Выявление и количественное определение различных типов вируса папилломы человека высокого онкогенного риска у женщин Томской области

Е.Г. Никитина, И.Г. Видяева, Л.Н. Уразова, В.Н. Стегний

ВЫЯВЛЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ВЫСОКОГО ОНКОГЕННОГО РИСКА У ЖЕНЩИН ТОМСКОЙ ОБЛАСТИ

В ходе исследования выявлена инфицированность разными типами вируса папилломы человека в группах обследованных женщин. Показаны региональные особенности инфицирования папилломавирусом женского населения Томской области. Частота встречаемости клинически значимой вирусной нагрузки у больных с фоновой патологией, дисплазиями и раком шейки матки достоверно превышает аналогичный показатель у здоровых лиц.

Ключевые слова: папилломавирус; вирусная нагрузка; рак шейки матки.

Рак шейки матки (РШМ) является тяжелым быстропрогрессирующим заболеванием, которое занимает второе место в мире по частоте встречаемости среди злокачественных новообразований у женщин. По данным ВОЗ, каждый второй зарегистрированный случай данной патологии в течение года заканчивается летальным исходом в связи с поздней диагностикой.

В Российской Федерации заболеваемость РШМ составляет 12 человек на 100 000 женского населения, а летальность - 4,6% от всех смертей от онкологической патологии у женщин, что несколько выше, чем в развитых европейских странах [1]. Наиболее высокие показатели заболеваемости регистрируются на Дальнем Востоке и в Сибири (Читинская область - 33,1%о, Республика Тыва - 25,5%, Томская область - 22,7%) (стандартизированный показатель на 100 000 населения) [2].

После открытия Гарольдом зур Хаузеном в начале 70-х гг. прошлого века этиологического фактора РШМ - вируса папилломы человека (ВПЧ) (Нобелевская премия, 2008 г.) - ученые всего мира направили свои усилия на исследование этой инфекции и ее роли в этиопатогенезе заболеваний шейки матки.

В настоящее время идентифицировано более 100 типов папилломавируса, которые по действию на эпителиальные клетки были разделены на группы низкого и высокого онкогенного риска. К первой группе относятся 4, 6, 11, 42, 43-й типы, вызывающие доброкачественные разрастания - бородавки, кондиломы, папилломы. Представители же второй группы - 16, 18, 31, 35, 45-й и другие типы - способны индуцировать развитие неопластических изменений клеток и инвазивного рака [3].

Известно, что развитие тяжелых дисплазий является процессом длительным и многостадийным. Причем персистентная инфекция с длительной экспрессией онкобелков является необходимым условием возникновения атипических изменений эпителия шейки матки. От момента инфицирования до развития неопластических изменений может проходить от 10 до 15 лет [4]. В связи с этим возникает возможность предотвращения данного процесса при выявлении ВПЧ у женщин на стадиях персистенции вируса и легких диспла-стических изменений эпителия шейки матки. В настоящее время активно ведутся работы по разработке программ ранней диагностики и профилактике предраковых патологий и рака шейки матки, которые основываются на информации об общей инфицированности и распространенности генотипов вируса папилломы в отдельных регионах.

Для повышения чувствительности и сохранения специфичности исследования, в дополнение к цитоло-

гическому анализу, ряд международных организаций (ASCCP, EUROGIN, IARC WHO) рекомендует использовать тесты, которые позволяют установить носитель-ство вируса, генотипировать отдельные типы и определять концентрацию ДНК ВПЧ в образце. В исследованиях, проведенных во многих странах мира, в том числе в России, показана прямая связь между повышенной вирусной нагрузкой и риском развития дисплазий и РШМ. Было обосновано введение такого понятия, как «клинически значимый» порог (3 lg ВПЧ на 100 000 клеток хозяина): вирусная нагрузка ниже этого значения редко встречается в образцах тяжелой дисплазии и рака и ассоциирована с регрессией инфекции. Также выделяется «порог прогрессии» (5 lg ВПЧ на 100 000 клеток хозяина): вирусная нагрузка выше данного значения обозначается как повышенная и ассоциирована с большей вероятностью наличия или прогрессии тяжелой цервикальной дисплазии [5-7].

Цель исследования - выявление и определение концентрации ДНК различных типов папилломавируса высокого онкогенного риска методом ПЦР в режиме «реального времени» у женщин Томской области.

