Свойства остеопластических материалов, импрегнированных сульфатированными гликозаминогликанами

Cвоиства остеопластических материалов, импрегнированных сульфатированными гликозаминогликанами

М.В. Лекишвили, М.Г. Васильев

ФГБУ «<Центральный институт травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова» МЗ РФ, Москва Контакты: Михаил Васильевич Лекишвили, 4509981@mail.ru

Данные, приведенные в статье, явились результатом комплексного экспериментального исследования отдельно сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ) с использованием культуры стромальных клеток костного мозга барана in vitro и костного коллагена, импрегнированного сГАГ, на модели гетеротопической имплантации на крысах и модели ортотопической имплантации на кроликах.

Достоверных данных, подтверждающих стимулирующее влияние сГАГ на регенерацию клеток и тканей, нами получено не было. Разработанный биокомпозиционный материал на основе аллогенного костного коллагена, импрегнированного сГАГ, был применен у 54 больных с различной костной патологией.

Положительные результаты хирургического лечения с использованием разработанного материала были получены у 48 пациентов, что составило 89% наблюдений и расценено как хороший показатель.

Ключевые слова: остеопластические материалы, сульфатированные гликозаминогликаны, эксперимент.

The properties of osteoplastic materials impregnated with sulfated glycosaminoglycans

M.V. Lekishvili, M.G. Vasiliev

Central Research Institute of Traumatology and Orthopaedics n.a. N.N. Priorov

The presented data have been obtained as a result of a comprehensive experimental study of separately sulfated glycosaminoglycans (sGAG) using in vitro stromal cell cultures of the sheep bone marrow and the bone collagen impregnated with sGAG on a rat heterotopic implantation model and on a rabbit orthotopic implantation model.

We have not obtained credible evidence that would support a sGAG stimulating effect on cell and tissue regeneration. The designed biocomposite material based on sGAG-impregnated allogenic bone collagen was used in 54 patients with various bone diseases.

Surgical treatment using developed material demonstrated a positive effect on outcomes in 48 patients (89%) that was regarded as a good result.

Key words: osteoplastic materials, sulfated glycosaminoglycans, experiment.

Введение

Уровень травматизма и заболеваний костной системы в России остается, к сожалению, на очень высоком уровне. В этой связи восстановление целостности костной ткани при различных патологических состояниях является одной из наиболее актуальных и сложных задач травматологии и ортопедии. Многолетний клинический опыт показывает, что для достижения положительного результата лечения патологии костной системы решающим фактором часто становятся имплантируемые биологические материалы. До сих пор многие исследователи считают, что оптимальным костно-пластическим материалом являются аутоткани, чье использова-

ние полностью исключает иммунологические реакции после заполнения ими тканевых дефектов [1—4]. Однако известно, что их получение возможно только непосредственно в процессе оперативного вмешательства, причем количество получаемых тканей всегда ограничено, особенно у детей, а процедура их забора сопровождается рядом негативных последствий как в процессе забора, так и после него. Все это справедливо ограничивает тактику широкого применения аутотканей в реконструктивной хирургии [5-7].

Что касается пластических материалов, предназначенных для восстановления поврежденных тканей, то в настоящее время предложено их большое разнообразие - биологических, синтетических, композиционных и т.д. К данным материа-

лам сформированы основные общемировые требования - прежде всего имплантируемые материалы должны быть максимально безопасными для пациентов. Дополнительно за счет набора своих свойств в результате имплантации они должны обеспечивать полное органотипическое восстановление, в частности костной ткани, в максимально короткие сроки при своей полной биодеградации [8-12]. При этом человеческая мысль не стоит на месте, и в мировой биоимплантологии идет постоянный поиск создания биокомпозиционных форм, эффективных в процессе восстановления поврежденных тканей. В этой связи определенный интерес представляют сульфатированные гликозаминогликаны (сГАГ) как компонент костного матрикса, участвующего в регуляции процессов костеобразования. В соединительной ткани они входят в состав протеогликановых комплексов.

