Исследование экспрессии мРНК маммаглобина А при различной патологии молочных желез

Перейти в содержание Вестника РНЦРР МЗ РФ N9.

Текущий раздел: Молекулярная медицина

Исследование экспрессии мРНК маммаглобина А при различной патологии молочных желез

Боженко В.К., Васкевич Е. Ф., Чазова Н.Л., Мельникова Н.В., Кудинова Е.А., Джикия Е.Л., Буйнова Д. С. «Российский Научный центр рентгенорадиологии Минздравсоцразвития России», г. Москва.

Контактная информация: 117997, ГСП-7, Москва, ул. Профсоюзная 86, Российский Научный Центр рентгенорадиологии Минздравсоцразвития России, тел.+7(495) 333-91-20

Адрес документа для ссылки: http://vestnik.mcrr.ru/vestnik/v9/papers/bozhenko_v9.htm

Резюме

Выполнен анализ экспрессии мРНК маммаглобина методом количественного ПЦР в реальном времени в 69 образцах ткани рака молочной железы, 42 образцах фиброаденомы молочной железы и 98 образцах нормальной ткани молочной железы. Показано, что в злокачественной опухоли экспрессия мРНК маммаглобина выше, чем при фиброаденоме или в нормальной ткани молочной железы. Экспрессия маммаглобина снижалась по мере увеличения размеров опухоли и роста метастатического потенциала или гистологических признаков злокачественности. Таким образом, мРНК маммаглобина может использоваться в качестве тканеспецифического маркера различных патологий молочной железы.

Ключевые слова: маммаглобин А, мРНК, рак молочной железы

Assessment of mammoglobin A mRNA expression in various breast diseases.

Bozhenko V.K., Vaskevich E.F., Chazova N.L., Melnikova N.V., Kudinova E.A., Dzhikiya

E.L., Buynova D.S.

Federal State Enterprise “Russian Scientific Center of Roentgenoradiology”

Summary

Expression of mammoglobin mRNA was assessed with quantitative real-time PCR in 69 tissue samples of breast cancer, in 42 breast fibroadenomas and in 98 tissue samples of normal breasts. It was demonstrated that in malignant

tumors the expression of mammoglobin mRNA was higher than in fibroadenomas or in normal breasts. The increase of tumors size, of its metastatic potential and of histological malignant features was accompanied by decrease of mammoglobin’s expression. Expression of mammoglobin mRNA may be used as a tissue-specific marker of various breast diseases.

Key words:_mammoglobin A, mRNA, breast cancer

Оглавление:

Введение

Материалы и методы

Результаты

Обсуждение

Введение

Проблема своевременной диагностики рака молочной железы остается одной из наиболее актуальной, т.к. у 30-40% первичных пациенток приходится констатировать местно-распространенный процесс или наличие отдаленных метастазов. Таким образом, поиск новых методов, позволяющих обнаружить опухоль раньше, чем она может быть выявлена при маммографии является актуальной практической задачей. Одним из наиболее перспективных направлений для поиска новых онкомаркеров и маркеров для рака молочной железы являются молекулярно-генетические исследования среди которых особое внимание заслуживает изучение органно и ткане-специфических профилей РНК (микро и мРНК). Одним из аргументов в пользу исследования РНК является то, что этот объект позволяет подбирать тканеспецифические последовательности, что, несомненно, повышает эффективность исследования по сравнению с другими группами онкомаркеров (Kopreski MS, 1999; Chen XQ, 2000; Wong SC, 2004). Одним из кандидатов на роль тканеспецифического маркера для патологий молочной железы является ген (и его продукты) маммаглобина А (SCGB2A1) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenelD: 4250).

В 1996 году Watson и Fleming идентифицировали ген маммаглобина который, определялся в узком спектре тканей, включая ткань молочной железы (Watson MA, Fleming TP,1994; Watson MA, Fleming TP, 1996). Ген локализован в 12-13 группе длинного плеча 11 хромосомы, и последовательность аминокислот, которую он кодирует, схожа с эпителиальными секреторными белками, принадлежащими к семейству утероглобинов. Эти белки также закодированы генами, сгруппировавшимися в данной хромосомной области. Ген, обнаруженный Watson и Fleming, кодирует белок с 93 аминокислотными остатками и имеет молекулярную массу 10,5кДа. Экспрессия

маммаглобина была обнаружена в эпителиальных клетках молочной железы, в клетках стромы экспрессии гена не наблюдалось.

