Способ оценки токсичности микро- и наночастиц по их морфологическим признакам
METHOD FOR ESTIMATING THE TOXICITY OF MICRO- AND NANOPARTICLES BY THE MORPHOLOGICAL FEATURES THEREOF

Изобретение относится к нанотехнологии, нанотоксикологии и медицине, а также к аналитической химии и материаловедению, в частности, к способу оценки степени токсичности частиц различной формы микро- и наноразмерного диапазона. При попадании в организм наночастицы преодолевают различные биологические барьеры, поэтому в определении и предсказании токсичности нанообъектов их характеристики являются очень важным параметром.
Свойства, благодаря которым наноматериалы столь привлекательны для широкого использования, делают их при определенном стечении обстоятельств опасными для человека и природы. Поэтому изучение их токсичности является важным аспектом с точки зрения оценки риска их влияния на окружающую среду, включая живые организмы. Токсичность твердых веществ зависит от размера их частиц. Тщательно размельченные твердые вещества являются более токсичными, чем те же вещества, имеющие более крупные частицы.
Согласно опубликованным работам, токсикологическая концепция оценки наночастиц базируется на относительно систематическом изучении немного более 10 типов частиц: серебра, золота, меди, алюминия, диоксида титана, оксидов цинка и кремния, фуллеренов, углеродных нанотрубок, оксида алюминия, оксида железа, селенида кадмия и ряда других [Исламов Р.А. Токсичность наноматериалов / Р.А. Исламов // Статья опубликована на сайте: www.nanometer.ru/2009/01/24/12328081661266-55571.html.]. В результате многочисленных исследований было установлено, что особенности токсического действия наночастиц, в отличие от макроформ веществ, зависят от множества факторов: физической природы их, свойств поверхности, структуры нанокластеров и наночастиц, разнообразия размеров, форм, способов получения и диспергирования, концентрации, состава, примесей, а также последствий биомодификации и биотрансформации одного и того же материала, биологической модели, на которой проводятся испытания. Причем, изменения этих факторов не всегда линейны.
Исходя из указанных сведений, очень важно знать количественный показатель токсичности наночастиц. В настоящее же время определяют только конкретные морфологические характеристики указанных частиц, по которым и судят об их токсичности.
Например, известны методики оценки морфометрических параметров наночастиц по монохромным и бинарным изображениям, основанные на автоматизации вычисления коэффициентов формы плоских фигур, предназначенные для быстрого получения данных о фракционном составе сыпучих материалов (Li L., Iskander М., Evaluation of Dynamic Image Analysis for Characterizing Granular Soils // Geotechnical Testing Journal. - №11, 2019. - p.; Wadell H. Volume, Shape and Roundness of Quartz Particles // Journal of Geology - 1935. - Vol. 43, no. 3. - P. 250-280).
Такие методики позволяют получить данные о размере частиц и представление об их форме, однако они не предусматривают оценку особенностей внутренней и поверхностной конфигурации частиц, которые являются важными при токсикологических исследованиях, а кроме того, не обеспечивают достоверного результата при оценке волокнистых частиц и материалов.
2
3
Известен метод оценки микропористости материалов из публикации Спивак, Ю.М. Определение параметров пористой структуры в por-Si и por-AlO путем компьютерной обработки данных растровой и атомно-силовой микроскопии / Ю.М. Спивак, (Соколова) Екатерина Николаевна Муратова, О.С. Петенко, П.Г. Травкин. - Текст: непосредственный // Молодой ученый. - 2012. - №5 (40). - С. 1-4. Данный метод имеет узкое применение и позволяет оценивать внутреннюю конфигурацию только материалов, а не отдельных частиц. Кроме того, данный метод не позволяет оценить иные особенности внешней или внутренней конфигурации, которые тоже важны для установления токсичности веществ.
Из диссертационной работы Карамова Данфиса Данисовича «Атомно-силовая микроскопия субмикронных пленок полидифениленфталида» известен способ оценки состояния поверхности частиц и материалов с использованием данных, полученных при атомно-силовой микроскопии, недостатком которого является то, что он не применим к изображениям полученными другими более распространенными дешевыми методами, используемыми в рутинной практике.
