СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ТРОМБОЗА СИСТЕМНО-ЛЕГОЧНОГО ШУНТА
METHOD FOR PREVENTION OF SYSTEMIC PULMONARY BYPASS THROMBOSIS

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно заявке США No. 62/524102, поданной 23 июня 2017 года, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области тромбопрофилактики и, в частности, к профилактике тромбоза стента у педиатрических пациентов, включая новорожденных, и к предотвращению тромбоза шунта у пациентов с факторами высокого риска, перенесших операцию по наложению системно–легочного шунта. У новорожденных с цианотическим врожденным пороком сердца, связанным с системно–легочным шунтом, существует высокий риск тромбоза.
Предшествующий уровень техники
Врожденные пороки сердца (ВПС) являются наиболее распространенным типом врожденного дефекта. Он поражает 8 из каждых 1000 новорожденных и имеет широкий спектр тяжести заболевания. Однако, большинство из тех, кто родился со структурными аномалиями сердца, в остальном здоровы, и корректирующие операции могут привести к нормальной продолжительности жизни (Monagle, 2005). Хотя были достигнуты значительные технические достижения в паллиативных и корректирующих мерах и в уходе за тяжелобольными новорожденными, эти процедуры связаны с повышенным риском острых тромботических событий (ATE) в этой популяции пациентов (Monagle, 2004; Tormene et al., 2006; Monagle et al., 2008; Manlhiot et al., 2011).
Паллиация с модифицированным BT–шунтом необходима для лечения отобранной группы новорожденных с цианотическим врожденным пороком сердца. Однако такие пациенты подвержены высокому риску тромботических осложнений, таких как острая окклюзия шунта, которая остается основным источником заболеваемости и смертности. Хотя в целом считается, что терапия аспирином снижает риск окклюзии шунта и улучшает выживаемость, ее обычно не назначают в течение 12–24 часов после операции. Ограниченный ретроспективный обзор педиатрических пациентов с сердечной недостаточностью с признаками окклюзии шунта в Медицинском центре Колумбийского университета показал, что большинство случаев происходило до введения антитромбоцитарного средства, что указывает на неудовлетворенную потребность в тромбопрофилактике в этот уязвимый период.
Heart
Circulation
Ann Thorac Surg
Prog Pediatr Cardiol.
Cardiol Young
J Thorac Cardiovasc Surg
Cardiol Young
J Thorac Cardiovasc Surg
Острые тромбоэмболические события (ОТС) быстро становятся новой эпидемией в центрах, которые ухаживают за тяжелобольными новорожденными из–за увеличения инвазивного мониторинга, технологий жизнеобеспечения, таких как экстракорпоральная мембранная оксигенация (ЭКМО), а также новых хирургических методов и трансплантационных материалов, используемых для лечения сложных врожденных пороков сердца. (Monagle P, Newall F, Barnes C, Savoia H, Campbell J, Wallace T, Crock C. “Arterial thromboembolic disease: a single–centre case series study.” J Paediatr Child Health. 2008; 44:2832; Tormene D, Gavasso S, Rossetto V, Simioni P. “Thrombosis and thrombophilia in children: a systematic review.” Semin Throm. Hemost. 2006; 32:724–728; Manlhiot C, Menjak IB, Brandão LR, Gruenwald CE, Schwartz SM, Sivarajan VB, Yoon H, Maratta R, Carew CL, McMullen JA, Clarizia NA, Holtby HM, Williams S, Caldarone CA, Van Arsdell GS, Chan AK, McCrindle BW. “Risk, clinical features, and outcomes of thrombosis associated with pediatric cardiac surgery.” Circulation. 2011; 124:1511–1519; Chalmers EA. “Pediatric thrombosis.” J Clin Pathol. 2000; 53:419–423.) В последнем случае младенцы (<6 месяцев) составляют основную долю (~70%) пациентов, наблюдаемых в центрах третичной помощи (высокоспециализированная медицинская помощь) с ATE. (Monagle P. “Anticoagulation in the young.” . 2004; 90:808–812.) В частности, наибольшему риску подвергаются пациенты с физиологией единственного желудочка, которым требуется наложению системно–легочного шунта (например, модифицированного шунта Блелока–Тауссига или центральных шунтов), особенно в раннем послеоперационном периоде. (Manlhiot C, Menjak IB, Brandão LR, Gruenwald CE, Schwartz SM, Sivarajan VB, Yoon H, Maratta R, Carew CL, McMullen JA, Clarizia NA, Holtby HM, Williams S, Caldarone CA, Van Arsdell GS, Chan AK, McCrindle BW. “Risk, clinical features, and outcomes of thrombosis associated with pediatric cardiac surgery.” . 2011; 124:1511–1519; Fenton KN, Siewers RD, Rebovich B, Pigula FA. “Interim mortality in infants with systemic–to pulmonary artery shunts.” . 2003; 76:152–156; Monagle Paul. “Thrombosis in children with BT shunts,” Glenns and Fontans. 2005; 21:17–21; Al Jubair KA, Al Fagih MR, Al Jarallah AS, Al Yousef S, Ali Khan MA, Ashmeg A, Al Faraidi Y, Sawyer W. “Results of 546 Blalock–Taussig shunts performed in 478 patients.” . 1998; 8:486–490.) Следовательно, это привело к субоптимальным послеоперационным исходам, о чем свидетельствует ретроспективный обзор 2058 новорожденных, которым была проведена паллиация с помощью системно–легочного шунта в нескольких центрах; уровень смертности и осложнений при выписке составлял около 6,7% и 12,3%, соответственно. (Heidari–Bateni G, Norouzi S, Hall M, Brar A, Eghtesady P. “Defining the best practice patterns for the pediatric systemic–to–pulmonary artery shunt procedure.” . 2014; 147:869–873.) Раннее назначение аспирина, необратимого ингибитора тромбоцитарной циклооксигеназы, в течение 12 часов после операции уменьшило риск тромбоза шунта и смерти в этой популяции пациентов. (Al Jubair KA, Al Fagih MR, Al Jarallah AS, Al Yousef S, Ali Khan MA, Ashmeg A, Al Faraidi Y, Sawyer W. Results of 546 “Blalock–Taussig shunts performed in 478 patients.” . 1998; 8:486–490; Heidari–Bateni G, Norouzi S, Hall M, Brar A, Eghtesady P. “Defining the best practice patterns for the pediatric systemic–to–pulmonary artery shunt procedure.” . 2014; 147:869–873; Li JS, Yow E, Berezny KY, Rhodes JF, Bokesch PM, Charpie JR, Forbus GA, Mahony L, Boshkov L, Lambert V, Bonnet D, Michel–Behnke I, Graham TP, Takahashi M, Jaggers J, Califf RM, Rakhit A, Fontecave S, Sanders SP. “Clinical outcomes of palliative surgery including a systemic–to–pulmonary artery shunt in infants with cyanotic congenital heart disease: does aspirin make a difference?” Circulation. 2007; 116:293–297; Motz R, Wessel A, Ruschewski W, Bürsch J. “Reduced frequency of occlusion of aorto–pulmonary shunts in infants receiving aspirin.” Cardiol Young. 1999; 9:474–477). Тем не менее, сохраняется острая необходимость в фармакологической защите перед введением перорального антитромбоцитарного средства, чтобы свести к минимуму период, в течение которого пациенты уязвимы для ATE.
12
Тиенопиридины (например, клопидогрел) представляют собой класс антитромбоцитарных средств, которые нацелены на рецептор ADP P2Y12 и, как известно, снижают риск ишемии и тромбоза у взрослых пациентов во время и после чрескожного коронарного вмешательства (ЧКВ). Они делают это путем ослабления потенцирования P2Y12 секреции плотных гранул тромбоцитов в ответ на сильные агонисты, стабилизации агрегации тромбоцитов, способствуя активации αIIbβ3, и ингибированию антитромбоцитарных эффектов простациклина. Несмотря на доказанную клиническую эффективность, клопидогрел имеет несколько основных недостатков, которые могут ограничить его использование в течение уязвимого периода для послеоперационных педиатрических пациентов с сердечными заболеваниями. К ним относятся необходимость перорального введения, которое может привести к неустойчивой абсорбции, особенно в случаях шунтирования, задержке начала действия из–за необходимости преобразования пролекарства в активный метаболит и необратимому ингибированию P2Y, которое потребовало бы переливания(ий) тромбоцитов в случае кровотечения
Интересно, что предыдущее клиническое исследование, в котором оценивали терапию с применением клопидогреля у детей с цианотическим врожденным пороком сердца, с системно–легочным шунтом, не показало каких–либо преимуществ в снижении частоты смерти или заболеваемости, связанной с шунтированием, у пациентов, получавших медикаментозное лечение. В большинстве случаев пациенты также получали терапию аспирином во время введения клопидогрела. Следует отметить, что клопидогрел является пролекарством, которое требует метаболизма в печени, чтобы генерировать свою активную форму, которая была неизвестна на момент проведения исследования. Это также необратимый ингибитор рецептора P2Y12. Целевое значение для ингибирования тромбоцитов в этом испытании составляло ~30%, как определено LTA. Одним из основных выводов, сделанных в этом исследовании, было то, что тромбоциты от этих молодых пациентов могут быть менее чувствительными к агонистам, таким как ADP, о чем свидетельствует более низкая доза клопидогрела, необходимая для достижения аналогичных уровней ингибирования агрегации тромбоцитов с использованием LTA по сравнению со взрослыми. Из этого можно сделать вывод, что сигнальный путь P2Y12 может регулироваться в процессе развития и/или иметь меньшее значение для поддержания генерации тромбов в этой популяции по сравнению со взрослыми.
