Разработка технологии производства гидролизатов сывороточных белков молока с использованием мембранной техники. Часть 1. Подбор ферментного препарата для проведения гидролиза в ферментативном мембранном реакторе

УДК 577.15

Разработка технологии производства гидролизатов сывороточных белков молока с использованием мембранной техники.

Часть 1. Подбор ферментного препарата для проведения гидролиза в ферментативном мембранном реакторе

Ю. Я. Свириденко, д-р биол. наук, академик РАН; Д. С. Мягконосов, канд. техн. наук; Д. В. Абрамов, канд. биол. наук; Е. Г. Овчинникова

Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия, г. Углич, Ярославская обл.

При помощи гидролиза можно получать продукты улучшенного состава, обладающие высокой степенью перевариваемости, с устраненными антигенными последовательностями, содержащимися в нативных белках и отсутствием дефектов вкуса. Во Всероссийском НИИ маслоделия и сыроделия проводятся исследования по созданию технологии гидро-лизатов сывороточных белков с регулируемым пептидным составом, реализуемой на базе ферментативного мембранного реактора.

Ферментативный мембранный реактор - специфическая технология, позволяющая вести непрерывный процесс ферментативного гидролиза субстрата, при котором гидролизованный субстрат отделяется от ферментативной среды при помощи специальной селективной мембраны. Главной целью технологии мембранного реактора является полное отделение фермента от продуктов гидролиза с целью сохранения его в активном состоянии внутри активной зоны реактора и получения свободного от фермента гидролизата. Важным вопросом при создании технологии белковых гидролизатов является подбор вида протеолитических ферментов, обеспечивающих максимально полную конверсию субстрата при требуемом молекулярно-массовом распределении продуктов гидролиза.

Гидролизаты белков, создаваемые для питания людей со специальными пищевыми потребностями (дети раннего возраста, спортсмены

в период соревнований, больные в период послеоперационного восстановления), должны состоятьв основном из пептидов с короткой длиной цепи [1].Такие гидролизаты обладают пониженной степенью антигенности, так как не содержа-тэпитопов [2] ибыстро абсорбируются в тонком кишечнике. Имеются данные, что гидролизат, состоящий в основном из свободных аминокислот абсорбируется медленнее, чем гидролизат, состоящий из пептидов [3]. Объяснением этому служит тот факт, что усвоение белковых веществ в тонком кишечнике может происходить только в виде свободных аминокислот, дипептидов и трипепидов. При этом скорость переноса азота через кишечную стенку выше при усвоении ди- и три-пептидов [4].

Высокое содержание свободных аминокислот в гидролизате нежелательно также и по ряду других причин. Во-первых, это придает продукту высокую осмоляльность, а высокое осмотическое давление жидкости в просвете кишечника подавляет усвоение питательных веществ [5]. Во-вторых, высокая концентрация свободных аминокислот ухудшает органолептические свойства гидролизатов. Водные растворы аминокислот обладают различными оттенками вкуса, часть из которых можно характеризовать как отрицательные с точки зрения вкусовых качеств пищевых продуктов. Особенно выраженные отрицательные оттенки вкуса придают незаменимые

аминокислоты, которыми богаты сывороточные белки. В частности, в водных растворах аргинин, гисти-дин, изолейцин, лейцин, валин и фенилаланин имеют выраженный горький вкус, цистеин - сернистый, глютаминовая кислота - бульонный, аланин, серин, глицин - сладкий [6].Поэтому, при получении гидро-лизатовследует избегать слишком глубокого протеолиза, сопровождающегося накоплением большого количества свободных аминокислот. Вследствие этого требуется тщательный подбор протеолитических ферментов.

В рамках проводимых в НИИ маслоделия и сыроделия исследований по разработке технологии гидролиза молочных белков в ферментативном мембранном реакторе были проведены опыты по подбору ферментных препаратов. Для гидролиза сывороточных белков испытывали ферментный препарат Alcalase 2.4L (Novozymes A / S, Дания) и ферментный препарат Панкреатин (ФВС Фармацойтичи С. п. А., Италия). Молекулярно-массовое распределение в гидролизатах определяли с помощью метода гель-фильтрафии высокого разрешения на колонке Superóse 12 (GE Healthcare) на базе комплекса лабораторного оборудования компаний LKB и Amersham Pharmacia. Детектирование разделяемых азотистых фракций осуществляли на длине волны 280 нм.

