НОВОЕ СОЕДИНЕНИЕ (KS513), ВЫДЕЛЕННОЕ ИЗ PSEUDOLYSIMACHION ROTUNDUM VAR. SUBINTEGRUM, КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННОЕ СОЕДИНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО ИНГРЕДИЕНТА, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ АЛЛЕРГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ, АСТМЫ ИЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
NOVEL COMPOUND (KS513) RECOVERED FROM PSEUDOLYSIMACHION ROTUNDUM VAR. SUBINTEGRUM, COMPOSITION CONTAINING SAID COMPOUND AS ACTIVE INGREDIENT, FOR PREVENTING OR TREATING ALLERGIC DISEASE, INFLAMMATORY DISEASE, ASTHMA OR CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE AND USE THEREOF

Область техники
Настоящее изобретение относится к новому соединению (KS 513), выделенному из Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum, композиции, содержащей указанное соединение, для предотвращения или лечения аллергического заболевания, воспалительного заболевания, астмы или хронической обструктивной болезни легких, и их применению.
Уровень техники
Как правило, воспалительный ответ представляет собой нормальный ответ организма человека, связанный с отеком, болью и т.п., в тех случаях, когда в ткань или клетку проникает что-либо, вызывающее определенные органические изменения в указанной ткани или клетке. Недавно было обнаружено, что в воспалительное заболевание вовлечены цитокины различных типов.
Аллергическая реакция может быть классифицирована на 4 категории, а именно, на реакции типа I, II, III и IV в соответствии с типами ответа, или на две категории, а именно, на аллергические реакции немедленного типа, такие как реакции типа I, II или III, и аллергические реакции замедленного типа, такие как реакции типа IV, в соответствии с периодами времени, проходящими с момента повторной сенсибилизации в результате воздействия аллергена до начала реакции.
К ним относится, например, аллергия I типа, задействующая антитела IgE и называемая аллергией по типу анафилаксии, вызывающая бронхиальную астму, атопические заболевания, такие как дерматит или гастроэнтерит и т.д., аллергический ринит, такой как поллиноз, аллергический конъюнктивит, пищевая аллергия и т.п.
Астма рассматривается как комплексный синдром дыхательных путей, который характеризуется различными клиническими симптомами, например, кашлем, диспноэ, вызываемыми нарушением проходимости дыхательных путей, острым или хроническим воспалением дыхательных путей, гиперреактивностью дыхательных путей (ГРП) и структурным ремоделированием, и может быть обратимой или необратимой. Чаще всего астма представляет собой аллергическое заболевание и характеризуется хроническим воспалением дыхательных путей и гиперреактивностью бронхов (Minoguchi K. and Adachi М., Pathophysiology of asthma. В источнике: Cherniack NS, Altose MD, Homma I. editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw-Hill, 1999, pp. 97-104).
Астма может быть разделена на два типа, а именно, на экзогенную астму и эндогенную астму. Экзогенная астма вызвана воздействием антигена и дает положительную реакцию при кожной пробе или в бронхопровокационном тесте на антиген. Обычный возраст ее начала постепенно снижается. В основном она вызывается клещом домашней пыли Dermatophagoides и пыльцой, эпителием животных, грибами и т.д. Эндогенная астма вызвана инфекциями верхних дыхательных путей, физическими упражнениями, эмоциональной нестабильностью, изменением климатической влажности и распространена у взрослых пациентов. Также могут быть детектированы посредством кожной пробы комплексы IgE-антиген экзогенной астмы за счет повышения уровней IgE в сыворотке.
et al.,
Immunotechnology
et al., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol.
et al., Phamacol. Rev.
Что касается патофизиологии, астму определяют по запускаемому Т-хелперами 2 (Th2) хроническому воспалению и различным воспалительным медиаторам, таким как цитокины, хемокины, сигнальные молекулы, молекулы адгезии и факторы роста из иммунных клеток и структурных клеток в дыхательных путях, вовлеченных в различные стадии астмы (Elias JA et at., J Clin Invest. 2003, 111, 291-297). Активированные воспалительные клетки, такие как эозинофилы, тучные клетки, альвеолярные макрофаги и т.д. в бронхах пациентов, страдающих астмой, высвобождают различные медиаторы воспаления, такие как цистеинил-лейкотриены, простагландины и т.д., и вовлечены в выраженное сужение бронхов (Maggi Е.  1998, 3, 233-244.; Pawankar R.  2001, 1, 3-6.; Barnes PJ  1998, 50, 515-596).
Соответственно, поскольку воспроизводство различных цитокинов, вовлеченных в активацию воспалительных клеток, таких как ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13 и т.д., и IgE, и воспроизводство цистеинил-лейкотриенов, высвобождаемых воспалительными клетками, являются главными причинами воспаления, аллергической реакции и астмы, до настоящего времени проводились многочисленные исследования, направленные на разработку ингибирующих воспроизводство указанных компонентов агентов.
В целом, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) представляет собой одно из заболеваний легких, вызываемое аномальным воспалительным заболеванием легкого, приводящим к обструкции дыхательных путей. ХОБЛ вызывает диспноэ в результате затрудненности выдоха, демонстрирует характеристики, например, малую обратимость ограничения или обструкции дыхательных путей, прогрессирующее развитие с течением времени и т.д., отличные от общих характеристик астмы, и может подразделяться на эмфизему легких и хронический обструктивный бронхит (Barnes Р.J., Pharmacol. Rev. 2004, 56, 515-548).
ХОБЛ была описан как один из факторов риска заболеваемости и смертности в результате заболеваний сердечно-сосудистой системы, а также как пятая по счету в мире основная причина смерти на 2001 год. Распространенность хронической обструктивной болезни легких согласно критериям Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких (GOLD) (отношение FEV1 (объем воздуха при форсированном выдохе за 1 секунду) к FVC (форсированной жизненной емкости легких), составляющее менее чем 0,7) составила 17,2% (25,8% для мужчин; 9,6% для женщин) среди корейцев в возрасте старше 45 лет (Kim, D.S. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2005, 172, 842-847.; Sin, D.D. et al., Proc. Am. Thorac. Soc. 2005, 2, 8-11.; Buist A.S. et al., Lancet, 2007, 370, 741-750)
У большинства пациентов с ХОБЛ наблюдаются все три патологических механизма (хронический обструктивный бронхит, эмфизема и закупорка слизью), поскольку все они индуцируются курением, однако могут наблюдаться различные пропорции эмфиземы и обструктивного бронхита. В развитых странах наиболее распространенной причиной ХОБЛ является, безусловно, курение сигарет, однако существуют и некоторые другие факторы риска, в том числе загрязнение воздуха (в частности, загрязнение воздуха в помещениях в результате сжигания топлива), неудовлетворительное питание и воздействия, связанные с родом занятий. ХОБЛ характеризуется ускорением нормального снижения функции легких, происходящей с возрастом. Медленно прогрессирующее ограничение циркуляции воздуха приводит к ограничению физических возможностей и преждевременной смерти, и достаточно выражено отличается от различных вариантов обструкции дыхательных путей и симптомов при астме, тяжесть которых редко возрастает.
+
+
Сообщалось, что патофизиологическое действие и синдром ХОБЛ принципиально отличаются от характерных для астмы. Хотя и ХОБЛ, и астма включают воспаление дыхательных путей, существуют заметные различия в природе воспалительного процесса, касающиеся различий воспалительных клеток, медиаторов, ответа на воспаление, анатомического распределения и ответа на противовоспалительную терапию, например, (а) применительно к воспалительным клеткам, при возникновении астмы в основном задействованы тучные клетки, эозинофилы, клетки D4 (Th2), макрофаги и т.д., тогда как при возникновении ХОБЛ в основном задействованы нейтрофилы, CD8 (Тс) и т.д.; (b) применительно к медиаторам воспаления, при возникновении астмы в основном задействованы лейкотриены В, гистамин, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13, эотаксин, RENTES, окислительный стресс и т.д. тогда как при возникновении ХОБЛ в основном задействованы ФНО-альфа, ИЛ-8, связанный с ростом онкоген-α (GRO-альфа) и т.д.; (с) применительно к воспалительному синдрому, при астме наблюдается иной воспалительный синдром за счет влияния на весь легочный тракт в раннем возрасте, например, ГРП (гиперреактивность дыхательных путей), отслоение эпителия, фиброз без вовлечения паренхимы, секреция слизи, относительно обратимая обструкция дыхательных путей, кашель, чихание, диспноэ и т.д., отличный от воспалительного синдрома при ХОБЛ, который обусловлен действием на периферические дыхательные пути у взрослых и при котором наблюдаются различные явления, такие как эпителиальная метаплазия, разрушение паренхимы, относительно необратимая обструкция дыхательных путей, хронический бронхит, эмфизема и т.д. (Barnes PJ., Chest 2000, 117, 10S-14S.; Saetta М. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001, 163, 1304-1309).
