Результаты доклинических исследований иммунотропной и противоопухолевой активности плацентарного препарата rimolans®

РЕЗУЛЬТАТЫ ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ИММУНОТРОПНОЙ И ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПРЕПАРАТА

RIMOLANS

Е.Я.Быкова, Л.Р.Хемий, Н.Л. Чарская

ООО «Рижский центр репродукции»

И.А.Барене, Л.В. Иванова, Л.Я. Штале, Д. Спруджа

Рижский Университет им. П. Страдыня; МНИОИ им. П. А. Герцена

Н.С.Сергеева, И.К.Свиридова, Л.М. Скуинь

Медицинская Академия постдипломного образования

1. Актуальность проблемы профилактики и лечения иммунодефицитных состояний у мелких домашних животных

Научно-практическими иследованиями последних лет доказано, что у домашних животных наблюдается рост патологии, обусловленной наличием и прогрессивным развитием вторичного иммунодефицитного состояния (ИДС) (22, 33, 46, 51). В основном ИДС развивается при хронической бактериально-вирусной инфекции, аутоиммунных заболеваниях, онкопатологии, при применении цитостатической и кортикостероидной терапии (8, 25,

27, 29,32,42).

Особую озабоченность ветеринарных врачей вызывает рост онкологических заболеваний у мелких домашних животных (10,15,28,48). Анализ наличия злокачественных опухолей среди 100 тыс. собак и кошек, проведенный Withrow Stephen J, and David M., показал, что данная патология наблюдается чаще у собак старше 10 лет. Около 50% смертных случаев связаны чаще всего с диагнозом рака молочных желез, остеосаркомы животных в возрасте 5-10 лет (17, 18, 30, 34). Группой риска развития данной патологии среди собак являются: золотистый ретривер, боксер, бернский зен-ненхунд (54).

Среди кошек рак молочной железы занимает третье место в структуре общей онкопатологии. Около 90% грудных опухолей железы у кошек являются злокачественными, и эти опухоли имеют тенденцию прогрессировать и метастазировать (15). В статистическом отчете American Veterinary Medical Association за 2004 год и в обзорах National Pet Owners' Survey и American Pet Products Manufacturers Association за 2005/2006 гг. отмечается,

что в США приблизительно 74 млн собак и 90 млн кошек, для которых рак - чрезвычайно серьезная угроза. Это основная причина болезни и смерти в 47% случаев среди собак и в 32% среди кошек. Исследованиями многих авторов доказано, что бактериально-вирусные инфекции и другая патология, ассоциированная с инфекцией различной локализации, составляют более 80% (в эту группу включены животные с онкопатологией, осложненной присоединившейся на фоне имеющегося ИДС).

Известно также, что хронически протекающие оппортунистические инфекции у животных (стафилококковые инфекции кожи и мочеполовой системы, ассоциированные вирусные инфекции дыхательных путей и т.д.); аллергические болезни (системная анафилаксия, ангионевротический отек, аллергический ринит, бронхит, острый аллергический гастрит, кожные аллергические болезни и т.д.) в большинстве случаев также развиваются на фоне нарушения функций иммунной системы (2, 11, 36, 37, 44, 46).

В связи с изложенными выше факторами проблема профилактики и лечения нарушений функции врожденного и адаптивного иммунитета среди мелких домашних животных чрезвычайно актуальна. Следовательно, актуальна разработка и внедрение новых препаратов, обладающих иммуномодулирующим действием (7, 9, 29).

В последние годы наметилась тенденция к созданию и использованию препаратов, изготовленных из природного сырья. Практическое значение применения таких препаратов исключительно велико. «Перспективным является развитие иммунофармакологии,- создание лекарственных препаратов на основе биомолекул-ферментов, белков, интерферонов, интерлейкинов и

других цитокинов» (С.В. Шабунин, А.М. Смирнов, В.И. До-рожкин, В.Д.Соколов, III съезд фармакологов и токси-клогов, 2011). Особый интерес вызывают препараты плаценты, содержащие большой спектр иммунорегуля-торных пептидов, аминокислот, гормонов и др. компонентов (1, 19, 31, 41, 43, 49, 52). По мнению многих авторов, препараты, получаемые из природных, биологически активных субстанций можно назвать терапией 21-го века, они безвредны для организма и практически не вызывают побочных реакций. Установлено также, что их клиническая эффективность превышает действие химически синтезированных препаратов (3, 5, 16, 26). Клинико-лабораторные исследования данных препаратов доказали, что являясь иммуномодуляторами, они корректируют имеющиеся нарушения ИДС. Препараты этой группы способствуют формированию функций гуморального иммунитета, модулируют специфический Т-клеточный иммунитет, систему фагоцитоза, НК клетки, систему цитокинов, хемокинов, лимфокинов. Этот факт объясняется особенностями функционирования компонентов иммунной системы, и именно тем, что иммуно-компетентные клетки организма функционально взаимосвязаны и сбалансированы между собой (6, 12,

47, 53).

К иммуномодуляторам относится и препарат плаценты человека, разработанный сотрудниками ООО «Рижского центра репродукции» и Рижского университета им. П. Страдыня (кафедра технологии лекарственных средств). Торговая марка препарата RIMOLANS зарегистрирована в WIPO (SERTIFICATE OF REGISTRATION WIPO 998 473, Geneva, April 30, 2009; Registration date: November 28, 2008; Date next payment due: November 28, 2018.).

2. Характеристика препарата RIMOLANS

Препарат RIMOLANS является экстрактом плаценты человека, в котором в природно-сбалансированном состоянии определены: группа цитокинов (TNF-a, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, L-8, IFNa, ß, GMCSF и др.), гормоны (хорионический гонадотропин, прогестерон, эстрадиол, и др.), ферритин, альфафетопротеин (AFP), аминокислоты.

При разработке технологии производства препарата была поставлена цель максимального сохранения биологически активных субстанций плаценты человека и их физиологического соотношения. Это очень важный момент, поскольку известно, что сложная многокомпонентная регуляция иммунитета при введении препаратов природного происхождения достигается не одним каким-либо продуктом, выделенным в чистом виде, а именно комплексом продуктов, близким к собственной их концентрации в организме.

