СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ ПО КОНЦЕНТРАЦИИ ХОЛЕСТЕРИНА В СЕМЕННОЙ ПЛАЗМЕ
METHOD FOR ASSESSING THE QUALITY OF CRYOPRESERVED STALLION SPERM BY CHOLESTEROL CONCENTRATION IN SEMINAL PLASMA

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к области животноводства, в частности к коневодству и может быть использовано для отбора жеребцов с высоким качеством криоконсервированной спермы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Холестерин относится к липидам, он циркулирует в крови и используется в качестве строительного компонента для всех клеток организма (Багорова, Н.В. Холестерин и его влияние на организм / Н.В. Багорова // Инновационная наука. - 2017. - №2. - С.209-210.). Известно, что это вещество является важным компонентом клеточных биомембран и, выполняя структурную и функциональную роль, оно влияет на клеточное деление, активность белковых рецепторов плазматических мембран и мембрансвязанных ферментов, стабильность сывороточных липопротеидов и транспортных структур желчи (Тюрюмин, Я.Л. Физиология обмена холестерина / Я.Л. Тюрюмин, В.А. Шантуров, Е.Э. Тюрюмина // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - Т. 84, №2. - С.153-158.). Холестерин также является одним из факторов стабильности мембран сперматозоидов, способствующим их сохранности и адекватной подвижности (Гусякова, О.А. Метаболические характеристики спермальной плазмы с различным числом сперматозоидов / О.А. Гусякова, В.М. Радомская, С.И. Мурский, А.И. Габрильчак, Г.В. Тукманов // Лабораторная служба. - 2008. - Т. 7, №1. - С. 15-19.).
Ближайшим аналогом (прототипом) заявляемого способа является способ оценки качества спермы жеребцов по активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови (Заявка №2021128712/14(060850), МПК G01N 33/49, A61D 99/00 (2006.01); заявл. 30.09.2021; Способ оценки качества спермы жеребцов по активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови / М.М. Атрощенко, А.И. Синякина, A.M. Зайцев, В.В. Калашников, А.А. Незаленова, А.А. Дацышин, М.Г. Енгалычева, A.M. Шитикова, О.В. Широкова; заявитель ФГБ-НУ "ВНИИ коневодства".), в котором в качестве критерия для оценки качества спермы используют уровень активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови. При уровне активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови выше 178 МЕ/л жеребца относят к группе с высоким качеством спермы, а при уровне активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови ниже 178 МЕ/л, соответственно, к группе с низким качеством спермы.
Недостатком этого способа является то, что он не дает возможности оценить качество криоконсервированной спермы жеребцов.
Мы поставили задачу изучить влияние концентрации холестерина в семенной плазме на качество криоконсервированной спермы жеребцов, оценив количественно значение предельно допустимой концентрации (ПДК) холестерина в ней. А затем выяснить, какая связь существует между концентрацией холестерина в семенной плазме и качеством криоконсервированной спермы.
Предлагаемый нами способ оценки качества криоконсервированной спермы жеребцов по концентрации холестерина в семенной плазме позволит это сделать, не прибегая к процедуре криоконсервации и последующему оттаиванию спермы, а также избежать проведения световой микроскопии для оценки морфологических показателей эякулята.
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Образцы спермы, предназначенной для исследования (n равно 32), получают используя известную методику (Науменкова, В.А. Рекомендации по взятию, разбавлению и замораживанию спермы жеребцов / В.А. Науменкова. - Дивово: «Изд-во ВНИИ коневодства», 2006. - 23 с. Далее - Рекомендации). После этого, каждый эякулят оценивают по следующим показателям: объем эякулята, концентрация сперматозоидов.
Затем одну часть эякулята подвергают процедуре криоконсервации - оттаивания, после чего оценивают выживаемость сперматозоидов при Т 2-4°С и определяют количество морфологически нормальных сперматозоидов в сперме, подвергшейся криоконсервации.
Для получения спермоплазмы другую часть эякулята сразу же после получения спермы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин с помощью центрифуги ELMI СМ-6М (SIA ELMI, Латвия). После световой микроскопии супернатанта, аликвоты семенной плазмы, свободные от сперматозоидов, замораживают при температуре -18°С до проведения исследований.
Определение концентрации холестерина в семенной плазме проводят на биохимическом анализаторе AU 680 (Beckman Coulter, США). Используя полученные результаты и известные рекомендации (Назаренко, Г.И. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований / Г.И. Назаренко, А.А. Кишкун. - М.: Медицина, 2002. - 544 с.), рассчитывают ПДК холестерина в семенной плазме жеребцов в границах 50 процентиля репрезентативной выборки. Оказалось, что ПДК холестерина в семенной плазме жеребцов равна 0,18 ммоль/л.
Затем животных распределяют по группам. В первую группу попали жеребцы со значением концентрации холестерина в семенной плазме больше 0,18 ммоль/л, во вторую группу, соответственно, меньше 0,18 ммоль/л.
Как видно из полученных данных, жеребцы с концентрацией холестерина в семенной плазме меньше 0,18 ммоль/л превосходили по количеству морфологически нормальных сперматозоидов в криоконсервированной сперме на 19,22% аналогов из группы с большим значением данного показателя (Р не больше 0,01).
Известно, что в сперме жеребцов после криоконсервации - оттаивания, морфологически нормальных сперматозоидов должно быть не менее 80% (Рекомендации). В этом случае сперма считается качественной, т.е. пригодной для искусственного осеменения. Следовательно, криоконсервированную сперму, в которой количество морфологически нормальных сперматозоидов после оттаивания равно этому значению или бюлыпе, можно смело относить к группе с высоким уровнем качества.
На основании результатов нашего эксперимента можно сделать следующее заключение - при значениях концентрации холестерина в семенной плазме меньше 0,18 ммоль/л, отмечается высокий уровень морфологически нормальных сперматозоидов в криоконсервированной сперме.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Применимость предлагаемого способа была проверена в условиях Терского племенного конного завода №169 Ставропольского края.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Производят отбор образцов спермы жеребцов и оценивают каждый по следующим показателям: объем эякулята, концентрация сперматозоидов.
Затем получают спермоплазму. Для этого часть эякулята, полученного от каждого жеребца, сразу же после отбора образцов спермы, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут с помощью центрифуги ELMI СМ-6М (SIA ELMI, Латвия). Проводят световую микроскопию супернатанта, чтобы убедиться в отсутствии сперматозоидов.
Полученные аликвоты семенной плазмы оценивают по концентрации холестерина на биохимическом анализаторе AU 680 (Beckman Coulter, США).
Одновременно, для контроля, оценивают выживаемость сперматозоидов при Т 2-4°С и определяют количество морфологически нормальных сперматозоидов в криоконсервированной сперме, предварительно подвергнув другую часть каждого эякулята процедуре криоконсервации - оттаивания.
Вывод: при концентрации холестерина в семенной плазме меньше 0,18 ммоль/л жеребца относят к группе с высоким качеством криоконсервированной спермы, а при концентрации холестерина в семенной плазме больше 0,18 ммоль/л, соответственно, к группе с низкой.
Таким образом, при практическом использовании предлагаемого способа, для определения качества криоконсервированной спермы жеребцов, не нужно оценивать выживаемость сперматозоидов при Т 2-4°С и знать количество морфологически нормальных сперматозоидов в ней, а достаточно определить уровень концентрации холестерина в семенной плазме.