МУЛЬТИПЛЕКСНЫЕ АНАЛИЗЫ НА ОСНОВЕ АПТАМЕРОВ
MULTIPLEX ANALYSES BASED ON APTAMERS

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной патентной заявки США сер. No. 61/656956, поданной 7 июня 2012 года, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящее изобретение, в целом, относится к способам, устройствам, реагентам и наборам, предназначенным для повышения эффективности мультиплексных анализов на основе аптамеров. Такие способы находят широкое применение в области диагностики, а также в обнаружении биомаркеров и конструировании, и разработке инструментов для исследования и разработки терапевтических препаратов на основе аптамеров. В частности, предлагаются материалы и способы для ослабления или удаления фонового сигнала.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] В следующем описании приводится краткое изложение информации, имеющей отношение к настоящему изобретению, и любая приведенная информация или публикации, упомянутые в настоящем документе, не признаны в качестве представляющих уровень техники, к которому относится настоящее заявленное изобретение.
[0004] Анализы, направленные на детекцию и количественное определение физиологически значимых молекул в биологических образцах и других образцах являются важными инструментами в научных исследованиях и в области предоставления медицинских услуг. Один класс таких анализов предполагает использование микрочипа, который включает один или несколько аптамеров, иммобилизированных на твердой подложке. Каждый аптамер способен связываться с молекулой-мишенью с высокой специфичностью и с очень высокой аффинностью. См., например, патент США No. 5475096 под названием "Nucleic Acid Ligands", см. также, например, патент США No. 6242246, патент США No. 6458543 и патент США No. 6503715, каждый из которых имеет название "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip". Поскольку микрочип взаимодействует с образцом, аптамеры связываются с их соответствующими молекулами-мишенями, присутствующими в образце, и вследствие чего позволяют определить отсутствие, присутствие, количество и/или концентрацию молекул-мишеней в образце.
[0005] Также были описаны мультиплексные анализы на основе аптамеров, которые обеспечивают этапы направленного взаимодействия и разделения мишеней в растворе, предназначенные для удаления специфических компонентов анализируемой смеси, см. патенты США No. 7855,054 и 7964,356 и публикации заявок на патенты США No. US/2011/0136099 и US/2012/0115752. В описанных способах анализа на основе аптамеров используются один или несколько этапов специфического захвата для отделения компонентов исследуемого образца от мишени или мишеней, которые подлежат детекции, при выделении аффинного комплекса аптамер-мишень.
[0006] Чувствительность и специфичность многих форматов анализа ограничены возможностью способа детекции обеспечивать отделение истинного сигнала от сигнала, который возникает из-за неспецифических ассоциаций в ходе анализа и приводит к образованию детектируемого сигнала. Это особенно верно в случае мультиплексных анализов на основе аптамеров. Согласно наблюдениям один из главных источников неспецифического связывания в анализе такого типа зависит от непредвиденных взаимодействий типа аптамер-аптамер. Так как взаимодействие мишени/аптамера зависит от сохранения структурных свойств аптамера, обладающего специфичностью к мишени, любой способ уменьшения степени взаимодействий типа аптамер-аптамер должен быть сбалансированным, так чтобы не уменьшать степень специфических взаимодействий мишени/аптамера. В настоящем изобретении описываются способы удаления фона в одноплексном или мультиплексном анализе на основе аптамеров с одновременным сохранением специфических взаимодействий мишени/аптамера.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] В настоящем изобретении предложены способы, устройства, реагенты и наборы, предназначенные для повышения эффективности анализов для определения одного аналита и мультиплексных анализов на основе аптамеров. В частности, предложены материалы и способы для ослабления или удаления фонового сигнала.
[0008] В одном варианте реализации изобретения предложены аптамеры, которые обладают высокой степенью аффинности и специфичности к молекуле-мишени и первому отделяемому тегу. В некоторых вариантах реализации изобретения аптамеры представляют собой фотоаптамеры. В некоторых вариантах реализации изобретения этот первый отделяемый тег представляет собой фотоотщепляемый биотин. Описаны другие теги и отщепляемые фрагменты и аптамер, содержащий такие теги и отщепляемые фрагменты.
[0009] Аптамер, содержащий первый отделяемый тег, который обладает специфической аффинностью к молекуле-мишени, иммобилизируют на твердой подложке в растворе до равновесного связывания с исследуемым образцом. Присоединение аптамера к твердой подложке проводят путем осуществления контакта первой твердой подложки с аптамером и обеспечения возможности ассоциации отделяемого первого тега, встроенного в аптамер, либо прямо, либо опосредованно с соответствующим первым захватывающим агентом, который присоединен к первой твердой подложке или входит в состав первой твердой подложки. После присоединения агрегаты типа аптамер/аптамер удаляют с помощью отмывок раствором, который доводят буфером до рН 11, вследствие чего происходит снижение фона анализа (иммобилизация "Связывание-0", определение приводится ниже).
[0010] Затем готовят исследуемый образец, и приводят во взаимодействие с иммобилизированными аптамерами, которые обладают специфической аффинностью к соответствующим молекулам-мишеням. Если исследуемый образец содержит молекулу-мишень (молекулы-мишени), в смеси с исследуемым образцом образуется аффинный комплекс аптамер-мишень. Необходимо отметить, что в дополнение к аффинным комплексам аптамера-мишени, к первой твердой подложке также будет присоединяться несвязанный аптамер. Аффинный комплекс аптамер-мишень, и несвязанный аптамер, который ассоциирован с зондом на твердой подложке, затем отделяют от остальной части смеси, вследствие чего происходит удаление свободной мишени и всех других несвязанных веществ в исследуемом образце (матрице образцов); т.е., компонентов смеси, не ассоциированных с первой твердой подложкой. Этот этап разделения в данном документе обозначают разделение Связывание-1 (см. определение ниже). После разделения аффинный комплекс аптамер-мишень наряду с любым несвязанным аптамером отделяют от первой твердой подложки с использованием способа, подходящего для конкретного используемого отделяемого первого тега.
[0011] В одном варианте реализации изобретения аффинные комплексы аптамер-мишень, связанные с твердой подложкой, обрабатывают агентом, который обеспечивает введение второго тега в компонент молекулы-мишени аффинных комплексов аптамер-мишень. В одном варианте реализации изобретения мишень представляет собой белок или пептид, и мишень подвергают биотинилированию путем обработки NHS-PEO4-биотином. Второй тег, введенный в молекулу-мишень, может быть таким же или отличным от тега, захватывающего аптамер. Если второй тег не отличается от первого тега или тега, захватывающего аптамер, до начала этого этапа введения тега можно блокировать свободные сайты захвата на первой твердой подложке. В этом иллюстративном варианте реализации изобретения первую твердую подложку промывают свободным биотином до начала введения тега в мишень. Способы введения тега и, в частности, введения тега в мишени, такие как пептиды и белки, описаны в патенте США No. 7855054.
[0012] Разделение совершают путем отделения несвязанных аптамеров и аффинных комплексов аптамер-мишень от первой твердой подложки. В одном варианте реализации изобретения первый отделяемый тег представляет собой фотоотщепляемый фрагмент, который отщепляется вследствие облучения УФ-лампой в условиях, которые обеспечивают расщепление ≥90% первого отделяемого тега. В других вариантах реализации изобретения отделение осуществляют по способу, подходящему для выбранного отделяемого фрагмента в первом отделяемом теге. Аффинные комплексы аптамер-мишень можно элюировать и собрать для дальнейшего использования в процессе анализа или можно нанести на другую твердую подложку для проведения остальных этапов анализа.
[0013] В одном варианте реализации изобретения осуществляют второе разделение (в данном документе называется разделением Связывание-2, см. определение ниже) для удаления свободного аптамера. Как было описано выше, в одном варианте реализации изобретения к мишени можно присоединить второй тег, используемый при разделении Связывание-2, в то время как аффинный комплекс аптамер-мишень все еще будет взаимодействовать с твердой подложкой, используемой при захвате Связывание-0. В других вариантах реализации изобретения второй тег можно присоединить к мишени в другой момент времени в процессе анализа до начала разделения Связывание-2. Смесь взаимодействует с твердой подложкой, при этом к поверхности твердой подложки прикреплен захватывающий элемент (второй), который способен связываться с тегом, связывающим мишень (второй тег), предпочтительно с высокой аффинностью и специфичностью. В одном варианте реализации изобретения твердая подложка представляет собой магнитные гранулы (такие как DynaBeads MyOne Streptavidin C1), содержащиеся внутри лунки микротитрационного планшета, и захватывающий элемент (второй захватывающий элемент) представляет собой стрептавидин. Магнитные гранулы являются удобным средством для отбора разделенных компонентов смеси. Аффинные комплексы аптамер-мишень, содержащиеся в смеси, вследствие этого связываются с твердой подложкой посредством связывающего взаимодействия тега (второго), захватывающего мишень, и второго захватывающего элемента на второй твердой подложке. Аффинный комплекс аптамер-мишень затем отделяется от остальной части смеси, например, путем промывки подложки буферными растворами, включающими буферы, содержащие органические растворители, охватывая, среди прочего, глицерин.
[0014] Аптамеры затем избирательно элюируют из комплексов аптамер-мишень буферами, содержащими хаотропные соли из группы, охватывающей, среди прочего, перхлорат натрия, хлорид лития, хлорид натрия и хлорид магния. Аптамеры, удерживаемые на гранулах Связывание-2 в силу взаимодействия типа аптамер/аптамер, не элюируются под воздействием этой обработки.
[0015] В другом варианте реализации изобретения аптамер, отделенный при разделении Связывание-2, детектируют и факультативно определяют количественно с помощью любых подходящих методов детекции нуклеиновых кислот, таких как, например, гибридизация ДНК на микрочипах, количественная ПЦР, масс-спектроскопия, клевазный тест, секвенирование нового поколения и им подобные методы. Эти способы детекции подробно описаны ниже.
[0016] Любые способы, описанные в данном документе, можно использовать для проведения анализа для определения одного аналита или мультиплексного анализа исследуемого образца. Любой мультиплексный анализ может включать использование двух, десяти, сотен или тысяч аптамеров для одновременного анализа равного количества молекул-мишеней в исследуемом образце, таком как, например, биологический образец. В этих вариантах реализации изобретения в исследуемый образец вводится множество аптамеров, и можно осуществить любой из вышеописанных анализов. После отделения аптамеров можно использовать любые подходящие мультиплексные способы детекции нуклеиновых кислот для независимого определения разных аптамеров, которые были отделены. В одном варианте реализации изобретения это можно совершить посредством гибридизации с комплиментарными зондами, которые по отдельности расположены на твердой поверхности. В другом варианте реализации изобретения каждый из разных аптамеров можно детектировать на основе молекулярного веса с использованием масс-спектроскопии. Еще в одном варианте реализации изобретения каждый из разных аптамеров можно детектировать на основе электрофоретической подвижности, такой как, например, в капиллярном электрофорезе, в геле или путем жидкостной хроматографии. В другом варианте реализации изобретения для детекции и факультативного количественного определения каждого из разных аптамеров с использованием количественной ПЦР можно использовать уникальные ПЦР-зонды. В другом варианте реализации изобретения для детекции и факультативного количественного определения каждого из разных аптамеров можно использовать способы секвенирования нового поколения.
[0017] В каждом из анализов, раскрытых в данном документе, для увеличения специфичности анализа и для снижения уровня неспецифического связывания можно использовать кинетическое испытание. В одном варианте реализации изобретения, который можно факультативно использовать в каждом из анализов, описанных в данном документе, дополнительного снижения уровня неспецифического связывания можно достичь либо за счет предварительной инкубации конкурирующей молекулы с исследуемым образцом, либо путем добавления конкурирующей молекулы в смесь в ходе равновесного связывания. В других вариантах реализации изобретения кинетическое испытание осуществляют путем разведения.
[0018] В другом варианте реализации изобретения описан способ детекции молекулы-мишени, которая может присутствовать в исследуемом образце, способ, включающий: экспонирование аптамера, обладающего специфической аффинностью к молекуле-мишени и несущего первый тег, характеризующийся специфической аффинностью к первому захватывающему элементу, на первой подложке, содержащей первый захватывающий элемент и позволяющей первому тегу ассоциировать с первым захватывающим элементом; промывку указанной твердой подложки одним или несколькими буферными растворами, которые обеспечивают диссоциацию агрегированных аптамеров; и элюирование аптамеров из указанной твердой подложки одним или несколькими буферными растворами, содержащими хаотропную соль, которая разрушает взаимодействия между аптамером/аналитом, но поддерживает взаимодействия типа аптамер/аптамер и ДНК-гибридизацию. В одном варианте реализации изобретения хаотропная соль выбрана из группы, состоящей из перхлората натрия, хлорида лития, хлорида натрия и хлорида магния и буферный раствор, который обеспечивает диссоциацию агрегированных аптамеров, содержит органический растворитель. В одном варианте реализации изобретения органический растворитель представляет собой глицерин.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0019] На Фигуре 1 графически изображено удерживание, зависимое от аптамера, и последующее элюирование аптамеров из гранул Связывание-2. Аптамер, меченый радиоактивным изотопом, не несущий биотина, инкубировали с магнитными стрептавидиновыми гранулами, несущими возрастающие количества биотинилированного аптамера, немеченого радиоактивным изотопом, и промывали. Удержанный материал затем элюировали 1 M хлоридом натрия в буфере CAPS при рН 10. Количество элюированного аптамера, меченого радиоактивным изотопом, пропорционально количеству немеченого аптамера, адсорбированного на гранулах Связывание-2.
[0020] На Фигурах 2A-2F иллюстрируется влияние концентрации плазмы крови на результат анализа, в котором аптамер предварительно не иммобилизируют до уравновешивания с исследуемым образцом. Ссылаясь на Фигуру 2, плазму крови титровали от 0% о/о до 25% о/о. Как можно видеть, сигнал большинства аналитов выходит на плато в диапазоне от 10 и до 20%.
[0021] На Фигурах 3A-3F графически изображен выход аптамера в элюате, полученном под воздействием фотоотщепления, в зависимости от концентрации плазмы крови, в котором аптамер предварительно не иммобилизируют до уравновешивания с исследуемым образцом. Получали элюат Связывание-1 под воздействием фотоотщепления и посредством гибридизации определяли количество аптамера (ось Y, относительные единицы флуоресценции). Как можно видеть, выход аптамера очень сильно сокращается с возрастанием концентрации плазмы крови, причем значительное влияние обнаружено даже при использовании 5%-ной плазмы крови. Неизвестно, воздействует ли связывание аналита на связывание аптамера с гранулами, однако следует отметить, что преимущественная потеря связанных аптамеров имела бы даже больший эффект зависимости от плазмы крови.
[0022] На Фигурах 4A-4D графически изображено сравнение результатов стандартного титрования плазмы крови (черные кривые) и титрования с предварительной иммобилизацией (пунктирные кривые).
4
[0023] На Фигурах 5A-5D графически изображено сравнение результатов элюирования 1 M NaCl/CAPSO и элюирования 1,8 M NaClO/PIPES с использованием формата анализа с предварительной иммобилизацией, описанного в данном документе. Стандартные кривые в буфере (нижние кривые) и кривые для добавления белка в 40%-ную плазму крови (верхние кривые) получали в формате анализа с предварительной иммобилизацией.
[0024] На Фигуре 6 изображены CV (коэффициенты вариации) для лунок, содержащих только буфер, в 8 повторностях с использованием элюирования перхлоратом и предварительно иммобилизированных аптамеров.
[0025] На Фигуре 7 иллюстрируются результаты добавления и извлечения аналитов, измеренные для 300 аналитов. Степень извлечения определяется как (сигнал, обусловленный аналитом, добавление 10 пм в плазму крови - сигнал, обусловленный аналитом плазма крови)/сигнал, обусловленный аналитом, добавление 10 пМ буфера).
