КОМПОЗИЦИИ АНТИТЕЛА К ИНТЕГРИНУ β1 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
INTEGRIN β1 ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS FOR USE THEREOF

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ (ЗАЯВКИ)
[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет в соответствии с § 119(e) раздела 35 кодекса США по заявке на патент США с серийным №61/746023, поданной 26 декабря 2012 года. Описание предшествующей заявки рассматривается как часть настоящей заявки и включено в полном объеме в описание настоящей заявки посредством ссылки.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Материал, содержащийся в прилагаемом перечне последовательностей, настоящим включен посредством ссылки в настоящую заявку. Прилагаемый текстовый файл, содержащий перечень последовательностей, с названием ONCO1100_1WO_Sequence_Listing был создан 23 декабря 2013 года и имеет размер 81 КБ. Указанный файл можно оценить с применением Microsoft Word на компьютере, в котором используется Windows OS.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Настоящее изобретение, в целом, относится к области иммунологии и, в частности, к антителам к интегрину и способам их применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Рак является одной из основных причин смертности в развитом мире, являющийся причиной более чем 500000 смертей в год только в одних Соединенных Штатах Америки. Каждый год в США более чем у одного миллиона людей диагностируют рак, и, в целом, по имеющимся оценкам, более чем у 1 из 3 человек разовьется какая-нибудь форма рака на протяжении их жизни. Хотя существует более 200 разных типов рака, четыре из них, включая рак молочной железы, легких, колоректальный рак и рак предстательной железы, являются причиной более половины всех новых случаев заболевания.
[0005] Рак молочной железы - самый распространенный вид рака у женщин, причем по подсчетам 12% женщин подвержены риску развития данного заболевания на протяжении их жизни. Хотя показатели смертности уменьшились вследствие более раннего выявления заболевания и улучшения методов его лечения, рак молочной железы остается основной причиной смертности у женщин среднего возраста. Кроме того, метастатический рак молочной железы все еще является неизлечимым заболеванием. На момент осмотра у большинства пациентов с метастатическим раком молочной железы были поражены один или два органа, но по мере прогрессирования заболевания, обычно, поражаются многие органы. Чаще всего местно-регионарные рецидивы поражения метастазами встречаются в коже и мягких тканях стенки грудной клетки, а также подмышечной и надключичной области. Чаще всего повторному поражению отдаленными метастазами подвергается костная ткань (30-40% случаев отдаленных метастазов), затем следуют легкие и печень. Хотя только у около 1-5% женщин с впервые диагностированным раком молочной железы имеются отдаленные метастазы на момент постановки диагноза, у около 50% пациентов с местным поражением в конечном счете повторно развиваются метастазы в пределах пяти лет. В настоящее время медиана выживаемости, начиная от проявления отдаленных метастазов, составляет около трех лет.
[0006] Современные способы диагностики и определения стадии рака молочной железы включают систему «опухоль-узел-метастаз» (TNM), которая основана на размере опухоли, наличии опухолевых клеток в лимфатических узлах и наличии отдаленных метастазов, как описано в American Joint Committee on Cancer: AJCC Cancer Staging Manual. Philadelphia, Pa.: Lippincott-Raven Publishers, 5th ed., 1997, pp 171-180, and in Harris, J R: "Staging of breast carcinoma" in Harris, J.R., Hellman, S., Henderson, I.C, Kinne D.W. (eds.): Breast Diseases. Philadelphia, Lippincott, 1991. Эти параметры применяются для составления прогноза и выбора соответствующей терапии. Также можно оценить морфологию опухоли, но поскольку опухоли со сходной морфологией могут характеризоваться значительной вариабельностью клинических признаков, этот подход имеет серьезные ограничения. В конечном итоге можно использовать анализы маркеров клеточной поверхности для деления определенных типов опухолей на подклассы. Например, один фактор, который учитывается в прогнозировании и лечении от рака молочной железы - это наличие эстрогенного рецептора (ЭР), поскольку ЭР-положительные злокачественные опухоли молочной железы обычно быстрее отвечают на гормональную терапию, которая включает тамоксифен и ингибиторы ароматазы, чем ЭР-отрицательные опухоли. Тем не менее, хотя эти анализы и имеют практическую ценность, они позволяют лишь частично прогнозировать клиническое поведение опухолей молочной железы, и рак молочной железы характеризуется значительным фенотипическим многообразием, отдельные формы которого не удается выявить с помощью современных средств диагностики и не удается излечить современными видами терапии.
[0007] Рак предстательной железы - самый распространенный вид рака у мужчин в развитом мире, на который по подсчетам приходится 33% всех новых случаев рака в США, и он является второй наиболее частой причиной смерти. Со времени внедрения анализа крови на простатоспецифический антиген (ПСА) ранее выявление рака предстательной железы способствовало существенному повышению показателей выживаемости, а показатель выживаемости, равный пяти годам, для пациентов с местной и региональной стадией рака предстательной железы на момент диагностики приближается к 100%. Тем не менее, более чем 50% пациентов в конечном итоге будут иметь местнораспространенную или метастазирующую опухоль.
[0008] В настоящее время радикальная простатэктомия и радиационная терапия обеспечивают излечение большинства локализованных опухолей. Однако возможности терапии очень ограничены в случае прогрессирующего заболевания. Стандартное лечение метастазирующей опухоли заключается в андрогенной аблации с применением агониста рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона (ЛГРГ) отдельно или в комбинации с антиандрогенами. Тем не менее, несмотря на максимальную андрогенную блокаду данное заболевание почти всегда прогрессирует, причем у большинства больных развивается андроген-независимое заболевание. В настоящее время не существует однозначно признанного лечения гормонорезистентного рака предстательной железы, и обычно используют режимы химиотерапии.
[0009] Рак легких представляет собой наиболее распространенный вид рака во всем мире, третий чаще всего диагностируемый рак в Соединенных Штатах Америки, и он несомненно является наиболее распространенной причиной смерти от рака. Курение сигарет считается причиной порядка 87% всех случаев заболевания раком легких, что делает рак легких предотвратимым заболеванием с самой высокой смертностью. Рак легких делят на два главных типа, на которые приходится более 90% всех случаев заболевания раком легких: мелкоклеточный рак легких (SCLC) и немелкоклеточный рак легких (NSCLC). На SCLC приходится 15-20% случаев заболевания, и он характеризуется по своему возникновению в крупных центральных дыхательных путях и гистологическим составом слоев мелких клеток с небольшим объемом цитоплазмы. SCLC является более агрессивным, чем NSCLC, характеризуется быстрым ростом и ранним и частым появлением метастазов. На NSCLC приходится 80-85% всех случаев заболевания, и его дополнительно разделяют на три главных подтипа на основании гистологии: аденокарциному, плоскоклеточную карциному (эпидермоидная карцинома) и крупноклеточную недифференцированную карциному.
[0010] Рак легких обычно проявляется на поздней стадии, и, следовательно, медиана выживаемости составляет только 6-12 месяцев после постановки диагноза, и общий показатель 5-летней выживаемости составляет всего лишь 5-10%. Хотя оперативное вмешательство является наилучшим шансом на излечение, оно показано только небольшой доле пациентов с раком легких, в то время как большинство вынуждено полагаться на химиотерапию и радиотерапию. Несмотря на попытки варьировать интервалами приема доз препарата и интенсивностью доз, характерных для этих видов терапии, показатели выживаемости лишь незначительно увеличились за последние 15 лет.
[0011] Колоректальный рак представляет собой третий наиболее распространенный вид рака и является четвертой наиболее частой смерти во всем мире. Около 5-10% всех форм колоректального рака относятся к наследственным формам, причем основной формой является семейный аденоматозный полипоз (САМ), аутосомно-доминантное заболевание, при котором у около 80% больных имеется генеративная мутация в гене, приводящая к аденоматозному полипозу толстой кишки (АРС). Колоректальная карцинома характеризуется местной инвазией за счет периферического роста и инвазией в другие места за счет лимфатического, гематогенного, чрезбрюшинного и периневрального распространения. Чаще всего внелимфатическому поражению подвергается печень, причем из всех экстраабдоминальных органов чаще всего поражаются легкие. К другим областям гематогенного распространения относятся костная ткань, почки, надпочечники и головной мозг.
[0012] Современная система классификации стадий колоректального рака основана на степени проникновения опухоли через кишечник и на наличии или отсутствии поражения лимфоузлов. Эта система классификации стадий рака определяется тремя основными классификациями по Дьюку: заболевание стадии А по Дьюку ограничивается поражением подслизистой оболочки толстой кишки и прямой кишки; заболевание стадии В по Дьюку характеризуется наличием опухолей, которые инвазируют через мышечную оболочку и могут проникать через стенку толстой кишки и прямой кишки; и заболевание стадии С по Дьюку характеризуется любой степенью инвазии через стенку кишечника с метастазами в региональные лимфатические узлы. Тогда как высокоэффективным методом лечения колоректального рака на ранних стадиях является хирургическое удаление опухоли, при котором показатель излечения пациентов, имеющих заболевание на стадии А по Дьюку, составляет 95%, этот показатель снижается до 75% у пациентов, имеющих заболевание на стадии В по Дьюку, и наличие метастазов в лимфатических узлах пациентов, имеющих заболевание на стадии С по Дьюку, позволяет с 60% вероятностью прогнозировать рецидив заболевания в пределах 5 лет. Лечение пациентов, имеющих заболевание на стадии С по Дьюку, с применением послеоперационного курса химиотерапии снижает частоту рецидивов до 40%-50% и в настоящее время является стандартным для этих пациентов.
[0013] Эпителиальные карциномы головы и шеи возникают в слизистых оболочках в области головы и шеи и обычно являются плоскоклеточными по природе. Эта категория включает опухоли околоносовых пазух, ротовой полости и носоглотки, ротовой части глотки, гортанной части глотки и гортани.
[0014] Ежегодное количество новых случаев заболевания раком головы и шеи в Соединенных Штатах Америки составляет около 40000 больных в год, что составляет около 5 процентов от общего количества злокачественных новообразований у взрослых людей. Рак головы и шеи более распространен в других странах, и частота возникновения данного заболевания во всем мире, вероятно, превышает полмиллиона случаев заболевания ежегодно. В Северной Америке и Европе указанные опухоли возникают в ротовой полости, ротовой части глотки или гортани, тогда как рак носоглотки более распространен в странах Средиземноморья и Дальнего Востока.
[0015] Традиционные методы терапии (радиационная терапия, химиотерапия и гормональная терапия), несмотря на свою практическую ценность, утратили свою эффективность из-за появления устойчивых к терапевтическому воздействию раковых клеток. Поэтому ясно, что для идентификации мишеней для лечения рака головы и шеи и вообще рака необходимы новые подходы.
[0016] Рак поджелудочной железы представляет собой злокачественное новообразование, возникающее в результате трансформации клеток, появляющихся в тканях, образующих поджелудочную железу. Наиболее распространенным видом рака поджелудочной железы, на который приходится 95% этих опухолей, является аденокарцинома (опухоли, в которых при световой микроскопии выявляется железистая структура), возникающая в пределах экзокринного компонента поджелудочной железы. Меньшее число опухолей возникает из клеток островков Лангерганса, и их классифицируют как нейроэндокринные опухоли. Рак поджелудочной железы представляет собой четвертую наиболее распространенную причину смерти от рака в Соединенных Штатах Америки и восьмую во всем мире.
[0017] Мультиформная глиобластома (GBM) является наиболее распространенной злокачественной опухолью головного мозга у взрослых людей с медианой выживаемости менее одного года при наиболее интенсивной терапии. К настоящему времени только три лекарственных средства были одобрены FDA для лечения GBM, но общая выживаемость не улучшилась за последние 25 лет.
[0018] Интегрины представляют собой молекулы клеточной адгезии, которые отвечают за механорецепцию микроокружения и запуск сигнальных путей, активируемых компонентами внеклеточного матрикса (ЭКМ), при нормальном и патологическом состояниях, таких как воспаление и рак. Важно отметить, что интегрины расположены на границе поверхности клетки и микроокружения, принимая участие в прогрессировании опухоли и регуляции сигнальных путей, отвечающих за рост и выживаемость клеток. Повышение экспрессии многих типов интегринов было ассоциировано с эпителиальными злокачественными новообразованиями в процессе инвазии, метастазирования и ангиогенеза. Важно отметить, что недавно во многих моделях солидного рака и гематопоэтических злокачественных новообразований было показано, что β1-интегрины, которые координируют более широкий спектр функциональных процессов, как, например, воспаление, пролиферация, адгезия и инвазия, вовлечены в терапевтическую резистентность. Важно отметить, что эта резистентность, опосредованная β1-интегрином, как предполагается, возникает на уровне опухолевых клеток самих по себе. В дополнение к вышеописанному β1-интегрин играет важную роль на протяжении васкуляризации опухоли, как, например, при VEGF-зависимом и VEGF-независимом ангиогенезе. Ингибирование β1-интегрина позволяет преодолеть резистентность к антиангиогенной терапии через многие потенциальные механизмы: (1) предотвращение кооптации сосудов (и/или роста/инвазии на любом классическом субстрате из ЭКМ; (2) снижение жизнеспособности опухолевых клеток после повреждающих воздействий, как, например, с помощью ионизирующей радиации; (3) непосредственное ингибирование пролиферация опухолевых клеток; (4) непосредственное ингибирование процесса васкуляризации; и (5) ингибирование агрессивного мезенхимального фенотипа, включая рост в виде сфероидов, который обычно наблюдается после установления резистентности к терапии.
[0019] Композиции, направленные против интегрина β1, как, например, антитела, направленно воздействующие на интегрин β1, также могут играть важную роль в лечении иммунологических/воспалительных заболеваний и нарушений, учитывая более широкую функциональную роль интегрина β1, которая обсуждалась выше. Кроме того, заболевания и нарушения, на которые можно направленно воздействовать через сигнальный путь интегрина β1, включают множественный склероз, болезнь Крона, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника и тому подобное. Аналогичным образом следует полагать, что можно направленно воздействовать на определенные заболевания глаз, включая влажную форму возрастной макулярной дегенерации сетчатки (ВМД).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0020] Настоящее изобретение основано на получении гуманизированных антител, имеющих каркасные последовательности, которые специфически связываются с интегрином β1. Известно, что интегрин β1 представляет собой белок, характеризующийся избыточной экспрессией в солидных опухолях, и, следовательно, он играет роль маркера раковых клеток, который можно использовать для характеристики, исследования, диагностики и лечения рака. В дополнение к этому, было продемонстрировано, что интегрин способствует развитию устойчивости рака к традиционной (например, химиотерапия и ионизирующее облучение) и прицельной видам терапии (например, трастузумаб, бевицизумаб, лапатиниб) за счет регуляции сигналов, отвечающих за рост и продолжительность существования опухоли, определяемых микроокружением опухоли. Ранее работы по гуманизации были ограничены количеством доступных каркасных участков антител человека. Настоящее изобретение удовлетворяет потребности в дополнительных каркасных последовательностях для антитела, которое специфически связывается с интегрином β1.
[0021] В одном варианте реализации изобретения в настоящем изобретении предложено гуманизированное антитело, которое специфически связывается с интегрином β1. Указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), причем VH-область менее чем около на 97%, 96% или 95% идентична VH-области, имеющей аминокислотную последовательность, которая изложена в SEQ ID NO: 2, и причем VL-область менее чем около на 97%, 96% или 95% идентична VL-области, имеющей аминокислотную последовательность, которая изложена в SEQ ID NO: 4.
[0022] В другом варианте реализации изобретения VH-область более чем на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентична VH-области, имеющей аминокислотную последовательность, которая изложена в SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 29-43 и SEQ ID NO: 91-100. В вариантах реализации изобретения VL-область более чем на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентична VL-области, имеющей аминокислотную последовательность, которая изложена в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 44-57 и SEQ ID NO: 107-116.
[0023] В другом варианте реализации изобретения антитело имеет CDR VH- и VL-областей из антитела-донора, такого как OS2966. В вариантах реализации изобретения CDR VH-области имеют аминокислотные последовательности, которые изложены в SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25, и CDR VL-области имеют аминокислотные последовательности, которые изложены в SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.
[0024] В одном аспекте в настоящем изобретении предложено антитело, которое содержит VH- и VL-области по настоящему изобретению.
[0025] В другом аспекте в настоящем изобретении предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по настоящему изобретению.
[0026] В другом аспекте в настоящем изобретении предложен вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.
[0027] В другом аспекте в настоящем изобретении предложена выделенная клетка-хозяин, которая содержит вектор по настоящему изобретению.
[0028] В другом аспекте в настоящем изобретении предложены фармацевтические композиции. В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит антитело по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
[0029] В другом аспекте в настоящем изобретении предложен иммуноконъюгат, содержащий антитело по настоящему изобретению, связанное с детектирующей или терапевтической группой.
[0030] В другом аспекте в настоящем изобретении предложен химерный белок, содержащий антитело по настоящему изобретению, функционально связанное с отдельным пептидом, таким как цитокин.
[0031] В другом варианте реализации изобретения в настоящем изобретении предложен способ лечения заболевания у субъекта. В вариантах реализации изобретения способ включает введение субъекту антитела по настоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, фармацевтической композиции по настоящему изобретению, иммуноконъюгата по настоящему изобретению или химерного белка по настоящему изобретению, тем самым обеспечивая лечение заболевания. В одном варианте реализации изобретения заболевание представляет собой клеточно-пролиферативное нарушение, такое как рак.
[0032] В другом варианте реализации изобретения в настоящем изобретении предложен способ выявления заболевания у субъекта. Способ включает приведение в контакт антитела или иммуноконъюгата по настоящему изобретению с образцом, взятым у субъекта; определение уровня интегрина β1 через специфическое связывание антитела с интегрином β1; и сопоставление определенного уровня интегрина β1 с уровнем интегрина β1 в нормальном образце, причем повышенный уровень интегрина β1 в образце, взятом у субъекта, по сравнению с нормальным образцом свидетельствует о наличии заболевания.
[0033] В другом варианте реализации изобретения в настоящем изобретении предложена VH-область, которая более чем на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентична VH-области, имеющей аминокислотную последовательность, которая изложена в SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 29-43 и SEQ ID NO: 91-100.
[0034] В другом варианте реализации изобретения в настоящем изобретении предложена VL-область, которая более чем на 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентична VL-области, имеющей аминокислотную последовательность, которая изложена в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 44-57 и SEQ ID NO: 107-116.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0035] Фигура 1 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот VH-области антитела OS2966, продуцируемого гибридомными клетками OS2966.
[0036] Фигура 2 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот VL-области антитела OS2966, продуцируемого гибридомными клетками OS2966.
[0037] Фигура 3 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы результаты анализа CDR продуцируемого гибридомными клетками антитела OS2966, которые используются в VH- и VL-областях антитела по настоящему изобретению.
[0038] Фигура 4 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы аминокислотные последовательности продуцируемого гибридомными клетками антитела OS2966, которые используются в VH- и VL-областях антитела по настоящему изобретению.
[0039] Фигура 5 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот VH-области антитела по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения. Консервативные CDR подчеркнуты.
[0040] Фигура 6 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот VH-области антитела по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения. Консервативные CDR подчеркнуты.
[0041] Фигура 7 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот VH-области антитела по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения. Консервативные CDR подчеркнуты.
[0042] Фигура 8 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот VH-области антитела по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения. Консервативные CDR подчеркнуты.
[0043] Фигура 9 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот VH-области антитела по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения. Консервативные CDR подчеркнуты.
