СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НУЖНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И СООТВЕТСТВУЮЩАЯ УСТАНОВКА
METHOD FOR CULTIVATION OF THE NECESSARY MICROORGANISMS AND THE CORRESPONDING INSTALLATION

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к области наращивания биомассы микроорганизмов путем культивирования в автотрофном и гетеротрофном режиме.
В частности, данное изобретение относится к способу культивирования по меньшей мере одного нужного микроорганизма в гетеротрофном или миксотрофном режиме и к установке для культивирования, специально приспособленной для применения указанного способа культивирования.
Предшествующий уровень техники
Гетеротрофией называют тип питания, при котором живому организму требуются уже готовые органические вещества. Гетеротрофный тип питания противоположен автотрофному, при котором живой организм усваивает неорганические вещества при наличии внешнего источника энергии, например солнечного света (фотоавтотрофия).
Миксотрофией называют тип питания, при котором живой организм способен питаться автотрофно либо гетеротрофно, либо обоими путями одновременно, или же путем примитивного бактериального фотосинтеза.
В тех случаях, когда нужно получать чистый штамм микроорганизмов, гетеротрофный или миксотрофный режимы в открытом культивировании не применяются. В самом деле, в открытой системе может происходить загрязнение культуры различными другими микроорганизмами, что влияет на эффективность использования сырья процесса культивирования, поскольку загрязняющие микроорганизмы (контаминанты) потребляют питательные вещества, предназначенные для нужного микроорганизма. Эти микроорганизмы-контаминанты просто в силу своего значительного присутствия влияют и на ожидаемое качество конечного продукта (биомассу нужного микроорганизма).
Риск загрязнения культур микроорганизмов в настоящее время ограничивается благодаря технологическим мерам предосторожности и стерилизации оборудования. Однако вложения и эксплуатационные расходы с целью осуществлять культивирование в асептических условиях весьма значительны и впрямую повышают стоимость производства нужных микроорганизмов или продуктов их обмена веществ.
Следовательно, было бы предпочтительно найти возможности производства нужных микроорганизмов в промышленных масштабах с приемлемым выходом при культивировании в открытой или закрытой системе безотносительно к условиям стерилизации культуральной среды и оборудования.
Осуществление изобретения
В свете сказанного выше в первом своем аспекте данное изобретение относится к способу культивирования по меньшей мере одного нужного микроорганизма в гетеротрофном или миксотрофном режиме в водной культуральной среде, причем микроорганизмы-контаминанты естественным образом развивающиеся в указанной культуральной среде, и этот способ отличается тем, что включает:
- этап забора порции культуральной среды, содержащей нужный микроорганизм и микроорганизмы-контаминанты;
- этап физического отделения нужных микроорганизмов от микроорганизмов-контаминантов в указанной порции культуральной среды;
- этап лизиса физически отделенных микроорганизмов-контаминантов с образованием лизата;
- этап введения указанного лизата обратно в культуральную среду.
Термин «культуральная среда» означает в данный момент времени среду, включающую питательные вещества, обеспечивающие развитие нужных микроорганизмов и микроорганизмов-контаминантов.
Слово «порция» в данном контексте означает объем, забранный в единицу времени, например за сутки или за час. В этом смысле слово «порция» можно рассматривать как суточный или часовой расход культуральной среды - объем культуральной среды, собираемый за сутки или за час соответственно. Этот объем, предпочтительно суточный, равен одному объему культуральной среды в данный момент или превышает его и предпочтительно равен трехкратному объему культуральной среды или превышает эту величину. Более предпочтительно собираемая порция соответствует объему, собираемому за час, который равен 1/24-й части суммарного объема культуральной среды или превышает эту величину.
Этот объем культуральной среды, собираемый за сутки, позволяет поддерживать такое количество нужных микроорганизмов и микроорганизмов-контаминантов, которое удовлетворяет должному действию способа по данному изобретению.
Способ культивирования по данному изобретению обладает тем преимуществом, что позволяет культивировать нужные микроорганизмы в открытой или закрытой системе без влияния на выход нужных микроорганизмов, поскольку микроорганизмы-контаминанты, которые обычно мешают культивированию в открытой системе, оказываются полезными для развития нужных микроорганизмов. Ведь лизат микроорганизмов-контаминантов представляет собой доступный источник питательных веществ для нужных микроорганизмов, в частности источник органического углерода. Применение способа по данному изобретению при культивировании в открытой системе сводит к минимуму вложения и эксплуатационные расходы, поскольку асептические условия не требуются.
