К вопросу генотипирования возбудителя бруцеллеза

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ И ТИПИРОВАНИИ ПАТОГЕНОВ

pilQ (Gil et al., 2004). Для амплификации участка гена FTT0918 были использованы пары праймеров 0918cis (Salomonsson et.al., 2009). Программы амплификации реакционных смесей состояли из циклов: I - 94°- 5 мин, II - (94°- 30 сек, Т отжига - 30 сек, 72°- 59 сек) х 30-40 циклов, III - 72°- 3 мин и 10°- режим хранения; Т отжига составляла 59°с праймерами AB/PE5/PD/PF; 60° -PE3 и 0918cis; 61°- PE2/PT/PQ; 64°- PE4.

У всех исследованных штаммов F.t. четырех подвидов выявлены участки пилевых генов: pilE2, pilE3; pilE4; pilE5; pilF; pilT; pilD и pilQ, продукты амплификации которых составили 214, 226, 248, 164, 364, 497, 161 и 289 п.н. соответственно. При использовании олиго-нуклеотидов АВ у вирулентных штаммов F.t. 3-х подвидов и F.t.novicida был обнаружен специфический участок гена pilA (~500 п.н.), который отсутствовал у вакцинного 15НИИЭГ, его вариантов и авирулентных штаммов F.t. subsp.holarctica. Вместе с тем pilA был выявлен как у вирулентных, так и аттенуированных штаммов F.t. подвидов tularensis и mediasiatica.

Для дискриминации вакцинных и авирулентных штаммов от вирулентных дополнительно использованы праймеры 0918cis, фланкирующие участок гена FTT0918. В результате был идентифицирован делеци-

рованный участок гена FTT0918 у вакцинного 15НИИ-ЭГ, его вариантов и авирулентных штаммов F.t. subsp. ^1агсйса (~2400 п.н.). Однако нами не выявлен специфический продукт амплификации (~4400 п.н.) в ДНК вирулентных штаммов К^ 3-х подвидов, который был обнаружен Salomonsson ейа1., 2009.

Штаммы F.phi1omiragia не были идентифицированы с помощью ПЦР со всеми указанными праймера-ми, что подтверждает таксономическую самостоятельность этого вида.

Таким образом, использование ПЦР-тест-систем с праймерами АВ и 0918cis позволило дискриминировать вирулентные штаммы К^1ю1агйтса от вакцинного 15НИИЭГ, его вариантов и авирулентных штаммов. Потеря полноценного гена рПА у штамма 15НИИЭГ, возможно, является одной из существенных генетических причин его аттенуации, что подтверждает данные, полученные Fors1und е^а1., 2006; Rohmer е^а1., 2006; Sa1omonsson et.aU, 2009 при исследовании штамма LVS (производного от 15НИИЭГ).

Полученные результаты вносят определенный вклад в изучение генов Кш1агег^, ответственных за вирулентность, и могут служить основой для продолжения поиска факторов патогенности возбудителя туляремии.

К ВОПРОСУ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА

Д.А. Ковалев, Ю.К. Кулаков*, Л.В. Ляпустина, Е.Н. Мисетова, С.И. Головнева

ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, *ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, Москва

Бруцеллез является широко распространенной зоо-нозной инфекцией, вызываемой большим числом различных хозяевоспецифических грамотрицательных бактерий рода Brucella. В России основными патогенными видами бруцелл являются: B.melitensis, вызывающая наиболее тяжелые формы эпидемической заболеваемости, часто с хроническим течением; B.abortus и B.suis, обусловливающие спорадическую заболеваемость; B.canis, выделяемая в России с 1994 г. от собак и представляющая потенциальную опасность для человека.

Одним из существенных недостатков в средствах и методах борьбы с бруцеллезом в Российской Федерации является несовершенная система дифференциации и систематики выделяемых изолятов, которая проводится путем анализа большого набора тестов, включающих серологическую специфичность, ростовые потребности, биохимические свойства. Молекулярные методы типирования возбудителя до штаммового уровня широко не используются в России, что не позволяет решать важные задачи молекулярной эпидемиологии и систематики штаммов бруцеллезного микроба, циркулирующих на территории Российской Федерации и сопредельных государств.

В настоящее время существует очень мало доступных способов субтипирования бруцеллезных изолятов

для ретроспективного эпидемиологического анализа. Данное типирование затруднено из-за высокого уровня (более 90 %) гомологии ДНК внутри рода Brucella.

Описанная ранее методика определения гипервариабельности в коротких тандемных последовательностях для типирования штаммов некоторых бактериальных патогенов, имеющих также высокий уровень гомологии ДНК (Y.pestis, B.anthracis, M.tuberculosis), нашла в настоящее время широкое применение. Использование данного подхода для генотипирования бруцелл стало возможным в начале текущего столетия, когда был сиквенирован геном трех видов бруцеллезного микроба, показавший наличие в геноме возбудителя бруцеллеза присутствия более 100 локусов, содержащих тандемные повторы различной длины, имеющих как видовой, так и в ряде случаев штаммовый генетический полиморфизм.

