ХИМЕРНЫЕ БЕЛКИ, ПОДОБНЫЕ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЕ
HYBRID PROTEINS ALIKE ALKALINE PHOSPHATASE

Данное изобретение относится к щелочным фосфатазам с улучшенными свойствами, к фармацевтическим композициям, содержащим щелочные фосфатазы с улучшенными свойствами, и к применению щелочных фосфатаз с улучшенными свойствами для предупреждения, лечения или излечения заболеваний.
Фосфатаза представляет собой фермент, который дефосфорилирует его субстраты, т.е. он гидролизует моноэфиры фосфорной кислоты до фосфатного иона и молекулы со свободной гидроксильной группой. Это действие является прямо противоположным действию фосфорилаз и киназ, которые присоединяют фосфатные группы к их субстратам, используя энергетические молекулы, такие как АТФ (аденозинтрифосфат). Фосфатазы можно классифицировать на две главные категории: цистеинзависимые фосфатазы (CDP) и металлофосфатазы.
Металлофосфатазы типично координируют в их активном сайте два важных для катализа иона металла. В настоящее время существует некоторая путаница относительно природы этих ионов металлов, поскольку успешные попытки их идентифицировать давали разные ответы. В настоящее время имеется доказательство того, что данные металлы могли быть магнием, марганцем, железом, цинком или любой их комбинацией. Полагают, что гидроксильный ион, связывающий мостиком два иона металла, участвует в нуклеофильной атаке на фосфатную группу.
Фосфатазы действуют противоположно киназам/фосфорилазам, которые добавляют фосфатные группы к белкам. Добавление или удаление фосфатной группы может активировать или дезактивировать фермент (например, пути сигнализации с участием киназы) или обеспечивать осуществление белок-белковые взаимодействия (например, домены SH3); следовательно, фосфатазы являются неотъемлемой частью многих путей трансдукции сигнала. Следует отметить, что добавление и удаление фосфата не обязательно соответствует активации или ингибированию фермента, и что несколько ферментов имеют отдельные сайты фосфорилирования для активирующей или ингибирующей функциональной регуляции. CDK (циклинзависимая киназа), например, может либо активироваться, либо дезактивироваться в зависимости от конкретного фосфорилируемого аминокислотного остатка. Фосфаты являются важными в трансдукции сигнала, так как они регулируют белки, к которым они присоединяются. Для обращения регуляторного эффекта фосфат удаляется. Это происходит само по себе посредством гидролиза или опосредуется протеинфосфатазами.
Один тип фосфатазы - щелочная фосфатаза (ALP или АР) (ЕС 3.1.3.1) - представляет собой фермент-гидролазу, ответственный за удаление фосфатных групп от многих типов молекул, включающих, например, нуклеотиды, белки и алкалоиды. Вплоть до недавнего времени щелочные фосфатазы считались наиболее эффективными в щелочной среде, о чем и свидетельствует название.
В данной области считается, что одной возможной физиологической ролью АР может быть то, что она взаимодействует с воспалительными молекулами. Сначала постулировали, что АР дефосфорилирует эндотоксины, и, как таковая, уменьшает воспалительный ответ на эти молекулы, оказывающие сильный воспалительный эффект. С того времени были постулированы и рассмотрены другие механизмы действия. Однако вплоть до настоящего времени, несмотря на ее полезную роль в большом числе воспалительных и других заболеваний, механизм действия все еще не был полностью выяснен. В прошлом щелочные фосфатазы коровьего происхождения использовали в животных моделях и клинических испытаниях для лечения, например, сепсиса, острой почечной недостаточности, воспалительного заболевания кишечника, энтероколита, ишемического реперфузионного повреждения или других воспалительных заболеваний (Riggle et al., J Surg Res. 2013 Mar; 180 (1): 21-6; Peters et al., J Pharmacol Exp Ther. 2013 Jan; 344 (1): 2-7; Martinez-Moya et al., Pharmacol Res. 2012 Aug; 66 (2): 144-53; Pickkers et al., Crit Care. 2012 Jan 23; 16 (1); Ramasamy et al, Inflamm Bowel Dis. 2011 Feb; 17 (2): 532-42; Lukas et al., Inflamm Bowel Dis. 2010 Jul; 16 (7): 1180-6; Bol-Schoenmakers et al., Eur J Pharmacol. 2010 May 10; 633 (1-3): 71-7; Heemskerk et al., Crit Care Med. 2009 Feb; 37 (2): 417-23; Tuin et al., Gut. 2009 Mar; 58 (3): 379-87; Su et al., Crit Care Med. 2006 Aug; 34 (8): 2182-7; van Veen et al., Br J Surg. 2006 Apr; 93 (4): 448-56; van Veen, Infect Immun. 2005 Jul; 73 (7): 4309-14; Verweij et al., Shock. 2004 Aug; 22 (2): 174-9).
1/2
Хотя в настоящее время и доступны щелочные фосфатазы, выделенные из природных источников, а также сконструированные рекомбинантно, которые являются полезными как в диагностике, так и в лечении заболеваний, существует потребность в альтернативных фосфатазах, например с измененной (например, с улучшенной) удельной активностью, стабильностью (например, Т in vivo или стабильность в отношении хранения (срок хранения)) или субстратной специфичностью.
Согласно настоящему изобретению предложены такие модифицированные фосфатазы, которые имеют улучшенные свойства по сравнению с химерной рекомбинантной щелочной фосфатазой, которая подробно описана в WO 2008/133511.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом воплощении согласно изобретению предложен выделенный белок, имеющий фосфатазную активность, содержащий аминокислотную последовательность из по меньшей мере 200 последовательных аминокислот, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO: 5, аминокислотную последовательность из по меньшей мере 50 последовательных аминокислот, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO: 6, и аминокислотную последовательность из по меньшей мере 40 последовательных аминокислот, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с SEQ ID NO: 7, где полноразмерный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с полноразмерной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, при условии, что аминокислота в положении 279 представляет собой лейцин (L), аминокислота в положении 328 представляет собой валин (V), и аминокислота в положении 478 представляет собой лейцин (L).
В предпочтительном воплощении полноразмерный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%-ную, по меньшей мере 95%-ную или по меньшей мере 98%-ную идентичность последовательности с полноразмерной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, при условии, что аминокислота, соответствующая положению 279, представляет собой лейцин (L), аминокислота, соответствующая положению 328, представляет собой валин (V), и аминокислота, соответствующая положению 478, представляет собой лейцин (L).
Под термином «соответствующее» здесь подразумевается конкретное положение по отношению к N-концевой аминокислоте зрелого белка, которая обозначается как «положение 1». Термин «соответствующее» в прямой форме не относится к конкретному аминокислотному остатку в данном конкретном положении.
Термины «белок» и «полипептид» относятся к соединениям, содержащим аминокислоты, связанные посредством пептидных связей, и они могут использоваться взаимозаменяемо.
Когда перечисляется «аминокислотная последовательность» в том виде, в котором здесь используется данный термин, она относится к аминокислотной последовательности молекулы белка или пептида. «Аминокислотная последовательность» может быть выведена из нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей белок. Однако подразумевается, что такие термины, как «полипептид» или «белок» не ограничиваются аминокислотной последовательностью выведенной аминокислотной последовательности, но могут включать посттрансляционные модификации выведенных аминокислотных последовательностей, такие как делеции, присоединения аминокислот, и такие модификации, как гликозилирования и присоединения липидных группировок. Также применение неприродных аминокислот, таких как D-аминокислоты, для улучшения стабильности или фармакокинетических характеристик, попадает в пределы объема термина «аминокислотная последовательность», если не указано иное.
Предпочтительно часть указанного белка содержит аминокислотную последовательность из 50-65, предпочтительно 60-65, более предпочтительно 62-65, более предпочтительно 64-65, наиболее предпочтительно 65 последовательных аминокислот, имеющую по меньшей мере 90%-ную, предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную идентичность последовательности с полноразмерным короновидным доменом человеческой PLAP (плацентарная щелочная фосфатаза). Для задач настоящего изобретения аминокислотная последовательность, соответствующая полноразмерному короновидному домену эталонной последовательности человеческой PLAP, подчеркнута в SEQ ID NO: 3, показанной на Фиг. 1, и соответствует положениям 366-430 в ней.
Предпочтительно часть указанного белка содержит аминокислотную последовательность из 200-365, более предпочтительно 250-365, более предпочтительно 300-365, более предпочтительно 350-365, более предпочтительно по меньшей мере 360-365, наиболее предпочтительно 365 последовательных аминокислот, имеющих 90%-ную, предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную идентичность последовательности с N-концевой областью, фланкирующей короновидный домен человеческой ALPI (кишечная щелочная фосфатаза). Эта N-концевая область, фланкирующая короновидный домен, считается одной из двух частей каталитического домена.
Предпочтительно часть указанного белка содержит аминокислотную последовательность из 40-54, предпочтительно 45-54, более предпочтительно 50-54, более предпочтительно 52-54, наиболее предпочтительно 54 последовательных аминокислот, имеющих 90%-ную, предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную идентичность последовательности с C-концевой областью, фланкирующей короновидный домен человеческой ALPI. Эта C-концевая область, фланкирующая короновидный домен, считается второй из двух частей каталитического домена.
Для задач настоящего изобретения аминокислотная последовательность эталонной последовательности зрелого белка человеческой ALPI показана на Фиг. 1 (SEQ ID NO: 2). Для определения N-концевой и C-концевой фланкирующих областей, совместно именуемых каталитическим доменом, здесь подчеркнут короновидный домен человеческой ALPI.
В конкретном предпочтительном воплощении согласно изобретению предложен белок по изобретению, где указанный белок содержит аминокислотную последовательность из 50-65, предпочтительно 60-65, более предпочтительно 62-65, более предпочтительно 64-65, наиболее предпочтительно 65 последовательных аминокислот, имеющих по меньшей мере 90%-ную, предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную идентичность последовательности с полноразмерным короновидный доменом человеческой PLAP, причем часть указанного белка содержит аминокислотную последовательность из 200-365, более предпочтительно 250-365, более предпочтительно 300-365, более предпочтительно 350-365, более предпочтительно 360-365, наиболее предпочтительно 365 последовательных аминокислот, имеющих по меньшей мере 90%-ную, предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную идентичность последовательности с N-концевой областью, фланкирующей короновидный домен человеческой ALPI, и часть указанного белка содержит аминокислотную последовательность из 40-54, предпочтительно 45-54, более предпочтительно 50-54, более предпочтительно 52-54, наиболее предпочтительно 54 последовательных аминокислот, имеющих по меньшей мере 90%-ную, предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную идентичность последовательности с C-концевой областью, фланкирующей короновидный домен человеческой ALPI.
2
Под N-концевой областью, фланкирующей короновидный домен, подразумевается отрезок аминокислот, смежный (т.е. предпочтительно находящийся в менее чем 20 аминокислотах, более предпочтительно менее чем в 15, более предпочтительно менее чем в 10, более предпочтительно менее чем в 5, более предпочтительно менее чем в 3, более предпочтительно менее чем в 2 аминокислотах, наиболее предпочтительно не разделенный аминокислотами) с последовательностью короновидного домена (соответствующие ему аминокислоты подчеркнуты на Фиг. 1), находящийся слева от короновидного домена, где левая сторона определяется как та часть пептидной цепи, которая несет аминогруппу (NH) первой аминокислоты.
Под C-концевой областью, фланкирующей короновидный домен, подразумевается отрезок аминокислот, соответствующий смежным положениям (т.е. находящийся в менее чем 20 аминокислотах, предпочтительно менее чем в 15, более предпочтительно менее чем в 10, более предпочтительно менее чем в 5, более предпочтительно менее чем в 3, более предпочтительно менее чем в 2 аминокислотах, наиболее предпочтительно не разделенный аминокислотами) с последовательностью короновидного домена (соответствующие ему аминокислоты подчеркнуты на Фиг. 1), находящийся справа от короновидного домена, где правая сторона определяется как та часть пептидной цепи, которая несет свободную альфа-карбоксильную группу последней аминокислоты.
У человека до настоящего времени было идентифицировано четыре изоформы щелочной фосфатазы. Ими являются кишечная (ALPI), плацентарная (ALPP), подобная плацентарной (GCAP) щелочная фосфатаза и щелочная фосфатаза печени/кости/почки (или неспецифичная в отношении ткани) (TNAP). Первые три вместе локализуются на хромосоме 2, тогда как неспецифичная в отношении ткани форма локализуется на хромосоме 1. Точные физиологические функции АР не известны, но АР, по-видимому, участвуют в большом числе физиологических процессов.
Последовательности человеческих щелочных фосфатаз известны в данной области и могут быть легко найдены в релевантных базах данных. Для определения % идентичности последовательности с короновидным доменом PLAP и каталитическим доменом ALPI предпочтительно используются соответствующие эталонные последовательности. Эталонная последовательность человеческой ALPI показана как SEQ ID NO: 2. Эталонная последовательность человеческой ALPP показана как SEQ ID NO: 3. В пределах данных эталонных последовательностей на Фиг. 1 подчеркнута последовательность, обычно известная как короновидный домен.
Плацентарная щелочная фосфатаза здесь сокращается как ALPP или PLAP. Сокращения ALPI или IAP относятся к кишечной щелочной фосфатазе. Щелочная фосфатаза, подобная плацентарной 2, сокращается здесь как ALPP2, ALPG или GCAP, и сокращения ALPL, TNSALP, TNAP или BLK используются здесь для названия щелочной фосфатазы печени/неспецифичной в отношении ткани. Здесь для одной и той же щелочной фосфатазы могут взаимозаменяемо использоваться разные сокращения.
С конформационной точки зрения щелочная фосфатаза, грубо говоря, состоит из двух доменов: короновидного домена и домена активного сайта (Mammalian Alkaline Phosphatases: From Biology to Applications in Medicine and Biotechnology.  Luis Millan; Wiley, 2006). Домен активного сайта может быть разделен на отдельные части, такие как каталитический остаток и три сайта ионов металла (Zn1, Zn2 и Mg3). С точки зрения первичной структуры очевидно, что короновидный домен фланкирован аминокислотами, которые образуют домен активного сайта. Следовательно, в предпочтительном воплощении каталитический домен не состоит из смежной последовательности аминокислот, а фланкирует короновидный домен. В том, что касается SEQ ID NO: 1, которая обозначает аминокислотную последовательность одной щелочной фосфатазы по изобретению, которая не ограничивает настоящее изобретение каким-либо образом, короновидный домен предпочтительно содержит аминокислоты в положении 366-430, тогда как каталитический домен предпочтительно относится к остальным последовательностям до положения 366 и после положения 430 в последовательностях зрелого белка, как изображено на Фиг. 1. Аминокислотные последовательности щелочных фосфатаз и относительные положения каталитического и короновидного доменов известны специалисту в данной области (Mammalian Alkaline Phosphatases: From Biology to Applications in Medicine and Biotechnology.  Luis Millan; Wiley, 2006).
В некоторых воплощениях белок согласно изобретению, таким образом, содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с короновидным доменом человеческой ALPP, и последовательность, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с каталитическим доменом человеческой кишечной щелочной фосфатазы. Предпочтительно указанная последовательность, имеющая указанную идентичность последовательности с короновидным доменом ALPP, находится в белке согласно изобретению приблизительно в том же самом положении, что и короновидный домен ALPP в нативном белке ALPP, т.е. приблизительно в положении 366-430 относительно положения 1, как показано на Фиг. 1 (последовательность, представляющая короновидный домен, подчеркнута).
Последовательность, имеющая идентичность последовательности с короновидным доменом ALPP, имеет по меньшей мере 95%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную, наиболее предпочтительно 100%-ную идентичность последовательности с нативной последовательностью короновидного домена ALPP, которая представлена подчеркнутыми аминокислотами в положениях 366-430 в SEQ ID NO: 3.
Процентная доля идентичности аминокислотной последовательности или нуклеиновокислотной последовательности, или термин «% идентичности последовательности» определяется здесь как процентная доля остатков в аминокислотной последовательности-кандидате или нуклеиновокислотной последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам в эталонной последовательности после выравнивания двух последовательностей и, при необходимости, введения пробелов для достижения максимального процента идентичности. В предпочтительном воплощении расчет по меньшей мере указанной процентной доли идентичности последовательности проводится без введения пробелов. Способы и компьютерные программы для выравнивания хорошо известны в данной области, например, «Align 2» или сервис BLAST Национального центра биотехнологической информации (NCBI).
Предпочтительно указанная последовательность, имеющая последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична N-концевой части, фланкирующей короновидный домен ALPI, располагается в белке согласно данной заявке приблизительно в том же самом положении, что и данная часть ALPI в природном белке ALPI, т.е. представлена положениями 1-365 bSEQ ID NO: 1 на Фиг. 1.
Кроме того, последовательность, имеющая идентичность последовательности с каталитическим доменом ALPI, предпочтительно имеет по меньшей мере 95%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную идентичность последовательности с N-концевой частью, фланкирующей короновидный домен ALPI, представленной положениями 1-365 на Фиг. 1, SEQ ID NO: 2, при условии, что аминокислота в положении 279 представляет собой L, и аминокислота, соответствующая положению 328, представляет собой V. Наиболее предпочтительно последовательность, имеющая идентичность последовательности с N-концевой частью каталитического домена ALPI, является идентичной природной последовательности каталитического домена ALPI за исключением того, что аминокислота в положении 279 представляет собой L, и аминокислота в положении 328 представляет собой V.
Предпочтительно указанная последовательность, имеющая последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична C-концевой части, фланкирующей короновидный домен ALPI, находится в белке согласно изобретению приблизительно в том же самом положении, что и данная часть ALPI в природном белке ALPI, т.е. представлена положениями 431-484 в SEQ ID NO: 1.
Последовательность, имеющая идентичность последовательности с C-концевой частью, фланкирующей короновидный домен ALPI, предпочтительно имеет по меньшей мере 95%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 98%-ную идентичность последовательности с C-концевой последовательностью, фланкирующей короновидный домен ALPI, и представлена положениями 431-484 в SEQ ID NO: 2, при условии, что аминокислота в положении 478 представляет собой L. Наиболее предпочтительно последовательность, имеющая идентичность последовательности с C-концевой частью каталитического домена ALPI, является идентичной нативной последовательности каталитического домена ALPI за исключением того, что аминокислота в положении 478 представляет собой L.
2+
2+
2+
2+
2+
2+
Ранее было показано, что щелочная фосфатаза, имеющая последовательность короновидного домена, которая имеет идентичность последовательности с короновидным доменом ALPP и имеющая каталитический домен, имеющий идентичность последовательности с каталитическим доменом ALPI (именуемая здесь catALPI/crownALPP), сохраняла ее исходную удельную активность в среде с низким содержанием Zn. Данные результаты показали, что активность in vivo является независимой от Zn. В сравнении с этим, ALPI быстро теряла ее активность при таких же условиях низкого содержания Zn. Авторы изобретения сделали вывод, что такой фермент, активность которого является независимой от Zn, мог бы быть полезным при заболеваниях, где истощение Zn является частью патологии (например, дефекты питания, алкогольная зависимость и повреждение целостности кишечника, хронические инфекции, включающие сепсис, или воспалительные заболевания в общем), или где может быть противопоказано добавление Zn (в качестве стабилизирующего агента при изготовлении) (например, острая фаза сепсиса, аутоиммунные заболевания). Помимо преимуществ в производстве и применении catALPI/crownALPP также имела преимущества в отношении стабильности во время хранения. Свойства catALPI/crownALPP подробно описаны в WO 2008/133511.
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
В настоящей заявке неожиданно показано то, что белок согласно настоящему изобретению является даже более стабильным при низкой концентрации Zn. Здесь показано то, что специфическая модификация, охватывающая три положения, по отношению к описанной ранее последовательности catALPI/crownALPP даже в большей степени увеличивает независимость от Zn. В заключение, таким образом, было показано, что нативная АР, такая как ALPI, теряет ее ферментативную активность в средах с низкими концентрациями Zn, catALPI/crownALPP (как описано в WO 2008/133511) сохраняет ее активность в средах с низкой концентрацией Zn, но теряет свою активность, например, при добавлении агентов, хелатирующих Zn, тогда как белок согласно настоящему изобретению сохраняет значительную часть его активности даже в присутствии хелатора цинка, такого как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Таким образом, при заболеваниях, при которых тяжелое истощение Zn является частью патологии, указанная нативная АР является неспособной развернуть ее ферментативную активность в месте, где она, как полагают, является наиболее полезной, например в месте воспаления. В отличие от этого, рекомбинантная АР, не чувствительная к очень низким концентрациям Zn, в частности белок согласно данному изобретению, сохраняет свою активность в среде с очень низкой концентрацией Zn, например в месте воспаления. Такой фермент, таким образом, является очень полезным для лечения заболеваний, которые обусловлены или сопровождаются низкими уровнями Zn. Такие пониженные уровни Znделали бы другие щелочные фосфатазы менее активными по сравнению с белком согласно изобретению.
2+
2+
2+
2+
Несколько ферментов в человеческом организме зависят от Znдля их активности, и, например, иммунологические ответы являются более эффективными при наличии достаточных уровней Zn. Известно, что цинк влияет на врожденный иммунитет, а также на конкретные части иммунной системы, и было установлено, что белки, содержащие цинк, накапливаются в местах воспаления. У здорового индивида эталонные значения сывороточного Zn составляют от 10 до 20 мкМ. Например, при алкогольной зависимости или во время недостаточного питания данные уровни могут снижаться до менее чем 10 мкМ или даже менее чем 1 мкМ. Кроме того, (суб)хроническое воспаление, такое как ревматоидный артрит, сепсис и болезнь Крона, присутствует с недостаточностью сывороточного цинка. В таких средах с дефицитом Zn белок согласно изобретению все еще является очень активным, тогда как другие, известные щелочные фосфатазы более или менее быстро теряют их фосфатазную активность.
2+
2+
2+
Согласно изобретению, таким образом, предложено понимание того, что белок согласно изобретению является особенно полезным в лечении заболевания, которое сопровождается местной или системной недостаточностью Zn. По сравнению с другими известными щелочными фосфатазами белок согласно изобретению является более активным при условиях с низкими концентрациями Zn. В предпочтительном воплощении, следовательно, согласно изобретению предложен белок по изобретению для применения в предупреждении или лечении заболевания, которое сопровождается недостаточностью Zn. Предпочтительно указанное заболевание включает воспалительное заболевание, более предпочтительно выбранное из группы, состоящей из аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, астмы, хронического обструктивного заболевания легких, атеросклероза, воспалительного заболевания желудочно-кишечного тракта, инфекции, сепсиса, нейродерматита, воспалительного заболевания печени, воспалительного заболевания легкого и воспалительного заболевания почки.
