Зависимость микровязкости мембран эритроцитов от фосфолипидного состава при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией

РАМН, 2007.-16 с.

7. Определение содержания меди, железа и цинка в сыворотке крови с помощью атомно-абсорбционного спектрофотометра “Спектр” [Текст]/Т.И.Мжельская// Лаб. дело.-1976.-№4.-С.229-232.

8. Клиническая оценка лабораторных тестов: пер. с англ. [Текст]/под ред. Н.У.Тица.-М.: Медици-

на, 1986.-480 с.

9. Anemia and iron deficiency: effects on pregnangy outcome [Text]/L.H.Allen//J. Clin. Nutr.-2000.-Vol.71.-P.1280-1284.

10. Jron deficiency anemia [Text]/A.K.Leung, K.W.Chan//Advances in Pediatrics.-2001.-Vol.48.-P.385-408.

Поступила 22.02.2008

УДК577.125.53/.352:618.2/.3:616.523

Н.А.Ишутина

ЗАВИСИМОСТЬ МИКРОВЯЗКОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ОТ ФОСФОЛИПИДНОГО СОСТАВА ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ, ОСЛОЖНЕННОЙ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

ГУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН

РЕЗЮМЕ

Изучен фосфолипидный спектр и микровязкость мембран эритроцитов при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией. Установлено, что клеточная дисрегуляция у беременных с герпес-вирусной инфекцией, сопровождалась уменьшением относительного содержания фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина и увеличением лизофосфатидилхолина, фосфати-дилсерина и сфингомиелина, приводящее к нарушению структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов, а именно увеличению относительной микровязкости.

Ключевые слова: беременность, фосфолипиды, герпес.

SUMMARY

N.A.Ishutina

THE DEPENDANCE OF MICRO VISCOSITY OF ERYTHROCYTE MEMBRANES ON PHOSPHOLIPID COMPOSITION AT PREGNANCY COMPLICATED WITH HERPES VIRAL INFECTION

The phospholipid composition and micro viscosity of erythrocyte membranes at pregnancy complicated with herpes-viral infection was studied. It was found out that cell deregulation in pregnant women with herpes viral infection was accompanied by the fall of the phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine values and by the rise of lysophosphatidylcholine, phosphatidyl serine and sphingomyelin values, which led to the failure of structure functional properties of erythrocyte membranes, namely to the rise of micro viscosity.

Целый ряд патологических состояний приводит к той или иной форме повреждения клетки, которое практически всегда подразумевает нарушение целостности как плазматической мембраны, так и мембран клеточных органелл.

Как известно, основными структурными компо-

нентами клеток являются фосфолипиды, а патологически протекающая беременность сопровождается нарушением фосфолипидного состава не только сыворотки крови и эритроцитарных мембран, но тканей плаценты [6, 10].

Изменение соотношения фосфолипидов, холестерина, жирных кислот могут косвенно свидетельствовать о нарушении микровязкости мембран. В свою очередь, изменение микровязкости мембран сопровождается функциональными нарушениями клеток крови. Ухудшаются их вязкоэластичекие и реологические свойства, нарушается микроциркуляция, снижается активность мембранносвязанных ферментов, тормозятся такие функционально важные мембранные процессы как связывание рецепторов с вторичными мессенджерами и лигандами [4].

В связи с этим можно сказать, что характеристика плазматической мембраны может служить тестом для определения состояния функционального аппарата клетки.

Цель данного исследования - выявить зависимость микровязкости мембран эритроцитов от фосфолипидного состава при беременности, протекающей на фоне герпес-вирусной инфекции.

Материал и методы исследования

В условиях специализированного отделения ДНЦ ФПД СО РАМН проведено исследование фосфолипидного состава и относительной микровязкости мембран эритроцитов у женщин, беременность которых сопровождалась обострением хронической герпес-вирусной инфекции (ХГВИ). Изучаемую группу составили 60 женщин, перенесших во время гестации обострение ХГВИ (титр антител к вирусу простого герпеса 1:12800) в разные сроки. В качестве группы сравнения обследованы 30 практически здоровых беременных.

