Способ получения биологически активного полифенольного комплекса из арктических бурых водорослей
METHOD FOR PRODUCING A BIOLOGICALLY ACTIVE POLYPHENOL COMPLEX FROM ARCTIC BROWN ALGAE

Изобретение относится к медицинской и лечебно-профилактической практике, к химико-фармацевтической, косметической и пищевой промышленности и касается технологии переработки арктических бурых водорослей с получением новых высокоэффективных антиоксидантов растительного происхождения.
В последнее время проявляется большой интерес к полифенольным соединениям бурых водорослей, проявляющих широкий спектр биологической активности. Так высокая антиоксидантная активность экстрактов бурых водорослей обусловлена содержанием полифенолов. Помимо антиоксидантных свойств полифенолы обладают целым спектром биологических активностей, например, уменьшают риск развития онкологических заболеваний, проявляют противовоспалительное, фунгицидное и антибактериальное действия, являются антидиабетическим средством и многое другое [KimS.-K., Himaya S.W.A. Medicinal effects of phlorotannins from marine Brown Algae // Advances in Food and Nutrition Research. - 2011. - Vol. 64. - P. 97-108;  LiY.-X.,  Wijesekara I., LiY. Phlorotannins as bioactive agents from brown algae // Process Biochemistry. - 2011. - Vol. 46, № 12. - P. 2219-2224]. Разнообразие видов биологической активности обуславливает необходимость разработки эффективных и селективных методов выделения полифенолов из биомассы бурых водорослей, а также перспективность практического применения этих компонентов в качестве лечебных и профилактических средств в пищевой, косметической и фармакологической отраслях.
Известен сухой экстракт из фукусовых водорослей, обладающий антиоксидантным действием, и способ его получения (Патент Ru № 2650808, МПК A61K 36/03 от 2016 г.). Способ состоит в том, что экстракцию водорослей проводят смесью фруктозы, глюкозы, сукрозы и воды с использованием микроволнового излучения, затем к реакционной смеси прибавляют фермент протосубтилин и проводят ферментацию с ультразвуковой обработкой, по окончании процесса фермент инактивируют, жидкий экстракт обрабатывают флокулянтом, отделяют осадок флокулянта. Экстракт из фукусовых водорослей, обладающий антиоксидантным действием, полученный вышеуказанным способом, представляет собой комплекс биологически активных веществ (БАВ), содержащий 25-35 г полифенолов в 100 г сухого экстракта.
Недостатком получаемого по данному способу экстракта является низкое содержание полифенолов в его составе.
Известен способ переработки бурых водорослей (Патент Ru № 2360545, МПК A23L 1/337 от 2008 г.), по которому водоросли подвергают гидролизу водным раствором соляной кислоты, экстракт направляют на извлечение водорастворимых полисахаридов. Водорослевый остаток экстрагируют этиловым спиртом, экстракт концентрируют и гексаном извлекают смесь жирных кислот, стеринов и пигментов, после чего дихлорметаном или хлороформом извлекают смесь полифенольных соединений и пигментов, который очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле.
Однако в указанном способе есть недостатки. Во-первых, часть полифенолов переходит в экстракт при гидролизе водным раствором соляной кислоты. Во-вторых, дихлорметан и хлороформ не являются лучшими экстрагентами при жидкость-жидкостной экстракции водорослевых полифенолов. Необходимо отметить, что в данном патенте отсутствует информация как о степени извлечения полифенольной фракции из водорослей, так и о доле полифенолов в составе очищенной фракции, что не позволяет сделать вывод об эффективности данного способа для извлечения полифенолов.
3
Известен способ комплексной переработки фукусовых водорослей с одновременным получением полного спектра биологически активных веществ из биомассы водоросли (Патент Ru № 2676271, МПК A61K 36/03, C08B 37/00, C08B 37/18 от 2018 г.), заключающийся в сверхкритической флюидной экстракции сырья для извлечения липидно-пигментного комплекса, водорослевый остаток экстрагируют водой, экстракт упаривают и добавляют этиловый спирт, отделяют осадок полисахаридов, из надосадочной жидкости осаждают маннит при термостатировании. Далее из водно-спиртового экстракта удаляют этанол, водный раствор подкисляют соляной кислотой и проводят жидкофазную экстракцию полифенольной фракции смесью этилацетата и н-бутанола, выход полифенольной фракции составляет 63±5 % от содержания в водоросли. Далее водорослевый остаток обрабатывают раствором NaHCO, подкисляют серной кислотой, выпадает альгинат натрия, волокнистый остаток - водорослевую клетчатку очищают горячей водой.
Недостатком данного способа для выделения фракции полифенолов является его многостадийность, а также отсутствие данных о содержании полифенолов в составе полифенольной фракции.
Laminaria japonica
Наиболее близким к заявленному является средство (Патент Ru № 2405562, МПК A61K 36/03, A61P 1/16 от 2009 г.), обладающее гепатопротекторным действием, представляющее собой продукт экстракции этанолом слоевищ , содержащий до 30% полифенольных соединений.
Недостатком получаемого средства является низкое содержание полифенолов в его составе за счет низкой селективности процесса экстракции, а также отсутствие информации о степени извлечения полифенолов из водорослей.
Техническим результатом изобретения является обеспечение наиболее полного и селективного извлечения биологически активного полифенольного комплекса из биомассы арктических бурых водорослей, обладающего антиоксидантными, бактериостатическими и фунгистатическими свойствами.
Способ получения полифенольного комплекса, обладающего антиоксидантными, бактериостатическими и фунгистатическими свойствами,  из биомассы бурых водорослей для целей настоящего изобретения заключается в следующем.