2+
Под термином «недостаточность цинка» или «недостаточность Zn» подразумевается то, что количество (местно) доступного цинка является недостаточным для обеспечения незатрудненной клеточной и/или ферментативной активности. Недостаточность цинка может быть абсолютной или относительной, где абсолютную недостаточность цинка можно легко определять посредством ссылки на эталонные значения у здоровых индивидов, известные в данной области. Относительная недостаточность цинка, например, может происходить, когда концентрации цинка все еще находятся в пределах границ, установленных эталонными значениями у здоровых индивидов, но необходимые концентрации цинка являются более высокими, чем нормальные, например во время воспаления. В некоторых воплощениях недостаточность цинка означает, что (местная) концентрация цинка у субъекта составляет меньше 10 мкМ, более предпочтительно меньше 5 мкМ, более предпочтительно меньше 2 мкМ, более предпочтительно меньше 1 мкМ, более предпочтительно меньше 0,1 мкМ, более предпочтительно меньше 0,05 мкМ, более предпочтительно меньше 0,02 мкМ, более предпочтительно меньше 0,01 мкМ, более предпочтительно меньше 0,005 мкМ, наиболее предпочтительно меньше 0,002 мкМ. В некоторых воплощениях недостаточность цинка означает, что (местная) концентрация цинка меньше, чем необходимо для незатрудненной клеточной и/или ферментативной активности.
Под термином «воспалительное заболевание» подразумевается любое заболевание, которое обусловлено или сопровождается защитным ответом ткани на повреждение или разрушение тканей, который служит для разрушения, разбавления или отгораживания как повреждающего агента, так и поврежденных тканей. Классическими признаками острого воспаления являются боль (страдание), повышение температуры (жар), покраснение (краснота), припухлость (опухоль) и потеря функции (нарушение функции). Типично воспаление характеризуется увеличением воспалительных параметров, таких как C-реактивный белок, лейкоциты и цитокины (IL-6 (интерлейкин-6), TNF-альфа (фактор некроза опухолей-альфа) и т.д.). Несмотря на то что воспаление исходно является защитным по природе, ненормальное воспалительное заболевание, такое как ревматоидный артрит и (другие) аутоиммунные заболевания, также попадает в пределы определения «воспалительного заболевания». В предпочтительном воплощении белок по настоящему изобретению предназначен для применения в лечении такого ненормального или вредного воспалительного заболевания.
Кроме того, во время стандартного фармакокинетического анализа авторы настоящего изобретения неожиданно наблюдали, что белок согласно данному изобретению нацелен на несколько органов, в частности, на кожу, почку, селезенку, печень, легкие, мозг, жировую ткань, кость и толстый кишечник. С использованием белка по изобретению, связанного с радиоактивным йодом, обнаружили, что %-ное отношение орган/кровь для белка согласно изобретению относительно такового для catALPI/crownALPP является особенно благоприятным для кожи, почки, селезенки, печени, легких, мозга, жировой ткани, кости и толстого кишечника, т.е. белок согласно изобретению в относительно большей степени подвергается направленной доставке в данные органы, чем известный белок catALPI/crownALPP. В частности, белок согласно изобретению находится в меньших концентрациях в крови, чем catALPI/crownALPP, и находится в больших концентрациях в упомянутых органах. Когда подлежит лечению состояние, относящееся к данным органам, такое как нейродерматит печени, повреждение почки, фиброзы печени, гипофосфатазия или тому подобное, для лечения необходимо меньше белка, что снижает затраты и/или увеличивает эффективность. Эксперименты, включающие заболевания, относящиеся к данным органам, уже были проведены (гипофосфатазия), проводятся (заболевание почки) или планируются. Согласно изобретению, таким образом, предложен белок, который демонстрирует улучшенную независимость от цинка и фармакокинетические характеристики по сравнению со щелочными фосфатазами, известными в данной области.
Авторы изобретения в разных рабочих воплощениях показали, что белок согласно изобретению является полезным в качестве лекарственного средства. Заболевания или состояния, которые можно лечить белком согласно изобретению, включают следующие: ослабленная почечная функция, повреждение почки, почечная недостаточность и гипофосфатазия. Кроме того, из-за конкретных характеристик белка щелочной фосфатазы согласно изобретению, которые составляют улучшения по сравнению с известными белками щелочными фосфатазами, которые использовались, белок согласно изобретению является полезным не только для ослабленной почечной функции, повреждения почки, почечной недостаточности и гипофосфатазии, но также и для предупреждения или лечения аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, астмы, хронического обструктивного заболевания легких, атеросклероза, воспалительного заболевания желудочно-кишечного тракта, инфекции, сепсиса, нейродерматита, воспалительного заболевания печени, воспалительного заболевания легкого и воспалительного заболевания почки. Все они представляют собой заболевания, поражающие органы, на которые нацелен белок согласно изобретению, и/или сопровождаются (относительной) недостаточностью цинка.
Термин «предупреждение» или «осуществление предупреждения» определяется здесь как введение (акт введения) белка согласно изобретению субъекту с намерением предупреждения заболевания указанного субъекта конкретным заболеванием. Хотя намерением лечения является предупреждение заболевания указанного субъекта указанным заболеванием, не является необходимым то, что данное болезненное состояние полностью предупреждается после одного или многих введений белка согласно изобретению, поскольку субъекты, например, не обязательно являются чувствительными к конкретному протоколу лечения. В целом, является предпочтительным то, что эффективность указанного предупреждения достигается в том, что группа субъектов, которые получили белок согласно изобретению для предупреждения конкретного заболевания, демонстрирует по меньшей мере ослабленное усиление тяжести заболевания или, например, меньше осложнений указанного заболевания по сравнению с группой субъектов, которые не получали указанный белок. Например, в случае почечного заболевания предпочтительно, чтобы у субъектов, подверженных риску развития почечного заболевания, после лечения белком согласно изобретению демонстрировалось меньшее ослабление почечной функции относительно субъектов, которых не лечили указанным белком. Если у субъекта развивается заболевание, против которого вводили белок для того, чтобы предупредить указанное заболевание, дополнительные введения (именуемые здесь «лечением») могут даваться либо для предупреждения усугубления данных болезненных состояний, либо в качестве лечения с целью излечения.
Термин «лечение» или «осуществление лечения» определяется здесь как введение (акт введения) белка согласно изобретению субъекту с намерением излечения субъекта от (ожидаемого) заболевания или улучшения, уменьшения или устранения симптомов заболевания у субъекта. Несмотря на то, что намерением лечения является излечение указанного субъекта, не обязательно, что указанный субъект излечивается после одного или многих введений белка согласно изобретению, так как субъекты, например, не обязательно являются чувствительными к определенному протоколу лечения. В целом, предпочтительным является то, что эффективность указанного лечения достигается в том, что субъекты, которых лечили белком согласно изобретению, демонстрируют по меньшей мере улучшение их болезненного состояния или, например, меньше осложнений указанного заболевания по сравнению с группой, не подвергавшейся лечению (или получавшей плацебо). Например, в случае почечного заболевания предпочтительно, чтобы субъекты, после лечения белком согласно изобретению, демонстрировали улучшенную почечную функцию или меньшее ослабление почечной функции относительно субъектов, которых не лечили указанным белком.
Согласно изобретению дополнительно предложен полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую белок согласно изобретению.
Термины «нуклеиновокислотная последовательность» и «полинуклеотид» в том виде, как они здесь используются, также охватывают неприродные молекулы, основанные на и/или происходящие от нуклеиновокислотных последовательностей, такие как, например, искусственно модифицированные нуклеиновокислотные последовательности, пептидные нуклеиновые кислоты, а также нуклеиновокислотные последовательности, содержащие по меньшей мере один модифицированный нуклеотид и/или неприродный нуклеотид, такой как, например, инозин, ЗНК («закрытая» нуклеиновая кислота), морфолино и 2'-O-метил-РНК.
Также предложен вектор, содержащий такой полинуклеотид согласно изобретению. Такой вектор предпочтительно содержит дополнительные нуклеиновокислотные последовательности, такие как необходимые элементы для транскрипции/трансляции нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей фосфатазу (например, последовательности промотора и/или терминатора). Указанный вектор также может содержать нуклеиновокислотные последовательности, кодирующие маркеры для селекции (например, антибиотик) для селекции или поддержания клеток-хозяев, трансформированных указанным вектором. Примерами подходящих векторов являются клонирующие или экспрессионные векторы. Согласно изобретению можно использовать любой вектор, подходящий для опосредования экспрессии в выбранной клетке-хозяине, либо интегрированный, либо эписомно реплицирующийся в клетке-хозяине. Вектор может представлять собой плазмиду, вирус (например, ретровирус, аденовирус, аденосателлитный вирус, бакуловирус и/или их производные), космиду, фаг или фагмиду, эписомный вектор или искусственную хромосому. Такой полинуклеотид или вектор является очень полезным для получения белка согласно изобретению, но также может использоваться для генотерапии.
Согласно изобретению, таким образом, предложен белок по изобретению для применения в качестве лекарственного средства. Также возможно лечить пациента, страдающего от или подверженного риску любого из вышеупомянутых заболеваний, подлежащих лечению полинуклеотидом согласно изобретению или вектором согласно изобретению, для того, чтобы экспрессировать белок согласно изобртению in vivo. Согласно изобретению, таким образом, также предложен полинуклеотид согласно изобретению или вектор согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно для предупреждения или лечения ослабленной почечной функции, повреждения почки, почечной недостаточности, гипофосфатазии, аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, астмы, хронического обструктивного заболевания легких, атеросклероза, воспалительного заболевания желудочно-кишечного тракта, инфекции, сепсиса, нейродерматита, воспалительного заболевания печени, воспалительного заболевания легкого и воспалительного заболевания почки.
Также предложен белок, полинуклеотид или вектор согласно изобретению для применения в способе предупреждения или лечения воспалительного заболевания, заболевания почки или гипофосфатазии.
Также предложено применение белка, полинуклеотида и/или вектора согласно изобретению для изготовления лекарственного средства, предпочтительно для предупреждения или лечения ослабленной почечной функции, повреждения почки, почечной недостаточности, гипофосфатазии, аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, астмы, хронического обструктивного заболевания легких, атеросклероза, воспалительного заболевания желудочно-кишечного тракта, инфекции, сепсиса, нейродерматита, воспалительного заболевания печени, воспалительного заболевания легкого и воспалительного заболевания почки.
2+
В другом воплощении согласно изобретению предложено применение белка щелочной фосфатазы согласно изобретению, полинуклеотида согласно изобретению или вектора согласно изобретению в получении лекарственного средства для лечения заболевания, которое сопровождается местной или системной недостаточностью Zn, причем указанное заболевание предпочтительно представляет собой воспалительное заболевание, заболевание почки или гипофосфатазию, предпочтительно указанное заболевание включает воспалительное заболевание, более предпочтительно - заболевание, выбранное из группы, состоящей из аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, астмы, хронического обструктивного заболевания легких, атеросклероза, воспалительного заболевания желудочно-кишечного тракта, инфекции, сепсиса, нейродерматита, воспалительного заболевания печени, воспалительного заболевания легкого и воспалительного заболевания почки.
2+
В еще одном другом воплощении согласно изобретению предложен способ лечения субъекта (предпочтительно человека) для лечения заболевания, которое предпочтительно сопровождается недостаточностью Zn, включающий введение эффективного количества фосфатазы согласно изобретению, где указанное заболевание предпочтительно включает воспалительное заболевание, более предпочтительно - выбранное из группы, состоящей из аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, астмы, хронического обструктивного заболевания легких, атеросклероза, воспалительного заболевания желудочно-кишечного тракта, инфекции, сепсиса, нейродерматита, воспалительного заболевания печени, воспалительного заболевания легкого и воспалительного заболевания почки.
Согласно изобретению, таким образом, предложен белок, полинуклеотид и/или вектор согласно изобретению для применения при ряде заболеваний. Белок согласно изобретению из-за его распределения в органах является особенно полезным для применения в лечении заболевания, затрагивающего желудочно-кишечный тракт, почку, кожу, печень, легкое, мозг, жировую ткань или кость.
В одном предпочтительном воплощении согласно изобретению предложен белок, полинуклеотид и/или вектор согласно изобретению для применения в лечении заболевания почки.
Несмотря на то, что продолжается проникновение в суть патофизиологии повреждения почки, и имеются терапии, которые улучшают почечную функцию [Lameire NH, Acute kidney injury: an increasing global concern. Lancet. 2013 Jul 13; 382 (9887): 170-9], все еще существует потребность в альтернативных лечениях для лечения повреждения почки и/или улучшения почечной функции. Согласно настоящему изобретению предложено такое альтернативное лечение посредством предоставления белка, полинуклеотида и/или вектора для применения согласно изобретению.
В предпочтительном воплощении согласно изобретению предложен белок, полинуклеотид и/или вектор для применения согласно изобретению, где указанное заболевание почки выбрано из группы из почечной недостаточности, острого повреждения почки, хронического заболевания почки, ишемического заболевания почки.
Термин острое повреждение почки (AKI), ранее именуемое острая почечная недостаточность, означает, что функция почки быстро теряется. AKI диагностируют на основе характерных лабораторных данных, таких как повышенный азот мочевины и креатинин крови или неспособность почек продуцировать достаточные количества мочи. AKI можно подразделять на преренальное AKI, внутреннее AKI и постренальное AKI.
osm
Na
Na
Преренальное AKI вызывается пониженным эффективным кровотоком к почке. Типичными лабораторными данными для преренального AKI являются: U больше 500, U: меньше 10, Fe: меньше 1% и отношение BUN/Cr: больше 20.
osm
Na
Na
Термин внутреннее AKI используется, когда очаги повреждения в самой почке являются причиной. Типичными лабораторными данными для внутреннего AKI являются: U: меньше 350, U: больше 20, Fe: больше 2% и отношение BUN/Cr: меньше 15.
osm
Na
Na
Термин постренальное AKI используется для тех состояний, где причиной AKI является закупорка мочевого тракта. Типичными лабораторными данными для постренального AKI являются: U: меньше 350, U: больше 40, Fe: больше 4% и отношение BUN/Cr: больше 15.
Во всем мире существует несколько руководств для классификации хронического заболевания почки. В качестве одного примера, ниже описаны критерии классификации Национального фонда почки (2002) «K/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease». Специалист может выбрать другие группы пациентов на основе других руководств.
2
2
Типично все индивиды со скоростью клубочковой фильтрации (GFR) меньше 60 мл/мин/1,73 м в течение 3 месяцев классифицируются как имеющие хроническое заболевание почки, независимо от присутствия или отсутствия повреждения почки. Обоснованием для включения данных индивидов является то, что ослабление функции почки до этого или меньшего уровня представляет собой потерю половины или более чем половины взрослого уровня нормальной функции почки, которое может быть ассоциировано с рядом осложнений. Обычно индивидов с хроническим повреждением почки классифицируют как имеющих хроническое заболевание почки, независимо от уровня GFR. Обоснованием для включения индивидов с GFR больше 60 мл/мин/1,73 м является то, что GFR может поддерживаться на нормальном или повышенном уровнях, несмотря на существенное повреждение почки и то, что пациенты с повреждением почки подвергаются повышенному риску двух главных исходов хронического заболевания почки: потери функции почки и развития сердечно-сосудистого заболевания, которые могут приводить к заболеваемости и смертности.
Потерю белка в моче рассматривают как независимый маркер ухудшения почечной функции и сердечно-сосудистого заболевания. Следовательно, согласно британским руководствам к стадии хронического заболевания почки добавляется буква «Р», если имеется значительная потеря белка.
5 стадий хронического заболевания почки типично классифицируют следующим образом:
2
Стадия 1: слегка ослабленная функция; повреждение почки с нормальной или относительно высокой GFR (большей или равной 90 мл/мин/1,73 м). Повреждение почки определяется как патологические отклонения или маркеры повреждения, включающие отклонения в анализе крови или мочи, или в исследованиях по визуализации.
2
Стадия 2: легкое уменьшение GFR (60-89 мл/мин/1,73 м) с повреждением почки. Повреждение почки определяется как патологические отклонения или маркеры повреждения, включающие отклонения в анализе крови или мочи, или в исследованиях по визуализации.
2
Стадия 3: умеренное уменьшение GFR (30-59 мл/мин/1,73 м). Британские руководства для скрининга и направления к врачу-специалисту делают различие между стадией 3А (GFR 45-59) и стадией 3В (GFR 30-44).
2
Стадия 4: серьезное уменьшение GFR (15-29 мл/мин/1,73 м). Подготовка к заместительной почечной терапии.
2
Стадия 5: установившаяся почечная недостаточность (GFR меньше 15 мл/мин/1,73 м), постоянная заместительная почечная терапия (RRT) или терминальная стадия почечной недостаточности (ESRD).
Термин «почечная недостаточность» теперь обозначает медицинское состояние, при котором почки не могут адекватно отфильтровывать продукты выделения из крови. Двумя главными формами являются острое повреждение почки, которое часто является обратимым при адекватном лечении, и хроническое заболевание почек, которое часто является необратимым.
Термин «ишемическое заболевание почки» используют для тех состояний, при которых клинически значимое уменьшение скорости клубочковой фильтрации или потери почечной паренхимы вызвано гемодинамически значимым стенозом почечной артерии или другими причинами, которые приводят к низкому кровяному давлению в почках, такими как, например, гемодинамический шок или применение артериального зажима для временного прерывания кровотока.
Авторы изобретения также показали, что белок согласно изобретению является полезным в лечении гипофосфатазии (НРР). Это было достаточно неожиданным, так как предыдущие эксперименты с использованием TNAP для лечения гипофосфатазии не смогли продемонстрировать эффективность заместительной терапии ферментом. Следовательно, разработали искусственный слитый белок между ферментом TNAP и пептидом хоминга кости (Whyte et al, N Engl J Med. 2012 Mar 8; 366 (10): 904-13). Неожиданно то, что для белка согласно настоящему изобретению не нужен такой пептид хоминга кости, и он способен эффективно уменьшать признаки симптомов гипофосфатазии в мышиной модели. В другом предпочтительном воплощении согласно изобретению, таким образом, предложен белок, полинуклеотид и/или вектор согласно изобретению для применения в лечении гипофосфатазии.
Метаболическая основа гипофосфатазии происходит от молекулярного дефекта в гене, кодирующем неспецифичную для ткани щелочную фосфатазу (TNAP). TNAP представляет собой эктофермент, связанный с клеточными мембранами наружной поверхности остеобласта и хондроцита. TNAP обычно гидролизует несколько веществ, включая неорганический пирофосфат (PPi) и пиридоксаль-5'-фосфат (PLP) - главную форму витамина B6.
При низком уровне TNAP неорганический пирофосфат (PPi) накапливается внеклеточно и мощно ингибирует образование гидроксиапатита (минерализацию), вызывая рахит у младенцев и детей и остеомаляцию (размягчение костей) у взрослых. PLP является главной формой витамина B6, и он должен дефосфорилироваться TNAP до пиридоксаля (PL) для пересечения клеточной мембраны. Недостаточность витамина B6 в мозге ухудшает синтез нейротрансмиттеров, что может вызывать судороги. В некоторых случаях отложение кристаллов кальция пирофосфата дегидрата (CPPD) в суставе может вызывать псевдоподагру.
В настоящее время нет одобренных терапий для НРР. Современная тактика заключается в облегчении симптомов, поддержании кальциевого баланса и применении физических, связанных с занятостью, зубных и ортопедических вмешательств, по мере необходимости. Введение бисфосфоната (синтетический аналог пирофосфата) у одного младенца не имело ощутимого эффекта на скелет, и заболевание младенца прогрессировало до смерти в возрасте 14 месяцев.
Пересадка клеток костного мозга у двух тяжело пораженных младенцев давала радиографическое и клиническое улучшение, несмотря на то, что механизм эффективности не полностью понятен, и сохранялась значительная заболеваемость. Ферментативная заместительная терапия с использованием нормальной сыворотки или обогащенной ALP сыворотки от пациентов с костным заболеванием Пэджета не была полезной [Whyte MP, Valdes R, Ryan LM, McAlister WH (September 1982). "Infantile hypophosphatasia: enzyme replacement therapy by intravenous infusion of alkaline phosphatase-rich plasma from patients with Paget bone disease". J. Pediatr. 101 (3): 379-86][Whyte MP, McAlister WH, Patton LS, et al. (December 1984). "Enzyme replacement therapy for infantile hypophosphatasia attempted by intravenous infusions of alkaline phosphatase-rich Paget plasma: results in three additional patients". J. Pediatr. 105 (6): 926-33]. Считали, что данные ферментативные заместительные терапии являются неэффективными, так как полагают, что функция щелочной фосфатазы осуществляется на поверхности кости, а не в крови. Дополнительные попытки улучшить эффективность ферментативной заместительной терапии, следовательно, строились вокруг нацеленного на кость фермента TNAP с многообещающими результатами [Whyte et al. N Engl J Med. 2012 Mar 8; 366 (10): 904-13]. Неожиданно то, что в настоящем изобретении показано то, что без введения искусственной нацеливающей на кость группировки белок согласно изобретению является полезным в мышиной модели гипофосфатазии. Одним преимуществом настоящего белка над белком, описанным в Whyte et al. и Millan et al. [J. Bone Miner. Res. 2008; 23 (6): 777-787], является то, что, из-за отсутствия искусственной нацеливающей на кость группировки, ожидается, что настоящий белок является значительно менее иммуногенным. Настоящий белок состоит из белка, имеющего высокую идентичность последовательности со встречающимися в природе человеческими белками щелочными фосфатазами. Кроме того, белок по настоящему изобретению имеет преимущество над нацеленной на кость щелочной фосфатазой в отношении легкости и стоимости получения.
В предпочтительном воплощении предложен белок, полинуклеотид и/или вектор согласно изобретению для применения в лечении гипофосфатазии, где указанная гипофосфатазия выбрана из перинатальной гипофосфатазии, младенческой гипофосфатазии, детской гипофосфатазии и взрослой гипофосфатазии.
Перинатальная гипофосфатазия является наиболее тяжелой формой гипофосфатазии. В утробе глубокая гипоминерализация приводит к caput membraneceum, деформированным или укороченным конечностям во время беременности и при рождении, и быстрой смерти из-за дыхательной недостаточности.
Младенческая гипофосфатазия появляется в первые 6 месяцев жизни. Постнатальное развитие часто кажется нормальным до начала плохого питания и неадекватного увеличения массы тела, и распознаются клинические проявления рахита. Гиперкальцемия и гиперкальцинурия также являются обычными и могут объяснять нефрокальциноз, нарушение функций почек и эпизоды рецидивирующей рвоты. Смертность приблизительно составляет 50% в первый год жизни.
