Оценка состояния про- и антиоксидантного статуса консервированной крови под влиянием берлитиона в условиях окислительного стресса in vitro

А.Г. Соловьева, Н.В. Диденко

ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ПРО- И АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА КОНСЕРВИРОВАННОЙ КРОВИ ПОД ВЛИЯНИЕМ БЕРЛИТИОНА В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА IN VITRO

ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России, Нижний Новгород, Россия

В работе исследованы изменения окислительного метаболизма консервированной крови в условиях окислительного стресса под влиянием берлитиона. Кровь подвергали воздействию АФК (озон, оксид азота, синглетный кислород) и берлитиона. Для оценки интенсивности перекисного окисления липидов и общей антиоксидантной активности использовался метод индуцированной биохемилюминесценции. Концентрацию малонового диальдегида, активность супероксиддисмутазы в крови определяли спектрофотометрическим методом. Показано, что берлитион обладает антиоксидантными свойствами, проявляющимися в повышении общей антиоксидантной активности и активности супероксиддисмутазы.

Ключевые слова: консервированная кровь, активные формы кислорода, берлитион, перекисное окисление липидов, антиоксиданты

In this paper the changes in the oxidative metabolism of stored blood under conditions of oxidative stress under the influence of berlition were investigated. Blood were exposed to ROS (ozone, nitric oxide, singlet oxygen) and berlition.The method of induced biochemiluminescence was used for the estimation of intensity of lipid peroxidation and total antioxidant activity. The concentration of malonic dialdehyde, the activity of superoxide dismutase in the blood were determined by spectrophotometrically. It was shown that berlition has antioxidant properties, manifested in increase of total antioxidant activity and activity of superoxide dismutase.

Key words: stored blood, reactive oxygen species, berlition, lipid peroxidation, antioxidants

Важным звеном патогенеза многих заболеваний является дисбаланс окислительного метаболизма [4]. Развитие окислительного стресса обусловлено интенсификацией процессов свободнорадикального окисления (СРО) и/или снижением антиоксидантной защиты, что приводит к накоплению активных форм кислорода (АФК) [2]. Последние вызывают окислительную модификацию белков и липидов, повреждение ДНК, нарушение структуры мембран. Однако в клинической практике недостаточное внимание уделяется разработке терапевтических стратегий, направленных на нейтрализацию последствий окислительного стресса, антиоксидантную защиту клеток от СРО.

Перспективным антиоксидантом является тиоловое соединение - берлитион - а-липоевая кислота (1,2-дитиолан-З-валериановая кислота, АЛК) [1]. Она хорошо всасывается при пероральном применении и быстро превращается во многих тканях организма в дигидролипоевую кислоту [6]. Эффекты АЛК реализуются как во внутриклеточной, так и во внеклеточной среде. Благодаря физико-химическим свойствам АЛК является сильной и реактивной биологической молекулой, необходимой для окислительного метаболизма и модуляции функций клеток.

Целью работы явилось оценить влияние берлитиона на динамику окислительного метаболизма консервированной крови в условиях окислительного стресса.

Материал и методы. Эксперимент проведен на 5 образцах консервированной крови, полученной со станции переливания крови (Нижний Новгород). Каждый образец был разделен на 7 проб: 1 - контроль (исходная кровь), 2, 4 и 6 - пробы крови, которые барботировались АФК; 3, 5 и 7 пробы - кровь, подвергнутая воздействию АФК и берлитиона. Пробу 2 барботировали кислород-озоновой смесью от озонатора «Медозонс-Систем» с дозой О3 - 500 мкг. Пробу 4 барботировали NO в концентрации 100ppm. Синтез газовой смеси производили с помощью экспериментального аппарата для генерации оксида азота, разработанного в Российском федеральном ядерном центре (РФЯЦ-ВНИИЭФ, г. Саров). Пробу 6 обрабатывали газовым потоком от аппарата «Airnergy» (Германия), содержащим синглетный кислород (СК), при мощности генератора 100%. В плазме крови и эритроцитах изучали активность процессов СРО с помощью метода индуцированной биохемилюминесценции на биохемилюминометре

БХЛ-06 (Н.Новгород). Оценивали следующие параметры хемилюминограммы: tg 2а -показатель, характеризующий скорость спада процессов СРО в плазме и свидетельствующий об общем антиоксидантном потенциале (АОА); S - светосумма хемилюминесценции за 30 сек. - отражает потенциальную способность биологического объекта к ПОЛ. Интенсивность ПОЛ определяли по уровню содержания вторичного продукта СРО - малонового диальдегида (МДА) в плазме и эритроцитах методом M.Uchiyama, M.Mihara [8]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли в гемолизате отмытых эритроцитов (1:10) по ингибированию образования продукта аутоокисления адреналина [5]. Концентрацию белка оценивали методом Лоури в модификации [7]. Результаты исследований обрабатывали с использованием программы Statistica 6.0.

