СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВАХ
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF ASCORBIC ACID IN DRUGS

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, касается способа определения количественного содержания аскорбиновой кислоты (АК) в лекарственных средствах (ЛС).
Для количественного определения АК известны методы окислительно-восстановительной титриметрии: индофенольный (титрант 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия), йодометрия (титрант йод), йод-хлорметрия (титрант йодмонохлорид), цериметрия (титрант церия (IV) сульфат). Методы основаны на экстрагировании АК из объекта анализа 2% раствором хлористоводородной кислоты, окислении АК титрантом до образования дегидроАК с установлением точки эквивалентности чаще индикаторным или инструментальным способом (Государственная фармакопея (ГФ) СССР, 1989, 11 изд, вып. 2, Общие методы анализа, М.: Медицина, 400 с.; ГОСТ 24556-89: Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витамина С; ГОСТ 30627.2-98: Продукты молочные для детского питания. Методы измерений массовой доли витамина С). Методики предусматривают прямое или обратное титрование.
Ограничениями методов являются:
- нестабильность растворов титрантов (всех перечисленных, кроме церия (IV) сульфата) к действию света, воздуха, повышенной температуры, способствующая даже при создании специальных условий непродолжительным срокам хранения растворов (5-10 суток) и вызывающая необходимость установки титра перед каждым применением растворов;
- мешающее влияние сопутствующих восстановителей (ионов железа (II), йодид ионов, натрия гидросульфита, оксида серы (IV)), способных взаимодействовать с окислителями (титрантами) и приводить к завышенным результатам количественного определения АК;
- способность йода, используемого в качестве титранта, к окислению более сильными окислителями;
- высокая чувствительность титрантов (йодхлорида, церия (IV) сульфата) к изменению рН;
- невозможность титрования йодом при повышенной температуре вследствие его летучести;
- достаточно высокая относительная погрешность определений: ±5,5-15% при доверительной вероятности 95%.
Известен способ количественного определения АК в субстанции (порошке), ЛС (таблетках, драже, растворах), растительных ЛС (плодах) методом йодатометрии, основанным на окислении АК калия йодатом в кислой среде в присутствии калия йодида с образованием дегидроАК (уравнение 1):
Избыточная капля калия йодата окисляет в кислой среде йодид ионы до свободного йода (уравнение 2), образующего с крахмалом продукт синего цвета, по возникновению которого устанавливают точку эквивалентности:
Данный метод количественного определения АК рекомендован Государственными фармакопеями (ГФ) различных изданий для количественного анализа АК в ЛС. Методика определения АК в субстанции (ГФ СССР, 1968, 10 изд., М.: Медицина, 1079 с.) заключается в том, что точную навеску субстанции массой около 0,5 г растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки. К 10 мл приготовленного раствора добавляют 1 мл 2% раствора хлористоводородной кислоты, 0,5 мл 1% раствора калия йодида, 2 мл 0,5% свежеприготовленного раствора крахмала и титруют 0,0167 моль/л раствором калия йодата до появления стойкого слабо синего окрашивания. Титр раствора калия йодата по АК составляет 8,824 мг/мл. Нормируемое содержание АК в субстанции - не менее 99,0%. Для определения АК в других ЛС (таблетках, драже, растворах и др.) (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, Общая фармакопейная статья (ОФС) ОФС.1.2.3.0017.15: Методы количественного определения витаминов) используется та же методика, но с предварительной стадией изолирования АК: точную навеску порошка 10 растертых таблеток (драже) или исходного раствора, эквивалентную 0,1 г АК, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 10 мл воды и 10 мл 2% раствора хлористоводородной кислоты, объем раствора доводят водой до метки, фильтруют. Далее 10 мл фильтрата анализируют по выше описанной методике с применением раствора калия йодата меньшей концентрации (0,00167 моль/л). Титр раствора калия йодата по АК составляет 0,8824 мг/мл. Данный метод определения количественного содержания АК наиболее близок к заявляемому способу и выбран за прототип.
Недостатками указанного способа являются (Пономарев В.Д. Аналитическая химия, 1982, ч. 2: Количественный анализ, М.: ВШ, 288 с.; Харитонов Ю.Я. Аналитическая химия (аналитика), 2005, кн. 2: Количественный анализ, М.: ВШ, 559 с.; ГОСТ 24556-89; ГОСТ 30627.2-98):
1
2
- неспецифичность титранта: калия йодат вступает в побочные взаимодействия с другими восстановителями (витаминами А, В, В, глюкозой, ионами и др.), являющимися сопутствующими компонентами или примесями к ЛС, ведущими к завышенным результатам количественного определения АК;
- зависимость реакции с калия йодатом от рН среды и ионной силы раствора;
- неустойчивость калия йодата в растворе к действию внешних факторов, вызывающая необходимость установки титра перед каждым применением растворов;
- визуальная фиксация точки эквивалентности, обусловливающая высокую относительную погрешность определения;
- при стоянии раствора крахмала происходит гидролиз полиса-харидных цепей и его окраска с йодом из синей превращается в красную, поэтому раствор индикатора должен быть всегда свежеприготовленным, что увеличивает продолжительность подготовки реактивов, а, значит, и анализа;
- резкое снижение чувствительности реакции с крахмалом при повышенной температуре;
- невозможность определения АК в мутных и окрашенных растворах;
- низкая точность определения: относительная погрешность составляет ±10-11,5%.
