Полиморфные варианты гена интерферона-лямбда 3 и особенности иммунного ответа у детей с хроническим вирусным гепатитом с

Полиморфные варианты гена интерферона-лямбда 3 и особенности иммунного ответа у детей с хроническим вирусным гепатитом С

Т.Б. Сенцовa1'2, И.А. Матинян1, И.В. Ворожко1, Л.И. Ильенко2, Т.В. Строкова1,2, О.О. Черняк1

1ФГБУН «Федеральный исследовательский центр питания и биотехнологии», Москва; 2ФГБОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Россия

Polymorphic variants of the gene of interferon lambda 3 and features of immune response in children with chronic viral hepatitis C

T.B. Sentsova1,2, I.A. Matinyan1, I.V. Vorozhko1, L.I. Ilyenko2, T.V. Strokova1,2, O.O. Chernyak1

1Federal Research Centre of Nutrition and Biotechnology, Moscow 2Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow

С целью изучения иммунных проявлений полиморфизма гена интерферона-лямбда 3 (IFN-X3) при хроническом вирусном гепатите С обследованы 110 больных детей русской национальности (54 девочки и 56 мальчиков) в возрасте от 3 до17 лет. Все дети с хроническим вирусным гепатитом С находились на комбинированной терапии (пегелированный интерферон + риба-вирин). Установлено, что среди изученных полиморфных вариантов гена IFN-X3 у детей с хроническим вирусным гепатитом С аллель Т маркера rs12979860 ассоциирован с инфицированием и хронизацией инфекции. Генотип T/T rs12979860 гена IFN-X3 является неблагоприятным для течения хронического вирусного гепатита С за счет низкого уровня активированных Т-лимфоцитов, интактности провоспалительных цитокинов TNF-a, IL-6, IL-1a, и интерферон-у индуцибельного белка IP-10. Выявленная взаимосвязь полиморфных вариантов С/C+CT локуса rs12979860 гена INF-X3 с экспрессией активированных Т-лимфоцитов свидетельствует о протективном характере этих генотипов в отношении развития хронического вирусного гепатита С у детей.

Ключевые слова: дети, интерферон-l 3, генный полиморфизм, генотип, rs12979860, rs8099917, иммунитет.

Для цитирования: Сенцова Т.Б., Матинян И.А., Ворожко И.В., Ильенко Л.И., Строкова Т.В., Черняк О.О. Полиморфные варианты гена интерферона-лямбда 3 и особенности иммунного ответа у детей с хроническим вирусным гепатитом С. Рос вестн перинатол и педиатр 2017; 62:(4): 32-36. DOI: 10.21508/1027-4065-2017-62-4-32-36

To study the immune manifestations of the interferon-lambda 3 genepolymorphism in chronic viral hepatitis C, 110 Russian children (54 girls and 56 boys) with chronic HCV infection aged from 3 to 17 years were examined. All children were on combined therapy (pegylated interferon + ribavirin). It was found that among the studied polymorphic variants of the IFN-X 3 gene in children with chronic HCV infection, T allele of the marker rs12979860 is associated with infection and chronization of HCV. The T/T rs12979860 genotype of the IFN-X3 gene is unfavorable for the course of chronic HCV infection due to low levels of activated T-lymphocytes, intactness of the proinflammatory cytokines TNF-a, IL-6, IL-1a, and interferon-y inducible protein IP-10. The revealed relation of the polymorphic variants of C/C + C/T locus rs12979860 of INF-X3 gene with the expression of activated T-lymphocytes discloses the protective nature of these genotypes to the development of chronic HCV infection in children.

Key words: children, interferon-l 3, gene polymorphism, genotype, rs12979860, rs8099917, immunity.