Всестороннее изучение сГАГ, по мнению ряда исследователей позволило говорить об их стимулирующем влиянии на процессы регенерации костной и хрящевой ткани практически на всех этапах регенерации [13-15]. Были получены данные об участии сГАГ в формировании коллагеновых волокон в процессе сборки молекулы матрикса [16-18]. Некоторые исследования показали, что сГАГ играют важную роль в процессе отложения кальция в созревающей костной ткани, действуя как активные хелаторы ионов кальция, обеспечивающие накопление в ткани кальция до концентрации, достаточно высокой для минерализации [19]. Ряд исследований показал, что отсутствие или недостаток сГАГ приводит к нарушению процесса костеобразования [20-22].

Данные, приведенные в статье, явились результатом комплексного исследования, направленного на получение максимально возможной объективной оценки свойств биокомпозиционного материала на основе аллогенного костного коллагена, импрегнированного сГАГ и предназначенного для клинического использования в травматологии и ортопедии.

Материал и методы

Анализ влияния сГАГ на пролиферацию и диф-ференцировку стромальных клеток костного мозга проводили in vitro на культуре стромальных клеток костного мозга барана в трех сериях опытов. В первой серии клетки костного мозга выращивали в среде, содержащей сГАГ в концентрации 50 мкг/мл, во второй серии концентрация сГАГ была 250 мкг/ мл, в третьей - 500 мкг/мл. В контрольной серии сГАГ в культуральную среду не добавляли. Опыт-

ные и контрольная серии эксперимента сравнивались по двум параметрам: по внешнему виду клеток в культуре и по их количеству. Культивирование проводили в течение 7 суток. На 7-е сутки культивирования клетки из 3 флаконов снимали трипсином и подсчитывали их количество во флаконе в камере Горяева. По одному флакону клеточных культур из каждой серии опытов на 7-е сутки культивирования фиксировали и окрашивали по Гимза-Романовско-му для морфологического исследования клеточных культур.

В качестве референсного метода исследования использовали МТТ-тест. Для проведения МТТ-те-ста клетки высевали в 24-луночные платы с плотностью 50 000 клеток/лун. Через 24 часа, когда клетки распластывались, в лунки вносили раствор сГАГ с таким расчетом, чтобы получить три серии: 1-я серия с концентрацией сГАГ в культуральной среде 50 мкг/мл, 2-я серия - 250 мкг/мл и 3-я серия -500 мкг/мл. В контрольной группе в культуральную среду раствор сГАГ не добавляли. Инкубировали клетки в течение 72 часов. Затем в лунки вносили МТТ и инкубировали в его присутствии (0,25 мг/ мл, Serva, Германия) в течение еще 3 часов. Форма-зан элюировали с помощью диметилсульфоксида в течение 30 минут при 37° С и проводили измерение оптической плотности элюата на плашечном фотометре «ЭФОС 9305» при длине волны 570 нм. Статистический анализ полученных данных выполняли в программе Microsoft Excel с применением метода дисперсионного анализа.

Исследование свойств костного коллагена, им-прегнированного сГАГ, проводили на модели ге-теротопической имплантации. Образование или отсутствие элементов костной ткани в области помещения какого-либо материала в мягкие ткани служит общепризнанным тестом на выявление остеоиндуктивных свойств исследуемых материалов - это так называемая модель гетеротопической имплантации [23, 24].

Для исследования остеоиндуктивного эффекта пластических материалов на основе костного коллагена, импрегнированного сГАГ, были изготовлены блоки костного коллагена из губчатого слоя костной ткани размером 3 x 3 x 1 мм, которые были насыщены сГАГ в дозе 700 мкг/см3. Контролем служили аналогичные образцы костного коллагена без насыщения сГАГ.

