РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTRX-TEVRS-РТН, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ФРАГМЕНТА ЭНДОГЕННОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ПАРАТИРЕОИДНОГО ГОРМОНА (1-34), ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/PTRX-TEVRS-РТН - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО PTH (1-34)
RECOMBINANT PLASMID DNA OF PTRX-TEVRS-PTH CODING A HYBRID PROTEIN CAPABLE OF PROTEOLYTIC SPLITTING TO FORM A FRAGMENT OF ENDOGENOUS HUMAN PARATHYROID HORMONE (1-34), AN ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/PTRX-TEVRS-PTH STRAIN - PRODUCER OF SAID PROTEIN AND A METHOD OF PRODUCING RECOMBINANT PTH (1-34)

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно может быть использовано для получения рекомбинантного фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона PTH (1-34).
Активный фрагмент эндогенного человеческого паратиреоидного гормона PTH (1-34), так же известный как терипаратид, способен индуцировать образование костной ткани, что делает его эффективным при лечении остеопороза.
Фрагмент эндогенного человеческого паратиреоидного гормона РТН (1-34) представляет собой 34-членный пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1.
Известен метод выделения РТН (1-34) из природного источника (Keutmann, H. T., Aurbach, G. D., Dawson, B. F., Niall, H. D., Deftos, L. J., and Potts, J. T., Jr. (1972) Biochemistry 10, 2779-2787). Недостаток данного метода заключается в небольших выходах продукта и невозможности масштабировать технологический процесс.
Известен химический способ получения PTH (1-34) посредством твердофазного пептидного синтеза /патент US4086196, C07К l4/635,  опубл. 25.04.1978/. Недостатком такого метода является наличие продуктов близкородственных примесей, которые возникают в ходе твердофазного синтеза, что значительно усложняет процесс очистки РТН (1-34). Ко всему прочему, химический синтез требует использования сложновоспроизводимых и трудоёмких методов.
Наиболее перспективным, с точки зрения производства PTH(1-34), является применение методов рекомбинантных ДНК. Так, в источнике /патент CN1424325, C07H21/00, опубл.18.06.2003/ описан биотехнологический метод получения РТН(1-34), посредством его слияния с глутатион-S-трансферазой. Протеолитическое расщепление образовавшегося гибридного белка осуществляли тромбином, затем проводили очистку на аффинной колонке с химотрипсином и дальнейшее протеолитическое расщепление с помощью пролинэндопептидазы и дополнительную хроматографическую очистку. Использование аффинной хроматографии и двух протеиназ делает технологию нерентабельной, а также увеличивает трудозатраты.
Известен способ получения  РТН (1-34) /патент РФ 2441019, C07K 1/36, опубл. 27.01.2012г./ в составе гибридного белка, который состоит из His-tag,  фрагмента белка β-галактозидазы, сайта расщепления энтерокиназы и РТН (1-34). Недостатком данного метода является необходимость использования мочевины, поскольку гибридный белок продуцируется в виде тел включения. Также для очистки гибридного белка была использована аффинная хроматография, что делает процесс очистки нерентабельным.
Аналог, наиболее близкий к заявленному способу получения РТН (1-34), описан в работе (Fu, Xiang-Yang et al, Biotechnology Progress (2005), 21(5), 1429-1435), в котором РТН (1-34) получают в составе  гибридного белка, состоящим из тиоредоксина и РТН (1-34). В процессе ферментации используют Тритон-Х 100 и термическую денатурацию, которая приводит к осаждению балластных белков. Нагревание проводят при 80°С в течение 15 минут. В данном способе белок инкубируют при высокой температуре, которая является нежелательной для белков и может привести к окислению метионинов, входящих в состав РТН (1-34).
Таким образом, техническая проблема, существующая при получении PTH (1-34) заключается в трудоемкости и сложности известных  способов. Изобретение решает техническую проблему получения высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный РТН (1-34) с высоким выходом.
Техническим результатом заявленного изобретения является обеспечение выхода рекомбинантного РТН (1-34) до 5% относительно суммарного белка клетки при чистоте препарата не ниже 98%.
