Средство, обладающее гипогликемическим действием, и способ его получения
DRUG WITH A HYPOGLYCEMIC EFFECT AND A METHOD FOR OBTAINING IT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения средства, обладающего гипогликемическим действием, из лекарственного растительного сырья.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В настоящее время отмечается тенденция к росту заболеваемости сахарным диабетом второго типа, часто называемым «болезнью цивилизации». По данным всемирной организации здравоохранения количество случаев заболевания диабетом второго типа в период с 1980 по 2014 г. возросло с 108 миллионов до 422 миллионов. При этом отмечен рост случаев преждевременной смертности, связанной с этим заболеванием, на 5% в период с 2000 по 2016 г. [1].
Диабет второго типа характеризуется нарушением толерантности к глюкозе, вызванной нечувствительностью клеток и тканей организма к инсулину. Инсулинорезистентность может приводить к целому ряду патологических процессов, таким как нарушение гликемии натощак, ожирение, повышение уровня триглицеридов, артериальная гипертония, увеличение уровня тромбических и антифибринолитических факторов, существенно повышающих риск развития сердечно-сосудистых заболеваний [2].
Программа лечения пациентов с сахарным диабетом второго типа должна обеспечивать комплексное воздействие на организм и включать прием препаратов, оказывающих не только сахароснижающее действие, а также нормализующих обмен веществ и препятствующих возникновению сосудистых осложнений [3].
К одним из наиболее перспективных средств для лечения заболеваний эндокринной системы относят средства растительного происхождения, представленные преимущественно сборами и препаратами на основе экстрактов. Средства растительного происхождения проявляют широкий спектр биологического действия и являются безопасными за счет невысокой концентрации действующих веществ, что практически исключает возможность передозировки.
Из уровня техники известны растительные средства на основе экстрактов листьев подсолнечника однолетнего (Helianthus annuus L.), травы манжетки обыкновенной (Alchemilla vulgaris L.), корней пиона древовидного (Paeonia suffruticosa Andr.) и др., обладающие гипогликемической активностью [4-6]. Недостатком описанных монокомпонентных растительных средств является узкий спектр биологического действия.
Наиболее близким к заявленному изобретению является средство, представляющее собой отвар растительного сбора, который содержит траву козлятника лекарственного (Galega officinalis L.), корни одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Webb.), цветки липы сердцевидной (Tilia cordata Mill), листья шелковицы белой (Morus alba L.), корни девясила высокого (Inula helenium L.), листья брусники обыкновенной (Vaccinium vitis-idaea L.), створки плодов фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris L.), листья лавра благородного (Laurus nobilis L.), траву череды поникшей (Bidens cernua L.) в соотношении 2:2:0,95:2:2:2:2:2:2:2 [7]. Настой готовят следующим образом: 2 г сбора помещают в стеклянную или эмалированную посуду, заливают 200 мл кипятка, накрывают крышкой, настаивают в течение 20-25 минут. Сырье отжимают. Объем полученного настоя доводят кипяченой водой до 200 мл.
Недостатком описанного средства является то, что условия приготовления настоя не обеспечивают полноценную и воспроизводимую экстракцию действующих веществ из растительного сырья.
Настоящее изобретение решает техническую проблему необходимости расширения ассортимента отечественных высокоэффективных и безопасных лекарственных средств для лечения сахарного диабета второго типа, обеспечивающих снижение уровня глюкозы в крови, а также препятствующих развитию сосудистых осложнений.
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что комплексный растительный экстракт пустырника травы (сем. Яснотковые) (Leonuri (сем. Lamiaceae)), брусники листья (сем. Вересковые) (Vitis-idaeae (сем. Ericaceae)), девясила высокого корневища с корнями (сем. Астровые) (Inulae rhizomata (сем. Asteraceae)), шиповника плоды (сем. Розовые) (Rosae (сем. Rosaceae) обладает выраженным гипогликемическим действием.
