Биофизические свойства эритроцитов периферической крови у больных с хронической ишемией мозга

Биофизические свойства эритроцитов периферической крови у больных с хронической ишемией мозга

^ К.Р. Бадалян1, И.А. Василенко2, А.И. Федин1

1 Кафедра неврологии Факультета дополнительного профессионального образования Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова, Москва 2 Лаборатория медицинской цитологии Российской медицинской академии последипломного образования, Москва

Биофизические свойства эритроцитов венозной крови у пациентов с хронической ишемией мозга исследованы методом микроэлектрофореза. Выявлено, что с увеличением тяжести заболевания возрастает процент неподвижных эритроцитов и снижается электрофоретиче-ская подвижность клеток. Также отмечено уменьшение гетерогенности анализируемой популяции по амплитуде колебаний эритроцитов.

Ключевые слова: хроническая ишемия мозга, эритроцит, микроэлектрофорез, биофизические свойства.

Введение

Цереброваскулярные болезни являются одной из лидирующих причин заболеваемости и смертности в мире. Хроническая ишемия мозга (ХИМ) по распространенности занимает ведущее место в структуре це-реброваскулярных болезней. Хроническая ишемия мозга может приводить к таким тяжелым исходам, как инсульт и сосудистая деменция, поэтому вопросы ее своевременной диагностики крайне актуальны.

Важное патогенетическое значение в инициации и прогрессировании ХИМ имеет микроциркуляторный блок, составными компонентами которого являются гемореологические изменения крови (повышение вязкости крови, увеличение гема-токрита, фибриногена, агрегации и адгезии тромбоцитов).

Главную роль в формировании реологических свойств крови играет самый многочисленный по количеству и объемной доле пул клеток — эритроциты. Деформируе-

Контактная информация: Бадалян Карине Рубеновна, kalliroya@mail.ru

мость эритроцитов имеет решающее значение в регуляции вязкости крови, оказывает существенное влияние на эффективность кровотока на уровне микрососудистого русла и обусловливает способность эритроцитов к транспорту веществ. Изменение деформируемости эритроцитов существенно сказывается на их способности проходить через узкие капилляры и агрегировать друг с другом. Улучшение вязкостно-эластичных свойств эритроцитов благоприятствует транспорту кислорода через эритро-цитарную мембрану, а их нарушение коррелирует с ухудшением оксигенации тканей. Нарушение деформируемости эритроцитов обусловливает развитие застойных явлений в микроциркуляторном русле и, как следствие, возникновение тканевой гипоксии.

Одним из факторов, определяющих форму эритроцита, является его мембрана, которая характеризуется определенными электрофизиологическими свойствами, сорб-ционной способностью, неспецифической проницаемостью и т.д. Известно, что живые эритроциты несут на своей поверхности

избыточный отрицательный заряд, который образуется вследствие диссоциации ионогенных, преимущественно кислотных, групп клеточной мембраны. Электрический заряд клеток играет важную роль в газообмене, адсорбции веществ из внешней среды, образовании структуры клеточных скоплений и во всех остальных физиологических проявлениях жизни. Поскольку величина электрического заряда поверхностных мембран эритроцитов зависит прежде всего от их физико-химической структуры и от свойств окружающей клетку среды, то наблюдающиеся при патологических состояниях изменения электрического заряда клеток крови могут быть обусловлены или нарушением клеточных структур, или изменениями среды, окружающей клетку.

Основным источником информации об электрическом заряде поверхностной мембраны циркулирующих в крови эритроцитов является метод микроэлектрофореза, основанный на прямо пропорциональной зависимости между величиной заряда и скоростью его перемещения в постоянном электрическом поле.

Установлено, что регистрация перемещения клеток крови в электрическом поле позволяет оценить не только их электрокинетический потенциал и, следовательно, морфофункциональное состояние мембран, но и общие закономерности изменения гомеостаза организма.

Регистрация тонких изменений морфо-функционального состояния мембран эритроцитов может оказаться информативной в плане решения задач ранней диагностики и профилактики многих заболеваний, в том числе ХИМ. В связи с этим целью исследования явилось определение диагностических критериев ХИМ на основе экспресс-анализа электрокинетических показателей эритроцитов венозной крови.

Материал и методы

Обследовано 95 пациентов с ХИМ. Диагноз выставлялся в соответствии с Между-

народной классификацией болезней 10-го пересмотра (МКБ-10), раздел "Другие це-реброваскулярные болезни", шифр 167.8 "Ишемия мозга (хроническая)".

