С помощью трансплантации эмбриональных стволовых клеток получены устойчивые к инфаркту миокарда животные

ИМИ!

Новости клеточных технологий

13

Данный метод дает возможность перенести геномную ДНК из донорского овоцита, находящегося на стадии метафазы II, в перивителлиновую полость безъядерного овоцита. Для слияния исследователи сначала использовали метод электропорации, но было обнаружено, что это вызывает активацию дальнейшего деления овоцита с образованием полярных телец. Для устранения этого артефакта было предложено использовать альтернативную технику слияния с помощью вируса Сендай, что позволило избежать нежелательной активации клеточного деления овоцита.

После этого была проведена проверка репродуктивной эффективности реконструированных овоцитов и чистоты переноса митохондриальной ДНК с помощью метода ST. Из гибридных бластоцист были получены две линии эмбриональных стволовых клеток (STES-1 и STES-2), которые несли на своей поверхности типичные маркеры плюрипотентности, такие как 0СТ4, SSEA-4, TRA-1 -60 и TRA-1 -81 и имели нормальный кариотип. In vivo проверка репродуктивного потенциала нового метода проводилась путем имплантации ST-эмбрионов самкам резус-макак. Процент фертилизации и образования 8-клеточного эмбриона, морулы и бластоцисты был близким к показателям контрольной группы, в которой самкам имплантировались нативные овоциты и намного превосходил

результаты, полученные при использовании для слияния метода электропорации. Из девяти беременных самок три родили четверых детенышей (одна двойня). Все они характеризовались нормальным развитием.

Исследование митохондриальной ДНК детенышей путем анализа гипервариабельного района Д-петли 1 [5], РТТ-РСП и рестрикционного анализа показал, что во всех исследованных образцах присутствовала митохондриальная ДНК только от овоцита-акцептора.

Опираясь на вышеописанные результаты можно утверждать, что авторам удалось разработать эффективный метод переноса геномной ДНК в клетки млекопитающих. Особую важность представляет тот факт, что исследователи впервые избежали гетероплазмии митохондриальной ДНК в акцепторных клетках, чего не удавалось достичь при использовании уже существующих методов [6—8].

Несмотря на все достоинства и перспективы, данный метод, как и отмечают сами авторы работы, имеет существенный недостаток, который состоит в использовании вируса для сливания кариопласта и цитопласта. Хотя проведенная проверка показала отсутствие вирусного генома в БТ-клетках, риск все равно остается, что может быть основным сдерживающим фактором при внедрении данного метода в практику.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Taylor R.W., Turnbull D.M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Rev. Genet. 2005; 6: 389—402.

2. Finsterer J. Hematological manifestations of primary mitochondrial disorders. Acta Haematol. 2DD7; 118 [21: 88—98.

3. Steffann J., Frydman N.. Gigarel N. et al. Analysis of mtDNA variant segregation during early human embryonic development: a tool for successful NARP preimplantation diagnosis. J. Med. Genet. 2DD6; 43: 244—7.

4. Tachibana M., Sparman M., Sritanaudomchai H. et al. Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature 2009; 461: 367-72.

5. Byrne J.A., Pedersen D., Clepper L. et al. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature 2007; 450: 497—502.

6. Meirelles F.V., Smith L.C. Mitochondrial genotype segregation in a mouse heteroplasmic lineage produced by embryonic karyoplast transplantation. Genetics 1997; 145: 445—51.

7. Meirelles F.V., Smith L.C. Mitochondrial genotype segregation during preimplantation development in mouse heteroplasmic embryos. Genetics 1998; 148: 877-83.

8. Sato A., Kono T., Nakada K. et al. Gene therapy for progeny of mito-mice carrying pathogenic mtDNA by nuclear transplantation. PNAS 2005; 102: 16765-70.

