СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА НА ФОНЕ ЭРАДИКАЦИОННОЙ ТЕРАПИИ HELICOBACTER PYLORI И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
METHOD OF DIAGNOSTIC OF THE STATE OF INTESTINES MICROBIOTIC ON THE BACKGROUND OF ERADICATION THERAPY Helicobacter pylori AND ITS APPLICATION

Предлагаемое изобретение относится к области биохимии, может быть использовано в медицине и ветеринарии для оценки прогнозирования риска возникновения кишечных расстройств при эрадикации - проведении антибактериальной терапии преимущественно против Helicobacter pylori, контроля за ходом и коррекции процесса лечения, направленного на восстановление кишечной микрофлоры.
Доказано, что микробиологический состав содержимого кишечника прямо или опосредованно влияет на общее состояние человека. Нарушение состава и функций кишечной микрофлоры может привести к ряду патологических состояний, таких как воспалительные заболевания, воспалительные поражения и язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, синдром мальабсорбции, атеросклероз, сахарный диабет, ревматоидный артрит, злокачественные новообразования желудочно-кишечного тракта, дерматиты, бронхиальная астма и другие аллергические заболевания [1, 2, 3, 4].
Такие факторы, как состав и режим питания, стресс оказывают влияние на содержание различных групп микроорганизмов в составе кишечной микрофлоры. Особо негативное влияние на микроорганизмы оказывают токсичные для бактерий вещества, кардинально изменяющие состав микробного сообщества. К подобным веществам относят антибиотики. Риски нарушения состава кишечной микрофлоры значительно увеличиваются у лиц, подвергающихся интенсивным курсам антибиотикотерапии. Так, в соответствии с Маастрихтским соглашением и Рекомендациями Российской гастроэнтерологической ассоциации, пациентам с ассоциированными с бактерией Helicobacter pylori язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, атрофическим гастритом рекомендована эрадикационная терапия антибиотиками, направленная на уничтожение данной бактерии (курс эрадикации). Курс эрадикации включает в себя ежедневный прием амоксициллина 1000 мг 2 раза в день, кларитромицина 500 мг 2 раза в день, висмута субсалицилата 240 мг 2 раза в день, ингибитора протонной помпы в стандартной дозе 2 раза в день; курс терапии - 10-14 дней. После проведения курса эрадикации у больных весьма часто возникает нарушение видового и, как следствие, функционального состава микробиоты (микрофлоры, микробиоценоза) кишечника, что приводит к нарушению функционирования кишечника, проявляющемуся в виде метеоризма, болей в животе, нарушении стула.
Известен [5] способ контроля эффективности коррекции нарушений микробиоценоза кишечника путем количественной оценки культуральными методами содержания различных групп бактерий до и после проведения курса лечения назначенным методом и средством, например - лечения антибиотиками. По содержанию микроорганизмов рассчитывают характеризующий эффективность применения назначенного курса лечения индекс дисбиоза (дисбактериоза).
Недостатком [5] является использование для культивирования микроорганизмов питательных сред, при котором невозможно учесть вносящих существенный вклад в метаболические свойства кишечной микрофлоры виды бактерий, некультивируемых на этих питательных средах. Из-за недостатков, при применении известного способа [5] результаты об уровне дисбиоза являются малодостоверными при значительных изменениях некультивируемых видов микроорганизмов. Недостаток ограничивает область применения аналога [5].
Наиболее близким к предлагаемому изобретению, прототипом, является способ оценки воздействия экзогенных факторов на микрофлору кишечника при его дисбиотических нарушениях [6]. По способу [6] оценивают скорость изменения количества микроорганизмов в каловых массах по результатам первой точки анализа (до воздействия экзогенного фактора) и последующих точек (в течение и/или после воздействия экзогенного фактора), сравнение скорости изменения (количества микроорганизмов в каловых массах) с эталонной (контрольной) группой. По различиям в скоростях изменения количества микроорганизмов в контрольной и опытной группах судят о значимости экзогенного фактора.
Недостатком прототипа [6] является необходимость наличия контрольной группы пациентов (при оценке воздействия экзогенного фактора на микробиоту человека) с тем же заболеванием или расстройством, но без воздействия экзогенного фактора. В случае лечения больных с Helicobacter pylori-инфекцией это означает неназначение антибиотикотерапии больным, из общей массы выделенным в состав контрольной группы, что недопустимо с этической точки зрения. Кроме того, основанный на культуральных методах микробиологического анализа прототип позволяет выявить только ограниченный спектр функциональных групп микроорганизмов в составе микрофлоры кишечника, например - из-за невозможности культивирования всех видов микроорганизмов пробы на одной питательной среде; этот недостаток аналогичен недостатку аналога [5].
