СОСТАВЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИКАНЦЕРОГЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ
COMPOSITIONS POSSESSING ANTI-CANCIROGENIC PROPERTIES

Настоящее изобретение относится к соединениям, которые вызывают апоптоз клеток и могут иметь противораковые свойства.
Те фрагменты описания данного изобретения, где упоминаются или обсуждаются документ, акт  или источник информации, не предполагают допущения, что такой документ, акт  или источник информации или любая их комбинация были на дату приоритета общедоступны, широко известны, или о них было известно, что они связаны с попыткой решить какую-либо проблему, касающуюся предмета настоящего описания изобретения.
В настоящее время миллионы людей больны или были больны раком.  Каждый год заболевает раком свыше миллиона людей.  Любой человек может заболеть раком в любом возрасте; однако около 77% всех случаев рака диагностируется у людей от 55 лет и старше.  Три вида рака, чаще всего встречающиеся у мужчин, - это рак простаты, легких и толстой кишки. У женщин чаще всего встречаются рак груди, легких и толстой кишки.
Рак развивается тогда, когда клетки в какой-либо части тела начинают бесконтрольно расти.  Хотя существует множество видов рака, все они начинаются вследствие бесконтрольного роста анормальных клеток. Нормальные клетки растут, делятся и отмирают упорядоченным образом. В ранние годы жизни человека нормальные клетки делятся быстрее, и это продолжается, пока ребенок не становится взрослым. После этого клетки в большинстве частей тела делятся только для замещения изношенных или отмирающих клеток и для залечивания травм. Раковые клетки отличаются от нормальных, так как они продолжают расти и делиться. Вместо того чтобы отмирать, они переживают нормальные клетки и продолжают образовывать новые анормальные клетки. Этот рост может привести к смерти человека, когда такие клетки не дают нормально функционировать жизненно важным органам  или распространяются по телу, повреждая важные системы. Чем быстрее рак будет обнаружен и начнется лечение, тем больше шансов у больного прожить еще долгие годы.
Раковые клетки развиваются вследствие повреждения ДНК.  В большинстве случаев при повреждении ДНК организм способен восстановить ее. В раковых клетках поврежденная ДНК не восстанавливается. Люди могут наследовать поврежденные ДНК, чем объясняется наследственный рак. Однако нередко ДНК человека повреждается вследствие неблагоприятного воздействия каких-либо факторов окружающей  среды, курения и т.п. Риск развития большинства видов рака можно уменьшить, если изменить образ жизни, например бросить курить и изменить диету на более здоровую.
Раковые клетки часто перемещаются в другие части тела, где они начинают расти и замещать нормальную ткань. Этот процесс, называемый метастазированием, происходит, когда раковые клетки проникают в кровеносные или лимфатические сосуды. Клетки первичной опухоли, распространяющиеся через кровеносные сосуды, могут разрастаться только в определенных, а не во всех органах.
Существует не менее 200 различных видов рака. Они могут развиваться почти в любом органе, жидкости или ткани. Различные типы рака могут вести себя очень по-разному. Вот почему больным раком необходимо лечение, направленное на их конкретный вид рака.
Четырьмя основными типами лечения рака являются хирургия, облучение, химиотерапия и биологические терапии. Существуют также гормональные терапии, такие как тамоксифен, и варианты трансплантации, например пересадка костного мозга.
Лечение может быть различным в зависимости от типа рака и стадии заболевания. Стадия означает, насколько опухоль выросла и распространилась ли в другие места организма.  Если рак локализован и не распространился,  основным способом лечения будет хирургия. Если весь рак нельзя удалить хирургией, варианты лечения включают облучение, химиотерапию или оба этих метода. Некоторые случаи рака требуют комбинации хирургии, облучения и химиотерапии.
В то время как хирургия и радиационная терапия используются для лечения локализованных опухолей, химиотерапия используется для борьбы с раковыми клетками, которые метастазировали (распространились) в другие части организма. В зависимости от типа рака и стадии его развития химиотерапию можно использовать для того, чтобы вылечить рак, предупредить его распространение, замедлить рост опухоли, убить раковые клетки, которые, возможно, распространились на другие части организма, или облегчить симптомы, вызванные раком.
Побочные эффекты химиотерапии зависят от типа лекарств, вводимых количеств и длительности лечения. Наиболее распространенными побочными эффектами являются тошнота и рвота, временное облысение, повышенная подверженность инфекциям и усталость. Многие из этих побочных эффектов причиняют дискомфорт или приводят к эмоциональному угнетению. Однако большинство побочных эффектов можно контролировать с помощью лекарств, поддерживающих мер или путем изменения графика лечения.
Тем не менее, существует потребность в средствах химиотерапии, которые имеют меньшие побочные эффекты и которые можно использовать для лечения линий рака, которые стали стойкими к обычному лечению.
Ликопин
Ликопин, ненасыщенный каротеноид с открытой цепью, без активности провитамина А, присутствует во многих овощах и фруктах. Это красный жирорастворимый пигмент, который придает красный цвет томатам, гуаве,  плодам шиповника, арбузам и розовым грейпфрутам. Ликопин - испытанный антиоксидант. В организме ликопин откладывается в печени, легких, предстательной железе, толстой кишке и коже. Его концентрация в тканях тела выше других каротиноидов (он составляет 50% всех каротиноидов  в сыворотке человека).
