СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ
METHOD OF DETERMINING COLLAGENOLYTIC ACTIVITY

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для скрининг-диагностики состояния протеиназно-ингибиторного потенциала в слезной жидкости /далее - «СЖ»/ в ходе лечения заболеваний, сопровождающихся деструкцией ткани роговицы или изменениями соединительной ткани глаза, таких как эрозия роговицы, язва роговицы, синдром «сухого глаза» /далее - «ССГ»/, открытоугольная глаукома и т.п., в частности для выбора тактики лечения или ее корректировки.
Известно, что ряд заболеваний глаза может сопровождаться изменением активности протеолитических ферментов в жидкостях глаза. Так, имеются сведения об изменении протеолитической активности при термических и химических ожогах глаза, бактериальных инфекциях, герпетических поражениях, отторжении роговичного трансплантата, хронических язвах роговицы, эндогенных и факогенных увеитах, катаракте, врожденной глаукоме, цилиохориоидальной отслойке, проникающих ранениях глаз [1, 2]. Исследования СЖ обладают особой диагностической значимостью при глазных заболеваниях. Состояние протеиназно-ингибиторного потенциала в СЖ позволяет судить о проницаемости сосудистой стенки и об активности плазменных протеолитических ферментов и их ингибиторов в регионарном микроциркулярном русле [1]. Известно, что при ряде заболеваний роговицы, сопровождающихся деструкцией ее ткани (эрозия роговицы, язва роговицы, ССГ), изменяется активность коллагеназ - ферментов семейства металлозависимых протеиназ матрикса, способных гидролизировать нативный коллаген /далее также - «коллагенолитические ферменты»/. Баланс указанных ферментов играет важную роль в процессе заживления и эпителизации роговицы [1]. К числу наиболее диагностически значимых относят матричные металлопротеиназы /далее - «ММП»/ второго и девятого типов /далее соответственно «ММП 2», «ММП 9»/, играющие важную роль в процессах восстановления и разрушения коллагена стромы роговицы. ММП 2 продуцируется кератоцитами в норме, однако повышение ее концентрации в СЖ может приводить к разрушению ткани роговицы. ММП 9 продуцируется эпителиальными клетками и полиморфно-ядерными нейтрофилами поврежденной роговицы [3]. Учитывая, что оба указанных коллагенолитических фермента расщепляют стромальный коллаген роговицы, замедляя ее регенерацию, содержание их в СЖ /далее - «коллагенолитическая активность СЖ», «КА СЖ»/ служит косвенным свидетельством выраженности процессов деструкции ткани роговицы. В частности, рядом исследователей [1, 2, 3] отмечено повышение КА СЖ по сравнению с нормой при таких заболеваниях, как эрозия роговицы, язва роговицы. Имеются данные, что заболевания соединительной ткани глаза также могут сопровождаться изменениями КА СЖ. В частности, выявлено понижение КА СЖ при первичной открытоугольной глаукоме [4].
Известно, что выраженность отклонения коллагенолитической активности в жидкостях глаза от нормы играет важную роль при выборе тактики лечения заболеваний глаза или ее корректировки в динамике лечения. Так, в зависимости от того, повышена или понижена (по сравнению с нормой) протеолитическая активность исследуемой жидкости глаза (в частности, КА СЖ), в комплексную схему лечения включают препараты, соответственно понижающие или повышающие патологически измененную ферментативную активность (гордокс, коллализин и т.п.) [5]. Отмечается также, что в случаях, когда повышение КА СЖ сопровождается обширной деструкцией ткани роговицы, необходимо добавлять хирургическое лечение для предотвращения перфорации глазного яблока.
