Композиция на основе аминокислот для восстановления фиброэластина в дермальных соединительных тканях
AMINO ACID-BASED COMPOSITION FOR RECOVERING FIBROELASTINE IN DERMAL CONNECTIVE TISSUES

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим в качестве активного ингредиента смесь аминокислот, способную стимулировать биосинтез эластина и коллагена.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Дерма является средним слоем кожи, выполняющим поддерживающие и трофические функции и обеспечивающим прочность, эластичность, тургор и метаболическую жизнеспособность кожи в целом. Дерма содержит клетки, называемые фибробластами, то есть специализированные клетки мезенхимального происхождения, которые постоянно восстанавливают интерстициальный матрикс, состоящий главным образом из гликозаминогликанов (GAG) и протеогликанов (PG), гидрофильных веществ гликозидной и гликопептидной природы, соответственно. Указанные макромолекулы удерживают большие количества воды, образуя гидрофильную сеть в форме геля, в который погружены все фибриллярные белки, придающие коже прочность и тонус.
Фибробласты также обеспечивают синтез эластина, белка, обладающего эластическими свойствами, придающего коже и слизистым оболочкам важнейшее свойство адаптации к морфологическим и механическим изменениям, которым они подвержены.
Эластин способен растягиваться в 7 раз и возвращаться к своим исходным размерам без существенных молекулярных изменений и теоретически способен повторять это растяжение неограниченное число раз.
Состояния, известные как старение кожи и фотостарение, представляют собой объективные дерматологические проявления очень сложных биохимических явлений, затрагивающих клетки, поверхностной ткани и прежде всего структуры глубоких тканей.
Фотостарение приводит к появлению на поверхности кожи морщин, варьирующих по числу и глубине, особенно в местах, подверженных воздействию света (лицо, шея и туловище), эластозу и более или менее распространенным пигментным пятнам, утолщению эпидермиса и веснушкам. Эластический компонент кожи, представленный сетью волокон эластина, расположенной в дистальной части дермы (сетчатом слое дермы), претерпевает существенные изменения в результате явлений фотостарения, описанных выше, что приводит к значительному снижению общей эластичности кожи. На макроскопическом уровне указанные явления снижают способность соединительной ткани кожи адаптироваться к механическому растяжению, что приводит к обвисанию и эластозу тканей.
Ген, кодирующий белок тропоэластин (ELN-ген), являющийся предшественником эластина, уникален; не существует нескольких генов (суперсемейства), которые кодировали бы различные формы эластина, как в случае с коллагеном [1]. Указанный ген кодирует различные формы тропоэластина (поэтому, вероятно, существуют разные процессы кодирования тропоэластина в здоровых и вновь сформированных тканях, например, в ответ на физические повреждения, такие как ожоги, или фотостарение); его экспрессия начинается уже во внутриутробном периоде и сохраняется на протяжении первых 5 лет жизни, после чего резко снижается вплоть до прекращения активности [1, 2]. Иными словами, синтез эластического компонента соединительной ткани и в частности дермы, слизистых оболочек, хрящевой ткани, интимы, соединительной ткани легких и клапанов/миокарда, прекращается уже в первые годы жизни. Указанный компонент постоянно обеспечивает в организме «резерв эластичности» и никогда не восполняется в течение жизни, за исключением случаев серьезного повреждения тканей, такого как ожоги и выраженное фотостарение. В этих случаях происходит сверхэкспрессия генов LOX (лизиноксидазы), кодирующих 5 различных ферментов, катализирующих окисление лизиновых остатков молекул-предшественников тропоэластина, что является необходимой стадией синтеза функционального эластина и его последующего включения в микрофибриллы, прикрепляющиеся к поверхности клеток [3, 4]. В частности, указанный фермент-зависимый процесс состоит из окисления лизина и одновременного образования основания Шиффа между аминогруппой L-LYS и альдозой с образованием поперечной межмолекулярной связи [5, 6]. Эластин является единственным белком соединительной ткани, который практически не замещается и остается неизменным на протяжении более чем 70 лет (средний период полураспада 74 года).
