СПОСОБ БОРЬБЫ С БАКТЕРИАЛЬНЫМИ БИОПЛЁНКАМИ
METHOD FOR CONTROLLING BACTERIAL BIOFILMS

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к способу борьбы с бактериальными биопленками и может использоваться в медицине и ветеринарии.
Уровень техники
Наиболее широко используемые препараты в борьбе с микроорганизмами - это антибиотики. Однако их активность снижается с каждым годом. Особенно устойчивыми к действию антибактериальных препаратов являются возбудители, способные к формированию бактериальных сообществ или биопленок. Установлено, что имеющие сложную структуру организованные сообщества патогенных бактерий могут формироваться практически на любых поверхностях и являются причиной многих проблем, в том числе и медицинских ( G.A. et al. Biofilm formation as microbial development // Ann Rev Microbiol 2000. P. 49-79; Hunt S.M. et al. Hypothesis for the role of nutrient starvation in biofilm detachment // Appl Environ Microbiol. 2004. P. 7418-25; Романова Ю.М. и др. «Биопленки патогенных бактерий и их роль в хронизации инфекционного процесса. Поиск средств борьбы с биопленками» // ВРАМН. 2011. №10. С. 31-39). Сложная инфраструктура и иерархия бактерий в бактериальной биопленке, формирование ею специальных средств жизнеобеспечения и защиты в виде матрикса приводят к тому, что биопленки становятся практически неуязвимыми для антибиотиков.
Нарастание резистентности бактерий к уже имеющимся препаратам и дефицит структур, которые потенциально могли бы лечь в основу новых антибиотиков, поставили на повестку дня поиск альтернативных способов борьбы с патогенными микроорганизмами.
Известен способ фотодинамической терапии для инактивации бактерий и биопленок, в котором используют катионный пурпуринимид в качестве фотосенсибилизатора для фотодинамической инактивации бактериальных биопленок (патент РФ №2565450, опубл. 20.10.2015). К недостаткам этого способа фотодинамической терапии следует отнести низкий уровень фотостабильности используемой композиции, что приводит к коротким срокам хранения и к существенным ограничениям при проведении терапии. Другим ограничением при использовании вышеуказанной композиции является низкий уровень эффективности терапии очагов бактериального поражения, обусловленный низким уровнем биодоступности молекул. Кроме того, предлагаемые для аппликационного применения растворы химических агентов имеют значительную химическую активность, что приводит к их ускоренному выводу или инактивации.
Известны также химические и микробиологические способы инактивации биопленок химическими агентами путем непосредственной аппликации их растворов - смеси ферментов (заявка РФ №2009106069, опубл. 27.08.2010), бактериофага (патент РФ №2565824, опубл. 20.10.2015; патент РФ №2646102, опубл. 01.03.2018), а также штаммами бактерий (патент РФ №2576008, опубл. 27.02.2016), комплексом антимикробных пептидов насекомых (патент РФ №2664708, опубл. 21.08.2018; патент РФ №2699712, опубл. 09.09.2019), одного или нескольких ненасыщенных алифатических длинноцепочечных спиртов или альдегидов определенной формулы (RU 2012126070), сипрозу (заявка РФ №2014145270, опубл. 10.107111.2016), ионы серебра в составе композиций (патент РФ №2553363, опубл. 10.06.2015). Недостатком данных способов является их относительно кратковременный эффект (вследствие метаболизма), необходимость повторения, но избегания передозировки. Использование бактериофагов в борьбе с биопленками с каждым годом набирает популярность. Но на сегодняшний день не получены достоверные результаты, которые показывают эффективность их применения. Бактериофаг высоко специфичен, т.е. действует только против одного вида бактерии и не эффективен по отношению к другим. Экспериментально доказано, что использование низких концентраций фаговых частиц или применение фагов в отношении бактерий, которые проявляют резистентность к фагам, стимулирует образование биопленок. Выделение и (или) получение генетически модифицированных фагов, действие которых будет направлено на разрушение биопленок - очень сложная, дорогая и трудная задача. Действие ферментов в основном направлено на разрушение матрикса (например, ДНКаза). При этом бактерии остаются жизнеспособными и вполне могут формировать биоматрикс заново и формировать новый очаг инфекции.
