Идентификация мутации dumps крупного рогатого скота

УДК 636.4.082:612.8:577.113.1

О.П. Курак, научный сотрудник Ж.А. Грибанова, научный сотрудник РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству»

ИДЕНТИФИКАЦИЯ МУТАЦИИ DUMPS КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

В исследованиях проведен анализ данных о молекулярном механизме мутации DUMPS крупного рогатого скота и ее влиянии на воспроизводительные качества животных и выживаемость потомства. Разработаны оптимальные параметры проведения ПЦР-ПДРФ для ее диагностики, позволяющие четко идентифицировать получаемые результаты.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, метод ПЦР-ПДРФ, ген UMPS, генотип, дефицит уридинмонофосфатсинтетазы.

The analysis of the data on the molecular mechanism of DUMPS mutation in cattle and its effect on reproductive traits of animals and survival rate of posterity was carried out in researches. Perfect parameters of carrying out PCR-RFLP for its diagnostics were developed allowing to identify the obtained results accurately.

Key words: cattle, PCR-RFLP method, UMPS gene, genotype, deficiency of uridine monophosphate synthase.

Введение. В последние годы в республике Беларусь многое делается для того, чтобы превратить молочное животноводство в высокодоходную отрасль. Наряду с внедрением новейших технологий содержания и кормления животных, намечается повысить молочную продуктивность поголовья дойного стада не только за счёт собственного разведения скота, но и ввоза из-за рубежа животных голштино-фризской породы. В этих условиях перед специалистами встают задачи не только реализации высокого генетического потенциала импортного скота, создания оптимальных условий содержания и кормления ввозимых животных в период их адаптации, но и ге-нетико-ветеринарное благополучие закупаемых животных. Практика ввоза молочного скота из-за рубежа свидетельствует о том, что наряду с быстрым увеличением продуктивности животных и ростом производства молока проявляются такие негативные факторы, как распространение различных наследственных заболеваний, в том числе вызываемых редкими мутациями, накопившимися в наследственности голштинов.

Анализ научной литературы показывает, что распространение отдельных мутаций с легальным исходом в ряде стран оказалось весьма значимым. Прежде всего, это касается BLAD, CVM и DUMPS-синдромов, наблюдающихся в голштинской и чсрно-псстрон породах.

Синдрим DUMrS (дефицит урнднммоно фосфатсинтетазы) - обусловлен точковой мутацией в кодирующей части гена UMPS [1], локализованного на первой хромосоме (аутосомно-рецессивная мутация, 1-я группа сцепления, ло-кус 2391) и проявляется дефицитом фермента уридинмонофосфатсинтетазы, который является причиной дефекта синтеза нуклеиновых кислот.

Изучен молекулярный механизм мутации: у гетерозиготных животных вследствие точечной замены С—>Т кодон 405 CGA, кодирующий аргинин, заменяется нонсенс-кодоном (Stop-codon) TGA. Точка мутации обозначена как R405 Stop (рисунок 1). В результате синтез аминокислотной последовательности фермента является незавершенным и его молекула короче на 76 аминокислотных остатков в районе С-конца субьеди-ницы, участвующей в катализе.

Таким образом, у животных - носителей синдрома DUMPS происходит синтез укороченного белка с нарушенными биологическими функциями. Из-за отсутствия каталитически активного сегмента белковой молекулы фермент лишен активности.

Данный фермент связан с воспроизводительной функцией животных и влияет на выжи-

ваемость потомства.

Мутация вызывает гибель эмбрионов, как правило, после первых 40 дней развития, однако, в ряде случаев, у носителей данной мутации отмечается задержка роста [15], и в отдельных случаях - более длительные межотельные периоды [2,3,4].

Мутация зарегистрирована у черно-пестрых голштинов в США и Европе, а также у животных красно-пестрой голштинской породы в Швейцарии. У носителей данной мутации отмечают задержку роста и другие отклонения, что может заканчиваться летальным исходом [5,6,7,8,9].

Нормальный ген UMPS Мутантный ген UMPS

(DUMPS) Arg _^ Стоп

I 1

1247 1247

5' - CCCGAGTA -3' 5' - CCTGAGTA -3'

Aval

Рисунок 1 - Схематическое изображение точковой мутации Arg405 Стоп в гене UMPS

Установлено, что источником мутации является бык Happy Herd Beautician, а ее дальнейшее распространение связано с его потомством -племенными животными, эмбрионами и спермо-продукцией.

В Беларуси таких исследований не проводилось, однако, вышеуказанные данные позволяют предположить, что данное заболевание могло быть завезено в республику с импортным племенным материалом - быками или спермой.

В этой связи проведение генетического мониторинга наследственной мутации DUMPS крупного рогатого скота является актуальной проблемой, решение которой позволит вести целенаправленный контроль за распространением мутации, повысить резистентность племенного поголовья республики и сохранность ремонтного молодняка, исключить завоз быков-носителей генетического груза и обеспечить ввод в племенные стада здоровых животных.