Материалы и методы

В исследовании приняли участие 491 женщина, прошедшая обследование и лечение в НИИ акушерства, гинекологии и перинатологии СО РАМН и НИИ онкологии СО РАМН (средний возраст - 35,9±0,6 лет). В зависимости от патологических изменений шейки матки было выделено 4 группы женщин: здоровые (n=152), с фоновой патологией (ФПШМ; n=257), дисплазиями I—III степени (n=23) и раком шейки матки I-IV стадий (n=59). В группу здоровых вошли женщины, не имеющие цитологических и кольпоскопических изменений эпителия шейки матки. В группу пациенток с ФПШМ включены женщины с хроническими воспалительными заболеваниями шейки матки. Диспластические изменения и рак шейки матки верифицированы гистологически. Материалом для выделения ДНК послужили соскобы эпителия цервикального канала и шейки матки. Работа проведена с использованием мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени», позволяющей выявлять, генотипировать каждый из 12 типов папилломавируса высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59) и определять концентрацию ДНК вируса (вирусную нагрузку). Статистическую обработку данных проводили с использованием непараметрического критерия х2 для анализа качественных признаков в программе STATISTICA 6.0 (StatSoft, 2007).

Результаты и обсуждение

ДНК ВПЧ выявлена у 184 из 491 обследованной женщины, что составило 37,4%. Согласно показателям инфицированности в группах частота выявления ДНК папилломавируса увеличивается пропорционально степени морфологических изменений эпителия шейки матки. Так, среди здоровых лиц ДНК вируса выявлена в 18% случаев, среди женщин с ФПШМ этот показатель составил 38%, а в группах больных дисплазиями и раком шейки матки - 65 и 75% соответственно (рис. 1). Эти результаты согласуются с клинико-экспериментальными данными, приведенными в литературе, относительно роли ВПЧ в формировании пролиферативной патологии шейки матки и клинической значимости обнаружения папилломавируса в качестве маркера предопухолевого состояния эпителия на ранних этапах канцерогенеза [8]. Согласно данным эпидемиологических исследований, встречаемость ВПЧ значительно варьирует в различных этнико-географических регионах [9]. Полученные результаты об инфицированности здоровых женщин не противоречат данным мировой литературы, согласно которым показатель общей ин-фицированности в этой группе в различных популяци-

ях не превышает 17-20% [10-11]. Обращает на себя внимание тот факт, что частота встречаемости ДНК вируса в группе с ФПШМ достаточно высока - 38% (против 18% среди здоровых лиц). Вероятно, это связано с тем, что хронический воспалительный процесс является патологическим состоянием, в результате которого происходит снижение местного иммунитета, а это облегчает проникновение вируса через микротрещины в эпителии и длительное его персистирование.

Таким образом, женщинам с ФПШМ, инфицированным папилломавирусом, необходимо рекомендовать тщательное динамическое наблюдение, что предполагает включение их в группу повышенного онкологического риска.

Не стоит упускать из виду и тот факт, что около 7 из 10 сексуально активных женщин когда-либо в течение жизни инфицируются ВПЧ, но развитие инвазивного цервикального рака происходит лишь в небольшом проценте случаев. Ранняя сексуальная активность, количество половых партнеров, сопутствующие урогенитальные инфекции, снижение иммунитета, стрессы, курение, а также этнические особенности являются дополнительными факторами риска для данной патологии [3].

80%

70%

Б 60%

о

ш 50%

ГО

£ 40% ш 30%

ГО

о 20%

I—

0%

Здоровые ФПШМ Дисплазии РШМ

Рис. 1. Инфицированность вирусом папилломы человека женщин обследованных групп. * Статистически значимые различия с группой здоровых (р<0,05).

** Статистически значимые различия с группой ФПШМ

При определении частоты встречаемости 12 генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска показаны региональные особенности инфицирования женского населения Томской области. Выявлено, что наиболее часто среди обследованных женщин встречается ВПЧ16 (38,1% случаев). Данные относительно встречаемости остальных одиннадцати типов представлены на рис. 2. Эпидемиологические исследования, проведенные как в России, так и в других странах, показали, что лидирующую позицию по частоте встречаемости во всем мире занимает ВПЧ 16-го типа (от 24 до 70% в разных популяциях) [9, 12-13].

В группе здоровых женщин наиболее часто встречаются ВПЧ31 и ВПЧ16 (22,2 и 18,5% соответственно), а среди женщин с ФПШМ - ВПЧ16 (25,5%) и ВПЧ52 (15,3%).

Следует отметить, что в группе женщин с фоновой патологией и раком шейки матки выявлены все иссле-

дуемые типы вируса, в то время как в группе здоровых лиц и больных дисплазиями некоторые варианты па-пилломавируса не обнаружены (ВПЧ33, 51, 59 и ВПЧ18, 52 соответственно).

