СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ГЛУБОКОГО ОЖОГА КОЖИ
THERAPY OF DEEP BURN OF SKIN

Изобретение относится к медицине, а именно к комбустиологии, и может быть использовано для местного полноценного восстановления дермального слоя при глубоком ожоге кожи III-Б степени.
Известны способы местного лечения ожогов с использованием раневых покрытий на основе биодеградируемых биополимеров, таких как покрытие для ран, в состав которого входит коллаген, хитозан, полисахарид растительного происхождения, латекс, каучук [1]. Известна повязка для лечения ран [2], представляющая собой перфорированную пленку и содержащая хитозан из панцырей краба в виде соли органической кислоты (уксусной, янтарной или гликолевой), глутаровый альдегид, поливиниловый спирт и биологически активную добавку. Известно биополимерное покрытие для лечения ран «Коллахит», содержащее хитозан, бычий коллаген, сшитый с помощью 0,1-10% глутарового альдегида или глиоксаля. Покрытие дополнительно может содержать антисептические препараты, например, фурагин в количестве от 0,5 до 5% к массе композиции, анестетики, например, анилокаин в количестве от 3 до 5% к массе композиции [3].
Однако указанные способы лечения глубоких ожогов нецелесообразны. Так, при степени ожога кожи IIIБ утрачиваются все слои кожного покрова, восстановление которых из клеточных и неклеточных структур из одной соединительной ткани невозможно. Поэтому применение указанных раневых покрытий при местном лечении глубоких ожогов для полноценного восстановления кожного дефекта неэффективно.
Известен способ лечения глубоких ожоговых ран [4] с помощью перфорированного пленочного перевязочного материала, содержащего смесь антибиотиков. В качестве пленочного перевязочного материала используют перевязочный материал, содержащий ряды отверстий, образующих прямоугольники сплошной поверхности с размерами сторон 100 и 200 мм, при этом отверстия выполнены прямоугольными формами с размерами сторон 1 и 3-5 мм на расстоянии 1 мм, лечение ожоговых ран проводят сначала до полного удаления некротических масс и образования грануляций, а затем щадящее дерматомное удаление грануляций и аутодермопластику. После аутодермопластики кожными трансплантатами и закрытия донорских ран дальнейшее лечение проводят с помощью перфорированного пленочного перевязочного материала.
Однако использование данного способа ограничивается площадью ожоговых ран, при которых есть необходимость в потребности донорских ресурсов кожи, кроме того, включение антибактериальных средств в раневое покрытие не исключает развитие антибиотикорезистентности госпитальной микробной флоры и формирование местных и общих аллергических реакций. Отсутствие в раневых покрытиях клеточного микроокружения для восстановления утраченных элементов дермы при ожоге IIIБ степени не может по своей сути сформировать дермальный слой кожи и полноценно восстановить кожный дефект. В состав пленочного не биодеградируемого перевязочного материала не входят строительные элементы, участвующие в восстановлении дермального слоя кожи.
Наиболее близким к заявляемому способу лечения глубоких ожогов являются способы с использованием культивированных фибробластов [5], эмбриональных фибробластов и фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток (ФМСК) [6], аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, иммобилизируемых на биодеградируемых мембранах [7], с выделением популяции базальных кератиноцитов человека для использования их в аллогенных трансплантатах [8].
Однако указанные способы не имеют универсального носителя клеточных структур, который бы обладал высокой биосовместимостью, создавал оптимальную микросреду для регенерации раны, обладал абсорбционной способностью в отношении раневого экссудата, предотвращал проникновение и развитие микроорганизмов, был проницаемым для паров воды и воздуха, но не высушивал дна раны, был эластичным, моделировал поверхность со сложным рельефом, создавал комфортные условия для жизнеобеспечения и пролиферации биомассы фибробластов.
Задача изобретения - повысить ранозаживляющие свойства раневого покрытия, полноценно восстановить дермальный слой при глубоком ожоге.
Задача достигается тем, что в качестве биодеградируемого материала на ожоговую поверхность кожи глубиной III-Б степени наносят губчатую композицию, приготовленную из 2% раствора ацетата коллагена, 2% раствора ацетата хитозана молекулярной массы 100-700 кДа и степенью дезацетилирования свыше 95%, в который на один грамм сухого хитозана добавлены: аскорбиновая кислота - 1,8 г, хондроитинсерная кислота - 5-100 мг, D-глюкуроновая кислота - 10-100 мг, гепарин - 2,5-5 мг и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота «адгелон» - 11-220 мкг, включающую аллогенные культивированные фибробласты, полученные из фетусов животного.
