Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение
METHOD FOR PRODUCING CHINESE HAMSTER OVARY CELL STRAIN, PRODUCER OF SARS-COV-2 VIRUS RECOMBINANT RBD PROTEIN, CHINESE HAMSTER OVARY CELL STRAIN, PRODUCER OF RECOMBINANT RBD PROTEIN OF SARS-COV-2 VIRUS, METHOD OF PRODUCING RECOMBINANT RBD PROTEIN OF SARS-COV-2 VIRUS, A TEST SYSTEM FOR ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY OF HUMAN BLOOD SERUM OR PLASMA AND ITS USE

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и касается создания нового штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцирующего рекомбинантный белок - рецептор-связывающий домен (RBD) вируса SARS-CoV-2, который может быть использован для диагностических целей.
Уровень техники
В конце 2019 года в Китайской Народной Республике (КНР) произошла вспышка новой инфекции с эпицентром в городе Ухань (провинция Хубэй). Через некоторое время был обнаружен возбудитель данной инфекции, которым оказался неизвестный ранее коронавирус, получивший название SARS-CoV-2. В течение нескольких месяцев SARS-CoV-2 распространился по всему миру, став причиной пандемии, затронувшей более 200 стран. К 1 мая 2020 года количество заболевших превысило 3 млн человек, а количество погибших - 220 тыс. человек. При этом прогнозируется дальнейший рост заболеваемости и смертности, поскольку в большинстве стран эпидемия еще не достигла своего пика.
SARS-CoV-2 вызывает потенциально тяжелую острую респираторную инфекцию, которая получила название COVID-19. Для данного заболевания характерно наличие таких клинических симптомов, как повышение температуры тела (более чем в 90% случаев); кашель - сухой или с небольшим количеством мокроты (более чем в 80% случаев); отдышка (в 55% случаев); утомляемость (в 44% случаев); ощущение заложенности в грудной клетке (более чем в 20% случаев). Наиболее тяжелыми осложнениями COVID-19 являются пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др.
В настоящее время не зарегистрировано специфических средств лечения и профилактики COVID-19. В основном производится симптоматическое лечение. 1 апреля 2020 года Департамент здравоохранения Москвы издал приказ «О внедрении технологии использования свежезамороженной плазмы от доноров-реконвалесцентов COVID-19» для лечения пациентов с COVID-19 в терминальной стадии заболевания.
Реконвалесценты - это люди, организм которых успешно справился с заболеванием, и они выздоровели без осложнений. Это произошло, в частности, и потому, что их иммунная система выработала антитела, которые нейтрализуют вирус.Если ввести плазму крови реконвалесцентов, которая содержит такие антитела, другим пациентам, это может смягчить течение их болезни.
Однако, не все образцы плазмы реконвалесцентов содержат одинаковое количество вируснейтрализующих антител. Поэтому актуальным вопросом является разработка метода, который позволил бы проводить масштабный скрининг плазмы и сывороток крови доноров-реконвалесцентов COVID-19 с целью отбора наиболее перспективных для терапии образцов.
2
Известен способ оценки сыворотки реконвалесцентов путем определения титра вируснейтрализующих антител (Ch. Shen et al. Treatment of 5 Critically Ill Patients With COVID-19 With Convalescent Plasma. JAMA. 2020;323(16):1582-1589. doi:10.1001). Данный способ основан на том, что к клеткам Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки) добавляют образцы сыворотки крови в различных разведениях и одновременно с этим заражают их коронавирусом SARS-CoV-2. Далее клетки инкубируют 37°С, 5% СО в течение 5 дней, затем оценивают цитопатическое действие вируса. Результат представляют как титр вируснейтрализующих антител (самое большое разведение сыворотки, которое показало ингибирующую активность SARS-CoV-2). К недостатком данного способа можно отнести длительный срок постановки анализа (5 дней) и необходимость придерживаться правил работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) II группы патогенности. Все это влечет за собой низкую производительность и высокую себестоимость данного анализа.
Кроме того, известен способ оценки плазмы реконвалесцентов путем определения титра вируснейтрализующих антител, в котором вместо коронавируса используются псевдотипированные лентивирусные частицы (PsV) (F.Wu Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered patient cohort and their implications, medRxiv 2020.03.30.20047365). Данный способ включает в себя культивирование клеток 293Т/АСЕ2, к которым добавляют образцы сыворотки крови в различных разведениях и одновременно с этим вносят PsV, содержащие ген люциферазы. Через 48 часов оценивают активность люциферазы стандартным набором (Promega). Результат представляют как титр вируснейтрализующих антител (самое большое разведение сыворотки, при добавлении которого активность люциферазы уменьшается на 50%). Недостатками данного способа являются длительность процесса (48 часов), трудоемкость, необходимость в дорогом оборудовании и высококвалифицированном персонале.
Из литературных данных известно, что рецептор-связывающий домен (RBD) белка S коронавируса SARS-CoV, является основной мишенью для вируснейтрализующих антител. В публикации Z. Cao et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virol J 7, 299 (2010)) описан способ обнаружения антител к RBD в сыворотке крови пациентов, перенесших инфекцию SARS-CoV. Способ реализуется следующим образом: к адсорбированному в лунках планшета RBD-His добавляют серию разведений образцов сывороток пациентов и контрольные образцы. Связавшиеся с RBD антитела детектируют с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP). Затем добавляют субстрат для HRP и оценивают титр антител к RBD. Данный способ как наиболее близкий к заявляемому был выбран за прототип. Недостатком данного способа является то, что он не позволяет детектировать антитела к коронавирусу SARS-CoV-2 в плазме крови реконвалесцентов COVID-19.
Таким образом, в настоящее время существует потребность в разработке быстрого способа анализа сыворотки и плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для определения образцов наиболее перспективных для терапии пациентов с COVID-19.
Раскрытие изобретения.
Задачей заявленного изобретения является создание эффективной тест-системы и способа для быстрого анализа сыворотки и плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для определения образцов сывороток и плазмы крови наиболее перспективных для терапии пациентов с COVID-19, а также способа для быстрого анализа сыворотки и плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2.
Технический результат представляет собой получение быстрой и эффективной тест системы для определения наиболее перспективных образцов сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.
Технический результат заключается в сокращении времени и упрощении процедуры анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.
Технический результат также представляет собой высокую и стабильную экспрессию рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.
Кроме того, технический результат заключается в неожиданно проявленном эффекте для анализа сыворотки и плазмы крови человека на наличие антител к вирусу SARS-CoV-2 отсутствии ложноположительных результатов у пациентов перенесших заболевание.
Технический результат достигается за счет разработки генетическая конструкции для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, включающий  SEQ ID NO:1
Также технический результат достигается за разработки штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса  SARS-CoV-2, содержащего генетическую конструкцию, включающую SEQ ID NO:1
Также технический результат достигается за счет разработки способа получения штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, включающий:
- получение генетической конструкции, включающей SEQ ID NO:1;
- введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции;
- селекцию клеток на антибиотике Hygromycin B.
Также технический результат достигается за счет разработки рекомбинантного белока RBD вируса SARS-CoV-2 для выявления антител к SARS-CoV-2, имеющий  SEQ ID NO:2, являющийся продуктом штамма клеток яичника китайского хомячка.
Также технический результат достигается за счет разработки способа получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, включающего:
- культивирование штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD;
- хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 из культуральной среды штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD;
- подтверждение получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, имеющего SEQ ID NO:2.