Согласно литературным данным, частота встречаемости ВПЧ 16 и 18 типов, с которыми связывают около 70-72% случаев РШМ, составляет около 45% от общего числа всех генитальных типов папилломавируса в мире [13]. Полученные нами данные показали, что на долю 16-го и 18-го типов ВПЧ в Томской области приходится 46% случаев, на долю других исследованных генотипов ВПЧ высокого онкогенного риска - 54% (рис. 2). Эти результаты подтверждают целесообразность определения широкого спектра генотипов с целью повышения чувствительности ДНК-теста.

Известно, что выявление нескольких типов ВПЧ ассоциировано с менее благоприятным прогнозом течения заболевания и более высоким риском персистен-

ции вируса в организме [14]. Нами показано, что около 50% женщин с фоновой патологией и диспластически-ми изменениями шейки матки инфицированы несколькими типами ВПЧ, в то время как в группе здоровых лиц смешанная инфекция наблюдается только в 19% случаев.

Использованная нами в работе технология ПЦР в режиме «реального времени» дает возможность не только выявлять присутствие вируса в образце и проводить типирование, но и определять концентрацию ДНК вируса в клетках.

Взаимосвязь между вирусной нагрузкой и степенью неопластических повреждений активно обсуждается в мировой литературе. Авторы подтверждают наличие корреляции между различными уровнями концентрации ДНК вируса и стадиями предраковой патологии и инвазивного рака [15-16], а также положительной ассоциации высокой нагрузки ВПЧ16 и тяжестью цервикальных повреждений [11, 17]. В нескольких работах показана связь не только с тяжестью повреждений, но и с прогнозом развития тяжелых цервикальных неопла-зий [17-18].

40%

^ 35% %

£ 30%

О

§ 25%

ГО

И 20%

I—

“ 15%

ГО

£ 10%

О

ГО

^ 5%

0%

38%

16 31 56 51 33 18 52 58 35 39 45 59

И'Тип ВПЧ

Рис. 2. Распределение типов ВПЧ среди инфицированных женщин

Длительное присутствие ВПЧ в ткани с активной экспрессией онкогенов вируса многократно увеличивает риск развития неопластических изменений. Женщины, у которых выявляется высокая вирусная нагрузка, особенно в сочетании с несколькими типами вируса и хроническими воспалительными заболеваниями шейки матки, имеют повышенный риск развития тяжелой дисплазии [19]. Таким образом, вирусная нагрузка может отражать тяжесть течения папилломавирусной инфекции, и определение концентрации ДНК вируса является дополнительным параметром, который позволяет с большей точностью прогнозировать вероятность развития неопластических состояний.

Согласно полученным нами результатам, в группе больных фоновой патологией, дисплазиями и раком шейки матки частота встречаемости клинически значимой вирусной нагрузки достоверно превышает ана-

логичный показатель у здоровых лиц. Количество случаев со значимой, т.е. > 3^, концентрацией ДНК вируса среди обследованных здоровых жительниц Томской области составило 14,5%, в группе больных ФПШМ -27,6%, среди женщин с дисплазиями - 56,5% (таблица). В группе больных РШМ со впервые установленным диагнозом клинически значимая вирусная нагрузка была выявлена у 56,4% женщин, в группе пациенток, прошедших комбинированное противоопухолевое лечение, высокие концентрации ДНК ВПЧ встречались в 25,0% случаев.

Следует отметить, что при выявлении у пациентки малозначимой концентрации ДНК вируса вероятность возникновения у нее тяжелых диспластических изменений минимальна [6-7]. Более вероятно, что в течение полутора лет произойдет спонтанная элиминация инфекции.

Распределение вирусной нагрузки среди женщин по группам

Диагноз ВПЧ

Клинически значимая вирусная нагрузка, % Малозначимая вирусная нагрузка, %

Здоровые

ФПШМ

Дисплазии

Первичный диагноз РШМ

РШМ после ПКЛ

Примечание. Процент рассчитывался внутри группы от общего числа обследованных в этой группе. * Статистически значимые различия с группой здоровых (р<0,05). ** Статистически значимые различия с группой женщин с ФПШМ (р<0,05); п - число обследованных в группе.

Проведение тестирования на наличие высокоон-когенных типов вируса папилломы с использованием технологии ПЦР в режиме «реального времени» дает возможность выделения группы риска развития злокачественной патологии. Полученные результаты отражают рост частоты встречаемости клинически значимой вирусной нагрузки в группах больных дисплазиями и раком шейки матки, в сравнении с группой здоровых и больных ФПШМ женщин. То есть выявление и количественное определение ВПЧ,

наряду с цитологическим скринингом, является целесообразным мероприятием, позволяющим проводить профилактику персистенции вируса, формирование групп риска, т. е. успешно использоваться как фактор ранней диагностики и прогноза риска развития патологии шейки матки.