Недостатки делают прототип [6] неприменимым для диагностики нарушений, вызванных патогенными микроорганизмами, поскольку изменение численности отдельных групп микроорганизмов может не оказывать значимого влияния на функционирование сообщества, тогда как появление небольшого количества патогенных микроорганизмов может быть критичным для здоровья пациента. Недостатки существенно ограничивают область применения прототипа [6].
Целью предлагаемого изобретения является повышение достоверности и точности диагностики нарушений видового состава микрофлоры кишечника человека при длительном приеме направленных на эрадикацию Helicobacter pylori лекарственных средств, повышение результативности лечебного процесса и качества жизни подвергающегося лечению пациента.
Цели достигают путем осуществления диагностики по заявляемому способу.
По заявляемому способу состояние микробиоты кишечника диагностируют путем установления нуклеотидных последовательностей отдельных микроорганизмов микробиоты кишечника пациента. Затем рассчитывают состав, количество видов и индекс разнообразия Шеннона H микробного сообщества до, в процессе осуществления (ходе) и после завершения эрадикации. Исходя из количества и состава видов микроорганизмов, индекса разнообразия H, делают выводы о состоянии микробного сообщества, диагностируют состояние микробиоты пациента, определяют и осуществляют курс корректирующего микрофлору кишечника лечения пациента, например - при антибиотикотерапии. При увеличении индекса H и разнообразия видов в микробном сообществе диагностируют уменьшение вероятности развития дисбиоза (дисбактериоза) и отсутствие потребности применения корректирующей микрофлору кишечника терапии. При увеличении индекса H и неизменности разнообразия видов в микробном сообществе диагностируют необходимость применения корректирующей микрофлору терапии, пациенту назначают стимулирующие нормальную микрофлору кишечника пребиотики. При неизменности индекса H и увеличении разнообразия видов в микробном сообществе диагностируют необходимость применения корректирующей микрофлору терапии, пациенту назначают стимулирующие нормальную микрофлору кишечника пребиотики. При увеличении индекса H и уменьшении разнообразия видов в микробном сообществе диагностируют необходимость применения корректирующей микрофлору терапии, пациенту назначают стимулирующие нормальную микрофлору кишечника пребиотики. При неизменности индекса H и уменьшении разнообразия видов в микробном сообществе диагностируют необходимость применения корректирующей микрофлору терапии и пациенту назначают стимулирующие нормальную микрофлору кишечника пребиотики. При уменьшении индекса H и увеличении разнообразия видов в микробном сообществе диагностируют необходимость применения корректирующей микрофлору терапии и пациенту назначают стимулирующие нормальную микрофлору кишечника пребиотики. При уменьшении индекса H и неизменности разнообразия видов в микробном сообществе диагностируют необходимость применения корректирующей микрофлоры терапии и пациенту назначают стимулирующие нормальную микрофлору кишечника пребиотики. При неизменности индекса H и разнообразия видов в микробном сообществе диагностируют стабильное, не требующее дополнительной терапии состояние сообщества микробиоты кишечника и отсутствие потребности применения корректирующей микрофлору кишечника терапии. При уменьшении индекса H и разнообразия видов в микробном сообществе диагностируют необходимость применения корректирующей микрофлоры терапии и пациенту назначают стимулирующие нормальную микрофлору кишечника пребиотики и увеличивающие микробное разнообразие кишечника пробиотики.
Способ осуществляют, например, следующим образом.
У больных до начала курса эрадикации, в процессе эрадикации и сразу после его окончания отбирают по 1 г проб (образцов) кала. Из 150 мг образцов кала любым известным методом, например фенольной экстракцией [7], выделяют дезоксирибонуклеиновую кислоту (далее по тексту - ДНК) с концентрацией, степенью чистоты и целостности, пригодной для полимеразной цепной реакции (далее по тексту - ПЦР) амплификации ДНК (увеличения количества копий ДНК) и установления нуклеотидной последовательности (секвенирования) на секвенаторах. Устанавливают нуклеотидную последовательность всей ДНК - например, методом дробовика на приборе SOLiD 5500, AppliedBiosystems [8], либо консервативных генов сообщества, позволяющих однозначно идентифицировать, например - секвенированием гена 16S рРНК на приборе MiSeq, Illumina [9], видовую принадлежность каждого микроорганизма. Принадлежность полученных нуклеотидных последовательностей к конкретным видам микроорганизмов устанавливают по базам данных, находящимся в открытом доступе (например, GenBank) с помощью программного обеспечения (например, с помощью программы QIIME [10]), позволяющего оценить процентное соотношение видов в сообществе. В результате получают высокодостоверную (исчерпывающую) информацию о составе сообщества, включая патогенные, некультивируемые и редкие (менее 0,1%) виды микроорганизмов.
