Оценка результативности тест-системы на основе микросателлитов в проведении ДНК-экспертизы крупного рогатого скота

7. Серебровский А.С. Генетический анализ. -М.: Наука, 1970. -342 с.

8. Захаров И.А. Генетические карты сельскохозяйственныхживотных.-Москва, 1995.-35с.

9. Смарагдов М. Г. Генетическое картирование локусов, ответственных за качественные показатели молока у крупного рогатого скота.-Генетика.- 2006, Т. 42, №1. С5-21.

10. Матюков В.С. Ещё раз о генофонде и селекции холмогорского скота.- Сыктывкар, 2007.-139 с.

11. Смарагдов М.Г. Тотальная геномная селекция с помощью SNP как возможный ускоритель традиционной селекции// Генетика - 2009.-Т. 45, №6. -С. 725-728.

12. Яковлев А.Ф., Смарагдов М.Г. Значительное повышение точности оценки племенной ценности животных в молочном скотоводстве//Зоотехния.-№5, 2011.-с. 2 -4.

13. VanRaden P.M., Sullivan P.G. International genomic evaluation methods for dairy cattle// Genet Sel Evol. - 2010. Т. 42. 1. С 7-15.

14. Zengting Liu, Franz R. Seefried, Friedrich Reinhardt, Stephan Rensing, Georg Thallerand Reinhard Reents. Impacts of both reference population size and inclusion of a residual polygenic effect on the accuracy of genomic prediction//Genetics Selection Evolution.-2011.T. 43:19 doi:10.1186/1297-9686-43-19

15. Liu Z., Seefried F.R., Reinhardt F., Rensing S., Thallerand G., Reents R. Impacts of both reference popu-lation size and inclusion of a residual polygenic effect on the accuracy of genomic predic-tion//Genetics Selection Evolution. - 2011. - Т. 43:19 doi:10.1186/1297-9686-43-19

DNA-TECHNOLOGY IN SELECTION OF AGRICULTURAL ANIMALS

A.F.Jakovlev, M.G.Smaragdov, V.S.Matjukov

Summary. The estimation of breeding value was and remains the most difficult stage in cultivation of agricultural animals and, in particular, dairy cattle. The problem of an estimation of breeding value of an animal consists that for its definition it is necessary to compare and analyse communication between selection signs at ancestors, lateral relatives, descendants and the animal.

The analysis of polymorphism of single nucleotides of DNA of all genome gives the chance to reveal communications of loci of quantitative signs with thousand markers and to raise reliability of an estimation of breeding value of animals from 30-40 % to 60-90 % and at the expense of reduction of an interval of generations and cost of check of bulls on quality of posterity to accelerate genetic progress. Technologically molecular genetics, biometry, cybernetics, and biotechnology have given keys to fast hereditary transformation of breeds and populations of agricultural animals. However the understanding of the remote genetic consequences of revolutionary change of population gene pool while lags behind rough progress of technical possibilities. Therefore it is necessary to aspire to receive the qualitative information on intraspecific genetic differentiation and the differentiated selective value of population gene pool by means of new means.

Key words: DNA, polymorphism, an individual nucleotide, a marker, an estimation, breeding value, sier, genomic selection, single nucleotide polymorphism.

УДК 636.082.2

ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТИВНОСТИ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ МИКРОСАТЕЛЛИТОВ В ПРОВЕДЕНИИ ДНК-ЭКСПЕРТИЗЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА*

E.A. ГЛAДЫРЬ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией

П.В. ГОРЕЛОВ, кандидат биологических наук, научный сотрудник

В.Н. MAУРЧEBA, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник

A.В. ШAXИН, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

ВНИИ животноводства Россельхозакадемии Ю.И. ЧИНAРОB, доктор сельскохозяйственных наук ООО «БИОСТРИМ»

НЛ. ЗИНОBЬEBA, член-корреспондент РAСXН, зам. директора

ВНИИ животноводства Россельхозакадемии E-mail: n_zinovieva@mail.ru

Резюме. Показана результативность тест-системы на основе микросателлитов, разработанной во ВНИИ животноводства, для проведения ДНК-экспертизы крупного рогатого скота. Используемыелокусы(TGLA126, TGLA122, TGLA227, INRA023, ILST005, ILST006, ETH185, ETH10, ETH225, BM1818, BM1824, BM2113, SPS115) сформированны в две мультиплексные панели. Число микросателлитов, совпадающих для разработанной и зарубежных тест-систем, варьирует от 9 до 11. Биоматериал для исследования был взят от животных черно-

* Исследования выполнены при финансовой поддержке Минобрнауки РФ, проекты № 16.512.11.2212.