Этапы получения заявляемого комплексного растительного экстракта были разработаны и подобраны с учетом требований современного типового оборудования, а также потребности пациентов и рынка в новых эффективных средствах, обладающих гипогликемическим действием.
Компоненты растительного сбора были подобраны с учетом многофакторных механизмов развития сахарного диабета второго типа и соответствуют принципам фармакологической регуляции функций эндокринной системы.
Корни и корневища девясила высокого семейства Астровые (Asteraceae) содержат комплекс биологически активных высокомолекулярных соединений, таких как инулин (до 44%), псевдоинулин и инулицин, сапонины, смолы, камеди. Было показано, что прием инулина способен улучшать липидный профиль и значительно снижать уровень холестерина в плазме крови больных сахарным диабетом второго типа [8].
Листья брусники семейства Вересковые (Ericaceae) содержат дубильные вещества и гликозид фенольного типа - арбутин. Из уровня техники известно, что арбутин является перспективным соединением для борьбы с таким осложнением сахарного диабета второго типа, как диабетическая нефропатия, которое в 80% случаев приводит к почечной недостаточности [9]. Было показано, что арбутин способен к ингибированию индуцированного повышенным содержанием глюкозы апоптоза трубчатых эпителиальных клеток, образующих почечные канальцы. Также было подтверждено бактерицидное, противовоспалительное и антиоксидантное действие арбутина [10-12].
Плоды шиповника семейства Розовые (Rosaceae) являются источником широкого спектра биологически активных соединений, таких как каротиноиды, витамины С, Ρ, В1, K, Е, полифенольные вещества, флавоноиды, катехины, антоцианы, дубильные вещества и хлорофиллы. Исследования с использованием линий мышей, имитирующих ожирение и инсулинорезистентность человека, показали, что соединения, входящие в состав плодов шиповника, способствуют предотвращению набора массы в условиях несоблюдения диеты, снижению инсулинорезистентности и уровня глюкозы в плазме крови и печени [13-14].
Трава пустырника семейства Яснотковые (Lamiaceae) содержит флавоноиды, такие как рутин, апигенин и др. Из уровня техники известно, что рутин способен снижать всасывание глюкозы из тонкого кишечника за счет ингибирования α-глюкозидаз и а-амилазы, что предотвращает резкое повышение уровня глюкозы в крови после приема пищи. Снижение уровня глюкозы в крови под действием рутина также может быть достигнуто за счет стимуляции секреции инсулина бета-клетками и увеличения поглощения глюкозы скелетными мышцами и жировой тканью. Гистопатологические исследования на животных моделях сахарного диабета показали, что рутин улучшает гистоархитектуру островков Лангерганса и подавляет глюколипотоксичность в бета-клетках поджелудочной железы [15].
Уровень техники содержит сведения о гипогликемической активности инулина, входящего в состав корней и корневищ девясила высокого, однако способность комплекса биологически активных веществ, содержащихся в листьях брусники, траве пустырника и плодах шиповника усиливать биологическое активность растительного экстракта неизвестна. Применение комплекса указанных лекарственных растений для получения средства, обладающего гипогликемическим действием также неизвестна из уровня техники.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение из растительного лекарственного сырья средства, обладающего выраженным гипогликемическим действием за счет содержания до 20% инулина, 1% арбутина, 1% органических кислот и 0,4% рутина и обеспечивающего повышение толерантности к углеводам на 14% в условиях глюкозотолерантного теста.
Указанный технический результат достигается осуществлением заявленных способов получения экстракта, обладающего гипогликемическим действием.
Один из способов включает следующие последовательные стадии: измельчение растительного сбора, содержащего высушенные корни и корневища девясила высокого, листья брусники, траву пустырника и плоды шиповника в соотношении 11:3:3:3 до размера частиц 3 мм, набухание растительного сырья в воде в течение 0,5 ч, двукратная экстракция растительного сырья водой в соотношении 1:10 при температуре 80°С в течение 1 ч, отстаивание растительного экстракта при температуре 4-8 С° в течение 30 часов, фильтрование.