Цель изобретения - обеспечение специфичности, линейности, расширенного диапазона аналитической области, правильности, прецизионности, высокой точности методики количественного определения АК в ЛС методом окислительно-восстановительной титриметрии путем использования в качестве титранта окисленной формы ферроина (ОФФ) и потенциометрического способа фиксации точки эквивалентности.
o
o
T
T
T
Поставленная цель достигается тем, что для количественного определения АК сначала готовят раствор титранта ОФФ с примерной концентрацией 0,02 моль/л путем растворения точных навесок реагентов: 14,0820 г фенантролина гидрохлорида моногидрата и 9,6440 г железа (III) аммония сульфата додекагидрата в 100 мл воды очищенной и 25 мл 10% раствора серной кислоты в мерной колбе вместимостью 1 л с последующим доведением объема раствора водой очищенной до метки. Затем устанавливают титр раствора ОФФ путем добавления к 25,00 мл приготовленного раствора 3 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, 2 г калия йодида, 1 мл 0,1% раствора крахмала и потенциометрического титрования смеси через 10 мин 0,1 моль/л раствором натрия тиосульфата на приборе «рН-340» при использовании платинового (индикаторный) и хлоридсеребряного (электрод сравнения) электродов с фиксацией значений электродвижущей силы электрохимической ячейки (Е, мВ) в зависимости от объема титранта (V, мл). В графической системе «Е, мВ - V, мл» строят кривые потенциометрического титрования, по которым определяют скачок титрования, V в точке эквивалентности (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1 ОФС.1.2.1.0004.15: Ионометрия). Для количественного определения АК в субстанции точную навеску массой около 0,1 г вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде очищенной, доводят объем раствора водой до метки, отбирают аликвотную часть полученного раствора объемом 10 мл. Для количественного определения АК в твердых ЛС (таблетках, драже), растворах, растительных ЛС точную навеску порошка растертых ЛС массой около 0,5 г или раствора объемом 0,50 мл вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в воде очищенной, доводят объем раствора водой до метки, отбирают аликвотную часть полученного раствора объемом 10 мл. Далее аликвотную часть раствора помещают в химический стакан вместимостью 50 мл, потенциометрически титруют из бюретки или микробюретки 0,02 моль/л раствором ОФФ на приборе «рН-340», как указано выше.
Содержание АК (С, %) вычисляют по уравнению (3) (Харитонов Ю.Я., 2005, кн. 2):
а
где  - навеска для анализа, г;
Т
V - объем титранта в точке эквивалентности, мл;
К - поправочный коэффициент к заданной концентрации титранта;
В/А
Т - титр раствора титранта по определяемому веществу, мг/мл;
Р - общая масса (объем) анализируемого ЛС, г(мл);
1
V - объем исходного раствора, мл;
2
V - объем аликвотной части раствора, мл.
В/А
Величину Т определяют по уравнению (4) (Харитонов Ю.Я., 2005, кн. 2):
В
где С - концентрация раствора титранта, моль/л;
А
М - относительная молекулярная масса определяемого вещества;
А
В
k k - стехиометрические коэффициенты уравнения реакции перед определяемым веществом и титрантом соответственно.
В аналитической практике в качестве индикатора широко применяется ферроин - координационное соединение катиона железа (II) с 1,10-фенантролином (орто-фенантролином) (Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1989, 448 с.; Харитонов Ю.Я., 2005, кн. 2) (уравнение 5):
Данное координационное соединение участвует в окислительно-восстановительных реакциях (ОВР), причем окисленная форма ферроина (ОФФ) более устойчива (lgβ=6,50), чем восстановленная форма (ВФФ) (lgβ=5,86) (Лурье Ю.Ю., 1989) (уравнение 6):
Интервал (потенциал) перехода окраски ферроина значителен: E°=+1,06 В; резкий переход цвета наблюдается при E°=+1,14 В. Кроме того, в ОВР ферроин практически не зависит от рН и ионной силы раствора (Лурье Ю.Ю., 1989). Перечисленные свойства побудили к предположению о возможности использования ОФФ в качестве титранта в окислительно-восстановительной титриметрии для количественного определения АК.
