Генетические банки растений: проблемы формирования, сохранения и использования

УДК 573.6:58.08523

О.И. Молканова, О.И. Короткое, Е.М. Ветчинкина, Н.А. Мамаева, О.Г. Васильева

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ БАНКИ РАСТЕНИЙ: ПРОБЛЕМЫ ФОРМИРОВАНИЯ, СОХРАНЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Наряду с традиционными способами сохранения растений ex situ все большее значение приобретает использование для этой цели генетических банков. Разрабатываются научные основы формирования и методологические аспекты сохранения генетических банков семян и меристем редких и ценных растений. При создании генетических банков особое внимание уделяется репрезентативности и сохранению генетической стабильности видов растений. Большая часть растительного материала хранится в условиях замедленного роста. Анализ относительных генетических расстояний между микроклонами и известными таксонами предложен как основной метод верификации коллекций in vitro.

Ключевые слова: биологическое разнообразие, генетические банки, идентификация, морфогенетический потенциал.

В настоящее время на территории России насчитывается более 85 ботанических садов и других интродукционных центров. Ботанические сады составляют основу системы сохранения биоразнообразия растений ex situ. В их коллекциях представлено около 1/3 флоры России.

Основной задачей ботанических садов в сохранении биологического разнообразия является изучение и сохранение генетических ресурсов природной флоры. Особый интерес представляет изучение возможностей сохранения в генетических банках видов, естественное возобновление которых в природе ослаблено или затруднено. Для таких видов от устойчивости воспроизводства ex situ зависит сохранность их генофонда в целом [1; 2].

Эффективность сохранения генофонда растений ex situ может быть существенно повышена путем создания генетических банков. По классификации Международного центра генетических ресурсов различают следующие их виды: 1) генетические банки семян; 2) банки растительного материала, сохраняемого in vitro; 3) полевые генные банки.

Материал и методика исследований

В настоящей работе представлена информация о банках семян и меристем in vitro ботанических учреждений России, в которых сохраняются представители как культурных, так и дикорастущих видов.

Исходным материалом для включения таксонов в генетические банки служат семена и фрагменты вегетативных органов растений. Материал поступает как непосредственно из экспедиций, так и по обмену между ботаническими учреждениями.

Методика биотехнологических исследований основывается на общепринятых классических приемах работы с культурами изолированных тканей и органов растений [3].

В качестве материала для выделения тотальной ДНК использовали апикальные части побегов в фазе активного роста. Выделение ДНК осуществляли по стандартной методике [4].

Для верификации коллекции in vitro использовали молекулярно-генетический анализ (основанный на сравнении относительных генетических расстояний между проверяемыми образцами (микроклонами) и известными таксонами) [5].

Долговременное хранение семян проводится при трех принятых в мировой практике режимах: +5 0С, -20 0С; -196 0С [6].

Результаты и их обсуждение

Одним из наиболее перспективных приемов сохранения генетического разнообразия растительного мира ex situ является долговременное хранение семян. Из 1700 ботанических садов мира долговременное хранение семян существует в 200 [7; 8].

Одним из крупнейших международных проектов в области долговременного хранения семян является проект «Millennium Seed Bank» (MSB). Его глобальной целью в течение первого десятилетия работы являлись сбор и разработка технологии консервации семян 10% видов мировой природной флоры; к концу 2020 г. - семян 25% видов растений мировой флоры [8].

34_О.И. Молканова, О.И. Коротков, Е.М. Ветчинкина, Н.А. Мамаева, О.Г. Васильева

2010. Вып. 3

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

В ГБС РАН с 1986 г. проводится комплексное изучение эффективности применения различных режимов хранения семян - низкие положительные температуры (+5°С), неглубокое замораживание (до -2°°...-25°С), криоконсервация (-196°С). Объектами исследования являлись 18° видов растений (охраняемые, лекарственные, декоративные и др.) из различных мест естественного произрастания [6].

На 2°1° г. генетический банк семян Государственного учреждения «Волгоградский региональный ботанический сад» представлен 7°3 образцами 353 видов, в том числе 218 редких и охраняемых в различных регионах России видов растений, относящихся к 57 семействам.

При хранении семян различных таксонов было выявлено, что всхожесть семян после криосо-хранения путем прямого погружения в жидкий азот видоспецифична. На модельных представителях семейства Orchidaceae установлено, что глубокое замораживание/оттаивание не оказывает отрицательного влияния на всхожесть семян в культуре in vitro [9].

