Сравнительная характеристика лимфокин-активированных киллеров, генерированных из различных источников

1 1

БИОТЕРАПИЯ 43

>- УДК 577.24:616-006.04 I. Zh. Shubina, K. S. Titov, O. V. Lebedinskaya, L. V Demidov, M. V. Kiselevsky COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF LYMPHOKINE-ACTIVATED KILLERS GENERATED FROM DIFFERENT CELL-SOURCES N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow ABSTRACT Comparative characteristics of lymphokine-activated killers (LAKs) generated from mononuclear leukocytes of peripheral blood, pleural effusion, spleen and liver of cancer patients was performed on the basis of morphology, immunophenotype and cytotoxicity analysis. Assessment methods involved morphological-histochemical study, flow cytometry and cytotoxicity tests. The data demonstrated technological feasibility for generation of highly functional LAKs with similar characteristics that may be obtained from different sources for adoptive immunotherapy of cancer patients. Key words: lymphokine-activated killers, malignant lesions. И. Ж. Шубина, К. С. Титов, О. В. Лебединская, Л. В. Демидов, М. В. Киселевский СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИМФОКИН-АКТИВИРОВАННЫХ КИЛЛЕРОВ, ГЕНЕРИРОВАННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва РЕЗЮМЕ Проведены исследования по сравнительной характеристике лимфокин-активированных киллеров (ЛАК), генерированных из монононуклеарных лейкоцитов периферической крови, экссудата, селезенки и печени онкологических больных на основе оценки морфологических, фенотипических и цитотоксических свойств ЛАК. Анализ клеточных популяций проведен с использованием методов морфо-гистохимического исследования, проточной цитофлюориметрии и цитотоксического теста. Полученные данные продемонстрировали возможность генерации из различных клеток-источников функционально активных ЛАК, имеющих сходную характеристику, которые можно применять для адоптивной иммунотерапии онкологических больных. Ключевые слова: лимфокин-активированные киллеры, злокачественные новообразования. Она отличается хорошей переносимостью и может ВВЕДЕНИЕ применяться совместно с другими традиционными Адоптивная иммунотерапия предполагает исполь- методами лечения - в случаях лекарственной резис-зование активированных ex vivo эффекторов иммуни- тентности, а также для стимуляции местного противо-тета. Наибольший клинический материал накоплен по опухолевого клеточного иммунитета. ИЛ2/ЛАК тераприменению интерлейкина-2 (ИЛ-2) в лечении злока- пия приводит к нормализации показателей иммунного чественных новообразований. В результате экспери- статуса и улучшению качества жизни онкологических ментальных исследований была выявлена возмож- больных [3; 9; 16]. ность генерировать in vitro лимфокин-активирован- В качестве источника для генерации ЛАК чаще ные киллерные (ЛАК) клетки, обладающие всего используются мононуклеарные лейкоциты пери-выраженной цитотоксической активностью в отноше- ферической крови (МНЛ), культивируемые в присут-нии опухолевых клеток [5; 10]. ствии препаратов ИЛ-2 [3; 6]. Адоптивная ИЛ-2/ЛАК иммунотерапия расширя- В настоящее время ИЛ-2/ЛАК терапия использует спектр возможностей противоопухолевого лечения. ется в адъювантном режиме с целью продления безре- —(

№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

цидивного периода и улучшения качества жизни он- метастазирования при росте опухолей различных ло-

кологических больных, а также для активации местно- кализаций, активация НКТ может усилить их цитоток-

го иммунного ответа в условиях локального (локо-ре- сический потенциал в отношении развивающихся ме-

гионарного) введения ЛАК [13; 17].