0,60
2
Способ осуществляют следующим образом. Термический ожог кожи моделируют на крысах самцах популяции Wistar массой 180-220 г. В основу положена экспериментальная модель [11] для изучения влияния препарата на процесс заживления глубокого ожога кожи крыс. Животным после удаления волосяного покрова в паравертебральной области спины на уровне ее середины под эфирным наркозом создают контактный термический ожог медной пластинкой с силой в 1,255 Н, нагретой до 220°С. Время экспозиции пластины составляет 14 с с глубиной ожога IIIБ степени (определяют на гистологическом срезе ткани кожи). Для вычисления процентного соотношения ожоговой поверхности к общей площади тела у крыс используют формулу, предложенную Lee (1929), в модификации формулы Мее - Рубнера: S=К×W, где S - поверхность тела в квадратных сантиметрах, К - коэффициент, равный 12,54, W - вес животного в граммах. Площадь ожоговой раны в эксперименте составляла 12 см (4-5% от общей поверхности кожи крысы). День нанесения ран животным считают нулевым. Животным на 2-й день после снятия ожогового струпа на ожоговую поверхность IIIБ степени проводят аппликацию раневого покрытия, приготовленного из 2% раствора ацетата коллагена, 2% раствора ацетата хитозана молекулярной массы 100-700 кДа и степени дезацетилирования свыше 95%, полученного из клешней камчатского краба), содержащего в своем составе на один грамм сухого хитозана аскорбиновую кислоту - 1,8 г, хондроитинсерную кислоту - 5-100 мг, D-глюкуроновую кислоту - 10-100 мг, гепарин - 2,5-5 мг и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота «адгелон» - 11-220 мкг, включающего имплантированные и культивированные аллогенные фибробласты в кондиционированной среде, полученные из фетусов животного.
Животным контрольной группы на ожоговую поверхность наносили губчатое раневое покрытие с кондиционированной средой, не содержащее аллогенные фибробласты. Раневое покрытие не удаляют до полного заживления раневой поверхности. Сроки анализа репарации ожоговой поверхности составляют 3, 7, 13, 16 и 30 суток с момента травмы после забора тканей ожоговой раны.
1
1
Анализ раневой ожоговой поверхности проводили с помощью иммуногистохимических реакций по стандартному стрептавидин-биотин-пероксидазному методу с моноклональными и поликлональными антителами ("Novocastra", Великобритания). Использовали следующие моноклональные и поликлональные антитела: Ki-67 (оценка воспаления и процессов репарации, маркер пролиферативной активности клеток), металлопротеиназа-9 (ММР-9) и металлопротеиназа-2 (ММР-2) (оценка ремоделирования внеклеточного соединительнотканного матрикса, деструкция его компонентов), CD68 (экспрессия в цитоплазме моноцитов, макрофагов, маркер активации), TGFβ (трансформирующий фактор роста β, оценка процессов репарации, фиброгенный фактор), коллагены IV и VII типов (оценка ремоделирования внеклеточного матрикса, составные компоненты базальных мембран),
Срезы, наклеенные на поли-L-лизиновые стекла, после депарафинирования подвергали микроволновой обработке в 0,01 М цитратном буфере (рН 6,0) в течение 15 минут для демаскировки антигенов. Блокирование эндогенной пероксидазной активности осуществляли 3% водным раствором перекиси водорода. Для избежания неспецифической адсорбции первичных антител проводили инкубацию с нормальной неиммунной сывороткой в течение 15 минут. Инкубацию проводили при температуре 25°С в течение 30 минут. После каждой процедуры обработки срезы промывали в трис HCL буфере - 0,05М, рН 7,6. Хромогеном служил диаминобензидин (ДАБ), гистологические срезы для обзорного анализа докрашивали гематоксилином и эозином, для выявления коллагеновых волокон по Ван-Гизону, для изучения аргирофильных структур использовали импрегнацию солями азотнокислого серебра.
