Ca2+-dependent Adenylate Cyclase of Plant Cells in Bacterial Pathogenesis

Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 15, No. 2, 2019, pp. 05-09 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2018 by Romanenko, Filinova and Lomovatskaya

ORIGINAL ARTICLE

OPEN /T1 ACCESS

9

Ca2+-dependent Adenylate Cyclase of Plant Cells in Bacterial Pathogenesis

A.S. Romanenko, N.V. Filinova*, L.A. Lomovatskaya

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Irkutsk, 664033, Russia

*E-Mail: filmova@sifibr.irk.m

Received March 5, 2019

plants of the resistant cultivar significantly increased, whereas in the cells of the susceptible

cultivar it remained unchanged.

Key words: Adenylate cyclase, Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, calcium, potatoes

В настоящее время ионы кальция признаны универсальными посредниками в клеточных реакциях организмов растений и животных. Именно ионы кальция в цитозоле служат связующим звеном для многих сигнальных путей, обеспечивая формирование сигнальной сети растительной клетки (Guo et al., 2018). Передача стрессовых сигналов с участием Ca2+ происходит благодаря его способности дифференцированно взаимодействовать с клеточными белками, в том числе с ферментами, которые являются ключевыми звеньями в других сигнальных системах растений (Hepler, 2005).

На клетках животных показано, что аденилатциклазная и кальциевая сигнальные системы активно реагируют на стрессоры разной природы (Cao et al., 2017), при этом тесно взаимодействуя между собой. У растений исследования по взаимному влиянию сигнальных систем менее многочисленны, чем таковые у животных. Пока в клетках растений выявлены только неселективные, регулируемые нуклеотидами кальциевые каналы, активация которых происходит при присоединении цАМФ (Chin et al., 2009). У животных давно выявлены изоформы аденилатциклазы, фермента, синтезирующего цАМФ, отличающиеся по чувствительности к ионам кальция (Halls, Cooper, 2011). Для растений такие сведения единичны (Chatukuta et al., 2018), что значительно осложняет понимание путей трансдукции сигналов, происходящих в растительных клетках на ранних этапах воздействия стрессоров. Цель настоящей работы - исследовать изменение чувствительности к экзогенным ионам Ca2+ трансмембранной аденилатциклазы (тмАЦ) из клеток растений двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к бактериальному возбудителю кольцевой гнили Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms), при действии экзополисахаридов (ЭПС) Cms.

MATERIALS AND METHODS

В работе использовали растения картофеля (Solanum tuberosum L.) сорта Луговской

(резистентный к Cms), сорта Лукьяновский (чувствительный к Cms) и ЭПС Cms вирулентного, мукоидного штамма 5369. Экзополисахариды Cms добавляли в жидкую среду роста растений и инкубировали в течение 1 мин. Пробоподготовку для выделения тмАЦ проводили по стандартной схеме, описанной в (Ломоватская и др., 2015). Кальций добавляли к выделенному ферменту в виде CaCl2 (ч.д.а., "Реахим", Россия) в следующих конечных концентрациях: 500 нМ, 1мкМ, 500 мкМ, 1 и 10 мМ, рассчитанных по содержанию Са2+. Об активности фермента судили по концентрации цАМФ, которую определяли методом иммуноферментного анализа. Активность выражали в мг белка/мин. Белок в пробе определяли по методу Бредфорда. Контролем служили образцы без добавления кальция. Эксперименты проводили в двукратной биологической и четырёхкратной аналитической повторностях. Результаты обрабатывали статистически с помощью программы SigmaPlot v. 12.3 ("SYSTAT Software", США). По литературным данным свободные ионы Са2+ в растительных клетках присутствуют в микромолярных концентрациях. Эти концентрации могут резко и кратковременно повышаться (до миллимолей в течение нескольких секунд) под влиянием стрессоров разной природы (White, Broadley, 2003). Поэтому в наших экспериментах мы применяли кальций в микро- и миллимолярных концентрациях.

