СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОКОЛИЧЕСТВ КЛОЗАНТЕЛА В ПЛАЗМЕ, МОЛОКЕ, ТКАНЯХ
METHOD FOR MICRODETERMINATION OF CLOSANTEL IN PLASMA, MILK, TISSUES

Изобретение относится к области ветеринарной медицины и касается определения микроколичеств клозантела в плазме, молоке, тканях животных после применения инъекционных препаратов, содержащих клозантел, таких как клозантин, клозентекс, фасковерм, роленол, сантел и др., используемых для защиты животных от экто- и эндопаразитов.
Клозантел - соединение, обладающее широким спектром противопаразитарного действия, используется для лечения и профилактики инвазий крупного рогатого скота и овец. Наиболее важной и востребованной является их высокая фасциолоцидная активность (Архипов И.А. и др. Спектр противопаразитарного действия сантела. Ветеринария, 1998, № 2, с.26-28). Клозантел эффективен против 6-недельных и половозрелых Fasciola hepatica и F.gigantica. В спектр противопаразитарной активности клозантела входит эффективность против нематод желудочно-кишечного тракта овец и крупного рогатого скота (например, H.contortus) (Waruiru R.M. Efficacy of closantel, albendazol and levamisol on an ivermectin resistant strain of Haemonchus contortus in sheep. Veter. Parasitol, 1997, V.73, № 1/2, p.65-71).
По своему химическому строению клозантел относится к салицинидам. Клозантел как и другие салициниды является водородоионофором и, как следствие, сильным разобщителем окислительного фосфорилирования. Это свойство лежит в основе противопаразитарного действия препаратов на основе клозантела (Bossche H. Van Den et al. Closantel a new antiparasitaric hudrogen ionophore. Drug. Chem. Toxicology, 1985, V.8, № 3, p.101-123).
Для изучения механизма действия препарата, его фармкинетики и определения остаточных количеств клозантела в пищевых продуктах после применения препарата требуется высокочувствительный метод определения микроколичеств клозантела в плазме, молоке, тканях животных. Трудность определения микроколичеств в животных тканях, особенно в крови, после введения животным соответствующих клозантелсодержащих препаратов, обусловлена тем, что клозантел легко и достаточно прочно связывается с альбумином крови (Van Wyk J.A/ et al Two fieldstrains of haemonchus resistans to rafoxanid, Ondersyepoort. J. Vet. Res., 1988, V.54, № 2, p.143-146).
Известно, что на долю альбумина приходится около 60% общего белка плазмы. Альбумин - один из самых низкомолекулярных белков плазмы (М=69000). Общая площадь поверхности множества мелких молекул альбумина велика, поэтому они хорошо подходят для выполнения функции переноса многих транспортируемых кровью веществ. Известна высокая связывающая способность альбумина, одна молекула альбумина может связать 25-30 молекул билирубина (Физиология человека. Под ред. Р.Шмидта, Г.Гевса, 1996, т.8, с.419).
Таким образом, после введения животным клозантелсодержащих препаратов клозантел в крови и тканях может находиться как в свободном, так и в связанном состоянии. Свободный клозантел легко экстрагируется определенными растворителями, тогда как связанный клозантел перед экстракцией необходимо перевести в свободное состояние.
Известен ряд методов определения клозантела в плазме и тканях животных. К сожалению, не всегда указывается о клозантеле, в каком состоянии идет речь. Способом, явившимся прототипом настоящего изобретения, является способ определения микроколичеств клозантела, описанный в работе Benchaoui H.A (Benchaoui H.A. et al. Determination of rafoxanid and closantel in ovine plasma by high performance liquid chromatography. Biomedical chromatography, 1993, V.7, p.181-183).
При подготовке проб к анализу для переведения связанного клозантела в свободное состояние авторы применили предварительное замораживание биологических образцов в низкотемпературном шкафу при минус 20°С в течение 24 часов с последующим медленным размораживанием. Далее клозантел экстрагировали и проводили определение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на аналитической колонке с детекцией при 282 нм. Процент экстракции 80%.
Недостаток известного метода состоит в необходимости замораживать образцы при минус 20°С и в последующем медленном размораживании. Для этого требуется дорогостоящая низкотемпературная холодильная установка. Подготовка образца к экстракции занимает около 40-48 часов.
Другим недостатком известного метода является нестабильность экстракции, т.к. замораживание и оттаивание не гарантируют 100% расщепления белка в местах связывания с клозантелом.
Для получения возможности определять как свободный, так и связанный клозантел в образцах плазмы, молока и тканей разработан прием предварительного ферментного гидролиза белка плазмы и животных тканей, с которым происходит связывание клозантела.
