СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО ГУМОРАЛЬНОГО ОТТОРЖЕНИЯ АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА СЕРДЦА
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR ACUTE HUMORAL REJECTION OF CARDIAC ALLOGRAFT

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии и клинической иммуногистохимии, и может быть использовано для диагностики антителоопосредованного (гуморального) отторжения аллотрансплантата сердца.
Своевременная диагностика данной формы отторжения позволяет предупредить тяжелые последствия (вплоть до потери трансплантата), обусловленные развитием данного осложнения.
Постановка диагноза гуморального отторжения аллотрансплантата сердца требует совокупности основных признаков данного осложнения, полученных при обследовании реципиента: клинических, морфологических, иммуногистохимических, иммунологических [Kobashigawa et al., ISHLT, Consensus, J. Heart and lung transplantation, 2011]. Каждый из показателей в отдельности не дает полного права постановки диагноза.
В связи с этим проблема диагностики отторжения гуморального типа аллотрансплантата сердца использует сумму (не менее двух-трех) максимально адекватных показателей [Stewart S., Winters G.L., Fishbein M.C. et al. J. Heart and Lung Transplantation, 2005, vol.24, №11, P.1717-1720]. В данной научно-клинической области медицины существует большое число методов диагностики, однако, не всегда отвечающих указанным требованиям. Наличие клинических признаков дисфункции аллотрансплантата (в отсутствие признаков отторжения клеточного типа) при постановке диагноза отторжения гуморального типа требует, как минимум, выявления морфологических изменений, характерных для отторжения гуморального типа, которые не всегда проявляются достаточно четко. К тому же клинические проявления дисфункции аллотрансплантата сердца при отторжении клеточного и гуморального типов не являются строго специфичными для каждой формы отторжения, а выявление антител, циркулирующих в крови реципиента и направленных против HLA-антигенов донора, часто бывает затруднительным. С другой стороны, наличие антител в крови реципиента не всегда четко коррелирует с дисфункцией трансплантата.
Был предложен гистологический способ диагностики отторжения гуморального типа аллотрансплантата сердца путем учета числа макрофагов в тканях, полученных при выполнении эндомиокардиальной биопсии [Hammond E.H., Stehlik J., Snow G., et al., Heart, Lung transplantation, 2005, vol.24. P.2015-2021]. При этом проводится учет числа макрофагов в просвете кровеносных сосудов миокарда. Недостатком метода является то, что, несмотря на высокую специфичность показателя, чувствительность метода не отвечает требованиям диагностики, так как показатель этот нередко отсутствует вовсе.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ диагностики отторжения аллотрансплантата сердца гуморального типа, описанный в 1993 году Hammond et al [J. Heart and Lung Transplantation, 1993, 12, 2, P. S115]. Способ основан на использовании иммуногистохимического метода с целью выявления в тканях миокарда антител (иммуноглобулинов) и компонентов комплемента, фиксированных в стенке кровеносных капилляров.
Основным недостатком метода является то, что в значительном числе случаев удается выявить фиксацию в тканях либо только иммуноглобулинов (IgG и\или IgM), или только компонентов комплемента (C4d, C3d). Этот факт можно объяснить в первом случае наличием ранней стадии отторжения, когда полный иммунный комплекс еще не сформирован, во втором - разрушением иммунных комплексов и вымыванием иммуноглобулинов в процессе восстановления постоянства внутренней среды организма при сохранении более прочных к гидролизу компонентов комплемента. Слабым местом данного метода является попытка использования субъективной визуальной оценки интенсивности экспрессии на поверхности эндотелия капилляров антигенов системы HLA первого и второго классов в качестве признака отторжения.
Нами поставлена задача - разработать метод диагностики острого отторжения гуморального типа аллотрансплантата сердца, основанный на определении стабильных иммуногистохимических показателей отторжения.
Технический результат заключается в обеспечении ранней, срочной и точной диагностики острого отторжения гуморального типа аллотрансплантата сердца путем определения комплекса минимального числа необходимых иммуногистохимических показателей отторжения, включающего оценку морфофункционального состояния клеток эндотелия лимфоносных капилляров.
