ЯЧЕЙКА ДЛЯ МНОГОПАРАМЕТРИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК БИОЛОГИЧЕСКИХ СУСПЕНЗИЙ

Полезная модель относится к молекулярной биологии и биотехнологии.
Уровень техники.
Для проведения медико-биологических и токсикологических экспериментов с использованием суспензии биологических объектов (клеточные суспензии, суспензии бактерий, дрожжей, микроорганизмов и внутриклеточных органелл) в настоящее время разработано и доступно большое число различных измерительных устройств и приборов для работы с биологическими объектами в самых разных состояниях. Это измерительные приборы, основанные на измерении оптических, электрических, механических характеристик биологических суспензий. Объединяющей особенностью всего разнообразия измерительной техники является их предназначение для измерения, как правило, одной характеристики биологического объекта (это может быть концентрация выбранных ионов, температура объекта, его оптические параметры, физические размеры, плотность, электрическая проводимость, и другие). За небольшим исключением, эти приборы позволяют проводить измерения и дают информацию о выбранном параметре в каждый данный момент времени, и не позволяют отслеживать кинетику изменения выбранной характеристики во времени. До появления компьютеров и современных приборов, снабженных соответствующими программами, позволяющими проводить долговременные наблюдения во времени, всякая регистрация изменения характеристик биологических объектов, требовала объединения нескольких независимых приборов в один измерительный комплекс.
В авторском свидетельстве СССР №1656438 описано устройство для исследования жидких сред, в котором эксплуатационные свойства улучшены за счет конструкции, обеспечивающей возможность радиального размещения измерительных электродов и датчиков для замены в случае повреждения и раздельного получения данных о физико-химических характеристиках биологических компонентов. Устройство содержит измерительную ячейку, которая термостатируется прокачкой жидкости через полость в корпусе ячейки. В ячейке сформированы сквозные каналы, в которых установлены электроды для измерения уровня кислорода и раздельные каналы для фотодиода и для светодиода. В объеме ячейки расположен магнитный элемент для перемешивания рабочей суспензии [1].
Изобретение РФ №2225437 описывает аппарат, который содержит термостатируемую ячейку, внутри которой выполнена кювета в виде шестигранной призмы, снабженная пробкой с отверстием для внесения проб и реагентов, датчик потребления кислорода и электронный модуль для передачи сигналов с датчика на компьютер. Термостатируемая ячейка также снабжена датчиками, позволяющими регистрировать дополнительно мембранный потенциал, концентрацию ионов кальция и набухание. Датчики имеют форму усеченного конуса и расположены горизонтально в отверстиях стенки ячейки перпендикулярно граням шестигранной кюветы [2].
+
+
+
2+
В известных устройствах затруднена возможность многопараметрического мониторинга концентраций нескольких ионов при использовании стандартных датчиков. Известно взаимное влияние стандартных датчиков, которые генерируют большие токи (кислородный электрод) на работу высокоомных потенциометрических датчиков (Н, К, ТРР, Са), которое препятствует мониторингу разных характеристик суспензии в одном объеме.
Задача разработки полезной модели состоит в том, чтобы предоставить исследователю возможность расширить спектр измеряемых параметров при многопараметрическом мониторинге концентраций разных характеристик суспензии в одном объеме и исключить возможность взаимного влияния регистрируемых характеристик биологического объекта.
Технический результат использования полезной модели заключается в обеспечении возможности быстрого и одновременного многопараметрического мониторинга характеристик (концентраций измеряемых параметров) биологических объектов в суспензии (митохондрий, клеток и т.п.) и в получении более точной информации о параметрах процесса медико-биологических исследований, касающихся воздействия на изучаемый объект токсических веществ, лекарств и других агентов.
Сущность технического решения полезной модели.
+
+
2+
Для достижения вышеуказанных целей объектом полезной модели является ячейка для многопараметрического мониторинга физико-химических характеристик биологических суспензий, содержащая термостатируемый рабочий объем, содержащий суспензию биологических объектов, магнитный смеситель для обеспечения механического перемешивания суспензии, первый канал с установленным датчиком для измерения концентрации растворенного кислорода и каналы для мониторинга других параметров суспензии. В ячейке, изготовленной из биологически инертного материала, выполнены второй, третий, четвертый и пятый каналы, в которых установлены оптические волоконные жгуты, с возможностью доставки света возбуждения в суспензию, и сбора света флуоресценции из ячейки для одновременной регистрации 5 параметров суспензии - концентрации растворенного кислорода, и свободных ионов Н, К, Са и редокс характеристики (NADH, FAD). Регистрацию изменения этих параметров биологического объекта во времени (кинетику), осуществляют путем последовательного поэтапного включения источника света, подключенного к соответствующему волоконному жгуту, размещенному во втором, третьем, четвертом и пятом каналах ячейки, и синхронизированного во времени включения устройства для соответствующего сбора света флуоресценции и передачи его к детектору.