Также технический результат достигается за счет разработки тест-системы для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, представляющей собой набор реагентов, включающий:
- планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2;
- положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2;
- отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2;
- конъюгат, содержащий 20-кратный концентрат моноклональных мышиных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена;
- 25-кратный концентрат промывочного буфера, содержащий концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывания планшетов;
- буфер для разведения сыворотки или плазмы и указанного конъюгата;
- раствор хромогена, содержащий раствор тетраметилбензидина;
- раствор субстрата, содержащий раствор перекиси водорода;
- стоп-реагент.
Также технический результат достигается за счет разработки способа для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, включающий применение тест-системы, где:
- в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2 вносят положительный контроль, отрицательный контроль, а также вносят предварительно разведенные испытуемые образцы сывороток или плазмы крови человека;
- проводят инкубацию указанных образцов при температуре от +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;
- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;
- вносят 1-кратный раствор конъюгата с последующей инкубацией при температуре +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;
- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;
- вносят хромоген-субстратный раствор в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от +15°С до +25°С;
- останавливают пероксидазную реакцию путем добавления в каждую лунку стоп-реагента;
- измеряют оптическую плотность на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм;
- проводят интерпретацию результатов.
Также технический результат достигается за счет разработки способа для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2, включающий применение тест-системы, в соответствии с которым:
- в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2 вносят положительный контроль, отрицательный контроль, а также вносят серии 2-кратных разведений испытуемых образцов сывороток или плазмы крови человека;
- проводят инкубацию указанных образцов при температуре от +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;
- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;
- вносят 1-кратный раствор конъюгата с последующей инкубацией при температуре +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;
- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;
- вносят хромоген-субстратный раствор в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от +15°С до +25°С;
- останавливают пероксидазную реакцию путем добавления в каждую лунку стоп-реагента;
- измеряют оптическую плотность на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм;
- проводят интерпретацию результатов.
Также технический результат достигается за счет разработки способа для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2 (вариант 1).
Также технический результат достигается за счет разработки способа для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS - CoV-2 (вариант 2).
Сущность заявленной группы изобретений поясняется чертежами, где на фиг. 1-4 представлены результаты исследования.
Осуществление изобретения
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлено схематическое изображение генетической конструкции для экспрессии рецептор-связывающего домена (RBD) вируса SARS-CoV2, где
SP - сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию белка в культуральную жидкость;
RBD - рецептор-связывающий домен RBD вируса SARS-CoV2;
His-tag - гистидиновая метка, обеспечивающая очистку белка методом аффинной хроматографии.
На фиг. 2 представлена схема плазмидного вектора р1-RBD-CoV-2, где
CMV- промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека;
генетическая конструкция - разработанная генетическая конструкция SEQ ID NO:1, экспрессирующая рецептор-связывающий домен (RBD) вируса SARS-CoV2;
poly(A) - сигнал полиаденилирования;
EBV ori - последовательность начала репликации вируса Эпштейна-Барра;
AmpR promoter - промотор гена устойчивости к ампициллину;
Amp - ген устойчивости к ампициллину, который кодирует фермент β-лактамазу, который расщепляет β-лактамное кольцо ампициллина и некоторых других антибиотиков;
ori - последовательность начала репликации;
TK promoter - промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса человека;
HygroВ - ген устойчивости к Hygromicin B, который кодирует фермент фосфатазу, которая инактивирует этот антибиотик путем его фосфорилирования.
HindIII, XhoI - сайты узнавания для соответствующих рестриктаз.
На фиг. 3 представлена электрофореграмма белкового препарата RBD после аффинной очистки, где
М - маркер молекулярного веса;
1.- образец белка RBD 0.75 мкг/мкл;
2.- образец белка RBD 1 мкг/мкл;
3.- образец белка RBD 0.5 мкг/мкл;
4.- образец белка RBD 0.25 мкг/мкл.
На фиг. 4 представлены результаты масс спектрального анализа белкового препарата RBD после аффинной очистки, где
[М]+- распределение молекулярных масс однозарядного иона;
[М]2+- распределение молекулярных масс двузарядного иона.
В экспериментальных исследованиях установлено, что большинство антител, обладающих вируснейтрализующей активностью в отношении вида коронавируcов (MERS, SARS и др.) специфически связываются с различными эпитопами рецептор-связывающего домена белка S (spike) (Hofmann H. et al. S protein of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus mediates entry into hepatoma cell lines and is targeted by neutralizing antibodies in infected patients. Journal of Virology. 2004, 78(12):6134-42; He Y. Receptor-binding domain of severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein contains multiple conformation-dependent epitopes that induce highly potent neutralizing antibodies. Journal of Immunology. 2005, 174(8):4908-15; He Y. Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 324(2):773-81.). Установлено, что нейтрализующей активностью обладают антитела, препятствующие связыванию белка S вируса SARS-CoV-2 с рецептором ангиотензин-превращающий фермент 2 (ACE2) на клетках человека. Рецептор-связывающий домен (RBD) является структурным доменом белка S, образующим сайт связывания с рецептором ACE2, поэтому антитела способные связываться с белком RBD могут блокировать контакт с рецептором и, как следствие, препятствовать проникновению вируса в клетки человека. Поэтому введение сыворотки или плазмы доноров-реконвалесцентов COVID-19, содержащей антитела к белку RBD вируса SARS-CoV-2, пациентам с COVID-19 является перспективным средством терапии.
Таким образом, анализ сыворотки или плазмы крови доноров-реконвалесцентов COVID-19 на наличие антител к белку RBD вируса SARS-CoV-2 позволит отбирать наиболее перспективные образцы сыворотки или плазмы, которые обладают терапевтическим эффектом.
В результате проведенной работы была создана генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, включающая SEQ ID NO:1.
Данная конструкция включает лидерный пептид тяжелой цепи иммуноглобулина G человека слитый с геном RBD вируса SARS-CoV-2 и гистидиновой меткой.
Лидерные пептиды - это сигнальные последовательности, которые играют центральную роль в нацеливании и транслокации почти всех секретируемых белков и многих интегральных мембранных белков как у прокариот, так и у эукариот. От выбора сигнального пептида напрямую зависит секреция рекомбинантного белка. Использование лидерного пептида тяжелой цепи иммуноглобулина G человека позволяет обеспечить высокие уровни продукции рекомбинантного белка RBD в культуральную среду.
Гистидиновая метка - это нуклеотидная последовательность, кодирующая 6 аминокислотных остатков гистидина. Данная метка необходима для последующей очистки белка на иммобилизованных металл-аффинных сорбентах. В данном методе используется способность гистидина связываться с хелатным ионом переходного металла, таким, как никель (Ni2+). Главными преимуществами использования гистидиновой метки является ее небольшой размер, легкость синтеза и отсутствие влияния на функции белка, его специфическую активность и структуру.
Кроме того, в результате проведенной работы была создан штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащий генетическую конструкцию, включающую SEQ ID NO:1 и разработан способ его получения, включающий: получение генетической конструкции, включающей SEQ ID NO:1; введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции; селекцию клеток на антибиотике Hygromycin B.
Также, был создан рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 для выявления антител к SARS-CoV-2, имеющий SEQ ID NO:2 и способ его получения, включающий: культивирование штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 из культуральной среды штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; подтверждение получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, имеющего SEQ ID NO:2.
Кроме того, была создана тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, представляющая собой набор реагентов, включающий: планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2; положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2; отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2; конъюгат, содержащий 20-кратный концентрат моноклональных мышиных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена; 25-кратный концентрат промывочного буфера, содержащий концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывания планшетов; буфер для разведения сыворотки или плазмы и указанного конъюгата; раствор хромогена, содержащий раствор тетраметилбензидина; раствор субстрата, содержащий раствор перекиси водорода; стоп-реагент.
