SCFV-АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ ПРОХОДЯТ ЧЕРЕЗ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЙ И/ИЛИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЙ СЛОИ

1. Фармацевтическая композиция, составленная для локального введения на поверхность барьера эпителиальной ткани, причем указанная композиция содержит растворимый антигенсвязывающий полипептид и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент, причем указанный полипептид способен проходить через один или несколько эпителиальных слоев менее чем за 8 ч в отсутствие усилителя проникновения.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанным тканевым барьером является поверхность глаза, полости носа, полости рта, кишечного тракта, кожи, слизистой оболочки рта и мочеполовых путей, суставов и полостей суставов, головного мозга и позвоночника.
3. Фармацевтическая композиция по п.1, которая предназначена для местного введения в глаз.
4. Фармацевтическая композиция по п.3, составленная для достижения внутриглазной концентрации антигенсвязывающего полипептида, по меньшей мере, приблизительно 100 нг/мл.
5. Фармацевтическая композиция по п.3, где антигенсвязывающий полипептид составлен для местного введения в глаз и способен проходить через роговицу и во внутриглазное пространство в отсутствие усилителя проникновения.
6. Фармацевтическая композиция по п.3, причем эта композиция находится в форме глазных капель.
7. Фармацевтическая композиция по п.3, причем эта композиция имеет рН менее 8.
8. Фармацевтическая композиция по п.3, где полипептид является достаточно растворимым для прохождения через один или несколько эпителиальных слоев менее чем приблизительно за 4 ч.
9. Фармацевтическая композиция по п.3, причем эта композиция дополнительно содержит один или несколько усиливающих проникновение агентов.
10. Фармацевтическая композиция по п.9, где усиливающий проникновение агент выбран из группы, состоящей из азона, хлорида бензалкония (BzCl), BL-7, BL-9, Brij 35, Brij 78, Brij 98, Brij 99, полиоксиэтилен-полиоксипропилена 1800, капрата натрия, каприловой кислоты, хлорида цетилпиридиния, хлоргексидина, холата, касторового масла, кукурузного масла, кремофора-EL, DMSO, бромида декаметония, дезоксихолата, декстрансульфата, ЭДТА, динатриевой соли ЭДТА, этанола, фузидата, гликохолата, лаурилсульфата, L-α-лизофосфатидилхолина, N-лауроилсаркозина, NMP, олеиновой кислоты, фосфолипидов, поли-20-оксиэтилен-9-лаурилового эфира, сапонина, Твина 20, Твина 40, Твина 60, Твина 80, таурохолата и тауродезоксихолата, в частности, капрата натрия.
D
-6
11. Фармацевтическая композиция по п.1, где этот полипептид имеет аффинность связывания в отношении антигена-мишени K, по меньшей мере, 10 М или ниже.
12. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая антигенсвязывающий полипептид в концентрации, большей чем 2,5 мг/мл, или большей чем 2,5 мг/мл, предпочтительно большей чем 5 мг/мл, гораздо более предпочтительно большей чем 10 мг/мл.
13. Фармацевтическая композиция по п.1, где антигенсвязывающий полипептид достигает терапевтической концентрации, большей чем приблизительно 100 нг/мл.
14. Фармацевтическая композиция по п.1, где антигенсвязывающий полипептид является стабильным при температуре от -80°С до 37°С.
15. Фармацевтическая композиция по п.1, где антигенсвязывающий полипептид остается стабильным в течение, по меньшей мере, восьми недель.
16. Фармацевтическая композиция по п.1, где антигенсвязывающий полипептид остается стабильным в течение, по меньшей мере, шести недель при 4°C.
17. Фармацевтическая композиция по п.1, где антигенсвязывающий полипептид остается стабильным в течение 1 месяца, предпочтительно, по меньшей мере, двух месяцев, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, шести месяцев при 20°C-40°C, предпочтительно при 37°C в ЗФР.
