СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИПА ЭНТЕРОВИРУСА, ЯВИВШЕГОСЯ ПРИЧИНОЙ РАЗВИТИЯ МЕНИНГИТА У ДЕТЕЙ
METHOD FOR TYPING ENTEROVIRUS CAUSING MENINGITIS IN CHILDREN

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и иммунологии, а именно к диагностике энтеровирусных (неполио) инфекций. Предназначен для определения типа энтеровируса, вызвавшего развитие менингита у детей, в первые дни заболевания по уровню CD3+IL4+ лимфоцитов. Может быть использован педиатрами, иммунологами, эпидемиологами.
Согласно существующим нормативным документам (МУ 3.1.1.2363-08 «Эпидемиологический надзор и профилактика энтеровирусной (неполио) инфекции»; СП 3.1.2950-11 «Профилактика энтеровирусной (неполио) инфекции»; «Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита», 4-е издание, ВОЗ, Женева) основными методами лабораторного подтверждения энтеровирусных (неполио) инфекций (ЭВИ) являются вирусологический и молекулярно-биологические методы: полимеразно-цепная реакция, секвенирование.
Вирусологические методы диагностики энтеровирусных инфекций являются длительным и трудоемким процессом. Окончательный ответ на вопрос, какой вирус (тип) вызвал заболевание, можно получить по истечению 10-14 дней от начала заболевания. Проведение таких исследований возможно в специально оборудованных лабораториях, сотрудники таких подразделений должны обладать определенными навыками работы с культурами клеток, владеть методами выделения и идентификации энтеровирусов.
Метод ПЦР бесспорно является наиболее быстрым и информативным. Однако на сегодняшний день используя данный способ, возможно лишь определить, является ли причиной инфицирования энтеровирус, либо заболевание вызвано другим возбудителем, т.е. назвать тип энтеровируса (ECHO или Коксаки) невозможно.
Метод секвенирования (определение нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания ее первичной структуры) является наиболее точным и высокотехнологичным способом диагностики, но является дорогостоящим и пока не может быть широко использован в рутинной практике.
Помимо традиционных способов индикации и идентификации энтеровирусов, которые были описаны выше, учеными были предложены и другие варианты их дифференцировки. Одним из ранних можно назвать способ использования гидрохлорида гуанидина, подавляющий репродукцию пикорновирусов, в т.ч. и вирусов Коксаки А. Для его проведения необходимо использование клеточных культур. Данный метод был запатентован в 1993 году, авторами его были К.И. Спыну и В.П. Вуткарев (патент РФ №1824441).
Позднее был описан и запатентован (1995 г.) метод иммунологической экспресс-диагностики энтеровирусных инфекций группой авторов (Аксенов О.А., Осипова З.А., Мурина Е.А.). В его основе лежал особый способ обработки исследуемого материала и дальнейшее его исследование в реакции связывания комплимента (РСК) со специфическими сыворотками (патент РФ №2034025).
Одним из последних изобретений является способ идентификации 5′HΤΡ генома энтеровирусов, который был описан в диссертационном исследовании Голициной Л.Н. в 2003 г., а позднее запатентован (патент РФ №2441917). Однако все эти методы выполняя одну и ту же задачу - дифференцировка энтеровирусов, не могут рассматриваться в качестве аналогов.
Задачей изобретения является разработка способа определения типа энтеровируса в первые дни заболевания на основании незначительного количества показателей, а именно по уровню CD3+IL4+ лимфоцитов, который определен в первые дни заболевания (1-7 день).
Технический результат: доступность и информативность диагностики типа энтеровируса, явившегося причиной развития менингита у детей.
Заявляется способ определения типа энтеровируса, явившегося причиной развития менингита у детей, отличающийся тем, что в крови заболевших детей в первые дни болезни определяют содержание Х=CD3+IL4+-лимфоцитов при спонтанном синтезе, рассчитывают значение Y по формуле Y=1,12+9,32*Х,
если Y выше критического значения 1,28, то делают заключение, что возбудителем заболевания являются вирусы Коксаки группы B;
если Y ниже критического значения 1,28, то делают заключение, что возбудителем являются вирусы ECHO;
при этом значения 1,12 и 9,32 - коэффициенты, которые выведены с помощью уравнения регрессии.
Предположим, что уровень CD3+IL4+ был равен 0,014 (109/л), тогда подставляя значения в формулу (1,12+9,32*0,014), получаем значение 1,25. Полученное значение (X=1,25) ниже критического значения (1,28), а это значит, что с вероятностью 95% этиологическим агентом менингита у ребенка являются вирусы ECHO.
Предположим, что уровень CD3+IL4 был равен 0,082 (109/л), тогда подставляя значения в формулу (1,12+9,32*0,082), получаем значение 1,885.
Полученное значение (X=1,885) выше критического значения (1,28), а это значит, что с вероятностью 95% этиологическим агентом менингита у ребенка являются вирусы Коксаки В.
Параметры общего анализа крови регистрировали с помощью гематологического анализатора «Cobas Micros 60» («ABX»). Оценку внутриклеточного синтеза цитокинов (IL-4) Т-лимфоцитами проводили в условиях 4-часовой инкубации в присутствии брефельдина A, без стимуляции (спонтанная экспрессия) и при стимуляции Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) («Sigma», 25 ng/ml) и иономицином («Sigma», 1 µg/ml) при 37°C (стимулированная экспрессия). Окрашивание проводили с использованием моноклональных антител: фикоэритрин (PE)-коньюгированные анти-IL-4 и фикоэритринцианин 5.1 (PC-5)-коньюгированные CD3 («IO Test»).
Методом дисперсионного и регрессионного анализов были выделены наиболее значимые иммунологические показатели, среди которых ведущее место занимал уровень CD3+IL4+-лимфоцитов при спонтанном синтезе. Была выведена формула, позволяющая установить с точностью до 95,0%, какой энтеровирус (ECHO или Коксаки B) вызвал заболевание.
Способ был проверен следующим образом.
В контрольную группу вошли данные пациентов, показатели иммунограммы которых не были использованы при выведении формулы.
В группу детей с ECHO-вирусными менингитами вошло 12 человек, с Коксаки B-вирусными менингитами - 15 человек.
Были получены следующие результаты:
- из 12 человек, от которых при проведении вирусологических исследований были выделены вирусы ECHO, совпадение результатов наблюдали в 11 случаях (полученное значение было ниже критического 1,28), в 1 случае значение было выше критического уровня;
- из 15 человек, от которых при проведении вирусологических исследований были выделены вирусы Коксаки B, совпадение результатов наблюдали в 12 случаях (полученное значение было выше критического 1,28), у 3-х детей данный показатель оказался ниже 1,28.
Таким образом, формула оказалась достоверной в 80,0% при Коксаки B-вирусных менингитах и в 92,0% - при ECHO-вирусных менингитах. Для проведения расчетов были использованы результаты обследования 94 детей, из них с ECHO-вирусными менингитами - 67 человек, с Коксаки B-вирусными менингитами - 27.