Для решения поставленной технической проблемы и заявленного технического результата предлагается  гибридный белок Trx-TEVrs-РТН, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2, содержащий тиоредоксин, специфический сайт узнавания TEV-протеиназы, рекомбинантного РТН (1-34), имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1.
Предлагается также  рекомбинантная  плазмидная  ДНК pTrx-TEVrs-РТН для экспрессии гибридного белка Trx-TEVrs-РТН (SEQ ID NO 2), состоящая из HindIII/MscI-фрагмента ДНК плазмиды pET32a, содержащего:
- последовательность промотора T7 и оператора lacO;
- последовательность, кодирующую гибридный белок SEQ ID NO 2;
- ген β-лактамазы в качестве генетического маркера;
- последовательность, кодирующую точку начала репликации;
- ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.
Предлагается Штамм Escherichia coli BL 21(DE3)/pTrx-TEVrs-РТН, продуцирующий гибридный белок Trx-TEVrs-РТН (SEQ ID NO 2), содержащий рекомбинантую плазмиду ДНК pTrx-TEVrs-РТН. Указанный Штамм Escherichia coli получен  путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН по п.2.
Способ получения рекомбинантного PTH(1-34) (SEQ ID NO 1), включает  в себя стадии:
- культивирования полученного штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН с получением биомассы клеток штамма-продуцента;
- выделения РТН(1-34) SEQ ID NO 1 из биомассы клеток штамма-продуцента.
На стадии выделения РТН(1-34) SEQ ID NO 1 осуществляют отделение гибридного белка в виде супернатанта, хроматографическую очистку гибридного белка, расщепление TEV-протеиназой, центрифугиование, отделение супернатанта и хроматографическую очистку РТН(1-34).
1. Конструируют экспрессионную плазмиду pTrx-TEVrs-РТН, содержащую гибридный ген, состоящий из слитых в рамке нуклеотидных последовательностей тиоредоксина, специфического сайта узнавания TEV-протеиназы (SEQ ID NO 3) и N-концевого фрагмента РТН (1-34).
2. Путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН, получают штамм-продуцент гибридного белка Trx-TEVrs-PTH(1-34), состоящего из разделенных специфическим сайтом узнавания протеиназы вируса гравировки табака (TEV-протеиназой) тиоредоксина и РТН(1-34), накапливающегося в растворимой форме во время культивирования.
3. Клеточную биомассу разрушают в буферном растворе 50мМ Трис pH 8.5 в присутствии ингибиторов клеточных протеаз и отделяют осветленный клеточный лизат, содержащий гибридный белок Trx-TEVrs-PTH SEQ ID NO 2. Полученный осветлённый клеточный лизат наносят на анионообменную смолу и элюируют белок в градиенте соли.
Протеолитическое расщепление рекомбинантной TEV-протеиназой проводят в течение не менее 18 часов при комнатной температуре при рН 8.0-8.5 в присутствии дитиотреитола при соотношении фермент : белок 1:100.
Дальнейшую очистку целевого продукта проводят с помощью обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте этанола. Для удаления остаточного спирта проводят упаривание, объединённые фракции лиофилизуют. Идентичность полученного РТН (1-34) подтверждают с помощью масс-спектрометрии.
В связи с отсутствием у РТН (1-34) жёсткой третичной структуры, он является доступной мишенью для клеточных протеаз. Чтобы избежать с этим связанных трудностей, фрагмент эндогенного человеческого паратиреоидного гормона РТН (1-34) (SEQ ID NO 1) получают в составе гибридного белка, содержащего N-концевой тиоредоксин и специфический сайт узнавания протеазы вируса гравировки табака (TEV протеазы, ЕС 3.4.22.4). С этой целью получают рекомбинантную векторную плазмиду pTrx-TEVrs-РТН, содержащую гибридный ген, состоящий из слитых в рамке нуклеотидных последовательностей тиоредоксина и терипаратида, разделенных специфическим сайтом узнавания TEV-протеинаы (SEQ ID NO 3),  при этом целевой ген РТН (1-34) амплифицировали с помощью ПЦР, используя плазмиду с искусственным геном РТН (1-34) в качестве матрицы. Полученным экспрессионным вектором трансформируют штамм Е. coli BL21(DE3) (New England Biolabs), получая штамм-продуцент гибридного белка Е. coli BL21(DE3)/pTrx-TEVrs-РТН. Выход РТН (1-34) высокой степени чистоты (98%) после обращённо-фазовой хроматографии достигает 5% относительно суммарного белка клетки.
