Экспресс-диагностика вируса гриппа птиц в объектах окружающей среды, содержащих патоген в низких концентрациях

13. Biller, D.H. Vaginal vault prolapsed: identification and surgical options / D.H. Biller, G.W. Davila // Cleve Clin.J.Med. - 2005. - Vol.72, №4. - P. 1-8.

14. Lang, J.H. Estrogen levels and estrogen receptors in patients with stress urinary incontinence and pelvis organ prolapsed / J.H. Lang, L. Zhu, Z.J. Sun, J. Chen // Int. J. Gynecol.Obstet. - 2003. -Vol.80. - P 35-39.

15. Mouritsen, L. Classification and evaluation of prolapsed / L. Mouritsen // Best. Pract. Res. Clin. Ob-stet.Gynaecol. - 2005. - Vol.19. - P. 895-911.

16. Mouritsen, L. Symptoms, bother and POPQ in women referred with pelvic organ prolapsed / L. Mouritsen, J.P Larsen // Int. Urogynecol. J. Pelvic Floor Dysfunct. - 2003. - Vol.14. - P. 122-127.

17. Neuman, M. Advanced mesh implants for vaginal pelvic floor reconstruction: report of 150 Prolift operations / M. Neuman, M. Friedman // Abstract International Urogynecologi-

cal Association Congress, Cancun June 2006.

18. Perioperative outcomes of tension free vaginal mesh procedures following introduction to a teaching servis / M. Alperin, R. Ellison, G. Sutkin, PA. Moalli [et al.] // Abstract AUGS meeting 2007 in: Journal of Pelvic Medicine & Surgery. - 2007. -Vol.13, №.5. - P 308.

19. Reisenauer, C. Anatomical conditions for pelvic floor reconstruction with polypropylene implant and its application for the treatment of vaginal prolapsed / C. Reisenauer, A. Krischniak, U. Drews,

D. Wallwiener // European Journal of Obstetrics & Gynecology and reproductive Biology. -2007. -Vol.131. - P. 214-225.

20. Transvaginal mesh repair of pelvic organ prolapsed: short term outcomes from a prospective multicenter study / D. Altman, T. Vairynen, M. Ellstrom Engh, C. Falconer [et al.] // Abstract International Continence Society congress, Rotterdam, 2007.

ПРИМЕНЕНИЕ СЕТЧАТЫХ ЭНДОПРОТЕЗОВ

В ЛЕЧЕНИИ ПРОЛАПСА ГЕНИТАЛИЙ

С.А. ГАСПАРЯН, Е.П. АФАНАСОВА,

Л.В. СТАРИЧЕНКО

Проведен анализ результатов оперативного лечения с 2007 по 2009 год 85 больных женщин с простыми и осложненными формами пролапса гениталий с использованием синтетических материалов фирм -производителей АМС, Джонсон и Джонсон с целью определения эффективности хирургического лечения. Показана высокая эффективность реконструктивных пластических хирургических вмешательств с использованием синтетических сетчатых эндопротезов в лечении генитального пролапса, а также относительно низкая частота послеоперационных осложнений. Вопрос о преимуществах и недостатках использования синтетических эндопротезов различных фирм требует дальнейшего изучения.

Ключевые слова: системы РгоШ, Peridgi и Apodgi для реконструкции тазового дна, недифференцированная дисплазия соединительной ткани, интра- и послеоперационные осложнения

EXPERIENCE OF GENITALS PROLAPSE TREATMENT

USING RETICULAR ENDOPROSTHESES

GASPARYAN S.A., AFANASOVA E.P.,

STARICHENKO L.V.

Analysis of the results of 85 women treatment using AMS and Jonson & Jonson synthetic materials was made to study the effectiveness of surgical correction of simple and complicated forms of genitals prolapse. The data obtained showed the high efficiency of reconstructive plastic surgery in treatment of genitals prolapse using synthetic reticular endoprostheses, relatively low frequency of postoperative complications. Advantages and disadvantages of different synthetic endoprostheses require further accumulation of experience.

Key words: the systems Prolift, Peridgi and Apodgi for the reconstruction of the pelvic floor, «the undifferentiated dysplasia of the connective tissue», intra- and postoperative complications

© Н.В. Левченко, В.И. Ефременко, 2011 УДК 616.901.5:598.2/.9:616-07:581.52

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ, СОДЕРЖАЩИХ ПАТОГЕН В НИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ

Н.В. Левченко1, В.И. Ефременко2 Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт 2Ставропольская государственная медицинская академия

Левченко Наталья Витальевна, младший научный сотрудник Ставропольского научно-исследовательского противочумного института,

тел.: 89283217618; e-mail: efremenko26@mail.ru.

