ПОЛУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ NK-КЛЕТОК С ХИМЕРНЫМИ АНТИГЕННЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ (CAR) ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМБИНАЦИИ CAS9/РНП И ВИРУСОВ AAV

1. Плазмида для использования с системами интеграции кластеризованных регулярных промежуточных коротких палиндромных повторов (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat, CRISPR)/CRISPR-ассоциированных белков 9 (Cas9), при этом плазмида содержит, в следующем порядке, левое плечо гомологии, акцептор сплайсинга, трансген и правое плечо гомологии; при этом левое и правое плечо гомологии имеют длину 800 п.н. или менее.
2. Плазмида по п. 1, дополнительно содержащая сигнал полиаденилирования между трансгеном и правым плечом гомологии.
3. Плазмида по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что левое плечо гомологии и правое плечо гомологии имеют одинаковую длину.
4. Плазмида по п. 3, отличающаяся тем, что плечи гомологии имеют длину 30 п.н.
5. Плазмида по п. 3, отличающаяся тем, что плечи гомологии имеют длину 300 п.н.
6. Плазмида по п. 3, отличающаяся тем, что плечи гомологии имеют длину 500 п.н.
7. Плазмида по п. 3, отличающаяся тем, что плечи гомологии имеют длину 800 п.н.
8. Плазмида по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что левое плечо гомологии и правое плечо гомологии имеют разную длину.
9. Плазмида для использования в способах интеграции CRISPR/Cas9, состоящая из 1 или 2 мотивов, примыкающих к протоспейсеру (PAM), и CRISPR-РНК (крРНК) и трансгена; при этом кодируемая нуклеиновая кислота содержит в следующем порядке PAM, крРНК и трансген; и при этом, когда используются 2 PAM и крРНК, кодируемая нуклеиновая кислота содержит первый PAM, первую крРНК, трансген, второй PAM и вторую нРНК.
10. Плазмида по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что плечи гомологии плазмиды по любому из пп. 1-8 и PAM плазмиды по п. 9 специфически гибридизуются с Сайтом 1 Интеграции АденоАссоциированного Вируса (AAVS1) хромосомы 19 человека.
11. Плазмида по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что трансген содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор для опухолевого антигена.
12. Аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы, содержащие плазмиду по любому из пп. 1-11.
13. Вектор AAV по п. 12, отличающийся тем, что серотип AAV содержит AAV6.
14. Вектор AAV по п. 12 или 13, отличающийся тем, что вектор дополнительно содержит плазмиду, кодирующую крРНК, транс-активирующую крРНК (тракрРНК) и эндонуклеазу CAS.
15. Вектор AAV по любому из пп. 12-14, отличающийся тем, что вектор представляет собой одноцепочечный AAV (ssAAV).
16. Вектор AAV по любому из пп. 12-15, отличающийся тем, что вектор представляет собой самокомплементарный AAV (scAAV).
17. Модифицированная клетка, содержащая плазмиду по любому из пп. 1-11 или вектор AAV по любому из пп. 12-16.
18. Модифицированная клетка по п. 17, отличающаяся тем, что модифицированная клетка представляет собой CAR NK-клетку.
19. Способы лечения онкологического заболевания у субъекта, включающие введение субъекту, страдающему онкологическим заболеванием, модифицированной клетки по п. 17 или 18.
20. Способ генетической модификации клетки путем гомологически направленной репарации, включающий
а) получение комплекса рибонуклеопротеина (РНП), содержащего эндонуклеазу CRISPR/Cas (Cas9) класса 2 в комплексе с соответствующей направляющей РНК CRISPR/Cas и вектор AAV, который содержит плазмиду, содержащую трансген (такой как, например, химерный антигенный рецептор для опухолевого антигена); при этом трансген фланкирован плечами гомологии; и при этом плечи гомологии имеют длину 800 п.н. или менее; и
b) введение трансгена и комплекса РНП в клетку; при этом трансген вводится в клетку посредством заражения клетки аденоассоциированным вирусом (AAV); при этом комплекс РНП гибридизуется с последовательностью-мишенью в геномной ДНК клетки, и ферменты репарации ДНК клетки вставляют трансген в геном хозяина в последовательность-мишень в геномной ДНК клетки, тем самым создавая модифицированную клетку.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что клетки представляют собой первичные или размножившиеся клетки.
22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что первичные клетки инкубируют в течение 4 дней до заражения в присутствии IL-2.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что первичные клетки размножаются в течение 4 дней до заражения в присутствии облученных питающих клеток.
24. Способ по любому из пп. 20-23, дополнительно включающий размножение модифицированных клеток с использованием облученных питающих клеток, экспрессирующих mbIL-21, после заражения.
25. Способ по любому из пп. 20-24, отличающийся тем, что клетка представляет собой NK-клетку.
26. Способ по любому из пп. 20-25, отличающийся тем, что трансген представляет собой химерный антигенный рецептор для опухолевого антигена.
27. Способ по любому из пп. 20-26, отличающийся тем, что комплекс РНП вводят в клетку посредством электропорации.
28. Способ по любому из пп. 20-27, отличающийся тем, что комплекс РНП вводят в клетку посредством трансфекции; и при этом комплекс РНП кодируется в том же или другом AAV.
29. Способ генетической модификации, по меньшей мере, одной клетки путем гомологически направленной репарации (HDR), включающий:
(a) введение в клетку (i) комплекса рибонуклеопротеидов (РНП), содержащего эндонуклеазу CRISPR/Cas класса 2 в комплексе с направляющей РНК CRISPR/Cas, кодирующей последовательность-мишень в геноме клетки, и (ii) вектор AAV, содержащий плазмиду, содержащую трансген, фланкированный первым и вторым плечами гомологии, каждое из которых имеет длину не более 800 п.н., при этом трансген кодирует химерный антигенный рецептор; и
(b) поддержание клетки в течение времени и в условиях, достаточных для (i) гибридизации комплекса РНП с последовательностью-мишенью и внесения двухцепочечного разрыва (ДЦР) в последовательность-мишень; и (ii) для вставки трансгена в геном клетки в последовательность-мишень и репарации разрыва посредством HDR, тем самым обеспечивая встраивание трансгена в геном клетки на участке ДЦР.
30. Способ по п. 28, отличающийся тем, что клетка представляет собой первичную или размножившуюся клетку.
31. Способ по п. 28 или 29, отличающийся тем, что клетка представляет собой естественный киллер (NK-клетку).
32. Способ по п. 28 или 29, отличающийся тем, что эндонуклеаза CRISPR/Cas класса 2 представляет собой Cas9.
33. Способ по п. 28 или 29, отличающийся тем, что клетка представляет собой первичную клетку, и способ дополнительно включает инкубацию клетки в присутствии IL-2, по меньшей мере, около 4 дней перед этапом (а).
34. Способ по п. 28 или 29, отличающийся тем, что клетка представляет собой первичную клетку, и способ дополнительно включает размножение клетки в течение, по меньшей мере, около 4 дней в присутствии mbIL-21 после этапа (b).
35. Способ по п. 33, отличающийся тем, что mbIL-21 содержат облученные питающие клетки, экспрессирующие mbIL-21, частицы PM21, экзосомы EX21 или любая их комбинация.