Активность пролиферации и апоптоза иммунокомпетентных клеток при злокачественных опухолях эпителиального происхождения

УДК 612.014:576.36:576.353.4:616-006.6

АКТИВНОСТЬ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК при злокачественных опухолях эпителиального происхождения

© 2010 г. В. П. Репина, О. А. Ставинская, Л. К. Добродеева

Институт физиологии природных адаптаций УрО РАН, г. Архангельск

В работе изучались реакции пролиферации и апоптоза лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов при злокачественных опухолях эпителиального происхождения у жителей Севера. Проанализированы факторы, влияющие на активность течения данного патологического процесса. Установлено, что для больных со злокачественными опухолями эпителиального происхождения, по сравнению с практически здоровыми лицами, характерно усиление пролиферации и апоптоза изучаемых клеток, при этом отмечается увеличение популяции молодых, мало дифференцированных клеток и клеток с низким уровнем метаболической активности. Развитие новообразований сопровождается увеличением уровня провос-палительных цитокинов TNF-a и К-1, уровни которых повышены соответственно у (50,72 ± 1,03) % и (64,71 ± 1,75) % обследованных лиц. Таким образом, при злокачественных новообразованиях выявляющиеся диспропорции пролиферации и апоптоза иммунокомпетентных клеток могут быть причиной неблагоприятного течения заболевания, сопровождающегося инфекционными осложнениями.

Ключевые слова: пролиферация, апоптоз, опухоль, лимфоцит, моноцит, нейтрофил, цитокин.

Иммунная система и многочисленные внутриклеточные системы репарации выполняют функцию элиминации трансформированных и опухолевых клеток, поддерживая оптимальный баланс клеточных популяций. Опухолевые клетки способны экспрессировать специфические белки — онкомаркеры. Многие антигены широко распространены в нормальных тканях, но экспрессированы в минимальных количествах, что недостаточно для индукции иммунного ответа. В противоположность этому на опухолевых клетках отмечается гиперэкспрессия онкомаркеров. При раке простаты, надпочечника, легких повышается уровень простатспецифических антигенов (PSA/PSMA) [10]. HER-2/neu обнаруживается при раке легких, яичников, молочной железы, простаты и толстой кишки [12]. Муцин (MUC1) ассоциируется с раком молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы [11]. Онкофетальные антигены, присутствующие на ранних стадиях развития эмбриона, у взрослых могут появляться при некоторых опухолях. К ним относится раково-эмбриональный антиген (CEA), обнаруживаемый в норме в пищеварительном тракте, поджелудочной железе, печени и бронхах на 2—6-й неделе гистогенеза, он определяется при раке толстой кишки, легких, молочной железы, матки, желудка. Альфа-фетопротеин (AFP), вырабатываемый желточным мешочком и печенью плода, в небольших концентрациях может присутствовать в сыворотке крови взрослых. Повышенные концентрации AFP наблюдаются при раке печени, метастазах злокачественных опухолей в печень, раке желудка и бронхиальных опухолях [13]. Использование различных методов иммунотерапии онкологических заболеваний предполагает также индукцию и активизацию как естественных киллеров, так и антигенспецифических цитотоксических лимфоцитов, индуцирующих гибель опухолевых клеток по механизму Fas-зависимого апоптоза или с использованием перфорин-гранзимового комплекса. Установлено, что уровень повреждения лимфоцитов при инкубации с меланомными опухолевыми клетками-мишенями достигает наиболее высоких (до 70 %) значений при низком соотношении мишень-эффектор. В то же время уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов составляет около 8 % [8]. Таким образом, при неспецифическом и анти-генспецифическом взаимодействии опухолевых клеток с лимфоцитами опухолевые клетки индуцируют апоптоз лимфоцитов [4].

У больных с эпителиальными опухолями кожи наблюдается активизация процессов апоптоза, в развитии которого задействованы TNF-a и IFN-y как факторы регуляции противоопухолевого иммунного ответа. Ослаблению противоопухолевого иммунитета у больных этой группы способствует и резкое снижение уровня естественной цитотоксичности, что требует поиска средств, обеспечивающих торможение проапопто-тической активности зрелых Т-лимфоцитов [8].

