Способы мечения клеток для визуализации in vivo

Обзоры

33

Способы мечения клеток для визуализации in vivo

A. О. Соловьева 123, К.Э. Зубарева 12, А.Ф. Повещенко 13, Е.А. Нечаева 2,

B. И. Коненков 13

1 Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск

2 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово

3 Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина МЗ РФ, Новосибирск

Methods of cells labeling for visualization in vivo

A.O. Solovieva 123, K.E. Zubareva 12, A.F. Poveschenko 13, E.A. Nechaeva 2, V.I. Konenkova 1 3

1 Scientific Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology of SB RAMS, Novosibirsk

2 State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector”, Koltsovo

3 Novosibirsk scientific research institute of circulation pathology n.a. academician. E. N. Meshalkin,

Novosibirsk

На сегодняшний день трансплантация клеток является перспективным направлением лечения различных заболеваний. Терапевтический потенциал клеток зависит от их миграционной активности, изучение которой необходимо для разработки эффективных подходов клеточной терапии. Для исследования выживаемости клеток in vivo и их распределения в организме после трансплантации применяются различные подходы. В данном обзоре представлены сравнительные характеристики контрастных агентов, таких как флуоресцентные красители, наночастицы, радиоактивные метки, репортерные гены, описаны особенности их взаимодействия с клетками. Проанализированы основные достоинства и недостатки различных способов контрастирования клеток.

Ключевые слова: миграция, визуализация in vivo, Y-хромосома, флуоресцентные красители, наночастицы, радиоактивные метки, репортерные гены.

Трансплантация клеток является быстроразвивающимся и перспективным направлением терапии различных заболеваний сердечно-сосудистой [1], нервной [2], эндокринной [3], иммунной систем [4], опорно-двигательного аппарата [5] и др. Такой подход предполагает способность трансплантированных клеток восстанавливать или регулировать функции поврежденных органов за счет пролиферации, дифференцировки, выделения различных биологически активных веществ в зоне патологического очага.

Для развития клеточных технологий и применения их в клинической практике необходимо получить детальную информацию о выживаемости, пространственном распределении и точной локализации трансплантированных клеток в организме реципиента. В данном обзоре представлены и проанализированы характеристики наиболее часто применяемых способов маркирования клеток.

J.V. Frangioni с соавт. (2004) были предложены следующие характеристики идеального маркера для изучения распределения и функционирования трансплантированных клеток в организме реципи-

Today cell transplantation is promising treatment of various diseases. The therapeutic potential of cells depends on their migratory activity, the study of which is necessary for developing effective approaches of cell therapy. There are different approaches to investigate cells survival in vivo and spatial distribution in the organism after transplantation. This review summarizes the comparative characteristics of contrast agents such as fluorescent dyes, nanoparticles, radioisotope, reporter genes, and the features of their interaction with the cells. The main advantages and disadvantages of different methods of labeling cells have been analyzed.

Key words: migration, visualization in vivo, Y-chromosome, fluorescent dyes, nanoparticles, radioisotopes, reporter genes.

ента: биосовместимость, безопасность экзогенных контрастных агентов; отсутствие необходимости генетической модификации клетки; определение единичной клетки в любой локализации; возможность оценки количества клеток; минимальное снижение количества контрастного агента при делении клетки; минимальный перенос контрастных агентов окружающим клеткам; длительная визуализация трансплантированных клеток (месяцы, годы) [6]. На сегодняшний день маркера, соответствующего всем выше изложенным параметрам, не существует. Каждый метод мечения клеток имеет свои достоинства и недостатки, поэтому выбор оптимального маркера будет зависеть от поставленных исследователем задач.

