Клональное микроразмножение редких и исчезающих видов растений

УДК 57.085.23

КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ

Т.Т. ДОАН1, Е.А. КАЛАШНИКОВА1, О.И. МОЛКАНОВА2

Рассматривается вопрос о влиянии гормонального состава питательной среды на морфогенетический потенциал изолированных эксплантов диоскореи нипонской, диоскореи кавказской и бересклета карликового. Установлено, что для диоскореи с целью получения стабильного коэффициента размножения и формирования растений с правильной морфологией целесообразно в питательную среду в качестве цитокинина добавлять препарат дропп в концентрации 0,5 мг/л в сочетании с НУК 0,5 м/л, а для бересклета — препарат цитодеф в концентрации 0,5 мг/л. Для формирования микроклубней необходимо присутствие в питательной среде ИМК в концентрации 3 мг/л.

Ключевые слова: диоскорея, бересклет, морфогенез, микроразмножение, адвентивные почки, пазушные почки, микроклубни, изолированные экспланты, in vitro.

В настоящее время сохранение биоразнообразия растений и создание генетических банков in vitro является одним из перспективных направлений биотехнологии, в частности, метод клонального микроразмножения, который позволяет в кратчайшие сроки получить большое количество растений при недостатке исходного материала и потомство, генетически идентичное исходному виду или форме. Стратегия сохранения биоразнообразия отражена в различных нормативных документах, таких как «Национальная стратегия по сохранению биоразнообразия России» (2001) и «Стратегия ботанических садов России по сохранению биоразнообразия растений» (2003). Задачами этих программ являются: формирование единого банка данных; инвентаризация редких видов и разработка системы критериев для их выявления и определения уровня их охраны; изучение биологических особенностей редких видов и механизмов действия на них лимитирующих факторов; разработка биологических принципов и способов сохранения редких видов; разработка единых методик работы с редкими и исчезающими видами растений при проведении популяционных исследований, интродукции и культивировании in vitro [5].

К редким относятся растения из семейства Dioscoreaceae и Celastraceae, в частности, диоскорея нипонская, диоскорея кавказская, а также бересклет карликовый, которые занесены в Красную книгу РФ. Кроме того, диоскорея является ценной лекарственной культурой, богатой биологически активными веществами, например, диосгенином, который накапливается в различных тканях и органах этих растений и обладает противоопухолевым действием, снижает содержание холестерина в крови, а также усиливает устойчивость растений к действию стрессовых абиотических и биотических факторов окружающей среды и др. [1, 3, 4, 7].

Цель исследования — изучить влияние гормонального состава питательной среды на морфогенетическую активность изолированных эксплантов и разработать регламент клонального микроразмножения изучаемых растений.

Методика

Объектами исследований служили растения диоскореи нипонской (Dioscorea nipponica), диоскореи кавказской (Dioscorea caucasia) и бересклета карликового (Euonymus nana Bieb.). В качестве первичного экспланта использовали молодые побеги длинной 1 см, содержащие одну или две пазушные почки. Стерилизацию растительного материала проводили в растворе KMnO4 в течение 20 мин, промывали в дистиллированной воде, после чего помещали в 0,1%-й раствор сулемы на 7 мин, а затем трижды промывали стерильной дистиллированной водой. Экспланты культивировали на модифицированной питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга, витамины — по Гамборгу, а также сахарозу — 3%, агар — 0,7%. Изучали влияние гормонального состава питательной среды на индукцию образования пазушных побегов, адвентивных почек и микроклубней. В качестве веществ с цитокининовой активностью использовали препараты дропп, цитодеф и 2iр в концентрациях 0,5 и 1,0 мг/л в сочетании с НУК 0,5 мг/л. Экспланты культивировали при температуре 24 °С, 16-часовом фотопериоде, освещении белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 3 тыс. лк.

Пересадку микрокультуры осуществляли с подбором оптимального времени культивирования для вида растений, которое определялось скоростью роста микрорастений.

Опыты проводили в четырехкратной повторности. Данные экспериментов представлены в виде x ± t05Sx, где x — среднее значение, Sx — ошибка средней, t05 — значение критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Исследования показали, что гормональный состав питательной среды приводит к изменению морфофизиологических процессов, которые проявлялись: 1) в формировании каллусной ткани в основании первичного экспланта с одновременной регенерацией растений; 2) в индукции развития существующих в растении меристем; 3) в формировании почек или микроклубней de novo.