Эксперимент проводили на 20 половозрелых крысах породы Вистар массой тела 150-200 г. Под тиопенталовым наркозом (внутрибрюшинно из расчета 6 мг на 100 г массы тела) животным делали кожные разрезы по средней линии живота, затем

делали надрез фасции слева и справа от средней линии и в образовавшиеся мышечные карманы помещали исследуемые образцы. Каждому животному был имплантирован один экспериментальный образец и один контрольный. Животных выводили из эксперимента через 1 месяц. Фрагменты тканей с имплантированными блоками вырезали, фиксировали в формалине. Полученные гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином.

Исследование свойств костного коллагена, импрегнированного сГАГ, на модели ортотопической имплантации проводили на половозрелых кроликах породы шиншилла в возрасте 1 года, массой тела около 3 кг на модели сегментарной резекции лучевой кости правой передней конечности. Животные были разделены на две группы по 10 кроликов в каждой. У животных опытной группы в сегментарный дефект лучевой кости размером 10 мм имплантировали блоки костного коллагена, полученного из спонгиозной костной ткани, импрегнированные сГАГ в дозе 700 мкг/см3. В контрольной группе животных дефект заполняли аналогичными блоками костного коллагена без сГАГ. Наркоз осуществляли внутримышечным введением 2,5 мл 10% раствора кетамина и 1 мл седуксена. Местную анестезию проводили раствором 0,5% новокаина в объеме 2 мл. В ходе операции выполняли сегментарную резекцию в средней трети диафиза лучевой кости на протяжении 1 см. Имплантируемый материал помещали в дефект, полностью его восполняя. В период наблюдения проводили рентгенологический контроль. Морфологические исследования были сделаны через 1 и 3 месяца от начала эксперимента.

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программы Microsoft Excel. В данном случае был применен Ц-критерий Манна-Уитни.

Для клинического использования был создан биокомпозиционный материал на основе аллоген-ных тканей, включающий костный коллаген, сГАГ и гидроксиапатит. Материал разработали в тканевом банке ЦИТО им. Н.Н. Приорова совместно с фирмой «Конектбиофарм», который получил коммерческое название «Остеоматрикс».

Анализ внедрения костно-пластического материала на основе костного коллагена, импрегниро-ванного сГАГ, «Остеоматрикс» и его эффективности проводили на основе результатов лечения 54 больных. Их возраст составил от 2 до 73 лет. Локализация поражений и их нозологическая форма имели достаточно широкий диапазон. У 9 пациентов была диагностирована гигантоклеточная опухоль, у 7 -солитарная киста, у 7 - хондрома, у 5 - аневриз-

мальная киста, у 5 - метафизарный фиброзный дефект, у 4 - фиброзная дисплазия, у 4 - энхондро-ма, у 3 - остеоидная остеома, у 2 - ложный сустав и по одному случаю - эозинофильная гранулема, остеохондрома, хондроматоз, несросшийся перелом, неврогенная опухоль, грыжа межпозвонкового диска и внутрикостная липома. С использованием только материала «Остеоматрикс» в виде блоков были прооперированы 33 больных, у остальных «Остеоматрикс» применили в сочетании с другими материалами: деминерализованными костными аллоимплантатами «Перфоост», замороженными кортикальными аллоимплантатами и композиционным материалом «Коллапан», включающим в себя синтетический гидроксиапатит, склеральный ксе-ноколлаген и гентамицин. Обследование пациентов проводили с применением клинических, рентгенологических, включая компьютерно-томографические, методов исследования.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования влияния сГАГ на морфологию клеточных культур стромальных клеток костного мозга и пролиферацию клеток in vitro показали, что клетки в клеточных культурах, включая контроль и опытные серии, имели правильный ориентированный рост и стандартную вытянутую веретеновидную форму. Хорошо контрастирова-лись ядра с ядрышками. В цитоплазме отсутствовала цитотоксическая зернистость. Картина была характерной для стандартной культуры стромальных клеток костного мозга (рис. 1).