Проблемы сохранения биоразнообразия растительного мира в контексте развития биотехнологии и устойчивого использования биологических ресурсов впервые рассмотрены в Международной конвенции о биологическом разнообразии [1].

Использование биотехнологических методов открывает принципиально новые возможности для сохранения и воспроизводства генофонда растений.

При создании генетических банков in vitro видов растений в качестве первичного экспланта предпочтителен семенной материал [1°; 11]. В ходе проведенных исследований на модельных представителях ряда семейств показано преимущество метода эмбриокультуры как метода преодоления покоя семян.

Семена видов рода Paeonia имеют простой глубокий морфофизиологический покой и для его нарушения необходима двухэтапная стратификации.

На первом этапе культивирования изолированных зародышей данного таксона (теплая страти -фикация) оптимальной является безгормональная питательная среда. Питательные среды, содержащие различные концентрации БАП, в первые недели развития зародышей стимулировали активацию их роста, однако дальнейшее культивирование растений на этих средах приводило к остановке роста растений.

Добавление в питательную среду ГК3 в концентрации °,1 - 1 мг/л позволяет сократить период эпикотильного покоя, однако не заменяет полностью необходимость холодной стратификации - развития апикальной меристемы побега без выдерживания проростков при низких положительных тем -пературах ни в одном из вариантов опыта получено не было. Установлено, что длительность этапа холодной стратификации зависит от видовой принадлежности объекта и продолжается от 4-5 (P. mascula) до 7-8 недель (P. suffruticosa) [12] (рис. 1).

см 10.00

9.00 5,00 7,00

б,да

5,00 4,00

3 до 2,да 1,00 одо

С

IfclM

tu 10,00 9,00 е,оо 7,00 6.00 5,00 4,00 3,00 2,00 too 0,00

I

ill

Р Дли на корня  Дл,-! на мы яд о л aii  д ли на эпнмуг v ля

ОД пи не корня  Дли на семядолей О Длина эпикстиля

А В

Рис. 1. Развитие проростков видов Раввта на 5(А) и 8(В) неделе холодной стратификации. Условные обозначения: 1 - Р. dвlavayi, 2 - Р. апвта1а, 3 - Р. тазси1а, 4 - Р. м^Штаптапа, 5 - Р.Шва, 6 - Р. tвnuifвlia, 7 - Р. зи//гиисвза, 8 - Р. 1асН/1вга

Показано, что одним из критериев выбора сроков изоляции зародышей является достижение ими стадии относительной автономности [13]. На примере Iris hybrida hort. показано, что наибольшей компетентностью к развитию характеризуются зародыши размером 3,5 - 5,0 мм и 5,1 - 6,0 мм, изолированные из семян через 40-50 и 50-60 дней после опыления (ДПО) соответственно (табл. 1). Они характеризуются оптимальными показателями относительно других возрастных периодов изоляции эксплантов (до 40, 60-70, более 70 ДПО), обеспечивая максимальный выход растений-регенерантов.

Таблица 1

Характеристика эксплантов и результативность получения растений-регенерантов Iris hybrida hort. с использованием метода эмбриокультуры

Возраст экспланта (число дней после опыления) Размер зародыша, мм Жизнеспособность зародышей, % Зародыши с отсутствием развития Выход растений-регенерантов, %

min max

до 40 2,0 3,4 6,2 85,0 44,0

40-50 3,5 5,0 57,5 20,3 75,5

50-60 5,1 6,0 67,5 18,4 67,0

60-70 6,1 7,0 92,5 35,8 38,4

более 70 6,1 7,0 94,0 73,5 24,0

Изучение биологических особенностей видов растений в коллекциях ботанических садов и в природных условиях послужило основой для разработки биотехнологических приемов их культивирования для дальнейшего воспроизводства.

Известно, что существует комплекс факторов, каждый из которых в отдельности и в сочетании с другими оказывает значительное влияние на развитие клеточных и тканевых систем in vitro. Среди них наиболее важными являются тип экспланта, физиологическое состояние донорских растений, условия культивирования растений in vitro, состав питательных сред и др. При этом степень влияния каждого из названных факторов зависит от генотипа [14].

У большинства исследуемых модельных видов установлено, что наибольшим морфогенетиче-ским потенциалом характеризуются экспланты, изолированные с растений, находящихся в имматур-ном-виргинильном состоянии по сравнению с эксплантами, взятыми с растений в генеративной фазе развития. На модельных видах древесных таксонов наблюдали снижение органогенного потенциала по мере увеличения возраста донорского растения. По нашему мнению, для их успешного введения в культуру in vitro целесообразно использовать маточные растения не старше 5-7 лет.

