КОМБИНИРОВАННЫЕ ПОКРЫТИЯ НА ОСНОВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ RGD-ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ БИФОСФОНАТОВ АМИНОКИСЛОТ И ПЭО-ПОДСЛОЯ ДЛЯ ТИТАНА
COMBINED COATINGS BASED ON BIOLOGICALLY ACTIVE RGD-FUNCTIONALISED AMINOACID BISPHOSPHONATES AND PEO-SUBLAYER FOR TITANIUM

Изобретение относится к области получения комбинированных покрытий для титана на основе биологически активных RGD-функционализированных бифосфонатных производных Arg-Gly-Asp-Cys-(RGDC)- замещенных ({[(2,5-диоксо-пирролидин-1-ил)алканоил]амино}-1-гидроксиалкан- 1,1- диил)бисфосфоновых кислот общей формулы (1a-h) в сочетании с неорганическим оксидированным пористым подслоем, полученным в ходе плазменно-электролитического оксидирования (ПЭО) металла:
Полученные покрытия могут найти применение для создания биологически активных биомиметических поверхностей для металлических имплантатов, улучшающих их остеоинтеграцию ([1] Queffelec С., Petit М., Janvier P., Knight D. A., Bujoli В. Chem. Rev. 2012, 112, 3777-3807; [2] Meyers S.R., Grinstaff M.W. Chem. Rev. 2012, 112, 1615-1632).
В работах ([3] Auernheimer J., Zukowski D., Dahmen C., Kantlehner M, Enderle A., Goodman S.L., Kessler H. ChemBioChem. 2005, 6(11), 2034-2040; [4] Mas-Moruno C., Dorfher P.M., Manzenrieder F., Neubauer S., Reuning U., Burgkart R., Kessler H. J. Biomed. Mater. Res. 2013, 101 A, P. 87-97) разработаны покрытия для титановых имплантатов, в которых цикло(-RGDfK-) пептид связан с якорным блоком из четырех фосфонопропионовых кислот через спейсеры, состоящие из одного или трех фрагментов аминогексановых кислот.
Вещества наносили на титановые диски (Ti6A14V) путем их вымачивания в буферных растворах с концентрацией действующего вещества 100-0,1 μМ при комнатной температуре в течение ночи. Адгезию клеток оценивали после 1 ч высевания клеток в планшеты с металлическими образцами. Показано увеличение степени адгезии мышиных остеобластов МС3Т3-Е1 на обработанной поверхности титана до 62% [3]. Иммобилизация пептидов на дисках Ti6A14V привела к более высоким значениям клеточной адгезии по сравнению с нефункционализированными образцами, как на механически отрезанных, так и полученных после пескоструйной обработки поверхностях [4]. В качестве недостатков данного метода следует указать многостадийность синтеза целевых соединений (~ 16 стадий), дороговизну цикло(-RGDfK-) пептидов, длительность обработки и возможную относительно более низкую степень химической адгезии полученных фосфонатов к неокисленной поверхности титана.
-4
-10
Известен синтез RGDC- замещенной (6-{[6-(2,5-диоксо-пирролидин-1-ил)гексаноил]амино}-1-гидроксигексан-1,1-диил)бисфосфоновой кислоты (1f) в реакции 4-N-(6-малеоимидогексаноил)аминобутан-1-гидрокси-1,1-бифосфоновой кислоты с RGDC-тетрапептидом в воде при рН=7 ([5] Beuvelot J., et al, 2009, J. Biomed. Mater. Res., 90B, 873-881). Полученное соединение наносили на стерилизованную и окисленную термически (15 ч при 200°С) поверхность титана путем физико-химической адсорбции из растворов (выдержка 3 ч) с концентрацией 10 и 10 М/л. Фиксация молекул на поверхности происходила путем дегидратации при 50°С, 0,3 мбар в течение 15 часов. Такая обработка поверхности металла улучшала адгезию, степень распределения и минерализацию остеобластоподобных клеток Saos-2.
В качестве недостатка данного метода можно отметить длительность обработки поверхности металла при нанесении покрытий.
-3
Наиболее близким к изобретению является способ [Parfenov E.V. et al, Surface & Coatings Technology, 2019, 357, 669-683], в котором RGDC-замещенную (3-{[6-(2,5-диоксо-пирролидин-1-ил)гексаноил]амино}-1-гидроксигексан-1,1-диил)бисфосфоновую кислоту (1d) наносили на поверхность наноструктурированного титана (Grade 4), модифицированную с помощью плазменно-электролитического оксидирования, путем физико-химической адсорбции из растворов с концентрацией 10 М/л (время выдержки 3 ч с последующим высушиванием).
Испытания in vitro, проведенные с использованием фибробластов, показали, что данный вариант комбинированного покрытия обеспечивает усиление пролиферации адгезированых клеток на 45% по сравнению с необработанным наноструктурированным титаном. К недостаткам метода следует отнести меньшую доступность и дороговизну наноструктурированного титана, отсутствие информации по влиянию структуры линкера и аминобифосфоната на жизнедеятельность клеток различной природы, а также содержание в целевых продуктах примеси продуктов трансформации диоксана, образующихся на стадии синтеза прекурсоров - коньюгатов аминобисфосфоновых кислот с малеимидосукцинимидными линкерами.
