     2700
tgagaacaga tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc     2760
ccctggagaa acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa     2820
ctgcacagac catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac     2880
cttcgacggg ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta     2940
ctgcggcagt aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc     3000
ctcagtgaaa tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt     3060
tgacggggag gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga     3120
gtctggccgg tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca     3180
cctgagcatc tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg     3240
gaattttgat ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga     3300
ccctgtggac tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt     3360
gcctctggac tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga     3420
ttcctcctgt agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc     3480
cgagccatat ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg     3540
cgcctgcttc tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt     3600
ggtgacctgg aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga     3660
gaacgggtat gagtgtgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg     3720
tcagcaccct gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg     3780
ccctccaggg aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc     3840
agtgtgtgag gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag     3900
tgaccctgag cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg     3960
ccaggagccg ggaggcctgg tggtgcctcc cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct     4020
gtatgtggag gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga     4080
cctggtcttc ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg aagtgctgaa     4140
ggcctttgtg gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc     4200
cgtggtggag taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc     4260
gtcagagctg cggcgcattg ccagccaggt gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac     4320
cagcgaggtc ttgaaataca cactgttcca aatcttcagc aagatcgacc gccctgaagc     4380
ctcccgcatc accctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt cccggaactt     4440
tgtccgctac gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg     4500
gccccatgcc aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg agaacaaggc     4560
cttcgtgctg agcagtgtgg atgagctgga gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct     4620
ctgtgacctt gcccctgaag cccctcctcc tactctgccc cccgacatgg cacaagtcac     4680
tgtgggcccg gggctcttgg gggtttcgac cctggggccc aagaggaact ccatggttct     4740
ggatgtggcg ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag     4800
caaggagttc atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt     4860
cacggtgctg cagtactcct acatggtgac tgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc     4920
caaaggggac atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa     4980
cactgggctg gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg     5040
ggagcaggcg cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa     5100
gaggctgcct ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca     5160
ggagctggag aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct     5220
cccccgagag gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat     5280
ccccaccctc tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga     5340
tggctcctcc agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt     5400
catttcaaaa gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag     5460
catcaccacc attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct     5520
tgtggacgtc atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc     5580
tgtgcgatac ttgacttcag aaatgcatgg tgccaggccg ggagcctcaa aggcggtggt     5640
catcctggtc acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc     5700
caacagagtg acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag cccagctacg     5760
gatcttggca ggcccagcag gcgactccaa cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct     5820
ccctaccatg gtcaccttgg gcaattcctt cctccacaaa ctgtgctctg gatttgttag     5880
gatttgcatg gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga ccttgccaga     5940
ccagtgccac accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt     6000
caactgtgac cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg ttaaagtgga     6060
agagacctgt ggctgccgct ggacctgccc ctgcgtgtgc acaggcagct ccactcggca     6120
catcgtgacc tttgatgggc agaatttcaa gctgactggc agctgttctt atgtcctatt     6180
tcaaaacaag gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca gccctggagc     6240
aaggcagggc tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagctgca     6300
cagtgacatg gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg tgggtgggaa     6360
catggaagtc aacgtttatg gtgccatcat gcatgaggtc agattcaatc accttggtca     6420
catcttcaca ttcactccac aaaacaatga gttccaactg cagctcagcc ccaagacttt     6480
tgcttcaaag acgtatggtc tgtgtgggat ctgtgatgag aacggagcca atgacttcat     6540
gctgagggat ggcacagtca ccacagactg gaaaacactt gttcaggaat ggactgtgca     6600
gcggccaggg cagacgtgcc agcccatcct ggaggagcag tgtcttgtcc ccgacagctc     6660
ccactgccag gtcctcctct taccactgtt tgctgaatgc cacaaggtcc tggctccagc     6720
