Способ количественного определения микрососудов в атеросклеротической бляшке сонных артерий
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF MICROVESSELS IN ATHEROSCLEROTHIC PLAQUE OF CAROTID ARTERIES

Изобретение относится к области медицины, в частности к ангионеврологии и сосудистой хирургии, и может быть использовано для количественного расчета микрососудов (МС) в атеросклеротической бляшке (АСБ) сонных артерий с помощью дуплексного сканирования (ДС) с введением контрастного вещества.
Атеросклеротическое поражение сонных артерий является ведущей причиной атеротромботического и гемодинамического подтипов ишемического инсульта (Джибладзе Д.Н. Патология сонных артерий и проблема ишемического инсульта (клинические, ультразвуковые и гемодинамические аспекты) / Под ред. Д.Н. Джибладзе. - М.: НИИ неврологии РАМН, 2002. - 207 с.). На сегодняшний день, помимо наличия или отсутствия очаговой неврологической симптоматики, степень стеноза брахиоцефальных артерий остается главным показателем, на основании которого оценивается риск развития острого нарушения мозгового крозообращения и определяется дальнейшая тактика лечения (Национальные рекомендации по ведению пациентов с заболеваниями брахиоцефальных артерий / «Ангиология и сосудистая хирургия». - 2013. - Т. 19 (приложение). - №2). Помимо степени стеноза артерий, как правило, уточняется локализация, протяженность, состояние поверхности и эхоструктура АСБ. Данная информация играет важную роль при определении как показаний к реконструктивному хирургическому вмешательству, так и вида его выполнения.
Известно, что формирование АСБ происходит в несколько этапов. В результате прогрессирования патологического процесса в участках отложения липидов разрастается молодая соединительная ткань, что ведет к образованию фиброзных бляшек, в центре которых формируется липидное ядро, представляющее собой скопление атгроматозных масс (липидно-белкового детрита). Вокруг липидного ядра возникает зона соединительной ткани, богатая клеточными элементами (макрофагами, пенистыми и гладкомышечными клетками, Т-лимфоцитами), коллагеном и эластическими волокнами (Верещагин Н.В., Моргунов В.А., Гулевская Т.С. Патология головного мозга при атеросклерозе и артериальной гипертонии / Под ред. Н.В. Верещагина, В.А. Моргунова, Т.С. Гулевской. - М.: Медицина, 1997. - 288 с.). В то же время происходит васкуляризация очага атеросклеротнческого поражения.
Сеть МС (vasa vasorum), окружающих сосуд, необходима для его нормального роста и развития. Однако эти же МС могут иметь значимую роль в развитии патологических процессов, в частности при атеросклеротическом поражении. Наличие новообразованных кровеносных сосудов в АСБ является новым маркером и важным прогностическим фактором ее нестабильности, который может быть связан с развитием симптомов острых нарушений мозгового кровотока. Согласно существующей гипотезе, в растущей АСБ диффузия кислорода уменьшается, что стимулирует ангиогенные факторы роста. Образованные новые сосуды внутри бляшки имеют незрелую структуру. Отсутствие перицитов в этих сосудах может привести к их разрыву с развитием кровоизлияний в бляшке, образованием участков изъязвлений и надрывов покрышки, и, как следствие, попаданию атероматозных масс в кровоток с эмболизацией артерий головного мозга (Alonso A., Artemis D., Hennerici M.G. Molecular Imaging of Carotid Plaque Vulnerability. Cerebrovasc Dis, 2015, vol. 39, №1, pp. 5-12). To есть основным фактором, лежащим в основе трансформации стабильной АСБ в нестабильную, является нарушение целостности ее структуры (Шевченко О.П., Мишнев О.Д., Шевченко А.О. и др. Ишемическая болезнь сердца, М, 2005). На современном этапе весьма важным направлением в оценке нестабильности АСБ, а следовательно, в коррекции стратегии профилактики инсульта является разработка методов как качественного, так и количественного определения МС в структуре АСБ.