При исследовании микропрепаратов анализ результатов иммуногистохимических реакций проводили отдельно в краях ожоговой раны и в зоне повреждения. При локализации продуктов реакций в клетках количественная оценка результатов реакций включала определение доли (%) окрашенных клеток и интенсивности их окрашивания по трехбалльной шкале. Интенсивность окраски: 0 - нет окрашивания, 1 балл - слабое окрашивание (+ слабая реакция), 2 балла - умеренное окрашивание (++ умеренная реакция), 3 балла - интенсивное окрашивание (+++ выраженная реакция). Неокрашенные, слабо окрашенные, умеренно окрашенные и сильно окрашенные структуры в каждом случае подсчитывали в ядрах 100 стромальных или эпителиальных клеток в трех различных полях зрения при увеличении ×400. Интенсивность реакции определяли по формуле
ИГХ реакция = ΣP(i)·i,
1
где i - интенсивность окрашивания в баллах от 1 до 3; P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью. Полученные цифровые данные трактовали следующим образом: от 1 до 100 - слабая реакция; от 101 до 200 - умеренная; от 201 до 300 - выраженная. Результаты иммуноморфологического исследования на ММР-9, MMP-2, TGFβ, коллаген IV типа оценивали по степени выраженности окраски клеток и экстрацеллюлярного матрикса по трехбалльной системе (0 - нет окрашивания, 1 балл - слабое окрашивание (+ слабая реакция), 2 балла - умеренное окрашивание (++ умеренная реакция), 3 балла - интенсивное окрашивание (+++ выраженная реакция). В каждом гистологическом срезе исследовали не менее 25 полей зрения при увеличении микроскопа ×400.
Морфометрию со статистической обработкой полученных результатов производили при помощи светового микроскопа "Leica DMLB" и анализатора изображения "Q550IW", снабженного программой "Leica Qwin" для статистической обработки.
Для получения аллогенных фибробластов использовали фетусы крыс (7-10-й день беременности).
Результаты исследования. Опытная группа животных показала существенное ускорение репаративных процессов в ожоговой ране. При гистологическом анализе выявляются изменения, манифестирующие выраженную биологическую активность раневого покрытия в отношении эпителиального и стромально-сосудистого компонента кожи. Это подтверждалось стимуляцией пролиферации и кератинизации эпидермоцитов, активацией ангиогенеза в центральных и периферических зонах ожога, ранней активацией моноцитарно-макрофагальных CD68 маркеров в течение первого этапа заживления. При этом регистрировалась интенсивная по сравнению с контролем экспрессия трансформирующего фактора роста бета-1 (TGF-β1) и Ki67 маркера пролиферативной активности фибробластов. В область термического повреждения более активно мигрировали фибробласты. Их пролиферация сопровождалась выработкой компонентов внеклеточного матрикса и деградацией некротизированных тканей. Снижение экспрессии матриксных металлопротеаз в присутствии опытного раневого покрытия указывает на супрессию деструктивных процессов внеклеточного матрикса. При этом отмечается усиленный синтез компонентов внеклеточного матрикса с образованием неостромы, служащей адгезивной матрицей для вновь образующегося эпителия. Выявленные особенности сочетались с более активной продукцией волокнистых структур (коллагенов IV и VII типов), что указывало на полноценное и быстрое формирование базальных мембран сосудов сосочкового слоя и эпидермиса кожи.
Проведенные исследования указывают на то, что раневое покрытие создает благоприятные условия для пролиферации, дифференцировки эмбриональных аллогенных фибробластов. Раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса, содержащее фибробласты, выделенные из десятидневного эмбриона крысы, показали высокую эффективность при реконструкции утраченной кожи в эксперименте.
Пример эксперимента.
2
Термический ожог кожи моделировали на 30 крысах-самцах популяции Wistar, массой 180-220 г. Площадь ожоговой раны составляла 12 см.
При проведении эксперимента животные были разделены на 3 группы по 10 животных: 1) крысы с глубоким термическим ожогом IIIБ степени и применением раневого покрытия на основе коллаген-хитозанового комплекса, содержащего имплантированные аллогенные эмбриональные фибробласты (опыт); 2) крысы с глубоким термическим ожогом IIIБ и применением раневого покрытия на основе коллаген-хитозанового комплекса, не содержащего аллогенные эмбриональные фибробласты, но содержащие кондиционированную среду, в которой культивировались аллогенные эмбриональные фибробласты (контроль 1); 3) крысы с глубоким термическим ожогом IIIБ без применения раневого покрытия с использованием только сухой асептической повязки (контроль 2).
На 2-й день под эфирным масочным наркозом после механического удаления струпа и стандартного туалета ожоговых ран с использованием растворов антисептиков в условиях асептики для животных опытной группы из контейнера с питательной средой извлекали раневое покрытие с эмбриональными фибробластами и моделировали его по контуру, соответствующему размеру и форме раны. Покрытие наносили на рану, прижимали ее ко дну и фиксировали с помощью стерильного марлевого бинта и пластыря. При наложении на рану покрытие выступало за края раны на 0,5-1 см. Для животных группы контроля 1 из контейнера с питательной средой, не содержащей фибробластов, извлекали раневое покрытие и моделировали его по контуру, соответствующему размеру и форме раны идентично опытной группе. Для животных группы контроля 2 использовали асептическую марлевую повязку, смачивали ее в стерильном физиологическом растворе и наносили на ожоговую поверхность. Клиническую оценку результатов производили на основе динамического визуального, планиметрического, иммуногистохимического контроля состояния ожоговой поверхности.