[0044] Фигура 10 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот VL-области антитела по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения. Консервативные CDR подчеркнуты.
[0045] Фигура 11 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот VL-области антитела по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения. Консервативные CDR подчеркнуты.
[0046] Фигура 12 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот VL-области антитела по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения. Консервативные CDR подчеркнуты.
[0047] Фигура 13 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот VL-области антитела по настоящему изобретению в одном варианте реализации изобретения. Консервативные CDR подчеркнуты.
[0048] Фигура 14 представляет собой блок-схему векторов.
[0049] Фигура 15 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы результаты анализа и выравнивания последовательностей гуманизированных VH-цепей по настоящему изобретению по сравнению с VH антитела OS2966 (SEQ ID NO: 2). На Фигуре 15 представлены следующие последовательности: OS2966 представляет собой SEQ ID NO: 2; Вариант 1 представляет собой SEQ ID NO: 6; Вариант 2 представляет собой SEQ ID NO: 8; Вариант 3 представляет собой SEQ ID NO: 10; Вариант 4 представляет собой SEQ ID NO: 12; Вариант 5 представляет собой SEQ ID NO: 14; Вариант 6 представляет собой SEQ ID NO: 29; Вариант 7 представляет собой SEQ ID NO: 30; Вариант 8 представляет собой SEQ ID NO: 31; Вариант 9 представляет собой SEQ ID NO: 32; Вариант 10 представляет собой SEQ ID NO: 33; Вариант 11 представляет собой SEQ ID NO: 34; Вариант 12 представляет собой SEQ ID NO: 35; Вариант 13 представляет собой SEQ ID NO: 36; Вариант 14 представляет собой SEQ ID NO: 37; Вариант 15 представляет собой SEQ ID NO: 38; VH2 представляет собой SEQ ID NO: 91; Вариант 16 представляет собой SEQ ID NO: 92; VH4 представляет собой SEQ ID NO: 93; Вариант 17 представляет собой SEQ ID NO: 94; VH5 представляет собой SEQ ID NO: 95; Вариант 18 представляет собой SEQ ID NO: 96; VH6 представляет собой SEQ ID NO: 97; Вариант 19 представляет собой SEQ ID NO: 98; VH7 представляет собой SEQ ID NO: 99; и Вариант 20 представляет собой SEQ ID NO: 100.
[0050] Фигура 16 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы результаты анализа и выравнивания последовательностей гуманизированных J-областей (VH) по настоящему изобретению, соответствующих выравниваниям на Фигуре 15. Представлены следующие последовательности: J1 представляет собой SEQ ID NO: 101; J2 представляет собой SEQ ID NO: 102; J3 представляет собой SEQ ID NO: 103; J4 представляет собой SEQ ID NO: 104; J5 представляет собой SEQ ID NO: 105; и J6 представляет собой SEQ ID NO: 106.
[0051] Фигура 17 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы результаты анализа и выравнивания последовательностей гуманизированных VL-цепей по настоящему изобретению по сравнению с VL антитела OS2966 (SEQ ID NO: 4). Представлены следующие последовательности: OS2966 представляет собой SEQ ID NO: 4; Вариант 1 представляет собой SEQ ID NO: 16; Вариант 2 представляет собой SEQ ID NO: 18; Вариант 3 представляет собой SEQ ID NO: 20; Вариант 4 представляет собой SEQ ID NO: 22; Вариант 5 представляет собой SEQ ID NO: 44; Вариант 6 представляет собой SEQ ID NO: 45; Вариант 7 представляет собой SEQ ID NO: 46; Вариант 8 представляет собой SEQ ID NO: 47; Вариант 9 представляет собой SEQ ID NO: 48; Вариант 10 представляет собой SEQ ID NO: 49; Вариант 11 представляет собой SEQ ID NO: 50; Вариант 12 представляет собой SEQ ID NO: 51; Вариант 13 представляет собой SEQ ID NO: 52; VkI представляет собой SEQ ID NO: 107; Вариант 14 представляет собой SEQ ID NO: 108; VkII представляет собой SEQ ID NO: 109; Вариант 15 представляет собой SEQ ID NO: 110; VkIII представляет собой SEQ ID NO: 111; Вариант 16 представляет собой SEQ ID NO: 112; VkIV представляет собой SEQ ID NO: 113; Вариант 17 представляет собой SEQ ID NO: 114; VkVI представляет собой SEQ ID NO: 115; и Вариант 18 представляет собой SEQ ID NO: 116.
[0052] Фигура 18 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы результаты анализа и выравнивания последовательностей гуманизированных J-областей (каппа-легких цепей) по настоящему изобретению, соответствующие выравниваниям, проиллюстрированным на Фигуре 17. Представлены следующие последовательности: J1 представляет собой SEQ ID NO: 117; J2 представляет собой SEQ ID NO: 118; J3 представляет собой SEQ ID NO: 119; J4 представляет собой SEQ ID NO: 120; и J5 представляет собой SEQ ID NO: 121.
[0053] Фигура 19 является графическим представлением, на котором проиллюстрированы результаты по частоте использования кодонов для VH- и VL-цепей по настоящему изобретению.
[0054] На Фигуре 20 представлен график, на котором проиллюстрированы результаты по относительной аффинности композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению (которые показаны в Таблице 2).
[0055] На Фигуре 21 представлен график, на котором проиллюстрированы результаты по относительной аффинности композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению (которые показаны в Таблице 2).
[0056] На Фигуре 22 представлен график, на котором проиллюстрированы результаты по относительной аффинности композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению (которые показаны в Таблице 2).
[0057] На Фигуре 23 представлен график, на котором проиллюстрированы результаты по относительной аффинности композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению (которые показаны в Таблице 2).
[0058] На Фигуре 24 представлен график, на котором проиллюстрированы результаты по относительной аффинности композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению (которые показаны в Таблице 2).
[0059] Фигура 25A-D представляет собой серию графиков, на которых проиллюстрированы результаты функциональной валидации композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению в анализах адгезии клеток к экстраклеточному матриксу (ЭКМ). Функциональное ингибирование β1-субъединицы интегрина с применением композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению (из Таблицы 2) оценивали в анализе адгезии клеток с применением микропланшетов на многих видах ЭКМ и многих клеточных линиях. На Фигуре 25А проиллюстрированы результаты для клеток PANC-1 рака поджелудочной железы человека. На Фигуре 25В проиллюстрированы результаты для клеток PANC-1 рака поджелудочной железы человека. На Фигуре 25В проиллюстрированы результаты для клеток PANC-1 рака поджелудочной железы человека. На Фигуре 25С проиллюстрированы результаты для клеток MDA-MB-231 трижды негативного рака молочной железы. На Фигуре 25D проиллюстрированы результаты для клеток AsPC-1 рака поджелудочной железы человека.
[0060] Фигура 26А-В представляет собой серию изображений и графиков, на которых проиллюстрированы результаты функциональной валидации композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению в анализах миграции клеток с применением экстраклеточного матрикса (ЭКМ). Функциональное ингибирование β1-субъединицы интегрина с применением композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению (из Таблицы 2) оценивали «методом зарастания царапины» в анализе миграции клеток с применением микропланшетов на фибронектине в качестве компонента ЭКМ с применением клеток трижды негативного рака молочной железы (MDA-MB-231). На снимках планшетов, полученных на 10х увеличении, было отмечено уменьшение миграции в зону царапины в лунках, в которые вносили OS2966, и варианты (H1, Н2, Н3) композитных антител человека (Фигура 26А). На Фигуре 26В представлен график результатов количественной оценки площади царапины без клеток для каждого условия (анализы осуществляли в трех повтори остях и повторяли).
[0061] Фигура 27А-В представляет собой серию изображений и графиков, на которых проиллюстрированы результаты функциональной валидации композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению в анализах образования трубки эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC). Функциональное ингибирование β1-субъединицы интегрина с применением композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению (из Таблицы 2) оценивали в модели ангиогенеза in vitro; анализ образования трубки эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC). Фигура 27А представляет собой серию снимков планшетов, полученных на 10х увеличении, демонстрирующих уменьшение образования сосудистых трубок в лунках, в которые вносили OS2966, и варианты (H1, Н2, Н3) композитных антител человека. На Фигуре 26В представлена серия графиков для количественной оценки образования закрытых единиц для каждого условия (анализы осуществляли по меньшей мере в трех повторностях и повторяли с эндотелиальными клетками-предшественниками).
[0062] Фигура 27А-В представляет собой серию изображений и графиков, на которых проиллюстрированы результаты функциональной валидации композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению в ортотопической ксенотрансплантатной модели трижды негативного рака молочной железы человека. Функциональное ингибирование β1-субъединицы интегрина с применением композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению (из Таблицы 2) оценивали в модели трижды негативного рака молочной железы человека in vivo с применением клеточной линии MDA-MB-231. На Фигуре 28А представлен график, на котором проиллюстрирована зависимость среднего объема опухоли для группы от времени. Фигура 28В представляет собой электрофореграмму.
[0063] Фигура 29 представляет собой серию изображений, на которых проиллюстрированы результаты функциональной валидации композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению в ортотопической ксенотрансплантантной модели спонтанных метастазов в легкие клеток негативного рака молочной железы человека.
[0064] Фигура 30А-С представляет собой серию изображений и графиков, на которых проиллюстрированы результаты функциональной валидации композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению в ксенотрансплантатной модели рака поджелудочной железы человека. Функциональное ингибирование β1-субъединицы интегрина с применением композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению (из Таблицы 2) оценивали в модели гемцитабин-резистентного рака поджелудочной железы человека in vivo с применением клеточной линии PANC1-GEMR. На Фигуре 30А представлен график, на котором проиллюстрирована зависимость среднего объема опухоли для группы от времени. На Фигуре 30В представлен график, на котором проиллюстрирована зависимость среднего объема опухоли для группы от времени. Фигура 30С представляет собой электрофореграмму.
[0065] Фигура 31А-В представляет собой серию изображений и графиков, на которых проиллюстрированы результаты функциональной валидации композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению в ксенотрансплантатной модели сформированной глиобластомы. Функциональное ингибирование β1-субъединицы интегрина с применением композитных вариантов антител человека по настоящему изобретению (из Таблицы 2) оценивали в модели формирования глиобластомы человека in vivo с применением клеточной линии U87MG. На Фигуре 31А представлен график, на котором проиллюстрирована зависимость среднего объема опухоли для группы от времени. Фигура 31В представляет собой электрофореграмму.
[0066] На Фигуре 32А-В проиллюстрированы результаты скринингового анализа иммуногенности (EpiScreen™). Фигура 32А представляет собой гистограмму. На Фиг. 32В суммированы данные по пролиферации здоровых донорных Т-клеток в когорте доноров.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0067] В настоящем изобретении предложены каркасные последовательности VH- и VL-областей и последовательности нуклеиновой кислоты, которые их кодируют. Такие последовательности используются, например, для получения каркасных участков для пересадки CDR из антитела-донора, например, антитела грызуна. Таким образом, может быть создано антитело, содержащее каркасный участок VH- и/или VL-областей по настоящему изобретению со специфичностью связывания, характерной для антитела-донора.
[0068] В настоящем изобретении также предложены гуманизированные антитела, обладающие специфичностью, характерной для антитела, названного OS2966, например, специфичностью связывания с интегрином β1 через CDR OS2966 мыши, введенные в каркасные области VH- и VL-областей, изложенные в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 29-57, 91-100 и 107-116.
[0069] Гуманизированные антитела по настоящему изобретению используют для различных терапевтических и диагностических целей, которые описаны в настоящем документе. Применения включают диагностирование и проведение лечения заболеваний, таких как рак.
[0070] До описания композиций и способов по настоящему изобретению следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается каким-нибудь описанным конкретным устройством, способами и экспериментальными условиями, поскольку такими устройствами, способами и условиями можно варьировать. Также следует понимать, что терминология, использованная в настоящем документе, приводится исключительно с целью описания конкретных вариантов реализации изобретения и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который ограничивается исключительно прилагаемой формулой изобретения.
[0071] При использовании в настоящем описании и приложенной формуле изобретения единственное число включает ссылку на множественное число, если из контекста очевидно не следует иное. Следовательно, например, ссылка на «композицию» или «способ» подразумевает одну или более композиций и способов, и/или описанные в настоящем документе этапы, что станет понятным специалистам в данной области техники при прочтении настоящего раскрытия, и так далее.
[0072] Если не указано иное, технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое им обычно придает специалист в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя в практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения могут быть использованы такие же способы и материалы, как описано в настоящем документе, или их эквиваленты, далее будут описаны иллюстративные способы и материалы.
[0073] Термин «интегрин β1» является синонимом CD29 и подразумевает ссылку на белок, кодируемый геном ITGB1. Интегрин β1 ассоциирован с рецепторами поздних антигенов и, как известно, одновременно связывается со многими альфа-субъединицами, включая альфа-1 включительно до альфа-9, например, связывание с субъединицей альфа-3 приводит к образованию комплекса α3β1, который взаимодействует с такими молекулами, как нетрин-1 и рилин.
[0074] Используемый в настоящем документе термин «к интегрину β1» применительно к антителу относится к антителу, которое специфически связывается с интегрином β1.
[0075] Термин «антитело» относится к полипептиду, кодируемому геном иммуноглобулина или его функциональными фрагментами, которое специфически связывается и распознает антиген. Известные гены иммуноглобулинов включают гены константных областей каппа-, лямбда-, альфа-, гамма-, дельта-, эпсилон- и мю-цепей, а также множество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируются либо как каппа-, либо как лямбда-цепи. Тяжелые цепи классифицируются как гамма-, мю-, альфа-, дельта- или эпсилон-цепи, которые в свою очередь определяют классы иммуноглобулинов, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно.
[0076] Иллюстративная структурная единица иммуноглобулина (антитела) включает тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара состоит из одной «легкой» (около 25 кДа) и одной «тяжелой» цепи (около 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область, состоящую из около 100-110 или большего количества аминокислот, которые, главным образом, отвечают за распознавание антигена. Термины вариабельная область легкой цепи (VL) и вариабельная область тяжелой цепи (VH) относятся к таким легким и тяжелым цепям, соответственно.
[0077] Примеры функциональных фрагментов антител включают без ограничений полноразмерные молекулы антител, фрагменты антител, такие как Fv, одноцепочечный Fv (scFv), области, определяющая комплементарность (CDR), VL (вариабельная область легкой цепи), VH (вариабельная область тяжелой цепи), Fab, F(ab)2' и любую комбинацию этих или любых других функциональных частей иммуноглобулина, способные связываться с антигеном-мишенью (см., например, Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993). Специалисту в данной области техники понятно, что различные фрагменты антител можно получить различными способами, например, расщеплением интактного антитела ферментом, таким как пепсин; или с помощью синтеза de novo. Фрагменты антител часто синтезируют de novo либо химическими методами, либо путем использования методологии рекомбинантной ДНК. Следовательно, используемый в настоящем документе термин «антитело» охватывает фрагменты антител, полученные либо путем модификации полного антитела, либо синтезированные de novo с применением методологий рекомбинантной ДНК (например, одноцепочечный Fv), или идентифицированные с применением библиотек фагового дисплея. Термин «антитело» также подразумевает бивалентные или биспецифические молекулы, диатела, триатела и тетратела. Бивалентные или биспецифические молекулы известны в данной области техники.
[0078] Обозначения «VH» или одна из «VH» относятся к вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fv, scFv, стабилизированный дисульфидной связью Fv (dsFv) или Fab. Обозначения «VL» или одна из «VL» относятся к вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, включая Fv, scFv, dsFv или Fab.
[0079] CDR главным образом отвечают за связывание с эпитопом антигена. CDR каждой цепи обычно называют CDR1, CDR2 и CDR3, последовательно нумеруют, начиная с N-конца, и также обычно идентифицируют по цепи, в которой расположен конкретный CDR. Следовательно, VH CDR3 расположен в вариабельном домене тяжелой цепи антитела, в которой он находится, тогда как VL CDR1 представляет собой CDR1 из вариабельного домена легкой цепи антитела, в которой он находится Нумерация вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, описанных в настоящем документе, приводится в соответствии с Кабат (см., например, Johnson et al., (2001) "Kabat Database and its applications: future directions" Nucleic Acids Research, 29: 205-206; and the Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest, Feb. 22, 2002 Dataset), если не указано иное.
[0080] Положения CDR и каркасных областей можно установить с применением различных широко известных в данной области техники определений, например, Кабат, Чотиа, международная база данных по иммуногенетике (IMGT) и AbM (см., например, Johnson et al., выше; Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins.). J. Mol. Biol. 196, 901-917; Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883; Chothia C. et al., 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol 1997, 273(4)). Определения антигенсвязывающих сайтов также описаны в следующем источнике: Ruiz et al., IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000); и Lefranc, M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan 1; 29(1): 207-9 (2001); MacCallum et al, Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J Mol. Biol., 262(5), 732-745 (1996); и Martin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin, et al, Methods Enzymol., 203, 121-153, (1991); Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992); и Rees et al, In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996).
[0081] Иллюстративный каркасный участок и последовательности CDR для VH- и VL-областей иммуноглобулина человека, описанные в данном документе, проиллюстрированы на Фигуре 4.
[0082] «OS2966» относится к антителу IgG1 мыши, которое специфически связывается специфически с интегрином β1 человека. OS2966 коммерчески доступный (под другим названием) из различных источников, как, например, Банк гибридом для исследований развития (Developmental Studies Hybridoma Bank) Университета Айовы. Были клонированы тяжелые и легкие цепи OS2966. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности VH-области OS2966 изложены в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности VH-области OS2966 изложены в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно. CDR OS2966, которые установлены для иллюстративных гуманизированных антител, описанных в данном документе, изложены в SEQ ID NO: 23-28 и проиллюстрированы на Фигуре 4.
[0083] «Гуманизированное антитело» относится к антителу, которое обладает специфичностью связывания, характерной для антитела-донора, т.е. содержит CDR-области антитела-донора, обычно моноклонального антитела мыши, перенесенные на последовательности каркасных участков иммуноглобулина человека. Описанное в настоящем документе «гуманизированное антитело» связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело-донор, и обычно его аффинность связывания составляет по меньшей мере 25% от аффинности связывания антитела-донора. Иллюстративный анализ аффинности связывания описан в Примере 5. Способы определения способности указанного антитела связываться с тем же самым эпитопом хорошо известны в данной области техники, см., например, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, в котором раскрыты методы картирования эпитопов или, в качестве альтернативы, эксперименты по конкурентному связыванию для определения способности указанного антитела связываться с тем же самым эпитопом, что и антитело-донор. В настоящем изобретении предложено гуманизированное антитело, которое содержит новую каркасную область.
[0084] «VH-» или «VL-» «область» или «каркасний участок» по настоящему изобретению относится к аминокислотной последовательности VH или VL, которая по меньшей мере на 70% идентична, часто по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 29-57, SEQ ID NO: 91-100 или SEQ ID NO: NO: 107-116. «Каркасный участок» VH- или VL-цепи относится к каркасным областям цепи, не включая CDR. Указанный термин применительно к каждой цепи охватывает все каркасные области.
[0085] «Гуманизированное антитело к интегрину β1» относится к гуманизированному антителу, содержащему последовательность каркасного участка иммуноглобулина человека, которое обладает специфичностью связывания, характерной для OS2966 мыши, перенесенного на этот каркасный участок. CDR гуманизированного антитела к интегрину β1 по настоящему изобретению по меньшей мере на 85%, чаще по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен CDR последовательностей тяжелой и легкой цепей, изложенных в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, соответственно. CDR VH-области изложены в SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25. CDR VH-области изложены в SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.
