НЕГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОБОЛОЧЕЧНЫХ ВИРУСОВ
NON-GENETIC MODIFICATION OF ENVELOPED VIRUSES

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к модифицированному оболочечному вирусу, где указанный вирус имеет по меньшей мере один противоопухолевый, опухолеспецифический пептид, негенетически присоединенный к вирусной оболочке или введенный в/через вирусную оболочку; к фармацевтической композиции, содержащей его; и к методу лечения рака с его использованием.
Предшествующий уровень техники
Недавнее одобрение антител, нацеленных на молекулы иммунных контрольных точек, такие как PD-1 (белок запрограммированной клеточной смерти 1), PD-L1 (лиганд белка запрограммированной клеточной смерти 1) и CTLA-4 (антиген цитотоксических Т-лимфоцитов 4 типа), функцией которых является прерывание систем отрицательной обратной связи в микроокружении опухоли для усиления уже имеющихся противоопухолевых иммунных ответов, было встречено с огромным энтузиазмом клиницистов. Применение этих антител-ингибиторов иммунных контрольных точек может вызвать длительные ответы у 10-20% раковых пациентов. Однако, остальные 80-90% пациентов не реагируют на них из-за отсутствия противоопухолевых иммунных ответов или других иммуносупрессивных аспектов микроокружения опухоли. Для расширения популяции пациентов, реагирующих на терапию ингибиторами контрольных точек, авторы изобретения разработали платформу векторов на основе оболочечных вирусов, называемую PeptiENV, для усиления или создания широкого противоопухолевого иммунитета и привлечения опухолеспецифических Т-эффекторных клеток в микроокружение опухоли.
Предпочтительно, путем лечения пациентов комбинацией иммуностимулирующих вирусов PeptiENV и антител, подавляющих иммунные контрольные точки, авторы изобретения планируют увеличить количество пациентов, отвечающих на терапию ингибиторами иммунных контрольных точек.
В данной патентной заявке описана платформа PeptiENV, которая включает новый способ нанесения на поверхность и встраивания иммуномодулирующих пептидов на вирусную оболочку, которая затем может быть легко перекрестно представлена на антигенпредставляющих клетках. В настоящее время не существует способов негенетического присоединения пептидов к вирусной оболочке с целью активации иммунной системы. В WO 2005/060541 описаны антивирусные пептиды, которые введены в вирусную оболочку с целью разрушения вирусной мембраны и уничтожения вируса.
У некоторых вирусов есть вирусные оболочки, покрывающие их защитные белковые капсиды. Оболочки обычно происходят из частей мембран клетки-хозяина (фосфолипидов и белков), но включают некоторые вирусные гликопротеины. Они могут помочь вирусам избежать иммунной системы хозяина. Гликопротеины на поверхности оболочки служат для идентификации и связывания с рецепторными сайтами на мембране хозяина. Затем вирусная оболочка сливается с мембраной хозяина, позволяя капсиду и вирусному геному проникать в и инфицировать хозяина. В дополнение к проникновению в клетку-хозяина через слияние мембран вируса и клетки-хозяина, некоторые вирусы альтернативно могут использовать эндоцитоз в качестве механизма проникновения.
По существу, авторы изобретения нашли новый способ повышения противоопухолевого иммунитета за счет противовирусного иммунитета с использованием терапевтических и клинически одобренных вирусов.
Изложение сущности изобретения
Согласно первому аспекту предложен модифицированный оболочечный вирус, выбранный из группы, содержащей вирус простого герпеса 1 (HSV-1), вирус простого герпеса 2 (HSV-2), вирус осповакцины, вирус везикулярного стоматита (лихорадки Индианы) (VSV), вирус кори (MeV), вирус Мараба и вирус болезни Ньюкасла (NDV), где указанный вирус имеет по меньшей мере один противоопухолевый, опухолеспецифический пептид, негенетически присоединенный к вирусной оболочке или введенный в/через вирусную оболочку.
Ссылка в данном описании изобретения на модифицированный оболочечный вирус относится к вирусу, который негенетически модифицирован так, чтобы содержать указанный по меньшей мере один противоопухолевый опухолеспецифический пептид в его вирусной оболочке. Во избежание неоднозначности, указанный вирус может включать или не включать какую(ие)-либо другую(ие) генетическую(те) модификацию(и), которые делают его пригодным для этой цели, но присоединение указанного по меньшей мере одного противоопухолевого, опухолеспецифического пептида к вирусной оболочке или через нее осуществлено негенетически.
Специалистам в данной области понятно, что некоторые вирусы имеют вирусные оболочки, покрывающие их защитные белковые капсиды. Оболочки обычно происходят из частей мембран клеток-хозяев (фосфолипидов и белков), но включают некоторые вирусные гликопротеины. Они могут помочь вирусам избежать иммунной системы хозяина. Гликопротеины на поверхности оболочки служат для идентификации и связывания с рецепторными сайтами на мембране хозяина. Во время инфекции вирусная оболочка сливается с мембраной хозяина, позволяя капсиду и вирусному геному проникать в хозяина и инфицировать его. Таким образом, пептиды, присоединенные к, введенные в, или проходящие через вирусную оболочку, можно использовать в качестве антигенов для инициации иммунного ответа.
Ссылка в данном описании изобретения на противоопухолевый пептид относится к пептиду, который может вызывать иммунный ответ против опухоли.
Ссылка в данном описании изобретения на опухолеспецифический пептид относится к пептиду, который может вызывать иммунный ответ против конкретной(ых) одной или более опухоли(ей).
В предпочтительном воплощении указанный пептид является идентифицированный у пациента или специфичным для пациента.
Специалистам в данной области очевидно, что точная природа пептида может варьироваться в зависимости от природы опухоли, подлежащей лечению, в действительности специфика технологии подразумевает, что разные противоопухолевые, опухолеспецифические пептиды будут использованы для лечения субъектов с разными типами рака и даже разные противоопухолевые, опухолеспецифические пептиды можно использовать для лечения субъектов с одним и тем же типом рака.
В еще одном воплощении изобретения указанный пептид имеет длину от 8 до 50 аминокислот, в идеальном случае длину от 15 до 35 аминокислот. В наиболее идеальном случае указанный пептид имеет длину, выбранную из группы, включающей:
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,
34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 и 50 аминокислот.
