Модуляция ассоциации липопротеидов низкой плотности с помощью плюроников

Модуляция ассоциации липопротеидов низкой плотности с помощью плюроников

А. А. Мельниченко1,2, Д. В. Аксенов3, О. М. Панасенко3, А. А. Ярославов4, И. А. Собенин1,3

1 ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН, Москва

2 Научно-исследовательский институт атеросклероза (Сколково), Москва

3 ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ РФ, Москва

4 ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова», Москва

Абстракт

Цель. Ключевым фактором в развитии атеросклероза является накопление холестфина в интиме магистральных сосудов человека. Известно, что именно липопротеиды низкой плотности (ЛНП) отвечают за транспорт холестерина в организме. Ранее было показано, что только ассоциаты (агрегаты) ЛНП вызывают накопление липидов в культивируемых клетках, т.е. атфогенны. Цель настоящего исследования состояла в поиске ингибиторов ассоциации ЛНП, выделенных из крови больных атеросклерозом. Материалы и методы. В работе использованы плюроники Р85, Ъ61 и F68. Общую фракцию ЛНП выделяли сыворотки больных срдечно-сосудистыми заболеваниями. Степень ассоциации ЛНП оценивали методом регистрации флуктуации светопропускания при помощи прибора. Средний размер образовавшихся ассоциатов оценивали методом квазиупругого лазерного рассеивания на приборе Аутосайзр 2-Малврн. Результаты. Нами были исследованы три группы амфифильных соединений: с гидрофильными, гидрофобными и промежуточными свойствами. Было показано, что плюроники с выраженными гидрофобными свойствами (Р85 и Ь61) в концентрациях близких или больших к критической концентрации мицеллообразования ингибировали процесс ассоциации ЛНП, в то время как «гидрофильный» плюроник F68 в любой концентрации не влиял на ассоциацию ЛНП.

Ключевые слова: липопротеиды, ассоциация липопротеидов, плюроники, атеросклероз.

Modulation of Low Density Lipoprotein Self-association with Pluronic Block Copolymers

A.A. Melnichenko1,2, D.V. Aksenov3, O.M. Panasenko3, A.A. Yaroslavov4, I.A. Sobenin1,3

1 Research Institute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow, Russia

2 Research Institute for Atherosclerosis Research (Skolkovo), Moscow, Russia

3 Russian Cardiology Research Complex, Moscow, Russia

4 Moscow State University, Moscow, Russia

Abstract

Aim. A key factor of atherogenesis is the accumulation of cholesterol in the intima of main arteries. It is known that low density lipoproteins (LDL) are responsiblefor the transport of cholesterol in the body. It was previously shown that

only LDL associates (aggregates) causes lipid accumulation in cultured cells, i.e. atherogenic. Aim of this study was

to find inhibitors of the association of LDL isolated from the blood of patients with coronary heart disease.

Materials and methods. We used Pluronic block copolymers P85, L61 and F68. The total LDL fraction was isolatedfrom serum of patients with cardiovascular diseases. Degree of association of LDL was measured by recording the fluctuations of light transmission through the device. The average size of the formed associates evaluated by quasi-elastic scattering on the laser device Autosayzer 2 Malvern.

Results. Multivariate predictors and markers of an abdominal aortic calcification included female gender, systolic ™ arterial hypertension, smoking duration, hyperhomocysteinemia, a high serum C-reactive protein level, ischemic heart

— disease, cerebrovascular disease and osteoporosis.

— Keywords: lipoproteins, lipoprotein association, Pluronic, atherosclerosis.

39

Одним из первых проявлений атеросклероза на клеточном уровне является накопление липидов, в частности эфиров холестерина, в интиме артерий [1-3]. Источником липидов, накапливающихся в интиме сосудов, являются циркулирующие в крови липопротеиды низкой плотности [4, 5]. При этом нативные липопротеиды низкой плотности (ЛНП), циркулирующие в крови, не способны вызывать накопление липидов в культивируемых клетках, то есть не атерогенны [6-8]. С другой стороны, многими исследователями было продемонстрировано, что модифицированные различным образом in vitro (ацетилированные, обработанные малоновым диальдегидом, вортексированные, гликозилированные и т. д.) ЛНП атерогенны [8-11].