Также был разработан способ для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, включающий: внесение в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2 положительного контроля, отрицательного контроля, а также предварительно разведенных испытуемых образцов сывороток или плазмы крови человека; проведение инкубации указанных образцов при температуре от +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа; промывку лунок не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера; внесение 1-кратного раствора конъюгата с последующей инкубацией при температуре +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа; промывку лунок не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера; внесение хромоген-субстратного раствора в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от +15°С до +25°С; остановку пероксидазной реакции путем добавления в каждую лунку стоп-реагента; измерение оптической плотности на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм; проведение интерпретации результатов.
Особенностью данного способа для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 является то, что для интерпретации результатов, исследуемый образец сыворотки или плазмы крови человека сравнивают с отсекающим значением оптической плотности Cut off, которое вычисляют по формуле:
450
ср
450
-
-
Cut off=АК+3 х SD АК,
где Cut off - отсекающие значения оптической плотности,
450
ср
-
АК - cреднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем,
450
-
SD АК - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля,
при этом образец считают положительным, если после проведения анализа оптическая плотность в лунках планшета с опытным образцом при длине волны 450 нм в 2,5 раза превышает отсекающие значения оптической плотности Cut off.
Также был разработан способ для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2, включающий: внесение в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2 положительного контроля, отрицательного контроля, а также серии 2-кратных разведений испытуемых образцов сывороток или плазмы крови человека; проведение инкубации указанных образцов при температуре от +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа; промывку лунок не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера; внесение 1-кратного раствора конъюгата с последующей инкубацией при температуре +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа; промывку лунок не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера; внесение хромоген-субстратного раствора в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от +15°С до +25°С; остановку пероксидазной реакции путем добавления в каждую лунку стоп-реагента; измерение оптической плотности на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм; проведение интерпретации результатов.
Особенностью данного способа для анализа сыворотки или плазмы крови человека является то, что при интерпретации результатов, исследуемый образец сыворотки или плазмы крови человека сравнивают со значением оптической плотности Cut off, которое вычисляют по формуле
450
ср
450
-
-
Cut off=АК+3 х SD АК,
где Cut off - отсекающие значения оптической плотности,
450
ср
-
АК - cреднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем,
450
-
SD АК - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля,
при этом титр антител определяют как наибольшее разведение образца сыворотки или плазмы крови человека, при анализе которого получают оптическую плотность при длине волны 450 нм в 2 раза превышающую отсекающие значения оптической плотности Cut off.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Разработка дизайна генетической конструкции, содержащей лидерный пептид тяжелой цепи иммуноглобулина G человека, ген RBD вируса SARS-CoV-2 и гистидиновую метку
На первом этапе работы авторы разработали дизайн генетической конструкции, позволяющей эффективно экспрессировать рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих и выполнять его хроматографическую очистку.
Для этого был выбран ген рецептор-связывающего домена (RBD) белка S коронавируса SARS-CoV-2, слитый с сигнальным пептидом тяжелой цепи иммуноглобулина G человека, обеспечивающий секрецию белка в культуральную жидкость и гистидиновой меткой для очистки рекомбинантного белка методом аффинной хроматографии. Таким образом, была разработана генетическая конструкция SEQ ID NO:1.
Схема генетической конструкции и представлена на Фиг. 1. Разработанная генетическая конструкция была синтезирована в ЗАО «Евроген». Таким образом, была получена конструкция pAL-TA-RBD-CoV-2.
Далее с помощью методов генной инженерии разработанная генетическая конструкция из pAL-TA-RBD-CoV-2 была клонирована с использованием эндонуклеаз рестрикции HindIII и XhoI в плазмидный вектор для эписомальной экспрессии в клеточных линиях млекопитающих, и полученная плазмида была названа p1-RBD-CoV-2 (Фиг. 2). Далее полученную плазмиду нарабатывали в препаративных количествах и очищали при помощи коммерческого набора Plasmid Midiprep 2.0 (Евроген /кат.№BC124).
Таким образом, в результате проведенной работы была получена плазмида p1-RBD-CoV-2, обеспечивающая экспрессию гена RBD вируса SARS-CoV-2.
Пример 2. Получение штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2
Штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 был получен на основе клеточной линии CHO-S. Это коммерческая клеточная линия на основе клеток яичника китайского хомячка СНО, адаптированная к культивированию в плотной суспензии в специальной культуральной среде для повышенной экспрессии белка.
6
Клетки CHO-S культивировали в шейкер-инкубаторе при 5% содержания CO2, 80%-ной влажности и скорости качания 120 об/мин в питательной среде HyClone HyCell TransFx-C transfection media (GE Healthcare, США) с добавлением 8 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), до достижения плотности 2*10 кл/мл 1 литр суспензии. Далее полученную суспензию трансфицировали плазмидным вектором p1-RBD-CoV-2, содержащим генетическую конструкцию SEQ ID NO:1, при помощи 1 мг/мл реагента Polyethylenimine (Polyscience, США) согласно инструкции производителя. Затем в течение 2 недель проводили селекцию трансфицированных клеток на антибиотике гигромицин Б. Данный антибиотик был выбран, поскольку плазмидный вектор p1-RBD-CoV-2 содержит ген устойчивости к антибиотику Hygromycin B.
Таким образом, в результате проведенной работы впервые был получен штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2. При этом продукция указанного белка составляет от 5 мг/л до 10 мг/л.
Пример 3. Способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 с помощью созданного штамма-продуцента
Разработанный способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2 включает следующие этапы:
1) культивирование штамма-продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2;
2) отбор культуральной среды;
3) хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2;
4) подтверждение подлинности полученного рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.
Культивирование клеток штамма-продуцента проводили в течение 7 дней в Шейкер-инкубаторе Multitron (Infors HT, Швейцария) при 5% содержания CO2, 80%-ной влажности и скорости качания 120 об/мин. Ежедневно определяли выживаемость клеток в суспензии при помощи счетчика клеток TC20 Automated Cell Counter (Bio-Rad, США). По истечении 7 дней культивирования клеточную суспензию осаждали центрифугированием 5000 об/мин. Культуральную жидкость осветляли при помощи фильтрации через шприцевые фильтры Millipore Express (PES) HP 0.45 мкм (Merckmillipore, Германия).
Далее проводили хроматографическую очистку белка из осветленной культуральной жидкости на приборе AKTA start (GE Healthcare, США). К прибору подключали хроматографическую колонку HisTag HP protein purification column (5 мл) и уравновешивали буфером (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 20 мМ иммидазол, рН=7.4). Далее осветленную культуральную жидкость (100 мл) разбавляли в несколько раз буфером (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 20 мМ иммидазол, рН=7.4) и наносили на уравновешенную колонку со скоростью 5 мл/мин. После окончания нанесения, колонку промывали 100 мл буфера (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 20 мМ иммидазол, рН=7.4) со скоростью 5 мл/мин. После окончания промывки связавшийся белок элюировали с колонки буфером (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 500 мМ иммидазол, рН=7.4) со скоростью 1 мл/мин. Так проводили 10 очисток по 100 мл. Фракции после очистки замораживали при температуре -20°С. Фракции после первичной очистки размораживали при комнатной температуре и концентрировали при помощи центрифужных концентраторов Amicon Ultra -50, -10K (Millipore, Ирландия) до концентрации белка 1-2 мг/мл. Концентрацию белка измеряли при помощи спектрофотометра Nanodrop 2000c. Далее колонку HiTrap desalting column уравновешивали буфером (20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия) на скорости 5 мл/мин. После уравновешивания скорость потока снижали до 1 мл/мин. Препарат с концентрацией 1-2 мг/мл наносили на колонку через шприц в объеме 1 мл. Собирали первый пик по UV280 соответствующий целевому рекомбинантному белку RBD. Суммарно проводили 5-10 циклов очистки. Полученные после второй стадии очистки фракции препарата объединяли и измеряли концентрацию белка на спектрофотометре Nanodrop 2000c. Далее препарат доводили буфером (20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия) до концентрации 1 мг/мл, разливали по 1 мл и хранили при температуре -20°С.
