КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЛИПИДНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ И КОРТИКОСТЕРОИД ИЛИ ПРОИЗВОДНОЕ ВИТАМИНА D
COMPOSITION CONTAINING LIPID NANOPARTICLES AND CORTICOSTEROID OR VITAMIN D DERIVATIVE

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей липидные наночастицы и кортикостероид и/или аналог витамина D в качестве активного(ых) ингредиента(ов), способу получения липидных наночастиц и применению композиции при лечении дерматологических заболеваний и состояний.
Предпосылки создания изобретения
st
Атопический дерматит (AD) представляет собой хроническое рецидивирующее воспалительное заболевание кожи с высоким уровнем преобладания в раннем детстве, поскольку оно поражает 10-20% всех детей (Katoh, J. Dermatol. 36, 2009, pp. 367-376). Заболевание характеризуется кожным зудом, покраснением, лихенизацией, папулами и сухостью кожи с ослабленным эпидермальным барьером и склонностью к кожным инфекциям (Reitamo et al., Textbook of Atopic Dermatitis, 1 Ed., Informa Healthcare, London, 2008). В патогенезе AD преимущественно придают значение иммунологическим нарушениям. Однако результаты нескольких недавних исследований демонстрируют значимость дефекта кожного барьера в AD в качестве движущей силы воспалительного процесса, а также в качестве обеспечения доступа иммунных клеток в коже к антигенам. Высоко значимая связь между AD и генетическим дефектом филагрина показывает, что разрушение кожного барьера критично для патогенеза AD (Palmer et al., Nat. Genet. 38, 2006, pp. 441-446; Weidinger et al., J. Allergy Clin. Immunol. 118, 2006, pp. 214-219).
В настоящее время лечение первой линии при AD представляет собой местное введение кортикостероидов, которые проявляют противовоспалительное и иммуносупрессивное действие широкого диапазона, в сочетании с увлажняющими средствами, которые могут способствовать заживлению сухой кожи и восстановить барьер (Reitamo et al., выше). Мази или кремы с высоким содержанием масла часто предпочитаются дерматологами, поскольку они более эффективны при поддержании кожи гидратированной и могут усиливать проникновение нанесенного вещества лекарственного средства (Wiedersberg et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 68, 2008, pp. 453-466; Reitamo et al., выше). Однако косметическая приемлемость препаратов такого типа может быть низкой, что отражается в меньшей подверженности лечению среди пациентов с AD (Yentzer et al., J. Drug Dermatol. 9, 2010, pp. 324-329). Кроме того, высвобождение вещества лекарственного средства из традиционных носителей, таких как мази и кремы, и его последующее проникновение в кожу может быть достаточно ограниченным и приводить к неспецифической доставке, например, уровень лекарственного средства может быть слишком низким для индукции у некоторых пациентов терапевтического эффекта, притом, что у других возникают неблагоприятные воздействия или системное проникновение препарата (Korting and Schaefer-Korting, Handbook Exp. Pharmacol., 2010, 435-468). Тот факт, что кожный барьер при AD ослаблен, дополнительно осложняется направленная доставка лекарственного средства в кожу, поскольку состояние барьера является ключевым для того, какое количество вещества лекарственного средства попадет в кожу и проникнет через нее (Bronaugh and Stewart, J. Pharm. Sci. 74, 1985, pp. 1062-1066; Moon and Maibach, Exogenous Dermatoses. Environmental Dermatitis (Menne and Maibach, Eds.), CRC, Boca Raton, 1991, pp. 217-226; Simonsen and Fullerton, Skin Pharmacol. Physiol. 20, 2007, pp. 230-236; Wilhelm et al., J. Invest. Dermatol. 97, 1991, pp. 927-932).
Путем оптимизации доставки кожных лекарственных средств является применение носителей на основе наночастиц. Особенно перспективными являются носители на основе частиц, полученных из липидов (липидные наночастицы, липосомы, микро- и наноэмульсии), поскольку они могут обладать преграждающими свойствами, усиливать проникновение в кожу и обладать свойствами направленного действия (Korting and Schaefer-Korting, выше). Твердые липидные наночастицы (SLN) составляют от 40 до 1000 нм и в принципе совместимы с эмульсией масла в воде, но жидкое масло замещается липидом при температуре плавления выше температуры тела. (Muller et al., Adv. Drug Del. Review 54, Suppl. 1, 2002, S131-S155). В результате их твердого состояния и малого размера SLN обладают сильными адгезивными свойствами, которые могут способствовать образованию преграды после нанесения на кожу, и они в большей степени косметически приемлемы по сравнению с мазью (Jenning et al., Int. J. Pharm. 199, 2000, pp. 167-177; Santos et al., J. DrugTarget, 2002, pp. 489-495; Wissing and Muller, Eur. J. Pharm. Biophar. 56, 2003, pp. 67-72). Преграждающие свойства снижают трансэпидермальную потерю воды (TEWL) и могут способствовать физическому восстановлению кожного барьера при заболевании кожи, подобном AD (Keck and Schwabe, J. Biomed. Nanotechnol. 5, 2009, pp. 428-436).
Псориаз является хроническим воспалительным кожным заболеванием, которое проявляется в виде покрасневших, сухих чешуйчатых бляшек в результате гиперкератоза. Бляшки чаще всего находятся на локтях, коленях и коже головы, хотя более интенсивные повреждения могут появляться и на других частях тела, в частности, в пояснично-крестцовой области. В наиболее обычном лечении легкого до умеренного псориаза используется местное применение композиции, содержащей кортикостероид в качестве активного ингредиента. Применение кортикостероидов, хотя оно эффективно, имеет недостаток, заключающийся в ряде неблагоприятных воздействий, таких как атрофия кожи, стрии, угревидная сыпь, периоральный дерматит, разрастание на коже грибов и бактерий, гипопигментация кожи и розовые угри.
Однако в течение многих лет предпочтительное нестероидное лечение псориаза состояло из местного лечения соединением-аналогом витамина D, кальципотриолом, составленным в композицию мази (в продаже в виде мази Daivonex или Dovonex от LEO Pharma), в которой кальципотриол присутствует в композиции раствора или крема (в продаже в виде крема Daivonex или Dovonex от LEO Pharma). Растворитель в композиции мази представляет собой пропиленгликоль, который имеет преимущество повышенного проникновения активного ингредиента в кожу, что ведет к повышенной эффективности, которая, как также известно, действует как раздражитель кожи. Таким образом, опубликовано, что включение пропиленгликоля в местные композиции часто вызывает у пациентов развитие контактного дерматита (в одном из исследований сообщается о ряде реакций раздражения в ответ на 12,5% пропиленгликоль (см. M. Hannuksela et al., Contact Dermatitis, 1, 1975, pp. 112-116), и число реакций раздражения повышается, когда пропиленгликоль применяют в высоких концентрациях (обзор Z. Catanzaro and J. Graham Smith, J. Am. Acad. Dermatol. 24, 1991, pp. 90-95). Вследствие повышенного проникновения кальципотриола в кожу, которое приводит, среди прочего, к присутствию пропиленгликоля, мазь Daivonex, как было обнаружено, более эффективна при лечении псориатических повреждений, чем крем Daivonex, но она также вызывала у значительной доли пациентов с псориазом раздражении кожи.
Человеческая кожа, в частности, внешний роговой слой, обеспечивает эффективный барьер против проникновения микробных патогенов и токсичных химикатов. В то время как это свойство кожи, как правило, предпочтительно, оно усложняет кожное введение фармацевтических препаратов, так что большое количество, если не большая часть активного ингредиента, наносимого на кожу пациента, страдающего кожным заболеванием, может не проникать в живые слои кожи, где он должен оказывать свое действие. Для обеспечения адекватного проникновения активного ингредиента в дерму и эпидермис, как правило, предпочтительно включать активный ингредиент в растворенном состоянии, как правило, в присутствии растворителя в виде спирта, например, этанола, или диола, например, пропиленгликоля. Как указано выше, пропиленгликоль является хорошо известным усилителем впитывания, т.е. веществом, которое способствует проникновению через роговой слой и «увлекает» низкомолекулярные компоненты, такие как терапевтически активные компоненты носителя, в эпидермис. Пропиленгликоль сам по себе может вызывать значительное раздражение кожи, и он также может «увлекать» низкомолекулярные потенциально раздражающие компоненты носителя в эпидермис, что ведет к общему раздражающему эффекту традиционных носителей, включая пропиленгликоль. По этой причине, присутствие пропиленгликоля в качестве растворителя в композициях, предназначенных для лечения воспалительных кожных заболеваний, может обострять воспалительный ответ.
Задачей настоящего изобретения является предоставление композиции с усиленным проникновением в кожу и улучшенной биологической активностью кортикостероида или аналога витамина D, входящих в композицию для местного применения в качестве активных ингредиентов, по сравнению с коммерчески доступными мазями в отсутствие традиционных усилителей впитывания, таких как пропиленгликоль, или других эксципиентов, которые потенциально являются раздражающими веществами. Другой задачей является предоставление композиций, которые обладают преграждающими свойствами, но имеют улучшенные косметические свойства, т.е. они являются менее жирными по сравнению с мазью и более приятны на коже по ощущениям.
Акне является кожным состоянием, представляющим собой мультифакториальное заболевание, поражающее сально-волосяные фолликулы, характеризующееся повышенной продукцией сального секрета из сальных желез, благодаря присутствию избыточного количества сального секрета в протоке сально-волосяного фолликула, приводящего к образованию комедонов (затвердевших порций сала в фолликулярном протоке). Дальнейшее закрытие протоков приводит к образованию пустул, папул или цист, которые часто являются объектом заселения бактериями, особенно Propionibacterium acnes, и в них локализуется воспаление. Обычное акне является наиболее распространенным кожным нарушением среди тинейджеров, но существенное число взрослых в возрасте 20-40 лет также подвержены акне. Доступные в настоящее время лекарственные средства для лечения акне включают пероксид бензоила, азелаовую кислоту, местные и системные антибиотики, такие как Fucidin, клиндамицин, эритромицин и тетрациклин, ретиноиды, такие как адапалин, третиноин, изотретиноин, и гормоны, такие как эстроген. Однако с этими лекарственными средствами связаны серьезные недостатки, включая тератогенность, раздражение кожи, фотосенсибилизацию и т.д. По причине отрицательных психосоциальных последствий пораженных индивидуумов, относительно небольшого количества лекарственных средств, доступных для местного лечения акне, и тяжести известных побочных эффектов этих лекарственных средств, предоставление новых лекарственных средств для адекватной терапии акне очень важно.
Таким образом, еще одной задачей настоящего изобретения является предоставление композиции, способной направлять включенный в нее активный ингредиент в волосяные фолликулы кожи. Направленная доставка в фолликулы представляет особый интерес в случае композиций, предназначенных для лечения акне и родственных нарушений, таких как розовые угри. Доставка активного ингредиента непосредственно в участок действия может иметь дополнительное преимущество снижения неблагоприятных воздействий, таких как раздражение кожи, так что предоставляется терапия акне, которая лучше переносится, по сравнению с вариантами лечения, находящимися на рынке в настоящее время.
Сущность изобретения
Проникновение в кожу вещества лекарственного средства, предназначенного для местного кожного применения, является сложным процессом, включающим три основных стадии: 1) высвобождении вещества из носителя, 2) проникновение в роговой слой и 3) распределение из рогового слоя в участки-мишени в живом эпидермисе и дерме. Первая стадия зависит от физико-химических свойств лекарственного средства и носителя, которые могут быть оптимизированы обработкой. Вторая и третья стадии более сложны. Физико-химические свойства лекарственного вещества и степень насыщения лекарственного средства в носителе опять же важны для распределения лекарственного вещества между носителем и кожей, и на него можно воздействовать оптимизацией носителя. Кроме того, на состояние основного биологического барьера, препятствующего проникновению в кожу - рогового слоя - воздействуют кожные заболевания. В исследовании, приведшем к настоящему изобретению, липидные наночастицы оценивали на предмет их свойств в качестве системы местной доставки лекарственного средства в кожу с ослабленной барьерной функцией. Липидные наночастицы сравнивали с традиционными препаратами мазей, которые подходят для доставки липофильных соединений в кожу и обладают преграждающими свойствами.
