Способ определения порога болевой чувствительности лабораторных животных и устройство для его осуществления
METHOD FOR DETERMINING THRESHOLD OF PAIN SENSITIVITY OF LABORATORY ANIMALS AND DEVICE FOR ITS IMPLEMENTATION

Относится к способам оценки поведенческих реакций лабораторных животных и может быть применен для классификации животных по уровню болевой чувствительности и возбудимости, а также для осуществления процедуры стрессирования путем электрокожного раздражения.
Известен способ определения стрессустойчивости у лабораторных животных по патенту РФ №2098015 (МПК А61В 5/05, G01N 27/02, приор. 10.03.1995, опубл. 10.12.1997), принятый за прототип. Согласно способу определяют уровень порога болевой чувствительности и по определенным значениям порога относят животных к группе с низкой или с высокой стрессустойчивостью. В нем использована методика определения порога болевой чувствительности, включающая воздействие на животных переменным электрическим током. В устройстве, реализующем способ, в качестве контактирующего проводника используется электропол, представляющий собой диэлектрическую стеклотекстолитовую пластину (30×50 см), на рабочей поверхности которой поперечно закреплены медные шины. Напряжение подают через лабораторный автотрансформатор между соседними токопроводящими шинами и плавно увеличивают с индикацией на вольтметре. Уровень общей реактивности организма определяют по порогу болевой чувствительности (амплитуде электрического напряжения) в момент появления реакции устранения конечностей с одновременной регистрацией значения подаваемого напряжения. Недостатком способа является то, что определение порога по реакции устранения конечности происходит с большим, вручную устанавливаемым шагом изменения электрического напряжения, что не предоставляет возможности для достаточно точной классификации животных, так как невозможно с помощью автотрансформатора обеспечить плавное увеличение напряжения с точно задаваемым минимальным шагом. Кроме того, нет возможности автоматизированного управления уровнем подаваемого электрического напряжения.
Техническая проблема состоит в том, чтобы обеспечить более точное задание минимальных значений уровня напряжения и регистрацию значения тока, характеризующих порог болевой чувствительности (возбудимости).
Ставится техническая задача определения порога болевой чувствительности не по реакции устранения конечностей, а по первичной ноцицептивной реакции (реакция вздрагивания), поскольку она является более ранней.
Для этого предлагается использовать импульсы постоянного тока с возможностью плавного и точного регулирования их амплитуды, скважности, количества, временного режима подачи на токопроводящие прутья пола клетки. Необходимо обеспечить возможность подачи электрического раздражения независимо на каждый токопроводящий прут пола клетки для обеспечения многофазного режима подачи импульсов, чтобы исключить возможность нахождения животным эквипотенциальных прутьев пола клетки для избегания электрического воздействия. При регистрации реакции животного также важно обеспечить автоматизированное измерение и запись параметров электрического воздействия. Для этого используется программное управление процессом создания электрических импульсов с определенными параметрами, т.е. с заданной амплитудой, длительностью и частотой следования, количеством, временными параметрами процесса подачи импульсов на прутья клетки в многофазном режиме, регистрации амплитуды импульсов и величины воздействующего на животное тока в момент первичной ноцицептивной реакции, а также сохранения зарегистрированных параметров в базе данных.
Применение импульсов постоянного тока для электрического раздражения лабораторных животных известно в аппаратно-программном комплексе «Шелтер» (http://rat-house.ru). Комплекс включает 8-канальный коммутатор напряжения и источник этого напряжения. Величина напряжения постоянна и составляет 100 В. В комплексе нет возможности плавного регулирования и автоматизированного управления амплитудой импульсов для фиксации первичной ноцицептивной реакции. Структурная схема комплекса не опубликована. Поскольку нет возможности плавного увеличения напряжения от 0В с точной регулировкой амплитуды, комплекс не может быть использован для достоверного определения минимального порога болевой чувствительности.
Предлагается способ, позволяющий эффективно с высокой точностью определять значения порога болевой чувствительности с минимальным шагом увеличения амплитуды электрического воздействия, который состоит в том, что на животных воздействуют импульсами постоянного тока с регулируемой амплитудой, длительностью и частотой, регулируемым количеством, а также с обеспечением подачи электрических импульсов на прутья пола клетки регулируемыми пачками в многофазном режиме для исключения возможности избегания животным электрического воздействия путем нахождения эквипотенциальных прутьев пола клетки.
