Морфогенез эспарцета песчаного in vitro и его регуляция с помощью гуминовых кислот торфа и нанобиокомпозитов

2. Виноградова Т.С. Инструментальные исследования сердечно-сосудистой системы (справочник). -М.: Медицина, 1986. - 416 с.

3. Гуменюк В.А., Семенова Я.С., Судаков К.В. Электрофизиологические и вегетативные показатели эмоционального восприятия человеком динамичной цветомузыки // Физиология человека. -2002. - №1. - С. 57-67.

4. Дергаева И.А., Урванцев Л.П. Влияние музыки на больных с пограничными нервно-психическими расстройствами // Ярославский психологический вестник. - М.; Ярославль, 2003. - Вып. 10. - С. 153-160.

5. Костюченко А.Л., Костин Э.Д., Курыгин АА. Эн-теральное искусственное питание в интенсивной медицине. - СПб.: Спецлит, 1996. - 332 с.

6. Николаева Е.Н., Колосова О.Н., Яковлева А.П., Мельгуй Н.В. Некоторые психофизиологические особенности здоровья студентов на Севере и возможность их коррекции // Вестник СВФУ. - 2012. -Т. 9, № 4. - С.25-32.

7. Рыжов Ю.Н. Влияние темпоритмической структуры музыки на психофизиологическое состояние человека // Психотехнологии в социальной работе / Под ред. В. В. Козлова. - Ярославль: ЯрГУ, 2005. - Вып. 10. - С. 203-208.

8. Свидерская Н.Е., Королькова Т.А. Влияние свойств нервной системы и темперамента на пространственную организацию ЭЭГ // Журнал высшей нервной деятельности. - 1996. - Т.46, №5. - С.849-858.

9. Сергиенко Е.А., Виленская Г.А. Роль темперамента в развитии регуляции поведения // Психологический журнал. - 2001. - Т.22, № 3. - С. 68-85.

10. Суворов Г.А., Прокопенко Л.В. Акустические колебания: шум, инфразвук, ультразвук эколого-ги-гиеническая оценка и контроль. - М., 2000. - 216 с.

11. Шушарджан. С. В. Музыкотерапия. Музыко-терапия и резервы человеческого организма. - М., 1998. - 145 с.

12. Hughes J., Daaboul Y., Fino J., Shaw G. The Mozart effect on epileptiform activity // Clin.Electroenceph-alogr. - 1998. - Vol. 29, N.3. - P. 109-119.

13. Kim S. J. The Effects of Music on Pain Perception of Stroke Patients During Upper Extremity Joint Exercises // Journal of Music Therapy. - 2005. - Vol. 42, N.1.

- Р. 81-92.

14. Lane R., McRae K., Reman E. et al. Neural correlates of heart rate variability during emotion // NeuroImage. - 2009. - Vol. 44, N. 1. - P. 213-222.

15. Timmers M., Fischer A., Manstead A. S. R. Gender differences in motives for regulating emotions // Personality and Social Psychology Bulletin. - 1998. - № 24.

- Р. 974-985.

16. Wahbeh H., Calabrese C., Zwickey H. Binaural beat technology in humans: a pilot study to assess psychologic and physiologic effects // J. Altern Complement Med. - 2007. - Vol. 13, N.1. - P. 25-32.

Поступила в редакцию 05.10.2015

Общая биология

УДК 581.143.6: 633.36

Морфогенез эспарцета песчаного in vitro и его регуляция с помощью гуминовых кислот торфа и нанобиокомпозитов

О.А. Рожанская*, Н.В. Барашкова**, Т.В. Шилова*, В.Г. Дарханова**, Н.С. Строева**

*Сибирский НИИ кормов СО РАН, г. Новосибирск **Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН, г. Якутск

Изучено влияние минерального состава питательных сред и новых стимуляторов роста из растительного сырья на морфогенез эспарцета (Onobrychis arenaria (Kit.) DC) в культуре тканей in vitro. Новые стимуляторы роста из растительного сырья, введённые в состав питательных сред для рекуррентной регенерации и микроклонального размножения эспарцета в концентрации 0,5-1 мг/л, влияют на морфогенез и позволяют заменять дорогостоящие синтетические цитокинины и ауксины, сократить сроки культивирования in vitro в 1,5-2 раза, увеличить выход побегов и частоту ризогенеза на

*РОЖАНСКАЯ Ольга Александровна - д.б.н., зав. лаб.; **БАРАШКОВА Наталья Владимировна - д. с.-х. н., зав.