[0086] В одном аспекте в настоящем изобретении предложены композитные гуманизированные антитела. Технология производства композитных антител человека позволяет получить гуманизированные неиммуногенные антитела без Т-клеточных эпитопов (деиммунизация) в вариабельной области (V-области) последовательностей (ЕР 2388871). В отличие от других технологий гуманизации, в которых используют единичные каркасные участки V-области иммуноглобулина человека в качестве «акцепторов» для областей, определяющих комплементарность (CDR), из исходного антитела (обычно антитела мыши), в Composite Human Antibodies™ содержится множество сегментов последовательностей («композитов»), полученных из V-областей антител, неродственных антителам человека. Ключевыми свойствами Composite Human Antibodies являются:
[0087] Сегменты последовательностей, полученные из баз данных для V-областей антител, неродственных антителам человека, подбирают после определения аминокислотных последовательностей, которые, как считаются, представляют особую важность для связывания исходного антитела с антигеном. Все подобранные сегменты последовательностей, полученные из баз данных для V-областей антител человека, проверяют на наличие потенциальных Т-клеточных эпитопов in silico с применением инструментов Antitope. Composite Human Antibodies™ сохраняют аффинность и специфичность лучше, чем стандартные гуманизированные антитела из-за точного совпадения сегментов последовательностей иммуноглобулина человека со всеми участками V-областей исходного антитела. Composite Human Antibodies™ лишены Т-клеточных эпитопов, и, таким образом, считаются и гуманизированными, и деиммунизированными антителами.
[0088] В одном варианте реализации изобретения антитела по настоящему изобретению получают путем идентификации подходящих остатков в каркасной области с целью введения мутации в специфические сайты внутри Т-клеточных эпитопов. Антитела по настоящему изобретению могут характеризоваться измененной аффинностью связывания и/или измененной иммуногенностью по сравнению с антителами-донорами.
[0089] Для картирования Т-клеточных эпитопов в пределах последовательности белка можно использовать известные в данной области техники способы. Например, EpiScreen™ (ЕР 1989544, Antitope, Великобритания) используют для картирования Т-клеточных эпитопов в пределах последовательности белка, чтобы определить его потенциальную иммуногенность, которая зависит от количества и активности Т-клеточных эпитопов в пределах последовательности. Обычно для картирования Т-клеточных эпитопов с помощью EpiScreen™ используют истощенные по CD8+ Т-клеткам МКПК, взятые не менее чем у 50 HLA-типированных доноров (которые представляют целевую популяцию людей). Обычно 15-мерные пептиды с 12 перекрывающимися аминокислотными остатками, входящими в состав белковой последовательности, анализируют много раз на повторных культурах по включению 3Н TdR на предмет стимуляции in vitro CD4+ Т-клеток. Часто отмечается стимуляция CD4+ Т-клеток двумя или тремя смежными и перекрывающимися пептидами, поскольку в нескольких пептидных последовательностях присутствует коровый 9-мер, который связывается с петлей, связывающейся с МНС класса II. После точной идентификации пептидов, которые стимулируют CD4+ Т-клетки in vitro, можно использовать методы in silico для разработки не содержащих Т-клеточных эпитопов (деиммунизированных) вариантов путем определения точного местоположения последовательностей корового 9-мера и местоположения ключевых якорных остатков МНС класса II.
[0090] Фраза «одноцепочечный Fv» или «scFv» относится к антителу, в котором вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи традиционного двухцепочечного антитела были соединены с образованием одной цепи. Обычно между двумя цепями встраивают линкерный пептид для стабилизации вариабельных доменов, не нарушая правильную укладку и формирование активного сайта связывания. Одноцепочечное гуманизированное антитело по настоящему изобретению, например, гуманизированное антитело к интегрину β1, может связываться в виде мономера. Другие иллюстративные одноцепочечные антитела могут формировать диатела, триатела и тетратела. (См., например, Hollinger et al., 1993, выше). Кроме того, гуманизированные антитела по настоящему изобретению, например, гуманизированное антитело к интегрину β1, могут составлять один компонент «воссозданного» антитела или фрагмента антитела, например, Fab, Fab'-мономер, Р(ab)'2-димер или полная молекула иммуноглобулина. Кроме того, гуманизированное антитело по настоящему изобретению может дополнительно содержать Fc-область антитела человека.
[0091] «Связывание» или «соединение», или «конъюгация» относится к любому методу, известному в данной области техники, для функционального соединения доменов, включая без ограничения рекомбинантное слияние в присутствии или в отсутствие промежуточных доменов, интеин-опосредованное слияние, нековалентную ассоциацию и связывание с помощью ковалентной связи, например, связывание с помощью дисульфидной связи, связывание с помощью пептидной связи; связывание с помощью водородной связи; связывание с помощью электростатических взаимодействий; и связывание с помощью конформационных взаимодействий, например, ассоциации антитела-антигена и биотина-авидина. В контексте настоящего изобретения указанные термины относятся к соединению группой антитела с эффекторной молекулой (ЭМ). Связывание может осуществляться либо с помощью химических, либо рекомбинантных методов. Химические методы относятся к реакции между группой антитела и эффекторной молекулой, в результате которой между двумя молекулами образуется ковалентная связь с образованием одной молекулы.
[0092] Термин «эффекторная группа» обозначает часть иммуноконъюгата, предназначенную для воздействия на клетку, которая является мишенью для адресующей части, или для установления наличия иммуноконъюгата. Следовательно, эффекторная группа, например, может представлять собой терапевтическую группу, такую как цитотоксическое средство или лекарственное вещество, или детектируемую группу, такую как флуоресцентная метка.
[0093] «Терапевтическая группа» представляет собой часть иммуноконъюгата, предназначенную для действия в качестве терапевтического средства.
[0094] Термин «терапевтическое средство» включает любое количество соединений, известных в настоящее время или которые будут разработаны в будущем, которые действуют в качестве химиотерапевтических средств, антинеопластических соединений, противовоспалительных соединений, антибактериальных соединений, активаторов или ингибиторов ферментов, аллостерических модификаторов, антибиотиков или других средств, которые применяют для достижения желательного терапевтического эффекта у пациента. Терапевтическое средство также может представлять собой токсин или радиоизотоп, при этом предполагаемый терапевтический эффект, например, заключается в уничтожении раковой клетки.
[0095] Термины «эффективное количество» или «количество, эффективное для», или «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, достаточному для вызова обнаруживаемого терапевтического ответа у субъекта. Предпочтительно, чтобы терапевтический ответ обеспечивал эффективное уменьшение пролиферации раковых клеток или, ингибирование роста раковых клеток субъекта. Анализы для определения терапевтических ответов хорошо известны в данной области техники. [0096] Термин «иммуноконъюгат» относится к композиции, включающей антитело, связанное со второй молекулой, такой как детектируемая метка или эффекторная молекула. Часто антитело связано со второй молекулой посредством ковалентной связи.
3
35
32
51
125
[0097] В случае иммуноконъюгата «детектируемая метка» или «детектируемая группа» относится к части иммуноконъюгата, которая обладает свойством, позволяющим ее обнаружить. Например, иммуноконъюгат можно метить с применением радиоактивного изотопа, который позволяет обнаружить клетки, в которых присутствует иммуноконъюгат, в иммуногистохимических анализах. «Детектируемая метка» или «детектируемая группа» представляет собой композицию, которую можно обнаружить с помощью спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических, химических или других физических методов. Например, подходящие метки включают радиоизотопы (например, Н, S, Р, Cr или I), флуоресцентные красители, электроноплотные реагенты, ферменты (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена или другие часто используемые в ИФА ферменты), биотин, дигоксигенин или гаптены и белки, которые можно сделать детектируемыми, например, путем включения радиоизотопной метки в пептид или которые можно использовать для детекции антител, специфически реагирующих с пептидом.
[0098] Термин «условия, обеспечивающие прохождение иммунологической реакции» включает обозначение условий, которые обеспечивают связывание антитела, выработанного к конкретному эпитопу, с этим эпитопом в большей степени с точки зрения возможности обнаружения, чем и/или до исключения в существенной степени, связывание, по существу, со всеми другими эпитопами. Условия, обеспечивающие прохождение иммунологической реакции, зависят от формата реакции связывания антитела и обычно представляют собой условия, которые используются в протоколах иммунологических анализов, или условия, встречающиеся in vivo. В отношении описания форматов и условий иммунологических анализов см. Harlow & Lane, выше. Условия, обеспечивающие прохождение иммунологической реакции, которые используются в способах по настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой «физиологические условия», что подразумевает обозначение условий (например, температура, осмолярность, рН), которые характерны для внутренней среды организма млекопитающего или клетки млекопитающего. Хотя и признано, что некоторые органы подвергаются воздействию экстремальных условий, для внутренней среды организма и клетки характерно рН 7 (т.е. рН от 6,0 до 8,0, чаще от 6,5 до 7,5), наличие воды в качестве преобладающего растворителя и температура выше 0 градусов °С и ниже 50 градусов °С. Осмолярность находится в диапазоне, который поддерживает жизнеспособность и пролиферацию клеток.
[0099] Термин «специфически связывается», «специфичность связывания», «специфически связывается с антителом» или «вступающий в специфическое иммунологическое взаимодействие с» при обозначения эпитопа относится к реакции связывания, которая определяется наличием эпитопа в гетерогенной группе белков или других биологических молекул. Следовательно, при указанных условиях иммунологического анализа конкретные антитела связываются с конкретным эпитопом со специфичностью связывания по меньшей мере в два раза выше фона и чаще в 10-100 раз выше от фона. Можно использовать целый ряд форматов иммунологического анализа для подбора антител, вступающих в специфическое иммунологическое взаимодействие с конкретным белком или углеводом. Например, обычно используют ИФА для подбора антител, вступающих в специфическое иммунологическое взаимодействие с белком или углеводом. См. Harlow & Lane, ANTIBODIES, А LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, New York (1988) and Harlow & Lane, USING ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, New York (1999), в отношении описания форматов и условий иммунологических анализов, которые можно использовать для определения специфической иммунореактивности. Используемый в настоящем документе термин «специфически связывается» означает, что антитело связывается с белком с Kd по меньшей мере около 0,1 мМ, по меньшей мере около 1 мкМ, по меньшей мере около 0,1 мкМ или более, или 0,01 или более.
[00100] Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» используются взаимозаменяемо в настоящем документе для обозначения дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов и их полимеров в одно- или двухцепочечной форме. Этот термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки или связи остова молекулы, которые являются синтетическими, встречающимися в природе или не встречающимися в природе, которые обладают сходными с эталонной нуклеиновой кислотой свойствами связывания и которые подвергаются метаболизму аналогично эталонным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают без ограничения: фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-О-метилрибонуклеотиды, пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК). Специалисту в данной области техники понятно, что комплементарную цепь для последовательности какой-нибудь нуклеиновой кислоты можно определить по другой цепи. Следовательно, любая конкретная последовательность нуклеиновой кислоты, изложенная в настоящем документе, также раскрывает комплементарную цепь.
[00101] Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Эти термины также применимы к встречающимся в природе аминокислотным полимерам, а также аминокислотным полимерам, в котором один или более аминокислотных остатков представляет собой синтетический химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты.
[00102] Термин «аминокислота» относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также аминокислотным аналогам аминокислотных миметиков, который функционируют аналогично встречающимся в природе аминокислотам. Встречающиеся в природе аминокислоты - это аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также модифицированные аминокислоты, например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Термин «аминокислотные аналоги» относится к соединениям, которые имеют такую же фундаментальную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота, т.е. альфа-углеродный атом, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но имеют такую же базовую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота. «Аминокислотные миметики» относится к химическим соединениям, которые имеют структуру, которая отличается от общей химической структуры аминокислоты, но функционируют аналогично встречающейся в природе аминокислоте. Аминокислоты могут обозначаться в настоящем документе либо общеизвестными трехбуквенными символами, либо однобуквенными символами согласно рекомендациям Комиссии по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB.
[00103] Термин «консервативно модифицированные варианты» применим и к аминокислотным последовательностям, и последовательностям нуклеиновых кислот. Что касается конкретных последовательности нуклеиновых кислот, консервативно модифицированные варианты относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или преимущественно идентичные аминокислотные последовательности, или, если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, преимущественно идентичные последовательности. Из-за вырожденности генетического кода большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодируют любой конкретный белок. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU - все кодируют аминокислоту аланин. Следовательно, в каждом положении, в котором аланин определяется кодоном, этот кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения свойств этого кодированного полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот являются «молчащими вариациями», которые представляют собой один вид консервативно модифицированных вариантов. Согласно настоящему документу каждая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, также определяет каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалист в данной области техники признает, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно представляет собой единственный кодон для метионина, и TGG, который обычно представляет собой единственный кодон для триптофана) может быть модифицирован с получением функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, присуща каждой описанной последовательности.
[00104] Что касается аминокислотных последовательностей, специалисту в данной области техники понятно, что отдельные замещения, делеции или вставки в последовательности нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, которые приводят к замене, присоединению или удалению одной аминокислоты или небольшого процента аминокислот в кодированной последовательности, приводят к образованию «консервативно модифицированного варианта», причем указанное изменение приводит к замещению аминокислоты аминокислотой с аналогичными химическими свойствами. Таблицы консервативных замещений, в которых содержится информация об аминокислотах, обладающих сходными функциональными свойствами, хорошо известны в данной области техники. Такие консервативно модифицированные варианты дополнительно включают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели по настоящему изобретению.
[00105] Например, допустимы такие замещения, при которых алифатическая аминокислота (G, A, I, L или V) замещается другим представителем данной группы, или замещение, как, например, замещение одного полярного остатка на другой, как, например, аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин. Каждая из следующих восьми групп содержит другие иллюстративные аминокислоты, которые представляют собой консервативные замещения друг на друга: 1) аланин (А), глицин (G); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серии (S), треонин (Т); и 8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, Creighton, Proteins (1984)).
[00106] Макромолекулярные структуры, такие как полипептидные структуры, можно охарактеризовать по различным уровням организации. Для ознакомления с общим обсуждением этой организации см., например, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3rd ed., 1994) и Cantor and Schimmel, Biophysical Chemistry Part I. The Conformation of Biological Macromolecules (1980). «Первичная структура» относится к аминокислотной последовательности конкретного пептида. «Вторичная структура» относится к локально-упорядоченым, трехмерным структурам полипептида. «Третичная структура» относится к полной трехмерной структуре полипептидного мономера. Домены представляют собой части полипептида, которые образуют компактную структурную единицу полипептида, и их длина обычно составляет от 50 до 350 аминокислот. Типичные домены состоят из участков с организацией более низкого уровня, как, например, фрагменты β-слоя и α-петель. «Четвертичная структура» относится к трехмерной структуре, образующейся путем нековалентного взаимодействия независимых единиц, составляющих четвертичную структуру.
[00107] Термины «выделенный» или «по существу, очищенный», применительно к нуклеиновой кислоте или белку, означают, что нуклеиновая кислота или белок, по существу, не содержат других клеточных компонентов, с которыми они ассоциированы в естественном состоянии. Они предпочтительно характеризуются однородным состоянием, хотя они могут быть находиться в сухом виде или в водном растворе. Степень чистоты и однородность обычно определяют с применением методов аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография. Преобладающую часть препарата составляет белок, который характеризуется существенной степенью очистки.
[00108] Термины «идентичный» или процент «идентичности» в отношении двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или более одинаковым последовательностям или подпоследовательностям, или которые имеют определенный процент отличающихся аминокислотных остатков или нуклеотидов (т.е. идентичны на около 60%, предпочтительно идентичны на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или характеризуются большей идентичностью на протяжении определенной области при сравнении или выравнивании на максимальное соответствие на протяжении указанного окна сравнения или обозначенной области), согласно измерениям с применением алгоритмов BLAST или BLAST 2.0 для сравнения последовательностей с параметрами по умолчанию, описанными ниже, или с помощью ручного выравнивания и визуально. Тогда такие последовательности считаются «по существу, идентичными». Это определение также относится или может применяться к комплементарной цепи исследуемой последовательности. Это определение также подразумевает последовательности, которые имеют делеции и/или вставки, а также последовательности, которые имеют замещения. Как описано ниже, предпочтительные алгоритмы могут учитывать пробелы и тому подобное. Идентичностью предпочтительно характеризуется область, длина которой составляет по меньшей мере около 25 аминокислот или нуклеотидов, или более предпочтительно область, длина которой составляет 50-100 аминокислот или нуклеотидов.
[00109] Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность выступает в роли эталонной последовательности, с которой сравнивают исследуемую последовательность. При использования алгоритма для сравнения последовательностей исследуемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, в случае необходимости задают координаты подпоследовательностей и задают параметры программы с алгоритмом сравнения последовательностей. Предпочтительно можно использовать параметры программы по умолчанию или задать альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей рассчитывает процент идентичности последовательностей для исследуемой последовательности в сравнении с эталонной последовательностью на основании заданных параметров программы.
[00110] Используемый в настоящем документе термин «окно сравнения» охватывает обозначение сегмента, состоящего из любого количества смежных положений, выбранных из группы, состоящей из 20-600, обычно от около 50 до около 200, чаще от около 100 до около 150 положений, по которым последовательность можно сравнить с эталонной последовательностью, состоящей из такого же количества смежных положений после оптимального выравнивая двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения широко известны в данной области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть выполнено, например, с помощью алгоритма локального выравнивания Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), с помощью алгоритма глобального выравнивания Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), с помощью метода поиска сходства Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. USA 85: 2444, 1988; с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном пакете Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) или при помощи выравнивания вручную и визуальной проверки (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)). При сравнении последовательностей, которые описаны в настоящем документе, часто используют выравнивание по Smith & Waterman с параметрами по умолчанию.
[00111] Другими примерами алгоритма, которые подходят для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) и Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403410 (1990), соответственно. BLAST и BLAST 2.0 обычно используют с параметрами по умолчанию для определения сходства последовательностей, что касается нуклеиновых кислот и белков по настоящему изобретению. Программное обеспечение для проведения анализов с применением BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации. Этот алгоритм включает, во-первых, идентификацию пар последовательностей с наибольшей балльной оценкой (HSP) путем определения коротких слов длиной W в последовательности запроса, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому пороговому баллу Т при выравнивании с положительной оценкой, либо соответствуют слову такой же длины в последовательности базы данных. Т называют пороговым баллом соседних слов. Эти изначальные совпадения соседних слов играют роль затравки для начальных поисков для того, чтобы найти более длинные содержащие их HSP. Совпадения слов распространяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности по мере увеличения кумулятивного балла выравнивания. Кумулятивные баллы для нуклеотидных последовательностей рассчитываются с применением, параметра М (наградный балл оценка для пары совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл для несовпадающих остатков, всегда <0). Для аминокислотных последовательностей для расчета кумулятивного балла используется матрица расчета баллов. Распространение совпадений слов в каждом направлении останавливается когда: кумулятивный балл выравнивания падает ниже величины X от полученного для него максимального значения; кумулятивный балл достигает нулевого или более низкого значения, из-за накопления одного или нескольких отрицательных баллов для выравнивания остатков; или по достижению конца последовательности. Параметры W, Т и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) по умолчанию применяются: длина слова (W), равная 11, ожидание, равное (Е) 10, предельное значение, равное 100, М=5, N=-4 и сравнение обоих цепей. Для аминокислотных (белковых) последовательностей программе BLASTP в качестве параметров по умолчанию используют длину слова, равную 3, ожидание (Е), равное 10, и матрицу расчета баллов BLOSUM62 (см. Henikoff& Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915)). Для целей настоящего изобретения используют алгоритм BLAST2.0 с параметрами по умолчанию.