В наиболее идеальном случае множество указанных пептидов присоединено к или встроено в/через вирусную оболочку. Эти пептиды могут быть идентичными или представлять один и тот же антиген с лишь незначительной модификацией, то есть иметь более 90% идентичность последовательности друг с другом и в наиболее идеальном случае более чем 92%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности последовательности друг с другом. Альтернативно, ряд разных противоопухолевых, опухолеспецифических пептидов негенетически присоединен или введен в/через вирусную оболочку.
Более предпочтительно, указанный пептид также содержит по меньшей мере один сайт расщепления, например, но без ограничения ими, сайт расщепления катепсином или сайт расщепления фурином. Еще более предпочтительно, указанный пептид содержит по меньшей мере один сайт процессинга иммунопротеосомы. Примеры этих сайтов и их расположение относительно структуры конъюгированного пептида показаны на Фиг. 7. В идеальном случае один противоопухолевый, опухолеспецифический пептид расположен между парой сайтов обработки иммунопротеасомами, и выше него находится по меньшей мере один сайт расщепления, в идеальном случае сайт расщепления фурином, за которым следует (еще выше) сайт расщепления катепсином.
Преимуществом является обнаруженный авторами изобретения факт, что эти пептиды, будучи присоединенными или введенными в/через выбранные оболочечные вирусы (HSV-1 и -2, вирус осповакцины, VSV, MeV, вирус Мараба и NDV) могут вызывать усиленные опухолеспецифические иммунные ответы и в значительной степени повышать противоопухолевую эффективность путем преобразования противовирусного иммунитета в противоопухолевый иммунитет.
Элегантность этой платформы по сравнению с другими заключается в том, что путем прикрепления или введения негенетическим образом идентифицированных у пациента индуцирующих противоопухолевый ответ, опухолеспецифических пептидов к/в/через вирусную оболочку, можно клинически использовать одобренный с медицинской точки зрения вирус. Это означает, что можно очень быстро реагировать на изменения опухолевых антигенов пациента, которые презентируются на MHC-I, просто покрывая вирус новым набором опухолеспецифических пептидов, полученных от указанного пациента.
Еще одна важная особенность изобретения заключается в том, что вирус, выбранный для этой платформы, должен пройти строгие этапы контроля качества и одобрения только один раз, что экономит время и деньги по сравнению с другими платформами, где вирусы, имеющие генетически введенные модификации, должны проходить этапы проверки каждый раз, когда вводят новую модификацию или пептид, что делает практически невозможным использование этих платформ в персонализированной медицине.
В дополнительном предпочтительном воплощении изобретения указанный(е) пептид(ы) присоединен(ы) или введен(ы) в/через указанную вирусную оболочку с использованием либо пептида, проникающего в клетку, либо пептида, конъюгированного с холестерином (приобретенного в PepScan или Ontores).
Как известно специалистам в данной области техники, проникающие в клетку пептиды (CPP) представляют собой короткие пептиды, которые облегчают клеточное введение/поглощение различных молекулярных агентов (от частиц наноразмера до небольших химических молекул и больших фрагментов ДНК). Этот "груз" ассоциирован с пептидами либо посредством химического связывания ковалентными связями, либо посредством нековалентных взаимодействий. Функция CPP заключается в доставке груза в клетки, процессе, который обычно происходит через эндоцитоз.
CPP, как правило, имеют аминокислотный состав, который либо содержит большое относительное количество положительно заряженных аминокислот, таких как лизин или аргинин, либо имеет последовательности, которые содержат чередующийся набор полярных/заряженных аминокислот и неполярных гидрофобных аминокислот. Эти два типа структур называются поликатионными или амфипатическими соответственно. Третий класс CPP представляет собой гидрофобные пептиды, содержащие только неполярные остатки, с низким суммарным зарядом, или имеющие гидрофобные аминокислотные группы, которые имеют решающее значение для клеточного поглощения.
Изобретение предусматривает использование любого известного CCP, связанного с указанным противоопухолевым, опухолеспецифическим пептидом.
Не желая быть связанными объяснением механизма действия, авторы считают, что хотя CPP обычно доставляет свой груз через липидный бислой, пептид, состоящий из последовательности CPP вместе с иммуногенным пептидом по изобретению, частично проходит через липидный бислой, в то время как часть его, по-видимому, прилипает, возможно посредством физических гидрофобных/гидрофильных взаимодействий, на мембране в достаточной степени для целей изобретения, или даже всецело.
Пример CPP, конъюгированного с указанным пептидом, показан на Фиг. 7B.
Специалистам в данной области техники также известно, что конъюгированные с холестерином пептиды являются короткими пептидами, присоединенными к холестерину. Авторы изобретения обнаружили, что они могут проникать в вирусную оболочку и таким образом закреплять конъюгированный пептид в вирусной оболочке. Эти пептиды могут быть конъюгированы с холестерином по N- или C-концу.
Опять, не желая быть связанными объяснением механизма действия, авторы изобретения считают, что, поскольку холестерин является компонентом липидной мембраны, конъюгированные с холестерином пептиды находят свое “нормальное” расположение в мембране. Фактически авторы изобретения предполагают, что гидроксигруппа холестерина взаимодействует с полярными концевыми группами мембранных фосфолипидов и сфинголипидов, в то время как объемный стероид и углеводородная цепь встроены в мембрану, наряду с неполярной жирнокислотной цепью других липидов.
Пример конъюгированного с холестерином пептида показан на Фиг. 7А.
В предпочтительном воплощении изобретения пептид для присоединения или встраивания в/через указанную оболочку содержит:
GRKKRRQRRRPQ (SEQ ID NO: 1) последовательность CPP на N- или C-конце указанного противоопухолевого, опухолеспецифического пептида;
RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 2) последовательность CPP на N- или C-
конце указанного противоопухолевого, опухолеспецифического пептида;
KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 3) последовательность CPP на N- или
C-конце указанного противоопухолевого, опухолеспецифического пептида; RRRRRRRRR (SEQ ID NO: 4) последовательность CPP на N- или C-конце
указанного противоопухолевого, опухолеспецифического пептида; KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 5) последовательность CPP на
N- или C-конце указанного противоопухолевого, опухолеспецифического пептида; AGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 6) последовательность CPP на N-
или C-конце указанного противоопухолевого, опухолеспецифического пептида; AGLWRALWRLLRSLWRLLWRA (SEQ ID NO: 7) последовательность CPP на
N- или C-конце указанного противоопухолевого, опухолеспецифического пептида; или холестериновую группировку на N- или C-конце указанного
противоопухолевого, опухолеспецифического пептида.