пестрой(п = 31 гол.), голштинской (п = 63 гол.), симментальской (п = 56гол.), швицкой(п = 30 гол.), холмогорской (п = 19 гол.), бестужевской (п = 34 гол.), костромской (п = 65 гол.), ярославской (п = 31 гол.) и бурой швицкой (п = 123 гол.) пород. Для сравнения достоверность происхождения подтверждена исследованием по 8-и генетическим системам (А, В, F-V, J, Ц, М, S, Z) групп крови. Число информативных и эффективных аллелей на локус микросателлитов было выше, чем аналогичных показателей по группам крови: 5,0 ± 0,3 против 2,6 ±

0,5 и 4,3 ± 0,3 против 3,4 ± 1,7 соответственно. Вероятность идентичности генотипов особей по 13 микросателлитам в зависимости от породы практически исключена и составляет от 6,8 х 10-14 до 2,1х 10-11 для неродственных животных и от 8,2 х 10-6до 1,1 х 10-5для полусибсов. Установлены высокие уровни достоверности результатов подтверждения (Р>0,99) и исключения (Р>0,9999) родителей. Показано 100 %-ное совпадение результатов оценки происхождения 47 пар мать

- дочь с результатами анализа по группам крови.

Ключевые слова: генетическая экспертиза, тест-системы, отцовство, микросателлиты, породы крупного рогатого скота

Контроль происхождения (отцовства) животных

- обязательное условие ведения племенной работы. Сегодня для этого применяют иммуногенетические и молекулярно-генетические методы анализа. Причем если эффективность использования эритроцитарных антигенов групп крови доказана рядом авторов [1], то для широкого освоения в России молекулярно-генетических методов необходимо проведение исследо-

контроля происхождения потомства, получаемого в России при использовании импортного семени, необходима разработка и освоение отечественных тест-систем, совместимых с национальными системами ДНК-идентификации стран-импортеров племенного скота. Кроме того, такие системы найдут применение в изучении вопросов популяционной генетики сельскохозяйственных животных [3, 4].

Исходя из изложенного, целью наших исследований была оценка результативности тест-систем для ДНК-экспертизы крупного рогатого скота, в сравнении с анализом по группам крови.

Условия, материалы и методы. Исследования проводили на базе Центра коллективного пользования научным оборудованием «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВНИИ животноводства. Для сравнения были использованы данные им-муногенетического исследования коров, полученные в рамках выполнения НИР по контракту с Минобрнауки России № 14.740.12.0821.

При анализе функциональных характеристик и потребительских свойств тест-системы для ДНК-анализа использовали биоматериал основных пород скота, разводимых в РФ. В ходе исследований были изучены образцы от животных черно-пестрой (31 гол.), голштинской (63 гол.), симментальской (56 гол.), швицкой (30 гол.), холмогорской (19 гол.), бестужевской (34 гол.), костромской (65 гол.) и ярославской (31 гол.) пород. Материалом для сравнительных исследований послу-

Таблица 2. Сравнительный анализ микросателлитов используемых в генетической экспертизе крупного рогатого скота в зарубежных странах_____________________________________________________

Локус Страна, фирма

сертификаты наборы

Канада США Германия Финляндия

МАХХА

2002 г. 2008 г. 2006 г. 2 1 г.