For citation: Sentsova T.B., Matinyan I.A., Vorozhko I.V., Ilyenko L.I., Strokova T.V., Chernyak O.O. Features of immune response in children with chronic viral hepatitis C. Ros Vestn Perinatol i Pediatr 2017; 62:(4): 32-36 (in Russ). DOI: 10.21508/1027-4065-2017-62-4-32-36

"У"линическая реализация принципов персонализи-_1\.рованной медицины предусматривает использование генетических исследований для прогноза развития и течения заболевания, а также эффективности проводимой фармакотерапии [1]. Новые возможности в лечении хронического вирусного гепатита С появились в связи с открытием ассоциативной связи

© Коллектив авторов, 2017

Адрес для корреспонденции: Сенцова Татьяна Борисовна — д.м.н., проф., зав. лабораторией клинической биохимии, иммунологии и аллергологии клиники Федерального исследовательского центра питания и биотехнологии, проф. кафедры госпитальной педиатрии № 2 педиатрического факультета РНИМУ имени Н.И. Пирогова. ORCID 0000-0002-3991-4702 Матинян Ирина Александровна — аспирант отделения педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и диетологии клиники Федерального исследовательского центра питания и биотехнологии. ОКСГО 0000-0002-7049-446Х Ворожко Илья Викторович — к.м.н., ст. научн. сотр. лаборатории клинической биохимии, иммунологии и аллергологии клиники Федерального исследовательского центра питания и биотехнологии. ОКСГО 0000-0003-2529-9152

полиморфизма локуса ДНК гена ^28В, который по сути является представителем интерферона-лямбда 3 (№N-^3) и ответом на лечение интерфероном-а в комбинации с рибавирином [2, 3]. Многочисленными исследованиями, проведенными у взрослых, показано, что пациенты с 1-м генотипом вируса гепатита С, гомозиготные по С-аллелю ге 12979860 гена

Строкова Татьяна Викторовна — д.м.н., проф., зав. отделением педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и диетологии клиники Федерального исследовательского центра питания и биотехнологии, зав.кафедрой гастроэнтерологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова. ОКСГО 0000-0002-0762-0873 Черняк Ольга Олеговна — к.б.н., научн. сотр. лаборатории клинической биохимии, иммунологии и аллергологии клиники Федерального исследовательского центра питания и биотехнологии. ОКСГО 0000-0001-5914-930Х 115446 Москва, Каширское шоссе, д. 21

Ильенко Лидия Ивановна — д.м.н., проф., зав. кафедрой госпитальной педиатрии №2 педиатрического факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова 117997 Москва, ул. Островитянова, д. 1

Сенцова Т.Б. и соавт. Полиморфные варианты гена интерферона-лямбда 3 и особенности иммунного ответа у детей с хроническим вирусным.

№N-^3, имеют больше шансов достичь устойчивого вирусологического ответа в сравнении с пациентами, имеющими Т-аллель [4].

В настоящее время общепризнано, что прогрес-сирование хронического вирусного гепатита С и эффективность противовирусной терапии могут быть обусловлены соотношением структурных особенностей генома вируса гепатита С, определяющих репли-кативную активность вируса, и адекватным функционированием иммунных механизмов [5, 6]. Поскольку иммунный ответ на инфекционный агент генетически детерминирован, то становится очевидным интерес исследователей к поиску так называемых «генов-кандидатов» [7]. Обнадеживающие результаты были получены Е. Са1ато и соавт. (2017), которые идентифицировали аллельные варианты генов HLA системы при элиминации вируса гепатита С [7]. В последующих работах исследовался уровень экспрессии генов интерферона-у (№N-7), интерлейкина-1 (^-1), фактора некроза опухоли-а (TNF-а), интер-лейкина-10 (^-10) и была определена их роль как предикторов персистенции или элиминации вируса гепатита С [9].

Благодаря достижениям экспериментальной и клинической иммунологии в последние годы в значительной степени изучены механизмы противовирусной защиты, в том числе системы интерферонов [10]. Доказано, что №N-^3 обладает способностью подавлять репликацию вируса гепатита С независимо от интерферонов I и II типов [11]. Кроме того, №N-^3 принимает участие в иммунорегуляции [12]. Вместе с тем до настоящего времени данные о частоте встречаемости полиморфных вариантов гена №N-^3 при развитии хронического вирусного гепатита С у детей носят противоречивый характер. Остается открытым вопрос об иммунных аспектах реализации регулятор-ных функций различных генотипов №N-^3 у детей с хроническим вирусным гепатитом С.