Известен способ определения КА СЖ, основанный на электрофоретической технологии (зимография), который включает субстратную сополимеризацию с полиакриламидным гелем для обнаружения ферментативной активности каждого отдельного фермента СЖ, в частности ММП 2 и ММП 9 [6]. При этом у пациента производят забор СЖ в количестве 0,2 мл с помощью капиллярной трубочки. Затем полученные образцы СЖ выдерживают в стандартно обработанном SDS-PAGE буфере. Производят электрофорез полученного геля, после чего SDS удаляют из геля путем выдерживания его в небуфференизированном ТритонХ-100. Полученную зимограмму окрашивают красителем. Фиксируют области, где субстрат был расщеплен ферментом, которые видны как отчетливые полоски на темно окрашенном фоне. Каждую конкретную зимограмму сравнивают с зимограммой нормы. При повышении активности хотя бы одной из исследуемых ММП определяют повышенную КА СЖ.
0
х
Наиболее близким к заявленному способу по совокупности существенных признаков является способ определения КА СЖ, основанный на определении степени гидролиза субстрата, в качестве которого используют стекловидное тело, по скорости высыхания реакционной смеси, когда бóльшая скорость высыхания соответствует большей скорости гидролиза [4]. Способ, принятый за прототип, осуществляют следующим образом. У пациента производят забор СЖ с помощью капиллярной трубочки. Затем исследуемую СЖ /далее - «ИСЖ»/ смешивают со стекловидным телом в равных объемах /далее - «исследуемая реакционная смесь прототипа, «ИРС прототипа»/. Полученную гомогенную ИРС прототипа наносят на поверхность предметного стекла и фиксируют время полного высыхания указанной смеси. Находят отношение /далее - «относительный временной показатель прототипа»/ времени полного высыхания проб стекловидного тела, имевшего контакт с физиологическим раствором (Т) /далее - «время полного высыхания контрольной реакционной смеси прототипа, «время полного высыхания КРС прототипа»/, ко времени полного высыхания проб стекловидного тела с ИСЖ (Т) /далее - «время полного высыхания ИРС прототипа»/. Результаты выражают в относительных единицах. Основываясь на значении относительного временного показателя прототипа, количественно определяют коллагеназную (коллагенолитическую) активность ИСЖ /далее - «коллагенолитическая активность ИСЖ по прототипу», «КА ИСЖ по прототипу»/ с помощью предварительно построенной номограммы /далее - «калибровочная кривая прототипа»/, которая служила для перевода относительных единиц в абсолютные. Для построения калибровочной кривой прототипа по оси ординат откладывали время полного высыхания проб с заданной активностью коллализина (0, 50, 100, 150, 200 КЕ в 1 мл раствора) /далее - «время полного высыхания проб стандартизированной реакционной смеси прототипа», «время полного высыхания проб СРС прототипа»/, по оси абсцисс - коллагеназную (коллагенолитическую) активность. Сравнительным ориентиром для определения результата считали время полного высыхания КРС прототипа, при котором активность равна нулю, и время полного высыхания проб СРС прототипа. КА ИСЖ согласно способу-прототипу считают сниженной при значениях: для лиц в возрасте до 40 лет - менее 202 КЕ/мл, для лиц старше 40 лет - менее 189 КЕ/мл; КА ИСЖ по прототипу считают нормальной при значениях: для лиц до 40 лет - 202-218 КЕ/мл, для лиц старше 40 лет - 202-218 КЕ/мл.
Задачей изобретения является создание способа, обеспечивающего возможность экспресс-определения КА СЖ, точность которого не зависит от возрастных изменений тканей глаза и возрастных изменений биохимического состава СЖ, за счет использования стандартизированного биологического моносубстрата, подобного по молекулярному строению белку, являющемуся маркером выраженности деструктивных и репаративных процессов в тканях глаза.