Проведенные в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина клинические исследования показали, что адоптивная иммунотерапия у пациентов со злокачественными выпотами (опухолевыми плевритами, асцитами и перикардитами) позволила получить клиническую эффективность у 88 % пациентов [1]. Следует отметить, что замедление или прекращение экссудации наступало только в тех случаях, когда в плевральном выпоте отмечалось значительное количество активированных лимфоидных клеток с наличием иммунобластов и митозов. Исследование показало эффективность предложенного метода адоптивной иммунотерапии при серозитах у больных диссеминированным раком яичников. При ИЛ-2/ЛАК терапии отмечалась деградация и последующее исчезновение из злокачественного выпота опухолевых клеток на фоне повышения числа активированных лимфоидных элементов у 67 % больных, а также снижение уровня маркера СА-125 у 50 % и частичная регрессия опухоли у 13 % пациенток [2]. При ИЛ-2/ЛАК терапии плевральных выпотов в качестве источника генерации лим-фокин-активированных киллеров были использованы лимфоциты, выделенные из экссудативной жидкости.

ИЛ-2/ЛАК иммунотерапия может также применяться для коррекции нарушений иммунитета у онкологических больных. В частности, при радикальных операциях у больных раком желудка производится спленэктомия как элемент лимфодиссекции 02, что вызывает длительную и спонтанно не восстанавливающуюся иммуносупрессию, приводящую к повышению количества послеоперационных инфекционных осложнений у больных данной категории, а по некоторым данным и уменьшает их 5-летнию выживаемость на 10 % [4; 12]. Вполне очевидно, что больные РЖ после радикальных операций, сопровождающихся удалением значительной части лимфоидной ткани, в том числе селезенки, нуждаются не только в заместительной, но и в дополнительной противоопухолевой терапии [15]. Для коррекции иммунологических нарушений у этой группы больных была исследована возможность применения ИЛ-2\ЛАК адоптивной имму-нотерапиии. В связи с этим была разработана методика генерации ЛАК-клеток из лимфоцитов селезенки для последующего применения в качестве адоптивной ИЛ-2/ЛАК иммунотерапии с использованием ИЛ-2 (ронколейкин).

В организме наряду с такими эффекторами врожденного иммунитета, как натуральные киллеры (НК), обнаруживают популяцию НКТ-клеток, экспресииру-ющих не только антигены НК (С016, С056), но и Т-клеточные маркеры (С03), генерация которых происходит главным образом в печени. По мнению некоторых исследователей [7; 8; 11; 14], НКТ обладают выраженной противоопухолевой активностью. Поскольку печень является одним из основных органов

тастазов.

Для оценки свойств ЛАК, получаемых из разных популяций клеток-источников, были проведены сравнительные исследования: изучение морфологических, фенотипических и цитотоксических свойств ЛАК, генерированных из монононуклеарных лейкоцитов (МНЛ) периферической крови, экссудата, селезенки и печени онкологических больных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение МНЛ из периферической крови

Из стабилизированной гепарином (20 ед/мл) периферической крови здоровых доноров выделяли моно-нуклеарные клетки (МНЛ) на одноступенчатом градиенте фиколла-урографина плотностью 1,077 г/см3 (ПанЭко, Россия) центрифугированием при 400 § в течение 30 мин. Лимфоидные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и трехкратно отмывали в 10-кратном объеме среды центрифугированием при 200 §. МНЛ культивировали в среде ЯРМ1 1640 с Ь-глутамином (150 мкг/мл), пенициллином (50 Ед./мл) со стрептомицином (50 мкг/мл), 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ПанЭко, Россия) (далее — полная среда) при 37 °С в атмосфере 5,0 % СО2.

Выделение МНЛ из экссудативной жидкости онкологических больных с метастатическим плевритом

Плевральную полость больных дренировали катетером на 2 нед. по разработанной в ГУ РОНЦ им.