Исследования показывают, что ликопин, содержащийся в томатах, более эффективно абсорбируется организмом, если он переработан в сок, соус, пасту или кетчуп. Химическая форма ликопина в томатах изменяется при температурной обработке, и он легче усваивается.
Томаты в американском питании занимают четвертое место из свежих овощей и первое место из консервированных. Появились и продолжают появляться эпидемиологические данные, указывающие на связь между усиленным потреблением томатов и снижением риска сердечно-сосудистых заболеваний и рака простаты. Ведущиеся предварительные исследования позволяют предположить, что ликопин снижает риск дегенерации желтого пятна, окисления липидов сыворотки, а также рака легких, мочевого пузыря, шейки матки, кожи, пищеварительного тракта, груди и простаты.  Ведутся исследования других потенциальных возможностей ликопина.
Токоферилфосфат
Витамин Е, как полагают, имеет много полезных свойств, улучшающих здоровье, в частности антиоксидантные свойства. Считается, что витамин Е имеет 8 различных форм: альфа-, бета-, гамма- и дельта-токоферолы и альфа-, бета-, гамма- и дельта-токотриенолы.  Токоферолы отличаются от токотриенолов тем, что они имею насыщенную фитильную боковую цепь, а не ненасыщенную изопренильную боковую цепь. Четыре формы отличаются количеством метильных групп на хроманольной группе (альфа - три, бета и гамма - по две, а дельта имеет одну группу).
В международной патентной заявке № WO 03/026673 раскрывается, что повышенные уровни накопления витаминов, в том числе токоферилфосфата, могут оказывать положительное действие для облегчения симптомов или лечения рака, так как токоферол влияет на адгезию клеток.  Однако в этом документе не указывается, что токоферилфосфат вызывает гибель клеток, а также не указывается различие в действии между альфа-токоферолом и дельта- и гамма-токоферолом.
Токоферилфосфат описывается также в международной заявке № WO 2004/06483, как обладающий свойствами, связанными с ингибированием разрастания моноцитов/макрофагов, разрастанием клеток гладких мышц, выдавливанием рецепторов CD36 и усвоением окисленного липопротеина низкой плотности (ЛНП).  Примеры иллюстрируют только ингибирование роста клеток, но не гибель клеток.  Кроме того, в этом документе не говорится о лечении рака или о различии в действии между альфа-токоферолом и дельта- и гамма-токоферолом.
В международных патентных заявках №№ WO 00/16772 и WO 03/039461 указывается, альфа-, гамма- и дельта-токотриенолы, а также гамма- и дельта токоферолы природного происхождения демонстрируют противораковое действие.  Альфа-токоферол, однако, не обладает противораковыми свойствами.  Кроме того, в этих заявках указывается, что использование перфосфатных производных соединений типа токоферола полезно при лечении рака.  Испытания на людях и обследования, направленные на определение связи усвоения свободного токоферола с заболеваемостью раком, не дали убедительного результата, и свободные токоферолы не являются полезным клиническим средством лечения рака.
До сих пор существует потребность в усовершенствованных средствах лечения рака.
Сущность изобретения
Установлено, что фосфатные производные 7:8-диметил-6-гидроксихроманов и 8-метил-6-гидроксихроманов (δ- и γ-гидроксихроманы) способны вызывать апоптоз клеток и, таким образом, могут быть полезны при лечении рака, тогда как 5:7:8-триметил-6-гидроксихроманы (α -гидроксихроманы) не обладают этим свойством.
Кроме того, показано, что комбинация одного или более фосфатных производных 7:8-диметил-6-гидроксихроманов и 8-метил-6-гидроксихроманов (δ- и γ-гидроксихроманы) может эффективно уничтожать раковые клетки при более низких концентрациях противоракового агента.
Согласно первому аспекту изобретения предлагается способ облегчения симптомов, лечения или предупреждения рака, включающий введение субъекту, страдающему раком или находящемуся в группе риска по заболеванию раком, фармацевтического состава, содержащего эффективное количество одного или более фосфатных производных одного или более гидроксихроманов, выбранных из группы, состоящей из  7:8-диметил-6-гидроксихроманов, 8-метил-6-гидроксихроманов и их смесей.
Согласно второму аспекту изобретения предлагается способ стимулирования апоптоза клеток, включающий введение в клетки эффективного количества одного или более фосфатных производных одного или более гидроксихроманов, выбранных из группы, состоящей из  7:8-диметил-6-гидроксихроманов, 8-метил-6-гидроксихроманов и их смесей.
Согласно третьему аспекту изобретения предлагается способ облегчения симптомов, лечения или предупреждения рака, включающий введение субъекту, страдающему раком или находящемуся в группе риска по заболеванию раком, эффективного количества фармацевтического состава, содержащего:
(a) один или более противораковых агентов; и
(b) одно или более фосфатных производных одного или более гидроксихроманов, выбранных из группы, состоящей из  7:8-диметил-6-гидроксихроманов, 8-метил-6-гидроксихроманов и их смесей.
Согласно четвертому аспекту изобретения предлагается способ стимулирования апоптоза клеток, включающий введение в клетки эффективного количества состава, содержащего один или более противораковых агентов и одно или более фосфатных производных одного или более гидроксихроманов, выбранных из группы, состоящей из  7:8-диметил-6-гидроксихроманов, 8-метил-6-гидроксихроманов и их смесей.