Обоснована возможность прогнозирования регенерационного потенциала в условиях in vitro на основе морфологического анализа вегетативных почек модельных представителей рода Rhododendron L. [15]. Максимальные показатели емкости почек отмечены у полувечнозеленого Rh. ledebourii (10,0) и листопадного Rh. roseum (9,6), имеющих высокий коэффициент размножения в культуре in vitro -(12,0 и 11,8 соответственно). Наименьшее значение емкости почек отмечено у листопадного Rh. schlippenbachii (4,0-6,0), отличающегося невысоким коэффициентом размножения in vitro (6,7).

Для всех изученных видов Rhododendron на 99%-м уровне значимости выявлена положительная корреляционная зависимость между емкостью почек и коэффициентом размножения в культуре in vitro. Наибольший коэффициент корреляции отмечен у Rh. japonicum (г=0,95**) и у Rh. catawbiense (r=0,90**) [16].

При изучении роли генотипа и условий культивирования в регуляции морфогенеза показано, что генотип определяет пределы изменчивости регенерационной способности.

Установлено, что на коэффициент размножения изучаемых таксонов (Rosaceae, Oleaceae, Acti-nidiaceae) оказывают влияние как генетические особенности видов и сортов, так и гормональный состав питательных сред, а также их взаимодействие [17].

В настоящее время в РФ банки асептических растений существуют во многих учреждениях. Работа по созданию банка асептических культур ГБС РАН ведется с 1995 г. Схема создания банка меристем растений in vitro представлена на рис. 2.

36 О.И. Молканова, О.И. Коротков, Е.М. Ветчинкина, Н.А. Мамаева, О.Г. Васильева

2010. Вып. 3 БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

Рис. 2. Схема создания банка асептических растений

В настоящее время банк in vitro ГБС РАН является одним из наиболее представительных в России и содержит более 800 наименований растений: 264 вида и 652 культивара из 37 семейств. При этом более 65 % таксонов в его составе относится к фиторесурсным видам. Наиболее полно представлены семейства Oleaceae, Ericaceae, Asteraceae, Liliaceae, Actinidiaceae, Orchidaceae, Rosaceae.

Аналогичный банк, насчитывающий 238 видов, существует в Волгоградском региональном ботаническом саду. В нем наиболее широко представлены семейства Fabaceae, Ranunculaceae, Actinidiaceae, Rosaceae, Brassicaceae.

Наиболее репрезентативной коллекцией in vitro ГУ «ВРБС» является коллекция представителей рода Clematis L., насчитывающая 94 наименования.

Особенностью этих коллекций является то, что они взаимно дополняют, а не дублируют друг друга (рис. 3, 4).

Другие семейства(31) 32%

Orchidaceae 5%

Asteraceae

7% Liliaceae 9%

Actinidiaceae 8%

Ericaceae 7%

Рис. 3. Количественный состав наиболее представленных семейств в банке in vitro культур ГБС РАН

Банки in vitro других ботанических учреждений РФ содержат не более 50 таксонов (Центральный сибирский ботанический сад, БИН им. В. Л. Комарова РАН, Ботанический сад-институт Уфимского научного центра РАН, Ботанический сад имени проф. А.Г. Генкеля Пермского государственного университета и Удмуртский государственный университет).

В последнее время значительное внимание уделяется введению в культуру in vitro видов, занесенных в Красные книги, особенно с категорией редкости I, II и эндемикам.

Рис. 4. Количественный состав наиболее представленных семейств в банке in vitro культур ГУ «ВРБС»

В ГБС РАН впервые разработаны эффективные приемы культивирования in vitro для видов с категорией редкости I: Aristolochia manshuriensis Kom., Sanguisorba magnifica I. Schischk. & Kom., Dioscorea japonica Thunb., Euonymus nana Bieb., а в ВРБС - Gladioluspalustris Gaud.

Основная цель при создании коллекций in vitro - сохранение жизнеспособности растений-регенерантов. Наиболее распространенным является хранение в условиях минимального роста, таким образом сохраняются практически все существующие коллекции растений in vitro.

В процессе исследований показано, что совместное использование оптимальных показателей интенсивности освещения, состава питательной среды, концентрации осмотиков и ретардантов значительно увеличивает как период субкультивирования, так и жизнеспособность эксплантов исследуемых культур. На модельных представителях семейств Oleaceae, Actinidiaceae, Ericacee установлено оптимальное содержание осмотиков и ретардантов в питательной среде, необходимое для культивирования регенерантов на протяжении 12-18 месяцев, а для семейства Liliaceae до 24 месяцев без пересадок. Оптимальными условиями сохранения для растений-регенерантов указанных семейств являются пониженная температура (3-7 0С), слабая освещенность (1,2-2,5 мкМ м-1 с-1) и V MS. Для видов семейств Rosaceae, Oleaceae эффективно добавление в состав питательной среды 40 г/л сахарозы и 8 г/л маннита, в то время как для Liliaceae - 20 г/л сахарозы и 5-7 мг/л АБК.