Рис. 1. Вид культуры стромальных клеток костного мозга барана через 7 суток культивирования. Окраска по Гимза-Романовскому. Увеличение х 100

При подсчете количества клеток в камере Горя-ева мы не выявили статистически достоверной разницы между исследуемыми экспериментальными сериями и контролем. Данные указаны в табл. 1.

Таблица 1. Влияние растворов сГАГ разной концентрации на пролиферацию стромальных клеток костного мозга (СККМ) барана

Контроль (без сГАГ) Концентрации сГАГ в культуре СККМ барана

50 мкг/мл 250 мкг/мл 500 мкг/мл

3,88 х106 3,77 х106 3,77 х106 3,8 х106

3,8 х106 3,78 х106 3,8 х106 3,82х106

3,85 х106 3,8х106 3,79 х106 3,82 х106

М±т 3,84±0,04 3,78±0,02 3,79±0,02 3,81±0,01

Р=3,36

Результаты МТТ-теста подтвердили отсутствие влияния сГАГ на пролиферацию стромальных клеток костного мозга (табл. 2). Как видно из табл. 2, оптические плотности образцов, полученных в разных опытных сериях, статистически не отличаются от контроля. Результаты проведенных исследований с использованием культуральных сред показали отсутствие какого-либо стимулирующего влияния растворов сГАГ на скорость деления стромальных клеток костного мозга барана независимо от концентрации растворов сГАГ (50 мкг/мл, 250 мкг/мл и 500 мкг/мл). Между тем очевидно, что сГАГ, выделенные в соответствии с патентом РФ № 2162331, не обладают цитотоксичностью, что, в свою очередь, не препятствует их использованию в клинической практике, учитывая многолетнее мнение ряда ученых о благоприятном влиянии сГАГ на регенерацию поврежденных тканей.

Таблица 2. Результаты МТТ-теста: оптическая плотность при длине волны 570 нм

Контроль (клетки без сГАГ) Концентрации сГАГ в культуре СККМ барана

50 мкг/мл 250 мкг/мл 500 мкг/мл

1 1,028 0,9529 0,8391 0,9662

2 1,029 0,9451 0,8387 0,9679

3 1,027 0,9448 0,8406 0,9652

4 1,026 0,9554 0,8329 0,9657

5 1,026 0,9534 0,8367 0,9711

М±т 1,027±0,001 0,9503±0,005 0,8376±0,003 0,9762±0,0023

Р=3,04

При гистологическом исследовании свойств костного коллагена, импрегнированного сГАГ, на модели гетеротопической имплантации в опытной и контрольной группах имплантированный материал через 1 месяц эксперимента находился на различных стадиях резорбции. В большинстве случаев больший объем образцов был сохранен, часть трабекул расслоена, в каждом препарате обнаруживались гигантские многоядерные клетки, осуществляющие резорбцию костного матрикса. Межтрабекулярные пространства имплантатов были заполнены различной по степени «зрелости» соединительной тканью. Состояние опытных образцов отличалось от контрольных большей сохранностью структур имплантатов. Но наиболее значимое отличие опытных образцов от контрольных заключалось в большем количестве кровеносных сосудов, где, как известно, наличие развитой сосудистой сети является благоприятным условием для гетерото-пического костеобразования (рис. 2). В большинстве случаев на поверхности трабекул отсутствовали какие-либо остеогенные клеточные элементы, однако в одном случае в опытной группе имелись участки, в которых трабекулы были покрыты плотным слоем клеток, по своей морфологии напоминающие остеобласты: клетки близко располагались друг к другу, имели прямоугольную форму, а под ними находилась оксифильная прослойка, похожая на остеоид (рис. 3). Анализируя результаты гистологических исследований как в опытных, так и в контрольных группах, мы констатировали отсутствие выраженных признаков остеогенеза, хотя в одном из опытных образцов имелись признаки начинающегося процесса костеобразования и во всех случаях предпосылки к нему - наличие сосудистой сети. Скорее всего, эксперимент надо было проводить более длительно, возможно, в течение 3 месяцев. Известно, что при использовании гетеротопической модели эксперимента в эти сроки на месте материалов, имплантированных крысам и обладающих остеоин-дуктивностью, формируется эктопическая кость. Более длительный срок эксперимента в отличие от срока, выбранного нами, дал бы большую и объективную информацию - являются ли исследуемые материалы остеоиндуктивными или нет. В нашем же случае мы сравнивали материалы с сГАГ и без таковых и их влияние на формирование костной ткани на ранних сроках. В результате разницы уловить не удалось.