Кангрелор, аналог аденозинтрифосфата (АТФ), является антагонистом рецептора P2Y12, вводимым внутривенно, со свойствами, более подходящими для кратковременного применения, которые включают быстрое, прямое, предсказуемое и обратимое ингибирование функции тромбоцитов. Не требует преобразования в активную форму по сравнению с клопидогрелем. Он имеет период полувыведения от 3 до 6 минут у взрослых с восстановлением гемостаза, оцениваемого по времени кровотечения, наблюдаемого в течение 10 минут после прекращения инфузии сверхтерапевтической дозы и полного восстановления функции тромбоцитов в течение 60 минут, что определяется по реакции на ADP.
Альтернативные формы и соли кангрелора, способы их получения и фармацевтические композиции, содержащие их, хорошо известны в данной области и изложены, например, в патенте США No. 5721219. Дополнительное раскрытие, относящееся к получению и использованию кангрелора, можно найти в патентах США No. 5955447; 6130208; 6114313; 8680052; 759316; 9295687; 9427448; 9439921; и 9700575.
Кангрелор также быстро инактивируется путем дефосфорилирования до нуклеозида. На основании этих характеристик он был выбран для клинической разработки в качестве антитромботического средства для внутривенного введения и недавно был одобрен FDA для применения у взрослых, перенесших ЧКВ.
Кангрелор может также иметь значение в качестве потенциального связующего средства для пероральной терапии у новорожденных с цианотическим врожденным пороком сердца, которые нуждаются в паллиативном лечении с помощью системно–легочного шунта.
Несмотря на достижения в области вспомогательной фармакотерапии, сохраняется острая необходимость в фармакологической защите до введения перорального антитромбоцитарного средства, чтобы минимизировать период сразу после операции, во время которой пациенты, в особенности, педиатрические пациенты, являются уязвимы для острого тромботического события (ATE).
12
Авторы настоящего изобретения предоставляют фармацевтическую композицию, включающую ингибитор P2Y в качестве антитромбоцитарных средств для применения в профилактике и/или лечении тромбоза, обладающую фармакологическими свойствами, которые хорошо подходят для тяжелобольных детей и детей с врожденным пороком сердца, требующими тромбопрофилактики.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к применению кангрелора для лечения и/или профилактики тромбоза шунта у пациентов, страдающих врожденным пороком сердца. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию кангрелора в лечении и/или профилактике тромбоза шунта или стента у педиатрических пациентов, перенесших шунтирование или имплантацию стента, соответственно. Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для применения у пациентов, страдающих врожденным пороком сердца, перенесших операцию шунтирования.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для применения при лечении и/или профилактике тромбоза шунта у пациентов, перенесших операцию шунтирования, где шунтирование выбрано из группы, включающей системно–легочный шунт, шунт Блелока–Тауссига, центральный шунт или паллиативные шунты между правым желудочком и легочной артерией.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор для применения у пациентов, перенесших операцию по наложению системно–легочного шунта.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для применения при лечении и/или профилактике тромбоза шунта или стента у педиатрических пациентов, страдающих врожденным пороком сердца.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор для применения в лечении и/или профилактике тромбоза шунта или стента у педиатрических пациентов, перенесших шунтирование или имплантацию стента.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для применения у педиатрических пациентов, перенесших шунтирование или имплантацию стента, где операция шунтирования или имплантация стента выбрана из группы, включающей системно–легочный шунт, шунт Блелока–Тауссига, центральный шунт, паллиативные шунты между правым желудочком и легочной артерией или стентирования артериального протока.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для применения у педиатрических пациентов, где педиатрические пациенты имеют физиологию единственного желудочка, временно облегченную системно–легочным шунтом.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для применения при лечении и/или профилактике тромбоза шунта или стента, где введение является внутривенным. Популяция пациентов для профилактики и/или лечения тромбоза шунта представляет собой взрослых и педиатрических пациентов, включая новорожденных. Популяция пациентов для профилактики и/или лечения тромбоза стента представляет собой педиатрических пациентов, включая новорожденных.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для применения при лечении и/или профилактике тромбоза шунта или стента, где способ включает:
i) проведение операции шунтирования или имплантации стента;
ii) введение композиции, включающей кангрелор, после операции.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, где композицию вводят в виде болюса или в виде непрерывной инфузии, или в виде болюса с последующей непрерывной инфузией, или в виде непрерывной инфузии с последующим болюсным введением.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для вышеуказанных показаний, где количество кангрелора, вводимого в виде непрерывной инфузии, составляет от примерно 0,1 до примерно 4 мкг/кг/мин. Предпочтительно количество кангрелора составляет от примерно 0,1 до 1,5 мкг/кг/мин, более предпочтительно от примерно 0,1 до 1 мкг/кг/мин, еще более предпочтительно от примерно 0,1 до 0,5 мкг/кг/мин, где еще более предпочтительное количество составляет от примерно 0,1 до 0,3 мкг/кг/мин.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для применения в качестве связующего средства для пероральных антитромбоцитарных терапий у педиатрических пациентов, перенесших шунтирование или имплантацию стента.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для применения в качестве связующего средства для пероральных антитромбоцитарных терапий у педиатрических пациентов, перенесших шунтирование или имплантацию стента, где операция шунтирования или имплантация стента выбрана из группы, включающей системно–легочный шунт, шунт Блелока–Тауссига, центральный шунт, паллиативные шунты между правым желудочком и легочной артерией или стентирования артериального протока.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для применения в качестве связующего средства для пероральных антитромбоцитарных терапий у педиатрических пациентов, перенесших шунтирование или имплантацию стента, где введение включает:
i) введение непрерывной инфузии кангрелора после операции шунтирования или имплантации стента в течение по меньшей мере одного часа или дольше;
ii) прекращение лечения кангрелором;
iii) введение пероральной антитромбоцитарной терапии.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для применения в качестве связующего средства, где непрерывную инфузию кангрелора предпочтительно проводят в дозировке, определенной выше.
Другой аспект изобретения предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для применения в профилактике острого тромбоза стента у пациентов, перенесших ортотопическую пересадку сердца.
Другой аспект изобретения предоставляет способ профилактики тромбоза шунта у педиатрических пациентов с высоким риском, перенесших операцию по наложению системно–легочного шунта.
Другим аспектом изобретения является способ профилактики тромбоза шунта у пациента с высоким риском, перенесших операцию по наложению системно–легочного шунта, включающий:
i) проведение операции по наложению системно–легочного шунта и
ii) введение кангрелора сразу после операции.
Пациент с высоким риском предпочтительно является педиатрическим пациентом, наиболее предпочтительно новорожденным.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1. Время от операции до окклюзии шунта у педиатрических пациентов с сердечной недостаточностью. Данные представляют послеоперационную внутрибольничную популяцию с 2013 по 2015 год. Пунктирная линия обозначает время, когда аспирин (ASA) обычно дают энтеральным путем.
Фигура 2. Экспрессия рецептора P2Y12 и реакция тромбоцитов на ADP. А, Репрезентативные гистограммы проточной цитометрии окрашивания антителом для рецептора P2Y12 на покоящихся тромбоцитах, выделенных у педиатрических кардиологических пациентов (NCP) по сравнению со здоровыми взрослыми (n=5 независимых экспериментов). Гистограммы окрашивания антителом для GPIbα (CD42b) и интегрина αIIbβ3 (CD61) приведены для сравнения. B–E, Кривые концентрация–эффект для определения значений EC50 для ADP, измеренных с помощью световой трансмиссионной агрегометрии (LTA) с использованием очищенных тромбоцитов от педиатрических и педиатрических пациентов с врожденными пороками сердца или здоровых взрослых добровольцев в присутствии фибриногена. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM; n=4–6 индивидуумов для каждой тестируемой концентрации ADP.
