АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ КОЖНОГО КАНДИДОЗА ПЛОТОЯДНЫХ, СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КОЖНОГО КАНДИДОЗА ПЛОТОЯДНЫХ, СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ТЕРАПИИ КОЖНОГО КАНДИДОЗА ПЛОТОЯДНЫХ
CARNIVORE CUTANEOUS CANDIDIASIS ASSOCIATED VACCINE, METHOD FOR PREPARING CARNIVORE CUTANEOUS CANDIDIASIS ASSOCIATED VACCINE, METHOD FOR PREVENTING AND TREATING CARNIVORE CUTANEOUS CANDIDIASIS

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микологии, в частности к получению вакцины против кожного кандидоза плотоядных животных, преимущественно, серебристо-черных лисиц, собак и кошек. До настоящего времени животных, больных кандидозом, лечили различными антимикотиками и антисептиками.
Известен протективный антиген гриба Candida albicans, предназначенный для иммунопрофилактики кандидоза желудочно-кишечного тракта у свиней. Антиген получен центрифугированием из биомассы штамма Candida albicans ВКПГУ-401/NCTC-885-653.
Способ изготовления препарата заключается в следующем:
- выращивание культуры гриба в чашках Петри на агаре Сабуро при 32-340°C в течение 2-х суток;
- съем культуры стерильным 0,15-молярным раствором NaCl;
- фильтрация через 2 слоя марли;
- центрифугирование (2500-3000 об/мин в течение 20 минут);
8
3
- дозировка биомассы при помощи оптического стандарта мутности ГКИ им. Тарасевича (осадок клеток ресуспензируют в 0,15 молярном растворе NaCl до концентрации 1,5×10 клеток в 1 см);
- добавление формалина до 0,5%-ной конечной концентрации формальдегида;
- выдерживание при 36-37°C в течение 2-х суток;
- контроль на стерильность;
- добавление стерильного 0,15 молярного раствора NaCl (около 70 объемных процентов);
- адсорбирование на стерильном геле гидроокиси алюминия (около 20 объемных процентов);
- выдерживание при 37°C в течение 10 дней при частом помешивании для лучшего растворения адъюванта по поверхности антигена;
- контроль на стерильность и безвредность.
3
3
3
3
2
3
2
Протективный антиген, содержащий в 1 см 15 млн гр. т., вводят с профилактической целью двукратно, с интервалом 14 дней внутримышечно в область внутренней поверхности бедра в дозах: супоросным свиноматкам за 2 месяца до опороса - 5,0 см, поросятам 20-дневного возраста - 1,5 см; аэрозольно с применением аэрозольных генераторов ДАГ-2 в дозах: супоросным свиноматкам за 2 месяца до опороса - 5,0 см/м, поросятам 20-дневного возраста- 1,5 см/м.
У свиноматок, привитых в вышеуказанных дозах, формируется противокандидозный иммунитет продолжительностью до 2-х месяцев [1].
Известна также вакцина против кандидоза сельскохозяйственных животных, предназначенная для профилактики висцеральных микозов телят и поросят. Вакцина включает растворимый комплекс белково-полисахаридных антигенов, полученных из депонированного во ВГНКИ вакцинного штамма Candida albicans №253 разрушением клеток грибов способом ультразвуковой дезинтеграции с последующим освобождением от поврежденных стенок и целых клеток методом фильтрации через мембраны при помощи вакуум-насоса.
Способ изготовления вакцины заключается в следующем:
- инкубация культуры гриба в пробирках на агаре Сабуро при 28°C в течение 3-х сут;
- съем культуры физ. раствором NaCl;
- выращивание культуры на матрасах на питательном агаре с солевым р-ром Хенкса при 28°C в течение 6 сут;
3
- съем культуры дистиллированной водой из расчета 25 см на каждый матрас;
8
9
3
- определение концентрации бластоспор (колеблется в пределах 8×10-1×10 спор/см);
8
8
3
- дозировка биомассы (концентрацию спор доводят до 4,5×10-5,5×10 м. т. 1 в см дистиллированной водой);
- выделение антигена из клеточной стенки и цитоплазмы полученной суспензии грибов методом разрушения клеток с помощью ультразвукового дезинтегратора (при длине волны 10-20 кГц и экспозиции 60 минут);
- освобождение от разрушенных и неразрушенных клеток методом фильтрации через мембрану «Владипор» МФА-МА №3 при помощи вакуум-насоса (полученный фильтрат представляет собой растворимый комплекс белково-полисахаридных антигенов);
- оценка полученных антигенов по индексу агломерации лейкоцитов (для изготовления вакцины используют антигены, имеющие индекс 6-10%);
- добавление формалина в конечном разведении смеси 0,4%;
- добавление адъюванта - 6% раствора гидроокиси алюминия в соотношении 10:1;
- выдерживание при 37°С в течение 21 суток.
