Янтарная кислота и её соли как индивидуальные антиоксиданты и генопротекторы

ТЕХНОЛОГИЯ И АППАРАТЫ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

УДК 644

Е. В. Никитина, Н. К. Романова

ЯНТАРНАЯ КИСЛОТА И ЕЁ СОЛИ КАК ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ

АНТИОКСИДАНТЫ И ГЕНОПРОТЕКТОРЫ

Ключевые слова: янтарная кислота и её соли, антиоксиданты, генопротекторы, пищевая

промышленность.

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что янтарная кислота её соли (Na, K и Ca) способны выступать восстанавливающими и ради-кал-акцептирующими агентами как индивидуальные вещества. Кроме того, исследованные сукцинаты обладали более эффективными ДНК-протективными свойствами по сравнению с янтарной кислотой. У всех тестируемых веществ отсутствовал генотоксический потенциал.

Key words: succinic acid and its salts (Na, K and Ca), antioxidants, genoprotectors, food

industry.

Present researches indicates that succinic acid and its salts (Na, K and Ca) capable to be reducing and radical- scavenging agents like individual substances. In addition studied salts of succinic acid possessed more effective DNA-protective properties as compared with succinic acid, genotoxic potential was not extend at all tested substances.

Основная причина патологических процессов в человеческом организме, вызывающих преждевременное старение и развитие многих болезней - избыточное накопление в организме кислородных свободных радикалов, то есть оксидантный стресс. За счет вредного воздействия свободных радикалов повреждаются стенки сосудов, мембраны, окисляются липиды. Концентрация свободных радикалов возрастает за счет снижения естественной антиоксидантной системы человека, вызванной воздействием радиации, УФ-облучения, курения, алкоголизма, некоторых лекарств, постоянных стрессов, некачественной загрязненной пищи.

Вредное воздействие свободных радикалов можно уменьшить систематическим употреблением пищевых продуктов и напитков, биологически активных добавок, обладающих высокой антиоксидантной активностью [1]. Янтарная кислота - универсальный промежуточный продукт обмена, образующимся в цикле трикарбоновых кислот, куда попадают двууглеродные молекулы ацетила из обменных реакций углеводов, белков и липидов. В физиологических условиях они диссоциированы в виде аниона - сукцината.

За последние годы изучена возможность и установлена эффективность его применения для профилактики и лечения заболеваний различных органов и систем человека. В основе лечебно-профилактического действия лежит усиление клеточного дыхания и транспорта ионов через клеточную стенку, стабилизация белкового обмена. Преимуществом этих естественных метаболитов является то, что действие их наиболее выражено при

патологических состояниях, в которых они наиболее быстро оптимизируют работу организма.

Соли янтарной кислоты применяют для лечения и профилактики заболеваний сердечно-сосудистой системы. Получен выраженный положительный эффект при атеросклеротических поражениях сосудов за счет участия сукцинатов в окислении жирных кислот, что снижает образование избыточных количеств холестерина. Соли янтарной кислоты предотвращают потерю кальция клетками [2].

Соли янтарной кислоты могут применяться в детском возрасте, т.к. являются нетоксичными, не вызывают аллергических реакций, она полностью идентична природному соединению, образующемуся в организме человека.

Причинами стимулирующего действия сукцината на клетку может быть вовлечение её как дополнительного энергетического субстрата в метаболизм, действие её как физиологически активного вещества, вовлекающего в ответную реакцию плазмалемму клетки [3]. Янтарная кислота известна своим влиянием на растения, показано увеличение прироста биомассы проростков пшеницы, картофеля, огурцов, валерианы, стимулируется рост корневой системы, улучшается всхожесть и урожайность [4]. Использование небольших доз (10 мг/л) янтарной кислоты переводит энергетический обмен в растениях в новое стационарное состояние, в котором метаболические процессы протекают интенсивнее [5].

Несмотря на известность положительных эффектов янтарной кислоты на организм человека как симулятора ферментных антиоксидантных систем, нет сведений о собственном антиоксидантном и генетически защитном потенциале сукцинатов и его солей. Целью работы было провести сравнительный анализ свойств янтарной кислоты и ее солей (Na, К, Са) как антиоксидантов и генопротекторов.

Экспериментальная часть

Янтарная кислота и её соли (Na, К, Са) синтезированы в Казанском институте органической химии и физики РАН. Водные растворы готовили на основе дистиллированный воды в концентрации 0.01 и 0.001%.