Число 16 12 25 13 13 16 11 11 12 18 11 13

локусов

в том числе 10 9 10 9 9 10 9 9 10 11 9

общих*

ВМ1818 * * * * * *

ВМ1824 * * * * * * * * * * * *

ВМ2113 * * * * * * * * * * * *

ОУР21 * * *

ЕТН10 * * * * * * * * * * * *

ЕТН225 * * * * * * * * * * * *

ЕТН3 * * * * * * * * * * *

!ЫРА023 * * * * * * * * * * * *

РМ067 * * * *

ЭРЭ115 * * * * * * * * * * * *

Т01_А126 * * * * * * * * * * * *

Т01_А122 * * * * * * * * * * * *

Т01_А227 * * * * * * * * * * * *

Т01_А53 * * * * * * * * * *

М0Т04В * * * * * *

ЭРЭ113 * * * * * *

088М36 * *

НЕМ * *

11_8Т005 *

ЕТН185 *

11_8Т006 * *

08РМ60 * *

088М66 *

ВМ5004 *

ВМ4208 *

В1_42 *

ВМ4107 *

ЕТН152 *

ВМ203 *

Рисунок. Результаты анализа аллельных профилей крупного рогатого скота различных пород по микросателлитам:  - № - среднее число аллелей на локус; К - Ыа>5% - среднее число информативных аллелей на локус;  - Ые - среднее число эффективных аллелей на локус;  -1 - информационный индекс Шеннона.

ваний, направленных на оценку точности и достоверности соответствующих тест-систем при генетической экспертизе происхождения племенного материала. В странах с развитым животноводством (США, Канада, Германия, Голландия и др.), начиная с 2004 г., применяют методы контроля достоверности происхождения, основанные на микросателлитах - высоко полиморфных последовательностях ДНК, равномерно распределенных по всему геному [2]. В этой связи для

* - общие локусы с предложенной тест-системой.

Таблица 1. Анализ результативности и достоверности результатов тест- черно-пестрой породе системы для проведения ДНК-экспертизы крупного рогатого скота по 13 рисунок).

см.

локусам микросателлитов

Порода Вероятность идентичности генотипа Подтверждение достоверности происхождения, если известны Исключение родителей

не родственные полу- сибсы оба родителя один родитель

Черно-пестрая 9,0*10-13 1,5*10-5 0,9999 0,9945 0,9999

Голштинская 6,8*10-14 8,2*10-6 0,9999 0,9977 0,9999

Симментальская 2,7*10-12 2,4*10-5 0,9998 0,9929 0,9999

Швицкая 4,4*10-13 1,5*10-5 0,9999 0,9955 0,9999

Холмогорская 1,6*10-13 1,1*10-5 0,9999 0,9966 0,9999

Бестужевская 1,6*10-12 1,8*10-5 0,9998 0,9931 0,9999

Костромская 4,6*10-13 1,7*10-5 0,9999 0,9958 0,9999

Ярославская 2,1*10-11 4,3*10-5 0,9996 0,9871 0,9999

жили образцы от 123 гол. бурой швицкой породы, в том числе 47 пар мать - дочь, достоверность происхождения которых была подтверждена по 8-и генетическим системам (А, В, F-V, J, L, М, S, Z) групп крови. Сравнительный анализ результативности предложенной тест-системы для ДНК-экспертизы потомства, полученного от завоза импортного семени, проводили на 63 быках голштинской черно-пестрой породы.

Выделение ДНК осуществляли на колонках фирмы Nexttec (Германия), исследование микросателлитов

- на ДНК-анализаторе АВ1 3130 х 1. Тест-система для ДНК-экспертизы крупного рогатого скота включала локусы TGLA126, TGLA122, Т01_А227, ^А023, ^Т005,

^Т006, ЕТН185, ЕТН10, ЕТН225, ВМ1818, ВМ1824,

ВМ2113, SPS115, сформированные в две мультиплексные панели.

Функциональные характеристики и потребительские свойства тест-системы оценивали по следующим показателям: вероятность совпадения генотипов животных по 13 микросателлитам, уровни достоверности результатов подтверждения происхождения (родителей) при условии, что известны оба или только один родитель, а также достоверности результатов исключения родителей.

Статистическую обработку проводили по стандартным методикам [5] с использованием программного обеспечения GenAlEx (версия 6.4).

Для расширения спектра прикладного применения предложенной тест-системы для подтверждения происхождения потомства, полученного в России с использованием импортного семени, был выполнен анализ микросателлитных локусов, включенных в племенные сертификаты, а также в наборы для генетической экспертизы крупного рогатого скота стран - основных импортеров племенного материала в Россию.

