ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ, ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ ПО МУТАЦИИ FLT3, ИНГИБИТОР МУТАНТНОГО FLT3 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING A MALIGNANT TUMOR, FLT3-POSITIVE, A FLT3 MUTANT INHIBITOR AND USE THEREOF

ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Область изобретения
[0001] Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения злокачественной опухоли, положительной по мутации Fms-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3), которая содержит азот-содержащее гетероциклическое соединение или его соль в качестве активного ингредиента, ингибитору мутантного FLT3 и их применению.
2. Описание связанной области
[0002] Fms-подобная тирозинкиназа 3 (FLT3) представляет собой белок, относящийся к рецепторным тирозинкиназам III класса, и имеет пять иммуноглобулиноподобных мотивов в N-концевом внеклеточном домене и два киназных домена в C-концевом. Нормальные CD34-положительные клетки-предшественники костного мозга человека и дендритные клетки-предшественники экспрессируют FLT3, которая играет важную роль в росте, дифференцировке этих клеток или тому подобном (Brown P, et al., European Journal of Cancer, том 40, стр. с 707 до 721, 2004). Кроме того, лиганд FLT3 (FL) представляет собой один из цитокинов, который экспрессируют клетки стромы костного мозга и T-клетки, чтобы тем самым оказывать эффект на развитие множества клеток гематопоэтических линий дифференцировки и стимулировать рост стволовых клеток, клеток-предшественников, дендритных клеток и естественных киллерных клеток через взаимодействия с другими факторами роста.
[0003] FLT3 образует димер при связывании FL с ним, и затем происходит активация аутофосфорилирования. Как результат, индуцируют фосфорилирование AKT и ERK в путях передачи сигнала PI3 и RAS. FLT3 играет важную роль в росте и дифференцировке гематопоэтических клеток.
В нормальном костном мозге экспрессия FLT3 ограничена ранними клетками-предшественниками, но при злокачественной опухоли крови, FLT3 экспрессируется на высоких уровнях или FLT3 подвергается генной мутации, тем самым внося вклад в злокачественный рост раковой опухоли через активацию путей передачи сигнала. Примеры злокачественной опухоли крови включают острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), острый миелолейкоз (AML), острый промиелоцитарный лейкоз (APL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелолейкоз (CML), хронический нейтрофильный лейкоз (CNL), острый недифференцированный лейкоз (AUL), анапластическую крупноклеточную лимфому (ALCL), пролимфоцитарный лейкоз (PML), ювенильный миеломоноцитарный лейкоз (JMML), T-клеточный ALL взрослых, миелодиспластический синдром (MDS) и миелопролиферативное заболевание (MPD).
[0004] Несмотря на то, что некоторые существующие способы терапии показывают в определенной степени успешные результаты против AML среди злокачественных опухолей крови, AML показыает рецидивирование и устойчивость во многих случаях и, следовательно, все еще представляет собой рефракторную злокачественную опухоль с 5-летним коэффициентом выживаемости приблизительно 24% (в Соединенных Штатах) (American Cancer Society, Cancer Facts and Figures, стр. с 9 до 24, 2012). Одна из причин рецидивирования и устойчивости заключается в генетических мутациях в клетках AML, среди которых мутацию гена FLT3 идентифицируют наиболее часто. Примеры генных мутаций FLT3 включают мутацию внутренних тандемных дупликаций (ITD), в которой повторяется часть околомембранного домена, и мутацию, в которой аминокислотные остатки, расположенные в тирозинкиназном домене (TKD), заменены на другие аминокислотные остатки посредством замены, делеции или добавления (American Cancer Society, Cancer Facts and Figures, стр. с 9 до 24, 2012), и известно, что FLT3 конститутивно активирован, даже в отсутствие лиганда, тем самым усиливая рост клеток злокачественной опухоли.
[0005] Поскольку мутация ITD известна как слабый прогностический фактор при AML, предпринимались попытки усовершенствования прогнозирования с помощью существующей химиотерапии, но имеет место определенная сложность. В такой ситуации NCCN Guidelines для лечения AML указывают, что участие в клиническом исследовании, которое может представлять собой предмет, следует учитывать в качестве одной из возможностей лечения. Кроме того, также в классификации WHO 4-й редакции мутация ITD описана в качестве одной из генетических мутаций, скрининг которых следует осуществлять для диагностирования и лечения AML.
[0006] Известно, что мутация TKD представляет собой мутации или делеции остатка аспарагиновой кислоты 835 (D835) и окружающих аминокислотных остатков, расположенных, в частности, в активирующей петле в AML, а также имели место некоторые сообщения о том, что мутация TKD является слабым прогностическим фактором. Кроме того, мутации остатка фенилаланина 691 (F691) и окружающих аминокислотных остатков, расположенных в домене-привратнике, которые известны в качестве одного из механизмов устойчивости лекарственных средств в других тирозинкиназах, также расценивают в качестве мутации TKD. В клинических исследованиях лечения AML с помощью лекарственного средства, направленного на FLT3, уже известна лекарственная устойчивость AML, имеющего как мутацию ITD, так и мутацию TKD.
[0007] Поскольку полагают, что ингибирование активности мутанта FLT3, вместе с ингибированием активности FLT3, является важным для лечения и улучшения прогноза AML, проводили разработку фармацевтического средства, ингибирующего FLT3 и мутантный FLT3. Например, AC220 (Ambit Inc.) представляет собой соединение, которое избирательно ингибирует тирозинкиназы III типа (FLT3, c-KIT, FMS и PDGFR), и проводили разработку фармацевтического средства, которое направлено на AML (WO2007/109120A). Однако нет сообщений о фармацевтическом средстве, которое достаточно ингибирует активность мутантного FLT3.
[0008] С другой стороны, азот-содержащее гетероциклическое соединение или его соль, описанные в WO2013/157540A, известны в качестве ингибиторов FLT3.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить фармацевтическую композицию для лечения злокачественной опухоли, положительной по мутации FLT3, ингибитор мутантного FLT3 и их применение.
[0012] Не известно соединение, которое представляет собой специфичное азот-содержащее гетероциклическое соединение или его соль и которое эффективно в случае, когда наблюдают мутантный FLT3, в частности, мутацию TKD. Настоящее изобретение предлагает следующее.
[1] Фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли, положительной по мутации FLT3, которая содержит соединение, представленное общей формулой [1]:
[0013]
[0014] в формуле
1
1-6
R представляет атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной,
2
1-6
2-6
2-6
R представляет атом водорода, C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной,
3
1-6
2-6
2-6
R представляет атом водорода, C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной,
m представляет целое число от 1 до 3,
4
4
4
3
1-6
1-6
R числом m представляют собой одно и то же или различное и представляют атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной, и один R, выбранный из R числом m, вместе с R могут образовывать C алкиленовую группу, которая может быть замещенной,
5
1-6
2-6
2-6
R числом m представляют собой одно и то же или различное и представляют атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной,
1
20
20
20
20
1-6
2-6
2-6
X представляет атом кислорода, N(R) (в формуле, R представляет атом водорода, C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной), C(=O), C(=O)-N(R) (в формуле, R имеет то же значение, как определено выше) или связь,
2
1-6
X представляет C алкиленовую группу, которая может быть замещенной, двухвалентную алициклическую углеводородную группу, которая может быть замещенной, или двухвалентную ароматическую углеводородную группу, которая может быть замещенной,
n представляет целое число от 0 до 3,
6
1-6
R числом n представляют собой одно и то же или различное и представляют атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной,
7
1-6
R числом n представляют собой одно и то же или различное и представляют атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной,
3
20
20
1-6
2-6
2-6
X представляет C алкиленовую группу, которая может быть замещенной, C алкениленовую группу, которая может быть замещенной, C алкиниленовую группу, которая может быть замещенной, или N(R)-C(=O) (в формуле, R имеет то же значение, как определено выше),
8
1-6
2-6
2-6
R представляет атом водорода, C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной,
9
1-6
2-6
2-6
3-8
R представляет C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, C алкинильную группу, которая может быть замещенной, или C циклоалкильную группу, которая может быть замещенной,
8
9
R и R, вместе с атомом азота, с которым они связаны, могут образовывать циклическую аминогруппу, которая может быть замещенной,
10
1-6
2-6
2-6
R представляет атом водорода, C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной, и
11
1-6
2-6
2-6
3-8
R представляет C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, C алкинильную группу, которая может быть замещенной, C циклоалкильную группу, которая может быть замещенной, арильную группу, которая может быть замещенной или, гетероциклическую группу, которая может быть замещенной; или
его соль.
10
[2] Фармацевтическая композиция согласно [1], в которой R представляет собой атом водорода.
1
20
20
1-6
2-6
2-6
[3] Фармацевтическая композиция согласно [1] или [2], в которой X представляет собой C(=O)-N(R) (в формуле, R представляет атом водорода, C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной).
3
2-6
[4] Фармацевтическая композиция согласно любому одному из с [1] до [3], в которой X представляет собой C алкиниленовую группу, которая может быть замещенной.
[5] Фармацевтическая композиция согласно любому одному из с [1] до [4], где мутация FLT3 включает мутацию TKD.
[6] Фармацевтическая композиция согласно [5], где мутация TKD представляет собой мутацию(мутации) одной или нескольких аминокислот в области аминокислот с 823 до 861 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[7] Фармацевтическая композиция согласно [6], где мутация TKD представляет собой мутацию по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислот 835, 836 и 842 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[8] Фармацевтическая композиция согласно [7], где мутация TKD представляет собой по меньшей мере одну, выбранную из группы, состоящей из следующего:
a. замена аспарагиновой кислоты 835 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 на валин, тирозин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
b. замена изолейцина 836 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 на лейцин-аспарагиновую кислоту; и
c. замена тирозина 842 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 на цистеин или гистидин.
[9] Фармацевтическая композиция согласно [5], где мутация TKD представляет собой мутацию(мутации) одной или нескольких аминокислот в области аминокислот с 604 до 822 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[10] Фармацевтическая композиция согласно [9], где мутация TKD представляет собой мутацию по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислот 621, 627, 676, 691 и 697 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[11] Фармацевтическая композиция согласно [10], где мутация TKD представляет собой мутацию аминокислоты 691 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[12] Фармацевтическая композиция согласно [11], где мутация аминокислоты 691 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 представляет собой замену фенилаланина на лейцин.
[13] Фармацевтическая композиция согласно любому одному из с [5] до [12], где мутация FLT3 дополнительно содержит мутацию ITD.
[14] Ингибитор мутантного FLT3, который содержит соединение или его соль, как определено в любом одном из с [1] до [4].
[15] Ингибитор согласно [14], который ингибирует мутантный FLT3, который содержит мутацию TKD.
[16] Ингибитор согласно [15], который ингибирует мутантный FLT3, который дополнительно содержит мутацию ITD.
[17] Ингибитор согласно любому одному из с [14] до [16], который дополнительно ингибирует FLT3 дикого типа.
[18] Ингибитор согласно любому одному из с [14] до [17], который представляет собой средство против злокачественной опухоли.
[19] Способ предсказания терапевтического эффекта посредством введения фармацевтической композиции, которая содержит соединение или его соль, как определено в любом одном из с [1] до [4], субъекту, который включает стадию обнаружения присутствия или отсутствия мутации FLT3.
[20] Способ выбора субъекта, к которому применяют фармацевтическую композицию, содержащую соединение или ее соль, как определено в любом одном из с [1] до [4], который включает стадию обнаружения присутствия или отсутствия мутации FLT3.
[21] Способ определения вводить ли или нет фармацевтическую композицию, содержащую соединение или его соль, как определено в любом одном из с [1] до [4], субъекту, который включает стадию обнаружения присутствия или отсутствия мутации FLT3.
[22] Способ согласно любому одному из с [19] до [21], в котором мутация FLT3 включает мутацию TKD.
[23] Способ согласно любому одному из с [19] до [22], в котором мутация FLT3 дополнительно включает мутацию ITD.
[0015] [1a] Способ лечения злокачественной опухоли, положительной по мутации FLT3, у субъекта, который включает стадию введения соединения или его соли, как определено в любом одном из с [1] до [4], субъекту.
[2a] Способ согласно [1a], в котором мутация FLT3 включает мутацию TKD.
[3a] Способ согласно [2a], в котором мутация TKD представляет собой мутацию(мутации) одной или нескольких аминокислот в области аминокислот с 823 до 861 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[4a] Способ согласно [3a], в котором мутация TKD представляет собой мутацию по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислоты 835, 836 и 842 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[5a] Способ согласно [4a], в котором мутация TKD представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из следующего:
a. замена аспарагиновой кислоты 835 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 на валин, тирозин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
b. замена изолейцина 836 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 на лейцин-аспарагиновую кислоту; и
c. замена тирозина 842 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 на цистеин или гистидин.
[6a] Способ согласно [2a], в котором мутация TKD представляет собой мутацию(мутации) одной или нескольких аминокислот в области аминокислот с 604 до 822 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[7a] Способ согласно [6a], в котором мутация TKD представляет собой мутацию по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислот 621, 627, 676, 691 и 697 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[8a] Способ согласно [7a], в котором мутация TKD представляет собой мутацию аминокислоты 691 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[9a] Способ согласно [8a], в котором мутация аминокислоты 691 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 представляет собой замену фенилаланина на лейцин.