Маркеры для исследования миграции трансплантированных клеток можно разделить на два класса: эндогенные (Y-хромосома), конститутивно присутствующие в клетках и экзогенные, внесенные извне. Последние в свою очередь можно разделить на прямые неспецифические (флуоресцентные красители, наночастицы, радиоактивны метки) и непрямые специфические (репортерные гены) (рис.).

e-mail: solovey_ao@mail.ru

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013

34

Обзоры

Классификация маркеров для визуализации клеток in vivo

Эндогенные маркеры

Наиболее достоверными маркерами для трекинга (отслеживания) клеток являются их «внутренние, собственные» — нормальные компоненты клеток [6]. К таким маркерам можно отнести гены Y-хромосомы при сингенной трансплантации клеток самцов-доно-ров самкам-реципиентам. Данная метка детектируется методом ПЦР и флуоресцентной гибридизацией in situ, а маркер характеризуется высокой стабильностью, отсутствием влияния на функциональную активность клетки и возможностью использования в долгосрочных экспериментах. Эта метка применяется на протяжении последних десятилетий [7, 8], но до сих пор не потеряла своей актуальности при исследовании количественного распределения трансплантированных клеток в организме реципиента [9—12]. Однако основным её недостатком является невозможность применения для прижизненной визуализации трансплантированных клеток в организме реципиента.

Экзогенные маркеры

Неспецифическое прямое мечение клеток

Флуоресцентные красители для исследования миграции трансплантированных клеток в организме реципиента успешно используются на протяжении многих лет. Метод основан на поглощении красителей клетками из культуральной среды. По механизму окрашивания клеток красители делятся на мембранные (Dil, Dio, PKH26 и др.), цитоплазматические (CFSE, CFDA и др.) и ядерные (Hoechst, DAPI и др.).

Мембранные флуоресцентные красители представляют собой липофильные производные кар-боцианинов, которые проникают в клетки путем латеральной диффузии. Маркеры, применяемые для изучения миграционной активности клеток, не должны влиять на их функциональную активность, что и показано для данной группы красителей [13]. Наиболее предпочтительными для исследований in vivo являются красители семейства PKH (PKH2, PKH26, PKH67). Это связано с длительным сохранением метки (до месяца), что позволяет проводить продолжительный мониторинг миграции клеток, и высокой интенсивностью флуоресценции [14, 15]. Также из этой группы красителей в эксперименталь-

ных исследованиях на животных часто используется флуорофор Dil, который привлекателен также за счет относительно низкой стоимости [15, 16].

К цитоплазматическим красителям относятся главным образом кальцеин, 2',7'-бис-(2-карбоксиэтил)-5(6)-карбоксифлуоресцеин (BCECF), диацетат флуоресцерина (FDA), 5(6)-карбоксифлу-оресцеин диацетат (CFDA), эфир ацетоксиметила (CFDA-AM) и CFSE [17]. Механизм их проникновения в клетку основан на присутствии в структуре молекулы липофильных ацетатных (ацетоксиметиль-ных) остатков, которые способствуют преодолению цитоплазматической мембраны. Эти функциональные группы чувствительны к внутриклеточным эстеразам. Отщепление ацетатных групп ферментами препятствует выходу красителей из клетки, поэтому скорость элиминации красителя из клетки зависит как от количества заряженных групп в структуре вещества, так и от скорости его взаимодействия с эстеразами. Из представленной группы наиболее устойчивым красителем является CFSE (до месяца), поэтому для долговременного мониторинга миграции клеток в основном применяется именно он [18, 19].

Мембранные и цитоплазматические красители используются для исследования пролиферации, так как при каждом делении клетки интенсивность флуоресценции снижается вдвое [20].

Ядерные красители. Красители данной группы связываются с АТ-богатыми участками малой бороздки ДНК клеток. Для этих красителей показано отсутствие (или минимальное) влияния на жизнеспособность и дифференцировочный потенциал клеток [21]. Однако, связываясь с ДНК, эти соединения ингибируют пролиферацию клеток. Наиболее широко используемыми красителями данной группы являются DAPI и Hoechst33342. Скорость выведения маркера, по-видимому, зависит от типа изучаемых клеток. Так, в лимфоцитах показано присутствие красителя Hoechst до 4 сут. [22, 23], а в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках костного мозга — до 1 мес. [24].

В работах других авторов описан метод идентификации отдельной популяции гемопоэтических клеток, которые имеют уникальную способность быстро выводить Hoechst33342 [25, 26].

