Универсальная серодиагностика на основе углеродных наночастиц

БИОЛОГИЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ _МЕДИЦИНА_

УДК 616-078:579

УНИВЕРСАЛЬНАЯ СЕРОДИАГНОСТИКА НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОЧАСТИЦ

В. А. Черешнев, М. Б. Раев

В начале 1990-х годов были клонированы и секвенированы гены, кодирующие рецепторы стрептококков групп А, B, C и G, обладающих способностью связывать человеческие иммуноглобулины через Fc-фрагмент молекулы. Методами генетической инженерии был сконструирован штамм E. coli — суперпродуцент этих рецепторов. Оказалось, что один из них, названный G белком, способен связывать человеческий IgG всех подклассов, а2-макроглобулин и альбумин. Позднее был получен рекомбинантный G белок, специфичный только к IgG, причем не только к человеческому, но и к IgG многих видов млекопитающих, вовлеченных так или иначе в научно-исследовательскую сферу деятельности человека [1, 5]. Это послужило основанием для создания ряда аффинных сорбентов для специфического выделения и очистки иммуноглобулинов класса G, что нашло свое применение в очистке антител как одной из стадий реализации гибридом-ной технологии. Однако было бы совершенно неоправданно использовать уникальные свойства G белка лишь в препаративной работе. Не менее важно адаптировать их для целей лабораторной диагностики. Мы использовали в работе оригинальные конъю-гаты, полученные ковалентным связыванием G белка с частицами коллоидного углерода

[7, 8, 9, 10]. Примененная метка (нанораз-мерные частицы углерода) способна визуализировать любые стереоспецифические взаимодействия, в которых принимает участие, а для аффинного компонента конъю-гата ^ белок) не играет никакой роли ни принадлежность, ни способ получения, ни источник определяемых иммуноглобулинов. Он «видит» все, что оказывается в доступной для него близости.

Прямое определение

С проблемой определения наличия в исследуемых материалах иммуноглобулинов чаще всего приходится сталкиваться в практике лабораторных работ, связанных с фракционированием белковых компонентов различных биологических материалов. Это может быть отработка режимов спиртового и сульфат-аммонийного методов фракционирования, качественная оценка процесса конъюгирования различных антител с хро-матографическими носителями при синтезе аффинных сорбентов и т. д. Для контроля чаще всего используется метод ИФА, относительно трудоемкий для рутинного тестирования. В ситуации можно ориентироваться по уровню общего белка, что существенно проще, но получаемая информация является

косвенной. Разработанные способы определения ^ позволили решить описанную проблему.

На нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм наносили ^ человека, кролика и мыши из серийных разведений в забуференном физрастворе (ЗФР), кратных 2. После подсушивания мембраны и 30-минутной инкубации в блокирующем растворе, в качестве которого использовали забуференный фосфатами физраствор, содержащий 0,05% «Твина-20» и 1% казеина (ЗФРТ-К), мембрану инкубировали в течение 15 минут в описываемом конъюгате G белка с частицами углерода. Результаты определения представлены на рис. 1.

Р и с. 1. Прямое определение ^С человека (1), кролика (2) и мыши (3) конъюгатом С белка с углеродными частицами

Полученные результаты, подтвержденные исследованиями аналитических характеристик 13 конъюгатов, синтезированных по одноэтапной схеме, свидетельствуют о реальной возможности разработки систем оперативного контроля за иммуноглобули-новой контаминацией с оценкой ее видоспе-цифичности.

Большое значение имеет перспектива разработки различных диагностических систем. Одной из демонстраций клинического применения описанного анализа является диагностика протеинурии при различных формах патологии урогенитальной сферы человека. Образцы мочи больных, находящихся на лечении в урологическом отделении, наносили на пористую мембрану при

помощи прибора «Био-Дот». Объем наносимой пробы составлял 100 мкл. Подсушенную и блокированную мембрану инкубировали в рабочем разведении конъюгата G белка с углеродом в течение 15 минут, после чего отмывали ЗФРТ и оценивали результаты исследования (рис. 2).