Поставленная задача решается тем, что в способе определения КА СЖ, включающем забор СЖ у пациента, приготовление исследуемой реакционной смеси, состоящей из субстрата и ИСЖ /далее - «ИРС»/, нанесение ИРС на поверхность предметного стекла, выдерживание ее до полного высыхания всей поверхности предметного стекла с измерением времени полного высыхания ИРС и определением значения временнóго показателя, количественное определение КА ИСЖ с помощью предварительно построенной калибровочной кривой зависимости времени полного высыхания проб стандартизированной реакционной смеси, каждая из которых состоит из субстрата и раствора коллагеназы с заданной коллагенолитической активностью /далее - «СРС», «пробы СРС»/, от коллагенолитической активности, в ходе которого откладывают по оси ординат значение временного показателя и устанавливают значение коллагенолитической активности на оси абсцисс, соответствующее значению временного показателя, и сопоставление полученного значения КА ИСЖ с нормальными величинами, согласно изобретению в ИРС в качестве субстрата используют гель коллагена. В ходе приготовления исследуемой реакционной смеси ИСЖ смешивают с гелем коллагена в соотношении 1-1,5:1 и выдерживают при комнатной температуре до получения гомогенной смеси /далее - «заявленная ИРС»/. В качестве временнóго показателя используют результат измерения времени полного высыхания заявленной ИРС /далее - «заявленный временной показатель»/. При полученном значении коллагенолитической активности менее 231,8 КЕ/мл определяют пониженную КА ИСЖ, при значении указанной активности 231,8-297,8 КЕ/мл определяют нормальную КА ИСЖ, а при значении указанной активности свыше 297,8 КЕ/мл - повышенную КА ИСЖ.
нi
нi
н
н
Предварительно с использованием заявленного способа были установлены нормальные значения КА СЖ. Для этого было обследовано 36 лиц (64 глаза) в возрасте от 3 до 59 лет без патологии переднего отрезка глаза /далее - «условно здоровые лица», «УЗЛ»/. Все обследованные были разделены на группы: I группа (6 чел.) - лица мужского пола в возрасте от 3 до 16 лет; II группа (6 чел.) - лица женского пола в возрасте от 3 до 17 лет; III группа (6 чел.) - лица мужского пола в возрасте от 20 до 40 лет; IV группа (6 чел.) - лица женского пола в возрасте от 21 до 40 лет; V группа (6 чел.) - лица мужского пола в возрасте от 42 до 57 лет; VI группа (6 чел.) - лица женского пола в возрасте от 45 до 59 лет. Согласно заявленному способу у каждого из пациентов производили забор СЖ в объеме 0,2 мл (из каждого глаза). Затем ИСЖ смешивали с гелем коллагена в соотношении 1-1,5:1, выдерживали при комнатной температуре (14-20°С) до получения гомогенной смеси /далее - «ИРС нормы»/. Среднее время выдерживания при указанной температуре составляло (5,0±0,2) мин. Полученную ИРС нормы каждого из пациентов наносили на 5 предметных стекол и фиксировали время полного высыхания ИРС нормы на поверхности каждого из предметных стекол. Определяли среднее время высыхания ИРС нормы у каждого конкретного пациента и с помощью предварительно построенной калибровочной кривой зависимости времени полного высыхания проб СРС от коллагенолитической активности устанавливали соответствующее полученному временнóму показателю значение коллагенолитической активности, рассматривая его как КА СЖ данного пациента. Затем в каждой из групп рассчитывали среднее время высыхания ИРС нормы (Т, где i=1…6) и среднее значение коллагенолитической активности в данной группе (КА, где i=1…6). После этого рассчитывали среднее время высыхания ИРС нормы (Т) и среднее значение коллагенолитической активности (КА) всех обследованных лиц.
н
Анализ результатов определения КА СЖ УЗЛ показал отсутствие статистически значимых различий значений КА СЖ обследованных лиц по полу и возрасту. В связи с этим авторами изобретения в качестве параметра нормы было принято среднее значение коллагенолитической активности всех обследованных лиц КА, выраженное в виде интервала нормальных значений КАСЖ 231,8-297,8 КЕ/мл.
Изобретение поясняется чертежом, на котором представлена калибровочная кривая зависимости времени полного высыхания проб СРС (проб с заданной активностью коллализина) от коллагенолитической активности.
Способ осуществляют следующим образом. У пациента производят забор СЖ в количестве 0,1-0,2 мл с помощью капиллярной трубочки. Затем ИСЖ смешивают с гелем коллагена в соотношении 1-1,5:1 и выдерживают при комнатной температуре (например, 14-20°С) до получения гомогенной смеси (заявленная ИРС). Наносят заявленную ИРС на предметное стекло тонким слоем. Засекают, например с помощью секундомера, время полного высыхания заявленной ИРС на всей поверхности предметного стекла, получая в результате указанного измерения заявленный временной показатель. Определяют значение КА ИСЖ с помощью предварительно построенной калибровочной кривой.