Второй способ включает следующие последовательные стадии: измельчение растительного сбора, содержащего высушенные корни и корневища девясила высокого, листья брусники, траву пустырника и плоды шиповника в соотношении 11:3:3:3 до размера частиц 3 мм, набухание растительного сырья в воде в течение 0,5 ч, двукратная экстракция растительного сырья водой в соотношении 1:10 в ультразвуковой ванне с подогревом при частоте колебаний 40 кГц при температуре 80°С в течение 20 мин, отстаивание растительного экстракта при температуре 4-8 С° в течение 30 часов, фильтрование.
Средство, полученное в результате реализации любого из заявленных способов, может быть использовано для получения лекарственных препаратов для лечения сахарного диабета второго типа и коррекции состояний, вызванных осложнением этого заболевания. Предлагаемое средство способствует повышению толерантности к углеводам, отличается широким спектром биологической активности и малой токсичностью. К преимуществам получаемого средства можно также отнести взаимное усиление полезных фармакологических свойств каждого входящего компонента.
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Сущность изобретения раскрывается в следующих примерах реализации заявленных способов, которые служат для иллюстрации, но не ограничивают объема притязаний.
Пример 1.
Высушенные корни и корневища девясила высокого, листья брусники, траву пустырника и ягоды шиповника измельчали до размера частиц 3 мм. Измельченное сырье смешивали в соотношении 11:3:3:3 заливали водой в соотношении 1:10 и выдерживали в течение 0,5 ч. После набухания растительного сырья проводили экстракцию водой при температуре 80°С в течение 1 ч. Извлечение фильтровали, после чего в сборник добавляли воду в объеме, равном слитому. Экстракцию повторяли дважды. Объединенное извлечение отстаивали при температуре 4-8°С в течение 30 ч и фильтровали.
Полученный продукт представляет собой водный экстракт с содержанием фруктозанов в пересчете на инулин 20,88%, флавоноидов в пересчете на рутин 0,4%, арбутина 1,063%, органических кислот в пересчете на яблочную кислоту 1,05%.
Пример 2.
Высушенные корни и корневища девясила высокого, листья брусники, траву пустырника и ягоды шиповника измельчали до размера частиц 3 мм. Измельченное сырье смешивали в соотношении 11:3:3:3 заливали водой в соотношении 1:10 и выдерживали в течение 0,5 ч. После набухания растительного сырья проводили экстракцию водой в ультразвуковой ванне с подогревом при частоте колебаний 40 кГц при температуре 80°С в течение 20 мин. Извлечение фильтровали, после чего в сборник добавляли воду в объеме, равном слитому. Экстракцию повторяли дважды. Объединенное извлечение отстаивали при температуре 4-8°С в течение 30 ч и фильтровали.
Полученный продукт представляет собой водный экстракт с содержанием фруктозанов в пересчете на инулин 21,06%, флавоноидов в пересчете на рутин 0,49%, арбутина 1,068%, органических кислот в пересчете на яблочную кислоту 1,14%.
Пример 3.
Для определения оптимального соотношения компонентов в сборе были составлены 3 композиции из 4 видов лекарственного растительного сырья, представленные в таблице 1.
Высушенные корни и корневища девясила высокого, листья брусники, траву пустырника и ягоды шиповника измельчали до размера частиц 3 мм. Измельченное сырье смешивали в соотношениях, указанных в таблице 1. Полученные композиции растительного сырья использовали для приготовления экстрактов согласно способу, описанному в примере 1.
В таблице 2 представлено количественное содержание фруктозанов в пересчете на инулин, флавоноидов в пересчете на рутин, арбутина и органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в экстрактах, полученных с использованием композиций с разным соотношением растительного сырья.
Пример 4.
