Гифомицеты - продуценты циклодепсипептидных соединений

Є

Гифомицеты — продуценты циклодепсипептидных соединений

М. В. БИБИКОВА, Т. О. ПУЖЕВСКАЯ, А. В. КАТЛИНСКИЙ

ОАО «ГНЦА» Государственный Научный Центр по Антибиотикам, Москва

Кафедра общей фармацевтической и биомедицинской технологий ММА им. И. М. Сеченова

Hyphomycetes, as Organisms Producing Cyclodepsipeptides

M. V. BIBIKOVA, T. O. PUZHEVSKAYA, A. V. KATLINSKY National Research Centre of Antibiotics, Moscow

Chair of General Pharmaceutical and Biomedical Technology, I. M. Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow

В обзоре рассматриваются циклодепсипептвдные соединения, продуцируемые гифомицетами, которые являются перспективным источником новых лекарственных средств для лечения заболеваний как инфекционной, так и патофизиологической природы.

Ключевые слова: гифомицеты, циклодепсипептиды, продуценты, антибиотики.

The review deals with cyclodepsipeptides produced by hyphomycetes. The cyclodepsipeptide compounds are prospective new agents for the treatment of diseases of the infectious and pathophysiologic nature.

Kay words: hyphomycetes, producers, cyclodepsipeptides, antibiotics.

Многие лаборатории и фирмы в мире ведут поиск и исследуют биологические свойства циклодепсипептидов (ЦДП), т. к. считается, что именно эта группа соединений наиболее перспективна для получения новых лекарственных средств [1]. Многие грибы, в первую очередь инсектицидные, являются продуцентами ЦДП, в связи с чем мы рассмотрели основные направления и успехи в поиске этих природных соединений.

Термин «депсипептиды» впервые был предложен в 1953 году известным советким учёным М. М. Шемякиным. Строение ряда природных депсипептидов было установлено М. М. Шемякиным с соавт. в 1960—70-е годы. Природные депсипептиды продуцируются бактериями, грибами, водорослями, морскими беспозвоночными, но не образуются у животных.

Химические свойства

Депсипептиды — это природные (или синтетические) соединения, имеющие в своем составе амино- и гидроксикарбоксильные кислотные остатки (обычно а-амино- и а-гидроксикислоты), часто изменённые. Некоторые депсипептиды содержат ё-аминокислоты, бета-аминокислоты,

© Коллектив авторов, 2010

Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, Нагатинская ул., д. За. ГНЦА

альфа-, бета-дидегидро-аминокислоты. Некоторые депсипептиды имеют в молекуле дисульфид-ные связи, молекулы отдельных металлов, галогенов и др. В циклодепсипептидах амино-и гидроксикислоты связаны в кольцевые структуры и по сравнению с различными природными циклическими пептидами характеризуются наличием по крайней мере одной эфирной связи.

Общая особенность большинства природных депсипептидов — наличие в их молекулах гетерокомпонент — фрагментов, не являющихся остатками аминокислот. Физико-химические свойства депсипептидов сходны со свойствами других пептидов: хорошо растворимы в эфире, метиленхлориде, диоксане, ацетонитриле, плохо — в воде. Для большинства депсипептидов характерны высокий положительный заряд и пространственное разделение гидрофобных и гидрофильных участков молекулы (амфифильность), что является важной особенностью антимикробных пептидов, обеспечивая возможность одновременно эффек-тивыно взаимодействовать с гидрофобным ядром липидной мембраны и полярным окружением [2].

Большое разнообразие циклопептидных природных соединений определяется их биосинтезом не на рибосомах, а на мультиферментных комплексах, что определяет продукцию микроорганизмом комплекса близких соединений. Поэтому близкие в таксономическом отношении штаммы, выделенные из различных природных источников, образуют различные вариации ком-

-е-

e

плексов аналогичных структур. Один штамм способен продуцировать более 10 близких соединений. Различные продуценты циклодепсипепти-дов деструксинов в целом продуцируют 34 аналога. Аналоги соединений проявляют различные биологические свойства, в связи с чем поиск и исследование этих аналогов является выжным направлением в скрининге природных антибиотиков, в какой-то мере аналогочным получению химических производных.

Классификация ЦДП основана на наименовании продуцента, а не на химической природе. ЦДП можно разделить на две группы: циклы с регулярно чередующимися пептидными и сложноэфирными фрагментами и нерегулярно построенные депсипептиды [3].

Определение структуры ЦДП с использованием методов ПМР и ЯМР является сложной задачей. В настоящее время широко используются для определения структуры ЦДП методы тандемной жидкостой хрломатографии/масс-спектро-метрии (ЬС-М8/М8), что значительно расширяет поисковые возможности [4, 5]. Именно исследования ЦДП методом ЬС-М8/М8 позволяют определять наличие в экстрактах минорных компонентов и давать их структурную характеристику.

Биологические свойства циклодепсипептидов грибов

Большой интерес к ЦДП определился к середине 90-х годов, что связано с развитием молекулярной биологии, медицины и фармакологии, позволившим установить у ЦДП широкий спектр биологической активности, необычный механизм действия и большое разнообразие конформацион-ной структуры молекул. Различные ЦДП проявляют иммуносупрессивные, гормоноподобные, антибиотические, противовирусные, противовоспалительные, антиатерогенные, противоопухолевые свойства, некоторые рассматриваются как потенциальные противомалярийные препараты [6]. Некоторые ЦДП исследуются на возможность их применения в клинике, некоторые — являются реактивами для исследования биологических процессов клеточной регуляции [7].

Выжными свойствами ЦДП являются высокая стабильность, селективность по отношению к определённым рецепторам, стабильность по отношению к ферментам в организме животного, а также высокая липофильность, в связи с чем они выводятся печенью легче, чем линейные пептиды.

Сегодня скрининг природных ЦДП и исследование их биологических свойств ведётся по всему миру, так как многие из них потенциально могут быть использованы в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве.

Антибактериальные соединения

Поиск новых антимикробных средств остается актуальным, несмотря на большое число используемых антибиотиков для лечения инфекционных заболеваний, что связано с распространением в клиниках резистентных возбудителей, появлением новых заболеваний, снижением иммунитета при трансплантологии, при СПИДе и др. Природные ЦДП часто проявляют антибактериальную активность, особенности же их структуры предполагают активность в отношении резистентных возбудителей.

