Влияние нанопрепаратов на активность амилаз

ТЕХНОЛОГИЯ

УДК 663.44

Влияние нанопрепаратов на активность амилаз

Д. В. Карпенко,

д-р техн. наук, доцент; С. М. Дроздов, студент; А. А. Евсеева,

студентка

Московский государственный университет пищевых производств

На современном этапе развития технологий нанопрепараты различных веществ все шире используются при производстве продукции массового потребления [1, 2]. На-ночастицы, обладающие высочайшей проникающей способностью, могут мигрировать в окружающую среду, результатом чего станет их попадание в состав сырья различных отраслей промышленности, в том числе пищевых производств. Так, в технологические процессы пивоварения наночастицы могут вовлекаться, прежде всего, в составе зернового сырья и технологической воды.

Следует учитывать мнение, высказываемое целым рядом исследователей, о том, что различные наночастицы при определенных условиях могут негативно воздействовать на протекание ряда процессов, базирующихся на применении тех или иных биообъектов [3, 4], ферментов, ферментных препаратов.

Эта точка зрения подтверждается и результатами исследований, проводившихся на протяжении последних лет на кафедре «Технологии бродильных производств и виноделие» ФГБОУВПО «МГУПП» [5-7]. В них изучали результаты отдельных технологических стадий пивоварения, проводившихся в лабораторном масштабе в присутствии ряда нанопрепаратов серебра, оксида цинка, меди. Было установлено, что при определенном содержании эти наночастицы вызывают замедление протекания ключевых процессов пивоваренного производства: солодоращения, затирания, спиртового брожения. Показано, что это обусловлено ухудшением основных технологических характеристик

ячменя, пивных дрожжей, гидролитических ферментов пивоваренного солода и ферментных препаратов микробного происхождения. В то же время, при низком содержании нано-частиц, за исключением наночастиц серебра, в условиях экспериментов наблюдалось возрастание активностей амилолитических и протеолитических ферментов.

По нашему мнению, это сделало целесообразным изучение влияния наночастиц диоксида титана и многослойных углеродных нанотрубок на активность амилолитического ферментного препарата микробного происхождения Амилоризин П10х, который может применяться на предприятиях отрасли, прежде всего, на стадии приготовления затора. Выбор именно этих нанопрепаратов в качестве объектов исследования был обусловлен следующим:

• ранее их влияние на объекты и процесс пивоваренного производства не изучалось;

• по крайней мере, нанопрепараты диоксида титана в настоящее время широко применяются в промышленном масштабе, что повышает вероятность их накопления в окружающей среде и попадания в технологические процессы пивоварения;

• параллельно с нашими на кафедре «Технологии бродильных производств и виноделие» проводились исследования, целью которых являлось установление влияния тех же нанопрепаратов на целевые ферменты микробного ферментного препарата протеолитического типа действия, а также на развитие популяций пивных дрожжей.

ПИВО и НАПИТКИ

5 • 2016

Технология

Влияние вышеуказанных нанопре-паратов оценивали, измеряя активность амилаз ферментного препарата Амилоризин П10х по методу определения амилолитической способности (АС) [8] в опытных, содержавших определенное количество конкретного нанопрепарата, и контрольных, не содержавших наночастиц, вариантах. В виду того, что в различных опытных вариантах колебание активности амилаз ферментного препарата было значительным, количество гидролизован-ного в ходе ферментативной реакции крахмала в ряде случаев не укладыва-

лось в заданный методом определения амилолитической активности диапазон, решено было не проводить расчет амилолитической способности по эмпирической формуле, предложенной в используемом методе определения, а оценивать влияние нанопрепаратов именно по количеству гидролизован-ного в опытных образцах крахмала, сравнивая его с таковым в соответствующем контрольном образце.

В первых сериях экспериментов варьировали содержание в опытных образцах наночастиц диоксида титана или углеродных нанотрубок.

80 -

40 -

0,025 0,05 0,1 0,25 0,5 1 2

Содержание наночастиц диоксида титана, мг/см3

Опыт Контроль

Рис. 1. Влияние нанопрепарата ТО., на активность амилолитических

ферментов

80 -

40 -

11111

I

I

0,1 0,25 0,5 1 2

Содержание углеродных нанотрубок, мг/см3

Опыт Контроль

Рис. 2. Влияние препарата углеродных нанотрубок на активность амилолитических ферментов

Диапазон варьирования равнялся 0,025-5,0 мг/ см3 реакционной среды для нанопрепарата диоксида титана и 0,1-5,0 мг/см3 для препарата многослойных углеродных нанотрубок. Для удобства сопоставления результатов всей серии экспериментов их выражали, принимая количество гидролизо-ванного крахмала в соответствующем, собственном для каждого отдельного эксперимента контрольном варианте, за 100%, а его количество в опытном варианте — в процентах по отношению к этой величине. Полученные данные представлены на рис. 1 и 2.