[10a] Способ согласно любому одному из с [1a] до [8a], в котором мутация FLT3 дополнительно включает мутацию ITD.
[0016] [1b] Соединение или его соль, как определено в любом одном из с [1] до [4], для применения в способе лечения злокачественной опухоли, положительной по мутации FLT3.
[2b] Соединение или его соль согласно [1b], где мутация FLT3 включает мутацию TKD.
[3b] Соединение или его соль согласно [2b], где мутация TKD представляет собой мутацию(мутации) одной или нескольких аминокислот в области аминокислот с 823 до 861 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[4b] Соединение или его соль согласно [3b], где мутация TKD представляет собой мутацию по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислоты 835, 836 и 842 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[5b] Соединение или его соль согласно [4b], где мутация TKD представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из следующего:
a. замена аспарагиновой кислоты 835 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 на валин, тирозин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
b. замена изолейцина 836 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 на лейцин-аспарагиновую кислоту;
c. замена тирозина 842 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 на цистеин или гистидин.
[6b] Соединение или его соль согласно [2b], где мутация TKD представляет собой мутацию(мутации) одной или нескольких аминокислот в области аминокислот с 604 до 822 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[7b] Соединение или его соль согласно [6b], где мутация TKD представляет собой мутацию по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислот 621, 627, 676, 691 и 697 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[8b] Соединение или его соль согласно [7b], где мутация TKD представляет собой мутацию аминокислоты 691 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[9b] Соединение или его соль согласно [8b], где мутация аминокислоты 691 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 представляет собой замену фенилаланина на лейцин.
[10b] Соединение или его соль согласно любому одному из с [1b] до [8b], где мутация FLT3 дополнительно включает мутацию ITD.
[0017] Соединение, представленное общей формулой [1], или его соль имеет ингибирующую активность, оказываемую на рост и фосфорилирование у клеточной линии, положительной по мутации FLT3, и клеточной линии, экспрессирующей мутантный FLT3. Соответственно, соединение, представленное общей формулой [1], или его соль можно использовать в качестве фармацевтической композиции для лечения злокачественной опухоли, положительной по мутации FLT3, или ингибитора мутантного FLT3.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0018] На фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность SEQ ID № 1.
ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0019] Далее в настоящем документе данное изобретение описано подробно.
В настоящем изобретении, если не указано иное, отдельные термины имеют следующие значения.
Лечение относится к предотвращению, лечению или тому подобному.
Предотвращение относится к ингибированию начала заболевания, снижению риска начала заболевания, задержке начала заболевания или тому подобному.
Лечение относится к усовершенствованию или ингибированию прогрессирования (поддержание или задержка) целевого заболевания или состояния.
Субъект относится к млекопитающему, включая человека, или тому подобному.
В случае, когда диапазон задан выражением «от a до b», диапазон включает значения a и b на обоих концах.
[0020] Атом галогена относится к атому фтора, атому хлора, атому брома или атому йода.
1-6
1-6
[0021] C алкильная группа относится к линейной или разветвленной C алкильной группе, такой как группа метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, пентил, изопентил или гексил.
1-3
C алкильная группа относится к группе метил, этил, пропил или изопропил.
2-6
2-6
C алкенильная группа относится к линейной или разветвленной C алкенильной группе, такой как группа винил, аллил, пропенил, изопропенил, бутенил, изобутенил, 1,3-бутадиенил, пентенил или гексенил.
2-6
2-6
C алкинильная группа относится к линейной или разветвленной C алкинильной группе, такой как группа этинил, пропинил, бутинил, пентинил или гексинил.
3-8
3-8
C циклоалкильная группа относится к C циклоалкильной группе, такой как группа циклопропил, циклобутил, циклопентил или циклогексил.
[0022] Арильная группа относится к группе фенил или нафтил.
1-6
1-6
Ar-C алкильная группа относится к ar-C алкильной группе, такой как группа бензил, дифенилметил, тритил, фенэтил или нафтилметил.
1-6
1-6
[0023] C алкоксильная группа относится к линейной, циклической или разветвленной C алкилоксигруппе, такой как группа метокси, этокси, пропокси, изопропокси, циклопропокси, бутокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, циклобутокси, пентилокси или гексилокси.
1-3
C алкоксильная группа относится к группе метокси, этокси, пропокси или изопропокси.
1-6
1-6
1-6
1-6
C алкокси C алкильная группа относится к C алкилокси C алкильной группе, такой как группа метоксиметил или 1-этоксиэтил.
1-6
1-6
1-6
1-6
Ar-C алкокси C алкильная группа относится к ar-C алкилокси C алкильной группе, такой как группа бензилоксиметил или фенэтилоксиметил.
2-6
2-6
[0024] C алканоильная группа относится к линейной или разветвленной C алканоильной группе, такой как группа ацетил, пропионил, валерил, изовалерилил и пивалоил.
Ароильная группа относится к группе бензоил или нафтоил.
Гетероциклическая карбонильная группа относится к никотиноил, теноил, пирролидинокарбонил или фуроил.
Аминоацетильная группа (α-замещенная) относится к аминоацетильной группе (α-замещенной), N-конец которой получен из аминокислоты (ее примеры включают такие аминокислоты, как глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин, цистеин, метионин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин, глутамин, аргинин, лизин, гистидин, гидроксилизин, фенилаланин, тирозин, триптофан, пролин и гидроксипролин) может иметь защитную группу.
2-6
Ацильная группа относится к группе формил, группе сукцинил, группе глутарил, группе малеоил, группе фталоил, C алканоильной группе, группе ароил, гетероциклической карбонильной группе или (α-замещенной) аминоацетильной группе.
1-6
1-6
[0025] Ацил C алкильная группа относится к ацил C алкильной группе, такой как группа ацетилметил, бензоилметил или 1-бензоилэтил.
1-6
1-6
Ацилокси C алкильная группа относится к ацилокси C алкильной группе, такой как группа ацетоксиметил, пропионилоксиметил, пивалоилоксиметил, бензоилоксиметил или 1-(бензоилокси)этил.
1-6
1-6
C алкоксикарбонильная группа относится к линейной или разветвленной C алкилоксикарбонильной группе, такой как группа метоксикарбонил, этоксикарбонил, изопропоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил или 1,1-диметилпропоксикарбонил.
1-6
1-6
Ar-C алкоксикарбонильная группа относится к ar-C алкилоксикарбонильной группе, такой как группа бензилоксикарбонил или фенэтилоксикарбонил.
Арилоксикарбонильная группа относится к группе фенилоксикарбонил или нафтилоксикарбонил.
1-6
1-6
[0026] C алкиламиногруппа относится к линейной или разветвленной C алкиламиногруппе, такой как метиламино-, этиламино-, пропиламино-, изопропиламино-, бутиламино-, втор-бутиламино-, трет-бутиламино-, пентиламино- или гексиламино группа.
1-6
1-6
Ди(C алкил)аминогруппа относится к линейной или разветвленной ди(C алкил)аминогруппе, такой как диметиламино-, диэтиламино-, дипропиламино-, диизопропиламино-, дибутиламино-, ди(трет-бутил)амино-, дипентиламино-, дигексиламино-, (этил)(метил)амино- или (метил)(пропил)аминогруппа.
1-3
1-3
Ди(C алкил)аминогруппа относится к линейной или разветвленной ди(C алкил)аминогруппе, такой как диметиламино-, диэтиламино-, дипропиламино-, диизопропиламино-, (этил)(метил)амино- или (метил)(пропил)аминогруппа.
1-6
1-6
[0027] C алкилсульфонильная группа относится к C алкилсульфонильной группе, такой как группа метилсульфонил, этилсульфонил или пропилсульфонил.
Арилсульфонильная группа относится к группе бензолсульфонил, п-толуолсульфонил или нафталинсульфонил.
1-6
1-6
C алкилсульфонилоксигруппа относится к C алкилсульфонилоксигруппе, такой как метилсульфонилокси- или этилсульфонилоксигруппа.
Арилсульфонилоксигруппа относится к бензолсульфонилокси- или п-толуолсульфонилоксигруппе.
[0028] Циклическая аминогруппа относится к циклической аминогруппе, которая содержит один или несколько атомов азота, в качестве гетероатомов образующих кольцо, такое как азетидинил, пирролидинил, пирролинил, пирролил, пиперидинил, тетрагидропиридил, гомопиперидинил, имидазолидинил, имидазолинил, имидазолил, пиразолидинил, пиразолинил, пиразолил, пиперазинил, гомопиперазинил, триазолил, тетразолил, морфолинил, тиоморфолинил, тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолинил или хинуклидинил и дополнительно может содержать один или несколько атомов кислорода или атомов серы.
[0029] Моноциклическая азот-содержащая гетероциклическая группа относится к моноциклической азот-содержащей гетероциклической группе, которая содержит только атомы азота, в качестве гетероатомов образующие кольцо, такое как группа азетидинил, пирролидинил, пирролинил, пирролил, пиперидил, тетрагидропиридил, пиридил, гомопиперидинил, октагидроазоцинил, имидазолидинил, имидазолинил, имидазолил, пиразолидинил, пиразолинил, пиразолил, пиперазинил, пиразинил, пиридазинил, пиримидинил, гомопиперазинил, триазолил или тетразолил.
Моноциклическая кислород-содержащая гетероциклическая группа относится к группе тетрагидрофуранил, фуранил, тетрагидропиранил или пиранил.
Моноциклическая серу-содержащая гетероциклическая группа относится к группе тиенил.
Моноциклическая азот-кислород-содержащая гетероциклическая группа относится к моноциклической азот-кислород-содержащей гетероциклической группе, содержащей только атомы азота и атомы кислорода, в качестве гетероатомов образующие кольцо, такое как группа оксазолил, изоксазолил, оксадиазолил или морфолинил
Моноциклическая азот-серу-содержащая гетероциклическая группа относится к моноциклической азот-серу-содержащей гетероциклической группе, содержащей только атомы азота и атомы серы, в качестве гетероатомов образующие кольцо, такое как группа тиазолил, изотиазолил, тиадиазолил, тиоморфолинил, 1-оксид-тиоморфолинил или 1,1-диоксид-тиоморфолинил.
Моноциклическая гетероциклическая группа относится к моноциклической азот-содержащей гетероциклической группе, моноциклической кислород-содержащей гетероциклическрй группе, моноциклической серу-содержащей гетероциклической группе, моноциклической азот-кислород-содержащей гетероциклической группе или моноциклической азот-серу-содержащей гетероциклической группе.
[0030] Бициклическая азот-содержащая гетероциклическая группа относится к бициклической азот-содержащей гетероциклической группе, содержащей только атомы азота, в качестве гетероатомов образующие кольцо, такое как группа индолинил, индолил, изоиндолинил, изоиндолил, бензимидазолил, индазолил, бензотриазолил, пиразолопиридинил, хинолил, тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолинил, изохинолинил, хинолизинил, циннолинил, фталазинил, хиназолинил, дигидрохиноксалинил, хиноксалинил, нафтиридинил, пуринил, птеридинил или хинуклидинил.
Бициклическая кислород-содержащая гетероциклическая группа относится к бициклической кислород-содержащей гетероциклической группе, содержащей только атомы кислорода, в качестве гетероатомов образующие кольцо, такое как группа 2,3-дигидробензофуранил, бензофуранил, изобензофуранил, хроманил, хроменил, изохроманил, 1,3-бензодиоксалил, 1,3-бензодиоксанил или 1,4-бензодиоксанил.
Бициклическая серу-содержащая гетероциклическая группа относится к бициклической серу-содержащей гетероциклической группе, содержащей только атомы серы, в качестве гетероатомов образующие кольцо, такое как группа 2,3-дигидробензотиенил или бензотиенил.
Бициклическая азот-кислород-содержащая гетероциклическая группа относится к бициклическрй азот-кислород-содержащей гетероциклической группе, содержащей только атомы азота и атомы кислорода, в качестве гетероатомов образующие кольцо, такое как группа бензоксазолил, бензизоксазолил, бензоксадиазолил, бензоморфолинил, дигидропиранопиридил, дигидродиоксинопиридил или дигидропиридооксазинил.
Бициклическая азот-серу-содержащая гетероциклическая группа относится к бициклической азот-серу-содержащей гетероциклической группе, содержащей атомы азота и атомы серы, в качестве гетероатомов образующие кольцо, такое как группа бензотиазолил, бензизотиазолил или бензотиадиазолил.
Бициклическая гетероциклическая группа относится к бициклической азот-содержащей гетероциклической группе, бициклической кислород-содержащей гетероциклической группе, бициклической серу-содержащей гетероциклической группе, бициклической азот-кислород-содержащей гетероциклической группе или бициклической азот-серу-содержащей гетероциклической группе.
[0031] Гетероциклическая группа относится к моноциклической гетероциклической группе или бициклической гетероциклической группе.