Антибиотическая активность ЦДП определяется их способностью связывать в растворах катионы щелочных и щелочноземельных элементов. Образующиеся комплексы способны переносить катионы через клеточные мембраны и/или индуцировать образование пор. Это свойство ЦДП обусловило их широкое применение при изучении ионной проницаемости биологических мембран [8].

Успешным примером создания новых лекарственных препаратов на основе ЦДП, является циклический липогликодепсипептид рамопла-нин (Ramoplanin) с мощной антибактериальной активностью, продуцируемый актиномицетом Actinoplanes ATCC 33076 [9, 10], а также ацилдеп-сипептид, продуцируемый стрептококком [11]. Эти антибиотики проходят клинические испытания. Механизм их действия основан на связывании с предшественником бактериальной стенки — липидом II [12, 13].

Эти успехи способствуют более внимательному анализу ранее описанных антибиотиков группы ЦДП.

Энниатины и баверицины, открытые еще в 40-е годы, продуцируемые многими изолятами инсектицидных грибов родов Fusarium, Beauveria, проявляют активность в отношении грамположительных микроорганизмов и микобактерий. Антибиотическая активность баверицина обнаружена в отношении бактерий Staphylococcus aureus, Streptococcus fae-calis, Bacillus subtilis, Sarcina lutea, Escherichia coli. B концентрации 0,1 мкг/мл баверицин ингибирует рост Bacillus pumilus, 1 мкг/мл — рост B.cereus, B.mycoides, B.sphaericus, Paenibacillus sp., 25 мкг/мл — P.validus. Показана ингибирующая активность баверицина в отношении анаэробных бактерий Eubacterium biforme, Peptostreptococcus anaerobius, P.productus, Bifidobacterium adolescentis, Clostridium perfringens, обнаружено бактерицидное действие на Mycobacterium tuberculosis и антипара-зитарная активность в отношении Plasmodium falciparum. Значительная токсичность этих антибиотиков лимитирует их использование как антиинфекционных препаратов.

Химически баверицин является циклическим гексадепсипептидом, состоящим из череду-

Є

R2

R1 R2 R3

Деструксин А СН=СН2 СНз СНз

Дигидродеструксин А СН2СН3 СНз СНз

Деструксин В СН(СН3>2 СНз СНз

N-деметилдеструксин В СН(СН3>2 СНз Н

Деструксин В2 СН(СНз>2 Н СНз

Деструксин D СН(СН3)СООН СНз СНз

Деструксин Е сносн2 СНз СНз

Деструксин Е диол снонснгон СНз СНз

Деструксин Е хлоргидрин CHOCH2CI СНз СНз

Рис. 1. Структура баверицина.

Рис. 2. Структура деструксинов.

ющихся остатков N-метил-Ь-фенилаланина и D-a-гидроксиизовалериановой кислоты, имеет мол. массу 783,96, относится к семейству энниа-тинов (рис. 1).

Энниатин — циклический гексадепсипептид с повторяющейся последовательностью D-a-гид-роксивалероил-Ь-метилизолейцина (энниатин А) или D-a-гидроксивалероил-Ь-метилвалина (энниатин B).

В настоящее время продолжают описывать новые аналоги энниатинов и баверицинов. В частности, при отборе соединений с антигрибной активностью был отобран штамм Fusarium sp. F31, продуцирующий энниатины, некоторые из которых были представлены новыми структурами, ингибирующими прорастание спор Botrytis cenerea в дозе 100 мкг/мл [14]. Интересно, что некоторые штаммы Fusarium sp., выделенные в качестве эн-дофитов также продуцировали энниатины, при этом растения с такими эндофитами проявляли резистентность к другим патогенам [15].

В 1961 г. в Японии были выделены и описаны гексадепсипептиды деструксины, продуцируемые грибковой культурой Oosporin destructor. В дальнейшем был выделен большой комплекс деструксинов из культуры Metarhizium anisopliae, а также отдельные деструксины из культур Alternaria brassiaceae, Aschersonia sp. Данные антибиотики проявляют высокую активность в отношении грамположительных и кислотоустойчивых микроорганизмов [16, 17], а в 2001г. были выделены их аналоги псевдодеструксины А и В из копрофильного гриба Nigrosabulum globosum [18].

При скрининге БАВ из грибковых культур, выделенных из моря в Бразилии, была выделена культура Beauveria felina, продуцирующая комплекс деструксинов, а также структурно близкие соединения розеотоксин B, розеокардин и исса-риин B [19]. Комплекс деструксинов (рис. 2) про-

являет высокую антитуберкулезную активность и цитотоксичность.

Помимо антибиотичнской активности деструксины проявляют инсектицидную, фитотоксическую, антивирусную, нематоцидную, иммуномодулирующую активности, влияют на кальциевый баланс и фосфорилирование в клетках. Высокая активность деструксинов способствовала поиску новых продуцентов и новых аналогов разными лабораториями мира. Деструксины были выделены из культуры гриба Aschersonia aleyrodis и фитопатогенного гриба Alternaria brassicae. Нами были выделены деструксины из копрофильного штамма Beauveria felina, основными копмонентами комплекса оказались деструксин В и псевдодеструксин Е [20].

Гриб Isaria был выделен из почвы и описан в 1959 г. (Taber and Vining), а в 1962 г. появилось первое сообщение о выделении из Isaria ^felina иса-риина А, а в дальнейшем были выделены и аналоги исариины B, C, D. Структурные исследования были проведены методами ЯМР, ПМР, секвини-рования [21]. Сруктурно близкой группой являются ЦДП, выделенные из гриба Isaria sp. в Индии, из которых 6 являются исариинами и 4 исаридинами. Определение структур проведено методом тандемной LC-MS/MS, с полным анализом полученных экспериментальных данных [22]. Структурные данные для двух соединений были подтверждены исследованием методом ЯМР. В сообщениях не приводятся данные по антимикробной активности соединений. Показана высокая активность в отношении москитов, переносящих малярийный плазмодий. Только исариин А1 был активен в отношении Plasmodium falciparum и подавлял его развитие внутри эритроцитов.