Предполагая, что в ОВР реагент ОФФ играет роль окислителя, а АК - роль восстановителя, уравнение реакции принимает вид в ионно-молекулярной форме (Лурье Ю.Ю., 1989; Беликов В.Г. Фармацевтическая химия: в 2 ч., Пятигорск: ПГФА, 2003, 720 с.) (уравнение 7):
Любые реакции, включая ОВР, самопроизвольно протекают при постоянной температуре до момента установления в системе устойчивого химического равновесия, характеризуемого константой равновесия (Кр) при температуре 20°С для ОВР (Пономарев В.Д., 1982, ч. 2) (уравнение 8):
где n - сбалансированное число электронов, участвующих в реакции,
o
Е - стандартная электродвижущая сила (ЭДС) (стандартный потенциал) реакции.
o
3+
2+
46
46
8
8
12
8
2
3
12
8
2
3
6
6
6
6
8
6
С учетом Е потенциальных редокс-пар: окислителя [Fe(CHN)]/[Fe(CHN)]=+1,06В, восстановителя СНО/СНО=-0,326В (Лурье Ю.Ю., 1989), соответственно стандартной ЭДС реакции (1,06-(-0,326)=1,386В) и n=2, получаем: lgK=2⋅1,386/0,059=46,98, откуда Кр=9,6⋅10. Вычисленная величина Кр свидетельствует о возможности (Кр>1) и достаточной полноте протекания реакции (9,6⋅10>>10) между ОФФ и АК при стандартных условиях. Данное заключение основано на известной закономерности практического протекания реакции до конца при условии величины степени превращения исходных веществ в продукты реакции не менее 99,99%, что соответствует константе равновесия Кр≥10 (Пономарев В.Д., 1982, ч. 2; Харитонов Ю.Я., 2005, кн. 2). Таким образом, реакция между ОФФ и АК при стандартных условиях не только возможна, но и характеризуется очень высокой практической полнотой. Ранее ОФФ в качестве окислителя для количественного определения АК не использовался.
Теоретическое обоснование требует практических доказательств, поэтому сначала необходимо было получить ОФФ. В соответствии с уравнением реакции взаимодействия 1,10-фенантролина и иона железа (III) в ионно-молекулярной форме (Лурье Ю.Ю., 1989) (уравнение 9):
или в полной молекулярной форме (уравнение 10):
молярное соотношение 1,10-фенантролина и иона железа (III) в реакции образования ОФФ составляет 3:1. В результате эмпирического опыта определения АК, содержащегося в объектах анализа в малых количествах, чаще всего используемая концентрация растворов титрантов составляет 0,02 моль/л (ГФ СССР, 1968, 10 изд.; ГФ РФ, 2015, 13 изд., ОФС.1.2.3.0017.15; ГОСТ 24556-89; ГОСТ 30627.2-98).
Раствор титранта ОФФ с концентрацией 0,02 моль/л (титр раствора ОФФ 11,9294 мг/мл) готовят с учетом молярного соотношения реагентов: 1,10-фенантролина и иона железа (III) 3:1 (уравнения 9, 10) и их молярных масс (234,7 г/моль фенантролина гидрохлорида моногидрата, 56 г/моль иона железа (III), 482,2 г/моль железа (III) аммония сульфата додекагидрата (Лурье Ю.Ю., 1989)). Для этого точные навески реагентов: 14,0820 г (0,06 моль) фенантролина гидрохлорида моногидрата и 9,6440 г (0,02 моль) железа (III) аммония сульфата додекагидрата (1,12 г иона железа (III)) вносят в мерную колбу вместимостью 1 л, добавляют 100 мл воды очищенной, 25 мл 10% раствора серной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до метки.
Установку титра раствора ОФФ проводят по методике установки титра 0,1 моль/л раствора железа (III) аммония сульфата (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.3.0001.15: Реактивы. Индикаторы): к 25,0 мл приготовленного раствора ОФФ прибавляют 3 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, 2 г калия йодида, 1 мл 0,1% раствора крахмала и через 10 мин титруют потенциометрически на приборе «рН-340», как описано выше, 0,1 моль/л раствором натрия тиосульфата. Реакции протекают согласно уравнениям (11, 12):
Титр раствора ОФФ оценивают по величине К, которую определяют по уравнению (13) (ГФ СССР, 1987, 11 изд., вып. 1, 336 с.):
1
1
где К, V - соответственно поправочный коэффициент и объем раствора ОФФ (мл), взятого для установки титра,
2
2
К, V - соответственно поправочный коэффициент и объем (мл) титранта, израсходованного на титрование.
