Физико - химические свойства экзополисахарида Lactococcus lactis

УДК 577.114.083

ФИЗИКО - ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА LACTOCOCCUS LACTIS

© 2017 Н.А. Фокина, Г.Т. Урядова, Л.В. Карпунина

Саратовский государственный аграрный университет имени Н. И. Вавилова

Статья поступила в редакцию 28.04.2017

Были определены физико-химические свойства экзополисахарида Lactococcus lactis В-1662: молекулярная масса, химическая природа, моносахаридный состав, относительная вязкость. Ключевые слова: бактерии, молочнокислые бактерии, лактококки, экзополисахариды, молекулярная масса, химическая природа, моносахаридный состав, вязкость.

ВВЕДЕНИЕ

Среди микробных биополимеров особое место занимают экзополисахариды (ЭПС). Источником получения экзополисахаридов на сегодняшний день являются многие бактерии, в том числе молочнокислые [1-5]. Известно, что они обладают реологическими, иммунности-мулирующими, ранозаживляющими, пленкообразующими свойствами [3-5]. Однако функции этих биополимеров являются не до конца изученными. Для формирования представления о влиянии ЭПС молочнокислых бактерий на физиологические реакции в организме животных, необходимо накопление данных об их структуре, физико-химических и биологических свойствах ЭПС разных видов и штаммов.

В связи с этим, целью работы явилось изучение физико-химических свойств экзополисахарида Lactococcus lactis В-1662.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования явился экзополи-сахарид Lactococcus lactis В-1662. Выделение и очистку ЭПС проводили по методу J. Cerning et.al. [6] в нашей модификации.

Культура Lactococcus lactis В-1662 была получена из Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Пущино-на-Оке).

Молекулярную массу экзополисахарида определяли методом аналитической гель-хроматографии [7], используя гелевый носитель TSKgel G 6000 PWXL (Япония). ЭПС идентифицировали на автоматическом анализаторе 2690 Allianse Waters. Наличие фракций ЭПС L.

Фокина Надежда Александровна, микробиолог.

E-mail: fockina.nadejda@yandex.ru

Урядова Галина Тимофеевна, аспирант кафедры

«Микробиология, биотехнология и химия»

E-mail:eni_galina@mail.ru

Карпунина Лидия Владимировна, доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры «Микробиология, биотехнология и химия». E-mail: karpuninal@mail.ru

lactis В-1662 определяли методом ионообменной хроматографии, используя носитель DEAE-Toyopearl 650 M [8].

Моносахаридный состав определяли с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с целлюлозным носителем [9].

Относительную вязкость определяли с помощью стеклянного вискозиметра ВПЖ-2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе изучали физико-химические свойства ЭПС L. lactis B-1662, который был получен нами ранее из культуры L. lactis B-1662 [10]. Данный ЭПС представлял собой порошок светло-коричневого цвета, без запаха, не имеющий в своем составе белка. Для его получения культуру L. lactis B-1662 выращивали на среде A. Welman [11] с сахарозой при температуре 27 °С, рН 5,5 в течение 48 ч на шуттель-аппарате при 180 об/мин. Очистку ЭПС проводили методом гель-фильтрации на колонке c носителем Sephadex G-10.

Молекулярную массу экзополисахарида определяли методом аналитической гель -хроматографии на колонке TSKgel G6000 PWXL. Колонку калибровали стандартными образцами сахаров с известными молекулярными массами, такими как: глюкоза 6 тыс Да, Dextran 10 тыс Да, Dextran 110 тыс Да, Dextran 2 млн Да («Fluca», Швейцария, «Merck» Германия). Экзополисаха-рид L. lactis B-1662 детектировали на автоматическом анализаторе 2690 Alliance Waters (рис. 1). Как видно из табл. 1, молекулярная масса L. lactis B-1662 была равна 10000 Да (табл. 1).

Дальнейшую очистку ЭПС L. lactis В-1662 проводили, используя метод ионообменной хроматографии на колонке с анионообменни-ком DEAE- Toyopearl 650М (20х200 мм). Элюцию проводили в два этапа: первоначально буфером 0,04 % NaN3, 0,05М КН2Р04. После отделения нейтральных фракций, элюцию осуществляли раствором NaCl в том же буфере с градиентом концентрации 1М. Фракции с колонки собирали

Таблица 1. Определение молекулярной массы ЭПС L. lactis В-1662 на колонке TSKgel тип G6000 PWXL

Время выхода

Образец максимального пика, мин Молекулярная масса, Да

Декстран 21,73 2 000 000

Декстран 23,20 110 000

Декстран 24,60 10 000

Глюкоза 25,76 6 000

ЭПС на сахарозе пики слева направо

1 25,51 10 000

Рис. 1. Хроматограмма определения молекулярной массы ЭПС, полученного из Ь \actis В-1662

на сахарозе на колонке с ТБ^е! 06000 РШХЬ

с помощью коллектора и затем исследовали на содержание углеводов фенол-серным методом [12]. Как видно из хроматограммы на рис. 2, образцы выходили одной фракцией соответствующей нейтральным веществам. Наличие одной нейтральной фракции было характерно и для некоторых ЭПС таких молочнокислых бактерий как Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii ssp. bulgaricus [13]. Хотя в литературе имеются данные о гетерогенности ЭПС некоторых штаммов лактококка [14].