ЦДП икосалиды представляют группу близких двадцатичленных кольцевых структур, сформированных амидными и эфирными свя-

О

e

зями, состоящими из двух остатков серина, двух — лейцина, двух гидроксикислотных единиц, в кольцевую структуру которых включены жирные кислоты. Икосалид А1, продуцируемый грибом Aureobasidium sp. OSI 59166,проявляет активность в отношении резистентных штаммов Streptococcus pyogenes, S.pneumoniae (Felton) и Enterococcus faecalis [23].

Антибактериальная активность установлена у эмерицелламидов А и В, продуцируемых изоля-том из моря Emericella sp. при совместном культивировании с актиномицетом Salinispora arenicola, также выделенным из моря. Антибиотики проявляют активность в отношении метициллинорези-стентных стафилококков (МЯ5А) [24].

Таким образом многие ЦДП проявляют антибиотическую активность, включая ингибирование резистентных штаммов. При этом наличие или отсутствие антибиотической активности близких соединений определяются небольшими различиями в радикалах молекул.

Антимикотики

Сегодня микозы имеют большой удельный вес в проблеме «оппортунистических инфекций», резко возросла частота и тяжесть грибковых инфекций, в том числе с хроническим течением. В возникновении, развитии и течении микозов основное значение имеет наличие иммунодефицитных состояний, как врождённых, так и связанных с ВИЧ-инфекцией, с трансплантологией, с антибиотико-и гормонотерапией. Проблема эффективной и безопасной терапии микозов связана с потребностью в антимикотических препаратах, с избирательностью действия на возбудителя и отсутствием токсического действия на макроорганизм. В связи со сходством структурно-биохимических свойств клеток гриба и макрорганизма, а также схожими метаболическими процессами и возможными мишенями действия, поиск таких препаратов достаточно сложен. Общие мишени в первую очередь связаны с синтезом стеролов (эргостерин, холестерин) и гормонов надпочечников.

Интерес паредставляют ЦДП джаспамиды (jaspamides), выделенные из морской водоросли Hemiastrella minor при поиске цитостатических соединений. Препарат проявляет антигрибную и противовирусную активности и рассматривается как перспективный терапевтический агент для лечения микозов, сопровождающих оппортунистические инфекции при СПИДе [25].

Описаны ЦДП с антигрибной активностью клаварипсины А и В, продуцируемые водным ги-фомицетом Claviriopsis aquatica [26], а также пет-реллин А [27].

В связи с эффективностью липопептидов (эхинокандины) можно отметить сообщение

о выделении ЦДП гломоспорина, содержащего

жирнокислотную цепь. Соединение продуцируется грибом Glomospora sp. BAUA 2825, выделенным из опавших сосновых иголок и проявляет антигрибную активность, в том числе в отношении Aspergillusfumigatus [28].

Разработка и использование нового метода скрининга антигрибных антибиотиков — поиск ингибиторов инозитол-фосфорилсерамид-синта-зы, позволил японским исследователям отобрать плеофунгины, продуцируемые культурой Phoma sp. SANK 13899 [29]. Плеофунгин A ингибировал фермент ИФС Saccharomyces cerevisiae и Aspergillus fumi-gatus, ИК50 составила 16 и 1,0 нг/мл соответственно, а также подавлял рост Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Afamigatus с МПК 2,0; 0,3 и 0,5 мкг/мл соответственно. Авторы полагают, что соединения принадлежат к новому классу ингибиторов ИФС. Структурые исследования показали, что антибиотики являются ЦДП, однако наличие необычных аминокислот очень затрудняет определение структуры, хотя авторы использовали ряд методов: ЯМР, метод Марфи, комбинации газового хроматографа и масс-спектрометрического анализа [30].

Комплекс ЦДП с высокой антигрибной активностью продуцирует культура Aureobasidium pullulans. Соединения состоят из восьми аминокислот и одной оксикислоты. Ауреобазидин А ингибирует прежде всего дрожжевые культуры, ингибируя активность инозитол-фосфорилсера-мид-синтазы. При воздействии антибиотика на Saccharomyces cerevisiae рост дрожжей останавливается немедленно [31].

Новым направлением в скрининге природных соединений является поиск препаратов, усиливающих активность антибиотиков, применяемых в клинике. При проведении широкого скрининга природных соединений, усиливающих активность известных антимикотиков, специалисты из Китая из 20 000 микробных экстрактов отобрали 12, проявляющих синергизм с азолами. Баверицин и его аналоги А, D, E, F усиливали активность микона-зола по отношению к резистентной C.albicans в 4—5 раз, а также по отношению к C.albicans, резистентной к флуконазолу [32].

Наибольшая активность была установлена у баверицина, который проявил с кетоконазолом высокий уровень синергизма в отношении различных грибных патогенов. На модели иммуно-компрометированных мышей комбинация баверицина (0,5 мг/кг) и кетоконазола (0,5 мг/кг) пролонгировала выживаемость животных, инфицированных C.parapsilosis, и снижала количество колониеобразующих единиц в органах животных, включая почки, лёгкие, мозг. Такой эффект не достигался даже при использовании 50 мг/кг кетоконазола.

Серьезной проблемой при лечении кандидо-зов и других патогенных микозов является разви-

e

тие множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) в процессе лечения. Развитие МЛУ у кандид связано с кассетными белками АВС, определяющими активный эффлюкс лекарств из клеток. Установлено, что некоторые природные и химически синтезированные депсипептиды ингибируют активность АВС белков, что приводит к усилению антигрибной активности азолов. Значительное развитие получили работы по скринингу природных метаболитов, снимающих МЛУ клинически важных грибных штаммов, резистентных к азолам. Показано, что многие ЦДП ингибируют эффлюкс антимикотиков из различных видов Candida [33].

Из культуры Metarhizium anisopliae был выделен комплекс из 8 деструксинов, один из которых не был описан ранее — изомер хлоргидрина деструксина Е. Новый антибиотик оказался специфичным ингибитором ^Н+-АТФазы Saccharomyces cerevisiae [34].

Противовирусные соединения

В качестве антивирусных препаратов перспективными являются каллипептины и хинок-сипептины с избирательностью в отношении ВИЧ. Соединении являются ингибиторами про-теазы. Проводятся исследования по получению полусинтетических аналогов этих соединений для создания лекарств для лечения СПИДа [1].