Определяли количественный состав отдельных фосфолипидов (ФЛ), результаты выражали в процентах от общей суммы. Липиды экстрагировали по методу Фолча [17]. Готовые экстракты разделяли на индивидуальные фракции ФЛ на пластинках с тонким слоем силикагеля ^ое1т, Германия). Двухмерную тонкослойную хроматографию и идентифика-

цию индивидуальных фракций ФЛ осуществляли по методу Кирхнера [7], количественное определение фракций проводилось спектрофотометрически.

Измерение микровязкости мембран эритроцитов проводили методом латеральной диффузии гидрофобного флуоресцентного зонда пирена [5]. Определение микровязкости основано на образовании экси-меров (активных димеров) пирена в липидном окружении. Флуоресценцию пирена измеряли на спек-трофлюориметре «ИкасЫ» (Япония). Для определения микровязкости липидного бислоя находили интенсивность флуоресценции или свечение пирена при длине волны возбуждения 334 нм, длина волны мономеров 395 нм, длина волны эксимеров 470 нм. Для определения микровязкости зоны липид-белковых контактов длина волны возбуждения 286 нм, длина волны мономеров 395 нм, длина волны эксимеров 470 нм. Оценка микровязкости основывается на вычислении коэффициента эксимеризации пирена (Кэкс=р47о/Тз95), который равен отношению интенсивности флуоресценции эксимеров к интенсивности флуоресценции мономеров. Коэффициент эксимеризации находится в обратной зависимости от микровязкости. Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Как известно, уровень ФЛ мембран эритроцитов мало подвержен изменениям, поскольку ФЛ обеспечивают целостность морфологической структуры эритроцита и прочно удерживаются эритроцитарной мембраной. В то же время даже незначительные структурные перераспределения, приводящие к утрате ассиметрии мембранных ФЛ клетками, в значительной степени могут сказаться на нарушении функций биомембран, ее проницаемости, вязкоэластических свойств, что влечет за собой снижение стабильности мембран клеток крови и тканей [3].

Анализ полученных данных показал, что беременность, осложненная ХГВИ, сопровождалась перераспределением мембранных ФЛ (табл. 1). Преобладающими изменениями при обострении ХГВИ в период беременности явилось уменьшение относительного

содержания фосфатидилэтаноламина (Ре) и фосфати-дилхолина (Рс), увеличение фосфатидилсерина (Рб), лизофосфатидилхолина (Ьрс) и сфингомиелина (8рИ).

Так, если обострение ХГВИ наблюдалось в I триместре (титр антител 1:12800), то доля Ре достоверно снижалась по сравнению с таковой в контрольной группе до 20,3±0,8% (р<0,01); во II триместре до 16,5±0,7% (р<0,001); и до 21,8±1,8% в III триместре (табл. 1). Одной из вероятных причин изменения количества Ре является возможность его превращения в Рс путем метилирования. Не исключен и вариант усиления гидролиза фосфолипазой А Ре (Ре содержит более 50% всей арахидоновой кислоты ФЛ мембран эритроцитов) [13].

Также при активации ХГВИ в период гестации снижалось содержание Рс. В I триместре содержание Рс было снижено до 26,6±0,57% (р<0,001); во II и в III триместрах имело тенденцию к снижению и составляло, соответственно, 28,7±0,9% и 27,6±1,3%, по сравнению с аналогичными показателями группы контроля (табл. 1). Обеднение эритроцитов Рс, формирующим внешнюю оболочку липидного матрикса клетки свидетельствует о дезинтеграции мембранных структур, завершающейся их деструкцией [1].

При высоком титре антител к вирусу простого герпеса содержание Рб в I триместре имело тенденцию к увеличению и составляло - 11,0±1,0% (р<0,05), во II триместре и в III триместре содержание Рб достоверно увеличивалось, по сравнению с аналогичными показателями группы контроля, и составляло, 12,9±0,57% (р<0,01) и 4,7±0,9% (р<0,001), соответственно (табл. 1). Обогащение плазматических мембран Рб может быть опосредовано повышением занятости скавенджер-рецепторов, вследствие чего осложняется выведение из кровотока поврежденных клеток и модифицированных липопротеидов, приводящее к возникновению воспалительных процессов в организме [9]. С другой стороны накопление Рб в мембранах эритроцитов способствует стимуляции электрокинетических, снижению тромбопластических свойств клеток, предотвращает агрегацию и агглютинацию эритроцитов, что можно рассматривать как проявление адаптационно-компенсаторных эффектов в структуре и функции биомембран [14].

