ШТАММ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, ПТИЦЫ И РЫБ
BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS STRAIN USED TO INCREASE PRODUCTIVITY OF FARM ANIMALS, BIRDS AND FISHES

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения кормовой добавки, повышающей продуктивность сельскохозяйственных животных, птицы и рыб.
Известны штаммы Bacillus subtilis DSM 5750 и Bacillus licheniformis DSM 5749, которые составляют основу кормовой добавки Bioplus 2В [Alexopoulos С. еt al., Field Evaluation of the Efficacy of Probiotic Containing Bacillus Licheniformis and Bacillus Subtilis Spores. Conference Proceedings New Perspectives of Probiotics. Kosice, Slovakia 15-19th September 2004]. Известны штаммы Bacillus subtilis ВКМ B-2250 (RU №2184774, кл. A61K 35/74, 10.07.02) и Bacillus licheniformis ВКМ B-2252 (RU №2203947, кл. A61K 35174, 26.09.2001 г), которые являются основой кормовой добавки Субтилис.
Известны штаммы Bacillus subtilis 3 и Bacillus licheniformis 31, которые являются основой Биоспорина [Смирнов В.В. И др. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus. Мiкробioлогiчний журнал. 1993. том 55, №4, с. 92-112].
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является выявление новых эффективных штаммов из рода Bacillus для кормовой добавки, повышающей продуктивность сельскохозяйственных животных, птицы и рыб. Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в повышении продуктивности сельскохозяйственных животных, птицы, рыб за счет использования кормовой добавки на основе предложенного штамма Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168. Штамм Bacillus amyloliquefaciens В-20 выделен из почв экологически чистого Приокско-Террасного заповедника, идентифицирован до вида с помощью анализа 16S РНК Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИ Генетика и внесен в депозитарий этой коллекции под номером: Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В 12168 [Научный отчет «Идентификация штамма В-20 до вида с помощью анализа 16S РНК» 20/01/2015 г. Москва].
Штамм Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168 может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет или на косяках с агаризованной средой на основе мясопептонного бульона с обязательным пересевом не реже 1 раза в 6 месяцев на эту же среду.
Штамм Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168, характеризуется следующими признаками.
Паспорт штамма микроорганизма.
Номер В 12168. Дата депонирования в ВКПМ 05.02.2015.
1. Родовое и видовое название культуры: Bacillus amyloliquefaciens.
2. Номер или наименование штамма: В-20.
4. Способ получения штамма: найден в естественных условиях, изолят, Московская область, Приокско-Террасный заповедник, Кулаков Г.В.
5. Культура идентифицирована до вида с помощью анализа 16S РНК Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИ Генетика и внесена в депозитарий этой коллекции под номером: Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В 12168 [Научный отчет «Идентификация штамма В-20 до вида с помощью анализа 16S РНК» 20/01/2015 г. Москва].
6. Культурально-морфологические особенности штамма. Клетки прямые, палочковидные, размером 2,5-4,0×0,5-0,8 мкм, подвижные, грамположительные, спорообразующие. Размер спор 1,0-1,2×0,6-0,7 мкм. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясопептонном агаре, агаре Хоттингера - колонии шероховатые, круглые, матовые, желтовато-серые, край неровный, лопастной. При росте в жидких средах: мясопептонном бульоне, LB-бульоне без аэрации образуют сухую пленку без помутнения среды, а при аэрации - интенсивную мутность.
7. Область применения штамма: пробиотик.
8. Продукт, синтезируемый штаммом: пробиотик.
9. Активность (продуктивность) штамма, другие производственные показатели: Не растет в анаэробных условиях, не образует ацетилметилкарбинол из глюкозы в реакции Фогес - Проскауэра, ферментирует с образованием кислоты глюкозу, маннозу, фруктозу, рибозу, ликсозу, целлобиозу, трегалозу, мальтозу, туранозу. Гидролизует крахмал, мочевину и эскулин. Обладает лецитиназной, каталазной активностью. Толерантен к концентрациям хлорида натрия в питательной среде в диапазоне 1-9%.
Штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным.
Штамм продуцирует биологически активные метаболиты, в том числе антибиотики и ферменты широкого спектра действия, подавляющие рост патогенной и условно-патогенной бактериальной и грибной микрофлоры. Для длительного хранения штамма споровую массу лиофильно высушивают. Для массового размножения бактерии используют мясопептонный бульон. Культивирование проводят при температуре 37°С.
10. Способ определения активности штамма с указанием метода: МПА, МПБ.
11. Способ, условия и состав сред для длительного хранения: Культуру поддерживают на МПА с добавлением канамицина (50 мкг/мл) с пересевом не реже 1 раза в месяц, хранят на МПА с добавлением 50 мкг/мл канамицина.
