СПОСОБ РАСПОЗНАВАНИЯ И КЛАССИФИКАЦИИ 3-ОКСОСТЕРОИДОВ И ИХ МЕТАБОЛИТОВ ПРИ ДОПИНГОВОМ КОНТРОЛЕ СПОРТСМЕНОВ
METHOD FOR IDENTIFICATION AND CLASSIFICATION OF 3-OXOSTEROIDS AND THEIR METABOLITES IN DOPING TEST OF SPORTSMEN

Изобретение относится к области медицины, а точнее к способам идентификации и определения стероидов и их метаболитов, и может быть использовано при допинговом контроле.
Известен способ распознавания и идентификации стероидов методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектором [1].
Основным недостатком указанного способа является низкая производительность процесса (одновременно можно анализировать 2-3 вещества), при этом достоверность результатов анализа не превышает 0,85, что сказывается на интерпретации результатов.
Известны также способы распознавания и идентификации анаболических андрогенных стероидов методами высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией [2-5].
Основным недостатком указанных технических решений также является низкая производительность процесса (одновременно можно анализировать 2-3 вещества) при достоверности результатов анализа не более 0,95, что также сказывается на интерпретации результатов, а кроме того, необходимые для детектирования нижние пределы концентрации определяемых веществ достаточно высоки и составляют от 10 до 2 нг/мл.
Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является обеспечение высокой точности и достоверности распознавания и классификации стероидов при одновременном уменьшении количества анализируемой биологической жидкости (плазмы крови), снижении нижнего предела детектирования и сокращении времени проведения анализа.
с
с
с
Поставленный технический результат достигается тем, что для способа идентификации 3-оксостероидов при исследовании плазмы крови, заключающегося в определении наличия и положения двойных связей и связанных с ними отличий в структурных характеристиках, известные и исследуемые стероиды химически модифицируют по карбоксильной группе (оксимы), снимают и регистрируют их масс-спектры, выбирают из масс-спектров характеристичные ионы (I) и нейтральные потери (Do), сравнивают выбранные I и Do с таковыми у известных оксимов 3-оксостероидов по абсолютной величине значений, при этом принимают во внимание только значения аналогичных I и Do с обеих сторон, разнящиеся не более чем на 0,3%, и на основании результатов сравнения идентифицируют оксимы 3-оксостероидов.
Анаболические андрогенные стероиды (ААС) самый распространенный класс соединений, которыми злоупотребляют спортсмены для достижения высоких спортивных результатов [6], и в списке запрещенных веществ Всемирного Антидопингового Агентства (ВАДА) [7] они стоят на первом месте в группе S1.
По мнению авторов, получение тех или иных производных анаболических стероидов, а именно введение в стероидную структуру фрагментов несущих постоянный заряд или легко ионизирующихся, в условиях реакций диссоциации, индуцированных соударениями, позволяет проводить идентификацию не только известных стероидов, но и изучать пути масс-спектрометрического распада новых (ранее неизвестных) стероидных структур и их предполагаемых метаболитов.
3-Оксостероиды - это стероиды, содержащие в качестве заместителя кислород у атома углерода в положении 3 в молекуле гонана (циклопентанпергидрофенантрена), являющегося основой всех стероидов. 3-Оксостероиды являются чрезвычайно важными гормонами и в зависимости от природы и местоположения заместителей, а также от наличия и местоположения двойных связей в молекуле проявляют различные регуляторные функции в организме. В настоящее время синтезировано большое количество различных стероидов (экзогенные), в том числе 3-оксостероидов, которые по функциональным свойствам не только повторяют, но и существенно превосходят природные стероиды, вырабатываемые организмом (эндогенные). Такие экзогенные стероиды, в частности тестостерон, андростендион и др., могут быть использованы и используются в качестве допинга. Поэтому для допинг-контроля спортсменов определение 3-оксостероидов и продуктов их метаболизма является чрезвычайно важным, но в то же время и чрезвычайно затруднительным. Причин тому несколько, но наиболее важной из них является химическая инертность стероидов. Так, например, 3-оксостероид можно получить дегидрированием гидрокортизона, а восстановить при довольно жестких условиях в присутствии катализатора Генбеста. Стероиды слабо ионизируются в процессе проведения ВЭЖХ-МС/МС-анализа с электрораспылительной ионизацией. Указанное обстоятельство приводит к тому, что для получения достоверных результатов анализа приходится исследовать большие количества анализируемого вещества. Кроме того, пределы детектирования стероидов при проведении вышеуказанного анализа составляют от 10 нг/мл до 2,0 нг/мл, чего явно недостаточно для достоверного анализа при содержании стероидов и продуктов их метаболизма <10,0 и до 2,0 пг/мл.
