Состав криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов
CRYOPRESERVANT COMPOSITION FOR LONG-TERM STORAGE OF PRIMARY KERATINOCYTES

Изобретение относится к клеточной биологии, криобиологии, а именно к созданию раствора для хранения запаса кератиноцитов кожи человека при отрицательных температурах и созданию клеточных банков. Изобретение можно отнести к регенеративной медицине, а именно к созданию заготовки стратегических запасов клеточных трансплантатов в безопасных для реципиента средах.
Известна среда для консервации клеток печени (RU 2161198, опубликовано: 27.12.2000 Бюл. №36), содержащая в качестве криопротектора содержащая в качестве криопротектора низкомолекулярный поливинилпирролидон, отличающаяся тем, что в качестве жизнеобеспечивающих компонентов дополнительно содержит питательную среду RPMI-1629, 1%-ный раствор альбумина человеческого, калий оротат при следующем соотношении компонентов, мас.ч.: Среда RPMI-1629 - 10-10,5 Поливинилпирролидон - 1-1,5 1%-ный раствор альбумина человеческого - 3-3,6 Калий оротат - 1-1,2 рН - 7,6.
Недостатками данного способа являются то, что данный известный криоконсервант содержит сниженное количество питательных веществ, в частности не содержит аналогов сыворотки, что снижает способность кератиноцитов после хранения образовывать жизнеспособные клеточные культуры. Кроме того, в данном способе достигается отсутствие слипания клеток в суспензии, за счет пресыщения раствора калием, что является недостатком в случае хранения кератиноцитов кожи, т.к. жизнеспособность и физиологическая активность данных клеток обусловлена их способностью быстро прилипать к субстрату после размораживания и образовывать многоклеточные колонии.
Известен способ кратковременного хранения клеток гепатоцитов (RU 2396748, опубликовано: 20.08.2010 Бюл. №23), в котором эти клетки помещают в жидкую клеточную среду, содержащую а) солевой раствор, выбранный из солевого раствора, содержащего, в частности, хлорид натрия, глюконат натрия, ацетат натрия, хлорид калия, хлорид магния и цитрат натрия, раствора Рингера-лактата, забуференного фосфатом солевого раствора (ЗФР), и/или водный раствор высокомолекулярного сахара, в частности гидроксиэтилкрахмала, b) глюкозу и с) сывороточный альбумин и/или плазму крови, и хранят в этой клеточной среде.
Недостатком данного способа является то, что данный способ предполагает кратковременное хранение клеток (печени) в криоконсерванте, содержащем набор солей, без содержания питательных добавок, а именно сыворотки и ее аналогов.
Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является среда для криоконсервации клеток человека и животных (RU 2303631, опубликовано: 27.07.2007 Бюл. №21), содержащая в своем составе аутологичную к донорскому костному мозгу сыворотку крови, при следующем соотношении компонентов, в об. %: сыворотка крови - 45-65, диметилсульфоксид - 5-15, сульфаниламиды и антибиотики - 0,1-1,5 и среда ДМЕМ - остальное, до 100.
Недостатком способа является обязательное внесение в состав криоконсерванта аутологичной сыворотки крови, что делает невозможным использование замораживаемых клеток в качестве донорских и препятствует созданию на основе данных клеток стратегического донорского запаса клеток в криобанках, т.к. сыворотка является фактором риска как в качестве переносчика вирусных и других инфекций, так и может быть причиной иммунной несовместимости донора и реципиента. Кроме того, при заготовлении клеток кожи (кератиноцитов) не предполагается дополнительное вмешательство (забор крови) у донора.
Способы длительного низкотемпературного хранения первичных клеточных культур и тканей человека является актуальной проблемой современной клеточной биологии и регенеративной медицины. Первичные кератиноциты человека и тканеинженерные конструкты на их основе незаменимы для исследований и разработок как в прикладной (комбустиология, дерматология, косметология, тест-системы для исследования действия терапевтических препаратов), так и в фундаментальной области. Данные клетки отличаются тем, что крайне плохо переживают замораживание в обычных (известных) криоконсервантах. Для обеспечения стабильной работы необходимы криобанки готовых образцов с сохранной жизнеспособностью.
