ЛЕЧЕНИЕ РАКА ГОЛОВНОГО МОЗГА ОНКОЛИТИЧЕСКИМ АДЕНОВИРУСОМ
CEREBRAL CANCER TREATMENT WITH ONCOLYTIC ADENOVIRUS

По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США № 61/836230, поданной 18 июня 2013 года, полное содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
A. Область изобретения
Изобретение в целом относится к области медицины и онкологии. Более конкретно, оно относится к композициям и способам лечения глиом у пациента с применением онколитических аденовирусов.
B. Описание предшествующего уровня техники
Развитие рака понимают как кульминацию сложных многостадийных биологических процессов, возникающих в результате накопления генетических перестроек. Многие, если не все, эти перестройки затрагивают специфические гены, регулирующие клеточный рост. Эти гены обычно делят на две категории: протоонкогены и опухолеподавляющие гены. Мутации генов обоих классов в целом обеспечивают преимущественный рост для клетки, содержащей измеренный генетический материал.
Функция опухолеподавляющих генов, в противоположность протоонкогенам, состоит в антагонизме пролиферации клеток. Когда опухолеподавляющий ген инактивирован, например, точечной мутацией или делецией, нарушается регуляторный механизм клетки для контролирования роста. Мутации и/или утрата функции опухолеподавляющего гена ретинобластомы ассоциированы с опухолеобразованием. В некоторых случаях опухоли головного мозга представляют собой метастазы в головной мозг из первичной опухоли за пределами центральной нервной системы (CNS). Опухоли головного мозга, развившиеся из метастазов, как правило, являются более распространенными, чем первичные опухоли головного мозга. Наиболее распространенными первичными опухолями, которые метастазируют в головной мозг, являются рак легкого, молочной железы, меланома и рак почки. Эти метастазы в головной мозг обычно находятся во множественных очагах, но также могут возникать солитарные метастазы.
Генная терапия представляет собой перспективное лечение опухолей головного мозга, включая глиомы, поскольку традиционные виды лечения, как правило, безуспешны и являются токсичными. В дополнение, идентификация генетических нарушений, способствующих злокачественным опухолям, предоставляет ключевую молекулярно-генетическую информацию, помогающую в дизайне генной терапии. Генетические нарушения, задающие прогрессирование опухолей, включают в себя инактивирование опухолеподавляющих генов и суперэкспрессию ряда факторов роста и онкогенов. Лечение опухолей может быть достигнуто посредством предоставления полинуклеотида, кодирующего терапевтический полипептид или другое лекарственное средство, которое выделяет мутации и полученную в результате аберрантную физиологию опухолей. Именно эти мутации и аберрантная физиология служат отличительным признаком опухолевых клеток от нормальных клеток. Опухолеселективный вирус может представлять собой перспективный инструмент для генной терапии. Последние достижения в области знаний, как вирусы реплицируются, применяются для конструирования опухолеселективных онколитических вирусов. Было показано, что в глиомах три вида вирусов являются пригодными в животных моделях: реовирусы, которые могут реплицироваться избирательно в опухолях с активированным метаболическим путем ras (Coffey et al, 1998); генетически измененные вирусы herpes simplex (Martuza et al, 1991; Mineta et al, 1995; Andreanski et al, 1997), включая вирусы, которые могут быть активированы посредством дифференциальной экспрессии белков в здоровых и раковых клетках (Chase et al, 1998); и мутантные аденовирусы, которые неспособны экспрессировать белок ElB55kDa и применяются для лечения 53-мутантных опухолей (Bischof et al, 1996; Heise et al, 1997; Freytag et al, 1998; Kirn et al, 1998). Взятые вместе, эти сообщения подтверждают значимость онколитических вирусов в качестве противораковых агентов. Во всех трех системах целью является внутриопухолевое распределение вируса и способность избирательно убивать раковые клетки. Генетически модифицированные аденовирусы, которые выделяют клеточные метаболические пути в ключевых точках, обладают и сильным и селективным противораковым действием в глиомах.
Отмечалась значимость выделения метаболического пути Rb для лечения глиом, поскольку нарушения метаболического пути pl6/Rb/E2F присутствуют в большинстве глиом (Fueyo et al, 1998a; Gomez-Manzano et al, 1998). Выделение этого метаболического пути посредством замены потери активности онкосупрессора через перенос генов pi 6 и Rb продуцирует цитостатическое действие (Fueyo et al, 1998a; Gomez-Manzano et al, 1998). Перенос E2F-1 приводит к мощному противораковому действию, поскольку экзогенный E2F-1 дикого типа индуцирует апоптоз и ингибирует опухолевый рост in vivo (Fueyo et al, 1998b). Однако лечение глиомных опухолей человека существующими аденовирусными конструктами реально не может воздействовать на значительные части опухоли, главным образом, поскольку аденовирусные векторы с недостаточной репликацией являются неспособными реплицироваться и инфицировать другие клетки, перенося таким образом экзогенную нуклеиновую кислоту достаточным количествам раковых клеток (Puumalainen et al, 1998). Хотя выделение метаболического пути pl6/Rb/E2F продуцирует противораковое действие in vitro, данное несовершенство векторной системы ограничивает терапевтическое действие гена in vivo.
Имеется сохраняющаяся потребность в дополнительных видах лечения рака, в частности опухолей головного мозга, включая создание дополнительных онколитических вирусов, которые являются способными к клеткоспецифичной репликации. Дополнительные виды лечения включают аденовирус с терапевтической способностью или со способностью отслеживания in vivo.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Таким образом, настоящее изобретение, относится к способу лечения глиомы у пациента-человека, включающему (a) идентификацию пациента, имеющего глиому; и (b) контактирование глиомы с онколитическим аденовирусом с ElA полипептидом, который не может связывать Rb, и включает фибриллярный белок с аминокислотой RGD, вставленной в HI домен, при этом лечение приводит к одному или более из (i) редукции опухолевой массы больше чем на 25%; (ii) шестимесячной выживаемости без прогрессирования; и (iii) некрозу опухоли, и указанное лечение не вызывает побочное действие, исходящее от указанного онколитического аденовируса, то есть является достаточным, чтобы вызвать завершение указанного лечения. Наблюдаются два или более из (i)-(iii) или наблюдаются все три из (i)-(iii). Больной также может продемонстрировать аутоиммунный ответ на указанную глиому. Опухолевый ответ может включать меньшие определенные границы опухоли, как определено посредством МРТ с контрастированием.
Онколитический аденовирус может представлять собой Δ24 аденовирус. СтадияСтадия (a) может включатьвизуализацию опухоли, и указанный способ может дополнительно включатьполучение биопсии указанной опухоли после стадиястадии (a) и перед стадиястадией (b). Глиома может представлять собой астроцитому, олигодендроглиому, анапластическую глиому, глиобластому, эпендимому, менингиому, опухоль области эпифиза, опухоль сосудистого сплетения, нейроэпителиальную опухоль, эмбриональную опухоль, периферическую нейробластическую опухоль, опухоль черепно-мозговых нервов, опухоль системы кроветворения, герминогенную опухоль или опухоль области турецкого седла. Глиома может быть рецидивирующей и/или глиома может представлять собой безуспешную одну или более терапию первичной глиомы.
Глиома может быть резектабельной, либо нерезектабельной. Глиома может быть резецирована после указанного лечения. Пострезекционное ложе опухоли может быть обработано указанным онколитическим аденовирусом. Глиома может контактировать с аденовирусом посредством доставки аденовируса интракраниально пациенту. Доставка может включать внутриопухолевую инъекцию, может включать множественные инъекции, например, когда указанному пациенту имплантируют катетер после резекции, и указанный онколитический аденовирус доставляется через указанный катетер. Онколитический аденовирус можно вводить иглой посредством медленной инфузии в течение периода, составляющего минимум 10 минут. Онколитический аденовирус можно вводить стереотаксически в более чем один участок глиомы у указанного пациента. Доза может составлять от приблизительно 103 до приблизительно 1015 вирусных частиц, от приблизительно 105 до приблизительно 1012 вирусных частиц, вводимых пациенту, или от приблизительно 107 до приблизительно 1010 вирусных частиц, вводимых пациенту. Лечение может включать дозы 1×107, 3×107, 1×108, 3×108, 1×109, 3×109, 1×1010 и 3×1010 вирусных частиц, включая увеличение дозы.
Способ может дополнительно включать введение пациенту второй терапии, при этом вторая терапия представляет собой антиангиогенную терапию, химиотерапию, иммунотерапию, хирургическое вмешательство, лучевую терапию, иммуносупрессивные агенты или генную терапию терапевтическим полинуклеотидом. Вторую терапию можно вводить пациенту перед введением композиции, включающей онколитический аденовирус, вводить пациенту в одно время с введением композиции, включающей онколитический аденовирус, либо вводить пациенту после введения композиции, включающей онколитический аденовирус. Химиотерапия может включать алкилирующий агент, ингибитор митоза, антибиотик или антиметаболит. Вторая терапия может в частности включать лучевую терапию и темозоломид.
Больной может быть дополнительно выбран, исходя из наличия Thl-ответа. Thl-ответ может характеризоваться увеличением антиген-специфического гамма-интерферона (IFN-γ), IL-12 и комплементсвязывающих антител.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения глиомы в популяции людей-пациентов, включающему (a) идентификацию пациентов, имеющих глиому; и (b) контактирование глиом с онколитическим аденовирусом с E1A полипептидом, который не может связывать Rb и включает фибриллярный белок с аминокислотой RGD, вставленной в HI домен, при этом лечение указанной популяции приводит к одному или более из (i) клинической пользы у 30% указанных пациентов, с клинической пользой, определенной посредством пациентов с полным объективным ответом+пациентов, частично ответивших на лечение плюс стабильное заболевание; (ii) 25% шестимесячной выживаемости без прогрессирования; (iii) 12-месячной медианой выживаемости для респондентов, с респондентами, определенными посредством пациентов с полным объективным ответом+пациентов, частично ответивших на лечение.
Онколитический аденовирус может представлять собой Δ24 аденовирус. Стадия (a) может включать визуализацию опухоли, и указанный способ может дополнительно включать получение биопсии указанной опухоли после стадиястадии (a) и перед стадиястадией (b). Глиома может представлять собой астроцитому, олигодендроглиому, анапластическую глиому, глиобластому, эпендимому, менингиому, опухоль области эпифиза, опухоль сосудистого сплетения, нейроэпителиальную опухоль, эмбриональную опухоль, периферическую нейробластическую опухоль, опухоль черепно-мозговых нервов, опухоль системы кроветворения, герминогенную опухоль или опухоль области турецкого седла. Глиома может быть рецидивирующей и/или глиома может представлять собой безуспешную одну или более терапию первичной глиомы.
Глиома может быть резектабельной или нерезектабельной. Глиома может быть резецирована после указанного лечения. Пострезекционное ложе опухоли может быть обработано указанным онколитическим аденовирусом. Глиома может контактировать с аденовирусом посредством доставки аденовируса пациенту интракраниально. Доставка может включать внутриопухолевую инъекцию, может включать множественные инъекции, например, когда указанному пациенту имплантируют катетер после резекции, и указанный онколитический аденовирус доставляется через указанный катетер. Онколитический аденовирус можно вводить иглой посредством медленной инфузии в течение периода, составляющего минимум 10 минут. Онколитический аденовирус можно вводить стереотаксически в более чем один участок глиомы у указанного пациента. Доза может составлять от приблизительно 103 до приблизительно 1015 вирусных частиц, от приблизительно 105 до приблизительно 1012 вирусных частиц, вводимых пациенту, или от приблизительно 107 до приблизительно 1010 вирусных частиц, вводимых пациенту.
Способ может дополнительно включать введение пациенту второй терапии, при этом вторая терапия представляет собой антиангиогенную терапию, химиотерапию, иммунотерапию, хирургическое вмешательство, лучевую терапию, иммуносупрессивные агенты или генную терапию терапевтическим полинуклеотидом. Вторую терапию можно вводить пациенту перед введением композиции, включающей онколитический аденовирус, вводить пациенту в одно время с введением композиции, включающей онколитический аденовирус, или вводить пациенту после введения композиции, включающейонколитический аденовирус. Химиотерапия может включать алкилирующий агент, ингибитор митоза, антибиотик или антиметаболит.