Цель работы: изучение иммунных проявлений полиморфных вариантов гена №N-^3 для прогноза развития и течения вирусного гепатита С у детей.

Характеристика детей и методы исследования

Обследованы 110 детей русской национальности (54 девочки и 56 мальчиков) в возрасте от 3 до17 лет с хроническим вирусным гепатитом С. Распределение детей по генотипам вируса гепатита С [13] представлено в табл. 1: 1-й генотип выявлялся у 65 (59%) детей, 2-й генотип — у 7 (6%), 3-й генотип — у 38 (35%).

Исходно синдром цитолиза был выявлен у 47 (50%) пациентов: медиана аланинаминотрансамина-зы составила 43,6 [27—64,2] Ед/л, отмечалось повышение уровня маркеров холестаза. Все дети находились на комбинированной противовирусной терапии (пегилированный интерферон 60 мкг/м2 1 раз в не-делю+рибавирин 15 мг/кг в сутки ежедневно). Курс лечения при 1-м генотипе вируса гепатита С составлял 48 нед, при 2-м и 3-м генотипах — 24 недели. Всем детям с хроническим вирусным гепатитом С до старта терапии и на ее фоне (4, 8, 12, 16, 24 и 48-я недели лечения) проводились антропометрические, биохимические, молекулярно-генетические и другие параклинические исследования. Контрольную группу составили 25 здоровых детей того же возраста русской национальности, обследование которых проводилось при диспансерном наблюдении в условиях поликлиники.

Для выделения ДНК использовали набор «Проба-Рапид-Генетика» фирмы «ДНК-Технология» (Россия). Анализ маркеров генетических полиморфизмов rs12979860 С>Т и rs8099917 T>G гена IFN-X3 проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при использовании детектирующего амплификатора ДТ-96 и наборами для ДНК-диагностики фирмы «ДНК-Технология» (Россия). Содержание растворимой фракции активированных Т-хелперов (sCD134), провоспалительных цитокинов TNF-a, IL-1a, IL-6 и интерферон-у ин-дуцибельного белка (IP-10) определяли методом им-муноферментного анализа с использованием наборов фирмы «BCM Diagnostics», «Bender Medsystems» (США) на спектрофотометре «Tecan» (Австрия).

Таблица 1. Клиническая характеристика детей с хроническим вирусным гепатитом С

Показатель 1-й генотип HCV, и=65

Возраст, годы 10,6[6,4;15] 10,5 [7,5;14,9]

Длительность инфицирования, годы 9,2 [5,6;12,95] 8,0 [5,9;11,7]

АЛТ, Ед/л 45 [29;63] 38 [24,5;68]

АСТ, Ед/л 43,9 [33,5;62] 33,7 [27,2;55]

ГГТ, Ед/л 27 [17,4;28,9] 18,7 [16,2;23,3]

Щелочная фосфатаза, Ед/л 192 [140;245] 204 [164;255]

Степень фиброза (МЕТАУШ) F0 F0

Примечание. АЛТ — аланинаминотрансаминаза; АСТ — аспартатаминотрансаминаза; ГГТ — гамма-глутамилтранспептидаза; HCV — вирус гепатита С.

Статистическая обработка данных выполнена с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ «Statistica for Windows» v.6.0, Stat SoftInc (США). Различия в частотах аллелей и генотипов выявляли с помощью метода х2 с поправкой Yates. Оценка доверительных интервалов (CI) для расчетных значений отношения шансов проводилась методом максимального правдоподобия по Wald. Различия в концентрации sCD134, TNF-a, IL-1a, IL-6, IP-10 при различных вариантах гена INF-X3 оценивали, используя непарный йест Aspin— Welch, данные выражали как среднее (М) и ошибку среднего (m).

Исследование явилось открытым, проспективным, было одобрено локальным комитетом по этике ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» и соответствует принципам, изложенным в декларации Хельсинкского соглашения. Информированное согласие было получено от всех родителей детей либо от их опекунов.

Результаты и обсуждение

При изучении частоты встречаемости полиморфных маркеров rs12979860 и rs8099917 гена IFN-X3 у детей с хроническим вирусным гепатитом С и в контрольной группе (здоровые дети) были получены результаты, представленные в табл. 2.