-0,8283
2
В качестве калибровочной кривой использовали кривую вида y=327,21x R=0,9615 [7], описывающую зависимость времени полного высыхания проб СРС от коллагенолитической активности. Для построения указанной калибровочной кривой готовили серию проб реакционной смеси (8 проб). Каждая из указанных проб состояла из геля коллагена и раствора коллагеназы, в качестве которого использовали коллализин, растворенный в физиологическом растворе. Концентрация коллализина в реакционной смеси подбиралась таким образом, чтобы обеспечить в каждой из проб серии определенную заданную активность указанного фермента (соответственно 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 КЕ/мл) /далее - «заявленная СРС», «пробы заявленной СРС»/. Затем пробы заявленной СРС наносили на предметные стекла (каждую пробу с определенной заданной активностью фермента - на 5 предметных стекол) и фиксировали время полного высыхания каждого предметного стекла.
Определяли среднее время высыхания каждой из проб заявленной СРС, которое рассматривали как временной показатель, соответствующий конкретной заданной активности коллализина. Для построения заявленной калибровочной кривой по оси ординат откладывали среднее время высыхания проб заявленной СРС, по оси абсцисс - заданную активность коллализина (коллагенолитическую активность), соответствующую каждой конкретной пробе заявленной СРС.
КА СЖ устанавливают, откладывая по оси ординат заявленной калибровочной кривой полученное в результате измерения значение заявленного временнóго показателя и определяя соответствующую коллагенолитическую активность на оси абсцисс. Затем сопоставляют полученное значение коллагенолитической активности с нормальными величинами и при значении коллагенолитической активности менее 231,8 КЕ/мл определяют пониженную КА ИСЖ, при значениях указанной активности 231,8-297,8 КЕ/мл определяют нормальную КА ИСЖ, а при значении указанной активности свыше 297,8 КЕ/мл - повышенную КА ИСЖ.
С использованием заявленного способа было обследовано 63 лица (126 глаз) в возрасте от 3 до 78 лет, которые были распределены по группам следующим образом: группа 1 (44 чел.) - УЗЛ; группа 2 (5 чел.) - лица с заболеваниями, сопровождавшимися изменениями соединительной ткани глаза (все пациенты - с первичной открытоугольной глаукомой /далее -«ПОУГ»/); группа 3 (14 чел.) - лица с заболеваниями, сопровождавшимися деструкцией ткани роговицы, в том числе 6 чел. - с эрозией роговицы, 8 чел. - с язвой роговицы на фоне ССГ. Обследование проводилось на базе Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» /ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава/ (отделение микрохирургии глаза) и Мариинской больницы Санкт-Петербурга (отделение микрохирургии глаза). В обследование были включены лица, проходившие профилактические осмотры в указанных учреждениях, и лица, находившиеся в указанных учреждениях на лечении в связи с заболеваниями глаз. Результаты определения КА СЖ подтверждали с помощью контрольного комплексного обследования /далее - «ККО»/, которое включало: визометрию, биомикроскопию, в т.ч. с исполюзованием 1% раствора флюоресцеина натрия; постановку проб Ширмера 1, 2 (определение слезопродукции) и Норна (определение стабильности слезной пленки) [1, 8]; измерение суммарной активности трипсиноподобных протеиназ по методу Эрлангера с соавторами в модификации В.А.Шатерникова [2]. У УЗЛ (группа 1) определение КА СЖ заявленным способом и ККО проводились однократно (при прохождении профилактического осмотра) /далее - «ККО УЗЛ»/; у лиц с наличием патологических изменений со стороны глаз (группы 2, 3) определение КА СЖ заявленным способом и ККО проводилось дважды: на момент обращения в стационар (до проведения каких-либо лечебных мероприятий) /далее - «ККО 1»/ и после проведения индивидуальной комплексной терапии, которая включала в себя (в тех или иных сочетаниях) хирургическое лечение, противоферментную терапию, противовоспалительную терапию, инстилляцию препаратов «искусственной слезы», инстилляцию препаратов, снижающих внутриглазное давление /далее - «ККО 2»/. Результат определения КА СЖ считали подтвержденными, если он коррелировал с клинической картиной со стороны глаза и значениями биохимических показателей, определенных в рамках ККО УЗЛ или ККО 1, ККО 2 [1, 2, 8]. Результат определения расценивали как ошибочный (ложноотрицательный или ложноположительный), если полученные величины КА СЖ противоречили клинико-биохимическим данным ККО УЗЛ или ККО 1, ККО 2. Проводили также хронометрирование процедуры определения КА СЖ у каждого обследуемого с последующим расчетом среднего времени, затрачиваемого на проведение анализа /далее - «длительность процедуры определения КА СЖ по заявленному способу»/.
