Синтез фрагментов субъединицы PB1 РНК-полимеразы вирусов гриппа а

О. В. Матусевич, И. А. Глуздиков, М. И. Титов

СИНТЕЗ ФРАГМЕНТОВ СУБЪЕДИНИЦЫ PB1 РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ВИРУСОВ ГРИППА А

Введение. Ограниченность выбора противовирусных препаратов является причиной низкой эффективности лечения острых и хронических вирусных инфекций [1]. Основным недостатком большинства современных противовирусных препаратов является невысокий уровень их специфичности — направленности на вирус-специфическую мишень [2].

РНК-зависимая РНК-полимераза вируса гриппа А состоит из трёх субъединиц: РА, РВ1 и РВ2. Субъединица РВ1 является ключевым в функциональном отношении компонентом полимеразного комплекса, так как содержит активный центр, а также два различных домена, взаимодействующих с субъединицами РВ2 и РА [4]. Структурная самосборка РНК-полимеразы осуществляется путём межмолекулярного взаимодействия по этим доменам.

Значительные возможности в разработке лекарственных препаратов связаны с конструированием пептидов, гомологичных функционально значимым доменам вирус-спе-цифических белков [3]. Представляемая работа посвящена синтезу пептидов — потенциальных ингибиторов РНК-полимеразы вирусов гриппа А. Их действие основано на конкурентном ингибировании образования комплекса вирусной РНК-полимеразы.

Выбор пептидов для синтеза был осуществлён сотрудниками ФГБУ НИИ Гриппа Минздравсоцразвития РФ (Санкт-Петербург) из аминокислотной последовательности белка РВ1 двух штаммов вируса гриппа А: Гонконгского изолята, родоначальника вспышки птичьего гриппа в мире (1997), а также Калифорнийского изолята свиного гриппа 2009 г. на основании данных о третичной структуре комплекса РНК-полимеразы и экспериментов т вШею по симуляции молекулярной динамики.

Экспериментальная часть. Синтез пептидов проводили твердофазным методом на 2-С1-тритилхлоридной смоле (ёмкость смолы 1,55 ммоль/г) по Fmoc-/t-Bu-стратегии с использованием как стандартных методик последовательного наращивания цепи, так и конвергентного подхода.

В реакциях последовательного наращивания пептидной цепи в качестве конденсирующих агентов использовали N N '-диизопропилкарбодиимид ^Ю) и 1-гидрокси-бен-зотриазол (НОВ^ (избытки 20 мол. % относительно активируемых аминокислот), реакции проводили в диметилформамиде (DMF). В реакциях использовали 2-3-кратные избытки защищённых аминокислот, продолжительность протекания реакций варьировалась от 1 до 48 ч. Для фрагментных конденсаций наряду с указанными реагентами использовались также 1-гидрокси-7-аза-бензотриазол (НОА^ и ^метилпирролидон ^МР).

Полноту протекания реакций оценивали с помощью теста Кайзера на свободные аминогруппы. В случае завершения реакции (отрицательный тест Кайзера) для последующих операций смолу промывали 6-8 раз DMF от компонентов реакционного раствора. В случае положительного теста реакцию повторяли, увеличивая избыток реагентов и её время.

© О. В. Матусевич, И. А. Глуздиков, М. И. Титов, 2011

Полноту протекания конденсации контролировали также с помощью индикатора бромфенолового синего. В реакционную смесь добавляли 3 капли 1 % раствора бром-фенолового синего в диметилацетамиде фМА). По мере протекания реакции окраска раствора изменялась с синей на жёлтую.

Для временной защиты а-аминогрупп использовалась 9-флуоренилметилоксикар-бонильная (Fmoc) группа, удаление которой проводили 2-3-кратной обработкой смолы 20 % раствором диэтиламина в диметилформамиде в течение 5-20 мин. В некоторых случаях смолу обрабатывали смесью DMF-диэтиламин-DBU (1,8-диазобицик-ло[5.4.0]ундец-7-ен) в объёмном соотношении 48 : 1 : 1 в течение 10 мин. Для удаления остаточных количеств диэтиламина или DBU смолу промывали 6-8 раз DMF.