cacattctat gccatctgcc agcaggacag ttgccaccag gagcaagtgt gtgaggtgat     6780
cgcctcttat gcccacctct gtcggaccaa cggggtctgc gttgactgga ggacacctga     6840
tttctgtgct atgtcatgcc caccatctct ggtctacaac cactgtgagc atggctgtcc     6900
ccggcactgt gatggcaacg tgagctcctg tggggaccat ccctccgaag gctgtttctg     6960
ccctccagat aaagtcatgt tggaaggcag ctgtgtccct gaagaggcct gcactcagtg     7020
cattggtgag gatggagtcc agcaccagtt cctggaagcc tgggtcccgg accaccagcc     7080
ctgtcagatc tgcacatgcc tcagcgggcg gaaggtcaac tgcacaacgc agccctgccc     7140
cacggccaaa gctcccacgt gtggcctgtg tgaagtagcc cgcctccgcc agaatgcaga     7200
ccagtgctgc cccgagtatg agtgtgtgtg tgacccagtg agctgtgacc tgcccccagt     7260
gcctcactgt gaacgtggcc tccagcccac actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa     7320
cttcacctgc gcctgcagga aggaggagtg caaaagagtg tccccaccct cctgcccccc     7380
gcaccgtttg cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt gtgcctgcaa     7440
ctgtgtcaac tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaactg ccaccaatga     7500
ctgtggctgt accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc gaagcaccat     7560
ctaccctgtg ggccagttct gggaggaggg ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga     7620
ggatgccgtg atgggcctcc gcgtggccca gtgctcccag aagccctgtg aggacagctg     7680
tcggtcgggc ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt gcctgccatc     7740
tgcctgtgag gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt     7800
cggctcccag tgggcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg tccgagtgaa     7860
ggaggaggtc tttatacaac aaaggaacgt ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg     7920
cccctcgggc tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaagct gtcgctgtga     7980
gcgcatggag gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat     8040
cgatgtgtgc acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct     8100
ggagtgcagg aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag aaaataacac     8160
aggtgaatgt tgtgggagat gtttgcctac ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca     8220
gatcatgaca ctgaagcgtg atgagacgct ccaggatggc tgtgatactc acttctgcaa     8280
ggtcaatgag agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc caccctttga     8340
tgaacacaag tgtctggctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga     8400
cacatgtgag gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg tcaaggtggg     8460
aagctgtaag tctgaagtag aggtggatat ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa     8520
agccatgtac tccattgaca tcaacgatgt gcaggaccag tgctcctgct gctctccgac     8580
acggacggag cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg tgtaccatga     8640
ggttctcaat gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt gaggctgctg     8700
cagctgcatg ggtgcctgct gctgcctgcc ttggcctgat ggccaggcca gagtgctgcc     8760
agtcctctgc atgttctgct cttgtgccct tctgagccca caataaaggc tgagctctta     8820
tcttgcaaaa ggc                                                        8833
<210>  2
<211>  2783
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная Последовательность
<220>
<223>  препро-ФфВ
<400>  2
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Leu Ile Leu Pro Gly
1. 5                   10                  15
Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr Ala Arg Cys
20                  25                  30
Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly Ser Met Tyr
35                  40                  45
Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly Cys Gln Lys
50                  55                  60
Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys Arg Val Ser
65                  70                  75                  80
Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu Phe Val Asn
85                  90                  95
Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro Tyr Ala Ser
100                 105                 110
Lys Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys Leu Ser Gly Glu Ala Tyr
115                 120                 125
Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly Asn Phe Gln Val Leu Leu
130                 135                 140
Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asn
145                 150                 155                 160
Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln Glu Gly Thr Leu Thr Ser
165                 170                 175
Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala Leu Ser Ser Gly Glu Gln
180                 185                 190
Trp Cys Glu Arg Pro Ser Ser Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met
195                 200                 205
Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val
210                 215                 220
Phe Ala Arg Cys His Pro Leu Val Asp Pro Glu Pro Phe Cys Glu Lys
225                 230                 235                 240
Thr Leu Cys Glu Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu
245                 250                 255
Leu Glu Tyr Ala Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly
260                 265                 270
Trp Thr Asp His Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu
275                 280                 285
Tyr Arg Gln Cys Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His
290                 295                 300
Ile Asn Glu Met Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro
