Средство для ингибирования репликации вируса SARS-CoV-2, опосредованного РНК-интерференцией
AGENT FOR INHIBITION OF REPLICATION OF SARS-COV-2 VIRUS MEDIATED BY RNA INTERFERENCE

Изобретение относится к биотехнологии, вирусологии, молекулярной биологии и иммунологии, а именно к средству для специфического подавления (ингибирования) репликации коронавируса SARS-CoV-2, опосредованного РНК-интерференцией с применением малых интерферирующих РНК (миРНК).
Разработка противовирусных препаратов, основанных на механизме РНК-интерференции (РНКи), является перспективным направлением в области борьбы с сезонными и хроническими вирусными инфекциями. РНКи является относительно простым и недорогим методом ингибирования экспрессии генов. Суть процесса заключается в блокировании трансляции вирусных белков за счет комплементарного связывания РНК-мишени с короткими (21-26 п.н.) двуцепочечными молекулами РНК (миРНК) и последующей деградации РНК-мишени [1]. В настоящее время самым распространенным методом инициации РНКи является введение в клетку синтетических молекул миРНК, размером 21-22 пн. Теоретически можно спроектировать миРНК к любому интересующему гену и подавить его экспрессию. Однако для того, чтобы оценивать ингибирующую активность тех или иных вариантов молекул миРНК, требуется разработка адекватной модели, позволяющей количественно оценивать эффективность подавления экспрессии.
Вирус SARS-CoV-2, который является причиной атипичной пневмонии COVID-19 - один из семи коронавирусов, инфицирующих людей. Среди них SARS-CoV-1, MERS-CoV и SARS-CoV-2, вызывающие серьезные заболевания респираторного тракта, тогда как HKU1, NL63, ОС43 и 229Е ассоциируют с заболеваниями средней тяжести [2] Стоит отметить, что SARS-CoV-2 является более контагиозным, чем SARS-CoV-1 [3].
Предыдущие эпидемии, вызванные бетакоронавирусами SARS-CoV-1 в 2003 году и MERS-CoV в 2012 году, способствовали появлению лекарственных препаратов, потенциально активных в отношении пандемичного SARS-CoV-2. Среди них можно выделить нуклеотидный аналог remdesivir (GS-5734), который ингибирует репликацию SARS-CoV-1 и MERS-CoV in vitro и in vivo [4]. Кроме того, сочетание ингибиторов протеазы ВИЧ-1 lopinavir/ritonavir показало эффективность на пациентах, зараженных SARS-CoV-1 [5]. В настоящее время проводятся клинические исследования эффективности данных препаратов в отношении SARS-CoV-2. Таким образом, остается актуальной разработка специфических противовирусных препаратов для подавления репликации SARS-CoV-2.
Молекулы миРНК являются перспективным лекарственным средством в отношении внутриклеточных патогенов, в том числе вирусов. В литературе встречаются данные об успешном применении миРНК в отношении инфекций, вызванных различными вирусами, в том числе коронавирусами [6-9]. Данный подход реализован рядом заявителей в своих изобретениях.
В патенте CN 101173275 В (07.05.2008) описано изобретение, представляющее собой две двуцепочечные молекулы РНК (дцРНК), направленные к двум отдельным участкам вирусной РНК, кодирующем белок М вируса атипичной пневмонии -1 (SARS-CoV-1). Одна из молекул миРНК направлена к участку с координатами 220-241 вирусной РНК, кодирующей М - белок SARS, тогда как вторая к участку 460-480. Комбинация этих двух молекул миРНК подавляла экспрессию вирусных генов более чем на 70%.
В документе CN 1648249 A (03.08.2005) описываются последовательности миРНК, сконструированные для подавления экспрессии генов М, N, и Е вируса SARS-CoV-1. Показано, что три из них (№15, 58 и 90) ингибируют экспрессию белков слияния GFP-M, GFP-N и GFP-E, соответственно. Еще три молекулы миРНК (№8*, 51* и 56*) содержали модификацию на 3' конце смысловой цепи. Эти модифицированные миРНК более эффективно ингибировали экспрессию генов вируса SARS-CoV-1 по сравнению с оригинальными миРНК.
В US 20050004063 A1 (06.01.2005) раскрыты шесть молекул миРНК (SARSi-1-6), направленных к области генома, кодирующей репликазу 1А вируса SARS-CoV-1. Показано, что самой эффективной была миРНК SARSi-4 (5'-gcacuugucuaccuugaugtt-3'). Кроме того, в этом патенте описаны миРНК (SARSi-7-11) направленные на область генома, кодирующую гены S, Е, N и М вируса SARS-CoV-1. Авторы показали, что SARSi-2, SARSi-3, SARSi-4 и SARSi-7-11 ингибировали репликацию коронавируса SARS-CoV-1 в культуре клеток FRhk-4. Самой эффективной оказалась миРНК SARSi-4, которая практически полностью ингибировала репликацию вируса. За ней следовали SARSi-2 и SARSi-3.
Также известны последовательности миРНК, сконструированные для подавления экспрессии генов, кодирующих РНК-зависимую РНК-полимеразу, хеликазу, нуклеопротеин N и протеолитические ферменты вируса SARS-CoV-1. Эти миРНК ингибировали репликацию штамма BJ01 коронавируса SARS-CoV-1 на 50-90%. При этом самыми эффективными были миРНК, направленные к генам, кодирующим протеолитические ферменты (CN 1569233 A, 26.01.2005). Раскрыты последовательности трех молекул миРНК, направленных к гену, кодирующему ORF3a вируса SARS-CoV-1 (CN 101085986 B, 12.12. 2007). Этот ген играет важную роль в репликации вируса поэтому сконструированные молекулы миРНК эффективно подавляют репликацию вируса.
Эффективность 62 молекул миРНК (способность ингибировать репликацию SARS-CoV-1), направленных к разным участкам генома вируса SARS-CoV-1, была протестирована в культуре клеток Vero и/или FRhk-4 (US 20070270360 A1, 22.11.2007).
