ТЕРАПИЯ МЕТАСТАТИЧЕСКОГО УРОТЕЛИАЛЬНОГО РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНЪЮГАТА АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО САЦИТУЗУМАБА ГОВИТЕКАНА (IMMU-132)
THERAPY OF METASTATIC UROTHELIAL CANCER USING ANTIBODY-DRUG CONJUGATE SATSITUZUMAB GOVITECAN (IMMU-132)

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[01] Данная заявка является частичным продолжением патентной заявки США № 15/069208, поданной 14.03.2016 (3/14/16), которая была частичным продолжением патентной заявки США № 14/667982 (в данное время - выданный патент США № 9493573), поданной 25.03.2015, которая была выделена из заявки США № 13/948732 (в данное время - патент США № 9028833), выданной 23.07.2013, претендующей, в соответствии с парграфом 119(е) раздела 35 Кодекса законов США, на приоритет временных патентных заявок США 61/736684, поданной 13.12.2012, и 61/749548, поданной 07.01.2013. Заявка 15/069208 претендует на приоритет, в соответствии с парграфом 119(е) раздела 35 Кодекса законов США, временных патентных заявок США 62/133654, поданной 16.03.2015, 62/133729, поданной 16.03.2015, 62/138092, поданной 25.03.2015, 62/156608, поданной 04.05.2015, и 62/241881, поданной 15.10.2015. Данная заявка претендует, в соответствии с парграфом 119(е) раздела 35 Кодекса законов США, на приоритет временной патентной заявки США 62/428655, поданной 01.12.2016. Текст каждой из приоритетных заявок включен в данный документ в полном объеме посредством ссылок.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[02] Данная заявка содержит Перечень последовательностей, который был подан в формате ASCII через систему EFS-Web и настоящим включен посредством ссылки в полном его объеме. Указанный документ в формате ASCII, созданный 13 ноября 2017 г., назван IMM356WO2_SL.txt и имеет размер 7835 байт.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[03] Данное изобретение относится к терапевтическому применению иммуноконъюгатов антител или антигенсвязывающих фрагментов антител и камптотецинов, таких как SN-38, с улучшенной способностью к нацеливанию на различные раковые клетки у людей. В предпочтительных вариантах реализации, антитела и терапевтические фрагменты связаны внутриклеточно расщепляемой связью, что повышает терапевтическую эффективность. В более предпочтительных вариантах реализации, иммуноконъюгаты вводят в конкретных дозировках и/или с конкретными графиками введения, которые оптимизируют терапевтический эффект. Оптимизированные дозировки и графики введения конъюгированных с SN-38 антител при терапевтическом применении для людей, как раскрыто в данном документе, продемонстрировали неожиданно улучшенную эффективность, которую нельзя было спрогнозировать на основании исследований на животных моделях, позволяющую эффективно лечить виды рака, резистентные к стандартным противораковым терапиям, включая иринотекан (CPT-11), родоначальное соединение для SN-38. Более предпочтительно, способы и композиции относятся к использованию для лечения Trop2-положительного рака, в частности, уротелиального рака, с использованием иммуноконъюгата анти-Trop-2 hRS7-SN-38. В конкретных вариантах реализации, иммуноконъюгат может быть введен человеку с Trop2-положительным раком в дозе от 3 до 18 мг/кг, более предпочтительно, от 4 до 12 мг/кг, более предпочтительно, от 8 до 10 мг/кг. В других предпочтительных вариантах реализации, способы и композиции могут быть использованы для лечения Trop2-положительного рака, который рецидивирует или является рефрактерным к другим стандартным противораковым терапиям, таким как химиотерапевтические препараты. Неожиданно, конъюгаты антитело-препарат (КАП) с анти-Trop-2-SN38 оказались эффективными для лечения Trop2-положительных раков у пациентов, рецидивирующих или демонстрирующих резистентность к терапии стандартными противораковыми агентами, включая иринотекан. В других предпочтительных вариантах реализации, КАП с анти-Trop-2-SN-38, таким как IMMU-132, может быть введен в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими агентами, которые могут проявлять синергический эффект с КАП, такими как ингибиторы микротрубочек, ингибиторы PARP (поли(АДФ-рибоза)полимераза), ингибиторы киназы Брутона или ингибиторы PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназа).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[04] На протяжении многих лет целью ученых в области специфической лекарственной терапии было использование моноклональных антител (МАТ) для специфической доставки токсических агентов при раке человека. Были разработаны конъюгаты опухолеассоциированных МАТ и пригодных токсических агентов, но продемонстрировали переменный успех в терапии рака у людей. Токсический агент чаще всего представляет собой химиотерапевтическое лекарственное средство, хотя радионуклиды, излучающие частицы, или бактериальные или растительные токсины, также были конъюгированы с МАТ, особенно для терапии рака (Sharkey and Goldenberg, CA Cancer J Clin. 2006 Jul-Aug; 56(4):226-243).
[05] Преимущества использования конъюгатов МАТ-химиотерапевтическое лекарственное средство заключаются в том, что (а) химиотерапевтическое лекарственное средство само по себе является структурно хорошо определенным; (b) химиотерапевтическое лекарственное средство связывается с белком МАТ с использованием очень четко определенной химии конъюгации, часто по специфическим сайтам, удаленным от антигенсвязывающих областей МАТ; (c) можно обеспечить большую воспроизводимость и, как правило, меньшую иммуногенность конъюгатов МАТ-химиотерапевтическое лекарственное средство по сравнению с химическими конъюгатами, включающими МАТ и бактериальные или растительные токсины, и поэтому они более пригодны для коммерческой разработки и одобрения регулирующими органами; и (d) конъюгаты МАТ-химиотерапевтическое лекарственное средство имеют на несколько порядков более низкую системную токсичность, чем конъюгаты радионуклид-МАТ, особенно по отношению к радиационно-чувствительному костному мозгу.
[06] Камптотецин (СРТ) и его производные представляют собой класс сильнодействующих противоопухолевых агентов. Иринотекан (также обозначаемый СРТ-11) и топотекан являются аналогами СРТ, которые были одобрены для лечения рака (Iyer and Ratain, Cancer Chemother.Phamacol.42:S31-S43 (1998)). Камптотецины действуют путем ингибирования фермента топоизомеразы I путем стабилизации комплекса топоизомераза I-ДНК (Liu, et al. in The Camptothecins: Unfolding Their Anticancer Potential, Liehr J.G., Giovanella, B.C. and Verschraegen (eds), NY Acad Sci., NY 922:1-10 (2000)). Камптотецины создают специфические проблемы при получении конъюгатов. Одной из проблем является нерастворимость большинства производных СРТ в водных буферах. Во-вторых, СРТ создают специфические проблемы при структурной модификации для конъюгирования с макромолекулами. Например, сам СРТ содержит только третичную гидроксильную группу в кольце E. Гидроксильная функциональная группа в случае СРТ должна быть связана с линкером, пригодным для последующей конъюгации белка; и в сильнодействующих производных СРТ, таких как SN-38, активный метаболит химиотерапевтического CPT-11 и других C-10-гидроксилсодержащих производных, таких как топотекан и 10-гидрокси-CPT, присутствие фенольного гидроксила в положении С-10 усложняет необходимую дериватизацию С-20-гидроксила. В-третьих, лабильность δ-лактонного фрагмента E-кольца камптотецинов в физиологических условиях приводит к значительному снижению противоопухолевой активности. Поэтому, протокол конъюгации выполняется таким образом, чтобы она проводилась при pH 7 или ниже, во избежание раскрытия лактонного кольца. Однако, для конъюгации бифункционального СРТ, имеющего реакционноспособную по отношению к амину группу, такую как активный сложный эфир, обычно требуется рН 8 или выше. В-четвертых, внутриклеточно расщепляемый фрагмент предпочтительно включен в линкер/спейсер, соединяющий СРТ и антитела или другие связывающие фрагменты.
[07] Существует потребность в более эффективных способах получения и введения конъюгатов антитело-СРТ, таких как конъюгаты антитело-SN-38. Предпочтительно, способы включают оптимизированные схемы дозирования и введения, которые максимизируют эффективность и минимизируют токсичность конъюгатов антитело-СРТ при терапевтическом применении для людей.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[08] В используемом в данном документе значении, сокращение «CPT» может относиться к камптотецину или любому из его производных, такому как SN-38, если прямо не указано иное. Данное изобретение разрешает неудовлетворенную потребность в данной области техники путем предоставления усовершенствованных способов и композиций для приготовления и введения иммуноконъюгатов СРТ-антитело. Предпочтительно, камптотецин представляет собой SN-38. Раскрытые способы и композиции пригодны для использования при лечении различных заболеваний и состояний, которые являются резистентными или менее чувствительными к другим формам терапии, и могут включать заболевания, против которых подходящие антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител для селективного нацеливания могут быть разработаны, или являются доступными или известными. Предпочтительные болезни или состояния, лечение которых может проводиться с помощью иммуноконъюгатов по данному изобретению, включают Trop2-положительные виды рака, такие как метастатический уротелиальный рак.
[09] Предпочтительно, нацеливающий фрагмент представляет собой антитело, фрагмент антитела, биспецифическое или другое поливалентное антитело или другую молекулу или соединение на основе антитела. Антитело может принадлежать к различным изотипам, предпочтительно, человеческим IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, более предпочтительно, содержать последовательности шарнирной и константной области человеческого IgG1. Антитело или его фрагмент может быть химерным антителом человека-мыши, химерным антителом человека-примата, гуманизированным (человеческая каркасная и мышиные гипервариабельные области (CDR)) или полностью человеческим антителом, а также их вариантами, такими как полу-IgG4 антитела (называемые «унителами» (unibodies)), как описано van der Neut Kolfschoten et al. (Science 2007; 317:1554-1557). Более предпочтительно, антитело или его фрагмент могут быть сконструированы или выбраны так, чтобы они содержали последовательности константной области человека, принадлежащие к конкретным аллотипам, что может приводить к снижению иммуногенности при введении иммуноконъюгата человеку. Предпочтительные аллотипы для введения включают аллотипы не-G1m1 (nG1m1), такие как G1m3, G1m3,1, G1m3,2 или G1m3,1,2. Более предпочтительно, аллотип выбирают из группы, состоящей из аллотипов nG1m1, G1m3, nG1m1,2 и Km3.
[010] Пригодные для применения антитела могут связываться с любым ассоциированным с заболеванием антигеном, известным специалистам. В тех случаях, когда болезненное состояние представляет собой рак, например, многие антигены, экспрессируемые или иначе ассоциированные с опухолевыми клетками, известны специалистам, включая, без ограничений, карбоангидразу IX, альфа-фетопротеин (AFP), α-актинин-4, A3, антиген, специфический к антителу A33, ART-4, B7, Ba 733, BAGE, BrE3-антиген, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8/m, CCL19, CCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD70L, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD132, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CTLA-4, CXCR4, CXCR7, CXCL12, HIF-1α, специфический антиген-p рака толстой кишки (CSAp), CEA (CEACAM5), CEACAM6, c-Met, DAM, EGFR, EGFRvIII, Trop-2, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, фактор роста фибробластов (FGF), Flt-1, Flt-3, фолатный рецептор, антиген G250, GAGE, gp100, GRO-β, HLA-DR, HM1.24, хорионический гонадотропин человека (HCG) и его субъединицы, HER2/neu, HMGB-1, фактор, индуцируемый гипоксией (HIF-1), HSP70-2M, HST-2, Ia, IGF-1R, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IFN-λ, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-25, инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), KC4-антиген, KS-1-антиген, KS1-4, Le-Y, LDR/FUT, фактор, подавляющий миграцию макрофагов (MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ESO-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5ac, MUC13, MUC16, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, антиген PAM4, муцин рака поджелудочной железы, рецептор PD-1, плацентарный фактор роста, p53, PLAGL2, простатическую кислую фосфатазу, PSA, PRAME, PSMA, PlGF, ILGF, ILGF-1R, IL-6, IL-25, RS5, RANTES, T101, SAGE, S100, сурвивин, сурвивин-2B, TAC, TAG-72, тенасцин, рецепторы TRAIL, TNF-α, антиген Tn, антигены Томсона-Фриденрайха, антигены некроза опухоли, VEGFR, фибронектин ED-B, WT-1, 17-1A-антиген, факторы комплемента C3, C3a, C3b, C5a, C5, маркер ангиогенеза, bcl-2, bcl-6, Kras, маркер онкогена и продукт онкогена (см., например, Sensi et al., Clin Cancer Res 2006, 12:5023-32; Parmiani et al., J Immunol 2007, 178:1975-79; Novellino et al. Cancer Immunol Immunother 2005, 54:187-207). Предпочтительно, антитело связывается с CEACAM5, CEACAM6, Trop-2, AFP, MUC5ac, CD74, CD19, CD20, CD22 или HLA-DR. Наиболее предпочтительно, антитело связывается с Trop-2.
[011] Типичные примеры противораковых антител, которые могут быть использованы, включают, без ограничений, hR1 (анти-IGF-1R, патент США № 9441043), hPAM4 (анти-MUC-5ac, патент США № 7282567), hA20 (анти-CD20, патент США № 7151164), hA19 (анти-CD19, патент США № 7109304), hIMMU31 (анти-AFP, патент США № 7300655), hLL1 (анти-CD74, патент США № 7312318), hLL2 (анти-CD22, патент США № 5789554), hMu-9 (анти-CSAp, патент США № 7387772), hL243 (анти-HLA-DR, патент США № 7612180), hMN-14 (анти-CEACAM5, патент США № 6676924), hMN-15 (анти-CEACAM6, патент США № 8287865), hRS7 (анти-Trop-2, патент США № 7238785), hMN-3 (анти-CEACAM6, патент США № 7541440), Ab124 и Ab125 (анти-CXCR4, патент США № 7138496), причем разделы Примеров каждого из указанных патентов или заявок включены в данный документ посредством ссылок. Более предпочтительно, антитело представляет собой IMMU-31 (анти-AFP), hRS7 (анти-Trop-2), hMN-14 (анти-CEACAM5), hMN-3 (анти-CEACAM6), hMN-15 (анти-CEACAM6), hLL1 (анти-CD74), hLL2 (анти-CD22), hL243 или IMMU-114 (анти-HLA-DR), hA19 (анти-CD19) или hA20 (анти-CD20). В особенно предпочтительном варианте реализации, антитело представляет собой hRS7 (анти-Trop-2).
[012] Альтернативные используемые антитела включают, без ограничений, абциксимаб (против гликопротеина IIb/IIIa), алемтузумаб (анти-CD52), бевацизумаб (анти-VEGF), цетуксимаб (анти-EGFR), гемтузумаб (анти-CD33), ибритумомаб (анти-CD20), панитумумаб (анти-EGFR), ритуксимаб (анти-CD20), тозитумомаб (анти-CD20), трастузумаб (анти-ErbB2), ламбролизумаб (против рецептора PD-1), ниволумаб (против рецептора PD-1), ипилимумаб (анти-CTLA-4), абаговомаб (анти-CA-125), адекатумумаб (анти-EpCAM), атлизумаб (против рецептора IL-6), бенрализумаб (анти-CD125), обинутузумаб (GA101, анти-CD20), CC49 (анти-TAG-72), AB-PG1-XG1-026 (анти-PSMA, патентная заявка США 11/983372, депонирован как ATCC PTA-4405 и PTA-4406), D2/B (анти-PSMA, WO 2009/130575), тоцилизумаб (против рецептора IL-6), базиликсимаб (анти-CD25), даклизумаб (анти-CD25), эфализумаб (анти-CD11a), GA101 (анти-CD20; Glycart Roche), муромонаб-CD3 (против рецептора CD3), натализумаб (анти-α4 интегрин), омализумаб (анти-IgE); анти-ФНО-α антитела, такие как CDP571 (Ofei et al., 2011, Diabetes 45:881-85), MTNFAI, M2TNFAI, M3TNFAI, M3TNFABI, M302B, M303 (Thermo Scientific, Rockford, IL), инфликсимаб (Centocor, Malvern, PA), цертолизумаб пегол (UCB, Brussels, Belgium), анти-CD40L (UCB, Brussels, Belgium), адалимумаб (Abbott, Abbott Park, IL), бенлиста (Human Genome Sciences); антитела для терапии болезни Альцгеймера, такие как Alz 50 (Ksiezak-Reding et al., 1987, J Biol Chem 263:7943-47), гантенерумаб, соланезумаб и инфликсимаб; антифибриновые антитела, такие как 59D8, T2G1s, MH1; анти-CD38 антитела, такие как MOR03087 (MorphoSys AG), MOR202 (Celgene), HuMax-CD38 (Genmab) или даратумумаб (Johnson & Johnson).
[013] В предпочтительном варианте реализации, химиотерапевтический фрагмент выбирают из камптотецина (CPT) и его аналогов и производных и, более предпочтительно, он представляет собой SN-38. Однако, другие химиотерапевтические компоненты, которые могут быть использованы, включают таксаны (например, баккатин III, таксол), эпотилоны, антрациклины (например, доксорубицин (DOX), эпирубицин, морфолинодоксорубицин (морфолино-DOX), цианоморфолинодоксорубицин (цианоморфолино-DOX), 2-пирролинодоксорубицин (2-PDOX) или пролекарственная форма 2-PDOX (про-2-PDOX); см., например, Priebe W (ed.), ACS symposium series 574, published by American Chemical Society, Washington D.C., 1995 (332pp), и Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2464-2469, 1996), бензохиноидные ансамицины, примером которых является гелданамицин (DeBoer et al., Journal of Antibiotics 23:442-447, 1970; Neckers et al., Invest. New Drugs 17:361-373, 1999), и т.п. Предпочтительно, антитело или его фрагмент связывается с по меньшей мере одним химиотерапевтическим фрагментом; предпочтительно, от 1 до примерно 5 химиотерапевтическими фрагментами; более предпочтительно, 6 или больше химиотерапевтическими фрагментами, более предпочтительно, от примерно 6 до примерно 12 химиотерапевтическими фрагментами.
[014] Примером водорастворимого производного CPT является CPT-11. Доступно большое количество клинических данных относительно фармакологии CPT-11 и его in vivo превращения в активный SN-38 (Iyer and Ratain, Cancer Chemother Pharmacol. 42:S31-43 (1998); Mathijssen et al., Clin Cancer Res. 7:2182-2194 (2002); Rivory, Ann NY Acad Sci. 922:205-215, 2000)). Активная форма SN-38 является на примерно 2-3 порядка величины более сильнодействующей, чем CPT-11. В конкретных предпочтительных вариантах реализации, иммуноконъюгат может представлять собой конъюгат hMN-14-SN-38, hMN-3-SN-38, hMN-15-SN-38, IMMU-31-SN-38, hRS7-SN-38, hA20-SN-38, hL243-SN-38, hLL1-SN-38 или hLL2-SN-38.
[015] Различные варианты осуществления могут касаться использования способов и композиций по данному изобретению для лечения рака, включая, без ограничений, неходжкинские лимфомы, В-клеточные острые и хронические лимфолейкозы, лимфому Беркитта, лимфому Ходжкина, острую крупноклеточную В-клеточную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфолейкоз, хронический лимфолейкоз, Т-клеточные лимфомы и лейкозы, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, карциномы, меланомы, саркомы, глиомы, виды рака костей и кожи. Карциномы могут включать карциномы полости рта, пищевода, желудочно-кишечного тракта, легочного тракта, легкого, желудка, толстой кишки, молочной железы, яичника, простаты, матки, эндометрия, шейки матки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, кости, мозга, соединительной ткани, печени, желчного пузыря, мочевого пузыря, почки, кожи, центральной нервной системы и яичек. Предпочтительно, рак представляет собой уротелиальный рак, более предпочтительно, метастатический уротелиальный рак, наиболее предпочтительно, метастатический уротелиальный рак, который рецидивирует или является рефрактерным к стандартной противораковой терапии, такой как лечение химиотерапевтическими препаратами.
[016] В определенных вариантах реализации, связанных с лечением рака, КАП могут использоваться в сочетании с хирургией, лучевой терапией, химиотерапией, иммунотерапией с использованием "голых" антител, радиоиммунотерапией, иммуномодуляторами, вакцинами и т.п. Такие комбинированные терапии могут позволить использовать введение более низких доз каждого терапевтического средства в таких комбинациях, тем самым снижая некоторые тяжелые побочные эффекты и потенциально уменьшая требуемые курсы терапии. В случае отсутствия или при минимальной перекрывающейся токсичности, также могут быть введены полные дозы каждого препарата. Неожиданно, комбинированная терапия иммуноконъюгатами антитело-SN38 и ингибиторами микротрубочек или ингибиторами PARP (поли(АДФ-рибоза)полимераза) продемонстрировала неожиданные синергические эффекты.
[017] Предпочтительная оптимальная дозировка КАП может включать дозу от 3 мг/кг до 18 мг/кг, которую предпочтительно вводят еженедельно, два раза в неделю или раз в две недели. Оптимальный график введения доз может включать циклы лечения, состоящие из двух последовательных недель терапии, за которыми следуют одна, две, три или четыре недели отдыха, или чередующихся недель терапии и отдыха, или одной недели терапии с последующими двумя, тремя или четырьмя неделями отдыха, или трех недель терапии с последующими одной, двумя, тремя или четырьмя неделями отдыха, или четырех недель терапии с последующими одной, двумя, тремя или четырьмя неделями отдыха, или пяти недель терапии с последующими одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью неделями отдыха, или введение один раз в две недели, один раз в три недели или один раз в месяц. Лечение может быть продлено на любое число циклов, предпочтительно, по меньшей мере 2, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6, по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, или по меньшей мере 16 циклов. Дозировка может составлять до 24 мг/кг. Типичные примеры доз применения могут включать 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг, 15 мг/кг, 16 мг/кг, 17 мг/кг и 18 мг/кг. Предпочтительные дозировки составляют 4, 6, 8, 9, 10, 12, 14, 16 или 18 мг/кг. Рядовому специалисту в данной области понятно, что различные факторы, такие как возраст, общее состояние здоровья, конкретная функция органа или вес, а также влияние предшествующей терапии на определенные системы органов (например, костный мозг), могут учитываться при выборе оптимальной дозировки иммуноконъюгата, и что дозировка и/или частота введения могут быть увеличены или уменьшены на протяжении курса терапии. Дозировка может быть повторена по мере необходимости, причем уменьшение опухоли наблюдается после всего лишь от 4 до 8 доз. Раскрытые в данном документе оптимизированные дозировки и схемы введения демонстрируют неожиданную превосходную эффективность и пониженную токсичность для людей, чего нельзя было предсказать на основании исследований на животных моделях. Неожиданно, повышенная эффективность позволяет лечить опухоли, которые ранее были признаны устойчивыми к одной или нескольким стандартным противораковым терапиям, включая родительское соединение CPT-11, из которого образуется SN-38 in vivo.
[018] Способы по данному изобретению могут включать использование КТ и/или ПЭТ/КТ или МРТ для измерения опухолевого ответа через регулярные промежутки времени. Также могут контролироваться уровни опухолевых маркеров в крови, таких как CEA (раково-эмбриональный антиген), CA19-9, AFP, CA 15.3 или PSA. Дозировки и/или схемы введения могут быть скорректированы по мере необходимости, в соответствии с результатами визуализации и/или уровнями маркеров в крови.
[019] Неожиданным результатом применения заявляемых в данном документе композиций и способов является неожиданная переносимость высоких доз конъюгата антитело-лекарственное средство, даже при повторных инфузиях, с наблюдаемыми токсическими эффектами только относительно низкого уровня в виде тошноты и рвоты или управляемой нейтропенией. Еще одним неожиданным результатом является отсутствие накопления конъюгата антитело-лекарственное средство, в отличие от других продуктов, в которых SN-38 конъюгирован с альбумином, ПЭГ или другими носителями. Отсутствие накопления ассоциировано с улучшенной переносимостью и отсутствием серьезной токсичности даже после многократного или повышенного дозирования. Эти неожиданные результаты позволяют оптимизировать дозировку и график доставки с неожиданно высокой эффективностью и низкой токсичностью. Заявленные способы обеспечивают уменьшение размера солидных опухолей у лиц с ранее резистентным раком до 15 % или больше, предпочтительно, 20 % или больше, предпочтительно, 30 % или больше, более предпочтительно, 40 % или больше (при измерении по наибольшему диаметру). Рядовому специалисту в данной области техники будет понятно, что размер опухоли может быть измерен различными способами, такими как общий объем опухоли, максимальный размер опухоли в любом измерении или комбинация измерений размеров в нескольких измерениях. Это может быть сделано с помощью стандартных рентгенологических процедур, таких как компьютерная томография, ультрасонография и/или позитронно-эмиссионная томография. Средства измерения размера менее важны, чем наблюдение тенденции уменьшения размера опухоли при лечении иммуноконъюгатом, предпочтительно приводящего к исчезновению опухоли.
[020] Хотя иммуноконъюгат можно вводить в виде периодической болюсной инъекции, в альтернативных вариантах реализации иммуноконъюгат можно вводить путем непрерывной инфузии конъюгатов антитело-лекарственное средство. Для увеличения Cmax и продления PK (фармакокинетики) иммуноконъюгата в крови, непрерывную инфузию можно проводить, например, с помощью постоянного катетера. Такие устройства известны специалистам, такие как катетеры Hickman, Broviac или Port-A-Cath (см., например, Skolnik et al., Ther Drug Monit 32:741-48, 2010), и может быть использован любой такой известный постоянный катетер. Специалистам также известны разнообразные инфузионные насосы непрерывного действия, и можно использовать любой такой известный инфузионный насос. Диапазон доз для непрерывной инфузии может составлять от 0,1 до 3,0 мг/кг в день. Более предпочтительно, эти иммуноконъюгаты могут быть введены путем внутривенных инфузий на протяжении относительно коротких периодов времени, составляющих от 2 до 5 часов, более предпочтительно, 2-3 часов.
[021] В особенно предпочтительных вариантах реализации, иммуноконъюгаты и схемы дозирования могут быть эффективными у пациентов, резистентных к стандартным терапиям. Например, иммуноконъюгат анти-Trop-2 hRS7-SN-38 может быть введен пациенту, не отвечавшему на предшествующую терапию иринотеканом, родительским агентом SN-38. Неожиданно, резистентный к иринотекану пациент может продемонстрировать частичный или даже полный ответ на hRS7-SN-38. Способность иммуноконъюгата специфически нацеливаться на опухолевую ткань может преодолевать резистентность опухоли за счет улучшенного нацеливания и повышенной доставки терапевтического агента. КАП также может быть эффективным для лечения раков, устойчивых к другим терапевтическим агентам, таким как противораковые агенты на основе платины. Конкретным предпочтительным субъектом может быть пациент с метастатическим раком толстой кишки, пациент с тройным негативным раком молочной железы, пациент с HER+, ER+, прогестерон+ раком молочной железы, пациент с метастатическим немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), пациент с метастатическим раком поджелудочной железы, пациент с метастатической почечно-клеточной карциномой, пациент с метастатическим раком желудка, пациент с метастатическим раком простаты, пациент с метастатическим уротелиальным раком или пациент с метастатическим мелкоклеточным раком легкого.
[022] В определенных предпочтительных вариантах реализации, антитело или иммуноконъюгат, такое как сацитузумаб говитекан, может быть использовано в комбинированной терапии с по меньшей мере одним ингибитором микротрубочек. Ряд ингибиторов микротрубочек известен специалистам, такие как алкалоиды барвинка (например, винкристин, винбластин), таксаны (например, паклитаксел), майтанзиноиды (например, мертанзин) и ауристатины. Другие известные ингибиторы микротрубочек включают демеколцин, нокодазол, эпотилон, доцетаксел, дискодермолид, колхицин, комбрестатин, подофиллотоксин, CI-980, фенилагистины, стеганацины, курацины, 2-метоксиэстрадиол, E7010, метоксибензолсульфонамиды, винорелбин, винфлунин, виндезин, доластатины, спонгистатин, ризоксин, тасидотин, галихондрины, гемиастерлины, криптофицин 52, ММАЕ и эрибулин мезилат (см., например, Dumontet & Jordan, 2010, Nat Rev Drug Discov 9:790-803). Любой такой известный ингибитор микротрубочек может быть использован в комбинации с антителом или конъюгатом антитело-лекарственный препарат (КАП). Предпочтительно, ингибитор микротрубочек представляет собой ингибитор микротрубочек, который проявляет синергетический эффект при использовании в сочетании с антителом или КАП. Одним из эффективных примеров является антитело, конъюгированное с SN-38, такое как сацитузумаб говитекан или лабетузумаб говитекан (нацеленные на CEACAM5), экспрессируемый многими солидными раками. Наиболее предпочтительно, ингибитор микротрубочек представляет собой паклитаксел или эрибулин мезилат.
