СПОСОБ ОЦЕНКИ НАРУШЕНИЯ ИМПРЕГНАЦИИ ЗАРОДЫША В СЛИЗИСТУЮ ОБОЛОЧКУ МАТКИ НА ПЕРВЫХ НЕДЕЛЯХ БЕРЕМЕННОСТИ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ, ПОДАВЛЯЮЩЕЙ СОДЕРЖАНИЕ ПРОГЕСТЕРОНА ВСЛЕДСТВИЕ СНИЖЕНИЯ АКТИВНОСТИ 5β-ПРЕГНЕН-3,20-ДИОН-ДЕГИДРОГЕНАЗЫ
METHOD FOR ASSESSING DISTURBED EMBRYO IMPREGNATION INTO UTERINE LINING DURING FIRST WEEKS OF PREGNANCY ACCOMPANYING AGGRAVATED CYTOMEGALOVIRUS INFECTION SUPPRESSING PROGESTERON CONCENTRATION OWING TO REDUCING 5β-PREGNEN-3,20-DION-DEHYDROGENASE ACTIVITY

1. Цель исследования - выявить, что при обострении цитомегаловирусной инфекции происходит снижение активности 5β-прегнен-3,20-дион-дегидрогеназы, снижающей действие прогестерона на слизистую оболочку матки на подготовку импрегнации зародыша, что приводит к замершей беременности.
2. Изобретение относится к медицине, а именно к прогнозу характера течения первых стадий гестации на фоне снижения активности 5β-прегнен-3,20-дион-дегидрогеназы, подавляющей активность прогестерона на подготовку к внедрению зародыша в слизистую оболочку матки.
3. Раскрытие изобретения
Прогестерон оказывает специфическое действие на подготовку эпителия слизистой матки к внедрению зародыша, а также оказывает влияние на рост миометрия. Связь прогестерона с рецепторами эпителиальных клеток слизистой матки происходит при непосредственном влиянии на этот процесс 5β-метаболита (5β-прегнен-3,20-диона). Если активность 5β-метаболита снижается в A и B кольцах прогестерона происходят изменения, что снижает эффективность его влияния на рецепторы слизистой в 10 раз [1-4]. Прогестерон оказывает влияние на формирование кровеносных сосудов в ворсинках [6] и образование в сосудах гладких мышечных клеток [1-4]. Таким образом, прогестерон определяет на ранних этапах беременности формирование жизненно важных систем развивающегося эмбриона: процессы половой дифференцировки зародыша [7], формирование кровеносных сосудов в формирующейся плаценте, пролиферацию эпителия слизистой оболочки матки, подготавливая ложе для принятия зародыша из маточных труб. Подавление активности 5β-метаболита прогестинового ряда нарушает формирование функциональной активности прогестерона к выполнению этих регуляторных процессов в период гестации.
Задачей исследования является определение гистохимическим методом активность 5β-прегнен-3,20-дион-дегидрогеназы на 11-12 неделях гестации в слизистой оболочке матки при обострении хронической цитомегаловирусной инфекции, с целью установить, что под ее влиянием происходит подавление активности 5β-прегнен-3,20-дион-дегидрогеназы, приводящее к снижению содержания прогестерона, что приводит к нарушению импрегнации зародыша в слизистую оболочку матки, нарушения формирования мелких кровеносных сосудов в ворсинках плаценты и формированию замершей беременности.
4. В доступной литературе аналогов по данному вопросу не отмечено.
5. Новая техническая задача - разработать способ оценки угрозы развития эмбриона на первых неделях гестации вследствие подавления активности 5β-прегаен-3,20-дион-дегидрогеназы, приводящей к снижению активного прогестерона. Эти процессы обусловлены обострением хронической цитомегаловирусной инфекции, что приводит к замершей беременности.
6. Осуществление изобретения
6.1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» СО РАМН. Обследовано 15 беременных при сроке гестации 11-12 недель в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией в стадии обострения (основная группа) и 10 беременных на тех же сроках гестации без таковой патологии (контрольная группа). У беременных симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз - обострение цитомегаловирусной инфекции устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности более 65%, а также ДНК цитомегаловируса. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.
6.2. Верификация цитомегаловируса, определение типоспецифических антител класса IgM и IgG, индекса авидности осуществлялись методами иммуноферментного анализа на микропланшетном ридере «Stat-Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), выявление ДНК цитомегаловируса методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).
6.3. Активность 5β-прегнен-3,20-дион-дегидрогеназы определяли гистохимическим методом в слизистой оболочке матки, взятой после аборта у лиц с обострением ЦМВИ. Контролем служила плацента от 10 беременных, не болевших, но принявших решение выполнить аборт.
Реакция выполнялась по следующему плану:
1. На замораживающем микротоме изготовлялись из нефиксированного материала плаценты срезы, которые монтировали на предметное стекло и помещали в инкубационный раствор, состоящий из следующих ингредиентов:
а) 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,6;
б) 5β-прегнен-3α,20α-дион (фирмы «Sigma») 25 мг/1 мл фосфатного буфера;
в) Нитросиний тетразолий (фирма «ICN») 1 мг/мл фосфатного буфера (5 мМоль);
г) НАДФ (фирмы «Serva») 1 мг/мл фосфатного буфера (5 мМоль).
2. Инкубация производилась при 37°C в течение 30 мин.
