Лизатные и рекомбинантные в ELISA-тест-системах для диагностики простого герпеса

микробиология

19. Waites K.B., Katz В., Schelonka R.L. Mycoplasmas and Ureaplasmas as neonathat pathogens. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18 (4): 757—89. doi: 10.1128/CMR.18.4.757-789.2005

20. Vancutsem E., Soetens O., Breugelmans M., Foulon W., Naessens A. Modified real-time PCR for detecting, differentiating, and quantifying Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum. J. Mol. Di-agn. 2011; 13 (2): 206—12. doi: 10.1016/j.jmoldx.2010.10.007.

21. Luki N., Lebel P., Boucher M., Doray В., Turgeon J., Brousseau R. Comparison of polymerase chain reaction assay with culture for detection of genital mycoplasmas in perinatal infections. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1998; 17 (4): 255—63.

22. Abele-Horn M., Wolff C., Dressel P., Zimmermann A., Vahlensieck W., Pfaff F., Ruckdeschel G. Polymerase chain reaction versus culture for detection of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis in the urogenital tract of adults and the respiratory tract of newborns. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15: 595—8.

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014

23. Blanchard A., Hentschel J., Duffy L., Baldus K., Cassell G.H. Detection of Ureaplasma urealyticum by polymerase chain reaction in the urogenital tract of adults, in amniotic fluid, and in the respiratory tract of newborns. Clin. Infect. Dis. 1993; 17 (Suppl. 1): S148—53.

24. Yoon B.H., Romero R., Lim J.H., Shim S.S., Hong J.S., Shim J.Y., Jun J.K. The clinical significance of detecting Ureaplasma urealyticum by the polymerase chain reaction in the amniotic fluid of patients with preterm labor. Am. J. Obstet. Gynecol. 2003; 189: 919—24.

25. Cheah F.C., Anderson T.P., Darlow B.A., Murdoch D.R. Comparison of the Mycoplasma Duo Test with PCR for Detection of Ureaplasma Species in Endotracheal Aspirates from Premature Infants. J. Clin. Microbiol. 2005; 43 (1): 509—10. doi: 10.1128/JCM.43.1.509— 510.2005

Поступила 10.10.13 Received 10.10.13

УДК 616.98:578.825.11]-078

Ганова Л.А.1, Ковтонюк Г.В.2, Коршун Л.Н.2, Киселева Е.К.2, Терещенко М.И.2, Вудмаска М.И.2, Мойса Л.Н.2, Шевчук В.А.2, Спивак Н.Я.1

ЛИЗАТНЫЕ И РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИГЕНЫ В ELIsA ТЕСТ-СИСТЕМАХ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА

1Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, 03143, Киев; 2ЧАО НПК "Диапроф Мед" 04123, Киев, Украина

Исследованы лизатные и рекомбинантные антигены различного производства в составе ELISA-тест-системы для определенияIgG KHerpexSimplex Virus 1-го и 2-го типов (HSV1 иHSV2). Для тестирования использованы панели сывороток PTH201 ("BBI Inc."), образцы которой содержат антитела к HSV1 и HSV2 в смешанных титрах, и 69 сывороток доноров (17 образцов имеют IgG к HSV1, 23 — к HSV2 и 29 не содержат антител к HSV. Диагностическая способность смеси рекомбинантных антигенов gG1 HSV1 и gG2 HSV2 (ЧАО НПК "Диапроф Мед") была сопоставима с таковой лизатного антигена Herpex Simplex Virus 1 & 2 (Membrane) EIE Antigen ("Virion Ltd."). В тест-системах для дифференцирования IgG к HSV1 и HSV2 рекомбинантный антиген gG1 HSV1 оказался сопоставимым с коммерческим аналогом Herpex Simplex Vi-rus-1 gG1M ("Viral Therapeutics Inc."). Вместе с тем способность выявлять IgG к HSV2 у рекомбинантного белка gG2 HSV2 существенно выше, чем у его аналога Herpex Simplex Virus-2 gG2с ("Viral Therapeutics Inc.").

Ключевые слова: Herpes .simplex virus; ELISA-тест-системы; лизатные и рекомбинантные антигены.

