Регуляция аденилатциклазной сигнальной системы пептидами инсулинового семейства, эпидермальным фактором роста, лептином и ее функциональные нарушения в лимфоцитах пациентов с сахарным диабетом 2-го типа

Регуляция аденилатциклазной сигнальной системы пептидами инсулинового семейства, эпидермальным фактором роста и лептином и ее функциональные нарушения в лимфоцитах пациентов с сахарным диабетом 2-го типа

Д.б.н. Л.А. КУЗНЕЦОВА1, д.б.н. С.А. ПЛЕСНЕВА, к.б.н. О.В. ЧИСТЯКОВА, Т.С. ШАРОВА, проф. М.Н. ПЕРЦЕВА

Regulation of the adenilate cyclase signal system by peptides of the insulin family, epidermal growth factor, and leptin and its functional disturbances in lymphocytes from patients presenting with type 2 diabetes mellitus

L.A. KUZNETSOVA, S.A. PLESNEVA, O.V. CHISTYAKOVA, T.S. SHAROVA, M.N. PERTSEVA

Лаборатория молекулярной эндокринологии Учреждения Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Впервые показано стимулируюшее влияние пептидов инсулинового семейства — инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1 и релаксина, а также эпидермального фактора роста (ЭФР) на активность аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС) в лимфоцитах контрольной группы испытуемых. Эффект гормонов усиливался в присутствии гуанилилимидо-дифосфата (ГИДФ). Впервые выявлено стимулируюшее действие лептина на активность АЦ в лимфоцитах контрольной группы, которое блокировалось антителами к рецептору лептина. Базальная активность АЦ увеличивалась в лимфоцитах больных сахарным диабетом 2-го типа (СД2), а стимуляция активности фермента изученными гормонами как без ГИДФ, так и в его присутствии резко снижалась. Влияние лептина на АЦ при СД2 обнаруживалось только при концентрации 10-8 М, и антитела к рецептору лептина блокировали стимуляцию АЦ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что выявленные в лимфоцитах у пациентов с СД2 нарушения АЦ-стимулирующего действия гормонов связаны с функциональными дефектами, локализованными в случае лептина на рецепторном уровне, а в случае пептидов инсулинового семейства и ЭФР, скорее всего, на уровне G¡-белка и его сопряжения с АЦ. Эти данные подтверждают концепцию авторов о том, что молекулярные дефекты в гормональной АЦСС являются одной из основных причин развития СД2.

Ключевые слова: аденилатциклазная сигнальная система, пептиды инсулинового семейства, эпидермальный фактор роста, лептин, лимфоциты, сахарный диабет 2-го типа.

This study showed for the first time the stimulating action of peptides of the insulin family, insulin-like growth factor-1, re-laxin, and epidermal growth factor (EGF) on the activity of the adenilate cyclase signal system (ACSS) in lymphocytes from the subjects of the control group. These hormonal effects were enhanced in the presence of guanylimidodiphosphate (GIDP). Moreover, leptin was for the first time shown to increase adenilate cyclase activity in lymphocytes from the control subjects and inhibition of this action by antibodies against leptin receptors. The patients presenting with type 2 diabetes mellitus (DM2) showed the enhanced baseline activity of adenilate cyclase in their lymphocytes whereas its stimulation by the above hormones, both in the presence and absence of GIDP, sharply declined. The influence of leptin on adenilate cyclase activity in patients with DM2 was apparent only at its concentrations above 10-8 M; it was inhibited by antibodies to leptin receptors. The results of this study indicate that disturbances of hormonal stimulation of adenilate cyclase activity in lymphocites of diabetic patients may be due to functional defects located at the receptor level in the case of leptin and at the level of Gs protein and its coupling to adenulate cyclase in case of peptides of the insulin family and GF. These findings confirm the concept being developed by the author according to which molecular defects in the hormone-dependent ACSS system constitute one of the main causes underlying the development of DM2.

Key words: adenilate cyclase signal system, peptides of the insulin family, epidermak growth afctor, leptin, lymphocytes, type 2 diabetes mellitus.

