ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛАКТОБАКТЕРИЙ
NUTRITIVE MEDIUM FOR EXTRACTION OF LACTOBACTERIA

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при изучении микрофлоры животных, а также бактериологической диагностике дисбактериоза кишечника.
Микрофлора закрытых полостей человека и животных представлена различными видами бактерий, выделение и идентификация которых является сложной, рутинной работой, и чтобы значительно сократить время исследований используются селективные среды.
Для выделения лактобактерий - основных представителей симбионтной микрофлоры предложен ряд питательных сред.
Известна питательная среда для выделения молочнокислых бактерий (Абросимова Н.А., Кушнарева М.В. Питательная среда для выделения молочно-кислых бактерий // Лабораторное дело, 1991, №3, С.78-79) в состав которой входят, г/л:
Сухая питательная среда
для контроля стерильности
33,0
Пептон
20,0
Агар КД
30,0
Глюкоза
18,0
Цитрат аммония
2,0
Калия дигидрофосфат
6,0
Ледяная уксусная кислота
1,32
Раствор солей
5,0
Вода дистиллированная
до 1 л
Раствор солей состоит из, масс.%:
Сульфат магния 7-водный
11,5
Сульфат марганца 4-водный
2,86
Сульфат железа (2) 7-водный
0,68
Дистиллированная вода
остальное
На данной среде хорошо растут различные молочнокислые бактерии, она обладает селективными свойствами, но ее недостатком является многокомпонентность и труднодоступность ряда ингредиентов.
Известна питательная среда для выделения лактобактерий (Пат. РФ №2202609), которая содержит, г/л:
Сернокислый марганец
0,049-0,05
Сернокислый магний
0,19-0,20
L-цистеин солянокислый
0,095-0,10
Калий фосфорнокислый 2-замещенный
1,95-2,0
Пептон
4,9-5,0
Глюкоза
19,8-20,0
Агар-агар
14,9-15,1
Стерильный мел
9,9-10,0
Гидролизат молозивной
казеино-сывороточной массы
остальное
На данной среде хорошо растут лактобактерии, индикация колоний которых осуществляется по расплавлению мела под колонией. Однако эта среда не обладает селективными свойствами, и на ней могут расти любые бактерии, в.ч. кишечная палочка или энтерококки, которые также могут вырабатывать кислоты и обесцвечивать среду под колониями. Она не прозрачная, что затрудняет описание выросших колоний. Кроме того, не всем лабораториям доступен гидролизат молозивной казеино-сывороточной массы.
Известна среда для выделения лактобактерий (Пат. РФ №2213779), состав которой представлен в следующем виде, г/л:
Панкреатический гидролизат казеина сухой
15-30
Экстракт кормовых дрожжей сухой
3-7
Глюкоза
17-25
Цистеин
0,1-0,3
Железо сернокислое 7-водное
0,03-0,06
Магний сернокислый 7-водный
0,6-1,0
Цитрат аммония
1,5-3,5
Калий фосфорнокислый 1-замещенный
4,0-8,0
Натрий лимоннокислый 3-замещенный
6,0-8,5
Натрий уксуснокислый плавленый
7,0-8,0
Агар микробиологический
7-12,0
Поваренная соль
3,0-8,0
Кристалвиолет
0,002-0,0025
Полимиксин М сульфат
0,04-0,06
Вода дистиллированная
остальное
Среда обладает выраженной селективностью, готовится без стерилизации. Однако она имеет фиолетовую окраску, что затрудняет исследование колоний в проходящем свете, ряд компонентов дорогостоящ и труднодоступен.
Известна простая, легко воспроизводимая питательная среда для выделения молочнокислых бактерий (Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М.: Наука, 1975. - С.60-61, прототип). Данная среда состоит из, масс.%:
Растительный отвар (капуста)
10,0
Пептон
1,0
Глюкоза
2,0
Этиловый спирт
8-16
Агар
2,0
Дистиллированная вода
остальное
Недостатком данной среды является слабые ростовые и селективные свойства, в результате чего на ней в равной степени растут бактерии других родов, которые могут подавлять рост молочнокислых бактерий, особенно при их низкой концентрации в исследуемом материале.
Задачей предлагаемого изобретения является получение простой в приготовлении и экономичной питательной среды для выделения молочнокислых бактерий из фекалий животных.
