СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ЛОКАЛЬНОГО ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ ФОНОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ШЕЙКИ МАТКИ
METHOD OF ESTIMATING ACTIVITY OF LOCAL INFLAMMATION IN BACKGROUND DISEASES OF UTERINE NECK

Изобретение относится к области медицины - к практической и экспериментальной - и может быть использовано в гинекологии, в клинической лабораторной диагностике для изучения активности локального воспаления слизистой оболочки шейки матки для выбора адекватного метода лечения.
Известно, что возрастание частоты предраковых и злокачественных новообразований шейки матки, особенно у молодых женщин, обусловлено сочетанием фоновой патологии с хроническим цервицитом [Этиология, патогенетические аспекты, оптимизация диагностики и терапии хронических цервицитов. / Э.А.Казачкова, Е.Л.Казачков, Б.И.Медведев. // Материалы VI Всероссийского форума «Мать и дитя». Москва, 2004. - С.367-368].
Частота цервицитов, обусловленных бактериальным инфицированием, составляет 40-50%. В последнее десятилетие для воспаления шейки матки характерно отсутствие четко выраженной клинической картины, склонность к длительному течению, рецидивированию, что приводит к формированию морфологических изменений как на поверхности шейки матки, так и в ее толще [Влияние инфекций на репродуктивную систему женщин. / В.И.Краснопольский, О.Ф.Серова, В.А.Туманова и др. // Российский вестник акушера-гинеколога. - 2004. - №5. - С.39-41]. Воспаление в ответ на хроническую инфекцию приводит к продукции неспецифических защитных противомикробных оксидантов, вызывающих окислительное повреждение ДНК клеток хозяина. [Микробиоценоз влагалища и патология шейки матки. Возможности коррекции дисбиотических состояний. / И.Б.Манухин, Г.Н.Минкина, B.C.Калинина // Поликлиническая гинекология. Клинические лекции. / Под ред. проф. В.Н.Прилепской. - 2-е изд., доп. - М.: МЕДпресс-информ, 2005. - С.37-46.] Параллельно с воспалением развивается вторичный местный иммунодефицит клеточных и гуморальных иммунных реакций [Роль воспаления в диагностике и лечении патологии шейки матки. / М.Н.Костава. // Гинеколог. - 2005. - №12. - С.27-30]. Эктопия шейки матки также относится к фоновой патологии и занимает одно из первых мест в структуре гинекологической заболеваемости [Рудакова Е.Б. Псевдоэрозия шейки матки. / Практическая гинекология. Клинические лекции. / Под ред. акад. РАМН В.И.Кулакова, проф. В.Н.Прилепской. - 3-е изд., доп. - М.: МЕДпресс-информ, 2006. - С.40-48].
Известны разные способы диагностики, оценки, исследования фоновых заболеваний шейки матки в виде запатентованных медицинских технологий: патент RU на изобретение №2134535 «Способ диагностики воспалительных заболеваний шейки матки» основан на воздействии знакопеременным током на клетки исследуемого органа в фоновой среде - молочной кислоте, разведенной в дистиллированной воде, при полном прекращении биокинетики спустя 20 минут диагностируют воспалительное заболевания шейки матки; патент RU на изобретение №2240040 «Способ диагностики воспалительных заболеваний шейки матки» основан на цветовом допплеровском картировании маточных и влагалищных артерий;
патент RU на изобретение №2240041 «Способ диагностики воспалительных заболеваний шейки матки» основан на дополнительной расширенной кольпоскопии при выявлении объемных включений в толще шейки при двухмерной сонографии и выявлении в них капсулы при трехмерной сонографии.
Однако по всем описанным выше способам по установлению воспалительного заболевания шейки матки нельзя судить о степени его активности и состоянии местного иммунитета шейки матки.
Недостатками всех названных способов является отсутствие информации о степени активности диагностируемого воспаления.