Наиболее значимую иммунорегуляторную функцию выполняют цитокины. Им в настоящее время отводится исключительно важная роль в регуляции иммунного ответа. Доказано, что с помощью цитокинов осущест-

вляются иммунные механизмы, направленные на элиминацию инфекционного агента и восстановление иммунного гомеостаза. Интерлейкины продуцируются различными клетками организма и являются факторами взаимодействия между клетками всех органов и систем. Во многих случаях они проявляют себя как факторы ау-токринной регуляции. Продуцировать и секретировать цитокины способны практически все клетки организма, в том числе, и эндотелиальные клетки плацентарной ткани. Однако именно при сроке беременности 3040 недель доношенная плацента усиленно продуцирует интерлейкины IL- 1р, IL-2, IL- 6, IL-12, IL-10, TNF-a и др. (14, 21, 45, 50, 52).

После получения лекарственной формы RIMOLANS на первом этапе была проведена оценка его острой цитотоксичности, биологической безвредности при различных способах введения (Отчёт: «Экспериментальная оценка острой цитотоксичности, профилактической и противоопухолевой эффективности препарата Римо-лан”. МНИОИ им. П.А.Герцена, М.,1999. Отчет: «Проверка биологической безвредности Римолана, введённого внутривенно». Государственный ветеринарный диагностический центр, Рига, 1999 г. Отчет: «Исследование безвредности плацентарного экстракта препарата Римолан». Рига, 2000). Результаты данных исследований in vitro и in vivo (среди 439 мышей) приведены ниже.

Объектом оценки острой цитотоксичности были перевивные клеточные линии человека: аденокарцинома молочной железы (MCF-7), карцинома яичников (SKOV-3) и эпидермальная карцинома гортани (Hep-2), а также 8 образцов опухолевых клеток, выделенных из клинического материала (из опухолевой ткани яичников и асцитической жидкости, полученной от пациенток с диагнозом рак яичников III-IV стадии и рак сигмовидной кишки). Выявлено, что в МТТ-тесте и радионуклидныхте-стах препарат RIMOLANS не обладает острой цитотоксичностью. При исследовании препарата in vivo на кроликах доказана биологическая безвредность RIMOLANS. В экспериментах исследованы и реакции животных в зависимости от пути введения: внутривенный, внутрикожный и подкожный. Статистически достоверные различия в клинических и биохимических показателях крови и мочи не выявлены.

Опытами in vivo доказано также, что препарат не об-ладаеттерратогенным и эмбриотоксическим действием и положительно влияет на репродуктивную систему подопытных животных (Отчёт: «Исследование эмбриоток-сического и тератогенного действия плацентарного экстракта препарата Римолан», 2001). В экспериментах были использованы белые крысы обоих полов из линии Wistar. При этих исследованиях препарат RIMOLANS вводился в критические периоды беременности (5-я и 9я недели беременности) в дозах, в пять раз превышающих запланированную терапевтическую дозу. Установлено, что препарат не вредит внутренним органам экс-

N п/п Способ введения RIMOLANS Доза RIMOLANS мг/кг Log2 обратных величин титров антител Индекс действия Число наблюдений р

1 контроль - 5,2+-0,1 - 15 -

2 подкожно 1 7,7+-0,1 1,5 15 <0.05

3 подкожно 10 6,8+-0,2 1,3 15 <0.05

4 внитрибрюшинно 1 7,8+-0,2 1,5 15 <0.05

5 внитрибрюшинно 10 7,0+-0,3 1,4 15 <0.05

Таблица 1. Влияние препарата RIMOLANS, введёного одновременно с антигеном (ЭБ), на титры антиэритроцитарных антител в крови мышей линии СВА

периментального плода животного и не действует на формирование внутренних органов; стимулирует развитие трофобласта у самок мышей, предотвращая проявление резорбции плода; не влияет на процесс формирования костных тканей скелета и окостенения позвоночных тканей во время эмбрионального развития. Аномалии в построении головного черепа, позвоночника, тазовой кости, верхних и нижних конечностей не обнаружены. Под воздействием RIMOLANS увеличивается индекс фертильности и гестации. Физиологические, биохимические показатели, которые характеризуют развитие потомства первого поколения до двухмесячного возраста при воздействии препарата RIMOLANS не меняются и не отличаются от показателей контрольной группы животных.

Учитывая особенности многокомпонентного состава и отсутствие у препарата острой цитотоксичности, тер-ратогенного и эмбриотоксического действия, проведены экспериментальные исследования по изучению его им-мунотропной и противоопухолевой активности (Отчёт об экспериментальном испытании иммунотропной активности Римолана. ГНЦ РФ, Институт Иммунологии МЗРФ, М.,1998. Отчёт: «Исследование противоопухолевой активности препарата Римолан на модели перевивных опухолевых штаммов мышей». МНИОИ им. П.А.Герцена, М.,2000. Отчёт: «Влияние препарата Римолан на уровень некоторых цитокинов (ИЛ-1а, ФНО-р, ИНФ-y, ИЛ-6, ГМ-КСФ) в сыворотке крови мышей-опухоленосителей на модели меланомы В-16». МНИОИ им. П.А.Герцена, М.,2000). Эксперименты были проведены среди 1855 мышей линий СВА, C57BL/6j, BDF1.

3. Результаты исследований иммунотроной активности RIMOLANS

Для оценки иммунофармакологической активности препарата проведено экспериментальное изучение влия-

ния его на показатели клеточного и гуморального иммунного ответа на инбредных мышах в модельных системах in vivo и in vitro, как при исходно нормальном иммунном статусе животных, так и при вторичном имму-нодефицитном состоянии. Эксперименты выполнены на мышах линии СВА, C57BL/6j и гибридах (СВА х C57BL/6j)F1.

3.1. Влияние препарата RIMOLANS на уровень антител в сыворотке крови и на антителообразующие клетки селезёнки мышей

Исследования проведены на мышах двух линий: СВА и C57BL/6j с учётом генетической обусловленности, существующих межлинейных различий антителогенеза у инбредных мышей. Статистически достоверное повышение уровня антиэритроцитарных антител в крови мышей линии СВА установлено при введении испытуемого препарата одновременно с антигеном (эритроциты барана

- ЭБ) за сутки до иммунизации (таблица 1, таблица 2).