В качестве постоянных защитных групп использовались: трет-бултилоксикарбо-нильная (ВОС) — для е-аминогруппы лизина, 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонильная (РМ) — для гуанидиновой группы аргинина, трифенилметильная (ТН;) — для амидных групп глутамина и аспарагина, ацетамидометильная (Аст) — для меркапто-группы цистеина, трет-бутильная ^Ви) — для ОН-групп треонина, тирозина и серина, (О^Ви) для в- и у-карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Пептиды, полученные последовательным наращиванием цепи по одной аминокислоте, в описанных выше условиях синтезировали по следующей общей методике:

1. В твердофазном реакторе суспендировали 0,5 г смолы в 10 мл DCM, выдерживали в течение 2 мин и отфильтровывали смолу.

2. К смоле добавляли раствор 0,5 ммоль С-концевой защищённой аминокислоты и 512 мкл (3,1 ммоль, 4 эквивалента по отношению к смоле) DIPEA в 3 мл DCM, перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали и промывали 2 х 8 мл DCM в течение 2 мин.

3. Далее в реактор добавляли 10 мл смеси DCM/метанол/DIPEA в соотношении 17 : 2 : 1, перемешивали в течение 10 мин и отфильтровывали, данную операцию проводили дважды, после чего смолу промывали DMF порциями по 10 мл (3 х 2 мин).

4. Деблокирование Fmoc-группы осуществляли описанным ранее способом.

5. К смоле добавляли охлаждённый раствор 1 ммоль (2-кратный избыток) следующей в эксперименте защищённой аминокислоты, 184 мг (1,2 ммоль) HOBt и 187 мкл (1,2 ммоль) DIC в 4 мл DMF, перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре, отфильтровывали смолу. Полноту конденсации контролировали по изменению окраски индикатора бромфенолового синего. Промывали смолу порциями по 10 мл DMF (7 х 2 мин).

Операции 4, 5 повторяли до присоединения последнего аминокислотного остатка.

Защищённые фрагменты для конвергентного синтеза получали следующим образом: для удаления DMF смолу дважды промывали дихлорметаном ^СМ), 10-15 раз по 1,5-2 мин обрабатывали 1 % раствором трифторуксусной кислоты (TFA) в DCM; полученные растворы объединяли в колбе, содержащей 10 % раствор пиридина в метаноле, смесь концентрировали на ротационном испарителе. К остатку добавляли воду, осадок отфильтровывали. Чистота полученных в указанных условиях защищённых пептидных фрагментов, по данным ВЭЖХ, составила более 95 %.

Для финального деблокирования целевого соединения, а также отщепления его от полимерного носителя смолу в течение 2 ч обрабатывали раствором TFA, содержащим этандитиол (EDT), воду и триизопропилсилан (Т1Б) в объёмных соотношениях

92,5 : 2,5 : 2,5 : 2,5. Полученный раствор концентрировали на ротационном испарителе. После добавления к остатку метилтретбутилового (МТВЕ) или диэтилового эфиров

продукт отфильтровывали. Полноту деблокирования боковых функциональных групп контролировали с помощью аналитической обращённофазной ВЭЖХ, при необходимости указанную процедуру повторяли.

В случае окисления метионина в метионинсодержащих пептидах таковые после финального деблокирования восстанавливали по методу, описанному в [5]: к раствору пептида в TFA добавляли EDT и триметилбромсилан (TMSBr) в количестве 15,7 и 13 мкл/мл соответственно, раствор выдерживали 15-30 мин при перемешивании, далее концентрировали и выделяли продукт с использованием MTBE, как описано выше.

Очистку полученных пептидов проводили методом препаративной обращённофазной ВЭЖХ в градиентном режиме в системе ацетонитрил-вода-TFA. Фракции, содержащие целевой компонент, после объединения и концентрирования в вакууме подвергались лиофилизации. Чистота полученных соединений составила не менее 95 %, их структура подтверждена масс-спектрометрически (MALDI-TOF).

Аналитическую жидкостную хроматографию проводили на хроматографе “KNAU-ER Smartline 2500”, препаративную — на хроматографе “KNAUER Preparative pump K-1800”. Оба прибора оснащены спектрофотометрическим детектором. Анализ проводили при длине волны 214 нм.

