Мультиплексная микродиагностика на основе биоузнавания: четыре поколения биосовместимых микрофлюидных систем

ISSN ÜS6S-5SS6

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2ÜÜ4, том 14, № 1, с. 3-9

ОБЗОРЫ =

УДК 54.063: 57.086.15 © Б. Г. Беленький

МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ МИКРОДИАГНОСТИКА НА ОСНОВЕ БИОУЗНАВАНИЯ: ЧЕТЫРЕ ПОКОЛЕНИЯ БИОСОВМЕСТИМЫХ МИКРОФЛЮИДНЫХ СИСТЕМ

Статья посвящена проблемам микроминиатюризации в биоаналитике. Рассмотрены современные системы, реализующие микрометоды молекулярного биоузнавания. Особенное внимание уделено микрофлюидным чип-анализаторам (МФЧА). Проводится сравнительный анализ методов мультиплексной микродиагностики.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время интенсивно развиваются методы мультиплексной микродиагностики на основе биоузнавания (биосенсоры). В 2002 г. выпуск соответствующих приборов за рубежом достиг 1 млрд. долларов США. Эти приборы используются в генетическом анализе (геномика), анализе белков (протеомика), анализе метаболизма (ме-табономика). Микрометоды мультиплексного анализа объединяются в три формата, которые могут найти и уже находят широкое применение во многих отраслях современной науки и техники.

Помимо удешевления приборов их миниатюризация дает большие преимущества за счет:

• уменьшения стоимости анализа;

• сокращения времени анализа;

• снижения потребления реагентов и анализируемых веществ;

• уменьшения производства потенциально вредных побочных продуктов;

• повышения эффективности разделения;

• возможности проведения анализа в полевых условиях.

ТРИ ФОРМАТА МИКРОМЕТОДОВ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА НА ОСНОВЕ БИОУЗНАВАНИЯ

Каналы в микроприборах по своим размерам и условиям течения (=100 мкм, 0.1 см/с) приближаются к кровеносным капиллярам в живом организме. Уменьшение геометрических размеров каналов приводит к увеличению разрешающей способности, однако узкие каналы предъявляют более высокие требования к системе детектирования, подвержены засорению и более чувствительны к адсорбции на их внутренней поверхности.

Реальные микролинейки биосенсоров (МЛБС) получают, пришивая биосенсоры-диагностикумы

к стеклянному или пластиковому планшету (матрице) или синтезируя на них сет олигонуклеотидов или олигопептидов с помощью автоматических методов нуклеотидного или пептидного синтеза, по заданной программе управляя процессом синхронного мультисинтеза с помощью сменяемых фотошаблонов (масок) — система "Affimetrix". Может быть использован и вариант предварительного синтеза лигандов и их программированной пришивки к планшету. Опознание (идентификация) лигандов, копулированных (прореагировавших) с размещенными на планшете биосенсорами, производится по их заранее известному положению на планшете (топологическое кодирование) с помощью планшетного флюориметра (система "Affimetrix").

Картирование на чипах, представляющих виртуальную микролинейку биосенсоров, реализуют, используя сет цветокодированных латексов (который получают путем пришивки биосенсоров к цветокодированным носителям), по соотношению в окраске латексов двух флюоресцентных красителей. Феномен взаимодействия (копуляция) латексов с диагностируемыми лигандами, маркируемыми третьим, сигнальным, красителем-флюорофором, производится в определенных температурно-временных условиях и выявляется с помощью трехцветного проточного цитофлюо-риметра — целл-сортера (система "FlowМetrix"). Причем два цветовых канала служат для опознания (цветокодирования) биосенсоров.

Идентификация лигандов может быть основана также на использовании микрофлюидных чип-анализаторов (МФЧА) — микроприборов высоко -эффективного капиллярного электрофореза, которые оснащены устройствами ввода проб и дерива-тизации, управляемыми микропроцессорным контроллером (lab-on-a-chip) .