[023] В других предпочтительных вариантах реализации, антитело или КАП могут быть использованы в комбинированной терапии с по меньшей мере одним ингибитором PARP. Специалистам известен ряд ингибиторов PARP, такие как олапариб, талазопариб (BMN-673), рукапариб, велипариб, нирапариб, инипариб, CEP 9722, MK 4827, BGB-290, ABT-888, AG014699, BSI-201, CEP-8983 и 3-аминобензамид (см., например, Rouleau et al., 2010, Nat Rev Cancer 10:293-301, Bao et al., 2015, Oncotarget [Epub ahead of print (электронная публикация до выхода печатного издания), September 22, 2015]). Любой такой известный ингибитор PARP может быть использован в комбинации с антителом или КАП, таким как, например, конъюгат SN-38-антитело. Предпочтительно ингибитор PARP представляет собой ингибитор, проявляющий синергический эффект при использовании в сочетании с антителом или КАП. Это было подтверждено при использовании антитела, конъюгированного с SN-38, такого как сацитузумаб говитекан. Наиболее предпочтительно, ингибитор PARP представляет собой олапариб или рукапариб.
[024] В других вариантах реализации, антитело или иммуноконъюгат могут быть использованы в комбинации с ингибитором киназы Брутона или ингибитором PI3K. Типичные ингибиторы киназы Брутона включают, без ограничений, ибрутиниб (PCI-32765), PCI-45292, CC-292 (AVL-292), ONO-4059, GDC-0834, LFM-A13 или RN486. Типичные ингибиторы PI3K включают, без ограничений, иделалисиб, вортманнин, деметоксивиридин, перифозин, PX-866, IPI-145 (дувелисиб), BAY 80-6946, BEZ235, RP6530, TGR1202, SF1126, INK1117, GDC-0941, BKM120, XL147, XL765, Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, CAL263, PI-103, GNE477, CUDC-907, AEZS-136 или LY294002. В заявляемой комбинированной терапии могут быть использованы любые ингибиторы киназы Брутона или PI3K, известные специалистам.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[025] Фиг. 1. Каскадная диаграмма (waterfall plot) лучших ответов у 6 пациентов с уротелиальной карциномой, получавших лечение сакузитумабом говитеканом. Клинические испытания с использованием IMMU-132 проводили, как описано в Примере 1 ниже. Используемые аббревиатуры: ПЗ (PD) представляет собой прогрессирующее заболевание; ЧО (PR) представляет собой частичный ответ; Пц (Pt) представляет собой пациента; RECIST представляет собой критерии оценки ответа солидных опухолей; СЗ (SD) представляет собой стабильное заболевание.
[026] Фиг. 2A. Оценка поражений-мишеней на сканах, полученных методом компьютерной томографии (КТ), с использованием критериев оценки ответа солидных опухолей, версия 1.1, у пациента (Pt) 6 до и после лечения савитузумабом говитеканом. Пациент 6 изначально имел 4 поражения-мишени (2 в печени, 1 в сигмовидной ободочной кишке, 1 в брюшине таза) с суммой наибольших диаметров 138 мм. Дополнительные нецелевые поражения присутствовали в печени и лимфатическом узле таза. Лечение начинали с уровня дозы 8 мг/кг. Белыми стрелками выделены целевые поражения 1-3 в осевых срезах, полученных в начале исследования. Осевые срезы той же области через 6 месяцев после 9 циклов лечения сацитузумабом говитеканом продемонстрировали уменьшение суммарного диаметра поражений-мишеней до 86 мм (минус 38 %) и стабильное заболевание в нецелевых поражениях.
[027] Фиг. 2B. Экспрессия Trop-2 (TACSTD2), определенная у трех пациентов с уротелиальной карциномой, получавших лечение сакузитумабом говитеканом (пациенты 3, 4 и 6). Контрольные предметные стекла инкубировали с нормальным козьим IgG. Соответствующие срезы, инкубированные с козьим анти-Trop-2 антителом, продемонстрировали сильную экспрессию Trop-2. Увеличенная вставка с экспрессирующими Trop-2 клетками (пациент 6) продемонстрировала локализацию Trop-2 на клеточных мембранах. Масштабные отрезки представляют собой 0,1 мм.
[028] Фиг. 3. Данные фаз I/II IMMU-132 для лучшего ответа по критериям RECIST.
[029] Фиг. 4. Ответы у 52 пациентов с ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы), получавших 10 мг/кг IMMU-132, после неудачных многочисленных предшествующих терапий.
[030] Фиг. 5. Выживаемость без прогрессирования у пациентов с ТНРМЖ, получавших 10 мг/кг IMMU-132.
[031] Фиг. 6. Наилучший ответ у 29 оцениваемых пациентов с НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого), получавших от 8 до 10 мг/кг IMMU-132.
[032] Фиг. 7. Время до прогрессирования у пациентов с НМРЛ, получавших 8-10 мг / кг ИММУ-132.
[033] Фиг. 8. Выживаемость без прогрессирования у пациентов с НМРЛ, получавших 8 или 10 мг/кг IMMU-132.
3
[034] Фиг. 9A. Ингибирование роста опухоли комбинацией IMMU-132 и олапариба при ТНРМЖ: BRCA1/2- (белок раннего развития рака молочной железы 1 или 2) и PTEN (гомолог фосфатазы и тензина, делетированный в хромосоме 10)-дефектные опухоли. Мыши-опухоленосители (объем опухоли (TV) около 0,3 см) получали олапариб (1 мг; около 50 мг/кг, внутрибрюшинно (i.p.) по схеме M-F (введение препарата с понедельника по пятницу); красные стрелки) или IMMU-132 (внутривенно (i.v.), еженедельно, черные стрелки). В качестве контроля использовали не нацеленный на опухоль КАП анти-CD20 SN-38.HCC1806 представляет собой BRCA1/2-дефектную опухолевую линию ТНРМЖ. Отдельно взятый олапариб не оказывал значительного противоопухолевого эффекта. Один IMMU-132 в значительной степени ингибировал рост опухоли по сравнению со всеми контрольными группами (P менее 0,0106, AUC (площадь под кривой)). IMMU-132 плюс олапариб дополнительно улучшали противоопухолевые ответы по сравнению со всеми группами (P менее 0,0019; AUC). Мыши в группе комбинированной терапии еще не достигли (have yet to reach) медианной выживаемости (более 80,5 дней), что более чем в 2 и 4 раза превышает показатели для монотерапии IMMU-132 или олапарибом, соответственно (P менее 0,0083).
3
[035] Фиг. 9B. Ингибирование роста опухоли комбинацией IMMU-132 и олапариба при ТНРМЖ: BRCA1/2- (белок раннего развития рака молочной железы 1 или 2) и PTEN (гомолог фосфатазы и тензина, делетированный в хромосоме 10)-дефектные опухоли. Мыши-опухоленосители (объем опухоли около 0,3 см) получали олапариб (1 мг; около 50 мг/кг, внутрибрюшинно, по схеме M-F (введение препарата с понедельника по пятницу); светлые стрелочки) или IMMU-132 (внутривенно, еженедельно, темные стрелочки). В качестве контроля использовали не нацеленный на опухоль КАП анти-CD20 SN-38. При BRCA1/2 дикого типа (w.t.), PTEN-дефектных MDA-MB-468 опухолях, один IMMU-132 создавал значительные противоопухолевые эффекты по сравнению со всеми контрольными группами (P менее 0,0098; AUC). Однако, комбинация IMMU-132 плюс олапариб ингибировала рост опухоли значительно лучше, чем только IMMU-132 или олапариб (P равно 0,004; AUC). Это приводит к значительному увеличению выживаемости по сравнению со всеми другими группами (P менее 0,045).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
[036] В последующем описании используется ряд терминов, и приведенные ниже определения предназначены для облегчения понимания предмета заявляемого изобретения. Термины, которые прямо не определены в данном документе, используются в соответствии с их простыми и обычными значениями.
[037] Если не указано иное, термины в единственном числе (в английском тексте - с артиклями a или an) означают “один или несколько”.
[038] Термин примерно используется в данном документе для обозначения плюс или минус десять процентов (10 %) от значения. Например, “примерно 100” относится к любому числу от 90 до 110.
[039] Антитело, в используемом в данном документе значении, относится к полноразмерной (т.е., природной или образующейся в результате нормальных процессов рекомбинации фрагментов гена иммуноглобулина) молекуле иммуноглобулина (например, антитела IgG) или антигенсвязывающей части молекулы иммуноглобулина, такой как фрагмент антитела. Антитело или фрагмент антитела могут быть конъюгированы или иначе дериватизированы в объеме заявляемого изобретения. Такие антитела включают, без ограничений, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 (и субформы IgG4), а также изотипы IgA. В используемом ниже значении, аббревиатура "МАТ" (MAb) может быть использована взаимозаменяемо по отношению к антителу, фрагменту антитела, моноклональному антителу или мультиспецифическому антителу.
2
2
[040] Фрагмент антитела представляет собой часть антитела, такую как F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv (одноцепочечный Fv), однодоменные антитела (DAB или VHH) и т.п., включая "полумолекулы" IgG4, упомянутые выше (van der Neut Kolfschoten et al. (Science 2007; 317(14 Sept):1554-1557). Независимо от строения, используемый фрагмент антитела связывается с тем же антигеном, который распознается интактным антителом. Термин «фрагмент антитела» также включает синтетические или генно-инженерные белки, которые действуют как антитело, связываясь со специфическим антигеном с образованием комплекса. Например, фрагменты антител включают в себя изолированные фрагменты, состоящие из вариабельных областей, такие как фрагменты «Fv», состоящие из вариабельных областей тяжелых и легких цепей, и рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, в которых легкие и тяжелые вариабельные области связаны пептидным линкером («белки scFv»). Фрагменты могут быть сконструированы различными способами для получения мультивалентных и/или мультиспецифических связывающих форм.
[041] "Голое" антитело обычно представляет собой целое антитело, не конъюгированное с терапевтическим агентом. Голое антитело может проявлять терапевтические и/или цитотоксические эффекты, например, с помощью Fc-зависимых функций, таких как фиксация комплемента (CDC, комплементзависимая цитотоксичность) и ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность). Однако, другие механизмы, такие как апоптоз, антиангиогенез, антиметастатическая активность, антиадгезивная активность, ингибирование гетеротипической или гомотипической адгезии и вмешательство в сигнальные пути, также могут обеспечивать терапевтический эффект. Голые антитела включают поликлональные и моноклональные антитела, природные или рекомбинантные антитела, такие как химерные, гуманизированные или человеческие антитела и их фрагменты. В некоторых случаях «голое антитело» может также относиться к «голому» фрагменту антитела. В используемом в данном документе значении, «голый» является синонимом «неконъюгированного» и означает несвязанный или неконъюгированный с терапевтическим агентом.
[042] Химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, который содержит вариабельные домены как тяжелой, так и легкой цепей антитела, включая определяющие комплементарность области (CDR) антитела, полученного от одного вида, предпочтительно, антитела грызуна, более предпочтительно, мышиного антитела, в то время как константные домены молекулы антитела получены из константных доменов человеческого антитела. Для применения в ветеринарии, константные домены химерного антитела могут быть получены из константных доменов других видов, таких как приматы, кошачьи или собачьи.
[043] Гуманизированное антитело представляет собой рекомбинантный белок, в котором CDR от антитела одного вида; например, мышиного антитела, переносят из вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей (heavy and light variable chains) мышиного антитела в вариабельные домены тяжелой и легкой цепей (heavy and light variable domains) человека (каркасные области). Константные домены молекулы антитела получены из константных доменов человеческого антитела. В некоторых случаях, определенные остатки каркасной области гуманизированного антитела, особенно соприкасающиеся с или близкие к последовательностям CDR, могут быть модифицированы, например, заменены соответствующими остатками из антитела мыши, грызуна, человекообразной обезьяны, или другого антитела.
[044] Человеческое антитело представляет собой антитело, полученное, например, от трансгенных мышей, которые были «модифицированы» для выработки антител человека в ответ на антигенную стимуляцию. В этом методе, элементы локусов тяжелой и легкой цепей человека вводят в штаммы мышей, полученные из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат целевые разрывы эндогенных локусов тяжелой цепи и легкой цепи. Трансгенные мыши могут синтезировать антитела человека, специфичные к различным антигенам, и мышей можно использовать для получения гибридом, секретирующих антитела человека. Методы получения антител человека от трансгенных мышей описаны Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), and Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994). Полностью человеческое антитело также может быть сконструировано методами генетической или хромосомной трансфекции, а также с помощью технологии фагового дисплея, которые все известны специалистам в данной области. См., например, McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990), где описано получение антител человека и их фрагментов in vitro, из репертуаров генов вариабельного домена иммуноглобулина от неиммунизированных доноров. В этом методе гены вариабельного домена человеческого антитела клонируют в рамке в ген мажорного или минорного белка оболочки нитевидного бактериофага и отображают в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговых частиц. Поскольку нитевидная частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, селекция на основе функциональных свойств антитела также приводит к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющего эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства B-клетки. Фаговый дисплей может быть проведен во множестве форматов, обзор которых приведен, например, в Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993). Человеческие антитела могут также генерироваться in vitro активированными В-клетками. См. патенты США №№ 5567610 и 5229275, разделы Примеров каждого из которых включены в данный документ посредством ссылок.
[045] Терапевтический агент представляет собой атом, молекулу или соединение, которые полезны при лечении заболевания. Примеры терапевтических агентов включают, без ограничений, антитела, фрагменты антител, иммуноконъюгаты, лекарственные средства, цитотоксические агенты, проапоптотические (pro-apopoptotic) агенты, токсины, нуклеазы (включая ДНКазы и РНКазы), гормоны, иммуномодуляторы, хелатирующие агенты, соединения бора, фотоактивные агенты или красители, радионуклиды, олигонуклеотиды, интерферирующую (interference) РНК, миРНК (малая интерферирующая РНК), RNAi (РНК-интерференция), антиангиогенные агенты, химиотерапевтические агенты, цитокины (cyokines), хемокины, пролекарства, ферменты, связывающие белки или пептиды или их комбинации.
[046] Иммуноконъюгат представляет собой антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, комплекс антитела или гибридный белок антитела, которые конъюгированы с терапевтическим агентом. Конъюгация может быть ковалентной или нековалентной. Предпочтительно, конъюгация является ковалентной. Конкретная форма иммуноконъюгата, в которой компонент антитела конъюгирован с лекарственным средством, называется в данном документе конъюгатом антитело-лекарственный препарат (КАП).
[047] В используемом в данном документе значении, термин гибридный белок антитела обозначает полученную рекомбинантными методами антигенсвязывающую молекулу, в которой одно или несколько природных антител, одноцепочечных антител или фрагментов антител связаны с другим фрагментом, таким как белок или пептид, токсин, цитокин, гормон и т.д. В определенных предпочтительных вариантах реализации, гибридный белок может содержать два или больше одинаковых или разных антител, фрагментов антител или одноцепочечных антител, слитых вместе, которые могут связываться с одним и тем же эпитопом, разными эпитопами на одном и том же антигене, или разными антигенами.
[048] Иммуномодулятор представляет собой терапевтический агент, который, в случае своего присутствия, изменяет, подавляет или стимулирует иммунную систему организма. Типично, используемый иммуномодулятор стимулирует пролиферацию или активацию иммунных клеток в каскаде иммунного ответа, таких как макрофаги, дендритные клетки, B-клетки и/или T-клетки. Однако в некоторых случаях иммуномодулятор может подавлять пролиферацию или активацию иммунных клеток. Примером иммуномодулятора, описанного в данном документе, является цитокин, который представляет собой растворимый небольшой белок размером приблизительно 5-20 кДа, высвобождаемый одной популяцией клеток (например, примированными Т-лимфоцитами) при контакте со специфическими антигенами, и который действует как межклеточный медиатор между клетками. Специалисту в данной области будет понятно, что примеры цитокинов включают лимфокины, монокины, интерлейкины и несколько родственных сигнальных молекул, таких как фактор некроза опухоли (ФНО) и интерфероны. Хемокины представляют собой подмножество цитокинов. Некоторые интерлейкины и интерфероны являются примерами цитокинов, которые стимулируют пролиферацию Т-клеток или других иммунных клеток. Типичные примеры интерферонов включают интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ и интерферон-λ.
[049] CPT является аббревиатурой для камптотецина, и при использовании в данной заявке СРТ обозначает сам камптотецин или аналог или производное камптотецина, такое как SN-38.
Анти-Trop2 антитела
[050] Предпочтительно, КАП по данному изобретению включают по меньшей мере одно антитело или его фрагмент, которые связываются с Trop-2. В конкретном предпочтительном варианте реализации, анти-Trop-2 антитело может быть гуманизированным антителом RS7 (см., например, патент США № 7238785, включенный в данный документ посредством ссылки в полном объеме), содержащим последовательности CDR легкой цепи CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO:1); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO:2); и CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO:3) и последовательности CDR тяжелой цепи CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO:4); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO:5) и CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO:6).
1
[051] Антитело RS7 представляло собой мышиный IgG против грубого мембранного препарата первичной плоскоклеточной карциномы легкого человека (Stein et al., Cancer Res. 50:1330, 1990). Антитело RS7 распознает 46-48 кДа гликопротеин, характеризуемый как кластер 13 (Stein et al., Int. J. Cancer Supp.8:98-102, 1994). Антиген был обозначен как EGP-1 (эпителиальный гликопротеин-1), но также называется Trop-2.
[052] Trop-2 представляет собой трансмембранный белок типа I и был клонирован как из человеческих (Fornaro et al., Int J Cancer 1995; 62:610-8), так и из мышиных клеток (Sewedy et al., Int J Cancer 1998; 75:324-30). Было показано, что, в дополнение к своей роли опухолеассоциированного переносчика кальциевого сигнала (Ripani et al., Int J Cancer 1998;76:671-6), экспрессия человеческого Trop-2 необходима для онкогенеза и инвазивности клеток рака толстой кишки, которые можно эффективно снижать с помощью поликлонального антитела против внеклеточного домена Trop-2 (Wang et al., Mol Cancer Ther 2008;7:280-5).
[053] О растущем интересе к Trop-2 как мишени для терапевтического воздействия при солидных раках (Cubas et al., Biochim Biophys Acta 2009; 1796:309-14) свидетельствуют, кроме того, отчеты, в которых задокументирована клиническая значимость сверхэкспрессируемого Trop-2 при карциноме молочной железы (Huang et al., Clin Cancer Res 2005; 11:4357-64), колоректальном раке (Ohmachi et al., Clin Cancer Res 2006; 12:3057-63; Fang et al., Int J Colorectal Dis 2009; 24:875-84) и плоскоклеточной карциноме ротовой полости (Fong et al., Modern Pathol 2008; 21:186-91). Особенно примечательны последние данные о том, что базальные клетки простаты, экспрессирующие высокие уровни Trop-2, чаще проявляют (are enriched for) in vitro и in vivo активность, схожую со стволовыми клетками (stem-like activity) (Goldstein et al., Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:20882-7).
[054] Исследования с использованием проточной цитометрии и иммуногистохимического окрашивания показали, что МАТ RS7 детектирует антиген на различных типах опухолей, при ограниченном связывании с нормальной тканью человека (Stein et al., 1990). Trop-2 экспрессируется главным образом карциномами, такими как рак легкого, желудка, мочевого пузыря, молочной железы, яичника, матки и простаты. Исследования локализации и терапии с использованием радиоактивно меченого мышиного МАТ RS7 на животных моделях продемонстрировали нацеливание на опухоль и терапевтическую эффективность (Stein et al., 1990; Stein et al., 1991). Сильное окрашивание RS7 было продемонстрировано в опухолях легкого, молочной железы, мочевого пузыря, яичника, матки, желудка и простаты (Stein et al., Int. J. Cancer 55:938, 1993). Случаи рака легкого включали как плоскоклеточный рак, так и аденокарциному (Stein et al., Int. J. Cancer 55:938, 1993). Оба типа клеток сильно окрашивались, указывая на то, что антитело RS7 не различает гистологические классы немелкоклеточной карциномы легкого.
[055] МАТ RS7 быстро интернализуется клетками-мишенями (Stein et al., 1993). Константа скорости интернализации МАТ RS7 имеет значение, промежуточное между константами скорости интернализации двух других быстро интернализующихся МАТ, которые продемонстрировали свою пригодность для получения иммуноконъюгатов (там же). Хорошо задокументировано, что интернализация иммуноконъюгатов необходима для проявления противоопухолевой активности (Pastan et al., Cell 47:641, 1986). Интернализация иммуноконъюгатов лекарственных средств была описана как важный фактор противоопухолевой эффективности (Yang et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:1189, 1988). Таким образом, антитело RS7 проявляет несколько свойств, важных для терапевтического применения.
[056] Хотя антитело hRS7 является предпочтительным, другие анти-Trop-2 антитела являются известными и/или общедоступными и, в альтернативных вариантах реализации, могут быть использованы в КАП по данному изобретению. Хотя гуманизированные или человеческие антитела являются предпочтительными для снижения иммуногенности, в альтернативных вариантах реализации может быть использовано химерное антитело. Как описано ниже, способы гуманизации антител хорошо известны в данной области техники и могут быть использованы для превращения доступного мышиного или химерного антитела в гуманизированную форму.
[057] Анти-Trop2 антитела являются коммерчески доступными из ряда источников и включают LS-C126418, LS-C178765, LS-C126416, LS-C126417 (LifeSpan BioSciences, Inc., Seattle, WA); 10428-MM01, 10428-MM02, 10428-R001, 10428-R030 (Sino Biological Inc., Beijing, China); MR54 (eBioscience, San Diego, CA); sc-376181, sc-376746, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); MM0588-49D6, (Novus Biologicals, Littleton, CO); ab79976, и ab89928 (ABCAM, Cambridge, MA).
[058] Другие анти-Trop-2 антитела были раскрыты в патентной литературе. Например, публикация США № 2013/0089872 раскрывает анти-Trop-2 антитела K5-70 (№ доступа FERM BP-11251), K5-107 (№ доступа FERM BP-11252), K5-116-2-1 (№ доступа FERM BP-11253), T6-16 (№ доступа FERM BP-11346), и T5-86 (№ доступа FERM BP-11254), депонированные в Международном депозитарии организмов в целях патентной процедуры (International Patent Organism Depositary, Tsukuba, Japan). Патент № 5840854 раскрывает анти-Trop-2 моноклональное антитело BR110 (ATCC No. HB11698). Патент США № 7420040 раскрывает анти-Trop-2 антитело, продуцируемое гибридомной клеточной линией AR47A6.4.2, депонированной в Международном депозитарном органе Канады IDAC (International Depository Authority of Canada, Winnipeg, Canada) под № доступа 141205-05. Патент США № 7420041 раскрывает анти-Trop-2 антитело, продуцируемое гибридомной клеточной линией AR52A301.5, депонированной в IDAC под № доступа 141205-03. Публикация США № 2013/0122020 раскрывает анти-Trop-2 антитела 3E9, 6G11, 7E6, 15E2, 18B1. Гибридомы, кодирующие репрезентативное антитело, были депонированы в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC), №№ доступа PTA-12871 и PTA-12872. Иммуноконъюгат PF 06263507, содержащий анти-5T4 (анти-Trop-2) антитело, присоединенное к ингибитору тубулина монометилауристатину F (MMAF), доступен от фирмы Pfizer, Inc.(Groton, CT) (см., например, Sapra et al., 2013, Mol Cancer Ther 12:38-47). Патент США № 8715662 раскрывает анти-Trop-2 антитела, прордуцируемые гибридомами, депонированными в AID-ICLC (Международный депозитарный орган - Коллекция клеточных линий Interlab) (Genoa, Italy) с номерами депонирования PD 08019, PD 08020 и PD 08021. Публикация патентной заявки США № 20120237518 раскрывает анти-Trop-2 антитела 77220, KM4097 и KM4590. Патент США № 8309094 (Wyeth) раскрывает антитела A1 и A3, идентифицируемые по перечням последовательностей. Разделы Примеров каждого из патентов или патентных заявок, упомянутых выше в данном абзаце, включены в данный документ посредством ссылок. Непатентная публикация Lipinski et al. (1981, Proc Natl. Acad Sci USA, 78:5147-50) раскрывает анти-Trop-2 антитела 162-25.3 и 162-46.2.
[059] Многочисленные антитела против Trop-2 известны в данной области и/или являются общедоступными. Как описано ниже, способы получения антител против известных антигенов были обычными в данной области техники. Последовательность человеческого белка Trop-2 также была известна в данной области (см., например, № доступа GenBank CAA54801.1). Способы получения гуманизированных, человеческих или химерных антител также были известны. Рядовой специалист в данной области, прочитав данное описание в свете общих знаний в данной области, мог бы создать и использовать род анти-Trop-2 антител в КАП по данному изобретению.
Конъюгаты камптотецина
[060] Неограничительные способы и композиции для получения иммуноконъюгатов, содержащих камптотециновый терапевтический агент, присоединенный к антителу или антигенсвязывающему фрагменту антитела, описаны ниже. В предпочтительных вариантах осуществления растворимость лекарственного средства повышают путем размещения имеющего определенный размер фрагмента полиэтиленгликоля (ПЭГ) (т.е. ПЭГ, содержащего определенное число мономерных звеньев) между лекарственным средством и антителом, где указанный ПЭГ представляет собой низкомолекулярный ПЭГ, предпочтительно содержащий 1-30 мономерных звеньев, более предпочтительно, содержащий 1-12 мономерных звеньев, наиболее предпочтительно, содержащий 6-8 мономерных звеньев.
[061] Предпочтительно, первый линкер присоединен к лекарственному средству на одном конце и может оканчиваться ацетиленовой или азидной группой на другом конце. Этот первый линкер может содержать имеющий определенный размер фрагмент ПЭГ с азидной или ацетиленовой группой на одном конце и другой реакционноспособной группой, такой как карбоновая кислота или гидроксильная группа, на другом конце. Указанный бифункциональный ПЭГ определенного размера может быть присоединен к аминогруппе аминоспирта, а гидроксильная группа последнего может быть присоединена к гидроксильной группе лекарственного средства в форме карбоната. Альтернативно, неазидный (или ацетиленовый) фрагмент указанного бифункционального ПЭГ определенного размера необязательно присоединен к N-концу L-аминокислоты или полипептида, а С-конец присоединен к аминогруппе аминоспирта, и гидроксигруппа последнего присоединена к гидроксильной группе лекарственного средства в форме карбоната или карбамата, соответственно.
[062] Второй линкер, содержащий антителосвязывающую группу и реакционноспособную группу, комплементарную азидной (или ацетиленовой) группе первого линкера, а именно ацетилен (или азид), может реагировать с конъюгатом лекарственное средство-первый линкер посредством реакции циклоприсоединения ацетилен-азид с образованием конечного бифункционального лекарственного продукта, пригодного для конъюгирования с антителами, нацеленными на заболевание. Антителосвязывающая группа предпочтительно представляет собой тиол или реакционноспособную по отношению к тиолу группу.
[063] Способы селективной регенерации 10-гидроксильной группы в присутствии С-20 карбоната в препаратах прекурсора лекарственное средство-линкер с участием аналогов СРТ, таких как SN-38, представлены ниже. Также могут быть использованы другие защитные группы для реакционноспособных гидроксильных групп в лекарственных средствах, такие как фенольный гидроксил в SN-38, например, трет-бутилдиметилсилил или трет-бутилдифенилсилил, и защиту с них снимают с помощью фторида тетрабутиламмония перед связыванием дериватизированного лекарственного средства с антителосвязывающим фрагментом.10-Гидроксильную группу аналогов СРТ альтернативно защищают в виде сложного эфира или карбоната, отличного от «BOC» (т-бутилоксикарбонил), так чтобы бифункциональный СРТ конъюгировался с антителом без предварительного удаления этой защитной группы. После введения биоконъюгата, защитная группа легко удаляется при физиологическом рН.
