СПОСОБ ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИИ ПОВЕРХНОСТИ МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ
METHOD FOR FUNCTIONALISING SURFACE OF MAGNETIC NANOPARTICLES

Изобретение относится к области молекулярной иммунобиотехнологии и может быть использовано в производстве высокочувствительных тест-систем для (качественного и полуколичественного) определения любых соединений, способных к стереоспецифическим взаимодействиям (антигенов, антител, нуклеиновых кислот, биологически активных макромолекул), а также в технологии изготовления функционально модифицированных частиц, пригодных для использования в фармакологии, косметологии, медицине.
К настоящему времени достаточно хорошо известны системы анализа с прямым мечением специфичных аналиту соединений (анти-аналитов) оптически плотными частицами или водорастворимыми цветными полимерами различной природы и размеров. Среди таких меток - латексы, в том числе цветные (Tarcha et al., Abbot Labs., Eur.pat.appl. 89116594.6), эритроциты (Guesdon J-L., AvrameasS., Ann. Immunol., 1980, v.131 C, p.389-396), неметаллические коллоиды серы, селена, теллура (Yost et al., Eur. pat. appl. 88110459.0), полимеризованные красители Конго красный, Трипановый голубой, Lissamine blue (Henry Robert P., US Pat. 4.452.886), коллоидное золото (Roth J., Heitz P.U., Immunolabeling with the Protein A - Gold Technique: An Overview, Ultrastructural Pathology, 1989, 13:467-484.). Использование данных меток позволяет визуально определять присутствие аналита как в гомогенных системах анализа (без разделения реагирующих компонентов) - например, по агглютинации довольно крупных частиц (с размерами от 0,2 до нескольких микрометров) или изменению спектральных характеристик (цвета) специфически агглютинирующих коллоидов, так и в многочисленных гетерогенных системах - ЭритроИммуноАдсорбции и, более широко, Седиментационно-Адсорбционном (Иммуно)Анализе; дот-, Вестерн-, Саузерн-, Нозерн-блотинге; иммуно- и гибридофильтрации (Flow-Through анализах), иммуномиграции (иммунохроматографии) и ряде других - по окрашиванию зоны специфического связывания аналита на непористом или пористом твердофазном носителе. Несмотря на возможность количественной регистрации с использованием простых колориметров, рефлектометров, денситометров, основным преимуществом перечисленных методов является прямое визуальное определение аналита, что условно выделяет их в группу так называемых безынструментальных методов.
Наиболее близким к заявляемому объекту по технической сущности и достигаемому результату является способ получения конъюгатов на основе частиц коллоидного углерода (Д.Ю. Плаксин, М.Б. Раев, Е.Т. Громаковская. Способ стереоспецифического анализа и способ получения конъюгата для стереоспецифического анализа. Патент РФ №2089912 от 10.09.1997).
В прототипе задачу повышения надежности анализа и стабильности используемых в анализе детектирующих реагентов решают путем ковалентного конъюгирования аффинного соединения (анти-аналита) с частицами коллоидного углерода. Для этого частицы вначале покрывают водорастворимым полимером, который является инертным амфипатическим соединением, способным относительно прочно сорбироваться на поверхности частиц. Сорбция полимера позволяет получить стабильный в растворах суспензоид. Сорбированный полимер экспонирует в водную фазу функциональные группы, способные ковалентно реагировать с гомо- и/или гетеробифункциональными конъюгирующими соединениями. Последующая обработка полученного комплекса бифункциональным реагентом, взятым в большом молярном избытке по отношению к функциональным группам полимера, приводит к ковалентной сшивке между сорбированными молекулами полимера и одновременно к внедрению на поверхность комплекса реакционно-способных групп бифункционального реагента. Следующим этапом является освобождение активированной метки от избытка конъюгирующего реагента. Последующее соединение с интактным (немодифицированным) анти-аналитом (аффинным соединением) завершается ковалентной пришивкой молекул анти-аналита к поверхности углеродной метки. В результате заявляемый способ позволяет получать конъюгаты прочной ковалентной структуры, которые устойчивы в растворах, в том числе в присутствии высоких концентраций детергентов.