[00112] «Библиотека фагового дисплея» относится к «библиотеке» бактериофагов, на поверхности которых экспрессируются экзогенные пептиды или белки. Чужеродные пептиды или полипептиды экспонируются на внешней поверхности фагового капсида. Чужеродный пептид может быть экспрессирован в виде рекомбинантных слитых белков, включенных в состав белка оболочки фага, в виде рекомбинантных слитых белков, которые отличаются от естественных белков оболочки фага, но которые способны встраиваться во внешнюю поверхность капсида, или в виде белков или пептидов, которые связываются с помощью ковалентной или нековалентной связи с такими белками. Это осуществляется путем встраивания экзогенной последовательности нуклеиновой кислоты в нуклеиновую кислоту, которая может быть упакована в фаговые частицы. Такие экзогенные последовательности нуклеиновых кислот могут быть встроены, например, в кодирующую последовательность гена белка оболочки фага. Если чужеродную последовательность клонируют в рамку считывания, белок, который она кодирует, будет экспрессироваться в составе белка оболочки. Следовательно, библиотеки последовательностей нуклеиновых кислот, как, например, библиотеки антительных репертуаров, полученных в результате экспрессии сегментов генов, кодирующих полный репертуар антител, вырабатываемых В-клетками одного или более индивидуумов, также могут быть встроены в геном фага для создания «фаговых библиотек». По мере экспрессии пептидов и белков, относящихся к пептидам и белкам, кодируемым библиотекой нуклеиновых кислот, в фаге образуется «пептидная библиотека». Тогда как при составлении таких библиотек используют множество бактериофагов, обычно используют нитчатый фаг (Dunn (1996) Curr. Opin. Biotechnol. 7: 547-553). См., например, описание библиотек фагового дисплея ниже по тексту.
[00113] Термин «химерные антитела» относится к антителам, в которых аминокислотную последовательность молекулы иммуноглобулина получают из двух или более видов. Обычно вариабельная область и легкой и тяжелой цепей соответствуют вариабельной области антител, полученных у одного вида млекопитающих (например, мышь, крыса, кролик и тому подобное), с желаемой специфичностью, аффинностью и связывающей способностью, тогда как константные области гомологичны последовательностям антител, полученных у другого вида (обычно человека), чтобы избежать выработки иммунного ответа у этого субъекта.
[00114] Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» или «гипервариабельный участок» используются взаимозаменяемо в настоящем документе и обозначают часть антигена, которая распознается и специфически связывается конкретным антителом. Если антиген представляет собой полипептид, эпитопы могут формироваться и из смежных аминокислот и несмежных аминокислот, сближающихся за счет укладки белка в третичную структуру. Эпитопы, формирующиеся из смежных аминокислот, обычно сохраняются после денатурации белка, тогда как эпитопы, формирующиеся за счет укладки белка в третичную структуру, обычно утрачиваются после денатурации белка. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3 и чаще по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот, имеющих уникальную пространственную конформацию. Антигенная детерминанта может конкурировать с интактным антигеном (т.е. «иммуногеном», используемым для выработки иммунного ответа) за связывание с антителом.
[00115] Конкуренцию между антителами определяют с помощью анализа, в котором исследуемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с гетерологичным антигеном. Известно много видов анализов конкурентного связывания, например: твердофазный прямой или непрямой радиоиммунный анализ (РИА), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (ИФА), конкурентный иммуноанализ в сэндвич-формате (см. Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242-253 (1983)); твердофазный прямой ИФА с использованием биотина-авидина (см. Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614-3619 (1986)); твердофазный прямой анализ с использованием меченого антигена, твердофазный прямой анализ с использованием меченого антигена в сэндвич-формате (см. Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press (1988)); твердофазный прямой РИА с использованием меченого антигена, с использованием метки 1-125 (см. Morel et al., Molec. Immunol. 25(1): 7-15 (1988)); твердофазный прямой ИФА с использованием биотина-авидина (Cheung et al., Virology 176: 546-552 (1990)); и прямой РИА с использованием метки (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32: 77-82 (1990)). Обычно такой анализ включает применение очищенного антигена, связанного с твердой фазой, или клеток, содержащих немеченый исследуемый иммуноглобулин и меченный эталонный иммуноглобулин. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества метки, связавшейся с твердой фазой или клетками, в присутствии исследуемого иммуноглобулина. Обычно исследуемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Антитела, идентифицируемые с помощью анализа конкурентного связывания (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же самым эпитопом, что и эталонное антитело и антитела, связывающиеся со смежным антителом, достаточно близко расположенном к эпитопу, связываемому эталонным антителом, для того чтобы возникло стерическое несоответствие. Обычно, если конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание эталонного антитела с гетерологичным антигеном по меньшей мере на 50 или 75%.
[00116] Антитела по настоящему изобретению, например, VH-полипептиды, VL-полипептиды или одноцепочечные антитела, можно получить с использованием стандартных методов, известных в области технологии рекомбинантной ДНК. Основные руководства, в которых описаны общие способы, использованные в настоящем изобретении, включают Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001) и Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1999).
[00117] Гуманизированные антитела по настоящему изобретению можно получить путем пересадки структур, определяющих специфичность, т.е. антигенсвязывающих петель антитела-донора, обычно антитела мыши на каркасный участок антитела человека. Каркасные области легких и тяжелых цепей антител человека, представленных в настоящем документе, без труда сможет установить специалист-практик. Номера положений тяжелых и легких цепей обозначают в соответствии со стандартными системами нумерации, например, системами нумерации по Кабат и Чотиа. Система нумерации по Чотиа идентична системе по Кабат, но вставки вводятся в CDR-L1 и CDR-H1 в структурно разные положения. Если не указано иное, в настоящем документе использована система нумерации по Кабат, что касается положений в последовательностях. Положение аминокислотного остатка в конкретной последовательности VH или VL не относится к количеству аминокислот в конкретной последовательности, но, скорее, относится к положению, которое обозначено со ссылкой на систему нумерации.
[00118] Положения CDR и, следовательно, положения каркасных областей тяжелых и легких цепей антител человека устанавливают с использованием определений, которые стандартны в данной области техники. Например, обычно используют следующие четыре определения. Определение Кабат основано на вариабельности последовательностей и чаще всего используется. Определение Чотиа основано на местоположении структурных петельных областей. Определение на основе модели антитела является компромиссом между двумя используемыми программными обеспечениями Oxford Molecular для моделирования антител. Определение контактов было недавно внедрено и основано на анализе доступных комплексных кристаллических структур. Ниже приводятся положения петель, т.е. CDR, установленные с применением четырех разных определений.
[00119] Последовательность VH или VL по настоящему изобретению содержит тяжелую или легкую цепь, которая, как правило, идентична по меньшей мере на 70%, чаще идентична на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности, входящей в состав SEQ ID NO: 5-22, 29-57, 91-100 или 107-116.
[00120] Кроме того, за пределами CDR OS2966 был идентифицирован целый ряд важных остатков, которые предпочтительно используются в гуманизированных VH- и VL-цепях. Например, в одном варианте реализации изобретения один или более аминокислотных остатков в VH-цепи идентичны остаткам OS2966 (SEQ ID NO: 2), включая остатки 48, 67, 69, 73, 76, 80, 89, 91 и 93. В одном варианте реализации изобретения один или более аминокислотных остатков в VL-цепи идентичны остаткам OS2966 (SEQ ID NO: 4), включая остатки 36 и 71.
[00121] Гуманизированное антитело по настоящему изобретению связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело-донор, например, связывается с тем же самым эпитопом β1-интегрина или конкурирует за связывание с тем же самым эпитопом β1-интегрина, с которым, например, связывается OS2966. Способы определения способности указанного антитела связываться с тем же самым эпитопом хорошо известны в данной области техники, см., например, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, в котором раскрыты методы картирования эпитопов или, в качестве альтернативы, эксперименты по конкурентному связыванию для определения способности указанного антитела связываться с тем же самым эпитопом, что и антитело-донор.
[00122] Стабильное гуманизированное антитело по настоящему изобретению может иметь измененную аффинность по сравнению с антителом-донором. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения аффинность одноцепочечного гуманизированного антитела к интегрину β1, например, может быть сниженной по сравнению с одноцепочечным антителом, содержащим VH- и VL-области OS2966. Такое снижение может быть 10-кратным в сравнении, но обычно гуманизированное антитело по настоящему изобретению имеет аффинность, которая составляет по меньшей мере 25%, чаще по меньшей мере 50% от аффинности сравнимого антитела дикого типа. («Сравнимое антитело дикого типа» относится к антителу того же самого варианта реализации изобретения, например, scFv, которое содержит VH- и VL-области антитела-донора.) В некоторых вариантах реализации изобретения аффинность по отношению к эпитопу увеличивается, так что гуманизированное антитело по настоящему изобретению имеет аффинность, которая в 2 раза, а иногда и в 5, 10, 50 или 100 раз выше аффинности сравнимого антитела дикого типа.
[00123] Области тяжелой и легкой цепи по настоящему изобретению обычно получают с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Методологии рекомбинантной ДНК, которые обычно применяют для этого хорошо известны специалистам в данной области техники. Обычно последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие каркасные участки и CDR антител-доноров, получают с помощью ПЦР, например, с использованием перекрывающихся праймеров. В этом методе антигенсвязывающие последовательности антитела-донора обычно соединяют с каркасными областями антитела человека путем встраивания необходимых последовательностей в олигонуклеотиды и получения серии продуктов с применением ПЦР, которые содержат необходимые последовательности антитела-донора и человека. Затем эти продукты можно объединить обычно с применением дополнительных ПЦР-реакций в правильной ориентации для получения VH- и VL-цепей, которые содержат каркасные области антитела человека с CDR антитела-донора. ДНК-последовательности VL и VH можно лигировать вместе либо непосредственно, либо через ДНК-последовательность, кодирующую пептидный линкер, с применением методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Эти методы включают ПЦР, а также методы, такие как лигирование in vitro. Последовательности VL и VH можно соединить в любой ориентации.
[00124] Из уровня техники известно достаточно примеров методов, чтобы специалисты могли реализовать способы амплификации in vitro.
[00125] Олигонуклеотиды, которые коммерчески недоступны, можно химически синтезировать по способу твердофазного фосфорамидитного синтеза, впервые описанного Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22: 1859-1862 (1981), с использованием автоматического синтезатора, как описано в Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984). Очистка олигонуклеотидов осуществляется либо с помощью электрофореза в акриламидном геле в нативных условиях, либо с помощью анионообменной ВЭЖХ, как описано в Pearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983).
[00126] Последовательность клонированных генов и синтетических олигонуклеотидов можно верифицировать после клонирования с использованием, например, секвенирования.
[00127] ПЦР-продукты субклонируют в подходящие клонирующие векторы, которые хорошо известны специалистам в данной области техники и коммерчески доступны. Затем определяют нуклеотидную последовательность кодирующих областей тяжелой или легкой цепи.
[00128] Специалисту в данной области техники понятно, что, используя информацию о последовательностях, полученную для вариабельных областей, получают нуклеиновые кислоты, кодирующие эти последовательности, с применением любого количества дополнительных способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Следовательно, ДНК, кодирующую Fv-области, получают с помощью любого подходящего способа, включая, например, другие методы амплификации, такие как лигазная цепная реакция (ЛЦР), транскрипционная амплификация и самоподдерживающаяся репликация последовательностей или клонирование и рестрикция соответствующих последовательностей.
[00129] Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и фрагменты антител по настоящему изобретению, также можно получить путем прямого химического синтеза с применением методов, таких как фосфотриэфирный метод; фосфодиэфирный метод; диэтилфосфорамидитный метод; и твердофазный способ из патента США №4458066. Если последовательность ДНК синтезирую химическим способом, в результате образуется одноцепочечный олигонуклеотид. Из него можно получить двухцепочечную ДНК путем гибридизации с использованием комплементарной последовательностью или путем полимеризации с использованием ДНК-полимеразы с применением одиночной цепи в качестве матрицы. Тогда как представляется возможным синтезировать химическим способом полную одноцепочечную Fv-область, предпочтительно синтезировать некоторое количество более коротких последовательностей (около 100-150 оснований), которые обычно позже подвергают сплайсингу, например, с применением ПЦР с перекрывающимися праймерами.
[00130] Применительно к нуклеиновым кислотам, единицы измерения массы приводятся либо в тысячах пар оснований (т.п.н.), либо в парах оснований (п.о.). Это расчетные показатели, получаемые на основе данных гель-электрофореза в агарозе или акриламиде, на основе данных секвенирования нуклеиновых кислот или на основе опубликованных данных для ДНК-последовательностей. Применительно к белкам, единицы измерения массы приводятся в килодальтонах или количестве аминокислотных остатков. Массу белков рассчитывают на основе данных гель-электрофореза, на основе данных секвенирования белков, на основе данных полученных аминокислотных последовательностей или на основе опубликованных данных для последовательностей белков.
[00131] VH- и VL-доменьт антитела по настоящему изобретению могут быть непосредственно связаны или могут быть разделены линкером, например, для стабилизации вариабельных доменов легкой цепи и тяжелой цепи антител, соответственно. Подходящие линкеры хорошо известны специалистам в данной области техники и включают хорошо известный линкер GlyGlyGlyGlySer (SEQ ID NO: 122) или его вариант. Например, типичным линкером является (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 123). Другие линкеры, включая шарнирные области, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают линкеры, которые описаны, например, в Alfthan et al, Protein Eng. 8(7), 725-31; Choi et al, Eur. J Immunol. 31(1), 94-106; Hu et al, Cancer Res. 56(13), 3055-61; Kipriyanov, et al, Protein Eng. 10(4), 445-53; Pack, et al, Biotechnology (NY) 11(11), 1271-7; и Roovers, et al, Cancer Immunol. Immunother. 50(1): 51-9.
[00132] Для получения высокого уровня экспрессии клонированного гена или нуклеиновой кислоты, таких как кДНК, кодирующие гуманизированные антитела, например, гуманизированное антитело по настоящему изобретению или иммуноконъюгат, или химерное антитело, содержащее гуманизированное антитело по настоящему изобретению, обычно субклонируют нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или иммуноконъюгат, в экспрессирующий вектор, который содержит соответствующий промотор для регуляции транскрипции, терминатор транскрипции/трансляции и в случае нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, сайт связывания рибосом для инициации трансляции. Подходящие бактериальные промоторы хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в Sambrook et al. и Ausubel et al, Бактериальные экспрессирующие системы для экспрессии белков доступны, например, в Е.coli, Bacillus sp.и Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302: 543-545 (1983). Наборы для таких экспрессирующих систем коммерчески доступны. Эукариотические системы экспрессии для клеток млекопитающих, дрожжей и клеток насекомых хорошо известны в данной области техники и также коммерчески доступны.
[00133] Часто для того, чтобы экспрессировать белок в клетке на высоком уровне, при конструировании последовательности нуклеиновой кислоты, которую необходимо экспрессировать, учитывается предпочтение в выборе кодона. Следовательно, нуклеиновую кислоту из одного организма, например, человека или мыши, можно создать с учетом предпочтения в выборе кодона экспрессирующей системы.
[00134] Выбор промотора, используемого для регуляции экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, зависит от конкретного применения. Промотор необязательно располагается примерно на том же расстоянии от сайта инициации транскрипции гетерологичной нуклеиновой кислоты, как и от сайта инициации транскрипции естественной нуклеиновой кислоты. Однако, как известно в данной области техники, допустимо некоторое изменение данного расстояния без потери функции промотора.
[00135] Помимо промотора, экспрессирующий вектор обычно содержит транскрипционную единицу или экспрессирующую кассету, которая содержит все дополнительные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, в клетках-хозяевах. Типичная экспрессирующая кассета, следовательно, содержит промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который необходимо экспрессировать, и сигналы, необходимые для эффективного полиаденилирования транскрипта, сайты связывания рибосом и сайты терминации трансляции. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, обычно может быть связана с последовательностью отщепляемого сигнального пептида для обеспечения секреции кодируемого белка трансформированной клеткой. Такие сигнальные пептиды в числе прочих включают сигнальные пептиды из тканевого активатора плазминогена, инсулина и фактора роста нервов, и эстеразы ювенильного гормона Heliothis virescens. Дополнительные элементы кассеты могут включать энхансеры и в случае использования геномной ДНК в качестве структурного гена, интроны с донорными и акцепторными сайтами сплайсинга.
[00136] Помимо последовательности промотора, экспрессирующая кассета также должна содержать область терминации транскрипции за структурным геном для обеспечения эффективной терминации. Область терминации может быть получена из того же гена, что и последовательность промотора, или может быть получена из разных генов.
L
[00137] Контрольные последовательности экспрессии, которые подходят для использования в конкретной клетке-хозяине, часто получают путем клонирования гена, который экспрессируется в этой клетке. Широко используемые прокариотические контрольные последовательности, определения для которых приведены в настоящем документе, включают промоторы для инициации транскрипции, необязательно с оператором, наряду с последовательностями сайта связывания с рибосомой, включают такие широко используемые промоторы, как промоторные системы генов бета-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (lac) (Change et al., Nature (1977) 198: 1056), промоторная система гена триптофана (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res). (1980) 8: 4057), tac-промотор (DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80: 21-25); и Pпромотор, полученный из фага лямбда, и сайт связывания рибосом N-гена (Shimatake et al., Nature (1981) 292: 128). Конкретная система промотора не носит ограничительного характера для настоящего изобретения, может быть использован любой доступный промотор, который функционирует у прокариот.
[00138] Стандартные бактериальные экспрессирующие векторы включают плазмиды, такие как плазмиды на основе pBR322, например, pBLUESCRIPT™' pSKF, pET23D, векторы, полученные с фага лямбда, и слитые экспрессирующие системы, такие как GST и LacZ. Эпитопные метки также могут быть присоединены к рекомбинантным белкам для обеспечения удобных способов выделения, например, c-myc, метка НА, метка 6-His (SEQ ID NO: 124), белок, связывающий мальтозу, метка VSV-G, метка, специфичная к DYKDDDDK (SEQ ID NO: 125), или любая такая метка, большое количество которых хорошо известно специалистам в данной области техники.
[00139] Эукариотические системы экспрессии для клеток млекопитающих, дрожжей и клеток насекомых хорошо известны в данной области техники и также коммерчески доступны. Для дрожжей векторы включают плазмиды, интегрирующиеся в геном дрожжевых клеток (Yeast Integrating plasmids) (например, Ylp5), и плазмиды, реплицирующиеся в дрожжевых клетках (Yeast Replicating plasmids) (серия плазмид YRp), а также pGPD-2. Экспрессирующие векторы, содержащие регуляторные элементы из эукариотических вирусов, обычно используются в эукариотических экспрессирующих векторах, например, векторы SV40, векторы, полученные из вируса папилломы, и векторы, полученные из вируса Эпштейна-Барра. Другие иллюстративные эукариотические векторы включают pMSG, pAV009/A+, рМТО10/А+, pMAMneo-5, pDSVE бакуловируса и любой другой вектор, обеспечивающий экспрессию белков под управлением промотора CMV, раннего промотора SV40, позднего промотора SV40, промотора гена металлотионеина, промотора вируса рака молочных желез мышей, промотора вируса саркомы Рауса, промотора гена полиэдрина, или других промоторов, которые продемонстрировали эффективность в обеспечении экспрессии генов в эукариотических клетках.