[0026] На Фигуре 8 иллюстрируется дозозависимый эффект буфера со сдвигом влево в формате с иммобилизацией для белка ERBB2. Измеренные эндогенные уровни снижены более чем в 10 раз и очень близки эндогенным уровням, описанным в литературе.
[0027] На Фигуре 9 иллюстрируется повышенный титр белка в буфере, лучший характер при добавлении и извлечении белка, более линейный характер титра плазмы крови и более стабильно предсказуемые эндогенные уровни белка в плазме крови для белка Активин А.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0028] Подробности раскрыты в описании характерных вариантов реализации настоящего изобретения. Тогда как изобретение описано в связи с приведенными вариантами реализации изобретения, понятно, что изобретение не ограничено этими вариантами реализации изобретения. С другой стороны, предполагается, что изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в настоящее изобретение, как определено формулой изобретения.
[0029] При практическом воплощении настоящего изобретения будут использованы, если не указано иное, традиционные методы химии, микробиологии, молекулярной биологии и методов на основе технологии рекомбинантной ДНК, которые относятся к уровню компетентности специалистов в данной области техники. Такие методов в полной мере объясняются в литературе. См., например, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition).
[0030] Если не указано иное, технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области (областях) техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при практическом воплощении или испытании настоящего изобретения можно использовать любые способы, устройства и материалы, похожие или эквивалентные таковым, описанным в данном документе, ниже описаны предпочтительные способы, устройства и материалы.
[0031] Все публикации, опубликованные патентные документы и патентные заявки, цитированный в данном описании, свидетельствуют об уровне компетентности в данной области (областях) техники, к которой относится настоящее изобретение. Все публикации, опубликованные патентные документы и патентные заявки, цитированные в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки в одинаковой степени, как если бы было указано, что каждая отдельная публикация, опубликованный патентный документ или патентная заявка специально и отдельно включена в данный документ посредством ссылки.
[0032] Подразумевается, что примеры в цитированных публикациях и связанные с ними ограничения являются иллюстративными, а не исчерпывающими. Другие ограничения цитированных публикаций станут понятными специалистам в данной области техники после чтения настоящего описания и изучения графических материалов.
[0033] Настоящее изобретение включает способы, устройства, реагенты и наборы, предназначенные для повышения эффективности мультиплексных анализов на основе аптамеров. Раскрытые способы, устройства, реагенты и наборы обеспечивают высокочувствительные анализы для детекции и/или количественного определения молекул-мишеней в исследуемом образце за счет ослабления или удаления фонового сигнала.
[0034] Следует отметить, что, если не указано иное в конкретном варианте реализации изобретения, способы детекции и/или количественного определения молекулы-мишени, описанные в данном документе, не зависят от специального порядка, в котором данные этапы описаны. Для иллюстративных целей данные способы описаны в виде специальной последовательности этапов; однако надо понимать, что допускается любое количество изменений порядка указанной последовательности этапов при условии достижения цели конкретного описанного анализа. Иначе говоря, этапы, перечисленные в любом из раскрытых способов, могут осуществляться в любом возможном порядке, и способы настоящего изобретения не ограничиваются каким-либо конкретным порядком, представленным в любом из описанных вариантов реализации изобретения, примерами или прилагаемой формулой изобретения. Кроме того, для удобства и легкости представления различные способы описаны со ссылкой на одну молекулу-мишень и один аптамер. Однако надо понимать, что любой из описанных способов можно осуществить в мультиплексном формате, который может обеспечить одновременную детекцию и/или количественное определение множества мишеней с использованием множества аптамеров, так что, например, в исследуемом образце можно детектировать и/или определить количественно множество молекул-мишеней за счет взаимодействия исследуемого образца с множеством аптамеров, причем каждый аптамер обладает специфической аффинностью к конкретной молекуле-мишени (т.е., в мультиплексном формате).
[0035] В контексте настоящего описания, включая прилагаемую формулу изобретения, формы единственного числа включают ссылки во множественном числе, если содержание явно не подразумевает иного, и используют взаимозаменяемо с "по меньшей мере один" и "один или несколько". Таким образом, обозначение "аптамер" включает смеси аптамеров и тому подобное.
[0036] В данном контексте термин "приблизительно" обозначает незначительную модификацию или изменение численной величины, так что основная функция данного элемента, к которому относится численная величина, остается неизменной.
[0037] Термин "каждый", в случае использования в данном документе для обозначения множества элементов, предназначен для обозначения по меньшей мере двух элементов. Нет необходимости, чтобы все элементы, образующие множество, удовлетворяли ассоциированным дополнительным ограничениям.
[0038] В данном контексте термины "включает", "включающий", "охватывает", "охватывающий", "содержит", "содержащий" и любые их варианты предназначены для охвата, не исключающего включения, так что процесс, способ, изделие, характеризуемое способом его получения, или состав вещества, которое содержит, включает или содержит элемент или перечень элементов, не включает лишь эти элементы, но может включать другие элементы, не перечисленные явным образом или не присущие такому процессу, способу, изделию, характеризуемому способом его получения или составу вещества.
[0039] В данном контексте "ассоциируют", "ассоциирует" и любой вариант этого относится к взаимодействию или комплексообразованию между тегом и зондом, которое приводит к образованию достаточно стабильного комплекса, с тем, чтобы обеспечить отделение „неассоциированных" или несвязанных материалов, таких как, например, несвязанные компоненты исследуемого образца, от комплекса тега-зонда при заданном условиях комплексообразования или реакции. Тег и зонд могут ассоциировать друг с другом непосредственно путем взаимодействия и специфического связывания друг с другом. Тег и зонд также могут ассоциировать друг с другом опосредованно, как, например, когда их комплексообразование опосредовано линкерной молекулой.
[0040] В данном контексте термин "нуклеотид" относится к рибонуклеотиду или дезоксирибонуклеотиду или их модифицированной форме, а также их аналогу. Нуклеотиды включают соединения, которые включают пурины (например, аденин, гипоксантин, гуанин и их производные и аналоги), а также пиримидины (например, цитозин, урацил, тимин и их производные и аналоги).
[0041] В данном контексте "нуклеиновая кислота", "олигонуклеотид" и "полинуклеотид" используют взаимозаменяемо для обозначения полимера, состоящего из нуклеотидов, и включают ДНК, РНК, ДНК/РНК-гибриды и модификации нуклеиновых кислот, олигонуклеотидов и полинуклеотидов такого типа, причем включено присоединение различных групп или фрагментов к нуклеотидным единицам в любом положении. Термины "полинуклеотид", "олигонуклеотид" и "нуклеиновая кислота" охватывают двух - или одноцепочечные молекулы, а также многоцепочечные (т.е., тройные спиральные) молекулы. Нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид являются более широкими терминами, чем термин аптамер, и, таким образом, термины нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид охватывают полимеры, состоящие из нуклеотидов, которые являются аптамерами, но термины нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид не ограничиваются аптамерами.
[0042] В данном контексте "нуклеиновые кислоты-лиганды", "аптамер", "SOMAmer" и "клон" используют взаимозаменяемо для обозначения нуклеиновой кислоты неприродного происхождения, которая оказывает желаемое действие на молекулу-мишень. Желаемое действие охватывает, среди прочего, связывание мишени, каталитическое изменение мишени, вступление в реакцию с мишенью таким образом, что происходит модификация или изменение свойств мишени или функциональной активности мишени, ковалентное соединение с мишенью (как в случае суицидного ингибитора) и содействие реакции между мишенью и другой молекулой. В одном варианте реализации изобретения данное действие заключается в специфическом аффинности к молекуле-мишени, причем такая молекула-мишень обладает трехмерной химической структурой, отличной от полинуклеотида, который связывается с нуклеиновой кислотой-лигандом посредством механизма, который не зависит от спаривания оснований по Уотсону/Крику или образования тройной спирали, причем аптамер не является нуклеиновой кислотой, обладающей известной физиологической функцией связывания с молекулой-мишенью. Аптамеры к заданной мишени включают нуклеиновые кислоты, которые идентифицируют в представляющей интерес смеси нуклеиновых кислот, в которой аптамер является лигандом мишени, по способу, включающему: (а) осуществление контакта представляющей интерес смеси с мишенью, причем нуклеиновые кислоты, обладающие повышенной аффинностью к мишени по сравнению с другими нуклеиновыми кислотами, содержащимися в представляющей интерес смеси, можно отделить от остальной части представляющей интерес смеси; (б) отделение нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью от остальной части представляющей интерес смеси; и (в) амплификацию нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью для получения обогащенной лигандами смеси нуклеиновых кислот, при помощи чего идентифицируют аптамеры молекул-мишеней. Признано, что аффинные взаимодействия являются вопросом степени взаимодействия; однако в этом контексте "специфическам аффинность" аптамера к его мишени означает, что аптамер связывается со своей мишенью с намного более высокой степенью аффинности, чем когда он связывается с другими, нецелевыми, компонентами в смеси или образце. Аптамер может включать любое подходящее количество нуклеотидов. "Аптамеры" относятся к нескольким таким группам молекул. Разные аптамеры могут иметь либо одинаковые, либо разные количества нуклеотидов. В качестве аптамеров может выступать ДНК или РНК, и они могут быть одноцепочечными, двухцепочечными или содержать двухцепочечные или трехцепочечные области. Аптамеры можно сконструировать с любой комбинацией желаемых нуклеотидов с модифицированными основаниями.
½
[0043] В данном контексте "SOMAmer" или модифицированный аптамер с низкой скоростью диссоциации относится к аптамеру (включая аптамеры, содержащие по меньшей мере один нуклеотид с гидрофобной модификацией) со скоростью диссоциации (t)≥30 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения SOMAmer созданы с использованием усовершенствованных методов SELEX, описанных в патенте США 7947447 под названием "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates."
[0044] Аптамер можно идентифицировать с использованием любого известного способа, включая процесс SELEX. См., например, патент США No. 5475096 под названием "Nucleic Acid Ligands". После идентификации аптамер можно получить или синтезировать по любому известному методу, включая химические методы синтеза и ферментативные методы синтеза.
[0045] В данном контексте термины "аффинный комплекс аптамер-мишень", "аффинный комплекс аптамера" или "комплекс аптамера" относятся к нековалентному комплексу, который образуется путем взаимодействия аптамера с молекулой-мишенью. "Аффинные комплексы аптамер-мишень", "аффинный комплекс аптамера" или "комплекс аптамера" относятся к нескольким таким группам комплексов. Аффинный комплекс аптамер-мишень, аффинный комплекс аптамера или комплекс аптамера, в целом, может быть обратимым или может диссоциировать за счет изменения окружающих условий, например, увеличение температуры, увеличение концентрации солей или добавление денатурирующего агента.
d
1/2
[0046] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен нековалентный комплекс аптамера и его мишени, причем аптамер имеет K для мишени приблизительно 100 нМ или меньше, причем скорость диссоциации (которая определяется периодом полувыведения комплекса; t) аптамера от мишени больше или равна приблизительно 30 минутам; и/или причем один, несколько или все пиримидины в последовательности нуклеиновой кислоты аптамера модифицированы в 5 положении основания.
[0047] В данном контексте "неспецифический комплекс" относится к нековалентной ассоциации между двумя или больше молекулами, отличными от аптамера и его молекулы-мишени. Из-за того что неспецифический комплекс не выбирается на основе аффинного взаимодействия между молекулами, входящими в его состав, но представляет взаимодействие между классами молекул, молекулы, ассоциированные в составе неспецифического комплекса, будут проявлять, в среднем, намного более низкую аффинность друг к другу и будут соответственно иметь более высокую скорость диссоциации, чем аптамер и его молекула-мишень. Неспецифические комплексы включают комплексы, образованные между аптамером и молекулой, не являющейся мишенью, аптамером и другим аптамером, конкурентом и молекулой, не являющейся мишенью, конкурентом и молекулой-мишенью, аптамером и конкурентом, и молекулой-мишенью и молекулой, не являющейся мишенью, а также агрегаты аптамера, молекулы-мишени, молекулы, не являющейся мишенью, поверхности и конкурента более высокого порядка.
[0048] В данном контексте "молекула-мишень", "аналит" и "мишень" используют взаимозаменяемо для обозначения любой представляющей интерес молекулы, с которой аптамер может связываться с высокой аффинностью и специфичностью и которая может присутствовать в исследуемом образце. "Представляющая интерес молекула" охватывает любое незначительное изменение конкретной молекулы, такое как, в случае белка, например, незначительные изменения аминокислотной последовательности, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидизация, ацетилирование, фосфорилирование или любая другая манипуляция или модификация, такая как конъюгирование с метящим компонентом, который, по существу, не влияет на идентификацию молекулы. Иллюстративные молекулы-мишени включают белки, полипептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, полисахариды, гликопротеины, гормоны, рецепторы, антигены, антитела, аффитела, миметики антител, вирусы, патогены, токсические вещества, субстраты, метаболиты, аналоги переходного состояния, кофакторы, ингибиторы, лекарственные вещества, красители, питательные вещества, ростовые факторы, клетки, ткани и любой фрагмент или часть любых из вышеприведенных веществ. Аптамер может быть идентифицирован в случае фактически любой химической или биологический молекула любого размера, и, таким образом, фактически любая химическая или биологическая молекула любого размера может служить подходящей мишенью. Мишень также можно модифицировать для повышения вероятности или силы взаимодействия между мишенью и аптамером. Мишень также можно модифицировать включением тега согласно вышеприведенному определению. В иллюстративных вариантах реализации изобретения молекула-мишень представляет собой белок. См. патент США No. 6376190 под названием "Modified SELEX Processes Without Purified Protein" для способов, в которых мишенью для SELEX является пептид.
[0049] "Полипептид", "пептид" и "белок" используют взаимозаменяемо в данном документе для обозначения полимеров, состоящих из аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и он может прерываться субъединицами неаминокислотной природы. Данные термины также охватывают аминокислотный полимер, который был модифицирован естественным образом или путем воздействия; например, образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой манипуляция или модификации, такой как конъюгирование с метящим компонентом. В пределах данного определения также включены, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислоты (включающие, например, не встречающиеся в природе аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области техники. Полипептиды могут состоять из отдельных цепей или ассоциированных цепей.
[0050] Термин "исследуемый образец" относится в данном документе к любому материалу, раствору или смеси, которая содержит множество молекул, и может включать по меньшей мере одну молекулу-мишень. Термин "исследуемый образец" включает биологические образцы, определение которых дано ниже, и образцы, которые можно использовать для исследований воздействия на окружающую среду или токсикологических исследований, таких как в случае загрязненной или потенциально загрязненной воды и промышленных сточных вод, например. В качестве исследуемого образца может выступать конечный продукт, промежуточный продукт или побочный продукт процесса подготовки, например, процесса производства. Исследуемый образец может включать любую подходящую анализируемую среду, буфер или разбавитель, который был добавлен к материалу, раствору или смеси, полученных от организма или из какого-нибудь другого источника (например, из окружающей среды или промышленного источника).
[0051] Термин "биологический образец" относится к любому материалу, раствору или смеси, полученных от организма. Он включает кровь (включая цельную кровь, лейкоциты, мононуклеары периферической крови, плазму крови и сыворотку крови), мокроту, образец выдыхаемого воздуха, мочу, сперму, слюну, менингеальную жидкость, амниотическую жидкость, жидкие выделения различных желез, лимфу, аспират выделений из сосков, бронхиальный аспират, синовиальную жидкость, аспират синовиальной жидкости, клетки, клеточный экстракт и цереброспинальную жидкость. Он также включает фракции всего ранее упомянутого, разделенные экспериментальным путем. Термин "биологический образец" также включает материалы, растворы или смеси, содержащие гомогенизированный твердый материал, такой как, полученный из образца кала, образца ткани или биоптата ткани, например. Термин "биологический образец" также включает материалы, растворы или смеси, полученные из клеточной линии, культуры ткани, культуры клеток, культуры бактерий, культуры вирусов или биологической системы, не содержащей клеток (например, IVTT).