Сроки анализа репарации ожоговой поверхности составляли 3, 7, 13, 16 и 30 суток с момента травмы. Животных, согласно сроку, выводили из опыта, для гистологического анализа забирали сектор ожоговой раны (с захватом центрального и периферического отделов), материал помещали в контейнер с забуференным нейтральным 10% раствором формалина и в течение 24 часов подвергали автоматизированной гистологической проводке на системе Leica (Германия) с заливкой в парафин. Секцию тканей в парафиновых блоках и их окраску осуществляли в стандартных автоматизированных условиях.
+
Для иммуногистохимического анализа ожоговой поверхности использовали моноклональные антитела к: TGF-β-1, CD68, Ki-67, MMP-2, ММР-9 и коллагену IV, VII типов. После проведения иммуногистохимических реакций гистологические срезы для обзорного анализа докрашивали гематоксилином и эозином, для выявления коллагеновых волокон - по методике Ван-Гизона, для изучения аргирофильных структур - по методике импрегнации солями азотнокислого серебра.
Результаты анализа планиметрического исследования показали, что при использовании опытных раневых покрытий с имплантированными аллогенными эмбриональными фибробластами при лечении ожоговой поверхности происходит существенное ускорение процессов заживления, что отражается в сроках полного восстановления кожи (таблица 1).
Таблица 1
Динамика заживления ожоговых ран крыс
Площадь ран после ожога IIIБ степени (см<sup>2</sup>)
Сутки наблюдения
Опыт. Раневое покрытие + кондиционированная среда + эмбриональные фибробласты
Контроль 1. Раневое покрытие + кондиционированная среда
Контроль 2. Асептическая повязка + физраствор
3
16,2±1,7<sup>1,3</sup>
23,45±0,9*
25,3±0,14
7
11,15±2,12<sup>1,3</sup>
14,75±0,5*
23,15±0,35
13
9,45±0,21<sup>2,4</sup>
13,1±0,42**
21,65±0,78
30
3,5±0,5<sup>1,3</sup>
5,25±0,35*
16,7±1,8
Примечания:
<sup>1</sup> - достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановыми покрытием с имплантированными эмбриональными фибробластами (опыт) и без применения местного лечения (контроль 2) (Р<0,05);
<sup>2</sup> - достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановым покрытием с имплантированными эмбриональными фибробластами (опыт) и без применения местного лечения (контроль 2) (Р<0,01);
* - достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановыми покрытиями в кондиционированной эмбриональными фибробластами в течение 5 дней среде ДМЕМ (контроль 1) и без применения местного лечения (контроль 2) (Р<0,05);
** - достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановым покрытием в кондиционированной эмбриональными фибробластами в течение 5 дней среде ДМЕМ (контроль 1) и без применения местного лечения (контроль 2) (Р<0,01);
<sup>3</sup> - достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановым покрытием с имплантированными эмбриональными фибробластами (опыт) и коллаген-хитозановым покрытием в кондиционированной эмбриональными фибробластами в течение 5 дней среде ДМЕМ (контроль 1) (Р<0,05);
<sup>4</sup> - достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановым покрытием с имплантированными эмбриональными фибробластами (опыт) и в кондиционированной эмбриональными фибробластами в течение 5 дней среде ДМЕМ (контроль 1) (Р<0.01);
Применение коллаген-хитозановых раневых покрытий с имплантированными аллогенными фибробластами при обширной глубокой ожоговой ране III-Б приводит к формированию прочного раневого струпа, играющего роль наружного барьера, препятствующего суперинфицированию дефектной поверхности. Имеющая место микробная флора мало активизирована, блокирована в коллаген-хитозановой конструкции. Собственно раневая ожоговая поверхность уже в ранние сроки не содержит микробной флоры. Имеет место в сроки 15-20 дней после аппликации раневого покрытия на раны активное формирование краевой пролиферативной реакции эпидермиса, на дне раны формируется слой зрелой и незрелой соединительной ткани, образуется морфологический субстрат будущей тканевой подложки для появления элементов дермы. Активное формирование элементов дермы начинается после 20 суток лечения, имеет место хорошая фибробластная реакция, способная формировать и закрывать дно раны слоем молодой соединительной ткани. В поздние сроки лечения появляется морфологическая волокнисто-клеточная структура, способная сформировать дермальный слой кожи. При использовании для закрытия ожоговой поверхности раневых покрытий очевидна более ранняя реакция продуктивного воспаления как по краям ожогового дефекта кожи, так и в центре обширного ожога, вся поверхность ожогового дефекта выстлана послойно молодой и зрелой грануляционной тканью, содержащей множество вновь образованных микрососудов. Деградация раневого покрытия начинается с 20-х суток. Характерной особенностью является быстрое формирование дермального слоя кожи, содержащего необходимое клеточное микроокружение.
