Анализ условий культивирования клеток В-клеточного хронического лимфолейкоза

Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 3

© РА. САРИБЕКЯН, И.А. ВОРОБЬЕВ, 2013 УДК 616.155.392.2-036.12-018.1-07

АНАЛИЗ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК В-КЛЕТОЧНОГО ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА

Р.А. Сарибекян1, И.А. Воробьев2, 3

'Научно-клиническое отделение криоконсервирования и биологии стволовых клеток ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, Москва; 2НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия; "Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

Резюме. При культивировании клеток В-клеточного хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) in vitro в большинстве работ наблюдался высокий уровень спонтанного апоптоза, что сильно затрудняет исследования данного заболевания в моделях ex vivo. Целью настоящей работы являлся поиск оптимальной среды для культивирования клеток В-ХЛЛ. В качестве фидерного слоя использовали предварительно подготовленную культуру стромальных клеток костного мозга больных В-ХЛЛ. При кокультивировании со стромальными клетками уровень спонтанного апоптоза клеток В-ХЛЛ был в 2—3 раза ниже, чем при использовании как стандартной среды RPMI-1640 с добавлением сыворотки, так и бессывороточной среды Hybridoma SFM, предназначенной для культивирования лимфоцитов. Таким образом, минимальный уровень спонтанного апоптоза клеток В-хЛл обеспечивает методика их кокультивирования с клетками стромы, получаемыми из костного мозга, в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки.

Ключевые слова: В-клеточный хронический лимфолейкоз, апоптоз, культивирование лимфоцитов

ANALYSIS OF B-CELL CHRONIC LYMPHOID LEUKEMIA CELL CULTURING CONDITIONS

R.A. Saribekyan’, I.A. Vorobyov2,1

’Hematology Research Center, Moscow, Russia; 2A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia;3Biological Faculty, M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia

Summary. High level of spontaneous apoptosis during in vitro culturing of B-cell chronic lymphoid leukemia (B-CLL) cells in the majority of studies seriously impedes ex vivo studies of this disease. We tried to find the optimal medium for B-CLL cell culturing. Bone marrow stromal cell culture derived from B-CLL patients was prepared to serve as the feeder layer. The level of spontaneous apoptosis of B-CLL cells in coculturing with stromal cells was 2-3-fold lower than in culturing in RPMl-1640 with the serum (standard medium) or in serum-free Hybridoma SFM, intended for lymphocyte culturing. Hence, the minimum level of B-CLL cell apoptosis was attained by these cells coculturing with bone marrow stromal cells in RPMI-1640 with 10% serum.

Key words: B-cell chronic lymphoid leukemia, apoptosis, lymphocyte culturing

В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) является самой распространенной формой лимфом — около 40% от всех диагностируемых случаев. Болезнь характеризуется медленным прогрессирующим накоплением CD5CD23+ опухолевых В-лимфоцитов, находящихся в Gg-фазе клеточного цикла. В связи с тем что уровень пролиферации клеток В-ХЛЛ достаточно низкий, а продолжительность их жизни в организме очень велика, можно предположить, что в накоплении опухолевых лимфоцитов большую роль играют дефекты апоптоза [1—5]. Однако при культивировании клеток В-ХЛЛ in vitro, напротив, наблюдается высокий уровень спонтанного апоптоза [6—8]. Это сильно затрудняет поиск и испытание химиотерапевтических средств в моделях ex vivo. Исследование факторов, которые могли бы поддержать жизнеспособность клеток В-ХЛЛ in vitro, может помочь в поиске механизмов, обеспечивающих их выживание в организме. Показано, что интерлейкин-4 (ИЛ-4), интерферон у (ИФНу) и другие факторы (фактор некроза опухоли a, CD40L) могут только частично препятствовать спонтанному апоптозу клеток В-ХЛЛ [9—11]. Ранние стадии В-ХЛЛ характеризуются инфильтрацией опухолевых клеток в костный мозг.

