СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННОГО ПРЕПАРАТА БРОМЕЛАЙНА, КОВАЛЕНТНО СВЯЗАННОГО С МАТРИЦЕЙ ХИТОЗАНА
METHOD FOR PRODUCING A HETEROGENEOUS BROMELINE PREPARATION WHICH IS COVALENTLY BOUND TO A CHITOSAN MATRIX

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в промышленности и исследовательских целях: при создании средств для удаления ржавчины с металлов, для смягчения кожаных изделий, для очищения сточных вод.
Бромелайн (КФ 3.4.22.32) - протеолитический растительный фермент, получаемый из ананаса. В 1957 г. ученые доказали, что у всех растений семейства бромелиевых (Bromeliacea) активные протеазы содержатся не только в плодах, но и в других частях растений. Для всех этих ферментов было предложено одно общее название - бромелайн. Наибольшее количество энзима содержится в нижней части сердцевины стебля зрелого растения. Молодые ткани включают незначительные количества фермента или полностью лишены протеолитической активности [Мосолов В.В. Протеолитические ферменты / В.В. Мосолов - М.: Наука, 1971. - 404 с].
Бромелайн относится к группе сульфгидрильных протеаз. Его активность повышается в присутствии цистеина, меркаптоэтанола, цианида и угнетается веществами, специфически реагирующими с SH-группамй, такими как n-хлормеркурийбензоат и фенилмеркурийацетат. Активность фермента, обработанного ртутью, может быть полностью восстановлена при добавлении избытка цистеина. Очищенный бромелайн из стеблей ананаса гидролизует некоторые низкомолекулярные синтетические субстраты. Из всех исследованных соединений быстрее других расщепляются производные аргинина.
Широко известно применение бромелайна в медицине, однако, кроме того, бромелайн можно использовать в кожевенной промышленности для смягчения кожаных изделий, при очищении сточных вод, при удалении ржавчины с металлов [Биотехнология растений: культура клеток / под ред. Р.Г. Бутенко. - М.: Агропромиздат, 1989. - 279 с, S.J. Taussiga S. Batkin Bromelain, the enzyme complex of pineapple (Ananas comosus) and its clinical application. An update // Journal of Ethnopharmacology. - 1988. - V. 22 - P. 191-203].
Известно, что в результате иммобилизации ферменты приобретают преимущества гетерогенных катализаторов - их можно удалять из реакционной смеси простой фильтрацией, появляется возможность перевода многих периодических ферментативных процессов на непрерывный режим, используя колонки или проточные аппараты с иммобилизованными ферментами. Иммобилизованные ферменты оказались в целом значительно более устойчивыми к внешним воздействиям, чем нативные (растворимые) ферменты. Они более долговечны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов [Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production: a review / Y. Kourkoutas [et al.] // Food Microbiol. - 2004. - V. 21, no. 4. - P. 377-39; Biocatalysts based on immobilized cells of microorganisms in the production of bioethanol and biobutanol / E.N. Efremenko [et al.] // Catalysis in Industry. - 2011. - Vol. 3, no. 1. - P. 41-46].
Хитозан представляет собой аминополисахарид, состоящий из полимеров глюкозамина и N-ацетилглюкозамйна. Хитозан растворим в кислоте и химически более универсален, чем хитин или целлюлоза. Хитозан, имеющий свободные аминогруппы, может использоваться для ковалентной иммобилизации ферментов с помощью таких бифункциональных реагентов, как диальдегиды, диизоцианаты. Хитозаны обладают следующими важными для практического применения свойствами: биосовместимость, пленкообразование, биоадгезивность, полифункциональность, гидрофильность, большинство из которых связаны с их катионной природой, уникальной среди полисахаридов и природных полимеров [G. Crini, P. Badot Application of chitosan, a natural aminopolysaccharide, for dye removal from aqueous solutions by adsorption processes using batch studies: A review of recent literature // Progress in Polymer Science. - 2008. - V. 33 - P. 399-447].