Гистопатологические исследования ХОБЛ указывают на преимущественное вовлечение периферических дыхательных путей (бронхиол) и паренхимы легких, тогда как при астме происходит воспаление всех дыхательных путей, однако паренхима легких не вовлечена. Наблюдается обструкция бронхиол с фиброзом и инфильтрацией макрофагами и Т-лимфоцитами. Наблюдается разрушение паренхимы легких, а также повышенное число макрофагов и CD8 (цитотоксических) Т-лимфоцитов (Saetta М. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, 157, 822-826). Биопсия бронхов демонстрирует аналогичные изменения с инфильтрацией макрофагами и CD8-клетками и повышенное число нейтрофилов у пациентов с тяжелой ХОБЛ (Di Stefano A. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, 158, 1277-1285).
В отличие от астмы, эозинофилы не выражены, за исключением периодов обострений или наличия у пациентов сопутствующей астмы (Fabbri L. et al., Thorax 1998, 53, 803-808.; Fabbri LM. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2003, 167, 418-424).
et al., Expert. Opino. Invest. Drug,
et al., Curr. Opin. Pharmacol.
Соответственно, терапевтический подход при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) будет отличаться от подхода при астме; однако предлагаемая в настоящем изобретении терапия направлена на неспецифическое лечение обоих заболеваний. Соответственно, специфические одобренные варианты противовоспалительной терапии для ХОБЛ отсутствовали, а доступные варианты противовоспалительной терапии изначально были разработаны для астмы. Задачи, возникающие при исследованиях ХОБЛ, многогранны; механизмы, лежащие в основе сложной и гетерогенной патологии указанного заболевания, требуют изучения; роль воспаления в прогрессировании заболевания должна быть подтверждена. (Hele D.  2003, 12, 5-18.; Fox, J C. 2009, 9, 231-242).
Продолжается усовершенствование современной доступной терапии для лечения астмы в форме бета-агонистов длительного действия, более безопасных стероидов и вариантов комбинированной терапии; в случае ХОБЛ антихолинергики обеспечивают симптоматическое облегчение. Стероиды использовались для лечения обострений, однако к настоящему времени пока не было описано лечение, которое оказывало бы значимое влияние на прогрессивное снижение функции легких при ХОБЛ или при развитии астмы.
Соответственно, до настоящего времени проводилось множество исследований, направленных на разработку новых лекарственных средств, обладающих потенциалом для успешного специфического лечения аллергических заболеваний, воспалительных заболеваний, астмы или ХОБЛ.
Авторы настоящего изобретения сосредоточили усилия на разработке эффективного агента для лечения, получаемого из природных источников, отличающегося безопасностью и эффективностью, например, растительного или животного происхождения и т.д., отличающегося высокой терапевтической активностью в отношении аллергических заболеваний, воспалительных заболеваний, астмы или ХОБЛ; в итоге, впоследствии были получены неожиданные результаты, например, впервые обнаружена мощная противовоспалительная, противоаллергенная и противоастматическая активность экстракта Pseudolysimachion longifolium (патент Кореи №10-860080 В1 и US 2012/0183632 A1) и различных выделенных из него соединений, таких как верпрозид (6-O-3,4-дигидроксибензоилкаталпол), пикрозид II (6-O-4-гидрокси-3-метоксибензоилкаталпол), верминозид (6-O-3,4-дигидроксициннамоилкаталпол), 6-O-вератроилкаталпол (6-O-3,4-диметоксибензоилкаталпол), минекозид (6-О-3-гидрокси-4-метоксициннамоилкаталпол), каталпол и т.п. (Патентная публикация Кореи №10-2006-125499 А1); мощная противовоспалительная, противоаллергенная и противоастматическая активность нового очищенного экстракта, содержащего значительное количество активных ингредиентов, таких как производные каталпола из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum (ATC2: патент Кореи №1476045 B1, АТС1: патент Кореи №1504651 В1); направленная против ХОБЛ активность указанного экстракта (патент Кореи №1476095 В1) и впервые выделенного из него нового соединения (KS-534).
Pseudolysimachion rotundum var subintegrum представляет собой многолетнее травянистое растение, распространенное в Корее, Китае, Японии, на о. Сахалине и в России.
На основании предшествующих исследований противовоспалительной, противоаллергенной и противоастматической активности экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum авторами настоящего изобретения была предпринята попытка разработки нового соединения, демонстрирующего противовоспалительную, противоаллергенную, противоастматическую и направленную против ХОБЛ активность, выделенного из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.
При этом в цитируемых выше опубликованных источниках, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки, не было описано или раскрыто новое соединение (KS-513), демонстрирующее противовоспалительную, противоаллергенную, противоастматическую и направленную против ХОБЛ активность, выделенное из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.
Соответственно, авторы настоящего изобретения обнаружили новое соединение, демонстрирующее противовоспалительную, противоаллергенную, противоастматическую и направленную против ХОБЛ активность, выделенное из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum; указанное предложенное в настоящем изобретении соединение демонстрировало мощную противовоспалительную, противоаллергенную, противоастматическую и направленную против ХОБЛ активность, определенную путем применения различных тестов, например, (1) теста на цитотоксичность с использованием линий клеток RAW264.7, (2) определения эффекта на экспрессию мРНК провоспалительного лекарственного фермента, такого как iNOS или СОХ-2, и провоспалительных лекарственных цитокинов, таких как ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа, в клетках линии RAW264.7, индуцированную ЛПС, (3) тестирования ингибирующего эффекта на экспрессию белка iNOS, вовлеченного в воспроизводство NO, и на уровень воспроизводства NO, (4) тестирования ингибирующего эффекта на экспрессию белка СОХ-2 и уровень воспроизводства простагландина Е2 (PGE2), (5) тестирования ингибирующего эффекта на уровень продуцирования ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа; и т.п.
Краткое описание изобретения
Техническая задача
В настоящем изобретении предложено новое соединение (KS513), выделенное из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum.
В настоящем изобретении также предложены фармацевтическая композиция и функциональный пищевой продукт, содержащие новое соединение (KS513), выделенное из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, в качестве активного ингредиента в количестве, эффективном для лечения и предотвращения аллергического заболевания, воспалительного заболевания, астмы или заболевания ХОБЛ.
В настоящем изобретении также предложено применение нового соединения (KS513), выделенного из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, для получения лекарственных средств, применяемых для лечения или предотвращения воспалительного заболевания, аллергического заболевания, астмы или ХОБЛ.
В настоящем изобретении также предложен способ лечения или предотвращения воспалительного заболевания, аллергического заболевания, астмы или ХОБЛ у млекопитающего или человека, включающий введение указанному млекопитающему или человеку эффективного количества нового соединения (KS513), выделенного из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, совместно с фармацевтически приемлемым носителем.
Техническое решение
В настоящем изобретении предложен 1aS,1bS,2S,4S,5aR,6S,6aS)-1а-(гидроксиметил)-4-метокси-2-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)октагидрооксирено[2',3':4,5]циклопента[1,2-с]пиран-6-ил-4-гидроксибензоат (KS-513),
представленный приведенной ниже химической формулой (1), его изомер, фармацевтически приемлемая соль или сольваты:
Предложенное в настоящем изобретении новое соединение может быть преобразовано в фармацевтически приемлемую соль и сольваты с применением стандартного хорошо известного в данной области техники способа. В случае солей подходит для применения и может быть получена с применением стандартного способа соль присоединения кислоты указанного соединения, образованная фармацевтически приемлемой свободной кислотой. Например, после растворения указанного соединения в избыточном количестве раствора кислоты, соли осаждают с использованием смешиваемого с водой органического растворителя, такого как метанол, этанол, ацетон или ацетонитрил, для получения соли присоединения кислоты, после чего смесь эквивалентного количества соединения и кислоты, разведенной водой или спиртом, например, простого монометилового эфира гликоля, может быть нагрета и затем высушена посредством испарения или профильтрован под пониженным давлением для получения высушенной солевой формы.