[064] В сочетании ацетилен-азид, называемом "клик-химия", азидная часть может находиться на L2, а ацетиленовая часть - на L3. Альтернативно, L2 может содержать ацетилен, а L3 - азид. "Клик-химия" относится к катализируемой медью(+1) реакции циклоприсоединения между ацетиленовым фрагментом и азидным фрагментом (Kolb HC and Sharpless KB, Drug Discov Today 2003; 8:1128-37), хотя известны и могут быть использованы альтернативные формы клик-химии. Клик-химия протекает в водном растворе при близких к нейтральным значениях рН и, следовательно, пригодна для конъюгации с лекарственным средством. Преимущество клик-химии заключается в том, что она является хемоселективной и дополняет другие хорошо известные химические методы конъюгации, такие как реакция тиол-малеимид.
[065] Типичный предпочтительный вариант реализации касается конъюгата производного лекарственного средства и антитела общей формулы (1), приведенной ниже.
m
МАТ-[L2]-[L1]-[AA]-[A’]-Лекарственный препарат (1)
где МАТ обозначает нацеленное на заболевание антитело; L2 представляет собой компонент сшивающего агента, содержащий антителосвязывающий фрагмент и одну или несколько ацетиленовых (или азидных) групп; L1 включает ПЭГ определенного размера с азидом (или ацетиленом) на одном конце, комплементарным к ацетиленовому (или азидному) фрагменту в L2, и реакционноспособную группу, такую как карбоновую кислоту или гидроксильную группу на другом конце; AA обозначает L-аминокислоту; m обозначает целое число со значениями 0, 1, 2, 3 или 4; и A’ представляет собой дополнительный спейсер, выбранный из группы этаноламина, 4-гидроксибензилового спирта, 4-аминобензилового спирта, или замещенного или незамещенного этилендиамина. L-аминокислоты AA выбирают из аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутамина, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина. Если группа А' содержит гидроксил, она связана с гидроксильной группой или аминогруппой лекарственного средства в форме карбоната или карбамата, соответственно.
[066] В предпочтительном варианте реализации формулы 1, A’ представляет собой замещенный этаноламин, производный от L-аминокислоты, в котором карбоксильная кислотная группа аминокислоты замещена на гидроксиметильный фрагмент. A’ может быть получен из любой из следующих L-аминокислот: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин.
[067] В примере конъюгата по предпочтительному варианту реализации формулы 1, m равен 0, A’ представляет собой L-валинол, и примером лекарственного средства является SN-38. В другом примере формулы 1, m равен 1 и представлен дериватизированным L-лизином, A’ представляет собой L-валинол, и примером лекарственного средства является SN-38. В этом варианте реализации, амидная связь сначала образуется между карбоновой кислотой аминокислоты, такой как лизин, и аминогруппой валинола, с использованием ортогональных защитных групп для аминогруппы лизина. Защитную группу на N-конце лизина удаляют, сохраняя интактной защитную группу в боковой цепи лизина, и N-конец связывают с карбоксильной группой на ПЭГ определенного размера с азидом (или ацетиленом) на другом конце. Затем гидроксильную группу валинола присоединяют к 20-хлорформиатным производным 10-гидрокси-защищенного SN-38, и это промежуточное соединение сочетают с компонентом L2, несущим антителосвязывающий фрагмент, а также комплементарную ацетиленовую (или азидную) группу, участвующую в клик-химии циклоприсоединения. Наконец, удаление защитных групп как в боковой цепи лизина, так и в SN-38, дает продукт этого примера.
[068] Не желая быть связанными какой-либо теорией, низкомолекулярный продукт SN-38, а именно валинол-SN-38-карбонат, образующийся после внутриклеточного протеолиза, обеспечивает дополнительный путь высвобождения интактного SN-38 посредством внутримолекулярной циклизации с участием аминогруппы валинола и карбонила карбоната.
1
10
[069] В другом предпочтительном варианте реализации, A’ общей формулы 1 представляет собой A-OH, где A-OH является деформирующимся (collapsible) фрагментом, таким как 4-аминобензиловый спирт или замещенный 4-аминобензиловый спирт, замещенный C-C алкильной группой в бензильном положении, и последний, через свою аминогруппу, присоединяется к L-аминокислоте или полипептиду, содержащему до четырех L-аминокислотных фрагментов; причем N-конец присоединяется к сшивающему агенту с терминальной антителосвязывающей группой.
[070] В другом примере предпочтительного варианта реализации, A-OH в A’ общей формулы 1 образуется из замещенного 4-аминобензилового спирта, и AA состоит из одной L-аминокислоты с m равен 1 в общей формуле 1, и примером лекарственного средства является SN-38. Отдельная аминокислота AA может быть выбрана из любой из следующих L-аминокислот: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин. Заместитель R в фрагменте 4-аминобензилового спирта (вариант реализации A’ с A-OH) представляет собой водород или алкильную группу, выбранную из C1-C10 алкильных групп. Пример этой формулы, в котором отдельная аминокислота AA представляет собой L-лизин и R представляет собой H, а примером лекарственного средства является SN-38, был обозначен как МАТ-CL2A-SN-38 (приведен ниже). Структура отличается от линкера МАТ-CL2-SN-38 тем, что отдельный лизиновый остаток замещен на дипептид Phe-Lys, присутствующий в линкере CL2. Дипептид Phe-Lys был сконструирован как сайт расщепления катепсина B лизосомальным ферментом, который считается важным для внутриклеточного высвобождения связанного лекарственного средства. Неожиданно, несмотря на удаление сайта расщепления катепсина, иммуноконъюгаты, содержащие линкер CL2A, по-видимому, являются более эффективными in vivo, чем содержащие линкер CL2.
[071] В предпочтительном варианте реализации, AA содержит полипептидный фрагмент, предпочтительно, ди-, три- или тетрапептид, который расщепляется внутриклеточной пептидазой. Примерами являются:Ala-Leu, Leu-Ala-Leu и Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:7) (Trouet et al., 1982).
[072] В другом предпочтительном варианте реализации, компонент L1 конъюгата содержит полиэтиленгликолевый (ПЭГ) спейсер определенного размера с 1-30 повторяющимися мономерными звеньями. В дополнительном предпочтительном варианте реализации, ПЭГ представляет собой ПЭГ определенного размера с 1-12 повторяющимися мономерными звеньями. Введение ПЭГ может включать использование гетеробифункциональных производных ПЭГ, которые являются коммерчески доступными. Гетеробифункциональный ПЭГ может содержать азидную или ацетиленовую группу.
[073] В предпочтительном варианте реализации, L2 имеет множество ацетиленовых (или азидных) групп, в диапазоне 2-40, но предпочтительно, 2-20 и, более предпочтительно, 2-5, и один антителосвязывающий фрагмент. В репрезентативном примере компонент L2 присоединен к 2 ацетиленовым группам, что приводит к присоединению двух присоединяемых через азид молекул SN-38. Связывание с МАТ может предусматривать сукцинимид.
[074] В предпочтительных вариантах реализации, когда бифункциональное лекарственное средство содержит реакционноспособный по отношению к тиолу фрагмент в качестве антителосвязывающей группы, тиолы в антителе генерируются в лизиновых группах антитела с использованием тиолирующего реагента. Способы введения тиольных групп в антитела путем модификаций лизиновых групп МАТ хорошо известны специалистам (Wong, в Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1991), pp 20-22). Альтернативно, восстановление в мягких условиях межцепочечных дисульфидных связей в антителе (Willner et al., Bioconjugate Chem.4:521-527 (1993)) с использованием восстановителей, таких как дитиотреитол (DTT), может генерировать от 7 до 10 тиолов в антителе; его преимуществом является включение множества фрагментов лекарственного средства в межцепочечную область МАТ вдали от антигенсвязывающей области. В более предпочтительном варианте реализации, присоединение SN-38 к восстановленным дисульфидным сульфгидрильным группам приводит к образованию иммуноконъюгата антитело-SN-38 с 6 ковалентно присоединенными фрагментами SN-38 на молекулу антитела. Известны другие способы получения цистеиновых остатков для присоединения лекарственных средств или других терапевтических агентов, такие как использование антител, модифицированных цистеином (см. патент США № 7521541, раздел Примеров которого включен в данный документ посредством ссылки).
[075] В альтернативных предпочтительных вариантах реализации, химиотерапевтический фрагмент выбирают из группы, состоящей из доксорубицина (DOX), эпирубицина, морфолинодоксорубицина (морфолино-DOX), цианоморфолинодоксорубицина (цианоморфолино-DOX), 2-пирролинодоксорубицина (2-PDOX), Pro-2PDOX, CPT, 10-гидроксикамптотецина, SN-38, топотекана, луртотекана, 9-аминокамптотецин, 9-нитрокамптотецина, таксанов, гелданамицина, ансамицинов и эпотилонов. В более предпочтительном варианте реализации, химиотерапевтический фрагмент представляет собой SN-38. Предпочтительно, в конъюгатах по предпочтительным вариантам реализации, антитело связывается с по меньшей мере одним химиотерапевтическим фрагментом; предпочтительно, от 1 до примерно 12 химиотерапевтических фрагментов; более предпочтительно, от примерно 6 до примерно 12 химиотерапевтических фрагментов.
[076] Кроме того, в предпочтительном варианте реализации, компонент линкера L2 содержит тиольную группу, которая реагирует с реакционноспособным по отношению к тиолу остатком, введенным в одну или несколько аминогрупп боковых цепей лизина указанного антитела. В таких случаях, антитело предварительно дериватизируют реакционноспособной по отношению к тиолу группой, такой как малеимид, винилсульфон, бромацетамид или йодацетамид, с помощью процедур, хорошо описанных в данной области.
[077] В контексте данной работы неожиданно был обнаружен способ, с помощью которого можно получить связанные с лекарственными средствами на основе СРТ линкеры, в которых СРТ дополнительно содержит 10-гидроксильную группу. Этот процесс включает, без ограничений, защиту 10-гидроксильной группы в виде т-бутилоксикарбонильного (BOC) производного, с последующим получением предпоследнего промежуточного соединения конъюгата лекарственное средство-линкер. Обычно, удаление BOC-группы требует обработки сильной кислотой, такой как трифторуксусная кислота (TFA). В таких условиях, CPT 20-O-линкер-карбонат, содержащий защитные группы, подлежащие удалению, также является восприимчивым к расщеплению, в результате чего образуется немодифицированный CPT. Фактически, обоснование для использования удаляемой в мягких условиях метокситритильной (MMT) защитной группы для боковой цепи лизина линкерной молекулы, как изложено в данной области техники, заключалось именно в том, чтобы избежать этой возможности (Walker et al., 2002). Было обнаружено, что селективное удаление фенольной защитной группы BOC возможно путем проведения реакций в течение коротких периодов времени, оптимально, от 3 до 5 минут. В этих условиях преобладающим был продукт, в котором ВОС в положении 10-гидроксила был удален, тогда как карбонат в положении 20 оставался интактным.
3
2
2
n
3
2
n
3
2
3
2
2
n
1
2
2
n
2
2
1
[078] Альтернативный подход включает защиту 10-гидрокси-положения аналога СРТ отличной от BOC группой, так чтобы конечный продукт был готов к конъюгации с антителами без необходимости удаления защитной группы 10-ОН. Защитная группа 10-гидрокси, которая превращает 10-ОН в фенольный карбонат или фенольный эфир, легко удаляется в условиях физиологических значений pH или с помощью эстераз после in vivo введения конъюгата. Более быстрое удаление фенольного карбоната в положении 10 по сравнению с третичным карбонатом в положении 20 10-гидроксикамптотецина в физиологических условиях было описано He et al. (He et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 12:4003-4008 (2004)). Защитная группа 10-гидрокси в SN-38 может представлять собой COR, где R может быть замещенным алкилом, таким как “N(CH)-(CH)-”, где n имеет значение 1-10 и где терминальная аминогруппа необязательно находится в форме четвертичной соли для повышенной растворимости в воде или простого алкильного остатка, такого как “CH-(CH)-”, где n имеет значение 0-10, или может быть алкоксильным фрагментом, таким как “CH-(CH)n-O-” где n имеет значение 0-10, или “N(CH)-(CH)-O-” где n имеет значение 2-10, или “RO-(CH-CH-O)-CH-CH-O-”, где R представляет собой этил или метил и n обозначает целое число со значениями 0-10. Такие 10-гидроксипроизводные легко получают обработкой хлорформиатом выбранного реагента, если конечное производное должно быть карбонатом. Типично, 10-гидроксисодержащий камптотецин, такой как SN-38, обрабатывают молярным эквивалентом хлорформиата в диметилформамиде с использованием триэтиламина в качестве основания. В таких условиях, положение 20-OH остается неизменным. Для образования 10-O-сложных эфиров используется хлорангидрид кислоты выбранного реагента.
m
[079] В предпочтительном способе получения конъюгата производного лекарственного средства и антитела общей формулы 1, где обозначения L2, L1, AA и A-X имеют значения, описанные в предыдущих разделах, сначала получают бифункциональный фрагмент лекарственного средства, [L2]-[L1]-[AA]-[A-X]-лекарственное средство, с последующей конъюгацией бифункционального фрагмента лекарственного средства с антителом (обозначенного в данном документе как "МАТ").
m
[080] В предпочтительном способе получения конъюгата производного лекарственного средства и антитела общей формулы 1, где обозначения L2, L1, AA и A-OH имеют значения, описанные в предыдущих разделах, бифункциональный фрагмент лекарственного средства получают путем сначала присоединения A-OH к C-концу AA посредством амидной связи, с последующим сочетанием аминового конца AA с карбоксильной кислотной группой L1. Если AA отсутствует (т.е. m равно 0), A-OH непосредственно присоединен к L1 через амидную связь. Сшивающий агент, [L1]-[AA]-[A-OH], присоединяется к гидроксильной или аминогруппе лекарственного средства, с последующим присоединением к фрагменту L1, путем использования реакции между азидной (или ацетиленовой) и ацетиленовой (или азидной) группами в L1 и L2 методами клик-химии.
2
2
[081] В одном варианте реализации, антитело представляет собой моноклональное антитело (МАТ). В других вариантах реализации, антитело может быть поливалентным и/или мультиспецифическим МАТ. Антитело может быть мышиным, химерным, гуманизированным или человеческим моноклональным антителом, и указанное антитело может находиться в интактной форме, в форме фрагмента (Fab, Fab’, F(ab), F(ab’)) или субфрагмента (одноцепочечные конструкты), или принадлежать к изотипу IgG1, IgG2a, IgG3, IgG4, IgA, или представлять собой их субмолекулы.
[082] В предпочтительном варианте реализации, антитело связывается с антигеном или эпитопом антигена, экспрессируемого на раковой или злокачественной клетке. Раковая клетка, предпочтительно, представляет собой клетку гемопоэтической опухоли, карциномы, саркомы, меланомы или глиальной опухоли. В наиболее предпочтительном варианте реализации, фрагмент антитела представляет собой анти-Trop-2, и КАП анти-Trop-2-SN-38 используется для лечения любого экспрессирующего Trop-2 рака. В другом предпочтительном варианте реализации, внутриклеточно расщепляемый фрагмент может расщепляться после его интернализации в клетку при связывании конъюгатом МАТ-лекарственное средство с его рецептором.
Общие методики антител
[083] Методы получения моноклональных антител против практически любого антигена-мишени хорошо известны специалистам. См., например, Köhler and Milstein, Nature 256:495 (1975), and Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL.1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991). Вкратце, моноклональные антитела могут быть получены путем инъекции мышам композиции, содержащей антиген, извлечения селезенки для получения B-лимфоцитов, слияния B-лимфоцитов с клетками миеломы для получения гибридом, клонирования гибридом, отбора положительных клонов, которые продуцируют антитела к антигену, культивирования клонов, продуцирующих антитела к антигену, и выделения антител из культур гибридомы. Рядовому специалисту в данной области техники будет понятно, что в тех случаях, когда антитела предназначены для введения людям, антитела будут связываться с человеческими антигенами.
[084] МАТ могут быть выделены и очищены из культур гибридом с помощью множества хорошо известных методов. Такие методы выделения включают аффинную хроматографию на сефарозе с белком А или белком G, эксклюзионную хроматографию и ионообменную хроматографию. См., например, Coligan на страницах 2.7.1-2.7.12 и страницах 2.9.1-2.9.3. Также см. Baines et al., “Purification of Immunoglobulin G (IgG)”, в: METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL.10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc.1992).
[085] После первоначального подъема антител к иммуногену эти антитела можно секвенировать и затем получать рекомбинантными методами. Гуманизация и химеризация мышиных антител и фрагментов антител хорошо известны специалистам в данной области, как обсуждается ниже.
[086] Квалифицированному специалисту в данной области будет понятно, что в заявляемых способах и композициях может использоваться любое из множества антител, известных в данной области. Пригодные для использования антитела являются коммерчески доступными из широкого круга известных источников. Например, различные линии гибридом, секретирующих антитела, доступны из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Manassas, VA). Большое количество антител против связанных с различными заболеваниями мишеней, включая, без ограничений, ассоциированные с опухолями антигены, были депонированы в АТСС и/или имеют опубликованные последовательности вариабельной области и доступны для использования в заявляемых способах и композициях. См., например, патенты США №№ 7312318; 7282567; 7151164; 7074403; 7060802; 7056509; 7049060; 7045132; 7041803; 7041802; 7041293; 7038018; 7037498; 7012133; 7001598; 6998468; 6994976; 6994852; 6989241; 6974863; 6965018; 6964854; 6962981; 6962813; 6956107; 6951924; 6949244; 6946129; 6943020; 6939547; 6921645; 6921645; 6921533; 6919433; 6919078; 6916475; 6905681; 6899879; 6893625; 6887468; 6887466; 6884594; 6881405; 6878812; 6875580; 6872568; 6867006; 6864062; 6861511; 6861227; 6861226; 6838282; 6835549; 6835370; 6824780; 6824778; 6812206; 6793924; 6783758; 6770450; 6767711; 6764688; 6764681; 6764679; 6743898; 6733981; 6730307; 6720155; 6716966; 6709653; 6693176; 6692908; 6689607; 6689362; 6689355; 6682737; 6682736; 6682734; 6673344; 6653104; 6652852; 6635482; 6630144; 6610833; 6610294; 6605441; 6605279; 6596852; 6592868; 6576745; 6572856; 6566076; 6562618; 6545130; 6544749; 6534058; 6528625; 6528269; 6521227; 6518404; 6511665; 6491915; 6488930; 6482598; 6482408; 6479247; 6468531; 6468529; 6465173; 6461823; 6458356; 6455044; 6455040; 6451310; 6444206; 6441143; 6432404; 6432402; 6419928; 6413726; 6406694; 6403770; 6403091; 6395276; 6395274; 6387350; 6383759; 6383484; 6376654; 6372215; 6359126; 6355481; 6355444; 6355245; 6355244; 6346246; 6344198; 6340571; 6340459; 6331175; 6306393; 6254868; 6187287; 6183744; 6129914; 6120767; 6096289; 6077499; 5922302; 5874540; 5814440; 5798229; 5789554; 5776456; 5736119; 5716595; 5677136; 5587459; 5443953; 5525338, разделы Примеров каждого из которых включены в данный документ посредством ссылок. Это перечисление приведено только в качестве примера, и в данной области техники известно множество других антител и их гибридом. Квалифицированному специалисту в данной области понятно, что последовательности антител или секретирующие антитела гибридомы против практически любого ассоциированного с заболеванием антигена могут быть получены простым поиском в базах данных ATCC, NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) и/или USPTO (Бюро по патентам и товарным знакам США) антител против выбранной ассоциированной с заболеванием мишени, представляющей интерес. Антигенсвязывающие домены клонированных антител могут быть амплифицированы, вырезаны, лигированы в вектор экспрессии, трансфицированы в адаптированную клетку-хозяина и использованы для продуцирования белка с использованием стандартных методов, хорошо известных в данной области. Выделенные антитела могут быть конъюгированы с терапевтическими агентами, такими как камптотецины, с использованием методик, раскрытых в данном документе.
Химерные и гуманизированные антитела
[087] Химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, в котором вариабельные области человеческого антитела были заменены вариабельными областями, например, мышиного антитела, включая определяющие комплементарность области (CDR) мышиного антитела. Химерные антитела проявляют пониженную иммуногенность и повышенную стабильность при введении субъекту. Способы конструирования химерных антител хорошо известны специалистам (например, Leung et al., 1994, Hybridoma 13:469).
[088] Химерное моноклональное антитело может быть гуманизировано путем переноса мышиных CDR из тяжелых и легких вариабельных цепей мышиного иммуноглобулина в соответствующие вариабельные домены человеческого антитела. Каркасные области мыши (FR) в химерном моноклональном антителе также заменяют последовательностями FR человека. Для сохранения стабильности и антигенной специфичности гуманизированного моноклонального (антитела), один или несколько человеческих остатков FR могут быть заменены мышиными аналогами. Гуманизированные моноклональные антитела могут быть использованы для терапевтического лечения субъектов. Методы получения гуманизированных моноклональных антител хорошо известны специалистам (см., например, Jones et al., 1986, Nature, 321:522; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534; Carter et al., 1992, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89:4285; Sandhu, Crit. Rev. Biotech., 1992, 12:437; Tempest et al., 1991, Biotechnology 9:266; Singer et al., J. Immun., 1993, 150:2844).
[089] Другие варианты реализации могут относиться к антителам приматов, отличных от человека. Общие методы выращивания терапевтически полезных антител у бабуинов приведены, например, в Goldenberg et al., WO 91/11465 (1991) и Losman et al., Int. J. Cancer 46:310 (1990). В другом варианте реализации, антитело может быть человеческим моноклональным антителом. Такие антитела могут быть получены от трансгенных мышей, которые были модифицированы для продуцирования специфических человеческих антител в ответ на антигенную стимуляцию, как описано ниже.
Человеческие антитела
[090] Способы получения полностью человеческих антител с использованием либо комбинаторных подходов, либо трансгенных животных, трансформированных локусами человеческого иммуноглобулина, известны специалистам (например, Mancini et al., 2004, New Microbiol. 27:315-28; Conrad and Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117-26; Brekke and Loset, 2003, Curr. Opin. Phamacol. 3:544-50; которые все включены в данный документ посредством ссылок). Ожидается, что такие полностью человеческие антитела будут проявлять даже меньше побочных эффектов, чем химерные или гуманизированные антитела, и будут функционировать in vivo, как по существу эндогенные человеческие антитела. В определенных вариантах реализации, в заявляемых способах и процедурах могут использоваться антитела человека, продуцируемые такими способами.
[091] В одной альтернативе, метод фагового дисплея может быть использован для генерирования антител человека (например, Dantas-Barbosa et al., 2005, Genet. Mol. Res. 4:126-40, включена в данный документ посредством ссылки). Человеческие антитела могут генерироваться у нормальных людей или у людей с проявлениями определенного болезненного состояния, такого как рак (Dantas-Barbosa et al., 2005). Преимущество конструирования человеческих антител у больного человека заключается в том, что репертуар циркулирующих антител может быть смещен в сторону антител против связанных с заболеванием антигенов.
st
[092] В одном неограничительном примере этой методологии, Dantas-Barbosa et al. (2005) сконструировали библиотеку фагового дисплея фрагментов человеческого Fab-антитела от пациентов с остеосаркомой. Как правило, общую РНК получали из циркулирующих лимфоцитов крови (там же). Рекомбинантные Fab клонировали из репертуаров антител с µ-, γ- и κ-цепями и вставляли в библиотеку фагового дисплея (там же). РНК были преобразованы в кДНК и использованы для создания библиотек кДНК Fab с использованием специфических праймеров против последовательностей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97, включена в данный документ посредством ссылки). Конструирование библиотеки проводили в соответствии с Andris-Widhopf et al. (2000, в:Phage Display Laboratory Manual, Barbas et al. (eds), 1 edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY pp. 9.1 to 9.22, включена в данный документ посредством ссылки). Конечные фрагменты Fab расщепляли рестрикционными эндонуклеазами и вставляли в геном бактериофага для создания библиотеки фагового дисплея. Такие библиотеки могут быть подвергнуты скринингу стандартными методами фагового дисплея. Квалифицированному специалисту в данной области будет понятно, что эта методика является только иллюстративным примером, и может быть использован любой известный способ получения и скрининга человеческих антител или фрагментов антител с помощью фагового дисплея.
[093] В другой альтернативе, трансгенные животные, которые были генетически модифицированы для продуцирования человеческих антител, могут быть использованы для генерирования антител против практически любой иммуногенной мишени с использованием стандартных протоколов иммунизации, как описано выше. Методы получения антител человека от трансгенных мышей описаны Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), и Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994). Неограничительным примером такой системы является XENOMOUSE (например, Green et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23, включена в данный документ посредством ссылки) фирмы Abgenix (Fremont, CA). У XENOMOUSE подобных животных гены антител мыши были инактивированы и заменены функциональными генами антител человека, в то время как остальная часть иммунной системы мыши остается интактной.
[094] Трансформацию трансгенных мышей проводили с помощью сконфигурированных с зародышевой линией YAC (искусственные хромосомы дрожжей), которые содержали участки человеческих локусов IgH и Ig-каппа, включая большинство последовательностей вариабельной области, вместе со (along) вспомогательными генами и регуляторными последовательностями. Репертуар вариабельной области человека может быть использован для генерирования антителопродуцирующих В-клеток, которые могут быть переработаны в гибридомы известными способами. XENOMOUSE, иммунизированная антигеном-мишенью, будет продуцировать человеческие антитела посредством нормального иммунного ответа, которые можно собирать и/или продуцировать стандартными способами, описанными выше. Доступны различные штаммы генетически модифицированных мышей, продуцирующие каждый разные классы антител. Было показано, что трансгенно продуцируемые человеческие антитела обладают терапевтическим потенциалом, сохраняя при этом фармакокинетические свойства нормальных человеческих антител (Green et al., 1999). Квалифицированному специалисту в данной области будет понятно, что заявляемые композиции и способы не ограничиваются использованием системы XENOMOUSE, но могут использовать любое трансгенное животное, которое было генетически модифицировано для получения антител человека.
Получение фрагментов антител
2
2
[095] Некоторые варианты реализации заявляемых способов и/или композиций могут касаться фрагментов антител. Такие фрагменты антител могут быть получены, например, путем расщепления пепсином или папаином целых антител обычными способами. Например, фрагменты антител могут быть получены путем ферментативного расщепления антител пепсином с получением фрагмента 5S, обозначенного F(ab'). Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с использованием тиольного восстановителя и, необязательно, блокирующей группы для сульфгидрильных групп, образующихся в результате расщепления дисульфидных связей, с получением моновалентных фрагментов 3.5S Fab'. Альтернативно, ферментативное расщепление с использованием пепсина дает два моновалентных Fab-фрагмента и Fc-фрагмент. Два Fab-фрагмента могут быть ковалентно конъюгированы с образованием F(ab) фрагмента антитела. Примерные способы получения фрагментов антител раскрыты в патенте США № 4036945; патенте США № 4331647; Nisonoff et al., 1960, Arch. Biochem. Biophys., 89:230; Porter, 1959, Biochem. J., 73:119; Edelman et al., 1967, METHODS IN ENZYMOLOGY, page 422 (Academic Press), и Coligan et al. (eds.), 1991, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, (John Wiley & Sons).
H
L
[096] Другие методы расщепления антител, такие как разделение тяжелых цепей с образованием моновалентных фрагментов легкой-тяжелой цепей, дальнейшее расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические методы, также могут быть использованы при условии, что фрагменты связываются с антигеном, распознаваемым интактным антителом. Например, фрагменты Fv содержат ассоциацию V и V цепей. Эта ассоциация может быть нековалентной, как описано в Inbar et al., 1972, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 69:2659. Альтернативно, вариабельные цепи может быть соединены межмолекулярной дисульфидной связью или сшиты химическими реагентами, такими как глутаральдегид. См. Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech., 12:437.