Для МФЧА характерно огромное число химических операций, производимых на ограниченной площади. Эти аналитические системы предназначаются для автоматического биохимического,

иммунного и генетического (гибридизационного) микроанализов. МФЧА — это мультиплексный микроаналитический проточный прибор с высокочувствительным детектированием, предназначенный для скоростного и многоступенчатого анализа. Важнейшее требование к МФЧА — его компактность, т. е. размещение его компонентов (капилляра, детектора и т. д.) на малой площади.

ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИЙ МЛБС И МФЧА

Технология микрокартирования (на МЛБС):

1) изготовление полимерной матрицы в системе "Affimetrix", цветокодированных латексов в системе "FlowМеtrix";

2) изготовление аналитической матрицы биосенсоров (микролинейки биосенсоров) путем автоматической аппликации: пришивки диагности-кумов (очищенных аффинным или другим селективным методом) с топологическим кодированием ("Affimetrix") или с цветовым кодированием (в системе "FlowМetrix" — виртуальная линейка двухцветокодированных латексов);

3) введение в аналиты сигнальной флюоресцентной метки (для наблюдения копуляции ана-литов с реальной МЛБС или виртуальной линейкой ("FlowМetrix");

4) копуляция (взаимодействие) аналитов с реальной МЛБС или виртуальной линейкой ("FlowМetrix");

5) наблюдение (распознавание, биоузнавание) копуляции с помощью планшетного флюоримет-ра по топологическим признакам (в системе "А£-fimetrix") или с помощью трехцветового проточного цитофлюориметра (целл-сортера) по цветовым (в системе "FlowMetrix") признакам.

Технология МФЧА:

1) изготовление МФЧА, подготовка к анализу;

2) получение конъюгата аналита с биосенсором;

3) узнавание

Наиболее распространенным методом биоузнавания является иммуноанализ. Здесь критическую роль играет изготовление монофункциональных антител, требующее сложных биологических методов (моноклональных антител в гибридной технологии) или прецизионных методов аффинного фракционирования полифункционального набора

) Принципиальным шагом в развитии технологии МФЧА была бы инсталляция в МФЧА монолитных сорбентов — система МФЧА(М) для микрохромато-графического фракционирования проб.

антител (иммуноспецифической сыворотки).

Выбор метода микромультиплексной диагностики определяется в первую очередь конкретной аналитической задачей. Например, поиском кандидатов в лекарства на основе взаимодействия библиотеки лигандов с белком-мишенью (эта разновидность метабономики представляет одну из наиболее сложных, одновременно важных задач аналитической биотехнологии и является прототипом многих других биотехнологических исследований).

Поиск кандидатов в лекарства можно организовать следующим образом:

а) с использованием МЛБС, полученной путем автоматической аппликации лигандов-биосенсоров: после копуляции флюоресцентно-мечен-ного белка-мишени с библиотекой лигандов МЛБС ее промывают и исследуют флюоресцирующие конъюгаты биосенсоров с белком-мишенью, используя с этой целью масс-спектрометр MALDI-MS для определения их химической структуры ("новизны");

б) при использовании МФЧА получают флюоресцирующие потенциальные конъюгаты (кандидаты в лекарства) взаимодействием библиотеки лигандов с флюоресцентно-меченным белком-мишенью и сравнивают полученную с помощью МФЧА электрофореграмму конъюгатов с элек-трофореграммой нативной флюоресцентно-меченной библиотекой лигандов. Наличие на электрофореграмме конъюгатов флюоресцирующих зон помимо флюоресцентно-меченного белка-мишени рассматривается как указывающее на взаимодействие (копуляцию) лиганда с белком-мишенью. Далее эту флюоресцирующую зону исследуют с помощью масс-спектрометра.