Результаты влияния препарата на уровень антиэритроцитарных антител в крови мышей, генетически слабо отвечающих на антиген (линия С57ВL/6j) свидетельствуют о том, что RIMOLANS статистически достоверно повышаеттитры антител, независимо от срока введения по отношению к антигенному стимулу (таблица 3). Причем, введение препарата в дозе 1мг/кг вызывало увеличение у животным обеих опытных групп исходного, нормального уровня IgM-образующих клеток; при введении препарата мышам, слабо реагирующим на тимус-зависимый антиген, 10мг/кг статистически достоверных различий количества АОК между опытной и контрольной группами не было выявлено.

Таким образом, RIMOLANS проявляет иммуностимулирующую активность на тимусзависимый антиген, повышая уровень антител в периферической крови мышей

N Способ Доза Log2 обратных Индекс Число

п/п введения RIMOLANS величин титров действия наблюдений р

RIMOLANS мг/кг антител

1 контроль - 5,7+-O,2 - 15 -

2 опыт 1 7,6+-O,1 1,5 15 <O.O5

Таблица 2. Влияние RIMOLANS (на индуктивную фазу иммунопоэза), введёного за сутки до антигена (ЭБ), на титры антиэритроцитарных антител в периферической крови мышей линии СВА

с генетической предрасположенностью, как к сильному, так и слабому иммунному ответу. RIMOLANS вызывает увеличение титров антиэритроцитарных антител в периферической крови мышей независимо от сроков его введения по отношению к антигенной стимуляции.

3.2. Влияние RIMOLANS на клеточноопосредованный иммунный ответ -реакцию гиперчувствительности замеделенного типа

Известно, что реакции ГЗТ являются защитной формой реагирования организма и обеспечивают антибактериальный иммунитет. Кожные реакции ГЗТ наблюдаются у сенсибилизированных животных после повторного вну-трикожного введения им специфического антигена (АГ). Эти реакции были изучены на мышах. Суть экспериментальной модельной системы ГТЗ заключается в том, что через 5-8 дней после контакта с АГ (иммунизация), повторный контакт с тем же АГ приводит к развитию местной воспалительной реакции. При постановке реакции мышей одной массы иммунизировали внутрибрюшинно эритроцитами барана (ЭБ). Для выявления сенсибилизации на 5-е сутки после иммунизации животным повторно

Таблица 3. Влияние препарата RIMOLANS линии С57BL/6j

в бедро (РК) вводили дозу ЭБ. В контралатеральную лапу вводили 0,05мл физраствора (РО). Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 часа по разнице массы опытной (РО) и контрольной лап (РК). Индекс реакции (ИР) вычисляли по формуле: ИР = (РО -РК)/РК0*100%. В эксперименте использовали 2 группы мышей линии СВА: опытной группе вводили подкожно и внутрибрюшинно RIMOLANS и контрольная, - без препарата. Полученные результаты показали, что RIMO-LANS стимулирует клеточно-опосредованную реакцию иммунитета ГЗТ. При этом в дозе 1мг/кг, независимо от способа введения, местная реакция, возникшая у мышей линии СВА на месте повторного контакта с антигеном, усиливалась вдвое по сравнению с реакцией у контрольных мышей. Доза 10мг/кг не влияла на развитие реакции ГТЗ.

Таким образом, усиление ГЗТ в экспериментальных условияхпри введении RIMOLANSсвидетельствуетости-мулирующем влиянии препарата на реакции клеточноопосредованного иммунного ответа, что, в свою очередь, указывает на стимулирующее влияние и противоинфек-ционный иммунитет. По степени регуляции реакции ГЗТ в экспериментах на мышах можно судить о способности препарата активизировать рецепторы на Т-эффекторах.

на титры антиэритроцитарных антител в крови мышей

N п/п Способ введения RIMOLANS Доза RIMOLANS мг/кг Log2 обратных величин титров антител Индекс действия Число наблюдений р

1 контроль - 3,8+-O,1 - 1O -

2 до иммунизации 1 5,3+-O,2 1,4 1O <O.O5

3 до иммунизации 1O 4,9+-O,1 1,3 1O <O.O5

4 вместе с ЭБ 1 5,3+-O,1 1,4 1O <O.O5

5 вместе с ЭБ 1O 5,1+-O,3 1,3 1O <O.O5

N п/п Способ введения RIMOLANS Доза RIMOLANS мг/кг Log2 обратных величин титров антител Индекс действия Число наблюдений р

1 контроль - 7,2+-1,2 1O -

2 подкожно 1 14,1+-1,6 12 <O.O5

3 подкожно 1O 6,9+-1,5 12 >O.O5

4 внутрибрюшинно 1 15,3+-1,6 1O <O.O5

5 внутрибрюшинно 1O 8,1+-1,5 11 >O.O5

Таблица 4. Влияние RIMOLANS на гиперчувствительность замедленного типа у мышей линии СВА

3.3. Влияние RIMOLANS на клеточноопосредованный иммунный ответ -реакцию трансплантат против хозяина

Обязательным условием развития реакиции трансплантат против хозяина (РТПХ) должна быть иммунологическая инертность реципиента. Экспериментально данный тип реакций воссоздается путем введения мышам Fl-гибридам лимфоидных клеток одной из родительских линий. Метод количественной оценки РТПХ основан на сравнении увеличения массы лимфатических узлов, в которых протекает РТПХ с аналогичными им контралатеральными узлами, в которых реакции нет. РПТХ даёт возможность оценить действие испытуемого соединения на эффекторную способность Т-лифоцитов в реакции трансплантационного иммунитета.

Реципиентам - мышам-гибридам (СВAхС57ВL/6j) F1, в подушечку правой задней лапы подкожно вводили 10 млн клеток селезёнки доноров - родительской линии СВА, в левую, - такое же количество сингенных клеток. RIMOLANS в дозах 1 и 10мг/кг вводили внутрибрюшинно мышам-реципиентам одновременно с переносом им клеток селезёнки от доноров. На 8-е сутки после пе-

реноса животных, выделяли подколенные лимфатические узлы в опытной и контрольной лапах и взвешивали их. Индекс реакции, отражающий отношение массы опытного и контрольного узлов высчитывали для каждого животного отдельно (таблица 5).

