Питательная среда для размножения на стадии пролиферации крыжовника сорта "Розовый-2"
GROWING MEDIUM FOR REPRODUCTION AT STAGE OF PROLIFERATION OF GOOSEBERRIES OF “PINK-2” VARIETY

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства, а именно касается питательных сред различного минерального и органического состава, предназначенных для культивирования ягодных и плодовых культур, которые непосредственно могут быть использованы в процессе микроклонирования крыжовника сорта «Розовый-2» на стадии его пролиферации.
Описаны питательные среды различного минерального и органического состава, предназначенные для культивирования ягодных и плодовых растений [Murashige Т., Skoog F.A revised for rapid growth and bioassays with tobako tissue culture // Physiol. Plantarum. 1962. V. 15. №3. P. 473-497; RU 2063682, A01H 4/00, 1996; Hunkova С.М., Libiakova G., Fejer J., Vugovic T. //Genetika.2018.V. 50. №1, P. 351-356].
Вместе с тем также известно, что даже для каждого сорта в рамках одного вида, исходя из его биологических требований, необходимо подбирать определенный питательный состав [Hedtrich С.М., Feucht W. Die Bedeutung der Meristem-Vermehrung-der derzeitige Stand beim Beeren-Obst//Obstbau (Bonn). 1981. V. 6. №3. P. 82-86]. Однако среди выявленных аналогов не выявлены питательные среды, позволяющие именно для крыжовника сорта Розовый-2 на стадии пролиферации при микроразмножении получить высокие коэффициенты размножения и длину побегов.
2
2
Аналогом предлагаемой в заявке питательной среды является известная питательная среда для размножения различных ягодных и плодовых культур, представляющая собой модифицированный сиреневой кислотой состав Мурасиге-Скуга, включающий макро- и микро-элементы в виде минеральных солей, а также смесь сернокислого железа и динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (NaЭДТА), позиционируемые как комплекс FеЭДТА, и специальные органические добавки для интенсификации микроразмножения [RU 2063682, А01Н 4/00, 1996]. Данная питательная среда содержит аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций азотнокислый, магний сернокислый, марганец сернокислый, калий фосфорнокислый, железо сернокислое, (NaЭДТА), борную кислоту, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, сиреневую кислоту, миоинозит, тиамин гидрохлорид, пиродоксин гидрохлорид, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, 6-бензиламинопурин, сахарозу, агар-агар, остальное - вода.
Данная питательная смесь при рН 5,5-5,7 нагревается до растворения агара, разливается по сосудам и автоклавируются при давлении 0,9 атм. при температуре 119-121°С, после чего осуществляется высаживание экспоната.
2
2
Наиболее близким аналогом заявляемой питательной среды, выбранным в качестве прототипа, является питательная среда для размножения различных ягодных и плодовых культур, описанная в протоколе Кворина-Лепуавра [Quoirin М., Lepoivre P.// Acta Horticulture. 1977. V. 78. Р. 437-442]. Данная среда содержит макро- и микро-элементы, а именно: аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, кальций азотнокислый, калий фосфорнокислый, железо(П) сернокислое и (NaЭДТА), позиционируемые, как уже было замечено выше, как железный комплекс ЭДТА, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, борную кислоту, воду. К данной минеральной составляющей питательной среды добавляются общепринятые органические препараты, активирующие микроразмножение, включающие миоинозит, тиамин гидрохлорид, пиродоксин гидрохлорид, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, 6-бензиламинопурин, сахарозу, агар-агар. Составы, описанные в протоколе Кворина-Лепуавра, были дополнительно проверены на эффективность выращивания крыжовника сорта «Розовый-2». При использовании составов, содержащих этилендиаминтетраацетат натрия NaЭДТА и железо сернокислое, а также другие указанные выше компоненты в качестве питательной среды для размножения крыжовника сорта «Розовый-2», были получены показатели, характеризующие эффективность этого состава при его использовании, а именно выявлено, что коэффициент размножения составляет 1,1, среднее число побегов (штук)-1,1, средняя длина побегов (см)-1,2.
Как показали дополнительные исследования питательной среды-прототипа, в процессе микроразмножения на этой среде в большинстве случаев не удается достичь высоких коэффициентов размножения и длины образуемых побегов крыжовника сорта «Розовый-2», поскольку у растений часто наблюдается железный хлороз и некроз тканей. При развитии микрорастений в стерильных условиях при использовании указанной выше питательной среды наблюдается снижение общего коэффициента размножения и производительности процесса, причиной чего, по всей вероятности, является отсутствие в питательной среде уже готового, хорошо усваиваемого комплекса железа (Ш).