Известен способ, описанный в патенте US 6774905 «Image data processing», предполагающий сравнение анализируемого изображения с эталонным, именно такой подход и является недостатком, так как в отсутствие эталона невозможно охарактеризовать объект в полной мере.
6
48
Из уровня техники известны технические решения, которые позволяют установить степень токсичности наночастицы посредством влияния на живые организмы. Например, из патента РФ №2692675 известен недеструктивный способ оценки цитотоксичности наночастиц с использованием микроводоросли Dunaliella salina в качестве биосенсора. Способ заключается в недеструктивной фотометрической оценке содержания хлорофилла в суспензиях культур микроводоросли Dunaliella salina, включает культивирование микроводоросли Dunaliella salina с использованием питательной среды Бен-Амотца, разведение наночастиц золота культуральной средой Бен-Амотца, подготовку проб путем внесения культуры микроводоросли Dunaliella salina в разведенные наночастицы золота таким образом, чтобы посевная доза составила 10 клеток/мл, триплицирование проб, инкубирование проб в течение 48 ч, фотометрическое измерение суспензий культур Dunaliella salina in vivo путем регистрации экстинкции на трех длинах волн: 640, 680 и 740 нм, вычисление высоты пика поглощения хлорофилла, расчет значения эффективности токсического действия по формуле, далее рассчитывают значения полуэффективной концентрации наночастиц золота ЕС50 методом линейной интерполяции по формуле. Вышеописанный способ позволяет эффективно оценить токсическое действие наночастиц золота.
Из патента РФ №2477485 известен способ оценки безопасности введения наночастиц меди в организм, заключающийся в определении изменения показателя экспрессии антигена каспазы-3 в микроглиоцитах сенсомоторной зоны коры головного мозга после введения наночастиц меди по сравнению с контрольной группой животных путем подсчета экспрессирующих каспазу-3 микроглиоцитов на условной единице площади идентичных сенсомоторных зон. Предлагаемый способ позволяет определить допустимую дозу вводимого препарата, органы-мишени, выбрать наиболее оптимальный способ введения препарата в организм.
Из патента РФ №2578545 известен способ оценки токсического действия наночастиц серебра, инкапсулированных в полимерную матрицу арабиногалактана, на ткань головного мозга лабораторных животных в отдаленном периоде воздействия. Способ включает воздействие на животных опытной группы токсикантом путем внутрижелудочного введения водного раствора АГ с наночастицами серебра (нано-Ag-Ar) из расчета 100 мкг серебра на килограмм массы в 0,5 мл дистиллированной воды на протяжении 9 дней. Подсчитывают количество патологически измененных нейронов без экспрессии каспазы 3, число патологически измененных нейронов с экспрессией каспазы 3, количество нормальных нейронов без экспрессии каспазы 3, количество нормальных нейронов с экспрессией каспазы 3, общее количество нейронов на единицу площади среза. Вычисляют отношения этих показателей на препаратах опытной группы к аналогичным показателям на препаратах контрольной группы. При увеличении числа патологически измененных нейронов без экспрессии каспазы 3 в 1,6 раза по отношению к контрольной группе, увеличении числа патологически измененных нейронов с экспрессией каспазы 3 в 2,7 раз по отношению к контрольной группе, снижении числа нормальных нейронов без экспрессии каспазы 3 в 0,6 раз по отношению к контрольной группе, увеличении числа нормальных нейронов с экспрессией каспазы 3 в 2 раза по отношению к контрольной группе, а также снижении общего числа нейронов на единицу площади в 0,5 раз по отношению к контрольной группе делают заключение о развитии патологического процесса с преобладанием повреждений нейронов по типу апоптоза в ткани головного мозга в отдаленном периоде воздействия нано-Ag-Ar.
Однако все указанные известные технические решения характеризуют способы установления токсичности наночастиц через конкретное воздействие на биологический организм, что является сложным и не во всех случаях применимым.
Также известны технические решения по установлению токсичности (качественному показателю) частиц.