_
Задачей изобретения является разработка комбинированных биологически активных покрытий на основе гибридных молекул, полученных путем химической сшивки бифосфонатов аминокислот (β-аланина, γаминомасляной и ε-аминокапроновой кислот) с линейным рипептидом RGD - фрагментом белков межклеточного матрикса через линкеры, различающиеся длиной и структурой ((2,5-диоксопирролидин-1-ил)-3-(2,5-диоксопиррол-1-ил)пропаноата (BMPS), (2,5-диоксопирролидин-1-ил) -6- (2,5-диоксопиррол-1-ил)гексаноата (EMCS), (2,5-диоксопирролидин-1-ил) -4- [(2,5-диоксопиррол-1-ил)метил]циклогексанкарбоксилата (SMCC)), в сочетании с неорганическим оксидированным пористым подслоем, полученным в ходе плазменно-электролитического оксидирования металла, а также in vitro исследование адгезии, пролиферативной активности, жизнеспособности мезенхимальных стволовых клеток, фибробластов и остеобластоподобных клеток для выявления наиболее перспективных вариантов создаваемых покрытий.
1
13
31
-3
3
4
2
3
2
Получение заявленных покрытий осуществляли следующим образом: 1 экв. аминобифосфонатов аминокислот (β-аланина, γ-аминомасляной и ε-аминокапроновой кислот) вовлекали во взаимодействие с 1 экв. N-гидрокисукцинимидомалеоимидных линкеров (BMPS, EMCS, SMCC), предварительно растворенных в ацетоне. Полученные производные после выделения и осушки смешивали с олигопептидом RGDC в соотношении 1:1 в водной среде при рН=7, в результате чего получали соединения 1a-h, структура которых установлена с помощью 1D и 2D спектроскопии ЯМР Н, C, P и MALDI-TOF/TOF спектрометрии. ПЭО покрытие получали на титане (Grade 2) в биполярном импульсном режиме в водном растворе, содержащем NaPO⋅12HO и Са(СНСОО). Образцы Ti с нанесенным ПЭО-покрытием выдерживали в водных растворах 1a-h с концентрацией ~10 М/л в течение 1 часа, а затем высушивали.
Предлагаемый способ обладает следующими преимуществами: 1. Способ обеспечивает получение целевых продуктов - (RGDC)-замещенных ({[(2,5-диоксо-пирролидин-1-ил)алканоил]амино}-1-гидрокси-алкан- 1,1- диил)бисфосфоновых кислот, обладающих большей чистотой в сравнении с известным способом, в котором получаемые продукты содержат побочные продукты трансформации диоксана, используемого на этапе синтеза прекурсоров - коньюгатов аминобисфосфоновых кислот с малеимидосукцинимидными линкерами.
2. Полученные соединения могут быть применены к ПЭО-модифицированному титану (Grade 2), когда как в известном способе использован более дорогой и менее доступный наноструктурированный титан.
3. Показана перспективность применения новых производных 1a, 1c, 1g, 1h в сочетании с ПЭО - покрытием на Ti марки Grade 2 в качестве покрытий, улучшающих адгезию и пролиферацию фибробластов, мезенхимальных стволовых клеток и остеобластоподобных MG63, тогда как в известном способе показана применимость 1d в сочетании с ПЭО- покрытием на наноструктурированном титане марки Grade 4 с использованием фибробластов в качестве модели.
Способ поясняется следующими примерами:
Общая методика синтеза RGD-замещенных бифосфонатов. Бифосфонаты аминокислот (β-аланина, γ-аминомасляной и ε-аминокапроновой кислот) (0.04 ммоль) растворяют в 0.6 мл воды, рН раствора доводят до 8-9 0.1 N раствором NaOH (~ 150 мкл). При хорошем перемешивании к полученному раствору прибавляют эквимольное количество линкера ((2,5-диоксопирролидин-1-ил)-3-(2,5-диоксопиррол-1-ил)пропаноата (BMPS), (2,5-диоксопирролидин-1-ил) -6- (2,5-диоксопиррол-1-ил)гексаноата (EMCS) или (2,5-диоксопирролидин-1-ил) -4 - [(2,5-диоксопиррол-1-ил)метил]циклогексанкарбоксилата (SMCC)) (0.04 ммоль), растворенного в 0.6 мл ацетона. Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 15-30 мин, затем нейтрализуют до рН=7 0.1 N раствором HCl и концентрируют при пониженном давлении. Получают конъюгаты аминобисфосфоновых кислот с малеимидосукцинимидными линкерами 2a-g в виде белого порошка. Тетрапептид RGDC (0.01 ммоль) растворяют в 1.5 мл бидистиллированной воды, рН доводят до 7 добавлением 0.1 N р-ра NaOH. К раствору добавляют эквивалентное количество соединений 2a-g (0.01 ммоль). Реакционную массу перемешивают в течение 1-2 часов при 38-40°С, затем растворитель упаривают при пониженном давлении.
Пример 1. Синтез соединения 1а.
Бифосфонат (3-аланина (9.4 мг, 0.04 ммоль) растворяют в 0.6 мл воды, рН раствора доводят до 8-9 0.1 N раствором NaOH (~ 150 мкл). При хорошем перемешивании к полученному раствору прибавляют 10.7 мг линкера BMPS (0.04 ммоль), растворенного в 0.6 мл ацетона. Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 15-30 мин, затем нейтрализуют до рН=7 0.1 N раствором HCl и концентрируют при пониженном давлении. Получают конъюгат аминобисфосфоновой кислоты с малеимидосукцинимидным линкером 2а в виде белого порошка. Тетрапептид RGDC (4.5 мг, 0.01 ммоль) растворяют в 1.5 мл бидистиллированной воды, рН доводят до 7 добавлением 0.1 N р-ра NaOH. К раствору добавляют 3.9 мг соединения 2а (0.01 ммоль). Реакционную массу перемешивают в течение 1-2 часов при 38-40°С, затем растворитель упаривают при пониженном давлении. Получают вещество в виде белого порошка с выходом 8.1 мг, 96%.