По одному из предпочтительных воплощений данного изобретения оно отвечает следующим признакам по отдельности или во всех технически осуществимых их комбинациях.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения этап физического разделения включает этап гравитационной фильтрации или сепарации, в результате которого получают по отдельности, с одной стороны, нужный микроорганизм, а с другой стороны – микроорганизмы-контаминанты.
По одному из конкретных воплощений данного изобретения нужный микроорганизм, отделенный на этапе разделения, вносят вновь в культуральную среду, сам по себе или же в смеси с лизатом микроорганизмов-контаминантов.
По одному из конкретных воплощений данного изобретения водная культуральная среда исходно не содержит органического углерода.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения, в котором культивирование происходит в миксотрофном режиме и водная культуральная среда исходно не содержит органического кислорода, перед этапом забора порции культуральной среды нужный микроорганизм в течение некоторого времени (t) остается в автотрофной культуре.
5
5
Предпочтительно время t подбирают так, чтобы концентрация нужного микроорганизма в культуральной среде составляла от 5х10клеток/мл до 1 х10клеток/мл. Также культивирование в автотрофном режиме в течение времени t предпочтительно позволяет определить точное физиологическое состояние нужного микроорганизма и получить референсные значения показателей его клеточного роста.
Смена автотрофного режима культивирования на миксотрофный осуществляется путем смешивания лизата микроорганизмов-контаминантов с нужным микроорганизмом; при этом указанный лизат служит источником питания для нужного микроорганизма, а именно дает органический углерод. Гетеротрофный режим устанавливается этапом появления в культуральной среде органического углерода из другого источника (не лизата микроорганизмов-контаминантов).
Соответственно, по одному из конкретных воплощений данного изобретения предлагаемый способ включает этап подачи органического углерода в культуральную среду. Обеспечение органическим углеродом может происходить путем непосредственного добавления его источника в культуральную среду; в лизат; к нужному микроорганизму, отделенному физическими методами; в смесь разделенных лизата и нужного микроорганизма; или путем комбинирования указанных вариантов.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения предлагаемый способ культивирования включает этап концентрирования микроорганизмов-контаминантов, отделенных на этапе физического разделения. Этап концентрирования микроорганизмов-контаминантов дает то преимущество, что становится возможным лизис большего количества этих микроорганизмов на этапе лизиса.
В примере одного из конкретных воплощений данного изобретения этап концентрирования включает этап гравитационной фильтрации или сепарации с тем, чтобы получить по отдельности, с одной стороны, концентрированные микроорганизмы-контаминанты и, с другой стороны, культуральную среду, не содержащую микроорганизмов-контаминантов. Это позволяет повторно использовать культуральную среду, не содержащую микроорганизмов-контаминантов. Также это в особенности снижает стоимость лизиса благодаря тому, что в результате концентрирования уменьшается объем, занимаемый микроорганизмами–контаминантами.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения культуральная среда включает несколько разных нужных микроорганизмов, причем способ по данному изобретению включает перед этапом физического разделения еще этап выделения определенного нужного микроорганизма или ряда различных нужных микроорганизмов из указанной забираемой порции, и таким образом, когда данная порция подвергается физическому разделению, она содержит только этот определенный нужный микроорганизм (или ряд нужных микроорганизмов).
По одному из конкретных воплощений данного изобретения предлагаемый способ культивирования включает повторение цикла, состоящего из ряда этапов. В примере одного из воплощений данного изобретения предлагаемый способ включает повторение цикла, состоящего по меньшей мере из этапов забора порции культуры, ее физического разделения, лизиса и внесения обратно в культуральную среду. Предпочтительно указанный повторяющийся цикл включает также этап концентрирования и/или этап внесения источника органического углерода.
Благодаря сочетанию различных режимов питания в повторяющемся цикле способ культивирования по данному изобретению можно охарактеризовать как способ культивирования по меньшей мере одного нужного микроорганизма в циклотрофном режиме.
По примеру одного из предпочтительных воплощений данного изобретения указанный по меньшей мере один нужный микроорганизм является цианобактерией Aphanizomenon flos-aquae (AFA).