2
Известен способ предотвращения образования биопленок на подложке, на которую нанесены частицы с локальным плазмонным резонансом (медь, серебро, золото, полупроводники, оксиды металлов) с плотностью 1-100 частиц/мкм (патент РФ №2650376, опубл. 11.04.2018). Предполагается, что при освещении поверхности поглощение и нагрев наночастиц предотвратят прикрепление микроорганизма к поверхности, ингибирование формирования биопленки и (или) разрушение уже сформированной биопленки. Недостатки данного способа заключаются в удалении наночастиц вследствие метаболизма, окисления и физико-химических процессов, сопровождающих нагревание в биосистемах (кипение, кавитация, флотация и т.п.).
Известен также способ разрушения биопленок прямым воздействием излучения фемтосекундного лазера (патент Украины №104321, 27.01.2014), предполагающий длительное (10-20 минут) высокоинтенсивное облучение ультрафиолетовыми лазерными импульсами варьируемой мощности и длины волны. К недостаткам способа можно отнести возможное повреждение здоровых клеток интенсивным ультрафиолетовым излучением лазера - вплоть до повреждения ДНК и возникновения мутаций.
Возможен отрыв биопленки от поверхности, на которой она располагалась, под действием лазерного излучения в слое жидкости (заявка Японии №2004-275979, опубл. 07.10.2004). Хотя принцип действия не раскрывается, можно предположить, что в этом случае генерируются ударные волны, отрывающие биопленку от поверхности (Song, W.D., Hong, М.Н., Lukyanchuk, В., & Chong, Т.С. (2004). Laser-induced cavitation bubbles for cleaning of solid surfaces. Journal of applied physics 95(6), 2952-2956). Этот способ с определенными допущениями (по механической прочности) применим к абиотическим поверхностям, однако на поверхности тканей может вызывать разрушения клеток здоровой такни и микрососудов крови (Shen, N., Datta, D., Schaffer, С.В., LeDuc, P., Ingber, D.E., & Mazur, E. (2005). Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mech. Chem. Biosyst, 2(1), 17-25.).
Наиболее близким аналогом является способ разрушения биопленок лазерным излучением с использованием композиции, содержащей серебро (публикация международной заявки WO 2014/089552, опубл. 12.06.2014). Разрушение биопленки на поверхности раны предполагается под действием локальной ударной волны, генерированной наносекундным лазерным излучением (длина волны 1064 нм) в слое серебросодержащей композиции на поверхности биопленки и вдавливающей бактерицидную композицию вглубь раны под действием последовательных лазерных импульсов. Основным недостатком метода является прямое лазерное воздействие на ткани, а также сложность оптимальной фокусировки, позволяющей под действием ударной волны обеспечить разрушение биопленки и транспорт композиции вглубь, но одновременно избежать разрушения компонент и целых клеток здоровой такни, а также микрососудов крови.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является разработка такого способа борьбы с бактериальными биопленками, который преодолевал бы недостатки ближайшего аналога, обеспечивая технический результат в виде упрощения применения и предотвращения прямого воздействия лазерного излучения на ткани организма при высокой эффективности.
Для решения этой задачи и достижения указанного технического результата в настоящем изобретении предложен способ борьбы с бактериальными биопленками, заключающийся в том, что: обеспечивают подложку из пластика, прозрачного для излучения используемого впоследствии лазера; наносят на одну сторону подложки металлический слой субмикронной толщины; накладывают подложку нанесенным металлическим слоем на бактериальную биопленку; сканируют металлический слой через подложку импульсами излучения лазера, обеспечивая в результате аппликационный перенос вещества металлического слоя в виде наночастиц на бактериальную биопленку.
Особенность способа по настоящему изобретению состоит в том, что в качестве материала для металлического слоя могут выбирать серебро или медь.
Другая особенность способа по настоящему изобретению состоит в том, что металлический слой могут выполнять из по меньшей мере двух подслоев разных металлов.
Еще одна особенность способа по настоящему изобретению состоит в том, что могут использовать лазер видимого или ближнего инфракрасного диапазона с длительностью импульсов от единиц до сотен наносекунд.
Краткое описание чертежей
Настоящее изобретение иллюстрируется приложенными чертежами.
На Фиг. 1 показано условная схема, поясняющая принцип аппликационного лазерного переноса наночастиц с прозрачной подложки на биопленки патогенных микроорганизмов.