Вместе с тем многоэтапный характер конъгирования создает ряд технологических сложностей. В первую очередь это касается необходимости проведения ряда хроматографических процедур очистки: от избытка сорбируемого полимера на первом этапе, и, как следствие, необходимость концентрирования; от избытка активирующего бифункционального реагента, за которым вновь следует процедура концентрирования, от несвязавшихся молекул анти-аналита. Подобная многоэтапность не только удлиняет описанный в прототипе способ, но и делает его трудоемким, малотехнологичным, затратным.
Задачей создания изобретения является разработка способа получения прочных функциональных конъюгатов, основой которых являются магнитные наночастицы.
Основой для решения поставленной задачи является применение магнитных полей, создаваемых вращающимся и/или неподвижным магнитами.
Описание разработанного способа
Поставленную задачу решают путем введения магнитных наночастиц в раствор полимера, сорбируемого на их поверхности, в непосредственной близости от вращающегося магнита. При этом частицы вводимого материала приобретают вращательное движение, что способствует практически мгновенной пептизации частиц. Введение в суспензию пептизированных частиц бифункционального реагента способствует активации поверхности для дальнейшего конъюгирования частиц с молекулами аффинных соединений (анти-аналитов). Единственной промежуточной стадией является удаление избытка сорбируемого полимера и бифункционального реагента, которое осуществляется в ходе последовательного осаждения-ресуспендирования частиц на неподвижном магните. Последняя процедура повторяется после конъюгирования активированных частиц с молекулами анти-аналита.
Заявляемый способ конъгирования представляет возможность для очень широкого выбора конкретных сорбируемых полимеров и активирующих/конъюгирующих реагентов. Данное обстоятельство вынуждает заявителя представить формулу изобретения, составленную в принципиальных терминах, попытка конкретизации которых неминуемо привела бы к сужению области действия заявляемого объекта.
В представленных ниже конкретных примерах описан способ получения детектирующих конъюгатов, осуществляемый с использованием глутарового альдегида в качестве сшивающего (гомо)бифункционального реагента. Использование данного вещества не является принципиальным для осуществления способа. Вместо глутаральдегида могут быть использованы другие известные гомо- и гетеробифункциональные соединения, которые в реакциях второго порядка способны реагировать предпочтительно с наиболее универсально представленными в возможных анти-аналитах и анти-анти-аналитах первичными аминогруппами (хотя, для ковалентного конъюгирования с суспензоидными метками таких анти-аналитов, как Fab'-фрагменты антител, более оптимальными могут оказаться, например, малеимидные реагенты, участвующие в реакциях тиол-дисульфидного обмена).
Использование глутаральдегида является предпочтительным, поскольку дополнительно отвечает требованию универсальности предлагаемого способа и является гомо-бифункциональным реагентом, относительно специфично реагирующим с первичными аминогруппами белков. Кроме того, немаловажным обстоятельством является доступность и практически самая низкая стоимость глутаральдегида, что также выгодно отличает его от возможных других, использование которых в рамках предлагаемого способа с экономической точки зрения, очевидно, является менее выгодной возможностью.
ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Нижеследующие примеры приводятся только с целью демонстрации возможностей настоящего изобретения, но никоим образом не ограничивают как спектр возможных технологических приемов синтеза конкретных реагентов, так и область возможного применения изобретения в целом.
Приводимые в примерах конкретные количественные параметры, даже в области указываемых диапазонов, не фиксируются формулой изобретения, потому что не являются принципиальными условиями осуществления заявляемого способа.
1. Получение активированных магнитных наночастиц.
