Получение растений-регенерантов Medicago varia индукцией каллусообразования листовых эксплантов в культуре in vitro

НАУКА И ОБРАЗОВАНИЕ, 2017, №1

УДК 602.64:579.66

Получение растений-регенерантов Medicago varia индукцией каллусообразования листовых эксплантов в культуре in vitro

Н.С. Строева, В.Г. Дарханова

Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН, г. Якутск

Исследованы особенности каллусообразования in vitro листовых эксплантов сортообразца Medicago varia Сюлинская, апробированы условия для получения растений-регенерентов из эмбриогенных каллусных тканей. Индукция каллусных клеток из листовых эксплантов осуществлялась в присутствии в питательной среде 2,4 Д-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), кинетина и нафтилуксус-ной кислоты (НУК). Соматические клетки дифференцировались в эмбриональные в присутствии высокой концентрации ауксинов - по 8 мг/л 2,4-Д и кинетина; НУК - 5мг/л на модифицированной питательной среде Гамборга В5. Каллус формировался вдоль надрезов и постепенно покрывал всю поверхность площади экспланта, имел желтый цвет, плотную консистенцию и зернистую структуру. При пассировании полученных каллусов на свежую агаризованную питательную среду Гамборга В5 (+10 г/л сахарозы + 4 г/л бактоагара, с добавлением БАП (0,2 мг/л)) стимулировалось развитие в каллусной ткани клеток меристематического и эмбрионального типа, из которых формировались почки и эм-бриоиды. Получены растения-регенеранты люцерны из эмбриоидов и почек с использованием питательной среды В5 и / В5 без фитогормонов для дальнейшего развития и укоренения.

Ключевые слова: Medicago varia, ауксины: 2,4-Д, НУК, цитокинины: БАП, кинетин, фитогормоны, каллусогенез, каллуссная ткань, морфогенез, соматические клетки, эмбриоиды, растения-регенеранты.

In vitro Callus Induction and Plant Regeneration from Leaf Explants of Medicago varia

N.S. Stroeva, V.G. Darhanova

Institute for Biological Problems of Cryolithozone, Yakutsk

The features of callus formation in vitro from leaf explants of Medicago varia Syulinskaya variety are investigated and conditions for plant regeneration from embryogenic callus tissue are tested. The induction of callus cells from leaf explants was carried out in the presence of a nutrient medium D 2,4 - dichlorophenoxy-acetic acid (2,4 - D), kinetin and naphthaleneacetic acid (NAA). Somatic cells differentiated to embryonic in the presence of a high concentration of auxin - 8 mg/l 2,4 - D and kinetin; NAA - 5 mg/l in the modified Gam-borg B5 medium. Callus formed along the incisions and gradually covered the entire surface of the explant area. It had a yellow color, dense texture and grain structure. Passaging the derived callus on fresh agar Gamborg B5 medium (10 g/l sucrose + 4 g/l of bactoagar supplemented with BAP (0.2 mg/l), stimulated the development into callus tissue cells of meristematic and embryonic types which formed the buds and embry-oids. The regenerated plants of M. varia from embryoids and buds are obtained for further development and rooting.

Key words: Medicago varia, auxins, 2,4-D, NAA, cytokinins, BAP, kinetin, plant hormones, callusogene-sis, callus tissue, morphogenesis, somatic cells, embryoids, regenerated plants.

Введение Сортообразец обладает всеми необходимыми

Люцерна изменчивая Сюлинская была выве- данными, чтобы занять достойное место в сево-дена в Институте северного луговодства АН РС(Я). оборотах сельскохозяйственных земледельческих предприятий республики [1]. --Получение нового материала для селекционного улучшения сортообразца актуально для СТРОЕВА Наталья Семеновна - н.с., сельского хозяйства и животноводства респуб-nataly.stroeva.62@mail.ru; ДАРХАНОВА Валентина лики. Исследования с использованием методов Гаврильевна - н.с., darhana@mail.ru. изолированной культуры тканей в селекции лю-

ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ MEDICAGO VARIA

церны являются новым направлением в условиях Якутии. Люцерна относится к числу немногих сельскохозяйственных растений, для которых определены основные условия культивирования тканей и клеток, обеспечивающие высокий выход регенерантов [2].

