СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПРИОБРЕТЕННОГО СИНДРОМА УДЛИНЕННОГО ИНТЕРВАЛА QT С ПОМОЩЬЮ КОМПЛЕКСА ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ И АНТИМИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ
METHOD FOR MODELING ACQUIRED LONG QT INTERVAL SYNDROME USING COMPLEX OF ANTI-TUBERCULOSIS AND ANTIMICROBIAL DRUGS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к экспериментальной медицине и фармакологии и может быть использовано для изучения токсического действия лекарственных препаратов на проводящую систему сердца, в доклиническом исследовании новых кардиопротективных средств, изучения механизмов их действия и в разработке новых способов лечения.
Уровень техники
Экспериментальные модели токсического поражения сердца широко используются для изучения механизмов формирования патологических процессов в проводящей системе сердца, выяснения роли различных факторов внешней и внутренней среды в развитии приобретенного синдрома удлиненного интервала QT и желудочковых аритмий, дают возможность изыскать средства для рационального терапевтического вмешательства и профилактики.
Синдром приобретенного удлиненного интервала QT (СПУИ QT) на ЭКГ в отличие от врожденного, является проявлением токсического действия лекарственных препаратов, в том числе антимикробных, на проводящую систему сердца. СПУИ QT развивается по причине дисфункции ионных каналов кардиомиоцитов и замедления реполяризации желудочков, и может быть причиной развития смертельно опасных вентрикулярных аритмий, особенно пируэтной аритмии (torsade de pointes; TdP), выражающейся в удлинении интервала QTс от 40 до 100 мс и внезапной смертью больного. Чаще всего СПУИ QT возникают на фоне применения фторхинолонов, макролидов, противогрибковых и противотуберкулезных препаратов (ПТП) (Tisdale JE. Drug-induced QT interval prolongation and torsades de pointes: Role of the pharmacist in risk assessment, prevention and management. Can Pharm J (Ott). 2016 May; 149(3):139-52. doi: 10.1177/1715163516641136), большинство из которых используется для лечения туберкулеза.
Современная тенденция химиотерапии больных туберкулезом органов дыхания при наличии множественной или широкой лекарственной устойчивости возбудителя направлена на формирование краткосрочных, полностью пероральных режимов лечения, основанных на применении комбинаций наиболее эффективных препаратов: фторхинолонов (моксифлоксацин, левофлоксацин), бедаквилина, линезолида в сочетании с резервными и новыми (деламанид, клофазимин) ПТП и некоторыми антимикробными препаратами, и отказ от применения инъекционных препаратов (аминогликозидов и полипептидов) из-за их высокой токсичности (WHO consolidated guidelines on drug-resistant tuberculosis treatment ISBN 978-92-4-155052-9 © World Health Organization 2019).
Клинические проявления кардиотоксичности регистрировались при применении практически всех фторхинолонов (Briasoulis A., Agarwal V., Pierce W. J. QT prolongation and torsade de pointes induced by fluoroquinolones: infrequent side effects from commonly used medications. Cardiology, 2011, vol. 120, pp. 103–10). Механизм кардиотоксичности фторхинолонов обусловлен влиянием на специфический ген (HERG), обеспечивающий формирование калиевых каналов и беспрепятственное прохождение по ним ионизированного калия. Вследствие нарушения калиевых токов происходит удлинение интервала QT. Наибольшую активность в отношении калиевых токов в сердце имеет моксифлоксацин. Риск аритмического синдрома при применении моксифлоксацина существенно повышается при наличии следующих факторов: пожилой возраст, нарушение клиренса креатинина, диарея или интенсивная мочегонная терапия с утратой электролитов [Stahlmann R., Lode H. Fluoroquinolones in the elderly: safety considerations // Drugs. Aging. — 2003. — Vol. 20, No 4 — P. 289–302].