К 20 мл раствора бычьего сывороточного альбумина (1-50 мг/мл в 0,01-0,2М фосфатном буферном растворе (ФБР) pH 6,0-8,5) добавляют 1-2 грамма магнитных частиц. Смешивание осуществляют в емкости, предварительно помещенной над вращающимся с максимальной скоростью элементом магнитной мешалки. За счет вращения самих частиц время их пептизации составляет несколько минут. В суспензию пептизированных частиц вносят равный объем глутарового альдегида в концентрации 10-25% и через 40-60 минут останавливают вращение магнита. За счет магнитного поля частицы оседают на дно в течение 5 минут, после чего удаляют супернатант и вносят ФБР. Включение вращения магнита приводит к быстрому ресуспендированию частиц в буферном растворе. Процедуру промывки повторяют три раза, что приводит к исчерпывающему освобождению от избытка полимера и бифункционального реагента.
2. Получение конъюгатов магнитных наночастиц с анти-аналитами (Стрептавидином, Белком G, Антителами)
После последнего деконтирования активированные частицы, ресуспендированные в 4,5 мл ФБР, вносят в 0,5 мл ФБР, содержащего 5 мг моноклональных антител к альфа-фетопротеину (МкАтАФП) человека. Процедуру производят в магнитном поле вращающегося магнита. Время конъюгирования составляет 30-60 минут, после чего осуществляют удаление избытка анти-аналита трехкратной промывкой частиц в ходе их оседания-ресуспендирования, используя неподвижный магнит. Отмытые частицы ресуспендируют в ФБР, содержащем 20% глицерина, 1% БСА и 0,1% азида натрия.
Конъюгаты углеродных частиц с Белком G, стрептавидином, другими антителами получают аналогичным способом.
Эффективность реагентов, полученных при помощи разработанной технологии, была продемонстрирована в аналитических моделях в сравнении с аналогичными по аффинным соединениям реагентами, метками в которых были немагнитные углеродные частицы с размером 160 нм.
Пример 1. Двухсайтное определение АФП в сыворотке крови беременных женщин на непористой твердой фазе с использованием конъюгата МкАтАФП - МЧ.
В качестве твердофазного реагента использовали планшеты для серийных разведении из полистирола, внутреннюю поверхность лунок которых сенсибилизировали моноклональными антителами к АФП человека, сорбированными в виде дотов из капель по 5 микролитров из ФБР с концентрацией белка 0,01 мг/мл. В лунки вносили сыворотку крови беременной женщины (срок беременности - середина третьего триместра) в серийном десятикратном разведении в ФБР, содержащем 0,05% Твин 20 (ФБРТ). После 30-минутной инкубации в лунки, промытые ФБРТ, вносили конъюгат МкАтАФП-МЧ и помещали планшет на неподвижный магнит. Результаты анализа наблюдали через 15 минут в виде окрашенных пятен в местах сорбции первых антител с постепенным гашением окраски по мере разведения сыворотки. Последнюю визуализируемую точку наблюдали при разведении сыворотки в 1000 раз.
Аналогичное исследование с детекцией специфического комплекса конъюгатом МкАтАФП-углерод продемонстрировал чувствительность определения на уровне 100-кратного разведения сыворотки, что на порядок ниже чувствительности предлагаемого способа.
Пример 2. Прямое определение трофобластического β-1-гликопротеина (ТБГ) в сыворотке крови беременных женщин на непористой твердой фазе с использованием конъюгата МкАтТБГ - МЧ.
В качестве твердой фазы использовали планшеты для серийных разведений из полистирола, на внутреннюю поверхность лунок которых сорбировали сыворотку крови беременной женщины (срок беременности - середина третьего триместра) в виде дотов из капель по 5 микролитров из 0,02 М карбонатно-бикарбонатного буфера pH 9,6 в серийном десятикратном разведении. После 30-минутной инкубации капли аспирировали, а в лунки, промытые ФБРТ, вносили конъюгат МкАтТБГ-МЧ и помещали планшет на неподвижный магнит. Результаты анализа наблюдали через 15 минут в виде окрашенных пятен в местах сорбции исследуемых проб с постепенным гашением окраски по мере разведения сыворотки. Последнюю визуализируемую точку наблюдали при разведении сыворотки в 100000 раз.
