КУЛЬТИВАЦИЯ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В ВОЗДУШНО-ЖИДКОСТНОЙ ЗОНЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ЦЕЛЬЮ ИХ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В ПАНКРЕАТИЧЕСКИЕ ЭНДОКРИННЫЕ КЛЕТКИ

1. Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, из плюрипотентных стволовых клеток, состоящий из следующих стадий:
a. культивирование плюрипотентных стволовых клеток;
b. дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток панкреатических клеток-предшественников передней кишки; и
с. дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем обработки по меньшей мере одной культуральной средой, обогащенной ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или одновременно ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы, и культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
2. Способ по п. 1, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, являются положительными для NKX6.1, PDX1 и НВ9.
3. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А.
4. Способ по п. 3, в котором по меньшей мере 30% полученных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А.
5. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
6. Способ по п. 5, в котором по меньшей мере 30% полученных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
7. Способ по п. 1, где способ также включает дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников
передней кишки, путем обработки средой, обогащенной ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или одновременно ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы, в планарной культуре.
8. Способ по п. 7, где способ также включает дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток, путем обработки средой, обогащенной ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или одновременно ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы, и культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
9. Способ по п. 1, где способ включает обработку средой, обогащенной трииодотиронином и ингибитором ALK5.
10. Способ по п. 1, где способ также культивирование клеток на пористом субстрате.
11. Способ по п. 10, где пористый субстрат не обладает покрытием.
12. Способ по п. 1, где указанный ингибитор ALK5 выбран из группы, состоящей из: ингибитора ALK5 II, ALK5i, SD208, TGF-B ингибитора SB431542, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III.
13. Способ по п. 12, в котором указанный ингибитор ALK5 является ингибитором ALK5 II.
14. Способ по п. 1, где способ также включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, средой, обогащенной ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина,
тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или одновременно ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы.
15. Способ по п. 14, в котором гормон щитовидной железы является трииодотиронином, а ингибитор ALK5 является ингибитором ALK5 II.
16. Способ по п. 15, где среда также обогащена одним или несколькими из следующих компонентов: ретиноевой кислотой, аскорбиновой кислотой, SANT-1 или LDN-193189.
17. Способ по п. 1, где способ повышает экспрессию гормонов поджелудочной железы.
18. Способ по п. 16, где указанный способ снижает экспрессию PTF1a, SOX9, CDX2, ZIC1 и SOX2.
19. Способ по п. 1, где способ увеличивает количество клеток, положительных для NKX6.1, которые со-экспрессируют инсулин, хромогранин-А и одновременно хромогранин-А и инсулин.
20. Способ по п. 1, в котором плюрипотентные стволовые клетки не имеют эмбрионального происхождения.
21. Способ по п. 1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, экспрессируют маркеры, характерные для бета-клеток.
22. Способ созревания в условиях in vivo клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, включающий трансплантацию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, полученные способом по п. 1 от млекопитающего.
23. Способ по п. 22, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А.
24. Способ по п. 22, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
25. Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, включающий дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для
клеток энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем обработки по меньшей мере одной культуральной средой, обогащенной ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или одновременно ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы, и культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
26. Способ по п. 25, где только клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, панкреатические энтодермальные клетки и панкреатические эндокринные клетки-предшественники культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
27. Способ по п. 25, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, являются положительными для NKX6.1, PDX1 и НВ9.
28. Способ по п. 25, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, являются клетками, положительными для одного гормона.
29. Способ по п. 28, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А.
30. Способ по п. 28, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
31. Способ по п. 25, где способ также культивирование клеток на пористом субстрате.
32. Способ по п. 31, где клетки находятся на листе или в агрегатных кластерах на верхней части пористого субстрата.
33. Способ по п. 25, где способ также включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, средой, обогащенной ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или одновременно ингибитором ALK5 и
гормоном щитовидной железы.
34. Способ по п. 33, в котором гормон щитовидной железы является трииодотиронином, а ингибитор ALK5 является ингибитором ALK5 II.
35. Способ по п. 34, где среда также обогащена одним или несколькими из следующих компонентов: ретиноевой кислотой, аскорбиновой кислотой, SANT-1 или LDN-193189.
36. Способ по п. 25, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, экспрессируют маркеры, характерные для бета-клеток.
37. Способ созревания в условиях in vivo клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, включающий трансплантацию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, полученные способом по п. 25, млекопитающему.
38. Способ по п. 37, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А.
39. Способ по п. 37, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
40. Способ включения экспрессии PDX1, NKX6.1 и НВ9 в клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, включающий:
a. культивирование плюрипотентных стволовых клеток;
b. дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток панкреатических клеток-предшественников передней кишки; и
с. дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1 и НВ9, путем обработки средой, обогащенной ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина или смеси перечисленного, или одновременно ингибитором ALK5 и гормоном
щитовидной железы, и культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
41. Способ по п. 40, в котором плюрипотентные стволовые клетки не имеют эмбрионального происхождения.