Известен также способ диагностики эктопии шейки матки у женщин репродуктивного возраста [патент RU на изобретение №2306569], основанный на исследовании фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, эстрадиола, прогестерона в сыворотке крови иммуноферментным методом.
Однако данным методом иммуноферментного анализа ИФА исследуют содержание гормонов в крови, данный способ позволяет диагностировать только неосложненную гормонзависимую эктопию.
Известен способ определения содержания цитокинов «суммарного интерферона, включающего ИНФα и ИНФγ, ИЛ1β, ИЛ8, ФНОα в вагинальных смывах» при генитальном кандидозе [Альтернативные подходы к терапии урогенитальных заболеваний с целью сохранения репродуктивного здоровья. / С.Б.Рыбалкин, А.К.Мирзабаева. // Методические рекомендации для врачей-клиницистов. - Спб., 2000 г - С.37].
Однако исследование цитокинов в вагинальных смывах не дает достоверной информации о состоянии локального иммунитета шейки матки, т.к. забор биоматериала производят достаточно далеко от патологического очага. Цитокины являются локальными медиаторами, поэтому целесообразно измерять их уровни в соответствующих тканях.
Известен также способ исследования содержания интерферона-γ - ИНФγ в слизи цервикального канала методом твердофазного ИФА у больных кандидозным цервицитом, забор осуществляли с помощью универсального зонда [Хронический рецидивирующий вульвовагинальный кандидоз: возможности терапии. / В.Н.Прилепская, А.С.Анкирская, Г.Р.Байрамова и др. // Журнал «Гинекология» Т.9, №3. - 2007. - http:// www.consilium medicum.].
Однако при данном исследовании цитокинов в цервикальном содержимом данные могут быть искажены при наличии воспалительных заболеваний верхнего отдела гениталий.
Наиболее близким по технической сущности к предложенному является метод диагностики патологических состояний шейки матки, описанный в публикации Грибовой С.Н. и Хрипуновой Г.И. [Грибова С.Н. и др. Современные представления об этиологии, патогенезе, методах диагностики и лечения фоновых и предраковых заболеваний шейки матки.// Саратовский научно-медицинский Журнал, №2(20) - 2008. - С.18-23].
Задачей заявляемого изобретения является повышение простоты осуществления способа при сохранении высокой точности результата.
Сущность заявляемого способа оценки активности локального воспаления при фоновых заболеваниях шейки матки характеризуется тем, что после клинического обследования и верификации диагноза больных производят с максимальной полнотой и атравматично сбор исследуемого продукта, подводя средство для снятия нативного материала к наружному зеву шейки матки непосредственно к поверхности зоны трансформации шейки матки и патологического очага, не вводя средство внутрь цервикального канала, затем помещают собранный материал до полного погружения в плотно закрывающуюся пробирку, заполненную 1,0 мл 0,155М раствором хлорида натрия, смесь встряхивают в центрифуге вортекс в течение 10 мин, исследуют полученные материалы методом твердофазного иммуноферментного анализа ИФА, спектрофотометрически осуществляют определение концентрации цитокина интерферон-γ в исследуемых пробах, судят об активности локального воспаления по полученной концентрации интерферон-γ в сравнении с нормальной его концентрацией, равной значениям до 3,2 пг/мл у здоровых лиц из эталонной группы, и при значении выше 3,2 пг/мл до 8 пг/мл судят о наличии хронически протекающего воспалительного процесса, при значении выше 8 пг/мл - судят о наличии активно протекающего воспалительного процесса и выраженном иммунном ответе.
Заявляется также способ с вышеуказанными признаками, в котором в случае наличия рубцовых изменений на поверхности шейки матки сбор исследуемого материала осуществляют с поверхности зоны трансформации с помощью полосок фильтровальной бумаги-аппликатора размером 1×0,4 см.