Волоконные жгуты содержат равномерно распределенные волокна для возбуждения и волокна для сбора флуоресценции, которые образуют гексагональную конфигурацию распределения волокон внутри каждого держателя жгута закрепленного в соответствующем канале ячейки.
Другой аспект полезной модели связан с выбором материала оптических волокон, где волокно для доставки света возбуждения в суспензию выполняют из кварца, а волокно сбора света флуоресценции из ячейки выполняют из стекла. При этом в жгуте содержится не менее 7 волокон, предназначенных для возбуждения, и около 2000 оптических волокон, предназначенных для регистрации флуоресценции.
Следующий аспект полезной модели обусловлен малым объемом измерительной ячейки, который лежит в пределах от 0,5 мл до 1,0 мл.
Другой аспект полезной модели связан с выбором условий проведения измерения параметров, где измерение проводят в термостатируемом объеме с точностью поддержания 0,1°С выбранной температуры в диапазоне температур от +25 до +37°С.
Следующий аспект полезной модели связан с выбором типа материала ячейки для исследования суспензий, которые входят в группу, состоящую из, выделенных митохондрий, клеток млекопитающих, бактерий, дрожжей, где в качестве биологически инертного материала используют органическое стекло или капролон.
Краткое описание чертежей.
На фиг. 1 приведена структурная схема ячейки.
На фиг. 2 приведена конструкция волоконного жгута.
Описание полезной модели.
+
+
2+
В ходе исследовательской работы, направленной на изучение биологических суспензий, возникла необходимость детального и последовательного изучения базовых функций суспензии, таких как трансмембранный электрический потенциал на внутренней мембране митохондрий или на мембране клеток и бактерий, определение скорости потребления кислорода по изменению концентрация растворенного кислорода в биологических суспензиях которые содержат выделенные митохондрии, суспензии клеток млекопитающих, бактерий и дрожжей, а также концентрации растворимых жизненно-важных физиологических ионов таких как ионов К, Ни Са.
Для проведения измерений указанных параметров биологических суспензий необходимо осуществлять перемешивание суспензии в ходе измерения, выполнять термостатирование ячейки и датчиков при постоянной, заданной в начале выполнения эксперимента, температуре.
Для осуществления многопараметрического мониторинга физико-химических характеристик биологических суспензий был выбран оптический способ измерения сигналов флуоресценции при регистрации концентрации разных типов ионов.
+
+
2+
В последние годы были синтезированы флуоресцентные красители, которые позволяют количественные измерения концентрации свободных ионов Н, К и Са, а также мембранного потенциала [3]. Анализ имеющихся данных позволил идентифицировать необходимые флуоресцентные краски, которые позволят заменить потенциометрические датчики по всем интересующих ионов.
2+
Для измерения концентрации ионов Са возможно использовать краски, входящие в группу Fluo-5N, Fluo-4AM, Calcein-AM [4]. Для измерения концентрации водорода Н+ можно использовать краски, входящие в группу FTUG, BCECF [5]. Известны флуоресцентные красители для измерения мембранного потенциала, входящие в группу DiBAC4(3), Safranin О, ТМРМ [6]. Регистрации редокс состояния биологических объектов не требует специальных красителей, потому что соединения, непосредственно принимающие участие в этих реакциях (митохондриальные и внутриклеточные пиридиновые нуклеотиды, митохондриальные и внутриклеточные флавиновые нуклеотиды [7]) сами являются флуоресцентными соединениями, и находятся в биологических объектах в количествах, достаточных для возбуждения регистрируемой флуоресценции.
Основываясь на спектральных характеристиках, идентифицированных флуоресцентных красителей, выбраны типы оптических волокон, которые позволяют доставку света возбуждения в суспензию биологических объектов, и сбор света флуоресценции. Предложена конструкция многоканальной ячейки с многопараметрической регистрацией нескольких характеристик суспензии биологических объектов с использованием оптического волоконного жгута (зонд Y типа) [8], обеспечивающего как доставку света возбуждения в ячейку, так и обеспечивающего сбор света флуоресценции за счет отражения и обратного рассеяния.
На фиг. 1 приведена структурная схема многоканальной ячейки. Ячейка (1) содержит реакционный объем (2) для размещения суспензии. Первый канал (3) сформирован для установки датчика измерения уровня кислорода. Второй (4), третий (5), четвертый (6) и пятый каналы (7) сформированы для установки держателей оптических волоконных Y жгутов (8). На фиг. 2 приведен внешний вид жгута, состоящего из двух типов световодов. Одну часть световодов, входящих в состав оптоволоконного жгута, образующих канал передачи света возбуждения в рабочий объем ячейки с биологической суспензией подключают через разъем держателя (9) к источнику света. В качестве источников света флуоресценции (или светорассеяния) используются светодиоды (заданной длины волны для каждого из оптических каналов), которые независимо «поджигаются» от источника питания, который управляется прикладной программой. Эти светодиоды расположены в индивидуальных излучателях, где они смонтированы вместе с оптическим коллиматором/линзами и узкополосным светофильтром на заданную длину волны. Свет возбуждения флуоресценции фокусируется и передается в объем суспензии через общий торец держателя жгута (8). Данные световоды выполнены из кварца. Вторая часть световодов, входящих в состав оптоволоконного жгута, образует канал сбора возбужденной флуоресценции из суспензии. Эту часть световодов подключают через разъем (10) к входу детектора флуоресценции.
