Пневмококковые вакцины, особенности доклинического изучения и клинических испытаний

ПРЕПАРАТЫ

Пневмококковые вакцины, особенности доклинического изучения и клинических испытаний

Немировская Т.И., Абрамцева М.В., Миронов А.Н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского

применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

Pneumococcal vaccine, highlights of preclinical

and clinical trials

Nemirovskaya T.I., Abramtseva M.V., MironovA.N.

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow

Статья посвящена анализу современных требований, предъявляемых к качеству и безопасности вновь разрабатываемых пневмококковых полисахаридных конъюгированных вакцин в доклинических и клинических испытаниях. На основании изучения рекомендаций ВОЗ и требований Европейской Фармакопеи обсуждаются методы изучения новых пневмококковых полисахаридных вакцин на уровне полуфабриката и готового препарата. Обсуждаются вопросы оценки иммунного ответа у привитых. Подчеркнута необходимость использования лицензированной вакцины в качестве препарата сравнения при проведении клинических испытаний новых пневмококковых вакцин. Показаны критерии приемлемости иммунного ответа привитых в ELISA. Указаны основные белковые носители, рекомендованные в качестве конъюгатов для полисахаридных пневмококковых вакцин.

Ключевые слова: пневмококковые вакцины, иммунный ответ, препарат сравнения, метод ELISA, конъюгаты для полисахаридных пневмококковых вакцин.

Библиографическое описание: Немировская Т.И., Абрамцева М.В., Миронов А.Н. Пневмококковые вакцины, особенности доклинического изучения и клинических испытаний // Биопрепараты. 2013. № 1. С. 12-15.

The present article is dedicated to the analysis of current requirements for the quality and safety of the newly developed pneumococcal polysaccharide conjugate vaccines in pre-clinical and clinical trials. Based on the examination of WHO guidelines and the requirements of the European Pharmacopoeia, the article discusses new research methods for the pneumococcal polysaccharide vaccines as applied to intermediate and finished preparations. The evaluation of immune response in vaccinated patients is also discussed in the article. It outlines the need for licensed vaccine use as a reference medicine in clinical trials of the new pneumococcal vaccines. The article describes the acceptance criteria of immune response determined by ELISA. It also points at the main protein carriers recommended as conjugates for pneumococcal polysaccharide vaccines.

Key words: pneumococcal vaccines, immune response, reference medicine, ELISA assay, conjugates for pneumococcal polysaccharide vaccines.

Bibliographic description: Nemirovskaya T.I., Abramtseva M.V., Mironov A.N. Pneumococcal vaccine vaccine, highlights of preclinical and clinical trials// Biopreparats (Biopharmaceuticals). 2013. № 1. P. 12-15.

Для корреспонденции:

Немировская Т.И. - начальник лаборатории бактериальных вакцин Испытательного центра экспертизы и контроля МИБП ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.

Адрес: ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России,119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41 e-mail: lot85@mail.ru

Статья поступила 15.08.2012 г, принята к печати 01.11.2012 г

Review

Единственной и наиболее экономичной мерой существенно влияющей на заболеваемость пневмококковой инфекцией является вакцинация. По химическим и серологическим характеристикам полисахаридной капсулы пневмококки подразделяются более чем на 90 серотипов, 23 из которых являются наиболее вирулентными [10]. Эти штаммы пневмококков, являются причиной 90% инвазивных пневмококковых инфекций как в развитых, так и в развивающихся странах. Капсу-лярные полисахариды 23 серотипов включены в состав лицензированных неконъюгированных полисахарид-ных вакцин, выпускаемых разными производителями. В России в 1999 г. была зарегистрирована вакцина Пневмо 23 производства «Санофи Пастер» (Франция). Эта вакцина применяется для профилактики инфекции пневмококковой этиологии у лиц старше 2 лет и особенно показана пациентам из группы риска: старше 65 лет, ослабленным или часто болеющим, а также лицам, находящимся в домах престарелых. Вакцина Пневмо 23 эффективный и безопасный препарат, однако она, как и все полисахаридные вакцины, содержит Т-клеточнонезависимые антигены, в связи с чем неспособна к стимуляции иммунного ответа у детей до 2-летнего возраста и формированию иммунной памяти [1]. Для преодоления недостаточной иммуногенности по-лисахаридных вакцин используют технологию протеиновой конъюгации. При этом каждый из полисахаридов, входящих в состав вакцины, ковалентно конъюгирован с белковым носителем. Главный принцип получения химических вакцин, к которым относятся пневмококковые полисахаридные и полисахаридно-конъюгирован-ные вакцины, заключается в выделении из бактериальной клетки протективных антигенов, обеспечивающих развитие надежного иммунитета, и очистка этих антигенов от балластных веществ. Изучение протектив-ного антигена включает в себя определение его подлинности, количественного содержания активного вещества, его чистоты и молекулярной структуры, а также содержания неспецифических примесей. Состав пневмококковых полисахаридов различных сероти-пов определяется по процентному содержанию азота, фосфора, уроновых кислот, гексозаминов, метилпен-тоз и О-ацетильных групп [10]. Серии очищенных полисахаридов - кандидатов в состав пневмококковой вакцины должны быть охарактеризованы по стабильности содержания в препарате остаточной влажности, остаточного белка (не более 3% по методу Лоури), нукле-