o
o
o
o
o
o
T
T
T
Важнейшей характеристикой любой методики анализа является ее специфичность - способность аналитической методики однозначно оценивать определяемое вещество в присутствии сопутствующих компонентов (Валидация аналитических методик (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик). Для оценки специфичности методики количественного определения АК с помощью ОФФ были приготовлены 3 модельные смеси (порошки), одна из которых (№1) аналогична составу драже «Ревит» (Машковский М.Д. Лекарственные средства, 2012, 16 изд. М.: Новая волна, 1216 с.) (табл. 1). Каждую смесь анализировали по выше описанной методике, но с большей концентрацией исходного раствора: навеску смеси массой около 0,5 г (точная навеска) растворяли в воде в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводили объем раствора водой до метки; далее отбирали 10 мл и титровали, как указано выше. Результаты титрования модельных смесей №1, №2, №3 с помощью 0,02 моль/л раствора ОФФ с К=1,00 приведены в табл. 2, из которых можно отметить, что величина Е модельной смеси №3 осталась без изменений, что свидетельствует об отсутствии взаимодействия титранта ОФФ с сопутствующими компонентами. Кривые потенциометрического титрования модельных смесей №1 и №2 с помощью 0,02 моль/л раствора ОФФ в системе «Е, мВ - V, мл» аналогичны по характеру и практически совпадают друг с другом (рис. 1). При анализе потенциометрической кривой титрования модельной смеси №1 выделяется: резко выраженный скачок титрования, при котором Е составляет от (-150) до +750 мВ (ширина скачка 900 мВ); Е в точке эквивалентности составляет +307 мВ, ему соответствует V 3,84 мл. Практически такие же результаты получены при титровании модельной смеси №2: резко выраженный скачок титрования, при котором Е составляет: от (-148) до +749 мВ (ширина скачка 897 мВ); Е в точке эквивалентности составляет +306 мВ, ему соответствует V 3,83 мл. Учитывая, что взаимодействие ОФФ с АК происходит в молярном соотношении 2:1 (уравнение 7), рассчитанный по уравнению (4) титр раствора ОФФ по АК составляет: 0,02⋅176,13⋅1/2=1,761 мг/мл, т.е. 1 мл 0,02 М раствора ОФФ соответствует 1,761 мг АК. По уравнению (3) содержание АК:
- в модельной смеси №1 составляет:
- в модельной смеси №2 составляет:
Одинаковые результаты содержания АК в модельных смесях №1 и №2, а также стабильность потенциала для модельной смеси №3 свидетельствуют об отсутствии влияния сопутствующих компонентов на результаты количественного определения АК. Полученные данные доказывают специфичность методики количественного определения АК с помощью ОФФ.
o
o
Т
Для сравнения с прототипом те же три модельные смеси титровали 0,00167 моль/л раствором калия йодата (способ-прототип) с потенциометрической фиксацией точки эквивалентности, как в случае заявляемого способа. Титр раствора калия йодата по АК составляет 0,8824 мг/мл. Результаты определения приведены в табл. 3. Из приведенных данных следует, что, несмотря на более широкий скачок титрования в способе-прототипе, чем в заявляемом способе, величины Е и V в точке эквивалентности варьируют в зависимости от состава модельной смеси. Различные объемы титранта, израсходованного на титрование смесей №1 и №2, а также вклад сопутствующих компонентов (смесь №3) во взаимодействие с титрантом свидетельствуют об отсутствии специфичности методики количественного определения АК по способу прототипу. По-видимому, это связано с большей величиной Е калия йодата (+1,19 В) в сравнении с ОФФ (+1,06 В).
Рассчитанное по уравнению (3) содержание АК составило:
- в модельной смеси №1
- в модельной смеси №2
- в модельной смеси №3
Таким образом, методика количественного определения АК по заявляемому способу характеризуется специфичностью (относительная погрешность определения составила (0,3397-0,3500)⋅100/0,3500=2,9%), в отличие от способа прототипа (неспецифична, относительная погрешность определения (0,3901-0,3500)⋅100/0,3500=11,5%).
a
1
АК
Важной характеристикой методики количественного определения является линейность - наличие линейной зависимости аналитического сигнала от концентрации определяемого вещества в анализируемой пробе (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик). Для оценки линейности методики количественного определения АК 0,02 моль/л раствором ОФФ использована выше приведенная модельная смесь №1, из которой готовили исходный раствор путем растворения навески массой около 0,5 г (точная навеска) в воде в мерной колбе вместимостью 50 мл и доведения объема раствора водой до метки. Из исходного раствора отбирали 6 аликвотных частей, которые титровали в выше описанных условиях 0,02 моль/л раствором ОФФ. Данные для расчета содержания АК: Р=5,0000 г, =0,5002 г, V=50 мл, T=1,761 мг/мл, К=1,00. Результаты определения С во взятых пробах приведены в табл. 4.
T
АК
T
АК
Для оценки линейности методики количественного определения АК заявляемым способом построен график в системе «V, мл - С, г» (рис. 2), из которого видно, что между V и С в модельной смеси №1 наблюдается линейная зависимость.