Результаты и их обсуждение. По данным биохемилюминесцентного анализа показано, что применение берлитиона способствовало повышению СРО на фоне воздействия всех АФК: при использовании О3 - на 3% (р=0,098), при Ш - на 6% (р=0,081), СК - на 12% (р=0,023) по сравнению с соответствующей АФК (рис. 1).

Полученный результат подтверждают данные измерения концентрации МДА в плазме крови при барботаже крови синглетным кислородом: содержание МДА возросло на 72% под воздействием берлитиона (рис. 2). В условиях окислительного стресса, вызванного NO, берлитион привел к снижению концентрации МДА в плазме на 31%.

плазма  эритроциты

Рис.1. Изменение светосуммы хемилюминесценции в консервированной крови под влиянием берлитиона в условиях окислительного стресса in vitro . Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0,05); ** -различия статистически значимы по сравнению с АФК (p<0,05); АО - антиоксидант

<

5 1

4 -

3 -

2 -

1 -

плазма  эритроциты

контроль О3 О3+АО NO NO+AO СК СК+АО

Рис. 2. Изменение концентрации малонового диальдегида в консервированной крови под

влиянием берлитиона в условиях окислительного стресса in vitro Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0,05); ** -различия статистически значимы по сравнению с АФК (p<0,05); АО - антиоксидант В эритроцитах берлитион не вызвал статистически значимых изменений светосуммы хемилюминесценции, при этом отмечено снижение концентрации вторичного продукта ПОЛ на 62% под воздействием берлитиона на фоне воздействия газообразного озона (рис. 2).

Берлитион вызвал повышение общей антиоксидантной активности плазмы на фоне воздействия всех АФК: при использовании О3 - на 14% (р=0,087), при NO - на 20% (р=0,031), СК - на 23% (р=0,028) по сравнению с соответствующей АФК (табл.). Активность супероксиддисмутазы под воздействием берлитиона также возросла при О3 на 11% (p=0,042), при NO - на 26% (0,017) по сравнению с соответствующей АФК без использования антиоксиданта.

0

Проведенные исследования показали, что берлитион снижает окислительный стресс за счет повышения антиоксидантных резервов.

Таблица. Влияние берлитиона на антиоксидантную систему консервированной крови при

Условия эксперимента tg2a, усл.ед. СОД, усл. ед./мг белка

Контроль 0,746±0,065 687,01±9,65

О3 0,864±0,072 1007,12±24,56*

О3+АО 0,986±0,081 1122,31±13,87**

NO 0,755±0,054 958,78±16,94*

NO+AO 0,902±0,033** 1209,65±27,02**

СК 0,795±0,071 1075,64±16,34*

СК+АО 0,981±0,060** 902,64±9,92

Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0,05); ** -

различия статистически значимы по сравнению с АФК (p<0,05); АО - антиоксидант

Известно, что а-липоевая кислота снижает окислительный стресс, связывая свободные радикалы, подавляя их образование и инактивируя оксиданты, что приводит к восстановлению клеточных мембран. Показано, что в высокой концентрации а-липоевая кислота действует в качестве "ловушки" свободных радикалов. Кроме того, а-липоевая кислота восстанавливает эндогенные системы защиты от радикалов. Антиокислительное действие берлитиона обусловлено наличием в молекуле двух тиоловых групп, в результате чего происходит связывание молекул свободных радикалов и свободного тканевого железа, предотвращается его участие в образовании активных форм кислорода (реакция Фентона), обеспечивается поддержка работы других антиоксидантных систем (глутатиона, убихинона) [1, 6].

Заключение. Таким образом, терапевтический потенциал берлитиона реализуется за счет редукции окислительного стресса. Берлитион обладает антиоксидантными свойствами за счет повышения общей антиокисдантной активности и увеличения активности супероксиддисмутазы.

Список литературы:

1. Аметов А.С., Мамедова И.Н. Лечение а-липоевой кислотой (Берлитионом) периферической вегетативной недостаточности у пациентов с сахарным диабетом 2 типа // Клин. фармакол. тер., 2003, 12 (2), 74-80.

2. Дубинина Е. Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса. Вопросы медицинской химии 2001; 47 (6): 561-581.

3. Кузьмина Е.И., Перетягин С.П., Евстигнеев С.В. Определение антиоксидантного потенциала в плазме крови ожоговых больных: пособие для врачей. Н. Новгород: ННИИТО; 2000; 12 с.

4. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М: Фирма Слово; 2006; 556 с.

5. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы. Вопросы медицинской химии. 1999; 45 (3): 109-116.

6. Яворская В.А., Бондарь О.Б., Ибрагимова Е.А., Скорый А.Ю. Антиоксидантная терапия при ишемическом инсульте // Международный неврологический журнал 3 (33) 2010

7. Dawson J.M., Heatlic P.L. Lowry method of protein quantification Evidence for Photosensitivity. Analytical Biochemistry 1984; 140 (2): 391-393.

8. Uchiyama M., Mihara М. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Analyticac Biochemistry 1978; 86: 271.