305                 310                 315                 320
Glu Gly Gln Leu Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys
325                 330                 335
Pro Cys Val His Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser
340                 345                 350
Arg Asp Cys Asn Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser
355                 360                 365
Asn Glu Glu Cys Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe
370                 375                 380
Lys Ser Phe Asp Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr
385                 390                 395                 400
Leu Leu Ala Arg Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu
405                 410                 415
Thr Val Gln Cys Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val
420                 425                 430
Thr Val Arg Leu Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His
435                 440                 445
Gly Ala Gly Val Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu
450                 455                 460
Lys Gly Asp Leu Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu
465                 470                 475                 480
Ser Tyr Gly Glu Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu
485                 490                 495
Leu Val Lys Leu Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys
500                 505                 510
Gly Asn Tyr Asn Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly
515                 520                 525
Leu Ala Glu Pro Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His
530                 535                 540
Gly Asp Cys Gln Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu
545                 550                 555                 560
Asn Pro Arg Met Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr
565                 570                 575
Ser Pro Thr Phe Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr
580                 585                 590
Leu Arg Asn Cys Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu
595                 600                 605
Cys Leu Cys Gly Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg
610                 615                 620
Val Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly
625                 630                 635                 640
Gln Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser
645                 650                 655
Leu Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys
660                 665                 670
Phe Cys Pro Pro Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys Ala Gln
675                 680                 685
Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp Ile Phe
690                 695                 700
Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met His Cys
705                 710                 715                 720
Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val Leu Ser
725                 730                 735
Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro
740                 745                 750
Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu
755                 760                 765
Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met Ser Met
770                 775                 780
Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg His Glu
785                 790                 795                 800
Asn Arg Cys Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala
805                 810                 815
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp
820                 825                 830
Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr
835                 840                 845
Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe
850                 855                 860
Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn
865                 870                 875                 880
Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro
885                 890                 895
Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu
900                 905                 910
Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp
915                 920                 925
Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu
930                 935                 940
Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser
945                 950                 955                 960
Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly
965                 970                 975
Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln
980                 985                 990
Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe  Gly Asn Ser Trp Lys  Val Ser Ser
995                 1000                 1005
Gln Cys  Ala Asp Thr Arg Lys  Val Pro Leu Asp Ser  Ser Pro Ala
1010                 1015                 1020
Thr Cys  His Asn Asn Ile Met  Lys Gln Thr Met Val  Asp Ser Ser
1025                 1030                 1035
Cys Arg  Ile Leu Thr Ser Asp  Val Phe Gln Asp Cys  Asn Lys Leu
1040                 1045                 1050
Val Asp  Pro Glu Pro Tyr Leu  Asp Val Cys Ile Tyr  Asp Thr Cys
1055                 1060                 1065
