СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ СМЕШАННОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ И БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ
INSTANT DIAGNOSTIC TECHQNIUE FOR MIXED HERPES VIRAL AND BACTERIAL INFECTIONS IN CHILDREN

Изобретение относится к новой медицинской биотехнологии и может быть использовано в клинической практике, как метод ранней диагностики смешанной герпесвирусной и бактериальной инфекции у детей.
Вирусные заболевания смешанной этиологии - одна из актуальных проблем современной клинической медицины. Особое место среди них занимает герпесвирусная инфекция, ассоциированная с вирусами респираторной группы, патогенными и условно-патогенными бактериями, грибами и простейшими. Наличие микст-герпесвирусной инфекции способствует затяжному течению респираторных заболеваний, хронизации бронхолегочной и ЛОР-патологии, а также вовлечению в процесс других органов и систем. За последние 10-15 лет возросло число пациентов с рецидивирующими герпесвирусными инфекциями. Среди обследованных детей дошкольного возраста, посещающих организованные коллективы, большинство (80-90%) инфицированы каким-либо из герпесвирусов. Представители семейства Herpesviridae обладают способностью пожизненно персистировать в организме инфицированного человека. Наряду с неблагоприятными экзогенными факторами персистенция и размножение герпесвирусов в иммунокомпетентных клетках определяют формирование вторичного иммунодефицита и способствуют развитию хронического рецидивирующего течения инфекционного заболевания, а также высокую частоту наслоения сопутствующих вирусных и бактериальных инфекций. Это обусловливает формирование хронической патологии органов дыхания, сердечно-сосудистой и других систем, нарушая гармоническое развитие ребенка.
В настоящее время известно 8 клинически значимых типов вирусов из семейства Herpesviridae: вирусы простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ 1, 2), вирус ветряной оспы (опоясывающего герпеса), вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), цитомегаловирус (ЦМВ), вирусы герпеса типов 6, 7 и 8.
Современный уровень лабораторной диагностики, позволяющий выявлять большое количество возбудителей или специфических антител различных классов, маркирующих их присутствие, не всегда позволяет характеризовать этиологическую значимость выявляемых возбудителей, что требует детального изучения микробиологического пейзажа верхних дыхательных путей, патогенных и колонизационных свойств микроорганизмов. Дифференциальная диагностика латентных и хронических герпесвирусных инфекций у пациентов-носителей патогенной и условно-патогенной бактериальной флоры затруднена. Это обусловлено низкой иммуногенностыо герпесвирусов, которые относятся к возбудителям оппортунистических инфекций и реактивируются под влиянием множества факторов при наличии дефектов в звеньях противовирусной защиты.
Известен способ выявления герпесвирусов в биоптатах и биологических жидкостях (моча, слюна) - цитологический метод.
Способ основан на обнаружении под световым микроскопом с иммерсией в мазках, взятых с пораженных участков слизистой и окрашенных по Романовскому-Гимзе, многоядерных гигантских клеток и внутриядерных включений (при подозрении на ВПГ-инфекцию), атипичных мононуклеаров (при подозрении на ВЭБ-инфекцию) и клеток в виде «совиного глаза» (при подозрении на ЦМВ-инфекцию). Цитологический метод отличается простотой техники получения большого количества информативного материала. Однако, несмотря на то, что цитологический метод технически доступен и отличается быстротой постановки, у него низкий уровень специфичности и он не позволяет диагностировать смешанную бактериально-герпесвирусную инфекцию (Микробиологические аспекты коклюшной инфекции у детей. Диссертация кандидата медицинских наук О.С.Калиногорской. С.-Петербург, НИИДИ, 2006 г.).