Предлагается в устройство определения порога болевой чувствительности лабораторных животных, включающее электрифицированный пол, выполненный из токопроводящих прутьев, ввести сопряженный с компьютером электронный блок, содержащий электронные ключи, регистр управления ключами, управляемый источник постоянного напряжения, управляющий автомат и контроллер USB. Каждый электронный ключ соединен с определенным разрядом регистра, а каждый прут пола клетки через электронный ключ соединен с управляемым источником постоянного напряжения. Регистр и источник напряжения соединены с блоком управления, связанным с компьютером через контроллер USB.
Технический результат состоит в том, что устройство позволяет более точно, надежно, достоверно и эффективно на основании более полной информации определять минимальный порог болевой чувствительности животных за счет возможности плавного и точного регулирования параметров электрического воздействия (амплитуда, длительность и частота импульсов, их количество), автоматического измерения и регистрации параметров при возникновении первичной ноцицептивной реакции животного, а также за счет исключения возможности избегания животным электрического воздействия путем реализации гибкой организации управления процессом подачи импульсов с фазированием (фаза - временной сдвиг импульсов, подаваемых на токопроводящие прутья пола клетки, т.е. один временной такт) и за счет фиксации и сохранения последовательности измерений на каждом шаге изменения параметров, что исключает влияние латентности в действиях экспериментатора и важно для отбора животных, имеющих наследственно обусловленные маргинальные (низкие или высокие) значения порога возбудимости (болевой чувствительности).
На фиг. 1 изображена структурная схема предлагаемого устройства.
На фиг. 2 изображена временная диаграмма варианта подачи импульсов с фазированием (8 фаз, показаны 2 пачки импульсов, 16 временных тактов).
На фиг. 3 приведен общий вид экспериментальной клетки с животным.
Для осуществления способа производят следующие операции:
1. Выбирают с помощью графического интерфейса управляющей программы параметр фазирования подаваемых импульсов (число фаз, определяющих количество импульсов в пачке), устанавливают параметры импульсов (начальная амплитуда напряжения, длительность импульса, частота). При выборе параметров следует учитывать размер животного и расстояние между прутьями пола таким образом, чтобы исключить возможность того, чтобы все лапы попали на прутья с одинаковой фазой.
2. Устанавливают режим увеличения амплитуды импульсов (автоматический или ручной) и шаг постепенного увеличения амплитуды.
3. Устанавливают параметры подачи импульсов - число пачек, длительность паузы между пачками.
4. Смачивают лапы животного водой.
5. Берут животное из домашней клетки и помещают в центр решетчатого пола.
6. Перед подачей электрических импульсов выдерживают паузу 10-15 секунд для обследования животным новой обстановки.
7. Начинают подачу пачек импульсов с заданными параметрами до появления у животного реакции вздрагивания. При этом в отдельном окне интерфейса программы отражается значение максимального тока, протекающего при замыкании животным прутьев пола клетки.
8. Нажатием соответствующей кнопки графического интерфейса программы фиксируют величину тока и напряжения, при котором наблюдается первая реакция вздрагивания, наблюдаемая экспериментатором.
9. Измеренные параметры автоматически заносятся в базу данных вместе с сопроводительной информацией.
Приведем пример конкретного выполнения способа. Определялся порог болевой чувствительности лабораторных крыс.
На компьютере с подключенным устройством с помощью графического интерфейса управляющей программы был выбран вариант формирования электрических импульсов с числом фаз, равным 8, поскольку при этом обеспечивается расстояние между прутьями пола клетки с одинаковым потенциалом величиной в 12 см (при диаметре прутка 4 мм и расстоянии между прутьями 11 мм), что, учитывая средний размер крысы (примерно 12-14 см), исключает возможность животному вставать на прутья с одинаковым напряжением, избегая тем самым действия электрического тока.
С помощью графического интерфейса была установлена частота следования импульсов на каждом токопроводящем прутке величиной 1 Гц, что в режиме 8 фаз позволяет формировать импульсы длительностью не более 125 мс.
Был установлен режим автоматического увеличения амплитуды импульсов на 0,1 В после выдачи одной пачки импульсов, т.е. по завершению всех 8 фаз (8 временных тактов). Было установлено начальное значение амплитуды импульсов 5 В. Была установлена величина паузы (нулевой потенциал на всех токопроводящих прутьях пола клетки) 5 с перед подачей следующей пачки импульсов.