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013

Обзоры

35

Достоинствами способа маркировки клеток с использованием красителей являются доступность, простота исполнения, отсутствие генетической модификации клеток и возможность применения для исследования пролиферации. К недостаткам данного способа относятся нестабильность метки (выведение красителя из клетки) и возможность переноса красителя в окружающие клетки. Основные достоинства и недостатки наиболее часто применяемых красителей представлены в табл.

Наночастицы представляют собой комплексы или частицы, имеющие размер до 100 нм; широко используются как в исследовательской, так и в клинической практике [27, 28]. Наночастицы применяются для изучения распределения клеток после трансплантации и могут быть синтезированы с лабильными размерами, формой, структурой, физическими свойствами (электронными, магнитными, оптическими, термическими) [29, 30].

Условия визуализации с применением наночастиц отличаются по своей чувствительности, разрешению, глубине проникновения и возможности количественного анализа [31].

Наночастицы по способу детекции делят на три класса:

1) флуоресцентные наночастицы для флуоресцентной визуализации;

2) магнитные наночастицы для магнитно-резонансной томографии (МРТ);

3) радиоизотопы, заключенные в наночастицы, для позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) и однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ).

Флуоресцентные наночастицы для флуоресцентной визуализации. Оптическая визуализация является одной из наиболее широко используемых технологий для изучения миграции трансплантированных клеток из-за её быстрой системы оценки, большого

Свойства различных красителей, используемых для исследования миграции клеток

Флуоресцентный краситель Компоненты клетки, которые окрашивает краситель Преимущества Недостатки Ссылки

Hoechst 33342 Ядро • высокая интенсивность флуоресценции • возбуждение UV • устойчивость к тушению • ингибирует пролиферацию клеток • перенос в немеченые клетки [17, 55, 56]

CFSE Цитоплазма • высокая интенсивность флуоресценции • метка сохраняется до месяца в окрашиваемых клетках • может быть использована для отслеживания делящихся клеток • высокая токсичность • перенос в немеченые клетки [17, 57-59]

FITC Мембрана и цитоплазма • метка сохраняется до месяца в окрашиваемых клетках • высокая токсичность • относительно низкая интенсивность флуоресценции [60]

Dil Мембрана • высокая интенсивность флуоресценции • длительное сохранение метки в окрашиваемых клетках • перенос в немеченые клетки [61]

PKH26 Мембрана • высокая интенсивность флуоресценции • метка сохраняется до месяца в окрашиваемых клетках • может быть использована для отслеживания делящихся клеток • высокая токсичность • высокая стоимость [62-64]

• флуоресценция в красной области спектра

* CFSE - карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидил эфир; FITC - флуоресцеин изотиоцианат; DiI - 1,1'-диоктадецил-3,3,3,3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013

36

Обзоры

временного разрешения, низкой стоимости, отсутствия излучения и высокой чувствительности (предел чувствительности 10-12 М метки) [32].

Для отслеживания клеток с помощью оптической визуализации применяются квантовые точки, которые состоят из флуоресцентных полупроводниковых наночастиц (диаметр 2—5 нм). В одной из первых работ показано применение квантовых точек в качестве метки для исследования распределения клеток в организме реципиента с помощью флуоресцентной микроскопии [33].

Способ контрастирования клеток с помощью квантовых точек имеет следующие преимущества: высокая фотостабильность и интенсивность флуоресценции, широкая полоса возбуждения и узкий пик флуоресценции, положение которого регулируется выбором размера нанокристалла и его составом. Эти свойства позволяют использовать одновременно несколько нанокристаллов в качестве меток различных популяций трансплантированных клеток в одном эксперименте. Однако существующие на данный момент квантовые точки не подходят для клинического применения из-за высокой токсичности. Для нивелирования этого недостатка в настоящее время ведутся активные разработки по созданию биосовместимых покрытий наночастиц (напр. хитозан, альгинат и др.), снижающих токсичность [31].