Ранее было продемонстрировано, что модифицированные любым способом ЛНП образуют ас-социаты, и эти ассоциаты проявляют атерогенные свойства, вызывая накопление внутриклеточных липидов. Была выявлена прямая зависимость между размером ассоциатов ЛНП и их способностью вызывать накопление липидов в клетках, причем нативные ЛНП не образовывали ассоциатов и не обладали атерогенными свойствами, т. е. не вызывали накопление внутриклеточных липидов [12]. Можно сделать предположение, что без модификации ЛНП невозможна их ассоциация, без ассоциации ЛНП не проявляются их атерогенные свойства. Исходя из этого, особый интерес представляет поиск модуляторов процесса ассоциации ЛНП.

Известно несколько эндогенных ингибиторов ассоциации ЛНП [10, 13], такие как липопроте-ид-дефицитная сыворотка, бычий сывороточный альбумин (БСА), липопротеиды высокой плотности (ЛВП) здоровых доноров и основной аполипопротеид ЛВП - ароА-I. Все они обладают амфифильными свойствами и, по-видимому, взаимодействуя с гидрофобными участками на поверхности ЛНП, предотвращают взаимодействие частиц ЛНП между собой и тем самым ингибируют ассоциацию. Мало известно об экзогенных ингибиторах ассоциации. Между тем поиск и изучение нетоксичных и биодоступных ингибиторов ассоциации ЛНП представляет большой практический интерес, если рассматривать подавление ассоциации ЛНП в качестве терапевтического подхода. Мы предположили, что на эту роль могут претендовать амфифильные сополимеры окиси пропилена (ОП) и окиси этилена (ОЭ), так называемые плюроники. В данной работе изучена способность различных плюроников влиять на ассоциацию ЛНП.

Методика исследования

В работе использованы плюроники P85, L61 и F68 (BASF (Wyandotte, MI).

Общую фракцию ЛНП выделяли двухстадийным ультрацентрифугированием в градиенте плотности NaBr из сыворотки больных сердечно-сосудистыми

40

заболеваниями (мужчины в возрасте 40-74 лет с ранним бессимптомным атеросклерозом сонных артерий) [14]. Концентрация белка в образцах ЛНП определялась с помощью метода Лоури.

Для изучения ассоциации ЛНП суспензию предварительно освобождали от имеющихся в ней спонтанно образующихся ассоциатов путем фильтрования через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм

[15]. Метод основан на том, что относительная дисперсия колебаний оптической плотности, вызванных случайными изменениями в количестве частиц, попадающих в оптический путь лазерного луча, отражает отклонения от их среднего размера, т. е. степень их ассоциации. Через определенные промежутки времени регистрировали флуктуацию светопропускания.

Средний размер образовавшихся ассоциатов оценивали методом квазиупругого лазерного рассеивания на приборе Аутосайзер 2-Малверн (Autosizer 2-Malvern, Malvern Instruments, UK). Для этого образцы ЛНП с концентрацией 2,5 мг белка / мл инкубировали при 37 °С в изотоническом фосфатном буфере при постоянном перемешивании - 1000 оборотов в минуту. Через определенные промежутки времени проводили измерение размера частиц.

Результаты исследования

Частицы ЛНП склонны к самопроизвольной ассоциации. В условиях инкубации суспензии частиц ЛНП при 37 °С при постоянном перемешивании происходит так называемая спонтанная, не индуцированная внешними факторами ассоциация ЛНП. Для оценки ассоциации ЛНП и влияния плюроников на этот процесс мы использовали два метода - метод флуктуации светопропускания и метод квазиупругого лазерного рассеивания. Во всех случаях результаты, полученные при помощи двух методов оценки ассоциации ЛНП, полностью совпадали (рис. 1 и 2).

В данной работе мы провели сравнительное исследование действия плюроников с различными гидрофильно-липофильными свойствами на процесс ассоциации ЛНП. Так, нами были использованы плюроник F68, обладающий высоким значением гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) 29 и выраженными гидрофильными свойствами, плюроник L61, характеризующийся значительной гидрофобностью (ГЛБ 3), и плюроник Р85

Рисунок 1. Кинетические кривые изменения среднего размера частиц ЛНП под влиянием плюроника Р85. Среда инкубации - ИФБ, рН 7,4, концентрация ЛНП 2,5 мг белка / мл, температура инкубации 37 °С, скорость перемешивания 1000 об/мин. Кривая (1) - суспензия ЛНП в отсутствие плюроника Р85, кривые (2) и (3) в присутствии, соответственно, 0,1 % и 0,01 % плюроника Р85

с умеренными гидрофильными и липофильными свойствами (ГЛБ 16).