1-6
1-6
[0032] C алкиленовая группа относится к линейной или разветвленной C алкиленовой группе, такой как метиленовая, этиленовая, пропиленовая, бутиленовая или гексиленовая группа.
1-3
C алкиленовая группа относится к метиленовой, этиленовой или пропиленовой группе.
2-6
2-6
C алкениленовая группа относится к линейной или разветвленной C алкениленовой группе, такой как виниленовая, пропениленовая, бутениленовая или пентениленовая группа.
2-6
2-6
C алкиниленовая группа относится к линейной или разветвленной C алкиниленовой группе, такой как этиниленовая, пропиниленовая, бутиниленовая или пентиниленовая группа.
[0033] Двухвалентная алициклическая углеводородная группа относится к группе, образуемой посредством удаления двух атомов водорода из алициклического углеводородного кольца, такого как 1,2-циклобутиленовая, 1,3-циклобутиленовая, 1,2-циклопентиленовая, 1,3-циклопентиленовая, 1,2-циклогексиленовая, 1,3-циклогексиленовая, 1,4-циклогексиленовая, бицикло(3.2.1)октиленовая, бицикло(2.2.0)гексиленовая или бицикло(5.2.0)нониленовая группа.
[0034] Двухвалентная ароматическая углеводородная группа относится к группе, образованной посредством удаления двух атомов водорода из ароматического углеводородного кольца, такого как фениленовая, индениленовая, нафтиленовая, флуорениленовая, фенантрениленовая, антриленовая или пирениленовая группа.
[0035] Силиловая группа относится к триметилсилиловой, триэтилсилиловой или трибутилсилиловой группе.
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
[0036] Амино-защитная группа представляет собой какую-либо стандартную группу, которую можно использовать в качестве защитной группы для аминогруппы, и включает группы, описанные, например, в T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 4-е издание, стр. с 696 до 926, 2007, John Wiley & Sons, INC. Конкретные примеры амино-защитной группы включают ar-C алкильную группу, C алкокси C алкильную группу, ацильную группу, C алкоксикарбонильную группу, ar-C алкоксикарбонильную группу, арилоксикарбонильную группу, C алкилсульфонильную группу, арилсульфонильную группу, и силильную группу.
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
[0037] Имино-защитная группа представляет собой какую-либо стандартную группу, которую можно использовать в качестве защитной группы для иминогруппы, и включает группы, описанные, например, в T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 4-е издание, стр. с 696 до 868, 2007, John Wiley & Sons, INC. Конкретные примеры имино-защитной группы включают ar-C алкильную группу, C алкокси C алкильную группу, ацильную группу, C алкоксикарбонильную группу, ar-C алкоксикарбонильную группу, арилоксикарбонильную группу, C алкилсульфонильную группу, арилсульфонильную группу и силильную группу.
1-6
2-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
[0038] Гидроксил-защитная группа представляет собой какую-либо стандартную группу, которую можно использовать в качестве защитной группы для гидроксильной группы и которая включает группы, описанные, например, в T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 4-е издание, стр. с 16 до 299, 2007, John Wiley & Sons, INC. Конкретные примеры гидроксил-защитной группы включают C алкильную группу, C алкенильную группу, ar-C алкильную группу, C алкокси C алкильную группу, ar-C алкокси C алкильную группу, ацильную группу, C алкоксикарбонильную группу, ar-C алкоксикарбонильную группу, C алкилсульфонильную группу, арилсульфонильную группу, силильную группу, тетрагидрофуранильную группу и тетрагидропиранильную группу.
1-6
2-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
[0039] Карбоксил-защитная группа представляет собой какую-либо стандартную группу, которую можно использовать в качестве защитной группы карбоксильной группы и которая включает группы, описанные, например, в T.W. Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 4-е издание, стр. с 533 до 643, 2007, John Wiley & Sons, INC. Конкретные примеры карбоксил-защитной группы включают C алкильную группу, C алкенильную группу, арильную группу, ar-C алкильную группу, C алкокси C алкильную группу, ar-C алкокси C алкильную группу, ацил C алкильные группы, ацилокси C алкильную группу и силильную группу.
[0040] [Соединение общей формулы [1] и его соль]
Азот-содержащее гетероциклическое соединение в настоящем изобретении представляет собой соединение, представленное общей формулой [1]:
[0041]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1
2
3
[0042] (в формуле, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, X, X, X, m и n имеют то же значение, как определено выше).
1
1-6
[0043] R представляет собой атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной, и предпочтительно атом водорода.
1-6
1
Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, C алкильная группа в R может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из атома галогена, цианогруппы, аминогруппы, которая может иметь защитную группу, и гидроксильной группы, которая может иметь защитную группу.
1-6
1-6
1-3
1
[0044] C алкильная группа в C алкильной группе, которая может быть замещенной в R, предпочтительно представляет собой C алкильную группу.
2
1-6
2-6
2-6
1-6
1-6
[0045] R представляет собой атом водорода, C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной, предпочтительно атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной, и более предпочтительно C алкильную группу, которая может быть замещенной.
1-6
2-6
2-6
1-6
1-6
2
Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, C алкильная группа, C алкенильная группа или C алкинильная группа в R могут быть замещенными одной или несколькими группами, выбранными из C алкиламиногруппы, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A, ди(C алкил)аминогруппы, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A, и гетероциклической группы, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A.
1-6
3-8
1-6
1-6
1-6
[0046] Группа заместителей A: атом галогена, цианогруппа, аминогруппа, которая может иметь защитную группу, гидроксильная группа, которая может иметь защитную группу, C алкильная группа, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей B, C циклоалкильная группа, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей B, арильная группа, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей B, C алкоксильная группа, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей B, C алкиламиногруппа, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей B, ди(C алкил)аминогруппа, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей B, гетероциклическая группа, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей B, и оксогруппа.
1-6
1-6
[0047] Группа заместителей B: атом галогена, цианогруппа, аминогруппа, которая может иметь защитную группу, гидроксильная группа, которая может иметь защитную группу, C алкильная группа, которая может быть замещенной атомом галогена или гидроксильной группой, C алкоксильная группа, которая может быть замещенной атомом галогена или гидроксильной группой, арильная группа, гетероциклическая группа и оксогруппа.
1-6
1-6
1-6
1-3
1-3
2
[0048] C алкильная группа, которая может быть замещенной в R, предпочтительно представляет собой C алкильную группу, замещенную ди(C алкил)аминогруппой, более предпочтительно C алкильную группу, замещенную ди(C алкил)аминогруппой, и еще более предпочтительно диметиламинометильную группу.
1-6
1-6
1-3
2
[0049] C алкильная группа в C алкильной группе, которая может быть замещенной в R, предпочтительно представляет собой C алкильную группу и более предпочтительно метильную группу.
1-6
2-6
2-6
1-6
1-6
2
Каждый из заместителей C алкильной группы, которая может быть замещенной, C алкенильной группы, которая может быть замещенной, или C алкинильной группы, которая может быть замещенной, в R предпочтительно представляет собой ди(C алкил)аминогруппу, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A-1, или гетероциклическую группу, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A-1, и более предпочтительно ди(C алкил)аминогруппу, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A-1.
1-6
1-6
1-3
Здесь ди(C алкил)аминогруппа в ди(C алкил)аминогруппе, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A-1, предпочтительно представляет собой ди(C алкил)аминогруппу и более предпочтительно диметиламиногруппу.
Гетероциклическая группа в гетероциклической группе, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A-1, предпочтительно представляет собой азетидинильную группу, пиперазинильную группу или морфолинильную группу.
1-6
[0050] Группа заместителей A-1: атом галогена, гидроксильная группа, которая может иметь защитную группу, и C алкильная группа, которая может быть замещенной гидроксильной группой.
3
1-6
2-6
2-6
1-6
1-6
[0051] R представляет собой атом водорода, C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной, предпочтительно атом водорода или C алкильную группу и более предпочтительно C алкильную группу.
1-6
2-6
2-6
3
Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, C алкильная группа, C алкенильная группа или C алкинильная группа в R может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из атома галогена, цианогруппы, аминогруппы, которая может иметь защитную группу, гидроксильной группы, которая может иметь защитную группу, арильной группы, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A, и гетероциклической группы, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A.
1-6
1-6
1-3
3
[0052] C алкильная группа в C алкильной группе, которая может быть замещенной в R, предпочтительно представляет собой C алкильную группу и более предпочтительно метильную группу.
[0053] m представляет собой целое число от 1 до 3, предпочтительно целое число 1 или 2 и более предпочтительно целое число 1.
4
1-6
[0054] R числом m представляют собой одно и то же или различное и представляют собой атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной, и предпочтительно атом водорода.
1-6
4
Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, C алкильная группа в R может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из атома галогена, цианогруппы, аминогруппы, которая может иметь защитную группу, и гидроксильной группы, которая может иметь защитную группу.
4
4
3
1-6
1-6
1-6
1-3
1-6
1-3
[0055] Один R, выбранный из R числом m, вместе с R могут образовывать C алкиленовую группу, которая может быть замещенной, и C алкиленовая группа в C алкиленовой группе, которая может быть замещенной, предпочтительно представляет собой C алкиленовую группу и более предпочтительно пропиленовую группу. Заместитель C алкиленовой группы, которая может быть замещенной, предпочтительно представляет собой атом галогена, гидроксильную группу или C алкоксильную группу, более предпочтительно атом фтора, гидроксильную группу или метоксигруппу и более предпочтительно атом фтора или метоксигруппу.
5
1-6
2-6
2-6
1-6
[0056] R числом m представляют собой одно и то же или различное и представляют собой атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной, и предпочтительно C алкильную группу, которая может быть замещенной.
1-6
2-6
2-6
5
Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, C алкильная группа, которая может быть замещенной, C алкенильная группа, которая может быть замещенной, или C алкинильная группа, которая может быть замещенной, в R могут быть замещенными одной или несколькими группами, выбранными из атома галогена, цианогруппы, аминогруппы, которая может иметь защитную группу, и гидроксильной группы, которая может иметь защитную группу.
1-6
1-6
1-3
5
[0057] C алкильная группа в C алкильной группе, которая может быть замещенной в R, предпочтительно представляет собой C алкильную группу и более предпочтительно метильную группу.
[0058] n представляет собой целое число от 0 до 3, предпочтительно целое число 0 или 1 и более предпочтительно целое число 0.
6
1-6
1-6
[0059] R числом n представляют собой одно и то же или различное и представляют собой атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной, предпочтительно атом водорода или C алкильную группу и более предпочтительно атом водорода.
7
1-6
1-6
[0060] R числом n представляют собой одно и то же или различное и представляют собой атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной, предпочтительно атом водорода или C алкильную группу и более предпочтительно атом водорода.
1-6
6
7
[0061] Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, C алкильная группа в R и R может быть замещенной атомом галогена, цианогруппой, аминогруппой, которая может иметь защитную группу, или гидроксильной группой, которая может иметь защитную группу.
8
1-6
2-6
2-6
[0062] R представляет собой атом водорода, C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной, и предпочтительно атом водорода.
1-6
2-6
2-6
8
Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, C алкильная группа, C алкенильная группа или C алкинильная группа в R могут быть замещенными одной или несколькими группами, выбранными из атома галогена, цианогруппы, аминогруппы, которая может иметь защитную группу, и гидроксильной группы, которая может иметь защитную группу.
9
1-6
2-6
2-6
3-8
1-6
3-8
1-6
[0063] R представляет собой C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной, или C циклоалкильную группу, которая может быть замещенной, предпочтительно C алкильную группу, которая может быть замещенной, или C циклоалкильную группу, которая может быть замещенной, и более предпочтительно C алкильную группу, которая может быть замещенной.
1-6
2-6
2-6
3-8
1-6
9
Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, C алкильная группа, C алкенильная группа, C алкинильная группа или C циклоалкильная группа в R могут быть замещенными одной или несколькими группами, выбранными из атома галогена, цианогруппы, аминогруппы, которая может иметь защитную группу, гидроксильной группы, которая может иметь защитную группу, и C алкоксильной группы, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A.
1-6
1-6
9
[0064] C алкильная группа, которая может быть замещенной в R, предпочтительно представляет собой C алкильную группу, не имеющую заместителя.
1-6
1-6
1-3
9
C алкильная группа в C алкильной группе, которая может быть замещенной в R, предпочтительно представляет собой C алкильную группу.
1-6
1-3
9
Заместитель C алкильной группы, которая может быть замещенной в R, предпочтительно представляет собой атом галогена или C алкоксильную группу и более предпочтительно метоксигруппу.
8
9
[0065] R и R, вместе с атомом азота, с которым они связаны, могут образовывать циклическую аминогруппу, которая может быть замещенной, и циклическая аминогруппа в циклической аминогруппе, которая может быть замещенной, предпочтительно представляет собой морфолинильную группу.
8
9
Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, циклическая аминогруппа, которую формируют с помощью R и R вместе с атом азота, с которым они связаны, может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из атома галогена, цианогруппы, аминогруппы, которая может иметь защитную группу, гидроксильной группы, которая может иметь защитную группу, и оксогруппы.
