Морфологическое изучение регенеративно-репаративного процесса печени на модели острой печеночной недостаточности при комплексном применении трансплантации гепатоцитов и препарата эрбисола

МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЕГЕНЕРАТИВНОРЕПАРАТИВНОГО ПРОЦЕССА ПЕЧЕНИ НА МОДЕЛИ

ОСТРОЙ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПРИ КОМПЛЕКСНОМ ПРИМЕНЕНИИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

ГЕПАТОЦИТОВ И ПРЕПАРАТА ЭРБИСОЛА

А.М.ХАДЖИБАЕВ, М.Д.УРАЗМЕТОВА, А.А.МАДАМИНОВ, Р.К.АХМЕДОВА, А.Г.МИРЗАКУЛОВ, З.С.ЗАЛЯЛОВА

MORPHOLOGICAL STUDY REGENERATIVEREPARATIVE PROCESSES LIVER A MODEL OF ACUTE LIVER FAILURE

IN COMPLEX APPLICATION TRANSPLANTATION HEPATOCYTE AND ERBISOL

A.M.KHADJIBAEV, M.D.URAZMETOVA, R.K.AKHMEDOV, A.A.MADAMINOV, A.G.MIRZAKULOV, Z.S.ZALYALOVA

Республиканской научный центр экстренной медицинской помощи

В эксперименте использовано 92 половозрелых беспородных крысы-самца массой 230-270 г. Гепато-токсическую модель острой печеночной недостаточности (ОПН) получали с помощью CCl4. Животные были разделены на 6 групп: 1-я - здоровые животные, 2-я - введение эрбисола здоровым животным, 3-я - определение исследуемых показателей у животных с ОПН, 4-я - лечение животных с ОПН введением эрбисола, 5-я - лечение животных с ОПН трансплантацией эмбриональных гепатоцитов (ЭГ), 6-я - лечение животных с ОПН сочетанным применением эрбисола и трансплантацией ЭГ. Трансплантацию ЭГ проводили методом внутрибрюшинного введения взвеси гепатоцитов. Для получения ЭГ использовали печень эмбрионов 28 крысят 1-2-дневного возраста. Трансплантация клеток выполнялась при жизнеспособности их более 90-95%. Трансплантацию ЭГ производили в период между 30 и 34 часами после моделирования острого поражения печени. Внутрибрюшинно вводили 50 млн (0,5х108) ресуспендированных гепатоцитов. При сочетанном применении ЭГ и эрбисола происходит потенцирование их влияния, выражающееся в интенсивной пролиферации гепатоцитов и гипертрофии и по-липлоидизации ядер гепатоцитов, отмечается раннее восстановление структуры и массы поврежденной печени. Трансплантация ЭГ способствует повышению эффективности регенерации печени, что обосновывает целесообразность использования комбинированной терапии ЭГ и иммуногепатокор-ректора эрбисола при ОПН.

Ключевые слова: острая печёночная недостаточность, регенерация, печень, гепатоцит, морфология, четы-реххлористый углерод, эрбисол.

In the experiment, 92 adult mongrel male rats weighing 230-270 g hepatotoxic model of acute liver failure (ALF) was obtained by CCl4. The animals were divided into 6 groups: 1st - healthy animals, 2nd - introduction Erbisol animal health, the third - the definition of the parameters studied in animals with acute renal failure, 4th - treatment of animals with ARF introduction Erbisol, 5 th - treatment of animals with ALF transplantation of embryonic hepatocytes (EG), 6th - treatment of animals with acute renal failure and the combined use of Erbisol and transplantation EG. EG transplant was performed by intraperitoneal injection of a suspension of hepatocytes. To obtain fetal liver using EG 28 rats 1-2 days old. Cell transplantation was performed at the viability of more than 90-95%. Transplantation EG produced between 30 and 34 hours after modeling acute liver damage. Were injected intraperitoneally with 50 million (0,5h108) resuspended hepatocytes. The combined application of EG and Erbisol occurs potentiation of their influence, reflected in the intense hepatocyte proliferation and hypertrophy and in diploidization nuclei of hepatocytes, there is an early restoration of the structure and weight of liver damage. EG transplantation enhances the effectiveness of regeneration of the liver, which proves the feasibility of using combination therapy EG and Erbisol in ALF Keywords: acute liver failure, regeneration, liver hepatocyte morphology, carbon tetrachloride, еrbisol.

