СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ D-ГЛЮКОЗЫ, МЕЧЕННОЙ ИЗОТОПОМ УГЛЕРОДА В ПОЛОЖЕНИИ 1
METHOD OF PRODUCING D-GLUCOSE LABELLED WITH CARBON ISOTOPE IN POSITION 1

13
14
13
Изобретение относится к органической химии, в частности к способам получения гексоз, содержащих изотопы углерода С или С, в частности D-глюкозы, меченной изотопом углерода в положении 1. Полученные продукты могут быть использованы в медицине в качестве изотопных диагностических средств, а также в научных исследованиях и других областях. Например, 1-C-D-глюкоза может быть использована для диагностики онкологических заболеваний.
14
14
В работе [J.C.Sowden, H.O.Fischer, J. Am. Chem. Soc. 69, 1963 (1947)] раскрыт способ получения D-глюкозы путем конденсации D-арабинозы с нитрометаном в метаноле в присутствии метилата натрия и последующего разложения солей 1-дезокси-1-нитроальдитов действием серной кислоты при низкой температуре. Недостатком предложенного способа является низкий выход целевого продукта в связи с большими потерями солей 1-дезокси-1-нитроальдитов вследствие их ретрораспада при выделении из реакционной среды путем обработки катионитом и последующей кристаллизации. Другим серьезным недостатком этой методики является необходимость использования большого избытка нитрометана (11 экв.), что делает этот подход неприменимым для синтеза изотопно-меченой глюкозы. Позднее этот же способ был применен для синтеза 1-C-глюкозы, исходя из С-меченого нитрометана [J.C.Sowden, J. Biol. Chem. 180, 55 (1949)]. Выход глюкозы в расчете на нитрометан в обоих случаях не превышает 6%.
11
Аналогичный подход был использован в работе [K.-O.Schoeps, B.Langstrom, S.Stone-Elander, C.Halldin, Appl. Radiat. Isot, 42, 877 (1991)] для синтеза 1-С-глюкозы, однако вместо метанола в качестве растворителя использовали диметилсульфоксид (ДМСО), а в качестве основания - водный раствор NaOH. Для разложения солей 1-дезокси-1-нитроальдитов в этой работе также применяли серную кислоту. Реакционную смесь нейтрализовали на колонке с анионитом, отделяли ДМСО на колонке с аминофазой, а моносахарид выделяли с помощью ВЭЖХ. Для синтеза использовали недостаток нитрометана (0,7 экв.); при этом выход глюкозы в расчете на нитрометан составил 10%. Предложенная методика не пригодна для синтеза больших количеств глюкозы, т.к. масштабирование данного процесса требует дорогостоящих препаративных колонок для ВЭЖХ и неэффективно с ценовой точки зрения. Кроме того, особенностью обоих изложенных способов является кислотное разложение солей 1-дезокси-1-нитроальдитов, которое требует нейтрализации кислоты большим количеством анионита или гидроксида бария, что крайне неудобно с препаративной точки зрения при проведении синтеза в крупных масштабах, хотя и приемлемо для маломасштабных синтезов.
Поэтому был предложен другой вариант нитрометанового способа получения L-глюкозы из L-арабинозы, где расщепление солей 1-дезокси-1-нитроальдитов до свободных моносахаридов осуществляли действием озона [Patent 278067 SK, C07H 3/02, 19.02.1992] (прототип), что практически не ограничивает масштабирование синтеза. В этой работе конденсацию нитрометана с арабинозой проводили в присутствии метилата натрия в ДМСО, избыток которого удаляли фильтрованием осадка солей 1-дезокси-1-нитроальдитов с последующей их промывкой спиртами. После обработки полученных солей озоном образовавшуюся D-глюкозу выделяли из реакционной смеси кристаллизацией в виде фенилгидразона. Недостатком данного способа является необходимость фильтрования солей 1-дезокси-1-нитроальдитов с последующей промывкой н-бутанолом и смесью н-бутанола и метанола на воздухе с целью отделения диметилсульфоксида, в ходе которого протекает частичное разложение указанных солей и образование побочных примесей, что заставило авторов очищать L-глюкозу в виде фенилгидразона и лишь затем выделять ее в свободном виде с помощью лигандообменной хроматографии. Кроме того, в данном способе используют значительный избыток нитрометана (2,8 экв.), что весьма удорожает этот подход к синтезу изотопно-меченой глюкозы. Выход глюкозы в расчете на нитрометан составил 7%.
