СИСТЕМА И НАБОР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
SYSTEM AND KIT FOR CYTOLOGICAL SPECIMENS ACQUISITION FOR RESEARCH

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области микроскопического исследования цитологических образцов.
Уровень техники, к которому относится изобретение
Рак шейки матки представляет собой вторую по распространенности разновидность рака у женщин в мире и ведущую причину смертности от рака среди женщин в развивающихся странах. Приблизительно 30% случаев рака у женщин представляют собой рак шейки матки, причем ежегодно диагностируют более чем 100000 новых случаев, например, в Индии. Оцениваемая совокупная скорость распространения (CAGR) случаев рака шейки матки составляет 2,56%, и при такой скорости распространения в 2012 году будет диагностировано приблизительно 175000 новых случаев рака шейки матки.
Одним из рекомендуемых средств скрининга рака шейки матки является обнаружение цитологических предшественников рака в анализах методом Папаниколау (Papanicolaou) (также называется мазок Папаниколау, анализ Папаниколау, мазок из шейки матки или анализ мазка), которое представляет собой обследование, используемое в гинекологии для обнаружения предопухолевых и злокачественных процессов в канале шейки матки, в частности в зоне трансформации (перекрытия цилиндрического эпителия многослойным плоским эпителием).
При взятии мазка Папаниколау используют зеркало, которым собирают клетки с внешнего устья шейки матки и слизистой оболочки канала шейки матки. Эти клетки исследуют под микроскопом для наблюдения аномалий. Задача данного анализа заключается в том, чтобы обнаружить потенциально предраковые изменения, которые, вызывает, среди прочих причин, передаваемый половым путем вирус папилломы человека (ВПЧ). Этот анализ по-прежнему представляет собой эффективный и широко используемый способ раннего обнаружения предракового состояния и рака шейки матки. Анализ может также обнаруживать инфекции и аномалии слизистой оболочки канала шейки матки и слизистой оболочки матки (эндометрия).
Данная процедура позволила эффективно снизить частоту заболевания раком шейки матки в развитых странах. Однако в настоящее время анализ Папаниколау считается трудоемким и занимающим много времени. Кроме того, требуемое множество стадий и методика делают весьма затруднительными автоматизацию всего процесса и его осуществление на месте оказания медицинской помощи, и это означает, что образцы невозможно анализировать на месте сбора, но требуется их доставка в лабораторию.
Британский патент № 1555507 A описывает предметную пластинку, изготовленную таким образом, что порцию вязкого раствора прозрачного полимера в смешанном растворителе, который содержит органическое соединение и воду, наносят на область пластинки, площадь которой составляет менее чем площадь покровной пластинки, после чего помещают покровную пластинку с покрытием из биологического красителя на вышеупомянутую порцию вязкого раствора на предметной пластинке, у которой покрытая красителем сторона находится в контакте с вязким раствором, и оставляют покровную пластинку в покое в течение некоторого времени.
Британский патент № 1557722 A описывает способ окрашивания и герметизации биологического образца, высушенного на воздухе и фиксированного на предметной пластинке микроскопа, в котором получают вязкую текучую композицию прозрачного полимера и биологический краситель в смешанном растворителе, содержащем воду, порцию данной вязкой текучей композиции наносят на область фиксированного биологического образца, площадь которой составляет менее чем площадь покровной пластинки, после чего помещают покровную пластинку на нанесенную порцию вязкой текучей композиции и оставляют покровную пластинку в покое до тех пор, пока краситель, растворенный в текучей композиции, не вступает в контакт с образцом и окрашивает его.
Патент США № 3796594 описывает покрытые красителем пластинки для дифференциального окрашивания крови.
Патент США № 3834874 описывает предварительно окрашенные предметные пластинки для микроскопа, поверхность которых покрыта высушенной смесью метиленового синего NN и ацетата крезилового фиолетового, используемые при обнаружении малярийных паразитов в крови.
Европейский патент 0291153 A1 описывает набор пластинок для микроскопа, в котором две прямоугольные пластинки обращены друг к другу своими лицевыми сторонами, но удерживаются на некотором расстоянии друг от друга посредством своих выступающих частей, таким образом, что между двумя пластинками образуется капиллярная щель.
Патент США № 4224277 описывает устройство для покровных пластинок и предварительно покрытых предметных пластинок для микроскопа, изготовленных с помощью вышеупомянутого устройства.
Сущность изобретения
Согласно первому аспекту настоящего изобретения, предложена система или набор для получения образцов в цитологических исследованиях. Данная система или набор содержат фиксатор для фиксации клеток, содержащихся в вышеупомянутом образце, модификатор клеточной поверхности для модификации поверхности клеток, содержащихся в вышеупомянутом образце, первое поддерживающее средство для образца, имеющее по меньшей мере две стороны, и второе поддерживающее средство для образца, имеющее по меньшей мере две стороны, причем по меньшей мере на одну сторону по меньшей мере одного из поддерживающих средств нанесен цитоплазматический краситель или ядерный краситель.
При использовании в настоящем документе термин «цитологический образец» определяется как любой образец, взятый из организма, предпочтительно млекопитающего, в достаточном количестве для исследования и/или анализа. В качестве неограничительного примера, цитологический образец включает образцы клеток, образцы кожи, образцы ткани и образцы слизистой оболочки.
При использовании в настоящем документе термин «фиксатор» означает композицию, которая может присутствовать в жидкой форме или нет и которая фиксирует цитологический образец таким образом, что цитологический образец прикрепляется к предметной пластинке в течение периода времени, достаточного для исследования и/или анализа цитологического образца.
При использовании в настоящем документе термин «модификация поверхности клеток» означает, что клетки обрабатывают таким образом, что они раскладываются и/или разворачиваются, и/или что уменьшается перекрывание клеток. Уменьшение степени складывания и свертывания клеток в процессе получения образца приводит к улучшению видимости клеточных и морфологических характеристик, которые используют для последующего обнаружения аномальных клеток в образце, например, в скрининге рака шейки матки.
Уменьшение перекрывания приводит к улучшению диспергирования клеток, которое представляет собой важный фактор, в частности, в клеточных суспензиях, где клетки проявляют тенденцию к перекрыванию друг друга, в частности, полиморфные модификации, которые являются очень мелкими по размеру и проявляют тенденцию к образованию кластеров и осаждению на крупные клетки. Как правило, обе цели могут быть достигнуты путем увеличения поверхностного заряда на клетках, что приводит к усилению отталкивания между отдельными клетками и, таким образом, обеспечивает улучшение диспергирования.