Для корреспонденции:

Сарибекян Рубен Альбертович, аспирант ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России.

Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4а.

E-mail: diezzz@bk.ru

Прямой контакт между костномозговыми клетками и лимфоцитами В-ХЛЛ через Р;- и Р2-интегрины увеличивает жизнеспособность опухолевых клеток, что способствует прогрессии заболевания [12—15]. Кроме того, в исследованиях in vitro было показано, что CD100, найденный на клетках В-ХЛЛ, и его высокоаффинный рецептор Plexin-B1 (который экспрессируется стромой костного мозга) могут увеличить жизнеспособность и пролиферативную активность опухолевых лимфоцитов В-ХЛЛ [14]. По данным других исследований, взаимодействия между клетками В-ХЛЛ и стромальными и эндотелиальными клетками, опосредованные CD38/CD31 и CD49d/VCAM-1 (vascular-cell adhesion molecule), способствуют их выживанию [16, 17]. Показано, что BCR-рецепторы, имеющие структуру, часто встречающуюся у лимфоцитов В-ХЛЛ, могут распознавать виментин из экстрактов из линии мышиных стромальных клеток [18]. Кроме того, другой характерный для В-ХЛЛ-клеток тип BCR-рецепторов узнает тяжелую цепь немышечного миозина [19]. На основе этих фактов можно предположить, что стромальные клетки могут служить источником антигенов, стимулирующих BCR-рецепторы опухолевых лимфоцитов ХЛЛ. Так как подобные межклеточные взаимодействия предотвращают апоптоз клеток В-ХЛЛ, они могут рассматриваться как преимущественный механизм для накопления и выживания опухолевых лимфоцитов в костном мозге in vivo. Эти факты по-

32

Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 3

Рис. 1. Варианты культивирования клеток В-ХЛЛ.

зволили предположить, что для выживания клеток В-ХЛЛ необходимо клеточное микроокружение. В ряде работ показано, что кокультивирование клеток В-ХЛЛ с I клетками стромы, выделенными из костного мозга, в несколько раз снижает процент их спонтанного апоптоза [7, 20]. Тем не менее исследования жизнеспособности В-ХЛЛ клеток в условиях in vitro, как с ис- ц пользованием различных известных сред, так и с применением стромальных клеток, остаются актуальными, так как публикации по этой проблеме сравнительно малочисленны и основаны на небольших сериях наблюдений. Ill

Цель работы — поиск оптимальных условий для культивирования В-клеток ХЛЛ.

Материалы и методы

В данной работе исследовали клетки, выделенные у 70 больных В-ХЛЛ (44 мужчин и 26 женщин) в возрасте от 39 лет до 81 года (средний возраст 58,2 года). Из них у 39 больных клетки были получены из образцов периферической крови, у 12 — из биоптатов селезенки или лимфатических узлов, у 19 — из биоптата костного мозга. Все больные проходили диагностические процедуры в Гематологическом научном центре Минздрава России. До забора данного материала никто из больных не получал какого-либо лечения В-ХЛЛ.