Задачей предлагаемого изобретения была разработка эффективного способа получения меченой D-глюкозы, меченной в положении 1, обеспечивающего повышение выхода и усовершенствование процесса. Поставленная задача решается тем, что конденсацию D-арабинозы с меченым нитрометаном, взятых в эквимолярном соотношении, проводят в растворе в диметилсульфоксиде в присутствии основания. В качестве основания используют метилат натрия или гидроксид натрия. Для отделения избытка диметилсульфоксида используют экстракцию реакционной смеси бензолом при комнатной температуре, после лиофилизации остатков бензола натриевые соли 1-дезокси-1-нитроальдитов получают в виде сухого порошка или сухой пены. Полученную смесь солей 1-дезокси-1-нитроальдитов охлаждают до температуры жидкого азота и прибавляют воду. Последующее медленное оттаивание при перемешивании позволяет получить водный раствор натриевых солей 1-дезокси-1-нитроальдитов в мягких условиях. Разложение солей 1-дезокси-1-нитроальдитов, содержащихся в полученном водном растворе, действием серной кислоты или озона приводит к смеси D-глюкозы, D-маннозы и D-арабинозы, из которой меченую D-глюкозу выделяют с помощью лигандообменной хроматографии.
Особенностью и одним из преимуществ предлагаемой методики является использование эквимолярного (1:1) соотношения реагентов (арабинозы и меченого нитрометана), что позволяет повысить эффективность использования изотопного сырья, минимизировав его расход, и тем самым повысить выход целевой глюкозы в расчете на введенный в реакцию нитрометан. С помощью этой методики впервые удалось получить синтетическую глюкозу с выходом 14% в расчете на введенный в реакцию нитрометан.
Сущность изобретения поясняется следующими примерами его реализации.
Пример 1
13
+
-
2+
13
3
2
3
1 г D-арабинозы (6,66 ммоль) растворили в 6 мл ДМСО, прибавили при перемешивании 360 мкл (6,66 ммоль) меченого нитрометана (CHNO), колбу заполнили аргоном, при перемешивании прибавили 2 мл раствора MeONa в МеОН (получен из 212 мг или 8,8 ммоль Na) и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Метанол отогнали в вакууме без нагревания, к полученному раствору прибавили при интенсивном перемешивании 40 мл бензола, образовавшуюся суспензию центрифугировали, супернатант отбросили. Экстракцию бензолом повторили еще два раза до полного отсутствия ДМСО в экстракте (контроль - по отсутствию нелетучего остатка после испарения бензола). Полученный желтый осадок заморозили и лиофилизовали. Получили 2 г желтого порошка, который заморозили в жидком азоте, прибавили 10 мл воды, дали оттаять образовавшемуся льду и в полученный раствор при +10°С продували озон до существенного исчезновения окраски реакционной смеси. Остаток озона отдули, барботируя аргон через полученный раствор. Реакционную смесь деионизовали последовательной обработкой ионообменными смолами Amberlyst 15 (H) и Dowex 1×8(HCO ), раствор лиофилизовали. Полученный сироп фракционировали на колонке с Dowex 50×8 (Ca) при элюировании водой. Выход D-глюкозы, меченной изотопом С, составил 170 мг (14,0%).
Пример 2
13
13
3
2
Синтез проводили аналогично примеру 1, однако после добавления меченого нитрометана (CHNO) в колбу при перемешивании прибавили 670 мкл 10 N раствора NaOH в воде (6,7 ммоль) и далее перемешивали при 40°С в течение 30 мин. Раствор охладили до комнатной температуры и прибавили при интенсивном перемешивании 40 мл бензола и далее обрабатывали, как описано в примере 1, до полного удаления ДМСО. Полученный желтый сироп заморозили и лиофилизовали. Полученную желтую пену подвергали озонолизу, как описано в примере 1, продувая озон до значения рН реакционной смеси 7,5-8,0 (5,5 мин). Выход D-глюкозы, меченной изотопом С, составил 125 мг (10,3%).
Пример 3
13
-
+
-
2+
3
2
2
4
3
3
Синтез проводили аналогично примеру 2, однако использовали половинную загрузку: 500 мг D-арабинозы (3,33 ммоль), 3 мл ДМСО, 180 мкл меченого нитрометана (CHNO) (3,33 ммоль) и 350 мкл 10 N раствора NaOH (3,5 ммоль). Желтую пену, полученную после отделения ДМСО экстрацией бензолом, заморозили в жидком азоте, прибавили 10 мл воды, дали оттаять образовавшемуся льду. Полученный раствор при интенсивном перемешивании прибавили к смеси 1,1 мл конц. HSO и 1,4 мл воды при -20°С. Дали нагреться до +10°С при перемешивании. Раствор разбавили водой до объема 30 мл, нейтрализовали кислоту анионитом Dowex 1×8 (НСО ) до pH 7, смолу отфильтровали. Фильтрат обессолили последовательной обработкой катионитом Dowex 50×8 (H) и анионитом Dowex 1×8 (НСО ). Фильтрат заморозили и лиофилизовали. Полученный сироп фракционировали на колонке с Dowex 50×8 (Са) при элюировании водой. Выход D-глюкозы, меченной изотопом С, составил 71 мг (11,5%).
