Алгоритм диагностики аденомиоза с использованием неинвазивных методов исследования

АЛГОРИТМ ДИАГНОСТИКИ АДЕНОМИОЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕИНВАЗИВНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сорокина А.В., Радзинский В.Е., Зиганшин Р.Х., Арапиди Г.П. УДК: 618.14-006.55:616-08-039.75

Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И. Пирогова,

Российский Университет Дружбы Народов,

Институт биоорганическойхимии им. М.М. Шемякина и ЮА. Овчинникова РАН

Резюме

Предлагается использовать неинвазивный двухступенчатый подход к ранней диагностике аденомиоза. Обследовано 120 пациенток с диагнозом «аденомиоз» различной степени тяжести и 30 практически здоровых пациенток составили контрольную группу. На первом этапе проводилось протеомное профилирование сыворотки крови с использованием МАЛДИ масс-спектрометрии, что позволило дифференцировать пациенток с аденомиозом и контрольную группу. На втором этапе проводилось исследование цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-10) и факторов роста (Е0Р, VEGF) в сыворотке крови с использованием иммуноферментного анализа, что позволило выявлять активные формы аденомиоза и тем самым определять прогноз течения.

Ключевые слова: аденомиоз, МАЛДИ масс-спектрометрия, ИЛ-6, ИЛ-10, факторы роста, EGF, VEGF.

ALGORITHM OF DIAGNOSIS OF ADENOMYOSIS BY NON-INVASIVE METHODS

Sorokina A.V., Radzinsky V.E.

The using of non-invasive methods are offered to early diagnosis of adenomyosis. Comparative MALDI mass spectrometry profiling of blood serum samples from patients with verified adenomyosis (n=120) as well as from a control group of healthy women (n=30) has been carried out. Mass spectrometry profiles demonstrated sensitivity and specificity close to 100% for the detection of adenomyosis. On the second stage we discovered the production of cytokines (IL-6, IL-10) and growth factors (EGF, VEGF) by an enzyme-linked immunosorbent assay from women with adenomiosis. We observed that levels of IL-6, IL-10, EGF, VEGF are correlated with the severity of the disease and prognosis.

Keywords: adenomyosis, MALDI mass spectrometry, IL-6, IL-10, growth factors, EGF, VEGF.

Эндометриоз является одной из наиболее актуальных проблем современной гинекологии и встречается у более чем 50% женщин репродуктивного возраста, причем в последние годы отмечается неуклонный рост данной патологии, и его ранняя диагностика чрезвычайно актуальна.

Среди всех поражений генитальным эндометриозом частота аденомиоза достигает 70-90%; помимо этого заболевание имеет склонность к рецидивированию после медикаментозной терапии [1].

По данным ряда авторов эффективность лечения аденомиоза зависит от степени его активности, определение которой на дооперационном этапе, представляет большие трудности. Существующие на сегодняшний день методы определения функциональной активности аденомиоза, в основном, базируются на степени выраженности той или иной клинической симптоматики, либо на эффективности лечения, что во многом является субъективным и не позволяет выявлять ранние стадии заболевания [5].

И.И. Куценко (1994) предложены морфо-функци-ональные критерии активных форм эндометриоза по результатам исследования удаленных маток, а также в соскобах эндометрия, где производится визуально-количественная оценка митотического режима и гистохимический анализ содержания РНК и ДНК. Недостатком данных подходов является их ретроспективный характер, необходимость инвазивного вмешательства (раздельное диагностическое выскабливание стенок полости матки под контролем гистероскопа). Применение данных ме-

тодов ограничено у пациенток, получавших гормонотерапию, а также у находящихся в менопаузе [6].

В диагностике аденомиоза в настоящее время широко используется ультразвуковая диагностика (УЗИ). Точность выявления рассматриваемой патологии по данным разных авторов колеблется от 74,4% до 96,8%, и в ряде случаев имеют место расхождения в диагнозе, установленном при трансвагинальном УЗИ и патоморфологическом исследовании удаленной матки [5].

В последнее время как за рубежом, так и в нашей стране предпринимаются усилия для создания малоинвазивных скрининговых методов диагностики аденомиоза и определения степени его активности.

Для поиска в сыворотке крови новых маркеров различных заболеваний все чаще используются пост-геномные методы анализа, среди которых протеомные технологии занимают ведущие позиции.

Для анализа такой структуры, как сыворотка крови используются различные методы фракционирования, позволяющие выделять из такой сложной смеси белков и пептидов относительно узкие и воспроизводимые по составу фракции, которые в дальнейшем анализируют масс-спектрометрией.