Что касается коллагена, коллаген IV типа играет ключевую роль в процессе структурирования базальной дермоэпидермальной мембраны и надмолекулярной организации внеклеточного матрикса (ЕСМ), особенно в отношении ориентации клеток в матриксе. Недостаток коллагена IV тесно коррелирует с утратой трофических и эластических свойств человеческой кожи, особенно при явлениях дистрофии кожи, типичных для старения кожи и фотостарения [7, 8].
Известно, что определенные комбинации аминокислот и олигопептидов, при их местном или пероральном применении в сочетании с подходящими носителями, стимулируют экспрессию генов, что приводит к синтезу новых белков в дермоэпидермальной соединительной ткани, слизистых оболочках и суставных хрящах, в частности к синтезу коллагена и тропоэластина [9, 10, 11, 12].
Одним из основных явлений, вовлеченных в прогрессирующее снижение эластической функции дермоэпидермальных тканей при старении кожи и фотостарении, является прогрессирующая потеря биосинтетической активности фибробластов, клеток, обеспечивающих восстановление белков коллагена и эластина и внеклеточного матрикса (ЕСМ) кожи. В результате этого явления, в случае недостаточного или сниженного синтеза новых структурных белков кожи и гидрофильного внеклеточного матрикса, усиливается их распад под действием специфических катаболических ферментов, называемых эластазами, металлопротеиназами, коллагеназами и желатиназами [13, 14, 15]. Указанные ферменты, сверхэкспрессируемые и синтезируемые в митохондриях стареющих фибробластов и макрофагов, смещают баланс «синтез-распад» в сторону распада, приводя к медленному, но прогрессирующему ухудшению состояния ткани, которая в результате становится менее плотной и менее эластичной с меньшим содержанием воды (недостаток GAG, PG и фиброэластинового компонента). Для ингибирования или по меньшей мере ограничения указанного явления, отчасти физиологического, но усугубляемого различными факторами окружающей среды и генетическими факторами, необходимо стимулировать экспрессию генов, индуцирующих синтез структурных белков (тропоэластина и коллагена) фибробластами во всех областях, где они присутствуют, и в то же самое время снижать экспрессию генов, кодирующих металлопротеиназы, особенно те, которые специализируются на расщеплении коллагена и эластина (коллагеназа и эластаза).
В свете повышенной катаболической активности, опосредованной сверхэкспрессией генов ферментов, разрушающих матрикс, в частности, коллагеназы и эластазы, местное или инъекционное введение веществ с доказанной активностью, ингибирующей экспрессию указанных ферментов, непосредственно в дермоэпидермальную ткань, слизистые оболочки или суставы имеет особое стратегическое значение. В частности, N-ацетилцистеин, N-ацетилированная форма серосодержащей аминокислоты L-цистеина, оказывает очевидное действие, ингибируя экспрессию металлоэластаз, индуцированную фотооблучением [16]. Его одновременное включение в полиаминокислотные композиции, стимулирующие образование эластина и коллагена, можно полезным образом применять для стимуляции восстановления и поддержания содержания эластина и коллагена в соединительной ткани.
Гиалуроновая кислота (НА) является основным GAG, присутствующим в аморфном интерстициальном матриксе соединительной ткани.
GAG (гликозаминогликаны) представляют собой полисахаридные молекулы, состоящие из повторяющихся моно- или дисахаридных единиц; гиалуроновая кислота представляет собой полиглюкомер, состоящий из N-ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты. НА является единственным GAG, молекула которого не содержит сульфатных групп, и единственным с неразветвленной линейной структурой. Другими GAG, присутствующими в аморфном матриксе соединительной ткани и компонентах других соединительнотканных структур, таких как сухожилия и хрящи, являются хондроитинсульфат, кератансульфат, гепарансульфат, дерматансульфат и гепарин. НА выполняет ключевые функции по насыщению ЕСМ водой, стимуляции подвижности клеток, обмену питательными веществами и белковыми факторами и модуляции биохимических процессов восстановления и организации матрикса волокнистой соединительной ткани.
