Способ определения качества сперматозоидов на основе анализа длины теломерных повторов в сперматозоидах

1. Cпособ количественного определения длины теломерных повторов в биологическом образце эукариотического организма, включающий следующие этапы:
(1) выделение из указанного биологического образца ДНК по стандартной методике;
(2) измерение концентрации ДНК, полученной на этапе (1);
(3) проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в стандартной реакционной смеси, с добавлением праймеров, комплементарных последовательности теломерных повторов, и ДНК полученной на этапе (2)в количестве 5 нг;
(4) проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в реакционной смеси, с добавлением по меньшей мере одной пары праймеров, один из которых способен комплементарно взаимодействовать с цепью теломерных повторов, а другой – с комплементарной ей цепью, и в условиях, подходящих для амплификации продукта, полученного на этапе (3);
(5) анализ длины теломерных повторов в исследуемом образце путем проведения, количественного анализа продуктов реакции, полученных на этапе (4).
2. Способ по п.1, в котором биологический образец представляет собой биологический образец позвоночного животного или человека.
3. Способ по п.2, в котором на этапе (4) используют пару праймеров, один из которых представляет собой праймер вида:
1
2
3
4
5
6
7
8
n
1
2
3
4
5
6
7
8
5’–ХХХХХХХХ (TTTGGG)YYYYYYYY–3’,
а другой – праймер вида:
1
2
3
4
5
6
7
8
m
1
2
3
4
5
6
7
8
5’–Х’Х’Х’Х’Х’Х’Х’Х’(CCCTTA)Y’Y’Y’Y’Y’Y’Y’Y’–3’
1
2
3
4
5
6
7
8
m
1
2
3
4
5
6
7
8
или 5’–Х’Х’Х’Х’Х’Х’Х’Х’(CCCTAT)Y’Y’Y’Y’Y’Y’Y’Y’–3’,
1
8
1
6
1
8
1
6
где каждый из Х – Х, Y – Y, Х’ – Х’, Y’ – Y’ независимо выбраны из А,С,T,G или отсутствуют (=0),
7
8
YYнезависимо выбраны из AG, GT, GG, ТA или TТ,
7
8
Y'Y’независимо выбраны из AA, СС, ТС, СА, СТ или АТ,
а n, m – независимо выбраны из целых чисел от 1 до 8,
при этом длина праймера независимо составляет не менее 18, но не более 55 нуклеотидов.
4. Способ по п.6, в котором на этапе (4) используют следующие пары праймеров:
TelG-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:1 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и TelC-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:2 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; или
Tel1-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:3, или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и Tel2-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; или
Tel1-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и Tel2b-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:5 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей.
5. Способ по любому из пп.1-4, включающий предварительную подготовку биологического образца.
6. Способ по любому из пп.1-4, в котором праймер на любом из этапов независимо представляет собой флуоресцентно-меченый праймер, люминесцентно-меченый праймер, праймер, меченый радиоактивным изотопом или биотинилированный праймер.
7. Способ по любому из пп.1-6, в котором меченые производные дезоксинуклеозидтрифосфатов представляют собой биотинилированные нуклеотиды или флуоресцентномеченые нуклеотиды, содержащие химические модификации.
8. Применение способа по любому из пп.1-7 для определения длины теломерных повторов в биологическом образце
в области вспомогательных репродуктивных технологий, в том числе, в ветеринарии для оценки качества яйцеклеток, ооцитов и/или сперматозоидов позвоночных животных или человека или
для исследования действия препаратов, препятствующих старению и стабилизирующих длину теломер в половых клетках у позвоночных животных или человека.
9. Применение по п.8, в котором биологическим образцом является ткань или жидкость, выделенная из живого организма.
10. Применение по п.8, в котором биологический образец содержит не более 100 клеток.
11. Набор для выявления и/или количественного определения активности теломеразы способом по п.1, включающий, по меньшей мере, дезоксинуклеозидтрифосфаты дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ или их меченые производные; а также пару праймеров, один из которых способен комплементарно взаимодействовать с цепью теломерных повторов в геноме исследуемого биологического объекта, а другой – с комплементарной ей цепью, в количествах, достаточных для проведения анализа активности теломеразы.
12. Набор по п.11, в котором в качестве пары праймеров, один из которых способен комплементарно взаимодействовать с цепью теломерных повторов, а другой – с комплементарной ей цепью, входит пара праймеров, один из которых представляет собой праймер вида:
1
2
3
4
5
6
7
8
n
1
2
3
4
5
6
7
8
5’–ХХХХХХХХ (TTTGGG)YYYYYYYY–3’,
а другой – праймер вида:
1
2
3
4
5
6
7
8
m
1
2
3
4
5
6
7
8
5’–Х’Х’Х’Х’Х’Х’Х’Х’(CCCTTA)Y’Y’Y’Y’Y’Y’Y’Y’–3’
1
2
3
4
5
6
7
8
m
1
2
3
4
5
6
7
8
или 5’–Х’Х’Х’Х’Х’Х’Х’Х’(CCCTAT)Y’Y’Y’Y’Y’Y’Y’Y’–3’,
1
8
1
6
1
8
1
6
где каждый из Х – Х, Y – Y, Х’ – Х’, Y’ – Y’ независимо выбраны из А,С,T,G или отсутствуют (=0),
7
8
YYнезависимо выбраны из AG, GT, GG, ТA или TТ,
7
8
Y'Y’независимо выбраны из AA, СС, ТС, СА, СТ или АТ,
а n, m – независимо выбраны из целых чисел от 1 до 8,
при этом длина праймера независимо составляет не менее 18, но не более 55 нуклеотидов.
13. Набор по п.11, в который в качестве пары праймеров, один из которых способен комплементарно взаимодействовать с цепью теломерных повторов, а другой – с комплементарной ей цепью, входят
TelG-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:1 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и TelC-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:2 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; или
Tel1-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:3, или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и Tel2-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; или
Tel1-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей; и Tel2b-праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO:5 или последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную ей.
14. Набор по любому из пп.12-13, в котором по меньшей мере один из праймеров представляет собой флуоресцентно-меченый праймер, люминесцентно-меченый праймер, праймер, меченый радиоактивным изотопом или биотинилированный праймер.
15. Набор по любому из пп.12-13, в котором меченые производные дезоксинуклеозидтрифосфатов представляют собой биотинилированные нуклеотиды или флуоресцентномеченые нуклеотиды, содержащие химические модификации.