Подготовил ВВ. Стадник

По материалам: Tachibana M„ Sparman M„ Sritanaudomchai H. et al. Mitochondrial gene replacement

in primate offspring and embryonic stem cells. Nature 2009; 461: 367-72

С помощью трансплантации эмбриональных стволовых клеток получены устойчивые к инфаркту миокарда животные

В настоящее время клеточная терапия считается одним из перспективных подходов в лечении пациентов, перенесших инфаркт миокарда [1—3]. Трансплантации некоторых видов клеток-предшественниц после инфаркта миокарда у человека показали, что трансплантированные клетки не только вносят вклад в пост-травматическую регенерацию сердечной мышцы, но и стимулируют процесс образования новых кардиомио-цитов из эндогенных тканевых и циркулирующих в кровотоке прогениторных клеток, принимающих активное участие в процессе регенерации [4—8]. Тем не менее, такой подход, обеспечивая коррекцию структуры и функции органа после повреждения, не может гарантировать

предотвращение повторного инфаркта. Иными словами, клеточная терапия до настоящего времени рассматривалась исследователями и клиницистами исключительно в лечебных, но не в профилактических целях.

Научная группа под руководством Б. Уатайа впервые задалась вопросом о том, насколько экзогенные эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) могут влиять на восприимчивость к инфаркту миокарда и посттрав-матические репаративные процессы, будучи трансплантированными задолго до развития патологии на самых ранних этапах развития организма. При планировании своих экспериментов исследователи основывались на результатах более ранней работы, где было показано,

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 4, 2009

І І І І І І

Новости клеточных технологий

что трансплантация аллогенных ЭСК в бластоцисты мышей с летальной мутацией в одном из генов, ответственных за развитие сердца, приводит к выживанию эмбрионов до момента рождения, в то время как без трансплантации ЭСК такие эмбрионы гибнут в середине периода гестации [9]. Тем не менее, до сегодняшнего дня оставалось неизвестным, насколько трансплантация ЭСК может повлиять на восприимчивость к кардиологическим заболеваниям у взрослых животных, не имеющих генетических дефектов.

В своих экспериментах исследователи использовали бластоцисты до стадии имплантации, полученные от мышей линии С57В1ДУ. В бластоцисты инъецировали ЭСК линии ГОЗА26, конститутивно экспрессирующие маркерный трансген (р-галактозидазу). Было показано, что вводимые ЭСК успешно встраиваются во внутреннюю клеточную массу бластоцист. Полученные химерные бластоцисты реимплантировали самкам мышей и оценивали эффекты трансплантации ЭСК на физиологию развившегося из них потомства, а также на устойчивость химерных животных к инфаркту миокарда. Исследователи показали, что клетки, дифференцировавшиеся из трансплантированных ЭСК, присутствуют в тканях, развившихся из бластоцист животных, в том числе в их миокарде. Интересно отметить, что рост химерных мышей в сравнении с животными из контрольной группы

(интактные мыши линии С57В1/6Л значительно ускорялся, и к 8 месяцам развития их вес превышал вес животных из группы контроля в 1,5 раза. Это происходило благодаря излишним отложениям у химерных животных подкожного и висцерального жира, что, тем не менее, не было ассоциировано у них с повышенным давлением и склонностью к диабету.

У животных из контрольной и экспериментальной групп не отличались эхокардиографические характеристики сердечной деятельности, а также анатомические характеристики сердца, включая вес органа и расположение коронарных артерий. Когда возраст животных достигал 12—14 месяцев, им проводилось моделирование инфаркта миокарда путем перевязки передней ветви левой коронарной артерии. Результаты наблюдений за восстановлением животных оказались ошеломляющими. После перевязки артерии смертность в группе контроля достигала 41 %, в то время как среди химерных животных она составляла 0%. После повреждения в сердце животных из контрольной группы начинался процесс разрастания зоны акинеза, в то время как у химерных животных сердечная деятельность стремительно восстанавливалась. Спустя месяц после операции у химерных животных полностью восстанавливалось нормальное анатомическое и гистологическое строение поврежденной стенки левого желудочка, а также

Схема получения химерных мышей

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 4, 2009

ИМИ!