Н. Н. Блохина методике под местной анестезией. В большинстве случаев плевральную пункцию проводили по лопаточной и задне-подмышечной линии. На основании рентгенологических исследований проводились пункции в оптимальных точках скопления плеврального выпота. Для дренирования плевральной полости использовали набор «Плеврокан» (фирмы США), кроме того, применяли подключичный катетер, соединенный со стерильными емкостями с гепарином (20 ед/мл), в которые эвакуировался экссудат. Собранный экссудат разделяли центрифугированием (1000 об/мин, 20 мин) на клеточную и плазменную части. Из клеточной фракции выделялись мононуклеар-ные (МНЛ) и опухолевые клетки на одноступенчатом градиенте плотности фиколла-урографина. Опухолевые клетки скапливались в виде белого кольца в области меньшей плотности, в то время, как МНЛ собирались на границе среды и градиента плотности. Интерфазное кольцо МНЛ собирали в 15-мл пробирки и трижды отмывали средой ЯРМ1 1640 посредством центрифугирования. Полученные МНЛ использовали для генерации ЛАК-клеток.

Выделение МНЛ из селезенки больных раком желудка, удаленной во время радикальной операции

В исследование были включены 23 больных со спленэктомией, которым была проведена радикальная

1 1

БИОТЕРАПИЯ 45

>- операция по поводу рака желудка. Во всех случаях ди- и среднеэффективное соотношение клетки-мише-агноз был подтвержден гистологически, преобладали ни/эффекторы (ЭС50), при котором отмечается лизис аденокарциномы различной степени дифференциров- 50 % опухолевых клеток. ки. Источником получения ЛАК-клеток служила селезенка, удаленная во время операции. Ее механически Проточная цитофлюориметрия измельчали и гомогенизировали. Взвесь спленоцитов Экспрессию поверхностных антигенов МНЛ дважды отмывали культуральной средой RPMI 1640 и ЛАК определяли при помощи моноклональных ани выделяли МНЛ на одноступенчатом градиенте плот- тител (Caltag Laboratories, США) против соответству-ности фиколла-урографина. Полученные МНЛ ресу- ющих антигенов. Результаты учитывали методом про-спендировали в полной культуральной среде и исполь- точной цитофлюорометрии на цитометре FACScan зовали для генерации ЛАК-клеток. (Becton Dickinson, США). Определяли уровень экспрессии дифференцировочных антигенов CD3, CD4, Выделение МНЛ из интактной ткани и парату- CD8, CD 16; активационных антигенов CD25, CD38, моральной области печени HLA-DR; молекул адгезии CD58. Гейт популяции клеВ исследование были включены 10 больных в воз- ток устанавливали на основе комбинации прямого расте от 15 до 67 лет с опухолевым поражением печени. (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния. При учете ре-Полученный операционный материал печени гомогени- зультатов подсчитывали 5000 событий в гейте. Стати-зир°вали механически в стеклянном гомогенизаторе стическая обработка материала проведена при помов стерильных условиях. Гепатоциты и эритроциты отде- щи программного пакета WINMDI 2.8. ляли от МНЛ центрифугированием при 50 g в течение 5 мин. МНЛ выделяли центирифугированием на гради- Морфо-гистохимическое исследование енте плотности фиколла-урографина. Полученные На 3-и сутки культивирования МНЛ и ЛАК кле-МНЛ ре суспендировали в полной среде RPMI 1640 точные суспензии центрифугировали и отмывали от и использовали для генерации ЛАК-клеток. среды для приготовления мазков клеток, которые окрашивали на РНК по Браше с контрольной обработкой Генерация ЛАК РНК-азой, эозин-азуром по Романовскому-Гимза, ре-Для получения культуры лимфокин-активирован- активом Шиффа по Шабадашу с контролем амилазой ных киллеров (ЛАК клеток) МНЛ, выделенные из пе- на гликоген и гликозаминогликаны (Р. Лилли, 1969). риферической крови, экссудативной жидкости, селе- в окрашенных по Браше мазках подсчитывалось про-зенки или печени, ресуспендировали в полной среде центное содержание выявляемых клеток. Статистиче-RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячь- ская обработка данных проводилась с использованием ей сыворотки, L-глутамина и антибиотиков (ПанЭко, программы «ИП-СО» (Россия). Россия) в концентрации 1х106 клеток в 1 мл среды. Затем добавляли 2000 МЕ/мл ИЛ-2 («Ронколейкин», РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Биотех, Россия). Клетки культивировали в пластико- Цитологическое изучение ЛАК, генерированных вых флаконах при 37 С и атмосфере 5 % СО2 в тече- из МНЛ периферической крови доноров, показало, что ние 3 сут. на 3-и сутки инкубации в мазках культуральной взвеси выявляются в большом количестве бластные клетки, Цитотоксичесий тест пролимфоциты и активированные пиронинофильные Цитотоксическую активность лимфоцитов опреде- лимфоциты, а также некоторое число клеточных форм ляли на НК-чувствительной линии эритробластного с морфогистохимическими признаками дендритных лейкоза человека К-562. Опухолевые клетки клеток (рис. 1). Бластные формы — клетки крупных (1x1°4 в 1 мл) инкубировали в полной культуральной размеров с эухроматичными ядрами, содержащими среде с МНЛ или ЛАК (в присутствии ИЛ-2) в соотно- несколько пиронинофильных ядрышек, и цитоплаз-шениях клетки-мишени/эффекторы, равных 1:5; 1:2; мой, имеющей ярко пиронинофильную окраску, ин-1:1 и 1:0,5 в плоскодонных 96-луночных микроплан- тенсивность которой значительно снижается после об-шетах (Costar, Франция) 48 ч. По истечении срока ин- работки РНК-зой. Данная морфогистохимическая кубации в лунки добавляли тетразолиевую соль МТТ характеристика свидетельствует об активности синте-(3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)2,5-дифенил тетразолия тических процессов в клетках и повышенном количес-бромид; ПанЭко, Россия)), которая метаболизируется тве РНК. Пролимфоциты и активированные лимфоци-жизнеспособными клетками, превращаясь в нераство- ты также имеют ярко пиронинофильную цитоплазму, римый в воде фармазан, и изменяя оптическую плот- интенсивность окраски которой уменьшается при дей-ность раствора пропорционально количеству выжив- ствии РНК-зы. ших клеток. Для последующей количественной оцен- Исследование иммунофенотипа ЛАК позволило ки кристаллы фармазана растворяли ДМСО установить, что эти клетки активно экспрессируют на (диметилсУльфоксид, Россия). Оптическую своей мембране антигены НК (CD16) - до 19,98 % по плотность измеряли на мультискане МСС-340 сравнению с экспрессией этого маркера на поверхнос-(Labsystem, финляндия) и рассчитывали процент ли- ти МНЛ, достигающей 9,13 %, и активационные мо-зиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности) лекулы CD25 - до 34,82 %, в то время, как на интакт- —(