Согласно пятому аспекту изобретения предлагается способ повышения эффективности ликопина, включающий комбинирование ликопина с одним или более фосфатными производными одного или более гидроксихроманов, выбранных из группы, состоящей из  7:8-диметил-6-гидроксихроманов, 8-метил-6-гидроксихроманов и их смесей.
Этот аспект изобретения включает фармацевтический состав, содержащий эффективное количество ликопина и эффективное количество одного или более фосфатных производных одного или более гидроксихроманов, выбранных из группы, состоящей из  7:8-диметил-6-гидроксихроманов, 8-метил-6-гидроксихроманов и их смесей.
Еще в одном аспекте изобретения предлагается способ повышения эффективности противоракового агента, включающий комбинирование противоракового агента с одним или более фосфатными производными одного или более гидроксихроманов, выбранных из группы, состоящей из  7:8-диметил-6-гидроксихроманов, 8-метил-6-гидроксихроманов и их смесей. Примером пригодного противоракового агента является тамоксифен.
Еще в одном аспекте изобретения предлагается фармацевтический состав, используемый для стимулирования апоптоза клеток и содержащий один или более противораковых агентов и одно или более фосфатных производных одного или более гидроксихроманов, выбранных из группы, состоящей из  7:8-диметил-6-гидроксихроманов, 8-метил-6-гидроксихроманов и их смесей.
Еще в одном аспекте изобретения предлагается фармацевтический состав, используемый для облегчения симптомов, лечения или предупреждения рака,  содержащий один или более противораковых агентов и одно или более фосфатных производных одного или более гидроксихроманов, выбранных из группы, состоящей из  7:8-диметил-6-гидроксихроманов, 8-метил-6-гидроксихроманов и их смесей.
Еще в одном аспекте изобретения предлагается использование одного или более противораковых агентов и одного или более фосфатных производных одного или более гидроксихроманов, выбранных из группы, состоящей из 7:8-диметил-6-гидроксихроманов, 8-метил-6-гидроксихроманов и их смесей, вместе с пригодным наполнителем или разбавителем при изготовлении лекарственного средства для облегчения симптомов, лечения или предупреждения рака.
Еще в одном аспекте изобретения предлагается фармацевтический состав, используемый для стимулирования апоптоза клеток и содержащий эффективное количество одного или более фосфатных производных одного или более гидроксихроманов, выбранных из группы, состоящей из  7:8-диметил-6-гидроксихроманов, 8-метил-6-гидроксихроманов и их смесей.
Еще в одном аспекте изобретения предлагается использование эффективного количества одного или более фосфатных производных одного или более гидроксихроманов, выбранных из группы, состоящей из 7:8-диметил-6-гидроксихроманов, 8-метил-6-гидроксихроманов и их смесей, вместе с пригодным наполнителем или разбавителем при изготовлении лекарственного средства для облегчения симптомов, лечения или предупреждения рака.
При лечении рака часто используется смесь цитотоксичных реагентов.  Лекарственная форма может содержать другие фармацевтические соединения, которые не препятствуют действию фосфатных производных гидроксихроманов. Кроме того, другой фармацевтический состав может вводиться до, совместно или после введения одного или более фосфатных производных одного или более гидроксихроманов. Примеры таких других фармацевтических соединений включают таксол, доцетаксол, адриамицин, тамоксифен и доксорубицин.
Термин "эффективное количество" в том смысле, в котором он здесь используется, означает количество, достаточное для того, чтобы вызвать апоптоз  клеток, или для облегчения симптомов, лечения или предупреждения рака.
Специалисты в данной области знают, какие противораковые агенты пригодны для использования в данном изобретении. Используемый здесь термин "противораковые агенты" включает, но не ограничительно, все соединения, стимулирующие апоптоз клеток, а также алкилирующие агенты, антиметаболитные агенты, иммунологические агенты, соединения, которые влияют на пути передачи сигналов, и другие химиотерапевтические агенты. Предпочтительно одним или более противораковыми агентами являются ликопин или тамоксифен.
1
2
3
4
4
Термин "гидроксихроманы" в том смысле, в каком он здесь используется, обозначает гидроксипроизводные хроманов. Гидроксипроизводные хроманов, используемые в изобретении, являются изомерами 7:8-диметил-6-гидроксихроманов и в энантиомерической или рацемической форме. Более предпочтительно, гидроксихроман выбирается из группы, состоящей из δ- и γ-токолов и их смесей. Токолы включают δ- и  γ-изомеры производных 6-гидрокси-2-метилхромана (структурную формулу см. ниже), где R, R и R могут быть водородом или метильными группами, т.е. производными γ-7:8-диметила и δ-8-метила.  У токоферолов R замещен 4:8:12-триметилтридецилом, а в положениях 2, 4, и 8 (см. *) может быть стереоизомер с R или S активностью или рацемический.  У токотриенолов R замещен 4:8:12-триметилтридека-3:7:11-триеном, а положение 2 может быть стереоактивным (например, стереоизомеры R или S) или рацемическим.
