ДИАГНОСТИРОВАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО ВАГИНОЗА

1. Устройство для выявления фермента или набор для выявления фермента для обнаружения наличия в исследуемом образце расщепляющей активности фермента сиалидазы, при этом устройство или набор содержат
(i) индикаторную молекулу, содержащую
(a) пептид, содержащий следующую последовательность:
1
2
3
4
5
X-X-X[Gal-Sial]-X-X(SEQ ID NO: 17),
где Sial представляет собой сиалильную группу;
3
3
X представляет собой аминокислоту, содержащую гликозильную акцепторную группу и выбранную из Ser, Thr, Tyr, Hyl, Hyp, Asn, Arg или фосфосерина (SEP), при этом X предпочтительно представляет собой Ser; и
1
2
4
5
1
2
4
5
D
X, X, X и X независимо выбраны из любой аминокислоты при условии, что, по меньшей мере, один, предпочтительно, по меньшей мере, два или три из X, X, X и X представляют собой -аминокислоту и/или нестандартную аминокислоту или не встречающуюся в природе аминокислоту; и
b) сайт захвата, который остается интактным после отщепления сиалильной группы от индикаторной молекулы присутствующим в образце ферментом сиалидазой;
(ii) зону захвата для приема исследуемого образца, при этом зона захвата содержит молекулы захвата, способные связываться с сайтом захвата индикаторной молекулы, независимо от того, была ли индикаторная молекула расщеплена, чтобы иммобилизовать индикаторную молекулу; и
(iii) связывающие молекулы, способные связываться с десиалированным производным индикаторной молекулы, при этом связывающие молекулы не способны связываться с индикаторной молекулой до тех пор, пока не произойдет отщепление сиалильной группы от индикаторной молекулы присутствующим в образце ферментом сиалидазой.
1
2
4
5
1
2
D
2. Устройство или набор по п. 1, отличающиеся тем, что, по меньшей мере, один из X, X, X и X представляет собой Ala, при этом X и X предпочтительно оба представляют собой Ala и/или при этом Ala предпочтительно представляет собой Ala или βAla.
1
2
4
5
D
L
3. Устройство или набор по любому из пп. 1, 2, отличающиеся тем, что, по меньшей мере, один из X, X, X и X представляет собой заряженную аминокислоту, необязательно при этом каждая заряженная аминокислота выбрана из Arg,Asp и Orn.
1
2
4
5
L
D
4. Устройство или набор по любому из пп. 1-3, отличающиеся тем, что, по меньшей мере, один из X, X, X и X представляет собой полярную аминокислоту, необязательно при этом каждая полярная аминокислота выбрана из Ser, Ser и Thr.
5. Устройство или набор по любому из пп. 1-4, отличающиеся тем, что пептид содержит следующую последовательность
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X[Gal-Sial]-X-X-X-X-X-X-X-X
(SEQ ID NO: 10),
где Sial представляет собой сиалильную группу;
1
X отсутствует или представляет собой Thr;
2
D
X отсутствует или представляет собой Ala;
3
X отсутствует или представляет собой Nle;
4
X отсутствует или представляет собой Glu;
5
D
X отсутствует или представляет собой Ala;
6
X отсутствует или представляет собой Arg;
7
X отсутствует или выбран из Glu, Arg, Ser, Nva, ßAla;
8
D
D
X отсутствует или выбран из Ser, Ala, SEP, Cyc;
9
D
X отсутствует или выбран из Nva, BIP, Ala, ßAla, Orn;
10
D
D
X выбран из Cyc, Ser, Ile, Ala, Ser;
11
D
X выбран из Ala, Pro, Orn, Nle;
12
X выбран из Ser, Thr, Tyr, Hyl, Hyp, Asn, Arg или SEP, предпочтительно представляет собой Ser;
13
D
X выбран из Ala, BIP, ßAla;
14
D
X выбран из Arg, Asp, Nle, Orn, Nva;
15
D
D
X отсутствует или выбран из Phe, BIP, Ser, Glu, Ala, Ser;
16
D
X отсутствует или выбран из Ser, Glu;
17
X отсутствует или выбран из Val, Ser, Thr;
18
X отсутствует или представляет собой Cha;
19
D
X отсутствует или представляет собой Ser;
20
X отсутствует или представляет собой Val.
