СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА ГЛИФОСАТСОДЕРЖАЩИХ СМЕСЕЙ
METHOD OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE COMPOSITION OF GLYPHOSATE-CONTAINING MIXTURES

Изобретение относится к аналитической химии, конкретно к методу тонкослойной хроматографии, и может быть использовано при анализе N-(фосфонометил)-глицина (глифосата), а также для количественного определения ингредиентов реакционной смеси, образующейся при каталитическом окислении N-(фосфонометил)-иминодиуксусной кислоты (ФИДУК) пероксидом водорода или кислородом с образованием глифосата, в том числе для анализа реакционной смеси, содержащей N-(оксид)-N-(фосфонометил)-иминодиуксусной кислоты (N-оксид ФИДУК) [RU 2618629, С07F 9/38, 05.05.2017]. Глифосат представляет собой пестицид, арборицид, гербицид с широким спектром активности и является действующим веществом препаратов, применяющихся для борьбы с сорняками, в том числе в России (раундап, торнадо, утал, форсат, фосулен, цидокор, и т.д.).
<img file="00000001.jpg" he="20" wi="160" img-content="undefined" img-format="jpg" />
В литературе описаны способы анализа глифосата, а также продуктов его биоразложения, основанные на различных физико-химических методах [Кузнецова Е.М., Гринько А.П., Чмиль В.Д. Методы определения глифосата в сельскохозяйственном и продовольственном сырье и продуктах питания // Проблеми харчування. 2008. V. 3-4. P. 55; Arkan T., -Perl I. The role of derivatization techniques in the analysis of glyphosate and aminomethyl-phosphonic acid by chromatography // Microchem. J. Elsevier B.V. 2015. V. 121. P. 99].
Известен способ анализа реакционных смесей, образующихся при каталитическом окислении ФИДУК, основанный на методе ИК-спектрометрии [Ющенко Д.Ю., Малышева Л.В., Баранова С.С., Хлебникова Т.Б., Пай З.П. Определение глифосата в продуктах окисления N-фосфонометилиминодиуксусной кислоты методом ИК-спектрометрии // Журн. Аналит. Химии, 2013. Т. 68, № 11, С. 1075], но этот подход дает только полуколичественную оценку содержания компонентов (определение мольного соотношения аналитов). Также описано ИК-спектрометрическое определение количественного содержания глифосата и ФИДУК при их совместном присутствии с использованием внутреннего стандарта [Ющенко Д.Ю., Хлебникова Т.Б., Пай З.П. ИК-спектрометрия для количественного контроля процесса синтеза глифосата // ХI Всероссийская конференция и школа «Аналитика Сибири и Дальнего Востока». Новосибирск. 2021. С. 108]. Однако эти методы не позволяют определить содержание N-оксида ФИДУК в анализируемых смесях.
Описан способ анализа глифосата, основанный на методе ЯМР-спектроскопии [Cartigny B., Azaroual N., Imbenotte M., Mathieu D., Vermeersch G., , Lhermitte M. Determination of glyphosate in biological fluids by 1H and 31P NMR spectroscopy // Forensic Sci. Int. 2004. V. 143, № 2-3. P. 141]. Существенными недостатками этого способа являются необходимость использования сложного оборудования (ЯМР-спектрометр) и высокие требования к квалификации обслуживающего персонала.
Известен способ количественного анализа глифосата в смеси с близким по строению природным гербицидом - глюфосинатом (RS-2-амино-4-гидроксиметилфосфоноилбутановая кислота) - и продуктами их разложения с использованием методов капиллярного электрофореза, где определение фосфоновых кислот после разделения смесей выполняют с использованием масс-спектрометрического детектора [Goodwin L., Startin J.R., Keely B.J., Goodall D.M. Analysis of glyphosate and glufosinate by capillary electrophoresis-mass spectrometry utilising a sheathless microelectrospray interface // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1004, № 1-2. P. 107]. Однако подобных подходов к количественному определению глифосата в смеси с ФИДУК и N-оксидом ФИДУК в литературе также не описано.
