ВАРИАНТЫ ПРОТЕАЗЫ КЛАДЫ APRL И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Вариантный фермент субтилизин клада AprL или его активный фрагмент, содержащий одну или несколько аминокислотных модификаций по сравнению с исходным ферментом субтилизином клада AprL, где модификация выбрана из: (i) A001C, A001D, A001E, A001Q, A001S, L010M, L010Q, S100G, S102K, S102R, Y103F, Y103M, S104D, G105M, G105R, S108F, S108H, S108K, S108R, E111Q, T114D, T115D, T115E, T115F, T115K, T115Q, N116E, K012C, K012F, K012H, K012M, K012N, K012Q, K012Y, V120S, M123C, M123I, L125I, G127A, G127D, G127I, G127M, G127S, G127T, G127V, A128E, A128H, A128K, A128P, A128R, A128S, A128T, S129H, S129Q, S129R, S129T, S129V, T132C, T132D, T132E, T132K, T132N, T132P, Q136A, Q136C, Q136K, Q136R, V138C, A143D, A143N, G145S, V147L, V148A, V148C, V148M, V148Q, K015A, K015C, K015E, K015I, K015M, K015S, K015T, K015V, S155D, S155F, S155K, S155N, S155R, S157D, S158D, S158I, S158K, S158R, N160C, N160D, N160I, N160M, N160R, T161C, T161D, T161E, T161K, T161Q, T161R, G165A, G165E, G165Q, G165R, G165S, Q017H, A018D, A018E, S181Q, N182D, S183A, S183G, N184C, N184E, N184Q, A186C, S187D, S187E, S187P, Q019D, Q019E, A193D, A193R, A202D, A202E, A202K, A202Q, A202V, G203A, G203C, G203E, G203N, G203Q, Y205E, T210C, T210E, T210I, T210P, T210V, A214E, T215C, L216C, L216H, L216K, L216M, N217S, L234E, L234F, L234Q, L234S, S235D, S235E, P238T, N239A, N239D, N239H, N239M, N239S, N239T, A024E, A024Q, L240D, S241E, S241N, S241Q, S241V, A242G, A242N, S243E, S243Q, S243V, Q244C, Q244E, V245A, V245C, V245T, N247D, N247W, N025D, N025G, N025Q, S250G, S251E, S258C, S258D, S258E, S258H, S258P, S259E, S259P, S259Q, V026A, V026C, V026E, V026H, V026Q, V026R, F260W, K264A, K264C, K264D, K264H, K264M, K264Q, K264S, K264Y, I267C, N268D, N268E, N268Q, V269C, K027C, K027D, K027E, K027M, K027P, A271E, Q274A, Q274C, Q274D, Q274E, Q274G, A029S, T003E, T003I, T003Q, T003V, V030C, I035A, I035S, I035T, I035V, S038T, N043A, N043C, N043F, N043H, N043Q, V044P, V045A, V045C, V045D, V045E, V045F, V045G, V045M, V045N, V045Q, V045R, V045S, V045T, G046D, A048N, A048W, F050H, V051I, A052F, A052G, A052K, A052N, A052P, A052R, A052V, G053N, G053R, A055C, A055D, A055E, A055G, A055H, A055N, A055S, A055V, N057C, N057E, N057G, N057V, T058C, T058I, T058K, T058W, A068C, A068N, A068S, V071A, L074G, D075E, N076K, T077C, T077D, T077H, T077M, T077N, T077P, T077Q, T077S, T078D, T078I, T078V, S086E, S086H, S086R, V087C, V087G, V087S, V087T, S088E, S088N, S088R, L089N, P009C, P009D, P009E, P009N, P009T, L095A, L095V, N096S, S098K, S098R, и G099Q;
(ii) A001Q, T003V, K015I, I035A, A068S, V071A, T077N, S086H, V087S, L095A, T115F, M123I, G127T, A128P, A128S, V147L, G165Q, G165S, N184Q, A202V, T210P, N217S, N239S, A242G, S250G, S258P, и Q274A; или
Bacillus sp.
(iii) T003V, A068S, T077N, S086H, T115F, M123I, G127T, A128P, G165Q, N184Q, A202V, T210P, N217S и S258P; где аминокислотные положения варианта субтилизина клада AprL пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина AprL , изложенной в SEQ ID NO:2.