Данные, представленные на рисунках, позволяют заключить, что, по крайней мере, в условиях эксперимента оба нанопрепарата, содержащиеся в реакционной среде в повышенных количествах (более 0,5 мг/см3 в случае диоксида титана и более 0,25 мг/см3 в случае многослойных углеродных на-нотрубок), оказывают ингибирующее воздействие на целевые ферменты препарата Амилоризин П10х. Степень ингибирования увеличивается при повышении содержания нанопрепарата и достигает 40-60% при максимальном из рассмотренных содержаний каждого из нанопрепаратов (5,0 мг/ см3 реакционной среды).

При этом нанопрепарат диоксида титана при его содержании в реакционной среде 0,5-2,0 мг/см3 вызывает большее снижение амилолитической активности, чем углеродные нанотруб-ки в тех же количествах, что согласуется с литературной информацией о сравнительно невысокой реакционной способности последних. Однако именно углеродные нанотрубки вызвали наибольшее снижение ферментативной активности амилаз препарата Амилоризин П10х при содержании наночастиц, равном 5,0 мг/см3. Это, в свою очередь, служит подтверждением точки зрения ряда исследователей о потенциально высоком токсическом (инактивирующем) воздействии этих наночастиц.

Крайне незначительный положительный эффект наночастиц двух исследуемых видов наблюдался при содержании диоксида титана, равном 0,05 мг/ см3, и содержаниях углеродных трубок, равных 0,1 и 0,25 мг/ см3. Необходимо признать, что такое увеличение амилолитической активности может быть обусловлено погрешностями определения и приборов.

Для выяснения этого вопроса и, в целом, уточнения приведенных выше

120 -г

° 100 -

60 -

20 -

0

5

120 -г

° 100 -

о 60 -

20 -

0

5

5 • 2016

ПИВО и НАПИТКИ 29

технология'

2

Я100-

85- -

75-

........I.............I.............I

1 ........1

20 40 60

Продолжительность контакта, мин

Опыт Контроль

112 -г § 110-^108-1 106-о о 104-

я- 102-¡100-^ 98* 9694--

20 40 60

Продолжительность контакта, мин

Опыт Контроль

95-

игр 90--

& 80-

Рис. 3. Влияние продолжительности контакта нанопрепарата ТО2

Рис. 4. Влияние продолжительности контакта нанопрепарата ТО2

5 120 -т

I 100£ о 8001 ^

I 5 40-не

£ 0-

20 40 60

Продолжительность контакта, мин

Опыт Контроль

5 140-

ии 120 <!§ 100-|| 80-I * 60-

| 401 20-е

£ 0-

20 40 60

Продолжительность контакта, мин

Опыт Контроль

Рис. 5. Влияние продолжительности

контакта углеродных нанотрубок

Рис. б. Влияние продолжительности

контакта углеродных нанотрубок

результатов были проведены серии экспериментов, в которых изучали влияние продолжительности контакта наночастиц двух используемых препаратов и ферментного препарата Амилоризин П10х на активность его целевых ферментов. Ввиду того, что в соответствии с используемым нами методом определения [8] продолжительность ферментативной реакции составляла 10 мин, было невозможно существенно варьировать продолжительность контакта каждого из нано-препаратов непосредственно с реакционной средой. Поэтому условия любого эксперимента рассматриваемых серий сводились к следующим:

• готовили раствор ферментного препарата Амилоризин П10х в дистиллированной воде с «рабочей» концентрацией, которую использовали в предыдущих экспериментах;

• раствор разделяли на две равные части, одну из которых использовали для формирования контрольных

образцов, а в другую вносили навеску соответствующего нанопре-парата так, чтобы обеспечить его необходимую концентрацию; эту смесь использовали для формирования опытных образцов; в данных сериях экспериментов использовали содержания наночастиц, при которых ранее наблюдались выраженное снижение (1,0 мг/ см3 для диоксида титана и 5,0 мг/ см3 для углеродных трубок) и более или менее существенное повышение (0,05 мг/см3 для диоксида титана и 0,1мг/ см3 для углеродных трубок) амилолитической активности ферментного препарата. • равные объемы контрольных и опытных вариантов отбирали через 20, 40 и 60 мин после внесения наночастиц в раствор ферментного препарата, добавляли к объемам субстрата (1 %-ного раствора растворимого крахмала) и проводили определение амилолитической

способности в соответствии с используемым методом. На основании значений оптической плотности рассчитывали количество гидро-лизованного крахмала, принимая значение для контроля за 100%. Полученные данные приведены на рис. 3-6.