Недавние исследования in vitro кожи с ослабленной барьерной функцией показали, что SLN способны сохранять в коже значительно более высокий уровень кортикостероида по сравнению с мазью. Этот резервуарный эффект наблюдали как для интактной кожи, так и для кожи с поврежденным барьером in vitro, и лекарственное средство четко локализовалось в роговом слое. Корреляция между специфичной локализацией лекарственного вещества в верхних слоях кожи, резервуарным эффектом кожи и терапевтическим эффектом лекарственного средства, нанесенного на кожу, после применения SLN, содержащего лекарственное средство, описана мало. Задачей настоящего изобретения является предоставление композиции с повышенной эффективностью лекарственного средства в результате способности липидных наночастиц закупоривать кожу или повышать взаимодействие с кожей с поврежденной барьерной функцией.
12-24
12-24
12-24
12-24
Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для местного применения, содержащей в качестве терапевтически активного ингредиента кортикостероид, введенный в виде твердого раствора или дисперсии в липидные наночастицы, причем указанные липидные наночастицы являются твердыми при температуре окружающей среды и содержат приблизительно 60-92% по массе первого липида с температурой плавления выше температуры тела, где указанный первый липид представляет собой воск, выбранный из группы, состоящей из сложных эфиров C спиртов и C жирных кислот, сложных моно-, ди- или триэфиров глицерина с C жирными кислотами, жирных C спиртов и холестерина, где указанные липидные наночастицы дополнительно содержат приблизительно 2-25% по массе фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества.
12-24
12-24
12-24
12-24
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции для местного применения, содержащей в качестве терапевтически активного ингредиента производное витамина D, введенное в виде твердого раствора или дисперсии в липидные наночастицы, причем указанные липидные наночастицы являются твердыми при температуре окружающей среды и содержат приблизительно 60-92% по массе первого липида с температурой плавления выше температуры тела, где указанный первый липид представляет собой воск, выбранный из группы, состоящей из сложных эфиров C спиртов и C жирных кислот, сложных моно-, ди- или триэфиров глицерина с C жирными кислотами с кислотным числом, равным 0,1 или ниже, жирных C спиртов и холестерина, где указанные липидные наночастицы дополнительно содержат приблизительно 2-25% по массе фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, выбранного из группы, состоящей из полоксамеров или этоксилированных жирных спиртов.
Краткое описание фигур
Изобретение далее описано в прилагаемых фигурах.
3
3
На фиг.1 показано относительное количество H BMV, проникающее через различные слои кожи, после нанесения BMV в мази и в трех различных SLN, соответственно, на интактную кожу (a) и кожу с ослабленной барьерной функцией (b) на период 24 часов. Результаты приведены по отношению к общему количеству измеренного H BMV. Среднее±SD (n=8).
3
3
На фиг.2 показано относительное количество H BMV, проникающее в кожу и в рецепторную среду, соответственно, после нанесения BMV в мази и в SLN из дистеарата, соответственно, на интактную кожу (a) и кожу с ослабленной барьерной функцией (b) на период 6, 16 или 24 час. Результаты приведены по отношению к общему количеству измеренного H BMV. Среднее±SD (n=6).
3
3
На фиг.3 показано относительное количество H BMV, проникающее в кожу (а) и в рецепторную среду (b), после нанесения SLN из дистеарата и мази, соответственно, на период 24 часов. Кожа, подвергнутая воздействию SLN, в некоторых случаях закупоривалась после нанесения SLN. Результаты приведены по отношению к общему количеству измеренного H BMV. Среднее±SD (n=8).
На фиг.4 показана концентрация BDP в коже безволосых крыс, обработанных BDP в SLN, составленных из дистеарата глицерина, по сравнению с BDP в мази. Композиция SLN описана в примере 1.
На фиг.5a показана AUC толщины ушей в исследовании, где сравнивали эффект BMV, введенного в SLN, с BMV в мази. Среднее±SEM (n=10). На 5b показана AUC толщины ушей в исследовании по подбору дозы. Среднее±SEM (n=8). Всех животных лечили оксазолоном по схеме лечения, описанной в примере 3, для индукции фенотипа AD.
На фиг.6a и 6b показаны уровни цитокинов IL-4 и IL-1 у сенсибилизированных мышей. Всех животных лечили оксазолоном по схеме лечения, описанной в примере 3, для индукции фенотипа AD. Среднее±SEM (n=4-10).
Фиг.7a и 7b представляют собой графики, показывающие снижение трансэпидермальной потери воды (TEWL) за счет нанесения липидных наночастиц, содержащих BMV, на уши обработанных оксазолоном мышей, по сравнению с применением мази, содержащей BMV. На фиг.7a показано сравнение SLN с мазью. На фиг.7b показаны значения TEWL в исследовании по подбору дозы.
Подробное описание изобретения
Определения
Термин "липидные наночастицы", как предполагается, означает твердые липидные наночастицы (SLN) или наноструктурированные липидные носители (IMLC). SLN представляют собой частицы наноразмера, полученные из липидов, твердых при температуре окружающей среды, (например, длинноцепочечных триглицеридов, жирных кислот и восков) и из поверхностно-активных веществ, в которых активный ингредиент может растворяться или диспергироваться. NLC представляют собой частицы наноразмера, полученные из липидов, твердых при температуре окружающей среды, и из липидов, жидких при температуре окружающей среды (масел), и из поверхностно-активных веществ, в которых активный ингредиент может растворяться или диспергироваться. Размер частиц в липидных наночастицах может находиться в диапазоне приблизительно 10-800 нм, например, 50-600 нм или 100-500 нм.
Термин "активный ингредиент", как предполагается, означает терапевтически активное вещество лекарственного средства, выбранное из производных или аналогов витамина D и кортикостероидов.
Термин "производное витамина D", как предполагается, означает биологически активный метаболит витамина D3, такой как кальцитриол, или предшественник такого метаболита, такой как альфакальцидол.
Термин "аналог витамина D", как предполагается, означает синтетическое соединение, содержащее остов витамина D с модификациями боковых цепей и/или модификациями самого остова. Аналог проявляет биологическую активность в отношении рецептора витамина D, сравнимую с такой активностью природных соединений витамина D.
"Кальципотриол" представляет собой аналог витамина D формулы:
Было обнаружено, что кальципотриол существует в двух кристаллических формах, ангидрата и моногидрата. Моногидрат кальципотриола и его получение описаны в WO 94/15912.
Термин "кортикостероид", как предполагается, означает стероидные соединения, синтезируемые в коре надпочечников из холестерина и его производных, в частности, таких производных, которые оказывают противовоспалительное действие. Неограничивающие примеры кортикостероидов включают амцинонид, бетаметазон, буденозид, клобетазол, клобетазон, кортизон, десонид, дезоксикортизон, дезоксиметазон, дексаметазон, дифлукортолон, дифлоразон, флукортизон, флуметазон, флунисолид, флуоцинонид, флуоцинолон, фторметолон, флупреднизолон, флурандренолид, флутиказон, халцинонид, галобетазол, гидрокортизон, мепреднизон, метилпреднизон, мометазон, параметазон, предникарбат, преднизон, преднизолон и триамцинолон или их фармацевтически приемлемый сложный эфир или ацетонид. Примерами наиболее используемых в настоящее время кортикостероидов являются бетаметазон и его сложные эфиры, такие как 17-валерат или 17,21-дипропионат, или 17-пропионат клобетазола.
Термин "стабильность при хранении" или "стабильный при хранении", как предполагается, означает, что композиция обладает характеристиками химической и физической стабильности, которые обеспечивают хранение композиции в течение достаточного периода времени при охлаждении или, предпочтительно, при комнатной температуре, что придает композиции возможность коммерческого использования, например, по меньшей мере, в течение 12 месяцев, в частности, по меньшей мере, в течение 18 месяцев и, предпочтительно, по меньшей мере, в течение 2 лет.
Термин "химическая стабильность" или "химически стабильный", как предполагается, означает, что не более чем 10%, предпочтительно, не более чем 6% активных ингредиентов деградирует в течение срока годности продукта, как правило, равного 2 годам, при комнатной температуре. Оценку химической стабильности при комнатной температуре осуществляют, подвергая композицию ускоренным исследованиям стабильности при 40°C, в которых композицию помещают в нагреваемый шкаф при 40°C, образцы забирают через 1 и 3 месяца и тестируют на присутствие продуктов разрушения ВЭЖХ. Если менее чем приблизительно 10% вещества деградировали через 3 месяца при 40°C, это, как правило, принимается за соответствие сроку годности 2 года при комнатной температуре. Когда активный ингредиент, включенный в композицию, представляет собой кальципотриол, "химическая стабильность", как правило, означает, что кальципотриол значимо не деградирует в течение времени с образованием 24-эпикальципотриола или других продуктов разрушения кальципотриола в конечном фармацевтическом препарате.
Термин "физическая стабильность" или "физически стабильный", как предполагается, означает, что активные ингредиенты не осаждаются из фаз пропеллента или носителя в течение срока годности композиции.
Термин "по существу безводный", как предполагается, означает, что содержание свободной воды в композиции мази не превышает приблизительно 2% по массе, предпочтительно, не превышает приблизительно 1% по массе композиции.
Термин "среднецепочечные триглицериды" используется для обозначения триглицеридных сложных эфиров жирных кислот с длиной цепи в 6-12 атомов углерода. Примером предпочтительно используемых в настоящее время таких среднецепочечных триглицеридов является смесь триглицеридов каприловой (C8) и каприновой (C10) кислот, например, доступная под торговым названием Miglyol 812.
Термин "полутвердый" используется для обозначения композиции или эксципиента, которые показывают вязкоупругие свойства и являются неньютоновскими по характеристикам, т.е. не текут при стрессе малого сопротивления сдвигу, но обладают свойствами пластичного, псевдопластичного или тиксотропного потока при высокой скорости сдвига при комнатной температуре. Обычными примерами полутвердых композиций являются мази и кремы.
Термин "закупоривающий", как предполагается, означает предоставление липидного слоя на поверхности кожи, который образует барьер для гидратации, достаточный для снижения трансэпидермальной потери воды, что приводит к гидратации кожи.
Термин "проникновение в кожу" как предполагается, означает диффузию активного ингредиента в различные слои кожи, например, в роговой слой, эпидермис и дерму.
Термин "проницаемость кожи", как предполагается, означает поток активного ингредиента через кожу в системный кровоток или в случае исследований in vitro, описанных ниже в примере 2, рецепторной жидкости в аппарат с клетками Franz, используемый в эксперименте.
Варианты осуществления
В настоящей композиции первый липид может содержаться в количестве приблизительно 65-92% по массе или приблизительно 70-90% по массе, или приблизительно 75-85% по массе, или приблизительно 80% по массе липидных наночастиц, и поверхностно-активное вещество содержится в количестве приблизительно 8-22% по массе, например, приблизительно 10-20% по массе липидных наночастиц. Первый липид может предпочтительно быть выбран из группы, состоящей из цетилпальмитата, пчелиного воска, стеарилпальмитата, стеарилбегената, моностеарата глицерина, дистеарата глицерина, дибегената глицерина, тримиристата глицерина, трипальмитата глицерина, тристеарата глицерина, бегенола, стеариновой кислоты, гидрогенизированного пальмового масла, гидрогенизированных глицеридов жирных кислот кокосового масла, гидрогенизированного касторового масла или цетостеарилового спирта.
В настоящей композиции поверхностно-активное вещество может представлять собой гидрофильное поверхностно-активное вещество и может предпочтительно быть выбрано из группы, состоящей из полоксамеров, таких как полоксамер 188 или полоксамер 407, полисорбатов, таких как полисорбат 80, сложные эфиры сахарозы (такие как стеарат сахарозы или пальмитат сахарозы), этоксилированные жирные спирты, такие как производные полиоксиэтиленового эфира касторового масла, или оно может представлять собой липофильное поверхностно-активное вещество, такое как фосфолипид, например, фосфатидилхолин сои или яичный лецитин.
6-10
6-10
Кроме того, липидные наночастицы могут включать приблизительно 1-40%, например, приблизительно 10-30% по массе или приблизительно 15-15% по массе, или приблизительно 20% по массе липидных наночастиц второго липида, который представляет собой масло при температуре окружающей среды, способное смешиваться с первым липидом, или липофильный эмульгатор (например, полиоксипропиленовый эфир жирной кислоты) или смягчающее средство. Второй липид может быть выбран из группы, состоящей из C моноглицерида, C диглицерида, изопропилмиристата или изопропилпальмитата, среднецепочечных триглицеридов или длинноцепочечных триглицеридов, включая растительные масла, такие как касторовое масло, подсолнечное масло, сафлоровое масло, масло энотеры, масло бурачникового семени, сезамовое масло, кукурузное масло, косточковое пальмовое масло, оливковое масло, масло авокадо, миндальное масло, рапсовое масло, кокосовое масло, хлопковое масло, арахисовое масло, соевое масло, масло зародышей пшеницы, виноградное масло или масло жожоба.
