Способ предупреждения и подавления интенсификации липопероксидации антиоксидантом глутатионом для улучшения критериев качества эмбрионов и перепелят в условиях промышленного производства
METHOD FOR PREVENTION AND SUPPRESSION INTENSIFICATION OF LIPOPEROXIDATION WITH ANTIOXIDANT GLUTATHIONE TO IMPROVE THE QUALITY CRITERIA OF EMBRYOS AND GROWING QUAILS IN INDUSTRIAL PRODUCTION

Данное изобретение относится к сельскому хозяйству, и в частности, к птицеводству (аэрозольное применение водного раствора восстановленного глутатиона перед инкубацией и перед переводом яиц в выводную тару).
Перепеловодство является сравнительно новой отраслью птицеводства в России. Это обусловлено короткими сроками выращивания перепелов с быстрым получением продукции и окупаемостью затрат [6].
У перепелов множество преимуществ: они обладают небольшими размерами, высокой яичной продуктивностью и коротким периодом инкубации. Мясо перепелов можно относить к диетическим продуктам, т.к. оно содержит множество витаминов и микроэлементов, также в нем много полноценных протеинов, но мало жира (3%) [5]. Кроме того, из-за высокой интенсивности обменных процессов, температура тела перепелов выше на 2°С, чем у других видов сельскохозяйственных птиц. Вследствие чего, они более устойчивы к различным инфекционным заболеваниям [7]. Но, не смотря на все вышеперечисленное, до сих пор в условиях производства, невозможно добиться 100% вывода перепелов (по РФ в среднем 75%) [4]. К тому же, как известно, развитие зародышей птиц осуществляется вне организма матери, из-за чего они особенно подвержены отрицательному воздействию факторов внешней среды, которое провоцирует масштабное развитие широкого спектра свободнорадикальных патологий [4]. При этом факторы стресса даже небольшой силы, выполняющие тренировочную функцию для взрослых организмов, зачастую могут перейти в разряд экстремальных для зародышей.
Стрессовыми воздействиями в промышленной инкубации могут быть: неравномерный прогрев партий яиц в различных зонах инкубатора и в сетке, длительный перенос в выводные шкафы, отсутствие аэроионизации, биоакустатики, задержка в инкубаторе и др.
Эмбрион, который формируется в неблагоприятных условиях, становится особенно уязвимым к действию свободных радикалов, синтез которых возрастает в разы преимущественно из-за нарушения реакций митохондриальной дыхательной цепи [2].
Для коррекции негативных последствий стрессовых воздействий в птицеводстве все чаще используют естественные метаболиты - антиоксиданты, позволяющие нивелировать в организме зародыша возникающие аномалии, обусловленные свободно-радикальной прогрессией и развитием перекисного окисления липидов (ПОЛ).
В данном эксперименте использовали глутатион (GSH) - трипептид γ-глутамилцистеинилглицин - тиол, антиоксидант, который содержится почти во всех эукариотических клетках и у некоторых прокариотов [9]. У млекопитающих он способен синтезироваться в печени, обеспечивающей при физиологических условиях до 90% всего циркулирующего глутатиона (GSH) [13]. Уровень GSH варьирует в зависимости от органов [15, 18]. Самый высокий фиксируют в печени (5-10 мм), затем в почках, селезенке, тонкой кишке, мозге, поджелудочной железе, легких, сердце и мышцах.
Глутатион - главный буфер редокса тиола, который служит для поддержания внутриклеточного гомеостаза. В условиях окислительного стресса глутатион может привести к обратимому образованию смешанных дисульфидов между тиольными группами белка (S-глутатионилирование) для предотвращения необратимого окисления белка [12].
Его главной функцией является инактивация свободных радикалов. Восстановленная форма глутатиона - центральный компонент антиоксидантной системы защиты эритроцитов. Заявленный трипептид обладает защитным действием в отношении репликативной системы клетки [16], выполняет коферментные функции. Известно также, что заявленный биостимулятор может стабилизировать мембранную структуру, перемещение ацилпероксидов, образующихся путем перекисного окисления липидов [11].
Активность связывания ДНК транскрипционных факторов, таких как c-Jun, NF-kB и Fos, модулируется изменением соотношения GSH/GSSG [14]; пониженное соотношение индуцирует S-глутатионилирование остатка цистеина в доменах связывания ДНК, приводящее к ингибированию связывания ДНК. Снижение синтеза GSH останавливает клеточный цикл в фазах S и G2 [17], в то время как пролиферирующие клетки в фазах S и G2 клеточного цикла показали повышенные уровни GSH в ядре. Эти результаты доказывают, что GSH необходим в соответствующий период для пролиферации клеток [14].