Клиническое исследование проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации последнего пересмотра (2000 г.) и требованиями Надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice).

Контрольную группу составили 54 практически здоровых донора-добровольца, сопоставимых по возрасту с лицами основной группы, с нормальными показателями артериального давления, не имевшие каких-либо неврологических нарушений.

Критерии включения пациентов с ХИМ в исследование: мужчины и женщины, проходившие стационарное обследование, без психических нарушений, состояние которых удовлетворяло критериям МКБ-10 (цереброваскулярная болезнь, хроническая ишемия головного мозга); пациенты, способные понять цель исследования и пройти диагностическое обследование. Критерии исключения пациентов с ХИМ из исследования: прием препаратов, влияющих на реологические свойства крови; наличие тяжелой деменции и неспособность выполнять команды; наличие психических заболеваний; наличие в анамнезе бронхиальной астмы, печеночной и почечной недостаточности, выраженной недостаточности кровообращения, онкологического заболевания; давность острого нарушения мозгового кровообращения менее 12 мес.

Пациенты были включены в исследование после подписания письменного согласия и подробного обследования с оценкой выраженности когнитивных расстройств в структуре ХИМ.

В зависимости от жалоб и данных неврологического осмотра были диагностированы различные стадии заболевания (I, II и III). Лица с остаточными явлениями перенесенного инфаркта мозга были отнесены к группе с III стадией заболевания (табл. 1).

Таблица 1. Распределение пациентов по возрасту, полу и стадиям заболевания

Средний возраст, годы

Стадия ХИМ 51,3 ± 7,3 64,8 ± 9,7 73,6 ± 9,8 Мужчины/женщины

I 9 3 - 3/9

II 13 22 5 16/24

III 6 14 23 18/25

Всего 28 39 28 37/58

Примечание. Здесь и в табл. 2-4 данные представлены в виде М ± SD (среднее ± стандартное отклонение).

Оценивали состояние эритроцитарного звена, показатели биохимического анализа крови. Диагноз подтверждался на основании жалоб, данных неврологического статуса, методов нейровизуализации (мультиспи-ральная компьютерная томография/магнитно-резонансная томография головного мозга). Для оценки степени выраженности нарушения кровотока в магистральных артериях головы проводилось ультразвуковое дуплексное сканирование (УЗДС).

Кровь для исследования в объеме 5—10 мл получали однократно из кубиталь-ной вены. Материалом для исследований служили эритроциты периферической крови, которые получали стандартным способом, отмывая в 0,3 М растворе сахарозы.

Электрокинетические показатели эритроцитов периферической крови оценивали с использованием экспресс-метода компьютерного микроэлектрофореза на базе модуля аппаратно-программного комплекса "Биони-МЭФ" (ТУ 9443-002-173904712012, ООО "Весттрэйд", Москва). Данный комплекс в оперативном режиме позволяет измерять процент неподвижных эритроцитов в анализируемой популяции, среднюю

Таблица 2. Результаты клинико-неврологическо-го обследования у пациентов с ХИМ

тадия ХИМ Адаптированная количественная неврологическая шкала А.И. Федина 5-балльная рейтинговая шкала

I 10,25 ± 4,95 10,0 ± 3,27

II 37,78 ± 13,58 18,0 ± 3,67

III 108,62 ± 22,06 30,0 ± 3,92

амплитуду их колебаний, отклонение и распределение клеток по амплитуде, элек-трофоретическую подвижность эритроцитов (ЭФПЭ) и ее отклонение.

Статистическая обработка материала выполнена с помощью пакета прикладных программ Microsoft Exel и Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., США, 2006). Применялись непараметрические методы анализа: сопоставление двух независимых групп по количественному признаку с использованием U-критерия Манна—Уитни, для выявления связи признаков применялся непараметрический корреляционный анализ по методу Спирмена. Данные представлялись в виде средних значений со стандартным отклонением. Различия, полученные при сравнительном анализе, считались статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты

Клинико-неврологическое обследование пациентов проводилось с использованием адаптированной количественной неврологической шкалы А.И. Федина и 5-балльной рейтинговой шкалы со стандартизированными критериями оценки выраженности каждого симптома (табл. 2). При нарастании степени недостаточности мозгового кровообращения повышалось количество и увеличивалась выраженность жалоб, объективно выявлялось прогресси-рование органических и психоэмоциональных нарушений.

При количественной оценке степени выраженности клинических синдромов по шкале А.И. Федина у пациентов с ХИМ

III стадии средний балл по группе достоверно превышал этот показатель в группах с I и II стадиями заболевания в 10,60 и 2,88 раза соответственно (р < 0,0001).

