Особенности экспрессии Е-кадхерина в карциномах желудка

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ Е-КАДХЕРИНА В КАРЦИНОМАХ ЖЕЛУДКА

Л.Е. Гаганов, Л.Е. Гуревич, Н.А. Корсакова, И.А. Казанцева

ГУ Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

Проведено сравнительное иммуногистохимическое исследование экспрессии Е-кадхерина в желудочном, кишечном и смешанном иммунофенотипических вариантах 55 карцином желудка и во внеопухолевой слизистой оболочке. Установлено статистически значимое преобладание аномальной экспрессии Е-кадхерина в группе карцином желудочного иммунофенотипа по сравнению с опухолями со смешанным иммунофеноти-пом, что позволяет предположить у них наличие более высокого инвазивного потенциала. Нормальная экспрессия Е-кадхерина наблюдалась во всех клетках неопухолевой слизистой желудка, в очагах интраэпители-альной неоплазии низкой степени и фокусах кишечной метаплазии. В очагах интраэпителиальной неоплазии высокой степени нормальная экспрессия Е-кадхерина отмечалась в 69% наблюдений, аномальная - в 31% в виде гетерогенного окрашивания отдельных клеток, что может быть ранним признаком карциномы.

Ключевые слова: рак желудка, иммуногистохимия, Е-кадхерин, муцины.

EXPRESSION OF E-CADHERIN IN GASTRIC CARCINOMAS

L.E. Gaganov, L.E. Gurevich, N.A. Korsakova, I.A. Kazantseva

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Clinical and Research Institute

A comparative immunohistochemical investigation was carried out on the E-cadherin expression in gastric, intestinal, and mixed immunophenotypical variants of 55 gastric carcinomas and extratumoral mucosa. Statistically significant prevalence of abnormal E-cadherin expression was established in the group of gastric phenotype carcinomas as compared with mixed phenotype tumors which allowed supposing in the first the presence of a higher invasive potential. Normal E-cadherin expression was observed in all cells of neotumorous gastric mucosa and in the foci of both intraepithelial neoplasia of a low degree and intestinal metaplasia. In the foci of a high degree intraepithelial neoplasia, the normal E-cadherin expression was noted in 69% of cases and abnormal one - in 31% manifesting itself by geterogeneous staining of separate cells which could be an early sign of carcinoma.

Key words: Gastric cancer, immunohistochemistry, E-cadherin, mucins.

Кадхерины - семейство трансмембранных кальций-зависимых гликопротеинов, обеспечивающих адгезивные межклеточные контакты. Известно 12 типов кадхе-ринов, каждый из которых кодируется отдельным геном. Для любого типа клеток характерен определённый набор экспрессируемых кадхеринов. Эпителиальные клетки экс-прессируют Е-кадхерин (увоморулин), обеспечивающий межклеточные контакты. Повреждение или исчезновение Е-кадхерина приводит к дестабилизации связей между клетками эпителиальных структур и является одним из основных механизмов инвазии. Во многих типах карцином недостаток или мутация Е-кадхерина коррелирует с их инвазивным и метастатическим потенциалом [3].

Карциномы желудка отличаются значительной гетерогенностью. Используемые гистологические клас-

сификации, подразделяющие карциномы желудка по типам роста и дифференцировки, не раскрывают в полной мере морфофункциональные особенности новообразований [6, 8, 9, 12]. Функциональные особенности карцином желудка, определяющиеся экспрессией муцинов [2], позволяют выделить четыре иммунофенотипических варианта: желудочный, кишечный, смешанный и неклассифицируемый [1]. Для опухолей с желудочным иммунофенотипом характерна экспрессия муцинов (MUC) 1-го, 5AC и 6-го типов, с кишечным - MUC2, а также гликопротеина CD10, экс-прессируемого щеточной каёмкой тонкой кишки [10].

Исследования, посвященные изучению экспрессии Е-кадхерина в разных иммунофенотипических вариантах рака желудка немногочисленны, противо-

речивы и часто проведены на небольшом количестве наблюдений [4, 7, 11, 13].

Настоящее исследование посвящено изучению экспрессии Е-кадхерина в различных вариантах карцином желудка, различающихся по экспрессии муцинов 1-го, 5AC, 6-го, 2-го типов и CD10 с целью уточнения их инвазивного потенциала.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследован операционный материал 22 гастрэк-томий и 33 резекций желудка, выполненных по поводу рака в хирургических отделениях МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского в период с апреля 2005 по июль 2007 г. Возраст оперированных пациентов - от 27 до 75 лет (в среднем 58,2 года), мужчин было 30, женщин - 25 (1,2:1).