В результате эксперимента выявлено, что в дозе 1мг/кг препарат RIMOLANS дает увеличение индекса реакции РПТХ в полтора раза, а доза 10мг/кг не влияла на этот показатель. У реципиентов-гибридов (СВА х С57ВL/6j) F1 под действием RIMOLANS в дозе 1мг/кг происходило увеличение регионарных лимфатических узлов, развивающееся при введении родительских (С57ВL/6j) спленоцитов в кожу стопы. Вероятно, повышение индекса реакции РПТХ происходит за счёт стимуляции RIMOLANS эффекторной способности

Т-лимфоцитов, оветственныхза этот тип клеточного реагирования.

3.4. Влияние RIMOLANS на гуморальный иммунный ответу мышей с вторичным иммунодефицитным состоянием

С целью изучения возможности применения RIMOLANS для коррекции вторичных ИДС использовали мышей с

Таблица 5. Влияние RIMOLANS на развитие РТПХ

N п/п Группа наблюдения Доза RIMOLANS мг/кг Индекс реакции РПТХ % Число наблюдений р

1 контроль - 2,3+-0,1 1O -

2 опыт 1 3,4+-O,3 1O <O.O5

3 опыт 1O 2,1+-O,2 1O >O.O5

N Группа Доза Кол-во АОК Число р

п/п наблюдения RIMOLANS на 10млн наблюдений (относительно

мг/кг спленоцитов контр. II)

1 контроль I - 151.З+-17.7 10 <0.05

2 ЦФ - контроль II - 52.2+-12.4 15 -

З ЦФ + RIMOLANS 1 105.5+-15.7 15 <0.05

Таблица 6. Влияние препарата RIMOLANS на количество АОК в селезёнках мышей линии СВА в условиях вторичного иммунодефицитного состояния, индуцированного препаратом циклофосфаном

индуцированной иммунологической недостаточностью. Для создания иммунодефицитного состояния мышам вводили цитостатический препарат циклофосфан (ЦФ), вызывающий состояние иммунодепрессии.

Опытной группе мышей, получивших ЦФ, одновременно с иммунизацией вводили внутрибрюшинно препарат RIMOLANS в дозе 1мг/кг. Функциональную активность клеток, продуцирующих анитела, оценивали на 5-е сутки после введения ЭБ (таблица 6). Уровень ан-тиэритроцитарных антител определяли в тесте гемагг-лютинации на 7-е сутки после иммунизации. Результаты опытов показывают, что введение RIMOLANS экспериментальным мышам с индуцированной иммунологической недостаточностью обеспечивает статистически достоверную стимуляцию антителообразующей функции В-лифоцитов. RIMOLANS вдвое увеличивает количество АОК, сниженное иммунодепрессивным действием ци-клофосфана (таблица 6, таблица 7). Выявлено регулирующее влияние RIMOLANS в реализации гуморального иммунного ответа. RIMOLANS в дозе 1мг/кг в

l,5 раза стимулирует антителогенез инбредных мышей при исходно нормальном иммунном статусе, и в l,7 раз -при вторичных иммунодефицитных состояниях. Применение RIMOLANS на фоне действия циклофосфана приводит к выраженному снижению иммунодепрессивного действия последнего.

Результаты опытов свидетельствуют о том, что введение препарата RIMOLANS экспериментальным мышам с индуцированной иммунологической недостаточностью обеспечивает статистически достоверную стимуляцию антителообразующей функции В-лифоцитов. RIMOLANS значительно, - в два раза, - увеличивает количество АОК, сниженное иммунодепрессивным действием циклофосфана.

3.5. Влияние RIMOLANS на миграцию кроветворных стволовых клеток

Изучено влияние RIMOLANS на миграцию стволовых кроветворных клеток (КОЕ). В качестве экспериментальной модельной системы использован метод субле-тального облучения мышей. Мышей тотально облучали дозой 450R. Количество колоний подсчитывали на поверхности селезёнки через 7 суток после облучения. RIMOLANS в дозе 1 и 10мг/кг вводили внутрибрюшинно мышам-гибридам (CBAxC57BL/6j) F1 сразу после облучения. На 8-е сутки после облучения подсчитывали количество КОЕ на поверхности селезёнки. Результаты выражали в абсолютном количестве КОЕ на каждую селезёнку (Хаитов,1972).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что RIMOLANS в испытанных дозах не оказывал влияния на

Таблица 7. Влияние RIMOLANS на титры антител в крови мышей линии СВА в условиях вторичного ИДС, индуцированного препаратом циклофосфаном

N Группа Доза Log2 обратных Индекс Число р

п/п наблюдения RIMOLANS величин титров действия наблюдений (относ.

мг/кг антител

1 контроль I - 6,7+-0,2 - 10 <0.05

2 ЦФ - контроль II - З,6+-0,1 - 15 -

З ЦФ + RIMOLANS 1 6,1+-0,З 2 15 <0.05

процесс миграции кроветворных стволовых клеток из костного мозга в селезёнку (таблица 8).

3.6. Влияние препарата RIMOLANS на фагоцитарную активность (ФА) нейтрофилов и систему комплемента

Фагоцитоз - один из важнейших показателей резистентности организма (врожденного иммунитета). Дефицит фагоцитоза, системы комплемента, приводит к нарушению механизма естественной резистентности, проявляющийся в виде повышенной частоты инфекций, вызываемых условно-патогенными микробами, недостаточностью эффекторных антимикробных реакций приобретённого имунитета, повышенной частоты возникновения опухолей (1,18). В качестве тест-культуры для определения фагоцитарной активности и фагоцитарного числа использовали стафилоккоковую культуру (штамм 209) в концентрации

10 млрд микроорганизмов в 1мл. Изучено влияние RIMOLANS на фагоцитарную активность нейтрофилов у мышей при исходно нормальном иммунном статусе и у мышей с индуцированной циклофосфаном вторичной иммунологической недостаточностью. Результаты эксперимента свидетельствуют о статистически достоверном регулирующем действии препарата RIMOLANS на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов при исходно нормальных его показателях и при вторичном иммунодефицитном состоянии (таблица 9, таблица 10).