Известен также метод оценки резистентности слизистых оболочек, основанный на определении основных показателей антиинфекционной резистентности при бактериальных инфекциях у детей (Скрипченко Н.В., Таликова Е.В., Железова Л.И., Мартынова И.А., Калиногорская О.С. Алгоритм оценки резистентности слизистых оболочек в прогнозировании исходов инфекционной патологии у детей: учебное пособие, СПб, 2002. - 14 с.). Наличие в мазках, взятых с пораженных участков слизистой оболочки, признаков воспаления: полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ), слизи, нитей фибрина, а также микроорганизмов, морфологически схожих с этиологически значимыми (пневмококки - ланцетовидные диплококки с капсулой, стафилококки, грибы и пр.), подтверждает роль бактериального компонента в развитии смешанной инфекции. Для определения прогноза течения бактериальной инфекции дополнительно используют способ его оценки, основанный на интегральном анализе показателей колонизационной активности возбудителя и неспецифической резистентности микроорганизма, индекс адгезии (ИА) - среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эпителиоците, индекс инфицирования (ИИ) - процент эпителиоцитов с адгезированными клетками микроорганизма, фагоцитарная активность (ФА) - процент активных фагоцитов из общего числа поли- и мононуклеаров (50 или 100), фагоцитарный индекс (ФИ) - среднее число микробных клеток, поглощенных одним активным фагоцитом. Однако, этот метод обеспечивает скрининговую диагностику бактериальной инфекции (моно- и смешанной), но не позволяет диагностировать герпесвирусную инфекцию, в том числе, (ЦМВ, ВЭБ и т.д.), что в конечном счете не обеспечивает точности диагностики.
Известен молекулярно-генетический метод диагностики герпесвирусной инфекции, основанный на многократном избирательном копировании (амплификации) определенного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro) - полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод позволяет на основании выявления амплифицированных фрагментов ДНК герпесвирусов в крови судить об активности инфекции. Частота выявления ДНК вирусов в крови при острых формах герпесвирусных инфекций составляет от 11% до 62% в зависимости от тяжести заболевания. Однако, при хроническом ее течении, когда возбудитель располагается преимущественно внутриклеточно, ПЦР оказывается недостаточно эффективной. Кроме того, ПЦР выявляет не только ДНК активно реплицирующегося вируса, но и вируса, пребывающего в фазе латенции, что не позволяет определить участие вирусов в развитии воспалительного процесса и не обеспечивает точности диагностики.
Наиболее близким к предлагаемому авторами способу экспресс-диагностики герпесвирусной инфекции является иммуноцитохимический метод (Е.В.Шарипова, Ю.В.Лобзин, И.В.Бабаченко, Р.А.Насыров, В.В.Иванова, А.С.Левина. «Клинико-этиологические особенности инфекционного мононуклеоза у детей раннего возраста», - Детские инфекции, 2009, №1), позволяющий определять антигены герпесвирусов в лимфоцитах крови с использованием моноклональных антител к латентному мембранному протеину ВЭБ-LPM-1, структурному вирусному белку поздней стадии репликации ЦМВ-рр 65 и поликлональных антител к ранним антигенам ВПГ 1 и 2 типов. Результаты метода позволяют полуколичественно определять экспрессию антигенов в лимфоцитах периферической крови («+» - слабоположительная, «++» - положительная, «+++» - резко положительная). Однако способ обеспечивает диагностику только герпесвирусной инфекции, а не сочетанной вирусно-бактериальной инфекции, что снижает точность диагностики. Недостатком метода также является травматичность способа получение материала для исследования (внутривенный забор крови).
Ликвидировать указанные недостатки поможет предложенный авторами способ экспресс-диагностики смешанной герпесвирусной и бактериальной инфекции у детей путем последовательной окраски по Романовскому-Гимзе и постановки реакции иммуноцитохимии. Авторы впервые предлагают способ одновременного выявления этиологически значимых микроорганизмов и герпесвирусов в браш-биоптате слизистой ротоглотки больных детей с помощью окрашивания препарата по Романовскому-Гимзе с последующей постановкой реакции иммуноцитохимии. По наличию в мазке деструктивных процессов в ядрах эпителиоцитов, специфически измененных лимфоидных и эпителиальных клетках (атипичные мононуклеары, многоядерные гигантские клетки и клетки в виде «совиного глаза»), высокой колонизационной активности условно-патогенных и патогенных микроорганизмов и фагоцитарной активности по отношению к ним устанавливают смешанную вирусно-бактериальную инфекцию. Затем препарат обезжиривают, обесцвечивают, наносят на выделенные зоны предметного стекла специфические моноклональные сыворотки к антигенам ВЭБ и ЦМВ и поликлональные к ВПГ 1, 2. При обнаружении в клетках при световой микроскопии включений коричнево-черного цвета за счет специфического окрашивания антигенов вирусов в клеточных структурах диагностируют моно- или микст-герпесвирусную инфекцию ВПГ 1, 2, ВЭБ, ЦМВ.