Увеличение интервала QT у пациентов, принимавших бедаквилин, обычно происходило в течение первых 8 недель [Fox G. J., Menzies D. A Review of the Evidence for Using Bedaquiline (TMC207) to Treat Multi-Drug Resistant Tuberculosis. //Infect Dis Ther (2013) 2:123–144]. В исследовании Guglielmetti L. et al., у 11% больных, получавщих Bdq, наблюдалось удлинение QTcF > 500 мс, а у 3 пациентов препарат был отменен [Guglielmetti L., Jaspard M., Le Dû D. et al. Long-term outcome and safety of prolonged bedaquiline treatment for multidrug-resistant tuberculosis. Eur Respir J, 2017, vol. 49, 1601799.). Однако не наблюдалось ни одного смертельного случая вследствие кардиотоксичности среди 1044 пациентов, пролеченных бедаквилином (Guglielmetti L., Tiberi S., Burman M., Kunst H.., Wejse C, Togonidze T. et al. QT prolongation and cardiac toxicity of new tuberculosis drugs in Europe: a Tuberculosis Network European Trialsgroup (TBnet) study. Eur Respir J., 2018, vol. 52, 1800537).
Клофазимин, аналогично моксифлоксацину и бедаквилину, может ингибировать специфические HERG- рецепторы калиевых каналов, причем даже в субтерапевтических концентрациях, и приводить к удлинению интервала QT (Abdelwahab MT, Court R, Everitt D, Diacon AH, Dawson R, Svensson EM, Maartens G, Denti P. Effect of Clofazimine Concentration on QT Prolongation in Patients Treated for Tuberculosis// Antimicrob Agents Chemother. 2021 Jun 17;65(7):e0268720). В исследованиях Diacon A. H. et alу пациентов, получавших монотерапию клофазимином, QT увеличился в среднем на 17 мс по сравнению с исходным уровнем, в при использовании комбинации клофазимина с бедаквилином - на 21 мс.[ Diacon A. H., Dawson R., Von Groote-Bidlingmaier F., Symons G., Venter A., Donald P. R. et al. Randomized dose-ranging study of the 14-day early bactericidal activity of bedaquiline (TMC207) in patients with sputum microscopy smear-positive pulmonary tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother., 2013, vol. 57, №5, pp. 2199–203].
Учитывая высокую частоту развития кардиальных проблем у больных туберкулезом (от 41 до 48%), актуальна профилактика кардиотоксичности с подбором эффективных препаратов и схем лечения на экспериментальных моделях.
Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому изобретению является cпособ моделирования токсического поражения сердца у крыс (RU2726926, 16.07.2020). Суть метода заключается в введении крысам, половозрелым самкам в возрасте 10-12 месяцев и массой более 330 г, комплекса препаратов с различными механизмами кардиотоксического действия, который обладает выраженным суммарным потенциалом кардиотоксичности. Комплексная схема представляет собой сочетание препаратов для перорального введения (моксифлоксацин + бедаквилин + линезолид + протионамид), и внутримышечного введения капреомицина в дозах, соответствующих терапевтическим дозам для человека. Кардиотоксичность проявлялась уменьшением частоты сердечных сокращений, появлением единичных экстрасистол, нарушением сердечного ритма, связанного с электрической проводимостью - увеличение интервалов QT и QRS на фоне снижения содержания калия и кальция.
Однако у данной модели имеются некоторые недостатки, обусловленные составом комплекса препаратов: наличие инъекционного препарата капреомицина существенно повышает общую токсичность, что проявляется снижением аппетита и прогрессирующим снижением массы тела крыс в отличие от крыс контрольной группы, в которой наблюдался физиологический прирост массы. Резкие изменения массы тела требуют коррекции дозировок препаратов и могут приводить к техническим погрешностям при введении лекарств. Также при более длительном, чем 14 дней, введении комплекса препаратов наблюдалась гибель животных на фоне усиления кардиотоксического эффекта, что может создать сложности при формировании групп по изучению лечебного эффекта патогенетических препаратов в качестве корректоров. Кроме этого, отказ от применения токсичного капреомицина в схемах лечения, является стратегической задачей современной химиотерапии туберкулеза с множественной и широкой лекарственной устойчивостью.