АК
T
С целью определения линейной зависимости: расчета уравнения градуировочного графика и вычисления коэффициента корреляции С обозначена через «х», V в точке эквивалентности через «у» (табл. 5). Коэффициенты уравнения линейной зависимости («а» и «b»), а также коэффициент корреляции («r») вычисляют по известным уравнениям (уравнения 14, 15, 16) (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик):
Подставляя значения в приведенные уравнения, получаем коэффициенты для заявляемого способа:
Таким образом, зависимость между объемом титранта (ОФФ) и концентрацией АК в присутствии вспомогательных веществ описывается уравнением линейной регрессии: у=25,674х-4,186. Линейная зависимость отвечает условию количественного определения r≥0,99 (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик), что позволяет утверждать о наличии достаточно жесткой линейной зависимости объема титранта ОФФ от концентрации АК.
Кроме того, наблюдаемая линейная зависимость во всем изученном диапазоне содержания АК (0,1761 г - 0,5952 г) составляет по отношению к номинальному значению содержания АК (0,3500 г) соответственно 50% и 170%. Таким образом, аналитическая область методики (интервал между верхним и нижним значением аналитических характеристик определяемого компонента в объекте анализа) составляет 50-170%) от номинального значения содержания АК, что вполне удовлетворяет фармакопейным требованиям к методикам количественного определения: «методики должны быть применимы в интервале 80-120% от номинального значения определяемой аналитической характеристики» (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик).
a
а
1
АК
T
АК
KIO3
АК
Для сравнения со способом-прототипом модельную смесь №1 титровали 0,00167 моль/л раствором калия йодата: из смеси №1 готовили раствор путем растворения навески массой около 0,5 г (точная навеска) в воде в мерной колбе вместимостью 50 мл и доведения объема раствора водой до метки. Анализу подвергали 6 аликвотных частей. Данные для расчета содержания АК: Р=5,0000 г, =0,4988 г, V=50 мл, T=0,8824 мг/мл, К=1,00. Результаты определения С во взятых пробах калия йодатом приведены в табл. 6. По графику «V, мл - С, г», построенному аналогично рис. 2, установлена линейная зависимость между V и С в модельной смеси №1. Данные для расчета уравнения градуировочного графика и вычисления коэффициента корреляции приведены в табл. 7. По приведенным уравнениям 14, 15, 16 вычислены коэффициенты «», «b», «r» для способа-прототипа:
Таким образом, зависимость между объемом титранта (калия йодата) и концентрацией АК в присутствии вспомогательных веществ описывается уравнением линейной регрессии: у=51,203х-10,409. Полученная линейная зависимость не отвечает условию количественного определения r≥0,99 (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик), при котором должна быть жесткая зависимость объема титранта от концентрации АК.
a
Следующей важной характеристикой методики количественного определения является правильность, характеризуемая отклонением среднего результата определений от значения, принимаемого за истинное значение. С целью оценки правильности методики количественного определения проводили 9 определений: три определения для каждой из трех аликвотных частей или концентраций, отличающихся на 20% (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик). В работе использовали модельную смесь №1. Для этого навеску смеси массой около 0,5 г (точная навеска) растворяли в воде в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводили объем раствора водой до метки, отбирали 5,00, 10,00, 15,00 мл аликвотной части раствора. Каждую аликвотную часть трижды потенциометрически титровали 0,02 моль/л раствором ОФФ (Р=5,0000 г; =0,5010 г; К=1,00; T=1,761 мг/мл). Открываемость (R, %) как характеристику критерия «правильность» определяли по уравнению (17) (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик):
АК
Результаты определения правильности заявляемой методики приведены в табл. 8. Для анализа лекарственных средств с содержанием действующего вещества более 1% и менее 10% (С в модельной смеси №1: 0,3500⋅100/5,0000=7%), согласно (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик), значение правильности должно быть в пределах 97-103%). Полученный средний результат по критерию «правильность» для заявляемой методики вполне удовлетворяет фармакопейным требованиям.
a
Аналогичным образом оценивали способ-прототип по критерию «правильность», используя те же объемы аликвотных частей раствора. Каждую аликвотную часть трижды потенциометрически титровали 0,00167 моль/л раствором калия йодата (Р=5,0000 г; =0,4995 г; К=1,00; T=0,8824 мг/мл). Результаты определения правильности методики-прототипа приведены в табл. 9. Полученный по методике-прототипу средний результат открываемости АК в модельной смеси №1 превышает верхний предел нормы, что свидетельствует о несоответствии методики фармакопейным требованиям по критерию «правильность».
a
1
2
ОФФ/АК
KIO3/АК
Другой важной характеристикой методики количественного определения является прецизионность (воспроизводимость) - рассеяние результатов относительно величины среднего результата (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик). С целью определения прецизионности использована модельная смесь №1, точную навеску которой массой около 0,5 г растворяли в воде в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводили объем раствора водой до метки. Далее 10 мл приготовленного раствора по 6 раз титровали 0,02 моль/л раствором ОФФ (заявляемый способ) и 0,00167 моль/л раствором калия йодата (способ-прототип). Исходные данные: P=5,0000 г, =0,5005 г, V=50 мл, V=10 мл, К=1,00, Т=1,761 мг/мл, T=0,8824 мг/мл. Расчет стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD, %) проводили по известным уравнениям 18 и 19 соответственно:
Результаты определения прецизионности методик количественного определения АК в модельной смеси №1 заявляемым способом и способом-прототипом приведены в табл. 10. Оценка прецизионности является функцией аналитических концентраций: при содержании определяемого компонента в образце в пределах 1-10% (в модельной смеси №1 концентрация АК 7%) значение RSD должно быть ≤±2,7%. Полученные данные свидетельствуют о соответствии значений RSD требованиям выше указанной ассоциации, а, значит, и о прецизионности обеих методик.