При помощи рентгенологического контроля на разных сроках исследования свойств костного коллагена, импрегнированного сГАГ и без них, на модели ортотопической имплантации мы получили

Рис. 2. Гистиоцитарный (мононуклеарный/макрофагаль-ный) инфильтрат в межтрабекулярном пространстве у животных опытной группы: 1 - трабекулы деминерализованного костного матрикса (ДКМ); «звездочкой» отмечены сидерофаги; стрелкой указан кровеносный сосуд с эритроцитами. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400

Рис. 3. Участок поверхности трабекулы образца с плотно расположенными клетками, подобными остеобластам (опытная группа): 1 - костные трабекулы ДКМ; 2 -остеобластоподобные клетки; стрелкой указана гигантская многоядерная клетка. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 200

данные, свидетельствующие об отсутствии существенных различий между опытом и контролем. На рентгенологических снимках в опытной и контрольной группах на 14-е сутки после операции дефект лучевой кости оставался с четкими ровными контурами. Мягкие ткани в области локтевой кости были уплотненными за счет послеоперационного отека. К 30-м суткам и в опытной, и в контрольной группе в области дефектов лучевой кости рентгенологически

определялось образование облаковидной костной мозоли. На 60-е сутки эксперимента в области дефектов наблюдалась плотная костная мозоль, заполняющая почти весь объем дефекта. На 90-е сутки было констатировано полное восстановление костной структуры и костномозговых каналов кости кроликов как в опытной, так и в контрольной группах (рис. 4).

В

5 \

I

Рис. 4. Рентгенограмма области операции: а - через 14 суток после имплантации материала; б - через 30 суток; в - через 60 суток; г - через 90 суток после операции

Гистологическое исследование препаратов показало, что восстановление костной ткани в обеих группах проходило через стадию энхондрального окостенения. К 1-му месяцу дефекты лучевой кости были заполнены незрелой костной тканью, сохраняющей в себе очаги хрящевой ткани. В немногочисленных областях незрелой кости обнаруживалось большое количество остеобластов и умеренное число остеокластов. Незрелая костная структура была окружена грубоволокнистой остеогенной соединительной тканью (рис. 5).

Рис. 5. Незрелая костная масса с очагами хрящевой ткани, окруженная грубоволокнистой остеогенной тканью, через 1 месяц. Контрольная группа - применение сГАГ. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 100

К 3-му месяцу экспериментального исследования была выявлена динамика морфологического изменения хрящевой ткани: развивающийся хрящ -пролиферирующий - созревающий, - последний затем замещается костным матриксом (рис. 6). Губчатая незрелая кость становилась более массивной за счет утолщения костных балок и аппозиционного роста со стороны лакун (рис. 7). Сами лакуны в губчатой кости заполнялись костными клетками и волокнистыми структурами. Через 3 месяца эксперимента после имплантации в костный дефект материалов губчатая кость становилась более компактной по сравнению с таковой через 1 месяц.

Данные морфометрии гистологических препаратов представлены в табл. 3 и 4. В связи с тем, что объем выборки недостаточен для того, чтобы сделать вывод о нормальности распределения сравниваемых признаков в генеральной совокупности, для статистического анализа полученных данных мы использовали непараметрический Ц-критерий Манна-Уитни.