В качестве свободной кислоты в вышеописанном способе может применяться органическая кислота или неорганическая кислота. Например, в настоящем изобретении может применяться органическая кислота, такая как метансульфоновая кислота, n-толуолсульфоновая кислота, уксусная кислота, трифторуксусная кислота, лимонная кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, щавелевая кислота, бензойная кислота, молочная кислота, гликолевая кислота, глюконовая кислота, галактуроновая кислота, глутаминовая кислота, глутаровая кислота, глюкуроновая кислота, аспарагиновая кислота, аскорбиновая кислота, карбонильная кислота, ванилиновая кислота, бромоводородная кислота и т.п., и неорганическая кислота, такая как соляная кислота, фосфорная кислота, серная кислота, азотная кислота, винная кислота и т.п.
Кроме того, предложенные в настоящем изобретении соединения в форме фармацевтически приемлемых солей металлов могут быть получены с использованием основания. Соль щелочного металла или щелочноземельного металла указанного соединения может быть получена с применением стандартного способа, например, после растворения соединения в избыточном количестве раствора гидроксида щелочного металла или щелочноземельного металла, нерастворимые соли отфильтровывают и оставшийся фильтрат подвергают испарению и высушиванию для получения соли металла указанного соединения. В качестве соли металла согласно настоящему изобретению фармацевтически подходящими являются соли натрия, калия или кальция, а соответствующая соль серебра может быть получена путем проведения реакции соли щелочного металла или соли щелочноземельного металла с подходящей солью серебра, например, нитратом серебра.
Фармацевтически приемлемые соли указанного соединения включают все возможные кислые или основные соли указанных соединений, если в настоящем описании конкретным образом не указано иное. Например, фармацевтически приемлемые соли согласно настоящему изобретению включают соли с гидроксильными группами, например, натрия, кальция и калия; соль с аминогруппами, например, соль бромистого водорода, соль серной кислоты, сероводородную соль, фосфатную соль, гидрофосфатную соль, дигидрофосфатную соль, ацетатную соль, сукцинатную соль, цитратную соль, тартратную соль, лактатную соль, манделатную соль, метансульфонатную (мезилатную) соль и n-толуолсульфонатную (тозилатную) соль и т.д., которые могут быть получены с применением стандартного хорошо известного в данной области техники способа.
Они могут существовать в форме оптически отличных диастереомеров, поскольку указанные соединения имеют несимметричные центры, соответственно, соединения согласно настоящему изобретению включают все оптически активные изомеры, R- или S-стереоизомеры и их смеси. Настоящим изобретением также охвачены все варианты применения рацемической смеси, более чем одного оптически активного изомера или их смесей, а также все способы получения или выделения диастереоизомера, хорошо известные в данной области техники.
Соединения согласно настоящему изобретению могут быть выделены путем применения способа выделения или очищения, хорошо известного в данной области техники, например, хроматографии на колонке с силикагелем или рекристаллизации, например, с применением способа, раскрытого в патентной публикации Кореи №10-2006-125499; или химически синтезированы путем применения хорошо известных способов в данной области техники, исключительно иллюстративных и никоим образом не ограничивающих настоящее изобретение.
Предложенное в настоящем изобретении новое соединение (KS 513) может быть получено из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum с применением следующей методики.
Например, новое соединение (KS 513) характеризуется получением посредством процесса добавления по меньшей мере одного экстрагирующего растворителя, выбранного из воды, низшего спирта С1-С4, такого как метанол, этанол, бутанол и т.д. или их смеси, предпочтительно, смеси воды и метанола, более предпочтительно, 10-100% (по массе) метанола в воде, с высушенным Pseudolysimachion rotundum var subintegrum на первом этапе; осуществление по меньшей мере одного способа экстракции, выбранного из рефлюкс-экстракции горячей водой, холодной водной экстракции, обработки ультразвуком или стандартной экстракции, предпочтительно холодной водной экстракции при температуре в диапазоне от 10 до 150°С, предпочтительно от 20 до 70°С, на протяжении периода в диапазоне от 30 минут до 72 часов, предпочтительно, от 1 до 48 часов, более предпочтительно, холодной водной экстракции при температуре в диапазоне от 10 до 60°С, предпочтительно от 20 до 50°С, на протяжении периода в диапазоне от 30 минут до 72 часов, предпочтительно, от 6 до 48 часов, многократно, и затем рефлюкс-экстракции при температуре в диапазоне от 40 до 120°С, предпочтительно от 60 до 90°С, на протяжении периода в диапазоне от 30 минут до 72 часов, предпочтительно, от 6 до 48 часов, многократно, для выделения первого экстракта на 2 этапе; осуществление способа фильтрации, концентрации под вакуумом и высушивания для выделения высушенного неочищенного экстракта на 3 этапе; и осуществление по меньшей мере одного способа очищения, выбранного из (i) распределительной хроматографии с обращенной фазой, (ii) колоночной флэш-хроматографии, (iii) колоночной хроматографии на RP С18, (iv) колоночной хроматографии с силикагелем, (v) ионообменной хроматографии или (iv) эксклюзионной хроматографии, с многократным проведением для выделения нового соединения (KS 513) согласно настоящему изобретению.
Термин «фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества» в настоящем документе включает фармацевтические добавки, неактивные ингредиенты, используемые для получения лекарственного средства. Они включают красители, вкусоароматические вещества, связывающие вещества, смягчающие вещества, наполнители, смазывающие вещества, консерванты и многие другие категории. Распространенные вспомогательные вещества включают кукурузный крахмал, лактозу, тальк, стеарат магния, сахарозу, желатин, стеарат кальция, диоксид кремния, шеллак и глазурь, хорошо известные в данной области техники (см. домашнюю страницу Управления по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств: www.fda.gov или онлайн-ресурс информации о лекарственных средствах: www.drugs.com) или ранее опубликованные источники (например, Rowe, Raymond С et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press, 7th Edition, 2012).
Термин «предотвращать» в настоящем документе включает любое действие, ингибирующее или задерживающее возникновение определенного заболевания или расстройства, описанного в настоящем документе, путем введения предложенной в настоящем изобретении композиции; а термин «лечить» в настоящем документе включает любое действие, смягчающее или благоприятным образом изменяющее симптом, связанный с определенным заболеванием или расстройством, описанным в настоящем документе, путем введения предложенной в настоящем изобретении композиции.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что новое соединение (KS 513), которое может быть получено из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, демонстрировало мощную противовоспалительную, противоаллергенную, противоастматическую и направленную против ХОБЛ активность в различных тестах, (1) в тесте на цитотоксичность с использованием линий клеток RAW264.7, (2) при тестировании эффекта на экспрессию мРНК провоспалительного лекарственного фермента, такого как iNOS или СОХ-2, и провоспалительных лекарственных цитокинов, таких как ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа, в клетках линии RAW264.7, индуцированную ЛПС, (3) тестирования ингибирующего эффекта на экспрессию белка iNOS, вовлеченного в воспроизводство NO, и на уровень воспроизводства NO, (4) тестировании ингибирующего эффекта на экспрессию белка СОХ-2 и уровень воспроизводства простагландина Е2 (PGE2), (5) тестировании ингибирующего эффекта на уровень продуцирования ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа и т.п.
Таким образом, в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция или функциональный пищевой продукт, содержащий(ая) в качестве активного ингредиента новое соединение (KS513), выделенное из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, в количестве, эффективном для лечения и предотвращения аллергического заболевания, воспалительного заболевания, астмы или заболевания ХОБЛ.
В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция или функциональный пищевой продукт, содержащий(ая) новое соединение (KS513), выделенное из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, и фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества, для лечения или предотвращения аллергического заболевания, воспалительного заболевания, астмы или хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, также предложено применение нового соединения (KS513), выделенного из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, для получения лекарственных средств, применяемых для лечения или предотвращения аллергического заболевания, воспалительного заболевания, астмы или хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения также предложено применение нового соединения (KS513), выделенного из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, и фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ для получения лекарственных средств, применяемых для лечения или предотвращения аллергического заболевания, воспалительного заболевания, астмы или хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения также предложен способ лечения или предотвращения аллергического заболевания, воспалительного заболевания, астмы или хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у млекопитающего, отличающийся тем, что указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества нового соединения (KS513), выделенного из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, млекопитающему, страдающему аллергическим заболеванием, воспалительным заболеванием, астмой или хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ).
