РЕКОМБИНАНТНЫЕ AAV ВЕКТОРЫ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ОСТЕОПРОТЕКТИВНЫЕ ГЕНЫ, ВКЛЮЧАЯ HAS2 И ЛУБРИЦИН, ПРИГОДНЫЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ОСТЕОАРТРИТА И СХОДНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СУСТАВОВ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
RECOMBINANT AAV VECTORS EXPRESSING OSTEOPROTECTIVE GENES, INCLUDING HAS2 AND LUBRICIN, SUITABLE IN TREATMENT OF OSTEOARTHRITIS AND SIMILAR JOINT DISEASES IN MAMMALS

Перекрестные ссылки на родственные заявки
Данная заявка заявляет приоритет предварительной патентной заявки США № 62/278,243, зарегистрированной 13 января 2016, и тем самым полностью включенной в данное описание путем отсылки.
Заявление относительно перечня последовательностей
Перечень последовательностей, относящихся к данной заявке, предоставляется в текстовом формате вместо бумажной копии, и тем самым полностью включается в данное описание путем отсылки. Название текстового файла, содержащего Перечень последовательностей - MER 16-291 SEQ Listing_ST25.txt. Текстовый файл имеет размер 57.6 KB; был создан 13 января 2016 и был передан в электронном виде через EFS-Web, одновременно с подачей данного описания изобретения.
Область техники
Настоящее изобретение имеет отношение к рекомбинантным векторам, к фармацевтическим композициям, содержащим такие рекомбинантные векторы, и к способам предотвращения и/или лечения острых и/или хронических заболеваний суставов, включая остеоартрит, у млекопитающих. В частности, изобретение имеет отношение к векторам на основе аденоассоциированного вируса (AAV), способным экспрессировать у хозяина биоактивный полипептид, принадлежащий к семейству белков гиалуронсинтазы 2 (HAS2), и лубрицин (PRG4). Соответственно, изобретение имеет отношение к области генной инженерии и обеспечивает биологическую доставку на основе аденоассоциированного вируса (AAV) и систему экспрессии для использования при лечении остеоартрита суставов у человека и млекопитающих посредством длительной генной экспрессии HAS2 и LUB в синовиальных клетках и хондроцитах.
Раскрытие изобретения
Остеоартрит (OA) является дегенеративным заболеванием суставов у млекопитающих, которое представляет собой трудную экономическую и медицинскую проблему (Matthews, G.L., и Hunter, D.J. (2011). Expert Opin. Emerging Drugs 1-13.; Brooks PM. Curr Opin Rheumatol 2002; 14: 573-577). Хрящ - это жесткая соединительная ткань, покрывающая окончания костей в местах соединений (суставах). Он обеспечивает относительное отсутствие трения, «сильно смазанную» поверхность между негнущимися костями и дает возможность плавного движения. В ходе развития OA хрящ частично или полностью утрачивается вследствие ненормального или повышенного «износа», приводя к тому, что концы костей обнажаются и трутся друг об друга, что является причиной воспаления, боли, отечности и потери подвижности. В настоящее время детальные причины первоначальной потери хряща, приводящие к OA, неизвестны, однако наблюдается сильная корреляция между числом случаев и возрастом, ожирением и перегрузкой, например, чрезмерной спортивной активностью.
У собак остеоартрит (OA) - одна из наиболее часто встречающихся причин хромоты, по оценкам он затрагивает приблизительно 20 процентов собак в возрасте выше одного года. В настоящее время нет способа лечения ОА, приводящего к выздоровлению, в связи с этим медицинское лечение в большинстве случаев нацелено на облегчение симптомов, а не на восстановление хряща. Обезболивающее лечение обычно включает стероидные и нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAIDS), показавшие эффективность при лечении OA в течение нескольких десятилетий. Однако при том что эти лекарственные средства могут подавлять воспаление в суставах, известно, что многие из них оказывают отрицательное действие на хрящ, усугубляя лежащий в основе процесс развития OA. В дополнение к традиционной обезболивающей и противовоспалительной терапии используется, с разной степенью успеха, прямое введение остеопротективных соединений природного происхождения для облегчения симптомов OA. Например, гиалуроновая кислота (HA) широко используется для восстановления вязкоэластичности и «смазки» поврежденных суставов. Кроме того, некоторую эффективность демонстрируют полисульфатированные гликозаминогликаны (PSGAGs), введенные внутрисуставным или внутримышечным путем, и введенные пероральным путем глюкозамин и хондроитин сульфат.
Однако для достижения реального облегчения симптомов вышеназванные лекарственные средства необходимо вводить часто, иногда даже в комбинации друг с другом. Эти частые суставные инъекции являются сложными/дорогими, несут риск инфекций и являются причиной стресса у пациента или животного. Также разрабатываются хирургические подходы, в большинстве случаев имеющие низкую эффективность у собак и лошадей, и обычно они используются только в отношении пациентов с тяжелой запущенной стадией болезни.
В дополнение к доставке вспомогательных/лекарственных средств некоторые группы исследователей попытались улучшить симптомы OA путем доставки вязкоэластичных/вязко-протективных полипептидов, нуклеиновых кислот, кодирующих их, или полипептидов или нуклеиновых кислот, способных экспрессировать у хозяина средства для продуцирования вязко-протективного белка (например, фермента). Наиболее интересные подходы включают использование полипептидов лубрицина (Flannery, США 7,642,236 B2), трибонектинов (США 7,618,914 B2, Центральный госпиталь Род-Айленда) и гиалуронансинтазы (США 6,423,514, to Millennium Pharmaceuticals).
Некоторые из этих попыток могут быть охарактеризованы как “генотерапия”, основные концепции которой хорошо определены (Evans CH, Robbins PD. Gene therapy for arthritis, In: Wolff JA (ed.). Gene Therapeutics: Methods и Applications of Direct Gene Transfer. Birkhauser: Boston, 1994, pp. 320-343). Недавно одна группа исследователей попыталась лечить остеоартрит с помощью доставки in vivo гена антагониста рецептора интерлейкина-1 (Il-1Ra) (США 2015/0031083 A1, Бэйлорский медицинский колледж; и смотри Frisbie, DD et al., Gene Therapy (2002)).
Компания Arthrogen использовала AAV5 для экспрессии человеческого интерферона бета (для уменьшения воспалительного цитокина) в случае ревматоидного артрита (RA). В отличие от OA в патологии RA передача воспалительного сигнала играет существенную роль, вследствие чего блокировка этого сигнала является ключевым терапевтическим подходом. В то же время другая группа, фокусируя внимание на возможной связи между воспалением и OA, использовала рекомбинантный AAV2 для экспрессии антагониста IL1 рецептора в случае лошадиного OA (Goodrich et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids (2013) 2, e70).
Тем не менее не доказана универсальная эффективность ни одного из этих подходов, и в этом отношении остается значительная неудовлетворенная потребность, касающаяся освобождения от боли и страданий пациентов с OA. Из этого следует, что существует явная и еще неудовлетворенная потребность медицины в более эффективных способах лечения, которые также являются экономически эффективными в долгосрочном плане.
Соответственно, как подробно описано в этом документе, заявители впервые успешно продемонстрировали, что векторы рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) могут доставлять кДНК, кодирующие терапевтические средства, с помощью однократной внутрисуставной инъекции в сустав млекопитающего с целью обеспечения локального и непрерывного продуцирования средства in vivo в синовиоцитах и хондроцитах.
Заявители также впервые выделили и секвенировали полноразмерную кДНК собачьего лубрицина (SEQ ID NO:4).
Настоящее изобретение предоставляет rAAV векторы, экспрессирующие in vivo у хозяина-млекопитающего терапевтически эффективные количества остеопротективных (защитных) и/или остеорегенеративных (восстанавливающих) генных продуктов.
В других аспектах rAAV может содержать кДНК, кодирующую агент с болезнь-модифицирующими, смазывающими, противовоспалительными и обезболивающими свойствами.
В других аспектах, rAAV вектор является вектором, происходящим из AAV серотипа, включая без ограничения, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8 и AAVrh.10. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV содержит ITR AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8 или AAVrh.10. В следующих вариантах осуществления rAAV частица содержит капсидные белки AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8 или AAVrh.10. В некоторых вариантах осуществления ITR и капсид происходят из одного и того же серотипа AAV. В других вариантах осуществления ITR и капсид происходят из разных серотипов AAV. В некоторых вариантах осуществления rAAV векторы могут быть AAV2 или AAV5 серотипов капсида. В некоторых родственных вариантах осуществления rAAV2 и rAAV5 векторы содержат, по меньшей мере, один ITR, происходящий из AAV2.
В некоторых аспектах вариантов осуществления rAAV векторы кодируют синтазу-2 гиалуроновой кислоты (HAS2) или ее вариант. В некоторых вариантах осуществления HAS2 представляет собой человеческую HAS2. В других вариантах осуществления HAS2 представляет собой собачью HAS2. В некоторых вариантах осуществления HAS2 представляет собой кодон-оптимизированную HAS2.
Гликозаминогликан гиалуроновая кислота (HA) представляет собой несульфатированный гликозаминогликан, состоящий из повторяющихся остатков глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина, соединенных бета-1-3 и бета-1-4 гликозидными связями. Она осуществляет различные биологические функции, включая заживление ран, клеточную миграцию, злокачественную трансформацию и обновление тканей. HA синтезируется различными типами клеток, включая эндотелиальные клетки, фибробласты и гладко-мышечные клетки, и присутствует в таких тканях как соединительная, эпителиальная и нервная ткань. В суставной щели HA вырабатывается синовиоцитами, которые секретируют HA в синовиальную жидкость, а также хондроцитами. HA синовиальной жидкости обеспечивает «смазку», гидратацию ткани, структурную целостность и каркасную структуру для белков матрикса и биомеханики, а также играет роль в гомеостазе сустава. Биологические эффекты HA в суставе определяются ее концентрацией и молекулярным весом. Она может синтезироваться весом в пределах от 5000 Da до 10000000 Da. HA низкого молекулярного веса (<500 кДа) вовлечена в рецептор-опосредованную активацию ангиогенеза, малигнизацию и воспаление, тогда как более высокомолекулярная HA обеспечивает «смазку» в суставе.
Размеры и концентрация суставной HA регулируется как скоростью ее синтеза, так и деградации. Деградация HA опосредуется гиалуронидазами, которые расщепляют HA на маленькие фрагменты, которые выходят в лимфатическую систему для удаления. Описаны три фермента, вырабатывающие HA и называемые гиалуронсинтазами (HAS) 1 2 и 3, которые находятся на внутренней поверхности плазматической мембраны в синовиоцитах. Показано, что HAS2 отвечает за выработку высокомолекулярной HA (Itano et al., 1999). Сообщалось, что уровни высокомолекулярной HA снижаются в остеоартритических суставах и у пациентов и у животных моделей с OA (Plickert et al., 2013). Вероятно, это происходит вследствие как уменьшенного синтеза HA, так и повышенной деградации HA посредством гиалуронидаз. Из числа HA-синаз HAS2 и 3 экспрессируются в хряще человека, а экспрессия одной из них, HAS2, снижается при ОА у человека. Уровни HA также снижаются вследствие повышенных уровней гиалуронидазы 2 - фермента, вызывающего деградацию HA (Yoshida et al.). Сообщалось, что промотор HAS2 находится под влиянием различных про- и анти-воспалительных медиаторов, при этом сообщалось о противоречивых результатах. К ним относятся TGFβ, первичный эпидермальный фактор роста, TNF-альфа и ретиноевая кислота (Guo, Kanter et al., 2007, Hyc et al., 2009). Как ожидается, понижающая регуляция с помощью воспалительных медиаторов в подверженных болезни суставах уменьшит экспрессию HAS2, приводя к сниженным уровням HA, и сможет выборочно влиять на различные изоформы HAS (David-Raoudi et al., 2009). В противоположность этому, сообщалось, что механическая стимуляция (Momberger et al. 2005) или компоненты хряща, такие как хондроитинсульфат, стимулируют выработку HA (Momberger et al., 2005, David-Raoudi et al., 2009). Выработка HA обуславливает перицеллюлярную локализацию, а также секрецию в экстрацеллюлярное пространство. Не ясно, что регулирует степень секреции. Однако, как правило, примерно 80% HA секретируется, тогда как остальная часть остается связанной с продуцирующими клетками. Эта клеточно-ассоциированная HA важна для сборки матричных белков; блокирование синтеза HAS2 приводит к уменьшению клеточно-ассоциированного матрикса и повышенному высвобождению протеогликанов (т.е. аггрекана) в среду, также подтверждая главную роль HAS2 как основного фермента, синтезирующего HA в хондроцитах (Nishida et al., 1999).
В некоторых аспектах вариантов осуществления rAAV векторы кодируют лубрицин или его вариант. В некоторых вариантах осуществления лубрицин является человеческим лубрицином. В других вариантах осуществления лубрицин является собачьим лубрицином. В некоторых вариантах осуществления лубрицин является кодон-оптимизированным лубрицином.
Лубрицин (PRG4), представляющий собой крупный муциновый гликопротеид, вырабатываемый клетками, выстилающими синовиальную полость, и хондроцитами хряща, обеспечивает защитную смазку для хрящевых поверхностей (Flannery 1999, Schmidt 2001, Waller 2013). Лубрицин наряду с HA также является важным смазывающим компонентом в синовиальной жидкости, обеспечивающим амортизацию. Отсутствие лубрицина на мышиной модели и при редких генетических заболеваниях у человека приводит к дегенерации хряща, характерной для (OA) (Rhee 2005, Ruan 2013). Пониженный синтез лубрицина обнаружен у пациентов с OA и на различных животных моделях OA (Elsaid, 2008). Показано, что дополнение внутрисуставного лубрицина рекомбинантным лубрицином улучшает патологическое состояние хряща (Flannery 2009).
В некоторых вариантах осуществления rAAV векторы могут быть AAV2 или AAV5 серотипами капсида, кодирующими кодон-оптимизированную гиалуронсинтазу-2 (HAS2) собаки.
В некоторых аспектах rAAV вектор вводится посредством внутрисуставной доставки. В некоторых вариантах осуществления rAAV вводится при помощи одной внутрисуставной доставки. В другом варианте осуществления после внутрисуставного введения in vivo выработка и секреция терапевтического агента из rAAV-трансдуцированных клеток может продолжаться, по меньшей мере, примерно 6 месяцев.
В некоторых вариантах осуществления rAAV вектор содержит экспрессионную кассету, содержащую универсальный промотор и кодон-оптимизированный и совпадающий по виду трансген (см., например, фиг. 1A).
В другом аспекте раскрытие предоставляет способ применения rAAV векторов для экспрессии in vivo в суставе животного остеопротективных и/или остеорегенеративных генных продуктов.
Все приведенные в описании ссылки, включая патентные заявки и публикации, полностью включаются в описание путем отсылки.
Краткое описание чертежей
Следующее подробное описание предоставлено в качестве примера, не предназначено для ограничения изобретения только конкретными описанными вариантами осуществления и может быть более понятным в сочетании с прилагаемыми чертежами:
фиг. 1A - диаграмма, показывающая HAS экспрессионную кассету в плазмиде (сверху) и rAAV вирусный вектор (внизу);
фиг. 1B - график, показывающий выработку HA из клеток, трансфицированных cHAS2 плазмидой экспрессии. Плазмида экспрессии cHAS была трансфицирована в 293 клетки, кондиционированную среду собирали через 3 дня, и количественно определяли уровни HA в среде, используя систему детекции на основе HA-связывающего белка. Сокращения: CBAcHAS2, HAS2 плазмида экспрессии. EGFP, EGFP плазмида экспрессии. Нетрансфицированные, отрицательные контрольные клетки. “Optimem” = клетки росли в среде без сыворотки. “Complete” = клетки росли в среде, содержащей сыворотку;
фиг. 1C показывает агарозные гели, использованные для разделения компонентов кондиционированной среды из cHAS-трансфицированных 293 клеток (+ или - обработка гиалуронидазой в течение 24 час), подтверждающие экспрессию HA. Сокращения: CM, кондиционированная среда. МДа, молекулярный вес или маркеры;
фиг. 2A - график, показывающий продуцирование rAAV вектора из мелкомасштабной упаковки cHAS2 в rAAV2 и AAV5 векторы с использованием метода тройной трансфекции. Упаковка EGFP кассеты экспрессии в AAV2 показана в качестве положительного контроля и упаковка cHAS при отсутствии плазмиды капсида в качестве отрицательного контроля. Выход rAAV показан как количество частиц, устойчивых к ДНКазе (DRP), на клетку;
фиг. 2B - график, показывающий «выход» rAAV вектора при производстве в больших масштабах путем тройной трансфекции. Показаны примеры общих титров для нескольких полученных партий вектора;
фиг. 2C - график, показывающий эффективность AAV2/HAS2 векторов in vitro. 293 клетки были инфицированы различными MOI, и HA уровни в кондиционированной среде были количественно определены через 3 дня;
фиг. 2D - графики, показывающие эффективность AAV5/HAS2 векторов in Vitro;
фиг. 3A - график, показывающий изменения веса тела после внутрисуставной инъекции rAAV/HAS2 векторов в нормальные суставы собак;
фиг. 3B - график, показывающий подсчет баллов при оценке хрящевой ткани;
фиг. 3C - график, показывающий подсчет баллов при оценке синовиальной ткани;
фиг. 4A - диаграмма, показывающая места отбора образцов для количественной оценки rAAV вектора в синовиальной ткани собаки;
фиг. 4B - график, показывающий количественный анализ копий генома вектора в синовиальном образце №3;
фиг. 4C - график, показывающий копии генома вектора в синовиальном образце №1. Доза вектора для AAV2 и AAV5 показана как L=низкая, M=средняя и H=высокая (как на фиг. 3A-C). Все образцы ткани были собраны через 28 дней после доставки вектора rAAV и проанализированы с помощью количественной ПЦР в отношении BGHpA;
фиг. 5A - график, показывающий cHAS экспрессию, полученную из вектора, в синовиальном образце №3;
фиг. 5B - график, показывающий мРНК вектора в синовиальном образце №1;
фиг. 5C - график, показывающий геном вектора и мРНК, получаемую от вектора, в исследованном синовиальном образце №3 от каждой отдельной собаки. Доза вектора для AAV2 и AAV5 показана как L=низкая, M=средняя и H=высокая. Все образцы ткани были собраны через 28 дней после доставки вектора rAAV и проанализированы с помощью количественной ПЦР в отношении BGHpA;
фиг. 6A - диаграмма, показывающая местоположение образцов мыщелка бедренной кости и плато большеберцовой кости, собранных для обнаружения rAAV вектора и мРНК в хряще;
фиг. 6B - график, показывающий геном вектора и мРНК, получаемую от вектора, у каждой отдельной собаки, проанализированный при исследовании образца мыщелка бедренной кости №1. В дополнение к этому, показаны копии генома вектора в контралатеральном (неинъецированном правом суставе) (за исключением образца №22, который не был протестирован);
фиг. 6C - график, показывающий среднюю величину генома вектора (инъецированные и неинъецированные суставы) и числа копий мРНК в каждой группе. Доза вектора для AAV2 и AAV5 показана как L=низкая, M=средняя и H=высокая (смотри фиг. 3). Все образцы ткани были собраны через 28 дней после доставки вектора rAAV и проанализированы с помощью количественной ПЦР в отношении BGHpA;
фиг. 6D - график, показывающий среднюю величину генома вектора (суставы, инъецированные PBS или вектором) и числа копий мРНК в хряще верхней суставной поверхности большеберцовой кости в каждой группе;
фиг. 7A - график, показывающий геномы векторов в синовиальной ткани (образцы №3 и №1) и хряще (мыщелок бедренной кости и плато большеберцовой кости) в каждой лечебной группе в тканях, собранных из левых коленных суставов. Значения, показанные на фиг. 7A и 7B, представляют собой среднее значение в группе ± стандартное отклонение (n=5/группа);
фиг. 7B - график, показывающий количественную оценку геномов вектора и мРНК из rAAV5/HAS2 вектора в различных тканях;
фиг. 8A - график, показывающий уровни HA в синовиальной жидкости собак. Уровни HA были количественно определены в SF образцах, собранных на день -7 (исходный) и день 28. Уровни HA у каждого животного были нормализованы относительно исходных уровней и выражены как % HA на день 28 по сравнению с неделей до введения вектора;
фиг. 8B - график, показывающий уровни HA в синовиальной жидкости собаки на день -7 (исходный) и день 28. Стрелки показывают животных с более высокими уровнями HA на день 28 по сравнению с исходным (до лечения);
фиг. 9 показывает полную аминокислотную последовательность лубрицина собаки. Расположение экзона 6 (муциновый домен) показано рамками. Подчеркнутые аминокислоты (с 378 по 782) удалены в укороченном собачьем лубрицине (далее “cLub1” или “cLub1co”), и расположение KEPAPTT-подобных повторов (возможные O-связанные сайты гликозилирования) показано жирным шрифтом. Когда название последовательности заканчивается на “co”, это означает, что кДНК последовательность является “кодон-оптимизированой”. Аналогично, “nonco” обозначает кодон-неоптимизированную последовательность;
фиг. 10 - диаграмма, показывающая полученные и использованные в экспериментах плазмиды. Плазмиды содержат укороченную (т.е. встроенную внутриклональную делецию), кодон-оптимизированную последовательность собачьего лубрицина (cLub1co), промотор (minCBA или CBA) и BGHpA сайт. Некоторые конструкции содержат N- или C-концевые гистидиновые метки (C-конец) и модификацию ATG (возможные инициирующие кодоны), удаленных из интронной последовательности. Превирусная AAV лубрицин плазмида также содержит фланкирующие ITR последовательности на обоих концах;
фиг. 11A - график, показывающий мРНК копий/клетку, продуцированные в том случае, когда minCBA cLub1, CBA CLUB1 и CBH cLub-nonco конструкции были трансфицированы в 293 клетки;
фиг. 11B - график, показывающий мРНК копий/клетку, продуцированные в том случае, когда ΔATG/6His/N', 6His/N', 6His/C', WT cLub и EGFP конструкции были трансфицированы в 293 клетки;
фиг. 12A - анти-лубрицин вестерн-блот, показывающий уровни секретированного лубрицина в кондиционированной среде (плазмиды, описанные выше). Синовиальную жидкость собаки использовали в качестве контроля;
фиг. 12B - вестерн-блот, показывающий выработку лубрицина из пре-вирусных плазмид, экспрессирующих лубрицин. Были исследованы и сравнены два клона в отношении экспрессии, полученной с помощью minCBA-cLubco плазмиды. В качестве отрицательных контролей были взяты культуральная среда нетрансфицированных клеток и клеток, трансфицированных EGFP-экспрессирующей плазмидой;
фиг. 13A - график, показывающий выход при мелкомасштабном продуцировании для векторов AAV2, кодирующих собачий лубрицин. Были проанализированы два cLub клона (-/+ 6xHis-tag) и сравнены с упаковкой EGFP и HAS2 кассет экспрессии имеющихся pre-вирусных (ITR-содержащих) плазмид. Отрицательные контроли включали нетрансфицированные клетки и трансфекции экспрессирующей плазмидой, не содержащей AAV2 капсид;
фиг. 13B - график, показывающий выход при мелкомасштабном продуцировании для векторов AAV5, кодирующих собачий лубрицин. Пре-вирусные плазмиды для EGFP и cLub кассет экспрессии были трансфицированы вместе с AAV5 капсид экспрессирующей плазмидой;
фиг. 14 - анти-лубрицин вестерн-блот, показывающий экспрессию лубрицина собаки из rAAV5 вектора in vitro. Человеческие 293 клетки были инфицированы rAAV5/minCBA-cLub1 в различных количествах в течение 72 час с последующей концентрацией кондиционированной культуральной среды. Культуральную среду от AAV5/CBA-EGFP инфицированных клеток использовали в качестве отрицательного контроля. Культуральную среду от клеток, трансфицированных пре-вирусной экспрессирующей лубрицин плазмидой, использовали в качестве положительного контроля;
фиг. 15 - Сводная таблица SEQ ID NOs;
фиг. 16 - выравнивание лубрицина собаки и человека;
фиг. 17 - график, показывающий уровни HA в разные моменты времени в синовиальной жидкости собаки при использовании MMR-модели. Синовиальную жидкость собирали за неделю до индукции OA (пре), через две недели после индукции и перед введением тестируемого препарата (день 0) и через 57, 112 и 182 дней после доставки тестируемого препарата;
фиг. 18A - график, показывающий обнаружение и экспрессию rAAV5 вектора в синовиальных образцах из суставов собак с OA через 182 дня после введения вектора;
фиг. 18B - график, показывающий обнаружение и экспрессию rAAV5 вектора в хряще (мыщелок бедренной кости) суставов собак с OA через 182 дня после введения вектора;
фиг. 18C суммирует геном AAV5 вектора и обнаружение cHAS2 мРНК в синовиальных и хрящевых образцах на день 182 на собачьей MMR-модели OA;
фиг. 19 показывает окрашенные сафранином-O срезы поверхностей хряща, полученных с медиальной поверхности суставов собак, которых обрабатывали одним PBS и rAAV5/cHAS2, в качестве примеров.