Инсулин, инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1) и релаксин — пептиды инсулинового семейства, имеющие структурно-функциональное сходство. Инсулин контролирует углеводный и липидный метаболизм; ИФР-1 оказывает преимущественно ростстимулирующий эффект, а также регулирует глюкозный гомеостаз и применяется при лечении сахарного диабета (СД) [1]. Релаксин,

функционально близкий к инсулину, регулирует у позвоночных репродуктивную систему, и его уровень положительно коррелирует с чувствительностью организма к инсулину, особенно при СД 2-го типа (СД2) [2]. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) стимулирует клеточную пролиферацию с участием аденилатциклазы (АЦ) и цАМФ-зависимого механизма [3]. Лептин, продуцируемый адипоцитами,

© Коллектив авторов, 2011

1e-mail: luda.kuznetsova@mail.ru

обладает широким спектром действия, включая регуляцию энергетического баланса, метаболизма глюкозы и функции инсулина [4].

Регуляция пептидами инсулинового семейства аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС) при СД2, за исключением наших работ, не изучена, а влияние лептина на АЦСС практически не исследовалось ни в норме, ни при СД2 [5—7]. Установлено, что активирующий АЦСС эффект инсулина и ИФР-1 реализуется через следующую сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа ^ ингибирующий ГТФ-связывающий белок Ру-димер) ^ фос-фатидилинозитол 3-киназа ^ протеинкиназа С £ (дзета) ^ стимулирующий ГТФ-связывающий белок ^ АЦ [5, 6, 8]. Согласно развиваемой нами концепции, АЦСС участвует в регуляции пептидами инсулиновой природы основных процессов в клетке (метаболизм, клеточный рост, апоптоз, расслабление гладких мышц) [9].

СД2 можно считать «семейной» формой болезни, связанной с ожирением и являющейся причиной целого ряда функциональных нарушений. Патогенез заболевания сложен и полностью не выяснен. Наша лаборатория в течение ряда лет занимается изучением молекулярных дефектов в АЦСС при СД2 у человека, а также на крысиных моделях [10, 11]. Согласно современной точке зрения, при СД2 функции почти всех отделов эндокринной системы нарушены [12]. Нарушения функций ин-сулиновой системы подтверждаются результатами исследований, которые выявили молекулярные дефекты регуляторных функций не только инсулина, но и родственных пептидов (ИФР-1, релаксин) на уровне АЦСС [10, 13]. Совокупность имеющихся к настоящему времени данных привели нас к выводу о полигормональном генезе сахарного диабета [11, 14].

Представления о патогенезе СД2 значительно расширяются благодаря исследованиям, проводимым на клеточном уровне. Объектом подобных исследований, как правило, служат клетки крови, в том числе лимфоциты. Лимфоциты играют важную роль при развитии целого ряда заболеваний, для которых характерны иммунорегуляторные взаимодействия и процессы иммуноаллергического воспаления. К таким заболеваниям можно отнести бронхиальную астму, СД2, инсулиновую и лептиновую резистентность, ожирение и др. Особый интерес к этим клеткам можно объяснить: 1) полноценностью метаболизма, что дает основания говорить о лимфоците как о своеобразном ферментном «зеркале» многих тканей; 2) присутствием в лимфоцитах АЦСС, чувствительной к целому ряду гормонов; 3) высокой жизнеспособностью лимфоцитов и наличием доступных методов получения достаточного количества этих клеток; 4) обнаружением нарушения функций ферментных систем лимфоцитов, что

является одним из звеньев в развитии патогенеза СД2 [15, 16]. Цель работы состояла в исследовании функционального состояния механизмов передачи гормональных сигналов, реализуемых через АЦСС в лимфоцитах контрольной группы лиц и пациентов с СД2.

Материал и методы

В исследовании участвовали пациенты контрольной группы и больные со средне-тяжелой формой СД2. Диагноз устанавливали на основании клинических проявлений болезни и данных лабораторного исследования (табл. 1).

Лимфоциты получали методом центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографин. После градиента обогащенную общую популяцию лимфоцитов отмывали центрифугированием в буфере для определения активности АЦ.

Активность АЦ определяли по методу [10] в реакционной смеси (конечный объем 50 мкл, мМ): 25 трис-НС1 (рН 7,5), 5 М§С12, 0,1 АТФ, 1 цАМФ, 20 креатинфосфата, 1 мкКи [а-32Р]АТФ, 0,2 мкг/мл кре-атинфосфокиназы и 15—20 мкг мембранного белка, при 37 °С в течение 3 мин при действии гормонов и 10 мин при влиянии негормональных агентов. Активность АЦ оценивали по количеству образовавшегося цАМФ и выражали в пикомолях цАМФ/мг белка/мин. Каждый эксперимент выполнен 2 раза в 4 параллельных пробах.