Во втором своем аспекте данное изобретение относится к установке для культивирования по меньшей мере одного нужного микроорганизма в гетеротрофном или миксотрофном режиме, включающей:
- по меньшей мере один открытый или закрытый культуральный отсек, пригодный для вмещения водной культуральной среды, содержащей по меньшей мере один нужный микроорганизм и микроорганизмы-контаминанты ;
- по меньшей мере одно разделяющее устройство, пригодное для осуществления по меньшей мере одного варианта физического отделения нужного микроорганизма от микроорганизмов-контаминантов в данной порции культуральной среды;
- устройство для лизиса, пригодное для осуществления лизиса физически отделенных микроорганизмов-контаминантов с образованием лизата;
- средства транспортировки, пригодные по меньшей мере для
- забора порции культуральной среды, содержащей нужный микроорганизм и микроорганизмы-контаминанты;;
- внесения указанного лизата обратно в культуральный отсек.
Конкретные преимущества, задачи и признаки установки по данному изобретению, будучи сходными с таковыми способа по данному изобретению, в настоящем документе отдельно не описываются.
По своим предпочтительным воплощениям данное изобретение также соответствует следующим признакам, взятым по отдельности или в любом из технически возможных их сочетаний.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения средства транспортировки пригодны для объединения лизата с нужным микроорганизмом, выделенным физическими методами, в результате чего образуется смесь, и для внесения указанной смеси в культуральный отсек.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения средства транспортировки также пригодны для внесения органического углерода в культуральную среду прямо в культуральном отсеке, в лизат, в смесь лизата и выделенного нужного микроорганизма или в нужный микроорганизм, выделенный физическими методами. Этот органический углерод берется из источника, отличного от лизата микроорганизмов-контаминантов.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения установка для культивирования включает по меньшей мере одну систему для концентрирования, пригодную для того, чтобы сконцентрировать физически отделенные микроорганизмы-контаминанты.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения средства транспортировки включают следующие средства:
- для создания первого потока - культуральной среды, содержащей нужный микроорганизм и микроорганизмы-контаминанты, из культурального отсека к разделяющему устройству;
- для создания второго потока - нужного микроорганизма из разделяющего устройства;
- для создания третьего потока – микроорганизмов-контаминантов из разделяющего устройства в систему для концентрирования;
- для создания четвертого потока – концентрированных микроорганизмов-контаминантов из системы для концентрирования в устройство для лизиса;
- для создания пятого потока - культуральной среды, не содержащей более микроорганизмов–контаминантов, из системы для концентрирования в культуральный отсек;
- для создания шестого потока – лизата из устройства для лизиса в культуральный отсек;
- для создания седьмого потока – органического углерода из содержащей его емкости;
- для объединения второго, шестого и седьмого потоков с образованием восьмого единого потока в культуральный отсек.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения, установка для культивирования включает устройство для отвода микроорганизмов-контаминантов. Предпочтительно оно состоит из устройства для отвода концентрированных микроорганизмов-контаминантов.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения установка для культивирования включает устройство для отвода культуральной среды, не содержащей микроорганизмов-контаминантов и нужного микроорганизма.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения установка для культивирования включает устройство для сбора нужного микроорганизма.
Описание фигур
Данное изобретение станет понятнее по прочтении нижеследующего описания, приведенного в качестве примера, не имеющего ограничительного характера и иллюстрируемого фигурами, которые представляют:
- Фигура 1 схематически изображает этапы способа по данному изобретению по его воплощениям.
- Фигура 2 изображает схему установки для культивирования по одному из воплощений данного изобретения.
- Фигура 3 - график изменения массовой концентрации Aphanizomenon flos-aquae (AFA) во времени в культуральной среде по одному из воплощений способа по данному изобретению в автотрофном или миксотрофном режиме с внесением лизата в различных концентрациях.
Осуществление изобретения
Следует отметить, что фигуры в настоящем документе выполнены без соблюдения масштаба.
Вообще говоря, объем данного изобретения не ограничивается теми его воплощениями и конкретными вариантами осуществления, которые описаны в настоящем документе на примерах, не имеющих ограничительного характера. Напротив, в этот объем входят любые модификации, ясные специалистам в данной области техники. Всякий признак любого воплощения данного изобретения может быть предпочтительно воплощен отдельно или в сочетании с любым другим признаком любого другого воплощения.
