Определение контактов фосфатных групп ДНК с нуклеофильными аминокислотами фермента репарации формамидопиримидин-ДНК гликозилазы E. сoli

УДК 547.693.32.057:542.95

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНТАКТОВ ФОСФАТНЫХ ГРУПП ДНК С НУКЛЕОФИЛЬНЫМИ АМИНОКИСЛОТАМИ ФЕРМЕНТА РЕПАРАЦИИ ФОРМАМИДОПИРИМИДИН-ДНК ГЛИКОЗИЛАЗЫ

E. coli

А. И. Рыхлевская1, О. М. Сидоркина3, Е. А. Романова2, Т. С. Орецкая1*, Ж. Лаваль3, С. А. Кузнецова

Для зондирования активного центра Fpg E. coli и определения контактов белка с фосфатными группами в ДНК использовали набор реакционноспособных аналогов субстратов, содержащих в своей структуре одновременно остаток 8-OG и тризамещенные пирофосфатные меж-нуклеотидные группировки в различных положениях по отношению к нему. Модифицированные ДНК-дуплексы были получены методом химического лигирования. Изучены свойства и реакционная способность синтезированных аналогов субстратов, исследовано их взаимодействие с Fpg E. coli, определены константы диссоциации ДНК-белковых комплексов. Изучено каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов Fpg и найдены новые не-гидролизуемые аналоги субстратов этого фермента. Подобраны оптимальные условия для ковалентного связывания реакционноспособных ДНК-дуплексов с ферментом и получены специфические ковалентные ДНК-белковые комплексы, что позволило определить контакты нуклеофильных аминокислот Fpg E. coli с фосфатными группами ДНК.

Репарация ДНК является одним из основных процессов, обеспечивающих стабильность и целостность генетической информации. Нарушения в системе репарации могут приводить к преждевременному старению, заболеваниям аутоиммунной системы, кардиологическим, онкологическим и ряду других [1-4]. Изучение основ механизма репарации, и в частности исследование субстратной специфичности и механизма действия ферментов, принимающих участие в этом процессе, является одной из приоритетных задач современной биоорганической химии, молекулярной биологии и медицины. Ключевую роль в репарации повреждений ДНК, вызванных воздействием активного кислорода, играет фермент эксцизионной репарации ДНК - формамидопиримидин-ДНК гликозилаза E. coli (Fpg) [5, 6]. Этот фермент узнает и выщепляет из ДНК остатки 7,8-дигидро-8-оксогуанина (8-OG) - наиболее распространенные повреждения ДНК, образующиеся под действием окислительных агентов, и является удобной моделью для исследования механизма действия репарирую-щих ферментов данного типа [7-10].

Целью настоящей работы явилось определение контактов Fpg E. coli с углеводофосфатным остовом ДНК. Для этого проводили зондирование активного центра фермента с помощью набора аналогов субстратов, содержащих в своей структуре одновременно остаток 8-OG и тризаме-щенные пирофосфатные межнуклеотидные группы в раз-

*Адресат для переписки.

личных положениях по отношению к нему. Модифицированные ДНК-дуплексы, содержащие реакционноспособ-ные тризамещенные пирофосфатные группы, предложенные нами ранее, успешно используются в настоящее время в качестве эффективных аффинных реагентов для кросслинкинга с ДНК-узнающими белками, поскольку ре-акционноспособные межнуклеотидные группы в этих соединениях способны образовывать специфические кова-лентные комплексы с нуклеофильными аминокислотами белков, сближенными с ними в составе фермент-субстратного комплекса [11-14].

В работе синтезированы модифицированные ДНК-дуплексы, содержащие остаток 8-OG и тризамещенные пиро-фосфатные межнуклеотидные группы, исследовано их взаимодействие с Fpg E. coli и определены константы диссоциации ДНК-белковых комплексов.

Исследовано каталитическое расщепление этих соединений Fpg и найдены новые негидролизуемые аналоги субстратов этого фермента.

Подобраны оптимальные условия для ковалентного связывания реакционноспособных ДНК-дуплексов с белком, получены специфические ковалентные ДНК-белковые комплексы.