Выход рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 после хроматографической очистки составил от 5 мг до 10 мг с литра культуральной среды (по результатам трех независимых экспериментов). Что является показателем эффективности разработанного способа получения, так как белки коронавируса относятся к группе сложнополучаемых в традиционных системах бактериальной экспрессии.
Подтверждение подлинности полученного рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 проводили при помощи белкового электрофореза в полиакриламидном геле, а также масс-спектрометрического анализа.
Для проведения белкового электрофореза готовили 12%-ный разделяющий полиакриламидный гель и 6%-ный фокусирующий полиакриламидный гель. Образцы очищенного рекомбинантного белка RBD разводили до различной концентрации (1 мкг/мкл, 0.75 мкг/мл, 0.5 мкг/мкл, 0.25 мкг/мл) буфером образца с содержанием В-меркаптоэтанола. Далее образцы прогревали при температуре 98°С в течении 5 мин и вносили в гель. Электрофорез проводили в камере Mini-Protean Tetra Cell (Bio-Rad, США, кат.№165-8000). Далее гель окрашивали реагентом EZBlue™ Gel Staining Reagent (Sigma-Aldrich, США, кат.№G1041) и проявляли при помощи гель-документирующей системы Gel Doc EZ system (Bio-Rad, США). Результаты электрофореграммы представлены на Фиг. 3.
По результатам электрофореграммы подвижность рекомбинантного белка RBD в денатурирующих условиях соответствовала ≈30 кДа, что обусловлено его гликозилированием (масса аминокислотной последовательности без учета гликозилирования составляет около 25 кДа). Таким образом, при первичном анализе препарата были подтверждена его ожидаемая молекулярная масса.
Более детальное подтверждение подлинности препарата осуществляли при помощи масс-спектрометрического анализа по следующей схеме:
1. Гидролиз белка трипсином в растворе
25 мкг рекомбинантного белка RBD растворяли в 20 mM бикарбонате аммония и добавляли до 100 мкл 25 мМ бикарбоната аммония (рH 8,3). В полученную реакционную смесь добавляли последовательно 1 мкл 1 M ДТТ и 10 мкл 110 mM йодацетамида. После проведения реакции (56°С, 30 мин в темноте) к смеси добавляли 4 мкл 1 M ДТТ для нейтрализации не связавшегося иодацетамида. К оставшейся части добавляли только трипсин, при этом, в обоих случаях соотношение белок: фермент составляло 25: 1. Реакцию вели при 37°С в течение 17 ч. Полученную реакционную смесь высушивали досуха с помощью вакуумного концентратора (Savant SPD121P, Thermo Scientific, США) и растворяли в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Образец обессоливали на колонках, содержащих обращено фазовую мембрану (аналог С18), образец элюировали 90% раствором ацетонитрила в воде. Для нанесения брали 4 мкл образца в 90% ацетонитриле и смешивали их с 1 мкл насыщенного раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты в 30%-ном растворе ацетонитрила, содержащем 0,5% ледяной уксусной кислоты по объему, на стальной мишени, которую затем подсушивали на воздухе при комнатной температуре.
2. MALDI-масс-спектрометрический анализ
Анализ пептидов проводили на время-пролетном MALDI-масс-спектрометре Ultraflextreme («Bruker Daltonics», Германия). Детектирование положительных ионов проводили в режиме рефлектрона при напряжениях: на ионном источнике IS1 – 20,12 кВ, IS2 – 17,82 кВ; на линзах – 7,47 кВ, рефлектроне Ref1 – 21,07 кВ, Ref2 – 10,80 кВ. Ионы детектировали в диапазоне m/z от 650 до 5000 Th. В качестве внутреннего стандарта использовали пики автолитических фрагментов трипсина и кератина, которые исключались из окончательных списков детектируемых масс.
3. Анализ данных масс-спектрометрии
Обработка масс-спектров проводилась с помощью программного обеспечения Flex Analysis 3.4 (Bruker Daltonik GMBH, Германия). К масс-спектрам применялись сглаживание по алгоритму Savizky Golay (ширина 0,2 m/z, 1 цикл), и вычитание базовой линии согласно алгоритму TopHat. Использовались следующие параметры детекции пиков: алгоритм детекции пиков - SNAP2, соотношение сигнал/шум - 3, максимальное число пиков в спектре - 500). Поиск и идентификация белков методом «пептидного отпечатка» («peptide mass fingerprint») осуществляли с помощью программного комплекса Proteinscape (версия 4, «Bruker Daltonik GMBH, Германия), использовались следующие параметры поиска: точность определения массы - 50 ppm; возможные посттрансляционные модификации - окисление метионина, гистидина, триптофана.
В результате масс-спектрального анализа было продемонстрировано, что рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 присутствует в растворе в виде одно и двухзарядного иона, и имеет молекулярную массу 31 кДа, что четко коррелирует с данными электрофореза (Фиг. 4).
Результаты исследования рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 при помощи белкового электрофореза в полиакриламидном геле, а также масс-спектрометрического анализа убедительно доказали его подлинность.
Таким образом, в результате проведенной работы впервые был получен рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2. Данный белок образует стабильную складчатую структуру.
Пример 5. Тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека с использованием рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2
Авторами впервые была создана тест-система на основе иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, в которой рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2, полученный с помощью штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 (примеры 1-3), является мишенью для антител, выявляемых в крови реконвалесцентов COVID-19.
Тест-система представляет собой набор реагентов, включающий:
1) планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2 2 SEQ ID NO:2;
2) положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD коронавируса SARS-CoV-2;
3) отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD коронавируса SARS-CoV-2;
4) конъюгат, содержащий 20-кратный концентрат моноклональных мышиных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена;
5) 25-кратный концентрат промывочного буфера, содержащий концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывания планшетов;
6) буфер для разведения, содержащий буферный раствор для разведения сыворотки или плазмы и конъюгата;
7) раствор хромогена, содержащий раствор тетраметилбензидина;
8) раствор субстрата, содержащий раствор перекиси водорода;
9) стоп-реагент, содержащий 1 М раствор серной кислоты.
Пример 6. Способ применения тест-системы для иммуноферментного анализа для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2
В данном примере описан способ использования разработанной тест-системы для иммуноферментного анализа (описанной в примере 5) для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов, наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.
Наиболее перспективными для терапии являются образцы сыворотки или плазмы крови, которые содержат вируснейтрализующие антитела. Из литературных данных известно, что белок RBD коронавирусов является одной из основных мишеней для вируснейтрализующих антител Z. Cao et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virol J 7, 299 (2010)).
В данном исследовании был проведен сравнительный анализ 218 образцов реконвалесцентной плазмы и сыворотки крови пациентов, перенесших COVID-19. Каждый образец был исследован с помощью разработанной тест-системы для иммуноферментного анализа (описанной в примере 5) и проанализирован на наличие вируснейтрализующих антител (ВНА) методом прямой вируснейтрализации вируса SARS-CoV-2 на культуре клеток.
Иммуноферментный анализ с использованием разработанной тест-системы был проведен согласно следующему протоколу.
1. Приготовление рабочих растворов
Для приготовления рабочего раствора буфера для промывания планшетов концентрат промывочного буфера развести в 25 раз дистиллированной водой.
Для приготовления рабочего раствора конъюгата, конъюгат развести в 20 раз буфером для разведения и тщательно перемешать пипетированием (раствор готовили непосредственно перед использованием).