Рис. 2. Прямое дот-иммуноаналитическое определение ^С

в моче 32 пациентов с различными патологиями урогенитального тракта. Интенсивность окрашивания дотов пропорциональна количеству ^С в пробах мочи, что может считаться косвенным признаком выраженности патологического процесса

На первый взгляд кажущаяся громоздкой, система анализа в реальной практике может быть существенно упрощена. Во-первых, совсем не обязательно использовать прибор «Био-Дот». Нанесение исследуемых образцов можно осуществлять капельным способом обыкновенной пипеткой. Во-вторых, нет необходимости собирать большое количество образцов, анализ можно проводить даже при наличии одной пробы.

Полученные результаты демонстрируют возможность дополнить спектр диагностических приемов дифференцированной диагностики различных патологий уроге-нитальной сферы. Интенсивно окрашенные доты свидетельствуют о наличии у больных тяжелого нефротического синдрома. Отсутствие окраски свидетельствует об отсутствии связи патологического процесса у больного с дисфункцией почек. Полученные результаты были воспроизведены в шести сериях аналогичных экспериментов с использованием шести конъюгатов G белка с углеродными частицами.

Определение антител к стрептококку группы А

Наиболее распространенным методом первичной иммунодиагностики стрептококковых инфекций является определение антител к группоспецифическому А полисахариду (АПСХ) [11, 12]. Диагностическая ценность подобного анализа может определяться несколькими факторами. Одним из них является выявление носителей СГА, особенно в тех случаях, когда непосредственный анализ с тампонов дает отрицательный результат. Наличие же в этом случае антител к АПСХ может свидетельствовать о персистенции стрептококков в подслизистых тканях и криптах миндалин при отсутствии их на поверхности самих слизистых оболочек [2]. С другой стороны, уровень антител к АПСХ дает ценную информацию о развитии вторичных форм стрептококковых инфекций. Так, например, антитела к АПСХ обнаружены во всех сыворотках больных первичным ревматизмом и почти у всех больных возвратным ревмокардитом (95%) [6]. Наличие высокого уровня антител к ^ацетилглюкозамину ^-АГА), который является группоспецифической детер-минантой АПСХ, может свидетельствовать об аутоиммунных процессах в организме больного, так как антитела к ^АГА перекрестно реагируют с антигенными детерминантами в клетках сердечных клапанов, скелетных, мышечных, кожных и других тканях, клетках мозга, почек, тимуса [1, 3, 13]. Они могут стать причиной аутоиммунных расстройств при развитии стрепткокковой инфекции. Считается, что увеличение синтеза перекрестно реагирующих антител, особенно мультиреак-тивных, является одной из наиболее важных причин развития постинфекционных осложнений и может свидетельствовать о запуске патологического механизма формирования ревматизма, ревматических пороков сердца, гломерулонефрита, рожи [4, 14, 16]. Все это

доказывает необходимость разработки надежных тест-систем (в том числе экспрессных) для определения антител к АПСХ и его отдельным специфическим детерминантам в образцах сывороток крови и слюны.

В качестве антилиганда использовали конъюгат АПСХ с БСА. Дело в том, что основным препятствием для непосредственного использования природного полисахарида в качестве антилиганда является его слабая физическая сорбция на полимерных материалах, используемых в иммуноана-лизе. Для преодоления этих трудностей АПСХ был модифицирован. Для этого полисахарид подвергали окислению периода-том натрия и конъюгировали с гидразидным производным БСА методом восстановительного аминирования [15]. Последующие эксперименты показали, что полученный препарат обладал хорошей сорбционной способностью за счет белковой составляющей и достаточной иммунореактивностью и специфичностью, присущими природному полисахариду.

Иммуносорбентом служили полоски нитроцеллюлозы с сорбированными на них АПСХ-БСА (антилиганд) в концентрации 0,1 мг/мл ЗФР, кроличьими ^ (внутренний положительный контроль) в концентрации 0,1 мг/мл ЗФР и БСА в концентрации 0,1 мг/мл ЗФР (внутренний отрицательный контроль), нанесенными дотами по 3 мкл. Подсушенные после нанесения антилиган-дов полоски блокировали в ЗФРТ-К в течение 30 минут при 37°С, промывали в ЗФРТ и вновь высушивали. Полученные описанным способом твердофазные реагенты инкубировали в растворах с известной концентрацией антистрептококковых антител, разведенных с шагом 2 в ЗФРТ, начиная с 50 нг/мл, в течение 30 минут, после чего осуществляли детекцию конъюгатом G белка с частицами углерода. Результаты анализа представлены на рис. 3.