Пример 2. Синтез соединения 1с.
Бифосфонат γ-аминомасляной кислоты (10 мг, 0.04 ммоль) растворяют в 0.6 мл воды, рН раствора доводят до 8-9 0.1 N раствором NaOH (~ 150 мкл). При хорошем перемешивании к полученному раствору прибавляют 10.7 мг линкера BMPS (0.04 ммоль), растворенного в 0.6 мл ацетона. Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 15-30 мин, затем нейтрализуют до рН=7 0.1 N раствором HCl и концентрируют при пониженном давлении. Получают конъюгат аминобисфосфоновой кислоты с малеимидосукцинимидным линкером 2с в виде белого порошка. Тетрапептид RGDC (4.5 мг, 0.01 ммоль) растворяют в 1.5 мл бидистиллированной воды, рН доводят до 7 добавлением 0.1 N р-ра NaOH. К раствору добавляют 4 мг соединения 2с (0.01 ммоль). Реакционную массу перемешивают в течение 1-2 часов при 38-40°С, затем растворитель упаривают при пониженном давлении. Получают вещество в виде белого порошка с выходом 8.3 мг, 97%.
Пример 3. Синтез соединения 1h.
Бифосфонат ε-аминокапроновой кислоты (11.1 мг, 0.04 ммоль) растворяют в 0.6 мл воды, рН раствора доводят до 8-9 0.1 N раствором NaOH (~ 150 мкл). При хорошем перемешивании к полученному раствору прибавляют 13.4 мг линкера SMCC (, 0.04 ммоль), растворенного в 0.6 мл ацетона. Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 15-30 мин, затем нейтрализуют до рН=7 0.1 N раствором HCl и концентрируют при пониженном давлении. Получают конъюгат аминобисфосфоновой кислоты с малеимидосукцинимидным линкером 2h в виде белого порошка. Тетрапептид RGDC (4.5 мг, 0.01 ммоль) растворяют в 1.5 мл бидистиллированной воды, рН доводят до 7 добавлением 0.1 N р-ра NaOH. К раствору добавляют 5.0 мг соединения 2h (0.01 ммоль). Реакционную массу перемешивают в течение 1-2 часов при 38-40°С, затем растворитель упаривают при пониженном давлении. Получают вещество в виде белого порошка с выходом 9.3 мг, 98%. Спектральные характеристики 2a-g, 1a-g.
1
2
3
5
3
3
3
6
13
2
6
5
3
6
1
1
8
4
7
31
+
+
2
2
2
2
2
2
C-P
C-P
2
10
16
2
10
2
Соединение 2а (BMPS-β). Спектр ЯМР Н (DO): 1.93-2.09 (м, 2Н, СН), 2.42 (т, J=6.5 Гц, 2Н, СН), 3.35 (т, J=7.8 Гц, 2Н, CH), 3.71 (т, J=6.0 Гц, 2Н, СН), 6.78 (с, НС=СН). Спектр ЯМР С (DO): 32.61 (С), 34.37 (С), 34.77 (С), 35.57 (т, J=7.8 Гц, С), 72.87 (т, J=133.7 Гц, С), 134.43 (C), 172.65 (С), 173.01 (С). Спектр ЯМР Р (DO): 17.68. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 446.093 [M+Na+K], 468.063 [M+2Na+K], расч. для CHNOP 386.189.
1
7
6
8
2
3
5
3
3
9
13
6
7
8
2
3
5
9
1
11
10
4
31
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
13
22
2
10
2
Соединение 2b (EMCS-β). Спектр ЯМР Н (DO): 1.13-1.24 (м, 2Н, СН), 1.43-1.57 (м, 4Н, СН, СН), 1.98-2.13 (м, 2Н, СН), 2.14 (т, J=7.4 Гц, 2Н, СН), 3.35-3.44 (м, 2Н, СН), 3.42 (т, J=7.0 Гц, 2Н, СН), 6.75 (с, 2Н, НС=СН). Спектр ЯМР С (DO): 24.81 (С), 25.41 (С), 27.28 (С), 32.76 (С), 35.49 (С), 35.74 (С), 37.43 (С), 72.93 (С), 134.27 (С), 173.42 (С), 176.46 (С). Спектр ЯМР Р (DO): 17.74. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 428.086 [М], расч. для CHNOP 428.269.
1
3
2
3
6
3
4
3
7
13
3
3
2
6
7
4
1
1
9
8
5
31
+
2
2
2
2
2
2
2
C-P
C-P
2
11
18
2
10
2
Соединение 2с (BMPS-γ). Спектр ЯМР Н (DO): 1.63-1.76 (м, 2Н, СН), 1.77-1.89 (м, 2Н, СН), 2.42 (т, J=6.4 Гц, 2Н, СН), 3.06 (т, J=6.8 Гц, 2Н, СН), 3.71 (т, J=6.6 Гц, 2Н, СН), 6.78 (с, НС=СН). Спектр ЯМР С (DO): 23.18 (т, J=6.8 Гц, С), 31.03 (С), 34.46 (С), 34.70 (С), 40.14 (С), 73.78 (т, J=134.8 Гц, С), 134.47 (С), 172.66 (С), 173.37 (С). Спектр ЯМР Р (DO): 18.20. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 400.080 [М], расч. для CHNOP 400.215.