Известен метод определения гистотопографического распределения новообразованных сосудов в АСБ артерий, в том числе и сонных, путем иммуногистохимического метода с применением стандартной методики: окраски гематоксилином и эозином, орсеином, импрегнации серебром. Для определения новообразованных сосудов использовали - CD 105 (эндоглин). Данный метод эффективен для определения новообразованных сосудов в АСБ и является чувствительным маркером новообразованных эндотелиальных клеток, эффективным показателем активации и пролиферации МС в бляшках (Мунтяну А.И., Райка М., Зота Е.Г. Иммуногистохимическое изучение роли мастоцитов и макрофагов в процессе ангиогенеза в атеросклеротических бляшках у пациентов с метаболическим синдромом. Архив патологии, Издательство Медиа Сфера (Москва), 2016, т. 78, №2, с. 19-28). Однако выполнение данного метода возможно только после хирургического удаления бляшки из сонных артерий, что не позволяет его использовать как метода оценки нестабильности АСБ на дооперационном этапе, а следовательно, в определении риска развития ишемического инсульта.
Другим способом определения неоваскуляризации в АСБ является ультразвуковой метод с введением эхоконтрастного вещества, основными преимуществами которого является малоинвазивность, безопасность и проведение на дооперационном этапе. Вводимые в кровь микропузырьки, заполненные инертным газом, под воздействием ультразвуковой волны демонстрируют особенные акустические свойства, а именно дают сильное отражение ультразвукового сигнала в отличие от эритроцитов и тканей. Микропузырыеи с током крови распределяются в организме так же, как эритроциты, а их размеры препятствуют выходу из сосудистого русла, поэтому вводимый препарат контрастирует исключительно сосуды. Появление мелкоточечных гиперэхогенных сигналов в структуре АСБ указывает на наличие МС. Существуют несколько подходов к оценке неоваскуляризации в структуре АСБ. Для определения степени неоваскуляризации используется градация шкалы от 0 до 3, где 0 - это ее отсутствие, 1 - умеренная степень, 2 - средняя степень и 3 - выраженная степень (Assaf Hoogi, Dan Adam, Aaron Hoffman, Hedviga Kerner, Shimon Reisner, Diana Gaitini Carotid Plaque Vulnerability: Quantification of Neovascularization on Contrast-Enhanced Ultrasound With Histopathologic Correlation. American Journal of Roentgenology. 2011; 196: 431-436). Метод основан на визуальной оценке, где учитывается лишь приблизительное количество МС. Сопоставление с данными патоморфологии заключалось в подтверждении наличия МС в срезах бляшки, определении площади, занимаемой МС, а также в вычислении отношения указанной площади к площади всей АСБ. При этом оценка происходит визуально, не разграничивая МС от участков кальция, который также дает высокоинтенсивный ультразвуковой сигнал. Поэтому очевидным недостатком метода является низкая точность в определении количества МС.
Наиболее близким техническим решением заявленного изобретения является способ выявления МС путем проведения дуплексного сканирования с введением контрастного вещества и построения кривой время-интенсивность. При этом выбирают подходящий кадр, на котором определяют зоны интереса и обводят их, после чего происходит автоматическое построение кривой. Зонами интереса являются просвет сосуда с контрастным препаратом, ядро АСБ и участки бляшки с повышением интенсивности сигнала от МС. Считается, что интенсивность выше в бляшках у симптомных больных в сравнении с асимптомными, что выражается в разных числовых значениях на кривой (Kozue Saito M.D., Kazuyuki Nagatsuka M.D. et al; Contrast-Enhanced Ultrasound for the Evaluation of Neovascularization in Atherosclerotic Carotid Artery Plaques, Stroke., 2014, 45: 3073-3075). Недостатками данного способа является низкая точность. Во-первых, отмечается вся область повышения интенсивности, без выделения кальция, поэтому результат будет завышен. Во-вторых, полученный результат выражается в дБ, при этом конкретное количество МС не подсчитывается, что дает лишь косвенное представление о степени неоваскуляризации.
Технический результат заявленного технического решения заключается в высокой достоверности и точности определения микрососудов в атеросклеротической бляшке сонных артерий.