Мониторинг мутации DUMPS, как и других рецессивных заболеваний крупного рогатого скота, может оказаться актуальным и для

исследований по картированию в геноме КРС локусов количественных признаков, так как выявлено, что локусы генов CD 18 (синдрома врожденного иммунодефицита) и UMPS сцеплены и расположены на первой хромосоме, на которой располагаются и гены, ассоциированные с признаками молочной продуктивности.

Была поставлена цель - разработать оптимальные параметры проведения ПЦР - ПДРФ для диагностики наследственной мутации DUMPS.

Материал и методика исследований. Исследования были выполнены в лаборатории генетики сельскохозяйственных животных РУП «НПЦ HAH Беларуси по животноводству» на базе РСУП «Брестплемпредприятие». Предметом исследований - биопробы спермы.

Геномную ДНК выделяли перхлоратным методом. Все основные растворы для выделения ДНК, амплификации и рестрикции готовили по Маниатису и др. [10].

Концентрация, нативность, подвижность ДНК, концентрация и специфичность амплифи-ката, а также результаты расщепления продуктов ПЦР оценивались элсктрофоретическим методом с последующей визуализацией на трансиллюминаторе в УФ-свете с длиной волны 260 нм. Для анализа распределения рестрикционных фрагментов ДНК использовали компьютерную видеосистему INFINITY (Франция).

В качестве маркера использовали ДНК плазмиды pBR322, расщепленной рестриктазой Alul, либо рестриктазой BsuRI.

Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы ОДО "Праймтех" (г. Минск).

В процессе работы были разработаны оптимизированные условия проведения ПЦР-ПДРФ: проведена оценка различных вариантов реакционной смеси, подобраны концентрационные и температурно-кинетические параметры реакции и условия анализа полиморфных фрагментов.

Результаты и их обсуждение. Установлено, что, что мутация приводит к утрате сайта рестрикции эндонуклеазой Aval, что позволяет дифференцировать мутантные и нормальные аллели данного гена и типировать гетерозиготы. Это позволяет быстро и точно тестировать животных на носительство DUMPS.

Для идентификации мутации была подобрана следующая пара праймеров, каждый из которых комплементарен одному из 3'- концов антипараллельных цепей целевого участка ДНК:

AVA 1:5-gCА ААТ ggC TgA AgA АСА ТСС Tg -3'

AVA2:5'- gCTТСТ AAC TgA ACT CCT CgA gT- 3'

Рассчитанная ориентировочная температура плавления составила 68°С для каждого из праймеров. Это дало возможность более точно оптимизировать температуру их отжига (^т*).

Концентрация праймеров в реакционной смеси для ПЦР анализа в серии опытов колебалась от 15 до 35 пМ на реакцию) и была оптимизирована выполнением серии опытов (с 15, 20, 25 и т.д. пМ). При этом учитывалось, что высокие концентрации праймеров в реакционной смеси могут вызывать отжиг их в несоответствующих участках ДНК и привести к накоплению неспецифических продуктов, которые сами по себе являются субстратом для ПЦР, конкурируя с матрицей ДНК за полимеразу и праймеры, что приводит к более низкому выходу специфического продукта. Оптимальная концентрация праймеров составила 25 пМ на пробу.

Проведена оценка различных вариантов компонентов реакционной смеси для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с подбором оптимальной концентрации MgCl2, смеси сШТР и Тая-полимеразы.

Установлено, что оптимальной концентрацией Тац-полимеразы для использования для наших условий является 1,5 е. а. на пробу. Большее количество фермента приводит к незначительному увеличению фона, недостаток - к отсутствию некоторых продуктов амплификации.

Подобран оптимальный температурно-временной режим амплификации: начальная денатурация - 95°С 10 мин; 45 циклов (денатурация - 95°С 30 с; отжиг - 58°С 30 с; синтез -72°С 1 мин); эллонгация - 72°С 30 мин, 4°С.

Выявлено, что при использовании пары праймеров АУА1 и АУАИ предлагаемый нами режим (с температурой отжига - 58°С) позволил получить амплификат достаточной концентрации и высокой специфичности: один фрагмент длиной 108 п.н., идентифицируемый электрофо-ретическим методом в 2% агарозном геле (рис.1), приготовленном на ТВЕ-буфере, с добавлением бромистого этидия._

I р в ' >    л? . .л, 1 ' "7 гг

Г7

Рисунок 1 - Амплифицированные фрагменты ДНК, полученные с использованием праймеров АУА1 и АУАИ. Дорожки 1,2,4,5,6 - амплификат, дорожка 3 - маркер

1аким образом, установлено, что синтезированные праймеры при подборе оптимальных концентрационных, температурных и кинетических параметров амплификации обладают достаточной степенью специфичности для использования их при ПЦР-анализе, направленном на идентификацию мутации в гене UMPS. Эффективность метода при этом составила 95%.

В случае успешной амплификации оставшуюся смесь подвергали инкубации с использованием эндонуклеазы Aval при температуре 37°С в течение 4-12 часов.