В кардии локализовалось 11 опухолей, на границе кардии и тела - 8, в теле - 9, на границе тела и антраль-ного отдела - 10, в антральном отделе - 17. Опухоли росли эндофитно, были изъязвлены (за исключением карциномы in situ). Определение глубины инвазии опухоли (T) и наличие метастазов в регионарные лимфатические узлы (N) проводилось по стандартным критериям международной системы TNM. Опухоль Tin выявлена в одном наблюдении, TI - также в одном, ТII — в 14, TIII - в 39.

Согласно международной гистологической классификации ВОЗ (2009), исследуемые карциномы были подразделены на следующие варианты: папиллярная аденокарцинома - у четырех больных (низкой степени злокачественности: low-grade); тубулярная - у 10 (8 - низкой степени злокачественности, 2 - высокой: high-grade); перстневидно-клеточная карцинома - у 18; смешанная - у 22; слизистая - у одного. В прилежащей к опухоли слизистой оболочке желудка выявлены очаги дисплазии (интраэпителиальной неоплазии): низкой степени - в 19 наблюдениях, высокой - в 13, а также фокусы кишечной метаплазии в 36 случаях.

Для микроскопического исследования операционный материал фиксировали в 10% формалине, заливали в парафин по рутинной методике. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования отбирали блоки с репрезентативными участками и изучали ткани опухоли. В качестве позитивного контроля использовали прилежащую неопухолевую слизистую оболочку, негативного - параллельные срезы того же блока с использованием вместо исследуемых антител буферного раствора.

ИГХ-исследование проводили пероксидазно-антипероксидазным методом на парафиновых срезах толщиной 5 мкм по стандартному протоколу. Использовали моноклональные антитела к муцинам и Е-кадхерину фирмы Novocastra, CD10 фирмы DAKO. Инкубация с первичными антителами проводилась после предварительной обработки срезов в микроволновом режиме дважды по 5 минут при мощности 650 Вт. На следующих этапах применяли KIT фирмы DAKO (Envision, Mouse/Rabbit); в качестве хромогена использовали диаминобензидин - ДАВ+ (DAKO), ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера.

Экспрессию соответствующих маркеров оценивали как число позитивно окрашенных клеток на 100 учтенных в репрезентативных полях зрения (при 400-кратном увеличении), выраженное в процентах. ИГХ-реакцию считали положительной при окрашивании более 5% опухолевых клеток для муцинов и Е-кадхерина и единичных для CD10.

В зависимости от типа экспрессируемых муцинов и CD10, карциномы желудка разделили на три группы с желудочным, кишечным и смешанным иммунофе-нотипом. К желудочному относили опухоли с изолированной или сочетанной экспрессией MUC1, 5AC, 6; к кишечному - MUC2 и (или) CD10; к смешанному - с сочетанной экспрессией желудочных и кишечных маркеров. «Неклассифицируемый» иммунофенотип, то есть с отсутствием экспрессии исследуемых маркеров, не выявлен (табл. 1).

Экспрессия муцинов и CD10 в карциномах желудка

Таблица 1

Фенотип Количество карцином MUC1 MUC5AC MUC6 MUC2 CD10

Желудочный 31 25 14 11 - -

Кишечный 2 - - - 1 1

Смешанный 22 21 9 10 12 13

Всего 55 46

Экспрессию Е-кадхерина оценивали по характеру окрашивания. Выделены два варианта экспрессии: нормальная и аномальная; нормальная проявлялась мембранным окрашиванием, аномальная - цито-плазматическим и гетерогенным (мембранно-цито-плазматическим). При наличии в опухоли нескольких вариантов окрашивания учитывался преобладающий вариант.

Для определения экспрессии Е-кадхерина в карциномах желудка применяли полуколичественный анализ. Окрашивание 5-25% клеток расценивали как слабую иммунореактивность, 26-50% - как умеренную, более 50% - как высокую. Статистическую обработку проводили посредством пакета программ Б1§таРЫ 11.0. Для сравнения частот использовали критерий X2. Различия считали значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В неопухолевой слизистой желудка, в том числе с признаками атрофического гастрита в очагах интраэпи-телиальной неоплазии низкой степени и фокусах кишечной метаплазии, мембранная (нормальная) экспрессия Е-кадхерина наблюдалась в 100% клеток (рис. 1).

Рис. 1. Мембранная экспрессия Е-кадхерина в очаге кишечной метаплазии и интраэпителиальной неоплазии низкой степени (лёгкой дисплазии). х400

В очагах интраэпителиальной неоплазии высокой степени мембранная экспрессия Е-кадхерина отмечалась в 69% - 9 из 13 наблюдений, аномальная- в виде гетерогенного окрашивания отдельных клеток - в 31% -4 из 13 (рис. 2).