[0052] В любом из вариантов реализации изобретения, раскрытых в данном документе, исследуемый образец можно сравнить с контрольным образцом. "Контрольный образец" относится в данном документе к любому материалу, раствору или смеси, которая содержит множество молекул, и, как известно, включает по меньшей мере одну молекулу-мишень. Также может быть известно точное количество или концентрация любых молекул-мишеней, присутствующих в контрольном образце. Термин контрольный образец включает биологические образцы, которые определены в данном документе, и образцы, которые можно использовать для исследований на воздействие на окружающую среду или токсикологических исследований, таких как в случае загрязненной или потенциально загрязненной воды и промышленных сточных вод, например. В качестве контрольного образца также может выступать конечный продукт, промежуточный продукт или побочный продукт процесса подготовки, например, процесса производства. Контрольный образец может включать любую подходящую анализируемую среду, буфер или разбавитель, который был добавлен к материалу, раствору или смеси, полученных от организма или из какого-нибудь другого источника (например, из окружающей среды или промышленного источника).
[0053] В данном контексте "молекула, не являющаяся мишенью" и "нецелевая" используют взаимозаменяемо для обозначения молекулы, содержащейся в исследуемом образце, которая может образовывать неспецифический комплекс с аптамером. Следует понимать, что молекула, которая не является мишенью для первого аптамера, может служить мишенью для второго аптамера. Подобным образом, молекула, которая является мишенью для первого аптамера, может не служить мишенью для второго аптамера.
[0054] В данном контексте термин "разделение" относится к выделению, концентрированию или удалению одного или нескольких молекулярных соединений из исследуемого образца или других молекул, содержащихся в исследуемом образце. Разделение можно использовать для увеличения чувствительности и/или снижения фона. Разделение будет наиболее эффективным после образования комплекса с аптамером, или когда аффинный комплекс аптамер-мишень становится необратимым вследствие введения ковалентной связи в ходе образования перекрестных связей. Этап разделения можно вводить после любого этапа или после каждого этапа, на котором происходит иммобилизация. Разделение также может быть основано на различии размеров или другом специфическом свойстве, по которому различаются аффинный комплекс аптамер-мишень и другие компоненты исследуемого образца. Разделения также можно достичь посредством специфического взаимодействия с аптамером или мишенью. Разделение также можно осуществить на основе физических или биохимических свойств аптамера, мишени, аффинного комплекса аптамер-мишень или ковалентного комплекса аптамер-мишень.
[0055] В анализах для определения одного аналита или мультиплексных анализах на основе аптамеров был разработан целый ряд этапов для отделения специфических аптамерных/аффинных комплексов от материалов, содержащихся в образце, или реагентов для анализов, которые могут приводить к появлению искажающих фоновых сигналов. Несмотря на реализацию этих этапов в анализах такого типа фон остается проблемой. В аналитических способах фон можно устранить опытным путем, или лучший подход заключается в идентификации источника фона и исключении взаимодействия, которое приводит к появлению фона. Было обнаружено, что взаимодействие типа аптамер-аптамер является источником фона в мультиплексных способах детекции аптамеров. Известны реагенты, которые ослабляют взаимодействия типа ДНК-ДНК и РНК-РНК, включая взаимодействия, которые основаны на последовательностях. Из-за того что внутренние взаимодействия аптамера определяют его вторичную и третичную структуру, не следовало бы ожидать, что эти типы реагентов, по существу, будут ослаблять фоновый сигнал в мультиплексном анализе, не оказывая влияния на укладку аптамера, и поэтому на связывание его с соответствующей мишенью. Описаны материалы и способы, которые обеспечивают установление баланса между потребностью в снижении фона и сохранением структуры аптамера.
[0056] В настоящем изобретении описаны усовершенствованные способы для осуществления мультиплексных анализов на основе аптамеров и фотоаптамеров для количественного определения одной или нескольких молекулы-мишени (молекул-мишеней), которые могут присутствовать в исследуемом образце, в которых аптамер (или фотоаптамер) можно отделить от аффинного комплекса аптамер-мишень (или ковалентного комплекса фотоаптамера-мишени) для окончательной детекции с использованием любого подходящего способа детекции нуклеиновых кислот, в виду того, что материалы и способы, описанные в данном документе, можно использовать для повышения общей эффективности данного анализа. Фотоаптамеры представляют собой аптамеры, которые содержат фотореактивные функциональные группы, которые обеспечивают возможность образования ковалентной связи или "фотосшивок" между аптамерами и молекулами-мишенями.
[0057] Было выявлено два непредусмотренных ограничения в результате подобного изучения ранее описанных способов осуществления одно- и мультиплексных анализов на основе аптамеров, включая мультиплексные анализы аффинности аптамеров методами протеомики. Во-первых, было установлено, что взаимодействия типа аптамер/аптамер являются главным источником фона анализа и потенциального ограничения возможности мультиплексной детекции. Во-вторых, было обнаружено, что матрицы образцов (в первую очередь сыворотка крови и плазма крови) препятствуют иммобилизации биотинилированных аптамеров на матрицах, замещенных стрептавидином. В данном документе описаны три главные инновации, которые позволяют уменьшить или устранить оба эти ограничения в процессе работы. Две из них присущи только усовершенствованному способу, описанному в данном документе, (обозначен в данном документе как мультиплексный анализ "Вариант 3"; одна была реализована в более раннего варианта анализа, который описан в Gold et al. (Dec. 2010) "Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery," PLoS One 5(12):e15005). Вариант 3 представляет собой один вариант реализации изобретения, описанного в данном документе.
[0058] Первое усовершенствование анализа, которое описано в Gold et al. (PLoS One (2010) 5(12):e15005), заключалось в использовании органических растворителей в некоторых промывочных буферах этапа Связывание-2 для уменьшения диэлектрической константы среды. Добавление этих промывочных буферов эффективно акцентирует отталкивание одноименных зарядов соседних фосфодиэфирных остовов аптамеров, таким образом, содействуя диссоциации взаимодействующих аптамеров, вызывающих появление фона.
[0059] Второе усовершенствование процесса, которое описано в данном документе, дает двойное преимущество. Во-первых, как в случае добавления органических растворителей в некоторые из промывочных буферов, используемых на этапе анализа Связывание-2, оно также противодействует склонности аптамеров к взаимодействию и, таким образом, снижает фон и улучшает способность мультиплексирования. Однако его главное преимущество заключается в противодействии ингибированию, зависящему от матриц, адсорбции биотинилированных аптамеров на стрептавидиновых матрицах. Такое ингибирование без труда детектируется даже при 5% о/о плазмы крови или сыворотки крови и ограничивает рабочие анализируемые концентрации до 5-10% концентраций плазмы крови или сыворотки крови. Это ограничение в свою очередь ограничивает чувствительность анализа.
[0060] Второе усовершенствование мультиплексного анализа, которое описано в данном документе, заключается в предварительной иммобилизации аптамеров, содержащих тег, на твердых матрицах до уравновешивания (называется "Связывание-0") с исследуемым раствором. Уравновешивание с исследуемым раствором затем проводят со связанными аптамерами в обработанных сосудах самих по себе. Как описано в данном документе исключительно в целях иллюстрации, биотинилированные аптамеры предварительно иммобилизировали на матрицах, содержащих стрептавидиновые гранулы, а уравновешивание с исследуемым раствором проводили с аптамерами, связанными гранулами. Этот этап предварительной иммобилизации обеспечивает возможность иммобилизации в условиях, которых у аптамеров уменьшается склонность к взаимодействию, а также обеспечивает возможность очень жестких промывок (с использованием основных или хаотропных солей) до уравновешивания, нарушая взаимодействие аптамеров и удаление всех аптамеров, несвязанных посредством очень сильного взаимодействия биотина-стрептавидина. Этот снижает количество аптамерных "агрегатов", выявляемых в процессе анализа -агрегатов, которые с некоторой детектируемой частотой удерживают фрагмент биотина или подвергаются биотинилированию в процессе анализа. Стоит отметить, что облучение отщепляет большинство, но не все фотоотщепляемые биотиновые фрагменты от аптамеров, тогда как некоторые аптамеры подвергаются биотинилированию посредством обработки NHS-биотином, предназначенной для белков, содержащих "тег". Биотинилированный аптамер, который захватывается на этапе Связывание-2, создает фон за счет взаимодействия с большим количеством фотоотщепленного аптамера, который затем отделяется при элюировании (Фигура 1). Также следует отметить, что формат с предварительной иммобилизацией с долей вероятности будет поддерживать очень большую возможность мультиплексной детекции, поскольку можно отдельно иммобилизировать панели аптамеров, затем объединить в форме, связанной с гранулами, таким образом, игнорируя условия, при которых аптамеры могу взаимодействовать и агрегировать.
[0061] Таким образом, предварительная иммобилизации позволяет игнорировать потребность в адсорбции аптамеров в присутствии раствора аналита, таким образом, обеспечивая количественную иммобилизацию даже при анализе ингибирующих концентраций растворов аналитов. Это обеспечивает возможность использования более высоких концентраций включительно по меньшей мере до 40% о/о плазмы крови или сыворотки крови, в отличие от самой высокой концентрации 10%, характерной для способа, который был ранее описан Gold et al. (Dec. 2010) PLoS One 5(12):e15005), или самой высокой концентрации 5%, используемой в более поздних вариантах способа, вследствие чего увеличивается чувствительность примерно в 4-8 раз, а также, увеличивается общая надежность анализа.
[0062] Третье усовершенствование общего процесса, которое описано в данном документе, заключается в использовании хаотропной соли при нейтральном рН для элюирования в ходе этапа Связывание-2, который подробно описан ниже. Предшествующие способы заключалось в использовании хлорида натрия при высоком рН (10), который нарушает ДНК-гибридизацию и взаимодействие типа аптамер/аптамер, а также взаимодействие типа белок/аптамер. Как отмечалось выше, ДНК-гибридизация и взаимодействия типа аптамер/аптамер способствуют появлению фона анализа. Хаотропные соли, охватывающие, среди прочего, перхлорат натрия, хлорид лития, хлорид натрия и хлорид магния при нейтральном рН поддерживают ДНК-гибридизацию и взаимодействия типа аптамер/аптамер, при этом нарушая взаимодействия типа аптамер/белок. Конечный результат заключается в значительном снижении (приблизительно в 10 раз) фона с одновременным повышение чувствительности анализа.
[0063] Краткое описание описанных выше мультиплексных анализов аптамеров
[0064] Аптамеры уравновешивали с исследуемым образцом (например, плазма крови) в растворе. За данный период произошло образование долгоживущих (средний период полувыведения приблизительно 30 минут) комплексов между аналитами и аптамерами, особенно аптамерами с низкой скоростью диссоциации, Уравновешенную смесь, содержащую матрицу образцов, аптамер, анализируемые белки и комплексы аптамер/аналит затем наносили на стрептавидин, иммобилизированный на агарозных гранулах (SA-агароза) (в случае, когда аптамер в качестве тега содержит биотиновый фрагмент). Аптамеры, содержащиеся в смеси, захватываются на SA-агарозе посредством присоединенного биотинового фрагмента. Необходимо отметить, что анализ зависит от количественного захвата аптамеров на данном этапе. Иммобилизированные аптамеры затем мягко промывали, удаляя свободный и слабосвязанный белок, но оставляя аптамер и комплексы аптамер/аналит. Этот этап, называемый "Связывание-1", можно рассматривать как этап очистки белка. (См., например, патенты США No. 7947447 и 7855054).
[0065] Агарозные гранулы, несущие аптамеры и комплексы аналита/аптамера, затем обрабатывали NHS-биотином, оставляя биотиновый "тег" на связанных аптамерами анализируемых белках. После дополнительной промывки аптамеры, включающие комплексы аптамер/биотинилированный аналит отделяли от агарозных гранул посредством отщепления лабильного линкер между аптамером и биотиновым фрагментом (как описано в данном Примере ниже исключительно в целях иллюстрации, фотолабильный линкер, отщепляется при использовании воздействия УФ-излучения). Так называемый элюат продукта реакции фотоотщепления затем переносят в лунку, несущую магнитные стрептавидиновые гранулы. Преимущественно адсорбируются комплексы аптамер/биотинилированный аналит. Этот этап захвата обозначен "Связывание-2". (См., например, патенты США No. 7947447 и 7855). После промывок аптамеры, которые на тот момент связались с гранулами через аналиты, элюировали раствором хлорида натрия при повышенном рН. Извлеченные аптамеры затем определяли количественно посредством гибридизации на коммерчески доступных микрочипах. Извлеченные количества аптамеров служат в качестве заместителя для концентрации белка, которую формально определяют по стандартной кривой.
[0066] Как отмечалось выше, наблюдали, что существенные количества аптамера, выявляемого в процессе анализа (т.е. который проходит этапы разделения), и создают фон даже в отсутствие добавленного белка из исследуемого образца. Источник этого фона, независимого от белка, сводился к взаимодействию типа аптамер/аптамер, что проиллюстрировано на Фигуре 1. Для решения этого вопроса было изучено несколько стратегий, направленных на уменьшение проблем, которые описаны в Gold et al. (PLoS One (2010) 5(12):e15005). В конечном итоге в качестве эффективной и подходящей стратегии для устранения данной проблемы была выбрана промывка теплым глицерином. Однако другие растворители и реагенты, которые снижают диэлектрическую постоянную воды, способны уменьшать фон анализа подобным образом. Примеры охватывают, среди прочего, глицерин, пропиленгликоль, трегалозу, этанол и тому подобное.
[0067] Уменьшение ингибирования захвата путем предварительной адсорбции аптамеров
[0068] Как отмечалось выше, определили, что сыворотка крови и плазма крови снижает эффективность захвата аптамеров, ограничивая концентрацию, которую можно измерять, что проиллюстрировано на Фигурах 2 и 3.
[0069] Что проиллюстрировано на Фигуре 4, предварительная иммобилизация аптамеров и последующее уравновешивание, которые описаны в данном документе, уменьшает проблему ингибирования захвата и обеспечивает возможность использования более высоких концентраций плазмы крови. В частности, можно использовать концентрации включительно по меньшей мере до 40% о/о плазмы крови или сыворотки крови, в отличие от самой высокой концентрации 10%, характерной для способа, который был ранее описан в Gold et al. (PLoS One (Dec. 2010) 5(12):е15005), или самой высокой концентрации 5%, используемой в более поздних вариантах способа, вследствие чего увеличивается чувствительность примерно в 4-8 раз, а также, увеличивается общая надежность анализа.
[0070] Ссылаясь на Фигуру 4, видно, что линейное увеличение сигнала можно наблюдать от начала до конца вплоть до использования 40% о/о плазмы крови (сравните линию, обозначенную (), формат с предварительной иммобилизацией, с линией, обозначенной (о), стандартный формат). Необходимо отметить намного более высокий сигнал, наблюдаемый для Spuriomer (заместитель для фона, зависимого от белка, нижние две панели) в стандартном формате, что указывает на то, что предварительная иммобилизации может снижать фон, зависимый от белка.
[0071] Снижение фона анализа и увеличение чувствительности анализа с использованием хаотропной соли для элюирования
[0072] Что проиллюстрировано на Фигуре 5, использование хаотропной соли для элюирования и уменьшает фон анализа, и увеличивает чувствительность анализа. Ссылаясь на Фигуру 5, видно, что фон анализа в буфере значительно снижается с использованием элюирования перхлоратом (сравните нижнюю кривую на Фигуре 5А с нижней кривой на Фигуре 5В). Фон анализа понижался до 20-40 ОЕФ. Различимые эндогенные уровни также до некоторой степени снижаются в случае ИЛ-11 с использованием элюирования перхлоратом, что свидетельствует о снижении фона, зависимого от белка (примерно 0,2 пМ в сравнении с 1 пМ).