β
Известно, что TGF стимулирует синтез клетками составных элементов экстрацеллюлярного матрикса, сдерживает его деградацию, известен как мощный фактор, активирующий коллагеносинтетическую функцию фибробластов, ингибирующий пролиферацию большинства эпителиальных клеток.
β
Достоверное увеличение интенсивности иммунопероксидазной реакции на TGF регистрируется в опыте уже на 7 сутки после ожога в моноцитах и макрофагах дна раны. В этих клетках экспрессия данного фактора роста продолжает опережающе нарастать до 13, а затем до 16 дней, дополняясь в опыте достоверно более высокой ИГХ-реакцией в глубоком слое лейкоцитарного вала, фибробластах, фиброцитах и эндотелии капилляров дна раны. Эти изменения свидетельствуют об активации основных этапов репарации - ограничения пораженного участка, фиброза, активации фагоцитоза и васкулогенеза.
β
При анализе результатов иммуногистохимических реакций определяется в краях раны положительная реакция на TGF, имеет место окрашивание сайтов связывания антител с фактором в цитоплазме стромальных клеток дермы - фибробластах, фиброцитах. Степень ее выраженности варьирует от слабой до умеренной. Различий между распределением продуктов иммуногистохимической реакции (ИГХР) в сетчатом или в сосочковом слоях нет. В эпидермисе и придатках кожи реакция отрицательная.
β
β
Результат ИГХР в струпе отрицательный. В большинстве участков поверхностный и глубокий слои лейкоцитарного вала также не окрашены. Исключение составляют небольшие по протяженности места глубокого слоя полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ), в которых наблюдается положительная реакция на TGF. В подлежащей грануляционной ткани положительная иммунопероксидазная реакция отмечается в цитоплазме фибробластов, фиброцитов, моноцитах/макрофагах и погибших мышечных волокнах. Слабая экспрессия TGF регистрируется в волокнистых структурах грануляционной и более зрелой соединительной ткани в глубине раны. В эндотелии микрососудов в относительно зрелых участках соединительной ткани продукты ИГХР не выявляются. В грануляционной ткани, напротив, клетки эндотелия демонстрируют иммунопозитивное окрашивание.
β
β
β
На седьмые сутки после ожога в группе контроля 1 в эпидермисе, волосяных фолликулах, сальных железах и волокнистых структурах дермы в краях ожоговой раны продукты ИГХР на TGF не выявляются или присутствуют в очень небольшом количестве. Умеренная реакция выявлена в цитоплазме фибробластов и фиброцитов краев раны и в макрофагах ее дна. Лейкоцитарный вал местами в глубоком слое умеренно окрашивается на TGF, оставаясь в ряде участков иммунонегативным. В волокнистых структурах грануляционной и соединительной ткани дна раны экспрессия TGF слабая, имеет очаговый характер (табл.2).
На седьмые сутки после ожога в опытной группе достоверно большая чем в группе контроля 1 интенсивность иммунопероксидазной реакции регистрируется в моноцитах, макрофагах дна раны и погибших мышечных волокнах. В них реакция оценивается как умеренная (табл.2).
Таблица 2
Активность фактора TGF<sub>β</sub> в контрольной и опытной ожоговой ране на 7 сутки после травмы
Структурный элемент
Интенсивность реакции на TGF<sub>β</sub> (от 0 до 3 баллов)
контроль 1
опыт
Край ожоговой раны
Эпителий волосяных фолликулов
-
-
Эпителий сальных желез
-
-
Фибробласты дермы
1,6±0,08
1,7±0,08
Волокнистые структуры сосочкового слоя
0,7±0,03
0,8±0,04
Поверхностные отделы сетчатого слоя
0,9±0,04
0,4±0,02
Глубокие отделы сетчатого слоя
1,0±0,05
0,08±0,02
Стенки сосудов
-
-
Базальный слой эпидермиса
-
-
Шиповатый слой эпидермиса
-
-
Зернистый слой эпидермиса
-
-
Роговой слой эпидермиса
-
-
Дно ожоговой раны
Струп
+
+
ПЯЛ под струпом (глубокий слой)
1,6±0,07
1,7±0,07
Макрофаги в дне раны
1,7±0,08
2,1±0,1*
Строма
0,8±0,03
0,9±0,04
Фибробласты
1,2±0,05
1,6±0,07
Эндотелий
0,7±0,03
0,8±0,04
* достоверно различимые показатели в сравнении с контролем.