Результаты и обсуждение. Среднее число аллелей на локус микросателлитов в зависимости от породы варьировало от 5,9 ± 0,6 в ярославской до 7,5 ± 0,8 в голштинской черно-пестрой породе; число информативных аллелей (встречающихся с частотой 5 % и более) - от 4,0 ± 0,3 в симментальской до 5,3 ± 0,4 в швицкой породе; число эффективных аллелей (вносящих наибольший вклад в рас- Таблица 3. Результаты расчета достоверности результатов ДНК-чет уровня гетерозиготности) экспертизы происхождения потомства, полученного от родителей импорт-

Число информативных и эффективных аллелей на локус микросателлитов было выше аналогичного показателя по группам крови: 5,0 ± 0,3 против 2,6 ± 0,5 и 4,3 ± 0,3 против 3,4 ± 1,7 соответственно, что указывает на высокую информативность разработанной тест-системы.

Вероятность идентичности генотипов особей по 13 микросателлитам в зависимости от породы составляет от 6,8 х 10-14 до 2,1 х 10-11 для неродственных животных и от 8,2 X 10-6 до 1,1 х 10-5 для полусибсов, то есть практически исключена (табл. 1).

Уровень достоверности результатов ДНК-эксперти-зы происхождения крупного рогатого скота с использованием предлагаемой тест-системы во всех исследованных породах крупного рогатого скота если известны оба родителя составил Р > 0,999, если известен один родитель Р > 0,99. Уровень достоверности исключения родителей также высок (Р > 0,9999).

Оценка происхождения дочерей в 47 парах «мать

- дочь» с использованием ДНК-анализа показала 100 %-ное совпадение результатов с данными, полученными по группам крови.

Число микросателлитных локусов, включенных в племенные сертификаты крупного рогатого скота в зарубежных странах, варьирует от 11 до 25, в представленных на рынке наборах для ДНК-экспертизы - от 11 до 18, из них общих с предложенной тест-системой

- от 9 до 11 (табл. 2).

Разработанная тест-система обеспечивает высокий уровень достоверности результатов ДНК-экспертизы потомства крупного рогатого скота, полученного от родителей импортного происхождения, имеющих соответствующие ДНК-профили. Он зависит от количества общих локусов, но в любом из приведенных вариантов (от 9 до 11 общих локусов) превышает 0,999 - если известны оба родителя и 0,99 - если известен один родитель, уровень достоверности исключения родителей выше 0,9999 (табл. 3).

Выводы. Таким образом, высокая информативность тест-системы анализа микросателлитов крупного рогатого скота (5,9...7,5 аллелей на локус в зависимости от породы), высокие уровни достоверности результатов подтверждения (Р>0,99) и исключения (Р>0,9999) родителей, а также 100 %-ное совпадение результатов оценки происхождения дочерей в 47 парах «мать-дочь» с данными анализа по группам крови доказывают результативность предлагаемой тест-системы в проведении ДНК-экспертизы крупного рогатого скота.

до 4,3 ± 0,4 - в голштинской черно-пестрой породе. Значение информационного индекса разнообразия Шеннона колебалось от 1,32 ±

0,12 в ярославской породе до 1,57 ± 0,11 в голштинской

Число общих локусов Вероятность идентичности генотипа Подтверждение достоверности происхождения, если известны Исключение родителей

не полу-родственники сибсы оба один родителя родитель

11 1,6*10-12 3,3*10-5 0,9999 0,9960 0,9999 10 1,9*10-11 8,6*10-5 0,9998 0,9936 0,9999 9 1,2*10-10 1,9*10-4 0,9996 0,9914 0,9999

Литература.

1. Букаров Н.Г., Хрунова А.И., НовиковА.А., Мишина Н.С., ПолиткинД.Ю. Оценка быков-производителей по генетическим маркерам групп крови // Зоотехния. - 2010. - № 11. - с. 2-3.

2. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers // Nucleic Acids Research. -1989. - 17. - 6463-6471

3. БагировВ.А., НасибовШ.Н., КленовицкийП.М., ЛесинС.А., ВоеводинВ.А., Зиновьева Н.А., ЭрнстЛ.К., В.В. Калашников, В.А. Солошенко Сохранение и рациональное использование генофонда животных// Доклады РАСХН. - 2009. - № 2. - с. 37-40

4. Зиновьева Н.А., Сизарева Е.И., Гладырь Е.А., Проскурина Н.В., Шавырина К.М. Некоторые аспекты использования микросателлитов в свиноводстве //Достижения науки и техники АПК. - 2009. - № 8. - с. 38-41.

5. Вейр Б. Анализ генетических данных // М.: Мир, 1995. - 319 с.