Восстановительная сила. Определение восстановительной силы проводили согласно Ler-tittikul с соавторами [6]. Один мл исследуемого раствора смешивали с 1 мл 0.2 М калий-натриевого фосфатного буфера (рН 6.5) и 1 мл 1% феррицианида калия. Реакционную смесь инкубировали 20 мин при 50 0С, после чего добавляли 1 мл 10% трихлоруксусной кислоты. Смесь центрифугировали при 750g 10 мин при комнатной температуре. К супернатанту (1 мл) добавляли 1 мл дистилированной воды и 200 мкл 0.1% FeCl3. Контроль готовили аналогично, заменяя 1% фер-рицианид калия на дистиллированную воду. Абсорбцию реакционной смеси измеряли при 700 нм. Редуцирующую силу выражали как увеличение абсорбции при 700 нм относительно контроля.

Радикал-связывающая активность. Метод определения активности связывания свободных радикалов с помощью ABTS (2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолино)-6-сульфоновая кислота) по Sun с соавторами в нашей модификации [7]. ABTS* синтезируется при добавлении K2S2O8 к ABTS. Реакционная смесь содержали 0.5 мл K-Na-фосфатный буфер (0,01 мМ, рН=7.4), 0.1 мл ABTS и 0.1 мл исследуемых растворов. Адсорбцию измеряли при 734 нм. Активность по связыванию свободных радикалов сукцинатов в отсутствии и присутствии витамина С считали по проценту связанного свободного радикала при комнатной температуре через 20 сек с начала смешивания растворов и через 20 мин.

Анализ генотоксических и генопротекторных свойств. ДНК-повреждающий тест позволяет прояснить многие биологические и молекулярные механизмы генотоксического генопротекторного действия веществ. В работе использовали суспензионную модификацию метода [8]. ДНК-повреждающее действие было протестировано на следующих штаммах Escherichia coli: Wp - дикий тип (работают все системы репарации); PolA- - polAI- (нарушен синтез ДНК-полимеразы I);

иУГА- - иУГА155- (нарушена эксцизионная репарация); РвсА- - ГвеД- (нарушена постреплекатив-ная репарация, общая рекомбинация). Принцип метода заключается в селективном ингибировании роста мутагенных штаммов по сравнению с диким типом.

Результаты исследований и обсуждений

Анализ восстановительной силы. Основное действие янтарной кислоты на клетку как антиоксиданта заключается в снижении интенсивности протекания перекисного окисления липидов, повышении содержания восстановленного глутатиона, восстановлении ти-ол-дисульфидного статуса клетки, повышении активности антиоксидантных ферментов (каталазы, и глутатион-пероксидазы) [9].

В работе был проведен скрининг собственной восстановительной силы сукцината и ряда его солей, которая отражает способность веществ, отдавать электроны, проявляя ан-тиоксидантные свойства. Анализ восстановительной силы заключается в определении способности исследуемых веществ, переводить Рв3+ в Рв2+ .

В концентрации 0.01 % наибольшей восстановительной силой обладала натриевая соль янтарной кислоты. Остальные из исследуемых веществ: сукцинат, сукцинат калия, сукцинат кальция, обладали меньшей активностью 0.4-0.5 опт.ед. (рис. 1) . С уменьшением концентрации исследуемых веществ до 0.001 % восстановительная сила янтарной кислоты возрастало до 0.12 опт.ед., а сукцината К, Са до 0.09 опт.ед., что касается сукцината Ыа, то восстановительная сила не изменилась (рис. 1). Большая восстановительная сила сукцина-тов в меньшей концентрации согласуется с данными, полученными ранее в экспериментах с растениями. Янтарная кислота действовала эффективнее на рост и развитие различных сельскохозяйственных культур в концентрации 0.001 % в большей степени чем в концентрации 0.01 или 1 % [5].

Янтарная Сукцинат На Сукцинат К Сукцинат С а к и сл о та

Рис. 1 - Восстановительная сила янтарной кислоты и её солей

Анализ антирадикальной активности. В процессе жизнедеятельности живого организма всегда происходит синтез реакционноспособных интермедиатов, в том числе свободных радикалов. Известно, что сукцинаты способные ускорять ферментных системы живой клетки, ответственны за детоксикацию подобных соединений [9,10].

Однако неизвестно, способна ли сама янтарная кислота или её соли связывать реак-ционнособоные радикалы. Полезность янтарной кислоты может быть обусловлена способностью, связывать свободные радикалы, в том числе и в организме человека.