H
L
H
L
[097] Предпочтительно, фрагменты Fv содержат V и V-цепи, соединенные пептидным линкером. Такие одноцепочечные антигенсвязывающие белки (scFv) получают путем конструирования структурного гена, содержащего последовательности ДНК, кодирующие V и V домены, соединенные олигонуклеотидной линкерной последовательностью. Структурный ген встраивается в экспрессионный вектор, который впоследствии вводится в клетку-хозяина, такую как Е. coli. Рекомбинантные клетки-хозяева синтезируют одну полипептидную цепь с линкерным пептидом, связывающим два V-домена. Способы получения scFv хорошо известны в данной области. См. Whitlow et al., 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97; Bird et al., 1988, Science, 242:423; патент США № 4946778; Pack et al., 1993, Bio/Technology, 11:1271, и Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech., 12:437.
[098] Другая форма фрагмента антитела представляет собой однодоменное антитело (dAb), которое иногда называют одноцепочечным антителом. Методы получения однодоменных антител хорошо известны специалистам (см., например, Cossins et al., Protein Expression and Purification, 2007, 51:253-59; Shuntao et al., Molec Immunol 2006, 43:1912-19; Tanha et al., J. Biol. Chem. 2001, 276:24774-780). Другие типы фрагментов антител могут содержать одну или несколько областей, определяющих комплементарность (CDR). Пептиды CDR («минимальные единицы распознавания») могут быть получены путем конструирования генов, кодирующих CDR антитела, представляющего интерес. Такие гены получают, например, путем использования полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области из РНК антителопродуцирующих клеток. См. Larrick et al., 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106; Ritter et al. (eds.), 1995, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, pages 166-179 (Cambridge University Press); Birch et al., (eds.), 1995, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc.)
Варианты антител
nd
[099] В определенных вариантах реализации, последовательности антителл, такие как Fc-областей антител, можно варьировать с целью оптимизации физиологических характеристик конъюгатов, таких как период полувывдения из сыворотки. Способы замещения аминокислотных последовательностей в белках широко известны в данной области, такие как сайт-направленный мутагенез (например, Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2 Ed, 1989). В предпочтительных вариантах реализации, изменения могут включать добавление или удаление одного или нескольких сайтов гликозилирования в последовательности Fc (например, патент США № 6254868, раздел Примеров которого включен в данный документ посредством ссылки). В других предпочтительных вариантах реализации, могут быть проведены специфические аминокислотные замещения в последовательности Fc (например, Hornick et al., 2000, J Nucl Med 41:355-62; Hinton et al., 2006, J Immunol 176:346-56; Petkova et al. 2006, Int Immunol 18:1759-69; патент США № 7217797; которые все включены в данный документ посредством ссылок).
Антигены-мишени и типичные антитела
6
6
7
[0100] В предпочтительном варианте осуществления используют антитела, распознающие и/или связывающиеся с антигенами, которые экспрессируются с высокими уровнями на клетках-мишенях, и которые экспрессируются преимущественно или исключительно на пораженных клетках по сравнению с нормальными тканями. Более предпочтительно, антитела быстро интернализуются после связывания. Типичным быстро интернализующимся антителом является антитело LL1 (анти-CD74), со скоростью интернализации приблизительно 8×10 молекул антитела на клетку в день (например, Hansen et al., 1996, Biochem J. 320:293-300). Таким образом, "быстро интернализующееся" антитело может быть антителом со скоростью интернализации от примерно 1×10 до примерно 1×10молекул антитела на клетку в день. Антитела, пригодные для использования в заявляемых композициях и способах, могут включать МАТ со свойствами, указанными выше. Типичные антитела, используемые для терапии, например, рака, включают, без ограничений, LL1 (анти-CD74), LL2 или RFB4 (анти-CD22), велтузумаб (hA20, анти-CD20), ритуксумаб (анти-CD20), обинутузумаб (GA101, анти-CD20), ламбролизумаб (против рецептора PD-1), ниволумаб (против рецептора PD-1), ипилимумаб (анти-CTLA-4), RS7 (анти-Trop-2), PAM4 или KC4 (оба против муцина), MN-14 (против раково-эмбрионального антигена (CEA, также известен как CD66e или CEACAM5)), MN-15 или MN-3 (анти-CEACAM6), Mu-9 (против специфического для толстой кишки антигена-p), Immu 31 (против альфа-фетопротеина), R1 (анти-IGF-1R), A19 (анти-CD19), TAG-72 (например, CC49), Tn, J591 или HuJ591 (анти-PSMA (простатический специфический мембранный антиген)), AB-PG1-XG1-026 (димер анти-PSMA), D2/B (анти-PSMA), G250 (МАТ против карбоангидразы IX), L243 (анти-HLA-DR) алемтузумаб (анти-CD52), бевацизумаб (анти-VEGF), цетуксимаб (анти-EGFR), гемтузумаб (анти-CD33), ибритумомаб тиуксетан (анти-CD20); панитумумаб (анти-EGFR); тозитумомаб (анти-CD20); PAM4 (также кливатузумаб, анти-MUC5ac) и трастузумаб (анти-ErbB2). Такие антитела известны специалистам (например, патенты США №№ 5686072; 5874540; 6107090; 6183744; 6306393; 6653104; 6730300; 6899864; 6926893; 6962702; 7074403; 7230084; 7238785; 7238786; 7256004; 7282567; 7300655; 7312318; 7585491; 7612180; 7642239; и публикации патентных заявок США №№ 20050271671; 20060193865; 20060210475; 20070087001; разделы Примеров каждого из которых включены в данный документ посредством ссылок). Конкретные известные пригодные для применения антитела включают hPAM4 (патент США № 7282567), hA20 (патент США № 7151164), hA19 (патент США № 7109304), hIMMU-31 (патент США № 7300655), hLL1 (патент США № 7312318), hLL2 (патент США № 5789554), hMu-9 (патент США № 7387772), hL243 (патент США № 7612180), hMN-14 (патент США № 6676924), hMN-15 (патент США № 8287865), hR1 (патент США № 9441043), hRS7 (патент США № 7238785), hMN-3 (патент США № 7541440), AB-PG1-XG1-026 (патентная заявка США 11/983372, депонирован как ATCC PTA-4405 и PTA-4406) и D2/B (WO 2009/130575), причем текст каждого указанного патента или заявки включен в данный документ посредством ссылок в отношении Фигур и разделов Примеров. В особенно предпочтительном варианте реализации, антитело представляет собой hRS7.
[0101] Другие пригодные антигены, которые могут быть мишенями при использовании описанных конъюгатов, включают карбоангидразу IX, B7, CCL19, CCL21, CSAp, HER-2/neu, BrE3, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20 (например, C2B8, hA20, МАТ 1F5), CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CEACAM5, CEACAM6, CTLA-4, альфа-фетопротеин (AFP), VEGF (например, бевацизумаб, расщепленный вариант фибронектина (fibronectin splice variant)), ED-B фибронектина (например, L19), Trop-2, EGP-2 (например, 17-1A), рецептор EGF (ErbB1) (например, цетуксимаб), ErbB2, ErbB3, фактор H, FHL-1, Flt-3, фолатный рецептор, Ga 733,GRO-β, HMGB-1, гипоксия-индуцируемый фактор (HIF), HM1.24, HER-2/neu, инсулиноподобный фактор роста (ILGF), IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IFN-λ, IL-2R, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-25, IP-10, IGF-1R, Ia, HM1.24, ганглиозиды, HCG, антиген HLA-DR, с которым связывается L243, антигены CD66, т.е., CD66a-d или их комбинация, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (MIF), MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5ac, плацентарный фактор роста (PlGF), PSA (специфический антиген простаты), PSMA, антиген PAM4, PD-1, PD-L1, NCA-95, NCA-90, A3, A33, Ep-CAM, KS-1, Le(y), мезотелин, S100, тенасцин, TAC, антиген Tn, антигены Томсена-Фриденрайха (Thomas-Friedenreich), антигены некроза опухоли, антигены ангиогенеза опухоли, TNF-α, рецептор TRAIL (R1 и R2), Trop-2, VEGFR, RANTES, T101, а также антигены раковых стволовых клеток, факторы комплемента C3, C3a, C3b, C5a, C5, и продукт онкогена.
[0102] Комплексный анализ пригодных антигенов-мишеней (обозначение кластеров (Cluster Designation, или CD)) на гематопоэтических злокачественных клетках, как показано с помощью проточной цитометрии, который могут служить руководством для выбора подходящих антител для иммунотерапии конъюгатами с лекарственными средствами, представлен Craig and Foon, Blood, предварительная интернет-публикация 15 января 2008 г.; DOL 10.1182/blood-2007-11-120535.
[0103] Антигены CD66 состоят из пяти разных гликопротеинов со схожими структурами, CD66a-e, кодируемых членами генного семейства раково-эмбрионального антигена (РЭА) - БЦЖ, CGM6, NCA, CGM1 и CEA, соответственно. Эти антигены CD66 (например, CEACAM6) экспрессируются главным образом в гранулоцитах, нормальных эпителиальных клетках пищеварительного тракта и опухолевых клетках различных тканей. К пригодным мишеням при раках также относятся антигены рака яичка, такие как NY-ESO-1 (Theurillat et al., Int. J. Cancer 2007; 120(11):2411-7), а также CD79a при миелолейкозе (Kozlov et al., Cancer Genet. Cytogenet. 2005; 163(1):62-7) и также заболеваниях B-клеток, и CD79b при неходжкинской лимфоме (Poison et al., Blood 110(2):616-623). Ряд вышеупомянутых антигенов раскрыт в предварительной заявке № 60/426379, озаглавленной “Использование мультиспецифических нековалентных комплексов для адресной доставки терапевтических средств" (Use of Multi-specific, Non-covalent Complexes for Targeted Delivery of Therapeutics), поданной 15 ноября 2002 г. Раковые стволовые клетки, которые описываются как более устойчивые к терапии популяции злокачественных клеток-предшественников (Hill and Perris, J. Natl. Cancer Inst. 2007; 99:1435-40), имеют антигены, которые могут быть нацелены на определенные типы рака, такие как CD133 при раке предстательной железы (Maitland et al., Ernst Schering Found. Sympos. Proc. 2006; 5:155-79), немелкоклеточном раке легкого (Donnenberg et al., J. Control Release 2007; 122(3):385-91) и глиобластоме (Beier et al., Cancer Res. 2007; 67(9):4010-5), и CD44 при колоректальном раке (Dalerba er al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007; 104(24)10158-63), раке поджелудочной железы (Li et al., Cancer Res. 2007; 67(3):1030-7), и при плоскоклеточном раке головы и шеи (Prince et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007; 104(3)973-8). Другой пригодной мишенью для терапии рака молочной железы является антиген LIV-1, описанный Taylor et al. (Biochem. J. 2003; 375:51-9). Антиген CD47 является дополнительной пригодной мишенью для раковых стволовых клеток (см., например, Naujokat et al., 2014, Immunotherapy 6:290-308; Goto et al., 2014, Eur J Cancer 50:1836-46; Unanue, 2013, Proc Natl Acad Sci USA 110:10886-7).
[0104] Для терапии множественной миеломы были описаны пригодные нацеливающие антитела против, например, CD38 и CD138 (Stevenson, Mol Med 2006; 12(11-12):345-346; Tassone et al., Blood 2004; 104(12):3688-96), CD74 (Stein et al., ibid.),CS1 (Tai et al., Blood 2008; 112(4):1329-37, и CD40 (Tai et al., 2005; Cancer Res. 65(13):5898-5906).
[0105] Антитела ингибиторов контрольных точек были использованы в терапии рака. Иммунные контрольные точки относятся к ингибирующим путям в иммунной системе, которые ответственны за поддержание самотолерантности и модулирование степени реакции иммунной системы, чтобы минимизировать повреждения периферических тканей. Однако, опухолевые клетки также могут активировать контрольные точки иммунной системы для снижения эффективности иммунного ответа против опухолевых тканей. Типичные примеры антител ингибиторов контрольных точек против антигена цитотоксических Т-лимфоцитов-4 (CTLA4, также известен как CD152), белок 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1, также известен как CD279) и лиганд 1 (белка) 1 запрограммированной гибели клеток (PD-L1, также известен как CD274), могут быть использованы в комбинации с одним или несколькими другими агентами для повышения эффективности иммунного ответа против клеток, тканей или патогенов заболевания. Типичные примеры анти-PD-1 антител включают ламбролизумаб (MK-3475, Merck), ниволумаб (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb), AMP-224 (Merck), и пидилизумаб (CT-011, CURETECH LTD.). Анти-PD-1 антитела являются коммерчески доступными, например от Abcam (ab137132), BIOLEGEND (EH12.2H7, RMP1-14) и Affymetrix ebioscience (j105, j116, mih4). Типичные примеры анти-PD-L1 антител включают MDX-1105 (MEDAREX), MEDI4736 (MEDIMMUNE) MPDL3280A (GENENTECH) и BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb). Анти-PD-L1 антитела также являются коммерчески доступными, например, от AFFYMETRIX EBIOSCIENCE (MIH1). Типичные примеры анти-CTLA4 антител включают ипилимумаб (Bristol-Myers Squibb) и тремелимумаб (Pfizer). Анти-PD1 антитела являются коммерчески доступными, например, от Abcam (ab134090), SINO BIOLOGICAL INC. (11159-H03H, 11159-H08H), и THERMO SCIENTIFIC PIERCE (PA5-29572, PA5-23967, PA5-26465, MA1-12205, MA1-35914). Ипилимумаб недавно получил одобрение FDA (Управление по контролю за пищевыми продуктами и медикаментами США) для лечения метастатической меланомы (Wada et al., 2013, J Transl Med 11:89).
[0106] Фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF) является важным регулятором врожденного и адаптивного иммунитета и апоптоза. Сообщалось, что CD74 является эндогенным рецептором MIF (Leng et al., 2003, J Exp Med 197:1467-76). Терапевтический эффект антагонистических анти-CD74 антител на опосредованные MIF внутриклеточные пути может быть полезен для лечения широкого спектра болезненных состояний, таких как виды рака мочевого пузыря, простаты, молочной железы, легкого, толстой кишки и хронический лимфолейкоз (например, Meyer-Siegler et al., 2004, BMC Cancer 12:34; Shachar & Haran, 2011, Leuk Lymphoma 52:1446-54); аутоиммунные болезни, такие как ревматоидный артрит и системная красная волчанка (Morand & Leech, 2005, Front Biosci 10:12-22; Shachar & Haran, 2011, Leuk Lymphoma 52:1446-54); болезни почек, такие как отторжение почечного аллотрансплантата (Lan, 2008, Nephron Exp Nephrol.109:e79-83); и многочисленные воспалительные заболевания (Meyer-Siegler et al., 2009, Mediators Inflamm epub March 22, 2009; Takahashi et al., 2009, Respir Res 10:33; милатузумаб (hLL1) представляет собой типичное типичный пример анти-CD74 антитела, пригодного для терапевтического применения при лечнии опосредованных MIF заболеваний.
[0107]  Анти-TNF-α антитела известны специалистам и могут быть использованы для лечения различных болезней. Известные антитела против TNF-α включают человеческое антитело CDP571 (Ofei et al., 2011, Diabetes 45:881-85); мышиные антитела MTNFAI, M2TNFAI, M3TNFAI, M3TNFABI, M302B и M303 (Thermo Scientific, Rockford, IL); инфликсимаб (Centocor, Malvern, PA); цертолизумаб пэгол (UCB, Brussels, Belgium); и адалимумаб (Abbott, Abbott Park, IL). Эти и многие другие известные анти-TNF-α антитела могут быть использованы в заявляемых способах и композициях.
[0108] В другом предпочтительном варианте реализации используются антитела, которые быстро интернализуются и затем повторно экспрессируются, процессируются и презентуются на клеточных поверхностях, обеспечивая непрерывное поглощение клеткой и образование скоплений (accretion) циркулирующего конъюгата. Примером наиболее предпочтительной пары антитело/антиген является LL1, МАТ против CD74 (инвариантная цепь, специфичный для класса II шаперон, Ii) (см., например, патенты США №№ 6653104; 7312318; разделы Примеров каждого из которых включены в данный документ посредством ссылок). Антиген CD74 экспрессируется с высокими уровнями на B-клеточных лимфомах (включая множественную миелому) и лейкозах, некоторые T-клеточные лимфомы, меланомы, виды рака толстой кишки, легкого и почки, глиобластомы, и некоторые другие виды рака (Ong et al., Immunology 98:296-302 (1999)). Обзор использования антител против CD74 при раке содержится в Stein et al., Clin Cancer Res.2007 Sep 15; 13(18 Pt 2):5556s-5563s, и включен в данный документ посредством ссылки.
[0109] Заболевания, которые предпочтительно лечат антителами против CD74, включают, без ограничений, неходжкинскую лимфому, болезнь Ходжкина, меланому, виды рака легкого, почки, толстой кишки, мультиформную глиобластому, гистиоцитомы, миелолейкозы и множественную миелому. Непрерывная экспрессия антигена CD74 в течение коротких периодов времени на поверхности клеток-мишеней, с последующей интернализацией антигена и повторной экспрессией антигена создает возможность интернализации нацеливающего антитела LL1 вместе с любым химиотерапевтическим фрагментом, который он несет. Это позволяет накапливать высокую и терапевтическую концентрацию конъюгата LL1-химиотерапевтическое лекарственное средство внутри таких клеток. Интернализированные конъюгаты LL1-химиотерапевтическое лекарственное средство циклически проходят через лизосомы и эндосомы, и химиотерапевтический фрагмент высвобождается в активной форме в клетках-мишенях.
[0110] Указанные выше антитела и другие известные антитела против связанных с заболеванием антигенов могут быть использованы в качестве конъюгатов СРТ, более предпочтительно - конъюгатов SN-38, в практике заявляемых способов и композиций. В наиболее предпочтительном варианте осуществления, конъюгированное с лекарственным средством антитело представляет собой конъюгат антитело против Trop-2-SN-38 (например, hRS7-SN-38).
Биспецифические и мультиспецифические антитела
[0111] Биспецифические антитела полезны в ряде биомедицинских применений. Например, биспецифическое антитело с сайтами связывания антигена поверхности опухолевой клетки и рецептора поверхности Т-клеток может направлять лизис определенных опухолевых клеток Т-клетками. Биспецифические антитела, распознающие глиомы и эпитоп CD3 на Т-клетках, успешно использовались при лечении опухолей головного мозга у людей (Nitta, et al. Lancet. 1990; 355:368-371). Предпочтительным биспецифическим антителом является антитело против CD3 × против Trop-2. В альтернативных вариантах реализации, анти-CD3 антитело или его фрагмент могут быть присоединены к антителу или фрагменту против антигена, ассоциированного с B-клеткой, например, анти-CD3 × анти-CD19, анти-CD3 × анти-CD20, анти-CD3 × анти-CD22, анти-CD3 × анти-HLA-DR или анти-CD3 × анти-CD74. В определенных вариантах осуществления способы и композиции для конъюгации терапевтического агента, раскрытые в данном документе, могут использоваться с биспецифическими или мультиспецифическими антителами в качестве нацеливающих фрагментов.
[0112] Многочисленные способы получения биспецифических или мультиспецифических антител известны, как раскрыто, например, в патенте США № 7405320, раздел Примеров которого включен в данный документ посредством ссылки.биспецифические антитела могут быть получены методом квадромы, который включает слияние двух разных гибридом, продуцирующих каждая моноклональное антитело, распознающие разные антигенные сайты (Milstein and Cuello, Nature, 1983; 305:537-540).
[0113] Другой способ получения биспецифических антител использует гетеробифункциональные перекрёстносшивающие агенты для химического связывания двух разных моноклональных антител (Staerz, et al. Nature, 1985; 314:628-631; Perez, et al. Nature, 1985; 316:354-356). Биспецифические антитела также могут быть получены восстановлением каждого из двух родительских моноклональных антител до соответствующих полумолекул, которые затем смешивают и создают возможность для повторного окисления с целью получения гибридной структуры (Staerz and Bevan. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986; 83:1453-1457). Другая альтернатива включает химическое сшивание двух или трех отдельно очищенных Fab'-фрагментов с использованием соответствующих линкеров.(см., например, европейскую патентную заявку 0453082).
[0114] Другие способы включают повышение эффективности создания гибридных гибридом путем переноса генов различных селектируемых маркеров с помощью полученных из ретровирусов челночных векторов в соответствующие родительские гибридомы, которые впоследствии сливаются (DeMonte, et al. Proc Natl Acad Sci U S A.1990, 87:2941-2945); или трансфекции гибридомной клеточной линии экспрессионными плазмидами, содержащими гены тяжелой и легкой цепей другого антитела.
H
L
H
L
H
L
H
L
H
L
L
H
[0115] Родственные V- и V-домены могут быть соединены пептидным линкером соответствующего состава и длины (обычно состоящим из более чем 12 аминокислотных остатков) с образованием одноцепочечного Fv (scFv), обладающего связывающей активностью. Способы получения scFv раскрыты в патенте США № 4946778 и патенте США № 5132405, разделы Примеров каждого из которых включены в данный документ посредством ссылок. Уменьшение длины пептидного линкера до менее чем 12 аминокислотных остатков предотвращает спаривание доменов V и V в одной цепи и приводит к спариванию доменов V и V с комплементарными доменами других цепей, приводя к образованию функциональных мультимеров. Полипептидные цепи доменов V и V, которые соединены линкерами размером от 3 до 12 аминокислотных остатков образуют преимущественно димеры (называемые диателами). С линкерами резмером от 0 до 2 аминокислотных остатков предпочтительными являются тримеры (называемые триателами) и тетрамеры (называемые тетрателами), но точные схемы олигомеризации, по-видимому, зависят от состава, а также от ориентации V-доменов (V-линкер-V или V-линкер-V), в дополнение к длине линкера.
[0116] Эти способы получения мультиспецифических или биспецифических антител имеют различные трудности с точки зрения низкого выхода, необходимости очистки, низкой стабильности или трудоемкости метода. Совсем недавно метод, известный как «док-и-лок" (dock and lock, DNL) использовался для получения комбинаций практически любых желаемых антител, фрагментов антител и других эффекторных молекул (см., например, патенты США №№ 7521056; 7527787; 7534866; 7550143; 7666400; 7858070; 7871622; 7906121; 7906118; 8163291; 7901680; 7981398; 8003111 и 8034352, разделы Примеров каждого из которых включены в данный документ посредством ссылок). В этом методе используются домены, связывающие комплементарный белок, называемые якорными доменами (AD) и доменами димеризации и стыковки (DDD), которые связываются друг с другом и позволяют собирать сложные структуры, начиная от димеров, тримеров, тетрамеров, квинтамеров и гексамеров. Они образуют стабильные комплексы с высоким выходом без необходимости интенсивной очистки. Методика DNL позволяет собирать моноспецифические, биспецифические или мультиспецифические антитела. Любые методы, известные в данной области для получения биспецифических или мультиспецифических антител, могут быть использованы в практике заявляемых в данном документе способов.
Аллотипы антител
[0117] Иммуногенность терапевтических антител связана с повышенным риском инфузионных реакций и уменьшением продолжительности терапевтического ответа (Baert et al., 2003, N Engl J Med 348:602-08). Степень, в которой терапевтические антитела индуцируют иммунный ответ у хозяина, может частично определяться аллотипом антитела (Stickler et al., 2011, Genes and Immunity 12:213-21). Аллотип антитела связан с вариациями аминокислотных последовательностей в определенных положениях последовательностей константной области антитела. Аллотипы антител IgG, содержащих константную область γ-типа тяжелой цепи, обозначают как аллотипы Gm (1976, J Immunol 117:1056-59).
[0118] Для обычных человеческих антител IgG1 наиболее распространенным аллотипом является G1m1 (Stickler et al., 2011, Genes and Immunity 12:213-21). Однако аллотип G1m3 также часто встречается у людей, принадлежащих к европеоидной расе (там же). Сообщалось, что антитела G1m1 содержат аллотипические последовательности, которые имеют тенденцию индуцировать иммунный ответ при введении реципиентам, не относящимся к G1m1 (nG1m1), таким как пациенты G1m3 (там же). Антитела, не относящиеся к аллотипу G1m1, не являются иммуногенными при введении пациентам G1m1 (там же).
[0119] Аллотип G1m1 человека содержит аминокислоты аспарагиновую кислоту в положении 356 по Кабат (Kabat) и лейцин в положении 358 по Кабат в последовательности СН3 тяжелой цепи IgG1. Аллотип nG1m1 содержит аминокислоты глутаминовую кислоту в положении 356 по Кабат и метионин в положении 358 по Кабат. Как G1m1, так и nG1m1 аллотипы содержат остаток глутаминовой кислоты в положении 357 по Кабат, и эти аллотипы иногда называют аллотипами DEL и EEM. Неограничивающий пример последовательностей константной области тяжелой цепи для антител аллотипов G1m1 и nG1m1 показан для типичных антител ритуксимаба (SEQ ID NO: 8) и велтузумаба (SEQ ID NO: 9).
Последовательность вариабельной области тяжелой цепи ритуксимаба (SEQ ID NO: 8)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Вариабельная область тяжелой цепи велтузумаба (SEQ ID NO: 9)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0120] В работе Jefferis and Lefranc (2009, mAbs 1:1-7) приведен обзор вариаций последовательностей, характерных для аллотипов IgG, и их влияния на иммуногенность. Они сообщили, что аллотип G1m3 характеризуется остатком аргинина в положении 214 по Кабат, по сравнению с остатком лизина в положении 214 по Кабат в аллотипе G1m17. Аллотип nG1m1,2 характеризовался глутаминовой кислотой в положении 356 по Кабат, метионином в положении 358 по Кабат и аланином в положении 431 по Кабат. Аллотип G1m1,2 характеризовался аспарагиновой кислотой в положении 356 по Кабат, лейцином в положении 358 по Кабат и глицином в положении 431 по Кабат. В дополнение к вариантам последовательности константной области тяжелой цепи Jefferis and Lefranc (2009) сообщили об аллотипических вариантах в константной области легкой цепи каппа, причем аллотип Km1 характеризуется валином в положении 153 по Кабат и лейцином в положении 191 по Кабат, аллотип Km1,2 - аланином в положении 153 по Кабат и лейцином в положении 191 по Кабат, и аллотип Km3 характеризуется аланином в положении 153 по Кабат и валином в положении 191 по Кабат.
[0121] Что касается терапевтических антител, то велтузумаб и ритуксимаб являются, соответственно, гуманизированным и химерным антителами IgG1 против CD20, которые используются для терапии широкого спектра гематологических злокачественных новообразований. В Таблице 1 приведено сравнение аллотипических последовательностей ритуксимаба и велтузумаба. Как показано в Таблице 1, ритуксимаб (G1m17,1) представляет собой DEL-аллотип IgG1, с дополнительным изменением последовательности в положении 214 по Кабат (CH1 тяжелой цепи) с лизина в ритуксимабе на аргинин в велтузумабе. Сообщалось, что велтузумаб является менее иммуногенным для людей, чем ритуксимаб (см., например, Morchhauser et al., 2009, J Clin Oncol 27:3346-53; Goldenberg et al., 2009, Blood 113:1062-70; Robak & Robak, 2011, BioDrugs 25:13-25), и этот эффект был приписан разнице между гуманизированным и химерным антителами. Однако различия между аллотипами EEM и DEL, вероятно, также объясняют более низкую иммуногенность велтузумаба.
Таблица 1. Сравнение аллотипов ритуксимаба и велтузумаба
Положение в тяжелой цепи и ассоциированные аллотипы
Полный аллотип
214 (аллотип)
356/358 (аллотип)
431 (аллотип)
Ритуксимаб
G1m17,1
K
17
D/L
1
A
-
Велтузумаб
G1m3
R
3
E/M
-
A
-
[0122] Для снижения иммуногенности терапевтических антител у индивидуумов с генотипом nG1m1 желательно выбрать аллотип антитела, соответствующий аллотипу G1m3, характеризующемуся аргинином в положении 214 по Кабат, и нуль-аллотипу nG1m1,2, характеризующемуся глутаминовой кислотой в положении 356 по Кабат, метионином в положении 358 по Кабат и аланином в положении 431 по Кабат. Неожиданно было обнаружено, что повторное подкожное введение антител G1m3 в течение длительного периода времени не приводило к значительному иммунному ответу. В альтернативных вариантах реализации тяжелая цепь человеческого IgG4 содержит аргинин в положении 214 по Кабат, глутаминовую кислоту в положении 356 по Кабат, метионин в положении 359 по Кабат и аланин в положении 431 по Кабат, как и аллотип G1m3. Поскольку иммуногенность, по-видимому, связана, по меньшей мере частично, с остатками в этих положениях, использование последовательности константной области тяжелой цепи человеческого IgG4 для терапевтических антител также является предпочтительным вариантом реализации. Комбинации антител IgG1 G1m3 с антителами IgG4 также могут быть использованы для терапевтического введения.