Регенерация растений в культуре соматических тканей происходит благодаря свойству то-типотентности растительной клетки [3]. Результат культивирования зависит от баланса фито-гормонов, типа экспланта, минерального состава среды, физических условий и длительности инкубации, способности вида или сорта к регенерации и других факторов [4, 5].

Вместе с тем культура изолированных тканей все больше находит применение в решении вопросов прикладного характера. Общеизвестно успешное применение культуры in vitro для размножения растений, оздоровления и производства посадочного материала, для создания новых форм и сортов [6].

Цель исследования - получение растений-регенерантов посредством индукции каллусогенеза и регенерации в культуре in vitro листовых эксплан-тов люцерны изменчивой сортообразца Сюлинская.

Материалы и методы

В качестве исходного экспериментального материала были использованы семена люцерны Сюлинская, относящейся по комплексу признаков к виду Medicago varia Mart. - люцерна изменчивая. Род люцерна Medicago L. принадлежит семейству бобовых - Fabaceae Lindl. (Le-guminosae Juss., Papilionaceae Giseke). Сортооб-разец Сюлинская характеризуется зимостойкостью, скороспелостью, засухоустойчивостью, холодостойкостью, высокой технологичностью благодаря прямостоячей форме куста. Урожайность сена в пределах 40-50 ц/га без орошения, урожайность семян в условиях криолитозоны достаточно высока - 1,5-2,5 ц/га [1].

В работе использовали методы культуры клеток и тканей в асептических условиях, рекомендованные О.А. Рожанской и Е.А Свеженцевой [7]. Все методы in vitro предусматривают выполнение трех главных требований: стерильность, питательная среда, контролируемые внешние условия (свет, температура, влажность). Работы по культивированию тканей проводились в ламинар-боксе (БОВ-001-АМС (вариант «СЛШ»), Россия), затем сосуды с тканями переносили в культуральную комнату. Культивирование проводили при освещенности 3-4 тыс. лк и 16-часовом фотопериоде, температуре 24 ± 1 °С, влажности воздуха 70%.

Для создания оптимальных условий, способствующих индукции каллусообразования в

культуре in vitro листовых эксплантов Medicago varia, клеток эмбрионального типа и получения растений-регенерантов были использованы методические рекомендации А.В. Мезенцева [2]. Реализация этого метода включает несколько этапов, с применением на каждом из них соответствующей питательной среды: получение асептических проростков - культивирование изолированных сегментов проростков (эксплантов) до образования каллусов - индукция соматического эмбриоидогенеза и почек - получение растений-регенерантов.

Использовалась агаризованной питательная среда Гамборга В5 с добавлением ауксинов: 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и 1-нафтилуксусной кислоты (НУК), цитокининов: кинетина (Кин) и 6-бензиламинопурина (БАП). Экспланты листьев получали из пробирочных растений люцерны, выращенных на среде 1/2В5 из стерильных семян. В опытах с каллусом использовали ткань, поддерживаемую в культуре в течение шести месяцев. После образования корней растения-регенеранты высаживали в смесь почвы и песка в соотношении 3:1.

Результаты и их обсуждение

Известно, что для получения каллусов используют полностью развитые, неповрежденные листья различного возраста [2]. На первом этапе нами для индукции каллусогенеза были использованы тройчатые листья проростков люцерны, выращенных в пробирках из стерильных семян. Тройчатые листья разделяли на листочки и делали на каждом из них ряд надрезов по всей площади листовой пластинки. Затем их помещали на модифицированную среду В5 с 15 г/л сахарозы, в которой увеличивали в три раза концентрацию хелата железа (111мг/л Na2-ЭДТА и 84 мг/л FеSO4•7H2O), добавляли нитрат аммония (250мг/л) и фитогормоны: 2,4-Д и ки-нетин по 8 мг/л, НУК 0,5 мг/л, которые индуцировали процесс дедифференцировки клеток листовой ткани и способствовали пролиферации каллуса (рис. 1).