• V 1 50 нг\мл

• • 2 25 нг\мл

• • 7 | ^ С . . -Л штшт

12.5 нг\мл

•1 1*1 6.25 нг\мл

•1 !•. * 3.0 нг\мл

• 1.5 нг\мл

• 1 1 1X 0.75 нг\мл

1*1 1 1 IV 0.38 нг\мл

!Ш.1» 0.19 нг\мл

•ни» 0.09 нг\мл

Рис.3. Дот-иммуноаналитическое определение антистрептококковых антител.

В крайней левой зоне каждой полоски — внутренний положительный контроль (^0 кролика), далее — внутренний отрицательный контроль (БСА) и в центре — зоны определения. Справа указаны концентрации антител в исследуемых пробах

Чувствительность определения, как следует из результатов анализа, составила 0,38 нг/мл. О высокой специфичности системы анализа свидетельствует отсутствие как ложноотрицательных результатов (все точки положительного контроля визуализированы в ходе определения), так и отсутствие лож-ноположительных (отсутствие связывания углеродного конъюгата в зонах сорбции БСА). Результаты определения воспроизведены в ходе тестирования 13 синтезированных конъюгатов.

Заключение

Приведенные исследования не исчерпывают возможности существенно расширить перечень определяемых объектов. В конечном итоге предметом определения является одна и та же молекула иммуноглобулина ^ а инструментом — один и тот же конъюгат G белка с частицами углерода. Однако, конструируя систему анализа (тест-систему), можно без труда «запрограммировать» его специфичность, что позволит на основе

одного и того же диагностикума разработать множество аналитических систем.

Можно предложить своего рода универсальный набор, предназначенный для самостоятельного конструирования в условиях научно-исследовательских лабораторий необходимых тест-систем, способных определять любые ^ в зависимости от интересов и потребностей исследователей. В состав набора достаточно ввести:

1. Конъюгат G белка с частицами коллоидного углерода.

2. 10-кратный концентрат ЗФРТ-К.

3. Полоски нитроцеллюлозы с отмеченными зонами нанесения антилигандов и нанесенными ^ кролика (в качестве внутреннего положительного контроля) и БСА (в качестве внутреннего отрицательного контроля).

Инструкция по применению сводится к рекомендации нанести соответствующий антиген из раствора с концентрацией 10— 100 мкг/мл каплей объемом 3—5 мкл в отмеченную на полоске зону, подсушить в течение 15—20 минут, выдержать полоски 30 минут в разведенном предварительно ЗФРТ-К, проинкубировать в течение 30— 60 минут в исследуемой пробе и после 3-кратной промывки в ЗФРТ-К осуществить детекцию, выдержав полоски в течение 15 минут в растворе конъюгата. Ориентируясь на спектр решаемых задач, имело бы смысл заранее подготовить необходимое количество иммуносорбентов требуемой специфичности. Можно самостоятельно сконструировать практически любую тест-систему определения антител, относящихся к иммуноглобулинам класса G при условии наличия соответствующих антигенов. Но даже при отсутствии соответствующих антигенов образцы можно напрямую сорбировать на нитроцел-люлозные полоски и осуществлять детекцию описанным способом.

Таким образом, конъюгат G белка стрептококка с наночастицами коллоидного углерода представляет собой универсальный инструмент, применение которого для прямой визуализации (детекции) специфических лигандов и взаимодействий с участием иммуноглобулинов G отвечает всем требованиям корректной диагностики, реализуя основные качественные характеристики: чувствительность, специфичность, воспроизводимость, надежность, наглядность, доступность, безопасность и др.

Библиографический список

1. Беляков В. Д. Клинико-лабораторная диагностика стрептококковых инфекций/

B. Д. Беляков, Н. И. Брико, А Р. Шихман// Вестник АМН СССР.- 1989.- № 11.-

C. 22-27.

2. Брико Н. И. Закономерности эпидемического процесса респираторной стрептококковой инфекции и система эпидемиологического надзора: дисс. ... д-ра мед. наук/Н. И. Брико.- М., 1995.-С. 171-172.

3. Брико Н. И. Болезни, вызываемые стрептококками группы А в начале XXI века: проблемы и перспективы профилак-тики/Н. И. Брико//Вестник Российской академии мед. наук.- 2001.- № 2.-С. 3-6.