Кроме того, заявляется также способ с вышеуказанными признаками, в котором сбор нативного материала с зоны патологического очага с максимальной полнотой и атравматично осуществляют с помощью средства, имеющего съемное покрытие из высокогигроскопического материала, помещенного на вращающийся валик, который перемещают по поверхности торцевой стороны в зоне наружного зева шейки матки, причем валик также выполнен съемным и крепящимся с дистальной стороны держателя, с проксимальной стороны которого выполнена ручка для манипуляций.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в том, что повышение точности в оценке активности воспаления шейки матки производят с учетом информации с нативной пробы, получаемой непосредственно с участка патологии, которая дает большую достоверность исследования. Это отсутствовало в наиболее близком аналоге. Достигается результат способа технически: проба встряхивается с использованием центрифуги вортекс, процесс исследуют ИФА с применением технических средств. Фильтровальная бумага-аппликатор - средство сбора нативного материала, а также другие используемые в способе средства - технические атрибуты заявляемого способа.
Особенности сбора исследуемого материала также имеют техническую сущность - сколько собрать и как материал для исследования, а также как его обработать до проведения исследования, а главное какую естественную жидкость выбрать для исследования. В подавляющем большинстве для исследования данного органа - шейки матки при данной патологии - используют исследование крови, реже содержимое цервикального канала, в заявляемом решении исследуется отделяемое цервикальных желез с поверхности зоны трансформации шейки матки.
Поскольку способ основан на использовании цитокина интерферона-γ, который является локальным показателем, целесообразно измерять его уровень непосредственно в изучаемых тканях, в данном случае шейки матки.
Измененное количество цитокина интерферона-γ служит признаком иммунодефицитного состояния и показателем течения заболевания. В данной заявке изучалась иммуноактивность конкретного органа, конкретной патологической зоны органа - очаге воспаления шейки матки - методом иммуноферментного анализа, который осуществлялся на заранее произведенных планшетах ЗАО «Вектор-Бест» г.Новосибирск - Россия. Учет результатов - спектрофотометрический на длине волны 450 нм. Для выяснения значений нормальной концентрации интерферона-γ был проведен анализ практически здоровых доноров - женщин репродуктивного возраста от 25-44 лет, представительниц различных социальных групп без любых заболеваний гениталий в настоящем времени и в прошлом, в первую очередь, шейки матки. Все названные до данной фазы способа признаки, входящие в приемы осуществления способа, носят технический характер, например как сам ИФА, так и особенности его осуществления.
Активность и точность локализации воспалительного процесса шейки матки подтверждается неоспоримо, например, при наличии нескольких воспалительных процессов вяло и/или активно текущих одновременно в одном организме. Например, наличие осложненной эктопии и отита или флегмонозного заболевания одновременно в одном организме другими методами, например, анализом крови даже на цитокины, не позволяет оценить активность воспалительного заболевания шейки матки отдельно от других сопутствующих заболеваний.
Подробное описание способа
Первоначально осуществляют клиническое обследование больной с помощью стандартных методов, т.е. с оценкой жалоб и соматического статуса, детальным сбором анамнеза с выявлением факторов, влияющих на иммунный статус, гинекологическое обследование с осмотром шейки матки с помощью зеркал, бимануальным исследованием, расширенной кольпоскопией, цитологическим исследованием соскоба с шейки матки. Затем дополнительно обследуют на наличие инфекций гениталий, т.е. осуществляют микроскопию окрашенных мазков из урогенитального тракта, бактериологическое исследование содержимого цервикального канала. Методом полимеразной цепной реакции обследуют на инфекции, передающиеся преимущественно половым путем. Проводят верификацию диагноза, критериями исключения из исследования являлись: беременность и лактация, воспалительные заболевания органов малого таза в стадии обострения, наличие инфекций, передающихся половым путем, в т.ч. папилломавирусной инфекции, наличие также цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки, наличие тяжелой экстрагенитальной патологии и признаков острых инфекционных заболеваний.