Рис. 6. Замещение хрящевой ткани костным матриксом через 3 месяца. Опытная группа - применение сГАГ. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 100

Рис. 7. Утолщение костных балок со стороны лакун через 3 месяца. Опытная группа - применение сГАГ. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 100

При сравнении опытной и контрольной групп по количеству хрящевой ткани в гистологических препаратах через 1 месяц после операции с применением Ц-критерия выявили, что Т (сумма рангов) опытной группы составила 36, а Т контрольной группы - 19, Ц-критерий равен 4, критическое значение Ц-критерия при р < 0,05 - 4. Следовательно, количество хрящевой ткани в опытных образцах было статистически достоверно больше, чем в контрольных (р < 0,05). Аналогичное сравнение количества новообразованной костной ткани через 1 месяц после операции показало, что статистически достоверной разницы между опытной и контрольной группами нет: ЦЭмп=9,5 (ЦКр=4 при р < 0,05).

Таблица 3. Гистоморфометрические показатели заживления костного дефекта через 1 месяц после операции

№ образца Масса ткани, % Толщина трабекул, мм

хрящевая ткань костная ткань

Опытная группа

1 7,3 46,4 0,09

2 42,7 24,5 0,085

3 13,0 66,4 0,10

4 8,6 67,0 0,088

5 10,8 75,4 0,085

Контрольная группа

6 7,4 56,2 0,083

7 6,6 30,8 0,081

8 9,8 42,3 0,085

9 6,7 67,0 0,09

10 8,4 55,6 0,09

^змп=4 иЭмп=9,5 иЭмп=8

Ц-критерий, полученный при сравнении количества хрящевой ткани в препаратах на 3-й месяц после операции, был равен 6 (Ц =4 при р < 0, 05). При сравнении опытной и контрольной групп по количеству новообразованной костной ткани ЦЭмп составил 12 (Ц=4 при р < 0,05), что также свидетельствует о том, что различия в этих группах статистически недостоверны.

Суммируя полученные нами результаты экспериментальных исследований, можно сказать, что сГАГ, выделенные в соответствии с патентом РФ № 2162331, не обладают свойствами, качественно влияющими на скорость пролиферации клеточных культур. Наличие сГАГ в костном коллагене принципиально не ускоряет костную регенерацию, хотя и обуславливает некоторые стимулирующие свойства, способствующие образованию хрящевой ткани в процессе заживления костной раны через энхон-дральный тип костеобразования.

Анализ результатов внедрения в клиническую практику нового костно-пластического материала на основе костного коллагена, импрегнированного сГАГ, «Остеоматрикс» был проведен на основе исходов лечения 54 больных с костной патологией.

В раннем послеоперационном периоде ни у кого из пациентов нагноений отмечено не было. Во всех случаях раны зажили в обычные сроки. Рентгенологические наблюдения свидетельствовали о том, что через 6-10 месяцев костные дефекты, заполненные «Остеоматриксом», по плотности рентгенологиче-

Таблица 4. Гистоморфометрические показатели заживления костного дефекта через 3 месяца после операции

№ образца Масса ткани, % Толщина

хрящевая ткань костная ткань трабекул, мм

Опытная группа

1 7,8 67,2 0,12

2 7,4 78,1 0,15

3 20,0 52,0 0,12

4 6,4 34,0 0,14

5 8,1 45,1 0,12

Контрольная группа

6 7,7 63,1 0,13

7 8,4 75,6 0,12

8 5,1 52,4 0,13

9 6,3 37,4 0,14

10 5,9 42,6 0,12

иЭмп=6

ского изображения еще отличались от окружающей костной ткани. Контроль восстановления целостности костей с помощью лучевых методов исследования в отдаленные послеоперационные сроки показал формирование костной ткани в сроки, сравнимые со сроками регенерации при применении других методов лечения, в том числе и при помощи имплантации других остеопластических материалов [25, 26]. Общее число положительных результатов в случаях использования «Остеоматрикса» отдельно или в комбинации с другими остеопластическими материалами было получено у 48 пролеченных пациентов, что составило 89% от общего количества клинических наблюдений.