42. Способ по п. 40, где способ также включает культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток или панкреатических эндокринных клеток-предшественников, в среде, обогащенной трииодотиронином и ингибитором ALK5 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
43. Способ по п. 42, в котором ингибитор ALK5 является ингибитором ALK5 II.
44. Способ по п. 40, где среда также обогащена одним или несколькими из следующих компонентов: ретиноевой кислотой, аскорбиновой кислотой, SANT-1 или LDN-193189.
45. Клеточная культура in vitro для дифференцировки клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, включающая:
а. культивационный сосуд;
b. объем дифференцировочной среды внутри указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда;
с. воздух внутри указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, свободную от указанной среды;
d. пористый субстрат, расположенный в зоне взаимодействия между указанной средой и указанным воздухом; и
е. клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные на поверхности указанного субстрата таким образом, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток.
46. Клеточная культура по п. 45, где указанные клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, экспрессируют маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки.
47. Клеточная культура по п. 45, где указанные клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, экспрессируют маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки.
48. Клеточная культура по п. 45, где указанные клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, экспрессируют маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток.
49. Клеточная культура по п. 45, где указанные клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, экспрессируют маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток-предшественников.
50. Клеточная культура по п. 45, где указанная дифференцировочная среда содержит ростовую среду, обогащенную ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина и смеси вышеперечисленных, или одновременно ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы.
51. Клеточная культура по п. 50, где указанная ростовая среда выбрана из MCDB131 или BLAR.
52. Клеточная культура по п. 51, где указанная ростовая среда является средой BLAR.
53. Клеточная культура по п. 52, где указанная ростовая среда обогащена трииодотиронином и ингибитором ALK5 II.
54. Клеточная культура по п. 46, где указанная дифференцировочная среда обогащена фактором роста, выбранным из FGF7, FGF10 или их сочетания, активатором РКС, выбранным из ТРВ, PDBu, PMA и ILV, и ингибитором рецептора ВМР, выбранного из LDN-193189, Noggin и Chordin.
55. Клеточная культура по п. 54, где указанная ростовая среда выбрана из MCDB131 или BLAR.
56. Клеточная культура по п. 55, где указанная ростовая среда является средой BLAR.
57. Клеточная культура по п. 56, где указанная среда обогащена FGF7, ТРВ и LDN-193189.
58. Клеточная культура по п. 47, где указанная дифференцировочная среда включает ростовую среду, обогащенную ингибитором ALK5 и ингибитором ВМР, выбранным из группы, состоящей из LDN-193189, Noggin и Chordin.
59. Клеточная культура по п. 58, где указанная ростовая среда выбрана из MCDB131 или BLAR.
60. Клеточная культура по п. 59, где указанная ростовая среда является средой BLAR.
61. Клеточная культура по п. 60, где указанная ростовая среда обогащена LDN-193189 и ингибитором ALK5 II.
62. Клеточная культура по п. 48, где указанная дифференцировочная среда содержит ростовую среду, обогащенную ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина и смеси вышеперечисленных, или одновременно ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы.
63. Клеточная культура по п. 62, где указанная ростовая среда выбрана из MCDB131 или BLAR.
64. Клеточная культура по п. 63, где указанная ростовая среда является средой BLAR.
65. Клеточная культура по п. 64, где указанная ростовая среда обогащена трииодотиронином и ингибитором ALK5 II.
66. Клеточная культура по п. 49, где указанная дифференцировочная среда содержит ростовую среду, обогащенную ингибитором ALK5 или гормоном щитовидной железы, выбранным из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина и смеси вышеперечисленных, или одновременно ингибитором ALK5 и гормоном щитовидной железы.
67. Клеточная культура по п. 66, где указанная ростовая среда выбрана из MCDB131 или BLAR.
68. Клеточная культура по п. 67, где указанная ростовая среда является средой BLAR.
69. Клеточная культура по п. 68, где указанная ростовая среда обогащена трииодотиронином и ингибитором ALK5 II.
70. Клеточная культура по п. 53, где ростовая среда также обогащена одним или несколькими из следующих компонентов:
а. сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина;
b. SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1;
c. ингибитор рецептора ВМР, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin;
d. PKC активатор, выбранный из TPB, PDBu, PMA, и ILV;
е. фактор роста фибробластов, выбранный из FGF7 или FGF10;
f. ретиноевая кислота;
g. аскорбиновая кислота;
h. гепарин; и
i. сульфат цинка.