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен также способ лечения или предотвращения аллергического заболевания, воспалительного заболевания, астмы или хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у млекопитающих, отличающийся тем, что указанный способ включает введение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество нового соединения (KS513), выделенного из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, и фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ млекопитающему, страдающему аллергическим заболеванием, воспалительным заболеванием, астмой или хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ).
Предложенная в настоящем изобретении композиция для лечения и предотвращения аллергического заболевания, воспалительного заболевания, астмы или хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), может содержать вышеуказанные соединения в количестве от 0,1~99%, предпочтительно, от 0,1~50% по массе от общей массы указанной композиции.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть представлена в форме фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемые носители, адъюванты или разбавители, например, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмалы, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Указанные составы может дополнительно включать наполнители, антиагглютинирующие агенты, смазывающие агенты, смачивающие агенты, вкусоароматические агенты, эмульгаторы, консерванты и т.п. Композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены в состав для обеспечения быстрого, продолжительного или отсроченного высвобождения активного ингредиента после его введения пациенту путем выполнения любых процедур, хорошо известных в данной области техники.
Например, композиции согласно настоящему изобретению могут быть растворены в маслах, пропиленгликоле или других растворителях, которые обычно используют для получения инъекционных составов. Подходящие примеры носителей включают физиологический солевой раствор, полиэтиленгликоль, этанол, растительные масла, изопропилмиристат, и т.п., однако не ограничиваются ими. В случае местного введения, экстракт согласно настоящему изобретению может быть представлен в форме мазей и кремов.
Фармацевтические составы, содержащие предложенную композицию, могут быть получены в любой форме, например, в виде лекарственной формы для перорального применения (порошок, таблетка, капсула, мягкая капсула, лекарственное средство на водной основе, сироп, эликсиры, пилюли, порошок, саше, гранулы), или состава для местного применения (крем, мазь, лосьон, гель, бальзам, пластырь, паста, спрей, аэрозоль и т.п.), или инъекционного состава (раствор, суспензия, эмульсия).
Композиция согласно настоящему изобретению в составе фармацевтических лекарственных форм может применяться в форме ее фармацевтически приемлемой соли, и также может применяться по отдельности или в подходящем сочетании, а также в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями.
Требуемая доза предложенного в настоящем изобретении экстракта или соединения варьируется в зависимости от состояния и массы тела субъекта, тяжести, формы лекарственного вещества, способа и периода введения, и может быть выбрана специалистами в данной области техники. При этом для получения требуемых эффектов, как правило, рекомендуется введение количества в диапазоне от 0,0001 до 1000 мг/кг, предпочтительно, от 0,001 до 100 мг/кг по массе в день предложенного в настоящем изобретении экстракта. Указанная доза может быть введена единоразово или разделена на несколько приемов в сутки.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может вводиться субъекту-животному, например, млекопитающим (крысам, мышам, домашним животным или человеку) различными способами. Включены все способы введения, например, введение может осуществляться перорально, ректально или путем внутривенной, внутримышечной, подкожной, внутрикожной, интратекальной, эпидуральной или интрацеребровентрикулярной инъекции.
В настоящем изобретении также предложены фармацевтическая композиция и функциональный пищевой продукт, содержащие новое соединение (KS513), выделенное из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum в качестве активного ингредиента в количестве, эффективном для лечения и предотвращения аллергического заболевания, воспалительного заболевания, астмы или заболевания ХОБЛ.
В настоящем изобретении также предложено применение нового соединения (KS513), выделенного из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, для получения лекарственных средств, применяемых для лечения или предотвращения воспалительного заболевания, аллергического заболевания, астмы или ХОБЛ.
В настоящем изобретении также предложен способ лечения или предотвращения воспалительного заболевания, аллергического заболевания, астмы или ХОБЛ у млекопитающего или человека, включающий введение указанному млекопитающему или человеку эффективного количества нового соединения (KS513), выделенного из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, совместно с фармацевтически приемлемым носителем.
Предложенный в настоящем изобретении экстракт согласно настоящему изобретению также может применяться в качестве главного компонента или добавки и вспомогательного агента при получении различных функционального пищевого продукта и пищевого продукта лечебного назначения.
Соответственно, еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении функционального пищевого продукта, содержащего терапевтически эффективное количество нового соединения (KS513), выделенного из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, содержащего активные ингредиенты для предотвращения или облегчения аллергического заболевания, воспалительного заболевания, астмы или хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).
Термин «функциональный пищевой продукт» в настоящем документе относится к функциональному продукту питания с повышенной функциональностью, например, физической функциональностью или физиологической функциональностью, за счет добавления экстракта согласно настоящему изобретению в стандартный пищевой продукт для предотвращения или ослабления целевых заболеваний у человека или млекопитающего.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении пищевого продукта лечебного назначения, содержащего терапевтически эффективное количество нового соединения (KS513), выделенного из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, совместно с ситологически приемлемой добавкой для предотвращения или облегчения аллергического заболевания, воспалительного заболевания, астмы или хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).
Термин «пищевой продукт лечебного назначения» в настоящем документе включает «пищевой продукт, содержащий экстракт или соединение(я) согласно настоящему изобретению, не демонстрирующий(ие) специфического направленного эффекта, однако демонстрирующий(ие) общенаправленный эффект в малых количествах в форме добавки или общего количества в форме порошка, гранул, капсул, пилюль, таблеток и т.п.
Термин «ситологически приемлемая добавка» в настоящем документе включает «любое вещество, предполагаемое применение которого приводит или может, как обоснованно ожидается, приводить, прямо или косвенно, к его включению в качестве компонента или другому влиянию на характеристики какого-либо пищевого продукта»; указанные добавки могут быть разделены на три группы в соответствии с происхождением, а именно: (1) химически синтезированная добавка, например, кетоны, глицин, цитрат калия, никотиновая кислота и т.д.; (2) природная добавка, такая как краситель на основе хурмы, экстракт лакрицы, кристаллическая целлюлоза, гуаровая камедь и т.д.; (3) смешанные добавки, такие как L-глутамат натрия, консерванты, красители из каменноугольной смолы и т.д., или различные категории в соответствии с функцией в продукте питания, например, загущающий агент, ускоритель созревания, отбеливающий агент, секвестрант, увлажнитель, антислеживающий агент, осветляющие агенты, отверждающий агент, эмульгатор, стабилизатор, загуститель, основания и кислоты, пенообразующие агенты, питательные вещества, красящий агент, вкусоароматический агент, подсластитель, консервирующий агент, антиоксидант и т.д., хорошо известные в данной области техники или из ранее опубликованных источников (см. «Общий стандарт Кодекса на пищевые добавки» (GSFA, Codex STAN 192-1995) на домашней интернет-странице GSFA: www.codexalimentarius.net/gsfaonline/index.html).
Если вещество добавляют в пищевой продукт для достижения конкретной цели в указанном пищевом продукте, его называют прямой добавкой; косвенные пищевые добавки представляют собой добавки, входящие в состав пищевого продукта в следовых количествах в результате упаковки, хранения или иных манипуляций.
Термин «пищевые продукты лечебного назначения или функциональные пищевые продукты» в настоящем документе могут относиться к пищевому продукту, лечебному напитку, биологически активной добавке и т.д., и могут быть представлены фармацевтической лекарственной формой, такой как порошок, гранулы, таблетки, суспензии, эмульсии, сироп, жевательные таблетки, капсулы, напиток и т.д.; или пищевым продуктом, например, хлебом, рисовыми хлебцами, сухофруктами, конфетами, шоколадом, жевательной резинкой, мороженым, молоком, например, маложирным молоком, молоком с гидролизованной лактозой, козьим молоком, переработанным молоком, молочным продуктом, таким как кисломолочный продукт, масло, концентрированное молоко, молочные сливки, молочный жир, натуральный сыр, плавленый сыр, сухое молоко, молочная сыворотка и т.д., готовым мясным продуктом, например, гамбургером, ветчиной, колбасой, беконом и т.д., готовым яичным продуктом, продуктом из рыбы, например, рыбными котлетами и т.д., лапшой, например, лапшой быстрого приготовления, высушенной лапшой, влажной лапшой, жареной лапшой, нежареной лапшой, желатинизированной сухой лапшой, приготовленной лапшой, замороженной лапшой, пастой и т.д., чайным продуктом, например, чайными пакетиками, чайным экстрактом и т.д., оздоровительными напитками, такими как фруктовые напитки, растительные напитки, газированные прохладительные напитки, напитки на основе соевого молока, лактатный напиток, смешанный напиток, и т.д., приправами, такими как соевый соус, паста из соевых бобов, паста из красного перца, черная паста из соевых бобов (ферментированный продукт из соевых бобов, подкрашенных карамелью), чонгукчан (соевые бобы, естественным образом ферментированные В. subtillis), смешанная паста, уксус, соус, кетчуп, карри, заправка и т.д., маргарин, кулинарный жир, пицца и т.д., однако не ограничиваются перечисленными, для предотвращения или ослабления целевого заболевания.