β
На тринадцатые сутки после ожога различия между контролем 1 и опытной группами в локализации и количестве продуктов реакции на TGF не выявлены. Вместе с тем, установлены изменения в уровне экспрессии данного фактора по сравнению с предыдущим сроком. Они касаются глубокого слоя лейкоцитарного вала, моноцитов/макрофагов под слоем ПЯЛ, фибробластов, фиброцитов и эндотелия капилляров дна раны, где отмечается статистически достоверное повышение интенсивности ИГХР (табл.3 и 4).
Таблица 3
Активность фактора TGF<sub>β</sub> в контрольной ожоговой ране на 13 сутки после травмы
Структурный элемент
Интенсивность реакции на TGF<sub>β</sub> (от 0 до 3 баллов) (контроль 1)
7 сутки
13 сутки
Край ожоговой раны
Эпителий волосяных фолликулов
-
-
Эпителий сальных желез
-
-
Фибробласты дермы
1,6±0,08
1,9±0,08
Волокнистые структуры сосочкового слоя
0,7±0,03
0,9±0,04
Поверхностные отделы сетчатого слоя
0,9±0,04
0,7±0,03
Глубокие отделы сетчатого слоя
1,0±0,05
0,1±0,05
Стенки сосудов
-
-
Базальный слой эпидермиса
-
-
Шиповатый слой эпидермиса
-
-
Зернистый слой эпидермиса
.
>
Роговой слой эпидермиса
-
-
Дно ожоговой раны
Струп
+
+
ПЯЛ под струпом (глубокий слой)
1,6±0,07
2,4±0,08*
Макрофаги
1,7±0,08
2,6±0,1*
Строма
0,8±0,03
1,1±0,05
Фибробласты
1,2±0,05
2,1±0,09*
Эндотелий
0,7±0,03
1,6±0,07*
* достоверно различимые показатели в сравнении со сроком 7 дней в контроле
Таблица 4
Активность фактора TGF<sub>β</sub> в опытной ожоговой ране на 13 сутки после травмы
Структурный элемент
Интенсивность реакции на TGF<sub>β</sub> (от 0 до 3 баллов) (опыт)
7 суток
13 суток
Край ожоговой раны
Эпителий волосяных фолликулов
-
-
Эпителий сальных желез
-
-
Фибробласты дермы
1,7±0,08
1,5±0,07
Волокнистые структуры сосочкового слоя
0,8±0,04
0,6±0,03
Поверхностные отделы сетчатого слоя
0,4±0,02
0,4±0,02
Глубокие отделы сетчатого слоя
0,08±0,02
0,3±0,01
Стенки сосудов
-
-
Базальный слой эпидермиса
-
-
Шиповатый слой эпидермиса
-
-
Зернистый слой эпидермиса
-
-
Роговой слой эпидермиса
-
-
Дно ожоговой раны
Струп
+
+
ПЯЛ под струпом (глубокий слой)
1,7±0,07
2,3±0,1*
Макрофаги
2,1±0,1
2,4±0,1*
Строма
0,9±0,04
0,9±0,04
Фибробласты
1,6±0,07
2,3±0,1*
Эндотелий
0,8±0,04
1,7±0,09*
* достоверно различимые показатели в сравнении со сроком 7 дней в опыте
β
β
β
На шестнадцатые сутки после ожога в контрольной группе 1 в эпидермисе, волосяных фолликулах, сальных железах и волокнистых структурах дермы в краях ожоговой раны продукты ИГХР на TGF не выявляются или минимальны. Умеренная, местами выраженная реакция выявлена в цитоплазме фибробластов и фиброцитов. Лейкоцитарный вал в глубоком слое неравномерно умеренно и слабо реагирует с антителами к TGF, оставаясь на многих участках неокрашенным. Высокая интенсивность иммунопероксидазной реакции отмечается в цитоплазме моноцитов, макрофагов, эндотелии капилляров. В последних, имея преимущественно умеренную степень выраженности, она достигает максимума в части клеток. Фибробласты, фиброциты окрашены не на всех участках. Реакция в них оценивается как умеренная, снижаясь до минимальной по направлению вглубь раны. В волокнистых структурах грануляционной и соединительной ткани дна раны экспрессия TGF слабая, имеет очаговый характер (табл.5).
