Применение метода RAPD-PCR в оценке генетической структуры лошадей якутской породы

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА RAPD-PCR В ОЦЕНКЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ЛОШАДЕЙ ЯКУТСКОЙ ПОРОДЫ

© Осипов В.Г.* *, Козлова Л.Г.*, Прокопьева М.И.*

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства»,

г. Якутск

Впервые проведены исследования полиморфизма случайно ампли-фицированных фрагментов ДНК, фланкированные инвертированными повторами случайных декануклеотидов, выделенные из луковиц волос лошадей якутской породы. Выявлено генетическое сходство у трех микропопуляций лошадей янского типа якутской породы из луковиц волос методом RAPD-PCR.

Оценена эффективность применения RAPD-PCR в исследовании генетической структуры микропопуляций внутрипородного типа якутской лошади.

Исследовали полиморфизм Целью исследований является изучение генетической структуры якутской породы лошадей.

Ключевые слова лошадь, якутская порода, табунное коневодство, луковица волос, амплификация, RAPD-PCR, локус, полиморфизм, генетическая структура.

В России исследования полиморфизма ДНК лошадей проводились в трех направлениях - исследование случайно амплифицированных фрагментов ДНК (RAPD-PCR), исследование рестрикционных фрагментов ДНК (наиболее часто называемое первоначальным термином «ДНК-фингерприн-тинг») и изучение полиморфизма микросателлитных фрагментов ДНК. Первые два метода традиционно мало использовались для проведения контроля происхождения лошадей. В настоящее время ведущие лаборатории в основном используют для лошадей панель микросателлитов, включающая 17 локусов [1, 2, 3].

Метод RAPD-PCR не часто, но используется. Так, в Египте, в Национальном научно-исследовательском центре, его применили для оценки гете-розиготности и определения филогенетического расстояния между популяциями местной и зарубежной арабских лошадей [4]. Ими было установлена эффективность RAPD-маркеров в обнаружении полиморфизма и оценки

* Заведующий лабораторией Селекции и генетики лошадей, кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник.

* Старший научный сотрудник лаборатории Селекции и генетики лошадей, кандидат ветеринарных наук.

* Младший научный сотрудник лаборатории Селекции и генетики лошадей.

100

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

генетического сходства различных популяций арабской породы лошадей. Бразильские ученые, используя также этот метод, отметили пригодность метода RAPD-PCR в оценке изменчивости и генетического расстояния и между породами своих и зарубежных лошадей [5].

Изучение микросателлитной ДНК современных местных пород лошадей Якутии только начинается [6, 7]. Обследованием охвачено всего чуть более 100 голов, что с учетом 171 тысячи голов лошадей республики крайне мало. Несмотря на это обстоятельство, пионерные исследования показали, что якутские лошади обладают своеобразным аллелофондом, большим числом идентифицированных аллелей и очень высоким уровнем генетической вариабельности.

До настоящего времени в Республике Саха (Якутия) у местных пород лошадей не проводилось изучение генетической структуры с применением метода RAPD-PCR. Целью исследований является оценка генетической структуры различных популяций лошадей янского типа якутской породы методом RAPD-PCR

Материал и методы исследований. Материалом исследования были образцы волос с волосяными луковицами из гривы лошадей, набранные в трех локальных популяциях янского типа якутской породы. В лаборатории селекции и генетики лошадей ЯНИИСХ ДНК выделялась сорбентным методом с использованием 25 декануклеотидных праймеров (дизайн предложен OperonTechnologies, США) для RAPD-ПЦР и 3 праймеров для ISSR-ПЦР с помощью набора «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика праймеров, использованных для анализа ДНК различных популяций лошадей янского типа якутской породы лошадей

Праймер Нуклеотидная последовательность 5'_3'