Протоколы конъюгирования
131
[0123] Антитела или их фрагменты могут быть конъюгированы с одним или несколькими терапевтическими или диагностическими агентами. Терапевтические агенты не обязательно должны быть одинаковыми, но могут быть разными, например, лекарственный препарат и радиоизотоп. Например, I может быть включен в тирозин антитела или гибридного белка, а лекарственное средство - присоединено к эпсилон-аминогруппе остатка лизина. Терапевтические и диагностические агенты также могут быть присоединены, например, к восстановленным группам SH и/или к углеводным боковым цепям. В данной области известно много способов получения ковалентных или нековалентных конъюгатов терапевтических или диагностических агентов с антителами или гибридными белками, и любой такой известный способ может быть использован.
[0124] Терапевтический или диагностический агент может быть присоединен к шарнирной области компонента восстановленного антитела путем образования дисульфидной связи. Альтернативно, такие агенты могут быть присоединены с использованием гетеробифункционального сшивающего агента, такого как N-сукцинил-3-(2-пиридилдитио) пропионат (SPDP).Yu et al., Int. J. Cancer 56:244 (1994). Общие методы такого конъюгирования хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al., “Modification of Antibodies by Chemical Methods,” в MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc.1995); Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,” в MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995). Альтернативно, терапевтический или диагностический агент может быть конъюгирован через углеводный фрагмент в Fc-области антитела. Углеводная группа может быть использована для увеличения содержания того же самого агента, что и связанный с тиольной группой, или углеводную группу можно использовать для связывания другого терапевтического или диагностического агента.
[0125] Способы конъюгирования пептидов с компонентами антитела через углеводный фрагмент антитела хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Shih et al., Int. J. Cancer 41:832 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101 (1990); и Shih et al., патент США № 5057313, включенные в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Общий способ включает взаимодействие компонента антитела, имеющего окисленную углеводную часть, с полимером-носителем, имеющим по меньшей мере одну функцию свободного амина. Эта реакция приводит к образованию первоначальной связи шиффова основания (иминовой), которая может быть стабилизирована восстановлением до вторичного амина с образованием конечного конъюгата.
[0126] Область Fc может отсутствовать, если антитело, используемое в качестве компонента антитела иммуноконъюгата, представляет собой фрагмент антитела. Однако, можно вводить углеводный фрагмент в вариабельную область легкой цепи полноразмерного антитела или фрагмента антитела. См., например, Leung et al., J. Immunol. 154:5919 (1995); Hansen et al., патент США № 5443953 (1995), Leung et al., патент США № 6254868, которые включены в данный документ посредством ссылок в полном объеме. Сконструированный углеводный фрагмент используется для присоединения терапевтического или диагностического агента.
[0127] Предпочтительный протокол конъюгации основан на реакции тиол-малеимид, тиол-винилсульфон, тиол-бромацетамид или тиол-йодацетамид, которая легко протекает при нейтральном или кислотном рН. Это устраняет необходимость в более высоких значениях рН для конъюгирования, как, например, было бы необходимо при использовании активных сложных эфиров. Дополнительные подробности примерных протоколов конъюгирования описаны ниже в разделе Примеры.
Терапевтическое лечение
[0128] В другом аспекте изобретение относится к способу лечения субъекта, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата антитело-лекарственный препарат (КАП), как описано в данном документе. Заболевания, которые можно лечить с помощью КАП, описанных в данном документе, включают, без ограничений, В-клеточные злокачественные новообразования (например, неходжкинскую лимфому, мантийноклеточную лимфому, множественную миелому, лимфому Ходжкина, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, лимфому Беркитта, фолликулярную лимфому, острый лимфолейкоз, хронический лимфолейкоз, волосатоклеточный лейкоз), с использованием, например, антитела против CD22, такого как МАТ hLL2 (эпратузумаб, см. патент США № 6183744), против другого эпитопа CD22 (hRFB4), или антител против других антигенов В-клеток, таких как CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD37, CD40, CD40L, CD52, CD74, CD80 или HLA-DR. Другие заболевания включают, без ограничений, аденокарциномы эндодермического эпителия пищеварительной системы, раковые заболевания, такие как рак молочной железы и немелкоклеточный рак легкого, и другие карциномы, саркомы, глиальные опухоли, миелоидные лейкозы и т.д. В частности, преимущественно используются антитела против антигена, например онкофетального антигена, продуцируемого или связанного со злокачественной солидной опухолью или новообразованием кроветворной системы, например, опухолью желудочно-кишечного тракта, желудка, толстой кишки, пищевода, печени, легкого, молочной железы, поджелудочной железы, печени, простаты, яичника, яичка, головного мозга, кости, уротелия или лимфатической системы, саркома или меланома. Такие терапевтические средства могут вводиться один или несколько раз, в зависимости от болезненного состояния и переносимости конъюгата, и могут также использоваться, необязательно, в сочетании с другими терапевтическими методами, такими как хирургия, внешнее облучение, радиоиммунотерапия, иммунотерапия, химиотерапия, антисмысловая терапия, терапия РНК-интерференции, генная терапия и т.п. Каждая комбинация будет адаптироваться к типу опухоли, стадии, состоянию пациента и предшествующей терапии, а также другим факторам, рассматриваемым лечащим врачом.
[0129] В используемом в данном документе значении, термин “субъект” относится к любому животному (т.е. позвоночным и беспозвоночным), включая, без ограничения, млекопитающих, включая людей. Предполагается, что этот термин не ограничен определенным возрастом или полом. Таким образом, термин охватывает взрослых и новорожденных субъектов, а также зародышей, как мужского, так и женского пола. Дозы, приведенные в данном документе, предназначены для людей, но могут регулироваться в соответствии с размером других млекопитающих, а также детей, в зависимости от веса или размера в квадратных метрах.
[0130] В предпочтительном варианте реализации терапевтические конъюгаты, содержащие антитело против Trop-2, такое как МАТ hRS7, можно использовать для лечения карцином, таких как рак пищевода, поджелудочной железы, легкого, желудка, толстой кишки и прямой кишки, мочевого пузыря, молочной железы, яичника, матки, почки и простаты, как раскрыто в патентах США №№ 7238785; 7517964 и 8084583, разделы Примеров которых включены в данный документ посредством ссылок. Антитело к hRS7 представляет собой гуманизированное антитело, которое содержит последовательности определяющих комплементарность участков (CDR) легкой цепи CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO: 1); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO: 2); и CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO: 3) и последовательности CDR тяжелой цепи CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO: 4); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO: 5) и CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 6)
[0131] В предпочтительном варианте реализации антитела, используемые при лечении заболеваний человека, представляют собой человеческие или гуманизированные (привитые на участке CDR) варианты антител; хотя могут использоваться мышиные и химерные версии антител. Молекулы IgG, принадлежащие тем же видам, что и агенты доставки, в основном являются предпочтительными для минимизации иммунного ответа. Это особенно важно при рассмотрении вопроса о повторном лечении. Для людей человеческое или гуманизированное антитело IgG с меньшей вероятностью будет вызывать у пациентов иммунный ответ против IgG. Антитела, такие как hLL1 и hLL2, быстро интернализируются после связывания с интернализирующим антигеном на клетках-мишенях, что означает также быструю интернализацию в клетках переносимого химиотерапевтического препарата. Однако, антитела, имеющие более низкие скорости интернализации, также могут быть использованы для осуществления селективной терапии.
111
177
212
213
211
62
67
90
125
131
32
33
47
111
67
142
153
161
166
166
186
188
189
212
223
225
59
75
77
89
99
105
109
143
149
169
194
198
199
227
211
11
13
15
75
198
224
126
133
77
113m
95
97
103
105
107
203
121m
122m
125m
165
167
168
197
109
105
142
143
161
166
199
57
58
51
59
75
201
225
76
169
[0132] В другом предпочтительном варианте реализации, терапевтический агент, используемый в комбинации с конъюгатом камптотецина по данному изобретению, может содержать один или несколько изотопов. Радиоактивные изотопы, пригодные для лечения больных тканей, включают, без ограничений- In, Lu, Bi, Bi, At, Cu, Cu, Y, I, I, P, P, Sc, Ag, Ga, Pr, Sm, Tb, Dy, Ho, Re, Re, Re, Pb, Ra, Ac, Fe, Se, As, Sr, Mo, Rh, Pd, Pr, Pm, Er, Ir, Au, Au, Th и Pb. Терапевтический радионуклид предпочтительно имеет энергию распада в диапазоне от 20 до 6000 кэВ, предпочтительно в диапазоне от 60 до 200 кэВ для Оже-излучателя, 100-2500 кэВ для бета-излучателя и 4000-6000 кэВ для альфа-излучателя. Максимальные энергии распада пригодных нуклидов, излучающих бета-частицы, предпочтительно составляют 20-5000 кэВ, более предпочтительно, 100-4000 кэВ, и наиболее предпочтительно - 500-2500 кэВ. Также предпочтительными являются радионуклиды, которые распадаются главным образом с образованием Оже-излучающих частиц. Например, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m и Ir-192. Энергии распада пригодных нуклидов, излучающих бета-частицы, предпочтительно составляют менее 1000 кэВ, более предпочтительно, менее 100 кэВ, и наиболее предпочтительно менее 70 кэВ. Также предпочтительными являются радионуклиды, которые распадаются главным образом с образованием альфа-частиц. Такие радионуклиды включают, без ограничений:Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, Th-227 и Fm-255. Энергии распада пригодных радионуклидов, испускающих альфа-частицы, предпочтительно составляют 2000-10000 кэВ, более предпочтительно, 3000-8000 кэВ, и наиболее предпочтительно - 4000-7000 кэВ. Дополнительные потенциально пригодные для использования радиоизотопы включают C, N, O, Br, Au, Ac, I, I, Br, In, Ru, Ru, Ru, Ru, Hg, Hg, Te, Te, Te, Tm, Tm, Tm, Pt, Pd, Rh, Pr, Pr, Tb, Ho, Au, Co, Co, Cr, Fe, Se, Tl, Ac, Br, Yb и т.п.
223
[0133] Радионуклиды и другие металлы могут быть доставлены, например, с использованием хелатирующих групп, присоединенных к антителу или конъюгату. Макроциклические хелаты, такие как NOTA (1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусная кислота), DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота) и TETA (триэтилентетрамин), используются с различными металлами и радиометаллами (radiometals), особенно с радионуклидами галлия, иттрия и меди, соответственно. Такие хелатные комплексы металлов можно сделать очень стабильными путем подбора размера кольца для металла, представляющего интерес. Могут быть использованы другие кольцевые хелаты, такие как макроциклические простые полиэфиры для образования комплексов Ra.
[0134] Терапевтические агенты для применения в сочетании с конъюгатами камптотецина, описанными в данном документе, также включают, например, химиотерапевтические препараты, такие как алкалоиды барвинка, антрациклины, эпидофиллотоксины, таксаны, антиметаболиты, ингибиторы тирозинкиназы, алкилирующие агенты, антибиотики, ингибиторы Cox-2, антимитотические средства, антиангиогенные и проапоптотические агенты, в частности доксорубицин, метотрексат, таксол, другие камптотецины, и другие из этих и других классов противоопухолевых агентов и т.п. Другие противораковые химиотерапевтические препараты включают азотистые аналоги иприта, алкилсульфонаты, нитрозомочевины, триазены, аналоги фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина, координационные комплексы платины, гормоны и т.п. Пригодные химиотерапевтические агенты описаны в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co.1995), и в GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co.1985), а также в переработанных изданиях этих публикаций. Другие пригодные химиотерапевтические агенты, такие как экспериментальные лекарственные средства, известны квалифицированным специалистам в данной области.
[0135] Типичные примеры пригодных для применения лекарственных средств включают, без ограничений, 5-фторурацил, афатиниб, аплидин, азарибин, анастрозол, антрациклины, акситиниб, AVL-101, AVL-291, бендамустин, блеомицин, бортезомиб, босутиниб, бриостатин-1, бусулфан, калихеамицин, камптотецин, карбоплатин, 10-гидроксикамптотецин, кармустин, целебрекс, хлорамбуцил, цисплатин (CDDP), ингибиторы Cox-2, иринотекан (CPT-11), SN-38, карбоплатин, кладрибин, камптотеканы, кризотиниб, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дазатиниб, динациклиб, доцетаксел, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин (2P-DOX), цианоморфолинодоксорубицин, доксорубицина глюкуронид, эпирубицина глюкуронид, эрлотиниб, эстрамустин, эпидофиллотоксин, эрлотиниб, энтиностат, агенты, связывающие рецептор эстрогена, этопозид (VP16), этопозида глюкуронид, этопозида фосфат, эксеместан, финголимод, флоксуридин (FUdR), 3',5'-O-диолеоил-FudR (FUdR-dO), флударабин, флутамид, ингибиторы фарнезил-протеинтрансферазы, флавопиридол, фостаматиниб, ганетеспиб, GDC-0834, GS-1101, гефитиниб, гемцитабин, гидроксимочевина, ибрутиниб, идарубицин, иделалисиб, ифосфамид, иматиниб, L-аспарагиназа, лапатиниб, ленолидамид, лейковорин, LFM-A13, ломустин, мехлорэтамин, мелфалан, меркаптопурин, 6-меркаптопурин, метотрексат, митоксантрон, митрамицин, митомицин, митотан, навельбин, нератиниб, нилотиниб, нитрозомочевина (nitrosurea), олапариб, пликомицин, прокарбазин, паклитаксел, PCI-32765, пентостатин, PSI-341, ралоксифен, семустин, сорафениб, стрептозоцин, SU11248, сунитиниб, тамоксифен, темазоломид (водная форма DTIC), трансплатин (transplatinum), талидомид, тиогуанин, тиотепа, тенипозид, топотекан, урамустин (uracil mustard), ваталаниб, винорелбин, винбластин, винкристин, алкалоиды барвинка и ZD1839. Такие агенты могут быть частью конъюгатов, описанных в данном документе, или альтернативно могут вводиться в комбинации с описанными конъюгатами, будь то до, одновременно с, или после конъюгата. Альтернативно, одно или несколько терапевтических "голых" антител, известных специалистам в данной области, могут быть использованы в комбинации с описанными конъюгатами. Типичные примеры терапевтических "голых" антител описаны выше.
[0136] В предпочтительных вариантах реализации, терапевтический агент для использования в комбинации с разрушающим ДНК конъюгатом антитела (DNA-breaking antibody conjugate) (например, SN-38-ADC) представляет собой ингибитор микротрубочек, такой как алкалоид барвинка, таксаны, майтанзиноид или ауристатин. Типичные примеры известных ингибиторов микротрубочек включают паклитаксел, винкристин, винбластин, мертанзин, эпотилон, доцетаксел, дискодермолид, комбрестатин, подофиллотоксин, CI-980, фенилагистины, стеганацины, курацины, 2-метоксиэстрадиол, E7010, метоксибензолсульфонамиды, винорелбин, винфлунин, виндезин, доластатины, спонгистатин, ризоксин, тасидотин, галихондрины, гемиастерлины, криптофицин 52, MMAE (монометилауристатин E) и эрибулин мезилат.
[0137] В альтернативном предпочтительном варианте осуществления терапевтическое средство для использования в комбинации с разрушающим ДНК КАП, таким как конъюгат SN-38-антитело, представляет собой ингибитор PARP, такой как олапариб, талазопариб (BMN-673), рукапариб, велипариб, CEP 9722, MK 4827, BGB-290, ABT-888, AG014699, BSI-201, CEP-8983 или 3-аминобензамид.
[0138] В другой альтернативе, терапевтический агент, используемый в комбинации с антителом или иммуноконъюгатом, представляет собой ингибитор киназы Брутона, такой как ибрутиниб (PCI-32765), PCI-45292, CC-292 (AVL-292), ONO-4059, GDC-0834, LFM-A13 или RN486.
[0139] В еще одной альтернативе, терапевтический агент, используемый в комбинации с антителом или иммуноконъюгатом, представляет собой ингибитор PI3K, такой как иделалисиб, вортманнин, деметоксивиридин, перифозин, PX-866, IPI-145 (дувелисиб), BAY 80-6946, BEZ235, RP6530, TGR1202, SF1126, INK1117, GDC-0941, BKM120, XL147, XL765, паломид 529 (Palomid 529), GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, CAL263, PI-103, GNE477, CUDC-907, AEZS-136 или LY294002.
[0140] Терапевтические агенты, которые можно использовать в сочетании с конъюгатами камптотецина, также могут включать токсины, конъюгированные с нацеливающими фрагментами. Токсины, которые могут быть использованы при этом, включают рицин, абрин, рибонуклеазу (РНКазу), ДНКазу I, ранпирназу, стафилококковый энтеротоксин-А, противовирусный белок фитолакки американской, гелонин, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas и эндотоксин Pseudomonas.(см., например, Pastan. et al., Cell (1986), 47:641, и Sharkey and Goldenberg, CA Cancer J Clin. 2006 Jul-Aug; 56(4): 226-43). Дополнительные токсины, пригодные для использования в данной заявке, известны специалистам в данной области и раскрыты в патенте США № 6077499.
[0141] Еще один класс терапевтических средств может включать один или несколько иммуномодуляторов. Пригодные для использования иммуномодуляторы могут быть выбраны из цитокина, фактора роста стволовых клеток, лимфотоксина, гемопоэтического фактора, колониестимулирующего фактора (CSF), интерферона (IFN), эритропоэтина, тромбопоэтина и их комбинации. Особенно полезными являются лимфотоксины, такие как фактор некроза опухоли (TNF), гемопоэтические факторы, такие как интерлейкин (IL), колониестимулирующий фактор, такой как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) или гранулоцитарный макрофаг-колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон, такие как интерфероны-α, -β, -γ или -λ, и фактор роста стволовых клеток, такой как обозначенный "фактор S1". Цитокины включают гормоны роста, такие как человеческий гормон роста, N-метионил-человеческий гормон роста, и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреостимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); печеночный фактор роста; простагландин, фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген, белок OB; фактор некроза опухоли-α и -ß; мюллерова ингибирующая субстанция; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; ингибин; активин; сосудистый эндотелиальный фактор роста; интегрин; тромбопоэтин (TPO); факторы роста нервов, такие как NGF-ß; тромбоцитарный фактор роста; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-α и TGF-ß; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-α, -β, -γ и -λ; колониестимулирующие факторы (CSF), такие как макрофагальный CSF (M-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-25, LIF, лиганд kit или FLT-3, ангиостатин, тромбоспондин, эндостатин, фактор некроза опухоли и лимфотоксин (LT). В используемом в данном документе значении, термин цитокин включает белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.
[0142] Пригодные для использования хемокины включают RANTES, MCAF, MIP1-альфа, MIP1-бета и IP-10.
[0143] Рядовому специалисту в данной области техники будет понятно, что иммуноконъюгаты по данному изобретению, содержащие камптотецин, конъюгированный с антителом или фрагментом антитела, можно использовать отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими агентами, такими как второе антитело, второй фрагмент антитела, второй иммуноконъюгат, радионуклид, токсин, лекарственное средство, химиотерапевтическое средство, лучевая терапия, хемокин, цитокин, иммуномодулятор, фермент, гормон, олигонуклеотид, РНКи или миРНК. Такие дополнительные терапевтические агенты могут быть введены отдельно, в комбинации с, или присоединены к иммуноконъюгатам антитело-лекарственное средство по данному изобретению.
Составление композиций и введение
[0144] Пригодные пути введения конъюгатов включают, без ограничений, пероральное, парентеральное, подкожное, ректальное, трансмукозальное, интестинальное введение, внутримышечное, интрамедуллярное, интратекальное, прямое интравентрикулярное, внутривенное, интравитреальное, интраперитонеальное, интраназальное, или внутриглазные инъекции. Предпочтительными путями введения являются парентеральные. Альтернативно, соединение можно вводить локально, а не системно, например, путем инъекции соединения непосредственно в солидную опухоль.
[0145] Композиции иммуноконъюгатов могут быть составлены в соответствии с известными способами приготовления фармацевтически пригодных композиций, причем иммуноконъюгат скомбинирован в смеси с фармацевтически пригодным эксципиентом. Одним из примеров фармацевтически пригодного эксципиента является стерильный забуференный фосфатом физиологический раствор. Другие пригодные эксципиенты хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), и Gennaro (ed.), REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990), и их пересмотренных изданиях.
[0146] В предпочтительном варианте реализации, композицию иммуноконъюгата составляют в биологическом буфере Гуда (pH 6-7), с использованием буфера, выбранного из группы, состоящей из N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновой кислоты (ACES); N-(2-ацетамидо)иминодиуксусной кислоты (ADA); N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновой кислоты (BES); 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновой кислоты (HEPES); 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES); 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS); 3-(N-морфолинил)-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (MOPSO); и пиперазин-N,N’-бис(2-этансульфоновой кислоты) [Pipes]. Более предпочтительными буферами являются MES или MOPS, предпочтительно, в диапазоне концентраций от 20 до 100 мМ, более предпочтительно, около 25 мМ. Наиболее предпочтительным является 25 мМ MES, рН 6,5. Композиция может дополнительно содержать 25 мМ трегалозы и 0,01% об./об. полисорбата 80 в качестве эксципиентов, с конечной концентрацией буфера, доведенной до 22,25 мМ в результате добавления эксципиентов. Предпочтительным способом хранения является лиофилизированная композиция конъюгатов, хранящаяся в интервале температур от минус 20 °C до 2 °C, при наиболее предпочтительном хранении при температуре от 2 °C до 8 °C.
[0147] Композиция иммуноконъюгата может быть составлена для внутривенного введения, например, путем болюсной инъекции, медленной инфузии или непрерывной инфузии. Предпочтительно, антитело по данному изобретению вводят инфузией на протяжении периода менее примерно 4 часов, и более предпочтительно, на протяжении периода менее примерно 3 часов. Например, первые 25-50 мг могут быть введены инфузией в течение 30 минут, предпочтительно даже в течение 15 мин, и остальную часть вводят инфузией на протяжении следущих 2-3 ч. Композиции для инъекций могут быть представлены в виде единичной дозированной формы, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах, с добавленным консервантом. Композиции могут иметь форму суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях, и могут содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, активный ингредиент может находиться в форме порошка для разведения пригодным носителем, например, стерильной апирогенной водой, перед применением.
[0148] Дополнительные фармацевтические способы могут быть использованы для контроля продолжительности действия терапевтического конъюгата. Препараты с контролируемым высвобождением могут быть приготовлены с использованием полимеров для образования комплекса или адсорбции иммуноконъюгата. Например, биосовместимые полимеры включают матрицы из поли(этилен-ко-винилацетата) и матрицы полиангидридного сополимера димера стеариновой кислоты и себациновой кислоты.Sherwood et al., Bio/Technology 10:1446 (1992). Скорость высвобождения иммуноконъюгата из такой матрицы зависит от молекулярной массы иммуноконъюгата, количества иммуноконъюгата в матрице и размера диспергированных частиц. Saltzman et al., Biophys. J. 55:163 (1989); Sherwood et al., выше. Другие твердые лекарственные формы описаны в Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), и Gennaro (ed.), REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990), и их пересмотренных изданиях.
2
[0149] Как правило, дозировка вводимого иммуноконъюгата для людей будет варьироваться в зависимости от таких факторов, как возраст пациента, вес, рост, пол, общее состояние здоровья и предыдущая история болезни. Может быть желательно предоставить реципиенту дозу иммуноконъюгата, которая находится в диапазоне от приблизительно 1 мг/кг до 24 мг/кг в виде однократной внутривенной инфузии, хотя также может быть введена более низкая или более высокая дозировка, в зависимости от обстоятельств. Например, дозировка 1-20 мг/кг для пациента весом 70 кг составляет 70-1400 мг, или 41-824 мг/м для пациента ростом 1,7 м. Дозировка может повторяться при необходимости, например, один раз в неделю на протяжении 4-10 недель, один раз в неделю на протяжении 8 недель или один раз в неделю на протяжении 4 недель. Она также может вводиться реже, например раз в две недели на протяжении нескольких месяцев, или ежемесячно или ежеквартально на протяжении многих месяцев, если это необходимо для поддерживающей терапии. Предпочтительные дозировки могут включать, без ограничений, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг, 15 мг/кг, 16 мг/кг, 17 мг/кг, 18 мг/кг, 19 мг/кг, 20 мг/кг, 22 мг/кг и 24 мг/кг. Можно использовать любое количество в диапазоне от 1 до 24 мг/кг. Дозировка предпочтительно вводится многократно, один или два раза в неделю. Может быть использована минимальная схема дозировки, составляющая 4 недели, более предпочтительно, 8 недель, более предпочтительно, 16 недель или дольше. График введения может включать введение один или два раза в неделю, в цикле, выбранном из группы, состоящей из:(i) еженедельно; (ii) раз в две недели; (iii) одна неделя терапии с последующими двумя, тремя или четырьмя неделями перерыва; (iv) две недели терапии с последующими одной, двумя, тремя или четырьмя неделями перерыва; (v) три недели терапии с последующими одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью неделями перерыва; (vi) четыре недели терапии с последующими одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью неделями перерыва; (vii) пять недель терапии с последующими одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью неделями перерыва; и (viii) ежемесячно. Цикл может повторяться 4, 6, 8, 10, 12, 16 или 20 раз или больше.
2
[0150] Альтернативно, иммуноконъюгат можно вводить в виде одной дозы каждые 2 или 3 недели, повторяя в общей сложности по меньшей мере 3 дозы. Или два раза в неделю в течение 4-6 недель. Если дозировка снижается до приблизительно 200-300 мг/м(340 мг на дозу для пациента ростом 1,7 м, или 4.9 мг/кг для пациента весом 70 кг), его можно вводить один или даже два раза в неделю в течение 4-10 недель. Альтернативно, частота введения доз может быть снижена, а именно, раз в 2 или 3 недели в течение 2-3 месяцев. Было установлено, однако, что даже более высокие дозы, такие как 12 мг/кг один раз в неделю или один раз в 2-3 недели, можно вводить путем медленной внутривенной инфузии, с повторными циклами дозирования. График дозирования может при желании повторяться с другими интервалами времени, и дозировка может вводиться различными парентеральными путями, с соответствующей корректировкой дозы и графика.
[0151] В предпочтительных вариантах реализации, иммуноконъюгаты пригодны для использования при терапии рака. Примеры раковых заболеваний включают, без ограничений, карциному, лимфому, глиобластому, меланому, саркому и лейкоз, миелому или лимфоидные злокачественные новообразования. Более конкретные примеры таких видов рака указаны ниже и включают: плоскоклеточный рак (например, эпителиально-плоскоклеточный рак), саркому Юинга, опухоль Вильмса, астроцитомы, рак легкого, включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточный рак легкого, рак брюшины, рак желудка (gastric or stomach), включая рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, мультиформную глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, гепатоцеллюлярную карциному, нейроэндокринные опухоли, медуллярный рак щитовидной железы, дифференцированный рак щитовидной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак эндометрия или рак матки, рак слюнной железы, рак почки (kidney or renal), рак простаты, рак вульвы, рак анального канала, рак полового члена, а также рак головы и шеи. Термин «рак» включает первичные злокачественные клетки или опухоли (например, такие, клетки которых не мигрировали в участки тела субъекта, отличные от места исходного злокачественного новообразования или опухоли) и вторичные злокачественные клетки или опухоли (например, такие, которые возникают в результате метастазирования, миграции злокачественных клеток или опухолевых клеток во вторичные участки, отличные от места исходной опухоли).