6. Устройство или набор по любому из пп. 1-5, отличающиеся тем, что пептид содержит или состоит из следующей последовательности
D
D
(i) Cyc-Ala-Ser[Gal-Sial]-Ala-Arg (SEQ ID NO: 11);
D
D
D
D
(ii) Glu-Ser-Nva-Cyc-Ala-Ser[Gal-Sial]-Ala-Arg-Phe-Ser-Val (SEQ ID NO: 12);
D
D
D
(iii) Arg-Ala-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-Ala-Asp-Ser (SEQ ID NO: 13);
D
D
(iv) Ser-SEP-Ala-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-Ala-Nle-Glu (SEQ ID NO: 14);
D
D
D
D
(v) Ala-Arg-Nva-Ser-ßAla-Ala-Nle-Ser[Gal-Sial]-BIP-Orn-Ala-Glu-Ser (SEQ ID NO: 15); или
D
D
D
D
D
(vi) Thr-Ala-Nle-Glu-Ala-Arg-ßAla-Cyc-Orn-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-ßAla-Nva-Ser-Glu-Thr-Cha-Ser-Val (SEQ ID NO: 16).
7. Устройство или набор по любому из пп. 1-6, отличающиеся тем, что пептид склонен к расщеплению одной или более специфическими сиалидазами, необязательно при этом одна или более специфических сиалидаз имеют бактериальное происхождение, необязательно, при этом бактерии представляют собой виды Prevotella, Bacteroides и/или Mobiluncus и/или Gardnerella vaginalis.
D
D
D
D
8. Устройство или набор по любому из пп. 1-7, отличающиеся тем, что связывающая молекула специфична для десиалированной формы пептида согласно п. 6, предпочтительно специфична для эпитопа, который присутствует в пептидном фрагменте Cyc-Ala-Ser[Gal]-Ala-Arg, который отсутствует или скрыт в соответствующем сиалированном пептидном фрагменте Cyc-Ala-Ser[Gal-Sial]-Ala-Arg.
9. Устройство или набор по любому из пп. 1-8, отличающиеся тем, что связывающая молекула представляет собой антитело, имеющее тяжелую цепь с 3 CDR и легкую цепь с 3 CDR, при этом CDR1 тяжелой цепи имеет последовательность SEQ ID NO:1; CDR2 тяжелой цепи имеет последовательность SEQ ID NO:2; CDR3 тяжелой цепи имеет последовательность SEQ ID NO:3; CDR1 легкой цепи имеет последовательность SEQ ID NO: 4; CDR2 легкой цепи имеет последовательность SEQ ID NO: 5; и CDR3 легкой цепи имеет последовательность SEQ ID NO: 6, при этом предпочтительно тяжелая цепь имеет последовательность SEQ ID NO: 7 и/или легкая цепь имеет последовательность SEQ ID NO: 8.
10. Устройство или набор по любому из пп. 1-9, отличающиеся тем, что связывающая молекула мечена репортерной молекулой, предпочтительно частицей золота.
11. Устройство или набор по любому из пп. 1-10, отличающиеся тем, что сайт захвата индикаторной молекулы содержит или состоит из молекулы биотина или фрагмента оксима; и/или находится на N- или C-конце пептида.
12. Устройство или набор по любому из пп. 1-11, отличающиеся тем, что сайт захвата индикаторной молекулы присоединен к пептиду с помощью линкера, при этом линкер необязательно содержит фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ), при этом пептид необязательно связан с биотиновой группой на своем N- или C-конце через линкер, содержищий или состоящий из фрагмента полиэтиленгликоля.
13. Устройство или набор по любому из пп. 1-12, отличающиеся тем, что индикаторная молекула содержит или состоит из следующей структури
D
D
(i) Cyc-Ala-Ser[Gal-Sial]-Ala-Arg-ПЭГ-Биотин;
D
D
D
D
(ii) Биотин-ПЭГ-Asp-Glu-Ser-Nva-Cyc-Ala-Ser[Gal-Sial]-Ala-Arg-Phe-Ser-Val;
D
D
D
(iii) Биотин-ПЭГ-Asp-Arg-Ala-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-Ala-Asp-Ser;
3
D
D
(iv) Биотин-ПЭГ-Asp-Ser-Ser(PO)-Ala-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-Ala-Nle-Glu;
D
D
D
D
(v) Биотин-ПЭГ-Asp-Ala-Arg-Nva-Ser-ßAla-Ala-Nle-Ser[Gal-Sial]-BIP-Orn-Ala-Glu-Ser; или
D
D
D
D
D
(vi) Биотин-ПЭГ-Asp-Thr-Ala-Nle-Glu-Ala-Arg-ßAla-Cyc-Orn-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-ßAla-Nva-Ser-Glu-Thr-Cha-Ser-Val.
