Получение специфических компонен-тов бактерий Clostridium perfringens для иммуноферментного анализа

межд. конф. Международная промышленная академия «Птицеводство - мировой и отечественный опыт» - 2004, 9-11 февраля 2004. -М.: Пищепромиздат, 2004. - С. 110.

4. Лухт, Х-В. Горох в кормлении животных / Х-В. Лухт // Животноводство России. - 2004. - №9. - С. 33.

5. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных: Справочное пособие - 3-е издание переработанное и дополненное/ Под ред. А.П. Калашникова, В.И. Фисинина, В.В. Щеглова, Н.И. Клейменова. -М.: Россельхозакадемия [и др.], 2003. - 456 с.

6. Подлетская, Н. Н. Влияние уровня витаминного питания на обмен микроэлементов у молодняка свиней / Н. Н. Подлетская, Б. А. Скуковский // Доклады ВАСХНИЛ. - 1980. - №1. - С. 25-27.

7. Фицев, А. Защита протеина в смеси гороха и ячменя / А. Фицев, В. Косолапов, Х. Ишмуратов // Животноводство России. -2004. - №8. - С. 33.

8. Шацких, Е. Органическая форма йода в рационах для бройлеров / Е. Шацких // Птицеводство - 2007. - №8. - С. 22-23.

ЗООГИГИЕНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЭКСТРУДИРОВАННОГО КОРМА В КОРМЛЕНИИ ДОЙНЫХ КОРОВ

Софронов В.Г., Сайфуллин А.С., Ямаев Э.И., Данилова Н.И., Софронов П.В., Кузнецова Е.Л.

Резюме

Введение 1,5 кг экструдированного корма, состоявшего из 25% ржи, 20% гороха, 25% кукурузы и 30% рапса, в рацион опытных дойных коров группы способствовало увеличению молочной продуктивности за четыре месяца эксперимента на 132 кг, а предварительное проращивание последнего компонента, с последующим экструдированием, на 334,4 кг. Экономическая эффективность на 1 рубль дополнительных затрат при использовании экструдированного корма, составляет до 1,57 рублей, а предварительное проращивание последнего рапса, с последующим экструдированием, - 2,78 рублей.

ZOOHYGIENIC JUSTIFICATION OF USE OF THE EXTRUDED FORAGE IN FEEDING

OF MILK COWS

Sofronov V.G., Saifullin A. S., Yamayev E.I., Danilova N.I., Sofronov P.V., Kuznetsova E.L.

Summary

Introduction of 1,5 kg of the extruded forage consisting of 25% of a rye, 20% of peas, 25% of corn and 30% of colza to a diet of experienced milk cows of group promoted increase in lactic efficiency in four months of an experiment on 132 kg, and a preliminary sprouting of the last component, with the subsequent extruding, on 334,4 kg. The economic efficiency for 1 ruble of padding expenses when using an extruded forage, is up to 1,57 rubles, and a preliminary sprouting of the last colza, with the subsequent extruding, - 2,78 rubles.

УДК 619:616-091:616.636.2

ПОЛУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ БАКТЕРИЙ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

Спиридонов А.Г. - к.б.н., с.н.с. ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»

Ключевые слова: анаэробная энтеротоксемия, диагностика, ИФА. Key words: enterotoxaemia infectious anaerobic, diagnostics, ELISA.

В структуре заболеваемости сельскохозяйственных животных

наибольшее экономическое значение имеют желудочно-кишечные болезни молодняка, в том числе анаэробная энтеротоксемия,

возбудителями которой являются бактерии Clostridium perfringens (Cl. perfringens) [1, 3, 4]. На сегодняшний день диагноз на инфекционную энтеротоксемию животных ставят на основании эпизоотологических,

клинических, патологоанатомических

данных и результатов лабораторного исследования патологического материала. Недостатками лабораторного метода являются трудоемкость и длительность исследований, требующего для постановки диагноза до 8 рабочих дней, а также высокая себестоимость исследования (дороговизна питательных сред, реактивов, затраты на приобретение и содержание лабораторных животных).