Ядерный краситель служит для окрашивания ядер клеток, содержащихся в образце, когда образец нанесен на вышеупомянутое первое поддерживающее средство для образца, или его покрывает вышеупомянутое первое поддерживающее средство для образца. Цитоплазматический краситель служит для окрашивания цитоплазмы клеток, содержащихся в образце, когда образец нанесен на вышеупомянутое второе поддерживающее средство для образца, или его покрывает вышеупомянутое второе поддерживающее средство для образца.
Также система или набор предоставляют возможность получения цитологического образца таким способом, что клетки в образце диспергируются таким образом, что они становятся подходящими для наблюдения с помощью микроскопа или для анализа с помощью автоматического оптического устройства для анализа клеток. Таким образом, одна важная отличительная особенность настоящего изобретения заключается в том, что она обеспечивает окрашивание данного образца на месте, т.е. на месте оказания медицинской помощи. Кроме того, исключается необходимость приготовления окрашивающего раствора на месте применения, поскольку красители предварительно наносят в соответствующем количестве на поддерживающее средство для образца. Кроме того, исключается необходимость осуществления сложного протокола и многостадийной процедуры окрашивания, а также проблема загрязнения, которая возникает, в основном, вследствие пыли и примесей в процессе окрашивания. Кроме того, сокращаются до минимума отклонения, такие как чрезмерное окрашивание или недостаточное окрашивание, вследствие того что красители распределяются при точном дозировании, что требуется для оптимального окрашивания.
Еще одно преимущество заключается в том, что можно легко регулировать уровень pH, который является важным для цитоплазматического окрашивания (где кислотный рН представляет собой преимущество при некоторых обстоятельствах) и ядерного окрашивания (где основный рН представляет собой преимущество при некоторых обстоятельствах).
Использование поддерживающего средства для образца, на которое предварительно нанесены красители, делает возможным осуществление окрашивания в замкнутом окружении, т.е. в картридже, что дополнительно устраняет пыль и примеси, а также повышает воспроизводимость процесса окрашивания.
В одном предпочтительном варианте осуществления, только на одну сторону первого и/или второго поддерживающего средства для образца наносят соответствующий краситель. Однако может оказаться преимущественным нанесение красителя на обе стороны первого и/или второго поддерживающего средства для образца; в таком случае при использовании данной системы не нужно заботиться о том, какая сторона поддерживающего средства обращена к образцу. Согласно такому варианту осуществления, исключаются ошибки вследствие использования несоответствующей стороны первого и/или второго поддерживающего средства для образца.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения, предложен способ получения образцов для цитологических исследований, причем данный способ включает следующие стадии:
фиксацию клеток, содержащихся в вышеупомянутом образце, с помощью фиксатора,
модификацию поверхности клеток, содержащихся в вышеупомянутом образце, с помощью модификатора клеточной поверхности,
изготовление первого поддерживающего средства для образца, имеющего по меньшей мере две стороны, и
второго поддерживающего средства для образца, имеющего по меньшей мере две стороны, причем по меньшей мере на одну сторону по меньшей мере одного из поддерживающих средств нанесен цитоплазматический краситель или ядерный краситель,
нанесение клеток на любое из первого или второго поддерживающего средства для образца, и
покрытие нанесенных клеток второго или первого поддерживающего средства для образца, соответственно. Важно понимать, что стадии данного способа не обязательно следует осуществлять в порядке, представленном выше.
Таким образом, настоящее изобретение предусматривает использование по меньшей мере одного типа предварительно изготовленного поддерживающего средства для образца. На это предварительно изготовленное поддерживающее средство для образца наносят ядерный краситель или цитоплазматический краситель. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, ядерный краситель нанесен по меньшей мере на одну сторону первого поддерживающего средства для образца, и цитоплазматический краситель нанесен по меньшей мере на одну сторону второго поддерживающего средства для образца. В качестве альтернативы, только на одно из двух поддерживающих средств для образца наносят краситель (например, ядерный краситель), а другой тип красителя (например, цитоплазматический краситель) добавляют в клеточную суспензию, например, вместе с фиксатором и/или модификатором клеточной поверхности.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, первое поддерживающее средство для образца и/или второе поддерживающее средство для образца присутствуют в виде предметной пластинки и/или покровной пластинки.
При использовании в настоящем документе термин «предметная пластинка» означает прозрачную пластинку, изготовленную из стекла или пластмассы, на которую можно наносить образцы, такие как клетки, для исследования с помощью оптического увеличительного устройства, такого как микроскоп.
При использовании в настоящем документе термин «покровная пластинка» означает прозрачную пластинку, изготовленную из стекла или пластмассы, которую используют, чтобы покрывать образцы, такие как клетки, перед исследованием с помощью оптического увеличительного устройства, такого как микроскоп.
Согласно общему пониманию, предметные пластинки и покровные пластинки отличаются друг от друга по размеру и толщине. В соответствии со стандартом ISO 8255-2, предметные пластинки для микроскопа имеют размеры 26×76 мм и толщину 1 мм, в то время как покровные пластинки обычно имеют размеры 18×18 мм и толщину от 100 до 200 мкм. Однако согласно контексту настоящего изобретения, термины «покровная пластинка» и «предметная пластинка» можно использовать взаимозаменяемым образом. В частности, при приготовлении мазков предметные пластинки для микроскопа используют на нанесения образца и его покрытия после осуществления обработки мазка.
Согласно настоящему изобретению, первое поддерживающее средство для образца и второе поддерживающее средство для образца присоединены друг к другу посредством шарнира. Данный вариант осуществления дополнительно упрощает использование системы или набора согласно настоящему изобретению. Такой шарнир может, например, состоять из шпунтового соединения, изготовленного между двумя пластмассовыми рамками, удерживающими первое и второе поддерживающее средство для образца. Другие возможности создания такого шарнира включают использование отрезка клейкой ленты, соединяющей первое и второе поддерживающее средство для образца. Специалист в данной области техники сможет найти и другие технические варианты осуществления, которые обеспечивают использование такого шарнира без применения изобретательского творчества.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, фиксатор и/или модификатор клеточной поверхности присутствуют в жидкой форме. Предпочтительно фиксатор содержит по меньшей мере один средство, выбранное из группы, состоящей из:
• этанола,
• изопропилового спирта,
• уксусной кислоты (предпочтительно ледяной уксусной кислоты),
• формальдегида и/или
• глутаральдегида.
Еще более предпочтительный фиксатор представляет собой смесь, содержащую этанол, изопропиловый спирт и уксусную кислоту, предпочтительно в объемном соотношении 7:2:1.