Детекция конъюгатом МкАтТБГ-углерод продемонстрировала чувствительность определения белка в разведении сыворотки в 10000 раз.
Пример 3. Прямое определение иммуноглобулинов G (IgG) с использованием конъюгата G белок - МЧ на непористой твердой фазе.
В качестве твердой фазы использовали планшеты для серийных разведений из полистирола, на внутреннюю поверхность лунок которых сорбировали IgG человека в виде дотов из капель по 5 микролитров из 0,02 М карбонатно-бикарбонатного буфера рН 9,6 в серийном двукратном разведении. После 30-минутной инкубации капли аспирировали, а в лунки, промытые ФБРТ, вносили конъюгат G белок-МЧ и помещали планшет на неподвижный магнит. Результаты анализа наблюдали через 15 минут в виде окрашенных пятен в местах сорбции исследуемых проб с постепенным гашением окраски по мере разведения сыворотки. Концентрация последней визуализируемой точки составляла 7,5 нг/мл.
При детекции конъюгатом G белок-углерод концентрация последней визуализируемой точки составила 32 нг/мл, что свидетельствует о четырехкратной разнице в чувствительности в пользу предлагаемого способа.
Пример 4. Прямое определение биотинилированных белков с использованием конъюгата Стрептавидин - МЧ на непористой твердой фазе.
В качестве твердой фазы использовали планшеты для серийных разведений из полистирола, на внутреннюю поверхность лунок которых сорбировали биотинилированный БСА в виде дотов из капель по 5 микролитров из 0,02 М карбонатно-бикарбонатного буфера pH 9,6 в серийном двукратном разведении. После 30-минутной инкубации капли аспирировали, а в лунки, промытые ФБРТ, вносили конъюгат Стрептавидин-МЧ и помещали планшет на неподвижный магнит. Результаты анализа наблюдали через 15 минут в виде окрашенных пятен в местах сорбции исследуемых проб с постепенным гашением окраски по мере разведения сыворотки. Концентрация последней визуализируемой точки составляла 1 нг/мл.
Чувствительность определения биотинилированного БСА при детекции конъюгатом Стрептавидин-углерод на порядок уступает предлагаемому способу и составила 10 нг/мл.
С целью предварительной оценки стабильности полученных реагентов четыре конъюгата были помещены на хранение в течение трех месяцев при температуре 22°C. Повторное исследование детектирующих свойств, в аранжировках описанных выше примеров продемонстрировали те же аналитические качества. Это свидетельствует о прочной и, следовательно, стабильной структуре синтезированных реагентов, что, в свою очередь, гарантирует надежность и воспроизводимость системы тестирования.
Технологический результат от использования предлагаемого изобретения заключается, прежде всего, в том, что технология получения конъюгатов магнитных частиц независима от уникального или дорогостоящего оборудования и объективно дефицитных или дорогих реагентов. Предлагаемые конъюгаты могут служить основой создания эффективных безынструментальных систем для упрощенного диагностического тестирования с высокой чувствительностью и надежностью. В качестве соединений, придающих функциональные качества МЧ, могут быть использованы практически любые биологически активные молекулы, несущие в своей структуре хотя бы одну свободную аминогруппу. Применение разработанного способа может найти свою реализацию не только в области биотехнологии (сепарирование белков, нуклеиновых кислот, клеток и т.д.), но и в решении таких актуальных проблем, как адресная доставка лекарств, контрастирование в МРТ и др. Широкомасштабное применение различных магнитных носителей с целью адресной доставки биологически активных соединений в современной практике ограничивается нестабильностью конъюгатов. В основе этой нестабильности лежат прежде всего проблемы, связанные с природой связи биомолекул с частицами. В большинстве случаев - это нековалентные связи, что и является основным ограничением в применении подобных конъюгатов. Предлагаемая разработка решает проблему нестабильности, в существенной степени обеспечивая принцип трансляционности и перспективность применения ее в реальной практике.