Технический результат настоящего изобретения заключается в повышении точности этиологической диагностики, экспрессивности и в снижении травматичности забора материала для исследования.
Авторами впервые предложен эффективный лабораторный экспресс-способ диагностики смешанной бактериально-герпесвирусной инфекции у детей. Метод имеет ряд отличий и преимуществ. Использование браш-биоптатов со слизистой ротоглотки устраняет необходимость инвазивного способа отбора материала, так как пробы отбираются щеточкой браш. Проведение исследования с помощью цитобактериоскопии и постановки реакции иммуноцитохимии осуществляются в одной пробе на одном предметном стекле. Способ обеспечивает сохранность клеточного материала, который сосредотачивается в одном месте, что значительно повышает эффективность представленного метода и экономит дорогие сыворотки и время, а также расширяет возможности цитологии, уже на ранних сроках инфицирования позволяя установить этиологический диагноз.
Авторы решили эту задачу, заявляя способ выявления бактериальной флоры и антигенов герпесвирусов в браш-биоптате слизистой ротоглотки больных детей с помощью окраски мазка по Романовскому-Гимзе и последующей постановки реакции иммуноцитохимии.
Преимуществом исследования мазков является неинвазивный характер забора материала для исследования, что особенно важно в детской практике. Простота забора материала позволяет многократно в течение периода наблюдения контролировать наличие антигенов герпесвирусов.
Иммуноцитохимический метод диагностики герпесвирусных инфекций, в котором используются моноклональные антитела к ВЭБ, ЦМВ и поликлональные - к ВПГ 1, 2 типа, обладает высокой специфичностью, возможностью визуализировать антигенные комплексы вирусов в клетках-мишенях больных с любой формой герпесвирусной инфекции.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. У пациента производят забор браш-биоптата слизистой ротоглотки с помощью щеточки от эндоскопа, монтированной на держателе, наносят на предметное стекло, высушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне (t +4°C) (20 мин), заливают раствором краски Романовского-Гимзы в количестве 5-8 капель (30 мин), добавляют к краске на мазках двойное количество капель нейтральной дистиллированной воды, нагретой до 50°-60°C (3-5 мин), смывают краску струей нейтральной дистиллированной воды, просушивают фильтровальной бумагой. На высушенном мазке производят оценку антиинфекционной резистентности слизистой ротоглотки, рассчитывая индекс адгезии (ИА) - среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эпителиоците, индекс инфицирования (ИИ) - процент эпителиоцитов с адгезированными клетками микроорганизма, фагоцитарную активность (ФА) - процент активных фагоцитов из общего числа поли- и мононуклеаров (50 или 100), фагоцитарный индекс (ФИ) - среднее число микробных клеток, поглощенных одним активным фагоцитом. Затем обесцвечивают препарат: иммерсионное масло на предметном стекле растворяют в 96% этаноле, погружают в дистиллированную воду, обрабатывают в течение 5-7 мин 2% раствором соляной кислоты, промывают в 3-х порциях дистиллированной воды. После этого, учитывая тропизм герпесвирусов к клеткам цилиндрического эпителия, проводят иммуноцитоцимическое исследование на антигены герпесвирусов в обесвеченном мазке. Мазки фиксировали в ацетоне в течение 3-5 минут, затем промывали в фосфатно-солевом буфере (pH 7.2-7.4) в течение 3-4 минут, и помещали в 3% раствор перекиси водорода на 5 минут с целью удаления эндогенной пероксидазы. После этого мазки промывали в двух порциях фосфатно-солевого буфера по 5 минут в каждой, наносили на них специфические антитела