Экспериментально установлено, что для диоскореи нипонской и диоскореи кавказской из всех изучаемых цитокининов наибольшей стимулирующей активностью индуцировать образование клубней и побегов обладал препарат дропп. В этих вариантах учитываемый показатель находился в пределах 3-4 шт., в то время как в вариантах с присутствием в питательной среде 2iр или препарата цитодеф частота образования клубней в среднем составила 1-2 шт. на один эксплант. Показано, что с увеличением концентрации цитокининов в питательной среде (с 0,5 до 1,0 мг/л во всех вариантах) коэффициент размножения увеличивался, однако при этом наблюдалось формирование мелких клубней и небольших по размеру побегов.

Исследования показали, что гормональный состав питательной среды оказывает существенное влияние на процесс формирования микроклубней [2, 6, 8], который зависит от исследуемого генотипа. Так, для диоскореи нипонской было характерно формирование микроклубней двух типов: 1) у основания стебля (рис. 1 а), 2) воздушные клубни в пазухе листьев (рис. 1 б). У диоскореи кавказской формирование микроклубней, как правило, происходило у основания побега (рис. 1 в, г).

Известно, что формирование клубней находится под контролем ауксинов. Поэтому представлялся интерес изучить влияние этих гормонов на индукцию образования микроклубней de novo в условиях in vitro. В работе испытывали ИУК и ИМК в различных концентрациях (3-7 мг/л). В результате исследований были установле-

ны некоторые закономерности: 1) с увеличением концентрации изучаемых ауксинов в питательной среде до 5 мг/л повышалась способность экс-плантов формировать микроклубни; 2) дальнейшее увеличение концентрации ауксинов до 7 мг/л приводило к снижению учитываемого показателя; 3) присутствие в питательной среде ИУК оказывало влияние на формирование воздушных микроклубней в пазухе листьев, а ИМК — у основания стебля.

Таким образом, для получения стабильного коэффициента размножения и формирования растений с правильной морфологией, целесообразно в питательную среду в качестве цитокинина добавлять препарат дропп в концентрации 0,5 мг/л в сочетании с НУК 0,5 м/л, а для формирования микроклубней — ИМК в концентрации 3 мг/л.

Аналогичные исследования по влиянию гормонального состава питательной среды на морфогенетическую активность изолированных экслантов были проведены и с бересклетом карликовым. Исследования показали, что гормональный состав питательной среды приводит к изменению морфофизиологических процессов, которые проявлялись: 1) в формировании каллусной ткани в основании первичного эксплан-та с одновременной регенерацией растений; 2) в индукции развития существующих в растении меристем; 3) в формировании вторичных боковых побегов (см. таблицу).

Экспериментально установлено, что оптимальной средой на первом этапе клонального микроразмножения бересклета карликового была среда, содержащая препарат цитодеф в изучаемых концентрациях. В этих условиях наблюдали формирование на одном экспланте от 3 до 5 шт. побегов, которые развивались из существующих

Влияние гормонального состава питательной среды на морфогенетическую активность изолированных эксплантов бересклета карликового

Препарат, мг/л Среднее количество побегов на 1 эксплант, шт. Средняя высота побегов, см Формирование каллусной ткани

2ір 1,G 2,3 і G,3 1,9 і G,1 і*

Дропп G,5 12,1 і 2,4 G,1 і G +

Дропп 1,G 18,3 і 3,G G,3 і G,1 +

Цитодеф G,5 3,6 і G,2 2,3 і G,2 -

Цитодеф 1,G 4,1 і G,5 2,5 і G,3 +

* + сильное образование каллусной ткани; ± среднее образование каллусной ткани; - отсутствие образования каллусной ткани.

а б в г

Рис. 1. Формирование микроклубней in vitro: а, б — диоскорея нипонская, в, г — диоскорея кавказская

меристем первого и второго порядка, средняя высота которых составляла 2,3-2,5 см (рис. 2 а, б).

а б в г д

Рис. 2. Формирование пазушных и адвентивных почек на среде МС, содержащей различные цитокинины: а — цитодеф 0,5 мг/л, б — цитодеф 1,0 мг/л, в — 2|р 1,0 мг/л, г — дропп 0,5 мг/л,

д — дропп 1,0 мг/л

В вариантах, в состав которых входил 21р, развитие побегов второго порядка нами не было отмечено. Как правило, побеги формировались из существующих меристем первичного экспланта, и средняя высота этих побегов не превышала 2 см (рис. 2 в). В основании побега было отмечено формирование каллусной ткани средней интенсивности.

Особо следует отметить вариант питательной среды, в состав которой входил препарат дропп. Уже на 14-е сут. с начала культивирования было отмечено сильное формирование каллусной ткани не только в основании экспланта, помимо этого клетки сегментов стебля из дифференцированного состояния переходили в дедиф-ференцированное. Причем сформировавшаяся каллусная ткань зеленела на свету и имела плотную консистентность. Кроме того, в хорошо пролиферирующей кал-лусной ткани под действием препарата дропп наблюдали массовое образование адвентивных почек, среднее число которых составило от 12 до 19 шт. на один экс-плант (рис. 2 г, д). Развитие адвентивных почек происходило медленно, и лишь через 4 нед. было отмечено формирование укороченных побегов, размер которых не превышал 3 мм.