Вирус гепатита В является инфекционным агентом, вызывающим тяжёлые заболевания, приводящие к острым и хроническим гепатитам, которые могут приводить к циррозу печени, а также являются риском развития карциномы печени. Пока не создано эффективных лекарств для лечения гепатита В. Культура клеток гепатомы человека Hep3B используется как модельная система для скрининга лекарственных средств. Показано, что в этой системе вирус гепатита В активно секрети-рует поверхностный антиген (HBsAg) в среду культивирования. S. F. Yeh с соавт. показали, что дест-руксины, выделенные из грибной культуры M.anisopliae, проявляют выраженный эффект на секрецию поверхностного антигена вируса в среду культивирования. При исследовании корреляции между структурой и эффективностью декструкси-нов авторы показали, что более активным является деструксин Е2 хлоргидрин [32—34].

Противоопухолевые соединения

Наибольший интерес вызывают ЦДП как потенциальные противоопухолевые соединения, некоторые из которых проходят клинические испытания.

Цитотоксическое действие ЦДП определяется их взаимодействием с тубулинами мажорного компонента клеточных микротрубочек, определяющих форму клеток в интерфазе и формирова-

ние митотического веретена, что приводит к накоплению культивируемых клеток в G2/M фазе клеточного цикла и подавлению митоза. Эти свойства депсипептидов определяют их высокую токсичность для животных клеток. В большинстве случаев депсипептиды ингибируют присоединение винбластина и винкристина к тубулину, неконкурентным образом ингибируют тубулин-зависимый гидролиз ГТФ, многие индуцируют формирование олигомеров тубулина с нарушенной морфологией, включая кольца тубулина [35].

Клинические испытания проходит ЦДП ап-лидин, выделенный из морских беспозвоночных, проявляющий высокую активность в отношении рака лёгкого, острой лимфобластомной лейкемии, рака простаты, желудка и др. [36]. Аплидин ингибирует пролиферацию клеток, индуцирует апоптоз трансформированных клеток. Разрабатывается препарат фирмой PharmaMar S.A.

Большое количество публикаций по исследованию противоопухолевой активности ЦДП касается баверицина. Баверицин проявляет выраженную цитотоксичность в отношении ряда клеточных линий, вызывая апоптоз клеток. Так, 50% цитотоксическое действие баверицина в отношении клеток лимфомы U-937 и клеток лейкемии HL-60, находящихся в стационарной фазе, проявлялось в концентрации 30 мкM и 15 мкM соответственно при обработке клеток в течение 24 ч.

Установлена высокая цитостатичность баверицина в отношении клеток двух линий Hep G2 (гепа-токлеточная карцинома) и MRS-5 (фибробласт-по-добные клетки лёгких), способность баверицина индуцировать апоптоз путём взаимодействия с про-и антиапоптическим семейством белков Bcl-2, также путем воздействия на митохондриальные мембранный потенциал, цитохром С и каспазу 3 [37]. Методом масс-спектрометрии с электроспрей-ионизацией показана способность баверицина в низкой концентрации (25 пмоль/мкл) не ковалентно взаимодействовать с олигонуклеотидами [38].

Способность клеток к миграции является критическим моментом, позволяющим раковым клеткам распространяться и метастазировать. Метастазы ответственны за гибель пациентов с онкологией в 90% случаев. В 2007 г. появилось сообщение о способности баверицина ингибировать ангиогенез опухолевых клеток и проявлять высокую активность в отношении клеточной линии рака груди (MDA-MB-231^ простаты (PC-3M) [39].

При применении противоопухолевых препаратов быстро развивается резистентность клеток к лекарственным средствам, прежде всего связанная с откачкой их из клеток мембранной помпой. Впервые было показано, что циклический пептид циклоспорин А ингибирует множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) опухолевых

О

клеток. В дальнейшем было показано, что многие ЦДП также способны ингибировать МЛУ опухолевых клеток. Наиболее исследованным ингибитором МЛУ опухолевых клеток из депсипепгидов является баверицин [40].

Специфическая и высокая противоопухолевая активность баверицина определила клинические испытания этого давно открытого грибного метаболита.

Многие описываемые ЦДП проявляют цито-токсическую активность в отношении трансформированных клеток. Описан паецилодепсипеп-тид, продуцируемый энтомопатогенным грибом Раесіїотусез стпатотет ВСС 9616. Параллельно культурой образуется аналог этого соединения — линейный депсипептид. Пять аминокислотных остатков включают глицин, два аланина, тирозин и О-пренилтирозин. Цитотоксичность в отношении раковых клеточных линий КВ (ИК50 5,9 мкМ) и ВС (ИК50 6,6 мкМ) и активность в отношении малярийного плазмодия проявляет только циклический депсипептид [41].

Высокая противоопухолевая активность установлена у бициклического депсипептида БЯ901228, получившего название ромидепсин. В 2008 г. началась 2 фаза его клинических испытаний. Препарат высокоактивен при множественной миеломе, при раке лёгкого.

Продуцентом является бактериальная культура СкготоЬасїегіит уЫаееыт 968 [42,43].

Соединение обладает уникальной структурой — циклодепсипептид состоит из трех аминокислот Б-цистеина, Б-валина, Ь-валина, а также из оксикислоты и 2,3-дегидро-треонина. Второй цикл предположительно определяется связью между двумя молекулами серы — одна цистеина и вторая от малонил- КоА. Мол. масса — 540. Это соединение является пролекарством. В организме связь между молекулами серы разрывается и одна молекула серы взаимодействует с молекулой цинка. В результате гидрофобная молекула пролекарства превращается в гидрофильную активную форму. Ромидепсин останавливает клеточный цикл трансформированных клеток в фазе

01 ив наномолярных концентрациях индуцирует их апоптоз.

Исследование ЦДП рассматривается как новое направление в поиске препаратов, ингибирующих формирование, а возможно и разрушающих образованные амилоидные бляшки. Опубликован патент на БЯ901228 — ингибитор гистон диацела-зы [44] как соединение, активное в отношении болезни Альцгеймера. Следует заметить, что данные о влиянии статинов (также проявляющих определенную противоопухолевую активность) на эту болезнь остаются противоречивыми: публиковались данные как о снижение развития болезни, так и о провокации ее появления.