Новости клеточных технологий

15

электрофизиологические параметры сердечной деятельности. В миокарде химерных животных не отмечалось признаков фиброза, а иммуногистохимическое окрашивание гистологических срезов ткани показало, что в миокарде после инфаркта резко возрастает количество пролиферирующих клеток, экспрессирующих ядерный маркер Ю67, а также маркеры стволовых клеток с-Кй и Бса-1. У химерных животных не развивалось хронической левожелудочковой недостаточности. Восстановление состояния животных было подтверждено функциональными тестами на беговой дорожке №геас)тШ-тест).

У животных из группы контроля подобного не происходило: у них, напротив, развивалась тяжелая хроническая сердечная недостаточность, обусловленная фиброзным перерождением стенки левого желудочка, ее истончением и связанным с этим патологическим расширением желудочка. Пролиферация клеток-предшественниц в миокарде контрольных животных оставалась на низком уровне, что и явилось причиной невозможности восстановления структуры сердечной мышцы. Угнетение сердечной деятельности приводило к застою жидкости в легких и их отеку. Результаты функциональных тестов (время бега в ЬгеайтШ-тесте и переносимость нагрузок), показанные мышами из контрольной группы, также были в разы хуже, чем у химерных животных.

Авторы работы считают, что в будущем трансплантация экзогенных ЭСК в бластоцисты человека может стать методом профилактики кардиологических заболеваний. Тем не менее, эта работа оставляет гораздо больше вопросов, чем ответов, и ее трудно назвать доклиническим исследованием возможностей применения стволовых клеток для профилактики инфаркта миокарда. Основным вопросом остается механизм, лежащий в основе полученного результата. Указывая на повышение количества делящихся прогениторных клеток в миокарде химерных животных после инфаркта в сравнении с животными из контрольной группы, исследователи не проверяют экспрессии маркерного трансгена ЭСК в клет-ках-предшественницах кардиомиоцитов. По этой причине происхождение активно делящихся клеток в миокарде остается неясным. Также Б. Уатайа и его коллеги показали, что в организме химерных животных, за счет обнаруженной у них избыточной жировой ткани, содержится в 2^3 раза больше мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), чем у животных из группы контроля. Известно, что данные клетки способны мигрировать в зоны повреждения миокарда и принимать участие в регенерации ткани, а многочисленные исследования трансплантации ММСК после инфаркта миокарда продемонстрировали положительный эффект клеточной терапии [10^12].

Тем не менее, авторы работы, упоминая про ММСК, не указывают, несли ли данные клетки маркерный трансген трансплантированных аллогенных ЭСК и принимали ли они участие в регенерации сердечной мышцы у химерных животных. Поэтому вряд ли возможно связать устойчивость к инфаркту миокарда с увеличением количества ММСК в организме химерных животных, обусловленное трансплантацией ЭСК в бластоцисту. Если

бы клетки-предшественницы кардиомиоцитов и ММСК в организме химерных животных несли в себе маркерный трансген, можно бы было заключить, что введение в бластоцисту экзогенных ЭСК приводит к тому, что в организме животного к моменту взросления образуется больше, чем в норме, стволовых элементов ^ткане-спе-цифичных стволовых клеток, ведущих свое происхождение от ЭСК [13].

Мыши линии В0БА26 не являются менее восприимчивыми к инфаркту миокарда, чем мыши линии С57В1У би [14], однако специальных исследований, направленных на выяснение этого факта, не проводилось. По этой причине устойчивость к инфаркту миокарда у химер вряд ли может быть объяснена характеристиками конкретной линии ЭСК, которые передаются химерным животным.