иновых кислот (не более 2%), отсутствию повышенной пирогенности и содержания эндотоксинов (с использованием кроликов или в ЛАЛ-тесте) [3]. Постоянство значений молекулярных параметров пневмококковых полисахаридов является, с одной стороны, важным показателем их потенциальной иммуногенности, с другой стороны, служит свидетельством валидации процесса их производства. В целях оптимизации процесса конъюгации полисахарида с белком-носителем, очищенный пневмококковый полисахарид может быть подвергнут процедуре модификации его структуры путем химического или физического воздействия. При этом в процессе модификации полисахарид может быть частично деполимеризован. Как лицензированные, так и вновь разрабатываемые пневмококковые конъюги-рованные вакцины, могут содержать в своем составе полисахаридные и олигосахаридные цепи. Степень полимеризации модифицированного полисахарида зависит от условий его производства, но для каждого препарата должно быть определено постоянство величины полимеризации. Молекулярные параметры полисахарида любого серотипа, составляющего вакцину, индивидуальны, но и для них должен быть определен диапазон возможных отклонений, определяющий, в конечном счете, стабильность готового препарата [8]. Основными требованиями для белков, используемых в качестве носителей для конъюгированных пневмококковых вакцин, являются доказательства их безопасности и способности обеспечить возможность формирования Т-зависимого иммунного ответа. Наиболее часто в качестве белковых носителей используют дифтерийный и столбнячный анатоксины, белок нетоксигенного дифтерийного мутанта CRM197, а также D-протеин из нетипируемой H. influenzae (табл. 1). Доклинические испытания пневмококковых полисахаридно-конъю-гированных вакцин должны включать исследования, подтверждающие отсутствие у белков-носителей дополнительной токсичности. Использование в качестве белковых носителей дифтерийных и столбнячных анатоксинов необходимо сопровождать подтверждением чистоты их очистки. Степень очистки и детоксикации белка-носителя должна гарантировать отсутствие реверсии токсина. Технология изготовления конъюгированных пневмококковых вакцин должна предполагать удаление непрореагировавших функциональных групп и реагентов, участвующих в процессе конъюгации. Большое значение для подтверждения стандартных

Таблица 1. Полисахаридно-белковый состав пневмококковых конъюгированных вакцин

Название вакцины Фирма-производитель Серотиповой состав Белковый носитель Адъювант Примечание

Превенар «Пфайзер» 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F CRM197 Алюминия фосфат Разрешена к медицинскому применению в РФ

Превенар13 «Пфайзер» 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F CRM197 Алюминия фосфат Разрешена к медицинскому применению в РФ

Синфлорикс «Глаксо СмитКляйн» 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F Столбнячный анатоксин Дифтерийный анатоксин D-протеин H. influenzae Алюминия фосфат Разрешена к медицинскому применению в РФ