18. Фармацевтическая композиция по п.1, где антигенсвязывающий полипептид является стабильным при восстанавливающих условиях, как измерено в дрожжевом анализе взаимодействия, называемом «контролем качества».
19. Фармацевтическая композиция по п.1, где полипептид остается в мономерной форме при физиологических условиях.
20. Фармацевтическая композиция по п.1, где полипептид является растворимьм при температуре окружающей среды в ЗФР при концентрациях, больших чем 1 мг/мл, предпочтительно больших чем 4 мг/мл, более предпочтительно больших чем 10 мг/мл, даже более предпочтительно больших чем 25 мг/мл или наиболее предпочтительно больших чем 50 мг/мл.
21. Фармацевтическая композиция по п.1, где полипептид обнаруживает среднюю точку перехода при титровании гидрохлоридом гуанидиния, по меньшей мере, 1,5 М, предпочтительно, по меньшей мере, 1,75 М, более предпочтительно, по меньшей мере, 1,9 М или наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 2 М.
22. Фармацевтическая композиция по п.1, где растворимость или кинетику прохождения этого антигенсвязывающего полипептида измеряют способом анализа, выбранным из стандартного способа анализа на монослое эпителиальных клеток Сасо-2, стандартного внутриклеточного одногибридного или двухгибридного способа анализа растворимости и стандартного способа анализа проницаемости через тощую кишку мыши.
23. Фармацевтическая композиция по п.1, где растворимость или кинетику прохождения измеряют стандартным анализом ПЭГ-осаждения или анализом хроматографии самовзаимодействия (SIC).
24. Фармацевтическая композиция по п.1, где антигенсвязывающий полипептид содержит полипептидный район, имеющий, по меньшей мере, один антигенсвязывающий мотив, фланкированный, по меньшей мере, одним каркасным районом.
25. Фармацевтическая композиция по 24, где антигенсвязывающий полипептид содержит один антигенсвязывающий мотив, фланкированный двумя каркасными районами, два антигенсвязывающих мотива, фланкированных тремя каркасными районами, три антигенсвязывающих мотива, фланкированных четырьмя каркасными районами, или шесть антигенсвязывающих мотивов, фланкированных восемью каркасными районами, с промежуточным линкерным районом между четвертым и пятым каркасными районами.
26. Фармацевтическая композиция по п.24, где антигенсвязывающим мотивом является CDR, а каркасным районом является каркасная область иммуноглобулина.
27. Фармацевтическая композиция по п.24, где каркасный район является альтернативным каркасным районом.
28. Фармацевтическая композиция по любому из пп.24-26, где каркасный район выбран, по меньшей мере, из части репертуара природных антител человека с использованием антигеннезависимого способа отбора на высокую внутриклеточную стабильность и растворимость в клетке дрожжей.
29. Фармацевтическая композиция по п.26, где полипептид содержит три CDR и четыре промежуточных каркасных района или шесть CDR и восемь каркасных районов и промежуточный линкерный район.
30. Фармацевтическая композиция по п.29, где указанный полипептид представлен формулой
Y; или
Z; или
Y-L-Z; или
Z-L-Y;
где Y обозначает [F1-CDR1-F2-CDR2-F3-CDR3-F4] и Z обозначает [F5-CDR1-F6-CDR2-F7-CDR3-F8]; где каркасные районы (F1-F4) Y происходят из одного или нескольких каркасов легкой цепи человека;
каркасные районы (F5-F6) Z происходят из одного или нескольких каркасов легкой цепи человека;
CDR (CDR1-3) Y происходят из одного или нескольких донорных CDR, способных связывать антиген-мишень;
CDR (CDR4-6) Z происходят из одного или нескольких донорных CDR, способных связывать антиген-мишень; и
L является гибким полипептидным линкером.
31. Фармацевтическая композиция по п.30, где Y и Z представлены любой из последовательностей, описанных здесь, или их консенсусными последовательностями.