10
1-6
2-6
2-6
[0066] R представляет собой атом водорода, C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной, и предпочтительно атом водорода.
1-6
2-6
2-6
1-6
10
Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, C алкильная группа, C алкенильная группа или C алкинильная группа в R могут быть замещенными одной или несколькими группами, выбранными из атома галогена, цианогруппы, аминогруппы, которая может иметь защитную группу, гидроксильной группы, которая может иметь защитную группу, и C алкоксильной группы, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A.
11
1-6
2-6
2-6
3-8
1-6
[0067] R представляет собой C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, C алкинильную группу, которая может быть замещенной, C циклоалкильную группу, которая может быть замещенной, арильную группу, которая может быть замещенной, или гетероциклическую группу, которая может быть замещенной, предпочтительно C алкильную группу, которая может быть замещенной, арильную группу, которая может быть замещенной, или гетероциклическую группу, которая может быть замещенной, и более предпочтительно арильную группу, которая может быть замещенной, или гетероциклическую группу, которая может быть замещенной.
1-6
2-6
2-6
3-8
1-6
11
Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, C алкильная группа, C алкенильная группа, C алкинильная группа, C циклоалкильная группа, арильная группа или гетероциклическая группа в R могут быть замещенными одной или несколькими группами, выбранными из атома галогена, цианогруппы, аминогруппы, которые могут иметь защитную группу, гидроксильной группы, которая может иметь защитную группу, и C алкоксильной группы, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A.
1-6
3-8
1-6
11
[0068] Заместитель каждой из C алкильной группы, которая может быть замещенной, C циклоалкильной группы, которая может быть замещенной, арильной группы, которая может быть замещенной, или гетероциклической группы, которая может быть замещенной, в R, предпочтительно представляет собой C алкоксильную группу, которая может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из группы заместителей A-2.
1-6
3-8
1-6
[0069] Группа заместителей A-2: атом галогена, C алкильная группа, C циклоалкильная группа, C алкоксильная группа и гетероциклическая группа.
1-6
1-6
1-3
11
[0070] C алкильная группа, которая может быть замещенной в R, предпочтительно представляет собой C алкильную группу, которая является замещенной, более предпочтительно C алкильную группу, которая является замещенной, и еще более предпочтительно этильную группу, которая является замещенной.
11
1-6
1-6
В случае, когда R представляет собой C алкильную группу, которая является замещенной, заместитель C алкильной группы предпочтительно представляет собой гетероциклическую группу и более предпочтительно пиридильную группу, пирролидинильную группу или морфолинильную группу.
11
[0071] Арильная группа, которая может быть замещенной в R, предпочтительно представляет собой арильную группу, которая является замещенной, и более предпочтительно фенильную группу, которая является замещенной.
11
[0072] В случае, когда R представляет собой фенильную группу, которая является замещенной, заместитель фенильной группы предпочтительно представляет собой атом галогена, цианогруппу или карбамоильную группу, и более предпочтительно атом фтора, цианогруппу или карбамоильную группу.
11
[0073] В случае, когда R представляет собой фенильную группу, которая является замещенной, фенильная группа не имеет заместителей в о-положении, предпочтительно имеет заместитель в м-положении или п-положении и более предпочтительно имеет заместитель только в п-положении.
Предпочтительные заместители в м-положении или п-положении представляют собой то, что описано выше.
11
[0074] Гетероциклическая группа, которая может быть замещенной в R, предпочтительно представляет собой пиридильную группу, которая может быть замещенной, индазолильную группу, которая может быть замещенной, пиразолопиридинильную группу, которая может быть замещенной, или изохинолильную группу, которая может быть замещенной.
11
[0075] В случае, когда R представляет собой пиридильную группу, которая может быть замещенной, она предпочтительно представляет собой пиридильную группу, представленную следующей формулой [I]:
12
13
1-6
1-6
1-6
(в формуле, R и R представляют собой одно и то же или различное и представляют атом водорода, атом галогена, C алкильную группу, C алкоксильную группу, C алкиламиногруппу или гетероциклическую группу, и * представляет положение связи).
12
1-6
1-6
1-6
[0076] R представляет собой атом водорода, атом галогена, C алкильную группу, C алкоксильную группу, C алкиламиногруппу или гетероциклическую группу и предпочтительно атом водорода.
13
1-6
1-6
1-6
1-6
[0077] R представляет собой атом водорода, атом галогена, C алкильную группу, C алкоксильную группу, C алкиламиногруппу или гетероциклическую группу и предпочтительно атом галогена или C алкоксильную группу и более предпочтительно атом фтора или метоксигруппу.
11
[0078] В случае, когда R представляет собой индазолильную группу, которая может быть замещенной, он предпочтительно представляет собой индазолильную группу, представленную следующей формулой [II]-(1) или [II]-(2):
14
16
15
17
1-6
1-6
(в формуле, R и R представляют собой одно и то же или различное и представляют атом водорода или C алкильную группу, R и R представляют собой одно и то же или различное и представляют атом водорода или C алкоксильную группу и * представляет положение связи).
14
16
1-6
[0079] R и R представляют собой одно и то же или различное и представляют собой атом водорода или C алкильную группу, и предпочтительно атом водорода.
1-6
1-3
14
16
[0080] C алкильная группа в R и R предпочтительно представляет собой C алкильную группу и более предпочтительно метильную группу.
15
17
1-6
[0081] R и R представляют собой одно и то же или различное и представляют собой атом водорода или C алкоксильную группу и предпочтительно атом водорода или метоксигруппу.
1-6
15
17
[0082] C алкоксильная группа в R и R предпочтительно представляет собой метоксигруппу, этоксигруппу или пропоксигруппу и более предпочтительно метоксигруппу.
11
[0083] В случае, когда R представляет собой пиразолопиридинильную группу, которая может быть замещенной, он предпочтительно представляет собой пиразолопиридинильную группу, представленную следующей формулой [III]:
18
19
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
(в формуле, R представляет атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной C алкоксильной группой, R представляет атом водорода, C алкильную группу, которая может быть замещенной C алкоксильной группой, или C алкоксильную группу и * представляет положение связи).
18
1-6
1-6
1-3
1-3
[0084] R представляет собой атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной C алкоксильной группой, предпочтительно атом водорода или C алкильную группу, которая может быть замещенной C алкоксильной группой, более предпочтительно атом водорода, метильную группу, этильную группу замещенную метоксигруппой, и еще более предпочтительно атом водорода или метильную группу.
19
1-6
1-6
1-6
1-3
1-3
R представляет собой атом водорода, C алкильную группу, которая может быть замещенной C алкоксильной группой, или C алкоксильную группу, предпочтительно атом водорода, C алкильную группу или C алкоксильную группу и более предпочтительно атом водорода, метильную группу или метоксигруппу.
1-6
1-6
1-6
18
19
[0085] C алкоксильная группа в C алкильной группе, которая может быть замещенной C алкоксильной группой в R и R, предпочтительно представляет собой метоксигруппу.
1-6
1-6
1-6
1-3
18
19
C алкильная группа в C алкильной группе, которая может быть замещенной C алкоксильной группой в R и R, предпочтительно представляет собой C алкильную группу и более предпочтительно метильную группу.
11
[0086] В случае, когда R представляет собой изохинолильную группу, которая может быть замещенной, он предпочтительно представляет собой изохинолильную группу, представленную следующей формулой [IV]:
(в формуле, * представляет положение связи).
1
20
20
20
20
20
20
[0087] X представляет собой атом кислорода, N(R) (в формуле, R имеет то же значение, как определено выше), C(=O), C(=O)-N(R) (в формуле, R имеет то же значение, как определено выше) или связь и предпочтительно C(=O)-N(R) (в формуле, R имеет то же значение, как определено выше).
20
1-6
2-6
2-6
[0088] R представляет собой атом водорода, C алкильную группу, которая может быть замещенной, C алкенильную группу, которая может быть замещенной, или C алкинильную группу, которая может быть замещенной, и предпочтительно атом водорода.
1-6
2-6
2-6
20
Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, C алкильная группа, C алкенильная группа или C алкинильная группа в R может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из атома галогена, цианогруппы, аминогруппы, которая может иметь защитную группу, и гидроксильной группы, которая может иметь защитную группу.
2
1-6
1-6
[0089] X представляет собой C алкиленовую группу, которая может быть замещенной, двухвалентную алициклическую углеводородную группу, которая может быть замещенной, или двухвалентную ароматическую углеводородную группу, которая может быть замещенной, и предпочтительно C алкиленовую группу, которая может быть замещенной, или двухвалентную алициклическую углеводородную группу, которая может быть замещенной.
1-6
2
Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, C алкиленовая группа, двухвалентная алициклическая углеводородная группа или двухвалентная ароматическая углеводородная группа в X могут быть замещенными одной или несколькими группами, выбранными из атома галогена, цианогруппы, аминогруппы, которая может иметь защитную группу, и гидроксильной группы, которая может иметь защитную группу.
1-6
1-6
2
[0090] C алкиленовая группа, которая может быть замещенной в X, предпочтительно представляет собой C алкиленовую группу, которая является незамещенной.
1-6
1-6
2
C алкиленовая группа в C алкиленовой группе, которая может быть замещенной в X, предпочтительно представляет собой метиленовую группу, этиленовую группу или триметиленовую группу и более предпочтительно триметиленовую группу.
1-6
1-6
1-3
2
Заместитель C алкиленовой группы, которая может быть замещенной в X, предпочтительно представляет собой C алкильную группу, более предпочтительно C алкильную группу и еще более предпочтительно этильную группу.
2
[0091] Двухвалентная алициклическая углеводородная группа, которая может быть замещенной в X, предпочтительно представляет собой двухвалентную алициклическую углеводородную группу, которая является незамещенной.
2
[0092] Двухвалентная алициклическая углеводородная группа в двухвалентной алициклической углеводородной группе, которая может быть замещенной в X, предпочтительно представляет собой циклобутиленовую группу или циклогексиленовую группу, и более предпочтительно циклобутиленовую группу.
2
В случае, когда X представляет собой циклобутиленовую группу, он предпочтительно представляет собой циклобутиленовую группу, представленную следующей формулой [2]:
(в формуле, * представляет положение связи), и более предпочтительно циклобутиленовую группу, представленную следующей формулой [3]:
(в формуле, * представляет положение связи).
2
В случае, когда X представляет собой циклогексиленовую группу, он предпочтительно представляет собой циклогексиленовую группу, представленную следующей формулой [4]:
(в формуле, * представляет положение связи).
2
[0093] Двухвалентная ароматическая углеводородная группа в двухвалентной ароматической углеводородной группе, которая может быть замещенной в X, предпочтительно представляет собой фениленовую группу.
2
В случае, когда X представляет собой фениленовую группу, он предпочтительно представляет собой фениленовую группу, представленную следующей формулой [5]:
(в формуле, * представляет положение связи).
2
1-6
[0094] Заместитель двухвалентной ароматической углеводородной группы, которая может быть замещенной в X, предпочтительно представляет собой атом галогена или C алкильную группу.
В случае, когда заместитель представляет собой атом галогена, он предпочтительно представляет собой атом хлора.
1-6
1-3
В случае, когда заместитель представляет собой C алкильную группу, он предпочтительно представляет собой C алкильную группу и более предпочтительно метильную группу.
3
20
20
20
20
1-6
2-6
2-6
2-6
2-6
[0095] X представляет собой C алкиленовую группу, которая может быть замещенной, C алкениленовую группу, которая может быть замещенной, C алкиниленовую группу, которая может быть замещенной, или N(R)-C(=O) (в формуле, R имеет то же значение, как определено выше), предпочтительно C алкиниленовую группу, которая может быть замещенной, или N(R)-C(=O) (в формуле, R имеет то же значение, как определено выше) и более предпочтительно C алкиниленовую группу, которая может быть замещенной.
1-6
2-6
2-6
3
Даже в случае, когда другие заместители относятся к какому-либо типу, C алкиленовая группа, C алкениленовая группа или C алкиниленовая группа в X может быть замещенной одной или несколькими группами, выбранными из атома галогена, цианогруппы, аминогруппы, которая может иметь защитную группу, и гидроксильной группы, которая может иметь защитную группу.
2-6
2-6
3
[0096] C алкиниленовая группа в C алкиниленовой группе, которая может быть замещенной в X, предпочтительно представляет собой этиниленовую группу.
[0097] Примеры солей соединения общей формулы [1] включают соли в основных группах, таких как аминогруппы, и соли в кислых группах, таких как гидроксильная группа и карбоксильная группа, которые являются общеизвестными.
Примеры солей в основных группах включают соли с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, азотная кислота и серная кислота; соли с органическими карбоновыми кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, щавелевая кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, винная кислота, аспарагиновая кислота, трихлоруксусная кислота и трифторуксусная кислота; и соли с сульфоновыми кислотами, такими как метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, мезитиленсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота.