В документе CN 101182517 А (21.05.2008) описывается смесь молекул миРНК, направленных к разным мишеням. В частности, к участку генома вируса SARS-CoV-1, кодирующему белок Spike (5'-AAGCTCCTAATTACACTCAAC-3'), белок nsp-9 (5'-AAGGATGAGGAAGGCААТТТА-3'), nsp-10 (5'-AAGGATAAGTCAGCTCAATGC-3') и nsp-13 (5'-ACTGGCACACTACTTGTCGA-3'). Эффективность смеси миРНК тестировали в культуре клеток FRhK-4, зараженной вирусом SARS-CoV-1.
Известно исследование, которое проводили на макаках-резусах, инфицированных SARS-CoV-1. Смесь препаратов миРНК вводили в количестве 30 мг (5% растворе глюкозы) на животное (US 2007/0203082 A, 30.08.2007)
Основное отличие от разрабатываемого препарата заключается в том, что миРНК, в документах CN 101173275 В, CN 1648249 A, US 20050004063 A1, CN 1569233 A, CN 101085986 B, US 20070270360 A1, CN 101182517 A, US 20070203082 A активны в отношении коронавируса SARS-CoV-1, а не пандемичного SARS-CoV-2.
50
Известно решение по патенту US 8653252 B2 (18.02.2014), которое описывает аналоги миРНК, содержащие "блокированные" мономеры нуклеиновых кислот (Locked Nucleic Acids, LNA) - siLNA. Классические молекулы миРНК и их аналоги siLNA были направлены к гену РНК-зависимой РНК полимеразы вируса SARS-CoV-1 (SARS 1-4). Из четырех исследуемых миРНК и siLNA самой эффективной оказалась SARS1, которая снижала вирусную цитотоксичность на 65% при дозе заражения 600 ТЦД. Отличие от разрабатываемого препарата заключается в использовании аналогов миРНК (siLNA), направленных к гену РНК полимеразы вируса SARS-CoV-1.
В WO 2004092383 A2 (10.02.2005) изобретение включает в себя несколько типов нуклеиновых кислот, такие как: короткие интерферирующие РНК (миРНК), микро-РНК (miRNA) и короткие шпилечные РНК (shRNA), а также способы, используемые для модуляции экспрессии РНК вируса SARS-CoV-1. Аналогичные изобретения описаны в патенте US 20040192626 A1 (30.09.2004) и в патенте US 20050020525 A1 (27.01.2005). Отличие от разрабатываемого препарата заключается в том, что в его состав которого входят только миРНК, ингибирующие репродукцию SARS-CoV-2.
Патент CN 102453712 B (19.02.2014) описывает изобретение на основе миРНК для ингибирования репликации вируса SARS-CoV-1 посредством молекул миРНК, направленных к гену хозяина, кодирующему PI4KB (phosphatidylinositol 4-kinase IIIβ). Этот фермент опосредует проникновение вируса в клетку. В отличие от разрабатываемого препарата, миРНК, описанные в патенте № CN 102453712 B направлены не к вирусному геному, а к геному клетки-хозяина.
Патент US 7339051 B2 (04.03.2008) описывает олигомерные соединения, состоящие из 8-80 азотистых оснований, направленных к геному SARS-CoV-1. Эти соединения гибридизуются с вирусной нуклеиновой кислотой и снижают репликацию SARS-CoV-1 не менее чем на 50%. Они направлены на рамки считывания генома вируса SARS-CoV-1 и при гибридизации с вирусной РНК регулируют процесс рибосомального сдвига рамки считывания. В отличие от разрабатываемого препарата в патенте № US 7339051 B2 описываются антисмысловные РНК и рибозимы.
В отношении нового вируса SARS-CoV-2 в настоящее время известно иммунобиологическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (RU 2720614 С1, 12.05.2020). Данное средство создано на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С' -конце гена. В другом варианте этого изобретения средство содержит оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1. Также в этом документе раскрыто иммунобиологическое средство, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида вируса.
Наиболее близкими по техническому решению являются изобретения CN 111139241 А от 12.05.2020 и CN 111139242 A от 12.05.2020, раскрывающие малые интерферирующие нуклеиновые кислоты для ингибирования нового коронавируса SARS-CoV-2. Отличием заявленного средства является новый, ранее не описанный состав молекул малых интерферирующих нуклеиновых кислот, направленных против генома SARS-CoV-2 в участках, кодирующих RdRP, лидерный протеин (nsp1) и ген N и ингибирующих репликацию этого вируса.
Таким образом, оценив технический уровень, можно заключить, что опосредуемое РНК-интерференцией ингибирование экспрессии генов вируса SARS-CoV-2 и репликации самого вируса с применением миРНК является перспективным направлением для разработки нового средства терапии инфекции COVID19.
Целью, лежащей в основе данного изобретения, является получение новых агентов, способных опосредовать мишень-специфическую интерференцию РНК, и обладающих высокой эффективностью в отношении SARS-CoV-2.
Решение этой проблемы обеспечено созданной молекулой миРНК, где каждая цепь миРНК имеет длину 21-27 нуклеотидов, и где указанная молекула миРНК способна опосредовать мишень-специфические подавление репликации вируса SARS-CoV-2, в частности за счет интерференции РНК.
Описание
Настоящее изобретение относится к средству для специфического подавления репликации коронавируса SARS-CoV-2 путем разрушения генома вируса и мРНК генов ORF1 (ORF1a, ORF1b), N, при помощи молекул миРНК.
Средство для ингибирования репликации вируса SARS-CoV-2, опосредуемого РНК-интерференцией, содержит эффективное количество молекул миРНК в виде комплементарных дуплексов, представленных нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO 4- SEQ ID NO 33.
Средство ингибирует репликацию по меньшей мере гена ORF1 (ORF1a, ORF1b) в участках, кодирующих РНК-полимеразу RdRP и лидерный протеин nsp1 SARS-CoV-2 и гена нуклеопротеина N SARS-CoV-2.
Средство включает синтетические молекулы миРНК, специфически связывающиеся с геномной РНК коронавирусов по принципу комплементарности.
Молекулы миРНК по изобретению, которые являются двухцепочечными или содержат дуплексную структуру, независимо содержат приблизительно от 3 до 27 (например, приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27) пар оснований.
