СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА (ВАРИАНТЫ)

1. Способ получения инсулина, включающий создание отличного от человека трансгенного млекопитающего, которое образует в молоке модифицированный предшественник инсулина, получение молока от указанного млекопитающего, очистку модифицированного предшественника инсулина из молока, дающую в результате чистый модифицированный предшественник инсулина, превращение указанного предшественника инсулина в инсулин и очистку инсулина.
2. Способ по п.1, в котором отличное от человека трансгенное млекопитающее создают клонированием последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует модифицированный предшественник инсулина, в плазмиду, посредством которого последовательность функционально связывают с промотором, который будет направлять экспрессию последовательности в клетках молочной железы с получением в результате экспрессирующей плазмиды, производят трансфекцию соматических клеток экспрессирующей плазмидой с инкорпорированием плазмиды в геном соматических клеток с получением в результате трансгенных соматических клеток, энуклеируют зрелую яйцеклетку с получением яйцеклетки с удаленным ядром, проводят слияние одной из соматических клеток с указанной яйцеклеткой, приводящее к образованию одноклеточного эмбриона, имплантируют эмбрион в матку млекопитающего-реципиента и производят мониторирование беременности до рождения трансгенного млекопитающего.
3. Способ по п.2, в котором промотор представляет собой β-казеиновый промотор, а инсулин и модифицированный предшественник инсулина представляют собой инсулин млекопитающего и модифицированный предшественник инсулина млекопитающего соответственно.
4. Способ по п.3, в котором инсулин млекопитающего и модифицированный предшественник инсулина млекопитающего представляют собой соответственно человеческий инсулин и модифицированный предшественник человеческого инсулина, инсулин крупного рогатого скота и модифицированный предшественник инсулина крупного рогатого скота, свиной инсулин и модифицированный предшественник свиного инсулина, овечий инсулин и модифицированный предшественник овечьего инсулина, козий инсулин и модифицированный предшественник козьего инсулина или инсулин грызуна и модифицированный предшественник инсулина грызуна.
5. Способ по п.4, в котором инсулин млекопитающего и модифицированный предшественник инсулина млекопитающего представляют собой человеческий инсулин и модифицированный предшественник человеческого инсулина.
6. Способ по п.2, в котором млекопитающее представляет собой крупный рогатый скот, образующий в молоке модифицированный предшественник человеческого инсулина, геном которой включает интегрированную плазмиду, включающую последовательность, кодирующую модифицированный предшественник человеческого инсулина и β-казеиновый промотор, который направляет экспрессию последовательности в клетках молочной железы указанного млекопитающего.
7. Способ по п.2, в котором млекопитающее представляет собой крупный рогатый скот, образующий в молоке слитый белок, содержащий фрагмент α-лактальбумина, сайт расщепления энтерокиназы и модифицированный предшественник человеческого инсулина, геном которого включает интегрированную плазмиду, причем плазмида содержит последовательность, кодирующую слитый белок и β-казеиновый промотор, который управляет экспрессией последовательности в клетках молочной железы указанного млекопитающего.
8. Способ по п.2, в котором соматические клетки представляют собой фибробласты.
9. Способ по п.2, в котором трансгенные соматические клетки получают путем выделения у самки, трансгенной по образованию в своем молоке модифицированного предшественника инсулина.
10. Способ по п.9, в котором трансгенные соматические клетки представляют собой фибробласты.
11. Способ по любому из пп.5-7, в котором экспрессирующая плазмида дополнительно включает ген устойчивости к неомицину.
12. Способ по п.11, в котором экспрессирующая плазмида представляет собой pβmhuIP.
13. Способ по п.11, в котором экспрессирующая плазмида представляет собой pNJK IP.
14. Способ по п.11, в котором экспрессирующая плазмида представляет собой pβKLE IP.
15. Способ по любому из пп.1, 2, 9, в котором млекопитающее представляет собой виды крупного рогатого скота, виды свиней, виды овец, виды коз или виды грызунов.
16. Способ по п.15, в котором млекопитающее принадлежит к видам крупного рогатого скота.
17. Способ по любому из пп.1, 2, 9, в котором инсулин и модифицированный предшественник инсулина представляют собой, соответственно, инсулин млекопитающего и модифицированный предшественник инсулина млекопитающего.
18. Способ по п.17, в котором инсулин млекопитающего и модифицированный предшественник инсулина млекопитающего представляют собой, соответственно, человеческий инсулин и модифицированный предшественник человеческого инсулина, инсулин крупного рогатого скота и модифицированный предшественник инсулина крупного рогатого скота, свиной инсулин и модифицированный предшественник свиного инсулина, овечий инсулин и модифицированный предшественник овечьего инсулина, козий инсулин и модифицированный предшественник козьего инсулина или инсулин грызунов и модифицированный предшественник инсулина грызунов.