Фиксаторы на спиртовой основе являются чрезвычайно подходящими для цитологических мазков, потому что они действуют быстро и обеспечивают хорошее окрашивание ядер. Предпочтительно используют смесь, содержащую этанол (70 об.%), изопропиловый спирт (70 об.%) и ледяную уксусную кислоту (10 об.%). Эта смесь имеет низкий уровень pH, который можно поддерживать, используя буферный раствор или регулируя концентрацию уксусной кислоты.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления, фиксатор содержит глутаральдегид и фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), причем он содержит предпочтительно 2-20 мас.% глутаральдегида в 0,05-1 М фосфатно-солевом буферном растворе. Предпочтительно значение pH фиксатора составляет от 5 до 6,5.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, модификатор клеточной поверхности содержит по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, состоящей из:
• средства, придающего положительный заряд клеточной поверхности,
• средства, придающего отрицательный заряд клеточной поверхности,
• хелатообразующего средства,
• антикоагирующего средства,
• средства, предотвращающего образование слизи,
• средства, поддерживающего дисперсию клеток, и/или
• средства, создающего микропоры на клеточной поверхности.
Средство, придающее положительный заряд клеточной поверхности, предпочтительно представляет собой по меньшей мере одно водорастворимое соединение, выбранное из группы, состоящей из поли-L-лизингидрохлорида и поливинилпирролидона (PVP).
Средство, придающее отрицательный заряд клеточной поверхности, предпочтительно по меньшей мере одно водорастворимое соединение, выбранное из группы, состоящей из декстрансульфата, поли-4-стиролсульфоната натрия, полиметакриловой кислоты, карбоксиметилцеллюлозы и/или полиакрилата натрия.
Важно понимать, что можно также использовать любое другое средство, молекулы которого производят положительный/отрицательный заряд в растворе, согласно контексту настоящего изобретения. Однако оказывается полезным, если вышеупомянутое средство является водорастворимым.
Можно использовать вышеупомянутые полимеры, имеющие различные молекулярные массы и/или различные концентрации. Оказывается, что высокомолекулярные полимеры своим действием придают клеткам высокий заряд. Аналогичным образом, высокая концентрация (например, хорошо действует концентрация от 5 до 10 мг/мл PVP в спиртовом фиксаторе) придает повышенный заряд клеточной поверхности (см. фиг.5).
Хелатообразующее агент и/или антикоагулянт предпочтительно представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), гидроксиэтилендиаминтриуксусной кислоты (HEDTA), нитрилотриуксусной кислоты (NTA), цитрата натрия, и/или динатрийоксалата или диметилоксалата, или других цитратов или оксалатов.
Средство, предотвращающее образование слизи, предпочтительно представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из гидроксида натрия, N-ацетил-L-цистеина и/или гипохлорита натрия. Предпочтительно модификатор клеточной поверхности содержит от 2 до 5 мас./об.% NaOH и 0,25 г/50 мл N-ацетил-L-цистеина, или 0,5 - 6 мас./об.% NaOCl.
Средство, поддерживающее дисперсию клеток и/или средство, создающее микропоры на клеточной поверхности, представляет собой предпочтительно поверхностно-активное вещество, предпочтительнее по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из дитиотреитола и/или трет-октилфеноксиполиоксиэтанола (Triton X-100). Присутствие этих средств создает регулируемые поры в клеточных мембранах, обеспечивая быстрый доступ красителя к цитоплазме и ядру.
Вышеупомянутые соединения обеспечивают надлежащую фиксацию, препятствуют коагуляции и способствуют хорошему диспергированию клеточных образцов. Они не влияют на окрашивание клеток, которое осуществляют метиленовый синий, эозиновый лазурный (EA) и оранжевый G (см. фиг.6), и способствуют тому, чтобы клетки сохраняли устойчивость в течение приблизительно одной недели (см. фиг.7).
Особенно предпочтительным оказывается то, что предложена смесь для клеточного препарата, которая включает по меньшей мере фиксатор и модификатор клеточной поверхности. В качестве альтернативы, оказывается предпочтительным, что в способе согласно настоящему изобретению стадии фиксации клеток, содержащихся в вышеупомянутом образце, и модификации поверхности клеток, содержащихся в вышеупомянутом образце, осуществляют одновременно.
Согласно этим вариантам осуществления, смесь для клеточного препарата служит для одновременной фиксации клеток и модификации поверхности клеток в образце.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления, фиксатор и/или модификатор клеточной поверхности может дополнительно включают краситель.
Кроме того, оказывается предпочтительным, что ядерный краситель содержит по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, состоящей из:
• кармина,
• метиленового синего,
• нейтрального/толуиленового красного,
• гематоксилина,
• сафранина,
• нильского голубого.
Аналогичным образом, оказывается предпочтительным, что цитоплазматический краситель содержит по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, состоящей из:
• эозина,
• альцианового синего,
• ксилидинового пунцового,
• алого красителя Бибриха (Biebrich),
• тартразина,
• красителя Ван Гизона (Van Gieson) (пикриновая кислота и кислый фуксин)
• красителя Райта (Wright).
Предпочтительнее можно использовать сочетание красителей, которые, например, содержит так называемая окрашивающая смесь Папаниколау, где данное сочетание включает гематоксилин, оранжевый G, эозин Y, светло-зеленый SF желтоватый и иногда коричневый бисмарк (Bismarck) Y.
Еще одно подходящее сочетание красителей используют в трехцветном красителе Массона (Masson), который составляют гематоксилин Вейгерта (Weigert), кислый фуксин, ксилидиновый пунцовый, фосфомолибденовая кислота и светло-зеленый SF желтоватый, или, в качестве альтернативы, зеленый стойкий FCF, метиловый синий, голубой водный или анилиновый синий.
Еще одно подходящее сочетание красителей используют в трехцветном красителе Лилли (Lillie), который аналогичен трехцветному красителю Массона, но он содержит алый краситель Бибриха, заменяющий кислый фуксин и/или ксилидиновый пунцовый.
Кроме того, можно также использовать флуоресцентные красители, такие как 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI).
Кроме того, можно также использовать определенные сочетания коммерчески доступных красителей, такие как наборы для окрашивания клеток, такие как набор HCS CellMask™, который поставляет компания Invitrogen.