Вследствие низкой летучести аминофосфоновых кислот способы количественного определения глифосата и продуктов его разложения методом газовой хроматографии (ГХ) с использованием пламенно-ионизационного детектора или детектора по теплопроводности без модификации аналитов не имеют практической значимости и не описаны в технической литературе. Существующие способы анализа аминофосфоновых кислот предполагают предваряющую анализ модификацию (дериватизацию) данных соединений с получением летучих производных (дериватов). Для количественного анализа глифосата и ФИДУК при совместном присутствии, основанном на использовании метода ГХ, предложен способ, в основе которого лежит образование соответствующих летучих метилсилильных производных [RU 2753453, G01N 30/02, 16.08.2021]. Тем не менее, способов газохроматографического анализа смесей глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК в литературе также не описано.
Известны способы количественного анализа смесей глифосата с его метаболитами, основанные на методе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). При этом в качестве элюента, как правило, используют фосфатные буферные растворы. Прямое детектирование аналитов осуществляют с использованием фотометрических детекторов при длине волны 195 нм [Moye H.A., Boning A.J. A Versatile Fluorogenic Labelling Reagent for Primary and Secondary Amines: 9-Fluorenylmethyl Chloroformate // Anal. Lett. 1979. V. 12, № 1. P. 25]. Недостатком этого способа детектирования является его низкая чувствительность. Повышение чувствительности анализа возможно путем проведения предколоночной или постколоночной дериватизации аналитов с целью введения в молекулы фосфоновых кислот хромофорных групп, обладающих высокими значениями коэффициентов экстинкции в области УФ-излучения. Постколоночную дериватизацию выполняют с использованием системы орто-фталевый альдегид / меркаптоэтанол, при этом полученные производные определяют флуориметрическим детектором (λвозбуждения = 320 - 340 нм, λэмиссии = 340 - 380 нм) [Winfield T.W. Determination of glyphosate in drinking water by direct aqueous injection HPLC, postcolumn derivatization, and fluorescence detection / T. W. Winfield // EPA. - Method 547, 1990. - 16 p]. Необходимо отметить, что все рассмотренные выше способы анализа методом ВЭЖХ с пред- или пост-колоночной дериватизацией аналитов описаны для количественного определения глифосата в смеси с продуктами его биоразложения.
Известные способы количественного определения глифосата и ФИДУК в продуктах реакции окисления ФИДУК основаны на методе ВЭЖХ с прямым фотометрическим определением аналитов при длине волны 190 - 200 нм [Pinel C., Landrivon E., Lini H., Gallezot P. Effect of the Nature of Carbon Catalysts on Glyphosate Synthesis // J. Catal. 1999. V. 182, № 2. P. 515-519]. Одним из недостатков этого метода является его низкая чувствительность, обусловленная тем, что значения коэффициентов молярной экстинкции аналитов относительно невысоки, так как в соответствующих молекулах присутствует только одна хромофорная функциональная группа - карбонильная. Вследствие этого максимумы поглощения исследуемых соединений, регистрируемые в диапазоне длин волн 200-800 нм, выражены нечетко, что приводит к значительной погрешности анализа. Также к общим недостаткам способов анализа продуктов реакции окисления ФИДУК методом ВЭЖХ относятся сравнительно дорогостоящее и сложное оборудование, расходные материалы и реактивы, что осложняет процедуру анализа, особенно в условиях промышленного производства.
Наиболее простые способы качественного определения глифосата в смеси с продуктами его разложения основаны на методе тонкослойной хроматографии (ТСХ), где для визуализации результата разделения смеси используют реакцию первичных и вторичных аминогрупп с нингидрином [Зеленкова Н.Ф., Винокурова Н.Г. Определение глифосата и продуктов его биодеградации хроматографическими методами // Журн. Аналит. Химии, 2008. Т. 63, № 9, С. 958].