Периферические мононуклеары (ПМК) выделяли из крови больных, у которых лейкоцитоз был выше 10 000 • 109/л, с использованием градиента фиколла ("Sigma-Aldrich"). Соотношение объемов кровь/фиколл составляло 3:5. Образцы крови центрифугировали при 1250 g и 25оС в течение 20 мин. Затем декантировали супернатант (содержащий плазму и тромбоциты), кольцо мононуклеа-ров снимали и ресуспендировали в растворе Хенкса ("Па-нэко"), после чего центрифугировали 4 мин при 400 g. После центрифугирования декантировали супернатант, полученные клетки ресуспендировали и культивировали в термостате при 5% CO2 и 37оС. Концентрация клеток в средах для культивирования составляла 106 в 1 мл. На первых этапах работы проводили подсчет уровня апоптоза среди периферических мононуклеаров в образце крови, взятом у больного до культивирования. В связи с тем что анализ этих образцов показал почти полное отсутствие апоптоза на данном этапе исследования, в дальнейшем этот анализ не проводили. Материал для культивирования, подготовленный из биоптатов селезенки и лимфатических узлов, включал клетки В-ХЛЛ и стромальный компонент. Для получения этого материала биоптат измельчали с помощью автоматической мельницы, полученную суспензию фильтровали через фильтр с размером ячеек 50 мкм и помещали в среду для культивирования. У 7 больных В-ХЛЛ с целью использования стромальных клеток в качестве подложки эти клетки выделяли из биоптата, полученного посредством трепанобиопсии подвздошной кости (антикоагулянт ЭДТА). Пункционный материал центрифугировали с использованием градиента плотности фиколл. Затем декантировали супернатант, кольцо мононуклеаров снимали и ресуспендировали в растворе Хенкса, после чего центрифугировали 4 мин при 400 g. После центрифугирования де-

кантировали супернатант, полученные клетки ресуспенди-ровали и инкубировали в термостате при 5% CO2 и 37оС в течение 24 ч в среде RPMI-1640 ("Панэко") с добавлением 10% сыворотки новорожденных телят NBCS ("Панэко"). Через 24 ч среду вместе со всеми не прикрепившимися клетками удаляли и добавляли новую. Полученные клетки выращивали в течение 20 дней, среду меняли каждые 3—4 дня. К полученной культуре с высоким содержанием стромальных клеток добавляли свежевыделенные ПМК из крови больных В-ХЛЛ. Апоптоз анализировали спустя 1, 2, 3 и 6 сут.

Культивирование клеток В-ХЛЛ осуществляли в трех вариантах (рис. 1). Первый вариант предусматривал использование среды Hybridoma SFM ("Invitrogen") без добавок и с различными добавками: фитогемагглютини-ном — ФГА ("Панэко") в концентрации 0,25 мг/мл, ИЛ-6 ("Invitrogen") в концентрации 100 мкг/мл, альбумином в концентрации 25 мг/мл ("US BioLogical"). При втором варианте использовали среду Hybridoma SFM с добавлением суспензии из лимфатических органов, содержащей клетки В-ХЛЛ и стромальный компонент. Третий вариант предполагал применение среды RPMI-1640 с добавлением сыворотки NBCS и использование подложки из предварительно культивированных стромальных клеток костного мозга. Подсчет процентного содержания апоптотических клеток осуществляли методом проточной цитофлюориме-трии (FACS Calibur, "BD Bioscience"). Анализ процентного содержания в культуре апоптотических лимфоцитов проводили непосредственно после выделения клеток, а также через 24, 48, 72 и 144 ч культивирования. Для маркирования апоптотических клеток использовали Annexin V-FITC ("BD Pharmingen"). Для того чтобы дифференцировать клетки В-ХЛЛ от Т-лимфоцитов, клеток стромы и других клеток, сходных с ними по параметрам светорассеяния, применяли окраску с помощью моноклональных антител к CD 19 PE ("Dako Cytomation"). При подсчете частоты апоптоза учитывали только популяции клеток, положительных по CD19, т.е. В-лимфоциты. Под частотой апоптоза мы подразумевали процентное отношение количества апоптотических клеток к общему количеству клеток в культуре. Для определения пролиферативного индекса использовали антитела к Ki-67 FITC ("Dako Cytomation"). Для фиксации и пермиабилизации клеток использовали растворы Cytofix и Cytoperm ("BD Biosci-

33

Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 3

Клетки CD19+, %

60 т

50-

40-

30-

20-

10-

[j i

г-

Hybridoma SFM+

/ фитогемагглютинин

^ Hybridoma SFM+ интерлейкин-6

Hybridoma SFM ^ Hybridoma SFM+альбумин Суспензии лимфатических

24 ч 48 ч 72 ч Длительность культивирования

Рис. 2. Уровень апоптоза при культивировании ПМК В-ХЛЛ в среде Hybridoma SFM с различными добавками (n = 20).