Ядерный краситель служит для окрашивания ядер клеток, содержащихся в образце, когда образец нанесен на вышеупомянутое первое поддерживающее средство для образца, или его покрывает вышеупомянутое первое поддерживающее средство для образца. Цитоплазматический краситель служит для окрашивания цитоплазмы клеток, содержащихся в образце, когда образец нанесен на вышеупомянутое вторе поддерживающее средство для образца, или его покрывает вышеупомянутое второе поддерживающее средство для образца.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, первое и второе поддерживающее средства для образца предназначены для помещения в автоматическое устройство для окрашивания образца.
Способ согласно настоящему изобретению предпочтительно может дополнительно включать по меньшей мере одну стадию, выбранную из группы, состоящей из:
a) подробного исследования шейки матки методом кольпоскопии;
b) осуществления анализа ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) в вышеупомянутом биологическом образце или в новом образце, имеющем сопоставимые свойства;
c) осуществления биомаркерного анализа в вышеупомянутом биологическом образце или в новом образце, имеющем сопоставимые свойства; и/или
d) визуального исследования вышеупомянутого биологического образца или нового образца, имеющего сопоставимые свойства, медицинским экспертом.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения, использование системы, набора или способа соответствует по меньшей мере одной цели, выбранной из группы, состоящей из:
• скрининга рака,
• диагностики рака,
• прогноза по отношению к данной терапии,
• сопутствующего наблюдения данной терапии рака.
Предпочтительно цитологический образец представляет собой образец клеток человека. Предпочтительно цитологический образец представляет собой образец клеток шейки матки. Однако, поскольку принципы возникновения рака и трансформации клеток являются всеобщими, данный способ можно также использовать для образцов других тканей организма, которые подлежат проверке на наличие аномалий, таких как образцы молочной железы, образцы предстательной железы, образцы печени, образцы легкого, образцы крови и т.д.
Оказывается предпочтительным, что цитологический образец выбран из группы, состоящей из:
• образца мазка,
• тканевого среза,
• жидкого образца и/или
• других цитологических образцов.
Образец мазка, например, является аналогичным или идентичным образцам, которые используют в анализах методом Папаниколау (также называется мазок Папаниколау, анализ Папаниколау, мазок из шейки матки или анализ мазка). Тканевый срез получают, например, используя микротом. Жидкий образец может предпочтительно состоять из суспензии клеток, например, полученных посредством мазка.
Другие подходящие образцы включают, но не ограничиваются этим, образцы, полученные тонкоигольной аспирационной биопсией для цитологического исследования (FNAC), абразивные цитологические образцы и/или отшелушенные образцы.
Во многих случаях, чтобы сделать образец, например, тканевый срез, или мазок, доступным для исследования, его фактически помещают на предметную пластинку. Однако для нанесения образца можно также использовать и другие устройства, например, такие как небольшая кювета, в том случае, когда образец представляет собой жидкий образец, или картридж, в том случае, когда образец представляет собой полученный кисточкой образец. Термин «срез», который используется в блок-схемах, таким образом, нисколько не ограничивает объем настоящего изобретения.
Пример: Ротационное нанесение ядерных красителей и цитоплазматических красителей на покровные пластинки и предметные пластинки
Предметные пластинки и покровные пластинки очищали согласно стандартному протоколу для чистого помещения.
1. Получение красителей:
a) эозин Y лазурный (EA): эозин Y 0,23 мас./об.%, зеленый стойкий F 0,08 мас./об.%, коричневый бисмарк 0,05 мас./об.%, фосфовольфрамовая кислота 0,2 мас./об.%, раствор в денатурированном спирте;
b) оранжевый G (OG): OG 0,3 мас./об.%, фосфовольфрамовая кислота 0,01 мас./об.%, раствор в денатурированном спирте;
c) метиленовый синий (MB)/крезиловый фиолетовый (CV): 80 г/л MB в метаноле, 40 г/л CV в метаноле.
2. Ротационное покрытие на устройстве для ротационного покрытия от компании Holmarc (Индия):
a) предметная пластинка MB/CV: 1000 об/мин в течение 20 секунд (200 мкл красителя);
b) покровная пластинка EA/OG: 3000 об/мин в течение 20 секунд (70 мкл красителя).
3. Концентрация наносимого средства и скорость вращения, используемые для покрытия, принимают следующие значения:
i) Покровные пластинки
Код
Скорость (об/мин)
Время (с)
Объем (мкл)
ОЕ1
2000
20
100
ОЕ2
2000
10
100
ОЕ3
1000
20
100
ОЕ4
1000
10
100
ОЕ5
500
10
100
ОЕ6
500
5
100
ОЕ7
500
10
100
ОЕ8
500
5
100
ОЕ9
500
10
100
ОЕ10
500
5
100
ii) Предметные пластинки
Код
Скорость (об/мин)
Время (с)
Объем (мкл)
ОЕ11
1000
10
150
ОЕ12
1000
5
150
ОЕ13
1000
10
200
ОЕ14
1000
5
200
ОЕ15
500
10
200
ОЕ16
500
5
200
ОЕ17
1000
10
200
Покрытие MB/CV (1:1)
i) Предметные пластинки
Код
Скорость (об/мин)
Время (с)
Объем (мкл)
Разбавление
МС1
1000
10
150
5х
МС2
1000
10
150
5х
МС3
1000
5
150
5х
МС4
1000
5
150
5х
МС5
1000
10
200
5х
МС6
1000
10
200
5х
МС7
1000
5
200
5х
МС8
1000
5
200
5х
Краткое описание чертежей
Эти и другие аспекты настоящего изобретения становятся очевидными и разъясняются по отношению к вариантам осуществления, описанным далее в настоящем документе. На чертежах:
Фиг.1 схематически представляет примерную систему или набор согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг.2 представляет примерный способ изготовления цитологической предметной пластинки согласно настоящему изобретению.
Фиг.3 представляет разнообразные проблемы, которые возникают в процессе получения образцов согласно предшествующему уровню техники.
Фиг.4 представляет примерную последовательность операций и функциональность каждого из компонентов согласно настоящему изобретению.
Фиг.5 представляет, как увеличивается дзета-потенциал (т.е. клеточный мембранный потенциал) клеток шейки матки при увеличении концентрации поливинилпирролидона (PVP).
Фиг.6 представляет клетки, в которых клеточные ядра (фиг.6A), или клеточная цитоплазма (фиг.6B) окрашивают, используя протоколы согласно настоящему изобретению.
Фиг.7 представляет постепенное разрушение клеток с течением времени в основном фиксаторе. Это разрушение усиливается, когда значение pH фиксатора выбирают ближе к нейтральному, без какого-либо изменения рисунка окрашивания.