В еще одном предпочтительном воплощении изобретения пептид для присоединения к или встраивания в/через указанную оболочку, содержит одну из следующих последовательностей, где последовательность SIINFEKL является просто представителем MHC-I рестриктированный эпитоп или пептид:
CPP пептиды:
GRKKRRQRRRPQRVRRALISLEQLESIINFEKLTEW (SEQ ID NO: 8)
RQIKIWFQNRRMKWKKRWEKISIINFEKLYKLK (SEQ ID NO: 9)
KLALKLALKALKAALKLARWEKISIINFEKLYKLK (SEQ ID NO: 10)
RRRRRRRRRRWEKISIINFEKLYKLK (SEQ ID NO: 11)
RWEKISIINFEKLYKLRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 12)
RWEKISIINFEKLYKLKETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 13)
RWEKISIINFEKLYKLAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 14)
AGLWRALWRLLRSLWRLLWRA RWEKISIINFEKLYKLK (SEQ ID NO: 15)
GRKKRRQRRRPQRWEKISIINFEKLYKL (SEQ ID NO: 16)
GRKKRRQRRRPQRWEKISIINFEKL (SEQ ID NO: 17)
GRKKRRQRRRPQRWEKISIINFEKLYKLRWEKISIINFEKL (SEQ ID NO: 18) (где RWEKI и YKLRWEKI представляют собой сайты иммунопротеосомного процессинга). Конъюгированные с холестерином пептиды:
LEQLESIINFEKLTEWRVRRALISC-холестерин (SEQ ID NO: 19)
холестерин-CRVRRALISLEQLESIINFEKLTEW (SEQ ID NO: 20)
холестерин-CSIINFEKL (SEQ ID NO: 21)
холестерин-CRWEKISIINFEKL (SEQ ID NO: 22) или
холестерин-CRWEKISVYDFFVWLYKLRWEKISIINFEKL (SEQ ID NO: 23)
Соответственно, наиболее предпочтительно, указанный(е) противоопухолевый(е), опухолеспецифический(е) пептид(ы) присоединен(ы) к или введен в/через указанную вирусную оболочку с использованием либо пептида, проникающего в клетку, либо пептида, конъюгированного с холестерином.
Как правило, вирусные частицы образуют комплекс с указанным СРР-пептидом или холестерин-конъюгированным пептидом при инкубации их в течение примерно
15 мин при 37°С.
В еще одном предпочтительном воплощении предложен указанный модифицированный оболочечный вирус по меньшей мере с одним противоопухолевым, опухолеспецифическим пептидом, который является MHC-I-специфичным и, таким образом, в идеальном случае вызывает иммунный ответ путем MHC-I-презентации на антигенпредставляющих клетках (APC) для активации эффекторных T-клеток,
+
называемых CD8 T-клетками, в частности цитотоксических T-лимфоцитов (CTL).
+
Дополнительно или альтернативно, предложен указанный модифицированный оболочечный вирус по меньшей мере с одним противоопухолевым, опухолеспецифическим пептидом, который является MHC-II-специфичным и, таким образом, в идеальном случае вызывает иммунный ответ посредством MHC-II- презентации на антигенпредставляющих клетках (APC) для активации CD4 (T- хелперного) клеточного ответа.
Соответственно, данное изобретение также позволяет использовать разные эпитопы MHC-II, нанесенные на вирусную оболочку, для усиления, отдельно или в сочетании с эпитопами MHC-I, иммунного ответа субъекта.
Дополнительно или в качестве альтернативы, изобретение также позволяет использовать пептид(ы), который(е) содержит(ат) слитую молекулу, включающую множество разных антигенов.
Еще более предпочтительно, предлагается комбинация разных модифицированных таким образом оболочечных вирусов, где указанные вирусы выбраны из группы, включающей: вирус простого герпеса 1 (HSV-1), вирус простого герпеса 2 (HSV-2), вирус осповакцины, вирус везикулярного стоматита (лихорадки Индианы) (VSV), вирус кори (MeV), вирус Мараба и вирус болезни Hьюкасла (NDV). Таким образом, изобретение касается применения по меньшей мере любых двух вышеуказанных вирусов, а также распространяется на применение комбинации любых 3, 4, 5, 6 или 7 вышеуказанных вирусов.
Соответственно, изобретение относится к использованию двух разных типов вирусов или вирусных каркасов, позволяющих использовать способ "прайм-буст" иммуновиротерапии, когда после лечения "прайм" (праймирующим) вирусом определенного вида/рода, покрытого указанными пептидами, следует лечение "буст" (бустерным) вирусом другого конкретного вида/рода (иммунологически отличным вирусом), покрытым теми же указанными пептидами. Метод "прайм-буст" иммуновиротерапии может дополнительно значительно увеличивать опухолеспецифические Т-клеточные иммунные ответы, направляя большинство иммунных ответов, созданных "прайм-буст" методом, на указанные пептиды.
При использовании изобретения оболочечный вирус, модифицированный, как описано здесь, можно использовать в "прайм-буст" иммуновиротерапии в комбинации с другим оболочечным вирусом, модифицированным, как описано здесь, но презентирующим те же самые пептиды, или любым другим вирусом, таким как аденовирус, который также был модифицирован, генетически или негенетически, чтобы презентировать те же самые пептиды.
Специалистам в данной области понятно, что, поскольку оболочечный вирус, а именно вирус простого герпеса 1 (HSV-1), является наиболее изученным онколитическим оболочечным вирусом, и сконструированная форма HSV-1, называемая T-VEC (Imlygic), является первым онколитическим вирусом, демонстрирующим эффективность в фазе III клинических испытаний и является первым онколитическим вирусом, одобренным и FDA (Управление по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США), и EMEA (Европейское агентство лекарственных средств) для лечения неоперабельной меланомы, крайне важно вводить новые способы повышения противоопухолевого иммунитета за счет противовирусного иммунитета этих терапевтических и клинически одобренных вирусов.