[00140] Некоторые экспрессирующие системы имеют маркеры, обеспечивающие амплификацию генов, такие как тимидинкиназа, гигромицин В-фосфотрансфераза и дигидрофолатредуктаза. В качестве альтернативы также подходят системы экспрессии с высоким выходом продукта, не связанные с амплификацией генов, как, например, применение вектора на основе бакуловируса в клетках насекомых с GPCR-кодирующей последовательностью под контролем промотора гена полиэдрина или других сильных промоторов генов бакуловируса.
[00141] Элементы, которые обычно включают в экспрессирующие векторы, также включают репликон, который функционирует в Е.coli, ген, кодирующий устойчивость к антибиотику, для обеспечения селекции бактерий, несущих рекомбинантные плазмиды, и уникальные сайты рестрикции во второстепенных областях плазмид для обеспечения вставки эукариотических последовательностей. Выбор конкретного гена устойчивости к антибиотикам не имеет решающего значения, подходят любые гены из многих известных в данной области техники генов устойчивости. Последовательности прокариотических генов необязательно выбирают таким образом, чтобы они не препятствовали репликации ДНК в эукариотических клетках в случае необходимости.
[00142] Стандартные способы трансфекции используют для получения линий бактериальных клеток, клеток млекопитающих, дрожжевых клеток или клеток насекомых для экспрессии белка в больших количествах, который затем очищают с использованием стандартных методов (см, например, Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods в Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). Трансформация эукариотических и прокариотических клеток осуществляется в соответствии со стандартными методами (см., например, Morrison, J. Bact. 132: 349-351 (1977); Clark-Curtiss&Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu et al., eds, 1983).
[00143] Могут быть использованы любые из хорошо известных методик для введения чужеродных нуклеотидных последовательностей в клетки-хозяева. Они включают применение трансфекции с использованием фосфата кальция, полибрена, слияние протопластов, электропорацию, липосомы, микроинъекцию, плазмидные векторы, вирусные векторы и любые другие хорошо известные методы введения клонированной геномной ДНК, кДНК, синтетической ДНК или другого чужеродного генетического материала в клетку-хозяина (см., например, в Sambrook и Russell, выше). Только необходимо, чтобы конкретная используемая генно-инженерная методика способствовала успешному введению по меньшей мере одного гена в клетку-хозяина, способную к экспрессии полипептида по настоящему изобретению.
[00144] После экспрессии вектор вводят в клетки, трансфецированные клетки культивируют в условиях, способствующих экспрессии белка, который выделяют из культуральной среды с использованием стандартных методов, указанных ниже.
[00145] Специалисту в данной области техники понятно, каким образом можно модифицировать нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид по настоящему изобретению (то есть антитело, метку или эффектор, или иммуноконъюгат, образующийся с использованием антитела) без уменьшения его биологической активности. Некоторые модификации могут быть внесены для облегчения клонирования, экспрессии или включения молекулы-мишени в слитый белок. Такие модификации хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, например, терминирующие кодоны, кодоны, отвечающие за добавление метионина к аминному концу, для получения сайта инициации транскрипции, добавление дополнительных генов аминокислот на любом конце для обеспечения удобного расположения сайтов рестрикции или дополнительных генов аминокислот для облегчения процесса очистки (как, например, полиHis).
[00146] После экспрессии рекомбинантные антитела, иммуноконъюгаты и/или эффекторные молекулы по настоящему изобретению могут быть очищены в соответствии со стандартными методиками в данной области техники, включая осаждение сульфатом аммония, применение колонок для аффинной хроматографии, колоночную хроматографию и тому подобное (см, в целом, R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Предпочтительными являются, по существу, чистые композиции с гомогенностью по меньшей мере около 90-95%, и наиболее предпочтительными для использования в фармацевтике являются композиции с гомогенностью от 98 до 99% и более. После частичной очистки или очистки до достижения требуемой гомогенности в случае применения в терапевтических целях полипептиды, по существу, не должны содержать эндотоксины.
[00147] Были описаны способы экспрессии одноцепочечных антител и/или повторной укладки с образованием соответствующей активной формы, включая одноцепочечные антитела, в клетках бактерий, таких как E.coli, и они хорошо известны и применимы к антителам по настоящему изобретению. См., Buchner, et al., Anal Biochem. 205: 263-270 (1992); Pluckthun, Biotechnology 9: 545 (1991); Huse, et al., Science 246: 1275 (1989) и Ward, et al., Nature 341: 544 (1989), все включены в настоящий документ посредством ссылки.
[00148] Часто функциональные гетерологичные белки выделяют из Е.coli или других бактерий из телец включения, и это требует солюбилизации с применением сильных денатурирующих веществ и последующей повторной укладки. Как хорошо известно в данной области техники, на этапе солюбилизации для расщепления дисульфидных связей необходимо наличие восстанавливающего средства. Иллюстративным буфером с восстанавливающим средством является: 0,1 М Трис, рН 8, 6 М гуанидин, 2 мМ ЭДТА, 0,3 М ДТЭ (дитиоэритритол). Повторное окисления дисульфидных связей может происходить в присутствии низкомолекулярных тиоловых реагентов в восстановленной и окисленной форме, как описано в Saxena, et al., Biochemistry 9: 5015-5021 (1970), который включен в настоящий документ посредством ссылки, и, особенно, как описано Buchner, et al., выше.
[00149] Ренатурация обычно осуществляется путем разбавления (например, 100-кратного) денатурированного и восстановленного белка в ренатурирующем буфере. Иллюстративный буфер состоит из 0,1 М Триса, рН 8,0, 0,5 М L-аргинина, 8 мМ окисленного глутатиона (GSSG) и 2 мМ ЭДТА.
[00150] В качестве модификации протокола очистки двухцепочечного антитела, области тяжелой и легкой цепей подвергают раздельной солюбилизации и восстановлению, и затем объединяют в ренатурирующем растворе. Предпочтительный выход получают, когда эти два белка смешивают в молярном соотношении таким образом, чтобы не превысить 5-кратный молярный избыток одного белка по сравнению с другим. Желательно добавлять избыток окисленного глутатиона или других окисляющих низкомолекулярных соединений в ренатурирующий раствор после завершения тиол-дисульфидного обмена.
[00151] В дополнение к рекомбинантным способам антитела и иммуноконъюгаты по настоящему изобретению также можно полностью или частично сконструировать с применением стандартного пептидного синтеза. Твердофазный синтез полипептидов по настоящему изобретению, длиной менее чем около 50 аминокислот, может быть выполнен путем присоединения С-концевой аминокислоты последовательности к нерастворимой подложке с последующим последовательным добавлением остальных аминокислот в последовательность. Методы твердофазного синтеза описаны Barany & Merrifield, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. VOL. 2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS, PART A. pp. 3-284; Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156 (1963), and Stewart, et al., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2ND ED., Pierce Chem. Co., Rockford, 111. (1984). Белки большей длины можно синтезировать путем конденсации аминного и карбоксильного концов более коротких фрагментов. Способы формирования пептидных связей путем активации карбоксильного конца (например, путем использования связывающего реагента N, N'-дициклогексилкарбодиимида) известны специалистам в данной области техники.
[00152] Консервативно модифицированные варианты антител по настоящему изобретению характеризуются по меньшей мере 80% сходством последовательностей, часто по меньшей мере 85% сходством последовательностей, 90% сходством последовательностей или по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сходством последовательностей на аминокислотном уровне с представляющим интерес белком, таким как гуманизированное антитело по настоящему изобретению.
[00153] Как отмечалось, термин «консервативно модифицированные варианты» применим и к аминокислотным последовательностям, и последовательностям нуклеиновых кислот. Что касается конкретных последовательности нуклеиновых кислот, консервативно модифицированные варианты относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или преимущественно идентичные аминокислотные последовательности, или, если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, преимущественно идентичные последовательности. Из-за вырожденности генетического кода большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодируют любой конкретный белок. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU - все кодируют аминокислоту аланин. Следовательно, в каждом положении, в котором аланин определяется кодоном, этот кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения свойств этого кодированного полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот являются «молчащими вариациями», которые представляют собой один вид консервативно модифицированных вариантов. Согласно настоящему документу каждая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, также определяет каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области техники понятно, что для получения функционально идентичной молекулы можно модифицировать каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно представляет собой единственный кодон для метионина). Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, присуща каждой описанной последовательности.
[00154] Что касается аминокислотных последовательностей, специалисту в данной области техники понятно, что отдельные замещения, делеции или вставки в последовательности нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, которые приводят к замене, присоединению или удалению одной аминокислоты или небольшого процента аминокислот в кодированной последовательности, приводят к образованию «консервативно модифицированного варианта», причем указанное изменение приводит к замещению аминокислоты аминокислотой с аналогичными химическими свойствами.
32
125
[00155] В одном варианте реализации изобретения предложен иммуноконъюгат, содержащий гуманизированное антитело по настоящему изобретению, связанное с эффекторной молекулой или детектируемой меткой. Предпочтительно эффекторной молекулой является терапевтическая молекула, такая как, например, токсин, химиотерапевтическое средство, небольшая молекула, цитокин или хемокин, фермент или радиоизотопная метка. Иллюстративные токсины включают без ограничений экзотоксин Pseudomonas или дифтерийный токсин. Подходящие токсины описаны, например, в Chaudhary, et al. (1987) Proc Natl Acad Sci US A 84: 4538, Chaudhary, et al. (1989) Nature 339: 394, Batra, et al. (1991) Mol Cell Biol 11: 2200. Brinkmann, et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 8616, Siegall, (1995) Semin Cancer Biol 6: 289. Примеры небольших молекул включают без ограничений, химиотерапевтические соединения, такие как таксол, доксорубицин, этопозид и блейомицин. Иллюстративные цитокины включают без ограничений ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6 и ИЛ-12. Подходящие цитокины и хемокины описаны, например, в Rosenblum et al. (2000) Int J Cancer 88: 267 and Xu et al. (2000) Cancer Res 60: 4475 и Biragyn et al. (1999) Nat Biotechnol 17: 253. Иллюстративные ферменты включают без ограничений РНКазы, ДНКазы, протеазы, киназы и каспазы. Подходящие протеазы описаны, например, в Bosslet et al. (1992) Br J Cancer 65: 234, Goshom et al. (1993) Cancer Res 53: 2123, Rodrigues et al. (1995) Cancer Res 55: 63, Michael et al. (1996) Immunotechnology 2:47, Haisma et al. (1998) Blood 92: 184. Иллюстративные радиоизотопы включают без ограничений Р и I. Подходящие радионуклиды также описаны, например, в Colcher et al. (1999) Ann N Y Acad Sci 880: 263. Дополнительными иллюстративными эффекторными фрагментами являются, например, Fc-фрагменты из гомологичных или гетерологичных антител.
[00156] Специалисту в данной области техники понятно, что последовательность любой белковой эффекторной молекулы можно изменить таким способом, чтобы, по существу, не ухудшить функциональные преимущества эффекторного белка. Например, глицин и аланин обычно считаются взаимозаменяемыми, как и аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, аспарагин и глутамин. Специалисту в данной области техники понятно, что многие различные измененные эффекторные последовательности будут кодировать эффекторы, обладающие примерно такой же активностью, что и нативный эффектор.
[00157] Как описано выше, эффекторную молекулу и антитело можно конъюгировать с помощью химических или рекомбинантных способов, как описано выше. Химические модификации включают, например, дериватизацию с целью связывания эффекторной молекулы и антитела друг с другом либо непосредственно, либо посредством связывающего соединения с помощью способов, которые хорошо известны в области химии белков. В случае гуманизированных антител по настоящему изобретению можно использовать способы и ковалентного, и нековалентного присоединения.
2
[00158] Метод присоединения эффекторной молекулы к антителу будет изменяться в зависимости от химической структуры группы, которую необходимо присоединить к антителу. Полипептиды обычно содержат много функциональных групп; например, карбоксильные группы (-СООН), свободные аминогруппы (-NH) или сульфгидрильные (-SH) группы, которые доступны для взаимодействия с подходящей функциональной группой на антителе, чтобы обеспечить связывание с эффекторной молекулой.
[00159] В альтернативном варианте антитело получают таким образом, чтобы обеспечить экспонирование или присоединение дополнительных реакционноспособных функциональных групп. Дериватизация может включать присоединение любой линкерной молекулы из целого таких молекул, которые доступны от Pierce Chemical Company, Rockford Ill.
[00160] Линкер способен к образованию ковалентных связей и с антителом, и с эффекторной молекулой. Подходящие линкеры хорошо известны специалистам в данной области техники и включают без ограничений углеродные линкеры с прямой или разветвленной цепью, гетероциклические линкеры или пептидные линкеры. Если антитело и эффекторная молекула представляют собой полипептиды, линкеры могут быть присоединены к входящим в их состав аминокислотам через их боковые группы (например, через дисульфидную связь к цистеину). Однако в предпочтительном варианте реализации изобретения линкеры будут соединены с альфа-углеродным атомом аминных и карбоксильных групп концевых аминокислот.
[00161] В некоторых случаях желательно, чтобы произошло отделение эффекторной молекулы от антитела, когда иммуноконъюгат связывается с сайтом-мишенью. Таким образом, в этих условиях иммуноконъюгаты будут содержать связи, которые поддаются расщеплению вблизи сайта-мишени. Расщепление линкера для отделения эффекторной молекулы от антитела может происходить ферментативным путем или в условиях, в которых иммуноконъюгат находится либо внутри клетки-мишени или вблизи сайта-мишени. Если сайт-мишень представляет собой опухоль, может быть использован линкер, который поддается расщеплению в условиях, характерных для микроокружения опухоли (например, при воздействии опухолеассоциированных ферментов или кислого рН).
[00162] В предпочтительном варианте реализации химической конъюгации по настоящему изобретению средство соединения эффекторной молекулы и антитела включает гетеробифункциональный конденсирующий реагент, который, в конечном счете способствует образованию межмолекулярной дисульфидной связи между эффекторной молекулой и антителом. Другие типы конденсирующих реагентов, которые пригодные к использованию в этом качестве для целей настоящего изобретения, описаны, например, в патенте США №4545985. В альтернативном варианте межмолекулярная дисульфидная связь может быть образована между остатками цистеина в эффекторной молекуле и антителом природного происхождения, или может быть введена с помощью генной инженерии. Средства для соединения эффекторной молекулы и антитела могут также включать применение тиоэфирных связей между гетеробифункциональными сшивающими реагентами или специфических расщепляемых при низком рН сшивающих средств или специфических расщепляемых протеазами линкеров, или других расщепляемых или нерасщепляемых химических связей. Средства для соединения эффекторной молекулы и антитела также могут включать введение пептидильной связи, образующейся между эффекторной молекулой и антителом, которые синтезируются отдельно с помощью стандартных химических методов синтеза пептидов или рекомбинантных методов.
[00163] Примеры химических модификаций эффекторной молекулы и антитела по настоящему изобретению также включают дериватизацию с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ), чтобы продлить период полувыведения из кровеносной системы и уменьшить иммуногенность, в соответствии с хорошо известными способами (см., например, Lisi, et al., Applied Biochem. 4: 19 (1982); Beauchamp, et al., Anal Biochem. 131: 25 (1982); и Goodson, et al., Biotechnology 8: 343 (1990)).
3
125
35
14
32
[00164] Антитела по настоящему изобретению необязательно могут быть ковалентно или нековалентно связаны с детектируемой меткой. Детектируемые метки, подходящие для применения с этой целью, включают любую композицию, которую можно обнаружить спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Пригодные метки в настоящем изобретении включают магнитные гранулы (например, DYNABEADS), флуоресцентные красители (например, флуоресцеинизотиоцианат, техасский красный, родамин, зеленый флуоресцентный белок и тому подобное), радиоизотопные метки (например, Н, I, S, С или Р), ферменты (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и другие ферменты, обычно используемые в ИФА), и колориметрические метки, такие как гранулы коллоидного золота или цветного стекла, или пластика (например, полистирола, полипропилена, латекса и тому подобное).
[00165] Средства обнаружения таких меток хорошо известны специалистам в данной области техники. Следовательно, например, радиоактивные метки могут быть обнаружены с помощью фотопленки или сцинтилляционных счетчиков, флуоресцентные маркеры могут быть обнаружены с помощью фотодетектора для обнаружения излучаемой флуоресценции. Ферментные метки обычно обнаруживаются посредством обеспечения взаимодействия фермента с субстратом и обнаружения продукта реакции, образующегося в результате воздействия фермента на субстрат, а колориметрические метки обнаруживают путем простой визуализации цветной меткой.
[00166] Антитела и/или иммуноконъюгат композиции по настоящему изобретению особенно пригодны к использованию для парентерального введения, такого как внутривенное введение или введение в полости тела.
[00167] Композиции для введения обычно содержат раствор антитела и/или иммуноконъюгата, растворенного в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе. Могут быть использованы различные водные носители, например, забуференный физиологический раствор и тому подобное. Эти растворы являются стерильными и, в целом, не содержат вредных веществ. Эти композиции можно стерилизовать с помощью обычных, хорошо известных методов стерилизации. Эти композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые необходимы для приближения к физиологическим условиям, как, например, вещества, регулирующие рН, и буферные вещества, вещества, регулирующие токсичность, и тому подобное, например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и тому подобное. Концентрацией слитого белка в этих препаратах можно широко варьировать, и ее подбирают в первую очередь, исходя из объемов жидкости, вязкости, массы тела и тому подобное, в соответствии с конкретным выбранным способом введения и потребностями пациента.
[00168] Следовательно, типичная дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению для внутривенного введения будет составлять около 0,1-10 мг на пациента в день. Могут быть использованы дозировки от 0,1 до около 100 мг на пациента в сутки. Современные способы приготовления композиций для введения известны или очевидны для специалистов в данной области техники и описаны более подробно в таких публикациях, как REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 19ТН ED., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995).
[00169] Композиции по настоящему изобретению можно вводить для терапевтических воздействий. При применении в терапевтических целях композиции вводят пациенту, страдающему от заболевания, в количестве, достаточном для излечения или по меньшей мере для частичной для купирования заболевания и связанных с ним осложнений. Количество, адекватное для достижения этой цели, определяется как «терапевтически эффективная доза». Количества, эффективные для применения с данной целью, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния здоровья пациента. Эффективным количеством соединения является количество, которое обеспечивает либо субъективное облегчение симптома (симптомов) или объективно различимое улучшение, которое отмечает клиницист или другой квалифицированный специалист.
[00170] В зависимости от дозировки и частоты введения, необходимых и переносимых пациентом, осуществляют однократное или многократное введение препарата. В любом случае композиция должна обеспечивать поступление достаточного количества белков по настоящему изобретению, чтобы обеспечить эффективное лечение пациента. Предпочтительно осуществляется одноразовое введение, но введение может осуществляться периодически либо до достижения терапевтического эффекта, либо до того момента, когда из-за побочных эффектов возникнет необходимость в досрочном завершении терапии. Как правило, этой дозы достаточно для лечения или облегчения симптомов, или признаков заболевания, без оказания неприемлемого токсического воздействия на пациента.