Вычисляют индекс видового разнообразия (индекс Шеннона H) [11] для каждой пробы (кала) по формуле
i
где p - доля вида микроорганизма в сообществе (доля от единого целого - единицы), n - количество видов микроорганизмов (изменяется от 1 до n). Исходя из формулы, на величину индекса Шеннона H влияют как количество видов микроорганизмов в сообществе, так и равномерность их распределения. Наибольшее значение индекса (при одинаковом количестве видов) H получается при одинаковой численности микроорганизмов всех видов в сообществе. При доминировании (преобладании) отдельных видов значение индекса уменьшается. Сравнивают количество видов микроорганизмов и индексы H в образцах пробы (кала) одного и того же пациента, например - до и после курса эрадикации. Выводы делают, исходя из случаев, описанных в Таблице.
В Случае 1 увеличивается как разнообразие (количество) видов в сообществе, так и индекс H, что является благоприятной характеристикой, поскольку равномерное увеличение численности видов и общего разнообразия делают сообщество более стабильным при воздействии внешних неблагоприятных факторов (например, при отравлении токсичными для бактерий веществами); при этом вероятность развития дисбиоза (дисбактериоза) уменьшается. Диагноз (вывод): в Случае 1 не требуется корректирующей микрофлору кишечника терапии.
В Случае 3 неизменность индекса Шеннона, при увеличении количества видов, обеспечивается возникшим преобладанием отдельных видов.
При увеличении численности представителей нормальной микрофлоры (например, видов бактерий, принадлежащих к родам Lactobacillus, Bifidobacterium) и/или уменьшении численности бактерий, негативно влияющих на работу кишечника, например Clostridium, Bacteroides). Диагноз (вывод): корректирующей микрофлору терапии не требуется.
При увеличении количества бактерий, негативно влияющих на работу кишечника, например - Clostridium, Bacteroides, и/или уменьшении численности представителей нормальной микрофлоры, например Lactobacillus, Bifidobacterium. Диагноз (вывод): следует назначить корректирующую терапию, например пребиотики для стимулирования нормальной микрофлоры кишечника.
В Случаях 4 и 2 индекс Шеннона Н увеличивается за счет снижения численности ранее доминирующих (до эрадикации) представителей сообщества и/или возникшего преобладания ранее минорных представителей сообщества, обеспечивающего более равномерное распределение численностей отдельных видов микроорганизмов, на фоне общего снижения количества видов (Случай 4) или при неизменном количестве видов (Случай 2). Уменьшение численности бактерий, негативно влияющих на работу кишечника, например Clostridium, Bacteroides, и/или увеличение численности представителей нормальной микрофлоры, например Lactobacillus, Bifidobacterium, является положительной динамикой изменения сообщества как в Случае 4, так и в Случае 2.
Диагноз (вывод):
- при уменьшении общего количества видов микроорганизмов необходима корректирующая микрофлору терапия, например назначение пробиотиков в виде живых клеток бактерий нормальной микрофлоры, для повышения общего разнообразия видов;
- при уменьшении количества представителей нормальной микрофлоры необходима корректирующая микрофлору терапия, например пребиотики для стимулирования нормальной микрофлоры кишечника.
В Случае 5 неизменность индекса Шеннона при уменьшении количества видов обеспечивается уменьшением численности доминирующих (до эрадикации) представителей сообщества.
Диагноз (вывод):
- при уменьшении общего количества видов микроорганизмов необходима корректирующая микрофлору терапия, например назначение пробиотиков в виде живых клеток бактерий нормальной микрофлоры, для повышения общего разнообразия видов;
- при уменьшении количества представителей нормальной микрофлоры необходима корректирующая микрофлору терапия, например пребиотики для стимулирования нормальной микрофлоры кишечника.