У всех обследованных лиц групп 1-3 (как с отсутствием, так и с наличием патологических изменений со стороны глаз) параллельно с определением КА СЖ заявленным способом (в те же сроки) проводили определение КА СЖ по способу-прототипу. Результат определения считали подтвержденным или расценивали как ошибочный с использованием тех же клинических и биохимических критериев (данные ККО УЗЛ или ККО 1, ККО 2), как и в заявленном способе. При выполнении хронометрирования фиксировали суммарное время, которое включало: время, затраченное на забор донорского трупного материала (забор аллогенного стекловидного тела) и время на выполнение непосредственно самого анализа ИСЖ с последующим расчетом среднего суммарного времени /далее - «длительность процедуры определения КА СЖ по прототипу»/.
Результаты определения представлены в таблицах 1-3, где в табл.1 показано распределение обследованных лиц по группам в зависимости от отсутствия или наличия патологических изменений со стороны глаз с учетом вида патологии. В табл.2, 3 приведены сравнительные данные, характеризующие точность определения КА СЖ (по группам и суммарную) и длительность процедуры определения КА СЖ при использовании заявленного способа и способа-прототипа.
Из данных табл.2-3 видно, что заявленный способ обеспечивает 100%-ную точность определения КА СЖ независимо от отсутствия или наличия патологических изменений со стороны глаз (вне зависимости от вида патологии). Так, у всех обследованных с помощью заявленного способа УЗЛ (группа 1-44 чел.) КА СЖ находилась в пределах нормы, что было подтверждено результатами ККО УЗЛ. При использовании способа-
прототипа в этой же группе у 9 из 44 человек (20,5%) были выявлены повышенные (по сравнению с нормой) значения КА СЖ, не подтвержденные результатами ККО УЗЛ (клинические патологические изменения со стороны глаз и значимые биохимические патологические отклонения от нормы в СЖ отсутствовали), которые были расценены как ложноположительные результаты определения. Из 5 больных с ПОУГ (группа 2) с помощью заявленного способа у 4 пациентов было выявлено понижение КА СЖ, подтвержденное ККО 1. Указанным больным в комплексную терапию были включены препараты, повышающие ферментативную активность. По результатам ККО 2 была отмечена положительная динамика течения болезни (по данным повторного определения КА СЖ заявленным способом: значения указанного показателя приблизились к нормальным значениям), что свидетельствовало о правильности выбора тактики лечения и, следовательно, о правильности определения КА СЖ на этапе скрининг-диагностики (до начала лечения). У одного больного группы 2 КА СЖ согласно заявленному способу находилась в пределах нормы, что также было подтверждено результатами ККО 1 (за 2 месяца до обследования указанный больной прошел курс плановой терапии по поводу ПОУГ). При применении способа-прототипа понижение КА СЖ зафиксировано у всех 5 больных, в т.ч. у пациента, у которого нормальное значение показателя КА СЖ (определенное заявленным способом) подтверждалось результатами ККО 1 (последний результат определения расценен как ложноотрицательный). По результатам определения КА СЖ заявленным способом в группе больных с деструкцией ткани роговицы (группа 3) повышение КА СЖ было выявлено у 12 из 14 больных, что было подтверждено данными ККО 1. Этим больным в комплексную схему лечения была включена противоферментная терапия (гордокс). Данные ККО 2 свидетельствовали о положительной динамике со стороны глаз (в результате повторного определения КА СЖ заявленным способом установлено снижение КА СЖ до уровня верхней границы интервала