Стоит отметить, что все случаи осложнений были связаны прежде всего с рецидивом основного заболевания. Относительно неудовлетворительным результатом применения «Остеоматрикса» в виде блока можно признать один случай, когда ребенку в возрасте 2 лет была проведена краевая резекция патологического очага, вызванного аневризмаль-ной кистой, в области проксимального отдела левой большеберцовой кости. Через 7 лет после операции при плановом рентгенологическом контроле была отмечена неоднородность плотности костных структур в области пластики, а еще через 2 года у мальчика произошел патологический перелом в области операции.

Анализируя результаты хирургического лечения пациентов с различной костной патологией с

помощью остеопластического материала, импре-гнированного сГАГ, можно констатировать, что представленный биокомпозиционный материал безопасен для клинического применения, обладает определенными остеоиндуктивными свойствами за счет, с нашей точки зрения, костного коллагена ал-логенного происхождения. Наличие или отсутствие сГАГ в остеопластическом материале не влияло на основные свойства использованных костных алло-имплантатов.

Без сомнения, хороший результат лечения пациентов с костной патологией зависит от множества факторов, однако пластические материалы часто

играют значительную роль. Разработка технологии получения и последующее комплексное исследование свойств новых остеопластических материалов являются необходимым условием развития такой области медицины, как биоимплантология. Надеемся, что наше исследование поможет практикующим врачам, работающим в областях реконструктивной хирургии, сформировать свое представление о некоторых российских остеопластических материалах с целью получения с их помощью положительного результата лечения многочисленных пациентов с костной патологией.

Литература

1. Enneking, W.F. Autogenous cortical bone grafts in the reconstruction of segmental defects / W.F. Enneking, J.L. Eady, H. Burchardt //J Bone Jt Surg Am. -1980. - Vol. 62. - № 7. - P. 1039-1058.

2. Reddi, A.H. Implant-stimulated interface reactions during collagenous bone matrix-induced bone formation /A.H. Reddi // Biomed Mater Res. - 1985. - Vol. 19. - № 3.- P. 233-239.

3. Summers, B.N. Donor site pain from the ilium: a complication of lumbar spine fusion / B.N. Summers, S.M. Eisenstein // J Bone Jt Surg Br. - 1989. - Vol. 71. -№ 5. - P. 677-680.

4. Goldberg, V.M. Selection of bone grafts for revision total hip arthroplasty / V.M. Goldberg // Clin Orthop Relat Res. -2000.- № 381. - P. 68-76.

5. Bos, G.D. Immune responses of rats to frozen bone allografts / G.D. Bos [et al.] // J Bone Jt Surg Am. - 1983. - Vol. 65. -№ 2. - P. 239-246.

6. Horowitz, M.C. Induction of specific T-cell responsiveness to allogeneic bone / M.C. Horowitz, G.E. Friedlaender // J Bone Jt Surgery Am. - 1991. - Vol. 73. - № 8.-P. 1157-1168.

7. Horowitz, M.C. Cytokines and estrogen in bone: anti-osteoporotic effects / M.C. Horowitz // Science. - 1993. - Vol. 260. - P. 626-627.

8. Bruck, S.D., Mueller E.P. Reference standards for implantable materials: problems and needs / S.D. Bruck, E.P. Mueller // Med Prog Technol. - 1989. - Vol. 15. -№ 1-2.- P. 5-20.

9. Damien, C.J. Bone graft and bone graft substitutes: a review of current technology and appli-cations / C.J. Damien, J.R. Parsons J.R. // J. Appl Biomater. - 1991. -Vol. 2. - № 3. - P. 187-208.