Для приготовления рабочего хромоген-субстратного раствора к 1,0 мл раствора хромогена добавить 9,0 мл раствора субстрата и тщательно перемешать (раствор готовить непосредственно перед использованием, хранению не подлежит).
1. Проведение анализа.
1.1 Внести контрольные и испытуемые образцы сывороток.
Освободить планшет из упаковки и внести в 2 повторах по 100 мкл положительного контроля, а также в 2 повторах по 100 мкл отрицательного контроля.
В остальные лунки планшета внести по 90 мкл буфера для разведения, а затем добавить по 10 мкл, предварительно разведенных в 20 раз испытуемых образцов (по две лунки на каждый образец).
Планшет заклеить пленкой и выдержать в течение 1 ч при температуре от +37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.
2.2 Промывание.
После окончания инкубации удалить жидкость из лунок и промыть планшет 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов, на автоматическом промывочном устройстве или вручную, доверху заполняя лунки (по 300 мкл/лунку). Затем жидкость окончательно удалить и подсушить планшет постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
2. 3 Внесение конъюгата.
В каждую лунку внести по 100 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител, планшет закрыть липкой пленкой и инкубировать в течение 1 часа при температуре +37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.
2.4 Промывание.
После окончания инкубации промыть планшет 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов.
2.5 Внесение хромоген-субстратного раствора.
В каждую лунку внести по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировать в течение 15 минут в темном месте при температуре от +20°С.
2.6 Остановка пероксидазной реакции.
Остановить реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1 М раствор серной кислоты) и провести учет результатов на спектрофотометре в течение 10 мин после остановки реакции.
2.8. Регистрация результатов
450
Измерить величину оптической плотности субстратной смеси на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм (А) в течение 10 мин после остановки реакции.
450
450
-
+
Вычислить среднее арифметическое значение оптической плотности отрицательного (АК) и положительного (АК) контролей по формулам 1 и 2.
450
ср
450
1
450
2
-
-
-
А К=(А К+АА К)/2 (1),
где
450
1
-
- А К - значение оптической плотности пробы 1 отрицательного контроля;
450
2
-
- А К - значение оптической плотности пробы 2 отрицательного контроля,
450
ср
450
1
450
2
+
+
+
А К=(А К+АА К)/2   (2)
где
450
1
+
- А К - значение оптической плотности пробы 1 положительного контроля;
450
2
+
- А К - значение оптической плотности пробы 2 положительного контроля.
450
450
ср
Вычислить среднее значение А для каждой опытной пробы (АОП) по формуле 3:
450
ср
450
1
450
2
АОП=(АОП+АОП)/2 (3)
где
450
1
- АОП - значение оптической плотности пробы 1;
450
2
- АОП - значение оптической плотности пробы 2.
При этом результаты измерения, полученные на контрольных образцах, должны удовлетворять следующим требованиям:
450
ср
+
1. Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (АК) - не менее 0,6;
450
ср
-
2. Значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (АК) - менее 0,2.
При получении иных показателей исследование необходимо повторить.
2.9 Интерпретация результатов.
450
Для интерпретации результатов вычисляют отсекающие значения оптической плотности А (Cut off).
Значение Cut off вычисляют по формуле:
450
ср
450
-
-
Cut off=АК+3 х SD АК,
где
450
-
- SD АК - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля.
450
ср
Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается положительным, если АОП выше, чем значение Cut off в 2,5 раза.
450
ср
Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается отрицательным, если АОП не превышает значение Cut off в 2,5 раза.
Реакцию вируснейтрализации ставили в варианте: постоянная доза вируса - разведения сыворотки или плазмы крови.
В лунки планшета вносили 2-кратные разведения сыворотки или плазмы крови, начиная с разведения 1/20 до 1/1280 в объеме 50 мкл/лунку в 3 повторах.
В отдельные лунки вносят контрольные образцы:
- разведения контрольной плазмы с известным титром ВНА по 50 мкл/лунку (контроль проведения) в 3 повторах.
- по 50 мкл контрольной негативной плазмы (не обладающей вируснейтрализующей активностью) в разведении 1/20, в 3 повторах (контроль плазмы).
- по 100 мкл ростовой среды в 3 повторах (РС) (контроль клеток).
- по 50 мкл РС и 50 мкл вируссодержащей суспензии с концентрацией 2000 TCID(tissue culture infective dose 50/мл (контроль дозы вируса) в 3 повторах.
Далее во все лунки, кроме контроля клеток, вносили по 50 мкл вируссодержащей суспензии с концентрацией 2000 TCID50/мл.
В качестве контроля вирусной активности (Контроль вируса) в отдельные лунки планшета вносили разведения вируссодержащей суспензии (внутренний контроль вносимых доз вируса при исследования нейтрализующей активности плазмы).
Далее планшет инкубировали в атмосфере 5% CO2 при 37°С в течение 60 минут.
5
Затем во все лунки планшета инокулировали по 20000 клеток Vero E6 в объеме 100 мкл/лунку (концентрация клеток 2×10 клеток/мл) в свежеприготовленной РС. Планшеты с клетками инкубировали в атмосфере 5% CO2 при 37°С в течение 96 часов до полного проявления цитопатического действия вируса в вирусном контроле в ожидаемом диапазоне.
Оценку вирусной продукции по цитопатическому действию (ЦПД) осуществляли на основе анализа жизнеспособности клеток при помощи микроскопирования, с целью визуального определения границы вирусного повреждения клеток.
Вируснейтрализующую активность плазмы/сыворотки оценивали визуально под микроскопом через 96 часов после инфицирования по ингибированию ЦПД вируса в культуре клеток Vero E6. Каждое из разведений плазмы/сыворотки испытывали в трех параллельных лунках. Результатом исследования являлось заключение о нейтрализации цитопатического действия вируса в культуре клеток Vero E6 при воздействии плазмы/сыворотки крови. За титр ВНА исследуемой плазмы/сыворотки принимали высшее ее разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2 лунках из 3.
Результаты сравнительного анализа образцов сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 с помощью двух методов: иммуноферментного анализа на антитела к рекомбинантному белку RBD с помощью разработанной тест-системы и на наличие вируснейтрализующих антител (ВНА) методом прямой вируснейтрализации коронавируса SARS-CoV-2 на культуре клеток представлены в таблице 1. Результаты зависимости оптической плотности (OD450) образца при разведении в 200 раз от титра ВНА распределились следующим образом (Таблица 2).