Таким образом, препарат RIMOLANS проявляет широкий спектр иммунотропной активности, стимулируя реакции клеточно-опосредованного и гуморального иммунного ответа у экспериментальных мышей, как при исходно нормальном, так и при вторичном иммунодефицитном состоянии (в дозе: 1мг/кг - в 1,5 раза стимулирует антите-логенез инбредных мышей при исходно нормальном иммунном статусе, и в 1,7 раза - при вторичных иммуно-дефицитных состояниях) стимулирует антителогинез, независимо от генотипа экспериментальных мышей. При применении препарата в индуктивную и пролиферативную фазу гуморального иммунного ответа стимулирует ре-

акции трансплантационного иммунитета; вызывает увеличение исходного, нормального уровня ^М-образующих клеток селезёнки и уровня антиэритроцитарных антител в периферической крови мышей с генетической предрасположенностью как к сильному, так и слабому иммунному ответу на тимусзависимый антиген; усиливает эффектор-ную активность Т-лимфоцитов в реакциях клеточного иммунитета - гиперчувствительности замедленного типа и трансплантат против хозяина; нормализует антителогинез у мышей с вторичной иммунологической недостаточностью, индуцированной циклофаном; регулирует фагоцитарную активность нейтрофилов при исходно нормальных показателях и при вторичном иммунодефицитном состоянии. Иммунотропная активность RIMOLANS одина-кого выражена при подкожном и внутрибрюшинном введении.

4.Результаты исследования противоопухолевой активности препарата RIMOLANS

4.1.Исследование противоопухолевой активности на модели перевивных опухолевых штаммов мышей

Целью исследования было изучение противоопухолевой активности препарата RIMOLANS в отношении 4-х перевивных опухолевых штаммов мышей: асцитных форм

- лимфоидной лейкемии L 1210; асцитной опухоли Эрлиха (АОЭ); солидных вариантов меланомы В-16 и саркомы S37.Работа выполнена на 900 мышах (самках и самцах) линии BDF1 и беспородных.

Противоопухолевую эффективность препарата RIMO-LANS на моделях солидных штаммов оценивали по кинетическим показателям роста опухолей в опытных и контрольных группах; торможению роста опухолей (ТРО, %); средней продолжительности жизни (СПЖ, сутки); увеличению средней продолжительности жизни (УСПЖ, %).

Критериями противоопухолевой эффективности препарата RIMOLANS в отношении асцитных форм опухо-

Таблица 8. Влияние RIMOLANS на миграцию кроветворных стволовых клеток сублетально облучённых мышей (СВАх С57ВL/6j)F1

N п/п Группа наблюдения Доза RIMOLANS мг/кг Число КОЕ на селезёнку Число наблюдений р

1 контроль - 16,2+-1,2 15 -

2 опыт 1 17,6+-1,8 15 >0.05

3 опыт 10 16,4+-2,4 15 >0.05

N п/п Способ введения RIMOLANS Доза RIMOLANS мг/кг ФА нейтрофилов % Число наблюдений р

1 контроль - 36,6+-5,1 10 <0.05

2 подкожно 1 62,6+-5,3 10 <0.05

3 подкожно 10 52,4+-4,0 10 <0.05

4 внутрибрюшинно 1 58,4+-6,9 10 <0.05

5 внутрибрюшинно 10 62,6+-5,3 10 <0.05

Таблица 9. Влияние RIMOLANS на ФА нейтрофилов мышей линии СВА

лей являлись: СПЖ (сутки), УСПЖ (%), объем асцитической жидкости (АЖ), торможение накопления АЖ (ТНаж). Контрольные группы составили: 1) животные с перевивными опухолями, не подвергшиеся никаким воздействиям; 2) животные с перевивным штаммом, которым вводили подкожно, трехкратно, (растворитель исследуемого препарата - инъекционная вода); 3) группа живот-ных-опухоленосителей, получавшая внутрибрюшинно трехкратно цитостатик платидиам (Лахема, Чехия).

В результате проведенных исследований найдено, что препарат RIMOLANS обладает кратковременным противоопухолевым эффектом в отношении штамма асцитной опухоли Эрлиха по параметру АЖ и не влиял на СПЖ и УСПЖ опытных групп мышей.

Изучение противоопухолевой эффективности препарата RIMOLANS проведено на мышах (самцах и самках) линии BDF1 в отношении лимфоидной лейкемии L1210. Установлено, что при введении RIMOLANS наблюдается четкое дозозависимое снижение накопления АЖ на всех сроках эксперимента. При этом, в дозе препарата

1,05 мг/кг констатировано снижение накопления асцита вдвое на 5-е и 7-е сутки эксперимента (ТНаж 50%) и на 63,9% - на 9-е сутки. По параметрам СПЖ и УСПЖ так же, как и для штамма АОЭ не выявлено увеличения жизни животных в опытных группах. Вместе с тем, Платидиам удлинял среднюю продолжительность жизни мышей-опухоленосителей на 52,5%.

В отношении штамма В-16 эффективность препарата RIMOLANS изучена на мышах-самках линии BDF1. Установлено отставание роста опухоли на 7-й и 11-й дни эксперимента для всех доз препарата RIMOLANS. Максимальное значение ТРО для меланомы В-16 в динамике эксперимента получено для животных, которым вводили Платидиам (74,6%-71,9% на 7-е-11-е сутки соответственно). В опытных группах мышей наибольшее значение ТРО отмечено также, как и для Платидиама на 7-й-11-й день опыта. Так, на 7-е сутки эксперимента ТРО

меланомы составило 48% для дозы RIMOLANS

1,05 мг/кг; 57.7% - для 210,0 мг/кг; 50,1 % - для

420,0 мг/кг.

В ходе эксперимента по изучению противоопухолевой эффективности препарата RIMOLANS в отношении перевивного опухлевого штамма саркомы S 37 выявлено, что препарат не увеличивал продолжительность жизни экспериментальных животных с саркомой S 37 и проявлял слабый противоопухолевый эффект.