В отличие от больных базалиомами с опухолевоассоциированным иммунодефицитом у пациентов с опухолевоассоциированным аутоиммунным синдромом, имеющих минимальные отклонения в показателях апоптоза, уровни естественной цитотоксичности и сывороточной продукции TNF-a и №N-7 сохранялись в норме. У больных базалиомами с опухолевоассоциированным иммунодефицитом индексы апоптоза значительно выше нормы, что отличает этих больных от пациентов с опухолевоассоциированным аутоиммунным синдромом. Такое различие связано с высоким уровнем апоптотической активности Т-клеток у больных с иммунодефицитом, у которых механизмы Fаs-опосредованного апоптоза могут играть существенную роль в канцерогенезе. Однако некоторые опухолевые клетки, например гемобластов, меланомы, карциномы и пр., достаточно резистентны к Fas-зависимому апоптозу и стабильно экспрессируют FasL, что частично объясняет механизм подавления противоопухолевого иммунитета [1].

Таким образом, физиологическая значимость процессов пролиферации и апоптоза и возможность их целенаправленной регуляции при различных опухолях вызывают повышенный интерес исследователей. Особо актуально изучение патологических изменений в функционировании клеток микроокружения и продукции цитокинов, которые ответственны за регуляцию программируемой клеточной гибели и пролиферации при онкологических заболеваниях.

Вследствие вышесказанного целью работы явилось выявление особенностей пролиферации и апоптоза при злокачественных опухолях эпителиального происхождения у жителей Севера.

Методы

Проведено обследование 70 человек со злокачественными опухолями эпителиального происхождения в возрасте от 25 до 60 лет, родившихся и проживающих на территории Архангельской области. В качестве группы сравнения обследованы 95 практически здоровых людей. Забор крови производился в утренние часы натощак. В мазках крови, окрашенных по Романовскому — Гимзе, определяли моноцитограмму, лимфоцитограмму и нейтрофилограмму по О. П. Гри-горовой, 1958. Для характеристики апоптоза моноцитов подсчитывали процент полиморфно-ядерных клеток, лимфоцитов — процент крупных клеток, нейтрофилов — процент клеток с пятью и более сегментами. Пролиферацию лимфоцитов выявляли, учитывая процент малых и средних лимфоцитов, моноцитов — процент промоноцитов и моноцитов. Функциональную активность Т- и В-лимфоцитов изучали в реакции бластной трансформации (РБТЛ) с конка-навалином А и фитогемагглютинином. Определение концентрации цитокинов ^-1, TNF-a в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуно-ферментного анализа (<^егатип Diаgnosticа», Германия). Реакцию оценивали с помощью фотометра «Ми1^кап MS» («Labsystems», Финляндия) при

длине волны 450 нм. Содержание фенотипов лимфоцитов определяли методом двойной пероксидазной метки с использованием моноклональных антител (НПЦ «МедБиоСпектр», Россия). Результаты исследования обработаны с использованием пакета прикладных программ «SPSS 11.5» (США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность — жители Архангельской области. Проведено определение границ нормального распределения количественных показателей при помощи критерия Шапиро — Уилка. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического ^критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия Уилкоксона. Корреляционный анализ параметров проведен с учетом ранговой корреляции Спирмена с определением коэффициента корреляции (г) и оценки его достоверности. Статистическая достоверность присваивалась при значении р < 0,05 [7].

Результаты исследования и их обсуждение

Для иммунного статуса обследованных лиц характерно снижение общего содержания лимфоцитов (1,83 ± 0,12)х 109 кл/л по сравнению с уровнем их концентрации у практически здоровых людей (3,99 ± 0,26)х109 кл/л; р = 0,01. В лимфоцитограмме при злокачественных новообразованиях выявляются признаки более выраженной лимфопролиферации с увеличением содержания больших лимфоцитов до (26,06 ± 1,34) % против (15,32 ± 0,56) % (рис. 1). При изучении функциональной активности лимфоидных клеток установлено снижение интенсивности ответа в РБТЛ на воздействие как конканавали-на А, так и фитогемагглютинина, соответственно (58,87 ± 1,39) и (36,92 ± 0,89) %. Это свидетельствует о снижении резервных возможностей активизации Т- и В-лимфоцитов на антигены опухоли.