D
D
14. Устройство или набор по любому из пп. 1-13, отличающиеся тем, что индикаторная молекула содержит (i) пептид, который содержит или состоит из последовательности Cyc-Ala-Ser[Gal-Sial]-Ala-Arg; и (ii) сайт захвата, который содержит или состоит из молекулы биотина или оксимного фрагмента, которые необязательно связаны с N- или C-концом пептида через линкер, содержащий или состоящий из фрагмента полиэтиленгликоля; и при этом связывающая молекула представляет собой антитело согласно п. 8 или 9, и предпочтительно мечена репортерной молекулой, наиболее предпочтительно частицей золота.
15. Антитело, способное специфически связываться с (i) десиалированным производным пептида согласно любому из пп. 1-7 или с (ii) индикаторной молекулой согласно любому из пп. 1-7 или пп. 11-14, при этом антитело связывается преимущественно с десиалированным производным, а не с сиалированным пептидом или индикаторной молекулой.
16. Антитело по п. 15, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой антитело согласно пп. 8, 9 и/или 10.
17. Индикаторная молекула, подходящая для использования при выявлении наличия в исследуемом образце расщепляющей активности фермента сиалидазы, при этом индикаторная молекула содержит
а) пептид согласно любому из пп. 1-7; и
b) сайт захвата, который остается интактным после отщепления сиалильной группы от индикаторной молекулы присутствующим в образце ферментом сиалидазой, при этом индикаторная молекула предпочтительно представляет собой индикаторную молекулу согласно любому из пп. 1-7 или пп. 11-14.
18. Индикаторная молекула по п. 17, отличающаяся тем, что индикаторная молекула представляет собой индикаторную молекулу согласно п. 13.
19. Пептид содержащий или состоящий из следующей последовательности
D
D
(i) Cyc-Ala-Ser[Gal-Sial]-Ala-Arg (SEQ ID NO: 11);
D
D
D
D
(ii) Glu-Ser-Nva-Cyc-Ala-Ser[Gal-Sial]-Ala-Arg-Phe-Ser-Val (SEQ ID NO: 12) ;
D
D
D
(iii) Arg-Ala-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-Ala-Asp-Ser (SEQ ID NO: 13);
D
D
(iv) Ser-SEP-Ala-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-Ala-Nle-Glu (SEQ ID NO: 14);
D
D
D
D
(v) Ala-Arg-Nva-Ser-ßAla-Ala-Nle-Ser[Gal-Sial]-BIP-Orn-Ala-Glu-Ser (SEQ ID NO: 15); или
D
D
D
D
D
(vi) Thr-Ala-Nle-Glu-Ala-Arg-ßAla-Cyc-Orn-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-ßAla-Nva-Ser-Glu-Thr-Cha-Ser-Val (SEQ ID NO: 16).
D
D
20. Пептид по п. 19, отличающийся тем, что пептид представляет собой пептид, содержащий или состоящий из последовательности Cyc-Ala-Ser[Gal-Sial]-Ala-Arg.
21. Пептид для использования в создании антитела по п. 15 или 16, при этом пептид представляет собой десиалированное производное пептида согласно любому из пп. 1-7.
22. Способ выявления наличия или отсутствия в исследуемом образце расщепляющей активности фермента сиалидазы, при этом способ включает
(i) приведение индикаторной молекулы согласно любому из пп. 1-7 или пп. 11-14 в контакт с исследуемым образцом;
(ii) добавление к исследуемому образцу связывающих молекул, способных связываться с десиалированным производным индикаторной молекулы, при этом связывающие молекулы не способны связываться с индикаторной молекулой до тех пор, пока не произойдет отщепление сиалильной группы от индикаторной молекулы присутствующим в образце ферментом сиалидазой, и при этом связывающие молекулы предпочтительно представляют собой связывающие молекулы согласно пп. 8, 9 и/или 10;
(iii) захват десиалированного производного индикаторной молекулы в зоне захвата посредством связывания молекул захвата в зоне захвата с сайтом захвата, при этом указанные молекулы захвата способны связываться с сайтом захвата независимо от того была ли расщеплена индикаторная молекула; и
(iv) детектирование отщепления сиалильной группы от индикаторной молекулы путем определения связывания связывающих молекул с десиалированным производным индикаторной молекулы, захваченным в зоне захвата.