Анализ антирадикальной активности показал, что собственно янтарная кислота независимо от концентрации проявляет низкую антирадикальную активность. В 2-3 раза большую активность проявляют соли янтарной кислоты. Особенно активной оказалась соль К в концентрации 0.001 % (рис. 2).

Янтарная Сукцинат Na Сукцинат К Сукцинат Са кислота

Рис. 2 - Радикал-акцепторная активность янтарной кислоты и её солей

ДНК-повреждающие и протективные свойства янтарной кислоты и ее солей. ДНК-повреждающую активность исследовали на штаммах Е. соїі мутантных по различным системам репарации. Как и следовало ожидать, по результатам анализа ДНК-повреждающей активности выявлено, что ни одно из используемых веществ не проявляло ДНК-повреждающие действия, индекс выживаемости был выше 90%.

Таблица 1 - ДНК-повреждающая активность янтарной кислоты и её солей

Концентрация, 0,01% Мутантные штаммы Е.соїі

Rec А- Pol А- Uvr А-

Янтарная кислота 92 ІІ4 І0З

Сукцинат Na ІЗІ 2ІЗ І2З

Сукцинат K ІЗІ І46 І 24

Сукцинат Ca ІЗ0 І2І І05

Концентрация, 0,001%

Янтарная кислота ІІЗ І4З ІІ4

Сукцинат Na ІЗ0 І25 ІІ0

Сукцинат K І80 І 67 І 92

Сукцинат Ca ІІ2 І75 ІЗ4

Ранее показано, что фармацевтический препарат «Реамберин», главным действующим веществом которого является янтарная кислота, не обладает мутагенным действием в тесте Эймса в концентрации 0.1-1000 мкл/чашку [11]. Кроме того, янтарная кислота относит-

ся к веществам 5 класса опасности, то есть практически нетоксична, является естественным метаболитом. Летальная доза натриевой соли янтарной кислоты больше на 8% чем у хлорида натрия и составляет 3.16 мкг-экв/кг (4.3 г/кг) при внутрибрюшинном введении [12].

Анализ ДНК-протективной активности показал, что наибольшей ДНК-защитной активностью обладали тестируемые соли янтарной кислоты, в этих случаях полностью снимался генотоксический эффект фурацилина. Янтарная кислота в концентрации 0.01 % обладала наименьшей активностью защищать генетический аппарат (рис.3).

Е. соНЕйсА-

Янтарная Сукцинаг Сукцинаг К Сукцинат Фурацилин

кислста Na Са

Янтарная Сукцинаг Сукцинаг К Сукцинат Фурацилин кислота Na Са

Е. coliUviA-

Янтарная Сукцинаг Сукцинаг К Сукцинат Фурацилин

кислста Na Са

Рис. 3 - Генопротекторная активность янтарной кислоты и её солей на мутантных штаммах Escherichia coli

Противоположную картину наблюдали при снижении концентрации исследуемых веществ в 10 раз. Янтарная кислота проявляла в этом случае наибольшую ДНК-защитную активность (рис. 3), исчезало генотоксическое действие фурацилина на все используемые дефектные штаммы. Соли Na и Са при концентрации 0, 001% незначительно снимали ДНК-повреждающий прессинг фурацилина в отношении штамма E.coli Rec А. Индекс выживаемости штаммов кишечной палочки, с дефектными системами эксцизионной репарацией и полимеразой I, в присутствии фурацилина и солей сукцината был сравним с индексом в присутствии только фурацилина.

Ранее было показано, что янтарная кислота является перспективным геропротекто-ром класса антиоксидантов, что проявляется в опытах на животных увеличением максимальной продолжительности жизни и значительным снижением развития спонтанных опухолей [13]. Эксперименты над эукариотическими организмами показали повышение резистентности при интоксикациях, радиозащитных свойств при терапии янтарной кислотой и её натриевой солью. Реализация генопротекторных свойств сукцинатов в случае с прокариотическим тест-объектом как кишечная палочка, может состоять в их индуцирующем действии на биосинтез белка. Можно предположить, что происходила интенсификация синтеза ферментов недефектных систем репарации у используемых штаммов Escherichia coli, то есть проявлялась усиленная компенсаторная реакция под воздействием сукцинатов.