Малые лимфоциты Средние лимфоциты Большие лимфоциты

Клетки

Рис. 1 Лимфоцитограмма, %

Примечания:  — группа больных со злокачественными новообразованиями;  — группа практически здоровых людей; ** — р < 0,001; * - р < 0,01.

Содержание моноцитов в периферической крови у больных по сравнению с таковым у здоровых практически не отличалось: (0,39 ± 2,28) и (0,34 ± 0,03)х109 кл/л соответственно. Однако в составе моноцитограммы при новообразованиях вы-

явлена выраженная пролиферация с (35,32 ± 1,48) до (55,64 ± 1,79) %; р < 0,01, со снижением уровня функционально активных моноцитов и повышением содержания промоноцитов с (11,54 ± 0,67) до (55,36 ± 1,52) % (рис. 2). Подобная закономерность выявлена у 98,57 % обследованных больных.

Содержание, %

55^6 ** 53,14

35,32

20,43 24Т *

11,54

Промоноциты Моноциты Полиморфноядерные

Клетки

Рис. 2 Моноцитограмма, %

Примечания:  — группа больных со злокачественными новообразованиями;  — группа практически здоровых людей; ** - р < 0,01.

Изменения пролиферативного характера касаются и сегментно-ядерных нейтрофилов: регистрируется сдвиг влево с повышением содержания палочкоядерных нейтрофилов с (1,38 ± 0,28) до (4,56 ± 0,63) %.

Представляло интерес сравнительное изучение уровня содержания в плазме митогена РЭА и активности пролиферативных процессов. Концентрации РЭА, превышающие норму, у больных регистрировали в (18,57 ± 0,61) % случаев. Были установлены взаимосвязи между концентрацией РЭА и содержанием СШ0+ (г = 0,27), при этом между концентрацией РЭА и уровнем моноцитов и промоноцитов в составе моноцитограммы данные взаимосвязи отсутствовали.

Сравнивая активность реакций пролиферации и апоптоза со стороны лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов при злокачественных новообразованиях установлено, что уровни апоптоза лимфоцитов по содержанию CD95+ в группе больных и здоровых статистически не различались: (0,45 ± 0,02) и (0,44 ± 0,12) х109 кл/л. Однако частота выявления апоптоза лимфоцитов и клеток с фрагментарными ядрами также была значительно выше у больных, соответственно (24,59 ± 1,32) и (12,79 ± 0,84) % и (8,24 ± 0,53) и (4,66 ± 0,87) %; р < 0,001. В абсолютном содержании апоптозу подвергаются (0,45 ± 0,04) х109 лимфоцитов/л, у здоровых количество гибнущих клеток составляет (0,51 ±

0,05) х109 кл/л. Концентрации моноцитов, подвергающихся программируемой гибели, у больных были в 2 раза выше, соответственно (0,09 ± 0,01) и (0,04 ± 0,012) х109 кл/л; р < 0,01 (рис. 3). Частота регистрации апоптоза нейтрофильных лейкоцитов у больных и здоровых была невысокой, соответственно (4,36 ± 0,41) и (3,28 ± 0,37) %, статистически значимых различий относительных и абсолютных величин установить не удалось.

Цитокиновый профиль обследуемых больных характеризуется повышенными концентрациями провоспалителных цитокинов: 1Ь-1 — (122,55 ± 20,51) пг/мл; Т№-а — (90,86 ± 13,41) пг/мл. TNF-а обладает способностью индуцировать апоптоз, участвует в реализации цитотоксического действия NK- и ЛАК-клеток, среди продуктов которых он обнаружен [3]. Наиболее высоких значений TNF-a достигает у (50,72 ± 1,03) % обследуемых лиц. Реактивная лимфопролиферация, по всей вероятности, индуцируется 1Ь-1, содержание которого повышено у (64,71 ± 1,75) % больных.