Для определения функции отдельных компонентов АЦСС использовали комплекс функциональных тестов. При действии форсколина выявлялась функция каталитического компонента АЦ. Использование фторида натрия и гуанинового ну-клеотида гуанилилимидодифосфата (ГИДФ) позволяло оценить участие ГТФ-связывающих G-белков. Влияние пептидов (10-8 М) на активность АЦ выявлялось при коротком сроке действия — 3 мин. О сопряжении между компонентами АЦСС судили по потенцированию (усилению) эффекта ГИДФ при действии исследуемых пептидов на АЦ.

Антитела к рецепторам лептина добавляли к пробам с мембранами лимфоцитов и преинкубиро-вали в течение 10 мин при комнатной температуре при перемешивании, затем вносили гормон и опре-

Таблица 1. Клиническая характеристика контрольной группы лиц и пациентов с СД2

Показатель Контроль

Пол, м/ж 12/22 25/27

Возраст, годы 66,7+2,9 65,9+5,7

Масса тела, кг 67,4+6,97 72,0+7,3

Рост, см 166,0+7,1 163,3+3,8

Индекс массы тела, кг/м2 24,3+1,6 28,6+2,9

Гликемия, ммоль/л 4,75+0,25 7,3+1,35

деляли активность АЦ. Контролем служили пробы с 25 мМ трис-НС1, рН 7,4. Содержание белка определяли методом Лоури.

Все данные представлены в виде средней + стандартная ошибка средней (М+m). Различия в пределах контрольной группы при действии пептидов и между контрольной и диабетической группами были статистически обработаны с использованием программы ANOVA и считались достоверными при р<0,05.

В работе использованы реактивы: креатин-фосфат, креатинфосфокиназа (3500 Ед/мг белка), ГИДФ, форсколин, трис-НС1, окись алюминия для колоночной хроматографии, АТФ, цАМФ, ими-дазол, кристаллический инсулин человека, ЭФР, ИФР-1 и лептин от фирмы «Sigma» (США). Кристаллический релаксин 2 человека был любезно предоставлен доктором J. Wide (Австралия). Антитела к рецепторам лептина (мышь) в разведении 1:1000 («Sigma - Aldrich», США). а-[32Р]АТФ (4 Ки/ ммоль) от фирмы «Изотоп» (Россия).

Результаты и обсуждение

Исследование АЦСС мембран лимфоцитов контрольной группы пациентов показало, что негормональные агенты форсколин, фторид натрия и ГИДФ (табл. 2), а также пептиды — инсулин, ИФР-1, релаксин и ЭФР (рис. 1), оказывают стимулирующее влияние на активность АЦ. Эффект пептидов усиливался в присутствии ГИДФ.

У пациентов с СД2 обнаружено увеличение ба-зальной активности АЦ, что свидетельствует о повышенной каталитической функции фермента. Повышение каталитической способности АЦ при СД2 может происходить за счет влияния гипергликемии,

Таблица 2. Влияние in vitro форсколина, фторида натрия и ГИДФ на активность АЦ в лимфоцитах контрольной группы лиц и пациентов с СД2

Агенты, М

Активность АЦ, пикомоль цАМФ/мг/мин

Без влияния

Форсколин, 10-

NaF, 10-

ГИДФ, 10-

контроль

13,1+1,2 27,7+2,2

рд—к=0,00000

37,0+2,0 55,9+1,4

ра к=0,00000 р =0,00000

75,4+5,3 53,3+2,5

ра к=0,00000 ра д=0,00000

22,5+2,1 38,7+1,9

ра к=0,00000 р =0,00000

как было показано ранее [16]. Наряду с этим выявлено снижение стимулирующего влияния фторида натрия на АЦСС при сопряжении с Gs-белком (см. табл. 2). Эффекты форсколина и ГИДФ не изменялись. У пациентов с СД2 снижалось стимули-

Рис. 1. Влияние in vitro пептидов инсулинового семейства и ЭФР, а также совместно пептидов и ГИДФ на активность АЦ в лимфоцитах контрольной группы лиц и пациентов с СД2.