[0073] В следующей таблице кратко изложены результаты (ОЕФ) сравнения элюирования CAPSO/NaCl и элюирования перхлоратом. Медиана и среднее значение для сигналов для всех SOMAmer в каждой группе с разведением (столбец 2) в присутствии плазмы крови (5% о/о плазмы крови для 5% SOMAmer; 0,316% о/о плазмы крови для 0,316% SOMAmer и 0,01% плазмы крови для 0,01% SOMAmer) показаны в строках 1-6; медиана и среднее значение для сигналов для всех SOMAmer, называемых Spuriomers (SOMAmer, сконструированные in silico, которые не имеют родственного аналита), в присутствии 5%-ной плазмы крови, показаны в строках 8 и 9; и медиана и среднее значение для сигналов всех SOMAmer при всех разведениях и в присутствии только буфера показаны в строке 10.
[0074] Результаты представленные на Фигуре 5 отражены в результатах, показанных в таблице. При элюировании перхлоратом уровень сигнала от буфера сравнительно низкий, значительно снижены уровни сигналов от Spuriomer в плазме крови и минимально снижены уровни сигналов в 0,01%-ных и 0,316%-ных смесях, в которых сигналы однозначно возникают от родственных аналитов.
[0075] Коэффициенты вариации (CV) в сигналах, обусловленных буфером, измеряли в 8 повторностях с использованием элюирования перхлоратом, мотивируя это тем, что сигналы, близкие к фону прибора, могли быть шумом и, таким образом, могли препятствовать достижению очень низкого нижнего предела количественного определения (LLOQ), подразумеваемого под этими очень низкими фонами. В данном эксперименте с медианным сигналом, равном всего лишь 32 ОЕФ, первоначальный медианный CV в строках составлял 6,2% (Фигура 6). Стабильность при этих очень низких сигналах, по-видимому, не являлась фактором, который ограничивает LLOQ.
[0076] Сравнение эффективности анализа
[0077] Было проведено формальное сравнение самого последнего варианта способа, раскрытого в Gold et al. (PLoS One (Dec. 2010) 5(12):e15005) (названный "Предыдущий анализ" в Таблице 2), и настоящего изобретения (Вариант 3 в Таблице 2). Высокая степень сходства между протоколами обеспечила возможность проведения исследования, в котором оба протокола анализа могут быть выполнены за один автоматизированный подход, фактически на одинаковых фильтровальных планшетах с минимальным вмешательством оператора. Исследование включает образцы плазмы крови в 8 повторностях для определения вариабельности, 8 лунок с дозозависимым эффектом буфера и 8 лунок с добавкой плазмы крови. Необходимо отметить, что в Варианте 3 использованы намного большие концентрации плазмы крови, чем в более раннем варианте анализа (40, 1,3 и 0,.044% в отличие от 5, 0,167 и 0,0056%). Краткое изложение результатов в ОЕФ для первичных данных и в ОЕФ для данных, нормализованных по концентрации плазмы крови, показаны ниже (Таблица 2).
[0078] Ссылаясь на Таблицу 2, видно, что при использовании в Варианте 3 уменьшаются уровни необработанных фоновых сигналов приблизительно в 4 раза, что определяется сигналами, обусловленными Spuriomer и аптамерами в случае материала нечеловеческого происхождения, тогда как необработанные сигналы, обусловленные аналитами, являются приблизительно одинаковыми, что измеряется с помощью сигналов, обусловленных аналитами со средним и высоким обилием. Необходимо отметить, что эти значения были получены в случае использования 40%-ной плазмы крови в Варианте 3, тогда как в более раннего варианта анализа использовали 5%-ную плазму крови. Если нормализовать сигналы по 100%-ной плазме крови (значения в скобках), уровни фона значительно снижаются (приблизительно в 30 раз), тогда как сигналы, обусловленные аналитами, снижаются приблизительно в 7 раз. Сигналы, обусловленные только буфером, снижаются почти логарифмически. Необходимо отметить, что снижение фона обходится высокой ценой- для предыдущих анализов требуется приблизительно 15 мкл плазмы крови, тогда как для Варианте 3 требуется приблизительно 60 мкл. Это увеличение объема расхода образцов, по-видимому, не играет важной роли в случае образцов, взятых у больших животных (например, человека), но может быть значимым фактором для анализа образцов в динамеке в случае небольших животных, таких как мыши. Общие степени извлечения были намного более высокими в случае варианта реализации настоящего изобретения, продемонстрированного в Варианте 3, чем в случае более ранних вариантов анализа, с медианами, составляющими приблизительно 80% для варианта реализации настоящего изобретения и всего лишь 25% для предыдущих анализов, что проиллюстрировано на Фигуре 7. Большую часть этого усовершенствования можно отнести на счет иммобилизации аптамеров до уравновешивания.
[0079] На Фигурах 8 и 9 изображены два примера прямого сравнения кривых титрования белка в буфере (левые панели, нижняя кривая), количества белка, введенного в плазму крови (левые панели, верхняя кривая), титр плазмы крови (средние панели) и рассчитанные эндогенные уровни (графическое отображение титра плазмы крови и стандартных кривых, полученных для белка, правые панели) в случае предыдущих анализов (верхние панели) и способа, описанного в данном документе (нижние панели). Необходимо отметить, что определенное количество белка добавляли в 5%-ную плазму крови в случае предыдущих анализов и 40% плазму крови в случае способа, описанного в данном документе. Типичная кривая сравнения, на которой показан дозозависимый эффект буфера, количества добавленной плазмы, а измеренные эндогенные уровни показаны на Фигуре 8. Яркий пример повышенной степени извлечения показан на Фигуре 9.
[0080] Усовершенствованный мультиплексный анализ аптамеров
[0081] В одном варианте реализации изобретения предложены аптамеры, которые обладают высокой степенью аффинности и специфичности к молекуле-мишени и первому отделяемому тегу. В некоторых вариантах реализации изобретения аптамеры представляют собой фотоаптамеры. В другом варианте реализации изобретения первый отделяемый тег добавляют в любое время в процессе анализа до разделения Связывание-1 (согласно приведенному ниже определению в абзаце [0082]). В одном варианте реализации изобретения этот первый отделяемый тег представляет собой фотоотщепляемый биотин. Описаны другие теги и отщепляемые фрагменты, и аптамер, содержащий такие теги и отщепляемые фрагменты.
[0082] Аптамер, содержащий отделяемый первый тег, который обладает специфической аффинностью к молекуле-мишени, иммобилизируют на твердой подложке в растворе до уравновешивания с исследуемым образцом. Присоединение аптамера к твердой подложке осуществляют путем нанесения аптамера на первую твердую подложку и ассоциации отделяемого первого тега, встроенного в аптамер, либо прямо, либо опосредованно с соответствующим первым захватывающим агентом, который присоединен к первой твердой подложке. Агрегаты типа аптамер/аптамер удаляют с помощью отмывок раствором, который доводят буфером до рН 11, вследствие чего происходит снижение фона анализа. Эти этапы включают "Связывание-0".
[0083] Затем готовят исследуемый образец (как описано в данном Примере) и приводят в контакт с иммобилизированными аптамерами, которые обладают специфической аффинностью к соответствующим молекулам-мишеням. Если исследуемый образец содержит молекулу-мишень (молекулы-мишени), в смеси с исследуемым образцом образуется аффинный комплекс аптамер-мишень. Необходимо отметить, что в дополнение к аффинным комплексам аптамера-мишени, к первой твердой подложке также будет присоединяться несвязанный аптамер. Аффинный комплекс аптамер-мишень и несвязанный аптамер, который ассоциировал с твердой подложкой, затем отделяют от остальной части смеси, вследствие чего происходит удаление свободной мишени и всех других несвязанных веществ в исследуемом образце (матрице образцов); т.е., компонентов смеси, не ассоциированных с первой твердой подложкой. После разделения аффинный комплекс аптамер-мишень наряду с любым несвязанным аптамером отделяют от первой твердой подложки с использованием способа, подходящего для конкретного используемого отделяемого первого тега.
[0084] В одном варианте реализации изобретения аффинные комплексы аптамер-мишень, связанные с твердой подложкой, затем обрабатывают агентом, который обеспечивает введение второго тега в компонент молекулы-мишени аффинных комплексов аптамер-мишень. В одном варианте реализации изобретения мишень представляет собой белок или пептид, и мишень подвергают биотинилированию путем обработки NHS-PEO4-биотином. Второй тег, введенный в молекулу-мишень, может быть таким же или отличным от тега, захватывающего аптамер. Если второй тег не отличается от первого тега или тега, захватывающего аптамер, до начала этого этапа введения тега можно блокировать свободные сайты захвата на первой твердой подложке. В этом иллюстративном варианте реализации изобретения первую твердую подложку промывают свободным биотином до начала введения тега в мишень. Способы введения тега и, в частности, введения тега в мишени, такие как пептиды и белки, описаны в патенте США No. 7855054. В других вариантах реализации изобретения введения тега в мишень осуществляют в любой другой момент времени в процессе анализа до начала разделения Связывание-2.
[0085] Разделение Связывание-1 совершают путем отделения аптамеров и аффинных комплексов аптамер-мишень от первой твердой подложки. В одном варианте реализации изобретения первый отделяемый тег представляет собой фотоотщепляемый фрагмент, который отщепляется вследствие облучения УФ-лампой в условиях, которые обеспечивают расщепление ≥90% первого отделяемого тега. В других вариантах реализации изобретения отделение осуществляют по способу, подходящему для выбранного отделяемого фрагмента в первом отделяемом теге. Аффинные комплексы аптамер-мишень можно элюировать и собрать для дальнейшего использования в процессе анализа или можно нанести на другую твердую подложку для проведения остальных этапов анализа.
[0086] В одном варианте реализации изобретения смесь может факультативно подвергаться кинетическому испытанию. Кинетическое испытание способствует снижению степени любого неспецифического связывания между аптамерами и молекулами, не являющимися мишенями. В одном варианте реализации изобретения к аффинным комплексам аптамера-мишени добавляют 10 мМ сульфат декстрана, и смесь инкубируют в течение приблизительно 15 минут. Другие конкуренты охватывают, среди прочего, конкурентные нуклеиновые кислоты. В другом варианте реализации изобретения кинетическое испытание запускают путем осуществления элюирования Связывание-1 в присутствии 10 мМ сульфата декстрана. В других вариантах реализации изобретения кинетическое испытание осуществляют после этапа равновесного связывания и до разделения Связывание-2. В других вариантах реализации изобретения кинетическое испытание осуществляют путем разведения.
[0087] В одном варианте реализации изобретения для удаления свободного аптамера осуществляют разделение Связывание-2, как было описано выше. В одном варианте реализации изобретения к мишени можно присоединить второй тег, используемый при разделении Связывание-2, в то время как аффинный комплекс аптамер-мишень все еще будет взаимодействовать с твердой подложкой, используемой в разделении Связывание-1. В других вариантах реализации изобретения второй тег можно присоединить к мишени в другой момент времени в процессе анализа до начала разделения Связывание-2. Смесь взаимодействует с твердой подложкой, при этом к поверхности твердой подложки прикреплен захватывающий элемент (второй), который способен связываться с тегом, связывающим мишень (второй тег), предпочтительно с высокой аффинностью и специфичностью. В одном варианте реализации изобретения твердая подложка представляет собой магнитные гранулы (такие как DynaBeads MyOne Streptavidin C1), содержащиеся внутри лунки микротитрационного планшета, и захватывающий элемент (второй захватывающий элемент) представляет собой стрептавидин. Магнитные гранулы являются удобным средством для отбора разделенных компонентов смеси. Аффинные комплексы аптамер-мишень, содержащиеся в смеси, вследствие этого связываются с твердой подложкой посредством связывающего взаимодействия тега (второго), захватывающего мишень, и второго захватывающего элемента на второй твердой подложке. Аффинный комплекс аптамер-мишень затем отделяется от остальной части смеси, например, путем промывки подложки буферными растворами, включающими буферы, содержащие органические растворители охватывающей, среди прочего, глицерин.
[0088] Аптамеры затем избирательно элюируют из комплексов аптамер-мишень буферами, содержащими хаотропные соли из группы, охватывающей, среди прочего, перхлорат натрия и хлорид лития. Аптамеры, удерживаемые на гранулах Связывание-2 в силу взаимодействия типа аптамер/аптамер, не элюируются под воздействием этой обработки.
[0089] В другом варианте реализации изобретения аптамер, отделенный при разделении Связывание-2, детектируют и факультативно определяют количественно с помощью любых подходящих методов детекции нуклеиновых кислот, таких как, например, гибридизация на ДНК-микрочипе, количественная ПЦР, масс-спектроскопия, клевазный тест, секвенирование нового поколения и тому подобное. Эти способы детекции подробно описаны ниже.
[0090] В одном варианте реализации изобретения в качестве контрольного образа может выступать объединенный биологический образец, который представляет контрольную группу. В другом варианте реализации изобретения в качестве контрольного образа может выступать биологический образец, полученный от индивидуума, собранный в первый раз, и исследуемый образец можно получить от одного и того же индивидуума, но собрать во второй раз, вследствие чего облегчается длительное повторное обследование индивидуума за счет измерения и оценки любых изменений количества или концентрации одной или нескольких молекул-мишеней с течением времени во многих биологических образцах, полученных у индивидуума.
[0091] Любые способы, описанные в данном документе, можно использовать для проведения анализа для определения одного аналита или мультиплексного анализа исследуемого образца. Любой мультиплексный анализ может включать использование двух, десяти, сотен или тысяч аптамеров для одновременного анализа равного количества молекул-мишеней в исследуемом образце, таком как, например, биологический образец. В этих вариантах реализации изобретения в исследуемый образец вводится множество аптамеров, каждый из которых распознает и факультативно образует поперечные связи с другим аналитом, и можно осуществить любой из вышеописанных анализов. После отделения аптамеров можно использовать любые подходящие мультиплексные способы детекции нуклеиновых кислот для определения разных аптамеров, которые были отделены. В одном варианте реализации изобретения это можно совершить посредством гибридизации с комплиментарными зондами, которые по отдельности расположены на твердой поверхности. В другом варианте реализации изобретения каждый из разных аптамеров можно детектировать на основе молекулярного веса с использованием масс-спектроскопии. Еще в одном варианте реализации изобретения каждый из разных аптамеров можно детектировать на основе электрофоретической подвижности, такой как, например, в капиллярном электрофорезе, в геле или путем жидкостной хроматографии. В другом варианте реализации изобретения для количественного определения каждого из разных аптамеров с использованием количественной ПЦР можно использовать уникальные ПЦР-зонды.
7
[0092] В каждом из анализов, раскрытых в данном документе, для увеличения специфичности анализа и для снижения уровня неспецифического связывания можно использовать кинетическое испытание. В одном варианте реализации изобретения, который можно факультативно использовать в каждом из анализов, описанных в данном документе, дополнительного снижения уровня неспецифического связывания можно достичь либо за счет предварительной инкубации конкурирующей молекулы с исследуемым образцом, либо путем добавления конкурирующей молекулы в смесь в ходе равновесного связывания. В одном варианте реализации изобретения 4 мкМ конкурентного олигонуклеотида Z-block (5'-(ACZZ)AC-3', где Ζ = 5-бензил-дУТФ) предварительно инкубируют в течение приблизительно 5 минут с исследуемой смесью.
[0093] Наборы
[0094] Другой аспект настоящего изобретения относится к наборам, пригодным для удобного осуществления любого из способов анализа исследуемых образцов, раскрытых в данном документе. Для повышения универсальности раскрытых способов, реагенты могут предоставляться в комбинированной упаковке, в одних и тех же или отдельных упаковках, чтобы соотношение реагентов позволяло существенно оптимизировать способ и анализ. Каждый реагент может находиться в отдельной упаковке, или различные реагенты можно объединить в одной или нескольких упаковках в зависимости от перекрестной реактивности и стабильности реагентов.