Ser Cys  Glu Ser Ile Gly Asp  Cys Ala Cys Phe Cys  Asp Thr Ile
1070                 1075                 1080
Ala Ala  Tyr Ala His Val Cys  Ala Gln His Gly Lys  Val Val Thr
1085                 1090                 1095
Trp Arg  Thr Ala Thr Leu Cys  Pro Gln Ser Cys Glu  Glu Arg Asn
1100                 1105                 1110
Leu Arg  Glu Asn Gly Tyr Glu  Cys Glu Trp Arg Tyr  Asn Ser Cys
1115                 1120                 1125
Ala Pro  Ala Cys Gln Val Thr  Cys Gln His Pro Glu  Pro Leu Ala
1130                 1135                 1140
Cys Pro  Val Gln Cys Val Glu  Gly Cys His Ala His  Cys Pro Pro
1145                 1150                 1155
Gly Lys  Ile Leu Asp Glu Leu  Leu Gln Thr Cys Val  Asp Pro Glu
1160                 1165                 1170
Asp Cys  Pro Val Cys Glu Val  Ala Gly Arg Arg Phe  Ala Ser Gly
1175                 1180                 1185
Lys Lys  Val Thr Leu Asn Pro  Ser Asp Pro Glu His  Cys Gln Ile
1190                 1195                 1200
Cys His  Cys Asp Val Val Asn  Leu Thr Cys Glu Ala  Cys Gln Glu
1205                 1210                 1215
Pro Gly  Gly Leu Val Val Pro  Pro Thr Asp Ala Pro  Val Ser Pro
1220                 1225                 1230
Thr Thr  Leu Tyr Val Glu Asp  Ile Ser Glu Pro Pro  Leu His Asp
1235                 1240                 1245
Phe Tyr  Cys Ser Arg Leu Leu  Asp Leu Val Phe Leu  Leu Asp Gly
1250                 1255                 1260
Ser Ser  Arg Leu Ser Glu Ala  Glu Phe Glu Val Leu  Lys Ala Phe
1265                 1270                 1275
Val Val  Asp Met Met Glu Arg  Leu Arg Ile Ser Gln  Lys Trp Val
1280                 1285                 1290
Arg Val  Ala Val Val Glu Tyr  His Asp Gly Ser His  Ala Tyr Ile
1295                 1300                 1305
Gly Leu  Lys Asp Arg Lys Arg  Pro Ser Glu Leu Arg  Arg Ile Ala
1310                 1315                 1320
Ser Gln  Val Lys Tyr Ala Gly  Ser Gln Val Ala Ser  Thr Ser Glu
1325                 1330                 1335
Val Leu  Lys Tyr Thr Leu Phe  Gln Ile Phe Ser Lys  Ile Asp Arg
1340                 1345                 1350
Pro Glu  Ala Ser Arg Ile Thr  Leu Leu Leu Met Ala  Ser Gln Glu
1355                 1360                 1365
Pro Gln  Arg Met Ser Arg Asn  Phe Val Arg Tyr Val  Gln Gly Leu
1370                 1375                 1380
Lys Lys  Lys Lys Val Ile Val  Ile Pro Val Gly Ile  Gly Pro His
1385                 1390                 1395
Ala Asn  Leu Lys Gln Ile Arg  Leu Ile Glu Lys Gln  Ala Pro Glu
1400                 1405                 1410
Asn Lys  Ala Phe Val Leu Ser  Ser Val Asp Glu Leu  Glu Gln Gln
1415                 1420                 1425
Arg Asp  Glu Ile Val Ser Tyr  Leu Cys Asp Leu Ala  Pro Glu Ala
1430                 1435                 1440
Pro Pro  Pro Thr Leu Pro Pro  Asp Met Ala Gln Val  Thr Val Gly
1445                 1450                 1455
Pro Gly  Leu Leu Gly Val Ser  Thr Leu Gly Pro Lys  Arg Asn Ser
1460                 1465                 1470
Met Val  Leu Asp Val Ala Phe  Val Leu Glu Gly Ser  Asp Lys Ile
1475                 1480                 1485
Gly Glu  Ala Asp Phe Asn Arg  Ser Lys Glu Phe Met  Glu Glu Val
1490                 1495                 1500
Ile Gln  Arg Met Asp Val Gly  Gln Asp Ser Ile His  Val Thr Val
1505                 1510                 1515
Leu Gln  Tyr Ser Tyr Met Val  Thr Val Glu Tyr Pro  Phe Ser Glu
1520                 1525                 1530
Ala Gln  Ser Lys Gly Asp Ile  Leu Gln Arg Val Arg  Glu Ile Arg
1535                 1540                 1545
Tyr Gln  Gly Gly Asn Arg Thr  Asn Thr Gly Leu Ala  Leu Arg Tyr
1550                 1555                 1560
Leu Ser  Asp His Ser Phe Leu  Val Ser Gln Gly Asp  Arg Glu Gln
1565                 1570                 1575
Ala Pro  Asn Leu Val Tyr Met  Val Thr Gly Asn Pro  Ala Ser Asp
1580                 1585                 1590
Glu Ile  Lys Arg Leu Pro Gly  Asp Ile Gln Val Val  Pro Ile Gly
1595                 1600                 1605
Val Gly  Pro Asn Ala Asn Val  Gln Glu Leu Glu Arg  Ile Gly Trp
1610                 1615                 1620
Pro Asn  Ala Pro Ile Leu Ile  Gln Asp Phe Glu Thr  Leu Pro Arg
1625                 1630                 1635
Glu Ala  Pro Asp Leu Val Leu  Gln Arg Cys Cys Ser  Gly Glu Gly
1640                 1645                 1650
Leu Gln  Ile Pro Thr Leu Ser  Pro Ala Pro Asp Cys  Ser Gln Pro
1655                 1660                 1665
Leu Asp  Val Ile Leu Leu Leu  Asp Gly Ser Ser Ser  Phe Pro Ala
1670                 1675                 1680
Ser Tyr  Phe Asp Glu Met Lys  Ser Phe Ala Lys Ala  Phe Ile Ser
1685                 1690                 1695
Lys Ala  Asn Ile Gly Pro Arg  Leu Thr Gln Val Ser  Val Leu Gln
1700                 1705                 1710
Tyr Gly  Ser Ile Thr Thr Ile  Asp Val Pro Trp Asn  Val Val Pro
1715                 1720                 1725
Glu Lys  Ala His Leu Leu Ser  Leu Val Asp Val Met  Gln Arg Glu
1730                 1735                 1740
Gly Gly  Pro Ser Gln Ile Gly  Asp Ala Leu Gly Phe  Ala Val Arg
1745                 1750                 1755
Tyr Leu  Thr Ser Glu Met His  Gly Ala Arg Pro Gly  Ala Ser Lys
1760                 1765                 1770
Ala Val  Val Ile Leu Val Thr  Asp Val Ser Val Asp  Ser Val Asp
1775                 1780                 1785
Ala Ala  Ala Asp Ala Ala Arg  Ser Asn Arg Val Thr  Val Phe Pro