3
3
3
3
Вакцину вводят с профилактической целью внутримышечно двукратно с интервалом между введениями в 7-10 дней. В зависимости от вида и возраста животных оптимальными дозами являются: телятам в возрасте 1-2 месяца - 1-2,0 см; 3-5 месяцев - 5,0 см; поросятам в возрасте 1-2 месяца - 1-2,0 см; 2-4 месяца - 3,0 см. После проведения массовой иммунизации молодняка случаи возникновения заболеваний прекращаются на период до 6 месяцев [2]. ПРОТОТИП.
Задачей наших исследований было получение вакцины для профилактики и терапии кожного кандидоза, обеспечивающей создание в организме плотоядных животных напряженного длительного иммунитета.
3
Нами получена ассоциированная вакцина, преимущественно, против кожного кандидоза серебристо-черных лисиц, собак и кошек, включающая бластоспоры штаммов грибов Candida albicans «Лисица» и Candida tropicalis «Змея» с концентрацией бластоспор 10-40 млн в 1 см 0,8-1%-ного серноватистокислого натрия, взятых в равных соотношениях.
Указанные вакцинные штаммы депонированы в Музее грибных культур лаборатории микологии и антибиотиков ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко г.Москва (Candida albicans «Лисица» под №95, Candida tropicalis «Змея» под №87). Справку о депонировании прилагаем.
Штамм С.ALBICANS №95 обладает следующими вакцинными свойствами.
КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. На сусле-агаре образует сметанообразные, гладкие, выпуклые, блестящие колонии беловатого цвета, мягкие по консистенции, однородные, с ровными или волнистыми краями. Глубокое врастание в питательную среду по краям или под колониями выражено отчетливо. Диаметр колоний 2-3 см. Клетки округлые 2-6 мкм в диаметре. На жидком сусле глубинный рост и образование осадка. Не образует поверхностной пленки и пристеночного кольца. Клетки круглые и слегка овальные размером 3-6,5×3,5-12,5 мкм. На картофельном и кукурузном агарах развитый древовидный псевдомицелий обнаруживают на 3-5-е сутки культивирования. Около нитей псевдомицелия крыловидные или шаровидные вертициллы. Нити псевдомицелия длиной от 260 до 2000 мкм, прямые или слегка изогнутые. Преобладающий тип филаментации - Mycotorula. Хламидоспоры крупные (9-15 мкм), круглые, двухконтурные располагаются на боковых и концевых веточках по краям колонии. Хламидоспоры обнаруживают также на морковно-картофельном и рисовом агарах через 24-48 ч после посева. На жидких белковых средах клетки С. albicans №95 в течение 2,5-3 ч прорастают, образуя короткие ростковые трубки.
50
ВИРУЛЕНТНЫЕ СВОЙСТВА. ЛД двухсуточной сусло-агаровой культуры С.albicans №95 при внутрибрюшинном введении белым мышам составляет 45-55 млн бластоспор. Гибель мышей наступает на 2-3 сутки после заражения.
3
ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. При двукратной вакцинации белых мышей вакциной с содержанием бластоспор 5,0-20 млн в 1 см развивается невосприимчивость к экспериментальному заражению (срок наблюдения 6 мес).
РЕАКТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Внутримышечное введение вакцины у белых мышей, собак, кошек и серебристо-черных лисиц не приводит к изменению клинического состояния животных.
Штамм С.TROPICALIS №87 обладает следующими свойствами.
КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. На сусле-агаре формируются складчатые круглые колонии с зубчатыми краями, коричневатые, вначале сметанообразные, позднее пленчатые, компактные (диаметром 3,5-4,5 см) с приподнятым неправильно бугристым центром и с радиально исчерченными неровными краями. Врастание в субстрат умеренное. Характерно образование петель, которые придают колониям своеобразный и характерный вид. Дрожжевые клетки овоидной формы размером 4,3-7,2×5,8-10,8 мкм. Псевдомицелий обильный, состоящий из длинных разветвленных нитей. Преобладающий тип роста - Mycotoruloides. На жидком сусле образуются поверхностная пленка с пузырьками, тонкое пристеночное кольцо и обильный осадок на дне. Микроскопически на жидком сусле клетки овальные (встречаются и круглые), размером 5-9×6-12 мкм. На бульоне Сабуро в поверхностной пленке овальные клетки (4-6×3,3-5,3 мкм), в осадке более крупные овальные клетки. В трех-пятисуточных культурах - клетки и нити псевдомицелия. На картофельном и кукурузном агарах развитый псевдомицелий обнаруживают на 3-5-е сутки. Нити длиной 500-2000 мкм и более с множеством боковых ответвлений и относительно небольшими крыловидными вертициллами и псевдоконидиями. Тип филаментации Mycotoraloides. Хламидоспоры отсутствуют.