Окислительно-восстановительное состояние клеточного тиола также регулирует запрограммированную гибель клеток [14]. Уменьшенное внутриклеточное отношение GSH/GSSG индуцирует потерю антиапоптотического белка Вс1-2, высвобождение цитохрома из митохондрий и активацию каспазы, индуцирующей апоптоз, тогда как увеличенное внутриклеточное отношение GSH / GSSG предотвращает запрограммированную гибель клеток [18].
Все это указывает на высокую значимость заявленного вещества в системе становления биологически полноценного зародыша.
На данный момент нет сведений о двухкратной обработке перепилиных яиц растворами восстановленного глутатиона.
С целью выявления эффективности двукратной обработки восстановленного глутатиона, была осуществлена дополнительная обработка перепелиных яиц водным раствором восстановленного глутатиона аэрозольным методом в диапазоне концентраций от 0,1 до 10% перед переводом в выводную тару. В ряде экспериментов установили, что обработка перепелиных яиц водными растворами восстановленного глутатиона аэрозольным методом - перед инкубацией 2,5% и перед переводом яиц в выводную тару-5%, по ряду критериев превосходит результат однократной обработки яиц. Отдельно следует отметить, что при использовании двукратной схемы применения данного метаболита для экспериментов брали только химически чистый глутатион без дополнительных формообразующих веществ.
В качестве прототипа данного метода взят опыт применения восстановленного глутатиона на инкубационных яйцах перепелов. При использовании оптимальной концентрации (2,5%) раствора глутатиона вывод перепелят опытной партии (79,2%) был выше на 7,6%, чем в контроле (71,6%)[3]. Также в качестве прототипа был выбран опыт по использованию препарата «Полиоксидоний» (антиоксидант, иммуномодулятор, детоксикант) для предынкубационной обработки куриных яиц. При использовании оптимального раствора вывод цыплят опытной партии (82,1%) превосходил контроль (80,1%) на 2% [1].
Задача изобретения - улучшение качества эмбрионов и перепелов в условиях промышленного производства при использовании антиоксиданта глутатиона, путем предупреждения и нивелирования интенсификации процессов липопероксидации.
Технический результат заключается в том, что двукратная обработка инкубационных яиц водным раствором восстановленного глутатиона аэрозольным методом способствовала снижению основных цитотоксичных продуктов липопероксидации - малонового диальдегида (МДА) на 26,2% и оснований Шиффа (ОШ) на 18,6%, при повышении содержания глутатиона в 1,6 раза и антиокислительной активности (АОА) в 1,5 раза. Указанное обусловило повышение качества суточного молодняка, что выразилось в превосходстве опытной группы с двукратной обработкой по критериям «Пасгар» и «Оптистарт» на 0,5 и 0,6 балла соответственно по сравнению с контролем. На пятые сутки этот результат был по 0,5 балла, а на десятые 0,5 и 0,4 балла выше, соответственно, по сравнению с контролем.
Способ осуществляется следующим образом. На поверхность скорлупы за 3-4 часа до начала инкубации яйцо обрабатывают водным раствором восстановленного глутатиона аэрозольным методом в концентрации 2,5%, а при переводе яиц в выводную тару - 5%. Предварительно восстановленный глутатион растворяют и смешивают в дистиллированной воде при 18-22°С.
Пример 1. Эксперимент проводили на трех партиях яиц, одна из которых контрольная и две опытные. При этом первую из них однократно обрабатывали водным раствором восстановленного глутатиона аэрозольным методом концентрацией 2,5%, а вторую - водными растворами восстановленного глутатиона аэрозольным методом в концентрациях: 2,5% перед инкубацией и 5% при переводе яиц в выводную тару. Яйца перепелов японской породы получали от одного родительского стада, сортировали по 250 штук в каждую партию при соблюдении аналогичности массы, время снесения и сроков хранения.
Двукратная обработка водным раствором восстановленного глутатиона аэрозольным методом в оптимальных концентрациях корректирует негативные последствия оксидативного стресса, о чем свидетельствует снижение основных токсичных продуктов липопероксидации - малонового диальдегида (МДА) на 26,2% и оснований Шиффа (ОШ) на 18,6% соответственно, тогда как при однократной обработке эти показатели имели меньшую разницу с контролем: 13,9% и 10,9% соответственно. Заявленный трипептид, проникая в яйцо, оказывает стимулирующие воздействие на антиоксидантную защиту организма, что выразилось в увеличении глутатиона в 1,6 раза и антиоксидантной активности (АОА) в 1,5 раза, соответственно, тогда как при однократной обработке разница также была меньше: 1,3 и 1,2 раза соответственно.