ПРЕПАРАТЫ

условий процесса конъюгации при производстве пневмококковых полисахаридных вакцин имеет соотношение полисахарид-белок. Как правило, это соотношение находится в области 0,3-3,0 в зависимости от серотипа пневмококка [10]. Молекулярные параметры полисаха-ридно-белкового комплекса пневмококкового конъю-гата также являются важным показателем, подтверждающим постоянство состава препарата и сохранение его стабильности в процессе хранения. Современные пневмококковые конъюгированные вакцины включают от 7 до 13 различных серотипов, что обуславливает необходимость количественного определения в готовом продукте каждого полисахарида (табл. 1). Важным показателем для подтверждения стабильности препарата служит потеря в массе при его высушивании, которая, как правило, лимитируется показателем в 2,5%. Как и другие вакцинные препараты, пневмококковые вакцины требуют подтверждения их стерильности, отсутствия аномальной токсичности, пирогенности и повышенного содержания эндотоксинов, а также определения количества адъювантов и консервантов, если они входят в состав вакцины. Вследствие отсутствия достоверной экспериментальной модели иммуноген-ности пневмококковых вакцин при их доклиническом изучении, при проведении клинических испытаний новых препаратов большое значение приобретает оценка иммунного ответа привитых. При этом, руководствуясь рекомендациями ВОЗ, иммунный ответ на введение новых пневмококковых вакцин в рандомизированных контролируемых испытаниях следует изучать в сравнении с уже лицензированной вакциной [9]. Пневмококковая конъюгированная вакцина Превенар, содержащая 7 серотипов пневмококка, входит в национальные календари прививок большинства зарубежных стран и с 2009 г. разрешена к медицинскому применению в России. В связи с тем, что при клинических испытаниях вакцины Превенар изучали и ее протективную эффективность, испытание новых пневмококковых вакцин рекомендовано проводить в сравнении с вакциной Превенар [10]. В последние годы стало наблюдаться некоторое замещение «вакцинных» серотипов пневмококка серотипами, не входящими в состав вакцины Превенар и, в том числе, антибиотикорезистентными 6А и 19А, что обусловило необходимость расширения ее серотипового состава. В США и Европе завершены клинические испытания 13-валентной пневмококковой полисахаридной конъюгированной вакцины Превенар 13, которая содержит 6 дополнительных серотипов: 1, 3, 5, 6А, 7F, 19A. По данным международных исследований, 13 серотипов пневмококка, входящих в состав вакцины Превенар 13, ответственны за 90% случаев инвазивных пневмококковых инфекций в мире. С 2011 г. в Российской Федерации разрешено медицинское применение вакцины Превенар 13.

Иммунный ответ в виде серотип-специфических IgG-антител в сыворотках привитых, определенных методом ELISA, основан на связывании полисахаридов, входящих в состав вакцины [5]. Общепризнанным защитным уровнем антител против пневмококковой инфекции в ELISA принята концентрация 0,20-0,35 мкг/мл [7, 9, 10]. При постановке данной реакции обязательно использование стандартных образцов и сывороток. Однако безадсорбционная методика постановки ELISA

предполагает определение наряду с протективными антителами к полисахаридной капсуле и непротектив-ных антител к клеточной стенке. Для сведения к минимуму влияния неспецифических антител на результаты исследований иммунных сывороток было предложено использование их преадсорбции либо очищенным полисахаридом клеточной стенки, либо фракциями неочищенной клеточной стенки из неинкапсулированных штаммов [6, 9, 10]. При апробации альтернативных методов оценки иммунного ответа на введение пневмококковых вакцин необходимо ориентироваться на корреляцию с результатом, полученным в ELISA. Дополнительным методом оценки поствакцинального пневмококкового иммунитета может служить опсоно-фагоцитарная реакция. Принято считать, что уровень титров серотип-специфических антител > 1:8, указывает на наличие в сыворотках привитых функциональных антител [4]. Иммунный ответ на пневмококковые конъюгированные вакцины может зависеть от схемы их применения, популяции прививаемого контингента и антигенного состава вакцин. Результаты первичного курса иммунизации, основанные на измерении IgG антител, должны быть получены спустя 4 недели после завершения цикла иммунизации [9]. На этом этапе должно быть показано достижение достоверного иммунного ответа на каждый серотип, входящий в состав вакцинного кандидата. Кроме того, важными аспектами для клинического изучения новых пневмококковых вакцин могут служить исследования авидности продуцируемых антител, а также влияния вакцинации на носительство пневмококков [2].

Программа клинического изучения новых конъюги-рованных вакцин против пневмококковой инфекции должна включать методы исследования, подтверждающие возможность формирования у привитых детей иммунологической памяти. Важное значение при изучении иммунного ответа на вновь разработанные пневмококковые конъюгированные вакцины приобретают вопросы, связанные с необходимостью введения бустер-дозы. Необходимость дополнительной иммунизации зависит от ряда факторов, таких как, например, утрата естественного повышения иммунитета вследствие низкого уровня циркуляции некоторых, либо всех серотипов, входящий в состав вакцины [10]. Применение вакцины Превенар в развитых странах предполагает введение 2 или 3 доз вакцины на первом году жизни ребенка с последующей бустер-иммунизацией на втором году жизни (начиная с 12 месяцев). В большинстве случаев считается, что бустер-дозу следует вводить спустя 6 месяцев после завершения курса первичной иммунизации. Как правило, время ревакцинации приходится на возраст ребенка между 12 и 24 месяцами.