Основная часть генетического банка in vitro ГБС РАН сохраняется при температуре 3-7оС. Генетическая стабильность коллекций in vitro контролируется с помощью молекулярных методов [15].

Сроки вступления растений-регенерантов в фазу генеративного развития важны для дальнейшего стабильного воспроизводства растений. По результатам оценки прохождения возрастных состояний растения, полученные с использованием методов in vitro, опережают растения, размноженные традиционными способами. Отмечено более раннее вступление в виргинильное и молодое генеративное состояние у представителей семейств Liliaceae, Iridaceae, Orchidaceae.

Виргинильные растения Iris hybrida hort. с применением метода эмбриокультуры возможно получить через 3-4 месяца после гибридизации, а средневозрастные генеративные особи - через 2-3 года. В случае использования традиционных приемов указанные сроки составляют соответственно 1-3 года и не менее 5 лет [18].

Длительным предгенеративным периодом развития характеризуются также представители семейства Orchideaceae. Так, Dactylorhiza incarnata в условиях in vivo зацветает на 10-11-й (15-18-й) год, D. maculata и D. fuchsia - на 6-8 и 8-11 года соответственно. В случае использования методов биотехнологии онтогенез указанных видов значительно ускоряется: в фазу генеративного развития растения вступают через 4-5 лет [19].

38 О.И. Молканова, О.И. Коротков, Е.М. Ветчинкина, Н.А. Мамаева, О.Г. Васильева

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

2010. Вып. 3

При сравнительном изучении способности к укоренению коллекционных растений и подро-щенных растений-регенерантов представителей семейств Oleaceae, Rosaceae, Ericaceae было выявлено, что по всем показателям как надземной части, так и корневой системы черенки с растений-регенерантов после цикла культивирования in vitro значительно превосходят аналогичные с коллекционных участков и характеризуются более высокой способностью к ризогенезу по сравнению исходными растениями. Это может быть использовано в дальнейшем при их размножении методом «зеленого черенкования».

При создании банков in vitro, на наш взгляд, необходимо использование методов генетического мониторинга для оценки состояния природных популяций. Применение молекулярно-генетических маркеров позволит определить степень генетического разнообразия исследуемых таксонов, а также оптимизировать состав и количество образцов для репрезентативной выборки при сохранении in vitro.

На наш взгляд, необходимо рассматривать сохранение коллекций in vitro как важнейший дополнительный метод в комплексе мер сохранения растений ex situ.

Выводы

1. При разработке приемов и методов сохранения отдельных таксонов растений должен быть использован дифференцированный подход с учетом биологических особенностей растений.

2. Отбор образцов и формирование core - коллекций в генетических банках следует проводить с использованием современных методов анализа генетического разнообразия.

3. Особое внимание должно быть уделено репрезентативности и поддержанию генетической чистоты таксонов, сохраняемых in vitro.

4. Наиболее перспективными следует считать сохранение асептических растений в режиме от 3 до 7 0С, а семян в режиме глубокого замораживания - 1960С.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Виноградова Ю.К., Горбунов Ю.Н., Макридин А.И., Молканова О.И., Швецов А.Н. Разработка принципов сохранения и воспроизводства генетических фиторесурсов // Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами. М., 2005. С. 343-351.

2. Молканова О.И., Коротков О.И. Сохранение коллекций редких и ценных видов растений в генетических банках in vitro // Теоретические и прикладные аспекты интродукции растений как перспективного направления развития науки и народного хозяйства: материалы Междунар. науч. конф., посв. 75-летию со дня образования Центрального ботанического сада НАН Беларуси (Минск, 15-18 ноября 2007 г.). Минск, 2007. С. 62-64.

3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. М.:ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.

4. Edwards S.K., Johonstone C., Thompson C. Simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucleic Acids Res. 1991. Vol. 19, № 6. Р. 1349.

5. Мельникова Н.В., Борхерт Е.В., Мартынов С.П., Окунева И.Б., Молканова О.И., Упелниек В.П., Кудрявцев А.М. Использование молекулярно-генетических маркеров для верификации коллекций in vitro сирени обыкновенной (Syringa vulgaris L.) // Генетика. 2009. Т. 45, №1. С. 97-103.