Термин "фосфатные производные" используется здесь для обозначения кислотных форм фосфорилированных агентов электронного переноса, солей фосфатов, в том числе металлических солей, таких как натриевые, магниевые, калийные и кальциевые, а также любых других производных, в которых протон фосфата заменен на другие заместители, такие как этильные либо метильные группы, или фосфатидильные группы. Термин включает смеси фосфатных производных, особенно полученные в результате реакций фосфорилирования, а также каждое из фосфатных производных по отдельности. Например, термин включает смесь монотокоферилфосфата (TP) и дитокоферилфосфата (T2P), а также TP и T2P по отдельности.  Смеси, пригодные для использования, описаны в международной патентной заявке № PCT/AU01/01475.
Предпочтительно одно или более фосфатных производных одного или более агентов электронного переноса выбирается из группы, состоящей из монотокоферилфосфата, дитокоферилфосфата, монотокотриенилфосфата, дитокотриенилфосфата и их смесей. Более предпочтительно одно или более фосфатных производных одного или более агентов электронного переноса представляет собой смесь, состоящую из одного или более из следующих соединений: монотокоферилфосфат, дитокоферилфосфат,  монотокотриенилфосфат и дитокотриенилфосфат.
1
2
2
n
1
2
1
2
В некоторых ситуациях возникает необходимость использовать такое фосфатное производное, как фосфатид, обладающий дополнительными свойствами, например лучшей растворимостью в воде. Фосфатидильные производные являются аминоалкильными производными органических фосфатов. Эти производные можно получить из аминов, имеющих структуру RRN(CH)OH, где n - целое число от 1 до 6, а R и R могут представлять собой либо H, либо короткие алкильные цепи с 3 или менее атомами углерода.  R и R могут быть одинаковыми или различными.  Фосфатидильные производные получают путем замещения гидроксильного протона агента электронного переноса фосфатом, который затем реагирует с амином, таким как этаноламин или N,N'-диметиламин, с образованием фосфатидильного производного агента электронного переноса. В одном из методов получения фосфатидильных производных используется основный растворитель, такой как пиридин или триэтиламин с хлорокисью фосфора, для получения промежуточного соединения, которое затем реагирует с гидроксигруппой амина с образованием соответствующего фосфатидильного производного, такого как дигидрофосфат Р-холила Р-токоферила.
В некоторых ситуациях, если требуются дополнительные свойства, такие как повышенная стабильность или улучшенная доставка, могут использоваться также комплексы фосфатных производных агентов электронного переноса. Термин  "комплексы фосфатных производных" обозначает продукт реакции  одного или более фосфатных производных агентов электронного переноса с одним или несколькими комплексообразующими агентами, выбранными из группы, включающей амфотерные поверхностно-активные вещества, катионные поверхностно-активные вещества, аминокислоты с азотными функциональными группами, а также белки, богатые такими аминокислотами, как описано в международной патентной заявке № PCT/AU01/01476. Примерами белков, богатых такими аминокислотами, являются белки, в которых по крайней мере 1 из 62 аминокислот является аргинином, или по крайней мере 1 из 83 - гистидином, или по крайней мере 1 из 65 - лизином, например различные формы белкового казеина.  Другие примеры включают инсулин,  паратиреоидный гормон (ПТГ), глюкагон, кальцитонин, адренокортикотропный гормон (АКТГ), пролактин, интерферон-α и -β и -γ, лютеинизирующий гормон (ЛГ) (известный также под названием гонадолиберин), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и колониестимулирующий фактор (КСФ).  Аминокислотный состав большинства из этих веществ приведен в таблице.
<b>Аминокислоты в белке</b>
<b>Аминокислоты</b>
<b>Отношение к суммарным аминокислотам</b>
<b>Инсулин</b>
<b>110</b>
арг.
5
1 к 22
гис.
2
1 к 55
лиз.
2
1 к 55
<b>ПТГ</b>
<b>84</b>
арг.
5
1 к 17
гис.
0
0
лиз.
5
1 к 17
<b>Глюкагон</b>
<b>180</b>
арг.
16
1 к 11
гис.
4
1 к 45
лиз.
10
1 к 18
<b>Кальцитонин</b>
<b>93</b>
арг.
6
1 к 16
гис.
3
1 к 31
лиз.
5
1 к 19
<b>АКТГ</b>
<b>41</b>
арг.
3
1 к 14
гис.
1
1 к 41
лиз.
4
1 к 10
<b>Пролактин</b>
<b>220</b>
арг.
12
1 к 18
гис.
9
1 к 13
лиз.
11
1 к 11
<b>Интерферон - </b><b>альфа и бета</b>
<b>133</b>
арг.
7
1 к 19
гис.
2
1 к 83
лиз.
7
1 к 19
<b>Интерферон - гамма</b>
<b>166</b>
арг.
8
1 к 21
гис.
2
1 к 83
лиз.
21
1 к 8
<b>ЛГ</b>
<b>92</b>
арг.
5
1 к 18
гис.
2
1 к 46
лиз.
7
1 к 13
<b>ФСГ</b>
<b>129</b>
арг.
5
1 к 26
гис.
2
1 к 65
лиз.
9
1 к 14
<b>КСФ</b>
<b>144</b>
арг.
6
1 к 24
гис.
3
1 к 48
лиз.
6
1 к 24
<b>Гормон роста домен AOD9604</b>
<b>16</b>
арг.
