Способ подготовки пробы мочи для определения монометилфталата, моноэтилфталата, монобутилфталата, монобензилфталата, моноэтилгексилфталата методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии
URINE SAMPLE PREPARATION METHOD FOR DETERMINING MONOMETHYLPHTHALATE, MONOETHYLPHTHALATE, MONOBUTYL PHTHALATE, MONOBENZYL PHTHALATE, MONOETHYLHEXYLPHTHALATE BY HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY / MASS SPECTROMETRY

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для подготовки биологических проб - мочи, в анализе моноэфиров орто-фталевой кислоты (монофталатов) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии в санитарно-гигиенических, экологических и научных организациях, осуществляющих деятельность в области профпатологии и экологии человека.
Монофталаты являются первичными метаболитами стойких органических загрязнителей окружающей среды - диэфиров о-фталевой кислоты (фталатов), производимых синтетическим путем. Уровень содержания некоторых монофталатов в моче человека варьирует более чем на 4 порядка [Blount В., Silva М., Caudill S., Needham L., Pirkle J., Sampson E., Lucier G., Jackson R., Brock J. Levels of seven urinary pHthalate metabolites in a human reference population. Environ. Health. Perspect, 2000, no. 108 (10), pp. 979-982.]. Актуальность определения монофталатов в биологических средах растет в связи с увеличением производства фталатов и их широким распространением в объектах окружающей среды, присутствием в пищевых продуктах, питьевой воде, и, как следствие в биологических средах человека. Токсическое действие фталатов проявляется в нарушении функционирования эндокринной системы, влиянии на репродуктивную систему. Фталаты также обладают мутагенным и эмбриотоксическим эффектом, а ди(2-этилгексил)фталат оказывает еще и канцерогенное действие. В организм человека фталаты поступают с продуктами питания, питьевой водой и в меньшей степени ингаляционным путем.
Для контроля содержания монофталатов в моче необходимо совершенствование методического обеспечения на базе современного инструментального оборудования и использование эффективных способов пробоподготовки. Предлагаемым способом возможно извлечение и определение следующих индивидуальных монофталатов: монометилфталата (ММФ), моноэтилфталата (МЭФ), монобутилфталата (МБФ), монобензилфталата МБзФ), моноэтилгексилфталата (МЭГФ). Физико-химические свойства указанных монофталатов приведены в таблице 1.
Из уровня техники известны следующие способы подготовки проб для определения монофталатов в моче.
3
3
3
3
3
3
3
3
4
Из источника информации: Martens F. Determination des metabolites monoester de butylbenzyl-pHthalate (bbp) par gc-ms dans les urines de personnes exposes: analysis of the monoester metabolites of butylbenzyl pHthalate by gc-ms in urine of exposed workers // Acta clinica. - 2002; 57:16-23., (метод 1) известен способ пробоподготовки мочи для определения в ней монофталатов методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ/МС). Согласно известному способу подготовку проб к анализу начинают с подкисления образцов мочи в количестве 20 см до pH 5,0 путем прибавления 50-150 мм 30% раствора уксусной кислоты. Подкисленные образцы подвергают ферментативному гидролизу в присутствии 100 мм β-глюкуронидазы (Helix pomatia, 30 ед./мл) в течение 24 часов при температуре 37°C с целью перевода связанных с глюкуроновой кислотой монофталатов в свободную форму. После гидролиза в 6 см мочи последовательно добавляют 60 мм внутреннего стандарта (моногексилфталата, 67,2 мг/дм), 6 см экстрагента (смесь н-гексана и дихлорметана в соотношении 80:20), 500 мг высаливателя NHCl, 50 мм раствора соляной кислоты (4 моль/дм) и проводят жидкостную экстракцию смесью гексана и дихлорметана в течение 15 минут.