Следует заметить, что в нашем случае оксостероиды модифицируют по кетогруппе.
Стандартные растворы аналитов могут быть приготовлены растворением точных навесок в точном объеме растворителя, например метанола. Рабочие растворы могут быть получены разбавлением до соответствующей концентрации.
В качестве химических модификаторов может быть использован гидроксиламин.
В качестве элюента могут быть использованы, например, смеси метанола, ацетата аммония и муравьиной кислоты.
В качестве экстрагента для ЖЖЭ может быть использован метилтретбутиловый эфир (МТБЭ).
В качестве регуляторов рН могут быть использованы гидрокарбонат натрия и карбонат калия.
В качестве системы ВЭЖХ-МС/МС могут быть использованы хромато-масс-спектрометр с тройным квадрупольным анализатором TSQ Quantum фирмы Thermo Finnigan (США), соединенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом модели Surveyor, оснащенным автосамплером, насосом высокого давления и дегазатором фирмы Thermo Finnigan (США).
В качестве вспомогательного оборудования могут быть использованы:

- автоматический шейкер фирмы Glas-Col, США - для ЖЖЭ;
- центрифуга марки Rotina 46R фирмы Hettich (ФРГ) для получения контрастной поверхности раздела между органической и водной фазами;
- упариватель фирмы Barnstead Inc. (CUJA), совмещенный с генератором азота марки Mistral-4 фирмы Schmidlin-DBS AG (Чехия) для упаривания органического экстракта;
- колонка Eclipse XDB-C18, 150×2.1 мм, размер частиц 5 мкм, размер пор 100 Á, фирмы Agilent (США) для хроматографического разделения.
В качестве мобильной фазы может быть использована система: 0,05% раствор муравьиной кислоты с 20 мМ раствором ацетата аммония (рН 3.0) (А) и метанол (В).
3
В качестве внутренних стандартов (ISTD) могут быть использованы, например, D-тестостерон и метилтестостерон.
В качестве 3-оксостероидов могут быть выбраны, например, тестостерон, метил-1-тестостерон, болдион, андростандион и другие подобные 3-оксостероиды.
Нейтральные потери - это потери исследуемой молекулой структурных фрагментов в процессе проведения масс-спектрометрического анализа. Следует заметить, что указанных потерь структурных фрагментов в процессе электрораспылительной ионизации может насчитываться довольно большое число, и при этом структурные фрагменты могут быть одинаковыми (например, одновременная потеря двух молекул воды) или, что чаще всего происходит на практике, разной природы и соответственно разной молекулярной массы. Вклад нейтральных потерь в суммарную информацию об исследуемом объекте достаточно велик и поэтому категория «нейтральные потери» как материальный объект, сопутствующий анализу, и была выбрана авторами в качестве критерия, вносящего существенный вклад в информацию об исследуемом веществе и, в частности, в установление его структуры.
Изобретение может быть осуществлено следующим образом.