Также вышеописанный экстракт или соединение может быть добавлен в пищевой продукт или напиток для предотвращения или ослабления целевого расстройства. Количество вышеописанного экстракта или соединения(ий) в пищевом продукте или напитке для функционального пищевого продукта или пищевого продукта лечебного назначения обычно может варьироваться от приблизительно 0,01 до 100% по массе относительно общей массы пищевого продукта в составе функционального пищевого продукта. В частности, хотя предпочтительно количество экстракта согласно настоящему изобретению в функциональном пищевом продукте, пищевом продукте лечебного назначения или специальном питательном продукте может варьироваться в соответствии с предусмотренным назначением каждого пищевого продукта, как правило, в качестве добавки предпочтительно используется количество экстракта или соединения(ий) согласно настоящему изобретению в диапазоне от приблизительно 0,01 до 5% для пищевого продукта, такого как лапша и т.п., от 40 до 100% для пищевого продукта лечебного назначения, на 100% состава пищевого продукта.
При условии, что состав лечебного напитка согласно настоящему изобретению в качестве важнейшего компонента включает вышеописанный экстракт или соединение(ия) в указанной пропорции, какие-либо конкретные ограничения для других жидких компонентов отсутствуют, при этом указанный другой компонент может представлять собой какой-либо подсластитель или природный углевод и т.д., такой как входящие в стандартные напитки. Примером вышеупомянутого природного углевода является моносахарид, такой как глюкоза, фруктоза и т.д.; дисахарид, такой как мальтоза, сахароза и т.д.; стандартный сахар, такой как декстрин, циклодекстрин; и сахарный спирт, такой как ксилит и эритрит и т.п. В качестве отличного от вышеуказанных подсластителей может предпочтительно подходить для применения природный подсластитель, такой как тауматин, экстракт стевии, например, леваудиозид А, глицирризин и др., и синтетический подсластитель, такой как сахарин, аспартам и т.п. Количество вышеописанного природного углевода обычно варьируется от приблизительно 1 до 20 г, предпочтительно от 5 до 12 г на 100 мл предложенного состава напитка.
Отличные от вышеупомянутых компоненты композиции представлены различными питательными веществами, витамином, минеральным веществом или электролитом, синтетическим вкусоароматическим агентом, красящим агентом и улучшителем в случае сыра, шоколада и т.п., пектиновой кислотой и ее солью, альгиновой кислотой и ее солью, органической кислотой, защитный коллоидный клей, агент для контроля рН, стабилизатор, консервант, глицерин, спирт, агент для карбонизации, используемый при получении газированных напитков и т.п. Отличный от указанных выше компонент может быть представлен фруктовым соком для получения натурального фруктового сока, напитка на основе фруктового сока или овощей, при этом указанный компонент может применяться независимо или в составе комбинации. Соотношение компонентов не столь важно, однако обычно варьирует от приблизительно 0 до 20% по массе на 100% предложенной композиции. Примеры добавок к пище, содержащих вышеупомянутый экстракт или соединение, представлены различными пищевыми продуктами, напитками, жевательными резинками, витаминными комплексами, оздоровительными пищевыми продуктами и т.п.
Предложенный(ые) в настоящем изобретении экстракт или соединение(я) согласно настоящему изобретению нетоксичны и, соответственно, не вызывают нежелательных реакций; их применение безопасно.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что могут быть осуществлены различные модификации и получены варианты композиций, применения и составов согласно настоящему изобретению без отступления от существа или объема настоящего изобретения.
Настоящее изобретение более конкретным образом описано в представленных ниже примерах. Тем не менее, следует понимать, что настоящее изобретение никоим образом не ограничивается указанными примерами.
Полезные эффекты настоящего изобретения
Согласно описанию предложенное в настоящем изобретении новое соединение (KS513), выделенное из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum, демонстрировало мощную противовоспалительную, противоаллергенную, противоастматическую и направленную против ХОБЛ активность путем применения различных тестов, (1) теста на цитотоксичность с использованием линии клеток RAW264.7, (2) тестирования эффекта на экспрессию мРНК провоспалительного лекарственного фермента, такого как iNOS или СОХ-2, и провоспалительных лекарственных цитокинов, таких как ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа, в клетках линии RAW264.7, индуцированную ЛПС, (3) тестирования ингибирующего эффекта на экспрессию белка iNOS, вовлеченного в воспроизводство NO, и на уровень воспроизводства NO, (4) тестирования ингибирующего эффекта на экспрессию белка СОХ-2 и уровень воспроизводства простагландина Е2 (PGE2), (5) тестирования ингибирующего эффекта на уровень продуцирования ИЛ- 1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа и т.п.
Краткое описание чертежей
Вышеуказанные и другие цели, признаки и другие преимущества настоящего изобретения будут более понятны после изучения приведенного ниже подробного описания в сочетании с прилагаемыми чертежами, где:
На фиг. 1 представлен эффект экспериментального образца KS-513 на цитотоксичность в клетках линии RAW264.7.
На фиг. 2 показан эффект экспериментального образца KS-513 на индуцируемую ЛПС экспрессию мРНК провоспалительного лекарственного фермента, такого как iNOS или СОХ-2, и провоспалительных лекарственных цитокинов, таких как ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа, в клетках линии RAW264.7. Указанные клетки обрабатывали KS-513 в заданных концентрациях в течение 2 часов до добавления 1 мкг/мл ЛПС, и клетки дополнительно инкубировали в течение 12 часов. Эффект KS-513 на уровни мРНК ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-1β, iNOS и СОХ-2 оценивали с применением количественной ПЦР в реальном времени. Для получения референсных значений также оценивали уровень мРНК СОХ-2.
На фиг. 3 показан ингибирующий эффект экспериментального образца KS-513 на уровень экспрессии белка iNOS, вовлеченного в воспроизводство NO, и уровень воспроизводства NO по оценке с применением вестерн-блоттинга и анализа на оксид азота (статистический анализ выполняли с применением t-критерия Стьюдента; P-значения (*),<0,05) считали указывающими на статистическую значимость).
На фиг. 4 показан ингибирующий эффект экспериментального образца KS-513 на уровень экспрессии белка СОХ-2 и уровень воспроизводства простагландина Е2 (PGE2), с применением вестерн-блоттинга и метода иммуноферментного анализа (ИФА), соответственно (статистический анализ выполняли с применением t-критерия Стьюдента, и Р-значения (**) <0,01 и (***) <0,001) считали указывающими на статистическую значимость);
На фиг. 5 показан эффект KS-513 на уровень высвобождаемых ИЛ-1-бета, ИЛ-6 и ФНО-альфа в клетках RAW264.7. Высвобождение ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6 оценивали с применением ИФА ELISA. Статистический анализ выполняли с применением t-критерия Стьюдента; Р- значения (*) <0,05, (**) <0,01 и (***) <0,001) считали указывающими на статистическую значимость.
Лучший вариант осуществления изобретения
Специалистам в данной области техники будет понятно, что могут быть осуществлены различные модификации и получены варианты композиций, применения и составов согласно настоящему изобретению без отступления от существа или объема настоящего изобретения.
Настоящее изобретение более конкретным образом описано в представленных ниже примерах. Тем не менее, следует понимать, что настоящее изобретение никоим образом не ограничивается указанными примерами.
ПРИМЕРЫ
Приведенные ниже сравнительный пример, примеры и экспериментальные примеры предназначены для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения без ограничения его объема.
