Способ очистки мундтицина Р436 (КС)
PURIFICATION METHOD OF MUNDTICIN P436 (KS)

Изобретение относится к области биотехнологии, биохимии и пищевой промышленности, в частности к получению препарата, используемого в качестве биоконсерванта в пищевой промышленности для деконтаминации мясной продукции от листерий, клостридий, энтерококков и других грамположительных микроорганизмов, участвующих в порче мясной продукции.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Enterococcus mundtii
Мундтицины - это низкомолекулярные катионные термостабильные пептиды IIa-класса, продуцируемые , слабо иммуногенные и нетоксигенные для человека и животных.
E. mundtii
E. mundtii
E. mundtii
E. mundtii
Наиболее известные мундтицины: мундтицин ATO6 (Bennik et al. 1998) [1] - выделенный из штамма  ATO6, полученного из цикория эндивий; мундтицин KS (Kawamoto et al. 2002) [3] - выделенный из штамма  NFRI 7393, полученного из травяного силоса в Таиланде; мундтицин CRL35 (Saavedra et al. 2004, 2007) [5, 6] - выделенный из штамма  CRL35, полученного из аргентинского сыра; мундтицин QU2 (K. Sonomoto et al. 2005) [7] - продуцируемый штаммом QU2, выделенным из соевых бобов. Несмотря на различные источники выделения штаммов-продуцентов, пептиды, после посттрансляционных модификаций, являются практически идентичными. В представленных работах подробно описаны физико-химические, генетические и биологические свойства мундтицинов, позволяющие утверждать, что они являются перспективными для использования в качестве биоконсервантов. Несмотря на это, существует ряд ограничений для внедрения их в практику, в первую очередь, малая индукция целевого пептида в культуральную среду и значительные потери его в процессе очистки от балластных примесей. Кроме того, сами штаммы-продуценты слабо охарактеризованы и, следовательно, не отвечают требованиям, предъявляемым к промышленным штаммам.
Listeria monocytogenes
Clostridium рerfringens.
В наши дни остается актуальной борьба с пищевыми токсикоинфекциями, связанными с заражением пищевых продуктов патогенными микроорганизмами, в частности  и  Получение препарата, где в качестве действующего вещества выступает бактериоцин, обладающий выраженной антилистериозной активностью, а также с антимикробным эффектом в отношение ряда грамположительных микроорганизмов, в частности энтерококков и клостридий, позволит предотвратить риски появления вспышек пищевой токсикоинфекции у населения, вызываемой листериями, клостридиями и энтерококками, а также увеличит срок годности продукции.
Carnobacterium maltaromaticum
Известно несколько бактериоцинов нашедших применение в пищевой промышленности, в частности: низин - коммерческий препарат «Nisaplin», педиоцин - Alta™ 2341 и Micocin, комбинация трех бактериоцинов (carnocyclin A, carnobacteriocin BM1, piscicolin 126), продуцируемых  UAL307. Из них только педиоцин рекомендован к применению для продукции из мяса.
Известны «проблемные» места для внедрения бактериоцинов (в т.ч. мундтицинов) в практику, такие как безопасность штаммов-продуцентов, невысокий выход и чистота получаемого продукта.
В частности, известен способ получения мундтицина CRL35, предложенный Farias et al. (1996) [8], с использованием трех стадий: преципитация мундтицина сульфатом аммония, гель-фильтрационная хроматография на Biogel P-6 и ВЭЖХ с использованием катионно-обменной колонки. К недостатку метода следует отнести то, что подобную методику невозможно масштабировать для получения препаративных количеств конечного продукта.
Также известен способ очистки мундтицина, предложенный Kawamoto et al. (2002) [3], с использованием 3-х стадий: осаждение из культуральной жидкости сульфатом аммония с последующей очисткой методом катионнообменной хроматографии на SP-Toyopearl и доочисткой на C18 SPE cartridge. Недостатком способа является низкий выход мундтицина (25,6%) с чистотой не выше 50%.