На рис. 1 приведены диаграммы молекулярно-массового распределения азотистых фракций в гидро-лизатах, полученных с помощью ферментных препаратов Панкреатин и Alcalase.

Среди продуктов гидролиза в ги-дролизате, полученном с помощью препарата Alcalase преобладают пептиды с разной молекулярной массой, количество свободных аминокислот

ENGINEERING AND TECHNOLOGY

а б

Рис. 1. Диаграммы молекулярно-массового распределения азотистых фракций в вариантах гидролизатов сывороточных белков, полученных с использованием разных ферментных препаратов: а - ферментный препарат Панкреатин; б - ферментный препарат А!са!азе. На диаграммах отмечены следующие азотистые фракции: 1 - конгломераты пептидов; 2 - фракция белков молочной сыворотки; 3- фракция пептидов с молекулярной массой 2-10 кДа; 4 - фракция пептидов с молекулярной массой 1-2 кДа; 5 - фракция пептидов с молекулярной массой менее 1 кДа; 6 - фракция свободных аминокислот

в таком гидролизате значительно меньше, чем пептидов. В гидролизате, произведенном с помощью ферментного препарата Панкреатин, наоборот, преобладают аминокислоты.

Ферментный препарат Alcalase 2.4L (Novozymes A/S) является наиболее подходящим вариантом для производства гидролизатов сывороточного белка в условиях мембранного реактора, поскольку обладает широкой специфичностью расщепления пептидных связей при низком количестве образуемых свободных аминокислот. Doucet et al [7], в ходе исследований установили, что средняя длина пептидной цепи в гидролизате сывороточного белка, полученного с помощью Alcalase, составляет 4,3 аминокислотных остатка. В исследовании Cheison et al [8] по оценке протеолитической активности и специфичности ферментных препаратов препарат Alcalase 2.4L показал наибольшую среди всех исследованных препаратов активность в расщеплении сывороточных белков при способности к сохранению активности в течение длительного времени.

Свойство ферментного препарата Alcalase гидролизовать субстрат с образованием малого количества свободных аминокислот позволяет получать гидролизат с низким показателем осмоляльности и отсутствием значительных дефектов вкуса. Достоинством препарата Alcalase 2.4L также является его сравнительно невысокая стоимость и коммерческая доступность.

Для определения оптимальных параметров технологии гидролиза в мембранном реакторе были проведены эксперименты по установлению концентрации субстрата (Б) и дозы внесения фермента (Е), обеспечивающих наибольший выход продуктов гидролиза. В качестве критерия оптимизации использовался показатель выхода гидролизата (%), рассчитанный по формуле:

где М - выход гидролизата, %; Мгидр - масса сухого гидролизата, полученного в результате гидролиза, кг; Мсубстр - масса сухого субстрата, направленного на гидролиз, кг.

Для исключения получения ложной зависимости по влиянию дозы вносимого фермента на выход гидролизата при расчете масса полученного сухого гидролизата М перед подстановкой в формулу уменьшалась на массу сухого вещества ферментного препарата, внесенного в ферментационную смесь. Поскольку щелочь, вносимая для установления рН, после фильтрации переходила в гидролизат и при увеличении дозы вносимой щелочи создавалась картина увеличения выхода гидролизата, масса внесенной щелочи также вычиталась из М .

гидр.

Гидролиз проводили при помощи ферментного препарата А1са!аБе 2.41_ при температуре 55 °С в течение 18 ч. В результате экспериментов установлена регрессионная зависимость, выражающая влияние не-

скольких факторов на выход гидро-лизата:

,

Где М - выход гидролизата, %; х - концентрация субстрата (массовая доля белка в ферментативной смеси (S)), %; y - доза внесения фермента (массовая доля фермента в ферментативной смеси (Е)), %.

Степень достоверности сглаживания экспериментальных данных регрессионной моделью R2=0,86.

Было обнаружено, что наибольший выход гидролизата (на уровне М ~ 70 %) может быть получен при концентрации субстрата S = 4,3% и дозе внесения фермента Е = 0,5%.

Другим важным вопросом являлось установление оптимальной температуры гидролиза сывороточных белков с помощью препарата Alcalase.