[0095] Набор содержит, в комбинированной упаковке, по меньшей мере один аптамер, содержащий тег, и одну или несколько твердых подложек, причем каждый включает по меньшей мере один захватывающий агент. Набор также может включать промывочные растворы, такие как буферная водная среда для разведения образцов, а также для промывки матрицы, реагенты для подготовки образцов и тому подобное. Набор может дополнительно содержать реагенты, пригодные для введения второго тега, в целом, посредством модификации дериватизации мишени. В дополнение к этому набор может содержать реагенты, подходящие для осуществления требуемого кинетического испытания в процессе осуществления аналитического способа. Относительные количества различных реагентов в наборах могут варьировать в широких пределах для обеспечения концентраций Реагенты, которые, по существу, оптимизируют реакции, которые должны происходить в ходе анализа, и кроме того, по существу, для оптимизации чувствительности анализа. При соответствующих условиях один или несколько реагентов в наборе могут предоставляться в виде сухого порошка, обычно лиофилизованного, включая вспомогательные вещества, которые при растворении будут обеспечивать раствор реагентов, имеющий соответствующие концентрации для осуществления способа или анализа в соответствии с настоящим изобретением. Набор может дополнительно включать письменное описание способа в соответствии с любым из способов, которые описаны в данном документе.
[0096] В одном варианте реализации изобретения набор для детекции и/или количественного определения одной или нескольких молекул-мишеней, которые могут присутствовать в исследуемом образце, включает по меньшей мере один аптамер, обладающий специфической аффинностью к молекуле-мишени и содержащий тег; и твердую подложку, причем указанная твердая подложка включает по меньшей мере один захватывающий агент, нанесенный на нее, и причем указанный захватывающий элемент способен ассоциировать с тегом на аптамере.
[0097] В другом варианте реализации изобретения набор для детекции и/или количественного определения одной или нескольких молекул-мишеней, которые могут присутствовать в исследуемом образце, включает по меньшей мере один аптамер, обладающий специфической аффинностью к молекуле-мишени и содержащий тег и метку; и твердую подложку, причем указанная твердая подложка включает по меньшей мере один захватывающий агент, нанесенный на нее, и причем указанный захватывающий элемент способен ассоциировать с тегом на аптамере.
[0098] В другом варианте реализации изобретения набор для детекции и/или количественного определения одной или нескольких молекул-мишеней, которые могут присутствовать в исследуемом образце, включает по меньшей мере один аптамер, обладающий специфической аффинностью к молекуле-мишени и содержащий отделяемый тег и метку; и твердую подложку, причем указанная твердая подложка включает по меньшей мере один захватывающий агент, нанесенный на нее, и причем указанный захватывающий элемент способен ассоциировать с тегом на аптамере.
[0099] В дополнение к этому, любой из вышеописанных наборы может содержать реагенты и материалы для осуществления кинетического испытания в ходе способа детекции с использованием данного набора.
[00100] В данном контексте "Связывание-1" относится к разделению аффинного комплекса аптамер-мишень или ковалентного комплекса аптамер-мишень. Целью Связывание-1 является, по существу, удаление всех компонентов из исследуемого образца, которые не ассоциированы с аптамером. Удаление большинства таких компонентов, в целом, будет улучшать эффективность введения тега в мишень за счет удаления молекул, не являющихся мишенями, на этапе введения тега в мишень, использованного в случае захвата Связывание-2, и может приводить к снижению фона анализа. В одном варианте реализации изобретения тег присоединяется к аптамеру либо перед проведением анализа, в ходе подготовки анализа или в ходе анализа путем присоединения тега к аптамеру. В одном варианте реализации изобретения тег представляет собой отделяемый тег. В одном варианте реализации изобретения отделяемый тег содержит расщепляемый линкер и тег. Как было описано выше, аптамер, содержащий тег, может захватываться на твердой подложке, если эта твердая подложка содержит захватывающий элемент, подходящий для этого тега. Твердую подложку можно затем промыть, как описанные в данном документе, до уравновешивания с исследуемым образцом для удаления любых нежелательных материалов (Связывание-0).
[00101] В данном контексте "Связывание-2" относится к разделению аффинного комплекса аптамер-мишень или ковалентного комплекса аптамер-мишень на основе захвата молекулы-мишени. Целью этапа Связывание-2 является удаление свободного или несвязанного аптамера из исследуемого образца до детекции и факультативного количественного определения. Удаление свободного аптамера из образца делает возможной детекцию аффинных комплексов аптамер-мишень или ковалентных комплексов аптамер-мишень с помощью любого подходящего метода детекции нуклеиновых кислот. При использовании количественной ПЦР для детекции и факультативного количественного определения удаление свободного аптамера необходимо для точной детекции и количественного определения молекулы-мишени.
[00102] В одном варианте реализации изобретения в качестве молекулы-мишени выступает белок или пептид, а свободный аптамер отделен от аффинного (или ковалентного) комплекса аптамер-мишень (и остальной части исследуемого образца) с использованием Реагенты, которые могут встраиваться в белки (и пептиды) и комплексы, которые включают белки (или пептиды), такие как, например, аффинный (или ковалентный) комплекс аптамер-мишень. Белок (или пептид), содержащий тег, и аффинный (или ковалентный) комплекс аптамер-мишень можно иммобилизировать на твердой подложке, обеспечивая отделение белка (или пептида) и аффинного (или ковалентного) комплекса аптамер-мишень от свободного аптамера. Такое введение тега может включать, например, биотиновый фрагмент, который можно встроить в белок или пептид.
[00103] В одном варианте реализации изобретения тег Связывание-2 присоединяется к белку (или пептиду) либо перед проведением анализа, в ходе подготовки анализа, либо в ходе анализа путем химического присоединения тега к мишеням. В одном варианте реализации изобретения тег Связывание-2 представляет собой отделяемый тег. В одном варианте реализации изобретения отделяемый тег содержит расщепляемый линкер и тег. В целом, однако нет необходимости в отделении белка (или пептида) от твердой подложки Связывание-2. Как было описано выше, мишени, содержащие тег, могут захватываться на второй твердой подложке, если эта твердая подложка содержит захватывающий элемент, подходящий для тега-мишени. Твердую подложку затем промывают различными буферными растворами, включая буферные растворы, содержащие органические растворители и буферные растворы, содержащие соли и/или поверхностно-активные вещества.
[00104] После промывки второй твердой подложки аффинные комплексы аптамер-мишень затем подвергают диссоциации, при которой разрушаются данные комплексы с получением свободного аптамера, тогда как молекулы-мишени, в целом, остаются связанными с твердой подложкой за счет связывающего взаимодействия захватывающего элемента и тега, захватывающего мишень. Аптамер можно отделить от аффинного комплекса аптамер-мишень любым способом, который разрушает структуру либо аптамера, либо мишени. Этого можно достичь посредством промывки аффинных комплексов аптамер-мишень, связанных на подложке, в буфере с высоким содержанием солей, который приводит к диссоциации нековалентно связанных комплексов аптамер-мишень. Элюированные свободные аптамеры собирают и детектируют. В другом варианте реализации изобретения для разрушения аффинных комплексов аптамер-мишень использован высокий или низкий рН. В другом варианте реализации изобретения для диссоциации аффинных комплексов аптамер-мишень использована высокая температура. В другом варианте реализации изобретения можно использовать комбинацию любых из вышеприведенных способов. В другом варианте реализации изобретения для отделения аптамерного компонента использовано протеолитическое расщепление белкового фрагмента.
[00105] В случае ковалентных комплексов аптамер-мишень отделение аптамера для последующего количественного определения выполняют с использованием расщепляемого линкера в составе конструкции аптамера. В другом варианте реализации изобретения расщепляемый линкер в составе тега-мишени будет приводить к отделению ковалентного комплекса аптамер-мишень.
[00106] В данном контексте термины "конкурирующая молекула" и "конкурент" используют взаимозаменяемо для обозначения любой молекулы, которая может образовывать неспецифический комплекс с молекулой, не являющейся мишенью, например, чтобы предотвратить повторное неспецифическое связывание молекулы, не являющейся мишенью, с аптамером. "Конкурентные молекулы" или "конкуренты" относятся к нескольким таким группам молекул. Конкурентные молекулы включают олигонуклеотиды, полианионы (например, гепарин, ДНК сперматозоида сельди, одноцепочечная ДНК сперматозоида лосося и полидекстраны (например, сульфат декстрана)), полимеры с фосфодиэфирной связью с удаленными азотистыми основаниями, дНТФ и пирофосфат. В случае кинетического испытания, в котором используется конкурент, в качестве такого конкурента также может выступать любая молекула, которая может образовывать неспецифический комплекс со свободным аптамером или белком, например, чтобы предотвратить повторное неспецифическое связывание этого аптамера или белка с молекулой, не являющейся мишенью. Такие конкурентные молекулы включают поликатионы (например, спермин, спермидин, полилизин и полиаргинин) и аминокислоты (например, аргинин и лизин). Когда в качестве кинетического испытания используется конкурент, используется довольно высокая концентрация по сравнению с предполагаемой концентрацией общего белка или общего аптамера, присутствующего в образце. В одном варианте реализации изобретения в кинетическом испытании в качестве конкурента использован приблизительно 10 мМ сульфат декстрана. В одном варианте реализации изобретения кинетическое испытание включает добавление конкурирующей молекулы в смесь, содержащую аффинный комплекс аптамер-мишень, и инкубацию смеси, содержащей аффинный комплекс аптамер-мишень в течение не менее приблизительно 30 секунд, приблизительно 1 минуты, приблизительно 2 минут, приблизительно 3 минут, приблизительно 4 минут, приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 30 минут и приблизительно 60 минут. В другом варианте реализации изобретения кинетическое испытание включает добавление конкурирующей молекулы в смесь, содержащую аффинный комплекс аптамер-мишень, и инкубацию смеси, содержащей аффинный комплекс аптамер-мишень в течение такого периода времени, что увеличивается соотношение измеренного уровня содержания аффинного комплекса аптамер-мишень к измеренному уровню содержания неспецифического комплекса.
[00107] В некоторых вариантах реализации изобретения кинетическое испытание осуществляют путем разведения исследуемого образца связывающим буфером или любым другим раствором, который незначительно увеличивает естественную скорость диссоциации аффинных комплексов аптамер-мишень. Разведение может быть приблизительно 2Х, приблизительно 3Х, приблизительно 4Х, приблизительно 5Х, или любым подходящим более сильным разведением. Более сильные разведения повышают эффективность кинетического испытания за счет снижения концентрации общего белка и аптамера после разведения, и вследствие этого снижения скорости их реассоциации. Если для введения кинетического испытания использовано разведение, полученную в результате смесь исследуемого образца, содержащую аффинный комплекс аптамер-мишень, можно концентрировать до проведения дополнительной обработки. Если применимо, это концентрирование может осуществляться с использованием способов, описанных в данном документе, в отношении факультативного отделения любых свободных аптамеров от исследуемого образца и/или факультативного удаления других компонентов из исследуемого образца, которые могут реагировать с агентом, обеспечивающим введение тега. Когда в качестве кинетического испытания используется разведение, выбирают такую степень разведения, которая представляется возможной, принимая во внимание и первоначальный объем исследуемого образца, и целесообразность извлечения аффинного комплекса аптамер-мишень из конечного (разведенного) объема без значительной потери комплекса. В одном варианте реализации изобретения разводят аффинный комплекс аптамер-мишень, и смесь инкубируют в течение ≥ приблизительно 30 секунд, ≥ приблизительно 1 минуты, ≥ приблизительно 2 минут, ≥ приблизительно 3 минут, ≥ приблизительно 4 минут, ≥ приблизительно 5 минут, ≥ приблизительно 10 минут, ≥ приблизительно 30 минут и ≥ приблизительно 60 минут. В другом варианте реализации изобретения разводят аффинный комплекс аптамер-мишень, и смеси, содержащие аффинный комплекс аптамер-мишень, инкубируют в течение такого периода времени, что увеличивается соотношение измеренного уровня содержания аффинного комплекса аптамер-мишень к измеренному уровню содержания неспецифического комплекса.
[00108] В некоторых вариантах реализации изобретения кинетическое испытание осуществлено таким образом, что эффект разведения образца и введения конкурирующей молекулы реализованы одновременно. Например, исследуемый образец можно развести большим объемом раствора конкурирующей молекулы. Объединение этих двух стратегий кинетического испытания может повышать эффективность кинетического испытания в большей степени, чем это достигается с использованием одной стратегии. В одном варианте реализации изобретения разведение может быть приблизительно 2Х, приблизительно 3Х, приблизительно 4Х, приблизительно 5Х или любым подходящим более сильным разведением, а в качестве конкурирующей молекулы выступает приблизительно 10 мМ сульфат декстрана. В одном варианте реализации изобретения кинетическое испытание включает разведение смеси, содержащей аффинный комплекс аптамер-мишень, добавление конкурирующей молекулы в смесь, содержащую аффинный комплекс аптамер-мишень, и инкубацию смеси, содержащей аффинный комплекс аптамер-мишень в течение не менее приблизительно 30 секунд, приблизительно 1 минуты, приблизительно 2 минут, приблизительно 3 минут, приблизительно 4 минут, приблизительно 5 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 30 минут и приблизительно 60 минут. В другом варианте реализации изобретения кинетическое испытание включает разведение смеси, содержащей аффинный комплекс аптамер-мишень, добавление конкурирующей молекулы в смесь, содержащую аффинный комплекс аптамер-мишень, и инкубацию смеси, содержащей аффинный комплекс аптамер-мишень в течение такого периода времени, что увеличивается соотношение измеренного уровня содержания аффинного комплекса аптамер-мишень к измеренному уровню содержания неспецифического комплекса.
[00109] В контексте данного описания аптамер может дополнительно содержать "тег", который относится к компоненту, который обеспечивает возможность прикрепления или иммобилизации аптамера (и любой молекулы-мишени, которая с ним связана) к твердой подложке. "Тег" представляет собой фрагмент, который способен ассоциировать с "захватывающим элементом". "Теги" или "захватывающие элементы" относятся к нескольким таким группам компонентов. Тег может быть прикреплен к аптамеру или включен в состав аптамера любым подходящим способом. В целом, тег позволяет аптамеру ассоциировать либо прямо, либо опосредованно с захватывающим элементом или рецептором, который прикреплен к твердой подложке. Захватывающий элемент обычно выбирают (или конструируют) таким образом, чтобы он проявлял высокую специфичность в ходе взаимодействия с тегом и сохранял эту ассоциацию в ходе последующих этапов или процедур обработки. Тег может обеспечивать прикрепление аффинного комплекса аптамер-мишень (или ковалентного аффинного комплекса аптамер-мишень) в заданных точках твердой подложки. Разные теги, поэтому, могут обеспечивать прикрепление разных ковалентных комплексов аптамер-мишень в разных заданных точках твердой подложки. В качестве тега может выступать полинуклеотид, полипептид, пептидная нуклеиновая кислота, закрытая нуклеиновая кислота, олигосахарид, полисахарид, антитело, аффитело, миметик антител, клеточный рецептор, лиганд, липид, биотин, полигистидин или любой фрагмент или производное этих структур, любая комбинация вышеприведенного или любая другая структура, на основе которой можно сконструировать или сконфигурировать захватывающий элемент (или линкерную молекулу, которая описана ниже) для связывания или иного типа специфического ассоциирования. В целом, тег конфигурируют таким образом, чтобы не происходило внутримолекулярное взаимодействие либо в самом теге, либо с аптамером, к которому он присоединен или в состав которого он входит. Если для идентификации аптамера используется SELEX, тег может быть присоединен к аптамеру либо до, либо после поведения SELEX. В одном варианте реализации изобретения тег включен в состав 5'-конца аптамера после поведения SELEX. В другом варианте реализации изобретения тег включен в состав 3'-конца аптамера после поведения SELEX. Еще в одном варианте реализации изобретения теги может быть включен в состав и 3'-, и 5'-концов аптамеров в процессе модификации после поведения SELEX. В другом варианте реализации изобретения в качестве тега может выступать внутренний сегмент аптамера.