50
ВИРУЛЕНТНЫЕ СВОЙСТВА. ЛД двухсуточной сусло-агаровой культуры С. tropicalis №87 при внутрибрюшинном введении белым мышам составляет 73-83 млн бластоспор. Гибель мышей наступает на 2-5 сутки после заражения.
3
ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. При двукратной вакцинации белых мышей вакциной с содержанием бластоспор 5,0-20,0 млн в 1 см развивается невосприимчивость к экспериментальному заражению (срок наблюдения 6 мес.).
РЕАКТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Внутримышечное введение вакцины у белых мышей, собак, кошек и серебристо-черных лисиц не приводит к изменению клинического состояния животных.
Вакцину готовят следующим образом:
- раздельно выращивают вакцинные штаммы на сусле-агаре (на матрасах) при 26-30°C в течение 2-3 суток;
3
- добавляют официнальный физ. раствор NaCl (по 200-300 см на каждый матрас);
3
- полученные суспензии пересевают с помощью пипетки Мора на новые матрасы с суслом-агаром (из расчета 5-7 см суспензии на 1 матрас);
- посевы инкубируют при 26-30°C в течение 3-5 суток;
- выращенные культуры снимают с питательной среды с помощью стерильного металлического скребка;
- биомассы грибов раздельно гомогенизируют со стерильным раствором 0,8-1%-ного серноватистокислого натрия в гомогенизаторах с вертикальными стаканами и нижним приводом (режимы: 10 минут - при скорости 3-6 тысяч оборотов в минуту или 3-5 минут - при скорости 9-12 тысяч оборотов в минуту);
- концентрированные гомогенаты выдерживают в течение 9-11 дней при 2-6°C;
- определяют содержание бластоспор грибов в гомогенатах путем подсчета в камере Горяева;
- определяют контаминацию грибного гомогената посторонней микрофлорой;
- стандартизируют грибные гомогенаты по определенным количествам грибных клеток в единице объема разбавителя (0,8-1% серноватистокислый натрий);
3
- стандартные грибные гомогенаты смешивают в соотношении 1:1 (от 10 до 40 млн бластоспор грибов в 1 см вакцины);
- грибные клетки в вакцинном гомогенате ступенчато инактивируют температурой 45-55°C (грибные суспензии прогревают в течение 14-18 час, затем оставляют при комнатной температуре на 5-9 час; такое чередование температур проводят 3 раза);
- гомогенат контролируют на стерильность;
- стандартизируют соединенный гомогенат по количеству бластоспор;
- pH вакцинного гомогената доводят до 7,0-7,2;
- разливают и укупоривают препарат;
- повторно инактивируют температурой 45-55°C в том же режиме;
- этикетируют;
- контролируют препарат согласно лабораторному регламенту.
Вакцину хранят при температуре от 2 до 25°C. Срок годности 2 года (срок наблюдения).
3
Представляем конкретные варианты вакцины с различным содержанием бластоспор грибов в 1 см препарата.
3
1 вариант: по 2,5 млн бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см вакцины.
3
2 вариант: по 5 млн. бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см вакцины.
3
3 вариант: по 10 млн бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см вакцины.
3
4 вариант: по 15 млн бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см вакцины.
3
5 вариант: по 20 млн бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см вакцины.
3
6 вариант: по 25 млн бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см вакцины.
3
7 вариант: по 30 млн бластоспор С. albicans №95 и С. tropicalis №87 в 1 см вакцины.
В результате испытаний на безвредность (использовано 140 белых мышей) из дальнейших опытов исключены 6-й и 7-й варианты вакцины, введение больших доз которых оказалось реактогенным для белых мышей. Остальные (1-5) варианты были испытаны на иммуногенность на лабораторных животных (198 белых мышей).
Все варианты вакцины иммуногенны - спустя 1 мес. после ревакцинации не удалось заразить ни одно животное (табл.1).