Определены специфические контакты нуклеофильных аминокислот Fpg E. coli с фосфатными группами ДНК в составе фермент-субстратного комплекса.

С х е м а

I I Ш IY Y YI

5' AgC TTg CAT gCp*Cp*Tp*(8-OxoG)p*Ap*gp*gT CgA CTC TAg Ag 3' 3' g AAC gTA Cg—g—A--------C--------T----C--CA gCT gAg 5'

o O

p*^O-P-"O-P-O- (дуплексы (I)-(VI)), OAlk O-

Alk=Et ((I) - (III), (V)-(VI), Me (IV). OO

p*^O-P—O-P-O— (дуплекс (IVa)),

r I I

OH O-O

p*—O-P-O— (дуплекс (IVn)). OH

Синтез реакционноспособных аналогов субстратов - Fpg E. coli

Для синтеза серии модифицированных ДНК-дуплексов (I)-(VI), содержащих одновременно остаток 8-OG и тризамещенные пирофосфатные группировки (их структура представлена на схеме), использовали метод химического лигирования, разработанный нами ранее для введения тризамещенных пирофосфатных групп в угле-водофосфатный остов ДНК [14]. Модифицированные межнуклеотидные группы вводили в пентануклеотидный участок с центральным нуклеотидом 8-OG, поскольку этот участок вовлечен в специфическое взаимодействие с белком. ДНК-дуплексы (I)-(VI) получали в результате конденсации 5'-фосфатной группы одного олигонуклео-тида с 3'-0-алкилфосфатной группой смежного олиго-нуклеотида, сближенных на комплементарной 22-звенной матрице.

Олигонуклеотиды, входящие в состав исходных ДНК-дуплексов, получали стандартным амидофосфитным методом на ген-синтезаторе «Applied Biosystems 380B» (США) [15]. Эффективность химического лигирования за-

1 2 3 4 5 6

висела от структуры реакционного узла и варьировала от 12 до 60% (табл. 1).

При введении стабильной дизамещенной пирофосфат-ной группировки, не содержащей ненуклеотидного заместителя (IVa), образующейся в результате конденсации 3'- и 5'-концевых фосфатных групп смежных олигонуклеотидов, эффективность лигирования была значительно выше и достигала 90%. Это связано с различием в нуклеофильности дианионфосфата и моноанионфосфата моноэфирной природы, участвующих в реакции.

Реакционную способность синтезированных ДНК-дуплексов (I)-(VI) подтверждали, выдерживая их в 0,4 М водном растворе N-метилимидазола (pH 8,0) и 0,5 М водном растворе этилендиамина (pH 8,0) в условиях, разработанных нами ранее для специфического расщепления модифицированной группы [14, 16]. Как и ожидалось, все синтезированные ДНК-дуплексы, содержащие тризамещен-ные пирофосфатные группировки, количественно расщеплялись под действием нуклеофильных агентов по модифицированной межнуклеотидной группе.

Связывание модифицированных ДНК-дуплексов с Fpg E. coli

Для определения условий получения ковалентных комплексов Fpg с модифицированными ДНК-дуплексами, а также для изучения влияния тризамещенной пирофосфат-ной группы на эффективность их взаимодействия с ферментом было изучено связывание ДНК-дуплексов (I)-(VI) с Fpg. Поскольку в связывании и катализе участвуют

Т а б л и ц а 1

Эффективность химического лигирования дуплексов

Рис. 1. Связывание Fpg E. coli c ДНК-дуплексом

12% 43% 60% 54% 90% 44% 30%

Катализ

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

д dup IV n

* dup VI

25 30

t, мин

Рис. 2. Зависимость степени расщепления аналогов субстратов Fpg E. coli от времени инкубации с ферментом

только активные молекулы белка, то нами предварительно была определена концентрация активных молекул Fpg E. coli. Для этого мы использовали метод Скэтчарда [17].

Связывание Fpg E. coli с модифицированными ДНК-дуплексами (I)-(VI) проводили буфере Д при температуре 0° в течение 5 мин. В качестве примера на рис. 1 представлен радиоавтограф нативного гель-электрофореза, полученный при связывании ДНК-дуплекса (II) с ферментом. Как видно из этого рисунка, с увеличением концентрации белка эффективность связывания увеличивается, а при концентрации 1 ,5 нМ происходит полное связывание модифицированного субстрата.