В соответствии со вторым аспектом изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая:
1) модифицированный оболочечный вирус, выбранный из группы, включающей вирус простого герпеса 1 (HSV-1), вирус простого герпеса 2 (HSV-2), вирус осповакцины, вирус везикулярного стоматита (лихорадки Индианы) (VSV), вирус кори (MeV), вирус Мараба и вирус болезни Hьюкасла (NDV), где указанный вирус имеет по меньшей мере один противоопухолевый, опухолеспецифический пептид, негенетически присоединенный к вирусной оболочке или введенный в/через вирусную оболочку; а также
2) подходящий носитель.
В соответствии с третьим аспектом изобретения предложен способ лечения рака, включающий воздействие на субъекта модифицированным оболочечным вирусом, выбранным из группы, включающей вирус простого герпеса 1 (HSV-1), вирус простого герпеса 2 (HSV-2), вирус осповакцины, вирус везикулярного стоматита (лихорадки Индианы) (VSV), вирус кори (MeV), вирус Мараба и вирус болезни Hьюкасла (NDV), где указанный вирус имеет по меньшей мере один противоопухолевый, опухолеспецифический пептид, негенетически присоединенный к вирусной оболочке или введенный в/через вирусную оболочку.
Еще более предпочтительно, указанный способ включает, после выбранного периода, воздействие на указанного субъекта другого модифицированного оболочечного вируса, выбранного из группы, содержащей: вирус простого герпеса 1 (HSV-1), вирус простого герпеса 2 (HSV-2), вирус осповакцины, вирус везикулярного стоматита (лихорадки Индианы) (VSV), вирус кори (MeV), вирус Мараба и вирус болезни Ньюкасла (NDV), где указанный вирус имеет по меньшей мере один противоопухолевый, опухолеспецифический пептид, негенетически присоединенный к вирусной оболочке или введенный в/через вирусную оболочку и, кроме того, где указанный вирус отличается от вируса, который использовали для предварительного воздействия. Альтернативно, в "прайм-буст" иммуновиротерапии указанный способ включает, после выбранного периода, воздействие на указанного субъекта любого другого вируса, такого как аденовирус, который также был модифицирован, в том числе генетически или негенетически, для презентации тех же пептидов. В качестве альтернативы, еще раз, указанный способ может быть осуществлен на практике путем использования сначала любого вируса, который был модифицирован любым образом, включая генетический или негенетический, для экспрессии выбранных пептидов, с последующим использованием модифицированного вируса по изобретению, имеющего такие же пептиды, для обеспечения бустерной терапии.
Таким образом можно применять на практике "прайм-буст" иммуновиротерапию.
В идеальном случае указанная стадия воздействия вируса на субъекта включает внутриопухолевую, внутриузловую, внутрибрюшинную или внутривенную инъекцию.
Наиболее предпочтительно рак, упоминаемый здесь, включает одно или более из следующих раковых заболеваний: рак носоглотки, синовиальный рак, гепатоцеллюлярный рак, рак почки, рак соединительной ткани, меланому, рак легкого, рак кишечника, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, рак головного мозга, рак горла, рак полости рта, рак печени, рак коси, рак поджелудочной железы, хориокарциному, гастриному, феохромоцитому, пролактиному, Т-клеточный лейкоз/лимфому, неврому, болезнь Гиппеля-Линдау, синдром Золлингера-Эллисона, рак надпочечников, рак анального канала, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, рак мочеточника, рак головного мозга, олигодендроглиому, нейробластому, менингиому, опухоль спинного мозга, рак кости, остеохондрому, хондросаркому, саркому Юинга, рак неизвестной первичной локализации, карциноидную опухоль, карциноид желудочно-кишечного тракта, фибросаркому, рак молочной железы, болезнь Педжета, рак шейки матки, колоректальный рак, рак прямой кишки, рак пищевода, рак желчного пузыря, рак головы, рак глаз, рак шеи, рак почки, опухоль Вильмса, рак печени, саркому Капоши, рак простаты, рак легкого, рак яичка, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак ротовой полости, рак кожи, мезотелиому, множественную миелому, рак яичников, эндокринный рак поджелудочной железы, глюкагоному, рак поджелудочной железы, рак паращитовидной железы, рак полового члена, рак гипофиза, саркому мягких тканей, ретинобластому, рак тонкой кишки, рак желудка, рак тимуса, рак щитовидной железы, трофобластический рак, хорионаденому, рак матки, рак эндометрия, рак влагалища, рак вульвы, нейрому слухового нерва, грибовидный микоз, инсулиному, карциноидный синдром, соматостатиному, рак десен, рак сердца, рак губ, рак мозговых оболочек, рак рта, рак нерва, рак неба, рак околоушной железы, рак брюшины, рак глотки, рак плевры, рак слюнной железы, рак языка и рак миндалин.
В еще одном воплощении изобретения, либо после воздействия на субъекта модифицированным вирусом, который экспрессирует по меньшей мере один противоопухолевый, опухолеспецифический пептид или после воздействия на указанного субъекта оболочечным вирусом, выбранным из группы, содержащий вирус простого герпеса 1 (HSV-1), вирус простого герпеса 2 (HSV-2), вирус осповакцины, вирус везикулярного стоматита(VSV), вирус кори (MeV), вирус Мараба и вирус болезни Hьюкасла (NDV), где указанный вирус имеет такой же или большую часть того(тех) же самого(ых) указанного(ых) пептида(ов), негенетически присоединенного(ых) к вирусной оболочке или введенного(ых) в/через вирусную оболочку, подвергая указанного субъекта воздействию ингибитора контрольной точки. Ингибитор контрольной точки ингибирует иммунные молекулы контрольной точки, такие как PD-1, PD-L1 и CTLA-4.
В прилагаемой формуле изобретения и в предшествующем описании изобретения, за исключением случаев, когда контекст требует иного из-за сформулированного выражения или необходимо подразумеваемого значения, слово “содержать” или его варианты, такие как “содержит” или “содержащий”, используют в инклюзивном смысле, т.е. описывают наличие указанных признаков, но не исключают наличия или добавления дополнительных признаков в различных воплощениях изобретения.