RESULTS

В корнях растений чувствительного сорта в варианте без ЭПС добавление в среду роста растений кальция при всех концентрациях не оказывало влияния на активность тмАЦ, тогда как после добавлении ЭПС кальций при самой высокой концентрации (10 мМ) ингибировал активность фермента на 30% (рис. 1а, б). В стеблях тех же растений в варианте без ЭПС 1 мкМ, 500 мкМ и 1 мМ кальция существенно стимулировали активность тмАЦ (рис. 1а). После инкубации с ЭПС при высоких концентрациях этого катиона (1 и 10 мМ) наблюдалось значительное ингибирование, особенно в стеблях, активности тмАЦ (рис. 1б).

У картофеля, резистентного к Cms сорта, в корнях активность тмАЦ после добавления кальция возросла как в варианте с ЭПС, так и без него. Чем больше была концентрация кальция, тем выше была активность фермента (рис. 2а, б). В варианте с ЭПС активирующий эффект всех концентраций Са2+ был

более выраженным. В клетках стеблей тех же растений в варианте без ЭПС активность тмАЦ не изменилась в присутствии всех концентраций кальция, но после добавлении ЭПС значительно возросла, особенно при миллимолярных концентрациях катиона (рис. 26).

140 120

§ 100

о

^ 80

О

Ï 60 40

О

Я 0

корень  стебель

0 500 нМ 1 мкМ 500 мкМ 1 мМ 10 мМ Концентрация Са 2+

Figure-1. Изменение активности тмАЦ из клеток растений картофеля восприимчивого сорта под влиянием

разных концентраций ионов кальция. Здесь и на рис. 2 (а) - контрольный вариант (без добавления ЭПС Cms), (б) - опытный вариант (с добавлением ЭПС Cms). M ± m.

Figure-2. Изменение активности тмАЦ из клеток растений картофеля устойчивого сорта под влиянием различных концентраций ионов кальция.

DISCUSSION

Модуляция активности тмАЦ ионами кальция, вероятно, свидетельствует о наличии нескольких изоформ этого фермента, отличающихся по чувствительности к данному иону. Возможно, у растений обоих сортов спектр изоформ тмАЦ различен. На основании полученных данных можно предположить, что эта особенность является одним из механизмов разной устойчивости растений данных сортов к Cms и обусловлена развитием/блокировкой системного ответа растений

картофеля обоих сортов на биотический стрессор. Ранее (Ломоватская и др., 2004) мы также установили зависимость системного ответа на биотический стрессор аденилатциклазной сигнальной системы растений картофеля от их сортовой принадлежности.

Опираясь на ранее полученные результаты (Романенко, Ломоватская, 2017) о наличии в структуре плазмалеммы и мембран клеточных органелл растений картофеля этих сортов цАМФ-зависимых Са2+-каналов, локализация которых количественно изменялась в ответ на воздействие

ЭПС Cms, можно предположить существование возможного механизма взаимовлияния

аденилатциклазной и кальциевой сигнальных систем при биотическом стрессе. В цитируемой работе мы показали, что в клетках корней растений тех же сортов картофеля ЭПС Cms интенсивно модулировали активность тмАЦ. По крайней мере, в клеточной стенке и плазмалемме клеток растений картофеля присутствуют рецепторы к ЭПС Cms, имеющие количественные и качественные сортовые различия. У растений восприимчивого сорта эти

Работа выполнена на оборудовании ЦКП "Биоаналитика" с использованием коллекций ЦКП "Биоресурсный центр" Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).

REFERENCES

Cao X.-Q., Juang Z.-H., Yi Y.-Y., Yang Y., Ke L.-P., Pei Z.-M., Zhu S. (2017) Biotic and abiotic stresses activate different Ca2+ permeable channels in Arabidopsis. Frontiers in Plant Sci., 8, Article 83. Doi: 10.3389/fpls.2017.00083.