3
3
3
3
3
2
3
Полученный экстракт промывают раствором соляной кислоты (10 ммоль/дм), обезвоживают с помощью сульфата натрия и высушивают над азотом при 60°С. Остаток растворяют в 200 см свежеприготовленного диазометана в диэтиловом эфире, при этом происходит метилирование монофталатов. После завершения реакции метилирования раствор высушивают в токе азота, остаток растворяют в 200 мм метанола, к которому добавлено 2 см боратного буферного раствора (pH 8,8). Смесь дважды экстрагируют 2 см гексана. Экстракт высушивают безводным сульфатом натрия, остаток растворяют в 150 мм ацетонитрила и анализируют методом ГХ/МС с разделением на капиллярной колонке. Значения m/z 91, 149 и 163 используются для селективного и чувствительного определения метилированных монофталатов. При подготовке пробы мочи таким известным способом предел количественного определения монобутилфталата (МБФ) и монобензилфталата (МБзФ) составляет 0,06 мг/дм.
Указанный метод имеет недостаток в том, что использование в качестве внутреннего стандарта моногексилфталата нецелесообразно, так как он может присутствовать в моче как метаболит дигесилфталата, что снижает точность определения.
3
3
13
3
3
3
3
3
4
Также известен способ подготовки пробы мочи твердофазной экстракцией (ТФЭ) в режиме он-лайн на колонке Chromolith Flash RP-18e SPE (4,6 мм × 25 мм, Merck, Germany), с последующим определением монофталатов в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с тандемным масс-спектрометрическим детектором и ионизацией электроспреем (HPLC-ESI-MS/MS) (метод 2) (Method №: 12-OD. NHANES 2003-2004. Laboratory Procedure Manual Analyte: PHthalate Metabolites Matrix: Urine Method: HPLC/ESI-MS/MS). Согласно этому известному способу к 1 см образца мочи добавляют 250 мм ацетата аммония (1 М, pH 6,5), смесь внутренних стандартов - индивидуальных монофталатов, меченых по C, метилумбеллиферил глюкуронид (50 мм, 0,0008 мг/дм) и 4-метилумбеллиферон для контроля реакции деглюкуронизации, 30 мм β-глюкуронидазы (Escherichia coli-K12, 140 ед./мл). Проводят процедуру деглюкуронизации при температуре 37°С в течение 90 минут для перевода связанных с глюкуроновой кислотой монофталатов в свободное состояние. После деконъюгации 0,5 см мочи наносят на колонку с сорбентом Chromolith Flash RP-18e для проведения ТФЭ. Колонку с нанесенной пробой промывают 0,1%-ным раствором уксусной кислоты в воде и 0,1%-ным раствором уксусной кислоты в ацетонитриле со скоростью 1,5 мл/мин. При этом происходит автоматическое переключение потока элюента с колонки ТФЭ на разделительную колонку жидкостного хроматографа (колонка Thermofinnigan Keystone Betasil pHenyl длиной 150 мм и внутренним диаметром 2,1 мм, зернение 3 мкм). Разделенные на хроматографической колонке аналиты поступают в масс-спектрометрический детектор для идентификации и количественного определения. Пределы обнаружения монофталатов этим известным способом находятся в диапазоне 0,000011-0,0001 мг/дм, точность определения не превышает 9%.
Однако, указанный метод имеет ряд недостатков:
- применение индивидуальных дейтерированных внутренних стандартов и реактивов для контроля реакции деглюкуронизации приводят к значительному удорожанию методики и невозможности использовать методику для массового анализа;
- использование дополнительного устройства для совмещения процедуры твердофазной экстракции и хроматографического разделения, что также приводит к удорожанию методики.