Pol А-  Rec А-  Uvr А-

Рис. 4 - ДНК-протективное действие культуральной жидкости с добавлением феноза-на натрия (А) и фенозана калия (Б), после культивирования дрожжей на синтетической среде

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что янтарная кислота способна выступать восстанавливающем и радикал-акцептирующим агентом как индивидуальное вещества, а не только как стимулятор ферментных систем, ответственных за антиоксидантную защиту. Кроме того, сукцинаты обладают эффективными ДНК-протективными свойствами при отсутствии генотоксичности. Данные обстоятельства по-

З80

зволяют рекомендовать к использованию янтарную кислоту и её соли в качестве пищевых добавок в малых дозах в продуктах профилактического и функционального питания, в настоящее время уже рекомендавано к использованию и другие препараты с выраженным антиоксидантным действием [14].

Литература

1. Орлова, О. А. В поиске натуральных питательных веществ, антиоксиданты на рынке функциональных продуктов / О. А. Орлова // Пищевая промышленность. - 2007. - № 11. - С. 10-11.

2. Налетова, А. В. Экология человека: пищевые технологии и продукты на пороге XXI века / А. В. Налетова // V Международный симпозиум. Пятигорск. - 1997. - С. 24-26.

3. Тарчевский, И. А. О вероятных причинах активирующего действия янтарной кислоты на растения / И. А. Тарчевский // Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве: сб. научн. статей. - Пущинский научный центр РАН. - 1996. - С. 217-219.

4. Андрианова, Ю. Е. Влияние янтарной кислоты на продуктивность сельскохозяйственных растений и рост биотехнологических ценных культур / Ю. Е. Андрианова // Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве: сб. научн. статей. Пущинский научный центр РАН. - 1996. - С. 219-231.

5. Карташова, И. М. Влияние янтарной кислоты на некоторые фотосинтетические и продукционные процессы в растениях гороха / И. М. Карташова // Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве: сб. научн. статей. - Пущинский научный центр РАН -1996.- С. 240-245.

6. Lertittikul, W. Characteristics and antioxidative activity of Maillard reaction products from a porcine plasma protein-glucose model system as influence by pH / W.Lertittikul, S.Benjakul, M. Tanaka // Food Chemistry. - 2007. - V.100. - P.669-677.

7. Sun, Y. Chemical properties and antioxidative activity of glycated a-lactalbumin with a rare sugar, D-allose, by Mail lard reaction / Y.Sun, S. Hayakawa, S. Puangmanee, K. Izumori // Food Chemistry. -2006. - V.95. - P. 509-517.

8. Slater, E.E. Rapid detection of mutagens and carcinogens. / E.E. Slater, M.D. Anderson, H.S. Rosenk-ranz // Cancer Research - 1971. - V.31. - P.970-973.

9. Ливанов, Г. А. Роль нарушений системы антиоксидантной защиты в формировании критических состояний у пациентов с острыми отравлениями веществами с угнетающим действием на ЦНС и возможности их коррекции препаратов реамберина / Г. А. Ливанов // Реамберин: реальность и перспективы: сб. научн. статей. - СПб. - 2002. - С. 34-44.

10. Румянцева, С. А. Комплексная антиоксидантная терапия реамберином у больных с критическими состояниями неврологического генеза / С. А. Румянцева // Реамберин: реальность и перспективы: сб. научн. статей. СПб. - 2002. - С. 74-98.

11. Оболенский, С. В. Реамберин - новое средство для инфузионной терапии в практике медицины критических состояний / С. В. Оболенский // Реамберин: реальность и перспективы: сб. научн. статей. СПб. - 2002. - С.5-16.

12. Ивницкий, Ю. Янтарная кислота в системе средств метаболической коррекции функционального состояния и резистентности организма. / Ю. Ю. Ивницкий, А. И. Головко, Г. А. Софронов // СПб.: изд-во ГВМУ ВС РФ. - 1998. - 81с.

13. Анисимов, В. Н. Средства профилактики преждевременного старения / В. Н. Анисимов // Успехи геронтологии. - 2000. - № 4. - С.55-74.

14. Никитина, Е. В. Изменение восстановительных и генопротекторных свойств солей фенозана под действием хлебопекарных дрожжей / Е.В. Никитина, О.В. Старовойтова, З.Ш. Мигалеева, О. А. Решетник // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2007. - № 5-6. - С.86-91.

© Е. В. Никитина - канд. биол. наук, доц. каф. технологии пищевых производств КГТУ; Н. К. Романова - канд. техн. наук, доц. той же кафедры, reshetnik@kstu.ru.