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа моделирования токсического поражения сердца с нарушением в проводящей системе, наиболее полно отражающий лекарственную токсическую этиологию и патогенез развития приобретенного синдрома удлиненного интервала QT посредством влияния на HERG- рецепторы калиевых каналов, в короткие сроки (до 2-х недель) и минимальной общей токсичностью для лабораторных животных.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка простого в исполнении способа моделирования приобретенного синдрома удлиненного интервала QT, отличающегося хорошей воспроизводимостью, отсутствием выраженной общей токсичности и отсутствием летального исхода у экспериментальных животных. Заявляемый способ позволяет в короткие сроки (до 2-х недель) и минимальной общей токсичностью для лабораторных животных (удовлетворительное состояние, пищевая и двигательная активность, прирост массы тела) создать модель токсического поражения сердца с нарушением в проводящей системе, наиболее полно отражающий лекарственную токсическую этиологию и патогенез развития приобретенного синдрома удлиненного интервала QT посредством влияния на HERG- рецепторы калиевых каналов.
Технический результат достигается способом моделирования приобретенного синдрома удлиненного интервалаQT у крыс, заключающийся в том, что токсическое поражение сердца у животных вызывают путем ежедневного в течение 2 недель введения комплекса препаратов - моксифлоксацина, бедаквилина, клофазимина, кларитромицина, при этом для моделирования использовали нелинейные самки крыс в возрасте 10-12 мес. и массой 300-330 г. Препараты моксифлоксацин, бедаквилин, клофазимин, кларитромицин вводят внутрижелудочно в 0,1% крахмальном геле в следующих дозах моксифлоксацин - 36 мг/кг, бедаквилин - 36 мг/кг, клофазимин – 27 мг/кг; кларитромицин – 45 мг/кг, которые не являются токсичными для крыс. При этом препараты вводят одновременно.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется следующими чертежами.
На фиг. 1 представлена кардиограмма крысы № 5 через 14 дней получения комплекса Mxf + Bdq + Cfz + Clr. На ЭКГ: увеличение интервалов QT, экстрасистолы.
На фиг. 2 представлена кардиограмма крысы №12 через 14 дней получения комплекса Mxf + Bdq + Cs+ Z. На ЭКГ: без отклонений от нормы.
Способ позволяет получить новую экспериментальную модель токсического поражения сердца с преимущественными нарушениями проводящей системы сердца, наиболее точно отражающую механизмы развития приобретенного синдрома удлиненного интервала QT и желудочковых аритмий, обусловленных ингибированием НERG –рецепторов.
Осуществление изобретения
Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25ºC.
Возможность реализации заявляемого изобретения показана, но не ограничена, в примерах конкретного выполнения.
Способ позволяет приблизить к клиническому течению данной патологии у больных лекарственно-устойчивым туберкулезом органов дыхания, нуждающихся в лечении комбинациями из противотуберкулезных и антимикробных препаратов в краткосрочных, полностью пероральных схемах, таких как фторхинолоны, (моксифлоксацин), линезолид, бедаквилин, клофазимин, и создать модель приобретенного синдрома удлиненного интервала QT в короткие сроки.
Кардиотоксичность проявляется следующим образом: достоверное удлинение интервала QT до 0,053±0,002 с по сравнению с фоновыми показателями (0,042±0,001с) (р=0.006) и индивидуальными отклонениями от исходного значения от 10 до 20 мс, качественными изменениями ЭКГ: нарушение сердечного ритма, связанного с электрической проводимостью в виде выпадения 3-го или 4-го комплекса QRSТ при наличии зубца Р (у одной крысы) и приподнятый выше изолинии интервал ST во II стандартном отведении и отведении AVF (у двух крыс).