ОРА02 TGC CGA GCTG

ОРА06 GGT CCC TGAC

OPA07 GAA ACG GGTG

OPA08 GTG ACG TAGG

OPA09 GGG TAA CGCC

ОРА10 GTG ATC GCAG

OPA11 CAA TCG CCGT

OPA12 TCG GCG ATAG

OPA15 TTC CGA ACCC

OPA17 GAC CGC TTGT

OPA18 AGG TGA CCGT

OPB13 TTC CCC CGCT

ОРВ20 GGA CCC TTAC

OPC02 GTG AGG CGTC

ОРСОЗ GGG GGT CTTT

Сельскохозяйственные науки

101

Амплификация выделенной ДНК проводилась в термоциклере Tprofes-sional компании Biometra с использованием набора из 25 декануклеотидных праймеров (дизайн предложен OperonTechnologies, США) для RAPD-ПЦР и 3 праймеров для ISSR-ПЦР (предложенные Столповским и соавт.). Реакцию проводили в следующем температурном режиме: начальная денатурация ДНК при температуре 95 °С - в течение 15 минут; далее 45 циклов по схеме: денатурация ДНК при 95 °С - 1 минута; отжиг праймеров при 36 °С - 1 минута; синтез цепей ДНК при 72 °С - 1 минута; заключительный синтез ДНК при 72 °С - 5 минут. Анализ продуктов амплификации проводили с помощью горизонтального электрофореза SE-1. Электрофоретическое разделение полученной амплифицированной ДНК по молекулярной массе проводили на 1 % агарозном геле с бромистым этидием и просматривали гель в трансиллюминаторе под УФ-светом.

Регистрацию результатов проводили визуально и с помощью фотографирования видеосистемой «GEL-IMAGER2». Определение размеров производили путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, маркеры), содержащих линейные фрагменты ДНК известной длины.

Результаты собственных исследований. Наиболее полиморфными оказались 17 праймеров (табл. 2).

Таблица 2

Число и размер фрагментов, полученных в ходе RAPD-PCR с одним праймером для всех популяций

Праймер Число фрагментов Диапазон длин, п.н. Праймер Число фрагментов Диапазон длин, п.н.

min max min max

OPA02 13 500 3000 ОРА17 15 380 1250

OPA06 5 300 400 ОРА18 13 600 1500

OPA07 8 500 1000 ОРВ13 8 600 1200

ОРА08 19 380 1500 ОРВ15 13 250 100

ОРА09 14 300 1200 ОРВ 15 14 300 1000

ОРА10 15 350 1500 ОРВ20 16 300 1200

ОРА11 11 400 1400 OPC02 20 350 1500

ОРА12 8 550 1000 OPC03 13 300 1000

ОРА15 8 550 1000

По полученным данным оценили генетическое сходство трех микропопуляций янского типа якутской породы лошадей из коневодческих хозяйств Верхоянского улуса. Один ампликон спектра рассматривали как один локус ДНК. Наибольшее количество ампликонов у всех проб располагается в пределах длин 1500-300 п.н. Наиболее полиморфными являются последовательности праймеров ОРА 08, ОРА 9, ОРА 10, ОРА 11, ОРА 17, ОРА 18, ОРВ 15, ОРВ 18, ОРВ 20, ОРС 02 и ОРС 03.

При сохранении пород основная задача состоит в том, чтобы не утратить специфические генные комплексы, которые обуславливают фенотипи-

102

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ческие породные характеристики, связанные с экстерьерными особенностями, продуктивностью, жизнеспособностью, резистентностью животных. Именно перечисленные особенности, отличающие местные породы от других широко распространенных пород лошадей, необходимо сохранять в племенных коневодческих хозяйствах.

Выявлены уникальные аллели для трех микропопуляций лошадей янского типа якутской породы. Так, аллели длиной 1200-380 п.н встречаются только в микропопуляции у лошадей из местности Табалах, аллели длиной 1500-350 п.н. встречаются только в микроопуляции у лошадей из местности Адыачча, аллели длиной 3000-300 п.н. встречаются только в микропопуляции у лошадей из местности Столбы.

Генетическое сходство между микропопуляцими янского типа якутской породы между микропопуляциями составляет между местностями Табалах и Адыачча 93,7 %, Столбы и Табалах 96,0 %, Столбы и Адыачча 90,0 % (табл. 3).