Таблица 1

Показатели состава мембранных фосфолипидов у беременных с ХГВИ и здоровых женщин

Группа Ре, % Рс, % Рє, % Ьрс, % ЯрИ, % РІ, %

I триместр

ХГВИ контроль 20,3±0,80 24,1±1,0 р<0,01 26,6±0,57 30,9±0,80 р<0,001 11,0±1,0 7,8±0,65 р<0,05 6,30±0,94 4,0±0,70 23,8±0,93 20,2±0,80 р<0,01 12,0±0,60 12,8±0,50

II триместр

ХГВИ контроль 16,5±0,70 20,6±0,60 р<0,001 28,7±0,90 32,2±1,30 р<0,05 12,9±0,57 9,0±0,80 р<0,01 7,5±0,39 5,3±0,60 р<0,01 23,4±0,45 20,6±0,60 р<0,001 11,0±0,63 12,3±0,40

III триместр

ХГВИ контроль 21,8±1,80 23,4±1,7 27,6±1,3 33,1±2,2 р<0,05 7,4±0,90 4,0±0,20 р<0,001 9,9±0,58 7,2±1,20 25,3±1,3 22,5±1,2 8,0±0,80 9,8±0,30

При обострении ХГВИ в период беременности наблюдалось увеличение процентного содержания 8рИ. В I триместре содержание данного ФЛ увеличивалось до 23,8±0,93% (р<0,01) во II до 23,4±0,57% (р<0,001)и в III триместре до 25,3±1,3%, по сравнению с показателями группы контроля (табл. 1). Как известно, 8рИ не подвергается действию фосфолипаз и, возможно, замещает Рс, что в какой-то мере направлено на сохранение структурной целостности эритроцитарной мембраны.

Нарушение нормального количественного соотношения отдельных фракций ФЛ приводит к дестабилизации липидных структур клеточных мембран. Одним из механизмов подобных изменений может быть активация эндогенной фосфолипазы А. Доказательством этого процесса является накопление специфического маркера мембранодеструкции Ьрс [12]. В эритроцитах периферической крови процентное содержание Ьрс имело тенденцию к увеличению при обострении ХГВИ в I триместре, во II триместре достоверно увеличивалось и составляло - 7,5±0,39% (р<0,01), а в III триместре также имело тенденцию к увеличению и составляло - 9,9±0,58%, по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы (табл. 1). Увеличение Ьрс, обладающего мембранотоксическим действием [16], способствует разрыхлению гидрофобной области липидного слоя мембран эритроцитов.

Количество фосфатидилинозитола мембран эритроцитов при беременности, осложненной герпесвирусной инфекцией изменялось незначительно.

При беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией, происходит патологическая активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран на фоне снижения антиоксидантной активности [10]. Весьма вероятна связь усиления процесса ПОЛ с ускорением метаболизма арахидоновой кислоты. Активация фосфолипазы А ведет к генерированию супеоксид-радикалов, образующихся под влиянием высвобожденной арахидоновой кислоты [11]. Возникающие при этом свободные радикалы нарушают проницаемость клеточных мембран, увеличивают вязкость липидного бислоя и уменьшают синтез эндогенных ФЛ [13].

Выявленная модификация фосфолипидного бислоя эритроцитарной мембраны может явиться существенным фактором нарушения процессов, связанных с явлениями деструкции мембраны, ее барьерных функций, проницаемости, процессов активного переноса веществ, трансмембранных градиентов. В клинической практике такое состояние называется жесткостью клетки и означает для эритроцита уменьшение или утрату деформируемости. Ослабление гидрофобных связей, нарушение физикохимических свойств мембраны оказывают влияние на функции интегральных белков, вызывают дестабилизацию липид-липидных и белок-липидных взаимодействий в мембране [4].