Очевидно, что процедуру с изготовлением МЛБС целесообразно использовать для одновременной работы с несколькими белками-мишенями (с разными флюоресцентными метками).**-1

Таким образом, все три метода ("Affimetrix", "FlowMetrix" и МФЧА) мультиплексной микродиагностики могут с успехом использоваться для поиска кандидатов в лекарства на основе взаимодействия библиотеки лигандов с белком-мишенью (в формате метабономики), как и в других аналогичных задачах. При этом характерной особенностью МЛБС является возможность их использования для прецизионного off-line анализа 100 и более лигандов или биологических функций, в то время как МФЧА — это аналитические системы on-line анализа, которые целесообразно применять

**) Вместо флюоресцентных маркеров можно применять другие, например электроактивные (с использованием более дешевого АМД), однако электрохимическое детектирование белков требует доработки.

в качестве портативных (переносных, карманных) дешевых анализаторов физико-химических параметров и биологических функций (до 200).

Отметим, что главные затраты при использовании МЛБС связаны с аппликацией диагностику-мов (получение МЛБС) и изготовлением планшетного флюориметра (при использовании метода проточного целл-сортера ("FlowMetrix")), а в случае МФЧА — с изготовлением чип-анализаторов. Безусловно, при использовании МЛБС эти затраты выше, т. к. в "FlowMetrix" используется групповое изготовление биосенсоров. Понятно, что именно МФЧА следует отнести к числу критических технологий биомедицинского анализа.

ПРЕДАНАЛИЗНАЯ ПОДГОТОВКА В ТЕХНОЛОГИЯХ МЛБС И МФЧА

Важнейшим элементом мультиплексной микродиагностики является подготовка прибора к анализу. Для оценки этого параметра можно использовать время подготовки, связанное с числом необходимых операций. С этой целью:

• для МЛБС ("АШтейх") необходимо:

а) пришить лиганды к матрице, б) пришить сигнальный флюорофор к аналитам;

• для метода "FlowMetrix" необходимо:

а) пришить биосенсоры-диагностикумы к пулам

цветокодированных латексов, б) составить из них диагностическую панель, в) пришить сигнальный флюорофор к аналитам;

• для МФЧА необходимо только пришить

сигнальный флюорофор к аналитам.

При сравнении описанных трех методов мультиплексной микродиагностики следует учесть большее время подготовки прибора к анализу у МЛБС ("АШтейх"), высокую стоимость проточного цитофлюориметра (целл-сортера), используемого в методе "FlowMetrix". Эти факторы отдают предпочтение МФЧА.

В табл. 1 показаны особенности методов мультиплексной микродиагностики. Из таблицы видно, что как метод биоузнавания наиболее эффективен метод МФЧА. Он же имеет наилучшее отношение качество/цена и поэтому является предпочтительным.

СОВРЕМЕННАЯ МИКРОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА — ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ МИКРОФЛЮИДНЫЙ ЧИП-АНАЛИЗАТОР (МФЧА) НА ОСНОВЕ ПОЛИИМИДОВ С ИНТЕГРИРОВАННЫМ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТОРОМ

В основе этого анализатора лежит комплекс новаций в области высоких технологий, который должен обеспечить беспрецедентно высокий уровень МФЧА, превосходящий соответствующие

коммерческие зарубежные аналоги. Применение этого МФЧА в биомедицинском анализе в России будет способствовать его развитию в нашей стране при максимальной доступности и минимальной стоимости приборов. При этом следует отметить относительную легкость выполнения технологических операций при его изготовлении.

За границей в разработке и изготовлении мик-рофлюидных (МФ) приборов занят ряд зарубежных университетов (Политехническая школа, г. Лозанна, Швейцария; Стэнфордский, Мичиганский, Луисвилльский университеты, США). В России — Институт аналитического приборостроения РАН и ЗАО "Люмекс". Российские разработчики в значительной мере повторяют начальные этапы развития МФЧА за рубежом. Основным требованием к современным МФЧА является использование оптимальных технологий разработки и изготовления, обеспечивающих массовое производство с минимальными затратами и значительным сокращением времени между возникновением идеи конструкции МФЧА и ее практической реализацией. Под оптимальной технологией понимается скоростное изготовление каналов, создание микродетекторов, сборка чипов. Выбор оптимальных материалов и технологий изготовления МФЧА должен обеспечить получение микроприборов с инертной поверхностью (биосовместимых) для использования в биомедицинском анализе.

