БИОСЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТИЛАМИНА, ДИМЕТИЛАМИНА И ТРИМЕТИЛАМИНА В ВОДНОЙ СРЕДЕ

Полезная модель относится к области охраны окружающей среды, а именно к устройствам для определения метилированных алифатических аминов (метиламина, диметиламина, триметиламина).
6
5
4
Метилированные алифатические амины как общие предшественники в органическом синтезе применяются в производстве инсектицидов, ускорителей вулканизации резиновых изделий, лекарственных средств, растворителей. Так, метиламин (МА) используется в производстве фунгицидов, дубильных веществ, красителей, ракетных топлив. Диметиламин (ДМА) - гербицидов и моющих средств. Триметиламин (ТМА) - бактерицидов, кормовых добавок, реагентов для флотационных процессов. Промышленное производство МА составляет 1.0×10 т/год, ДМА - 2.7×10 т/год, ТМА - 3.5×10 т/год. Известно, что попадание и накопление метилированных алифатических аминов в грунтовых водах приводит к ухудшению качества питьевой воды. Предельно допустимая концентрация (ПДК) метиламина в воде составляет 1 мг/л (33 мкМ). Метилированные амины могут находиться в водоемах, промышленных стоках и служить предшественниками канцерогенных и мутагенных соединений. Поэтому закономерен интерес исследователей к мониторингу метилированных алифатических аминов в водной среде. Известен хроматографический метод определения метилированных алифатических аминов (МА, ДМА, ТМА) в газовой фазе [Erupe, M.E., Liberman-Martin, A., Silva, P.J., Malloy, Q.G., Yonis, Y., Cocker, Iii, D.R., Purvis-Roberts, K. Determination of Methylamines and Trimethylamine-N-oxide in Particulate Matter by Non-suppressed Ion Cromatography. Journal of Chromatography. 2010. V.1217. №13. Р.2070-2073]. Известен амперометрический медиаторный ферментный биосенсор на основе фермента метиламиндегидрогеназы для определения гетероциклического соединения гистамина ([4-(2-аминоэтил)-имидазол), содержащего аминогруппу, в водных средах [K. Zeng, H. Tachikawa, Z. Zhu, and V. L. Davidson Amperometric Detection of Histamine with a Methylamine Dehydrogenase Polypyrrole Based Sensor. Anal. Chem. 2000. V.72. P.2211-2215]. Метилированные алифатические амины можно определять в водных растворах методом титрования. Однако эта методика предусматривает использование для анализа большого количества вещества (сотни мг) [Сиггиа С, Ханна Дж. Г. Количественный органический анализ по функциональным группам // М.: Химия. 1983. 672 с].
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель - создание устройства для определения МА (ДМА, ТМА каждого по отдельности) простого по конструкции и эксплуатации.
Технический результат, который может быть получен при использовании полезной модели, заключается в том, что предлагаемый биосенсор обеспечивает быстрое определение содержания МА (ДМА, ТМА) без использования сложного стационарного дорогостоящего оборудования, дорогостоящего ферментного препарата и большого количество вещества.
Сущность полезной модели заключается в том, что биосенсор для определения МА (ДМА, ТМА) включает в себя кислородный электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащем бактериальные клетки аэробных метилобактерий Methylopila musalis BKM B-2646, иммобилизованные на носителе.
Метилобактерий представляют собой грамотрицательные палочки, 0.8-1.2×1.0-8.0 µm, зачастую плеоморфные; могут ветвиться, что особенно характерно для старых клеток. На агаризованных минеральных средах с метанолом большинство видов образует розовые колонии (за счет синтеза каротиноидного пигмента). Метилобактерий подвижны благодаря единственному полярному, околополярному или латеральному жгутику. Строгие аэробы, кислород служит терминальным акцептором электронов. Мезофилы, хемоорганотрофы. Ростовые факторы не требуют. Факультативные метилотрофы, растут на ФА (в микромолярных концентрациях), формиате и метаноле, некоторые штаммы растут на метилированных аминах и галометанах. Ассимилируют C1-соединения посредством серинового цикла. Широко распространены в природе. Род относится к классу Alphaproteobacteria, порядку Rhizobiales, семейству Methylobacteriaceae.
T
T
T
Штамм Methylopila musalis - аэробные факультативно метилобактерий, выделенные из банана. Он назван Methylopila musalis sp. nov. (типовой штамм BKM B-2646=DSM 24966=CCUG 61696) (Doronina N.V,, Kaparulina E.N., Bykova T.V., Trotsenko Yu. A. Methylopila musalis sp. nov., an aerobic, facultatively methylotrophic bacterium isolated from banana fruit // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2013. V.63. P.1847-1852).