Фармакологическая активность

Проблема атеросклероза — одна из ключевых в кардиологии, от её решения зависят предупреждение и лечение инфаркта миокарда, инсульта, тромбозов и других заболеваний сердечно-сосудистой системы, приводящих к инвалидизации работоспособного населения и характеризующихся высокой смертностью.

Многие годы в разных странах проводили поиск ингибиторов фермента ацил-КоА-холестерол-ацил-трансферазы (АХАТ), который катализирует внутриклеточную этерификацию холестерина и играет важную роль в регуляции содержания внутриклеточного свободного холестерина, в абсорбции холестерина в кишечнике и в образовании липопротеидов в печени. В качестве продуцентов ингибиторов АХАТ описаны культуры Albophoma yamanashiensis, Emericella falconensis, Penicillium multicolor, P.funiculosum, P.sclerotiorum и др. Ингибиторами фермента АХАТ являются ЦДП [43], в частности баверицин. Показано, что многие ингибиторы АХАТ воздействуют также на рецептор эндотелина, моноаминоксидазу, фосфо-липазу А2, некоторые из них проявляют выраженную противоопухолевую активность, ингибируют присоединение вируса ВИЧ-1 к Т-4 лимфоцитам [45], баверицин проявляет также антиконвульсив-ную и антиаритмическую активности.

В связи с выраженной активностью ингибиторов АХАТ, многие лаборатории проводят скрининг как природных, так и химически синтезированных ингибиторов, однако наличие значительных побочных эффектов или низкая эффективность in vivo затрудняют их разработку. Проведённые недавно молекулярно-биологические исследования показали существование двух различных изоформ АХАТ: АХАТ1 и АХАТ2. АХАТ1 экспрессируется в различных тканях и клетках, в то время как АХАТ2 экспрессируется преимущественно в гепатоцитах печени и в тонком кишечнике. Ранее описанные ингибиторы АХАТ пурпактин А, терпендол С, глисопренин А, спилидон ингибировали обе формы фермента при-бизительно в одинаковой степени [46, 47].

Особого внимания заслуживают циклические тетрадепсипептиды (13-членный цикл), проявляющие антиатерогенные свойства. Бавериолиды (рис. 3), выделенные из культуры Beauveria sp. FO-6979, разрабатываются в Японии, а их близкие аналоги баверолиды, выделенные из различных видов Beauveria, Paecilomyces — объединенной группой ученых из Чехии, Австрии и Германии. В обоих случаях их рассматривают как перспективные антиатерогенные соединения [48—50]. Соединения не проявляют ни антибиотической, ни цитотоксической активности.

Бавериолиды, представленные 9 аналогами, избирательны либо к АХАТ 1, либо к АХАТ2. Бавериолиды I и III ингибировали только изофермент

О

Рис. 3. Структура бавериолидов.

АХАТ 1. Баверицин проявлял избирательность к подавлению активности АХАТ2. Экспериментальные данные этих исследований представлены в таблице.

S. Omura с соавт. разработали метод скрининга антиатерогенных препаратов с оценкой подавления накопления жировых капель в макрофагах мышей J774 in vitro. Ими показано, что бавериолиды I и Ш ингибируют накопление жировых капель в макрофагах, блокируют синтез эфиров хо-

лестерина, подавляют с высокой селективностью активность фермента АХАТ1, и что более важно, при пероральном приёме ингибируют развитие атеросклероза у генетически модифицированных мышей, снижая активность рецептора для ЛПНП и аполипопротеина Е, не оказывая значительного влияния на синтез триглицеридов и фосфолипидов. Авторы полагают, что ингибирование синтеза холестерина в макрофагах происходит за счёт нарушения связи между выделением холестерина из лизосом и его синтезом в эндоплазматическом ретикулюме. Препараты не проявляли таких побочных эффектов, как диарея или цитотоксичность. Авторы получили 104 деривата бавериолидов и установили, что дифинил-производные в 10 раз активнее бавериолида III . На этой же модели было показано, что деструксин Е ингибирует накопление жировых капель в макрофагах 1774, а 18-членный ЦДП баверицин, ингибирующий АХАТ2, не влиял на накопление липидных частиц в микросомах [51].

Показано, что деструксины В и Е ингибируют развитие остеопороза, не влияя на выживаемость и дифференциацию остеокластов. Предполагается, что эти свойства деструксинов связаны с их способностью ингибировать У-АТФазу [52].

У-АТФаза локализована на мембранах остеокластов и ее подавление рассматривается как возможная мишень для разработки лекарственных средств при остеопорозе. Также У-АТРа8е локализована в ренальных интеркалированных клетках и в макрофагах. Более того, У-АТФаза представлена во внутриклеточных компартментах, таких как лизосомы, эндосомы, аппарат Гольд-жи, секреторные везикулы, где определяют их за-кисление. Появились данные, что У-АТФазе из разных органелл имеют специфичность и, следовательно, различные биологические эффекты. Показано, что деструксин В ингибирует У-АТФа-зе специфически, дозозависимо и обратимо. За-кисление внутриклеточных органелл также блокируется деструксином В. Представляет интерес, что деструксин В блокирует У-АТФазу ЕШегососст Ыгае, активность которой усиливается валиномицином [53].

Показано, что деструксин Е является Са++ ионофором, в присутствии которого повышается уровень кальция в человеческих клеточных

Изучение гиполипидемического действия бавериолидов I и III и баверицина на модельных ферментативных системах.

