Способ получения отдельных фракций матриксного гиалуроната различных молекулярных масс высокой фракционной и химической чистоты в едином технологическом цикле
METHOD FOR OBTAINING INDIVIDUAL FRACTIONS OF MATRIX HYALURONATE OF VARIOUS MOLECULAR WEIGHTS OF HIGH FRACTIONAL AND CHEMICAL PURITY IN A SINGLE TECHNOLOGICAL CYCLE

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано при производстве соли гиалуроновой кислоты для медицинских целей.
Гиалуронат - несульфатированный гликозаминогликан, который входит в состав соединительной, эпителиальной и нервной тканей. Гиалуронат является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса, содержится во многих биологических жидкостях (слюне, синовиальной жидкости, и др.). В синовиальной жидкости полисахарид отвечает за её вязкость, входит в состав стекловидного тела. Гиалуронат - важный компонент суставного хряща, в котором присутствует в виде оболочки каждой клетки - хондроцита. Также гиалуронат входит в состав кожи, где участвует в регенерации ткани. По химической структуре это поли-(2-ацетамидо-2-дезокси-D-глюко)-D-глюкуроногликан, состоящий из остатков D-глюкуроновой кислоты и D-N-ацетилглюкозамина, соединённых поочерёдно β-1,4- и β-1,3-гликозидными связями.
Молекула содержит большое количество карбоксильных групп и является полианионом. В свободном состоянии 100 % кислота нестабильна и не встречается в нативном и выделенном состоянии. Карбоксильные группы молекулы в нативном состоянии в основном замещены катионами натрия, а также калия, кальция, в очень незначительном количестве катионами железа, цинка, меди и водорода, к полисахариду ковалентно присоединены белки и пептиды поэтому в некоторых источниках ее называют гиалуронан.
В качестве целевого продукта выделяют соли гиалуроновой кислоты - гиалуронаты, в основном гиалуронат натрия, а не "гиалуроновую кислоту". В медицине, инъекционных препаратах, наружной косметике используют именно гиалуронаты - соли гиалуроновой кислоты. В данной работе будет использоваться термин «гиалуронат», в терминах СИ для названия органических и неорганических анионов.
Из-за высокого содержания во внеклеточных матриксах гиалуронат играет важную роль в гидродинамике тканей, процессах миграции и пролиферации клеток, а также участвует в ряде взаимодействий с поверхностными рецепторами клеток. Гиалуронат принимает участие в процессах врожденного иммунитета.
Гиалуронат с различными молекулярными массами широко применяется в медицине и косметологии. Причем гиалуронат с различной молекулярной массой вызывает различный биохимический ответ, имеет различную реологию. Поэтому очень важно разрабатывать современные методы получения отдельных фракций ультрачистого матриксного гиалуроната различных молекулярных масс.
Известно большое число способов, позволяющих выделить гиалуронат из животных тканей.
Известен способ получения гиалуроната, согласно которому гиалуронат получают из петушиных гребней, которые обескровливают, измельчают, экстрагируют водой при 90-100°C, после термообработки экстракционную массу охлаждают до 4-60°C в течение 2-4 ч, отделяют липиды, массу фильтруют, отделяют осадок сырья, а в фильтрат вводят активированный уголь в количестве 1-2% от массы исходного сырья, перемешивают 1-2 ч, смесь фильтруют, полученный фильтрат смешивают с осадком сырья и проводят 2-хстадийную экстракцию водой в течение 18-24 ч при 20-22°C в присутствии пенициллина в количестве 0,05-0,07% от массы исходного сырья с последующей сушкой экстракта. Выход препарата составляет 3,8-4% по отношению к массе исходного сырья (SU 1616926 А1, опубл.30.12.1990).
Известен также способ получения гиалуроната, предусматривающий многократную экстракцию измельченных куриных гребней водным раствором н-пропилового, изо-пропилового или трет-бутилового спирта, объединение экстрактов, добавление к ним хлорида натрия, расслоение системы, отделение водной фазы и осаждение из него целевого продукта. Степень извлечения гиалуроната 50%, содержание белка - менее 1 % (RU 2017751 C1, опубл. 15.08.1994).