Больной может быть дополнительно выбран, исходя из наличия Thl-ответа. Thl-ответ может характеризоваться увеличением антиген-специфического гамма-интерферона (IFN-γ), IL-12 и комплементсвязывающих антител.
Варианты осуществления, рассмотренные в контексте способов и/или композиции по изобретению, могут быть задействованы в соответствии с любым другим способом или композицией, описанными в настоящем описании. Таким образом, вариант осуществления, относящийся к одному способу, может также быть применен к другим способам по изобретению.
Термин «приблизительно» относится к погрешности определения вируса, белка или других количеств и измерений, и предполагает содержание по меньшей мере одного стандартного отклонения ошибки для любого конкретного анализа, измерения или количественной оценки.
Используемые в описании формы единственного числа могут означать одно или более чем одно. В пункте (пунктах) формулы изобретения, при использовании в сочетании со словом «включающий», формы единственного числа могут означать одно или более чем одно.
Другие цели, свойства и преимущества настоящего изобретения станут очевидными на основе последующего подробного описания. Однако должно быть понятно, что подробное описание и конкретные примеры, указывая предпочтительные варианты осуществления изобретения, даются только путем иллюстраций, поскольку различные изменения и модификации в пределах сущности и объема изобретения станут очевидны квалифицированным специалистам в данной области из данного подробного описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Следующие чертежи формируют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение может быть лучше понятно посредством ссылки на один или более из данных чертежей в комбинации с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных в данном документе:
ФИГ. 1A-D. Осевое контрастное изображение: Больного лечили DNX-2401 после первого рецидива с безуспешным хирургическим вмешательством, лучевой терапией, Темозоломидом и одним курсом Дазатиниба. На данный момент отсутствуют признаки заболевания 32 месяца после лечения с полным ответом на терапию DNX-2401 (по критериям МакДональда). (ФИГ. 1A) Предварительное лечение, (ФИГ. 1B) 2 месяца, (ФИГ. 1C) 8 месяцев, (ФИГ. 2D) 23 месяца. Стрелка: Опухоль. Необходимо отметить очевидное прогрессирование на ФИГ. 1B, вызванное воспалением, не опухолевым ростом. Опухоль продолжает отвечать на лечение (ФИГ. 1C), становясь меньше и делаясь волокнистой. Необходимо отметить отсутствие опухоли на ФИГ. 1D. Небольшая область усиления ниже борозды является кистой (стрелка).
ФИГ. 2. Осевое контрастное изображение: Больного лечили DNX-2401 на 3-м рецидиве после безуспешного предшествующего хирургического вмешательства, лучевой терапии, Темозоломида и Бевацизумаба. Необходимо отметить долевое строение опухоли через 2 месяца после лечения Delta-24-RGD (левая панель), переходящее в очевидную дисинтеграцию («мыльные пузыри») через 6 месяцев (правая панель). Опухоль была резецирована через 6 месяцев и подвергнута анализу. Независимое патогистологическое заключение установило, что опухоль была большей частью некротической с остатком, инфильтрированным иммунными клетками с превалированием T-клеток (слева через 2 месяца, справа через 6 месяцев).
ФИГ. 3. Фронтальные контрастные изображения (Правое): Больного лечили в группе A исследования DNX-2401 при 1-ом рецидиве после безуспешного предшествующего хирургического вмешательства, лучевой терапии и Темозоломида. Левое изображение через 1 месяц, правое изображение через 10 месяцев после лечения DNX-2401. Объем опухоли редуцировался на 82% за 10 месяцев.
ФИГ. 4. Осевое контрастное изображение (Правое): Больного лечили в группе A исследования DNX-2401 при 1ом рецидиве после безуспешного предшествующего хирургического вмешательства, лучевой терапии и Темозоломида.
ФИГ. 5. Изображения T2/режим с подавлением сигнала свободной воды: Больного лечили в группе A исследования DNX-2401 при 1ом рецидиве после безуспешного предшествующего хирургического вмешательства, лучевой терапии и Темозоломида. Изображения демонстрируют значительное улучшение с практически полным погашением сигнала режима с подавлением сигнала свободной воды.
ФИГ. 6. Разрезы через опухоль человека, резецированную в Фазе 1, пациент группы В. Окрашенный белок гексон Ad показал убедительное доказательство распространения вируса и антиглиомного действия через 2 недели после лечения DNX-2401. A, Вирусиндуцированный некроз; B, Инфицированные опухолевые клетки; C, неинфицированные опухолевые клетки.
ФИГ. 7. Разрезы через опухоль человека, резецированную в Фазе 1, пациент группы В. Окрашены на наличие T-клеток, как показано. Необходимо отметить инфильтрацию преимущественно T-клетками CD8. H&E, гематоксилин/эозин; CD3, T-клеточный специфический маркер обычно присутствует в отдыхающих и активированных Т-лимфоцитах; CD4, T-клеточный маркер, экспрессируемый в T-лимфоцитах хелперах/индукторах; CD8, T-клеточный маркер обычно присутствует в субпопуляции цитотоксических/супрессорах T-клеток.
ФИГ. 8. Дизайн Фазы I клинического испытания.
ФИГ. 9. План эскалации клинической дозы исследования.
ФИГ. 10. Критерии ответа.
ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Злокачественные опухоли, которые являются истинно резистентными к традиционным видам лечения, представляют собой значительную терапевтическую проблему. Данные злокачественные опухоли включают, но без ограничения, злокачественные глиомы, которые являются наиболее широко распространенными первичными опухолями головного мозга имеющими годовую заболеваемость, составляющую 6,4 случаев на 100000 (CBTRUS, 2002-2003). Данные изнуряющие в неврологическом аспекте опухоли представляют собой наиболее распространенный подтип первичных опухолей головного мозга и являются одним из наиболее беспощадных видов рака у человека. При наиболее агрессивном раке, проявлении мультиформной глиобластомы (GBM), медиана продолжительности выживаемости для пациентов варьирует от 9 до 12 месяцев, несмотря на максимальные лечебные усилия (Hess et ah, 1999). Классическое заболевание, злокачественная глиома, является по существу резистентной к современным схемам лечения (Shapiro и Shapiro, 1998). Фактически, приблизительно у 1/3 пациентов с GBM опухоль будет продолжать расти несмотря на лучевую терапию и химиотерапию. Медиана выживаемости даже при агрессивном лечении, включая хирургическое вмешательство, лучевую и химиотерапию, составляет менее 1 года (Schiffer, 1998). Поскольку несколько хороших методов лечения являются доступными для многих из этих рефрактерных опухолей, принципиально важным является исследование новых и инновационных терапевтических подходов.
Один перспективный способ улучшить лечение основывается на концепции, что встречающиеся в природе вирусы могут быть сконструированы с целью оказания онколитического действия в опухолевых клетках (Wildner, 2001; Jacotat, 1967; Kirn, 2001; Geoerger et al, 2002; Yan et al, 2003; Vile et al, 2002, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки). В случае аденовирусов специфические делеции в пределах их аденовирусного генома могут ослабить их способность реплицироваться внутри нормальных покоящихся клеток, при этом они сохраняют способность реплицироваться в опухолевых клетках. Один такой реплицирующийся при особых условиях аденовирус, Δ24, описан у Fueyo с соавт (2000), смотрите также Патентную Публикацию США №20030138405, и Патенты США 8168168 и 6824771, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки. Аденовирус Δ24 является производным аденовируса 5 типа (Ad-5) и содержит делецию 24 пары нуклеотидов в пределах участка CR2 гена E1A. Значительное противоопухолевое действие Δ24 продемонстрировано в системах культивирования клеток и в ксенотрансплантатных моделях злокачественной глиомы.
Онколитические аденовирусы включают реплицирующиеся при особых условиях аденовирусы (CRAD), такие как Delta 24, которые обладают некоторыми свойствами, делающими их кандидатами на использование в качестве биотерапевтических препаратов. Одним таким свойством является способность реплицироваться в пермиссивной клетке или ткани, которая усиливает первоначальную ввходную дозу онколитического вируса и помогает агенту распределяться в близлежащих опухолевых клетках, обеспечивая направленное противоопухолевое действие.
I. ОНКОЛИТИЧЕСКИЙ АДЕНОВИРУС Δ24
Продемонстрировано онколитическое действие аденовируса Δ24 in vitro и in vivo. В целом, аденовирус представляет собой 36 т.п.н., линейный, двухцепочечный ДНК-вирус (Grunhaus и Horwitz, 1992). Аденовирусная инфекция приводит к тому, что аденовирусная ДНК, сохраняется эписомально, что уменьшает потенциальную генотоксичность, связанную с интегрирующими векторами. Также аденовирусы являются структурно стабильными, и после интенсивной амплификации не обнаружено перестройки генома. Аденовирус может инфицировать практически все эпителиальные клетки вне зависимости от стадии их клеточного цикла. На настоящий момент аденовирусная инфекция, по всей видимости, связана только с легким течением заболевания, такого как острое респираторное заболевание у людей.
Особой формой вируса Δ24 является DNX-2401 (DNATrix, Houston TX), который представляет собой реплицирующийся при особых условиях аденовирусный (AdV) вектор типа 5 для внутриопухолевого введения, который содержит делецию 24 bp (bp 923-946; Rb-связывающий домен) в гене E1A и вставку RGD интегрин-связывающего мотива (4C пептид: Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Plie-Cys: SEQ ID NO: 1) в петле H1 волокна Ad. DNX-2401 может использовать интегрины определенных клеточных поверхностей для проникновения в опухолевые клетки.
DNX-2401 проникает в клетки посредством как обычного аденовирусного рецептора (CAR), так и RGD-связывающих интегринов, обычно экспрессируемых только на опухолевых клетках и новообразованных сосудах. Это является значительным улучшением по сравнению с предыдущим поколением аденовирусов, которые для активности должны полагаться на CAR-рецептор. Данный пептид RGD-4C (CDCRGDCFC; SEQ ID NO: 1), как было показано, с высокой аффинностью связывается с RGD-связывающими (α,νβ3 и α,νβ5) интегринами, присутствующими на поверхности клеток многих типов, включая опухолевые клетки. Важно, что RGD-связывающие интегрины, как было показано, являются экспрессируемыми в сосудистой сети опухоли на глиомных клетках, но не в здоровом головном мозге, тем самым предоставляя основу для значительно повышенного и селективного инфицирования глиобластомы DNX-2401.
Оказавшись внутри клетки, репликация DNX-2401 ограничивается клетками с дефектами метаболического пути Rb, первичным контрольным метаболическим путем для деления клеток. Поскольку практически все опухолевые клетки, включая >90% глиобластом, имеют дефекты метаболического пути Rb/pl6 и уже в клеточном цикле, DNX-2401 реплицируется и избирательно и эффективно убивает данные опухолевые клетки. Данная высокая степень избирательности достигается посредством делеции 24 bp связывающего домена Rb, обычно присутствующего в белке El вируса. Главная функция данной области состоит в создании возможности репликации аденовируса в здоровых клетках, которые имеют нормальную функцию Rb. Делеция данной области обусловливает, что DNX-2401 становится способным реплицироваться только в опухолевых клетках с дефектами метаболического пути Rb.
A. Механизм Онколитического Вируса Δ24
Значительное увеличение пролиферации клеток, что является характерным для трансформации из низкодифференцированной глиомы в промежуточно-дифференцированную, в значительной степени связано с дисрегуляцией метаболического пути pl6/Rb/E2F (Fueyo et ah, 2000; Fueyo et ah, 1998; Chintala, 1997). Наиболее убедительным является отсутствие мутационного наложения, наблюдаемого среди различных компонентов данного метаболического пути, что свидетельствует, что важного терапевтического усовершенствования в лечении данных опухолей можно достигнуть посредством конкретного нацеливания метаболического пути Rb (Kyritsis and Yung, 1996; Fueyo et ah, 1999). По всей вероятности, разрушенное состояние Rb будет предоставлять благоприятные возможности для задействования агентов, которые функционируют исключительно у не имеющих Rb опухолевых клеток (Fueyo et ah, 1999). Наиболее здоровые клетки головного мозга человека обычно находятся в состоянии покоя. Клетки в центральной нервной системе (CNS) делятся редко, и у данных клеток деление запускается специфически ограниченным образом. Формируется жесткий регулирующий контроль, который жестко ограждает клетки от происходящего деления клеток. Метаболический путь pl6/Rb/E2F является важным метаболическим путем для поддержания неделящегося состояния полностью дифференцированной клетки или негативно регулирует развитие клеточного цикла нормальных делящихся клеток.