Магнитные наночастицы для МРТ. Магнитно-резонансная томография — это неинвазивный способ визуализации, основанный на измерении электромагнитного отклика ядер атомов водорода. МРТ практически не имеет ограничений по объему и глубине изучаемого объекта, поэтому отлично подходит для исследования целого организма [34, 35]. Пространственное разрешение МРТ составляет около 10 мкм, а средний размер клеток — 5—50 мкм, поэтому МРТ может применяться для исследования миграции трансплантированных клеток.

Магнитные наночастицы для применения в качестве контрастных агентов для МРТ состоят из магнитного ядра (например, оксид железа), покрытого оболочкой (например, сульфид цинка или кадмия), на поверхности которой располагаются функциональные группы. Безопасность и удобство МРТ с применением магнитных частиц позволило провести несколько клинических исследований, включая определение миграции дендритных клеток у пациентов с меланомой, нервных стволовых клеток у пациентов с повреждением головного мозга, Сй34+-гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с хроническим повреждением спинного мозга, клеток островков Лангерганса у больных сахарным диабетом [36].

Радиоизотопы, заключенные в наночастицы, для ПЭТ и ОФЭКТ. Однофотонная эмиссионная компьютерная томография — это диагностический метод создания томографических изображений с использованием главным образом агентов с гамма-излучающими радиоизотопами (технеций-99м (99mTc), индий-111 (111In), йод-1 23 (123I), йод-131 (131I)). Позитронно-эмиссионная томография — это радионуклидный томографический метод исследования, основанный на детекции позитрон-излучающих радиоизотопов (кислород-15 [15O], углерод-11 [11C], азот-13 [13N], фтор-18 [18F]) [37]. Первая группа агентов продуцирует гамма-лучи различных энергетических уровней, которые детектируются ОФЭКТ

камерой. Позитрон-излучающие радиоизотопы производят высокоэнергетические гамма-лучи, которые характеризуются способность глубоко проникать в ткани, что обуславливает возможность применения такого подхода для исследований не только на мелких животных, но и на человеке [38].

Одним из самых больших преимуществ ПЭТ и ОФЭКТ является высокая чувствительность (ОФЭКТ 10-10—10-11 М, ПЭТ 10-11-10-12 М), что допускает применение малых, нефармакологических доз (нанограммы) метки для визуализации [39]. С применением контрастных агентов (2-^-18]-фтор-2-дезокси-й-глюкоза для ПЭТ, октреотид для ОФЭКТ), зарегистрированных Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA), проведено множество доклинических и несколько клинических исследований[40].

Основными недостатками данных методов являются: низкое пространственное разрешение, что не позволяет установить точную локализацию трансплантированных клеток в органе; радиационная нагрузка на пациента; короткий период жизни радиоизотопов, который ограничивает продолжительность отслеживания клеток [41].

Решением этих проблем может стать применение наночастиц. Такие радиоизотопы, заключенные в наночастицы, получают путем хелатирования радиоизотопных ионов в предварительно синтезированные наночастицы, что приводит к уменьшению облучающего воздействия на пациента и увеличению срока детекции. Для подобных целей применяют наночастицы на основе различных полимеров [42] или неорганические наночастицы (квантовые точки) [43].

Такой подход позволяет совмещать в одном исследовании два способа детекции: высокую чувствительность ПЭТ с высоким пространственным разрешением МРТ или флуоресцентной визуализации [43, 44]. Например, показано, что аминосилан, покрытый магнитными наночастицами, может функционировать с флуоресцентным красителем (флуо-ресцеином) и позитрон-излучающим радиоизотопом (галлий-68) [45].

Несмотря на то, что контрастные агенты на основе наночастиц часто используются для исследования миграции клеток, есть определенные риски, связанные со снижением количества контрастного агента при делении клетки, переносом наночастиц в окружающие клетки и недостаточным количеством информации о влиянии метки на функциональную активность клеток.

