СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ САМОПРОИЗВОЛЬНОГО ВЫКИДЫША
METHOD FOR PREDICTION OF SPONTANEOUS MISCARRIAGE

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, клинической иммунологии, и может быть использовано для прогнозирования самопроизвольного выкидыша у беременных как при наличии клинических проявлений данной патологии, так и при ее отсутствии на момент обследования, в сроке гестации 6-12 недель.
Актуальность заявленного способа определяется тем, что самопроизвольный выкидыш относится к основным видам акушерско-гинекологической патологии. Частота этого осложнения беременности в течение многих лет составляет 15-20% от всех желанных беременностей (Сидельникова В.М., Сухих Г.П. Невынашивание беременности: руководство для практикующих врачей. - М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2010. - 536 с.). Развитие данной патологии приводит к тяжелым последствиям для физического (кровотечениям, инфекции) и эмоционального состояния женщины (Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. - М.: Триада, 2005. - 340 с.). Таким образом, прогнозирование самопроизвольного выкидыша является важной проблемой, что позволит профилактировать данное осложнение и предотвратить неблагоприятный исход беременности.
Известен способ прогнозирования исхода беременности у женщин с угрожающим выкидышем ранних сроков (до 12) недель, включающий исследование спермы отца ребенка, путем количественного определения плацентарного альфа-2 микроглобулина (ПАМГ-2). При уровне ПАМГ-2 в сперме мужа менее или равном 8 мкг/мл прогнозируют самопроизвольный выкидыш. При уровне ПАМГ-2 в сперме 16-64 мкг/мл прогнозируют донашивание беременности (Патент №2103686. Российская Федерация. Способ прогнозирования исхода беременности у женщин с угрожающим выкидышем ранних сроков. / Посисеева Л.В., Бойко Е.Л. // Изобретения. Полезные модели. - 1998. - №3, Ч.2. - С.332). Способ имеет недостатки:
- прогнозирование самопроизвольного выкидыша лишь при наличии клинических проявлений данной патологии;
- необходимость обследования отца ребенка;
- исследование ПАМГ-2 не может объективно отражать качество спермы в момент зачатия, т.к. впоследствии его уровень может изменяться при инфекционно-воспалительных процессах, под действием неблагоприятных факторов окружающей среды, в стрессовых ситуациях и др.;
- длительность проведения реакции (18-24 ч).
Известен способ прогнозирования исхода беременности у женщин с угрожающим выкидышем, который включает определение в периферической крови женщины продукции фактора, угнетающего миграцию лейкоцитов, до и после проведения сохраняющей терапии. При его снижении на 25% и более по сравнению с исходным уровнем прогнозируют досрочное прерывание беременности (Патент №2033607. Российская Федерация. Способ прогнозирования исхода беременности у женщин с угрожающим выкидышем. / Барсегян О.К., Сотникова Н.Ю., Кудряшова А.В. // Изобретения. Полезные модели. - 1995. - №11. - С.200-201).
Способ имеет недостатки:
- прогнозирование самопроизвольного выкидыша лишь при наличии клинических проявлений данной патологии;
- необходимость обследования пациентки дважды;
- прогноз невозможно осуществить сразу, т.к. повторное обследование проводится только после проведения сохраняющей терапии;
- высокая индивидуальная вариабельность показателей;
- отсутствие стандартизированных наборов для определения данного показателя, поэтому его применение ограничено авторскими наборами.
Известен способ прогнозирования самопроизвольного выкидыша у женщин, участвующих в программе ЭКО, путем исследования в фолликулярной жидкости содержания специфических иммунных комплексов альфа 2-макроглобулин-иммуноглобулин G (МГ-IgG) и лактоферрин-иммуноглобулин G (ЛФ-IgG). При значении МГ-IgG менее 0,6 мкг/мл, а ЛФ-IgG менее 0,8 мкг/мл прогнозируют вероятность раннего выкидыша (Патент №2394495. Российская Федерация. Способ прогнозирования риска ранних плодовых потерь при индуцированной беременности в программах ЭКО. / Зорина P.M., Маркина Л.А., Зорина В.Н. и др. // Изобретения. Полезные модели. - 2010. - №20).