№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

Рис. 1. Лимфокин-активированные киллеры (ЛАК) в культуре мононкулеарных лейкоцитов (МНЛ) периферической крови человека, инкубированных с интерлейкином-2 (3-и сутки культивирования).

Микрофотографии ЛАК в мазках культуральной взвеси:

А - окраска азуром 11-эозином. Ок. 10; об. 40;

Б - окраска метиловым зелёным-пиронином по Браше. Ок. 10; об. 100;

В - окраска Шифф-йодной кислотой по Шабада-шу. Ок. 10; об. 100

ных МНЛ экспрессия антигена к ИЛ-2 практически не регистрируется (1,49%) (рис. 2, А, Б).

Об активации ЛАК свидетельствует также повышенная экспрессия антигена главного комплекса гис-

Рис. 2. Экспрессия поверхностных антигенов на лимфоцитах периферической крови (МНЛ) и лимфо-кин-активированных-киллерах (ЛАК), представленная в режиме «ОоіРІоІ»:

А — МНЛ, уровень экспрессии ЄО3 - 64,80 %, СШ6 - 9,13 %, Є04 - 39,74 %, 0025 - 1,49 %;

Б — ЛАК, уровень экспрессии С03 - 57,31 %, С016 - 19,98 %, С04 - 14,16 %, С025 - 34,82 %

тосовместимости II класса (НЬА-ОЯ) (рис.3) и молекул адгезии (0058) (рис. 4).