У детей с хроническим вирусным гепатитом С выявлялась достоверно повышенная частота встречаемости аллеля Т сайта rs12979860 гена INF-X3 (OR=2,69, p=0,008) как в гомозиготном Т/Т, так и в гетерозиготном Т/C состоянии, что дает основание рассматривать его в качестве прогностического маркера, ассоциированного с риском развития хро-

нического вирусного гепатита С. Напротив, у здоровых детей чаще обнаруживалось носительство аллеля С (OR=0,37, p=0,008) и генотипа C/C, нежели у детей с хроническим вирусным гепатитом С. Можно предположить, что носительство этого аллеля является протективным в отношении инфицирования вирусом гепатита С. При анализе частоты встречаемости полиморфных маркеров в локусе rs8099917 у детей с хроническим вирусным гепатитом и в контрольной группе не выявлено различий в отношении как аллелей, так и гомо- и гетерозиготных генотипов.

Принципиально важным следует считать поиск иммунологических маркеров, характеризующих экспрессию гена INF-X3 у детей с хроническим вирусным гепатитом С. Попытки секвенирования данного гена c определением аминокислоты, подлежащей замене, не выявили связи с результатами противовирусной терапии, однако был сделан вывод о том, что мутации в основном связаны с регуляцией транскрипции, влияющей на функциональную активность генома [14]. Учитывая это обстоятельство, мы изучали концентрацию провоспалительных цитокинов TNF-a, IL-1a, IL-6, sCD134, IP-10 у детей с хроническим вирусным гепатитом С. Как показало проведенное исследование, у детей с гомозиготным генотипом Т/Т rs12979860 гена IFN-X3 отмечалось статистически достоверное (p<0,0001) снижение содержания sCD134 по сравнению с пациентами, имеющими С/С и С/Т генотип (табл. 3).

Изменений в концентрации провоспалительных цитокинов и IP-10 в исследуемых группах не выявлено (р>0,05). У детей с хроническим вирусным гепатитом С при полиморфных вариантах G/G и T/G rs 8099917 гена INF-X3 развитие заболевания проис-

Таблица 2. Распределение частот аллелей и генотипов гена IFN-I3 у детей с хроническим вирусным гепатитом С (ХВГС) и в контрольной группе

Table 2. Frequency distribution of alleles and genotypes of the IFN-I3 gene in children with chronic HCV and in the control group

Аллели, генотипы Частоты аллелей и генотипов дети с ХВГС контрольная группа (n=110) (n=25) OR [95% CI] Р

Полиморфный маркер IFN-X3 С>Т [rs12979860]

Аллель С 0,464 0,700 0,37 (0,18-0,78) 0,008

Аллель Т 0,536 0,300 2,69(1,28-5,65) 0,008

Генотип С/С 0,119 0,480 0,15(0,04-0,50) 0,004

Генотип С/Т 0,667 0,440 2,55(0,92-7,04) 0,004

Генотип Т/Т 0,214 0,080 3,14(0,62-15,88) 0,004

Полиморфный маркер IFN-X3 T>G [rs8099917]

Аллель Т 0,702 0,800 0,59 (0,26-1,36) 0,21

Аллель G 0,298 0,200 1,69 (0,73-3,91) 0,21

Генотип Т/Т 0,452 0,640 0,46(0,17-1,29) 0,32

Генотип Т/G 0,500 0,320 2,13(0,75-5,98) 0,32

Генотип G/G 0,048 0,040 1,20(0,10-3,95) 0,32

Сенцова Т.Б. и соавт. Полиморфные варианты гена интерферона-лямбда 3 и особенности иммунного ответа у детей с хроническим вирусным

Таблица 3. Содержание TNF-a, IL-1a, IL-6, sCD134 и IP-10 (в пг/мл) у детей с хроническим вирусным гепатитом С при различных полиморфных вариантах гена INF-I3

Table 3. TNF-a, IL-1a, IL-6, sCD134 and IP-10 levels in children with CVHC and various polymorphic variants of the INF-X3 gene