Способ представляет собой введение лабораторному животному (крыса) комплекса препаратов, который обладает выраженным потенциалом кардиотоксичности. Комплексная схема представляет собой сочетание препаратов со сходными механизмами кардиотоксического действия, а именно, связанных с ингибированием НERG–рецепторов, в результате чего уменьшается перенос ионов калия по калиевым каналам, что на ЭКГ регистрируется в виде удлинения интервала QT. Одномоментно внутрижелудочно вводили моксифлоксацин, бедаквилин, клофазимин, кларитромицин (Mxf + Bdq + Cfz + Clr). Дозы препаратов соответствуют терапевтическим дозам для человека. Использование половозрелых крыс самок в возрасте 10-12 месяцев и массой более 330 г повышает развитие кардиотоксичности.
Перед введением комплекса препаратов крысам проводили функциональные исследования. На ЭКГ оценивали частоту сердечных сокращений (ЧСС), показатели временных интервалов сердечных сокращений (RR, PQ, QRS, QT).
Использовали 30 нелинейных самок крыс массой 300-330 г в возрасте 10-11 мес. Для создания модели животные были поровну распределены на 3 группы случайным образом. Первой группе животных вводили комплекс моксифлоксацин+ бедаквилин+ клофазимин+ кларитромицин (Mxf + Bdq + Cfz + Clr). т.е. из препаратов со сходным профилем токсичности; во 2 группе – комплекс моксифлоксацин+бедаквилин+ циклосерин + пиразинамид (Mxf + Bdq + Cs+ Z), т.е. из препаратов с разным профилем безопасности. Препараты вводили в течение 14 дней внутрижелудочно в 0,1% крахмальном геле, в следующих дозах: моксифлоксацин-36 мг/кг; бедаквилин -36 мг/кг; клофазимин – 27 мг/кг; кларитромицин – 45 мг/кг; циклосерин - 90 мг/кг; пиразинамид- 225 мг/кг. Дозы препаратов соответствовали терапевтическим дозам для человека.
Контрольной группе в это же время вводили ежедневно перорально 0,1 % раствор крахмального клейстера в объеме 2,0 мл (соответствующем объему вводимых комплексов в опытных группах). Комплексы препаратов готовили ex tempore следующим образом: таблетку каждого препарата тщательно растирали в фарфоровых ступках и добавляли необходимый объем 0,1% крахмального геля с тем, чтобы нужное количество препарата содержалось в 0,5 мл крахмальной взвеси. Непосредственно перед введением все препараты набирали в один шприц и одномоментно в общем объеме 2 мл вводили в желудок крысе. Через 14дней всех крыс выводили из эксперимента, предварительно проведя все необходимые тесты.
Критериями оценки токсичности являлись: динамика массы тела, клиническая картина интоксикации, данные ЭКГ, результаты биохимических исследований и патоморфологических исследований.
Результаты исследования.
Животные всех групп в течение всего периода исследования (14 дней ежедневных введений) удовлетворительно переносили манипуляции, гибели животных не было, отрицательного влияния на динамику массы тела не наблюдали (таблица 1).
Таблица 1 - масса тела крыс опытных и контрольной групп до (исходная) и через 14 дней ежедневного применения препаратов (абсолютный вес).
Группа
Количество крыс
препараты
Масса тела (г) на сутки опыта
Исходная (0)
14
1
10
Mxf + Bdq + Cfz + Clr
297 ± 17
327 ± 26
2
10
Mxf + Bdq + Cs+ Z
293 ± 20
311 ± 21
3
10
крахмальная взвесь
318 ± 14
347 ± 17
Для определения показателей электрической активности сердца у крыс регистрировали показатели ЭКГ на электрокардиографе SHILLER AT-1 (Швейцария) при скорости протяжки ленты 50 мм/сек в I, II и III стандартных отведениях и в усиленных однополюсных отведениях от конечностей в aVL aVR и aVF. Оценивали частоту сердечных сокращений (ЧСС), показатели временных интервалов сердечных сокращений (RR, PQ, QRS, QT).