Таблица 1
Определение длительности поствакцинального иммунитета
Вариант вакцины
Количественный состав С. albicans + С. tropicalis, бластоспоры, млн в 1 см<sup>3</sup>
Количество животных
Результаты экспериментального заражения белых мышей через:
1 мес
3 мес
6 мес
1
2,5+2,5
36
-
1 (+), 2 (+-)
3 пали, 2 (+), 3 (+-)
2
5+5
36
-
-
1 (+), 3 (+-)
3
10+10
36
-
-
1 (+-)
4
15+15
36
-
-
1 (+), 1 (+-)
5
20+20
36
-
-
1(+)
Контроль
-
18
4(+),
3(+),
4(+),
1 (+-), 1 (-)
3(+-)
2(+-)
Примечания:
(-) - не заболели;
(+) - заболели;
(+-) - вначале незначительное угнетение, затем самопроизвольное выздоровление.
Изучение длительности поствакцинального иммунитета показало, что мыши, привитые 1 вариантом вакцины, уже через 3 мес после повторной вакцинации в результате экспериментального заражения проявляют клиническую картину кандидоза (табл.1).
Как видно из таблицы 1, мыши, привитые 2, 3, 4 и 5 вариантами вакцины, спустя 1 и 3 мес после иммунизации не реагировали на экспериментальное заражение. Однако через 6 мес после иммунизации в каждой группе заболевало кандидозом около 15% экспериментально зараженных животных. При этом наименее иммуногенным оказался 2 вариант вакцины, а наиболее иимуногенными - 3 и 5. Поскольку в 3 варианте вакцины содержание бластоспор грибов меньше, чем в 5, а по профилактической эффективности оба варианта равны, оптимальной для использования мы сочли 3 вариант.
Полученную вакцину (3 вариант) применяли двукратно с интервалом 12-16 дней внутримышечно (в симметричные точки тела) с профилактической и лечебной целями на серебристо-черных лисицах, собаках и кошках в дозах, приведенных в табл.2.
Таблица 2
Рекомендуемые лечебно-профилактические дозы для плотоядных животных в зависимости от их возраста и массы тела
Вид животных
Возраст животных
Живая масса
Объем препарата, см<sup>3</sup>
Лисицы
с 30 до 45 сут
-
0,3-0,7
старше 45 сут
-
0,8-1,2
Собаки
старше 45 сут
до 1 кг
0,3-0,7
от 1 до 35 кг
0,8-1,2
от 35 и более кг
1,3-1,7
Кошки
старше 45 сут
до 1 кг
0,3-0,7
от 1 и более кг
0,8-1,2
Результаты испытаний показали, что вакцина является безвредной и создает напряженный иммунитет длительностью до 6 мес. Наиболее оптимальным для иммунизации серебристо-черных лисиц является возраст от 30 дней, собак и кошек - старше 45 дней. Профилактический эффект через 3 мес после ревакцинации составил 100%, через 6 мес - 86,7% (90% у собак и кошек, 80% у лисиц) и через 9 мес - 56,7% (50% у собак, 60% у кошек и лисиц). Терапевтический эффект составил 100%. Терапевтический эффект от иммунизации начинал проявляться спустя 2-5 сут после первого введения вакцины, а через 3-5 сут после повторного применения препарата наступало полное выздоровление.
Предложенная вакцина апробирована нами в 2008-2010 гг. в лабораторных (лаборатория микологии и антибиотиков им. А.Х.Саркисова ВИЭВ) и практических (ООО «Агрофирма Прозоровская» Калининградской области, ООО «Валента» г.Владимир, ОАО «Племенной зверосовхоз Салтыковский» Московской обл.) условиях с положительными результатами на поголовье 142 серебристо-черных лисиц, 169 собак, 174 кошек, 40 белых мышей.
Вакцина найдет применение в зверохозяйствах, частном секторе, клубах собако- и фелиноводства, цирках, зоопарках, питомниках в качестве эффективного профилактического и терапевтического средства против кандидозов плотоядных животных.
Просим назвать вакцину КАНДИДЕРМ-К согласно утвержденной документации.
Источники информации
1. Автореф. дис.…канд. биол. наук: 03.00.07 / А.М.Шарафутдинов; Ульян, гос. с.-х. акад. - Ульяновск, 2001. - С.6-7. - Технология получения протективного антигена гриба С. albicans и возможность его практического применения.
2. Автореф. дис.…д-ра ветеринар. наук: 16.00.03 / В.А.Агольцов; Нижегор. гос. с.-х. акад. - Нижний Новгород, 2006. - С.30-31, 42. - Кандидоз, аспергиллез и мукороз животных (диагностика и меры борьбы).