Клинико-экспериментальные исследования

УДК: 616.36-004-003.93-089.843-032

Острая печёночная недостаточность (ОПН) представляет собой клинический синдром, характеризующийся внезапным развитием тяжёлого нарушения функции печени, который сопровождается энцефалопатией, выраженной коагулопатией и другими метаболическими расстройствами, в том числе и глубокими нарушениями в иммунной системе. Особое место отводится фульминантной печёночной недостаточности, которая характеризуется развитием этого синдрома у здорового человека. До настоящего времени основным и ведущим методом лечения больных остается поддерживающая терапия, которая включает коррекцию имеющихся нарушений основных видов обмена, проведение специализированной нутритивной поддержки, улучшение функ-

ционального состояния печени и других органов и систем [2, 7]. Успешное внедрение в клиническую практику трансплантации печени при ОПН оказало существенное влияние на прогноз и выживаемость этой группы больных. Являясь радикальным методом лечения больных, трансплантация печени, по всей видимости, не сможет в ближайшей перспективе кардинально изменить ситуацию, сложившуюся в лечении печеночной недостаточности, в связи со сложностями, связанными с организацией донорского этапа и рядом других, прежде всего, экономических проблем [1, 4].

Большой интерес вызывает оценка возможности компенсации печеночной недостаточности и улучшения клинического течения заболевания с помощью

новых клеточных технологий. Наиболее полно соответствовать задаче замены и одновременно стимуляции обновления специализированных клеток печени с целью компенсации печеночной недостаточности могла бы пересадка эмбриональных клеток, о чем свидетельствует множество работ, посвященных этой актуальной проблеме. При этом особое место приобретает использование различных препаратов, которые, помимо гепатопротективного, обладают и имму-нокорригирующим действием [3,5, 6].

Цель. Изучение морфологических изменений в печени у животных с ОПН при комплексном применении трансплантации эмбриональных гепатоцитов (ЭГ) и гепатопротектора эрбисола.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В эксперименте использовано 92 половозрелыех-беспородных крысы-самца. Основными критериями включения животных в исследование были масса 230-270 г, возраст 23-24 недели, шерстяной покров

- гладкий, блестящий; поведение и общее состояние

- активная динамика движения и потребления кормов. Перед началом исследования крыс, отвечающих этим критериям, разделили на группы методом рандомизации. Протокол исследования был одобрен Национальным этическим комитетом (№ 4 от 13 апреля 2011 г.). В процессе проведения эксперимента были также соблюдены требования Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Всех крыс умерщвляли путем вскрытия

яремной вены под эфирным наркозом.