Подробное описание изобретения
Остеоартрит (OA) является одной из наиболее часто встречающихся причин хромоты у млекопитающих и у собак, по оценкам он затрагивает приблизительно 20% собак в возрасте более одного года. OA представляет собой прогрессирующую и дегенеративную болезнь, приводящую к появлению боли, воспаления и снижению подвижности сустава. Для лечения OA требуются новые безопасные и эффективные методы лечения, которые улучшат «смазку» сустава и уменьшат воспаление и боль. Как раскрывается в описании, заявители обнаружили, что векторы рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) можно использовать для доставки генов, кодирующих терапевтические средства, посредством однократной внутрисуставной инъекции с целью обеспечить локальную и длительную продукцию средства в суставе. Были получены rAAV векторы с AAV2 и AAV5 серотипами капсида, кодирующие кодон-оптимизированную синтазу-2 гиалуроновой кислоты (HA) собаки (HAS2).
11
11
Двадцать две взрослых здоровых собаки, серонегативные в отношении AAV2 и AAV5 капсидов, получили rAAV2 (1, 5 и 10×10 векторных геномов/сустав), rAAV5 (5×10 векторных геномов/сустав) или PBS (контроль) с помощью внутрисуставной инъекции. Не было отмечено неблагоприятных клинических признаков после 28-дневного наблюдения. Гистопатологическое исследование показало минимальное синовиальное воспаление в суставах, обработанных rAAV5, и отсутствие значительных изменений в rAAV2 лечебных группах. Геномы вектора (VG) были обнаружены в синовиальной оболочке всех rAAV-обработанных суставов и в большинстве образцов хряща. rAAV5 векторы обуславливали повышенное обнаружение VG и мРНК экспрессии по сравнению с rAAV2 в обеих тканях. Предварительный анализ также показал тенденцию к повышению уровней HA в синовиальной жидкости обработанных суставов. В итоге, наше исследование продемонстрировало перенос генов в ткани сустава собаки и приемлемый профиль безопасности при использовании rAAV2 и rAAV5 векторов, кодирующих HAS2 при введении с помощью однократной внутрисуставной инъекции у некоторого числа собак.
HA синтаза 2 собаки. В одном аспекте изобретения раскрытие предоставляет вектор рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), состоящий из AAV капсида и одноцепочечного ДНК-генома. Вирусные капсиды согласно раскрытию могут обеспечивать поглощение вектора в клетки сустава с последующей транспортировкой в ядра клеток, приводя к экспрессии терапевтического гена. В некоторых вариантах осуществления геном ДНК содержит один или более AAV инвертированных концевых повторов (ITR), фланкирующих одну или более кассет экспрессии, с целью экспрессии in vivo у животного-хозяина терапевтического гена. В некоторых вариантах осуществления изобретения вирусные гены не будут присутствовать или экспрессироваться из rAAV генома.
В некоторых вариантах осуществления изобретения с того момента, когда rAAV вводится животному и поглощается клетками животного, rAAV геном будет существовать в виде экстрахромосомной эписомы. В некоторых вариантах осуществления rAAV раскрытия может продолжать действовать продолжительное время в клетках сустава; например, но не ограничиваясь этим, примерно более 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 1 года, 2 лет или 3 лет. Экспрессия эписомальным rAAV будет продолжаться, приводя к выработке и секреции терапевтического средства в синовиальную жидкость, тем самым обеспечивая локальную и продолжительную выработку средства непосредственно в суставе. Выбранный трансгенный продукт может способствовать здоровому состоянию сустава, увеличивая «смазку» сустава, уменьшая боль и деградацию хряща и тому подобное.
В другом аспекте изобретение предоставляет способ лечения нуждающихся в этом животных, включающий стадию введения животному терапевтически эффективного количества rAAV согласно раскрытию. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение собакам предложенного продукта напрямую в затронутый болезнью сустав. В некоторых вариантах осуществления однократного лечения достаточно для того, чтобы получить значительное улучшение в состоянии животного.
В других вариантах осуществления лечение повторяется. В некоторых вариантах осуществления лечение повторяется в пределах 2-3 недель после первого введения, и в других вариантах осуществления второе введение предоставляется более чем через 3 недели после первого. В некоторых родственных вариантах осуществления второе дозирование включает введение rAAV с тем же самым терапевтическим геном, и rAAV содержит капсид того же самого серотипа, как в ходе первого лечения, а в других родственных вариантах осуществления второе дозирование включает введение rAAV с тем же самым терапевтическим геном, но rAAV содержит капсид серотипа, отличного от серотипа капсида при первом дозировании. В некоторых вариантах осуществления rAAV имеет капсид серотипа 5. В родственных вариантах осуществления, когда требуется повторное введение, первое дозирование может включать введение rAAV, имеющего капсид серотипа 5, а второе дозирование может включать введение rAAV, имеющего капсид серотипа 5.
В некоторых аспектах сверхэкспрессия белка HAS2 в остеоартритическом суставе повышает уровни HA в синовиальной жидкости и улучшает здоровье сустава путем увеличения смазывающих, противовоспалительных и обезболивающих свойств HA. Показано, что сверхэкспрессия HAS2 приводит к повышению уровней HA в культуральной среде различными типами клеток in vitro. Это было продемонстрировано с использованием CHO, 293 и COS клеток, устойчиво трансфицированных или временно трансфицированных. Чтобы обеспечить сверхэкспрессию HA в суставе in vivo, кДНК HAS2 может быть доставлена в хрящ и/или синовиальный слой, обычные места синтеза HA, при помощи rAAV вектора, кодирующего HAS2 кассету экспрессии. Не желая быть связанными теорией, отметим, что перенос генов в клетки будет обеспечивать HAS2 кассету экспрессии для длительной экспрессии HAS2 и последующей выработки HA. Поскольку терапевтический вектор будет содержать универсальный промотор, он не будет подвергаться подавлению воспалительными медиаторами, присутствующими в остеоартритическом суставе в отличие от эндогенного HAS2 промотора. В том случае, когда вектор вводится путем внутрисуставной инъекции, это может привести к трансдукции различных типов клеток, при этом основным типом клеток являются синовиоциты. Наконец, было показано, что одного HAS2 протеина достаточно для того, чтобы синтезировать HA, и считается, что другие ассоциированные белки или компоненты не являются необходимыми для продуцирования HA in vitro (Yoshida et al.).
Собачий лубрицин. В некоторых аспектах продукция лубрицина в остеоартритических суставах увеличивается посредством внутрисуставной доставки рекомбинантного аденоассоциированного вирусного (rAAV) вектора, кодирующего лубрицин, в качестве возможного лечения остеоартрита (OA) у собак. Лубрицин представляет собой большой секретируемый гликопротеин, который работает как смазывающее вещество и защищает хрящевые поверхности в суставе. В этом документе описывается открытие и получение кДНК полноразмерного собачьего лубрицина, который был использован для конструирования укороченной и кодон-оптимизированной версии собачьего лубрицина (cLub1co). Последний затем используется для создания различных плазмид, экспрессирующих лубрицин. После трансфекции в HEK293 клетки плазмиды были охарактеризованы в отношении продуцирования мРНК и белка лубрицина. Результаты показали и выработку мРНК лубрицина и секрецитированный лубрицин из каждой конструкции. rAAV векторы были созданы с кассетой экспрессии cLub1co и продемонстрировали возможность продуцирования вектора rAAV/cLub1. Клетки HEK293, инфицированные этой конструкцией, синтезировали и секретировали собачий лубрицин.
Способы и композиции, описанные в этом документе, также могут использоваться для терапевтического лечения остеоартрита. Термины "терапия" или "терапевтическое лечение", в связи с тем, что они относятся к остеоартриту, и поскольку они используются в данном описании и в области ветеринарной медицины, имеют отношение к лечению или поддержанию и/или ускорению лечения субъектов, уже страдающих от или восстанавливающихся (например, находящихся на фазе выздоровления) после остеоартрита, или лечению, целью которого является замедление потери хряща и/или восстановление хряща у субъектов с поставленным диагнозом остеоартрита или имеющих риск развития остеоартрита. Важнейшей целью терапии является уменьшение риска развития процесса в сторону потери хряща и кости. В описании утверждается, что субъект страдает от остеоартрита или подвергается риску развития остеоартрита, в том случае, если с достаточной вероятностью ожидается, что субъект будет страдать от прогрессирующей потери хряща, связанной с остеоартритом. Страдает ли конкретный субъект от остеоартрита или подвергается риску развития остеоартрита, легко может установить специалист в соответствующей ветеринарной или медицинской области.
Способы и композиции, описанные в документе, также могут использоваться для профилактического лечения остеоартрита. Термины "предотвращение", "профилактика", "предупредительное лечение" и "профилактическое лечение", учитывая, что они относятся к остеоартриту и используются в области человеческой и ветеринарной медицины, имеют отношение к лечению или здоровых субъектов или субъектов, страдающих от неродственных заболеваний, у которых, однако, имеется риск развития остеоартрита.
В этом документе описываются терапевтические и профилактическое способы лечения остеоартрита, в которых используются фармацевтические композиции, содержащие векторы, способные экспрессировать HAS или полипептиды лубрицина in vivo, и способы и композиции, вызывающие длительное увеличение в суставе концентраций гиалуроновой кислоты или лубрицина, для того, чтобы уменьшить или устранить потерю хряща.
Как предусмотрено в описании, фармацевтическая композиция обладает "терапевтической эффективностью" или является "терапевтически эффективной" в том случае, если введение этого количества композиции достаточно, чтобы вызвать значительное улучшение клинических признаков или измеряемых маркеров болезни у субъекта-млекопитающего, страдающего от остеоартрита. При использовании в описании фармацевтическая композиция обладает "профилактической эффективностью" или является "эффективной" в том случае, если введение этого количества композиции достаточно, чтобы предотвратить развитие остеоартрита у субъекта.
Также в документе описывается вектор, способный экспрессировать in vivo у хозяина HAS или полипептид лубрицина или их варианты или фрагменты или их комбинации. В вариантах осуществления HAS или полипептиды лубрицина для использования в настоящем изобретении генетически адаптируются к целевым биологическим видам (например, векторы, кодирующие собачий HAS2, доставляются страдающим от OA собакам).
Примеры “вариантов”, “производных” и тому подобного, описанного в данном документе, включают, но не ограничиваются этим, варианты HAS и лубрицина, производные, и тому подобное, которые кодируются нуклеотидными последовательностями, которые не являются точно такими же, как нуклеотидные последовательности, раскрытые в описании, но в которых изменения в нуклеотидных последовательностях не изменяют закодированную аминокислотную последовательность, или приводят в результате к консервативным заменам остатков аминокислот, делеции дополнительной одной или нескольких аминокислот, замене остатков аминокислот аминокислотными аналогами, которые незначительно влияют на свойства закодированных полипептидов (например, вариант или производное имеет примерно более 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% желательной активности полипептида дикого типа), и тому подобное. Примеры консервативных аминокислотных замен включают замены глицин/аланин; замены валин/изолейцин/лейцин; замены аспарагин/глутамин; замены аспарагиновая кислота/глутаминовая кислота; замены серин/треонин/метионин; замены лизин/аргинин; и замены фенилаланин/тирозин/триптофан. Другие типы замен, изменений, дополнений, делеций и производных, которые дают в результате функциональные производные HAS или лубрицина, также описываются в этом документе, и специалисту в данной области техники хорошо известно, как сделать, идентифицировать или выбрать такие варианты или производные, и как протестировать эти варианты или производные на HAS или лубрицин активность. Специалист в данной области техники может оптимизировать экспрессию HAS или полипептидов лубрицина изобретения; например, но без ограничения, удалением скрытого участка сплайсинга, адаптацией частоты использования кодона введением консенсусной последовательности Козак перед стартовым кодоном, изменением частоты использования кодона или их комбинацией с целью улучшения экспрессии.
Вектор для использования в настоящем изобретении может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую собачий полипептид HAS2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления собачий полипептид HAS2 является вариантом собачьего HAS2, имеющим, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% гомологию или идентичность с SEQ ID NO: 2.
Вектор для использования в настоящем изобретении может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид лубрицина собаки, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления полипептид лубрицина собаки является вариантом собачьего лубрицина, имеющим, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% гомологию или идентичность с SEQ ID NO: 7.
Идентичность или гомологию последовательности можно установить путем сравнения последовательностей при выравнивании, для того чтобы максимально увеличить перекрытие и идентичность, при этом сводя к минимуму пропуски (гэпы) в последовательности. В частности, идентичность последовательностей может быть определена при помощи любого из целого ряда математических алгоритмов. Неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 2264-2268, модифицированный как в Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993,90, 5873-5877.
Другим примером математического алгоритма, используемым для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers & Miller, CABIOS 1988,4, 11-17. Такой алгоритм вводится в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программного обеспечения GCG для выравнивания последовательностей. При использовании программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей может использоваться таблица весов замен остатков PAM120, штраф за продление гэпа 12 и штраф за пропуск 4. Еще одним подходящим алгоритмом для идентификации участков локального сходства последовательности и выравнивания является алгоритм FASTA, описанный в Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 2444-2448.
В общем, сравнение аминокислотных последовательностей может быть выполнено путем выравнивания аминокислотной последовательности полипептида известной структуры с аминокислотной последовательностью полипептида неизвестной структуры. Затем сравниваются аминокислоты в последовательностях и группы аминокислот, которые являются гомологичными, объединяются. Этот метод обнаруживает консервативные области полипептидов и учитывает аминокислотные вставки и делеции. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть определена путем использования коммерчески доступных алгоритмов (смотри также описание гомологии выше). В дополнение к вышеперечисленным также можно упомянуть программы BLAST, gapped BLAST, BLASTN, BLASTP и PSI-BLAST, предоставляемые Национальным центром по биотехнологической информации. Эти программы могут выравнивать гомологичные участки двух аминокислотных последовательностей и широко используются в данной области техники для этой цели.
Составной частью самих программ поиска являются методы выравнивания с учетом гэпов. Учет гэпов может быть выключен при необходимости. Штраф (Q) для гэпа (пропуска) длиной один составляет Q=9 для белков и BLASTP, и Q=10 для BLASTN, но может заменяться на любое целое число. Штраф на остаток для продолжения гэпа (R) составляет R=2 для белков и BLASTP, и R=10 для BLASTN, но может заменяться на любое целое число. Любая комбинация значений Q и R может использоваться для того, чтобы выровнять последовательности для того, чтобы довести до максимума совпадение и идентичность, при этом сводя к минимуму пропуски последовательности. Матрицей сравнения аминокислот является BLOSUM62, однако могут использоваться другие матрицы сравнения аминокислот, такие как PAM.
Термины "протеин", "полипептид" и "фрагмент полипептида" используются в описании взаимозаменяемым образом для обозначения полимеров из остатков аминокислот любой длины.
Использованный в описании термин "полинуклеотид" используется для обозначения полимерной формы нуклеотидов любой длины, которые содержат дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды.
Термин "вектор", использованный в описании, относится к рекомбинантной ДНК или РНК плазмиде или вирусу, который содержит гетерологичный полинуклеотид, подлежащий доставке в клетку-мишень, например, in vivo. Гетерологичный полинуклеотид может содержать последовательность, представляющую интерес для терапевтической цели, и необязательно может быть в форме кассеты экспрессии. При использовании в описании "вектор" не обязательно должен быть способен к репликации в конечной клетке-мишени или субъекте.
Термин "рекомбинантный”, использованный в описании, означает полинуклеотид полусинтетического или синтетического происхождения, который или не встречается в природе или связывается с другим полинуклеотидом в порядке, не обнаруженном в природе.
Использованный в описании термин "гетерологичный" означает происходящий из объекта, генетически отличного, от остальной части объекта, с которым он сравнивается. Например, полинуклеотид может быть помещен с помощью методов генетической инженерии в плазмиду или вектор, происходящий из другого источника, и является таким образом гетерологичным полинуклеотидом. Промотор, отделенный от его природной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, отличающейся от природной последовательности, соответственно является гетерологичным промотором.
Полинуклеотиды для использования согласно изобретению могут содержать дополнительные последовательности, например, дополнительные кодирующие последовательности в пределах той же самой единицы транскрипции, контролирующие элементы, такие как промоторы, участки связывания рибосомы, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования, дополнительные единицы транскрипции под контролем одного и того же или разных промоторов, последовательности, которые обеспечивают возможность клонирования, экспрессию, гомологичную рекомбинацию и трансформацию клетки-хозяина, и любую подобную конструкцию, которая может быть необходима для обеспечения вариантов осуществления этого изобретения.
В некотором аспекте раскрытие предоставляет способ лечения млекопитающего, страдающего от остеоартрита или имеющего риск развития остеоартрита (OA), включающий введение указанному субъекту-млекопитающему терапевтически эффективного количества аденоассоциированного вируса (AAV), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую защищающий кость или восстанавливающий кость полипептид, и функционально связанную с промотором, при этом полипептид экспрессируется in vivo у субъекта-млекопитающего в количестве, эффективном для облегчения или предотвращения симптомов OA. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляется внутрисуставным путем.
В некоторых вариантах осуществления полипептид может кодировать гиалуронсинтазу (HAS), включая HAS2 (HAS2), лубрицин, антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1R), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), фактор роста фибробластов 2 (FGF-2), трансформирующий ростовой фактор бета 1 (TGFβ1), костный морфогенетический белок 7 (BMP7), глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазу (GFAT), интерлейкин 10 (IL-10), гемоксигеназу-1 HO-1, их биологически активные укороченные варианты или их комбинации. В одном варианте осуществления субъект-млекопитающее может быть человеком, собакой или кошкой. В отдельном варианте осуществления субъект является собакой.
В некоторых вариантах осуществления субъект-млекопитающее страдает от или имеет риск развития хронического остеоартрита.
В других вариантах осуществления полипептид является HAS2 собаки или лубрицином собаки. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид HAS2, имеет последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичность с последовательностью, установленной в SEQ ID NO: 3, или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид лубрицин, имеет последовательность, обладающую, по меньшей мере, 90% идентичностью с последовательностью, установленной в SEQ ID NO: 6.
В некоторых вариантах осуществления полипептид HAS2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления полипептид HAS2 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из полипептида, обладающего, по меньшей мере, 90% идентичностью с последовательностью, установленной в SEQ ID NO: 2, его фрагмента, варианта и гомолога, демонстрирующего HAS активность in vivo у субъекта. “Активность HAS” означает выработку биологически активной гиалуроновой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления AAV вектор содержит в направлении от 5' к 3' следующие элементы: 5' AAV ITR, «лишний» участок, CBA, интрон (IN), cHAS2 кодон-оптимизированную кДНК, сигнал полиаденилирования (pA) и 3' AAV ITR.