[00110] В одном варианте реализации изобретения тег представляет собой биотиновую группу, а захватывающий элемент представляет собой белок, связывающий биотин, такой как авидин, стрептавидин, нейтравидин, Экстравидин или Траптавидин. Эту комбинацию можно в целях удобства использовать в различных вариантах реализации изобретения, поскольку биотин легко встраивается в аптамер в ходе синтеза, а стрептавидиновые гранулы являются общедоступными.
[00111] В одном варианте реализации изобретения тег представляет собой полигистидин, а захватывающий элемент представляет собой нитрилотриуксусную кислоту (NTA), образующую хелатные комплексы с ионом металла, таким как никель, кобальт, железо или любой другой ион металла, способный к образованию координационного соединения с полигистидином при образовании хелатных комплексов с NTA.
[00112] В одном варианте реализации изобретения тег представляет собой полинуклеотид, который сконструирован для гибридизации непосредственно с захватывающим элементом, который содержит комплементарную полинуклеотидную последовательность. В данном случае тег иногда обозначают "тегом последовательности", а захватывающий элемент, в целом, обозначают "зондом". В этом варианте реализации изобретения тег, в целом, сконфигурирован таким образом, и реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что тег не будет гибридизоваться с зондом, отличным от зонда, который полностью ему комплементарен. Это дает возможность разработать мультиплексный формат анализа, поскольку каждая комбинация тега/зонда может иметь уникальные последовательности.
[00113] В некоторых вариантах реализации изобретения тег содержит нуклеотиды, которые являются частью аптамера, как такового. Например, если для идентификации аптамера используется SELEX, аптамер, в целом, включает 5'-фиксированный конец, отделенный от 3'-фиксированного конца нуклеотидной последовательностью, которая варьирует в зависимости от аптамера, то есть, вариабельной областью. В одном варианте реализации изобретения тег может содержать любое подходящее количество нуклеотидов, включенных в состав фиксированного конца аптамера, такого как, например, полный фиксированный конец или любая часть фиксированного конца, включая нуклеотиды, которые находятся внутри фиксированного конца. В другом варианте реализации изобретения тег может содержать любое подходящее количество нуклеотидов, включенных в состав вариабельной области аптамера, такой как, например, полная вариабельная область или любая часть вариабельной области. В дополнительном варианте реализации изобретения тег может содержать любое подходящее количество нуклеотидов, которые перекрываются и с вариабельной областью, и с одним из фиксированных концов, то есть, тег может содержать нуклеотидную последовательность, которая включает любую часть (включительно всю) вариабельной области и любую часть (включительно всю) фиксированного конца.
[00114] В другом варианте реализации изобретения тег может ассоциировать непосредственно с зондом и ковалентно связываться с зондом, вследствие чего обеспечивает ковалентное связывание аптамера с поверхностью твердой подложки. В этом варианте реализации изобретения тег и зонд могут включать подходящие реакционноспособные группы, которые при ассоциации тега с зондом, будут находиться достаточно близко друг от друга, чтобы вступить в химическую реакцию, с образованием ковалентной связи. Реакция может происходить спонтанно или может требовать активации, такой как, например, фотоактивация или химическая активация. В одном варианте реализации изобретения тег включает диеновый фрагмент, а зонд включает диенофил, и в результате спонтанной реакции конъюгации диена и диенофила Дильса-Альдера образуется ковалентная связь. Можно использовать любые соответствующие дополнительные химические реакции, такие как, например, реакция N-аминометилирования Манниха, образование дисульфидной связи, реакция Курциуса, альдольная конденсация, образование оснований Шиффа и реакция присоединения Майкла.
[00115] В другом варианте реализации изобретения тег ассоциирует опосредованно с зондом, а именно, например, через линкерную молекулу, которая дополнительно описана ниже. В этом варианте реализации изобретения тег может включать полинуклеотидную последовательность, комплементарную конкретной области или компоненту линкерной молекулы. Тег, в целом, сконфигурирован таким образом, и реакция гибридизация проводится таким образом, что тег не будет гибридизоваться с полинуклеотидной последовательностью, отличной от полинуклеотидной последовательности, включенной в состав данной линкерной молекулы.
[00116] Если тег включает полинуклеотид, данный полинуклеотид может включать любое подходящее количество нуклеотидов. В одном варианте реализации изобретения тег включает по меньшей мере приблизительно 10 нуклеотидов. В другом варианте реализации изобретения тег включает от приблизительно 10 до приблизительно 45 нуклеотидов. Еще в одном варианте реализации изобретения тег включает по меньшей мере приблизительно 30 нуклеотидов. Разные теги, которые включают полинуклеотид, могут включать либо одинаковое количество нуклеотидов, либо разное количество нуклеотидов.
[00117] В некоторых вариантах реализации изобретения теговый компонент является бифункциональным в том смысле, что он включает функциональную группу для специфического взаимодействия с захватывающим элементом на твердой подложке или "зондом", определение которого дано ниже (компонент, который служит для ассоциации с зондом), и функциональную группу для диссоциации молекулы, к которой он присоединен, от компонента тега, который служит для ассоциации с зондом. Средство для диссоциации компонента тега, который служит для ассоциации с зондом, включает химическое средство, фотохимическое средство или другое средство в зависимости от конкретного тега, который используется.
[00118] В данном контексте "захватывающий элемент", "зонд" или "рецептор" относится к молекуле, которая сконфигурирована для ассоциации либо прямо, либо опосредованно с тегом. "Захватывающий элемент", "зонд" или "рецептор" представляет собой набор копий однотипной молекулы или однотипной структуры из многих молекул, который способен к иммобилизации фрагмента, через который присоединяется тег к твердой подложке путем ассоциации либо прямо, либо опосредованно с тегом. "Захватывающие элементы" "зонды" или "рецепторы" относятся к нескольким таким группам молекул. В роли захватывающего элемента, зонда или рецептора может выступать полинуклеотид, полипептид, пептидная нуклеиновая кислота, закрытая нуклеиновая кислота, олигосахарид, полисахарид, антитело, аффитело, миметик антител, клеточный рецептор, лиганд, липид, биотин, полигистидин или любой фрагмент или производное этих структур, любая комбинация вышеприведенного или любая другая структура, на основе которой можно сконструировать или сконфигурировать тег (или линкерную молекулу) для связывания или иного типа специфического ассоциирования. Захватывающий элемент, зонд или рецептор может быть присоединен к твердой подложке либо ковалентно, либо нековалентно любым подходящим способом.
[00119] Тогда как термины "захватывающий элемент", "зонд" и "рецептор" используют взаимозаменяемо, зонд, в целом, относится к полинуклеотидной последовательности. В одном варианте реализации изобретения зонд включает полинуклеотид, который имеет последовательность, комплементарную полинуклеотидной последовательности тега. В этом варианте реализации изобретения последовательность зонда, в целом, сконфигурирован таким образом, и реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что зонд не будет гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, отличной от тега, для которого данный зонд включает комплементарную последовательность (т.е., зонд, в целом, сконфигурирован таким образом, и реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что зонд не будет гибридизоваться с другим тегом или аптамером).
[00120] В другом варианте реализации изобретения зонд ассоциирует с тегом опосредованно, например, через линкерную молекулу. В этом варианте реализации изобретения зонд может включать полинуклеотидную последовательность, комплементарную конкретной области или компоненту линкерной молекулы. Зонд, в целом, сконфигурирован таким образом, и реакция гибридизация проводится таким образом, что данный зонд не будет гибридизоваться с полинуклеотидной последовательностью, отличной от полинуклеотидной последовательности, включенной в состав данной линкерной молекулы.
[00121] Если зонд включает полинуклеотид, данный полинуклеотид может включать любое подходящее количество нуклеотидов. В одном варианте реализации изобретения зонд включает по меньшей мере приблизительно 10 нуклеотидов. В другом варианте реализации изобретения зонд включает от приблизительно от 10 до приблизительно 45 нуклеотидов. Еще в одном варианте реализации изобретения зонд включает по меньшей мере приблизительно 30 нуклеотидов. Разные зонды, которые включают полинуклеотид, могут включать либо одинаковое количество нуклеотидов, либо разное количество нуклеотидов.
[00122] В некоторых вариантах реализации изобретения захватывающий зонд является бифункциональным в том смысле, что он включает функциональную группу для специфического взаимодействия с полинуклеотидным тегом и функциональную группу для диссоциации зонда от твердой подложки, так что зонд и аптамер отделяются одновременно. Средство для диссоциации зонда от твердой подложки включает химическое средство, фотохимическое средство или другое средство в зависимости от конкретного захватывающего зонда, который используется.
[00123] Вследствие реципрокного характера взаимодействия в паре между конкретным тегом и захватывающим элементом, тег, используемый в одном варианте реализации изобретения, может быть использован в качестве захватывающего элемента в другом варианте реализации изобретения, а захватывающий элемент, используемый в одном варианте реализации изобретения, может быть использован в качестве тега в другом варианте реализации изобретения. Например, аптамер с биотиновым тегом может захватываться стрептавидином, присоединенным к твердой подложке, в одном варианте реализации изобретения, тогда как аптамер со стрептавидиновым тегом может захватываться биотином, присоединенным к твердой подложке, в другом варианте реализации изобретения.
[00124] В данном контексте линкер представляет собой молекулярную структуру, которая используется для соединения двух функциональных групп или молекулярных структур. В данном контексте "спейсерный линкер" или проще говоря "спейсер" относится к группе подходящих атомов, которые обеспечивают отделение или пространственное разделение двух разных функциональных групп в пределах аптамера. В данном контексте "отделяемый" или "расщепляемый" элемент, фрагмент, или линкер относится к молекулярной структуре, которая может быть разрушена с получением двух отдельных компонентов. Отделяемый (или расщепляемый) элемент может содержать одну молекулу, в которой может быть разрушена химическая связь (обозначен в данном документе "встроенный расщепляемый линкер"), или он может содержать две или больше молекул, в которых нековалентное взаимодействие может быть разрушено или нарушено (обозначен в данном документе "гибридизационный линкер").
[00125] В некоторых вариантах реализации изобретения необходимо пространственно отделять определенные функциональные группы от других для того, чтобы предотвратить перекрестное влияние отдельных функциональных групп. Например, присутствие метки, которая поглощает определенные длины волн светового излучения, рядом с фотоотщепляемой группой может перекрестно влиять на эффективность фотоотщепления. Поэтому желательно разделять такие группы невзаимодействующим фрагментом, который обеспечивает достаточное пространственное разделение для получения полного эффекта фотоотщепления, например. В некоторых вариантах реализации изобретения "спейсерный линкер" был введен в аптамер и с меткой, и с фотоотщепляемой функциональной группой.
[00126] В одном варианте реализации изобретения спейсерные линкеры введены в аптамер в ходе синтеза, и следовательно они могут включать некоторое количество фосфорамидитных спейсеров, охватывая, среди прочего, алифатические углеродные цепи, длиной 3, 6, 9, 12 и 18 атомов углерода, цепи полиэтиленгликоля, длиной 1, 3 и 9 единиц этиленгликоля или тетрагидрофурановый фрагмент (называемый dSpacer (Glenn Research), или любую комбинацию вышеприведенного или любую другую структуру или химический компонент, который можно сконструировать или сконфигурировать удлинения фосфодиэфирного остова. В другом варианте реализации изобретения спейсерный линкер включает полинуклеотиды, такие как поли dT, dA, dG или dC, или поли U, A, G, или С, или любую комбинацию вышеприведенного. В другом варианте реализации изобретения спейсеры включают один или несколько рибозных или дезоксирибозных фрагментов с удаленными азотистыми основаниями. Необходимо отметить, что такие последовательности сконструированы таким образом, что они не нарушают структуру или функцию аптамера.
[00127] В данном контексте "гибридизационный линкер" относится к линкеру, который содержит две или больше молекул, в которых нековалентное взаимодействие может быть разрушено или нарушено с применением химических или физических методов. В некоторых вариантах реализации изобретения гибридизационный линкер используется для соединения аптамера с тегом, вследствие чего образуется отделяемый тег. Например, гибридизационный линкер может быть использован в любом из описанных анализов для образования расщепляемой связи между аптамером и биотином (например, в анализах аффинности и анализах сшивания) или расщепляемой связи между аптамером и группой, опосредующей фотосшивание (например, в анализах сшивания).
[00128] В одном варианте реализации изобретения гибридизационный линкер содержит две нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с образованием нековалентной связи. В одном варианте реализации изобретения в качестве одной из нуклеиновых кислот, которая участвует в образовании гибридизационной связи, может выступать область аптамера, как такового, а в качестве другой нуклеиновой кислоты может выступать нуклеиновая кислота, комплементарная этой области. Отделение может происходить по любому подходящему механизму разрушения дуплексов нуклеиновых кислот (тем не менее, при этом будет сохраняться совместимость с анализом). В одном варианте реализации изобретения для разрушения гибридизационного линкера использован 20 мМ NaOH в анализе фотосшивания с двойным захватом. Гибридизационная линкерная молекула может обладать любой подходящей конфигурацией и может включать любые подходящие компоненты, включая один или несколько полинуклеотидов, полипептидов, пептидных нуклеиновых кислот, закрытых нуклеиновых кислот, олигосахаридов, полисахаридов, антител, аффител, миметиков или фрагментов антител, рецепторов, лигандов, липидов, любой фрагмент или производное этих структур, любую комбинации вышеприведенного или любую другую структуру или химический компонент, который можно сконструировать или сконфигурировать с образованием отделяемой структуры.
[00129] В одном варианте реализации изобретения отделяемый тег состоит по меньшей мере из одного полинуклеотида, состоящего из подходящего количества нуклеотидов. В одном варианте реализации изобретения полинуклеотидный компонент линкерной молекулы включает по меньшей мере приблизительно 10 нуклеотидов. В другом варианте реализации изобретения полинуклеотидный компонент линкерной молекулы включает от приблизительно 10 до приблизительно 45 нуклеотидов. Еще в одном варианте реализации изобретения полинуклеотидный компонент линкерной молекулы включает по меньшей мере приблизительно 30 нуклеотидов. Линкерные молекулы, используемые в любом из способов, раскрытых в данном документе, могут включать полинуклеотидные компоненты, имеющие либо одинаковое количество нуклеотидов, либо разное количество нуклеотидов.
[00130] "Твердая подложка" относится к любому субстрату, имеющему поверхность, к которой могут быть присоединены молекулы, прямо или опосредованно, либо посредством ковалентньгх, либо нековалентных связей. Твердая подложка может включать любой субстратный материал, который способен обеспечивать физическую поддержку для захватывающих элементов или зондов, которые присоединены к поверхности. Материал, в целом, может выдерживать условия, связанные с присоединением захватывающих элементов или зондов к данной поверхности, и любую последующую подготовку, манипуляции или обработку, встречающиеся в ходе проведения анализа. В качестве материалов могут выступать материалы природного происхождения, синтетические материалы или модифицированный материал природного происхождения. Подходящая твердая подложка материалы может включать кремний, чип из кремниевых пластин, графит, поверхности с зеркальным покрытием, слоистые материалы, мембраны, керамика, пластмассу (включая полимеры, такие как, например, поли(винилхлорид), циклоолефиновые сополимеры, агарозные гели или гранулы, полиакриламид, полиакрилат, полиэтилен, полипропилен, поли(4-метилбутен), полистирол, полиметакрилат, поли(этилентерефталат), политетрафторэтилен (ПТФЭ или Teflon), найлон, поли(винилбутират)), германий, арсенид галлия, золото, серебро, пленки Лэнгмюра-Блоджета, проточный чип и т.д., либо используемые отдельно, либо совместно с другими материалами. Могут быть рассмотрены дополнительные жесткие материалы, такие как стекло, которое включает диоксид кремния и дополнительно включает, например, стекла, доступные в виде Биостекла. Другие материалы, которые можно использовать, включают пористые материалы, такие как, например, стеклянные гранулы с контролируемым размером пор, сшитые гранулированные Sepharose или агарозные смолы, или сополимеры сшитых бисакриламида и азалактона. Другие гранулы включают наночастицы, полимерные гранулы, сплошные гранулы, парамагнитные гранулы или микрогранулы. Также предусмотрены любые другие материалы, известные в данной области техники, которые могут содержать одну или несколько функциональных групп, таких как любая из аминной, карбоксильной, сульфгидрильной или гидроксильной функциональной группы, например, расположенные на поверхности.