3
3
13
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
2
4
3
4
Еще известен способ твердофазной экстракции (автоматизированный процесс) для определения 15 метаболитов фталатов в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ/МС/МС) и ионизацией электроспреем (метод 3) (Silva М., Slakman A., Reidy J., Preau J., Herbert A., Samandar E., Needham L., Calafat A. Analysis of human urine for fifteen pHthalate metabolites using automated solid-pHase extraction // Journal of ChromatograpHy B. 2004. - 805:161-16). Подготовка пробы известным способом включает следующие операции: к 1 см мочи добавляют 1 см буферного раствора ацетата аммония (pH 2), смесь меченых по С внутренних стандартов монофталатов и 5 мм фермента β-глюкуронидазы (Escherichia Coli К-12, 200 ед./мл). Дополнительно в каждый образец добавляют 4-метилумбеллиферил глюкуронид (50 мм, 0,0008 мг/дм) и 4-метилумбеллиферон для проверки полноты реакции деглюкуронизации. Образы выдерживают в течение 90 минут в термостате при температуре 37°С для перевода метаболитов фталатов в свободную форму. После ферментативного расщепления монофталатов, связанных с глюкуроновой кислотой, проводят автоматическую твердофазную экстракцию на картриджах с полимерным сорбентом на основе стирол-дивинилбензол-метакрилата (60 мг/3 мл). Картриджи конденционируют 1 см ацетонитрила и промывают 1 см фосфатного буфера pH 2 (0,14 М NaHPO в 0,85% HPO). Образец мочи разбавляют 1 см фосфатного буфера pH 2 и загружают на картридж со скоростью 1 см/мин. Картридж промывают 2 см 0,1 М муравьиной кислоты и 1 см воды. Картриджи сушат пропусканием воздуха в течение 0,5 мин. Аналиты элюируют 1 см ацетонитрила, затем 1 см этилацетата со скоростью 1 см/мин. Элюат упаривают досуха в испарителе сухим азотом при температуре 55°С. Остаток перерастворяют в 200 мм воды для анализа. Разделение монофталатов проводят на обращено-фазной колонке в градиентном режиме элюирования. Диапазон измеряемых концентраций составляет 0,00023-0,00107 мг/дм, степень твердофазной экстракции - 86-106%.
Недостатками указанных известных методов являются использование в качестве экстрагента токсичного дихлорметана (метод 1), недостаточная чувствительность (метод 1); узкий диапазон измеряемых концентраций (методы 2, 3); низкая степень извлечения отдельных монофталатов в условиях кислой реакции среды (методы 1, 2, 3); сложность подготовки проб (методы 1, 3).
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ подготовки проб для определения 8 индивидуальных монофталатов в моче (Blount В., Milgram K., Silva М., Malek N., Reidy J., Needham L., Brock J. Quantitative Detection of Eight PHthalate Metabolites in Human Urine Using HPLC-APCI-MS/ MS // Anal. Chem. 2000. - 72, 4127-4134). Известный способ включает отбор пробы мочи, проведение реакции деглюкуронизации, осуществление твердофазной экстракции (далее - ТФЭ) последовательно на двух картриджах Oasis HLB, высушивание экстракта, растворение в воде и анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии.
3
2
14
3
3
Согласно известному способу исследуемую пробу мочи в количестве 1 см обрабатывают ацетатом аммония (250 мм 1 М раствора, pH 6,5). В пробу добавляют индивидуальные внутренние стандарты, меченые по атому углерода, С, вносят 5 мм β-глюкуронидазы (Е. Coli, штамм K12, 200 ед./см, оптимальная рекомендуемая pH для действия данного фермента 6,0-6,5, Roche Biomedical, Mannheim, Germany). Образцы инкубируют при температуре 37°С в течение 90 минут с целью гидролиза глюкуронидов (в данном случае монофталатов, связанных с глюкуроновой кислотой) и перевода монофталатов в свободную форму. После ферментативной деконъюгации образцы мочи загружают на картриджи Оазис HLB и проводят твердофазную экстракцию монофталатов в присутствии щелочного и кислотного буферных растворов на разных картриджах.
3
3
3
3
3
3
3
3
4
2
4
Картридж №1 (3 мл/60 мг Oasis HLB) обрабатывают 1 смацетонитрила и 2 см основного буферного раствора (1 см 30% раствора NHOH смешивают с 200 см смеси ацетонитрила и воды, взятых в соотношении 1:1). Деконъюгированный образец мочи разбавляют 1 см основного буферного раствора и наносят на картридж. Элюат собирают в виалу. Пропускают через картридж 1 см буферного раствора со скоростью потока <2 см/мин, собирая элюат в виалу. Объединенные основные буферные элюаты (экстракты) подкисляют добавлением 3 см кислотного (pH 2) буферного раствора (0,14 М раствор NaHPO, содержащий 1% концентрированной фосфорной кислоты).