В некоторых вариантах осуществления полипептид лубрицин содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7. В других вариантах осуществления полипептид лубрицин имеет аминокислотную последовательность, выбранную из полипептида, имеющего, по меньшей мере, 90% идентичность с последовательностью, установленной в SEQ ID NO: 7, его фрагмента, варианта, гомолога, демонстрирующего активность лубрицина in vivo у субъекта. “Активность лубрицина” означает обеспечение «смазки» практически аналогичным способом и в той же самой степени, как эндогенно-продуцированный лубрицин. Такую смазывающую активность можно измерить методами, известными в данной области техники (см., например, Swan, DA et al., Biochem J. 1985 Jan 1; 225(1): 195-201).
В некоторых вариантах осуществления промотор может быть выбран из группы, состоящей из промотора CMV IE, промотора RSV, промотора HSV-1 TK, раннего промотора SV40, позднего промотора SV40, основного аденовирусного позднего промотора, промотора гена фосфоглицераткиназы, промотора гена металлотионеина, промотора гена α-1 антитрипсина, промотора гена альбумина, промотора гена коллагеназы, промотора гена эластазы I, CBA промотора, промотора гена β-актина, промотора гена β-глобина, промотора гена γ-глобина, промотора гена α-фетопротеина и промотора гена мышечной креатинкиназы (CK).
В следующих вариантах осуществления AAV содержит AAV2 или AAV5 капсид.
В другом аспекте раскрытие предоставляет способ увеличения выработки гиалуроновой кислоты и в хондроцитах и/или в синовиоцитах млекопитающего (например, человека или собаки). В одном варианте осуществления способ может содержать стадию введения рекомбинантного AAV (“rAAV”), содержащего геном rAAV вектора, при этом геном rAAV вектора содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую HAS2 млекопитающего (например, человека или собаки), обеспечивая достаточное время для экспрессии фермента HAS2 и последующего катализа выработки дополнительной гиалуроновой кислоты, таким образом, увеличивая уровень гиалуроновой кислоты у млекопитающего.
Раскрытие также предоставляет способ увеличения выработки полипептида лубрицина в хондроцитах и/или синовиоцитах млекопитающего (например, человека или собаки). В одном варианте осуществления способ может включать стадии введения rAAV, содержащего геном rAAV вектора, при этом геном rAAV вектора содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую лубрицин, млекопитающему (например, человеку или собаке), обеспечивая достаточное время для экспрессии лубрицина, таким образом, увеличивая уровень лубрицина у собаки.
В одном варианте осуществления HAS2 продуцируется в достаточном количестве после введения rAAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую HAS2, для лечения или предотвращения симптомов OA у млекопитающего (например, человека или собаки).
В другом варианте осуществления лубрицин продуцируется в достаточном количестве после введения rAAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую лубрицин, для лечения или предотвращения симптомов OA у млекопитающего (например, человека или собаки).
В одном варианте осуществления уровни HA восстанавливаются до уровней, обнаруженных у здорового млекопитающего (например, человека или собаки). Квалифицированный специалист может посмотреть целый ряд ссылок, для того, чтобы понять какие уровни HA обнаружены у здоровых животных (например, Smith, GN et al., Arthritis Rheum. 1998;41:976-985; Balazs E et al., Disorders of the Knee. Philadelphia: J B Lippincott; 1982, pp. 61-74).
В другом варианте осуществления уровни лубрицина восстанавливаются до уровней, обнаруженных у здорового млекопитающего (например, человека или собаки).
В другом аспекте раскрытие предоставляет способ лечения собаки, страдающей от или имеющей риск развития OA, включающий введение указанной собаке терапевтически эффективного количества вектора AAV, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую HAS2 или полипептид лубрицина, функционально связанную с промотором. В другом варианте осуществления раскрытие предоставляет способ лечения человека, страдающего от или имеющего риск развития OA, включающий введение указанному человеку терапевтически эффективного количества вектора AAV, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую HAS2 или полипептид лубрицина, функционально связанную с промотором.
В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид HAS2, имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты, установленной в SEQ ID NO: 3, или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид лубрицина, имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 6.
В некоторых вариантах осуществления AAV кодирует полипептид HAS2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления AAV кодирует полипептид лубрицина, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, или содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7.
В одном варианте осуществления промотор может быть выбран из промотора CMV IE, промотора RSV, промотора HSV-1 TK, раннего промотора SV40, позднего промотора SV40, основного аденовирусного позднего промотора, промотора гена фосфоглицераткиназы, промотора гена металлотионеина, промотора гена α-1 антитрипсина, промотора гена альбумина, промотора гена коллагеназы, промотора гена эластазы I, промотора гена β-актина, CBA промотора, промотора гена β-глобина, промотора гена γ-глобина, промотора гена α-фетопротеина и промотора гена мышечной протеинкиназы.
В другом аспекте раскрытие предоставляет способ предотвращения развития OA у субъекта-млекопитающего с риском развития остеоартрита, включающий введение указанной собаке профилактически эффективного количества rAAV, содержащего геном вектора rAAV, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую HAS2 или полипептид лубрицина, функционально связанную с промотором. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид HAS2, имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 3, или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид лубрицина, имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует полипептид HAS2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или нуклеиновая кислота кодирует полипептид лубрицина, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CMV IE, промотора RSV, промотора HSV-1 TK, раннего промотора SV40, позднего промотора SV40, основного аденовирусного позднего промотора, промотора гена фосфоглицераткиназы, промотора гена металлотионеина, промотора гена α-1 антитрипсина, промотора гена альбумина, промотора гена коллагеназы, промотора гена эластазы I, промотора гена β-актина, промотора гена β-глобина, промотора гена γ-глобина, α- промотора гена фетопротеина и промотора гена мышечной креатинкиназы. В некоторых вариантах осуществления вектор rAAV содержит CBA-cHAS2co-BGH. В других вариантах осуществления вектор rAAV содержит pITR/minCBA-HIb-cLub1co-BGH.
В другом аспекте раскрытие предоставляет рекомбинантный плазмидный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую собачий HAS2 или полипептид лубрицина, функционально связанный с промотором. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид HAS2, имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 3, или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид лубрицина имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует полипептид HAS2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, или нуклеиновая кислота кодирует полипептид лубрицина, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.
В одном аспекте раскрытие предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую рекомбинантный вирусный вектор, кодирующий и экспрессирующий in vivo у хозяина-млекопитающего HAS или лубрицин, и необязательно один или более фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов или разбавителей.
В другом аспекте раскрытие предоставляет способ лечения субъекта-млекопитающего, страдающего от или имеющего риск развития остеоартрита, включающий внутрисуставное введение указанному субъекту-млекопитающему терапевтически эффективного количества подробно описанной выше фармацевтической композиции. В одном варианте осуществления субъект является человеком или собакой.
В другом аспекте раскрытие предоставляет систему биологической доставки и экспрессии на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для использования при лечении или предотвращении OA в суставах человека или млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления способ реализуется посредством длительной экспрессии гена HAS2 или лубрицина человека или млекопитающего в синовиальных клетках и/или хондроцитах после доставки rAAV, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую HAS2 или лубрицин человека или млекопитающего, левый и правый инвертированные концевые повторы AAV (L ITR и R ITR), сигнал упаковки AAV и необязательно невирусные, некодирующие «лишние» последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления экспрессия гена HAS2 или лубрицина человека или млекопитающего в синовиальных клетках и/или хондроцитах регулируется промотором, индуцируемым воспалением, который располагается выше рамки считывания последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей HAS2 или лубрицин человека или млекопитающего, и который специфически активируется повышенными уровнями иммуностимулирующих субстанций.
В некоторых вариантах осуществления промотор, индуцируемый воспалением, выбирают из следующих: промотора NF-KB, промотора интерлейкина 6 (II-6), промотора интерлейкина-1 (11-1), промотора фактора некроза опухолей (TNF), промотора циклооксигеназы 2 (COX-2), промотора фактора комплемента 3 (C3), промотора сывороточного амилоида A3 (SAA3), промотора воспалительного белка-1a макрофагов (MIP-1a) и их гибридных конструкций. В некоторых вариантах осуществления геном вектора rAAV содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, или ее биологически эффективный вариант. В некоторых вариантах осуществления AAV система содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую маркерный ген, который обеспечивает мониторинг генома вектора в синовиальных клетках и хондроцитах. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, или ее консервативную последовательность, кодирующую те же самые аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления геном вектора rAAV содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид HAS2, установленный в SEQ ID NO: 2, или полипептид лубрицин, представленный в SEQ ID NO: 7. Геном вектора rAAV может содержать молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую, по меньшей мере, 80% или 90% идентичность последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 3. В других вариантах осуществления геном вектора rAAV содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую, по меньшей мере, 80% или 90% идентичность последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 6.
В некоторых вариантах осуществления AAV система содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую HAS2 или лубрицин человека или млекопитающего, левый и правый AAV инвертированные концевые повторы (L ITR и R ITR), сигнал упаковки и необязательно невирусные, некодирующие «лишние» последовательности нуклеиновой кислоты, при этом экспрессия гена HAS2 или лубрицина человека или млекопитающего в синовиальных клетках и/или хондроцитах регулируется промотором, индуцируемым воспалением, который специфически активируется повышенными уровнями иммуностимулирующих субстанций, для лечения или предотвращения остеоартрита (OA).
Вирусные частицы и способы получения вирусных частиц
Также в описании предоставляются вирусные частицы, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую HAS2 или лубрицин. Вирусные векторы могут использоваться для доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей HAS2 или лубрицин, для экспрессии белка в клетке-мишени в определенном месте (например, суставе). Известно много видов вирусов и многие были исследованы на предмет доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени. Экзогенная нуклеиновая кислота может быть вставлена в вектор, такой как, например, аденоассоциированный вирус (AAV).
В некоторых вариантах осуществления вирусная частица является рекомбинантной AAV частицей, содержащей нуклеиновую кислоту, содержащую один или два AAV ITR и последовательность, кодирующую HAS2 или лубрицин, описанную в данном документе, фланкированную одним или двумя ITR. Нуклеиновая кислота инкапсулируется в AAV частицу. AAV частица также содержит капсидные белки. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит функционально связанные компоненты в направлении транскрипции, контролирующие последовательности, включая последовательности инициации и терминации транскрипции, и последовательность(и), кодирующую(ие) интересующий белок (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок). Эти компоненты фланкированы на 5' и 3' конце функциональными AAV ITR последовательностями. Под "функциональными AAV ITR последовательностями" подразумевается, что функционирование ITR последовательностей предназначается для сохранения, репликации и упаковки AAV вириона. Смотри Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; и Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16, которые все полностью включаются в данное описание путем отсылки. Для осуществления некоторых аспектов изобретения рекомбинантные векторы содержат, по меньшей мере, все последовательности AAV, необходимые для инкапсулирования, и физические структуры для инфицирования rAAV. AAV ITR для использования в векторах изобретения не обязаны иметь нуклеотидную последовательность дикого типа (например, как описано в Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801), и могут быть изменены путем вставки, делеции или замены нуклеотидов или AAV ITR могут происходить из нескольких AAV серотипов. В настоящее время известно более чем 40 серотипов AAV, и продолжается выявление новых серотипов и вариантов существующих серотипов. Смотри Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; и Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810. Использование любого AAV серотипа рассматривается в рамках настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления вектор rAAV является вектором, происходящим из серотипа AAV, включая без ограничения, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8 и AAVrh.10. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV содержит ITR AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8 или AAVrh.10. В дополнительных вариантах осуществления rAAV частица содержит капсидные белки AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8 или AAVrh.10.
Разные серотипы AAV используются для оптимизации трансдукции клеток-мишеней или для «нацеливания» на конкретный тип клеток в отдельной мишени (например, суставе). Частица rAAV может содержать вирусные белки и вирусные нуклеиновые кислоты одного и того же серотипа или смешанного серотипа. Например, частица rAAV может содержать капсидные белки AAV2 и, по меньшей мере, один AAV2 ITR или она может содержать капсидные белки AAV2 и, по меньшей мере, один AAV5 ITR. В другом примере частица rAAV может содержать капсидные белки AAV5 и, по меньшей мере, один AAV2 ITR. Любая комбинация серотипов AAV для продуцирования частиц rAAV рассматривается в этом документе, как если бы каждая комбинация была прямо предусмотрена в настоящем документе.
Частицы rAAV могут продуцироваться при помощи методов, известных в данной области техники. Смотри, например, патенты США № 6,566,118, 6,989,264, 6,995,006. При осуществлении на практике изобретения клетки-хозяева для продуцирования частиц rAAV включают клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, микроорганизмов и дрожжей. Клетки-хозяева также могут быть упаковывающими клетками, в которых гены rep и cap AAV устойчиво сохраняются в клетке-хозяине или продуцирующих клетках, в которых геном вектора AAV устойчиво сохраняется. Типичные упаковывающие и продуцирующие клетки происходят из клеток 293, A549 или HeLa. Векторы AAV очищают и заключают в составы при помощи стандартных методов, известных в данной области техники.
В некоторых аспектах предоставляется способ продуцирования какой-либо частицы rAAV, как описано в этом документе, включающий (a) культивирование клетки-хозяина при условии, что частицы rAAV продуцируются, при этом клетка-хозяин содержит (i) один или более генов упаковки AAV, при этом каждый указанный ген упаковки AAV кодирует белок репликации или инкапсулирования AAV; (ii) pro-вектор rAAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую любой гибридный белок, раскрытый в описании, фланкированный, по меньшей мере, одним AAV ITR, и (iii) хелперный функционал AAV; и (b) выделение частиц rAAV, продуцированных клеткой-хозяином. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один указанный AAV ITR выбирают из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8 и AAVrh.10 ITR. В некоторых вариантах осуществления указанный белок, образующий капсид, выбирают из группы, состоящей из капсидных белков AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8 и AAVrh.10. В следующем варианте осуществления частицы rAAV очищают. Использованный в описании термин “очищенный” включает получение частиц rAAV, свободных, по меньшей мере, от некоторых других компонентов, которые также могут присутствовать в случаях, когда частицы rAAV являются частицами естественного происхождения или являются полученными из них. Таким образом, например, изолированные AAV частицы можно получить, используя метод очистки, чтобы выделить их из первичной смеси, такой как лизат культуры или культуральная среда для продуцирования. Обогащение можно измерить различными способами, такими как, например, по количественному отношению устойчивых к ДНКазе частиц (DRP), присутствующих в растворе, или по инфекционности, или его можно измерить относительно второго, потенциально мешающего вещества, присутствующего в первичной смеси, например, загрязнений, включая контаминанты культуры для продуцирования или внутрипроизводственные контаминанты, включающие хелперный вирус, компоненты среды и тому подобное.
Также предоставляются фармацевтические композиции, содержащие частицу rAAV, включающую нуклеиновую кислоту, кодирующую HAS2 или лубрицин, изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции могут подходить для целого ряда способов введения, описанных в документе, включая, например, системное или локальное введение. Фармацевтическая композиция rAAV, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую HAS2 или лубрицин, может вводиться системно, например, с помощью внутривенной инъекции, с помощью катетера, смотри патент США № 5,328,470, или с помощью стереотаксической инъекции, Chen et al., 1994, PNAS, 91: 3054-3057. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, содержащие rAAV, описанные в этом документе, и фармацевтически приемлемый носитель, пригодны для введения человеку. Такие фармацевтически приемлемые носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода и масло, включая масла минерального, животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло и тому подобное. Солевые растворы и водный раствор декстрозы, полиэтиленгликоль (PEG) и глицериновые растворы также могут использоваться в качестве жидких носителей, в частности для инъецируемых растворов. Кроме того, фармацевтическая композиция может включать дополнительные ингредиенты, например, консервирующие вещества, буферы, средства, регулирующие тоничность, антиоксиданты и стабилизаторы, неионные смачивающие или осветляющие средства, средства, повышающие вязкость (загустители) и тому подобное. Фармацевтические композиции, описанные в этом документе, могут быть упакованы в единичные дозированные лекарственные формы или множественные дозированные формы. В большинстве случаев композиции создаются в виде стерильного и практически изотонического раствора.
Ссылки
Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в данном описании, полностью включены в данный документ посредством ссылки во всех отношениях.
Aalbers CJ et al. 2015. Preclinical potency and biodistribution studies of an AAV5 vector expressing human interferon-b (ARTI02) for local treatment of patients with rheumatoid arthritis. PLoS One 2015, 10:e130612.
Ai, M et al. Anti-lubricin monoclonal antibodies created using lubricin-knockout mice immunodetect lubricin in several species and in patients with healthy and diseased joints. PLOS 2015. 10:e0116237
Apparailly F et al. Adeno-associated virus pseudotype 5 vector improves gene transfer in arthritic joints. Hum Gene Ther 2005; 16: 426-434.
Asokan A, Smulski RJ. 2012. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Molecular Therapy 20:699-708.
Blewis ME et al. 2007. A model of synovial fluid lubricant composition in normal and injured joints. European Cells and Materials 13:26-39.
Calcedo R et al. 2015. Preexisting neutralizing antibodies to adeno-associated virus capsids in large animals other than monkeys may confound in vivo gene therapy studies. Human Gene Therapy Methods 26:103-105.
Clark, KR et al. (1999). Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses Hum Gene Ther 10: 1031-1039.
David-Raoudi M et al. Chondroitin sulfate increases hyaluronan production by human synoviocytes through differential regulation of hyaluronan synthases. Arthritis & Rheumatism 2009, 60:760-770.
Elsaid KA et al. Decreased lubricin concentrations and markers of inflammation in the synovial fluid of patients with anterior cruciate ligament injury. Arthritis & Rheumatism 2008, 58:1707-1715.
Evans CH et al. 2009. Gene therapy of the rheumatic diseases: 1998 to 2008. Arthritis Research Therapy 11:209.
Evans CH et al. 2009. Progress and Prospects: genetic treatments for disorders of bones and joints. Gene Therapy 16:944-952.
Flannery CR et al. Prevention of cartilage degeneration in a model of osteoarthritis by intraarticular treatment with recombinant lubricin. Arthritis & Rheumatism 2009, 60:840-847.
Flannery et al. 1999: Articular cartilage superficial zone protein (SZP) is homologous to megakaryocyte stimulating factor precursor and is a multifunctional proteoglycan with potential growth-promoting, cytoprotective, and lubrication properties in cartilage metabolism. Biochem Biophys Res Comm, 254:535-41.
Goodrich LR et al. 2013. Optimization of scAAVIL-1ra in vitro and in vivo to deliver high levels of therapeutic protein for treatment of osteoarthritis. Molecular Therapy-Nucleic Acids 2:e70.
Guo N et al. A rapid increase in hyaluronan synthase-2 mRNA initiates secretion of hyaluronan by corneal keratocytes in response to transforming growth factor beta. J Biol Chem 2007, 282:12475-83.
Hemphill DD et al. 2014. Adeno-associated viral vectors show serotype specific transduction of equine joint tissue explants and cultured monolayers. Scientific Reports 4:5861-5868.
Hunter DJ, Matthews G. Emerging drugs for osteoarthritis. 2011. Expert Opin Emerg Drugs 16:479-491.
Hurlbut GD et al. 2010. Preexisting immunity and low expression in primates highlight translational challenges for liver-directed AAV8-mediated gene therapy. Molecular Therapy 18:1983-1994.
Hyc A et al. Pro- and anti-inflammatory cytokines increase hyaluronan production by rat synovial membrane in vitro. Intern J Molec Medicine 2009, 24:579-585.
Itano N et al. 1999. Three isoforms of mammalian hyaluronan synthases have distinct enzymatic properties. JBC 1999, 274:25086-92.
Itano N et al. 1999. Three isoforms of mammalian hyaluronan synthases have distinct enzymatic properties. JBC 1999, 274:25086-92.
Keiser NW et al., Engelhardt. 2011. Unique characteristics of AAV1, 2, and 5 viral entry, intracellular trafficking and nuclear import define transduction efficiency in HeLa cells. Hum Gene Ther 22:1433-1444.
Kwiecinski et al. 2011: The effect of molecular weight on hyaluronan's cartilage boundary lubricating ability - alone and in combination with proteoglycan 4. Osteoarthritis Cartilage 19:1356-62.
Kyostio-Moore S et al. 2015. Over-expression of cystatin C in synovium does not reduce synovitis or cartilage degradation in established osteoarthritis. Arthritis Res Ther 17:5-21.
S. Kyostio-Moore et al. Local gene delivery of heme oxygenase-1 by adeno-associated virus into osteoarthritic mouse joints exhibiting synovial oxidative stress. Osteoarthritis and Cartilage Volume 21, Issue 2, February 2013, Pages 358-367.
Lee HH et al. Persistence, localization, and external control of transgene expression after single injection of adeno-associated virus into injured joints. Hum Gene Ther 2013, 24:457-466.
Li P et al. Hylan G-F 20 maintains cartilage integrity and decreases osteophyte formation in osteoarthritis through both anabolic and anti-catabolic mechanisms. Osteoarthritis Cartilage 2012, 20:1336-46.
Loeser RF. Osteoarthritis year in review 2013: biology. Osteoarthritis and Cartilage, 21:1436-1442.
Mease PJ et al. 2009. Local delivery of recombinant adeno-associated vector containing a tumor necrosis factor alpha antagonist gene in inflammatory arthritis: a Phase 1 dose-escalation safety and tolerability study. Ann Rheum Dis 68:1247-1254.
Mietzsch M et al. 2014. Differential adeno-associated virus serotype-specific interaction patterns with synthetic heparins and other glycans. J Virology 88:2992-3003.
Miltner O et al. Efficacy of intraarticular hyaluronic acid in patients with osteoarthritis - a prospective clinical study. Osteoarthritis Cartilage 2002, 10:680-6.
Mingozzi F et al. 2013. Prevalence and pharmacological modulation of humoral immunity to AAV vectors in gene transfer to synovial tissue. Gene Therapy 20:417-424.
Momberger TS et al. Hyaluronan secretion by synoviocytes is mechanosensitive. Matrix Biology 2005, 24:510-519.
Nishida Y et al. Antisense inhibition of hyaluronan synthase-2 in human articular chondrocytes inhibits proteoglycan retention and matrix assembly. JBC 1999, 274:1893-21899.