Фигура 3. Влияние кангрелора на агрегацию тромбоцитов в ответ на ADP. A–D, Репрезентативные кривые ADP (20 мкМ)–индуцированной агрегации тромбоцитов, выделенных у педиатрических и педиатрических пациентов с врожденными пороками сердца или здоровых взрослых добровольцев в присутствии указанных концентраций кангрелора.
Фигура 4. IC50 кривые для кангрелора с использованием LTA и микрофлюидного устройства.
Кривые концентрация–эффект для определения значений IC50 для 20 мкM ADP (A–D) и 5 мкM ADP (E–H), измеренных с помощью LTA, с использованием очищенных тромбоцитов от педиатрических и педиатрических пациентов с врожденными пороками сердца или здоровых взрослых добровольцев в присутствии фибриногена. Данные представляют собой среднее±SEM. n=4–6 индивидуумов для каждой концентрации тестируемого антагониста. I–J, Кривые концентрация–эффект для кангрелора в условиях потока. Микрожидкостное устройство, содержащее тромбогенную поверхность коллагена, использовали для определения значений IC50 для кангрелора, добавленного к цельной крови, обработанной PPACK, от педиатрических пациентов с физиологией единственного желудочка (n=4; 38 отдельных случаев свертывания) или здоровых взрослых (n=7; 56 отдельных случаев свертывания). Данные представляют собой среднее ± SEM.
Фигура 5. Взаимодействие тромбоцитов человека с плазменным VWF в потоке. A и B, Накопление человеческих тромбоцитов на поверхностно–иммобилизованном VWF, полученном от мышей, обладающих человеческим доменом A1 (VWFHA1). Цельную кровь от педиатрических пациентов с физиологией единственного желудочка или здоровых взрослых инфузировали через реактивный субстрат в течение 3 минут (скорость касательного напряжения у стенки 1600 с–1) до оценки количества взаимодействующих тромбоцитов. mAb 6D1 является антителом, блокирующим функцию к VWF–рецептору на тромбоцитах GPIbα. C, Способность человеческих тромбоцитов, транслоцируемых на поверхностно–иммобилизованной плазме мыши VWFHA1, подвергаться твердой адгезии и арест в ответ на стимуляцию ADP. Абциксимаб является антителом, блокирующим функцию интегрина αIIbβ3, который необходим для прочной адгезии. Данные представляют собой среднее±SEM (n=5 индивидуумов на группу).
Фигура 6. Влияние кангрелора на образование тромбоцитов у мышей–аватаров. Зависимость от времени среднего размера сформировавшегося тромба (A–D) и максимального размера полученного тромба (E) у поврежденных лазером артериол мышей–мутантов VWFHA1 до и после введения кангрелора (у того же животного). Эффекты ингибитора αIIbβ3 абциксимаба (болюс 0,25 мкг/кг; инфузия 0,125 мкг/кг/мин) показаны для сравнения (n=3 независимых эксперимента для каждой возрастной группы). Каждый символ (E) представляет собой площадь тромба в 1 артериоле мыши. Результаты для кангрелора представляют собой среднее ± SEM из 8 независимых экспериментов, выполненных для каждой возрастной группы педиатрических пациентов с CHD или здоровых взрослых добровольцев. F, Процентное изменение размера тромба в ответ на лечение кангрелором, основанное на данных, показанных в E. Данные представляют среднее ± SEM.
Фигура 7. Фармакодинамические свойства кангрелора, вводимого новорожденным с CHD в раннем послеоперационном периоде. В настоящее время проводится фаза 1 клинического испытания для оценки уровней лекарственного средства в плазме и влияния на агрегацию тромбоцитов с использованием LTA и микрофлюидики. A, репрезентативные результаты LTA у новорожденного после операции по установке шунта за 1 ч до приема кангрелора, за 15 мин до окончания инфузии (0,5 микрограмм/кг/мин в течение 1 ч) и через 1 ч после прекращения инфузии кангрелора. B, микрофлюидные результаты в тех же условиях, как указано для LTA. Результаты сравнивают со здоровым взрослым, который не получал кангрелор.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к применению кангрелора для профилактики и/или лечения тромбоза шунта у пациента, страдающего врожденным пороком сердца. В одном варианте осуществления пациенты являются педиатрическими пациентами, имеющими цианотические заболевания сердца.
Таким образом, изобретение относится к применению кангрелора для профилактики и/или лечения тромбоза шунта или стента у пациента с высоким риском, перенесшего операцию по установки паллиативных шунтов или имплантации стента. Как правило, операция включает наложение системно–легочных шунтов, шунта Блелока–Тауссига, центральных шунтов, паллиативных шунтов между правым желудочком и легочной артерией или установку стентов артериального протока. Преимущественно в соответствии со способом по настоящему изобретению кангрелор вводят после операции в соответствии с вышеуказанными предпочтительными вариантами осуществления, тем самым снижая риск острых тромбоэмболических событий, особенно у педиатрических пациентов.
Как сообщалось ранее, пациенты, перенесшие вышеупомянутую операцию по шунтированию или имплантации стента, подвергаются высокому риску возникновения тромботических осложнений, таких как, без ограничения, острая окклюзия шунта, которая остается основным источником заболеваемости и смертности.
Следует отметить, что хорошо известная и широко используемая терапия аспирином может помочь в снижении риска окклюзии шунта, но обычно ее не вводят в течение 12–24 часов после операции; поэтому сразу после операции или имплантации существует уязвимый период вплоть до приема аспирина, где риск возникновения острых тромбоэмболические событий не контролируется. На сегодняшний день нет других доступных антитромбоцитарных терапий, которые обладают желательными характеристиками кангрелора, которые включают внутривенное введение, быстрое начало, быструю обратимость и форму, которая не требует метаболической трансформации для блокады рецептора P2Y12. Эти характеристики идеально подходят для данной популяции пациентов, которые имеют высокий риск образования тромбов и кровотечений в раннем послеоперационном периоде.
Способ по настоящему изобретению предоставляет эффективный способ лечения и/или профилактики тромботических осложнений, особенно у педиатрических пациентов, причем указанный способ включает введение кангрелора вскоре после окончания операции и в другом варианте осуществления также в сочетании с пероральной антитромбоцитарной терапией. Согласно изобретению кангрелор предпочтительно вводят внутривенно путем непрерывной инфузии в дозировке, как указано выше, которая хорошо подходит, переносится и безопасна также для педиатрических пациентов.
В частности, изобретение относится к применению кангрелора для профилактики и/или лечения тромбоза шунта у педиатрических пациентов с высоким риском, имеющих физиологию единственного желудочка, перенесших операцию по наложению системно–легочного шунта.
Определения
В каждом аспекте настоящего изобретения термин «кангрелор» охватывает соединение формулы I, а также его таутомерную, энантиомерную и диастереомерную формы и их рацемические смеси, и фармацевтически приемлемые соли этих соединений, включая тетранатриевую соль.
Формула I
В настоящей заявке, если не указано иное, определение педиатрических пациентов включает индивидуумов от рождения до приблизительно 18 лет или с массой на основании роста (согласно ленте Броселоу) 36 кг или менее. Пациенты, возраст которых менее 18 лет, но масса которых превышает 36 кг, могут по–прежнему считаться педиатрическими пациентами, учитывая их хронологический возраст; однако тогда необходимо будет оценить массу и использовать дозы для взрослых. Таким образом, педиатрические пациенты включают, например: новорожденных до примерно первых 28 дней жизни; новорожденные до примерно 12 месяцев; педиатрические пациенты от: до примерно 18 лет; от примерно 1 до примерно 3 лет, от примерно 3 до примерно 5 лет, от примерно 6 до примерно 10 лет, от примерно 11 до примерно 14 лет и от примерно 14 до примерно 18 лет.
Врожденные пороки сердца (CHD) или врожденное заболевание сердца (CHD) являются структурные проблемы, возникающие в результате аномального развития сердца или крупных кровеносных сосудов. По меньшей мере, 18 различных типов врожденных пороков сердца признаются, с большим количеством дополнительных анатомических вариаций. Слово «врожденный» означает существующее при рождении. Врожденные пороки сердца могут быть цианотическими или ацианотическими.
Примерами распространенного типа врожденного порока сердца являются, но не ограничиваются ими: стеноз аортального клапана (AVS), дефект межпредсердной перегородки (ASD), коарктация аорты (CoA), полный дефект атриовентрикулярного канала (CAVC), d–транспозиция магистральных сосудов, аномалия Эбштейна, синдром гипоплазии левых отделов сердца, I–транспозиция магистральных сосудов, открытый артериальный проток (PDA), атрезия легочной артерии, стеноз легочного ствола, дефекты единственного желудочка, тетрада Фалло, тотальный аномальный дренаж легочных вен (TAPVC), атрезия трехстворчатого клапана, артериальный ствол и дефект межжелудочковой перегородки (VSD).