Группа sCD134 TNF-a IL-1a IL-6 IP-10

Полиморфный маркер INF-X3 С>Т [rs12979860]

1. С/С+С/Т 416,8 ± 192,7 0,7033 ± 0,086 0,3527 ± 0,0063 0,4954 ± 0,0073 199,5 ± 21,2

2. Т/Т 95,67 ± 54,46 0,8135 ± 0,222 0,3438 ± 0,0077 0,5124 ± 0,018 240,9 ± 43,12

Pl-2 < 0,0001 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05

Полиморфный маркер INF-X3 T>G [rs8099917]

1. Т/Т 638 ± 349 0,7039 ± 0,085 0,3548 ± 0,0085 0,5112 ± 0,009 254,2 ± 31,36

2. G/G+^G 168 ± 114 0,722 ± 0,116 0,3481 ± 0,0066 0,4923 ± 0,0094 182,3 ± 22,54

P1-2 < 0,0007 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05

ходило при более низких уровнях (^<0,0007) sCD134, нежели в группе детей с Т/Т генотипом. Изменения в содержании цитокинов и IP-10 отсутствовали у пациентов с полиморфным вариантом Т/Т и G/G +TG rs1299860, а также у детей с полиморфизмом сайта rs8099917.

На основании полученных данных можно предположить, что носители генотипа Т/Т rs1299860 гена INF-y3 в случае заболевания вирусным гепатитом С будут иметь прогрессирующее течение за счет низкого уровня активированных Т-клеток. Факт сниженных концентраций sCD134 у детей с генотипами G/G+T/G rs8099917 гена IFN-X3 предусматривает проведение дополнительных исследований ввиду отсутствия разницы распределения этого генотипа у здоровых и больных детей.

Таким образом, оценка ассоциаций исследуемых полиморфизмов гена INF-X3 с иммунными показателями позволила выявить интактность некоторых маркеров клеточного звена, что, по-видимому, отражает низкую противовирусную активность сформировавшегося воспаления и может рассматриваться как один из факторов негативной реализации аллеля Т/Т rs12979860 у детей с хроническим вирусным гепатитом С. Напротив, повышенные значения концен-

трации sCD134 у детей с вариантами С/С+С/T локуса rs12979860 гена INF-X 3 указывают на определенное протективное влияние этих полиморфизмов в условиях хронического течения вирусного гепатита С и характеризует значительный адаптационный эффект клеточного иммунитета, несмотря на отсутствие значимых различий в синтезе провоспалительных цитокинов и IP-10.

Выводы

1. Среди изученных полиморфных вариантов гена INF-X3 у детей с хроническим вирусным гепатитом С аллель Т rs12979860 ассоциирован с инфицированием и хронизацией инфекции.

2. Генотип T/T гена IFN-X3 rs12979860 является неблагоприятным для течения хронического вирусного гепатита С за счет низкого уровня активированных Т-лимфоцитов, интактности провоспалительных цитокинов TNF-a, IL-6, IL-1a и IP-10.

3. Выявленная взаимосвязь полиморфных вариантов C/C+CT rs12979860 гена IFN-X3 с экспрессией активированных Т-лимфоцитов свидетельствует о протективном характере этого локуса в отношении развития хронического вирусного гепатита С у детей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Дедов И.И., Тюльпаков А.Н., Чехонин В.П., Баклау-шев В.П., Арчаков А.И., Мошковский С.А. Персонализированная медицина: современное состояние и перспективы. Вестн РАМН 2012; 67 (12): 4-12. [Dedov I.I., Tyul'pakov A.N., Chekhonin V.P., Baklaushev V.P., Ar-chakov A.I., Moshkovskii S.A. Personalized Medicine: State-Of-The-Art And Prospects. Annals of the Russian academy of medical sciences 2012; 67(12):4-12. (In Russ)] DOI:10.15690/vramn.v67i12.474

2. Daneshvar M., Nikbin M., Talebi S., Javadi F., Aghasade-ghi M.R., Mahmazi S., Sadat S.M. Role of IL28-B Polymorphism (rs12979860) on Sustained Virological Response to Pegylated Interferon/Ribavirin in Iranian Patients With Chronic Hepatitis C. Iranian Red Crescent Med J 2016; 18 (9): e28566. http://doi.org/10.5812/ircmj.28566