Фигура 1 иллюстрирует способ 20 по одному из конкретных воплощений данного изобретения для автотрофного или миксотрофного культивирования по меньшей мере одного нужного микроорганизма в водной культуральной среде, содержащей микроорганизмы-контаминанты, естественным образом развивающиеся в этой среде. Этот способ включает этап 21 забора порции культуральной среды, содержащей нужный микроорганизм и микроорганизмы-контаминанты. Предпочтительно способ 20 осуществляется в миксотрофном режиме, причем водная культуральная среда исходно не содержит органического углерода, и перед этапом 21 нужный микроорганизм питается автотрофно в течение времени t.
Способ 20 включает этап 22 физического разделения нужного микроорганизма и микроорганизмов-контаминантов в данной порции культуральной среды.
Осуществление этапа физического разделения 22 основывается на морфологических или фенотипических различиях между нужным микроорганизмом и микроорганизмами-контаминантами. Например, они могут различаться по размерам, форме, свойствам поверхности, плотности, способности к агрегации или флокуляции.
В примере одного из воплощений данного изобретения этап физического разделения 22 включает этап гравитационной фильтрации или сепарации, в результате чего получаются по отдельности, с одной стороны, концентрированные микроорганизмы-контаминанты, а с другой стороны – питательная среда. Примерами фильтрации по одному из предпочтительных воплощений данного изобретения является тангенциальная или тупиковая фильтрация. Фильтрация осуществляется с использованием мембранных фильтров.
Способ 20 при необходимости включает также этап 23 концентрирования микроорганизмов-контаминантов, отделенных на этапе 22.
Этап концентрирования микроорганизмов-контаминантов 23, который проводится при необходимости, основывается на морфологических или фенотипических признаках микроорганизмов-контаминантов, например на их размерах, форме, свойствах поверхности, плотности, способности к агрегации или флокуляции.
По одному из предпочтительных воплощений данного изобретения этап концентрирования микроорганизмов-контаминантов 23 включает этап гравитационной фильтрации или сепарации, в результате чего получаются по отдельности, с одной стороны, концентрированные микроорганизмы-контаминанты и, с другой стороны – культуральная среда, не содержащая микроорганизмов-контаминантов. Что касается физического разделения, то в одном из конкретных воплощений данного изобретения применяется, например, тангенциальная или тупиковая фильтрация, которая осуществляется, в частности, с использованием мембранного фильтра.
Способ 20 включает этап 24 лизиса микроорганизмов-контаминантов, отделенных путем физического разделения; в результате этого этапа образуется лизат. Этот лизат предпочтительно предоставляет питательные вещества, доступные для нужного микроорганизма, в частности органический углерод. В одном из конкретных воплощений данного изобретения этап лизиса 24 заключается в химическом, и/или термическом, и/или механическом лизисе микроорганизмов-контаминантов.
Способ 20 включает также этап 25 внесения указанного лизата в культуральную среду.
По одному из предпочтительных воплощений данного изобретения этап 25 осуществляется таким образом. что лизат микроорганизмов-контаминантов вносится в культуральную среду в смеси с нужным микроорганизмом, отделенным на этапе физического разделения 22.
Наконец, способ 20 включает при необходимости этап 26, а именно внесение органического углерода в культуральную среду. Источником этого органического углерода не является лизат микроорганизмов-контаминантов. На этапе 26 в культуральную среду включается органический углерод в дополнение к питательным веществам (в том числе органическому углероду), имеющимся в составе лизата микроорганизмов-контаминантов.
Предпочтительно этап 26 включения дополнительного органического углерода в культуральную среду осуществляется путем внесения указанного органического углерода в смесь лизата и нужного микроорганизма, или в лизат, или в нужный микроорганизм, отделенный на этапе физического разделения 22, или непосредственно в водную культуральную среду.
По одному из предпочтительных воплощений данного изобретения предлагаемый способ включает повторение цикла из этапов 21-26, причем этапы 23 и 26 осуществляют при необходимости.
По одному из примеров воплощения данного изобретения, в котором предлагаемый способ культивирования происходит в гетеротрофном режиме, этап 26, на котором вносится дополнительный органический углерод, осуществляется в цикле C1 из этапов 21-25 после осуществления цикла С1 по меньшей мере один раз; таким образом, начиная с этого момента цикл C2 из этапов 21-26 повторяют столько раз, сколько нужно.