В настоящем описании, если не указано иное, определение операции шунтирования включает, но не ограничивается: системно–легочные шунты, шунты Блелока–Тауссига, центральные шунты, или паллиативные шунты между правым желудочком и легочной артерией.
В настоящем описании, если не указано иное, определение имплантации стента или стентирование включает, но не ограничивается ими, стентирования артериального протока.
Подробное описание
В одном аспекте настоящее изобретение демонстрирует с помощью стандартных LTA, высокопроизводительных микрофлюидных устройств и новых биологических платформ, что кангрелор является эффективным в профилактике и лечении тромбообразования в педиатрических популяциях высокого риска, страдающих врожденным пороком сердца.
Реакция тромбоцитов на ADP и кангрелор была практически одинаковой для всех исследуемых возрастных групп (Р>0,05) на основании рассчитанных значений EC50 и IC50, полученных методом LTA.
Эффективность кангрелора in vitro дополнительно оценивали с использованием цельной крови от педиатрических пациентов с физиологией единственного желудочка и микрофлюидных анализов с высокой пропускной способностью, которые дали аналогичные значения IC50. В соответствии с этими выводами было обнаружено, что тромбоциты от педиатрических пациентов экспрессировали аналогичные уровни рецептора P2Y12, как и их аналогичные взрослые.
P
Для демонстрации терапевтической полезности кангрелора в биологически релевантной модели тромбоза, авторы изобретения также оценили поведение тромбоцитов in vivo у новорожденных и пожилых пациентов с врожденным пороком сердца в артериолах, поврежденных лазером, у мышей–аватаров (мышей, генетически модифицированных для поддержки опосредованного тромбоцитами гемостаза и тромбоза) до и сразу после введения лекарственного средства. Во всех случаях использование кангрелора в дозах, рекомендуемых для чрескожного коронарного введения (на 1 кг массы тела), уменьшало размер тромба на >45%, предотвращая тем самым закупоривание сосудов (<0,0001).
12
Чтобы продемонстрировать потенциальную клиническую полезность кангрелора, авторы изобретения сначала оценили реактивность тромбоцитов у новорожденных с цианотическим врожденным пороком сердца и, в частности, вклад рецептора P2Y в поддерживающую агрегацию и образование тромба.
in vitro
in vivo
12
50
50
При использовании стандартных, а также новых технологий  и  не было выявлено значительных различий в реакции тромбоцитов на ADP–индуцированную агрегацию или кангрелор–опосредованную блокаду рецепторов P2Y у новорожденных и детей старшего возраста с врожденными пороками сердца по сравнению со здоровыми взрослыми. Фактически, значения EC и IC, соответственно, были почти идентичны, как определено LTA с использованием очищенных тромбоцитов.
12
Как показано в настоящем экспериментальном разделе, тромбоциты от педиатрических пациентов с цианотическим врожденным пороком сердца имеют почти идентичный ответ на блокаду ADP и рецепторов P2Y, как их аналогичные взрослые. Кангрелор может оказаться эффективным антитромботическим препаратом с фармакологическими свойствами, хорошо подходящим для применения в ближайшем послеоперационном периоде у новорожденных, с облегчением с помощью системно–легочных шунтов.
Хотя технологии ex–vivo, такие как проточная цитометрия, агрегометрия и микрофлюидные устройства, могут дать важную информацию о функции тромбоцитов у детей и реакции на лекарственное средство, они не могут полностью воспроизвести сложные события адгезии и активации, критические для образования тромбов на артериальной стороне кровообращения. Для решения этой проблемы авторы изобретения использовали модель мыши–аватара, которая лучше отражает внутрисосудистую среду у людей, позволяя тромбоцитам человека, но не мыши поддерживать биологически значимые взаимодействия в местах повреждения сосудов.
12
Фактически, сила этой биологической платформы в оценке антитромботических свойств ингибиторов P2Y12, таких как тиенопиридиновые производные клопидогрела, была достигнута путем оценки способности тромбоцитов, выделенных из взрослых, получавших лекарственное средство, поддерживать образование тромбов в поврежденных лазером артериолах этих животных. В соответствии с этой зависимостью от рецептора P2Y для максимальной генерации тромбов была способность кангрелора ограничивать способность тромбоцитов от новорожденных и детей старшего возраста с врожденным пороком сердца поддерживать рост тромба и закупорку сосудов. Преимущественно, кангрелор не полностью предотвращал накопление тромбоцитов в местах повреждения артериол по сравнению с ингибитором интегрина αIIbβ3 абциксимабом, который почти отменял взаимодействия тромбоцитов со стенками сосуда.
12
Предыдущее клиническое исследование, в котором оценивали ингибитор P2Y клопидогрел у детей с цианотическим врожденным пороком сердца, облегченным системно–легочным шунтом, не продемонстрировало какого–либо значительного снижения смертности от какой–либо причины или заболеваемости, связанной с шунтом.
Помимо профилактики тромбоза шунта, могут быть и другие показания к применению кангрелора в этой популяции высокого риска. Несмотря на общее улучшение выживаемости после многоступенчатого паллиативного лечения гипоплазии левой половины сердца, пациентам в конечном итоге может потребоваться ортотопическая пересадка сердца. Однако сообщалось, что у 25% пациентов с трансплантацией развивается васкулопатия сердечного аллотрансплантата, что требует реваскуляризации коронарной артерии и установки стента в качестве краткосрочного паллиативного решения. Фактически, недавнее исследование показало, что ЧКВ может быть выполнено безопасно и эффективно в этой популяции пациентов, и имеет значение как часть развивающейся стратегии для улучшения результатов до повторной трансплантации. Кангрелор, который, как было показано, значительно снижает ишемические события во время ЧКВ у взрослых с ишемической болезнью сердца без значительного увеличения риска сильного кровотечения, также может играть роль в предотвращении острого тромбоза стента у этих пациентов.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению кангрелора для лечения и/или профилактики острого тромбоза стента у педиатрических пациентов, подвергаются или прошедших ортотопическую пересадку сердца. Эти пациенты обычно нуждаются в реваскуляризации коронарной артерии и установке стента в качестве краткосрочного паллиативного решения.
12
12
Учитывая, что тромбоз шунта остается основной причиной заболеваемости и смертности и что пациенты подвергаются наибольшему риску во время первоначального паллиативного лечения физиологии единственного желудочка, авторы изобретения в настоящем документе на удивление представляют доклинические доказательства того, что не–тиенопиридиновый ингибитор P2Y может заполнить критическую терапевтическую пустоту в тромбопрофилактике. Это обосновано на основании результатов, представленных в настоящем изобретении, демонстрирующих, что тромбоциты от педиатрических пациентов с цианотическим врожденным пороком сердца имеют устойчивый ответ на ADP и удивительно так же поддаются ингибированию P2Y с помощью кангрелора, как и их аналогичные взрослые. Кроме того, эти данные не ограничиваются педиатрическими пациентами с шунтированием, но, по–видимому, не зависят от возраста и типа поражения сердца.
in vivo
12
Уникальным в этом исследовании является возможность установить эффективность кангрелора  с использованием модели мыши–аватара, которая позволяет оценить взаимодействие тромбоцитов человека с поврежденной стенкой сосуда, тем самым демонстрируя, что этот ингибитор P2Y дает предполагаемый биологический ответ.
Кроме того, данные in vitro, полученные в ходе клинического исследования PK/PD фазы 1, включающего инфузию кангрелора при 0,5 мкг/кг/мин или 0,25 мкг/кг/мин в течение одного часа у послеоперационных новорожденных с CHD, которым потребовалось паллиативное лечение с наложением системно–легочного шунта, продемонстрировали как эффективность, так и быструю обратимость кангрелора, как оценивали с помощью LTA и микрофлюидики (фиг. 7).
Вышеуказанные неклинические и клинические исследования предоставляют убедительные доказательства эффективного использования кангрелора в профилактике и/или лечении тромбоза шунта или стента у пациентов, страдающих врожденным пороком сердца, которые нуждаются в паллиативном лечении наложением системно–легочного шунта.
Понятно, что все предпочтительные группы или варианты осуществления настоящего изобретения, описанные выше, могут комбинироваться друг с другом и также применяться с соответствующими поправками.
В одном аспекте изобретение предоставляет применение кангрелора для профилактики и/или лечения тромбоза шунта у пациентов, страдающих врожденным пороком сердца, перенесших операцию шунтирования. Лечение и/или профилактика тромбоза шунта у пациентов с высоким риском, перенесших операцию шунтирования, включает проведение операции шунтирования и введение кангрелора сразу после операции.
В другом аспекте изобретение предоставляет применение кангрелора для профилактики и/или лечения тромбоза шунта или стента у педиатрических пациентов с цианотическим врожденным пороком сердца, который был временно облегчен системно–легочным шунтом, шунтом Блелока–Тауссига, центральным шунтом, паллиативными шунитам между правым желудочком и легочной артерией, и стентированием артериального протока, где педиатрические пациенты подвержены высокому риску тромботических осложнений. Тромботические осложнения или острые тромбоэмболические события, такие как острая окклюзия шунта, остаются основным источником заболеваемости и смертности.