[0152] Другие примеры раковых заболеваний или злокачественных новообразований включают, без ограничений: детский острый лимфобластный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, адренокортикальный рак, (первичный) гепатоцеллюлярный рак взрослых, (первичный) рак печени взрослых, острый лимфоцитарный лейкоз взрослых, острый миелоидный лейкоз взрослых, лимфому Ходжкина взрослых, лимфоцитарный лейкоз взрослых, неходжкинскую лимфому взрослых, первичный рак печени взрослых, саркому мягких тканей взрослых, СПИД-ассоциированные лимфомы, СПИД-ассоциированные злокачественные новообразования, анальный рак, астроцитому, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, рак кости, глиому ствола головного мозга, опухоли головного мозга, рак молочной железы, рак почечной лоханки и мочеточника, лимфому центральной нервной системы (первичную), лимфому центральной нервной системы, мозжечковую астроцитому, церебральную астроцитому, рак шейки матки, детский (первичный) гепатоцеллюлярный рак, детский (первичный) рак печени, детский острый лимфобластный лейкоз, детский острый миелоидный лейкоз, глиому ствола головного мозга у детей, детскую мозжечковую астроцитому, церебральную астроцитому у детей, опухоли экстракраниальных зародышевых клеток у детей, болезнь Ходжкина у детей, лимфому Ходжкина у детей, глиому гипоталамуса и зрительного пути у детей, лимфобластный лейкоз у детей, медуллобластому у детей, детскую неходжкинскую лимфому, детские пинеальные и супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли, детский первичный рак печени, рабдомиосаркому у детей, саркому мягких тканей у детей, детскую глиому зрительных путей и гипоталамуса, хронический лимфолейкоз, хронический миелогенный лейкоз, рак толстой кишки, кожную Т-клеточную лимфому, эндокринную карциному клеток панкреатических островков, эндометриальный рак, эпендимому, эпителиальный рак, рак пищевода, саркому Юинга и родственные опухоли, экзокринный рак поджелудочной железы, опухоль экстракраниальных зародышевых клеток, опухоль внегонадных зародышевых клеток, рак внепеченочных желчных протоков, рак глаза, рак молочной железы у женщин, болезнь Гоше, рак желчного пузыря, рак желудка, желудочно-кишечную карциноидную опухоль, опухоли желудочно-кишечного тракта, герминогенные опухоли, волосатоклеточный лейкоз, рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак, лимфому Ходжкина, гипергаммаглобулинемию, гипофарингеальный рак, виды рака кишечника, внутриглазную меланому, рак островковых клеток, рак островковых клеток поджелудочной железы, саркому Капоши, рак почки, рак гортани, рак губ и полости рта, рак печени, рак легкого, лимфопролиферативные расстройства, макроглобулинемию, рак молочной железы у мужчин, злокачественную мезотелиому, злокачественную тимому, медуллобластому, меланому, мезотелиому, метастатический бессимптомный первичный плоскоклеточный рак шеи, метастатический первичный плоскоклеточный рак шеи, множественную миелому, множественную миелому/новообразование плазматических клеток, миелодиспластический синдром, миелогенный лейкоз, миелоидный лейкоз, миелопролиферативные расстройства, рак полости носа и околоносовых пазух, рак носоглотки, нейробластому, неходжкинскую лимфому, немеланомный рак кожи, немелкоклеточный рак легкого, бессимптомный первичный метастатический плоскоклеточный рак шеи, рак ротоглотки, остео-/злокачесвенную фиброзную саркому, остеосаркому/злокачесвенную фиброзную гистиоцитому, остеосаркому/злокачесвенную фиброзную гистиоцитому кости, эпителиальный рак яичников, герминогенную опухоль яичников, потенциальную низкозлокачественную опухоль яичника, рак поджелудочной железы, парапротеинемии, истинную красную полицитемию, рак околощитовидной железы, рак полового члена, феохромоцитому, опухоль гипофиза, первичную лимфому центральной нервной системы, первичный рак печени, рак простаты, рак прямой кишки, почечноклеточный рак, рак почечной лоханки и мочеточника, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак слюнной железы, саркоидоз, саркомы, синдром Сезари, рак кожи, мелкоклеточный рак легкого, рак тонкого кишечника, саркому мягких тканей, плоскокклеточный рак шеи, рак желудка, супратенториальные примитивные нейроэктодермальные и пинеальные опухоли, T-клеточную лимфому, рак яичка, тимому, рак щитовидной железы, переходноклеточный рак почечной лоханки и мочеточника, рак переходного эпителия почечной лоханки и мочеточника, трофобластические опухоли, рак клеток почечной лоханки и мочеточника, рак уретры, рак матки, саркому матки, рак влагалища, глиому зрительных путей и гипоталамуса, рак вульвы, макроглобулинемию Вальденстрема, опухоль Вильмса, и любое другое лимфопролиферативное заболевание, помимо неоплазии, расположенное в перечисленных выше системах органов.
[0153] Способы и композиции, описанные и заявленные в данном документе, могут быть использованы для лечения злокачественных или предраковых состояний и для предотвращения прогрессирования до неопластического или злокачественного состояния, включая, без ограничений, расстройства, описанные выше. Такие применения показаны при состояниях с известным или подозреваемым предшествующим прогрессированием до неоплазии или рака, в частности, с происходившим ростом неопухолевых клеток, включающим гиперплазию, метаплазию или, особенно, дисплазию (обзор таких состояний с аномальным ростом приведен в Robbins and Angell, Basic Pathology, 2d Ed., W.B.Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79 (1976)).
[0154] Дисплазия часто является предвестником рака и встречается главным образом в эпителии. Это наиболее неупорядоченная форма роста неопухолевых клеток, связанная с потерей однородности отдельных клеток и архитектурной ориентации клеток. Дисплазия обычно возникает там, где существует хроническое раздражение или воспаление. Диспластические расстройства, которые можно лечить, включают, без ограничений, ангидротическую эктодермальную дисплазию, передне-фациальную дисплазию, асфиксическую торакальную дисплазию, атриодигитальную дисплазию, бронхолегочную дисплазию, церебральную дисплазия, дисплазию шейки матки, хондроэктодермальную дисплазия, ключично-черепную дисплазию, врожденную эктодермальную дисплазию, краниодиафизарную дисплазию, краниокарпотарзальную дисплазию, краниометафизарную дисплазию, дентиновую дисплазию, диафизарную дисплазию, эктодермальную дисплазию, дисплазию эмали, энцефало-офтальмологическую дисплазию, тарзомегалию, метафизарную множественную дисплазию, эпифизарную точечную дисплазию, эпителиальную дисплазию, фациодигитогенитальную дисплазию, семейную фиброзную дисплазию челюстей, семейный губчатый белый невус слизистой оболочки, фибромышечную дисплазию, фиброзную дисплазию кости, цементную дисплазию, наследственную почечно-ретинальную дисплазию, гидротическую эктодермальную дисплазию, гипогидротическую эктодермальную дисплазию, лимфопеническую дисплазию тимуса, дисплазию молочной железы, челюстно-лицевую остеодисплазию, метафизарную дисплазию, дисплазию Мондини, монооссальную фиброзную дисплазию, мукоэпителиальную дисплазию, множественную эпифизарную дисплазию, окулоаурикуловертебральную дисплазию, глазо-зубо-пальцевую дисплазию, окуловертебральную дисплазию, одонтогенную дисплазию, глазо-челюстно-костную дисплазию, периапикальную цементную дисплазию, полиоссальную фиброзную дисплазию, псевдоахондропластическую спондилоэпифизарную дисплазию, дисплазию сетчатки, септо-оптическую дисплазию, спондилоэпифизарную дисплазию и вентрикулорадиальную дисплазию.
[0155] Дополнительные предраковые расстройства, лечение которых может проводиться, включают, без ограничений, доброкачественные диспролиферативные расстройства (например, доброкачественные опухоли, фиброзно-кистозные состояния, гипертрофию тканей, полипы или аденомы кишечника и дисплазию пищевода), лейкоплакию, кератозы, болезнь Боуэна, ромбовидную кожу шеи (Farmer's Skin), солнечный хейлит и солнечный кератоз.
[0156] В предпочтительных вариантах реализации, способ по изобретению используется для ингибирования роста, прогрессирования и/или метастазирования раков, в частности, перечисленных выше.
[0157] Дополнительные гиперпролиферативные заболевания, расстройства и/или состояния включают, без ограничений, прогрессирование и/или метастазы злокачественных опухолей и родственные расстройства, такие как лейкемия (включая острые лейкозы; например, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз [включая миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный и эритролейкоз]) и хронические лейкозы (например, хронический миелоцитарный лейкоз [гранулоцитарный] и хронический лимфоцитарный лейкоз), истинная красная полицитемия, лимфомы (например, болезнь Ходжкина и неходжкинская лимфома), множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей, и солидные опухоли, включая, без ограничений, саркомы и карциномы, такие как фибросаркома, мииксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак простаты, плоскоклеточный рак, базально-клеточный рак, аденокарцинома, рак потовых желез, рак сальных желез, папиллярная карцинома, папиллярная аденокарцинома, цистаденокарцинома, медуллярная карцинома, бронхогенная карцинома, почечно-леточная карцинома, гепатома, рак желчных протоков, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома (emangioblastoma), невринома слухового нерва, олигодендроглиома, менингиома, меланома, нейробластома и ретинобластома.
[0158] Аутоиммунные заболевания, которые можно лечить с помощью иммуноконъюгатов, могут включать острые и хронические иммунные тромбоцитопении, дерматомиозит, хорею Сиденхема, тяжёлую псевдопаралитическую миастению, системную красную волчанку, волчаночный нефрит, ревматическую лихорадку, полигландулярные синдромы, буллезный пемфигоид, сахарный диабет, пурпуру Геноха-Шенлейна, постстрептококковый нефрит, нодозную эритему, артериит Такаясу, АНЦА-ассоциированный васкулит, аддисонову болезнь, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, саркоидоз, язвенный колит, экссудативную многоформную эритему, IgA-нефропатию, нодозный полиартериит, анкилозирующий спондилит, синдром Гудпасчера, облитерирующий тромбангиит, синдром Шегрена, первичный билиарный цирроз, тиреоидит Хашимото, тиреотоксикоз, склеродермию, хронический активный гепатит, полимиозит/дерматомиозит, полихондрит, буллезный пемфигоид, пузырчатку обыкновенную, гранулематоз Вегенера, мембранозную нефропатию, боковой амиотрофический склероз, сухотку спинного мозга, гигантоклеточный артериит/полимиалгию, злокачественную анемию, быстро прогрессирующий гломерулонефрит, псориаз или фиброзирующий альвеолит.
Наборы
[0159] Различные варианты реализации могут касаться наборов, содержащих компоненты, пригодные для лечения рака у пациента. Типичные примеры наборов могут содержать по меньшей мере одно антитело, конъюгированное с лекарственным средством, как описано в данном документе. Если композиция, содержащая компоненты для введения, не составлена для доставки через пищеварительный тракт, например, путем пероральной доставки, может быть включено устройство, способное доставлять компоненты набора каким-либо другим путем. Одним из типичных устройств для такого применения, как парентеральная доставка, является шприц, который используется для введения композиции в организм субъекта путем инъекции. Также могут быть использованы ингаляционные устройства.
[0160] Компоненты набора могут быть упакованы вместе или разделены на два или больше контейнеров. В некоторых вариантах реализации, контейнеры могут представлять собой флаконы, которые содержат стерильные лиофилизированные составы композиции, пригодные для разведения. Набор также может содержать один или несколько буферов, пригодных для разведения и/или разбавления других реагентов. Другие контейнеры, которые могут быть использованы, включают, без ограничений, мешочек, лоток, коробку, тубу и т.п. Компоненты набора могут быть упакованы и храниться стерильно в контейнерах. Другим компонентом, который может быть включен, являются инструкции для особы, использующей набор для его применения.
Примеры
[0161] Различные варианты реализации данного изобретения иллюстрируются следующими примерами, не ограничивающими его объем.
Пример 1. Клинические испытания сацитузумаба говитекана (IMMU-132) при метастатическом уротелиальном раке
[0162] Для пациентов с метастатической резистентной к платине уротелиальной карциномой (PRUC) не существует одобренных FDA (Управление по контролю за продуктами и лекарствами США) методов лечения. Процент пациентов с объективным ответом на химиотерапию второй линии обычно составляла менее 20 %, при медиане общей выживаемости менее 1 года. Мы сообщаем в данном документе о нашем опыте работы с 6 пациентами с запущенной PRUC, получавшими ранее интенсивное лечение (идентификатор ClinicalTrials NCT01631552), с использованием нового конъюгата антитело-лекарственное средство - сацитузумаба говитекана (IMMU-132). Этот конъюгат антитело–лекарственное средство содержит активный метаболит иринотекана, SN-38, конъюгированный с анти-Trop-2 антителом (hRS7).
[0163] Trop-2 широко экспрессируется в меньше или равно 83 % уротелиальных карцином. Из 6 пациентов, у 3 наблюдался клинически значимый ответ (выживаемость без прогрессирования от 6,7 до 8,2 месяцев; общая выживаемость от 7,5+ до 11,4+ месяцев). Сацитузумаб говитекан хорошо переносится. На основании этих результатов были инициированы испытания фазы II. Данный отчет демонстрирует полезность конъюгатов анти-Trop-2-антитело–лекарственное средство, таких как сацитузумаб говитекан, в качестве новой терапевтической стратегии лечения PRUC.
Вступление
[0164] Уротелиальная карцинома мочевого пузыря (UC) является шестой по распространенности формой рака (например, Sharma et al., 2009, Am Fam Physician 80:717-23). Комбинированная химиотерапия на основе цисплатина является единственным известным методом лечения, который продемонстрировал полезный эффект на выживание для пациентов с запущенным заболеванием (Logothetis et al., 1990, J Clin Oncol 8:1050-55; Loehrer et al., 1992, J Clin Oncol 10:1066-73). Однако только небольшая субпопуляция достигает долгосрочного выживания. Для участников клинических испытаний, медиана общей выживаемости составила 15 месяцев, а 5-летняя выживаемость составила всего 15 % (von der Maase et al., 2005, J Clin Oncol 23:4602-8) После прогрессирования в течение от 6 до 12 месяцев после химиотерапии (резистентной к платине уротелиальной карциномы [PRUC]), независимо от ее проведения в периоперационный или более поздний период (advanced setting), выживаемость составляла только от 4 до 9 месяцев для субъектов, удовлетворяющих условиям участия в клинических испытаниях. В США не было одобрено никаких химиотерапевтических агентов второй линии, а в Европе доступен только винфлунин (Bellmunt et al., 2009, J Clin Oncol 27:4454-61) Разработка эффективных методов лечения второй линии при запущенном уротелиальном раке является важной неудовлетворенной медицинской потребностью (Faltas et al., 2015, Expert Opin Ther Targets 19:515-25).
[0165] Конъюгаты антитело–лекарственный препарат (КАП), нацеленные на антигены клеточной поверхности, представляют собой привлекательную терапевтическую стратегию для резистентных к химиотерапии опухолей, включая PRUC (Cardillo et al., 2015, Bioconjug Chem 26:919-31). Сацитузумаб говитекан (IMMU-132) представляет собой КАП второго поколения, содержащий гуманизированное моноклональное антитело против Trop-2 (hRS7), конъюгированное с активным метаболитом иринотекана, SN-38 (Goldenberg et al., 2015, Oncotarget 6:22496-5120). Он продемонстрировал приемлемую токсичность и превосходную терапевтическую активность в отношении нескольких солидных опухолей как в доклинических, так и в клинических условиях (Cardillo et al., 2015, Bioconjug Chem 26:919-31; Starodub et al., 2015, Clin Cancer Res 21:3870-78), и является рациональным выбором для нацеливания на UC. Известно, что белок Trop-2 (TACSTD2) экспрессируется в нормальном уротелии (Stepan et al., 2011, J Histochem Cytochem 59:701-10) и в меньше идли равно 83 % уротелиальных карцином (Faltas et al., 2016, Clin Genitourin Cancer 14:e75-9). Клинические испытания фазы II с использованием иринотекана у пациентов с PRUC продемонстрировали суммарную эффективность терапии всего 5 % (95 % доверительный интервал, 1 %-17 %), включая полный ответ продолжительностью 33 месяца и общую выживаемость 5,4 месяца (Beer et al., 2008, Clin Genitourin Cancer 6:36-9). Иринотекан также использовался в комбинации с другими лекарственными средствами (Chaudhary et al., 2014, Am J Clin Oncol 37:188-93).
[0166] В рамках расширенных исследований по оценке сацитузумаба говитекана (идентификатор ClinicalTrials NCT01631552), мы первоначально исследовали 6 пациентов с PRUC, 3 из которых достигли клинически значимых ответов. В данном Примере описан этот клинический опыт, который демонстрирует, что этот КАП является привлекательным кандидатом для лечения PRUC.
Материалы и методы
[0167] Гуманизированное анти-Trop-2 антитело RS7 (hRS7) было получено, как описано в патенте США № 7238785, фигуры и раздел Примеров которого включены в данный документ посредством ссылки.SN-38, присоединенный к линкеру CL2A, был получен и конъюгирован с hRS7 (анти-Trop-2) в соответствии с патентом США № 7999083 (Примеры 10 и 12 которого включены в данный документ посредством ссылки). Протокол конъюгации приводил к соотношению примерно 6-8 присоединенных молекул SN-38 на молекулу антитела.
[0168] Пациенты удовлетворяли условиям участия в клинических испытаниях с использованием IMMU-132, если они имели запущенную PRUC, функциональный статус (performance status) от 0 до 1 по шкале Восточной кооперативной онкологической группы (Eastern Cooperative Oncology Group), и интактную функцию органов (Starodub et al., 2015, Clin Cancer Res 21:3870-78). Все пациенты дали информированное согласие. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с утвержденными методическими рекомендациями. Сацитузумаб говитекан вводили внутривенно в дни 1 и 8 21-дневных циклов, которые повторяли до развития ограничивающей дозу токсичности или прогрессирования. Ответ оценивали с использованием Критериев оценки ответа солидных опухолей (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors), версия 1.1. При наличии такой возможности, иммуногистохимическое окрашивание образцов биопсии архивных опухолей, полученных от пролеченных пациентов, проводили как описано ранее (Starodub et al., 2015, Clin Cancer Res 21: 3870-78).
Результаты
[0169] Средний возраст пациентов составил 72,5 года (диапазон значений, от 42 до 80 лет). Все пациенты имели метастазирующее заболевание и ранее получали лечение платиносодержащими схемами и другими линиями терапии (медианное число предшествующих терапий - 3; Таблица 2). Из 6 пациентов, 5 принадлежали к группам низкого или промежуточного риска в соответствии с прогностической моделью для пациентов с UC, получающих системную терапию спасения (Sonpavde et al., 2015, J Clin Oncol 33 (abstract 311). Все 6 пациентов с PRUC были доступны для оценки ответа. Двое достигли частичного ответа, при этом пациент с лучшим терапевтическим эффектом продемонстрировал уменьшение на 38 % целевых поражений, включая метастазы в печени (Фиг. 1). У одного пациента было стабильное заболевание с 28 % уменьшением целевых поражений, и у 3 пациентов было прогрессирующее заболевание, в том числе у 1 пациента было выявлено прогрессирующее заболевание в соответствии с критериями оценки ответа солидных опухолей, версия 1.1, из-за нового очага, несмотря на 12 % снижение его целевых поражений при лечении (Таблица 2). Для 3 пациентов с клинически значимым ответом выживаемость без прогрессирования составила от 6,7 до 8,2 месяцев, а общая выживаемость - от 7,5+ до 11,4+ месяцев.
[0170] Сацитузумаб говитекан, как правило, хорошо переносился. У двух пациентов наблюдалась токсичность 3 степени (боль в боку и бактериемия). Негематологической токсичности 4 степени не наблюдалось. Иммуногистохимический анализ архивной опухолевой ткани PRUC от пациентов, получавших сацитузумаб говитекан, показал значительную экспрессию белка Trop-2 на клеточной поверхности (Фиг. 2).
Таблица 2. Исходные характеристики и клинические результаты.
Пц.№
Пол
Возраст (лет)
Первичный очаг UC
Участки метастазирования
Предшествующее лечение
Гб (г/дл)
ЛДГ (МЕ/л)
Альбумин (г/дл)
Сацитузумаб говитекан
Лучший ответ (%)
ВБП (мес.)
ОВ (мес.)
Доза (мг/кг)
Циклов (n)
1
M
42
мочевой пузырь
кость
гемцитабин + карбоплатин
13
134
3,8
12
4
ПЗ (−30)
1,5
10,8
гемцитабин + цисплатин
доцетаксел
2
M
80
почечная лоханка
печень, легкие, лимфатические узлы средостения
гемцитабин + карбоплатин
12,7
210
4
10
6
ПЗ (−30)
1,9
1,9+
3
M
71
мочевой пузырь
тазовый, парааортальный, RPLNs
паклитаксел, ифосфамид, цисплатин
11,1
218
3,9
8
4
ПЗ (−12)
1,8
1,8+
доцетаксел
4
M
66
почечная лоханка
Легкие, парааортальные лимфатические узлы, поясничная мышца
гемцитабин + цисплатин
9,6
148
3,6
8
13
СЗ (−28)
6,7
11,4+
5
M
74
мочевой пузырь
SCV, медиастинальный, RPLNs
БЦЖ
13,5
156
4,4
11
12+
ПЗ (−33)
7,5+
7,5+
гемцитабин + цисплатин
Исследовательское (DN24-02)
6
M
75
мочеточник
печень, легкие, тазовые лимфатические узлы, брюшина
гемцитабин + цисплатин (адъювант)
9,3
187
2,6
8
25
ЧО (−38)
8,2
10,5
гемцитабин + карбоплатин
доцетаксел + икрукумаб
Сокращения: БЦЖ представляет собой бациллу Кальметта-Герена; Гб представляет собой гемоглобин; ЛДГ представляет собой лактатдегидрогеназу; M представляет собой мужской; ОВ представляет собой общую выживаемость; ПЗ представляет собой прогрессирующее заболевание; ВБП представляет собой выживаемость без прогрессирования заболевания; ЧО представляет собой частичный ответ; Пц. № представляет собой номер пациента; RECIST 1.1 представляет собой критерии оценки ответа солидных опухолей (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors), версия 1.1; RPLNs представляет собой ретроперитонеальные лимфатические узлы; SCV представляет собой надключичный; СЗ представляет собой стабильное заболевание; UC представляет собой уротелиальную карциному.
Обсуждение
[0171] Хотя алкалоид барвинка винфлунин доступен в Европе из-за результатов испытаний фазы III, сравнивающих его с лучшим поддерживающим лечением второй линии, его эффективность была незначительной, без улучшения общей выживаемости (Bellmunt et al., 2009, J Clin Oncol 27:4454-61). Суммарная эффективность терапии для пациентов, получающих терапию второй линии, например, винфлунин или другие агенты, включая таксаны и пеметрексед, обычно составляла менее 20 %, с медианой общей выживаемости всего от 4 до 9 месяцев (Bellmunt et al., 2009, J Clin Oncol 27:4454-61; Sweeney et al., 2006, J Clin Oncol 24:3451-57; Galsky et al., 2007, Invest New Drugs 25:265-70). Недавно представленное положительное рандомизированные испытания фазы II доцетаксела с рамуцирумабом или икрукумабом или без них продемонстрировали эффективность терапии 5 % и выживаемость без прогрессирования в течение, равную 10,4 недель в контрольной группе, получавшей только доцетаксел (Petrylak et al., 2012, J Clin Oncol 30 (Abstract TPS4675). Большой институциональный обзор часто назначаемого препарата второй линии, пеметрекседа, показал частоту объективного ответа 5 % (95 % доверительный интервал, 1 %-9 %) и медианную выживаемость без прогрессирования заболевания 2,4 месяца (Bambury et al., 2015, Oncologist 20:50-15). Таким образом, в данное время пациенты с PRUC имеют ограниченный выбор терапии.
[0172] В этой первой группе пациентов с PRUC, включенных в испытания фазы I/II, сацитузумаб говитекан продемонстрировал предварительный сигнал значительной клинической активности в этой когорте, получавшей интенсивное предшествующее лечение. Как ранее наблюдалось для клеточных линий UC и полученных от пациентов опухолей PRUC, мы детектировали высокие уровни экспрессии белка Trop-2 в биоптатах опухолей у пациентов, получавших сацитузумаб говитекан (Фиг. 2). Размер нашей выборки не позволил установить корреляцию между уровнями экспрессии Trop-2 и клиническим ответом. Тем не менее, активность, наблюдаемая в этой небольшой группе пациентов с PRUC, с хорошей общей переносимостью, согласуется с доклиническими результатами, указывающими, что КАП селективно доставляет значительную долю сильнодействующего лекарственного средства в опухолевые клетки, а не в нормальные клетки (Sharkey et al., 2015, Clin Cancer Res 21:3870-78). Представленные выше данные демонстрируют безопасность и эффективность IMMU-132 при метастатическом раке уротелия.
Пример 2. Дальнейшие исследования IMMU-132 при метастатическом уротелиальном раке
[0173] Следуя примеру 1, проводили дальнейшие исследования на пациентах с mUC (метастатический уротелиальный рак), предварительно получавших платиносодержащую химиотерапию. Такие пациенты имеют ограниченные терапевтические возможности, с ответами на иммунотерапию ингибиторами контрольных точек (IO) у меньшинства пациентов. Мы представляем дополнительные доказательства безопасности и активности сацитузумаба говитекана (IMMU-132) в качестве терапии для пациентов с mUC, ранее получавших лечение химиотерапией (ClinicalTrials.gov, NCT01631552).
Метод
[0174] Мы зарегистрировали 32 пациента с mUC и ECOG PS 0-1 (функциональный статус от 0 до 1 по шкале Восточной кооперативной онкологической группы), которые не реагировали на одну или более предшествующую стандартную терапию (медиана=3; диапазон, 1-5).IMMU-132 вводили в дозе 8 или 10 мг/кг в дни 1 и 8 каждые 21 день, продолжая лечение до прогрессирования заболевания (ПЗ) или неприемлемой токсичности. Пациенты с оцениваемым ответом получали больше или равно 2 доз, и имели больше или равно 1 оценки ответа после базовой линии.
Результаты
[0175] Двадцать пять пациентов [средний возраст 68 лет (диапазон:50-91), 24 мужчины] оценивали для определения безопасности и эффективности лечения; 23 получали предшествующую платиносодержащую терапию; 46 % имели более 2 предшествующих терапий; 4 также получали IO-агенты. Очаги метастазирования включали печень (N=4; 16 %), легкие (N=7; 28 %), кости (N=4; 16 %) и лимфатические узлы (N=16; 64 %). Пациенты получали в среднем 7 циклов (диапазон, 2-23) IMMU-132. Процент пациентов с объективным ответом (ORR) составлял 36 % (9/25) [1 полный (ПО) и 8 частичных ответов (ЧО)]; 44 % (11/25) имели стабильное заболевание (СЗ). Кроме того, пациенты с 1 линией предшествующей химиотерапии имели частоту объективного ответа (ORR) 53,8 % (7/13) и 16,7 % у пациентов с 2-5 линиями предшествующей терапии. Медиана ВБП для всех пациентов составляет 7,2 мес. (95 % ДИ, 4,9-10,7); медиана выживаемости еще не достигнута. Из 4 пациентов с прогрессированием после предшествующей IO, у 1 наблюдался ЧО и у 2 - СЗ при использовании IMMU-132. Продолжительность ответа у пациентов CR/PR в данное время составляет 5,1 мес. (95% ДИ, 4,1-12,9) и 10/11 пациенты (5 с более или равно 20 % уменьшения опухоли) имели стабильное заболевание более 4 мес. Нейтропения 4 степени (16 %) длилась менее 7 дней, а негематологические неблагоприятные эффекты (АЕ) 3 степени включали утомляемость (12 %) и гипофосфатемию (8 %). Случаев смерти, связанных с лечением, не наблюдалось. Анализ экспрессии Trop-2 выявил положительное окрашивание от 1+ до 3+ в 95 % из 19 архивных образцов пациентов.