2
4
2
2
4
4
4
3
6
5
7
2
12. Способ, условия и состав сред для размножения штамма: Оптимальная температура роста +37°C, рН - 7,0. Состав среды - пептон 5 г/л; дрожжевой экстракт 3 г/л; NaCl 5 г/л; (KHPO)×3HO - 18,3 г/л; KHPO - 6,0 г/л; (NH)×2SO - 2,0 г/л; NaCHO×5,5HO - 1,2 г/л, вода водопроводная - до 1 л.
3
13. Оптимальные условия и состав среды для ферментации: Оптимальная температура роста +37°C, рН 7,2. Состав среды: пептон мясной ферментативный - 10,0 г; дрожжевой экстракт - 5,0 г; хлорид натрия - 5,0 г; дистиллированная вода - до общего объема 1 дм.
14. Литературные ссылки: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. (1984-1989). Vol. 1-4 Baltimore. Williams and Wilkins. Handbook of new bacterial Systematics. 1994. Goodfelow M. and A.G. O'Donnel (Ed). London. Acad. Press.
15. Является ли штамм: зоопатогенным: нет; представляет ли опасность по каким-либо другим причинам: нет.
4
4
2
4
4
2
4
2
4
+10
3
16. Форма депонирования: национальное патентное депонирование. Культивирование штамма Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168 проводят в ферментере на промышленных ферментационных средах, приготовленных на деминерализованной воде и содержащих, мас.%: картофельный крахмал, осахаренный альфа-амилазой, - 10, кукурузный экстракт - 2,4, белково-витаминный концентрат или пивные дрожжи - 0,3, лактоза - 0,28, (NH)×2SO - 0,8, KSO - 0,3, MgSO×7HO - 0,014, CuSO - 0,00038, NaCl - 0,03, вода - остальное, рН  7,2. Инокулят штамма выращивают в 750-мл колбах, содержащих 100 мл питательной среды следующего состава, мас.%: триптон - 1, дрожжевой экстракт - 1, хлористый натрий - 0,25, глюкоза - 1, деминерализованная вода - остальное, рН 7,2. Колбы инкубируют на качалке (280 об/ мин) при 37°C в течение 8 часов. Выращенную культуру в количестве 5% от объема среды в ферментере стерильно засевают в ферментер. Процесс ферментации ведут при 37°C и интенсивном перемешивании (800 об/мин), рН поддерживают в пределах 7.0-7.4 с помощью 12.5% NH×4 ОН и 6% HSO. Наработка биомассы осуществлялась в ферментере в течение 48±2 ч. При указанном способе культивирования может быть получен титр спор (5-10)×10 КОЕ/см.
Изобретение поясняется примерами.
Пример 1.
Испытания предложенного штамма Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168 в виде кормовой добавки, повышающей продуктивность новорожденных поросят.
Эффективность кормовой добавки была испытана на новорожденных поросятах с диагнозом диарея, протекавшей на фоне сложной эпизоотической обстановки в хозяйстве. Контрольные группы поросят получали кормление в соответствии со штатной методикой для этого хозяйства. Поросятам опытных групп (5 групп по 10 голов в каждой группе) задавали кормовую добавку на основе предложенного штамма Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168 перорально с водой за 20 мин до кормления в разовой даче на голову по 20 мл три раза в день в течение трех суток. Испытания показали, что состояние поросят в контрольных группах (также 5 групп по 10 голов) характеризовалось продолжением диареи, развитием гипотрофии, в результате чего отход поросят составил 18%. В опытных же группах через сутки после дачи кормовой добавки общее состояние поросят стало улучшаться, диарея прекратилась, падежа поросят не было, а через двое суток все животные уже практически были здоровы.
Пример 2.
Сохранность цыплят в первые недели. Проведены испытания на цыплятах бройлерной птицефабрики (по 25 тыс. цыплят в опытной и в контрольной группах). Отход цыплят в контрольной группе, не получавших кормовую добавку, составил 4%, в опытных - 1,8%. В опытных группах цыплята также более интенсивно набирали вес. После первых трех дней средний вес цыпленка в контрольной группе равнялся 58 г, в опытной - 69 г.
Пример 3.
Кормовая добавка аквариумным рыбам. Проводилось кормление подрощенной молоди золотых рыб (оранда) экструдированным кормом с добавлением кормовой добавки на основе штамма Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168. Количество корма составляло 100 г, кормовой добавки - 2 мл. Количество рыб в опытной и контрольной группах составляло по 50 экз. Кормление осуществляли 3 раза в сутки. Корм поедался охотно. Темп роста молоди в опытной группе по сравнению с контрольной составил 18%. Выход рыб в опытной группе - 95%, в контрольной - 76%. Вода в аквариумах не портилась, мутность отсутствовала.
Проведенные испытания показали повышение продуктивности животных, птицы и рыб при использовании кормовой добавки на основе предложенного штамма Bacillus amyloliquefaciens В-20/ВКПМ В 12168.