Ефременко Виталий Иванович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, заведующий кафедрой биологической химии СтГМА, тел.: 89624402261.

Проблема возникновения новых и возвращающихся инфекционных болезней, поражающих население государств, расположенных на различных континентах, до настоящего времени не теряет своей актуальности. К таким инфекциям относится грипп птиц, который в начале ХХ! века приобрел способность вызывать заболевания человека при контакте с больной птицей [1, 2,

5, 6, 9]. В 2009 году в 15 странах выявлено свыше 400 случаев тяжелых заболеваний человека с высокой летальностью, вызванной гриппом птиц H5N1, однако в нашей стране заболевание людей этой инфекцией не зарегистрировано [4]. Вместе с тем, начиная с 2005 года, в различных регионах России на путях миграции перелетных птиц отмечались быстро распространяющиеся эпизоотии среди дикой и домашней птицы, вызванные вирусом высокопатогенного гриппа птиц серотипа H5N1, что потребовало принятия эффективных противоэпидемических мер по защите от данного заболевания не только домашней птицы, но и людей [7]. Грипп птиц - высоко контагиозная энтеральная инфекция, способная инфицировать все виды пернатых с поражением у них паренхиматозных органов. Основными распространителями в природе вирусов гриппа птиц, в том числе высокопатогенных, считаются дикие мигрирующие утки, проявляющие к данному возбудителю относительную устойчивость и распространяющие инфекцию через фекальные массы в водоемы. В водоемах вирус сохраняется длительное время особенно при низкой температуре воды, при контакте с которой происходит заражение здоровой птицы [6]. При этом концентрация вируса гриппа птиц в воде водоемов зачастую бывает настолько низкой, что все известные лабораторные методы исследования не позволяют обнаружить его присутствия.

Цель исследования: разработка новых лабораторных диагностических систем, обеспечивающих выявление возбудителя гриппа птиц в объектах окружающей среды с низкой концентрацией патогена.

Материал и методы. Вирус гриппа птиц, депонированный в государственную коллекцию вирусов как Grebe / Novosibizsk / 29 / 05 (H5N1), выращенный роллерным способом в культуре клеток СПЭв и инактивированный p-пропиолактоном, а также иммунную асцитическую жидкость мышей, иммунизированных данным вирусом, получали из ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН в рамках совместно выполняемой научной темы. Специфические иммуноглобулины класса G (IgG) выделяли из асцитической жидкости фракционированием каприловой кислотой, затем ковалентно иммобилизировали на поверхность гранулированных магнитных иммуносорбентов, полученных нами на основе алюмосиликата с магнитным порошком и полиглюкином, активированных натрием перхлоратом за счет наличия в структуре сорбентов альдегидных групп. Данный сорбент имел удельную поверхность 66 м2/г, объем пор - 1,24 см3/г и их радиус - 38 нм и прочно связывал иммуноглобулины (IgG) против вируса гриппа птиц.

Конъюгацию IgG с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) фирмы «Sigma» осуществляли по традиционным методам. Полученный коньюгат, освобожденный от непрореагировавшего красителя, имел рабочее разведение 1:16. Иммунопероксидазные конъюгаты с рабочим титром 1:200 получали методом перйодант-ного окисления. При постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали унифицированную диагностическую тест-систему «Ампли Сенс  Influenza вирус A-H5/H7 для выявления РНК вируса гриппа А и идентификации субтипов A-H5/H7» методом обратной транскриптации (ОТ) (ЦНИИЭ, Москва).

Статистическую обработку полученных результатов проводили, оценивая дисперсию, стандартное отклонение, доверительный интервал выборки из результатов эксперимента, с использованием компьютерной

программы Microsoft Office Excel, 2007.

Результаты и обсуждение. Традиционными методами выявить возбудитель гриппа птиц в водных объектах окружающей среды затруднительно в связи с тем, что его концентрация в водоеме значительно ниже порога чувствительности известных методов диагностики. Для обеспечения селективного концентрирования вируса гриппа птиц из проб большого объема водной среды использованы твердофазные магнитные иммуносорбенты (МИС). В предварительных исследованиях была показана возможность таких сорбентов концентрировать на своей поверхности инактивированный вирус гриппа птиц, находящийся в 5000 мл водопроводной воды, содержащей 10 нг и выше патогена. После концентрирования на МИС вирус специфически обнаруживали с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) и ОТ-ПЦР [3]. Вместе с тем в открытых водоемах из-за очень низкой концентрации вируса в воде возникает необходимость его концентрирования в пробах, объем которых может достигать несколько сотен литров воды. С этой целью нами была сконструирована установка для микробиологического (вирусологического) мониторинга, на которую получен патент РФ на полезную модель [8].