Аденовирус человека обычно инфицирует клетки человека, которые находятся в состоянии покоя (неделящиеся) или делящиеся клетки (нормальные или раковые клетки). В результате внедрения данного вируса в клетку человека (вирусная инфекция) аденовирусная ДНК незамедлительно транскрибируется посредством синтеза аденовирусного белка E1A. Область CR2 белка E1A специфически взаимодействует с белком Rb и приводит к высвобождению E2F, инициируя вступление клетки в S-фазу (фаза синтеза ДНК) клеточного цикла, и сохраняет клетку в цикле деления. Данная последовательность событий эффективно вовлекает клетку-хозяина исключительно с целью экспрессии закодированных в вирусе белков. Активная выработка аденовирусных частиц зависит от данной способности направлять клетки к активному способу репликации, принципиально важного свойства онколитических вирусов. В качестве следствия своих биологических характеристик, опухолевые клетки обеспечивают среду для репликации, которая благоприятствует данной активности. Мутации в принципиальных последовательностях вирусного генома делают аденовирус неспособным связываться и инактивировать белки-супрессоры опухолевого роста. Данные модифицированные аденовирусы способны реплицироваться исключительно в клетках, утративших функциональный целевой опухолеподавляющий ген (только опухолевые клетки).
Таким образом, экспрессия белка E1A с делецией 24 пары оснований в участке CR2 предохраняет белок от связывания и инактивирования Rb. Данный аттенуированный ElA-мутантный аденовирус не способен реплицироваться в нормальных, находящихся в состоянии покоя клетках, которые имеют функционально активный метаболический путь Rb. И наоборот, опухолевые клетки являются пермиссивными к репликации вируса, который в свою очередь эффективно внедряется и растворяет клетки глиомы человека как in vitro, так и in vivo.
Онколитический потенциал Δ24 является впечатляющим по сравнению с другими аденовирусами с недостатком репликации при особых условиях, таких как Onyx-015. Действие Δ24 в мышиной опухолевой ксенотрансплантатной модели интракраниальной глиомы показано на ФИГ 2. В данном случае, кривая представляет носители делеции RA55 в участке E1B, как в Onyx-015. Онколитический аденовирус не обладает такой же степенью потенциальных возможностей, как Δ24 при применяемых сравнимых дозах (в данном случае 1×108 БОЕ). Также показана негативная регуляция Δ24, который инактивирован воздействием ультрафиолетового излучения. Противоопухолевое действие Δ24 продемонстрировано в ряде клеточных линий опухолей человека и в животных ксенотрансплантатных моделях с известными дефектами метаболического пути pl6/Rb/E2F. Пермиссивная репликация Δ24 в клеточных линиях с дефектами pl6/Rb/E2F контрастирует со значительно ослабленной репликацией в нормальных астроцитах и нормальных находящихся в состоянии покоя фибробластах. Дополнительно, активность данного вируса аттенуирована при введении в опухолевые клетки, в которых Rb функционально восстановлен посредством методик стабильной или временной трансфекции.
Применению онколитических аденовирусов для лечения опухолей головного мозга благоприятствуют некоторые факторы. Во-первых, глиомы не метастазируют, и поэтому действенный локальный подход должен являться достаточным для лечения заболевания. Во-вторых, каждая глиома заключает в себе несколько популяций клеток, экспрессирующих различные генетические нарушения (Sidransky et al, 1992; Collins and James, 1993; Furnari et al, 1995; Kyritsis et al, 1996). Таким образом, спектр опухолей, чувствительных к переносу одного гена в раковые клетки, может быть ограничен. В-третьих, компетентные по репликации аденовирусы могут инфицировать и разрушать раковые клетки, которые останавливаются в Go. Поскольку глиомы неизменно включают покоящиеся клетки, данное качество является важным. В итоге, метаболический путь p l6-Rb является аномальным в большинстве глиом (Hamel et al, 1993; Henson et al, 1994; Hirvonen et al, 1994; Jen et al, 1994; Schmidt et al, 1994; Costello et al, 1996; Fueyo et al, 1996b; Kyritsis et al, 1996; Ueki et al, 1996; Costello et al, 1997), делая таким образом стратегию Δ24 подходящей для большей части данных опухолей. Хотя утрата функции опухолеподавляющего гена ретинобластомы связана с причинами различных типов опухолей и не ограничивается лечением глиом.
В других вариантах осуществления изобретения мутация E1A (напр., Δ24 мутация в E1A) может применяться в комбинации с мутациями в E1B участке того же аденовируса, продуцируя таким образом двойной мутантный аденовирус. В определенных вариантах осуществления изобретения аденовирус может включать мутацию и делецию Δ24 в участке E1B, что предотвращает экспрессию или функцию белка ElB55kD. Было показано, что белок ElB55kD связывается и инактивирует p53. Мутация участка E1B может включать делецию аденовирусных последовательностей от 2426bp до 3328bp учетного номера генного банка NC_001406, который включен в данный документ посредством ссылки.
В определенных вариантах осуществления изобретения онколитический аденовирус применяется в качестве экспрессионного аденовирусного вектора. Подразумевается, что «экспрессионный аденовирусный вектор» включает такие векторы, которые содержат аденовирусные последовательности, достаточные для (a) поддержания упаковки вектора и (b) экспрессии клонированного в ходе этого полинуклеотида. Расположение вставки полинуклеотида, кодирующего гетерологичный полипептид, являющийся объектом исследования, в пределах аденовирусных последовательностей, не является наиболее важным для изобретения. Полинуклеотид, кодирующий полипептид, являющийся объектом исследования, может быть вставлен в участок делеционной области E3 в векторах замещения E3, как описано у Karlsson et al (1986), или другой участок, который не является ключевым для репликации вируса в клетке-мишени. Общепринятыми способами синтеза аденовирусных частиц являются котрансфекция с последующей последовательной рекомбинацией in vivo челночной плазмиды и аденовирусной плазмиды-помощника либо в клетки 293, либо в клетки 911 (Introgene, The Netherlands).
B. Выделение Интегрина на Поверхности опухолевой клетки
Модификации онколитического аденовируса, описанные в данном документе, могут быть сделаны для улучшения способности онколитического аденовируса лечить рак. Настоящее изобретение также включает любую модификацию онколитического аденовируса, что улучшает способность аденовируса намечать опухолевые клетки. Включены модификации генома онколитического аденовируса с целью улучшения способности аденовируса инфицировать и реплицироваться в раковых клетках посредством изменения рецептор-связывающих молекул.
Рецепторы клеточной поверхности являются перспективными кандидатами для таргетной терапии рака. Отсутствие или наличие низких уровней рецептора для вируса Коксаки и аденовируса (CAR) в некоторых типах опухолей может ограничивать эффективность онколитического аденовируса. К фиброзному выступу может быть добавлен ряд пептидных мотивов, например, мотив RGD (последовательности RGD, имитирующие нормальные лиганды интегринов клеточной поверхности), мотив Tat, полилизиновый мотив, мотив NGR, мотив CTT, мотив CNGRL, мотив CPRECES или мотив strept-tag (Rouslahti и Rajotte, 2000). Мотив может быть вставлен в HI петлю аденовирусного фибриллярного белка. Модифицирование капсида делает возможным инфицирование CAR-независимой клетки-мишени. Это делает возможной более выраженную репликацию, более действенное инфицирование и увеличенный лизис опухолевых клеток (Suzuki et ah, 2001, включенный в данный документ посредством ссылки). Также могут быть добавлены пептидные последовательности, которые связывают специфические рецепторы глиомы человека, такие как EGFR или uPR. Специфические рецепторы, обнаруженные исключительно или преимущественно на поверхности раковых клеток, можно применять в качестве мишени для связывания и инфицирования аденовирусом, таким как EGFRvIII.
II. МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ ПУТЬ RB
Rb представляет собой опухолеподавляющий ген, утрата функции которого связана с опухолеобразованием. Белок ретинобластомы, или Rb, как используется в данном документе, относится к полипептиду, закодированному геном ретинобластомы (Rb). Ген ретинобластомы локализован в 13ql4 у людей и кодирует белок приблизительно 110 килодальтон (kD). Нефосфорилированный Rb ингибирует пролиферацию клеток посредством секвестрирования факторов транскрипции (напр., E2F) и удерживая клетки в Gi клеточного цикла. Факторы транскрипции высвобождаются из Rb, если Rb является фосфорилированным. Связывание E1A с Rb вызывает высвобождение фактора транскрипции во многом таким же образом, как и фосфорилирование. Некоторые вирусные онкобелки намечают Rb для инактивирования, чтобы облегчить репликацию вируса. Данные белки включают аденовирус E1A, SV40 большой T-антиген и папилломавирус E7.
Белок E1A представляет собой один из первых вирусспецифичных полипептидов, синтезированных после аденовирусной инфекции, и он является необходимым для того, чтобы произошла репликация вируса (Dyson and Harlow, 1992; Flint and Shenk, 1997). Взаимодействие белка Rb и белка E1A приводит к высвобождению E2F из предсуществующих клеточных комплексов E2F-Rb. Затем E2F становится свободным для активирования транскрипции из промоторов E2 аденовируса и E2F-регулируемых генов инфицированной клетки. Транскрипционная активация данных клеточных генов, в свою очередь, помогает создать окружающую среду, пригодную для синтеза вирусной ДНК, в находящихся, с другой стороны, в состоянии покоя клетках (Nevins, 1992). Для связывания Rb являются важными два сегмента E1A; один включает аминокислоты 30-60, и другой - аминокислоты 120-127 (Whyte et al, 1988; Whyte et al, 1989). Делеция любой области предотвращает образование выявляемых комплексов ElA/Rb in vitro и in vivo (Whyte et al, 1989).
Аденовирус, содержащий мутацию Delta 24, продуцирует белок E1A, который не может связывать Rb, заставляя инфицированную клетку оставаться в Go. Таким образом, мутантный метаболический путь Rb и мутантный E1A, наряду с активацией E2F, являются необходимыми для транскрипции аденовируса Δ24.
Ретинобластомный (Rb) метаболический путь, как используется в данном документе, относится к взаимодействию группы регуляторных белков, которые взаимодействуют с Rb или другими белками, которые взаимодействуют с Rb при регулировании пролиферации клеток (для ознакомления смотрите Kaelin, 1999). Белки в пределах метаболического пути Rb включают, но без ограничения, Rb, семейство E2F факторов транскрипции, DRTF, RIZ286, MyoD287, c-Abl288, MDM2289, hBRGl/hBRM, pl6, pl07, pl30, c-Abl тирозинкиназу и белки с консервативными мотивами LXCXE, циклин E-cdk 2 и циклин D-cdk 4/6. Фосфорилирование Rb высвобождает E2F, который связан с нефосфорилированным Rb. E2F стимулирует транскрипцию и активность циклина E, что приводит к большему фосфорилированию Rb. Нефосфорилированный Rb действует в качестве опухолевого супрессора посредством связывания с регуляторными белками, что увеличивают репликацию ДНК, такими как E2F (The Genetic Basis of Human Cancer, Vogelstein and Kinzler eds., 1998).
Дефектный ретинобластомный метаболический путь, как используется в данном документе, относится к инактивации, мутации или делеции Rb или неспособности повышающих или понижающих регуляторных белков, которые взаимодействуют с Rb, регулировать пролиферацию клеток вследствие мутации или модификации одного или более белков, деятельности белка или межбелковых взаимодействий. Мутации, обусловливающие дефектный метаболический путь Rb, включают, но без ограничения, инактивирующие мутации в Rb, белках INK4 и CIP/KIP и активирующие мутации в генах циклина, таких как циклин D/cdk 4, 6 и циклин E, cdk 2. Мутации в одном или другом элементе регуляторного метаболического пути Rb, включая p16, циклин D, cdk4, E2F или сам Rb, могут трансформироваться почти в 100 процентах опухолей человека (The Genetic Basis of Human Cancer, 1998). Rb-ассоциированные опухоли включают глиомы, саркомы, опухоли легкого, молочной железы, яичника, шейки матки, поджелудочной железы, желудка, ободочной кишки, кожи, гортани, мочевого пузыря и простаты.
III. СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА ГОЛОВНОГО МОЗГА
Настоящее изобретение затрагивает лечение опухолей головного мозга, включая опухолевые клетки с нарушенным метаболическим путем Rb. Следует иметь в виду, что применяя способы и композиции изобретения, можно лечить широкий спектр опухолей головного мозга, включая глиобластому, анапластическую астроцитому и глиосаркому.
Термин «глиома» относится к опухоли, берущей начало в нейроглии головного мозга или спинного мозга. Глиомы являются производными типов глиальных клеток, таких как астроциты и олигодендроциты, таким образом глиомы включают астроцитомы и олигодендроглиомы, а также анапластические глиомы, глиобластомы и эпендимомы. Астроцитомы и эпендимомы могут возникать во всех областях головного мозга и спинного мозга как у детей, так и у взрослых. Олигодендроглиомы, как правило, возникают в полушариях головного мозга взрослых. Глиомы составляют 75% опухолей головного мозга в педиатрии и 45% опухолей головного мозга у взрослых. Оставшимися процентами опухолей головного мозга являются менингиомы, эпендимомы, опухоли шишковидного тела, опухоли сосудистого сплетения, нейроэпителиальные опухоли, эмбриональные опухоли, периферические нейробластические опухоли, опухоли черепно-мозговых нервов, опухоли системы кроветворения, герминогенные опухоли и опухоли области турецкого седла.
В рамках данного документа, критерии ответа и прогрессирования (все ответы длятся по меньшей мере 4 недели) определены как такие термины, которые были одобрены Всемирной Организацией Здравоохранения и адаптированы для опухолей головного мозга, с использованием критериев Макдональда (Macdonald et ah, 1990), и определены с применением двумерных измерений очагов повреждения, накапливающих контраст (уменьшение наиболее длинного поперечного диаметра поражения на МРТ-изображении):
- Полный ответ: исчезновение всех поражений и отсутствие стероидов свыше физиологической дозы;
- Частичный ответ: уменьшение размеров >50% и стабильные или сниженные стероиды;
- Стабильное заболевание: уменьшение размеров <50%;
- Прогрессирование: новое поражение, явное прогрессирование неиндексных поражений, >25% роста индексных поражений, или явное клиническое ухудшение при отсутствии радиологического прогрессирования.
Глиобластома представляет собой разрушительную первичную низкодифференцированную злокачественную глиому, резистентную к общепринятым видам лечения. Современные вмешательства, такие как хирургическое вмешательство, лучевая терапия и химиотерапия, удлиняют суммарную медиану выживаемости до приблизительно 14,6 месяцев. Многие новые компоненты, даже при тестировании в комбинации, не в состоянии улучшить общую выживаемость или привести к приемлемому клиническому ответу. Существует значительная нереализованная потребность медицины в новом способе воздействия на данные опухоли, который может оказать влияние на течение болезни.
Низкодифференцированные злокачественные глиомы представляют собой высоковаскуляризированные и инфильтративные опухоли, и вследствие этого склонны к рецидивированию несмотря на хирургическое удаление. Возможности терапии ограничены для впервые диагностированного, а также рецидивирующего заболевания, и особенно ограничены для пациентов, имеющих опухоли, не поддающиеся хирургическому лечению. Более того, тогда как 80% или более рецидивных глиобластом возникают в той же области, что и первичная опухоль, дополнительная лучевая терапия часто невозможна из-за проблем токсичности. Темозоломид одобрен для лечения впервые диагностированной глиобластомыы и рецидивирующей анапластической астроцитомы, а бевацизумаб был одобрен в последнее время для лечения рецидивирующей глиобластомы. Данные лекарственные препараты доставляются системно и должны вводиться в виде многодозового режима. Темозоломид наиболее эффективно применяется в виде адъюванта к хирургическому лечению или лучевой терапии. И наоборот, бевацизумаб часто вводят отдельно при рецидивирующем заболевании, или экспериментально, в комбинации с существующими химиотерапевтическими препаратами, такими как иринотекан.
Прогресс в понимании биологии опухоли сделал возможной идентификацию ряда главных сигнальных метаболических путей и процессов онкогенеза. Однако, вследствие чрезмерного количества метаболических путей и альтернативных сигнальных систем, ингибирование одной мишени может быть недостаточной для выраженного ингибирования опухолевого роста, и может требоваться комбинация нескольких агентов.
В настоящее время существует ряд антиангиогенных агентов, рассматриваемых в клинической практике. Благодаря ускоренному его одобрению FDA, антиангиогенным лекарственным препаратом, чаще всего исследуемым у пациентов с опухолями головного мозга, является бевацизумаб (Avastin), который представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, которое прерывает метаболический путь VEGF, индуцирует уменьшение размера опухолевых сосудов и приводит к более нормализованной сосудистой сети, которая обладает уменьшенной проницаемостью. Данное соединение в настоящее время применяется в ряде исследований как в виде отдельного, так и комбинированного агента, в предварительном и рецидивирующем контексте.
Большинство продолжающихся в настоящее время II/III фаз исследований перешли на применение низкомолекулярных ингибиторов тирозинкиназы или ингибиторов интегрина, таких как энзастаурин, цедираниб, пазопаниб, сорафениб, сунитиниб и циленгитид. Схемы лечения могут включать комбинацию данных видов лечения и часто содержат предписываемые в это же время неантиангиогенные виды лечения, и могут вводиться пациентам как с впервые диагностированным, так и с рецидивирующим заболеванием. Предварительные результаты указывают на то, что при том, что некоторые из данных агентов могут незначительно пролонгировать 6-месячную выживаемость без прогрессирования заболевания, остается продемонстрировать возможную долговременную пользу и влияние на выживаемость.
Мультиформная глиобластома является наиболее распространенной злокачественной первичной опухолью головного мозга у взрослых. Более половины данных опухолей имеют нарушения в генах, участвующие в регуляции клеточного цикла. Часто имеется делеция в CDKN2A или утрата экспрессии гена ретинобластомы. Другие типы опухолей головного мозга включают астроцитомы, олигодендроглиомы, эпендимомы, медуллобластомы, менингиомы и шванномы.
Во многих контекстах не является необходимостью, чтобы клетки погибали или индуцированно переносили гибель клеток или «апоптоз». Пожалуй, для осуществления полноценного лечения, все, что требуется, это то, что опухолевый рост до некоторой степени должен быть замедлен. Может быть, что рост клеток полностью блокируется или что достигается некоторая регрессия опухоли. Клинические термины, такие как тяжесть «ремиссии» и «редукции опухоли» также рассматриваются с учетом их нормального использования.
Термин «терапевтический эффект» относится к чему-либо, что способствует или облегчает благополучие больного в соответствии с терапевтическим лечением его/ее состояния, которое включает лечение предрака, рака и гиперпролиферативных заболеваний. Список его неисчерпывающих примеров включает удлинение жизни больного в любой период времени, уменьшение или замедление неопластического развития болезни, уменьшение гиперпролиферации, редукцию опухолевого роста, замедление метастазирования, редукцию скорости пролиферации раковых клеток или опухолевых клеток и уменьшение боли у больного, что можно объяснить состоянием больного.
A. Аденовирусная терапия
Квалифицированым специалистам в данной области хорошо известно, как применять аденовирусную доставку в ситуациях in vivo и ex vivo. Для вирусных векторов обычно можно подготавливать запас вирусного вектора. В зависимости от вида вируса и достигаемого титра, пациенту будет доставлено от 1 до 100, от 10 до 50, 100-1000 или вплоть до 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012 или 1×1013 инфекционных частиц в фармацевтически приемлемой композиции, как рассмотрено ниже.
Для ряда типов опухолей рассматривается ряд путей введения. Когда может быть идентифицирована дискретная опухолевая масса, или солидная опухоль, может быть принят ряд прямых, местных и регионарных подходов. Например, аденовирус может быть непосредственно инъецирован в опухоль. Ложе опухоли может быть обработано перед, во время или после резекции и/или другого лечения (видов лечения). После резекции или другого лечения (видов лечения) аденовирус обычно будет доставляться посредством катетера, имеющего доступ в опухоль или в участок резидуальной опухоли, после хирургического вмешательства. Можно воспользоваться сосудистой сетью опухоли для введения вектора в опухоль посредством инъекции в питающую вену или артерию. Также можно воспользоваться путем более дистальной кровеносной сети.
Способ лечения рака включает лечение опухоли, а также лечение области вблизи или окружающей опухоль. В данной заявке термин «участок резидуальной опухоли» указывает на зону, которая является близлежащей к опухоли. Данная зона может включать полости тела, в которых лежит опухоль, а также клетки и ткань, которые находятся рядом с опухолью.
B. Лекарственные формы и Пути введения Пациентам
При рассмотрении применения в клинической практике будет необходимо приготовить фармацевтические композиции в форме, подходящей для предполагаемого применения. Обычно это подразумевает приготовление композиций, которые фактически не содержат пирогены, а также другие примеси, которые могут являться вредными для людей и животных.
Действующие композиции настоящего изобретения могут включать классические фармацевтические препараты. Обычно будет необходимо задействовать подходящие соли и буферы, чтобы сделать доставку векторов стабильной и обеспечить возможность поглощения клетками-мишенями. Водные композиции настоящего изобретения включают в себя эффективное количество вектора для клеток, растворенного или распределенного в фармацевтически приемлемом носителе или водной среде. Данные композиции также именуются прививкой. Фраза «фармацевтически или фармакологически приемлемый» относится к молекулярным частицам и композициям, которые не производят побочных, аллергических или других нежелательных реакций при введении животному или человеку. Как используется в данном документе, «фармацевтически приемлемый носитель» включает какой-либо и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и тому подобное. Применение данных сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением случаев, когда какая-либо традиционная среда или агент несовместимы с настоящим изобретением, предполагается их применение в терапевтических композициях. Также в композиции могут быть включены дополнительные активные ингредиенты.
Введение данных композиций в соответствии с настоящим изобретением будет проходить через подходящий путь, но особенно привлекательными являются интракраниальное/внутриопухолевое введение. Введение может происходидь посредством инъекции или инфузии, см. Kruse et al. (1994), специально включенной посредством ссылки, для способов выполнения интракраниального введения. Данные композиции можно обычно вводить в качестве фармацевтически приемлемых композиций.
Эффективное количество терапевтического агента определяют на основе предполагаемой цели, например, элиминации опухолевых клеток. Термин «однократная доза» относится к физически дискретным единицам, подходящим для применения у больного, при этом каждая единица содержит предварительно заданное количество терапевтической композиции, рассчитанное, чтобы оказывать желаемые ответы, рассмотренные выше, в соответствии с его введением, т.е., с подходящим путем и схемой лечения. Количество, подлежащее введению, как в соответствии с рядом методик лечения и однократной дозой, зависит от больного, подлежащего лечению, состояния больного и необходимой защиты. Точные количества терапевтической композиции также зависят от суждения практикующего врача и являются индивидуальными для каждого индивида. Сконструированные вирусы настоящего изобретения можно вводить непосредственно животным, или в качестве альтернативы, вводить в клетки, которые в последующем введут животным.
Как используется в данном документе, термин «введение in vitro» относится к манипуляциям, выполняемым на клетках, извлеченных из животного, включая, но без ограничения, культивируемые клетки. Термин «введение ex vivo» относится к клеткам, с которыми проводят манипуляции in vitro, и которые в последующем вводят живому животному. Термин «введение in vivo» включает все манипуляции, выполняемые на клетках внутри животного. В определенных аспектах настоящего изобретения, композиции можно вводить in vitro, ex vivo или in vivo. Пример введения in vivo включает инъекцию непосредственно в опухоли растворенных композиций посредством интракраниального введения для избирательного уничтожения опухолевых клеток.