19. Способ по п.18, в котором инсулин млекопитающего и модифицированный предшественник инсулина млекопитающего представляют собой, соответственно, человеческий инсулин и модифицированный предшественник человеческого инсулина.
20. Способ по любому из пп.1, 2, 9, в котором модифицированный предшественник инсулина не вызывает гипогликемию у отличного от человека трансгенного млекопитающего.
21. Способ по п.20, в котором модифицированный предшественник инсулина включает модифицированный С-пептид.
22. Способ по п.21, в котором модифицированный С-пептид включает аминокислоты, которые обычно не обнаруживают в природных предшественниках инсулина.
23. Способ по п.22, в котором модифицированный С-пептид включает следующие три аминокислоты: Ala-Ala-Lys.
24. Способ по п.21, в котором модифицированный предшественник инсулина дополнительно включает модифицированную В-цепь.
25. Способ по п.24, в котором модифицированная В-цепь включает все аминокислоты природной В-цепи кроме С-концевой аминокислоты.
26. Способ по пп.1, 2, 9, в котором последовательность, кодирующая модифицированный предшественник инсулина, функционально связанная с промотором, направляющим экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в клетках молочной железы, обнаруживают в соматических клетках и половых клетках млекопитающего.
27. Способ по п.1, в котором очистка модифицированного предшественника инсулина из молока включает очистку молока отличного от человека трансгенного млекопитающего и хроматографию очищенного молока с получением в результате очищенного модифицированного предшественника инсулина.
28. Способ по п.1, в котором превращение модифицированного предшественника инсулина в инсулин и очистка инсулина включает ферментное расщепление и транспептидацию модифицированного предшественника инсулина с получением транспептидированного материала и хроматографию расщепленного транспептидированного материала с получением чистого инсулина.
29. Способ по п.1, в котором проводят очистку модифицированного предшественника инсулина из молока отличного от человека трансгенного млекопитающего, которое образует в молоке модифицированный предшественник инсулина с получением в результате очищенного молока и производят катионообменную хроматографию очищенного молока и дальнейшую обращенно-фазовую хроматографию с получением в результате чистого модифицированного предшественника инсулина.
30. Способ по любому из пп.27-29, в котором хроматография представляет собой ионообменную хроматографию, такую как катионобменную или обращенно-фазовую хроматографию.
31. Способ по п.30, в котором хроматография является многостадийной.
32. Способ по п.28, в котором ферментное расщепление представляет собой трипсинолизис.
33. Способ по любому из пп.27-29, в котором хроматография представляет собой обращенно-фазовую хроматографию.
34. Способ по п.31, в котором проводят три стадии хроматографии.
35. Способ по п.34, в котором стадии хроматографии включают использование матриц с обращенной фазой.
36. Способ по п.35, в котором матрицы с обращенной фазой представляют собой С4 или С18 матрицы с обращенной фазой.
37. Способ получения инсулина, включающий создание отличного от человека трансгенного млекопитающего, которое образует в молоке модифицированный предшественник инсулина, получение молока от указанного млекопитающего, очистку молока, обработку очищенного молока катионообменной хроматографией с получением продукта катионообменной хромотографии, обращенно-фазовую хроматографию продукта катионообменной хроматографии с получением в результате чистого модифицированного предшественника инсулина, трипсинолизис и транспептидацию чистого модифицированного предшественника инсулина с получением трипсинизированного и транспептидированного материала, первую обращенно-фазовую хроматографию трипсинизированного и транспептидированного материала с получением первого обращенно-фазовой хроматографией материала, вторую обращенно-фазовую хроматографию первого обращенно-фазовой хроматографией материала с получением второго обращенно-фазовой хроматографией материала и третью обращенно-фазовую хроматографию второго обращенно-фазовой хроматографией материала с получением в результате чистого инсулина.
38. Способ по п.37, в котором инсулин и модифицированный предшественник инсулина являются соответственно инсулином млекопитающего и модифицированным предшественником инсулина млекопитающего.
39. Способ по п.38, в котором инсулин млекопитающего и модифицированный предшественник инсулина млекопитающего представляют собой, соответственно, человеческий инсулин и модифицированный предшественник человеческого инсулина, инсулин крупного рогатого скота и модифицированный предшественник инсулина крупного рогатого скота, свиной инсулин и модифицированный предшественник свиного инсулина, овечий инсулин и модифицированный предшественник овечьего инсулина, козий инсулин и модифицированный предшественник козьего инсулина или инсулин грызунов и модифицированный предшественник инсулина грызунов.
40. Способ по п.39, в котором инсулин млекопитающего и модифицированный предшественник инсулина млекопитающего являются соответственно человеческим инсулином и модифицированным предшественником человеческого инсулина.
41. Способ по п.40, в котором отличное от человека трансгенное млекопитающее представляет собой свинью, овцу, козу или грызуна.
42. Способ по п.40, в котором млекопитающее представляет собой вид крупного рогатого скота.