Для повышения эффективности питательной среды, применяемой для выращивания крыжовника сорта «Розовый-2», а именно увеличения коэффициента его размножения и длины побегов, предлагается новый состав питательной среды для размножения на стадии пролиферации крыжовника сорта «Розовый-2», содержащий следующие компоненты (мг/л): аммоний азотнокислый 200-360, калий азотнокислый 750-1550, кальций азотнокислый 650-800, магний сернокислый 120-250, калий фосфорнокислый 300-370, борная кислота 6,0-6,4, цинк сернокислый 8,0-9,2, калий йодистый 0,075-0,085, натрий молибденовокислый 0,2-0,3, медь сернокислая 0,02-0,03: кобальт хлористый 0,02-0,03, железный(П) комплекс гидроксиэтилидендифосфоновой кислоты 15,2-60,8, миоинозит 100, тиамин гидрохлорид 0,5, пиродоксин гидрохлорид 0,5, никотинамид 0,5; глицин 1000, 6-бензиламинопурин 0,3, сахароза 30000, агар 6000, остальное вода до 1 л.
Сопоставительный анализ предлагаемого состава с составом-прототипом показывает, что заявляемая питательная среда, как и известная, выбранная в качестве прототипа, содержит макро- и микро-элементы, регуляторы роста и другие органические добавки, однако она отличается от известной тем, что в качестве комплекса железа(П) в ней используется комплекс гидроксиэтилидендифосфоновой кислоты- Fe(П)HEDP, в отличие от прототипа, где используется железо(П) сернокислое и этилендиаминтетраацетат натрия, позиционируемый как железный комплекс EDTA.
Дополнительные исследования питательных растворов, в которых вместо предлагаемого комплекса железа(П) с гидроксиэтилидендифосфоновой кислотой - Fe(П)HEDP содержатся комплексы железа(Ш) с аминоуксусными кислотами, такими как этилендиаминтетрауксусная кислота(ЕDТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), этилендиаминди(2-гидроксифенил)уксусная кислота (EDHHA)], показали, что в интервале предлагаемых концентраций компонентов в составах высокая эффективность получаемой питательной среды не достигается. Кроме того, известно, что комплексы железа(П) с карбоксилсодержащими комплексонами не образуются, поскольку в процессе комплексообразования при взаимодействии солей железа(П) с EDTA, DTPA, EDDH железо(П) окисляется в железо(Ш).
Процесс микроклонирования крыжовника сорта «Розовый-2» на стадии его пролиферации с использованием предлагаемой питательной среды проводится по следующей схеме: в питательную среду вносятся компоненты в подобранных оптимальных концентрациях (табл.1, среда 2-4), добавляется вода, и объем раствора доводится до 1 л, затем устанавливается рН 5,5-5,7 и проводится нагревание до полного растворения агара. После этого питательная среда разливается по культуральным сосудам и автоклавируется при давлении 0,1 мПа (при температуре 119-121°С) в течение 20-25 мин. После этого в каждый сосуд высаживается по 5 микрочеренков длиной 2-3 узла. Культуры инкубируются в световой комнате при интенсивности освещения 2500 люкс, 16-ти часовом фотопериоде и температуре 20-22°С.
Ниже предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами и таблицами: Таблица 1 «Концентрация компонентов питательных сред», Таблица 2 «Влияние состава питательной среды на микроразмножение крыжовника сорта Розовый-2 на стадии пролиферации».
Пример 1. В питательную среду вносят компоненты в указанных концентрациях (табл. 1, среда 2). Объем раствора доводят до 1 л, устанавливают рН 5,5-5,7 и при нагревании добиваются растворения агара. Питательную среду разливают по культуральным сосудам и автоклавируют при давлении 0,1 мПа (при температуре 119-121 С) в течение 20 мин. После этого в каждый сосуд высаживают по 5 микрочеренков длиной 2-3 узла. Культуры инкубируют в световой комнате при интенсивности освещения 2500 люкс, 16-ти часовом фотопериоде и температуре 20-22°С. Морфометрические показатели микропобегов рассматривали на 60-тый день субкультивирования.
Использование разработанной питательной среды обеспечивает увеличение коэффициента размножения крыжовника сорта «Розовый-2» в 1,82 раза по сравнению со средой Кворина-Лепуавра, что на стадии пролиферации в первую очередь определяет эффективность питательной среды (табл. 2).
Пример 2. Осуществляют аналогично примеру 1. Концентрации компонентов указаны в табл. 1. (Среда 3). Результаты размножения на предлагаемой среде представлены в табл. 2. Предложенная среда обеспечивает увеличение коэффициента размножения в 1,36 раза и средней величины побегов в 1,18 раз по сравнению со средой Кворина-Лепуавра.
Пример 3. Осуществляют аналогично примеру 1. Концентрация компонентов указана в табл. 1 (Среда 4). Результаты размножения на разных средах представлены в табл. 2. На разработанной среде по сравнению со средой Кворина-Лепуавра наблюдается увеличение коэффициента размножения в среднем в 1,64 раза и средней длины побегов в 1,18 раз.
Как показали исследования, при более высоких концентрациях питательных веществ (среда 5) и более низких (среда 1) по сравнению с предложенным диапазоном концентраций рост эксплантов ухудшается и, следовательно, подобные питательные растворы менее эффективны (табл. 2).
Таким образом, применение предлагаемой питательной среды позволяет получить новый эффект: увеличить коэффициент размножения и длину побегов по сравнению с известной средой, обеспечивая увеличение коэффициента размножения крыжовника сорта Розовый-2 в 1,36-1,82 раза, что на стадии пролиферации является основным показателем эффективности действия предлагаемой питательной среды.