В предпочтительном варианте осуществления изобретение предоставляет применение кангрелора для профилактики и/или лечения тромбоза шунта у педиатрических пациентов с высоким риском, перенесших операцию по наложению системно–легочного шунта. Педиатрические пациенты имеют физиологию единственного желудочка.
В другом аспекте изобретение предоставляет применение кангрелора для профилактики и/или лечения тромбоза стента у педиатрических пациентов с высоким риском, которые перенесли паллиативное лечение с помощью стентирования артериального протока.
В другом аспекте изобретение предоставляет применение кангрелора для снижения частоты и/или предотвращения смертности у пациентов высокого риска, перенесших операцию шунтирования, где смертность может быть связана с острыми тромботическими осложнениями. Пациенты высокого риска представляют собой педиатрических пациентов с врожденным пороком сердца. В частности, педиатрические пациенты имеют физиологию единственного желудочка.
В другом аспекте изобретение предоставляет применение кангрелора для снижения частоты и/или предотвращения смертности у педиатрических пациентов высокого риска, перенесших операцию по стентированию, где смертность может быть связана с острыми тромбоэмболическими событиями. Пациенты высокого риска представляют собой педиатрических пациентов с врожденным пороком сердца.
Изобретение также предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, для введения один раз или в соответствии с режимом дозирования, где несколько доз вводят с различными интервалами времени в течение заданного периода времени.
Введение фармацевтических композиций, включающих кангрелор, может быть осуществлено в соответствии с потребностями пациента, например, с помощью перорального, сублингвального, интраназального, внутриглазного, ректального, трансдермального, мукозального, местного или парентерального введения. Парентеральные способы введения включают, без ограничения, внутрикожное, подкожное (п/к, суб–кож., Hypo), внутримышечное (в/м), внутривенное (в/в), внутрибрюшинное (в/б), внутриартериальное, интрамедуллярное, внутрисердечное, внутрисуставное (сустав), интрасиновиальное (область суставной жидкости), внутричерепное, интраспинальное и интратекальное (спинномозговые жидкости).
Любое известное устройство, пригодное для парентеральной инъекции или инфузии лекарственных форм, может быть использовано в способах по настоящему изобретению.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения введение осуществляется парентеральным, более предпочтительно внутривенным введением, через периферический IV или центральный венозный катетер.
При внутривенном введении фармацевтическая композиция, включающая кангрелор, может вводиться в виде болюса, в виде непрерывной инфузии, в виде болюса с последующей непрерывной инфузией или в виде непрерывной инфузии с последующим болюсным введением.
В одном варианте осуществления изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, где момент времени введения фармацевтической композиции составляет от примерно получаса до примерно 24 часов после прекращения операции шунтирования или имплантации стента, например, по меньшей мере, примерно полчаса, примерно 1 час, примерно 2 часа, примерно 3 часа, примерно 4 часа, примерно 5 часов, примерно 6 часов, примерно 7 часов, примерно 8 часов, примерно 9 часов и примерно 10 часов или более с момента прекращения операции шунтирования или имплантации стента. Предпочтительно, введение проводят по меньшей мере через 1 час, более предпочтительно в течение периода времени, составляющего от 2 до 4 часов после прекращения операции шунтирования или имплантации стента.
Предпочтительно фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, вводят в виде непрерывной инфузии. Например, фармацевтическую композицию согласно изобретению можно вводить после операции шунтирования или имплантации стента в виде непрерывной инфузии в течение по меньшей мере от около 10 минут до около 72 часов. Предпочтительно введение продолжают в течение, по меньшей мере, около 1 часа, около 2 часов, около 3 часов, около 4 часов, около 5 часов, около 6 часов, около 7 часов, около 8 часов, около 9 часов или около 24 часов или дольше. Более предпочтительно, инфузия продолжается в течение по меньшей мере от около 10 минут до около 2 часов; еще более предпочтительно, инфузия продолжается в течение по меньшей мере одного часа или в течение короткого периода времени, такого как менее чем около часа, например, около 15 минут, около 30 минут или около 45 минут, в зависимости, например, от дозы, возраста или массы пациентов.
Когда фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, вводят в виде болюса,
его вводят в течение короткого периода времени, такого как около двух минут или менее или около одной минуты или менее, после операции шунтирования или имплантации стента.
В одном аспекте настоящего изобретения кангрелор можно вводить до, во время и/или после операции шунтирования или имплантации стента.
При введении в виде болюса кангрелор вводят в дозе от примерно 5 мкг/кг до примерно 100 мкг/кг, предпочтительно от примерно 5 мкг/кг до примерно 40 мкг/кг, еще более предпочтительно от примерно 10 мкг/кг до примерно 35 мкг/кг, еще более предпочтительно от примерно 10 мкг/кг до примерно 30 мкг/кг. Например, фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, вводят в количестве примерно 5 мкг/кг, примерно 10 мкг/кг, примерно 15 мкг/кг, примерно 20 мкг/кг, примерно 25 мкг/кг или примерно 30 мкг/кг.
В одном варианте осуществления внутривенную дозу до примерно 4 мкг/кг/мин можно вводить примерно через 2–4 ч после операции шунтирования или имплантации стента и продолжать до предпочтительного времени введения перорального средства.
Композицию можно вводить один, два, три или более раз в день.
В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, вводят после того, как острое тромбоэмболическое событие распознано или диагностировано, или при появлении симптомов острого тромбоэмболического события.
Например, фармацевтическую композицию можно вводить при появлении симптомов острого тромбоэмболического события. Фармацевтическую композицию вводят в течение короткого промежутка времени с момента появления симптомов острого тромбоэмболического события.
Короткий период времени может варьироваться от примерно одной или примерно двух минут до примерно одного или примерно двух часов.
В некоторых вариантах осуществления способ включает введение фармацевтической композиции, включающей кангрелор, в качестве профилактики острого тромбоэмболического события.
Подходящими для такой профилактики пациентами являются педиатрические субъекты с заболеванием сердца, которым проводили операцию шунтирования или имплантацию стента для установки системно–легочных паллиативных шунтов (например, шунта Блелока–Тауссига или центрального шунта), паллиативных шунтов между правым желудочком и легочной артерией или стентов артериального протока, которые подвергаются риску тромботических событий после репарации структурной врожденной болезни сердца.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет введение фармацевтической композиции, включающей кангрелор, для лечения тромбоза шунта или стента у педиатрических пациентов, перенесших имплантацию стента или шунтирование, одновременно или последовательно (до или после), по меньшей мере, с одним дополнительным терапевтическим средством.
Дополнительным терапевтическим средством может быть, например, без ограничения, ингибитор P2Y12–рецептора, такой как пероральный ингибитор P2Y12–рецептора, ингибитор гликопротеина IIb/IIIa, аспирин и гепарин. Введение пероральной антитромбоцитарной терапии, либо одновременно, либо последовательно с фармацевтической композицией, включающей кангрелор, педиатрическим пациентам, перенесшим операцию шунтирования или имплантацию стента, может также привести к переходу пациента на длительное или поддерживающее лечение антитромбоцитарным ингибитором.
Как упоминалось выше, настоящее изобретение также предусматривает применение кангрелора в качестве связующего средства для пероральных антитромбоцитарных терапий у педиатрических пациентов, которым требуется паллиативный системно–легочный шунт, шунт Блелока–Тауссига, центральный шунт, паллиативный шунт между правым желудочком и легочной артерией или стент артериального протока.
В одном варианте осуществления кангрелор является полезным для перехода педиатрических пациентов от введения кангрелора после операции шунтирования или имплантации стента к применению длительного или поддерживающего лечения с помощью пероральной антитромбоцитарной терапии, т.е. перорального P2Y12 или аспирина.
В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическую композицию, включающую кангрелор, вводят способом, включающим:
i) введение непрерывной инфузии кангрелора после операции шунтирования или имплантации стента в течение по меньшей мере от получаса до 72 часов;
ii) прекращение лечения кангрелором; и
iii) введение пероральной антитромбоцитарной терапии.
В дополнительном варианте осуществления применение кангрелора в способе для перевода педиатрических пациентов от введения кангрелора после операции шунтирования или имплантации стента к применению длительного или поддерживающего лечения с помощью пероральной антитромбоцитарной терапии включает непрерывную инфузию кангрелора после операции шунтирования или имплантации стента в дозировке в соответствии с указанными выше предпочтительными единицами.
Кангрелор можно вводить отдельно или в сочетании с различными фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает кангрелор и может дополнительно включать один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов.