Примеры солей в кислых группах включают соли с щелочными металлами, такими как натрий и калий; соли с щелочноземельными металлами, такими как кальций и магний; соли аммония; и соли с азот-содержащими органическими основаниями, такими как триметиламин, триэтиламин, трибутиламин, пиридин, N,N-диметиланилин, N-метилпиперидин, N-метилморфолин, диэтиламин, дициклогексиламин, прокаин, дибензиламин, N-бензил-β-фенэтиламин, 1-эфенамин и N,N'-дибензилэтилендиамин*.
Среди солей, указанных выше, предпочтительные соли включают фармакологически приемлемые соли.
[0098] Соль может представлять собой ангидрид, гидрат или сольват.
[0099] Соединение, представленное общей формулой [1], или его соль можно синтезировать в соответствии с известным способом, например, способом, описанным в WO2013/157540A, который описан выше.
[0100] [Новое фармацевтическое применение соединения общей формулы [1] и его соли]
Соединение общей формулы [1] и его соль можно использовать для лечения злокачественной опухоли, положительной по мутации FLT3.
[0101] <FLT3>
FLT3 представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 (номер доступа UniProt: P36888), или полипептид, по существу идентичный полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID № 1. Кроме того, FLT3 представляет собой белок, относящийся к рецепторным тирозинкиназам III класса, и активирует путь передачи сигнала PI3K-AKT и путь передачи сигнала ERK-MAPK, чтобы оказывать эффект на клеточный рост, выживаемость и дифференцировку. FLT3 состоит из пяти иммуноглобулиноподобных доменов N-концевого внеклеточного домена, трансмембраного домена, околомембранного домена, тирозинкиназного домена (TKD) и C-концевого домена.
В соответствии с находкой авторов настоящего изобретения, соединение, представленное общей формулой [1], связывается с FLT3 через конкретную ковалентную связь с цистеином 695 аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[0102] TKD представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности из аминокислот с 604 до 958 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1, или полипептид, по существу идентичный полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности из аминокислот с 604 до 958 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
[0103] Домен-привратник из TKD представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности из аминокислот со 604 до 822 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1, или полипептид, по существу идентичный полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности из аминокислот с 604 до 822 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
Мутация домена-привратника из TKD известна в качестве одной из причин механизма устойчивости к ингибиторам киназ. Среди ингибиторов FLT3 присутствуют те, у которых ингибиторные эффекты, оказываемые на активность FLT3, заметно ослаблены из-за структурных изменений в сайте связывания АТФ, стерических затруднений, таких как сужение сайта связывания или исчезновение межмолекулярного взаимодействия с аминокислотами в месте мутации, которое происходит за счет мутаций домена-привратника.
[0104] Активирующая петля TKD представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности из аминокислот с 823 до 861 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1, или полипептид, по существу идентичный полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности из аминокислот с 823 до 861 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
Активирующая петла TKD обычно принимает уложенную структуру между N-концевой N долей и C-концевой C долей TKD и играет роль, которая препятствует доступу субстрата и АТФ к сайту связывания субстрата и сайту связывания АТФ (неактивная форма FLT3). С другой стороны, когда мутации возникают в аминокислоте, расположенной в активирующей петле, в частности, D835 или Y842, это ведет к значительным структурным изменениям в активирующей петле, в соответствии с чем сайт связывания АТФ становится открытой структурой (активная форма FLT3). Среди ингибиторов FLT3, которые связываются через межмолекулярное взаимодействие, такое как электростатическое взаимодействие или водородные связи, с сайтом связывания АТФ неактивной формы FLT3, также имеют место те, у которых ингибирующая FLT3 активность ослаблена из-за невозможности сохранения межмолекулярного взаимодействия с активной формой FLT3 и снижения силы связывания за счет мутации D835 или Y842.
[0105] Околомембранный домен FLT3 представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности из аминокислот с 572 до 603 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1, или полипептид, по существу идентичный полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности из аминокислот с 572 до 603 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1.
В отношении околомембранного домена известно, что мутации аминокислот в повторяющихся аминокислотных последовательностях различной длины могут возникать в различных местоположениях в таком домене.
[0106] «По существу идентичен полипептиду» относится к аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, которая может иметь высокую идентичность аминокислотной последовательности (например, идентичность последовательностей 80% или больше, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% или больше и еще более предпочтительно 98% или больше), и также может иметь ту же функцию.
В отношении аминокислотной последовательности, если не указано иное, «идентичность» относится к процентной доле с учетом числа совпадающих аминокислот, общих для двух последовательностей, в случае, когда две последовательности выравнивают оптимальным образом. Поиск и анализ идентичности между аминокислотными последовательностями можно осуществлять с помощью алгоритма или программы (например, BLASTP или ClustalW), хорошо известных специалистам в данной области. Параметры, в случае использования программы, могут быть надлежащим образом приведены специалистами в данной области, и также в каждой программе можно использовать параметры по умолчанию. Конкретные процедуры для таких аналитических способов также хорошо известны специалистам в данной области.
[0107] <Мутация FLT3>
Мутация FLT3 относится к мутации аминокислоты в аминокислотной последовательности FLT3. В дополнение к пути передачи сигнала PI3K-AKT и пути передачи сигнала ERK-MAPK, мутация может активировать путь передачи сигнала STAT5 или другие пути.
Мутация аминокислоты относится к делеции, замене или добавлению одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности. Мутация аминокислот включает случай, когда любое одно из делеции, замены или добавления (например, замена) происходит однократно или многократно, и случай, когда два или больше, выбранных из делеции, замены и добавления независимо происходит в комбинации из одного или нескольких из них (например, одна замена и три добавления).
Дополнительно, число и положение аминокислот, подлежащих удалению, замене или добавлению в «делеции, замене или добавлении одной или нескольких аминокислот» конкретно не ограничены до тех пор пока получаемый мутант имеет планируемую функцию в любом случае. Число аминокислот, подлежащих делеции, замене или добавлению, составляет, например, от 1 до 30 в любом случае.
[0108] Делеция аминокислоты относится к мутации, при которой удаляют один или несколько аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности. Делеция включает делецию аминокислотного остатка с конца аминокислотной последовательности и делецию аминокислотного остатка в середине аминокислотной последовательности.
Замена аминокислоты относится к мутации, при которой один или несколько аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности заменяют на один или несколько других аминокислотных остатков.
Добавление аминокислоты относится к мутации, при которой один или несколько аминокислотных остатков добавляют в аминокислотную последовательность. Добавление включает добавление аминокислотного остатка к концу аминокислотной последовательности и добавление аминокислотного остатка в середину аминокислотной последовательности.
[0109] Мутация FLT3 предпочтительно включает мутацию TKD. Мутация TKD охватывает мутацию в домене-привратнике TKD и мутацию в активирующей петле TKD. Мутация FLT3 также может включать мутацию ITD, в дополнение к мутации TKD.
[0110] Мутация TKD относится к тому, что имеет место мутация в аминокислотной последовательности TKD.
[0111] Мутация в домене-привратнике TKD, например, представляет собой мутацию(мутации) одной или нескольких аминокислот в области аминокислот с 604 до 822 аминокислотной последовательности SEQ ID № 1, и предпочтительно мутацию по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислот 621, 627, 676, 691 и 697 в SEQ ID № 1. Мутация в домене-привратнике TKD более предпочтительно представляет собой мутацию аминокислоты 691 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 и еще более предпочтительно замену фенилаланина в аминокислоте 691 в SEQ ID № 1 на лейцин. В любом случае, получаемый мутант FLT3 имеет активность FLT3 и предпочтительно мутантную активность FLT3.
[0112] Мутацию в домене-привратнике TKD также можно выполнять из какой-либо одной из следующих аминокислотных последовательностей. В любом случае, получаемый мутант FLT3 имеет активность FLT3:
a. аминокислотная последовательность, которая имеет делецию, замену или добавление для фенилаланина 691 (предпочтительно замену фенилаланина 691, более предпочтительно замену фенилаланина 691 на лейцин) в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1;
b. аминокислотная последовательность, которая имеет делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот, отличных от аминокислоты 691 в аминокислотной последовательности из вышеприведенного a; и
c. аминокислотная последовательность, которая имеет 80% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью из вышеприведенного a (при условии, что фенилаланин 691 удален, заменен или добавлен (предпочтительно заменен и более предпочтительно заменен на лейцин)).
[0113] Мутация в активирующей петле TKD представляет собой, например, мутацию(мутации) одной или нескольких аминокислот в области аминокислот с 823 до 861 аминокислотной последовательности SEQ ID № 1. Предпочтительной является мутация по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислоты 835, 836 и 842 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1. Более предпочтительной является по меньшей мере одна мутация, выбранная из группы, состоящей из следующего:
a. замена аспарагиновой кислоты 835 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 на валин, тирозин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
b. замена изолейцина 836 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 на лейцин-аспарагиновую кислоту; и
c. замена тирозина 842 в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 на цистеин или гистидин.
В любом случае, получаемый мутант FLT3 имеет активность FLT3 и предпочтительно мутантную активность FLT3.
[0114] Мутацию в активирующей петле TKD также можно выполнять с использованием какой-либо одной из следующих аминокислотных последовательностей. В любом случае, получаемый мутант FLT3 имеет активность FLT3:
a. аминокислотная последовательность, которая имеет делецию, замену или добавление аспарагиновой кислоты 835 (предпочтительно замену аспарагиновой кислоты 835 и более предпочтительно замену аспарагиновой кислоты 835 на валин, тирозин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин) в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1;
b. аминокислотная последовательность, которая имеет делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот, отличных от аминокислоты 835 в аминокислотной последовательности из вышеприведенного a;
c. аминокислотная последовательность, которая имеет 80% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью из вышеприведенного a (при условии, что аспарагиновая кислота 835 удалена, заменена или добавлена (предпочтительно заменена и более предпочтительно заменена на валин, тирозин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин));
d. аминокислотная последовательность, которая имеет делецию, замену или добавление изолейцина 836 (предпочтительно замену или делецие изолейцина 836, и более предпочтительно замену изолейцина 836 на лейцин-аспарагин) в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1;
e. аминокислотная последовательность, которая имеет делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот, отличных от аминокислоты 836, в аминокислотной последовательности из вышеприведенного d;
f. аминокислотная последовательность, которая имеет 80% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью из вышеприведенного d (при условии, что изолейцин 836 удален, заменен или добавлен (предпочтительно заменен или добавлен и более предпочтительно заменен на лейцин-аспарагин));
g. аминокислотная последовательность, которая имеет делецию, замену или добавление тирозина 842 (предпочтительно замену тирозина 842 и более предпочтительно замену тирозина 842 на цистеин или гистидин) в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1;
h. аминокислотная последовательность, которая имеет делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот, отличных от аминокислоты 842 в аминокислотной последовательности из вышеприведенного g;
i. аминокислотная последовательность, которая имеет 80% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью из вышеприведенного g (при условии, что тирозин 842 удален, заменен или добавлен (предпочтительно заменен и более предпочтительно заменен на цистеин или гистидин)).
50
50
50
[0115] Наличие у получаемого мутанта FLT3 активности FLT3 или наличие у получаемого мутанта FLT3 мутантной активности FLT3 могут измерять и определять специалисты в данной области в соответствии с известным способом. В отношении более конкретного способа измерения и стандартов принятия решений можно дать ссылку на описание раздела примеров в указанном выше WO2013/157540A и описание раздела примеров данного описания. Дополнительно, наличие у получаемого мутанта FLT3 мутантной активности FLT3 можно определять на основании того, что получаемый мутант FLT3 имеет активность FLT3, но не подвергается ингибированию с помощью ингибитора FLT3 из связанной области, предпочтительно по меньшей мере одного ингибитора FLT3, выбранного из группы, состоящей из квизартиниба (Ambit Biosciences Corporation) и сорафениба (Bayer HealthCare Pharmaceuticals, Inc.). В отношении фразы «не подвергается ингибированию», это можно определять, например, с использованием способа измерения, описанного в разделе примеров данного описания со ссылкой на стандарты принятия решений, которые включают значение IC 10 нмоль/л или 100 нмоль/л или больше в анализе ингибирования фермента, значение GI 10 нмоль/л или 100 нмоль/л или больше в анализе клеточного роста и значение IC 90 нмоль/л или больше в анализе ингибирования внутриклеточного фосфорилирования.
[0116] Мутация ITD относится к мутации, при которой аминокислотная последовательность в околомембранном домене FLT3 повторяется в различных местах в таком домене. Сообщалось, что повторяющийся отрезок аминокислотной последовательности в мутации ITD варьирует от 2 до 42 аминокислот. В частности, во многих случаях с мутацией ITD, такую мутацию наблюдают с высокой частотой в аминокислотной последовательности из аминокислот с 591 до 599 в SEQ ID № 1. Для мутации ITD и FLT3, имеющего мутацию ITD, можно дать ссылку на WO2000/011470A (JP4542268B).
[0117] <Положительный по мутации FLT3 >
Выражение о том, что определенная злокачественная опухоль положительна по мутации FLT3, относится к тому, что в клетках злокачественной опухоли имеет место мутация в аминокислотной последовательности FLT3. Кроме того, «положительный по мутации FLT3» также относится к тому, что имеет место мутация в гене FLT3, который кодирует аминокислотную последовательность, имеющую такую мутацию. В случае, когда имеет место мутация в аминокислотной последовательности FLT3, ясно, что имеет место мутация в гене FLT3.