Все ссылки, в том числе любые патенты или патентные заявки, указанные в данном описании изобретения, включены в него посредством ссылки. Не допускается, чтобы какая-либо ссылка представляла собой предшествующий уровень техники. Кроме того, не допускается, чтобы какой-либо документ из уровня техники являлся частью общих знаний в данной области.
Предпочтительные признаки каждого аспекта изобретения могут быть такими,
как описанные в отношении любых других аспектов.
Другие признаки настоящего изобретения станут очевидными из следующих ниже примеров. Вообще говоря, изобретение распространяется на любой новый признак, или на любую новую комбинацию признаков, раскрытых в этом описании (включая прилагаемую формулу изобретения и фигуры). Таким образом, признаки, целые числа, характеристики, соединения или химические группировки, описанные в связи с конкретным аспектом, воплощением или примером изобретения, следует понимать как применимые к любому другому аспекту, воплощению или примеру, описанному в данном описании, если они не являются несовместимыми с ними.
Кроме того, если не указано иное, любой признак, раскрытый в данном документе, может быть заменен альтернативным признаком, служащим той же или аналогичной цели.
Во всем описании изобретения и формуле изобретения единственное число включает множественное число, если контекст не требует иного. В частности, когда используется неопределенный артикль, описание следует понимать как предполагающее множественность, а также единственность, если контекст не требует иного.
Воплощение настоящего изобретения ниже будет описано посредством примера со ссылкой на следующее, где:
На Фиг. 1 представлено краткое изложение данных, полученных, когда противоопухолевый, опухолеспецифический пептид прикреплен к разным вирусным оболочкам с использованием либо CPP, либо конъюгированного с холестерином пептида;
На Фиг. 2 показано, что CPP-содержащие пептиды могут быть присоединены к оболочке вируса простого герпеса 1. CPP-содержащий и FITC-меченый пептид образовывали комплекс с HSV-1 и для обнаружения комплексов использовали сэндвич- вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Антитело против HSV-1 наносили на дно 96-луночного планшета и комплексы PeptiENV инкубировали в лунках. После отмывки несвязанной фракции анти-FITC-HRP-конъюгированное антитело использовали для обнаружения комплекса PeptiENV. На нижней панели Фиг. 2 показано, что CPP-содержащие пептиды имеют уменьшенное время диффузии в комплексе с HSV-1. Флуоресцентную корреляционную спектроскопию использовали для анализа кинетики диффузии пептидов в комплексе с HSV-1.
На Фиг. 3 на верхней панели показано, что холестерин-содержащие пептиды могут быть присоединены к оболочке вируса осповакцины. Холестерин-содержащие и FITC-меченые пептиды образовывали комплекс с вирусом осповакцины. После очистки комплексов PeptiENV с помощью 36% сахарозной подушки и ультрацентрифугирования, очищенные комплексы анализировали посредством проточной цитометрии. A. Вирус осповакцины без комплекса с пептидами и B. Вирус осповакцины в комплексе с холестерин-содержащими FITC-мечеными пептидами. На Фиг. 3, средняя панель, показано, что холестерин-содержащие пептиды могут быть прикреплены к оболочке вируса осповакцины. Холестерин-содержащие и FITC- меченые пептиды образовывали комплекс с вирусом осповакцины, и для обнаружения комплексов использовали сэндвич-вариант ELISA. Антитело против вируса осповакцины наносили на дно 96-луночного планшета, и комплексы PeptiENV инкубировали в лунках. После отмывки несвязанной фракции анти-FITC-HRP- конъюгированное антитело использовали для обнаружения комплексов PeptiENV. На Фиг. 3, нижняя панель, показано, что холестерин-содержащие SIINFEKL-пептиды легко презентируются дендритными клетками. В мышиные спленоциты вводили холестерин-содержащие SIINFEKL-пептиды и презентацию MHC-I эпитопа SIINFEKL с помощью CD11 c положительной DC-популяцией определяли посредством проточной цитометрии.
На Фиг. 4, верхняя панель, показано, что CPP-содержащие пептиды могут быть присоединены к оболочке вируса осповакцины. СРР-содержащие и FITC-меченые пептиды образовывали комплекс с вирусом осповакцины. После очистки комплексов PeptiENV с помощью 36% сахарозной подушки и ультрацентрифугирования очищенные комплексы анализировали посредством проточной цитометрии. A. HSV-1 без комплекса с пептидами и B. HSV-1 в комплексе с CPP-содержащими FITC- мечеными пептидами. На Фиг. 4, средняя панель, показано, что CPP-содержащие пептиды могут быть присоединены к оболочке вируса осповакцины. CPP-содержащий и FITC-меченый пептид образовывал комплекс с вирусом осповакцины, и для обнаружения комплексов использовали сэндвич-ELISA. Антитело против вируса осповакцины наносили на дно 96-луночного планшета и в лунках инкубировали комплексы PeptiENV. После отмывки несвязанной фракции, анти-FITC-HRP- конъюгированное антитело использовали для обнаружения комплекса PeptiENV. На Фиг. 4, нижняя панель, показано, что CPP-содержащие SIINFEKL-пептиды явно презентируются дендритными клетками. Спленоциты мыши были активированы с помощью CPP-содержащих SIINFEKL-пептидов, а презентация эпитопа MHCI SIINFEKL с помощью CD11c-положительной DC-популяции была определена с помощью проточной цитометрии.
На Фиг. 5, нижняя панель, показано, что PeptiENV может индуцировать активацию DC даже с очень низким количеством вируса. Вирус осповакцины образовывал комплекс с CPP- или холестерин-содержащими SIINFEKL-пептидами и его использовали для инфицирования мышиных спленоцитов. Через два часа после инфицирования дендритные клетки анализировали с помощью проточной цитометрии в отношении экспрессии маркеров активации DC. На нижней панели Фиг. 5 показано, что PeptiENV может индуцировать презентацию специфических противоопухолевых эпитопов MHC класса I CD11c-положительными DC даже при очень низком количестве вируса. Вирус осповакцины образовывал комплекс с CPP- или холестерин- содержащими SIINFEKL-пептидами и его использовали для инфицирования мышиных спленоцитов. Через два часа презентацию MHCI-эпитопа SIINFEKL посредством CD11c положительной DC-популяции определяли с помощью проточной цитометрии.