В настоящее время исследователи используют несколько схем мультилокусного VNTR-типирования (MLVA) с разными локусами бруцелл. Наиболее часто в MLVA используют комбинацию локусов, предложенную P. Le Fleche et al., которая включает восемь маркеров с хорошей возможностью к видовой идентификации, обозначенных как минисателлитный набор, и семь - с большей дискриминационной способностью (микросателлитный набор).

НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК

Цель работы заключалась в оценке схемы MLVA типирования на соответствие основным критериям типирования возбудителя бруцеллеза до уровня штам-мовой дифференциации.

В работе были использованы 26 штаммов бруцелл трех основных патогенных видов (B. melitensis, B. abortus, B. suis), представленных 14 известными референтными, двумя вакцинными, восемью полевыми штаммами и двумя австралийскими изолятами, выделенными от мышевидных грызунов Австралии, имеющими неясное таксономическое положение.

Схема MLVA-типирования включала анализ вариабельных тандемных повторов штаммов бруцелл в ПЦР с праймерами, ограничивающими 9 VNTR-локусов из обеих панелей (мини- и микросателлитная) MLVA-15.

Референтные и вакцинные штаммы бруцелл с известными генотипами использовали для подтверждения стабильности сохранения количества повторов в анализируемых локусах и оценки воспроизводимости MLVA специфических штаммовых генотипов, стабильности тандемных повторов в анализируемых локусах и соответствия фенотипическим методам анализа.

Для решения этой задачи полученные MLVA генотипы на основе сиквенсного анализа для лабораторных референтных (15) и вакцинных (2) штаммов сравнивали с одноименными штаммовыми генотипами, представленными в международных базах данных. Для 13 штаммов результаты сравнения показали идентичность MLVA генотипов со стабильным наследованием тандемных повторов в анализируемых локусах. Воспроизводимость результатов MLVA-типирования для этих штаммов не зависела от интенсивности проводимых лабораторных пересевов или длительности хранения штаммов.

С другой стороны, было установлено, что три референтных штамма B.melitensis 16М (по всем 9 локу-сам), B.suis Thomsen, B.abortus 292 (по 7 локусам) и

вакцинный штамм B.melitensis Rev-1 (по 8 локусам) имели MLVA генотипы, не соответствующие представленным в международной базе данных. Эти штаммы также не отвечали результатам детальной фенотипи-ческой идентификации, что мы объясняем их исходным несоответствием и возможным загрязнением при пересевах и хранении.

Дендрограмма, построенная с использованием программного обеспечения SAS JMP 8 версии, на основе данных MLVA-9 типирования 26 изолятов выявила генетически родственный кластер, составленный из полевых штаммов B. melitensis C-457, 548, 565 вместе с референтным штаммом B. melitensis 63/9 второго биовара. Этот кластер при сравнении с Международной MLVA систематикой показывал наибольшее родство со Средиземноморским восточным генотипом 45, что согласуется с ранее полученными Ю.К. Кулаковым и др. данными о циркуляции изолятов этого генотипа как на территории России, так и в приграничных государствах.

Полевые штаммы B.abortus 1552, A-422 группировались в родственный кластер вместе с большинством референтных штаммов вида B.abortus.

Штамм B. suis 6 попал в кластер вместе с референтными штаммами B.suis 1-4 биоваров, а штамм B. suis 3-4 - с референтным штаммом B.suis 5 биовара.

Австралийские штаммы Brucella 83-4, 83-6 формировали общий, но удаленный от других штаммов бруцелл кластер.

Таким образом, анализ полученных данных показал, что MLVA-типирование, проведенное по девяти локусам, позволяет систематизировать штаммы бруцелл в соответствии с существующим таксономическим положением видов бактерий рода Brucella. В то же время подтверждение более тонких дискриминационных возможностей данной системы генотипирова-ния требует проведения дальнейших исследований.

АДАПТАЦИЯ ПЦР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗА И ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЗА ЛЕПТОСПИРОЗНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

А.Н. Ваганова, Н.А. Стоянова, Н.К. Токаревич

ФБУН «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера», Санкт-Петербург

Лептоспироз - инфекционное заболевание, тяжело протекающее у человека и поражающее ряд млекопитающих, в том числе домашних и сельскохозяйственных животных, для которых часто характерно бессимптомное течение. Лептоспирозная инфекция характеризуется разнообразными клиническими проявлениями, в связи с чем необходимо лабораторное подтверждение диагноза. Актуальной проблемой является также разработка доступных методов для скрининговых исследований на носительство лептоспир у животных.

«Золотым стандартом» диагностики лептоспиро-за является реакция микроагглютинации (РМА), требующая наличия живых культур лептоспир, с чем свя-

зана ее трудоемкость. Результаты РМА, свидетельствующие о лептоспирозной инфекции, могут быть получены, как правило, на второй неделе заболевания и в ряде случаев диагноз может быть поставлен только на основании повторного исследования сыворотки с интервалом в несколько дней. Антитела к лептоспирам, выявляемые в РМА, могут длительно сохраняться после перенесенного заболевания и вакцинации, что усложняет интерпретацию результата.

Доказательством лептоспирозной этиологии заболевания является обнаружение возбудителя в организме хозяина. Применяемые для этих целей классические микробиологические методы исследования обладают