2. Вариант по п. 1, где указанный вариант характеризуется улучшенной стабильностью по сравнению с исходным ферментом субтилизином клада AprL.
3. Вариант по п. 2, где указанная улучшенная стабильность характеризуется (i) PI > 1,2 для стабильности или (ii) PI > 1,2 для стабильности с одним или несколькими из PI > 0,8 для очистки с помощью HDD, PI> 0,8 для очистки с помощью HDL при pH 6 или pH 8, PI > 0,8 для очистки с помощью ADW или PI > 0,8 для экспрессии.
4. Вариант по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий одну или несколько аминокислотных модификаций по сравнению с исходным ферментом субтилизином клада AprL, где модификация выбрана из:
(i) A001C, A048R, A052F, G099S, G099T, G101A, G127F, G127I, G127M, G127Q, G127T, G127V, I121M, L010M, L095A, L095F, L095Q, L095S, L125I, L125V, M123C, M123I, N025F, N025S, N116C, N140R, N184C, P238C, P238D, P238I, P238M, P238N, Q136A, S098F, S098H, S102D, S158Q, S241R, T077C, T077F, T215C, V026I, V026Q, V045R, и V149C; или
(ii) A001C, A024E, A128D, G053C, G099T, G101A, G101N, G165E, G203C, L095Q, L095S, L125S, N061E, N116C, N184C, S098D, S102D, S102E, S104D, S129E, S155D, S158E, и V026T.
5. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариант характеризуется улучшенной очисткой с помощью HDL при pH 6 и/или pH 8 по сравнению с исходным ферментом субтилизином клада AprL.
6. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанная улучшенная очистка с помощью HDL при pH 6 характеризуется (i) PI > 1,1 для очистки с помощью HDL при pH 6 или (ii) PI > 1,1 для очистки с помощью HDL при pH 6 с одним или несколькими из PI > 0,8 для очистки с помощью HDD, PI > 0,8 для очистки с помощью HDL при pH 8, PI > 0,8 для очистки с помощью ADW, PI > 0,8 для экспрессии или PI > 0,8 для стабильности; и где указанная улучшенная очистка с помощью HDL при pH 8 характеризуется (i) PI > 1,1 для очистки с помощью HDL при pH 8 или (ii) PI > 1,1 для очистки с помощью HDL при pH 8 с одним или несколькими из PI > 0,8 для очистки HDD, PI > 0,8 для очистки с помощью HDL при pH 6, PI > 0,8 для очистки с помощью ADW, PI > 0,8 для экспрессии или PI > 0,8 для стабильности.
7. Вариант по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий одну или несколько аминокислотных модификаций по сравнению с исходным ферментом субтилизином клада AprL, где модификация выбрана из: A029T, A048K, A048R, A052F, A052R, A068G, A113C, D119H, E111Q, G099A, G099S, G127A, G127T, G165A, K012G, K012H, K027C, K027E, K027M, L095F, L125I, L125V, L240Q, N025F, N025G, N025L, N043R, N116R, N140R, N160C, N184C, N239K, P238C, P238I, P238M, Q136F, Q136H, Q136K, Q136R, Q136W, S098F, S098H, S104A, S158Q, S241R, V045R, и Y103M.
8. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариант характеризуется улучшенной очисткой с помощью HDD по сравнению с исходным ферментом субтилизином клада AprL.
9. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанная улучшенная очистка с помощью HDD характеризуется (i) PI > 1,1 для очистки с помощью HDD или (ii) PI > 1,1 для очистки с помощью HDD с одним или несколькими из PI > 0,8 для очистки с помощью HDL при pH 6, PI > 0,8 для очистки с помощью HDL при pH 8, PI > 0,8 для очистки с помощью ADW, PI > 0,8 для экспрессии или PI > 0,8 для стабильности.