24 ч Hybridoma и Hybridoma + альбумин (различия статистически значимы — p < 0,01);

24—48—72 ч Hybridoma и суспензии лимфатических органов (различия статистически значимы — p < 0,01);

24—48—72 ч Hybridoma + альбумин и Hybridoma + ФГА (различия статистически значимы — p < 0,01);

48—72 ч Hybridoma + альбумин и суспензии лимфатических органов (различия статистически значимы — p < 0,01).

ence"). Количество регистрируемых событий составляло 30 000 для каждой пробы. Анализ полученной информации проводили с помощью программы CellQuest. Отсечки выставляли по негативным контролям. Там, где сделать это не удавалось, использовали метод сравнения гистограмм. Для определения статистической значимости использовали U-критерий Манна—Уитни.

Результаты и обсуждение

При культивировании изолированных ПМК больных В-ХЛЛ в среде Hybridoma SFM процент апопто-тических клеток, начиная с 24 ч, составляет около 30 и в дальнейшем практически не снижается (рис. 2). Добавление к инкубационной среде ИЛ-6 не снижает уровня апоптоза, тогда как добавление альбумина (25 мг/мл) приводит к существенному снижению, особенно в 1-е сутки (см. рис. 2). Добавление ФГА в среде Hybridoma SFM приводило к повышению уровня апоптоза и не стимулировало пролиферацию клеток. Митотических клеток в культуре не обнаружено при исследовании с помощью фазово-контрастной микроскопии. Также анализ с помощью антител к Ki-67 не выявил пролиферирующих клеток. Однако при добавлении в среду культивирования (ФГА в среде Hybridoma SFM) 20% сыворотки на 3-и сутки выявлено 26% Ki-67-положительных клеток. Однако при этом доля апоптотических клеток оставалась очень высокой и составляла 50,5 ± 13,9% на 1-е сутки, 55,9 ± 16,7% на 2-е сутки и 51,3 ± 15,4% на 3-и сутки. Таким образом, по уровню спонтанного апоптоза наименее благоприятной средой явилась среда Hybridoma SFM с добавлением ФГА независимо от его концентрации, а пролиферацию клеток больных В-ХЛЛ в среде Hybridoma SFM стимулировали с помощью ФГА только в присутствии сыворотки.

При сравнении уровня апоптоза в культурах из суспензий лимфатических органов и в культурах ПМК, выращенных на средах Hybridoma SFM и Hybridoma SFM с добавлением альбумина, оказалось, что уро-

Клетки CD19+, %

Длительность культивирования

Рис. 3. Средний процент апоптотических клеток при культивировании ПМК В-ХЛЛ с использованием и без использования фидерного слоя из стромальных клеток костного мозга (n = 19).

На все сроки RPMI + NBCS со стромальными клетками и RPMI + NBCS (различия статистически значимы — p < 0,01).