На Фиг. 6 показано, что комплексообразование PeptiENV вирус-пептид не влияет на вирусную инфекционность. Инфекционность PeptiENV сравнивали с нормальным не образующим комплекс вирусом, а жизнеспособность клеток измеряли через 3 суток после заражения.
На Фиг. 7 схематично представлены A) холестерин-конъюгированный иммуномодулирующий пептид, и B) иммуномодулирующий пептид, имеющий N- концевую пептидную последовательность проникновения в клетку. Обозначение разных функциональных последовательностей объектов: (1): холестерин (A) или последовательность проникновения в клетку (B); (3): сайт расщепления катепсином D/E. (2): сайт расщепления фурином (4): сайты иммунопротеасомного процессинга. (5): MHC-I рестриктированный эпитоп.
На Фиг. 8 показано, что различные CPP-последовательности можно использовать для присоединения противоопухолевых пептидов к вирусной оболочке. CPP-содержащие и FITC-меченые пептиды образовывали комплекс с вирусом осповакцины, и для обнаружения этих комплексов использовали сэндвич-ELISA. Антитело против вируса осповакцины наносили на дно 96-луночного планшета, и комплексы PeptiENV инкубировали в лунках. После отмывки несвязанной фракции анти-FITC-HRP-конъюгированное антитело использовали для обнаружения комплексов PeptiENV.
На Фиг. 9 показано, что CPP-содержащие пептиды не имеют каких-либо противовирусных эффектов и могут быть безопасно присоединены к вирусной оболочке без потери инфекционности или онколитического эффекта. В четырех разных клеточных линиях, A549, MDMBA436, B16F10 и B16-OVA, определяли вирусную инфекционность и PeptiENV сравнивали с немодифицированным вирусом.
На Фиг. 10 показано, что противоопухолевые пептиды, закрепленные в вирусной оболочке с помощью CPP или холестериновых группировок, индуцируют мощный противоопухолевый иммунитет, что приводит к усилению контроля за ростом опухоли и увеличению выживаемости. A. Сравнение опухолевого роста между группами имитации (обработка только инъекционной средой), только вируса осповакцины, PeptiENV с противоопухолевыми пептидами, присоединенными к вирусной оболочке с помощью холестериновой группировки (PeptiENV VACV/chol), и PeptiENV с противоопухолевыми пептидами, присоединенными к вирусной оболочке с помощью CPP-группировки (PeptiENV VACV/cpp). B. кривая выживаемости Каплана-
Мейера для групп мышей, обработанных PeptiENV VACV/cpp, только вирусом осповакцины, одним противоопухолевым пептидом (без вируса) или имитатором. C. Анализ посредством проточной цитометрии опухолеспецифических T-клеток в обработанной опухоли. PeptiENV может индуцировать множественную фильтрацию опухолеспецифических эффекторных Т-клеток в микроокружение опухоли. D. Анализ посредством проточной цитометрии вирус-специфических T-клеток в микроокружении опухоли. PeptiENV индуцирует противовирусный иммунитет, сравнимый с немодифицированным вирусом осповакцины, при этом специфически индуцирует мощный противоопухолевый иммунитет, не представленный немодифицированным вирусом осповакцины.
На Фиг. 11 показано, что у мышей, обработанных PeptiENV VACV/chol и PeptiENV VACV/cpp, наблюдается сильный противоопухолевый иммунный ответ и они защищены от повторного появления опухоли, при этом мыши, обработанные имитатором, не защищены. 500000 B16-OVA клеток инъецировали в противоположный бок относительно предыдущей имплантации опухоли и следили за мышами в течение 14 суток. У мышей, получавших PeptiENV, опухолевого роста не наблюдалось, в то время как в группе, получавшей имитатор, частота возникновения опухолей составляла 100%.
На Фиг. 12 показано, что противоопухолевые пептиды, закрепленные в оболочке вируса простого герпеса 1 (ВПГ-1) при помощи СРР-группировки, индуцируют сильный противоопухолевый иммунитет, приводящий к усиленному контролю роста опухоли. A. Кривая роста опухолей в группах, обработанных PeptiENV HSV-1/cpp, только HSV-1 и имитатором. B. Проточно-цитометрический анализ опухолеспецифических Т-клеток в обработанной опухоли. PeptiENV может индуцировать множественную фильтрацию опухолеспецифических эффекторных Т- клеток в микроокружение опухоли.
На Фиг. 13 показаны измерения поверхностного плазмонного резонанса (SPR) для подтверждения высокого сродства CPP-содержащих противоопухолевых пептидов к вирусной оболочке. Для анализа данных SPR использовали подобранную модель кинетики двухсайтового связывания.
Конкретное описание Материалы и методы: Пептиды:
Пептиды, использованные в этом исследовании, перечислены ниже, и все они были приобретены у PepScan:
CPP пептиды:
GRKKRRQRRRPQRVRRALISLEQLESIINFEKLTEW (SEQ ID NO: 8)
GRKKRRQRRRPQRVRRALISLEQLESIINFEKLTEW-FITC (SEQ ID NO: 24)
RQIKIWFQNRRMKWKKRWEKISIINFEKLYKLK-FITC (SEQ ID NO: 25)
KLALKLALKALKAALKLARWEKISIINFEKLYKLK-FITC (SEQ ID NO: 26)
RRRRRRRRRRWEKISIINFEKLYKLK-FITC (SEQ ID NO: 27)
FITC -RWEKISIINFEKLYKLRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 28)
FITC-RWEKISIINFEKLYKLKETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 29)
FITC-RWEKISIINFEKLYKLAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 30)
GLWRALWRLLRSLWRLLWRARWEKISIINFEKLYKLK-FITC (SEQ ID NO: 31)
GRKKRRQRRRPQRWEKISIINFEKL (SEQ ID NO: 17)
GRKKRRQRRRPQRWEKISIINFEKLYKLRWEKISIINFEKL (SEQ ID NO: 18)
Холестерин-конъюгированные пептиды: LEQLESIINFEKLTEWRVRRALISC-холестерин (SEQ ID NO: 19)
FITC-LEQLESIINFEKLTEWRVRRALISC-холестерин (SEQ ID NO: 32)
холестерин-CRVRRALISLEQLESIINFEKLTEW (SEQ ID NO: 20)
холестерин-CRVRRALISLEQLESIINFEKLTEW-FITC (SEQ ID NO: 33)
холестерин-CSIINFEKL (SEQ ID NO: 21)
холестерин-CRWEKISIINFEKL (SEQ ID NO: 22)
холестерин-CRWEKISVYDFFVWLYKLRWEKISIINFEKL (SEQ ID NO: 23)
Клеточные линии
2
2
Клеточную линию карциномы легкого человека A549, эпителиальную клеточную линию почек африканской зеленой мартышки Vero (B) и клеточные линии меланомы мыши B16 / OVA и B16-F10 культивировали в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS) (Life Technologies), 1% L-глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина при 37°С/5% СО. Линию клеток трижды негативного рака молочной железы человека MDMBA436 культивировали в RPMI с 10% эмбриональной сывороткой теленка (FBS) (Life Technologies), 1% L-глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина при 37°C/5% CO.