EFFECTIVENESS EVALUATION OF TEST-SYSTEM BASED ON MICROSATELLITES

FOR DNA EXPERTISE IN CATTLE E.A. Gladyr, P.V. Gorelov, V.N. Maurcheva, A.V. Shahin, Y.I. Chinarov, N.A. Zinovieva

Summary. The effectiveness of the test-system based on microsatellites for DNA expertise of cattle was shown. The average numbers of alleles per loci are varied of 5.9 to 7.5 depending of breed. The high probability levels of the parentage confirmation (P>0.99) and exclusion (P>0.9999) were detected. The results of daughters’ parentage evaluation in 47 pairs “mother - daughter” were 100% in accordance with the data received by blood groups analysis.

Key words: genetic expertise, test-system, parentage, microsatellite, cattle breeds

УДК 636.082

МОНИТОРИНГ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ СТАДА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ ПОРОДЫ ТЮМЕНСКОЙ ОБЛАСТИ НА ОСНОВЕ ДНК-ДИАГНОСТИКИ МАРКЕРОВ ПРОДУКТИВНОСТИ

М. А. ЧАСОВЩИКОВА, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

О.М. ШЕВЕЛЁВА, доктор сельскохозяйственных наук, профессор Тюменская ГСХА E-mail: texnolzoo@mail.ru

Резюме. Цель исследований заключалась в проведении мониторинга встречаемости ценных ДНК генотипов каппа-казеина и пролактина у крупного рогатого скота в условиях Тюменской области в зависимости от степени голштинизации. Исследования проводили в ФГУП «Учебно-опытноехозяйство Тюменской ГСХА» на коровах черно-пестрой породы с разной долей голштинской крови в количестве 100 гол. Образцы крови проанализированы методом ПЦР-ПДРФ анализа геномной ДНК.

У 70 % коров обнаружены аллели каппа-казеина АА, у 25 %

- АВ и лишь у 5 % желательный генотип - ВВ. По пролактину генотип АА имели 50 % животных, 48 % были гетерозиготными (АВ) и только 2 % коров характеризовались желательным генотипом ВВ.

В целом среди обследованного поголовья установлено семь разных комплексных генотипов. Чаще всего это CSN3MPRLM и CS^'^'PRLf'13, на их долю приходится 68 %. Реже встречаются животные с генотипами CSN3№PRLM и CSN3АВPRLАВ - 25 %. Доля коров гомозиготных по В-аллелям составляет 2...3 %. Частота встречаемости В-аллеля каппа-казеина у коров с кровностью по голштинской породе 50 % и менее составила 0,103±0,040, а более 50 % - 0,204±0,034, В-аллеля гормона пролактин - 0,276±0,059 и 0,261±0,037соответственно.

В целом по обследованной популяции частота встречаемости ценных В-аллелей каппа-казеина составила - 0,175±0,027, пролактина - 0,260±0,031.

Ключевые слова: каппа-казеин, пролактин, генотип, аллель, ДНК-диагностика, черно-пестрая порода.

В последние годы в животноводческой практике все шире применяют методы генетических исследований. ДНК-диагностика позволяет выявить маркеры продуктивных качеств сельскохозяйственных животных, что значительно повышает эффективность селекционно-племенной работы [1...3]. В молочном скотоводстве наиболее распространены такие генетические маркеры, как ген каппа-казеина (CSN3) и ген гормона пролактин (PRL). Сегодня известно десять аллелей каппа-казеина крупного рогатого скота, из которых наиболее распространены аллели А и В [2]. В-аллель указывает на более высокое содержание белка в молоке, а также на его лучшие коагуляционные свойства [2, 3]. Пролактин стимулирует развитие молочной железы, выполняет функцию секреции молока. Установлено, что животные с генотипом ВВ по пролактину отличаются более высокими удоями и массовой долей жира в молоке [3].

По данным отечественных и зарубежных исследователей, у большей части животных голштинской породы (от 60 до 90 %) выявлен генотип каппа-казеина АА, в то время как комбинация аллелей ВВ встречается крайне редко. Частота аллеля А составляет от 0,74 до 0,95, В

- от 0,05 до 0,26 [2].

Частота встречаемости В-аллеля каппа-казеина у животных отечественной черно-пестрой породы в конце прошлого века варьировала от 0,23 до 0,43, сейчас - от 0,07 до 0,41 и в среднем равна 0,20. Чаще всего в популяциях черно-пестрого скота в России и за