С целью определения устойчивости 0,02 моль/л раствора ОФФ его хранили в склянках темного стекла с притертыми пробками в защищенном от света месте, периодически устанавливая его титр (поправочный коэффициент) с помощью 0,1 моль/л раствора натрия тиосульфата (подробная методика приведена в примере 1, пункт 1). Результаты определения устойчивости 0,02 моль/л раствора ОФФ приведены в табл. 11. Таким образом, при надлежащих условиях хранения даже в течение 4 месяцев 0,02 моль/л раствор ОФФ устойчив: согласно ГФ РФ (2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.3.0002.15: Титрованные растворы), допустимое отклонение К≤2%).
Способ количественного определения АК поясняется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Количественное определение АК в субстанции
1. Приготовление раствора титранта ОФФ (0,02 моль/л) и установление его титра (поправочного коэффициента). 1 мл раствора должен содержать 11,9294 мг ОФФ.
o
o
o
T
T
T
В мерную колбу вместимостью 1 л с помощью 100 мл воды очищенной вносят точные навески 14,0820 г фенантролина гидрохлорида моногидрата и 9,6440 г железа (III) аммония сульфата додекагидрата (железоаммониевых квасцов), добавляют 25 мл 10% раствора серной кислоты, содержимое колбы перемешивают и через 10 мин доводят объем раствора водой очищенной до метки. Для установления точной концентрации к 25,00 мл приготовленного раствора ОФФ добавляют 3 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, 2 г калия йодида, 1 мл 0,1%) раствора крахмала. Через 10 мин смесь титруют из бюретки или микробюретки 0,1 моль/л раствором натрия тиосульфата потенциометрически на приборе «рН-340» при использовании платинового (индикаторный) и хлоридсеребряного (электрод сравнения) электродов, фиксируя значения Е (мВ) в зависимости от V (мл). В графической системе «Е, мВ - V, мл» строят кривую потенциометрического титрования (рис. 3), по которой определяют скачок титрования и V в точке эквивалентности. На представленной потенциометрической кривой титрования обнаружен скачок титрования, где в точке эквивалентности величина Е составляет +413 мВ, ей соответствует объем титранта (0,1 моль/л раствора натрия тиосульфата) 25,00 мл. Таким образом, используя уравнение (13), величина К раствора ОФФ составляет:
Значит, фактически раствор ОФФ приготовлен с теоретически заданной концентрацией (0,02 моль/л).
2. Количественное определение АК в субстанции
o
T
Около 0,1 г субстанции АК (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют примерно в 50 мл воды очищенной, доводят объем раствора водой до метки. Аликвотную часть полученного раствора объемом 10 мл помещают в химический стакан вместимостью 50 мл, потенциометрически титруют 0,02 моль/л раствором ОФФ на приборе «рН-340», применяя в качестве индикаторного электрода платиновый электрод, в качестве электрода сравнения - хлоридсеребряный электрод. В процессе титрования фиксируют значения Е (мВ) и V (мл), по которым строят кривую потенциометрического титрования (рис. 4). На потенциометрической кривой титрования субстанции АК отмечен потенциал в точке эквивалентности, составивший +310 мВ, ему соответствует объем титранта 5,76 мл.
a
1
2
T
Результаты анализа: =0,1015 г, V=100 мл, V=10 мл, V=5,76 мл, K=1,00, Т=1,761 мг/мл, Р=100%.
Содержание АК в субстанции:
Согласно ГФ (ГФ СССР, 1968, 10 изд.), содержание АК в субстанции должно быть не менее 99,0%, поэтому полученный результат удовлетворяет фармакопейным требованиям.
Пример 2. Количественное определение АК в 5% растворе для инъекций (производитель ОАО «Мосхимфармпрепараты», г. Москва)
1. Приготовление раствора титранта ОФФ (0,02 моль/л) и установление его титра (поправочного коэффициента) проводят аналогично примеру 1 (пункт 1). Величина К=1,00.
2. Количественное определение АК в инъекционном растворе
Ампулу с инъекционным раствором АК вскрывают, содержимое ампулы с помощью шприца извлекают и переносят в химический стакан. 0,50 мл инъекционного раствора АК помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки. Аликвотную часть полученного раствора объемом 10 мл помещают в химический стакан вместимостью 50 мл, потенциометрически титруют из микробюретки 0,02 моль/л раствором ОФФ аналогичным образом, как описано в примере 1 (пункт 2).
