АНАЛИЗ РАСЩЕПЛЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО VAMP

1. Антигенный полипептид? содержащий эпитоп VAMP, где указанный антигенный полипептид состоит из 10-65 аминокислотных остатков, где указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно с C-конца от участка расщепления нейротоксином клостридий в указанном VAMP.
2. Антигенный полипептид по п.1, где указанный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, предпочтительно, 10-16 аминокислотных остатков, более предпочтительно, 10-15 аминокислотных остатков.
3. Антигенный полипептид по п.1 или 2, где указанный VAMP выбран из VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5 и/или YKT6.
4. Антигенный полипептид по любому из пп. 1-3, где указанный эпитоп VAMP содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности VAMP, выбранной из: SEQ ID NO: 15 - SEQ ID NO: 34, и SEQ ID NO: 48 - SEQ ID NO: 78.
5. Антигенный полипептид по любому из пп. 1-4, где указанный эпитоп VAMP представляет собой эпитоп VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 и выбран из:
-
эпитопа VAMP дляBoNT/F или BoNT/D, содержащего или состоящего из KLSELDDRADALQ (SEQ ID NO: 15);
-
эпитопа VAMP для BoNT/F5 или BoNT/FA, содержащего или состоящего из ERDQKLSELDDRA (SEQ ID NO: 32);
-
эпитопа VAMP для BoNT/B или TeNT, содержащего или состоящего из FETSAAKLKRKYW (SEQ ID NO: 22) или FETSAAKLKRKYWWK (SEQ ID NO: 49);
-
эпитопа VAMP для BoNT/G, содержащего или состоящего из AKLKRKYWWKN (SEQ ID NO: 27); и
-
эпитопа VAMP для BoNT/X, содержащего или состоящего из ADALQAGASQF (SEQ ID NO: 53).
6. Антигенный полипептид по любому из пп. 1-4, где указанный эпитоп VAMP представляет собой эпитоп для VAMP4, VAMP5 и/или YKT6 и выбран из:
-
эпитопа VAMP для BoNT/X, содержащего или состоящего из SESLSDNATAF (SEQ ID NO: 62), SDQLLDMSSTF (SEQ ID NO: 66) или SEVLGTQSKAF (SEQ ID NO: 75).
7. Полипептид, содержащий антигенный полипептид по любому из пп. 1-6, где полипептид не содержит область из более 17, предпочтительно, 16, более предпочтительно, 15 последовательных аминокислот, имеющих 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью природного VAMP.
8. Антигенный белок, содержащий полипептид по любому из пп. 1-6 или полипептид по п.7, ковалентно связанный с носителем.
9. Применение антигенного полипептида по любому из пп. 1-6 или полипептида по п.7, или антигенного белка по п.8 для получения антител к C-концевому продукту расщепления VAMP.
10. Антитело, которое связывается с антигенным полипептидом по любому из пп.1-6 или c полипептидом по п.7, или с антигенным белком по п.8.
11. Антитело по п.10, где указанное антитело представляет собой поликлональное антитело.
12. Антитело по п.10, где указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.
D
-7
13. Антитело по любому из пп. 10-12, где K между указанным антителом и указанным эпитопом ниже, чем 10 M.
14. Применение антитела по любому из пп. 10-13 в клеточном анализе с усилением сигнала для расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий.
15. Способ определения расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в клетке, включающий:
приведение клетки в контакт с нейротоксином клостридий в условиях, подходящих для активности нейротоксина клостридий;
приведение цитоплазматического содержимого указанной клетки в контакт с первым антителом для детекции к C-концевому продукту расщепления VAMP после расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в условиях, подходящих для связывания первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP, где указанное первое антитело для детекции представляет собой антитело по любому из пп. 10-13; и
детекцию пригодными способами связывания указанного первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP.
16. Способ по п.15, дополнительно включающий d) количественную оценку пригодными способами количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции.
17. Способ определения иммунной устойчивости к расщепляющему VAMP нейротоксину клостридий у пациента, включающий:
добавление расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий к тестируемому образцу, полученному от пациента;
приведение клетки в контакт с тестируемым образцом со стадии a) в условиях, подходящих для активности нейротоксина клостридий;
приведение цитоплазматического содержимого указанной клетки в контакт с первым антителом для детекции к C-концевому продукту расщепления VAMP после расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в условиях, подходящих для связывания первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP, где указанное первое антитело для детекции представляет собой антитело по любому из пп. 10-13;
детекцию пригодными способами связывания указанного первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP;
количественную оценку количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с первым антителом для детекции;
повторение стадий a) - e) с отрицательным контрольным образцом вместо тестируемого образца; и
сравнение количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции, на стадиях (e) и (f), где детекция более низкого количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции, на стадии (e) по сравнению с количеством C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции, на стадии (f) является показателем присутствия нейтрализующих антител против расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий.
18. Набор, содержащий клетку, чувствительную к интоксикации расщепляющим VAMP нейротоксином; и первое антитело для детекции против расщепленного VAMP, где указанное первое антитело для детекции представляет собой антитело по любому из пп. 10-13.