Таблица 3

Генетическое сходство между микропопуляциями янского типа якутской породы

Коэффициент генетического сходства Уч. Табалах Уч. Адыачча Уч. Столбы

Табалах -

Адыачча 0,9370 -

Столбы 0,9602 0,9073 -

Заключение

Полученная информация позволит оценить генетические связи между между микропопуляциями лошадей. RAPD анализ может служить своеобразным экспресс-методом выявления генетического полиморфизма, что особенно актуально для малоизученных популяций животных, а также как источник уникальных локус - специфичных маркеров.

Список литературы:

1. Храброва Л.А. Контроль происхождения лошадей по микросателлитам ДНК / Л.А. Храброва, А.М. Зайцев, Л.В. Калинкова, М.А. Зайцева // Научное обеспечение конкурентноспособности племенного, спортивного и продуктивного коневодства в России и странах СНГ: сб. науч. трудов / ВНИИК. -Дивово, 2007. - Ч. 1. - С. 98-102.

2. Зайцева М.А. Породоспецифические особенности микросателлитов ДНК лошадей заводских и местных пород: автореф. дисс. .. .канд. с.-х. наук. -Дивово, 2010. - 23 с.

3. Зайцева М.А. Генетические особенности лошадей якутской, прилен-ской и мегежекской пород по микросателлитам ДНК [Текст] / М.А. Зайцева, Р.В. Иванов, С.М. Миронов, В.Г. Осипов // Проблемы коневодства: матер. 5-й междунар. науч.-практ. конф. - Новосибирск, 2012. - С. 150-156.

Сельскохозяйственные науки

103

4. do Egito A.A. Genetic variability of Pantaneiro horse using RAPD-PCR markers / A.A. do Egito, B.H. Fuck, C. McManus, S.R. Paiva, M. do Socorro Maues Albuquerque, S.A. Santos, U.G.P. de Abreu, J.A. da Silva, F.T.P. de Souza Sereno, A. da Silva Mariante // Revista Brasileira de Zootecnia. - 2007. - Vol. 36, № 4. - P. 1-7.

5. Mahrous K.F. Genetic variations of between horse breeds using RAPD-PCR markers / K.F. Mahrous, S.S. Alam, A.M. Hassan // Nature and Science. -2010. - № 8 (5). - P. 90-99.

6. Калинкова Л.В. Генетическая характеристика якутской лошади / Л.В. Калинкова, И.С. Гавриличева, А.М. Зайцев, М.А. Зайцева, В.Г. Осипов, РВ. Иванов // Коневодство и конный спорт. - 2015. - № 1. - С. 22-23.

7. Зайцева М.А. Первые результаты изучения генетической структуры лошадей якутской, мегежекской и приленской пород / М.А. Зайцева, А.М. Зайцев, В.Г. Осипов, РВ. Иванов, Л.Г. Козлова, М.И. Прокопьева // Наука и техника в Якутии. - 2015. - № 2 (27). - С. 8-11.

БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ ЗАВОЗНЫХ ОВЕЦ В УСЛОВИЯХ ЯКУТИИ

© Хомподоева У.В.* *, Ильин А.Н.*, Багиров В.А.*, Иванов Р.В.*, Афанасьев И.И.*

Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства РАСХН им. Л.К. Эрнста, г. Москва Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства»,

г. Якутск

Представлены результаты биохимических показателей крови завозных овец в условиях Якутии. Установленные пределы физиологиче-

* Старший научный сотрудник лаборатории Технологии продуктивного коневодства Якутского научно-исследовательского института сельского хозяйства, кандидат сельскохозяйственных наук.

* Старший научный сотрудник лаборатории Технологии продуктивного коневодства Якутского научно-исследовательского института сельского хозяйства, кандидат сельскохозяйственных наук.

* Заместитель директора по научно-организационной работе, заведующий лабораторией Репродуктивной криобиологии Центра биотехнологий ВИЖа, член-корреспондент РАСХН, доктор биологических наук.

* Заместитель директора по науке, заведующий лабораторией Технологии продуктивного коневодства Якутского научно-исследовательского института сельского хозяйства, доктор сельскохозяйственных наук.

" Младший научный сотрудник лаборатории Технологии продуктивного коневодства Якутского научно-исследовательского института сельского хозяйства.