2
1 к 8
Предпочтительные комплексообразующие агенты выбираются из группы, состоящей из аргинина, лизина и третично-замещенных аминов, например, следующей формулы:
1
2
3
NRRR
1
где R выбирается из группы, включающей смешанные алкильные радикалы с прямой или разветвленной цепью от С6 до С22 и их  карбонильные производные;
2
3
2
3
2
2
2
3
2
2
3
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
R и R независимо выбираются из группы, содержащей H, CHCOOX, CHCHOHCHSOX, CHCHOHCHOPOX, CHCHCOOX, CHCHCHOHCHSOX или CHCHCHOHCHOPOX, причем X представляет собой H, Na, K или алканоламин, при условии, что R и R оба не являются H; и
1
2
3
2
3
3
2
2
2
4
2
3
2
2
2
4
2
где, если R представляет собой RCO, то R может быть CH, а R может быть (CHCH)N(CHOH)-HCHOPO, либо R и R вместе могут быть N(CH)N(CHOH)CHCOO-.
Предпочтительные комплексообразующие агенты включают аргинин, лизин или лаурилиминодипропионовую кислоту, где комплексообразование происходит между основным центром на азоте и сложным эфиром фосфорной кислоты с образованием стабильного комплекса.
Фосфатное производное гидроксихромана может вводиться животным или людям в виде различных лекарственных форм, таких как пищевые добавки, энтеральное питание, парентеральные лекарственные формы, суппозитории, пероральные лекарственные формы, аэрозоли, внутриглазные формы, формы для пульмональной и назальной доставки, для чрескожной доставки, включая накладки и кремы.
Например, фосфатное производное гидроксихромана может вводиться в лекарственной форме для  перорального или парентерального применения.  Такие формы включают таблетки, порошки, жевательные таблетки, капсулы, пероральные суспензии, суспензии, эмульсии или жидкости, детские составы и энтеральное питание.
Лекарственная форма может содержать любые добавки, обычно используемые в приготовлении этой лекарственной формы, такие как крахмал или полимерные связующие, подсластители, красящие вещества, эмульгаторы, покрытия и т.п.  Другие возможные добавки очевидны для специалистов в этой области.
В одном варианте осуществления изобретения лекарственная форма имеет энтеросолюбильное покрытие, как описано в международной заявке PCT/AU01/01206, включенной в данный документ путем отсылки.
В другом варианте лекарственная форма является составом для местного применения, как описано в международной заявке PCT/AU02/01003, включенной в данный документ путем отсылки.
Предпочтительно субъект является животным.  Более предпочтительно животное является млекопитающим.  Наиболее предпочтительно млекопитающее является человеком.
Далее будут описаны различные варианты/аспекты изобретения со ссылками на следующие чертежи, на которых:
Фиг. 1 - результаты примера 1.
Фиг. 2 - воздействие на линию рака простаты (DU-145) из примера 2.
Фиг. 3 - воздействие на разрастание клеток MCF-7 рака груди из примера 3.
Фиг.4 - сравнительная активность различных гамма-токоферилфосфатов из примера 4.
Примеры.
Далее будут описаны различные варианты/аспекты изобретения на примерах, не носящих ограничительного характера.
Пример 1.
RASMC
В этом исследовании сравнивалась эффективность или действенность различных форм токоферолов (α, γ  и δ) с соответственными фосфорилированными соединениями фирм ADM и BASF при ингибировании разрастания клеток гладких мышц аорты крыс ().
Материалы
Пластинки с 96 лунками (проба на жизнеспособность клеток MTS)
Пластинки с 6 лунками (проба на счет фактических клеток)
Среда DMEM/F12- GIBCO/Life Technologies
Фосфатный буферный солевой раствор (PBS)
Сыворотка эмбрионального бычка (FBS)
Клетки гладких мышц аорты крыс (RASMC) p: 6-8  Cell Applications, Inc.
Клеточный титр 96 - водный раствор один (MTS) - Promega
Трипсин - раствор в этилендиаминотетрауксусной кислоте (R-001-100) - Chemicon
Нейтрализующий трипсин раствор (R-002-100) - Chemicon
Этанол
Гемоцитометр
Трипановый синий (0,5% весовых в PBS)
Смеси α, γ и  δ изомеров токоферилфосфатов (монотокоферилфосфат и дитокоферилфосфат)
Методики
Разрастание клеток гладких мышц аорты крыс (RESMC) - Проба  MTS.
