СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО IN VITRO
METHOD FOR DETERMINING MEDICINAL SENSITIVITY OF NONSMALL CELL LUNG CANCER IN VITRO

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для определения лекарственной чувствительности немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) in vitro при выборе лекарственной терапии.
В настоящее время для лекарственного лечения НМРЛ используется несколько схем цитостатической (противоопухолевой) терапии, при этом выбор тех или иных препаратов осуществляется эмпирическим путем - на основании статистической вероятности получения положительного эффекта (Gentzler RD, Johnson ML. Complex decisions for first-line and maintenance treatment of advanced wild-type non-small cell lung cancer. Oncologist. 2015 Mar; 20(3):299-306. doi: 10.1634/theoncologist. 2014 - 0212).
Недостатком является отсутствие индивидуального подбора цитостатической лекарственной терапии.
Техническим результатом изобретения является индивидуальный подбор цитостатической лекарственной терапии на срезах опухолевой ткани, правильное и своевременное проведение цитостатической лекарственной терапии.
Указанный технический результат достигается в способе определения лекарственной чувствительности НМРЛ in vitro путем культивирования раковых клеток в присутствии цитостатика, в котором культивируют срезы опухолевой ткани толщиной 300-500 мкм, полученные из первичной опухоли, при этом срезы помещают в 24-луночный планшет, по 2 среза в каждую лунку с питательной средой и различными цитостатиками, часть лунок оставляют контрольными, культивируют в условиях CO2-инкубатора при постоянном перемешивании в течение 24 часов, по окончании культивирования один срез из пары помещают в формалин для дальнейшего гистологического исследования, второй - фиксируют в реагенте RNAlater и хранят при - 80°С до определения в них экспрессии РНК-маркеров, при увеличении экспрессии РНК-маркеров в сравнении с контрольным образцом определяют лекарственную чувствительность к исследуемому цитостатику.
На данный момент для разработки и усовершенствования противоопухолевой терапии in vitro используются два типа клеточных систем - иммортализованные опухолевые клеточные линии и первичные культуры опухолевых клеток.
Первые, иммортализованные («перевиваемые») клеточные линии - это однородная популяция клеток, которые ведут свое начало от первичной опухоли и обладают способностью непрерывно делиться вне организма в течение неограниченного количества пассажей. Линии НМРЛ с успехом используются для валидации таргетной терапии и для исследования механизмов химиочувствительности и резистентности, поскольку, они способны сохранять в своем геноме клинически значимые мутации, в том числе и в драйверных генах. Однако, иммортализованные клеточные линии представляют собой чистую гомогенную клеточную популяцию, утратившую многие свойства исходной опухоли, и сохранившие в «дистиллированном» виде только некоторые из ее молекулярных и биологических особенностей.
Известны первичные культуры опухолевых клеток, недавно выделенных из организма. Они гетерогенны по природе, полнее и объективнее характеризуют «родительскую» опухоль, по крайней мере, на первых этапах культивация. При пассировании in vitro такие клетки сохраняют морфологию и молекулярно-патогенетические характеристики клеток первичной опухоли, но большая их часть способна к весьма ограниченному росту in vitro (5-25 пассажей), в то время как проведение тестов на лекарственную чувствительность на ранних пассажах весьма затруднительно ввиду малого процента эпителиальных клеток в культуре. Также, процент успешной перевивки опухоли в культуру для рака легкого составляет не более 30%. Причем, представленные 30% выведенных первичных культур получают с помощью специальных условий культивирования и добавочных биоактивных компонентов, в частности, использования комбинации фидерных клеточных слоев и ингибитора Rho-связанной спиральной киназы ROCK, что делает подобную процедуру довольно затратной и трудоемкой по исполнению, а соответственно не совсем оптимальной для рутинного тестирования лекарственной чувствительности.