Предпочтительно, по меньшей мере, одна цепь имеет 3'-выступ из 1-5 нуклеотидов, более предпочтительно из 1-3 нуклеотидов и наиболее предпочтительно из 2 нуклеотидов. Другая цепь может иметь тупые концы или имеет 3'-выступ до 6 нуклеотидов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения все нуклеотиды миРНК по изобретению являются немодифицированными. В других вариантах осуществления нуклеотиды в одном или нескольких (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27) положениях независимо в одной или обеих цепях молекулы миРНК являются модифицированными.
В другом варианте данного изобретения молекула миРНК может содержать по меньшей мере один модифицированный аналог нуклеотида. Аналоги нуклеотидов могут быть локализованы в положениях, которые по существу не определяют мишень-специфическую активность, например, опосредующую РНК активность, например, в районе при 5'-конце и/или 3'-конце двухцепочечной молекулы РНК. В частности, эти выступы могут быть стабилизированы включением модифицированных аналогов нуклеотидов.
Модификации можно использовать для улучшения характеристик in vitro или in vivo, таких как стабильность, активность, иммуногенность и/или биодоступность. В частности, каждая нуклеотидная последовательность миРНК SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 33 может содержать по меньшей мере один модифицированный аналог нуклеотида.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один химически модифицированный нуклеотид находится в смысловой нити, в антисмысловой нити или в обеих нитях миРНК.
Нуклеотидная последовательность миРНК содержит по меньшей мере один модифицированный аналог нуклеотида, где модифицированный аналог нуклеотида представляет собой нуклеотид замкнутой нуклеиновой кислоты (LNA).
В некоторых вариантах осуществления молекула миРНК может содержать одну или несколько делеций, замен и/или добавлений нуклеотидов в последовательности по меньшей мере из 15 нуклеотидов из SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 33; однако при условии, что молекула миРНК сохраняет свою активность, например, в опосредовании РНКи.
Последовательность двухцепочечной молекулы РНК данного изобретения должна иметь достаточную идентичность относительно молекулы нуклеиновой кислоты-мишени для опосредования мишень-специфической РНКи.
Идентичность означает степень родства последовательностей между нуклеотидными последовательностями, которую определяют на основе совпадения порядка и природы нуклеотидов в последовательностях. В одном из вариантов осуществления антисмысловая нить ми-РНК, имеющая комплементарность, составляющую 80% и от 80% вплоть до 100%, например, комплементарность 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с последовательностью мРНК-мишени, считают по существу комплементарной, и ее можно применять в настоящем изобретении. Процент комплементарности описывает процент следующих друг за другом нуклеотидов в первой молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать пары оснований согласно правилу Уотсона-Крика с группой следующих друг за другом нуклеотидов во второй молекуле нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления "супрессия", или "сайленсинг", или "ингибирование" используются взаимозаменяемо для обозначения понижающей регуляции экспрессии продукта последовательности-мишени относительно ее нормального уровня экспрессии в организме дикого типа. Супрессия включает экспрессию, которая уменьшается на примерно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% относительно уровня экспрессии дикого типа.
Эффективное количество имеет значение, общепринятое в данной области. Как правило, термин относится к количеству соединения или средства/композиции, которые вызывают биологический ответ клетки, ткани, системы, животного или человека. Эффективное количество средства представляет собой количество, необходимое для осуществления по меньшей мере 25% снижения параметра, например, ингибирования репликации генов коронавируса. Диапазон эффективного количества миРНК составляет 0,2-5,0 мг/мл, предпочтительно 0,5-0,75 мг/мл.
В некоторых вариантах осуществления средство по изобретению дополнительно содержит общепринятые эксципиенты и/или добавки. Подходящие эксципиенты включают консерванты, ароматизаторы, стабилизаторы, антиоксиданты, средства регуляции осмоляльности, буферы и средства регуляции рН, вспомогательные вещества (векторы) для внутриклеточной доставки. Подходящие добавки включают физиологически и биологически совместимые буферы (например, фосфатно-солевой буфер) или очищенная вода или, необязательно, растворы с добавлением калиевых, кальциевых или натриевых солей (например, хлорида кальция, глюконата кальция или лактата кальция). Кроме того, можно использовать суспендирующие средства.
В некоторых вариантах осуществления средство используется в комплексе с одной или более последовательностями SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 33 для достижения дополнительного ингибирующего эффекта. Это не исключает использование одиночных дуплексов миРНК в эффективном количестве.
Далее, данное изобретение относится к способу ингибирования экспрессии вируса SARS-CoV-2 в клетке, где выделенные молекулы миРНК имеет длину 21-27 нуклеотидов для инициации интерференции РНК, в клетках млекопитающих, в частности в клетках человека.
Способ ингибирования репликации вируса SARS-CoV-2 в клетке включает приведение в контакт клетки, инфицированной упомянутым вирусом, со средством по настоящему изобретению, способным к мишень-специфической интерференции РНК.
Предпочтительно приведение в контакт клетки, инфицированной вирусом SARS-CoV-2, предусматривает введение молекулы РНК в клетку-мишень, например, в выделенную клетку-мишень, например, в клеточную культуру, одноклеточный микроорганизм или клетку-мишень или множество клеток-мишеней в многоклеточном организме. Более предпочтительно стадия введения предусматривает опосредованную носителем доставку, например, посредством липосомных, катионных носителей или посредством инъекции/электропорации. Введение средства можно проводить известными способами, где нуклеиновую кислоту вводят в желаемую клетку-мишень in vitro или in vivo.
В другом предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к способам ингибирования репликации вируса SARS-CoV-2, предусматривающим введение в клетку млекопитающего молекулы миРНК, имеющей полинуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 80% (более предпочтительно, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99%), идентичную последовательности, выбранной из группы, включающей: SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 33.