Нами впервые установлена диагностическая значимость включения в состав иммуногистохимических показателей острого отторжения гуморального типа признака, которым является увеличение числа эндотелиальных клеток лимфоносных капилляров, содержащих лизосомный аппарат. Учет этого показателя позволяет диагностировать отторжение даже при выявлении лишь одного иммуногистохимического признака данного осложнения: фиксации в стенке кровеносных капилляров только компонентов системы комплемента (C4d, C3d) или антител к аллоантигенам (иммуноглобулинов классов G и/или М).
Известно, что в миокарде здорового сердца отмечаются лишь единичные клетки эндотелия лимфоносных капилляров, содержащие в цитоплазме лизосомы. По-видимому, при развитии отторжения происходит активация эндотелия лимфоносных капилляров и появление во многих из них лизосом, участвующих в процессе фагоцитоза чужеродных, денатурированных соединений собственного организма, в том числе иммунных комплексов.
Таким образом, принимая во внимание определенный уровень увеличения числа эндотелиальных клеток лимфоносных капилляров, содержащих лизосомы, можно проводить достоверную диагностику острого гуморального отторжения аллотрансплантата сердца при наличии у пациента даже одного стабильного показателя отторжения: фиксации в стенке кровеносных капилляров фрагментов системы комплемента (C4d, C3d) или иммуноглобулинов классов G и/или М.
При наличии двух указанных иммуногистохимических признаков отторжения учет предлагаемого нами показателя, связанного с увеличением клеток эндотелия лимфоносных капилляров, содержащих лизосомы, позволяет повысить достоверность диагностики отторжения у данной категории реципиентов.
Вопрос о способе выявления лизосом разработан в области электронно-микроскопических исследований [Куприянов В.В. «Система микроциркуляции и микроциркуляторное русло». Архив анатомии, гистологии, эмбриологии. 1972, том 62, №3, стр.14-25; Бобрик И.И, Шевченко Е.А., Черкасов В.Г. «Развитие кровеносных и лимфатических сосудов», Кардиогенез, 1991, Киев, стр.174-197]. Однако данный метод сложен, требует длительных сроков выполнения и его возможности ограничены в условиях срочной диагностики реакции отторжения.
Для визуализации лизосом эндотелия лимфоносных капилляров миокарда могут быть использованы, например, антитела к маркеру лизосом CD68 (макросиалину), выявляемому с помощью метода иммунофлюоресценции.
Таким образом, изобретение направлено на повышение достоверности диагноза гуморального (антителоопосредованного) отторжения аллотрансплантата сердца реципиента, что позволяет повысить эффективность контроля качества функционирования пересаженного органа и тем самым продлить его жизнеспособность.
Предлагаемый метод позволяет своевременно выбрать адекватную тактику лечения, что способствует восстановлению функции аллотрансплантата, улучшению качества жизни реципиента и сокращению сроков его пребывания в стационаре.
Сущность изобретения состоит в следующем.
Для диагностики острого гуморального отторжения аллотрансплантата сердца не ранее чем через шесть дней после аллотрансплантации выполняют биопсию миокарда аллотрансплантата. Проводят иммуногистохимическое исследование образцов. При наличии фиксации в стенке кровеносных капилляров хотя бы одного из следующих элементов: компонента C3d системы комплемента, компонента C4d системы комплемента, иммуноглобулинов класса G, иммуноглобулинов класса М (антител к аллоантигену или аллоантигенам) и при наличии в поле зрения микроскопа при увеличении 10/40 (окуляр ×10, объектив ×40) не менее 30 клеток эндотелия лимфоносных капилляров, содержащих лизосомы, диагностируют острое гуморальное отторжение аллотрансплантата сердца. Наличие лизосом в эндотелии лимфоносных капилляров определяют путем иммуногистохимического исследования с использованием антител к CD68.
Способ осуществляется следующим образом.