В эксперименте острое поражение печени получали путем создания гепатотоксической модели ОПН с помощью СС14 (в дозе 200 мкг/100 г массы в объемном соотношении токсин:масло - 1:1). Животные были разделены на 6 групп (рис. 1): 1-я группа - здоровые крысы, 2-я группа - введение эрбисола здоровым животным, 3-я группа - определение изучаемых показателей у животных с ОПН, 4-я группа - лечение животных с ОПН введением эрбисола, 5-я группа - лечение животных с ОПН трансплантацией ЭГ, 6-я группа -лечение животных с ОПН сочетанным применением эрбисола и трансплантацией ЭГ. Эрбисол животным вводили внутримышечно ежедневно в дозе 0,08 мл/ кг. Трансплантацию ЭГ проводили методом внутри-брюшинного введения взвеси гепатоцитов. Для получения ЭГ использовали печень эмбрионов 28 крысят 1-2-дневного возраста. ЭГ выделяли по методу с применением ЭДТА. Жизнеспособность гепатоцитов оценивали по их окрашиванию 0,2% раствором три-панового синего с подсчетом клеток в камере Горяева. Трансплантация клеток выполнялась при жизнеспособности их более 90-95%. Трансплантацию ЭГ животным производили в период между 30 и 34 часами после моделирования острого поражения печени. С помощью специальной иглы, соединенной с 5 мл шприцем, внутрибрюшинно вводили 50 млн (0,5х108) ресуспендированных гепатоцитов. Иммуносупрессия при этом не применялась. После трансплантации клеток животных помещали в теплое помещение со свободным доступом к воде и пище.

Группа 2,п=12. Определение исследуемых показателей при применении эрбисола

Погибло от ОПН. п=32

Основные группы. п=3б

Рис. 1. Схема выполнения эксперимента. Животные разделены на серии А и Б в соответствии со сроками вывода их из эксперимента.

Для оценки клинического состояния применялась унифицированная методика с учетом пятибалльной степени печеночной энцефалопатии.

Морфологическое исследование. Ткань печени фиксировали в течение 48 ч в 10% растворе нейтрального формалина. После фиксации материал проводили по общепринятой гистологической методике с изготовлением парафиновых срезов толщиной 4-6 мкм на микротоме Leica RM 2145 (Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином. Через 7 и 21 сутки после операции анализировали пролиферацию клеток, участие в регенерации перисинусоидальных клеток, желчных протоков, афферентных и эфферентных сосудов печени, полнокровие центральных и вен воротной системы, выраженность жировой дистрофии гепатоцитов, очаги некроза гепатоцитов, состояние портальных трактов и перипортальных зон (разрастание соединительной ткани, формирование междольковых септ, инфильтрация) и желчных капилляров (изменения эндотелия, холестаз), воспалительно-клеточную инфильтрацию паренхимы, наличие делящихся клеток. Степень выраженности регенерационного процесса в печени оценивали по следующим показателям: масса регенерирующей печени; коэффициент массы печени - масса печени, приходящаяся на 1 г. Подсчет двуядерных гепатоци-тов на 1000 подсчитанных клеток проводили на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

У интактных крыс 1-й группы структура печеночной паренхимы характеризовалась четким расположением гепатоцитов, радиальными балками вокруг центральных вен, тонкими стенками сосудов центральных и портальных трактов, отсутствием инфильтратов и соединительной ткани в паренхиме. На препаратах печени животных сохранена структура органа, нечетко выражено дольчатое строение, печеночные пластинки размещены радиально, центральные вены, ветви воротной вены, синусоиды умеренного кровенаполнения, умеренно выражена междольчатая соединительная ткань, характерный полиморфизм гепатоцитов (светлые и темные), большое количество светлых гепатоцитов в периферических отделах долек. Цитоплазма гепатоцитов базофильная, ядро круглое, расположено в центре клетки, стенки желчных протоков покрыты кубическим эпителием. Между ге-патоцитами выявляются звездчатые эндотелиоциты (купферовские клетки) (рис. 2 а,б).

После введении эрбисола у животных (2-я гр.) на 7-е сутки морфологическая картина печени практически не отличалась от таковой у крыс 1-й группы (рис. 2в). К 21-м суткам эксперимента большая часть гепатоцитов с гиперхромными, увеличенными в размерах ядрами, много двуядерных форм, цитоплазма неравномерно окрашена без явлений дистрофии, четко просматривается балочная структура долек. Венозная система с явлениями застойного полнокровия, выражена гиперплазия синусоидальных эндотелиоцитов. Гепатоциты различных размеров (рис. 2г). Следовательно, можно заключить, что препарат эрбисол, обладающий иммуномодулирующим и стимулирующим регенерацию в печени действием,

не оказывает токсического влияния на гепатоциты.