[0118] Является ли это положительным по мутации FLT3 или нет, то есть мутации FLT3, можно исследовать посредством анализа последовательности гена FLT3 или последовательности мРНК, которая представляет собой продукт транскрипции FLT3. Способ анализа последовательностей может представлять собой, например, способ дидезоксинуклеотидной терминации цепи (Sanger et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463). Также возможно анализировать последовательности с использованием подходящего секвенатора ДНК.
[0119] Кроме того, мутации FLT3 также можно анализировать с помощью такого способа, как гибридизация in situ, анализ блоттинга по Саузерну, анализ нозерн-блоттинга, ДНК микрочип, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-ПЦР), анализ фрагментов, ПЦР одноцепочечного конформационного полиморфизма (PCR-SSCP), ПЦР полиморфизма длины фрагментов рестрикции (PCR-RFLP), система амплификации рефракторных мутаций (ARMS), ПЦР-клэмпинг пептидо-нуклеиновых кислот (PNA)-LNA, PCR-Invader, Scorpion ARMS, Cyleave, iPLEX или SMart Amplification Process (SMAP). Эти способы можно использовать в соответствии со стандартным способом.
[0120] Примеры образца для обнаружения мутаций FLT3 включают кровь, костный мозг, хирургический образец и биоптат.
[0121] Соединение общей формулы [1] и его соль можно использовать при различных злокачественных опухолях. Экспрессия FLT3 ограничена ранними клетками-предшественниками, но при злокачественной опухоли крови, FLT3 экспрессируется на высоких уровнях или FLT3 подвергается генной мутации, тем самым внося вклад в озлокачествленный рост злокачественной опухоли через активацию путей передачи сигнала. Примеры злокачественной опухоли крови, для которой соединение общей формулы [1] и его соль являются эффективными, включает острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), острый миелолейкоз (AML), острый промиелоцитарный лейкоз (APL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелолейкоз (CML), хронический нейтрофильный лейкоз (CNL), острый недифференцированный лейкоз (AUL), анапластическую крупноклеточную лимфому (ALCL), пролимфоцитарный лейкоз (PML), ювенильный миеломоноцитарный лейкоз (JMML), T-клеточный ALL взрослых, миелодиспластическый синдром (MDS) и миелопролиферативное заболевание (MPD).
Соединение общей формулы [1] и его соль можно использовать для этих злокачественных опухолей, которые являются положительными по мутации FLT3.
[0122] [Дозированная форма и другие]
Соединение общей формулы [1] или его соль можно использовать в качестве активного ингредиента ингибитора мутантного FLT3. Предпочтительно, соединение общей формулы [1] или его соль можно использовать в качестве средства, которое ингибирует мутантный FLT3, содержащий мутацию TKD. Такое средство также может представлять собой то, которое ингибирует FLT3 дикого типа. Ингибитор мутантного FLT3, содержащий соединение общей формулы [1] или его соль в качестве активного ингредиента, в частности, можно использовать в качестве средства против злокачественной опухоли.
[0123] Фармацевтическая композиция или средство может содержать только одно из или два или больше из соединения общей формулы [1] и его различных солей. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с другими терапевтическими средствами, включая известное противоопухолевое средство, которое стандартно используют в данной области.
[0124] Типично, добавки, такие как эксципиент, связывающее средство, смазывающее средство, средство для улучшения распадаемости, краситель, ароматизатор, эмульсификатор, поверхностно-активное средство, солюбилизирующее средство, суспендирующее средство, регулирующее тоничность средство, буферное средство, консервант, антиоксидант, стабилизатор и ускоритель абсорбции, которые используют в составе, можно добавлять в фармацевтическую композицию или средство.
[0125] Примеры пути введения фармацевтической композиции или средства включают способы, такие как способ внутривенной, внутриартериальной, ректальной, интраперитонеальной, внутримышечной, внутриопухолевой или внутрипузырной инъекции, пероральное введение, трансдермальное введение и суппозитории. В отношении дозы и частоты введения, например, для взрослого, например, дозу от 0,01 до 1000 мг/кг/сутки можно вводить один раз или несколькими разделенными частями посредством перорального или парентерального введения (например, инъекции, инфузии или ректального введения). Примеры дозированной формы включают таблетки, капсулы, порошки, сиропы, гранулы, пилюли, суспензии, эмульсии, растворы, порошковые препараты, суппозитории, глазные капли, назальные капли, ушные капли, пластыри, мази и инъекции.
[0126] Как уже описано, соединение общей формулы [1] или его соль можно считать, в частности, эффективным для злокачественных опухолей, положительных по мутации FLT3. Соответственно, анализ гена FLT3 для исследования присутствия или отсутствия мутаций FLT3 можно осуществлять для того, чтобы предсказывать эффект лечения фармацевтической композицией или средством, содержащим соединение общей формулы [1] или его соль; чтобы выбирать субъекта, у которого применять фармацевтическую композицию; и также для того, чтобы определять применимость лечения фармацевтической композицией или средством. Настоящая заявка также предусматривает эти варианты осуществления.
[0127] В отношении ингибиторов FLT3 в связанной области, могут иметь место некоторые случаи, когда активность ингибитора FLT3 против FLT3 высока, но его эффективность значительно хуже для определенного мутантного FLT3. Между тем, в соответствии с исследованием, проведенным авторами настоящего изобретения, соединение общей формулы [1] или его соль могут быть эффективными для различных мутантных FLT3. В частности, в отношении мутаций в активирующей петле и более конкретно мутаций в аминокислоте 835, 836 или 842 аминокислотной последовательности SEQ ID № 1, соединение общей формулы [1] или его соль могут быть эффективными против различных мутантных FLT3.
[0128] Далее в настоящем документе, настоящее изобретение описано со ссылкой на следующие примеры, но настоящее изобретение не ограничено этим.
[ПРИМЕРЫ]
[0129] [Пример получения]
Соединения, описанные в таблицах с 1-1 до 1-4, синтезировали в соответствии со способом, описанным в указанном выше WO2013/157540A.
[0130] [Таблица 1-1]
[0131] [Таблица 1-2]
[0132] [Таблица 1-3]
[0133] [Таблица 1-4]
[0134] [Пример 1: анализ ингибирования фермента мутантного FLT3 (FLT3 D835Y)]
Квизартиниб (Ambit Biosciences Corporation) использовали в качестве эталонного соединения 1.
2
6 мкл (0,75 нг) мутантного белка FLT3 (FLT3 D835Y, Life Technologies) и 3 мкл раствора (100 ммоль/л HEPES, 10 ммоль/л MgCl, 25 ммоль/л NaCl, 0,01% BSA, 1 ммоль/л DTT, pH 7,5), содержащего тестируемое соединение в предварительно определяемой концентрации, смешивали и инкубировали при 25°C в течение 15 минут. После этого 3 мкл (конечная концентрация: 0,25 мкмоль/л) пептидного субстрата биотин-AAA-AEEEEYFELVAKKK (Toray Industries, Inc.) (SEQ ID № 2) и 3 мкл (конечная концентрация: 15 мкмоль/л) АТФ (Sigma-Aldrich) добавляли туда соответствующим образом, после чего следовало встряхивание в течение 2 минут и затем все вмести инкубировали при 25°C в течение 40 минут для того, чтобы осуществлять ферментативную реакцию. Следует отметить, что FLT D835Y относится к белку FLT3 с заменой аспарагиновой кислоты 835 на тирозин.
50
[0135] Затем 30 мкл раствора для остановки ферментативной реакции (5 мкг/мл стрептавидина, 0,19 мкг/мл PT66-K, 30 мкмоль/л HEPES (pH 7,0), 150 ммоль/л KF, 75 мМ EDTA, 0,15% BSA, 0,075% Tween20), содержащего Streptavidin-Xlent (Cisbio) и Mab PT66-K (Cisbio) добавляли для того, чтобы останавливать ферментативную реакцию, после чего следовала совместная инкубация при комнатной температуре в течение 1 часа для того, чтобы осуществлять реакцию антиген-антитело. После этого, фосфорилирование пептидного субстрата измеряли посредством измерения флуоресценции с разрешением по времени на 615 нм и 665 нм с использованием Envision (PerkinElmer). Получая значение, полученное делением значения флуоресценции при 665 нм на значение флуоресценции при 615 нм в качестве измеряемого значения, получая измеряемое значение лунки без добавления соединения (обработка только DMSO) и с добавлением АТФ в качестве 0% ингибирования и получая измеряемое значение лунки без добавления соединения (обработка только DMSO) и без добавления АТФ в качестве 100% ингибирования, 50% ингибирующую концентрацию (значение IC) тестируемого соединения вычисляли посредством Fit Model 205 версии 5.3.1 из XLfit (ID Business Solutions Limited). Результаты представлены в таблице 2.
[0136] [Таблица 2]
№ соединения
IC<sub>50</sub>
№ соединения
IC<sub>50</sub>
Эталонное соединение 1
-
21
+++
1
++
22
+++
2
+++
23
+++
3
++
24
+++
4
++
25
+++
5
+++
26
+++
6
++
27
+++
7
+++
28
+++
8
++
29
+++
9
+++
30
+++
10
+++
31
++
11
++
32
+++
12
++
33
++
13
++
34
+++
14
+++
35
+++
15
++
36
+++
16
+++
37
+++
17
+++
38
+++
18
+++
39
+++
19
+++
40
+++
20
+++
41
+++
50
[0137] В таблице стандарты оценки значения IC для ферментативной активности мутантного белка FLT3 представляют собой следующее.
+++: меньше чем 1 нмоль/л
++: больше чем или равно 1 нмоль/л и меньше чем 10 нмоль/л
+: больше чем или равно 10 нмоль/л и меньше чем 100 нмоль/л
-: больше чем или равно 100 нмоль/л
[0138] [Пример 2: создание клеточных линий 32D, экспрессирующих мутантный FLT3, и анализ клеточного роста с использованием этих клеточных линий]
Материалы
2
В качестве клеточной линии 32D, совместно экспрессирующей FLT3 дикого типа/лиганд FLT3 (32D FLT3/FL), использовали известные клетки, описанные в Shiotsu Y, et al., Blood, том 114, стр. с 1607 до 1617, 2009. RPMI1640 и DMEM приобретали в Life Technologies или SIGMA. Клетки 32D получали из RIKEN Bioresource Center и культивировали в присутствии 5% CO при 37°C с использованием среды RPMI1640, содержащей 1 нг/мл IL-3 мыши, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 100 ед./мл пенициллина и 100 нг/мл стрептомицина. Клетки PLAT-E любезно предоставлены доктором Kitamura Toshio из Tokyo University, и их культивировали в среде DMEM, содержащей 1 мкг/мл пуромицина, 10 мкг/мл бластицидина S, 10% FBS, 100 ед./мл пенициллина и 100 нг/мл стрептомицина. Ретровирусный вектор pMXs-IP любезно предоставлен доктором Kitamura Toshio из Tokyo University (Kitamura T, et al., Exp Hamtol, том 31, стр. с 1007 до 1014, 2003). Вектор pGEM-T, FuGENE6 и CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay приобретали в Promega Corporation.
[0139] 2-2. Создание клеточных линий
Клеточные линии, за исключением 32D FLT3/FL, создавали следующим образом, в соответствии с известными процедурами, описанными в Tsujimura A, et al., Int J Hematol, том 92, стр. с 624 до 633, 2010 и Lu Y, et al., Leukemia, том 21, стр. с 2246 до 2257, 2007.
(1) FLT3 D835Y, FLT3 D835V, FLT3 D835H, FLT3 D835E, FLT3 D835N, FLT3 D835Ins, FLT3 Y842C и FLT3 Y842H
Векторы, экспрессирующие D835Y-, D835V-, D835H-, D835E-, D835N- и D835Ins-мутантны FLT3 (I836L⋅D-), конструировали посредством вставки полноразмерной последовательности D835-мутантного гена FLT3, вставленной в вектор pMKIT-Neo, описанный в Yamamoto Y, et al., Blood, том 97, стр. с 2434 до 2439, 2001, в ретровирусный вектор pMXs-IP.
Вектор, экспрессирующий Y842C- или Y842H-мутантный FLT3, конструировали посредством введения мутаций Y842C и Y842H в ген FLT3 с C-концевым добавлением последовательности FLAG, вставленный в вектор pGEM-T в качестве матрицы, используя праймеры, приведенные далее, и в соответствии с протоколом QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Corporation) и последующей вставки полноразмерной последовательности Y842-мутантного гена FLT3 в ретровирусный вектор pMXs-IP. Вводимые мутации подтверждали посредством анализа последовательностей.
(2) FLT3 ITD, FLT3 ITD⋅D835Y, FLT3 ITD⋅Y842C и FLT3 ITD⋅Y842H
Вектор, экспрессирующий ITD-мутантный FLT3, конструировали посредством введения ITD-мутантного гена FLT3 (клон Mt2), описанного в Kiyoi H, et al., Leukemia, том 12, стр. с 1333 до 1337, 1998, в ретровирусный вектор pMXs-IP в виде последовательности, имеющей последовательность FLAG, добавленную на ее C-конец.