Непрямое специфическое мечение клеток

Репортерные гены. Выявление продукта экспрессии репортерных генов является одним из подходов для визуализации трансплантированных клеток. Метод основан на использовании генов, которые кодируют зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его производные; р-галактозидазу; тимидинкиназу и др. [46, 47]. Однако этот подход требует инвазивных методов детекции (биопсия или эксплантация органа с последующим гистологическим анализом) за исключением поверхностных «просвечивающих» тканей, в которых возможна неинвазивная детекция GFP [48].

Для неинвазивного in vivo мониторинга распределения трансплантированных клеток применяется

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013

Обзоры

37

биолюминесцентная визуализация, основанная на детекции видимого света, выделяемого в результате реакции фермента люциферазы с субстратом люциферином [49]. Чувствительность детекции зависит от длины волны испускаемого света, уровня экспрессии фермента в целевых клетках, локализации источника люминесценции в животном, эффективности оптики и чувствительности детектора [50]. Длина волны эмиссии люциферазы и ее аналогов составляет более 600 нм, что соответствует красной и инфракрасной области спектра, которая глубоко проникает в ткани млекопитающих [51, 52]. Данная область спектра характеризуется минимальным рассеиванием и поглощением окружающими тканями, что увеличивает эффективность детекции [53].

Большое количество репортерных генов используются для радионуклидной визуализации. Как правило, такие гены делят на три различных класса: кодирующие либо рецепторы, либо ферменты, либо белки-переносчики. При использовании рецептор-основан-ных репортеров радиоактивная метка связывается с рецептором допамина D2 (D2R), который кодирует репортерный ген. Ферменто-основанные системы используют репортерный ген для продукции специфических ферментов, таких как тирозинкиназа вируса простого герпеса I типа (HSV1-TK), который модифицирует радиоактивную метку, препятствуя ее выходу из клетки. Третий класс репортерных генов кодируют белки-переносчики радиоактивных меток (симпорте-ры). Например, для переноса радиоактивного йода используется переносчик йодида натрия [54].

Использование репортерных генов позволяет оценить распределение введенных клеток в реальном времени в течение продолжительного периода. Преимуществом данного метода является дополнительная возможность изучения функциональной активности клеток. Также одним из преимуществ использования репортерных генов является то, что сигнал генерируется только живыми клетками. Однако флуоресцентные белки характеризуются низкой фотостабильностью, что ограничивает продолжительность их использования. Этот метод подходит только для исследования на небольших животных,

ЛИТЕРАТУРА:

1. Takehara N. Cell therapy for cardiovascular regeneration. Ann. Vasc. Dis. 2013; 6(2): 137-44.

2. Drela K., Siedlecka P., Sarnowska A. et al. Human mesenchymal stem cells in the treatment of neurological diseases. Acta. Neurobiol. Exp. (Wars). 2013; 73(1): 38-56.

3. Dominguez-Bendala J., Lanzoni G., Inverardi L. et al. Concise review: mesenchymal stem cells for diabetes. Stem Cells Transl. Med. 2012; 1(1): 59-63.

4. Michael M., Shimoni A., Nagler A. Recent compounds for immunosuppression and experimental therapies for acute graft-versus-hostdisease. Isr. Med. Assoc. J. 2013; 15(1): 44-50.

5. Steinert A.F., Rackwitz L., Gilbert F. et al. Concise review: the clinical application of mesenchymal stem cells for musculoskeletalregeneration: current status and perspectives. Stem Cells Transl. Med. 2012; 1(3): 237-47.

6. Frangioni J.V., Hajjar R.J. In vivo tracking of stem cells for clinical trials in cardiovascular disease. Circulation 2004; 110(21): 3378-83.

7. Schiffer M.S., Michael A.F. Renal cell turnover studied by Y chromosome (Y body) staining of the transplanted human kidney. J. Lab. Clin. Med. 1978; 92(6): 841-8.

8. Hruban R.H., Long P.P., Perlman E.J. et al. Fluorescence in situ hybridization for the Y-chromosome can be used to detect cells of recipient origin in allografted hearts following cardiac transplantation. Am. J. Pathol. 1993; 142(4): 975-80.