Компонент Подавление синтеза ЭХ в макрофагах Подавление полилизосомального метаболизма холестерина Подавление АХАТ-1

КИ5оСкМ) КИ5о

Бавериолид I 0,78 0,37 6,0 1,5 2,5

Бавериолид III 0,41 0,21 5,5 1,5 1,0

Баверицин 0,13 0,01 1,0 8,0 —

Бавериолид R

БавериолидIV

Бавериолид V

Бавериолид VI

Бавериолид VII

Бавериолид VIII

БавериолидIX Баверолид Fa

Є

линиях, который не ингибируется блокаторами кальциевых каналов, за исключением нифиди-пина. Соединение также индуцирует фосфори-лирование крупных внутриклеточных белков, при этом ЭДТА незначительно ингибирует этот процесс. Эти данные можно сопоставить с исследованиями ЦДП баверициана. При исследовании механизма токсичности баверицина было сделано предположение, что она связана с увеличением концентрации внутриклеточного Са2+. Несмотря на тот факт, что баверицин может активизировать инфлюкс кальция в клетки, предполагается, что баверицин избирательно и полностью высвобождает запасной клеточный кальций. На ооцитах Xenopus авторы показали, что баверицин активирует кальций-зависимый выход ионов хлора, нарушая при этом баланс внутриклеточного рН. Эти процессы блокировались нифлумовой кислотой, специфическим блокатором кальций-активируемого потока хлора. Именно это и явилось причиной гибели оо-цитов. Цитотоксический эффект наблюдался в дозе 10 и 30 мкМ, но при 50 мкМ эффект значительно снижался [54].

Со способностью деструксина В подавлять V-АТФазу, связывают блокировку деструксином способности клофибрата (клинический гиполипи-демический препарат) индуцировать ретроградное движение аппарата Гольджи от мембраны к эндо-плазматическому ретикулюму. В настоящее время высказывается мнение, что важнее не ингибировать синтез холестерина (как статины), а ингибировать доставку холестерина от эндоплазматичес-кого ретикулюма к мембране.

Деструксины А, В, Е, близкие к ним соединения розеотоксин и розеокардин, а также мицели-альный экстракт Cordyceps sinensis проявляют кардиотонические свойства: усиливают сокращение и снижают частоту сокращений сердечной мышцы крыс. Эффекты не связаны с увеличением цАТФ. Следует отметить, что структурно эти соединения принципиально отличаются от известных кардиотонических препаратов [55, 56].

Определенный интерес вызывают данные о способности деструксина- А4 хлоргидрина проявлять эритропоэтин-индуцирующую и иммуномодулирующую активности [57].

Из культуры Hapsidospora irregularis выделен циклический пентадепсипептид леулацин, который является новым высокоактивным и специфичным Са2+-блокирующим агентом, структурно полностью отличающийся от клинически используемых соединений, таких как бензодиазепены, дигидропиридины, верапамил и его аналоги (рис. 4). Авторы полагают, что новое соединение может рассматриваться как потенциально более эффективное новое лекарственное средство для лечения тромбоза и атеросклероза. Показано, что внутри-

Рис. 4. Структура леулацина.

вєн^я ижєкция прeпaрaтa крь^м c гипєртєнзи-єй жи^єт кровяноє дaвлeниe [58].

OnraaHii дeпcипeптиды микропєптини, явля-ющиecя эффeктивными ингибитoрaми намита, что позволяєт aвтoрaм рaccмaтривaть иx в кaчecтвe возможный прeпaрaтoв для лєчєния кaрдиoвacкy-литов; coe,nHHeHre SCH58149 проявляєт гиполи-пидeмичecкиe cвoйcтвa и нoрмaлизyeт cooiHoffle-ниє ЛПНП и ЛПВП; иccлeдyeтcя coeдинeниe SCH217048 c прoтивoвocпaлитeльнoй aктивнoc-тью, дєйствующєє кaк aнтaгoниcт нeйрoкeнинa.

Пoкaзaнo, что инceктицидныe cвoйcтвa грибнык культур опрєдєляются cингeзoм ЦДП. В чacтнocти, Уровєнь пaтoгeннocти грибa Metarhizium anisopliae кoррeлирoвaл c уровнєм продукции дecтрyкcинoв. Пoкaзaнo, что бaвeрoлид L, циклocпoрин A, дєст-рyкcин A cyпрeccирoвaли иммунную шотему игслє-доганныи: mce^^ix, что приводило к повишєнию тигрa E.coli при зaрaжeнии опытный экзeмплярoв Drosophila melanogaster, Galleria mellonella. Бaвeрoли-ды и бaвeриoлиды тaкжe вытают иммyнocyпрec-cивнoe cocтoяниe нaceкoмыx. Под влияниєм этиx coeдинeний прoиcxoдиг cнижeниe cингeзa mce^-мыми aнтимикрoбныx пєптидов, и^ющт ожов-ную роль в иммунитєтє нaceкoмыx. В рeзyльтaтe нaceкoмыe cтaнoвятcя чувствительны к инфициро-вaнию бaктeриями и быcтрo от hhx пoгибaют. В cвязи c близocтью ряда дeфeнcинoв нaceкoмыx и чeлoвeкa возни^єт нє^м^нний интeрec к при-родє вторичныи: мeтaбoлитoв, прoдyцирyeмыx ин-ceктицидными грибaми [59].

Заключение

В нacтoящee врємя мы являeмcя cвидeтeлями з^чи^льного рacширeния HarnHx прeдcтaвлe-ний о возможный иcтoчникax нoвыx лeкaрcтвeн-Hiix cрeдcтв и вoзмoжныx cпeктрax биoлoгичec-кой aктивнocти прирoдныx coeдинeний. Aнaлиз циклoдeпcипeптидныx coeдинeний, продуцирує-

e

мых, прежде всего, инсектицидными грибами демонстрирует широкий спектр природных соединений, многие из которых успешно разрабатываются как лекарственные препараты для различных направлений в клинике. Мощные антибактериальные антибиотики — липоглико-депсипептид рамопланин и ацилдепсипептид проходят клинические испытания. Исследуется ряд антибиотиков — фунгицидов, оценивается противовирусная активность различных дест-руксинов. Четыре депсипептида проходят кли-

нические испытания в качестве противоопухолевых средств. Успешно разрабатываются бавероли-ды — бавериолиды в качестве новых нетоксичных антиатерогенных препаратов. Целый ряд цикло-депсипептидов исследуются как соединения нормализующие гомеостаз организма. Таким образом, данные по биологической активности показывают, что циклодепсипептиды являются перспективными соединениями для разработки лекарственных препаратов для заболеваний как инфекционной, так и патофизиологической природы!.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ballard C. E, Yu H. Wang B. Recent development in depsipeptide research. Curr Med Chem 2002; 9: 471—498.

2. Шемякин М. М., Хохлов А. С., Антонов В. К. Антибиотики-депси-пептиды. Химия антибиотиковю M.: 2: 1161—1172.