вень апоптоза в культурах из суспензий лимфатических органов был ниже уровня апоптоза в культурах из изолированных ПМК в 2 и в 2,5 раза соответственно (см. рис. 2), что, по-видимому, обусловлено присутствием в культуре стромальных клеток. Для проверки этого предположения были проведены эксперименты по культивированию изолированных ПМК В-ХЛЛ вместе с предварительно выращенной культурой с высоким содержанием стромальных клеток из неродственного костного мозга (п = 19). Опухолевые лимфоциты от каждого больного культивировали тремя способами: 1) в среде Hybridoma SFM, 2) в среде RPMI-1640 с добавлением 10% NBCS без фидерного слоя, 3) в среде RPMI-1640 с добавлением 10% NBCS на стромальных клетках костного мозга. При совместном культивировании клеток В-ХЛЛ с неродственными стромальными клетками средний уровень апоптоза у них составлял 10,5 ± 3,9% на 1-е сутки, 10,9 ± 4,8% на 2-е сутки, 11,5 ± 5,3% на 3-и сутки и 10,1 ± 3,1% на 6-е сутки. В то же время при культивировании ПМК В-ХЛЛ в той же среде в отсутствие фидерного слоя частота апоптоза составила 20 ± 5,2% на 1-е сутки, 21,7 ± 6,7% на 2-е сутки, 25,7 ± 8,2% на 3-и сутки и возросла до 40,1 ± 10,9% на 6-е сутки. Таким образом, при культивировании изолированных ПМК более 3 сут наблюдается увеличение уровня спонтанного апоптоза во времени, а при использовании фидерного слоя уровень апоптоза остается низким на протяжении всего времени культивирования (рис. 3).

На рис. 4 приведен пример одного из экспериментов по культивированию клеток В-ХЛЛ, полученных из периферической крови больного К., с использованием стромальных клеток костного мозга (рис. 5).

Несмотря на то, что клетки В-ХЛЛ имеют анти-апоптотический фенотип и большую продолжительность жизни in vivo, они быстро подвергаются спонтанному апоптозу при культивировании. Уже спустя 24 ч культивирования в стандартных средах (RPMI-1640 с добавлением сыворотки крупно-

34

Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 3

Рис. 4. Dot-plot с проточного цитофлюориметра, полученный у больного К. на 6-е сутки культивирования в среде RPMI-1640 + 10% NBCS. а — без подложки из стромальных клеток. В верхнем левом квадранте — жизнеспособные В-лимфоциты CD19+AnnexinV (49%); в правом верхнем квадранте — апоп-тотические В-лимфоциты CD19+AnnexinV+ (28%); б — с подложкой стромальных клеток. В верхнем левом квадранте — жизнеспособные В-лимфоциты CD19+AnnexinV (87%); в правом верхнем квадранте — апоптоти-ческие В-лимфоциты CD19+AnnexinV+ (3,5%).

го рогатого скота, бессывороточная среда AIM-V) 25—50% клеток находятся в состоянии апоптоза [6—8]. Наиболее распространенной средой для культивирования мононуклеаров крови является RP-MI-1640 с добавлением сыворотки (10%).

Однако было показано, что в среде Hy-bridoma SFM, специально разработаной для культивирования клеток в отсутствии сыворотки, процент лимфоцитов, подвергающихся спонтанному апоптозу, ниже, чем при использовании стандартной среды RPMI-1640 [21]. Поэтому первая серия проведенных экспериментов представляла собой изучение влияния различных добавок к среде Hybridoma SFM на спонтанный апоптоз клеток В-ХЛЛ. Полученные результаты показали, что добавление альбумина в среду культивирования позволяет снизить долю клеток, подвергшихся апоптозу, на 10%, что соответствует данным литературы [22].

Высказывалось предположение, что ИЛ-6 способен снижать уровень апоптоза культивируемых CD5+-клеток В-ХЛЛ и препятствовать снижению уровня Bcl-2 в культивируемых опухолевых лимфоцитах. После 2 сут культивирования в среде RPMI-1640 с добавлением ИЛ-6 отмечалось снижение процента апоптотических клеток почти в 2 раза [23, 24], однако исходный уровень апоптоза (около 50%) в данных работах был значительно выше, чем в настоящем исследовании. В то же время в условиях, когда уровень спонтанного апоптоза клеток В-ХЛЛ не превышал 20%, присутствие ИЛ-6 в среде RPMI-1640 с 10% сыворотки FCS не оказывало существенного влияния на жизнеспособность культивируемых клеток В-ХЛЛ [25]. Таким образом, мы полагаем, что с помощью ИЛ-6 довести уровень апоптоза культивируемых клеток В-ХЛЛ менее чем до 20—30%, по-видимому, невозможно.