1790                 1795                 1800
Ile Gly  Ile Gly Asp Arg Tyr  Asp Ala Ala Gln Leu  Arg Ile Leu
1805                 1810                 1815
Ala Gly  Pro Ala Gly Asp Ser  Asn Val Val Lys Leu  Gln Arg Ile
1820                 1825                 1830
Glu Asp  Leu Pro Thr Met Val  Thr Leu Gly Asn Ser  Phe Leu His
1835                 1840                 1845
Lys Leu  Cys Ser Gly Phe Val  Arg Ile Cys Met Asp  Glu Asp Gly
1850                 1855                 1860
Asn Glu  Lys Arg Pro Gly Asp  Val Trp Thr Leu Pro  Asp Gln Cys
1865                 1870                 1875
His Thr  Val Thr Cys Gln Pro  Asp Gly Gln Thr Leu  Leu Lys Ser
1880                 1885                 1890
His Arg  Val Asn Cys Asp Arg  Gly Leu Arg Pro Ser  Cys Pro Asn
1895                 1900                 1905
Ser Gln  Ser Pro Val Lys Val  Glu Glu Thr Cys Gly  Cys Arg Trp
1910                 1915                 1920
Thr Cys  Pro Cys Val Cys Thr  Gly Ser Ser Thr Arg  His Ile Val
1925                 1930                 1935
Thr Phe  Asp Gly Gln Asn Phe  Lys Leu Thr Gly Ser  Cys Ser Tyr
1940                 1945                 1950
Val Leu  Phe Gln Asn Lys Glu  Gln Asp Leu Glu Val  Ile Leu His
1955                 1960                 1965
Asn Gly  Ala Cys Ser Pro Gly  Ala Arg Gln Gly Cys  Met Lys Ser
1970                 1975                 1980
Ile Glu  Val Lys His Ser Ala  Leu Ser Val Glu Leu  His Ser Asp
1985                 1990                 1995
Met Glu  Val Thr Val Asn Gly  Arg Leu Val Ser Val  Pro Tyr Val
2000                 2005                 2010
Gly Gly  Asn Met Glu Val Asn  Val Tyr Gly Ala Ile  Met His Glu
2015                 2020                 2025
Val Arg  Phe Asn His Leu Gly  His Ile Phe Thr Phe  Thr Pro Gln
2030                 2035                 2040
Asn Asn  Glu Phe Gln Leu Gln  Leu Ser Pro Lys Thr  Phe Ala Ser
2045                 2050                 2055
Lys Thr  Tyr Gly Leu Cys Gly  Ile Cys Asp Glu Asn  Gly Ala Asn
2060                 2065                 2070
Asp Phe  Met Leu Arg Asp Gly  Thr Val Thr Thr Asp  Trp Lys Thr
2075                 2080                 2085
Leu Val  Gln Glu Trp Thr Val  Gln Arg Pro Gly Gln  Thr Cys Gln
2090                 2095                 2100
Pro Glu  Gln Cys Leu Val Pro  Asp Ser Ser His Cys  Gln Val Leu
2105                 2110                 2115
Leu Leu  Pro Leu Phe Ala Glu  Cys His Lys Val Leu  Ala Pro Ala
2120                 2125                 2130
Thr Phe  Tyr Ala Ile Cys Gln  Gln Asp Ser Cys His  Gln Glu Gln
2135                 2140                 2145
Val Cys  Glu Val Ile Ala Ser  Tyr Ala His Leu Cys  Arg Thr Asn
2150                 2155                 2160
Gly Val  Cys Val Asp Trp Arg  Thr Pro Asp Phe Cys  Ala Met Ser
2165                 2170                 2175
Cys Pro  Pro Ser Leu Val Tyr  Asn His Cys Glu His  Gly Cys Pro
2180                 2185                 2190
Arg His  Cys Asp Gly Asn Val  Ser Ser Cys Gly Asp  His Pro Ser
2195                 2200                 2205
Glu Gly  Cys Phe Cys Pro Pro  Asp Lys Val Met Leu  Glu Gly Ser
2210                 2215                 2220
Cys Val  Pro Glu Glu Ala Cys  Thr Gln Cys Ile Gly  Glu Asp Gly
2225                 2230                 2235
Val Gln  His Gln Phe Leu Glu  Ala Trp Val Pro Asp  His Gln Pro
2240                 2245                 2250
Cys Gln  Ile Cys Thr Cys Leu  Ser Gly Arg Lys Val  Asn Cys Thr
2255                 2260                 2265
Thr Gln  Pro Cys Pro Thr Ala  Lys Ala Pro Thr Cys  Gly Leu Cys
2270                 2275                 2280
Glu Val  Ala Arg Leu Arg Gln  Asn Ala Asp Gln Cys  Cys Pro Glu
2285                 2290                 2295
Tyr Glu  Cys Val Cys Asp Pro  Val Ser Cys Asp Leu  Pro Pro Val
2300                 2305                 2310
Pro His  Cys Glu Arg Gly Leu  Gln Pro Thr Leu Thr  Asn Pro Gly
2315                 2320                 2325
Glu Cys  Arg Pro Asn Phe Thr  Cys Ala Cys Arg Lys  Glu Glu Cys
2330                 2335                 2340
Lys Arg  Val Ser Pro Pro Ser  Cys Pro Pro His Arg  Leu Pro Thr
2345                 2350                 2355
Leu Arg  Lys Thr Gln Cys Cys  Asp Glu Tyr Glu Cys  Ala Cys Asn
2360                 2365                 2370
Cys Val  Asn Ser Thr Val Ser  Cys Pro Leu Gly Tyr  Leu Ala Ser
2375                 2380                 2385
Thr Ala  Thr Asn Asp Cys Gly  Cys Thr Thr Thr Thr  Cys Leu Pro
2390                 2395                 2400
Asp Lys  Val Cys Val His Arg  Ser Thr Ile Tyr Pro  Val Gly Gln
2405                 2410                 2415
Phe Trp  Glu Glu Gly Cys Asp  Val Cys Thr Cys Thr  Asp Met Glu
2420                 2425                 2430
Asp Ala  Val Met Gly Leu Arg  Val Ala Gln Cys Ser  Gln Lys Pro
2435                 2440                 2445
Cys Glu  Asp Ser Cys Arg Ser  Gly Phe Thr Tyr Val  Leu His Glu
2450                 2455                 2460
Gly Glu  Cys Cys Gly Arg Cys  Leu Pro Ser Ala Cys  Glu Val Val
2465                 2470                 2475
Thr Gly  Ser Pro Arg Gly Asp  Ser Gln Ser Ser Trp  Lys Ser Val
2480                 2485                 2490
Gly Ser  Gln Trp Glu Asn Pro  Cys Leu Ile Asn Glu  Cys Val Arg
2495                 2500                 2505
Val Lys  Glu Glu Val Phe Ile  Gln Gln Arg Asn Val  Ser Cys Pro
2510                 2515                 2520
Gln Leu  Glu Val Pro Val Cys  Pro Ser Gly Phe Gln  Leu Ser Cys