Эти фармацевтические композиции могут включать один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов, включая, но не ограничиваясь ими, носители, разбавители, стабилизирующие агенты, солюбилизирующие агенты, поверхностно–активные вещества, буферы, антиоксиданты, консерванты, средства, регулирующие тоничность, объемообразующие агенты, смазывающие агенты, эмульгаторы, суспендирующие агенты или агенты, способствующие регулированию вязкости, наполнители, разрыхлители, связующие, смачивающие агенты, антибактериальные средства, антибиотики, противогрибковые средства, хелатирующие агенты, подсластители, отдушки, ароматизаторы, красители, средства для введения и их комбинации.
Конкретные эксципиенты включают, но не ограничиваются ими, кукурузный крахмал или желатин, лактозу, сахарозу, декстрозу, микрокристаллическую целлюлозу, каолин, маннит, сорбит, дикальцийфосфат, хлорид натрия, альгиновую кислоту, кроскармеллозу натрия, крахмалгликолят натрия, глицерин, этанол, пропиленгликоль, полисорбат 80 (Tween–80™), поли(этилен)гликоль 300 и 400 (PEG 300 и 400), пегилированное касторовое масло (например, Cremophor EL), полоксамер 407 и 188, циклодекстрин или производные циклодекстрина (включая HPCD ((2–гидроксипропил)–циклодекстрин) и (2–гидроксиэтил)–циклодекстрин), гидрофильные и гидрофобные носители и их комбинации.
Гидрофобные носители включают, например, жировые эмульсии, липиды, пегилированные фосфолипиды, полимерные матрицы, биосовместимые полимеры, липосферы, везикулы, частицы и липосомы. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции могут включать полиолы, такие как сорбит, лактоза, сахароза, инозитол или трегалоза.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть составлены для пути, которым они вводятся пациентам, которые включают твердые вещества, жидкости и суспензии. Например, если фармацевтическая композиция составлена для внутривенного (IV) введения, фармацевтическая композиция может содержать жидкость, вводимую внутривенно, которая включает, но не ограничивается этим, воду для инъекций (WFI), физиологический раствор, 0,9% NaCl, Фосфатно–солевой буферный раствор, 5% декстрозы в воде и 0,002% полисорбата 80 в воде или раствор Рингера.
Такие композиции могут включать кангрелор в количестве примерно от 0,10 до 200 мкг/мл.
Если фармацевтическая композиция составлена для внутримышечного введения, фармацевтическая композиция может содержать жидкость, вводимую внутривенно, которая включает, но не ограничивается ими, WFI, физиологический раствор, 0,9% NaCl, Фосфатно–солевой буферный раствор и 5% декстрозы в воде.
Если фармацевтическая композиция составлена для перорального введения, фармацевтическая композиция может включать эксципиенты, которые включают, но не ограничиваются ими, разбавители (например, карбонат натрия и кальция, фосфат натрия и кальция и лактозу), связующие (например, камедь акации, крахмал, желатин, сахароза, поливинилпирролидон (повидон), сорбит, трагакант, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия, гидроксипропилметилцеллюлоза и этилцеллюлоза), наполнители (например, фосфат кальция, глицин, лактоза, кукурузный крахмал, сорбит или сахарозу), смачивающие агенты, смазывающие агенты (например, стеараты металлов, стеариновая кислота, полиэтиленгликоль, воски, масла, диоксид кремния и коллоидный диоксид кремния, кремнийсодержащая жидкость или раствор), разрыхлители (например, картофельный крахмал, комкрахмал и альгиновая кислота), ароматизаторы (например, мята перечная, масло грушанки, фруктовые ароматизаторы, жевательная резинкиа и т.п.) и красители.
Эксципиенты могут также включать покрытия, такие как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, для задержки абсорбции в желудочно–кишечном тракте. Для перорального применения фармацевтическая композиция может быть изготовлена в форме таблетки, капсулы, суспензии или жидкого сиропа или эликсира, облаток и тому подобного.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть получены путем смешивания кангрелора с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Способы смешивания и устройства, используемые для смешивания, известны в данной области техники.
В определенных вариантах осуществления кангрелор и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей растворяют и затем смешивают. Полученная смесь может быть высушена, например, путем лиофилизации, для образования твердой фармацевтической композиции, или полученная смесь может оставаться в форме раствора в виде жидкой фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления твердая фармацевтическая композиция может быть солюбилизирована в жидкости, вводимой внутривенно, перед введением, например, в виде болюса или инфузии.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию получают растворением и смешиванием кангрелора, маннита, сорбита и, необязательно, гидроксида натрия, и затем лиофилизацией смеси. Перед введением лиофилизированную смесь растворяют в жидкости, вводимой внутривенно, такой как WFI или физиологический раствор.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение без каких–либо ограничений.
Экспериментальная часть
Способы
Реагенты
ADP и коллаген типа 1 (ChronoPar) получали от Chronolog (Havertown, PA). Человеческий фибриноген приобретали у Sigma Co. (Saint Louis, MO) и абциксимаб (ReoPro) у Centocor, Inc (Marvin, PA). Поликлональное анти–VWF–антитело и Alexa 488 конъюгированное антитело против CD61 (GPIIIa) человека были приобретены у Dako (Carpinteria, CA) и B Bio–Rad (Raleigh, NC; clone Y2/51), соответственно. MAb 6D1 (антитело, блокирующее функцию к человеческому GPIbα) и кангрелор (ингибитор P2Y12) были любезно предоставлены Barry Coller (Rockefeller University, NY) и The Medicine Company (Parsippany, NJ).
Мышь
HA1
Животных–мутантов VWF получали и подвергали возвратному скрещиванию в течение 10 поколений на фоне 129/SvJ, как описано ранее. Все процедуры, выполняемые на животных, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию при медицинском центре Колумбийского университета.
Популяция пациентов
Образцы крови у 78 пациентов с CHD (от новорожденных до 18 лет) и здоровых взрослых были собраны для оценки реактивности тромбоцитов и реакции на кангрелор с использованием световой трансмиссионной агрегометрии (LTA), покрытых коллагеном многоканальных микрофлюидных устройств и генетически модифицированных мышей, которые поддерживают тромбоз, опосредованный тромбоцитами человека, но не мыши (мышь аватар).
Пациенты подпадали под участие в исследовании, если им было от 0 до 18 лет и с известным врожденным пороком сердца. Критерии исключения включали дефекты коагуляции, известные врожденные или генетические заболевания, которые, как ожидается, влияют на функцию тромбоцитов, массу тела <3 кг для педиатрических пациентов и <6 кг для старших педиатрических пациентов, сердечно–легочную нестабильность, требующую срочного или экстренного хирургического/катетерного вмешательства, лекарства или других условия, которые могут существенно повлиять на функцию тромбоцитов.
Семьдесят восемь педиатрических пациентов с врожденными пороками сердца были включены в это исследование. Были выбраны три различные группы исследуемой популяции (Таблица 1).
Таблица 1. Исходные демографические характеристики пациентов с сердечно–сосудистыми заболеваниями
Исходные характеристики
0–28 дней
1–10 лет
11–18 лет
No.
39
31
8
средний возраст
12,8
4,1
15,3
пациент женского пола, % пациентов
23,1
54,8
37,5
этническая принадлежность, % пациентов
Испанского/латино–американского происхождения
20,5
25,8
12,5
раса,% пациентов
Белая
56,4
64,5
62,5
Негроидная
7,6
6,5
12,5
Азиатская
15,5
3,2
12,5
коренной американец
0
0
0
Другие
20,5
25,8
12,5
средний гестационный возраст (недели)
38
Диагноз, % пациентов
синдром гипоплазии левых отделов сердца
23,1
19,4
0
атрезия легочной артерии с неповрежденной желудочковой перегородкой
0
3,2
0
атрезия трехстворчатого клапана
0
6,5
0
транспозиция магистральных сосудов
33,3
12,9
0
тетрада Фалло
2,6
19,4
25
двуприточный левый желудочек
5,1
3,2
0
двойное отхождение магистральных сосудов от правого желудочка
0
3,2
12,5
коарктация
12,8
3,2
12,5
PDA
0
12,9
0
ASD
0
0
25
гетеротаксис
7,7
0
0
В первую группу вошли доношенные новорожденные (0–28 дней) с массой тела ≥3 кг, которым была назначена операция на сердце с применением искусственного кровообращения. Из них 56,4% составляли белые, 7,6% составляли негроидная расса, 15,5% составляли азиаты, 20,5% составляли испанского/латино–американского происхождения и 23,1% составляли пациенты женского пола. Пациенты с патологией единственного желудочка составляли 23,1% популяции, включенных в исследование, причем с D–транспозиций магистральных сосудов составляли большинство пациентов (33,3%). В течение этого периода времени ~23% новорожденных, нуждающихся в паллиации с системно–легочным шунтом, имели признаки окклюзии шунта, требующие хирургического вмешательства и/или быстрого ответа ЭКМО. Интересно, что все события произошли в течение 24 часов после операции с большинством случаев до начала терапии аспирином, фиг. 1.