Как следует из табл. 1, ЛАК, генерированные из МНЛ периферической крови, обладали достоверно большей НК-активностью по сравнению с интактны-ми МНЛ. ЭС50 для этих клеток составляет 2,2 и 5,6 соответственно. Исследование цитотоксической активности лимфоцитов показало, что при соотношении клетка-мишень/эффектор 1:5 МНЛ лизируют 52 % клеток К-562, в то время, как в аналогичных условиях ЛАК вызывают гибель 92 % опухолевых клеток. В меньших соотношениях (1:2 и 1:1) эти различия не столь значимы, хотя активность ЛАК превышает таковую для МНЛ.

Анализ морфологической, иммунофенотипичес-кой и цитотоксической характеристик генерированных клеток показал, что при воздействии ИЛ-2 на МНЛ периферической крови здоровых доноров происходила активация клеток лимфоидного ряда — генерация ЛАК. При этом зрелые лимфоциты подвергались

ЬАК

Эт: 106.06 СУ: 17.72

[405-1023] 2903

10й Ю1 Ю2 103 10*

HLA-DR

Рис. 3. Гистограммы экспрессии НГА-ОЯ на лимфоцитах периферической крови (МНЛ) и лимфокин-акти-вированных-киллерах (ЛАК):

А — МНЛ; Б - ЛАК;

По оси абсцисс - количество клеток; по оси ординат - интенсивность флюоресценции;

— гистограмма контрольных клеток;

— гистограмма клеток, окрашенных МКА к НГА-ОЯ

Ч

Рис. 4. Гистограммы экспрессии 0058 на лимфоцитах периферической крови (МНЛ) и лимфокин-активи-рованных-киллерах (ЛАК):

А — МНЛ; Б - ЛАК;

По оси абсцисс - количество клеток; по оси ординат - интенсивность флюоресценции;

— гистограмма контрольных клеток;

— гистограмма клеток, окрашенных МКА к 0058

бласттрансформации и характеризовались морфологически как пролимфциты и иммунобласты. Об активации лимфоцитов свидетельствует накопление РНК в цитоплазме, проявлявшееся в ее яркой пиронино-фильной окраске. Характер иммунофенотипа ЛАК в виде повышенной экспрессии активационных антигенов и молекул адгезии также отражает фенотипический профиль активированных лимфоцитов. Стимуляция цитотоксической функции проявилась в повышении киллерной активности ЛАК по отношению

к опухолевым клеткам в сравнении с интактными МНЛ периферической крови здоровых доноров.

При морфологическом изучении экссудата больных с метастатическим плевритом было выявлено, что в злокачественном выпоте при первом исследовании обнаруживается большое количество опухолевых клеток и незначительное число зрелых лимфоцитов и макрофагов (рис. 5, А).

В результате экстракорпоральной генерации ЛАК-клеток из МНЛ экссудата в культуре определялось

Цитотоксическая активность ЛАК-клеток и МНЛ, %

Таблица 1

Эффекторы Соотношение мишень*/эффектор эс50

1:5 1:2 1:1 1:0,5

ЛАК 92 52 35 16

±2,1 ±1,8 ±1,1 ±1,2 2,2

МНЛ 52 31 22 20

±1,1 ±2,1 ±1,3 ±3,2 5,6

* Клетки-мишень - эритробластный лейкоз человека К-562

большое количество бластных форм и пролимфоцитов. Цитологическое исследование остаточной экссудативной жидкости в конце 1-го курса внутриплев-ральной ИЛ-2/ЛАК иммунотерапии (14 сут) выявило практическое отсутствие или незначительное число деградирующих опухолевых клеток, а также наличие большого количества активированных лимфоцитов (см. рис. 5, Б).

