Цитокиновый ответ при экспериментальной инфекции, вызванной listeria monocytogenes

ЦИТОКИНОВЫЙ ОТВЕТ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ LISTERIA MONOCYTOGENES

Антошина И. Ф., Мезенцева М.В., Ермолаева С.А., Шаповал И.М., Юров Д. С., Варфоломеев А. Ф.

НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф.Гамалеи РАМН, Москва, Россия

Работа посвящается изучению характеристик изменений показателей иммунного ответа на начальных этапах развития инфекции, вызванной L.monocytogenes, в зависимости от количества и свойств заражающих бактерий. Полученные результаты показывают, что на начальных этапах инфекции листерии способны подавлять основной для элиминации внутриклеточных паразитов Th1- тип иммунного ответа. Проведенные нами исследования важны для понимания степени нарушений иммунитета при инфекции, вызванной L. monocytogene, и в дальнейшем для разработки подходов к выбору тактики лечения листериоза и, возможно других заболеваний, вызываемых внутриклеточными бактериями.

Ключевые слова: Listeria monocytogenes, цитокины, Th1- тип иммунного ответа, Th2- тип иммунного ответа, in vivo.

Вирусы, внутриклеточные микробы, простейшие, злокачественные клетки вызывают заболевания, протекающие по клеточному типу иммунитета, тогда как внеклеточные микробы влияют на гуморальное звено иммунитета. Но при многих заболеваниях могут нарушаться оба типа иммунного ответа. При этом цитокины являются продуктом иммунокомпетентных клеток, в то же время иммунокомпетентные клетки служат мишенями действия цитокинов. Listeria monocytogenes является факультативным внутриклеточным паразитом, вызывающим тяжелое заболевание людей и животных, листериоз. Начиная с 1960-х гг., L. monocytogenes используют как модельный объект для изучения закономерностей развития иммунного ответа, характерного при инфекциях, вызываемых внутриклеточными бактериями.

Целью нашей работы являлась характеристика изменений показателей иммунного ответа на начальных этапах развития инфекции, вызванной L.monocytogenes, в зависимости от количества и свойств заражающих бактерий. Нами были проведены эксперименты, в которых мыши линии Balb/c были внутривенно инфицированы листериями дикого типа штамма EGDe, бактериями изогенных штаммов, с мутациями в генах, контролирующих продукцию PAMPs. В первой серии экспериментов при заражении мышей L. monocytogene в дозе 0,1 LD50 бактерии накапливались в печени мышей в небольших количествах, инфекция протекала в легкой форме и животные выздоравливали уже через 3 суток наблюдения. В следующей серии экспериментов исследовались закономерности изменения экспрессии генов цитокинов при средне-высокой степени инфицированности животных (1,0 LD50). Далее нами был проведен эксперимент при летальной дозе патогена (10 LD50). Животные погибали на 2 сутки после инфицирования.

Экспрессия генов 10 цитокинов (ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-1Р, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-а) оценивалась в спленоцитах, выделенных из селезенок мышей, по активности их мРНК, определяемых методами обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) [1] . Выделение РНК проводили по методике P.Chomczynsky, N.Sacchi [2]. Спленоциты выделяли в эксперименте через 6 часов, и далее каждый день в течении 3-7 суток после заражения животных L. monocytogene. В те же сроки производили высевы на чашки Петри для подсчета накопления бактерий в печени мышей.

Результаты, полученные в ходе проведенных экспериментов, схематически представленные в таблице, позволили сделать следующие выводы:

1) Показано, что при листериозе, не зависимо от степени заражения и штамма L.monocytogene, синтез ИЛ-10 на уровне экспрессии гена был либо подавлен, либо находился на уровне здоровых животных. А т.к. известно, что избыток ИЛ-10 приводит к снижению противоинфекционной защиты и развитию хронических инфекций, полученные данные подтверждают тот факт, что хроническая инфекция, вызванная исследованными патогенами, не развивается.

2) Отмечено, что при листериозе при низкой степени инфицированности у мышей на 2 - 3 сутки наблюдения наряду с экспрессией генов ИЛ-6 и ИЛ-10 отмечалась транскрипция ИЛ-4 - цитокинов, вырабатываемых Th-2 и обуславливающих гуморальный тип иммунного ответа. По-видимому, и выработка антител происходила у этих животных на 3 день после заражения. При средневысокой и летальной дозах заражения животных уже через 6 часов после инфицирования, у мышей был обнаружен активный синтез мРНК ИЛ-4 и ИЛ-6. Что может свидетельствовать о том, что антитела к инфекции начинали вырабатываться у мышей через 6 часов развития заболевания.