2
Технический результат достигается тем, что количественное определение МС в АСБ сонных артерий проводят путем ДС сканирования с введением контрастного вещества, при этом в процессе ДС осуществляют запись кинопетли изображения сонных артерий в течение не более 5 мин, затем выявляют 20 кадров, расположенных на одинаковом расстоянии друг от друга, начиная с первого кадра появления контрастного вещества в бляшке, определяют площадь АСБ на каждом кадре, после чего изображение увеличивают в 1,5-2 раза и визуально подсчитывают количество МС в пределах выделенной площади атеросклеротической бляшки, после этого суммируют количество МС на всех кадрах и делят на суммарную площадь АСБ на всех кадрах, определяя количество МС на 1 см АСБ.
2
В заявленном способе разработан новый подход к оценке неоваскуляризации АСБ, определяемой при проведении ДС с введением контрастного вещества, состоящий в расчете абсолютного количества МС на 1 см бляшки. Методика количественного расчета неоваскуляризации бляшки осуществляется следующим образом.
1. Первым этапом проводят ДС сонных артерий на ультразвуковом приборе, имеющем высокое разрешение в В-режиме, линейным датчиком для оценки периферических сосудов (в нашем случае прибор Philips iU22, датчик L9-3) с оценкой структуры, протяженности и поверхности атеросклеротической бляшки, а также степени стеноза сосуда, к которому она приводит.
2. Затем во время проведения ДС в меню прибора активируют специальный режим работы с контрастным веществом с низким механическим индексом (в нашем приборе опция Contrast General, МИ 0,06). Это позволяет сохранять целостность микропузырьков контрастного вещества на время, необходимое для проведения диагностической процедуры (до 15 мин).
3. Далее на экран ультразвукового прибора в продольной плоскости сканирования выводят два одинаковых изображения зоны интереса (сонные артерии в месте локализации АСБ), работающих в разных режимах сканирования: на одном в В-режиме, на втором в режиме получения потока крови с контрастом.
4. Затем через предварительно установленную бранюлю в подкожную вену руки болюсно вводят 2,4 мл контрастного препарата SonoVue, состоящего из микропузырьков, заполненных высокомолекулярным инертным газом гексофторидом серы, и следом болюсно вводят 5 мл 0,9% физиологического раствора.
5. После появления гиперэхогенного сигнала от контраста, заполняющего просвет сосудистого русла, и получения четкого изображения контура АСБ путем регулировки интенсивности в серой шкале, направление оси ультразвукового луча устанавливают на боковой край сонных артерий (бифуркация общей сонной и устье внутренней сонной артерии) в месте локализации АСБ. Далее, не смещая датчик с установленного места, медленно производят наклон датчика по направлению к противоположному краю сосудов, что позволяет сканировать всю толщу АСБ в продольной плоскости сканирования. Меняя пошагово угол ультразвукового луча, проводят задержку на каждой новой плоскости сканирования на 5-10 с, что дает возможность при последующей обработке данных исследовать наличие МС в разных ультразвуковых срезах. В процессе дуплексного сканирования запись кинопетли изображения сонных артерий проводят в течение 3-5 мин (оптимальное время четкого заполнения просвета сосуда микропузырьками) с момента введения контрастного средства. Выявляют 20 кадров, расположенных на одинаковом расстоянии друг от друга, начиная с первого кадра появления контрастного вещества в бляшке (см. Фиг. 1). Далее определяют площадь атеросклеротической бляшки на каждом кадре.
6. После окончания исследования с контрастным веществом сохраненные данные переносят с ультразвукового прибора через сетевой кабель на персональный компьютер, оснащенный рабочей станцией с программным обеспечением QLAB, где в специализированном режиме VPQ (количественный анализ сосудистых бляшек) с покадровой записью видеоклипа производят количественный подсчет МС в структуре АСБ.
7. Для оценки количества МС выбирают каждый N-й кадр, где N = номер последнего кадра - номер 1 кадра с момента появления пузырьков в АСБ)/ 20. Полученную величину округляют до целого числа. При этом анализируют 20 кадров.