Ortved KF et al. Implantation of rAAV5-IGF-I transduced autologous chondrocytes improves cartilage repair in full-thickness defects in the equine model. Mol Ther 2015, 23:363-373.
Payne KA et al. Single intra-articular injection of adeno-associated virus results in stable and controllable in vivo transgene expression in normal rat knees. Osteoarthritis Cartilage 2011, 19:1058-1065.
Plickert HD et al. Hyaluronic acid concentrations in synovial fluid of dogs with different stages of osteoarthritis. Research in Veterinary Science 2013, 94:728-734.
Rapti K et al. 2012. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy 20:73-83.
Rhee DK et al. Consequences of disease-causing mutations on lubricin protein synthesis, secretion, and post-translational processing. JBC 2005, 280:3125-3132.
Ryan MZC et al. Proteoglycan 4 expression protects against the development of osteoarthritis. Sci Transl Med 2013, 5:176ra34.
Sarzi-Puttini P et al. Osteoarthritis: an overview of the disease and its лечения strategies. Semin. Arthritis Rheum 2005, 35:1-10.
Schmid T et al. 2001. Superficial zone protein (SZP) is an abundant glycoprotein in human synovial fluid and serum. Trans Orthop Res Soc 26:82.
Sharkey M. The challenges of assessing osteoarthritis and postoperative pain in dogs. 2013. The AAPS Journal 15:598-607.
Vugmeyster Y et al. Disposition of human recombinant lubricin in naive rats and in a rat model of post-traumatic arthritis after intra-articular or intravenous administration. AAPS J 2012, 14:97-104.
Waller KA et al. Role of lubricin and boundary lubrication in the prevention of chondrocyte apoptosis. PNAS 2013.
Watanabe K and Yamaguchi Y. Molecular identification of a putative human hyaluronan synthase. JBC 1996, 271:22945-48.
Watanabe, S et al. Adeno-associated virus mediates long-term gene transfer and delivery of chondroprotective IL-4 to murine synovium. Molecular Ther 2000; 2: 147-151.
Watson RS et al. scAAV-mediated gene transfer of interleukin-1-receptor antagonist to synovium and articular cartilage in large mammalian joints. Gene Therapy 20:670-677.
Yoshida M et al. Expression analysis of three isoforms of hyaluronan synthase and hyaluronidase in the synovium of knees in osteoarthritis and rheumatoid arthritis by quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. Arthritis Research Therapy 2004, 6:R514-R520.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Конструирование и оценка HAS2 AAV вектора
Пример 1a - Общее описание
13
12
Были созданы rAAV векторы, содержащие кодон-оптимизированную кДНК HAS2 собаки и универсальный промотор, и упакованы в капсиды AAV2 или AAV5. Крупномасштабные партии векторов получали методом тройной трансфекции и очищали с помощью градиента CsCl. Выход полученного вектора оценивали с помощью количественной ПЦР полиA сайта (pA) гормона роста крупного рогатого скота (BGH). Всего были получены 4 партии AAV2/HAS2 (из которых 3 были объединены для in vivo исследований, 2×10 DRP/общее количество). Были получены две партии AAV5/HAS2 (5×10 DRP/общее количество), чтобы протестировать стабильность параметров «выхода» и получить достаточное количество вируса.
11
11
Двадцать две взрослых здоровых собаки, серонегативных в отношении AAV2 и AAV5 капсид, получили rAAV2 (1, 5 и 10×10 векторных геномов/сустав), rAAV5 (5×10 векторных геномов/сустав) или PBS (контроль) с помощью внутрисуставной инъекции. Не было отмечено неблагоприятных клинических признаков после 28-дневного наблюдения. Гистопатологическое исследование показало минимальное синовиальное воспаление в суставах, обработанных rAAV5, и отсутствие значительных изменений в лечебных группах rAAV2. Геномы вектора (VG) были обнаружены в синовиальной оболочке всех rAAV-обработанных суставов и в большинстве образцов хряща. rAAV5 векторы обуславливали обнаружение повышенного VG и повышенную экспрессию мРНК по сравнению с rAAV2 в обеих тканях. Была отмечена тенденция к повышению уровней HA в синовиальной жидкости обработанных суставов. В итоге, представленные результаты продемонстрировали перенос генов в ткани сустава собаки и приемлемый профиль безопасности при использовании векторов rAAV2 и rAAV5, кодирующих HAS2, при введении с помощью однократной внутрисуставной инъекции собакам.
Пример 1b - Методы
Клонирование и получение экспрессирующего вектора HA. Собачий ген HAS2 (Генбанк XM 539153.3; SEQ ID NO: 1) был кодон-оптимизирован для экспрессии у собак с помощью алгоритма от компании GeneArt/Invitrogen. Кодон-оптимизированную собачью кДНК HAS2 (1656 п.о.; SEQ ID NO:3) синтезировали с помощью фланкирования NheI-NsiI сайтами рестрикционного фермента. Затем этот фрагмент клонировали в плазмиду, содержащую убиквитиновый куриный b-актиновый промотор (CBA), гибридный интрон и полиA (pA) гормона роста крупного рогатого скота (BGH). Полученную в результате pCBA-HI-cHAS2-BGHpA плазмиду очищали с использованием набора maxi kit (Qiagen) для анализа экспрессии.
Экспрессия cHAS2 in vitro и получение HA. Плазмидный вектор, содержащий cHAS2, был трансфицирован в 293 клетки, кондиционированную среду, и клеточные лизаты собирали в 250 мкл буфера RIPA с ингибиторами протеаз через 3 дня. Лизаты клеток центрифугировали, для того чтобы удалить клеточный дебрис, и 30 мкл лизата клеток загружали на 4-12% nu-page gel и пропускали в буфере 1x Mops. Белковый гель переносили на нитроцеллюлозную мембрану и исследовали при помощи анти-HAS2 (sc-34-068; Santa Cruz Biotechnology) в 5% молоке в PBS-T 0,1% твин-20 в течение ночи при 4°C. В качестве вторичных антител использовали ослиные анти-козьи вторичные антитела (при разведении 1:5000). Детектирование бета-актина использовали, чтобы показать равную загрузку клеточных лизатов.
Количественное определение уровней HA и молекулярного веса в культурах in vitro. Выработку HA HAS2-экспрессирующими клетками оценивали путем трансфекции pCBA-HI-cHAS2-BGHpA в 293 клетки (в Optimem или полной среде). Количественную оценку уровней HA в кондиционированной среде проводили с помощью набора для тестирования HA (Corgenix, Inc.). Этот набор содержит HA-связывающий белок, происходящий от аггрекана. Молекулярный вес HA оценивали, пропуская концентрированную кондиционированную среду на агарозном геле. Маркеры HA различного размера пропускали параллельно (Select-HA HiLadder, Hyalose, Austin, TX). Аналогичный гель пропускали параллельно с последующей обработкой гиалуронидазой в течение 24 час. Оба геля окрашивали All-stain.
5
4
Получение rAAV вектора с cHAS. Кассету экспрессии cHAS2 клонировали в ITR-содержащую плазмиду AAV для получения кассеты экспрессии, фланкированной инвертированными концевыми повторами AAV, (пре-вирусная плазмида pDC627), чтобы сконструировать psITR/CBA-HI-cHAS2-BGHpA. «Лишний» участок ДНК в 600 п.о. (хромосома 16 P1 клон 96.4B) было включено выше кассеты экспрессии, чтобы получить геном вирусного вектора в общей сложности в 4500 п.о. Чтобы протестировать упаковку cHAS2 кассеты экспрессии, содержащей плазмиду, 293 клетки высевали 8×10 клеток/лунку (6-луночные планшеты) и на следующий день трансфицировали psITR/CBA-HI-cHAS2-BGHpA, или psp70/EGFP, pHLP-19cap2 или p5repCMVcap5 плазмидами и pAdHELP в двух повторах (Promega CaPO набор). Клетки собирали через 3 дня, лизаты титровали на предмет BGHpA копий, используя qPCR анализ и праймер/зонд для BGHpA последовательностей (SEQ ID NOs:12-14). В качестве стандарта использовали плазмиду, содержащую BGHpA. Выход вируса rAAV выражали как количество частиц, устойчивых к ДНКазе (DRP), на клетку. Производство вектора в большом масштабе осуществляли, используя тройную трансфекцию psITR/CBA-HI-cHAS2-BGH, pIM45BD rep-cap плазмиду для AAV2 векторов и pHLP19-cap5 для AAV5 векторов, и pAdHELP. Вектор очищали с помощью CsCl, и полученную партию вектора титровали с использованием TaqMan анализа и праймер/зонда для BGHpA последовательностей (Applied Biosystems/Life Technologies).
Эффективность rAAV/cHAS2 в хондроцитах и синовиоцитах кроликов in vitro. Способность вектора трансдуцировать такие типы клеток сустава, как первичные синовиоциты и хондроциты, была протестирована на кроличьих клетках. Клетки инфицировали 1e5 DRP/клетку и культивировали в течение 3 дней. Лизаты клеток собирали с целью детектирования HAS2 белка при помощи вестерн-блоттинга, и культуральную среду количественно исследовали в отношении уровней HA, как описано выше. Чтобы проверить влияние выработки HA на протеазы, деградирующие внеклеточный матрикс, воспалительные цитокины и выработку структурных белков хряща в состоянии болезни, клетки сначала инфицировали векторами rAAV, а затем через 24 часа стимулировали с помощью IL-1b. Через 24 часа и клетки и культуральную среду собирали для проведения анализа продукции мРНК и HA.
11
11
Оценка rAAV/cHAS2 в нормальных суставах собаки. Использовали собак смешанной породы (самцы и самки, 8-10 кг). Для исследования использовали собак с сывороточным титром <4 или 4 для AAV2 и/или AAV5 капсид. rAAV2 и AAV5 векторы, кодирующие cHAS2, вводили (AAV2: 1, 5 и 10×10, AAV5, 5×10 DRP/сустав) внутрисуставным путем. PBS использовали в качестве отрицательного контроля. Клинические признаки у животных (боль, хромота, опухание инъецированного сустава и другие патологические изменения) регистрировали один раз в день в течение 7 дней до инъекции, два раза в день в течение 7 дней после инъекции и затем один раз в день на всем протяжении исследования. Животных умерщвляли через 4 недели. Образцы цельной крови отбирали через -7, 1, 14 и 28 дней после введения вектора для подсчета белых клеток крови (WBC). Образцы синовиальной жидкости (SF) собирали на день -7, день 14 и день 28 для количественного определения уровней HA. Образцы синовиальной ткани, хряща и печени собирали для выделения ДНК и РНК. Геном вектора cHAS2 и копии мРНК определяли с помощью количественной ПЦР, используя наборы праймер/зонд BGHpA (Applied Biosystems/Life Technologies). Для гистологического анализа медиальную поверхность колена (большеберцовая кость, бедренная кость и синовиальная оболочка) заливали в парафин и делали срезы. Срезы были окрашены толуидиновым синим и исследованы получившим профессиональную сертификацию патологом. Хрящевую ткань оценивали по степени изнашиваемости хряща и потери протеогликана (оценка: 0-5). Синовиальную патологию оценивали по численности воспалительных клеток (оценка: 0-5), поскольку синовиального утолщения не наблюдалось.
Пример 1c - Результаты
Оптимизация кодонов и получение экспрессионной кассеты HAS2. HAS2 млекопитающих является высококонсервативным белком. Например, аминокислотная последовательность HAS2 человека и собаки содержит только 2 аминокислотных различия (99.3% идентичность). Аналогично, собачий и кроличий HAS2 отличаются только тремя аминокислотами (99.5%). На уровне ДНК сходство между собачьей кДНК и кДНК человеческой синтазы HAS2 составляет 93.9%. Поскольку кодон-оптимизация может улучшить экспрессию генов, собачья HAS2 GenBank последовательность (XM 539153.3) была оптимизирована GeneArt/Invitrogen. Это дало в результате нуклеотидную последовательность, имеющую 78% сходство с исходной последовательностью из GenBank. Содержание оптимизированной по GC кДНК было увеличено с 44.4% до 59.0%. Эту кДНК использовали для создания универсальной экспрессионной плазмиды с промотором CBA, чтобы обеспечить конститутивную экспрессию HAS2, в отличие от эндогенного промотора (фиг. 1A). Промотор CBA менее подвержен влиянию различных про- и антивоспалительных цитокинов.
HAS2 экспрессия и продуцирование HA in vitro. Чтобы проверить экспрессию белка HAS2 in vitro, 293 клетки трансфицировали двумя клонами (№1 и 2) плазмидных векторов CBA-HI-cHAS2-BGHpA, а затем анализировали клеточные лизаты в отношении HAS2 белка (мембранный белок) с помощью вестерн-блоттинга. Клетки, трансфицированные плазмидой экспрессии, показали полосу 64 кДа, которая показывает предполагаемый cHAS (не показано). Далее мы оценили, обуславливает ли сверх-экспрессия белка HAS2 в клетках 293 к обнаружению повышенной HA в культуральной среде, указывая и на продукцию и секрецию HA через клеточную мембрану. Уровни HA в среде от клеток, трансфицированных pCBA-cHAS2, были повышены в 6,5 и 9 раз по сравнению с нетрансфицированными клетками и клетками, трансфицированными CBA-EGFP, соответственно (фиг. 1B). Таким образом, результаты подтвердили, что сверх-экспрессия cHAS2 в клетках приводит к повышенным уровням HA во внеклеточном компартменте. Размер HA, продуцированной in vitro, был оценен на агарозном геле. Данные показали высокий молекулярный вес HA в кондиционированной среде, полученной от клеток, трансфицированных кассетой экспрессии HAS2. Размер этого материала был больше чем 1,5 Мега Дальтон (МДа) (исходя из оценки с использованием маркеров с молекулярным весом HA). Этот материал исчезал после обработки гиалуронидазой, показывая, что этим материалом была HA (фиг. 1C).
Создание векторов rAAV с кассетой экспрессии HAS2. Затем кассета экспрессии cHAS2 была клонирована в плазмиду с AAV ITR. Схематическое изображение полученного в результате вирусного генома показана на фиг. 1A. Способность генерировать векторы rAAV с капсидами AAV2 и AAV5 и кДНК HAS2 была проверена в маломасштабном эксперименте по упаковке (фиг. 2A) с последующим крупномасштабным продуцированием вектора. Оба и векторы AAV2 и AAV5 можно было получить с помощью стандартных методов тройной трансфекции (фиг. 2B). Потенциальная возможность этого материала была протестирована путем инфицирования клеток 293 и анализа продуцированных уровней HA в культуральной среде. И AAV2 и AAV5 векторы приводили к дозочувствительному увеличению HA в культуральной среде (фиг. 2C, D).
Оценка+ вектора rAAV/HAS2 в нормальном суставе собаки. Векторы rAAV2 и AAV5 с cHAS2 были доставлены в суставы нормальных собак путем внутрисуставного введения, за животными наблюдали в течение 28 дней. Не было отмечено клинических признаков, изменения веса тела (фиг. 3A), хромоты или гибели в ходе исследования. У некоторых животных было отмечено повышенное количество белых клеток крови (WBC) на день -7, вероятно вследствие стресса, связанного с перевозкой. В общем, количество WBC на день 1, 14 и 28 находились в пределах нормальных значений. Гистологическая оценка колена, инъецированного PBS-, AAV-инъецированного (левого) и контралатерального (неинъецированного) показала очень маленькую потерю протеогликана и дегенерацию хряща (счет в баллах в пределах 0 - 0,5; максимальный счет 5) (фиг. 3B). Эти минимальные изменения были типичными изменениями, связанными с возрастом. Минимальные изменения синовиальной ткани наблюдались в обработанном PBS и AAV2 контралатеральном суставах (фиг. 3C). Во всех левых коленах самцов и самок, обработанных вектором AAV5, наблюдался синовит (воспаление синовиальной оболочки) от минимального до умеренного (как правило, распространенный на суставную капсулу и медиальную коллатеральную связку), в коллатеральных суставах синовит не наблюдался. Таким образом, в целом лечение хорошо переносилось, при этом были отмечены небольшие неблагоприятные воздействия.
Образцы, собранные из синовиальной и хрящевой тканей, исследовали с целью обнаружения вирусных геномов (фиг. 4A, 6A). Синовиальные образцы, собранные близко к месту инъекции, образец №3, показали наличие геномов вектора во всех суставах, обработанных AAV (фиг. 4B). AAV2-обработанные суставы содержали приблизительно 0,01 - 2 геномов вектора (VG)/клетку. Интересно отметить, что минимальный дозозависимый ответ наблюдался с AAV2, несмотря на 10-кратное различие между группами с низкой и высокой дозами. Суставы, обработанные AAV5 векторами, показали более высокое и более постоянное детектирование в пределах от 1 до 12 копий/клетку. В некоторых коллатеральных (неинъецированных) суставах был установлен низкий уровень VG, который был более выражен в лечебной группе с низкой дозой AAV2 и был более спорадический в группах с более высокими дозами AAV2 и AAV5 (не показано).
Синовиальный образец, собранный дальше от места инъекции, образец №1, был проанализирован с целью оценки AAV, распространенного в сустав (фиг. 4C). В суставах, инъецированных низкой дозой AAV2, наблюдалось более постоянное детектирование VG. Эти уровни были сравнимы с уровнями, измеренными в синовиальном образце №3. В лечебной группе с AAV5 во всех синовиальных образцах №1 были отмечены постоянно детектируемые VG (в пределах трехкратного). Эти уровни, однако, были ниже, чем уровни VG, обнаруживаемые в синовиальной ткани №3, что демонстрирует зависящую от местоположения трансдукцию.
Экспрессию за счет генома вектора анализировали путем количественной оценки мРНК, происходящей от вектора. Для синовиального образца №3 была установлена экспрессия, составляющая 2/5, 4/5 и 4/5 от групп, обработанных AAV2 (низкой, средней и высокой), тогда как во всех суставах, обработанных AAV5, имелись детектируемые копии мРНК (фиг. 5A). Экспрессия вектора также была установлена в отношении векторов AAV5 в синовиальной ткани №1, хотя уровни были ниже, аналогично уменьшенному обнаружению VG в этом местоположении (фиг. 5B). Детектирование мРНК хорошо коррелировало с обнаружением VG; мРНК и ДНК VG в каждом отдельном инъецированном суставе в синовиальном образце №3 показано в качестве примера (фиг. 5C).
Обнаружение генома вектора в хряще собаки. Образцы хряща, собранные из мыщелков бедренной кости и верхней суставной поверхности большеберцовой кости, были исследованы на предмет обнаружения вирусных геномов (VG; фиг. 6A). ДНК вектора и мРНК обнаруживали в каждом отдельном инъецированном суставе, и средний групповой показатель в мыщелках бедренной кости показан в качестве примера (фиг. 6B, C). Результаты показали, что вектор AAV5 присутствовал на постоянной основе в хряще, и были установлены сравнимые уровни транскриптов, полученных от вектора. Сравнимая доза вектора AAV2 (средняя) давала в результате уровни VG, сходные как от вектора AAV5, однако показала приблизительно в 100-раз более низкие уровни мРНК. В дополнение к этому, копии VG AAV2, по-видимому, имели обратную корреляцию с дозой вектора. В суставах, инъецированных rAAV5, также были обнаружены вектор и экспрессия в образцах хряща, собранных из верхней суставной поверхности большеберцовой кости, в то время как они не были обнаружены в суставах, обработанных rAAV2 (фиг. 6D). Обнаружение ДНК вектора в контралатеральных (неинъецированных) суставах было минимальным для всех векторов.
Результаты, полученные в синовиальной ткани и хряще, суммированы на фиг. 7A. Что касается переноса гена в синовиальную ткань, AAV5 векторы давали в результате приблизительно в 10 раз больше копий ДНК вектора в обоих местах взятия синовиальных образцов по сравнению с вектором AAV2. Перенос гена в хрящ был в 10 - 20 раз ниже, чем в синовиальную ткань при помощи AAV5, в то время как геномы вектора AAV2 были обнаружены на сходных уровнях и в синовиальной и в хрящевой тканях. Обнаружение генома вектора rAAV5 и мРНК суммированы на фиг. 7B, показывая устойчивый перенос гена и экспрессию вектором rAAV5/HAS2 во всех проверенных образцах ткани. Заявители считают этот результат весьма неожиданным.
Анализ уровней HA в синовиальной жидкости. Чтобы установить, можно ли обнаружить какие-либо изменения уровней HA в синовиальной жидкости после введения вектора rAAV, были количественно определены уровни HA в синовиальных образцах, собранных на дни -7 (исходный) и день 28. Поскольку был обнаружен высокий уровень вариативности между животными, уровни HA у каждого животного были нормализованы относительно исходных уровней у каждого животного. Результаты показали, что по сравнению с животными, обработанными PBS, и AAV2/высокие и AAV5/умеренные дозы в среднем повышали уровни HA в синовиальной жидкости (фиг. 8A и 8B).
Пример 1d - Заключение
Чтобы обеспечить сверхэкспрессию HA в суставе in vivo, заявители создали векторы rAAV с двумя серотипами капсида. Выбор серотипа капсида AAV является важным, поскольку любые предсуществующие нейтрализующие антитела у видов-мишеней могут нейтрализовать терапевтический вектор и, следовательно, блокировать перенос гена rAAV векторами. Раскрытые в описании результаты показали, что у большинства из исследуемых собак имелись низкие уровни нейтрализующих антител к обоим капсидам и AAV2 и AAV5. В связи с этим, заявители исследовали локализацию AAV2 и AAV5 капсида непосредственно в ткани-мишени, а именно в коленном суставе собаки, после внутрисуставной инъекции. Поскольку, как ожидается, HA экспрессия полезна и для синовиоцитов и для хондроцитов, количество копий генома вектора было определено в синовиальных и хрящевых образцах собаки, соответственно. Результаты показали, что AAV2 обеспечивал очень неустойчивый перенос гена в синовиальную и хрящевую ткани собаки in vivo и показал небольшой дозозависимый эффект, причины которого не ясны. Подобные эксперименты, проведенные на суставах кроликов с OA, продемонстрировали весьма сопоставимое обнаружение генома rAAV2 вектора со сравнимой дозой вектора (Kyostio-Moore 2015). В противоположность вектору AAV2, геномы вектора AAV5 обнаруживались на постоянной основе в обоих типах тканей (n=5/группа).