В предлагаемом техническом решении используют штамм-продуцент Escherichia coli BL21 (DE3), содержащий плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-PTH для суперпродукции гибридного белка Trx-TEVrs-PTH, содержащего последовательность тиоредоксина и РТН (1-34) человека.
Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-PTH:
- кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного
человеческого РТН (1-34);
- состоящую из SgrAI/XbaI-фрагмента ДНК плазмиды pET32a, содержащего последовательность промотора T7 и оператора lacO;
- содержащую последовательность, кодирующую гибридный белок SEQ ID NO 2, включающего в себя последовательность тиоредоксина, специфического сайта узнавания TEV-протеиназы и адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного человеческого терипаратида;
- содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pTrx-TEVrs-РТН клеток Е.coli к пенициллиновым антибиотикам; последовательность, кодирующую точку начала репликации; ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.
Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена гибридного белка Trx-TEVrs-РТН, содержащего на 5'-конце ген тиоредоксина, соединенного с геном сайта узнавания TEV-протеиназы и РТН (1-34). Для конструирования плазмиды используют химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.
Последовательность TEVrs-PTH получают химическим синтезом.
Концевые его участки, содержащие соответствующие вектору сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции вводят с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами А1 и В1 (SEQ ID NO 4), и затем последовательность клонируют в векторную плазмиду pET32a.
Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки
. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки
. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаризованной среде "Дифко" – колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие, серые, край ровный.
Физико-биологические признаки
. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимальном значении рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам
. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).
Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН отличается от штамма-реципиента Е.coli BL21 (DE3) только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pTrx-TEVrs-РТН, которая и придаёт ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.
Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3) соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.
Клетки Е.coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН являются суперпродуцентом. При индукции изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка Trx-TEVrs-РТН, который накапливается в клетках в растворимой форме в количестве не менее 35% от суммарного белка клетки.
Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pTrx-TEVrs-РТН, для чего нуклеотидную последовательность TEVrs-PTH (SEQ ID NO 5) амплифицируют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (SEQ ID NO 4), содержащими сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции MscI (N-конец гена, праймер А1) и HindIII (С - конец гена, праймер В1), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с обработанной по тем же сайтам векторной плазмидой pET32a. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Е.coli BL21(DE3) и высевают на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют с помощью секвенирования.
Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/pTrx-TEVrs-РТН выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) до достижения максимальной плотности культуры.
На (SEQ ID NO 1) изображена аминокислотная последовательность фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона РТН (1-34).
На (SEQ ID NO 2) изображена аминокислотная последовательность гибридного белка Trx-TEVrs-PTH.
На (SEQ ID NO 3) изображена аминокислотная последовательность специфического сайта узнавания TEV-протеиназы.
На (SEQ ID NO 4) изображена нуклеотидная последовательность праймеров, использованных для амплификации гена синтетического фрагмента TEVrs-PTH.
На (SEQ ID NO 5) изображенаи нуклеотидная последовательность синтетического фрагмента TEVrs-PTH
Изобретение иллюстрируется следующими рисунками.
Фиг. 1.Физическая карта плазмиды pTrx-TEVrs-РТН.
Фиг. 2. Электрофореграмма лизата клеток штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3) / pTrx-TEVrs-РТН. М — стандарт молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610; С — лизат клеток.
Фиг. 3. Профиль аналитической ОФ ВЭЖХ полученного РТН (1-34). Образец — раствор РТН (1-34) в виде объединённых фракциях после конечной очистки, в объёме 20 мкл.
Фиг. 4. Масс-спектр полученного РТН (1-34). Образец — раствор РТН (1-34) в виде объединённых фракциях после конечной очистки, в объёме 20 мкл.
Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК.
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов – 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.