Таким образом, оптимальные условия, обеспечивающие повышение коэффициента размножения и формирование хорошо развитых микропобегов бересклета карликового, предусматривают присутствие в питательной среде препарата цитодеф в концентрации 0,5 мг/л.

Заключение

Исходя из представленных экспериментальных данных, можно сделать вывод о том, что с увеличением концентрации изучаемых цитокининов в питательной среде (с 0,5 до 1,0 мг/л во всех вариантах) коэффициент размножения увеличивается, однако при этом формируются мелкие клубни (растения диоскореи) и множество адвентивных почек (растения бересклета). Установлено, что реализация морфогенетического потенциала растений зависела от генотипических особенностей растения-донора и соответствующей оптимизации питательной среды по гормональному составу.

1. Васильева И.С., ПасешниченкоВ.А. Стероидные гликозиды растений и культуры клеток диоскореи, их метаболизм и биологическая активность // Успехи биологической химии. 2000. Т. 40. С. 153-204.

2. Грубишич Д., Чулафич Л., Боевич Д.-Цветич. Проявление признака образования воздушных корней у реликтовых видов диоскореи балканской (Dioscorea balcanica Kosanin) и диоскореи кавказской (Dioscorea caucasica Lipsky) // Физиология растений. 1993. Т. 40. № 2. С. 283-287.

3. Крылова И.Л. Dioscorea caucasica lipsky. Ареал, морфология, биология и эколого-ценотическая характеристика. Материал Растительных ресурсов. 1996. Вып. 4. Т. 32. С. 1-13.

4. Лещанкина В.В., Лукаткин А.C. Выращивание диоскореи ниппонской (Dioscorea nipponica Makino) в культуре in vivo и in vitro // Актуальная проблема инноваций с нетрадиционными растительными ресурсами и создание функциональных продуктов / Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева. Саранск, 2001. С. 109-113.

5. Молканова О.И., Стахеева Т.С., Василева О.Г, Коновалова Л.Н, Сучкова Н.К. Использование биотехнологических методов для размножения и сохранения редких и ценных видов растений // Ботанические сады как центры сохранения биоразнообразия и рационального использования растительных ресурсов: матер. Межд. науч. конф., посв. 60-летию Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН. М., 2005. С. 354-356.

6. Орешникова А.В., Носов А.М., МанаковМ.Н. Физиологические особенности культивируемых клеток Dioscorea deltoidea wall. при выращивании в режиме закрытого протока // Физиология растений. 1994. Т. 41. № 6. С. 918-922.

7. Торшилова А.А. Репродуктивная биология Dioscorea nipponica Makino (Dioscoreace-ae): автореф. дис. ... канд. биол. наук. СПб, 2007. 20 с.

8. Чулафич Л. Клональное микроразмножение диоскореи балканской- эндемичного вида флоры Югославии // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М., 1991. C. 209-212.

Рецензент — д. с.-х. н. О.Н. Аладина

CLONAL MICROPROPAGATION OF RARE AND ENDANGERED SPECIES OF PLANTS

DOAN THU THUY1, E.A. KALASHNIKOVA1, O.I. MOLKANOVA2

This article deals with the influence of nutrient medium hormonal composition on morphogenetic potential of isolated explants Dioscorea nipponica, Dioscorea caucasia and Euonymus nana. It has been established that the Dioscorea obtains stable coefficient of reproduction and formation of plants with correct morphology, it is advisable to add Dropp preparation as a cytokinin to nutrient medium at concentration of 0.5 mg/l in combination with NAA 0.5 mg/l, and for wahoo (Euonymus nana) — Tsitodef preparation at concentration of 0.5 mg/l. For the formation of micro-tubers there should be ША in nutrient medium at concentration of 3 mg/l.

Key words: dioscorea, euonymus, morphogenesis, micro-propagation, adventitious buds, auxiliary buds, micro-tubers, isolated explants, in vitro.

Доан Тху Тхуи — аспирант кафедры генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49. Тел.: 8 (499) 976-40-72; e-mail: doanthuyy@yahoo.com).

Калашникова Елена Анатольевна — д. б. н., профессор кафедры генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева. E-mail: kalashnikova@timacad.ru.

Молканова Ольга Ивановна — к. б. н., ГБС им. Н.В. Цицина (127276, г. Москва, ул. Ботаническая, 31. Тел.: (495) 618-06-49; e-mail: molkanova@mail.ru).