2
8. На каждом из 20-ти кадров вручную обводят контур АСБ (см. фиг 2), после чего программное обеспечение QLAB автоматически определяет площадь выделенного фрагмента в квадратных сантиметрах (см). Затем изображение увеличивают в 1,5-2 раза, что позволяет различить ветвление МС (см. фиг. 3), а именно их ход, после чего визуально рассчитывают их количество в пределах выделенного фрагмента. МС выглядят как мелкоточечные гиперэхогенные включения в структуре АСБ. Для того чтобы отличить МС от включений кальция, имеющих сходную с МС интенсивность свечения при ультразвуковом исследовании с контрастированием, используют соседние кадры: сосуд ветвится, в то время как кальций постоянно находится на одном месте.
2
9. Суммарное количество МС на всех 20-ти кадрах делят на сумму площадей АСБ на этих же 20-ти кадрах, получая в результате количество МС на 1 см бляшки.
Каротидная эндартерэктомия была выполнена 20-ти пациентам после проведения как стандартного ДС, так и с введением контрастного вещества SonoVue. Во всех 20 случаях была выполнена количественная оценка плотности расположения МС в АСБ заявленным ультразвуковым и гистохимическим методом с помощью световой микроскопии.
Для гистохимического исследования, выделенные после каротидной эндартерэктомии, бляшки разрезали на поперечные блоки шириной 2-4 мм, фиксировали в 10% растворе формалина и заливали в парафин. С полученных парафиновых блоков делали срезы толщиной 4 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, а также по методу ван Гизона. Каждый окрашенный препарат сканировали с использованием сканера Aperio АТ2 при увеличении 40х. На полученных изображениях обводили площадь бляшки, определяли диаметр всех расположенных в бляшке МС и подсчитывали количество всех МС, а также МС различного диаметра на 1 см бляшки. Была обнаружена значимая прямая зависимость между результатами заявленного ультразвукового исследования и данными морфологического исследования, касающимися плотности МС диаметром >30 мкм, >40 мкм, >50 мкм, >60 мкм, >70 мкм и >80 мкм в бляшке (см. таблицу 1).
Кроме того, абсолютные значения количества МС, как правило, находились вблизи величины плотности МС диаметром >30 мкм в бляшке, определенной при морфологическом исследовании. Таким образом, заявленный способ ДС с контрастированием может быть надежным методом обнаружения МС диаметром более 30 мкм в АСБ.
Примеры осуществления способа.
Пример 1.
Пациент А., 62 лет. Диагноз: Атеросклероз брахиоцефальных артерий. Дисциркуляторная энцефалопатия. Артериальная гипертония.
ДС сонных артерий слева: в бифуркации общей сонной артерии с переходом на устье внутренней сонной артерии визуализируется концентрической формы, гетерогенная с преобладанием гипоэхогенного компонента атеросклеротическая бляшка с ровной поверхностью, протяженностью 18 мм, стеноз общей сонной артерии (ОСА) 50-55%, внутренней сонной артерии (ВСА) 70-75%.
ДС с введением контрастного вещества «Соновью»: гиперэхогенный сигнал от контраста в просвете сонных артерий зарегистрирован на 11 секунде от момента введения. На 18 секунде визуализируются первые микрососуды в виде мелкоточечных гиперэхогенных сигналов в АСБ (кадр 238). Запись кинопетли прекращена через 3 мин 45 с в связи с ослаблением гиперэхогенного сигнала от контраста.
Всего получено 2206 кадров. Начиная с первого кадра появления контраста в бляшке, фиксируем МС. В данном случае это 238 кадр. Таким образом, при выделении 20 кадров учитывается 1968 кадров (2206-238). Для вычисления количества МС выбрано 20 кадров, расположенных на одинаковом расстоянии друг от друга. Первым анализируемым кадром является кадр 238 (момент появления контраста в АСБ). Каждый следующий кадр отстоит от предыдущего на величину N, равную 1968 (общее количество учитываемых кадров) / 20=98,4=98 (округленная величина). В итоге анализируются следующие кадры: 238, 336, 434, 532, 630, 728, 826, 924, 1022, 1120, 1218, 1316, 1414, 1512, 1610, 1708, 1806, 1904, 2002, 2100.
