Влияние цитофлавина на метаболическую активность остеобластов и фибробластов

методов оценки общей антиоксидантной активности плазмы крови выявило наличие выраженного дисбаланса в системе «про-/антиоксиданты» на фоне опухолевого процесса у пожилых больных с КРР в сторону превалирования первого звена. Так, общая антиоксидантная активность плазмы до операции у больных КРР была выше показателей контрольной группы на 25,5-27,1%. В 1-е сутки после операции установлено резкое снижение антиоксидантной активности плазмы у всех оперированных больных. На 3-и сутки в основной группе больных на фоне комплексного лечения с использованием тамерита отмечается постепенное повышение этого показателя. В группе сравнения динамика амперометрического показателя антиоксидантной активности плазмы крови существенно отличалась от аналогичных данных основной группы, и даже к 12-м суткам этот показатель оставался ниже показателей контроля на 24,5% и на 35,5% ниже показателя основной группы.

Исследования индуцированной хемилюминесцен-ции плазмы крови у больных КРР показали, что перед операцией уровень БВХЛ был у них несколько снижен (на 18,8-23,3% относительно показателей контрольной группы), что нехарактерно для многих других патологических состояний. После проведения операции, уже на 1-е сутки, показатель БВХЛ у больных группы сравнения возрастал и превышал контрольные значения на 18,8%. В дальнейшем рост этого показателя у оперированных больных, не получавших тамерит в комплексном лечении, продолжался, и к 12-м суткам он практически в два раза превышал показатели контрольной группы. У больных основной группы на 1-е сутки после операции также выявлен подъем этого показателя, но на фоне применения тамерита менее значимый, а к 3-м суткам данный показатель даже снижался, приближаясь к до-операционному уровню. На 12-е сутки после отмены тамерита у больных основной группы также отмечен рост показателя БВХЛ относительно контрольных цифр

(на 17,1%), но его уровень, тем не менее, был гораздо ниже аналогичных значений больных группы сравнения.

Полученные данные, отражающие положительную динамику в системе «про-/антиоксиданты» на фоне дополнительного включения в традиционные схемы ведения периоперационного периода тамерита, свидетельствуют о необходимости коррекции систем иммунной и антиоксидантной защиты у онкологических больных на фоне выраженного окислительного стресса и значительной эндогенной интоксикации. Позитивное воздействие тамерита на защитные системы организма проявляется снижением осложнений у гериатрических онкологических больных в периоперационном периоде, в том числе снижением числа летальных исходов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Барышников А. Ю. Взаимоотношение опухоли и иммунной системы организма // Практическая онкология. - 2003. - Т. 4. № 3. -С. 127-130.

2. Галактионов В. Г. Иммунитет к опухолям // Иммунология. -М.: изд-во МГУ, 1998. - С. 348.

3. Гришина Т. И. Клиническое значение нарушений иммунитета при хирургических вмешательствах (обзор литературы) // Анд-рология и генитальная хирургия. - 2000. - № 2. - С. 14.

4. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. Клинико-иммунологическая эффективность применения галавита в ходе комплексной послеоперационной терапии у больных с распространенными формами острого перитонита // Анналы хирургической гепатологии. - 1990. -Т. 3. № 2. - С. 100-110.

5. Ярилин А. А. Патология иммунной системы. Основы иммунологии. - М.: Медицина, 1999. - С. 440-486.

6. Bergmann L., Mitron P. S. Cytokines in cancer therapy // Contrib. Oncol. Basel. Karger. - 1994. - Vol. 46. - P. 1-10.

7. Zbar A. P. The immunology of colorectal cancer // Surgical oncology. - 2004. - Vol. 13. № 2. - P. 45-53.

Поступила 28.08.2009

Л. Л. ОРДЯН, В. Л. ПОПКОВ, П. А. ГАЛЕНКО-ЯРОШЕВСКИЙ1

ВЛИЯНИЕ ЦИТОФЛАВИНА НА МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ОСТЕОБЛАСТОВ И ФИБРОБЛАСТОВ

Кафедра ортопедической стоматологии Кубанского государственного медицинского университета, Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Кирова, 75. E-mail: Popkov.victor@rambler.ru, тел. 253-17-93; гкафедра фармакологии Кубанского государственного медицинского университета,

Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4. E-mail: Kybfarma@rambler.ru, тел. 262-34-99

Проведено исследование влияния препарата метаболического типа действия цитофлавина, обладающего противоише-мическим, антиоксидантным и энергокорригирующим свойствами, на метаболическую активность культивированных остеобластов теменной кости и фибробластов кожи крыс. Показано, что цитофлавин не оказывает цитотоксического воздействия на исследуемые клетки и способен повышать их пролиферативную активность в интактных условиях. При метаболической гипоксии, вызванной разобщителем окислительного фосфорилирования 2,4-динитрофенолом и дыхательным ядом цианидом Na, цитофлавин оказывает протекторное действие относительно остеобластов и фибробластов крыс.