На рис. 1 приведены типичные кинетические кривые изменения среднего размера частиц ЛНП в случае спонтанной ассоциации и в присутствии плюроника Р85. Видно, что при спонтанной ассоциации происходит увеличение среднего размера частиц в зависимости от времени инкубации (рис. 1). В то же время при добавлении различных концентраций плюроника Р85 формирование ассо-циатов заметно ингибировалось. Так, добавление к суспензии ЛНП до начала инкубации плюроника Р85 в концентрации 0,1 % (в/в %) ингибировало процесс ассоциации после 4,5 часа инкубации на 93 % (рис. 1). Эффект подавления зависел от концентрации плюроника, в концентрации Р85 0,01 % наблюдалось подавление ассоциации после 4,5 часа инкубации на 79 % (рис. 1).

Аналогичные данные были получены методом флуктуации светопропускания. На рис. 2 представлены типичные кривые изменения флуктуации светопропускания суспензии ЛНП в присутствии различных концентраций плюроника в инкубационной среде. Как видно из рисунка 2, наименьшая концентрация плюроника Р85 - 0,005 % - не оказывала влияния на процесс ассоциации ЛНП. Таким образом, очевидно, что плюроник Р85 является ингибитором ассоциации ЛНП только в концентрации близкой или большей, чем критическая кон-

центрация мицеллообразования (ККМ) (табл. 1), или близкой к ней, которая составляет в его случае 0,03 %.

Когда плюроник Р85 добавлялся в суспензию ЛНП в ходе инкубации, т. е. когда процесс ассоциации частиц уже был инициирован и произошло увеличение среднего размера частиц ЛНП, также наблюдалась остановка дальнейшей ассоциации липопротеидов (рис. 3). Плюроник Р85 в концентрации 0,1 % добавлялся к суспензии ЛНП после первого и после второго часа инкубации, в обоих случаях не происходило дальнейшего увеличения среднего размера частиц, т. е. ассоциация полностью подавлялась. Необходимо отметить, что добавление плюроника не вызывало уменьшение среднего размера частиц, можно предположить, что под действием плюроника не происходило диссоциации образовавшихся ассоциатов ЛНП. Следовательно, ассоциация имеет необратимый характер и является, скорее всего, слиянием частиц ЛНП.

Помимо плюроника Р85, мы изучили способность двух других плюроников ингибировать ассоциацию ЛНП. Было показано, что плюроник F68, характеризующийся выраженными гидрофильными свойствами и высоким значением ГЛБ, не оказывает влияния на процесс ассоциации частиц ЛНП. На рис. 4 приведены типичные кинетические кривые изменения флуктуации светопропускания

41

Рисунок 2. Кинетические кривые изменения флуктуации светопропускания суспензии под влиянием плюроника Р85. Среда инкубации - ИФБ, рН 7,4, концентрация ЛНП 0,5 мг белка / мл, температура инкубации 37°С, скорость перемешивания 100 об / мин. Кривая (1) - суспензия ЛНП в отсутствие плюроника Р85, кривые (2), (3) и (4) в присутствии, соответственно, 0,005, 0,1 и 0,01 % плюроника Р85

Таблица 1. Характеристики использованных в работе плюроников.

Плюроник Молекулярная масса, Да Критическая концентрация мицеллообразования, % Гидрофильно-липофильный баланс

Ь61 2000 > 0,022 3

Р85 4600 0,005-0,05 16

F68 8400 > 0,4 29

в присутствии плюроника F68 в концентрации 0,4 % и в отсутствие плюроника (рис. 4). Использование большей концентрации плюроника F68 (4 %) также не приводило к угнетению процесса ассоциации ЛНП (данные не приводятся). С другой стороны, применение обладающего выраженными гидрофобными свойствами и низким значением ГЛБ плюроника L61 приводило к подавлению ассоциации ЛНП. Так, в концентрации 0,022 % плюроник L61 ингибировал рост флуктуации светопропускания суспензии ЛНП после 2 часов инкубации на 78 % (рис. 5). Использование большей концентрации плюроника L61 - 0,22 % приводило к почти полному подавлению процесса ассоциации ЛНП, а применение меньшей концентрации -

42

0,0022 % не влияло на ассоциацию частиц ЛНП (данные не приводятся).