Таблица 5
Активность фактора TGF<sub>β</sub> в контрольной ожоговой ране на 16 сутки после травмы
Структурный элемент
Интенсивность реакции на TGF<sub>β</sub> (от 0 до 3 баллов) (контроль 1)
13 сутки
16 сутки
Край ожоговой раны
Эпителий волосяных фолликулов
-
-
Эпителий сальных желез
-
-
Фибробласты дермы
1,9±0,08
2,1+0,1
Волокнистые структуры сосочкового слоя
0,9±0,04
0,5±0,02
Поверхностные отделы сетчатого слоя
0,7±0,03
0,5±0,02
Глубокие отделы сетчатого слоя
0,1±0,05
0,6±0,02
Стенки сосудов
-
-
Базальный слой эпидермиса
-
-
Шиповатый слой эпидермиса
-
-
Зернистый слой эпидермиса
-
-
Роговой спой эпидермиса
-
-
Дно ожоговой раны
Струп
+
+
ПЯЛ под струпом (глубокий слой)
2,4±0,08
1,2+0,06*
Макрофаги
2,6±0,1
2,3+0,07
Строма
1,1±0,05
0,9+0,04
Фибробласты
2,1±0,09
2,3±0,08
Эндотелий
1,6±0,07
2,3±0,07*
* достоверно различимые показатели в сравнении со сроком 13 дней в контроле
β
На шестнадцатые сутки после ожога в опыте в краях раны положительная реакция на TGF имеет место в цитоплазме стромальных клеток дермы - фибробластов, фиброцитов. Степень ее выраженности оценивается как умеренная - высокая. В эпидермисе и придатках кожи реакция - отрицательная. Различий между распределением продуктов ИГХР в сетчатом или в сосочковом слоях нет.
β
β
Струп и поверхностный слой лейкоцитарного вала не окрашены. Глубокий слой ПЯЛ демонстрирует положительную умеренную и выраженную степень реакции на TGF. В подлежащей грануляционной ткани в большом количестве присутствуют клетки моноцитарно-макрофагального ряда. В их цитоплазме имеет место умеренная и выраженная иммунопероксидазная реакция, что достоверно выше, чем в группе сравнения. В цитоплазме фибробластов, фиброцитов, в эндотелии микрососудов также отмечается более высокая, умеренная и выраженная реакция. В волокнистых структурах грануляционной ткани и более зрелой соединительной ткани в глубине раны экспрессия TGF ограничивается слабой - умеренной степенью. Интенсивность реакции в этих элементах по мере удаления от поверхности раны не снижается (табл.6).
Таблица 6
Активность фактора TGF<sub>β</sub> в опытной ожоговой ране на 16 сутки после травмы
Структурный элемент
Интенсивность реакции на TGF<sub>β</sub> (от 0 до 3 баллов)
контроль 1
опыт
Край ожоговой раны
Эпителий волосяных фолликулов
W
-
Эпителий сальных желез
-
-
Фибробласты дермы
2,1±0,1
2,7±0,1*
Волокнистые структуры сосочкового слоя
0,5±0,02
0,7±0,02
Поверхностные отделы сетчатого слоя
0,5±0,02
0,6±0,03
Глубокие отделы сетчатого слоя
0,6±0,02
0,9±0,04
Стенки сосудов
-
-
Базальный слой эпидермиса
-
-
Шиповатый слой эпидермиса
-
-
Зернистый слой эпидермиса
-
-
Роговой слой эпидермиса
-
-
Дно ожоговой раны
Струп
+
+
ПЯЛ под струпом (глубокий слой)
1,2±0,06
2,2±0,0б*
Макрофаги
2,3±0,07
2,8±0,07*
Строма
0,9±0,04
0,8±0,04
Фибробласты
2,3±0,08
2,8±0,08*
Эндотелий
2,3±0,07
2,7±0,08*
* достоверно различимые показатели в сравнении с 16 сутками в контроле
При иммуногистохимическом анализе маркера Ki-67, отражающего величину пролиферативного пула клеток, выявлено, что:
на 7 сутки после ожога достоверных различий между экспрессией этого показателя не выявлено. К 13 суткам после ожога в обеих группах отмечается повышение экспрессии Ki-67 в фибробластах, эндотелии капилляров, макрофагах и полиморфноядерных лейкоцитах дна раны. Более высокая пролиферативная активность регистрируется в непосредственной близости в краях раны в базальном слое эпидермиса. В этой зоне в опытной группе пролиферация эпителия в базальном и частично в шиповатом слоях эпидермиса достоверно выше, чем в контроле. На 16 сутки в обеих группах возрастает экспрессия Ki-67 в макрофагах и эндотелии сосудов в дне раны, что обусловлено необходимостью фагоцитоза погибших тканевых компонентов, активацией иммунных реакций, развитием грануляционной и соединительной ткани. В опыте в этот срок экспрессия Ki-67 фибробластами дна раны, формирующими основные волокнистые структуры внеклеточного матрикса, достоверно выше, чем в контроле.