Фиг.8 представляет примерный процесс окрашивания клеток шейки матки на предметных пластинках.
Фиг.9 представляет примерную последовательность операций, иллюстрирующую приготовление красителя и примерный процесс окрашивания.
Фиг.10 представляет первое и второе поддерживающее средство для образца согласно примерному варианту осуществления.
Фиг.11 представляет результаты предварительного точечного нанесения красителя способом согласно настоящему изобретению.
Подробное описание вариантов осуществления
Хотя настоящее изобретение подробно проиллюстрировано и описано на чертежах и в представленном выше описании, данные иллюстрации и описание следует рассматривать как иллюстративные или примерные, но не ограничительные; настоящее изобретение не ограничивается описанными вариантами осуществления. Другие разновидности описанных вариантов осуществления могут понимать и осуществлять специалисты в данной области техники при практической реализации заявленного изобретения в результате изучения чертежей, описания и прилагаемой формулы изобретения. В формуле изобретения слово «включающий» не исключает другие элементы или стадии, а неопределенный артикль «a» или «an» не исключает множественное число. Тот факт, что определенные измеренные величины представлены во взаимно различных зависимых пунктах формулы изобретения, сам по себе не показывает, что сочетание данных измеренных величин невозможно использовать в качестве преимущества. Никакие условные обозначения в формуле изобретения не следует истолковывать как ограничивающие ее объем.
Хотя варианты осуществления описанной системы и варианты осуществления описанного способа подробно представлены в описании со ссылкой на чертежи, данные описания и чертежи следует рассматривать как примерные и неограничительные; настоящее изобретение не ограничивается описанными вариантами осуществления.
Например, можно практически осуществлять настоящее изобретение в конфигурации, в которой смесь для клеточного препарата поступает в один или несколько контейнеров и перемешивается на месте перед диспергированием в ней образца. Может оказаться преимущественным предварительное нанесение ядерного красителя на предметную пластинку и цитоплазматического красителя на покровную пластинку, без отклонения от настоящего изобретения. Все такие видоизменения рассматриваются как варианты осуществления настоящего изобретения. Дополнительные варианты и сочетания должны быть очевидными для специалиста в данной области техники, причем все такие варианты считаются входящими в объем описанных способов.
Фиг.1 схематически представляет описанную систему 100, согласно варианту осуществления. Контейнер 101 содержит смесь для клеточного препарата в жидкой форме. Представленный контейнер 101 имеет крышку 109, которая в закрытом состоянии является воздухонепроницаемой и, следовательно, защищает жидкость 107, содержащуюся в контейнере 101.
Жидкость 107 имеет такой состав, что она одновременно выполняет разнообразные функции. Она может быть предусмотрена для выполнения двух основных групп функций, а именно фиксации клеток и препарирования клеток. Термин «фиксация», используемый в настоящем документе, имеет смысл умерщвления, консервации и отверждения (ткани, клеток и т.д.) для последующего микроскопического исследования. Препарирование клеток представляет собой функцию, посредством которой клетки готовят для помещения на предметную пластинку. Соответствующий процесс будет подробно описан ниже.
Предметная пластинка 103 напоминает прямоугольную стеклянную пластинку, которую обычно используют в качестве цитологической предметной пластинки, за исключением того, что, помимо прочего, на нее нанесен ядерный краситель. Предметная пластинка предназначена для покрытия покровной пластинкой, которая напоминает покровную пластинку, обычно используемую в качестве цитологической предметной пластинки, т.е. представляющую собой прямоугольную стеклянную пластинку, за исключением того, что на нее нанесен цитоплазматический краситель. После представления основных частей описанной системы далее будет приведено подробное описание в отношении этих частей и предполагаемого способа их использования.
Цитологический образец получают у пациентов традиционным образом. В качестве примера, образец можно собирать из шейки матки пациентки, обследуемой для выявления рака шейки матки. Образец получают, используя особую деревянную лопаточку или ватную палочку, или кисточку. Полученный таким способом образец погружают в смесь 107 для клеточного препарата, предпочтительно находящуюся внутри контейнера 109, и перемешивают или встряхивают таким образом, что составляющие компоненты образца, в частности клетки, равномерно суспендировались в смеси для клеточного препарата.
Согласно одному варианту осуществления, смесь для клеточного препарата обязательно содержит фиксатор, задача которого заключается в том, чтобы фиксировать клетки для последующего помещения на предметную пластинку. Основной компонент фиксатора представляет собой смесь этанола, изопропилового спирта и ледяной уксусной кислоты, находящихся в соотношении 7:2:1, соответственно. Несмотря на то что можно использовать и другие соотношения, вышеупомянутое соотношение обеспечивает соответствующий уровень pH для сохранения клеток без разрушения в течение некоторого периода времени. Если долгосрочное хранение не предусмотрено, в интересах других функций фиксатора данное соотношение можно изменять посредством некоторого экспериментирования. Другие функции могут представлять собой, например, скорость окрашивания клеток на последующих стадиях.
Согласно альтернативному варианту осуществления, основной компонент фиксатора представляет собой смесь, содержащую 2-4 об.% глутаральдегида в 0,1 М фосфатно-солевом буферном растворе (PBS). Этот раствор может содержать соли натрия или соли калия.
Однако чтобы получать качественные предметные пластинки, т.е. предметные пластинки, которые содержат, в основном, одиночный слой клеток, которые не перекрываются и равномерно распределяются на поверхности предметной пластинки, поверхность, в фиксатор добавляют другие соединения, и все они совместно называются термином «клеточный препарат». Обнаружено, что клетки не слипаются друг с другом, если они содержат заряд на своей поверхности. Чтобы клетки приобрели поверхностный заряд, в фиксатор добавляют другие компоненты. Поли-L-лизингидрохлорид (PLL) или поливинилпирролидон (PVP) при смешивании в соответствующих количествах придают положительный заряд клеткам, и, следовательно, они отталкиваются друг от друга, что способствует образованию клеточного монослоя. В качестве альтернативы, можно также использовать соединения, которые придают отрицательный заряд. Некоторые из соединений, которые можно использовать, представляют собой декстрансульфат, поли-4-стиролсульфонат натрия, полиметакриловую кислоту, карбоксиметилцеллюлозу и/или полиакрилат натрия. Данный список отнюдь не является исчерпывающим. Зная соответствующий принцип, можно использовать и другие разнообразные соединения.