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
4
Картридж №2 (10 мл/60 мг Oasis HLB) промывают 1 см ацетонитрила, 1 см воды и 2 см кислотного буферного раствора. Подкисленный образец (элюат с 1-го картриджа) наносят на картридж №2, промывают картридж 3 см кислотного буферного раствора (0,14 М раствор NaHPO, содержащий 1% концентрированной фосфорной кислоты), 9 см воды (для удаления солей). Аналиты элюируют 2 см ацетонитрила и 2 см этилацетата. Объединенный элюат (экстракт) высушивают в потоке азота при температуре 55°С. Остаток растворяют в 200 мм воды и анализируют методом ВЭЖХ/МС/МС. Диапазон измеряемых концентраций составляет 0,0006-0,0012 мг/дм, относительное стандартное отклонение 12,5-17,2%, степень экстракции более 90%.
Недостатком этого известного способа является то, что:
- экстракция проводится последовательно на двух картриджах Oasis, что значительно увеличивает время подготовки пробы;
3
- после разбавления деконъюгированных образцов мочи основным буферным раствором реакция среды образцов повышается до pH 8, в результате чего твердофазная экстракция отдельных монофталатов, таких как монометилфталат, моноэтилфталат и моноэтилгексилфталат, не обеспечивает их эффективного извлечения. В проведенных нами исследованиях по эффективности извлечения монофталатов из стандартных растворов методом ТФЭ в зависимости от показателя реакции среды раствора (pH) установлено, что степень экстракции указанных выше монофталатов из подщелоченной пробы (pH 8), а именно такая реакция среды устанавливается в известном способе после разбавления деконъюгированных образцов мочи 1 см основного буферного раствора, составляет 8,77%, 19,3% и 65% соответственно. Остатки монофталатов не извлекаются с первого картриджа, происходит их потеря, что снижает точность и чувствительность определения известным способом;
- экстракция пробы мочи с кислой реакцией среды (pH 5), которая достигается в результате обработки объединенных элюатов, полученных в результате ТФЭ с первого картриджа, фосфатным буферным раствором, имеет низкую степень извлечения монометилфталата, моноэтилфталата, монобутилфталата, монобензилфталата и моноэтилгексилфталата с картриджа Oasis HLB с использованием ацетонитрила в качестве экстрагента (в рабочих условиях элюирующая сила этилацетата меньше, чем ацетонитрила). Исследование эффективности извлечения монофталатов ацетонитрилом из подкисленных (pH 3-5) стандартных растворов методом ТФЭ на картриджах Oasis HLB показало, что степень экстракции перечисленных монофталатов составляет всего 12,7-28,5%, т.е. в результате снижается точность и чувствительность определения известным способом;
-4
-1
3
- известный метод не позволяет определять монофталаты в моче на уровне их реального содержания в диапазоне концентраций от 10 до 10 мг/дм и выше;
- использование индивидуальных дейтерированных внутренних стандартов существенно увеличивает стоимость анализа.
-4
-1
3
Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в повышении степени экстракции монометилфталата до 100%, моноэтилфталата до 94%, монобутил фталата - 96%, монобензилфталата - 92%, моноэтилгексилилфталата - 100% с погрешностью извлечения ± 10% и в расширении диапазона измеряемых концентраций монофталатов от 10 до 10 мг/дм, реально присутствующих в моче, при одновременном упрощении процедуры пробоподготовки и снижении себестоимости анализа.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Указанный технический результат достигается предлагаемым Способом подготовки пробы мочи для определения монометилфталата, моноэтилфталата, монобутилфталата, монобензилфталата, моноэтилгексилфталата методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии, включающим отбор пробы мочи, центрифугирование отобранной пробы, проведение реакции деглюкуронизации, осуществление твердофазной экстракции на картридже Oasis HLB с получением подготовленной пробы, которую в дальнейшем помещают в пробоотборное устройство хромато-масс-спектрометра для определения в пробе мочи индивидуальных монофталатов: монометилфталата, моноэтилфталата, монобутилфталата, монобензилфталата, моноэтилгексилфталата, отличающийся тем, что отобранную пробу центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 2000 об/мин., в пробу вносят концентрированную уксусную кислоту до достижения pH смеси 4,8; далее к 5 см подкисленного образца добавляют 0,2 см водного раствора фермента β-глюкуронидазы, выделенного из слюны виноградной улитки Helix Pomatia, с активностью более 100000 ед./мл, далее полученную смесь инкубируют при температуре +37°С в течение 24 часов, охлаждают и доводят до pH 7, добавляя 40%-ный водный раствор гидроксида натрия, смесь центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 2000 об/мин., отбирают верхний слой в количестве 5 см и, используя этот верхний слой, проводят твердофазную экстракцию на картридже Oasis HLB 5сс в два этапа, на первом этапе пропускают через него последовательно 1 см метанола и 1 см дистиллированной воды, полученные сливы удаляют, наносят на картридж отобранный после центрифугирования верхний слой жидкости в количестве 5 см, промывают картридж 1 см 5%-ным раствором метанола и пропускают через картридж 0,5 см ацетонитрила, собирая экстракт, на втором этапе этот же картридж вначале последовательно промывают 1 см 0,4%-ным раствором натрия гидроокиси, 1 см 5%-ного раствора метанола и полученный слив удаляют, затем пропускают через указанный картридж 0,5 см ацетонитрила, присоединяя полученный при этом экстракт к экстракту, полученному на первом этапе, объединенный экстракт фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм, получая подготовленную для исследования пробу мочи, которую затем вводят в пробоотборное устройство жидкостного хроматографа, оснащенного масс-спектрометрическим детектором.