Настоящая композиция может представлять собой крем (эмульсия «масло-в-воде»), лосьон, распыляемый состав или водный гель, где липидные наночастицы обычно присутствуют в количестве примерно 1-40% по массе, например, приблизительно 5-30% по массе или приблизительно 10-20% по массе композиции. Композиция дополнительно содержит водную фазу, в которой липиды могут в некоторых обстоятельствах формировать сеть, так что происходит образование из композиции геля, или которая может содержать загуститель. Загуститель может быть выбран из группы, состоящей из карбомера, производного целлюлозы, такого как гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гиалуроновой кислоты, альгината, декстрана или их производных. Загуститель, как правило, присутствует в количестве приблизительно 0,1-5% по массе, например, приблизительно 0,5% по массе композиции. Композиция может дополнительно содержать смягчающее средство, которое может быть выбрано из группы, состоящей из силиконового масла, парафинового масла и холестерина или глицерина, аллантоина, пантенола, полиглицерина или сложного эфира полиглицерина. Смягчающее средство может быть включено в количестве приблизительно 10-50% по массе или приблизительно 20-40% по массе, или приблизительно 30% по массе композиции.
Активный ингредиент может присутствовать в композиции в различных формах, т.е. растворяться или диспергироваться в водной фазе, растворяться или диспергироваться липидной/водной фазе поверхностного слоя или растворяться или диспергироваться в липидных наночастицах, на их поверхности или в их ядре. Ранее было показано, что активный ингредиент с наибольшей вероятностью ассоциирован с липидной поверхностью и не встраивается в ядро наночастиц с высокой эффективностью, что приводит к нулевым профилям высвобождения и отсутствию специфичного направленного действия на кожу через 6 часов [L.B. Jensen et al., Int. J. Pharm. 390(1), 2010, pp. 53-60]. Это согласуется с открытиями последнего времени, согласно которым некоторое количество активного ингредиента растворяется или диспергируется в водной фазе, по меньшей мере, в липидных наночастицах из цетилпальмитата и трипальмитата, тогда как большая часть активного ингредиента встраивается в липидную поверхность или ассоциируется с ней. Как правило, полагают, что более высокая растворимость липидного компонента и более эффективная инкапсуляция активного ингредиента может достигаться с применением более полярного липида по сравнению с менее полярным липидом [J. Zhang and E. Smith, J. Pharm. Sci. 10 DOI 1002/jps.22329, 2010]. Таким образом, исследования растворимости валерата бетаметазона (BMV, модельный активный ингредиент) в расплавленном липиде характеризовались корреляцией между полярностью липида и растворимостью в носителе, что соответствует предшествующим результатам по липидам, содержащим различные количества моноглицеридов [L.B. Jensen et al., выше; V.V. Kumar et al., Int. J. Pharm. 335(1-2), 2007, pp. 167-175]. Как показано, полярность липида контролирует высвобождение BMV в исследованиях высвобождения in vitro, проводимых с разнообразными липидами с различной полярностью [L.B. Jensen et al., выше].
Эффект липидной полярности может также отражаться на проникновении в кожу активных ингредиентов, введенных в липидные наночастицы, возможно в результате изменяющихся взаимодействий липидных наночастиц с липидами кожи. Компоненты с параметрами растворимости, близкими к таким параметрам кожи, могут характеризоваться хорошей смешиваемостью с кожей, и изменение параметров растворимости липида может быть способом контроля высвобождения активного ингредиента из липидных наночастиц и его распределения в коже [K.B. Sloan et al., J. Invest. Dermatol. 87(2), 1986, pp. 244-252]. В качестве примера, параметры растворимости BMV в коже оцениваются числом 12 [L.B. Jensen et al., выше] и около 10 для свиной кожи [Z. Liron и S. Cohen, J. Pharm. Sci. 73(4), 1984, pp. 538-542]. Используемые липиды имеют параметры растворимости от 8,7 до 9,5. Липидные наночастицы, составленные из дистеарата, которые имеют параметр растворимости 9,5, близкий к коже, таким образом, как ожидается, будут в большей степени смешиваемыми с кожными липидами, чем липидные наночастицы из трипальмитата и цетилпальмитата. BMV растворим в данном липиде, и липидные наночастицы из дистеарата меньше по размеру, чем другие липидные наночастицы; их диаметр составлял 150,9±0,12 нм. Этим может объясняться большее количество BMV в коже и, особенно, в роговом слое после применения BMV в липидных наночастицах из дистеарата, по сравнению с липидными наночастицами из трипальмитата и цетилпальмитата (см. пример 2).
14
3
14
Для минимизации любых различий в профилях проникновения, вызванных различиями по размеру, предусматривалось, чтобы липидные частицы значительно не колебались по среднему диаметру. Средний диаметр коррелирует с площадью поверхности частиц, который, как полагают, является важным параметром взаимодействия липидных наночастиц с кожей и проникновения в нее, а также их любых преграждающих свойств [S. Wissing et al., J. Cosmet. Sci. 52(5), 2001, pp. 313-324; R.H. Muller et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54, Suppl. 1, 2002, S131-S155]. Таким образом, в настоящей композиции липидные наночастицы могут иметь средний диаметр в диапазоне приблизительно 10-800 нм, в частности, приблизительно 50-600 нм, например, 100-500 нм. Средний диаметр конкретных липидных наночастиц с BMV (см. пример 1) находился в диапазоне 150-212 нм при PdI менее чем 0,24. В общем, полагают, что частицы более 10 нм не проникают в интактную кожу, но пораженная кожа может пропускать частицы больших размеров (с диаметром 500-700 нм), поскольку барьер в ней ослаблен. Измеренный размер частиц указывает на то, что частицы не могут проникать в интактную кожу, тогда как кожа с поврежденным барьером может быть проницаемой для частиц. Липидные наночастицы, полученные из цетилпальмитата, были более монодисперсными, чем другие типы липидов, и это может быть следствием того, что цетилпальмитат является липидом типа воска с отличающейся кристаллической структурой. Данный тип липида, как ранее было показано, образовывал гомогенные частицы малого размера с превосходной физической стабильностью [V. Jenning и S. Gohla, Int. J. Pharm. 196(2), 2000, pp. 219-222]. Измерения размера указывали на то, что SLN не могут проникать через интактную кожу, но, если кожа характеризуется ослабленной барьерной функцией, проникновение частиц возможно. Исследования, обсуждаемые ниже в примере 2, с меченными C липидными частицами и меченным H BMV показали, что отношение BMV/липид повышалось по направлению внутрь кожи и достигало максимума в рецепторном слое, и поэтому был сделан вывод, что BMV не доставляется в клетки-мишени более глубоких слоев кожи липидными наночастицами, которые, тем не менее, служат в качестве резервуара вещества лекарственного средства в верхних слоях кожи. С применением меченного C липида также было показано, что липидные частицы в основном остаются на поверхности кожи и в роговом слое в интактной коже и в коже с ослабленной барьерной функцией. Таким образом, активный ингредиент должен высвобождаться из частиц, чтобы дополнительно диффундировать в кожу и достичь клеток-мишеней в живом эпидермисе и дерме.
Считается предпочтительным, чтобы липидные наночастицы не проникали через кожу, даже если барьер сильно ослаблен, как проиллюстрировано в настоящем описании на коже, на которую воздействовали отрывом липкой ленты. Тот факт, что липидные частицы остаются на поверхности кожи также дает возможность того, что липидные наночастицы могут улучшать гидратацию кожи и физически усиливать барьерные свойства. Это свойство имеет отношение к лечению кожного заболевания, такого как AD, при котором состояние физического кожного барьера сильно связано с патогенезом AD, поскольку в его основе лежит взаимодействие с иммунным барьером кожи.
Липидные наночастицы превосходили мазь в плане достижения высокого уровня лекарственного вещества в коже. Это может быть хорошо видно из результатов, приведенных на фиг.3. Большая доля активного ингредиента, как было обнаружено, находится в верхнем слое как интактной кожи, так и кожи с ослабленной барьерной функцией, что с наибольшей вероятностью связано с большой площадью поверхности и адгезивными свойствами липидных наночастиц. Кроме того, липидные наночастицы и активный ингредиент могут проникать через волосяные фолликулы и складки кожи, из которых частицы могут действовать в качестве резервуара для лекарственного средства. После нанесения липидных наночастиц из дистеарата на интактную кожу и кожу с нарушенной барьерной функцией большее количество активного ингредиента присутствовало в роговом слое и эпидермисе, по сравнению с частицами из трипальмитата и цетилпальмитата, что, как предполагается, связано с различиями в полярности липидов и размером частиц (фиг.1). Таким образом, тесное взаимодействие с кожей, слияние с липидами кожи и высвобождение вещества лекарственного средства контролируемым образом может представлять собой механизм усиливающих проникновение свойств липидных наночастиц, в дополнение к обнаруженному ранее преграждающему эффекту [R.H. Muller et al., выше].
Большее количество BMV в эпидермисе интактной кожи и в рецепторной среде интактной кожи и кожи с ослабленной барьерной функцией при нанесении SLN из цетилпальмитата может быть связано с другой структурой липида, более низкой полярности и меньшей растворимости в BMV [J. Zhang и E. Smith, выше; V. Jenning и S. Gohla, выше]. Это может вызывать более легкое высвобождение BMV из носителя SLN и распределение по коже.
BMV очень эффективно задерживался в коже, когда барьер был интактным (фиг.1a), но проникал через нее подобно мази, когда барьер был ослаблен (фиг.1b). Однако по сравнению с использованием мази в коже с ослабленной барьерной функцией было обнаружено большее количество активного ингредиента. Наиболее предпочтительный профиль проникновения тестируемых липидных наночастиц (ср. пример 2) получали с липидными наночастицами из дистеарата, использование которых приводило к большей растворимости активного ингредиента и сохранению более высокого количества активного ингредиента в коже, и его меньшее количество оказывалось в рецепторной среде. Уровень активного ингредиента в коже был сходным для интактной кожи и кожи с ослабленной барьерной функцией, причем это указывало на то, что липидные наночастицы эффективно прилипают к поверхности интактной кожи, а также поверхности кожи с ослабленной барьерной функцией.
Было обнаружено, что повышенное количество активного ингредиента сохранялось в коже, интактной, а также с ослабленным барьером, во время нанесения SLN из дистеарата на 6, 16 и 24 часов, по сравнению с мазью (фиг.2). Минимальное повышение в рецепторной среде после 24 часов может объясняться обеднением слоя препарата, т.е. количества активного ингредиента, доступного для проникновения в кожу. Активный ингредиент, как полагают, частично встраивается в частицы, частично в поверхностный слой частиц. Последствием существования этой структуры, как показано ранее, является взрывообразное высвобождение с последующим контролируемым высвобождением [E.B. Souto et al., Int. J. Pharm 278(1), 2004, pp. 71-77; V. Jenning et al., J. Control. Release 66(2-3), 2000, pp. 115-126]. Когда поверхностный слой истощается вследствие взрывообразного высвобождения, тогда из частиц в кожу может диффундировать меньшее количество активного ингредиента с более низкой скоростью высвобождения. Другой причиной наблюдаемого профиля является насыщение кожи или волосяных фолликулов, в частности, BMV, встроенным в SLN или в какие-либо кристаллы BMV, присутствующие в SLN, полученных из цетилпальмитата и трипальмитата, соответственно. Возможно, происходит начальная, преходящая диффузия путем сброса через волосяные фолликулы и потовые протоки с последующей стационарной диффузией через SC (R. J. Scheuplein, Mechanism of percutaneous absorption. II. Transient diffusion и the relative importance of various routes of skin penetration, J Invest Dermatol 48 (1) (1967) 79-88). Данный эффект может соответствовать постоянным концентрациям BMV, наблюдаемым в этих исследованиях. Таким образом, липидные наночастицы можно использовать для создания в коже, а также в волосяных фолликулах резервуара и поддержания постоянного количества активного ингредиента, доступного для всасывания. Однако скорость обмена между частицами и кожей может меняться в зависимости со временем нанесения по причине встраивания лекарственного средства. Временные профили и количество лекарственного вещества в рецепторной среде указывают, что вещество лекарственного средства находится в поверхностном слое частиц. Таким образом, при нанесении на кожу липидные наночастицы имеют способность доставлять активный ингредиент двухфазным путем, сначала за счет взрывообразного высвобождения с поверхности частиц и из водной фазы, с последующим резервуарным эффектом в роговом слое, где высвобождается вещество лекарственного средства, более тесно ассоциированное с липидными частицами.