По одному из примеров воплощения данного изобретения, в котором способ культивирования 20 происходит в миксотрофном режиме, водная культуральная среда исходно не содержит органического углерода, и нужный микроорганизм растет автотрофно в течение времени t до этапа 21, а этап 26, на котором вносится дополнительный органический углерод, осуществляется начиная с выполнения первого цикла этапов 21-15 до этапа забора порции культуры 21; таким образом способ 20 начинается с цикла С2, причем указанный этап 26 осуществляется путем внесения дополнительного органического углерода непосредственно в водную культуральную среду по меньшей мере в первом цикле С2.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения способ культивирования 20 включает этап (на фигурах он не показан) осветления лизата, полученного на этапе лизиса 24, концентрирования лизата и/или подведения в нем рН, что осуществляется до этапа 25.
На фиг.2 изображена установка 27 для культивирования по меньшей мере одного нужного микроорганизма 28 в гетеротрофном или миксотрофном режиме. Предпочтительно эту установку не нужно держать в асептических условиях ни до, ни во время ее использования для культивирования.
Установка 27 включает открытый или закрытый культуральный отсек 29, который вмещает водную культуральную среду 30, указанный по меньшей мере один нужный микроорганизм 28 и микроорганизмы-контаминанты 32.
Установка 27 также включает по меньшей мере одно разделяющее устройство 33, в котором осуществляется отделение по меньшей мере одним физическим методом нужного микроорганизма 28 от микроорганизмов-контаминантов 32 в порции культуральной среды 30.
Установка 27 включает устройство для лизиса 34, в котором осуществляется лизис микроорганизмов-контаминантов 32, отделенных для получения лизата 35.
По одному из конкретных воплощений данного изобретения предлагаемая установка включает по меньшей мере одну систему концентрирования 36, чтобы осуществлять концентрирование отделенных микроорганизмов-контаминантов 32 перед их лизисом.
Установка 27 включает средства транспортировки для
- забора порции культуральной среды 30, содержащей нужный микроорганизм 28 и микроорганизмы-контаминанты 32;
- введения лизата 35 в культуральный отсек 29.
Предпочтительно средства транспортировки также служат для объединения лизата 35 с отделенным нужным микроорганизмом 28, в результате чего образуется смесь, и для введения указанной смеси в культуральный отсек 29.
Предпочтительно средства транспортировки служат для добавления органического углерода к культуральной среде 30 непосредственно в культуральном отсеке 29, или к лизату 35, или к физически отделенному нужному микроорганизму 28, или к смеси лизата 35 и нужного микроорганизма 28, или к комбинации по меньшей мере двух из указанных компонентов.
По одному из конкретных воплощений данного изобретения средства транспортировки включают средства для
- создания первого потока 37 культуральной среды 30, содержащей нужный микроорганизм 28 и микроорганизмы-контаминанты 32, из культурального отсека 29 в разделяющее устройство 33;
- создания второго потока 38 нужного микроорганизма 28 из разделяющего устройства 33;
- создания третьего потока 39 микроорганизмов-контаминантов 32, выходящего из разделяющего устройства 33 и поступающего в систему концентрирования 36;
- создания четвертого потока 40 концентрированных микроорганизмов-контаминантов 32 из системы концентрирования 36 в устройство для лизиса 34;
- создания пятого потока 41 культуральной среды 30, не содержащей микроорганизмов-контаминантов, из системы концентрирования 36 в культуральный отсек 29;
- создания шестого потока 42 лизата 35 из устройства для лизиса 34 в культуральный отсек 29;
- создания седьмого потока 43 органического углерода;
- объединения второго потока 38, шестого потока 42 и седьмого потока 43, в результате чего образуется единый восьмой поток 44 в культуральный отсек 29.
По одному из конкретных воплощений данного изобретения установка 27 включает емкость с органическим углеродом 45. Седьмой поток 43 предпочтительно выходит из емкости с органическим углеродом 45.
Пятый поток 41 предпочтительно не содержит нужных микроорганизмов.
По одному из конкретных воплощений данного изобретения средства для создания различных потоков включают по меньшей мере один двигатель и/или насос (на фигурах они не показаны).