Enterococcus mundtii
Lactobacillus casei
Listeria innocua
Известен штамм  ST4SA [Patent US 8444998], который продуцирует пептид - бактериоцин ST4SA (м.в. 3400 Да), обладающий антимикробными свойствами, однако представленные авторами высокие значения бактерицидной активности препарата относятся лишь к чувствительному тестовому штамму лактобактерий -  LHS. Активность в отношении листерий оценена только для одного представителя этого рода - непатогенного штамма  LMG 13568.
Enterococcus mundtii
Известен штамм  PPHS-5-13, продуцирующий субстанцию пептидной природы (бактериоцина) с антилистериозной активностью, не обладающий резистентностью к ванкомицину [патент RU 2532227 C1]. Недостатком штамма является то, что сам бактериоцин не охарактеризован, а штамм недостаточно аннотирован по таким показателям как наличие факторов вирулентности и биогенных аминов.
Enterococcus faecium
L. monocytogenes
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм  1073, продуцирующий бактериоцин Е-1073 (м.в. 3256 Да), выделенный из кишечника бройлерного цыпленка, идентифицированный и исследованный в ГНЦ ПМБ. Этот штамм в условиях глубинного культивирования продуцировал в культуральную жидкость бактериоцин Е-1073 с активностью против  на уровне 800- 1600 АЕ/мл. Такой невысокий выход целевого продукта потребовал дополнительного использования специфических активаторов биосинтеза - конкурентных бактерий и сигнальных пептидов, что в целом усложняет технологию получения бактериоцинов.
Enterococcus mundtii
Техническим результатом изобретения является получение штамма- продуцентамундтицина Р436, обладающего антимикробной активностью против листерий, клостридий и энтерококков, а также повышение чистоты и выхода мундтицина Р436, пригодного для промышленного применения.
Enterococcus mundtii
,-
Технический результат достигается тем, что предложен штамм  - продуцентмундтицина Р436, обладающего антимикробной активностью депонирован в музее ГНЦ ПМБ с присвоением номера «ГКПМ - Оболенск» В-8925.
Enterococcus mundti
L. monocytogenes
Cl. рerfringens
Штамм  был выделен из подглазничных синусов птицы. В результате ПЦР-анализа со специфичными праймерами было установлено, что он содержит бактериоцин - мундтицин. Фенотипически его проявление характеризуется ингибированием тест-штаммов  и  (табл. 1 (см. в графической части)).
Было проведено полногеномное секвенирование штамма с последующей сборкой и аннотацией генома. Полногеномное секвенирование осуществляли на Illumina MiSeq instrument (San Diego, CA USA, Illumina, Inc.) и MGISeq-2000 (Shenzhen, China, MGI Tech Co., Ltd). Сборку генома de novo проводили с использованием программы SPAdes v. 1.13.1. Финальную аннотацию проводили, используя NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline. Поиск факторов вирулентности и антибиотикоустойчивости осуществляли, используя программы ResFinder 4.1. и VirulenceFinder 2.0 (Center for Genomic Epidemiology (http://www.genomicepidemiology.org). Поиск генов бактериоцинов проводили с помощью программы Bagel 4 и BLAST. Биогенные амины искали, используя программу BLAST. Профаги искали, используя программу Prophage Hunter (https://doi.org/10.1093/nar/gkz380).
E. mundtii
Геном штамма «ГКПМ - Оболенск» В-8925 был размещен в базу данных NCBI под № JAIZFT (штамм SCPM-O-B-8925). Штамм не содержит генов вирулентности и антибиотикорезистентности. Не содержит генов биогенных аминов и профагов. Содержит ген мундтицина (фиг.1, табл. 2, табл. 3 (см. в графической части)).
E. mundtii
При культивировании на питательном агаре №1 штамм «ГКПМ - Оболенск» В-8925 образует колонии S-формы, диаметром 0,1-0,2 мм, с образованием пигмента желтоватого цвета. При микроскопии по Грамму видны грамположительные кокки, расположенные одиночно или парами. Каталаза- и оксидазанегативные. В полужидком агаре неподвижны. Факультативный анаэроб, оптимальная температура культивирования 37°С. Сбраживает аргинин, маннитол, L-арабинозу, мелибиозу, раффнозу, сорбитол, мелицитозу, не сбраживает сорбозу (ЭН-КОККУС тест, Erba Lachema, Чехия)
Таким образом, штамм отвечает критериям безвредности, в том числе, отвечает требованиям QPS (Квалифицированный список презумпции безопасности) от Европейского агентства по безопасности пищевых продуктов (EFSA) и может использоваться в качестве штамма-продуцента в промышленных условиях.