10. Лекишвили, М.В. Новые биопластические материалы в реконструктивной хирургии / М.В. Лекишвили, А.Ф. Пана-сюк // Вестник РАМН. - 2008. - № 9. - С. 33-36.

11. Bisphosphonate delivery to tubular bone allografts / G.R. DiResta et al. // Clin Orthop Relat Res. - 2008, Vol. - 466, № 8. - P. 1871-1879.

12. Agholme F. Experimental results of combining bisphosphonates with allograft in a rat model / F. Agholme, P. Aspenberg // J. Bone Jt Surg Br. - 2009. - Vol. 91. -№ 5. - P. 670-675.

13. Касавина, Б.С. Мукополисахариды костной и хрящевой ткани в норме и патологии / Б.С. Касавина, Т.А. Коль-чинский, Г.Д. Зенкевич // Успехи современной биологии. - 1970. - Т. 69. - С. 353-363.

14. Modulation of macrophage and B cell function by glycosaminoglycans / L.E. Wrenshall [et al.] // J Leukoc Biol. -1999. - Vol. 66. - № 3. - P. 391- 400.

15. Панасюк, А.Ф. Хондроитинсульфаты и их роль в обмене хондроцитов и межклеточного матрикса хрящевой ткани / А.Ф. Панасюк, Е.В. Ларионов // Научно-практическая ревматология. - 2000.-№ 2. - С. 46-55.

16. Слуцкий, Л.И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани. - Л.: Медицина, 1969. -375 с.

17. Bassleer, C. In-vitro evaluation of drugs proposed as chondroprotective agents / C. Bassleer, Y. Henrotin, P. Franchimont // Int J Tissue React. - 1992. - Vol. 14. -№ 5. - P. 231-241.

18. Омельяненко, Н.П. Соединительная ткань (гистофизиология и биохимия) / Н.П. Омельяненко; Под ред. С.П. Миронова. - М.: Известия, 2009. - Т. 1. - 379 с.

19. Ultrastructural and immunocytochem-ical study of bone-derived cells cultured in three-dimensional matrices: influence of chondroitin-4 sulfate on mineralization / M. Bouvier [et al.] // Differentiation. -1990. - Vol. 45. - № 2. - P. 128-137.

20. Layton, L.L. Effect of cortisone upon chondroitin sulfate synthesis by animal tissues / L.L. Layton // Proc Soc Exp Med. - 1951. - Vol. 76. - № 3. - P. 596-598.

21. Duthie, R.B.The histochemistry of the preosseous stage of bone repair studied by auto-radiography / R.B. Duthie, A. Barker // J Bone Joint Surg Br. - 1955. - Vol. 37-B. - № 4. - P. 691-700.

22. Richterich, R. Ammonia excretion of the guinea pig and rabbit / R. Richterich, L. Goldstein , E.H. Dearborn // Am J Physiol. - 1958. - Vol. 192. - № 2.- P. 392-400.

23. Bo, H. Quantitative and sensitive in vitro assay for osteoinductive activity of demineralized bone matrix / H. Bo, T. Bao-wei, E.N. Marcel // J Orthop Res. - 2003. -Vol. 21.- № 4. - P. 648-654.

24. Bone tissue engineering in a critical size defect compared to ectopic implantation in the goat / C.K. Moyo [et al.] // J Orthop Res. - 2004. - Vol. 22. - № 3. - P. 544-551.

25. Лекишвили, М.В. Технологии изготовления костного пластического материала для применения в восстановительной хирургии (экспериментальное исследование) / М.В. Лекишвили: Дис. ... докт. мед. наук.- М., 2005. - 289 с.

26. Васильев, М.Г. Исследование влияния пластических материалов на основе костного коллагена, импрегнированного сульфатированными гликозаминогли-канами, на регенерацию костной ткани / М.Г. Васильев: Дис. . канд. мед. наук. -М., 2011.- 123 с.