Технический результат заключается в создании средства, которое специфично воздействует на уникальные последовательности в геноме вируса SARS-CoV-2. Молекулы миРНК направлены против геномных мишеней в пределах генов ORF1 (RdRP - ген РНК-зависимой РНК полимеразы и nsp1 - ген лидирующего протеина) и N (ген нуклеопротеина). Синтетические миРНК представляют собой дуплексы комплементарных одноцепочечных РНК длиной 21-27 нуклеотидов, представленные SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 33. Таким образом, средство, содержащее миРНК по настоящему изобретению, целенаправленно воздействует на специфические участки одного или нескольких указанных генов вируса SARS-CoV-2 и ингибируют экспрессию этих генов, при этом осуществляют эффективное блокирование репликативного цикла вируса. Это дает новую возможность целенаправленного воздействия на экспрессию SARS-CoV-2 в клетках для лечения инфекции COVID19, вызываемой данным вирусом.
Краткое описание графических материалов/фигур.
ФИГ. 1. Схема биологического эффекта препаратов миРНК, направленных против геномных мишеней коронавирусов.
ФИГ. 2. Схематическое изображение генома вируса SARS-CoV-2 с указанием мишеней, против которых направлены миРНК но настоящему изобретению (мишени nsp1 - лидерный протеин, RdRP - РНК-полимераза, N - нуклеопротеин).
ФИГ. 3. (А) Схематическое изображение одной из возможных модификаций (LNA), обеспечивающих повышение стабильности миРНК, направленных против геномных мишеней коронавирусов. (Б) Результаты электрофореза, отражающие повышенную стабильность миРНК. (В) Результаты количественного определения миРНК, отражающие их повышенную стабильность
ФИГ. 4. Схематическое изображение коммерческой плазмиды pVAX-1 (Thermofisher, США).
ФИГ. 5. Схема экспрессионной конструкции, содержащей IRES, кодирующая ген RdRp SARS-CoV-2.
ФИГ. 6. Схема экспрессионной конструкции, содержащей IRES, кодирующая ген капсидного белка N SARS-CoV-2.
ФИГ 7. Схема экспрессионной конструкции, содержащей IRES, кодирующая ген лидерного белка nsp1 SARS-CoV-2.
ФИГ. 8. Оценка эффективности средств подавления препаратом миРНК, работающих по механизму РНКи на in vitro модели инфекции с использованием синтетической экспрессионной плазмиды pVAX-RdRP-IRES-Luc.
ФИГ. 9. Оценка эффективности средств подавления препаратом миРНК, работающих по механизму РНКи на in vitro модели инфекции с использованием синтетической экспрессионной плазмиды pVAX-N-IRES-Luc.
ФИГ. 10. Оценка эффективности средств подавления препаратом миРНК, работающих по механизму РНКи на in vitro модели инфекции с использованием синтетической экспрессионной плазмиды pVAX-LP-IRES-Luc.
ФИГ. 11. Оценка эффективности средств подавления препаратом миРНК, работающих по механизму РНКи на in vitro модели инфекции с использованием реплицирующегося в клетках Vero вируса SARS-CoV-2. Результаты ПЦР-РВ из супернатантов на первые сутки после инфекции.
ФИГ. 12. Оценка эффективности средств подавления препаратом миРНК, работающих по механизму РНКи на in vitro модели инфекции с использованием реплицирующегося в клетках Vero вируса SARS-CoV-2. Результаты ПЦР-РВ из супернатантов на четвертые сутки после инфекции.
ФИГ. 13. Оценка эффективности средств подавления препаратом миРНК, работающих по механизму РНКи на in vitro модели инфекции с использованием реплицирующегося в клетках Vero вируса SARS-CoV-2. Результаты ПЦР-РВ из лизатов на четвертые сутки после инфекции.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение включает:
(1) разработку молекул малой интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (миРНК) для специфического подавления репликации коронавируса SARS-CoV-2;
(2) синтез, очистку и дуплексирование миРНК для специфического подавления репликации коронавируса SARS-CoV-2;
(3) модель эксперимента, подтверждающего противовирусную активность миРНК для специфического подавления репликации коронавируса SARS-CoV-2.
Стадия (1) состоит из следующих шагов: (а) анализ геномов коронавируса SARS-CoV-2 для установления генетических мишеней, перспективных для подавления репликативного цикла SARS-CoV-2 по механизму РНКи; (б) разработка молекул миРНК, обладающих специфичностью в отношении геномных мишеней коронавируса SARS-CoV-2 (мишени RdRP, N, nsp1); (в) отбор препаратов миРНК, обладающих повышенной предсказанной эффективностью. Шаги (а) - (в) осуществляются in silico с помощью программных средств без экспериментального подтверждения.
Стадия (2) состоит из следующих шагов: (г) синтез молекул миРНК, в том числе с применением модифицированных нуклеотидов; (д) очистка молекул миРНК; (е) подтверждение качества молекул миРНК; (ж) дуплексирование молекул миРНК
Стадия (3) состоит из следующих шагов: (з) разработка модели эксперимента, подтверждающего противовирусную активность препаратов миРНК для специфического подавления репликации коронавируса SARS-CoV-2; (и) создание экспрессионных плазмид, содержащих вставки полноразмерных генов (геномных мишеней) коронавируса SARS-CoV-2; (к) подтверждение эффективности препаратов миРНК в культурах клеток с использованием экспрессионных плазмид, содержащих вставки полноразмерных генов (геномных мишеней) коронавируса SARS-CoV-2; (л) подтверждение эффективности препаратов миРНК в культурах клеток Vero с использованием реплицирующегося вируса SARS-CoV-2.
ПРИМЕР 1. Синтез миРНК обладающих противовирусной активностью в отношении коронавируса SARS-CoV-2.
Синтез миРНК осуществляется твердофазным амидофосфатным синтезом на автоматическом ДНК/РНК синтезаторе (Polygen, Германия).
Очистка миРНК проводится методом обращено-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии).