После клинического обследования больных и подтверждения наличия неспецифического воспаления шейки матки производят сбор биоматериала с поверхности патологического очага и зоны трансформации. Сбор биоматериала осуществляют следующим образом: больную располагают на гинекологическом кресле, шейку матки обнажают в зеркалах Куско. Стерильным сухим ватным тампоном удаляют влагалищное отделяемое с поверхности шейки матки. Затем производят с максимальной полнотой и атравматично сбор исследуемого продукта, подводя средство для снятия нативного материала к наружному зеву шейки матки непосредственно к поверхности зоны трансформации шейки матки и патологического очага, не вводя средство внутрь цервикального канала. Таким средством может быть цитощетка, шпатель, а также другие технические устройства для забора исследуемого материала, в том числе описанное в подаваемой заявке в п.3 формулы данного изобретения средство. С помощью данного средства осуществляют сбор нативного материала с зоны патологического очага с максимальной полнотой и атравматично. Оно имеет съемное покрытие из высокогигроскопического материала, помещенного на вращающийся валик, который перемещают по поверхности торцевой стороны в зоне наружного зева шейки матки. Валик также выполнен съемным и крепящимся с дистальной стороны держателя, с проксимальной стороны которого выполнена ручка для манипуляций. Длина держателя, по крайней мере, превосходит длину влагалища и, как правило, составляет 20-22 см.
Средством для сбора исследуемого материала может также быть фильтровальная бумага-аппликатор соответствующих размеров. Сорбирующую способность фильтровального материала на максимальное его впитывание предварительно оценивают в контрольных исследованиях. Полоску фильтровального материала взвешивают до и после пропитывания на аналитических весах. Средство для сбора исследуемого продукта - полоску мягкого фильтровального материала, размером 1,0×0,4 см с помощью пинцета плотно фиксируют к поверхности патологического очага, деликатным нежным надавливанием пинцетом дают возможность фильтровальному материалу впитать в себя воспалительный секрет цервикальных желез и компоненты поврежденных тканей в течение 15-20 секунд, а такой размер фильтровального материала, как правило, позволяет получить до 5,0±0,5 мг нативного материала. Это средство применяется в случае наличия рубцовых изменений на поверхности шейки матки, с помощью него осуществляют сбор исследуемого материала в виде отделяемого цервикальных желез с поверхности зоны трансформации.
Описанные в данной заявке приемы снятия нативного материала обеспечивают максимальную полноту сбора и атравматичность в отличие от наиболее близкого аналога, когда цервикальный секрет берут из цервикального канала, а не с зоны патологического очага и с зоны трансформации, как в заявляемом способе.
Затем пробу помещают в пронумерованную пробирку до полного погружения, заполненную 1,0 мл 0,155М раствором хлорида натрия, закрывают крышкой. Смыв биоматериала с поверхности фильтровального материала осуществляют в центрифуге вортекс CM 70М-07, Elmi в течение 10 мин в режиме встряхивания. Затем пробирку помещают в штатив. Исследуемым тестируемым материалом является отделяемое со слизистой оболочки шейки матки, разведенное 1:200 в 0,155М растворе хлорида натрия.
Образцы тестируют методом твердофазного иммуноферментного анализа ИФА. Исследуемый образец в количестве 100 мкл вносят в лунку планшета с помощью автоматической пипетки. На первой стадии анализа ИНФγ, содержащийся в калибровочных и исследуемых образцах, связывается с первыми антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок планшета. На второй стадии анализа иммобилизованный ИНФγ взаимодействует с коньюгатом вторых антител с биотином. Количество связавшегося коньюгата прямо пропорционально количеству ИНФγ в исследуемом образце. На последней стадии анализа в лунки вносят авидин-пероксидазу. Во время инкубации с субстратной смесью - раствором хромогена тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся меченых антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках с помощью иммуноферментного анализатора «Stat Fax-2100» на длине волны 450 нм на основании калибровочного графика, полученного при исследовании калибровочных проб, имеющихся в наборе реактивов, рассчитывают концентрацию ИНФγ в анализируемых образцах. Результаты выражают в пг/мл. Общее время проведения анализа 90-100 мин.