23. Способ выявления наличия или отсутствия в исследуемом образце расщепляющей активности фермента сиалидазы, при этом способ включает
(i) добавление исследуемого образца в зону захвата, содержащую молекулы захвата, при этом указанные молекулы захвата связаны с сайтом захвата индикаторной молекулы согласно любому из пп. 1-7 или пп. 11-14, при этом указанные молекулы захвата остаются связанными с сайтом захвата независимо от того, происходит ли отщепление сиалильной группы от индикаторной молекулы присутствующим в образце ферментом сиалидазой;
(ii) добавление связывающих молекул, способных связываться с десиалированным производным индикаторной молекулы, при этом связывающие молекулы не способны связываться с индикаторной молекулой до тех пор, пока не произойдет отщепление сиалильной группы от индикаторной молекулы присутствующим в образце ферментом сиалидазой, и при этом связывающие молекулы предпочтительно представляют собой связывающие молекулы согласно пп. 8, 9 и/или 10;
(iii) детектирование отщепления сиалильной группы от индикаторной молекулы путем определения связывания связывающих молекул с десиалированным производным индикаторной молекулы, захваченным в зоне захвата.
24. Способ диагностирования бактериального вагиноза в исследуемом образце путем выявления расщепляющей активности фермента сиалидазы в образце, при этом способ включает
(i) приведение индикаторной молекулы согласно любому из пп. 1-7 или пп. 11-14 в контакт с исследуемым образцом;
(ii) добавление к исследуемому образцу связывающих молекул, способных связываться с десиалированным производным индикаторной молекулы, при этом связывающие молекулы не способны связываться с индикаторной молекулой до тех пор, пока не произойдет отщепление сиалильной группы от индикаторной молекулы присутствующим в образце ферментом сиалидазой, и при этом связывающие молекулы предпочтительно представляют собой связывающие молекулы согласно пп. 8, 9 и/или 10;
(iii) захват десиалированного производного индикаторной молекулы в зоне захвата посредством связывания молекул захвата в зоне захвата с сайтом захвата, при этом указанные молекулы захвата способны связываться с сайтом захвата независимо от того была ли расщеплена индикаторная молекула; и
(iv) детектирование отщепления сиалильной группы от индикаторной молекулы путем определения связывания связывающих молекул с десиалированным производным индикаторной молекулы, захваченным в зоне захвата, при этом повышенный по сравнению с контролем уровень расщепления является диагностическим признаком бактериального вагиноза.
25. Набор для выявления фермента для обнаружения наличия в исследуемом образце расщепляющей активности фермента сиалидазы, содержащий
(i) индикаторную молекулу согласно любому из пп. 1-7, при этом индикаторная молекула предпочтительно лиофилизирована на носителе;
(ii) молекулы захвата, способные связываться с сайтом захвата индикаторной молекулы, независимо от того, была ли расщеплена индикаторная молекула, при этом молекулы захвата предпочтительно содержат стрептавидин;
(iii) твердую подложку, к которой молекулы захвата могут быть прикреплены, или прикреплены, для образования зоны захвата для приема исследуемого образца, при этом твердая подложка предпочтительно содержит нитроцеллюлозу; и
(iv) связывающие молекулы, способные связываться с десиалированным производным индикаторной молекулы, при этом связывающие молекулы не способны связываться с индикаторной молекулой до тех пор, пока не произойдет отщепление сиалильной группы от индикаторной молекулы присутствующим в образце ферментом сиалидазой, и при этом связывающие молекулы предпочтительно представляют собой связывающие молекулы согласно пп. 8, 9 и/или 10; и необязательно
(v) пробирку и/или буфер для экстракции; и/или
(vi) молекулы контрольного обнаружения и связывающие вещества контрольного обнаружения.
26. Использование устройства для выявления фермента или набора для выявления фермента по любому из пп. 1-14, способа по любому из пп. 22-24 или набора для выявления фермента по п. 25 для диагностирования бактериального вагиноза в исследуемом образце.