2
2
Воздействие α-, δ- и γ-токоферолов и их фосфорилированных аналогов оценивалось по RASMC.  Для каждого соединения испытывались 3 концентрации: 100, 500 и 1000 мкг/мл.  Клетки гладких мышц аорты крыс (RASMC) высеивали в питательную среду (DMEM/F12 + 10% FBS) на пластинки с 96 лунками (5000 клеток/лунка) и выдерживались при 37°C в 5% CO).  Через 24 часа питательную среду удаляли и заменяли минимальными средами DMEM/F12.  В течение 48 часов проводилось сывороточное голодание для синхронизации клеток.  Затем минимальные среды заменяли на питательные среды плюс различные лечебные средства и оставляли еще на 4 дня. Лечебные средства приготавливали в виде маточных растворов либо в 100% этаноле (для альфа-T, альфа-TP, гамма-T и дельта-T), либо в 100% уксусной кислоте (для гамма-TP и дельта-TP), а затем разбавляли для получения конечной концентрации клеток таким образом, чтобы конечная концентрация этанола не превышала 0,1%, а конечная концентрация уксусной кислоты не превышала 0,02%.  При данных условиях испытаний такие концентрации наполнителя не вызывали существенных изменений в разрастании RASMC.  Каждый эксперимент проводился 8 раз.  В конце периода выращивания в каждую лунку добавляли 20 мл реагента MTS и замеряли поглощательную способность на длине волны 490 нм после инкубации в течение еще 1 часа при 37°C, 5% CO. Проба CellTiter 96 Aqueous является колориметрическим методом для определения количества жизнеспособных клеток при испытаниях на разрастание.  CellTiter 96 Aqueous состоит из растворов нового тетразолиевого соединения (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий, внутренняя соль; MTS) и реагента электронной связи (феназин метосульфат; PMS).  MTS под биологическим действием клеток превращается в формазан, продукт, растворимый в среде культуры клеток ткани.  Поглощательную способность формазана на 490 нм можно измерять непосредственно на пластинках с 96 лунками, и эта поглощательная способность прямо пропорциональна количеству клеток (т.е. чем больше поглощательная способность, тем больше количество жизнеспособных клеток).
Результаты и выводы
На фиг. 1 показано в процентах ингибирование разрастания RASMC, оцененное подсчетом клеток, для δ- и γ-токоферолов и их фосфорилированных аналогов.
Результаты показывают, что смеси δ- и γ-токоферилфосфатов вызывают апоптоз (гибель клеток) в модели RASMC (только 10% клеток усваивали краситель, а это позволяет предполагать, что 90% клеток погибли).  Кроме того, результаты показывают, что смеси δ- и γ-токоферилфсфатов вызывают значительный апоптоз, тогда как нефосфорилированная форма не вызывает. Смеси δ-токоферилфсфатов производства как ADM, так и BASF проявили наибольшую эффективность по сравнению с другими испытывавшимися аналогами.  Представляется также, что эффективность зависит от дозы.
Она также весьма отлична от эффективности α-токоферилфосфата, который не вызывает апоптоза RASMC, а просто предупреждает избыточный рост клеток посредством механизма регулирования. Под действием α-токоферилфосфата клетки RASMC не размножались, но все клетки были здоровы и жизнеспособны (как было установлено по усвоению красителя).  В то же время под действием δ- и γ-токоферилфосфата клетки RASMC не размножались, и остающиеся клетки не были жизнеспособны.  Это указывает на другой механизм действия.
Пример 2
В этом исследовании сравнивалось воздействие смеси ликопина и γ-токоферилфосфата, по отдельности и вместе, на клетки рака простаты.
Материалы и методы
Культура исходных клеток.
2
Клетки рака простаты DU-145 были приобретены в Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США).  Исходные клетки были выращены в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (производства Gibco BRL, Grand Island NY), к которой добавили 5% FBS (сыворотки эмбрионального бычка, Gibco BRL, Grand Island NY) в увлажненной атмосфере с содержанием CO в воздухе 5%, при 37°C.  Клетки пересеивали 1-2 раза в неделю.
Испытание на рост клеток.
5
Клетки на исходных пластинках обрабатывали трипсин/версином, добавленным к равному объему фенольного RPMI-1640 без красного цвета (Gibco BRL, Grand Island NY) с добавлением 5% сыворотки эмбрионального теленка, обработанной нагруженной декстраном угольной пылью (DCFCS).  Клетки заново суспензировали до концентрации 0,1x10клеток/мл с помощью гемоцитометра и размещали в один слой аликвотами по 0,5 мл в пластиковые чашки для выращивания с 24 лунками (производства Costar, Corning USA).  Через 24 часа клетки обрабатывали соответствующими концентрациями (см. таблицу) смеси γ-токоферилфосфатов (γ-TP) (фирмы Vital Health) и ликопина (фирмы Sigma) или комбинациями ликопина и γ-TP, разведенными в фенольном RPMI-1640 без красного цвета с добавлением 5% DCFCS.  Питательную среду меняли каждые 3-4 дня.  Комбинация ликопина и γ-TP содержала их в соотношении 1:1 по молекулярному весу/массе, причем содержание ликопина варьировалось в пределах 5 мкг/мл - 40 мкг/мл.
Счет клеток.
Клетки дважды промывали 0,9% NaCl, чтобы удалить неприросшие мертвые клетки, а затем лизировали в 0,5 мл 2,5мМ буферного раствора Хипса плюс две капли лизирующего реагента зап-оглобина II (производства Beckman Coulter, Coulter Corp USA) в течение 5-15 минут.  Высвободившиеся ядра суспензировали в изотоне III (Beckman Coulter, Coulter Corp, USA) и считали с помощью счетчика Коултера, в котором размер частиц был установлен на >5мкм.  Каждый счет выполнялся три раза на содержимом трех ячеек. Результаты вычислялись как среднее значение ± стандартная погрешность.  Значения Р определялись посредством проверки по критерию Стьюдента на независимых образцах  (с помощью стандартных программных пакетов SPSS).
Результаты
Результаты представлены в приведенных ниже таблицах и на соответствующих фигурах чертежей.