с готовым разведением производства фирмы BioGenex (США) ВЭБ (клон 1108-1), ЦМВ (клон ВМ204), а также герпеса I-II типов (поликлональную сыворотку) и инкубировали при t 37°C в течение 30 минут. После инкубации промывали в двух порциях фосфзатно-солевого буфера по 5 минут в каждой и в последующем использовали тест систему QD420-YIK фирмы BioGenex (США) «Super Sensitiv Polymer-HRP Detection System». Вначале на мазки наносили реагент Super Enhancer и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут, промывали в двух порциях фосфатно-солевого буфера по 5 минут в каждой, затем наносили реагент «Poly-HRP Reagent», инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут, промывали в двух порциях фосфатно-солевого буфера по 5 минут в каждой, обрабатывали в водном растворе, содержащем 0,05% 3,3-диаминобензидин тетрахлорида (ДАБ) и 0,025% растворе перекиси водорода в течение 3 минут, в заключение окрашивали гематоксилином. Для получения достоверных результатов и исключения возможности неспецифических реакций проводили контроль качества реактивов и специфичности антисыворотки. Для этого вместо специфических антител наносили неиммунную сыворотку или буфер, получая при этом отрицательные результаты. Неспецифическое связывание сыворотки устраняли посредством максимального разведения высококонцентрированных антител и укорочения времени инкубации. Таким образом, постановка иммуноцитохимической реакции занимала около 3-4 часов.
Критерием оценки ИЦХ-реакции служат интенсивность окраски (светло-, темно-коричневое окрашивание вплоть до черного), ее локализация (в цитоплазме, ядре) и степень распространения на клетку. В каждом мазке оценивали не менее 100 клеток в одном поле зрения, причем исследовали не менее 3-х зон стекла. При наличии от 5% до 30% лимфоцитов, содержащих антиген, реакция считается слабоположительной (+). При наличии лимфоцитов с позитивной реакцией в количестве от 30 до 70% реакция считается положительной (или умеренно положительной, (++), а при окрашивании 70% и более лимфоцитов - сильно положительной (+++). Результаты ИЦХ исследования позволяют полуколичественно оценивать уровень экспрессии антигенов в лимфоцитах периферической крови. Это проводится по известной шкале McCarthy, которая предполагает учет интенсивности окрашивания клеток в баллах (1 - слабое окрашивание, 2 - умеренное окрашивание, 3 - сильное и 4 - очень сильное окрашивание).
Пример №1.
Фамилия, имя А. Даниил
Пол М
Дата рождения / возраст 17.12.2008 г. 1 год 1 мес
№ истории болезни №15628
Диагноз направления: часто болеющий ребенок, обследование
Антитела к ВЭБ, ЦМВ: IgM (VCA) ВЭБ - положит., IgG (EA) ВЭБ - положит., IgM ЦМВ - отрицат., IgG ЦМВ - отрицат.
ПЦР в жидкостях: слюна: ВЭБ - положит., ЦМВ - отрицат.; кровь: ВЭБ - отрицат., ЦМВ - отрицат.; моча: ВЭБ - отрицат., ЦМВ - отрицат.
ИЦХ мазка из ротоглотки: умеренно положительная реакция на ВЭБ
5
Посев на флору - S.pneum. 10
Морфо-функциональное исследование слизистой ротоглотки:
Компенсированная форма дисбиоза слизистой II степени.
Микроструктура слизистой носоротоглотки и ларинго-трахеального секрета:
3
Резидентная микрофлора представлена сапрофитными нейссериями и зеленящими стрептококками (Streptococcus viridians) - 10
Морфофункциональное состояние слизистой носо-ротоглотки:
Эпителиоциты: с деструкцией ядра - 20%, нити фибрина 2+.
ИИ (индекс инфицирования, % - процент эпителиоцитов, колонизированных этиологически значимыми микроорганизмами - высоковирулентным штаммом пиогенного стрептококка - менее 20%/
ИА (индекс адгезии, среднее количество клеток пиогенного стрептококка, адгезированных на 1-ом эпителиоците) - 10-20 микробных клетки.