Гипофосфатазия в детстве имеет варьирующее клиническое выражение. В результате аплазии, гипоплазии или дисплазии цемента зуба происходит преждевременная потеря молочных зубов (т.е. до возраста 5 лет). Часто сначала выпадают резцы; время от времени преждевременно выпадают почти все молочные зубы. Рентгеновские снимки зубов иногда демонстрируют увеличенные камеры пульпы и корневые каналы, характерные для «раковинообразных зубов» при рахите. Пациенты также могут демонстрировать запоздалое начало хождения, характерную походку вразвалку, жалобы на тугоподвижность и боль, и имеют слабость мышц поясов верхних и нижних конечностей (особенно в бедрах), согласующуюся с непрогрессирующей миопатией. Типично рентгеновские снимки показывают рахитические деформации и характерные дефекты кости около концов главных длинных костей (т.е. «языки» рентгенопрозрачности, выдающиеся из рахитической пластинки роста в метафиз). Обычными являются задержка роста, частые переломы и остеопения. У тяжело пораженных младенцев и детей раннего возраста это не является необычным, несмотря на появление на рентгеновских снимках широко «открытых» родничков, для того, чтобы произошел функциональный синостоз швов черепа. Иллюзия «открытых» родничков возникает из-за больших площадей гипоминерализованного свода черепа. Затем истинное преждевременное костное срастание швов черепа может увеличивать внутричерепное давление.
Гипофосфатазия взрослых может быть ассоциирована с рахитом, преждевременной потерей молочных зубов или ранней потерей взрослых зубов, с последующим относительно хорошим состоянием здоровья. Остеомаляция проявляется в болезненности стоп из-за рецидивирующих плохо заживающих усталостных переломов плюсневой кости и дискомфорте в бедрах или тазобедренных суставах из-за псевдопереломов бедренной кости, которые, при их проявлении в рентгенографическом исследовании, отличаются от большинства других типов остеомаляции (которые происходят медиально) по их положению в латеральных покровах проксимального отдела бедренной кости. Некоторые пациенты страдают от отложений кристаллов кальция пирофосфата дигидрата со случающимися время от времени открытыми приступами артрита (псевдоподагры), которые, по-видимому, являются результатом повышенных эндогенных уровней неорганического пирофосфата (PPi). Данные пациенты также могут страдать от дегенерации суставных хрящей и пирофосфатной артропатии. Рентгеновские снимки могут выявлять псевдопереломы в латеральных покровах проксимального отдела бедренной кости, усталостные переломы, и пациенты могут испытывать остеопению, хондрокальциноз, признаки пирофосфатной артропатии и кальцинированный периартрит.
В предпочтительном воплощении предложен белок, полинуклеотид и/или вектор для применения в лечении гипофосфатазии согласно изобретению, где данное лечение приводит к продленному выживанию; повышенной массе тела; улучшенному скелетному фенотипу (такому как индукция вторичных центров окостенения, улучшенная минерализация кости, например в трубчатой кости и/или в кортикальном слое кости, или индукция остеоида); ослаблению черепно-лицевых дефектов (таких как нарушения формы и срастание венечного шва); улучшенному зубочелюстному фенотипу (такому как улучшение высоты и формы коренных зубов, толщины дентина и минерализации кости) и/или к уменьшению уровней PPi в плазме пациента.
Также предложено применение белка, полинуклеотида и/или вектора согласно изобретению для получения лекарственного средства для предупреждения или лечения гипофосфатазии, где лечение приводит к продленному выживанию, повышенной массе тела, улучшенному скелетному фенотипу (такому как индукция вторичных центров окостенения, улучшение минерализации кости, например в трубчатой кости и/или кортикальном слое кости, или индукция остеоида); ослаблению черепно-лицевых дефектов (таких как нарушения формы и срастание венечного шва); улучшенному зубочелюстному фенотипу (такому как улучшение высоты и формы коренных зубов, толщины дентина и минерализации кости) и/или к уменьшению уровней PPi в плазме пациента.
Также предложен способ лечения субъекта, страдающего или подверженного риску гипофосфатазии, где лечение приводит к продленному выживанию, повышенной массе тела, улучшенному скелетному фенотипу (такому как индукция вторичных центров окостенения, улучшение минерализации кости, например в трубчатой кости и/или кортикальном слое кости, или индукция остеоида); ослаблению черепно-лицевых дефектов (таких как нарушения формы и срастание венечного шва); улучшенному зубочелюстному фенотипу (такому как улучшение высоты и формы коренных зубов, толщины дентина и минерализации кости) и/или к уменьшению уровней PPi в плазме у указанного субъекта.
В более предпочтительном воплощении предложен белок, полинуклеотид и/или вектор для применения в лечении гипофосфатазии согласно изобретению, где указанная гипофосфатазия выбрана из младенческой, детской или взрослой гипофосфатазии. Более предпочтительно гипофосфатазия представляет собой младенческую гипофосфатазию.
Для обозначения соответствующих изоформ щелочной фосфатазы во всем описании изобретения, примерах и литературе в данной области используется другая номенклатура. Для ясности в Таблице 1, приведенной ниже, перечислены обычно используемые названия и сокращения или используемые в данной заявке названия и сокращения.
Под термином «секретируемая» подразумевается, что к зрелому белку не был присоединен посттрансляционный гликозилфосфатидилинозитольный (GPI) якорь, обеспечивая то, что белок секретируется и не связывается с мембраной. GPI якорь представляет собой гликолипид, который может быть присоединен к С-концу белка во время посттрансляционной модификации. Он состоит из фосфатидилинозитольной группы, связанной через углеводсодержащий линкер (глюкозамин и манноза с инозитольным остатком через гликозидную связь), и посредством мостика этаноламинфосфата (EtNP) - с C-концевой аминокислотой зрелого белка. Две жирные кислоты в пределах гидрофобной фосфатидилинозитольной группы заякоривают белок в клеточной мембране. Для продуцирования и последующего процессинга преимущественным и, таким образом, предпочтительным является то, что белок согласно изобретению не содержит GPI якорь.
Ясно, что любая из описанных секретируемых модифицированных фосфатаз (и, таким образом, также секретируемый белок согласно изобретению) может, например, быть продуцирован посредством введения в клетку-хозяина нуклеиновой кислоты, способной кодировать указанную секретируемую фосфатазу в функциональной связи с регуляторными последовательностями, и обеспечения экспрессии указанной клеткой-хозяином указанной секретируемой фосфатазы и возможно выделением продуцированной фосфатазы из среды, в которой выращивается и/или поддерживается клетка-хозяин. Однако, помимо мутаций в вышеупомянутой последовательности присоединения GPI, существуют другие способы, которые создают не содержащие GPI якоря секретируемые белки, например:
1. После экспрессии в виде заякоренных в мембране белков могут быть использованы фосфолипазы для отщепления GPI якоря. Следовательно, согласно изобретению также предложен способ получения секретируемой фосфатазы, включающий культивирование хозяина, способного экспрессировать заякоренную в мембране фосфатазу, обеспечение продуцирования указанной клеткой-хозяином указанной фосфатазы и инкубирование полученых клеток с фосфолипазой и, возможно, выделение высвобожденной фосфатазы.
2. Для получения секретируемой формы в противном случае заякоренного GPI белка также можно использовать подавление продуцирования GPI якоря или применение клетки (типа), которая является дефицитной по продуцированию GPI якоря. Примерами линий клеток, которые были сделаны дефицитными по биохимии GPI заякоривания, являются, например, Jurkat, АМ-В, С84, BW, S49, СНО (клетки яичников китайского хомяка) и Raji. В еще одном воплощении изобретения, следовательно, предложен способ продуцирования секретируемой фосфатазы, включающий культивирование клетки-хозяина, способной к экспрессии секретируемой (щелочной) фосфатазы (например, клетки-хозяина, содержащей нуклеиновоокислотную последовательность, кодирующую любую из упомянутых модифицированных секретируемых (щелочных) фосфатаз), обеспечение продуцирования указанным хозяином указанной секретируемой фосфатазы и возможно выделение продуцированной фосфатазы, где указанная клетка-хозяин не способна к биосинтезу функциональных белков, заякоренных GPI. Однако клетка-хозяин также может продуцировать фосфатазу с функциональной сигнальной последовательностью GPI.
3. Для ингибирования присоединения GPI якоря к белку может быть использовано подавление с использованием или применение клетки, дефицитной по трансамидазам, делающее белок безъякорным и секретируемым. Такая дефицитная клетка была получена посредством мутагенеза в СНО.
Вектор согласно изобретению предпочтительно содержит дополнительные нуклеиновокислотные последовательности, такие как необходимые элементы для транскрипции/трансляции нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей фосфатазу (например, последовательности промотора и/или терминатора). Указанный вектор также может нуклеиновокислотные содержать последовательности, кодирующие селективные маркеры (например, антибиотик) для отбора или поддержания клеток, трансформированных указанным вектором. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность GPI якоря, отсутствует в полинуклеотиде и/или векторе согласно изобретению. Примерами подходящих векторов являются клонирующие или экспрессионные векторы. Согласно изобретению может быть использован любой подходящий вектор для опосредования экспрессии в подходящей клетке-хозяине, либо интегрированный, либо эписомно реплицирующийся в клетке-хозяине. Данный вектор может представлять собой плазмиду, вирус (например, ретровирус, аденовирус, аденосателлитный вирус, бакуловирус или их производные), космиду, фаг или фагмиду, эписомный вектор или искусственную хромосому.
Кроме того, согласно изобретению также предложена клетка-хозяин, содержащая белок, нуклеиновокислотную последовательность или вектор согласно изобретению, как здесь описано. Данная клетка может быть эукариотической клеткой, предпочтительно клеткой млекопитающего, растительной клеткой или дрожжевой клеткой, которая подходит для продуцирования рекомбинантных белков. Подходящие дрожжевые клетки-хозяева включают, например, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Предпочтительные клетки-хозяева представляют собой клетки, происходящие из млекопитающего (или более предпочтительно - человека), такие как ВНК (почка новорожденного хомяка), НЕК293 (эмбриональная почка человека), СНО или PerC6™. В особенно предпочтительном воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку СНО.
Нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая белок согласно изобретению, вектор, содержащий указанную нуклеиновокислотную последовательность, и/или клетка-хозяин, содержащая указанную нуклеиновокислотную последовательность, являются очень полезными в продуцировании белка согласно изобретению. Белок согласно изобретению содержит сайты гликозилирования, и, следовательно, данный белок предпочтительно продуцируется в клетках, которые обеспечивают желательную картину гликозилирования. В предпочтительном воплощении используемая система продуцирования представляет собой платформу продуцирования in vitro на основе млекопитающего (например, человека), и даже более предпочтительно продуцирование включает крупномасштабное продуцирование. В другом предпочтительном воплощении используемая система продуцирования представляет собой растительную или дрожжевую платформу или платформу на основе млекопитающего (предпочтительно не являющегося человеком), в которую вводится искусственная подобная человеческой картина гликозилирования.
В одном воплощении согласно изобретению, таким образом, предложен способ продуцирования белка согласно изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид согласно изобретению или вектор согласно изобретению, и обеспечение продуцирования клеткой-хозяином указанного белка. Предпочтительные клетки-хозяева представляют собой клетки, происходящие из млекопитающего (или более предпочтительно человека), такие как BHK, HEK293, СНО или PerC6™. В особенно предпочтительном воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку СНО. Предпочтительно способ продуцирования белка согласно изобретению дополнительно включает сбор и возможно очистку указанного белка из указанной культуры.
Как уже упоминалось, описанный здесь белок согласно изобретению является полезным в терапии. В одном воплощении согласно изобретению предложена композиция, предпочтительно фармацевтическая композиция, содержащая белок согласно изобретению. Указанная фармацевтическая композиция возможно содержит фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
Данная композиция может быть представлена в любой форме, например в виде таблетки, в виде инъецируемой жидкости или в виде инфузионной жидкости и т.д. Кроме того, композицию, белок, нуклеотид и/или вектор согласно изобретению можно вводить посредством разных путей, например внутривенно, ректально, бронхиально или перорально. Еще одним подходящим путем введения является применение капельницы в двенадцатиперстную кишку.
В предпочтительном воплощении используемым путем введения является внутривенный путь. Для специалиста очевидно, что предпочтительно доставляется эффективное количество белка согласно изобретению. В качестве отправной точки можно использовать 1-50000 U(единица)/кг/сутки. Другим подходящим путем, например, для НРР, является подкожный путь. При использовании внутривенного пути введения белок согласно изобретению можно (по меньшей мере в течение определенного количества времени) вводить посредством непрерывной инфузии.
Указанная композиция согласно изобретению возможно может содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, стабилизаторы, активаторы, носители, усилители проникновения, пропелленты, дезинфицирующие агенты, разбавители и консерванты. Подходящие эксципиенты обычно известны в области фармацевтических композиций, и их легко может найти и применить квалифицированный специалист, например, ссылаясь на Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia PA, 17th ed. 1985.
Для перорального введения белок можно, например, вводить в твердых лекарственных формах, таких как капсулы, таблетки (например, с энтеросолюбильным покрытием) и порошки, или в жидких лекарственных формах, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. АР может быть инкапсулирована в желатиновых капсулах совместно с неактивными ингредиентами и порошковыми носителями, такими как глюкоза, лактоза, сахароза, маннит, крахмал, целлюлоза или производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновая кислота, натрия сахарин, тальк, карбонат магния и тому подобное. Примерами дополнительных неактивных ингредиентов, которые можно добавлять для предоставления желательного цвета, вкуса, стабильности, буферной емкости, дисперсии или других известных желательных характеристик, являются красный оксид железа, силикагель, лаурилсульфат натрия, диоксид титана, съедобные белые чернила и тому подобное. Для получения прессованных таблеток можно использовать аналогичные разбавители. И таблетки, и капсулы можно изготовлять в виде продуктов с замедленным высвобождением для обеспечения непрерывного высвобождения лекарственного средства в течение периода, составляющего часы. Прессованные таблетки могут быть покрыты сахаром или покрыты пленкой для маскировки какого-либо неприятного вкуса и защиты таблетки от атмосферы, или покрыты энтеросолюбильным покрытием для селективного распада в желудочно-кишечном тракте. Жидкие лекарственные формы для перорального введения могут содержать красители и корригенты для улучшения приема пациентом.
В предпочтительном воплощении композиция, содержащая белок согласно изобретению, подходит для перорального введения и содержит энтеросолюбильное покрытие для защиты АР от вредных эффектов желудочных соков и низкого рН. Энтеросолюбильное покрытие и композиции с контролируемым высвобождением являются хорошо известными в данной области. Композиции энтеросолюбильного покрытия, используемые в данной области, могут содержать раствор водорастворимого полимера энтеросолюбильного покрытия, смешанный с активным(и) ингредиентом(ами) и другими эксципиентами, которые диспергированы в водном растворе, и которые можно затем высушивать и/или гранулировать. Сформированное энтеросолюбильное покрытие дает устойчивость к атаке белка согласно изобретению атмосферной влагой и кислородом во время хранения и желудочными жидкостями и низким pH после проглатывания, при легком распаде при щелочных условиях, которые существуют в нижних отделах кишечного тракта.
В изобретении предложена композиция согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно для лечения заболевания, сопровождающегося местной или системной недостаточностью цинка, воспалительных заболеваний, заболевания почки или гипофосфатазии. Воспалительное заболевание предпочтительно выбрано из группы, состоящей из аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, астмы, хронического обструктивного заболевания легких, атеросклероза, воспалительного заболевания желудочно-кишечного тракта, инфекции, сепсиса, нейродерматита, воспалительного заболевания печени, воспалительного заболевания легкого и воспалительного заболевания почки. Заболевание почки предпочтительно выбрано из группы, состоящей из почечной недостаточности, острого повреждения почки, хронического заболевания почки и ишемического заболевания почки. Гипофосфатазия предпочтительно выбрана из группы, состоящей из перинатальной гипофосфатазии, младенческой гипофосфатазии, детской гипофосфатазии и взрослой гипофосфатазии.
Помимо того факта, что белок согласно изобретению может быть включен в фармацевтическую композицию, такая фосфатаза также может быть частью питательной композиции или нутрицевтика.
Белок согласно изобретению может быть добавлен в питательное вещество (такое как молоко), но также может продуцироваться в указанном питательном веществе (например, посредством молекулярной инженерии). Кроме того, можно получать таблетки и/или капсулы, которые затем добавляют в питательное вещество, или которые могут непосредственно приниматься человеком.
Дополнительно предложен способ лечения субъекта, страдающего от воспалительного заболевания, заболевания почки или гипофосфатазии, включающий введение эффективного количества белка согласно заявке, например выделенного или рекомбинантного белка, имеющего фосфатазную активность, где часть указанного белка содержит аминокислотную последовательность из по меньшей мере 50 последовательных аминокислот, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с полноразмерным короновидным доменом человеческой PLAP, часть указанного белка содержит аминокислотную последовательность из по меньшей мере 200 последовательных аминокислот, имеющую 90%-ную идентичность последовательности с N-концевой областью, фланкирующей короновидный домен человеческой ALPI, и часть указанного белка содержит аминокислотную последовательность из по меньшей мере 40 последовательных аминокислот, имеющую 90%-ную идентичность последовательности с C-концевой областью, фланкирующей короновидный домен человеческой ALPI, где полноразмерный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности с полноразмерной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, при условии, что аминокислота в положении 279 представляет собой лейцин (L), аминокислота в положении 328 представляет собой валин (V), и аминокислота в положении 478 представляет собой лейцин (L), или эффективного количества полинуклеотида согласно заявке, или эффективного количества вектора согласно заявке.
Изобретение будет более подробно объяснено в следующих, неограничивающих примерах.
Описание чертежей
Фиг. 1 - аминокислотные последовательности зрелого белка LVL-RecAP, hlAP и hPLAP. Предполагаемые короновидные домены разных белков подчеркнуты.
Фиг. 2 - распределение в органах LVL-RecAP по сравнению с catALPI/crownALPP. Показано распределение LVL-RecAP в органе относительно крови, поделенное на распределение catALPI/crownALPP в органе относительно крови (соответствует отношению по оси y). Более высокое значение указывает на нацеливание LVL-RecAP в соответствующий орган по сравнению с catALPI/crownALPP.
-/-
Фиг. 3 - выживание мышей Akp2, обработанных одним из: носителя, 1 мг LVL-RecAP/кг/сутки, 8 мг LVL-RecAP/кг/сутки или 16 мг LVL-RecAP/кг/сутки.
Фиг. 4 - сывороточные концентрации креатинина у поросят, страдающих от почечного ишемического/реперфузионного повреждения. Животные с имитацией воздействия подверглись хирургической процедуре, во время которой была удалена левая почка. Однако не проводили закупорку и реперфузию почки. В группе, которая получала 0,32 мг/кг/сутки, в сутки 0 половину дозы вводили до реперфузии, и оставшуюся половину дозы вводили в 8 плюс/минус 2 часа после реперфузии. Полную дозу вводили ежесуточно в течение остающегося прижизненного периода.
Фиг. 5 - концентрации АР у поросят, страдающих от почечного ишемического/реперфузионного повреждения. Животные с имитацией воздействия подверглись хирургической процедуре, во время которой была удалена левая почка. Однако не проводили закупорку и реперфузию почки. В группе, которая получала 0,32 мг/кг/сутки (200 U/кг/сутки), в сутки 0 половину дозы вводили до реперфузии, и оставшуюся половину дозы вводили в 8 плюс/минус 2 часа после реперфузии. Полную дозу вводили ежесуточно в течение остающегося прижизненного периода.
-/-
-/-
Фиг. 6 - улучшение выживания и массы тела мышей AIpI посредством обработки LVL-RecAP. A) LVL-RecAP16 выживали до конца эксперимента. Среднее выживание составляло р19, р22 и р42,5 для носителя, LVL-RecAP1 и LVL-RecAP8 соответственно. Б) Мыши AIpI, обработанные носителем, легче, чем однопометные мыши WT (дикий тип); обработка LVL-RecAP1 улучшает массу тела до значений, близких к WT, в р18. Мыши, обработанные носителем, не выживают дольше, и мыши, обработанные LVL-RecAP8, все еще легче, чем однопометные мыши WT в р53. В то же самое время мыши, обработанные LVL-RecAP16, демонстрируют массу тела, значимо не отличающуюся от их однопометных мышей WT в р53.
-/-
-/-
-/-
-/-
Фиг. 7 - обработка LVL-RecAP улучшает скелетный фенотип мышей AIpI. Рентгеновские снимки позвоночника, передней конечности, грудной клетки, задней конечости и лап от мышей Аkp2, обработанных носителем, LVL-RecAP1, LVL-RecAP8, LVL-RecAP16 и необработанных контролей WT (увеличение 5×). А) Мыши Akp2 демонстрируют тяжелую остеомаляцию (стрелки) в позвонках, длинных костях и грудной клетке. У мышей Akp2 отсутствуют вторичные центры окостенения (звездочка). Обработка LVL-RecAP 1 слегка корректирует данный фенотип (наконечники стрелок) по сравнению с необработанным WT в р18. Б) Обработка LVL-RecAP8 и LVL-RecAP16 явно корректирует фенотип костей в позвонках, длинных костях и грудной клетке. В частности, улучшаются самые дистальные окончания, как продемонстрировано развитием вторичных центров окостенения в плюсневой области (наконечники стрелок).
-/-
-/-
Фиг. 8 - улучшенная минерализация у мышей AIpI, обработанных LVL-RecAP. А) Гистологический анализ бедренных костей обработанных носителем AIpI (р18), LVL-RecAP8 (р51), LVL-RecAP16 (р53) и необработанных мышей WT в р53. Окрашивание по фон Косса выявило лучшую минерализацию кости при увеличении дозировок LVL-RecAP8 и LVL-RecAP16. Центры вторичного окостенения и кортикальная область кости демонстрируют поразительное улучшение минерализации (черный) по сравнению с необработанными. У LVL-RecAP8 и LVL-RecAP16 имеется меньше губчатой кости по сравнению с WT, но повышенная минерализация в губчатой области, а также больше остеоида, который, как ожидается, станет губчатой костью. Б/В) Анализ BV (объем кости/TV(общий объем) и OV(объем остеоида)/BV для LVL-RecAP8 и LVL-RecAP16 продемонстрировал меньший объем кости и больший объем остеоида, чем у контролей, соответствующих по возрасту.
i
i
i
i
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
Фиг. 9 - улучшение остеомаляции и плазматических уровней PP у мышей AIpI, обработанных LVL-RecAP. А) Гистологический анализ бедренных костей обработанных носителем AIpI (р18), LVL-RecAP8 (р51), LVL-RecAP16 (р53) и необработанных мышей WT в р53. Трехцветное окрашивание срезов бедренных костей по Голднеру демонстрирует тяжелую остеомаляцию у AIpI и улучшенную минерализацию в кортикальной области и во вторичном окостенении при повышенных дозировках LVL-RecAP8 и LVL-RecAP16. Присутствие увеличенных областей остеоида свидетельствует об отложении кости, но еще не минерализованной. Б/В) Концентрации PP в плазме мышей Akp2, получающих LVL-RecAP1, LVL-RecAP16, и WT. Обработка LVL-RecAP1 приводит к значимому снижению повышенных уровней PP у мышей AIpI в р18. В р53 обработка LVL-RecAP16 приводила к коррекции плазматических уровней PP - сопоставимых с контролями WT.