[00131] Материал, используемый для твердой подложки, может принимать любую конфигурацию из множества конфигураций, начиная с простой и заканчивая сложной. Твердая подложка может иметь любую форму из целого ряда форм, включая полоску, пластину, диск, палочку, частицу, гранулу, трубку, лунку (микротитр) и тому подобное. Твердая подложка может быть пористой или непористой, магнитной, парамагнитной или немагнитной, полидисперсной или монодисперсной, гидрофильной или гидрофобной. Твердая подложка также может быть в форме геля или суспензии плотноупакованных (как в столбцовой матрице) или неплотно упакованных частиц.
[00132] В одном варианте реализации изобретения для захвата аффинных комплексов аптамер-мишень или ковалентных комплексов аптамер-мишень, содержащих тег, из исследуемой смеси использована твердая подложка с прикрепленным захватывающим элементом. В одном конкретном примере, когда в качестве тега выступает биотиновый фрагмент, в качестве твердой подложки может выступать гранула, покрытая стрептавидином, или смола, такая как Dynabeads М-280 Streptavidin, Dynabeads MyOne Streptavidin, Dynabeads M-270 Streptavidin (Invitrogen), стрептавидин-агарозная смола (Pierce), смола Ultralink, содержащая стрептавидин, стрептавидиновые гранулы MagnaBind (ThermoFisher Scientific), BioMag Streptavidin, ProMag Streptavidin, Диоксид кремния с поверхностью, покрытой стрептавидином (Bangs Laboratories), Streptavidin Sepharose High Performance (GE Healthcare), стрептавидин-полистирольные микросферы (Microspheres-Nanospheres), полистирольные частицы, покрытые стрептавидином (Spherotech), или любая другая гранула, покрытая стрептавидином, или смола, широко используемая специалистами в данной области техники для захвата молекул, содержащих биотиновый тег.
[00133] Как было описано выше, одной целью настоящего изобретения является превращение сигнала, обусловленного белком, в сигнал, обусловленный аптамером. В результате этого количество собранных/детектированных аптамеров является показателем и может быть непосредственно пропорциональным количеству связанных молекул-мишеней и количеству молекул-мишеней в образце. Можно применить целый ряд схем детекции без элюирования аффинного комплекса аптамер-мишень или ковалентного комплекса аптамер-мишень из второй твердой подложки после разделения Связывание-2. В дополнение к следующим вариантам реализации способов детекции изобретения, специалистам в данной области техники известны другие способы детекции.
[00134] Многие способы детекции требуют встраивания в аптамер обнаруживаемой метки до детекции. В этих вариантах реализации изобретения метки, такие как, например, флуоресцентные или хемилюминесцентные красители, можно встроить аптамеров либо в ходе синтеза, либо после синтеза с использованием стандартных методов синтеза нуклеиновых кислот. Радиоактивные метки можно встроить либо в ходе синтеза, либо после синтеза с использованием стандартных ферментативных реакций с соответствующими реагентами. Мечение также может происходить после разделения Связывание-2 и элюирования за счет использования подходящих ферментативных методов. Например, использование праймера с вышеупомянутыми метками в ПЦР обеспечит включение метки в продукт реакции амплификации элюированных аптамеров. При использовании метода гель-электрофореза для количественного определения также можно встроить массовые метки разных размеров с использованием ПЦР. Эти массовые метки также могут включать разные флуоресцентные или хемилюминесцентные красители для дополнительной возможности мультиплексной детекции. Метки можно опосредованно присоединять к аптамерам за счет использования специфического тега, встроенного в аптамер, либо в ходе синтеза, либо после синтеза, и затем за счет присоединения зонда, который ассоциирует с тегом и несет метку. Метки включают описанные выше метки, а также ферменты, используемые в стандартных анализах для колориметрических считываний данных, например. Эти ферменты работают в комбинации с субстратами ферментов и включают ферменты, такие как, например, пероксидаза хрена (HRP) и щелочная фосфатаза (АР). Метки также могут включать вещества или соединения, которые являются электрохимическими функциональными группами для электрохимической детекции.
[00135] Например, аптамер можно пометить, как было описано выше, радиоактивным изотопом, таким как 32Р, до взаимодействия с исследуемым образцом. Используя какой-нибудь из четырех основных анализов и их варианты, которые обсуждались выше, осуществление детекции аптамеров становится возможным просто благодаря количественному определению радиоактивности на второй твердой подложке в конце анализа. Уровень радиоактивности будет прямо пропорциональным количеству молекул-мишеней в первоначальном исследуемом образце. Подобным образом, мечение аптамера флуоресцентным красителем перед взаимодействием с исследуемым образцом, как было описано выше, обеспечивает простое считывание показателя флуоресценции непосредственно на второй твердой подложке. Для непосредственного считывания показателей второй твердой подложки подобным образом можно использовать хемилюминесцентную метку или квантовую точку, не требующие элюирования аптамера.
[00136] Элюирование аптамера или отделение ковалентного комплекса фотоаптамера-мишени от второй твердой подложки дает возможность использовать дополнительные схемы детекции в дополнение к схемам, описанным выше. Например, отделенный аптамер, фотоаптамер или ковалентный комплекс фотоаптамера-мишени можно разогнать на полиакриламидном геле и детектировать, и факультативно определить количественно с помощью красителя нуклеиновых кислот, такого как SYBR Золото. Альтернативно, отделенный аптамер, фотоаптамер или ковалентный комплекс фотоаптамера можно детектировать и определить количественно с использованием капиллярного гель-электрофореза (CGE) с использованием флуоресцентной метки, встроенной в аптамер, как было описано выше. В другой схеме детекции используется количественная ПЦР для детекции и количественного определения элюированного аптамера, например, с использованием SYBR Green. Альтернативно, для детекции и количественного определения элюированного аптамера можно использовать ДНК-анализ Invader. В другой альтернативной схеме детекции используется секвенирование нового поколения.
[00137] В другом варианте реализации изобретения количество или концентрация аффинного комплекса аптамер-мишень (или ковалентного комплекса аптамер-мишень) определена с использованием "молекулярного маяка" в ходе процесса репликации (см., например, Tyagi et al, Nat. Biotech. 16:49 53, 1998; патент США No. 5925517). Молекулярный маяк представляет собой специфический зонд из нуклеиновой кислоты, который свертывается в петлеобразную шпильку и содержит флуорофор на одном конце и гаситель на другом конце шпилечной структуры, так что флуорофор генерирует слабый сигнал или не генерирует никакого сигнала, когда образуется шпилька. Петлеобразная последовательность обладает специфичностью к полинуклеотидной последовательности-мишени, и при гибридизации с последовательностью аптамера шпилька развертывается и вследствие этого генерирует флуоресцентный сигнал.
32
125
3
13
35
[00138] Для мультиплексной детекции небольшого количества аптамеров, все еще связанных на второй твердой подложке, можно использовать флуоресцентные красители с разными спектрами возбуждения/испускания для детекции и количественного определения двух или трех, или пяти, или до десяти отдельных аптамеров. Подобным образом для мультиплексных считываний данных можно использовать разновеликие квантовые точки. Квантовые точки могут быть введены после отделения свободного аптамера от второй твердой подложки. За счет использования гибридизируемых последовательностей, обладающих специфичностью к аптамерам, прикрепленных к уникальным квантовым точкам, можно осуществлять мультиплексированное считывание данных для 2, 3, 5 и до 10 аптамеров. Мечение разных аптамеров разными радиоактивными изотопами, которые можно по отдельности детектировать, такими как Р, I, Н, С и S, также можно использовать для ограниченного количества мультиплексных считываний данных.
[00139] Для мультиплексной детекции аптамеров, отделенных от второй твердой подложки Связывание-2, можно использовать один флуоресцентный краситель, встроенный в каждый аптамер, как было описано выше, вместе со способом количественного определения, который позволяет идентифицировать последовательность аптамера наряду с количественным определением уровня аптамера. Способы охватывают, среди прочего, гибридизацию на ДНК-чипе, гибридизации на микрогранулах, секвенирование нового поколения и CGE-анализ.
[00140] В одном варианте реализации изобретения используется стандартная матрица для ДНК-гибридизации или чип для гибридизации каждого аптамера или фотоаптамера с уникальными или рядом уникальных зондов, иммобилизированных на стеклянной подложке или чипе, такие как матрицы Agilent, матрицы Illumina BeadChip, матрицы NimbleGen или напечатанные по заказу матрицы. Каждый уникальный зонд комплементарен последовательности аптамера. В качестве комплементарной последовательности может выступать уникальный гибридизационный тег, встроенный в аптамер, или часть последовательности аптамера, или вся последовательность аптамера. Аптамеры, отделенные от твердой подложки Связывание-2, добавляют в соответствующий буфер для гибридизации и обработки с использованием стандартных способов гибридизации. Например, раствор аптамеров инкубируют в течение 12 часов на матрице для ДНК-гибридизации приблизительно при 60°С для обеспечения точности гибридизации. Матрицы промывают и затем сканируют во флуоресцентном сканере для стеклянных подложек с получением изображения интенсивности гибридизации аптамера на каждом элементе матрицы. Сегментацию и количественный анализ изображений выполняют с использованием программного обеспечения для обработки изображений, такого как ArrayVision. В одном варианте реализации изобретения в мультиплексных анализах на основе аптамеров детекция может осуществляться с использованием до 25 аптамеров, до 50 аптамеров, до 100 аптамеров, до 200 аптамеров, до 500 аптамеров, до 1000 аптамеры и до 10000 аптамеров.
[00141] В одном варианте реализации изобретения для гибридизации использованы доступные микрогранулы, имеющие уникальные ДНК-зонды, комплементарные аптамеру, как было описано выше. Могут быть доступны микрогранулы с уникальными флуоресцентными красителями, такими как Luminex beads technology, или можно использовать метку в виде штрихового кода, как в технологии Illumina VeraCode technology или активируемых лазером транспондерных метках. В одном варианте реализации изобретения аптамеры, отделенные от твердой подложки Связывание-2, добавляют в соответствующий буфер для гибридизации и обрабатывают с использованием стандартных способов гибридизации на микрогранулах. Например, раствор аптамеров инкубируют в течение двух часов с набором микрогранул приблизительно при 60°С для обеспечения точности гибридизации. Растворы затем анализируют на приборе Luminex, который считает отдельные типы гранул и определяет количественно сигнал флуоресценции аптамеров. В другом варианте реализации изобретения гранулы VeraCode вносят в раствор аптамеров и подвергают гибридизации в течение двух часов приблизительно при 60°С, и затем наносят на сетчатую поверхность, и сканируют с использованием сканера для стеклянных подложек для идентификации и количественного определения флуоресценции. В другом варианте реализации изобретения транспондерные микрогранулы инкубируют с образцом аптамеров приблизительно при 60°С и затем определяют количественно с использованием соответствующего устройства для транспондерных микрогранул. В одном варианте реализации изобретения в мультиплексных анализах аптамеров детекция может осуществляться путем гибридизации с микрогранулами с использованием до 25 аптамеров, до 50 аптамеров, до 100 аптамеров, до 200 аптамеры и до 500 аптамеров.
[00142] Образец, содержащий элюированные аптамеры, можно обработать для включения в его состав тегов с уникальной массой наряду с флуоресцентными метками, как было описано выше. Аптамеры с массовой меткой затем вводят в прибор CGE, по существу, ДНК-секвенатор, и аптамеры идентифицируют по их уникальным массам и определяют количественно с использованием флуоресценции от красителя, встроенного в ходе реакции введения метки. Один иллюстративный пример этого метода был разработан Althea Technologies.
[00143] В любых способах, описанных выше, аптамеры, находящиеся в растворе, можно амплифицировать и факультативно пометить до количественного определения. Можно использовать стандартную ПЦР-амплификацию с раствором аптамеров, элюированных из твердой подложки Связывание-2. Такую амплификацию можно использовать до гибридизации на ДНК-матрице, гибридизации на микрогранулах и регистрации данных CGE.
[00144] В другом варианте реализации изобретения аффинный комплекс аптамер-мишень (или ковалентный комплекс аптамер-мишень) детектирован и/или определен количественно с использованием количественной ПЦР. В данном контексте "количественная ПЦР" относится к ПЦР-реакции, осуществляемой таким образом и в таких контролируемых условиях, что результаты анализа являются количественными, то есть, анализ позволяет определить количество или концентрацию аптамера, присутствующего в исследуемом образце.
[00145] В одном варианте реализации изобретения количество или концентрация аффинного комплекса аптамер-мишень (или ковалентного комплекса аптамер-мишень) в исследуемом образце определена с использованием TaqMan ПЦР. Этот метод, в целом, основан на 5'-3' экзонуклеазной активности фермента, обеспечивающего репликацию олигонуклеотидов, получения сигнала от последовательности-мишени. Зонд TaqMan выбирают, исходя из последовательности аптамера, который определяют количественно, и, в целом, включает 5'-концевой флуорофор, такой как 6-карбоксифлуоресцеин, например, и 3'-концевой гаситель, такой как, например, 6-карбокситетраметилфлуоресцеин, для генерации сигнала по мере амплификации последовательности аптамера с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). По мере того как полимераза копирует последовательность аптамера, экзонуклеазная активность способствует отделению флуорофора от зонда, отжиг которого происходит в 5'-3' направлении от ПЦР-праймеров, вследствие чего генерируется сигнал. Сигнал усиливается по мере образования продукта репликации. Количество ПЦР-продукта зависит как от количества осуществляемых циклов репликации, а также от начальной концентрации аптамера.
[00146] В другом варианте реализации изобретения количество или концентрация аффинного комплекса аптамер-мишень (или ковалентного комплекса аптамер-мишень) определена с использованием интеркалирующего флуоресцентного красителя в ходе репликационного процесса. Интеркалирующий краситель, такой как, например, SYBR green, генерирует сильный сигнал флуоресценции в присутствии двухцепочечной ДНК по сравнению с сигналом флуоресценции, генерированным в присутствии одноцепочечной ДНК. По мере образования продукта двухцепочечной ДНК в ходе ПЦР усиливается сигнал, производимый красителем. Величина производимого сигнала зависит и от количества циклов ПЦР, и от начальной концентрации аптамера.
,
[00147] В другом варианте реализации изобретения аффинный комплекс аптамер-мишень (или ковалентный комплекс аптамер-мишень) детектирован и/или определен количественно с использованием масс-спектрометрии. Теги с уникальной массой могут быть введены с использованием ферментативных методов, описанных выше. Для считывания данных масс-спектроскопии не требуется никакая детектируемая метка, скорее используется масса, как таковая, и для идентификации, и количественного определения с использованием методов, широко используемых специалистами в данной области техники, на основе местоположения и площади под пиками масс-спектра, образованными в ходе масс-спектроскопического анализа. Примером использования масс-спектроскопии является система MassARRAY разработанная Sequenom.