В большинстве экспериментов этих серий степень воздействия, как активирующего, так и ингибирующего, каждого нанопрепарата была менее выраженной, чем в случае присутствия наночастиц в тех же количествах непосредственно в реакционных средах, что позволяет предположить непосредственное участие как нанопрепарата ТЮ2, так и углеродных нанотрубок в процессе ферментативного катализа.

В то же время, по нашему мнению, подтвердились основные выводы, сделанные на основании первых серий экспериментов: при низком содержании каждый из нанопрепаратов незначительно повышает амилолитическую способность ферментного препарата, тогда как при повышении содержания оказывает выраженный ингиби-рующий эффект. Вновь, как и в первой серии экспериментов, наибольшее снижение активности амилаз наблюдалось в результате контакта с углеродными нанотрубками (5,0 мг/см3 в течение 20 мин).

Следует отметить, что динамика влияния времени контакта двух разновидностей нанопрепаратов на АС ферментного препарата отличается — в общем, вне зависимости от степени и направления влияния его интенсивность в случае наночастиц диоксида титана повышается, тогда как в случае углеродных нанотрубок снижается по мере увеличения продолжительности присутствия в растворе ферментного препарата Амилоризин П10х.

По нашему мнению, весь массив приведенных данных позволяет заключить, что при определенных условиях как наночастицы диоксида титана, так и углеродные нанотрубки вызывают технологически и экономически существенное отрицательное воздействие, по крайней мере, на амилазы ферментного препарата микробного происхождения, вследствие чего их присутствие в технологических средах пивоваренного производства нежелательно. Очевидно, целесообразно также установить влияние вышеназванных нанопрепаратов на активность основных гидролитических ферментов солода, определяющих результаты

30 ПИВО и НАПИТКИ

5 • 2016

Технология

стадии затирания и всего технологического процесса пивоварения в целом. Данные исследования проводятся в настоящее время, об их результатах будет сообщено.

ЛИТЕРАТУРА

1. Kulkarni S. K. Nanotechnology: Principles and Practices. 3rd Edition/S. K. Kulkarni — Springer, 2015. — 418 p.

2. Bennat C. Skin penetration and stabilization of formulations containing microfine titanium dioxide as physical UV filter/C. Bennat, C. Mttl-ler-Goymann // Inter. J. Cos. Sci. — 2000. — № 22. — P. 271-283.

3. KumarC. (Ed.) Nanomaterials — toxicity, health and environmental issues. Nanotechnologies for the Life Sciences. Volume 5/C. Kumar. — Wiley, 2006. — 346 p.

4. Donaldson, K. Ultrafine particles: mechanisms of lung injury/K. Donaldson, V. Stone // Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Series A — Mathematical, Physical and Engineering Sciences. — 2000. — Vol. 358. — P. 2741-2749.

5. Карпенко Д. В. Влияние наночастиц серебра на прорастание ячменя и качество свежепроросшего солода/Д. В. Карпенко, Ю. А. Уваров // Пиво и напитки. — 2012 — № 3. — С. 32-33.

6. Карпенко Д. В. Влияние наночастиц металлов на сбраживание пивного сусла/Д. В. Карпенко, Ю. А. Уваров, А. И. Маринин, В. В. Оли-шевский // Пиво и напитки. — 2012 — № 1. — С. 16-17.

7. Карпенко Д. В. Влияние наноцинка на активность протеолитических фермен-тов/Д. В. Карпенко, У. В. Вартанова, Н. О. Борисова, М. А. Широкова // Пиво и напитки. — 2015. — № 5. — С. 16-19.

8. Мальцев П. М. Химико-технологический контроль производства солода и пи-ва/П. М. Мальцев, Е. И. Великая, М. В. За-зирная, П. В. Колотуша — М.: Пищевая промышленность, 1976. — 448 с. с4

Влияние нанопрепаратов на активность амилаз

Ключевые слова

амилолитическая активность; нанопрепарат диоксида титана; нанотехнологии; препарат углеродных нанотрубок; ферменты.