лаб., BNW-07@yandex.ru; *ШИЛОВА Татьяна Васильевна - с.н.с.; **ДАРХАНОВА Валентина Гаврильевна -н.с.; **СТРОЕВА Наталья Семеновна - н.с.

15-90%. При этом эффективность антисептической обработки семян эспарцета с помощью смеси этанола и перекиси водорода достигает 97%, лабораторная всхожесть асептических семян - 72%. Разработаны протоколы рекуррентной регенерации с участием нанобиокомпозитов как заменителей синтетических фитогормонов. Новые селекционные биотехнологии предназначены для создания высокопродуктивных и долголетних форм эспарцета, устойчивых к условиям криолитозоны.

Ключевые слова: эспарцет песчаный, in vitro, рекуррентная регенерация, регуляторы роста, нанобио-композиты.

Morphogenesis of the Onobrychis Arenaria In Vitro and Its Control by Using Peat Humic Acids and Nano-Biocomposites

O.A. Rozhanskaya*, N.V. Barashkova**, T.V. Shilova*, V.G. Darkhanova**, N.S. Stroeva**

*Scientific Research Institute of Fodder SB RAS, Novosibirsk **Institute for Biological Problems of Cryolithozone SB RAS, Yakutsk

The influence of a mineral composition of the nutrient solutions and new growth stimulants from a vegetable origin raw materials on the morphogenesis of Onobrychis arenaria in a culture of the tissue in vitro studied. The new growth stimulants from a vegetable origin raw materials, which were put into composition of the nutrient media for the recurrent regeneration and the micro-cloning multiplication of the onobrychis in concentration 0.5-1 mg/l, have an effect on the morphogenesis and permit to change the expensive synthetical cytokinins and the auxins, reduce the cultivation's time in vitro in 1.5-2 times, increase the appearance of the scions and the frequency of rhizogenesis by 15-90%. The effectiveness of the antiseptic treatment of the seeds of the onobrychis with a mixture of ethanol and hydrogen dioxide achieves 97 % and the germination of the aseptic seeds under laboratory conditions is 72 %.

The protocols of the recurrent regeneration with nano-biocomposites as the alternatives of the synthetical plant hormones are worked out. The new selection biological technologies are applicable for creation of highly productive and longeval forms of onobrychis, which are resistent in conditions of the cryolithic zone.

Key words: onobrychis arenaria, in vitro, recurrent regeneration, regulators of the growth, nano-biocomposites.

Введение

Изучение особенностей морфогенеза in vitro кормовых растений, широко распространённых в естественных ценозах Якутии и пригодных к хозяйственному использованию, позволяет применять селекционные биотехнологии в направлении повышения адаптивности.

Эспарцет песчаный (Onobrychis arenaria (Kit.) DC) относится к особо ценным кормовым травам, поскольку кормовая масса его богата белком и не вызывает тимпанита у скота, растение устойчиво к засухе, толерантно к солонцеватым и щебнистым почвам с бедным минеральным составом. Однако произрастающий на лугах и в редколесьях Якутии эспарцет сибирский (Onobrychis sibirica (Sirj.) Turcz. ex Grossh. [1], по нашим наблюдениям, не отличается долголетием, имеет небольшую надземную массу, а плоды его быстро осыпаются по мере созревания. В Якутии нет сортов эспарцета, адаптированных к условиям криолитозоны.

Для формирования популяций растений-реге-нерантов мы используем технологию рекуррентной регенерации, обеспечивающую отбор на

устойчивость к абиотическим и биотическим повреждающим факторам [2]. Эффективность автоселекции адаптивных генотипов растет с увеличением числа пассажей [3]. Данная технология предусматривает чередование регенераци-онных циклов и микроклонального размножения, поэтому сроки создания популяций, пригодных для селекции, зависят от частоты реализации морфогенеза и продолжительности пассажа. Основой циклического процесса также может послужить вторичная регенерация из каллусов, сформировавшихся у оснований побегов в процессе клонирования первичных регене-рантов [4].

Цель исследований - разработка и совершенствование методик культивирования in vitro эспарцета для создания высокопродуктивных и долголетних форм, устойчивых к условиям криолитозоны. Поставленные задачи включают изучение влияния новых стимуляторов роста из растительного сырья как химических факторов, инициирующих и стимулирующих определенные типы морфогенеза в эксплантах тканей эспарцета.