Известен также способ получения гиалуроната, согласно которому петушиные гребни, отмытые от загрязнений и крови, гомогенизируют, проводят последовательную двухстадийную экстракцию сырья физиологическим раствором при 80-90°C, в соотношении сырье : растворитель 1:5, смесь фильтруют, отделяют осадок сырья, экстракты объединяют, осаждают гиалуроновую кислоту 1-2%-ным водным раствором уксусной кислоты, осадок растворяют в дистиллированной воде в соотношении осадок : растворитель 1:2, подщелачивают раствором едкого натра до значения pH 7,0-7,3 и медленно подогревают до 80-90°C, фильтруют, фильтрат лиофилизируют. (RU 2102400 C1, опубл. 20.01.1998). Данный способ принят за прототип.
Однако, ни один из предложенных способов не позволяет получать гиалуронат различных молекулярных масс в едином технологическом цикле, способы имеют небольшой выход, полученный гиалуронат имеет низкую молекулярную массу.
Техническая проблема, решаемая изобретением, заключается в получении вещества матриксного гиалуроната различных молекулярных масс высокой фракционной и химической чистоты из животных замороженных или свежих субпродуктов (куриный гребень, кожа крупного рогатого скота, глаза), исключающий засорение его микробиологическими токсинами с максимальным выходом гиалуроната широкого молекулярного спектра и получением сопутствующих продуктов (хондроитинсульфата, шрота), в едином технологическом цикле.
Технический результат, позволяющий решить указанную проблему, заключается в обеспечении полного обескровливания материала, полной очистки его от минеральных солей и низкомолекулярных органических соединений.
Техническая проблема решается способом получения гиалуроната, включающим промывку субпродукта проточной водой, измельчение его, экстракцию, фильтрацию и объединение экстрактов, по которому, согласно изобретению, в качестве сырья берут животные замороженные или свежие субпродукты, выбранные из куриного гребня, кожи крупного рогатого скота и глаз, после промывки денатурируют субпродукт путем его обезвоживания насыщенным раствором хлорида натрия с последующим его набуханием в дистиллированной воде, повторяют цикл обезвоживания и набухания по меньшей мере один раз, после чего повторяют обезвоживание, дезинфицируют денатурированный материал 2,5-3% раствором пероксида водорода, после чего проводят измельчение и гомогенизируют денатурированный материал и проводят трёхкратную экстракцию из измельченного денатурированного материала 0.85-0,9% раствором хлорида натрия при температуре 35-40°С с отделением шрота вакуумной фильтрацией на металлических сетках, затем проводят объединение экстрактов и ферментолиз при вакуумировании энзимным комплексом, включающим папаин, пепсин, трипсин и фосфодиэстеразу при температуре 30-35°С в течение 24-36 часов при рН 6,5-7,2, нагревают ферментационную смесь до 70-80°С, быстро охлаждают до 5-10°С и отделяют липидную плёнку, затем проводят последовательную ультрафильтрацию с конечной мембраной с размером пор не более 0,2 мкм, осаждают гиалуронат хлоридом цетилпиридиния, растворяют осадок гиалуронат цетилпиридиния в 0,9-1,2% растворе хлорида натрия до концентрации не более 0,1%, фильтруют раствор через мембрану с размером пор не более 0,2 мкм, затем готовят раствор гиалуроната с концентрацией не более 0,15% с последующей очисткой и разделением гиалуронат на фракции путем каскадной фильтрации методом обратного осмоса и получают готовый продукт.
В качестве готового продукта можно получать очищенный раствор по меньшей мере одной фракции гиалуроната с концентрацией 0,5-2,5% в 0,9% растворе хлорида натрия.
Также в качестве готового продукта можно получать сухой гиалуронат путем концентрирования очищенного раствора по меньшей мере одной фракции гиалуроната, ультрафильтрации на мембране с размером пор не более 0,2 мкм, осаждения этанолом в соотношении раствор : этанол = 1 : 5 и сушки осадка с получением готового продукта.
При этом сушку осадка можно проводить либо при 35-40°С в течение 3-5 часов и затем при 50-60°С в течение 24-36 часов, либо путем распыления в вакууме.
Предпочтительно в качестве соединения активного кислорода использовать пероксид водорода в виде 2,5-3% раствора.
Кроме того, измельчение и гомогенизацию денатурированного материала целесообразно проводить до размеров частиц 0,005-0,01 мм.