Таким образом, проведенные in vivo эксперименты свидетельствуют о том, что данный препарат в отношении исследованных штаммов обладет цитостатическим действием разной степени выраженности. Торможение роста опухоли для изученных групп мышей колебалось от40 до 64%. Самый слабый противоопухолевый эффект был получен на саркоме S 37 (ТРО - 33,9%), максимальный антибластомный эффект на лимфоидной лейкемии L 1210 (63,9% - торможение накопления асцитической жидкости). Выявлено также, что эффективная доза RIMOLANS значительно ниже для асцитных форм опухолей (1,05-10,5 мг/кг) в сравнении с таковыми при солидных опухолях (105,0-210,0 мг/кг). Тем не менее, значительное, но временное угнетение роста изученных перевивных опухолевых штаммов (45% торможение роста опухоли при асцитной опухоли Эрлиха; 63,9% при асцитных формах - лимфоидной лейкемии L 1210; 56,3% при меланоме В-16) свидетельствуют о выраженных противоопухолевых потенциях данного препарата. Учитывая тот факт, что современная терапия опухолей основывается на сочетанном применении препаратов с разным механизмом действия, перспективным является применение препарата RIMOLANS, как возможного модификатора классических цитостатиков.

Выявленный противоопухолевый эффект RIMOLANS в экспериментальных системах in vivo при отсутствии такового на моделях перевивных опухолевых клеток in vitro указывает на имеющийся у препарата опосредованный,

а не прямой антибластомный механизм действия. Реализация такого опосредованного противоопухолевого действия вероятно осуществляется через различные системы, прежде всего через иммунную и, в частности, учитывая природу RIMOLANS, черезцитокины (38,39,40,44). Их воздействие на клетки-предшественники заключается не только в запуске механизма образования дифференцированных колоний, но и в активации специализированных функций (таких, как фагоцитоз и убивание клеток-мишеней) у клеток с законченной дифференци-ровкой (1,4,47,53).

4.2. Влияние препарата RIMOLANS на уровень цитокинов интерлейкин -1в (^-1в), туморнекротический фактор-а (Т^-а), интерферон - у (^-у), интерлейкин - 6 (^-6),

GM - гранулоцито-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) в сыворотке мышей-опухоленосителей на модели меланом В-16

В данном исследовани проведена оценка сочетанного противоопухолевого эффекта RIMOLANSи Платидиама на модели перевивного опухолевого штамма мышей меланомы В-16 и исследование влияния RIMOLANS на уровень перечисленных выше цитокинов в динамике роста опухоли. Опухолевый штамм меланому В 16 поддерживали на мышах линии С57 В16. Штамм перевивали мышам линии BDF1. Исследования проведены среди 4-х групп мышей:

I контрольная группа - мыши-опухоленосители, не подвергшиеся никаким воздействиям;

II группа - мыши-опухоленосители. получавшие вну-трибрюшинно трехкратно Платидиам в суммарной терапевтической дозе 8,0 мг/кг;

III группа - мыши-опухоленосители, получавшие RIMO-LANS (35,0 мг/кг) подкожно трехкратно (1-е, 3-е, 5-е

сутки после перевивки опухоли) в суммарной дозе -

105,0 мг/кг;

IV группа - мыши-опухоленосители, получавшие RIMOLANS и Платидиам по схеме. RIMOLANS - 1-й, 3-й, 5-й дни опыта (суммарная доза 105,0 мг/кг). Платидиам 2-й, 4-й, 6-й дни эксперимента (суммарная терапевтическая доза 8,0 мг/кг).

Противоопухолевую эффективность препарата оценивали по кинетическим показателям роста опухоли В-16 в опытных и контрольных группах и значениям торможения роста опухоли (ТРО). При определении цитокинов были использования тест-системы для иммуно-ферментного анализа фирмы Cytimmune (USA). Концентрацию каждого цитокина определяли в динамике опухолевого роста (7-9 раз).

При сравнительной оценке параметров роста меланомы В-16 в группах животных (II, III, IV) отмечено наиболее выраженное отставание в росте опухолей у мышей после введения комбинации 2-х агентов: RIMOLANS с Платидиамом. При этом, начиная с 11-го дня опыта и на протяжении всего эксперимента размеры опухолей животных IV группы были существенно меньше, чем в других группах животных. Наибольшее значение ТРО (36,77%) на 8-е сутки опыта было получено в группе животных, получивших RIMOLANS с Платидиамом. В эти же сроки эксперимента практически не выявлен эффект ТРО в группе животных с RIMOLANS и незначительный эффект в группе мышей, получавших Платидиам (ТРО 19,4%). В остальные сроки эксперимента значение ТРО во всех изученных группах нарастало, однако, наибольшей по прежнему осталось в IV-й группе мышей. При этом эффективность данного сочетания линейно нарастала к 11-му дню эксперимента (значение ТРО- торможение роста опухоли 74%) и увеличилась на 14-е сутки до 84.9% по сравнению с 74,7%

- во II-й и 56,3% - в III- й группах.

Таким образом, на моделе меланомы В-16 также подтверждена противоопухолевая эффективность препа-

Таблица 10. Влияние RIMOLANS на ФА нейтрофилов в условиях вторичного иммунодефицитного состояния, индуцированного препаратом циклофосфаном

N п/п Группа наблюдения Доза RIMOLANS мг/кг ФА нейтрофилов % Фагоцитарное число Число наблюдений р

1 контроль I - 43,5+-3,8 6,9 10 -

2 ЦФ - контр.II - 3,5+-4,5 6,7 10 <0.05*

3 RIMOLANS 1 71,6+-5,6 8,4 10 <0.05*

4 ЦФ+ RIMOLANS 1 43,9+-5,2 6,3 10 <0.05**

рата RIMOLANS по параметру ТРО-торможение роста опухоли. Кроме этого получены убедительные данные по потенцирующему действию этого препарата по отношению к Платидиаму.

Результаты исследования по оценке уровней изученных цитокинов у мышей опухоленосителей, получивших препарат RIMOLANS не выявил устойчивых изменений их уровней в сравнении со значениями до прививки опухоли. Введение RIMOLANS не способствовало изменениям в уровнях изученных цитокинов по сравнению с контрольными группами (I и II). При сочетанном использовании RIMOLANS с Платидиамом у мышей-опухоле-носителей также не было выявлено существенных изменений содержания указанных цитокинов в сравнении с контрольными группами.