Клеточные элементы крови, регистрируемые на слизистой носоротолотки (среднее количество клеток в поле зрения):
- полиморфзно-ядерные лейкоциты (ПМЯЛ) - 20 кл. в поле зрения
- лимфоциты 3-6 в поле зрения
- эозинофилы - 2-3 в поле зрения.
- другие - нет.
Состояние фагоцитоза: ФА - фагоцитарная активность (количество клеток крови в % с фагоцитарной активностью по отношению к клеткам пиогенного стрептококка - 40%
ФИ - фагоцитарный индекс (среднее количество поглощенных клеток микроорганизма на 1 фагоцит) - 3-5 м.кл./фагоцит.
Уровень местного неспецифического иммунитета:
SIgA - уровень общего неспецифического секреторного иммуноглобулина А в реакции непрямой иммунофлюоресценции (в lg) - 4 lg.
Таким образом, с помощью предложенного способа неинвазивным методом выявлена смешанная вирусно-бактериальная инфекция (ВЭБ + ЦМВ + пневмококковая) на фоне дисбактериоза слизистой оболочки II степени и снижения антиинфекционной резистентности слизистых. Этиология герпесвирусной инфекции подтверждена серологическим методом (IgM VCA) ВЭБ - положит.) и молекулярно-биологическим (ПЦР слюны на ВЭБ положит.).
Пример №2.
Фамилия, имя П. Даниил
Пол М
Дата рождения / возраст 30.11.2008 г. 1 год 1 мес
№ истории болезни №15589
Диагноз направления: часто болеющий ребенок, обследование
Антитела к ВЭБ, ЦМВ: IgM (VCA) ВЭБ - положит., IgG (EA) ВЭБ - положит. IgM ЦМВ - положит., IgG ЦМВ - отрицат.
ПЦР в жидкостях: слюна: ВЭБ - отрицат., ЦМВ - отрицат; кровь: ВЭБ - отрицат., ЦМВ - отрицат; моча: ВЭБ - отрицат., ЦМВ - отрицат.
ИЦХ мазка из ротоглотки: умеренно положительная реакция на ВЭБ и ЦМВ.
Посев на флору: отрицат.
Морфо-функциональное исследование слизистой носоротоглотки:
Декомпенсированная форма дисбиоза слизистой III степени.
1
Резидентная микрофлора практически отсутствует: регистрируются единичные клетки непатогенных нейссерий и «зеленящих» стрептококков (Streptococcus viridas) - 10.
4
Патогенная флора: Streptococcus pneumonia 10, биопленка!
Эпителиоциты: с деструкцией ядер - 15%, нити фибрина 1+
ИИ (индекс инфицирования, % - процент эпителиоцитов, колонизированных этиологически значимыми микроорганизмами - высоковирулентным штаммом пневмококка - 20-30%
ИА (индекс адгезии, среднее количество клеток пневмококка, адгезированных на одном эпителиоците) - в среднем около 20 клеток пневмококка (на поверхности эпителиоцита и в биопленке!)
Клеточные элементы крови, регистрируемые на слизистой носоротолотки (среднее количество клеток в поле зрения):
- полиморфно-ядерные лейкоциты (ПМЯЛ) - 2-5 кл. в поле зрения
- лимфоциты 2-5 в поле зрения
- эозинофилы - нет
- другие - атипичные мононуклеары, 2-3 в поле зрения!
Состояние фагоцитоза: ФА - фагоцитарная активность (количество клеток крови в % с фагоцитарной активностью по отношению к пневмококкам - 10%
ФИ - фагоцитарный индекс (среднее количество поглощенных клеток микроорганизма на 1 фагоцит) - 3-5 м.кл./фагоцит. Незавершенный фагоцитоз.