Также технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ очистки мундтицина Р436, заключающийся во внесении сорбента CM-sepharose C25 - до 10 % по объему, в биоректор с питательным бульоном (Brucella broth (Himedia, Mumbai, India) с добавлением мясного экстракта (5 г/л) и лактозы (2г/л)) перед культивированием штамма-продуцента в течение 12 часов с последующим автоклавированием культуральной жидкости при 0,5 АТМ в течение 10 минут, отбором сорбента на фильтрационных ситах, промывкой и упаковкой его в хроматографическую колонку с последующей элюцией сорбированного мундтицина буфером следующего состава: 0,4М NaCl, 10 %/V глицерина, 20 %/V этилового спирта, 0,01 М ацетатный буфер, рН 5,0, затем полученный продукт одностадийной очистки доочищают с использованием ВЭЖХ методом обращено-фазовой хроматографии на колонке С18.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.
Таблица 1. МПК мундтицина Р436 для тестированных штаммов.
Фигура1. Ген мундтицина Р436 штамма-продуцента штамм SCPM-O-B-8925
Таблица 2. Сравнение последовательностей мундтицина Р436 с наиболее близким мундтицином АТО6.
E. mundtii
Фигура 2. График кривой роста и параметров культивирования штамма В-8925.
Фигура 3. Хроматограмма элюата Р436 после одностадийной очистки.
Таблица 4. Данные аналитической хроматографии элюата Р436 после одностадийной очистки.
Фигура 4. Мундтицин Р436 после двустадийной очистки.
Таблица 5. Хроматографические данные очищенного мундтицина Р436.
Фигура 5. Масс-спектр очищенного образца мундтицина Р436.
L. monocytogenes
Фигура 6. Антимикробная активность мундтицина Р436 с использованием «спот-метода» на тест-штамм ATCC 19111.
L. monocytogenes
Фигура 7. Образцы мундтицина Р436 на форезе, залитого тест-культурой
ATCC 19111.
Культивирование штамма
Пример 1.
Приготовление инокулята.
E. mundtii
24 часовые колонии  В-8925 засевают в пробирку с 5 мл питательной среды (Brucella broth (Himedia, Mumbai, India) с добавлением мясного экстракта (5 г/л) и лактозы (2г/л)) и культивируют при температуре 37°С, проводя последовательные пересевы культуры в пробирки каждые два часа. Культуру из пробирки четвертого пассажа переносят в колбу с 300 мл питательной среды и культивируют в инкубаторе (IS-971 RF, Korea) при температуре 32°С и скорости вращения 110 об/мин. Для засева культуры в биореактор используют 4-х часовую культуру.
Приготовление сорбента для культивирования.
+
В качестве сорбента используют CM Sephadex C-25 (Sigma, C25120, Sweden). Подготовка сорбента следующая: сухой порошок заливают деионизованной водой и отстаивают до полного набухания. Далее сорбент переводят в Na- форму, последовательно отмывая шестью объемами 1М HCl, десятью объемами деионизованной воды, шестью объемами 1M NaOH после чего окончательно отмывают деионизованной водой до нейтральных значений рН (5 - 7) и стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 10 мин. Приготовленный таким образом сорбент вносят в объеме 10% от объема в биореактор с питательной средой, непосредственно перед культивированием.
Глубинное культивирование.
2
E. mundtii
В качестве биореактора используют Sartorius Biostat B plus (Германия) с рабочим объемом 8 литров. Культивирование ведут при температуре 32°С, с перемешиванием 120-160 об/мин. с контролем рН (датчик Hamilton EasyFerm Plus pH Sensors 225mm) и dO(Hamilton OxyFerm™ DO Sensor 225mm). Время культивирования 12 часов. По окончанию культивирования в биореактор вносят 2,5 л деионизованной воды с 10 мл 1М HCl и продолжают перемешивать еще 30 минут, после чего биомассу вместе с сорбентом перекачивают в бутыль и автоклавируют при 0,5 атм 15 минут. Далее сорбент собирают на фильтрационном сите пропуская через него биомассу (фиг.2 График кривой роста и параметров культивирования штамма В-8925).