В Случаях 6 и 7 уменьшение индекса Шеннона H объясняется возникшим преобладанием отдельных видов микроорганизмов (минорных в точке анализа до эрадикации) и/или уменьшением численности доминирующих (до эрадикации) представителей сообщества на фоне увеличения количества видов (Случай 6) и при неизменном количестве видов (Случай 7). При увеличении численности представителей нормальной микрофлоры, например видов бактерий, принадлежащих к родам Lactobacillus, Bifidobacterium, и/или уменьшении численности бактерий, негативно влияющих на работу кишечника, например Clostridium, Bacteroides. Диагноз (вывод): корректирующей микрофлору терапии не требуется.
При увеличении количества негативно влияющих на работу кишечника бактерий, например Clostridium, Bacteroides, и/или уменьшении численности представителей нормальной микрофлоры, например Lactobacillus, Bifidobacterium. Диагноз (вывод): следует назначить корректирующую терапию, например пребиотики для стимулирования нормальной микрофлоры кишечника.
В Случае 8 не меняется индекс Шеннона и количество видов, что свидетельствует о стабильности сообщества при проведении антибиотикотерапии даже при незначительных изменениях видового состава. Диагноз (вывод): необходимо дальнейшее наблюдение состояния микрофлоры с учетом видового состава.
Случай 9 характеризует наименее благоприятные для сообщества изменения. Уменьшающиеся количество видов и индекс Шеннона H свидетельствуют о снижении общего разнообразия и, как следствие, снижении устойчивости сообщества с возможным преобладанием отдельных видов. Возрастает риск возникновения нарушений кишечного пищеварения. Диагноз (вывод): необходима корректирующая микрофлору терапия, например включающая пребиотики для стимулирования нормальной микрофлоры и пробиотики для увеличения микробного разнообразия.
Таким образом, степень нарушения состава микрофлоры кишечника после эрадикационной терапии определяют по изменению индекса видового разнообразия микроорганизмов - индекса Шеннона H - до и после воздействия антибиотиков, отражающего количество и равномерность представленности видов в сообществе на основании анализа нуклеотидных последовательностей.
ПРИМЕР 1. Исследование проводилось на 34 пациентах, страдающих язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, в стадии обострения и/или ремиссии, гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью, хроническим гастритом, которым была назначена эрадикационная терапия. В соответствии с IV Маастрихтским консенсусом и Рекомендациями Российской гастроэнтерологической ассоциации пациенты дважды в день, в течение 14 дней принимали амоксициллин, кларитромицин, висмута субсалицилат, эзомепразол в дозах 1000 мг, 500 мг, 240 мг, 20 мг соответственно.
Отбор каловых масс и анализ микробного сообщества проводили за сутки до начала эрадикационной терапии и через сутки после ее окончания.
По количеству видов и индексу Шеннона H, в соответствии с Таблицей, пациенты распределились следующим образом: Случай 1 - 6 человек, Случай 2 - 4 человека, Случай 3 - 0 человек, Случай 4 - 5 человек, Случай 5 - 3 человека, Случай 6 - 0 человек, Случай 7 - 2 человека, Случай 8 - 0 человек, Случай 9 - 14 человек. Для профилактики нарушения микрофлоры параллельно с приемом антибиотиков назначали содержащий лактулозу пребиотик Дюфалак, после курса антибактериальной терапии - содержащий бактерии Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium пробиотик Бифиформ.
В результате у всех пациентов (34 чел.) удалось избежать продолжительных нарушений кишечного пищеварения, проявляющихся в виде метеоризма, болей в животе, нарушении стула, типичных последствий антибиотикотерапии. Отсутствие продолжительных нарушений кишечного пищеварения - фактор, способствующий высокому качеству жизни пациентов.
ПРИМЕР 2. Пациент К., пол мужской. Диагностирован хронический гастродуоденит. При цитологическом исследовании обнаружена бактерия Helicobacter pylori. В течение 14 дней пациент проходил стандартный курс эрадикационной терапии: амоксициллин 1000 мг дважды в день, кларитромицин 500 мг дважды в день, висмута субсалицилат 240 мг дважды в день, эзомепразол 20 мг дважды в день. Образцы кала были отобраны за сутки до начала эрадикиционной терапии и через сутки после ее окончания. Нуклеотидная последовательность всей выделенной ДНК была установлена на секвенаторе второго поколения SOLiD 5500 (AppliedBiosystems). До эрадикации в образце кала идентифицировано 126 видов микроорганизмов, индекс Шеннона H составлял 3,86, после эрадикации количество видов снизилось до 110, индекс H снизился до 2,85. Увеличение неравномерности распределения видов в сообществе и соответственно уменьшение индекса H произошло преимущественно за счет увеличения количества бактерий родов Prevotella с 12,5% до 35,2%, Bacteroides - c 20,2% до 39,1% и уменьшения количества бактерий родов Coprococcus - с 15,3% до 0,8%, Blautia - с 4,8% до 1,5%. Среди бактерий, которые перестали детектироваться, все виды Bifidobacterium, Escherichia, Shigella.