+
2-
2
2
4
3
2
2
4
Кроме того, следует предотвращать свертывание крови и сгущение других клеток в образце. Таким образом, в смесь для клеточного препарата добавляют антикоагулянты. В смесь для клеточного препарата добавляют также одно или несколько из следующих средств: этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), гидроксиэтилендиаминтриуксусную кислоту (HEDTA), нитрилотриуксусную кислоту (NTA), цитрат натрия, динатрийоксалат (NaCO) или диметилоксалат ((CH)CO). Эти соединения можно использовать в разнообразных концентрациях, которые составляют для EDTA от 1 до 1,5 мг на 1 мл смеси для клеточного препарата; для цитрата натрия 3,8% по отношению к объему смеси для клеточного препарата, для оксалата 1% по отношению к объему смеси для клеточного препарата и т.д. В результате некоторого экспериментирования можно также определить соответствующие количества для других вышеупомянутых соединений.
Кроме того, в смесь для клеточного препарата добавляют средства, предотвращающие образование слизи, такие как 1% NaOH, 2% NaOH + 0,25 г N-ацетил-L-цистеина или 3 мас./об.% NaOCl.
Кроме того, в смесь для клеточного препарата добавляют поверхностно-активные вещества для улучшения диспергирования клеток в смеси для клеточного препарата и образования в мембране ограниченного числа пор, которые способствуют окрашиванию клеток. Подходящее поверхностно-активное вещество представляет собой дитиотреитол (DTT). Приблизительно 1 мас./об.% по отношению к смеси для клеточного препарата представляет собой подходящую концентрацию поверхностно-активного вещества в смеси для клеточного препарата. Используя вышеупомянутую концентрацию, образец можно хранить без значительного разрушения клеток в течение приблизительно одной недели. Если такая необходимость отсутствует, поверхностно-активное вещество можно использовать в концентрации от 1 до 2 мас./об.%.
Таким образом, этот единственный компонент, а именно смесь для клеточного препарата, используют для препарирования клеток при изготовлении на месте применения предметных пластинок для цитологического исследования.
Предметная пластинка 103 является аналогичной обычной цитологической предметной пластинке, но содержит предварительно нанесенный краситель. Согласно одному варианту осуществления, цитоплазматический краситель предварительно нанесен на предметную пластинку. В качестве красителя выбирают метиленовый синий (MB) или крезиловый фиолетовый (CV), или смеси этих двух красителей. Для этой цели можно использовать и другие эквивалентные ядерные красители, которые являются гидрофобными по своей природе. На данную предметную пластинку наносят краситель методом ротационного покрытия, используя соответствующую технологию, в результате которой на предметной пластинке образуется равномерный слой красителя. Покрытие толщиной от 10 нм до 10 мкм обеспечивает достаточное количество красителя.
Однако хорошее цитоплазматическое окрашивание обеспечивается, когда его осуществляют в среде, у которой значение pH составляет от 4,5 до 6,5. Для достижения этой цели, согласно одному варианту осуществления, цитоплазматический краситель, который предварительно наносят на предметную пластинку, имеет нейтральное значение pH, и смесь для клеточного препарата имеет значение pH от 4,5 до 6,5, т.е. смесь для клеточного препарата содержит уксусную кислоту, и уровень pH смеси для клеточного препарата регулируют таким образом, чтобы он находился в заданном интервале в процессе приготовления. Согласно еще одному варианту осуществления, в котором смесь для клеточного препарата содержит глутаральдегид и PBS, краситель, предварительно нанесенный на предметную пластинку, содержит подходящую кислоту, смешанную с ним перед его предварительным нанесением на предметную пластинку. Подходящая кислота представляет собой хлористоводородную кислоту (HCl). Количество HCl для смешивания с красителем регулируют таким образом, чтобы при диспергировании образца в заданном количестве смеси для клеточного препарата и его помещении на предметную пластинку значение pH находилось в оптимальном интервале, а именно от 4,5 до 6,5.
На покровную пластинку 105 предварительно наносят ядерные красители. Оранжевый G (OG) и эозиновый лазурный (EA) смешивают и предварительно наносят на покровную пластинку 105. Кроме того, на покровную пластинку также предварительно наносят сочетание ядерных красителей методом ротационного покрытия, толщина которого составляет от 10 нм до 10 мкм.
4
Кроме того, ядерное окрашивание является наиболее эффективным, когда значение pH среды является основным и составляет от 7 до 10. Ядерное окрашивание можно осуществлять при pH на уровне 7 или даже в интервале от 6 до 7, но тогда это окрашивание является слабым или медленным. Таким образом, ядерный краситель, предварительно наносят на покровную пластинку вместе с основанием, таким как гидроксид натрия (NaOH) или гидроксид аммония (NHOH). Таким образом, когда сама смесь для клеточного препарата является кислой и нанесена на предметную пластинку, которая является нейтральной, или когда смесь для клеточного препарата является нейтральной (pH 7), и ее уровень pH изменяется на предметной пластинке до 4,5-6,5 в случае цитоплазматического окрашивания, данный уровень pH снова возвращается в интервал от 7 до 10 за счет основания, смешанного с ядерным красителем, предварительно нанесенным на покровную пластинку.
Хотя выше представлено несколько вариантов осуществления описанной системы, можно разработать многочисленные альтернативные варианты осуществления, используя принципы, на которых основана описанная система. Например, можно смешивать цитоплазматические красители со смесью для клеточного препарата, таким образом, что цитоплазма клеток окрашивается, когда образец диспергируется в ней. Когда истекает заданное время после введения образца в смесь для клеточного препарата, небольшое количество полученного образца наносят на предметную пластинку, покрытую ядерным красителем и основанием, таким образом, что уровень pH полученного образца изменяется на месте, и ядра клеток окрашиваются. Согласно такому варианту осуществления, на покровной пластинке отсутствует покрытие, и, следовательно, она представляет собой покровную пластинку, обычно используемую в качестве цитологической предметной пластинки. Еще один вариант осуществления, который можно разработать, заключается в том, чтобы окрашивать ядра клеток, используя сначала смесь для клеточного препарата, у которой уровень pH превышает 7, и которая содержит ядерный краситель, а затем изменять pH на месте на предметной пластинке до 5-6,5 с помощью предметной пластинки, на которую предварительно наносят цитоплазматический краситель и кислоту. Все такие другие варианты осуществления считаются включенными в настоящее изобретение.
Фиг.2 представляет способ изготовления цитологической предметной пластинки. Первый стадия в описанной ниже процедуре представляет собой стадию не описанного процесса, а процесса, осуществляемого обычно для получения цитологического образца. Однако операция получения цитологического образца представлена как стадия 211 в блоке пунктирной линией и пунктирной стрелкой, чтобы показать, что она, по существу, не представляет собой часть описанного способа.