Получение вирусов
Вирус простого герпеса 1 получали в клетках Vero, очищали ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы и элюировали в 20 мМ MES, 100 мМ NaCl, 30 мМ Tris-HCl (pH 7,2). Штамм вируса осповакцины Western reserve (VVDD- mDAI-RFP) получали в клетках A549, очищали ультрацентрифугированием на 36% сахарозной подушке и элюировали в 1 мМ Tris (pH 9,0).
ELISA
7
2,5×10 частиц вируса осповакцины образовывали комплекс с 8 мкг либо CPP- пептида-FITC, либо холестерин-конъюгированного пептида-FITC в 100 мкл DMEM в течение 15 минут при 37°C. После комплексообразования несвязанные пептиды удаляли ультрацентрифугированием (20,000 г, 40-80 мин) на 36% сахарозной подушке в 1 мМ Tris (pH 9,0). Для ELISA 96-луночные иммунопланшеты Maxisorb покрывали поликлональными антителами против вируса осповакцины (Abcam) в течение ночи при 4°C в концентрации 2 мкг/мл. Комплексы вирус осповакцины-пептид инкубировали в течение 30-60 мин при 37°C или при комнатной температуре и три раза промывали 1xPBS. Комплексы определяли с помощью анти-FITC антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (Abcam) (разведение 1:5000 в 2% BSA(бычий сывороточный альбумин)-PBS).
7
2,5×10 частиц вируса простого герпеса 1 образовывали комплекс с 8 мкг либо CPP-пептида-FITC, либо холестерин-конъюгированного пептида-FITC в 100 мкл DMEM в течение 15 минут при 37°C. Для ELISA 96-луночные иммунопланшеты Maxisorb покрывали поликлональными антителами против HSV-1 (Abcam) в течение ночи при 4°C в концентрации 2 мкг/мл. Комплексы HSV-1-пептид инкубировали в течение 30-60 мин при 37°C или при комнатной температуре и промывали 1xPBS три раза. Комплексы определяли с помощью анти-FITC антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (Abcam) (разведение 1:5000 в 2% BSA-PBS)
Проточная цитометрия
7
5×10 частиц вируса осповакцины образовывали комплекс с 24 мкг либо CPP- пептида-FITC, либо холестерин-конъюгированного пептида-FITC в 200 мкл DMEM в течение 15 минут при 37°C. После комплексообразования несвязанные пептиды удаляли ультрацентрифигированием (20,000 г, 40-80 мин) с помощью 36% сахарозной подушки в 1 мМ Tris (pH 9,0) и элюировали в 2% формалин в PBS. После фиксации формалин удаляли с помощью еще одного ультрацентрифугирования (20,000 г, 40-80 мин) на 36% подушке сахарозы и осадок элюировали в 1x сверхчистом PBS (Gibco). Проточную цитометрию проводили с использованием микропроточного цитометра Apogee A50 (Apogee), и для оценки комплексов использовали FITC-детекцию.
6
Эксперименты с перекрестной презентацией 2×10 спленоцитов в 800 мкл 10% культуральной среды RPMI-1640 инкубировали с 200 мкл разведения пептидов (0,19 мкг/мкл) GRKKRRQRRRPQRVRRALISLEQLESIINFEKLTEW (SEQ ID NO: 8), LEQLESIINFEKLTEWRVRRALISC-холестерин (SEQ ID NO: 19) или холестерин- CRVRRALISLEQLESIINFEKLTEW (SEQ ID NO: 20).
Комплексы вирус осповакцины-пептид получали, как описано для ELISA. После 2 ч инкубации клетки промывали и окрашивали либо APC антимышиным H-2Kb, связанным с SIINFEKL, либо APC мышиным IgG1, контроль изотипа κ (BioLegend, San Diego, CA, USA), и образцы анализировали с помощью проточной цитометрии.
Анализ жизнеспособности клеток
Жизнеспособность клеток измеряли с использованием анализа пролиферации клеток CellTiterGlo 96 AQueous One Solution (Promega) и многолуночного планшетного ридера (Varioscan; ThermoLabsystems) для определения люминесценции образцов.
Поверхностный плазмонный резонанс
Измерение проводили с использованием многопараметрического прибора SPR Navi™ 220A (Bionavis Ltd, Tampere, Finland). В качестве электродного буфера использовали фосфатно-солевой буфер (PBS) (pH 7,4). В ходе экспериментов использовали постоянную скорость потока 20 мкл/мин, и температура была установлена на + 20°C. Лазерное излучение с длиной волны 670 нм использовали для поверхностного плазмонного возбуждения.
7
Сенсорный слайд с поверхностью диоксида кремния активировали путем 5- минутной плазменной обработки с последующим покрытием APTES ((3- аминопропил)триэтоксисилан) путем инкубации сенсора в 50 мМ APTES в изопропаноле в течение 4 ч. Затем сенсор промывали и помещали в устройство SPR и вирусы иммобилизовывали in situ на поверхности сенсора двух испытательных каналов путем введения 1,1×10 БОЕ (бляшкообразующих единиц) VACV в PBS (pH 7,4) в течение примерно 12 мин, с последующим 3-минутным промыванием PBS. CPP- содержащий противоопухолевый пептид или пептид без CPP-последовательности (не взаимодействующий контроль) затем вводили в оба проточных канала проточной кюветы параллельно, с увеличением концентрации пептида в диапазоне от 1,23 мкМ до 100 мкМ.
