Пролиферативный потенциал колониеобразующих единиц фибробластов при стабильном функционировании кроветворного стромального микроокружения и после его активации

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3

Пролиферативный потенциал колониеобразующих единиц фибробластов при стабильном функционировании кроветворного стромального микроокружения и после его активации

И.Н. Шипунова, Н.В. Сац, А.Е. Бигильдеев, О.А. Жиронкина, Н.И. Дризе ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России, Москва

Введение. Кроветворное микроокружение в костном мозге формируется потомками мезенхимных стволовых клеток (МСК), способных к самоподдержанию и дифференцировке во все линии стромальных клеток. Помимо МСК описаны их потомки - колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕф), более дифференцированные индуцибельные предшественники и терминально дифференцированные стромальные клетки. КОЕф широко используются для характеристики костномозгового стромального микроокружения (СМ), однако, эти клетки представляют собой гетерогенную популяцию, различающуюся по дифференцировочному и пролиферативному потенциалу. Целью данной работы было охарактеризовать популяцию КОЕф по пролиферативному потенциалу при стабильном функционировании СМ в костном мозге молодых и старых животных, а также после активации стромальных клеток-предшественников при формировании новых кроветворных территорий.

Материалы и методы. Активация стромальных клеток-предшественников достигалась in vivo при имплантации костно-мозгового цилиндра под капсулу почки сингенных мышей, а также in vitro при эксплантации в длительную культуру костного мозга (ДККМ). ДККМ культивировали в стандартных условиях по методу Декстера. КОЕф получали в среде а-МЕМ с 20% эмбриональной телячьей сыворотки и 5 нг/мл основного фактора роста фибробластов. Пролиферативный потенциал КОЕф определяли по способности их потомков к последовательному пассированию из ячейки 96-луночной платы в ячейку 24-, затем 6-луночной платы, и во флакон Т25.

Результаты и обсуждение. Показано, что в стабильно функционирующем костном мозге молодых мышей КОЕф практически не пролиферируют (0-2% популяции), тогда как у взрослых и старых мышей пролиферируют 10—14% КОЕф. Следовательно, поддержание гомеостаза СМ с возрастом нарушается, что приводит к активации таких ранних предше-

ственников, как КОЕф. После имплантации костно-мозгового цилиндра под капсулу почки СМ строится заново за счет функционирования МСК. В сформированном очаге эктопического кроветворения СМ функционирует аналогично таковому в костном мозге. Однако анализ пролиферативного потенциала КОЕф из очага выявил, что у молодых животных КОЕф начинают пролиферировать (6,3% популяции, причем из них 2,1% пролиферируют очень интенсивно), у взрослых и старых животных пропорция пролиферующих КОЕф увеличивается в 1,5—2 раза по сравнению с исходным костным мозгом. При этом появляются интенсивно пролиферирующие КОЕф (12,5— 16,7% от пролиферириующей популяции). Таким образом, для построения новой территории МСК делятся, производя потомков с повышенным пролиферативным статусом. При эксплантации костномозгового цилиндра в ДККМ МСК формируют СМ площадью 25 см2, тогда как под капсулой почки образуется очаг площадью приблизительно 0,25 см2, что означает необходимость проделать дополнительные деления для стромальных клеток-предшественников. Анализ пролиферативного потенциала КОЕф из очагов эктопического кроветворения, образованных подслоем прилипающих клеток из ДККМ, показал, что 58,3% КОЕф из культур, полученных от молодых животных, пролиферируют, причем 41,7% из них интенсивно, а среди КОЕф из культур, полученных от старых животных, пролиферирует 70,8%, из них половина — интенсивно.

Заключение. Полученные данные подтверждают устоявшиеся представления о редком самообновлении клеток СМ. Возмущающее воздействие приводит к активации МСК и КОЕф и стимулирует пролиферацию ранних клеток-пред-шественников СМ, особенно сильно у взрослых и старых животных. Возможно, активация клеток СМ влияет на их способность регулировать кроветворение, что выражается в возрастных изменениях в кроветворной ткани.

Возможная роль ToN-подобных рецепторов в повышении резистентности опухолевых (лейкозных) клеток к действию химиотерапевтических препаратов в условиях in vitro и in vivo

Д. В. Щебляков, Д. Ю. Логунов, И.В. Раковская, Б. С. Народицкий ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России

Введение. Toll-подобные рецепторы (TLR) являются главными компонентами системы врожденного иммунитета, которые выполняют важные функции в формировании реакций иммунной защиты организма против развивающейся бактериальной или вирусной инфекции. TLR представлены на клетках разного типа — от эпителиальных до иммунокомпетентных. Как известно, связывание TLR с собственными лигандами приводит к активации ряда адапторных белков и протеинкиназ, которые участвуют в индукции ключевых провоспалительных факторов. В итоге такой индукции развивается как врожденный иммунный ответ, обусловленный усилением экспрессии ряда провоспалительных цитокинов, антибактериальных белков, так и приобретенный иммунный ответ через созревание дендритных клеток, презентации антигенов и т.д.

Благодаря своей способности усиливать специфические и неспецифические иммунные реакции агонисты TLR нашли применение не только в терапии инфекционных заболеваний, но и в химиотерапии различных злокачественных новообразований. Однако к настоящему моменту описаны принципиально различные эффекты TLR на опухоли. Показано, что различные агонисты TLR могут обладать как противоопухолевым действием (липополисахарид, имиквимод, CpG), так и, в определенных условиях, в зависимости от типа опухоли, типа лиганда и способа его введения, повышать устойчивость опухолевых клеток к апоптозу и стимулировать их пролиферацию (липополисахарид, липопептид).

Результаты и обсуждение. В нашей работе показано, что активация TLR2-зависимого сигнального пути в клет-

ках миеломоноцитарного лейкоза мышей WEHI-3B при добавлении к ним агониста TLR2-липидассоциированных мембранных белков Mycoplasmaarginini (ЛАМБ) или в условии микоплазменной инфекции приводит к конститутивной активации в них транскрипционного NF-kB, подавлению развития апоптоза при действии различных химиотерапевтических препаратов в условии in vitro. Более того, на модели миеломоноцитарного лейкоза мышей in vivo нами показано, что внутримышечное введение ЛАМБ микоплазмы приводило к повышению устойчивости опухоли к действию 5-фторурацила в условии, усилению опухолевого роста и к сокращению продолжительности жизни мышей. Кроме того на опухолевых клетках, выделенных из образцов костного мозга человека с различными формами лейкозов (содержащих не менее 95% бластных клеток) был проведен анализ экспрессии TLR2, а также устойчивости опухолевых клеток к действию химиотерапевтического препарата цисплатин при добавлении агониста TLR2 ЛАМБ M. arginini. Было установлено, что опухолевые клетки, выделенные из костного мозга больных острым лимфобластным лейкозом, характеризовались высоким уровнем экспрессии TLR2. При этом обработка опухолевых клеток ЛАМБ M. arginini приводило к увеличению их резистентности к индукции апоптоза.

Заключение. Результаты нашей работы позволяют сделать заключение о том, что хронические инфекции у больных злокачественными новообразованиями могут влиять не только на скорость прогрессии некоторых TLR2-позитивных опухолей, но и на эффективность проводимой противоопухолевой терапии.

28