При проведении аналитической ВЭЖХ использовали колонку “Waters X-Bridge C18”, 3,5 мкм, 4,6 х 100 мм при скорости потока элюента 1 мл/мин. Для элюирования использовали следующие системы: фаза А — 0,1 % TFA, фаза Б — 0,1 % TFA в ацетонитриле, а также градиентные методы — метод 1: изменение концентрации фазы Б в А от 0 до 97 % за 15 мин, метод 2: изменение концентрации фазы Б в А от 0 до 84 % за 13 мин, метод 3: изменение концентрации фазы Б в А от 5 до 99 % за 15 мин.

При проведении препаративной ВЭЖХ использовали колонку “Waters X Bridge C18”, 10 мкм, 127 A, 50 х 250 мм при скорости потока элюента 50 мл/мин.

Масс-спектры регистрировали на времяпролетном масс-спектрометре с лазерной матричной ионизацией (MALDI-TOF) “Voyager-DE PerSeptive BioSystems” в режиме задержки экстракции (DE).

В табл. 1 представлены экспериментальные данные для синтезированных соединений, где речь идёт о содержании целевого соединения в смеси, полученной после финального деблокирования пептида, значения рассчитаны по методу внутренней нормализации; фактор отклика детектора не учитывался.

Таблица 1

Экспериментальные данные для синтезированных соединений

Обозначение Содержание целевого соединения, % (ВЭЖХ) £д, мин [М + Н] +

РВ1(1-5) 81,4 5,39 -

РВ1(1-25) 59,1 7,78 2782,87

РВ1(6-13) 36,3 8,97 931,26

РВ1(14-25) 75,5 6,61 1314,57

РВ 1(26-30) 52,9 5,25 548,23

РВ1(111-130) 41,1 7,04 2427,72

РВ1(271-290) 51,6 6,43 2184,17

РВ1(381-386) 84,0 5,89 753,31

РВ1(381-390) 87,7 5,69 1252,78

РВ 1(381-400) 61,3 6,90 2358,98

РВ 1(395-400) 71,1 7,07 631,61

Обозначение Содержание целевого соединения, % (ВЭЖХ) £д, мин [М + Н] +

РВ 1(411-420) 34,7 9,50 1112,50

РВ 1(525-530) 45,98 8,00 601,43

РВ 1(525-535) 38,72 7,904 1201,87

Условия хроматографирования: фаза А — 0,1 % TFA, фаза Б — 0,1 % TFA в ацетонитриле; изменение концентрации фазы Б в А от 0 до 97 % за 15 мин, для пептида РВ1(1—25) приводится при изменении концентрации фазы Б в А от 0 до 84 % за 13 мин.

Данные приводятся для пептида РВ1(1—25), полученного последовательным наращиванием пептидной цепи.

Результаты и их обсуждение. Были синтезированы следующие фрагменты субъединицы РВ1 РНК-полимеразы вируса гриппа А: 1-5, 1-25, 6-13, 14-25, 26-30, 111-130, 271-290, 381-386, 381-390, 381-400, 395-400, 411-420, 525-530, 525-535. Аминокислотные последовательности всех обсуждаемых в работе пептидов представлены в табл. 2.

Таблица 2

Аминокислотные последовательности синтезированных пептидов

Обозначение Аминокислотная последовательность

РВ1(1-5) H-Met1-Asp2-Val3-Asn4-Pro5-OH

РВ1(1-25) H-Met1-Asp2-Val3-Asn4-Pro5-||-Thr6-Leu7-Leu8-Phe9-Leu10-Lys11--Val12-Pro13-||-Ala14-Gln15-Asn16-Ala17-Ile18-Ser19-Thr20-Thr21--Phe22-Pro23-Tyr24-Thr25-OH

РВ1(6-13) H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val‘ -Pro8-OH

РВ1 (14-25) H-Ala1-Gln2-Asn3-Ala4-Ile5-Ser6-Thr7-Thr8-Phe9-Pro10-Tyr11-Thr12- -OH

РВ1 (26-30) H-Gly1-Asp2-Pro3-Pro4-Tyr5-OH

РВ1(111-130) H-Met1-Glu2-Val3-Val4-Gln5-||-Gln6-Thr7-Arg8-Met9-Asp10-Lys11- -Leu12-Thr13-||-Gln14-Gly15-Arg16-Gln17-Thr18-Tyr19-Asp20-OH

РВ1(271-290) H-Leu1-Pro2-Val3-Gly4-Gly5-Asn6-Glu‘-Lys8-Lys9-Ala10-Lys11-Leu12- -Ala13-Asn14-Val15-Val16-Arg17-Lys18-Met19-Met20-OH