Полученный РНК-олигонуклеотид высушивался при мягких условиях (не выше 15°С) и разводился в деионизированной воде MQ/DEPC (DNAse/RNAse free) в концентрации 600 нмоль/л. олигонуклеотиды с меткой объединяются в эквимолярных количествах, перемешиваются и подвергаются дуплексированию, т.е. образованию водородных связей между азотистыми основаниями нуклеотидов двух цепей, в соответствии со стандартной методикой, в следующих комбинациях:
SEQ ID NO 4+ SEQ ID NO 5; SEQ ID NO 6+ SEQ ID NO 7; SEQ ID NO 8+ SEQ ID NO 9; SEQ ID NO 10+ SEQ ID NO 11; SEQ ID NO 12+ SEQ ID NO 13; SEQ ID NO 14+ SEQ ID NO 15; SEQ ID NO 16+ SEQ ID NO 17; SEQ ID NO 18+ SEQ ID NO 19; SEQ ID NO 20+ SEQ ID NO 21; SEQ ID NO 22+ SEQ ID NO 23; SEQ ID NO 24+ SEQ ID NO 25; SEQ ID NO 26+ SEQ ID NO 27; SEQ ID NO 28+ SEQ ID NO 29; SEQ ID NO 30+ SEQ ID NO 31; SEQ ID NO 32+ SEQ ID NO 33. При этом SEQ ID с четными номерами являются смысловыми, а с нечетными - антисмысловыми.
Для подтверждения структуры полученных молекул РНК используется масс-спектрометр BRUKER microflex LT (матрица 3-НРА). Синтетические миРНК представляют собой дуплексы комплементарных одноцепочечных РНК длиной 21 нуклеотидов (таблица 1). Противовирусный эффект обусловлен привлечением клеточных ферментов (DICER, Ago, мультисубъединичного комплекса RISC), ответственных за деградацию РНК-мишени вируса. (ФИГ. 1).
Данные молекулы миРНК направлены против геномных мишеней в пределах генов ORF1 (RdRp - ген РНК-зависимой РНК полимеразы и nsp1 - ген лидирующего протеина) и N (ген нуклеопротеина) (ФИГ. 2).
В состав миРНК включены модифицированные нуклеотиды (LNA, Locked Nucleic Acids), обеспечивающие надежную связь миРНК с мишенью и повышающие стабильность дуплексов (ФИГ. 3).
При использовании миРНК предпочтительно использование модификаций, повышающих эффективность молекул и их устойчивость к ферментативной деградации РНКазами. Одним из возможных способов модификации является синтез ковалентно-замкнутых нуклеиновых кислот (LNA - «locked nucleic acid»). Такая модификация приводит к образованию более прочных дуплексов, а также к устойчивости к нуклеазной деградации. Введение подобных модификаций в олигонуклеотидную последовательность позволяет пролонгировать время нахождения миРНК в биологических средах (сыворотка крови, слизистые оболочки, цитоплазма клетки и т.д.), что усиливает их биологический эффект.
Повышенная стабильность модифицированных миРНК подтверждена экспериментально при смешивании миРНК (С=1 мг/мл) с FBS в соотношении 1:1 и последующей инкубацией смеси миРНК/FBS при +37С в течение 5 суток. Детекцию не деградировавшей миРНК осуществляли методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. Количественное определение миРНК определяли с помощью программного обеспечения Image Lab (BioRad) (ФИГ. 3). Показано, что LNA-модификация молекулы миРНК приводит к увеличению стабильности дуплексов миРНК и сохранению их структуры в течение 120 часов, что в среднем в 60 раз больше по сравнению с немодифицированной миРНК.
Таким образом, использование модифицированных миРНК для подавления экспрессии генов является одним из вариантов для достижения пролонгированного противовирусного эффекта.
ПРИМЕР 2. Оценка противовирусной активности препаратов миРНК в модели с использованием экспрессионной плазмиды, содержащей вставку полноразмерных генов SARS-CoV-2.
Для скрининга противовирусной активности миРНК была создана in vitro модель. С этой целью были разработаны генетические конструкции, позволяющие осуществлять экспрессию вирусных белков в культурах клеток человека. Проведена разработка конструкций, содержащих полноразмерный ген RdRP РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса SARS-CoV-2 (2796 нукл), ген капсидного белка N (1260 нукл), ген лидерного белка nsp1 (540 нукл). В качестве экспрессионного вектора использовали плазмиду pVAX-1, применяемая при разработке ДНК-вакцин и обеспечивающая стабильную экспрессию белка в эукариотических клетках (ФИГ. 4).
Трансфекцию проводили в культуре клеток человека Нер-2. В качестве репортерного гена использовали ген светляковой люциферазы Luc. Генетическая конструкция представляет собой синтетическую вставку в трех вариантах:
1. бицистронная экспрессионная конструкция (ФИГ. 5) для оценки ингибирующей активности миРНК в эукариотических клетках, содержащая IRES из IRES-EGFP вектора (Clontech, США) и полноразмерный ген RdRP (SEQ ID NO 1);
2. бицистронная экспрессионная конструкция (ФИГ. 6) для оценки ингибирующей активности миРНК в эукариотических клетках, содержащая IRES из IRES-EGFP вектора (Clontech, США) и полноразмерный ген N (SEQ ID NO 2);
3. бицистронная экспрессионная конструкция (ФИГ. 7) для оценки ингибирующей активности миРНК в эукариотических клетках, содержащая IRES из IRES-EGFP вектора (Clontech, США) и полноразмерный ген лидерного белка nsp1 (SEQ ID NO 3).
ПРИМЕР 3. Оценка эффективности подавления репликации гена RdRP SARS-CoV-2 с помощью синтезированных молекул миРНК.
Для оценки эффективности сайленсингового эффекта миРНК в условиях in vitro были спроектированы и синтезированы генетические конструкции, позволяющие осуществлять экспрессию вирусных белков в культурах клеток.
4
2
Для проведения анализа клетки Нер-2 высаживали в 24-луночный планшет в количестве 13*10 клеток на лунку в 600 мкл полной питательной среды DMEM (10% фетальной бычьей сыворотки, 2% буферного раствора HEPES, 0,1% антибиотика гентамицина, 0,6% L-глутамина) накануне трансфекции и инкубировали сутки при 37°С в СО инкубаторе до достижения 75% конфлюентности. Перед внесением трансфекционной смеси в лунках с клетками заменяли полную питательную среду DMEM на бессыворточную среду DMEM (2% буферного раствора HEPES, 0,1% антибиотика гентамицина, 0,6% L-глутамина) с промежуточной отмывкой клеток с помощью физиологического раствора (0.9% раствор хлорида натрия).