Важно отметить, что обнаружение AAV5 в образцах хряща было неожиданным, поскольку сообщалось, что хрящ трудно поддается трансдукции в условиях in vivo, вследствие большого внеклеточного матрикса, и в настоящее время нет других сообщений о детектировании AAV5 в хряще крупных животных после внутрисуставной доставки. Кроме того, в раскрытых исследованиях на собаках были получены непредвиденно высокие уровни вектора rAAV5 в синовиальной ткани собаки, которые были также примерно в 2-logs выше в синовиальной ткани по сравнению с хрящом, показывая предпочтение AAV5 в отношении синовиальной выстилки собак. Этот преимущественный профиль экспрессии также не мог быть предсказан раньше этого раскрытия.
В дополнение к обнаружению высокого уровня вектора, была подтверждена экспрессия рекомбинантной HAS2 с помощью анализа мРНК в синовиальной и хрящевой тканях собаки, указывая на то, что промотор CBA был функциональным в двух типах клеток. Кроме того, обнаружение транскриптов AAV5 в образцах хряща подтвердило, что хондроциты были трансдуцированы вектором, а не вирусом, депонированным во внеклеточном матриксе хряща. Что касается AAV2, сравнимые уровни геномов векторов и транскриптов также наблюдались в синовиальной выстилке. Однако экспрессия мРНК из векторов AAV2 неожиданно была приблизительно в 100 раз ниже, чем количество обнаруженных соответствующих геномов векторов в образцах хряща, что указывает на то, что некоторая часть вектора оставалась снаружи хондроцитов, возможно задерживаясь в экстрацеллюлярном матриксе. Эти принципиальные различия могли быть приняты во внимание только после того, как заявители провели основательные нестандартные эксперименты.
Хотя векторы были введены только в один сустав у каждого животного, геномы векторов были обнаружены в отдельных случаях в контралатеральном неинъецированном суставе. Это наблюдалось, главным образом, в синовиальных образцах, полученных из суставов, обработанных AAV2. Однако ни одно из животных с геномами векторов, обнаруженными в контралатеральных суставах, не продемонстрировало каких-либо детектируемых транскриптов HAS2 в этих суставах.
Таким образом, раскрытые в описании результаты показывают, что капсид AAV5 обеспечивает хороший перенос генов посредством внутрисуставной доставки в сустав собаки. Она основывается на низком предсуществующем гуморальном иммунитете к AAV5 у субъектов и способности трансдуцировать ткани сустава после внутрисуставной инъекции. Инъекции в сустав могут обеспечить перенос гена не только в синовиальную выстилку, но также в хондроциты хряща. Оба типа тканей будут получать пользу от повышенного синтеза HA, обеспеченного раскрытыми в описании композициями для доставки гена и методами: синовиальная ткань - благодаря повышенной способности обеспечивать «смазку» в синовиальной жидкости; и хрящевая ткань - благодаря выполнению роли каркасной структуры для повышенного скрепления матрикса и, следовательно, улучшенного состояния хряща. Эти результаты показывают, что сверх-экспрессия HA с помощью AAV-опосредованного переноса гена HAS2 в пораженный участок будет уменьшать патологические изменения и боль при OA .
Пример 2 - Создание и оценка вектора AAV лубрицина
Пример 2a - Краткое описание
Не так давно было показано, что внутрисуставные инъекции рекомбинантного белка лубрицина уменьшали дегенерацию хряща на крысиной модели OA (Flannery 2006). Однако рекомбинантный лубрицин, введенный в суставы, имел очень короткое время полужизни в синовиальной жидкости, при этом большая часть белка выводилась в пределах 72 часов (Vugmeyster 2011). В связи с этим потребовались бы повторные внутрисуставные инъекции, являющиеся трудоемкими, стрессогенными и дорогими. В противоположность HAS2 (смотри Пример 1) лубрицин кодируется большой кДНК и содержит множество ДНК повторов в его муцин-подобном домене, затрудняя его «посадку» в векторы rAAV и соответственно, экспрессию на высоких уровнях. Чтобы избежать этой проблемы, заявители создали укороченную кДНК лубрицина собаки, чтобы обеспечить оптимальные небольшие кассеты экспрессии для повышенного продуцирования лубрицина. Важно отметить, что до этого открытия ни полноразмерная последовательность лубрицина собаки, ни укороченная форма, раскрытая в этом описании, не были известны.
Коротко, заявители создали кДНК полноразмерного лубрицина собаки, которую потом использовали для создания укороченной и кодон-оптимизированной версии лубрицина собаки (cLub1co). Последнюю затем использовали для создания различных плазмид, экспрессирующих лубрицин. После трансфекции в клетки HEK293 плазмиды были охарактеризованы относительно выработки мРНК лубрицина и белка. Результаты показали и продуцирование мРНК лубрицина и секрецию лубрицина из каждой конструкции. И наконец, заявители создали rAAV векторы с cLub1 кассетой экспрессии и продемонстрировали возможность продуцирования rAAV/cLub1 вектора. Клетки HEK293, инфицированные этой конструкцией, синтезировали и секретировали собачий лубрицин.
Пример 2b - Методы
Клонирование лубрициа собаки. Поскольку в GenBank не имеется в наличии полноразмерной кДНК лубрицина собаки (неполная последовательность: GenBank № ABD38836.1), была получена полная кДНК собаки из специально созданной кДНК библиотеки хряща собаки. Для этого были получены перекрывающиеся фрагменты с помощью количественной ПЦР с разными праймерами. Затем полноразмерную кДНК (SEQ ID NO: 4) использовали для создания укороченной формы лубрицина собаки (cLub1), сходной с опубликованной более короткой версией лубрицина человека (Flannery 2009). Этот собачий укороченный лубрицин содержал делецию в последовательности, кодирующей аминокислоты 378 - 782. Укороченная последовательность лубрицина была кодон-оптимизированна (cLub1co) и синтезирована (GeneArt/ Invitrogen). Фрагмент cLubco (тупой конец KpnI к PmeI) был клонирован в Mfe (тупой конец) - сайт PmeI плазмиды, содержащей энхансер CMV, куриный β-актиновый промотор и укороченный гибридный интрон (HIb)(min CBA), и сайт полиаденилирования (pA) бычьего гормона роста (BGH). Продуктами реакции лигирования были трансформированы клетки E. coli Stable II, которые выращивали при 30°C, чтобы свести к минимуму перестройку ДНК. Полученные клоны были исследованы рестрикционным методом анализа, а места соединения при клонировании были проанализированы с помощью секвенирования ДНК. Были получены дополнительные конструкции, которые содержали кодоны для 6x гистидин (6xHis) и модификации в двух последовательностях “ATG”, присутствующих в интронной последовательности. Экспрессионные плазмиды использовали для анализа экспрессии лубрицина in vitro.
Анализ экспрессии лубрицина собаки. Плазмиды, экспрессирующие лубрицин, были трансфектированы в клетки HEK293 при помощи липофектамина 2000 (Invitrogen), затем выращивали клетки в течение 72 час. Чтобы проанализировать экспрессию мРНК лубрицина, клетки собирали и измеряли уровни транскиптов с помощью количественного ПЦР-анализа в реальном времени (RT), используя праймеры/зонды, специфические к BGH pA (система RT-ПЦР 7500; Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния). Для анализа продуцирования белка собирали культуральную среду и концентрировали приблизительно в от 20 до 30 раз (100k MWCO filter, Millipore). Образцы прогоняли на 4-12% Bis-Tris геле или 3-8% Трис-ацетате (NuPAGE; Thermo Fisher Scientific), SDS-PAGE геле (восстановленном) в MOPS или Трис-ацетатном буфере, соответственно. Лубрицин детектировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием мышиного анти-лубрицинного антитела (9G3, Millipore) (Ai 2015) и козьего анти-мышиного HRP в качестве вторичного антитела (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Пенсильвания).
5
4
Получение AAV/cLub1co. Кассета экспрессии cLub1 была клонирована в плазмиду, содержащую инвертированные концевые повторы (ITR) AAV, для получения кассеты экспрессии, фланкированной ITR AAV (превирусная плазмида pDC627), чтобы сконструировать psITR/minCBA-HI-cLub1co-BGHpA. Чтобы протестировать упаковку плазмиды cLub1, содержащей кассету экспрессии, клетки 293 высевали по 8×10 клеток/лунку (6-луночные планшеты) и на следующий день трансфицировали psITR/minCBA-HI-cLub1co-BGHpA, или psp70/EGFP, pHLP-19cap2 (AAV2) или плазмидами p5repCMVcap5 (AAV5) и pAdHELP (Promega CaPO набор), чтобы упаковать векторы в капсиды AAV2 или AAV5. Через 3 дня клетки собирали, и количественно оценивали лизаты относительно выхода вектора с помощью количественного ПЦР-анализа (система RT-ПЦР 7500) с использованием праймеров/зондов, специфических к последовательностям BGH pA (Applied Biosystems/Life Technologies), и стандартной кривой серийно разведенной линеаризованной плазмидной ДНК, содержащей BGH pA. Выход вируса rAAV выражали как количество частиц, устойчивых к ДНКазе (DRP), на клетку (Clark 1999).
Производство вектора в масштабах для исследования проводили с помощью тройной трансфекции psITR/minCBA-HI-cLub1co-BGH, pHLP19-cap5 для векторов AAV5, и pAdHELP. Векторы очищали с помощью градиента CsCl, и выходы количественно определяли, как описано выше (University of Massachusetts Medical School, Вустер, Массачусетс).
Пример 2c - Результаты
Получение короткого лубрицина собаки. Поскольку у последовательности лубрицина собаки, имеющейся в GenBank, отсутствовал большой участок экзона 6 (кодирующий 857 аминокислот), была создана полноразмерная кДНК лубрицина собаки (4017 п.о., не включающая стоп-кодон; SEQ ID NO:4), кодирующая белок с общим количеством аминокислот 1339 (SEQ ID NO: 5; фиг. 9), который немного меньше, чем человеческая последовательность из 1404 аминокислот). Аминокислотная последовательность лубрицина собаки имеет 79% идентичность с последовательностью человеческого лубрицина (SEQ ID NO:11; фиг. 16).
Поскольку полноразмерный лубрицин собаки был слишком большим, чтобы установить его в вектор rAAV вследствие лимита упаковки, была создана укороченная версия лубрицина собаки. Укороченная версия лубрицина собаки, “Lub1,” была создана путем устранения последовательности, кодирующей аминокислоты 378 - 782 в муцин-подобном домене, в результате была получена кДНК длиной 2949 п.о. (SEQ ID NO: 6), которая кодировала 983 аминокислоты (SEQ ID NO: 7). Несмотря на устранение большого участка муцин-подобного домена, осталось приблизительно десять KEPAPTT-подобных пептидных повторов. Важно отметить, что ничто из перечисленного не является идентичным каноническому повтору человеческой последовательности, но даже в том случае, если бы являлось, специалист не смог бы предсказать, может ли быть эффективной доставка укороченного собачьего Lub1 при лечении OA. Считается, что эти повторы важны для смазывающих свойств, так как они потенциально являются O-связанными сайтами присоединения олигосахарида. Кодон-оптимизация этого короткого лубрицина (Lub1co; SEQ ID NO: 6) увеличила содержание GC с 44% до 60% и обеспечила 74% сходство по нуклеотидам с исходной последовательностью ДНК собаки. Эта короткая кДНК собаки затем использовалась для получения плазмидной кассеты экспрессии с промотором minCBA, cLub1co и BGHpA (фиг. 10). Также были сделаны экспрессионные плазмиды с 6x His-tags (гистидиновыми метками) и модификациями в предполагаемых нуклеотидных последовательностях ATG в интронном участке (чтобы минимизировать ложные сайты старта трансляции).
Анализ экспрессии лубрицина собаки. Экспрессия cLub1co из минимальной плазмиды с промотором CBA (minCBA-cLub1co) была подтверждена in vitro путем демонстрации повышенных уровней мРНК в трансфицированных клетках 293 (фиг. 11A). Активность за счет конструкции minCBA-cLub1co с укороченным интроном была примерно в 3 раза ниже, чем при использовании полноразмерной конструкции CBA-HI (CBA-cLub1co). Очень небольшая транскрипция наблюдалась при использовании плазмиды, содержащей полноразмерный лубрицин и кодон-неоптимизированную конструкцию (CBH-cLubr). Также был проведен анализ транскрипта в отношении кассет экспрессии с различными модификациями (фиг. 10, 11B). Экспрессия из minCBA-Lub1co была сравнима с экспрессией EGFP и конструкцией с C-концевой 6xHis-tag. Делеция предполагаемых двух кодонов ATG, присутствующих в гибридном интроне, по-видимому, увеличивает уровни экспрессии примерно в 2 раза. Дополнительные морфологические изменения, наблюдаемые в Lub1co трансфектированных клетках, также подтвердили экспрессию Lub1, поскольку эти изменения не наблюдались в нетрансфектированных клетках или клетках, трансфектированных EGFP-плазмидой (не показано).
Продуцирование белка Lub1 собаки из разных экспрессионных плазмид была протестирована с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела к лубрицину, и был продемонстрирован белок весом 250-380 кДа в концентрированной культуральной среде (фиг. 12A). Предполагаемый размер, исходя из 1339 аминокислот, составляет приблизительно 160 кДа, однако бóльший и диффузный вид сигнала вероятно является следствием гликозилирования. Обнаружение небольшого количества было видно в нетрансфицированных клетках или клетках, трансфицированных EGFP плазмидой. В дополнение к этому, ΔATG модификация по-видимому увеличивает детекцию лубрицина, сходную с детекцией, наблюдаемой для повышенных уровней транскрипта из этих конструкций. Также была подтверждена экспрессия белка из превирусной плазмиды AAV и показано сравнимое обнаружение белка (фиг. 12B). Таким образом, эти результаты продемонстрировали, что плазмиды с экспрессионной кассетой лубрицина собаки, экспрессировали и секретировали гликозилированный белок лубрицин.
Получение вектора rAAV с кассетой экспрессии лубрицина собаки. Подтвердив экспрессию лубрицина собаки из плазмидных векторов, мы затем протестировали, может ли кассета экспрессии быть упакована в капсиды серотипов AAV2 и AAV5 в маломасштабном эксперименте по упаковке (фиг. 13A, B). Результаты показали эффективность упаковки лубрицина собаки капсидами AAV2 и AAV5, сравнимую с полученной для EGFP векторов экспрессии. Включение 6xHis-tag не изменило выход rAAV вектора. Примерно в 5 раз более низкий уровень упаковки был обнаружен для вектора AAV2 с кассетой экспрессии HAS2 собаки. Затем осуществили получение в масштабах, необходимых для проведения исследования, чтобы оценить возможность масштабирования выработки вектора. Выход вектора был сравним с выходом стандартных векторов AAV2 и AAV5 с EGFP в качестве трансгена (данные не показаны). Затем вектор rAAV5 был протестирован в отношении продуцирования лубрицина и секреции в клетках HEK293 in vitro. Анализ кондиционированной среды с помощью вестерн-блоттинга показал дозозависимое обнаружение лубрицина собаки (фиг. 14). Таким образом, результаты показывают, что укороченная версия лубрицина собаки может использоваться для создания векторов rAAV, и что клетки, инфицированные этим вектором, могут опосредовать синтез и секрецию лубрицина в среду.
Пример 2d - Заключение
Как указано выше, лубрицин в качестве трансгена присутствует в целом ряде направлений поисковых работ по созданию rAAV. Во-первых, размер кДНК лубрицина вместе с необходимыми элементами экспрессии превышает вместимость rAAV упаковки и, таким образом, требовалась более короткая версия кДНК. Интересно отметить, что по сравнению с аминокислотной последовательностью лубрицина человека в муцин-подобном домене в последовательности собаки не существует правильных KEPAPTT-повторов (фиг. 16). В случае создания рекомбинантного вектора rAAV любые повторяющиеся ДНК последовательности могут представлять собой проблему, поскольку повторяющиеся последовательности могут уменьшать стабильность и целостность вирусных геномов, вызывая делеции и перестановки в ДНК во время продуцирования вируса. Однако, раскрытые (и неожиданные) результаты показали, что создание rAAV вируса, содержащего и экспрессирующего новую последовательность лубрицина собаки, возможно, принимая во внимание, что сопоставимые выходы векторов были получены при сравнении со стандартными векторами-репортерами EGFP. Более того, клетки, инфицированные раскрытым вектором, продуцировали и секретировали собачий лубрицин. Соответственно, это первое сообщение, демонстрирующее стратегию на основе одного вектора rAAV для доставки гена лубрицина.
Пример 3 - Исследование эффективности in vivo AAV-HAS2 на модели удаления средней менисковой связки (MMR)
Целью этого исследования была оценка эффективности генной терапии на основе гена HA синтазы-2 с использованием макроскопических наблюдений и гистологии на модели OA коленного сустава собаки. Двенадцать специально выращенных интактных самцов беспородных собак (фенотип фоксхаунд, ≈20-23 кг) были подвергнуты под анестезией артроскопической процедуре удаления средней менисковой связки (MMR) правого коленного сустава (d -14).
11
Фосфатно-буферный раствор (PBS контроль) или 5×10 частиц, устойчивых к ДНКазе [кап.], рекомбинантного AAV5, несущего собачью синтазу 2 гиалуроновой кислоты (cHAS-2), вводили внутрисуставным путем на день 0 (n = 6 собак/группа).
Образцы плазмы собирали на День 0 и 182 от всех собак с целью определения уровней биомаркеров воспаления в суставе. Синовиальную жидкость из правого и левого суставов собирали для анализа уровня HA на день 0, 56, 112 и 182 от группы, обработанной PBS (контроль) и всех групп, пролеченых cHAS-2.
Собак подвергали эвтаназии на день 182, измеряли хрящевой дефект, вызванный удалением связки мениска (показанный окрашиванием Китайской тушью) и собирали ткани суставов для гистопатологического исследования в соответствии со стандартными методами Международного общества исследования OA (OARSI).
Общие и гистологические данные были проанализированы с помощью программы для статистического анализа GraphPad Prism 6 с использованием критерия Краскела-Уоллиса.
Были измерены общие уровни HA в синовиальной жидкости, которые не показали каких-либо связанных с обработкой различий в общих уровнях HA (фиг. 17).
Образцы синовиальной ткани и хряща собирали из обработанных суставов в день 182 и анализировали на обнаружение вирусных геномов (фиг. 18A). ДНК и мРНК, происходящие от вектора, были обнаружены в каждом отдельном суставе, инъецированном rAAV5/cHAS-2, в образцах синовиальной ткани (фиг. 18A) и большинстве образцов хряща (фиг. 18B). Данные, суммированные на фиг. 18C, показывают среднюю величину в группе геномов вектора и мРНК в образцах двух тканей.
Доказательств локальной или системной токсичности, связанной с внутрисуставным введением генотерапии HA синтазой-2, не было обнаружено. Наблюдалось устойчивое предохранение структуры хряща в пролеченной cHAS-2 группе по сравнению с группой, обработанной PBS. Уменьшенный размер и глубина повреждений на обеих суставных поверхностях медиального мыщелка бедренной кости и медиального плато большеберцовой кости были более выражены в мыщелке бедренной кости у четырех из шести собак, обработанных rAAV5/cHAS2.
На фиг. 19, в нижнем левом углу изображений показан гистопатологический счет баллов, на основе Cook et al. (2001), для каждого медиального мыщелка бедренной кости и медиального хряща большеберцовой кости (2x). У собаки 994731/PBS наблюдалась распространенная эрозия вплоть до средней зоны со значительной потерей протеогликана на обеих хрящевых поверхностях. Не было отмечено хондропротекторного действия. У собаки 993107, которую лечили rAAV5/cHAS2, наблюдалось поверхностное повреждение в поверхностной зоне бедренного хряща, но, в общем, была отмечена хорошая сохранность оставшегося хряща и небольшая потеря протеогликана. Наблюдалось поражение плата большеберцовой кости вглубь в среднюю зону с умеренным истощением протеогликана. Наблюдался хондропротекторный эффект в мыщелке бедренной кости, так как основной хрящ был в относительно нормальном состоянии. У собаки 992879, которую лечили rAAV5/cHAS2, была отмечена некоторая потеря протеогликана в бедренном хряще, но общая морфология была сохранена. Плато большеберцовой кости имело четко выраженную очаговую эрозию, однако, большая часть хряща была сохранена. Таким образом, имеется некоторое доказательство хондропротекции, поскольку повреждения были меньше и менее тяжелые.
Примечательно, что одно из животных, пролеченных rAAV5, у которого вектор в образце хряща не обнаруживался, имело самую большую площадь поражения верхней суставной поверхности большеберцовой кости (собака 993107, фиг. 19). Наоборот, одно из животных, пролеченных rAAV5, (собака 992879), у которого вектор был обнаружен и в синовиальной ткани и в хряще, однако не обнаруживалась мРНК в хряще, имело лучшую структуру хряща.
Соответственно, лучшая структура хряща связана с присутствием вектора rAAV5-HAS2, а самая большая площадь поражения верхней суставной поверхности большеберцовой кости связана с отсутствием вектора. Таким образом, несмотря на варьирование в обнаружении вектора/мРНК, вектор rAAV5, экспрессирующий HAS2, по-видимому, вызывал желательный клинический результат.
Вместе взятые, эти результаты подтвердили устойчивый опосредованный rAAV5 перенос генов в синовиальную и хрящевую ткань суставов собак с OA и продемонстрировали длительную экспрессию, обусловленную вектором, по меньшей мере, в течение шести месяцев. Гистологический анализ показал уменьшенную патологию хряща и задержку прогрессирования болезни в большинстве суставов, обработанных cHAS-2, наряду с тем, что наблюдались небольшие различия в общих уровнях HA в синовиальной жидкости. Последнее может указывать на то, что локальная экспрессия HA в хрящевой и синовиальной ткани обладает некоторыми болезнь-модифициующими свойствами при отсутствии повышения общих уровней HA в синовиальной жидкости. Альтернативно, изменения молекулярного веса синтезированной HA, которые не могут обнаруживаться путем измерения общих уровней HA, также могут способствовать благотворному воздействию rAAV5/cHAS-2.