3. Ивашкин В.Т. Иммунная система и повреждения печени при хронических гепатитах В и С. Рос журн гастроэнте-рол гепатол колопроктол 2009; 19 (6): 4—10. [Ivashkin V.T. Immune system and liver damage in chronic hepatitis B and C. Russ J Gastroenterol Hepatol Coloproctol 2009; 19 (6): 4-10 (in Russ)]

4. Fateh A., Aghasadeghi M., Siadat S.D., Vaziri F., Sadeghi F., Fateh R, Keyvani H. et al. Comparison of Three Different Methods for Detection of IL28 rs12979860 Polymorphisms as a Predictor of Treatment Outcome in Patients with Hepatitis C Virus. Osong Public Health Res Perspect 2016; 7 (2): 83-89. DOI: 10.1016/j.phrp.2015.11.004

5. Pfeffer L.M., Li K., Fleckenstein J.F., Marion T.N., Dia-ment J., Yang C.H. An Interferon Response Gene Signature Is Associated with the Therapeutic Response of Hepatitis C

Patients. PLoS ONE 2014; 9 (8): e104202. D01:10.1371/ journal.pone.0104202

6. Кистенева Л.Б., Сускова В.С., Московская И.А., Холод-няк Т.Е. Особенности клеточного иммунитета новорожденных, родившихся у матерей с гепатитом С. Рос вестн перинатол и педиатр 2009; 54 (5): 74—81. [Kisteneva L.B., Suskova V.S., Moskovskaya I.A., Kholodnyak G.E. The specific features of cell immunity in neonatal infants born to mothers with hepatitis C. Ros vestn perinatol pediatr 2009; 54 (5): 74-81. (in Russ)]

7. Heim M.H., Bochud P. Y, George J. Host - hepatitis C viral interactions: The role of genetics. J Hepatol 2016; 65 (1 Suppl): S22-32. DOI: 10.1016/j.jhep.2016.07.037

8. Waldron P.R., Belitskaya-Levy I., Chary A., Won J., Winters M., Monto A., Ryan J., Lazzeroni L.C., Holodniy M. Genetic Variation in the IL-6 and HLA-DQB1 Genes Is Associated with Spontaneous Clearance of Hepatitis C Virus Infection. J Immunol Res 2016; 2016: 6530436. DOI: 10.1155/2016/6530436.

9. Fritsch S.D., Weichhart T. Effects of Interferons and Viruses

Поступила 31.03.17

Конфликт интересов:

Авторы данной статьи подтвердили отсутствие

конфликта интересов, финансовой или какой-либо

другой поддержки, о которых необходимо сообщить.

on Metabolism. Front Immunol 2016; 7: 630. DOI: 10.3389/ fimmu.2016.00630.

10. Bruening J., Weigel B., Gerold G. The Role of Type III Interferons in Hepatitis C Virus Infection and Therapy. J Immunol Res 2017; 2017: 7232361. DOI: 10.1155/2017/7232361

11. Boisvert M., Shoukry N.H. Type III Interferons in Hepatitis C Virus Infection. Front Immunol 2016; 7: 628. DOI: 10.3389/ fimmu.2016.00628

12. Egli A., Santer D.M, O'Shea D, Tyrrell D.L., Houghton M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerg Microbes Infect 2014; 3 (7): e51. D0I:10.1038/emi.2014.51

13. Walker A., Bergmann M., Camdereli J., Kaiser R, Lubke N., Timm J. A genotype independent, full-genome reverse-transcription protocol for HCV genotyping and resistance testing. J Clin Virol 2017; 91: 42-48. DOI: 10.1016/j.jcv.2017.04.008

14. O'Brien T.R., Prokunina-Olsson L., Donnelly R.P. IFN-X4: the paradoxical new member of the interferon lambda family. J Interferon Cytokine Res 2014; 34 (11): 829-838. DOI: 10.1089/jir.2013.0136

Received on 2017.03.31

Conflict of interest: The authors of this article confirmed the absence conflict of interests, financial or any other support which should be reported.