Методом твердофазного ИФА тестируют свежеприготовленные образцы. Если это невозможно, то для исключения бактериального пророста пробирки с образцами помещают в морозильную камеру и осуществляют хранение при t -20°С. При этом не допускают даже однократного оттаивания образцов.
Для получения количественного значения эталонной нормы концентрацию интерферона-γ заблаговременно определяли в отделяемом со слизистой шейки матки у 20 практически здоровых лиц - женщин активного репродуктивного возраста с 25-44 лет и осуществляли построение градуировочной кривой. Диапазон полученных значений концентраций составил до 3,2 пг/мл. У большей части здоровых лиц величина составила в пределах значения 1,6-3,2 пг/мл.
У 20 пациенток с острым воспалением или обострением хронического воспалительного процесса возраста с 24 по 44 года диапазон полученных измеренных значений концентрации ИНФγ составил выше 8 пг/мл. У большей части больных величина укладывалась в пределах значения 12,6 пг/мл.
У 20 пациенток с длительным и вялотекущим хроническим воспалительным процессом того же репродуктивного возраста от 25 до 44 лет диапазон полученных измеренных концентраций ИНФγ составил 3,2 - 8 пг/мл.
На основании полученных данных можно сделать обобщения, с помощью которых можно определять активность течения воспаления шейки матки или хронически вялотекущее воспаление у больных. В зависимости от сделанной оценки больным назначается разное лечение. Опыт показывает, что и при правильной оценке состояния воспаления шейки матки и адекватном лечении наступает выздоровление больных как с остропротекающим воспалением, так и с длительно затянувшемся хроническим процессом воспаления.
Предложенный способ проиллюстрирован следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациентка И-ва Е.В., 30 лет. Обратилась на консультативный прием с диагнозом: Осложненная эктопия шейки матки на фоне бактериального неспецифического цервицита. Умеренная рубцовая деформация шейки матки. После клинического обследования и верификации диагноза больной произведено фильтровальной бумагой-аппликатором снятие нативного материала непосредственно с поверхности эктопии с максимальной полнотой и атравматично. Собранный материал до полного погружения был помещен в пробирку Эппендорф, заполненную 1,0 мл 0,155М раствором хлорида натрия. Пробирка помещена в центрифугу вортекс CM 70М-07, Elmi, установлен режим встряхивания на 10 мин. Бумага извлечена из пробирки с помощью пинцета, исследуемый образец материала в количестве 100 мкл с помощью автоматической одноканальной пипетки внесен в лунку планшета из набора «ИНФγ-ИФА-БЕСТ», произведено исследование образца методом твердофазного ИФА. Рассчитана концентрация ИНФγ - 10,6 пг/мл, произведено ее сравнение со значениями: для нормы, активно и хронически протекающими воспалительными процессами. Дано заключение: активно протекающий воспалительный процесс, выраженный иммунный ответ.
Пример 2. Пациентка М-ва Е.В., 31 год. Обратилась на консультативный прием с диагнозом: Осложненная эктопия шейки матки на фоне хронического неспецифического цервицита. После клинического обследования и верификации диагноза больной произведено фильтровальной бумагой-аппликатором снятие нативного материала непосредственно с поверхности эктопии с максимальной полнотой и атравматично. Собранный материал до полного погружения был помещен в пробирку Эппендорф, заполненную 1,0 мл 0,155М раствором хлорида натрия. Пробирка помещена в центрифугу вортекс СМ 70М-07, Elmi, установлен режим встряхивания на 10 мин. Бумага извлечена из пробирки с помощью пинцета, исследуемый образец в количестве 100 мкл с помощью автоматической одноканальной пипетки внесен в лунку планшета из набора «ИНФγ-ИФА-БЕСТ», произведено исследование образца методом твердофазного ИФА. Рассчитана концентрация ИНФγ - 7,5 пг/мл, произведено ее сравнение со значениями: для нормы, активно и хронически протекающими воспалительными процессами. Дано заключение: хронически протекающий воспалительный процесс.Назначено адекватное лечение с включением иммуномодуляторов локально в виде свечей на первом этапе, далее лечение по стандартной схеме.