Реферат

Применение нанотехнологий в промышленном масштабе позволяет решать широкий спектр задач, но при этом возникает вероятность распространения наночастиц в окружающей среде. Результатом этого может быть повышение их содержания в основном сырье и полупродуктах, и готовой продукции пищевых производств, в частности, пивоваренного. Необходимо учитывать, что рядом исследователей установлено негативное воздействие тех или иных наночастиц и наноматериалов на биологические объекты различной природы и ферменты, ферментные препараты. Как следствие, актуальная задача — определение влияния нанопрепаратов, в частности, диоксида титана и многослойных углеродных трубок на активность ферментов, действующих на различных стадиях пивоваренного производства. В качестве объекта воздействия нанопрепаратов в нашей работе использовали целевые ферменты микробного ферментного препарата Амилоризин П10х амилолитического типа действия. Влияние исследуемых нанопрепаратов оценивали по количеству крахмала, гидролизованного под действием ферментного препарата на 1%-ный раствор растворимого крахмала, сопоставляя значения контролируемого показателя в опытных и контрольных, не содержавших наночастиц, образцах. Установлено, что характер влияния наночастиц диоксида титана и углеродных нанотрубок на активность амилаз ферментного препарата Амилоризин П10х существенно зависит от содержания нанопрепарата в реакционной среде. Небольшие количества наночастиц не изменяют амилолитическую активность или даже повышают ее на 5-30% по сравнению со значениями в контрольном варианте. Однако повышение содержания наночастиц выше определенных значений приводит к снижению активности амилаз на 10-60%. «Пороговое» содержание и степень снижения амилолитической активности зависят от нанопрепарата, внесенного в реакционную среду или контактировавшего с раствором ферментного препарата. С точки зрения авторов, полученные результаты делают целесообразным продолжение исследований влияния наночастиц на технологические процессы, протекающие на ключевых стадиях пивоваренного производства.

Авторы

Карпенко Дмитрий Валерьевич, д-р техн. наук, доцент; Дроздов Сергей Михайлович, студент; Евсеева Алёна Александровна, студентка Московский государственный университет пищевых производств 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, DoKa.65@mail.ru

The Influence of Nanopreparations on the Activity of Amylases

Key words

amylolytic activity; nanopreparation of the titan dioxide; nanotechnology; preparation of carbon nanotubes; enzymes.

Abstract

Application of nanotechnology on an industrial scale allows solve a wide range of tasks, but at the same time there is the probability of the spread of nanoparticles in the environment. This may result in an increase of its content in the main raw materials and semi-finished and finished products of food production, in particular, of the brewing. It should be taken into consideration that a number of researchers found a negative impact of certain nanoparticles and nanomaterials on biological objects of various nature and enzymes, enzyme preparations. As the consequence, the actual problem is to determine the influence of nanomaterials, in particular titanium dioxide and carbon multilayer nanotubes, on the activity of enzymes acting at different stages of the brewing industry. In our work microbial enzyme preparation Amilorizin P10x of amylolytic type of action was used as the object of nanomaterials impact. Effect of nanomaterials was evaluated by the amount of starch hydrolyzed by the action of the enzyme preparation on a 1% solution of soluble starch, comparing the values of the controlled parameter in the experimental and control (not containing nanoparticles) samples. It was found that the effect of titanium dioxide nanoparticles and carbon nanotubes on amylase activity Amilorizin P10x enzyme preparation substantially depends on the nanoparticles content in the reaction medium. Small amounts of nanoparticles do not alter the amylolytic activity or even increase it to 5-30% compared with the values in the control variant. However, increasing nanoparticles content above specific values results in a reduction of amylase activity by 10-60%. «Threshold» content and the degree of the amylolytic activity reduction depends on nanomaterials, introduced into the reaction medium or contacted with a solution of the enzyme preparation. From the point of view of the authors, these results make it reasonable to continue studies of the influence of nanoparticles on the technological processes at the key stages of the brewing industry.

Authors

Karpenko Dmitrij Valer'evich, Doctor of Technical Science, Associate Professor;

Drozdov Sergei Mihajlovich, Student;

Evseeva Alena Aleksandrovna, Student

Moscow State University of Food Productions,

11 Volokolamskoe Shosse, Moscow, 125080, Russia, DoKa. 65@mail.ru

5 • 2016 ПИВО и НАПИТКИ 31