Установка «Аквадиамаг» представляет собой плавающую платформу, на которой находятся насос, прокачивающий через силиконовые трубки жидкость водоема через 3 последовательно расположенные съемные магнитные «ловушки» с МИС и дополнительную магнитную «ловушку» с МИС, расположенную в стеклянной трубке, закрепленной в замкнутом магнитном поле. Регулировка водяного потока через «ловушки» осуществляется непосредственно на самом устройстве с помощью электронного стабилизатора оборотов насоса. Питание установки - от автономных аккумуляторных батарей со светодиодными индикаторами заряда, находящихся на плавающей платформе. Емкость аккумуляторных батарей обеспечивает непрерывную работу установки в пределах суток. За этот период через 4 магнитные «ловушки» с магнитными сорбентами, на поверхности которых могут быть иммобилизованы IgG не только против вируса гриппа птиц, но и против других возбудителей, прокачиваются сотни литров воды, из которой селективно концентрируются на МИС соответствующие патогены.

Так как в Ставропольском крае не было зарегистрировано вируса гриппа птиц, проведены модельные опыты по его обнаружению в 200 литрах воды, находящейся в емкости, куда вносили 50 нг инактивированного вируса гриппа птиц, и путем рециркуляции через МИС пропускали около 500 литров жидкости в течение 10 часов, используя для этого установку «Аквадиамаг».

В дальнейшем наличие вируса на поверхности МИС выявляли количественным иммунофлуоресцент-ным анализом (КИФА). С этой целью к опытным и контрольным (не контактирующим с вирусом гриппа птиц, а также обработанным гетерогенными вирусными вакцинами, содержащими антигены вирусов гепатита А, В и «Гриппол») пробам МИС по 100 мкл 10% взвеси сорбентов добавляли 200 мкл раствора IgG меченного ФИТЦ, в рабочем разведении 1:16, инкубировали 30 мин при 37оС и тщательно отмывали от несвязавшихся компонентов.

Исследуемые опытные и контрольные взвеси в объеме 10 мкл наносили на предметное стекло и микроскопировали. Прибором, регистрирующим уровень свечения магнитных гранул, служил люми-

несцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической насадкой ФМЭЛ-14. К насадке подсоединяли источник тока УБПВ-1 и вольтметр цифровой универсальный В7-76. Рабочее напряжение составляло 800-900 В, увеличение объектива х40 и окуляра х10. Применялись возбуждающие светофильтры БС-8-2, СЗС-7-2, ФС-1-6. Диаметр зонда фотометрической насадки, с площади которого выявляли уровень свечения МИС, составлял 0,5 мм. После обнаружения в поле зрения гранул сорбента закрывали полевую диафрагму и снимали цифровые показания уровня свечения 10-15 гранул на вольтметре. Определяли среднеарифметические значения величины флуоресценции опытных, контрольных гранул и пространства между ними - фона. Интенсивность флуоресценции МИС (М) представляла собой разницу между среднеарифметическими показателями уровня свечения гранул и фона: (М)=М гранул -М фона. За положительные принимались результаты, при которых уровень флуоресценции опытных гранул в 2 и более раз превышал аналогичный показатель контрольных.

В результате трехкратного испытания данного способа установлена возможность обнаружения низких концентраций антигенов вируса гриппа птиц в воде, которые концентрировались на поверхности МИС с последующим их выявлением методом КИФА. При этом отношение уровня флуоресценции опытных гранул МИС к контрольным составляло 2,1-2,3. Проведенные исследования показали возможность индикации вируса гриппа птиц с использованием МИС в КИФА, включая пробы внешней среды (вода) с очень низкой концентрацией патогена.

Дисперсия случайной выборки из результатов эксперимента по определению чувствительности МИС + КИФА (девять результатов с чувствительностью 10 нг/ мл, один - 5 нг/мл) составила 2,5, стандартное отклонение - 1,5811, доверительный интервал - 3,5764.

Наличие вируса гриппа птиц Н5Ж на МИС было подтверждено также в опытных пробах, в отличие от контрольных, при использовании ИФА и ОТ-ПЦР в соответствии с описанными нами ранее методическими приемами [3].

Дисперсия случайной выборки из результатов эксперимента по определению чувствительности МИС + ИФА (восемь результатов с чувствительностью 10 нг/ мл, два - 5 нг/мл) составила 4,4444, стандартное отклонение - 2,1082, доверительный интервал - 4,7687.