Ключевые слова: цитофлавин, остеобласты, фибробласты, гипоксия, пролиферация.

L. L. ORDYAN, v. L. pOpKOv, p. A. GALENKO-YAROSHEvSKY INFLUENCE CYTOFLAVINY OF A METABOLIC ACTIVITI OSTEOBLASTS AND FIBROBLASTS

Department of orthopedic stomatology of Kuban State Medical University,

Russia, 350063, Krasnodar, st. Kirova, 75. E-mail: Popkov.victor@rambler.ru, tel. 253-17-93;

Кубанский научный медицинский вестник № 9 (114) 2009 УДК 616.314.17-008.1:615.272.014

Кубанский научный медицинский вестник № 9 (114) 2009

department of pharmacology of Kuban State Medical University,

Russia, 350063, Krasnodar, st. Sedina, 4. E-mail: Kybfarma@rambler.ru, tel. 262-34-99

The organized study of the influence medicines preparation metabolic type of the action cytoflavin, possessing antiishemic, antioxidant and energecorrection characteristic on metabolic activity cultivated osteoblasts parietal bones and fibroblasts of the skin of the rats. It is shown that cytoflavin does not render the cytotoxical of the influence on under investigation hutches and capable to raise their proliferation activity in usual ordinary conditions. On background metabolic hypoxia, caused disconnected oxidant phosphoric process 2, 4-dinitrophenoli and respiratory poison of the cyanide Na, cytoflavin raises cytoprotection activity osteoblasts and fibroblasts of the rats.

Key words: osteoblasts, fibroblasts, hypoxia, proliferation.

Среди основных заболеваний тканей пародонта преобладают воспалительно-дистрофические процессы, которые сопровождаются значительными деструктивными изменениями пародонтального комплекса, лишая, таким образом, естественные зубы опорной па-родонтальной поддержки и в случае отсутствия адекватного и эффективного лечения приводя к их потере. Преобладающей патологией в структуре этих заболеваний является хронический генерализованный пародонтит (ХГП), протекающий годами с частыми обострениями, трудно поддающийся эффективному лечению [4, 5, 13].

Среди патогенетических факторов развития ХГП существенное значение приобретают состояния, способствующие нарушению метаболических процессов в костной ткани на фоне хронической гипоксии [4, 15]. Выявлена определенная связь между прогрессированием симптомов ХГП и углублением метаболических изменений, характерных для клеточного ацидоза [1, 5] всех тканевых структур пародонта.

Имеются данные, свидетельствующие об инициальной роли свободнорадикального окисления как одного из пусковых факторов развития воспалительно-дистрофических процессов в пародонтальном комплексе [2, 6]. Важнейшим этапом патофизиологических нарушений является деэнергизация клеток тканей пародонта за счет снижения активности дыхательной мощности митохондрий с активацией свободнорадикальных процессов. Возникающая дискоординация процессов окислительного фосфорилирования и тканевого дыхания приводит к развитию гипоксии в па-родонте, метаболическим изменениям, ацидозу, активации процессов ПОЛ, резким изменениям реологии сосудов и в конечном итоге к воспалению, деструкции и резорбции костной структуры пародонтального комплекса [6, 8]. Для нейтрализации таких состояний необходимы лекарственные средства, которые могли бы нивелировать динамику развития данной патологии, способствуя уменьшению деструкции тканей пародонтального комплекса [3, 4]. В этом аспекте представляется перспективным комплексный препарат метаболического типа действия «цитофлавин» (1 мл раствора содержит: янтарная кислота - 100 мг; никоти-намид - 10 мг; рибоксин (инозин) - 20 мг; рибофлавина мононуклеотид (рибофлавин) - 2 мг), обладающий выраженной противоишемической, антиоксидантной и энергокорригирующей активностью [7, 9, 10].

В отличие от известных препаратов, синтезированных на основе янтарной кислоты, цитофлавин обладает преимуществом, так как содержащийся в нем компонент метилглюкамин способствует проникновению сукцината и других компонентов цитофлавина как через неповрежденную, так и через поврежденную клеточную мембрану.

Известно, что костная ткань альвеолярных отростков и слизистая оболочка десны, клеточными компонентами которых являются соответственно остеобласты и фибробласты, наиболее уязвимы при ХГП [4, 5, 15]. Это послужило веским аргументом в пользу проведения исследований в избранном направлении.