Поставленная задача достигается тем, что предложена питательная среда для выделения лактобактерий, включающая капустный отвар, глюкозу, агар, отличающаяся тем, что в качестве дополнительных источников питания и селективности содержит молочную сыворотку, дрожжевой аутолизат и уксусную кислоту при следующем соотношении компонентов, масс.%:
Молочная сыворотка
9-10,0
Дрожжевой аутолизат
9-10,0
Глюкоза
1,9-2,0
Уксусная кислота 70%
0,14-0,16
Агар
1,8-2,0
Капустный отвар
остальное
Молочную сыворотку получали в условиях лаборатории, для чего в 1 л подогретого до 60-70°C молока с жирностью 2,5% при постоянном помешивании добавляли 2,5-3 мл 70% уксусной кислоты (эссенции), после створаживания сгусток казеина отделяли, а сыворотку фильтровали через ватно-марлевый фильтр и использовали для приготовления среды. Неиспользованный остаток сыворотки можно сохранить, подвергнув его автоклавированию при 115°C в течение 20 мин.
Дрожжевой аутолизат получали по Н.И.Розанову (Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных. М., Гос., из-во с.-х. литературы, 1952. - С.91).
Капустный отвар готовили по Квасникову (Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М.: Наука, 1975. - С.65).
Взятые компоненты питательной среды смешивают в колбе и доводят до кипения и кипятят 2-3 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и автоклавируют 20 мин при 0,5 атм, после остывания среды до 45-50°С в нее вносят уксусную кислоту и разливают в чашки Петри. Готовая для использования среда прозрачная, светло-коричневого цвета, с приятным молочно-растительным с уксусным оттенком запахом, с pH 5,3-5,5.
Новизна заявленного предложения состоит в том, что разработана питательная среда, обладающая выраженными селективными свойствами по отношению к лактобактериям, на которой они дают хороший рост и формируют типичные для них колонии размером 1,5-2 мм. Селективные свойства среды обусловлены содержащейся в ее составе уксусной кислотой,  к которой лактобактерии устойчивы, в то время как другие бактерии (стафилострептококки, энтеробактерии, псевдомонады, бациллы и др.) к этому веществу чувствительны.
Примеры конкретного получения питательной среды для выделения лактобактерии.
В качестве тест-штаммов использовали Lactobacillus plantarum, Escherichia coli и Staphylococcus aureus, выделенных из фекалий телят. Испытуемые культуры по отдельности выращивали на агаровых средах при температуре 37°C в течение 24 ч, после чего по оптическому стандарту мутности №10 готовили 1 млрд взвесь каждого тест-штамма. После этого методом десятикратных серийных разведений в физиологическом растворе довели концентрацию микроорганизмов до 1000 микробных клеток в 1 мл. Из этого разведения отбирали по 0,1 мл и вносили в 3 чашки Петри с питательной средой. Посевы инкубировали в анаэростате с использованием газогенерирующих пакетов «Анаэрогаз» в течение 24 ч при 37°C,                   после чего учитывали количество выросших колоний.
Пример 1. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 7,0; дрожжевой аутолизат 7,0; глюкоза 1,7; уксусная кислота 70% 0,10; агар 1,4; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество колоний лактобактерий составило в среднем 25, эшерихий  54 и стафилококков  33. Среда имеет мягкую консистенцию, что затрудняет работу с бактериологической петлей.
Пример 2. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 8,0; дрожжевой аутолизат 8,0; глюкоза 1,8; уксусная кислота 70% 0,12; агар 1,6; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерий составило в среднем 43, эшерихий  24 и стафилококков  17. Среда также имеет мягкую консистенцию.
Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 9,0; дрожжевой аутолизат 9,0; глюкоза 1,9; уксусная кислота 70% 0,14; агар 1,8; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерий составило в среднем 56, эшерихий  0 и стафилококков  0. Среда имеет плотную консистенцию и не скарифицируется при работе бактериологической петлей.
Пример 4. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 10,0; дрожжевой аутолизат 10,0; глюкоза 2,0; уксусная кислота 70% 0,16; агар 2,0; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерий составило в среднем 62, эшерихий  0 и стафилококков  0. Среда имеет плотную упругую консистенцию и не скарифицируется при работе бактериологической петлей.