Количественная характеристика неврологических симптомов и синдромов по 5-балльной рейтинговой шкале отражала аналогичную тенденцию: степень выраженности симптомов у пациентов с III стадией заболевания оказалась выше, чем у пациентов с I и II стадиями, в 3 и 1,67 раза соответственно (р < 0,0001).

При анализе результатов дообследования было выявлено, что по мере прогресси-рования ишемии нарастают визуально-качественные изменения вещества головного мозга, характеризующиеся очагово-атро-фическими нарушениями.

Наиболее частой причиной церебровас-кулярной патологии, по мнению ряда авторов, является атеросклероз, при котором развиваются стенозирующие и окклюзи-онные поражения прецеребральных и церебральных сосудов. Увеличение толщины комплекса интима—медиа (ТИМ), выявляемое при УЗДС, в настоящее время является ключевым показателем развития атеро-склеротического процесса в магистральных артериях головы.

Толщина комплекса интима—медиа у пациентов с I стадией ХИМ составляла 0,81 ± 0,24 мм, у пациентов со II стадией ХИМ — 1,32 ± 0,35 мм, у пациентов с III стадией ХИМ - 1,62 ± 0,39 мм (рисунок). Было обнаружено, что по мере про-грессирования заболевания нарастали изменения в сосудистой стенке: ТИМ у пациентов с I стадией заболевания оказалась ниже, чем у пациентов со II и III стадиями, в 1,6 и 2 раза соответственно (р < 0,001). Также отмечалась разница ТИМ у пациентов со II и III стадиями: у пациентов со II стадией ТИМ была в 1,2 раза меньше (р < 0,001).

На первом этапе исследования мы оценивали общие показатели электрокинетических свойств мембран эритроцитов у пациентов с ХИМ. При анализе результатов был

1,8 г 1,6 1,4

I 1,2  1,0

К 0,8 н

0,6 0,4 0,2 0

I стадия II стадия III стадия

Характеристика ТИМ у пациентов с ХИМ. Различия всех показателей между собой достоверны.

выявлен ряд достоверных изменений мор-фофункционального статуса эритроцитов, отражающих нарушение клеточного гомео-стаза в условиях развития ишемии (табл. 3). Так, в сравнении с условно здоровыми лицами у обследованных пациентов процент неподвижных эритроцитов оказался практически в 2 раза выше, а средняя амплитуда колебаний и ее среднеквадратичное отклонение, напротив, в 1,2 раза ниже (р < 0,05).

Следующим этапом исследования было выявление особенностей морфофункцио-нальных изменений эритроцитов у пациентов с разными стадиями заболевания.

Таблица 3. Характеристика электрофоретиче-ских показателей эритроцитов у пациентов с ХИМ и лиц контрольной группы

Показатели

Контрольная Пациенты группа с ХИМ

Неподвижные 4,86 ± 4,60 11,09 ± 13,10* эритроциты, %

Средняя амплитуда 8,08 ± 2,60 5,67 ± 1,57*

колебаний

эритроцитов, мкм

Среднеквадратичное 2,04 ± 1,16 1,90 ± 1,70*

отклонение

амплитуды колебания

эритроцитов, мкм

ЭФПЭ, мкм см/В с 0,257 ± 0,060 0,223 ± 0,048

* Различия с показателями контрольной группы достоверны (р < 0,05).

Таблица 4. Характеристика электрофоретических показателей эритроцитов крови у пациентов с разными стадиями ХИМ

Показатели Стадия ХИМ

I II III

Неподвижные эритроциты, % 4,50 ± 3,59* 11,14 ± 13,66 12 93 + 9 9*' ***

Средняя амплитуда колебаний эритроцитов, мкм 5,20 ± 1,61*** 5,97 ± 1,57 5,49 ± 1,54***

Среднеквадратичное отклонение амплитуды колебаний эритроцитов, мкм 2,16 ± 1,08 1,71 ± 0,77*** 2,02 ± 1,47***

ЭФПЭ, мкм см/В с 0,217 ± 0,04 0,238 ± 0,05** 0,210 ± 0,05**

Среднеквадратичное отклонение ЭФПЭ, мкм см/В с 0,052 ± 0,01 0,052 ± 0,02** 0,049 ± 0,02**, ***

Примечание. Статистически значимые различия (р < 0,05): * -ХИМ; *** - по сравнению с контролем. между I и III стадиями ХИМ; ** - между II и III стадиями

При оценке электрокинетических показателей у пациентов с разными стадиями ХИМ было отмечено, что с увеличением тяжести заболевания повышалась доля неподвижных эритроцитов (табл. 4). Так, при II и III стадиях ХИМ процент неподвижных клеток превышал показатели пациентов с I стадией ХИМ в 2,5 и 3 раза соответственно (р < 0,05).