L.A. Ganova1, G.V Kovtonyuk2, L.N. Korshun2, E.K. Kiseleva2, M.I. Tereschenko2, M.I. Vudmaska2, L.N. Moiysa2, V.A. Shevtchuk2, N.Ya. Spivak1

THE LYSATE AND RECOMBINANT ANTIGENS IN ELISA-TEST-SYSTEMS FOR DIAGNOSTIC OF HERPES SIMPLEX

1The D.K. Zabolotniy institute of microbiology and virology of the National academy of sciences of Ukraine, 03143 Kiev, Ukraine; 2The research-and-production complex "DiaprofMed'; 04123 Kiev, Ukraine

The lysate and recombinant antigens of various production included in formula ofELISA-test-systems were analyzed. The ELISA-test-systems are used for detection of IgG to Herpes simplex virus type I and II. For testing the panel of serums PTH 201 (BBI Inc.) were used. The samples of this panel contain antibodies to Herpes simplex virus type I and II in mixed titers. The 69 serums of donors were used too (17 samples had IgG to Herpes simplex virus type I, 23 samples to Herpes simplex virus type II and 29 samples had no antibodies to Herpes simplex virus). The diagnostic capacity of mixture of recombinant antigens gG1 Herpes simplex virus type I andgG2 Herpes simplex virus type II (The research-and-production complex "DiaprofMed") was comparable with mixture of lysate antigen Herpes simplex virus type I and II (Membrane) EIE Antigen ("Virion Ltd."). In the test-systems for differentiation of IgG to Herpes simplex virus type I the recombinant antigen gG1 Herpes simplex virus type I proved to be comparable with commercial analogue Herpes simplex virus-1 gG1M ("Viral Therapeutics Inc."). At the same time, capacity to detect IgG to Herpes simplex virus type II in recombinant protein gG2 Herpes simplex virus type II is significantly higher than in its analogue Herpes simplex virus-2 gG2c ("Viral Therapeutics Inc.").

Keywords: Herpes simplex virus; ELISA-test-systems; lysate and recombinant antigen.

Возбудителем простого герпеса является Herpes simplex virus (HSV), 2 серотипа которого — HSV1 и HSV2 — широко распространены во всем мире. По данным ВОЗ, в индустриально развитых странах около 90% взрослого населе-

Для корреспонденции:

Ганова Лариса Александровна, зав. лаб. иммунохимии Адрес: 03164, Киев, ул. Булаховского, 5/58 E-mail: galkov@ukr.net

ния инфицировано HSV1, 20% — HSV2 и 30% — обоими серотипами [1, 2]. Первичное заболевание приводит к пожизненной персистенции вируса в организме, и возможна его реактивации. Преобладание хронических и бессимптомных форм заболевания, а также возможность атипичных проявлений осложняют диагностику простого герпеса по внешним симптомам [3]. Одной из проблем является дифференцирование HSV1 от HSV2, которое не всегда проводится в клиниках. Оно необходимо для прогноза течения заболевания и возможных осложнений, поскольку частота рецидивов,

15 -i

10 -

5 -

вызванных Hsv2, в 4 раза выше, а заболевание протекает в более тяжелой форме, чем при инфицировании Hsv1 [3, 4]. В клинико-лабораторной практике для выявления Hsv обычно используют метод серодиагностики, поскольку антитела к вирусу сохраняются в организме после первичного инфицирования, а их уровень имеет прогностическое значение и определяет эффективность терапии. Чаще всего прибегают к твердофазному иммуноферментному анализу (ИФА), который отличается высокой точностью и позволяет выявлять специфические антитела в короткие сроки. При конструировании коммерческих тест-систем в качестве антигенов, детектирующих специфические антитела, часто применяют лизатные антигены Hsv1 и Hsv2. Они имеют антигенную гомологию не только между собой, но и с другими типами герпесвирусов человека [1]. Поэтому данные тесты в большинстве случаев несовершенны, обладают низкой специфичностью и не позволяют дифференцировать Hsv1 от Hsv2. В связи с этим является актуальным поиск высокоспецифичных антигенов, прежде всего полученных методами генной инженерии. Из 10 поверхностных антигенов данных вирусов только гликопротеины gG1 и gG2, соответствующие Hsv1 и Hsv2, являются типоспецифиче-скими, наиболее иммуногенными и не имеют антигенного сродства с белками других герпесвирусов [5— 7], поэтому их часто используют при изготовлении диагностических тест-систем.