Значимое повышение проникновения BMV после закупорки кожи с ослабленной барьерной функцией может иметь разные причины. Во-первых, закупорка почти всегда увеличивает количество лекарственного вещества, поглощенного кожей, по причине повышенного коэффициента диффузии вследствие возрастания содержания воды в роговом слое и нарушения липидного барьера [J. A. Bouwstra et al., J. Recept. Signal Transduct. Res. 21 (2-3), 2001, pp. 259-286]. Кроме того, закупорка может способствовать эффекту повышения проницаемости кожного барьера для поверхностно-активного вещества, присутствующего в липидных наночастицах. Закупорка также может воздействовать на обмен лекарственного средства между композицией и кожей, поскольку воде не удается испариться после нанесения. По причине очень большого количества лекарственного средства, проникающего в рецепторную среду после закупорки кожи с ослабленной барьерной функцией, эти результаты также поддерживают предположение о том, что активный ингредиент ассоциирован с поверхностью частиц, а не инкапсулируется в твердом ядре частиц.
В другом исследовании дипропионат бетаметазона (BDP), введенный в SLN, наносили на кожу безволосых крыс, и демонстрировали способность SLN задерживать кортикостероид в коже. По сравнению с мазью, значительно большее количество BDP присутствовало в коже через 1 и 3 суток, соответственно, и через 7 суток после нанесения препарата лекарственное вещество еще может детектироваться в коже, когда вводится в SLN, но при введении в мази в этот же момент лекарственное вещество не выявляется.
Липидные наночастицы типа, как описано выше, могут быть получены способом, включающим:
12-24
12-24
12-24
12-24
(a) солюбилизацию или диспергирование кортикостероида в липидной фазе, содержащей приблизительно 60-92% по массе первого липида с температурой плавления выше температуры тела, причем указанный первый липид представляет собой воск, выбранный из группы, состоящей из сложных эфиров C спиртов и C жирных кислот, сложных ди- или триэфиров глицерина и C жирных кислот, жирных C спиртов и холестерина, указанный первый липид находится в расплавленном состоянии, указанная липидная фаза необязательно включает приблизительно 1-40% по массе второго липида, который представляет собой масло при температуре окружающей среды, способное смешиваться с первым липидом, или липофильный эмульгатор или смягчающее средство;
(b) диспергирование липидной фазы, полученной на стадии (a) в водное фазе, содержащей 0,2-10% по массе фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, выбранного из группы, состоящей из полоксамера, полисорбата и этоксилированного жирного спирта, с образованием эмульсии;
(c) гомогенизацию эмульсии, полученной на стадии (b), с использованием гомогенизатора высокого давления с образованием наночастиц липидной фазы, содержащих кортикостероид, и
(d) охлаждение гомогенизированной эмульсии, полученной на стадии (c) для отвердевания наночастиц.
Размер липидных наночастиц, полученных данным способом, как установлено, находился в диапазоне приблизительно 100-500 нм.
Альтернативно, липидные наночастицы можно получать способом, включающим:
12-24
12-24
12-24
12-24
(a) солюбилизацию или диспергирование кортикостероида в липидной фазе, содержащей приблизительно 60-92% по массе первого липида с температурой плавления выше температуры тела, причем указанный первый липид представляет собой воск, выбранный из группы, состоящей из сложных эфиров C спиртов и C жирных кислот, сложных ди- или триэфиров глицерина и C жирных кислот, жирных C спиртов и холестерина, указанный первый липид находится в расплавленном состоянии, указанная липидная фаза необязательно включает приблизительно 1-40% по массе второго липида, который представляет собой масло при температуре окружающей среды, способное смешиваться с первым липидом, или липофильный эмульгатор или смягчающее средство;
(b) отвердевание липидной фазы, полученной на стадии (a), в жидком азоте или на сухом льду;
(c) перемалывание отвердевшей липидной фазы до размера частиц, приблизительно равного 50-100 мкм;
(d) диспергирование порошка, полученного на стадии (c), в холодной водной фазе, содержащей приблизительно 0,2-10% по массе поверхностно-активного вещества, и
(e) гомогенизацию дисперсной системы, полученной на стадии (d), с использованием гомогенизатора высокого давления при комнатной температуре или ниже комнатной температуры, с получением липидных наночастиц.
Композиции липидных наночастиц, содержащие кортикостероид, могут предпочтительно использоваться при лечении воспалительных кожных заболеваний или состояний, таких как экзема, атопический дерматит, контактный дерматит, псориаз, старение кожи, фотостарение, акне, крапивница или прурит.
В другом варианте осуществления липидные наночастицы дополнительно содержат второй липид, который представляет собой масло при температуре окружающей среды, способное смешиваться с первым липидом, или липофильный эмульгатор или смягчающее средство. Количество второго липида составляет приблизительно 1-40% по массе, например, приблизительно 10-35% по массе или приблизительно 15-30% по массе, или приблизительно 20-25% по массе от массы липидных наночастиц. Более конкретно, липидные наночастицы могут содержать приблизительно 80-85% по массе первого липида и приблизительно 15-20% по массе второго липида.
6-10
6-10
В данном варианте осуществления второй липид может предпочтительно быть выбран из группы, состоящей из C моноглицеридов, C диглицеридов, среднецепочечных триглицеридов, таких как триглицериды каприловой/каприновой кислот, длинноцепочечных триглицеридов, таких как касторовое масло, изопропилмиристат или изопропилпальмитат.
14-28
В варианте осуществления, включающем в качестве активного ингредиента производное или аналог витамина D, указанный первый липид может предпочтительно быть выбран из группы, состоящей из цетилпальмитата, жирного C спирта, гидрогенизированного пальмового масла и триглицерида с кислотным числом 0,1 или ниже, означающим низкое содержание свободных жирных кислот, которые вредны для химической стабильности производных витамина D, вследствие хорошо известной чувствительности производных витамина D к кислоте. В таком варианте осуществления липидные наночастицы, содержащие первый и второй липид, как было обнаружено, предпочтительны для препарата производных витамина D, поскольку этот вариант предоставляет лекарственному соединению возможность встраиваться в липидные наночастицы, в которых оно в меньшей степени подвержено деградации разрушающими компонентами в водной фазе композиции. Применение первого и второго липида может повышать загрузку лекарственного средства в липидные наночастицы и предотвращать присутствие активного ингредиента в водной фазе. Кроме того, когда липидные наночастицы обладают структурой, не подверженной полиморфной инверсии во время хранения, что приводит к выбросу лекарственного средства и его распределению в водной фазе, стабильность может еще сильнее возрастать. Второй липид может предпочтительно быть выбран из изопропилмиристата, изопропилпальмитата, среднецепочечных триглицеридов, таких как триглицериды каприловой/каприновой кислоты, или длинноцепочечных триглицеридов, таких как касторовое масло. В предпочтительном в настоящее время варианте осуществления указанный первый липид представляет собой цетилпальмитат, и указанный второй липид представляет собой триглицерид каприловой/каприновой кислоты. Производное витамина D может быть выбрано из кальципотриола, кальцитриола, максакальцитола, такальцитола, причем все они хорошо известны как средства для местного применения на кожу.
3
1/2
Композиции, содержащие лекарственное средство, включающее липидные наночастицы, предназначенные для направленного действия на волосяные фолликулы, могут предпочтительно содержать липиды, которые обладают параметром растворимости, близким к кожному жиру, присутствующему в сальных железах волосяных фолликулов. Таким образом, оказывается, что эффект первого и/или второго липида, присутствующего в липидных наночастицах, по доставке активного соединения в богатые жиром области, например, волосяные фолликулы, может объясняться свойствами растворимости эксципиента, что определяется коэффициентами растворимости Гильдебранда (JH Hildebrand and RL Scott, Solubility of Non-Electrolytes, Reinhold, New York, 1949). Коэффициенты Гильдебранда (параметры растворимости δ) для моделей композиций кожного жира показывают, что кожный жир является в общем неполярным, маслянистым веществом с коэффициентом Гильдебранда приблизительно 7,5-8 (кал/см) (ср. DW Osborne et al., "The Influence of Skin Surface Lipids on Topical Formulations" in Topical Drug Delivery Formulations, Vol. 42, 1990 (Drugs и Pharmaceutical Science)). Как было обнаружено, липиды с коэффициентами Гильдебранда в пределах ±2 единиц от кожного жира смешиваются с этим жиром и, таким образом, подходят для целей солюбилизации активных соединений для их доставки в комплекс волосяного фолликула. Другим воздействующим фактором является температура плавления липида, поскольку высвобождение вещества лекарственного средства может инициироваться расплавлением, а также слиянием с кожным жиром и другими липидами кожи. Липиды с параметром растворимости, близким к кожному жиру, могут включать цетилпальмитат, стеарилпальмитат и стеарилбегенат.
Кальципотриол, как известно, является соединением, исключительно чувствительным к кислым условиям (при pH ниже приблизительно 7,0 в водной композиции или в присутствии кислых реагентов в неводной композиции), которые вносят вклад в быструю деградацию кальципотриола. Чтобы обеспечить соответствующую химическую стабильность вещества на всем протяжении срока хранения композиции, может быть рекомендовано включать в нее соединение, способное нейтрализовать кислые примеси, которые могут присутствовать в одном или нескольких эксципиентах композиции и которые вредны для химической стабильности кальципотриола. Нейтрализующее кислоту соединение может предпочтительно быть выбрано из буфера, такого как фосфатный буфер, который может включаться в количестве приблизительно 0,025-0,1% по массе композиции, так что pH композиции составит 7,5 или более. Нейтрализующее кислоту соединение может также представлять собой амин с липидным якорем, т.е. с длинной липидной цепью, прикрепляющейся между водной фазой и липидной наночастицей. Примерами таких аминов являются третичные амины, такие как триэтаноламин, трометамол, моноэтаноламин или диэтаноламин, которые могут быть включены в композицию в количестве приблизительно 0,1-2% по массе.
В данном варианте осуществления настоящей композиции липидные наночастицы могут присутствовать в количестве 1-40% по массе, например, приблизительно 5-30% по массе или приблизительно 10-20% по массе композиции. Композиция может представлять собой крем (масло в воде), лосьон, распыляемый препарат или водный гель, причем композиция дополнительно включает водную фазу. Водная фаза может дополнительно содержать липид, такой как силиконовое масло, парафиновое масло или холестерин и/или загуститель. Загуститель может быть выбран из карбомера или из производного целлюлозы, например, гидроксипропилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы. Загуститель, как правило, присутствует в количестве 0,1-5% по массе, в частности, приблизительно 0,5% по массе композиции. Композиция может дополнительно содержать смягчающее средство, которое может быть выбрано из группы, состоящей из силиконового масла, парафинового масла и холестерина. Смягчающее средство может быть включено в количестве приблизительно 10-50% по массе или приблизительно 20-40% по массе, или приблизительно 30% по массе композиции.
Композиция согласно данному варианту осуществления может быть получена способом, включающим:
12-24
12-24
12-24
12-24
(a) солюбилизацию или диспергирование производного витамина D в липидной фазе, содержащей приблизительно 60-92% по массе первого липида с температурой плавления выше температуры тела, причем указанный первый липид представляет собой воск, выбранный из группы, состоящей из сложных эфиров C спиртов и C жирных кислот, сложных триэфиров глицерина и C жирных кислот с кислотным числом 0,1 или менее, жирных C спиртов и холестерина, и необязательно приблизительно 1-40% по массе второго липида, который представляет собой масло при комнатной температуре, способное смешиваться с первым липидом, причем указанный первый липид находится в расплавленном состоянии;
(b) диспергирование липидной фазы, полученной на стадии (a), в водной фазе, содержащей приблизительно 0,2-10% по массе фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, выбранного из полоксамера или этоксилированного жирного спирта;
(c) гомогенизацию эмульсии, полученной на стадии (b), с использованием гомогенизатора высокого давления для образования наночастиц липидной фазы, содержащих производное витамина D, и
(d) охлаждение гомогенизированной эмульсии, полученной на стадии (c), для затвердевания наночастиц. Размер липидных наночастиц, полученных данным способом, как установлено, находится в диапазоне приблизительно 100-500 нм.