На первом 238 кадре и далее также на последующих кадрах визуально обводят контуры АСБ и автоматически вычисляют их площади. Затем изображение увеличивают в 1,5 раза и посчитывают количество МС, в каждом из 20-ти кадров. Результаты исследований указаны в таблице 2.
2
Проведено суммирование количества МС на выбранных кадрах и поделено на сумму площадей бляшки в этих кадрах. В результате получена величина количества МС на 1 см АСБ: (6+8+12+9+7+5+4+9+7+5+5+4+6+8+11+7+8+4+5+6)/(0,43+0,40+0,38+0,46+0,35+0,36+0,38+0,37+0,31+0,30+0,45+0,33+0,34+0,32+0,41+0,44+0,39+0,42+0,40+0,36)=136/7,6=17,89. Далее полученное значение округлено до целого числа - 18 МС на 1 см АСБ.
Пример 2.
Пациент С., 57 лет. Диагноз: Атеросклероз брахиоцефальных артерий, артерий нижних конечностей. Хроническая ишемия нижних конечностей III. Артериальная гипертония.
ДС сонных артерий справа: в бифуркации общей сонной артерии с переходом на устье внутренней сонной артерии визуализируется концентрической формы, гетерогенная с преобладанием гипоэхогенного компонента, гиперэхогенными включениями и с небольшими участками кальциноза атеросклеротической бляшки с ровной поверхностью, протяженностью 18 мм, стеноз ОСА 35-40%, ВСА 75-80%.
ДС с введением контрастного вещества «Соновью»: гиперэхогенный сигнал от контраста в просвете сонных артерий зарегистрирован на 6 секунде от момента введения. На 10 секунде визуализированы первые микрососуды в виде мелкоточечных гиперэхогенных сигналов в структуре АСБ. Запись кинопетли прекращена через 4 мин в связи с ослаблением гиперэхогенного сигнала от контраста.
Всего получено 2205 кадров. Начиная с первого кадра появления контраста в бляшке, фиксируем МС. В данном случае это 152 кадр. Таким образом, при выделении 20 кадров учитывается 2053 кадра (2205-152). Для вычисления количества МС выбрано 20 кадров, расположенных на одинаковом расстоянии друг от друга. Первым анализируемым кадром является кадр 152 (момент появления контраста в АСБ). Каждый следующий кадр отстоит от предыдущего на величину N, равную 2053 (общее количество учитываемых кадров) / 20=103. В итоге анализируются следующие кадры: 152, 255, 358, 461, 564, 667, 770, 873, 976, 1079, 1182, 1285, 1388, 1491, 1594, 1697, 1800, 1903, 2006, 2109.
На первом 152 кадре и далее также на последующих кадрах визуально обводят контуры АСБ и автоматически вычисляют их площади. Затем изображение увеличивают в 2 раза и подсчитывают количество микрососудов, в каждом из 20-ти кадров. Результаты исследований указаны в таблице 3.
2
2
Проведено суммирование количества МС на выбранных кадрах и поделено на сумму площадей бляшки в этих кадрах. В результате получена величина количества сосудов на 1 см АСБ: (4+8+6+5+1+3+3+4+5+4+2+4+3+6+4+5+3+2+2+1)/(0,18+0,17+0,11+0,11+0,10+0,12+0,13+0,13+0,12+0,11+0,12+0,13+0,11+0,14+0,15+0,13+0,17+0,11+0,13+0,14)=75/2,61=28,73. Далее полученное значение округлено до целого числа - 29 МС на 1 см АСБ.
Таким образом, заявленный способ обладает высокой достоверностью и точностью в определении количества МС в АСБ сонных артерий, что подтверждается хорошей корреляцией с результатами гистологии, и позволяет выявлять АСБ со значительной неоваскуляризацией, отражающей процессы активного воспаления и роста бляшки, ее нестабильность и, как следствие, повышенный риск развития острого нарушения мозгового кровообращения.