По одному из конкретных воплощений данного изобретения установка 27 включает первое устройство 46 для отвода микроорганизмов-контаминантов 32, второе устройство 47 для отвода культуральной среды 30, не содержащей нужных микроорганизмов и микроорганизмов-контаминантов, и устройство 48 для сбора нужного микроорганизма 28.
Способ 20 для культивирования по меньшей мере одного нужного микроорганизма 28 в гетеротрофном или миксотрофном режиме подробно описан далее в настоящем документе согласно одному из его воплощений, в котором установка 27 используется конкретным образом по одному из воплощений указанного способа.
Вначале водную культуральную среду 30 и нужный микроорганизм 28 вносят в культуральный отсек 29. Предпочтительно нужный микроорганизм 28 пребывает в культуре в автотрофном режиме в течение времени t.
Затем вводят органический углерод непосредственно в культуральный отсек 29 согласно этапу 26 через седьмой поток 43 из емкости 45. С этого момента режим культивирования изменяется: культура становится миксотрофной и в культуральной среде 30 развиваются микроорганизмы-контаминанты вместе с нужным микроорганизмом 28.
На этапе 21 собирают порцию культуральной среды 30, содержащую нужный микроорганизм 28 и микроорганизмы-контаминанты 32; это происходит путем создания первого потока 37 культуральной среды 30 из культурального отсека 29 в разделяющее устройство 33.
В разделяющем устройстве 33 осуществляется этап 22 физического разделения нужного микроорганизма 28 и микроорганизмов-контаминантов 32 в собранной порции культуральной среды 30. Предпочтительно этап 22 осуществляется путем тангенциальной фильтрации через мембранный фильтр.
После этапа физического разделения 22, создается второй поток 38 нужного микроорганизма 28, выходящий из разделяющего устройства 33, а также третий поток 39 микроорганизмов-контаминантов 32 из разделяющего устройства в систему концентрирования 36.
В системе концентрирования 36, при необходимости осуществляется этап 23 концентрирования микроорганизмов-контаминантов 32, отделенных на этапе 22 Предпочтительно этап 23 осуществляется путем тангенциальной фильтрации через мембранный фильтр. Этап 23 можно рассматривать как второе физическое разделение для отделения, с одной стороны, концентрированных микроорганизмов-контаминантов 32 и, с другой стороны, культуральной среды 30, не содержащей микроорганизмов-контаминантов 32 и нужного микроорганизма 28.
После этапа 23 создаются четвертый поток 40 концентрированных микроорганизмов-контаминантов 32 из системы концентрирования 36 в устройство для лизиса 34 и пятый поток 41 культуральной среды 30, не содержащей микроорганизмов-контаминантов 32 и нужного микроорганизма 28, из системы концентрации 36 в культуральный отсек 29.
Затем проводят этап 24 лизиса отделенных и концентрированных микроорганизмов-контаминантов 32 в устройстве для лизиса 34, в результате чего получается лизат 35.
В воплощении данного изобретения, в котором этапа концентрирования 23 нет, третий поток 39 направляется прямо в устройство для лизиса 34. В таком воплощении изобретения этапу лизиса 24 подвергаются отделенные микроорганизмы-контаминанты 32, поступающие непосредственно из разделяющего устройства 33 по третьему потоку 39.
Затем на этапе 25 лизат 35 шестым потоком 42 вводится в культуральную среду 30 в культуральный отсек 29. Предпочтительно второй поток 38 нужного микроорганизма 28 и шестой поток 42 лизата 35 объединяются, так что получается смесь, поступающая в отсек 29.
Этот цикл С2 способа культивирования по данному изобретению может повторяться несколько раз.
После первого цикла С2 на этапе 26 каждого из последующих циклов С2 седьмой поток 43 органического углерода из содержащей его емкости 45 предпочтительно объединяется со вторым потоком 38 и шестым потоком 42, так что образуется единый восьмой поток 44, которым смесь поступает в отсек 29.
Пример культивирования Aphanizomenon flos-aquae (AFA)
в миксотрофном режиме в открытой среде
Микроорганизмы
В этом эксперименте нужным микроорганизмом 28 был изолированный штамм цианобактерий Aphanizomenon flos-aquae (AFA), представляющих промышленный и коммерческий интерес.
В качестве микроорганизмов-контаминантов 32 использовали смесь пяти штаммов бацилл с различными морфологическими и фенотипическими признаками. Эта смесь представляла собой жидкий препарат сконцентрированных живых бактериальных клеток. Можно также использовать, например, раствор, имеющийся в продаже под названием "Bactilit™" (производство компании CG PACKAGING).