Работа выполнена на базе лаборатории онковирусологии НИИ онкологии СО РАМН под руководством д-ра биол. наук, проф. Л.Н. Уразовой, д-ра биол. наук, проф. В.Н. Стегния.

ЛИТЕРАТУРА

1. Аксель Е.М., Давыдов М.И. Состояние онкологической помощи населению России и стран СНГ 2004 г. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина

РАМН. 2006. № 17. С. 15-37.

2. Салчак Ч.Т., СиразетдиноваА.К., Рассеник Т.И. Анализ состояния онкологической помощи больным раком шейки матки в Республике Тыва

// Сибирский онкологический журнал. 2008. № 3. С. 58-60.

3. НовикВ.И. Эпидемиология РШМ, факторы риска, скрининг // Практическая онкология. 2002. Т. 3, № 3. С. 156-165.

4. Мазуренко Н.Н. Роль вирусов папиллом в канцерогенезе шейки матки // Актуальные вопросы в клинической онкологии. 2003. Т. 5, № 1.

С. 67-74.

5. Josefsson A.M., Magnusson P.K., Ylitalo N. Viral load of human papilloma virus 16 as a determinant for development of cervical carcinoma in situ: a

nested case-control study // Lancet. 2000. № 355(9222). Р. 2189-2193.

6. Snijders P.J., van den Brule A.J., Meijer C.J. The clinical relevance of human papillomavirus testing: relationship between analytical and clinical sen-

sitivity // J. Pathol. 2003. № 201(1). Р. 11-16.

7. Dalstein V., Riethmuller D., Pretet J.L. et al. Persistence and load of high-risk HPV are predictors for development of high-grade cervical lesions: a

longitudinal French cohort study // Int. J. Cancer. 2003. № 106. Р. 396-403.

8. Zur Hausen H. Human pathogenic papillomaviruses, topics in microbiology and immunology // Berlin. 1994. № 186. Р. 131-157.

9. Евстигнеева Н.П. Папилломавирусная инфекция урогенитального тракта женщин: эпидемиология, факторы персистенции, оптимизация

ранней диагностики и профилактики онкогенеза: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М., 2007. 42 с.

10. Steben M., Duarte-Franco E. Human papillomavirus infection: epidemiology and pathophysiology // Gynecol. Oncol. 2007. № 107. Р. 2-5.

11. Syrjanen K., Kulmala S.M., Shabalova I. et al. Epidemiological, clinical and viral determinants of the increased prevalence of high-risk human papillomavirus (HPV) infections in elderly women // Eur. J. Gynaecol. Oncol. 2008. № 29 (2). Р. 114-122.

12. Bosch F.X., Lorincz A., Munoz N. The casual relation between human papillomavirus and cervical cancer // J. Clin. Pathol. 2002. № 55. Р. 244-265.

13. ИмянитовЕ.Н., Хансон К.П. Молекулярная онкология: клинические аспекты. СПб.: СПбМАПО, 2007. 215 с.

14. Куевда Д.А., Шипулина О.Ю. Количественный подход в диагностике папилломавирусной инфекции // Практическая онкология. 2006. № 3. С. 135-141.

15. Sun C.A., Lai H.C., Chang C.C. et al. The significance of human papillomavirus viral load in prediction of histologic severity and size of squamous Intraepithelial Lesions of Uterine Cervix // Gynecol. Oncol. 2001. № 83. Р. 95-99.

16. Einstein M.H., Studentsov Y.Y., Ho G.Y. et al. Combined human papillomavirus DNA and human papillomavirus-like particle serologic assay to identify women at risk for high-grade cervical intraepithelial Neoplasia // Int. J. Cancer. 2007. № 120. Р. 55-59.

17. Moberg M., Gustavsson I., Gyllensten U. Type-specific associations of human papillomavirus load with risk of developing cervical carcinoma in situ

// Int. J. Cancer. 2004. № 12 (5). Р. 854-859.

18. Xu Y., Dotto J., Hui Y. et al. High grade CIN and viral load of high-risk human papillomavirus: significant correlations in patients of 22years old or

younger // Int. О. Clin. Exp. Pathol. 2009. № 2. Р. 169-175.

19. Moberg M., Gustavsson I., Wilander E., Gyllensten U. High viral loads of human papillomavirus predict risk of invasive cervical carcinoma // Br. J.

Cancer. 2005. № 92. Р. 891-894.

Статья представлена научной редакцией «Биология» 1 февраля 2011 г.