Второй тип световодов изготавливают из стекла. При формировании общей части оптического жгута первую и вторую часть световодов равномерно перемешивают друг с другом для образования гексагональной конфигурации (11), представленной на фиг. 2 внутри пластикового держателя жгута (8). Держатели жгутов экспонируются в рабочий объем ячейки через сквозные отверстия второго (4), третьего (5), четвертого (6) и пятого каналов (7). Общее число световодов, используемых для изготовления жгута, содержит не менее 7 волокон, предназначенных для возбуждения, и около 2000 оптических волокон, предназначенных для регистрации флуоресценции.
Геометрические размеры комбинированного торца, в котором сходятся волокна возбуждения и регистрации флуоресценции с учетом диаметра и высоты измерительной ячейки не превышает 2.0-3.0 мм.
В состав устройства для непрерывного многопараметрического мониторинга физико-химических характеристик биологических суспензий дополнительно к ячейке, снабженной световыми «Y» образными жгутами входят источник питания, блок питания источников излучения (света) содержащие светофильтры с разными длинами волн, регистратор излучения и детекторы, блок для подключения кислородного электрода, узлы контроля и поддержания параметров температуры и скорости работы магнитной мешалки, блоки усилителей сигналов и АЦП. Источник питания обеспечивает и поддерживает работу всех остальных узлов прибора. Сигналы с выходов регистраторов через АЦП передается на компьютер с монитором. Управление подачей возбуждающего света и съем данных излучения флуоресценции осуществляется с помощью программы, которая позволяет производить запись и хранение полученной информации.
Устройство работает следующим образом. На первом этапе осуществляют подготовку суспензии и вспомогательных растворов. В зависимости от задач эксперимента выбирают скорость механического перемешивания суспензии от 300 до 700 об/мин, предпочтительно 600 об/мин и задают температуру термостатирования ячейки в диапазоне температур от +25 до +37°С, например, 30°С. В объем измерительной ячейки вводят от 0,5 до 1,0 мл, предпочтительно 1,0 мл экспериментального водного раствора и закрывают измерительный объем герметичной крышкой. Определяют тактовую частоту работы датчиков и запускают программу регистрации показаний датчиков установленных на ячейке. После установления «базовой линии» показаний датчиков, в объем измерительной ячейки через отверстие в герметичной крышке вносится определенный объем биологической суспензии выбранной из группы, состоящей из выделенных митохондрий, суспензии клеток млекопитающих, суспензии бактерий, суспензии дрожжей. Каждую следующую добавку вводят с временным интервалом, необходимым для достижения стационарного показания датчиков. Регистрируемые параметры датчиков сохраняют в компьютере и анализируют.
Предлагаемая полезная модель позволяет повысить эффективность работы устройства и обеспечить возможность многопараметрического мониторинга концентраций измеряемых параметров митохондрий или клеток. Устройство обеспечивает возможность расширить зону применения и обеспечить получение более точной информации о параметрах процесса медико-биологических исследований, касающихся воздействия на изучаемый объект токсических веществ, лекарств и других агентов.
Источники информации
1. Холмухамедов Э.Л. Устройство для исследования жидких сред // Авторское свидетельство № SU 1656438 (15.06.1991).
2. Красников Б.Ф. АППАРАТ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА МИТОХОНДРИЯМИ ИЛИ КЛЕТКАМИ // Патент РФ № RU 2225437 (10.03.2004)
3. Spence М.Т.Z., Johnson I.D. (2010). The molecular probes handbook: a guide to fluorescent probes and labeling technologies. Live Technologies Corporation, Carlsbad, CA.
2+
4. Rajdev S., Reynolds I.J. Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Caconcentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons // Neurosci Lett. 1993. 162(1-2). 149-152.
5. Gotor R., Ashokkumar P., Hecht M., Keil K., Rurack K. Optical pH Sensor Covering the Range from pH 0-14 Compatible with Mobile-Device Readout and Based on a Set of Rationally Designed Indicator Dyes // Anal Chem. 2017. 89(16). 8437-8444.
6. Wolff C., Fuks В., Chatelain P. Comparative study of membrane potential-sensitive fluorescent probes and their use in ion channel screening assays // J Biomol Screen. 2003. 8(5). 533-543.
7. Skala M., Ramanujam N. Multiphoton redox ratio imaging for metabolic monitoring in vivo // Methods Mol Biol. 2010. 594155-162.
8. Зонды отражения/обратного рассеяния с расширенным диапазоном. Материалы фирмы Ocean Optics (https://oceanoptics.ru/probes.html).