Fucus vesiculosus
По заявленному способу воздушно-сухие слоевища бурых водорослей Фукуса пузырчатого () измельчают до размера фракции 0,5 мм. На первой стадии водоросли подвергают экстракции хлороформом для максимального удаления липидно-пигментного комплекса, содержащего жирные кислоты, хлорофилл и каротиноиды. На второй стадии для селективного и наиболее полного выделения полифенольного комплекса водорослевый остаток 1, высушивают при 40°С, измельчают до фракции менее 0,01 мм и экстрагируют ацетоном при 50°С в две стадии по 1 ч с гидромодулем 1:20 при постоянном перемешивании. Экстракт отделяют от водорослевого остатка 2 путем фильтрования через капроновый фильтр и центрифугируют для удаления остатков водорослей. На третьей стадии полученный ацетоновый экстракт концентрируют на роторном испарителе до густого состояния и добавляют воду для получения полифенольного экстракта. Водный раствор полифенолов лиофильно высушивают с получением порошка полифенольного комплекса. Полученный полифенольный комплекс представляет собой порошок от светло-коричневого до темно-коричневого цвета.
Схема выделения полифенолов по данному способу представлена на фигуре 1.
Применение ацетона в качестве экстрагента позволило достичь наиболее полного и селективного извлечения полифенольного комплекса:  выделяется 94,5±2,3 % полифенолов, относительно их содержания в исходной водорослевой биомассе, а процентная доля полифенолов в получаемом комплексе составляет 84,0±1,9 %.
Подтверждение возможности получения данным способом заявленного технического результата - полифенольного комплекса из биомассы арктических бурых водорослей, обладающего антиоксидантными, бактериостатическими и фунгистатическими свойствами, приводится в следующем примере.
Пример 1.
Fucus vesiculosus
100 г сушеных слоевищ Фукуса пузырчатого () (влажность составляет 9% масс) измельчают до размера частиц 0,03-0,20 мм и экстрагируют хлороформом в аппарате Сокслета в течение 8 часов для удаления липидно-пигментного комплекса. Водорослевой остаток I после экстракции хлороформом высушивают в сушильном шкафу при 40°С, измельчают до фракции менее 0,01 мм, помещают в емкость, заливают 1,95 л ацетона и экстрагируют ацетоном при температуре 50°С в две стадии по 60 минут с гидромодулем 1:20 при постоянном перемешивании. Экстракты отделяют от водорослевого остатка 2 путем фильтрования через капроновый фильтр и центрифугируют для удаления остатков водорослей. Полученный ацетоновый экстракт концентрируют на роторном испарителе до густого состояния и добавляют 50 мл дистиллированной воды для получения водного полифенольного экстракта. Водный раствор полифенолов лиофильно высушивают с получением коричневого порошка полифенольного комплекса. Выход полифенольной фракции составляет 7,3 г (7,3 % от массы абсолютно сухих водорослей или 95 % от содержания полифенолов в абсолютно сухих водорослях).
Новый продукт представляет собой полифенольный комплекс, который отличается от экстракта по прототипу содержанием полифенолов и фармакологическим действием.
Были проведены испытания антиоксидантной, бактериостатической и фунгистатической активностей полифенольного комплекса, получение которого описано в примере 1, а также проведены исследования действия полифенольного комплекса нафагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов человека.
Объектом исследования являлся полифенольный комплекс, обладающий антиоксидантными, бактериостатическими и фунгистатическими свойствами, полученный по заявляемому способу.
Антиоксидантная активность полифенольного комплекса определялась по отношению к DPPH радикалу. В качестве стандарта использовали аскорбиновую кислоту.
E.coli
C. albicans
in vitro
E. coli
C. albicans
Исследовалось бактериостатическое действие суспензий полифенольного комплекса концентрации 20 пг/мл на штамм кишечной палочки () и фунгистатическое действие на штаммы дрожжеподобных грибов в условиях . Каплю суспензии (0,03 мл) наносили на поверхность посева микроорганизмов (200 млн. бактерий). В качестве питательной среды использовали мясо-пептонный агар (для ) и сахарную среду Сабуро (для ). Результат определяли через сутки инкубации посева бактерий в термостате при 37 ⁰С. Бактериостатический эффект выявляли по наличию зоны отсутствия или задержки роста бактерий. Оценку чувствительности производили в % относительно каждого из изучаемых представителей микроорганизмов.
in vitro
Исследовалось влияние суспензий полифенольного комплекса в концентрации 5 пг/мл на фагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов человека в стандартном опыте определения фагоцитоза частиц латекса нейтрофилами цитратной крови человека . Оценку результатов проводили по фагоцитарному показателю (% фагоцитирующих клеток из числа сосчитанных 100 нейтрофилов) в мазках окрашенных методом  Романовского-Гимза и фагоцитарному числу (среднее количество частиц латекса, поглощенное одним фагоцитом).
E. coli,
С. albicans
По результатам проведенных исследований установлено, что полифенольный комплекс обладает высокой антиоксидантной активностью, составляющей 461±37 мг аскорбиновой кислоты на 1 г экстракта. Установлен значимый бактериостатический эффект по отношению к культурам бактерий а также показана фунгистатическая активность к подавлению роста дрожжеподобных грибов . Установлено, что полифенольный комплекс не снижает активность фагоцитов, напротив, выражена тенденция увеличения фагоцитарной реакции.
Таким образом, заявленное изобретение обеспечивает достижение указанного технического результата, а именно обеспечение наиболее полного и селективного извлечения биологически активного полифенольного комплекса из биомассы арктических бурых водорослей, обладающего антиоксидантными, бактериостатическими и фунгистатическими свойствами.