[00171] Композиции иммуноконъюгата с контролируемым высвобождением для парентерального применения по настоящему изобретению могут быть выполнены в виде имплантатов, масляных инъекций или в виде дисперсных систем. Для более широкого ознакомления с системами доставки белков см. Banga, A.J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, Pa., (1995), который включен в настоящий документ посредством ссылки. Дисперсные системы включают микросферы, микрочастицы, микрокапсулы, нанокапсулы, наносферы и наночастицы. Микрокапсулы содержат терапевтический белок в качестве центральной коровой структуры. В микросферах терапевтическое вещество диспергировано по всей частице. Частицы, микросферы и микрокапсулы с размером, меньшим чем около 1 мкм, в целом, называют наночастицами, наносферами и нанокапсулами, соответственно. Капилляры имеют диаметр около 5 мкм, так что только наночастицы вводятся внутривенно. Диаметр микрочастиц обычно составляет около 100 мкм, и их вводят подкожно или внутримышечно. См., например, Kreuter, J., COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., pp. 219-342 (1994); и Tice & Tabibi, TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, N.Y., pp. 315-339, (1992), оба из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.
[00172] Для контролируемого высвобождения ионов из композиций иммуноконъюгата по настоящему изобретению могут быть использованы полимеры. Различные разлагаемые и неразлагаемые полимерные матрицы для применения с целью контролируемой доставки лекарственных средств известны в данной области техники (Langer, R., Accounts Chem.. Res. 26: 537-542 (1993)). Например, блок-сополимер, полаксамер 407 при низких температурах существует в виде вязкой, но, тем не менее, подвижной жидкости, но образует полутвердый гель при температуре тела. Было показано, что он является эффективным носителем для приготовления препарата и замедленной доставки рекомбинантного интерлейкина-2 и уреазы (Johnston, et al., Pharm. Res. 9: 425-434 (1992); и Pec, et al, J. Parent. Sci. Tech. 44(2): 58-65 (1990)). В альтернативном варианте в качестве микроносителя для контролируемого высвобождения белков был использован гидроксиапатит (Ijntema, et. al., Int. J. Pharm. 112: 215-224 (1994)). Еще в одном аспекте для контролируемого высвобождения, а также направленной доставки инкапсулированного в липиды лекарственного вещества использованы липосомы (Betageri, et al., LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa. (1993)). Известны многочисленные дополнительные системы для контролируемой доставки терапевтических белков. См., например, патенты США №5055303, 5188837, 4235871, 4501728, 4837028 4957735 5019369 и, 5055303; 5514670; 5413797; 5268164; 5004697; 4902505; 5506206, 5271961; 5254342 и 5534496, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки.
[00173] Используемые в настоящем документе термины «рак» и «раковый» обозначают или служат для описания физиологического состояния у млекопитающих, при котором популяция клеток характеризуется неконтролируемым ростом клеток. Примеры рака включают без ограничений карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз, доброкачественные или злокачественные опухоли. Более конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких, плоскоклеточный рак легких, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или карциному матки, карциному слюнных желез, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени и различные виды рака головы и шеи, нейрофиброматоз типа I или II. Другие примеры таких видов рака включают устойчивые к терапии, рефрактерные или метастатические виды рака.
[00174] Другие заболевания или нарушения, которые можно лечить, включают «воспалительные заболевания или нарушения». Используемый в настоящем документе термин «воспалительное заболевание или нарушение» включает без ограничений прурит, воспаление кожи, псориаз, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, остеоартрит, системную красную волчанку, тиреоидит Хашимото, миастению гравис, диабет типа I или II, астму, воспалительное поражение легких, воспалительное поражение печени, воспалительное поражение клубочков, атопический дерматит, аллергический контактный дерматит, раздражающий контактный дерматит, себорейный дерматит, синдром Шегрена, кератоконъюнктивит, увеит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание суставов, кожи или мышцы, острый или хронический идиопатический воспалительный артрит, миозит, демиелинизирующие заболевания, хроническое обструктивное заболевание легких, интерстициальное заболевание легких, интерстициальный нефрит и хронический активный гепатит.
[00175] Используемый в настоящем документе термин «метастазы» относится к процессу, посредством которого раковые клетки распространяются или перемещаются из очага возникновения в другие области тела с развитием аналогичного ракового поражения в новом местоположении. «Метастатическая» или «метастазирующая» клетка представляет собой клетку, которая утрачивает адгезивные контакты с соседними клетками и мигрирует через кровяное русло или лимфу из первичного очага заболевания для инвазии в соседние структуры тела.
[00176] Используемый в настоящем документе термин «субъект» относится к любому животному (например, млекопитающему), включая без ограничений человека, низших приматов, грызунов и им подобных, которое должно получать конкретное лечение. Обычно термины «субъект» и «пациент» используются в настоящем документе взаимозаменяемо по отношению к человеку.
[00177] Используемый в настоящем документе термин «субъект с подозрением на наличие рака» относится к субъекту, у которого проявляется один или несколько симптомов, свидетельствующих о наличии рака (например, заметная припухлость или масса), или который подвергается скрининговому исследованию на наличие рака (например, во время обычного физикального осмотра). Субъект с подозрением на наличие рака также может иметь один или несколько факторов риска развития рака. Субъект с подозрением на наличие рака, в целом, не был обследован на наличие рака. Однако термин «субъект с подозрением на наличие рака» охватывает индивидуума, который прошел первоначальную диагностику, но для кого не известна стадия рака. Термин дополнительно включает людей, которые когда-то имели рак (например, индивидуум с заболеванием в стадии ремиссии).
[00178] Используемый в настоящем документе термин «субъект, который имеет риск наличия рака» относится к субъекту, с одним или несколькими факторами риска для развития конкретного рака. Факторы риска включают без ограничений пол, возраст, генетическую предрасположенность, воздействие окружающей среды, предыдущие случаи возникновения рака, предсуществующие заболевания нераковой природы и образ жизни.
[00179] Используемый в настоящем документе термин «характеристика рака у субъекта» относится к определению одного или нескольких свойств образца пораженной раком ткани субъекта, включая без ограничений наличие доброкачественной, предраковой или пораженной раком ткани, стадию рака и прогноз для субъекта. Виды рака могут быть охарактеризованы путем определения экспрессии одного или нескольких маркерных генов, принимающих участие в развитии рака, включая без ограничений раскрытые в настоящем документе маркерные гены.
[00180] Используемые в настоящем документе термины «онкомаркер (онкомаркеры)», «опухолевый маркер (опухолевые маркеры)» или «маркер (маркеры) солидной опухоли» относятся к гену или генам, или белку, полипептиду, или пептиду, образующихся в результате экспрессии гена или генов, уровни экспрессии которых отдельно или в комбинации с другими генами, коррелируют с наличием онкогенных раковых клеток по сравнению с неонкогенными клетками, как, например, в случае интегрина β1. Корреляция может относиться либо к повышенной или пониженной экспрессии гена (например, повышенным или пониженным уровням мРНК или пептида, кодируемого геном).
[00181] Используемый в настоящем документе термин «обнаружение пониженного или повышенного уровня экспрессии по сравнению с экспрессией, характерной для контроля, не пораженного раком» относится к измерению уровня экспрессии гена (например, уровня мРНК или белка) по отношению к уровню, характерному для контрольного образца, не пораженного раком. Экспрессию генов можно определить с помощью любого подходящего способа, включая, без ограничений способы, которые описаны в настоящем документе.
[00182] Используемый в настоящем документе термин «обнаружение изменения уровня экспрессии генов в образце клеток в присутствии указанного исследуемого соединения по сравнению с отсутствием указанного исследуемого соединения» относится определению изменения уровня экспрессии (например, увеличения или уменьшения) в присутствии исследуемого соединения по сравнению с отсутствием исследуемого соединения. Экспрессию генов можно определить с помощью любого подходящего способа.
[00183] Используемый в настоящем документе термин «инструкции по применению указанного набора для обнаружения рака у указанного субъекта» включает инструкции по применению содержащихся в наборе реагентов для обнаружения и характеристики рака в образце, взятом у субъекта.
[00184] Используемый в настоящем документе «постановка диагноза» или «диагностическая информация» относится к любой информации, которая будет полезной при определении наличия или отсутствия заболевания, или нарушения у пациента и/или при разделении заболеваний или нарушений на категории по фенотипическим признакам или любые категории, имеющие значение с точки зрения прогноза или вероятной реакции на лечение (либо лечения, в целом, или какого-либо конкретного вида лечения) заболевания или нарушения. Аналогичным образом, диагностика относится к предоставлению любого рода диагностической информации, включая без ограничений информацию о вероятном наличии или отсутствии заболевания у субъекта (как, например, в случае опухоли), информацию, связанную с природой или классификацией опухоли, как, например, в случае опухоли с высоким риском развития или опухоли с низким риском развития, информацию, связанную с прогнозом и/или информацию, полезную при выборе соответствующего лечения. Выбор лечения может включать выбор конкретного химиотерапевтического средства или другого способа лечебного воздействия, такого как оперативное вмешательство или лучевая терапия, или выбор, заключающийся в приостановлении или проведении терапии.
[00185] Используемые в настоящем документе термины «составление прогноза», «прогностическая информация» или «прогнозируемая информация» относится к предоставлению информации, касающейся влияния рака (например, согласно определениям с помощью диагностических способов по настоящему изобретению) на дальнейшее состояние здоровье субъекта (например, предполагаемая заболеваемость или смертность, вероятность заболевания раком и риск появления метастазов).
[00186] Используемый в настоящем документе термин «опухолевая ткань, поученная в результате оперативного вмешательства» относится к раковой ткани субъекта (например, биоптату ткани), которая был удалена (например, во время оперативного вмешательства).
[00187] Используемый в настоящем документе термин «субъект, которому был поставлен диагноз рака» относится к субъекту, которого обследовали и у которого обнаружили раковые клетки. Рак может быть выявлен с помощью любого подходящего способа, включая без ограничений биопсию, рентгенограмму, анализ крови и способы диагностики по настоящему изобретению.
[00188] Используемые в настоящем документе термины «биоптат ткани», «образец, взятый у пациента», «образец опухоли» и «образец раковой ткани» относятся к образцу клеток, ткани или биологической жидкости, которые берут у субъекта с целью определения наличия или отсутствия раковой ткани в образце, включая раковые клетки, или для определения профиля экспрессии генов, характерного для этой раковой ткани. В некоторых вариантах реализации изобретения биоптат тканей или биологическая жидкость были взяты из-за подозрения на наличии рака у субъекта. Затем биоптат ткани или биологическую жидкость исследуют на присутствие или отсутствие рака, раковых клеток и/или исследуют профиль экспрессии генов в раковых клетках.
[00189] В определенных вариантах реализации настоящего изобретения экспрессия раковых клеток, как, например, раковых клеток поджелудочной железы, толстой кишки, молочной железы, печени, почек, головного мозга, GBM и им подобных, включает повышение уровней интегрина β1 по сравнению неонкогенными опухолевыми клетками толстой кишки. Интегрины представляют собой гетеродимерные белки экстраклеточного матрикса (ЭКМ), состоящие из альфа- и бета-цепи, которые обеспечивают связывание со многими партнерами с образованием различных интегринов. Принимая участие в клеточной адгезии и миграции, интегрины обеспечивают обратимое взаимодействия клеток с экстраклеточным матриксом или с рецепторами на других клетках, и, таким образом, играют решающую роль в инвазии и метастазировании раковых клеток. Интегрин-опосредованная адгезия также влияет на внутриклеточные сигнальные пути и, таким образом, обеспечивает регуляцию выживаемости, пролиферации и дифференцировки клеток.
[00190] Интегрин β1 может функционально взаимодействовать с наибольшим количеством известных альфа-интегринов, в результате чего приобретает способность взаимодействовать с разнообразными компонентами ЭКМ и вовлечен в развитие рака. Например, избыточная активность сигнального пути, связанного с интегрином β1, ассоциирована с ростом злокачественных опухолей при раке молочной железы, как в клинических проявлениях, так и в линиях опухолевых клеток в культуре.
[00191] Было обнаружено, что интегрин β1 непосредственно влияет на рост опухоли. Конкретно, воздействие на опухолевые клетки антителами к интегрину β1 уменьшает размер опухоли и подавляет метастазы.
[00192] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы определения экспрессии интегрина β1 в качестве онкомаркера. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения уровень экспрессии определяют непосредственно (например, на уровне белка), в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения уровень экспрессии определяют в образцах тканей (например, биоптатах тканей). В других вариантах реализации настоящего изобретения уровень экспрессии определяют в биологических жидкостях (например, включая без ограничений плазму крови, сыворотку крови, цельную кровь, слизь и мочу). В настоящем изобретении дополнительно предложены наборы для обнаружения маркеров, в некоторых вариантах реализации изобретения наличие онкомаркера используется для составления прогноза для субъекта. Информация также используется для назначения курса лечения. Например, если у субъекта обнаружен маркер, свидетельствующий о наличии клеток солидной опухоли, можно начать применение дополнительных видов терапии (например, гормональную или радиационную терапию) на более раннем этапе, когда они с большей вероятностью будут эффективными (например, до появления метастазов). В дополнение к этому, если у субъекта обнаружена опухоль, которая не отвечает на гормональную терапию, можно избежать растрат и неудобств, связанных с такой терапией.
[00193] В вариантах реализации изобретения экспрессию гена интегрина β1 определяют путем измерения уровня белка. Уровень экспрессии гена можно измерить с помощью любого подходящего способа. В некоторых вариантах реализации изобретения белки обнаруживают с помощью иммуногистохимии с применением антител, описанных в настоящем документе.
[00194] Связывание антитела обнаруживают с помощью методик, известных в данной области техники (например, радиоиммуноанализ, ИФА (твердофазный иммуноферментный анализ), иммунологические анализы в «сэндвич» формате, иммунорадиометрические анализы, реакция диффузии в геле, анализы иммунодиффузии, иммунологические анализы in situ (например, с применением коллоидного золота, ферментных или радиоизотопных меток), вестерн-блот, реакции преципитации, анализы агглютинации (например, анализы агглютинации в геле, анализы гемагглютинации и т.д.), анализы фиксации комплемента, иммунофлуоресцентные анализы, анализы с использованием белка А и иммуноэлектрофоретические анализы и т.д.
[00195] В одном варианте реализации изобретения связывание антитела осуществляется путем детектирования метки на первичном антителе. В другом варианте реализации изобретения первичное антитело обнаруживается посредством обнаружения связывания вторичного антитела или реагента с первичным антителом. В дополнительном варианте реализации изобретения вторичное антитело мечено. В данной области техники известны многие способы обнаружения связывания в иммуноанализе, и они находятся в пределах объема настоящего изобретения.
[00196] В некоторых вариантах реализации изобретения используется автоматизированной анализ обнаружения. Способы автоматизации иммуноанализов включают способы, которые описаны в патентах США №5885530, 4981785, 6159750 и 5358691, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации изобретения также автоматизировано проведение анализов и представление результатов. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения применяют программное обеспечение, которое составляет прогноз, исходя из наличия или отсутствия ряда белков, соответствующих онкомаркерам.
[00197] В других вариантах реализации изобретения могут применять иммуноанализ, описанный в патентах США №5599677 и 5672480, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки.
[00198] В некоторых вариантах реализации изобретения используется компьютерная аналитическая программа для преобразования необработанных данных, полученных с помощью анализа для обнаружения (например, присутствие, отсутствие или количество конкретного маркера или маркеров), в данные, несущие прогностическую ценность для клинициста. Врач может получить доступ к прогностическим данным с применением любых подходящих средств. Следовательно, преимущество некоторых вариантов реализации настоящего изобретения дополнительно заключается в том, что клиницисту, который, вероятно, будет проходить практику по генетике и молекулярной биологии, не обязательно нужно понимать необработанные данные. Данные предоставляются непосредственно клиницисту в наиболее приемлемой форме. В этом случае для оптимизации ухода за больным клиницист сразу же сможет воспользоваться данной информацией.
[00199] Настоящее изобретение предусматривает любой способ, обеспечивающий возможность получения, обработки и передачи информации в лаборатории и из лабораторий, в которых проводятся анализы, источников информации, медицинского персонала и субъектов. Например, в некоторых вариантах реализации по настоящему изобретению у субъекта берут образец (например, биоптат или сыворотку, или образец мочи) и направляют в профильный центр (например, клиническую лабораторию в медицинском учреждении, службу по определению профиля генома, и т.д.), расположенный в любой части мира (например, в стране, отличной от страны, где проживает субъект или где, в конечном счете, используется информация) для получения необработанных данных. Если образец включает ткань или другой биологический образец, субъект может посетить медицинский центр, чтобы у него взяли образец и отправили в профильный центр, или субъекты могут сами взять образцы и напрямую отправить их в профильный центр. Если образец включает ранее определенную биологическую информацию, субъект может напрямую отправить информацию в профильную службу (например, информационную карту, содержащую информацию, можно отсканировать с помощью компьютера и передать данные на компьютер профильного центра, используя электронную систему связи). После поступления образца в профильную службу его подвергают обработке и получают профиль (например, данные экспрессии), характерный для диагностической или прогностической информации, которая необходима субъекту.
[00200] Данные профиля затем получают в формате, подходящем для интерпретации лечащим врачом-клиницистом. Например, вместо предоставления необработанных данных экспрессии подготовленный формат может представлять собой диагноз или оценку риска для субъекта наряду с рекомендациями для конкретных вариантов лечения. Эти данные могут быть продемонстрированы клиницисту любым подходящим способом. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения профильная служба составляет отчет, который может быть распечатан для врача-клинициста (например, во время осмотра) или отображаться на мониторе компьютера клинициста.
[00201] В некоторых вариантах реализации изобретения информацию сначала анализируют в момент осмотра больного или в местном учреждении. Затем необработанные данные направляются в центральное учреждение по обработке данных для дальнейшего анализа и/или для преобразования необработанных данных в подходящую для применения информацию для клинициста или пациента. Преимущество центрального учреждения по обработке данных заключается в предоставлении конфиденциальности (все данные хранятся в центральном учреждении по обработке данных с единообразными протоколами безопасности), скорости и единообразия анализа данных. Центральное учреждение по обработке данных затем может контролировать судьбу данных после лечения субъекта. Например, с применением электронной системы связи центральное учреждение может предоставлять данные клиницисту, субъекту или исследователям.
[00202] В некоторых вариантах реализации изобретения субъект имеет прямой доступ к данным с применением электронной системы связи. Субъекту предоставлен выбор дальнейшего медицинского вмешательства или консультации, исходя из результатов. В некоторых вариантах реализации изобретения данные используются для исследовательских целей. Например, данные могут быть использованы для дальнейшей оптимизации включения или исключения маркеров, как пригодных показателей конкретного состояния или стадии заболевания.
[00203] В других вариантах реализации в настоящем изобретении предложены наборы для выявления и характеристики рака. В некоторых вариантах реализации изобретения наборы содержат антитела, специфические по отношению к онкомаркеру, как, например, антитела по настоящему изобретению, в дополнение к детектирующим реагентам и буферам. В других вариантах реализации изобретения наборы содержат реагенты, предназначенные для обнаружения мРНК или кДНК (например, олигонуклеотидные зонды или праймеры). В некоторых вариантах реализации изобретения наборы содержат все необходимые компоненты и/или в достаточном количестве для осуществления анализа для обнаружения, включая все контроли, инструкции для осуществления анализов, а также любое необходимое программное обеспечение для анализа и представления результатов.
[00204] Другой вариант реализации настоящего изобретения относится к набору для исследования наличия белков, таких как интегрин β1, например, в образце ткани или в биологической жидкости. В наборе может содержаться, например, антитело для детекции полипептида. В дополнение к этому, набор может содержать стандартный или контрольный образец; инструкции для обработки образцов, проведения исследования и интерпретации результатов; и буферы, и другие реагенты, необходимые для проведения исследования.