+
При иммуногистохимическом анализе маркера CD68 на клетках системы фагоцитирующих мононуклеаров как уникального регулятора клеточных и клеточно-матриксных взаимоотношений в очаге повреждения, включения в воспаление иммунной системы, активации репаративных механизмов, ограничения очага воспаления, определяя морфогенез пиогенной мембраны, осуществления избирательного фагоцитоза поврежденных тканей и регуляции репарации в продуктивную фазу, установлено, что увеличение экспрессии CD68 в моноцитарно-макрофагальных клеточных элементах достигает высоких величин в обеих группах (опыт и контроль 1) к 13 суткам в дне раны, на границе струпа и в подлежащей грануляционной ткани. Однако в опыте происходит их достоверно большее накопление во всех слоях ожоговой раны, опережающее контроль, включая и 16 сутки наблюдения, что может означать ранний переход воспалительного процесса в продуктивную фазу.
β
Иммуногистохимический анализ маркеров ММР-9 и ММР-2, как основных протеаз, участвующих в процессе заживления раны и эпителизации раневой поверхности, показал, что их активность изменяется по мере заживления ожоговой раны. Снижение активности указанных ферментов совпадает с активацией репаративной стадии. Синтез ММР происходит только в живых клетках. Эти ферменты участвуют в ремоделировании внеклеточного матрикса в течение раневого процесса, активируют превращение латентной формы TGF в активную. ММР-2 действует на протеолитические процессы, ММР-9, действуя на пролиферацию Т-лимфоцитов, обеспечивает иммуносупрессию, стимулирует ангиогенез.
Снижение экспрессии ММР-9 регистрируется на 13 сутки в опытной группе в лейкоцитарном вале под струпом, опережая таковую в контроле, включая и 16 сутки наблюдения. До этого времени различий между группами (опыт и контроль 1) и по срокам с момента нанесения ожога нет. К 16 дню в опыте отмечается существенное угнетение экспрессии ММР-9 в строме и фибробластах грануляционной ткани, соединительной ткани в дне раны. Представляется, что раннее снижение активности деструктивных изменений, вызываемых ММР-9, способствует ускорению репаративных процессов.
Выраженность экспрессии ММР-2 и ее локализация в обеих группах до 16 суток не изменяется. Исключение составляет слой макрофагов в дне раны, граничащий с ПЯЛ, где реакция достоверно выше, чем в контрольной группе.
Коллагены IV и VII типов, являясь компонентами базальных мембран эпителия и сосудов, позволяют судить о завершенности ремоделирования ткани. Достоверные различия между опытной и контроль 1 группами в экспрессии коллагенов IV и VII типов выявляются на 13 сутки. В опыте коллагенизация дна раны наступает раньше и осуществляется активнее до 16 суток. Раньше, чем в контроле, и в большем объеме формируются базальные мембраны микрососудов в созревающей грануляционной ткани, заполняющей дно раны.
Таким образом, применение композиции для лечения глубокого ожога IIIБ степени, содержащей коллаген, хитозан медицинского назначения с молекулярной массой 100-700 kDa и степенью дезацетилирования свыше 95%, глиокозаминогликаны, а также имплантированные аллогенные фибробласты в кондиционированной питательной среде, существенно ускоряет процесс заживления, создавая благоприятные условия для полноценного восстановления дермального слоя кожи.
Литература
1. Патент РФ №2193895, A61L 15/28, БИПМ №34 от 2002.12.10.
2. Патент РФ №2219954, A61L 15/28, БИМП №36 от 2003.12.27.
3. Патент РФ №2108114, A61L 15/28. БИМП №10 от 10.04.98.
4. Патент №2108078, A61L 15/00. (БИ №10) 1998.04.10.
5. В.П.Туманов, Л.И.Будкевич // Педиатрия. Журнал им. Г.Н.Сперанского. - 1999. - №5. - С.13.
6. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Расулов М.Ф. и др. // Вестник хирургии. - 2003. - Т.162, №4. - С.38-42.
7. Расулов М.Ф., Севастьянов В.И., Егорова В.А. и др. // Патофизиология и экспериментальная терапия. - 2005. - №2. - С.20-23.
8. Спичкина О.Г., Калмыкова Н.В., Воронкина И.В. // Скорая медицинская помощь. - 2006. - №3. - С.178-180.
9. Патент РФ №2254145, A61L 15/28, 15/32, 26/00. БИПМ №17 от 20.06.2005.
10. Патент РФ №2252787, A61L 15/28, 15/32, 27/60, БИПМ №15 от 27.05.2005.
11. Клебановас Ю., Лашас Л., Лашене Д., Пангоните Д. Проблемы эндокринологии, 2005. - №1. - с.42.