ПОЛУЧЕНИЕ БИБЛИОТЕКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

1. Способ выполнения ферментативной реакции с использованием электрофореза, включающий:
обеспечение системы электрофореза, содержащей:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец и второй конец и длину между первым и вторым концами;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор фермента для фермента;
второй участок вблизи второго конца и содержащий второй кофактор фермента для указанного фермента, причем второй кофактор фермента имеет электрический заряд, противоположный электрическому заряду первого кофактора фермента;
реакционный участок между первым участком и вторым участком и содержащий фермент; и
пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно; и
приложение электрического поля между парой электродов для перемещения первого кофактора фермента из первого участка на реакционный участок и перемещения второго кофактора фермента из второго участка на реакционный участок с образованием активированного ферментного комплекса, содержащего фермент, первый кофактор фермента и второй кофактор фермента.
2. Способ по п. 1, в котором когда первый кофактор фермента представляет собой ион металла, второй кофактор фермента представляет собой полинуклеотид.
3. Способ по п. 1, дополнительно включающий нанесение субстрата для активированного ферментного комплекса на реакционный участок перед стадией (с), причем приложение электрического поля включает в себя реагирование активированного ферментного комплекса с субстратом на реакционном участке с образованием продукта реакции.
4. Способ по п. 1, в котором приложение электрического поля включает в себя миграцию непрореагировавших первого и второго кофакторов ферментов из реакционного участка для отделения непрореагировавших первого и второго кофакторов ферментов от продукта реакции на реакционном участке.
5. Способ по п. 1, в котором первый электрод представляет собой положительный электрод, а первый кофактор фермента имеет положительный заряд, при этом второй электрод представляет собой отрицательный электрод, а второй кофактор фермента имеет отрицательный заряд.
6. Способ по п. 3, в котором субстрат представляет собой целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту, причем необязательно целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота представляет собой двухцепочечную ДНК, двухцепочечную РНК или ДНК/РНК гибрид.
2+
2
2
7. Способ по п. 1, в котором фермент представляет собой транспозазу, причем необязательно транспозаза представляет собой транспозазу Тn5, и при этом необязательно первый кофактор фермента содержит Mg, необязательно в виде Mg(OAc) или MgCl и необязательно второй кофактор фермента представляет собой адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки.
8. Способ получения библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот из целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий:
обеспечение системы электрофореза, содержащей:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец и второй конец, ширину и длину между первым и вторым концами;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор транспозазы, причем первый кофактор транспозазы представляет собой ион металла;
реакционный участок, расположенный на расстоянии от первого конца и содержащий транспосомный комплекс, содержащий транспозазу и адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки; и
пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно;
нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на реакционный участок;
приложение первого электрического поля между парой электродов для перемещения первого кофактора транспозазы из первого участка на реакционный участок с образованием активированного транспосомного комплекса, содержащего транспозазу, адаптор полинуклеотидной транспозазы и первый кофактор транспозазы; и
инкубирование целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты с активированным транспосомным комплексом на реакционном участке в условиях, достаточных для фрагмента целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, а не множества фрагментов нуклеиновых кислот, и мечение фрагментов нуклеиновых кислот, таким образом создавая библиотеку меченых фрагментов нуклеиновых кислот.
9. Способ по п. 8, в котором транспосомный комплекс иммобилизуют на твердой подложке на реакционном участке, необязательно посредством взаимодействия стрептавидин-биотин.
10. Способ по п. 9, включающий высвобождение транспосомного комплекса из твердой подложки после создания меченых фрагментов нуклеиновой кислоты.
11. Способ по п. 10, дополнительно включающий изменение величины первого электрического поля после стадии для перемещения меченых фрагментов нуклеиновой кислоты, связанных с транспосомным комплексом, высвобожденным из твердой подложки на участке для сбора.
12. Способ получения библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот из целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий:
обеспечение системы электрофореза, содержащей:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец и второй конец, ширину и длину между первым и вторым концами;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор транспозазы для транспозазы, причем первый кофактор транспозазы представляет собой ион металла;
второй участок вблизи второго конца и содержащий второй кофактор транспозазы для транспозазы, причем второй кофактор транспозазы имеет электрический заряд, противоположный электрическому заряду первого кофактора транспозазы, при этом второй кофактор транспозазы представляет собой адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки;
реакционный участок между первым участком и вторым участком и содержащий транспозазу; и
пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно;
нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на реакционный участок;
приложение первого электрического поля между парой электродов для перемещения первого кофактора транспозазы из первого участка на реакционный участок и перемещения второго кофактора транспозазы из второго участка на реакционный участок с образованием активированного транспосомного комплекса, содержащего транспозазу, первый кофактор транспозазы и второй кофактор транспозазы; и
инкубирование целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты с активированным транспосомным комплексом на реакционном участке в условиях, достаточных для фрагмента целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, а не множества фрагментов нуклеиновых кислот, и мечение фрагментов нуклеиновых кислот, таким образом создавая библиотеку меченых фрагментов нуклеиновых кислот.
13. Способ по п. 12, в котором одноцепочечная область метки содержит одно или более из: праймерной последовательности, штрихкодовой последовательности, последовательности уникального молекулярного идентификатора (UMI), метки амплификации, метки обогащения или метки очистки.
14. Способ по п. 12, в котором транспозазу иммобилизуют на твердой подложке на реакционном участке, причем реакционный участок необязательно содержит лунку, при этом твердая подложка представляет собой гранулированную частицу или поверхность лунки.