-/-
-/-
-/-
-/-
Фиг. 10 - отсутствие черепно-лицевых дефектов у мышей AIpI, обработанных LVL-RecAP. Полученные посредством мкКТ (микрокомпьютерная томография) изображения изоповерхности черепов мышей WT (А, Г), обработанных носителем AIpI (Б, Д) и LVL-RecAP16 (В, Е) в р21 и р53 соответственно. Ни лобные, ни теменные кости обработанных мышей AIpI не были значимо отличными от таковых у мышей WT. Взрослые черепа мышей AIpI, обработанных LVL-RecAP16, по-видимому, не отличались от WT в показателях размера и формы.
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
Фиг. 11 - обработка LVL-RecAP частично восстанавливает зубочелюстной фенотип у мышей AIpI. По сравнению с (А) рентгеновским снимком и (Г) анализом мкКТ контролей дикого типа в р25-26, нижние челюсти (Б, Е) необработанной мыши AIpI характеризуются гипоминерализованной и уменьшенной альвеолярной костью (АВ), короткими коренными зубами (М1, М2 и М3) с тонким дентином (DE), широкими камерами пульпы и дефектным (белая звездочка) дентином резцов (INC). По сравнению с (Д) гистологией контрольных тканей периодонта, (Е) мыши AIpI не демонстрируют неклеточного цемента (АС), и остеоид альвеолярной кости вторгается в пространство PDL (периодонтальная связка), создавая анкилоз кость-зуб (звездочка). (В, 3) Мыши AIpI, обработанные LVL-RecAP8, демонстрируют улучшенный рентгенографический вид высоты коренных зубов, толщины дентина и минерализации кости, несмотря на то, что зубы-резцы остаются дефектными. (И) Гистологически LVL-RecAP не восстанавливает неклеточный цемент на поверхности корня. По сравнению с (Й, Л) контролями в р53, (К, М) мыши AIpI, обработанные LVL-RecAP16, демонстрируют пониженную минерализацию альвеолярной кости вокруг коренных зубов. У обработанных мышей AIpI форма и минерализация коренных зубов оказываются относительно нормальными, тогда как зубы-резцы остаются тяжело пораженными по аналогу корня (белая звездочка). По сравнению с гистологией (Н) контрольных коренных зубов WT, (П) мыши AIpI, обработанные LVL-RecAP16, характеризуются смесью минерализованной альвеолярной кости и остеоида (звездочки), и уменьшенным, но сохраняющимся пространством PDL. Плохое периодонтальное присоединение доказывается отсутствием цемента, дезорганизацией и отсоединением PDL и ослаблением роста эпителия соединительной связки периодонта. Отмечали маленькие области присоединения PDL (шеврон) к зубу. По сравнению с сильной и параллельной организацией коллагеновых волокон PDL в (О) контрольных тканях, на которую указывает окрашивание пикросириусом под поляризованным светом, (Р) мыши AIpI, обработанные LVL-RecAP16, характеризуются менее организованным PDL, несмотря на то, что существуют области организации и присоединения, смежные с прорывными областями присоединения корня зуба (белый шеврон).
Фиг. 12 - обработка RecAP ослабляет индуцированное LPS (липополисахарид) продуцирование цитокинов в человеческих эпителиальных клетках проксимальных канальцев (ciPTEC). CiPTEC предобрабатывали recAP (1-5-10 U/мл), с последующей инкубацией с LPS (10 мкг/мл) в течение 24 ч, и затем измеряли продукцию TNF-α (фактор некроза опухолей-альфа), IL-6 (интерлейкин-6) и IL-8 (А) в клетках на генном уровне посредством кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция) и (Б) на уровне белка в супернатанте посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). (В) recAP (10 U/мл) вводили за 2 ч до воздействия LPS, одновременно с LPS или через 2 ч после воздействия LPS, с последующим измерением содержания белка TNF-α, IL-6 и IL-8. (Г) ciPTEC предобрабатывали неактивной АР, не имеющей гидролитических свойств, в течение 2 ч, с последующей инкубацией с LPS (10 мкг/мл) в течение 24 ч, после чего измеряли содержание белка TNF-α, IL-6 и IL-8. Контрольные клетки инкубировали с культуральными средами. Данные выражены как среднее плюс/минус SEM (стандартная ошибка среднего) (n равно 5), # - p меньше 0,05 по сравнению с контролем, * - p меньше 0,05 по сравнению с LPS.
Фиг. 13 - эффекты recAP не ограничиваются воспалением, индуцированным LPS, и являются специфичными для почки. CiPTEC предобрабатывали recAP (10 U/мл) в течение 2 ч, с последующей 24-часовой инкубацией с (A) TNF-α (10 нг/мл) или (Б) супернатантом стимулированных LPS мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС, 1 нг/мл LPS), после чего измеряли продукцию IL-6 и IL-8 на уровне белка посредством ELISA. (В) РВМС преинкубировали с recAP (10 U/мл) в течение 2 ч, с последующим воздействием LPS (1 нг/мл) в течение 24 ч. Продукцию IL-6 и TNF-α измеряли посредством ELISA. Контрольные клетки инкубировали с культуральной средой. Данные выражены как среднее плюс/минус SEM (n равно 5), # - p меньше 0,05 по сравнению с контролем, * - p меньше 0,05 по сравнению с LPS.
Фиг. 14 - эффект recAP на индуцированное LPS высвобождение АТФ in vitro. ciPTEC предобрабатывали recAP (10 U/мл), с последующей инкубацией с LPS (10 мкг/мл или 100 мкг/мл). Через 30 минут собирали супернатант для определения клеточного высвобождения АТФ посредством биолюминисценции. Контрольные клетки инкубировали с культуральными средами. Данные выражены как среднее плюс/минус SEM (n равно 5), # - р меньше 0,05 по сравнению с контролем.
1/2
1/2
Фиг. 15 - recAP предупреждает индуцированное LPS ухудшение почечной функции in vivo. Почечную функцию оценивали чрескожным измерением t (период полувыведения) FITC (флуоресцеинизотиоцианат)-синистрина. AKI индуцировали у крыс посредством LPS (0,3 мг/кг массы тела, t равно 0), с последующей обработкой recAP (1000 U/кг массы тела) в t, равное 2. Измерения t проводили в t, равное 2 ч, и t, равное 21,5 ч (А, Б: примеры кинетики FITC-синистрина, полученной для одной крысы в два соответствующих момента времени). Мочу отбирали между t, равным 5, и t, равным 16 ч, и плазму отбирали в t, равное 1,5, и t, равное 24 ч, обеспечивая расчет (В) фракционной экскреции мочевины и (Г) клиренса креатинина со средним значением в плазме для t, равного 1,5, и t, равного 24 ч. Данные выражены как среднее плюс/минус SEM (плацебо, LPS, n равно 6; LPS плюс recAP, n равно 5), # - р меньше 0,05 по сравнению с плацебо.
Фиг. 16 - recAP предупреждает повреждение почки во время индуцированного LPS AKI in vivo. (А) экскрецию KIM-1 (молекулы повреждения почки 1) мочи и (Б) экскрецию NGAL (липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов), (В) уровни NGAL в плазме (t равно 24 ч) и (Г) содержание белка KIM-1 в почке определяли посредством ELISA. (Д) Залитые в парафин срезы почки окрашивали антителом против KIM-1 для визуализации экспресии белка KIM-1. Масштабные линейки: 400 мкм (левая панель), 200 мкм (правая панель). Данные выражены как среднее плюс/минус SEM (плацебо, LPS, n равно 6; LPS плюс recAP, n равно 5; параметры мочи: плацебо, n равно 5), # - р меньше 0,05 по сравнению с плацебо.
Фиг. 17 - отсутствие эффекта recAP на индуцированные LPS цитокины в супернатанте. Собирали супернатант ciPTEC, инкубированных 24 ч с LPS (10 мкг/мл) или инкубированных со средой (контроль), инкубировали с recAP (10 U/мл) или без нее в течение еще 24 ч, с последующим измерением TNF-α, IL-6 и IL-8 посредством ELISA. Данные выражены как среднее плюс/минус SEM, # - p меньше 0,05 по сравнению с контролем, * - р меньше 0,05 по сравнению с LPS.
Фиг. 18 - корреляция между ферментативными активностями RecAP в человеческой сыворотке при 25°C и при 37°C.
Фиг. 19 - корреляция между ферментативными активностями LVL-RecAP в человеческой сыворотке при 25°C и при 37°C.
На Фиг. 20 показана активность/мкг белка RecAP и LVL-RecAP при 25°C и при 37°C. Значения представляют среднюю A активности между 25°C и 37°C для данной концентрации белка.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Стабильность LVL-RecAP в буфере
Материалы:
Человеческие рекомбинантные щелочные фосфатазы:
1. sALPI-ALPP-CD (SEQ ID NO: 4) (DOM: 04 августа 2008 г.)
2. LVL-recAP (SEQ ID NO: 1) (DOM: 14 октября 2011 г.)
Способы:
Недостаточность цинка:
Определяли ферментативную активность и содержание белка обеих партий человеческой рекомбинантной щелочной фосфатазы. Затем для каждого условия готовили 100 мкг/мл растворов белка для определения зависимости от цинка для партий sALPI-ALPP-CD и LVL-recAP, как описано в Таблице 2.
Полученные образцы хранили при RT (комнатная температура) и анализировали на предмет ферментативной активности в T, равное 0 ч, Т, равное 2 ч, и T, равное 24 ч.
Определения ферментативных активностей осуществляли согласно стандартным методикам, как показано в SOP (стандартный порядок действий) РС001.
280
recAP
280
Концентрации белка определяли посредством измерений OD (оптическая плотность при 280 нм) (ε 1,01 мл/мг/см OD).
Результаты
2+
Как ясно показано в Таблице 3, LVL-RecAP является значительно более стабильной (т.е. демонстрирует большую остаточную ферментативную активность; отмечено значениями со звездочками) в присутствии агента, хелатирующего металл (EDTA), чем sALPI-ALPP-CD, подразумевая меньшую зависимость от Znдля ее активности.
Пример 2
Стабильность LVL-RecAP в буфере.
Материалы:
Человеческие рекомбинантные щелочные фосфатазы:
1. sALPI-ALPP-CD (DOM: 04 августа 2008 г.)
2. LVL-recAP (DOM: 14 октября 2011 г.)
Способы:
Во втором независимом эксперименте стабильность sALPI-ALPP-CD и LVL-recAP тестировали для нескольких условий, как описано в Таблице 4. Для партий обеих рекомбинантных АР в данном эксперименте для определения стабильности для каждого буферного условия готовили 100 мкг/мл растворы белка в 0,025 М глициновом буфере, pH 9,6, человеческой сыворотке и человеческой плазме с цитратом. Все приготовленные образцы рекомбинантной АР инкубировали при 37°C и анализировали на предмет ферментативной активности в T, равное 0, T, равное 0,5 ч, Т, равное 1 ч, Т, равное 2 ч, и T, равное 24 ч.
280
recAP
280
Определения ферментативных активностей проводили согласно SOP РС001. Концентрации белка определяли посредством измерений OD (ε 1,01 мл/мг/см OD).
2+
Как ясно показано в Таблице 5, и в соответствии с результатами в Таблице 3, LVL-RecAP является значительно более стабильной в присутствии агента, хелатирующего металл (EDTA), чем sALPI-ALPP-CD (как обозначено значениями со звездочками), подразумевая меньшую зависимость от Znдля ее активности.
Пример 3
Тепловая стабильность и кинетика с PLP LVL-RecAP.
СПОСОБЫ
Экспрессия белка
2
2
Конструировали экспрессионные плазмиды, содержащие гены секретируемых sALPI-PLAP-CD и LVL-RecAP, меченных эпитопом FLAG, как описано ранее (Kozlenkov et al. J Biol Chem 277, 22992-22999 (2002) и Kozlenkov et al. J. Bone Miner. Res. 19, 1862-1872 (2004)). Ферменты, меченные FLAG, временно трансфицировали в клетки COS-1 посредством электропорации, затем выращивали в среде DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) в течение 24 ч, как описано ранее (Narisawa et al. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, G1068-1077 (2007)), когда среду заменяли бессывороточной Opti-MEM (Life Technologies). Opti-MEM, содержащую секретированные белки, собирали через 60 часов после трансфекции, затем фильтровали через 2 мкм фильтр из ацетата целлюлозы и диализировали против TBS, содержащего 1 мМ MgCl и 20 мкМ ZnCl.
Ферментативная кинетика
-1
Для измерения относительных каталитических активностей ферментов, меченных FLAG, планшеты для микротитрования покрывали антителом против FLAG М2 (Sigma-Aldrich) в концентрации 0,2-0,6 мкг мл. Данные планшеты инкубировали с насыщающими концентрациями LVL-RecAP или sALPI-PLAP, меченных FLAG, в течение 3 ч при комнатной температуре, после чего планшеты промывали PBS, содержащим 0,008% Tween-80, и относительные активности в отношении PLP сравнивали для ферментов, насыщенных М2.
2
2
i
650
i
m
-1
Гидролиз физиологического субстрата - пиридоксаль-5'-фосфата (PLP) (Sigma-Aldrich) измеряли при pH 7,4 в стандартном буфере для анализа (50 мМ буфер Tris-HCl, 100 мМ NaCl, 1 мМ MgCl и 20 мкМ ZnCl). Концентрацию высвобожденного фосфата определяли с использованием P ColorLock Gold (Innova Biosciences) посредством измерения поглощения при 650 нм (A). Стандартные кривые, построенные для возрастающих концентраций фосфата, были линейными от 0 до 50 мкМ, и все эксперименты продумывали так, чтобы они попадали в данный интервал концентраций гидролизованного фосфата. Молярные скорости реакции, выраженные как [P] с, рассчитывали для указанного интервала концентрации субстрата, и их аппроксимировали к модели одного связывающего сайта (GraphPad Prism) относительно [субстрата] для расчета K (графики Лайнуивера-Берка не применяли, из-за недостатка точности обратных преобразований при очень низких концентрациях субстрата).
i
650
i
Использовали концентрацию субстрата 400 мкМ для PLP. Концентрация растворимого фермента составляла примерно 1 нМ, и время инкубации варьировало от 15 до 30 мин в зависимости от каталитической эффективности каждого фермента. Для обеспечения стационарных условий и для поправки на неспецифичные сигналы субстрата в способе P ColorLock Gold, раннее показание (в 5 мин) вычитали из более позднего показания, и ΔA измеряли на соответствующей стандартной кривой P, построенной отдельно для каждого эксперимента. Все эксперименты проводили от трех до пяти раз, и полученные константы приведены в виде среднего значения плюс/минус SD (стандартное отклонение).
2
2
405
2
2
Для измерения термостабильности ферменты, меченные FLAG, инкубировали при 65°C в 1 М DEA (диэтиламин) (рН 9,8), содержащем 1 мМ MgCl и 20 мкМ ZnCl. Образцы удаляли в разные моменты времени и помещали на лед, затем измеряли остаточную активность с использованием pNPP, используя следующий способ: активность связанных ферментов измеряли как поглощение при 405 нм (A) как функцию времени при 25°C, используя pNPP (10 мМ) в качестве субстрата при pH 7,4 в 50 мМ буфере Tris-HCl, 100 мМ NaCl, содержащем 1 мМ MgCl и 20 мкМ ZnCl. Ферменты также инкубировали в данном буфере в течение 10 мин при возрастающих температурах (25-100°C), и остаточную активность измеряли таким же образом.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Продукция ферментов, меченных FLAG
Для сравнения кинетических свойств LVL-RecAP с sALPI-PLAP в обе кДНК добавляли посредовательность метки FLAG, как делали ранее для сравнительного исследования PLAP и TNAP (Kozlenkov et al. J Biol Chem 277, 22992-22999 (2002) и Kozlenkov et al. J. Bone Miner. Res. 19, 1862-1872 (2004)). кДНК экспрессировали в клетках COS-1, и выделяли супернатант культуры, содержащий секретированные ферменты. Успешную экспрессию и выделение подтверждали посредством анализа вестерн-блоттингом с антителом против FLAG.
Кинетические параметры с физиологическими субстратами
6
Фосфогидролазные свойства LVL-RecAP и sALPI-PLAP исследовали в отношении физиологических субстратов, вовлеченных в воспаление и конвульсии, конкретно в отношении PLP - витамера витамина В. LVL-RecAP демонстрировала меньшую Km, чем sALPI-PLAP (30,1 мкМ по сравнению с 60,7 мкМ) при физиологическом pH (7,4), указывая на то, что улучшенная LVL-RecAP имеет более высокую аффинность в отношении PLP, чем sALPI-PLAP при физиологическом рН.
Стабильность фермента
Влияние аминокислотных мутаций в LVL-RecAP на общую стабильность фермента исследовали посредством исследований тепловой инактивации. Несмотря на то, что sALPI-PLAP уже имеет сильно улучшенную термостабильность (50% инактивации при 77,8°C), LVL-RecAP была даже более устойчивой к тепловой инактивации (50% инактивации при 80,6°C).
Пример 4
Фармакокинетическое распределение LVL-RecAP у крыс
Часть А. Радиоактивное мечение йодом-125
Белок sALPI-PLAP-CD и белок LVL-RecAP радиоактивно метили йодом-125 с использованием методики с хлорамином-Т, как описано Greenwood et al.*. Принцип мечения основан на окислении йода "in situ" до атомного йода и нуклеофильном замещении им гидроксильной группы остатков тирозина в фенольных кольцах в орто положении.
Белок sALPI-PLAP радиоактивно метили, используя методику с хлорамином-Т для того, чтобы получать конечную удельную активность примерно 0,5 мКи/мг и конечную концентрацию примерно 1 мг/мл (NaCl 0,9%).
*F.C Greenwood, V.M Hunter, H.G Glover, The preparation of 131llabelled growth hormone of high specific radioactivity, Biochem. J. 89 (1963) 114-123
A. 1 Материалы
2
2
- Щелочная фосфатаза sALPI-PLAP (496,7 U/мг) и LVL-RecAP (624 U/мг) была предоставлена AM-Pharma в концентрации 6,34 мг/мл в 25%-ном масс/об. глицерине, 5 мМ Tris, 2 мМ MgCl, 50 мкМ ZnCl, pH 8,0. Белок sALPI-PLAP и белок LVL-RecAP хранили при 4°C.
-5
- Радиоизотоп йод-125 приобретали у Perkin Elmer в виде йодида натрия в 10 н. гидроксиде натрия (удельная активность 643,8 ГБк/мг - чистота радиоизотопа: 99,95%).
- Хлорамин-Т (N-хлор-п-толуолсульфонамид, MW (молекулярная масса) 227,6 г/моль), трихлоруксусную кислоту, метабисульфит натрия (MW 190,1 г/моль) и тирозин приобретали у Sigma.
Данный 5 мМ буфер, pH 8, готовили в лаборатории Chelatec.
- 0,9% NaCl был предоставлен Versol.
А. 2 Способ
125
850 мкг белка, примерно 600 мкКи NaI, 50 мкл Tris буфера и 10 мкл хлорамина-Т (404,8 нмоль, 50 эквивалентов/белок) последовательно добавляли в 1,5 мл пробирку Эппендорфа Lo-Bind. Давали реакционной смеси перемешиваться 1 минуту при комнатной температуре. 2 мкл радиоактивно метящей среды смешивали с раствором 5% MBS, и эффективность радиоактивного мечения оценивали посредством моментальной тонкослойной хроматографии (ITLC) с 10% ТСА в качестве элюента (щелочная фосфатаза - внизу полоски, и свободный 125-йод элюировался наверху полоски).
После добавления в неочищенную смесь 30 мкл раствора тирозина (10 мг/мл в воде), йодированную sALPI-PLAP и йодированную LVL-RecAP очищали посредством гель-фильтрации (G10, GE Healthcare) и элюировали 0,9% NaCl. Фракции объема 0,2 мл отбирали в пробирки. Радиоактивость в каждой фракции измеряли в автоматическом гамма-счетчике, откалиброванном для радиоизотопа йод-125 (Wallace Wizard 2470 - Perkin Elmer). Фракции, содержащие желательный продукт, йодированный радиоактивным йодом, объединяли. Радиохимическую чистоту радиоактивно меченого соединения подтверждали посредством ITLC.
А.3 Результаты и характеристики радиоактивно меченого белка sALPI-PLAP
Эффективность радиоактивного мечения, определенная посредством ITLC, составляла свыше 85% для обоих белков. После очистки на G10 радиочистота метящей реакции составляет больше, чем 97% для обоих белков.
Характеристики раствора радиоактивно меченой sALPI-PLAP после очистки на G10 обобщены в Таблице 6.
A.4 Активность щелочной фосфатазы
Ферментативную активность радиоактивно меченой sALPI-PLAP оценивали посредством ELISA.
Материалы
- Набор для колориметрического анализа щелочной фосфатазы (ссылка ab83369 - номер партии: GR118166-3).
- Немеченая рекомбинантная человеческая щелочная фосфатаза, разведенная до концентрации 0,25 мг/мл в 0,9% NaCl.
- Радиоактивно меченная рекомбинантная человеческая щелочная фосфатаза, разведенная до концентрации 0,25 мг/мл в 0,9% NaCl.
Протокол
В наборе Abeam в качестве субстрата фосфатазы используется п-нитрофенилфосфат (pNPP), который становится желтым (максимальная лямбда равна 405 нм) при дефосфорилировании АР. Данный набор может выявлять в образцах 10-250 мкU АР.
Колориметрический анализ щелочной фосфатазы проводили на немеченой и йодированной радиоактивным йодом sALPI-PLAP. Данный анализ проводили, как описано в протоколе, предоставленном Abcam.
Кратко, получали стандартную кривую от 0 до 20 нмоль/лунку стандарта pNPP (конечный объем: 120 мкл). В каждую лунку добавляли 10 мкл ферментативного раствора АР. Параллельно опытный образец sALPI-PLAP разводили в 15000 и в 8000 раз в буфере для анализа. Добавляли 10 и 20 мкл каждого разведения, и конечный объем доводили до 80 мкл буфером для анализа. Затем в каждую лунку, содержащую опытный образец, добавляли 50 мкл раствора pNPP.