а
1
2
T
Результаты анализа: =0,50 мл, V=50 мл, V=10 мл, V=2,85 мл, K=1,00, T=1,761 мг/мл, Р=1 мл.
Содержание АК в инъекционном растворе:
Согласно ГФ (ГФ СССР, 1968, 10 изд.), содержание АК в 5% инъекционном растворе должно быть 0,0475-0,0525 г/мл, поэтому полученный результат удовлетворяет фармакопейным требованиям.
1
2
Пример 3. Количественное определение АК в драже «Ревит», содержащих 35 мг АК, 0,86 мг ретинола пальмитата (витамин А), по 1 мг тиамина гидрохлорида (витамин В) и рибофлавина (витамин В), вспомогательных веществ до массы 1 драже 0,5 г (Машковский М.Д., 2012, 16 изд.) (производитель ОАО «Уралбиофарм», г. Екатеринбург)
1. Приготовление раствора титранта ОФФ (0,02 моль/л) и установление его титра (поправочного коэффициента) проводят аналогично примеру 1 (пункт 1). Величина К=1,00.
2. Количественное определение АК в драже «Ревит»
На аналитических весах взвешивают каждое из 10 драже, определяют среднюю массу 1 драже. Затем 10 драже помещают в ступку и тщательно растирают до образования однородного порошка. Точную навеску порошка растертых драже массой около 0,5 г вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют примерно 25 мл воды очищенной, перемешивают, доводят объем раствора водой до метки. Аликвотную часть полученного раствора объемом 10 мл помещают в химический стакан вместимостью 50 мл, потенциометрически титруют из микробюретки 0,02 моль/л раствором ОФФ аналогичным образом, как описано в примере 1 (пункт 2).
а
1
2
T
Результаты анализа: Р (средняя масса 1 драже)=0,5050 г, =0,5012 г, V=50 мл, V=10 мл, V=4,00 мл, K=1,00, Т=1,761 мг/мл.
Содержание АК в драже «Ревит»:
Содержание АК в 1 драже «Ревит» должно быть 0,0333-0,0368 г, поэтому полученный результат удовлетворяет фармакопейным требованиям.
Пример 4. Количественное определение АК в таблетках АК с глюкозой, содержащих по 25 мг АК и глюкозы, вспомогательных веществ до массы 1 таблетки 3,0 г (Машковский М.Д., 2012, 16 изд.) (производитель ОАО «Татхимфармпрепараты», г. Казань)
1. Приготовление раствора титранта ОФФ (0,02 моль/л) и установление его титра (поправочного коэффициента) проводят аналогично примеру 1 (пункт 1). Величина К=1,00.
2. Количественное определение АК в таблетках АК с глюкозой
На аналитических весах взвешивают каждую из 10 таблеток, определяют среднюю массу 1 таблетки. Затем 10 таблеток помещают в ступку и тщательно растирают до образования однородного порошка. Точную навеску порошка растертых таблеток массой около 0,5 г вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют примерно 25 мл воды очищенной, перемешивают, доводят объем раствора водой до метки. Аликвотную часть полученного раствора объемом 10 мл помещают в химический стакан вместимостью 50 мл, потенциометрически титруют из микробюретки 0,02 моль/л раствором ОФФ аналогичным образом, как описано в примере 1 (пункт 2).
а
1
2
Т
Результаты анализа: Р (средняя масса 1 таблетки)=3,0010 г, =0,4995 г, V=50 мл, V=10 мл, V=0,48 мл, K=1,00, T=1,761 мг/мл.
Содержание АК в драже «Ревит»:
Согласно ГФ (ГФ СССР, 1968, 10 изд.), содержание АК в 1 таблетке АК с глюкозой должно быть 0,0238-0,0263 г, поэтому полученный результат удовлетворяет фармакопейным требованиям.
Пример 5. Количественное определение АК в плодах шиповника коричного (Rosa majalis)
1. Приготовление раствора титранта ОФФ (0,02 моль/л) и установление его титра (поправочного коэффициента) проводят аналогично примеру 1 (пункт 1). Величина К=1,00.
2. Количественное определение АК в плодах шиповника
Из грубо измельченных плодов шиповника отбирают точную навеску массой около 0,5 г, помещают в ступку, где тщательно растирают со стеклянным порошком, постепенно добавляя 50 мл воды, настаивают 10 мин. Извлечение декантируют, отбирают его аликвотную часть объемом 10 мл, помещают в химический стакан вместимостью 50 мл, титруют из микробюретки 0,02 моль/л раствором ОФФ аналогичным образом, как описано в примере 1 (пункт 2).
а
1
2
T
Результаты анализа: =0,5100 г, V=50 мл, V=10 мл, V=1,85 мл, K=1,00, T=1,761 мг/мл, Р=100%.