В основе МФЧА лежит микрофлюидика, под которой понимают физико-химическую гидродинамику ламинарных потоков. Современные полимерные МФЧА можно собирать (ламинировать открытые каналы) при комнатной температуре.

МФЧА включает аналитический процессор, представляющий канализированную пластину с устройством ввода пробы, детектор, потенцио-стат, систему обработки информации. Созданные МФ-системы развиваются с использованием различных материалов и технологий. Можно назвать четыре поколения биосовместимых МФЧА-сис-тем.

• Первое поколение — МФЧА на основе стеклянно-кремневой технологии микроэлектроники и детектора лазер-индуцируемой флюоресценции (ЛИФ) [1]. Используемые технологии: фотолитография (травление, сверление отверстий — микрососудов, нанесение контактов), сборка прибора (склейка, сварка). При этом используются хорошо полированные стеклянные заготовки (для минимизации растрава при травлении).

Коммерциализация — лабораторный прибор.

• Второе поколение — микрофлюидные системы на основе эластомерной (полидиметилсилок-сановой, ПДМС) технологии [2] и амперометрического детектора (АМД) [3] (ПДМС-технология

Табл. 1. Сравнение эффективности систем

№ Характеристики Методы мультиплексной микродиагностики

метода МЛБС ("ААйшеШх") "FlowMetrix" МФЧА

1 Аналитическая система О£Т-1іпе О£Т-Нпе, сет цветокодированных латексов с пришитыми лигандами Оп-1іпе

2 Изготовление чип-анализатора Стандартное Стандартное Индивидуальное, нестандартное

З Конструкция по- Биочип — планшет Групповое изготовле- Более сложная,

лимерной осно- с пришитыми ние цветокодирован- чем биочипа

вы биочипа лигандами, относительно проста ных латексов, относительно проста

4 Конструкция Планшетный Целл-сортер, Амперометриче-

анализатора флюориметр, относительно проста сложная ский детектор (АМД) интегрирован с биочипом; относительно проста

5 Время и надеж- Малое, надежное Надежное Малое, менее на-

ность детектиро- (кинетический кон- дежное, чем

вания троль) в МЛБС

б Преимуществен- Прецизионный ана- Прецизионный анализ Портативные ана-

ное применение, лиз известных био- известных биологиче- лизаторы физ.-хим.

число анализи- логических функ- ских функций, параметров, в т.ч.

руемых функций ций, 64 биолог. функций

(аналитов) 100 и более более100

7 Мультиплекс-ность — разнообразие аналитических сайтов (функций) Не ограничена Не ограничена Ограничена, ана-литы одного или близких классов веществ

S Возможность иммуноанализа, составления иммунных диагностических панелей Требует развития, не ограничена

9 Главные затраты Аппликация диаг- Изготовление цветоко- Изготовление чип-

ностикумов, изго- дированных латексов, анализаторов

товление планшет- целл-сортера

ного флюориметра

может использоваться для изготовления целл-сортера, линейки электродов, микросборников). Используемые технологии: быстрое макетирование, изготовление реплик, нанесение контактов, адгезионная сборка. Благодаря липкости ПДМС и простоте адгезионной сборки чипов не требуется чистых, обеспыленных комнат и специальной сборки-склейки.

Коммерциализация — биоаналитические технологии, карманный прибор.

• Третье поколение — микрофлюидные системы на основе полиимидов [4], для которых характерны: термо- и химическая стойкость, регулируемые адгезия и реология, использование АМД, возможность создания сложных многослойных МФЧА. Технологии: фотолитография с использованием полиимидных фоторезистов, анодное травление, перенос слоев, метод вспомогательного слоя, нанесение контактов, ламинирование.

Коммерциализация — карманный прибор.