В настоящее время для диагностики многих инфекционных заболеваний применяют серологические методы (РСК, РДП, РНГА, ИФА и др.), позволяющие по титрам специфических антител в сыворотке крови выявлять больных животных, а также определять напряженность иммунитета у вакцинированных животных.

В ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» разработана ассоциированная вакцина против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят [2]. Однако отсутствие метода определения специфических антител к бактериям С1. регЕл^е^ в сыворотке крови животных затрудняет контролировать напряженность поствакцинального иммунитета.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось получение специфических компонентов бактерий С1. регЕп^е^ для набора препаратов для определения специфических антител к бактериям С1. регЕп^е^ в сыворотке крови животных методом ИФА.

Материалы и методы исследований. Работа проводилась в условиях лаборатории бактерийных инфекций ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и скотоводческих хозяйств Республики Татарстан, неблагополучных по анаэробной энтеротоксемии телят.

При выполнении работы использовали следующие штаммы С1. регЕл^е^: №28 (тип А), ЬБ-1 (тип В), №392 (тип С), №213 (тип Д), полученные из ФГБУ «ВГНКИ».

Иммуноферментный анализ проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для иммунологических реакций по общепринятой методике. Результаты реакции учитывали по показаниям оптической плотности при длине волны 490 нм.

Результаты исследований. Для набора препаратов для определения специфических антител к бактериям С1. регЕл^е^ методом ИФА антиген готовили следующим образом: получили биомассу бактерий С1. регЕп^е^ каждого серотипа по отдельности

(А, В, С, Д), освобождали ее от остатков питательной среды путем 3-кратного отмывания физиологическим раствором. Готовили суспензии бактерий С1. рег£п^е^ с концентрацией по 20 млрд. м.к. в 1 см3. Затем суспензии бактерий С1. ретШ^е^ смешивали в равных соотношениях. Таким образом получали суспензию бактерий С1. рег£п^е^ с содержанием в 1 см3 по 5 млрд. м.к. каждого серотипа. Полученную суспензию (20 млрд. м.к. в 1 см3) озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе с частотой 20 мГц в течение 10-15 минут при 40С до полного разрушения клеток. Затем эндотоксин осаждали сульфатом аммония при 40% насыщении рН 7,0 и очищали дифференцированным растворением преципитата в 0,02 М фосфатном буфере рН 6,8 с последующим диализом против водопроводной воды.

Контрольную положительную сыворотку к антигену бактерий С1. регЕп^е^ получили путем гипериммунизации клинически здорового молодняка крупного рогатого скота 6-7-месячного возраста. Для этой цели применяли корпускулярный антиген и анатоксины производственных штаммов бактерий С1. регЕп^е^ серотипов А, В, С и Д. Корпускулярный антиген представлял собой инактивированные формалином бактерии С1. регЕл^е^, содержащий по 2,5 млрд. м.к. каждого серотипа в 1 см3. Для получения анатоксина бактерии С1. регЕп^е^ выращивали в жидкой питательной среде в течение 7 часов, потом токсин инактивировали формалином при температуре 370С в течение 10 суток. Затем анатоксин очищали путем центрифугирования и фильтрации культураль-ной среды через бактериальные фильтры.

Гипериммунизацию животных проводили 4-х кратно с интервалом 14 дней. При этом животным вводили одновременно корпускулярный антиген подкожно и анатоксин

- внутримышечно. Для предупреждения анафилактического шока, начиная со второго цикла иммунизации, животным вводили по 2 см3 антигена подкожно за 30-40 минут до введения основной дозы антигена. Схема ги-перимунизации быков-продуцентов представлена в таблице 1. Через 20 дней после последнего введения антигена у животных из яремной вены брали пробу крови для определения титров специфических антител. Производственное взятие крови производили при наличии антител в сыворотке крови быков-продуцентов к С1. регЕН^е^ в титрах 1:6400

- 1:12800 в ИФА.