Оказалось, что все синтезированные ДНК-дуплексы (I)-(VI), содержащие тризамещенные пирофосфатные группы, а также дуплекс (IVa), содержащий стабильную дизамещенную пирофосфатную группу, эффективно связываются с ферментом. Известно, что введение пирофос-фатных группировок в структуру природных субстратов может изменять эффективность их связывания с ферментами. Так, эффективность связывания урацил-ДНК глико-зилазы с ДНК-дуплексом, содержащим дизамещенную пирофосфатную группу с З'-конца по отношению к остатку дезоксиуридина, была на 4 порядка ниже, чем с аналогичными субстратами природного строения [18]. В то же время введение этой модифицированной группы в структуру аналога субстрата Fpg (ДНК-дуплекс (IVa)) непосредственно с З'-конца от 8-OG хотя и приводило к уменьшению эффективности связывания, но значительно

Рис. 3. Радиоавтограф 12% SDS-ПААГ, иллюстрирующий связывание ДНК-дуплексов (III) и (IV) с ферментом в оптимальных условиях

в меньшей степени (табл. 2). Специфичность связывания Fpg с модифицированными ДНК-дуплексами была подтверждена методом конкурентного вытеснения избытком холодного субстрата. Константы диссоциации комплексов аналогов субстратов (I)-(VI) с белком приведены в табл. 2. Они были рассчитаны как описано в работе [19]. Как видно из табл. 2, эффективность связывания зависела от положения модифицированной межнуклеотидной группы и ее природы. Так, введение тризамещенной пирофос-фатной группы с З'-конца от остатка 8-OG и через одно звено от него (дуплексы (IV) и (V)) значительно уменьшало эффективность связывания с ферментом по сравнению с эффективностью связывания природного субстрата (IVn). Введение модификации с 5'-конца от 8-OG (дуплексы (II) и (III)) также приводило к уменьшению эффективности связывания, однако в меньшей степени, чем для дуплексов (IV) и (V). Эти данные свидетельствуют о том, что межнуклеотидные фосфаты с З'-конца от остатка 8-OG играют особую роль в узнавании и связывании Fpg с ДНК. В случае ДНК-дуплекса (IVa), когда с З'-конца от 8-OG находилась дизамещенная пирофосфатная группа, т.е. при введении дополнительного отрицательного заряда, значение константы увеличивалось (от З.1 нМ для дуплекса (IV) до 4,1 нМ для дуплекса (IVa)), что свидетельствует о том, что такие субстраты хуже узнаются белком и связываются с ним. По мере удаления модифицированных межнуклеотидных групп от остатка 8-OG значение константы диссоциации уменьшалось.

Каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов Fpg E. coli.

Каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов ферментом Fpg E. coli проводили, как описано

Т а б л и ц а 2

Константы диссоциации аналогов субстратов Fpg E. coli

Номер дуплекса

Kd, nM 0,19±0,04 0,72±0,14 1,0±0,2 3,1±0,6 4,1±0,8 0,35±0,07 1,1±0,2 0,38±0,08

в [20]. На рис. 2 представлены кривые зависимости доли расщепленных ДНК-дуплексов (I)-(VI), (IVa) и (IVn) от времени инкубации с белком. Оказалось, что все дуплексы, за исключением дуплексов (IV) и (IVa), расщепляются ферментом. Эффективность расщепления зависела от положения модифицированной группы и была выше, когда тризамещенная группировка находилась с 5'-конца от остатка 8-OG. Так, дуплексы (I)-(III) расщеплялись ферментом даже более эффективно, чем природный субстрат (IVn). Это может быть связано с тонкими конформацион-ными изменениями в структуре этих субстратов, способствующими ускорению каталитического процесса.