Chatukuta P., Dikobe T.B., Kawadza D.T., Sehlabane K.S., Takundwa M.M., Wong A., Gehring C., Ruzvidzo O. (2018) Biomolecules, 8(15). Doi:10.3390/biom8020015.

Chin K., Moeder W., Yoshioka K. (2009) Biological roles of cyclic ucleotide-gated ion channels in plants: What we know and don't know about this 20 member ion channel family. Botany, 87, 668-677.

Cоореr D.M.F., Shell M.J., Thorn P., Irvine R.F. (1998) Regulation of adenylyl cyclase by membrane potential. J. Biol. Chem., 273(2), 27703-27707.

Guo J., Islam M.A., Lin H., Ji C., DuanY., Peng L., Zeng Q., Day B., Kang Z., Guo J. (2018) Genome-wide identification of cyclic nucleotide-gated ion channel gene family in wheat and functional analyses. Frontiers in Plant Sci., 9, Article 18. doi: 10.3389/fpls.2018.00018.

Halls M.L., Cooper D.M.F. (2011) Regulation by Ca2+ -signaling pathways of adenylyl cyclases. Bootman M.D., Berridge M.J., Putney J.W., Roderick H.L. (eds). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 3, Cold Spring Harbor Laboratory Prerss, Cambridge, UK, 1-22 a004143.

Hepler P.K. (2005) Calcium: a central regulator of plant growth and development. Plant Cell, 17, 2142-2155.

White P.J., Broadley M.R. (2003) Calcium in plants. Annals Bot., 92, 487-511.

Ломоватская Л.А, Романенко А.С., Рыкун О.В. (2015) Трансмембранная аденилатциклаза

контролирует факторы вирулентности фитопатогена Pseudomonas siringae и мутуалиста Rhizobium leguminosarum. Микробиология, 84(4), 404-410.

Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В., Копытчук В.Н., Саляев Р.К. (2004) Возможная роль эндогенного цАМФ картофеля в

рецепторы обладали сродством к супрессорным компонентам ЭПС, у растений устойчивого сорта - к элиситорным (Романенко и др., 1998). Очевидно, что системная реакция индуцируется в корнях, непосредственно контактирующих со стрессовым фактором. При этом под воздействием стрессора в плазмалемме клеток корней растений возникает электрохимический потенциал, системно распространяющийся до верхушки стебля (Новикова и др., 2017), а активность тмАЦ меняется под его воздействием (Соореr et al., 1998). Модуляция активности тмАЦ может приводить к локальному изменению концентрации цАМФ, что способствует активации потенциалзависимых Са2+-каналов, повышая кратковременно и локально концентрацию ионов кальция в составе плазмалеммы за счёт их выхода из свободного пространства клеточной стенки (Новикова и др., 2017). Дополнительный вклад в супрессию развития системного сигнала в клетках растений чувствительного сорта вносит ингибирование тмАЦ высокими концентрациями кальция. Очевидно, что для растений каждого сорта картофеля существует тонкая внутренняя регуляция этих процессов, зависящая от первичных триггеров сигналов, в частности от рецепторов, а также от активности тмАЦ.

ACKNOWLEDGMENT

развитии системного сигнала при патонегезе кольцевой гнили. ДАН, 394(5), 715-117.

Новикова Е.М., Воденеева В.А., Сухов В.С. (2017) Разработка математической модели потенциала действия высших растений, учитывающей роль вакуоли в генерации электрического сигнала. Биологические мембраны, 34(2), 109-125.

Романенко А.С., Ломоватская Л.А. (2017) Влияние экзополисахаридов бактериального возбудителя

кольцевой гнили на субклеточную локализацию регулируемых циклическими нуклеотидами ионных каналов (CGNC) в клетках корней картофеля. Биологические мембраны, 34(2), 1-8.

Романенко А.С., Рымарева Е.В., Шафикова Т.Н. (1998) Компоненты оболочек клеток картофеля, обладающие сродством к токсину возбудителя кольцевой гнили. ДАН, 358(2), 277-279.