Следовательно, обнаруженное торможение роста опухоли меланомы В-16 в группе мышей, получивших как один RIMOLANS, так и в комбинации с Платидиамом, вероятно, не был связан с функциональными изменениями со стороны иммунной системы, которые бы стимулировали выброс в кровь медиаторов активированных клеток. Но, поскольку препарат RIMOLANS включает в себя большое количество цитокинов, в том числе ИЛ-2, и, учитывая частичную гомологию мышиных и человеческих цитокинов, нельзя исключить наличие возможной локальной активации под действием ИЛ-2 каких-либо иммуннокомпетентных клеток. К ним можно отнести лимфо-кин - активированные киллерные клетки и /или активированные цитотоксические лимфоциты, инфильтрирующие опухоль. Кроме того, известно, что цитокины наряду с потенциальными противоопухолевыми эффектами обладают свойствами медиаторов воспалительных реакций. Поэтому отсутствие массированной секреции изученных цитокинов в ответ на введение RIMOLANS может рассматриваться как показатель хорошей переносимости этого препарата при его парентеральном введении, на что указывало стабильно хорошее состояние экспериментальных животных опухоленосителей, получавших RIMOLANS (отсутствие конъюктивита, ринита и других воспалительных реакций, активное поведение, блестящая гладкая шерсть ).

Таким образом, на основании результатов изучения in vivo действия плацентарного препарата RIMOLANS и данных его состава можно утверждать, что статистически доказанный иммуномодулирующий и противоопухолевый эффекты объясняются особенностью многофункционального и взаимосвязанного действия, входящих в состав препарата иммуннокомпетентных протеинов и аминокислот.

Литература

1. Безбородов П. Н. Коррекция общего адаптационного синдрома у новорожденных телят с функциональной диспепсией бионормализатором из плаценты. //Автореф. Дис.к.б.н.,БГСА, Белгород. 2006. 32 с.

2. Белов М. В. Хирургические и консервативные методы лечения собак при отитах: Дис.к.в.н., СПбГАВМ, 2002

3. Ветра Я.Я.,Быкова Е.Я., Иванова Л.В., Барене И.А., Штале Л.Я. Перспективы клинического применения препарата Римо-лан. // Объединенный иммунологический форум. Санкт-Петербург, 30 июня-5 июля. Российский иммунологический журнал, Том 2 (11), №2-3, 2008, стр.165.

4. Горбунова О.Л., Ширшев С.В., Бахметьев Б.А. Роль хорионического гонадотропина и половых стероидных гормонов в модуляции вторичного иммунного ответа, реакции гиперчувствительности замедленного типа и фагоцитарной активности лейкоцитов. // Цитокины и воспаление. 2007. Т.6, №4, с. 33-37.

5. Гриневич Ю. А., Храновская Н. Н., Бендюг Г. Д. Влияние клеток эмбриональной печени на естественную противоопухолевую резистентность организма//Иммунология, 2003, №3, стр.153-157

6. Егорова В.Н.,Сахарова Е.Д. Возможность использования медицинского препарата Ронколейкин при иммунозамести-тельной терапии в ветеринарной практике.//Ж. Ветеринарная Практика №1(8),2000,стр.19-21.

7. Ефимова Н.Ю., Тулева Н.П., Тулев М.Ю., Лыкова А.А. Применение иммуномодулирующих препаратов при опухолевых бо-лезняху мелкихдомашнихживотных.//Мат.Ш с. фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации». СПб., 2011.стр. 177-179.

8. Жернати И., Лилбер Ж. Иммунологические воспаления. Часть 1. Действующие факторы и механизмы. //Ветеринар, 4/2002, с.20-29.

9. Забродский П.Ф., Терентюк Г.С., Плахута И.А. Сравнительная характеристика эффективности иммуномодуляторов при иммунодефиците, обусловленном циклофосфамидом.//Вестник ВолГМУ, 2007. №1(21). С.37-39.

10. Каблуков А. Рак молочной железы у кошек (статистческие исследования),2010).//http://vegavet.spb.ru/speshials/44-hi-ryrgiya/262-rmg

11. Карпенко Л.Ю., Тиханин В.В. Биохимические и иммунологические показатели крови собак при демодекозе. // http://www.dompitomci.ru/doc/vet/vet_doc/nc_98/nc_98-2000.html

12. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины.// Изд. СПб.2008. 552 стр.

13. Крукиер И. И. Динамика цитокинов в разные сроки развития плаценты при физиологической и осложненной беременности. // Вопросы биологии, №1, 2005. с.18.

14. Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Авруцкая В.В. Процессы рецепции ангиогенных факторов роста в плаценте, плодных оболочках и сыворотке крови при осложненной беременности //Материалы I Рег. форума «Мать и дитя». Казань. 2007,стр.80-81

15. Кулешова Я.А., Ягников С.А. Диагностика и лечение опухолей носовой полости у собак и кошек. // Методические рекомендации, Москва, РУДН,2008, С.32.

16. Лебединская О.В., Черешнев В.А., Фхматова Н.К., Лебединская Е.А., Родионов С.Ю., Киселевский М.В. Механизмы действия а-фетопротеина в составе препарата профеталь на мононуклеарные лейкоциты крови и клетки первичных культур селезенки.//Труды VIII Конгресса. «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». М. 2007.стр. 27.

17. Мищенко С. Н.. Опухоли молочных желез собак (диагностика, верификация): Дис.к.в.н.,/Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины (СПбГАВМ), 2002.

18. Островский М.В. РАК - не приговор! 2007.№ 4,стр. 35-36.

19. ПальчиковМ.Ю. Бионормализующее действие препаратов из плаценты человека при ранней стимуляции половой цикличности у коров. Дис. к.б.н., 2005.152 с.

20. Санин А.В. Применение иммуномодуляторов при вирусных заболеваниях мелких домашних животных. // Российский журнал ветеринарной медицины. 2005. №1. с. 38-42

21. Сельков С.А., Павлов О.В. Плацентарные макрофаги. М. 2007.стр.185

22. Семенов С.А., Быкова Е.А., Хемий Л.Р., Мухина Н.В., Черкай

З.Н. Результаты исследования показателей врожденного иммунитета у собак./ Тез. Докл. Межд.. конгресса «Актуальные проблемы ветеринарной медицины». СПб., ЛЕНЭКСПО, 2006 г.

23. Смирнов А.М., Дорожкин В. И. Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии. Мат. III съезда фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации». СПб., 2011. стр. 407-413.

24. Соколов В.Д. Подходы к решению актуальных проблем ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации. Там же, стр.5-7.

25. Стекольников А.А. Проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации. Там же.стр.3-5.