Следует отметить очевидные минусы работы, не позволяющие с уверенностью строить гипотезы о механизмах полученного эффекта: во-первых, количество химерных животных, полученных исследователями, составляло всего 7 штук, причем в статистической оценке параметров сердечной деятельности, гистологическом и морфометрическом анализе учитывались данные, полученные по 3^4 животным. Приведенные в статье иллюстрации, демонстрирующие изменение сократительной функции сердца экспериментальных животных в динамике после перевязки передней левой коронарной артерии, демонстрируют, что у химерных животных инфаркт фактически не развивался. Возможно, это связано с особенностями кровоснабжения сердца химерных животных — при оценке сосудистой сети в сердце животных авторы ограничились осмотром расположения основных коронарных артерий, не уделив внимания возможному присутствию мелких коллатеральных сосудов. Фотографии гистологических препаратов сердца химерных животных через 1 месяц после индукции инфаркта демонстрируют картину интактного сердца без каких-либо следов процессов репарации, что также косвенно указывает на то, что у химерных животных после перевязки передней ветви левой коронарной артерии инфаркт не развивался. Более хорошо развитая кровеносная система органа у химерных животных в сравнении с контрольными также могла бы послужить объяснением их устойчивости к перевязке коронарной артерии и быстрого восстановления их нормального состояния.

Можно предположить, что трансплантация ЭСК в бластоцисту должна оказывать влияние не только на постинфарктную репарацию, но на более эффективное восстановление состояния организма после самых разнообразных травматических повреждений. Тем не менее, на данный момент эта работа — единственная в своем роде, и на ее основе сложно рассуждать о возможности подобного эффекта. Также в исследовании не была оценена общая продолжительность жизни химерных животных в сравнении с животными из группы контроля без индукции экспериментального инфаркта миокарда. В то же время, это крайне интересно, поскольку могло бы выявить возможные побочные эффекты трансплантации ЭСК в бластоцисту на онтогенез развившегося из нее организма.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Segers V.F., Lee R.T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature 2008; 451: 937-42.

2. Wu S.М., Chien K.R., Mummery C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell 2008; 132: 637-43.

3. Dimmeler S., Leri A. Aging and disease as modifiers of efficacy of cell therapy. Circ. Res. 2008; 102: 1319-30.

4. Quaini F., Urbanek K., Beltrami A.P. et al. Chimerism of the transplanted heart. N. Engl. J. Med. 2002; 346: 5—15.

5. Kajstura J., Flosoda T., Bearzi C. et al. The human heart: A self-renewing organ. Clin. Translat. Sci. 2008; 1: 80—6.

6. Deb A., Wang S., Skelding K.A. et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mistmatched bone marrow transplantation patients. Circulation 2003; 107: 1247-9.

7. Kubo FI., Jaleel N.. Kumarapeli A. et al. Increased cardiac myocyte progenitors in failing human hearts. Circulation 2008; 118: 649-57.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 4, 2009

I I I I I I

I I I

Новости клеточных технологий

8. Rupp S., Koyanagi М., Iwasaki M. et al. Characterization of longterm endogenous cardiac repair in children after heart transplantation. Eur. Heart J. 2008; 29: 1867—72.

9. Fraidenraich D., Stillwell E., Romero E. et al. Rescue of cardiac defects in id knockout embryos by injection of embryonic stem cells. Science 2DD4; 306: 247-52.

10. Joggerst S.J., Flatzopolous A.K. Stem cell therapy for cardiac repair: benefits and barriers. Expert. Rev. Mol. Med. 2009; 11: e20.

11. Madonna R., Geng Y.J., De Caterina R. Adipose tissue-derived stem cells. Characterization and potential for cardiovascular repair.

Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2009; 29: 1723.

12. Sensebw L., Krampera M., Schrezenmeier FI. et al. Mesenchymal stem cells for clinical application. Vox Sang. 2009; in print.

13. Otto A., Collins-Flooper FI., Patel K. The origin, molecular regulation and therapeutic potential of myogenic stem cell populations. J. Anat. 2009; 5[2151: 477-97.

14. Barandon L., Couffinhal T., Dufourcq P. et al. Repair of myocardial infarction by epicardial deposition of bone-marrow-cell-coated muscle patch in a murine model. Ann. Thorac. Surg. 2004; 78: 1409—17.