В качестве альтернативы по отношению к клеточным культурам, нами предложено использовать тканевые экспланты (тканевые срезы; слайсы). Слайсы представляют собой тонкие срезы толщиной 300-500 мкм опухолевой ткани, полученные из первичной опухоли. При культивировании в питательной среде до 7 суток слайсы сохраняют свою структуру без изменения морфологических свойств. Методика их получения проста, не занимает много времени и, может быть применена при большинстве солидных опухолей.
Основным преимуществом оценки лекарственной чувствительности с использованием слайсов представляется возможность сохранения архитектоники ткани, внутренней структуры и индивидуальной вариабельности опухоли.
Методика изготовления тканевых слайсов и их последующего культивирования состоит в следующем.
С помощью вибратома формируют срезы ткани толщиной, например, 400 мкм из первичной опухоли. Затем срезы опухоли помещают в 24-луночный планшет, по 2 среза в каждую лунку. В каждую лунку вносится 1 мл полной питательной среды с различными противоопухолевыми препаратами. Лунки с контролем содержат 1 мл питательной среды без препаратов. Планшет с пластинками культивируют в условиях CO2-инкубатора при постоянном перемешивании в течение 24 часов. После культивирования один срез из пары помещают в формалин для дальнейшего гистологического исследования, второй фиксируют в реагенте для стабилизации РНК в тканях - RNAlater, и хранят при - 80°С до выделения кДНК.
Производят морфологический анализ воздействия препаратов на ткань в сравнении с контрольным образцом, а именно анализ РНК - маркеров связанных с активацией процессов гибели клеток под воздействием препаратов. При увеличении экспрессии РНК-маркеров в сравнении с контрольным образцом определяют лекарственную чувствительность к исследуемому цитостатику.
Способ подтверждается следующим примером.
Для оценки воспроизводимости данного способа уровень экспрессии маркеров - мРНК HEXIM1, HSPA2, ТОВ1 и TSYPL2 был оценен методом ПЦР в режиме реального времени в 173 пластинках, полученных от 21 пациента. Выделенные из пластинок нуклеиновые кислоты перед проведением реакции обратной транскрипции обрабатывали ДНКазой. Для оценки значимости полученных результатов был использован метод 2^-ΔΔCt. Экспрессия кандидатных генов варьировалась в зависимости от исследуемых препаратов.
Больная Г., 65 лет. Диагноз: Периферический рак нижней доли правого легкого cT1bN0M0/pT2aN2M0 IIIA стадия. 16.09.2019 г. выполнена VATS справа, нижняя лобэктомия. По данным послеоперационного гистологического заключения высокодифференцированная аденокарцинома нижней доли правого легкого, преимущественно стелющегося строения, с ацинарным и солидными компонентами. Метастазы в 1 лимфоузле 4R группы, 1-7 группы, 1-8 группы, 1-9 группы, 1-11 группы нижней доли, 2 перибронхиальных лимфоузлах. Учитывая данные заключения, пациентке показано проведение адъювантной химиотерапии.
Из послеоперационного опухолевого материала были получены тканевые срезы, которые впоследствии прошли инкубацию в течение 24 часов с препаратом Цисплатин (30 мкг/ мл) и Гефитиниб (4 мкг/мл). Было обнаружено статистически значимое увеличение экспрессии всех кандидатных маркеров (HEXIM1, HSPA2, ТОВ1 и TSYPL2) при воздействии на тканевые пластинки цисплатина. Данные результаты продемонстрировали, что клетки, находящиеся в тканевой пластинке, реагируют на воздействие химиопрепарата в клеточной среде в соответствии с его механизмом действия (активируется система репарации ДНК).
Пациентке был назначен курс адъювантной химиотерапии по схеме Пеметрексед 500 мг/м2 в/в в 1 день + Цисплатин 75 мг/ м2 в/в в 1 день 21 дневного цикла. По данным контрольной КТ грудной клетки через 2 цикла химиотерапии отмечен частичный регресс.
Способ обеспечивает индивидуальный подбор цитостатической лекарственной терапии с использованием срезов опухолевой ткани, правильное и своевременное проведение цитостатической лекарственной терапии.