Целью работы явилось выявление протекторных свойств у цитофлавина относительно остеобластов и фибробластов и его способности повышать пролиферативную активность этих клеток как в норме, так и в условиях гипоксии.

Материалы и методы

Объектом исследования были культуры остеобластов теменной кости и фибробластов кожи новорожденных крыс. Животных подвергали эвтаназии путём дислокации шейных позвонков. Извлекали участки костей свода черепа и измельчали на фрагменты размером 1- 3 мм3 в среде RPMI-1640, содержавшей 40 мкг/мл ген-тамицина. Фрагменты костной ткани вносили в круглодонную пробирку объемом 15 мл и осаждали при 0-4° С в среде DMEM в течение 15 минут. Надосадочную жидкость удаляли и ткань ресуспендировали в 10 мл среды, содержавшей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина и 0,1% L-глютамина.

После ресуспендирования фрагменты кости вносили по 5 мл во флаконы для культивирования. Через 24 часа проводили смену среды. В дальнейшем смену среды осуществляли каждые 3 суток.

Через 7 дней культивирования при 37° С и 5%-ном СО2 наблюдали образования клеточного монослоя, которые формировали монослой вокруг тканевых фрагментов. Форма клеток соответствовала изображениям остеобластов, приводимым в литературе [11]. Остеобласты отличались от фибробластов поляризо-ванностью и образованием пластов.

Для получения первичной культуры фибробластов кожу измельчали на фрагменты и помещали в пластиковые флаконы для культивирования. Среда инкубации содержала 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 40 мкг/мл антибиотика гентамицина. Через 10-14 дней после формирования монослоя клеток их обрабатывали трипсином, переводили в суспензию и рассевали по 100 мкл в 96-луночные планшеты «Costar» для проведения эксперимента.

Исходные растворы цитофлавина готовили на среде RPMI-140 и вносили в лунки планшета до разведений 1:10, 1:20 и 1:100.

Для моделирования гипоксии добавляли цианид Na (NaCN) до конечной концентрации 0,2 ммоль и 2, 4-динитрофенол (ДНФ) - до 0,5 ммоль, указанные концентрации, согласно литературным данным, являются суб-токсическими [16]. Содержимое планшет инкубировали в течение 1 суток.

Оценку цитотоксичности проводили с помощью МТТ-теста, который основан на способности дегидрогеназ живых клеток превращать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,2-дифе-нилтетразолий бромистый (МТТ) в голубые кристаллы формазана, не растворимые в воде. Количество образовавшегося формазана характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов в клетках и может быть использовано в качестве критерия цито-токсического действия изучаемых соединений [14].

Среду отбирали через 4 часа инкубации. Кристаллы формазана растворяли в лунках планшета диме-тилсульфоксидом и измеряли оптическую плотность на ИФА-анализаторе планшетов «Пикон». Полученные результаты представляли в виде средних значений 3 измерений с помощью стандартного математического обеспечения Ехе1.

Жизнеспособность клеток контролировалась по окрашиванию трипановым синим и составляла 90-95%.

По окончании инкубации клеток с веществами среду из лунок удаляли и вносили по 200 мкл чистой среды. Затем в каждую лунку вносили по 10 мкл раствора МТТ (5 мг/мл в фосфатном буфере). Инкубировали при 37° С в течение 3 часов. После инкубации среду удаляли и вносили в каждую лунку по 150 мкл диметил-сульфоксида для растворения образовавшихся гранул формазана. Оптическую плотность образцов регистрировали при длине волны 530 нм на анализаторе иммуноферментных реакций «УНИПЛАН» АИФР-01 (Россия). Результаты выражали в % от контроля. Использовалось по 5 образцов на каждую точку.

Все полученные количественные результаты представлены в виде:

X = М + т,

где X - изучаемый показатель, М - его среднее значение в исследуемой статистической выборке, т - ошибка среднего.

Результаты исследования

Установлено, что цитофлавин не токсичен для остеобластов теменной кости и фибробластов кожи крыс. При внесении в среду инкубации интактных клеток ци-тофлавина в разведениях 1:10, 1:20 и 1:100 отмечалась достоверная тенденция к повышению метаболической и пролиферативной активности клеток: остеобластов -на 5,9-7,2%, фибробластов - на 11,6-16,1% соответственно (табл. 1 и 2).