Для оценки гипогликемической активности водных экстрактов растительных композиций, представленных в таблице 1 (пример 3), использовали глюкозотолерантный тест (ГТТ), который является наиболее распространенным исследованием в эндокринологии для диагностики нарушения обмена углеводов у больных сахарным диабетом.
Дизайн эксперимента был одобрен биоэтической комиссией ФГБНУ ВИЛАР (протокол №38 от 23.11.2020). Все процедуры на крысах проводили в соответствии с «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей», Страсбург, 1986. Исследования проводили согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации №199н от 01.04.2016, Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (2012 г. ) и в соответствии с Федеральными законами от 12.04.2010 г. №61-ФЗ (ред. от 28.11.2018 г. ) «Об обращении лекарственных средств» [16-21].
Опыты были выполнены на 24 белых нелинейных крысах-самцах массой тела 300-350 г. Крыс содержали в виварии ФГБНУ ВИЛАР на стандартном рационе в стандартных пластиковых клетках (6 крыс на клетку) при свободном доступе к воде и корму при температуре 20-25°С и относительной влажности не более 75%. Крысы были разделены на 4 группы по 6 животных в каждой:
• 1 группа - контроль, получала воду,
• 2 группа - водный экстракт № 1,
• 3 группа - водный экстракт № 2,
• 4 группа - водный экстракт № 3.
Водные экстракты вводили в дозе 1 мл/100 г массы животного однократно внутрь (per os) за 30 минут до введения глюкозы.
Уровень глюкозы в крови у крыс, полученную из пальцев задних конечностей, определяли с применением тест-полосок и глюкометра «Опе Touch Verio Рго+» компании Life Scan (США), сначала натощак, а затем, после введения глюкозы в дозе 2 г/кг, через 30, 60, 90 и 120 мин.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ статистического анализа Statistica 10, достоверность различий между группами оценивали по критерию Манна-Уитни.
Результаты исследования гипогликемической активности водных экстрактов растительных композиций в условиях ГТТ у крыс представлены на фиг. 1.
У контрольных крыс после введения глюкозы характер изменения гликемической кривой происходил следующим образом: уровень глюкозы поднимался на 30 мин на 39%, выше исходного принятого за 100%, а затем в течение 1,5 ч постепенно снижался до исходного уровня. В группе 4 животных, которые получили экстракт растительной композиции № 3, высота подъема кривой на 30 минуте была на 14% ниже (при статистически значимых результатах), чем в контроле. При введении животным экстрактов композиций № 1 и 2 статистически значимого снижения уровня гипогликемической кривой отмечено не было.
Таким образом, было установлено, что введение экстракта растительной композиции № 3, содержащей корни и корневища девясила высокого, траву пустырника, листья брусники и плоды шиповника в соотношении 11:3:3:3, обеспечивает у животных в условиях углеводной нагрузки повышение толерантности к углеводам на 14% (данные статистически значимы относительно контроля).
Учитывая, что гликемическая кривая в условиях пероральной углеводной нагрузки способна в определенной степени отразить резорбционную способность кишечника, гликогенсинтезирующую деятельность печени, а также воздействие на регуляцию вегетативной и эндокринной системы, можно предположить, что под действием водного экстракта растительной композиции № 3 происходит усиление процессов утилизации глюкозы в организме экспериментальных животных, которое выражается в увеличении толерантности к углеводам [22].
Из результатов, приведенных в примерах следует, что указанная техническая проблема решена - создано растительное средство на основе корней и корневищ девясила высокого, травы пустырника, листьев брусники и плодов шиповника, обладающее выраженным гипогликемическим действием за счет содержания до 20% инулина, 1% арбутина и 0,4% рутина и обеспечивающего повышение толерантности к углеводам в условиях ГТТ.
Источники информации
1. Feudtner С. Diabetes: the sweet irony of modern technology // Bulletin of the World Health Organization. - 2011. - Vol. 89. - № 2. - p. 90-91.