поскольку ограничен глубиной проникновения волны эмиссии метки в ткани. Недостатком этого метода также является необходимость модификации генетического материала клетки, что может привести к изменению её функциональной активности, а также трудоемкость процесса получения культуры клеток, стабильно экспрессирующей репортерный ген на протяжении продолжительного периода времени.

Заключение

На данный момент существует значительное разнообразие контрастирующих агентов и систем их детекции. Каждый способ мечения клеток имеет свои достоинства и недостатки, поэтому выбор оптимального варианта определяется конкретными задачами исследования.

Перспективы развития данного направления связаны с поиском контрастных агентов, способных передавать информацию не только о распределении клеток, но и об их функциональном состоянии и взаимодействии с микроокружением.

Также на настоящий момент ведется разработка новых универсальных маркеров, которые могут детектироваться одновременно несколькими методами визуализации, что позволит получить максимальную информацию о распределении трансплантированных клеток. Например, mbGluc-biotin - это новый репортерный ген, который можно одновременно детектировать посредством ОФЭКТ, магнитно-резонансной и флуоресцентной томографии [65]. Это позволяет сочетать высокую чувствительность ОФЭКТ с высоким пространственным разрешением МРТ или флуоресцентной визуализации.

Быстрый прогресс в разработке маркеров, наряду с усовершенствованием систем визуализации in vivo приближают применение контрастирующих агентов в клинической практике в качестве диагностического средства при клеточной трансплантации.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 14-04-32184 мол_а) и Фонда Михаила Прохорова (договор №АМ — 141/13).

9. Соловьева А.О., Повещенко А.Ф., Шевченко А.В. и др. Изучение динамики миграциионной активности клеток костного мозга в условиях сингенной трансплантации in vivo у мышей СВА. Бюллетень ВСНЦ ЭЧ СО РАМН. 2011; 3(80): 221-5.

10. Коненков В.И., Соловьева А.О., Повещенко А.Ф. и др. Исследование миграции клеток костного мозга в лимфоидные и нелимфоидные органы в условиях трансплантации in vitro сингенным реципиентам с использование генетических маркеров. Вестник лимфологии 2011; 2: 7-13.

11. Lin W.R., Inatomi O., Lee C.Y. et al. Bone marrow-derived cells contribute to cerulein-induced pancreatic fibrosis in the mouse. Int. J. Exp. Path. 2012; 93: 130-8.

12. Garrovo C., Bergamin N., Bates D. et al. In vivo tracking of murine adipose tissue-derived multipotent adult stem cells and ex vivo cross-validation. Int. J. Mol. Imaging. 2013; 2013: 1-13.

13. De Clerck L.S., Bridts C.H., Mertens A.M. et al. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J. Immunol. Meth. 1994; 172: 115-24.

14. Hendrikx P.J., Martens C.M., Hagenbeek A. et al. Homing of fluorescently labeled murine hematopoietic stem cells. Exp. Hematol. 1996; 24: 129-40.

15. Donega V., van Velthoven C.T., Nijboer C.H. et al. Intranasal mesenchymal stem cell treatment for neonatal brain damage: long-term cognitive and sensorimotorimprovement. PLoS One 2013; 8(1): 1-7.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013

38

Обзоры

16. Dai W., Hale S.L., Martin B.J. et al. Allogeneic mesenchymal stem cell transplantation in postinfarcted rat myocardium short- and long-term effects. Circulation 2005; 112: 214—23.

17. Weston S.A., Parish C.R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J. Immunol. Meth. 1990; 133: 87—97.

18. Chang Q., Yan L., Wang C.Z. et al. In vivo transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells accelerates repair of injured gastric mucosa in rats. Chin. Med. J. (Engl). 2012; 125(6): 1169-74.

19. Sato M., Uchida K., Nakajima H. et al. Direct transplantation of mesenchymal stem cells into the knee joints of Hartley strain guinea pigs with spontaneous osteoarthritis. Arthritis Res. Ther. 2012; 14(1): 4-9.