Очистка мундтицина Р436.
Пример 2.Собранный на фильтрационном сите CM Sephadex C-25 в объеме 800 мл последовательно промывают шестью объемами деионизованной воды, 2,5 л 0,1 М фосфатно-солевого буфера рН 7,4 с 10 % этанола, и переносят на хроматографическую колонку XK 50/60 (28988964, GE Healthcare). Хроматографию ведут на хроматографе AKTA Purifier 100 (GE Healthcare) с детекцией при длине волны А280 и скоростью 12 мл/мин. Сорбент промывают 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7,4 с 10 % этанола, до выхода на базовую линию после чего элюируют 100% буфером В (0,4 М NaCl, 20% этанола, 10 % глицерина (141339.1211, Panreac)). В собранной фракции определяют активность. Также, для анализа чистоты и выхода мундтицина, аликвоту активной фракции анализируют в ВЭЖХ обращенно-фазовой хроматографии на колонке Partisphere rtf c18, 5μm 150×4,6 (4522-0202, Whatman). Элюцию проводят в градиентном режиме 0→100%. Буфер А dH2O+0,1 % ТФУ, буфер В ACN + 0,1 % ТФУ (фиг.3, таб.4). Выход полученного мундтицина 150-270 % (от контрольного культивирования, без внесения сорбента) и чистотой не ниже 55-72% в одну стадию.
Получение мундтицина Р436 с чистотой ≥90%.
Пример 3.Для получения высокоочищенного мундтицина Р436 после одностадийной хроматографии доводят рН активного элюата до 10,6 1М раствором NaOH при перемешивании, центрифугируют, доводят рН супернатанта до 7,4 раствором 1М HCl и проводят обращенно-фазовую хроматографию на колонке Reprosil-PurBasic С18, 5μm 250×4,6 (Dr Maisch GmbH, Germany). Элюцию проводят в градиентном режиме 0→100%. Буфер А dH2O+0,1% ТФУ, буфер В ACN + 0,1% ТФУ. Активную фракцию собирают, упаривают на роторном испарителе Laborota 4000 (Heidolph, Германия), доводят объем до 1/10 исходного объема деионизованной водой и проводят ТФЭ (твердофазная экстракция) на колонке Strata C18-Е (Phenomenex, USA). В качестве элюата используют ацетонитрил с 2% муравьиной кислотой. Чистоту полученного мундтицина определяют хроматографически анализируя в ВЭЖХ обращенно-фазовой хроматографией на колонке Partisphere rtf c18, 5μm 150×4,6 (4522-0202, Whatman). Элюцию проводят в градиентном режиме 0→100%. Буфер А dH2O+0,1 % ТФУ, буфер В ACN + 0,1 % ТФУ (фиг.4, таб.5) и масс-спектрально методом MALDI-TOF MS на масс-спектрометре microflex LRF, Bruker Daltonik, в линейном режиме. Масс-спектры получают и анализируют с использованием программ FlexControl и FlexAnalisys (фиг. 5).
Определение антибактериальной активности Р436 спот-методом.