Однако когда образец получают известным способом, используя лопаточку или палочку, или кисточку, или любой другой подходящий инструмент, образец диспергируют в специально изготовленной смеси дли клеточного препарата, описанной выше, причем диспергирование осуществляют на соответствующей стадии 213. Смесь для клеточного препарата используют, чтобы подготовить клетки в образце для помещения их на подготовленную предметную пластинку. Диспергирование можно осуществлять путем перемешивания образца в смеси для клеточного препарата, используя инструмент, с помощью которого получают образец, например лопаточку. В качестве альтернативы, контейнер, содержащий смесь для клеточного препарата, слегка встряхивают с содержащим образец инструментом, погруженным в нее. Следует понимать, что часть содержащего образец инструмента погружается в смесь для клеточного препарата. Для такого диспергирования образца в смеси для клеточного препарата может потребоваться минимальное время. Это может зависеть от точного состава смеси для клеточного препарата.
На стадии нанесения 215 количество образца, диспергированного в смеси для клеточного препарата, называемого «изготовленный образец», наносят на предметную пластинку, на которую предварительно нанесен цитоплазматический краситель, и оставляют для равномерного распространения на пластинке. Количество изготовленной смеси, нанесенной на предметную пластинку, следует определять, поскольку уровень pH изготовленной смеси должен изменяться на месте на данной стадии или на последующей стадии, и оно может составлять меньшее или большее число капель в различных местах на предметной пластинке. Когда изготовленный образец вступает в контакт с предварительно нанесенным красителем, и краситель растворяется в смеси для клеточного препарата, он начинает окрашивание цитоплазмы клеток в изготовленном образце.
После выдерживания в течение соответствующего периода времени для окрашивания цитоплазмы клеток в изготовленном образце, покровную пластинку, на которую предварительно нанесен по меньшей мере ядерный краситель, используют, чтобы покрыть нанесенный изготовленный образец на стадии покрытия 217, таким образом, что поверхность покровной пластинки, на которую предварительно нанесен ядерный краситель, вступает в контакт с покрываемой ей изготовленным образцом. Период времени, который должен истечь перед помещением покровной пластинки, может зависеть от точного состава смеси для клеточного препарата согласно различным описанным выше вариантам осуществления. Этот период можно устанавливать экспериментальным путем и определять как минимальный период времени, который должен истечь, прежде чем покровную пластинку можно будет помещать на образец.
Когда покровная пластинка, на которую предварительно нанесен ядерный краситель, вступает в контакт с изготовленным образцом, нанесенным на предметную пластинку, ядерный краситель растворяется в смеси для клеточного препарата и начинает окрашивание ядер клеток. Как в случае времени, требуемого для окрашивания после нанесения изготовленного образца на предметную пластинку, требуется выдерживание в течение минимального периода времени для окрашивания клеток ядерным красителем, прежде чем изготовленные предметные пластинки можно будет высушивать в ускоренном режиме, если это необходимо, например, путем нагревания.
Таким образом, изготавливают предметную пластинку для исследования посредством микроскопа или автоматического оптического устройства для анализа клеток. Как можно видеть из представленного выше описания, изготовление цитологической предметной пластинки направлено на изготовление предметной пластинки на месте с использованием меньшего числа стадий, чем число стадий в способах, известных до настоящего времени. Следует понимать, что хотя в данном описании представлено изготовление одной предметной пластинки, такую же систему можно использовать для единовременного изготовления более чем одной предметной пластинки с таким же изготовленным образцом, что может потребоваться в соответствии с обычными лабораторными стандартами или руководствами. Объем смеси для клеточного препарата и количество образца, получаемого от пациентов, можно стандартизировать таким образом, чтобы можно было изготавливать единовременно требуемое число предметных пластинок.
Можно видеть, что используемый на практике набор на основе описанной системы и способа может содержать заданное количество смеси для клеточного препарата, чтобы изготавливать число предметных пластинок, требуемое согласно соответствующей лабораторной практике, а также стандартизировать количество получаемого образца, предпочтительный инструмент для его получения, способ диспергирования образца для получения препарата образца, а также минимальный период времени, требуемого на разнообразных стадиях способа, таким образом, чтобы требуемое число качественных предметных пластинок можно было изготавливать на месте для дальнейшего исследования.
По существу, способ можно описать как включающий три стадии. Первая стадия представляет собой диспергирование цитологического образца в смеси для клеточного препарата, причем одновременно осуществляется множество функций, таких как диспергирование клеток в смеси для клеточного препарата, модификация клеточной поверхности, придание поверхности клеток электрического заряда таким образом, чтобы они распределялись равномерно и не соединялись друг с другом, и подготовка клеточной поверхности для окрашивания. Кроме того, смесь для клеточного препарата может также иметь уровень pH, который является оптимальным для окрашивания. Вторая стадия представляет собой окрашивание цитоплазмы клеток. Третья стадия представляет собой изменение pH изготовленного образца на месте и окрашивание ядер клеток в изготовленном образце. Несмотря на то что выше представлен только данный вариант осуществления описанного способа, на его основе можно разрабатывать множество вариантов осуществления данного способа. Например, смесь для клеточного препарата может также содержать цитоплазматический краситель, таким образом, что, в дополнение к функциям, уже описанным для первой стадии, одновременно может быть также окрашена и цитоплазма. Можно вносить подходящие изменения в смесь для клеточного препарата, таким образом, что окрашиваются сначала ядра клеток, а затем цитоплазма. Все такие варианты рассматриваются в качестве вариантов осуществления описанного способа, и, следовательно, на них распространяется настоящее изобретение.
Фиг.3 представляет разнообразные проблемы, которые возникают в процессе получения образцов согласно предшествующему уровню техники. На фиг.3A полиморфная модификация перекрывается с клеткой, что затрудняет последующее визуальное исследование вышеупомянутой клетки или вносит искажения в автоматический анализ изображения. Фиг.3B представляет клетки, которые являются сложенными, что приводит к проблемам, аналогичным тем, которые обсуждались в отношении фиг.3A. Фиг.3C представляет клетки, которые частично перекрываются, снова затрудняя последующее визуальное исследование и внося искажения в автоматический анализ изображения. Фиг.3D представляет клетки, которые должны присутствовать, чтобы обеспечивать соответствующий анализ изображения, в том числе визуальный анализ или автоматический анализ изображения, т.е. эти клетки являются развернутыми, и клетки надлежащим образом диспергированы без какого-либо перекрывания.