20. Ragnarson B., Bengtsson L., Haegerstrand A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry 1992; 97: 329-33.

21. Leiker M., Suzuki G., Vijay S. et al. Assessment of a nuclear affinity labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cell Transplant. 2008; 17(8): 911-22.

22. Ludowyk P.A., Willenborg D.O., Parish C.R. Selective localisation of neuro-specific T lymphocytes in the central nervous system. J. Neuroimmunol. 1992; 37: 237-50.

23. Kruse C.A., Kong Q., Schiltz P.M. et al. Migration of activated lymphocytes when adoptively transferred into cannulated rat brain. J. Neuroimmunol. 1994; 55: 11-21.

24. Alberti-Amador E., Garcia-Miniet R., Serrano-Sanchez T. et al. Evaluation of the survival of bone marrow mononucleate cells transplanted in a rat model of striatal lesion with quinolinic acid. Rev. Neurol. 2005; 40(9): 518-22.

25. Goodell M.A., Brose K., Paradis G. et al. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 1996; 183: 1797-806.

26. Rossi L., Challen G.A., Sirin O. et al. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Meth. Mol. Biol. 2011; 750: 47-59.

27. Cho E.C., Glaus C., Chen J. et al. Inorganic nanoparticle-based contrast agents for molecular imaging. Trends Mol. Med. 2010; 16: 561-73.

28. Michalet X., Pinaud F.F., Bentolila L.A. et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science 2005; 307: 538-44.

29. Laurent S., Forge D., Port M. et al. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis, stabilization, vectorization, physicochemical characterizations, and biological applications. Chem. Rev. 2008; 108: 2064-110.

30. Na H.B., Song I.C., Hyeon T. Inorganic nanoparticles for MRI contrast agents. Adv. Mater. 2009; 21: 2133-48.

31. Xu C. Nanoparticle-based monitoring of cell therapy. Nanotechnology 2011; 9; 22(49): 1-31.

32. Sutton E.J., Henning T.D., Pichler B.J. et al. Cell tracking with optical imaging. Eur. Radiol. 2008; 18: 2021-32.

33. Lei Y., Tang H., Yao L. et al. Applications of mesenchymal stem cells labeled with Tat peptide conjugated quantum dots to cell tracking in mouse body. Bioconjug. Chem. 2008; 19: 421-7.

34. Li L., Jiang W., Luo K. et al. Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles as MRI contrast agents for Non-invasive Stem Cell Labeling and Tracking. Theranostics. 2013; 3(8): 595-615.

35. Buxton R.B. Introduction to functional magnetic resonance imaging: principles and techniques. 2nd ed. New York: Cambridge University Press; 2009.

36. Bulte J.W. In vivo MRI cell tracking: clinical studies. Am. J. Roentgenol. 2009; 193: 314-25.

37. Weaner L.E., Hoerr D.C. Synthesis and application of radioisotopes in pharmaceutical research and development. In: Abdel-Magid A.F., Caron S., editors. Fundamentals of early clinical drug development: from synthesis Design to formulation. New York: Wiley; 2006. p. 189-214.

38. Lewellen T.K. Recent developments in PET detector technology. Phys. Med. Biol. 2008; 53: 287-317.

39. Massoud T.F., Gambhir S.S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Develop. 2003; 17: 545-80.

40. Welling M.M., Duijvestein M., Signore A. et al. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. J. Cell Physiol. 2011; 226: 1444-52.

41. Chen I.Y., Wu J.C. Cardiovascular molecular imaging: focus on clinical translation. Circulation 2011; 123: 425-43.

42. Rossin R., Muro S., Welch M.J. et al. In vivo imaging of Cu-64-labeled polymer nanoparticles targeted to the lung endothelium. J. Nucl. Med. 2008; 49: 103-11.

43. Cai W.B., Chen K., Li Z.B. et al. Dual-function probe for PET and near-infrared fluorescence imaging of tumor vasculature. J. Nucl. Med. 2007; 48: 1862-70.

44. Patel D., Kell A., Simard B. et al. The cell labeling efficacy, cytotoxicity and relaxivity of copper-activated MRI/PET imaging contrast agents. Biomaterials 2011; 32: 1167-76.