При добавлении ФГА к среде культивирования уровень апоптоза повышался, что соответствует данным литературы [26]. Одним из возможных объяснений этого явления может быть способность ФГА индуцировать клеточную пролиферацию. Следствием этого может быть увеличение количества погибших клеток в результате их неспособности пройти контрольные точки (check points) клеточного цикла. Однако в наших экспериментах в бессывороточной среде пролиферация клеток с помощью ФГА не индуцировалась. Стандартные методики стимуляции лимфоцитов с помощью ФГА предполагают использование среды с добавлением сыворотки [27, 28]. В нашей работе при добавлении к среде Hybridoma SFM сыворотки (20% NBCS) пролиферирующие клетки были обнаружены, что может свидетельствовать о невозможности индуцированного ФГА деления опухолевых лимфоцитов в бессывороточной среде, в отличие от нормальных клеток [29]. Однако ФГА во всех случаях повышает уровень апоптоза опухолевых клеток.

Клетки первичной культуры стромальных клеток костного мозга, так и клеточных линий, полученных из костного мозга, могут предотвращать спонтанный апоптоз клеток В-ХЛЛ [7, 8, 12]. Кокультивирование клеток В-ХЛЛ со стромальными клетками из человеческих и мышиных линий также предохраняет их от апоптоза, индуцированного флударабином и декса-метазоном [30]. Полученные нами данные позволяют

Рис. 5. Клетки фидерного слоя, использованного для культивирования клеток В-ХЛЛ у того же больного. Фазово-контрастная микроскопия (Nikon Eclipse). Ув. 20.

35

Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 3

предположить, что существенное снижение уровня апоптоза (не менее чем в 3 раза на 3-и сутки и примерно в 4—5 раз на 6-е сутки) позволит культивировать клетки от больных В-ХЛЛ продолжительное время.

В работе W. Ding и соавт. [7] лимфоциты В-ХЛЛ кокультивировали со стромальными клетками костного мозга, полученными как от больных В-ХЛЛ, так и от здоровых доноров. При этом различия в количестве апоптотических лимфоцитов при их ко-культивировании со стромальными клетками от здоровых людей и больных В-ХЛЛ, составляли менее 5%. Следует отметить, что процент апоптотических клеток В-ХЛЛ при их кокультивировании со стромальными клетками в данной работе практически совпадает с нашими данными, несмотря на то что мы использовали клетки костного мозга и ПМК В-ХЛЛ, полученные от разных пациентов. Кроме того, в ряде исследований в качестве фидерного слоя применяли клекти не из первичной культуры костного мозга, а из клеточных линий. Так, в работе I. Gehrke и соавт. [8] при использовании фидерного слоя из линии стромальных клеток костного мозга человека HS5 уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов В-ХЛЛ оставался более низким, чем при культивировании изолированных лимфоцитов, в течение всего времени культивирования (5 сут), как и в нашей работе. Однако процент клеток, подвергшихся апоптозу, был в 2 раза выше, чем в наших экспериментах.

Таким образом, оптимальные условия для культивирования клеток В-ХЛЛ in vitro несколько отличаются от условий для нормальных В-клеток. Клетки В-ХЛЛ более чувствительны к наличию фидерного слоя, состоящего преимущественно из мезенхимальных клеток, получаемых при культивировании на подложке клеток костного мозга, и в меньшей степени стимулируются ФГА.

ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]

1. Giordano M. Apoptosis in chronic lymphocytic leukemia. Medicina (B Aires). 2000; 60(Suppl. 2): 12—6.

2. Goolsby C., Paniagua M., Tallman M., Gartenhaus R.B. Bcl-2 regulatory pathway is functional in chronic lymphocytic leukemia. Cytometry B Clin. Cytom. 2005; 63(1): 36—46.