Заключение
й
[0176] При частоте объективных ответов (ORR) 36 % и медиане ВБП 7,2 месяцев в популяции, получавшей ранее интенсивное лечение, такие промежуточные результаты показывают эффективность и переносимость IMMU-132 в качестве терапии 2 линии или более поздней для пациентов с mUC, получавших ранее лечение платиной или IO.
Пример 3. Клинические испытания КАП анти-Trop2 IMMU-132 при различных Trop-2+ раках
Резюме
5
[0177] В данном примере приводятся результаты клинических испытаний I фазы и продолжающегося продолжения II фазы с использованием IMMU-132, КАП интернализующегося гуманизированного антитела против Trop-2 hRS7, конъюгированного рН-чувствительным линкером с SN-38 (среднее соотношение лекарственное средство-антитело = 7,6). Trop-2 представляет собой трансдуцирующий кальций трансмембранный белок типа I, экспрессируемый с высокой плотностью (около 1×10), частотой и специфичностью многими карциномами человека, при ограниченной экспрессии нормальной тканью. Доклинические исследования на голых мышах, несущих ксенотрансплантаты опухоли поджелудочной железы человека Capan-1, показали, что IMMU-132 способен доставлять в опухоль до 120 раз большее количество SN-38, чем при максимально переносимой терапии иринотеканом.
[0178] Показанные результаты были получены в ходе первоначальных исследований фазы I на 25 пациентах с неудачей множественных предшествующих терапий (некоторые из них включали препараты, ингибирующие топоизомеразу I/II), и продолжающегося продолжения фазы II, в данное время сообщающего о 69 пациентах, в том числе с колоректальным раком (КРР), мелкоклеточным и немелкоклеточным раком легкого (МРЛ, НМРЛ, соответственно), трижды негативным раком молочной железы (ТНРМЖ), раком поджелудочной железы (РПЖ (PDC - карцинома протока поджелудочной железы)), раком пищевода и другими видами рака.
+
[0179] Как подробно обсуждается ниже, Trop-2 не был обнаружен в сыворотке, но сильно экспрессировался (иммуногистохимическое окрашивание больше или равно 2) в большинстве архивных опухолей. В испытаниях по схеме 3+3, IMMU-132 вводили в дни 1 и 8 в повторяющихся 21-дневных циклах, начиная с 8 мг/кг/дозу, а затем 12 и 18 мг/кг, до ограничивающей дозу нейтропении. Для оптимизации кумулятивного лечения с минимальными задержками фаза II фокусируется на 8 и 10 мг/кг (n = 30 и 14, соответственно). Из 49 пациентов, сообщивших об ассоциированных побочных эффектах (ПЭ) к этому моменту, нейтропения более или равно 3-й степени наблюдалась у 28 % (4 % - 4-й степени). Наиболее распространенными негематологическими токсическими эффектами у этих пациентов были усталость (55 %; ≥G3 = 9%), тошнота (53 %; ≥G3 = 0%), диарея (47 %; ≥G3 = 9%), алопеция (40 %) и рвота (32 %; ≥G3 = 2%); также часто наблюдалась алопеция. Гомозиготный UGT1A1 *28/*28 был обнаружен у 6 пациентов, 2 из которых имели более тяжелые формы гематологической и желудочно-кишечной токсичностей.
[0180] В Фазе I и в фазе продолжения участвует в данное время 48 пациентов (за исключением РПЖ), которых оценивали по методике RECIST/CT на лучший ответ. Семь (15 %) из пациентов имели частичный ответ (ЧО), включая пациентов с КРР (N = 1), ТНРМЖ (N = 2), МРЛ (N = 2), НМРЛ (N = 1) и раком пищевода (N = 1), и еще 27 пациентов (56 %) имели стабильное заболевание (СЗ), в общей сложности 38 пациентов (79 %) с ответом на заболевание; 8 из 13 оцениваниемых с использованием метода КТ пациентов с РПЖ (62 %) имели СЗ, с медианой времени до прогрессирования (ВДП), равной 12,7 недель, по сравнению с 8,0 неделями в их последней предшествующей терапии. ВДП для остальных 48 пациентов составляло 12,6+ недель (диапазон от 6,0 до 51,4 недель). РЭА (раково-эмбриональный антиген) плазмы и CA19-9 коррелировали с ответами (пациентов), имевших повышенные титры этих антигенов в крови. Анти-hRS7 или анти-SN-38 антитела не детектировались, несмотря на дозировку на протяжении нескольких месяцев.
[0181] Конъюгат выводился из сыворотки в течение 3 дней, что согласуется с in vivo исследованиями на животных, в которых ежедневно высвобождалось 50 % SN-38, причем более 95 % SN-38 в сыворотке связывалось с IgG в неглюкоронидированной форме, и в концентрациях, как сообщается, до 100 раз превышающих уровни SN-38 у пациентов, получавших иринотекан. Эти результаты показывают, что КАП, содержащий hRS7-SN-38, является терапевтически активным при метастатических солидных раках с управляемыми диареей и нейтропенией.
Фармакокинетика
[0182] Два метода ИФА (ELISA) были использованы для измерения клиренса IgG (захват анти-hRS7-идиотипическим антителом) и интактного конъюгата (захват анти-SN-38 IgG/зондом с анти-hRS7 идиотипическим антителом).SN-38 измеряли методом ВЭЖХ. Клиренс фракции общего IMMU-132 (интактный конъюгат) происходил быстрее, чем IgG (не показано), что отражает известное постепенное высвобождение SN-38 из конъюгата. Определение SN-38 (несвязанного и общего) методом ВЭЖХ показало, что более 95% SN-38 в сыворотке было связано с IgG. Низкие концентрации SN-38G позволяют предположить, что SN-38, связанный с IgG, защищен от глюкоронидации. Сравнение результатов ИФА для конъюгата и ВЭЖХ для SN-38 показало, что они перекрываются, указывая на то, что ИФА может использоваться вместо мониторинга клиренса SN-38.
[0183] Краткое описание схемы дозирования и пула пациентов приведено Таблице 3.
Таблица 3. Параметры клинических испытаний
Схема дозирования
Введение раз в неделю в течение 2 недель каждые 21 день на протяжении до 8 циклов. При первоначальном зачислении введение запланированной дозы задерживали и дозу уменьшали в случае связанной с лечением токсичности больше или равно 2 степени; протокол изменяли с учетом задержки и снижения дозы только в случае токсичности больше или равно 3 степени.
Когорты уровней дозы
8, 12, 18 мг/кг; позднее снижена до промежуточного уровня дозы 10 мг/кг.
Размер когорт
Стандартная схема Фазы I [3+3]; продолжение включало около15 пациентов с выбранными видами раков.
ДЛТ (дозолимитирующая токсичность)
ANC (абсолютное число нейтрофилов) степени 4 больше или равно 7 дней; фебрильная нейтропения любой продолжительности степени больше или равно 3; тромбоциты степени 4 (G4 Plt) больше или равно 5 дней; гемоглобин степени 4; тошнота/рвота/диарея (N/V/D) степени 4 любой продолжительности/тошнота/рвота/диарея степени 3 на протяжении более 48 ч; инфузионные реакции степени 3; ассоциированная негематологическая токсичность степени больше или равно 3.
Максимально допустимая доза (МДД)
Максимальная доза, при которой более или равно 2/6 пациентов переносят 1<sup>й</sup> 21-дневный цикл без задержки или снижения доз или токсичности степени ≥G3.
Пациенты
Метастатический колоректальный, поджелудочной железы, желудка, пищевода, легкого (НМРЛ, МРЛ), трижды негативный молочной железы (ТНРМЖ), простатя, яичника, почки, мочевого пузыря, головы/шеи, печеночноклеточный. Рефрактерный/рецидивирующий после стандартных схем лечения метастатического рака. Для зачисления НЕ требуется предшествующая иринотекан-содержащая терапия. Отсутствие объемных очагов поражения более 5 см.Не менее 4 недель после любой "большой" операции, и 2 недель после схем лучевой или химиотерапии. Болезнь Жильбера или известное метастатическое поражение ЦНС исключаются.
Статус клинических испытаний
[0184] Всего было описано 69 пациентов (включая 25 пациентов в фазе I) с различными метастатическими раками, имеющих в среднем 3 предшествующих терапии. Восемь пациентов имели клиническое прогрессирование и были исключены до проведения КТ. Тринадцать пациентов с раком поджелудочной железы, поддающихся оценке с помощью КТ, были зарегистрированы отдельно. Медиана ВДП (время до прогрессирования) у пациентов с РПЖ (рак поджелудочной железы) составляла 11,9 недель (диапазон от 2 до 21,4 недель) по сравнению с медианой ВДП, равной 8 неделям для последней предшествующей терапии.
[0185] В общей сложности 48 пациентов с различными видами рака прошли по крайней мере 1 КТ-обследование, по результатам которого были определены лучший ответ (Фиг. 3) и время до прогрессирования (ВДП; не показано). Обобщенные данные по лучшему ответу - из 8 оцениваемых пациентов с ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы) у 2 наблюдался ЧО (частичный ответ), 4 - СЗ (стабильное заболевание) и 2 - ПЗ (прогрессирующее заболевание), с суммарным ответом [ЧО + СЗ] 6/8 (75 %). Для МРЛ (мелкоклеточный рак легкого), у 4 оцениваемых пациентов наблюдалось 2 ЧО, 0 СЗ и 2 ПЗ, с суммарным ответом 2/4 (50 %). Для КРР (колоректальный рак), у 18 оцениваемых пациентов наблюдалось 1 ЧО, 11 СЗ и 6 ПЗ, с суммарным ответом 12/18 (67 %). Для рака пищевода, у 4 оцениваемых пациентов наблюдалось 1 ЧО, 2 СЗ и 1 ПЗ, с суммарным ответом 3/4 (75 %). Для НМРЛ (немелкоклеточный рак легкого), у 5 оцениваемых пациентов наблюдалось 1 ЧО, 3 СЗ и 1 ПЗ, с суммарным ответом 4/5 (80 %). Для всех получающих лечение пациентов, у 48 оцениваемых пациентов наблюдалось 7 ЧО, 27 СЗ и 14 ПЗ, с суммарным ответом 34/48 (71 %). Эти результаты демонстрируют, что КАП анти-Trop2 (hRS7-SN-38) проявляет значительную клиническую эффективность против широкого спектра солидных опухолей у людей.
[0186] Сообщенные побочные эффекты терапии (нежелательные эффекты) обобщены в Таблице 4. Как видно из данных, приведенных в Таблице 4, терапевтическая эффективность hRS7-SN-38 была достигнута при дозах КАП, демонстрирующих приемлемо низкий уровень неблагоприятных побочных эффектов.
Таблица 4.
Перечень ассоциированных побочных эффектов для IMMU-132-01Критерии: Всего больше или равно 10 % или больше или равно 3 степени
N = 47 пациентов
ВСЕГО
Степени 3
Степени 4
Усталость
55 %
4 (9 %)
0
Тошнота
53 %
0
0
Диарея
47 %
4 (9 %)
0
Нейтропения
43 %
11 (24 %)
2 (4 %)
Алопеция
40 %
--
--
Рвота
32 %
1 (2 %)
0
Анемия
13 %
2 (4 %)
0
Дисгевзия
15 %
0
0
Пирексия
13 %
0
0
Боль в животе
11 %
0
0
Гипокалиемия
11 %
1 (2 %)
0
Снижение лейкоцитов (WBC)
6 %
1 (2 %)
0
Фебрильная нейтропения
6 %
1 (2 %)
2 (4 %)
Тромбоз глубоких вен
2 %
1 (2 %)
0
Оценка по CTCAE (Общая терминология критериев нежелательных явлений) v 4.0
[0187] Исследования, описанные в Таблице 4, были продолжены, к настоящему времени был зарегистрирован 261 пациент. Результаты (не показаны) в общем соответствуют тенденциям, указанным в Таблице 4, с исключением только для нейтропении, демонстрирующей частоту нежелательных эффектов степени 3 или выше более 10 % обследованных пациентов. Для всех других нежелательных явлений частота ответов степени 3 или выше составляла менее 10 %. Это отличает иммуноконъюгаты по данному изобретению от подавляющего большинства КАП и, в некоторых вариантах реализации, заявляемые способы и композиции относятся к КАП с анти-Trop-2, которые проявляют эффективность при различных солидных опухолях, с частотой нежелательных явлений степени 3 или выше менее 10 % пациентов для всех нежелательных явлений, кроме нейтропении. При продолжении исследований, для в общей сложности 421 образца от 121 пациента с доступными образцами базовой линии и по крайней мере одного образца последующих исследований, не было выявлено образования антител против hRS7 или против SN-38, несмотря на повторные циклы лечения.
[0188] Типичные примеры частичных ответов на КАП анти-Trop-2 были подтверждены данными КТ (не показаны). В качестве типичного примера ЧО при КРР, женщина в возрасте 62 лет с первичным диагнозом КРР была подвергнута первичной гемиколэктомии. Через четыре месяца, ей была проведена резекция печени по поводу метастазов в печени, и она 7 месяцев получала лечение FOLFOX и 1 месяц - 5FU. На момент включения в исследования, у нее наблюдались множественные очаги поражения, главным образом в печени (3+ Trop-2 по иммуногистологии), был назначен hRS7-SN-38 в начальной дозе 8 мг/кг примерно через 1 год после первоначального диагноза. При ее первом КТ-обследовании был достигнут ЧО, с 37 % уменьшением целевых поражений (не показано). Пациент продолжал лечение, достигнув максимального снижения на 65 % после 10 месяцев лечения (не показано), со снижением РЭА с 781 нг/мл до 26,5 нг/мл), с последующим прогрессированием через 3 месяца.
й
[0189] В качестве типичного примера ЧО при НМРЛ, у мужчины в возрасте 65 лет был диагностирован НМРЛ стадии IIIB (плоскоклеточный). Первоначальное лечение кабоплатином/этопозидом (3 месяца) совместно с рентгенотерапией (XRT) 7000 сГр привело к ответу продолжительностью 10 месяцев. Затем ему была назначена поддерживающая терапия тарцева, которую он продолжал до тех пор, пока ему не предложили принять участие в испытаниях IMMU-132, в дополнение к проведению люмбальной ламинэктомии. Он получил первую дозу IMMU-132 после 5 месяцев тарцева, имея в это время очаг поражения 5,6 см в правом легком с обильным плевральным выпотом. Сразу после введения ему 6 дозы через два месяца первая КТ показала, что первичное целевое поражение уменьшилось до 3,2 см (не показано).
[0190] В качестве типичного примера ЧО при МРЛ, у женщины в возрасте 65 лет был диагностирован слабодифференцированный МРЛ. После приема карбоплатина/этопозида (ингибитор топоизомеразы-II), который закончился через 2 месяца без ответа, а затем топотекана (ингибитор топоизомеразы-I), который закончился через 2 месяца, также без ответа, она получала местную рентгенотерапию (XRT) (3000 сГр), которая закончилась спустя 1 месяц. Однако, к следующему месяцу прогрессирование продолжилось. Пациент начал прием IMMU-132 со следующего месяца (12 мг/кг; снижена до 6,8 мг/кг; экспрессия Trop-2 3+), и после двух месяцев IMMU-132 наблюдалось уменьшение на 38 % целевых поражений, включая значительное уменьшение основного очага в легких (не показано). Пациент прогрессировал через 3 месяца после приема 12 доз.
[0191]  Эти результаты важны тем, что они демонстрируют эффективность КАП анти-Trop-2, даже у пациентов с неудачей терапии или прогрессированием заболевания после многократных предшествующих терапий.
В заключение, в использованных дозах первичная токсичность представляла собой управляемую нейтропению, с несколькими случаями токсичности 3 степени.IMMU-132 продемонстрировал доказательства активности (ЧО и длительное СЗ) у пациентов с рецидивирующим/рефрактерным трижды негативным раком молочной железы, мелкоклеточным раком легкого, немелкоклеточным раком легкого, колоректальным раком и раком пищевода, включая пациентов с предшествующей историей рецидива после терапии ингибитором топоизомеразы-I. Эти результаты показывают эффективность КАП анти-Trop-2 для широкого спектра раковых заболеваний, устойчивых к существующим методам лечения.
Пример 4. Лечение пациентов с запущенным метастатическим раком поджелудочной железы с использованием КАП анти-Trop2
Резюме
[0192] Trop-2 представляет собой трансмембранный кальций-трансдуцирующий белок I типа, экспрессируемый с высокой плотностью, частотой и специфичностью при многих видах рака эпителия, включая аденокарциному протоков поджелудочной железы, с ограниченной экспрессией в нормальной ткани. Все 29 протестированных образцов микрочипов опухолей поджелудочной железы были Trop-2-позитивными по иммуногистохимии, и было обнаружено, что клеточные линии рака поджелудочной железы человека экспрессируют 115-891 тыс. копий Trop-2 на клеточной мембране.
[0193] Выше мы описали результаты исследований IMMU-132 фазы I, включающих пациентов с 13 разными типами опухолей, с использованием схемы 3+3. Дозолимитирующей токсичностью фазы I была нейтропения. Более 80 % из 24 оцениваемых пациентов в этих исследованиях имели долговременное стабильное заболевание, с частичными ответами (RECIST), наблюдаемыми у пациентов с колоректальным раком (КРР), трижды негативным раком молочной железы (ТНРМЖ), мелкоклеточным и немелкоклеточным раком легкого (МРЛ, НМРЛ) и раком пищевода (ЭАК (EAC - эзофагеальная аденокарцинома)). В данном примере приводятся результаты исследований IMMU-132 фазы I/II в когорте пациентов с метастатическим РПЖ. Пациенты с РПЖ, имеющие в среднем 2 неудачи предшествующих терапий (диапазон 1-5), получали IMMU-132 в дни 1 и 8 повторяющихся 21-дневных циклов.
[0194] В подгруппе пациентов с РПЖ (N=15), 14 получали предшествующие схемы лечения, включающие гемцитабин. Исходные данные о токсичности у 9 пациентов включали нейтропению [у 3 из 9 – больше или равно 3-й степени, 33 %; и 1 случай фебрильной нейтропении 4-й степени), которая приводила к задержкам или снижению дозы. У двух пациентов была диарея 3 степени; ни у одного пациента не было тошноты или рвоты 3-4 степени. Алопеция (1-2 степени) наблюдалась у 5 из 9 пациентов. Лучший ответ оценивали у 13 из 14 пациентов, с 8 случаями стабильного заболевания на протяжении от 8 до 21,4 недель (медиана 12,7 недель; 11,9 недель для всех 14 пациентов). Один пациент, который продолжает лечение, еще не прошел первое КТ-обследование. У пяти пациентов было прогрессирующее заболевание в соответствии с RECIST; 1 выбыл из исследований после всего 1 дозы из-за клинического прогрессирования и не оценивался. Титры CA19-9 сыворотки снизились у 3 пациентов со стабильным заболеванием на величину от 23 до 72 %. Несмотря на многократные введения, ни у одного из пациентов не развился антительный ответ на IMMU-132 или SN-38. Образцы сыворотки с пиковыми и минимальными концентрациями препарата показали, что клиренс IMMU-132 проходил быстрее, чем IgG, что было ожидаемым на основании известного локального высвобождения SN-38 в опухолевой клетке. Концентрации SN-38, связанного с IgG, в пиковых образцах одного пациента, получавшего 12 мг/кг IMMU-132, показали уровни около 4000 нг/мл, что в 40 раз выше титров SN-38, зарегистрированных у пациентов, получавших терапию иринотеканом.
[0195] Мы пришли к выводу, что IMMU-132 является активным (долговременное стабильное заболевание) у 62 % (8/13) пациентов с РПЖ, имеющих множественные неудачи предшествующих терапий, с управляемой нейтропенией и незначительной желудочно-кишечной (GI) токсичностью. Пациентам с запущенной РПЖ могут назначаться повторные циклы лечения (более 6) по 8-10 мг/кг IMMU-132 в дни 1 и 8 21-дневного цикла, с некоторыми корректировками дозы или поддержкой фактором роста при нейтропении в последующих циклах лечения. Эти результаты согласуются с результатами, полученными у пациентов с поздними стадиями КРР, ТНРМЖ, МРЛ, НМРЛ, ЭАК, которые продемонстрировали частичные ответы и долговременное стабильное заболевание при введении IMMU-132. Таким образом, монотерапия IMMU-132 представляет собой новую эффективную схему лечения для пациентов с РПЖ, включая пациентов с опухолями, которые ранее были резистентными к другим схемам лечения РПЖ.
Методы и результаты
[0196] Экспрессия Trop-2 - Экспрессия Trop-2 на поверхности различных линий раковых клеток определяли методом проточной цитометрии с использованием шариков QUANTBRITE PE. Для ряда молекул Trop-2, детектированных в различных клеточных линиях, были получены следующие результаты:Рак поджелудочной железы BxPC-3 (891000); рак желудка NCI-N87 (383000); рак молочной железы MDA-MB-468 (341000); плоскоклеточный рак легкого SK-MES-1 (27000); рак поджелудочной железы Capan-1 (115000); рак желудка AGS (78000) рак толстой кишки COLO 205 (52000). Экспрессия Trop-2 также наблюдалась у 29 из 29 (100 %) тканевых микрочипов аденокарциномы поджелудочной железы (не показано).
2
[0197] Накопление SN-38 – Накопление SN-38 определяли у голых мышей с ксенотрансплантатами человеческого рака поджелудочной железы Capan-1 (около 0,06-0,27 г). Мышам вводили внутривенной инъекцией иринотекан 40 мг/кг (773 мкг; общее количество эквивалентов SN-38 = 448 мкг). Эта доза является MTD (максимально переносимая доза) для мышей. Эквивалентная доза для человека = 3,25 мг/кг или около 126 мг/м. Или мышам вводили внутривенной инъекцией IMMU-132 1,0 мг (соотношение SN-38:антитело = 7,6; эквиваленты SN-38 = 20 мкг). Эта доза значительно ниже максимально переносимой дозы у мышей. Эквивалентная доза для человека составляет около4 мг/кг IMMU-132 (около 80 мкг/кг эквивалентов SN-38). Аутопсии проводили у 3 животных на интервал времени, для мышей, получавших инъекции иринотекана в моменты времени 5 мин, 1, 2, 6 и 24 часов, или для мышей, получавших инъекции IMMU-132 в моменты времени 1, 6, 24, 48 и 72 ч. Ткани извлекали и анализировали с помощью анализа методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на SN-38, SN-38G и иринотекан. Экстракты от животных, получавших IMMU-132, также подвергали кислотному гидролизу для высвобождения SN-38 из конъюгата (т.е., SN-38 [ОБЩИЙ]). Результаты (не показано) демонстрируют, что КАП IMMU-132 обладает способностью доставлять в опухоль в 120 раз большее количество SN-38 по сравнению с иринотеканом, хотя с КАП вводили в 22 раза меньшее количество эквивалентов SN-38.
[0198] Клинический протокол IMMU-132 – Протокол, использованный в исследованиях фазы I/II, был таким, как указано в Таблице 5 ниже.
Таблица 5. Клинический протокол с использованием IMMU-132:ОБЗОР
Схема дозирования
Введение раз в неделю в течение 2 недель каждые 21 день на протяжении до 8 циклов.Пациентам с объективными ответами разрешено продолжать лечение после 8 циклов. При первоначальном зачислении, введение задерживали и запланированную дозу уменьшали при больше или равно 2-й степени токсичности, связанной с лечением; протокол был изменен позже по ходу исследований, чтобы задержка введения и снижение дозы применялись только в случае больше или равно 3-й степени токсичности. Развитие тяжелой токсичности вследствие лечения требует снижения дозы на 25 % от назначенной дозы для 1<sup>го</sup> случая, 50 % для 2<sup>го</sup> случая, и лечение полностью прекращали при 3<sup>м</sup> случае.
Когорты уровней дозы
8, 12, 18 мг/кг; позднее снижена до промежуточного уровня дозы 10 мг/кг.
Размер когорт
Стандартная схема фазы I [3+3]; продолжение включает 15 пациентов для выбранных видов рака.
ДЛТ (дозолимитирующая токсичность)
ANC (абсолютное число нейтрофилов) степени 4 более или равно 7 дней; фебрильная нейтропения любой продолжительности степени больше или равно 3; тромбоциты степени 4 более или равно 5 дней; гемоглобин степени 4; тошнота/рвота/диарея (N/V/D) степени 4 любой продолжительности или любая реакция из тошноты/рвоты/диареи степени 3 на протяжении более 48 ч; инфузионные реакции степени 3; не связанная с гемом токсичность степени больше или равно 3, по меньшей мере вероятно вызванная исследуемым препаратом.
Максимально допустимая доза (МДД)
Максимальная доза, при которой более или равно 2/6 пациентов переносят полный 21-дневный цикл лечения без задержки или снижения дозы или развития токсичности больше или равно 3 степени.
Пациенты
• Метастатический колоректальный, поджелудочной железы, желудка, пищевода, легкого (НМРЛ, МРЛ), трижды негативный молочной железы, простаты, яичника, почки, мочевого пузыря, головы и шеи, почечно-клеточный.• Рефрактерный/рецидивирующий после стандартных схем лечения метастатического рака.• Для зачисления НЕ требуется предшествующая иринотекан-содержащая терапия.• Отсутствие объемных очагов поражения более5 см.• Не менее 4 недель после любой "большой" операции, и 2 недель после схем лучевой или химиотерапии.• Болезнь Жильбера или известное метастатическое поражение ЦНС исключаются.
[0199] Пациентам вводили IMMU-132 в соответствии с описанным выше протоколом. Далее приведено описание типичного конкретного случая.34-летний белый мужчина, у которого первоначально был диагностирован метастатический рак поджелудочной железы (печень), прогрессировал на нескольких схемах химиотерапии, включая гемцитабин/эрлотиниб/FG-3019, FOLFIRINOX и GTX до введения IMMU-132 (доза 8 мг/кг в дни 1 и 8 21-дневного цикла). Пациент получал препарат в течение 4 месяцев с хорошей симптоматической переносимостью, улучшением болевых ощущений, максимальным снижением CA19-9 на 72 % (с 15885 Е/мл до 4418 Е/мл) и статуса стабильного заболевания по критериям RECIST-КТ наряду с доказательствами некроза опухоли. Терапия должна была быть приостановлена из-за абсцесса печени; пациент скончался через примерно 6 недель, через 6 месяцев после начала терапии.
[0200] Исследования 14 пациенты с запущенным РПЖ, которые рецидивировали после в среднем 2 предшествующих терапий, продемонстрировали подтвержденную методом КТ противоопухолевую активность, с 8/13 (62 %) стабильными заболеваниями. Медиана продолжительности ВДП для 13 оцениваемых методом КТ пациентов составляла 12,7 недель по сравнению с 8,0 неделями, определенными для последней предшествующей терапии. Этот КАП, с известным препаратом наномолярного уровня токсичности, конъюгированным с антителом, нацеленным на Trop-2, распространенным при многих эпителиальных раках, с помощью линкера, обеспечивающего расщепление в опухолевом очаге, представляет новую эффективную стратегию в терапии рака поджелудочной железы с помощью КАП. По сравнению с существующим в настоящее время стандартом лечения пациентов с раком поджелудочной железы, увеличение времени до прогрессирования у пациентов с раком поджелудочной железы, особенно у пациентов, резистентных к множественным предшествующим методам лечения, было неожиданным и не могло быть предсказано.
Пример 5. Дальнейшие результаты клинических исследований I/II фазы
Трижды негативный рак молочной железы (ТНРМЖ)
[0201] Клинические испытания фазы I/II (NCT01631552), описанные в Примерах выше, были продолжены, с привлечением 56 пациентов с ТНРМЖ, которые получали 10 мг/кг. Популяция пациентов ранее получала интенсивное лечение до начала терапии IMMU-132, с по крайней мере двумя предыдущими линиями терапии, включая лечение таксаном. Предыдущее лечение включало циклофосфамид, доксорубицина, карбоплатин, гемцитабин, капецитабин, эрибулин, цисплатин, анастрозол, винорелбин, бевацизумаб и тамоксифен. Несмотря на такой обширный анамнез лечения, пациенты с ТНРМЖ хорошо реагировали на IMMU-132, с 2 подтвержденными полными ответами (ПО), 13 частичными ответами (ЧО) и 25 стабильными заболеваниями (СЗ), с суммарным объективным ответом 29 % (15/52) (Фиг. 4). Суммируя частоты ПО плюс ЧО плюс СЗ, лечение ТНРМЖ дало 71 % благоприятных ответов для пациентов, получавших лечение IMMU-132 (не показано). Медиана времени до прогрессирования в этой получавшей ранее интенсивное лечение популяции пациентов с ТНРМЖ составляла 9,4 месяцев, в диапазоне от 2,9 до 14,2 месяцев до настоящего времени. Однако, 72 % пациентов, участвующих в исследовании, все еще продолжали лечение. Выживаемость без прогрессирования в этой группе пациентов показана на Фиг. 5.