Внесение в среду инкубации №СЫ и 2,4-ДНФ вызывало снижение степени адгезии к субстрату, оцениваемой по уменьшению их площади и увеличению межклеточного расстояния. При этом №СЫ и 2,4-ДНФ угнетали рост остеобластов на 36,3 и 44,5%, а фибробластов - на 35,9 и 45,2% соответственно (табл. 1 и 2).

Введение в инкубационную среду цитофлавина в условиях гипоксии, вызванной №СЫ и ДНФ в разведениях 1:10, 1:20 и 1:100, индуцировало достоверное увеличение жизнеспособности клеточных культур. Препарат способствовал нормализации адгезии и количества клеток крыс: остеобластов - на 37,5-55,5 и 51,5-58,1%, фибробластов - на 42,3-43,7 и 43,4-58,4% соответственно (табл. 1 и 2).

Таблица 1

Влияние цитофлавина на жизнеспособность остеобластов крыс в МТТ-тесте

Вещества Разведение препарата

и их сочетания 1:10 1:20 1:100

Контроль 1301,0 ± 173,0

№СЫ 829,0 ± 51,0*

ДНФ 722,0 ± 43,0*

Цитофлавин 1379,7 ± 122,6 1395,2 ± 115,3 1386,1 ± 87,0

Цитофлавин + №СЫ 0,2 мМ 1289,0 ± 98,0+ 1257,0 ± 131,2+ 1140,0±146,0+

Цитофлавин + ДНФ 0,5 мМ 1102,0 ± 124,1° 1141,0 ± 138,7° 1094,0 ± 156,0°

Примечание: здесь и в табл. 2: р < 0,01 по сравнению с контролем, + №С1\1, ° ДНФ.

Таблица 2

Влияние цитофлавина на жизнеспособность фибробластов

кожи крыс в МТТ-тесте

Вещества Разведение препарата

и их сочетания 1:10 1:20 1:100

Контроль 1423,0 ± 138,0

№СЫ 912,0 ± 91,0*

ДНФ 779,0 ± 55,0*

Цитофлавин 1589,0 ± 151,4 1652,0 ± 147,0 1609,0 ± 91,7

Цитофлавин + №СЫ 0,2 мМ 1311,0 ± 119,0+ 1298,0 ± 105,0+ 130,01±141,0+

Цитофлавин + ДНФ 0,5 мМ 1117,0 ± 121,0° 1234,0 ± 158,0 1189,0 ± 111,5

Кубанский научный медицинский вестник № 9 (114) 2009

УДК 616.379-008.64-0.005.1-08-008.9 Кубанский научный медицинский вестник № 9 (114) 2009

Учитывая, что ДНФ вызывает увеличение окислительных процессов и уменьшение образования макро-эргических соединений, можно предполагать участие свободнорадикальных механизмов повреждения в его цитотоксичесском действии. В эксперименте цито-флавин оказывал выраженное протективное действие именно на модели гипоксии, вызванной ДНФ, индуцируя повышение жизнеспособности культур и способствуя поддержанию мембранного потенциала митохондрий [12]. Полученные данные подтверждают наличие у цитофлавина антиоксидантной, антигипоксической и цитопротекторной активности.

№С1\1, блокируя дыхательную цепь, вызывал накопление продуктов цикла трикарбоновых кислот. Вероятно, цитофлавин способствует нормализации метаболических процессов в условиях гипоксии, вызванной №С1\1.

Таким образом, цитофлавин не оказывает цитоток-сического воздействия на остеобласты и фибробласты кожи крыс в интактных условиях и повышает их пролиферацию. При метаболической гипоксии, вызванной №СЫ и 2,4-ДНФ, препарат защищает культивируемые клетки от гипоксии и способствует повышению их пролиферативной активности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Белоклицкая Г. Ф. Сезонная и возрастная направленность показателей обмена углеводов и системы пируват-лактат при катаральном гингивите и генерализованном пародонтите // Вестн. стоматологии. - 1996. - № 3. - С. 187-191.

2. Воскресенский О. Н. Роль перекисного окисления липидов в патогенезе пародонтита / О. Н. Воскресенский, Е. К. Ткаченко // Стоматология. - 1991. - № 4. - С. 5-10.

3. Галенко-Ярошевский П. А. Очерки фармакологии средств метаболической терапии / П. А. Галенко-Ярошевский, И. С. Чек-ман, Н. А. Горчакова. - М.: Медицина, 2001. - 240 с.

4. Григорян А. С. Болезни пародонта. Патогенез, диагностика, лечение / А. С. Григорян, А. И. Грудянов, Н. А. Рабухина, О. А. Фролова. - М.: МИА, 2004 - 320 с.

5. Грудянов А. И. Заболевания пародонта. - М.: издательство «Медицинское информационное агентство», 2009. - 336 с.: ил.