Развитие этого подхода предложено в работах, где аминофосфорные кислоты предварительно модифицируют до поглощающих в УФ-свете нитрозопроизводных [Young J.C., Khan S.U., Marriage P.B. Fluorescence detection and determination of glyphosate via its N-nitroso derivative by thin-layer chromatography // J. Agric. Food Chem. 1977. V. 25, № 4. P. 918] или соответствующих тиоуретанов [Rembisz , Zakrzewski R., Skowron M., Ciesielski W. Image analysis of phenylisothiocyanate derivatised and charge-couple device-detected glyphosate and glufosinate in food samples separated by thin-layer chromatography // Int. J. Environ. Anal. Chem. 2016. V. 96, №.4. P. 320-331]. Недостатками этой группы методов является возможность разложения N-оксида ФИДУК при получении его производных (например, поглощающих свет в УФ области).
При этом метод ТСХ можно также использовать для количественного анализа глифосата и его основного продукта разложения - N-аминометилфосфоновой кислоты (АМФК) [Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде: Справочник. - Т.2 / Сост. Клисенко М.А., Калинина А.А., Новикова К.Ф., Хохолькова Г.А. - М.: Агропромиздат, 1992. - 416с].
Однако эти методы неприменимы для количественного анализа смесей, одновременно содержащих глифосат, ФИДУК и N-оксид ФИДУК, поскольку используемые для пост-хроматографической дериватизации реагенты могут окисляться N-оксидом ФИДУК, в результате чего будет образовываться дополнительное количество ФИДУК, состав смеси аналитов изменится, и следовательно, количественный анализ достаточно лабильного N-оксида ФИДУК окажется искаженным.
Таким образом, значительное количество представленных в литературе методов количественного анализа глифосатсодержащих смесей основано на принципе их хроматографического разделения. При этом наиболее экономически доступным и простым с точки зрения процедуры выполнения является метод ТСХ, который не требует сложной приборной базы, высокой квалификации исполнителя, а также дорогостоящих расходных материалов и реактивов. В этой связи использование метода ТСХ для решения задачи количественного определения глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК представляется обоснованным.
Наиболее близкими к предлагаемому решению является способ количественного определения глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК с использованием метода ТСХ [Д.Ю. Ющенко, Т.Б. Хлебникова, З.П. Пай // Тонкослойная хроматография для количественного контроля процесса синтеза глифосата, «Аналитика Сибири и Дальнего Востока», 12 - 17 сентября 2016, Барнаул, Россия, С. 154]. В этой работе для количественного анализа реакционной смеси, образующейся при каталитическом окислении ФИДУК пероксидом водорода, использован метод ТСХ, в котором визуализация аналитов выполняется путем обработки пластин «Сорбфил» ПТСХ-АФ-В-УФ 3%-раствором лимонной кислоты в уксусном ангидриде с последующей регистрацией величины флуоресценции при 365 нм.
Известно, что при обработке лимонной кислоты уксусным ангидридом образуется смесь изомерных соединений [Malachowski R., , Jerzmanowska Z. Untersuchungen über  II.: Konstitution und Bildungsart der -anhydride // Berichte der Dtsch. Chem. Gesellschaft A B Ser. 1928. Vol. 61, № 11. P. 2525-2538], включая цис-аконитовый ангидрид (ЦАА), номер CAS 6318-55-4,
способный реагировать с третичными аминами с образованием флуоресцирующих производных [Feldmann E.G., Koehler H.M. The Colorimetric Determination of Lidocaine With cis-Aconitic Anhydride // J. Am. Pharm. Assoc. (Scientific ed.). 1959. Vol. 48, № 10. P. 549-552, Yamamoto M., Uno T. Colorimetric determination and detection of tertiary amines with cis-aconitic anhydride. // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 1976. Vol. 24, № 9. P. 2237-2240]. Качественный и количественный состав смеси, образующейся при взаимодействии уксусного ангидрида и лимонной кислоты, нестабилен и зависит от температуры и времени приготовления, влажности воздуха, условий и длительности хранения. Вследствие этого 3%-раствор лимонной кислоты в уксусном ангидриде как реагент для дериватизации имеет малый срок годности. Использование в количественном анализе такого агента, обладающего непостоянным химическим составом, приводит к снижению чувствительности метода, а необходимость использования для дериватизации свежеприготовленного 3%-раствора лимонной кислоты в уксусном ангидриде приводит к увеличению расхода реагентов и трудозатрат, особенно при выполнении серийных рутинных анализов. Эти факторы значительно затрудняют проведение количественного анализа в условиях производства и являются существенными недостатками прототипа.