Пример 5. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 11,0; дрожжевой аутолизат 11,0; глюкоза 2,1; уксусная кислота 70% 0,18; агар 2,2; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерий составило в среднем 46, эшерихий 0 и стафилококков  0. Несмотря на хороший рост лактобактерий на данной среде, выросшие колонии более мелкие, чем на вариантах сред в примерах 3 и 4. Среда имеет плотную упругую консистенцию и не скарифицируется при работе бактериологической петлей.
Пример 6. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 12,0; дрожжевой аутолизат 12,0; глюкоза 2,2; уксусная кислота 70% 0,20; агар 2,4; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерии составило в среднем 23, эшерихий  0 и стафилококков  0. На данном варианте среды рост лактобактерий более замедлен, а формирующиеся колонии значительно меньшего размера (0,5-0,7 мм), чем на вариантах сред в примерах 3 и 4, на которых тест-штамм лактобактрий формировал колонии размером 1-2 мм.
-9
-3
-5
-7
-9
-3
-5
-7
-9
6
2
Пример 7. Исследовали фекалии от 30-дневного теленка. Для этого физиологическим раствором осуществили десятикратные разведения 1 г фекалий до значения 10. Из пробирок с разведением 10, 10, 10 и 10 отобрали 0,1 мл суспензии и засеяли на питательную среду, содержащую, масс.%: молочная сыворотка 9,0; дрожжевой аутолизат 9,0; глюкоза 1,9; уксусная кислота 70% 0,14; агар 1,8; капустный отвар - остальное. Через 24 ч инкубации при температуре 37°C в условиях повышенного содержания CO учитывали рост бактерий. Из разведения 10 на среде выросло 265 колоний, которые по морфологии соответствовали колониям лактобактерий, при микроскопии это были грамположительные палочки. Колоний, характерных для энтеробактерий, стафилококков, бацилл, не было. Из разведения 10 выросло 96 колоний, типичных для колоний лактобактерий, при микроскопии колоний установлено, что их образовывали грамположительные палочки. Колоний, характерных для энтеробактерий, стафилококков, бацилл, не было. Из разведения 10 и 10 бактериальный рост полностью отсутствовал. Следовательно, в фекалиях теленка количество лактобактерий было 9,6·10 колониеобразующих единиц в 1 г.
-9
-3
-5
-7
-9
-3
-5
2
Пример 8. Исследовали фекалии от 30-дневного теленка. Для этого физиологическим раствором осуществили десятикратные разведения 1 г фекалий до значения 10. Из пробирок с разведением 10, 10, 10 и 10 отобрали 0,1 мл суспензии и засеяли на питательную среду, содержащую, масс.%: молочная сыворотка 10,0; дрожжевой аутолизат 10,0; глюкоза 2,0; уксусная кислота 70% 0,16; агар 2,0; капустный отвар - остальное. Через 24 ч инкубации при температуре 37°C в условиях повышенного содержания CO учитывали рост бактерий. Из разведения 10 на среде выросло 215 колоний, которые по морфологии соответствовали колониям лактобактерий, при микроскопии это были грамположительные палочки. Колоний, характерных для энтеробактерий, стафилококков, бацилл, не было. Из разведения 10 выросло 63 колонии, типичных для колоний лактобактерий, при микроскопии колоний установлено, что их образовывали грамположительные палочки. Колоний, характерных для энтеробактерий, стафилококков, бацилл, не было.
-7
-9
6
Из разведения 10 и 10 бактериальный рост полностью отсутствовал. Следовательно, в фекалиях теленка количество лактобактерий было 6,3×10 колониеобразующих единиц в 1 г.
Таким образом, полученные результаты позволяют определить оптимальные соотношения ингредиентов питательной среды для выделения лактобактерий, а именно - молочная сыворотка 9,0-10%; дрожжевой аутолизат 9,0-10%; глюкоза 1,9-2,0%; уксусная кислота 70% 0,14-0,16%; агар 1,8-2,0%; капустный отвар - остальное. Данная среда обеспечивает хороший рост лактобактерий при полном подавлении роста эшерихий, стафилококков и др. бактерий, а поэтому может использоваться в качестве селективной при выделении лактобактерий от животных.