2
Для приготовления вектора ДНК плазмиды pET32a (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера 50 мМ ацетатат калия, 20 мМ Трис-ацетат, 10 мМ ацетат магния, 100 мкг/мл БСА  рестриктазой MscI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 50 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl, 100 мкг/мл БСА рестриктазой HindIII (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT , растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.
Для приготовления гена TEVrs-PTH проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы искусственный ген TEVrs-PTH (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А1 (SEQ ID NO 4) и В1 (SEQ ID NO 4), по 60 пмоль каждого. ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, состоящем из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 сек при 60°С, элонгация - 40 сек при 72°С, 30 циклов ПЦР. Ген после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE, затем обрабатывают теми же рестриктазами, которые используют при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.
2
Полученный синтетический фрагмент с геном рекомбинантного PTH (1-34) в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг, полученного из ДНК лазмиды pET32a, описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.
R
Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3). Трансформанты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pTrx-TEVrs-РТН. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования. Физическая карта плазмиды pTrx-TEVrs-РТН представлена на фиг.1. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Ori – участок инициации репликации плазмиды. Ap – ген устойчисовсти к ампицилину. LacI – ген репрессора лактозного оперона. Trx-TEVrs-РТН – ген рекомбинантного белка, кодирующий тиоредоксин, сайт узнавания TEV-протеиназы и терипаратид.
Пример 2. Получение штамма-продуцента Е.coli BL21 (DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН и определение его продуктивности.
Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН получают трансформацией компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3) плазмидой pTrx-TEVrs-РТН, получение которой как описано в примере 1.
550
550
550
Штамм продуцента Е.coli BL21 (DE3)/ p Trx-TEVrs-РТН культивируют при 37°С в 100 мл LB-бульона (рН 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч в орбитальном шейкере-инкубаторе в колбах Ерленмейера со скоростью вращения 190 об/мин до оптической плотности А 0,7-0,8. Затем прибавляют изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозид до концентрации 0,2 мМ и инкубируют в течение 6 ч, или продолжают выращивание в отсутствие индуктора в течение 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А и количество культуры, соответствующее 1 мл с А 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осаждённые клетки в 100 мкл лизирующего буферного раствора с красителем бромфеноловым синим обрабатывают ультразвуком в течение 20 сек, инкубируют 3 мин при 100°С, аликвоты по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Приводили оценку содержания гибридного белка Trx-TEVrs-РТН в клеточном лизате путём анализа насыщенности полос в программном обеспечении ImageJ. Определяют На фиг 2. представлена электрофореграмма лизата клеток штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/ pTrx-TEVrs-РТН, содержание гибридного белка от общего клеточного не менее 30%.
Пример 3. Получение гибридного белка Trx-TEVrs-РТН, его расщепление и выделение рекомбинантного PTH (1-34).
После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С), разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе в буфере (50 мМ Tрис/HCl, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ ПМСФ, рН 8) и отделяют супернатант центрифугированием (15000 g, 45 мин). Осветленный клеточный лизат наносят на анионообменную смолу уравновешенную буфером для нанесения (50 мМ Трис/HCl, 10 рН 8,5). Гибридный белок элюируют градиентом концентрации соли в буфере для нанесения. В элюат добавляют TEV-протеиназу, тем самым инициируя расщепление гибридного белка, и инкубируют при 22°С в течении 18 ч. Из полученной смеси отбирают пробу в количестве 30 мкл и с красителем бромфеноловым синим инкубируют 3 мин при 100°С. Пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. После инкубирования при 22°С в течении 18 ч. доводят рН раствора соляной кислотой до 3.0 и центрифугируют. Дальнейшую очистку и анализ рекомбинантного РТН проводят посредством обращенно-фазовой хроматографии. На фиг. 3 представлен профиль аналитической ОФ ВЭЖХ РТН (1-34), которая свидетельствует о чистоте конечного препарата более 99%.
Идентификацию образующегося рекомбинантного РТН (1-34) проводят с помощью TOF-ESI-масс-спектрометрии на масс-спектрометре Agilent technologies 6224, результирующий масс-спектр представлен на Фиг. 4. Полученный сигнал рекомбинантного РТН соответствует расчётному значению массы 4117 Да. Элюат упаривают на роторном испарителе и лиофилизуют.