Рис.1. Экспланты листьев люцерны in vitro

СТРОЕВА, ДАРХАНОВА

Материал инкубировали в течение 30 дней. Первые 6-7 дней листовые экспланты оставались зелеными, постепенно светлея и утолщаясь, затем вдоль разрезов возникала каллусная ткань. На начальном этапе каллус бледно-желтого цвета имеет рыхлую, средней плотности, однородную структуру. Затем формировалась светлая, желтовато-зеленая, влажная, мягкая каллусная ткань (таблица).

Получение каллусной ткани

Среда с добавками, мг/л Экспланты Результат

1/2 В5 Семена Семядоли, побеги, апексы

В5 + 2,4-Д 8+Кин 8 + НУК 0,5 Листья Каллус

В5 + БАП 0,2 Каллус Каллус, эмбриоды, почки,регенерация

В5 Эмбриоды, почки Развитие и рост побегов

1/2В5 Побеги Растения-регенеранты с корнями

При пассировании полученных каллусов на свежую среду В5 с добавкой 10 г/л сахарозы, 4 г/л бактоагара, БАП 0,2 мг/л продолжалась пролиферация ткани, изменялась консистенция и морфология. Эта среда стимулировала развитие клеток меристематического и эмбрионального типа, из которых после многократных делений формируются почки и эмбриоиды (таблица).

Через три недели, вследствие интенсивной пролиферации, образовывались хорошо развитые каллусы, которые состояли из однородной, более или менее рыхлой, светлой (от светло-желтой до светло-зеленой) ткани морфогенного типа (рис. 2).

Известно, что от соотношения фитогормонов в питательной среде зависит тип морфогенеза в культуре ткани. Их локальное соотношение в среде является определяющим в развитии типов дифференцированных структур на каллусах одного происхождения [2]. В наших экспериментах наблюдалось одновременное образование зеленых почек и эмбриоидов. У побегов, возникших из почек, появляются сразу тройчатые листья. В отличие от них, у побегов эмбриоген-ного происхождения первые листья - простые, как у семенного проростка (рис. 2).

При субкультивировании эмбриоидов и почек на свежую среду В5 без гормонов в течение 2-3 недель из них формировались растения-регенеранты (таблица, рис. 3).

Рис 2. Морфогенная каллусная ткань и эмбриоиды

Рис. 3. Регенерация в каллусной культуре люцерны

Для дальнейшего развития побеги переносили в колбы со средой 1/2В5 без гормонов. Через 2-3 недели регенеранты достигали высоты 6-7 см. Растения с хорошо развитыми корнями извлекали из пробирок и переносили в почвенный субстрат для адаптации к условиям фитотрона.

Полученные из каллуса растения-регенеранты являются исходным материалом для использования в селекционно-генетических программах по улучшению хозяйственно-ценных признаков люцерны с применением методов биотехнологии. Кроме того, растения-регенеранты могут использоваться для изучения феномена сомакло-нальной изменчивости, а также при создании сложногибридных популяций.

Представленная работа - сообщение о получении побегов в культуре каллусной ткани люцерны изменчивой сортообразца Сюлинская, произрастающей в условиях Центральной Якутии. Дальнейшие исследования будут направлены на усовершенствование схемы культивирования, изучение сомаклональной изменчивости растений-регенерантов и отбор образцов с высоким морфогенетическим потенциалом.

К ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТИТЕЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ АРКТИЧЕСКИХ ТУНДР О-ВА БОЛЬШОЙ ЛЯХОВСКИЙ

Выводы

Установлен состав питательных сред для кал-лусообразования и регенерации растений в культуре in vitro листовых эксплантов Medicago varia, сортообразец Сюлинская. Индукция кал-лусогенеза происходит на модифицированной питательной среде Гамборга В5 в присутствии высокой концентрации фитогормонов: по 8 мг/л 2,4-Д и кинетина, с добавкой 0,5 мг/л НУК. Каллус формируется вдоль надрезов и постепенно покрывает всю поверхность экспланта, имеет желтую окраску, плотную консистенцию и зернистую структуру. Индукция стеблевого морфогенеза и эмбриоидогенеза происходит при пассировании каллусов на свежую среду В5 с добавлением БАП (0,2 мг/л). В каллусной ткани возникают клетки меристематического и эмбрионального типа, из которых формируются почки и эмбриоиды. После переноса на безгормональные среды В5 и V В5 происходит дальнейшее развитие и укоренение растений-регенерантов люцерны.

Работа выполнена в рамках проекта НИР № 0376-2014-002. Тема 52.1.11 «Разнообразие растительного мира таежной зоны Якутии: структура, динамика, сохранение».

Литература

1. Денисов В.Г., Стрельцова В.С. Люцерна в Якутии. Новосибирск, 2000. 198 с.

2. Мезенцев А.В. Методические указания по регенерации и размножению люцерны с использованием культуры тканей, клеток и протопластов. М., 1980. 25 с.

3. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. 272 с.

4. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. М.: Наука, 1975. С. 1-50.

5. Рожанская О.А. Особенности регуляции морфогенеза эспарцета и люцерны in vitro / О .А. Рожанская, В.Г. Дарханова, Н.С.Строева, К.Г. Королев, О.И. Ломовский // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2008. №5. С. 58-65.

6. Муравлев А. А. Методические рекомендации по получению растений in vitro из соматической ткани рапса /А.А. Муравлев, М.В. Баев-ская, О.П.Стрижак, А.Е. Фомина // Кормопроизводство. 2010. № 9. С. 3-7.

7. Рожанская О.А., Свеженцева Е.А. Получение и отбор сомаклональных вариаций для селекции рапса: Метод. рекомендации / СО РАСХН. СибНИИкормов. Новосибирск, 1991. С. 7-18.

Поступила в редакцию 08.09.2016

УДК 581.6

К продуктивности растительных сообществ арктических тундр о-ва Большой Ляховский

Е.Г. Николин

Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН, г. Якутск Государственный природный заповедник Усть-Ленский МПР и Э России, г.Якутск

Приведены данные по продуктивности растительных сообществ арктических тундр о-ва Большой Ляховский (Новосибирские острова). Исследование проведено методом укосов. Запас надземной фитомассы в растительности равнинных ландшафтов северо-восточной оконечности острова по усредненным показателям варьирует в пределах от 60,3 до 700,4 г/м2, а на локальных участках достигает 1501,5 г/м2. При значениях выше 150 г/м2 наибольшую фитомассу формируют мхи, доля которых составляет 70-90 %. Масса кормовых растений в мелкобугорковых тундрах при максимальных значениях не превышает 86,8 г/м2. Более высока доля кормовой фракции в сообществах байджа-раховых комплексов на приморских лугах и приморских тундровых луговинах, что обеспечивается в основном за счет сосудистых растений. Лишайники и макроводоросли, как компоненты рациона питания диких растительноядных животных, могут учитываться лишь в качестве сопутствующего корма летнего периода. Местами кормовое значение имеет Salix polaris.

Ключевые слова: арктические тундры, продуктивность растительных сообществ, фитомасса, кормовые растения, о-в Большой Ляховский, Новосибирские острова.

НИКОЛИН Евгений Георгиевич - д.б.н., в.н.с., enikolin@yandex.ru.