СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ КОНТАМИНАНТОВ ПОЛИМЕРОВ ГЛЮКОЗЫ

1. Способ обнаружения провоспалительных контаминантов полимеров глюкозы, причем указанные контаминанты способны к инициации отдельно или в комбинации воспалительной реакции, отличающийся тем, что включает по меньшей мере один анализ воспалительного ответа in vitro с применением клеточной линии, которая позволяет обнаружить по меньшей мере один фактор воспалительного ответа, при этом клеточная линия представляет собой клеточную линию либо макрофагов, либо дифференцируемую в макрофаги, либо клетку, экспрессирующую один или несколько толл-подобных рецепторов (TLR) или NOD-подобных рецепторов, таких как TLR2, TLR4 или NOD2, а также позволяет обнаружить ответы рецептора(ов), или их комбинацию.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полимеры глюкозы выбирают из группы полимеров глюкозы для перитонеального диализа, энтерального и парентерального питания и кормления новорожденных, а более конкретно, из полимеров глюкозы для перитонеального диализа.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеточная линия представляет собой клеточную линию макрофагов, предпочтительно - клеточную линию, дифференцируемую в макрофаги, более предпочтительно - линию, дифференцируемую в макрофаги ТНР-1.
6
6
6
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что клеточную линию применяют при плотности от 0,5 до 1×10 клеток/мл, предпочтительно от 0,7 до 0,8×10 клеток/мл и еще более предпочтительно приблизительно 0,75×10 клеток/мл.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что анализ воспалительного ответа заключается в размещении клеток клеточной линии в присутствии препарата полимеров глюкозы, который может содержать провоспалительные контаминанты, и в измерении продуцирования цитокинов острой фазы воспаления, причем продуцирование этих цитокинов указывает на то, что препарат содержит контаминанты, способные инициировать воспалительную реакцию.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что цитокины острой фазы воспаления выбирают из группы, состоящей из TNF-α, IL-1β и хемокинов, таких как CCL5/RANTES и IL-8/CXCL8, предпочтительно хемокин представляет собой RANTES.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что цитокин представляет собой RANTES.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что продуцирование цитокинов измеряют через 20 ч. стимуляции для RANTES и/или 8 ч. стимуляции для TNF-α.
9. Способ по п.5, отличающийся тем, что молекулу, выбранную из мурамилдипептида (MDP) и родственных молекул (L18-MDP, гликолил-MDP), формилированных микробных пептидов типа f-MLP (трипептид формил-Met-Leu-Phe) и липополисахаридов (LPS), предпочтительно MDP из S. aureus, f-MLP или LPS, очищенные из Escherichia coli, добавляют к препарату полимера глюкозы.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что молекулу, выбранную из MDP и LPS, добавляют к препарату полимера глюкозы.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что MDP добавляют к препарату полимера глюкозы в концентрации от 1 до 100 мкг/мл, предпочтительно приблизительно 10 мкг/мл.
12. Способ по п.3, отличающийся тем, что он обладает одной или несколькими из следующих характеристик, предпочтительно всеми этими характеристиками:
6
6
6
- клеточную линию применяют при плотности от 0,5 до 1×10 клеток/мл, предпочтительно от 0,7 до 0,8×10 клеток/мл и еще более предпочтительно приблизительно 0,75×10 клеток/мл; и/или
- концентрация полимера глюкозы составляет менее 50 мг/мл, предпочтительно приблизительно 25 мг/мл; и/или
- продуцирование цитокинов измеряют через 20 ч стимуляции для RANTES и/или 8 ч стимуляции для TNF-α; и/или
- MDP добавляют к препарату полимера глюкозы в концентрации от 1 до 100 мкг/мл, предпочтительно приблизительно 10 мкг/мл.
13. Способ по п.3, отличающийся тем, что он позволяет обнаружить загрязнение полимера глюкозы пептидогликанами (PGN) и/или LPS, предпочтительно PGN среднего размера, приблизительно 120 кДа, и/или LPS, еще более предпочтительно LPS.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеточная линия позволяет обнаружить активность одного или нескольких толл-подобных рецепторов (TLR) или NOD-подобных рецепторов, таких как TLR2, TLR4 и NOD2, при этом в этой клеточной линии репортерный ген находится под непосредственным контролем сигнального пути, связанного с TLR или NOD-подобным рецептором(и), при этом предпочтительно репортерный ген кодирует окрашенный или флуоресцирующий белок, или кодирует белок, активность которого может быть измерена с помощью субстрата или без него, еще более предпочтительно кодирует секретируемую щелочную фосфатазу.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что клеточная линия позволяет обнаружить активность рецептора TLR2, в частности линия HEK-Blue™ hTLR2.
16. Способ по п.14, отличающийся тем, что клеточная линия позволяет обнаружить активность рецептора NOD2, в частности линия HEK-Blue™ hNOD2.