В то же самое время дуплекс (IVa), содержащий стабильную дизамещенную пирофосфатную группу с 3'-кон-ца от остатка 8-OG (как и дуплекс IV, содержащий реакци-онноспособную тризамещенную пирофосфатную группу с 3'-конца от остатка 8-OG), не расщеплялся ферментом. Известно, что механизм каталитического выщепления остатков 8-OG ферментом Fpg E. coli включает расщепление фосфодиэфирных связей с 3'- и 5'-концов от остатка 2'-дезоксирибозы, образующейся в результате дегликози-лирования, по механизму последовательного ß-5-элимини-рования [21]. На основании полученных данных можно предположить, что Fpg E. coli не расщепляет ДНК-дуплексы (IV) и (IVa), поскольку модифицированная межнук-леотидная группа, расположенная с 3'-конца от 8-OG, препятствует ß-элиминированию. Таким образом, мы обнаружили, что дуплексы (IV) и (IVa) - негидролизуемые аналоги субстратов Fpg E. coli. Эти соединения являются наиболее близкими к физиологическим субстратам структурными аналогами Fpg и могут быть использованы для рентгеноструктурного анализа ДНК-белкового комплекса.

Региоспецифическое ковалентное связывание реакционноспособных аналогов субстратов с Fpg E. coli

Региоспецифическое ковалентное связывание Fpg E. coli с ДНК-дуплексами (I)-(VI) изучали в условиях, подобранных нами в экспериментах по нековалентному связыванию. Реакционноспособные аналоги субстратов выдерживали с ферментом в буфере Д, варьируя температуру и время инкубации. В работе [11] было показано, что в присутствии N-метилимидазола эффективность кова-лентного связывания может возрастать за счет N-метили-мидазольного катализа, поэтому реакцию проводили в присутствии N-метилимидазола.

Оказалось, что специфический кросслинкинг наблюдается только в случае ДНК-дуплексов (III) и (IV), содержащих тризамещенные пирофосфатные группы с 5'- и 3'-концов от остатка 8-OG соответственно. Максимальная эффективность связывания (30%) наблюдалась в случае дуплекса (IV) при температуре 20° в присутствии 0,05 М N-метилимидазола (рис. 3). С меньшей эффективностью ковалентно связывался с ферментом дуплекс (III) (10%). Образование ковалентных комплексов аналогов субстратов (III) и (IV) с Fpg E. coli является прямым экспери-

ментальным доказательством сближенности нуклеофиль-ных групп аминокислот белка, формирующих активный центр Fpg, с межнуклеотидными фосфатами с 3'- и 5'-концов от 8-OG в ДНК.

Таким образом, в настоящей работе впервые было проведено зондирование активного центра Fpg E. coli с помощью набора синтетических ДНК-дуплексов, содержащих реакционноспособные тризамещенные пирофос-фатные группировки в различных положениях от остатка 8-OG.

В ходе работы было установлено наличие контактов фосфатных групп субстрата, расположенных с 3'- и с 5'-конца от остатка 8-OG, с нуклеофильными группами аминокислот фермента Fpg E. coli, в составе фермент-субстратного комплекса. В продолжение этих исследований планируется идентифицировать природу аминокислот, вовлеченных в специфические взаимодействия с фосфатными группами ДНК. Результаты исследования могут быть использованы при изучении про- и эукариотических гомологов Fpg, а также других репарирующих ферментов. В совокупности с результатами других исследований они позволят пополнить знания о механизмах репарации ДНК.

Экспериментальная часть

В работе использовали КДИ, МЭС, ЭДА («Merck»), EDTA, LiClO4 («Fluka»); акриламид, N,N'-метиленбисак-риламид, KCl («Serva»); HEPES, MgCl2 («Sigma»); поли-

32

нуклеотидкиназу Т4 (МБИ « Ферментас »); [у- P] ATP (1000 Ки/ммоль; «Изотоп»). Вода очищена на системе лабораторной очистки «Millipore».

5'-32Р-метку вводили фосфорилированием олигонукле-отидов (2, 4, 6, 8, 10 и 12) с помощью Т4-полинуклео-тидкиназы.