2
2
2
Трансфекцию проводили в два этапа. Первую дисперсию трансфекционного агента общим объемом 80 мкл, состоящего из 0,25 мкг плазмиды pVAX-siRdRP-1190-Luc, или pVAX-siRdRP-1146-Luc, или pVAX-siRdRP-full-Luc и 0,5 мкл коммерческого трансфекционного агента Lipofectamine3000 (с добавкой Р3000), готовили в бессывороточной среде OPTIMEM. Приготовленные смеси выдерживали 15 мин при комнатной температуре и вносили в лунки с монослоем клеток. Вторую дисперсию трансфекционного агента общим объемом 87,5 мкл, состоящего из 7,5 мкл соответствующей миРНК (концентрация 0,1 мг/мл) и 1,5 мкл коммерческого трансфекционного агента Lipofectamine3000, готовили в бессывороточной среде OPTIMEM. В качестве контроля в одну из лунок после 1 трансфекции никаких миРНК не вносили. В качестве неспецифичных к снтезированным плазмидам миРНК использовали siUTR, siIL4, siGFP, в качестве специфичной - siLuc. Приготовленные смеси выдерживали 15 мин при комнатной температуре и вносили в лунки с монослоем клеток. Клетки инкубировали при 37°С в СО инкубаторе. Через 4 часа в каждую лунку добавляли 60 мкл 10% фетальной бычьей сыворотки. После этого клетки инкубировали при 37°С в СО инкубаторе в течение 20 часов и затем определяли люциферазную активность методом люциферазного теста. Тест проводился с использованием коммерческого набора "Luciferase Assay System" (Promega) согласно рекомендациям производителя. Для этого удаляли ростовую среду из лунок, затем добавляли 150 мкл лизирующего буфера Glo lysis byffer, 1x (USA). Клетки выдерживали 15 минут при 37°С в СО инкубаторе для достижения полного лизиса. Затем соскабливали их со дна ячеек и переносили клеточную суспензию в пробирки типа Eppendorf на 1,5 мл. Для осаждения клеточного дебриза полученный лизат центрифугировали 2 минуты на 10000 оборотов. Отбирали по 50 мкл супернатанта в отдельные пробирки типа eppendorf на 1,5 мл и добавляли к ним люциферазный субстрат в соотношении 1:1. Эффективность трансфекции оценивали по уровню люминисценции на Glomax 20/20 luminometr.
Для всех количественных данных вычисляли среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего (m). Определяли межгрупповые различия и оценивали достоверности различий между группами с помощью U-критерия Манна-Уитни с использованием программы Statistica 8.0.
При оценке эффективности средств подавления репликации вируса препаратами миРНК, работающих по механизму РНКи на in vitro модели инфекции с использованием синтетической экспрессионной плазмиды pVAX-RdRP-IRES-Luc установлена ингибирующая активность препаратов в отношении гена RdRP вируса SARS-CoV-2 (ФИГ. 8).
ПРИМЕР 4. Оценка эффективности подавления репеликации гена N SARS-CoV-2 с помощью синтезированных молекул миРНК
Анализ проводили аналогично методике, описанной выше.
Данные эффективности средств подавления репликации вируса препаратами миРНК, работающими по механизму РНКи на in vitro модели инфекции с использованием синтетической экспрессионной плазмиды pVAX-N-IRES-Luc представлены на ФИГ. 9. Установлена ингибирующая активность препаратов в отношении гена N вируса SARS-CoV-2 (× - статистически значимо отличается от siUTR, siIL4, siGFP (р≤0,05); $ - статистически значимо отличается от siLuc (р≤0,05); N=3).
ПРИМЕР 5. Оценка эффективности подавления репликации гена лидерного белка nsp1 SARS-CoV-2 с помощью синтезированных молекул миРНК. Анализ проводили аналогично методике, описанной выше.
При оценке эффективности средств подавления репликации вируса препаратами миРНК, работающих по механизму РНКи на in vitro модели инфекции с использованием синтетической экспрессионной плазмиды pVAX-LP-IRES-Luc установлена ингибирующая активность препаратов в отношении гена nsp1 вируса SARS-CoV-2
(ФИГ. 10. × - статистически значимо отличается от siUTR, siIL4, siGFP (р≤0,05); $ - статистически значимо отличается от siLuc (р≤0,05); N=4).
ПРИМЕР 6. Скрининг противовирусной активности миРНК на модели SARS-CoV-2 в экспериментах in vitro.
Противовирусную активность синтезированных молекул миРНК исследовали на клеточной модели. Исследование противовирусной активности проводили на клетках Vero С1008 (Е6) (Почки зеленой мартышки). Через 1 и 4 суток после инфекции оценивалась вирусная нагрузка методом РТ-ПЦР. Для этого собирали супернатанты и клеточные лизаты, из которых затем выделяли РНК для последующей постановки реакции РТ-ПЦР с целью определения количества копий вирусной РНК. Клетки лизировали непосредственно в лунке без использования механических и ферментативных методов отделения. Каждый вариант миРНК был изучен в 1 концентрации в дублях в 4-х независимых повторах. Данные представлены в виде количества копий вирусной РНК на 1 мл супертатанта и на 100 тыс.клеток.
При оценке эффективности средств подавления репликации вируса препаратами миРНК, работающих по механизму РНКи на in vitro модели инфекции с использованием реплицирующегося в клетках Vero вируса SARS-CoV-2 в супернатантах на первые сутки после инфекции установлена противовирусная активность препаратов миРНК. Данные представлены на ФИГ. 11.
В супернатантах на 4 сутки после инфекции оценивали эффективность средств подавления репликации вируса препаратами миРНК, работающих по механизму РНКи на in vitro модели инфекции с использованием реплицирующегося в клетках Vero вируса SARS-CoV-2. Установлена противовирусная активность препаратов миРНК (ФИГ. 12, * - статистически значимо отличается от siLuc (siL-01)).
В лизатах клеток 4 сутки после инфекции (ФИГ. 13, * - статистически значимо отличается от siLuc (siL-01)) показана противовирусная активность препаратов миРНК, работающих по механизму РНКи, на in vitro модели инфекции с использованием реплицирующегося в клетках Vero вируса SARS-CoV-2.