Табл. 2. Перспективные области применения микрофлюидного чип-анализатора, МФЧА

Область применения Выполняемые функции

Защита от химического и биологического оружия Клинический анализ Высокопроизводительное обследование

• Четвертое поколение — микрофлюидные системы на основе полиимидов. Используемые технологии: МФ-приборы третьего поколения

плюс оптронный ЛИФ-мультидетектор на основе полупроводниковых гетероструктур типа А3В5 (ОЛИФ [5]).

Коммерциализация — биоаналитические технологии, карманный прибор.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Размышляя о будущем развитии микрофлюид-ных приборов, можно высказать следующие соображения:

1) в МФЧА для подачи раствора можно применить не только электроосмос, но и микронасос.

2) необходимо развить амперометрическое детектирование в МФЧА для анализа белков (применительно к иммуноанализу).

3) помимо АМД в качестве детектора можно

использовать масс-спектрометр: микроэлектро-

спрей для МФЧА, МАЬБІ для МЛБС.

4) движение жидкости в каналах МФЧА может быть оптимизировано на основе микрофлюи-дики (физико-химической гидродинамики ламинарного потока).

В настоящее время отказываются от использования в МФЧА дорогостоящих громоздких оптических (ЛИФ) детекторов и переходят на электрохимический (амперометрический) детектор

(АМД), по чувствительности близкий флюоресцентному, но значительно более простой и дешевый.

Имеется принципиально новый, предложенный в прошлом году в Стэнфордском университете подход, основанный на применении для детектирования в микрочипах сверхминиатюрных интегрированных оптронных ЛИФ-мультидетекторов на основе полупроводниковых гетероструктур типа А3В5. Использование подобного детектора решает проблему изготовления сверхмалых (размером с наручные часы) МФЧА.

Таким образом, из приборов мультиплексного микроанализа по целому ряду характеристик выделяются как наиболее эффективные приборы МФЧА. А из них реальными для сегодняшней России являются МФЧА третьего поколения (по-лиимидные чип-анализаторы с монолитным сорбентом и микросхемными высокочувствительным АМД и высоковольтным потенциостатом с нано-секундным переключением).

Перспективные области применения МФЧА указаны в табл. 2.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Manz A., Harrison D.J., Verpoorte E., Wid-mer H.M. Planar chips technology for miniaturization of separation systems: A developing perspective in chemical monitoring // Adv. Chroma-togr. 1993. V. 33. P. 1-66.

2. Duffy D.C., McDonald J.C., Schueller O.J.A., Whitesides G.M. Rapid prototyping of microflu-idic systems in poly(dimethylsiloxane) // Anal. Chem. 1998. V. 70, N 23. P. 4974-4984.

3. Metz S., Holzer R. and Renaud Ph. Polyimide-based microfluidic devices // Lab on a Chip. Cambridge, UK: Royal Society of Chemistry, 2001. V. 1, N 1. P. 29-34.

4. Woolley A.T., Hadley D., Landre P. et al. Functional integration of PCR amplification and capillary electrophoresis in a microfabricated DNA analysis device // Anal. Chem. 1996. V. 68, N 23. P.4081-4086.

5. Locascio L.E., Perso C.E., Lee C.S. Measurement of electroosmotic flow in plastic imprinted microfluid devices and the effect of protein adsorption on flow rate // Journal of Chromatography A. 1999. V. 857, N 1-2. P. 275-284.

Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург

Материал поступил в редакцию 1.12.2003.

MULTIPLEX MICRODIAGNOSTICS BASED ON BIORECOGNITION: FOUR GENERATIONS OF BIOCOMPATIBLE MICROFLUIDIC SYSTEMS

B. G. Belenkii

Institute for Analytical Instrumentation RAS, Saint-Petersburg

The paper is devoted to microminiaturization problems in bioanalytics. State-of-the-art systems that realize microtechniques of molecular biorecognition are considered. Particular attention is given to microfluidic chip analyzers (MFCA). A comparative analysis of multiplex microdiagnostic techniques is made.