В 1998, Becker и др. идентифицировал новый ген, который имел сильную гомологию с геном маммаглобина А (Becker RM, 1998). Этот новый ген назвали -маммаглобин B. Есть исследования подтверждающие, что экспрессия маммаглобина А (далее маммаглобин) определяется, в основном, в ткани молочной железы (Watson MA, 1999; Bernstein JL, 2005), в то время как экспрессия гена маммаглобина В, обнаружена во многих органах и тканях, таких как: рак молочной железы, матки, слюнных желез, слезной железе, яичка, яичников и щитовидной железы (Becker RM ,1998; Muller-Schottle

F, 2000; Stoeckelhuber M ,2006; Sjodin A,2005)

В ткани молочной железы без признаков заболевания был определен низкий, базовый уровень экспрессии мРНК маммаглобина, который не зависит от возраста, индекса массы тела, климактерического статуса, расы или онконаследствености (Bernstein JL, 2005). В другом исследовании было показано, что мРНК маммаглобина в 10 раз интенсивней экспрессируется при злокачественном новообразовании, чем при доброкачественном процессе (Watson MA, 1996; O'Brien N,2002). Было высказано предположение, что чем менее агрессивный фенотип опухоли, тем определяются более высокие уровни мРНК маммаглобина; и соответственно, для низкодифференцированной опухоли характерны меньшие уровни экспрессии мРНК маммаглобина (Span PN, 2004; Núñez-Villar MJ, 2003). Целью нашего исследования было изучение диагностической информативности мРНК маммаглобина при различных патологиях молочной железы. Перейти в оглавление статьи >>>

Материалы и методы

Мы проанализировали 69 пациенток со злокачественными заболеваниями молочной железы и 42 пациентки с фиброаденомой (ФА) молочной железы. Исследования проводились на операционном материале, после удаления или резекции молочной железы. Для анализа у каждой пациентки было взято две пробы ткани (нормальной и патологичной) которые были собраны в 2 стерильные пробирки содержащих раствор EverFresh RNA ^Клоноген, Санкт-Петербург) для сохранения РНК и заморожены при -70 С.

Выделение общей РНК проводили набором RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Германия) с использованием протокола выделения «Purification of Total RNA from Animal Tissues». Реакцию обратной транскрипции проводили при помощи набора QuantiTest Reverse

Transcription (Qiagen, Германия) с использованием протокола «Reverse Transcription with Elimination of Genomic DNA for Quantitative, Real-Time PCR».

Постановка ПЦР

Детекцию мРНК маммаглобина проводили методом ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе «ДТ-96» («ДНК-технология», Россия). Для проведения одной реакции ПЦР использовали 10 мкл. 2,5Х реакционной смеси; 1 мкл. MgCl2 (25 мМ) («Syntol», Россия), 7,5 мкл деионизованной воды, 1 мкл. прямого праймера (10 pmol), 1 мкл. обратного праймера (10 pmol) («Syntol», Россия), 0,5 мкл праймера «проба» содержащего флуорофор «Tag man», 5 мкл. образца кДНК. В работе использовали следующие праймеры:

а) для маммаглобина

Прямой 5 - GAACACCGACAGCAGCA-3’

Обратный 5 - TCTCCAATAAGGGGCAGCC-3’

Проба 5-FAMTGGTCCTCATGCTGGCGGCC-3!

б) для HPRT1

Прямой 5 - AAGCCAGACTTTGTTGGATTTGA-3’

Обратный 5,- AACTTGAACTCTCATCTTAGGCTT-3,

Проба 5-FAMAGCAGGAGATTGCCACCTACCGCA-3!