Таблица 1:  Результаты для смеси γ-токоферилфосфатов через 12 дней
Концентрация гамма-TP (мкг/мл)
0
10
15
20
25
30
40
Всего жизнеспособных клеток / лунка (X10<sup>5</sup>)
5,617
5,103
3,400
1,603
0,859
0,113
0,007
5,992
5,851
3,464
1,447
1,052
0,192
0,005
5,901
5,713
3,530
1,419
1,074
0,168
0,008
5,844
5,835
5,239
Среднее (X10<sup>5</sup>)
5,738
5,556
3,465
1,490
0,995
0,157
0,007
Откл. Стьюд. (X10<sup>5</sup>)
0,274
0,398
0,065
0,099
0,118
0,040
0,001
Таблица 2:  Результаты для ликопина через 12 дней
Концентрация ликопина (мкг/мл)
0
5
10
15
20
25
30
Всего жизнеспособных клеток / лунка (X10<sup>5</sup>)
4,677
4,392
3,555
3,704
0,127
1,759
0,212
4,984
4,383
3,869
3,727
0,222
1,196
0,075
4,922
4,325
0,478
0,073
4,724
4,453
4,317
Среднее (X10<sup>5</sup>)
4,680
4,367
3,712
3,716
0,276
1,478
0,120
Откл. Стьюд. (X10<sup>5</sup>)
0,259
0,036
0,222
0,016
0,182
0,398
0,080
Таблица 3:  Результаты для комбинации ликопина и смеси γ-токоферилфосфатов через 8 дней
Концентрация гамма-TP (мкг/мл)
0
10
15
20
25
30
40
Всего жизнеспособных клеток / лунка (X10<sup>5</sup>)
1,348
0,071
0,040
0,007
0,010
0,006
0,005
1,673
0,074
0,020
0,010
0,010
0,010
0,005
1,110
0,010
0,000
1,391
Среднее (X10<sup>5</sup>)
1,381
0,073
0,030
0,009
0,010
0,008
0,003
Откл. Стьюд. (X10<sup>5</sup>)
0,231
0,002
0,014
0,002
0,000
0,003
0,003
На фиг. 2 представлены результаты из этих трех таблиц (воздействие смеси γ-TP (GTP-0805), ликопина (2 мкг/мл) и их комбинации на линию клеток рака простаты (DU-145)), выраженные в виде процентного сокращения количества жизнеспособных клеток.
Выводы
Результаты показывают, что комбинация ликопина и смеси γ-токоферилфосфатов приводила к гибели клеток рака простаты всего через 8 дней.  Кроме того, результаты показывают, что большее количество клеток рака простаты погибло при более низкой концентрации ликопина в комбинированном лечебном средстве, чем при использовании одного только ликопина. Далее, результаты показывают, что смесь γ-токоферилфосфатов является сильным апоптическим агентом.
Пример 3
Воздействие in vitro смеси γ-TP отдельно и в комбинации с тамоксифеном, широко используемым для лечения рака средством, исследовалось на линии клеток рака груди (MCF-7).
Методика
Культура исходных клеток
2
. Клетки рака молочной железы человека MCF-7, номер пересева 390, были любезно предоставлены д-ром К. Осборном. Исходные клетки были выращены в виде однослойных культур в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (производства Gibco BRL, Grand Island NY), к которой добавили 5% FBS (сыворотки эмбрионального бычка, Gibco BRL, Grand Island NY). 10-8 М эстрадиола в увлажненной атмосфере с содержанием CO в воздухе 5%, при 37°C. 17 β-эстрадиол (активатор клеточного цикла) растворяли в этаноле и разбавляли в пропорции 1:10,000 в питательной среде. Клетки пересеивали раз в неделю, приготавливая суспензию из 0,06% трипсина / 0,02% этилендиаминотетрауксусной кислоты (pH 7,3).
Испытание на рост клеток.
5
Клетки на исходных пластинках суспензировали путем обработки трипсин/версином, добавленным к равному объему фенольного RPMI-1640 без красного цвета (Gibco BRL, Grand Island NY) с добавлением 5% сыворотки эмбрионального теленка, обработанной нагруженной декстраном угольной пылью (DCFCS).  Клетки заново суспензировали до концентрации 0,1x10клеток/мл с помощью гемоцитометра и размещали в один слой аликвотами по 0,5 мл в пластиковые чашки для выращивания с 24 лунками (производства Costar, Corning USA).  Через 24 часа клетки обрабатывали соответствующими концентрациями тамоксифена, ликопина, смеси γ-TP, γ-T (фирмы Vital Health) и ликопина (фирмы Sigma)
или их комбинациями, с эстрадиолом или без него, разведенными в фенольном RPMI-1640 без красного цвета с добавлением 5% DCFCS.  Питательную среду меняли каждые 3-4 дня.
Счет клеток.
Клетки дважды промывали 0,9% NaCl, чтобы удалить неприросшие мертвые клетки, а затем лизировали в 0,5 мл 2,5мМ буферного раствора Хипса плюс две капли лизирующего реагента зап-оглобина II (производства Beckman Coulter, Coulter Corp USA) в течение 5-15 минут.  Высвободившиеся ядра суспензировали в изотоне III (Beckman Coulter, Coulter Corp, USA) и считали с помощью счетчика Коултера, в котором размер частиц был установлен на >5мкм.  Каждый счет клеток выполнялся три раза на содержимом трех ячеек. Результаты вычислялись как среднее значение ± стандартная погрешность.  Значения Р определялись посредством проверки по критерию Стьюдента на независимых образцах  (с помощью стандартных программных пакетов SPSS).