Альтернативно, композицию можно получать способом, включающим:
12-24
12-24
12-24
12-24
(a) солюбилизацию или диспергирование производного витамина D в липидной фазе, содержащей приблизительно 60-92% по массе первого липида с температурой плавления выше температуры тела, причем указанный первый липид представляет собой воск, выбранный из группы, состоящей из сложных эфиров C спиртов и C жирных кислот, сложных триэфиров глицерина и C жирных кислот с кислотным числом 0,1 или менее, жирных C спиртов и холестерина, и необязательно приблизительно 1-40% по массе второго липида, который представляет собой масло при комнатной температуре, способное смешиваться с первым липидом, причем указанный первый липид находится в расплавленном состоянии;
(b) отвердевание липидной фазы, полученной на стадии (a), в жидком азоте или на сухом льду;
(c) перемалывание отвердевшей липидной фазы до размера частиц, приблизительно равного 50-100 мкм;
(d) диспергирование порошка, полученного на стадии (c), в холодной водной фазе, содержащей приблизительно 0,2-10% по массе поверхностно-активного вещества, и
(e) гомогенизацию дисперсной системы, полученной на стадии (d), с использованием гомогенизатора высокого давления при комнатной температуре или ниже комнатной температуры, с получением липидных наночастиц.
3
Композиции липидных наночастиц, содержащих производное или аналог витамина D, можно использовать для профилактики или лечения воспалительного или гиперпролиферативного состояния кожи, такого как псориаз, себопсориаз, ладонно-подошвенный пустулез, дерматит, ихтиоз, розовые угри, акне или актинический кератоз. В литературе описано, что себоциты экспрессируют рецептор витамина D (VDR) и что экспрессия VDR индуцируется обработкой биологически активным метаболитом витамина D 1α,25-дигидроксивитамином D (кальцитриол), см. C. Kramer et al, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 113, 2009, pp. 9-16. Инкубация культивируемых себоцитов кальцитриолом приводила к снижению секреции провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-8. Таким образом, можно предположить, что производные витамина D могут иметь терапевтический эффект в отношении нарушений сальных желез, таких как акне, при направленном действии на волосяные фолликулы. Кроме того, производные витамина D, как известно, снижают гиперпролиферацию кератиноцитов и могут, как ожидается, оказывать такое действие также на кератиноциты фолликулярного протока.
Хотя ранее возникло предположение, что аналоги витамина D, такие как кальципотриол, можно использовать в лечении акне (см. WO 91/12807), композиции, описанные в предшествующей ссылке, затем оказались неэффективными для такого лечения. Отсутствие эффективности, наблюдаемое с предшествующими композициями, как полагают, вызвано тем, что активный ингредиент не был направлен в место его действия, и в настоящее время предполагают, что когда аналог витамина D будет направлен на волосяные фолликулы, можно будет увеличить эффективность лечения акне.
Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к способу направленного действия производного витамина D, такого как кальципотриол, на сальные железы волосяных фолликулов, включающему нанесение на область кожи нуждающегося в таком лечении пациента терапевтически эффективного количества композиции липидных наночастиц, как описано выше. Более конкретно, площадь кожи, которую нужно лечить, содержит комедон, пустулу, папулу или цисту, ассоциированные с акне или родственным заболеванием, таким как розовые угри. Производное витамина D предпочтительно представляет собой кальципотриол или моногидрат кальципотриола.
Кроме того, предусматривается получение композиций липидных наночастиц, содержащих как кортикостероид, так и производное или аналог витамина D, в качестве активных ингредиентов в фармацевтически приемлемом водном носителе. В данном варианте осуществления композиция может быть стабилизирована добавлением антиоксиданта, который может быть выбран из группы BHA и BHT, или смеси BHA и BHT.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Композиции по изобретению
Твердые липидные наночастицы, содержащие бекламетазон-17-валерат (BMV)
Ингредиент
Композиция А (мг/г)
Композиция B (мг/г)
Композиция C (мг/г)
Композиция D (мг/г)
Композиция E (мг/г)
Композиция F (мг/г)
BMV
1
1
1
0,12
0,12
1,2
Дистеарат глицерина
100
-
-
100
25
100
Цетил-пальмитат
-
100
-
-
-
-
Трипальмитат глицерина
-
-
100
-
-
-
Полисорбат 80
25
25
25
25
4
25
Вода
До 1 г
До 1 г
До 1 г
До 1 г
До 1 г
До 1 г
Твердые липидные наночастицы, содержащие дипропионат бетаметазона (BDP)
Композиция G
Эксципиент (мг/г)
Единица
мг
Дипропионат бетаметазона
0,643
Дистеарат глицерина
100
Полисорбат 80
20
Дигидрат двухзамещенного фосфата натрия
10
Гидроксид натрия (хлористоводородная кислота)
в кол-ве, достаточном для pH 6,0
Вода, очищенная
до 1 г
Липидные наночастицы, содержащие моногидрат кальципотриола
Композиция H
мг/г
1
Моногидрат кальципотриола
0,0522
2
Цетилпальмитат
160
3
MCT
40
4
Полоксамер 407
48
6
Диазолидинилмочевина
5
7
Дигидрат двухзамещенного фосфата натрия
20
8
BHA-BHT (50:50)
3
9
Гидроксид натрия (хлористоводородная кислота)
в кол-ве, достаточном для pH 8,0/8,5
10
Вода, очищенная
До 1 г
Композиция I
мг/г
1
Моногидрат кальципотриола
0,0522
2
Цетилпальмитат
200
3
Полоксамер 407
48
4
Диазолидинилмочевина
10
5
Дигидрат двухзамещенного фосфата натрия
20
6
BHA-BHT (50:50)
3
7
Гидроксид натрия (хлористоводородная кислота)
в кол-ве, достаточном для pH 8,5
8
Вода, очищенная
До 1 г
Композиция J
мг/г
1
Моногидрат кальципотриола
0,0522
2
Цетилпальмитат
160
3
MCT
40
4
Карбомер 974 P
10
5
Полоксамер 407
48
6
Диазолидинилмочевина
5
7
Дигидрат двухзамещенного фосфата натрия
20
8
BHA-BHT (50:50)
3
9
Гидроксид натрия (хлористоводородная кислота)
в кол-ве, достаточном для pH 8,0/8,5
10
Вода, очищенная
До 1 г
Композиция K
мг/г
1
Моногидрат кальципотриола
0,0522
2
Цетилпальмитат
200
3
Полоксамер 407
48
5
Карбомер 974 P
10
5
Диазолидинилмочевина
10
6
Дигидрат двухзамещенного фосфата натрия
20
7
BHA-BHT (50:50)
3
8
Гидроксид натрия (хлористоводородная кислота)
в кол-ве, достаточном для pH 8,0/8,5
9
Вода, очищенная
До 1 г
Композиция L
мг/г
1
Моногидрат кальципотриола
0,0522
2
Тристеарат глицерина
80
3
Касторовое масло
20
4
Полоксамер 407
24
5
Карбомер 974 P
10
6
Диазолидинилмочевина
5
7
Дигидрат двухзамещенного фосфата натрия
20
8
BHA-BHT (50:50)
3
9
Гидроксид натрия (хлористоводородная кислота)
в кол-ве, достаточном для pH 8,5
10
Вода, очищенная
До 1 г
Композиция M
мг/г
1
Моногидрат кальципотриола
0,0522
2
Dynasan P60
80
3
Miglyol 812 или фракционированное кокосовое масло
20
4
Полоксамер 407
24
5
Карбомер 974 P
10
6
Диазолидинилмочевина
5
7
Дигидрат двухзамещенного фосфата натрия
20
8
BHA-BHT (50:50)
3
9
Гидроксид натрия (хлористоводородная кислота)
в кол-ве, достаточном для pH 8,0/8,5
10
Вода, очищенная
До 1 г
Композиция N
мг/г
1
Моногидрат кальципотриола
0,0522
2
Бегенол
80
4
Полоксамер 407
24
5
Карбомер 974 P
10
6
Диазолидинилмочевина
5
7
Дигидрат двухзамещенного фосфата натрия
20
8
BHA-BHT (50:50)
3
9
Гидроксид натрия (хлористоводородная кислота)
в кол-ве, достаточном для pH 8,5
10
Вода, очищенная
До 1 г
Липидные наночастицы, содержащие моногидрат кальципотриола и дипропионат бетаметазона
Композиция O
мг/г
1
Моногидрат кальципотриола
0,0522
2
Дипропионат бетаметазона
0,643
3
Dynasan 118
80
4
Mygliol 812
20
5
Полоксамер 188
20
6
Карбомер 974 P
5
7
Диазолидинилмочевина
5
8
Дигидрат двухзамещенного фосфата натрия
14
9
BHA-BHT (50:50)
3
10
Гидроксид натрия (хлористоводородная кислота)
в кол-ве, достаточном для pH 6,6
11
Вода, очищенная
До 1 г
Композиция P
мг/г
1
Моногидрат кальципотриола
0,0522
2
Дипропионат бетаметазона
0,643
3
Тристеарат
100
4
Полоксамер 188
10
5
Карбомер 974 P
5
6
Диазолидинилмочевина
5
7
Дигидрат двухзамещенного фосфата натрия
14
8
BHA-BHT (50:50)
3
9
Гидроксид натрия (хлористоводородная кислота)
в кол-ве, достаточном для pH 6,6
10
Вода, очищенная
До 1 г
Композиция Q
мг/г
1
Моногидрат кальципотриола
0,0522
2
Дипропионат бетаметазона
0,643
3
Dynasan 118
80
4
Касторовое масло
20
5
Полоксамер 407
20
6
Карбомер 974 P
5
7
Диазолидинилмочевина
5
8
Дигидрат двухзамещенного фосфата натрия
14
9
BHA-BHT (50:50)
3
10
Гидроксид натрия (хлористоводородная кислота)
в кол-ве, достаточном для pH 6,6
11
Вода, очищенная
До 1 г
Кальципотриол, встроенный в липидные наночастицы (композиция H-L) определяли как химически стабильный (>90%) через 3 месяца хранения при 40°C.
Кальципотриол, встроенный в липидные наночастицы (композиция H-M), определяли как химически стабильный (>90%) через 18 месяцев хранения при 25°C.
Дипропионат бетаметазона определяли как химически стабильный (>90%) в композиции G после 6 месяцев хранения при 25°C.
Стабильность композиции N при 25°C оценивается как бессрочная.
Кальципотриол и дипропионат бетаметазона, встроенные в липидные наночастицы (композиции O-Q), определяли как химически стабильные (>90%) в SLN после 6 месяцев хранения при 25°C.
Получение препаратов
Получение SLN осуществляли горячей гомогенизацией при высоком давлении, как описано в EP 605497.
В кратком изложении, для SLN с BMV и BDP липид расплавляли при 80°C, и BMV или BDP растворяли в расплавленном липиде при перемешивании. Водный раствор полисорбата 80 при такой же температуре добавляли к липидной смесь, и смесь мягко гомогенизировали в течение 2 мин при 6000 об./мин с использованием высокоскоростного миксера Silverson High Speed Mixer L4RT от Silverson Machines Ltd. (Chesham, United Kingdom), с получением грубой эмульсии. Эмульсию гомогенизировали при высоком давлении с использованием EmulsiFlex C5 от Avestin Inc. (Ottawa, ON, Canada), причем гомогенизатор помещали на водяную баню Julabo TW 20 (Seelbach, Germany) для поддержания температуры при 80°C. Грубую эмульсию обрабатывали при 600 бар, применяя четыре цикла гомогенизации. Эти параметры обработки выбирали из предшествующих исследований, поскольку они приводили к образованию SLN с небольшим средним размером частиц (<200 нм) и низкой полидисперсностью. Дисперсионные среды с SLN охлаждали при комнатной температуре, защищая при этом от света, и затем доводили в них pH до 5,0. Мазь с BMV составляли из 99% (масс./масс.) белого мягкого парафина и 1% (масс./масс.) парафинового масла, и ее получали суспендированием кристаллов BMV в мази с использованием ступки. Все препараты с BMV хранили при 5°C, защищая от света до использования.