При изучении иммунофенотипа данной популяции ЛАК наблюдалось увеличение экспрессии маркера НК 0016 (до 30 %), активационных антигенов 0025 (до 44 %), 0038 (до 24 %), молекул адгезии 0058 (до 87 %), маркера ГКГ II типа НГА-0Я (до 49 %) по сравнению с экспрессией тех же маркеров на поверхности МНЛ, выделенных из экссудата, которая для всех названных маркеров регистрировалась на уровне 0-10 %. Однако уровень экспрессии отмеченных поверхностных антигенов этой популяции ЛАК был несколько ниже, чем у ЛАК, генерированных из периферической крови здоровых доноров. Цитотокси-ческая активность ЛАК, генерированных из МНЛ экссудата, достигала 804,5 % , в то время, как цитотоксичность МНЛ экссудата составляла 55±3,8 % (р<0,05).

При анализе свойств ЛАК, генерированных из лимфоцитов селезенки больных РЖ, было обнаружено, что их морфо-функциональная характеристика совпадает с ЛАК, полученными из МНЛ периферической крови доноров. Эти клетки были представлены крупными лимфоцитами типа иммунобластов с экспрессией активационных молекул (0038+, 0058+, НГА-0Я+) и высокой цитотоксической активностью (до 90 % ± 2,2).

При опухолевом поражении печени в паратумо-ральной области обнаруживают большое количество НКТ-клеток. НКТ, выделенные из параметастатичес-ких участков печени больных, обладали почти в 3 раза большей НК-активностью по сравнению с интакт-ными МНЛ периферической крови этих пациентов (табл. 2). ЭС50 для данных субпопуляций составляет 1,3 и 3,5 соответственно. Исследование цитотоксичес-кой активности лимфоцитов показало, что при соотношении клетка-мишень/эффектор 1:5 МНЛ лизируют 62 % клеток линии К-562, в то время, как в аналогичных условиях НКТ-клетки печени вызывают гибель 90 % опухолевых клеток. При соотношениях 1:2 и 1:1 различия в цитотоксической активности значительно меньше, хотя активность НКТ остается более высокой по сравнению с МНЛ.

ЛАК, генерированные из НКТ печени онкологических больных, по своей киллерной активности почти на порядок превышают цитотоксичность интактных

Ч

Рис. 5. Культура клеток плеврального экссудата онкологических больных:

А - микрофотография опухолевых клеток в мазке культуральной взвеси плеврального экссудата онкологического больного;

Б - микрофотография опухолевой клетки, окруженной макрофагами и активированными лимфоцитами, в мазке культуральной взвеси плеврального экссудата онкологического больного при стимуляции интерлейкином-2.

Окр. азуром П-эозином. Ок. 10; об. 100

Таблица 2

Цитотоксическая и НК-активность ЛАК-клеток, полученных из НКТ печени и периферической крови онкологических больных с метастазами в печень, %

Эффекторы Соотношение мишени/эффекторы* ЭС5о

1:5 1:2 1:1 1:0,5

ЛАК

ЛАК

МНЛ 62±11 41±21 32±13 20±9 3,5

НКТ печени 90±21 56±16 43±9 27±11 1,3

* Клетки-мишень - эритробластный лейкоз человека К-562

МНЛ (ЭС50 равна 0,27 и 3,5 соответственно). При этом ЛАК, полученные из НКТ печени, превышают по цитотоксичности ЛАК, генерированные из МНЛ периферической крови. ЛАК, полученные из НКТ печени, также достоверно превосходят цитотоксичность ин-тактных НКТ-клеток печени (ЭС50 равна 0,27 и 1,3 соответственно). Наряду с этим следует отметить, что киллерные свойства НКТ-клеток печени практически не отличаются от активности ЛАК, генерированных из МНЛ при исследовании в указанном диапазоне соотношений клетка-мишень/эффектор.