По вертикали: % стимуляции фермента, рассчитанный по разности между стимулированной и базальной активностью АЦ в контроле и при СД2. По горизонтали: влияние агентов, М: 1 — ГИДФ, 10-6; 2 — инсулин, 10-8; 3 — ИФР-1, 10-8; 4 — релаксин, 10-8; 5 — ЭФР, 10-8; 6 — инсулин + ГИДФ; 7 — ИФР-1 + ГИДФ; 8 — релаксин +ГИДФ; 9 — ЭФР + ГИДФ. * — достоверные отличия активности АЦ при СД2 от контрольных величин. Величина базальной активности АЦ в лимфоцитах составляла у контрольной группы лиц и пациентов с СД2 13,0±1,4 и 30,2±5,3 пикомолей цАМФ /мг белка/мин соответственно.

Примечание. В скобках — % стимуляции фермента, рассчитанный по разности между стимулированной и базальной активностью АЦ в контроле и при диабете. рд—к — разница между базальной активностью АЦ при СД и контроле; ра—к, ра—д — разница между активностью АЦ при действии агентов и базальной активностью фермента в контроле и при СД соответственно.

Рис. 2. Влияние in vitro антител к рецептору лептина на стимуляцию лептином активности АЦ в лимфоцитах контрольной группы лиц и пациентов с СД2.

1 — контроль; 2 — СД2; 3 — контроль+антитела; 4 — СД2+антитела.

По вертикали: % стимуляции фермента, рассчитанный по разности между стимулированной и базальной активностью АЦ в контроле и при СД2. * — достоверные отличия активности АЦ при СД2 от контрольных величин; * — достоверное влияние антител на активность АЦ в контроле и при СД2.

рующее действие исследованных пептидов, а потенцирование их эффектов в присутствии ГИДФ практически отсутствовало (см. рис. 1).

Лептин in vitro (3 мин) достоверно стимулировал активность АЦ при концентрациях 10-11—10-8 М в мембранах лимфоцитов контрольных испытуемых (рис. 2). Для доказательства участия рецепторов леп-тина в стимуляции АЦ были применены специфические антитела. Обработка мембран антителами вызывала отчетливое подавление стимуляции АЦ леп-тином. Представленные данные свидетельствуют об участии рецепторов лептина в стимулирующем влиянии гормона на АЦ в лимфоцитах при изученных концентрациях у контрольной группы пациентов. При СД2 на фоне увеличения активности АЦ лептин не стимулировал фермент при концентрациях 10-11— 10-9 М (см. рис. 2). Ослабленный АЦ-стимулирующий эффект выявлялся только при 10-8 М. Антитела блокировали это влияние гормона.

Таким образом, при СД2 наблюдаются изменения в регуляции АЦ: на фоне возрастания базальной активности фермента влияния изученных гормонов инсулинового семейства, ЭФР и лептина, а также фторида натрия на АЦСС ослабевают. Эти данные свидетельствуют о нарушении АЦ-стимулирующего действия как негормонального агента (фторида натрия), так и гормонов не только инсулиновой группы, но и лептина и ЭФР. Полученные результаты могут служить подтверждением нашей гипотезы о системном ответе эндокринной системы организма на дефекты в функционировании АЦСС при действии гормонов различной природы и по-

лигормональном генезе молекулярных дефектов в АЦСС. Можно предположить, что нарушения в АЦ-стимуляции гормонами возникают как на ре-цепторных (что видно на примере лептина), так и на пострецепторных этапах передачи сигналов через АЦСС, и конкретно — на этапе взаимодействия Gs-белка и АЦ. Снижение функции Gs-белка при нарушении гормональной стимуляции АЦ подкрепляют данные о том, что чувствительность фермента к фториду натрия также снижается.

Выводы

1. Впервые показано стимулирующее влияние пептидов инсулинового семейства, ЭФР и лептина на активность АЦ в лимфоцитах человека.

2. При СД2 в лимфоцитах человека увеличивается базальная активность АЦ и снижается чувствительность АЦСС к фториду натрия, пептидам ин-сулинового семейства, ЭФР и лептину. Нарушения гормональной регуляции активности АЦ при СД2 связаны с функциональными дефектами, локализованными в случае лептина на рецепторном уровне, а в случае пептидов инсулинового семейства и ЭФР, скорее всего, на уровне Gs-белка и его сопряжения с АЦ. 8

Работа поддержана грантами: РФФИ 10-0401052 и «Фундаментальные науки — медицине», 2011 г. Благодарим Е.А. Манову, к.м.н., врача-эндокринолога Клинической больницы РАН, Санкт-Петербург, за подбор больных и помощь в получении экспериментального материала.