В статье «Morphological and Physicochemical Characterization of Agglomerates of Titanium Dioxide Nanoparticles in Cell Culture Media» за авторством Veronica Freyre-Fonseca и др. доказывается, что морфологические признаки частиц (размер и форма) находятся во взаимосвязи с их агломерационной способностью, что в свою очередь указывает на взаимосвязь между геометрией наноразмерных частиц и стабильностью их размера, а следовательно, и степень токсичности для окружающей среды.
Однако, в статье не показывается количественная связь между токсичностью и размером частиц непосредственно, по их данным невозможно установить степень или количественный уровень токсичности частиц по морфологическим признакам.
Связь ряда морфологических признаков частиц, а именно коэффициент сферичности и состояние поверхности частиц, с их токсичностью частично рассматривается в отчете ФБУН ФНЦ Медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения о НИР «Изучение особенностей внутреннего действия наночастиц на организм в целях оценки связанных с ним рисков для здоровья, различных мероприятий по управлению ими, в т.ч. нормирование наночастиц различных аэрозолях». Однако, в указанном отчете, рассматривается только один морфологический признак, а также отсутствуют графические или математические закономерности или иные указания по количественной (бальной) оценке токсичности частиц через их морфологические параметры, не приведена классификация частиц по морфологическим признакам в совокупности с токсичностью.
При этом из уровня техники не были выявлены известные способы оценки степени токсичности микро- и наночастиц по их морфологическим признакам, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому изобретению не представляется возможным.
Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении универсальности и возможности оценки токсичности микро- и наночастиц по их морфологическим признакам с использованием ряда комплекса оценочных показателей без привлечения биологических объектов.
Указанный технический результат достигается предлагаемым Способ оценки степени токсичности микро- и наночастиц по их морфологическим признакам, характеризующийся тем, что посредством растрового электронного сканирующего микроскопа осуществляют освещение частиц световым или электронным пучком, выполняют регистрацию изображений частиц, полученное изображение частицы переводят в режим двухцветного черно-белого изображения и получают изображение проекции частицы, далее с использованием проекции частицы определяют следующие морфологические признаки этой частицы: коэффициент сферичности, пористость, строение поверхности частицы, внутреннюю конфигурацию частицы путем установления ее полнотелости или пустотелости, заполняемости жидкостью или газом; проводят бальную оценку полученных при измерении морфологических признаков частицы, исходя из следующей шкалы:
а о степени токсичности частицы судят по индексу токсичности /, определяемому по формуле:
где I - индекс токсичности частицы;
1…n
R - баллы, исходя из морфологических признаков частицы;
причем при значении индекса токсичности более 0,8, токсичность частицы оценивают как низкую, при значении индекса равного 0,4-0,8 токсичность частицы оценивают как среднюю, а при значении индекса менее 0,4 токсичность частицы оценивают как высокую.
Поставленный технический результат обеспечивается за счет следующего.
К наночастицам (далее - НЧ) относят материалы размером менее 100 нм, а к микрочастицам - материалы размером 100-2500 нм.
Интенсивное развитие производства и использования наноматериалов, обладающих высокой реакционной способностью и реактивностью по сравнению с другими материалами большего размера, требует проведение оценки их токсических свойств, прогнозирования опасности для людей, животных, растений и экосистем в целом, разработки критериев вредного действия материалов, имеющих нанометровые размеры.
В соответствии с современными представлениями о составе, физико-химических свойствах и форме наноматериалов можно выделить основные следующие их виды: углеродные наночастицы (фуллерены, нанотрубки, графены, нанопены, нанопровода и др.), наночастицы элементарных (простых) веществ, бинарных соединений (окислов, сульфидов, нитридов и др.), сложных (тройных и более) химических соединений и композитных соединений на основе кремния, магния, цинка, титана, золота, серебра и др. металлов, квантовые точки, нанороботы и наночастицы органических полимеров и биополимеров.
По форме различают точечные наночастицы (с размером менее 100 нм в любом измерении), линейные (протяжные) объекты, такие как нанотрубки углерода, нановолокна, нанонити, нанофиламенты, что характеризуются одним макроскопическим измерением (длиной), двумерные объекты (пленки нанометровой толщины) и, наконец, трехмерные объекты с тонкой (фрактальной) структурой в нанометровом диапазоне (нанопен), нанокомпозиты и др.