Реакционные смеси стандарта и образца инкубировали 60 мин при 25°C в темноте. Все реакции затем останавливали 20 мкл останавливающего раствора. OD (оптическая плотность) при 405 нм измеряли на микропланшет-ридере.
Строили стандартную кривую pNP. Показания образцов наносили на стандартную кривую для получения количества pNP, генерированного образцом АР. Может быть рассчитана активность АР опытных образцов:
Активность sALPI-PLAP (U/мл) = A/V/T × степень разведения опытного образца
А: количество pNP, генерированного образцами (в мкмоль).
V: объем образца, добавленного в лунку для анализа (в мл).
Т: время реакции в минутах.
Активность sALPI-PLAP (U/мг)=активность sALPI-PLAP (U/мл) / концентрация sALPI-PLAP (мг/мл).
Результаты
В Таблице 7 обобщены результаты.
Ферментативная активность немеченой и радиоактивно меченной sALPI-PLAP является сходной - примерно 475 U/мг. Таким образом, активность sALPI-PLAP не нарушается посредством йодирования радиоактивным йодом с использованием хлорамина-Т в качестве окислителя.
125
Часть Б: ИССЛЕДОВАНИЕ БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА I-sALPI-PLAP У ЗДОРОВЫХ КРЫС
Б.1 Материалы
Характеристики линии крыс, использованной в данном исследовании, представлены ниже:
Вид
: Крысы Sprague Dawley
Линия
: Cri CD (SD) IGS BR
Источник
: Charles River France
Число и пол
: 15 самцов
Интервал массы тела/возраст
: Приблизительно 250 г в начале исследования
Период акклимации
: Пять суток до обработки
Способ идентификации
: Идентификация клетки с группой (время умерщвления).
Обращение с животными
Условия содержания животных
: Крыс содержали в виварии до обработки и в помещении для радиоактивности после обработки.
Пища
: Свободно доступная крысиная диета. Без периода голодания до обработки.
Вода
: Водопроводную воду неограниченно доставляли посредством полипропиленовой бутыли.
Содержание
: Перед обработкой животных содержали в группах по три в поликарбонатных клетках в стандартных условиях, идентифицировали посредством карточки с указанием номера исследования, номера животного, пола и дат начала и окончания исследования. Животных, предназначенных для измерения баланса экскреции, после обработки переводили в камеры для исследования метаболизма (по одному на камеру).
Условия среды
: Температуру записывали каждые сутки. Температура комнаты составляла от 22 до 24°C. Искусственный световой цикл контролировали с использованием автоматического таймера (10 часов света, 14 часов темноты).
Персонал
: Участвующие ассистенты имели подходящую квалификацию и прошли подходящее обучение.
Отбор
: Животные были осмотрены в момент получения руководителем исследования. Отобрали только здоровых животных. Особое внимание уделяли любому признаку воспалительной реакции у животных (например, абсцесс; воспаление кожи и т.д.).
125
125
Б.2 Дозирующий раствор I-sALPI-PLAP и I-LVL-RecAP
Растворы йодированного sALPI-PLAP и LVL-RecAP разводили до концентрации 0,25 мг/мл в 0,9% NaCl непосредственно перед введением in vivo.
Б.3 Схема исследования
Схема исследования представлена в Таблицах 8 и 9.
Б.4 Введение
Во время эксперимента средняя масса крыс Sprague Dawley составляла примерно 240 г. Неанестезированные крысы подвергались внутривенной инъекции в боковую (левую) хвостовую вену уровня дозы 400 мкг/кг, соответствующего количеству 96 мкг белка на крысу и активности примерно 58 мкКи на крысу. Объем инъекции составлял примерно 380 мкл. Объемы индивидуальной дозы рассчитывали с использованием индивидуальной массы тела каждой крысы в сутки обработки. Крыс помещали в конкурентное устройство (contention device). Для того чтобы расширить кровеносные сосуды хвоста, хвост погружали в теплую воду (45°C) и затем дезинфицировали спиртом. Дозирующий раствор медленно инъецировали в хвостовую вену. Для того чтобы рассчитать реальную дозу, полученную каждой крысой, шприцы взвешивали до и после обработки, и осуществляли счет аликвоты дозирующего раствора на гамма-счетчике.
Б.5 Распределение в разных органах
Во время умерщвления животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 2,5 мл/кг массы тела смеси кетамина гидрохлорида (50 мг/мл) и ксилазина гидрохлорида (20 мг/мл) в PBS. Крыс затем быстро умерщвляли обескровливанием посредством внутрисердечного прокола. Интересующие органы отбирали с последующим разрезанием на куски для органов, весящих более 2 г, таких как печень, желудок, тонкий кишечник и толстый кишечник. Каждый кусок затем промывали физиологической сывороткой до протирания мягкой бумажной салфеткой, взвешивали и осуществляли счет раздельно. Отобранными органами были печень, почки, сердце, легкие, селезенка, скелетные мышцы, бедренная кость, мозг, щитовидная железа, желудок, тонкая кишка с содержимым, толстая кишка с содержимым, кожа и околопочечный жир.
Счет радиоактивности ткани осуществляли в автоматическом гамма-счетчике (Wallace Wizard 2470 - Perkin Elmer), откалиброванном для радиоизотпа йод-125 (эффективность: 74% - время счета: 10 с).
Концентрация радиоактивности в органах/тканях выражается как процентная доля инъецированной дозы на грамм ткани (%ID/r). Анализ данных включает процентную долю инъецированной дозы (%ID) и эквивалентное количество белка на орган или ткань. Для хорошо определенных органов их рассчитывали с использованием счета радиоактивности в целом органе. Для крови это достигалось с предположением, что кровь составляет 6,4% общей массы тела.
Кроме того, рассчитывали отношение между радиоактивностью, сохраняющейся в тканях, и радиоактивностью в крови (отношение орган / кровь). Наконец, рассчитывали отношение между отношением орган/кровь для sALPI-PLAP и отношением орган/кровь для LVL-RecAP (Фиг. 2).
Б.6 Распределение в крови и сыворотке крыс
Уровень радиоактивности в крови и сыворотке
Во время умерщвления получали образцы крови от обескровливаний посредством внутрисердечного прокола у крыс, анестезированных внутрибрюшинной инъекцией смеси кетамина гидрохлорида и ксилазина гидрохлорида в PBS.
В другие моменты времени, указанные в схеме исследования (Таблица 8 и 9), кровь отбирали из боковой хвостовой вены (правой) с использованием «иглы-бабочки» 23-го калибра без анестезии.
Каждый образец крови собирали в предварительно взвешенные пробирки Microvette с активатором свертывания (Sarstedt). Пробирки взвешивали, и радиоактивность измеряли на гамма-счетчике.
Образцы крови инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, и затем их центрифугировали в течение 5 минут при 10000 g для получения сыворотки. Сыворотку отбирали в предварительно взвешенные пробирки, и осуществляли счет на гамма-счетчике.
Концентрация радиоактивности в крови и сыворотке выражается как процентная доля инъецированной дозы и эквивалентное количество sALPI-PLAP на мл.
Анализ данных включает процентную долю инъецированной дозы, рассчитанную для всей крови и сыворотки.
В таблицах 10 и 11 показано отношение радиоактивности, измеренной в разных органах, по отношению к радиоактивности sALPI-PLAP и LVL-RecAP в сыворотке крови соответственно. На Фиг. 2 показано отношение отношения орган/кровь LVL-RecAP к отношению орган/кровь sALPI-PLAP. Отношение 2, например, показывает, что LVL-RecAP подвергается направленной доставке в указанный орган в два раза более эффективно, чем sALPI-PLAP. Более высокие отношения дополнительно указывают, что относительно большая активность LVL-RecAP обнаруживается в конкретном органе при использовании такой же дозы.
Пример 5
-/-
Мышиная модель Akp2 младенческой гипофосфатазии
В уровне техники известна мышиная модель Акр2-/- младенческой гипофосфатазии (J Dent Res 90 (4): 470-476, 2011). Кратко, мышей Akp2-/-создавали путем вставки кассеты Neo в экзон 6 мышиного гена TNALP (Akr2) посредством гомологичной рекомбинации для функциональной инактивации гена Akr2, что приводит к отсутствию выявляемых мРНК или белка TNALP.
В методиках использования животных и отбора тканей соблюдали одобренные протоколы от Комитета по этике обращения с животными Медицинского исследовательского института Сэнфорд-Бернем (Sanford-Burnham). Животных обрабатывали одним из носителя (N равно 10), 1 мг LVL-RecAP/кг/сутки (N равно 10), 8 мг LVL-RecAP/кг/сутки (N равно 8) или 16 мг LVL-RecAP/кг/сутки (N равно 10). Измеряли выживание и оценивали развитие скелета. Оценивали минерализацию почек. Измеряли PPi плазмы, пиридоксаль плазмы, кальций плазмы и уровни фосфата, измеряли длину бедренной и/или большой берцовой кости для разных групп обработки. Данные микроКТ отбирали для анализа остаточного гиперостеодоза при каждой дозе.
Результаты
- Улучшенное долговременное выживание для животных, обработанных 16 мг/кг/сутки (Фиг. 3).
- Имело место (неполное) избавление от скелетного дефекта в длинных костях даже при наивысшей дозе (данные не показаны).
- Имело место некоторое восстановление зубного фенотипа (данные не показаны).
- По-видимому, имеет место избавление от краниосиностоза (данные не показаны; требуют подтверждения).
- Работа на почках все еще продолжается. Имелось указание на минеральное вещество в почках необработанных мышей и меньшее количество минерального вещества в почках обработанных мышей (данные не показаны).
Пример 6
Ишемическая реперфузия в свиной почечной модели.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Информация о носителе, контроле и опытном веществе
Получение контрольного и опытного вещества
Свежее контрольное вещество - раствор разбавителя LVL-RecAP (плацебо) - готовили для применения в исследовании до введения каждой дозы и хранили охлажденным при 2-8°C, когда оно не применялось.
Опытное вещество - LVL-RecAP - использовали в том виде, в котором его получили. При приготовлении композиций опытного вещества не делали корректировок чистоты. Композиции опытного вещества получали путем смешивания с подходящим объемом стерильного физиологического раствора для достижения номинальных концентраций 0; 0,96 или 4,8 мг/мл. Композиции готовили перед каждым введением дозы в ламинаре с использованием стерильного оборудования и асептических методик. Композиции распределяли в подходящее число сывороточных бутылей из желтого стекла, выдерживали на льду до применения и применяли для дозирования в пределах 2 часов после приготовления. В отдельных случаях, по мере необходимости, по ходу исследования делали дополнительные препараты.
Анализ дозируемых композиций
0,5 мл образцы конечной дозируемой композиции в двойной повторности отбирали до дозирования в каждые сутки получения в сутки 0 (группы 3-7) и в сутки 7 (группа 7). Образцы отбирали из средних слоев и хранили для возможного будущего анализа в замороженном состоянии (от -50 до -90°C).
Информация об опытной системе
Приобретение и акклимация животных
Самцов экспериментально наивных домашних йоркширских свиней кроссбред (фермерских свиней) (в возрасте приблизительно 8-10 недель в момент получения) получали от Midwest Research Swine, Gibbon, Миннесота. На протяжении 10-28 суток периода акклимации животных ежесуточно наблюдали в отношении общего состояния здоровья и любых признаков заболевания. Проводили анализы яиц и паразитов в образцах стула, и все результаты для животных, включенных в исследование, были отрицательными.
Рандомизация, назначение для исследования и содержание C использованием методик раздельной простой рандомизации животных (весящих от 12,5 до 25,0 кг в момент рандомизации) приписывали к контрольной группе и группам обработки, идентифицированным в следующей Таблице 12.
Животные, выбранные для исследования, были настолько однородными по возрасту и массе, насколько это возможно. До включения в исследование ветеринар оценил состояние здоровья животных. Дополнительных животных, полученных для исследования, но не включенных в исследование, переводили в запасную колонию.
Каждому животному назначали номер животного, используемый в системе сбора данных Provantis™, и имплантировали микрочип, несущий уникальный идентификационный номер. Каждое животное также идентифицировали по метке на ухе от поставщика. Индивидуальный номер животного, номер импланта, номер метки на ухе и номер исследования составляли уникальную идентификацию для каждого животного. Каждую клетку идентифицировали по номеру животного, номеру исследования, номеру группы и полу.
Животных индивидуально содержали в загонах с фальшполами или в мобильных клетках из нержавеющей стали с полами, покрытыми пластиком. Данный тип содержания обеспечивал адекватное пространство для физической активности данных животных. Введение животным обеспечивали согласно исследовательским SOP MPI. Флуоресцентный свет давался в течение приблизительно 12 часов в сутки. Темновую часть цикла время от времени прерывали из-за активностей, связанных с исследованием. Температуру и влажность непрерывно отслеживали, записывали и поддерживали в максимально возможной степени в пределах назначенных протоколом интервалов 16,1-27,2°C и 30-70% соответственно. Реальные данные по температуре и влажности не приведены, но сохранены в файле исследования.
Пищу (сертифицированная Lab Diet #5К99, PMI Nutrition International, Inc.) предлагали посредством ограниченных кормлений, за исключением обозначенных периодов. По необходимости предлагали пищевые добавки, включающие кусочки волокон или таблетки.
Хирургические процедуры
Связанные с процедурой лекарственные средства
В следующей Таблице 13 представлены связанные с процедурой лекарственные средства и уровни дозы, используемые по ходу исследования.
До- и послеоперационные процедуры проводили согласно исследовательским SOP MPI. До хирургического вмешательства животные голодали в течение по меньшей мере 8 часов, и анестезию индуцировали и поддерживали, как показано в Таблице 13. Поддерживали температуру тела 37 плюс/минус 3°C.Д о хирургического вмешательства проводили ультразвуковые исследования для определения того, присутствовали ли почечные кисты. Если кисты не наблюдались, левую почку удаляли, и правую почку обрабатывали, как описано ниже. При наличии кист на одной почке данную почку удаляли, и расположенная на противоположной стороне почка подвергалась процедуре закупорки. При наличии кист в обеих почках животное удаляли из исследования без подвергания его хирургическому вмешательству. Хирургическое вмешательство
Почечную ишемию/реперфузионное повреждение индуцировали с использованием процедуры, опубликованной Lee et al. (J. Vet. Med. Sci 72 (1): 127-130). После анестезии всех животных помещали в положение лежа на спине, и готовили места хирургического вмешательства чередующимися протираниями хлоргексидиновым скрабом и раствором. Для экспонирования обеих почек проводили срединную лапаротомию. На основе данных ультразвукового исследования удаляли левую или правую почку.
Для животных группы 2 (имитация) вставленные хирургические тампоны для лапаротомии затем удаляли и учитывали, и брюшную полость промывали теплым хлоридом натрия. Брюшную полость закрывали традиционным способом, и кожу закрывали скобками для кожи и клеем для ткани. Животным затем давали поправиться.
Для всех других животных после удаления определенной почки оставшиеся почечные сосуды выделяли и вытягивали с использованием петель для сосудов. Петли для сосудов использовали для закупорки сосудов на 45 (плюс/минус 1) минут, после чего обеспечивали реперфузию сосудов. Внутривенную болюсную дозу контрольного или опытного соединения вводили в объеме дозы 0,333 мл/кг (половину дозы - 0,167 мл/кг вводили животным группы 7) непосредственно перед реперфузией. Для всех животных группы 1, 5 и 6 (контроль, 0,32 и 1,6 мг/кг) имплантированные хирургические тампоны для лапаротомии затем удаляли и учитывали, брюшную полость промывали и закрывали, как описано выше, и давали животным поправиться. Для всех животных группы 7 (0,32 мг/кг/сутки) делали разрез в паховой области и выделяли левую или правую бедренную вену. Продвигали в сосуд катетер, и данный катетер проводили под кожей и выводили наружу через разрез, сделанный на грудной клетке. С использованием нерассасывающегося шва прикрепляли и заякоривали на мышце порт. Имплантированные хирургические тампоны для лапаротомии затем удаляли и учитывали, брюшную полость промывали и закрывали, как описано выше, и давали животным поправиться. Введение опытного или контрольного соединения
В сутки 0 всем животным группы 1, 5 и 6 непосредственно перед реперфузией внутривенно вводили контрольное или опытное соединение в полной дозе 0, 0,32 и 1,6 мг/кг соответственно. Все дозы вводили в объеме дозы 0,333 мл/кг. Также в сутки 0 опытное соединение внутривенно вводили всем животным группы 7 с объединенным уровнем дозы 0,32 мг/кг двумя отдельными половинами дозы 0,16 мг/кг в объеме дозы 0,167 мл/кг. Первую дозу вводили непосредственно перед реперфузией, и вторую дозу вводили приблизительно в 8 (плюс/минус 2) часа после реперфузии. Полные дозы 0,32 мг/кг/сутки (0,333 мл/кг) вводили всем животным группы 7 в сутки 1-7 приблизительно в то же самое время суток, что и исходную дозу в сутки 0 (плюс/минус 2 часа).
Статистика
В Таблице 14, приведенной ниже, определен набор сравнений, используемых в статистических анализах, описанных в данном разделе.
Необработанные данные сводили в таблицы в пределах каждого интервала времени, и для каждого ожидаемого результата и группы рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение. Для концентраций сывороточного креатинина группы обработки сравнивали с контрольными группами с использованием ковариационного анализа с повторными измерениями (RMANCOVA).
Ковариационный анализ с повторными измерениями (RMANCOVA)
Для ожидаемых результатов, измеренных в трех или более чем трех интервалах времени после теста, проводили анализ с повторными измерениями (смешанная модель). Для каждого ожидаемого результата модель анализировали на предмет эффектов обработки, времени и взаимодействия обработки и времени. В качестве ковариаты в модель включали данные до анализа (последнее измерение перед дозированием).
При отсутствии значимого (р больше 0,05) взаимодействия обработки со временем оценивали главный эффект обработки. Если эффект обработки не был значимым (р больше 0,05), результаты считались не значимыми, и на переменной не проводилось дополнительных анализов. Если эффект обработки был значимым (p меньше 0,05), строили линейные контрасты для парного сравнения каждой группы обработки с контрольной группой. Если взаимодействие было значимым (р меньше 0,05), каждую группу обработки сравнивали с подходящей контрольной группой посредством простого эффекта «обработки» для каждого момента времени. Эти попарные сравнения простых эффектов были получены из взаимодействия «обработки со временем».
Результаты всех попарных сравнений приведены с уровнями значимости 0,05 и 0,01. Все критерии представляли собой двухсторонние критерии.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Сывороточный креатинин
Как показано на Фиг. 4, во всех интервалах имели место увеличения креатинина от легких до умеренных по отношению к значениям до анализа. Креатинин имел тенденцию к максимальному увеличению в 24 часа после реперфузии и затем его уровень постепенно уменьшался на протяжении последующих интервалов. Изменения уровня креатинина согласовались с пониженной клубочковой фильтрацией, вторичной по отношению к почечному повреждению, связанному с процедурой (данные не показаны). В большинстве групп обработки и в большинстве интервалов введение опытного соединения имело тенденцию ослаблять увеличения креатинина, связанные с процедурой, демонстрируя защитный эффект LVL-RecAP.
Как проиллюстрировано на Фиг. 5, имели место дозозависимые увеличения активности щелочной фосфатазы (ALP) во всех группах обработки, получающих опытное соединение в 24 часа после реперфузии, относительно значений до анализа. Активность ALP постепенно уменьшалась в группах обработки, получающих 1,6 мг/кг или менее, но продолжала прогрессирующе возрастать у животных, получающих 0,32 мг/кг/сутки.
Пример 7
Тестирование безопасности у человека
Материалы и методы
Задачи:
Оценить безопасность и переносимость однократной и многократных доз рекомбинантной улучшенной щелочной фосфатазы (LVL-recAP), введенной посредством внутривенной (в.в.) инфузии, у здоровых субъектов.
Определить фармакокинетику (РК) LVL-recAP после в.в. инфузии однократной и многократных доз LVL-recAP у здоровых субъектов.
Схема и обработки
Это 2-частное одноцентровое исследование с плановым числом - 50 здоровых субъектов. Часть A будет рандомизированным двойным слепым исследованием с контролем в виде плацебо и однократно нарастающими дозами (SAD) во вплоть до 4 последовательных групп из 8 здоровых субъектов мужского и женского пола в каждой (6 на LVL-recAP и 2 на плацебо). Будет сделана попытка включения в каждую группу обработки равного числа субъектов мужского и женского пола с минимум 2 и максимум 4 субъектами женского пола на группу. Одна доза LVL-recAP или плацебо будет введена посредством 1-часовой в.в. инфузии. Часть Б будет рандомизированным двойным слепым исследованием с контролем в виде плацебо и многократно нарастающими дозами (MAD) во вплоть до 2 групп из 9 здоровых субъектов мужского и женского пола в каждой (6 на LVL-recAP и 3 на плацебо). Будет сделана попытка включения в каждую группу обработки равного числа субъектов мужского и женского пола с минимум 2 и максимум 4 субъектами женского пола на группу. Субъекты будут получать 1-часовую в.в. инфузию LVL-recAP или плацебо в сутки 1, 3 и 5. Будут введены следующие обработки:
Часть A
Группа 1: 1-часовая инфузия 200 U/кг LVL-recAP
Группа 2: 1-часовая инфузия 500 U/кг LVL-recAP
Группа 3: 1-часовая инфузия 1000 U/кг LVL-recAP
Группа 4: 1-часовая инфузия 2000 U/кг LVL-recAP
Часть Б
Группа 5: 1-часовые инфузии 500 U/кг LVL-recAP в сутки 1, 2 и 3
Группа 6: 1-часовые инфузии 1000 U/кг LVL-recAP в сутки 1, 2 и 3
После завершения суток 9 для группы 1 и суток 4 для группы 2 части A будут осуществлять промежуточную оценку РК.
В зависимости от результатов, схемы инфузии и отбора проб для РК могут быть скорректированы для остальных групп SAD и MAD.
В этом первом исследовании, осуществляемом на людях, субъектам, участвующим в наименьшем уровне дозы в части A (группа 1) будут осуществлять дозирование согласно сигнальной схеме дозирования для обеспечения минимального риска. Это означает, что исходно дозирование будут осуществлять 2 субъектам. Один из этих субъектов будет получать активное лекарственное средство LVL-recAP, и другой субъект будет получать плацебо. Если результаты по безопасности и переносимости в первые 24 часа после дозирования для исходных субъектов являются приемлемыми для главного исследователя, другим 6 субъектам с наименьшим уровнем дозы будут осуществлять дозирование рандомизированным способом с плацебо в качестве контроля (5 активных и 1 плацебо). Период наблюдения
Часть А: с суток 1 до 48 часов (сутки 3) после введения лекарственного средства. Короткие амбулаторные посещения клинического исследовательского центра в сутки 4, 6, 9 и 15.