Заявленный способ определения микроколичеств клозантела в плазме включает отбор пробы крови, центрифугирование образца с получением плазмы, ферментный гидролиз белка, экстракцию из пробы клозантела, его очистку и последующее определение ВЭЖХ методом. Способ определения микроколичеств клозантела в молоке и тканях животных включает отбор пробы, подготовку пробы к анализу, состоящую из проведения ферментного гидролиза белков, экстракции клозантела и его очистки с последующим определением методом ВЭЖХ.
Ферментный гидролиз белков проводят в присутствии фермента химотрипсина, (например α-химотрипсина фирмы ICN), что приводит к расщеплению внутренних связей в белковой молекуле с образованием олигопептидов. Химотрипсин отличается от трипсина более глубоким гидролизом белка (М.Д.Машковский Лекарственные средства, 1998, т.2. С.113). Гидролиз проводится при температуре, равной температуре тела животных, в пределах 37-40°С (Lang H. Sinthese und Eigenschaften polymer gebundener Enzyme. Nachr. Chem. Techn., 1972, V.20, p.71).
Экстрагентами клозантела могут служить хлороформ и ацетонитрил, метанол или их смеси.
Очистка клозантела осуществляется экстракцией примесей гексаном.
Хроматографический анализ клозантела проводят на колонке Диасорб С-16 в изократическом режиме в системе ацетонитрил: 0.01М ортофосфорная кислота в соотношении 9:1 при длине волны 237 нм. При этом клозантел элюируется со временем удерживания между 8-9 минутой. Чувствительность метода - 2 мкг/мл плазмы, молока или ткани животных.
Количество химотрипсина, вносимое в плазму, молоко или ткани при проведении ферментного гидролиза, позволяет получать максимальный процент экстракции и является оптимальным. Его уменьшение приводит к снижению процента экстракции клозантела. Определено оптимальное время ферментного гидролиза, равное 1 час для плазмы и молока и 2 часа для тканей. Уменьшение времени инкубации приводит к снижению процента экстракции клозантела из плазмы до 50-60%. Увеличение времени инкубации не влияет на полноту экстракции (таблица 1).
Показана возможность экстракции предложенным методом как низких, так и высоких концентраций клозантела с неизменным процентом экстракции.
Пример осуществления предлагаемого изобретения.
Пример 1. Определение клозантела в плазме (модельный опыт).
Клозантел внесли в плазму, полученную из крови телят, в количестве, указанном в таблице 2. Далее провели подготовку образцов к анализу. 1,0 мл плазмы поместили в сцинтилляционный флакон, туда же добавили 0,1 мл водного раствора, содержащего 10 мг химотрипсина. После чего образцы были помещены в термошкаф. Время инкубации 1 час, температура инкубации 40°С. После проведения ферментного гидролиза в охлажденные до комнатной температуры пробы добавили по 2 мл ацетонитрила и 4 мл хлороформа. Экстракцию проводили дважды при встряхивании в течение 10 минут с последующим центрифугированием при 4500 об/мин. Полученные экстракты отобрали, объединили вместе и упарили в вакууме при 50°С досуха. Остаток растворили в ацетонитриле, трижды промыли гексаном, упарили в вакууме досуха и растворили в 1 мл метанола.
Проведение хроматографического анализа. На хроматографическую колонку, заполненную обращенной фазой Диасорб С-16, нанесли 0.05 мл подготовленного образца. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил: 0,01 М ортофосфорная кислота в соотношении 9:1 соответственно. Скорость потока 1 мл/мин. Давление 130 атм. Детектирование вели при длине волны 237 нм. Время удерживания клозантела составило 8-9 минут.
Результаты определения клозантела в плазме телят приведены в таблице 2.
Пример 2. Определение оптимального времени инкубации при проведении ферментного гидролиза (модельный опыт).
Клозантел внесли в плазму, полученную из крови телят, в количестве 10 мкг/мл. Далее вели подготовку образцов к анализу. 1,0 мл плазмы поместили в сцинтилляционный флакон, туда же добавили 0,1 мл водного раствора, содержащего 10 мг химотрипсина. После чего образцы были помещены в термошкаф на 0,5, 1 и 1,5 часа при температуре 40°С. После проведения ферментного гидролиза в охлажденные до комнатной температуры пробы добавили по 2 мл ацетонитрила и 4 мл хлороформа. Экстракцию проводили дважды при встряхивании в течение 10 минут с последующим центрифугированием при 4500 об/мин. Полученные экстракты отобрали, объединили вместе и упарили в вакууме при 50°С досуха. Остаток растворили в ацетонитриле, трижды промыли гексаном, упарили в вакууме досуха и растворили в 1 мл метанола.