Во вторую группу вошли педиатрические пациенты в возрасте от 1 до 10 лет (в среднем 4,1 года), которым предстояло пройти катетеризацию левых отделов сердца в диагностических или терапевтических целях; в третью группу вошли пациенты подросткового возраста в возрасте от 11 до 19 лет (в среднем 15,3 года), также проходивших катетеризацию левых отделов сердца.
Взятие крови
Для исследований с участием пациентов с врожденными пороками сердца кровь брали из центрального венозного катетера после очистки линии от гепарина; кровь от здоровых взрослых добровольцев получали с помощью обычной венепункции. В большинстве случаев 3,8% тринатрийцитрата служили антикоагулянтом. Для проведения микрофлюидных исследований цельную кровь собирали в шприц, содержащий ингибитор тромбина H–D–Phe–Pro–Arg–хлорметилкетон (PPACK, Calbiochem, San Diego, CA) для достижения конечной концентрации 100 мкМ. Генерацию PRP или очищенных тромбоцитов проводили центрифугированием, как описано ранее.
Пример 1
Оценка агрегации тромбоцитов с помощью световой трансмиссионной агрегометрии (LTA)
В данном примере исследовали реактивность тромбоцитов и реакцию на кангрелор у детей и здоровых взрослых.
Очищенные тромбоциты суспендировали до конечной концентрации 400000/мкл в буфере для тромбоцитов, включающем 145 мМ NaCl, 10 мМ Hepes, 0,5 мМ Na2HPO4, 5 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 0,1% глюкозы, рН 7,4. Исходные растворы кангрелора получали в день эксперимента и добавляли в суспензии тромбоцитов (37°C, 1200 об/мин) за 10 мин до индукции агрегации с ADP (5 мкМ или 20 мкМ). Человеческий фибриноген (конечная концентрация 200 мкг/мл) добавляли в суспензии тромбоцитов непосредственно перед активацией. Агрегацию оценивали с помощью Люми–Агрегометра Chronolog Lumi–Aggregometer (модель 540 VS, Chronolog, Havertown, PA), и давали возможность продолжаться в течение 6 минут после добавления агониста. Результаты представлены в виде максимального процентного изменения светопропускания по сравнению с исходным уровнем с использованием буфера тромбоцитов в качестве эталона.
Результаты
Реакция тромбоцитов на ADP
12
Существуют противоречивые результаты в отношении общей реактивности тромбоцитов у новорожденных с цианотическим врожденным пороком сердца по сравнению с их здоровыми сверстниками и взрослыми, особенно в ответ на физиологически значимые агонисты, такие как ADP. Было также неясно, поддаются ли тромбоциты из этой популяции высокого риска ингибированию антитромботическими препаратами, такими как антагонисты рецепторов P2Y, как у взрослых.
12
Для решения эти терапевтически важных проблем, авторы изобретения сначала оценили уровень экспрессии рецептора P2Y на тромбоцитах, выделенных из новорожденных с цианотическим врожденным пороком сердца. По сравнению с тромбоцитами от взрослых не было обнаружено заметных различий в поверхностной экспрессии P2Y12 (фиг. 2A); аналогичные результаты были получены для рецепторов тромбоцитов для VWF (GPIbα) и фибриногена (αIIbβ3), которые необходимы для образования тромба.
50
Затем авторы изобретения определили функциональный ответ тромбоцитов у новорожденных, а также пожилых пациентов с врожденными пороками сердца на стимуляцию ADP. Это было достигнуто путем вычисления значений EC для агониста с использованием изолированных тромбоцитов в буфере с добавлением фибриногена.
50
На фиг. 2 (B–E) показан средний (± SEM) процент агрегации тромбоцитов в зависимости от концентрации ADP. Рассчитанные значения EC достоверно не различались для всех тестируемых возрастных групп со средними значениями (± SEM) в диапазоне от 2,9±0,1 мкмоль/л до 3,4±0,1 мкмоль/л (таблица 2, Р<0,001).
50
50
Таблица 2. Значения EC и IC для ADP и кангрелора, соответственно.
Тромбоциты
Взрослый
0–28 дней
1–10 лет
11–18 лет
EC<sub>50</sub> ± SEM(мкмоль/л)
3,2±0,2
3,4±0,1
2,9±0,1
3,2±0,2
IC<sub>50</sub> ± SEM*(нмоль/л)
0,82±0,3
0,82±0,2
0,79±0,2
0,85±0,2
IC<sub>50</sub> ± SEM**(нмоль/л)
0,66±0,3
0,74±0,3
0,68±0,3
0,76±0,2
*=20 мкМ ADP, **=5 мкМ ADP
Влияние кангрелора на агрегацию тромбоцитов
50
12
Было показано, что кангрелор является мощным ингибитором ADP–индуцированной агрегации тромбоцитов у взрослых. На сегодняшний день нет информации о его способности эффективно смягчать реакцию ADP тромбоцитов у новорожденных с врожденным пороком сердца. С этой целью авторы рассчитали значения IC для этого антагониста рецептора P2Y с использованием низких и высоких концентраций ADP (5 мкМ против 20 мкМ). В соответствии с результатами, полученными с помощью проточной цитометрии и в исследованиях агрегации тромбоцитов, индуцированной ADP, не наблюдалось статистической разницы в количестве кангрелора, необходимого для достижения полумаксимального ингибирования при любой концентрации агониста (фиг. 3А–D (20 мкМ ADP), фиг. 4A–D (20 мкМ ADP), фиг. 4E–H (5 мкМ ADP); Таблица 1, P<0,001). Аналогичные результаты наблюдали и для более старшей популяции пациентов с врожденным пороком сердца.
Пример 2
Адгезия тромбоцитов в оценке потока у новорожденных с физиологией единственного желудочка с использованием многоканального микрофлюидного устройства
В этом примере адгезию тромбоцитов у новорожденных с физиологией единственного желудочка исследовали с помощью многоканального микрофлюидного устройства.
–1
HA1
Проточную камеру с параллельными пластинами использовали для оценки накопления тромбоцитов на поверхностно–иммобилизованной плазме VWF при скорости касательного напряжения у стенки 1600 с. Вкратце, поликлональное антитело против VWF абсорбировали в течение ночи (4°C) на шести–луночном планшете с культурами тканей. Затем планшет промывали и блокировали неспецифические взаимодействия путем добавления TBS, содержащего 3% BSA, pH 7,4 (30 мин, 37°C). Плазму человека или мыши (VWF), полученную из гепаринизированной цельной крови, добавляли и планшеты помещали при 37°С на дополнительный час перед использованием. Затем цитратную цельную кровь перфузировали над реакционноспособным субстратом в течение 3 минут с последующим добавлением тромбоцитарного буфера без CaCl2 в течение 1 минуты. Количество прикрепленных тромбоцитов на единицу площади определяли с помощью автономного анализа (ImagePro Plus, Media Cybernetics, Bethesda, MD) записанных цифровых изображений. Для исследований ингибирования GPIbα mAb 6D1 (10 мкг/мл) добавляли в антикоагулированную кровь человека в течение 10 минут перед использованием.
Микрожидкостные устройства с 8 отдельными каналами (ширина 250 мкм × высота 60 мкм) изготавливали в полидиметилсилоксане (PDMS), как описано ранее. Устройство обратимо герметизировали в вакууме на предметном стекле, причем его каналы потока были ориентированы перпендикулярно структурированной поверхности коллагена типа 1 (1 мг/мл). Для визуализации накопления тромбоцитов с течением времени за 7 мин до проведения экспериментов (конечная концентрация 0,125 мкг/мл) добавляли конъюгированное, не блокирующее функцию мышиное анти–человеческое CD61 (GPIIb/IIIa) антитело Alexa Fluor 488.
–1
Цельная кровь новорожденных с патологией единственного желудочка или здоровых взрослых перфузировали по протромботической поверхности при начальной скорость касательного напряжения у стенки 100 с путем отвода из одного выходного отверстия в шприцевой насос (Harvard Apparatus Pump 11 Elite, Holliston, MA). Накопление тромбоцитов визуализировали (10–кратный объектив), используя автоматизированную систему инвертационного микроскопа (DMI6000, Leica), оснащенную CCD–камерой (DFC365FX, Leica). Специальная вставка содержала три микрофлюидных устройства, позволяющих провести параллельное тестирование четырех условий. Изображения были сняты с интервалом 30 с в общей сложности 5 мин. Интенсивности флуоресценции тромбоцитов, которые прямо пропорциональны общей массе тромбоцитов, измеряли и анализировали с помощью программного обеспечения Image J (Image J; NIH, Bethesda, MD). Центр 65% протромботической области был выбран для анализа, чтобы избежать краевых эффектов. Исходное изображение было взято в качестве фона, а последующие изображения были скорректированы в фоновом режиме. Адгезия тромбоцитов и образование агрегатов не наблюдали выше или ниже по потоку от коллагенового потока до полной окклюзии канала.