Как следует из данных, представленных в табл. 3, уровень экспрессии дифференцировочных антигенов CD3, CD4 и CD8 ЛАК, полученных из лимфоцитов печени и периферической крови онкологических больных, различен. В популяции ЛАК из МНЛ периферической крови преобладает CD3+ и CD4+ (в 2 и 14,5 раз больше, чем в популяции ЛАК, генерированных из НКТ печени, соответственно), в то время, как экспрессия антигена CD8 выше на ЛАК, полученных из НКТ. Уровень экспрессии рецепторов ИЛ-2 (CD25) в рассматриваемых популяциях ЛАК существенно не отличается. Наиболее выраженные различия

наблюдаются в соотношении активационных антигенов 0038 и НЬА-0Я, уровень которых значительно выше на ЛАК из НКТ печени, чем на ЛАК из периферической крови (в 2 и 6,5 раз соответственно). Существенных различий в уровне экспрессии антигенов НК (0016, 0057) и молекул адгезии (0058) для ЛАК, полученных из обоих источников, не выявлено.

Таким образом, ЛАК, полученные из НКТ печени, существенно превышали по уровню НК-активности ЛАК-клетки из периферической крови, а также ин-тактные НКТ печени и МНЛ. Наиболее значимые различия выявлялись при соотношениях клетки-мишень/эффекторы 1:2; 1:1 и 1:0,5. ЛАК-клетки, полученные из НКТ печени онкологических больных, по своему иммунологическому фенотипу отличаются от ЛАК, генерированных из МНЛ периферической крови тех же больных. Эти различия выражаются прежде всего в уровне дифференцировочных антигенов 003 и 004, экспрессия которых выше на поверхности ЛАК, генерированных из МНЛ периферической крови. В то же время в популяции ЛАК, полученных из НКТ печени, отмечается больший процент клеток, экспрессирующих маркёры НК, молекулы адгезии

Таблица 3

Иммунофенотип ЛАК-клеток, полученных из НКТ печени и МНЛ периферической крови онкологических больных

CD-маркёр ЛАК из НКТ печени, % ЛАК из МНЛ периферической крови онкологических больных, %

CD3 44,7 ± 7,1 73,3± 5,4

CD4 18,3± 3,5 44,1± 4,1

CD8 28,4± 6,2 18,6± 3,4

CD16 6,3± 2,2 10,9± 3,1

CD25 13,0± 4,3 11,3± 2,3

CD38 49,2± 6,5 25,7± 5,5

CD57 18,1± 3,1 15,1± 4,2

CD58 31,7± 5,2 25,9± 3,7

HLA-DR 46,2± 4,6 7,9± 4,5

и активационные антигены 0038 и НЬА-0Я по сравнению с ЛАК из МНЛ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что из НКТ печени могут быть получены ЛАК, обладающие более высокой цитотокси-ческой активностью, чем ЛАК, генерированные из МНЛ периферической крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, при сравнительной оценке ЛАК, генерируемых из МНЛ периферической крови здоровых доноров и онкологических больных, МНЛ, выделенных из экссудативной жидкости больных с метастатическим плевритом, селезенки и НКТ онкологических больных, показано, что ЛАК, полученные из популяций различных клеток-источников, имеют сходные морфологические, иммунофенотипические и цитоток-сические свойства. При этом клеточный состав популяции активированных ИЛ-2 мононуклеарных лейкоцитов включает значительное количество пролимфоцитов и бластных клеток. Иммунофенотипические и функциональные свойства ЛАК заметно отличаются от свойств интактных лимфоцитов, что проявляется в повышенной экспрессии активационных антигенов и значительном усилении цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток. В результате проведенных исследований предложены варианты генерации функционально активных ЛАК из различных клеток-источников, которые могут быть использованы для адоптивной иммунотерапии онкологических больных.