По физическому состоянию при измельчении получают наночастицы в форме сплошных фаз или макродисперсий, а при молекулярной конденсации наночастиц из растворов или из газовой фазы, насыщенной парами веществ под влиянием восстановителей, электрического разряда, лазерного излучения, высокотемпературной плазмы и др. - конденсированные НЧ.
В организм человека НЧ могут поступать различными путями: через дыхательные пути, кожу, желудочно-кишечный тракт. Опасность их влияния связана с острым, подострым, хроническим воздействием и проявлением отдаленных эффектов действия. Накопленные экспериментальные данные свидетельствуют о низкой острой токсичности исследованных образцов при попадании наноматериалов в организм млекопитающих. Проявление подострого воздействия нанообъектов несколько отставлено во времени от начала введения, а длительное хроническое воздействие их может проявляться при достаточно низких концентрациях.
Реализация токсических свойств наноматериалов обеспечивается физическим сродством к биологическим структурам, например посредством электростатического или гидрофобного взаимодействия. Большинство негативных эффектов наноматериалов определяются окислительным стрессом и повреждением ДНК, что может привести к воспалительной реакции, апоптозу и некрозу клеток.
Технический результат предлагаемого способа достигается тем, что микро- и наноразмерные объекты (частицы и волокна) предлагается классифицировать и охарактеризовать на основе монохромных и бинарных изображений, полученных различными способами регистрации изображений, например, растровой электронной микроскопии в компьютерном анализаторе изображений. При этом определяют количественные характеристики формы, пористости, строения поверхности, внутренней конфигурации частиц, значения которых получают расчетным путем на основании измерений, выполненных по микроскопическим изображениям. А в качестве оценочного критерия токсичности микро- и наночастиц в заявляемом способе предлагается использовать относительный показатель - индекс токсичности, который определяется по формуле:
где I - индекс токсичности частицы;
1…n
R - баллы, исходя из морфологических признаков частицы;
При нахождении значения этого индекса, представляющего относительную безразмерную величину, используют совокупность значений, характеризующих исследуемую микро- и наночастицу. Причем каждому морфологическому признаку частицы было предложено присвоить свою бальную оценку в соответствии со шкалой, приведенной в таблице 1.
Причем при выборе системы индексации учитывали, что связь морфологии частицы с вероятным взаимодействие с тканями биологического объекта, заключается в том, что чем сложнее внешняя и внутренняя конфигурация частицы, тем, больше вероятность взаимодействия с тканями. Следовательно, частицы, не имеющие внутренней конфигурации и пористости, обладающие гладкой поверхностью и имеющие форму, максимально соответствующую сфере, обладают минимальной вероятностью взаимодействия с тканями организма. Поэтому численное значение «1» в предложенной формуле индекса токсичности характеризует модельную частицу, обладающую минимальной возможностью взаимодействия с тканями биологического объекта.
А о токсичности частицы судили по количественному показателю индекса токсичности: при значении индекса более 0,8, токсичность частицы оценивают как низкую, при значении индекса равного 0,4-0,8 токсичность частицы оценивают как среднюю, а при значении индекса менее 0,4 токсичность частицы оценивают как высокую.
При реализации предлагаемого способа осуществляют определенные операции в следующей последовательности (на примере конкретного выполнения):
1. Частицы, анализ которых требуется провести, собирают любым удобным и доступным способом. В настоящем примере рассматривается струйное осаждение частиц на поверхность двухстороннего углеродного скотча. Накладка углеродного скотча размещалась на поверхности нейтральной подложки, затем на поверхность скотча с помощью полой трубки и воронки наносили пробу исследуемого дисперсного материала, в количестве, соответствующем площади накладки углеродного скотча. После осаждения углеродный скотч на подложке поместили в герметичный контейнер.
2. Герметичный контейнер доставили к месту проведения анализа, а именно в лабораторию с растровым электронным сканирующим микроскопом, например, марки S-3400N (Hitachi, Япония) с максимальным ускоряющим напряжением 120 кВ.
3. Пластину из контейнера помещают в рабочие отсеки микроскопа и проводят съемку в режиме топографического контраста с получением изображений при кратности увеличений ×500. В зависимости от размера исследуемых частиц можно использовать и другую кратность увеличения, например, ×200; ×300; ×500 до ×2500, исходя из условия: чем меньше частица, тем выше кратность увеличения.