6. Дмитриева Л. А. Клинико-лабораторная оценка эффективности применения мексидола в комплексном ле-

чении хронического генерализованного пародонтита / Л. А. Дмитриева, Е. П. Просвирова // Пародонтология. - 2004. -№ 3 (32). - С. 28-34.

7. Коваленко А. Л. Оригинальные лекарственные препараты производства ООО НТФФ «Полисан» - цитофлавин / А. Л. Коваленко, Л. Е. Алексеева // Исаков В. А., Сологуб Т. В., Коваленко А. Л., Романцев М. Г. Реамберин в терапии критических состояний: Руководство для врачей, издание третье, дополненное. - СПб, 2001. -С. 6-7.

8. Петрович Ю. А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита смешанной слюны и крови при хроническом генерализованном пародонтите / Ю. А. Петрович, М. Н. Пузин, Т. В. Сухова // Российский стоматологический журнал. - 2000. - № 3. -С. 11-13.

9. Румянцева С. А. Энергокоррекция цитофлавином в остром периоде инсульта / С. А. Румянцева, О. Р. Кузнецов, В. И. Евсеев, А. А. Кравчук, Е. В. Силина // Вестник интенсивной терапии. -2005. - № 3. Нейрореаниматология. - С. 19-22.

10. Румянцева С. А. Антиоксидантная нейропротекция при инсульте / С. А. Румянцева, А. И. Федин, Е. В. Силина, С. Б. Борле-вич. - СПб: «Тактик-Студио», 2008. - 104 с.

11. Alliot-Licht В. Cellular activity of osteoblasts / В. Alliot-Licht, M. Gregoir, I. Orly, J. Menanteau // Biomaterials. - 1991. - Vol. 12. -P. 752-756.

12. Andreyev A. Y. Mitochondrial metabolism of reactive oxygen species / A. Y. Andreyev, Y. E. Kushnareva, A. A. Starkov // Biochemistry (Moscov). - 2005. - Vol. 70. № 2. - P. 200-214.

13. Kaner D. Minimally invasive flap surgery and enamel matrix derivative in the treatment ot localized aggressive periodontitis: case report / D. Kaner, J. P. Bemimoulin, В. М. Kleber, A. Friedmann // Int. J. Periodontics Restorative Dent. - 2009. - № 29 (1). - P. 89-97.

14. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays // J. Immunol. Methods. - 1983. - Vol. 65. № 1. - P. 55-63.

15. Pinchback J., Tailor B., Gibbins J., Hunter N. Microvascular angiopathy in advanced periodontal disease / J. Pinchback, B. Tailor, J. Gibbins, N. Hunter // J. Pathology. - 1996. - Vol. 179. № 2. -P. 204-209.

16. Rahn C. A. Assessment of mitochondrial membrane potential as an indicator of cytotoxicity / C. A. Rahn, D. W. Bombick, D. J. Doolittle // Fundam. Appl. Toxicol. - 1991, Apr. - № 16 (3). - Р. 435-48.

Поступила 09.11.2009

г. г. петрик1, с. а. павлищук1, с. в. бутаева2 ПОКАЗАТЕЛИ МЕТАБОЛИЗМА И ГЕМОСТАЗА

на этапах развития диабетических АНГИОПАТИЙ

Кафедра терапии № 1 ФПК и ППС Кубанского государственного медицинского университета,

Россия, 350063, г. Краснодар, ул.Седина, 4. E-mail: spirogr@bk.ru; Эндокринологическое отделение краевой клинической больницы № 1,

Россия, 350086, г. Краснодар, ул. 1 Мая, 167

С целью определения факторов риска развития сосудистых поражений на разных стадиях заболевания у больных сахарным диабетом 1-го и 2-го типов (СД1 и СД2) выполнен комплексный анализ параметров метаболизма, гемограммы, тромбоцитарного и плазменного гемостаза у 147 пациентов с СД1 и 245 пациентов с СД2 (из которых 42 и 53 пациента соответственно не имели мик-ро- и/или макрососудистых поражений). Результаты исследования выявили разнообразные изменения показателей метаболизма и гемостаза уже на ранних стадиях СД1 и СД2 и их многогранную связь с активацией тромбоцитов и внутреннего пути коагуляции. Выявление сопряженности отдельных показателей метаболизма и коагуляции свидетельствует о необходимости нормализации не только углеводного и липидного, но и белкового обмена и открывает возможности для первичной и вторичной профилактики сердечно-сосудистых заболеваний путем коррекции метаболических нарушений и прокоагулянтной активности на этапах развития СД.