17. Способ по п.14, отличающийся тем, что клеточная линия позволяет обнаружить активность рецептора TLR4, в частности линия HEK-Blue™ hTLR4.
18. Способ по п.14, отличающийся тем, что клеточная линия позволяет обнаружить активность рецепторов TLR2, TLR4 и NOD2, в частности линия Raw-Blue™.
19. Способ по п.14, отличающийся тем, что анализ воспалительного ответа заключается в размещении клеток клеточной линии в присутствии препарата полимеров глюкозы, который может содержать провоспалительные контаминанты, и в измерении активности рецептора или сигнала репортерного гена, причем обнаружение данной активности или данного сигнала, указывает на то, что препарат содержит контаминанты, способные активировать один или несколько рецепторов врожденного иммунитета и инициировать воспалительную реакцию.
20. Способ по п.16, отличающийся тем, что он позволяет обнаружить загрязнение полимера глюкозы MDP.
21. Способ по п.15, отличающийся тем, что он позволяет обнаружить загрязнение полимера глюкозы PGN.
22. Способ по п.18, отличающийся тем, что он позволяет обнаружить загрязнение полимера глюкозы PGN.
23. Способ по п.1, отличающийся тем, что анализируемый препарат полимера глюкозы имеет концентрацию полимера от 5 до 50 мг/мл.
24. Способ по п.1, отличающийся тем, что он включает этап обработки препарата полимера глюкозы мутанолизином до инкубации указанного препарата с клетками.
25. Способ по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно включает этап фильтрации препарата полимера глюкозы с порогом отсечения от 30 кДа до 150 кДа, предпочтительно от 30 до 100 кДа или от 30 до 50 кДа и, в частности, приблизительно 30 кДа, при этом фильтрат инкубируют с клетками, и при этом результаты для фильтрата необязательно сравнивают с результатами для препарата полимера глюкозы.
26. Способ по п.1, отличающийся тем, что он включает этапы, заключающиеся в
(a) выполнении по меньшей мере одного анализа воспалительного ответа in vitro, заключающегося в размещении макрофагов в присутствии препарата полимеров глюкозы, которые могут содержать провоспалительные контаминанты, и в измерении продуцирования цитокинов острой фазы воспаления, в частности TNF-α или RANTES, предпочтительно RANTES, причем продуцирование этих цитокинов указывает на то, что препарат содержит контаминанты, способные к инициации воспалительной реакции, и
(b) размещении клеточной линии, которая позволяет обнаружить активность рецептора врожденного иммунитета или нескольких рецепторов врожденного иммунитета, таких как TLR2, TLR4 или NOD2, в присутствии препарата и обнаружении активности рецептора или сигнала репортерного гена, связанного с этим рецептором, причем обнаружение данной активности или данного сигнала указывает на присутствие в препарате контаминанта, который представляет собой агонист рецептора.
27. Способ по п.26, отличающийся тем, что он включает проведение анализа с помощью макрофагов (а) и анализа (b) с помощью клеток, которые позволяют обнаружить активность рецептора TLR2, и необязательно анализа (b) с помощью клеток, которые позволяют обнаружить активность рецептора NOD2, и/или анализа (b) с помощью клеток, которые позволяют обнаружить активность рецепторов TLR2, TLR4 и NOD2; предпочтительно он включает проведение анализа с помощью макрофагов (а) и анализа (b) с помощью клеток, которые позволяют обнаружить активность рецептора TLR2, таких как HEK-Blue™ hTLR2, клеток, которые позволяют обнаружить активность рецептора NOD2, таких как HEK-Blue™ hNOD2, и клеток, которые позволяют обнаружить активность рецепторов TLR2, TLR4 и NOD2, таких как Raw-Blue™.
28. Способ по любому из пп.1-27, отличающийся тем, что он дополнительно включает этап, заключающийся в идентификации или количественном определении контаминанта(ов), способного к инициации воспалительной реакции.
29. Способ по п.28, отличающийся тем, что контаминант(ы), способный к инициации воспалительной реакции, идентифицируют или количественно определяют путем размещения препарата полимера глюкозы в присутствии клеток клеточной линии, как определено по любому из пп.14-18, и путем измерения активности рецептора или сигнала репортерного гена, причем обнаружение данной активности или данного сигнала указывает на присутствие в препарате контаминанта, который представляет собой агонист рецептора.
30. Способ по п.29, отличающийся тем, что он позволяет количественно определить пептидогликаны (PGN), при этом применяемая клеточная линия позволяет обнаружить активность рецептора TLR2, в частности, посредством репортерного гена, находящегося под непосредственным контролем сигнального пути, связанного с рецептором иммунитета TLR2.
31. Способ по п.30, отличающийся тем, что он включает этап обработки препарата полимера глюкозы мутанолизином, инкубирования препаратов полимера глюкозы, обработанных мутанолизином, и/или необработанных препаратов полимера глюкозы, а также количественного определения PGN.