В оптимальном варианте энзимный комплекс используют в виде раствора с общей концентрацией ферментов 1,5-1,8% в соотношении по объему 20-25 мл раствора энзимного комплекса к 10000 мл смеси экстрактов при соотношении папаина, пепсина, трипсина и фосфодиэстеразы по массе (1,5-1,6):(0,3-0,35):(0,3-0,35):(0,1-0,15).
-3
Также в оптимальном варианте каскадную фильтрацию в непрерывном цикле проводят на установках обратного осмоса с размером пор мембраны на первой установке 0,1 мкм и с размером пор мембраны на последней установке 0,2х10 мкм.
При этом важно, что раствор, полученный при осаждении гиалуроната хлоридом цетилпиридиния, можно использовать в качестве побочного продукта, содержащего хондроитинсульфат с примесями.
Предложенный способ позволяет получать матриксный гиалуронат практически в нативном состоянии с наивысшими молекулярными массами высокой фракционной и химической чистоты, идентичный гиалуронату организма человека из малоценных субпродуктов животноводства. Кроме того, данный способ позволяет получать сульфатсодержащие гликозаминогликаны (хондроитинсульфат), шрот в едином технологическом цикле, т.е. способ практически безотходен.
Способ получения гиалуроната осуществляли следующим образом.
Обезвоживание и денатурация
Проводили первоначальную обработку очищенного и отмытого субпродукта насыщенным при комнатной температуре раствором хлорида натрия (35,9 г на 100 мл воды, т.е. 35,9%) с осадком кристаллического хлорида натрия для предотвращения разбавления раствора с возможностью консервирования исходного материала. Субпродукт помещали в денатурационные ванны из расчета 1 часть материала на 3 части раствора по массе. Метод основан на осмотических процессах, в результате которых субпродукт обезвоживается, белки и мукополисахариды денатурируют.
Затем денатурированный материал вынимали из раствора, давали стечь раствору обратно в ванну на ситах и обеззараживали соединениями активного кислорода в отдельных емкостях, предпочтительно 2,5-3% пероксидом водорода. На 1 кг материала брали 200-250 мл 3% раствора пероксида водорода. Поскольку обеззараживание проводят на обезвоженном, денатурированном материале, разрушения гиалуроната не происходит.
Затем после первого обезвоживания и обеззараживания материал помещали в дистиллированную воду для набухания. Цикл обезвоживания, обеззараживания и набухания проводили несколько раз, предпочтительно проводить 3 раза обезвоживание и 2 раза набухание. Это приводит к полному обескровливанию материала, полной очистке от других минеральных солей, низкомолекулярных органических соединений и не приводит к засорению материала дорогостоящими органическими растворителями.
Насыщенные растворы хлорида натрия использовали несколько раз (до 5-6 раз) до определенного загрязнения, затем утилизировали.
Также многократные процессы денатурации (обезвоживания) и набухания приводят к инактивации гиалуронидазы и частичному разрушению межклеточного матрикса и гиалуронат-белковых комплексов, что в дальнейшем приводит к максимальному выходу гиалуроната.
Гомогенизация
После последнего обезвоживания (денатурации) и обеззараживания материал пропускают через мясорубку и гомогенизируют в дисковом истирателе до размеров частиц 0,005-0,01 мм. Гомогенизация денатурированного материала позволяет предотвратить деполимеризацию молекул гиалуроната.
Экстракция
Экстракцию проводили без варок, что разрушает молекулы гиалуроната, без добавления химических реагентов, из денатурированного материала. Таким образом, одновременно идут два процесса: набухание и экстракция. Экстракцию проводили 0,85-0,9% раствором хлорида натрия в нейтральной среде при температуре 35-40°С. В гомогенизат вначале добавляли раствор 0,85-0,9% хлорида натрия в количестве в 3 раза превышающей объем гомогенизата. Экстракцию проводят в течение часа при перемешивании. Затем проводят отделение экстракта от шрота путем вакуумной фильтрации на металлических сетках. Шрот вновь заливают 0,85-0,9% раствором хлорида натрия в количестве, в 2 раза превышающем объем шрота. Проводят вторую экстракцию при тех же параметрах. Затем проводят отделение второго экстракта вакуумной фильтрацией на металлических сетках. Первый и второй экстракты объединяют. Шрот вновь заливают раствором 0,85-0,9% хлорида натрия 1:1 по объему. Проводят третью экстракцию при тех же параметрах. Затем проводят отделение третьего экстракта вакуумной фильтрацией на металлических сетках. Третий экстракт объединяют со смесью первого и второго экстракта. Шрот поступает на сушку для последующего использования.