Сравнительный пример 1. Аналитический аппарат
Точку плавления определяли без коррекции с помощью аппарата для микроопределения точки плавления Кофлера (Kofler); оптическое вращение с применением поляриметра Jasco Р-1020; УФ-данные с применением спектрометра видимого и УФ-диапазона UV-VIS 2450; Фурье-ИК-спектры с применением Jasco FT/IR-4200; ЯМР-спектры с применением фурье-спектрометра для ЯМР Varian UNITY 400 МГц с применением ТМС в качестве внутреннего стандарта; масс-спектрометрию высокого разрешения с ионизацией электрораспылением (HRESIMS) с применением квадрупольного микромасс-спектрометра Waters Q-TOF Premier; ВЭЖХ-анализ в эксперименте проводили в системе ВЭЖХ Gilson с применением детектора видимого и УФ-диапазона UV/VIS-155 и насоса 305.
Пример 1. Получение нового соединения (KS 513) из Pseudolysimachion rotundum var subintegrum
1-1. Получение неочищенного экстракта
4,0 кг высушенного Pseudolysimachion rotundum var subintegrum (культивация: 244, Соимьян, Ымсон, провинция Чхунчхон-Пукто, Корея, в соответствии с надлежащей сельскохозяйственной практикой (GAP), KRIBB 0020697, банк растительных экстрактов Корейского исследовательского института биологических наук и биотехнологии (KRIBB), Тэджон, Корея) измельчали и смешивали с 10 л 40% метанола. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов и двукратно экстрагировали путем рефлюкс-экстракции при 78°С в течение 12 часов для сбора фильтрата. Экстракт фильтровали через фильтровальную бумагу для удаления дебриса. Собранный фильтрат концентрировали с помощью ротационного испарителя (EYELA, N-2100, Япония) при 55-65°С под пониженным давлением и высушивали в аппарате для замораживания-высушивания с получением 397,4 г высушенного неочищенного экстракта
1-2. Получение очищенного экстракта
200 г высушенного неочищенного экстракта растворяли в смешанном растворителе (25% МеОН-вода) и подвергали дополнительному очищению с применением препаративной хроматографии с обращенной фазой (Zeoprep С18, 75 мкм, 200×250 мм, Zeochem, Луисвилль, США). Элюировавшие фракции (f1-f4) собирали и концентрировали под вакуумом. 5,0 г фракции f2 загружали на колонку RP С-18 (Zeoprep С18, 20×250 мм, 10 мкм, Zeochem, Луисвилль, США) для жидкостной хроматографии среднего давления (ЖХСД): и элюировали растворителем (раствор МеОН-вода = 2:8, 3:7, 4:6, 10:0) для выделения 5 субфракций, т.е. f2a, f2b, f2c, f2d и f2e.
11-3. Получение нового соединения KS513
23
29
13
2,3 г субфракции (f2b) подвергали полупрепаративной ВЭЖХ (Synergy Polar-RP 4 мкм, 21,2×250 мм, Phenomenex, Торренс, Калифорния, США, 23% MeCN в Н20) с получением белого аморфного порошка нового иридоидного соединения (1aS,1bS,2S,4S,5aR,6S,6aS)-1a-(гидроксиметил)-4-метокси-2-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)октагидрооксирено-[2',3':4,5]циклопента[1,2-с]пиран-6-ил-4-гидроксибензоата (KS-513; CHlO), демонстрировавшего следующие физико-химические свойства:
20
D
[α] -64,0° (с 0,2, МеОН).
-
Масс-спектрометрия высокого разрешения с ионизацией электроспреем (HRESIMS) (наблюдаемое отношение м/з: 513,1609 [М-Н]): кластер квазимолекулярного иона 3:1
-1
-1
ИК-спектр: 3412 см (гидроксильная группа); 1692 см, (карбонил α,β-ненасыщенного сложного эфира)
1
13
ЯМР-спектры Н и С: таблица 1
Экспериментальный пример 1. Тест на цитотоксичность.
Для определения цитотоксичности предложенного в настоящем изобретении соединения проводили следующий тест на цитотоксичность в клетках линии RAW264.7 с применением способа, раскрытого в опубликованных источниках (Lee, S.U., et al., 2010, Anti-resorptive saurolactam exhibits in vitro anti-inflammatory activity via ERK-NK-kappa В signaling pathway, International Immunopharmacology, 10, pp298-303).
1-1. Оценка цитотоксичности в клетках RAW264.7
5
Клетки RAW264.7 (TIB-71, АТСС), макрофаги мыши, суспендировали в среде DMEM (модифицированная по Дульбекко среда Игла, Gibco) с добавлением 5% ФБС (фетальной бычьей сыворотки) в концентрации 1×10 клеток/мл, и 100 мкл указанной суспензии инокулировали 96-лучночные планшеты для прикрепления клеток к планшетам в течение 4 часов. Их обрабатывали различными концентрациями экспериментального образца (соединение KS 513) и культивировали в течение 24 часов. Смешивали с 10 мкл раствора ССК-8 в соответствии с инструкциями производителя набора (Dojindo Co. Ltd), проводили реакцию в течение 30 мин - 4 часов, и определяли поглощение в растворе при 570 нм. Жизнеспособность клеток рассчитывали в соответствии с приведенной ниже математической формулой 1 на основании данных группы отрицательного контроля, обработанной 0,2% ДМСО; результат представлен в таблице 2.
Математическая формула 1
Жизнеспособность клеток (%) = OD 570 нм (экспериментальная группа)/ OD 570 нм (группа отрицательного контроля)×100
В результате, как показано на фиг. 1 и в таблице 2, было подтверждено, что при воздействии соединением KS 513 в концентрациях менее 80 мкМ наблюдалась более чем 95% жизнеспособность клеток; соответственно, оно не проявляло цитотоксичности в клетках RAW264.7.
Экспериментальный пример 2. Ингибирование экспрессии мРНК провоспалительного лекарственного фермента и провоспалительных лекарственных цитокинов.
Для определения ингибиторного эффекта на провоспалительный лекарственный фермент, такой как iNOS или СОХ-2, и провоспалительные лекарственные цитокины, такие как ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа, в клетках линии RAW264.7, индуцируемые ЛПС, проводили следующий тест с применением ПЦР в реальном времени (полимеразная цепная реакция в реальном времени, количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени, кПЦР) в соответствии с раскрытым в опубликованных источниках способом (Livak, K.J., Schimittgen T.D., 2001, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitiative PCR and the 2 (-Delta Delta C(T) method, Methods 25, p402-408):
2-1. Процедура
Клетками RAW264.7 инокулировали 6-луночные планшеты в концентрации 1×106 клеток/лунку для инкубирования в течение 12 часов. Предварительно обрабатывали соединением KS-513 в различных концентрациях (2,5, 5,10 и 20 мкМ) и добавляли 1 мкг/мл ЛПС (L6529, Sigma) для инкубации в течение 12 часов.
Тотальную РНК экстрагировали с применением Триазола В (Invitrogen); кДНК синтезировали с применением набора для обратной транскрипции Omniscript (205113, Qiagen, Gmbh, Хильден, Германия) после количественного определения. Синтезированную кДНК смешивали с матрицей и праймерами согласно таблице 3 (SEQ.I.D. 1-14), проводили денатурацию при 94°С в течение 5 минут с применением смеси для ПЦР (мастер-микс для ПЦР, Bioneer, Корея), и осуществляли следующую реакцию: 1 цикл предварительной денатурации; при 95°С в течение 30 секунд, 60°С в течение 45 секунд, 72°С в течение 45 секунд, 30 циклов денатурации; 10 минут при 72°С, 1 цикл конечной элонгации (фиг. 2).
В результате было подтверждено, что уровень экспрессии мРНК провоспалительного лекарственного фермента, такого как iNOS или СОХ-2, и провоспалительных лекарственных цитокинов, таких как ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа, в клетках линии RAW264.7, индуцированной ЛПС (1 мкг/мл), повышался в контрольной группе, получавшей ЛПС; в экспериментальной группе, предварительно обработанной соединением KS-513 в различных концентрациях, указанные уровни дозозависимым образом значимо снижались по сравнению с уровнями в контрольной группе, получавшей ЛПС (100%), как видно из таблицы 4.
Экспериментальный пример 3. Ингибирующий эффект на экспрессию белка iNOS и воспроизводство NO.