с
с
с
с
с
с
Растворяют точные навески веществ-эталонов в органических растворителях, каждую аликвоту модифицируют гидроксиламином в кислой среде, органические компоненты каждой модифицированной аликвоты количественно отделяют, упаривают в токе азота, перерастворяют сухие остатки в мобильной фазе и далее каждую аликвоту вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией в режиме регистрации положительных ионов. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики веществ-эталонов (детектируют полный МС/МС-спектр, определяют время удержания, молекулярную массу, прекурсор-ионы, характеристичные ионы, нижний предел обнаружения и определяют нейтральные потери). Одновременно готовят пробы исследуемых биологических жидкостей по аналогичной схеме и также снимают и регистрируют их хроматографические и масс-спектрометрические характеристики; далее выбирают из масс-спектров исследуемых биологических жидкостей I и Do, которые несут информацию о наличии и/или положении двойных связей в молекуле, для чего сравнивают выбранные I и Do с таковыми у известных оксимов 3-оксистероидов по абсолютной величине значений, при этом принимают во внимание только значения аналогичных I и Do с обеих сторон, разнящиеся не более чем на 0,3%, и на основании результатов сравнения разбивают данные о I и Do на группы соответствия структурным характеристикам известных оксимов 3-оксостероидов, для чего составляют таблицу соответствия выбранных I и Do структурным характеристикам известных оксимов 3-оксостероидов и на основании местоположения выбранных I и Do в группе соответствия классифицируют природу и структуру распознанных оксимов 3-оксостероидов.
Для лучшего понимания изобретение может быть проиллюстрировано, но не исчерпано следующими примерами его конкретного осуществления.
Пример 1.
3
А. Получение масс-спектров, определение характеристических ионов, времени удержания и пределов детектирования известных стероидов. Готовят стандартные растворы аналитов (1 мг/мл): тестостерон, метилтестостерон, андростендион, 1-тестостерон, метил-1-тестостерон, 1-андростендион, болденон, метандиенон, болдион, дигидротестостерон, местанолдон, 5α-андростан-3,17-дион. Рабочие растворы готовят растворением точной навески стероидов - эталонов в метаноле. Далее получают рабочие растворы стероидов разбавлением стандартных растворов до содержания 10 мкг/мл. Из каждого рабочего раствора отбирают аликвоты объемом 100 мкл, вводят внутренний стандарт (D-тестостерон и метилтестостерон) и химически модифицируют их. Параметры модификации: гидроксиламином в кислой (HCl) среде - 30-35 мин, 60-70°С. Органический слой модифицированных аликвот количественно отделяют, упаривают в токе азота, перерастворяют сухой остаток в мобильной фазе состава: 0,05% раствор муравьиной кислоты с 20 мМ раствором ацетата аммония (рН 3.0).
Приготовленные таким образом рабочие растворы вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС (хромато-масс-спектрометр с тройным квадрупольным анализатором TSQ Quantum фирмы Thermo Finnigan (США), соединенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом модели Surveyor, оснащенным автосамплером, насосом высокого давления и дегазатором фирмы Thermo Finnigan (США)). Анализ ведут при скорости потока подвижной фазы 0.2 мл/мин. Определяемые вещества разделяют градиентным элюированием при условиях: 0 мин - 40% В; 8-9 мин - 90% В; 12-18 мин - 40% В; общее время анализа с учетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляет 18 мин. Ионизацию при атмосферном давлении осуществляют электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Напряжение на капилляре - 3.8 кВ; температура капилляра 245°С; скорость потока осушающего газа (азот) - 0.45 л/мин; скорость потока газа (аргон) в камере соударения - 0.075 л/мин; температура в камере ионизации 200°С; давление на распылителе - 2 атм.
Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации селективных реакций (SRM). Ширина пика для прекурсор-ионов и соответствующих характерных ионов на первом квадруполе (Q1) и третьем квадруполе (Q3) составляет 0.5 а.е.м. (на половине высоты), время задержки - 5 мс. Обработку полученных данных (масс-спектры, характеристические ионы, время удержания и пределы детектирования исследуемых стероидов) проводят с применением программного обеспечения Xcalibur версии 1.3 фирмы Thermo Finnigan, США.
Результаты анализа стероидов-эталонов представлены в таблице.