Любые криоконсерванты содержат криопротекторы - вещества, способствующие снижению повреждающего действия негативных факторов отрицательных температур, за счет снижения количества и размеров кристаллов льда в замораживаемых клетках. Данные вещества хорошо проникают через мембраны внутрь клетки и препятствуют росту кристаллов льда. Однако зачастую это достигаются при повышении концентрации криопротекторов, что в свою очередь также может оказывать негативное воздействие на выживаемость клеток - т.к. высокие концентрации криопротекторов (DMSO) токсичны для клеток животных и человека. Токсическое побочное действие криопротекторов, связанное, например, с генерацией активных форм кислорода и/или индукцией апоптотической гибели, может быть снижено за счет активности дополнительных компонентов, например, антиоксидантов, стабилизаторов мембран и т.п.
Одним из таких веществ является альфа-липоевая кислота. Присутствие ее в криоконсерванте позволяет стабилизировать клеточные мембраны, повреждаемые криопротектором и кристаллами льда, что приводит к увеличению процента выживших после заморозки-разморозки клеток. Альфа-липоевая кислота является антиоксидантом, подавляющим образование активных форм кислорода в процессе криоконсервации.
Так же, для обеспечения выживаемости при криоконсервации культур клеток человека ранее использовали эмбриональную сыворотку телят (FBS) в качестве питательной добавки, позволяющий снизить концентрацию криопротектора (использовать его не более 10% в среде), а также за счет повышения вязкости криоконсерванта. Для создания клеточных криобанков, основной задачей которых является обеспечение бесперебойной работы производства биомедицинских клеточных продуктов использование животной сыворотки не приемлемо. В качестве заменителя сыворотки в предложенном составе криоконсерванта выступает Panexin NTA, позволяющий обеспечить бессывороточное хранение первичных клеточных культур.
Технический результат заключается в увеличении выхода живых и способных к активному росту кератиноцитов человека из глубокой заморозки после длительного хранения.
Технический результат достигается предлагаемым составом криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов, содержащим питательную среду DMEM/F12, причем он дополнительно содержит заменитель сыворотки Panexin NTA, криопротектор DMSO и альфа-липоевую кислоту в концентрации 200 мкМ растворенную в DMSO при следующем соотношении ингредиентов, %:
питательная среда DMEM/F12
70-85%;
заменитель сыворотки Panexin NTA
10-15%;
криопротектор DMSO
9,999-14,999%;
альфа-липоевая кислота
0,001%.
Предлагаемый состав криоконсерванта используют следующим образом.
Кератиноциты кожи человека после этапа культивирования снимают с поверхности культурального пластика при помощи раствора Трипсина и раствора Версена любым известным способом, после чего центрифугируют, а осадок ресуспендируют в растворе предлагаемого криоконсерванта в концентрации от 1 до 3 млн. клеток на 1 мл раствора и помещают в специальные криопробирки. Затем, полученную суспензию кератиноцитов в пробирках постепенно охлаждают, со скоростью 1-3°С в минуту и доводят температуру суспензии до -70°С. Замороженные по такому протоколу кератиноциты закладывают на хранение в жидкий азот (температура хранения в жидком азоте -196°С), где пробирки с клеточной суспензией могут храниться по несколько лет. Для размораживания кератиноциты вынимают из азота и быстро нагревают до +37°С. Оттаявшую суспензию центрифугируют, осадок ресуспендируют в стандартной среде для культивирования кератиноцитов и высевают в культуральные флаконы. После хранения в предложенном криоконсерванте и размораживания культура кератиноцитов кожи человека в течение 7 суток полностью восстанавливает свою морфологию и физиологическую активность.