Дисперсия случайной выборки из результатов эксперимента по определению чувствительности МИС + ОТ-ПЦР (восемь результатов с чувствительностью 10 нг/мл, два - 5 нг/мл) составила 4,4444, стандартное отклонение - 2,1082, доверительный интервал -4,7687.

Таким образом, была показана принципиальная возможность обнаружения с помощью МИС и установки «Аквадиамаг» патогенов в пробах воды большого объема даже в том случае, если низкая концентрация не позволяет обнаружить их всеми известными методами. Это осуществляется за счет селективного концентрирования патогена на МИС с последующим его выявлением КИФА, ИФА, ПЦР

Заключение. Эффективный вирусологический мониторинг вируса гриппа птиц в водных объектах окружающей среды возможен лишь при сочетанном использовании магнитных иммуносорбентов и инди-

кационных методов количественного иммунофлуо-ресцентного анализа, иммуноферментного анализа, обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией, одновременно сочетающих в себе способность осуществлять динамическое, селективное концентрирование патогена из загрязненных проб большого объема с высокой чувствительностью и специфичностью определения патогена.

Разработана установка «Аквадиамаг», обеспечивающая динамическое концентрирование вируса гриппа птиц на магнитных иммуносорбентах из воды открытых водоемов объемом несколько сот литров (фактора передачи вируса здоровым птицам), где его концентрация на несколько порядков ниже чувствительности всех известных индикационных методов, позволяющих исследовать ограниченный объем проб.

Литература

1. Бектемиров, Т.А. Птичий грипп и возможная пандемия / Т.А. Бектемиров // Биопрепараты.

- 2005. - № 17. - С. 14-16.

2. Гендон, Ю.З. Эпизоотии гриппа птиц и борьба с ними / Ю.З. Гендон // Журн. микробиол. - 2006.

- № 5. - С. 17-28.

3. Ефременко, В.И. Экспериментальные данные по выявлению вируса гриппа птиц с помощью магнитных иммуносорбентов / В.И. Ефременко, Д.К. Львов, П.Г. Дерябин [и др.] // Вопросы вирусологии. - № 3. - 2008. - С. 43-45.

4. Крылов, П.С. Аминокислотные замены в гемаг-глютинине вируса гриппа подтипа H5, влияющие на антигенную специфичность и вирулентность вируса / П.С. Крылов, И.А. Руднева, Т.А. Тимофеева [и др.] // Вопр. вирусол. - 2009. -Т.54, № 5. - С. 14-19.

5. Липатов, А.С. Эволюция вирусов гриппа птиц H5N1 с 1997 по 2004 г. в Южной и ЮгоВосточной Азии / А.С. Липатов, Ю.А. Смирнов, Н.В. Каверин, РГ. Вебстер // Вопросы вирусологии. - 2005. - № 4. - С. 11-17.

6. Львов, Д.К. Популяционные взаимодействия в биологической системе: вирус гриппа А-дикие и домашние животные - человек; причины и последствия проникновения на территорию России высокопатогенного вируса гриппа A / H5N1 / Д.К. Львов // Журн. микробиол. - 2006.

- № 3. - С. 96-100.

7. Онищенко, Г.Г. Ситуации заболеваемости гриппом птиц в мире и в Российской Федерации. Совершенствование надзора и контроля за гриппом при подготовке к возможной пандемии / Г.Г. Онищенко // Журн. микробиол. -2006. - № 5. - С. 4-17.

8. Пат. 64784 РФ, МПК G01N 33/553, C12M 1/00. Установка для микробиологического мониторинга объектов водной среды / В.И. Ефременко, А.Л. Столяров, Э.М. Игуменов, А.М. Игуменов, Е.Н. Афанасьев, А.В. Таран, И.В. Жарникова, Н.В. Левченко, Т.В. Жарникова, С.А. Курчева (РФ). - № 2006144331; Заявлено 12.12.2006; Опубл. 10.07.2007 г. Бюл. №

19.

9. Peiris, J.S. Avian influenza virus (H5N1): a threat to human health / J.S. Peiris, M.D. de Jong, Y Guan // Clin. Microbiol. Rev. - 2007. - Vol. 20. - P. 243267.

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА ВИРУСА ГРИППА

ПТИЦ В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ,

СОДЕРЖАЩИХ ПАТОГЕН

В НИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ

Н.В. ЛЕВЧЕНКО, В.И. ЕФРЕМЕНКО

Разработаны диагностические тест-системы, обеспечивающие выявление вируса гриппа птиц в воде открытых водоемов, при контакте с которой происходит заражение здоровой птицы. При этом концентрация вируса в воде водоемов зачастую бывает настолько низкой, что все известные лабораторные методы исследования не позволяют обнаружить его присутствие.