При анализе ЭФПЭ было установлено, что при всех стадиях ХИМ преобладали клетки с поверхностным зарядом ниже среднего уровня и довольно высокой однородностью, более выраженной у пациентов с ХИМ I стадии. Показатели ЭФПЭ и ее среднеквадратического отклонения в группе со II стадией ХИМ были на 12 и 6% соответственно выше, чем в группе с III стадией ХИМ (р < 0,05).

Несмотря на то что величины средней амплитуды колебаний эритроцитов и ее среднеквадратического отклонения при прогрессировании заболевания практически не изменялись, были выявлены особенности гистограмм распределения средних амплитуд колебаний эритроцитов, характерные для каждой стадии заболевания.

Так, у пациентов с ХИМ I стадии регистрировалась одна вершина гистограммы с левосторонней асимметрией. Наблюдался правосторонний эксцесс, свидетельствующий о появлении в общем пуле клеток

эритроцитов с высокой амплитудой колебания.

У пациентов со II и III стадиями ХИМ на гистограммах регистрировались две вершины распределения средних амплитуд колебания с правосторонней асимметрией, более выраженной у пациентов со II стадией ХИМ. Также при II стадии заболевания обращал на себя внимание максимальный в сравнении с другими стадиями разброс амплитуд колебаний с более выраженной правосторонней асимметрией: средняя амплитуда колебания у больных со II стадией ХИМ была выше, чем в группах с I и III стадиями ХИМ, на 13 и 8% соответственно.

Можно отметить, что с нарастанием клинической симптоматики заболевания более отчетливо были выражены две вершины гистограммы распределения средних амплитуд колебаний эритроцитов с увеличением в общем пуле количества клеток с пониженной амплитудой колебаний эритроцитов и уменьшением разброса амплитуд.

При сопоставлении электрокинетических характеристик мембран эритроцитов со стадиями ХИМ было выявлено увели -чение процента неподвижных эритроцитов по мере повышения стадии заболевания (г = 0,5, р < 0,05). Также было отмечено, что по мере прогрессирования заболевания скорость перемещения эритроцитов в исследуемой среде снижалась, о чем сви-

детельствовала обратная корреляционная связь (г = -0,5, р < 0,05).

При анализе корреляционных связей выраженности неврологической симптоматики по шкале А. И. Федина с показателями микроэлектрофореза мембран эритроцитов было отмечено увеличение количества неподвижных клеток по мере нарастания неврологического дефицита (г = 0,53, р < 0,05). В то же время скорость перемещения эритроцитов в электрическом поле (ЭФПЭ) и среднеквадратиче-ское отклонение показателя снижались, о чем свидетельствовала обратная корреляционная связь (г = -0,54, р < 0,05).

При сопоставлении данных 5-балльной рейтинговой шкалы с электрокинетическими показателями мембран эритроцитов было выявлено, что по мере нарастания неврологической симптоматики увели -чивалась доля неподвижных эритроцитов в исследуемой среде, на что указывала прямая линейная корреляционная связь (г = 0,58, р < 0,05).

Для определения зависимости биофизических параметров мембраны эритроцитов от ТИМ по данным УЗДС у пациентов с ХИМ был проведен корреляционный анализ. Было установлено, что с увеличением ТИМ уменьшалось значение среднеквадратичного отклонения амплитуды колебаний эритроцита, о чем свидетельствовала умеренной силы отрицательная линейная связь показателей (г = -0,51, р < 0,01).

Также было обнаружено, что ЭФПЭ и среднеквадратическое отклонение показателя по мере прогрессирования атеро-склеротического процесса также снижались: отмечена обратная корреляционная связь показателей с ТИМ (коэффициент корреляции для ЭФПЭ и среднеквадрати-ческого отклонения ЭФПЭ составил -0,52 при р < 0,05).

Обсуждение и выводы

Эффект любого фактора реализуется в условиях целостного организма опосредо-

ванно - через мембранные системы клеток. В этом плане мембраны эритроцитов представляют собой удобный объект для исследования, поскольку отражают общие принципы структуры мембран клеток организма и обладают такими преимуществами, как простота выделения, стабильность в искусственной среде, своеобразие организации, не усложненной внутриклеточными мембранами, вследствие отсутствия органелл и ядерного аппарата. Развитие патологических процессов и состояний сопровождается молекулярными изменениями плазматических мембран клеток, которые не только являются непосредственной мишенью повреждающего действия патогенных факторов, но и страдают за счет универсальных механизмов повреждения клетки.