45. Stelter L., Pinkernelle J.G., Michel R. et al. Modification of aminosilanized superparamagnetic nanoparticles: feasibility of multimodal detection using 3 T MRI, small animal PET, and fluorescence imaging. Mol. Imag. Biol. 2009; 12: 25-34.

46. Lee A.S., Wu J.C. Imaging of embryonic stem cell migration in vivo. Meth. Mol. Biol. 2011; 750: 101-14.

47. Yaghoubi S.S., Barrio J.R., Namavari M. et al. Imaging progress of herpes simplex virus type 1 thymidine kinase suicide gene therapy in living subjects with positron emission tomography. Cancer Gene Ther. 2005; 12: 329-39.

48. Acton P.D., Zhou R. Imaging reporter genes for cell tracking with PET and SPECT. Q. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 2005; 49 (4): 349-60.

49. Wilson T., Hastings J.W. Bioluminescence. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998; 14: 197-230.

50. Wu J.C., Sundaresan G., Iyer M. et al. Noninvasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice. Mol. Ther. 2001; 4: 297-306.

51. Contag P.R., Olomu I.N., Stevenson D.K. et al. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 1998; 4: 245-7.

52. Verkhusha V.V., Otsuna H., Awasaki T. et al. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 2001; 276: 29621-4.

53. Rice B.W., Cable M.D., Nelson M.B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed. Opt. 2001; 6: 432-40.

54. Kraitchman D.L., Bulte J.W. In vivo imaging of stem cells and beta cells using direct cell labeling and reporter gene methods. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2009; 29: 1025-30.

55. Brenan M., Parish C.R. Intracellular fluorescent labelling of cells for analysis of lymphocyte migration. J. Immunol. Meth. 1984; 74: 31-8.

56. Bradbury M.G., Qiu M.R., Parish C.R. The immunomodulatory compound 2-acetyl-4-tetrahydroxybutyl imidazole causes sequestration of lymphocytes in non-lymphoid organs. Immunol. Cell Biol. 1997; 75: 497-502.

57. Fulcher D.A., Lyons A.B., Korn S.L. et al. The fate of selfreactive B cells depends primarily on the degree of antigen receptor engagement and availability of T cell help. J. Exp. Med. 1996; 183: 2313-28.

58. Lyons A.B., Parish C.R. Are murine marginal zone macrophages the splenic white pulp analogue of high endothelial venules?. Eur. J. Immunol. 1995; 25: 3165-72.

59. Lyons A.B. Pertussis toxin pretreatment alters the in vivo cell division behaviour and survival of B lymphocytes after intravenous transfer. Immunol. Cell Biol. 1997; 75: 7-12.

60. Butcher E.C., Weissman I.L. Direct fluorescent labelling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J. Immunol. Meth. 1980; 37: 97-108.

61. Dittel B.N., Visintin I., Merchant R.M. et al. Presentation of the self antigen myelin basic protein by dendritic cells leads to experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 1999; 163: 32-9.

62. Hendrikx P.J., Martens C.M., Hagenbeek A. et al. Homing of fluorescently labeled murine hematopoietic stem cells. Exp. Hematol. 1996; 24: 129-40.

63. Beavis A.J., Pennline K.J. Tracking of murine spleen cells in vivo: Detection of PKH26-labeled cells in the pancreas of non-obese diabetic (NOD) mice. J. Immunol. Meth. 1994; 170: 57-65.

64. Young A.J., Hay J.B. Rapid turnover of the recirculating lymphocyte pool in vivo. Int. Immunol. 1995; 7: 1607-15.

65. Niers J.N. A single reporter for targeted multimodal in vivo imaging. J. Am. Chem. Soc. 2012; 134(11): 5149-56.

66. Wolf.D. Re: Mesenchymal stem cells: potential precursors for tumor stroma and targeted-delivery vehicles for anticancer agents. J. Nat. Cancer Inst. 2005; 97(7): 540-41.

Поступила 12.08.2013

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013