1
8
7
9
3
2
3
6
3
4
3
10
13
3
7
8
9
2
6
10
4
1
1
12
11
5
31
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
C-P
2
14
24
2
10
2
Соединение 2d (EMCS-γ). Спектр ЯМР Н (DO): 1.12-1.28 (м, 2Н, СН), 1.41-1.58 (м, 4Н, СН, СН), 1.66-1.80 (м, 2Н, СН), 1.80-1.95 (м, 2Н, СН), 2.14 (т, J=7.5 Гц, 2Н, СН), 3.11 (т, J=6.8 Гц, 2Н, СН), 3.42 (т, J=6.9 Гц, 2Н, СН), 6.76 (с, 2Н, НС=СН). Спектр ЯМР С (DO): 23.36 (С), 24.87 (С), 25.26 (С), 27.43 (С), 31.06 (С), 35.61 (С), 37.34 (С), 39.98 (С), 73.81 (т, J=134.1 Гц, С), 134.26 (С), 173.41 (С), 176.80 (С). Спектр ЯМР Р (DO): 18.21. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 440.322 [М-2Н], расч. для CHNOP 442.295.
1
4
5
3
2
3
8
3
6
3
9
11
13
3
3
4
5
2
9
8
6
1
1
11
10
7
31
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
C-P
C-P
2
13
22
2
10
2
Соединение 2е (BMPS-ε). Спектр ЯМР Н (DO): 1.11-1.22 (м, 2Н, СН), 1.32-1.43 (м, 2Н, СН), 1.42-1.56 (м, 2Н, СН), 1.76-1.91 (м, 2Н, СН), 2.41 (т, J=6.0 Гц, 2Н, CH), 3.04 (т, J=6.8 Гц, 2Н, СН), 3.71 (т, J=6.4 Гц, 2Н, СН), 6.82 (с, 2Н, СН). Спектр ЯМР С (DO): 23.23 (т, J=5.8 Гц, С), 27.00 (С), 27.97 (С), 33.56 (С), 34.55 (С), 34.83 (C), 39.41 (С), 74.18 (с, J=134.5 Гц, С), 134.53 (С), 172.60 (С), 173.21 (С). Спектр ЯМР P (DO): 18.50. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 428.086 [М], расч. для CHNOP 442.295.
1
10
4
5
3
9
11
2
3
8
3
6
3
12
14
13
3
3
9
10
4
11
5
2
8
12
6
1
1
14
13
7
31
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
C-P
C-P
2
16
28
2
10
2
Соединение 2f (EMCS-ε). Спектр ЯМР Н (DO): 1.13-1.21 (м, 2Н, СН), 1.20-1.31 (м, 2Н, СН), 1.38-1.52 (м, 2Н, СН), 1.44-1.57 (м, 6Н, СН, СН, СН), 1.78-1.92 (м, 2Н, СН), 2.13 (т, J=7.2 Гц, 2Н, СН), 3.09 (т, J=6.7 Гц, 2Н, СН), 3.42 (т, J=6.8 Гц, 2Н, СН), 6.76 (с, 2Н, СН). Спектр ЯМР С (DO): 23.23 (т, J=6.0 Гц, C), 24.90 (С), 25.33 (С), 26.92 (С), 27.26 (С), 28.12 (С), 33.55 (С), 35.57 (С), 37.46 (С), 39.29 (С), 74.21 (т, J=133.6 Гц, С), 134.27 (С), 173.41(С), 176.66 (С). Спектр ЯМР Р (DO): 18.52. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z: 470.391 [М], расч. для CHNOP 470.348.
1
8
7
9
3
2
6
3
4
3
10
13
3
3
7
8
2
9
4
10
6
1
1
12
11
5
31
2
2
2
2
2
2
2
2
C-P
C-P
2
Соединение 2g (SMCC-γ). Спектр ЯМР Н (DO): 0.86-1.00, 1.60-1.71 (м, 4Н, СН), 1.16-1.34, 1.71-1.81 (м, 4Н, СН), 1.48-1.65 (м, 1Н, СН), 1.64-1.78 (м, 2Н, СН), 1.80-1.92 (м, 2Н, СН), 2.06-2.16 (м, 1Н, СН), 3.10 (т, J=6.7 Гц, 2Н, СН), 3.28 (д, J=7.0 Гц, 2Н, СН), 6.75 (с, 2Н, СН=СН). Спектр ЯМР С (DO): 23.46 (т, J=6.2 Гц, С), 28.33 (С), 29.14 (С), 31.15 (С), 36.05 (С), 39.95 (С), 43.47 (С), 44.86 (С), 73.83 (т, J=132.3, С), 134.17 (С), 173.58 (С), 179.68 (С). Спектр ЯМР Р (DO): 18.25.
1
10
4
9
5
3
8
2
8
3
6
3
12
13
3
3
4
9
5
10
2
11
6
12
8
1
1
14
13
7
31
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
C-P
C-P
2
18
30
2
10
2
Соединение 2h (SMCC-ε). Спектр ЯМР H (DO): 0.86-1.00, 1.61-1.70 (м, 4Н, СН), 1.20-1.30 (м, 2Н, СН), 1.23-1.34, 1.70-1.80 (м, 2Н, СН), 1.38-1.52 (м, 2Н, СН), 1.44-1.56 (м, 2Н, СН), 1.48-1.64 (м, 1Н, СН), 1.77-1.90 (м, 2Н, СН), 2.04-2.16 (м, 1Н, СН), 3.09 (т, J=6.8 Гц, 2Н, СН), 3.28 (д, J=7.3 Гц, 2Н, СН), 6.75 (с, 2Н, СН=СН). Спектр ЯМР С (DO): 23.40 (т, J=5.8 Гц, С), 26.90 (С), 28.20 (С), 28.34 (С), 29.14 (С), 33.73 (С), 36.04 (С), 39.18 (С), 43.46 (С), 44.78 (С), 74.26 (т, J=131.3 Гц, С), 134.18 (С), 173.58 (С), 179.56 (С). Спектр ЯМР Р (DO) 18.60. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z: 499.066 [М+3Н], расч. для CHNOP 496.137.