[00148] Можно использовать компьютерную программу для проведения одного или нескольких этапов любого из способов, раскрытых в данном документе. Другим аспектом настоящего изобретения является компьютерный программный продукт, содержащий машиночитаемый носитель данных, имеющий компьютерную программу, хранящуюся на нем, которая, при загрузке в компьютер, осуществляет или способствует осуществлению любого из способов, раскрытых в данном документе.
[00149] Одним аспектом раскрытия является продукт любого из способов, раскрытых в данном документе, а именно, результат анализа, который можно оценить на месте исследования или можно отправить в другое место для оценки и передачи заинтересованной стороне в удаленное местоположение при желании. В данном контексте "удаленное местоположение" относится к местоположению, которое в физическом смысле отличается от местоположения, в котором получают результаты. Соответственно, результаты можно направить в другую комнату, другое здание, другую часть города, другой городи тому подобное. Данные можно передать с помощью любых подходящих средств, таких как, например, факс, почта, доставка на следующий день, электронная почта, ftp, голосовая почта и тому подобное.
[00150] "Передача" информации относится к передачи данных, представляющих эту информацию в виде электрических сигналов, через подходящий канал связи (например, частную сеть или сеть общего пользования). "Продвижение" элемента относится к любому способу доставки этого элемента от одного местоположения к следующему, будь то путем физического транспорта этого элемента или иным способом (где это возможно), и включает, по меньшей мере в случае данных, физический транспорт средства, несущего данные или передающего данные.
ПРИМЕРЫ
[00151] Следующие примеры приведены лишь для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема правовой охраны изобретения, который определяется прилагаемой формулой изобретения.
[00152] Вышеизложенная информация описывает настоящее изобретение со ссылкой на различные варианты реализации изобретения и примеры. Ни один из конкретных вариантов реализации изобретения, пример или элемент конкретного варианта реализации изобретения, или пример не должен толковаться как крайне важный, обязательный или существенный элемент или признак любого из пунктов формулы изобретения.
[00153] Следует понимать, что в раскрытые варианты реализации изобретения можно вносить различные модификации и замены, не выходя за пределы объема настоящего изобретения, который изложен ниже в формуле изобретения. Описание, охватывающее фигуры и примеры, должно рассматриваться в иллюстративном смысле, а не в ограничительном смысле, и предполагается, что все такие модификации и замены должны быть включены в объем настоящего изобретения. Соответственно, объем настоящего изобретения может определяться пунктами прилагаемой формулы изобретения и их правовыми эквивалентами, а не примерами. Например, этапы, перечисленные в любой заявке на выдачу патента, если объектом изобретения является способ или процесс, могут выполняться в любом возможном порядке и не ограничиваются порядком, представленным в любом из вариантов реализации изобретения, примерах или формуле изобретения.
Анализ аффинности методами протеомики
[00154] Связывание-0
2
[00155] 133 мкл 7,5% стрептавидин-агарозной суспензии в 1×SB17,Tw (40 мМ HEPES, 102 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 5 мМ MgCl, 5 мМ KCl, 0,05% Tween-20) добавляли в лунки фильтровального планшета (0,45 мкм планшеты Millipore HV (Durapore cat# MAHVN4550)). Размораживали соответствующую смесь аптамеров 1.1x (все аптамеры содержат флуорофор Cy3 и фотоотщепляемый биотиновый фрагмент на 5'-конце) с последующим перемешиванием на вортексе. Смесь аптамеров 1.1x затем кипятили в течение 10 минут, перемешивали на вортексе в течение 30 секунд и охлаждали до 20°С на водяной бани в течение 20 минут. Жидкость, содержащую стрептавидин-агарозную суспензию, затем удаляли из фильтровальных планшетов путем центрифугирования (1000×g в течение 1 минуты). 100 мкл смесь аптамеров добавляли в лунки фильтровального планшета (с помощью автоматизированного устройства). Смесь инкубировали при 25°С в течение 20 минут на шейкере, установленном на 850 об/мин, с защитой от света.
[00156] Промывки этапа Связывание-0
[00157] Через 20 минут после инкубации раствор удаляли посредством вакуумной фильтрации. Добавляли 190 мкл 1х буфера CAPS для предварительной промывки аптамеров (50 мМ CAPS, 1 мМ EDTA, 0,05% Tw-20, рН 11,0), и смесь инкубировали в течение 1 минуты со встряхиванием. Промывочный раствор CAPS затем удаляли посредством вакуумной фильтрации. Промывку CAPS затем повторяли один раз. Добавляли 190 мкл 1×SX17,Tw, и смесь инкубировали в течение 1 минуты со встряхиванием. 1×SB17,Tw затем удаляли посредством вакуумной фильтрации. Дополнительно добавляли 190 мкл 1×SX17,Tw, и смесь инкубировали в течение 1 минуты со встряхиванием. 1×SB17,Tw затем удаляли путем центрифугирования (1 минута при 1000×g). После удаления 1×B17,Tw, добавляли 150 мкл буфера для хранения из этапа Связывание-1 (150 мМ NaCl, 40 мМ HEPES, 1 мМ EDTA, 0,02% азида натрия, 0,05% Tween-20), и фильтровальный планшет осторожно герметизировали только по периметру планшета и хранили при 4°С в темноте до использования.
[00158] Подготовка образцов
2
[00159] Семьдесят пять мкл образца с 40%-ным разведением вносили в планшет с 40%-ным образцом (конечный 40%-й образец содержит: 20 мкМ Z-block, 1 мМ бензамидина, 1 мМ EGTA, 40 мМ HEPES, 5 мМ MgCl, 5 мМ KCl, 1% Tween-20). Сто девяносто пять мкл 1×SB17,Tw вносили в планшет с 1%-ным образцом. Девяносто мкл 1×SB17,Tw вносили в планшет для разведения 1 к 10. Сто тридцать три мкл 1×SB17,Tw вносили в планшет с 0,005% образцом. Образцы размораживали в течение 10 минут на устройстве для размораживания пробирок в штативе при 25°С в инкубаторе, затем перемешивали на вортексе и осаждали при 1000×g в течение 1 минуты. Крышки убирали из пробирок. Образцы перемешивали (5 раз по 50 мкл), и 50 мкл 100%-ного образца переносили в планшет с 40%-ным образцом, содержащий разведенные образцы. 40%-ный образец затем перемешивали на планшете для образцов путем перемешивания пипетированием (110 мкл 10 раз). Пять мкл 40%-ного образца затем переносили в планшет с 1%-ным образцом, содержащий 1×SB17,Tw. Снова этот образец перемешивали пипетированием (120 мкл 10 раз). После перемешивания 10 мкл 1%-ного образца переносили в планшет для разведения 1 к 10, содержащий 1×SB17,Tw, который перемешивали пипетированием (75 мкл 10 раз). Семь мкл 0,1%-ного образца из планшета для разведения 1 к 10 переносили в планшет с 0,005%-ным образцом, содержащий 1×SB17,Tw, и перемешивали пипетированием (110 мкл 10 раз).
[00160] Подготовка планшета до уравновешивания
[00161] Хранящийся раствор Связывание-0 удаляли из фильтровальных планшетов посредством вакуумной фильтрации. Затем добавляли сто девяносто мкл 1×SB17,Tw с последующим удалением из фильтровальных планшетов посредством вакуумной фильтрации. Затем в фильтровальные планшеты добавляли дополнительные 190 мкл 1×SB17,Tw.
[00162] Уравновешивание
[00163] Буфер 1×SB17,Tw удаляли из фильтровальных планшетов путем центрифугирования (1 минута при 1000×g). 100 мкл образца с соответствующим разведением добавляли в фильтровальные планшеты (три фильтровальных планшета, один для каждого образца с разведением 40%, 1% или 0,005%). Фильтровальные планшеты герметизировали только по периметру, избегая повышенного давления на лунки. Давление вызывает утечку в ходе уравновешивания. Планшеты затем инкубировали в течение 3,5 часов при 28°С на термошейкере, установленном на 850 об/мин, с защитой от света.
[00164] Обработка фильтровальных планшетов
[00165] После уравновешивания фильтровальные планшеты помещали в вакуумные коллекторы, и образец удаляли посредством вакуумной фильтрации. Добавляли сто девяносто мкл промывочного раствора, содержащего биотин (100 мкМ биотина в 1×SB17,Tw), и жидкость удаляли посредством вакуумной фильтрации. Образец затем промывали 5х с использованием 190 мкл 1×SB17,Tw (вакуумная фильтрация). Добавляли сто мкл 1 мМ NHS-биотина в 1×SB17,Tw (свежеприготовленный), и фильтровальные планшеты промокали на абсорбирующих подушечках, и смесь инкубировали в течение 5 минут со встряхиванием. Жидкость удаляли посредством вакуумной фильтрации. Добавляли сто и двадцать пять мкл 20 мМ глицина в 1×SB17,Tw, и жидкость удаляли посредством вакуумной фильтрации. Снова добавляли 125 мкл 20 мМ глицина в 1×SB17,Tw, и жидкость удаляли посредством вакуумной фильтрации. Впоследствии образцы промывали 6х с использованием 190 мкл 1×SB17,Tw, причем жидкость удаляли посредством вакуумной фильтрации. В каждый из фильтровальных планшетов затем добавляли восемьдесят пять мкл буфера для проведения реакции фотоощепления (2 мкм Z-block в 1×SB17,Tw).
[00166] Фотоотщепление
[00167] Фильтровальные планшеты промокали на абсорбирующих подушечках и облучали в течение 6 минут с использованием УФ-лампы BlackRay со встряхиванием (800 об/мин, 25°С). Планшеты поворачивали на 180 градусов и облучали в течение дополнительных 6 минут под источником светового излучения BlackRay. Фильтровальный планшет, содержащий образцы с 40%-ным разведением, помещали на пустой 96-луночный планшет. Фильтровальный планшет, содержащий образцы с 1%-ным разведением, ставили поверх фильтровального планшета, содержащего образцы с 40%-ным разведением, и фильтровальный планшет, содержащий образцы с 0,005%-ным разведением, ставили поверх фильтровального планшета, содержащего образцы с 1%-ным разведением. Сборку планшетов центрифугировали в течение 1 минуты при 1000×g. 96-луночный планшет с элюированным образцом помещали на автоматизированную станцию для дозирования жидкостей. 60% глицерин в 1×SB17,Tw из инкубатора на 37°С помещали на автоматизированную станцию для дозирования жидкостей.
[00168] Связывание-2
4
[00169] В ходе установки анализа 50 мкл 10 мг/мл гранул MyOne SA (500 мкг) добавляли в 96-луночный планшет ABgene Omni-tube для Связывания-2 и помещали в Cytomat. 96-луночный планшет с гранулами для Связывания-2 суспендировали в течение 90 секунд, помещали на магнитную мешалку на 60 секунд, и удаляли супернатант. Весь элюат из этапа Связывание-1 переносили в планшет с гранулами из этапа Связывание-2 и инкубировали на термошейкере Пельтье (1350 об/мин, 5 минут, 25°С). Планшет переносили на магнитную мешалку при 25°С на 2 минуты, и удаляли супернатант. Добавляли следующие 75 мкл 1×SB17,Tw, и образец инкубировали на шейкере Пельтье при 1350 об/мин в течение 1 минуты при 37°С. Затем добавляли 75 мкл 60% глицерина в 1×SB17,Tw (подогретый до 37°С), и образец снова инкубировали шейкере Пельтье при 1350 об/мин в течение 1 минуты при 37°С. Планшет переносили на магнитную мешалку, нагретую до 37°С, и инкубировали в течение 2 минут с последующим удалением супернатанта. 37°С 1×SB17,Tw и цикл промывки глицерином повторяли еще два раза. Образец затем промывали для удаления остаточного глицерина с использованием 150 мкл 1×SB17,Tw, шейкера Пельтье (1350 об/мин, 1 минуты, 25°С) с последующим помещением на 1 минуту при 25°С на магнитную мешалку. Супернатант удаляли, и добавляли 150 мкл 1×SB17,Tw с заменой на 0,5 M NaCl, и инкубировали при 1350 об/мин в течение 1 минуты (25°С) последующим помещением на 1 минуту при 25°С на магнитную мешалку. Супернатант удаляли, и добавляли 75 мкл перхлоратного элюирующего буфера (1,8 M NaClO, 40 мМ PIPES, 1 мМ EDTA, 0,05% Triton Х-100, 1х контроли для проведения гибридизации, рН=6,8) с последующей 10-минутной инкубацией на шейкере Пельтье (25°С, 1350 об/мин). После этого планшет переносили в магнитный сепаратор и инкубировали в течение 90 секунд, и получали супернатант.
[00170] Гибридизация
[00171] Двадцать мкл элюированного образца добавляли с помощью автоматизированного устройства в пустой 96-луночный планшет. Пять мкл 10х блокирующего буфера Agilent, содержащего второй набор контролей для проведения гибридизации, добавляли с помощью автоматизированного устройства к элюированным образцам. Затем в лунки вручную добавляли 25 мкл 2х буфера для гибридизации Agilent HiRPM. 40 мкл гибридизационной смеси нагружали на стеклянные подложки Agilent. Матрицу Agilent 8 на 15k помещали на стеклянную подложку, и сэндвич закрепляли с помощью зажима. Затем сэндвич инкубировали с вращением (20 об/мин) в течение 19 часов при 55°С.
[00172] Промывка после гибридизации
[00173] Обработку стекол после гибридизации осуществляли на устройстве для обработки препаратов Little Dipper (SciGene, Cat# 1080-40-1). Приблизительно 750 мл промывочного буфера 1 (промывочного буфера 1 Oligo aCGH/ChIP-on-chip, Agilent Technologies) вносили в один стеклянный сосуд для окрашивания. Приблизительно 750 мл промывочного буфера 1 (промывочный буфер 1 Oligo aCGH/ChIP-on-chip, Agilent Technologies) вносили в Баню #1 устройства для обработки препаратов Little Dipper. Приблизительно 750 мл промывочного буфера 2 (промывочный буфер 1 Oligo aCGH/ChIP-on-chip, Agilent Technologies), нагретого до 37°С, вносили в Баню #2 устройства для обработки препаратов Little Dipper. Скорость магнитной мешалки в случае обеих бань устанавливали на 5. Температурный регулятор для Бани #1 не включали, тогда, как температурный регулятор для Бани #2 устанавливали на 37°С. До двенадцати сборок, состоящих стекол/уплотняющих прокладок, последовательно разбирали в первом сосуде для окрашивания, содержащем промывочный буфер 1, и стекла помещали в штатив для стекол, в то время как они все еще были погруженными в промывочный буфер 1. По мере разборки всех сборок, состоящих из стекол/уплотняющих прокладок, штатив для стекол быстро переносили в Баню #1 устройства для обработки препаратов Little Dipper, и запускали программу автоматической промывки. Стекла инкубируются в устройстве для обработки препаратов Little Dipper в течение 300 секунд в Бане #1 со скоростью 250 с последующим переносом в 37°С Баню #2, содержащую промывочный раствор 2 Agilent (промывочный буфер 2 Oligo aCGH/ChIP-on-chip, Agilent Technologies), и инкубируются в течение 300 секунд со скоростью 100. После этого устройство для обработки препаратов Little Dipper переносит штатив для стекол во встроенную центрифугу, где стекла центрифугировали в течение 300 секунд со скоростью 690.
[00174] Визуализация микрочипов
[00175] Стеклянные подложки для микрочипов визуализировали с помощью сканера для микрочипов (Agilent G2565CA Microarray Scanner System, Agilent Technologies) в канале Cy3 с разрешением 5 мкм с параметром 100% РМТ и опцией XRD, разрешенной при 0,05. Полученные в результате изображения в формате tiff обрабатывали с использованием программного обеспечения Agilent для выделения характерных признаков версии 10.7.3.1 с использованием протокола GE1_107_Sep09.