Фиг.4 представляет примерную последовательность операций, а также функциональность каждого из компонентов согласно настоящему изобретению. Следует отметить, что данный пример отнюдь не является ограничительным. Кроме того, следует отметить, что компоненты I и II (т.е. фиксатор и модификатор клеточной поверхности) можно объединять.
Фиг.5 представляет, как увеличивается дзета-потенциал (т.е. клеточный мембранный потенциал) клеток шейки матки при увеличении концентрации поливинилпирролидона (PVP). Поливинилпирролидон положительно влияет на заряд клеточных мембран. В образце 1 используют только фиксатор на спиртовой основе. В образцах 2-4 используют такой же фиксатор на спиртовой основе, который содержит 2, 4, или 5 мг/мл PVP.
Фиг.6 представляет окрашенные клетки. На фиг.6A ядра клеток окрашивает метиленовый синий, а на фиг.6B цитоплазму клеток окрашивают эозиновый лазурный (EA) и оранжевый G (OG). Важно отметить, что на данное окрашивание не влияют предшествующие стадии, осуществляемые согласно настоящему изобретению, т.е. использование хелатообразующих средств и антикоагулирующих средств (для предотвращения сгущения клеток), таких как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), гидроксиэтилендиаминтриуксусная кислота (HEDTA), нитрилотриуксусная кислота (NTA), цитрат натрия, оксалаты; использование средств, предотвращающих образование слизи, таких как 1% NaOH, 2% NaOH + 0,25 г/50 мл N-ацетил-L-цистеина, 3% NaOCl; использование поверхностно-активных веществ (для улучшения диспергирования клеток и образования ограниченного числа пор в мембране), таких как дитиотреитол (DTT), Triton X-100 и т.д.
Фиг.7 представляет постепенное разрушение клеток с течением времени в фиксаторе на спиртовой основе. Это разрушение замедляется, когда уровень pH фиксатора приближается к нейтральному, составляя, например, от 4,5 до 6,5, в результате добавления основания или соответствующего буферного раствора.
4
Фиг.8 представляет примерную последовательность операций для изготовления красителей в сочетании с поверхностно-активным веществом и основанием (для изменения pH на месте применения). Поверхностно-активное вещество, такое как Triton X-100 или DTT, смешивают непосредственно с фиксатором, таким как фиксатор, на основе спирта или глутаральдегида, в котором затем собирают образцы. Необязательно вышеупомянутый раствор может также содержат краситель, например, цитоплазматический краситель, в том числе эозиновый лазурный (EA) и/или оранжевый G (OG). Уровень pH раствора предпочтительно поддерживают в интервале от 4,5 до 6,5. Еще один краситель (ядерный краситель, такой как гематоксилин, метиленовый синий, и т.д.) наносят на предметную пластинку вместе с каким-либо основным соединением, таким как NaOH, NaCl, NHOH и т.д. Концентрацию основания следует выбирать таким образом, чтобы уровень pH желательного объема фиксатора (имеющего кислую природу) может быстро изменяться до основного интервала от 7,5 до 9,5. Следует отметить, что можно также добавлять ядерный краситель в клеточную суспензию, и можно наносить цитоплазматический краситель на предметную пластинку.
Фиг.9 представляет примерную последовательность операций, иллюстрируя изготовление красителя, а также примерный процесс окрашивания. В качестве ядерного красителя используют смесь метиленового синего (MB) и крезилового фиолетового (CV). Для этой цели можно также использовать и другие ядерные красители, которые являются гидрофильными. Краситель наносят на предметную пластинку методом ротационного покрытия, используя соответствующий протокол, чтобы обеспечивать образование равномерного слоя красителя толщиной от 10 нм до 10 мкм. Для окрашивания цитоплазмы оранжевый G (OG) и эозиновый лазурный (EA) смешивают друг с другом, используя один растворитель, и затем наносят на покровную пластинку. Это обеспечивает, что ядерный краситель и цитоплазматический краситель предварительно нанесены, и соответствующие виды окрашивания можно одновременно осуществлять в едином устройстве для окрашивания. Предметную пластинку и покровную пластинку (т.е. первое и второе поддерживающее средство для образца) можно сочетать таким образом, что они присоединяются друг к другу с помощью шарнира, как представлено на фиг.10. Между этими поверхностями может быть предусмотрена распорка толщиной от 2 до 100 мкм, таким образом, что когда клетки помещают между двумя поддерживающими средствами для образца, клетки оказываются защищенными от сжатия.
Фиг.10 представляет примерный вариант осуществления, включающий первое поддерживающее средство для образца (предметная пластинка 1001) и второе поддерживающее средство для образца (покровная пластинка 1002), причем оба поддерживающих средства для образца соединяются посредством шарнира 1005. Кроме того, предусмотрена распорка 1003, толщина которой может составлять от 2 до 100 мкм, чтобы предотвращать сжатие клеток. Распорка может иметь амортизирующие и/или самоклеящиеся свойства. На фиг.10 цитоплазматический краситель предварительно нанесен на предметную пластинку, и ядерный краситель предварительно нанесен на покровную пластинку. Однако можно использовать и обратную конфигурацию (т.е. цитоплазматический краситель можно наносить на покровную пластинку, и ядерный краситель можно наносить на предметную пластинку). Кроме того, покровная пластинка и предметная пластинка могут иметь близкие или даже одинаковые размеры, или отличаться друг от друга еще более, чем представлено на фиг.10. Как обсуждается выше, ядерный краситель или цитоплазматический краситель можно также вносить в клеточную суспензию заблаговременно.
Фиг.11 представляет результаты предварительного нанесения красителей на месте применения способом согласно настоящему изобретению. На предметные пластинки и покровные пластинки наносят красители, используя ротационное покрытие, как описано в примере 1. Предварительно покрытые предметные пластинки затем использовали в экспериментах по окрашиванию клеток шейки матки. Для этой цели образец клеток шейки матки, собранных в среде, наносили на предметную пластинку, а затем сверху помещали покровную пластинку. Предметные пластинки исследовали под микроскопом через 3 минуты после окрашивания и получали изображения. Фиг.11A представляет окрашивание оранжевым G. Фиг.11B представляет окрашивание эозиновым лазурным, и фиг.11C представляет окрашивание метиленовым синим (MB) и крезиловым фиолетовым (CV). Фиг.11D представляет изображение цитоплазмы клеток шейки матки сочетанием оранжевого G (OG) и эозинового лазурного (EA) через 3 минуты после окрашивания.