РВ1 (381-386) H-Phe1-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg6-OH

РВ1 (381-390) H-Phe1-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg6-Lys7-Lys8-Ile9-Glu10-OH

РВ1 (381-400) H-Phe1-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg6-||-Lys7-Lys8-Ile9-Glu10-Lys11-Ile12- -Arg13-Pro14-||-Leu15-Leu16-Val17-Glu18-Gly19-Thr20-OH

РВ1 (395-400) H-Leu1-Leu2-Val3-Glu4-Gly5-Thr6-OH

РВ1(411-420) H-Met1-Phe2-Asn3-Met4-Leu5-Ser6-Thr7-Val8-Leu9-Gly10-OH

РВ1 (525-530) H-Ile1-Gly2-Val3-Thr4-Val5-Ile6-OH

РВ1 (525-535) H-Ile1-Gly2-Val3-Thr4-Val5-Ile6-Lys7-Asn8-Asn9-Met10-Ile11-OH

РВ1(691-720) H-Lys1-Cys2-Cys3-Thr4-Leu5-Phe6-Glu7-Lys8-Phe9-Phe10-Pro11-||-Ser12-Ser13-Ser14-Tyr15-Arg16-Arg17-Pro18-Val19-Gly20-Ile21-Ser22--Ser23-Met24-||-Met25-Glu26-Ala27-Met28-Val29-Ser30-OH

Знаком || обозначены фрагменты для конвергентного синтеза.

Последовательное наращивание пептидной цепи. Все представленные в таблице пептиды, кроме РВ1(111-130), РВ1(381-400) и РВ1(691-720), были синтезированы последовательным наращиванием пептидной цепи по одной аминокислоте.

t, мин t, мин

Рис. 1. Хроматограммы пептида PB1

а — после финального деблокирования; а — после финального деблокирования;

б — после восстановления б — после восстановления

Синтетические проблемы при «посадке» следующего аминокислотного остатка или же деблокировании Fmoc-группы возникали чаще всего в реакциях с гидрофобными, пространственно-затруднёнными защищёнными аминокислотами — Val, Leu, Ile, Asn, Gln, а также Lys, особенно, если таковые оказывались соседними в аминокислотной последовательности.

PB1(111—130) обсуждаемым способом получить не удалось: проблемы в синтезе были отмечены при попытке провести реакцию с защищённым остатком глутамина в положении 6. Реакцию не удавалось провести как при увеличении времени до Т суток, так и при замене HOBt на HOAt. Описанные сложности могут быть связаны, в том числе с недостаточной доступностью реакционного центра пептидил-полимера и с агрегацией пептидных цепей [5]. Возникновение такого рода проблем в значительной степени зависит от конкретной аминокислотной последовательности. Хроматограмма полученной после финального деблокирования смеси продуктов содержала два пика, отвечающие, по данным масс-спектрометрии, пептидам 6—20 и 7—20 соответственно.

Пептид PB1(271—290), синтезированный последовательным наращиванием пептидной цепи, содержит два метионина в положениях 19 и 20. После финального деблокирования данного пептида, на хроматограмме полученной смеси присутствовало 4 пика (рис. 1): пики І —3, соответствующие соединениям с окисленными метионинами, а также целевое соединение (пик 4).

Аналогичная картина наблюдалась с пептидом PB1(525—535), содержащим один метионин в положении 10. На рис. 2 представлены хроматограммы до и после его восстановления: пики І и 3 соответствуют окисленной форме, а пик 2 — целевому соединению. Поскольку восстановлению метионина предшествовала повторная процедура деблокирования, пику 4 соответствует Fmoc-защищённый пептид, что подтверждается исчезновением данной группы пиков (3 и 4) после обработки смеси водным раствором аммиака.

Конвергентный синтез. Конвергентно были синтезированы пептиды PB1(1—25), PB1(111—130) и PB1(381—400), кроме того, была предпринята не увенчавшаяся успехом попытка конвергентного синтеза пептида PB1(691—720) (табл. 3).