Олигодезоксирибонуклеотиды природного строения, использованные в работе, были синтезированы на автоматическом ДНК-синтезаторе «Applied Biosystems 380B» (США) по стандартной амидофосфитной схеме [15]. Синтез модифицированных олигонуклеотидов с включением остатков 7,8-дигидро-8-оксогуанина был осуществлен с использованием коммерческого З'-амидофосфитного производного модифицированного 2'-дезоксигуанозина («Glen Research»). Деблокирование функциональных групп олигомеров проводили концентрированным аммиаком в присутствии 0,25 М 2-меркаптоэтанола (36 ч, 20°). Синтез олигонуклеотидов с 3'-алкилфосфатной группой проводили с использованием предварительно синтезированного модифицированного твердофазного носителя для автоматического олигонуклеотидного синтеза, как описано нами ранее [23].

Фермент формамидопиримидин-ДНК гликозилаза E. coli предоставлен для работы доктором Ж. Лавалем (Институт Густава Русси, Париж, Франция).

Буферные растворы: А - 0,05 М МЭС (pH 6,0), 0,02 M MgCl2; Б - 0,5 M МЭС (pH 4,5), 1M MgCl2; В - 0,05 M Трис-борат (pH 8,5), 0,001 M EDTA; Г - 0,4 M N-MeIm (pH 8,0), 0,2 M NaCl, 0,12 M MgCl2; Д - 0,025 M HEPES

(pH 7,6), 0,1 M KCl, 0,005 M ß-меркаптоэтанол. 0,002 M Na2EDTA, 0,1% (w/v) BSA, 6% (v/v) глицерин; E - 0,089 М Трис-борат (pH 8,5) (Ж), 0,025М Трис (pH 8,3), 0,2 М глицин, 0,1% SDS.

Получение модифицированных ДНК-дуплексов методом химического лигирования. К 0,15 о.е. исходных дуплексов (I)-(VI) в 14 мкл буфера А (общенуклеотидная концентрация С0 составила 10-3М) добавляли 1 мкл 3 М КДИ (конечная концентрация КДИ составила 0,2 М). Реакцию проводили в течение 3-4 сут при 20° в темноте, затем анализировали реакционные смеси с помощью электрофореза в пластинах 20%-го ПААГ, содержащего 7 М мочевину, в буфере В при постоянном напряжении 1200 В с последующей радиоавтографией. Выходы продуктов химического лигирования в дуплексах I-VI варьировали от 12 до 90%.

Аминолиз и гидролиз ДНК-дуплексов (I)-(VI). 0,10,5 нмоль дуплексов выдерживали в 0,5 М водном растворе ЭДА (pH 8,0) или в буфере Г при 20° в течение 20 ч. Реакционные смеси анализировали гель-электрофорезом, как описано выше.

Определение активности Fpg E. coli методом Скэт-чарда. Для определения концентрации активных молекул Fpg методом Скэтчарда изучали связывание 5-20 фмоль ДНК-дуплекса (IVn) с 4 нМ фермента в 20 мкл буфера Д при температуре 0° в течение 5 мин. Метод расчета активности фермента из полученных данных описан в [17].

Связывание модифицированных ДНК-дуплексов с Fpg E. coli. К 10-100 фмолям ДНК добавляли 1-100 нМ белка в 20 мкл буфера Д. Смесь инкубировали в течение 5 мин. при температуре 0°, затем анализировали с помощью электрофореза в пластинах 10%-го нативного ПААГ в буфере Е при постоянном напряжении 120 В, с последующей радиоавтографией.

Каталитическое расщепление ДНК-дуплексов (I)-(VI) ферментом Fpg E. coli. 1 0-100 фмоль модифицированных ДНК-дуплексов (I)-(VI) инкубировали с З0 нг фермента в 12 мкл буфера Д при температуре З7°. Из реакционной смеси через 2, 5, 10, 20, З0 и 60 мин отбирали по 2 мкл раствора, добавляли З мкл смеси bpb и xc в 80%-м водном растворе формамида и анализировали с помощью электрофореза в пластинах 20%-го ПААГ в буфере В в присутствии 7 М мочевины при постоянном напряжении 1200 В.

Ковалентное связывание реакционноспособных аналогов субстратов с Fpg E. coli. К 10-100 фмолям ДНК-дуплексов (I)-(VI) добавляли 10-100 нМ белка в 20 мкл буфера Д, а также в некоторых случаях 1,6 мкл 0,64 М N-MeIm (конечная концентрация составила 0,05 М). Смесь инкубировали в течение 24 ч при температуре 0 и 20°. Реакционные смеси анализировали с помощью электрофореза по Лэммли в пластинах 12%-го денатурирующего ПААГ, содержащего 0,1% SDS в буфере Ж при постоянном напряжении 200 В, с последующей радиоавтографией.