Критический цикл и исходное количество копий кДНК определяли с помощью компьютерной программы «ДТ-96», поставляемой вместе с прибором. Статистический анализ проводился в программе Статистика 6.0. Для оценки относительного содержания мРНК маммаглобина в образцах использовали анализ содержания мРНК референтного гена HPRT1 в том же образце, характеризующимся низким и стабильным уровнем экспрессии мРНК в клетке. При отношении экспрессии мРНК маммаглобина к мРНК HPRT1 меньше 1, предполагалось, что экспрессия мРНК маммаглобина в образце практически отсутствует, а при отношении больше 1, о наличие экспрессии маммаглобина в образце.

Перейти в оглавление статьи >>>

Результаты

В работе было установлено, что повышенный уровень экспрессии мРНК маммаглобина наблюдается как при фиброаденоме (увеличен по сравнению с нормальной тканью молочной железы в 83,33% случаев), так и при злокачественном новообразовании (увеличен в 86,95% случаев).

При анализе результатов экспрессии мРНК маммаглобина в опухолевой ткани, ФА и норме было выявлено, что при злокачественной опухоли средний уровень экспрессии равен 161,03 отн.ед, при фиброаденоме - 80,60 отн.ед., а в нормальной ткани молочной железы он составляет 59,45 отн.ед. Таким образом, базовый уровень экспрессии в неизмененных тканях молочной железы ниже, чем при раке молочной железы и фиброаденоме (Таблица 1).

Следует отметить, что различия между экспрессией маммаглобина при ФА и в нормальной ткани молочной железы не достоверны (р=0,34). Так же не достоверны различия в группах ФА и РМЖ (р=0,15). При сравнении группы норма ткань МЖ - РМЖ различия в экспрессии мРНК маммаглобина достоверны (р=0,0057).

Таблица 1. Средние значение относительной экспрессии мРНК маммаглобина в различных тканях молочной железы.

Характеристики Общее число обследованных МГА/НРЯТ, отн. ед. Стандартная ошибка

Злокачественная опухоль 69 161,03 40,97

Фиброаденома 42 80,60 25,23

Норма 98 59,45 9,81

Тип рака

Инфильтративно дольковый 13 80,00 15,79

Инфильтративно протоковый 44 161,58 55,22

Слизистый 4 492,60 316,45

Прочие формы 8 133,94 76,11

Размер опухоли

Т1 25 194,22 84,35

Т2 28 72,61 30,26

Т3 3 49,01 35,45

Т4 13 313,51 122,06

Метастазы в ЛУ

N0 41 193,50 63,32

N1 15 167,56 68,94

N2 9 66,42 36,32

N3 4 16,63 10,26

Степень злокачественности опухоли

01 11 279,13 117,61

02 35 204,45 69,17

03 22 38,48 13,86

Рецепторы эстрогенов

Положительные 45 129,15 45,61

Отрицательные 24 220,15 81,09

Рецепторы прогестерона

Положительные 42 152,43 50,22

Отрицательные 27 174,42 70,87

с-егЬ2

Отрицательный 31 189,55 60,86

Слабоположительный 28 83,35 39,48

Положительный 10 290,16 179,26

Амплификация Иег2\^еи

Есть 10 346,92 192,84

Нет 28 51,98 22,86

При анализе уровня мРНК маммаглобина и таких характеристик опухоли как размер (Т) и наличие местных метастазов (К) достоверных отличий не обнаружено, что может быть связано с высокими значениями стандартной ошибки для маммаглобина. В тоже время следует отметить тенденцию снижения уровня экспрессии маммаглобина ростом стадии опухолевого процесса.

При анализе экспрессии соотношения мРНК маммаглобина и гистологической формы РМЖ обнаружены, что достоверные отличия для слизистой формы рака. Среднее значение при инфильтративном дольковом раке - 80,07 отн.ед, при протоковой форме рака - 161,58 отн.ед., а при слизистом раке - 492,60 отн.ед.

При анализе уровня экспрессии мРНК маммаглобина и степени злокачественности

обнаружены различия при 01 (низкая степень злокачественности) и при 03 (высокая

степень злокачественности) (р=0,0019), так же и при 02 (умеренная степень

злокачественности) и 03(р=0,059). Достоверных различий межу 01 и 02 степенями

злокачественности обнаружено не было (р=0,40). Причем было обнаружено, что чем выше

степень злокачественности тем, меньший уровень экспрессии мРНК маммаглобина

6

(Табл.1). Так при G1 уровень маммаглобина составляет 279,13отн.ед, при G2- 204,45 отн.ед, при G3 - 38,48 отн.ед.