[00205] В некоторых вариантах реализации изобретения применяют методы визуализации in vivo экспрессии онкомаркеров у животного (например, человека или млекопитающего, кроме человека). Например, в некоторых вариантах реализации изобретения интегрин β1 мечен с применением меченого антитела по настоящему изобретению. Специфически связанные меченые антитела могут быть обнаружены в клетках индивидуума с использованием способа визуализации in vivo, включая без ограничений радионуклидную визуализацию, позитронно-эмиссионную томографию, компьютеризованную аксиальную томографию, рентгенографию или магнитно-резонансный метод визуализации, обнаружение флуоресценции и обнаружение хемилюминесции.
[00206] Способы визуализации in vivo по настоящему изобретению пригодны для диагностики раковых опухолей, которые экспрессируют маркеры, характерные для клеток солидных опухолей, по настоящему изобретению (например, при раке молочной железы). Визуализацию in vivo используют для визуализации маркера, свидетельствующего о наличии рака. Такие методы обеспечивают диагностику без применения неприятной биопсии. Способы визуализации in vivo по настоящему изобретению также можно использовать для предоставления прогнозов для пациентов, больных раком. Например, можно обнаружить маркер, свидетельствующий о наличии раковых клеток. Способы визуализации in vivo по настоящему изобретению дополнительно можно использовать для обнаружения метастатических раковых опухолей рака в других частях тела.
[00207] В некоторых вариантах реализации изобретения реагенты (например, антитела), специфические по отношению к онкомаркерам по настоящему изобретению, мечены флуоресцентной меткой. Меченые антитела вводят субъекту (например, перорально или парентерально). Антитела, меченные флуоресцентной меткой, детектируют с применением любого подходящего способа (например, с применением устройства, описанного в патенте США №6198107, который включен в настоящий документ посредством ссылки).
[00208] В других вариантах реализации изобретения антитела мечены радиоактивной меткой. Применение антител для диагностики in vivo хорошо известно в данной области техники.
[00209] В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложены препараты для лечения заболеваний и нарушений, включая иммунологические/воспалительные заболевания и нарушения, учитывая более широкую функциональную роль интегрина β1, которая обсуждалась выше. Кроме того, заболевания и нарушения, на которые можно направленно воздействовать с помощью композиций по настоящему изобретению, включают множественный склероз, болезнь Крона, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника и тому подобное. Аналогичным образом следует полагать, что можно направленно воздействовать на определенные заболевания глаз, включая влажную форму возрастной макулярной дегенерации сетчатки (ВМД).
[00210] В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложены препараты для лечения заболеваний, таких как рак, например, рак молочной железы, головного мозга, предстательной железы и толстой кишки. В некоторых вариантах реализации изобретения онкомаркеры, такие как интегрин β1, являются мишенями в методах терапии.
[00211] В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложены антитела, которые направлено воздействуют на опухолевые клетки, которые экспрессируют онкомаркер, например, интегрин β1.
[00212] В некоторых вариантах реализации изобретения терапевтические антитела включают антитело по настоящему изобретению, конъюгированное с цитотоксическим средством, которое обсуждалось выше.
[00213] Следующие ниже примеры приведены с целью дополнительной иллюстрации преимуществ и признаков настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Несмотря на то, что их обычно используют, в качестве альтернативы могут быть использованы другие процедуры, методики или методы, известные специалистам в данной области техники.
ПРИМЕР 1
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ВАРИАБЕЛЬНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА
6
[00214] Анализировали последовательность генов, кодирующих вариабельные (V)-области моноклонального антитела OS2966 к интегрину β1 человека. Общую РНК экстрагировали из 3-10×10 клеток гибридомы с применением набора RNAqueous-4PCR Kit™ (Ambion, Уоррингтон, Великобритания) и использовали для синтеза кДНК. Фрагменты тяжелой и каппа-легкой цепи V-области иммуноглобулина мыши амплифицировали с помощью ПЦР с применением праймеров для вырожденных лидерных последовательностей генов иммуноглобулина мыши (Sigma) и уникальных праймеров для константных доменов (Sigma), как показано в Таблице 1. Полученные в результате ПЦР-фрагменты субклонировали в векторную систему pGEM-T Easy I™ (Promega, Саутгемптон, Великобритания), и вставки секвенировали с применением вектор-специфического праймера M13Forward (Sigma). Все этапы секвенирования ДНК были выполнены Geneservice Ltd, Кембридж, Великобритания. Уникальные нуклеотидные последовательности V-области были получены для OS2966 (SEQ ID NO: 1 (VH) и 3 (VL)).
[00215]
ПРИМЕР 2
СОЗДАНИЕ ХИМЕРНЫХ АНТИТЕЛ
R
[00216] Последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи моноклонального антитела OS2966 амплифицировали с помощью ПЦР и субклонировали в векторы pANT для экспрессии антител (Фигура 14), причем V-области тяжелой и легкой цепи клонировали в pANT17 и pANT13, соответственно. Гены V-области тяжелой цепи клонировали в pANT17 с применением сайтов узнавания MluI и HindIII в одной рамке считывания либо с геном χ1 тяжелой цепи иммуноглобулина человека (аллотип (Glm3 (Glm(f)), либо с геном χ4 тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и гены V-области легкой цепи клонировали в pANT13 с применением сайтов узнавании BssHII и BamHI в одной рамке считывания с геном константной области легкой цепи каппа-типа иммуноглобулина человека (аллотип Km3). Транскрипция генов и тяжелой, и легкой цепей осуществлялась под контролем промотора CMV I/E (US 5168062 и US 5385839, Университет Айовы), и в плазмиде pANT17 содержался мутантный миниген dhfr (Simonsen & Levinson 1983, PNAS 80: 2495-2499) под контролем промотора SV40 и поли(А)-последовательности для обеспечения селекции в эукариотических клетках. И pANT17, и pANT13 содержали ген β-лактамазы (Ap) для обеспечения селекции в прокариотических клетках и точку начала репликации рМВ1 для размножения в клетках прокариот. Все плазмиды размножали в клетках Е.coli штамма XL 1-blue (Stratagene, номер по каталогу 200130).
[00217] Затем экспрессирущие конструкции тяжелой и легкой цепей котрансфецировали либо транзиентно трансфецировали в клетки НЕК293 с применением трансфекции на основе фосфата кальция, либо стабильно трансфецировали в клетки NS0 путем электропорации. Секретируемые антитела выделяли из культуральных супернатантов с помощью хроматографии на белке А.
ПРИМЕР 3
ПОЛУЧЕНИЕ ГУМАНИЗИРОВАННЫХ АНТИТЕЛ
[00218] Гуманизированные антитела получали с применением способов, описанных в ЕР 1844074 (Antitope Ltd). Структурные модели V-областей антител мыши получали с применением Swiss PDB и анализировали для определения важных аминокислот из V-областей OS2966, которые, вероятно, имеют важное значение для связывания антитела с интегрином β1 («лимитирующие остатки»). Для идентификации сегментов последовательностей V-областей антител человека, содержащих каждый ограничивающий остаток, который необходимо использовать при разработке гуманизированных антител, применяли базу данных последовательностей V-областей антител человека. Для введения в последовательность каждого лимитирующего остатка обычно применяли две или более альтернативные последовательности сегментов V-областей, в результате чего получали большое число возможных гуманизированных последовательностей V-областей антител к интегрину В1. Затем эти последовательности анализировали для предсказания связывания пептида с МНС класса II клеток, не являющихся зародышевыми, с помощью анализа in silico, как описано в Fothergill et al. (WO 9859244, патентообладатель Eclagen Ltd), а также на предмет наличия известных CD4+ Т-клеточных эпитопов с применением баз данных, включая "The Immune Epitope Database and Analysis Resource", доступную во всемирной компьютерной сети по следующему адресу: immuneepitope.org/. Последовательности V-областей, характерные для предсказанных пептидов, связывающихся с МНС класса II клеток, не являющихся зародышевым, или характеризующиеся значительными совпадениями по базам данных для Т-клеточных эпитопов, исключали из исследования. В результате этого набор последовательностей V-областей сократился. Затем выбранные комбинации сегментов последовательностей V-областей объединяли для получения гуманизированных аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелых и легких цепей. Для синтеза гена были выбраны последовательности пяти тяжелых цепей и четырех легких цепей (обозначены VH1-VH5, и Vκ1-Vκ4, соответственно) (SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22). В дополнение к этому, дополнительно был разработан набор последовательностей тяжелых и легких цепей V-области (обозначены VH6-VH15 и Vκ5-Vκ13, соответственно) (SEQ ID NO: 29-38 и 44-52, соответственно).
[00219] В дополнение к вышеописанному, гуманизированные антитела были разработаны с применением общих способов Winter (патент США №6548640 В2) с изменениями по Winter, Carr, Harris (ЕР 0629240 В1), в которых были разработаны последовательности с применением последовательностей CDR антитела OS2966 (SEQ ID NO: 23-28), для замены последовательностей CDR в наборе последовательностей V-областей, характерных для клеток зародышевой линии человека, путем присоединения последовательностей J-областей иммуноглобулина человека. В дополнение к этому, лимитирующие остатки, упомянутые в вышеприведенном абзаце, которые используются в гуманизированных антителах, вводили в каркасные последовательности V-областей иммуноглобулинов, характерных для клеток зародышевой линии. Полученные в результате последовательности тяжелой и легкой цепей V-областей были обозначены как VH16-VH20 и Vκ14-Vκ18, соответственно, и перечислены как SEQ ID NO: 39-43 и 53-57.
[00220] В дополнение к вышеописанному, были разработаны деиммунизированные антитела с применением общих способов Carr et al. (US 7465572 В2), с помощью которых были идентифицированы эпитопы CD4+ Т-клеток, находящиеся внутри последовательностей V-области OS2966 (SEQ ID NO: 2 и 4), и для потенциального удаления одного или более из указанных эпитопов вводили мутации. [00221] ДНК, кодирующую V-области варианта гуманизированного OS2966, синтезировали и субклонировали в экспрессирующие векторы pANT17 и pANT13, как описано в Примере 2. Все комбинации гуманизированных VH- и VK-цепей (т.е. комбинации VH1-VH5 и Vκ1-Vκ4 (т.е. в общей сложности 20 пар) транзиентно трансфецировали в HEK293, а также трансфецировали в клетки NS0, и антитела выделяли из культуральных супернатантов с помощью хроматографии на белке А, как описано в Примере 2.
ПРИМЕР 4
АНАЛИЗ ГУМАНИЗИРОВАННЫХ АНТИТЕЛ
[00222] Связывание гуманизированных вариантов OS2966, полученных с применением клеток HEK и NS0, с интегрином β1 человека оценивали с помощью ИФА по конкурентному связыванию в сравнении с химерным антителом из Примера 2. Химерное антитело OS2966 биотинилировали с применением набора Biotin Tag™ Micro Biotinylation (Sigma-Aldrich). 96 луночные планшеты MaxiSorp (Nunc) покрывали интегрином β1 человека в концентрации 0,5 мкг/мл (конечный объем 100 мкл) при температуре 4°С на протяжении ночи. Планшеты промывали промывочным буфером (0,05% Tween20 в ФСБ Дульбекко) и блокировали с применением ФСБ Дульбекко-2% БСА в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 3 раза промывочным буфером. Исследуемые гуманизированные антитела в различных концентрациях предварительно смешивали с биотинилированным химерным антителом (конечная концентрация 0,02 мкг/мл) и затем добавляли в планшеты, покрытые интегрином β1 человека (конечный объем 100 мкл). Планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и промывали 3 раза промывочным буфером. Добавляли 100 мкл стрептавидина-пероксидазы хрена (Sigma-Aldrich) с разведением 1 к 500 и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза промывочным буфером и добавляли 100 мкл субстрата SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich, номер по каталогу Р9187), и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 4 минут. Реакцию останавливали путем добавления 50 мкл 3М HCl. Образцы анализировали спектрофотометрически на планшетном анализаторе Dynex при 490 нм.
ПРИМЕР 5
ПОЛУЧЕНИЕ scFv'- И Fab'-ФРАГМЕНТОВ
[00223] Из вариантов гуманизированного антитела OS2966 к интегрину человека из Примера 3 получали scFv'-фрагменты и клонировали в векторы М13 для фагового дисплея, как описано в Benhar I. and Reiter Y., Current Protocols in Immunology, Unit 10.19B, Wiley Online Library, May 2002 (доступен во всемирной компьютерной сети по следующему URL-адресу: currentprotocols.com/protocol/im1019b), с применением вектора pCANTAB5E в составе экспрессирущего модуля RPAS (Amersham Pharmacia Biotech, Литл Чалфонт, Великобритания). Гуманизированные VH- и VK-гены амплифицировали с применением праймеров, которые обеспечивали введение концевых сайтов рестрикции SfiI и NotI, внутреннего линкера Gly4Ser и С-концевой метки his6 в продукт амплификации. Конструкции, содержащие scFv, встраивали в вектор pCANTAB5E в виде фрагментов SfiI-NotI и трансформировали ими E.coli НВ2151, что приводило к экспорту scFv в периплазму и частично в ростовую среду. scFv'-фрагменты выделяли из ростовой среды посредством никель-хелатной аффинной хроматографии с применением картриджей HIS-Select HF (Sigma-Aldrich). Очищенные scFv'-фрагменты исследовали в анализе конкурентного связывания, как подробно описано в Примере 4. Из гуманизированных вариантов OS2966 из Примера 3 также получали Fab'-фрагменты с применением способа, использованного для scFv'-фрагментов, за исключением того, что амплифицированные гены гуманизированных VH и VK дополнительно амплифицировали с генами СН1 и Сκ константной области с образованием фрагментов VH-CH1 и VK-Сκ, которые дополнительно амплифицировали с праймерами для соединения этих фрагментов с лидерной последовательностью pelB, состоящей из 22 аминокислот ((Lei S.P., Lin Н.С., Wang S.S., Callaway J., and Wilcox G., J Bacteriol. 169 (1987) p 4379-4383), между фрагментами генов VH-CH1, расположенными выше сайта инициации транскрипции, и VK-Сκ, расположенными ниже сайта инициации транскрипции, что приводит к образованию бицистронного гена Fab. Fab'-фрагменты из вариантов гуманизированных антител были получены и очищены, как описано выше для scFv'-фрагментов, и исследованы в анализе конкурентного связывания интегрина 01 человека, как подробно описано в Примере 4.
ПРИМЕР 6
АНАЛИЗ ОТВЕТОВ CD4+ Т-КЛЕТОК
+
+
[00224] Оценивали иммуногенный потенциал гуманизированных антител из Примеров 3 и 5 по сравнению с гуманизированным антителом к интегрину β1 K20 человека (Poul et al., Molecular Immunology 32 (1995) p 102-116). МКПК (мононуклеарные клетки периферической крови) выделяли из лейкоцитарной пленки здоровых доноров (из крови, взятой в пределах 24 часов), полученной в Национальной службе переливания крови Великобритании (Больница Адденбрук, Кембридж, Великобритания) и согласно одобрению, предоставленному Комитетом по этике местных исследований Адденбрука. МКПК выделяли из лейкоцитарной пленки путем центрифугирования в градиенте плотности Lymphoprep (Axis-shield, Данди, Великобритания), и CD8 Т-клетки истощали с применением CD8 RosetteSep™ (StemCell Technologies Inc, Лондон, Великобритания). Характеристику доноров проводили путем идентификации гаплотипов HLA-DR, используя набор для HLA-типирования тканей на основе ПЦР с применением аллель-специфических праймеров (Biotest, Солихалл, Великобритания). Также определяли Т-клеточные ответы на контрольные антигены, включая сенсибилизирующий антиген - столбнячный токсин (KLH Pierce, Крамлингтом, Великобритания, и пептиды, полученные из вируса гриппа А и вирусов Эпштейна-Барра). Затем МКПК замораживали и хранили в жидком азоте до применения.
+
6
5
+
6
[00225] Для получения дендритных клеток (ДК) моноцитарного происхождения были выбраны 50 разных доноров МКПК, чтобы обеспечить распределение с частотами встречаемости аллотипов HLA-DR и HLA-DQ, сходными с частотами, характерными для общей популяции людей. МКПК рекультивировали в культуральной среде AIM-V, и CD14 клетки выделяли с применением микрочастиц Miltenyi CD14 и колонок LS (Miltenyi Biotech, Оксфорд, Великобритания). Моноциты ресуспендировали в AIM-V, дополненной 1000 Ед/мл ИЛ-4 и 1000 Ед/мл ГМ-КСФ («среда для культивирования ДК»), до получения концентрации 4-6×10 МКПК/мл, а затем помещали в 24-луночные планшеты (конечный объем культуральной среды составлял 2 мл). На 2-е сутки заменяли половину питательной среды, в которой культивировали ДК. К 3-им суткам моноциты дифференцировались в частично зрелые ДК, которые предварительно инкубировали либо с 40 мкг/мл исследуемого гуманизированного или химерного антитела, 100 мкг/мл KLH, либо только средой. Частично зрелые ДК инкубировали с антигеном в течение 24 часов, после чего удаляли избыток исследуемого антитела путем двойной промывки клеток и ресуспендирования в среде для культивирования ДК, дополненной 50 нг/мл ФНО-α (Peprotech, Лондон, Великобритания). На 7-е сутки заменяли половину среды, в которой культивировали ДК (дополненной 50 нг/мл ФНО-α) до сбора зрелых ДК на 8-е сутки. Производили подсчет собранных зрелых ДК и оценивали жизнеспособность по исключению трипанового синего. Затем ДК подвергали воздействию γ-излучения (4000 рад) и ресуспендировали при 2×10 клеток на мл в среде AIM-V до использования в ELISpot и анализах пролиферации. В дополнение к этому, на 8-е сутки также получали свежевыделенные CD4+ Т-клетки. Для выделения CD4 Т-клеток МКПК рекультивировали в культуральной среде AIM-V, и CD4+ клетки выделяли с применением микрочастиц Miltenyi CD4 и колонок LS (Miltenyi Biotech, Оксфорд, Великобритания), и ресуспендировали в среде AIM-V при 2×10 клеток/мл.
5
+
4
[00226] На 8-е сутки проводили анализы пролиферации Т-клеток, в которых 1×10 аутологичных CD4 Т-клеток добавляли к 1×10 ДК, нагруженных гуманизированным или химерным антителом (соотношение 10:1), в 96-луночные планшеты с U-образной формой дна, при этом добавляли среду AIM-V до конечного объема 200 мкл/лунку). На 14-е сутки аналитические планшеты подвергались облучению [3Н] с активностью 1 мкКи (Perkin Elmer, Биконсфилд, Великобритания) на лунку в 25 мкл AIMV в течение 6 часов до сбора на плоские фильтры (Perkin Elmer) с использованием коллектора клеток TomTec Mach III (Hamden CT, США). Все препараты антител исследовали на шести культурах клеток. Число импульсов в минуту (ерш) для каждой лунки определяли с помощью измерения активности сцинтилляционным методом с применением сцинтиллятора Meltilex™ (Perkin Elmer) на сцинтилляционном счетчике 1450 Microbeta Wallac Trilux (Perkin Elmer) в режиме счета paralux с низким фоном. Число импульсов в минуту для каждого образца антитела нормировали по значениям, полученным для контрольной среды.