1
23
22
2
5
3
2
16
3
2
16
3
2
11
24
11
3
3
6
21
2
19
2
19
3
3
12
15
13
23
22
2
5
6
3
16
11
24
19
15
21
12
25
18
14
4
20
13
17
7
10
31
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
25
43
9
17
2
Соединение 1a (RGDC-BMPS-β). Спектр ЯМР H (DO): 1.55-1.68 (м, 2Н, СН), 1.74-1.84 (м, 2Н, СН), 1.96-2.10 (м, 2Н, СН), 2.38-2.45 (м, 2Н, СН), 2.52 (дд, J=8.4 Гц, J=16.0 Гц, 1Н, СНН), 2.66 (дд, J=4.9 Гц, J=16.0 Гц, 1Н, CHH), 2.94 (дд, J=8.5 Гц, J=14.0 Гц, 2Н, СН), 3.11-3.20 (м, 3Н, СН, CHH), 3.31-3.43 (м, 2Н, СН), 3.70 (т, J=7.0 Гц, 2Н, СН), 3.70-3.80 (м, 1H, СН), 3.87 (д, 1Н, J=16.9 Гц, CHH), 4.02 (д, J=16.9 Гц, 1Н, СНН), 4.40 (дд, J=4.1 Гц, J=8.5 Гц, 1Н, СН), 4.58-4.70 (м, 1Н, СН). Спектр ЯМР С (DO): 23.77 (C), 29.49 (С), 32.97 (С), 34.79 (С), 35.84 (С), 36.07 (С), 38.21 (С), 39.95 (С), 40.59 (С), 42.48 (), 51.39 (С), 53.20 (С), 54.39 (С), 156.76 (С), 170.81 (C), 172.54 (С), 172.64 (С), 173.82 (С), 176.43 (С), 178.03 (С), 178.91 (С, С). Спектр ЯМР Р (DO): 17.93. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 836.169 [M+H], расч. для CHNOPS 835.671.
1
7
6
8
26
25
2
5
3
2
19
3
2
19
3
2
14
3
2
14
27
3
9
24
2
22
2
22
3
3
15
18
13
26
7
6
8
25
2
5
3
19
9
14
27
22
18
24
15
28
22
17
4
16
23
20
10
13
31
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Соединение 1b (RGDC-EMCS-β). Спектр ЯМР Н (DO): 1.15-1.30 (м, 2Н, СН), 1.43-1.53 (м, 4Н, СН, СН), 1.55-1.63 (м, 2Н, СН), 1.60-1.76 (м, 2Н, СН), 1.98-2.03 (м, 2Н, СН), 2.05-2.25 (м, 2Н, СН), 2.53 (дд, J=8.3 Гц, J=15.9 Гц, 1H, CHH), 2.66 (дд, J=4.9 Гц, J=15.9 Гц, 1Н, СНН), 2.93 (дд, J=8.6 Гц, J=14.0 Гц, 1Н, СНН), 3.17 (дд, J=4.1 Гц, J=14.0 Гц, 1Н, CHH), 3.11-3.18 (м, 2Н, СН), 3.36-3.46 (м, 4Н, СН, СН), 3.47-3.57 (м, 1Н, СН), 3.86 (д, J=16.8 Гц, 1Н, СНН), 4.00 (д, J=16.8 Гц, 1Н, CHH), 4.40 (дд, J=4.1 Гц, J=8.6 Гц, 1Н, СН), 4.58-4.76 (м, 1Н, CH). Спектр ЯМР С (DO): 24.00 (С), 25.55 (С), 25.83 (С), 26.78 (С), 30.72 (С), 33.66 (С), 35.64 (С), 35.88 (С), 38.23 (С), 39.11 (С), 39.79 (С), 40.76 (С), 42.45 (С), 51.37 (С), 53.84 (С), 54.34 (С), 156.75 (С), 170.02 (С), 172.59 (С), 176.46 (С, С, С), 178.03 (С), 179.50 (С, С). Спектр ЯМР P(DO): 17.95.
1
24
3
2
23
6
17
3
2
12
4
12
25
7
20
20
22
13
16
13
3
24
23
2
6
7
17
12
4
25
20
16
22
13
26
19
15
21
5
14
18
8
11
31
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
26
45
9
17
2
Соединение 1c (RGDC-BMPS-γ). Спектр ЯМР Н (DO): 1.58-1.70 (м, 2Н, СН), 1.66-1.77 (м, 2Н, СН), 1.80-1.91 (м, 2Н, СН), 1.85-1.94 (м, 2Н, СН), 2.40-2.46 (м, 2Н, СН), 2.62-2.84 (м, 2Н, СН), 2.98 (дд, J=8.3 Гц, J=14.0 Гц, 1Н, CHH), 3.01-3.12 (м, 2Н, СН), 3.10-3.20 (м, 1Н, СНН), 3.14-3.20 (м, 2Н, СН), 3.68-3.75 (м, 2Н, СН), 3.85-3.97 (м, 1Н, СНН), 3.98-4.08 (м, 2Н, СНН), 3.99-4.09 (м, 1Н, СН), 4.39-4.46 (м, 1Н, СН), 4.66-4.73 (м, 1Н, СН). Спектр ЯМР С (DO): 23.22 (С), 23.46 (С), 27.84 (С), 31.01 (С), 33.62 (С), 35.82 (С), 36.60 (С), 40.14 (С), 40.32 (С, С), 42.31 (С), 50.53 (С), 52.82 (С), 54.21 (С), 156.76 (С), 169.98 (С), 172.01 (С, С), 172.89 (С), 175.97 (С), 176.14 (С), 178.31 (C, С). Спектр ЯМР Р (DO): 18.17. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 849.15 [М], расч. для CHNOPS 849.698.