Смеси аминокислот для инъекционного, местного или перорального применения раскрыты в ЕР 2033689, WO 2007/048522 и WO 2011/064297. Тем не менее, ни одна из раскрытых композиций не содержит смесь глицина, L-пролина, L-аланина, L-валина, L-лейцина и гидрохлорида L-лизина в подходящих соотношениях, способную стимулировать синтез как коллагена, так и эластина.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к композициям, содержащим смесь аминокислот, селективно стимулирующую экспрессию генов, кодирующих тропоэластин (ELN), лизиноксидазу (LOXL-1) и коллаген IV типа (COL4A1), и ингибирующую экспрессию генов, кодирующих металлоэластазы.
Смесь аминокислот по изобретению состоит из глицина, L-пролина, L-аланина, L-валина, L-лейцина и гидрохлорида L-лизина в следующих массовых соотношениях:
- глицин:
1;
- L-пролин:
0,7-0,8;
- L-аланин:
0,47-0,76;
- L-валин:
0,35-0,56;
- L-лейцин:
0,13-0,27;
- гидрохлорид L-лизина:
0,10-0,12.
Также возможно присутствие L-цистеина или N-ацетил-L-цистеина в количестве от 1 до 20% по массе от всей смеси аминокислот. Предпочтительны следующие массовые соотношения:
- глицин:
1;
- L-пролин:
0,75;
- L-аланин:
0,48-0,51;
- L-валин:
0,35-0,37;
- L-лейцин:
0,13-0,15;
- гидрохлорид L-лизина:
0,10-0,11;
или:
- глицин:
1;
- L-пролин:
0,75;
- L-аланин:
0,75-0,76;
- L-валин:
0,54-0,56;
- L-лейцин:
0,13-0,14;
- гидрохлорид L-лизина:
0,10-0,11;
или:
- глицин:
1;
- L-пролин:
0,75;
- L-аланин:
0,75-0,76;
- L-валин:
0,54-0,56;
- L-лейцин:
0,13-0,14;
- гидрохлорид L-лизина:
0,10-0,11;
или:
- глицин:
1;
- L-пролин:
0,75;
- L-аланин:
0,49-0,51;
- L-валин:
0,35-0,36;
- L-лейцин:
0,26-0,27;
- гидрохлорид L-лизина:
0,10-0,11.
Указанные композиции могут быть в форме, подходящей для перорального применения, такой как растворы, гранулы, диспергируемый порошок, таблетки или капсулы.
Композиции по изобретению могут дополнительно содержать гиалуроновую кислоту или ее соли, в частности гиалуронат натрия, со средней молекулярной массой от 500000 до 3000000 Да в количестве от 0,01 до 3% по массе от общей массы композиции. Указанные композиции, содержащие смесь аминокислот, описанную выше, и гиалуроновую кислоту, являются подходящими для местного или инъекционного применения. Примеры используемых композиций включают гели, мази, эмульсии, трансдермальные пластыри, стерильные растворы и стерильные порошки аминокислот, разработанные для восстановления в стерильных водных растворах гиалуронатов.
В случае композиций для перорального применения стандартные дозы глицина составляют от 100 до 1500 мг.
В случае композиций для инъекционного применения стандартные дозы глицина составляют от 10 до 50 мг, и стандартные дозы гиалуроновой кислоты или ее натриевой соли составляют от 10 до 100 мг.
В случае композиций для местного применения концентрация глицина может составлять от 0,1 до 2% мг/мл.
Композиции по изобретению полезны в лечении эластоза и дермоэпидермальной атрофии в результате фотостарения, кожных расстройств дермоатрофической и ятрогенной этиологии [17], ожогов (включая лучевые ожоги), поражений кожи, пролежней, аплазии кожи, вызванной применением лекарственных средств (антиретровирусных лекарственных средств, лекарственных средств против ВИЧ, кортикостероидов или химиотерапии), поражений сухожилий и суставов.