Ферментолиз
В смесь экстрактов добавляют раствор, содержащий ферментный комплекс с точно заданными характеристиками: количественным составом энзимов и их активностью, что очень важно для сохранения нативного состояния молекулы гиалуроната и предотвращения процесса деполимеризации. Для разрушения белков и мукополисахаридов раствор содержит папаин, пепсин, трипсин, для разрушения нуклеиновых кислот - фосфодиэстеразу.
Для определения максимального выхода гиалуроната натрия была произведена серия экспериментов на различном сырье с содержанием белка 19,8-20,5, которая выявила оптимальные соотношения смеси экстрактов к раствору ферментного комплекса и соотношение ферментов.
Так оказалось, что при соотношении смеси экстрактов к раствору ферментов с общей концентрацией ферментов 1,5-1,8% в соотношении по объему 20-25 мл раствора ферментативного комплекса к 10000 мл смеси экстрактов дает максимальный выход гиалуроната натрия. При этом оптимальное соотношение ферментов в ферментативном комплексе папаин, пепсин, трипсин, фосфодиэстераза по массе составляет (1,5-1,6):(0,3-0,35):(0,3-0,35):(0,1-0,15).
Ферментолиз ведут при вакуумировании, чтобы избежать окислительной деструкции гиалуроната и для удаления сероводорода, образующегося в процессе реакции. Ферментолиз проводят при температуре 30-35°С при перемешивании в течение 24-36 часов с рН-контроллером, при рН среды 6,5-7,2.
Отделение липидов и дезактивация ферментов
После ферментолиза смесь нагревают до 70-80°С при перемешивании для дезактивации ферментов и отделения липидов. Инактивацию ферментов совмещают с отделением липидов, и нагрев до критических температур, при которых ускоряется реакция гидролиза гликозидных связей, происходит только один раз. При достижении заданной температуры смесь быстро охлаждают до 5-10°С, с поверхности снимают липидную пленку. После этого смесь последовательно фильтруют под давлением на мембране 1,2 мкм, затем 0,65 мкм, далее 0,45 мкм, с конечной мембраной не более 0,2 мкм, что позволяет выделить из раствора, содержащего целевой продукт, клеточные мембраны и белковые молекулы и стерилизовать раствор, исключая загрязнение его микробиологическими токсинами.
Отделение гиалуроната
После всех операций раствор содержит сумму веществ: целевой продукт - гиалуронат натрия различных молекулярных масс, пептиды, остаточные белки, сульфатсодержащие гликозаминогликаны (хондроитинсульфат), низкомолекулярные органические вещества. Для выделения гиалуроната используют метод осаждения четвертичными солями аммония, предпочтительно цетилпиридинийхлоридом. В смесь вливают раствор цетилпиридинийхлорида с концентрацией 0,25-0,5%, на 1 л целевого продукта идет 100 мл 0,25-0,5% раствора хлорида цетилпиридиния. В осадок выпадает соль гиалуроната цетилпиридиния с различными молекулярными массами. В растворе остаются все остальные компоненты.
Надосадочную жидкость сохраняют для последующего выделения сульфатсодержащих гликозаминогликанов в процессах обратного осмоса на мембранах с необходимым размером пор.
Получение гиалуроната натрия
Соль гиалуроната цетилпиридиния не подвергают сушке, а сразу растворяют в растворе хлорида натрия с концентрацией 1,2-0,9% при комнатной температуре и перемешивании в течение 24-36 часов в соотношении 1 часть осадка гиалуроната цетилпиридиния на 30 частей раствора хлорида натрия по массе. Получившийся раствор фильтруют через мембрану не более 0,2 мкм для стерилизации и отправляют на фракционирование с одновременной очисткой.
Фракционирование и очистка
Так как гиалуронат с различными молекулярными массами имеет различный биохимический ответ, необходимо получать гиалуронат различных фракций высокой фракционной чистоты. Данная задача решается в данном методе каскадной фильтрацией в стерильном непрерывном цикле. Ведут каскадную фильтрацию методом обратного осмоса на мембранах и получают различные фракции гиалуроната натрия.