Проведение хроматографического анализа. На хроматографическую колонку, заполненную обращенной фазой Диасорб С-16, нанесли 0.05 мл подготовленного образца. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил: 0.01 М ортофосфорная кислота в соотношении 9:1 соответственно. Скорость потока 1 мл/мин. Давление 140 атм. Детектирование вели при длине волны 237 нм. Время удерживания клозантела составило 8-9 минут.
Результаты определения клозантела в плазме телят приведены в таблице 2.
Пример 3. Определение клозантела в молоке (модельный опыт).
Клозантел внесли в молоко коров в количестве, указанном в таблице 2. Далее вели подготовку образцов к анализу. 1,0 мл молока поместили в сцинтилляционный флакон, туда же добавили 0,1 мл водного раствора, содержащего 10 мг химотрипсина. После чего образцы были помещены в термошкаф. Время инкубации 1 час, температура инкубации -40°С. После проведения ферментного гидролиза в охлажденные до комнатной температуры пробы добавили по 2 мл ацетонитрила и 4 мл хлороформа. Экстракцию проводили дважды при встряхивании в течение 10 минут с последующим центрифугированием при 4500 об/мин. Полученные экстракты отобрали, объединили вместе и упарили в вакууме при 50°С досуха. Остаток растворили в ацетонитриле, трижды промыли гексаном, упарили в вакууме досуха и растворили в 1 мл метанола.
Проведение хроматографического анализа. На хроматографическую колонку, заполненную обращенной фазой Диасорб С-16, нанесли 0,05 мл подготовленного образца. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил: 0,01 М ортофосфорная кислота в соотношении 9:1 соответственно. Скорость потока 1 мл/мин. Давление 150 атм. Детектирование вели при длине волны 237 нм. Время удерживания клозантела составляло 8-9 минут.
Результаты определения клозантела в молоке приведены в таблице 2.
Пример 4. Определение клозантела в тканях (модельный опыт).
Клозантел внесли в измельченные в блендере пробы мышц телят в количестве, указанном в таблице 2. Далее вели подготовку образцов к анализу. 5,0 г ткани поместили в сцинтилляционный флакон, туда же добавили 5 мл 0,05 М трис-НСl буфера, содержащего 0,09% NaCl (pH 7,1) и 0,3 мл водного раствора, содержащего 100 мг химотрипсина. После чего образцы были помещены в термошкаф. Время инкубации 2 часа, температура инкубации - 40°С. После проведения ферментного гидролиза в охлажденные до комнатной температуры пробы добавили по 4 мл ацетонитрила и метанола и экстрагировали клозантел при встряхивании в течение 1 часа. Вторую экстракцию проводили 6 мл ацетонитрила в течение 0,5 часа с последующим центрифугированием при 4500 об/мин. Полученные экстракты отобрали, объединили вместе и упарили в вакууме при 50°С С до водного слоя и экстрагировали из него клозантел 5 мл хлороформа. Хлороформенный экстракт упарили досуха при 40°С. Остаток растворили в ацетонитриле, трижды промыли гексаном, упарили в вакууме досуха и растворили в 1 мл метанола.
Проведение хроматографического анализа. На хроматографическую колонку, заполненную обращенной фазой Диасорб С-16, нанесли 0,05 мл подготовленного образца. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила с 0,01М ортофосфорной кислотой в соотношении 9:1 соответственно. Скорость потока 1 мл/мин. Давление 155 атм. Детектирование вели при длине волны 237 нм. Время удерживания клозантела составило 8-9 минут.
Результаты определения клозантела в тканях телят приведены в таблице 2.
Предлагаемое изобретение дает возможность определять микроколичества как свободного, так и связанного клозантела в плазме, молоке, тканях сельскохозяйственных животных.
Таблица 1.Влияние времени инкубации на процент экстракции клозантела из плазмы.
Время
внесено
обнаружено
% экстракции
t, ч
мкг/мл
мкг/г
0,5
10
5,67
56.7
1
10
8,3
83
1,5
10
8,13
81,1
Таблица 2.Результаты определения клозантела в плазме, тканях, молоке.
Вид
№
внесено
обнаружено
% экстракции
пробы
эксперимента
мкг/мл (г)
мкг/г
плазма
1
2
1,58
79
2
3
2,48
81,5
3
4
3,304
82,6
4
5
3,93
78,6
5
10
8,30
83
6
15
11,83
79
7
20
16,66
83,3
8
30
23,96
80,00
среднее
80,88
ткани
9
2,00
1,78
89
10
3,40
3,06
90
молоко
11
2,00
1,85
92,5
12
15
13,60
90,1