6. Тихонова В.Л. Долговременное хранение семян // Физиология растений.1999. Т. 46, № 3. С. 467-476.

7. Международная программа ботанических садов по охране растений / Междунар. совет ботан. садов по охране растений. Botanic Gardens Conserv.Intern. М., 2000. 57 с.

8. Kew Plants people possibilities. URL: http://www.kew.org/visit-wakehurst/garden-attractions-A-Z/Millennium-Seed-Bank.htm

9. Антипина В.А. Особенности формирования банка вегетативных и генеративных диаспор орхидных для длительного хранения: дис. ... канд. биол. наук. М., 2009. 363 с.

10. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Размножение растений. СПб.: Изд-во СПб. ун-та, 2002. 230 с.

11. Ишмуратова М.И., Ткаченко К.Г. Семена травянистых растений: особенности латентного периода, использование в интродукции и размножении in vitro. Уфа: Гилем, 2009. 116 с.

12. Ветчинкина Е.М. Биологические особенности культивирования in vitro семян и зародышей редких видов растений: дис. ... канд. биол. наук. М., 2010. 176 с.

13. Эмбриология растений: использование в генетике, селекции, биотехнологии / пер. с англ. Т.Б. Батыгина и др. М.: Агропромиздат., 1990. 509 с.

14. Орлов П. А. Клеточные и генно-инженерные технологии модификации растений. Минск: Тонпик, 2006. 284 с.

15. Васильева О.Г. Биолого-морфологические основы клонального микроразмножения некоторых представителей рода Rhododendron L.: автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2°°9. 2° с.

16. Васильева О.Г., Молканова О.И. Изучение регенерационного потенциала модельных видов рода Rhododendron L. // Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира: материалы III Всерос. науч.-практ. конф. (Волгоград, 4-7 августа 2°1° г.). Волгоград, 2°1°. С. 118-123.

17. Молканова О.И. Генетические банки растений в ботанических садах России // Сб. науч. тр. Никит. ботан. сада. Ялта, 2°°9. Т. 131. С. 22-27.

18. Мамаева Н.А. Сравнительный анализ морфологических и биологических признаков сортов садовых бородатых ирисов (секция Iris рода Iris L.): дис. ... канд. биол. наук. М., 2°°8. 132 с.

19. Коновалова Т.Ю. Разработка эффективных пальцекоренников (Dactylorhiza nevski) in vitro //Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира: материалы II Всерос. науч.-практ. конф. (Волгоград, 19-21 августа 2°°8 г.). Волгоград, 2°°8. С. 64-68.

Поступила в редакцию 2°.°8.1°

O.I. Molkanova, candidate of biology O.I. Korotkov, candidate of biology E.M Vetchinkina, candidate of biology N.A. Mamaeva, candidate of biology O.G. Vasil'eva, candidate of biology

The gene banks: problems of formation, preservation and use

Along with traditional plant ex situ conservation methods, the creation of gene banks is coming more actual. Scientific and methodological bases for creation and conservation of rare and valuable plants seed and meristem gene banks are under development. During the creation of gene banks, plant species representativeness and genetic stability preservation is given a high priority. Most of the plant material is stored under conditions providing minimum growth processes. Evaluation of the relative genetic distance between microclones and known taxa is proposed as a method to verify in vitro germplasm collections.

Keywords: biological diversity, gene banks, identification, morphogenetic potential.

Молканова Ольга Ивановна, кандидат биологических наук

Учреждение Российской академии наук «Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН» 127276, Россия, Москва, ул. Ботаническая, 4 E-mail: molkanova@mail.ru

Коротков Олег Игоревич, кандидат биологических наук ГУ «Волгоградский региональный ботанический сад» 4°°131, Россия, Волгоград, пр. Ленина, 27 E-mail: vrbs@list.ru

Ветчинкина Екатерина Михайловна, кандидат биологических наук

Учреждение Российской академии наук «Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН» 127276, Россия, Москва, ул. Ботаническая, 4 E-mail: yarilko@inbox. ru

Мамаева Наталья Анатольевна, кандидат биологических наук

Учреждение Российской академии наук «Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН» 127276, Россия, Москва, ул. Ботаническая, 4 E-mail: new_tech_@mail. ru

Васильева Ольга Григорьевна, кандидат биологических наук

Учреждение Российской академии наук «Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН» 127276, Россия, Москва, ул. Ботаническая, 4 E-mail: new_tech_@mail. ru