Получение твердых липидных наночастиц и наноструктурированных липидных носителей, содержащих кальципотриол, проводили сходным образом. Кальципотриол растворяли в горячем масле (в случае NLC), и смесь добавляли к расплавленному липиду. Для SLN кальципотриол растворяли в расплавленном липиде, и поддерживали температуру 80°C до перемешивания. pH раствора полоксамер/вода доводили до 8,0, нагревали его до температуры 80°C и добавляли в расплавленную смесь липид-лекарственное средство. Предварительные эмульсии получали с использованием высокоскоростного миксера Silverson High Speed Mixer L4RT от Silverson Machines Ltd. (Chesham, United Kingdom). Затем дисперсионные смеси SLN получали гомогенизацией при высоком давлении, применяя 500-800 бар и 3 цикла с использованием EmulsiFlex C5 от Avestin Inc. (Ottawa, ON, Canada) с гомогенизатором, размещенным на водяной бане Julabo TW 20 (Seelbach, Germany) для поддержания температуры 80°C. После охлаждения SLN смешивали с буфером, консервантом и стабилизатором, и pH доводили до 8,0 или 8,5. При осуществлении загустевания препаратов карбомером использовали охлаждение, добавляя карбомер постепенно с использованием высокоскоростного миксера Silverson High Speed Mixer L4RT от Silverson Machines Ltd. (Chesham, United Kingdom), и затем pH доводили, как на конечной стадии.
Характеристика препаратов
Характеристику осуществляли через 0-3 суток после дня их получения, и исследования in vivo начинали в течение одной недели после получения препаратов.
Динамическое светорассеяние (DLS)
Анализ размера частиц SLN проводили посредством DLS на Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK), оснащенном лазером с длиной волны 633 нм и оптической системой детекции 173°. Измерения проводили при 25°C в образцах (n=3), соответственно разбавленных перед измерением очищенной водой, т.е. для измерения использовали вязкость воды. Программное обеспечение Malvern DTS v 5.10 применяли для получения и анализа данных. Распределение размера частиц описывали посредством индекса полидисперсности (PdI) и среднего гидродинамического диаметра (Z-среднее).
Микроскопия
Растворимость BMV в липиде, а также его присутствие в конечных препаратах, в SLN и мази, оценивали микроскопически с использованием микроскопа Nikon Eclipse 80i, укомплектованного нагревателем Linkam PE94; оба прибора от DFA Instruments (Glostrup, Denmark). Программное обеспечение, используемое для получения данных, представляло собой Image Pro Plus.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
SLN и мазь анализировали количественно на содержание BMV, BDP и кальципотриола, соответственно, путем ВЭЖХ.
Характеристики SLN и мази
Анализ DLS показал, что средний диаметр четырех различных SLN (отличающихся только содержанием BMV), тестируемых в исследовании по поиску дозы, составлял 179,9-193,6 нм при PdI 0,179-0,216. Оптимизация концентраций поверхностно-активного вещества и липида для снижения раздражения кожи при сохранении малого среднего размера частиц и низкого PdI показала, что это возможно при использовании композиции 2,5% (масс./масс.) дистеарата и 0,4% (масс./масс.) полисорбата 80. Z-средний SLN с данной композицией составлял 205,4 нм, и PdI был равен 0,228. Значения Z-среднего и PdI зависели от концентраций поверхностно-активного вещества и липида. Для обеих концентраций липида повышенная концентрация поверхностно-активного вещества снижала Z-средний и PdI до определенного уровня поверхностно-активного вещества, после которого размер частиц более не уменьшался. BMV растворяли в липиде в SLN, и в конечных препаратах микроскопией не выявляли кристаллов лекарственного средства. В мази кристаллы BMV (<25 мкм) распределялись равномерно по всему носителю. Анализ ВЭЖХ показал, что концентрация BMV в SLN и в мази была на ожидаемом уровне с относительными стандартными отклонениями менее чем 1,4% (кроме 0,003 мг/г SLN, где относительное отклонение составляло 10,3%). Это иллюстрирует тот факт, что BMV равномерно распределяется в обоих типах препарата и химически стабилен в них.
Пример 2
Исследования проникновения в кожу
Получение образцов кожи
Свиные уши получали из недавно забитых свиней из Danish Meat Trade College (Roskilde, Denmark). Уши хранили при -20°C и медленно оттаивали при 4°C перед обриванием и удалением более толстой кожи с задней части ушей с использованием скальпеля. Подкожную ткань осторожно снимали скальпелем, и нарезали кожу на подходящие куски перед замораживанием при -20°C до использования (не позднее чем через 14 суток). Два куска кожи получали с каждого уха, и их обрабатывали для имитации интактной кожи и кожи с ослабленной барьерной функцией.
2
Ослабление кожного барьера индуцировали 25 последовательными соскобами липкой лентой, нанося липкие диски D-Squame (Cuderm Corp., Dallas, USA). Давление на липкую ленту 225 г/см применяли посредством аппликатора для липкой ленты D-Squame в течение 5 с (Cuderm Corp., Dallas, USA). Кожу монтировали на пробковую плиту мелкими булавками, растягивая ее для предотвращения проблем с морщинами кожи при соскобах липкой лентой. Способ адаптировали из Simonsen et al., где создавали модель кожи для симуляции барьерных свойств кожи с AD [L. Simonsen and A Fullerton, Skin Pharmacol. Physiol. 20(5), 2007, pp. 230-236]. Эффект соскобов липкой лентой на свежей коже по сравнению с замороженной и оттаявшей валидировали в начальном исследовании, где сравнивали свежую и замороженную кожу (n=6) и использовали соскобы липкой лентой 0, 5, 15, 25 и 40 раз. Пункционные биопсии отбирали и фиксировали в 10% (масс./масс.) формалине с последующей окраской гематоксилином-эозином перед оценкой путем микроскопии.
Исследование проникновения в кожу и ее проницаемости
3
14
Оценивали профили проникновения BMV и липида. Меченный H BMV и меченный C липид использовали для исследования проникновения частиц BMV и липида (дистеарата и трипальмитата) в интактную кожу и кожу с ослабленной барьерной функцией.
2
2
Кожу монтировали на диффузионные ячейки Франца, повернув сторону дермы к рецепторной среде (площадь диффузии 3,14 см, реципиентный объем 10 мл, постоянное перемешивание, поддерживается температура 32°C). Раствор 1% (масс./масс.) метил-β-циклодекстрина в изотоническом ацетатном буфер, pH 5,5 (15 мМ ацетат натрия, 100 мМ хлорид натрия), использовали в качестве рецепторной среды. После уравновешивания кожи в течение 30 мин изотоническим раствором хлорида натрия и в течение 60 мин рецепторной средой, рецепторную среду обновляли, и 20 мг препарата (6,4 мг препарата/см) наносили на поверхность кожи шпателем. Точное количество нанесенного препарата определяли взвешиванием шпателя до и после нанесения. По окончании инкубации кожу отделяли и анализировали. Все исследования проводили на интактной коже или коже с ослабленной барьерной функцией, и время нанесения препарата меняли, используя 6, 16 и 24 часов. Закупорку осуществляли путем монтажа стеклянной пробки на верхнюю часть кожи, чтобы гарантировать условия полной закупорки. По окончании времени нанесения излишки препарата удаляли, дважды протирая кожу хлопковым тампоном. 10 мл этилацетата использовали для экстракции BMV и липида с хлопковых тампонов и с крышки донорного отсека. Смесь гептан:этанол (30:70) использовали для экстракции BMV из мази. Роговой слой удаляли нанесением максимум 15 липких лент на интактную кожу с использованием липких дисков D-Squame (Cuderm Corp., Dallas, USA), применяя способ, как при индукции повреждения кожи. Для кожи с ослабленной барьерной функцией осуществляли максимум 3 соскоба клейкой лентой. В обоих случаях первую ленту обозначали как излишек препарата. Способ удаления роговой оболочки разработан в предшествующих исследованиях с различными препаратами и результатами тестов, где применяли различное количество полос клейкой ленты через 24 часа воздействия препарата. Однако если эпидермис начинал отделяться менее чем за 15 или 3 отрыва ленты, соответственно, соскоб клейкой лентой завершали и последнюю ленту применяли для подсчета эпидермиса. Эпидермис и дерму разделяли нагреванием (инкубация в течение 5 мин при 60°C и высокой влажности). Кожу, окружающую область применения (обозначенную как необработанная кожа), разрезали на мелкие куски и также анализировали для включения в исследование анализ латерального проникновения и получения всего материала препарата. Soluene 350 добавляли к полосам клейкой ленты и к образцам кожи для солюбилизации ткани и экстракции лекарственного вещества и липида. Через 24 часа инкубации при 50°C, 10 мл Hionic-Fluor добавляли к образцам с Soluene 350 и анализировали путем сцинтилляционного считывания жидкости в жидкостном сцинтилляционном счетчике Tri-Carb 2100 TR от Packard Instrument Company (Meriden, USA). Экстракты с крышки и хлопкового тампона и содержание в рецепторной среде анализировали путем смешивания 1 мл с 10 мл Hionic-Fluor перед сцинтилляционным считыванием. Подходящую жидкость (т.е. этилацетат, рецепторную среду, гептан:этанол (30:70) и Soluene 350 в смеси с Hionic-Fluor) использовали в качестве измерений фона.
При сравнении воздействия в течение 6, 16 и 24 часов количество BMV в различных слоях кожи объединяли с учетом факта, что структура кожи меняется в течение 24 часов, так что эффективность процедуры разделения также может меняться.
Исследования проникновения in vitro проводили на интактной свиной коже и коже с ослабленной барьерной функцией в диффузионной ячейке Франца, меняя липидный компонент SLN, длительность нанесения и присутствие условий закупорки, для оценки того, как SLN воздействуют на профиль проникновения вещества лекарственного средства внутрь кожи и сквозь нее.
Отношение BMV к дистеарату, как было обнаружено, повышается с глубиной кожи, т.е. в кожу проникает больше BMV, чем липида. Это отношение в избыточном препарате составляло приблизительно 1. В роговом слое оно падало ниже 1, и затем повышалось по мере проникновения через эпидермис и дерму до достижения 3,6 в рецепторной среде. По сравнению с дистеаратом профиль дипальмитата был немного другим, поскольку снижение отношения BMV к липиду наблюдали в дерме, и это значение в рецепторной среде составляло 2,7, что было ниже, чем для дистеарата. Факт, что отношение BMV/липид повышалось с глубиной кожи, означает задержку липидных частиц, в основном, на поверхности или в верхних слоях кожи и высвобождение BMV из частиц для проникновения в кожу. В таблице 3 показаны данные по проникновению липида в различные слои кожи и в рецепторную среду. Как в интактной коже, так и в коже с ослабленной барьерной функцией имеется тенденция к тому, что эпидермиса достигает больше дистеарата, чем трипальмитата. Когда у кожи ослаблена барьерная функция за счет соскоба липкой лентой, наблюдали повышение количества липида, достигающего эпидермиса, дермы и рецепторной среды. Повышение проникновения липида (в ~3-7 раза) было очень низким по сравнению с повышением проникновения BMV (~3-60 раза) в коже с ослабленной барьерной функцией, что подтверждает факт высвобождения BMV из наночастиц и его раздельной диффузии через кожу.
Основное различие, наблюдаемое между SLN и мазью после обработки кожи в течение 24 часов, состояло в том, что SLN обеспечивали по существу более высокое общее количество BMV, остающееся в коже, как в интактной, так и в коже с ослабленной барьерной функцией (фиг.1). Когда барьер был интактным, большое количество вводимого в SLN BMV находили в роговом слое и меньше - в рецепторном слое (фиг.1a). SLN обеспечивали большую степень локализации BMV в верхних слоях кожи, откуда он мог диффундировать в более глубокие слои кожи, и было очевидно, что SLN приводят к тому, что существенно больше BMV проникает глубже в роговой слой интактной кожи по сравнению с мазью (p<0,05). С SLN из цетилпальмитата больше BMV проникало в эпидермис. Только незначительное количество BMV (<0,9%) проникало в рецепторную среду, когда SLN наносили на интактную кожу, в то время как значительно больше (8,4±4,0%) проникало через интактную кожу после использования мази (фиг.1a). После соскоба липкой лентой кожи перед нанесением SLN или мази, проникновение BMV из всех препаратов в рецепторную среду сильно увеличивалось (13,8-21,8%) (фиг.3b). Значительно больше BMV оставалось в коже с ослабленной барьерной функцией после нанесения SLN по сравнению с мазью (p<0,05), но сходное количество BMV проникало в рецепторную среду (фиг.1b). Тенденция была такова, что больше BMV оставалось в роговой оболочке в интактной коже и в коже с ослабленной барьерной функцией после введения BMV в SLN из дистеарата по сравнению с SLN из трипальмитата и цетилпальмитата (фиг.1).