Таблица 1. Результаты сравнительного анализа образцов плазмы и сыворотки крови реконвалесцентов COVID-19
№
Титр вируснейтрализующих антител, 1/
Значение оптической плотности образца при разведении в 200 раз (OD450)
1
320
2,87
2
1280
2,85
3
320
2,78
4
1280
2,75
5
640
2,72
6
640
2,70
7
128
2,34
8
1024
2,26
9
40
2,02
10
128
1,93
11
512
1,88
12
640
1,87
13
40
1,83
14
1024
1,80
15
320
1,76
16
80
1,75
17
320
1,74
18
320
1,74
19
128
1,69
20
128
1,56
21
160
1,56
22
128
1,51
23
320
1,49
24
160
1,47
25
1024
1,46
26
80
1,45
27
40
1,43
28
80
1,43
29
80
1,42
30
1024
1,42
31
160
1,34
32
256
1,39
33
1280
1,38
34
64
1,33
35
160
1,32
36
320
1,32
37
160
1,30
38
80
1,17
39
160
1,16
40
256
1,15
41
128
1,14
42
128
1,13
43
160
1,12
44
160
1,10
45
16
1,09
46
256
1,09
47
160
1,08
48
256
1,08
49
640
1,06
50
256
1,06
51
320
1,05
52
80
1,05
53
256
1,04
54
160
1,03
55
128
1,02
56
128
1,00
57
64
0,99
58
40
0,98
59
20
0,97
60
64
0,97
61
40
0,97
62
512
0,95
63
256
0,94
64
32
0,93
65
40
0,91
66
40
0,89
67
20
0,85
68
20
0,84
69
80
0,84
70
128
0,83
71
16
0,82
72
64
0,82
73
64
0,81
74
256
0,81
75
320
0,80
76
40
0,78
77
128
0,78
78
20
0,78
79
16
0,78
80
20
0,75
81
256
0,74
82
256
0,74
83
16
0,72
84
20
0,72
85
20
0,72
86
64
0,72
87
20
0,71
88
20
0,71
89
16
0,70
90
40
0,70
91
20
0,68
92
1024
0,68
93
32
0,68
94
80
0,68
95
20
0,65
96
16
0,65
97
20
0,64
98
64
0,64
99
20
0,64
100
20
0,63
101
16
0,63
102
40
0,63
103
32
0,62
104
20
0,62
105
20
0,61
106
64
0,61
107
40
0,60
108
32
0,60
109
640
0,59
110
64
0,59
111
40
0,57
112
20
0,57
113
20
0,57
114
20
0,56
115
128
0,55
116
32
0,55
117
320
0,54
118
64
0,52
119
16
0,51
120
256
0,51
121
20
0,51
122
20
0,51
123
64
0,50
124
16
0,50
125
20
0,50
126
64
0,49
127
80
0,49
128
20
0,48
129
32
0,48
130
20
0,46
131
16
0,45
132
20
0,45
133
640
0,45
134
20
0,44
135
20
0,44
136
80
0,44
137
20
0,43
138
64
0,43
139
20
0,42
140
20
0,42
141
20
0,42
142
20
0,41
143
20
0,41
144
80
0,41
145
20
0,39
146
160
0,39
147
20
0,38
148
16
0,38
149
160
0,35
150
32
0,35
151
20
0,35
152
32
0,35
153
20
0,34
154
16
0,33
155
20
0,32
156
16
0,32
157
16
0,32
158
32
0,32
159
16
0,32
160
16
0,31
161
16
0,31
162
20
0,30
163
20
0,30
164
32
0,30
165
16
0,30
166
32
0,29
167
32
0,27
168
128
0,27
169
32
0,27
170
20
0,26
171
16
0,26
172
64
0,25
173
20
0,24
174
32
0,24
175
32
0,23
176
16
0,23
177
16
0,22
178
16
0,21
179
16
0,21
180
32
0,21
181
16
0,21
182
16
0,21
183
20
0,21
184
20
0,20
185
16
0,20
186
32
0,20
187
16
0,19
188
1024
0,19
189
16
0,19
190
40
0,18
191
16
0,18
192
20
0,18
193
16
0,18
194
16
0,18
195
16
0,17
196
16
0,16
197
32
0,16
198
16
0,15
199
32
0,14
200
16
0,13
201
16
0,13
202
32
0,13
203
32
0,13
204
0
0,13
205
16
0,12
206
32
0,12
207
64
0,12
208
32
0,11
209
16
0,11
210
0
0,10
211
16
0,08
212
16
0,08
213
16
0,08
214
32
0,07
215
160
0,07
216
128
0,07
217
16
0,07
218
0
0,06
Таблица 2. Распределение зависимости оптической плотности (OD450) образца при разведении в 200 раз от титра ВНА.
Значение оптической плотности образца при разведении в 200 раз (OD450)
Титр ВНА от 1/64 и выше
Титр ВНА ниже 1/64
1,1 - 2,8
94%
6%
0,72 - 1
65%
35%
0,3-0,7
29%
71%
До 0,2
3,8%
96,2
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что диагностическая чувствительность разработанной тест-системы для анализа сыворотки или плазмы крови пациентов, перенесших COVID-19 и обладающих вируснейтрализующей активностью (титр 1/64 и выше), составляет от 96,8%. Установлена корреляция между уровнем оптической плотности (OD450) образца при разведении в 200 раз от титра ВНА, представленная в таблице 2. А время проведения анализ составляет 2,5 часа.
Пример 7. Способ применения разработанной тест-системы для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2
В данном примере описан способ применения разработанной тест-системы (пример 5) для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2.
Для исследования было отобрано 10 образцов плазмы и сыворотки крови реконвалесцентов COVID-19.
Иммуноферментный анализ с использованием разработанной тест системы был проведен согласно следующему протоколу.
1. Приготовление рабочих растворов.
Для приготовления рабочего раствора буфера для промывания планшетов концентрат промывочного буфера развести в 25 раз дистиллированной водой.
Для приготовления рабочего раствора конъюгата, конъюгат развести в 20 раз буфером для разведения и тщательно перемешать пипетированием (раствор готовили непосредственно перед использованием).
Для приготовления рабочего хромоген-субстратного раствора к 1,0 мл раствора хромогена добавить 9,0 мл раствора субстрата и тщательно перемешать. (раствор готовить непосредственно перед использованием, хранению не подлежит).
2. Проведение анализа.
2.1 Внести контрольные и испытуемые образцы сывороток
Освободить планшет из упаковки и внести в 2 повторах по 100 мкл положительного контроля, а также в 2 повторах по 100 мкл отрицательного контроля.
В остальные лунки планшета внести серию двукратных разведений исследуемых образцов (по два повтора на каждый образец).
Планшет заклеить пленкой и выдержать в течение 1 ч при температуре от +37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.
2.2 Промывание.
После окончания инкубации удалить жидкость из лунок и промыть планшет 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов, на автоматическом промывочном устройстве или вручную, доверху заполняя лунки (по 300 мкл/лунку). Затем жидкость окончательно удалить и подсушить планшет постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
2. 3 Внесение конъюгата.
В каждую лунку внести по 100 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител, планшет закрыть липкой пленкой и инкубировать в течение 1 часа при температуре +37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.
2.4 Промывание.
После окончания инкубации промыть планшет 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов.
2.5 Внесение хромоген-субстратного раствора.
В каждую лунку внести по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировать в течение 15 минут в темном месте при температуре от +20°С.
2.6 Остановка пероксидазной реакции.
Остановить реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты) и провести учет результатов на спектрофотометре в течение 10 мин после остановки реакции.
2.8. Регистрация результатов
450
Измерить величину оптической плотности субстратной смеси на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм (А) в течение 10 мин после остановки реакции.
450
450
-
+
Вычислить среднее арифметическое значение оптической плотности отрицательного (АК) и положительного (АК) контролей по формулам 1 и 2.
450
ср
450
1
450
2
-
-
-
АК=(АК+АА К)/2   (1)
где
450
1
-
- АК - значение оптической плотности пробы 1 отрицательного контроля,
450
2
-
- АК - значение оптической плотности пробы 2 отрицательного контроля.
450
ср
450
1
450
2
+
+
+
АК=(АК+АА К)/2   (2)
где
450
1
+
- АК - значение оптической плотности пробы 1 положительного контроля,
450
2
+
- АК - значение оптической плотности пробы 2 положительного контроля.
450
450
ср
Вычислить среднее значение А для каждой опытной пробы (АОП) по формуле 3:
450
ср
450
1
450
2
АОП=(АОП+АОП)/2    (3)
где
450
1
- АОП - значение оптической плотности пробы 1,
450
2
- АОП - значение оптической плотности пробы 2.
При этом результаты измерения, полученные на контрольных образцах, должны удовлетворять следующим требованиям:
450
ср
+
1. Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (АК) - не менее 0,6;
450
ср
-
2. Среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (АК) - менее 0,2.