1
8
7
9
27
2б
3
2
6
3
2
20
3
2
20
3
2
15
3
2
15
4
28
3
10
3
25
3
23
3
23
3
3
16
19
13
3
27
8
7
9
26
2
6
20
10
4
15
28
23
19
25
16
29
22
18
17
24
5
21
31
+
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
29
51
9
17
2
Соединение 1d (RGDC-EMCS-γ). Спектр ЯМР Н (DO): 1.16-1.31 (м, 2Н, СН), 1.38-1.55 (м, 4Н, СН, СН), 1.53-1.67 (м, 2Н, СН), 1.61-1.77 (м, 2Н, СН), 1.66-1.77 (м, 2Н, СН), 1.77-1.90 (м, 2Н, СН), 2.05-2.20 (м, 2Н, СН), 2.52 (дд, J=8.4 Гц, J=16.2 Гц, 1Н, СНН), 2.65 (дд, J=4.8 Гц, J=16.2 Гц, 1Н, СНН), 2.93 (дд, J=8.5 Гц, J=14.0 Гц, 1Н, CHH), 3.16 (дд, J=4.0 Гц, J=14.0 Гц, 1Н, СНН), 3.08-3.15 (м, 2Н, СН), 3.10-3.18 (м, 2Н, СН), 3.42 (т, J=7.0 Гц, 2Н, СН), 3.54 (т, J=6.1 Гц, 1Н, СН), 3.86 (д, J=16.8 Гц, 1Н, CHH), 4.01 (д, J=16.8 Гц, 1Н, CHH), 4.40 (дд, J=4.0 Гц, J=8.5 Гц, 1Н, СН), 4.59-1.68 (м, 1Н, СН). Спектр ЯМР С (DO): 23.73 (С), 23.98 (С), 25.45 (С), 25.67 (С), 27.73 (С), 30.53 (С), 31.48 (С), 35.70 (С), 38.20 (С), 38.72 (С), 39.75 (С), 39.82 (С), 40.71 (С), 42.45 (С), 51.37 (С), 53.79 (С), 54.32 (С), 156.75 (С), 170.95 (С), 172.61 (С), 175.85 (С), 176.44 (С), 176.96 (С), 178.01 (С). Спектр ЯМР Р (DO): 18.24. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 910.533 [M-4H+Na], 926.498 [М-4Н+K], расч. для CHNOPS 891.778.
1
4
5
3
26
2
25
3
8
19
14
6
14
27
9
22
24
15
18
13
3
26
4
5
25
2
8
9
19
6
14
27
22
18
24
15
28
23
21
17
7
16
20
10
13
31
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
28
49
9
17
2
Соединение 1e (RGDC-BMPS-ε). Спектр ЯМР Н (DO): 1.18-1.32 (м, 2Н, СН), 1.38-1.46 (м, 2Н, СН), 1.46-1.58 (м, 2Н, СН), 1.57-1.72 (м, 2Н, СН), 1.80-1.93 (м, 2Н, СН), 1.84-1.96 (м, 2Н, CH), 2.42 (т, J=6.7 Гц, 2Н, CH), 2.72-2.89 (м, 2Н, СН), 2.94-3.02 (м, 1Н, CHH), 3.00-3.10 (м, 2Н, СН), 3.10-3.20 (м, 1Н, СНН), 3.14-3.20 (м, 2Н, СН), 3.67-3.75 (м, 2Н, СН), 3.87-4.09 (м, 2Н, СН), 3.98-4.08 (м, 1Н, СН), 4.40-4.51 (м, 1Н, СН), 4.65-4.77 (м, 1Н, CH). Спектр ЯМР С (DO): 23.19 (С), 23.42 (С), 26.99 (С), 27.89 (С, С), 33.58 (С), 33.71 (С), 35.75 (С), 35.93 (С), 39.50 (С, С), 40.35 (С), 42.29 (С), 50.32 (С), 52.81 (С), 53.88 (С), 156.76 (С), 170.08 (С), 170.74 (С), 171.93 (С), 172.75 (С), 174.32 (С), 174.80 (С), 177.71 (С, С). Спектр ЯМР Р (DO): 18.65. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 879.242 [М+2Н], расч. для CHNOPS 877.751.