Способ имеет недостатки:
- применение способа ограничено, т.к. возможно только у женщин, принимающих участие в программах ЭКО;
- инвазивный способ забора исследуемого материала (фолликулярная жидкость);
- неустановленная точность способа.
Известен способ иммуноферментного определения в сыворотке крови цитокина - ИЛ-1β в 1 триместре гестации (6-12 недель) при физиологическом течении беременности. Повышенные показатели данного цитокина коррелируют с самопроизвольным выкидышем в ранние сроки беременности (Fortunate S.J. IL-1β is a better inducer of apoptosis in human fetal membranes than IL-6. / S.J. Fortunate, R. Menon // Placenta. - 2003.- Vol.24 (10). - P.922-928).
Данный способ был выбран  в качестве прототипа. Однако он имеет ряд недостатков:
- высокая индивидуальная вариабельность показателей для уровней данного цитокина в сыворотке крови;
- исследования проводятся только при физиологическом течении беременности;
- неустановленная точность способа.
Техническим результатом является повышение точности прогнозирования самопроизвольного выкидыша.
Заявляемый технический результат достигается тем, что у беременных женщин в сроке 6-12 недель определяют относительное содержание CD45RA+CD62L+ клеток в популяции CD4+ лимфоцитов в периферической крови и при его значении, равном или более 46,7%, прогнозируют самопроизвольный выкидыш с точностью 85,1%, чувствительностью 76,9% и специфичностью 88,9%.
Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать самопроизвольный выкидыш у беременных женщин как при наличии клинических проявлений данной патологии, так и при ее отсутствии на момент обследования, в сроке гестации 6-12 недель по определению относительного содержания CD45RA+CD62L+ клеток в популяции CD4+ лимфоцитов в периферической крови.
Ранее данный показатель не использовался для прогнозирования самопроизвольного выкидыша. В литературе также отсутствуют данные об изменении содержания CD45RA+CD62L+ лимфоцитов при угрозе самопроизвольного выкидыша. В настоящее время известно, что иммунные механизмы играют важную роль в развитии беременности (Сотникова Н.Ю., Кудряшова А.В., 2005). Плацентарный барьер, ограждающий иммунную систему плода от воздействия материнских иммунокомпетентных клеток, не является абсолютно непроницаемым для антигенов плода (Germain S.J. с соавт., 2007). Развитие невынашивания беременности сопровождается повышением проницаемости плаценты и ведет к усиленному поступлению антигенов плода в кровоток беременной женщины, что может определять дифференцировку клеток памяти (Сотникова Н.Ю., и др., 2005). Переход клеток на новую стадию дифференцировки изменяет их функциональные свойства (van Leeuwen R. et al., 2006). Нарушение дифференцировки лимфоцитов может вести к изменению иммунорегуляции, определяя неадекватный иммунный ответ матери на антигены плода, приводя к формированию патологии беременности (Lopez-Jaramillo Р., et al., 2008; Cackovic M., et al, 2008; Sharma А. et al., 2007; Omoy A., 2007; Wilczynski J.R., et al., 2006; Zalel Y. et al., 2008). Мы предполагаем, что раннее изменение характера дифференцировки Т-хелперов, в частности уровня периферических наивных (CD45RA+CD62L+) клеток, у женщин в 1 триместре беременности является одним из механизмов, определяющих развитие самопроизвольного выкидыша, и может отражать нарушение иммунорегуляции, что позволяет прогнозировать самопроизвольный выкидыш.
Способ осуществляется по стандартной методике следующим образом.
1. К 3 мл гепаринизированной крови из кубитальной вены добавляют 3 мл Среды 199 и выделяют обогащенную популяцию лимфоцитов стандартным методом скоростного центрифугирования при 1500 об/мин в течение 20 минут в двойном градиенте плотности фиколл-верографина (Boum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Invest. - 1968. - Vol.21. N 97. - P.77).