2525                 2530                 2535
Lys Thr  Ser Ala Cys Cys Pro  Ser Cys Arg Cys Glu  Arg Met Glu
2540                 2545                 2550
Ala Cys  Met Leu Asn Gly Thr  Val Ile Gly Pro Gly  Lys Thr Val
2555                 2560                 2565
Met Ile  Asp Val Cys Thr Thr  Cys Arg Cys Met Val  Gln Val Gly
2570                 2575                 2580
Val Ile  Ser Gly Phe Lys Leu  Glu Cys Arg Lys Thr  Thr Cys Asn
2585                 2590                 2595
Pro Cys  Pro Leu Gly Tyr Lys  Glu Glu Asn Asn Thr  Gly Glu Cys
2600                 2605                 2610
Cys Gly  Arg Cys Leu Pro Thr  Ala Cys Thr Ile Gln  Leu Arg Gly
2615                 2620                 2625
Gly Gln  Ile Met Thr Leu Lys  Arg Asp Glu Thr Leu  Gln Asp Gly
2630                 2635                 2640
Cys Asp  Thr His Phe Cys Lys  Val Asn Glu Arg Gly  Glu Tyr Phe
2645                 2650                 2655
Trp Glu  Lys Arg Val Thr Gly  Cys Pro Pro Phe Asp  Glu His Lys
2660                 2665                 2670
Cys Leu  Ala Glu Gly Gly Lys  Ile Met Lys Ile Pro  Gly Thr Cys
2675                 2680                 2685
Cys Asp  Thr Cys Glu Glu Pro  Glu Cys Asn Asp Ile  Thr Ala Arg
2690                 2695                 2700
Leu Gln  Tyr Val Lys Val Gly  Ser Cys Lys Ser Glu  Val Glu Val
2705                 2710                 2715
Asp Ile  His Tyr Cys Gln Gly  Lys Cys Ala Ser Lys  Ala Met Tyr
2720                 2725                 2730
Ser Ile  Asp Ile Asn Asp Val  Gln Asp Gln Cys Ser  Cys Cys Ser
2735                 2740                 2745
Pro Thr  Arg Thr Glu Pro Met  Gln His Cys Thr Asn  Gly Ser Val
2750                 2755                 2760
Val Tyr  His Glu Val Leu Asn  Ala Met Glu Cys Lys  Cys Ser Pro
2765                 2770                 2775
Arg Lys  Cys Ser Lys
2780
<210>  3
<211>  2050
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная Последовательность
<220>
<223>  зрелый ФфВ
<400>  3
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1. 5                   10                  15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20                  25                  30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35                  40                  45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50                  55                  60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65                  70                  75                  80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85                  90                  95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr
100                 105                 110
Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr
115                 120                 125
Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile
130                 135                 140
Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys
145                 150                 155                 160
Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165                 170                 175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180                 185                 190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
195                 200                 205
Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr
210                 215                 220
Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225                 230                 235                 240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245                 250                 255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260                 265                 270
Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
275                 280                 285
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val
290                 295                 300
Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
305                 310                 315                 320
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys
325                 330                 335
Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly
340                 345                 350
Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu
355                 360                 365
Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn
370                 375                 380
Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu
385                 390                 395                 400
Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
405                 410                 415
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp
420                 425                 430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435                 440                 445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450                 455                 460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu
465                 470                 475                 480
Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val
485                 490                 495
Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu
500                 505                 510
Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala
515                 520                 525
Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu
530                 535                 540
Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
545                 550                 555                 560
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu
565                 570                 575
Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala
580                 585                 590
Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys
595                 600                 605
Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu Leu Met Ala Ser
610                 615                 620
Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly
625                 630                 635                 640
Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His
645                 650                 655
Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn
660                 665                 670
Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp
675                 680                 685
Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro
690                 695                 700
Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu
705                 710                 715                 720
Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val
725                 730                 735
Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn
740                 745                 750
Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly
755                 760                 765
Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr
770                 775                 780
Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
785                 790                 795                 800
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly
805                 810                 815
Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly
820                 825                 830
Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro
835                 840                 845
Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro
850                 855                 860
Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly
865                 870                 875                 880
Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg
885                 890                 895
Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu
900                 905                 910
Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp
915                 920                 925
Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe
930                 935                 940
Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile
945                 950                 955                 960
Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr
965                 970                 975
Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu
980                 985                 990
Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly
995                 1000                1005
Asp Ala  Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr  Ser Glu Met His
1010                 1015                 1020
Gly Ala  Arg Pro Gly Ala Ser  Lys Ala Val Val Ile  Leu Val Thr
1025                 1030                 1035
Asp Val  Ser Val Asp Ser Val  Asp Ala Ala Ala Asp  Ala Ala Arg
1040                 1045                 1050
Ser Asn  Arg Val Thr Val Phe  Pro Ile Gly Ile Gly  Asp Arg Tyr
1055                 1060                 1065
Asp Ala  Ala Gln Leu Arg Ile  Leu Ala Gly Pro Ala  Gly Asp Ser
1070                 1075                 1080
Asn Val  Val Lys Leu Gln Arg  Ile Glu Asp Leu Pro  Thr Met Val
1085                 1090                 1095
Thr Leu  Gly Asn Ser Phe Leu  His Lys Leu Cys Ser  Gly Phe Val
1100                 1105                 1110
Arg Ile  Cys Met Asp Glu Asp  Gly Asn Glu Lys Arg  Pro Gly Asp
1115                 1120                 1125
Val Trp  Thr Leu Pro Asp Gln  Cys His Thr Val Thr  Cys Gln Pro
1130                 1135                 1140
Asp Gly  Gln Thr Leu Leu Lys  Ser His Arg Val Asn  Cys Asp Arg
1145                 1150                 1155
Gly Leu  Arg Pro Ser Cys Pro  Asn Ser Gln Ser Pro  Val Lys Val
1160                 1165                 1170
Glu Glu  Thr Cys Gly Cys Arg  Trp Thr Cys Pro Cys  Val Cys Thr
1175                 1180                 1185
Gly Ser  Ser Thr Arg His Ile  Val Thr Phe Asp Gly  Gln Asn Phe
1190                 1195                 1200
Lys Leu  Thr Gly Ser Cys Ser  Tyr Val Leu Phe Gln  Asn Lys Glu
1205                 1210                 1215
Gln Asp  Leu Glu Val Ile Leu  His Asn Gly Ala Cys  Ser Pro Gly
1220                 1225                 1230
Ala Arg  Gln Gly Cys Met Lys  Ser Ile Glu Val Lys  His Ser Ala
1235                 1240                 1245
Leu Ser  Val Glu Leu His Ser  Asp Met Glu Val Thr  Val Asn Gly
1250                 1255                 1260
Arg Leu  Val Ser Val Pro Tyr  Val Gly Gly Asn Met  Glu Val Asn
1265                 1270                 1275
Val Tyr  Gly Ala Ile Met His  Glu Val Arg Phe Asn  His Leu Gly
1280                 1285                 1290
His Ile  Phe Thr Phe Thr Pro  Gln Asn Asn Glu Phe  Gln Leu Gln
1295                 1300                 1305
Leu Ser  Pro Lys Thr Phe Ala  Ser Lys Thr Tyr Gly  Leu Cys Gly