10. Вариант по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий одну или несколько аминокислотных модификаций по сравнению с исходным ферментом субтилизином клада AprL, где модификация выбрана из: A001C, A001D, A024E, A024G, A048C, A048D, A048K, A048N, A052F, A052M, A052V, A052Y, A055C, A072G, A091G, A113C, A128P, A128Q, A133G, A133S, A133T, A143E, A143F, A143H, A143N, A143S, A143W, A193D, A202C, A202D, A202E, A202Q, A227S, D119F, D119S, D119Y, G053C, G053E, G053N, G053Q, G060L, G060Y, G099A, G099T, G101A, G117D, G117V, G127A, G127S, G127T, G130D, G130H, G203A, G203C, G203E, G203M, H237I, I035A, I035C, I035M, I035T, I121L, K012N, K015M, K027C, K027L, K027M, K027R, K264A, K264S, L010M, L095F, L125V, L234Q, L240N, L249I, M123C, M123I, M123L, N025F, N025G, N025L, N025S, N057C, N061A, N076G, N096D, N096G, N116A, N116C, N116L, N116Y, N140A, N160C, N182C, N182D, N184C, N211S, N247F, N247H, N247I, N247L, N247Q, N247S, N247V, N247W, N247Y, P009E, P009T, P238A, P238C, P238D, P238F, P238I, P238R, Q017H, Q136A, Q136C, Q136F, Q136H, Q136K, Q136L, R144F, R144L, R248K, S086R, S088N, S088Y, S097G, S097H, S097Y, S098H, S098L, S100L, S102D, S102E, S102G, S102K, S129E, S129H, S155A, S155D, S155E, S155H, S157D, S158I, S158Q, S181A, S181Q, S183G, S241R, S241T, S243I, S243N, S243T, S243V, S243Y, S251E, S258C, S258D, S258P, T058C, T058D, T058F, T058I, T077C, T077F, T077L, T077M, T078Q, T132A, T132Q, T132V, T132Y, T161Q, T210I, T215C, V026Q, V026R, V026T, V028A, V028C, V045I, V071A, V071L, V120A, V120C, V120I, V146A, V146H, V146K, V147L, V149C, Y056H, и Y255C.
11. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариант характеризуется улучшенной очисткой с помощью ADW по сравнению с исходным ферментом субтилизином клада AprL.
12. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанная улучшенная очистка с помощью ADW характеризуется (i) PI > 1,1 для очистки с помощью ADW или (ii) PI > 1,1 для очистки с помощью ADW с одним или несколькими из PI > 0,8 для очистки с помощью HDL при pH 6, PI > 0,8 для очистки с помощью HDL при pH 8, PI > 0,8 для очистки с помощью HDD, PI > 0,8 для экспрессии или PI > 0,8 для стабильности.
13. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный PI для стабильности измерен в соответствии с анализом стабильности из примера 1, PI для очистки с помощью HDD измерен в соответствии с анализом очистки с помощью HDD из примера 1, PI для очистки с помощью HDL измерен в соответствии с анализом очистки HDL из примера 1, PI для очистки с помощью ADW измерен в соответствии с анализом очистки с помощью ADW из примера 1 и/или PI для экспрессии измерен в соответствии с анализом по определению белка из примера 1.
14. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный исходный фермент субтилизин клада AprL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2, 9, 12, 13, 14, 15 или 16.
15. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный исходный фермент субтилизин клада AprL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2 или 9.
16. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный исходный фермент субтилизин клада AprL содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2.
17. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный исходный фермент субтилизин клада AprL и/или указанный вариант содержат:
(i) мотив YNT (SEQ ID NO:46) между Asp32 и His63;
(ii) мотив Y56N57T58 (SEQ ID NO:45);
1
3
1
3
(iii) мотив F50V51X52G53E54X55Y56N57T58 (SEQ ID NO:48), где X представляет собой A или S, и X представляет собой A или S;
4
4
(iv) мотив LSXS (SEQ ID NO:55) между Lys236 и Arg246, где X представляет собой A или G;
(v) мотив L240S241A242S243 (SEQ ID NO:50);
(vi) мотив L240S241G242S243(SEQ ID NO:56);
4
5
4
5
(vii) мотив KXXXLSXSQXR (SEQ ID NO:57), где X представляет собой любую аминокислоту, X представляет собой A или G, и X представляет собой I или V;
5
5
(viii) мотив K236XXXLSASQXR246 (SEQ ID NO: 52), где X представляет собой любую аминокислоту, и X представляет собой I или V;
5
5
(ix) мотив K236XXXLSGSQXR246 (SEQ ID NO:60), где X представляет собой любую аминокислоту, и Xпредставляет собой I или V; или
(viii) мотив 1, выбранный из (i), (ii) и (iii), в комбинации с мотивом 2, выбранным из (iv), (v), (vi), (vii), (viii) и (ix).
18. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный исходный фермент субтилизин клада AprL и/или указанный вариант содержат область "петли" между остатками 52-60.
19. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный исходный фермент субтилизин клада AprL и/или указанный вариант содержат остаток Arg248.
20. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный исходный фермент субтилизин клада AprL и/или указанный вариант содержат (i) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45, 46, 47 или 48; и (ii) аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 55, 56, 57, 58, 59 или 60.
21. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный исходный фермент субтилизин клада AprL и/или указанный вариант содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:49 или 58 между Lys236 и Arg246 и аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:46 между Asp32 и His63.
22. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный исходный фермент субтилизин клада AprL и/или указанный вариант содержат остаток Asn96.
23. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный исходный фермент субтилизин клада AprL и/или указанный вариант содержат водородную связь между остатками 96 и 98.
24. Вариант по любому из предыдущих пунктов, где указанный вариант характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2.
25. Композиция, содержащая по меньшей мере один вариант по любому из пп. 1-24.
26. Композиция по п. 25, где указанная композиция представляет собой чистящую композицию или моющую композицию.
27. Композиция по п. 26, где указанная моющая композиция выбрана из группы, состоящей из моющего средства для стирки белья, моющего средства для смягчения ткани, моющего средства для мытья посуды и моющего средства для твердых поверхностей.
28. Композиция по любому из пп. 25-27, где указанная композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество; по меньшей мере один стабилизатор; по меньшей мере одно отбеливающее средство; по меньшей мере один вспомогательный ингредиент; один или несколько дополнительных ферментов или производных ферментов, выбранных из группы, состоящей из ацилтрансфераз, альфа-амилаз, бета-амилаз, альфа-галактозидаз, арабинозидаз, арилэстераз, бета-галактозидаз, каррагиназ, каталаз, целлобиогидролаз, целлюлаз, хондроитиназ, кутиназ, эндо-бета-1,4-глюканаз, эндо-бета-маннаназ, эстераз, экзо-маннаназ, галактаназ, глюкоамилаз, гемицеллюлаз, гиалуронидаз, кератиназ, лакказ, лактаз, лигниназ, липаз, липоксигеназ, маннаназ, оксидаз, пектатлиаз, пектинацетилэстераз, пектиназ, пентозаназ, пероксидаз, фенолоксидаз, фосфатаз, фосфолипаз, фитаз, полигалактуроназ, протеаз, пуллуланаз, редуктаз, рамногалактуроназ, бета-глюканаз, танназ, трансглутаминаз, ксиланацетилэстераз, ксиланаз, ксилоглюканаз и ксилозидаз, дополнительных ферментов металлопротеаз и их комбинаций.
29. Композиция по любому из пп. 25-28, где указанная чистящая композиция не содержит фосфата или содержит фосфат.
30. Композиция по любому из пп. 25-29, где указанная чистящая композиция не содержит бора или содержит борат.
31. Композиция по любому из пп. 25-30, где указанная композиция представляет собой композицию в виде гранул, порошка, твердого вещества, бруска, жидкости, таблетки, геля, однократной дозы или пасты.
32. Способ очистки поверхности или предмета, нуждающихся в очистке, включающий приведение указанной поверхности или предмета, нуждающихся в очистке, в контакт с вариантом по любому из пп. 1-24 или композицией по любому из пп. 25-31 с получением очищенной поверхности или предмета.
33. Композиция для обработки ткани, корма для животных, обработки кожи, обработки перьев, обработки зерна, обработки целлюлозного этанола, очистки линз, удаления омертвевших тканей или добавки для тканевой культуры клеток, содержащая вариант по любому из пп. 1-24.
34. Полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант по любому из пп. 1-24, где указанный полинуклеотид необязательно является выделенным.
35. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 34.
36. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п. 35.