Взятие образцов тканей миокарда производят под контролем флюороскопии или эхокардиографии. Через правую бедренную вену или внутреннюю яремную вену справа с помощью биоптома (например, биопсийных щипцов фирмы Cordis) проникают в полость правого желудочка, достигают межжелудочковой перегородки и вырезают образцы тканей миокарда. Методика взятия биопсии миокарда описана, например, в следующем источнике информации: Kirklin J.K., Young J.В., Mc Giffin, "Heart Transplantation" 2002, New York, 883 p.
3
Для целей диагностики острого отторжения гуморального типа берут 2-3 образца тканей аллотрансплантата, величиной около 1 мм.
Образцы погружают в гелевый раствор Criomatrix для предохранения от высыхания при транспортировке в лабораторию и дальнейшего замораживания при -20 С.
Взятие материала эндомиокардиальной биопсии аллотрансплантата сердца может быть проведено, например, по следующей схеме: первую биопсию выполняют через 6 дней после трансплантации, далее в течение первого месяца - раз в неделю; в течение второго месяца - один раз в две недели; первые полгода - ежемесячно; вторые полгода - один раз в два месяца. В течение второго года после трансплантации - один раз в три месяца; начиная с четвертого года - через каждые шесть месяцев; далее - один раз в год.
Иммуногистохимический анализ 2-3-х фрагментов тканей аллотрансплантата сердца, полученных при выполнении эндомиокардиальной биопсии, включает следующие этапы. Кусочки тканей помещают на монтировочный столик и замораживают при -20 С. Серийные замороженные срезы толщиной 4 мкм готовят с помощью микротом-криостата (например, Microm HM505E) и укладывают на предметные стекла, используемые для гистологических срезов. После просушивания и промывки в фосфатном буфере pH-7,4 (трижды по 2 мин) срезы обрабатывают мечеными изотиоцианатом флюоресцеина (FITC) моноклональными или поликлональными антителами к ряду соединений: иммуноглобулинам классов М, G (например, фирмы Dako[Denmark]); компонентам комплемента C3d (например, фирмы Dako [Denmark]); C4d (например, фирм Quidel [USA] или Serotec [UK]); маркеру лизосом CD68 (макросиалину) (например, фирмы Dako (клон КР 1) [Denmark]), инкубируют 40 мин при комнатной температуре. Затем отмывают в фосфатном буфере (pH-7,4, трижды по 2 мин) и заключают в 60% глицерин под покровное стекло.
Для исследования могут быть применены: прямой и непрямой методы иммунофлюоресценции. При непрямом методе в качестве вторых (промежуточных) антител могут быть использованы антитела к иммуноглобулинам мыши, кролика, меченные FITC (например, Dako, Denmark). Анализ проводят с помощью люминесцентного микроскопа, например, Leitz Laborlux S (Leica), используя увеличение окуляра ×10 и объектива ×40.
Учитывают фиксацию в стенках кровеносных капилляров миокарда антител (иммуноглобулинов G, М) и компонентов комплемента (C3d, C4d).
Для визуализации лизосом эндотелия лимфоносных капилляров миокарда используют антитела к маркеру лизосом CD68 (макросиалину), выявляемому с помощью метода иммунофлюоресценции.
После окончательной промывки в нейтральном фосфатном буфере (шестикратно по 2 минуты) срезы заключают в нейтральный 60% глицерин под покровное стекло.
Часть срезов, выделенных для гистологического контроля, окрашивают гематоксилином и эозином с целью исключения случаев острого отторжения клеточного типа и оценки морфологических признаков гуморального отторжения.
При иммуногистохимическом анализе используют вышеперечисленные антитела к иммуноглобулинам классов G, М, компонентам комплемента C3d, C4d и маркеру лизосом CD68. По окончании обработки обращается внимание на присутствие таких признаков острого гуморального отторжения как фиксация в стенках капилляров миокарда антител одного из классов иммуноглобулина (G и/или М), а также одного из компонентов системы комплемента (C3d, C4d).
При наличии фиксации в стенке кровеносных капилляров хотя бы одного из следующих элементов: компонента C3d системы комплемента, компонента C4d системы комплемента, иммуноглобулинов класса G, иммуноглобулинов класса М (антител к аллоантигену или аллоантигенам) и при наличии в поле зрения микроскопа при увеличении 10/40 (окуляр ×10, объектив ×40) не менее 30 клеток эндотелия лимфоносных капилляров, содержащих лизосомы, диагностируют острое гуморальное отторжение аллотрансплантата сердца.