1310                 1315                 1320
Ile Cys  Asp Glu Asn Gly Ala  Asn Asp Phe Met Leu  Arg Asp Gly
1325                 1330                 1335
Thr Val  Thr Thr Asp Trp Lys  Thr Leu Val Gln Glu  Trp Thr Val
1340                 1345                 1350
Gln Arg  Pro Gly Gln Thr Cys  Gln Pro Ile Leu Glu  Glu Gln Cys
1355                 1360                 1365
Leu Val  Pro Asp Ser Ser His  Cys Gln Val Leu Leu  Leu Pro Leu
1370                 1375                 1380
Phe Ala  Glu Cys His Lys Val  Leu Ala Pro Ala Thr  Phe Tyr Ala
1385                 1390                 1395
Ile Cys  Gln Gln Asp Ser Cys  His Gln Glu Gln Val  Cys Glu Val
1400                 1405                 1410
Ile Ala  Ser Tyr Ala His Leu  Cys Arg Thr Asn Gly  Val Cys Val
1415                 1420                 1425
Asp Trp  Arg Thr Pro Asp Phe  Cys Ala Met Ser Cys  Pro Pro Ser
1430                 1435                 1440
Leu Val  Tyr Asn His Cys Glu  His Gly Cys Pro Arg  His Cys Asp
1445                 1450                 1455
Gly Asn  Val Ser Ser Cys Gly  Asp His Pro Ser Glu  Gly Cys Phe
1460                 1465                 1470
Cys Pro  Pro Asp Lys Val Met  Leu Glu Gly Ser Cys  Val Pro Glu
1475                 1480                 1485
Glu Ala  Cys Thr Gln Cys Ile  Gly Glu Asp Gly Val  Gln His Gln
1490                 1495                 1500
Phe Leu  Glu Ala Trp Val Pro  Asp His Gln Pro Cys  Gln Ile Cys
1505                 1510                 1515
Thr Cys  Leu Ser Gly Arg Lys  Val Asn Cys Thr Thr  Gln Pro Cys
1520                 1525                 1530
Pro Thr  Ala Lys Ala Pro Thr  Cys Gly Leu Cys Glu  Val Ala Arg
1535                 1540                 1545
Leu Arg  Gln Asn Ala Asp Gln  Cys Cys Pro Glu Tyr  Glu Cys Val
1550                 1555                 1560
Cys Asp  Pro Val Ser Cys Asp  Leu Pro Pro Val Pro  His Cys Glu
1565                 1570                 1575
Arg Gly  Leu Gln Pro Thr Leu  Thr Asn Pro Gly Glu  Cys Arg Pro
1580                 1585                 1590
Asn Phe  Thr Cys Ala Cys Arg  Lys Glu Glu Cys Lys  Arg Val Ser
1595                 1600                 1605
Pro Pro  Ser Cys Pro Pro His  Arg Leu Pro Thr Leu  Arg Lys Thr
1610                 1615                 1620
Gln Cys  Cys Asp Glu Tyr Glu  Cys Ala Cys Asn Cys  Val Asn Ser
1625                 1630                 1635
Thr Val  Ser Cys Pro Leu Gly  Tyr Leu Ala Ser Thr  Ala Thr Asn
1640                 1645                 1650
Asp Cys  Gly Cys Thr Thr Thr  Thr Cys Leu Pro Asp  Lys Val Cys
1655                 1660                 1665
Val His  Arg Ser Thr Ile Tyr  Pro Val Gly Gln Phe  Trp Glu Glu
1670                 1675                 1680
Gly Cys  Asp Val Cys Thr Cys  Thr Asp Met Glu Asp  Ala Val Met
1685                 1690                 1695
Gly Leu  Arg Val Ala Gln Cys  Ser Gln Lys Pro Cys  Glu Asp Ser
1700                 1705                 1710
Cys Arg  Ser Gly Phe Thr Tyr  Val Leu His Glu Gly  Glu Cys Cys
1715                 1720                 1725
Gly Arg  Cys Leu Pro Ser Ala  Cys Glu Val Val Thr  Gly Ser Pro
1730                 1735                 1740
Arg Gly  Asp Ser Gln Ser Ser  Trp Lys Ser Val Gly  Ser Gln Trp
1745                 1750                 1755
Ala Ser  Pro Glu Asn Pro Cys  Leu Ile Asn Glu Cys  Val Arg Val
1760                 1765                 1770
Lys Glu  Glu Val Phe Ile Gln  Gln Arg Asn Val Ser  Cys Pro Gln
1775                 1780                 1785
Leu Glu  Val Pro Val Cys Pro  Ser Gly Phe Gln Leu  Ser Cys Lys
1790                 1795                 1800
Thr Ser  Ala Cys Cys Pro Ser  Cys Arg Cys Glu Arg  Met Glu Ala
1805                 1810                 1815
Cys Met  Leu Asn Gly Thr Val  Ile Gly Pro Gly Lys  Thr Val Met
1820                 1825                 1830
Ile Asp  Val Cys Thr Thr Cys  Arg Cys Met Val Gln  Val Gly Val
1835                 1840                 1845
Ile Ser  Gly Phe Lys Leu Glu  Cys Arg Lys Thr Thr  Cys Asn Pro
1850                 1855                 1860
Cys Pro  Leu Gly Tyr Lys Glu  Glu Asn Asn Thr Gly  Glu Cys Cys
1865                 1870                 1875
Gly Arg  Cys Leu Pro Thr Ala  Cys Thr Ile Gln Leu  Arg Gly Gly
1880                 1885                 1890
Gln Ile  Met Thr Leu Lys Arg  Asp Glu Thr Leu Gln  Asp Gly Cys
1895                 1900                 1905
Asp Thr  His Phe Cys Lys Val  Asn Glu Arg Gly Glu  Tyr Phe Trp
1910                 1915                 1920
Glu Lys  Arg Val Thr Gly Cys  Pro Pro Phe Asp Glu  His Lys Cys
1925                 1930                 1935
Leu Ala  Glu Gly Gly Lys Ile  Met Lys Ile Pro Gly  Thr Cys Cys
1940                 1945                 1950
Asp Thr  Cys Glu Glu Pro Glu  Cys Asn Asp Ile Thr  Ala Arg Leu
1955                 1960                 1965
Gln Tyr  Val Lys Val Gly Ser  Cys Lys Ser Glu Val  Glu Val Asp
1970                 1975                 1980
Ile His  Tyr Cys Gln Gly Lys  Cys Ala Ser Lys Ala  Met Tyr Ser
1985                 1990                 1995
Ile Asp  Ile Asn Asp Val Gln  Asp Gln Cys Ser Cys  Cys Ser Pro
2000                 2005                 2010
Thr Arg  Thr Glu Pro Met Gln  Val Ala Leu His Cys  Thr Asn Gly
2015                 2020                 2025
Ser Val  Val Tyr His Glu Val  Leu Asn Ala Met Glu  Cys Lys Cys
2030                 2035                 2040
Ser Pro  Arg Lys Cys Ser Lys
2045                 2050
<---