ITD⋅D835Y-мутантный FLT3-экспрессирующий вектор конструировали посредством замены последовательности, содержащей аспарагиновую кислоту 835, расщепляемой SphI, в ITD-мутантный ген FLT3 с добавлением C-концевой последовательности FLAG, вставленный в вектор pGEM-T, на соответствующую последовательность D835Y-мутантного гена FLT3 с добавлением C-концевой последовательности FLAG, вставленную в вектор pGEM-T, и последующей вставки полноразмерной ITD⋅D835Y-мутантной последовательности FLT3 с добавлением C-концевой последовательности FLAG в ретровирусный вектор pMXs-IP.
ITD⋅Y842C-мутантный или ITD⋅Y842H-мутантный FLT3-экспрессирующий вектор конструировали посредством введения мутаций Y842C и Y842H в ITD-мутантный ген FLT3 с добавлением C-концевой последовательности FLAG, вставленный в вектор pGEM-T в качестве матрицы, используя праймеры, представленные далее и в соответствии с протоколом QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Corporation), и последующей вставки полноразмерного ITD⋅Y842-мутантного гена FLT3 в ретровирусный вектор pMXs-IP. Вводимые мутации подтверждали посредством анализа последовательностей.
[0140] Мутантные FLT3 pMXs-IP ретровирусные векторы, полученные в соответствии с указанной выше процедурой, вводили в клетки PLAT-E с использованием FuGENE6, после чего культивировали в течение 2 суток и собирали культуральный супернатант, содержащий вирусы. После добавления культурального супернатанта, содержащего вирус, в клетки клеточной линии гематопоэтических предшественников мыши 32D в присутствии 10 мкг/мл полибрена, клетки культивировали в присутствии 0,5 нг/мл IL-3 мыши. Клеточные линии 32D, экспрессирующие индивидуальные мутантные FLT3 (32D FLT3 D835Y, 32D FLT3 D835V, 32D FLT3 D835H, 32D FLT3 D835E, 32D FLT3 D835N, 32D FLT3 D835Ins, 32D FLT3 Y842C, 32D FLT3 Y842H, FLT3 ITD, FLT3 ITD⋅D835Y, FLT3 ITD⋅Y842C и FLT3 ITD⋅Y842H) создавали посредством отбора клеток в 4 мкг/мл пуромицина через 2 суток после инфицирования вирусом. Экспрессию FLT3 подтверждали с помощью вестерн-блоттинга. Все созданные таким образом клеточные линии 32D, экспрессирующие мутантные FLT3, и клеточные линии 32D, совместно экспрессирующие FLT3/лиганд FLT3, способны к росту в отсутствие IL-3 и культивированию в среде RPMI1640, содержащей 10% FBS, 100 ед./мл пенициллина и 100 нг/мл стрептомицина.
[0141] Последовательности праймеров, используемые для введения мутации Y842C или мутации Y842H в ген FLT3
Праймеры, используемые для введения мутации Y842C
TGT
5'-CATGAGTGATTCCAACGTTGTCA-3' (SEQ ID № 3)
ACA
5'-TGACAACGTTGGAATCACTCATG-3' (SEQ ID № 4)
Праймеры, используемые для введения мутации Y842H
CAT
5'-CATGAGTGATTCCAACGTTGTCA-3' (SEQ ID № 5)
ATG
5'-TGACAACGTTGGAATCACTCATG-3' (SEQ ID № 6)
Сайты мутагенеза подчеркнуты.
[0143] 2-3. Анализ клеточного роста
(1) Квизартиниб (Ambit Biosciences Corporation) использовали в качестве эталонного соединения 1 и сорафениб (Bayer HealthCare Pharmaceuticals, Inc.) использовали в качестве эталонного соединения 2.
Анализ жизнеспособности клеток для клеточных линий 32D, совместно экспрессирующих FLT3/лиганд FLT3, и клеточных линий 32D, экспрессирующих мутантный FLT3, (32D FLT3 D835Y, 32D FLT3 D835V, 32D FLT3 D835H, 32D FLT3 D835E, 32D FLT3 D835N, 32D FLT3 D835Ins, 32D FLT3 Y842C и 32D FLT3 Y842H) для соединений осуществляли в соответствии со следующей процедурой.
2
50
[0144] Отдельные клетки высевали в 96-луночный планшет (Becton, Dickinson и Company) с плотностью от 1000 до 10000 клеток/лунка, и клеточную культуру начинали при 37°C в присутствии 5% CO. На следующие сутки соединение, разведенное в 3-кратном общем соотношении, добавляли в каждую лунку, после чего следовало дополнительное культивирование в течение 2 суток. Затем, чтобы оценивать жизнеспособность клеток, CellTiter 96 AQueous One SolutionReagent добавляли в каждую лунку в соответствии с протоколом Promega Corporation, после чего следовало культивирование в течение 1 часа. После этого поглощение (OD=492 нм) измеряли с использованием считывателя микропланшетов MPR-A4i II (Tosoh Corporation). В случае недостаточного поглощения, поглощение измеряли после осуществления культивирования в течение еще 1-2 часов. Взяв лунку без добавления соединения в качестве 0% ингибирования роста и взяв лунку без высева клеток в качестве 100% ингибирования роста, 50% ингибирующую концентрацию (значение GI) тестируемого соединения вычисляли с помощью программного обеспечения XLfit 5.3.1 (Fit Model 205) (ID Business Solutions Limited).
Результаты представлены в таблице 3.
[0145] [Таблица 3]
Соединение 38
Соединение 39
Соединение 40
Соединение 41
Эталонное соединение 1
Эталонное соединение 2
FLT3/FL
++
+++
+++
+++
++
+
FLT3 D835Y
+++
++
+++
++
+
-
FLT3 D835V
+++
++
+++
++
-
-
FLT3 D835H
++
++
++
++
++
-
FLT3 D835E
++
+++
+++
++
++
+
FLT3 D835N
++
+++
+++
++
++
+
FLT3 D835Ins
++
+++
+++
++
++
+
FLT3 Y842C
++
++
++
++
+
-
FLT3 Y842H
++
++
++
++
+
-
50
[0146] В таблице стандарты оценки значений GI для роста различных клеток 32D, экспрессирующих белок FLT3, представляют собой следующее.
+++: меньше чем 1 нмоль/л
++: больше чем или равно 1 нмоль/л и меньше чем 10 нмоль/л
+: больше чем или равно 10 нмоль/л и меньше чем 100 нмоль/л
-: больше чем или равно 100 нмоль/л
[0147] Кроме того, отдельные термины в таблицы имеют следующие значения.
FLT3/FL: штамм, совместно экспрессирующий белок FLT3 и белок FL (лиганд FLT3)
FLT3 D835Y: штамм, экспрессирующий белок FLT3, который имеет замену аспарагиновой кислоты 835 на тирозин
FLT3 D835V: штамм, экспрессирующий белок FLT3, который имеет замену аспарагиновой кислоты 835 на валин
FLT3 D835H: штамм, экспрессирующий белок FLT3, который имеет замену аспарагиновой кислоты 835 на гистидин
FLT3 D835E: штамм, экспрессирующий белок FLT3, который имеет замену аспарагиновой кислоты 835 на глутаминовую кислоту
FLT3 D835N: штамм, экспрессирующий белок FLT3, который имеет замену аспарагиновой кислоты 835 на аспарагин
FLT3 D835Ins: штамм, экспрессирующий белок FLT3, который имеет замену изолейцина 836 на лейцин и аспарагиновую кислоту
FLT3 Y842C: штамм, экспрессирующий белок FLT3, который имеет замену тирозина 842 на цистеин
FLT3 Y842H: штамм, экспрессирующий белок FLT3, который имеет замену тирозина 842 на гистидин
[0148] Соединения по настоящему изобретению демонстрировали сильный ингибиторный эффект, оказываемый на клеточный рост клеток, экспрессирующих какой-либо мутантный FLT3, и сила ингибиторного эффекта эквивалентна или превышает ингибиторный эффект, оказываемый на клетки, совместно экспрессирующие FLT3/лиганд FLT3.
[0149] (2)
Анализ жизнеспособности клеток клеточных линий 32D, экспрессирующих мутантный FLT3 (FLT3 ITD, FLT3 ITD⋅D835Y, FLT3 ITD⋅Y842C и FLT3 ITD⋅Y842H), для соединений осуществляли в соответствии с процедурой, описанной в разделе 2-3. (1).
Результаты представлены в таблице 4.
[0150] [Таблица 4]
Соединение 38
FLT3 ITD
++
FLT3 ITD⋅D835Y
++
FLT3 ITD⋅Y842C
++
FLT3 ITD⋅Y842H
+++
50
[0151] В таблице стандарты оценки значений GI для роста различных клеток 32D, экспрессирующих белок FLT3, представляют собой то же, что и для таблицы 2.
[0152] Кроме того, отдельные термины в таблице имеют следующие значения.
FLT3 ITD: штамм, экспрессирующий белок FLT3, который имеет мутацию ITD
FLT3 ITD⋅D835Y: штамм, экспрессирующий белок FLT3, который имеет мутацию ITD и также имеет замену аспарагиновой кислоты, соответствующей 835-му положению в FLT3 дикого типа, на тирозин
FLT3 ITD⋅Y842C: штамм, экспрессирующий белок FLT3, который имеет мутацию ITD и также имеет замену тирозина, соответствующую 842-му положению в FLT3 дикого типа, на цистеин
FLT3 ITD⋅Y842H: штамм, экспрессирующий белок FLT3, который имеет мутацию ITD и также имеет замену тирозина, соответствующую 842-му положению в FLT3 дикого типа, на гистидин
[0153] Соединения по настоящему изобретению демонстрировали сильный ингибиторный эффект, оказываемый на клеточный рост клеток, экспрессирующих мутантный FLT3, который имеет мутацию ITD и также имеет D835Y, Y842C или Y842H, и сила ингибиторного эффекта эквивалента или больше ингибиторного эффекта, оказываемого на клетки, экспрессирующие мутантный FLT3, который имеет только мутацию ITD.
[0154] [Пример 3: анализ ингибирования фосфорилирования FLT3 с использованием клеток HEK293T, временно экспрессирующих мутантный FLT3]
3-1. Материалы
2
клеточную линию HEK293T приобретали в DS Pharma Biomedical Co., Ltd. DMEM приобретали в Life Technologies. Клеточную культуру осуществляли с использованием среды DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) при 37°C в присутствии 5% CO. Вектор pcDNA3.1(+) и реактив для генной трансфекции Lipofectamine 2000 приобретали в Life Technologies. Количественное определение внутриклеточного фосфорилировання FLT3 осуществляли с использованием PathScan Phospho-FLT3(Tyr591) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit #7021 (Клеточн* сигнализаци* Технологи*).
[0155] 3-2. Конструкция вектора, экспрессирующего мутантный FLT3
Вектор, экспрессирующий ITD-мутантный FLT3, конструировали посредством встраивания ITD-мутантного гена FLT3 в виде последовательности, имеющей последовательность FLAG, добавленную на C-конце, в вектор pcDNA3.1(+).
Вектор, экспрессирующий ITD⋅F691L-мутантный FLT3, конструировали посредством введения мутации F691L в ITD-мутантный FLT3-экспрессирующий вектор в качестве матрицы, используя праймеры, представленные далее и в соответствии с протоколом QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Corporation), и затем вставляли полноразмерный ITD⋅F691L-мутантный ген FLT3 в вектор pcDNA3.1(+). Введенные мутации подтверждали посредством анализа последовательностей.
[0156] Последовательности праймеров, используемые для введения мутации F691L
TTT
5'-CCAATTTACTTGATGGAATACTGTTGC-3' (SEQ ID № 7)
AAA
5'-GCAACAGTATTCCATCAAGTAAATTGG-3' (SEQ ID № 8)
Сайты мутагенеза подчеркнуты.
[0157] 3-3. Анализ ингибирования фосфорилирования в клетках HEK293T, временно экспрессирующих мутантный FLT3 (FLT3 ITD или FLT3 ITD⋅F691L)
Квизартиниб (Ambit Biosciences Corporation) использовали в качестве эталонного соединения 1. В отношении FLT3 ITD или FLT3 ITD⋅F691L, которые представляют собой мутантный FLT3, гены индивидуально вводили в клетки HEK293T посредством экспрессирующего вектора, встраивая каждый ген, и анализ ингибиторного эффекта соединений, оказываемого на фосфорилирование FLT3 в клетках, временно экспрессирующих эти мутантные FLT3, осуществляли в соответствии со следующей процедурой.