Содержание, хЮ кл/л

Рис. 3. Апоптоз иммунокомпетентных клеток

Примечания: 0 — группа больных со злокачественными новообразованиями;  — группа практически здоровых людей; ** - р < 0,01.

Итак, при злокачественных опухолях эпителиального происхождения наблюдается усиление процессов пролиферации и апоптоза лимфоцитов, моноцитов и нейтрофильных гранулоцитов периферической крови. Сопряженность активизации пролиферативных реакций и апоптоза является механизмом регуляции иммунного гомеостаза и необходима для восстановления исходного уровня и сохранения достаточного количества функционально активных иммунокомпетентных клеток. Однако при опухолевом процессе это происходит за счет снижения уровня функционально активных лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов. В этих условиях увеличивается популяция молодых, мало дифференцированных клеток и клеток с низким уровнем метаболической активности.

При взаимодействии клеток иммунной системы с клетками, подверженными злокачественной трансформации, основную роль играют лимфоциты и макрофаги. Ассоциированный с опухолью трансплантационный иммунитет можно переносить с помощью лимфоцитов на интактных реципиентов [14, 15]. Макрофаги выполняют одну из важных функций в противоопухолевом иммунитете в антителозависимой цитотоксичности опухолевых клеток и путем выработки противоопухолевых TNF-a и которые блокируют пролиферацию опухолевых клеток, вызывая их лизис и активируя эффекторные цитотоксические клетки [16]. Т-лимфоциты обеспечивают клеточно опосредованную цитотоксичность

опухолевых клеток [6], а моноциты, инфильтрируя опухоль, способствуют её разрушению, спонтанному рассасыванию и препятствуют метастазированию [2, 5]. Поэтому можно считать, что диспропорция пролиферации и апоптоза иммунокомпетентных клеток при злокачественных новообразованиях может быть причиной неблагоприятного течения заболевания. Что касается соотношения пролиферации и апоптоза ней-трофильных гранулоцитов, то снижение количества функционально активных фагоцитов опасно с позиции инфекционных осложнений. При иммунодефицитных состояниях, сопровождающих злокачественные новообразования, наблюдается торможение миграции стволовых клеток и истощение способности костного мозга продуцировать достаточное количество грану-лоцитов [12].

Список литературы

1. Алентьева С. Ю. Новые подходы к иммунофармакотерапии базалиом различных иммунологических фенотипов / С. Ю Алентьева, А. Е. Дорофеев, Е. С. Снарская и др. // Аллергология и иммунология. — 2004. — Т. 5, № 3.

— С. 510.

2. Зенков Н. К. Механизмы активации макрофагов / Н. К. Зенков, Е. Б. Меньшикова, В. А. Шкурупий // Успехи современной биологии. — 2007. — Т. 127, № 3.

— С. 243—255.

3. Князькин И. В. Биология апоптоза / И. В. Князькин,

B. Н. Цыган // Апоптоз в онкоурологии. Гл. 1. — СПб. : Наука, 2007. — С. 15—45.

4. Кондрашева И. Г. Индукция апоптоза лимфоцитов человека при их взаимодействии с опухолевыми клетками in vitro / И. Г. Кондрашева, А. В. Хомякова, Е. Ю. Москалева // Аллергология и иммунология. — 2004.

— Т. 5, № 1. — С. 35.

5. Луговская С. А. Структура и функции моноцитов и макрофагов / С. А. Луговская // Клиническая лабораторная диагностика. — 1997. — № 9. — С. 10—15.

6. Райхлин Н. Т. Регуляция и проявление апоптоза в физиологических условиях и в опухолях / Н. Т Райхлин, А. Н. Райхлин // Вопросы онкологии. — 2002. — № 48. —

C. 159—171.

7. Сергиенко В. И. Математическая статистика в клинических исследованиях / В. И. Сергиенко, И. Б. Бондарева. — 2-е изд., перераб. и доп. — М. : ГЭОТАР-Медиа, 2006. — 304 с.