15. Способ по п. 12, в котором величину первого электрического поля, приложенного на стадии (c), устанавливают таким образом, чтобы целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота по существу не имела электрофоретической подвижности в пределах матрицы для электрофореза.
16. Способ по п. 12, в котором система электрофореза содержит участок для сбора вдоль длины между первым участком и реакционным участком.
17. Способ по п. 16, в котором приложение первого электрического поля на стадии (c) включает в себя перемещение меченых фрагментов нуклеиновых кислот на участок для сбора.
18. Способ по п. 12, включающий изменение величины или направления первого электрического поля через гелевую матрицу для электрофореза.
19. Способ по п. 12, в котором система электрофореза содержит дополнительные участки вдоль ширины и длины, каждый из которых содержит различные реагенты для тагментации, и вторую пару из положительного и отрицательного электродов на противоположных сторонах ширины на одном из: первого конца или второго конца.
20. Способ по п. 19, включающий приложение второго электрического поля между второй парой электродов, причем направление второго электрического поля перпендикулярно направлению первого электрического поля, приложенного на стадии (с).
21. Способ получения библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот из целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий:
обеспечение системы электрофореза, содержащей:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец и второй конец, ширину и длину между первым и вторым концами;
первый участок, содержащий первый кофактор транспозазы для транспозазы, причем первый кофактор транспозазы представляет собой ион металла;
второй участок, содержащий второй кофактор транспозазы для транспозазы, причем второй кофактор транспозазы имеет электрический заряд, противоположный электрическому заряду первого кофактора транспозазы, при этом второй кофактор транспозазы представляет собой адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки;
третий участок, содержащий лизирующий реагент;
четвертый участок, содержащий транспозазу;
реакционный участок между первым участком и вторым участком; и
первую пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно; и
вторую пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на противоположных сторонах ширины на одном из: первого конца или второго конца;
нанесение цельных клеток, содержащих целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту, на реакционный участок;
приложение первого электрического поля для перемещения лизирующего агента на реакционный участок и/или через него для лизиса клеток, таким образом нанося целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту на участок для образца;
приложение второго электрического поля для перемещения первого кофактора транспозазы из первого участка на реакционный участок, перемещения второго кофактора транспозазы из второго участка на реакционный участок и/или перемещения транспозазы из участка транспозазы на реакционный участок с образованием активированного транспосомного комплекса, содержащего транспозазу, первый кофактор транспозазы и второй кофактор транспозазы; и
инкубирование целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты с активированным транспосомным комплексом на реакционном участке в условиях, достаточных для фрагмента целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, а не множества фрагментов нуклеиновых кислот, и мечение фрагментов нуклеиновых кислот, таким образом создавая библиотеку меченых фрагментов нуклеиновых кислот.
22. Способ по п. 21, в котором первое электрическое поле и второе электрическое поле отличаются, а стадию (с) выполняют перед стадией (d); или
в котором первое электрическое поле и второе электрическое поле являются одинаковыми, а стадию (с) выполняют одновременно со стадией (d).
23. Устройство электрофореза, содержащее:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец, второй конец и длину между первым и вторым концами;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор фермента для фермента;
второй участок вблизи второго конца и содержащий второй кофактор фермента для указанного фермента, причем второй кофактор фермента имеет электрический заряд, противоположный электрическому заряду первого кофактора фермента;
реакционный участок между первым участком и вторым участком и содержащий фермент; и
пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно.
24. Устройство электрофореза, содержащее:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец и второй конец, ширину и длину между первым и вторым концами;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор транспозазы, причем первый кофактор транспозазы представляет собой ион металла;
реакционный участок, расположенный на расстоянии от первого конца и содержащий транспосомный комплекс, содержащий транспозазу и адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки; и
пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно.
25. Устройство электрофореза, содержащее:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец, второй конец и длину между первым и вторым концами;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор транспозазы для транспозазы, причем первый кофактор транспозазы представляет собой ион металла;
второй участок вблизи второго конца и содержащий второй кофактор транспозазы для транспозазы, причем второй кофактор транспозазы имеет электрический заряд, противоположный электрическому заряду первого кофактора транспозазы, при этом второй кофактор транспозазы представляет собой адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки;
реакционный участок между первым концом и вторым концом и содержащий транспозазу; и
пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно.
26. Устройство электрофореза, содержащее:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец и второй конец, ширину и длину между первым и вторым концами;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор транспозазы для транспозазы, причем первый кофактор транспозазы представляет собой ион металла;
второй участок вблизи второго конца и содержащий второй кофактор транспозазы для транспозазы, причем второй кофактор транспозазы имеет электрический заряд, противоположный электрическому заряду первого кофактора транспозазы, при этом второй кофактор транспозазы представляет собой адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки;
третий участок, содержащий лизирующий реагент;
четвертый участок, содержащий транспозазу;
реакционный участок между первым концом и вторым концом; и
первую пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно; и
вторую пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на противоположных сторонах ширины на одном из: первого конца или второго конца.
27. Система для получения библиотеки меченных фрагментов нуклеиновых кислот из целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащая:
устройство по любому одному из пп. 23-26;
источник питания;
контроллер, выполненный с возможностью управления направлением и/или величиной первого и второго электрических полей для перемещения реагентов и/или меченых фрагментов нуклеиновых кислот на реакционный участок, участок для сбора и/или приемные участки, и/или через них.