В карциномах желудка экспрессия Е-кадхерина выявлялась в 93% (51 из 55) случаев: из них нормальная -в 31% (17 из 55) (рис. 3); аномальная - в 62% (34 из 55); в 7% (4 из 55) экспрессия отсутствовала. При «аномальном» типе экспрессии цитоплазматическое окрашива-

ние наблюдалось в 24% (13 из 55) наблюдений (рис. 4); гетерогенное - в 38% (21 из 55) (рис. 5, табл. 2).

Рис. 2. Гетерогенная экспрессия Е-кадхерина в интраэпителиальной неоплазии высокой степени (тяжёлой дисплазии). х400

Рис. 3. Мембранная экспрессия Е-кадхерина в солидной аденокарциноме низкой степени злокачественности. х400

Рис. 4. Цитоплазматическая экспрессия Е-кадхерина в перстневидно-клеточной карциноме высокой степени злокачественности. х400

Рис. 5. Гетерогенная экспрессия Е-кадхерина в тубулярной аденокарциноме низкой степени злокачественности. х400.

В карциномах с мембранной экспрессией Е-кадхерина иммунореактивными были в среднем 63% клеток, с цитоплазматической - 47%, с гетерогенной - 50%. Карциномы с мембранной экспрессией Е-кадхерина имели высокую иммунореактивность - в 11 из 17 случаев, умеренную - в 5, слабую - в одном;

при цитоплазматической экспрессии Е-кадхерина высокая иммунореактивность отмечена в 6 наблюдениях из 13, умеренная - в 3, слабая - в 4; при гетерогенной экспрессии высокая иммунореактивность выявлялась в 12 наблюдениях из 21, умеренная - в 4, слабая - в 5 (табл. 3).

В карциномах с желудочным иммунофенотипом мембранный тип экспрессии обнаружен в 16% наблюдений (5 из 31), цитоплазматический - в 26% (8), гетерогенный - в 55% (17), экспрессия отсутствовала в 3% (одно наблюдение). В карциномах с кишечным иммунофенотипом в одном наблюдении выявлен цитоплазматический тип экспрессии Е-кадхерина, в другом экспрессия отсутствовала. В опухолях со смешанным иммунофенотипом мембранный тип экспрессии выявлен в 54% наблюдений (в 12 из 22), цитоплазматический - в 14% (3 наблюдения из 22), гетерогенный - в 23% (5), экспрессия отсутствовала в 9% - в двух случаях (рис. 6). Различия в типах экспрессии Е-кадхерина между желудочным и смешанным иммунофеноти-пами достоверны (р=0,01). Сравнение экспрессии Е-кадхерина не проводились с группой карцином, имеющих кишечный иммунофенотип ввиду ее малочисленности (2 наблюдения).

Таблица 2

Экспрессия Е-кадхерина в карциномах желудка и внеопухолевой слизистой оболочке

Патология Количество Тип экспрессии

мембранный цито-плазматический гетерогенный отсутствует

Карцинома 55 17

Интра-эпителиальная неоплазия высокой степени 13 9 (69%) - 4 (31%) -

низкой степени 19 19 (100%) - - -

Кишечная метаплазия 36 36 (100%) - - -

Нормальная слизистая 16 16 (100%) - - -

Особенности экспрессии Е-кадхерина в карциномах желудка

Таблица 3

Тип экспрессии Количество карцином Иммунореактивность

слабая умеренная высокая

Мембранный 17 1 5 11

Цитоплазматический 13 4 3 6

Гетерогенный 21 5 4 12

Примечание: различия незначительны (р=0,5).

Рис. 6. Экспрессия Е-кадхерина в различных вариантах карцином желудка

В опухолях с желудочным иммунофенотипом иммунореактивными к Е-кадхерину были в среднем 49% клеток, с кишечным - 22%, со смешанным - 51%. Карциномы с желудочным иммунофенотипом имели высокую иммунореактивность в 17 случаях из 31, умеренную - в 7, слабую - в 6; со смешанным: высокую - в 12 случаях из 22, умеренную - в 4, слабую - в 4. В единственной карциноме с кишечным иммунофено-

типом, экспрессирующей Е-кадхерин, выявлена умеренная иммунореактивность (табл. 4).

Различия в иммунореактивности к Е-кадхерину между карциномами желудочного и смешанного им-мунофенотипов незначительны (р=0,8).