Работа выполнена в рамках гранта ЮТА8 (№ 97-1645) при поддержке РФФИ (№2 00-04-48253), а также гранта

Ведущие научные школы (№2 00-15-97944).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Zhang Q.-M., Ishicawa N., Nakahara T., Yonei S. // Nucleic Acids

Res. 1998. 26. P. 4669.

2. Lipinski L.J., Hoehr N., Mazur S.J., Dianov G.L., Senturker S.,

Dizdaroglu M., Bohr V.A. // Nucleic Acids Res. 1999. 27. P. 3153.

3. Tano K., Akasaka S., Hashimoto M., Asano M., Yamamoto K.,

Utsumi H, Takimoto K. // Mutat. Res. 1998. 420. P. 7.

4. Alhama J., Ruiz-Laguna J., Rodriguez-Ariza A., Toribio F., Lopez-

Barea J., Pueyo C. // Mutagenesis. 1998. 13. P. 589.

5. Boiteux S., O'Connor T.R., Laval J. // EMBO J. 1987. 6. P. 3177.

6. Bailly V., Verly W.G., O'Connor T.R., Laval J. // Biochem. J. 1989.

262. P. 581.

7. Menissier-de Murcia J., Molinete M., Gradwohl G., Simonin F.,

Murcia G.de // J. Mol. Biol. 1989. 210. P. 229.

8. Mazen A., Menissier-de Murcia J., Molinete M., Simonin F.,

Gradwohl G., Poirer G., Murcia G. de // Nucleic Acids Res. 1989. 17. P. 4689.

9. Angulo J.F., Rouer E., Mazin A., Tissier A., Horellou P., Benarous

R., Devoret R.// Nucleic Acids Res. 1991. 19. P. 5117.

10. Navaratham S., Myles G.M., Strange R.W., Sancar A. // J. Biol. Chem. 1989. 264. P. 16067.

11. Purmal A.A., Shabarova Z.A. // Nucl. Acids Res. 1992. 20. С. 3713.

12. Kuznetsova S.A., Catherine C., Edgardo U., Elias I., Vasseur M., Blumenfeld M., Shabarova Z.A. // Nucl. Acids Res. 1996. 24. P. 4783.

13. Ивановская М.Г., Козлов И.А., Кубарева Е.А., Таран Е.А., Са-разев Т.В., Шабарова З.А. //Мол. биол. 1997. 31. С. 435.

14. Кузнецова С.А., Ивановская М.Г., Шабарова З.А. // Биоорг. Химия. 1990. 16. С. 219.

15. MatteucciM.D., Caruthers M.H. // J. Am. Chem. Soc. 1981. 103. P. 3185.

16. Кузнецова С.А., Ивановская М.Г., Шабарова З.А. // Биоорг. химия. 1991. 17. С. 1633.

17. Shilov I., Tashlitsky V., Khodoun M., Vasil'ev S., Alekseev Y., Kuzubov A., Kubareva E., Karyagina A. // Nucl. Acids Res. 1998. 26. P. 2659.

18. Purmal A.A., Wallace S.S., Kow Y.W. // Biochemistry. 1996. 35. P. 16630.

19. Castaing B., Boiteux S., Zelwer C. // Nucleic Acids Res. 1992. 20. P. 389.

20. Castaing B., Geiger A., Seliger H., Nehls P., Laval J., Zelwer C., Boiteux S. // Nucleic Acids Res. 1993. 21. P. 2899.

21. BhagwatM, Gerlt J.A. // Biochemistry. 1996. 35. P. 659.

22. Долинная Н.Г., Громова Е.С., Михайлов С.Н., Шабарова З.А. // Биоорг. химия. 1978. 4. С. 535.

23. Нарышкин Н.А., Ивановская М.Г., Орецкая Т.С., Волков Е.М., Гейт М.Дж., Шабарова З.А. // Биоорг химия. 1996. 22. С. 691.

Поступила в редакцию 20.06.00