Пример 1. Пациент С., 52 года.
Выполнена операция ортотопической аллотрансплантации сердца с использованием аппарата искусственного кровообращения. В послеоперационном периоде отмечались явления миокардиальной недостаточности. При исследовании первой эндомиокардиальной биопсии (6-е сутки после трансплантации) признаков отторжения выявлено не было.
На 15 сутки у больного появились клинические признаки реакции отторжения: одышка в состоянии покоя, наджелудочковая тахикардия, по данным инструментальных исследований фракция изгнания левого желудочка снизилась до 41%. Выполнена повторная эндомиокардиальная биопсия. Клеточное отторжение по данным эндомиокардиальной биопсии отсутствует. В стенках капилляров миокарда аллотрансплантата была выявлена фиксация значительного количества иммуноглобулина G. Фиксации фрагментов комплемента обнаружено не было. При использовании антител к CD68 отмечена выраженная экспрессия данного маркера в зоне цитоплазмы эндотелия лимфоносных капилляров миокарда (выявлено 60-80 клеток эндотелия лимфоносных капилляров, содержащих лизосомы, в поле зрения микроскопа при объективе ×40). На основании полученных данных поставлен диагноз острого отторжения гуморального типа (AMR-1). Причина дисфункции трансплантата была подтверждена выявлением в крови реципиента анти-НLА-антител к антигенам донора. Больному проведена пульсгормональная терапия солумедролом (1 г в\в в течение 3-х суток), проведено три сеанса плазмаферреза, однократное введение ритуксимаба 375 мг на 1 кг веса (специфическая терапия по поводу гуморального отторжения трансплантата). В результате чего состояние больного улучшилось, фракция изгнания левого желудочка выросла до 70%.
Таким образом, в результате ранней диагностики острого гуморального отторжения аллотрансплантата сердца по заявленному способу своевременно была назначена специфическая терапия, направленная на его лечение, которая оказалась эффективной.
При исследовании контрольной биопсии, выполненной на 28 день после трансплантации, признаков отторжения отмечено не было (AMR-0). Больной был выписан в удовлетворительном состоянии.
Пример 2. Пациент К., 64 года.
Выполнена ортотопическая аллотрансплантация сердца с использованием аппарата искусственного кровообращения. Операция и ранний послеоперационный период осложнился массивным кровотечением из области послеоперационной раны. Дважды за первые послеоперационные сутки проводилась санация полости перикарда. К 18-му дню после трансплантации состояние больного стабилизировалось. Выполнена первая эндомиокардиальная биопсия. Признаков отторжения не выявлено. На 31-й день после операции по данным инструментальных методов обследования зарегистрировано снижение фракции изгнания левого желудочка с 69 до 50%. При исследовании эндомиокардиальной биопсии признаков клеточного отторжения нет, фиксации иммуноглобулинов в стенках капилляров миокарда не обнаружено, однако в данной локализации выявлено значительное количество фиксированного C4d компонента комплемента. Кроме того, отмечена выраженная реакция с маркером CD68 в области лимфатических капилляров миокарда (50-80 эндотелиальных клеток лимфоносных капилляров, содержащих лизосомы, в поле зрения при увеличении 10/40). Поставлен диагноз острого отторжения гуморального типа (AMR-1). В крови реципиента обнаружены анти-HLA-A2 и анти-HLA-DR - антитела, направленные к антигенам донора, что является четким подтверждением связи дисфункции трансплантата с развитием гуморального (антителообусловленного) отторжения. Больному усилена базовая иммуносупрессивная терапия, выполнено 4 сеанса плазмафереза с общим объемом замещения плазмы 4500 мл. В результате проведенных мероприятий фракция изгнания увеличилась до 70%. На контрольной биопсии, выполненной на 44 день после трансплантации, признаков отторжения отмечено не было (AMR-0). Больной был выписан в удовлетворительном состоянии.
Пример 3. Пациент Г., 49 лет.