Таким образом, плюроники с выраженными гидрофобными свойствами (Р85 и L61) в концентрациях близких к ККМ или больших ККМ ингибировали процесс ассоциации ЛНП, в то время как «гидрофильный» плюроник F68 в любой концентрации не влиял на ассоциацию ЛНП.

Ассоциация частиц ЛНП может выражаться как в обратимой агрегации частиц, так и в необратимом слиянии модифицированных частиц ЛНП. Механизмы ассоциации частиц ЛНП до сих пор полностью не ясны. Имеются данные, свидетельствующие о том, что при модификации ЛНП происходят изменения поверхностного гидрофильного

Рисунок 3. Кинетические кривые изменения среднего размера частиц ЛНП под влиянием плюроника Р85. Среда инкубации - ИФБ, рН 7,4, концентрация ЛНП 2,5 мг белка / мл, температура инкубации 37 °С, скорость перемешивания 1000 об/мин. Кривая (1) - суспензия ЛНП в отсутствие плюроника Р85, кривая (2) - в присутствии 0,1 % плюроника Р85, добавленного после двух часов инкубации, кривая (3) - в присутствии 0,1 % плюроника Р85, добавленного после одного часа инкубации

Рисунок 4. Кинетические кривые изменения флуктуации светопропускания суспензии ЛНП под влиянием плюроника F68. Среда инкубации - ИФБ, рН 7,4, концентрация ЛНП 0,5 мг белка / мл, температура инкубации 37 °С, скорость перемешивания 100 об/мин. Кривая (1) - суспензия ЛНП в отсутствие плюроника F68, кривая (2) в присутствии 0,4 % плюроника F68

•чР

О4

CQ

:

5 I

ш

о

с

6 с

о

N

ф

со

и

к

S

е

1

2

Время, минуты

Рисунок 5. Кинетические кривые изменения флуктуации светопропускания суспензии ЛНП под влиянием плюроника L61. Среда инкубации - ИФБ, рН 7,4, концентрация ЛНП 0,5 мг белка / мл, температура инкубации 37 °С, скорость перемешивания 100 об/мин. Кривая (1) - суспензия ЛНП в отсутствие плюроника L61, кривая (2) в присутствии 0,022% плюроника L61.

слоя частицы, нарушения ее гидратно-сольватной оболочки, приводящие к повышению гидрофоб-ности частицы и потере ее стабильности в растворе [10, 13]. На основании этого, предполагается, что ассоциация частиц ЛНП обусловлена гидрофобными взаимодействиями модифицированных частиц ЛНП.

Мы изучили влияние плюроников на процесс ассоциации ЛНП. Плюроники состоят из липо-фильной части, образованной окисью пропилена, и гидрофильной части, построенной окисью этилена, и имеют следующую структуру: (ОЭ^-(ОП) М-(ОЭ)^ Такая структура определяет основные свойства плюроников, в том числе способность взаимодействовать с биологическими мембранами и вызывать в них структурные перестройки

[16]. Важными характеристиками плюроников являются критическая концентрация мицелло-образования, при превышении которой происходит сборка отдельных сополимеров в мицеллы, а также гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ), отражающий соотношение гидрофильных и гидрофобных свойств вещества. В настоящее время существует большое количество плюроников, отличающихся количеством мономеров ОЭ и ОП и, соответственно, характеризующихся разными гидрофильными и липофильными свойствами, молекулярной массой и ККМ [17]. Так, полимеры,

44

характеризующиеся значительным количеством остатков ОП и небольшим ОЭ, отличаются высокой липофильностью относительно низкими ККМ и ГЛБ, например, плюроник L61. Напротив, плюроники, в составе которых ОЭ преобладает, гидрофильны и характеризуются высокими значениями ККМ и ГЛБ - плюроник F68. Наконец, существует группа плюроников с промежуточными свойствами, например Р85.