Используя метод тонкослойной хроматографии, которую проводили на пластинке с целлюлозным носителем POLIGRAM GEL 300 с толщиной слоя 0,1мм, определяли моносаха-ридный состав ЭПС L. lactis B-1662. В качестве «свидетелей» использовали спиртовые растворы моносахаров (Fluca) таких как: D- глюкоза, D -галактоза, L - манноза, D - рамноза, D- глю -коуроновая кислота, D - ксилоза. Гидролиз ЭПС

проводили 2 н. раствором трифторуксусной кислоты при 110° С в течение 3 часов. Элюентом являлся раствор, состоящий из этилацетата, пиридина, уксусной кислоты, воды в соотношении 5:5:1:3. В качестве проявителя использовали анилин фталат. Было определено, что в состав ЭПС входят ксилоза и глюкоза (рис. 3). Полученные результаты согласуется с литературными данными о том, что глюкоза и ксилоза, наряду с маннозой, рамнозой, галактозой могут являться структурными моносахаридами ЭПС [15,16].

В процессе исследований было установлено, что ЭПС изучаемой культуры обладал низкой вязкостью и это не позволяло определить динамическую вязкость. Относительная вязкость была определена с помощью капиллярного вискозиметра и составила 1,3 мм2/с. Значение относительной вязкости было сопоставимо с показателем вязкости ЭПС других молочнокислых бактерий - лактобацилл [14].

1 M

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

МЛ

Рис. 2. Ионообменная хроматография ЭПС L. lactis В-1662 на БЕЛЕ - Toyopearl 650M

Рис. 3. Определение моносахаридного состава ЭПС L. lactis В-1662 методом тонкослойной хроматографии Примечание: 1,2,4 - углеводы-свидетели, 3-ЭПС

Таким образом, из культуральной жидкости L. В-1662 впервые выделен ЭПС, представленный одной нейтральной фракцией с молекулярной массой 10000 Да, обладающей небольшой относительной вязкостью.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ганина В.И., Рожкова Т.В. Анализ зарубежных исследований в области молочнокислых бактерий, синтезирующих экзополисахариды // Изв. вузов. Пищ. технол. 2005. № 5-6. С. 65-66.

2. Лахтин М. В., Лахтин В.М., Алешкин А.В. Экзопо-лимеры пробиотических лактобацилл и бифи-добактерий (новые подходы и свойства) // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра

Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2012. Т. 87. № 5. С. 257-261.

3. Ботина С.Г., Рожкова И.В., Семенихина В.Ф. Использование штаммов молочнокислых бактерий, синтезирующих экзополисахариды, в производстве кисломолочных продуктов питания // Хранение и переработка сельхозсырья. 2010. № 1. С. 38-40.

4. Влияние экзополисахаридов Lactobacillus delbrueckii spp.bulgaricus на цитокиновый статус лабораторных мышей / Е.В. Полукаров, Е.А. Горельникова, Л.В. Карпунина, Е.И. Тихомирова // Медицинская иммунология. 2009. №4-5. С. 309-310.

5. Правдивцева М.И., Карпунина Л.В., Бухарова E.H. Влияние лаксаранов на процесс заживления ран у животных // Аграрная наука в XXI веке; проблемы и перспективы: сборник науч. статей VI Всерос-

сийской науч. - практ. конф. Саратов, 2012. Ч.П. С. 82-84.

6. CerningJ., Bouillanne C., DesmazeaudM.J. Exocellular polysaccharide production by Streptococcus thermophilus // Biotechnol. Lett. 1988. Vol. 10. P. 255-260.

7. Варбанец Л.Д., Здоровенко Г.М., Книрель Ю.А. Методы исследования эндотоксинов. Киев: Наукова думка, 2006. 234 с.

8. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. 536 с.

9. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. М.: Мир, 1965. 508 с.

10. Фокина Н.А., Урядова Г.Т., Карпунина Л.В. Выделение экзополисахарида из L^^omaus lactis при различных условиях культивирования // Аграрный научный журнал. 2016. № 12. С. 40-42.

11. Welman A.D., Maddox I.S., Archer R.H. Screening and selection of exopolysaccharide-producing strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus // J. Appl.

Microbiol. 2003. Vol. 95. P. 1200-1206.

12. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J.K., Rebera P.A., Smith T. Colorimetric method for determination of sugars and related substances //Anal. Chem. 1956. Vol. 28. No. 3. Р. 350-356.

13. Полукаров Е.В. Экзополисахариды молочнокислых бактерий и их функциональная значимость в организме животных: дис. ... канд. биол. наук. Саратов, 2009. 106 с.

14. Рожкова Т.В. Биотехнология стартовых культур на основе молочнокислых бактерий, синтезирующих полисахариды. Дис. ... канд. тех. наук. М., 2006. 159 с.

15. De Vuyst L., Degeest B. Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria // FEMS Microbiol Rev. 1999. Vol. 23. P. 153 - 177.

16. Характеристика полисахаридов, секретируемых Bifidobacterium adolescentis 94 БИМ / Г.И. Новик, Н.И. Астапович, Й. Кюблер, А. Гамъян // Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. С. 205-210.

PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF EXOPOLYSACCHARIDE LACTOCOCCUS LACTIS

© 2017 N. A Fokina, G.T. Uryadova, L.V. Karpunina

Saratov State Agrarian University named after N.I. Vavilov

Physic-chemical properties of the exopolysaccharide (EPS) of Lactococcus lactis B-1662 were determined: molecular weight, chemical nature, monosaccharide composition, relative viscosity. Keywords: вacteria, Lactic acid bacteria, Lactococci, exopolysaccharide (EPS), molecular weight; chemical nature; monosaccharide composition; relative viscosity.

Nadezhda Fokina, Microbiologist, Educational, Research

and Testing Laboratory to Determine the Quality of Food

and Agricultural Products.

E-mail: fockina.nadejda@yandex.ru

Galina Uryadova, Post-Graduate Student at the Microbiology,

Biotechnology and Chemistry Department.

E.mail:eni_galina@mail.ru

Lidia Karpunina, Doctor of Biology Science, Professor at the Microbiology, Biotechnology and Chemistry Department. E-mail: karpuninal@mail.ru