Пример 4
13
+
-
2+
13
3
2
3
2.5 г D-арабинозы (16,65 ммоль) растворили в 15 мл ДМСО, прибавили при перемешивании 900 мкл (16,65 ммоль) меченого нитрометана (CHNO), колбу заполнили аргоном, при перемешивании прибавили 670 мг порошкообразного NaOH (16.65 ммоль) и перемешивали при 40°С ч. К полученному раствору прибавили при интенсивном перемешивании 40 мл бензола, образовавшуюся суспензию центрифугировали, супернатант отбросили. Экстракцию бензолом повторили еще два раза до полного отсутствия ДМСО в экстракте (контроль - по отсутствию нелетучего остатка после испарения бензола). Полученный желтый осадок заморозили и лиофилизовали. Полученный желтый порошок заморозили в жидком азоте, прибавили 15 мл воды, дали оттаять образовавшемуся льду и в полученный раствор при +10°С продували озон до pH≈7. Остаток озона отдули, барботируя аргон через полученный раствор. Реакционную смесь деионизовали последовательной обработкой ионообменными смолами Amberiyst 15 (H) и Dowex 1×8 (НСО ), раствор лиофилизовали. Полученный сироп фракционировали на колонке с Dowex 50×8 (Ca) при элюировании водой. Выход D-глюкозы, меченной изотопом С, составил 378 мг (12,5%).
14
14
14
3
2
упрощает способ
Подобным же образом при использовании C-меченого нитрометана (CHNO) может быть получена D-глюкоза, меченная изотопом С. Преимущество данного способа состоит в том, что бензольная экстракция ДМСО, проводимая при комнатной температуре, позволяет быстро получить натриевые соли 1-дезокси-1-нитроальдитов в сухом виде без заметного разложения последних. Это повышает устойчивость натриевых солей 1-дезокси-1-нитроальдитов при хранении, увеличивает выход целевой D-глюкозы в расчете на введенный в реакцию нитрометан, а также резко снижает объем примеси диметилсульфоксида, что существенно облегчает контроль за полнотой превращения солей при озонолизе и выделение целевого продукта. Предложенная бензольная экстракция диметилсульфоксида из реакционной смеси значительно  получения D-глюкозы и ранее не применялась в подобном процессе.
Для уменьшения разложения натриевых солей 1-дезокси-1-нитроальдитов при растворении в воде был применен оригинальный прием, заключающийся в предварительном охлаждении сосуда, содержащего сухие натриевые соли 1-дезокси-1-нитроальдитов, до температуры жидкого азота и быстрого прибавления необходимого количества воды, которая при этом сразу замерзает. Оттаивание полученной смеси солей при перемешивании позволяет получить водный раствор натриевых солей 1-дезокси-1-нитроальдитов в мягких условиях. Данная процедура также увеличивает выход целевого продукта - D-глюкозы - в расчете на введенный в реакцию нитрометан.
Выделение моносахарида проводится с помощью лигандообменной хроматографии в воде, что позволяет уверенно проводить очистку граммовых количеств смесей и существенно упрощает процедуру выделения конечного продукта.
Одним из преимуществ предлагаемой методики является также использование эквимолярного (1:1) соотношения реагентов (арабинозы и нитрометана), что позволяет повысить эффективность использования изотопного сырья, минимизировав его расход.
Сравнение различных способов синтеза глюкозы (Glc) из арабинозы (Ага) нитрометановым методом
Способ
Ara, ммоль
CH<sub>3</sub>NO<sub>2</sub>, ммоль
CH<sub>3</sub>NO<sub>2</sub>/Ara, моль/моль
Удаление растворителя
Метод разложения солей 1-дезокси-1-нитроальдитов
Выход Glc в расчете на CH<sub>3</sub>NO<sub>2</sub>, %
Метод выделения Glc
(Patent 278067 SK)
66,6
185
2,78
Фильтрование
O<sub>3</sub>
7
Образование фенилгидразона,
Прототип
кристаллизация, затем лигандо-обменная хроматография
Пример 1
6.66
6,66
1,0
Экстракция бензолом
O<sub>3</sub>
14
лигандо-обменная хроматография
Пример 2
6,66
6,66
1,0
Экстракция бензолом
O<sub>3</sub>
10
лигандо-обменная хроматография
Пример 3
3,33
3,33
1,0
Экстракция бензолом
H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
12
лигандо-обменная хроматография
Пример 4
16,65
16,65
1,0
Экстракция бензолом
O<sub>3</sub>
12
лигандо-обменная хроматография