Эксперименты на животных
3
Во всех экспериментах на животных использовали линию мышей C57BL/6JOlaHsd. 350000 клеток B16-OVA инъецировали в правый бок мышей (в эксперименте по повторному заражению клетки инъецировали в левый бок) и, когда размер опухоли достигал примерно 50 мм (через 10-12 дней после инъекции), мышей лечили немодифицированными вирусами, PeptiENV-платформой, только пептидами или средой для инъекции (имитатор). Мышей лечили в сутки 0, 2, а затем на 8-10 сутки вводили бустерное лечение. Опухоли измеряли каждые вторые сутки, пока размер опухоли не достигал максимально допустимого размера.
--->
SEQUENCE LISTING
<110> Cerullo, Vicenzo
Capasso, Christian
Ylosmaki, Erkko
<120> Envelope Virus Platform PeptiENV
<130> 4599P/WO
<150> GB1616365.1
<151> 2016-09-27
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<400> 1
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln
1               5                   10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell pentrating peptide
<400> 2
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1                5                  10                  15
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell pentrating peptide
<400> 3
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Ala
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell pentrating peptide
<400> 4
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1                5
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell pentrating peptide
<400> 5
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1                5                  10                   15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell pentrating peptide
<400> 6
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu
1                5                  10                   15
Ala Lys Lys Ile Leu
20
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell pentrating peptide
<400> 7
Ala Gly Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg
1                5                  10                  15
Leu Leu Trp Arg Ala
20
<210> 8
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell pentrating peptide
<400> 8
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln Arg Val Arg Arg
1                5                   10                 15
Ala Leu Ile Ser Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys
20                  25                   30
Leu Thr Glu Trp
35
<210> 9
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<400> 9
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1                5                  10                  15
Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr Lys Leu
20                   25                 30
Lys
<210> 10
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<400> 10
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1                5                  10                  15
Leu Ala Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr
20                   25                  30
Lys Leu Lys
35
<210> 11
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<400> 11
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile
1                5                  10                   15
Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr Lys Leu Lys
20                   25
<210> 12
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<400> 12
Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr Lys Leu
1                5                   10                 15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
20                  25
<210> 13
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<400> 13
Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr Lys Leu
1                 5                  10                  15
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
20                           25         30
Lys Lys Arg Lys Val
35
<210> 14
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<400> 14
Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr Lys Leu
1                5                  10                  15
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu
20                  25                 30
Ala Lys Lys Ile Leu
35
<210> 15
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<400> 15
Ala Gly Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg
1                5                  10                  15
Leu Leu Trp Arg Ala Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu
20                  25                  30
Lys Leu Tyr Lys Leu Lys
35
<210> 16
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<400> 16
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln Arg Trp Glu Lys
1                5                  10                  15
Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr Lys Leu
20                  25
<210> 17
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<400> 17
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln Arg Trp Glu Lys
1                5                  10                   15
Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
20                 25
<210> 18
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<400> 18
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln Arg Trp Glu Lys
1                5                  10                  15
Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr Lys Leu Arg Trp Glu Lys
20                  25                  30
Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
35                  40
<210> 19
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> X
<222> (26)..(26)
<223> cholesterol
<400> 19
Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp
1                5                  10                  15
Arg Val Arg Arg Ala Leu Ile Ser Cys Xaa
20                  25
<210> 20
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> cholesterol
<400> 20
Xaa Cys Arg Val Arg Arg Ala Leu Ile Ser Leu Glu Gln Leu Glu Ser
1                5                  10                  15
Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp
20                  25
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> cholesterol
<400> 21
Xaa Cys Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1                5                  10
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> cholsterol
<400> 22
Xaa Cys Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1                5                  10                  15
<210> 23
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> cholesterol
<400> 23
Xaa Cys Arg Trp Glu Lys Ile Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1                5                  10                  15
Tyr Lys Leu Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
20                  25                   30
<210> 24
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> X
<222> (37)..(37)
<223> FITC
<400> 24
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln Arg Val Arg Arg
1               5                    10                 15
Ala Leu Ile Ser Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys
20                  25                  30
Leu Thr Glu Trp Xaa
35
<210> 25
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> X
<222> (34)..(34)
<223> FITC
<400> 25
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1                5                  10                  15
Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr Lys Leu
20                  25                  30
Lys Xaa
<210> 26
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> X
<222> (36)..(36)
<223> FITC
<400> 26
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1                5                  10                   15
Leu Ala Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr
20                  25                  30
Lys Leu Lys Xaa
35
<210> 27
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> X
<222> (27)..(27)
<400> 27
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile
1                5                  10                  15
Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr Lys Leu Lys Xaa
20                  25
<210> 28
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> FITC
<400> 28
Xaa Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr Lys
1                5                  10                  15
Leu Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
20                  25
<210> 29
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> FITC
<400> 29
Xaa Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr Lys
1                5                  10                  15
Leu Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro
20                  25                   30
Lys Lys Lys Arg Lys Val
35
<210> 30
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> FITC
<400> 30
Xaa Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Tyr Lys
1                5                  10                  15
Leu Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala
20                   25                 30
Leu Ala Lys Lys Ile Leu
35
<210> 31
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> X
<222> (38)..(38)
<223> FITC
<400> 31
Gly Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1                5                   10                  15
Leu Trp Arg Ala Arg Trp Glu Lys Ile Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys
20                   25                  30
Leu Tyr Lys Leu Lys Xaa
35
<210> 32
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> Z
<222> (1)..(1)
<223> FITC
<220>
<221> X
<222> (27)..(27)
<223> cholesterol
<400> 32
Glx Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu
1                5                  10                  15
Trp Arg Val Arg Arg Ala Leu Ile Ser Cys Xaa
20                   25
<210> 33
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell penetrating peptide
<220>
<221> Z
<222> (1)..(1)
<223> cholesterol
<220>
<221> X
<222> (27)..(27)
<223> FITC
<400> 33
Glx Cys Arg Val Arg Arg Ala Leu Ile Ser Leu Glu Gln Leu Glu Ser
1                5                   10                 15
Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Xaa
20                  25
<---