Внутриопухолевую инъекцию или инъекцию в опухолевую сосудистую сеть конкретно рассматривают для дискретных, солидных, доступных опухолей, включая опухоль, вскрытую во время хирургического вмешательства. Для опухолей от 1,5 до 5 см в диаметре объем инъекции будет составлять от 1 до 3 куб.см, предпочтительно 3 куб.см. Для опухолей более 5 см в диаметре объем инъекции будет составлять от 4 до 10 куб.см, предпочтительно 5 куб.см. Множественные инъекции, доставляемые в виде единой дозы, включают в себя от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мл объема, предпочтительно 0,2 мл. Контакт с вирусными частицами может предпочтительно происходить посредством выполнения множественных инъекций в опухоль, с интервалами приблизительно 1 см.
В случае хирургического вмешательства, настоящее изобретение применяется до операции, чтобы превратить неоперабельную опухоль в объект для резекции. В качестве альтернативы, настоящее изобретение применяется во время хирургического вмешательства и/или после него, для лечения остаточной или метастатической болезни. Например, в ложе резецированной опухоли можно выполнить инъекцию или перфузию лекарственной формы, включающей аденовирус. Перфузия может быть продолжена после резекции, например, посредством оставления катетера, имплантированного в область хирургического вмешательства. Также предусматривается периодическое послеоперационное лечение.
Когда это целесообразно, также может применяться непрерывное введение, предпочтительно посредством катетеризации, например, когда опухоль удалена, и ложе опухоли обрабатывают для элиминации остаточной, микроскопической болезни. Данная непрерывная перфузия может иметь место в течение периода от приблизительно 1-2 ч до приблизительно 2-6 ч, до приблизительно 6-12 ч, до приблизительно 12-24 ч, до приблизительно 1-2 дней, до приблизительно 1-2 недель или дольше с последующим началом лечения. В целом, доза терапевтической композиции посредством непрерывной перфузии будет эквивалентна дозе, даваемой посредством единичной или множественных инъекций, подобранной в течение периода времени, во время которого происходит перфузия.
Схемы лечения также могут изменяться и часто зависят от типа опухоли, локализации опухоли, прогрессирования заболевания и здоровья и возраста пациента. Очевидно, определенные типы опухоли потребуют более агрессивного лечения, тогда как в это же время, некоторые пациенты не могут переносить более утомительные протоколы. Врач-клиницист будет более подготовлен к принятию таких решений, исходя из известной эффективности и токсичности (при наличии таковых) терапевтической лекарственной формы.
Растворы активных соединений в виде свободных оснований или фармакологически приемлемых солей можно приготовить в воде, подходящим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии также можно приготовить в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах. При обычных условиях хранения и применения данные препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.
Терапевтические композиции настоящего изобретения предпочтительно вводят в форме инъекционных композиций либо в виде жидких растворов, либо суспензий; также можно приготовить твердые формы, пригодные для разведения, или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Данные препараты также могут быть приготовлены в виде эмульсии. Типичная композиция для данных целей включает фармацевтически приемлемый носитель. Например, композиция может содержать 10 мг, 25 мг, 50 мг или вплоть до приблизительно 100 мг сывороточного альбумина человека на миллилитр фосфатно-буферного солевого раствора. Другие фармацевтически приемлемые носители включают водные растворы, нетоксичные эксципиенты, включая соли, консерванты, буферы и тому подобное. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, солевые растворы, парентеральные среды, такие как хлорид натрия или декстроза Рингера. Внутривенные среды включают текучие и питательные наполнители. Консерванты включают антимикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы. pH и точную концентрацию ряда компонентов фармацевтической композиций регулируют в соответствии с хорошо известными параметрами. Если путь является местным, форма может представлять собой крем, мазь или бальзам.
C. Комбинированная терапия
Резистентность опухолевых клеток к ряду видов терапии представляет главную проблему клинической онкологии. Одной из целей текущего исследования рака является поиск путей улучшения эффективности химио- и лучевой терапии, а также других традиционных видов лечения рака. Один из путей состоит в комбинировании данных общепринятых видов лечения с терапией онколитическим аденовирусом. Традиционная терапия лечения видов рака может включать удаление всего или части пораженного органа, внешнее облучение, ксеноновую дуговую и аргоно-лазерную фотокоагуляцию, криотерапию, иммунотерапию и химиотерапию. Выбор лечения зависит от множества факторов, таких как, 1) мультифокальное или монофокальное заболевание, 2) участок и размер опухоли, 3) метастазирование заболевания, 4) возраст пациента или 5) данные патогистологического исследования (The Genetic Basis of Human Рак, 1998).
В контексте настоящего изобретения следует иметь в виду, что аденовирусную терапию можно применять в сочетании с противораковыми агентами, включая химио- или лучевое терапевтическое вмешательство, а также лучевые диагностические методики. Также можно доказать эффективность комбинированной онколитической вирусной терапии с иммунотерапией.
Клетка-«мишень», контактирующая с мутантным онколитическим вирусом и необязательно по меньшей мере с одним другим агентом, может убивать клетки, ингибировать клеточный рост, ингибировать метастазирование, ингибировать ангиогенез или, с другой стороны, преломляет или редуцирует гиперпролиферативный фенотип намеченных клеток. Данные композиции могут быть предоставлены в комбинированном количестве, эффективном для уничтожения или ингибирования пролиферации клетки-мишени. Данный процесс может вовлекать контактирование клетки с экспрессионным конструктом и агентом (агентами) или фактором (факторами) в одно и тоже время или в различное время. Это может быть достигнуто посредством контактирования клетки с единой композицией или фармакологической лекарственной формой, которая включает оба агента, или посредством контактирования клетки с двумя различными композициями или лекарственными формами, при этом одна композиция включает онколитический аденовирус, а другая включает второй агент.
Онколитическую аденовирусную терапию также можно комбинировать с иммуносупрессией. Иммуносупрессия может быть выполнена, как описано в WO 96/12406, который включен в данный документ посредством ссылки. Примеры иммуносупрессивных агентов включают циклоспорин, FK506, циклофосфамид и метотрексат.
В качестве альтернативы, лечение онколитическим аденовирусом может предшествовать или следовать за вторым агентом или лечением с интервалами, варьирующими от минут до недель. В вариантах осуществления, где второй агент и онколитический аденовирус вводят в клетку раздельно, можно в целом убедиться в том, что между временем каждой доставки проходит незначительный период времени, так что второй агент и онколитический аденовирус все еще могут быть способны оказывать на клетку преимущественно комбинированное действие. В таких случаях предусматривается, что агент будет контактировать с клеткой в обоих способах в пределах приблизительно 12-24 ч друг от друга, а более предпочтительно, в пределах приблизительно 6-12 ч друг от друга, с временной задержкой, составляющей лишь приблизительно 12 часов, что является наиболее предпочтительным. однако, в некоторых ситуациях может быть необходимо значительно продлить временной период для лечения, когда между соответствующими введениями проходит несколько дней (2, 3, 4, 5, 6 или 7) до нескольких недель (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8).
Также является понятным, что будет необходимо более чем одно введение либо онколитического аденовируса, и/либо второго агента. Может быть задействован ряд комбинаций, где онколитическим аденовирусом является «A», а другим агентом является «B», в соответствии с примерами, приведенными ниже:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B.
Предусматриваются и другие комбинации. И опять же, для достижения гибели клеток, оба агента доставляют в клетку в комбинированном количестве, эффективном для уничтожения клетки.
Агенты или факторы, пригодные для применения в комбинированной терапии, представляют собой любой антиангиогенный агент и/или любое химическое соединение или способ лечения с противораковой активностью; вследствие этого, термин «противораковый агент», который применяется на протяжении данной заявки, относится к агенту с противораковой активностью. Данные соединения или способы включают алкилирующие агенты, ингибиторы топоизомеразы-I, ингибиторы топоизомеразы-II, антиметаболиты ДНК/РНК, антиметаболиты ДНК, антимитотические агенты, а также ДНК-повреждающие агенты, которые индуцируют повреждение ДНК при введении в клетку.
Примеры химиотерапевтических лекарственных препаратов и пролекарств включают CPT11, темозоломид, соединения платины и пролекарства, такие как 5-FC. Примеры алкилирующих агентов включают, в том числе, хлорамбуцил, цисплатин, циклодизон, флуородопан, метил-ломустин, пиперазинедион, тероксирон. Ингибиторы топоизомеразы-I заключают в себе соединения, такие как камптотецин и производные камптотецина, а также морфолинодоксорубицин. Доксорубицин, пиразолоакридин, митоксантрон и рубидазон являются иллюстрациями ингибиторов-топоизомеразы II. Антиметаболиты ДНК/РНК включают L-аланозин, 5-фторурацил, производные аминоптерина, метотрексат и пиразофурин; при этом группа антиметаболитов ДНК заключает в себе, например, Ара-С, гуанозол, гидроксимочевину, тиопурин. Типичными антимитотическими агентами являются колхицин, ризоксин, таксол и винбластин-сульфат. Другие агенты и факторы включают излучение и волны, которые индуцируют повреждение ДНК, такие как γ-облучение, рентгеновские лучи, УФ-облучение, микроволны, электронная эмиссия и тому подобное. Ряд противораковых агентов, также описанных как «химиотерапевтические агенты», действуют с целью индуцирования повреждения ДНК, которые все предназначены для применения в способах комбинированного лечения, раскрытых в данном документе. предусмотренныеые для использования химиотерапевтические агенты включают, напр., адриамицин, блеомицин, 5-фторурацил (5-FU), этопозид (VP-16), камптотецин, актиномицин-D, митомицин C, цисплатин (CDDP), подофиллотоксин, верапамил и даже перекись водорода. Изобретение также заключает в себе применение комбинации одного или более ДНК-повреждающих агентов, будь то основанные на излучении или активные соединения, такой как применение рентгеновских лучей с цисплатином или применение цисплатина с этопозидом.
При лечения предрака или рака, в соответствии с изобретением, возможен контакт клеток предракового поражения или опухолевых клеток с агентом в дополнение к онколитическому аденовирусу. Это может быть достигнуто посредством облучением участка локализации опухоли излучением, таким как рентгеновские лучи, УФ-облучение, γ-лучи или даже микроволны. В качестве альтернативы, клетки контактируют с агентом посредством введения больному терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающий соединение, такое как адриамицин, блеомицин, 5-фторурацил, этопозид, камптотецин, актиномицин-D, митомицин C, подофиллотоксин, верапамил или, более предпочтительно, цисплатин. Агент может быть приготовлен и использован в качестве комбинированной терапевтической композиции или набора, посредством его комбинирования с онколитическим аденовирусом.
2
2
2
Агенты, которые непосредственно сшивают нуклеиновые кислоты, конкретно ДНК, рассматриваются для облегчения повреждения ДНК, приводящего к синергетической, антинеоплатической комбинации с онколитическим аденовирусом. Применяются агенты цисплатины, такие как цисплатин, и другие ДНК-алкилирующие агенты. Цисплатин широко применяется для лечения рака, с действующими дозами, применяемыми в клинической практике, составляющими 20 мг/м в течение 5 дней каждые три недели в течение всего трех курсов. Цисплатин не всасывается перорально и, вследствие этого, должен доставляться посредством инъекции внутривенно, подкожно, интратуморально или внутрибрюшинно. Блеомицин и митомицин C представляют собой другие противораковые агенты, которые вводят посредством инъекции внутривенно, подкожно, интратуморально или внутрибрюшинно. Типичная доза блеомицина составляет 10 мг/м, тогда как данная доза для митомицина C составляет 20 мг/м.
2
2
Агенты, которые повреждают ДНК, также включают соединения, которые препятствуют репликации ДНК, митозу и расщеплению хромосом. Данные химиотерапевтические соединения включают адриамицин, также известный как доксорубицин, этопозид, верапамил, подофиллотоксин и тому подобное. Широко применяясь в условиях стационара для лечения новообразований, данные соединения вводят посредством болюсных инъекций внутривенно в дозах, варьирующих от 25-75 мг/м с 21-дневными интервалами для адриамицина, до 35-50 мг/м для этопозида внутривенно или двойной внутривенной дозы перорально.