3. Messmer B.T., MessmerD, Allen S.L., Kolitz J.E., KudalkarP., Cesar D., et al. In vivo measurements document the dynamic cellular kinetics of chronic lymphocytic leukemia B cells. J. Clin. Invest. 2005; 115(3): 755—64.

4. Defoiche J., Debacq C., Asquith B., Zhang Y., Burny A., Bron D., et al. Reduction of B cell turnover in chronic lymphocytic leukaemia. Br. J. Haematol. 2008; 143(2): 240—7.

5. van Gent R., Kater A.P., Otto S.A., Jaspers A., Borghans J.A., Vrisekoop N., et al. In vivo dynamics of stable chronic lymphocytic leukemia inversely correlate with somatic hypermutation levels and suggest no major leukemic turnover in bone marrow. Cancer Res. 2008; 68(24): 10137—44.

6. Collins R.J., Verschuer L.A., Harmon B.V, Prentice R.L., Pope J.H., Kerr J.F. Spontaneous programmed death (apoptosis) of B-chronic lymphocytic leukaemia cells following their culture in vitro. Br. J. Haematol. 1989; 71(3): 343—50.

7. Ding W., Nowakowski G.S., Knox T.R., Boysen J.C., Maas M.L., Schwa-ger S.M., et al. Bi-directional activation between mesenchymal stem cells and CLL B-cells: implication for CLL Disease Progression. Br. J. Haematol. 2009; 147(4): 471—83.

8. Gehrke I., GandhirajanR.K., Poll-Wolbeck S.J., HallekM., KreuzerKA. Bone marrow stromal cell-derived vascular endothelial growth factor (VEGF) rather than chronic lymphocytic leukemia (CLL) cell-derived VEGF is essential for the apoptotic resistance of cultured CLL cells. Mol. Med. 2011; 17(7—8): 619—27. doi: 10.2119/molmed.2010.00210.

9. Dancescu M., Rubio-Trujillo M., Biron G., Bron D., Delespesse G., Sar-fati M. Interleukin 4 protects chronic lymphocytic leukemic B cells from

death by apoptosis and upregulates Bcl-2 expression. J. Exp. Med. 1992; 176(5): 1319—26.

10. Grdisa M. Influence of CD40 ligation on survival and apoptosis of B-CLL cells in vitro. Leuk. Res. 2003; 27(10): 951—6.

11. Kay N.E., Bone N.D., Lee Y.K., JelinekD.F., LelandP., Battle T.E., et al. A recombinant IL-4-Pseudomonas exotoxin inhibits protein synthesis and overcomes apoptosis resistance in human CLL B cells. Leuk. Res. 2005; 29(9): 1009—18.

12. Lagneaux L., Delforge A., Bron D., De Bruyn C., Stryckmans P. Chronic lymphocytic leukemic B cells but not normal B cells are rescued from apoptosis by contact with normal bone marrow stromal cells. Blood. 1998; 91(7): 2387—96.

13. Burger J.A., Kipps TJ. Chemokine receptors and stromal cells in the homing and homeostasis of chronic lymphocytic leukemia B cells. Leuk. Lymphoma. 2002; 43(3): 461—6.

14. Granziero L., CircostaP., Scielzo C., Frisaldi E., Stella S., GeunaM., et al. CD100/Plexin-B1 interactions sustain proliferation and survival of normal and leukemic CD5+ B lymphocytes. Blood. 2003; 101(5): 1962—9.

15. Redondo-Munoz J., Ugarte-Berzal E., Garcla-Marco JA., del CerroM.H., Van den Steen P.E., Opdenakker G., et al. Alpha4beta1 integrin and 190-kDa CD44v constitute a cell surface docking complex for gelatinase B/MMP-9 in chronic leukemic but not in normal B cells. Blood. 2008; 112(1): 169—78.

16. Hall B.M., Gibson L.F. Regulation of lymphoid and myeloid leukemic cell survival: role of stromal cell adhesion molecules. Leuk. Lymphoma. 2004; 45(1): 35—48.