Пример 3. Пациентка К-ва Е.О., 33 года. Обратилась на прием с целью профосмотра. После клинического обследования и верификации диагноза больной произведено средством для забора исследуемого биологического материала с поверхности шейки матки снятие нативного материала непосредственно с поверхности зоны трансформации с максимальной полнотой и атравматично путем прокатывания валика рабочей частью по поверхности экзоцервикса. Средство извлекли из влагалища, избегая касания стенок. Произвели снятие покрытия валика с помощью пинцета и поместили его до полного погружения в пробирку Эппендорф, заполненную 1,0 мл 0,155М раствором хлорида натрия. Пробирка помещена в центрифугу вортекс CM 70М-07, Elmi, установлен режим встряхивания на 10 мин. Покрытие валика извлечено из пробирки с помощью пинцета, с отжатием избытка жидкости путем прижимания к стенке пробирки. Исследуемый образец в количестве 100 мкл с помощью автоматической одноканальной пипетки внесен в лунку планшета из набора «ИНФγ-ИФА-БЕСТ», произведено исследование образца методом твердофазного ИФА. Рассчитана концентрация ИНФγ - 5,9 пг/мл, произведено ее сравнение со значениями: для нормы, активно и хронически протекающими воспалительными процессами. Дано заключение: хронически протекающий воспалительный процесс шейки матки.
Способ апробирован в клинике акушерства и гинекологии педиатрического факультета Саратовского государственного медицинского университета на базе женской консультации ММУ «10 Городская клиническая больница» г.Саратова и Центральной научно-исследовательской лаборатории Саратовского государственного медицинского университета.
Таким образом, заявляемый способ оценки активности локального воспаления слизистой шейки матки при фоновых заболеваниях, основанный на определении уровня ИНФγ в отделяемом с поверхности патологического очага, позволяет:
- на основании полученных данных оценить активность локального воспаления;
- на основании полученных результатов осуществить своевременное адекватное патогенетическое лечение.
Данный способ обладает следующими преимуществами: высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл; возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала; стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более); простотой проведения реакции; наличием как инструментального, так и визуального учета; возможностью автоматизации всех этапов реакции; относительно низкой стоимостью диагностических наборов.
Отличия в достигаемом результате - достоинства заявляемого изобретения.
Для проверки достоверности результатов в оценке активности воспаления шейки матки осуществляют параллельно подсчет числа лейкоцитов в поле зрения мазка с поверхности экзоцервикса. Была произведена микроскопия окрашенного мазка с подсчетом количества лейкоцитов. Для нормы количество лейкоцитов составляет до 10 клеток в поле зрения. 15-20-25 клеток в поле зрения свидетельствует о бессимптомно протекающем хроническом воспалительном процессе, 30-35-40 клеток в поле зрения - о хронически протекающем воспалительном процессе, 45-50-55 клеток в поле зрения - об активно остропротекающем воспалительном процессе. Эти данные совпали с выводами, сделанными по заявляемому способу, о наличии хронически протекающего воспаления.
Увеличение числа лейкоцитов в мазке было характерно для картины активно протекающего острого процесса и наоборот - уменьшение числа лейкоцитов характеризовало наличие хронического воспалительного процесса.
На основании этих проверочных данных подтверждается вывод на деление больных с активно и хронически протекающим воспалением шейки матки при условии значения концентрации цитокина, полученного изложенным способом с известным набором реактивов ИФА, с учетом особенностей взятия пробы на начальном этапе и обработки проб на последующих этапах.