Таблица 1 -Схема гипериммунизации быков-продуцентов антигеном бактерий С1. Рег&т§еп8

Этап иммунизации Срок иммунизации, сут. Антиген С1. регй^е^ Доза антигена, см3 Способ введения

1-ый 1 корпускулярный анатоксин 10,0 1,0 подкожно внутримышечно

11-ой 14 корпускулярный анатоксин 15,0 3,0 подкожно внутримышечно

111-ий 28 корпускулярный анатоксин 20,0 5,0 подкожно внутримышечно

ГУ-ый 42 корпускулярный анатоксин 25,0 10,0 подкожно внутримышечно

Контрольную отрицательную сыворотку получили от молодняка крупного рогатого скота 6-7-месячного возраста из хозяйства, свободного от анаэробной энтеротоксе-мии, после выдерживания их в карантине в течение 2 месяцев.

Стандартизировали основные условия проведения серологических исследований методом ИФА.

Проводили определение оптимальной концентрации антигена для адсорбции на полистироловый 96-луночный планшет. При этом оценивали интенсивность иммунофер-ментной реакции при следующих концентрациях антигена в растворе: 2,0; 2,5; 5,0; 8,0; 10 мкг/см3. В качестве тестируемых образцов использовали «положительные» и «отрицательные» контрольные образцы сывороток крови животных. Проводили подбор концентрации сорбции антигена при параллельном тестировании различных разведений конъ-югата. Наиболее приемлемый показатель титра сывороток крови животных при этом выявили при разведении конъюгата 1:2500 и концентрации сорбированного антигена 5-8 мкг/см3. Таким образом, данное разведение конъюгата, при исходной концентрации сорбированного антигена 5-8 мкг/см3, сочли оптимальным и использовали в дальнейшей работе.

Проводили подбор оптимальной времени экспозиции адсорбции антигена. С этой целью испытали режимы иммобилизации в течение 6, 18, 24 часов при температуре 40С. Процесс адсорбции антигена оценивали по интенсивности реакции с контрольными гипериммунными положительными и отрицательными сыворотками в серийных разведениях. Критерием являлось достижение максимального значения ОП. Минимальные показатели оптической плотности наблюдались при инкубации при температуре 40С в тече-

ние 18 и 24 часов. В результате проведенных исследований установили, что эффективно использовать режим иммобилизации антигена в течение 18 часов при температуре 40С.

Проводили определение оптимального времени экспозиции исследуемых сывороток, для установления которого в 3-х повтор-ностях оценивали интенсивность реакции в зависимости от времени инкубирования специфических и отрицательных сывороток в серийных разведениях при температуре 370С. При этом конъюгат использовали в рабочем разведении 1:2500. При этом установили, что показатели оптической плотности исследуемых сывороток в диапазоне от 15 до 60 мин возрастали, а далее стабилизировались. Наблюдаемый эффект зафиксировали для сывороток, обладающих различным уровнем специфической активности. На этом основании 60-минутную экспозицию сывороток считали достаточной для достижения максимальной и стабильной реакции.

Для учета и интерпретации результатов, полученных тест-системой ИФА, определили позитивно-негативный порог тест-системы, который находился в диапазоне <15% - >22%. В дальнейшем все пробы, значение Ксв которых было меньше позитивно-негативного порога, считали отрицательными, а пробы со значением Ксв равным или превышающим этот показатель положительными.

Провели межлабораторное комиссионное испытание компонентов тест-системы для выявления специфических антител к бактериям С1. регРп^е^ в сыворотке крови крупного рогатого скота методом иммуно-ферментного анализа на специфичность, чувствительность и воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа.