Агенты, которые прерывают синтез и правильность воспроизведения предшественников и субъединиц нуклеиновых кислот, также приводят к повреждению ДНК. В связи с этим разработан ряд предшественников нуклеиновых кислот. Особенно подходящими являются агенты, которые прошли тщательное тестирование и легко доступны. В связи с этим агенты, такие как 5-фторурацил (5-FU), преимущественно используются неопластической тканью, делая данный агент особенно пригодным для нацеливания на опухолевые клетки. Несмотря на существенную токсичность, 5-FU применим в широком спектре носителей, включая местные, однако внутривенное введение с дозами, варьирующими от 3 до 15 мг/кг/день, является широко применяемым, или в качестве альтернативы 5-FC можно вводить и преобразовывать в ткани-мишени или в клетки-мишени.
Другие факторы, которые вызывают повреждение ДНК и интенсивно используются, включают факторы, из которых наиболее известны γ-лучи, рентгеновские лучи и/или прямая доставка радиоизотопов в опухолевые клетки. предусматриваются и другие виды факторов, повреждающих ДНК, такие как микроволны и УФ-облучение. Наиболее вероятно, что все данные факторы влияют на широкий спектр повреждений ДНК, на предшественники ДНК, репликацию и репарацию ДНК и сборку и сохранность хромосом. Диапазоны доз для рентгеновских лучей варьируют от суточных доз, составляющих от 50 до 200 рентген длительных периодов времени (от 3 до 4 недель), до разовых доз, составляющих от 2000 до 6000 рентген. Диапазон доз для радиоизотопов широко варьирует и зависит от периода полураспада изотопа, силы и типа испускаемого излучения и накопления опухолевыми клетками.
Иммунотерапию применяют как часть комбинированной терапии, в сочетании с терапией мутантным онколитическим вирусом. Общий подход к комбинированной терапии обсужден ниже. В общем, опухолевая клетка должна нести какой-либо маркер, который поддается выделению, т.е., не имеется в большинстве других клеток. Существует много опухолевых маркеров, и любой из них может быть подходящим для выделению в контексте настоящего изобретения. Обычные опухолевые маркеры включают раковоэмбриональный антиген, простат-специфический антиген, мочевой опухолеассоциированный антиген, эмбриональный антиген, тирозиназу (p97), gp68, TAG-72, HMFG, сиалированный антиген Lex, MucA, MucB, PLAP, эстрогеновый рецептор, рецептор ламинина, erb B и pi 55. Антитела, специфичные для CAR, интегрина или других молекул клеточной поверхности, применяются для идентификации клеток, которые аденовирус мог в значительной мере инфицировать. CAR представляет собой белок аденовирусного рецептора. Пентонная основа аденовируса опосредует прикрепление вируса к рецепторам интегрина и интернализацию частиц.
Специалиста в данной области направляют к 15 изданию «Remington's Pharmaceutical Sciences» 1980 года. Некоторые колебания в дозировке обязательно возникнут в зависимости от состояния больного, подлежащего лечению. Человек, ответственный за введение, так или иначе, будет определять подходящую дозу для конкретного больного. Более того, при введении человеку препараты должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты, как требует бюро биологических стандартов Управления по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов.
В дополнение к терапии онколитическим аденовирусом, комбинированной с химио- и лучевой терапией, также предполагается, что комбинация с другой генной терапией будет являться преимущественной. Например, выделение онколитического аденовируса в комбинации с одновременным выделением p53 может оказать улучшенное противораковое лечение. Понятно, что таким способом можно выделить любой связанный с опухолью ген или нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, например, p21, Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, BCRA2, pi 6, FHIT, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, FCC, MCC, ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl и abl.
Антиангиогенную терапию также можно комбинировать преимущественно с терапией онколитическим аденовирусом, раскрытой в данном документе. В частности, бевацизумаб (Avastin), Genentech/Roche) представляет собой ингибитор ангиогенеза, лекарственный препарат, который замедляет рост новых кровеносных сосудов. Он лицензирован для лечения ряда видов рака, включая колоректальный, легкого, молочной железы (за пределами США), глиобластому (США и Япония), почки и яичников. Бевацизумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, которое ингибирует фактор роста сосудистого эндотелия A (VEGF-A). VEGF-A представляет собой химический сигнал, который стимулирует ангиогенез при ряде заболеваний, особенно при раке. Бевацизумаб был первым клинически доступным ингибитором ангиогенеза в Сеодиненных Штатах.
Дополнительно предусматривается, что виды терапии, описанные выше, могут быть реализованы в комбинации со всеми видами хирургических вмешательств. Приблизительно 60% людей с раком будут подвергаться хирургическому вмешательству любого вида, которое включает превентивное, диагностическое или определяющее стадию заболевания, радикальное и паллиативное хирургическое вмешательство. Данные виды хирургического вмешательства применяют в сочетании с другими видами терапии, такими как терапия онколитическим аденовирусом.
Радикальное хирургическое вмешательство включает резекцию, при которой механически удаляется, иссекается или разрушается вся или часть раковой ткани. Резекция опухоли относится к механическому удалению по меньшей мере части опухоли. В дополнение к резекции опухоли, лечение с помощью хирургического вмешательства включает лазерную хирургию, криохирургию, электрохирургию и микроскопически контролируемую операцию (операцию Моса). Дополнительно предусматривается, что настоящее изобретение применяется в сочетании с удалением видов поверхностного рака, предрака или незначительного объема нормальной ткани.
После иссечения части или всех раковых клеток, ткани или опухоли в теле может быть образована полость. Лечение может быть достигнуто посредством перфузии, прямой инъекции, системного введения или местного нанесения на область с дополнительной противораковой терапией. Данное лечение можно повторять, например, через каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней, или через каждые 1, 2, 3, 4, и 5 недель или через каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. Кроме того, данные виды лечения могут состоять в изменяющихся дозировках. Более того, при видах лечения, задействующих более одного типа лечения (т.е., конструкт, противораковый агент и хирургическое вмешательство), время между данными типами лечения может составлять интервал приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или приблизительно 24 часа; интервал приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней; интервал приблизительно 1, 2, 3, 4, или 5 недель; и интервал приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев или более.
Также следует отметить, что любой из вышеизложенных видов терапии может оказаться полезными сам по себе. В этом отношении, акцент на химиотерапию и терапию немутантным онколитическим вирусом в комбинации также следует понимать как предположение, что данные методики можно задействовать отдельно.
IV. СПОСОБЫ СКРИНИНГА
С аденовирусом Δ24 и другим мутантным аденовирусом, которые неспособны связывать Rb, необходимо, чтобы метаболический путь Rb был дефектным, чтобы клетка считывала и транслировала вирусные белки. Требуется, чтобы метаболический путь Rb был дефектным в том смысле, что он не способен репрессировать активирующее транскрипцию действие E2F. E2F активирует транскрипцию клеточных генов и аденовирусной ДНК, если его активность не репрессирована. Примеры путей, которыми E2F может выключать репрессию, включают, но без ограничения, Rb, неспособный связывать E2F (т.е., связывание E1A с Rb), суперэкспрессию E2F, меньше Rb, чем E2F, и ситуации, в которых Rb остается фосфорилированным.
В дополнение, авторы настоящего изобретения наблюдали, что идентификация Thl, ориентирующего иммунный ответ у больных, прогнозирует успешное лечение онколитическими аденовирусами настоящего изобретения. Также, наличие Th2-ответа может быть индикатором отсутствия ответа. Специфическим маркером Thl является IL-12p70. Также высокие уровни антител к опухолеассоциированным антигенам, таким как NLRP4, можно оценивать и при обнаружении прогнозируемого ответа на терапию онколитическим вирусом.
Маркеры Thl включают IL-1β, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-γ, TNF-α, TNF-α, GMCSF, расщепленную каспазу-3, неоптерин и β2-микроглобулин. Поверхностные маркеры Thl включают CXCR3, CCR5, CCR1 и β1- и α-цепи рецептора для IL-12. Маркеры Th2 включают IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, TGFβ и фосфорилированный STAT3. Поверхностные маркеры Th2 включают CXCR4, CCR3, CCR4, CCR7, CCR8, рецептор для IL-1 и CD30. Опухолеассоциированные антигены включают BRAF, CABYR, CRISP3, CSAG3, CTAG2, DHFR, FTHL17, GAGE1, LDHC, MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4, MAGEB6, MAPK1, MICA, MUC1, NLPR4, NYES01, P53, PBK, PRAME, SOX2, SPANXAl, SSX2, SSX4, SSX5, TSGAIO, TSSK6, TULP2, XAGE2 и ZNF 165. В частности, исследуют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 из CABYR, MAGEA1, MAGEA3, MAGEB6, NLPR4, NYES01, PBK и ZNF165.
Антитела можно применять для выявления аденовирусных белков (напр., E1A), Rb, и других белков метаболического пути Rb, Thl-ответа, Th2-ответа или опухолеассоциированных антигенов. В определенных аспектах изобретения, может вырабатываться одно или более антител, которые являются иммунореактивными с многочисленными антигенами. Данные антитела применяют в ряде диагностических или терапевтических вариантов применения, описанных в данном документе ниже.
Как используется в данном документе, термин «антитело» предназначен для широкого отнесения к любому иммунологическому связывающему агенту, такому как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. В целом, IgG и/или IgM являются предпочтительными, поскольку они являются наиболее распространенными антителами в физиологической ситуации, и поскольку их наиболее легко изготовить в лабораторных условиях. Средства для приготовления и анализа антител также хорошо известны в данной области (см., напр., Harlow and Lane (1988), включенный в данный документ посредством ссылки).
Определенные варианты осуществления изобретения предоставляют антитела к антигенам и транслируемые белки, полипептиды и пептиды, которые связываются по меньшей мере с одним агентом для образования конъюгата с антителом. С целью повышения эффективности молекул антител как диагностических или терапевтических агентов, является общепринятым связывание или ковалентное связывание или образование компекса по меньшей мере с одной желаемой молекулой или фрагментом. Репортерная молекула определяется как любой фрагмент, который может быть выявлен с применением анализа. Неограничивающие примеры репортерных молекул, которые конъюгируют с антителами, включают ферменты, радиоизотопные метки, гаптены, флуоресцентные метки, фосфоресцирующие молекулы, хемилюминесцентные молекулы, хромофоры, люминесцентные молекулы, фотоаффинные молекулы, окрашенные частицы или лиганды, такие как биотин.
Определенные примеры конъюгатов с антителом представляют собой такие конъюгаты, в которых антитело связано с выявляемой меткой. «Выявляемые метки» представляют собой соединения и/или элементы, которые можно выявить благодаря их специфическим функциональным особенностям и/или химическим характеристикам, применение которых делает возможным выявление антитела, к которому они прикрепляются, и/или при необходимости дополнительно количественно определить.
Экспрессиию Rb или экспрессию аденовирусного гена в популяциях клеток можно определить посредством вестерн-блоттинга с применением антител в качестве зондов к аденовирусным белкам. Выявленный уровень вирусных белков может указать, происходит ли экспрессия вируснного белка в клетке.
Можно задействовать способы иммунологического анализа для определения биологических компонентов, таких как белок (белки), полипептид (полипептиды) или пептид (пептиды), задействованные в репликации аденовируса или метаболических путях Rb или клеток p53. Некоторые способы иммунологического анализа включают ферментный иммуносорбентный тест (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA), иммунорадиометрический анализ, иммунофлуоресцентный анализ, хемилюминесцентный анализ, биолюминесцентный анализ и вестерн-блоттинг, причем упомянуты только некоторые из них. Стадияы ряда пригодных способов иммунологического анализа описаны в научной литературе, такой как, напр., Doolittle and Ben-Zeev (1999); Gulbis and Galand (1993); De Jager et al. (1993); Nakamura et al. (1987), каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.
Что касается определения антигена, анализируемым биологическим образцом может быть любой образец, который, как подозревается, содержит антиген, такой как, например, срез ткани или препарат, гомогенизированный экстракт ткани, клетка, органелла, отделенные и/или очищенные формы любых указанных выше антиген-содержащих композиций или даже любая биологическая текучая среда, которая входит в контакт с клеткой или тканью, включая кровь и/или сыворотку, хотя предпочтительными являются образцы или экстракты тканей.
В целом, определение образования иммунокомплекса хорошо известно в данной области и может быть достигнуто посредством применения ряда подходов. Данные способы в целом основаны на выявлении метки или маркера, такого как любой из радиоактивных, флюоресцентных, биологических и ферментных маркеров. Патенты США, описывающие применение данных меток, включают 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 и 4366241, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки. Конечно, можно найти дополнительные преимущества посредством использования вторичного связывающего лиганда, такого как вторичное антитело и/или конфигурация биотина/авидина для связывания с лигандом, как известно в данной области.