L. monocytogenes
E. faecalis
Cl. perfringens
Пример 4. За основу метода берут процедуру, описанную Ennahar et al. 2000 [2]. Коротко: в чашку Петри заливают 20 мл «нижнего» агара, состоящего из Antibiotic Assay Medium №1 с добавлением BactoAgar до 1 %. После застывания «нижнего» агара в колбу с расплавленным и охлажденным до 50°С «верхним» агаром (полужидкий Мюллер-Хинтон агар) вносят суспензию тест-штамма ( ATCC 19111,  ATCC 29212,  ATCC 13124) до конечной концентрации 0,5 единиц по Мак-Фарланду, перемешивают и наслаивают по 5 мл на чашки с «нижним» агаром. Чашки оставляют до застывания агара и слегка подсушивают. На подготовленные таким образом чашки наносят по 10 мкл двукратных разведений исследуемого раствора мундтицина Р436. Чашки инкубируют при температуре 37°С. Учет результатов проводят через 16-18 часов, за 1 УЕ принимают зону четкого ингибирования роста тест-штамма в максимальном разведение равную 2 мм (фиг.6). Также, у очищенного мундтицина Р436 определяли молекулярную массу и антимикробную активность в 16% трицин SDS-ПААГ электрофорезе (по протоколу Schagger and Von Jagow, 1987) с маркерами Spectra Multicolor Low Range protein (26628, Termo Scientific) используя аппарат Mini Protean Tetra system (Bio-Rad). Для определения антибактериальной активности полосы, содержащей мундтицин Р436, гель заливали агаром с тест-микроорганизмом и инкубировали при 37°С в течение 18 ч (фиг.7).
Перевод активности мундтицина Р436 из УЕ в мг/мл.
L. monocytogenes
L. monocytogenes
Для перевода активности из УЕ в мг/мл получают «эталонный» образец Р436 (двухстайдийная очистка мундтицина Р436) и проверяют его активность против штамма-«стандарта»  ATCC 19111.Концентрацию в мг/мл полученного эталонного образца рассчитывают по формуле:С= А/l, где с - концентрация, А - оптическая плотность при длине волны 280, l - длина оптического пути кюветы (1 см - пренебрегается),  - коэффициент экстинкции, постоянная величина, высчитанная на основании данных базы Bactibase и равная 3,27 (14105/4308,55).При переводе результата активности в спот-методе на полученную концентрацию эталонного образца получили значение 1УЕ = 1,25 нг мундтицина Р436 для тест-культуры  ATCC 19111.
Список использованной литературы
1. Bennik M.H., Vanloo B., Brasseur R., Gorris L.G.M., Smid E.J. (1998). A novel bacteriocin with a YGNGV motif from vegetable-associated Enterococcus mundtii: full characterization and interaction with target organisms. BBA-Biomemranes 1373, Issue 1: 47-58.
2. Ennahar, S., Deschamps, N., & Richard, J. (2000). Natural variation in susceptibility of Listeria strains to class IIa bacteriocins. Current Microbiology, 41, 1-4.
3. Kawamoto S., Shima J., Sato R., Eguchi T., Ohmomo S., Shibato J., Horikoshi N., Takeshita K., Sameshima T. (2002) Biochemical and genetic characterization of Mundticin KS, an antilisterial peptide produced by Enterococcus mundtii NFRI 7393. Appl Environ Microbiol 68: 3830-3840.
4. Patrzykat A., Friedrich C.L., Zhang L., Mendoza V. and Hancock R.E.W. (2002) Sublethal Concentrations of Pleurocidin-Derived Antimicrobial Peptides Inhibit Macromolecular Synthesis in Escherichia coli. Antimicrob Agents CH 46 No. 3: 605-614.
5. Salvucci E., Saavedra L. and Sesma F. (2007) Short peptides derived from the NH2-terminus of subclass IIa bacteriocin enterocin CRL35 show antimicrobial activity. J Antimicrob Chemoth 59: 1102-1108
6. Saavedra, L., Minahk, C., de Ruiz Holgado, A.P. and Sesma, F. (2004) Enhancement of the enterocin CRL35 activity by a synthetic peptide derived from the NH2-terminal sequence. Antimicrob Agents Chemother 48, 2778-2781
7. Zendo T., Eungruttanagorn N., Fujioka S., Tashiro Y., Nomura K., Sera Y., Kobayashi G., Nakayama J., Ishizaki A., Sonomoto K. (2005). Identification and production of a bacteriocin from Enterococcus mundtii QU 2 isolated from soybean. J Appl Microbiol. 2005; 99(5):1181-90. doi: 10.1111/j.1365-2672.2005.02704.x.
8. Farias M.E., Faria R.N., de Ruiz Holgado A.P., Sesma F. (1996) Purification and N-terminal amino acid sequence of enterocin CRL 35, a ‘pediocin-like’bacteriocin produced by Enterococcus faecium CRL 35. Lett Appl Microbiol 22:417-419.