3) Установлены дозо-зависимые различия в профиле синтеза мРНК цитокинов в первые трое суток после инфекции, вызванной L. monocytogenes дикого типа. Так, при низких дозах заражения, происходило частичное подавление синтеза мРНК цитокинов, вырабатываемых Th2, а активность мРНК цитокинов, относящихся к Th1-типу, не изменялась. При средних дозах заражения, также происходило частичное подавление синтеза мРНК цитокинов, вырабатываемых Th2, и подавление цитокинов, характеризующих развитие ТЫ-тип иммунного ответа. При высокой дозе заражения на фоне подавления экспрессии генов цитокинов, характерных для Th1 типа иммунного ответа, наблюдалась активации синтеза цитокинов, характеризующих развитие иммунного ответа по Th2 пути.

В первые сутки развития инфекции у мышей, зараженных разными штаммами L. monocytogene с мутациями в геж lmo0028, кодирующем белок метаболизма пептиодгликана L,D-карбоксипептидазу, при низкой степени инфицированности было отмечено нарушение функций Т-1 звена иммунитета. А при средне-высокой и высокой степени инфицированности, было обнаружено нарушение функций практически всех иммунокомпетентных клеток организма, т.к. в экспериментах регистрировалось снижение экспрессии генов цитокинов, вырабатываемых Th-1, В-лимфоцитами и моноцитами/макрофагами, и дисбаланс в синтезе цитокинов, продуцируемых Th2.

Таким образом, на начальных этапах инфекции листерии способны подавлять основной для элиминации внутриклеточных паразитов Th1- тип иммунного ответа.

Проведенные нами исследования важны для понимания степени нарушений иммунитета при инфекции, вызванной L. monocytogene, и в дальнейшем для разработки подходов к выбору тактики лечения листериоза и, возможно других заболеваний, вызываемых внутриклеточными бактериями.

Таблица: Изменения иммунитета у мышей при экспериментальной инфекции, вызванной L.

monocytogene in vivo

Listeria monocytogene Низкая степень заражения Средне-высокая степень заражения Летальная доза

Wt - дикий штамм Ті ты (тил-6, тіил-4) і В-лимфоциты, моноциты/макрофаги Норма - ТЫ, ИЛ-10 Ті Th2 (ТИЛ-6, ТіИЛ-4, іИЛ-10) іТМ, B-лимфоциты, моноциты/макрофаги Т Th2 (ИЛ-4, ИЛ-6) іТМ, В-лимфоциты, моноциты/макрофаги Норма -ИЛ-10

d28 - штамм с делецией гена lmo0028 Ті ^ (тип-6, тіип- 4, іИЛ-10) ітм, моноциты/макрофаги Норма - ИФН-а, ИЛ-12, ФНО- а Ті Th2 (ТИЛ-6, ТіИЛ-4, іИЛ-10) іТМ, В-лимфоциты, моноциты/макрофаги Т Th2 (ИЛ-4, ИЛ-6) іТМ, моноциты/макрофаги Норма - ИФН- a, ИЛ-10, ФНО- a

i28 - штамм с инсерцией в гене lmo0028 - - Т Th2 (ИЛ-4, ИЛ-6) і В-лимфоциты, моноциты/макрофаги Норма -ИЛ-10, Th1

Примечание: | - активация клет ок/экспрессии генов цитокинов; j - подавление функций клеток/экспрессии генов цитокинов; Норма - на уровне здоровых животных.

ЛИТЕРАТУРА

1. С.М. Gelder, P.S Thomas, D. H. Yates et al //Thorax. 1995. 1 50. P. 1033-1037.

2. Chomczynski P., Sacchi N. // Anal. Biochem. 1987. 1 162. P. 156-159.

3. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2011г.

4. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2010г.

5. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2009г.

6. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2008г.

7. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2007г.

8. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2006г.

9. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2005г.

10. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2004г.

11. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2003г.

12. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2002г.

13. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2001г.

14. Сборник научных тезисов и статей «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2000г.

15. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2011г.

16. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2010г.

17. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2009г.

18. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2008г.

19. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2007г.

20. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2006г.

21. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2005г.

22. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2004г.

23. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2003г.

24. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2002г.

25. Электронный сборник научных трудов «Здоровье и образование в XXI веке». 2001г.

THE CYTOKINE ANSWER AT THE EXPERIMENTAL INFECTION CAUSED LISTERIA MONOCYTOGENES

Antoshina I.F., Mezentseva M. V, Ermolaeva S.A., Shapoval I.M., Jurov D.S., Varfolomeev A.F.

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia, 123098, Gamaleya st. 18,

Laboratory of latent infections

Work was devoted to studying changes of immune response indicator levels at the initial stages of the infection caused by L.monocytogenes in dependence on quantity and properties of infecting bacteria. The obtained results showed that L.monocytogenes is capable to suppress the basic for elimination of intracellular parasites Th1 - type of the immune answer at the initial stages of infection. Our research is important for understanding of degree of infringements of immunity during infection caused by L. monocytogenes, and further for working out of approaches to a choice of tactics for listeriosis treatment and, it is possible other diseases caused by intracellular bacteria.

Keywords: Listeria monocytogenes, cytokines, Th1 - type of the immune answer, Th2 - type of the immune answer, in vivo.