Фирма Novozymes A/S в сопроводительной документации к ферментному препарату Alcalase [9] указывает, что данный ферментный препарат обладает наибольшей активностью по отношению к сывороточному белку при температуре около 70 °С из-за чувствительности основного белка сыворотки молока бета-лактоглобулина к температуре. При температуре между 55 и 70 °С данный белок подвергается обратимой денатурации вследствие развертывания и потери вторичной структуры. Результат - высокая предрасположенность сывороточного белка к ферментативному гидролизу при температурах свыше 55 °С, что, в частности, отмечали в своих исследованиях Cheisonetal [8].

Проведенные эксперименты по гидролизу сывороточного белка с помощью ферментного препарата Alcalase 2.4L в диапазоне температур 55...65 °С показали, что наиболее интенсивно гидролиз протекает при температуре 65 °С. При такой температуре практически полное отсутствие негидролизованного белка в субстрате наблюдалось уже через 60 мин.

Таким образом, для производства гидролизатов белков молочной сыворотки в ферментативном мембранном реакторе был выбран ферментный препарат Alcalase 2.4L. Установлены оптимальные условия гидролиза: концентрация субстрата (S = 4,3%), доза внесения фермента (Е = 0,5%), температура гидролиза (t = 65 °C) и продолжительность гидролиза (т = 60 мин). Дальнейшие исследования по разработке технологии гидролиза в ферментативном

мембранном реакторе направлены на оптимизацию параметров мембранного разделения продуктов гидролиза (порог отсечения мембран по молекулярной массе, температура и давление питательного раствора при фильтрации).

ЛИТЕРАТУРА

1. Clemente, A. Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition/A. Clemente // Trends in Food Science & Technology. - 2000. - № 11. - P. 254-262.

2. Siemensma, A. D. The importance of peptide lengths in hypoaUergenic infant formulas / A. D. Siemensma, W. J. Weijer, H. J. Bak // Trends

Food Sci. Technol. - 1993. - № 4. -P. 16-21.

3. Manninen, A. H. Protein hydrolysates in sports and exercise: A brief review/ A. H. Manninen // Journal of Sports Science and Medicine. - 2004. -№ 3. - P. 60-63.

4. Boza, J. J. Protein hydrolysatevs free amino acid- based diets on the nutritional recovery of the starved rat/J. J. Boza [et al] // Eur. J. Nutr. -2000. - № 39. - P. 237-243.

5. Tomarelli, R. M. Osmolality, osmolarity, and renal solute load of infant formulas/ R. M. Tomarelli // J Pediatr. - 1976. - № 88. - P. 454-456.

6. Nishimura, T. Taste of free amino acids and peptides/ T. Nishimura, H. Kato //

Food Reviews International. - 1988. -№ 4 (2). - P. 175-194.

7. Doucet, D. E n zy m e-In d u ce d Gelation of Extensively Hydrolyzed Whey Proteins by Alcalase: Peptide Identification and Determination of Enzyme Specificity/D. Doucet [et al] // J. Agric. Food Chem. - 2003. - № 51. -P. 6300-6308.

8. Cheison, S. C. Multivariate strategy in screening of enzymes to be used for whey protein hydrolysis in an enzymatic membrane reactor/S. C. Cheison, Z. Wang, S.-Y. Xu// International Dairy Journal. -2007. - № 17 (4). - P. 393-402.

9. Alcalase* FoodGrade. B 318e-GB. Bagsvaerd. Denmark. Novo Nordisk A/S, 1998.

Разработка технологии производства гидролизатов сывороточных белков молока с использованием мембранной техники. Часть 1. Подбор ферментного препарата для проведения гидролиза в ферментативном мембранном реакторе

Ключевые слова

антигенность; гидролиз; мембраны; молочные белки; специальное питание; сывороточные белки, ферментные препараты