Мы исследовали способность плюроников Р85, L61 и F68 с различными характеристиками ККМ и ГЛБ, указанными в таб. 1. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что способность амфифильных сополимеров окиси пропилена и окиси этилена ингибировать ассоциацию ЛНП прямо зависит от выраженности гидрофобных свойств плюроника. Плюроники с выраженными и умеренными гидрофобными свойствами L61 и Р85 способны значительно ингибировать ассоциацию ЛНП, но происходит это только в концентрации, близкой к критической концентрации мицеллообразования. Из этого можно сделать вывод о том, что именно мицеллярная форма плюроника способна вызывать ингибирование ассоциации частиц ЛНП, а унимеры плюроников ингибирующими свойствами не обладают. Эти данные подтверждают предположение, впервые выдвинутое КЬюо и соавторами [10], о роли ги-

От редакции

дрофобных взаимодействий в процессе ассоциации ЛНП. Предположительно в ходе инкубации при постоянном перемешивании происходят конформационные изменения структуры ЛНП, приводящие к экспозиции гидрофобных участков на поверхности частиц. Далее начинает происходить взаимодействие гидрофобных участков разных частиц, приводящее к ассоциации ЛНП. В случае присутствия в суспензии ЛНП амфифиль-ных веществ липофильная часть амфифильной молекулы может взаимодействовать с гидрофобными доменами на поверхности частицы ЛНП, экранировать их и, таким образом, предотвращать процесс ассоциации ЛНП.

В процессе атерогенеза уровень рН во внеклеточном пространстве атеросклеротических поражений снижается [18]. Бпеск и соавторы исследовали эффект, который оказывает низкий, но физиологичный уровень рН на ключевой процесс атерогенеза - агрегацию модифицированных ЛНП. Чем ниже был уровень рН, тем более интенсивно происходила агрегация предварительно обработанных сфингомиелиназой частиц. При рН 5,56,0 агрегаты были значительно больше (>1 мкм), чем образованные в нейтральной среде (100200 нм). Обработка сфингомиелиназой приводила к существенному резкому снижению а-спиралей и одновременному увеличению р-листов в структуре апоВ-100. Агрегация частиц была вызвана взаимодействием между вновь экспонированными сегментами апоВ-100. Микроэмульсия, состоящая из ЛНП, обедненных апоВ-100, не была способна образовывать крупные агрегаты. Агрегация ЛНП, вызванная сфингомиелиназой, прекращалась при снижении температуры до 15 °С, при данной также замедляются изменения в конформации апоВ-100, которые вызываются протеолиической деградацией апо-В 100 сфингомиелиназой или взаимодействием с частицами ЛВП. Гидролиз сфингомиелина способствует экспонированию чувствительных к протеазе участков апоВ-100,

взаимодействие которых приводит к последующей агрегации частиц. Агрегаты ЛНП могут приводить к задержке липидов ЛНП в закисленных участках интимы артерий, пораженных атеросклерозом. В другой работе была продемонстрирована связь склонности к ассоциации и накоплению ЛНП, обедненных сфинголипидами, в интиме сосудов у мышей с измененным генотипом [19]. Это в очередной раз подтверждает необходимость предотвращения самоагрегации модифицированных ЛНП.

Плюроники, использованные нами как ингибиторы ассоциации ЛНП, ранее в данном качестве не использовались. Мог^а и соавторы показали, что некоторые плюроники, например L81, изменяют вторичную структуру апоВ-100, увеличивая локальную гидратацию, таким образом, ингибируя секрецию хиломикронов за счет модификации конформации апоВ-100 в первичных липопроте-идах [20]. С другой стороны, МодЫин и соавторы изучили свойства использованного плюроника F68. К сожалению, внутривенное введение данного плюроника очень редко [21], но вызывает гиперчувствительность у некоторых лиц. МодЫин и соавторы продемонстрировали, что повышенный уровень ЛНП и ЛВП (липопротеидов высокой плотности) в плазме крови подавляет активацию комплемента, вызванную данным плюроником. Это свидетельствует о том, что ЛНП имеют сходство с данным плюроником.

Описанная в работе возможность модуляции ассоциации ЛНП различными плюрониками можно рассматривать как предпосылку к созданию лекарственного средства, которое будет влиять на развитие атеросклероза на самой начальной стадии - стадии накопления липидов в сосудистой стенке.

Конфликт интересов

Работа поддержана Министерством образования и науки России.

Список литературы

1. Anichkov N. N. Particular pathological anatomy. Issue II. Heart and vessels. Second edition. Moscow - Leningrad:

Medgiz; 1947. Russian (Аничков Н. Н. Частная патологическая анатомия. Вып. II. Сердце и сосуды. Второе издание. М. ; Л. : Медгиз , 1947).