1
4
10
5
3
9
11
29
28
2
3
8
22
17
17
6
30
3
12
27
25
25
3
3
18
21
13
3
3
29
9
70
4
11
28
2
8
22
72
6
17
30
25
21
27
18
1
31
24
20
23
19
7
26
13
16
31
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
C-P
2
31
55
9
17
2
Соединение 1f (RGDC-EMCS-ε). Спектр ЯМР Н (DO): 1.15-1.30 (м, 4Н, СН, СН), 1.41-1.53 (м, 2Н, СН), 1.42-1.50 (м, 2Н, СН), 1.45-1.61 (м, 4Н, СН, СН), 1.54-1.65 (м, 2Н, СН), 1.64-1.74 (м, 2Н, СН), 1.74-1.90 (м, 2Н, СН), 2.13 (т, J=7.4 Гц, 2Н, СН), 2.48-2.72 (м, 2Н, СН), 2.88-2.99 (м, 1Н, СНН), 3.12-3.29 (м, 1Н, СН), 3.06-3.17 (м, 2Н, СН), 3.10-3.18 (м, 2Н, СН), 3.42 (т, J=7.10 Гц, 2Н, СН), 3.45-3.52 (м, 1Н, СН), 3.82-3.92(м, 1Н, CHH), 3.93-4.04 (м, 1Н, СНН), 4.40 (дд, J=4.0 Гц, J=8.6 Гц, 1Н, СН), 4.56-4.72 (м, 1Н, СН). Спектр ЯМР С (DO): 23.55 (т, J=6.0 Гц, С), 24.03 (С), 25.48 (С), 26.15 (С), 26.36 (С, С), 30.89 (С), 33.97 (С), 35.61 (С), 38.23 (С), 38.94 (С), 39.40 (С, С), 40.72 (С), 42.40 (С), 51.43 (С), 53.93 (С), 54.64 (С), 74.37 (С), 156.74 (С), 171.03 (С), 172.61 (С), 177.92 (С), 176.46 (С), 176.56 (С, С), 180.08 (С, С). Спектр ЯМР Р (DO): 18.71. Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 920.398 [М+Н], расч. для CHNOPS 919.831.
1
8
7
9
27
26
3
8
7
2
6
3
2
22
3
2
22
10
3
2
15
3
2
15
4
28
3
25
2
23
2
23
3
3
16
3
3
19
13
3
27
7
8
2
26
9
20
15
4
28
23
10
6
19
25
16
29
22
18
17
21
24
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
31
53
9
17
2
Соединение 1g (RGDC-SMCC-γ). Спектр ЯМР Н (DO): 0.83-0.99 (м, 2Н, СНН), 1.19-1.30 (м, 2Н, CHH), 1.37-1.50 (м, 1Н, СН), 1.52-1.65 (м, 2Н, СН), 1.55-1.72 (м, 2Н, СН), 1.67-1.77 (м, 2Н, СН), 1.68-1.77 (м, 2Н, CHH), 1.77-1.85 (м, 2Н, CHH), 1.78-1.87 (м, 2Н, СН), 1.96-2.06 (м, 1Н, СН), 2.53 (дд, J=8.2 Гц, J=16.0 Гц, 1Н, СНН), 2.66 (дд, J=4.8 Гц, J=16.0 Гц, 1Н, СНН), 2.99-3.05 (м, 2Н, СН), 2.93 (дд, J=8.6 Гц, J=14.0 Гц, 1Н, СНН), 3.17 (дд, J=4.1 Гц, J=14.0 Гц, 1Н, СНН), 3.08-3.12 (м, 2Н, СН), 3.11-3.16 (м, 2Н, СН), 3.41 (т, J=6.0 Гц, 1Н, СН), 3.85 (д, J=16.8 Гц, 1Н, CHH), 4.00 (д, J=16.8 Гц, 1H, CHH), 4.40 (дд, J=4.1 Гц, J=8.6 Гц, 1Н, СН), 4.63 (дд, J=4.8 Гц, J=8.2 Гц, 1H, СН). Спектр ЯМР С (DO): 23.86 (С), 24.13 (С), 29.25 (С), 29.53 (С), 29.56 (С), 31.25 (С), 36.71 (С), 38.27 (С), 39.71 (С), 40.17 (С), 40.83 (С), 42.45 (С), 45.41 (С), 46.98 (С), 51.36 (С), 54.06 (С), 54.32 (С), 156.74 (С), 171.11 (С), 172.63 (С), 176.49 (С), 177.91 (С), 178.01 (С). Масс-спектр MALDI-TOF/TOF m/z 941.786 [M+H+Na], расч. для CHNOPS 917.275.
1
10
9
4
11
5
3
29
10
28
9
2
8
3
2
22
3
2
22
12
3
2
17
3
2
17
3
6
30
27
2
25
2
25
3
3
18
3
3
21
13
3
29
4
5
9
10
28
2
11
22
6
17
30
25
12
8
21
27
18
31
20
26
19
23
7
31
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Соединение 1h (RGDC-SMCC-ε). Спектр ЯМР Н (DO): 0.84-1.00 (м, 2Н, СНН), 1.18-1.32 (м, 2Н, СНН), 1.20-1.30 (м, 2Н, СН), 1.37-1.52 (м, 1H, СН), 1.41-1.52 (м, 2Н, СН), 1.48-1.56 (м, 2Н, СН), 1.55-1.66 (м, 2Н, СН), 1.66-1.80 (м, 2Н, CHH), 1.66-1.82 (м, 2Н, СН), 1.79-1.85 (м, 2Н, CHH), 1.77-1.87 (м, 2Н, СН), 1.96-2.06 (м, 1Н, СН), 2.53 (дд, J=8.4 Гц, J=16.0 Гц, 1Н, CHH), 2.67 (дд, J=5.0 Гц, J=16.0 Гц, 1Н, CHH), 2.99-3.05 (м, 2Н, СН), 2.94 (дд, J=8.5 Гц, J=14.0 Гц, Ш, СНН), 3.18 (дд, J=4.1 Гц, J=14.0 Гц, 1Н, СНН), 3.10 (т, J=6.7 Гц, 2Н, СН), 3.13-3.19 (м, 2Н, СН), 3.58-3.66 (м, 1Н, СН), 3.87 (д, J=16.9 Гц, 1Н, СНН), 4.02 (д, J=16.9 Гц, 1Н, СНН), 4.41 (дд, J=4.1 Гц, J=8.5 Гц, 1Н, CH), 4.64 (дд, J=50 Гц, J=8.4 Гц, 1Н, СН). Спектр ЯМР С (DO): 23.61 (С), 23.92 (С), 27.01 (С), 28.29 (С), 29.26 (С), 29.54 (С), 30.19 (C), 34.22 (С), 36.77 (С), 38.25 (С), 39.26 (С), 39.86 (С), 40.69 (С), 42.48 (С), 45.45 (С), 46.92 (С), 51.38 (С), 53.67 (С), 54.36 (С), 156.75 (С), 172.59 (С), 175.44 (С), 176.46 (С), 178.03 (С), 179.85 (С). Спектр ЯМР Р (DO): 18.77.