5
+
4
[00227] Для проведения анализов ELISpot планшеты ELISpot (Millipore, Уотфорд, Великобритания) покрывали антителом, улавливающем ИЛ-2, в объеме 100 мкл/лунку (R&D Systems, Абингдон, Великобритания) в ФСБ. Затем планшеты промывали дважды в ФСБ, инкубировали на протяжении ночи в блокирующем буфере (1% БСА (Sigma) в ФСБ) и промывали в среде AIM V. На 8-е сутки 1×10 аутологичных CD4 Т-клеток добавляли к 1×10 ДК, нагруженных антигеном DC (в соотношении 10:1) в 96-луночные планшеты ELISpot. Все препараты антител исследовали на шести культурах клеток. Для каждого донора МКПК также использовали отрицательный контроль (отдельно среда AIM V), контроль без клеток и положительный контроль РНА (10 мкг/мл).
2
2
[00228] После дальнейшей инкубации в течение 7 суток планшеты ELISpot проявляли с помощью трех последовательных промывок в дНО и ФСБ до добавления 100 мкл очищенного биотинилированного детектирующего антитела (R&D Systems, Абингдон, Великобритания) в ФСБ/1% БСА. После инкубации при 37°С в течение 1,5 часа планшеты дополнительно промывали три раза в ФСБ и добавляли 100 мкл отфильтрованного стрептавидина-АР (R&D Systems) в ФСБ/1% БСА на 1 час (инкубация при комнатной температуре). Стрептавидин-АР удаляли и планшеты промывали четыре раза в ФСБ. BCIP/NBT (R&D Systems) добавляли в каждую лунку и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Проявление пятен блокировали путем промывания лунок и задних поверхностей лунок три раза дHО. Высохшие планшеты сканировали на анализаторе Immunoscan™, и количество пятен на лунку (spw) определяли с применением программного обеспечения Immunoscan™ в версии 4.
[00229] И в случае анализов пролиферации, и анализов содержания ИЛ-2 с помощью ELISpot результаты выражали в виде индекса стимуляции (ИС), который определяли как соотношение cpm (анализ пролиферации) или количество пятен (анализ ELISpot) для исследуемого антитела против контрольной среды с применением порогового значения ИС, равного или больше 2 (ИС≥2,0) для положительного ответа Т-клеток.
ПРИМЕР 7
МОДЕЛЬ ОПУХОЛИ НА ЖИВОТНЫХ
[00230] Можно использовать модель опухоли на животных для анализа in vivo гуманизированных антител к интегрину β1 на предмет замедления роста опухоли. Например, можно использовать ортотопическую модель рака молочной железы с применением клеток MDA-MB-231 в качестве модели роста первичной опухоли и спонтанных метастазов на мышах с геном интегрина β1 человека, интегрированным в геном, или иммунодефициных мышах (например, мыши линии пи/пи с тяжелым комбинированным иммунодефицитом [SCID]).
3
[00231] Мышам с геном интегрина β1, интегрированным в геном (самок и самцов возрастом 7-10 недель распределяют поровну по группам), можно ввести подкожно в жировую прослойку молочной железы клетки MDA-MB-231 в объеме 0,1 мл. Антитело к интегрину β1 по настоящему изобретению, OS2966 или контрольное антитело, родственное по изотипу, можно вводить в дозировке 1 мг/кг-20 мг/кг, как, например, 5 мг/кг или 10 мг/кг (объем дозы 10 мл/кг) еженедельно, начиная со дня после введения опухолевых клеток («День 2»), или когда опухоль доступна пальпации и средний объем опухоли составляет около 100 мм. Измерения размера опухоли можно проводить один раз в две недели на протяжении эксперимента с помощью штангенциркуля. Для получения результатов проводились наблюдения за животными.
ПРИМЕР 8
АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[00232] Анализ последовательностей осуществляли на тяжелых и легких цепях, полученных в приведенных выше Примерах, для определения имеющих важное значение находящихся вне CDR аминокислотных остатков VH- и VL-цепей из последовательности OS2966, которые предпочтительно включены в гуманизированные последовательности. Такие остатки идентичны остаткам OS2966 помимо остатков CDR. Такие остатки обозначены как «с»-остатки на Фигурах 15 и 16. Как проиллюстрировано на этих Фигурах, что касается VH-цепи, остатки 48, 67, 69, 73, 76, 80, 89, 91 и 93 предпочтительно идентичны соответствующим остаткам OS2966 (SEQ ID NO: 2). Кроме того, что касается VL-цепи, остатки 36 и 71 предпочтительно идентичны соответствующим остаткам OS2966 (SEQ ID NO: 4).
[00233] Частота использования кодонов, соответствующих последовательностям VH и VL, представлена на Фигуре 17, тогда как на Фигуре 18 в кратком виде представлены аминокислотные последовательности VH- и VL-цепей.
ПРИМЕР 9
СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ИНТЕГРИНА β1
[00234] Гуманизированные антитела по настоящему изобретению могут быть использованы для повышения радиочувствительности путем ингибирования интегрина (31, как описано в заявке на патент США №20070237711, Park et al., Cancer Res 2008; 68: (11)4398 и Yao et al., Cancer Res 2007; 67: (2)659, все из которых в полном объеме включены в настоящий документ. Антитела по настоящему изобретению могут быть использованы в способе совместного введения антитела или описанных в настоящем документе композиций, содержащих антитела, в комбинации с ионизирующим излучением, что приводит к усилению апоптоза в опухолевых клетках, особенно в опухолевых клетках рака молочной железы.
ПРИМЕР 10
ВАЛИДАЦИЯ И АНАЛИЗ КОМПОЗИТНЫХ ВАРИАНТОВ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА
[00235] Композитные гуманизированные антитела были получены, как обсуждалось в Примере 3. В Таблице 2 приведен список различных созданных антител, в котором показано, какие последовательности VH и Vk были использованы.
[00236]
5
[00237] Связывание композитных вариантов антител человека (из Таблицы 2) оценивали в FACS-анализе конкурентного связывания с применением химерного антитела мыши OS2966 (Fab OS2966 мыши, расщепленный до получения Fc-фрагментов антитела человека). Вкратце, серийно разведенные (трехкратно) химерные или гуманизированные антитела, начиная с 25,0 мкг/мл, предварительно смешивали с OS2966 мыши при постоянной концентрации (0,1875 мкг/мл) в FACS-буфере (1% БСА в 1х ФСБ, рН 7,4) до смешивания с 3×10 клеток Jurkat. После инкубации на льду в течение 1 часа клетки промывали, и связывание OS2966 мыши определяли с помощью меченного ФЭ антитела козы, специфического к Fc-фрагменту иммуноглобулина мыши (Jackson ImmunoResearch, номер по каталогу 115-116-071). После инкубации на льду в течение 45 мин клетки промывали, ресуспендировали в 300 мкл FACS-буфера и анализировали на Beckton Dickinson FACScalibur™. Среднее геометрическое значение интенсивности флуоресценции наносили на график зависимости от концентрации антител (Фигуры 20-24). Эти данные были использованы для расчета значений ИК50 для каждого антитела, и эти значения нормировали по ИК50 химерного антитела, которое включали в каждый FACS-анализ (Таблица 3).
[00238]
Таблица 3. Относительная афинность варианта антитела человека.
Относительную ИК50 рассчитывали путем деления ИК50 исследуемого антитела на ИК50 химерного антитела, которое анализировали в этом же анализе.
[00239] Три варианта (H1, Н2, Н5) продемонстрировали немного большую относительную аффинность, и относительная аффинность четырех вариантов (Н3, Н4, Н10, Н13) была намного ниже, чем аффинность антитела OS2966 мыши.
[00240] Функциональное ингибирование β1-субъединицы интегрина β1 с применением вариантов антител человека оценивали в анализе адгезии клеток с применением микропланшетов на многих видах ЭКМ и многих клеточных линиях: рака поджелудочной железы человека PANC-1 (Фигуры 25А и 25В), трижды негативного рака молочной железы человека MDA-MB-231 (Фигура 25С) и рака поджелудочной железы человека AsPC-1 (Фигура 25D). Вкратце, анализы адгезии клеток к ЭКМ осуществляли с применением 10 мкг/мл компонентов ЭКМ или БСА (контроль). Клетки предварительно инкубировали с применением 10 мкг/мл антител в бессывороточной среде DMEM/F12 в течение 30 минут. Адгезию исследовали в течение от 30 минут до 1 часа. Неадгезировавшие клетки удаляли из чашек, клетки фиксировали с применением 1% параформальдегида, и планшеты окрашивали кристаллическим фиолетовым в течение 30 минут. После интенсивной промывки кристаллический фиолетовый солюбилизировали в Тритоне Х-100 в течение 1 часа и в планшетах определяли уровень поглощения при А590.
[00241] Все 19 вариантов антител человека были функционально активными в отношении уменьшения адгезии клеток к ЭКС с некоторой статистически значимой вариацией в зависимости от белков ЭКМ и клеточной линии. В данном, анализе не была отмечена явная корреляция относительной аффинности (Таблица 3) и функции независимо от типа ЭКМ или клеточной линии. Эти данные нормировали по отрицательному контролю, IgG (БСА, бычий сывороточный альбумин в качестве отрицательного контроля; IgG, контрольный изотип, OS2966, OS2966 мыши; TS2/16, положительный контроль - антитело, активирующее интегрин β1; FN, фибронектин; LN, ламинин; С1, коллаген типа I; С4, коллаген типа IV).
[00242] Функциональное ингибирование β1-субъединицы интегрина β1 с применением вариантов антител человека оценивали «методом зарастания царапины» в анализе миграции клеток с применением микропланшетов на фибронектине в качестве компонента ЭКМ с применением клеток трижды негативного рака молочной железы (MDA-MB-231). Вкратце, планшеты покрывали 10 мкг/мл фибронектина и производили посев опухолевых клеток. Желтый наконечник пипетки использовали для нанесения царапины в монослоях конфлуентных клеток и среду заменяли с добавлением 10 мкг/мл указанных антител. Планшеты фиксировали через 8 часов после инкубации при 37°С и фотографировали. На снимках планшетов, полученных на 10х увеличении, было отмечено уменьшение миграции в зону царапины в лунках, в которые вносили OS2966, и варианты (H1, Н2, Н3) композитных антител человека (Фигура 26А). Количественная оценка площади царапины без клеток для каждого условия (анализы осуществляли в трех повторностях и повторяли) проиллюстрирована на Фигуре 26В.
[00243] Миграция клеток трижды негативного рака молочной железы значительно уменьшалась из-за воздействия композитных вариантов антител OS2966 человека.
[00244] Функциональное ингибирование β1-субъединицы интегрина β1 с применением вариантов антител человека оценивали в модели ангиогенеза in vitro; анализ образования трубки эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC). Вкратце, планшеты покрывали матригелем и производили посев клеток HUVEC. Планшеты фотографировали через 8 часов после инкубации при 37°С и производили количественную оценку образования сосудистых трубок (образование закрытых единиц). На снимках планшетов, полученных на 10х увеличении, было отмечено уменьшение образования сосудистых трубок в лунках, в которые вносили OS2966, и варианты (H1, Н2, Н3) композитных антител человека (Фигура 27А). Количественная оценка образования закрытых единиц для каждого условия (анализы осуществляли в трех повторностях и повторяли) проиллюстрирована на Фигуре 27В.
[00245] Варианты композитных антител человека полностью блокировали при проведении анализа образования сосудистых трубок in vitro.
6
3
[00246] Функциональное ингибирование β1-субъединицы интегрина β1 с применением вариантов антител человека оценивали в модели трижды негативного рака молочной железы человека in vivo с применением клеточной линии MDA-MB-231. Вкратце, 10 клеток вводили в жировую прослойку четвертой молочной железы самкам безтимусных мышей линии nu/nu возрастом 5-6 недель. После формирования опухолей (средний объем подкожной опухоли = 80-100 мм) мыши были рандомизированы в группы лечения. Контрольные и исследуемые антитела вводили в концентрации 5 мг/кг внутрибрюшинно (IP) два раза в неделю. IgG человека в эквивалентных дозах выступал в качестве контроля (Sigma). Размер ортотопических опухолей измеряли с помощью штангенциркуля два раза в неделю. Как проиллюстрировано на Фигуре 28А, варианты Н1-Н3 антител человека значительно уменьшали рост опухолей in vivo, вызванных введением MDA-MB-231, по сравнению с контролем IgG. Была отмечена более высокая эффективность для вариантов композитных антител человека по сравнению с OS2966 мыши, особенно для Н3. Оценка фармакодинамических параметров с помощью Вестерн-блот анализа продемонстрировала снижение экспрессии белков сигнальных путей, регулирующих рост клеток (фосфорилированная внеклеточно регулируемая киназа, ERK и фосфорилированная киназа фокальной адгезии, FAK), в опухолях, которые подвергались воздействию, по сравнению с контролем, что могло способствовать уменьшению пролиферации и усилению апоптоза (Фигура 28В).
6
3
[00247] Функциональное ингибирование β1-субъединицы интегрина β1 с применением вариантов антител человека оценивали in vivo на модели спонтанных метастазов в легкие с применением линии клеток негативного рака молочной железы человека MDA-MB-231. Вкратце, 10 клеток вводили в жировую прослойку четвертой молочной железы самкам безтимусных мышей линии nu/nu возрастом 5-6 недель. После формирования опухолей (средний объем подкожной опухоли = 80-100 мм) мыши были рандомизированы в группы лечения. Контрольные и исследуемые антитела вводили в концентрации 5 мг/кг внутрибрюшинно (IP) два раза в неделю. IgG человека в эквивалентных дозах выступал в качестве контроля (Sigma). Через 7 недель мышей перфузировали, извлекали легкие и получали фронтальные срезы для анализа с помощью окрашивания гематоксилином и эозином. Спонтанные метастазы в легкие наблюдались у 50% (3 из 6) мышей, которым вводили контрольное антитело IgG. Спонтанные метастазы в легкие отсутствовали у всех мышей, которым вводили OS2966 или варианты Н1-Н3 композитных антител человека (0%, 0/28 мышей). Результаты проиллюстрированы на Фигуре 29.
[00248] Варианты композитных антител человека полностью предотвращали спонтанные метастазы в легкие в ортотопической модели трижды негативного рака молочной железы.
6
3
[00249] Функциональное ингибирование β1-субъединицы интегрина β1 с применением вариантов антител человека оценивали в модели гемцитабин-резистентного рака поджелудочной железы in vivo с применением клеточной линии PANC1-GEMR. Вкратце, 10 клеток вводили подкожно самкам безтимусных мышей линии nu/nu возрастом 5-6 недель. После формирования опухолей (средний объем подкожной опухоли = 80-100 мм) мыши были рандомизированы в группы лечения. Контрольные и исследуемые антитела в концентрации 5 мг/кг или гемцитабин в концентрации 50 мг/кг вводили внутрибрюшинно (IP) два раза в неделю. IgG человека в эквивалентных дозах выступал в качестве контроля (Sigma). Размер подкожных опухолей измеряли с помощью штангенциркуля два раза в неделю. На Фигуре 30А проиллюстрированы результаты верификации in vivo резистентности к гемцитабину на линии PANC1-GEMR. На Фигуре 30В проиллюстрировано, что вариант Н3 композитного антитела человека значительно уменьшал рост опухолей in vivo, вызванных введением PANC1-GEMR, по сравнению с контролем IgG. На Фигуре 30С с помощью Вестерн-блот анализа проиллюстрирована оценка фармакодинамических параметров белков сигнальных путей, имеющих особую важность для регуляции роста клеток (фосфорилированная внеклеточно регулируемая киназа, ERK и фосфорилированная киназа фокальной адгезии, FAK), в опухолях, которые подвергались воздействию, по сравнению с контролем, что могло способствовать уменьшению пролиферации и усилению апоптоза.
7
3
[00250] Функциональное ингибирование β1-субъединицы интегрина β1 с применением вариантов антител человека оценивали в модели формирования глиобластомы человека in vivo с применением клеточной линии U87MG. Вкратце, 10клеток вводили подкожно самкам безтимусных мышей линии nu/nu возрастом 5-6 недель. Мышей рандомизировали в группы лечения после формирования опухолей (средний объем подкожной опухоли = ~200-250 мм). Контрольные и исследуемые антитела вводили в концентрации 5 мг/кг внутрибрюшинно (IP) два раза в неделю. IgG человека в эквивалентных дозах выступал в качестве контроля (Sigma). Размер подкожных опухолей измеряли с помощью штангенциркуля два раза в неделю. На Фигуре 31А проиллюстрировано, что вариант Н3 композитного антитела человека значительно уменьшал рост заложенных опухолей in vivo по сравнению с контролем IgG. Эффективность Н3 была эквивалентной эффективности OS2966 мыши. Оценка фармакодинамических параметров с помощью Вестерн-блот анализа продемонстрировала снижение экспрессии белков сигнальных путей, имеющих особую важность для регуляции роста клеток (фосфорилированная внеклеточно регулируемая киназа, ERK и фосфорилированная киназа фокальной адгезии, FAK), в опухолях, которые подвергались воздействию Н3, по сравнению с контролем, что могло способствовать уменьшению пролиферации и усилению апоптоза, как проиллюстрировано на Фигуре 31В.
+
[00251] Для определения потенциала варианта Н3 антитела в отношении клинической иммуногенности использовали анализ EpiScreen™ для определения зависимости пролиферации Т-клеток от времени. Исследовали способность полностью гуманизированных и химерных антител вызывать ответ CD4 Т-клеток, который определяли по скорости пролиферации против панели 12 HLA-типированных доноров. Данные по пролиферации Т-клеток здоровых доноров после воздействия химерного (мышиного/человеческого) антитела OS2966, гуманизированного антитела Н3 и гуманизированного антитела положительного контроля проиллюстрированы на Фигуре 32А. CD4+ Т-клетки инкубировали с аутологичными зрелыми ДК, нагруженными образцами, и оценивали их пролиферацию через 7 суток после инкубации. Данные по пролиферации с ИС≥2,00 (обозначен красной пунктирной линией), которые статистически значимо отличались (р<0,05) согласно непарному двухвыборочному t-критерию Стьюдента, принимали за положительные. На Фиг. 32В суммированы данные по пролиферации здоровых донорных Т-клеток в когорте доноров. Проиллюстрированы положительные (ИС≥2,0, значимое р<0,05) Т-клеточные ответы для пролиферации («П»). Проиллюстрированы пограничные ответы (значимое р<0,05 при ИС≥1,90) (*). Частота положительных ответов для анализа пролиферации показана в процентах внизу столбцов. А33 (гуманизированное антитело А33) представляет собой используемое в клинической практике эталонное контрольное мАТ, которое характеризуется высокими уровнями иммуногенности в клинике и обычно вызывает ответ у 20-30% Т-клеток при проведении анализа EpiScreen. Для каждого донора также использовали контроль воспроизводимости иммуногенных свойств (клетки, инкубированные с 100 мкг/мл KLH).
[00252] Композитный вариант Н3 антитела человека продемонстрировал значительное снижение иммуногенности (0% ответов) по сравнению с химерным антителом OS2966 мыши/человека (25% ответов). Исходя из данных анализа EpiScreen™, был сделан вывод, что антитело Н3 человека характеризуется клинически приемлемым профилем иммуногенности, что подтверждает снижение иммуногенности в результате применения технологии Antitope Composite Human Antibody.
[00253] Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на описанный выше пример, следует понимать, что модификации и изменения находятся в пределах сущности и объема настоящего изобретения. В соответствии с этим, настоящее изобретение ограничивается только описанной ниже формулой изобретения.