Реферат

При помощи гидролиза можно получать продукты улучшенного состава, обладающие высокой степенью перевариваемости, с устраненными антигенными последовательностями, содержащимися в нативных белках и отсутствием дефектов вкуса. Во Всероссийском НИИ маслоделия и сыроделия проводятся исследования по созданию технологии гидролизатов сывороточных белков с регулируемым пептидным составом на базе ферментативного мембранного реактора. Ферментативный мембранный реактор -специфическая технология, позволяющая вести непрерывный процесс ферментативного гидролиза субстрата, при котором гидролизованный субстрат отделяется от ферментативной среды при помощи селективной мембраны. Ключевым элементом при создании технологии белковых гидролизатов является подбор вида протеолитических ферментов, обеспечивающих максимально полную конверсию субстрата при требуемом молекулярно-массовом распределении продуктов гидролиза. Для гидролиза сывороточных белков испытывали высокоэффективные ферментные препараты: Alcalase 2.4L (Novozymes A/S, Дания) и Панкреатин (ФВС ФармацойтичиС. п. А., Италия).Наиболее подходящим для данных целей был признан ферментный препарат Alcalase 2.4L. В ходе работы были получены данные по параметрам процессов гидролиза сывороточных белков, использованные для оптимизации технологии гидролиза в мембранном реакторе. Методом факторного эксперимента были установлены оптимальные параметры гидролиза сывороточных белков ферментным препаратом Alcalase. Оптимальные показатели состава ферментативной смеси: концентрация субстрата S=4,3%, доза внесения фермента 0,5%, выход гидролизата при оптимальных параметрах гидролиза достигает 70%. Оптимальная температура гидролиза сывороточных белков ферментным препаратом Alcalase составляет 65 °С, при такой температуре практически полный гидролиз белка в субстрате наблюдается уже через 60 мин.

Авторы

Свириденко Юрий Яковлевич, д-р биол. наук, профессор, академик РАН,

Мягконосов Дмитрий Сергеевич, канд. техн. наук, Абрамов Дмитрий Васильевич, канд. биол. наук, Овчинникова Елена Григорьевна Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия, 152613, Ярославская обл., г. Углич, Красноармейский бульвар, д. 19, uglich-cheese@mail.ru

Development of manufacturing processes of whey protein hydrolyzates using membrane technology. Part 1. Select of enzyme preparation for hydrolysis in enzymatic membrane reactor

Key words

antigenicity; hydrolysis; membranes; milk proteins; special nutrition; whey proteins; enzyme preparations

Abstracts

Hydrolysis is used to obtain much better composition products with a high degree of digestibility, eliminated antigenic sequences contained in native proteins, and without any flavour defects. The All-Russian R&D Institute of Butter and Cheesemaking is conducting research in developing a technology for producing hydrolysates of whey proteins with a controlled peptide composition by using an enzymatic membrane reactor. The enzyme membrane reactor is a specific technology for ensuring a continuous process of substrate enzyme hydrolysis, during which the hydrolysed substrate is separated from the fermentative medium with a selective membrane. When a protein hydrolysate technology is developed, the key element is to select the kind of proteolytic enzymes that would ensure fullest substrate conversion with the required molecular mass distribution of hydrolysis products. The following high-performance enzyme preparations were tested for hydrolysis of whey proteins: Alcalase 2.4L (Novozymes A/S, Denmark) and Pancreatin (ABC FarmaceuticiS. p. A., Italy). Enzyme preparation Alcalase 2.4L was found to be the most promising one for these purposes. The research effort yielded data on the parameters of the process of whey protein hydrolysis, which were used for optimising the hydrolysis technology in a membrane reactor. The factorial test method established optimal parameters for whey protein hydrolysis with the Alcalase enzyme preparation. The optimal indicators of the enzyme mix composition are as follows: substrate concentration S = 4.3% and enzyme introduction dosage - 0.5%. Hydrolysate yield with optimal hydrolysis parameters is up to 70%. The optimal temperature for hydrolysis of whey proteins with the Alcalase enzyme preparation is 65 °C. At such a temperature, a complete hydrolysis of protein in the substrate was observed as early as in 60 minutes.

Authors

Sviridenko Yuriy Yakovlevich, Doctor of Biological Science, Professor, Academician of RAS,

Myagkonosov Dmitry Sergeevich, Candidate of Technical Science, Abramov Dmitry Vasilievich, Candidate of Biological Science, Ovchinnikova Elena Grigoryevna

All-Russian Scientific Research Institute of Butter and Cheese Making, 19, Krasnoarmeysky Bulvar, Uglich, Yaroslavl region, 152613, uglich-cheese@mail.ru