На Фиг. 2 приведены изображения микробиологических результатов применения способа по настоящему изобретению.
Подробное описание вариантов осуществления
Способ по настоящему изобретению осуществляется следующим образом. На одну сторону пластиковой подложки наносят металлический слой субмикронной толщины. Пластик подложки пропускает излучение используемого впоследствии лазера, в качестве которого используют лазер видимого или ближнего инфракрасного диапазона с длительностью импульсов от единиц до сотен наносекунд. В качестве металла выбирают серебро или медь, причем наносить могут два подслоя и более из разных металлов.
Подложку с нанесенным металлическим слоем накладывают на биопленку так, что металлический слой контактирует с биопленкой. После этого сканируют металлический слой через подложку импульсами лазерного излучения, в результате чего обеспечивается аппликационный перенос вещества из металлического слоя в виде наночастиц на бактериальную биопленку. Это схематически показано на Фиг. 1.
Способ по настоящему изобретению проверяли в следующем эксперименте. Ночную бульонную культуру разводят в 100 раз питательной средой и переносят в 24 луночные плашки по 1 мл. В каждую лунку плашки помешают стерильные стекла одинакового размера. Далее инкубируют в течение 24 часов в термостате при температуре 37°С. За сутки на поверхности стекол формируется достаточно плотный слой биопленки. Затем сформированную биопленку в течение нескольких секунд аппликационно покрывают слоем наночастиц с обеих сторон. В качестве материала наночастиц могут быть использованы серебро и медь. Аппликационный перенос осуществляют сканированием подложки со слоем наночастиц наносекундным лазером ИК-диапазона (длительность импульса 120 нм, длина волны 1064 нм) с энергией импульса 0,2 мДж и частотой следования импульсов 20 кГц при фокусировке объективом с фокусным расстоянием 163 мм. После переноса частиц стекла переносят в пробирки с физиологическим раствором ДНК-азы и интенсивно встряхивают на шейкере в течение 1 часа. Под воздействием ДНК-азы матрикс биопленки разрушается, но при этом клетки бактерий остаются невредимыми. Затем полученную суспензию титруют стандартным микробиологическим методом и для определения КОЕ (колониеобразующая единица) высевают на твердую питательную среду.
Экспериментальные исследования показали, что использование метода аппликационного лазерного переноса наночастиц серебра и меди является высокоэффективным методом в борьбе с биопленками, формированными на твердой подложке. При этом в контрольном эксперименте с пластиковой подложкой без металлического слоя показано, что этот эффект не связан с воздействием самого лазера.
Фиг. 2 иллюстрирует сказанное. Левые и правые фотографии относятся, соответственно, к данным исследования коллоидной инактивации биопленок Pseudomonas aeruginosa (синегнойной палочки) и Staphylococcus aureus (золотистого стафилококка) с использованием серебряных, медных и химически-инертных золотых наночастиц, а также контрольного эксперимента с лазерным воздействием без наночастиц. Светло-серый цвет соответствует красному окрашиванию красителем теста Live/dead мертвых бактерий, темно-серый цвет соответствует зеленому окрашиванию красителем теста Live/dead живых бактерий.
Количественные данные проведенных исследований приведены в прилагаемой таблице, показывающей влияние аппликационного лазерного переноса наночастиц различных материалов (с контролем по аналогичному лазерному воздействию через пластиковую подложку без металлического слоя) на сформированные биопленки и их значения КОЕ/мл.
Таким образом, в предложенном способе прозрачная пластиковая подложка позволяет использовать для переноса наночастиц из металлического слоя относительно низкоинтенсивное импульсное лазерное излучение, слабо нагревающее эти наночастицы. В данном способе используется лазер с импульсами излучения в видимом и ближнем ИК-диапазонах, имеющими наносекундную длительность, хорошо поглощаемыми металлическим слоем и крайне незначительно - прозрачной подложкой. При этом используются медные и серебряные частицы с высоким бактерицидным эффектом, тогда как химически-инертные золотые наночастицы показывают незначительный эффект инактивации биопленок.
Все это свидетельствует, что предложенный способ борьбы с бактериальными биопленками, обладая высокой эффективностью, обеспечивает технический результат в виде упрощения применения и предотвращения прямого воздействия лазерного излучения на ткани организма.