4. Полученные изображения загружают в удобный анализатор изображений, например, в настоящем примере использовали программу ImageJ. Но можно использовать и другие анализаторы изображений, например, компьютерные программы Видео-Тест, Image Expert и другие.
5. Изображение частицы переводят в режим двухцветного черно-белого изображения, получая изображение проекции частицы.
6. Определяют морфологические параметры частицы по ее проекции с использованием известных приемов и методик.
7. Вычисляют индекс токсичности и делают вывод о степени токсичности частицы
При вводе в компьютер изображения, на котором присутствуют анализируемые объекты, проводят следующие действия:
- Фильтрация для устранения артефактов регистрации изображения.
- Схематизация изображений всех объектов и их внутренних элементов, введенных в компьютер, выполняется за один проход обработки.
- Математический анализ параметров выделенных в ходе схематизации объектов. Вычисление отдельных параметров:
коэффициент сферичности по методике, описанной в пособии: Градус Л.Я. Руководство по дисперсионному анализу методом микроскопии. - М.: Химия, 1979. - 232 с.);
пористость по методу из публикации Solymar М., Fabricius I.L. Image analysis and estimation of porosity and permeability of Arnager Greensand, Upper Cretaceous, Denmark // Physics and Chemistry of the Earth, Part A: Solid Earth and Geodesy. - Volume 24, Issue 7, 1999. - P. 587-591;
оценивают строение поверхности частицы по способу из монографии Luerkens D.W. Theory and Application of Morphological Analysis: Fine Particles and Surfaces (Fine Particle Science & Technology. - CRC Press, 1991. - 304 p.;
оценивают внутреннюю конфигурацию частицы по алгоритму из второй главы монографии Naito М., Yokoyama Т., Hosokawa K., Nogi K. Nanoparticle Technology Handbook. - Elsevier, 2018. - 904 p.;
оценивают признаки агломератов, образуемых частицами, по методу из статьи Kittelson D.B. Engines and Nanoparticles: A Review // J. Aerosol Sci. - 1998, №5/6. - 575-588 p.;
- Удаление в изображении объектов/элементов, не подлежащих анализу.
- Вычисление индекса токсичности.
В таблице 2 приведены примеры конкретного осуществления, а именно примеры внешнего вида и описательных морфологических характеристик частиц, обнаруженных в рабочей зоне сварочного цеха, и индекс токсичности, описывающий их морфологические признаки, установленный, по предлагаемой формуле.
С точки зрения токсичности, чем меньше значение индекса, тем токсичнее частица.
Практическим путем была доказана достоверность токсичности частиц с полученными значениями индекса токсичности. Для этого проведен ряд опытов с использованием частиц с различным индексом токсичности.
Опыт 1.
Параллельно проводили оценку опасности дисперсных наноразмерных частиц оксида магния по способу из изобретения и по методике из нормативного документа «МР 1.2.0016-10 Методика классифицирования нанотехнологий и продукции наноиндустрии по степени их потенциальной опасности».
Результаты оценки по заявляемому способу показали, что индекс токсичности для исследуемых материалов составляет 0,4, что соответствует средней степени токсичности и соотносится с результатом по методике MP 1.2.0016-10, так как по ней данный материал оценивается, как обдающий средней степенью потенциальной опасности.
Опыт 2.
Параллельно проводили оценку опасности дисперсных наноразмерных частиц оксида алюминия по способу из изобретения и по методике из нормативного документа «МР 1.2.0016-10 Методика классифицирования нанотехнологий и продукции наноиндустрии по степени их потенциальной опасности».
Результаты оценки по предлагаемому способу показали, что индекс токсичности для исследуемого материала составляет 0,27, что соответствует высокой степени токсичности и соотносится с результатом по методике МР 1.2.0016-10, так как, согласно этой методике, данный материал оценивается, как обдающий высокой степенью потенциальной опасности.
Таким образом, предлагаемый способ является достоверным и точным и позволяет устанавливать степень токсичности микро-инаночастицы без использования биологического объекта.