Часть Б: с суток 1 до 48 часов (сутки 7) после последнего введения лекарственного средства. Короткие амбулаторные посещения клинического исследовательского центра в сутки 8, 10, 13 и 19. Субъектов будут подвергать скринингу на предмет приемлемости в пределах 3 недель перед (первым) введением лекарственного средства для каждой группы исследования.
Последующие осмотры будут иметь место в сутки 15 (часть А) и сутки 19 (часть Б).
Субъекты
Часть A: 32 здоровых субъекта мужского и женского пола
Часть Б: 18 здоровых субъектов мужского и женского пола
Главные критерии для включения
Пол: мужской или женский
Возраст: 18-55 лет включительно
2
Индекс массы тела (BMI): 18,0-30,0 кг/м включительно
Исследуемое лекарственное средство
Активное лекарственное средство
Активное вещество: LVL-recAP, улучшенная рекомбинантная форма эндогенной человеческой щелочной фосфатазы (АР).
Активность: фермент-гидролаза, ответственный за дефосфорилирование моноэфиров фосфорной кислоты.
Показание: острое повреждение почки.
Дозировка: 600, 1500, 3000 и 6000 U/мл.
Лекарственная форма: в.в. инфузия.
Изготовитель: аптека PRA.
Плацебо
2
2
Вещество: 20 мМ цитрат, 250 мМ сорбит, 2 мМ MgCl, 50 мкМ ZnCl, pH 7,0.
Активность: нет.
Показание: не применимо.
Дозировка: не применимо.
Лекарственная форма: в.в. инфузия.
Изготовитель: Nova Laboratories Ltd, Gloucester Crescent, Wigston, Leicester, LE18 4YL, Великобритания
Критерии для оценки
Безопасность: нежелательные явления (АЕ), показатели жизнедеятельности (включающие систолическое и диастолическое кровяное давление в положении лежа на спине, пульс, температуру тела, частота дыхания), электрокардиограмма (ECG) с 12 отведениями, непрерывный мониторинг сердечной деятельности (телеметрия), клинические лабораторные анализы (включающие клиническую химию [АР считается РК параметром], гематологию и анализ мочи), физический осмотр и антитела против лекарственного средства (ADA).
Фармакокинетика: РК параметры, основанные на анализе сывороточных концентраций LVL-recAP и активности АР.
Результаты
Для всех групп дозирования были завершены периоды времени дозирования и наблюдения, и в любой из данных групп не наблюдали серьезных нежелательных явлений. Анализы всех измеренных параметров продолжаются.
Пример 8
Материалы и методы
Мыши
-/-
-/-
-1
i
Получение и характеризация мышей AIpI были описаны ранее (Narisawa et al., 1997). Мыши AIpI' фенокопируют младенческую НРР, включая общую недостаточность TNAP, накопление PP и дефекты минерализации (Fedde et al., 1999; Narisawa et al., 2001; Anderson et al., 2004; Millan et al., 2008). Дополнение пищи витамином B6 кратковременно подавляет спазмы и продлевает продолжительность жизни до 18-22 суток после рождения, но гипоминералиация и накопление остеоида продолжают усугубляться с возрастом (Narisawa et al., 1997; Fedde et al., 1999; Narisawa et al., 2001; Millan et al., 2008). Следовательно, всем животным (производителям, кормящим матерям, мышатам и сосункам, отнятым от матери) в данном исследовании давали свободный доступ к модифицированной лабораторной пище для грызунов 5001, содержащей повышенные уровни (325 млн) пиридоксина. Генотипирование проводили посредством ПЦР на геномной ДНК, как описано ранее (Yadav et al., 2011). Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию (IACUC) одобрил все исследования на животных.
Растворимая химерная человеческая щелочная фосфатаза (LVL-RecAP)
2
2
Использовали раствор 10,1 мг/мл LVL-RecAP в 25%-ном (масс./об.) глицерине, 5 мМ Tris/HCl, 2 мМ MgCl, 50 мкМ ZnCl и с pH 8,0. Фермент имел чистоту, превышающую 99,99%, как определенно посредством жидкостной хроматографии высокого давления.
Исследование доза-ответ с использованием LVL-RecAP
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
Мышей AIpI делили на 5 когорт: обработанные носителем - мыши AIpI, обработанные только носителем (n равно 14); LVL-RecAP1 - мыши AIpI, обработанные LVL-RecAP в дозировке 1 мг/кг/сутки (n равно 14); LVL-RecAP8 - мыши AIpI, обработанные LVL-RecAP в дозировке 8 мг/кг/сутки (n равно 12) и LVL-RecAP16 - мыши AIpI, обработанные LVL-RecAP в дозировке 16 мг/кг/сутки (n равно 10). Однопометные мыши AIpI дикого типа служили в качестве контрольных животных и не получали инъекций (n равно 14). Когортам носителя или LVL-RecAP осуществляли ежесуточную п.к. (подкожную) инъекцию в область лопатки. Инъекции вводили утром от 8:00 до 11:00. Введенные объемы рассчитывали на основе массы тела, измеренной до инъекции. Все обработки начинались в сутки 1 после рождения и повторялись ежесуточно вплоть до 53 суток или до времени вскрытия.
Отбор образцов
Вскрытие проводили в сутки 53 после рождения (р53), через 24 ч после последней инъекции LVL-RecAP для тех животных, которые завершили экспериментальный протокол, или раньше - для тех животных, которые казались терминально больными. Перед эвтаназией внутрибрюшинно вводили авертин. Кровь отбирали в пробирки с литий-гепарином посредством прокола сердца. Вскрытие состояло из общего обследования патологии и рентгеновского исследования.
Радиография и микрокомпьютерная томография (мкКТ)
3
3
Радиографические изображения скелетов получали с использованием Faxitron МХ-20 DC4 (Чикаго, Иллинойс, США), используя энергию 20 кВ. Половины нижних челюстей сканировали при 30 кВ. Целые отсеченные черепа от мышей Р21 фиксировали, затем сканировали при разрешении 18 мкм изотропных вокселей с использованием системы визуализации мкКТ eXplore Locus SP (GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, Лондон, Онтарио, Канада). Измерения осуществляли при рабочем напряжении 80 кВ и токе 80 мА со временем экспозиции 1600 мс, используя методику сканирования по способу Паркера, при которой образец вращается на 180 градусов плюс угол веерного пучка 20 градусов. Сканы калибровали на основе гидроксиапатитной модели, и 3D (трехмерные) изображения реконструировали при эффективном размере воксела 18 мкм. Для различения минерализованной ткани использовали фиксированный порог 1400 единиц Хаунсфилда. Интересующие области (ROI) для теменных и лобных костей устанавливали как имеющие длину 1 мм, ширину - 1 мм, глубину, эквивалентную толщине кости, и положение, начинающееся на расстоянии 0,75 мм от сагиттальных и венечных швов, как было описано ранее (Liu et al., 2014). Параметры объема, плотности и структуры кости измеряли с использованием версии 2.2 программы Microview (GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, Лондон, Онтарио) и устоявшихся алгоритмов (Meganck et al., 2009; Umoh et al., 2009). Проводили анализ посредством t-критериев Стьюдента, сравнивая количественные результаты, для установления статистически значимых различий между генотипами. Данные мкКТ костей анализировали и приводили согласно рекомендациям Bouxsein et al. 2010 (Bouxsein et al., 2010). Для визуализации зубов отсеченные половины нижних челюстей сканировали на мкКТ Scanco Medical 50 (Scanco Medical AG, , Швейцария) при размере воксела 10 мкм. Z-стопки нижних челюстей экспортировали в виде файлов DICOM и переориентировали с использованием программы ImageJ (1.48 г) со сравнимыми венечными, сагиттальными и поперечными плоскостями среза, выбранными для сравнения. Для количественного анализа нижние челюсти сканировали на мкКТ Scanco Medical 35 при размере воксела 6 мкм, 55 кВп, 145 мА, с шагом вращения 0,36 градусов (угловой интервал 180 градусов) и экспозицией на изображение 400 мс. Для 3D реконструкции и просмотра изображений использовали программу мкКТ Scanco (HP, DECwindows Motif 1.6). После 3D реконструкции разделяли объемы коронки, эмали, корней и альвеолярных костей с использованием глобального порога 0,6 г/см. Общий объем (TV), объем кости (минерализованной ткани) (BV) и плотность минерального вещества ткани (TMD) измеряли для всей коронки и отдельно для эмали, дентина корня и альвеолярной кости в области разделения корней. Для эмали и корня также измеряли толщину.
Гистологические анализы
Образцы кости очищали, фиксировали в 4% параформальдегиде/забуференном фосфатом физиологическом растворе в течение 3 суток при 4°C и затем переносили в 70%-ный этанол для хранения при 4°C. Срезы в пластике получали, как описано ранее (Yadav et al., 2012). Трехцветное окрашивание по фон Косса и Ван Гисону проводили на срезах в пластике, как описано ранее (Narisawa et al., 1997). Срезы, окрашенные по фон Косса или Ван Гисону, сканировали системой ScanScopeXT (Aperio, Vista, СА, США), и изображения анализировали с использованием программы Bioquant Osteo (Bioquant Osteoanalysis Co., Nashville, TN, США). Левые половины нижних челюстей, используемые для гистологии, фиксировали в растворе Буэна в течение 24 ч, затем деминерализовали в растворе AFS (уксусная кислота, формальдегид, хлорид натрия) и заливали в парафин для получения серийных срезов, как описано ранее (Foster, 2012). Для окрашивания пикросириусом красным депарафинизированные срезы ткани окрашивали 0,2%-ным водным раствором гидрата фосфомолибденовой кислоты, 0,4% конго красного 80 и 1,3% 2,4,6-тринитрофенола (Polysciences, Inc., Warrington, РА), как описано ранее (Foster, 2012). Срезы, окрашенные пикросириусом красным, наблюдали под поляризованным светом для получения фотомикрофотографий. Тестирование биомеханики
-1
После удаления мышечной ткани измеряли длину бедренной кости, большой берцовой кости, плечевой кости и лучевой кости с использоваием циркуля. Кости замораживали, заворачивали в марлю, содержащую физиологический раствор, чтобы избежать обезвоживания. Выделенные бедренные и большие берцовые кости оценивали с использованием трехточечного анализа на изгиб, используя универсальную установку для тестирования материалов Instron 1101, как описано ранее (Huesa et al., 2011). Кости медленно оттаивали и выдерживали при комнатной температуре до тестирования. Интактные бедренные и большие берцовые кости размещали в установке для тестирования на двух опорах, разделенных расстоянием 15 мм, и прилагали нагрузку к средней части диафиза, таким образом осуществляя трехточечный анализ на изгиб при скорости 2 мм мин.
i
Анализ PP
i
Концентрации PP в плазме определяли посредством дифференциального поглощения на активированном угле УДФ-D-[6-3Н]глюкозы (Amersham Pharmacia) из продукта реакции 6-фосфо[6-3Н]глюконата, как описано ранее (Hessle et al., 2002; Yadav et al., 2014).
Статистика
-/-
Учитывая то, что разные концентрации LVL-RecAP приводили к разной выживаемости, не было возможности сравнивать три когорты обработки при соответствии по возрасту. По этой причине для сравнения обработанных мышей AIpIс когортой WT применяли параметрический непарный двусторонний t-критерий Стьюдента. Различия считали значимыми при р меньше 0,05. Для сравнения различий в кривых выживания среди когорт обработки применяли критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона.
Результаты
-/-
Повышенная выживаемость и масса тела у мышей AIpI, обработанных LVL-RecAP
Выживаемость у мышей, получающих 8 мг/кг/сутки (LVL-RecAP8) или 16 мг/кг/сутки (LVL-RecAP 16) LVL-RecAP, была значимо улучшенной по сравнению с когортами, обработанными носителем и 1 мг/кг/сутки (LVL-RecAP1) (p равно 0,001) (Фиг. 6А). Различия были статистически значимыми при сравнении кривых выживания обработанных когорт друг с другом (p меньше 0,0001 для всех сравнений). Медиана выживания составляла 44, 22 и 19 суток в когортах, обработанных LVL-RecAP8, LVL-RecAP1 и носителем соответственно. Медиана выживания не могла быть рассчитана для когорты LVL-RecAP16, так как животные жили до завершения эксперимента в сутки 53.
-/-
-/-
Животные AIpI весили меньше, чем их однопометные мыши WT, начиная примерно с р7. Обработка 1 мг/кг/сутки LVL-RecAP приводила к статистически значимому увеличению массы тела по сравнению с мышами, обработанными носителем, и незначимому различию по сравнению с однопометными мышами WT в 18 суток обработки (Фиг. 6Б). Мыши AIpI обычно умирают к р18-24 на питании с витамином B6, следовательно, сравнение долгоживущих когорт LVL-RecAP8 и LVL-RecAP16 с мышами, обработанными носителем, не было возможным, и их, вместо этого, сравнивали с мышами WT. Животные в когорте LVL-RecAP8 весили значимо меньше, чем их однопометные мыши WT с р18 (Фиг. 6Б), тогда как мыши в когорте LVL-RecAP16 демонстрировали нормализацию массы тела и были неотличимыми от мышей WT в р53 (Фиг. 6Б).
-/-
Обработка LVL-RecAP улучшает скелетный фенотип мышей AIpI
-/-
-/-
Рентгенограммы необработанных мышей AIpI (Фиг. 7А) продемонстрировали сильные скелетные нарушения, включающие пониженную плотность минерального вещества ткани и сломанные кости, как описано ранее (Yadav et al., 2011). Авторы изобретения обнаружили улучшение скелетной патологии у мышей AIpI, получающих 1 мг/кг/сутки LVL-RecAP в течение 18 суток (Фиг. 7А), и польза была более сильной в когортах LVL-RecAP8 и LVL-RecAP16 (Фиг. 7Б). Дистальные конечности демонстрировали нормализованную морфологию, независимо от дозы, в то время как в позвоночнике, передних конечностях, задних конечностях и грудной клетке для всех когорт обработки наблюдали частичную коррекцию. Мыши LVL-RecAP8 и LVL-RecAP16 также демонстрировали незначительные трещины или переломы в бедренных и больших берцовых костях. Суставный контур в коленях и локтях демонстрировал ненормальности у LVL-RecAP8 и LVL-RecAP 16 в р44 и р53 соответственно (Фиг. 7).
i
i
i
i
-/-
-/-
-/-
-/-
Для оценки степени улучшения остеомаляции авторы изобретения провели гистоморфометрический анализ залитых в пластик недекальцифицированных срезов задних лап обработанных LVL-RecAP и контрольных мышей WT (Фиг. 8А и 9А). Авторы изобретения измерили объемы кости и остеоида (Фиг. 8Б, 8В) и также проанализировали сывороточные уровни PP (Фиг. 9Б, 9В). В соответствии с более ранними данными (Yadav et al., 2011), окрашивание по фон Косса выявило, что мыши AIpI демонстрируют тяжелые дефекты в минерализации, тонкую трубчатую кость, уменьшенную губчатую кость и нарушенные центры окостенения (Фиг. 8А), тогда как и животные, обработанные LVL-RecAP8, и животные, обработанные LVL-RecAP16 демонстрировали значительно усиленную трубчатую кость и улучшенные вторичные центры окостенения. Гистоморфометрия (Фиг. 8Б, 8В) выявила, что отношение BV/TV (Фиг. 8Б) и в когорте LVL-RecAP8, и в LVL-RecAP16 все еще было значимо ниже, чем в соответствующих по возрасту контролях WT (0,0321 и 0,0302, N равно 9), тогда как процентная доля OV/BV (Фиг. 8 В) была значимо выше для обеих когорт обработки по сравнению с контролями WT (0,0001 и 0,0175, N равно 9). Различия между когортами обработки LVL-RecAP8 и LVL-RecAP16 не были статистически значимыми. Гистологическое трехцветное окрашивание (Фиг. 9А) на заключенных в пластик срезах задних конечностей подтвердило эти данные. Мыши AIpI имеют сильно сниженную минерализованную массу кости (области, окрашенные зеленым) с недостаточностями в трубчатой и губчатой кости, отмеченными накоплением остеоида (области, окрашенные красным). В отличие от этого, 53-суточные контроли WT имеют прочные трубчатые кости, губчатую кость, присутствующую во вторичных окостенениях, и мало остеоида на поверхностях костей. Мыши AIpI в когортах LVL-RecAP8 и LVL-RecAP16 демонстрируют значительное улучшение в трубчатой кости, особенно в когорте LVL-RecAP16, где не было замечено больших различий по сравнению с мышами WT. В то время как образование губчатой кости во вторичных центрах окостенения у мышей AIpI улучшается посредством обработки, мыши LVL-RecAP8 и LVL-RecAP16 все еще сохраняли большие, чем нормальные области остеоида (красный). В соответствии со скелетными данными, авторы изобретения обнаружили коррекцию сывороточных концентраций PP во всех когортах обработки. Животные LVL-RecAP1 (Фиг. 9Б) имеют значительно пониженные уровни PP по сравнению с контрольными животными, обработанными носителем. Животные, обработанные LVL-RecAP16, имеют уровни PP, которые статистически не отличимы от уровней однопометных мышей WT.
-/-
Отсутствие черепно-лицевых нарушений у мышей AIpI, обработанных LVL-RecAP
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
Мыши AIpI характеризуются нарушениями черепно-лицевых форм и срастания венечного шва (Liu et al., 2014). Для определения степени, в которой черепно-лицевой скелет подвергается влиянию обработки у мышей AIpI, авторы изобретения провели анализы на основе мкКТ лобных и теменных черепных костей. Результаты в р21 показывают, что и лобные, и теменные кости мышей AIpI, обработанных носителем, значительно уменьшаются в объемной доле кости, содержании минерального вещества кости, плотности минерального вещества кости, содержании минерального вещества ткани и плотности минерального вещества ткани по сравнению с WT или с обработанными мышами AIpI (Таблица 15). В отличие от этого, ни лобные, ни теменные кости обработанных мышей AIpI не были значимо отличными от лобных и теменных костей мышей дикого типа. Взрослые черепа мышей AIpI, обработанных LVL-RecAP16, не казались отличными от WT в показателях размера и формы (Фиг. 10).
-/-
-/-
Таблица 15. мкКТ анализы черепных костей. Лобные и теменные кости анализировали у WT, необработанных AIpI (носитель) и мышей AIpI, обработанных RecAP16, в р21. Значения приводятся как средние плюс/минус SD.
-/-
Обработка LVL-RecAP частично избавляет AIpI от зубочелюстных дефектов
-/-
-/-
-/-
Удаление AIpI у мышей приводит к происходящим в ходе развития дефектам минерализации в цементе, дентине, альвеолярной кости и эмали (Foster et al., 2014а; Foster et al., 2014b; McKee et al. 2011; Yadav et al., 2012), согласующимся с описаниями клинических случаев у субъектов-людей с НРР. Отсутствие неклеточного цемента приводит к потере прикрепления периодонта к поверхности корня зуба и преждевременному выпадению зуба - отличительному признаку НРР. Обработанных LVL-RecAP8 и обработанных носителем мышей AIpI сравнивали с WT в р25-26, когда формирование коренных зубов почти завершалось. Рентгенография и визуализация посредством мкКТ выявили, что, по сравнению с контролями (Фиг. 11А, Г), нижние челюсти необработанных мышей AIpI характеризовались сильно гипоминерализованной костью, короткими коренными зубами с тонким дентином, широкими камерами пульпы и сильно дефектными резцами (Фиг. 11Б, Е). По гистологии зубы мышей AIpI характеризовались отсутствием неклеточного цемента, и остеоид альвеолярной кости вторгался в пространство периодонтальной связки (PDL), приводя к анкилозу и потере функционального периодонта (Фиг. 11Ж по сравнению с 11Д). Введение 8 мг/кг/сутки LVL-RecAP улучшало рентгенографический вид высоты коренного зуба, толщину дентина и минерализацию кости в р26, несмотря на то, что резец оставался дефектным (Фиг. 11В, З). Гистологически, несмотря на то, что данная доза LVL-RecAP не восстанавливала прикрепление неклеточного цемента к поверхности корня, пространство PDL, ассоциированное с коренным зубом, и границы альвеолярной кости лучше поддерживались (Фиг. 11И).
-/-
-/-
Когорту LVL-RecAP16 сравнивали с WT в р50-53 для определения влияния на структуру и функцию зрелых зубов. Рентгенография и визуализация посредством мкКТ показали пониженную минерализацию альвеолярной и межзубной кости вокруг коренных зубов в нижних челюстях мышей AIpI по сравнению с контролями (Фиг. 11Й-М). Форма коренных зубов и дентин оказывались, главным образом, нормализованными у мышей LVL-RecAP16, и это подтверждалось анализом первого коренного зуба посредством мкКТ (Таблица 16). Эмаль в группе LVL-RecAP16 не отличалась от WT по BV/TV или TMD. Коронки и корни коренных зубов демонстрировали умеренные, но значимые снижения BV/TV и TMD на 4-10% по сравнению с WT, указывая на то, что минерализация дентина не полностью восстанавливалась, и толщина корня была снижена на 15%. Минерализация альвеолярной кости в группе LVL-RecAP16 имела более тяжелые дефекты с BV/TV, сниженным на 27%, и TMD, сниженной на 13% по сравнению с WT. Зубы-резцы у обработанных мышей AIpI также оставались сильно пораженными (Фиг. 11К, М).
По гистологии мыши LVL-RecAP 16 характеризовались смесью минерализованной альвеолярной кости и остеоида, и уменьшенным, но сохраняющимся пространством PDL (Фиг. 11Н, П). В группе LVL-RecAP16 не отмечали потери зубов к р53, хотя прикрепление периодонта оставалось недостаточным, что доказывается недостатком цемента, дезорганизацией PDL, отсоединением от поверхности корня и уменьшением роста соединительного эпителия. Однако маленькие области присоединения PDL к зубу наблюдали в ассоциации с организованными волокнами PDL (Фиг. 11O, Р), что указывает на наличие некоторого нарушенного прикрепления, которое может функционировать для удерживания коренных зубов.
Литературные ссылки к Примеру 8
Anderson Н.С., Sipe J.В., Hessle L, Dhanyamraju R., Atti E., Camacho N.P.,  Impaired calcification around matrix vesicles of growth plate and bone in alkaline phosphatase-deficient mice. Am. J. Pathol. 2004; 164 (3): 841-847.
Bouxsein ML, Boyd SK, Christiansen BA, Guldberg RE, Jepsen KJ, .Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res 2010; 25 (7): 1468-86.
Fedde KN, Blair L, Silverstein, J, Coburn SP, Ryan LM, Weinstein RS, Waymire K, Narisawa S, , MacGregor GR, Whyte MP, Alkaline phosphatase knockout mice recapitulate the metabolic and skeletal defects of infantile hypophosphatasia. J Bone Miner Res 1999; 14: 2015-2026.