3. Шредер Э, Любке К. Пептиды, из-во «Мир». 1969.

4. Jestoi M, Rokka M, Rizzo A. et al. Determination of Fusarium-mycotoxins beauvericin and enniatins with liquid chromatography — tandem mass spec-trometry(LC-MS/MS). J Liq Chromatogr Technol 2005; 28: 369—381.

5. Potterat O., Wagner K., Haag H. Liquid chromatography-electrospray time-of-flight mass spectrometry for on-line accurate mass determination and identification of cyclodepsipeptides in a crude extract of the fungus Metarrhizium anisopliae. J Chromatography 2000; 872: 85—90.

6. Fotie J., Morgan R. E. Depsipeptides from microorganisms: a new class of antimalarials. Mini Rev Med Chem 2008; 11: 1088—1094.

7. Sarabia F, Chammaa S., Ruiz A. S. et al. Chemistry and biology of cyclic depsipeptides of medicinal and biological interest. Current Medicinal Chemistry, 2004; 11: 1309—1332.

8. Овчинников Ю. А., Иванов В. Т., ШкробA. M. Мембраноактивные комплексоны, М.: 1974.

9. Dongwoo Shin, Yosup Rew, Dale L. Boger. Total synthesis and structure of the ramoplanin A1 and A3 aglycones: two minor components of the ramoplanin complex. Proceed Nat Acad Sci 2004; 101: 11977—11979.

10. Fulco P., Wenzel R. P. Ramoplanin: a topical lipoglycodepsipeptide antibacterial agent. Expert Rev Anti Infect Ther 2006; 4: 939—945.

11. Heike Brotz-Oesterhelt, Dieter Beyer, Hein-Peter Kroll et al. Disregulation of bacterial proteolytic machinery by a new class of antibiotics. Nat Med 2005; 11: 1082—1087.

12. Breukink E, de Kruijff B. Lipid II as a target for antibiotics. Nat Rev. Drug Discov 2006; 5: 321—330.

13. Xiao Fang, Kittichoat Tiyanont, Yi Zhang, et al. The mechanism of action of ramoplanin and enduracidin. Mol BioSyst 2006; 2: 69—76.

14. Pohanka A. Antifungal antibiotics from potential biocontrol microor-ganisms// Doctoral diss. Dept Chem SLU. Acta Univers Agricul Sueciae 2006; 47.

15. Schulz B., Boyle C., Siegfried D. S. et al. Endophytic fungi: a source of novel biologically active secondary metabolites. Mycol Res 2002; 106: 996—1004.

16. Pedras M. S., Irina Zaharia L., Ward D. E. The destruxins: synthesis, biosynthesis, biotransformation, and biological activity. Phytochemistry.

2002; 59: 579—596.

17. Gupta S., Roberts D. W., Renwick J. A. Insecticidal cyclodepsipeptides from Metarrhizium anisopliae. J Chem Soc Perkin Trans I. 1989; 2347—2357.

18. Che Y., Swenson D. C., Gloer J. B. et al. Pseudodestruxins A and B: new cyclic depsipeptides from the coprophilous fungus Nigrosabulum globo-sum. J Nat Prod 2001; 64: 555—558.

19. Lira S. P., Vita-Marques A. M., Seleghim M. H. et al. New destruxins from the marine-derived fungus Beauveria felina. J Antibiot 2006; 59: 553—563.

20. Бибикова М. В., Пужевская Т. О., Даниленко А. H. и др. Образование деструксинов копротрофным штаммом Beauveria feline №7. Антибиотики и химиотер. В печати.

21. Baute R., Deffieux G., Merlet D. et al. New insecticidal cyclodepsipeptides from the fungus Isariafelina. I. Production, isolation and insecticidal properties of isariins B, C and D. J Antibiotics 1981; 34: 1261—1265.

22. Sabareesh V., Ranganayaki R. S., Raghothama S. et al. Identification and characterization ofa library of microheterogeneous cyclohexadep-sipep-tides from the fungus Isaria. Amer Chem Soc 2007; 70: 5.

23. Boros C., Smith C. J., Vasina Y.et al. Isolation and identification of the icosalides — cyclic peptolides with selective antibiotic and cytotoxic activities. J.Antibiotics 2006; 59: 486—489.

24. Oh D. C., Kauffman C. A., Jensen P. R., Fenical W. Induced production of emericellamides A and B from the marine-derived fungus Emericella sp. in competing co-culture. J Nat Prod 2007; 70: 515—520.

25 . Tabudravu J. N., Morris L. A., Milne B. F., Jaspars M. Conformational studies of free and Li+ complexed jasplakinolide, a cyclic depsipeptide from the Fijian marine sponge Jaspis splendens. Organic Biomol Chem 2005; 3: 745—749.

26. Kaida K., Fudou R., Kameyama T. et al. New cyclic depsipeptide antibiotics clavariopsins A and B, produced by an aquatic hyphomycete Claviriopsis aquatica. J. Antibiotics 2001; 54: 22—28.

27. Lee K. K. et al. Petriellin A, a fungicidal 13-depsipeptide. J Org Chem 1995; 60: 5384—5387.

28. Sato T., Ishiyama D., Honda R. et al. Glomosporin, a novel antifungal cyclic depsipeptide from Glomospora sp. 1. Production, isolation, physico-chemical and biological activities. J Antibiotics 2000; 53: 597—602.

29. Yano T., Aoyagi A., Kozuma S. et al. Pleofungins, novel inositol phosphoryl-ceramide synthase inhibitors, from Phoma sp. SANK 13899. I. Taxonomy, fermentation, isolation, and biological activities. Ibid 2007; 60: 43—51.

30. Aoyagi A., Yano T., Kozuma S., Takatsu T. Pleofungins, novel inositol phosphorylceramide synthase inhibitors, from Phoma sp. SANK 13899. II. Structural elucidation. Ibid 2007; 60: 136—142.

31. Cerantola V., Guillas I., Roubaty C. et al. Aureobasidin A arrests growth of yeast cells through both ceramide intoxication and deprivation of essential inositolphosphorylceramides. Mol Microbiol 2009; 71: 1523—1537.

32. Yan K., Zhang Y., Huang R. et al. High-throughput synergy screening identifies microbial metabolites as combination agents for the treatment off. Natural products and antifungal drug discovery. Methods Mol Med 2007; 2.