При испытании антигена и сывороток крови на специфичность использовали: кон-

трольную положительную сыворотку к бактериям С1. регбп^е^, контрольную отрицательную сыворотку по отношению к бактериям С1. регИ^е^, сыворотку крови от вакцинированных против анаэробной энтеро-токсемии и больных анаэробной энтероток-семией телят, а также гетерогенные гипериммунные сыворотки (сальмонелл-лезную, эшерихиозную). При этом установили, что все компоненты набора активны и специфичны в ИФА. Специфический антиген не реагировал с гетерогенными гипериммунными сыворот-ками (сальмонеллезной, эшери-хиозной), тогда как с гомологичными сыворотками (гипериммунной сывороткой и сыворотками крови, полученными от вакцинированных против анаэробной энтеротоксе-мии и явно больных животных) давал положительную реакцию в высоких титрах -1:3200 - 1:12800.

Заключение. Получены специфический антиген бактерий С1. регй^е^ и гипериммунная к нему сыворотка, которые могут быть использованы при создании набора препаратов для выявления антител к возбудителям анаэробной эниеротоксемии животных. Стандартизированы основные условия проведения реакции ИФА.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Куриленко, А.Н. Бактериальные и вирусные болезни молодняка с.-х. животных / А.Н. Куриленко, В.Л. Крупальник, Н.В. Пименов. - М.: КолосС, 2005. - С. 84-91.

2. Патент РФ на изобретение №2428202. Вакцина ассоциированная против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят / Г.Н. Спиридонов, А.А. Иванов, Х.Н. Макаев, М.Т. Хурамшина, А.Г. Спиридонов, Э Р. Галиуллина; заявитель и патентообладатель ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»; опубл. 10.09.2011, Бюл. №25.

3. Салимов, В.А. Некоторые особенности патологоанатомической диагностики анаэробной энтеротоксемии телят, вызванной С1. регВп^е^ типа А / В.А. Салимов, Н.П.Салимова // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях: Матер. науч.-практ. конф. - Воронеж, 2002. -С. 527-528.

4. Спиридонов, Г.Н. Инфекционная энтеротоксемия молодняка сельскохозяйственных животных в регионе Среднего Поволжья и Предуралья / Г.Н. Спиридонов, А.Ф. Махмутов, М.Т. Хурамшина, А.Г. Спиридонов // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири: Матер. науч.-практ. конф. - Краснообск, 2010. - С. 134-139.

ПОЛУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ БАКТЕРИЙ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

Спиридонов А.Г.

Резюме

В статье представлены методы получения специфических компонентов бактерий Clostridium perfringens и гипериммунной сыворотки для иммуноферментного анализа. Антиген получили методом озвучивания суспензии бактерий Cl. perfringens, содержащей в 1 см3 по 5 млрд. м.к. бактерий серотипов А, В, С, Д, на ультразвуковом дезинтеграторе с частотой 20 мГц в течение 10-15 минут при 40С с последующим осаждением эндотоксина сульфатом аммония и диализом против водопроводной воды. Положительную сыворотку получили путем гипериммунизации молодняка крупного рогатого скота корпускулярным антигеном и анатоксином бактерий Cl. perfringens серотипов А, В, С и Д. Гипериммунизацию животных проводили 4-х кратно с интервалом 14 дней. При этом животным вводили одновременно корпускулярный антиген подкожно и анатоксин - внутримышечно. Провели стандартизацию основных условий проведения реакции ИФА: определение оптимальной концентрации и времени адсорбции антигена на полистироловый планшет, подбор времени экспозиции исследуемых сывороток. Наиболее приемлемый показатель титра сывороток крови животных выявили при разведении конъюгата 1:2500 и концентрации сорбированного антигена 5-8 мкг/см3. Установили, что эффективно использовать режим иммобилизации антигена в течение 18 часов при температуре 40С. Межлабораторное комиссионное испытание показало, что все компоненты тест-системы активны и специфичны. Специфический антиген не реагирует с гетерогенными гипериммунными сыворотками (сальмонеллезной, эшерихиозной), тогда как с гомологичными сыворотками (гипериммунной и сыворотками крови от вакцинированных и больных анаэробной энтеротоксемией животных) дают положительную реакцию в высоких титрах -1:3200 - 1:12800

PRODUCTION OF SPECIFIC COMPONENTS OF BACTERIA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS FOR ELISA

Spiridonov A.G.