У животных с ОПН (3-я гр.) на 7-й день имели место центрлобулярные некрозы гепатоцитов, захватывающие различные площади печеночной дольки (рис. 2д). Структура ткани печени крыс на 21-й день эксперимента подверглась значительным деструктивно-дистрофическим изменениям, выразившимся в увеличении площади некротизированных участков (10-15% от общей площади исследуемых участков печени). Деструктивные изменения гепатоцитов сопровождались увеличением мезенхимально-клеточной реакции, особенно заметной в зонах портальных трактов, где обнаруживалось скопление мононуклеаров. Ге-патоциты не образовывали трабекул, располагались беспорядочно, синусоиды резко сужены. Отмечалось расширение крупных портальных трактов за счет разрастания стромы и заполнения ее воспалительным инфильтратом. Некоторые портальные тракты были с некротическими изменениями сосудов, стенки которых слабо различались. Выявлялась деструкция желчных протоков. В гепатоцитах имела место жировая и гидропическая дистрофия, а также воспалительные инфильтраты (рис. 2е). Следовательно, на используемой модели морфологически выявлена картина острого поражения структуры печени, которая является гистологическим отражением ОПН.

У животных с ОПН (4-я гр.) при введении эрбисо-ла к 7-м суткам все еще преобладают некротически-дистрофические процессы, имеющие диффузный характер (рис. 2ж). Просветы синусоид не просматриваются, просветы центральных вен пусты или с единичными эритроцитами. На фоне дистрофических процессов просматриваются репаративные процессы в ядрах гепатоцитов, выражающиеся в их гиперхромии, анизохромии, увеличении размеров ядер, что свидетельствует о накоплении хромосомного материала для дальнейших репаративных процессов с помощью деления клеток. К 21-м суткам дистрофические процессы отчасти сохраняются, усиливается кровоток, что выражено в явном венозном полнокровии. Улучшение состояния цитоплазмы клеток говорит о внутриклеточном накоплении гликогена. Увеличилось количество двуядерных гепато-цитов, количество гепатоцитов на единицу площади ткани, гепатоцитов различной формы и размеров. Просветы синусоидов просматриваются нечетко, в гепатоцитах сохраняются явления белковой и жировой дистрофии (рис. 2з). Надо отметить, что эрбисол в целом положительно влияет на функцию сохранившихся гепатоцитов, стимулируя регенерацию печеночной ткани и способствуя восстановлению функции клеток.

В морфологической картине печени у животных с ОПН и введением эмбриональных гепатоцитов (5-я гр.) на 7-е сутки сохранялась очаговая дистрофия и некрозы гепатоцитов, выраженные застойные явления в синусоидах и центральных венах. В большинстве гепатоцитов начальные репаративные процессы протекали на фоне набухания клеток. Выражена активность фибробластов и мононуклеарных клеток. Отчетливо видны ядра различных размеров и ядрышки. Синусоиды неравномерно расширены

* ч V

О

• / л _ . t < : 1  ' в *

¿Да.'

< «У

_M ' " ОМ* I

' г-. ». v '

г  - • ' «

ш

с t

•  . ж •

С V' /, .

I Г м* \ ' '*

Ж

Kjft" V f.,

7V--Г:

+> V v * •

-л

«

«

41

m *

• • #

Va,

* •

: » »

К

го

в • с

О О» - „Ф "

„ Э в ,

» Ж* II ?" V

. « "

<fv • ^ *

I«

Д

ta

L*3)r

* * * ♦ > « > • «

»* ** *

• > «»л*'

л*.

в» t "

eft- S " »X - .