Изменения в сообществе кишечной микрофлоры пациента отнесли к Случаю 9. Пациенту рекомендован курс приема пребиотиков (лактулоза) и пробиотиков (Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium).
Рекомендованный согласно установленного с использованием предлагаемого изобретения диагноза курс лечения благополучно, без нарушений кишечного пищеварения, завершен. И впоследствии пациент избежал нарушений кишечного пищеварения, проявляющихся в виде метеоризма, болей в животе, нарушении стула, что существенно улучшило качество его жизни по сравнению с очень высокой (≈95%) вероятностью возможного (качества жизни) без применения предлагаемого изобретения.
По прототипу [6] же установить выявленное заявляемым способом состояние микрофлоры кишечника невозможно, т.к. представители родов Prevotella, Bacteroides, Coprococcus, Blautia не культивируются на питательных средах, предложенных в прототипе. В этом проявилось одно из преимуществ предлагаемого изобретения в сравнении с прототипом.
ПРИМЕР 3. Пациентка Л., пол женский. Диагностирована гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь. При цитологическом исследовании желудка обнаружена бактерия Helicobacter pylori. В течение 14 дней пациентка проходила стандартный курс эрадикационной терапии с ежедневным приемом: антибиотик амоксициллин 1000 мг дважды в день, антибиотик кларитромицин 500 мг дважды в день, висмута субсалицилат 240 мг дважды в день, ингибитор протонной помпы эзомепразол 20 мг дважды в день. Образцы кала отобраны за сутки до начала эрадикиционной терапии и через сутки после ее окончания.
Нуклеотидная последовательность всей выделенной ДНК установлена на секвенаторе SOLiD 5500 (производства фирмы AppliedBiosystems, США). До эрадикации в образце кала идентифицировано 117 видов микроорганизмов, индекс Шеннона H=2,87, после эрадикации количество видов снизилось до 103, индекс Шеннона увеличился до H=3,26. Увеличение индекса Шеннона H произошло преимущественно за счет уменьшения количества представителей микроорганизмов рода Lachnospiraceae с 41,4% до 4,7% и увеличения представленности бактерий родов Bacteroides с 28,2% до 51,8%, Alistipes - с 1,4% до 3,5%, Faecalibacterium - с 4,5% до 7,6%. Среди бактерий, которые перестали детектироваться, все виды Bifidobacterium, Lactobacillus. Изменения в сообществе кишечной микрофлоры пациентки отнесли к Случаю 4 по Таблице.
При проведении эрадикационной терапии пациентке рекомендован курс приема пребиотика лактулоза. С учетом выявленного по завершении курса лечения полного отсутствия основных представителей молочнокислых бактерий рекомендован также курс приема пробиотиков - живых клеток бактерий Lactobacillus. Рекомендованный согласно установленного с использованием предлагаемого изобретения диагноза курс лечения пациентки благополучно, без нарушений кишечного пищеварения, завершен.
В процессе антибиотикотерапии и по ее завершении пациентка избежала нарушений кишечного пищеварения, проявляющихся в виде метеоризма, болей в животе, нарушении стула, что существенно улучшило качество ее жизни по сравнению с очень высокой (≈95%) вероятностью возможной без применения предлагаемого изобретения.
По прототипу установить описанное в ПРИМЕРЕ 3 состояние микрофлоры кишечника невозможно, т.к. представители Lachnospiraceae, Bacteroides, Alistipes, Faecalibacterium не культивируются на предложенных в прототипе питательных средах.
Приведенные примеры осуществления предлагаемого изобретения в клинической практике показывают, что заявленные цели (предлагаемого изобретения) достигнуты в полной мере.