Поставленный технический результат достигается за счет следующего. Предлагаемый способ отличается от прототипа условиями проведения реакции деглюкуронизации и процедурой твердофазной экстракции. Благодаря тому, что перед проведением реакции деглюкуронизации пробу мочи центрифугируют со скоростью 2000 об./мин в течение 10 минут, удаляется осадок, мешающий более полному протеканию реакции ферментативного гидролиза.
Благодаря тому, что перед реакцией деглюкуронизации в образец пробы мочи добавляется концентрированная уксусная кислота, достигается оптимальная реакция среды в каждом анализируемом образце мочи (pH 4,8±0,2).
Благодаря тому, что ферментативный гидролиз (реакцию деглюкуронизации) мочи проводят с использованием фермента β-глюкуронидазы (Helix pomatia, тип НР-2) с активностью более 100000 ед./мл с предварительным подкислением образца до pH 4,8±0,2, оптимальной для активности данного фермента, достигается практически 100%-ный переход монофталатов в свободную форму в течение 24 часов.
Также следует отметить, что фермент β-глюкуронидаза выделяют из разных организмов, например, в предлагаемом с пособе используется реактив из слюны виноградной улитки (Helix Pomatia). Это готовый реактив, используется специально для мягкого гидролиза, чтобы не разрушить извлекаемое соединение. Можно еще выделять этот фермент из кишечной палочки (Е. coli), но он действует слабее, чем полученный от улитки. Поэтому, когда описывают фермент, указывают его происхождение. Пример использования в тексте: After Е. coli β-glucuronidase (5 μL, 200 units/ mL) was added, the samples were sealed with Teflon-lined screw caps and gently mixed.
Благодаря тому, что после завершения реакции_деглюкуронизации в пробе мочи устанавливают нейтральную реакцию среды pH 7, путем добавления к пробе 40%-ного раствора гидроксида натрия, и проводят ТФЭ в два этапа на картридже Oasis HLB 5сс, то уже на первом этапе степень извлечения ММФ составляет 93,4%, МЭФ 81,6%, МЭГФ 70%, МБФ 46%, МБзФ 27,5%.
3
3
А при проведении повторной экстракции монофталатов с этого же картриджа Oasis HLB 5сс в условиях уже слабощелочной среды путем его промывания 1 см 0,4%-ного раствора гидроксида натрия и, тем самым подщелачивая нанесенную на картридж пробу мочи после первого этапа до pH 8, и пропускания через картридж 0,5 см ацетонитрила, извлекаются остаточные количества монофталатов в количестве 6,6% ММФ, 12,4% МЭФ, 50% МБФ, 30,0% МЭГФ и 64,5% МБзФ.
Таким образом, при проведении ТФЭ предлагаемым способом последовательно в условиях нейтральной среды (pH 7) и слабощелочной среды (pH 8) общая степень экстракции ММФ из образцов мочи составляет 100%, МЭФ - 94%, МЭГФ - 100%, МБФ - 96%, МБзФ - 92% с погрешностью извлечения ± 10%, что значительно выше, чем в прототипе.