33. Chen H. C., Chou C. K., Sun C. M., Yeh S. F. Suppressive effects of destruxin B on hepatitis B virus surface antigene gene expression in human hepatoma cells. Antiviral Res 1997; 34: 137—144.

34. Yeh S. F., Pan W., Ong G. T. Study of structure-activity correlation in destruxins, a class of cyclodepsipeptides possessing suppressive effect on the generation of hepatitis B virus surface antigen in human hepatoma cells. Biochem Biophys Res Commun 1996; 229: 65—72.

35. HamelE., CovellD. G. Antimitotic Peptides and depsipeptide. Cur Med Chem — Anti-Cancer Agents 2002; 2: 19—53.

36. Mitsiades C. S., Ocio E. M., Pandiella A. et al. Aplidin, a marine organism — derived compound with potent antimyeloma activity in vitro and in vivo. Cancer Res 2008; 68: 5216—5225.

37. Calo L.Cytotoxic effects of the mycotoxin beauvericin on human cell lines of myeloid origin. Pharmacol Res 2004; 49: 73—77.

38. Pocsfalvi G., Di Landa G., Ferranti P. et al. Observation of non-covalent interactions between beauvericin and oligonucleotides using electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 1997; 11: 265—272.

Є

39. Zhan J., Burns A. M., Liu M. X. et al. Search for cell motility and angio-genesis inhibitors with potential anticancer activity: beauvericin and other constituents of two endophytic strains of Fusarium oxysporum. J Nat Prod 2007; 70: 227—232.

40. Klaric M. S., Pepeljinjak S. Beauvericin chemical and biological aspects and occurrence.Arh. Hig Rada Toxikol 2005; 5: 343—350.

41. Isaka M., Palasarn S., Lapanun S., Sriklung K. Paecilodepsipeptide A, an antimalarial and antitumor cyclohexadepsipeptide from the insect pathogenic fungus Paecilomyces cinnamomeus BCC 9616. J Nat Prod 2007; 70: 675—678.

42. Ueda H., Nakajima H., Hor Y., et al. FR901228, a novel antitumor bicyclic depsipeptide produced by Chromobacterium violaceum No. 968. I. Taxonomy, fermentation, isolation, physico-chemical and biological properties, and antitumor activity. J Antibiotics 1994; 47: 301—310.

43. Shigematsu N., Ueda H., Takase S. et al. FR901228, a novel antitumor bicyclic depsipeptide produced by Chromobacterium violaceum No. 968.

II. Structure determination. Ibid 1994; 47: 311—314.

44 Dangond Fernando. (W0/2003/083067) Histone deacetylase inhibitors

for the treatment of multiple sclerosis, amyotrophic sclerosis and Alzheimers disease. (Netherlands).

45. Tomoda H., Huang X. H., Cao J. et al. Inhibition of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase activity by cyclodepsipeptide antibiotics. J Antibiotics 1992; 45: 1626—1632.

46. Ohshiro T., Rudel L. L., Omura S., Tomoda H. Selectivity of microbial acyl-CoA — cholesterol acyltransferase inhibitors toward isozymes. J Antib 2007; 69: 43—51.

47. Ohshiro T., Rudel L. L., Omura S., Tomoda H. Compared with acyl-CoA:cholesterol O-acyltransferase (ACAT) 1 and lecithin: cholesterol acyltransferase (ACAT2) displays the greatest capacity to differentiate cholesterol from sitosterol. J Biol Chem 2003.

48. Namatame I. H. Tomoda, Satoshi Omura. Antiatherogenic activity of fungal beauveriolides, inhibitors of lipid droplet accumulation in macrophages. J Antibiotics 1996; 49: 73—77.

49. Jegorov A., Sedmera P., Matha V. Beauverolides L and La from Beauveria tenella and Paecilomyces fumosoroseus. Phytochemystry 1994; 37: 1300—1303.

50,

51

Matsuda D., Namatame I., Tomoda H. et al. New beauveriolides produced by amino acid-supplemented fermentation of Beauveria sp. FO-6979. J Antibiotics 2004; 57: 1—9.

Naganuma S., Kuzuya N., Sakai K. et al. Inhibition of the accumulation of lipid droplets in macrophage J774 by bafilomycin B1 and destruxin E. Biochim Biophys Acta 1992; 1126: 41—48.

52. Nagai K., Woo J.T. Destruxins, cyclodepsipeptides block the formation of actin rings and prominent clear zones and ruffled borders in osteoclasts. Bone 2003; 33: 443—455.

53. Muroi M., Shiragami N., Takatsuki A. Destruxin B, a specific and readily reversible inhibitor of vacular-type H+ translocation ATPase. Biochem Biophys. Res Com 1994; 205: 1555—1563.

54. Hih-Yung Tang, Yi-Wen Chen et al. Beauvericin activated Ca2+- activated CI- current and deaths in Xenopus oocytes via influx of extracellular Ca2+. Chem Res Toxicol 2002; 15: 854—860.

55. Tsunoo A., Kamijo M. Non-cyclic AMP-dependent, positive inotropic cyclodepsipeptides with negative chronotropy1. J Pharm Exper Ther 1999; 290: 1006—1012.

56. Akinobu Tsunoo, Masayuki Kamijo, Naoki Taketomo et al. Roseocardin, a novel cardiotonic cyclodepsipeptide from Trichothecium roseum TT103. J Antibiiotics 1997; 50: 1007—1013.

57. Cai P., Smith D., Katz B. et al. Destruxin-A4 chlorohydrin, a novel destruxin from fugus OS-F68576: isolation, structure determination, and biological activity as an inducer of erythropoietin. J Nat Prod 1998; 61: 290—293.

58. Hamano K., Kinoshita M., Furuya K. et al. Leualacin, a novel calcium blocker from Hapsidospora irregularis I. Taxonomy, fermentation, isolation. physico-chemical and biological properties. J Antibiotics 1992; 45: 899.

59. Pal S., St Leger R. J., Wu L. P. Fungal peptide destruxin A plays a specific role in suppressing the innate immune response in Drosophila melanogaster. J Biol Chem 2007; 282: 8969—8977.

-Q-