Точковая мутация цитозина —> тимин, приводящая к утрате сайта рестрикции данной эн-донуклеазой, изменяет и картину распределения фрагментов на геле после рестрикции. Это позволяет проводить дифференцирование нормальных (DUMPS10) и мутантных (DUMPSdp) аллелей и типировать гетерозиготы.

Анализ рестрикционных фрагментов методом электрофоретического разделения (рисунок 2) проводился в 2-4% агарозном геле, приготовленном на TBE буфере, окрашенном бромистым этидием, при напряжении 110-130 V в течение 20-40 мин. Перед внесением в гель пробы смешивали в соотношении 1:6 с маркерной краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 40% сахарозы.

Лабораторные исследования показали - для успешной иденжфицикации рсзулыа!а рестрикции фрагмента гена UMPS, необходим агарозный гель достаточно высокой концентрации - 4%.

Рисунок 2 - электрофорез рестрикцированных амплификатов

При этом генотип DUMPStd/td (животных, свободных от мутации) представлен тремя фрагментами размером 51 п.о., 36 п.о. и 21 п.о.; гетерозиготный генотип DUMPStd/dp (у животных-носителей мутации) дает следующую картину: четыре фрагмента размером 87 п.о., 51 п.о., 36 п.о. и 21 п.о.; рецессивный генотип DUMPSdp/dp идентифицируется как два фрагмента- 87 и 21 п.о.

Идентификация мутации DUMPS, проводимая на основе анализа ПЦР-ПДРФ, с помощью подобранных специфических праймеров и ре-стриктазы, является наиболее надежным методом, позволяющим безошибочно определять мутантный аллель в гомо- или гетерозиготной форме. Предложенная методика в дальнейшем может быть несколько модифицирована с учетом условий конкретной лаборатории.

Выводы:

1. Проведен анализ зарубежных данных о молекулярном механизме мутации DUMPS крупного рогатого скота и ее влиянии на воспроизводительные качества животных и выживаемость потомства Изучены данные о распространении мутации среди голштинской породы.

2. Установлено, что синтезированные праймеры AVAI и AVAII при оптимизированных условиях обладают достаточной степенью специфичности для использования их в ПЦР-анализе и получения амплификата без побочных неспецифических продуктов.

3. Подобраны условия эффективного проведении ПЦР-ПДРФ, необходимые для достижения высокой чувствительности анализа: оптимизированы кинетические, температурные и концентрационные параметры проведения ПЦР и рестрикции полученного амплификата, а также режимы анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена DUMPS электрофорети-ческим методом.

4. Полученные результаты будут использованы для последующего проведения мониторинга наследственной мутации DUMPS среди племенного поголовья белорусской черно-пестрой породы и красной породной группы.

Литература

1. Жигачев А.И. Проблема контроля скрытых генетических дефектов у крупного рогатого скота / А. И. Жигачев // Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве с.-х. животных : материалы Междунар. науч. конф. / ГНУ ВНИИ генетики и разведения с.-х. животных. - СПб, 2009.-С. 123-128

2. Citek J., Blähovä В. - Recessive disorders - a serious health hazard? Journal of Applied Biomedicine 2: 187.194, ISSN 1214-0287, 2004.

3. Grzybowski G. et al., Dadania przesiewowe ne obecnosc genu wczesnej abumieral-nosci rarodkon DUMPS u budla w Polsce // Med. Weter.- 1998.- V.54, № 3.- P. 189-193

4. Kuhn M. Т., Shanks R.D. Assotiation of deficiency of uridine monophosphate synthase with production and reproduction // J. Dairy Sei., 1994, 77: 589-597.

BecTHHK ErCXA № 4

5. Robinson J.L., Popp RG, Snanks R.D., Oosterhof A., Veerkamp J.H. Testing for deficiency of uridine monophosphate synthase among Holstein-Friesian cattle in North America and Europe // Livestok Production Science, 1993, V.36.-P.287-298.

6. Schvvenger B., Schober S., Simon D. DUMPS cattle carry a point mutation in the wridine monophosphate synthase gene // Genomics - 1993. -V.16 - P. 1626-1631.

7. Snanks R. D., Popp R. G., McCoY G. C., Nelson D. R., Robinson J. L. Identification of the homozygous recessive genotype for the deficiency of uridine monophosphate syntase in 35-day bovine embrions // Journal of Reproduction and Fertility -1992.-V. 10.- P.945

8. Ghanem М.Е., Nakao T., Nishibori M. Deficiency of uridine monophosphate synthase (DUMPS) and X-chromosome deletion in fetal mummification in cattle // Anim. Reprod. Sei., 2006. 91:45-54.

9. Meydan H., Ozdil F., Yildiz M.A. Identification of BLAD and DUMPS as genetic disorders using PCR-RLFP in Holstein bulls reared in Turkey // Proceedings of the 57lh Annual Meeting of the European Association for Animal Production, Sept. 17-20 2006, Antalya, Turkey, p. 91.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование // М.: "Мир",-1984.-480 с.