А

1,5 _

Рис. 3. Хроматограммы пептида PB1(1-25), полученного а — конвергентным путём; б — последовательным наращиванием пептидной цепи

и-------------1------------1------------1-------------

6 7 8 9 10

г, мин

Таблица 3

Конвергентный синтез пептидов

Целевые соединения Конденсации фрагментов Растворитель Избыток карбоксильной компоненты Реагент Время реакции, ч

(6 13) + (14 25) N1^ 2 НОА! 338

РВ1(1 25) N1^ 2 НОВ! 173

(1-5) + (6-25) БМР 2,37 НО А! 144*

БМР 2,66 НОВ! 48

(6 13) + (14 20) БМР 2,9 НОВ! 235

РВ1(111-130) БМР 2,9 НОА! 163

(1-5) + (6-20) БМР 3 НОА! 336

РВ1 (381-400) (7-14) + (15-20) БМР 2,44 НОА! 168

(1-6) + (7-20) БМР 3,5 НОА! 72

РВ1(691-720) (12-24) + (25-30) БМР 3 НОА! 330

* За указанное время реакция не прошла.

Наличие в молекулах РВ1(1-25), РВ1(381-400) и РВ1(691-720) остатков пролина в положениях 5, 13 (для РВ1(1-25)), 14 (для РВ1(381-400)) и 11 (для РВ1(691-720)) открыло возможности для использования в их синтезе фрагментных конденсаций с традиционным разбиением аминокислотной последовательности по данной аминокислоте. Такой выбор обусловлен весьма низкой способностью пролина подвергаться рацемизации [5]. В случае пептидов РВ1(381-400) и РВ1(691-720) разбиение проводили также по аргинину в положении 6 и метионину в положении 24 соответственно. В конденсациях использовали 2-3,5-кратные избытки защищённых фрагментов. Применительно к данным пептидам, на наш взгляд, целесообразно использовать избытки не менее 2,5-кратных.

Как видно из приведённых в таблице данных, в синтезе пептида РВ 1(1-25) конденсацию фрагментов 6-25 и 1-5 удалось провести при замене НОА! на НОВ!. В указанных условиях при использовании НОА! данная реакция не проходила, что было подтверждено масс-спектрометрически. Целевое соединение, полученное с использованием конвергентного подхода на хроматограмме совпадало с таковым, полученным последовательным наращиванием пептидной цепи (рис. 3).

Представляло интерес сравнение подходов в синтезе пептида PB1(1—25), поскольку каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Конвергентный подход, на наш взгляд, является более предпочтительным, так как позволяет упростить процедуру очистки конечного продукта в условиях обращённофазной ВЭЖХ, а также использовать фрагменты, получаемые для синтеза пептида 1-25 для биологических испытаний.

Одним из ключевых моментов, обеспечивающих протекание реакций в конвергентном синтезе, является растворимость защищённого фрагмента в используемых для конденсаций растворителях. Поскольку предсказать заранее растворимость фрагмента достаточно сложно, на практике возникают ситуации, когда одно из достоинств конвергентного синтеза — возможность одновременного синтеза фрагментов — превращается в недостаток — непригодность фрагмента для реакции по указанной выше причине становится понятной, когда другие фрагменты могут быть уже синтезированы, что и наблюдалось в случае пептида PB1(691-720). Тогда провести конденсацию фрагментов 12-30 и 1-11 не удалось, т. к. фрагмент 1-11 не только не растворялся в DMF и в NMP, но и образовывал в них гель.

Литература

1. De ClercqE. Antivirals and antiviral strategies // Nature Rev. Microbiol. 2004. Vol. 2. P. 704-720.

2. КисёлевО. И., ДееваЭ.Г, СлитаА. В., ПлатоновВ.Г. Антивирусные препараты для лечения гриппа и ОРЗ. Дизайн препаратов на основе полимерных носителей. СПб., 2000.

3. Trivedi V. D, Cheng S.-F, Wu C.-W. et al. The LLSGIV stretch of the N-terminal region of HIV-1 gp41 is critical for binding to a model peptide, T20 // Protein Engineering. 2003. Vol. 16. N 4. P. 311-317.

4. Ghanem A., Mayer D., Chase G. et al. Peptide-Mediated Interference with Influenza A Virus Polymerase // J. of Virology. 2007. Vol. 81. N 14. P. 7801-7804.

5. Chan W. C., White P. D. Fmoc solid phase peptide synthesisK Oxford, 2004.

Статья поступила в редакцию 1 февраля 2011 г.