Таблица 1
<b>Известный оксим-3-оксостероид</b>
<b>Характеристич. ионы I</b><sub>c</sub>
<b>Нейтральные потери Do</b>
<b>Примечание</b>
Тестостерон
304, 286, 124, 112
18
I
Метил-1-тестостерон
318, 300, 286, 201
117
III
1-Андростендион
317, 299, 285, 218, 185
117 (99+18)
III
Дигидротестостерон
306, 288, 274, 159, 133
18, 36 (18+18)
IV
Андростендион
317, 124, 112
36 (18+18)
I
5α-Андростан-3,17-дион
319, 301, 286, 159, 133
18
IV
Метандиенон
316, 299, 280, 256, 136, 120
60, 18, 36 (18+18)
II
Метилтестостерон
318, 300, 282, 124, 112
18, 36 (18+18)
I
Болденон
302, 285, 266, 242, 136, 120
60, 18, 36 (18+18)
II
Болдион
315, 298, 281, 255, 136, 120
60, 18, 36 (18+18)
II
Местанолон
320, 302, 288, 159, 133
18, 36 (18+18)
IV
1-Тестостерон
304, 286, 272, 201, 187,
117
III
Сопоставление выбранных характеристичных ионов, несущих информацию о наличии и/или положении двойных связей в молекуле (в Таблице 1 выделены жирным шрифтом), и нейтральных потерь при анализе масс-спектров 12 исследованных оксимов 3-оксостероидов позволяет выделить четыре группы соответствия выбранных характеристичных ионов и нейтральных потерь структурным характеристикам исследованных 3-оксостероидов (в Таблице 1 в графе «Примечание» обозначены римскими цифрами от I до IV)
Б. Подготовка проб и анализ исследуемых образцов плазмы крови.
3
У трех спортсменов из группы риска (мужчины, 22, 23 и 27 лет) получают образцы крови забором из пальца (по 150,0 мкл), отделяют плазму и делят ее на две аликвоты (объемом 20,0 и 30,0 мкл) и далее к каждому образцу плазмы крови первой аликвоты объемом 20,0 мкл добавляют 50 мкл раствора внутренннего стандарта, содержащего D-тестостерон (10 нг/мкл) и метилтестостерон (10 нг/мкл), и химически модифицируют их. Параметры модификации: гидроксиламином в кислой (HCl) среде - 30-35 мин, 60-70°С. Модифицированные аликвоты подщелачивают до рН 9.5-10.0 смесью гидрокарбоната натрия и карбоната калия (1:2), добавляют 5 г сульфата аммония и далее экстрагируют с 5 мл МТБЭ в течение 10 мин на автоматическом экстракторе. Центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, органический экстракт упаривают досуха в токе азота. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола, затем 15 мкл раствора вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении в режиме регистрации положительных ионов. Анализ ведут при следующих параметрах. Скорость потока подвижной фазы 0,2 мл/мин. Определяемые вещества разделяют градиентным элюированием при условиях: 0 мин - 40% В; 8-9 мин - 90% В; 12-18 мин - 40% В, общее время анализа с учетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляет 18 мин. Ионизацию при атмосферном давлении осуществляют электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов. Напряжение на капилляре - 3.8 кВ; температура капилляра - 245°С; скорость потока осушающего газа (азот) - 0.45 л/мин; скорость потока газа (аргон) в камере соударения - 0.075 л/мин; температура в камере ионизации - 200°С; давление на распылителе - 2 атм. Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации селективных реакций (SRM). Ширина пика для прекурсор-ионов и соответствующих характерных ионов на первом квадруполе (Q1) и третьем квадруполе (Q3) составляет 0.5 а.е.м. (на половине высоты), время задержки - 5 мс.
Результаты анализа первой аликвоты образцов плазмы крови представлены в Таблицах 2, 3 и 4 (спортсмены 22, 23 и 27 лет соответственно).
Примечание: в таблицах представлены данные масс-спектров стероидов, совпадающих по характеристикам с рассматриваемыми четырьмя группами стероидов-эталонов.