6
2
2
2
2
50
Клетки HEK293T высевали в колбы T75 (8×10 клеток/колба) и культивировали в присутствии 5% CO при 37°C в течение 24 часов и заменяли среду (15 мл). Раствор Lipofectamine 2000 (смесь 160 мкл реактива Lipofectamine и 4,0 мл OPTIMEM) и раствор вектора (смесь 64 мкг плазмидной ДНК и 4,0 мл OPTIMEM) смешивали в соотношении 1:1 и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем брали 3 мл получаемой смеси и добавляли к клеткам HEK293T, для которых заменяли среду, после чего следовало культивирование в присутствии 5% CO при 37°C в течение еще 24 часов. Клетки HEK293T, в которые вводили ген FLT3 ITD или FLT3 ITD⋅F691L, высевали в 96-луночные планшеты (#3300, Corning) c плотностью 50000 клеток/лунка для каждой и предварительно культивировали в присутствии 5% CO при 37°C в течение 24 часов. После предварительного культивирования растворы соединений в серийных разведениях добавляли в каждую лунку и клетки культивировали в присутствии 5% CO при 37°C в течение 60 минут. Для того чтобы количественно определять фосфорилированный FLT3 в клетках HEK293T после культивирования, образец обрабатывали с использованием PathScan Phospho-FLT3(Tyr591) Chemiluminescent Sandwich ELISA Kit в соответствии с приложенным протоколом. Вкратце, каждую лунку промывали с использованием 100 мкл PBS, в нее добавляли 50 мкл лизирующего буфера и затем лизат делили на аликвоты. Лизат разводили надлежащим образом и лизат добавляли по 50 мкл/лунка в ELISA планшет, на котором иммобилизовали FLT3 Mouse mAb, после чего следовала реакция при 4°C в течение 24 часов. После завершения реакции, супернатант из каждой лунки выбрасывали, после чего следовало промывание буфером для промывания и затем добавляли Phospho-FLT3(Tyr591) Rabbit Detection Antibodies, после чего следовала реакция при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку промывали и в нее добавляли вторичные антитела, связанные с HRP, после чего следовала реакция при комнатной температуре в течение 30 минут. После завершения реакции каждую лунку промывали, в каждую лунку добавляли жидкость для обнаружения (1:1 смесь раствора Luminol/Enhancer и Stable Peroxide Buffer) и измеряли количество света, испускаемого при 425 нм в считывателе планшетов EnVision. Взяв лунку без добавления соединения в качестве 0% ингибирования фосфорилирования и взяв лунку без высева клеток в качестве 100% ингибирования фосфорилирования, 50% ингибирующую концентрацию (значение IC) тестируемого соединения вычисляли с помощью программного обеспечения XLfit 5.3.1 (Fit Model 205) (ID Business Solutions Limited).
Результаты представлены в таблице 5.
[0158] [Таблица 5]
Соединение 38
Эталонное соединение 1
FLT3 ITD
+++
+++
FLT3 ITD⋅F691L
++
-
50
[0159] В таблице стандарты оценки значений IC для фосфорилирования FLT3 в клетках HEK293T, временно экспрессирующих мутантный FLT3, представляют собой следующее.
+++: меньше чем 10 нмоль/л
++: больше чем или равно 10 нмоль/л и меньше чем 30 нмоль/л
+: больше чем или равно 30 нмоль/л и меньше чем 90 нмоль/л
-: больше чем или равно 90 нмоль/л
[0160] Кроме того, отдельные термины в таблице имеют следующие значения.
FLT3 ITD: штамм, который временно экспрессирует белок FLT3, имеющий мутацию ITD
FLT3 ITD⋅F691L: штамм, который временно экспрессирует белок FLT3, имеющий мутацию ITD и также имеющий замену фенилаланина, соответствующего 691-му положению в FLT3 дикого типа, на лейцин
[0161] Соединения по настоящему изобретению сильно ингибировали фосфорилирование FLT3 в клетках HEK293T, экспрессирующих FLT3 с мутацией ITD, на уровне, эквивалентом или больше такового для эталонного соединения 1. Кроме того, соединения по настоящему изобретению демонстрировали сильный ингибиторный эффект, оказываемый на фосфорилирование FLT3, даже для клеток HEK293T, экспрессирующих FLT3 с мутацией ITD⋅F691L, для которых ингибиторный эффект фосфорилирования FLT3 эталонного соединения 1 заметно ослаблен.
[0162] Азот-содержащее гетероциклическое соединение или его соль можно использовать в качестве фармацевтической композиции для лечения злокачественной опухоли, положительной по мутации FLT3, и ингибитора мутантного FLT3.
[Предварительный список последовательностей]
[0163] SEQ ID № 1 FLT3
SEQ ID № 2 пептидный субстрат FLT3
SEQ ID № 3 Праймер для мутации Y842C
SEQ ID № 4 Праймер для мутации Y842C
SEQ ID № 5 Праймер для мутации Y842H
SEQ ID № 6 Праймер для мутации Y842H
SEQ ID № 7 Праймер для мутации F691L
SEQ ID № 8 Праймер для мутации F691L
[Список последовательностей]
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  FUJIFILM Corporation
<120>  ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ,
ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ ПО МУТАЦИИ FLT3, ИНГИБИТОР МУТАНТНОГО FLT3 И ИХ
ПРИМЕНЕНИЕ
<130>  15F00798
<150>  JP 2014-169709
<151>  2014-08-22
<150>  JP 2014-178737
<151>  2014-09-03
<160>  8
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  993
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Pro Ala Leu Ala Arg Asp Gly Gly Gln Leu Pro Leu Leu Val Val
1               5                   10                  15
Phe Ser Ala Met Ile Phe Gly Thr Ile Thr Asn Gln Asp Leu Pro Val
20                  25                  30
Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn Asn Asp Ser Ser Val Gly
35                  40                  45
Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu Ser Pro Glu Asp Leu Gly
50                  55                  60
Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr Val Tyr Glu Ala Ala Ala
65                  70                  75                  80
Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr Leu Gln Val Leu Val Asp
85                  90                  95
Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val Phe Lys His Ser Ser Leu
100                 105                 110
Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn Arg Gly Val Val Ser Met
115                 120                 125
Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala Gly Glu Tyr Leu Leu Phe
130                 135                 140
Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile Leu Phe Thr Val Ser Ile
145                 150                 155                 160
Arg Asn Thr Leu Leu Tyr Thr Leu Arg Arg Pro Tyr Phe Arg Lys Met
165                 170                 175
Glu Asn Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser Glu Ser Val Pro Glu Pro
180                 185                 190
Ile Val Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln Gly Glu Ser Cys Lys Glu
195                 200                 205
Glu Ser Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu Lys Val Leu His Glu Leu
210                 215                 220
Phe Gly Thr Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg Asn Glu Leu Gly Arg Glu
225                 230                 235                 240
Cys Thr Arg Leu Phe Thr Ile Asp Leu Asn Gln Thr Pro Gln Thr Thr
245                 250                 255
Leu Pro Gln Leu Phe Leu Lys Val Gly Glu Pro Leu Trp Ile Arg Cys
260                 265                 270
Lys Ala Val His Val Asn His Gly Phe Gly Leu Thr Trp Glu Leu Glu
275                 280                 285
Asn Lys Ala Leu Glu Glu Gly Asn Tyr Phe Glu Met Ser Thr Tyr Ser
290                 295                 300
Thr Asn Arg Thr Met Ile Arg Ile Leu Phe Ala Phe Val Ser Ser Val
305                 310                 315                 320
Ala Arg Asn Asp Thr Gly Tyr Tyr Thr Cys Ser Ser Ser Lys His Pro
325                 330                 335
Ser Gln Ser Ala Leu Val Thr Ile Val Glu Lys Gly Phe Ile Asn Ala
340                 345                 350
Thr Asn Ser Ser Glu Asp Tyr Glu Ile Asp Gln Tyr Glu Glu Phe Cys
355                 360                 365
Phe Ser Val Arg Phe Lys Ala Tyr Pro Gln Ile Arg Cys Thr Trp Thr
370                 375                 380
Phe Ser Arg Lys Ser Phe Pro Cys Glu Gln Lys Gly Leu Asp Asn Gly
385                 390                 395                 400
Tyr Ser Ile Ser Lys Phe Cys Asn His Lys His Gln Pro Gly Glu Tyr
405                 410                 415
Ile Phe His Ala Glu Asn Asp Asp Ala Gln Phe Thr Lys Met Phe Thr
420                 425                 430
Leu Asn Ile Arg Arg Lys Pro Gln Val Leu Ala Glu Ala Ser Ala Ser
435                 440                 445
Gln Ala Ser Cys Phe Ser Asp Gly Tyr Pro Leu Pro Ser Trp Thr Trp
450                 455                 460
Lys Lys Cys Ser Asp Lys Ser Pro Asn Cys Thr Glu Glu Ile Thr Glu
465                 470                 475                 480
Gly Val Trp Asn Arg Lys Ala Asn Arg Lys Val Phe Gly Gln Trp Val
485                 490                 495
Ser Ser Ser Thr Leu Asn Met Ser Glu Ala Ile Lys Gly Phe Leu Val
500                 505                 510
Lys Cys Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Thr Ser Cys Glu Thr Ile Leu
515                 520                 525
Leu Asn Ser Pro Gly Pro Phe Pro Phe Ile Gln Asp Asn Ile Ser Phe
530                 535                 540
Tyr Ala Thr Ile Gly Val Cys Leu Leu Phe Ile Val Val Leu Thr Leu
545                 550                 555                 560
Leu Ile Cys His Lys Tyr Lys Lys Gln Phe Arg Tyr Glu Ser Gln Leu
565                 570                 575
Gln Met Val Gln Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Glu Tyr Phe Tyr Val
580                 585                 590
Asp Phe Arg Glu Tyr Glu Tyr Asp Leu Lys Trp Glu Phe Pro Arg Glu
595                 600                 605
Asn Leu Glu Phe Gly Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val
610                 615                 620
Met Asn Ala Thr Ala Tyr Gly Ile Ser Lys Thr Gly Val Ser Ile Gln
625                 630                 635                 640
Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Lys Ala Asp Ser Ser Glu Arg Glu
645                 650                 655
Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Met Met Thr Gln Leu Gly Ser His Glu
660                 665                 670
Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Leu Ser Gly Pro Ile Tyr
675                 680                 685
Leu Ile Phe Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Tyr Leu Arg
690                 695                 700
Ser Lys Arg Glu Lys Phe His Arg Thr Trp Thr Glu Ile Phe Lys Glu
705                 710                 715                 720
His Asn Phe Ser Phe Tyr Pro Thr Phe Gln Ser His Pro Asn Ser Ser
725                 730                 735
Met Pro Gly Ser Arg Glu Val Gln Ile His Pro Asp Ser Asp Gln Ile
740                 745                 750
Ser Gly Leu His Gly Asn Ser Phe His Ser Glu Asp Glu Ile Glu Tyr
755                 760                 765
Glu Asn Gln Lys Arg Leu Glu Glu Glu Glu Asp Leu Asn Val Leu Thr
770                 775                 780
Phe Glu Asp Leu Leu Cys Phe Ala Tyr Gln Val Ala Lys Gly Met Glu
785                 790                 795                 800
Phe Leu Glu Phe Lys Ser Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn
805                 810                 815
Val Leu Val Thr His Gly Lys Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu
820                 825                 830
Ala Arg Asp Ile Met Ser Asp Ser Asn Tyr Val Val Arg Gly Asn Ala
835                 840                 845
Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Phe Glu Gly Ile
850                 855                 860
Tyr Thr Ile Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu
865                 870                 875                 880
Ile Phe Ser Leu Gly Val Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Val Asp Ala
885                 890                 895
Asn Phe Tyr Lys Leu Ile Gln Asn Gly Phe Lys Met Asp Gln Pro Phe
900                 905                 910
Tyr Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Ile Ile Met Gln Ser Cys Trp Ala Phe
915                 920                 925
Asp Ser Arg Lys Arg Pro Ser Phe Pro Asn Leu Thr Ser Phe Leu Gly
930                 935                 940
Cys Gln Leu Ala Asp Ala Glu Glu Ala Met Tyr Gln Asn Val Asp Gly
945                 950                 955                 960
Arg Val Ser Glu Cys Pro His Thr Tyr Gln Asn Arg Arg Pro Phe Ser
965                 970                 975
Arg Glu Met Asp Leu Gly Leu Leu Ser Pro Gln Ala Gln Val Glu Asp
980                 985                 990
Ser
<210>  2
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Пептидный субстрат FLT3
<400>  2
Ala Ala Ala Ala Glu Glu Glu Glu Tyr Phe Glu Leu Val Ala Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys
<210>  3
<211>  26
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер для мутации Y842C
<400>  3
catgagtgat tccaactgtg ttgtca                                           26
<210>  4
<211>  26
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер для мутации Y842C
<400>  4
tgacaacaca gttggaatca ctcatg                                           26
<210>  5
<211>  26
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер для мутации Y842H
<400>  5
catgagtgat tccaaccatg ttgtca                                           26
<210>  6
<211>  26
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер для мутации Y842H
<400>  6
tgacaacatg gttggaatca ctcatg                                           26
<210>  7
<211>  30
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер для мутации F691L
<400>  7
ccaatttact tgattttgga atactgttgc                                       30
<210>  8
<211>  30
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер для мутации F691L
<400>  8
gcaacagtat tccaaaatca agtaaattgg                                       30
<---