Содержание АК в плодах шиповника коричного:
Согласно ГФ (ГФ СССР, 1989, 11 изд., вып. 2), содержание АК в плодах шиповника должно быть не менее 0,2%, поэтому полученный результат удовлетворяет фармакопейным требованиям.
Таким образом, положительный эффект предлагаемого способа заключается в следующем:
o
1
2
1. Заявляемая методика количественного определения АК, в отличие от способа-прототипа, характеризуется специфичностью: способностью однозначно оценить концентрацию АК в присутствии сопутствующих компонентов (действующих (лекарственных) и вспомогательных веществ). При одинаковом содержании АК в модельных смесях с сопутствующими компонентами и без них расход титранта (ОФФ) в обоих случаях одинаков; при наличии только сопутствующих компонентов расхода титранта не происходит. В способе-прототипе, напротив: расход титранта (калия йодата) наблюдается даже в случае отсутствия АК, кроме того, он завышен в смеси, где, наряду с АК, содержатся сопутствующие компоненты. Возможно, причиной этому является более высокое значение Е калия йодата (+1,19 B), вступающего в побочные взаимодействия с другими восстановителями (витаминами A, B, В, глюкозой и др.). Сравнивая с номинальным содержанием АК в модельных смесях, относительная погрешность определения по заявляемому способу составляет 2,9%, по способу-прототипу 11,5%. Специфичность заявляемой методики также подтверждена ее апробацией на различных ЛС промышленного производства (инъекционном растворе, драже, таблетках, плодах шиповника) путем сравнения полученных результатов определения АК с номинальным содержанием АК.
а
2. Заявляемая методика, в отличие от прототипа, характеризуется линейностью - достаточно жесткой зависимостью объема титранта (ОФФ) от концентрации АК, что графическим и расчетным способами подтверждается уравнением линейной регрессии: у=25,674х-4,186 и достаточным значением коэффициента корреляции (0,990), отвечающим фармакопейному условию количественного определения (≥0,99). Методика по способу-прототипу описывается уравнением линейной регрессии: у=51,203х-10,409 (с большими почти в 2 раза значениями углового коэффициента «b» и свободного члена уравнения «») и недостаточным для фармакопейного условия количественного определения значением коэффициента корреляции (0,985).
3. Заявляемая методика характеризуется расширенным по сравнению с фармакопейным требованием ее применимости (80-120% от номинального значения определяемой аналитической характеристики при наличии линейной зависимости) диапазоном аналитической области концентраций АК (50-170%). Поскольку известная методика (способ-прототип) не отвечает условиям линейности, определение для нее аналитической области концентраций АК не представляется целесообразным.
4. Заявляемая методика, в отличие от прототипа, характеризуется правильностью, что подтверждается определением содержания АК при трех уровнях концентраций, отличающихся на 20%: открываемость АК, определяющая правильность методики, составляет 99,6%, что удовлетворяет фармакопейным требованиям (97-103%) для анализируемых концентраций АК). По способу-прототипу открываемость АК составляет 110,0%, что превышает допустимый верхний предел нормы (еще раз подтверждается получение завышенных результатов при применении известной методики).
5. Заявляемая методика, как и известная методика, обладает прецизионностью (воспроизводимостью результатов относительно среднего результата): значение относительного стандартного отклонения находится примерно на одном уровне (1,3-1,4%), не превышающем предельную норму (должно быть ≤±2,7% для анализируемых концентраций АК).
6. Заявляемая методика, в отличие от известной методики, отличается высокой точностью определения содержания АК: несмотря на то, что относительное стандартное отклонение результатов обеих методик примерно одинаковое (1,3%, 1,4%), относительная погрешность определения, оцененная по номинальному содержанию АК, по заявляемой методике (2,9%) в 4 раза ниже, чем по прототипу (11,5%). По-видимому, для способа-прототипа характерно наличие не случайных, а систематических погрешностей, обусловленных протеканием побочных реакций с сопутствующими компонентами.
7. Заявляемая методика отличается устойчивостью титранта (0,02 моль/л раствора ОФФ), при хранении которого в надлежащих условиях в течение наблюдаемого периода (4 месяцев), традиционного для устойчивых титрантов, поправочный коэффициент стабилен (отклонение на 1% при норме до 2%). Кроме того, реакция с предложенным титрантом (ОФФ), в отличие от реакции с применяемым титрантом (калия йодатом), не зависит от рН среды и ионной силы раствора.
8. Заявляемая методика отличается упрощенностью выполнения, не требуя использования никаких вспомогательных реактивов, что характерно для способа-прототипа (растворы хлористоводородной кислоты, калия йодида, крахмала). Кроме того, потенциометрический способ фиксации точки эквивалентности (заявляемый способ), в отличие от индикаторного способа (прототип), позволяет проводить титрование в окрашенных и мутных растворах (исключая фильтрацию взвесей), в растворах с повышенной температурой, снизить относительную погрешность определения АК.