Ссылки
Sanderson RO et al., Systematic review of the management of canine osteoarthritis. Veterinary Record (2009) 164, 418-424.
McIlwraith CW. Frank Milne Lecture: from arthroscopy to gene therapy: 30 years of looking in joints. Am Assoc Equine Pract 2005;51:65-113.
Cook et al., The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the dog. Osteoarthritis Cartilage, 2010;18 suppl 3:S66-79.
Изобретение далее описывается в следующих пронумерованных параграфах:
1. Способ лечения субъекта-млекопитающего, страдающего от остеоартрита (OA), включающий внутрисуставное введение указанному субъекту-млекопитающему терапевтически эффективного количества рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую защищающий кость или восстанавливающий кость полипептид, функционально связанную с промотором, при этом полипептид экспрессируется in vivo у млекопитающего-субъекта в количестве, эффективном для облегчения симптомов OA.
2. Способ по п. 1, согласно которому полипептид является гиалуронсинтазой (HAS), лубрицином, антагонистом рецептора интерлейкина-1 (IL-1R), инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF-1), фактором роста фибробластов 2 (FGF-2), трансформирующим ростовым фактором бета 1 (TGFβ1), костным морфогенетическим белком 7 (BMP7), глюкозамин-фруктозо-6-фосфат аминотрансферазой (GFAT), интерлейкином 10 (IL-10), гемоксигеназой-1 HO-1, их биологически активными укороченными вариантами или их комбинациями.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором полипептид является полипептидом HAS2.
4. Способ по любому из пунктов 1-3, в котором субъект-млекопитающее является человеком, собакой или кошкой.
5. Способ по любому из пунктов 1-4, в котором субъект-млекопитающее является собакой.
6. Способ по п. 5, в котором полипептид представляет собой HAS2 собаки.
7. Способ по п. 5 или 6, в котором полипептид HAS2 содержит аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, или фрагмент, вариант или гомолог, который демонстрирует активность HAS2 in vivo у субъекта.
8. Способ по любому из пунктов 5-7, согласно которому полипептид HAS2 содержит аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 2.
9. Способ по любому из пунктов 5-8, согласно которому нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид HAS2, имеет нуклеотидную последовательность, обладающую, по меньшей мере, 90% идентичностью с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3.
10. Способ по любому из пунктов 5-9, согласно которому rAAV включает геном вектора rAAV, содержащий в порядке от 5' к 3' следующие элементы: 5' инвертированный концевой повтор (ITR) AAV, «лишний» участок нуклеиновой кислоты, промотор, интрон (IN), кодон-оптимизированную кДНК cHAS2, сигнал полиаденилирования (pA) и 3' ITR AAV.
11. Способ по п. 10, согласно которому промотор является куриным бета-актиновым промотором (CBA).
12. Способ по п. 1 или 2, согласно которому полипептид представляет собой полипептид лубрицин.
13. Способ по п. 12, согласно которому полипептид лубрицин содержит аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, или его фрагмент, вариант или гомолог, который демонстрирует активность лубрицина in vivo у субъекта.
14. Способ по п. 13, согласно которому полипептид лубрицин содержит аминокислотную последовательность, как установлено в SEQ ID NO: 7.
15. Способ по п. 13 или 14, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид лубрицина содержит нуклеотидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичность с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6.
16. Способ по любому из пунктов 13-14, в котором rAAV содержит геном вектора rAAV, кодированный плазмидой pITR/minCBA-HI-cLub1co-BGH.
17. Способ по любому из пунктов 1-9 или 12-16, в котором промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CMV IE, промотора RSV, промотора HSV-1 TK, раннего промотора SV40, позднего промотора SV40, основного аденовирусного позднего промотора, промотора гена фосфоглицераткиназы, промотора гена металлотионеина, промотора гена α-1 антитрипсина, промотора гена альбумина, промотора гена коллагеназы, промотора гена эластазы I, промотора гена β-актина, промотора CBA, промотора гена β-глобина, промотора гена γ-глобина, промотора гена α-фетопротеина и промотора гена мышечной креатинкиназы (CK).
18. Способ по п. 1, в котором AAV содержит капсид AAV2 или AAV5.
19. Способ увеличения выработки гиалуроновой кислоты в хондроцитах и/или синовиоцитах собаки, включающий стадии введения rAAV собаке, при этом rAAV содержит геном вектора rAAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент HAS2, функционально связанную с промотором, и при этом после введения фермент HAS2 экспрессируется и катализирует выработку дополнительной гиалуроновой кислоты, таким образом, увеличивая уровень гиалуроновой кислоты (HA) у собаки.
20. Способ по п. 19, в котором HAS2 продуцируется в достаточном количестве для лечения симптомов OA у собаки.
21. Способ по п. 20, в котором уровни HA восстанавливаются до уровней, обнаруженных у здоровых собак.
22. Способ лечения собаки, страдающей от OA, включающий введение собаке терапевтически эффективного количества rAAV, согласно которому rAAV включает геном вектора AAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую HAS2, функционально связанную с промотором.
23. Способ лечения человека, страдающего от OA, включающий введение человеку терапевтически эффективного количества rAAV, согласно которому rAAV включает вектор AAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую HAS2, функционально связанную с промотором.
24. Способ по любому из пунктов 19-23, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая HAS2, имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3, или кодирует HAS2, который имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
25. Способ по любому из пунктов 19-23, в котором HAS2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.
26. Способ увеличения выработки лубрицина в хондроцитах и/или синовиоцитах собаки, включающий стадии введения rAAV собаке, при этом rAAV включает вектор rAAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую лубрицин, функционально связанную с промотором, и согласно которому после введения экспрессируется лубрицин, таким образом, увеличивая уровень лубрицина у собаки.
27. Способ по п. 26, в котором лубрицин продуцируется в достаточном количестве для лечения симптомов OA у собаки.
28. Способ по п. 26, в котором уровни лубрицина восстанавливаются до уровней, обнаруженных у здоровых собак.
29. Способ лечения собаки, страдающей от OA, включающий введение указанной собаке терапевтически эффективного количества rAAV, согласно которому rAAV содержит геном вектора rAAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую лубрицин, функционально связанную с промотором.
30. Способ лечения человека, страдающего от OA, включающий введение указанному человеку терапевтически эффективного количества rAAV, согласно которому rAAV содержит геном вектора rAAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую лубрицин, функционально связанную с промотором.
31. Способ по любому из пунктов 26-30, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид лубрицина, имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, или нуклеиновая кислота кодирует лубрицин, который имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 7.
32. Способ по любому из пунктов 26-30, в котором лубрицин имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.
33. Способ по любому из пунктов 19-32, в котором промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CMV IE, промотора RSV, промотора HSV-1 TK, раннего промотора SV40, позднего промотора SV40, промотора гена фосфоглицераткиназы, промотора гена металлотионеина, промотора гена α-1 антитрипсина, промотора гена альбумина, промотора гена коллагеназы, промотора гена эластазы I, промотора CBA, промотора гена β-актина, промотора гена β-глобина, промотора гена γ-глобина, промотора гена α-фетопротеина и промотора гена мышечной креатинкиназы.
34. Способ по любому из пунктов 19-25, в котором rAAV содержит геном rAAV вектора, кодированный плазмидой Ps-AAV-ITR/CBA-cHAS2co-BGH.
35. Способ по любому из пунктов 26-32, в котором rAAV содержит геном вектора rAAV, кодированный плазмидой Ps-AAV-ITR/minCBA-HI-cLub1co-BGH.
36. Способ предотвращения развития OA у субъекта-млекопитающего с риском развития ОА, включающий введение указанной собаке терапевтически эффективного количества rAAV, при этом rAAV включает геном вектора rAAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую HAS2, функционально связанную с промотором.
37. Способ по п. 36, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид HAS2, имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, или кодирует HAS2, которая имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.
38. Способ по п. 36 или 37, в котором полипептид HAS2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.
39. Способ предотвращения развития OA у субъекта-млекопитающего с риском развития ОА, включающий введение указанной собаке терапевтически эффективного количества rAAV, согласно которому rAAV содержит геном вектора rAAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую лубрицин, функционально связанную с промотором.
40. Способ по п. 39, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая лубрицин, имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, или нуклеиновая кислота кодирует лубрицин, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7.
41. Способ по п. 40, в котором полипептид лубрицин имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.
42. Способ по любому из пунктов 36-38, в котором промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CMV IE, промотора RSV, промотора HSV-1 TK, раннего промотора SV40, позднего промотора SV40, промотора гена фосфоглицераткиназы, промотора гена металлотионеина, промотора гена α-1 антитрипсина, промотора гена альбумина, промотора гена коллагеназы, промотора гена эластазы I, промотора CBA, промотора гена β-актина, промотора гена β-глобина, промотора гена γ-глобина, промотора гена α-фетопротеина и промотора гена мышечной креатинкиназы (CK).
43. Способ по п. 26, в котором rAAV содержит геном вектора rAAV, кодируемый плазмидой Ps-AAV-ITR/CBA-cHAS2co-BGH.
44. Способ по п. 26, в котором rAAV содержит геном вектора rAAV, кодируемый плазмидой Ps-AAV-ITR/minCBA-HI-cLub1co-BGH.
45. Способ по любому из пунктов 19-44, в котором rAAV вводится внутрисуставным путем.
46. Рекомбинантный плазмидный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую собачий полипептид HAS2, функционально связанную с промотором.
47. Рекомбинантная плазмида по п. 46, в которой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид HAS2, имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3, или нуклеиновая кислота кодирует полипептид HAS2, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2.
48. Рекомбинантная плазмида по п. 46 или 47, в которой полипептид HAS2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.
49. Рекомбинантная плазмида по любому из пунктов 46-49, содержащая pCBA-HI-cHAS2-BGHpA.
50. Рекомбинантный плазмидный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую укороченный собачий лубрицин, функционально связанный с промотором.
51. Рекомбинантная плазмида по п. 50, в котором последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая лубрицин имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, или нуклеиновая кислота кодирует лубрицин, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 7.
52. Рекомбинантная плазмида по п. 50 или 51, в которой полипептид лубрицин имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.
53. Рекомбинантная плазмида по любому из пунктов 46-49 или 50-52, в котором промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CMV IE, промотора RSV, промотора HSV-1 TK, раннего промотора SV40, позднего промотора SV40, промотора гена фосфоглицераткиназы, промотора гена металлотионеина, промотора гена α-1 антитрипсина, промотора гена альбумина, промотора гена коллагеназы, промотора гена эластазы I, промотора CBA, промотора гена β-актина, промотора гена β-глобина, промотора гена γ-глобина, промотора гена α-фетопротеина и промотора гена мышечной креатинкиназы.
54. Рекомбинантный вирусный вектор AAV5, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8.
55. rAAV, содержащий вектор rAAV по п. 53.
56. Фармацевтическая композиция, содержащая rAAV по п. 55, и, по меньшей мере, один фармацевтически или с точки зрения ветеринарии приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
57. Способ лечения субъекта-млекопитающего, страдающего от остеоартрита, включающий внутрисуставное введение указанному субъекту-млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п. 56.
58. Способ по п. 57, в котором субъект-млекопитающее является человеком или собакой.
59. Система биологической доставки и экспрессии на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для использования при лечении или предотвращении OA суставов у млекопитающих посредством длительной экспрессии гена HAS2 или лубрицина в синовиальных клетках и/или хондроцитах, содержащая rAAV, при этом rAAV содержит вектор rAAV, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую HAS2 или лубрицин, левый и правый инвертированный концевой повторы (L ITR и R ITR) AAV, и в которой экспрессия гена HAS2 или лубрицина в синовиальных клетках и/или хондроцитах регулируется промотором, который располагается выше рамки считывания последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей HAS2 или лубрицин, и который специфически активируется повышенными уровнями иммунностимулирующих субстанций.
60. Система AAV по п. 59, в котором HAS2 представляет собой HAS2 млекопитающего.
61. Система AAV по п. 59 или 60, в котором HAS2 представляет собой HAS2 человека.
62. Система AAV по любому из пунктов 59-61, в котором промотор представляет собой промотор, индуцируемый воспалением.
63. Система AAV по п. 62, в которой индуцибельный промотор выбирают из следующего: промотора NF-KB, промотора интерлейкина 6 (II-6), промотора интерлейкина-1 (11-1), промотора фактора некроза опухоли (TNF), промотора циклооксигеназы 2 (COX-2), промотора фактора комплемента 3 (C3), промотора сывороточного амилоида A3 (SAA3), промотора воспалительного белка-1a макрофагов (MIP-1a) и их гибридных конструкций.
64. Система AAV по любому из пунктов 59-63, в которой геном вектора rAAV включает нуклеиновую кислоту, кодирующую HAS2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, лубрицин, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или его функциональный вариант.
65. Система AAV по любому из пунктов 59-64, в которой геном вектора rAAV содержит маркерный ген, дающий возможность мониторинга генома вектора в синовиальных клетках и/или хондроцитах.
66. Система AAV по любому из пунктов 59-65, в которой геном вектора rAAV содержит нуклеиновую кислоту, имеющую, по меньшей мере, 80% или 90% идентичность последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO: 6.
67. Система AAV по любому из пунктов 59-66, в которой геном вектора rAAV содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO: 6.
68. Система AAV по любому из пунктов 59-67 для лечения или предотвращения остеоартрита (OA).
69. Фармацевтическая композиция, содержащая AAV систему, по любому из пунктов 59-68.
70. rAAV, содержащий вектор rAAV, в котором вектор rAAV содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую собачий полипептид HAS2, функционально связанную с промотором.
71. rAAV по п. 70, в котором последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид HAS2, имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3, или нуклеиновая кислота кодирует полипептид HAS2, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
72. rAAV по п. 70 или 71, в котором полипептид HAS2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.
73. rAAV, содержащий вектор rAAV, при этом rAAV вектор включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую укороченный собачий лубрицин, функционально связанную с промотором.
74. rAAV по п. 73, в котором последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая лубрицин, имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, или нуклеиновая кислота кодирует лубрицин, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7.
75. rAAV по п. 73 или 74, в котором полипептид лубрицин имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.
76. rAAV по любому из пунктов 50-53, в котором вектор rAAV содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8.
77. rAAV по любому из пунктов 71-72 или 74-76, в котором промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CMV IE, промотора RSV, промотора HSV-1 TK, раннего промотора SV40, позднего промотора SV40, промотора гена фосфоглицераткиназы, промотора гена металлотионеина, промотора гена α-1 антитрипсина, промотора гена альбумина, промотора гена коллагеназы, промотора гена эластазы I, промотора CBA, промотора гена β-актина, промотора гена β-глобина, промотора гена γ-глобина, промотора гена α-фетопротеина и промотора гена мышечной креатинкиназы.
78. rAAV по любому из пунктов 71-77, в котором rAAV содержит капсид AAV2 или капсид AAV5.
79. Фармацевтическим композиция, содержащая rAAV по любому из пунктов 71-78, и, по меньшей мере, один фармацевтически или с точки зрения ветеринарии приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
80. Способ лечения субъекта-млекопитающего, страдающего от остеоартрита, включающий внутрисуставное введение указанному субъекту-млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п. 79.
81. Способ по п. 80, в котором субъект-млекопитающее является человеком или собакой.
82. Выделенная нуклеиновая кислота, имеющая последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4.
83. Выделенный полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.
Далее изобретение будет конкретизировано приведенными ниже и не имеющими ограничительного характера пунктами формулы изобретения.
--->
Перечень последовательностей
<110> Merial, Inc.