Вычисление полумаксимальной ингибирующей концентрации и чувствительности кангрелора
Значения флуоресценции с поправкой на фон подбирали с помощью 4–х параметрической модели доза–эффект.
где C представляет концентрацию кангрелора; FI, скорректированная на фон флуоресценция соответствующей области интереса; A и B, минимальная и максимальная интенсивности, соответственно; и D, коэффициент Хилла. Данные были устанавливали с помощью программы log (ингибитор) vs. ответа в GraphPad Prism 5.00 (GraphPad Software, La Jolla, California).
Результаты
in vitro
(
300s
50
Дополнительные доказательства, подтверждающие эффективность кангрелора  в снижении агрегации тромбоцитов у новорожденных с физиологией единственного желудочка, были представлены в микрофлюидных исследованиях, которые воссоздают гемодинамические условия тромбоза. Цельную кровь, собранную в PPACK, обрабатывали различными концентрациями кангрелора и затем перфузировали поверх иммобилизованного на поверхности коллагена. В каждом эксперименте 8 одновременно формирующихся тромбов на устройство были изображены в реальном времени. Наблюдалось, что флуоресцентно меченые тромбоциты накапливаются только в месте экспозиции коллагена с минимальной неспецифической адгезией вверху или внизу по течению. Определение поверхностной флуоресценции при 300с FI) позволило рассчитать эффективные значения IC, которые составили 0,69 нМ и 0,95 нМ для новорожденных с CHD по сравнению со здоровыми взрослыми, соответственно (фиг.4I и J).
Пример 3
in vivo
Анализ тромбообразования  у педиатрических и старше пациентов с врожденным пороком сердца
Ранее было описано введение анестезии, введение венозных и артериальных катетеров, флуоресцентное мечение тромбоцитов человека и хирургическая препарирование мышцы, поднимающей яичко, у 12–недельного самца мыши VWF HA1.
2
Тромбоциты человека (700K/мкл) непрерывно вводили (25 мкл/мин) через катетер, помещенный в ипсилатеральную бедренную артерию за 2 мин до и во время лазер–индуцированного повреждения для обеспечения уровня циркулирующих клеток, эквивалентного человеческому. Повреждение стенки сосуда артериол (диаметр 40–65 мкм) выполняли импульсным лазером на красителе на азоте, применяемым через 20–кратный водно–иммерсионный объектив Olympus. Взаимодействия между тромбоцитов человека и стенками сосудов визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием системы, оборудованной конфокальным сканером с вращающимся диском Yokogawa CSU–22, камерой iXON EM и линией излучения лазера 488 нм (Revolution XD, Andor Technology, South Windsor, CT) для обнаружения кальцеин–AM–меченных клеток, соответственно. Степень образования тромба оценивали в течение 3 минут после травмы, а максимальную площадь (мкм) покрытия определяли с помощью автономного анализа (ImagePro Plus, Media Cybernetics, Bethesda, MD).
После установления базовой линии для нормального образования тромба у поврежденных артериол кангрелор затем вводили сначала в виде внутривенного болюса (30 мкг/кг), а затем в виде непрерывной инфузии (4 мкг/кг/мин), как описано в предыдущих клинических испытаниях.
Было исследовано минимум 5 мышей на группу пациентов (2 и 4 артериальных сегмента до и после введения кангрелора на мышь, соответственно).
Статистические данные
Для сравнения средних площадей тромба между различными группами лечения, авторы изобретения подобрали линейные смешанные модели со случайными перехватами для каждого исследуемого животного. Линейные смешанные модели позволяют сравнивать средние различия между группами лечения, а также учитывать влияние кластеризации данных на SE в результате многочисленных измерений, полученных от каждой мыши, использованной в прижизненных исследованиях. В случае исследований агрегации тромбоцитов значения представлены как среднее ± SEM. Двухсторонний критерий Стьюдента был использован для сравнения контрольных условий и лечений. Различия со значениями P <0,05 считались статистически значимыми.
Результаты
In Vivo эффективность кангрелора
Ранее авторы изобретения показали доклиническую полезность модели мыши–аватара, которая предпочтительно поддерживает гемостаз и тромбоз, опосредованный тромбоцитами человека, а не мыши.
R1326H
Этот переход в видовой специфичности для тромбоцитов произошел в результате включения одиночной мутации R1326H в домен А1 VWF мыши (VWF), а в последнее время путем замены всего домена его человеческим аналогом (VWFHA1).
HA1
2
2
Р
Следует отметить, что мутантные животные VWF имеют глубокий фенотип кровотечения из–за неспособности мышиных тромбоцитов стабильно взаимодействовать с поврежденным эндотелием сосудов. Поскольку взаимодействие тромбоцитов человека с VWF является ключевым для инициации тромбообразования в этой модели мыши–аватара, авторы сначала оценили способность тромбоцитов от новорожденных с CHD накапливаться на VWF человека или мыши, иммобилизованных на поверхности, в условиях артериального потока. Важно отметить, что тромбоциты из вышеуказанных накапливались в плазме VWF от людей или мышей–мутантов VWFHA1 на уровнях, сравнимых с таковыми у здоровых взрослых (фиг.5А и В). Кроме того, не было отмечено достоверных различий в количестве тромбоцитов у новорожденных, прикрепленных к любому субстрату (2,432 ± 55 тромбоцитов/мм против 2,223 ± 156 тромбоцитов/мм, соответственно; =0,84). Важно отметить, что это взаимодействие может быть ингибировано добавлением моноклонального антитела 6D1, которое блокирует способность рецептора тромбоцитов GPIba взаимодействовать с доменом A1 VWF.
Хотя GPIbα инициирует отложение тромбоцитов при скоростях артериального сдвига, это адгезивное взаимодействие является лабильным по своей природе, позволяя тромбоцитам перемещаться в ответ на силы, создаваемые текущей кровью. В конечном итоге именно рецептор интегрина тромбоцитов αIIbβ3 стабилизирует адгезию путем взаимодействия с лигандами, такими как VWF, в ответ на ADP и/или тромбин. В соответствии с этим сценарием является способность абциксимаба, ингибитора человеческого αIIbβ3, предотвращать прочную адгезию тромбоцитов от педиатрических пациентов с CHD или здоровых взрослых к поверхностно–иммобилизованному VWF в ответ на ADP–индуцированную активацию в потоке (фиг. 5C).
HA1
in vivo
После установления того факта, что плазма VWF поддерживает прикрепление, а также ADP–индуцированную прочную адгезию, авторы изобретения решили определить потенциальный терапевтический эффект кангрелора в предотвращении тромба, опосредованного тромбоцитами человека, . Доза и способ введения препарата были основаны на предыдущих клинических испытаниях у взрослых, перенесших ЧКВ.
12
Флуоресцентно меченные тромбоциты человека непрерывно вводили через катетер, введенный в бедренную артерию, и их поведение в ответ на вызванное лазером повреждение артерии контролировали до и после введения кангрелора. В соответствии с требованием, чтобы ADP стимулировал вторую волну агрегации, блокада рецептора P2Y на тромбоцитах у педиатрических кардиологических пациентов (NCP) привела к уменьшению размера тромба на ~45% (P<0,0001) (фиг. 6 A–F; см. таблицу III).
Таблица III
2
Линейная смешанная модель сравнения среднего размера тромбоцитов человека (мкм) у мышей–мутантов VWFHA1. Столбец сравнения представляет собой среднее различие между размером тромба до и после введения кангрелора для каждой протестированной возрастной группы. Стандартные ошибки и статистические данные были получены при подгонке линейной смешанной модели.
Возрастная группа
Оценка сравнения
Стандартная ошибка
<i>P</i>–значение
0–28 дней
2,261
224
<0,0001
1–10 лет
3,314
224
<0,0001
11–18 лет
3,475
224
<0,0001
Взрослые
3,501
224
<0,0001
Напротив, введение абциксимаба отменяло накопление тромбоцитов на >90% (Р<0,0001). Аналогичные результаты были получены при использовании тромбоцитов от пожилых пациентов с врожденными пороками сердца и здоровых взрослых.
Различные изменения могут быть внесены в вышеуказанные способы без отклонения от объема изобретения, как определено в формуле изобретения ниже. Предполагается, что все материалы, содержащиеся в приведенном выше описании и показанные на прилагаемых фигурах, должны толковаться как иллюстративные, а не как ограничивающие.