Можно провести биопсию опухоли и, вышеуказанные исследования выполняли при этом для определения наличия или отсутствия глиомных клеток, либо перед, либо во время или после лечения. Пример протокола биопсии состоит в следующем. Стереотактическая биопсия представляет собой точное введение металлического зонда в опухоль головного мозга, отрезание небольшого кусочка опухоли головного мозга и его извлечение, чтобы затем исследовать под микроскопом. Пациента транспортируют в блок КТ или МРТ и под местной анестезией прикрепляют рамку к волосистой части головы. «Штыри» рамки прикрепляют к наружной пластинке черепа для стабильной фиксации (до окончания биопсии рамка не будет и не может смещаться вперед от этой точки). Получают изображение (МРТ или КТ). Нейрохирург исследует изображение и определяет наиболее безопасную траекторию или путь к мишени. Эти средства позволяют обойти жизненно важные структуры. Определяют пространственные координаты мишени и выбирают оптимальный путь. Под общей анестезией выполняют биопсию. Над точкой входа производят небольшой разрез, и сквозь череп просверливают небольшое отверстие. Перфорируют твердую мозговую оболочку, и в мишень медленно вводят биопсийный зонд. Биопсийный препарат вынимают и помещают в жидкий консервант для исследования под микроскопом. Часто в блоке для биопсий присутствует патоморфолог, чтобы было возможно быстро определить успешность биопсии.
V. ПРИМЕРЫ
Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Квалифицированным специалистам в данной области следует понимать, что методики, раскрытые в примерах, которые следуют за представленными методиками, раскрыты авторами изобретения для адекватного функционирования при практическом использовании изобретения, и таким образом могут считаться установленными предпочтительными способами их практического использования. Однако, в свете настоящего раскрытия, квалифицированным специалистам в данной области следует понимать, что в конкретных вариантах осуществления, которые раскрыты, могут быть сделаны многие изменения, которые все-таки получают похожий или одинаковый результат без выхода за пределы концепции, сущности и объема правовых притязаний изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что определенные агенты, которые являются как химически, так и физиологически связанными, могут быть замещены агентами, описанными в данном документе, при этом могут быть достигнуты такие же или сходные результаты. Все подобные аналогичные замещения и модификации, очевидные квалифицированным специалистам в данной области, считаются находящимися в пределах сущности, объема и концепции изобретения, которые определены прилагаемой формулой изобретения.
ПРИМЕР 1 - СПОСОБЫ
Фаза 1 возрастания дозы, состоящее из двух частей исследование DNX-2401 при низкодифференцированной глиоме было начато в спонсируемом исследовании нового препарата в Онкологическом центре им. М.Д.Андерсона в Хьюстоне, Техас. Чтобы быть допущенными к исследованию, для пациентов требовалось наличие подтвержденной гистологически, рецидивирующей низкодифференцированной злокачественной глиомы. Группа A исследования характеризовала прямую внутриопухолевую инъекцию разовой дозы DNX-2401 в зону роста, подтвержденной с помощью биопсии рецидивирующей глиомы, тогда как Группа B характеризовала инъекцию разделенной дозы вируса в ложе резекции после иссечения глиомы. Начальная доза для обеих групп исследования составила 107 (напр., 1×107) вирусных частиц (vp), с перспективой повышения дозы с приращениями, для которых логарифм отношения соседних значений равен 0,5, вплоть до 310 vp. Первичными целями исследования было определение безопасности, толерантности, выполнимости и биологического действия инъецируемого DNX-2401 в опухоли головного мозга человека in situ.
Пациенты в Группе A получили прямую внутриопухолевую инъекцию с помощью иглы и когортой подвергались стандартному увеличению дозы. Опухоли могли быть или могли не быть хирургически резектабельными. Величины назначенных доз составили: 1×107, 3×107, 1×108, 3×108, 1×109, 3×109, 1×1010 и 3×1010 вирусных частиц (vp). За пациентами наблюдали в течение 28 дней с последующей инъекцией вируса перед тем, как были включены и получили лечение пациенты в следующей когорте.
Группа B включала только пациентов с резектабельными опухолями. Пациенты в Группе B получили прямую внутриопухолевую инъекцию с помощью постоянно имплантированного катетера в центр опухоли, а затем когортой подверглись стандартному увеличению дозы (т.е., величины доз составили 1×107, 3×107, 1×108, 3×108, 1×109, 3×109, 1×1010 и 3×1010 вирусных частиц (vp)). Увеличение дозы для группы B было аналогичным группе A, за исключением того, что группа B отставала от группы A на одну величину дозы. Пациенты в Группе A не были включены в Группу B. После 14 дней наблюдения опухоль резецировали единым блоком с катетером в месте для предоставления биологических препаратов для патоморфологического и молекулярного анализов. После удаления опухоли в остаточную опухоль, окружающую полость резекции, дополнительно вводили в виде инъекции DNX-2401 (т.е., интрамуральную инъекцию в ложе опухоли).
В Группу A набор 25 больных завершился в сентябре 2012 года. Максимальная достигнутая доза по плану составила 3×1010 vp. Набор в Группу B, в которой оценивали DNX-2401 в качестве дополнения к хирургическому вмешательству, был начат позже и включил 12 больных с максимальной дозой, составившей 3×108 vp. Наблюдение, как было запланировано, происходило с месячными интервалами в течение 4 месяцев, каждые 2 месяца в течение 2 лет, и каждые 4 месяца в течение жизни, соответственно, для обоих лечебных групп. Пациентам проводили и будет проводиться мониторинг токсичности и симптомов, и оценивали с применением магнитно-резонансных изображений (MRI), спинномозговой пункции и других исследований в качестве подходящих, исход из клинических стандартов лечения в течение продолжения исследования.
ПРИМЕР 2 - РЕЗУЛЬТАТЫ
Оценку исследования для обоих лечебных групп проводили с равными временными интервалами, как уже указано в графике выполнения оценок. Данные регистрировали в электронных индивидуальных регистрационных картах с помощью стандартов Андерсона и отслеживали внутриинституционально через службу исследования новых препаратов в Онкологическом центре им. М.Д.Андерсона приблизительно каждые 4 недели. Представленные данные не проверялись и на данном стадияе считались предварительными.
Длительность лечения. Максимальное воздействие вируса на пациента в Группе A состояло в 3×1010 vp после внутриопухолевой доставки (4 пациента). Максимальная доза, доставленная трем пациентам в группе B, составила 6×108 vp.
Таблица 1Воздействие
Количество пациентов
суммарная доза
комментарии
Группа А (N=25)
Когорта 1-1×10<sup>7</sup>
3
1×10<sup>7</sup>
Интратуморальная
Когорта 2-3×10<sup>7</sup>
3
3×10<sup>7</sup>
Интратуморальная
Когорта 3-1×10<sup>8</sup>
3
1×10<sup>8</sup>
Интратуморальная
Когорта 4-3×10<sup>8</sup>
3
3×10<sup>8</sup>
Интратуморальная
Когорта 5-1×10<sup>9</sup>
3
1×10<sup>9</sup>
Интратуморальная
Когорта 6-3×10<sup>9</sup>
3
3×10<sup>9</sup>
Интратуморальная
Когорта 7-1×10<sup>10</sup>
3
1×10<sup>10</sup>
Интратуморальная
Когорта 8-3×10<sup>10</sup>
4
3×10<sup>10</sup>
Интратуморальная
Группа В (N=12)
Когорта 1-1×10<sup>7</sup>
3
2×10<sup>7</sup>
Интратуморальная/интрамуральная
Когорта 2-3×10<sup>7</sup>
3
6×10<sup>7</sup>
Интратуморальная/интрамуральная
Когорта 3-1×10<sup>8</sup>
3
2×10<sup>8</sup>
Интратуморальная/интрамуральная
Когорта 4-3×10<sup>8</sup>
3
6×10<sup>8</sup>
Интратуморальная/интрамуральная
Таблица 2Распределение Пациентов
Всего
Количество подвергшихся скринингу
48
Количество не прошедших скриниг
11
Группа А - интратуморальное введение
Количество получивших лечение
25
В настоящее время состоят в исследовании посредством последующего врачебного наблюдения
3
Группа В - интратуморальное/интрамуральное введение
Количество получивших лечение
12
В настоящее время состоят в исследовании посредством последующего врачебного наблюдения
2
Всего в исследование было включено 37 пациентов, с 25 пациентами, получившими лечение в группе A (внутриопухолевое введение DNX-2401), и 12 пациентами, получившими лечение в группе B (внутриопухолевое/интрамуральное введение DNX-2401). По состоянию на март 2013 года, двух из 25 пациентов, получивших лечение в группе A и одного из 12 пациентов, получившего лечение в группе B, оставили в исследовании и вели согласно протоколу.
Из 37, включенных в исследование, у 29 пациентов была гистологически подтвержденная глиобластома, у семерых была анапластическая астроцитома, и у одного пациента была глиосаркома. После включения в исследование 27 пациентов перенесли первый рецидив и у 10 пациентов рецидив опухоль возник дважды. Что касается функциональных нарушений, о 90-100 по шкале Карновского сообщалось у 28 пациентов (20 пациентов в Группе A и восемь пациентов в Группе B) и о 70-80 по шкале Карновского сообщалось у девяти пациентов (пять пациентов в Группе A и четыре пациентов в Группе B).
Группа A (включено в исследование 25). Всех пациентов, которые имели измеряемую опухоль и закончили лечение однократной дозой, считали подлежащими для оценки ответа (N=25). Пациентов с гистологически подтвержденными рецидивирующими низкодифференцированными глиомами активно предварительно лечили в связи с заболеванием во время регистрации исследования. Все пациенты получали лучевую терапию с сопутствующим темозоломидом.
Все пациенты (которые могут или не могут поддаваться хирургическому лечению) успешно завершили лечение (N=25) вплоть до дозы, составляющей 3×1010 vp. Хотя это было исследование с повышением дозы, охватывающее увеличение четырех порядков, всех пациентов включили в анализ эффективности. Полный ответ (CR) наблюдали у 4 (16%) пациентов, частичный ответ (PR) у 2 (8%), стабильное заболевание (SD) у 7 (28%) и прогрессирующее заболевание (PD) у 12 (48%). Клиническую пользу (CR+PR+SD) наблюдали у 13 (52%) пациентов. Наименьшая доза, при которой наблюдали ответ (CR) с применением критериев RANO, составила 1×108 vp (когорта 3). У данного пациента продолжали признавать полный ответ, и он оставался жив и в исследовании на 38 месяце после лечения DNX-2401. Второй CR был в 7 когорте при дозе Ie10 vp.
Всех пациентов включили в анализ PFS (выживаемость без прогрессирования заболевания) и OS (общую выживаемость). Всего 7 (28%) пациентов достигли по меньшей мере 6-месячной выживаемости без прогрессирования (PFS-6). Медиана OS для всех больных составила 8 месяцев и 1 год. OS составила 32% у 1 выжившего пациента (5,5 месяцев), который еще не достиг отметки однолетней. Медиана OS для респондентов (CR+PR) составила 14 месяцев. Что касается марта 2013 года, шесть пациентов (24%, 2 CR, 1 PR, 3SD) остались живы, 5 из которых выжили через более чем один год после лечение.
Группа B (зарегистрировано 12). Пациентов с гистологически подтвержденной рецидивирующей низкодифференцированной глиомой активно предварительно лечили к моменту включения в исследование. Все пациенты получали лучевую терапию с сопутствующим темозоломидом.
Все пациенты успешно завершили лечение (N=12) вплоть до дозы, составившей 3×108 vp (в течение общего воздействия, составившего 6×108 vp, фракционно доставленного в дни 0 и 14). Три пациента (25%) имели измеряемые проявления заболевания после резекции через 14 дней после внутриопухолевой инъекции, и 9 (75%) пациентов не имели измеряемых проявлений заболевания вследствие хирургического вмешательства. Из тех 3 пациентов с измеряемыми проявлениями заболевания частичный ответ (PR) был достигнут у 1, и стабильное заболевание (SD) у 2 пациентов. Из 9 пациентов (75%) без измеряемых проявлений заболевания, 5 (56%) пациентов демонстрировали стабильное заболевание (SD), которое определили посредством отсутствия рецидива. Клиническая польза (CR+PR+SD) для всех пациентов в группе B составила 66%. Всего по меньшей мере у 3 (25%) пациентов не наблюдалось прогрессирование в течение 6 месяцев. В марте 2013 года живыми остались семь (58%) пациентов.