Экспериментально доказано, что миРНК по настоящему изобретению, каждая цепь из которых имеет длину 21-27 нуклеотидов обладают значительным ингибирующим действием на ген ORF1 (мишени RdRP и nsp1) и ген N вируса SARS-CoV-2.
Таким образом, распознавание комплексов миРНК с РНК вируса приводит к активации механизма РНК-интерференции и привлечению клеточных ферментов, обеспечивающих деградацию геномной РНК вируса. Противовирусная активность миРНК используемых для специфического подавления репликации коронавируса SARS-CoV-2 подтверждена в экспериментах in vitro, в культурах клеток, содержащих экспрессионный вектор с вставкой целых генов вируса SARS-CoV-2, а также в культурах клеток VERO, содержащих нативный реплицирующийся штамм вируса SARS-CoV-2.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, P. 806-811
2. Corman V.M. et al. Hosts and Sources of Endemic Human Coronaviruses. 2018. P. 163-188.
3 Tang B. et al. An updated estimation of the risk of transmission of the novel coronavirus (2019-nCov) // Infect. Dis. Model. 2020. Vol. 5. P. 248-255.
4. Andersen K.G. et al. The proximal origin of SARS-CoV-2 // Nat. Med. 2020.
5. Sheahan T.P. et al. Broad-spectrum antiviral GS-5734 inhibits both epidemic and zoonotic coronaviruses // Sci. Transl. Med. 2017. Vol. 9, №396. P. eaal3653.
6. Chu C.M. Role of lopinavir/ritonavir in the treatment of SARS: initial virological and clinical findings // Thorax. 2004. Vol. 59, №3. P. 252-256.
7. Li T. et al. миРНК targeting the Leader sequence of SARS-CoV inhibits virus replication // Gene Ther. 2005. Vol. 12, №9. P. 751-761.
8. He M.-L. et al. Kinetics and synergistic effects of миРНКs targeting structural and replicase genes of SARS-associated coronavirus // FEBS Lett. 2006. Vol. 580, №10. P. 2414-2420.
9. Tang Q. et al. Application of миРНК Against SARS in the Rhesus Macaque Model. 2008. P. 139-158.
--->
Перечень последовательностей
<110> ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России
<120> «Средство для ингибирования экспрессии генов вируса SARS-CoV-2, опосредованного РНК-интерференцией»
<160> NUMBER OF SEQ ID NOS: 33
<210> SEQ ID NO 1
<211> 7951
<212> DNA
<213> artificial
:
<400> SEQUENCE 1
GCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTatagATGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATCTACAATGATAAAGTAGCTGGTTTTGCTAAATTCCTAAAAACTAATTGTTGTCGCTTCCAAGAAAAGGACGAAGATGACAATTTAATTGATTCTTACTTTGTAGTTAAGAGACACACTTTCTCTAACTACCAACATGAAGAAACAATTTATAATTTACTTAAGGATTGTCCAGCTGTTGCTAAACATGACTTCTTTAAGTTTAGAATAGACGGTGACATGGTACCACATATATCACGTCAACGTCTTACTAAATACACAATGGCAGACCTCGTCTATGCTTTAAGGCATTTTGATGAAGGTAATTGTGACACATTAAAAGAAATACTTGTCACATACAATTGTTGTGATGATGATTATTTCAATAAAAAGGACTGGTATGATTTTGTAGAAAACCCAGATATATTACGCGTATACGCCAACTTAGGTGAACGTGTACGCCAAGCTTTGTTAAAAACAGTACAATTCTGTGATGCCATGCGAAATGCTGGTATTGTTGGTGTACTGACATTAGATAATCAAGATCTCAATGGTAACTGGTATGATTTCGGTGATTTCATACAAACCACGCCAGGTAGTGGAGTTCCTGTTGTAGATTCTTATTATTCATTGTTAATGCCTATATTAACCTTGACCAGGGCTTTAACTGCAGAGTCACATGTTGACACTGACTTAACAAAGCCTTACATTAAGTGGGATTTGTTAAAATATGACTTCACGGAAGAGAGGTTAAAACTCTTTGACCGTTATTTTAAATATTGGGATCAGACATACCACCCAAATTGTGTTAACTGTTTGGATGACAGATGCATTCTGCATTGTGCAAACTTTAATGTTTTATTCTCTACAGTGTTCCCACCTACAAGTTTTGGACCACTAGTGAGAAAAATATTTGTTGATGGTGTTCCATTTGTAGTTTCAACTGGATACCACTTCAGAGAGCTAGGTGTTGTACATAATCAGGATGTAAACTTACATAGCTCTAGACTTAGTTTTAAGGAATTACTTGTGTATGCTGCTGACCCTGCTATGCACGCTGCTTCTGGTAATCTATTACTAGATAAACGCACTACGTGCTTTTCAGTAGCTGCACTTACTAACAATGTTGCTTTTCAAACTGTCAAACCCGGTAATTTTAACAAAGACTTCTATGACTTTGCTGTGTCTAAGGGTTTCTTTAAGGAAGGAAGTTCTGTTGAATTAAAACACTTCTTCTTTGCTCAGGATGGTAATGCTGCTATCAGCGATTATGACTACTATCGTTATAATCTACCAACAATGTGTGATATCAGACAACTACTATTTGTAGTTGAAGTTGTTGATAAGTACTTTGATTGTTACGATGGTGGCTGTATTAATGCTAACCAAGTCATCGTCAACAACCTAGACAAATCAGCTGGTTTTCCATTTAATAAATGGGGTAAGGCTAGACTTTATTATGATTCAATGAGTTATGAGGATCAAGATGCACTTTTCGCATATACAAAACGTAATGTCATCCCTACTATAACTCAAATGAATCTTAAGTATGCCATTAGTGCAAAGAATAGAGCTCGCACCGTAGCTGGTGTCTCTATCTGTAGTACTATGACCAATAGACAGTTTCATCAAAAATTATTGAAATCAATAGCCGCCACTAGAGGAGCTACTGTAGTAATTGGAACAAGCAAATTCTATGGTGGTTGGCACAACATGTTAAAAACTGTTTATAGTGATGTAGAAAACCCTCACCTTATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGATAGAGCCATGCCTAACATGCTTAGAATTATGGCCTCACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCAcaCCGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAAATGGTCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGCCACAACTGCTTATGCTAATAGTGTTTTTAACATTTGTCAAGCTGTCACGGCCAATGTTAATGCACTTTTATCTACTGATGGTAACAAAATTGCCGATAAGTATGTCCGCAATTTACAACACAGACTTTATGAGTGTCTCTATAGAAATAGAGATGTTGACACAGACTTTGTGAATGAGTTTTACGCATATTTGCGTAAACATTTCTCAATGATGATACTCTCTGACGATGCTGTTGTGTGTTTCAATAGCACTTATGCATCTCAAGGTCTAGTGGCTAGCATAAAGAACTTTAAGTCAGTTCTTTATTATCAAAACAATGTTTTTATGTCTGAAGCAAAATGTTGGACTGAGACTGACCTTACTAAAGGACCTCATGAATTTTGCTCTCAACATACAATGCTAGTTAAACAGGGTGATGATTATGTGTACCTTCCTTACCCAGATCCATCAAGAATCCTAGGGGCCGGCTGTTTTGTAGATGATATCGTAAAAACAGATGGTACACTTATGATTGAACGGTTCGTGTCTTTAGCTATAGATGCTTACCCACTTACTAAACATCCTAATCAGGAGTATGCTGATGTCTTTCATTTGTACTTACAATACATAAGAAAGCTACATGATGAGTTAACAGGACACATGTTAGACATGTATTCTGTTATGCTTACTAATGATAACACTTCAAgGTATTGGGAACCTGAGTTTTATGAGGCTATGTACACACCGCATACAGTCTTACAGGTAAggatccGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACcatgCACCatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaactcgagTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT
<210> SEQ ID NO 2
<211> 6429
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 2:
GCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAAggatccGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACcatgCACCatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaactcgagTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT
<210> SEQ ID NO 3
<211> 5692
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 3:
GCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTatagATGGAGAGCCTTGTCCCTGGTTTCAACGAGAAAACACACGTCCAACTCAGTTTGCCTGTTTTACAGGTTCGCGACGTGCTCGTACGTGGCTTTGGAGACTCCGTGGAGGAGGTCTTATCAGAGGCACGTCAACATCTTAAAGATGGCACTTGTGGCTTAGTAGAAGTTGAAAAAGGCGTTTTGCCTCAACTTGAACAGCCCTATGTGTTCATCAAACGTTCGGATGCTCGAACTGCACCTCATGGTCATGTTATGGTTGAGCTGGTAGCAGAACTCGAAGGCATTCAGTACGGTCGTAGTGGTGAGACACTTGGTGTCCTTGTCCCTCATGTGGGCGAAATACCAGTGGCTTACCGCAAGGTTCTTCTTCGTAAGAACGGTAATAAAGGAGCTGGTGGCCATAGTTACGGCGCCGATCTAAAGTCATTTGACTTAGGCGACGAGCTTGGCACTGATCCTTATGAAGATTTTCAAGAAAACTGGAACACTAAACATAGCAGTGGTGTTACCCGTGAACTCATGCGTGAGCTTAACGGAGGGTAAggatccGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACcatgCACCatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaactcgagTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT
<210> SEQ ID NO 4
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 4:
AGACGUGGUCCAGAACAAAtt
<210> SEQ ID NO 5
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 5:
UUUGUUCUGGACCACGUCUtt
<210> SEQ ID NO 6
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 6:
ACUGAGGGAGCCUUGAAUAtt
<210> SEQ ID NO 7
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 7:
UAUUCAAGGCUCCCUCAGUtt
<210> SEQ ID NO 8
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 8:
CCCACCAACAGAGCCUAAAtt
<210> SEQ ID NO 9
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 9:
UUUAGGCUCUGUUGGUGGGtt
<210> SEQ ID NO 10
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 10:
GCAUAUUGACGCAUACAAAtt
<210> SEQ ID NO 11
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 11:
UUUGUAUGCGUCAAUAUGCtt
<210> SEQ ID NO 12
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 12:
GUAGUUGAAGUUGUUGAUAtt
<210> SEQ ID NO 13
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 13:
UAUCAACAACUUCAACUACtt
<210> SEQ ID NO 14
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 14:
GAAUAGAGCUCGCACCGUAtt
<210> SEQ ID NO 15
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 15:
UACGGUGCGAGCUCUAUUCtt
<210> SEQ ID NO 16
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 16:
GGUGUCUCUAUCUGUAGUAtt
<210> SEQ ID NO 17
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 17:
UACUACAGAUAGAGACACCtt
<210> SEQ ID NO 18
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 18:
GGUGUACUGACAUUAGAUAtt
<210> SEQ ID NO 19
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 19:
UAUCUAAUGUCAGUACACCtt
<210> SEQ ID NO 20
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 20:
CUUCGUAAGAACGGUAAUAtt
<210> SEQ ID NO 21
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 21:
UAUUACCGUUCUUACGAAGtt
<210> SEQ ID NO 22
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 22:
GUUACGAUGGUGGCUGUAUtt
<210> SEQ ID NO 23
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 23:
AUACAGCCACCAUCGUAACtt
<210> SEQ ID NO 24
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 24:
GUAAGGCUAGACUUUAUUAtt
<210> SEQ ID NO 25
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 25:
UAAUAAAGUCUAGCCUUACtt
<210> SEQ ID NO 26
<211> 25
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 26:
AUGGGGUAAGGCUAGACUUUAUUAT
<210> SEQ ID NO 27
<211> 27
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 27:
AUAAUAAAGUCUAGCCUUACCCCAUUU
<210> SEQ ID NO 28
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 28:
GGAAGGAAGUUCUGUUGAAtt
<210> SEQ ID NO 29
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 29:
UUCAACAGAACUUCCUUCCtt
<210> SEQ ID NO 30
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 30:
UCAGGAGUAUGCUGAUGUCtt
<210> SEQ ID NO 31
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 31:
GACAUCAGCAUACUCCUGAtt
<210> SEQ ID NO 32
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 32:
UGUUGGACUGAGACUGACCtt
<210> SEQ ID NO 33
<211> 21
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 33:
GGUCAGUCUCAGUCCAACAtt
<---