Уровень местного неспецифического иммунитета:
SIgA - уровень общего неспецифического секреторного иммуноглобулина А в реакции непрямой иммунофлюоресценции (в lg) - 2 lg
Таким образом, с помощью предложенного способа неинвазивным методом выявлена смешанная вирусно-бактериальная инфекция (ВЭБ + пневмококковая) на фоне дисбактериоза слизистой оболочки III степени и снижения антиинфекционной резистентности слизистых. Этиология герпесвирусной инфекции подтверждена серологическим методом (IgM (VCA) ВЭБ - положит., IgG (EA) ВЭБ - положит. IgM ЦМВ - положит.). Молекулярно-биологическое исследование крови, слюны и мочи оказалось неинформативным (ПЦР крови, слюны и мочи на ДНК ВЭБ и ЦМВ отрицат).
Пример №3.
Фамилия, имя Д. Владимир
Пол М
Дата рождения / возраст 17.07.2007 г. 2 г 6 мес
№ истории болезни №15374
Диагноз направления: часто болеющий ребенок, обследование
Антитела к ВЭБ, ЦМВ: IgM (VCA) ВЭБ - положит., IgG (EA) ВЭБ - отрицат. IgM ЦМВ - отрицат., IgG ЦМВ - положит.
ПЦР в жидкостях: слюна: ВЭБ - отрицат., ЦМВ - положит; кровь: ВЭБ - отрицат., ЦМВ - отрицат; моча: ВЭБ - отрицат., ЦМВ - отрицат.
ИЦХ мазка из ротоглотки: выраженная положительная реакция на ВЭБ и умеренно положительная на ЦМВ.
3
Посев на флору: St.aureus 10
Морфо-функциональное исследование слизистой ротоглотки:
3
5
Декомпенсированная форма дисбиоза слизистой ротоглотки III степени. Резидентная микрофлора представлена сапрофитными нейссериями и зеленящими стрептококками (Streptococcus viridians) - 10, условно-патогенная (S.aureus) - 10, единичные в поле зрения нити актиномицетов.
Эпителиоциты: с деструкцией цитоплазмы и ядра - 5-10%, нити фибрина 1+.
ИИ (индекс инфицирования, % - процент эпителиоцитов, колонизированных этиологически значимым микроорганизмом - S.aureus) - 40%.
ИА (индекс адгезии, среднее количество клеток золотистого стафилококка, адгезироваиных на одном эпителиоците) - 30-40 м.кл. на поверхности 1 эпителиоцита.
Клеточные элементы крови, регистрируемые на слизистой носоротолотки (среднее количество клеток в поле зрения):
- полиморфно-ядерные лейкоциты (ПМЯЛ) - 1-2 кл. в поле зрения
- лимфоциты - 3-6 в поле зрения
- другие - нет.
Состояние фагоцитоза: ФА - фагоцитарная активность (количество клеток крови в % с фагоцитарной активностью по отношению к клеткам этиологически значимым микроорганизмов - не регистрируется.
ФИ - фагоцитарный индекс (среднее количество поглощенных клеток микроорганизма на 1 фагоцит) - не регистрируется
Уровень местного неспецифического иммунитета:
SIgA - уровень общего неспецифического секреторного иммуноглобулина А в реакции непрямой иммунофлюоресценции (в lg) - 4 lg.
Таким образом, с помощью предложенного способа неинвазивным методом выявлена смешанная вирусно-бактериальная инфекция (ВЭБ + ЦМВ + стафилококковая) на фоне дисбактериоза слизистой оболочки III степени и выраженного снижения антиинфекционной резистентности слизистых. Этиология герпесвирусной инфекции подтверждена серологическим методом (IgM (VCA) ВЭБ - положит., IgG ЦМВ - положит.). С помощью ПЦР выявлена только ДНК ЦМВ в слюне.
Клинические наблюдения показывают, что при подозрении на заболевания герпесвирусной этиологии (типичные и особенно атипичные формы инфекционного мононуклеоза как острого, так и хронического течения) обосновано расширенное диагностическое обследование больного, направленное на выявление как вирусов семейства Herpesviridae, так и бактериальных агентов.
Способ отличается простотой и доступностью, может быть использован в практике любой бактериологической лаборатории, не требует дорогостоящих реактивов и оборудования.