нормальных значений), что говорило о целесообразности назначения указанного противоферментного препарата и, тем самым, подтверждало точность определения КА СЖ на этапе скрининг-диагностики. У 2 больных группы 3 показатели КА СЖ, определенные заявленным способом, находились в пределах нормы, что полностью коррелировало с результатами ККО 1. Полученные данные могли быть обусловлены тем, что указанные больные на момент обследования находились на длительном консервативном лечении и получали поддерживающую дозу гордокса. При использовании способа-прототипа повышение КА СЖ было отмечено у всех больных группы 3 (14 чел.), в т.ч. у двух пациентов, у которых повышение КА СЖ не подтверждалось результатами ККО 1 (результаты определения последних расценены как ложноположительные). Результаты хронометрирования (табл.4) показали, что применение заявленного способа сокращает длительность процедуры определения КА СЖ в 1,5-9 раз, что обусловлено отсутствием необходимости забора донорского трупного материала (затрачиваемое время составляет 15 мин-3 ч) и исключением необходимости приготовления КРС прототипа непосредственно в ходе анализа (затрачиваемое время 15-30 мин).
Таким образом, заявленный способ позволяет при его реализации повысить точность определения КА СЖ на 19% при полном отсутствии как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов определения и сократить длительность процедуры определения в среднем в 7,9 раза. Отсутствие ложноположительных и ложноотрицательных результатов определения позволяет избежать, с одной стороны, назначения нецелесообразной противоферментной терапии, с другой стороны, необходимости проведения дополнительного ККО (в случае отсутствия корреляции между клинической картиной со стороны глаз и полученными величинами КА СЖ). Кроме того, скрининг-анализ, обеспечиваемый заявленным способом, способствует своевременному назначению (в случае выявления патологически измененной КА СЖ) противоферментной терапии, которая позволяет затормозить деструктивные процессы тканей роговицы, роговицы. И наконец, применение заявленного способа полностью исключает возможность инфицирования лиц, проводящих анализ (за счет отсутствия контакта с трупным материалом).
Источники информации
1. Сомов Е.Е., Бржеский В.В. Слеза. Физиология. Методы исследования. Клиника. - СПб.: Наука, 1994. - С.5-42.
2. Столярова Е.П. Значение оценки параметров антиоксидантной системы и протеиназно-ингибиторного баланса слезной жидкости для прогноза и лечения заболеваний глаза: Автореф. дис. …канд. мед. наук: 03.00.04 / Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца. - М., 2009. - С.3-4.
3. Twining SS, Fukuchi T, Yue BY et al. Alpha 2-macroglobulin is present in and synthesized by the cornea. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences 1994; Vol.35: P.3226-3233.
4. Воеводина И.А. Использование протеолитических ферментов в консервативном лечении первичной открытоугольной глаукомы: Автореф. дис. …канд. мед. наук: 14.00.08 / Военно-медицинская академия. - СПб., 1998. - С.7-9 (прототип).
5. Справочник ВИДАЛЬ Лекарственные препараты в России. М.: АстраФармСервис, 2003. - С.353, 1180.
6. Ollivier FJ, Brooks DE, Kallberg ME et al. Evaluation of various compounds to inhibit activity of matrix metalloproteinases in the tear film of horses with ulcerative keratitis. American Journal of Veterinary Research, 2003; Vol.64: P.1081-1087.
7. Вадзинский Р.Н. Статистические вычисления в среде Excel. Библиотека пользователя. - СПб.: Питер, 2008. - С.400-404.
8. Сомов Е.Е. Введение в клиническую офтальмологию. СПб.: изд. ПМИ, 1991. - С.95.