При применении заявляемого способа в лечебной практике выявлены его отличия, показывающие преимущества заявляемого способа по сравнению с прототипом [6]:
- заявляемый способ свободен от недостатка прототипа, позволяет проводить диагностику у людей (пациентов) вне зависимости от наличия эталонной группы обследуемых, определить оптимальный курс лечения;
- способ обеспечивает персонифицированный подход к пациенту, например с учетом высокой степени вариабельности как количественного, так и качественного состава микробиоты кишечника различных индивидов;
- способ позволяет установить видовой состав кишечной микрофлоры с учетом минорных представителей сообщества микробиоты кишечника, метаболический потенциал которых существенно влияет на функционирование системы пищеварения;
- заявляемый способ позволяет установить видовой состав кишечной микрофлоры на любой момент анализа, то есть - до начала, в процессе, после завершения процесса лечения; это позволяет осуществлять контроль на всех стадиях лечебного процесса, а при необходимости - корректировать процесс, например, назначением пребиотической или пробиотической терапии.
Достоинства предлагаемого изобретения по сравнению с прототипом существенно упрощают и ускоряют диагностику пациента, повышают достоверность результата диагностики и результативность процесса лечения, повышают производительность труда медперсонала, предохраняют пациента от риска дисбактериоза при лечении, например антибиотикотерапии. Это повышает качество жизни как подвергающегося лечению пациента, так и обслуживающего пациента медперсонала, избавляя их от связанных с устранением дисбактериоза хлопот.
Заявляемый способ с использованием общедоступных препаратов, лекарственных средств и аналитического оборудования применим в медицинской практике для анализа состояния кишечной микрофлоры, диагностики состояния пациентов при эрадикации - проведении антибактериальной терапии и контроля эффективности направленного на восстановление кишечной микрофлоры лечения, устранения кишечных расстройств, возникающих вследствие эрадикации. Приведенные примеры применения предлагаемого изобретения показывают его полезность для диагностики состояния людей в медицине.
Применение заявляемого способа способствует выявлению причин кишечных расстройств при проведении антибактериальной терапии, выбору оптимального курса лечения, контролю и коррекции хода процесса лечения пациента. В результате ускоряется процесс излечения, повышается качество лечебных процедур, пациент избавляется от традиционно сопровождающих процесс лечения антибактериальными препаратами нарушений работы кишечника виде метеоризма, болей в животе, нарушении стула. Отсутствие нарушений способствует более высокому качеству жизни пациента - по сравнению с жизнью при наличии нарушений.
Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Способ диагностики состояния микробиоты кишечника имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.
Заявляемое техническое решение можно реализовать при массовом применении в деятельности организаций здравоохранения путем использования известных материалов, стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.
Использованные источники
1.  et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases // Cellular & molecular immunology. - 2011. - T. 8. - № 2. - C. 110-120.
2. Fong I.W. The Role of Microbes in Common Non-Infectious Diseases. - Springer New York, 2014.
3. Sherbet G.S.G. Bacterial Infections and the Pathogenesis of Autoimmune Conditions Bacterial Infections and the Pathogenesis of Autoimmune Conditions // British Journal of Medical Practitioners. - 2009. - T. 2. - № 1.
4. Sun J., Chang E.B. Exploring gut microbes in human health and disease: pushing the envelope // Genes & Diseases. - 2014. - T. 1. - № 2. - C. 132-139.
5. Патент RU 2410031. МПК A61B 10/00 (2006.01), G01N 33/48 (2006.1). Приоритет от 27.10.2009. Опубликован 27.01.2011. Описание патента.
6. Патент RU 2483113. МПК C12Q 1/04 (2006.1). Приоритет от 11.01.12. Опубликован 27.05.2013. Описание патента.
7. Zhang В.W. et al. A widely applicable protocol for DNA isolation from fecal samples // Biochemical genetics. - 2006. - T. 44. - № 11-12. - C. 494-503.
8. Mitra S. et al. Analysis of the intestinal microbiota using SOLiD 16S rRNA gene sequencing and SOLiD shotgun sequencing // BMC genomics. - 2013. - T. 14. - № Suppl 5. - C. S16.
9. Kozich J.J. et al. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform // Applied and environmental microbiology. - 2013. - T. 79. - № 17. - C. 5112-5120.
10. Caporaso J.G. et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data // Nature methods. - 2010. - T. 7. - № 5. - C. 335-336.
11. Shannon С.E. A mathematical theory of communication // ACM SIGMOBILE Mobile Computing and Communications Review. - 2001. - T. 5. - № 1. - C. 3-55.