Подготовила А.С. Григорян

По материалам: Yamada S., Nelson T.J., Behfar A. et al. Stem cell transplant Into pre-implantation embryo yields myocardial Infarction-resistant adult phenotype. Stem Cells 2009: in print

Развитие скелетных мышц и их регенерация из миосателлитоцитов реализуются за счет различных генетических программ

Регенерация скелетных мышц имеет важное клиническое значение при мышечных дистрофиях и различных травмах, и зависит от камбиального резерва, формируемого клетками-миосателлитами. Как формирующие скелетное мышечное волокно миобласты, так и клетки-миосателлиты образуются из единых мышечных предшественников с высоким пролиферативным потенциалом [2]. После завершения формирования мышечного волокна во время эмбрионального развития скелетной мышцы клетки-миосателлиты располагаются вне многоядерного волокна и остаются пролиферативно-неактивными. Выживание и распространение этих клеток основано на экспрессии транскрипционного фактора Рах7 [2].

Исследования in vitro подтверждают важную роль Рах7 в процессах выживания миобластов, их пролиферации и установлении миогенного фенотипа [1—2]. Также было показано, что в покоящихся клетках-миосателли-тах наблюдается постоянная экспрессия Рах7 [3]. Основываясь на этих данных, исследователи из отдела эмбриологии института Карнеги Christoph Lepper и Chen-Ming Fan решили проверить гипотезу о том, что влияние Рах7 ответственно за самообновление и вызванную травмами регенерацию скелетных мышц in vivo.

В опубликованном в журнале Nature исследовании была прослежена судьба миосателлитов с инактивированным геном Рах7 у мышей. Инактивация происходила в результате Сге-опосредованной рекомбинации двух аллельных вариантов гена Рах7: Pax7f и Рах7СЕ. Были использованы мыши линии Rosa26, характеризующиеся экспрессией lacZ после Сге-опосредованной рекомбинации. Зависящая от тамоксифена активность CreERT2 подтверждалась ß-галактозадазной активностью.

В результате, на 5 и 10 сут. после травмы, вызванной кардиотоксином, у гетерозиготных по аллельным вариантам гена Рах7 (Рах7+/СЕ) мышей на 60^90 сут. после рождения все мышечные волокна, полученные в

ß

зывает, что основным источником регенерирующих волокон являются потомки клеток, экспрессирующих Рах7.

Оказалось неожиданным, что и у мышей с полностью выключенным геном Рах7 миофибриллы регенерировали, причем в волокнах не было обнаружено ни мРНК Рах7, ни самого белка Рах7. Таким образом, функциональный белок Рах7 не требуется для регенерации скелетных мышц после травмы во взрослом возрасте.

У мутантов Рах7~Ав зародышевой линии, напротив, после травмы регенерировали лишь редкие тонкие волокна. Более того, считается [4], что эти фибриллы имеют иное, не Рах7-зависимое, происхождение. У таких мутантов выжившие изолированные клетки не обладали типичными характеристиками миосателлитов. Исследователи провели анализ судьбы клеток, участвующих в регенерации миофибрилл у таких мутантов, используя в качестве метки 5-этинил-2’-дезокксиуридин, и обнаружили, что потомки клеток Рах7~ не только формируют волокно, но и занимают нишу клеток-сателлитов.

Наиболее вероятными кандидатами для функциональной замены Рах7 в данном случае являются другие представители семейства Рах. Известно, что РахЗ и Рах7 могут замещать друг друга в эмбриональном мио-гистогенезе [1]. Для проверки гипотезы о возможном замещении Рах7 на РахЗ во время процесса мышечной регенерации у взрослых мышей исследователи выключили оба гена. Оказалось, что ни Рах7, ни РахЗ не влияют на регенерацию скелетных мышц у взрослых организмов.

Следующей задачей исследования стало определение критического периода влияния Рах7 на регенерацию in vivo.

В результате оказалось, что регенерация мышечных фибрилл перестает быть зависимой от клеток-потомков Рах7+ предшественников после 21 сут. постнатального развития. Именно на этом сроке развития завершается формирование «архитектурного облика» мышечного волокна, распределяются ядра, и обособляются молчащие клетки-миосателлиты [5]. Потомки клеток-мутантов по Рах7, напротив, сливались в фибриллу только после 31 сут. постнатального развития.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 4, 2009