С применением транскриптомики и протеомики in vitro было обнаружено, что смесь аминокислот индуцирует повышение экспрессии генов, кодирующих тропоэластин (ELN) и коллаген IV типа (COLIV), через 120 часов инкубации человеческих фибробластов. Неожиданным образом, указанный эффект отсутствует при исключении даже одной из аминокислот или изменении массовых соотношений.
Доставка аминокислот в форме водного раствора в геле с гиалуроновой кислотой в форме натриевой соли восстанавливает пластичность дермального матрикса и гарантирует удержание аминокислот в дермоэпидермальной области на протяжении достаточно длительного времени для оказания желаемого биологического эффекта.
Композиции для инъекций могут быть получены растворением аминокислот в форме стерильного порошка в стерильном растворе натриевой соли гиалуроновой кислоты введением геля с гиалуроновой кислотой (натриевой солью) непосредственно (например, шприцем для кожной имплантации) во флакон, содержащий порошок. После полного растворения полученный гелевый раствор вводят инъекцией в дермоэпидермальную область.
Стерильный водный раствор натриевой соли гиалуроновой кислоты может содержать буферные агенты для коррекции рН (например, фосфатный буфер) или агенты для коррекции осмолярности (например, хлорид натрия), а также другие технологические адъюванты, позволяющие обеспечить необходимые физико-химические свойства и тканевую совместимость стерильных фармацевтических форм для инъекций. Изобретение подробно проиллюстрировано в следующих примерах.
ПРИМЕР 1
СТЕРИЛЬНЫЙ РАСТВОР ГИАЛУРОНАТА НАТРИЯ
СТЕРИЛЬНЫЙ ПОРОШОК АМИНОКИСЛОТ
ПРИМЕР 2
СТЕРИЛЬНЫЙ РАСТВОР ГИАЛУРОНАТА НАТРИЯ
СТЕРИЛЬНЫЙ ПОРОШОК АМИНОКИСЛОТ
ПРИМЕР 3
СТЕРИЛЬНЫЙ РАСТВОР ГИАЛУРОНАТА НАТРИЯ
СТЕРИЛЬНЫЙ ПОРОШОК АМИНОКИСЛОТ
ПРИМЕР 4
ГИДРОГЕЛЬ ДЛЯ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ НА ОСНОВЕ АМИНОКИСЛОТ И ГИАЛУРОНАТА НАТРИЯ
ПРИМЕР 5
САШЕ (ПАКЕТИКИ) ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАСТВОРА ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
Эксципиенты: консерванты бензоат натрия, сорбат калия; регуляторы кислотности лимонная кислота, цитрат натрия.
Анализ эффективности
Эффективность смесей аминокислот по изобретению оценивали путем сравнения с контрольными смесями и смесями с гиалуроновой кислотой по стимуляции образования структурных компонентов внеклеточного матрикса, в частности неосинтеза эластина, и повышения эффективности построения эластических волокон (эластогенез) при одновременной стимуляции образования коллагена.
Использовали первичную культуру стандартизированных человеческих фибробластов. Дизайн исследования предполагал оценку экспрессии генов эластина и коллагена. Экспрессию генов оценивали посредством RT-qPCR в следующие моменты времени: 24, 72 и 120 ч. Образование указанных матриксных белков оценивали методом вестерн-блоттинга в момент времени 120 ч.
Проводили первичную оценку цитотоксичности смесей аминокислот и гиалуроновой кислоты для подтверждения того, что максимальная анализируемая концентрация не была цитотоксичной. На основании полученных данных была выбрана концентрация 1000 мкг/мл.
Результаты транскрипционного исследования
Это исследование включало отрицательный контроль (NC), соответствующий необработанным фибробластам (физиологический ответ). Смесь А, состоящая только из аминокислот, входящих в состав коллагена (Gly, L-Pro, L-Lys, L-Leu), не индуцировала существенной экспрессии генов. В отличие от этого, две смеси, содержащие шесть анализируемых аминокислот, С и D, состоящие из аминокислот, наиболее представленных как в коллагене, так и в эластине (Gly, L-Pro, L-Lys, L-Leu, L-Ala и L-Val), индуцировала существенную модуляцию генов ELN (эластин) и COLIV (коллаген IV) через 120 ч.