Для упрощения способа по данному изобретению микроорганизмы-контаминанты 32 исходно вносили в культуру цианобактерий из расчета одна клетка нужного микроорганизма 28 на одну клетку микроорганизма-контаминанта 32. При этом трихом (нить) независимо от своего размера считался как одна клетка.
Культуральные среды
Использовали культуральную среду BG11 (подробный состав приведен в таблицах A-D); при автотрофном режиме эту среду брали как таковую, при миксотрофном режиме в нее добавляли сывороточный порошок в конечной концентрации 4,5 г/л.
Условия культивирования
Культуру Aphanizomenon flos-aquae (AFA) выращивали в помещении с кондиционированием воздуха и регулируемой температурой, которую поддерживали 25±1°C. Культуральный отсек 29, изготовленный из боросиликатного стекла (общий объем 250 мл; объем культуры 200 мл; эффективная высота 70 мм; эффективный диаметр 60 мм) был снабжен устройством для перемешивания (съемная лопастная пропеллерная мешалка; диаметр 30 мм; скорость вращения 60 об/мин).
/
2
Для освещения использовали светодиодную панель (излучение в диапазоне для фотосинтеза; освещенность на внешней стенке реакционного сосуда 200 мкмоль/см).
5
6
Плотность посева составляла 5х10 и 1х10 клеток/мл.
Отдельные операции и рабочие условия при физическом отделении нужного микроорганизма от микроорганизмов-контаминантов и при концентрировании микроорганизмов-контаминантов
При физическом отделении Aphanizomenon flos-aquae от смеси различных видов бацилл, служившей моделью микроорганизмов-контаминантов, делается первая тангенциальная фильтрация через мембранный фильтр.
При концентрировании модели микроорганизмов-контаминантов делается второе физическое разделение – указанные микроорганизмы-контаминанты отделяются от культуральной среды BG11 путем второй тангенциальной фильтрации через мембранный фильтр.
При первой фильтрации используется мембранный фильтр с порами размером 5 мкм. При первой фильтрации можно использовать мембранные фильтры с порами размером от 0,65 мкм до 20 мкм, предпочтительно от 1,2 мкм до 20 мкм, предпочтительно от 3 мкм до 20 мкм, более предпочтительно от 5 мкм до 20 мкм.
При второй фильтрации используется мембранный фильтр с порами размером 0,2 мкм. При второй фильтрации порог отсечения по размеру частиц может быть менее 5 мкм, предпочтительно менее 3 мкм, предпочтительно менее 1,2 мкм, предпочтительно менее 0,65 мкм, предпочтительно менее 0,2 мкм.
Объемная скорость фильтрации при первой тангенциальной фильтрации (то есть скорость забора порции культуральной среды) берется предпочтительно равной одному объему установки для культивирования 27 в сутки или превышающей эту величину, предпочтительно равной трехкратному объему установки 27 в сутки или превышающей эту величину.
Линейная скорость потока при первой тангенциальной фильтрации составляет предпочтительно 2,1 м/с или меньше, предпочтительно 0,7 м/с или меньше.
Отдельные операции и рабочие условия при лизисе микроорганизмов-контаминантов
Лизис микроорганизмов-контаминантов осуществляли путем тепловой обработки в щелочной среде. К раствору концентрированных микроорганизмов-контаминантов добавляли раствор соды (5 н) до конечной концентрации 0,1 н. Полученный раствор держали в течение 10 минут при температуре 70°C, после чего остужали.
Полученные результаты
В способе культивирования по данному изобретению перед этапом забора 21 порции культуральной среды нужный микроорганизм пребывает в культуре в автотрофном режиме в культуральной среде 30 в течение времени t для подтверждения должного физиологического состояния микроорганизма и определения референсных значений показателей роста культуры. По истечении времени t делается переход к циклическому процессу соответственно циклу С2 с этапом 26 (внесение органического углерода) и этапом 23 (концентрирование).