ЛИТЕРАТУРА

1. Rajpathak S.N., Gunter M.J., Wylie-Rosett J. et al. The role of insulin-like growth factor-1 and its binding proteins in glucose homeostasis and type 2 diabetes. Diabetes Metab Res Rev 2009; 25: 3—12.

2. Sherwood O.D. Relaxin's physiological roles and other diverse actions. Endocrine Reviews 2004; 25: 205—234.

3. Chaturvedi D., Edwin F, Sun H, Patel T.B. Analysis of EGF receptor interactions with alpha subunit of the stimulatory GTP binding protein of adenylyl cyclase, Gs. Methods Mol Biol 2006; 327: 49—59.

4. Villanueva E.C., Myers M.G. Leptin receptor signaling and the regulation of mammalian physiology. Int J Obes 2008; 32: 8—12.

5. Pertseva M.N., Shpakov A.O., Plesneva S.A., Kuznetsova L.A. A novel view on the mechanism of action of insulin and other insulin superfamily peptides: involvement of adenylyl cyclase signaling system. Comp Biochem Physiol 2003; 134: 11—34.

6. Pertseva M.N., Shpakov A.O., Kuznetsova L.A. et al. Adenylyl cyclase signaling mechanisms of relaxin and insulin action: similarities and differences. Cell Biol Internat 2006; 30: 533— 540.

7. Illiano G., Naviglio S., Pagano M. et al. Leptin affects adenylate cyclase activity in H9c2 cardiac cell line: effects of short- and long-term exposure. Am J Hypertens 2002; 15: 638—643.

8. Плеснева С.А., Кузнецова Л.А., Шпаков А.О. и др. Изучение структурно-функциональной организации аденилатциклаз-ного сигнального механизма действия инсулиноподобного фактора роста 1, обнаруженного в мышечной ткани представителей позвоночных и беспозвоночных. Журн эвол биохим и физиол 2008; 44: 459—466.

9. Перцева М.Н. Гипотеза о ключевой координирующей роли аденилатциклазного сигнального механизма и цАМФ в регу-ляторном действии пептидов инсулинового суперсемейства на фундаментальные клеточные процессы: клеточный рост, апоптоз, метаболизм. Журн эвол биохим и физиол 2000; 36: 494—503.

10. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А. и др. Идентификация нарушений в гормоночувствительной аденилатци-клазной сигнальной системе в тканях крыс с диабетом 1 и 2 типов, используя функциональные тесты и синтетические нанопептиды. Технологии живых систем 2007; 4: 96—108.

11. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Концепция молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как причин эндокринных заболеваний. Рос физиол журн им. И.М. Сеченова 2004; 90: 446.

12. Deedwania P. Hypertension, dyslipidemia, and insulin resistance in patients with diabetes mellitus or the cardiometabolic syndrome:

benefits of vasodilating ß-blockers. J Clin Hypertens (Greenwich) 2011; 13: 52—59.

13. Плеснева С.А., Кузнецова Л.А., Шпаков А.О. и др. Аденилат-циклазные сигнальные механизмы действия пептидов инсулинового семейства и их функциональные нарушения в миомегрии беременных женщин при сахарном диабете второго типа. Рос физиол журн им. И.М. Сеченова 2008; 94: 1126—1136.

14. Перцева М.Н., Шпаков А.О. Гипотеза эволюционного происхождения ряда болезней человека и животных. Журн эвол биохим и физиол 2010; 46: 261—267.

15. Berstein L.M., Pravosudov I.V., Kryukova O.G. Hormonal regulation of adenylate cyclase activity in circulating lymphocytes and its interrelationship with hormone sensitivity of tumor tissue in colorectal cancer patients. Neoplasma 1995; 42: 57—61.

16. Marcil J., Anand-Srivastava M.B. Lymphocytes from spontaneously hypertensive rats exhibit enhanced adenylyl cyclase-Gi protein signaling. Cardiovasc Res 2001; 49: 234—243.

17. Kawabe J., Aizawa Y, Takehara N. et al. Glucose modifies the cross-talk between insulin and the beta-adrenergic signaling system in vascular smooth muscle cells. J Hypertens 2000; 18: 1457— 1464.