Материалы и методы исследования

Для проведения экспериментов in vitro использовали семенной материал эспарцета песчаного СибНИИК 30 и сложногибридных популяций сомаклонов СГП-11, СГП-12, СГП-13. Семена, очищенные от плодовых оболочек, дезинфицировали и проращивали на безгормональных питательных средах. Асептические растения служили источником эксплантов для каллусооб-разования и регенерации. Ткани инкубировали при 16-часовом фотопериоде, освещенности 2000 лк, температуре 21°С. Применяли питательные среды с минеральным составом по Гамборгу (B5) или Мурасиге-Скугу (MS) [5,6]. Фитогор-моны и экспериментальные регуляторы роста добавляли в питательную среду перед автоклавиро-ванием.

Новый биостимулятор ГК^ предоставленный лабораторией агроэкологии Томского государственного педагогического университета - водный раствор высокомолекулярных веществ из стандартного образца торфа 1S103H (США) с концентрацией гуминовых кислот 0,1% [7]. Регуляторы роста - нанобиокомпозиты разработаны и изготовлены в Институте химии твёрдого тела и механохимии СО РАН методами механохими-ческой активации растительного сырья: КЛ - из коры лиственницы, МП05 - из хвои пихты, ами-ногумат АГ12 - из бурого угля с добавкой соевого белка [8-10].

Опыты имели 3 повторности во времени, объем выборки в каждом варианте составлял 2030 эксплантов. Различия средних оценивали с помощью критерия Фишера или непараметрических критериев статистики [11].

Результаты и обсуждение

Опыт 1. Изучено влияние минерального состава питательных сред на морфогенез проростков из асептических семян эспарцета (табл. 1). На среде MS всхожесть была выше на 10%, чем на среде Гамборга половинного состава (1/2В5), однако выход асептических растений снижался из-за повышенной частоты инфекции. Скорость роста и развития побега была несколько выше на среде 1/2В5. Поскольку эта среда содержит значительно меньше солей и углеводов, чем MS, её использование представляется более выгодным в экономическом отношении.

Опыт 2. Сравнительное изучение влияния синтетического цитокинина БАП и препарата ГКst проведено в культуре тканей листовых и корневых эксплантов эспарцета (табл. 2). На среде MS без экзогенных регуляторов роста (контроль) морфогенные структуры в листовых тканях не формировались, хотя средний объём экспланта увеличился более чем вдвое. В тканях

Т а б л и ц а 1

Влияние минерального состава питательной среды на прорастание семян эспарцета in vitro после дезинфекции

Показатели морфогенеза Питательная среда

1/2В5 MS

Всхожесть, % 68 78

Доля инфицированных проростков, % 7 12

Высота побега, см 7,4±0,6 6,0±0,5*

Число листьев на побег 2,4±0,2 2,3±0,2

Длина корня, см 4,8±0,3 5,0±0,3

*Разница средних арифметических достоверна на 5%-м уровне значимости.

Т а б л и ц а 2

Влияние цитокинина БАП и препарата из торфа FKst на морфогенез в тканях листовых и корневых эксплантов эспарцета in vitro

Показатели морфогенеза MS без добавок (контроль) MS+БАП 0,5 мг/л ms + rest 1 мл/л

Происхождение экспланта Лист Корень Лист Корень Лист Корень

Частота кал-лусогенеза, % 0 40 93 100 7 33

Объём каллуса, см3 0 0,3 0,07 0,4 0,003 0,3

Объём экспланта по отношению к исходному, % 266 373 100 100 210 515

Частота регенерации, % 0 13 40 33 0 0

Число регене-рантов на эксплант 0 1,0 2,3 3,0 0 0

корневого происхождения, напротив, обнаружена довольно высокая эндогенная биологическая активность: почти половина эксплантов приступила к каллусогенезу, причём на каждом третьем каллусе начался спонтанный эмбриои-догенез и возникло растение-регенерант.

В присутствии БАП почти все листовые экс-планты сформировали каллус, в котором с частотой 40% происходил эмбриоидогенез и развивались 2-3 растения-регенеранта. Корневые ткани на среде с БАП увеличили частоту каллусогенеза до 100%, частоту регенерации в - 2,5 раз, число регенерантов на эксплант - втрое. Препарат ГКst в культуре листовых тканей продемонстрировал слабую морфогенную активность, вызвав образование небольших каллусов с частотой 7%, причём регенерация отсутствовала, как на безгормональной среде. В культуре корневых тканей добавка ГКй, очевидно, препятствовала действию эндогенных регуляторов роста, снизив частоту каллусообразования и исключив регенерацию.