ЛИТЕРАТУРА

1. Давыдов М. И., Нормантович В. А., Киселевский М. В. и др. Адоптивная иммунотерапия при опухолевых плевритах: клинико-лабораторное исследование // Российский онкологический журнал. - 2000. -№ 6. - С. 14-17.

2. Киселевский 'М. В., Блюменберг А. Г. Адоптивная иммунотерапия рака яичников: Сборник статей, приуроченный к Европейской школе по онкологии. -2001. - С. 164-176.

3. Розенберг С. Адоптивная клеточная терапия: клинические исследования В. Т. ДеВита, С. Хеллман, С. А. Розенберг (ред.). Биологические методы лечения онкологических заболеваний: Пер. с англ. - М.: Медицина, 2002. - С. 504-522.

4. Суслов Ю. А., Шпиготский А. Н., Балуева Н. В. и др. Комбинированная химиоиммунотерапия в лечении распространенного рака желудка // Медицинский вестник. - 2003. - № 2. - С. 12-16.

5. Топейлиен С. Л. Адоптивная клеточная терапия: преклинические исследования В. Т. ДеВита, С. Хеллман, С. А. Розенберг (ред.). Биологические ме-

тоды лечения онкологических заболеваний: Пер. с англ. - М.: Медицина, 2002. - С. 484-503.

6. Basse P.H. Tissue distribution and tumor localization of effector cells in adoptive immunotherapy of cancer // APMIS Suppl. - 1995. - Vol. 55. - P. 1-28.

7. Godfrey D. I., Kronenberg M. Going both ways: Immune regulation via CD1d-dependent NKT cells // Clin. Invest. - 2004 - Vol. 114. - P. 1379-1388.

8. Kenna T., Mason L. G., Porcelli S. A. et al. NKT cells from normal and tumor-bearing human liver are phenotypically and functionally distinct from murine NKT cells // Journal of Immunology. - 2003. - Vol. 171, № 4. -P. 1775-1779.

9. Morse M. A., Clay T. M., Lyerly H. K. Current status of adoptive immunotherapy of malignancies // Exp Opin Biol Ther. - 2002. - Vol. 2, № 3. - P. 237-247.

10. Mule J. J., Shu S., Rosenberg S. A. The anti-tumor efficacy of lymphokine-activated killer cells and recombinant interleukin 2 in vivo // J Immunol. - 1985. - Vol. 135.

- P. 642-646.

11. Nakagawa R., Nagafune I., Tazunoki Y. et al. Mechanisms of the antimetastatic effect in the liver and of the hepatocyte injury induced by -galactosylceramide in mice // Journal of Immunology. - 2001. - Vol. 166, № 11.

- P. 6578-6584.

12. Okuna K., Tanaka A., Shironory H. et al. Suppression of T-cell function in gastric cancer patients after total gastrectomy with splenectomy: implications of splenic autotransplantation // Gastric cancer. - 1999. -№ 2. - P. 20-25.

13. Sato T. Locoregional immunotherapy for liver metastases. // Semin Oncol. - 2002. - Vol. 29, № 2. - P. 160-167.

14. Sincovics J. G., Horvath J. C. Human natural killer cells: a comprehensive review // Int J Oncol. - 2005.

- Vol. 27, № 1. - P. 5-47.

15. Sugimachi K., Kodama Y., Kumashiro R. et al. Clinical evaluation of prophilactic splenectomy in a total gasrtectomy for gastric cancer // Gastric cancer. - 1980. -Vol.70. - P. 701-709.

16. Taneja S. S., Pierce W., Figlin R., Belldegrun A. Immunotherapy of renal cell carcinoma: The era of interleukin-2 treatment // Urology. - 1995. - Vol. 45. - P. 911-924.

17. Yamaguchi Y., Ohshita A., Kawabuchi Y., Ohta K. et al. Adoptive immunotherapy of cancer using autologus lymphocytes - current status and new strategies // Hum Cell. - 2003. - Vol. 16, № 4. -P.183-189.

Поступила 17.08.2006.