8. Снарская Е. С. Механизмы апоптоза лимфоцитов у больных с базально-клеточным и метатипическим раком кожи и его возможная роль в патогенезе и диагностике // Е. С. Снарская, Ю. Е. Зубова, О. А. Пронина // Аллергология и иммунология. — 2004. — Т. 5, № 1. — С. 105.

9. Boon T. Human tumor antigens recognized by T-lymphocytes // T. Boon, V. D. Briggen // J. Exp. Med.

— 1996. — Vol. 183, N 3. — Р 725—729.

10. ButterfieldL. H. Generation of Human T-cell Responses to an HLA-A2.l-restricted Peptide Epitope Derived from -Fetoprotein // L. H. Butterfield, A. Koh, W Meng, et al. // Cancer Res. — 1999. — Vol. 59. — Р 3134 — 3142.

11. Field E. J. Lymphocyte sensitization: An in vitro test for cancer // E. J. Field, E. A. Caspary // Lancet. - 1970.

- Vol. 2. - Р 1337-1341.

12. Haas R. I. Congenital immunodeficiency and agranulocitosis // R. I. Haas, D. Niethammer, S. F. Goldman // Acta Paediat. Scand. - 1977. - Vol. 49. - Р 279-283.

13. Houghton A. N. Cancer antigens: immune recognition of self and altered self // A. N. Houghton // J. Exp. Med.

- 1994. - Vol. 180. - Р 1-4.

14. Kawashima I. Identification of HLA-A3-restricted Cytotoxic T Lymphocyte Epitopes from Carcinoembryonic Antigen and HER-2/neu by Primary in Vitro Immunization with Peptide-pulsed Dendritic Cells // I. Kawashima, V Tsai,

S. Southwood, et al. // Cancer Res. - 1999. - Vol. 59. -Р 431-435.

15. Riech K. Cell immunity in mammary cancer Patients as measured by the leucocyte migration test // K. Riech, A. Arndit, G. Pasternak // J. Cancer. - 1976. - Vol. 17. -Р 212-218.

16. Roseberg St. Lymphokine-activated killer cells: A new approach to immunotherapy of cancer // St. Roseberg // J. Nat.Cancer Inst. - 1985. - Vol. 75. - Р 595-612.

ACTIVITY OF PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF IMMUNOCOMPETENT CELLS AT MALIGNANT TUMOURS OF EPITHELIAL ORIGIN

V. P. Repina, O. A. Stavinskaja, L. K. Dobrodeeva

Institute of Environmental Physiology, Ural Branch, Russian Academy of Science, Arkhngelsk, Russia.

In work were studied reactions of proliferation and apoptosis of lymphocytes, monocytes, neutrophils at malignant tumours epithelial origins at inhabitants of the North. The factors influencing activity of current of given pathological process are analysed. It is established, that for patients with malignant tumours epithelial origins, in comparison with practically healthy persons, strengthening of proliferation and apoptosis studied cells is characteristic, thus the increase in a population young, few the differentiated cells and cells with a low level of metabolic activity is marked. Development of new growths is accompanied by increase in a level proinflammatory cytokines TNF-a and IL-1, which levels are raised accordingly at (50,72 ± 1,03) and (64,71 ± 1,75) % of the examined persons. Thus, at the malignant new growths, coming to light disproportions of proliferation and apoptosis immunocompetent cells can cause adverse clinical course, accompanied by infectious complications.

key words: proliferation, apoptosis, a tumour, lymphocyte, monocyte, neutrophil, cytocine.

Контактная информация:

Репина Вероника Павловна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Института физиологии природных адаптаций Уральского отделения РАН

Адрес: 163061, г. Архангельск, пр. Ломоносова, д. 249

Тел./факс (8182) 21-04-58

E-mail: repina-veronika@yandex.ru

Огатья поступила 31.03.2009 г.