Summary

The article describes a new method to produce components specific to Clostridium perfringens and hyperimmune serum for ELISA test. The antigen was produced by ultrasonification of CL.perfringens bacterial suspension containing 5 billion of each A, B, C, D serotypes per 1 cm3. The ul-trasonication was performed using ultrasonic disintegrator at 20 mHz frequency during 10-15 min at 4 C. It was followed by endotoxin sedimentation with ammonium sulfate and dialysis against tap water. Positive serum was produced by young calves hyperimmunization with corpuscular antigen and anatoxin from Cl. perfringens A, B, C, D serotypes. The 4-fold hyperimmunization was performed with 14-days intervals. Simultaneously the animals were introduced corpuscular antigen subcutaneously and anatoxin intravenously. The basic conditions for ELISA test (determining optimal and antigen absorption time in polysterol plates, appropriate exposure time of tested sera) were standardized. The most appropriate titration in animal blood sera was determined at 1:2500 conjugate solution and 5-8 mkg/cm3 absorbed antigen concentration. The most efficient mode of antigen fixation was was 18hours at 4C. Interlaboratory commission trial showed that ll the components of the test-system were active and specific. Specific antigen does not respond to heterogenic hyperimmune sera (salmonella, escherichia) while with homogenic sera (hyperimmune and blood sera sampled from vaccinated and infected with anaerobic enterotoxemy) it responses at high titers - 1:3200-1:12800.

УДК 619:617.711/.713-002-022.6

ШТАММ MORAXELLA BOVOCULI «СХ-Ч6 № -ДЕП» ВОЗБУДИТЕЛЯ ИНФЕКЦИОННОГО КЕРАТОКОНЪЮНКТИВИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Спиридонов Г.Н. - д.б.н., Дуплева Л.Ш. - к.б.н., Спиридонов А.Г.- к.б.н., Зарипов А.С. - зав. отделом, Хусаинов И.Т. - м.н.с., Юсупова Ю.В - н.с.

ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»

Ключевые слова: крупный рогатый скот, инфекционный кератоконъюнктивит, возбудитель, Moraxella bovoculi, биологические свойства.

Key words: cattle, infectious keratoconjunctivitis, pathogen, Moraxella bovoculi, biological properties.

В последние годы установлено широкое распространение в некоторых регионах Российской Федерации инфекционного кера-токонъюнктивита крупного рогатого скота, вызываемого бактериям Moraxella bovis и Moraxella bovoculi. Заболевание характеризуется слезотечением, гиперемией сосудов конъюнктивы, светобоязнью, серозно-гнойным истечением, помутнением и изъязвлением роговицы, деформацией глазного яблока в виде кератоглобуса или кератоконуса, частичной или полной потерей зрения [4, 5].

Заболевание причиняет значительный экономический ущерб развитию скотоводства вследствие снижения удоев молока до 50%, прироста массы тела на 31-37%, гибели животных, а также затрат на проведение лечебно-профилактических мероприятий.

Согласно определителю бактерий

Берджи 1984 г. род Moraxelta, предложенный Lwoff (1939), относился к семейству Neisseriaceae [3]. Однако с современных позиций таксономии, на основе изучения 16S рРНК и анализа рРНК-ДНК гибридизации, в настоящее время род Moraxelta отнесён к семейству Moraxellaceae. До недавнего времени для ветеринарной медицины наиболее важным представителем этого рода считался Moraxella bovis, вызывающий инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота. В настоящее время установлено, что инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота может быть вызван и другими представителями рода Moraxella, в частности бактериями Moraxella bovoculi. Впервые эти бактерии были выделены при инфекционном кератоконъюнктивите у молочных коров калифорнийскими учеными Angelos J. A. и со-