Сравнительное ИГХ-исследование выявило неоднородность экспрессии Е-кадхерина в различных иммунофенотипических вариантах карцином желудка и в прилежащей неопухолевой слизистой оболочке. Установлено, что нормальный (мембранный) тип экспрессии Е-кадхерина выявлялся в 31% карцином, аномальный (цитоплазматический и гетерогенный) - соответственно в 24 и 38%, экспрессия отсутствовала в 7%. В группе карцином, имеющих желудочный иммунофенотип, обнаружено статистически значимое преобладание аномальной экспрессии Е-кадхерина по сравнению с опухолями, имеющими смешанный иммунофенотип (р=0,01), что позволяет предположить у них наличие более высокого инвазивного потенциала (сравнение с группой карцином, имеющих кишечный иммунофенотип, не проводились). Значимого различия в иммунореактивности между исследованными группами карцином не выявлено.

Во всех клетках неопухолевой слизистой желудка, в очагах интраэпителиальной неоплазии низкой степени и фокусах кишечной метаплазии наблюдалась нормальная экспрессия Е-кадхерина. В очагах интраэпителиальной неоплазии высокой степени нормальная экспрессия Е-кадхерина отмечалась в 69% наблюдений, аномальная - в 31% в виде гетерогенного окрашивания отдельных клеток, что может быть ранним признаком карциномы.

Таблица 4

Иммунореактивность карцином к Е-кадхерину в зависимости от фенотипического варианта опухоли

Фенотип Количество карцином Иммунореактивность

слабая умеренная высокая отсутствует

Желудочный 31 6 7 17 1

Кишечный 2 - 1 - 1

Смешанный 22 4 4 12 2

ЛИТЕРАТУРА

1. Гаганов Л.Е., Гуревич Л.Е., Корсакова Н.А. Иммунофенотипические варианты карцином желудка по типам экспрессируемых муцинов // Патология органов пищеварения и ассоциированные с ней заболевания. Проблемные вопросы и пути решения / Материалы XXXVII сессии ЦНИИ гастроэнтерологии; XI съезда Научного общества гастроэнтерологов России. М., 2011.

2.

3.

4.

Гаганов Л.Е., Казанцева И.А., Гуревич Л.Е., Корсакова Н.А. Сравнительное иммуногистохимическое исследование экспрессии муцинов в карциномах различных анатомических отделов желудка // Альманах клинической медицины. 2010. №.22. С.48-54. Chan O.A. E-cadherin in gastric cancer // World J. Gastroenterol. 2006. V.12, No.2. Р.199-203.

LillehojE.P., Lu W, Kiser T. et al. MUC1 inhibits cell proliferation by a beta-catenin-dependent mechanism // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V.1773, No.7. P.1028-1038.

5. Morohara K., Tajima Y, Nakao K. et al. Gastric and intestinal phenotypic cell marker expressions in gastric differentiat-ed-type carcinomas: association with E-cadherin expression and changes // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2006. V.132. P.363-375.

6. Namikawa T. Kobayashi M., Kitagawa H. et al. Differentiated adenocarcinoma with a gastric phenotype in the stomach: difficulties in clinical and pathological diagnoses // Clin. J. Gastroenterol. 2009. No.2. P.268-274.

7. Namikawa T. Hanazaki K. Mucin phenotype of gastric cancer and clinicopathology of gastric-type differentiated adenocarcinoma // World J. Gastroenterol. 2010. V.16, No.37. P.4634-4639.

8. Roh J., Srivastava A., Lauwers G. et al. Micropapillary carcinoma of stomach: a clinicopathologic and immunohisto-chemical study of 11 cases // Am. J. Surg. Path. 2010. V.34, No.8. P.1139-1146.

9. Toki F., Takahashi A., Aihara R. et al. Relationship between

clinicopathological features and mucin phenotypes of advanced gastric adenocarcinoma // World J. Gastroenterol. 2010. V.16, No.22. P.2764-2770.

10. Seki T., Ito T., Kawachi H. et al. Relationship between mucin expression of gastric intramucosal signet ring cell carcinoma and its background mucosa // J. Med. Dent. Sci. 2009. V.56. P.25-35.

11. Zhang H., Zhang Q., Zhao T. et al. Expression of mucins and E-cadherin in gastric carcinoma and their clinical significance // World J. Gastroenterol. 2004. V.10, No.20. P.3044-3047.

12. Zheng H., LiX., Hara T. et al. Mixed-type gastric carcinomas exhibit more aggressive features and indicate the histogenesis of carcinomas // Virch. Arch. 2008. V.452. P.525-534.

13. Zhou Y., Xu C., Han B. et al. Expression of E-cadherin and P-catenin in gastric carcinoma and its correlation with the clinicopathological features and patient survival // World J. Gastroenterol. 2002. V.8, No.6. P.987-993.