3
И при дальнейшем исследовании на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором такой подготовленной предлагаемым способом пробы обеспечивается определение индивидуальных моноэфиров в диапазоне 0,00022-1,16 мг/дм с погрешностью определения, не превышающей 25% для ММФ, 28% для МЭФ, 26% для МБФ, 27% для МБзФ и 27% для МЭГФ.
Таким образом, заявляемый технический результат обеспечивается за счет совокупности заявленных операций, их последовательности и режимов в предлагаемом способе, а также за счет совокупности реагентов, используемых при пробоподготовке.
Предлагаемый способ был опробован в лабораторных условиях. Для его реализации были использованы следующие реактивы, материалы и оборудование:
- аналитические стандарты монометилфталата (ММФ), моноэтилфталата (МЭФ), монобутилфталата (МБФ), монобензилфталата (МБзФ), моно-2-этилгексилфталата (МЭГФ) с содержанием основного компонента не менее 99,0% (Sigma-Aldrich, США);
- вода дистиллированная для хроматографии ЖХ-МС (Chromasolv, Германия);
- ацетонитрил для хроматографии ЖХ-МС (Sharlau, Испания);
- метанол для хроматографии ЖХ-МС (Sharlau, Испания);
- натрия гидроокись, химически чистый, ГОСТ 4328-77;
- кислота уксусная ледяная, химически чистая, ГОСТ 61-75;
- водный раствор β-глюкуронидазы (Helix pomatia), тип НР-2, ≥ 100000 ед/мл (Sigma-Aldrich, США);
- картриджи Oasis HLB 5сс для твердофазной экстракции (Waters, США);
3
3
- полипропиленовые пробирки вместимостью 15 см и 50 см;
- фильтры мембранные с диаметром пор 0,2 мкм (Agilent, США);
- индикаторная бумага (pH 5-9, шаг 0,5);
3
- виалы с завинчивающейся крышкой вместимостью 1,5 см;
- калибровочная смесь для настройки масс-спектрометра (Agilent, США);
- жидкостный хроматограф с трехквадрупольным масс-спектрометрическим детектором 6460 и источником ионизации электростатическим распылением, бинарным насосом (Agilent Technologies, США);
- весы лабораторные равноплечие второго класса точности; наибольший предел взвешивания 200 г, погрешность взвешивания по шкале мг ± 0,15 мг, ГОСТ Р 53228-2008;
3
3
3
3
- микродозаторы с переменным объемом 5-50 мм с погрешностью ≤ 3%, 20-200 мм с погрешностью ≤ 2%, 100-1000 мм с погрешностью ≤ 1%, 500-5000 мм с погрешностью ≤ 1%;
окр
- термостат электрический суховоздушный с диапазоном рабочих температур от Т. до 60±0,4°С;
- устройство для твердофазной экстракции с вакуумным насосом и штативом для картриджей;
- pH-метр;
- центрифуга.
При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия:
- температура воздуха (20±5)°С;
- атмосферное давление 630-800 мм рт.ст.;
- влажность воздуха от 30 до 80%.
Выполнение измерений на масс-спектрометре проводят в лабораторных помещениях, оборудованных согласно требованиям руководства по эксплуатации прибора.
Для осуществления предлагаемого способа проводят следующие операции в нижеуказанной последовательности:
3
3
3
Образец мочи в количестве 20 см помещают в полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см, центрифугируют течение 10 мин со скоростью 2000 об/мин., отбирают надосадочный слой, вносят по каплям концентрированную уксусную кислоту для доведения реакции среды мочи до pH 4,8 (~50 мм), оптимальной для проведения реакции деглюкуронизации с применением фермента β-глюкуронидазы (Helix Pomatia). Измерение pH мочи проводят с использованием pH-метра с точностью pH ±0,2, так как отклонение pH от оптимального значения (pH 4,5-5,0) замедляет действие фермента.