Состав анализируемых смесей показан в таблице ниже.
Количественный анализ экспрессии генов эластина (ELN) и коллагена IV (COLIV) в сравнении с контролем
На Фиг. 1 показаны результаты посттрансляционного исследования.
Как показано на диаграмме, смесь А повышает только синтез коллагена, в то время как смеси С и D существенно модулируют синтез как эластина, так и коллагена IV.
Относительный количественный анализ белков коллагена IV и эластина с использованием NC в качестве эталона
Обсуждение
На диаграмме на Фиг. 2 показаны результаты исследований проведенных на монослое человеческих фибробластов с применением транскриптомных методов, демонстрирующие, что лишь определенные смеси аминокислот, возможно в комбинации с гиалуроновой кислотой, могут модулировать биосинтез белков внеклеточного матрикса и, в частности, стимулировать эластогенез. Только смеси аминокислот в соотношениях, раскрытых в данной заявке, повышают экспрессию эластина на генном и белковом уровне, а также стимулируют образование коллагена (в частности коллагена IV).
Следует отметить, что целостность и качество матрикса обусловлены не только коллагеном, но образованием и физиологическим взаимодействием всех структурных белков, образуемых фибробластами, в частности эластина.
В действительности, коллаген и эластин поддерживают анизотропию матрикса, то есть способность образуемых волокон распределять силы растяжения, которая утрачивается с возрастом.
Также было продемонстрировано, что рассматриваемые смеси аминокислот приводят к физиологической индукции гена эластина с кинетикой, сильно отличающейся от ответа на UV-облучение, когда синтез эластина происходит быстро, беспорядочно и вследствие индукции эластазы фактически приводит к его распаду.
Выводы
Результаты данного исследования демонстрируют, что только смеси по изобретению значимо стимулируют образование двух рассматриваемых белков. Таким образом, продемонстрировано не только существование механизма индукции, но также то, что образуемая мРНК кодирует функциональный белок.
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Bashir, MM et al. (1989), J Biol Chem 264, 8887-8891.
2. Chen, Z et al., (2009), Exp Dermatol 18, 378-386.
3. Indik Z et al., (1989), Am J Med Genet 34, 81-90.
4. Cenizo V et al., (2006), Exp Dermatol 15, 574-581.
5. Maki et al., (2005), Am J Pathol 167, 927-936.
6. Noblesse et al., (2004), J Invest Dermatol 122, 621-630.
7. Abreu-Velez AM et al., N Am J Med Sci. 2012 Jan; 4(1): 1-8.
8.  F et al., Maturitas. 1996 Nov; 25(3): 209-15.
9. Lupo MP et al., (2007). Cosmeceutical peptides. Dermatol Ther 20, 343-349.
10. Reddy В et al., Bioactive oligopeptides in dermatology: Part I. Exp Dermatol. 2012 Aug; 21(8): 563-8. doi: 10.1111/j.1600-0625.2012.01528.x. Epub 2012 Jun 4.
11. Proksch E et al., Skin Pharmacol Physiol. 2014; 27(3):113-9.
12. Dioguardi FS, (2008) Nov-Cec; 26(6): 636-40.
13. Fisher GJ et al., J Invest Dermatol. 2001 Aug; 117(2): 219-26.
14. Rijken F et al., J Investig Dermatol Symp Proc. 2009 Aug; 14(1):67-72. doi: 10.1038/jidsymp.2009.15.
15. Quan T et al., J Investig Dermatol Symp Proc. 2009 Aug; 14(1):20-4. doi: 10.1038/jidsymp.2009.8.
16. Chung JH et al., J Invest Dermatol. 2002 Aug; 119(2): 507-12.
17. Schoepe S et al., Exp Dermatol. 2006 Jun; 15(6): 406-20.