При ковалентной иммобилизации очень часто используют сшивающие агенты. В нашем случае в роли сшивающего агента выступал глутаровый альдегид, который содержит по одной альдегидной группе на обоих концах цепи. Эти группы при нейтральных значениях рН реагируют со свободными аминогруппами. Таким образом, один конец молекулы глутарового альдегида может быть присоединен к носителю, а другой - к ферменту. Гелеобразующее действие альдегидов было отмечено еще в начале XX в. С помощью глутарового альдегида трудно осадить из раствора белковую составляющую, в лучшем случае раствор превращается в гель. Для того, чтобы получить нерастворимую матрицу, состоящую из фермента и глутарового альдегида, необходимо либо заполимеризовать глутаровый альдегид, либо осадить фермент или адсорбировать его на поверхности какого-либо нерастворимого носителя. При первом подходе увеличивается длина связывающей молекулы, во втором случае уменьшается расстояние между молекулами фермента. Кроме того, глутаровый альдегид быстро реагирует с белками в более «мягких» условиях и наименее токсичен среди известных в настоящее время бифункциональных реагентов [Патент RU 2016901, МПК C12N 11/02, C12N 9/08, опубл. 30.07.1994].
В качестве прототипа служил способ получения гетерогенного препарата различной дисперсности на основе бромелайна и хитозана, изложенный авторами настоящего изобретения в заявке №2017123458 на патент РФ. Способ включает иммобилизацию бромелайна на матрицу кислоторастворимого хитозана среднемолекулярного (200 кДа) или высокомолекулярного (350 кДа) в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г указанной матрицы; при этом в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 50 мМ трис-глициновый буфер с рН 8.5-9.0 для среднемолекулярного и с рН 8.5 для высокомолекулярного хитозана; инкубирование при комнатной температуре в течение 4 часов для среднемолекулярного и 5 часов для высокомолекулярного хитозана; промывание образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером с рН 7.5 до отсутствия в промывных водах белка.
Недостатком прототипа является получение препарата, в котором бромелайн удерживается в матрице носителя относительно слабыми нековалентными связями и взаимодействиями, что не позволяет проводить ферментативные процессы в реакторах непрерывного действия.
Технический результат заявленного изобретения заключается в увеличении скорости ферментативной реакции и повышении эффективности использования препарата на основе бромелайна и хитозана, в том числе в реакторах непрерывного действия.
В своей работе мы оптимизировали условия для иммобилизации бромелайна путем ковалентного связывания с матрицей хитозана с использованием глутарового альдегида в качестве сшивающего агента. После ковалентной иммобилизации фермент прочно связан с носителем, более стабилен при варьировании значений рН среды и температуры, не вымывается из реактора.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного Препарата бромелайна путем ковалентного связывания с матрицей хитозана с применением глутарового альдегида в качестве сшивающего агента, включающем иммобилизацию ферментного Препарата в буферном растворе, инкубирование и промывание, согласно изобретению, иммобилизацию бромелайна проводят на матрицу среднемолекулярного хитозана (200 кДа) или высокомолекулярного хитозана (350 кДа): к 900 мг носителя добавляют 18 мл раствора фермента в 0.05 М трис-глициновом буфере с рН 9.0 для среднемолекулярного или рН 8.5 для высокомолекулярного хитозана (в концентрации 1 мг/мл) и 10 мл глутарового альдегида с 15% концентрацией для среднемолекулярного или 10% концентрацией для высокомолекулярного хитозана; инкубируют с периодическим перемешиванием в течение 1 часа; суспензию центрифугируют при 1500 g в течение 10 мин, образовавшийся осадок промывают 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7.5) до отсутствия в промывных водах белка.
В качестве метода иммобилизации вместо адсорбции применяется ковалентное связывание, которое обеспечивает прочную и необратимую «сшивку» молекул бромелайна с матрицей носителя с помощью глутарового альдегида, а, следовательно, возможность применения гетерогенного ферментного препарата в проточных реакторах непрерывного действия. Время инкубации фермента с носителем сокращено на 4 часа.
На фиг. 1. приведена диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах иммобилизованного бромелайна; на фиг. 2. - диаграмма значений общей активности (в ед на 1 мл раствора) препаратов иммобилизованного бромелайна; на фиг. 3 - диаграмма значений удельной активности (в ед на 1 мг белка в пробе) препаратов иммобилизованного бромелайна, где 1 - бромелайн, иммобилизованный ковалентым методом на среднемолекулярном хитозане с использованием глутарового альдегида; 2 - бромелайн, иммобилизованный ковалентным методом на высокомолекулярном хитозане с использованием глутарового альдегида.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования был выбран бромелайн фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве носителей для иммобилизации применяли два вида хитозана (ЗАО «Биопрогресс»): хитозан кислоторастворимый среднемолекулярный (Mr=200 кДа), хитозан кислоторастворимый высокомолекулярный (Mr=350 кДа).