Для достижения лучшего понимания полученных через 24 часа обработки результатов в исследование ввели два добавочных момента времени, то есть, 6 и 16 часов. Для этих исследований выбрали дистеарат из-за более высокой растворимости BMV в этом липиде. После нанесения на 6, 16 и 24 часа, соответственно, было показано, что во все моменты времени в коже присутствовали меньшие количества BMV при использовании мази (фиг.2), и что нанесение SLN из дистеарата приводило к наличию постоянного и значительно большего количества BMV в коже. Количество BMV, проникающего в рецепторную среду для кожи с ослабленной барьерной функцией повышалось только в малой степени через 24 часа при введении в SLN (фиг.2b).
Когда кожу немедленно закупоривали на 24 часа после введения SLN, количество BMV, которое проникало в рецепторную среду, значительно повышалось по сравнению с незакупоренным состоянием, и его количество в коже понижалось (фиг.3). После закупорки и в отличие от интактной кожи повышение BMV, который проникал в рецепторную среду, было очень большим для кожи с ослабленной барьерной функцией; 65,6±15,2% при использовании SLN из дистеарата (фиг.3b).
Доставка дипропионата бетаметазона in vivo в кожу безволосых крыс
2
После наркоза изофлураном 100 мкл препарата наносили на площадь 4×3 см на спине крысы. Крысу оставляли на 2 минуты (для высыхания препарата), «биопленку» Optiskin (5,3×7,2 см, URGO laboratories, France) наносили на эту область, и на нее сверху наносили полоску Fixomull (BSN medical, Germany). Крыс фиксировали в разные интервалы времени после дозирования, и сразу отбирали точечные биопсии кожи и образцы крови. Перед фиксированием от каждого животного получали образцы сублингвальной крови. Крыс подвергали эвтаназии CO. Биопсии кожи отбирали из обработанной области кожи. Кожу осторожно очищали тканью, вымоченной в 99,9% этаноле. Биопсии взвешивали и держали при -80°С до проведения количественного анализа. Количественный анализ проводили путем ЖХ-МС/МС.
На фиг.4 проиллюстрировано, что можно получить более высокий уровень дипропионата бетаметазона (BDP) и его метаболитов бетаметазона (BOP) и монопропионата бетаметазона (BMP) в коже в течение более длительного периода времени после введения в SLN в кожу безволосых крыс по сравнению с введением мази. На 3 сутки достигалась стационарная концентрация вещества лекарственного средства в коже, и на 7 сутки вещество лекарственного средства еще оставалось в коже до некоторой степени, хотя оно не детектировалось при введении в мази. Эти данные подтверждают резервуарный эффект, наблюдаемый in vitro, когда кортикостероид BMV в SLN наносили на интактнную свиную кожу и кожу с ослабленной барьерной функцией.
Пример 3
Оценка липидных наночастиц, содержащих BMV, в качестве системы доставки в кожу на модели индуцированного у мышей атопического дерматита
Фенотип AD индуцировали путем повторных стимуляций оксазолоном (Man et al., J. Invest. Dermatol. 128, 2008, pp. 79-86). Мышей сенситизировали нанесением 10 мкл 0,8% (масс./об.) оксазолона в ацетоне на каждую сторону правого уха (время обозначено как сутки -7). Контрольную группу обрабатывали 10 мкл ацетона на каждую сторону правого и левого уха. Через семь суток после сенситизации (время обозначено как сутки 0), мышей стимулировали первый раз 0,4% (масс./об.) оксазолоном в ацетоне. Более конкретно, мышам дозировали по 10 мкл 0,4% (масс./об.) оксазолона на каждую сторону правого уха через сутки от 0 до 21 суток. На те же сутки, когда наносили оксазолон, мышам в контрольной группе дозировали по 10 мкл ацетона на каждую сторону левого и правого уха, соответственно. На 10 сутки начинали лечение на основе ежедневного однократного лечения до окончания исследования на 21 сутки. Считывали следующие параметры: толщина уха, TEWL, анализ цитокинов, гистологическая оценка кожи и количественный анализ BMV в ткани уха и в сыворотке.
Поиск дозы BMV, вводимого в SLN
Исходное исследование проводили для поиска отношения доза-ответ для BMV в SLN и для установления дозы для использования при сравнении эффекта SLN и мази. Три различные концентрации BMV в SLN применяли в данном исследовании. Мышей разделяли на 8 групп по 4-8 животных (всего 52 мыши), включающих две ацетоновые контрольные группы мышей (n=4), у которых не индуцировали AD и которых обрабатывали один раз в день 10 мкл ацетона на каждую сторону правого и левого уха или один раз в сутки 5 мкл SLN-плацебо на каждую сторону правого уха. Другие группы состояли из мышей, у которых имел место AD, индуцированный оксазолоном, и которых лечили один раз в сутки на каждой стороне правого уха 10 мкл ацетона (n=7), 10 мкл 3,0 мкг/ухо/сутки BMV в ацетоне (n=6), 5 мкл SLN-плацебо (n=7), 5 мкл 0,030 мкг/ухо/сутки BMV в SLN (n=8), 5 мкл 1,20 мкг/ухо/сутки (n=8) и 5 мкг 12,0 мкг/ухо/сутки BMV в SLN (n=8). Левое ухо не обрабатывали.
Раздражение и эффект SLN и мази
Композицию SLN оптимизировали в исследовании, в котором оценивали раздражающий эффект носителя SLN на кожу мышиных ушей. Более конкретно, оценивали концентрацию поверхностно-активного вещества полисорбата 80. Получали различные препараты-плацебо для поиска оптимальных уровней поверхностно-активного вещества и липида, что приводило к среднему размеру частицы, приблизительно равному 200 нм, и низкой полидисперсности частиц (<0,25). Кроме того, частицы данной композиции не должны индуцировать какого-либо раздражающего действия на здоровую кожу мышиного уха и должны предоставлять достаточную растворимость BMV в липидной смеси (>0,012% (масс./масс.)). Композиция носителя SLN, которая отвечала этим критериям, как было обнаружено, представляла собой 2,5% (масс./масс.) липида и 0,4% (масс./масс.) полисорбата 80 (таблица 1). Эффект данного препарата SLN сравнивали с традиционной парафиновой мазью, которая, как было показано, не раздражала здоровую кожу мышиных ушей.
Для сравнения SLN с мазью для доставки BMV, 69 мышей разделили на 8 групп по 4-10 животных, в которых одна из групп представляла собой ацетоновую контрольную группу (n=4), в которой не индуцировали AD. У всех мышей в других группах развивался AD, индуцированный оксазолоном, и их обрабатывали один раз в сутки с каждой стороны от правого уха следующими препаратами: 10 мкл ацетона (n=8), 10 мкл 3,0 мкг/ухо/сутки BMV в ацетоне (n=8), 10 мкл 1,20 мкг/ухо/сутки BMV в ацетоне (n=10), 5 мкл 1,20 мкг/ухо/сутки BMV в SLN (n=10), 6 мкл 1,20 мкг/ухо/сутки BMV в мази (n=10), 5 мкл SLN-плацебо (n=10) и 6 мкг мази-плацебо (n=9). Схема лечения в другом отношении была сходной со схемой в исследовании по поиску дозы. SLN наносили пипеткой, и для мази использовали шпатель в связи с более высокой вязкостью. Композиции тестируемых составов показаны в таблице 1.
Толщина уха
В качестве меры степени воспаления кожи измеряли толщину правого и левого уха с использованием цифрового микрометра от Mitutoyo Americ Co. (Aurora, IL, USA), применяя значения толщины необработанного уха в качестве внутреннего контроля. Все измерения на всем протяжении исследований проводились одним и тем же человеком для минимизации вариабельности, связанной с измеряющим индивидуумом. Измерения проводили перед применением лечения на сутки 10, 12, 14, 17, 19 и 21.
Трансэпидермальная потеря воды (TEWL)
TEWL использовали в качестве индикатора состояния кожного барьера, применяя Vapometer от Delfin Technologies Ltd. (Kuopio, Finland). TEWL измеряли в течение 20 сек на правом ухе мыши (один раз на мышь), с использованием ногтевого адаптера с диаметром 4,5 мм. Измерения проводили перед применением лечения на сутки -7, 10, 14 и 20 в исследовании по поиску дозы и на сутки -7, 10, 13, 17 и 20 в исследовании, в котором SLN сравнивали с мазью. Сразу после каждого измерения TEWL измеряли относительную влажность и температуру окружающей среды.
Получение образцов в конечной точке
На 21 сутки через два часа после последнего нанесения препаратов, от всех животных получали образцы крови и правого уха. В ацетоновых контрольных группах отбирали оба уха. Животных подвергали наркозу изофлураном, и кровь отбирали из глаза с использованием капиллярной пробирки. Кровь помещали во флаконы Vacutainer объемом 2,5 мл, и оставляли в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 1000 g и 4°C. Супернатант переносили в некодированную пробирку Micronics объемом 1,4 мл с U-образным дном и хранили при 80°C до количественного анализа лекарственного средства. После получения крови животных умерщвляли, и отрезали правое ухо скальпелем. Используя дерматом Stiefel (Offenbach am Main, Germany) из середины уха выделяли биопсию размером 8 мм для анализа ткани, и из нее отбирали биопсию размером 3 мм и сохраняли в 10% (об./об.) формальдегиде с нейтральной реакцией за счет буфера. Оставшуюся ткань уха из биопсии размером 8 мм разрезали на две половины, с одной из которых проводили соскоб липкой лентой перед анализом концентрации лекарственного средства, и другую использовали для анализа цитокинов. Обе быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до проведения анализа.
Уровень цитокинов в ткани уха
3
4
Ткань уха гомогенизировали в 200 мкл буфера для лизиса с использованием тканевого гомогенизатора Precellys 24 в охлаждающей ячейке Cryolys от Bertin Technologies (Montigny-le-Bretonneux, France). Буфер для лизиса содержал 1 мМ NaVO, 0,4% (об./об.) нонилфеноксиполиэтоксилэтанол (NP40) и ингибитор протеазы Complete™ от Roche Diagnostics (Mannheim, Germany), растворенный в PBS. После гомогенизации образцы оставляли на льду на период 15-30 минут перед центрифугированием при 4°C и 15000 g в течение 15 минут с использованием Microcentrifuge 157 MP от Ole Dich Instrument makers (Hvidovre, Denmark). Супернатант хранили при -80°C до проведения анализа цитокинов MSD. Определение концентрации общего белка проводили для нормализации концентрации образца перед определением цитокинов. Белок измеряли с использованием набора для анализа белка BCA Pierce от Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA). Планшеты считывали на спектрофотометре для чтения планшетов VICTOR(TM) X3 Multilabel от Perkin Elmer (Skovlunde, Danmark). Специфическую концентрацию цитокинов IFN-γ, IL-1-β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, общего IL-12 и TNF-α в ткани уха определяли посредством 9-плексного анализа в 96-луночном планшете с 10 пятнами в каждой лунке для определения мышиных цитокинов MSD TH1/TH2 multi-spot при помощи сканера MSD Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA). Анализ MSD оптимизировали для применения в ткани. Таким образом, планшет блокировали в течение 1 часа 150 мкл смесью калибровочных стандартов MSD, с последующей 3-кратной промывкой 150 мкл 0,05% (об./об.) полисорбата 20. 25 мкл разведенных образцов супернатанта ткани добавляли в планшет с последующим встряхиванием в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем добавляли 25 мкл раствор антител для детектирования SULFO-TAG™ (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Промывку повторяли 3 раза 0,05% (об./об.) полисорбатом 20 до окончательного добавления 150 мкл буфера для считывания, разведенного 1:2 водой MilliQ, и считывания планшета на сканере MSD Sector Imager 6000.