При клиническом изучении новых пневмококковых конъюгированных вакцин большое значение имеют показатели иммунного ответа на белковый носитель. Отмечено, что использование в качестве белкового носителя дифтерийного или столбнячного анатоксинов, а также нетоксичного дифтерийного мутанта CRM197 вызывает увеличение специфических антитоксических антител, но неспособно заменить плановую иммунизацию против дифтерии или столбняка. Тем не менее, совместное введение новых пневмококковых вакцин с

( Обзор

Review

вакцинами календаря прививок, содержащими дифтерийный и столбнячный анатоксины, может привести к усилению антитоксичного иммунитета. В этой связи особое внимание следует обратить на возможное повышение реактогенности одновременно вводимых вакцин [10]. Специальному изучению должны быть подвергнуты также вопросы безвредности и иммуногенно-сти новых пневмококковых конъюгированных вакцин при их совместном введении с другими вакцинными препаратами. Одновременное введение разных вакцин, содержащих одинаковые белковые конъюгаты, может привести к снижению иммунного ответа на один или несколько антигенов (т.е. к иммунной интерференции). Большое значение при проведении клинических испытаний имеют данные о заболеваемости, вызванной тем или иным серотипом, а также состояние по-пуляционного иммунитета. Кроме того, для выяснения эффекта от вакцинации крайне важно определение уровня заболеваемости пневмококковой этиологии, вызванной невакцинными серотипами, что поможет либо подтвердить положительный эффект от вакцинации, либо получить доказательства, что вакцинация повлекла за собой замену циркулирующих серотипов на новые, не входящие в состав испытуемой пневмококковой вакцины.

Литература:

1. Немировская Т.И. Пневмококковая инфекция и вакцинопрофилактика // Сб. тез. II Всеросс. на-уч.-практич. конф. «Вакцинопрофилактика и им-мунореабилитация в практике врача». М. 2011, 2-3 июня. С. 22-23.

2. Пневмококковая инфекция и ее профилактика // Пособие для практических врачей / Под ред. Харит С.М. Санкт-Петербург. 2009. С. 40-43.

3. European Pharmacopoeia 6,0, V. 6. 01/2008. P. 825827.

4. Henckaerts I., Durant N., De Grave D., Schuerman L., Poolman J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children // Vaccine. 2007. V. 25.13. P. 2518-2527.

5. Jdar L., Butler J., Carlone G., Dagan R., Goldblatt D., Kyhty H., Klugman K., Plikaytis B., Siber G., Kohberger R., Chang I., Cherian T. Serological criteria for evaluation and licensure of new pneumococcal conjugate vaccine formulations for use in infants // Vaccine. 2003. V 21.23. P. 3265-3272.

6. Poolman J.T., Frasch C.E., Kyhty H., Lestrate P., Madhi S.A., Henckaerts I. Evaluation of pneumococcal polysaccharide immunoassays using a 22Fadsorption step with samples from infants vaccinated with conjugate vaccines //Clin. Vaccine Immunol. 2010. V. 17(1) P. 134-142.

7. Wernette C.M., Frasch C.E., Madore D., Carlone G., Goldblatt D., Plikaytis B., Benjamin W., Quataert S.A., Hildreth S., Sikkema D.J., Kyhty H., Jonsdottir I., Nahm M.H. Enzyme-linked immunosorbent assay for quantitation of antibodies to pneumococcal polysaccharides // Clin. Diagn. Lab Immunol. 2003. V. 10.4. P. 514-519.

8. Recommendations for the Production and Control of Pneumococcal Conjugate Vaccines. Technical Report Series No 927. Geneva: WHO, 2005. P. 98.

9. WHO/Health Canada consultation on serological criteria for evaluation and licensing of new pneumococcal vaccines 7-8 July 2008. P. 39. Ottawa, Canada.

10. Recommendations to assure the quality, safety and efficacy of pneumococcal conjugate vaccines. Expert Committee on Biological Standardization. Geneva: WHO, 19 to 23 October 2009. P. 44.