Суть каскадной фильтрации в стерильном непрерывном цикле заключается в том, что фракционирование и очистку ведут на стерильных мембранах в стерильных установках для ультрафильтрации в асептической зоне. Раствор гиалуроната для ультрафильтрации в систему поступает после стерилизационной фильтрации. Поступающий в систему раствор хлорида натрия также стерилен. Сосуды для раствора гиалуроната, раствора хлорида натрия и тангенциальные фильтры соединены последовательно между собой в замкнутую систему, где жидкость не соприкасается с внешней средой. Прошедший через мембрану фильтрат сразу же поступает в следующую тангенциальную установку с мембраной с меньшим диаметром пор. Раствор, прошедший через последнюю мембрану, утилизируется. В системе работают все тангенциальные установки одновременно, нет прерывистости цикла.
-3
Вначале для извлечения фракций гиалуроната с наибольшей молекулярной массой (10-15 млн. Да) из смеси используют мембрану с диаметром пор 0,1 мкм. Таким образом можно выделить фракции гиалуроната от 10 до 15 млн. Да и далее ниже. Количество фракций и молекулярная масса зависят от количества выбранных мембран с различным диаметром пор. В данной работе используются мембраны с диаметром пор от 0,2⋅10 мкм до 0,1 мкм.
Для фракционирования и очистки готовят раствор гиалуроната натрия с концентрацией, не превышающей 0,1-0,15% (на 10-15 г соли берут 10 л 0,9% раствора хлорида натрия).
При фильтрации ведут контролируемый долив чистого раствора 0,85-0,9% раствора хлорида натрия в систему. Данный метод позволяет достигать максимальной фракционной и химической очистки целевого продукта.
Получение готового продукта
Для получения гиалуроната в виде сухого продукта раствор каждой из требуемых фракций концентрируют, проводят стерилизационную фильтрацию под давлением на мембране не более 0,2 мкм, и осаждают 5-кратным объемом 94-96% этанола. Полученный осадок гиалуроната натрия с определенной молекулярной массой сушат вначале при температуре 35-40°С в течение 3-5 часов, затем температуру поднимают до 55-60°С и сушат 24-36 часов. В результате получают стерильный гиалуронат натрия необходимой степени химической и фракционной очистки.
Осадок гиалуроната можно также сушить с помощью распыления при вакуумировании.
В качестве готового продукта можно использовать непосредственно стерильные прозрачные растворы фракций с концентрациями 0,5-2,5%.
Таким образом получают несколько индивидуальных фракций гиалуроната натрия.
Возможно также получение из стерильных установок обратного осмоса стерильного раствора фракций гиалуроната в 0,9% растворе хлорида натрия без осаждения с определенной концентрацией как конечный продукт.
В таблицах 1-7 приведены характеристики полученных продуктов.
Таблица 1
Сравнительные характеристики заявляемого способа и прототипа
Характеристики
Прототип
Предлагаемый способ
Фракционность
Смесь фракций
Фракционная чистота с шагом от 200 тыс. Да до 5 млн. Да
Выход гиалуроната, % к исходной массе
До 50 % максимальный
До 75 %, учитывая все фракции
Содержание сопутствующих гликозаминогликанов (в том числе хондроитин-сульфатов), мас. %
Нет данных
Следы
Содержание белка, %
До 0,2
Менее 0, 02
Содержание нуклеиновых кислот, мкг/мл
Следы
Не обнаруживаются
Вязкость 0,5 % раствора, мПа⋅c
Вязкость смеси 300
Вязкость наивысшей фракции 1250
Содержание основного вещества, %
Нет данных
Не менее 98,7
Срок хранения, годы
2
5
Таблица 2
Физико-химические характеристики сухого продукта с молекулярной массой 10-15 млн. Да
Наименование показателя
Характеристика продукта
Внешний вид
Мелкодисперсный порошок
Цвет
Белый
Растворимость
Растворяется в воде после набухания при комнатной температуре