17. Zucchetto A., Benedetti D., Tripodo C., Bomben R., Dal Bo M., Marconi D., et al. CD38/CD31, the CCL3 and CCL4 chemokines, and CD49d/ vascular cell adhesion molecule-1 are interchained by sequential events sustaining chronic lymphocytic leukemia cell survival. Cancer Res. 2009; 69(9): 4001—9.

18. BinderM., Lechenne B., Ummanni R., ScharfC., Balabanov S., TruschM., et al. Stereotypical chronic lymphocytic leukemia B-cell receptors recognize survival promoting antigens on stromal cells. PLoS One. 2010; 5(12): e15992.

19. Chu C.C., Catera R., Hatzi K., Yan XJ., Zhang L., Wang X.B., et al. Chronic lymphocytic leukemia antibodies with a common stereotypic rearrangement recognize nonmuscle myosin heavy chain IIA. Blood. 2008; 112(13): 5122—9.

20. Kay N.E., Shanafelt T.D., Strege A.K., Lee Y.K., Bone N.D., Raza A. Bone biopsy derived marrow stromal elements rescue chronic lymphocytic leukemia B-cells from spontaneous and drug induced cell death and facilitates an "angiogenic switch". Leuk. Res. 2007; 31(7): 899—906.

21. Levesque M.C., O’Loughlin C.W., Weinberg J.B. Use of serum-free media to minimize apoptosis of chronic lymphocytic leukemia cells during in vitro culture. Leukemia. 2001; 15(8): 1305—7.

22. Jones D.T., Ganeshaguru K., Anderson R.J., Jackson T.R., Bruckdor-fer K.R., Low S.Y., et al. Albumin activates the AKT signaling pathway and protects B-chronic lymphocytic leukemia cells from chlorambucil-and radiation-induced apoptosis. Blood. 2003; 101(8): 3174—80.

23. Tangye S.G., Raison R.L. Human cytokines suppress apoptosis of leukae-mic CD5+ B cells and preserve expression of bcl-2. Immunol. Cell Biol. 1997; 75(2): 127—35.

24. Moreno A., Villar M.L., Camara C., Luque R., Cespon C., Gonzalez-Porque P., et al. Interleukin-6 dimers produced by endothelial cells inhibit apoptosis of B-chronic lymphocytic leukemia cells. Blood. 2001; 97(1): 242—9.

25. Castejon R., Vargas JA., Romero Y., BrizM., Munoz R.M., Durantez A., et al. Modulation of apoptosis by cytokines in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Cytometry. 1999; 38: 224—30.

26. Carloni M., Meschini R., Ovidi L., Palitti F. PHA-induced cell proliferation rescues human peripheral blood lymphocytes from X-ray-induced apoptosis. Mutagenesis. 2001; 16(2): 115—20.

27. Rober K.H. PHA-induced soluble factors(s) can activate B-cells from patients with chronic lymphatic leukaemia. Clin. Exp. Immunol. 1979; 37(3): 517—22.

28. Davis S. Characterization of the phytohemagglutinin-induced proliferating lymphocyte subpopulations in chronic lymphocytic leukemia patients using a clonogenic agar technique and monoclonal antibodies. Blood. 1981; 58(5): 1053—5.

29. Blaehr H., Ladefoged J. Mitogen-induced lymphocyte transformation in four different serum-free media. J. Immunol. Methods. 1988; 111(1): 125—9.

30. Kurtova A.V, Balakrishnan K., Chen R., Ding W., Schnabl S., Quiro-ga M.P., et al. Diverse marrow stromal cells protect CLL cells from spontaneous and drug-induced apoptosis: development of a reliable and reproducible system to assess stromal cell adhesion-mediated drug resistance. Blood. 2009; 114(20): 4441—50.

Поступила 05.09.12

36