32. Фармацевтическая композиция по п.30, где указанный антигенсвязывающий полипептид является одноцепочечным антителом, содержащим, по меньшей мере, один из
(1) каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL), имеющего, по меньшей мере, приблизительно 85% сходство с каркасом VL, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7; и
(2) каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), имеющего, по меньшей мере, приблизительно 85% сходство с каркасом VH, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO:8, 9, 10 и 11.
33. Фармацевтическая композиция по п.32, где каркас вариабельного домена легкой цепи (VL) имеет, по меньшей мере, приблизительно 85% сходство с SEQ ED NO 2 и каркас вариабельного домена тяжелой цепи (VH) имеет, по меньшей мере, приблизительно 85% сходство с SEQ ID NO:8.
34. Фармацевтическая композиция по п.32, где каркас вариабельного домена легкой цепи (VL) имеет, по меньшей мере, приблизительно 85% сходство с SEQ ED NO 4, и каркас вариабельного домена тяжелой цепи (VH) имеет, по меньшей мере, приблизительно 85% сходство с SEQ ID NO:10.
35. Фармацевтическая композиция по п.32, где каркас вариабельного домена легкой цепи (VL) имеет, по меньшей мере, приблизительно 95% сходство с SEQ ID NO 7 и каркас вариабельного домена тяжелой цепи (VH) имеет, по меньшей мере, приблизительно 95% сходство с SEQ ID NO 8.
D
36. Фармацевтическая композиция по п.32, где аффинность антитела в отношении его антигена характеризуется константной диссоциации K, меньшей чем приблизительно 100 нМ.
37. Фармацевтическая композиция по п.32, где антитело имеет специфичность в отношении TNFα человека.
38. Фармацевтическая композиция по любому из пп.32-37, где антитело является химически модифицированным.
39. Фармацевтическая композиция по п.1, где эксципиент выбран из группы, включающей хлорид бензалкония, Твин 20, Твин 40, Твин 60, Твин 80 и хлоргексидин.
макс
40. Способ идентификации антигенсвязывающего полипептида, имеющего величину Ѕ V, соответствующую кинетике прохождения антигенсвязывающего полипептида по п.1, предусматривающий
(i) экспрессию внутриклеточно кандидатных антигенсвязывающих полипептидов в клетках-хозяевах, имеющих индуцибельную систему репортерного гена, где эта система репортерного гена дает регистрируемый сигнал в присутствии антигенсвязывающего полипептида, имеющего указанную кинетику прохождения, и
(ii) скрининг указанных клеток на регистрируемый сигнал, где присутствие указанного сигнала идентифицирует кандидатный полипептид как антигенсвязывающий полипептид, имеющий указанную кинетику прохождения.
41. Набор для проведения способа по п.40.
42. Антигенсвязывающий полипептид, идентифицированный способом по п.40 и/или определенный в любом из пп.32-38.
43. Антигенсвязывающий полипептид по п.42 в качестве фармацевтического средства.
44. Антигенсвязывающий полипептид по п.42 в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных со сверхэкспрессией TNFα.
45. Антигенсвязывающий полипептид по п.44 в качестве лекарственного средства для лечения глазного нарушения, выбранного из группы, состоящей из увеита, болезни Бехчета, ретинита, синдрома сухих глаз, глаукомы, синдрома Шегрена, диабетической невропатии, склерита и кератита.
46. Антигенсвязывающий полипептид по п.44 в качестве лекарственного средства для лечения увеита.
47. Антигенсвязывающий полипептид по п.42 в качестве лекарственного средства для лечения связанной с возрастом дегенерации желтого пятна.
48. Выделенная полинуклеотидная молекула, кодирующая антитело по п.42.
49. Клонирующий или экспрессирующий вектор, содержащий выделенную полинуклеотидную молекулу по п.48.
50. Подходящая клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором по п.49.
51. Клетка-хозяин по п.50, являющаяся прокариотической или эукариотической клеткой, в частности, клеткой Е.coli, клеткой дрожжей, растения, насекомого или млекопитающего.