Метастатический НМРЛ
[0202] Также продолжаются клинические испытания для пациентов с метастатическим немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), с 29 оцениваемыми пациентами, зарегистрированными на сегодняшний день, которые получали 8 или 10 мг/кг IMMU-132. Лучшие ответы по критериям RESIST 1.1 показаны на Фиг. 6. Из 29 пациентов, наблюдалось 8 ЧО и 13 СЗ. Время до прогрессирования для пациентов с НМРЛ представлено на Фиг. 7, которая показывает, что 21/33 (64 %) пациентов с НМРЛ демонстрировали ЧО или СЗ. Медиана времени до прогрессирования составляла 9,4 (9/4) месяцев, с диапазоном значений от 1,8 до 15,5+ месяцев, и 47 % пациентов все еще проходили лечение. Выживаемость без прогрессирования у пациентов с НМРЛ, получавших 8 или 10 мг/кг IMMU-132, показана на Фиг. 8. Медиана ВБП составляла 3,4 месяцев при 8 мг/кг и 3,8 месяцев при 10 мг/кг. Однако, исследования продолжаются, и средние показатели выживаемости без прогрессирования, вероятно, улучшатся.
Метастатический МРЛ
[0203] Сопоставимые результаты были получены для пациентов с метастатическим МРЛ. Лучший ответ по RECIST 1.1 для пациентов с метастатическим МРЛ, получавших 8 или 10 мг/кг IMMU-132, показал 6 ЧО и 8 СЗ из 25 оцениваемых пациентов (не показано). Время до прогрессирования показало медиану, равную 4,9 месяцев, с диапазоном значений от 1,8 до 15,7+ месяцев, и 7 пациентов продолжали получать лечение IMMU-132 (не показано). Выживаемость без прогрессирования показало медианное ВБП 2,0 месяца для 8 мг/кг и 3,6 месяцев для 10 мг/кг (не показано). Медиана общей выживаемости (OS) составляла 8,1 месяцев для 8 мг/кг и пока не могла быть определена для 10 мг/кг.
[0204] Таким образом, продолжающиеся клинические испыания фазы I/II показывают повышенную эффективность IMMU-132 при введении с указанными дозировками КАП, по меньшей мере при ТНРМЖ, НМРЛ, МРЛ и уротелиальных раках. Превосходный терапевтический эффект при этих подвергавшихся интенсивному лечению и резистентных метастатических раковых заболеваниях возникал без индуцирования тяжелой токсичности, которая могла бы исключить клиническое применение.IMMU-132 продемонстрировал приемлемый профиль безопасности у пациентов с различными солидными формами рака, получавших ранее интенсивную терапию, в среднем, 2-5 предшествующих терапий. Только нейтропения показала частоту более 20 % популяции пациентов для побочных реакций степени 3 или выше. Исследование также демонстрирует, что повторные дозы IMMU-132 могут вводиться людям в терапевтических дозах, не индуцируя перекрестнореагирующих анти-IMMU-132 антител хозяина. Эти результаты демонстрируют безопасность и полезность IMMU-132 для лечения различных Trop-2-позитивных видов рака у людей.
Пример 6. Комбинированная терапия с использованием КАП IMMU-132 и ингибиторов микротрубочек или ингибиторов PARP
[0205] Синтетическая летальность представляет собой концепцию, по которой клетка, несущая один из двух возможных дефектов гена или белка, является жизнеспособной, тогда как клетка, содержащая оба дефекта, нежизнеспособна. Мутации BRCA1/2 связаны с недостатками репарации ДНК и ассоциируются с ТНРМЖ. Другие механизмы репарации включают поли(аденозиндифосфорибоза)полимеразу (PARP), которая может использоваться раковыми клетками для преодоления потери BRACA1/2. Обработка клеток ТНРМЖ с помощью IMMU-132 или паклитаксела приводит к расщеплению и дезактивации PARP, тогда как олапариб, представляющий собой малую молекулу, непосредственно ингибирует PARP. Таким образом, предположение о том, что объединение IMMU-132 с паклитакселом или олапарибом будет эффективно нокаутировать активность PARP, было исследовано на ксенотрансплантатах ТНРМЖ, чтобы установить, приведут ли такие комбинации к синтетической летальности.
[0206] Цель этого исследования состояла в определении того, будет ли объединение конъюгата антитело-лекарственное средство, индуцирующее разрывы цепи ДНК, такое как сацитузумаб говитекан (также известный как IMMU-132, анти-Trop-2 hRS7-CL2A-SN-38), с ингибиторами микротрубочек (например, паклитаксел или эрибулин мезилат) или ингибиторами поли(аденозиндифосфорибоза)полимеразы (PARP) (например, олапариб) при раке (например, голые мыши с ксенотрансплантатами TNBC) улучшать противоопухолевые эффекты. Рядовому специалисту в данной области техники будет понятно, что неожиданные улучшенные эффекты комбинации конъюгатов антитело-SN-38 с ингибиторами PARP или микротрубочек не ограничены конкретными типичными примерами антитела, лекарственного средства, ингибитора PARP или ингибитора микротрубочек, а скорее характерны для классов антител против опухолеассоциированных антигенов (TAA), лекарственных средств, индуцирующих разрывы цепи ДНК, ингибиторов PARP и ингибиторов микротрубочек.
Экспериментальные процедуры
3
3
2
3
3
[0207] В неограничительном примере, мышей с ксенотрансплантатами человеческого ТНРМЖ (трижды негативный рак молочной железы) (MDA-MB-468 или HCC1806; около 0,3 см) лечили максимально переносимой дозой паклитаксела (15 мг/кг еженедельно × 5 недель) и IMMU-132 в дозе 10 мг/кг или 12,5 мг/кг в дни 1, 8, 22 и 29. Мышей с опухолями HCC1806 (около 0,28 см) лечили 2 циклами IMMU-132 (12,5 мг/кг) и 0,5 мг/кг эрибулина мезилата (эквивалент человеческой дозы 1,4 мг/м) еженедельно в течение 2 недель 21-дневного цикла. В исследованиях по изучению ингибирования PARP использовали мышей с опухолями MDA-MB-468 (около 0,32 см), получавших олапариб (50 мг/кг, ежедневно (qd) × 5 дней, × 4 недели; 33 % человеческой дозы, равной 800 мг в день) и IMMU-132 (10 мг/кг, два раза в неделю × 4 недели). Олапариб вводили в виде внутрибрюшинных (i.p.) инъекций ежедневно в течение 5 последовательных дней с двумя днями отдыха перед повтором (qd×5). Эта процедура выполнялась в течение четырех недель.IMMU-132 вводили внутрибрюшинно (i.p.) два раза в неделю в течение четырех недель. Контрольные животные получали не нацеленный на опухоль КАП анти-CD20 hA20-CL2A-SN-38, отдельно или в комбинации с олапарибом. Первичной конечной точкой была медиана времени выживания (MST), определяемая как время прогрессирования опухолей до 1,0 см.
[0208] В альтернативных вариантах реализации, анализ синергических эффектов мог проводиться путем in vitro анализа. Клоногенный анализ может быть использован для определения выживаемости фракции клеток (Ibrahim et al., 2012, Cancer Discovery 2:1036-47). Вкратце, 350-800 клеток высевают в 6-луночные плоскодонные планшеты для культивирования клеток с двумя параллельными опытами. Через двадцать четыре часа после посева клетки промывают и добавляют свежую среду в присутствии увеличивающихся доз КАП и/или PARP или ингибитора микротрубочек (например, олапариба), по отдельности и в комбинациях, или без них. Среды, содержащие лекарственных препарат (и/или), обновляют в день 4. Колонии фиксируют и окрашивают после 7 дней обработки 1,5 мл 6,0% глутарового альдегида и 0,5% кристаллического фиолетового, и колонии подсчитывают по стандартным процедурам. Выжившую фракцию (SF) клеток рассчитывают следующим образом:
SF =
где Коэффициент эффективности посева =
[0209] Взаимодействие между КАП и PARP или ингибитором микротрубочек оценивают с использованием метода анализа множественных лекарственных эффектов Chou and Talalay (1984, Adv Enzyme Regul 22:27-55). Этот метод количественно описывает взаимодействие между двумя или более лекарственными средствами, причем значения меньше 1 указывают на синергетические взаимодействия, значения больше 1 - на антагонистические взаимодействия, и значения, равные 1 - на аддитивные взаимодействия.
Результаты
[0210] Мыши с опухолями MDA-MB-468, получавшие комбинацию IMMU-132 и паклитаксела, демонстрировали превосходные противоопухолевые эффекты (не показано), с более 11-кратным уменьшением опухоли, по сравнению с 1,4-кратным уменьшением в группе одного IMMU-132 (P=0,0003; площадь под кривой, AUC) или 11,4-кратным увеличением размера опухоли у мышей, получавших один паклитаксел (P менее 0,0001; AUC).
3
[0211] Для MDA-MB-468, комбинация 200 мкг IMMU-132 плюс паклитаксел давала прекрасный противоопухолевый эффект по показателю площади под кривой (AUC) по сравнению со всеми другими группами (Таблица 6, P менее 0,0013). Снижение количества IMMU-132, вводимого с паклитакселом, до 100 мкг, также приводит к значительным противоопухолевым эффектам по сравнению с мышами, получавшими только паклитаксел, только IMMU-132 (100 мкг), или не получавшими лечения животными (Таблица 7, P менее 0,0328). Дальнейшие сравнения кривых роста для групп паклитаксела или не получавших лечения контрольных групп проводить нельзя, поскольку каждая из них начала терять мышей из-за прогрессирования заболевания (т.е., объем опухоли (TV) более 1,0 см), по состоянию на день 49 проведения терапии.
Таблица 6. Сравнение площади под кривыми между мышами-носителями опухоли MDA-MB-468, получавшими IMMU-132 (200 мкг) плюс паклитаксел, и всеми другими группами лечения.
Лечение
Время сравнения
Объем опухолей (см<sup>3</sup>)в этот день (среднее ± стандартное отклонение)
P-значение(AUC)
IMMU-132 (200 мкг)плюспаклитакселпротив (vs.)
IMMU-132 (200 мкг)
до дня 98 терапии
0,162 ± 0,144 vs. 0,621 ± 0,324
0,0003
IMMU-132 (100 мкг)
до дня 70 терапии
0,050 ± 0,062 vs. 0,634 ± 0,335
0,0002
паклитаксел
до дня 49 терапии
0,025 ± 0,041 vs. 0,705 ± 0,206
менее 0,0001
IMMU-132 (100 мкг) + паклитаксел
до дня 112 терапии
0,202 ± 0,191 vs. 0,496 ± 0,286
0,0013
без лечения
до дня 49 терапии
0,025 ± 0,041 vs. 0,663 ± 0,349
менее 0,0001
Таблица 7. Сравнение площади под кривыми между мышами-носителями опухоли MDA-MB-468, получавшими IMMU-132 (100 мкг) плюс паклитаксел, и всеми другими группами лечения.
Лечение
Время сравнения
Объем опухолей (см<sup>3</sup>)в этот день (среднее ± стандартное отклонение)
P-значение(AUC)
IMMU-132 (100 мкг)плюспаклитакселпротив (vs.)
IMMU-132 (200 мкг)
до дня 98 терапии
0,663 ± 0,349 vs. 0,621 ± 0,324
0,9539
IMMU-132 (100 мкг)
до дня 70 терапии
0,311 ± 0,196 vs. 0,634 ± 0,335
0,0328
паклитаксел
до дня 49 терапии
0,211 ± 0,155 vs. 0,705 ± 0,206
менее 0,0001
без лечения
до дня 49 терапии
0,211 ± 0,155 vs. 0,663 ± 0,349
0,0001
17 дней
[0212] Для быстро прогрессирующих ксенотрансплантатов HCC1806 (Фиг. 9A-9B), комбинация IMMU-132 плюс паклитаксел продемонстрировала превосходный противоопухолевый эффект по сравнению с монотерапией IMMU-132 (P=0,0195, AUC). Это очень агрессивная опухоль с медианой времени выживания (МВВ) всего 10 дней после начала терапии для не получавших лечения контрольных животныхе (18 дней после инокуляции опухолевых клеток). По показателю выживаемости, комбинация, которая достигала значения МВВ 38 дней, обеспечивала значительное улучшение выживаемости по сравнению со всеми другими терапиями (P мене 0,017; лог-ранговый). Следует отметить, что этот результат был достигнут при низкой дозе, равной всего 0,25 мг, которая будет эквивалентна человеческой дозе всего 1 мг/кг.
[0213] Мыши, получавшие комбинацию IMMU-132 плюс эрибулин мезилат (не показано), демонстрировали значительно более высокий противоопухолевый ответ, чем все другие группы монотерапии (P менее 0,0432; двусторонний t-критерий). Это привело к значительному увеличению выживаемости для комбинации (МВВ=23 дня) по сравнению с монотерапией эрибулином или IMMU-132 (МВВ=18 и 14 дней, соответственно; P менее 0,0044; лог-ранговый).
[0214] Аналогично, комбинирование терапии IMMU-132 с олапарибом превосходило терапию одним агентом у мышей с опухолями MDA-MB-468 (P менее 0,0032; AUC). Результаты суммированы в Таблице 8. Все комбинированные терапии IMMU-132 хорошо переносились.
Таблица 8. Сравнение площади под кривыми между мышами-носителями опухоли MDA-MB-468, получавшими IMMU-132 плюс олапариб, и всеми другими группами лечения.
Лечение
Время сравнения
Объем опухолей (см<sup>3</sup>)в этот день (среднее ± стандартное отклонение)
P-значение(AUC)
IMMU-132плюсолапарибпротив (vs.)
только IMMU-132
до дня 49 терапии
0,030 ± 0,038 vs. 0,088 ± 0,069
0,0023
hA20-SN-38 плюс олапариб
до дня 49 терапии
0,030 ± 0,038 vs. 0,652 ± 0,306
менее 0,0001
только hA20-SN-38
до дня 42 терапии
0,045 ± 0,045 vs. 0,654 ± 0,285
0,0002
только олапариб
до дня 28 терапии
0,083 ± 0,050 vs. 0,649 ± 0,267
менее 0,0001
физиологический раствор
до дня 28 терапии
0,083 ± 0,050 vs. 0,697 ± 0,352
менее 0,0001
AVE
[0215] Определение соотношения лекарственное средство-антитело (DAR). Пять клинических партий IMMU-132 были оценены методом ВЭЖХ гидрофобных взаимодействий (HIC-ВЭЖХ), который определил три разрешенных пика, соответствующих продуктам с DAR 6, 7 и 8, причем наибольшая фракция содержит продукт с DAR = 8 (не показано). Этот способ обеспечивает стабильное получение IMMU-132 с суммарным DAR (DAR) 7,60 ± 0,03 для пяти клинических партий. Результаты HIC-ВЭЖХ были подтверждегны методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Анализ показал, что более 99 % из 8 доступных сульфгидрильных групп вступали в реакцию сочетания с линкером CL2A, с присоединенным SN-38 или без него (не показано). Не было обнаружено незамещенных (или имеющих концевые N-этилмалеимидные группы) тяжелых или легких цепей. Таким образом, различия в DAR у продуктов вызваны высвобождением SN-38 линкером в процессе получения, а не более низкой начальной степенью замещения. После получения и лиофилизации IMMU-132 оставался стабильным в течение нескольких лет.
+
[0216] Влияние DAR на фармакокинетику и противоопухолевую эффективность у мышей. Мыши с ксенотрансплантатами Trop-2 человеческого рака желудка (NCI-N87) получали 2 курса лечения с интервалом 7 дней, каждый с равными дозами белка (0,5 мг) IMMU-132, имеющего значения DAR, равные 6,89, 3,28 или 1,64. Животные, получавшие КАП с DAR 6,89, имели значительно улучшенную медиану времени выживания (МВВ) по сравнению с мышами, получавшими КАП с DAR 3,38 или 1,64 (МВВ=39 дней vs. 25 и 21 дня, соответственно; P менее 0,0014) (не показано). Не наблюдалось различий между группами, получавшими конъюгаты с DAR 3,28 или 1,64, и контрольной группой физиологического раствора.
[0217] Для дополнительного выяснения важности более высоких значений DAR, мышам с опухолями желудка NCI-N87 вводили 0,5 мг IMMU-132 с DAR 6,89 два раза в неделю в течение двух недель (не показано). Другая группа получала дважды дозу белка (1 мг) конъюгата IMMU-132 с DAR 3,28. Хотя обе группы получали одинаковое общее количество SN-38 (36 мкг) в каждой из схем дозирования, в группе, получавшей конъюгат с DAR 6,89, рост опухоли ингибировался в значительно большей степени, чем у животных-носителей опухоли, получавших конъюгат с DAR 3,28 (P=0,0227; AUC) (не показано). Кроме того, лечение продуктом с более низким DAR существенно не отличалось от не получавших лечения контролей. В совокупности эти исследования показывают, что более низкое значение DAR снижает эффективность.
[0218] Исследование фармакокинетического поведения конъюгатов, приготовленных с такими различными значениями соотношений, проводили на не имеющих опухолей мышах, получавших по 0,2 мг каждого конъюгата, неконъюгированного IgG hRS7, или IgG hRS7, подвергнутого восстановлению с последующим присоединением концевых N-этилмалеимидных групп. Брали 5 образцов сыворотки в моменты времени от 0,5 до 168 ч и анализировали методом ИФА на hRS7 IgG. Не наблюдалось значительной разницы в клиренсе этих конъюгатов по сравнению с неконъюгированным IgG (не показано). Таким образом, уровень замещения не влиял на фармакокинетику конъюгатов и, что не менее важно, восстановление межцепочечных дисульфидных связей, по-видимому, не дестабилизировало антитело.
+
WAF1/Cip1
WAF1/Cip1
+
WAF1/Cip1
WAF1/Cip1
[0219] Механизм действия IMMU-132 при ТНРМЖ. Апоптотический путь, используемый IMMU-132, исследовали в клеточной линии ТНРМЖ, MDA-MB-468, и в клеточной линии HER2 SK-BR-3, чтобы подтвердить, что функционирование КАП основано на входящем в его состав SN-38. Клетки подвергали воздействию 1 мкМ SN-38, SN-38-эквивалента IMMU-132, или белкового эквивалента hRS7. Клетки собирали и проводили вестерн-блоттинг. Отдельно взятый SN-38 и IMMU-132 опосредовали более 2-кратное повышение p21 в течение 24 ч в MDA-MB-468, и через 48 ч количество p21 в этих клетках начинало снижаться (31 % и 43 % для SN-38 или IMMU-132, соответственно) (не показано). Интересно, что в опухолевой линии HER2 SK-BR-3 ни SN-38, ни IMMU-132 не опосредовали повышение p21 выше конститутивных уровней в первые 24 часа, но, как видно для клеток MDA-MB-468 после 48 ч воздействия SN-38 или IMMU-132, количество p21 снижалось на более 57 % (не показано). Как SN-38, так и IMMU-132 приводили к расщеплению прокаспазы-3 на ее активные фрагменты в течение 24 ч, но с большей степенью активных фрагментов (with the greater degree of active fragments), наблюдаемой после воздействия в течение 48 часов. Следует отметить, что в обеих клеточных линиях IMMU-132 опосредовал более высокую степень расщепления прокаспазы-3, причем самый высокий уровень наблюдается через 48 ч по сравнению с клетками, подвергшимися воздействию SN-38 (не показано). Наконец, SN-38 и IMMU-132 оба опосредовали расщепление поли(АДФ-рибоза)полимеразы (PARP) начиная с 24 ч, с почти полным расщеплением через 48 ч (не показано). Взятые вместе, эти результаты подтверждают, что IMMU-132 имеет механизм действия, сходный со свободным SN-38 при введении in vitro.
[0220] Сравнение доставки SN-38 с помощью IMMU-132 и иринотекана в модели ксенотрансплантата опухоли человека. Конститутивные продукты, полученные из иринотекана или IMMU-132, определяли в сыворотке и опухолях мышей с имплантированным подкожно (sc) ксенотрансплантатом рака поджелудочной железы человека (Capan-1), которым вводили иринотекан (773 мкг; эквиваленты SN-38 = 448 мкг) и IMMU-132 (1,0 мг; эквиваленты SN-38 = 16 мкг). Через 5 интервалов после введения 3 животных из каждой группы подвергали эвтаназии, и сыворотку экстрагировали для выделения представляющих интерес продуктов.
[0221] Иринотекан очень быстро выводится из сыворотки, причем превращение в SN-38 и SN-38G наблюдается в течение 5 мин (не показано). Ни один из продуктов не был обнаружен через 24 ч. Значения AUC (площадь под кривой) за период времени 6 ч составляли 21,0, 2,5, и 2,8 мкг/мл·ч для иринотекана, SN-38, и SN-38G, соответственно (конверсия SN-38 у мышей = [2,5 + 2,8)/21 = 25,2 %]). Животные, получавшие IMMU-132, имели намного более низкие концентрации свободного SN-38 в сыворотке, но он детектировался в течение 48 ч (не показано). Свободный SN-38G детектировался только в моменты времени 1 и 6 ч, и имел уровни в 3-7 раз более низкие, чем свободный SN-38 (не показано).
5мин-6ч
5мин-2ч
[0222] В опухолях Capan-1, иссеченных у получавших иринотекан животных, уровни иринотекана оставались высокими на протяжении 6 ч, но не детектировались через 24 ч (AUC = 48,4 мкг/г·ч). Уровни SN-38 были значительно более низкими и детектировались только на протяжении 2 ч (т.е., AUC = 0,4 мкг/г·ч), а значения SN-38G были почти в 3 раза выше (AUC = 1,1 мкг/г·ч) (не показано). Опухоли, взятые у животных, получавших IMMU-132, не содержали детектируемых свободных SN-38 или SN-38G, и весь SN-38 в опухоли был связан с IMMU-132. Важно отметить, что поскольку в опухолях не детектировался SN-38G, можно предположить, что связанный с IMMU-132 SN-38 не был глюкуронидирован. Величина AUC для связанного с IMMU-132 SN-38 в этих опухолях составляла 54,3 мкг/г·ч, что в 135 раз выше количества SN-38 в опухолях животных, получавших иринотекан в течение 2-часового периода, когда SN-38 можно было детектировать, несмотря на то, что мыши, которым вводили иринотекан, получали в 28 раз больше эквивалентов SN-38, чем при введении с IMMU-132 (т.е., 448 и 16 мкг эквивалентов SN-38, соответственно)
Выводы
[0223] IMMU-132 представляет собой гуманизированное антитело против Trop-2, конъюгированное с 7,6 молекулами SN-38, активного метаболита иринотекана, ингибитора топоизомеразы I. Клинически IMMU-132 продемонстрировал управляемую токсичность и обнадеживающие ответы у пациентов с рецидивирующим/рефрактерным ТНРМЖ (ClinicalTrials.gov, NCT01631552). Одна лишь терапия IMMU-132 продемонстрировала значительные противоопухолевые эффекты в ксенотрансплантатах человеческого ТНРМЖ при эквивалентной дозе для человека, в 5 раз меньшей, чем при клиническом применении (т.е. 10 мг/кг). Поскольку доклинические исследования показывают, что IMMU-132 можно комбинировать с двумя различными ингибиторами микротрубочек или ингибитором PARP со значительно повышенной противоопухолевой активностью, эти данные подтверждают использование IMMU-132 и других конъюгатов антитело-лекарственный препарат (КАП), которые вызывают разрывы ДНК, в комбинации с ингибиторами микротрубочек и/или ингибиторами PARP вообще, а также другими химиотерапевтическими агентами, нацеленными на клеточное деление путем ингибирования микротрубочек или репарации ДНК. Предпочтительный класс КАП представлен конъюгатами анти-Trop-2 антитела для пациентов с Trop2-положительными раками, включая, без ограничений, ТНРМЖ, метастатический рак толстой кишки, МРЛ, НМРЛ и уротелиальный рак, поскольку это мишень, которая экспрессируется в высоких количествах при большом числе раковых заболеваний и локализуется на клеточной поверхности и цитоплазматически в раковых клетках.
[0224] Синергия была достигнута, когда IMMU-132 комбинировали с ингибиторами PARP (например, олапарибом) в опухолевых линиях ТНРМЖ, имеющих дефекты BRCA1/2, а также экспрессию дикого типа, в том числе только с дефектом PTEN. Это позволяет предположить, что IMMU-132 может синергически взаимодействовать с любой опухолью, имеющей какие-либо нарушения путей гомологичной рекомбинации ДНК. В сочетании с олапарибом, терапия IMMU-132 достигла значительных противоопухолевых эффектов, превышающих те, которые наблюдались при монотерапии каждым из них отдельно, что приводило к значительному увеличению выживаемости.IMMU-132 в сочетании с ингибиторами микротрубочек (например, паклитакселом или эрибулином мезилатом) также значительно повышал эффективность по сравнению с монотерапией каждым агентом.
[0225] В целом, эти данные свидетельствуют о неожиданном значительном преимуществе комбинированной терапии конъюгатом антитело-лекарственный препарат (КАП), который нацелен на раковые клетки и индуцирует разрывы цепи ДНК, такой как IMMU-132, и ингибиторами микротрубочек или ингибиторами PARP. Нацеливание на путь репарации ДНК PARP в BRCA1/2-мутантных опухолях ТНРМЖ путем комбинирования терапии IMMU-132 с паклитакселом или олапарибом достигли синтетической летальности в этой модели заболевания без видимой токсичности. В типичном варианте реализации, комбинация IMMU-132 и ингибитора PARP или микротрубочек используется для лечения Trop-2-позитивных видов рака, таких как уротелиальный рак. Эти данные служат обоснованием использования IMMU-132 в сочетании с другими химиотерапевтическими средствами, которые также нацелены на механизмы репарации ДНК у пациентов с уротелиальными или подобными опухолями.
[0226] Из вышеприведенного описания квалифицированный специалист в данной области техники может легко определить основные характеристики этого изобретения и, не выходя за пределы его сущности и объема, может провести различные изменения и модификации изобретения для его адаптации к различным применениям и условиям без чрезмерного экспериментирования. Все патенты, патентные заявки и публикации, упомянутые в данном документе, включены в него посредством ссылок.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> IMMUNOMEDICS, INC.
<120> ТЕРАПИЯ МЕТАСТАТИЧЕСКОГО УРОТЕЛИАЛЬНОГО РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
КОНЪЮГАТА АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО САЦИТУЗУМАБА ГОВИТЕКАНА
(IMMU-132)
<130> IMM356WO2
<140>
<141>
<150> 62/428,655
<151> 2016-12-01
<160> 9
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 1
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Ala
1            5               10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 2
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1            5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 3
Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr
1            5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 4
Asn Tyr Gly Met Asn
1             5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 5
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys
1            5                10               15
Gly
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 6
Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1             5               10
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 7
Ala Leu Ala Leu
1
<210> 8
<211> 330
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 8
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1            5                10               15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20               25               30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35              40               45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50              55               60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65               70             75               80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85               90              95
Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100              105              110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115              120              125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130               135             140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145             150              155              160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165              170              175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180              185             190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195               200               205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210              215             220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225              230              235              240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245              250              255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260             265              270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275              280              285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290              295             300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305              310              315              320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325             330
<210> 9
<211> 330
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1            5                10               15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20               25               30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35              40               45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50              55               60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65               70              75               80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85               90              95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100              105              110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115               120              125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130               135             140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145             150              155              160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165             170              175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180              185             190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195              200               205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210              215            220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225              230              235              240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245              250              255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260             265              270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275              280              285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290             295              300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305              310              315              320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325             330
<---