Genzyme
Dias Figueiredo, Monica
RM Kyostio-Moore, Sirkka
Berthelette, Patricia
<120> Recombinant AAV Vectors Expressing Osteoprotective genes,
including HAS2 and Lubricin, useful in the Treatment of
Osteoarthritis and Related Joint Conditions in Mammals
<130> MER 16-291
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1656
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Canine hyaluronic acid synthase 2 (cHAS2) - GenBank XM 539153.3
<400> 1
atgcattgtg agaggtttct atgcatcctg agaataattg gaaccacact ttttggagtg 60
tctctcctcc ttggaatcac agctgcttac attgttggct accaatttat ccaaacagat 120
aattactact tctcttttgg actgtatggt gcctttttag catcacacct catcatccaa 180
agcctgtttg cctttttgga gcatcgaaaa atgaagaaat ccctagaaac acccatcaaa 240
ttgaacaaga ctgttgctct ttgcatcgct gcctatcaag aagatccaga ctacttacga 300
aaatgtttgc aatctgtgaa gaggctaacc taccctggga ttaaagttgt catggtcata 360
gatgggaact cggaagatga cctttatatg atggacatct ttagcgaagt catgggcagg 420
gacaaatcag ccacttatat ctggaagaac aacttccacg agaaaggtcc tggtgagacg 480
gatgagtcac ataaagaaag ctcgcaacat gtcacccagt tggtcttgtc caacaaaagt 540
atttgcatca tgcaaaaatg gggtggaaaa agagaagtca tgtacacggc cttcagagca 600
ctgggacgaa gtgtggatta tgtacaggtt tgtgattcag acaccatgct tgaccctgcc 660
tcatctgtgg agatggtgaa agttttagaa gaagacccca tggttggagg tgtcggggga 720
gatgtccaga ttttaaacaa gtatgattcc tggatctcct tcctcagcag tgtgagatac 780
tggatggctt ttaacataga aagggcctgc cagtcttatt ttgggtgtgt ccagtgcatt 840
agtggacctc tgggaatgta cagaaactcc ttgctgcatg aatttgtgga agactggtac 900
aatcaggaat ttatgggcag ccaatgtagt tttggggacg accggcatct aacgaaccga 960
gtgctgagtc tgggctatgc aacaaaatac acagctcgat ccaagtgcct tacggagacg 1020
cctatagagt atctcagatg gttaaaccag cagacccgct ggagcaagtc ctacttccga 1080
gagtggctgt acaatgcgat gtggttccat aaacatcact tgtggatgac ctatgaggcc 1140
gttatcactg gattcttccc tttctttctc attgccacag tgatccagct cttctacagg 1200
ggtaaaattt ggaacatcct cctcttcttg ttaactgtcc agttagtagg tctcataaaa 1260
tcctcctttg ccagctgcct tagaggaaat attgtcatgg tcttcatgtc cctctactca 1320
gtgctataca tgtcaagttt acttcctgcc aaaatgtttg ccattgccac gataaacaaa 1380
gctgggtggg gcacatctgg aaggaaaacc attgtcgtta atttcatagg actcattcca 1440
gtatcggttt ggtttacaat cctcctgggt ggtgtgattt tcaccattta taaggaatct 1500
aaaaagccat tctcagaatc caagcagaca gttctcattg ttggaacgtt gctctatgca 1560
tgctattggg tcatgctttt gacgctgtat gtggttctca tcaataagtg tggcaggagg 1620
aagaagggac aacagtatga catggtgctc gatgta 1656
<210> 2
<211> 552
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cHAS2 polypeptide
<400> 2
Met His Cys Glu Arg Phe Leu Cys Ile Leu Arg Ile Ile Gly Thr Thr
1 5 10 15
Leu Phe Gly Val Ser Leu Leu Leu Gly Ile Thr Ala Ala Tyr Ile Val
20 25 30
Gly Tyr Gln Phe Ile Gln Thr Asp Asn Tyr Tyr Phe Ser Phe Gly Leu
35 40 45
Tyr Gly Ala Phe Leu Ala Ser His Leu Ile Ile Gln Ser Leu Phe Ala
50 55 60
Phe Leu Glu His Arg Lys Met Lys Lys Ser Leu Glu Thr Pro Ile Lys
65 70 75 80
Leu Asn Lys Thr Val Ala Leu Cys Ile Ala Ala Tyr Gln Glu Asp Pro
85 90 95
Asp Tyr Leu Arg Lys Cys Leu Gln Ser Val Lys Arg Leu Thr Tyr Pro
100 105 110
Gly Ile Lys Val Val Met Val Ile Asp Gly Asn Ser Glu Asp Asp Leu
115 120 125
Tyr Met Met Asp Ile Phe Ser Glu Val Met Gly Arg Asp Lys Ser Ala
130 135 140
Thr Tyr Ile Trp Lys Asn Asn Phe His Glu Lys Gly Pro Gly Glu Thr
145 150 155 160
Asp Glu Ser His Lys Glu Ser Ser Gln His Val Thr Gln Leu Val Leu
165 170 175
Ser Asn Lys Ser Ile Cys Ile Met Gln Lys Trp Gly Gly Lys Arg Glu
180 185 190
Val Met Tyr Thr Ala Phe Arg Ala Leu Gly Arg Ser Val Asp Tyr Val
195 200 205
Gln Val Cys Asp Ser Asp Thr Met Leu Asp Pro Ala Ser Ser Val Glu
210 215 220
Met Val Lys Val Leu Glu Glu Asp Pro Met Val Gly Gly Val Gly Gly
225 230 235 240
Asp Val Gln Ile Leu Asn Lys Tyr Asp Ser Trp Ile Ser Phe Leu Ser
245 250 255
Ser Val Arg Tyr Trp Met Ala Phe Asn Ile Glu Arg Ala Cys Gln Ser
260 265 270
Tyr Phe Gly Cys Val Gln Cys Ile Ser Gly Pro Leu Gly Met Tyr Arg
275 280 285
Asn Ser Leu Leu His Glu Phe Val Glu Asp Trp Tyr Asn Gln Glu Phe
290 295 300
Met Gly Ser Gln Cys Ser Phe Gly Asp Asp Arg His Leu Thr Asn Arg
305 310 315 320
Val Leu Ser Leu Gly Tyr Ala Thr Lys Tyr Thr Ala Arg Ser Lys Cys
325 330 335
Leu Thr Glu Thr Pro Ile Glu Tyr Leu Arg Trp Leu Asn Gln Gln Thr
340 345 350
Arg Trp Ser Lys Ser Tyr Phe Arg Glu Trp Leu Tyr Asn Ala Met Trp
355 360 365
Phe His Lys His His Leu Trp Met Thr Tyr Glu Ala Val Ile Thr Gly
370 375 380
Phe Phe Pro Phe Phe Leu Ile Ala Thr Val Ile Gln Leu Phe Tyr Arg
385 390 395 400
Gly Lys Ile Trp Asn Ile Leu Leu Phe Leu Leu Thr Val Gln Leu Val
405 410 415
Gly Leu Ile Lys Ser Ser Phe Ala Ser Cys Leu Arg Gly Asn Ile Val
420 425 430
Met Val Phe Met Ser Leu Tyr Ser Val Leu Tyr Met Ser Ser Leu Leu
435 440 445
Pro Ala Lys Met Phe Ala Ile Ala Thr Ile Asn Lys Ala Gly Trp Gly
450 455 460
Thr Ser Gly Arg Lys Thr Ile Val Val Asn Phe Ile Gly Leu Ile Pro
465 470 475 480
Val Ser Val Trp Phe Thr Ile Leu Leu Gly Gly Val Ile Phe Thr Ile
485 490 495
Tyr Lys Glu Ser Lys Lys Pro Phe Ser Glu Ser Lys Gln Thr Val Leu
500 505 510
Ile Val Gly Thr Leu Leu Tyr Ala Cys Tyr Trp Val Met Leu Leu Thr
515 520 525
Leu Tyr Val Val Leu Ile Asn Lys Cys Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gln
530 535 540
Gln Tyr Asp Met Val Leu Asp Val
545 550
<210> 3
<211> 1656
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon-optimized cHAS2
<400> 3
atgcactgcg agcggtttct gtgcatcctg aggatcatcg gcaccaccct gttcggcgtg 60
tccctgctgc tgggcatcac cgccgcctac atcgtgggct accagttcat ccagaccgac 120
aactactact tcagcttcgg cctgtacggc gccttcctgg ccagccacct gatcatccag 180
agcctgttcg ccttcctcga gcaccggaag atgaagaagt ccctggaaac ccccatcaag 240
ctgaacaaga ccgtggccct gtgtatcgct gcctaccagg aagatcccga ctacctgcgg 300
aagtgcctgc agagcgtgaa gaggctgacc taccccggca tcaaggtggt catggtcatc 360
gacggcaaca gcgaggacga cctgtacatg atggacatct tcagcgaagt gatgggcagg 420
gacaagagcg ccacctacat ctggaagaac aacttccacg agaagggccc tggcgaaacc 480
gacgagagcc acaaagaaag cagccagcac gtgacccagc tggtgctgag caacaagagc 540
atctgcatca tgcagaagtg gggcggcaag agggaagtga tgtacaccgc cttcagagcc 600
ctgggcagaa gcgtggacta cgtccaagtg tgcgacagcg acaccatgct ggaccccgcc 660
agcagcgtgg aaatggtcaa ggtgctggaa gaggacccca tggtcggagg cgtgggcggc 720
gacgtgcaga tcctgaacaa atacgacagc tggatcagct tcctgagcag cgtgcggtac 780
tggatggcct tcaacatcga gagggcctgc cagagctact tcggctgcgt gcagtgcatc 840
agcggccctc tgggcatgta ccggaacagc ctgctgcacg agttcgtcga ggactggtac 900
aaccaggaat tcatgggcag ccagtgcagc ttcggcgacg acaggcacct gaccaacagg 960
gtgctgagcc tgggctacgc caccaagtac accgccaggt ccaagtgcct gaccgagaca 1020
cccatcgagt acctgcggtg gctgaaccag cagaccaggt ggtccaagtc ctacttcaga 1080
gagtggctgt acaacgccat gtggttccac aagcaccacc tgtggatgac ctacgaggcc 1140
gtgatcaccg gattcttccc tttcttcctg atcgccaccg tgattcagct gttctacagg 1200
ggcaagatct ggaatatcct gctgttcctg ctgaccgtcc agctcgtggg cctgatcaag 1260
agcagcttcg ccagctgcct gaggggcaac atcgtgatgg tgttcatgag cctgtacagc 1320
gtgctgtaca tgtcctccct gctgcccgcc aagatgttcg ccattgccac catcaacaag 1380
gccggctggg gcacaagcgg cagaaagacc atcgtggtca acttcatcgg cctgatcccc 1440
gtgtccgtgt ggttcaccat cctgctgggc ggcgtgatct tcaccatcta caaagagagc 1500
aagaagccct tcagcgagag caagcagacc gtgctgatcg tgggaaccct gctgtacgcc 1560
tgctactggg tcatgctgct gaccctgtac gtggtgctga ttaacaagtg cggcaggcgg 1620
aagaagggcc agcagtacga catggtgctg gacgtg 1656
<210> 4
<211> 4020
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Canine Full length lubricin
<400> 4
atgcagtgga aaatacttcc catatacttg ctgctcctct ctgttttctt gattcagcaa 60
gtttcttctc aagatttacc aagctgtgca gggagatgtg gggaagggta ttctagagat 120
gccatctgca actgtgatta taactgtcaa cactacatgg agtgctgccc tgatttcaag 180
aaagcctgca ctgtggagct ttcctgtaaa ggtcgctgct tcgagtcctt tgcacgaggg 240
agggagtgtg actgtgactc agactgtaag aagtatggca agtgctgtcc cgattatgag 300
gatttttgtg gaagagtgca taatcccaca tcacctccat cttcaaagac tgcacctcca 360
tctccaggag catctcaaac catcaaatca acagccaaac gttcacccaa agcaccaaat 420
aagaagaaga ctaagaaagt tatagaatca gaggaaataa cagaagaaca ttctgtttct 480
gaaaaccaag agtcttcttc ctcctcttcc tcttcctctt caactattcg gaaaatcaag 540
tcttccaaaa attcagcagc taataaagaa ttaaagaaga aacccaaagt aaaagataac 600
aagaaggaaa gaactcctaa aaagaaacct ccgccagaac caccagttgt agatgaagct 660
ggaagtggac tggacaatgg tgacatcaag ctcaccccaa ctcctgacat tcctaccacc 720
caacgcaata aggttaccac atctcccaag tttacaacag gcaaaccaat aaatcctaaa 780
cctagtcttc cacctaatac tgatacatcc aaagagacct cttcaacacc taataaggag 840
acaacagtga aaagtaaaga gactttagca aacaaagaga cttcaagtaa agcaaaagag 900
aagattactt cagccaaaga gacacgaagt gcagagaaaa cacctgctaa agattttgta 960
cccacaacca aagctcctgt taaatctaca cccaaagctg aaagtacaac caaatctcct 1020
gctcccacca ccaccaagga gcccactcct accaccacca agaagcctgc acccactacc 1080
cccaagaaac ctgctcccac tactcccaag gagcctgtac ccactaccac caaggggcca 1140
cccaccacgc ccaagaaacc tgaacccacc actcccaagg atcctgctcc caccaccacc 1200
aaggagccca ctcccaccac ccccaagaag cctgctccca ctactcccaa ggagcctgta 1260
cccattacca ccaaggagcc tgaacccacc acccccaaga agcctgaacc caccactccc 1320
aaggagcctg ctcccaccac tcccaaggag cctgtaccca ctaccaccaa ggagcctgaa 1380
cccaccactc ccaaggagcc tgcacccacc acccccaagg agcctgctcc cactactccc 1440
aaggagcctg tacctactac caccaaggag ccacccacca cccccaagaa gcctgaaccc 1500
accactccca aggagcctgc tcccaccact cccaaggagc ctgtacccac taccaccaag 1560
gagcctgaac ccaccactcc caaggagctt gcacccacca cccccaagga gcctgctccc 1620
actactccca aggagcctgt acctactacc accaaggagc cacccaccac ccccaagaag 1680
cctgaaccca ccactcccaa ggagcctgca cccaccaccc ccaaggagcc tgctcccact 1740
actcccaagg agccacctac cacccccaag aagcctgaac ccaccactcc caaagaggct 1800
gctcccacca ccaagaaacc agctgccacc actcccaagg agcctgcacc cactatcact 1860
aaggagcctg caccaactac tcccaacaag cctgaaccca ccactcccaa agagcctgtg 1920
cccacaaccc ccaaggagcc tgaacccact ccccctaagg aacctgctcc taccaccacc 1980
aaggaccctg cacctaccag tcccaaggaa cctactccca ccgcccccaa ggagcctgta 2040
cctactgccc ccaaggagcc tgaacccatg gcccccaaga agcctgtacc cactgccccc 2100
aagcagccta cacccaccac ccccaaggag ccttcaccca ctgtccccaa ggagcctgaa 2160
cctatggccc ccaaggagcc tgtacccaca gctcccaaga aacctgcacc caccgccccc 2220
aaggaccctg cacccaccgc ccccaaggag cctgaaccca ctgcccccaa taaggaatct 2280
gcacccacca catccaagga acaggttccc atcaccacca aggagcccac acccaaactc 2340
ccgaaggagc ctgctccagc ctctcttgag acgcctgctc caaccacctc agacgccttt 2400
actacaacta cgactatgga gcctcccact actcccaaga accctgctga gtcaactcct 2460
aagtttcctg cagaacccac accaaagcct cttgaaaaca gtcccaaaga accagttgta 2520
cctataacca aggctcctga agtgaccaaa cctgaaatga ctacaacagc taaagataaa 2580
acaacagaaa aagacataat acctgaaatt acaactgctg tacctaagat tacaacccag 2640
gagacagcaa ctccaacaga agaaacgacc actgagtcca aaacaagtac aaccacacaa 2700
gtaacatcta ccacatcatc caaaaacact cctaaagcaa caactctcgc acccaaagta 2760
atgactgcaa cacaaaagac aactacaact gaagagacta tgaataaacc tgaagaaacc 2820
acagctgtgc caaaggatac agctacgagt actaaagtct caactcctag accccgaaag 2880
ccaaccaaag caccaaagaa gcccacttct accaaaaagc caaacacaat acctaaaaga 2940
aaaaaaccaa agactacacc aactccccca aagatgacta catcgacaat gcccaaatta 3000
caccctacct cttcagtgga agccatgctc caaactacca ccagccccaa ccaaagacct 3060
aactcagaaa tagttgaagt aaatccaaat gaagatacag atgctgctgg aaaaaaacct 3120
cacatgttcc ccaggccccc tgtgttaact cctatattta tcccagggac tgatatctta 3180
gtgagaggat ccaatcaaga cattgccatc aatcccatgc tttcagatga gactaattta 3240
tgcaacggta agccagtaga tggactgact actttgcgca atggaaccat ggtcgcattt 3300
cgaggtcatt atttctggat gctgagtcca tccaatccac catctccacc tcgtaaaatt 3360
actgaagttt ggggtattcc ctcccccatt gatactgttt ttactaggtg caactgtgaa 3420
ggaaaaactt tcttctttaa gggttcccag tactggcgtt tcaccaatga tataaaagat 3480
gcagggtatc ccaaacaaat tgtaaaagga tttggaggac taaatggaag aatagtggca 3540
gctctctcaa tagctaaata caaggacaga cctgaatctg tgtatttttt caagagaggt 3600
ggcagcgttc agcagtacac ttataaacag gaacccatca aaaagtgcac tggaagaagg 3660
cccgctatca attacccagt gtatggagaa acaacacagg ttagaagacg tcgctttgaa 3720
cgcgccatag gaccttctca aacacacacc atcagaattc actattcacc catcagagtc 3780
tcttatcaag ataaaggttt cctccataat gaagtcaaaa tgagttcaca gtggagagga 3840
tttccaaatg tggttacttc agctatagca ctgcccaaca tcagaaaacc tgatggctat 3900
gattactacg ccttttctag gaatcaatac tataacattg atgtacccag cagaacagca 3960
agagttgtta ctactcgttt tgggaggacc ttatccaata tctggtacaa ctgtccttag 4020
<210> 5
<211> 1339
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> full-length lubricin polypeptide - translation of SEQ ID NO: 4
<400> 5
Met Gln Trp Lys Ile Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Pro Ser Cys Ala Gly Arg
20 25 30
Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Ile Cys Asn Cys Asp Tyr Asn
35 40 45
Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Lys Ala Cys Thr
50 55 60
Val Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Ala Arg Gly
65 70 75 80
Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ser Asp Cys Lys Lys Tyr Gly Lys Cys Cys
85 90 95
Pro Asp Tyr Glu Asp Phe Cys Gly Arg Val His Asn Pro Thr Ser Pro
100 105 110
Pro Ser Ser Lys Thr Ala Pro Pro Ser Pro Gly Ala Ser Gln Thr Ile
115 120 125
Lys Ser Thr Ala Lys Arg Ser Pro Lys Ala Pro Asn Lys Lys Lys Thr
130 135 140
Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val Ser
145 150 155 160
Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile
165 170 175
Arg Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Lys Glu Leu Lys
180 185 190
Lys Lys Pro Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Glu Arg Thr Pro Lys Lys
195 200 205
Lys Pro Pro Pro Glu Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser Gly Leu
210 215 220
Asp Asn Gly Asp Ile Lys Leu Thr Pro Thr Pro Asp Ile Pro Thr Thr
225 230 235 240
Gln Arg Asn Lys Val Thr Thr Ser Pro Lys Phe Thr Thr Gly Lys Pro
245 250 255
Ile Asn Pro Lys Pro Ser Leu Pro Pro Asn Thr Asp Thr Ser Lys Glu
260 265 270
Thr Ser Ser Thr Pro Asn Lys Glu Thr Thr Val Lys Ser Lys Glu Thr
275 280 285
Leu Ala Asn Lys Glu Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Lys Ile Thr Ser
290 295 300
Ala Lys Glu Thr Arg Ser Ala Glu Lys Thr Pro Ala Lys Asp Phe Val
305 310 315 320
Pro Thr Thr Lys Ala Pro Val Lys Ser Thr Pro Lys Ala Glu Ser Thr
325 330 335
Thr Lys Ser Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr
340 345 350
Thr Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr
355 360 365
Pro Lys Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Lys Gly Pro Pro Thr Thr Pro
370 375 380
Lys Lys Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys Asp Pro Ala Pro Thr Thr Thr
385 390 395 400
Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro
405 410 415
Lys Glu Pro Val Pro Ile Thr Thr Lys Glu Pro Glu Pro Thr Thr Pro
420 425 430
Lys Lys Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro
435 440 445
Lys Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Glu Pro Thr Thr Pro
450 455 460
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro
465 470 475 480
Lys Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys
485 490 495
Lys Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys
500 505 510
Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys
515 520 525
Glu Leu Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys
530 535 540
Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Lys
545 550 555 560
Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu
565 570 575
Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro
580 585 590
Glu Pro Thr Thr Pro Lys Glu Ala Ala Pro Thr Thr Lys Lys Pro Ala
595 600 605
Ala Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Ile Thr Lys Glu Pro Ala
610 615 620
Pro Thr Thr Pro Asn Lys Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Val
625 630 635 640
Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Glu Pro Thr Pro Pro Lys Glu Pro Ala
645 650 655
Pro Thr Thr Thr Lys Asp Pro Ala Pro Thr Ser Pro Lys Glu Pro Thr
660 665 670
Pro Thr Ala Pro Lys Glu Pro Val Pro Thr Ala Pro Lys Glu Pro Glu
675 680 685
Pro Met Ala Pro Lys Lys Pro Val Pro Thr Ala Pro Lys Gln Pro Thr
690 695 700
Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ser Pro Thr Val Pro Lys Glu Pro Glu
705 710 715 720
Pro Met Ala Pro Lys Glu Pro Val Pro Thr Ala Pro Lys Lys Pro Ala
725 730 735
Pro Thr Ala Pro Lys Asp Pro Ala Pro Thr Ala Pro Lys Glu Pro Glu
740 745 750
Pro Thr Ala Pro Asn Lys Glu Ser Ala Pro Thr Thr Ser Lys Glu Gln
755 760 765
Val Pro Ile Thr Thr Lys Glu Pro Thr Pro Lys Leu Pro Lys Glu Pro
770 775 780
Ala Pro Ala Ser Leu Glu Thr Pro Ala Pro Thr Thr Ser Asp Ala Phe
785 790 795 800
Thr Thr Thr Thr Thr Met Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Asn Pro Ala
805 810 815
Glu Ser Thr Pro Lys Phe Pro Ala Glu Pro Thr Pro Lys Pro Leu Glu
820 825 830
Asn Ser Pro Lys Glu Pro Val Val Pro Ile Thr Lys Ala Pro Glu Val
835 840 845
Thr Lys Pro Glu Met Thr Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Lys
850 855 860
Asp Ile Ile Pro Glu Ile Thr Thr Ala Val Pro Lys Ile Thr Thr Gln
865 870 875 880
Glu Thr Ala Thr Pro Thr Glu Glu Thr Thr Thr Glu Ser Lys Thr Ser
885 890 895
Thr Thr Thr Gln Val Thr Ser Thr Thr Ser Ser Lys Asn Thr Pro Lys
900 905 910
Ala Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Met Thr Ala Thr Gln Lys Thr Thr
915 920 925
Thr Thr Glu Glu Thr Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Thr Ala Val Pro
930 935 940
Lys Asp Thr Ala Thr Ser Thr Lys Val Ser Thr Pro Arg Pro Arg Lys
945 950 955 960
Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Asn Thr
965 970 975
Ile Pro Lys Arg Lys Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Pro Lys Met
980 985 990
Thr Thr Ser Thr Met Pro Lys Leu His Pro Thr Ser Ser Val Glu Ala
995 1000 1005
Met Leu Gln Thr Thr Thr Ser Pro Asn Gln Arg Pro Asn Ser Glu
1010 1015 1020
Ile Val Glu Val Asn Pro Asn Glu Asp Thr Asp Ala Ala Gly Lys
1025 1030 1035
Lys Pro His Met Phe Pro Arg Pro Pro Val Leu Thr Pro Ile Phe
1040 1045 1050
Ile Pro Gly Thr Asp Ile Leu Val Arg Gly Ser Asn Gln Asp Ile
1055 1060 1065
Ala Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr Asn Leu Cys Asn Gly
1070 1075 1080
Lys Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn Gly Thr Met Val
1085 1090 1095
Ala Phe Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro Ser Asn Pro
1100 1105 1110
Pro Ser Pro Pro Arg Lys Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile Pro Ser
1115 1120 1125
Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys Thr
1130 1135 1140
Phe Phe Phe Lys Gly Ser Gln Tyr Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile
1145 1150 1155
Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Gln Ile Val Lys Gly Phe Gly Gly
1160 1165 1170
Leu Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala Leu Ser Ile Ala Lys Tyr Lys
1175 1180 1185
Asp Arg Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys Arg Gly Gly Ser Val
1190 1195 1200
Gln Gln Tyr Thr Tyr Lys Gln Glu Pro Ile Lys Lys Cys Thr Gly
1205 1210 1215
Arg Arg Pro Ala Ile Asn Tyr Pro Val Tyr Gly Glu Thr Thr Gln
1220 1225 1230
Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile Gly Pro Ser Gln Thr
1235 1240 1245
His Thr Ile Arg Ile His Tyr Ser Pro Ile Arg Val Ser Tyr Gln
1250 1255 1260
Asp Lys Gly Phe Leu His Asn Glu Val Lys Met Ser Ser Gln Trp
1265 1270 1275
Arg Gly Phe Pro Asn Val Val Thr Ser Ala Ile Ala Leu Pro Asn
1280 1285 1290
Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Arg Asn
1295 1300 1305
Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg Thr Ala Arg Val Val
1310 1315 1320
Thr Thr Arg Phe Gly Arg Thr Leu Ser Asn Ile Trp Tyr Asn Cys
1325 1330 1335
Pro
<210> 6
<211> 2949
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon-optimized truncated cLub
<400> 6
atgcagtgga agatcctgcc tatctacctg ctcctgctga gcgtgttcct gatccagcaa 60
gtgtccagcc aggacctgcc cagctgcgcc ggaagatgcg gcgagggcta cagcagggac 120
gccatctgca actgcgacta caactgccag cactacatgg aatgctgccc cgacttcaag 180
aaggcctgca ccgtcgagct gagctgcaag ggccggtgct tcgagagctt cgccaggggc 240
agagagtgcg actgcgacag cgactgcaag aaatacggca agtgctgccc tgactacgag 300
gacttctgcg gcagggtgca caaccccacc agccccccta gcagcaagac cgcccctcca 360
tctcctggcg ccagccagac catcaagagc accgccaaga ggtcccccaa ggcccccaac 420
aagaaaaaga ccaagaaagt gatcgagagc gaggaaatca ccgaggaaca cagcgtgtcc 480
gagaatcaag agagcagcag cagctccagc tccagcagca gcaccatccg gaagatcaag 540
agcagcaaga acagcgccgc caacaaagag ctgaagaaga agcccaaagt caaggacaac 600
aagaaagagc ggacccccaa gaagaaaccc cccccagagc cccctgtggt ggatgaggcc 660
ggcagcggcc tggacaacgg cgacatcaag ctgaccccca cccccgacat ccccaccacc 720
cagaggaaca aagtgaccac ctcccccaag ttcaccaccg gcaagcccat caaccccaag 780
cccagcctgc cccccaacac cgacaccagc aaagaaacca gcagcacccc taacaaagag 840
acaaccgtca agagcaaaga gacactggct aacaaagaaa cctccagcaa ggccaaagag 900
aagatcacca gcgccaaaga gactcggagc gccgagaaaa cccccgccaa ggacttcgtg 960
cccaccacca aggcccctgt gaagtccacc cctaaggccg agtctaccac caagagccct 1020
gcccccacca ccaccaaaga gccaacccct acaaccacca agaaacccgc tcctaccaca 1080
cccaagaagc cagccccaac tacccctaaa gaacccgtgc ctaccaccac aaagggccct 1140
cccacaaccc ctaagaaacc tgagcccacc acccccaagg accccgctcc cacaacaaca 1200
aaagagccca cccccactac acccaaaaag cctgctccta caactcccaa agagcccgtc 1260