К 900 мг хитозана добавляли 18 мл раствора бромелайна в концентрации 1 мг/мл и 10 мл глутарового альдегида (1, 2.5, 5, 10, 15, 20 и 25%), инкубировали с периодическим перемешиванием в течение 1 часа. Суспензию центрифугировали при 1500 g в течение 10 мин. После окончания инкубирования образовавшийся осадок промывали 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7.5) до отсутствия в промывных водах белка (контроль осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Содержание белка в иммобилизованных препаратах бромелайна определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275]. Определение протеолитической активности фермента проводили на субстрате азоказеине (Fluka). К 50 мг образца добавляли 200 мкл трис-HCl буфера (рН 7.5), 800 мкл азоказеина (0.5% в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7.5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл ТХУ (5%), инкубировали 10 минут при -4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл трис-HCl буфера. За единицу каталитической активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную протеолитическую активность бромелайна рассчитывали по формуле:
ПА=D*1000/120/200/Ср,
где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность пробы при 410 нм,
Ср - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы в мкл,
1000 - пересчет в мкМ.
Статистическую обработку полученных результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
В нашем эксперименте для получения гетерогенных биокатализаторов на основе бромелайна, иммобилизованного на матрицах среднемолекулярного и высокомолекулярного хитозанов, в качестве сшивающего агента мы использовали глутаровый альдегид с концентрациями 1, 2.5, 5, 10, 15, 20 и 25%. Результаты отражены на фиг. 1-3.
Наибольшее количество белка в гетерогенных препаратах (в мг на г носителя) наблюдалось при иммобилизации бромелайна с помощью ковалентного связывания с матрицей среднемолекулярного (СМ) хитозана при использовании глутарового альдегида с 25% концентрацией. При разработке биокатализатора на основе высокомолекулярного (ВМ) хитозана наибольшее содержание белка в образцах регистрировалось при использовании глутарового альдегида с 5, 10 и 25% концентрацией (фиг. 1).
Высокие значения общей активности (в ед на мл раствора) бромелайна наблюдались при его иммобилизации на матрице среднемолекулярного (СМ) хитозана с помощью ковалентного связывания с применением 1, 5, 10 и 15% глутарового альдегида. При создании гетерогенных препаратов на основе высокомолекулярного (ВМ) хитозана наибольшая активность проявлялась при использовании глутарового альдегида с 5, 10, 15 и 20% концентрацией (фиг. 2).
Наибольшую удельную активность показали препараты бромелайна, иммобилизованного с помощью ковалентного связывания на матрице среднемолекулярного (СМ) хитозана при использовании 1, 10 и 15% глутарового альдегида. При разработке биокатализаторов на основе высокомолекулярного (ВМ) хитозана наибольшая удельная активность наблюдалась при использовании глутарового альдегида с 5, 10, 15 и 20% концентрацией (фиг. 3).
Метод ковалентной иммобилизации бромелайна имеет свои преимущества: фермент защищен от неблагоприятных условий среды, прочно и необратимо связан с носителем, препарату можно придавать различные конфигурации, молекула энзима стабильна, также возможно создать катализатор с контролируемыми свойствами. Мы сравнили полученные результаты по определению каталитической активности и содержания белка для препаратов иммобилизованного бромелайна.
Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (в ед на мг белка) выявлено при ковалентной иммобилизации бромелайна на матрице среднемолекулярного хитозана с 15% глутаровым альдегидом и высокомолекулярного хитозана с 10% глутаровым альдегидом.
Из вышеизложенного материала следует, что среди апробированных нами вариантов иммобилизации для создания гетерогенных препаратов на основе бромелайна наиболее перспективным является ковалентное связывание с матрицей среднемолекулярного хитозана (200 кДа) с 15% глутаровым альдегидом в качестве сшивающего агента или высокомолекулярного хитозана (350 к Да) с 10% глутаровым альдегидом в качестве сшивающего агента при использовании 0.05 М трис-глицйнового буфера с рН 9.0 и 8.5 соответственно.
Таким образом, была разработана методика получения гетерогенного биокатализатора на основе бромелайна, ковалентно иммобилизованного на матрице среднемолекулярного (200 кДа) и высокомолекулярного (350 кДа) хитозанов с использованием глутарового альдегида в качестве сшивающего агента.