3
3
3
3
3
Отбирают 5 см подкисленного образца в полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см, добавляют 0,2 см водного раствора фермента β-глюкуронидазы (Helix Pomatia, тип НР-2, ≥ 100000 ед/мл, производство Sigma-Aldrich). Смесь перемешивают и нагревают в термостате при температуре +37°С в течение 24 часов. Далее пробу охлаждают и доводят до pH 7, добавляя по каплям 40%-ный водный раствор гидроксида натрия (~30 мм), контролируя показатель pH индикаторной бумагой (pH 5-9, шаг 0,5). Затем смесь центрифугируют 10 мин со скоростью 2 тыс.об./мин. Отбирают верхний слой мочи в количестве 5 см и проводят твердофазную экстракцию на картридже Oasis HLB 5сс в два этапа.
3
3
3
3
3
На первом этапе пропускают через него последовательно 1 см метанола и 1 см дистиллированной воды, слив удаляют. Наносят на картридж отобранный после центрифугирования верхний слой мочи в количестве 5 см, промывают картридж 1 см 5%-ного раствора метанола, слив удаляют. Пропускают через картридж 0,5 см ацетонитрила, собирая экстракт в виалу для анализа.
3
Затем проводят второй этап твердофазной экстракции с использованием этого же картриджа в условиях слабощелочной среды (pH 8) путем промывания картриджа 1 см 0,4%-ным раствором гидроксида натрия, слив удаляют.
3
После этого пропускают через картридж 0,5 см ацетонитрила, элюируя остаточные количества монофталатов в виалу для анализа.
Экстракты после первого и второго этапа ТФЭ объединяют и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Подготовленную таким образом пробу вводят в жидкостный хроматограф с масс-спектрометрическим детектором.
3
Для количественного определения монофталатов применяют метод абсолютной градуировки. Строят зависимости сигнала детектора от концентрации индивидуальных монофталатов в градуировочных растворах, приготовленных на основе ацетонитрила в диапазоне концентраций 0,00022-1,16 мг/дм. Для каждого монофталата градуировку проводят по основному дочернему иону, имеющему максимальный отклик сигнала детектора (m/z) (таблица 2). При этом для построения градуировочных графиков используют аналитические стандарты ММФ, МЭФ, МБФ, МБзФ, МЭГФ.
Селективное количественное определение пяти монофталатов проводится при обнаружении в пробе характерных пар родительского и подтверждающего дочернего ионов, образующихся в ходе масс-спектрометрического анализа. В таблице 2 приведены родительские и дочерние ионы монофталатов, полученные в оптимальном режиме работы масс-спектрометрического детектора с тройным квадруполем LC/MS 6460 Agilent Technologies для качественного и количественного определения монофталатов в моче.
18
Хроматографическое разделение проводится на колонке с обращенной фазой С Eclipse XDB длиной 150 мм и внутренним диаметром 4,6 мм зернением 5 мкм при элюировании смесью ацетонитрил/вода в соотношении 70:30 (объемных %) со скоростью 0,6 мл/мин в оптимальных условиях работы жидкостного хроматографа (таблица 3).
Параметры детектора, отвечающие за поступление анализируемых компонентов из жидкостного хроматографа в масс-спектрометрический детектор, представлены в таблице 4.
3
Массовые концентрации монофталатов в пробе мочи (мг/дм) рассчитывают по формуле:
3
где X - массовая концентрация монофталата в моче, мг/дм;
3
С - массовая концентрация монофталата в анализируемом экстракте, рассчитанная по градуировочной характеристике, мг/дм;
0
3
С - массовая концентрация монофталата в холостой пробе (ацетонитрил), рассчитанная по градуировочной характеристике, мг/дм;
1
1
3
V - объем экстракта, см (V=1);
0
0
3
V - объем мочи, взятый для анализа, см (V=5).
За результат измерения  принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений.
При проведении исследований проверяли эффективность извлечения монофталатов из стандартного водного раствора способом твердофазной экстракции (ТФЭ) на картриджах Oasis HLB в зависимости от pH среды. Данные приведены в таблице 5.
Данные, приведенные в таблице 5, показывают, что наилучшие показатели по экстракции получены при нейтральном рН среды, равном 7. Что и было использовано в качестве одного из режимов в предлагаемом способе.