Крыса с предварительно смоченными водой лапами была помещена в клетку и запущена подача импульсов на прутья пола клетки.
Вздрагивание животного фиксировалось визуально и нажималась кнопка «измерение» графического интерфейса.
Были получены пороговые значения напряжения и тока - 20,7 В; 2,1 мА, которые наблюдались на экране компьютера и сохранились в базе данных.
Устройство для осуществления способа (фиг. 1) содержит блок из 24-х электронных ключей 1 (выполненных в виде оптореле на полевых транзисторах), соединенный с токопроводящими прутьями пола клетки 2 и с гальванически развязанным управлением от триггеров 24-х разрядного регистра 3. На выход каждого ключа поступает электрический потенциал от управляемого источника напряжения 4 (выполненного на основе ШИМ-модулятора и масштабирующего операционного усилителя). Ток, потребляемый от источника напряжения, измеряется с помощью 10-разрядного аналого-цифрового преобразователя 5. Всеми узлами устройства управляет управляющий автомат 6. Для питания и гальванической развязки служит импульсный преобразователь напряжения 7, а для связи с компьютером 8 контроллер USB 9.
В регистр 3 из компьютера 8 через контроллер USB 9 может быть записан произвольный код, в соответствии с которым осуществляется подача нулевого потенциала или заданного напряжения на токопроводящие прутья пола клетки 2, соединенные с выходами ключей 1. На выход каждого ключа поступает сигнал от управляемого источника напряжения 4. Импульсный источник напряжения выполнен на основе ШИМ -модулятора и масштабирующего усилителя, реализованного на операционном усилителе. Схема управления аналого-цифрового преобразователя 5 построена таким образом, что измерение тока осуществляется непрерывно с частотой около 100 кГц, однако в регистре результата, реализованным в составе управляющего автомата, запоминается только максимальное из полученных значений. Это значение может быть считано в любой момент времени. После считывания полученное в предыдущем периоде максимальное значение тока сбрасывается, и процесс формирования максимального значения начинается заново.
В реализованном варианте устройства выходное напряжение управляемого источника устройства может изменяться в диапазоне (0..28.4)В. Минимально возможный шаг изменения напряжения составляет 0,1 В. Максимально возможное значение измеряемого тока через объект исследования составляет 17 мА.
Для работы устройства совместно с компьютером используется свободно распространяемый набор драйверов и специальных библиотек (http://www.ftdichip.com/Drivers/D2XX.htm). Для операционной системы Windows устанавливаются драйвер FTD2XX, реализующий доступ к USB устройству с помощью DLL библиотеки. Алгоритм программного управления устройством реализуется с помощью посылки 4-х байтных слов (нулевой байт каждого слова содержит код операции):
- установка уровня подаваемого на прутья клетки напряжения (0-й байт 0×00, 1-й и 2-й байт 0×00, 3-й байт цифровое значение напряжения 0-255);
- управление выходами ключей (0-й байт 0×10, 1-й - 3-й байты - цифровое значение, записываемое в 24-разрядный регистр);
- чтение максимального значения тока (0-й байт 0×20, 1-й байт - 0×00, 2-й и 3-й байты - цифровое значение тока).
На фиг. 2 приведена временная диаграмма, отражающая один из конкретных вариантов подачи раздражающих импульсов с фазированием на токопроводящие прутья пола клетки. Например, подача импульсов в режиме 8 фаз обеспечивает расстояние между прутьями пола клетки с одинаковой фазой величиной в 12 см (при диаметре прутка 4 мм и расстоянии между ними 11 мм). Это исключает возможность животному вставать на токопроводящие прутья пола с одинаковым напряжением, избегая тем самым действия электрического тока (фиг. 3). Следует отметить, что при наличии клетки с другими расстояниями между токопроводящими прутьями число фаз соответственно меняется. В показанном на фигуре варианте подачи раздражающих импульсов (8 фаз) на каждый прут клетки подаются импульсы с частотой 1 Гц с длительностью импульса 125 мс. Частота следования импульсов и их длительность задаются с помощью программно управляемых таймеров, при этом минимальное значение времени срабатывания таймера составляет 1 мс. В то же время предельная величина длительности импульса, обеспечиваемая реализованным устройством, лимитируется быстродействием электронных ключей (оптореле) и составляет 10 мс.