* 4

в

" •• . -т

» ' * ; *

• V « V« t • *

•Ï О  ; j* • » * ;

,'•» ;в »  v j. . л* 1Л» , . Ч*1;^ " * m

2 в w - ,.4

Л

В А Г 4* • V»

И

в _ J

•Г 1 s

»V

о

SflN Ек л. Ï

АSal**

• )

» f

a e

< « ♦ '

N * < * •» ;

..»к*

Л * 1. jfl r  f " * -

[ЯШмщ s •

ils* V- v

М

Рис. 2. Морфологическая картина печени крыс разных групп:

A. Печень норма. Интактная крыса. Ув.10 х 20.

Б. Печень норма. Интактная крыса. Фрагмент предыдущего препарата. Ув.10 х 40.

B. Структура печени с моделью ОПН CClf на 7-е сутки. Ув.10 х 20. ГГ Структура печени с моделью ОПН CClt на 21-е сутки. Ув.10 х 40.

Д. Структура печени с моделью ОПН и введением эрбисола на 7-е сутки. Ув.10 х 20. Е. Структура печени с моделью ОПН и введением эрбисола на 21-е сутки. Ув.10 х 40. Ж. Структура печени с моделью ОПН и введением эрбисола на 7-е сутки. Ув.10 х 40. З. Структура печени с моделью ОПН и введением эрбисола на 21-е сутки. Ув.10 х 40. И. Структура печени с моделью ОПН и введением ЭГ на 7-е сутки. Ув.10 х 40. К. Структура печени с моделью ОПН и введением ЭГ на 21-е сутки. Ув.10 х 40.

Л. Структура печени с моделью ОПН и комбинированным введением ЭГ и эрбисола на 7-е сутки. Ув.10 х 40. М. Структура печени с моделью ОПН и комбинированным введением ЭГ и эрбисола на 21-е сутки. Ув.10 х 40. Примечание. Окраска гематоксилином и эозином.

В

Е

(рис. 2и). К 21-м суткам эксперимента отмечается значительное улучшение морфологической картины в печени, которая практически не отличалась от печени крыс 1-й группы. Регенеративные процессы имеют очаговый характер, просветы синусоидов неравномерно расширены, так же как венозных сосудов. Наблюдается также гиперплазия синусоидальных элементов, имеющая неравномерный характер. Репаративные процессы по сравнению с группой без лечения выражены значительно лучше (рис. 2к). Следовательно, использование эмбриональных гепатоцитов способствует восстановлению поврежденной ткани печени, что, несомненно, благоприятно сказывается на течении печеночной недостаточности вплоть до полного выздоровления.

Наиболее оптимальные результаты отмечены в группе животных с ОПН и комбинированным введением ЭГ и эрбисола на 7-е и 21-е сутки исследования. Просветы синусоидных капилляров и балочная структура очень четко просматриваются. Сохраняется гиперплазия синусоидных эндотелиоцитов. Отмечается тенденция к восстановлению структуры печени, при этом уже на ранних сроках лечения структура органа близка к структуре в группе ин-тактных животных: печеночные балки размещены радиально, центральные вены, ветви воротной вены, синусоиды умеренного кровенаполнения, отчетливо прослеживается характерный полиморфизм гепа-тоцитов (светлые и темные), большое количество светлых гепатоцитов в периферийных отделах долек (рис. 2 л,м). Можно заключить, что комбинированное применение эрбисола и ЭГ способствует стимуляции репаративного процесса, при котором в процессе лечения отмечается значительное восстановление поврежденной ткани печени, что подтверждено морфологическими исследованиями.

ВЫВОДЫ

1. У животных с ОПН отмечаются выраженные морфологические изменения в печени, обусловленные распространенным некротическим процессом и выраженной воспалительной реакцией. При введе-

нии ЭГ отмечается в целом положительная динамика в виде регенерации клеток печеночной паренхимы и уменьшения воспалительной реакции, которые менее выражены в группе животных, леченных эрбисолом.

2. При сочетанном применении ЭГ и эрбисола происходит потенцирование их влияния, выражающееся в интенсивной пролиферации гепатоцитов и гипертрофии и полиплоидизации ядер гепатоцитов, отмечается раннее восстановление структуры и массы поврежденной печени.