ccaaccacaa ccgagccagc ccctgccagc ctggaaaccc ctgcccctac taccagcgac 1320
gcgttcacca ccacaaccac catggaaccc cccaccactc ctaagaatcc cgccgagagc 1380
acccccaagt ttcccgccga gcctacccct aagcccctgg aaaacagccc caaagaacct 1440
gtggtgccta tcaccaaagc ccccgaagtg accaagcccg agatgaccac cacagccaag 1500
gacaagacca ccgagaagga catcatccct gagatcacca ccgccgtgcc caaaatcacc 1560
acccaagaga cagccacccc caccgaggaa accaccaccg agagcaagac cagcaccacc 1620
acacaagtga cctccaccac aagctccaag aacaccccca aagccaccac cctggccccc 1680
aaagtgatga ccgccaccca gaaaaccact accaccgaag agactatgaa caagcccgaa 1740
gagacaacag ccgtgcctaa ggacaccgcc acctccacca aggtgtccac ccccagaccc 1800
cggaagccca ccaaggctcc aaagaagccc acctctacca agaagcctaa caccatcccc 1860
aagaggaaga aacccaagac cacccctacc ccccccaaga tgacaaccag caccatgccc 1920
aagctgcacc ccacctccag cgtggaagcc atgctgcaga ccaccacctc tcccaaccag 1980
aggcccaaca gcgagatcgt ggaagtgaac cccaacgagg acaccgacgc cgctggcaag 2040
aaaccccaca tgttccccag gcctcccgtg ctgaccccta tcttcatccc cggcaccgac 2100
atcctcgtgc ggggcagcaa ccaggatatc gccatcaacc ctatgctgag cgacgagaca 2160
aacctgtgca acggcaagcc cgtggacggc ctgaccaccc tgagaaacgg caccatggtg 2220
gccttcaggg gccactactt ctggatgctg agccccagca accctcccag ccctcctcgg 2280
aagatcaccg aagtgtgggg catccccagc cccatcgaca ccgtgttcac caggtgcaat 2340
tgcgagggca agacattctt cttcaagggc tcccaatact ggcggttcac caacgacatc 2400
aaggacgccg gctaccccaa gcagatcgtg aagggcttcg gcggcctgaa cggcaggatc 2460
gtggccgccc tgtctatcgc caagtacaag gacaggcccg agagcgtgta cttcttcaag 2520
aggggcggca gcgtgcagca gtacacctac aagcaagagc ccatcaagaa gtgcaccggc 2580
agaaggcccg ccatcaacta ccccgtgtac ggcgaaacca cccaagtgcg gaggcggaga 2640
ttcgagaggg ccatcggccc tagccagacc cacaccatca ggatccacta cagccccatc 2700
agggtgtcct accaggacaa gggcttcctg cacaacgaag tgaagatgag cagccagtgg 2760
cggggcttcc ccaacgtcgt gaccagcgcc attgccctgc ccaacatccg gaagcccgac 2820
ggctacgact actacgcctt cagccggaac cagtactaca acatcgacgt gcccagcagg 2880
accgccaggg tggtcaccac cagattcggc aggaccctga gcaacatctg gtacaactgc 2940
ccctgatga 2949
<210> 7
<211> 981
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Truncated codon-optimized cLUB polypeptide - translation of SEQ
ID NO: 6
<400> 7
Met Gln Trp Lys Ile Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Pro Ser Cys Ala Gly Arg
20 25 30
Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Ile Cys Asn Cys Asp Tyr Asn
35 40 45
Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Lys Ala Cys Thr
50 55 60
Val Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Ala Arg Gly
65 70 75 80
Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ser Asp Cys Lys Lys Tyr Gly Lys Cys Cys
85 90 95
Pro Asp Tyr Glu Asp Phe Cys Gly Arg Val His Asn Pro Thr Ser Pro
100 105 110
Pro Ser Ser Lys Thr Ala Pro Pro Ser Pro Gly Ala Ser Gln Thr Ile
115 120 125
Lys Ser Thr Ala Lys Arg Ser Pro Lys Ala Pro Asn Lys Lys Lys Thr
130 135 140
Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val Ser
145 150 155 160
Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile
165 170 175
Arg Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Lys Glu Leu Lys
180 185 190
Lys Lys Pro Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Glu Arg Thr Pro Lys Lys
195 200 205
Lys Pro Pro Pro Glu Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser Gly Leu
210 215 220
Asp Asn Gly Asp Ile Lys Leu Thr Pro Thr Pro Asp Ile Pro Thr Thr
225 230 235 240
Gln Arg Asn Lys Val Thr Thr Ser Pro Lys Phe Thr Thr Gly Lys Pro
245 250 255
Ile Asn Pro Lys Pro Ser Leu Pro Pro Asn Thr Asp Thr Ser Lys Glu
260 265 270
Thr Ser Ser Thr Pro Asn Lys Glu Thr Thr Val Lys Ser Lys Glu Thr
275 280 285
Leu Ala Asn Lys Glu Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Lys Ile Thr Ser
290 295 300
Ala Lys Glu Thr Arg Ser Ala Glu Lys Thr Pro Ala Lys Asp Phe Val
305 310 315 320
Pro Thr Thr Lys Ala Pro Val Lys Ser Thr Pro Lys Ala Glu Ser Thr
325 330 335
Thr Lys Ser Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr
340 345 350
Thr Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr
355 360 365
Pro Lys Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Lys Gly Pro Pro Thr Thr Pro
370 375 380
Lys Lys Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys Asp Pro Ala Pro Thr Thr Thr
385 390 395 400
Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro
405 410 415
Lys Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Glu Pro Ala Pro Ala Ser Leu Glu
420 425 430
Thr Pro Ala Pro Thr Thr Ser Asp Ala Phe Thr Thr Thr Thr Thr Met
435 440 445
Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Asn Pro Ala Glu Ser Thr Pro Lys Phe
450 455 460
Pro Ala Glu Pro Thr Pro Lys Pro Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu Pro
465 470 475 480
Val Val Pro Ile Thr Lys Ala Pro Glu Val Thr Lys Pro Glu Met Thr
485 490 495
Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Lys Asp Ile Ile Pro Glu Ile
500 505 510
Thr Thr Ala Val Pro Lys Ile Thr Thr Gln Glu Thr Ala Thr Pro Thr
515 520 525
Glu Glu Thr Thr Thr Glu Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr Gln Val Thr
530 535 540
Ser Thr Thr Ser Ser Lys Asn Thr Pro Lys Ala Thr Thr Leu Ala Pro
545 550 555 560
Lys Val Met Thr Ala Thr Gln Lys Thr Thr Thr Thr Glu Glu Thr Met
565 570 575
Asn Lys Pro Glu Glu Thr Thr Ala Val Pro Lys Asp Thr Ala Thr Ser
580 585 590
Thr Lys Val Ser Thr Pro Arg Pro Arg Lys Pro Thr Lys Ala Pro Lys
595 600 605
Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Asn Thr Ile Pro Lys Arg Lys Lys
610 615 620
Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Pro Lys Met Thr Thr Ser Thr Met Pro
625 630 635 640
Lys Leu His Pro Thr Ser Ser Val Glu Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr
645 650 655
Ser Pro Asn Gln Arg Pro Asn Ser Glu Ile Val Glu Val Asn Pro Asn
660 665 670
Glu Asp Thr Asp Ala Ala Gly Lys Lys Pro His Met Phe Pro Arg Pro
675 680 685
Pro Val Leu Thr Pro Ile Phe Ile Pro Gly Thr Asp Ile Leu Val Arg
690 695 700
Gly Ser Asn Gln Asp Ile Ala Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr
705 710 715 720
Asn Leu Cys Asn Gly Lys Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn
725 730 735
Gly Thr Met Val Ala Phe Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro
740 745 750
Ser Asn Pro Pro Ser Pro Pro Arg Lys Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile
755 760 765
Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys
770 775 780
Thr Phe Phe Phe Lys Gly Ser Gln Tyr Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile
785 790 795 800
Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Gln Ile Val Lys Gly Phe Gly Gly Leu
805 810 815
Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala Leu Ser Ile Ala Lys Tyr Lys Asp Arg
820 825 830
Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys Arg Gly Gly Ser Val Gln Gln Tyr
835 840 845
Thr Tyr Lys Gln Glu Pro Ile Lys Lys Cys Thr Gly Arg Arg Pro Ala
850 855 860
Ile Asn Tyr Pro Val Tyr Gly Glu Thr Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg
865 870 875 880
Phe Glu Arg Ala Ile Gly Pro Ser Gln Thr His Thr Ile Arg Ile His
885 890 895
Tyr Ser Pro Ile Arg Val Ser Tyr Gln Asp Lys Gly Phe Leu His Asn
900 905 910
Glu Val Lys Met Ser Ser Gln Trp Arg Gly Phe Pro Asn Val Val Thr
915 920 925
Ser Ala Ile Ala Leu Pro Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr
930 935 940
Tyr Ala Phe Ser Arg Asn Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg
945 950 955 960
Thr Ala Arg Val Val Thr Thr Arg Phe Gly Arg Thr Leu Ser Asn Ile
965 970 975
Trp Tyr Asn Cys Pro
980
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BGH-Forward Primer
<400> 8
tctagttgcc agccatctgt tgt 23
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BGH-Reverse Primer
<400> 9
tgggagtggc accttcca 18
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BGH Probe
<400> 10
tcccccgtgc cttccttgac c 21
<210> 11
<211> 1404
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human PRG4 transcript variant A amino acid sequence
<400> 11
Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val
1 5 10 15
Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly
20 25 30
Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr
35 40 45
Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys
50 55 60
Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg
65 70 75 80
Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys
85 90 95
Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser
100 105 110
Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr
115 120 125
Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys
130 135 140
Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val
145 150 155 160
Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
165 170 175
Ser Thr Ile Arg Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg
180 185 190
Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr
195 200 205
Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser
210 215 220
Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr
225 230 235 240
Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys
245 250 255
Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys
260 265 270
Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu
275 280 285
Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr
290 295 300
Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp
305 310 315 320
Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu
325 330 335
Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro
340 345 350
Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro
355 360 365
Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr
370 375 380
Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr
385 390 395 400
Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr
405 410 415
Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro
420 425 430
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro
435 440 445
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Pro
450 455 460
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys
465 470 475 480
Glu Pro Ala Pro Thr Ala Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys
485 490 495
Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys
500 505 510
Glu Pro Ser Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys
515 520 525
Ser Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser
530 535 540
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ser Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro
545 550 555 560
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro
565 570 575
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro
580 585 590
Ala Pro Thr Thr Thr Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro
595 600 605
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Leu
610 615 620
Thr Pro Thr Thr Pro Glu Lys Leu Ala Pro Thr Thr Pro Glu Lys Pro
625 630 635 640
Ala Pro Thr Thr Pro Glu Glu Leu Ala Pro Thr Thr Pro Glu Glu Pro
645 650 655
Thr Pro Thr Thr Pro Glu Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Ala Ala
660 665 670
Ala Pro Asn Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro
675 680 685
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr
690 695 700
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr Thr Leu Lys Glu Pro
705 710 715 720
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Lys Glu Leu Ala Pro Thr
725 730 735
Thr Thr Lys Glu Pro Thr Ser Thr Thr Ser Asp Lys Pro Ala Pro Thr
740 745 750
Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr
755 760 765
Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr
770 775 780
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Lys
785 790 795 800
Glu Leu Ala Pro Thr Thr Thr Lys Gly Pro Thr Ser Thr Thr Ser Asp
805 810 815
Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys
820 825 830
Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Glu
835 840 845
Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr Thr Lys
850 855 860
Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro Glu Leu
865 870 875 880
Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu Pro
885 890 895
Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu Met Thr
900 905 910
Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr Thr Pro
915 920 925
Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala Thr Thr
930 935 940
Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr Gln Val
945 950 955 960
Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile Thr Thr Leu
965 970 975
Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys Thr Ile
980 985 990
Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Lys
995 1000 1005
Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln Lys
1010 1015 1020
Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys
1025 1030 1035
Thr Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg
1040 1045 1050
Lys Met Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile
1055 1060 1065
Ala Glu Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro
1070 1075 1080
Asn Ser Lys Leu Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly
1085 1090 1095
Gly Ala Glu Gly Glu Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val
1100 1105 1110
Phe Met Pro Glu Val Thr Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val
1115 1120 1125
Pro Asn Gln Gly Ile Ile Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr
1130 1135 1140
Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg
1145 1150 1155
Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu
1160 1165 1170
Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ile Thr Glu Val
1175 1180 1185
Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr Arg Cys Asn
1190 1195 1200
Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser Gln Tyr Trp Arg
1205 1210 1215
Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Phe
1220 1225 1230
Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala Leu Ser
1235 1240 1245
Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys
1250 1255 1260
Arg Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val
1265 1270 1275
Gln Lys Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr
1280 1285 1290
Gly Glu Thr Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile
1295 1300 1305
Gly Pro Ser Gln Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala
1310 1315 1320
Arg Leu Ala Tyr Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys
1325 1330 1335
Val Ser Ile Leu Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala
1340 1345 1350
Ile Ser Leu Pro Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr
1355 1360 1365
Ala Phe Ser Lys Asp Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg
1370 1375 1380
Thr Ala Arg Ala Ile Thr Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys
1385 1390 1395
Val Trp Tyr Asn Cys Pro
1400
<210> 12
<211> 5050
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human PRG4 transcript variant A nucleic acid sequence
<400> 12
aaactcatct atcctttacg gcaagggtac ctacggtacc tgaaaacaac gatggcatgg 60
aaaacacttc ccatttacct gttgttgctg ctgtctgttt tcgtgattca gcaagtttca 120
tctcaagatt tatcaagctg tgcagggaga tgtggggaag ggtattctag agatgccacc 180
tgcaactgtg attataactg tcaacactac atggagtgct gccctgattt caagagagtc 240
tgcactgcgg agctttcctg taaaggccgc tgctttgagt ccttcgagag agggagggag 300
tgtgactgcg acgcccaatg taagaagtat gacaagtgct gtcccgatta tgagagtttc 360
tgtgcagaag tgcataatcc cacatcacca ccatcttcaa agaaagcacc tccaccttca 420
ggagcatctc aaaccatcaa atcaacaacc aaacgttcac ccaaaccacc aaacaagaag 480
aagactaaga aagttataga atcagaggaa ataacagaag aacattctgt ttctgaaaat 540
caagagtcct cctcctcctc ctcctcttcc tcttcttctt caacaattcg gaaaatcaag 600
tcttccaaaa attcagctgc taatagagaa ttacagaaga aactcaaagt aaaagataac 660
aagaagaaca gaactaaaaa gaaacctacc cccaaaccac cagttgtaga tgaagctgga 720
agtggattgg acaatggtga cttcaaggtc acaactcctg acacgtctac cacccaacac 780
aataaagtca gcacatctcc caagatcaca acagcaaaac caataaatcc cagacccagt 840
cttccaccta attctgatac atctaaagag acgtctttga cagtgaataa agagacaaca 900
gttgaaacta aagaaactac tacaacaaat aaacagactt caactgatgg aaaagagaag 960
actacttccg ctaaagagac acaaagtata gagaaaacat ctgctaaaga tttagcaccc 1020
acatctaaag tgctggctaa acctacaccc aaagctgaaa ctacaaccaa aggccctgct 1080
ctcaccactc ccaaggagcc cacgcccacc actcccaagg agcctgcatc taccacaccc 1140
aaagagccca cacctaccac catcaagtct gcacccacca cccccaagga gcctgcaccc 1200
accaccacca agtctgcacc caccactccc aaggagcctg cacccaccac caccaaggag 1260
cctgcaccca ccactcccaa ggagcctgca cccaccacca ccaaggagcc tgcacccacc 1320
accaccaagt ctgcacccac cactcccaag gagcctgcac ccaccacccc caagaagcct 1380
gccccaacta cccccaagga gcctgcaccc accactccca aggagcctac acccaccact 1440
cccaaggagc ctgcacccac caccaaggag cctgcaccca ccactcccaa agagcctgca 1500
cccactgccc ccaagaagcc tgccccaact acccccaagg agcctgcacc caccactccc 1560
aaggagcctg cacccaccac caccaaggag ccttcaccca ccactcccaa ggagcctgca 1620
cccaccacca ccaagtctgc acccaccact accaaggagc ctgcacccac cactaccaag 1680
tctgcaccca ccactcccaa ggagccttca cccaccacca ccaaggagcc tgcacccacc 1740
actcccaagg agcctgcacc caccaccccc aagaagcctg ccccaactac ccccaaggag 1800
cctgcaccca ccactcccaa ggaacctgca cccaccacca ccaagaagcc tgcacccacc 1860
actcccaaag agcctgcccc aactaccccc aaggagactg cacccaccac ccccaagaag 1920
ctcacgccca ccacccccga gaagctcgca cccaccaccc ctgagaagcc cgcacccacc 1980
acccctgagg agctcgcacc caccacccct gaggagccca cacccaccac ccctgaggag 2040
cctgctccca ccactcccaa ggcagcggct cccaacaccc ctaaggagcc tgctccaact 2100
acccctaagg agcctgctcc aactacccct aaggagcctg ctccaactac ccctaaggag 2160
actgctccaa ctacccctaa agggactgct ccaactaccc tcaaggaacc tgcacccact 2220
actcccaaga agcctgcccc caaggagctt gcacccacca ccaccaagga gcccacatcc 2280
accacctctg acaagcccgc tccaactacc cctaagggga ctgctccaac tacccctaag 2340
gagcctgctc caactacccc taaggagcct gctccaacta cccctaaggg gactgctcca 2400
actaccctca aggaacctgc acccactact cccaagaagc ctgcccccaa ggagcttgca 2460
cccaccacca ccaaggggcc cacatccacc acctctgaca agcctgctcc aactacacct 2520
aaggagactg ctccaactac ccccaaggag cctgcaccca ctacccccaa gaagcctgct 2580
ccaactactc ctgagacacc tcctccaacc acttcagagg tctctactcc aactaccacc 2640
aaggagccta ccactatcca caaaagccct gatgaatcaa ctcctgagct ttctgcagaa 2700
cccacaccaa aagctcttga aaacagtccc aaggaacctg gtgtacctac aactaagact 2760
cctgcagcga ctaaacctga aatgactaca acagctaaag acaagacaac agaaagagac 2820
ttacgtacta cacctgaaac tacaactgct gcacctaaga tgacaaaaga gacagcaact 2880
acaacagaaa aaactaccga atccaaaata acagctacaa ccacacaagt aacatctacc 2940
acaactcaag ataccacacc attcaaaatt actactctta aaacaactac tcttgcaccc 3000
aaagtaacta caacaaaaaa gacaattact accactgaga ttatgaacaa acctgaagaa 3060
acagctaaac caaaagacag agctactaat tctaaagcga caactcctaa acctcaaaag 3120
ccaaccaaag cacccaaaaa acccacttct accaaaaagc caaaaacaat gcctagagtg 3180
agaaaaccaa agacgacacc aactccccgc aagatgacat caacaatgcc agaattgaac 3240
cctacctcaa gaatagcaga agccatgctc caaaccacca ccagacctaa ccaaactcca 3300
aactccaaac tagttgaagt aaatccaaag agtgaagatg caggtggtgc tgaaggagaa 3360
acacctcata tgcttctcag gccccatgtg ttcatgcctg aagttactcc cgacatggat 3420
tacttaccga gagtacccaa tcaaggcatt atcatcaatc ccatgctttc cgatgagacc 3480
aatatatgca atggtaagcc agtagatgga ctgactactt tgcgcaatgg gacattagtt 3540
gcattccgag gtcattattt ctggatgcta agtccattca gtccaccatc tccagctcgc 3600
agaattactg aagtttgggg tattccttcc cccattgata ctgtttttac taggtgcaac 3660
tgtgaaggaa aaactttctt ctttaaggat tctcagtact ggcgttttac caatgatata 3720
aaagatgcag ggtaccccaa accaattttc aaaggatttg gaggactaac tggacaaata 3780
gtggcagcgc tttcaacagc taaatataag aactggcctg aatctgtgta ttttttcaag 3840
agaggtggca gcattcagca gtatatttat aaacaggaac ctgtacagaa gtgccctgga 3900
agaaggcctg ctctaaatta tccagtgtat ggagaaacga cacaggttag gagacgtcgc 3960
tttgaacgtg ctataggacc ttctcaaaca cacaccatca gaattcaata ttcacctgcc 4020
agactggctt atcaagacaa aggtgtcctt cataatgaag ttaaagtgag tatactgtgg 4080
agaggacttc caaatgtggt tacctcagct atatcactgc ccaacatcag aaaacctgac 4140
ggctatgatt actatgcctt ttctaaagat caatactata acattgatgt gcctagtaga 4200
acagcaagag caattactac tcgttctggg cagaccttat ccaaagtctg gtacaactgt 4260
ccttagactg atgagcaaag gaggagtcaa ctaatgaaga aatgaataat aaattttgac 4320
actgaaaaac attttattaa taaagaatat tgacatgagt ataccagttt atatataaaa 4380
atgtttttaa acttgacaat cattacacta aaacagattt gataatctta ttcacagttg 4440
ttattgttta cagaccattt aattaatatt tcctctgttt attcctcctc tccctcccat 4500
tgcatggctc acacctgtaa aagaaaaaag aatcaaattg aatatatctt ttaagaattc 4560
aaaactagtg tattcactta ccctagttca ttataaaaaa tatctaggca ttgtggatat 4620
aaaactgttg ggtattctac aacttcaatg gaaattatta caagcagatt aatccctctt 4680
tttgtgacac aagtacaatc taaaagttat attggaaaac atggaaatat taaaatttta 4740
cacttttact agctaaaaca taatcacaaa gctttatcgt gttgtataaa aaaattaaca 4800
atataatggc aataggtaga gatacaacaa atgaatataa cactataaca cttcatattt 4860
tccaaatctt aatttggatt taaggaagaa atcaataaat ataaaatata agcacatatt 4920
tattatatat ctaaggtata caaatctgtc tacatgaagt ttacagattg gtaaatatca 4980
cctgctcaac atgtaattat ttaataaaac tttggaacat taaaaaaata aattggaggc 5040
ttaaggatta 5050
<---