4. Брико Н. И. Клинико-эпидемиологическая характеристика стрептококковой (группы А) инфекции на современном этапе/ Н. И. Брико, Н. Н. Филатов, М. В. Журавлев, А. А. Еровиченков, А. Ю. Бражников// Терапевтический архив.- 2002.- № 11.-С. 26-33.

5. Гупалова Т. В. Получение и свойства ре-комбинантного G белка/Т. В. Гупалова,

В. И. Голубков, Л. Н. Суворов, А. С. Андреев, А. В. Дмитриев, А. А. Тотолян,//Вестник РАМН.- 1996.- Т. 3.- С. 44-50.

6. Мясоедова С. Е. Диагностическое значение антител к А-полисахариду стрептококка при ревматизме и ревматических пороках сердца/С. Е. Мясоедова, М. М. Голубая, Н. И. Брико,//Современные проблемы ревматологии. Материалы 1-го съезда ревматологов России.— Оренбург.— 1993.— С. 45-46.

7. Раев М. Б. Способ получения конъюга-та для стереоспецифического анализа/ М. Б. Раев//Патент РФ № 2314827.- 2008.

8. Раев М. Б. Способ защиты и стабилизации твердофазных реагентов иммуноанали-тических систем/М. Б. Раев//Патент РФ № 2327992.- 2008.

9. Раев М. Б. Конструирование и применение универсальной тест-системы с использованием неферментных диагно-стикумов для безинструментальной оценки уровня специфических антител/ М. Б. Раев, Е. Г. Орлова, О. Л. Горбунова, М. С. КраснъХ///Биотехнология.- 2006.— № 1.- С. 84-88.

10. Раев М. Б. Неинструментальные иммуно-аналитические системы на основе углеродных наночастиц: Дисс. ... д-ра биологических наук/М. Б. Раев.— Пермь, 2008.

11. Rayev M. B. A Novel Method for the Se-rodiagnosis of Group A Streptococcal Antibodies/M. B. Rayev, I. V. Ambrosov, N. I. Briko//Streptococci and the Host. Ad. Thea Horaud et al. Advances in Experimental medicine and biology.— Plenum Press, New York and London.- 1997.- Vol. 418.— P. 327-329.

12. Шмакова З. Ф. Иммунологическое изучение лизатов клеточной стенки стрептококка группы А/З. Ф. Шмакова, А Р. Ших-

май, Н. И. Брико, В. Д. Кузнецов///Антибиотики и химиотерапия.— 1991.— Т. 36.— № 8.— С. 28—31.

13. Amie J. Group A beta-haemolytic streptococcal pharyngitis in children younger than 5 years//. Amie//Isr. J. Med. Scien.— 1994.— V. 30.— № 8.— Р. 619—622.

14. Baxter F. Severe group A streptococcal infection and streptococcal toxic shock syndrome/F. Baxter, J. McChesney//Can. J. Anaesth.— 2000.— 47(11).— P. 1129— 1140.

15. Gray G. R. The direct coupling of oligosaccharides to protein and derivatized gel/ G. R. Gray^//Arch. Biochem. and Biophys.— 1974.— V. 163.— № 2.— P. 426—428.

16. Salvadori L. G. Group A strep tococcus-liposome ELISA antibody titers to group A polysaccharide and opsonophagocytic capabilities of the antibodies/L. G. Salvadori, M. S. Blake, M McCarty//}. of Infec. Dis.— 1995.— V. 171.— № 3.— P. 593—600.

V. A. Chereshnev, M. B. Raev

UNIVERSAL SERODIAGNOSIS BASED ON CARBONIC NANOPARTICLES

On the basis of original diagnostic reagent, conjugate of nanodimensional carbonic particles and streptococcal G protein, the universal system of stereospecific interaction visualization with assistance of immunoglobulins G (IgG) was developed. Construction of a wide spectrum of analytical systems fitting both research objectives and diagnostic testing outside medical institutions is quite possible with the reagents worked out. Specificity of analysis might be easily programmed depending on urgency of the target. The systems designed are highly specific and sensitive, simple in relation to procedure, reliable and reproductible.

Keywords: conjugate, nanodimensional particles, group A streptococci, G protein, dot-analysis.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УРО РАН, г. Пермь

Материал поступил в редакцию 10.11.2008