Мы провели сравнительные исследования полученных нами ре-комбинантных белков gG1 и gG2 с их коммерческими аналогами (рекомбинантными и лизатными) в составе иммуноферментных тест-систем, выявляющих IgG к вирусу простого герпеса.

Материалы и методы. Сыворотки: панель сывороток Anti-Herpex simplex virus (Hsv) Type 1 и 2 Mixed Titer pERFoRMANcE panel pTH201 (BBI inc.), включающая 25 образцов, из которых 2 отрицательных, 21 содержит IgG к Hsv1 и Hsv2, 1 (№ 3) имеет igg к Hsv2, а также igm к Hsv1 и Hsv2, 1 (№ 14) имеет ^M к Hsv2; сыворотки из станций переливания крови различных регионов Украины — 69 образцов, из которых 17 содержат igg к Hsv1, 23 — к Hsv2 и 29 не имеют антител к вирусу простого герпеса. Все сыворотки предварительно проверены в коммерческих тест-системах Herpex simplex virus 1 +2 igg Elisa, Herpex simplex virus 2 igg ELisA ("Nova Tec inc.", Германия) и Hsv1 igg ("orgenium Laboratories", Финляндия).

Антигены: Herpex simplex virus 1 & 2 (membrane) EiE Antigen (cat. № 7157Gb, Lot. 871028.04d, "virion Ltd."). Лизатный очищенный антиген, полученный из штаммов Hsv1 mac intyre (ATcc vR-539) и Hsv2 Ms (ATcc vR-540); Herpex simplex virus (Hsv) Type 1 (cat.

№ BA1051vs, Lot. A1051 FLA, "vmon/senon Ltd."). Лизатный очищенный антиген, полученный на культуре клеток vero; Herpex simplex virus (Hsv) Type 2 (cat. № BA1052vs, lot. A1052 FpA.1, "virion/serion ltd."). Лизатный очищенный антиген, полученный на культуре клеток vero; herpex simplex virus-1 gG1M (lot. N2402, "viral Therapeutics Inc."). Рекомбинантный очищенный антиген Hsv1 gg, состоящий из N-концевых 190 аминокислот, экспрессирован в saccharomyces cerevisiae; herpex simplex virus-2 gG2с (lot. E2506, "viral Therapeutics inc."). Рекомбинантный очищенный антиген Hsv2 gg с аминокислотной последовательностью leu343—Asp649; экспрессирован в saccharomyces cerevisiae; gg1 Hsv1 (с 008—12, ЧАО НПК "Диапроф Мед"). Рекомбинантный очищенный антиген gg1, состоящий из 189

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

15

10

0

16

12

8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Рис. 1 Результаты тестирования панели сывороток pTH201 на igg к Hsv в тест-системах с использованием различных антигенов.

a — смесь антигенов: лизатного Herpex simplex virus 1 & 2 (membrane) EiE Antigen ("virion ltd.") (светлый столбик), рекомбинантных белков gg1 Hsv1 и gg2 Hsv2 (темный столбик); б — антигены: лизатный Hsv Type 1 ("virion/serion ltd.") (светлый столбик), рекомбинантный gg1 Hsv1 (темный столбик); в — антигены: лизатный Hsv Type 2 ("virion/serion ltd.") (светлый столбик), рекомбинантный gg2 Hsv2 (темный столбик).

Здесь и на рис. 2: по оси абсцисс — номера тестируемых сывороток панели; по оси ординат — величина A (ОП /cut off).

4 иссл '

микробиология

аминокислот с иммунодоминантными регионами нативного gG1; экспрессирован в E. coli; gG2 HSV2 (с 005—12, ЧАО НПК "Диапроф Мед"). Рекомбинантный очищенный антиген gG2, состоящий из 68 аминокислот с иммунодоминантными регионами нативного gG2, экспрессирован в E. coli.

Очистку белков gG1 HSV1 и gG2 HSV2 проводили методом металл-аффинной хроматографии на IDA-toyopeаrl ("TOSOH", Япония) с использованием системы Bio-Rad (США). Целевой белок элюировали ступенчато буфером с имидазолом (40—200 мМ). При очистке белка gG2 HSV2 использовали дополнительно хроматографию на глутатион-се-фарозе ("Amersham", США) с элюцией целевого белка 50 мМ трис-НО-буфером (рН 8,0). Концентрацию белков измеряли биуретовым методом, степень их чистоты контролировали при помощи электрофореза в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.