Foster BL, Nagatomo KJ, Nociti FH, Fong H, Dunn D, Tran AB, Wang W, Narisawa S, , Somerman MJ 2012 Central role of pyrophosphate in acellular cementum formation. PLoS One 7 (6): e38393.
Foster B.L., Nagatomo K.J., Tso H.W., Tran A.B., Nociti F.H., Jr., Narisawa S., Yadav M.C., McKee M.D., Millan J.I., Somerman M.J. Tooth root dentin mineralization defects in a mouse model of hypophosphatasia. J Bone Miner Res. 2013; 28 (2): 271-82.
Foster BL, Nociti FH, Jr., Somerman MJ (2014a). The rachitic tooth. Endocr Rev 35 (1): 1-34.
Foster BL, Ramnitz MS, Gafni Rl, Burke AB, Boyce AM, Lee JS et al. (2014b). Rare Bone Diseases and Their Dental, Oral, and Craniofacial Manifestations. J Dent Res 93(7 suppl):7S-19S.
Hessle L, Johnson K.A., Anderson H.C., Narisawa S., Sali A., Goding J.W., Terkeltaub R., , Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002; 99 (14): 9445-9449.
Huesa O, Yadav M.C., , Goodyear S.R., Robins S.P., Tanner K.E., Aspden R.M., , Farquharson C. PHOSPHO1 is essential for mechanically competent mineralization and the avoidance of spontaneous fractures. Bone. 2011; 48 (5): 1066-1074.
Liu J, Nam HK, Campbell C, Gasque КС, , Hatch NE. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase deficiency causes abnormal craniofacial bone development in the Alpl(-/-) mouse model of infantile hypophosphatasia. Bone 2014; 67: 81-94.
McKee M.D., Nakano Y., Masica D.L., Gray J.J., Lemire I., Heft R., Whyte M.P., Crine P.,  Enzyme replacement therapy prevents dental defects in a model of hypophosphatasia. J. Dent. Res. 2011; 90 (4): 470-476.
Meganck JA, Kozloff KM, Thornton MM, Broski SM, Goldstein SA. Beam hardening artifacts in micro-computed tomography scanning can be reduced by X-ray beam filtration and the resulting images can be used to accurately measure BMD. Bone 2009; 45 (6): 1104-1116.
Narisawa S, Lemire I, Loisel TP, Boileau G, Leonard P, Gramatikova S, Terkeltaub R, Pleshko Camacho N, McKee MD, Crine P, Whyte MP, Enzyme replacement therapy for murine hypophosphatasia. J Bone Miner Res 2008; 23: 777-787.
Narisawa S, Wennberg C.  Abnormal vitamin B6 metabolism in alkaline phosphatase knock-out mice causes multiple abnormalities, but not the impaired bone mineralization. J Pathol 2001; 193: 125-133.
Narisawa S, ,  Inactivation of two mouse alkaline phosphatase genes and establishment of a model of infantile hypophosphatasia. Dev Dyn 1997; 208: 432-446.
Umoh JU, Sampaio AV, Welch I, Pitelka V, Goldberg HA, Underhill TM et al. In vivo micro-CT analysis of bone remodeling in a rat calvarial defect model. Phys Med Biol 2009; 54 (7): 2147-61.
Yadav M.C., Lemire I., Leonard P., Boileau G., Blond L., Beliveau M., Cory E., Sah R.L., Whyte M.P., Crine P.,  Dose response of bone-targeted enzyme replacement for murine hypophosphatasia. Bone. 2011; 49 (2): 250-256.
Yadav M.C., de Oliveira R.C., Foster B.L., Fong H., Cory E., Narisawa S., Sah R.L., Somerman M., Whyte M.P.,, Enzyme replacement prevents enamel defects in hypophosphatasia mice. J. Bone Miner. Res. 2012; 27 (8): 1722-1734.
-/-
Yadav, M. C, Huesa, C, Narisawa, S., Hoylaerts, M. F., Moreau, A., Farquharson, J.L. Ablation of osteopontin improves the skeletal phenotype of Phospho1 mice. J. Bone Miner. Res. In Press (2014).
Пример 9
Щелочная фосфатаза защищает против воспаления почки
Методы
Культура клеток
2
ciPTEC культивировали согласно установившейся практике при 33°C (Wilmer, 2010). Клетки трансфицировали Т-антигеном вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 и основной каталитической субъединицей человеческой теломеразы, обеспечивая их постоянную пролиферацию. Клетки культивировали в DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко)/среде Хэма F12, не содержащей фенолового красного (Gibco, Paisly, Великобритания), дополненной ITS (5 мкг/мл инсулина, 5 мкг/мл трансферрина, 5 нг/мл селена; Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Нидерланды), 36 нг/мл гидрокортизона (Sigma-Aldrich), 40 пг/мл трийодтиронина и 10% фетальной телячей сыворотки (Greiner Bio-One, , Австрия). До эксперимента клетки высевали в луночный планшет (48400 клеток/см), инкубировали в течение 1 суток при 33°C с последующим 7-суточным периодом созревания при 37°C. В сутки эксперимента клетки преинкубировали в течение двух часов с LVL-RecAP (1, 5 или 10 U/мл, любезный подарок от AM-Pharma, Bunnik, Нидерланды) (Kiffer-Moreira, 2014), с последующей инкубацией в течение 24 ч с 10 мкг/мл LPS (Е. coli 0127:В8; Sigma-Aldrich), растворенного в 10 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнка), pH 7,4 (HEPES: Roche Diagnostics, Мангейм, Германия; HBSS: Gibco). В качестве альтернативы, 10 U/мл LVL-RecAp (примерно 17 мкг/мл) вводили клеткам, инкубированным с LPS, одновременно или через два часа. Контрольные клетки инкубировали с одной культуральной средой. DLPS (детоксифицированный липополисахарид) (Е. coli 055:В5; Sigma-Aldrich, 10 мкг/мл) и неактивную LVL-RecAP (17 мкг/мл, любезный подарок от AM-Pharma) использовали в качестве отрцательных контролей. В других наборах экспериментов LPS заменяли рекомбинантным белком - человеческим TNF-α (фактор некроза опухолей-альфа) (Ebioscience, Вена, Австрия) или супернатантом РВМС, предстимулированных с LPS (1 нг/мл) или без него в течение 24 ч. Все эксперименты (n равно 5) проводили минимум в двойной повторности.
Выделение мононуклеарных клеток периферической крови
6
РВМС выделяли из лейкоцитарных пленок, полученных от здоровых доноров крови (банк крови Неймегена, n равно 5), посредством дифференциального центрифугирования через Ficoll-Pague Plus (GE Healthcare, Diegem, Бельгия). РВМС ресуспендировали в среде RPMI-1640 (Gibco), обогащенной 0,5 мг/мл гентамицина (Sigma-Aldrich), 1 мМ пируватом (Gibco) и 2 мМ глутамаксом (Gibco). Клетки высевали в 96-луночные планшеты при плотности 0,5×10 клеток/лунку, преинкубировали с АР (10 единиц/мл) или без нее в течение 2 ч с последующей инкубацией с LPS (1 нг/мл) в течение 24 ч. Все эксперименты проводили в двойной повторности.
Измерение АТФ и анализ жизнеспособности клеток
Супернатант собирали через 30 минут после введения LPS с предобработкой LVL-RecAP или без нее, с последующим прямым измерением продукции АТФ с использованием набора для биолюминисцентного анализа АТФ CLS II (Roche Diagnostics) согласно протоколу изготовителя. Жизнеспособность клеток оценивали после 24 ч инкубации с LPS посредством осуществления анализа МТТ (анализ на основе 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолия бромида). Кратко, среду заменяли 100 мкл предварительно нагретого раствора МТТ (Sigma-Aldrich; 0,5 мг/мл в культуральной среде), инкубировали в течение 3 ч при 37°C с последующим добавлением 200 мкл DMSO (диметилсульфоксид) для солюбилизации осажденных внутри клетки кристаллов формазана. Экстинкцию красителя измеряли при 570 нм с коррекцией длины волны 670 нм.
Животная модель
1/2
Эксперименты на животных проводили согласно руководствам Национальных институтов здоровья, и протоколы для экспериментов на животных были одобрены экспертным советом организации. Самцов крыс Sprague-Dawley, не содержащих специфичных патогенов (RjHan: SD; Janvier, Франция), делили на три группы: плацебо (n равно 6), LPS (n равно 6) или LPS плюс LVL-RecAP (n равно 6). Исходный образец плазмы (кровь с литий-гепарином) отбирали за семь суток до эксперимента посредством прокола хвостовой вены с использованием Multivette (Sarstedt, Etten-Leur, Нидерланды). За трое суток до эксперимента исходную почечную функцию оценивали как t FITC-синистрина (Schock-Kusch, 2011). В t, равное 0 ч, вводили плацебо (0,9% NaCl, физиологический раствор) или 0,3 мг/кг BW (масса тела) LPS (Е. coli 0127:В8, растворенная в физиологическом растворе) в виде в.в. болюса для индуцирования почечной недостаточности, индуцированной LPS. В t, равное 1,5 ч, получали плазму, как описано выше. В t, равное 2 ч, крыса получала в.в. болюс плацебо или LVL-RecAP (1000 U/кг BW, разведенные в физиологическом растворе), с последующим вторым измерением почечной функции. В t, равное 5 ч, все животные получали 5 мл физиологического раствора (п.к.) для предупреждения обезвоживания, с последующим 16-часовым периодом сбора мочи. В t, равное 21,5 ч, проводили третье чрескожное измерение. В t, равное 24 ч, крыс анестезировали (в.б. (внутрибрюшинно), 3 мг/кг BW ксилазина и 80 мг/кг BW 10% кетамина), отбирали для получения плазмы ретробульбарный образец крови с литий-гепарином, и начинали перфузию цельной крови (6 мин, физиологический раствор плюс 50 IU (международные единицы)/мл гепарина, 21 кПа; 3 мин, 4% параформальдегида (PFA; 21 кПа). После перфузии физиологическим раствором правую почку аккуратно удаляли, быстро замораживали и хранили при -80°C до переработки. Левую почку, удаленную после перфузии PFA, хранили в 4% PFA при 4°C до обработки на гистологию и иммуногистохимию. Одно животное из группы LPS плюс LVL-RecAP и один образец мочи из группы плацебо исключали из-за затруднений с инъекцией и сбором соответственно.
Измерения почечной функции
1/2
Почечную функцию оценивали у свободно передвигающихся крыс в сознательном состоянии посредством чрескожного измерения кинетики устранения FITC-синистрина (Fresenius Kabi, Линц, Австрия), имеющегося в продаже маркера GFR (скорость клубочковой фильтрации), используя новое измерительное устройство, как опубликовано ранее (Schock-Kusch 2011, Schock-Kusch 2009). Кратко, крыс анестезировали посредством ингаляции изофлурана (5% - индуцирование, 1,5-2% - поддержание; Abbott Laboratories, Иллинойс, США) и выбривали на спине. Оптическую часть устройства фиксировали на этом участке с удаленной шерстью, используя специально разработанный двухсторонний клейкий пластырь (Lohmann GmbH, Neuwied, Германия), тогда как электронная часть устройства была включена в корсет для грызуна (Lomir Biomedical, Malone, США). После установления исходного сигнала инъецировали в хвостовую вену FITC-синистрин (5 мг на 100 г BW, разведенный в забуференном физиологическом растворе). Затем давали животным восстановиться от анестезии, продолжая измерение в течение приблизительно 120 минут после инъекции. Т рассчитывали посредством однокомпартментной модели, примененной к чрескожно измеренной кинетике устранения FITC-синистрина (Schock-Kusch, 2009). Кроме того, параметры почечной функции определяли в образцах плазмы и мочи с использованием автоматического анализатора Hitachi 704 (Boehringer Mannheim, Мангейм, Германия). Рассчитывали фракционную экскрецию мочи и клиренс эндогенного креатинина со средними значениями в плазме при t, равном 1,5 ч, и t, равном 24 ч.
Гистология и иммуногистохимия
После фиксации в течение по меньшей мере 24 ч ткань обрабатывали, заливали в парапласт и нарезали с толщиной срезов 3 мкМ. Для традиционной гистологии на почечной ткани проводили окрашивание НЕ (гематоксилин-эозин). Повреждение почки оценивали с использованием бальной системы со шкалой от 0 до 4 (0 - нет изменений; 4 - тяжелое повреждение, например заметные изменения клеток канальцев). KIM-1 выявляли посредством первичного козьего антитела против крысиного KIM-1 (1:50; AF3689, R&D Systems, Abingdon, Великобритания) и вторичного кроличьего антитела против IgG козы (1:200; Р0449, DAKO, Heverlee, Бельгия). Иммуноокрашивание визуализировали с использованием реакивов системы VECTASTAIN Eline ABC (Vector Labs, Амстердам, Нидерланды) и 3,3'-диаминобензидина (DAB, Sigma-Aldrich), с последующим контрастным окрашиванием гематоксилином. Все бальные оценки проводили слепым способом.
Цитокины и маркеры повреждения почки
Наборы для ELISA на человеке (R&D Systems) использовали для определения TNF-α, IL-6 и IL-8 в супернатанте согласно инструкциям изготовителя. Плазматические уровни цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α, INF-γ) определяли посредством одновременного анализа Luminex согласно инструкциям изготовителя (Millipore, Cork, Ирландия). KIM-1 и NGAL определяли посредством ELISA (R&D Systems) согласно инструкциям изготовителя.
Гомогенизация ткани
Быстро замороженные почки гомогенизировали посредством TissueLyser LT (Qiagen, Venlo, Нидерланды) согласно инструкциям изготовителя в реактиве для экстракции белка ткани (T-PER; Thermo Scientific, Rockford, США), дополненном таблетками полной смеси ингибиторов протеаз, не содержащей EDTA (Roche Applied Science, Almere, Нидерланды). Общее содержание белка определяли с использованием набора для анализа белка на основе бицинхониновой кислоты (Thermo Scientific), и образцы хранили при -80°C до анализа.
Анализы ПЦР в реальном времени
РНК экстрагировали из замороженного осадка клеток или измельченных почек (2000, 30 с; Mikro-dismembrator U, Sartorius Stedim Biotech, Aubagne Cedex, Франция) реактивом Trizol. РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (M-MLV) (Invitrogen, Breda, Нидерланды). Количественную ПЦР в реальном времени (кПЦР-РВ) проводили с использованием Taqman (Applied Biosystems, Carlsbad, США). Гены амплифицировали и нормировали к экспрессии GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) (ciPTEC: Ct: 18,9 плюс/минус 0,1; почечная ткань: Ct: 24,8 плюс/минус 0,2). ПЦР-реакция начиналась с 2 мин стадии инкубации при 50°C с последующими исходной денатурацией в течение 10 мин при 95°C и 40 циклами по 15 с при 95°C и 1 мин при 60°C. Различия между группами рассчитывали сравнительным способом ΔΔCt. Наборы праймеров/зондов обобщены в Таблице 17.
Содержание пуринов в моче
2
4
2
Содержание аденозина, АМФ (аденозинмонофосфат), АДФ (аденозиндифосфат), АТФ и цАМФ (циклическиймаденозинмонофосфат) в моче определяли посредством ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Кратко, 4 объема мочи смешивали с 1 объемом хлорацетальдегида (разведенного в 6 раз в 1 М ацетатном буфере, pH 4,5; Sigma-Aldrich) с последующей дериватизацией (60 мин, 70°C, 500 об/мин) и центрифугированием (3 мин, RT (комнатная температура), 13400 об./мин), после чего супернатант переносили во флакон для ВЭЖХ и осуществляли инъекцию. Пурины разделяли посредством системы ВЭЖХ (Thermo Scientific) с использованием колонки Polaris С18-А (150×4,6 мм) с градиентной элюцией, используя элюент А (0,1 М KНРO, 10 мМ TBAHS (рН 6,5) и 2% МеОН) и элюент Б (HO: ACN: THF; 50:49:1). Времена удерживания составляли 7,1 (аденозин), 8,4 (АМФ), 12,5 (АДФ), 16,2 (АТФ) и 14,8 мин (цАМФ). Количественное измерение было основано на площадях пиков образцов и эталонных стандартов, измеренных с использованием флуоресценции (возбуждение: 280 нм; испускание: 420 нм).
Статистический анализ
Данные выражаются как среднее плюс/минус SEM (стандартная ошибка среднего) или медиана [25-ый перцентиль, 75-ый перцентиль]. Нормальность данных оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Статистические различия между группами оценивали с использованием ANOVA (дисперсионный анализ) с апостериорными сравнениями с использованием критерия множественных сравнений Бонферрони или критерия Крускала-Уоллиса с апостериорным критерием Данна. Статистически значимым считали двухстороннее значение p, меньшее, чем 0,05. Все тесты осуществляли с использованием Graphpad Prism 5.00 для Windows (Graphpad Software Inc. Сан-Диего, CA, США).
LVL-RecAP ослабляет индуцированный LPS воспалительный ответ in vitro
Предобработка человеческих ciPTEC (Wilmer, 2010) LVL-RecAP дозозависимо ослабляла индуцированное LPS продуцрование цитокинов - TNF-α, IL-6 и IL-8 на уровне гена и белка (Фиг. 12А-Б). Детоксифицированный LPS (dLPS) использовали в качестве отрицательного контроля, и он не имел эффекта. Аналогичные защитные результаты на уровне белка были получены при введении LVL-RecAP одновременно с LPS или через 2 ч после воздействия LPS (Фиг. 12В). Контрольный эксперимент проводили для подтверждения того, дефосфорилирует ли LVL-RecAP цитокины, экскретируемые в среду, чего не происходило (Фиг. 17). Для подтверждения того, что индуцированное LVL-RecAP уменьшение продуцирования цитокинов было обусловлено дефосфорилирующей природой фермента, исследовали эффект неактивной LVL-RecAP, которая не имеет гидролитических свойств. Неактивная LVL-RecAP не ослабляла индуцированный LPS воспалительный ответ в ciPTEC (Фиг. 12Г).
Эффекты LVL-RecAP in vitro являются специфичными для почки и не ограничиваются воспалением, индуцированным LPS
Для дальнейшего исследования защитного механизма почки посредством LVL-RecAP ciPTEC инкубировали с провоспалительным цитокином TNF-α, который не может быть дефосфорилирован телячьей IAP (Chen, 2010). Индуцированное TNF-α продуцирование цитокинов IL-6 и IL-8 также ослаблялось предобработкой LVL-RecAP, тогда как неактивный LVL-RecAP не имел эффекта (Фиг. 13А).
В патогенезе ассоциированного с сепсисом AKI LPS индуцирует местный воспалительный ответ через связывание с TLR4 (Toll-подобный рецептор 4), экспрессируемым на РТЕС (ciPTEC Ct: 30,5 плюс/минус 3,9; n равно 5). Другим отличительным признаком заболевания является системный воспалительный ответ, который поражает и почечные эпителиальные, и эндотелиальные клетки, вызывая развитие AKI (Peters, 2014). Для имитации этого почечного воспаления, индуцированного эндотоксином, ciPTEC инкубировали с супернатантом стимулированных LPS мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС, 1 нг/мл LPS). Это индуцировало продуцирование IL-6 и IL-8, которое снижалось при предобработке ciPTEC LVL-RecAP (Фиг. 13Б, TNF-α не выявлялся). Наряду с данными о том, что воспалительные ответы, опосредованные TNF-α, ослаблялись обработкой LVL-RecAP, это свидетельствует о присутствии другого медиатора, на который оказывает направленный эффект LVL-RecAP. В отличие от этого, предобработка РВМС LVL-RecAP не влияла на индуцированный LPS воспалительный ответ в данных клетках (Фиг. 13В), указывая на то, что эффекты LVL-RecAP являются специфичными для почки.
LVL-RecAP может оказывать эффекты, защищающие почки in vitro, через путь АТФ/аденозина
Второй потенциальной мишенью LVL-RecAP является АТФ, высвобождаемый во время клеточного стресса, вызванного, например, воспалением и гипоксией (Eltzschig, 2012). Внеклеточный АТФ имеет вредные эффекты, но может превращаться эктонуклеотидазами (например АР) в АДФ, АМФ и, в конечном счете, в аденозин, оказывая противовоспалительные и защищающие ткань эффекты через связывание с одним из рецепторов аденозина - А1, А2А, А2В и A3 (Bauerle, 2011, Di Sole, 2008). Интересно, что в то время как на экспрессию рецепторов аденозина А1, А2В и A3 в ciPTEC не влияла инкубация с LPS (данные не показаны), экспрессия А2А подвергалась повышающей регуляции при стимуляции LPS (кратность увеличения: 4,1 плюс/минус 0,4; р меньше 0,001 по сравнению с плацебо). Данный эффект ослаблялся совместной обработкой LVL-RecAP (кратность увеличения: 2,9 плюс/минус 0,2; p меньше 0,001 по сравнению с плацебо; p меньше 0,05 по сравнению с LPS), свидетельствуя о роли аденозинового пути в защитном эффекте LVL-RecAP. Кроме того, авторы изобретения наблюдали повышенные внеклеточные концентрации АТФ после инкубации с LPS, что было более выраженным с более высокой концентрацией LPS, но обращалось преинкубацией с LVL-RecAP (Фиг. 14). LPS не влиял на жизнеспособность клеток вплоть до 24 ч (данные не показаны). Это поддерживает гипотезу о том, что LVL-RecAP может оказывать его защищающий почки эффект через АТФ/аденозиновый путь.
Обработка LVL-RecAP во время AKI, индуцированного LPS, у крыс ослабляет нарушенную почечную функцию
1/2
1/2
Для подтверждения полезных эффектов LVL-RecAP in vivo у крыс индуцировали AKI посредством LPS (0,3 мг/кг BW), и почечную функцию оценивали посредством чрескожного измерения кинетики синистрина, меченного флуоресцеина изотиоцианатом (FITC), как описано ранее (Schock-Kusch, 2011). FITC-синистрин подвергается клиренсу почками только посредством фильтрации, и его исчезновение из компартмента плазмы можно измерять чрескожно в реальном времени (Schock-Kusch, 2011, Schock-Kusch, 2009). Это обеспечивает более точное исследование прогрессирования AKI по сравнению с обычно используемым клиренсом креатинина. До инъекции LPS отбирали исходный образец крови для определения клинических параметров и цитокинов плазмы, и из измеренной кинетики определяли исходный период полувыведения (t) FITC-синистрина для установления гомогенности между группами (данные не показаны). Через 1,5 ч обработка LPS приводила к повышенным уровням цитокинов плазмы, нарушениям в нескольких параметрах плазмы (Таблица 18), пилоэрекции, диарее и ослабленной спонтанной активности, подтверждая присутствие системного воспаления. Через два часа после введения LPS крыс обрабатывали LVL-RecAP (1000 U/кг BW) или плацебо (физиологический растор), непоседственно после этого следовали чрескожные измерения почечной функции. LPS значимо пролонгировал t FITC-синистрина, выявляя значимое снижение почечной функции. Эта тенденция ослаблялась обработкой LVL-RecAP (Фиг. 15А). Во всех группах почечная функция полностью восстанавливалась в пределах 24 ч (Фиг. 15Б). Тем не менее, уровни мочевины в плазме были значимо меньше у животных, обработанных LVL-RecAP, по сравнению с животными, которые получали LPS без LVL-RecAP (Таблица 19). Также обработка LVL-RecAP предупреждала индуцированное LPS увеличение фракционной экскреции мочи (Фиг. 15В) и индуцированное LPS уменьшение клиренса эндогенного креатинина (Фиг. 15Г). Биоактивность LVL-RecAP была подтверждена в плазме и показала восьмикратное увеличение через 22 ч после инъекции (плацебо: 293 плюс/минус 12 U/мл; LPS: 260 плюс/минус 13 U/мл; LPS плюс АР: 2150 плюс/минус 60 U/мл; p меньше 0,0001).