По данным Сурая П. и Фисинина В.И. (2012), интенсивность липопероксидации имеет обратную зависимость с качеством становления органов и тканей молодняка, использованием питательных и минеральных веществ их организмом, терморегуляцией [11]. Таким образом, тенденция, наблюдаемая в таблице 1, очевидно обуславливает условия для получения высоко жизнеспособных и биологически полноценных особей, обладающих спектром преимуществ относительно контрольных особей. Заявленное нашло многократное подтверждение в последующих таблицах.
Пример 2. Данные таблицы 2 указывают на выраженное стимулирующее воздействие глутатиона на эмбриональную жизнеспособность. Заявленное выразилось в том, что вывод перепелят и выводимость яиц достоверно повысились в опытной группе на 9,60% (р<0,05) и 9,25% (р<0,01), соответственно. При этом наибольшее снижение количества отходов инкубации отмечали при двукратной обработке яиц по таким отходам инкубации, как: «кровяные кольца» в 1,5 раза, «замершие» - в 2,2 раза, «задохлики» - в 2 раза, «слабые» - в 1,7 раза относительно контроля. Необходимо отметить, что однократная обработка яиц имела меньший эффект по аналогичным категориям отходов инкубации.
Пример 3. Снижение эндогенной интоксикации продуктами ПОЛ обусловило сохранение целостности и функциональности мембранных структур клеток [10], определяя условия для повышения качества получаемого молодняка суточного возраста. Анализ данных таблицы 3 свидетельствовал о том, что перепелята по критериям «Пасгар» и «Оптистарт» в опытной группе с двукратной обработкой превосходили контроль на 0,5 и 0,6 балла соответственно, тогда как в группе с однократной разница была менее значительной и составила 0,3 и 0,4 балла, соответственно.
При дальнейшем выращивании перепелят было установлено, что по критериям качества опытная группа с двукратной обработкой сохраняла тенденцию к увеличению (таблицы 4, 5), по сравнению с контролем и группой с однократной, что также свидетельствует о более выраженном положительном влиянии первой на качество и интенсивность развития птицы. Так, разница с контролем на пятые сутки составляла по 0,5 балла, а на десятые 0,5 и 0,4 соответственно, тогда как при однократной она была в те же сутки 0,3 и 0,2 и по 0,2 балла соответственно.
Также стоит отметить, что только вылупившиеся перепелята опытной группы с двукратной обработкой яиц лучше реагировали на звук (постукивание). Так, в течение 30 секунд 9 из 10 особей направились к источнику звука, тогда как в контроле этот результат составил -7 из 10.
Пример 4. Известно, что температура тела является показателем качества и здоровья молодняка суточного возраста, при ее снижении прогноз на дальнейшую сохранность не благоприятный. Повышение температуры под крылом на 0,4°С у представителей опытной группы при двукратной обработке инкубационных яиц (против 0,1°С при однократной) также подтверждает улучшение качества перепелов (таблица 6).
Пример 5. По данным Орлова М.В. (1987) скорлупа является главным источником минеральных веществ, необходимых для построения костяка. Во время эмбриогенеза кальций и другие микроэлементы из нее поступают к зародышу, что обуславливает условия, облегчающие проклев и сокращение сроков вывода [8]. Так, в опытной группе с двукратной обработкой толщина скорлупы была меньше на 7,7%, нежели в контроле (против 6,0%) при однократной). Кроме того, при биохимическом исследовании сыворотки крови было выявлено, что содержание общего кальция в организме цыплят суточного возраста опытной группы возросло на 3,1%, магния - на 10,6%, при достоверном увеличении неорганического фосфора- на 9,3% (р<0,05), что также свидетельствует о более эффективном усвоении заявленных элементов из скорлупы яйца [4].
Вывод: Двукратная обработка водным раствором восстановленного глутатиона в оптимальных концентрациях по предложенной схеме определила снижение интенсивности липопероксидации, повлекшее повышение жизнеспособности особей, а также позитивные изменения объективно-субъективных критериев их качества, при повышении температуры тела и лучшем использовании минеральных веществ скорлупы организмом эмбриона, как важнейших характеристик биологической полноценности молодняка.