Масс-спектрометрия - метод анализа вещества путем определения массы (чаще, отношения массы к заряду) и относительного количества ионов, получаемых при ионизации и фрагментации исследуемого вещества. За разработку этого метода Джон Фенн и Коичи Танаке были удостоены Нобелевской премии по химии в 2002 году [4].

В литературе описаны примеры успешного применения этого метода для выявления различий между сывороткой крови больных раком желудка, прямой кишки, простаты, гепатоклеточной карциномы, эндометрия, яичников и сывороткой крови здоровых людей [3].

Рядом преимуществ по сравнению с другими вариантами масс-спектрометрии обладает времяпролетная МАЛДИ масс-спектрометрия, а именно большей производительностью и чувствительностью.

Однако данный метод диагностики позволяет лишь дифференцировать одно заболевание от другого; определить степень активности с помощью масс-спектрометрии не представляется возможным. В связи с этим, на втором этапе диагностики можно использовать определение иммунологических маркеров, а именно цитокинов и факторов роста в сыворотке крови.

Установлено, что цитокины и факторы роста являются важными регуляторами клеточной пролиферации и дифференцировки, наряду с гормонами.

К настоящему времени можно считать доказанной роль многих цитокинов и факторов роста в патогенезе эндометриоза [8]. В то же время, лишь очень небольшое число исследований касалось аденомиоза.

Цитокины вовлечены фактически в каждое звено иммунитета, включая дифференцировку предшественников клеток иммунной системы, представление антигена, клеточную активацию и пролиферацию, экспрессию молекул адгезии и острофазового ответа [2].

В настоящий момент диагностическая значимость оценки уровня концентрации цитокинов заключается в констатации самого факта ее повышения или понижения у данного больного с конкретным заболеванием, причем для оценки тяжести и прогноза течения заболевания целесообразно определять концентрацию как про- (интерлейкин-6 - ИЛ-6), так и противовоспалительных (интерлейкин-10 - ИЛ-10) цитокинов в динамике [9].

Повышение содержания таких факторов роста, как сосудисто-эндотелиальный (VEGF) и эпидермальный (EFG) создает благоприятные условия для инвазии и последующего роста жизнеспособных фрагментов эндометрия [7].

Таким образом, целью данного исследования явилось выявление в сыворотке крови пациенток потенциальных маркеров, которые можно будет использовать для диагностики, определения степени тяжести и прогноза аденомиоза.

Материалы и методы

Для достижения поставленной цели в период с 2006 по 2010 гг. было проведено обследование 150 пациенток, из которых 120 - больные аденомиозом разной степени активности и распространенности (основная группа) и 30

- практически здоровых женщин репродуктивного возраста (контрольная группа). Исследование проводилось на материалах гинекологических отделений ГКБ № 64, ГКБ № 29, НМХЦ им. Н.И. Пирогова Росздрава г. Москвы.

Аденомиоз был диагностирован клинически с использованием дополнительных методов обследования: УЗИ, гистероскопия, морфологическое исследование.

Протеомное профилирование сывороток крови проводили в лаборатории Института Биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Для фракционирования образцов сывороток крови использовали набор для профилирования, содержащий магнитные микрочастицы со слабой катионообменной поверхностью MB -WCX производства компании Braker Daltonics (Германия). Описание этого набора для профилирования, а также рекомендованного для него протокола фракционирования можно найти на Интернет странице компании - www.bdal.de.

Фракционирование сывороток крови проводили на специализированном роботе ClinProt robot (Bruker Daltonics, Германия), по протоколу, рекомендованному производителем магнитных микрочастиц.

Масс-спектры получали с использованием время-пролетного масс-спектрометра Ultraflex (Bruker Daltonics, Германия).

Масс-спектрометрические данные анализировали с использованием компьютерной программы ClinProTools 2.1 (Bruker Daltonics, Германия). Математические модели для классификации масс-спектров смеси пептидов и белков, полученных после фракционирования сывороток крови, строили на основе Генетического Алгоритма (ГА) и Управляемой Нейронной Сети (Supervised Neural Network, УНС).

Для построения классификационных моделей масс-спектры каждой из групп «контроль» и «аденомиоз» разделяли пополам, одну пару использовали для построения классификационной модели, а вторую - для ее валидации.

Содержание ИЛ-6 и ИЛ-10 в сыворотке крови определяли твердофазным иммуноферментным методом с использованием диагностических тест-систем ЗАО «Век-тор-Бест» (Россия); для изучения факторов роста VEGF и EGF использовали тест-системы BioSource International. Исследование проводили в лаборатории клинической иммунологии ГКБ № 29.

Результаты и их обсуждение

Анализ клинического течения аденомиоза не обнаружил у больных достаточных различий в возрасте, времени наступления менархе и количества родов в зависимости от степени инвазии эндометриоза в миометрий.