2. Nathan D. M. et al. Impaired fasting glucose and impaired glucose tolerance: implications for care // Diabetes care. - 2007. - Vol. 30. - № 3. - p. 753-759.
3. Дедов И.И. и др. Консенсус совета экспертов Российской ассоциации эндокринологов по инициации и интенсификации сахароснижающей терапии у больных сахарным диабетом 2 типа // Сахарный диабет. - 2011. - № 4. - С. 6-17.
4. Onoja S.О. et al. Potential antidiabetic and antioxidant activities of a heliangolide sesquiterpene lactone isolated from Helianthus annuus L. leaves // Acta Pharmaceutica. - 2020. - Vol.70. - № 2. - p. 215-226.
5. Патент РФ RU 2356569 C1 от 09.01.2008.
6. Патент РФ RU 2129435 C1 от 10.12.1997.
7. Патент РФ RU 2611353 С2 от 14.07.2015.
8. Dehghan P. et al. Inulin controls inflammation and metabolic endotoxemia in women with type 2 diabetes mellitus: a randomized-controlled clinical trial // International journal of food sciences and nutrition. - 2014. - Vol. 65. - № 1. - p. 117-123.
9. Ma Z. J. et al. Association of the HLA-DQA1 and HLA-DQB1 alleles in type 2 diabetes mellitus and diabetic nephropathy in the han ethnicity of China // Journal of diabetes research. - 2013. - Vol. 2013. - Article ID 452537.
10. Jurica K. et al. Arbutin and its metabolite hydroquinone as the main factors in the antimicrobial effect of strawberry tree (Arbutus unedo L.) leaves // Journal of Herbal Medicine. - 2017. - Vol. 8. - p. 17-23.
11. Zhang B. et al. Inhibition of oxidative stress and autophagy by arbutin in lipopolysaccharide-induced myocardial injury // Pharmacognosy Magazine. - 2019. - Vol. 15. - № 63. - p. 507-513.
12. Farzanegi P. et al. Effect of swimming training and arbutin supplement on cardiac antioxidant enzymes and oxidative stress in diabetic rats // Journal of Gorgan University of Medical Sciences. - 2015. - Vol.17. - № 3. - p. 39-45.
13. Ninomiya K. et al. Potent anti-obese principle from Rosa canina: structural requirements and mode of action of trans-tiliroside  // Bioorganic & medicinal chemistry letters. - 2007. - Vol. 17. -№ 11. - p. 3059-3064.
14. Andersson U. et al. Rose hip exerts antidiabetic effects via a mechanism involving down regulation of the hepatic lipogenic program // American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. - 2011. - Vol. 300. - p. E111-E121.
15. Ghorbani A. Mechanisms of antidiabetic effects of flavonoid rutin // Biomedicine & Pharmacotherapy. - 2017. - Vol. 96. - p. 305-312.
16. Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики».
17. Российская Федерация. Законы. Об обращении лекарственных средств: Федеральный закон № 61-ФЗ: [принят Государственной думой 24 мая 2010 года: одобрен Советом Федерации 31 марта 2010 года]. - Текст: непосредственный.
18. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 199н от 01.04.2016 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».
19. Российская Федерация. Законы. О внесении изменений в Федеральный закон «Об обращении лекарственных средств: Федеральный закон №429-ФЗ: [принят Государственной думой 9 декабря 2014 года: одобрен Советом Федерации 17 декабря 2014 года]. - Текст: непосредственный.
20. Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях - Страсбург, 18 марта 1986 года.
21. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р. У. Хабриева. М.: ОАО Изд-во «Медицина» - 2005. - 828 с.
22. Фитотерапия против диабета. Травы жизни / В.Ф. Корсун, Т.Е. Трумпе, Е.В. Корсун, Н.В. Ершов, Н.А. Огренич. - М.: ЗАО издательство Центр-полиграф, 2016. - 351 с.