3
4
2
3
2
Получение покрытия методом плазменно-электролитического оксидирования (ПЭО). ПЭО покрытие получали на титане (Grade 2) в биполярном импульсном режиме в водном растворе, содержащем 20 г/л NaPO⋅12HO и 25 г/л Са(СНСОО) при температуре 20°С. Длительность обработки составляла 10 минут. Амплитуда положительного импульса напряжения составляла 470 В, отрицательного 40 В, частота 300 Гц. Длительность положительного импульса составляла 1,7 мс, отрицательного 0,87. Импульсы разделялись паузами в 0,38 мс. Образцы перед покрытием полировались до шероховатости Ra<0,15 мкм и промывались в изопропиловом спирте в ультразвуковой ванне в течение 3 минут. Полученное оксидное покрытие имеет толщину 20-30 мкм, пористость 8-10% и шероховатость поверхности Ra 0,8-1,2 мкм.
2
2
Исследование биологической активности соединений. Образцы Ti с ПЭО покрытием подвергали ультразвуковой обработке в течение 10 мин в 95% этаноле и промывали деионизированной водой, сушили на воздухе и стерилизовали автоклавированием при 134°С. Для нанесения органического покрытия образцы помещали в чашку Петри с 10 М раствором RGD-производного, который предварительно стерилизовали пропусканием через фильтр СА 0,22 мкм. Через 1 час образцы высушивали на воздухе. Затем образцы помещали в 24-луночный планшет с обработанной для адгезии клеток поверхностью (SPL) для культивирования клеток. Фибробласты (ФЛЭЧ-104) из легких эмбриона человека, и МСК из жировой ткани человека (Биолот) и остеобластоподобные клетки остеосаркомы человека MG63 (ЦКП "Коллекция культур клеток позвоночных») культивировали в модифицированной среде Дульбекко (DMEM) (Sigma), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Biowest), в культуральных флаконах 25 см (SPL) в увлажненной атмосфере 5% СО. Среда менялась два раза в неделю. После достижения монослоя клетки отделяли с использованием раствора трипсина/Версена 1:1(Биолот) и подсчитывали с использованием автоматического счетчика клеток ТС20 (BioRad). В каждую лунку планшета с образцами помещали 16-10 клеток в 0,8 мл культуральной среды. Клетки в лунках с образцами Ti без органического покрытия обрабатывали как отрицательные контрольные (NC). Лунки планшета без образцов использовали в качестве положительного контроля. Планшеты для культивирования инкубировали в течение 7 суток в стандартных условиях (37°С, 5% СО).
2
Пролиферативную активность клеток определяли с помощью набора EZ4U (Biomedica), модификации теста МТТ, который оценивает метаболическую активность клеток, коррелирующую с количеством живых клеток клеток. Три образца каждого типа переносили после инкубации в другой 24-луночный планшет с 0,8 мл свежей среды DMEM. Затем к каждой лунке добавляли 80 мкл активированного раствора EZ4U и инкубировали при 37°С, 5% СО в течение 3,5 часов. После чего образцы извлекали и измеряли оптическое поглощение раствора с использованием микропланшетного ридера (Spark 10М, Tecan) при длине волны 450 нм с референсной длиной волны 620 нм. Вычисляли среднее значение и стандартное отклонение для оптической плотности относительно отрицательного контроля в %.
Результаты in vitro исследования представлены на рис. 1-3. Значительное снижение адгезии и пролиферации мезенхимальных стволовых клеток наблюдалось при использовании длинноцепочечных производных, содержащих EMCS-линкер (1b,d,f), а также RGDC-BMPS-ε (производного бифосфоната аминокапроновой кислоты) (1е), тогда как SMCC-связанные продукты (1g,h) приводили к росту клеток на поверхности до 20% (рис. 1).
Значительное (на уровне 30%) увеличение степени пролиферации фибробластов наблюдалось в случае использования органических покрытий RGDC-BMPS-β (1а) и RGDC-BMPS-γ (1с) (рис. 2).
Образец с нанесенным органическим покрытием на основе бифосфоната β-аланина с коротким BMPS- линкером и RGD (1а) также показал наилучшую адгезию остеобластоподобных клеток MG-63 через 7 дней, по сравнению с другими образцами (рис. 3). Производные, содержащие EMCS-линкер, RGDC-EMCS-β (1b) и RGDC-EMCS-γ (1d), приводили к снижению степени адгезии и пролиферации данного сорта клеток на поверхности.
На основании исследования можно заключить, что RGD-функционализированные гибридные молекулы 1a, 1c, 1g, 1h могут быть перспективны в качестве органического покрытия для моделирования биологической активности ПЭО- модифицированной поверхности титановых имплантатов.