Интересно, что при некотором сходстве мор-фогенных ответов на БАП и TKst в отношении каллусогенеза и регенерации обнаружилось различие их действия на объём экспланта, а именно: эндогенные гормоны вызывали увеличение объёма, БАП блокировал этот процесс, а препарат TKst стимулировал рост объёма корневых экс-плантов. Поскольку увеличение размеров экспланта обусловлено эффектом растяжения клеток, присущим ауксинам, можно предположить ауксиновую активность у препарата TKst. Очевидно, в эндогенном комплексе корневых тканей эспарцета при наличии ауксинов преобладают цитокинины.

Опыт 3. Изучено влияние нанобиокомпозита из коры лиственницы КЛ на развитие эмбриои-дов эспарцета из листового каллуса в течение 6 недель (рисунок). Наиболее значимым эффектом препарата явилось повышение частоты ризоге-неза почти вдвое, а также увеличение количества растений-регенерантов на 24% и числа корней втрое под действием добавки КЛ в дозе 0,5 мг/л. Удвоенная доза препарата способствовала повышению частоты ризогенеза на 68% по сравнению с безгормональной средой, ускорению роста побегов и развития листьев и корней на 45, 32 и 119% соответственно.

Таким образом, использование в составе питательной среды препарата из коры лиственницы в концентрации 0,5-1 мг/л сокращает сроки культивирования эспарцета in vitro в 1,5-2 раза.

Опыт 4. Проведено сравнительное изучение влияния двух регуляторов роста: синтетического ауксина НУК (а-нафтилуксусная кислота) и препарата МП05 на развитие почек эспарцета в процессе микроклонального размножения (табл. 3). Добавки НУК и МП05 в дозе 1 мг/л увеличили количество развивающихся побегов на 20 и 30% соответственно, способствуя появлению новых адвентивных побегов.

Естественно, средняя высота побегов и количество листьев при этом уменьшились. Кроме того, оба препарата в первый месяц снизили вдвое частоту ризогенеза по сравнению с безгормональной средой. Очевидно, в биологической системе почек эспарцета in vitro нанобиокомпо-зит МП05 в изученной дозе проявил активность ауксинового типа и пригоден для замены НУК. Анализ результатов эксперимента также показал, что второй месяц культивирования незначительно увеличивает показатели морфогенеза, поэтому целесообразно 1 -месячные безкорневые побеги эспарцета со среды с добавкой МП05 пассировать на безгормональную среду для укоренения.

Опыт 5. Изучение влияния аминогумата АГ12 проводили посредством добавления препарата

Влияние нанобиокомпозита КЛ на развитие эмбриоидов эспарцета из листового каллуса

Т а б л и ц а 3

Влияние ауксина НУК и нанобиокомпозита МП05 на развитие побегов из почек эспарцета in vitro

Показатели морфогенеза 1/2В5 без гормонов (контроль) 1/2В5 +НУК 1 мг/л 1/2В5 + МП05 1 мг/л

Период инкубации, сут 25 60 25 60 25 60

Число побегов на эксплант 1,0 1,1 1,2* 1,3* 1,3* 1,4*

Высота побега, см 3,8 5,6 3,0* 3,9* 3,2* 3,8*

Число листьев на побег 2,4 3,8 1,6* 3,1* 1,4* 3,0*

Частота ризогенеза, % 40 67 21* 61 21* 31*

Число корней на эксплант 1,6 3,6 1,8 4,1 4,0* 4,1

Длина корня, см 1,9 2,4 4,0* 6,0* 1,5 3,7*

*Разница средних арифметических с контролем достоверна на 5%-м уровне значимости.

перед автоклавированием в питательную среду 1/2В5 в концентрации 1 мг/л. В качестве эксплан-тов использовали почки асептических растений эспарцета в фазе розетки. Результаты представлены в табл. 4.

Препарат достоверно стимулировал индукцию ризогенеза, увеличив его частоту на 15% и обеспечив за 1,5-2 месяца полное укоренение побегов. Кроме того, под действием аминогумата достоверно повысилась на 10% облиственность растений и на 9% их высота.

Таким образом, применение АГ12 в дозе 1 мг/л позволяет ускорить процесс микроклонального размножения эспарцета и увеличить его эффективность.