3
3
Дополнительно на повышение степени экстракции влияет увеличение количественного перехода монофталатов в свободную форму при проведении реакции деглюкуронизации в оптимальных условиях, а именно pH мочи для поддержания максимальной активности используемой β-глюкуронидазы составляет 4,8, оптимальном количестве анализируемого образца мочи 5 см, которому соответствует оптимальное количество β-глюкуронидазы (Helix Pomatia, ≥ 100000 ед/мл) 0,2 см, температура термостатирования 37°С, время термостатирования 24 часа. Благодаря этим режимам обеспечивается переход монофталатов в свободную форму на 100%. Данные исследования по установлению зависимости полноты протекания реакции ферментативного гидролиза (реакции деглюкуронизации) от времени термостатирования (на примере монометилфталата) представлены на Рис. 1.
В ходе лабораторных испытаний предлагаемого способа подготовки проб мочи для анализа монофталатов методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии были установлены следующие характеристики методики измерения: диапазоны измерений пяти монофталатов в моче, значения показателей точности, правильности, повторяемости и внутрилабораторной прецизионности. Полученные данные приведены в таблице 6 «Диапазон измерений, значения показателей точности, повторяемости, воспроизводимости» и таблице 7 «Значения пределов повторяемости, критического диапазона, внутрилабораторной прецизионности при доверительной вероятности Р=0,95».
3
Приведенные в таблицах 6 и 7 данные показывают, что предлагаемый способ подготовки пробы мочи позволяет с высокой точностью определять в моче пяти монофталатов в широком диапазоне концентраций от 0,00022 до 1,16 мг/дм. Наряду с низкими концентрациями возможно извлечение из проб и анализ монофталатов с высокими концентрациями в моче, обусловленными загрязнением продуктов питания и питьевой воды фталатами.
Для доказательства того, что предлагаемым способом можно измерять содержание монофталатов в моче в широких диапазонах, приведены данные в таблице 8.
3
3
В таблице 8 приведены результаты измерения монофталатов в рабочих пробах мочи  с использованием предлагаемого способа пробоподготовки. По результатам измерений концентрации монофталатов в пробах мочи (n=10), можно судить о присутствии анализируемых соединений в реальных образцах мочи в широком диапазоне концентраций от 0,00034 мг/дм до 0,2729 мг/дм (значения определены вблизи нижней границы диапазона, на уровне середины диапазона, а также единичные значения получены вблизи верхней границы). Уровень содержания отдельных аналитов в проанализированных образцах мочи варьирует более чем на 3 порядка (таблица 8).
3
Для определения степени экстракции и погрешности извлечения монофталатов предлагаемым способом использовали процедуру «задано-получено» (таблица 8). Для этого проводили повторный анализ рабочих проб мочи с добавлением в них монофталатов в концентрациях 0,0005-0,025 мг/дм (примерно 50-150% от полученных значений). Расчет степени экстракции проводили по формуле:
где x - степень экстракции, %;
А - количество монофталата в пробе после экстракции, мг;
В - количество монофталата в пробе до экстракции, мг.
Данные, приведенные в таблице 8, показывают, что средняя степень экстракции монометилфталата из мочи составляет 100%, моноэтилфталата 94%, монобутилфталата 96%, монобензилфталата 92%, моноэтилгексилилфталата 100% с погрешностью извлечения ММФ не более ±6%, МЭФ ±9%, МБФ ±8%, МБзФ ±10%, МЭГФ ±10% соответственно (таблица 8).
Таким образом, предлагаемый способ подготовки проб мочи позволяет обеспечить следующие преимущества при определении индивидуальных монофталатов по сравнению с прототипом:
- позволяет достигнуть 100%-ное извлечение монометилфталта и моноэтилгексилфталата из образцов мочи для последующего анализа методом жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии;
- повышает степень экстракции моноэтилфталата, монобутилфталата и монобензилфталата из образцов мочи до 92-96%;
3
3
- расширяет диапазон измерения монофталатов в моче, что позволяет установить реальные концентрации анализируемых соединений на уровне от 0,00022 мг/дм до 1,16 мг/дм;
- наряду с упрощением процедуры подготовки проб к анализу одновременно снижается себестоимость анализа.
Заявляемый способ пробоподготовки прост и может быть рекомендован для серийных анализов.