LVL-RecAP предупреждает повреждение почки во время индуцированного LPS AKI in vivo
Почечный защитный эффект LVL-RecAP на индуцированное LPS AKI исследовали далее посредством оценки почечной гистологии и специфичных маркеров повреждения канальцев. Между группами обработки не обнаружили различий в гистологии с изменениями, которые варьировали от отсутствия повреждения (0) до минимальных дегенеративных изменений, подобных пеновидному внешнему виду и минимальному набуханию проксимальных клеток канальцев (1), и пеновидному внешнему виду и умеренному набуханию, а также нескольким случаям апоптоза (2) (плацебо: 1 [0,75-2]; LPS: 1,5 [0-2]; LPS плюс LVL-RecAP: 1 [0-1,0]). Обработка LPS приводила к значимому увеличению уровней экспрессии почечного IL-6, тогда как другие цитокины и маркеры повреждения (МРО - миелопероксидаза; ВАХ - Bcl2-ассоциированный белок X; iNOS - индуцибельная синтаза оксида азота) не подвергались влиянию (Таблица 20). LVL-RecAP не могла уменьшать уровни экспрессии почечного IL-6, но действительно усиливала почечную экспрессию противовоспалительного цитокина IL-10 (Таблица 20). Кроме того, введение LPS приводило к значимому увеличению экскреции в мочу молекулы повреждения почки (KIМ)-1 и липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL), что сопровождалось повышенными уровнями экспрессии почечных генов. Данный эффект предупреждался совместным введением LVL-RecAP (Фиг. 16А-Б, Таблица 20). Аналогичные эффекты LVL-RecAP наблюдали для уровней NGAL в плазме (Фиг. 16В) и для уровней почечного белка KIM-1 (Фиг. 16Г), который главным образом локализовался на апикальной поверхности эпителиальных клеток проксимальных канальцев (Фиг. 16Д).
Пониженная экскреция аденозина в мочу во время индуцированного LPS AKI in vivo
Для того чтобы дополнительно прояснить почечный защитный механизм LVL-RecAP авторы изобретения исследовали роль АТФ-аденозинового пути. Обработка LPS имела тенденцию к уменьшению уровней экспрессии генов в почке для всех четырех рецепторов аденозина, из которых только для рецептора аденозина A3 достигалась статистическая значимость (Таблица 20). Интересно, что обработка LPS значимо снижала экскрецию в мочу аденозина (плацебо: 68,0 плюс/минус 7,8 пг аденозина / 10 мкг креатинина; LPS: 19,4 плюс/минус 6,3 пг аденозина / 10 мкг креатинина; р меньше 0,001) без изменения экскреции цАМФ, АТФ, АДФ и АМФ (данные не показаны). Это может свидетельствовать о том, что почка утилизирует аденозин во время AKI, индуцированного LPS. Обработка LVL-RecAP не имела эффекта на экспрессию гена рецептора аденозина (Таблица 20) или на экскрецию аденозина в мочу (LPS плюс LVL-RecAP: 16,7 плюс/минус 6,8 пг аденозина / 10 мкг креатинина: p меньше 0,001 по сравнению с плацебо) по сравнению с одним LPS.
Параметры плазмы определяли через 1,5 ч после введения LPS. Данные выражены как среднее плюс/минус SEM и медиана [25-ый перцентиль, 75-ый перцентиль] в зависимости от распределения каждого параметра. Различия в распределении параметров плазмы по сравнению с t, равным 24, вероятно связаны с величиной выборки. Значимые различия оценивали с использованием однофакторного ANOVA с апостериорным критерием Бонферрони, или критерия Крускала-Уоллиса с апостериорным критерием Данна. Плацебо, LPS - n равно 6; LPS плюс recAP - n равно 5. # p меньше 0,05 по сравнению с плацебо. * p меньше 0,05 по сравнению с LPS. LPS  -липополисахарид; recAP - рекомбинантная щелочная фосфатаза; ND - не определено.
Параметры плазмы определяли через 24 ч после введения LPS. Параметры мочи были определены от 5 до 21 ч после введения LPS. Данные выражены как среднее плюс/минус SEM и медиана [25-ый перцентиль, 75-ый перцентиль] в зависимости от распределения каждого параметра. Значимые различия оценивали с использованием критерия Крускала-Уоллиса с апостериорным критерием Данна или однофакторного ANOVA с апостериорным критерием Бонферрони. Плацебо, LPS - n равно 6; LPS плюс recAP - n равно 5; параметры мочи: плацебо - n равно 5. # p меньше 0,05 по сравнению с плацебо. * p меньше 0,05 по сравнению с LPS. LPS -липополисахарид; recAP - рекомбинантная щелочная фосфатаза.
Данные выражены как среднее плюс/минус SEM и медиана [25-ый перцентиль, 75-ый перцентиль] в зависимости от распределения каждого параметра. Значимые различия кратности увеличения оценивали с использованием критерия Крускала-Уоллиса с апостериорным критерием Данна или однофакторного ANOVA с апостериорным критерием Бонферрони. Плацебо, LPS - n равно 6; LPS плюс recAP - n равно 5. # p меньше 0,05 по сравнению с плацебо. * p меньше 0,05 по сравнению с LPS. LPS - липополисахарид; recAP - рекомбинантная щелочная фосфатаза; МРО - миелопероксидаза; ВАХ - белок X, ассоциированный с Bcl2; iNOS - индуцибельная синтаза оксида азота.
Литературные ссылки к Примеру 9
Bauerle, J.D., Grenz, A., Kim, J.H., Lee, Н.Т., Eltzschig, H.K. 2011. Adenosine generation and signaling during acute kidney injury. J Am Soc Nephrol 22: 14-20.
Chen, K.T., Malo, M.S., Moss, A.K., Zeller, S., Johnson, P., Ebrahimi, F., Mostafa, G., Alam, S.N., Ramasamy, S., Warren, H.S., et al. 2010. Identification of specific targets for the gut mucosal defense factor intestinal alkaline phosphatase. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 299: G467-475.
Di Sole, F. 2008. Adenosine and renal tubular function. Curr Opin Nephrol Hypertens 17: 399-407.
Eltzschig, H.K., Sitkovsky, M.V., Robson, S.C. 2012. Purinergic signaling during inflammation. N Engl J Med 367: 2322-2333.
Kiffer-Moreira, Т., Sheen, C.R., Gasque, K.C., Bolean, M., Ciancaglini, P., van Elsas, A., Hoylaerts, M.F., Millan, J.L. 2014. Catalytic signature of a heat-stable, chimeric human alkaline phosphatase with therapeutic potential. PLoS One 9:e89374.
Peters, E., Heemskerk, S., Masereeuw, R., Pickkers, P. 2014. Alkaline Phosphatase: A Possible Treatment for Sepsis-Associated Acute Kidney Injury in Critically III Patients. Am J Kidney Dis. 63: 1038-48
Schock-Kusch, D., Sadick, M., Henninger, N., Kraenzlin, В., Claus, G., Kloetzer, H.M., Weiss, C, Pill, J., Gretz, N. 2009. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrol Dial Transplant 24: 2997-3001.
Schock-Kusch, D., Xie, Q., Shulhevich, Y., Hesser, J., Stsepankou, D., Sadick, M., Koenig, S., Hoecklin, F., Pill, J., Gretz, N. 2011. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney Int 79: 1254-1258.
Wilmer, M.J., Saleem, M.A., Masereeuw, R., Ni, L., van der Velden, T.J., Russel, F.G., Mathieson, P.W., Monnens, L.A., van den Heuvel, L.P., Levtchenko, E.N. 2010. Novel conditionally immortalized human proximal tubule cell line expressing functional influx and efflux transporters. Cell Tissue Res 339:449-457.
Пример 10
Сравнение LVL-RecAP с RecAP при разных температурных условиях
10.6. МАТЕРИАЛЫ
10.6.1 Эталонные стандарты LVL-RecAP
Номер партии
NB1963p1
PRA ID
14-049
Содержание белка
9,9 мг/мл (OD280)
Активность
6537 U/мл (660 U/мг)
Условия хранения
номинальные при -70°C
Срок годности
08 января 2015 г.
RecAP
Номер партии
2013-052, партия 62
PRA ID
14-311
Содержание белка
13,3 мг/мл (OD280)
Активность
9871 U/мл (742 U/мг)
Условия хранения
при 2-8°C
Срок годности
06 июня 2016 г.
10.6.2 Пустая матрица
Следующую биологическую матрицу использовали для приготовления растворов образцов.
Матрица
сыворотка
Вид
человек
Поставщик
Sera Laboratories International, Haywards Heath, Великобритания
Условия хранения
при номинальной температуре хранения -20°C
PRA ID
14-0624, 14-0647 и 14-0652
Сроки хранения
02 мая 2016 (14-0624),
06 мая 2016 (14-0647 и 14-0652)
10.7. СПОСОБЫ
10.7.1 Приготовление растворов
10.7.1.1 2 М гидроксид натрия
2-молярный раствор гидроксида натрия готовили путем растворения 8 г гидроксида натрия в приблизительно 90 мл воды Milli-Q и после охлаждения до комнатной температуры объем доводили до 100 мл. Раствор хранили при комнатной температуре максимум вплоть до одного месяца.
10.7.1.2 1 М хлорид магния
1 - молярный раствор хлорида магния готовили путем растворения 4,06 г хлорида магния гексагидрата приблизительно в 16 мл воды Milli-Q. После растворения объем доводили до 20 мл. Раствор хранили при номинальной температуре +4°C максимум вплоть до одного месяца.
10.7.1.3 0,1 М хлорид цинка
0,1 - молярный раствор хлорида цинка готовили путем растворения 272,5 мг хлорида цинка приблизительно в 16 мл воды Milli-Q. После растворения объем доводили до 20 мл.
Раствор хранили при номинальной температуре +4°C максимум вплоть до одного месяца.
10.7.1.4 Раствор 0,025 М глицина, pH 9,6, для способа при 25°C
0,025-молярный раствор глицина, pH 9,6, готовили путем растворения
3,76 г глицина в приблизительно 1800 мл воды Milli-Q. Раствор нагревали до 25°C и доводили до pH 9,6 2 М гидроксидом натрия (см. Раздел 10.7.1.1). Объем доводили до 2000 мл и повторно проверяли pH. pH при 25°C должен был составлять pH 9,6. Раствор хранили при номинальной температуре +4°C максимум вплоть до одной недели.
10.7.1.5 Буфер-разбавитель для фермента для способа при 25°C
Буфер-разбавитель для фермента готовили путем смешивания 0,5 мл 1 М хлорида магния (см. Раздел 10.7.1.2) с 0,5 мл 0,1 М хлорида цинка (см. Раздел 10.7.1.3) и 500 мл 0,025 М раствора глицина, pH 9,6 (см. Раздел 10.7.1.4). В данный раствор добавляли 5,00 г маннита и 0,25 г бычьего сывороточного альбумина и растворяли при перемешивании. Проверяли pH и, если считали необходимым, доводили до pH 9,6 при 25°C с использованием 2 М гидроксида натрия. Каждые сутки готовили свежий буфер-разбавитель для фермента.
10.7.1.6 0,0103 М п-нитрофенилфосфат, pH 9,6, для способа при 25°C
0,0103 М п-нитрофенилфосфат, pH 9,6, готовили путем растворения 1528 мг п-нитрофенилфосфата в приблизительно 360 мл 0,025 М раствора глицина, pH 9,6 (см. Раздел 10.7.1.4). Проверяли pH и, если считали необходимым, доводили до pH 9,6 при 25°C с использованием 2 М гидроксида натрия (см. Раздел 10.7.1.1). После проверки pH объем доводили до 400 мл 0,025 М раствором глицина, pH 9,6. Данный раствор хранили при номинальной температуре +4°C максимум вплоть до 5 суток.
10.7.1.7 Рабочий субстрат для способа при 25°C
Рабочий субстрат готовили путем смешивания 120 мл 0,0103 М раствора п-нитрофенилфосфата, pH 9,6, (см. Раздел 10.7.1.6) с 1,25 мл 1 М раствора хлорида магния (см. Раздел 10.7.1.2). В данный раствор добавляли приблизительно 15 мл 0,025 М раствора глицина, pH 9,6 (см. Раздел 10.7.1.4) и проверяли pH и, если считали необходимым, доводили до pH 9,6 при 25°C с использованием 2 М гидроксида натрия (см. Раздел 10.7.1.1). Объем доводили до 145 мл 0,025 М раствором глицина, pH 9,6. Каждые сутки готовили свежий рабочий субстрат.
10.7.1.8 0,025 М раствор глицина, pH 9,6, для способа при 37°C
0,025-молярный раствор глицина, pH 9,6, готовили путем растворения 3,76 г глицина в приблизительно 1800 мл воды Milli-Q. Раствор нагревали до 25°C и доводили до pH 9,6 2 М гидроксидом натрия (см. Раздел 10.7.1.1). Объем доводили до 2000 мл и повторно проверяли рН. pH при 37°C должен был составлять pH 9,6. Раствор хранили при номинальной температуре +4°C максимум вплоть до одной недели.
10.7.1.9 Буфер-разбавитель для фермента для способа при 37°C
Буфер-разбавитель для фермента готовили путем смешивания 0,5 мл 1 М хлорида магния (см. Раздел 10.7.1.2) с 0,5 мл 0,1 М хлорида цинка (см. Раздел 10.7.1.3) и 500 мл 0,025 М раствора глицина, pH 9,6 (см. Раздел 10.7.1.8). В данный раствор добавляли 5,00 г маннита и 0,25 г бычьего сывороточного альбумина и растворяли при перемешивании. Проверяли pH и, если считали необходимым, доводили до pH 9,6 при 37°C с использованием 2 М гидроксида натрия. Каждые сутки готовили свежий буфер-разбавитель для фермента.
10.7.1.10 0,0103 М п-нитрофенилфосфат, pH 9,6, для способа при 37°C
0,0103 М п-нитрофенилфосфат, pH 9,6, готовили путем растворения 1528 мг п-нитрофенилфосфата в приблизительно 360 мл 0,025 М раствора глицина, pH 9,6 (см. Раздел 10.7.1.8). Проверяли pH и, если считали необходимым, доводили до pH 9,6 при 37°C с использованием 2 М гидроксида натрия (см. Раздел 10.7.1.1). После проверки pH объем доводили до 400 мл 0,025 М раствором глицина, pH 9,6. Данный раствор хранили при номинальной температуре +4°C максимум вплоть до 5 суток.
10.7.1.11 Рабочий субстрат для способа при 37°C
Рабочий субстрат готовили путем смешивания 120 мл 0,0103 М раствора п-нитрофенилфосфата, pH 9,6, (см. Раздел 10.7.1.10) с 1,25 мл 1 М раствора хлорида магния (см. Раздел 10.7.1.2). В данный раствор добавляли приблизительно 15 мл 0,025 М раствора глицина, pH 9,6 (см. Раздел 10.7.1.4), проверяли pH и, если считали необходимым, доводили до pH 9,6 при 37°C с использованием 2 М гидроксида натрия (см. Раздел 10.7.1.1). Объем доводили до 145 мл 0,025 М раствором глицина, pH 9,6. Каждые сутки готовили свежий рабочий субстрат.
10.7.2 Раствор LVL-RecAP для внесения (500 мкг/мл)
Раствор recAP для внесения готовили путем разведения 252,5 мкл LVL-RecAP (Раздел 10.6.1) до 5,00 мл буфером-разбавителем для фермента (Раздел 10.7.1.5). Конечная концентрация раствора для внесения составляет 500 мкг/мл, данный раствор использовали для приготовления образцов человеческой сыворотки с внесенной recAP (Раздел 10.7.4).
10.7.3 Раствор RecAP для внесения (500 мкг/мл)
Раствор RecAP для внесения готовили путем разведения 188,0 мкл RecAP (Раздел 10.6.1) до 5,00 мл буфером-разбавителем для фермента (Раздел 10.7.1.5). Конечная концентрация раствора для внесения составляет 500 мкг/мл, данный раствор использовали для приготовления образцов человеческой сыворотки с внесенной RecAP (Раздел 10.7.5).
10.7.4 Приготовление образцов человеческой сыворотки с внесенной LVL-recAP
Образцы сыворотки готовили путем внесения LVL-RecAP в три индивидуальные партии пустой сыворотки с использованием следующей концентрации:
Образцы сыворотки хранили при номинальной температуре -70°C до анализа.
10.7.5 Приготовление образцов человеческой сыворотки с внесенной RecAP
Образцы сыворотки готовили путем внесения RecAP в три индивидуальные партии пустой сыворотки с использованием следующей концентрации:
Образцы сыворотки хранили при номинальной температуре -70°C до анализа.
10.7.6 Приготовление растворов образцов для определения ферментативной активности LVL-RecAP и RecAP
Растворы образцов для определения ферментативной активности LVL-RecAP и RecAP готовили путем разведения образца продукта LVL-RecAP или образца продукта RecAP с использованием буфера-разбавителя для фермента (Раздел 10.7.1.5 для способа при 25°C или Раздел 10.7.1.9 для способа при 37°C).
Образец 1 из образца LVL-RecAP и/или RecAP разводили, беря 125 мкл образца сыворотки с LVL-RecAP и/или RecAP и разбавляя до 2,50 мл буфером-разбавителем для фермента с получением конечного раствора образца для определения ферментативной активности LVL-RecAP или RecAP.
Образец 2 из образца LVL-RecAP и/или RecAP разводили, беря 125 мкл образца сыворотки с LVL-RecAP и/или RecAP и разбавляя до 2,00 мл буфером-разбавителем для фермента с получением конечного раствора образца для определения ферментативной активности LVL-RecAP или RecAP.
Образец 3 из образца LVL-RecAP и/или RecAP разводили, беря 167 мкл образца сыворотки с LVL-RecAP и/или RecAP и разбавляя до 2,00 мл буфером-разбавителем для фермента с получением конечного раствора образца для определения ферментативной активности LVL-RecAP или RecAP.
Образец 4 из образца LVL-RecAP и/или RecAP разводили, беря 250 мкл образца сыворотки с LVL-RecAP и/или RecAP и разбавляя до 2,00 мл буфером-разбавителем для фермента с получением конечного раствора образца для определения ферментативной активности LVL-RecAP или RecAP.
Образец 5 из образца LVL-RecAP и/или RecAP разводили, беря 500 мкл образца сыворотки с LVL-RecAP и/или RecAP и разбавляя до 2,00 мл буфером-разбавителем для фермента с получением конечного раствора образца для определения ферментативной активности LVL-RecAP и/или RecAP.
Образец 6 из образца LVL-RecAP и/или RecAP разводили, беря 1000 мкл образца сыворотки с LVL-RecAP и/или RecAP и разбавляя до 2,00 мл буфером-разбавителем для фермента с получением конечного раствора образца для определения ферментативной активности LVL-RecAP и/или RecAP.
Эндогенный (образец 7) из образца LVL-RecAP и/или RecAP разводили, беря 1000 мкл образца сыворотки с LVL-RecAP и/или RecAP и разбавляя до 2,00 мл буфером-разбавителем для фермента с получением конечного раствора образца для определения ферментативной активности LVL-RecAP и/или RecAP.
10.8. ВЫПОЛНЕНИЕ, РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
10.8.1 Оборудование и установка
Использовали следующий способ и установку:
Спектрофотометр: Thermo Fisher Evolution 300 UV/VIS с одной нагревательной ячейкой Пельтье, установленной на 25°C (AN-18-3) или 37°C (AN-18-4), с магнитной мешалкой.
Длина волны: 405 нм.
Измерение: в течение 3 минут, измерение каждые 15 секунд. Первую минуту не принимали во внимание для расчетов.
Тип кюветы: стеклянная.
Следующие растворы отбирали пипеткой в стеклянную кювету. Температура растворов составляла 25°C плюс/минус 0,5°C для AN-18-3 или 37°C плюс/минус 0,5°C для AN-18-4.
Сначала, до добавления образца смешивали рабочий субстрат и разбавитель для фермента. Раствор перемешивали, кювету немедленно помещали в спектрофотометр и измеряли увеличение поглощения от 1 до 3 минут с шагом 15 секунд для получения по меньшей мере 9 точек данных. В точке данных 3 минуты (последней) оптическая плотность составляла 1,5 или менее. Кроме того, линейность была приемлемой; коэффициент корреляции (г) для каждой повторности должен был составлять 0,990 или более. Все результаты от образцов с коэффициентом корреляции (г) 0,990 или более принимали во внимание для оценки, результаты от образцов с коэффициентом корреляции (г) меньше 0,990 приводили только для информации. Измерение ферментативной активности осуществляли в режиме двух повторностей с одним анализом для каждого разведения.
10.8.2 Ферментативная активность LVL-RecAP и RecAP
Несмотря на то, что в плане исследования было описано, что различие для двух индивидуальных результатов (ферментативной активности) должно составлять 5,0% или менее для принятия двух индивидуальных результатов разведения, для оценки использовали все результаты с коэффициентом корреляции (r) для каждого измерения 0,990 или более. Это делали из-за того, что способ определения ферментативной активности был подтвержден для образцов лекарственного продукта LVL-RecAP при 25°C плюс/минус 0,5°C, а не для щелочных фосфатаз другого происхождения и/или других условий.
На Фиг. 19 показана корреляция между ферментативными активностями RecAP в человеческой сыворотке при 25°C и при 37°C.На Фиг. 20 показана корреляция между ферментативными активностями LVL-RecAP в человеческой сыворотке при 25°C и при 37°C.
На Фиг. 20 показана активность / мкг белка при 25°C и при 37°C для RecAP и LVL-RecAP. Значения представляют среднюю A активности между 25°C и 37°C для данной концентрации белка.