Выполнена ортотопическая аллотрансплантация сердца. Группа крови донора А2, группа крови реципиента В3. По данным инструментальных методов обследования фракция изгнания левого желудочка составляла 31%. При исследовании эндомиокардиальной биопсии, выполненной на 9-й день после операции, в стенках большинства капилляров миокарда выявлена фиксация C3d и C4d компонентов комплемента. Фиксированных иммуноглобулинов не обнаружено. В стенках лимфатических капилляров отмечена выраженная реакция с маркером CD68 (до 80 клеток эндотелия лимфоносных капилляров в поле зрения микроскопа при увеличении 10/40). Поставлен диагноз острого отторжения гуморального типа (AMR-1). Больному проведена пульсгормональная терапия солумедролом (1000 мг\сут в течение 3-х дней), 3 сеанса плазмафереза, 2-х недельный курс лечения антитимоцитарным глобулином, 3-кратное введение ритуксимаба (по 375 мг\кг). При контрольной биопсии, выполненной на 22-е сутки после трансплантации, признаков отторжения выявлено не было (AMR-0). По данным инструментальных методов обследования фракция изгнания левого желудочка составляла 68%. Больной был выписан в удовлетворительном состоянии.
Пример 4. Пациент Я., 61 год.
Операция по поводу ортотопической аллотрансплантации сердца с использованием аппарата искусственного кровообращения.
При иммуногистохимическом исследовании материала первой эндомиокардиальной биопсии, выполненной на 7-е сутки после трансплантации, выявлено значительное количество иммуноглобулина М в стенках капилляров миокарда (50-80% капилляров в поле зрения). В том же количестве обнаружена экспрессия маркера CD68 на эндотелии лимфатических капилляров миокарда. Фиксации компонентов комплемента не выявлено. Поставлен диагноз острого отторжения гуморального типа (AMR-1). По данным инструментальных методов обследования фракция изгнания левого желудочка составляла 51%. В крови реципиента в высоком титре выявлены анти-HLA-DR и анти-MICA-антитела, направленные к антигенам донора, что подтверждает связь дисфункции трансплантата с развитием гуморального (антителообусловленного) отторжения. Проведена пульсгормональная терапия солумедролом (1000 мг\сут в течение 3-х дней) и 2 сеанса плазмафереза. При исследовании контрольной эндомиокардиальной биопсии, выполненной на 18-й день после трансплантации, признаков отторжения не обнаружено (AMR-0). По данным инструментальных методов обследования фракция изгнания левого желудочка составляла 72%. Больной был выписан в удовлетворительном состоянии.
Пример 5. Пациент Б., 44 года.
Выполнена операция ортотопической аллотрансплантации сердца с использованием аппарата искусственного кровообращения. Клинических признаков расстройства функционирования трансплантата не было. Проведено иммуногистохимическое исследование материала эндомиокардиальной биопсии, выполненной через две недели после операции. Установлено отсутствие фиксации в стенках капилляров миокарда иммуноглобулина (класс М), компонента комплемента (C4d) и экспрессии маркера CD68 - одних из основных показателей развития отторжения гуморального типа. Поставлен диагноз: AMR-0. Антител, направленных к антигенам донора, в крови реципиента не выявлено. Больной получал стандартную иммунодепрессивную терапию по схеме, принятой в институте. При повторной биопсии признаков отторжения гуморального типа не отмечено. Больной выписан в удовлетворительном состоянии.
Патентуемый способ апробирован на 50 пациентах, подвергнутых операции ортотопической аллотрансплантации сердца. Во всех случаях диагноз, поставленный с помощью предлагаемого способа, был подтвержден данными клинического наблюдения, инструментального исследования больных, а также обнаружением в крови реципиентов анти-HLA-антител, направленных к антигенам донора.
Предлагаемый метод позволяет своевременно и точно поставить диагноз острого отторжения гуморального типа, что способствует проведению адекватных лечебных мероприятий и приводит к восстановлению функционирования аллотрансплантата сердца, а в результате к улучшению качества жизни реципиента и сокращению сроков его пребывания в стационаре.