ELISA-тест-система. В предварительном исследовании установлено, что среди планшетов Nunc с различной сорбци-онной емкостью (Maxi Sorp, Medi Sorp, Poly Sorp LW) для всех исследуемых антигенов оптимальными являются планшеты Poly Sorp LW, поэтому их использовали в дальнейших экспериментах. Антигены сорбировали в 50 мМ карбонат-бикарбо-натном буфере (рН 9,2) по 0,3 мкг/мл/100 мкл в лунку. При исследовании смеси рекомбинантных антигенов HSV1 и HSV2 сорбционная концентрация составляла 0,1 и 0,3 мкг/мл соответственно. Для блокировки неспецифических сайтов связывания планшеты обрабатывали экстрактом казеина молока.

В качестве конъюгатов при проведении ИФА использовали меченные пероксидазой мышиные моноклональные антитела (МКАТ) к IgG человека. Мышей иммунизировали IgG человека ("Sigma", США) общепринятым методом [5]. Очищенные МКАТ получали при помощи аффинной хроматографии на протеин-А- и протеин^-сефарозе ("Amersham", США). Конъюгирование МКАТ с пероксидазой хрена ("Sigma", США) проводили методом перйодатного окисления [2].

ELISA для определения вирусспеци-фических IgG выполняли в непрямом формате. Тестируемые сыворотки, разведенные 1:50 с использованием 50 мМ трис^О-буфера с блокирующими компонентами, вносили по 100 мкл в лунки иммуносорбента и инкубировали при 37oC в течение 1 ч. Антитела, которые не связались с антигенами иммуносорбента, удаляли промывкой планшета (6 раз) 0,1 М фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) с 0,05% тритона Х100. Образовавшиеся иммунные комплексы выявляли конъюга-том, который добавляли в лунки иммуно-сорбента по 100 мкл и инкубировали при 37oC в течение 30 мин. После промывки планшета в указанном режиме реакцию проявляли раствором тетраметилбензи-дина ("Kementec Diagnostics Inc."), который вносили по 100 мкл в лунку и инкубировали при 18—25oC в темноте в течение 30 мин. Реакцию останавливали 0,5 М серной кислотой (по 100 мкл в лунку). Оптическую плотность (ОП) содержимого лунок измеряли в двухволновом режиме при 450/620 нм на спектрофотометре Labsystems Multiskan (Финляндия).

Учет результатов проводили по формуле:

А= ОП /cut off,

12 -i

8 -

При каждой постановке ИФА использовали 5 дублей отрицательного контроля, который изготавливали на предприятии ЧАО НПК "Диапроф Мед" из сыворотки, не содержащей специфические антитела к HSV1 и HSV2, с добавлением антимикробных консервантов. Каждую тестируемую сыворотку повторяли в трех дублях. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Способность рекомбинантных белков gG1 HSV1 и gG2 HSV2 выявлять IgG к HSV оценивали в сравнении с лизатными аналогами в формате тест-системы для определения IgG к HSV1 и HSV2 (рис. 1, а), а также тест-систем для дифференцирования IgG к HSV1 и HSV2 (рис. 1, б, в).

Для тестирования использовали смешанную панель сывороток PTH201 (BBI Inc.), 2 образца которой (№ 10 и 19) являются отрицательными. Согласно паспортным данным на панель сывороток, образцы № 3, 7 и 14 содержат IgM к HSV2, № 20 — IgM к HSV1 и HSV2. В образце № 3 из 6 тест-систем, указанных в паспорте, 5 диагностировали IgG к HSV2 и 3 — к HSV1. В сыворотке № 7 IgG к HSV2 выявили 4 тест-системы и только 1 к HSV1. В образце № 20 лишь 2 тест-системы обнаружили специфические IgG: 1 — к HSV1 и 1 — к HSV2. В сыворотке № 14 вирусспецифические IgG не выявлены ни одной тест-системой.