В таблице 2 представлены коэффициенты эксиме-ризации пирена, отражающие текучесть мембран эритроцитов в группе контроля и у беременных с хронической герпес-вирусной инфекцией. Как видно из данных таблицы, у беременных с герпес-вирусной инфекцией наблюдалось снижение текучести (т.е увеличение микровязкости) мембран эритроцитов по сравнению с контрольной группой.

Так, при обострении герпес-вирусной инфекции в I триместре беременности текучесть мембран эритроцитов в липидном бислое была достоверно снижена до 0,56±0,05, в зоне белок-липидных контактов -до 0,79±0,06, по сравнению со здоровыми беременными (табл. 2).

При обострении герпес-вирусной инфекции во II триместре (титр антител к вирусу простого герпеса 1:12800) текучесть в липидном бислое была снижена до 0,47±0,08 (контроль 0,68±0,05), а в зоне белок-липидных контактов мембран эритроцитов до 0,67±0,07 (контроль 1,29±0,05).

В III триместре при активации вируса герпеса снижение текучести мембран наблюдалось в липидном бислое и составляла - 0,60±0,05 (контроль

0,82±0,07), а в зоне липид-белковых контактов составляла -0,86±0,08 (контроль 1,13±0,04).

Представленные данные свидетельствуют о том, что у беременных с герпес-вирусной инфекцией имеет место снижение текучести или увеличение микровязкости мембран эритроцитов, особенно выражены эти

Таблица 2

Показатели микровязкости мембран эритроцитов практически здоровых и беременных

с герпес-вирусной инфекцией

Группа Эритроциты, Рэ/Тм

Липидный бислой Белок-липидные контакты

I триместр

ХГВИ 0,56±0,05 0,79±0,06

Контроль 0,98±0,09 1,0±0,07

р<0,001 р<0,05

II триместр

ХГВИ 0,47±0,08 0,67±0,07

Контроль 0,68±0,05 1,29±0,05

р<0,05 р<0,001

III триместр

ХГВИ 0,60±0,05 0,86±0,08

Контроль 0,82±0,07 1,13±0,04

р<0,05 р<0,01

изменения в липидном бислое в I и во II триместрах.

Текучесть или микровязкость мембран является интегральным показателем, зависящим от нескольких компонентов: ненасыщенности липидов, содержания холестерина в мембранах, фосфолипидного состава и количества белка, введенного в мембрану [2, 4, 8].

Важнейшим регулятором текучести мембран является холестерин [15]. Увеличением уровня холестерина в мембранах эритроцитов, объясняют повышение относительной микровязкости липидного бислоя мембран при атеросклерозе, ишемической болезни сердца и инфаркте миокарда. Увеличение молярного соотношения холестерин/фосфолипиды обнаружено как при экспериментальном канцерогенезе, так и у онкологических больных [4].

Важное значение в изменении структурнофункциональных свойств мембраны придается также увеличению сфингомиелина, способствующего наряду с холестерином увеличению микровязкости липидной фазы мембран [8].

Увеличение ненасыщенности липидов (повышение числа двойных связей) ведет к повышению текучести мембран. При этом особенно значимым является появление первой двойной связи в липидной молекуле, с увеличением степени ненасыщенности эффект прогрессивно снижается [2, 4].

Повышение микровязкости мембран сопровождается функциональными нарушениями клеток крови. Ухудшаются их вязкоэластические и реологические свойства, нарушается микроциркуляция, снижается активность мембраносвязанных ферментов, тормозятся такие функционально важные мембранные процессы как связывание рецепторов с вторичными мессенджерами и лигандами [4].

Таким образом, беременность, осложненная герпес-вирусной инфекцией, сопровождалась нарушением структурно-функционального состояния клеточных мембран, что выражалось повышением микровязкости как липидного бислоя, так и зоны липид-белковых контактов.

Таким образом, активация ХГВИ в период беременности приводит к изменению состава фосфоли-пидных компонентов мембран и их структурной реорганизации. Наблюдается увеличение процентного содержания лизофосфатидилхолина, фосфатидилсе-рина, сфингомиелина и снижение фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина, что в свою очередь отражается на функциональных свойствах мембран эритроцитов, а именно относительной микровязкости. Увеличение микровязкости эритроцитарных мембран сопровождается нарушением функционирования их транспортных и ферментных систем и изменением метаболического состояния всей клетки.