Результаты
-8
-8
На фиг. 3 показано воздействие на разрастание клеток рака молочной железы MCF-7 различных доз тамоксифена (Tam), γ-T (гамма-ток), γ-TP (смесь гамма-TP) по отдельности и смеси γ-TP плюс тамоксифен (10M) без эстрадиола (-E). Комбинация смеси γ-TP и самой низкой дозы тамоксифена (10M) имеет более высокую ингибиторную эффективность, чем самая высокая доза тамоксифена, что заставляет предположить наличие синергетического эффекта.
Выводы
Результаты испытаний in vitro показывают, что смесь γ-TP обладает сильной активностью в плане противодействия разрастанию и стимулирования апоптоза как сама по себе, так и в комбинации с такими агентами, как тамоксифен. Смесь  γ-TP очень сильна в отношении линий клеток рака груди MCF-7.  Она столь же сильна, сколь и тамоксифен, в отношении линий клеток рака груди, но при более низких дозах.  Заметен эффект синергии с тамоксифеном (при низких дозах).  Кроме того, ингибирование роста раковых клеток смесью γ-TP зависит от дозирования.
Пример 4
in vitro
В этом примере исследовалась активность  гамма-токоферилфосфатов (γ-T, γ-TP, γ-T2P и γ-TPM) в отношении клеток рака молочной железы MCF-7.
Условия роста клеток рака молочной железы
MCF-7
2
2
.  Клетки выращивались в пластиковых склянках для выращивания клеток ткани размером 75 cm в один слой в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10%  сыворотки эмбрионального бычка (FBS) в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO в 95% воздуха при 37°C.  Клетки пересеивались  каждые две недели путем суспензирования в 0,06% трипсина / 0,02% этилендиаминотетрауксусной кислоты (pH 7,3).
Испытания на разрастание линии клеток рака молочной железы MCF-7 (Испытания MTS).
Клетки трипсинировали (как и во время пересеивания) в DMEM с добавлением 10% FBS.  Затем клетки снова суспензировали, доводя до количества 10 000 клеток/мл с помощью гемоцитометра.  Клетки высеивали в количестве 1000 клеток на лунку или путем вливания 100 мкл суспензии клеток в пластинки для культивирования с 96 лунками. До начала экспериментов клетки оставляли на ночь, а затем синхронизировали (путем сывороточного голодания в течение 24 часов).
После синхронизации клетки обрабатывали соответствующими концентрациями лечебных средств в 100% этаноле (2, 5, 10, 15, 20, 30 & 50 мкг/мл), а затем вносили их в среду RPMI 1640 с добавлением сыворотки эмбрионального теленка (FCS), обработанной нагруженной декстраном угольной пылью (DCFBS).  Конечная концентрация этанола, воздействовавшая на клетки, не превышала 1%.  Через 72 часа пластинки инкубировали с реагентом MTS (как описано в примере 1) в течение 1 часа.  Измерение проводилось с помощью спектрофотометра на длине волны 490 нм.  Для каждого испытывавшегося соединения проводилось 8 опытов (с различными концентрациями, которые приводятся ниже).
Сокращения названий лечебных средств: GT = гамма-токоферол; GTP = гамма-токоферилфосфат; GT2P = гамма-дитокоферилфосфат, GTPM = смесь гамма-токоферилфосфатов (комбинация GTP и GT2P).  Обратите внимание: 0 мкг/мл указывает на использование контроля, а именно наполнителя (т.е. 1% этанола).
Проведенные эксперименты:
-
GT отдельно (без E) при 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30 и 50 мкг/мл
-
GTP отдельно (без E) при 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30 и 50 мкг/мл
-
GT2P отдельно (без E) при 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30 и 50 мкг/мл
-
GTPM отдельно (без E) при 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30 и 50 мкг/мл
Результаты
Результаты представлены в приведенной ниже таблице и на фиг. 4.
<b>Лечебное средство</b>
<b>Концентрация</b>
0
1
2
5
10
15
20
30
50
GT
0
-6.104
15.685
36.36
68.689
56.82
79.766
82.743
62.622
GTP
0
7.32
5.624
4.807
25.102
43.512
64.719
81.81
109.928
GT2P
0
7.283
4.91
31.07
39.471
53.126
64.557
98.43
126.506
GTPM
0
0.927
24.929
23.11
52.068
73.217
98.11
112.197
127.996
Выводы
Результаты показывают, что GTPM является наиболее сильным противораковым средством, за ним идут GT2P и  GTP, а GT - наименее сильное средство с ограниченной активностью. Обнаружено существенное снижение роста раковых клеток после обработки гамма-токоферилфосфатами: это показывает, что GTP, GT2P и GTPM могут вылечивать или замедлять образование и распространение рака.
Слова "содержащий" или "включающий" и их формы, используемые в данном описании и формуле изобретения, не ограничивают заявляемое изобретение и не исключают каких-либо его вариантов или дополнений.
Специалистам будут очевидны возможности модификаций и усовершенствований изобретения. Такие модификации и усовершенствования входят в объем изобретения.