Отличительным признаком предлагаемого технического решения является определение количественного содержания глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК при их совместном присутствии методом тонкослойной хроматографии с пост-дериватизацией разделенных компонентов путем обработки пластины ~1%-раствором ЦАА в уксусном ангидриде.
Сущность предлагаемого технического решения описывается следующими стадиями:
- разделение компонентов анализируемого образца методом восходящей тонкослойной хроматографии на пластинах с закрепленным слоем силикагеля;
- пост-хроматографическую дериватизацию разделенных аналитов путем обработки пластины ~1%-раствором ЦАА в уксусном ангидриде;
- идентификацию компонентов разделяемой смеси осуществляют сопоставлением значений хроматографической подвижности Rf с Rf внешних стандартов глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК;
- количественное определение глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК на основании измерения флуоресценции пятен дериватизированных аналитов при УФ-возбуждении в области 350-365 нм.
Изобретение решает задачу разработки эффективного способа количественного анализа глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК методом ТСХ.
Технический результат - выполнение количественного анализа глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК методом ТСХ с использованием их производных, флуоресцирующих при УФ-возбуждении в области 350-365 нм, с удовлетворительной точностью с получением воспроизводимых результатов.
Другими преимуществами предложенного способа являются:
- использование простого и доступного оборудования для проведения анализа;
- сокращение времени непосредственного анализа в сравнении с описанными методами жидкостной и/или газовой хроматографии для решения поставленной задачи;
Задача анализа глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК при их совместном присутствии (в частности, в пробах, отобранных из реакционных смесей), решается путем выбора состава элюента для разделения компонентов образца, нанесенного на пластины с закрепленным слоем силикагеля, осуществлением разделения методом восходящей тонкослойной хроматографии компонентов анализируемого образца, нанесенного на пластину с закрепленным слоем силикагеля, обработкой пластины с разделенными аналитами ~1-%-ным раствором ЦАА в уксусном ангидриде с получением их производных, измерения флуоресценции пятен аналитов при УФ-возбуждении в области 350-365 нм, количественного определения аналитов относительно внешних стандартов глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК, нанесенных на пластину рядом с образцом перед выполнением анализа.
Описание предлагаемого технического решения.
Хроматографическое разделение компонентов анализируемой смеси выполняют на пластинах для тонкослойной хроматографии с закрепленным слоем силикагеля. Анализируемые растворы аналитов с концентрациями до 0.05М объемом 0.3 мкл наносят на пластины микрошприцем в форме пятен диаметром 3 мм на расстоянии от края пластины и между пятнами по 10 мм и на расстоянии от края пластины до линии старта 11 мм. Восходящее элюирование подвижной фазой выполняют в камерах, закрытых притертой крышкой, с принудительным насыщением слоя парами элюента. Элюирование осуществляют смесью водного раствора аммиака и изопропанола в соотношении: водный 15%-раствор аммиака / изопропанол = 10 / 15.
Пост-хроматографическую дериватизацию осуществляют обработкой пластин 1%-раствором цис- аконитового ангидрида в уксусном ангидриде с последующим нагреванием при 110°С в течение 1-2 мин. Регистрацию пятен производных глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК на пластинах после дериватизации выполняют на длинах волн 350-365 нм в виде флюоресцентных зон с использованием денситометра с последующей фото/видео-регистрацией изображения и его количественной обработкой на основании интенсивности величин флуоресценции.