На ЭКГ частота сердечных сокращений, интервалы PQ и QRS существенно не изменились по сравнению с исходными показателями у крыс всех групп (таблица1). Достоверное удлинение интервала QT до 0,053±0,002 с по сравнению с исходными показателями 0,042±0,001с (р= 0,006) наблюдали только в 1 группе крыс. Причем у 3 из 10 крыс индивидуальные отклонения от исходного значения составили 20 мс. Также у них выявлены качественные изменения ЭКГ-нарушение сердечного ритма, связанного с электрической проводимостью: выпадение 3-го или 4-го комплекса QRSТ при наличии зубца Р (у двух крыс) и приподнятый выше изолинии интервал ST во II стандартном отведении и отведении AVF (у одной крысы).
Удлинение интервала QT на ЭКГ у крыс 2 группы не было достоверным по сравнению с исходными данными (0,043±0,005 против 0,041±0,001; р=0,34), а индивидуальные отклонения интервала QT наблюдались у единичных крыс до 10 мс.
Таблица 2 - Показатели ЭКГ крыс-самок опытных групп после перорального ежедневного введения комплексов препаратов по сравнению с контролем
Группы
ЧСС (удар/мин)
RR (cек)
PQ (cек)
QT (cек)
QRS (cек)
1
320,6±15,3
0,19±0,01
0,07±0,005
0,053±0,002
0,026±0,003
2
325,2±16,1
0,19±0,009
0,068±0,003
0,043±0,005
0,023±0,002
Контроль
324,7±18,4
0,17±0,004
0,069±0,003
0,043±0,001
0,022±0,001
+
+
+
+
+
+
+
+
+
По результатам биохимических исследований крови выявлено значительное увеличение активности АСТ у крыс 1 группы (246.931.3) по сравнению с контролем (104,114,95) и с данными 2 группы (110.74.3). Содержание калия (4.430.11) и кальция (2.180.03) в сыворотке крови крыс 1 группы не отличалось от контроля (4,370,26 и 2.10,02 соответственно), а у крыс 2 группы наблюдалось снижение калия (3.790.05) и повышение кальция (2.30.02).
При патоморфологическом исследовании относительная масса сердца у крыс опытных групп была практически одинаковой, от 0,33 до 0,37.
При гистологическом исследовании признаки токсического поражения сердца были минимальными в виде слабо выраженного отека стромы и /или слабо выраженного венозного полнокровия у единичных животных из 2 группы и у половины животных 1 группы.
Выводы: введение в течение 14 дней старым самкам крыс комплекса препаратов (Mxf + Bdq + Cfz + Clr), обладающих кардиотоксическим потенциалом и общим механизмом действия, привело к развитию кардиотоксического эффекта, который на ЭКГ проявился значительным удлинением интервала QT как по сравнению с исходными показателями, так и по сравнению с контрольной группой, не получавшей препаратов,  с индивидуальными отклонениями от исходного значения до 20 мс; нарушением сердечного ритма, связанного с электрической проводимостью в виде выпадения 3-го или 4-го комплекса QRSТ при наличии зубца Р или  приподнятого выше изолинии интервала ST во II стандартном отведении и отведении AVF. Также отмечалось повышение в 2 раза активности фермента АСТ. Дисбаланса содержания калия и кальция не наблюдалось.
Введение в те же сроки другого комплекса препаратов с разным профилем безопасности (Mxf + Bdq + Cs+ Z), не сопровождалось развитием кардиотоксичности.
Таким образом, проведенные исследования позволили получить новую экспериментальную модель изолированного токсического поражения сердца без выраженных органических поражений тканей сердца, в основе которой лежит сочетание кардиотоксичных потенциалов фторхинолонов, бедаквилина, клофазимина и кларитромицина, сходного механизма действия их на проводящую систему сердца, и поло-возрастных факторов, приводящих к развитию синдрома удлиненного интервала QT. Предложенная модель проста в исполнении, отличается хорошей воспроизводимостью, возможностью использования нелинейных животных (крыс), отсутствием выраженной общей токсичности и летального исхода у экспериментальных животных, и коротким периодом развития патологического состояния.