Биосенсор для определения МА (ДМА, ТМА) включает кислородный электрод Кларка 1, на котором размещен биорецептор 2, представляющий собой носитель, содержащий иммобилизованные клетки (ИмК) штамма Methylopila musalis BKM B-2646. Биорецептор 2 прикрепляется к электроду с помощью фиксатора 3 (Фиг.1). Регистрируемым параметром является максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt (нА/мин), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации потребленного кислорода. Для обработки данных используют SigmaPlot 11.0.
Нижний предел определения 11 мкМ для МА; 16 мМ для ДМА, 6 мМ для ТМА, долговременная стабильность - 5 суток, продолжительность анализа - 10 мин. Биосенсор чувствителен к наличию промежуточного продукта окисления МА формальдегида, а также таких соединений как метанол, этанол, глюкоза.
На фиг.1 представлена схема биосенсора для определения МА (ДМА, ТМА). На фиг.2 представлена градуировочная кривая зависимости ответа биосенсора на основе ИмК штамма Methylopila musalis BKM B-2646 от концентрации МА. На фиг.3 представлена градуировочная кривая зависимости ответа биосенсора на основе ИмК штамма Мету1орПа тизаНз ВКМ В-2646 от концентрации ДМА. На фиг.4 представлена градуировочная кривая зависимости ответа биосенсора на основе ИмК штамма Methylopila musalis BKM B-2646 от концентрации ТМА. В качестве носителя для клеток, используемых в биорецепторе, могут использоваться полисахаридные гели, поливиниловые спирты, целлюлозные мембраны, стекловолокна, в частности, хроматографическая стеклобумага.
2
4
4
2
4
2
Для создания биорецептора используют клетки бактериального штамма Methylopila musalis BKM B-2646. Бактериальная культура обладает способностью к окислению МА, ДМА и ТМА. Метилобактерий выращивали на среде «K», которая содержала (г/л): KHPO - 2.0; MgSO·7HO - 0.125; NaCl - 0.5; FeSO·7HO - 0.002; вода дистиллированная 1 л, значение pH 7.2 устанавливали 3M NAOH. Культивирование проводили в колбах объемом 750 мл, содержащих 200 мл среды. После стерилизации (1 атм.; 30 мин) в среду добавляли 1 мл 30% (об/об) метиламина и 20 мл жидкой посевной культуры или засевали смывом стерильной средой с агаризованной скошенной культуры. Метилобактерий инкубировали на качалке (140 об/мин) при температуре 29°C до начала стационарной фазы роста (2-5 сут.). Штамм поддерживали пересевом на агаризованной (2% агара «Difco») среде «K» с метанолом. Биомассу (конец экспоненциальной фазы роста) отделяли центрифугированием при 5000 g в течение 30 мин, +4°C. Клеточную суспензию хранили в холодильнике при +4°C.
Аликвоту клеточной суспензии центрифугировали при 10000 g в течение 3 мин при комнатной температуре. Клетки отмывали дважды 50 мМ K-фосфатным буфером, pH 7.5. Иммобилизацию клеток M. musalis BKM B-2646 осуществляли методом физической адсорбции. Для этого клеточную суспензию, содержащую 10 мкл 50 мМ K-фосфатного буфера (pH 7.5) с 1 мг сырой биомассы, наносили на полоску носителя, формируя пятно диаметром 5 мм. Пятно подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Полученный биорецептор на основе иммобилизованных клеток (ИмК) M. musalis BKM B-2646 фиксировали на измерительной поверхности кислородного электрода типа Кларка («Кронас», Россия) с помощью фиксатора.
Принцип определения МА, ДМА и ТМА основан на измерении скорости потребления кислорода ИмК штамма M. musalis BKM B-2646 в процессе окисления МА (ДМА, ТМА), содержащегося в образце.
Биосенсор для определения МА (ДМА, ТМА), работает следующим образом. Электрод Кларка 1 с размещенным на нем биорецептором 2, содержащим ИмК M. musalis ВКМ В-2646, погружают в измерительную ячейку вместимостью 2 мл с 50 мМ калий-фосфатным буферным раствором (pH 7.5) и регистрируют силу тока, отражающее содержание кислорода в среде (фоновое). Добавляют аликвоту анализируемого образца и регистрируют потребление кислорода. Рассчитывают величину изменения максимальной скорости потребления кислорода (ответ сенсора, dI/dt, нА/мин) и определяют концентрацию МА по предварительно построенной градуировочной кривой (фиг.2), концентрацию ДМА по предварительно построенной градуировочной кривой (фиг.3), концентрацию ТМА по предварительно построенной градуировочной кривой (фиг.4). Измерения проводят при комнатной температуре и постоянном перемешивании.
Таким образом, предлагаемый биосенсор обеспечивает быстрое определение содержание МА (ДМА, ТМА) без использования сложного дорогостоящего оборудования.
Кроме того, биосенсор может быть использован в полевых условиях.