3. Комбинированная терапия трансплантацией ЭГ и иммуногепатокорректором эрбисолом способствует повышению эффективности регенерации печени, что обосновывает целесообразность использования данной схемы при лечении ОПН.

ЛИТЕРАТУРА

1. Журавель С.В., Андрейцева О.И., Новрузбеков М.С.,

Чжао АВ. Прогнозирование и трансплантация печени при острой печеночной недостаточности. Consilium medicum. Хирургия 2005; 7(1).

2. Могилевец Э.В., Гарелик П.В., Батвинков Н.И. Методы стимуляции регенерации при циррозе печени. Новости хир 2013; 21(3): 103-109.

3. Николаенко А.Н. Основные направления в создании и внедрении нового лекарственного препарата Эрбисол. Новый украинский препарат «Эрби-сол». Тез. докл. Киев 1994; 4-9.

4. Шагидулин М.Ю., Онищенко Н.А., Крашенниников

В.М. Трансплантация гепатоцитов как метод лечения печеночной недостаточности: экспериментальный и клинический опыт. Вестн трансплан-тол и искусств органов 2010; 2: 53-60.

5. Юшков Б.Г., Данилова И.Г., Казакова И.А. Роль стволовых клеток в регенерации печени и почек. Вестн Уральской мед акад науки 2013; 43 (1): 46-47.

6. Chiang C.H., Chang C.C., Huang H.C. et al. Investigation of hepatoprotective activity of induced pluripotent stem cells in the mouse model of liver injury. J Biomed Biotechnol 2011; 2011:219060.

7. Michalopoulos G.K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Compr Physiol 2013; 3(1): 485-513.

ГЕПАТОЦИТЛАР ТРАНСПЛАНТАЦИЯСИНИ ВА ЭРБИСОЛ ДОРИСИНИ БИРГАЛИКДА ЦУЛЛАГАНДА ЖИГАРДАГИ РЕГЕНЕРАЦИОНРЕПАРАТИВ ЖАРАЁНЛАРНИ УТКИР ЖИГАР ЕТИШМОВЧИЛИГИНИНГ

МОДЕЛИДА МОРФОЛОГИК УРГАНИШ

А.М.Хаджибаев, М.Д.Уразметова, А.АМадаминов, Р.К.Ахмедова, А.Г.Мирзакулов, З.С.Залялова Республика шошилинч тиббий ёрдам илмий маркази

Тажрибада огирлиги 230-270 г. булган 92 нафар жинсий етилган наслсиз эркак каламушлар кулланилди. Уткир жигар етишмовчилик модели CCl4 ёрдамида олдинди. Хайвонлар 6 гурух,га булинди: 1) сог каламушлар, 2) эрбисол кулланилган сог каламушлар гурух,и, 3)уткир жигар етишмовчилик билан булган каламушлар, 4) уткир жигар етишмовчилиги эрбисол билан даволанган х,айвонлар, 5) уткир жигар етишмовчилиги эмрионал гепато-цит трансплантацияси билан даволанган каламушлар, 6) уткир жигар етишмовчилиги эрбисол ва эмбрионал гепатоцит трансплантацияси билан бирга даволанган каламушлар гурух,и. Эмбрионал гепатоцитлар транспла-тацияси ва эрбисол бирга кулланилган каламушлар гурух,ида узаро таъсирини кучайтириш кузатилди, гепа-тоцитларда пролиферация, гипертрофия ва полиплоидизация жараёнлари кучайган эди, шикастланган жигар тукимаси ва вазни нисбатан тезрок тикланилиши кузатилди.

Контакт: Мадаминов Айбек Азадович,

старший научный сотрудник отдела экспериментальной медицины РНЦЭМП.

Тел: +998901753504; e-mail: aybekm1@gmail.com