Учитывая особенности регуляторной активности препаратов АГ12 и МП05 (табл. 3), для повышения эффективности микроклонального раз-

Т а б л и ц а 4

Влияние нанобиокомпозита АГ12 на развитие побегов из почек эспарцета in vitro

Показатели морфогенеза 1/2В5 без добавок (контроль) 1/2В5 + АГ12 1 мг/л

Период инкубации, сут 27 58 27 58

Число побегов на эксплант 1,0 1,1 1,0 1,1

Высота побега, мм 58 60 53 65

Число листьев на побег 4,5 7,3 4,4 8,1*

Частота ризогенеза, % 45 85 55* 100*

Число корней на эксплант 3,3 3,5 3,0 3,3

Длина корня, мм 27 21 17* 22

*Разница средних арифметических с контролем достоверна на 5%-м уровне значимости.

множения эспарцета можно рекомендовать следующий протокол:

1) 1-месячная инкубация эксплантов почек на среде 1/2В5 с добавкой МП05 в дозе 1 мг/л;

2) пассирование неукоренённых побегов на среду 1/2В5 с добавкой АГ12 в дозе 1 мг/л.

Выводы

1. Эффективность антисептической обработки семян эспарцета с помощью смеси этанола и перекиси водорода достигает 97%, лабораторная всхожесть асептических семян - 72%.

2. Новые стимуляторы роста из растительного сырья, введённые в состав питательных сред для рекуррентной регенерации и микро-клонального размножения эспарцета в концентрации 0,5-1 мг/л, влияют на морфогенез и позволяют заменять дорогостоящие синтетические цитокинины и ауксины, сократить сроки культивирования in vitro в 1,5-2 раза, увеличить выход побегов и частоту ризогенеза на 15-90%.

3. Для повышения эффективности микрокло-нального размножения эспарцета рекомендуется следующий протокол: 1 -месячная инкубация эксплантов почек на среде 1/2В5 с добавкой МП05 в дозе 1 мг/л с последующим пассирова-

нием неукоренённых побегов на среду 1/2В5 с добавкой АГ12 в дозе 1 мг/л.

Литература

1. Черепанов С.К. Сосудистые растения СССР. -Л.: Наука, 1981.- 510 с.

2. Рожанская О.А. Создание исходного материала для селекции кормовых культур в условиях Сибири с помощью методов биотехнологии: Автореф. дис. ... д.б.н. - СПб., 2007. - 33 с.

3. Рожанская О.А., Дарханова В.Г., Строева Н. С. Автоселекция in vitro эспарцета песчаного на адаптивность // Сиб. вест. с-х. науки. - 2011. - №3-4. -С. 131-134.

4. Рожанская О.А., Дарханова В.Г., Строева Н. С. и др. Особенности регуляции морфогенеза эспарцета и люцерны in vitro // Сиб. вест. с-х. науки. - 2008. -№5. - С. 58-65.

5. Gamborg O.L. Nutrient requirement of suspension cultures of soybean root cell / O.L. Gamborg, R.A. Miller, K. Ojima // Exp.Cell Res. - 1968. - V. 50. - P. 151-158.

6. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. plant. - 1962. - V. 15. - P. 473-497.

7. Рожанская ОА., Инишева Л.И., Ларина Г.В. Характеристика биологической активности препаратов гумино-вых кислот торфов в культуре тканей растений // Сиб. вест. с-х науки. - 2013. - №3. - С. 20-27.

8. Korolev K.G., Lomovskij O.I., Rozhanskaya O.A., Vasil'ev V.G. Mechanochemical preparation of water-soluble forms of triterpene acids // Chem. Natural compounds. - 2003. - 39:4. - P. 366-372.

9. Патент РФ № 2267927. Биостимулятор роста растений / К.Г. Королев, О.И. Ломовский, О.А. Рожанская. - Опубл. в Б.И. - 2006. - № 2.

10. Дарханова В.Г., Строева Н.С., Королев К.Г. и др. Применение нанобиокомпозитов для стимуляции роста растений in vitro / Материалы II Международного форума по нанотехнологиям (Москва, 6-8 октября 2009 г.) http://iusnanotech09.iusnanoforum.ni/cgi-bin/ show.pl?option=&id=&lang=ru.

11. Сорокин О. Д. Прикладная статистика на компьютере. - Краснообск: ГУП РПО СО РАСХН, 2004. - 162 с.

Поступила в редакцию 25.03.2015