Количественный анализ BMV в ткани уха и сыворотке
Количественный анализ BMV в ткани уха и сыворотке проводили с использованием масс-спектрометрии (МС). 300 мкл 5 мг/мл раствора протеиназы K и 1700 мкл буфера для расщепления с pH 8,5 (1,58% гидрохлорид Trizma, 0,029% EDTA, 0,20% додецилсульфат натрия, 0,117% хлорид натрия), добавляли к образцу ткани уха с последующей обработкой ультразвуком в течение 20 мин для гомогенизации образца. 50 мкл образца переносили в планшет с глубокими лунками, и индуцировали осаждение добавлением 150 мкл метанола, содержащего внутренний стандарт E01271 (20 нМ). После центрифугирования при 4000 об./мин. в течение 30 мин при 10°C образцы анализировали. Для осаждения белка в образцах сыворотки добавляли 100 мкл внутреннего стандарта в ацетонитриле. 20 мкл образца и стандарта, соответственно, переносили в планшет с глубокими лунками. После осторожного встряхивания планшет центрифугировали при 4000 об./мин в течение 30 мин при 10°C. Образцы анализировали на системе ЖХ-МС/МС с СВЭЖХ от Waters (Milsford MA, USA) и масс-спектрометре API5000 от Applied Biosystems (Carlsbad, CA, USA). Программное обеспечение Analyst (API5000) и Waters Acquity применяли для получения и анализа данных. Температура составляла 60°C, и поток - 0,5 мл/мин. Использовали способ создания градиента потока, меняя подвижную фазу от 0 до 100% смеси метанол:1M ацетат аммония:муравьиная кислота:вода (900:2:0,755:100) и метанол:1M ацетат аммония:муравьиная кислота:вода (50:2:0,755:950) в течение 2,3 мин. Предел детекции определяли как 11,11 нг/мг для образцов кожи и 0,001 нг/мл для образцов сыворотки.
Анализ данных
Все данные наносили на графики в Microsoft Excel или Graph Pad Prism 5.0. Статистический анализ проводили в Graph Pad Prism 5.0. Для сравнения средних значений проводили односторонний ANOVA (p<0,05) с последующим тестом для множественных сравнений методом Ньюмана-Кейлса или Даннетса.
Валидация модели AD
2
2
Модель хронического воздействия оксазолона является хорошо валидированной и принятой моделью AD (Man et al., выше). Так, животная модель авторов изобретения также характеризовалась наличием хорошо индуцированного фенотипа AD. Толщина ушей, обработанных оксазолоном, возрастала, тогда как какого-либо изменения не наблюдали в толщине ушей, обработанных только ацетоном. Как и ожидалось, лечение BMV в ацетоне вызывало значительное снижение толщины ушей у сенситизированных оксазолоном мышей. Кроме того, значения TEWL коррелировали с данными по толщине ушей, что подтверждало воспаление кожи и ослабление ее барьерной функции. Таким образом, значения TEWL повышались от 10 г/м×ч до 30-35 г/м×ч через 10 суток обработки оксазолоном. Экспрессия цитокинов подвергалась положительной регуляции в группе, сенситизированной оксазолоном, тогда так она не изменялась у мышей, обработанных только ацетоном. Уровень цитокинов снижался у мышей, сенситизированных оксазолоном, после лечения BMV в ацетоне, что подтверждало эффективность местного лечения кортикостероидом. Гистологическая оценка также ясно показывала значимые воспалительные реакции в ткани уха сенситизированных оксазолоном мышей; образцы кожи от мышей, обработанных только ацетоном, наоборот, не характеризовались признаками воспаления, тогда как образцы от мышей, которых лечили BMV, проявляли только признаки мягкого воспаления, что коррелирует с эффективностью лечения лекарственным средством (данные не показаны).
Сходное снижение толщины ушей от BMV в SLN и мази
Толщину уха выбирали в качестве одной из конечных точек, поскольку ее можно использовать в качестве меры воспаления кожи (Patrick et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 81, 1985, pp. 476-490; Young et al., J. Invest Dermatol. 82, 1984, pp. 367-371). Результаты измерения толщины ушей показали, что SLN и мазь с BMV вызывали сходное и значимое (P<0,05) снижение толщины ушей и что эффект был в таком же интервале, как эффект 1,20 мкг/ухо/сутки BMV в ацетоне в качестве контроля (фиг.5a). Это ясно указывало на то, что BMV высвобождался из носителя SLN и проникал в кожу, достигая клеток-мишеней в количестве, достаточно высоком для оказания эффекта, сравнимого с мазью и BMV, вводимого в ацетоне. Ранее in vitro показано, что когда BMV в SLN наносили на свиную кожу, общее количество вещества лекарственного средства, которое оставалось в коже и отдельно в роговом слое, значительно превышало количество при введении BMV в мази; см. пример 2. Однако, необходимо, чтобы вещество лекарственного средства высвобождалось из SLN и проникало в роговой слой для оказания эффекта, который подтверждается в данном исследовании in vivo.
В исследовании по поиску дозы имел место отдельный эффект доза-ответ в отношении толщины уха, который отражался в значимом (P<0,05) снижении толщины уха после нанесения SLN с BMV в концентрациях 1,20 мкг/ухо/сутки и 12,0 мкг/ухо/сутки, по сравнению с необработанными животными или с группой SLN-плацебо (фиг.5b). Не наблюдали эффекта от лечения 0,03 мкг/ухо/сутки BMV в SLN.
Сходный эффект BMV в SLN и мази демонстрируется по уровням цитокинов
Многочисленные стимуляции оксазолоном, как показано, вызывают сдвиг в кожном воспалении от ответа с преимущественным преобладанием Th1 к ответу с преобладанием Th2, что отражается в экспрессии цитокинов, которая обычно наблюдается при человеческом AD (Kitagaki et al., J. Invest. Dermatol. 105, 1995, pp. 749-755; Kitagaki et al., J. Immunol. 159, 1997, pp. 2484-2491; Matsumoto et al., Skin Res. Technol. 10, 2004, pp. 122-129). В данном исследовании оценивали цитокины, продуцируемые как Th1, так и Th2. В исследовании по поиску дозы имел место явный эффект доза-ответ на BMV в SLN, т.е. уровень IL-1β, IL-4, IL-8, IL-10 и IL-12 снижался по сравнению с дозой BMV, наносимого в SLN (данные не показаны). К сожалению, концентрация IL-5 и TNF-β была ниже предела детекции после обработки BMV, поэтому они были исключены из анализа данных. По сравнению с ацетоновым контролем уровни IL-8 и IL-12 значимо повышались после нанесения SLN-плацебо мышам, не сенситизированным оксазолоном, что указывает на раздражение от носителя SLN.
Сравнение BMV в SLN с BMV в мази показало, что в обоих препаратах BMV отрицательно регулируемый уровень IL-1β, IL-4, IL-8, IL-10 и IL-12 также был выявлен в исследовании по поиску дозы. Примеры этого приведены на фиг.6a и 6b, которые демонстрируют негативную регуляцию цитокинов IL-4 и IL-1β. Между препаратами не имелось значимых отличий относительно регуляции цитокинов, и это означало, что два препарата равно эффективны в этом отношении. Однако примечательно, что уровни цитокинов после нанесения мази-плацебо, как правило, были выше, чем после нанесения SLN-плацебо, указывая на то, что носитель-мазь был более раздражающим, чем SLN.
TEWL снижали за счет введения BMV в SLN или мази
TEWL можно использовать в качестве индикатора барьерных свойств кожи (Levin and Maibach, J. Contr. Rel. 103, 2005, pp. 291-299; Proksch et al., J. Dermatol. Sci. 43, 2006, pp. 159-169; Werner and Lindberg, Acta Derm. Venereal. 65, 1985, pp. 102-105) и для оценки закупоривающих свойств носителя, наносимого на кожу (Loden, Acta Derm. Venereol. 72, 1992, pp. 327-330). Сравнение SLN с мазью при нанесении 1,20 мкг BMV/ухо/сутки показало, что лечение любым препаратом значимо снижало значения TEWL до уровня, который был сравним с контрольным (фиг.7a). В исследовании по поиску дозы только лечение BMV в SLN 1,2 мкг/ухо/сутки вызывало значимое (P<0,05) снижение значения TEWL (фиг.7b). В отличие от предшествующих исследований, проводимых с SLN, нанесенными на кожу (Jenning et al., Int. J. Pharm. 199, 2000, pp. 167-177; Santos et al., J. Drug Target. 10, 2002, pp. 489-495; Wissing and Muller, Eur. J. Pharm. Biopharm. 56, 2003, pp. 67-72), TEWL не указывала на какие-либо закупоривающие эффекты ни от SLN-плацебо, ни от мази-плацебо. TEWL снижалась только за счет препаратов, которые включали BMV. Причина, по которой закупоривающий эффект не проявлялся, может быть следствием того, что измерения проводили через сутки после нанесения препаратов. К этому времени препарат мог не присутствовать на коже в количестве, достаточном для индукции закупоривания, особенно потому, что мыши постоянно чесали и чистили свои уши. Снижение TEWL после введения препаратов с BMV, таким образом, как представляется, связано с терапевтическим эффектом BMV, в особенности, с сосудосуживающим эффектом, который может снижать испарение воды с поверхности кожи (Kolbe et al., Skin Re. Technol. 7, 2001, pp. 73-77).
SLN повышает количество BMV в коже
Концентрацию BMV в коже и сыворотке анализировали через два часа после последнего нанесения на 21 сутки. Сравнение SLN с мазью показало, что концентрация BMV в коже после нанесения SLN была значительно выше (в 5 раз), чем после нанесения BMV в мази. Концентрация BMV в сыворотке была сходной для SLN, мази и ацетонового контроля в дозе 1,20 мкг/ухо/сутки (фиг.8). Исследование по поиску дозы показало, что уровень BMV в сыворотке сравним после нанесения SLN с BMV 12,0 мкг/ухо/сутки и BMV в ацетоне 3,0 мкг/ухо/сутки (фиг.8). Уровень в коже, однако, был выше для SLN с BMV 12 мкг/ухо/сутки, чем для BMV в ацетоне 3,0 мкг/ухо/сутки. После применения SLN с 0,03 мкг/ухо/сутки уровень лекарственного средства не мог быть измерен в сыворотке, и очень низкий уровень BMV присутствовал в коже, и это объясняется тем, что от данного препарата не наблюдалось эффекта.
Ответ на дозу, наблюдаемый посредством толщины уха, TEWL и уровня цитокинов в ткани уха и концентрации в коже, достигаемой при нанесении различных препаратов, включая контрольные, указывал на то, что BMV проникал чрезкожно и оказывал местное действие. Однако возможность того, что мыши поглощали BMV перорально, когда они чесали и чистили свои уши, не может быть отвергнута при интерпретации сывороточных концентраций. Тот факт, что больше BMV обнаруживается в коже после нанесения SLN может быть указанием на способность SLN более плотно прилегать к коже и создавать в ней резервуар препарата по сравнению с действием мази. Этот эффект также наблюдали in vitro, когда SLN с BMV сравнивали с мазью, см. пример 2. В настоящем исследовании показано, что кроме того, что повышенное количество вещества лекарственного средства сохранялось в любом оставшемся роговом слое и/или в жизнеспособном эпидермисе, вещество лекарственного средства из SLN также достигало участка-мишени в степени, которая вызывала эффект, равный традиционному препарату и контролю с ацетоном. Сходный результат обнаруживали в другом исследовании in vivo по сравнению эффекта циклоспорина A, наносимого в тех же SLN или в масле, на мышиной модели AD. Продемонстрировано, что циклоспорин A в SLN был более эффективен, чем в масле, и что количество вещества лекарственного средства в роговом слое кожи значительно повышалось при использовании (Kim et al., Pharmazie, 64, 2009, pp. 510-514). В другом исследовании, проведенном на пациентах с экземой, показало, что лечение пропионатом клобетазола, введенным в SLN, индуцировало эффект кожного резервуара и превосходило по эффективности использованный для сравнения коммерчески распространяемый крем. (Kalariya et al., Indian J. Exp. Biol., 2005, pp. 233-240).
Пример 4
Исследования по проникновению в кожу и проницаемости кожи проводили с композициями H, L, J, M, N, как описано в примере 2, за исключением того, что использовали только интактную кожу свиных ушей, и рецепторную среду заменяли 4% BSA. Данные этих исследований показывали, что липидные наночастицы могли сохранять кальципотриол в роговом слое и, конкретно, в живой коже, по сравнению с кремом. Кроме того, при нанесении липидных наночастиц очень небольшое количество вещества лекарственного средства проникало через кожу в рецепторную среду.