Литература:
1. Аганичева А.А., Алексеева С.А., Кузнецов О.Ю. Способ повышения эмбриональной и постэмбриональной жизнеспособности цыплят.// Патент РФ №2540533, 2013.-МПК A01K 45/00.
2. Азарнова, Т.О. Научно-практические аспекты профилактики оксидативного стресса, как способа оптимизации условий инкубации и акселерации эмбрионов кур: дис. … доктора биол. наук. / Т.О. Азарнова; МГАВМиБ - М., 2013. - 309 с.
3. Азарнова Т.О. Эффективность реализации антиоксидантного и обменостимулирующего действий глутатиона в промышленном перепеловодстве / Т.О. Азарнова, В.А. Попова, М.С. Найденский, И.С. Луговая, В.А. Комар // Ветеринарный фармакологический вестник. 2020. №3 (12). С. 70-80.
4. Бессарабов Б.Ф. Инкубация яиц сельскохозяйственной птицы / Б.Ф. Бессарабов, А.A. Крыканов, А.Л. Киселев. - Санкт-Петербург [и др.]: Лань, 2015. - 160 с.: ил. (+ вклейка, 16 с.). - (Учебник для вузов. Специальная литература).
5. Бессарабов Б.Ф. Технология производства яиц и мяса птицы на промышленной основе: учебное пособие / Б.Ф. Бессарабов, А.А. Крыканов, Н.П. Могильда. // Санкт-Петербург: Лань, 2012. - 336 с.: ил. - (Учебники для вузов. Специальная литература).
6. Голубов И.И. Развивать отечественное перепеловодство! [Текст] / И.И. Голубов, Г.В. Красноярцев // Птица и птицепродукты. - 2012. - №5. - С. 27-29.
7. Орда М.С. Перепеловодство - перспективная отрасль животноводства. Проблемы патологии / М.С. Орда, Ю.О. Ляднович // Ветеринарный журнал Беларуси. - 2017. - №2. - С. 81-84.
8. Орлов М.В. Биологический контроль в инкубации / М.В. Орлов. - М.: Россельхозиздат, 1987. - 224 с.
9. Смирнов Л.П. Роль глутатиона в функционировании систем антиоксидантной защиты и биотрансформации (обзор) / Л.П. Смирнов, И.В. Суховская // Ученые записки Петрозаводского государственного университета. - 2014 - №6- 34 с.
10. Сурай П. Современные методы борьбы со стрессами в птицеводстве: от антиоксидантов к витагенам / П. Сурай, В.И. Фисинин // Сельскохозяйственная биология. 2012. Т. 47. №4. С. 3-13.
11. Толпыгина О.А. Роль глутатиона в системе антиоксидантной защиты(обзор) / О.А. Толпыгина// ACTA BIOMEDICA SCIENTIFICA / - 2012- №2-2 - 178 с.
12. Ballatori, N., Krance, S.М., Plasma membrane glutathione transporters and their roles in cell physiology and pathophysiology//Mol Aspects Med 30, 2009 -13-28.
13. Deneke S.M., Fanburg B.Y., Regulation of cellular glutathione/Deneke S.M., Fanburg B. Y. // Amer. J. Physiol.- 1989. - Vol. 257. - P. L163-L173.
14. Johnson, W.M., Dysregulation of glutathione homeostasis in neurodegenerative diseases/ Johnson W.M., Wilson-Delfosse A.L., Mieyal J.J.//Nutrients, 2012 Oct 9; 4(10) - 1399-1440.
15. Koji Aoyama, Impaired Glutathione Synthesis in Neurodegeneration/ Koji Aoyama, Toshio Nakaki. -2013: Journal of Molecular Sciences, 14(10), 2013. - 1378-1395 c.
16. Mandal, P.K., Brain oxidative stress: detection and mapping of antioxidant marker 'Glutathione' in different brain regions of healthy male/female, MCI and Alzheimer patients using non-invasive magnetic resonance spectroscopy. / Mandal P.K., Tripathi M., Sugunan S. -: Biochem Biophys Res Commun, 2012. - 43-48.
17. Neal M., Time to get Personal: A Framework for Personalized Targeting of Oxidative Stress in Neurotoxicity and Neurodegenerative Disease/ Neal M., Richardson J.R. // Curr Opin Toxicol. 2018 Feb; 7: 127-132.
18. Niedzielska E., Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases/ Niedzielska E, Smaga I, Gawlik M, Moniczewski A, Stankowicz P, Pera J, Filip M. // Mol Neurobiol. 53(6), 2016 - 4094-4125.