71. Клеточная культура по п. 61, где среда также обогащена одним или несколькими из следующих компонентов:
а. сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина;
b. SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1;
с. гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина и их сочетаний;
d. PKC активатор, выбранный из TPB, PDBu, PMA, и ILV;
е. фактор роста фибробластов, выбранный из FGF7 или FGF10;
f. ретиноевая кислота;
g. аскорбиновая кислота;
h. гепарин; и
i. сульфат цинка.
72. Клеточная культура по п. 65, где среда также обогащена одним или несколькими из следующих компонентов:
а. сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина;
b. SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1;
c. ингибитор рецептора ВМР, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin;
d. PKC активатор, выбранный из TPB, PDBu, PMA, и ILV;
е. фактор роста фибробластов, выбранный из FGF7 или FGF10;
f. ретиноевая кислота;
g. аскорбиновая кислота;
h. гепарин; и
i. сульфат цинка.
73. Клеточная культура по п. 69, где среда также
обогащена одним или несколькими из следующих компонентов:
а. сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина;
b. SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1;
c. ингибитор рецептора ВМР, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin;
d. PKC активатор, выбранный из TPB, PDBu, PMA, и ILV;
е. фактор роста фибробластов, выбранный из FGF7 или FGF10;
f. ретиноевая кислота;
g. аскорбиновая кислота;
h. гепарин; и
i. сульфат цинка.
74. Клеточная культура по п. 70, где указанная среда обогащена ретиноевой кислотой, аскорбиновой кислотой и SANT-1.
75. Клеточная культура по п. 71, где указанная среда обогащена ретиноевой кислотой, гепарином, SANT-1 и сульфатом цинка.
76. Клеточная культура по п. 72, где указанная среда обогащена LDN-193189, ретиноевой кислотой, аскорбиновой кислотой и SANT-1.
77. Клеточная культура по п. 73, где указанная среда обогащена LDN-193189, SANT-1 и гепарином.
78. Клеточная культура по п. 73, где по меньшей мере 30% полученных клеток экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
79. Клеточная культура по п. 73, где по меньшей мере 30% полученных клеток экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А.
80. Среда, используемая для индуцирования дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, содержащая ростовую среду, обогащенную следующими компонентами:
а. ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из: ингибитора ALK5 II, ALK5i, SD208, TGF-B ингибитора SB431542, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитора рецептора TGF-βV, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III; и
b. ингибитор рецептора ВМР, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin.
81. Среда по п. 80, также содержащая SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранной из SANT-1 или HPI-1.
82. Среда по п. 81, также содержащая ретиноевую кислоту.
83. Среда по п. 82, содержащая ингибитор ALK5 II, SANT-1, LDN-193189 и ретиноевую кислоту.
84. Среда по п. 83, также содержащая один или несколько обогатителей, выбранных из:
а. сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина;
b. гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина и их сочетаний;
с. аскорбиновая кислота;
d. гепарин; и
e. сульфат цинка.
85. Дифференцировочная среда по п. 83, где указанная ростовая среда выбрана из MCDB-131 или BLAR.
86. Дифференцировочная среда по п. 84, где указанная ростовая среда обогащена ингибитором ALK5 II, SANT-1, LDN-193189, гепарином, сульфатом цинка и ретиноевой кислотой.
87. Среда, используемая для индуцирования дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, содержащая ростовую среду, обогащенную следующими компонентами:
а. ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из: ингибитора ALK5 II, ALK5i, SD208, TGF-B ингибитора SB431542, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII,
ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III;
b. гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из трииодотиронина, тироксина, аналогов трииодотиронина, аналогов тироксина и их сочетаний; и
с. SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1.
88. Среда по п. 87, также содержащая ретиноевую кислоту.
89. Среда по п. 88, также содержащая аскорбиновую кислоту.
90. Среда по п. 87, также содержащая один или несколько обогатителей, выбранных из:
a. ингибитор рецептора ВМР, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin;
b. гепарин; и
c. сульфат цинка.
91. Дифференцировочная среда по п. 90, где указанная ростовая среда выбрана из MCDB-131 или BLAR.
92. Дифференцировочная среда по п. 91, где указанная ростовая среда обогащена ингибитором ALK5 II, LDN-139189, сульфатом цинка трииодотиронином, SANT-1 и гепарином.
93. Клеточная культура in vitro, содержащая популяцию дифференцированных плюрипотентных стволовых клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, где по меньшей мере 30% указанных дифференцированных клеток экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
94. Клеточная культура in vitro, содержащая популяцию дифференцированных плюрипотентных стволовых клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, где по меньшей мере 30% указанных дифференцированных клеток экспрессируют NKX6.1 и хромагранин.
95. Способ скрининга композиций относительно воздействия на
производство гормона поджелудочной железы, включающий культивирование клеток согласно способу по п. 1 в присутствии тестовой композиции, и измерение воздействия указанной тестовой композиции на производство гормонов поджелудочной железы.
96. Способ по п. 95, в котором указанный гормон поджелудочной железы является инсулином.