Пример использования
Для создания запаса криоконсервированных первичных кератиноцитов кожи человека разработан способ хранения их в виде замороженной клеточной суспензии в криоконсерванте в жидком азоте. Для повышения жизнеспособности и пролиферативной активности клеток, прошедших стадию хранения было проведено сравнение криоконсервантов разного состава: криосреда созданная на основе DMEM/F12 (Панеко, Россия) с 10% DMSO добавлением 10% сыворотки коров (FBS), как положительный контроль; криосреда созданная на основе DMEM/F12 (Панеко, Россия) с 10% DMSO добавлением 10% Panexin NTA (PAN-Biotech, Германия) - заменитель животной сыворотки; криопротектор заявленного состава созданный на основе DMEM/F12 (Панеко, Россия) с 10% DMSO добавлением 10% Panexin NTA (PAN-Biotech, Германия) и Альфа-липоевой кислотой (далее LA) в количестве 0,001% (200 мкМ р-р в ДМСО).
Стоит отметить, что для оценки жизнеспособности кератиноцитов недостаточно оценить количество живых клеток, вышедших из разморозки экспресс-тестом по вытеснению клетками красителя Трипанового синего, т.к. данные клетки отличаются тем, что могут погибать в течение нескольких суток после произведенного воздействия отрицательными температурами.
Для более точной оценки состояния культуры размороженных кератиноцитов был выбран МТТ - тест, колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. Только активные НАДФ-Н-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты в живых клетках могут, при определенных условиях, восстанавливать тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид в нерастворимый формазан, который имеет пурпурное окрашивание. Интенсивность образования гранул формазана коррелирует с жизнеспособностью клеток, таким образом данный тест является косвенным показателем жизнеспособности культуры. МТТ тестирование проводили на размороженных культурах клеток после их посева на культуральный пластик через 2,5, 24, 48 часов, 7 и 10 дней после разморозки. Результаты приведены на фиг. 1 - «Изменения показателей оптической плотности при МТТ-тестировании культур кератиноцитов, прошедших стадию хранения в криосредах разного состава». По горизонтальной оси время культивирования культуры после размораживания. На рисунке D+P - криоконсервант на основе среды DMEM с добавлением заменителя сыворотки Panexin NTA, D+P +LA криоконсервант на основе среды DMEM с добавлением заменителя сыворотки Panexin NTA и с альфа-липоевой кислотой, согласно заявленному составу, D+FBS - стандартный криоконсервант с бычьей сывороткой в составе.
Проведя анализ полученных данных можно сказать, что в течение суток после размораживания происходит уменьшение числа активных клеток во всех вариантах криосред. Добавление LA (р=0,001). Через сутки проявляется особенность кератиноцитов кожи - гибель части клеток, через несколько часов (суток) после воздействия отрицательными температурами. Добавление LA в процессе криоконсервации приводит к более интенсивной пролиферации клеток в процессе их культивирования после размораживания. Через 10 дней культивирования количество клеток, замороженных в присутствии D+P +LA возрастает. Таким образом, добавление LA к криоконсервантам повышает выживаемость клеток.
Динамика изменения числа клеток, замороженных в присутствии Panexin NTA, несколько отличается от динамики числа клеток, замороженных с использованием сыворотки: количество жизнеспособных клеток в присутствии сыворотки в течение 24 часов меняется незначительно, однако уже к 3 суткам после разморозки уровень живых клеток сопоставим во всех вариантах. Добавление LA к Panexin NTA активирует пролиферацию клеток, начиная с 7 дня культивирования.
Показано, что заявляемый состав криоконсерванта позволяет хранить кератиноциты кожи человека длительное время с сохранностью их жизнеспособности и при этом, использовать данные клетки для нужд регенеративной медицины, т.к. в нем не содержится сыворотки крови животных. Добавление альфа-липоевой кислоты к криоконсерванту позволяет увеличить выход жизнеспособных клеток из глубокой заморозки.
Таким образом, использование заявляемого криоконсерванта, содержащего Panexin NTA и альфа-липоевую кислоту, позволяет увеличить выход жизнеспособных клеток в культуре кератиноциов.