Электрофоретическая подвижность эритроцитов, безусловно, зависит от их мем-бранно-клеточных характеристик и опосредована перестройками белок-липидной составляющей мембран при изменении баланса антиоксидантных систем клетки. Зарегистрированное нами снижение отрицательного заряда у пациентов с ХИМ определяет повышение агрегационной способности эритроцитов и свидетельствует о нарушении реологических свойств крови.

Особенности электрокинетических свойств эритроцитов, скорее всего, могут быть обусловлены изменением активности №/К-АТФазы, перестройками метаболизма, вызывающими морфологическую модификацию клеток. Так, снижение ЭФПЭ может развиваться по следующему механизму: повышенный уровень катехолами-нов и адренореактивность эритроцитов приводят к ингибированию №/К-АТФазы и, соответственно, к накоплению кальция в цитозоле эритроцита, изменяющего характер межмолекулярных взаимодействий. Кроме того, известно, что мембранные белки эритроцита в течение всей его жизни не синтезируются и не обновляются, поэтому длительная супрессия активности №/К-АТФазы свидетельствует в пользу необратимости изменений в активных

Результаты исследований

центрах фермента. Механизмами, формирующими эти изменения, могут выступать факторы различного генеза, в том числе дезорганизация липидного бислоя продуктами перекисного окисления липидов и активными формами кислорода.

Таким образом, полученные результаты продемонстрировали, что в условиях ХИМ прогрессирование заболевания тесно связано с патофизиологическими механизмами нарушения морфофункционального состояния эритроцитов периферической крови, объективными показателями которого являются процент неподвижных клеток и величина ЭФПЭ: с увеличением тяжести ХИМ увеличивается процент неподвижных эритроцитов и снижается скорость перемещения клеток в переменном электрическом поле. Кроме того, отмечается уменьшение гетерогенности анализируемой популяции эритроцитов, по-видимому, за счет вовлечения в патологический процесс большего количества эритроцитов, обладающих типичными изменениями реологических свойств, связанными с нарушением мембранных характеристик клеток.

Выявленные корреляционные связи биофизических параметров эритроцитов с ТИМ продемонстрировали тесную связь прогрессирования атеросклеротического процесса в условиях ХИМ с патофизиологическими механизмами нарушения мор-фофункционального состояния эритроцитов периферической крови: с увеличением ТИМ по данным УЗДС снижается среднеквадратичное отклонение амплитуды колебания эритроцитов в исследуемой среде,

ЭФПЭ, а также среднеквадратичное отклонение ЭФПЭ.

Заключение

Таким образом, критериями тяжести ХИМ могут служить показатели электрокинетической активности эритроцитов (процент неподвижных клеток, средняя амплитуда их колебаний и ее отклонение, ЭФПЭ и ее отклонение).

Использование микроэлектрофореза позволяет оперативно получать объективные данные об изменении поверхностного заряда клеток, степень изменения которого определяется особенностями морфофунк-циональных характеристик циркулирующих эритроцитов у больных при прогрес-сировании заболевания и может оказаться информативной для оценки эффективности проводимых лечебных и профилактических мероприятий с использованием разнообразных фармакологических и физиотерапевтических средств.

Клеточный микроэлектрофорез может применяться как дополнительный метод при исследовании функционального состояния эритроцитов при ХИМ. Раскрытие ключевых универсальных механизмов адаптационных перестроек клеточных мембран крайне важно при разработке методов диагностики развития патологического процесса и патогенетически обоснованной стратегии восстановления функциональных свойств эритроцитов.

Срекомендуемой литературой вы можете ознакомиться на нашем сайте www.atmosphere-ph.ru

Biophysical Characteristics of Peripheral Blood Erythrocytes in Patients with Chronic Brain Ischemia K.R. Badalyan, I.A. Vasilenko, and A.I. Fedin

Biophysical characteristics of venous erythrocytes of patients with chronic brain ischemia were investigated with microelectrophoresis. Data analysis revealed that percent of fixed erythrocytes and their electrophoretic mobility correlated with disease severity. We also observed decrease in heterogenity of amplitude oscillations of analyzed erythrocytes.

Key words: chronic brain ischemia, erythrocyte, microelectrophoresis, biophysical characteristics.