ЛИТЕРАТУРА

1. Фосфолипидный состав эритроцитов у больных хронической почечной недостаточностью [Текст]/Р.Н.Акалаев, А.А.Абидов//Вопр. мед. химии.-1993.-№5.-С.43- 45.

2. Структурно-функциональные изменения мембран лимфоцитов и эритроцитов под воздействием

переменного магнитного поля [Текст]/Бордюшов Ю.Н. [и др.]//Вопр. мед. химии.-2000.-Т.46, №1.-С.72-79.

3. Фосфолипиды мембран эритроцитов у больных хроническим бронхитом, сочетанным с уроли-тиазом [Текст]/А.В.Вязова//Патол. физиол. и экс. те-рапия.-2006.-№1.-С.12-15.

4. Изменение микровязкости мембран лимфоцитов и эритроцитов крови у онкологических больных [Текст]/Горшинская И.А. [и др.]//Вопр. мед. химии.-1999.-Т.45, №1.-С.53-57.

5. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов [Текст]/ Г.Е.Добрецов.-М.: Наука, 1989.-С.191-206.

6. Гистохимическое исследование фосфолипидов в плаценте беременных при герпесе [Текст]/ И.В.Довжикова//Бюл. физиол. и патол. дыхания.-2003.-Вып.15.-С.19-23.

7. Тонкослойная хроматография: пер с англ. [Текст]/Ю.Кирхер.-М.: Мир,1981.-С.52-115.

8. Липидный состав и структурнофункциональные свойства мембран эритроцитов разного возраста [Текст]/Ли B.C. [и др.]//Вопр. мед. хи-МИИ.-1982.-Т.28, вып.6.-С.66-71.

9. Особенности воздействия перфторана на структурно-метаболические нарушения в печени при экспериментальном атеросклерозе [Текст]/Лескова Г.Ф [и др.]//Бюл. экспер. биол. и медицины.-2003.-Т.136,№10.-С.386-389.

10. Фосфолипиды при нарушении дыхательной функции организма [Текст]/М.Т.Луценко.-Благовещенск: Амурский гос. ун-т, 2006.-164 с.

11. Антиоксиданты, перекисное окисление липидов и рецепторзависимое увеличение концентрации Са2+ в тромбоцитах человека [Текст]/Негреску Е.В. [и др.]//Вопр. мед. ХИМИИ.-1992.-Т.38, №1.-С.36-39.

12. Биологические мембраны. Двенадцать очерков о структуре, свойствах и функции мембран: пер. с англ. [Текст]/под ред. Д.С.Парсон.-М.: Мир, 1978.-230 с.

13. Анализ спектра фосфолипидов и активности фосфолипазы А2 тромбоцитов у беременных с поздним токсикозом, больных гипертонической болезнью [Текст]/Шехтман М.М [и др.]//Акуш. и гин.-1997.-№4.-С.15-17.

14. Модификация состава жирных кислот крови при сердечно-сосудистых заболеваниях [Текст]/

Э.А.Эндакова, Т.П.Новгородцева, В.И.Светашев.-Владивосток, 2002.-С.5-11.

15. Структурно-функциональный анализ мембран эритроцитов с различным содержанием холестерина [Текст]/Халилов Э.М. [и др.]//Вопр. мед. химии.-1982.-Т.27, вып.1.-С.81-86.

16. Lipoprotein - like phospholipid particles inhibit the smooth muscle cell cytotoxicity of lisophosphotidil-choline and platelet-activating factor [Text]/Nilsson J. [et al.]//Arteriosclerosis, Thrombososant Vasc. Bid.-Vol.18, №l.-P.13-19.

17. A simple metod for the isolation and purification of total lipids from animals tissues [Text]/ J.Folch, M.Lees, G.H.Sloane//J. Biol. Chem.-1957.-Vol.226.-P.497-509.

Поступила 22.02.2008