Для определения ингибирующего эффекта на экспрессию белка iNOS, вовлеченного в воспроизводство NO и уровень воспроизводства NO, проводили следующий тест:
Известно, что NO демонстрирует различные биологические свойства, влияющие, например, на вазодилатацию, свертываемость крови, нейропередачу, почечную функцию, воспаление, противоопухолевую активность и т.п. с участием NO-синтазы. NO, являясь одной из активных форм кислорода и обладающим высокой реакционной способностью биогенным веществом, играет важную роль в реакции запуска воспаления и синтезируется из L-аргинина с помощью NOS (синтазы оксида азота). В частности, iNOS (индуцируемая NOS) вовлечена в воспалительный ответ и экспрессируется при стимуляции воспалительных цитокинов, таких как ФНО-альфа, ЛПС (липополисахаридом) и т.п. (Nathan, С., 1992, Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells, FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Society for Experimental Biology, 6, pp. 3051-3064).
3-1. Эффект на уровень экспрессии iNOS
Для определения эффекта экспериментального образца на уровень экспрессии iNOS в клетках RAW264.7 проводили следующий анализ с применением способа, раскрытого в опубликованных источниках (Lee, S.U., et al., Anti-resorptive saurolactam exhibits in vitro anti-inflammatory activity via ERK-NF-kappabeta signaling pathway: International immunopharmacology, 10, pp298-303).
6
Уровень экспрессии iNOS в клетках RAW264.7, индуцированной ЛПС (1 мкг/мл) определяли с применением анализа методом вестерн-блоттинга. Клетками RAW264.7 инокулировали 96-луночные планшеты в концентрации 1×10 клеток/лунку для инкубации в течение 12 часов. Предварительно обрабатывали соединением KS-513 в различных концентрациях (2,5, 5, 10 и 20 мкМ), добавляли 1 мкг/мл ЛПС (L6529, Sigma) и инкубировали в течение 12 часов.
Для экстракции белка после троекратного промывания клеток ледяным ФСБ в клетки добавляли лизирующий буфер (50 мМ Tris HCl (рН 8,0), 5 мМ ЭДТК, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,1% ДСН, 1 мМ ПМСФ) и таблетку коктейля ингибиторов протеаз (Roche, Германия, 11697498001), проводили реакцию при 4°С в течение 30 минут и центрифугировали в течение 10 минут со скоростью 12000 об/мин для сбора супернатанта.
Эквивалентное количество белка выделяли посредством ДСН-ПААГ и указанный белок переносили на нитроцеллюлозную мембрану (BR162-0145, Bio-Rad). Проводили реакцию мембраны с блокирующим буфером (раствор 1×ФСБ с 5% обезжиренного молока и 0,1% Tween 20, SH30258.01, Hyclone) в течение 1 часа для блокирования неспецифического связывания антитела. Добавляли антитело (анти-iNOS) против белка, выдерживали 1-2 часа, промывали раствором TBST, содержащим 0,1% Tween 20, и проводили реакцию с вторичным антителом. Проводили реакцию продукта с системой усиленной хемилюминесценции (ECL) и количество белка определяли с использованием аппарата для анализа изображений (LAS-4000, Fujifilm).
Количественное определение белка выполняли путем определения показателя поглощения с применением аналитического набора (набор для белкового анализа по методу Бредфорда, Thermo) при 595 нм; результат показан на фиг. 3А.
3-2. Ингибиторный эффект в отношении воспроизводства NOS
Для определения количества продуцированного NO в среде проводили следующий тест в соответствии с раскрытым в опубликованных источниках способом (Ding, А.Н., et al., 1988, Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages, Comparison of activating cytokines and evidence for independent production, Journal of Immunology, 141, pp2407-2412).
5
Клетками RAW264.7 инокулировали 96-луночные планшеты в концентрации 1×10 клеток/ лунку для инкубации в течение 18 часов. Предварительно обрабатывали соединением KS-513 в различных концентрациях (2,5, 5, 10 и 20 мкМ), добавляли 1 мкг/мл ЛПС (L6529, Sigma) и инкубировали в течение 24 часов. Добавляли в среду эквивалентное количество реактива Грисса (G4410, Sigma) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 10 минут для определения показателя поглощения при 540 нм. Уровень NO в среде определяли с применением стандартной кривой на основании различных концентраций нитрита натрия; результат представлен в таблице 5 и на фиг. 3.
В результате было подтверждено, что уровень экспрессии белка iNOS в экспериментальной группе, обработанной KS-513, понижался дозозависимым образом, тогда как в обработанной ЛПС группе он увеличивался (фиг. 3А); уровень воспроизводства NO в экспериментальной группе понижался дозозависимым образом относительно обработанной ЛПС группы (100%).
Экспериментальный пример 4. Ингибирование экспрессии белка СОХ-2 и уровня воспроизводства PGE2
Для определения ингибиторного эффекта на экспрессию белка СОХ-2 и уровень воспроизводства PGE2 проводили следующий тест с применением способа, раскрытого в опубликованных источниках (Chen, С, et al., 1999, Involvement of p38 mitogen-activated protein kinase in lipopolysaccharide-induced iNOS and COX-2 expression in J774 macrophage, Immunology, 97, pp 124-129)
Уровень экспрессии СОХ-2 в клетках RAW264.7, индуцированной ЛПС (1 мкг/мл) определяли с применением анализа методом вестерн-блоттинга в соответствии со способом, описанным в экспериментальном примере 3.
5
Клетками RAW264.7 инокулировали 96-луночные планшеты в концентрации 1×10 клеток/лунку для инкубации в течение 18 часов. Предварительно обрабатывали соединением KS-513 в различных концентрациях (2,5, 5, 10); добавляли 1 мкг/мл ЛПС (L6529, Sigma) и инкубировали в течение 24 часов. Уровень PGE2 в клетках определяли с применением системы иммуноферментного анализа (ИФА; Amersham Pharmacia); результат представлен на фиг. 4А, АВ и в таблице 6.
В результате было подтверждено, что уровень экспрессии белка СОХ-2 в экспериментальной группе, обработанной KS-513, понижался дозозависимым образом, тогда как в обработанной ЛПС группе увеличивалось (фиг. 4А); уровень воспроизводства PGE2 в экспериментальной группе понижался дозозависимым образом относительно обработанной ЛПС группы (100%).
Экспериментальный пример 5. Ингибирование продуцирования провоспалительных цитокины.
Для определения ингибиторного эффекта на продуцирование провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа и т.п., проводили следующий тест с применением способа раскрытого в опубликованных источниках (Lee, S.U., et al., Anti-resorptive saurolactam exhibits in vitro anti-inflammatory activity via ERK-NF-kappabeta signaling pathway: International immunopharmacology, 10, pp298-303)
Воспалительные цитокины, такие как ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа и т.п., принимают значительное участие в воспалении в различных клетках, например, активированных лимфоцитах, макрофагах и т.п.
5
Клетками RAW264.7 инокулировали 96-луночные планшеты в концентрации 1×10 клеток/лунку для инкубации в течение 18 часов. Предварительно обрабатывали соединением KS-513 в различных концентрациях (2,5, 5, 10 и 20 мкМ), добавляли 1 мкг/мл ЛПС (L6529, Sigma) и инкубировали в течение 24 часов. Уровень воспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа и т.п., в клеточной среде определяли с использованием набора для ИФА ELISA (ИЛ-1-бета:559603, ИЛ-6:555240, ФНО-альфа:5558534, BD); результат представлен на фиг. 5 и в таблицах 7-9.
В результате было подтверждено, что уровень продуцируемых провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа, в экспериментальной группе, обработанной KS-513, понижался дозозависимым образом, тогда как в обработанной ЛПС группе (1 мкг/мл) он увеличивался (фиг. 5). Уровень воспроизводства провоспалительных цитокинов в экспериментальной группе понижался дозозависимым образом относительно обработанной ЛПС группы (100%).
5
Экспериментальный пример 6. Тест на острую токсичность при пероральном введении у крыс
Тест на острую токсичность выполняли путем введения предложенного в настоящем изобретении соединения СПФ-крысам линии Спрег-Доули возрастом 6 недель.
250 мг/кг, 500 мг/кг, 1000 мг/кг, 5000 мг/кг предложенного в настоящем изобретении соединения вводили перорально в каждой группе, состоящей из 2 крыс, и наблюдали за симптомами у крыс в течение 14 дней. После введения экстракта или соединений наблюдали за всеми клиническими изменениями, т.е. смертностью, клиническими признаками, изменением массы тела, и проводили анализ крови, например, гематологический тест и гематологический биохимический тест. Аномальные изменения органов брюшной полости и органов грудной клетки оценивали после аутопсии.