В связи с выявленными различиями и особенностями в клиническом течении и молекулярно-биологических процессах, в работе мы использовали термины «активный» и «неактивный» аденомиоз, отражающие степень клинической и морфологической активности эндометриоидного процесса [6].

В зависимости от степени выраженности основных клинических проявлений, характерных для аденомиоза, все исследованные пациенты (n=120) условно были раз-

делены на 2 клинические группы: I группу составили 76 пациенток с клинически активным аденомиозом; II группу - 44 пациентки с клинически неактивным аде-номиозом.

Для определения форм клинической активности произвели оценку наиболее распространенных клинических проявлений аденомиоза - болевого синдрома и гиперполименореи.

Определение степени болевого синдрома осуществляли с помощью системы для оценки выраженности болей и дисменореи, согласно которой интенсивность боли определялась в баллах: 1-3 балла - слабая боль; 4-6

- умеренная боль; 7-9 - сильная [1].

Общеизвестно, что наличие аденомиоза часто сопровождается маточными кровотечениями, зачастую вызывающими анемизацию больных. В связи с чем, ги-пер- и полименорею различали без анемии и с анемией. По степени тяжести различали легкую (Hb 90-110 г/л), среднюю (Hb 70-90г/л) и тяжелую (Hb - ниже 70 г/л) анемию.

Пациенток с умеренной и сильной болью и пациенток с гиперполименореей в сочетании с анемией средней и тяжелой степени относили к I группе больных с клинически активным проявлением заболевания. Больных со слабой болью, отсутствием анемии или гиперполименореей в сочетании с анемией легкой степени относили ко II группе пациенток, с клинически неактивным аденомиозом.

Анализ длительности заболевания аденомиозом в зависимости от момента начальных клинических проявлений до первой госпитализации позволил выявить, что при активном аденомиозе продолжительность данного периода в более, чем 50% случаев составила 1-5 лет, а при неактивном аденомиозе - 6-10 лет, то есть для активного аденомиоза характерна меньшая длительность заболевания с момента первых симптомов до госпитализации и соответственно быстрое прогрессирование процесса.

В I группе гиперпластические процессы эндометрия (81,5%) и миома матки (75,6%) выявлены чаще, чем во II группе (60,2% и 31,5%). Эндометриоидные кисты яичников наблюдались у 25,2% больных с активным аденомио-зом и всего лишь у 3,5% пациенток из II группы.

На первом этапе исследования проводилось масс-спектрометрическое профилирование сывороток крови больных аденомиозом и контрольной группы.

На основании масс-спектрометрического профилирования сывороток крови после их фракционирования на магнитных микрочастицах со слабой катионообменной поверхностью (MB-WCX) были построены классификационные модели с использованием обоих математических алгоритмов. При использовавшихся параметрах обработки масс-спектров в них воспроизводимо детектировали 96 пиков. После изучения вклада площадей отдельных пиков в классификационные модели, 3 пика были выделены как наиболее значимые для их специфичности и чувствительности (рис. 1). Чувствительность и специфичность метода приближалась к 100%.

На втором этапе исследования проводился твердофазный иммуноферментный анализ ИЛ-6, ИЛ-10, VEGF и EGF, что позволило выявить взаимосвязь между степенью активности аденомиоза и концентрацией данных белков в сыворотке крови.

При анализе значений концентраций ИЛ-6, ИЛ-10 полученных методом ИФА, были получены следующие данные - рис. 2.

Присутствие в сыворотке крови ИЛ-6 обнаружено у 49 (81,6%) больных аденомиозом; из них 34 (69,4%) пациенток I группы - средняя концентрация 435,5 пг/мл и 15 (30,6%) пациенток II группы - средняя концентрация 223,6 пг/мл (р<0,05). В контрольной группе ИЛ-6 в сыворотке крови обнаружено не было.

Присутствие в сыворотке крови ИЛ-10 обнаружено у 32 (53,3%) больных аденомиозом; из них 22 (68,7%) пациенток I группы - средняя концентрация 324,5 пг/мл и 10 (31,3%) пациенток II группы - средняя концентрация 164,1 пг/мл (р<0,05). В контрольной группе ИЛ-10 обнаружен у 3(10%) пациенток - средняя концентрация 145,2 пг/мл.

Степень участия цитокинов в патогенезе аденомиоза находится в прямой зависимости от стадии иммунного ответа, степени вовлеченности в него различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток, тяжести и распространенности патологического процесса. Изменение иммунореактивности обследованных пациенток адено-миозом сопровождалось активацией продукции провос-палительных цитокинов (ИЛ-6) и в меньшей степени противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10).

При анализе значений концентраций EFG и VEGF, полученных методом ИФА, были получены следующие данные - рис. 3.