Содержание основного вещества
Не менее 98,7 %
рН 0,5 % водного раствора при комнатной температуре
6,8 - 7,2
Вязкость, мПа⋅с
Не менее 1250
Массовая доля влаги, %
Не более 5 %
Токсичность
Не токсичен
Содержание белка, мас. %
Не более 0,015
Содержание нуклеиновых кислот
Не обнаруживаются
Таблица 3
Физико-химические характеристики сухого продукта с молекулярной массой 10-5 млн. Да
Наименование показателя
Характеристика продукта
Внешний вид
Мелкодисперсный порошок
Цвет
Белый
Растворимость
Растворяется в воде после набухания при комнатной температуре
Содержание основного вещества
Не менее 98,7 %
рН 0,5 % водного раствора при комнатной температуре
6,8 - 7,2
Вязкость, мПа⋅с
Не менее 800
Массовая доля влаги, %
Не более 5 %
Токсичность
Не токсичен
Содержание белка, мас. %
Не более 0,015
Содержание нуклеиновых кислот
Не обнаруживаются
Таблица 4
Физико-химические характеристики сухого продукта с молекулярной массой 5-1 млн. Да
Наименование показателя
Характеристика продукта
Внешний вид
Мелкодисперсный порошок
Цвет
Белый
Растворимость
Растворяется в воде после набухания при комнатной температуре
Содержание основного вещества
Не менее 98,7 %
рН 0,5 % водного раствора при комнатной температуре
6,8 - 7,2
Вязкость, мПа⋅с
Не менее 720
Массовая доля влаги, %
Не более 5 %
Токсичность
Не токсичен
Содержание белка, мас. %
Не более 0,02
Содержание нуклеиновых кислот
Не обнаруживаются
Таблица 5
Физико-химические характеристики сухого продукта с молекулярной массой 15 - 10 млн. Да
Наименование показателя
Характеристика продукта
Внешний вид
Мелкодисперсный порошок
Цвет
Белый
Растворимость
Растворяется в воде после набухания при комнатной температуре
Содержание основного вещества
Не менее 98,7 %
рН 0,5 % водного раствора при комнатной температуре
6,8 - 7,2
Вязкость, мПа⋅с
Не менее 850
Массовая доля влаги, %
Не более 5 %
Токсичность
Не токсичен
Содержание белка, мас. %
Не более 0,015
Содержание нуклеиновых кислот
Не обнаруживаются
Таблица 6
Физико-химические характеристики сухого продукта с молекулярной массой 1 млн.-800 тыс. Да
Наименование показателя
Характеристика продукта
Внешний вид
Мелкодисперсный порошок
Цвет
Белый
Растворимость
Растворяется в воде после набухания при комнатной температуре
Содержание основного вещества
Не менее 98,7 %
рН 0,5 % водного раствора при комнатной температуре
6,8 - 7,2
Вязкость, мПа⋅с
Не менее 680
Массовая доля влаги, %
Не более 5 %
Токсичность
Не токсичен
Содержание белка, мас. %
Не более 0,025
Содержание нуклеиновых кислот
Не обнаруживаются
Таблица 7
Физико-химические характеристики сухого продукта с молекулярной массой 800 тыс.-600 тыс. Да
Наименование показателя
Характеристика продукта
Внешний вид
Мелкодисперсный порошок
Цвет
Белый
Растворимость
Растворяется в воде после набухания при комнатной температуре
Содержание основного вещества
Не менее 98,7 %
рН 0,5 % водного раствора при комнатной температуре
6,8 - 7,2
Вязкость, мПа⋅с
Не менее 650
Массовая доля влаги, %
Не более 5 %
Токсичность
Не токсичен
Содержание белка, мас. %
Не более 0,025
Содержание нуклеиновых кислот
Не обнаруживаются
Таблица 8
Физико-химические характеристики сухого продукта с молекулярной массой 100-50 тыс. Да
Наименование показателя
Характеристика продукта
Внешний вид
Мелкодисперсный порошок
Цвет
Белый
Растворимость
Растворяется в воде после набухания при комнатной температуре
Содержание основного вещества
Не менее 98,7 %
рН 0,5 % водного раствора при комнатной температуре
6,8 - 7,2
Вязкость, мПа⋅с
Не менее 530
Массовая доля влаги, %
Не более 5 %
Токсичность
Не токсичен
Содержание белка, мас. %
Не более 0,023
Содержание нуклеиновых кислот
Не обнаруживаются