Каких-либо изменений смертности, клинических признаков, изменений массы тела и генерализованных данных в любой группе ни у самок, ни у самцов не наблюдалось. Кроме того, не наблюдалось какой-либо токсичности в экспериментальной группе, получавшей лечение 5000 мг/кг предложенного в настоящем изобретении соединения.
50
Соответственно, было подтверждено, что предложенное в настоящем изобретении соединение, полученное согласно настоящему изобретению, представляет собой эффективное и безопасное вещество с полулетальной дозой (LD) более чем 5000 мг/кг при пероральном введении.
Варианты изобретения
Здесь и далее в настоящем документе описаны способы получения и виды вспомогательных веществ, однако настоящее изобретение не ограничивается ими. Репрезентативные примеры получения описаны ниже.
Получение состава для инъекций
KS513
100 мг
Метабисульфит натрия
3,0 мг
Метилпарабен
0,8 мг
Пропилпарабен
0,1 мг
Дистиллированная вода для инъекций,
оптимальное количество
Состав для инъекций получали путем растворения активного компонента, контроля показателей рН на уровне, составляющем приблизительно 7,5, с последующим заполнением всеми компонентами ампулы объемом 2 мл и стерилизации путем стандартного для составов для инъекций способа.
Получение порошка
KS 513
500 мг
Кукурузный крахмал
100 мг
Лактоза
100 мг
Тальк
10 мг
Порошковый состав получали путем смешивания указанных выше компонентов и наполнения запечатанной упаковки.
Получение таблеток
KS 513
200 мг
Кукурузный крахмал
100 мг
Лактоза
100 мг
Стеарат магния,
оптимальное количество
Состав в виде таблеток получали путем смешивания указанных выше компонентов и таблетирования.
Получение капсул
KS513
100 мг
Лактоза
50 мг
Кукурузный крахмал
50 мг
Тальк
2 мг
Стеарат магния,
оптимальное количество
Состав в виде таблеток получали путем смешивания указанных выше компонентов и наполнения желатиновых капсул с применением стандартного для желатиновых составов способа.
Получение жидкости KS 513
1000 мг
Сахар
20 г
Полисахарид
20 г
Лимонный ароматизатор
20 г
Жидкий состав получали путем растворения активного компонента с последующим наполнением всеми компонентами ампулу объемом 1000 мл и стерилизации с применением стандартного для жидких составов способа.
Получение функционального пищевого продукта
KS 513
1000 мг
Смесь витаминов,
оптимальное количество
Витамин А, ацетат
70 г
Витамин Е
1,0 мг
Витамин В<sub>10</sub>.
13 мг
Витамин В<sub>2</sub>
0,15 мг
Витамин В6
0,5 мг
Витамин В1
20,2g
Витамин С
10 мг
Биотин
10 г
Амид никотиновой кислоты
1,7 мг
Фолиевая кислота
50 г
Пантотенат кальция
0,5 мг
Смесь минеральных веществ,
оптимальное количество
Сульфат железа
1,75 мг
Оксид цинка
0,82 мг
Карбонат магния
25,3 мг
Однозамещенный фосфат калия
15 мг
Двузамещенный фосфат кальция
55 мг
Цитрат калия
90 мг
Карбонат кальция
100 мг
Хлорид магния
24,8 мг
Вышеупомянутые смеси витаминов и минеральных веществ могут различным образом варьировать. Такие вариации не должны считаться отступлением от существа и объема настоящего изобретения.
Получение лечебного напитка
KS 513
1000 мг
Лимонная кислота
1000 мг
Олигосахарид
100 г
Абрикосовый концентрат
2 г
Таурин
1 г
Дистиллированная вода
900 мл
Лечебный напиток получали путем растворения активного компонента, смешивания, перемешивания при 85°С в течение 1 часа, фильтрации с последующим заполнением всеми компонентами ампулы объемом 1000 мл и стерилизации с применением стандартного для получения лечебного напитка способа.
Соответственно, очевидно, что варианты осуществления описанного изобретения могут различным образом варьировать. Такие вариации не должны считаться отступлением от существа и объема настоящего изобретения, и подразумевается, что все такие модификации, как будет очевидно специалисту в данной области техники, включены в объем приведенной ниже формулы изобретения.
Промышленная применимость
Согласно описанию настоящего изобретения, предложенное в настоящем изобретении соединение KS513 из экстракта Pseudolysimachion rotundum var subintegrum демонстрировало выраженную противовоспалительную, противоаллергенную, противоастматическую и направленную против ХОБЛ активность, что подтверждается в различных тестах, например, (1) в тесте на цитотоксичность с применением линии клеток RAW264.7, (2) при тестировании эффекта на экспрессию мРНК провоспалительного лекарственного фермента, такого как iNOS или СОХ-2, и провоспалительных лекарственных цитокинов, таких как ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа в клетках линии RAW264.7, индуцированную ЛПС, (3) при тестировании ингибирующего эффекта на экспрессию белка iNOS, вовлеченных в воспроизводство NO, и уровень воспроизводства NO, (4) при тестировании ингибирующего эффекта на экспрессию белка СОХ-2 и уровень воспроизводства простагландина Е2 (PGE2), (5) при тестировании ингибирующего эффекта на уровень продуцирования ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ФНО-альфа и т.п. Соответственно, оно может применяться в качестве терапевтического средства или функционального пищевого продукта для лечения и предотвращения аллергического заболевания, воспалительного заболевания, астмы или хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ЁНЧИН ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД.; КОРЕЯ РЕСЁРЧ ИНСТИТЬЮТ ОФ БАЙОСАЙЕНС ЭНД БАЙОТЕКНОЛОДЖИ
<120>  НОВОЕ СОЕДИНЕНИЕ (KS 513), ВЫДЕЛЕННОЕ ИЗ PSEUDOLYSIMACHION ROTUNDUM VAR. SUBINTEGRUM, КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННОЕ СОЕДИНЕНИЕ, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ АЛЛЕРГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ, АСТМЫ ИЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
<130>  PCT/KR2016/006318
<160>  14
<210>    1
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223>    Индуцируемая синтаза оксида азота (iNOS)
<400>    1
1 CCT TGT TCA GCT ACG CCT TC 20
5      10     15
<210>    2
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223>    Индуцируемая синтаза оксида азота (iNOS)
<400>    2
1 AAG GCC AAA CAC AGC ATA CC 20
5      10     15
<210>    3
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223>    Циклооксигеназа (COX) -1
<400>    3
1 GTG GCT ATT TCC TGC AGC TC 20
5      10     15
<210>    4
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223>    Циклооксигеназа (COX) -1
<400>    4
1 CAG TGC CTC AAC CCC ATA GT 20
5      10     15
?
<210>    5
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223>    Циклооксигеназа (COX) -2
<400>    5
1 AGA AGG AAA TGG CTG CAG AA 20
5      10     15
?
<210>    6
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223>    Циклооксигеназа (COX) -2
<400>    6
1 GCT CGG CTT CCA GTA TTG AG 20
5      10     15
?
<210>    7
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223>   Интерлейкин-1бета (IL1?)
<400>    7
1 CAG GCA GGC AGT ATC ACT CA 20
5      10     15
?
<210>    8
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223> Интерлейкин-1бета (IL1?)
<400>    8
1 AGG CCA CAG GTA TTT TGT CG 20
5       10     15
?
<210>    9
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223> Интерлейкин-6  (IL-6)
<400>    9
1 GTT CTC TGG GAA ATC GTG GA 20
5       10     15
?
<210>    10
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223> Интерлейкин-6 (IL-6)
<400>    10
1 GGA AAT TGG GGT AGG AAG GA 20
5       10     15
?
<210>    11
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223> Альфа-фактор некроза опухоли (TNF-alpha)
<400>    11
1 ACG GCA TGG ATC TCA AAG AC 20
5       10     15
?
<210>    12
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223> Альфа-фактор некроза опухоли (TNF-alpha)
<400>    12
1 CGG ACT CCG CAA AGT CTA AG 20
5       10     15
?
<210>    13
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223>  Глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназа (GAPDH)
<400>    13
1 AAC TTT GGC ATT GTG GAA GG 20
5       10     15
?
<210>    14
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Homo Sapiens
<220>
<223> Глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназа (GAPDH)
<400>    14
1 ACA CAT TGG GGG TAG GAA CA 20
5       10     15
<---