2. Smith E.B. The relationship between plasma and tissue lipids in human atherosclerosis. Adv Lpid Res. 1974; 12:

1-49.

3. Mahley R. W, Innerarity T.L,, Weisgraber K.H, Oh S. Y. Altered metabolism (in vivo and in vitro) of plasma lipoproteins after selective modification of lysine residues of apoproteins. J Clin Invest. 1979; 64: 743-50.

4. Alaupovic P. Apoliproproteins and lipoproteins. Atherosclerosis, 1971; 13 (2): 141-6.

5. Cookson F. B. The origin of foam cells in atherosclerosis. Br J Exp Pathol, Feb 1971; 52 (1): 62-96. Bates S. R, Wissler R. W. Effect of hyperlipemic serum on cholesterol accumulation in monkey aortic medial

cells. Biochim Biophys Acta. 1976; 450 (1): 78-88.

7. Ross R, Harker L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. 1976; 193: 1094-100.

45

8. Goldstein J. L, Ho Y. K. , Basu S. K. et al. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein,producing massive cholesterol deposition. Proc Natl Acad Sci USA. 1979; 76: 333-7.

9. Fogelman A. M,Shechter I, Seager J. et al. Malondialdehyde Alteration of Low Density Lipoproteins Leads to Cholesteryl Ester Accumulation in Human Monocyte-Macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980; 77: 2214-18.

10. Khoo J. C , Miller E,,McLoughlin P. et al. Prevention of low density lipoprotein aggregation by high density lipoprotein or apolipoprotein A-I. J. Lipid Res. 1990; 31: 645.

11. Lopes-Virella M.F, Klein R.L,Lyons T. J. et al. Glycosylation of low-density lipoprotein enhances cholesteryl ester synthesis in human monocyte-derived macrophages. Diabetes. 1988; 37: 550.

12. Tertov V. V, Sobenin I. A, Gabbasov Z. A. et al. Lipoprotein aggregation as an essential condition of intracellular lipid caused by modified low density lipoproteins. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 16: 489.

13. Talbot R. M, del Rio J, D , Weinberg P. D. Effect of fluid mechanical stresses and plasma constituents on aggregation of LDL. of Llipid Research. 2003; 44: 837.

14. Tertov V. V, Kaplun V. V, Orekhov A.A. Low-density lipoprotein modification occurring in human plasma possible mechanism of in vivo lipoprotein desialylation as a primary step of atherogenic modification. Atherosclerosis. 1998; 138: 183-95.

15. Tertov V. V, Sobenin I. A, Gabbasov Z. A. et al. Multiple-modified desialylated low density lipoproteins that cause intracellular lipid accumulation. Isolation,fractionation and characterization. Laboratory Investigation. 1992; 67: 665-75.

16. Vinogradov S. V, Batrakova E. V, Li S. et al. Mixed polymer micelles of amphiphilic and cationic copolymers for delivery of antisense oligonucleotides. J. Drug Target 2004; 12: 517.

17. Batrakova E. V, Li S , Alakhov V. Y, Miller D. W. et al, Optimal structure requirements for pluronic block copolymers in modifying P-glycoprotein drug efflux transporter activity in bovine brain microvessel endothelial cells. Farmacol. Exp. Ther. 2003; 304: 845.

18. Sneck M , Nguyen S. D , Pihlajamaa T. et al. Conformational changes of apoB-100 in SMase-modified LDL mediate formation of large aggregates at acidic pH, J Lipid Res. 2012; 53 (9): 1832-9.

19. Deevska G.M ,Sunkara M,Morris A.J. et al, Characterization of secretory sphingomyelinase activity,lipoprotein sphingolipid content and LDL aggregation in ldlr-/- mice fed on a high-fat diet. Biosci Rep. 2012; 32 (5): 479-90.

20. Morita S.Y,Kawabe M,Nakano M. et al, Pluronic L81 affects the lipid particle sizes and apolipoprotein B conformation. Chem Phys Lipids. 2003; 126 (1): 39-48.

21. Moghimi S. M, Hunter A. C, Dadswell C. M. et al. Causative factors behind poloxamer 188 (Pluronic F68 , Flocor)-in-duced complement activation in human sera. A protective role against poloxamer-mediated complement activation by elevated serum lipoprotein levels. Biochim Biophys Acta. 2004; 1689 (2): 103-13.