Смесь рекомбинантных белков gG1 HSV1 и gG2 HSV2, как и лизатный антиген Herpex Simplex Virus 1 & 2 (Membrane) EIE Antigen ("Virion Ltd."), в котором присутствуют антигены HSV 1-го и 2-го типов, детектировала IgG во всех положительных сыворотках, кроме образца № 20, который содержит преимущественно специфические IgM. При тестировании данной сыворотки в тест-системе, в которой использовали смесь рекомбинантных белков, ОП/cut off со-

1

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

15 и

10 -

5 -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

где ОП — величина ОП в лунке с иссле-

иссл J

дуемым образцом. Величину cut off рассчитывали, прибавляя к среднему значению отрицательного контроля коэффициент 0,2.

Рис. 2. Сравнение рекомбинантных белков в тест-системах для дифференцирования IgG к HSV1 и HSV2.

a — определение IgG к HSV1 с использованием антигенов Herpex Simplex Virus-1 gG1M ("Viral Therapeutics Inc.") (светлый столбик), gG1 HSV1 (темный столбик); б — определение IgG к HSV2 с использованием антигенов Herpex Simplex Virus-2 gG2с ("Viral Therapeutics Inc.") (светлый столбик), gG2 HSV2 (темный столбик).

ставила 0,9, лизатного антигена — 0,2. В сыворотках № 14, 10 и 19 с помощью данных антигенов не удалось обнаружить специфические антитела.

В тест-системах для дифференцирования IgG к HSV1 и HSV2 использование рекомбинантного антигена gG1 HSV1, как и его лизатного аналога HSV Type 1 ("Virion/ Serion Ltd."), не определило IgG в сыворотках № 3, 7, 14 и 20, в которых большинство указанных в паспорте тест-систем детектирует преимущественно специфические IgM к HSV2, за исключением образца № 20, взятого, вероятно, от пациента с первичной смешанной инфекцией обоими типами HSV (см. рис. 1, б).

Способность рекомбинантного белка gG2 HSV2 к определению вирусспецифических IgG существенно выше, чем лизатного антигена HSV Type 2 ("Virion/Serion Ltd."). С помощью рекомбинантного белка выявлен IgG к HSV2 во всех пробах, которые содержат данные антитела. В отличие от этого использование лизатного антигена HSV Type 2 в тест-системе не определило IgG к HSV2 в положительных образцах № 3, 5, 6, 7, 12 и 18 (р < 0,05). Диагностическая способность тест-системы, в которой используется данный лизат-ный антиген, ниже, чем при применении рекомбинантного антигена gG2 HSV2.

Сравнительные исследования белков gG1 HSV1 и gG2 HSV2 с их рекомбинантными аналогами производства "Viral Therapeutics Inc." (рис. 2) проводили с использованием донорских сывороток, предварительно диагностированных на IgG к HSV1 и HSV2.

Способность детектировать специфические антитела к HSV1 (см. рис. 2, а) у анализируемых рекомбинантных антигенов была сопоставима при анализе большинства исследуемых сывороток, кроме образцов № 15, 16 ,17, при тестировании которых с использованием белка gG1 HSV1 величина ОП/cut off была достоверно выше (р < 0,05).

Из 23 исследованных сывороток, содержащих IgG к HSV2 (см. рис. 2, б), рекомбинантный антиген gG2 HSV2 в отличие от своего коммерческого аналога Herpex Simplex Virus-2 gG2с в большинстве образцов выявлял специфические антитела со значением ОП/cut off существенно выше (р < 0,05), за исключением сыворотки № 6. Результаты тестирования 4 сывороток (№ 4, 11, 12 и 16) достоверно не различались при использовании данных антигенов. При использовании коммерческого антигена не удалось обнаружить IgG к HSV2 в положительной сыворотке № 5.

Диагностическая способность тест-систем относительно выявления IgG к HSV1 при использовании рекомбинантных антигенов gG1 HSV1 и Herpex Simplex Virus-1 gG1M сопоставима. В тест-системе для выявления IgG к HSV2 антиген gG2 HSV2 оказался способным обнаруживать вирусспеци-фические антитела значительно лучше своего аналога — Herpex Simplex Virus-2 gG2a

При тестировании 29 сывороток крови здоровых доноров, в которых по данным предварительных исследований в коммерческих тест-системах отсутствуют IgG к HSV 1-го и 2-го типов, результаты ИФА во всех исследуемых тест-системах были отрицательными. Необходимо отметить, что при использовании лизатного антигена Herpex Simplex Virus 1 & 2 (Membrane) EIE Antigen результат тестирования одной из сывороток был близок к границе значения ОП/cut off 0,9.