Средняя концентрация в сыворотке крови EFG в I группе составила 647,4 пг/мл, во II группе - 334,5 пг/мл, в контрольной группе - 45,9 пг/мл.

Средняя концентрация в сыворотке крови VEFG в I группе составила 725,3 пг/мл, во II группе - 250,6 пг/мл, в контрольной группе - 38,3 пг/мл.

По нашим данным содержание в сыворотке крови таких цитокинов, как ИЛ-6 и ИЛ-10, а также факторов роста - VEGF и EGF повышено в сравнении с контрольной группой, что согласуется с данными литературы, касающимися наружного эндометриоза [8].

Заключение

Привлекательность использования сыворотки крови для диагностики различных заболеваний обусловлена, главным образом, тем обстоятельством, что она наиболее полно представляет фенотип человека, его состояние в конкретный момент времени [3]. Еще одно немаловажное достоинство сыворотки крови - ее доступность, поскольку она является наиболее распространенным в медицинской практике первичным клиническим образцом.

На сегодняшний день нет однозначного ответа на вопрос, в какой связи находятся регистрируемые

Активный аденомиоз II  Неактивный аденомиоз

800.

600.

400.

200.

0.

725,3

647,4

334,5

_______________

250,6

1

EFG

Активный аденомиоз I  Неактивный аденомиоз

VEGF

Контроль

Рис. 2. Уровень цитокинов в сыворотке крови у больных аденомиозом Рис. 3. Уровень факторов роста в сыворотке крови у больных аденомиозом

масс-спектрометрией в сыворотке крови изменения пептидно-белковых паттернов с исследуемым патологическим процессом в организме. Предполагается, что эти изменения могут отражать реальные колебания концентраций белков и пептидов, напрямую ассоциированных с заболеванием.

Результаты исследования свидетельствуют о том, что клиническая активность аденомиоза обусловлена нарушениями молекулярно-биологических процессов. Для клинически активного аденомиоза характерно более выраженное повышение уровня ИЛ-6, ИЛ-10, VEGF и EGF, т.е. пролиферации, неоангиогенеза и иммуносупрессии.

Таким образом, применение масс-спектрометрического анализа сыворотки крови на первом этапе и определение концентрации цитокинов ИЛ-6, ИЛ-10, а также факторов роста VEGF и EGF на втором этапе диагностики позволяет не только достоверно поставить диагноз, но и определить степень активности заболевания, а значит и необходимость терапии в настоящий момент.

Литература

1. Адамян Л.В. Эндометриозы. / Л.В. Адамян, В.И. Кулаков, Е.Н. Андреева - М.: Медицина. Издание 2-е, 2006. - 416 с.

2. Адамян Л.В. Цитокины в перитонеальной жидкости и периферической крови больных с сочетанными доброкачественными заболеваниями матки. / Л.В. Адамян, Х.З. Гусаева, И.А. Василенко и др. // Проблемы репродукции. - 2008.

- № 6. - С. 16-19.

3. Зиганшин Р.Х. Поиск потенциальных биомаркеров рака яичников в сыворотке крови. / Р.Х. Зиганшин, Д.Г. Алексеев, Г.П. Арапиди и др. // Биомедицинская химия.-2008. - № 54. - С. 408-419.

4. Ильина Е.Н. Масс-спектрометрия нуклеиновых кислот в молекулярной медицине. / Е.Н.Ильина, В.М.Говорун// Биоорганическая химия. - 2009. - № 2(35).

- С. 1-16.

5. Ищенко А.И. Эндометриоз: современные аспекты. / А.И. Ищенко, Е.А. Кудрина. - М: ООО «Медицинское информационное агенство». 2008. - 176 с.

6. Куценко, И.И. Генитальный эндометриоз. / И.И. Куценко.-Краснодар: Адыгея. - 1994. - 192 с.

7. Сидорова И.С. Неоангиогенез и экспрессия факторов роста в различных по клинической активности формах аденомиоза. / И.С. Сидорова, А.Л. Унанян, Е.А. Коган и др. // Тезисы Первого Международного конгресса по репродуктивной медицине. - 2006. - С. 86-7.

8. Berkkanoglu M. Immunology and endometriosis/ M.Berkkanoglu, A.Arici // AGRI.

- 2003. - 50. - P. 48-59.

9. Koumantakis E. Soluble serum interleukin-2 receptor, interleukin-6 and interleukin-1a in patients with endometriosis and in controls. / E. Koumantakis, I. Matalliotakis, M. Neonaki //Arch Gynecol Obstet - 1994. - 255 - P. 107-12.

Контактная информация

Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И. Пирогова 105203, г. Москва, ул. Нижняя Первомайская, 70

e-mail: nmhc@mail.ru