При получении иных показателей исследование необходимо повторить.
2.9 Интерпретация результатов.
450
Для интерпретации результатов вычисляют отсекающие значения оптической плотности А (Cut off).
Значение Cut off вычисляют по формуле:
450
ср
450
-
-
Cut off=АК+3 х SD АК,
где
450
-
- SD АК - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля.
450
ср
Титр антител вычисляли как последнее разведение образца, в котором АОП выше, чем значение Cut off в 2 раза
Результаты проведенного исследования представлены в таблице 3.
Таблица 3. Титры антител к RBD в образцах плазмы и сыворотки крови реконвалесцентов COVID-19
Номер пациента
Титр антител к RBD
1
1:512
2
1:256
3
1:64
4
1:32
5
1:256
6
1:128
7
1:512
8
1:256
9
1:128
10
1:256
Таким образом, результаты проведенного исследования, доказывают, что разработанная тест-система может быть использована для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2.
Специалисту среднего уровня понятно, что данная тест система может также использоваться для детекции антител к белку RBD вируса SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови людей, для оценки напряженности иммунного ответа после введения вакцины, содержащей своем составе рецептор-связывающий домен RBD вируса SARS-CoV-2 или его ген.
Пример 8 Сравнение тест-систем для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека с различными вариантами адсорбированных белков коронавируса по их способности неспецифически определять антитела против сезонного коронавируса человека ОС43.
Задача данного эксперимента заключалась в сравнении нескольких тест-систем для иммуноферментного анализа, основанных на использовании рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 (разработанная тест-система), или рекомбинантного полноразмерного белка S вируса SARS-CoV-2, или разрушенного вируса SARS-CoV-2, по их способности неспецифически связываться с антителами к сезонному коронавирусу ОС43, который циркулирует в популяции человека.
На первом этапе полноразмерный белок S вируса SARS-CoV-2, или вирус SARS-CoV-2, инактивированный нагреванием при температуре 56°С в течении 30 мин и разрушенный воздействием УЗ (в течение 1 минуты на ультразвуковом гомогенизаторе soniprep 150 Plus, MSE), наносили в лунки планшетов для иммуноферментного анализа в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл и адсорбировали ночь при температуре +4°С.
Таким образом, к началу эксперимента было подготовлено 3 планшета:
1. планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2 2 SEQ ID NO:2, являющийся частью разработанной тест-системы (пример 5);
2. планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2;
3. планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках вирусом SARS-CoV-2, инактивированным нагреванием и разрушенным с помощью ультразвука.
Затем подготовили рабочие растворы необходимые для анализа (тест-система пример 5).
Для приготовления рабочего раствора буфера для промывания планшетов концентрат промывочного буфера развести в 25 раз дистиллированной водой.
Для приготовления рабочего раствора конъюгата, конъюгат развести в 20 раз буфером для разведения и тщательно перемешать пипетированием (раствор готовили непосредственно перед использованием).
Для приготовления рабочего хромоген-субстратного раствора к 1,0 мл раствора хромогена добавить 9,0 мл раствора субстрата и тщательно перемешать (раствор готовить непосредственно перед использованием, хранению не подлежит).
Далее в лунки каждого из 3 планшетов нанесли:
1) положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD коронавируса SARS-CoV-2 (тест-система, пример 5) в 2 повторах по 100 мкл;
2) отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD коронавируса SARS-CoV-2 (тест-система, пример 5) в 2 повторах по 100 мкл;
3) образцы сыворотки крови пациентов, которые перенесли заболевание, вызванное сезонным коронавирусом ОС43, но при этом не болели COVID-19 (10 образцов), разведенные в 200 раз в 2 повторах по 100 мкл.
Далее все планшеты заклеили пленкой и выдержали в течение 1 ч при температуре +37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.
После окончания инкубации удалили жидкость из лунок и промыли планшеты 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов. Затем жидкость окончательно удалили и подсушили планшеты постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
Далее в каждую лунку внесли по 100 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител, планшеты закрыли липкой пленкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре +37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.
После окончания инкубации промыли планшеты 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов.
Затем в каждую лунку всех 3 планшетов внесли по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировали в течение 15 минут в темном месте при температуре от 20°С
После этого остановили реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты) и провели учет результатов на спектрофотометре в течение 10 мин после остановки реакции.
450
Далее измерили величину оптической плотности субстратной смеси на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм (А) в течение 10 мин после остановки реакции.
450
450
-
+
Вычислили среднее арифметическое значение оптической плотности отрицательного (АК) и положительного (АК) контролей для каждого планшета по формулам 1 и 2.
450
ср
450
1
450
2
-
-
-
А К=(А К+АА К)/2 (1)
где
450
1
-
- А К - значение оптической плотности пробы 1 отрицательного контроля,
450
2
-
- А К - значение оптической плотности пробы 2 отрицательного контроля.
450
ср
450
1
450
2
+
+
+
А К=(А К+АА К)/2 (2)
где
450
1
+
- А К - значение оптической плотности пробы 1 положительного контроля,
450
2
+
- А К - значение оптической плотности пробы 2 положительного контроля.
450
450
ср
Вычислили среднее значение А для каждой опытной пробы (АОП) по формуле 3:
450
ср
450
1
450
2
АОП=(АОП+АОП)/2 (3)
где
450
1
- А ОП - значение оптической плотности пробы 1,
450
2
- А ОП - значение оптической плотности пробы 2.
450
Для интерпретации результатов вычислили отсекающие значения оптической плотности А (Cut off).
Значение Cut off вычислили по формуле:
450
ср
450
-
-
Cut off=АК+3 х SD АК,
где
450
-
- SD АК - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля.
450
ср
Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считался положительным, если АОП выше, чем значение Cut off в 2,5 раза.
Для планшета с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2 2 SEQ ID NO:2:
450
ср
+
Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (АК) составило 1,960.
450
ср
-
Среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (АК) составило 0,052.
Средние значения оптической плотности позволяют говорить о том, что исследование прошло успешно и его результаты достоверны.
Значение Cut off составляет:
Cut off=0,052+3 х 0,0000125=0,052038
450
ср
В данном тесте исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считался положительным, если АОП было выше, чем значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,052038=0,13).
450
ср
Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается отрицательным, если АОП не превышало значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,052038=0,13).
Для планшета с адсорбированным в лунках полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2:
450
ср
+
Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (АК) составило 2,008.
450
ср
-
Среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (АК) составило 0,064.
Средние значения оптической плотности позволяют говорить о том, что исследование прошло успешно и его результаты достоверны.
Значение Cut off составляет:
Cut off=0,064+3 х 0,0001805=0,064542
450
ср
В данном тесте исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считался положительным, если АОП было выше, чем значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,064542=0,16).
450
ср
Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается отрицательным, если АОП не превышало значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,064542=0,16).
Для планшета с адсорбированным в лунках вирусом SARS-CoV-2, инактивированным нагреванием и разрушенным с помощью ультразвука:
450
ср
+
Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (АК) составило 2,081
450
ср
-
Среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (АК) составило 0,061.
Средние значения оптической плотности позволяют говорить о том, что исследование прошло успешно и его результаты достоверны.
Значение Cut off составляет:
Cut off=0,061+3 х 0,0001325=0,0613975.
450
ср
В данном тесте исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считался положительным, если АОП было выше, чем значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,0613975=0,15).
450
ср
Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается отрицательным, если АОП не превышало значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,0613975=0,15).
Полученные результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4. Средняя оптическая плотность опытных и контрольных образцов, полученная в результате проведения сравнительного анализа тест-систем для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека с различными вариантами адсорбированных белков коронавируса по их способности неспецифически определять антитела против сезонного коронавируса человека ОС43.