Само собой разумеется, что если расширить список стероидов-эталонов (т.е. известных стероидов), то безусловно рассматриваемые 4 группы стероидов пополнятся новыми стероидами и их метаболитами, да и само число групп безусловно будет больше нежели четыре.
Таблица 2
Характеристичные ионы
Нейтральные потери
Нижний предел обнаружения
Примечание
317, 124, 112
36 (18+18)
5,2 пг/мл
Группа I
318, 300, 286, 201
117
6,0 пг/мл
Группа III
Таблица 3
Характеристичные ионы
Нейтральные потери
Нижний предел обнаружения
Примечание
304, 286, 124, 112
18
4,5 пг/мл
Группа I
315, 298, 281, 255, 136, 120
60, 18, 36 (18+18)
8,3 пг/мл
Группа II
Таблица 4
Характеристичные ионы
Нейтральные потери
Нижний предел обнаружения
Примечание
320, 302, 288, 159, 133
18, 36 (18+18)
2,5 пг/мл
Группа IV
317, 299, 285, 218, 185
117 (99+18)
5,3 пг/мл
Группа III
По Таблицам 2-4 (графа «Примечание») установлена (распознана) принадлежность анализируемых стероидов к соответствующим группам и далее сами стероиды проклассифицированы (по сравнению выбранных характеристичных ионов).
Таким образом, у спортсменов из группы риска установлено наличие в плазме крови:
22 года - эндогенный стероид метил-1-тестостерон и экзогенный стероид андростендион,
23 года - экзогенный стероид тестостерон и эндогенный стероид болдион,
27 лет - эндогенные стероиды местанолон и 1-андростендион.
В. Сопоставительный анализ исследуемых образцов плазмы крови без дериватизации.
а) Пробоподготовку и анализ плазмы крови (по 30,0 мкл второй аликвоты каждого образца из части Б Примера 1) проводят как в Примере 1, за исключением того, что образцы не модифицируют гидроксиламином. Результаты анализа отрицательные - ни один стероид не был обнаружен.
3
б) У спортсмена (мужчина, 22 года) получают образец крови забором из вены (6,5 мл), отделяют плазму (объем 1,5 мл), добавляют 50 мкл раствора внутренннего стандарта, содержащего D-тестостерон (10 нг/мкл) и метилтестостерон (10 нг/мкл), подщелачивают до рН 9.5-10.0 смесью гидрокарбоната натрия и карбоната калия (1:2), добавляют 5 г сульфата аммония и далее экстрагируют с 5 мл МТБЭ в течение 10 мин на автоматическом экстракторе. Центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, органический экстракт упаривают досуха в токе азота. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола, затем 15 мкл раствора вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС. Анализ ведут при тех же параметрах, что и в части Б Примера 1. Результаты анализа представлены в виде МС-МС-спектров на стр.16 описания. Нижний предел обнаружения стероидов составляет 8 нг/мл (8000 пг/мл)
Как видно из описания, примера осуществления способа и сопоставительного анализа, заявляемое изобретение обеспечивает высокую точность распознавания и классификации 3-оксостероидов и их метаболитов при допинговом контроле спортсменов, снижает порог детектирования, позволяет уменьшить количество плазмы крови, необходимое для проведения анализа, при одновременном сокращении времени проведения анализа.
Масс-спектры оксимов 3-оксостероидов (представлены масс-спектры трех стероидов-эталонов из 12). Стрелками обозначены нейтральные потери и представлены их значения.
1-тестостерон оксим
Метил-1-тестостерон оксим
1-андростерон оксим
2
**Фактически нейтральные потери оксима 1-андростерона составляют 117 {99+18(-Н0)}
МС/МС-спектры плазмы крови из части «В» Примера 1 (соспоставительной)
Следует отметить, что по значениям характеристичных ионов МС-спектры не совпадают и не кореллируют ни с одной из установленных 4-х групп 3-оксостероидов-эталонов.