26. Степанов В. А.Применение препарата «Плацента активное начало» при лечении гнойных ран у собак. Дис.к.в.н.,/Вороне-жский государственный аграрныйуниверситет(ВГАУ)-2002, с. 28

27. Терентюк Г.С. Химиотерапия рака молочных желез у собак.//Ветеринарная патология,2008. №1(24),стр.76-80.

28. Тимофеев С.В., Терентюк Г.С. Особенности функционального состояния иммунной системы у собак, больных раком молочной железы.//Ветеринарная медицина, 2006. № 4. стр.19.

29. Тиханин В.В., Карпецкая Н.Л. Аллергия и аллергические дерматиты у собак и кошек. http://www.veterinarka.ru/con-tent/view/1771/123/

30. Тодд Бессингер. Обзор эпидемиологии рака у собак. По материалам Kelsey, JL, AS Moore и L T Glickman (1998). Эпидемиологические исследования факторов риска раковых заболеваний у домашний животных. // http://www.dalmatin-club.ru/stat_dalm/obzor_epidemiologii_raka.htm

31. Турченко А.Н., Коба И.С. Фармакопрофилактика послеродовых заболеваний у коров с использованием плацентарных средств. Мат. III с. фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации». СПб., 2011, стр. 446-449.

32. Черванев В.А., Терентюк Г.С. Способ коррекции иммунной недостаточности при лечении верифицированных форм рака молочной железы и меланомы собак. Патент на изобретение № 2320293, дата приоритета 07.11.2006, Бюл. №9.

33. Шабан Л., Поляк С. И др. Первичный иммунодефицит у собак: общие сведения и диагностика. // Ветеринар, 6/2002. С. 8-17.

34. Шабунин С.В. Основное напраление развития ветеринарной фармакологии. Мат. III с. фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации». С.- П., 2011. С 490-492.

35. Якунина М.Н. Рак молочной железы у собак и кошек. VetP-harma, №2-2011. стр.64-71.

36. Battersby, I., K. Murphy, S. Tasker, and K. Papasouliotis . Retrospective study of fever in dogs: laboratory testing, diagnoses and influence of prior treatment.// Journal of Small Animal Prac-tice,2006. 47(7):370-376.

37. Bensignor, E. and D.N. Carlotti. Sensitivity patterns to house dust mites and forage mites in atopic dogs: 150 cases. //Veterinary Dermatology. 2002.13(1): 37-42. ISSN: 0959-4493.

38. Bikova J., Semjonov S., Keisha A., Ivanova L., Eglite A., Im-munotharapy of dogs of oncological diseasea.//Congres Federation of E.I.W.C, Netherlands, Stramproy, 2004,p. 55-62.

39. Bikova J., Keisha A. ,Barene I.,Vitola A., Ivanova all. Clinical Results of Using New Immunemodulator in Veterinary Practice in Case of Oncological Diseases.//Farm animal reproduction-Reducing infection diseases./Symp.The Faculty of Veterinary Medicine. Jelgava,Latvia. 2003.Uppsala.p 51.

40. Cozzi PJ. Padrid PA, Takeda J, Alegre ML, Yuhki N.Bioactivity of recombinant feline interleukin-2 on human and feline leukocytes. //Vet Immunol Immunopathol, 48:1-2, 27-33 , 1995.

41. Das C., Kumar V. S., Gupta S., Kumar S. Network of cytokines, integrins and hormones in human trophoblast cells// J. Reprod. Immunol. 2001. Vol. 53, N 1-2. P. 257 - 268.

42. Feldman Edward C.,Nelson Richard W. Canine and Feline Endocrinology and Reproduction Medicine for Small Animals. //.So-fion. 2008.1256 p.p.

43. Govallo V. Immunology of Pregnance and Cancer. //Nova Science Publishers, Ins.USA, 1993, 310 p.p.

44. Holscher C., The power of combinatorial immunology: IL-12 and IL-12-related dimeric cytokines in infectious diseases. //Med Microbiol Immunol 2004 193:1-17.

45. Ivanova L., Bärene I.,Guseva L., Kreile I.,Bikova J., Stäle L., Da-berte I. Daudzkomponentu biologiski aktTvu preparätu standar-tizäcijas iespejas.// AML MedicTnas nozares zinätniskäs konferences tezes. RTga, Latvija. 25.02.2000.136l pp.

46. Jean D. V.M. // Иммунная система защита против болезней. // Мир собак. 2000.Nr.5. http://www.pets.kiev.ua/dogs/ms5-00/imunitet.html

47. Junttila Ilkka S., Mizukami Kiyoshi., Dickensheets Harold. at all. Tuning sensitivity to IL-4 and IL-13: differential expression of IL-4Ralpha, IL-13Ralpha1, and gammac regulates relative cytokine sensitivity.//The Journal of experimental medicine . 2008;205(11): 2595-608.

48. Moore A. Advances in the treatment of mammary neoplasia// Proceeding og the 31st World Congress WSAVA/FECAVA/CSAVA Retrieved on 2007-03-21: 562-565.

49. Paria B.C., Ma W., Tan J. at all. Cellular and molecular responses of the uterus to embryo implantation can be elicited by locally applied drowth factors// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001.Vol. 98, N3. P. 1047 - 1052.

50. Pogorelova T.N, Krukier I.I., Drukker N.A. Placental receptors of the growth factors in the conditions of intrauterine hypoxia //VIII World Congress International Society for adaptive medicine 2006.-P. 51.

51. Shatp C.A. Надвигающаяся буря или что необходимо знать заводчикам об имунной системе. // Ж. Ты и собака, 3/2004.

52. Sprudza D., Bikova E.,. Ivanova L., Artjuha M., Sergejeva N., at all.InterleikTna-2 satura petTsana preparätä Rimolans.// Pasau-les latviesu ärstu 4.kongress.Tezes. RTga, Latvija, 2001.gada 2022 jünijs.46 lpp.

53. Ward P.P., Paz E., Paz O.M. Multifunctional roles of lactoferrin: a critical overview. // Cellular and Molecular Life Sciences (CMLS) .Volume 62, Number 22 / 2005 . P. 2540-2548.

54. Withrow Stephen J, and David M. Vail. Introduction to cancer in cats and dogs Small Animal. // Clinical Oncology. St Louis: Saunders Elsevier, 2007.