Таблица 4
Исследуемый образец
RBD
Полноразмерный белок S
Вирус SARS-CoV-2
1
0,055
0,159
0,132
2
0,060
0,493
0,519
3
0,053
0,152
0,414
4
0,054
0,142
0,117
5
0,055
0,268
0,436
6
0,055
0,143
0,134
7
0,048
0,065
0,136
8
0,048
0,351
0,581
9
0,049
0,130
0,090
10
0,049
0,159
0,281
K-
0,052
0,064
0,061
K+
1,960
2,008
2,081
Неожиданно было выявлено, что использование разработанной тест-системы для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2 (тест-система по примеру 5) для анализа сыворотки и плазмы крови человека на наличие антител к вирусу SARS-CoV-2 не дает ложноположительных результатов у пациентов перенесших заболевание, вызванное сезонным коронавирусом человека ОС43, тогда как при использовании тест-системы для иммуноферментного анализа сыворотки и плазмы крови человека с адсорбированным в лунках полноразмерным белком S наблюдалось 30% ложноположительных результатов, а при использовании тест-системы для иммуноферментного анализа сыворотки и плазмы крови человека с адсорбированным в лунках вирусом SARS-CoV-2, инактивированным нагреванием и разрушенным с помощью ультразвука наблюдалось 50% ложноположительных результатов.
Результаты проведенного исследования можно объяснить тем, что полученный авторами рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2 имеет низкий процент гомологии с вирус-связывающим доменом белка S вируса ОС43. Таким образом, использование рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2 (по сравнению с полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2 или разрушенным вирусом SARS-CoV-2) в тест-системе для иммуноферментного анализа сыворотки и плазмы крови человека для определения антител к вирусу SARS-CoV-2 приведет к получению более точных и достоверных результатов.
Пример 9. Оценка результатов, полученных при использовании тест-системы для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека в различных экспериментальных условиях.
В данном исследовании использовали тест-систему для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека (пример 5), в качестве исследуемого образца выбрали плазму крови человека с известным титром антител против белка RBD вируса SARS-CoV-2 (1:512). Была проведена серия экспериментов, в которых анализ титра антител против белка RBD вируса SARS-CoV-2 проводился по протоколу, описанному в примере 7, за исключением 1 параметра, который был изменен.
Эксперимент №1. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7 (контроль).
Эксперимент №2. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила +36°С.
Эксперимент №3. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила +38°С.
Эксперимент №4. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации с конъюгатом, которая составила +36°С.
Эксперимент №5. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации с конъюгатом, которая составила +38°С.
Эксперимент №6. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации с хромогеном, которая составила +15°С.
Эксперимент №7. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила +25°С.
Эксперимент №8. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме скорости перемешивания при инкубации исследуемых образцов, которая составила 250 оборотов/минуту.
Эксперимент №9. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме скорости перемешивания при инкубации исследуемых образцов, которая составила 350 оборотов/минуту.
Эксперимент №10. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме скорости перемешивания при инкубации с конъюгатом, которая составила 250 оборотов/минуту.
Эксперимент №11. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме скорости перемешивания при инкубации с конъюгатом, которая составила 350 оборотов/минуту.
Полученные результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5. Титр антител к белку RBD вируса SARS-CoV-2, полученный в экспериментах №1-11
Эксперимент №
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
ТитрIgG кбелкуRBD
1:512
1:512
1:512
1:512
1:512
1:512
1:512
1:512
1:512
1:512
1:512
Как видно из представленных данных, изменение температуры, скорости перемешивания при инкубации с исследуемыми образцами и антителами, а также температуры при инкубации с хромогеном в указанном диапазоне значений, не влияет на полученный результат.
Кроме того, была проведена серия экспериментов, в котором разработанная тест система (пример 5) использовалась для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов, наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2. Эксперименты проводили по протоколу, описанному в примере 6, за исключением 1 параметра, который был изменен.
Эксперимент №12. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6 (контроль).
Эксперимент №13. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила +36°С.
Эксперимент №14. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила +38°С.
Эксперимент №15. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации с конъюгатом, которая составила +36°С.
Эксперимент №16. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации с конъюгатом, которая составила +38°С.
Эксперимент №17. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации с хромогеном, которая составила +15°С.
Эксперимент №18. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила +25°С.
Эксперимент №19. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме скорости перемешивания при инкубации исследуемых образцов, которая составила 250 оборотов/минуту.
Эксперимент №20. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме скорости перемешивания при инкубации исследуемых образцов, которая составила 350 оборотов/минуту.
Эксперимент №21. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме скорости перемешивания при инкубации с конъюгатом, которая составила 250 оборотов/минуту.
Эксперимент №22. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме скорости перемешивания при инкубации с конъюгатом, которая составила 350 оборотов/минуту.
Полученные результаты представлены в таблице 6.
450
ср
Таблица 6. Среднее значение оптической плотности опытного образца (AОП) при длине волны 450 нм, полученное в серии экспериментов №12-22
Эксперимент №
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
A<sub>450</sub>
1,69
1,69
1,69
1,69
1,69
1,69
1,69
1,69
1,69
1,69
1,69
Как видно из представленных данных, изменение температуры, скорости перемешивания при инкубации с исследуемыми образцами и антителами, а также температуры при инкубации с хромогеном в указанном диапазоне значений, не влияет на полученный результат. А время проведения анализ составляет 2,5 часа.
Таким образом, разработаны генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 и способ его получения, а также тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, которая позволяет быстро и эффективно проводить тест для определения наиболее перспективных образцов сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.
--->
Перечень последовательностей
SEQ ID NO:1
<110> ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России
<120> Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента
рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника
китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2,
способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система
для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее
применение
<160> 1
<170> BISSAP1.3.6
<210> 1
<211> 765
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
atgggctgga gcttgatcct tctgttcctg gttgctgtgg ccaccagagt gctgtctcgg      60
gtgcagccca ccgaatccat cgtgcggttc cccaatatca ccaatctgtg ccccttcggc     120
gaggtgttca atgccaccag attcgcctct gtgtacgcct ggaaccggaa gcggatcagc     180
aattgcgtgg ccgactactc cgtgctgtac aactccgcca gcttcagcac cttcaagtgc     240
tacggcgtgt cccctaccaa gctgaacgac ctgtgcttca caaacgtgta cgccgacagc     300
ttcgtgatcc ggggagatga agtgcggcag attgcccctg gacagacagg caagatcgcc     360
gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgtg tgattgcctg gaacagcaac     420
aacctggact ccaaagtcgg cggcaactac aattacctgt accggctgtt ccggaagtcc     480
aatctgaagc ccttcgagcg ggacatctcc accgagatct atcaggccgg cagcacccct     540
tgtaacggcg tggaaggctt caactgctac ttcccactgc agtcctacgg ctttcagccc     600
acaaatggcg tgggctatca gccctacaga gtggtggtgc tgagcttcga actgctgcat     660
gcccctgcca cagtgtgcgg ccctaagaaa agcaccaatc tcgtgaagaa caaatgcgtg     720
aacttcgcgg ccgcacatca ccaccatcac catcatcatt gataa                     765
SEQ ID NO:2
<110> ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России
<120> Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента
рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника
китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2,
способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система
для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее
применение
<160> 1
<170> BISSAP1.3.6
<210> 2
<211> 229
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35                  40                  45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50                  55                  60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85                  90                  95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100                 105                 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115                 120                 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130                 135                 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165                 170                 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180                 185                 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195                 200                 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe His
210                 215                 220
His His His His His
225
<---