Количественную обработку изображений выполняют с использованием денситометра «Сорбфил» с программным обеспечением «Сорбфил денситометр, количественный расчет ТСХ (версия 2.3.0.2994)».
Задача количественного анализа глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК решается измерением интенсивности величин флуоресценции пятен производных глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК и их сопоставлением с величиной флуоресценции пятна производного соответствующего внешнего стандарта. Хроматограмма смеси глифосата, ФИДУК и N-оксида ФИДУК, полученная в описанных выше условиях, приведена на Фигуре.
Метод внешнего стандарта заключается в том, что на пластину для ТСХ наряду с анализируемыми образцами наносят известное количество N-оксида ФИДУК и/или ФИДУК и/или глифосата (внешние стандарты).
Массу N-оксида ФИДУК, ФИДУК или глифосата в мкг вычисляют по формуле:
,
где  - площадь пика определяемого компонента, а  - коэффициент чувствительности определяемого компонента. Значение  вычисляют по формуле
,
где  - масса стандарта определяемого вещества,  - площадь пика стандарта определяемого вещества.
Метрологические характеристики предложенного способа определяют в соответствии с рекомендациями ICH [Ich. Validation of analytical procedures: text and methodology q2(r1) // International conference on harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. Geneva, switzerland, 2005], основываясь на стандартных методах [Statistics and chemometrics for analytical chemistry / J.C. Miller and J.N. Miller/ Harlow, England Pearson Prentice Hall, 2005]. Полученные значения приведены в таблице 1.
Для оценки правильности и прецизионности метода анализируют смеси N-оксида ФИДУК, ФИДУК или глифосата на различных уровнях концентраций каждого из аналитов (низкий, средний и высокий) в пределах диапазона линейности. На основе полученных данных рассчитаны величины относительного стандартного отклонения RSD и относительной погрешности ε (таблица 2).
Таблица 1 - Метрологические характеристики определения количества глифосата ФИДУК и N-оксида ФИДУК с использованием метода ТСХ (доверительный интервал, P=0.95)
Параметр
ФИДУК
N-оксид ФИДУК
Глифосат
Диапазон линейности, мкг/точка (количество точек)
0.09 - 2.04 (10)
0.09 - 3.50 (10)
0.07 - 2.54 (10)
Предел обнаружения, мкг/точка
0.11
0.11
0.08
Предел определения, мкг/точка
0.34
0.33
0.24
Параметры калибровочного графика y = ax + b
a
61790
106818
29910
S<sub>a</sub>
952
1511
543
b
356
-7237
-443
S<sub>b</sub>
1100
1868
440
S<sub>y/x</sub>
2092
3556
692
Коэффициент детерминации, R<sup>2</sup>
0.9978
0.9981
0.9977
Таблица 2 - Правильность и прецизионность метода
Аналит
Введено, мкг/точка
Найдено, мкг/точка
Найдено, мкг/точка(среднее значение)
RSD, %
RSD, % (среднее значение)
ε, %
ε, % (среднее значение)
ФИДУК
0.20
0.20
0.20
0.21
0.202
1.4
1.6
2.0
2.2
1.00
1.00
1.04
1.03
1.023
2.0
2.8
2.00
2.00
2.04
2.05
2.030
1.3
1.8
N-оксид ФИДУК
0.20
0.20
0.19
0.20
0.195
2.6
1.7
3.4
2.2
1.50
1.48
1.52
1.53
1.510
1.8
2.4
3.00
2.98
3.01
3.02
3.003
0.7
0.9
глифосат
0.20
0.21
0.20
0.20
0.198
2.9
2.1
3.9
2.8
1.00
1.01
0.97
0.98
0.987
2.1
2.8
2.00
1.98
2.01
2.03
2.007
1.3
1.7