6
2. Суспензию лимфоцитов дважды отмывают физиологическим раствором, доводят концентрацию клеток до 1×10 кл/мл. К 0,1 мл полученной суспензии одновременно добавляют по 5 мкл моноклональных антител anti-human CD4, CD62L, CD45RA, коньюгированных с PC5, с FITC, с РЕ соответственно (Caltag Laboratories, USA). Клетки инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте, отмывают в 1 мл физиологического раствора и фиксируют в 0,5 мл фиксирующего раствора CellFix™ (BD Biosciences, Belgium).
3. Определяют относительное (процентное) содержание CD45RA+CD62L+ клеток в CD4+ лимфоцитарном гейте на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson, USA) с использованием программного обеспечения CellQuest Pro.
Использование предлагаемого способа позволяет с высокой точностью 85,1% прогнозировать самопроизвольный выкидыш у беременных женщин как при наличии клинических проявлений данной патологии, так и при ее отсутствии на момент обследования, в сроке 6-12 недель гестации.
Отличительные признаки заявленного способа
Установлен новый прогностический параметр относительного содержания CD45RA+CD62L+ клеток в популяции CD4+ лимфоцитов, при значении которого 46,7% или более, прогнозируют развитие самопроизвольного выкидыша.
Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:
Пример 1. Пациентка В., 29 лет, беременность первая, желанная, в зарегистрированном браке. На момент обследования в женской консультации в сроке 6-7 недель беременности жалоб не предъявляет, клинические признаки угрозы самопроизвольного выкидыша отсутствуют.
Было проведено обследование по заявленному способу:
Уровень CD45RA+CD62L+ лимфоцитов составил 57,3%, что выше заявляемого уровня (>46,7%).
Заключение: прогнозируется самопроизвольный выкидыш.
В сроке 9-10 недель беременности женщина поступила в стационар с клиническими признаками самопроизвольного выкидыша. Начата сохраняющая терапия, без эффекта, произошел самопроизвольный выкидыш.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Пример 2. Пациенка М., 27 лет. Беременность пятая, желанная. Брак зарегистрированный. В анамнезе 1 своевременные роды, 4 медицинских аборта, без осложнений. На момент обследования в женской консультации в сроке 9-10 недель беременности жалоб не предъявляет, клинические признаки угрозы самопроизвольного выкидыша отсутствуют.
Было проведено обследование по заявленному способу:
уровень CD45RA+CD62L+ лимфоцитов составил 12,2%, что ниже заявляемого уровня (<46,7%).
Заключение: развитие самопроизвольного выкидыша не прогнозируется.
Беременность закончилась своевременными родами в 40-41 неделю гестации. Родился живой доношенный мальчик массой 4100 г, ростом 53 см, оценкой по шкале Апгар 8-9 баллов.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Пример 3. Пациентка Ф., 25 лет. Беременность вторая, желанная. В анамнезе 1 медицинский аборт, без осложнений, вегето-сосудистая дистония. Поступила в стационар с диагнозом:
Беременность 6-7 недель, угроза прерывания.
Было проведено обследование по заявленному способу:
уровень CD45RA+CD62L+ лимфоцитов составил 46,7%, что равно заявляемому уровню (=46,7%).
Заключение: Прогнозируется развитие самопроизвольного выкидыша.
При поступлении предъявляла жалобы на боли внизу живота, сукровичные выделения из половых путей в течение двух дней. Проводилась сохраняющая терапия без эффекта, через два дня произошел самопроизвольный выкидыш.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Результаты исследований сведены в таблицу 1.
Показатель
Количество обследованных
Всего женщин
67
Истинно-положительный результат
10
Ложно-положительный результат
7
Истинно-отрицательный результат
47
Ложно-отрицательный результат
3
Итого: точность заявляемого способа - 85,1%
Чувствительность заявляемого способа - 76,9%
Специфичность заявляемого способа - 88,9%
Преимущества заявляемого способа:
1. Высокая точность - 85,1%.
2. Хорошая воспроизводимость метода.
3. Простота в интерпретации результатов обследования.
4. Способ дает возможность прогнозировать самопроизвольный выкидыш как при наличии клинических проявлений данной патологии, так и при ее отсутствии на момент обследования.
5. Предлагаемый способ позволяет своевременно выбрать правильную тактику ведения женщин с риском развития данной акушерско-гинекологической патологии и избежать неблагоприятных исходов беременности.