Полученные результаты убедительно продемонстрировали достаточно высокую способность рекомбинантных анти-

генов gG1 HSV1 и gG2 HSV2 к детекции специфических IgG и возможность их использования в иммуноферментных тест-системах для диагностики простого герпеса 1-го и 2-го типов.

Выводы

1. В тест-системе для определения IgG к HSV 1-го и 2-го типов диагностическая способность смеси рекомбинантных антигенов gG1 HSV1 и gG2 HSV2 (ЧАО НПК "Диапроф Мед") сопоставима с таковой лизатного антигена Herpex Simplex Virus 1 & 2 (Membrane) EIE ¿Antigen ("Virion Ltd.").

2. В тест-системах для дифференцирования IgG к HSV1 и HSV2 рекомбинантный антиген gG1 HSV1 сопоставим с коммерческим аналогом Herpex Simplex Virus-1 gG1M ("Viral Therapeutics Inc."). Способность выявлять IgG к HSV2 у рекомбинантного белка gG2 HSV2 существенно выше, чем у аналогичного антигена Herpex Simplex Virus-2 gG2с ("Viral Therapeutics Inc.").

ЛИТЕРАТУРА

3. Аковбян В.А., Масюкова С.А., Владимирова Е.В., Зудин А.Б., Покровская С.Б. Генитальный герпес: современные проблемы и пути их решения. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2003; 5 (1): 1—18.

4. Ковтонюк Г.В., Коршун Л.М., Шевчук В.О., Кисельова О.К., Вудмаска М.1., Ганова Л.О, Терещенко М.1., Мойса Л.М., Сшвак М.Я. 1муноферментна тест-система для серодiагностики вiрусу герпесу 2 типу. Мiкробiологiчний журнал. 2012; 74 (2): 67—72.

references

1. Gorander s., Harandi A., Lindqvist M., Bergstroma T., Liljeqvista J. Glycoprotein G of herpes simplex virus 2 as a novel vaccine antigen for immunity to genital and neurological disease. J. Virol. 2012; 86 (14): 7544—53.

2. Looker K.J., Garnett G.P., schmid G.P. An estimate of the global prevalence and incidence of herpes simplex virus type 2 infection. Bull. WorldHealth Org. 2008; 86 (10): 805—12.

3. Akovbyan v.A., Masyukova s.A., vladimirova E.v., Zudin A.B., Pokrovskaya s.B. Genital herpes: modern problems and ways of their decision. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khi-mioterapiya. 2003; 5

4. Kovtonyuk G.v., Korshun L.M., shevchuk v.O., Kiselyova O.K., vudmaska M.I., Ganova L.O, Tereshchenko M.I., Moysa L.M., spivak M.Ya. ELisA test-kit for Herpes 2 serodiagnosis. Mikrobiologichniy zhurnal. 2012; 74

5. Eis-Hubinger A., Daumen M., Matz B., schneweis K. Evaluation of three glycoprotein G2-based enzyme immunoassays for detection of antibodies to herpes simplex virus type 2 in human sera. J. Clin. Microbiol. 1999; 37 (5): 1242—6.

6. Tunback P., Liljeqvist J., Lowhagen G., Hoebeke J., Liljeqvist J. Glycoprotein G of herpes simplex virus type 1: identification of type-specific epitopes by human antibodies. J. Gen. Virol. 2000; 81: 1033—40.

7. Tunback P., Bergstrom T., Lowhagen G., Hoebeke J., Liljeqvistat J. Type-specific reactivity of anti-glycoprotein G antibodies from herpes simplex virus-infected individuals is maintained by single or dual type-specific residues. J. Gen. Virol. 2005; 86: 247—51.

8. Kohler G., Howe s., Milstein C. Fusion between immunoglobu-lin-secreting and nonsecreting myeloma cell lines. Eur. J. Immunol. 1976; 6 (4): 292—5.

Поступила 23.04.13 Received 23.04.13