3. Срезы ополаскивались в дистиллированной воде и заключались в глицерин-желатину.
4. Контрольные срезы инкубировались в среде, содержащей вместо 5β-прегнен-3α,20α-диона фосфатный раствор pH 7,6.
Прототипом подобного типа реакций на выявление дегидрогеназ нами использована рекомендация, предложенная Lojda Z. (1965).
5. После изготовления срезы, заключенные в глицерин-желатину, просматривались под цифровым микроскопом МТ (Япония).
6. Участки препарата, шириной 10 см разрешением 300 пикселей формата Tiff по программе «Scion Corporation)) (USA) цитофотометрировали зондом 0,10×0,10 и автоматически получали результат плотности исследуемых участков.
7. Содержание прогестерона в периферической крови определяли с помощью наборов ЗАО «НВОИммунотех» (Москва).
8. Статистическую обработку данных осуществили по критерию Манна-Уитни, гипотезу о статистической значимости различий двух выборок - с помощью t критерия Стьюдента.
7. В процессе исследования были получены следующие результаты
Исследования показали, что при обострении цитомегаловирусной инфекции при сроке 11-12 недель, который характеризовался наличием IgM к цитомегаловирусу с титром антител IgG 1:1600, индекса авидности 80% и маркера репликации вируса ДНК цитомегаловируса в соскобе цервикального канала матки. В периферической крови беременных определялось снижение прогестерона до 90,5±2,0 нмоль/л (контроль - 180,0±3,0 нмоль/л). При этом на гистологических срезах гистохимическим методом отмечалось снижение 5β-прегнен-3,20-дион-дегидрогеназы до 47,6±0,25 усл. ед. (контроль - 133,0±0,95 усл. ед.) (фигура 1, 2). Это приводило к формированию замершей беременности, заканчивающейся самопроизвольным абортом.
Литература
1. Cheng W., Lau О. Dual control of Lif expression and Lif receptor function regulate Stat-3 activation an the onset of Best Pract Res. Clin Obstet Gynecol. 2000; 14; 5; 815-826.
2. Lee W.S., Harder I.A. Progesterone inhibits arterial smooth muscule cell proliferation. Nat Med. 1997; 3; 1005-1008.
3. Morey A.K., Pedram A. Mesure des concentrations du steroide dans in plasma l′endometre is tissue mammaire. Endocrinol. 1997; 138; 3330-3339.
4. Otsuki M. Saito H. Arteriosclerosis Thromb. Vascular. Biol. 2001; 21; 243-248; Padwick M. Prys-Davies I. Whitehead M.
5. Siiteri P.K., Wilson I. Testosterone formation and metabolism during male sexual differentiation in the human embryo. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1974; 38.
6. Vazquez F., Rodriguez-Manzaneque J. Progesterone regulates proliferation of endothelial cells. Arterioscler. Thromb Vase. Biol. 1999; 19; 1925-1929.
7. Wright F., Giacomini M. Antihormone activity of progesterone and progestins In: Bardin C. Milgrom E.E. Mauvais-Iarvis P. Progesterone and progestions Raven Press: New York; 1983; 121-134.
8. (27) Posad C., Smitz I. Human Reprod. 2000; 15(suppli); 129-148.
9. (2) Adams M.R., Golden D. Circulation. 1995; 92; 1-627.
10. (11) Friedler S., Ravel. A. Human Reprod. 1999; 14; 1944-1948.
Пример 1.
Беременная О., 21 год.
На 11 неделе гестации отмечалось обострение цитомегаловирусной инфекции с титром антител к цитомегаловирусу 1:1600. В формирующейся плаценте отмечалось снижение 5β-прегнен-3,20-дион-дегидрогеназы гистохимическим методом до 47,6 усл. ед. при контроле - 133,0 усл. ед. Количество прогестерона снижалось до 90,5 нмоль/л; контроль - 180,0 нмоль/л. Задерживалось формирование кровеносных сосудов в ворсинках хориона и импрегнация зародыша в слизистую оболочку матки, что привело к замершей беременности и выкидышу на 12 неделе гестации.
Пример 2.
Беременная К., 20 лет.
Обострения цитомегаловирусной инфекции не отмечалось. Аборт был выполнен на 11 неделе по ходатайству беременной. Гистохимически в формирующейся плаценте содержание 5β-прегнен-3,20-дион-дегидрогеназы определялось в пределах 133,0 усл. ед. Количество прогестерона - 180,0 нмоль/л. Признаков гибели эмбриона на первых неделях гестации не отмечалось.
На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция в плаценте на 12 неделе беременности на 5β-прегнен-3,20-дион-дегидрогеназу при обострении цитомегаловирусной инфекции с титром антител 1:1600. На момент исследования активность 5β-прегнен-3,20-дион-дегидрогеназы составляла 47,6±0,25 усл. ед., при контроле - 133,0±усл. ед., что снижало содержание активного прогестерона до 90,5±2,0 нмоль/л и приводило к замершей беременности.
На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция на 12 неделе беременности на активность 5β-прегнен-3,20-дион-дегидрогеназу исчисляемой цитофотометрически в 133,0±0,95 усл. ед. Обострения цитомегаловирусной инфекции на всем протяжении гестации у беременной не отмечалось. Беременность протекала без осложнений и закончилась вовремя нормальными родами.