Как показали наблюдения, при автотрофном режиме нужный микроорганизм проходит первую (соответствующую экспоненциальной) фазу роста продолжительностью 100 часов, а затем, между 100-м и 600-м часом имеет место фаза линейного роста. После 600-го часа наблюдается замедление роста. Такая картина обычно характерна для несбалансированного роста культуры, то есть в тех случаях, когда факторы внешней среды становятся ограничивающими. Под факторами внешней среды имеются в виду факторы питания (наличие субстрата, продукты метаболизма) или физико-химические факторы. Резонно полагать, что по достижении определенной плотности культуры ограничивающим фактором становится световая энергия (эффект самозатенения).
Применяя линейную регрессию, можно вывести примерное уравнение скорости роста культуры микроорганизмов, а именно: y = 0,002x + 0,4453.
Также возможно оценить объемную производительность нужного микроорганизма путем измерений его массовой концентрации.
Концентрацию клеток в культуре определяют путем измерения поглощения света жидким образцом. Поглощение среды измеряют с помощью спектрофотометра на длине волны 600 нм. Получаемая величина поглощения (или оптическая плотность) считается прямо пропорциональной концентрации (закон Ламберта-Бера: Abs = ε.l.C), что справедливо в области значений оптической плотности 0,1-0,4. Чтобы оставаться в этом диапазоне, делают разведения культуры.
Определяют также массовую концентрацию клеток, измеряя содержание взвешенных веществ (SS). Концентрация взвешенных веществ ([SS]) оценивается путем определения сухой массы известного объема суспензии клеток. Суспензию клеток пропускают через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (Ø=4,7 cм), который предварительно высушивают при температуре 60°C и давлении 200 мм рт. ст. в течение 24 часов и взвешивают. После фильтрования мембранный фильтр и осевшие на нем клетки высушивают в таких же условиях и взвешивают. Разница масс относительно объема позволяет определить концентрацию взвешенных веществ в профильтрованной суспензии.
g
X
Рост культуры микроорганизмов оценивают по времени удвоения количества клеток в культуре (или времени генерации t) и по объемной продуктивности (r).
max
x
-3
Показателями автотрофного роста Aphanizomenon flos-aquae являются максимальная концентрация взвешенных веществ ([SS]), равная 0,75 г/л и максимальная объемная продуктивность (r max), равная 26х10 г/л/ч.
Когда способ по данному изобретению осуществляется в миксотрофном режиме, то есть когда первый цикл С2 начинается с этапа 26 внесения органического углерода в культуральную среду, наблюдается прирост продуктивности, хотя часть внесенного органического углерода потребляется микроорганизмами-контаминантами. Внесение в культуру лизата микроорганизмов-контаминантов дает ей высоко доступный органический углерод, и некоторое количество исходного органического углерода, потребленного микроорганизмами-контаминантами, используется повторно.
Расчет повышения продуктивности при культивировании Aphanizomenon flos-aquae способом по данному изобретению в миксотрофном режиме
Регистрировали массовую концентрацию Aphanizomenon flos-aquae во времени (каждый час на протяжении 150 часов) в культуральной среде BG11 без добавок (автотрофный режим – контроль). Параллельно регистрировали массовую концентрацию Aphanizomenon flos-aquae во времени в культуральной среде BG11 при осуществлении способа по данному изобретению в миксотрофном режиме, причем этап внесения лизата микроорганизмов-контаминантов в культуральную среду проводили при различных концентрациях лизата (0,1 г/л, или 1 г/л, или 5 Г/л).
Изменение массовой концентрации Aphanizomenon flos-aquae во времени демонстрируется графиком, представленным на фиг. 3.
Полученные результаты свидетельствуют, что благодаря добавлению лизата увеличиваются продуктивность и максимальная концентрация Aphanizomenon flos-aquae в культуре. Этот эффект тем более выражен, чем выше концентрация лизата в диапазоне 0,1-5 г/л.
Стехиометрический анализ показывает, что добавление лизата в концентрации 5 г/л (что соответствует 165 мг органического углерода на 1 л) позволяет повысить максимальный титр Aphanizomenon flos-aquae на 111 мг/л. Это эквивалентно выходу нужного микроорганизма в гетеротрофном режиме 0,6 г AFA на 1 г органического углерода в виде лизата
Кинетический анализ показывает, что при внесении в культуральную среду лизата в концентрации 5 г/л продуктивность за 29 часов культивирования Aphanizomenon flos-aqu возрастает с 26, 4 мг/л/ч до 91,2 мг/л/ч, то есть прирост составляет +340%.