Тест-системы представляют собой магнитные иммуносорбенты, которые за счет реакции антиген-антитело селективно концентрируют на своей поверхности вирус гриппа птиц из объема жидкости в несколько сот литров, прокачиваемой через сорбенты созданной установкой «Аквадиамаг». В дальнейшем вирус выявляется с помощью специфических иммуноглобулинов, меченных флуоресцеинизотионом - в количественном иммунофлуоресцентном анализе, меченных ферментом - в иммуноферментном анализе и при использовании полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Разработанные диагностические тест-системы позволяют с высокой специфичностью обнаруживать вирус гриппа птиц, присутствующий в 200 литрах воды в количестве 50 нг.

Ключевые слова: вирус гриппа птиц, магнитные иммуносорбенты, иммунобиологические и геннодиагностические системы

AVIAN INFLUENZA VIRUS EXPRESS DIAGNOSTICS

IN THE ENVIRONMENTAL SAMPLES WITH LOW

CONCENTRATION OF THE PATHOGEN

LEVCHENKO N.V., EFREMENKO V.I.

The authors have developed the diagnostic test-systems to detect avian influenza virus in the open water reservoirs if it contains the pathogen the healthy birds get infected by contact with open water. The virus concentration in an open water reservoirs frequently is so low that all known methods usually used do not allow detecting the presence of the virus.

These test systems are the magnetic immunosorbents which are selectively concentrated virus on its surface due to antigen-antibody reaction. Avian influenza virus isolation was performed by pumping of several hundred liters of liquid volume through the sorbents of the installation “AQUADIAMAG”.

Later the virus is detected by specific immunoglobulins labeled by flyuorestseinizotiotsiats during the quantitative immunofluorescent analysis, or labeled by enzyme - in ELISA and polymerase chain reaction with reverse transcription.

The above diagnostic test system allows a high specificity detection of 50 ng of avian influenza virus in 200 liters of water.

Key words: avian influenza virus, Magnetic immunosorbents, immunobiological and genetic diagnostic systems

© А.В. Алабут, 2011

УДК: 616.72-005.6-06-089.28/.29

ТАКТИКА АКТИВНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ТРОМБОЭМБОЛИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ ЭНДОПРОТЕЗИРОВАНИИ КРУПНЫХ СУСТАВОВ

А.В. Алабут Ростовский государственный медицинский университет

Частота симптомных тромбоэмболических осложнений при эндопротезировании тазобедренного сустава на фоне тромбопрофи-лактики составляет, по разным данным, от 1,3% до 3,4%, при эндопротезировании коленного сустава - от 1,7% до 2,8% [1]. Частота фатальных тромбоэмболий колеблется от 1% до 2,3%, нефатальные тромбозы развиваются в 7,9-15,2% случаев [4]. При эндопротезировании тазобедренного сустава среднее время до развития тромбоза глубоких вен ориентировочно составляет 21 день, до развития тромбоэмболии легочной артерии -34 дня [5]. При эндопротезировании коленного сустава среднее время до развития тромбоза глубоких вен - 20 дней, среднее время до развития тромбоэмболии легочной артерии значительно меньше - в среднем составляет 12 дней.

Алабут Анна Владимировна, травматолог-ортопед, кандидат медицинских наук, заведующая отделением ортопедии и реконструктивно-пластической хирургии Ростовского государственного медицинского университета, тел.: (863)2985182, 89185585182; e-mail: alabut@mail.ru.

Риск летальных исходов от тромбоэмболических осложнений после эндопротезирования тазобедренного сустава сохраняется достаточно высоким (4-20%) в течение шести месяцев [2]. Основные факторы риска смерти: пожилой возраст, мужской пол, низкая оценка физического статуса по шкале ASA (Американское общество анестезиологов) перед операцией, сердечно-сосудистые заболевания - являются довольно частыми в группе больных, которым показано эндопротезирование суставов нижних конечностей.

Цель исследования: разработка активной перио-перационной тактики ведения больных, направленной на уменьшение летальности от тромбоэмболических осложнений.

Материал и методы. Проведен анализ лечения 104 больных, которым выполнялось эндопротезирование коленного сустава, и 121 больного, которому выполняли замещение тазобедренного сустава. С целью активного выявления патологии сосудистого русла всем больным в предоперационном периоде выполняли триплексное исследование вен и ультразвуковое исследование артерий нижних конечностей. При выявлении патологии вен и артерий осуществлялись