Механизм опухолевого ответа. Основные преимущества однократного введения DNX-2401 в качестве монотерапии при рецидивирующей низкодифференцированной глиоме включают:
- стойкий противоопухолевый ответ с характерными изменениями при МРТ
- минимальные, если они вообще возникают, токсические побочные эффекты, улучшающие тем самым качество жизни пациента
- не исключается применение других противораковых агентов или видов лечения в комбинации
- возможность полного противоопухолевого ответа
Опухолевый ответ на терапию, во всей видимости, сопровождается значительными изменениями при МРТ с контрастированием. Они включают ранние, всеобъемлющие изменения и в контрастной картине («гроздь винограда») в некоторых случаях с последующим появлением «нитевидной» картине или что напоминает «мыльные пузыри». Через несколько месяцев после лечения DNX-2401 некоторые опухоли начинают прогрессировать и имеют менее определяемые границы. Теперь считается, что это вызвано воспалением, таким как воспаление, наблюдаемое при других иммунотерапевтических продуктах. Это будет иметь место при превращении в более дискретную опухоль меньшего размера, которая в некоторых случаях переходит к полному ответу.
Получено подтверждение, что характерные изменения при МРТ, наблюдаемые во время данного испытания, связаны с ответом, частично, из патологических отчетов при хирургическом резецировании опухолей. Две опухоли резецировали через несколько месяцев после терапии DNX-2401 в ответ на то, что походило на прогрессирование опухоли. В обоих случаях патоморфологи сообщали, что опухоли были на >80% разрушены («связанный с лечением некроз»), при этом оставшаяся опухоль инфильтровалась за счет примешивания иммунных клеток (впоследствии было показано, что это были преимущественно CD8 T клетки). Авторы предполагают, инфицирование DNX-2401 может представлять собой инициирование эффективного противоопухолевого иммунного ответа или дестабилизации опухоли иным образом. Если данное открытие подтверждается, это могло бы объяснить сохранение противоглиомного действия, наблюдаемого (на МРТ-изображениях и/или резекции после лечения) в опухолях некоторых пациентов после однократной инъекции DNX-2401.
Противоопухолевый ответ на лечение является особенно важной концевой точкой при данном заболевании, так как смещение нормальных тканей головного мозга вследствие быстро растущей опухоли приводит в итоге к тяжелой инвалидности и смерти. В общем, существует высокая неудовлетворенная потребность в новой методике активного воздействия на глиобластому, которое при минимальных осложнениях, может положительно влиять на течение болезни. Как новый агент, связанный с меньшими побочными эффектами, при пониженном риске лекарственной резистентности и побочной токсичности, DNX-2401 обладает способностью быть более безопасным и более эффективным, чем существующие в настоящее время виды терапии рецидивирующей глиобластомы. Более того, похоже, что по эффективности он превышает даже Avastin, который достигал частоты объективных ответов, составляющей 25,9% (22/85). У двадцати двух пациентов достигнута частичная ремиссия, с медианой продолжительности ответа 4,2 месяца.
Биомаркеры и противоопухолевый иммунитет. Опыт, полученный во время Фазы I клинического исследования, выявил интересную корреляцию между пациентами, которые ответили на онколитическую терапию DNX-2401, и пациентами, которые не ответили. Данная корреляция основана на анализе сыворотки на антитела к связанным с раком антигенам (CRA). Поскольку антигены CRA не присутствуют в нормальных тканях и «включаются» раком по мере их прогрессирования, они несут информацию о природе заболевания внутри рака.
Авторы изобретения тестировали пациентов, поступивших в Фазу I клинического исследования на наличие или отсутствие антител к 31 различному CRA. Они специально искали пациентов, которые экспрессировали антитела к данным антигенам перед получением DNX-2401, в также пациентов, у которых вырабатывались антитела после лечения. Неожиданно, пациенты с опухолями, которые имели рентгенологический ответ на DNX-2401, имели низкий гуморальный иммунный ответ на определенный набор опухолевых антигенов или не имели его.
Отсутствие иммунного ответа предполагало, что ответ на терапию DNX-2401 может быть основан на клеточном против гуморального иммунном ответе. Из-за этого, авторы изобретения рассматривали цитокиновый профиль респондентов против нереспондентов с предположением, что сильные респонденты должны демонстрировать большее смещение к Thl (цитотоксические клетки T8), а нереспонденты должны демонстрировать профиль, более соответствующий профилю Th2 (антителопродуцирующий). В целом, Thl-ответ характеризуется увеличением антиген-специфического гамма-интерферона (IFN-γ), IL-12 и комплементсвязывающих антител, тогда как фенотип Th2 характеризуется выработкой IL-4, IL-5, IL-10 и повышением IgE, IgA и общих IgG антител. Данное ожидание было подтверждено экспрессией цитокинов (с использованием анализов полуколичественного MSD ELISA).
Измерение антител в сыворотке пациента обладает некоторыми преимуществами по сравнению с другими более традиционными классами биомаркеров. Во-первых, сыворотка является легко доступной тканью, требующей относительно неинвазивного взятия образцов. Во-вторых, антитела предоставляют усиленный ответ, и их относительно большое количество делает возможным раннее уведомление или обнаружение небольших изменений. В-третьих, не требуется биопсия ткани, которая является как инвазивной, неприятной для пациента, так и, в зависимости от доступности опухоли, часто содержит смесь ряда типов клеток.
Безопасность. К настоящему времени не ожидается токсичность, связанная с введением DNX-2401 в опухоли головного мозга. Побочные эффекты в целом являются от легких до умеренных по тяжести и не связаны с вирусом после обоих типов введения (т.е. внутриопухолевого и интрамурального). Не было пациентов, прервавших исследование из-за побочного действия, и анализ сыворотки, слюнной жидкости и мочи пациента не показал распространение вируса. Все серьезные побочные эффекты в виде смерти считались не связанными с DNX-2401. Данный профиль безопасности является значительным в том, что Avastin может вызывать тяжелую токсичность у пациентов. Ни один из данных пациентов не испытывал каких-либо побочных эффектов, связанных с лекарственным препаратом, и таким образом в настоящем нет абсолютно никаких сложностей с токсичностью или безопасностью DNX-2401.
Данные безопасности из двух дополнительных клинических исследований, проведенных с DNX-2401, подтверждают безопасность, наблюдаемую в клиническом исследовании головного мозга. 21 женщина с гинекологическими злокачественными опухолями ежедневно принимала в течение 3 дней дозы, варьирующие от 1e9 vp до 1e12 vp/день при гинекологическом раке (Kimball et ah, 2010; ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00562003). В дополнение, получали лечение 12 пациентов с низкодифференцированной глиомой, и исследователи сообщили, что инфузия вируса в опухоль и окружающий головной мозг является возможной и безопасной. Побочные эффекты носили временный характер, и тяжелые побочные эффекты не были связаны с вирусом (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01582516).
Применение множества современных видов лечения рака ограничено вследствие их тяжелой токсичности для пациентов. Например, >99% пациентов, включенных в исследование AVF3708g, которые получали бевацизумаб, сообщали об испытанных побочных эффектах, включая утомляемость, головную боль, гипертензию, кровотечение/кровоточивость, случаи венозной/артериальной тромбоэмболии. Другие тяжелые случаи включали осложнения при заживлении ран, протеинурию, перфорацию желудка и/или кишечника. На основании исторических данных токсичности методов лечения рака, отсутствие побочных эффектов DNX-2401 является неожиданным и удивительным.
Примеры результатов конкретных пациентов. Три пациента, которые получали только лечение глиобластомы DNX-2401, продолжали последующее врачебное наблюдение. Подробности предоставлены ниже.
Пациент #12. Пациентке #12 (56-летняя белая женщина) был установлен диагноз, который привел к резекции опухоли с последующим химиотерапевтическим лечением, которое состояло из темозоломида и дазатиниба, и лучевой терапии. Она была включена в Группу А (внутриопухолевое введение DNX-2401) и рандомизирована в Когорту 3. Она получила 4 внутриопухолевые инъекции/1 мл DNX-2401 с суммарной дозой, составившей 1×108 вирусных частиц (vp). Клинически, пациентка чувствовала себя очень хорошо. В последующем все неврологические симптомы исчезли в течение первых 6 месяцев. У нее отмечалось незначительное увеличение общего размера поражения головного мозга, что выглядело как ложное прогрессирование/воспаление; однако, за этим последовало непрерывное уменьшение размеров опухоли. Во время исследования она не испытывала тяжелых побочных эффектов (SAE). Считалось, что все побочные эффекты не связаны с DNX-7401 за исключением лимфоцитопении, которую сочли маловероятно связанной и обусловленной темозоломидом. К 32 месяцу пациентка в настоящее время жива и наблюдается на выживаемость. Последняя МРТ выявила лишь рубцевание и уменьшение окружающего головного мозга, что считалось полным ответом только на вирусную терапию. Состояние пациентки продолжает оставаться удовлетворительным, и она проходит контрольное обследование каждые 4 месяца. Она чувствует себя хорошо и сообщает о прогулках в течение 60 минут в день и занятиях садоводством, деятельности, к которой она была неспособна до получения DNX-2401.
Пациент #33. Пациентка #33 (40-летняя белая женщина) подверглась резекции первичной опухоли, идентифицированной, как глиобластома. Она получала химиотерапию темозоломидом и лучевую терапию. Ее включили в Группу A (внутриопухолевое введение DNX-2401) и рандомизировали в Когорту 7. Она получила 4 внутриопухолевые инъекции/мл DNX-2401 в суммарной дозе, составившей 1×1010 vp. Она чувствовала себя хорошо в течение месяца тотчас после инъекции с исчезнувшими неврологическими симптомами, в частности экспрессивной афазией и сложными частичными эпилептическими припадками. Дополнительно, практически исчезла масса с усиленным контрастированием, а также патологические изменения в режиме с подавлением сигнала свободной воды на серийных МРТ-снимках. Пациентка не испытывала тяжелых побочных эффектов во время исследования. В общем, похоже, что пациентка имела полный ответ по критериям МакДональда. После введения DNX-2401 пациентка в настоящее время жива и чувствует себя хорошо. К настоящему времени она не имеет неврологических симптомов в течение 16 месяцев после инъекции DNX-2401.
Пациент #42. Пациентка #42 (белая женщина) подверглась резекции первичной опухоли, которая подтвердила глиобластому. Она получила лучевую терапию, а также получила 4 курса химиотерапии в виде следующего: темозоломид, вновь мемантин темозоломид и мацитентан. Она была включена в Группу B (внутриопухолевое/интрамуральное введение DNX-2401) и рандомизирована в Когорту 4. Она получила одну внутриопухолевую инъекцию/мл DNX-2401 в суммарной дозе, составившей 3×108 vp, с последующими 10 интрамуральными инъекциями/1 мл DNX-2401 в суммарной дозе, составившей 3×108 vp. После резекции измеряемые проявления заболевания отсутствовали. Во время участия в исследовании она не испытывала тяжелых побочных эффектов. Пациентка в настоящее время жива и чувствует себя хорошо.
Квалифицированному специалисту в данной области вполне очевидно, что настоящее изобретение хорошо адаптирована для достижения целей и получения упомянутых результатов и преимуществ, а также присущих ему результатов и преимуществ. Способы, процедуры и методики, описанные в данном документе, в настоящее время являются показательными для предпочтительных вариантов осуществления и предназначены для иллюстрирования и не предполагаются в качестве ограничений объема правовых притязаний квалифицированным специалистам в данной области встретятся изменения в них и другие варианты применения, которые включены в пределы сущности изобретения или ограничены объемом правовых притязаний приложенной формулы изобретения.
VI. Ссылки
Следующие ссылки в той степени, в которой они предоставляют иллюстративные процедурные или иные подробности, дополнительные к тем, которые изложены в данном документе, специально включены в данный документ посредством ссылки.