Сравнение экспрессии мРНК маммаглобина в зависимости от гормонального статуса опухоли больных РМЖ, показало, что уровень экспрессии маммаглобина не связан с экспрессией рецепторов эстрогенов и прогестерона.

Мы также обнаружили, что для опухолей с амплификацией НБК-2/пеи характерен сниженный уровень экспрессии МГА, который в среднем составляет 51,98 отн. ед, в то время как при отсутствии амплификации в ткани опухоли уровень маммаглобина составляет 346,92 отн.ед.

Прмн: мам/ИРРТ, Распред.:Экспоненциальное Критерий Хи-квадрат = 38,38063, сс = 4 (скорр.) , р = 0,00000

Группа

Рисунок 1. Форма распределения значений отношения уровня экспрессии мРНК

маммаглобина А к уровню экспрессии мРНК гена ИРЯТ1 (п=182).

Сравнение достоверности отличия средних проводили с помощью статистики Стьюдента. Несмотря на то, что вид распределения отношения экспрессии маммаглобина к ИРЯТ1 имеет экспоненциальный характер (Рис.1). оценки достоверности отличия средних параметрическими и непараметрическими методами не отличаются.

Перейти в оглавление статьи >>>

Обсуждение

В нашей работе выявлено, что в злокачественной опухоли экспрессия мРНК маммаглобина выше, чем при фиброаденоме или нормальной ткани молочной железы, что находит находится в соответствии с литературными данными (Watson MA,1996; O'Brien N,2002).

Также в литературе высказывались предположения, что увеличение степени злокачественности опухоли должно приводить к снижению уровня экспрессии тканеспецифических маркеров, одним из которых является маммаглобин. В нашем исследовании, мы подтвердили такую закономерность. Экспрессия маммаглобина повышена при начальных стадиях и снижается по мере увеличения размеров опухоли и роста метастатического потенциала или гистологических признаков злокачественности. Дополнительным подтверждением связи степени злокачественности является сильная отрицательная корреляция амплификации Her2/neu (которая характерна для неблагоприятных вариантов РМЖ) и уровня экспрессии маммаглобина.

Полученные нами закономерности по изменению экспрессии тканеспецифического маркера молочной железы позволяют высказать ряд предположений по дальнейшим перспективам его использования как маркера. Исследование его экспрессии в ткани может быть дополнительным критерием для определения уровня злокачественности опухоли и дальнейшие исследования по связи этого уровня и прогноза помогут установить, насколько данный показатель может использовать как независимый. В тоже время, обнаруженная закономерность снижения уровня экспрессии с ростом стадии и степени злокачественности позволяет предположить, что исследование мРНК маммаглобина в крови пациентов с различной патологией молочной железы может быть перспективным маркером раннего рака молочной железы, т. к. наибольшее повышение его уровня в ткани РМЖ происходи именно на ранних стадиях. В тоже время снижение уровня экспрессии мРНК маммаглобина в ткани опухоли при более поздних стадиях не должно сказаться на диагностических параметрах, т.к. размеры опухоли при этом существенно выше.

Вывод, мРНК маммаглобина является перспективным тканеспецифическим маркером различных патологий молочной железы. Дальнейшее изучение его прогностических и диагностических свойств поможет установить место этого показателя в алгоритмах диагностики патологии молочных желез.

Перейти в оглавление статьи >>>

Список литературы

1. Becker RM, Darrow C, Zimonjic DB, Popescu NC, Watson MA, Fleming TP. Identification of mammaglobin B, a novel member of the uteroglobin gene family. Genomics 1998;54:70-78.

2. Bernstein JL, Godbold JH, Raptis G, et al. Identification of mammaglobin as a novel serum marker for breast cancer. Clin Cancer Res 2005;11:6528-35.

3. Chen XQ, Bonnefoi H, Pelte MFet al.: Telomerase RNA as a detection marker in the serum of breast cancer patients. Clin Cancer Res 2000, 6:3823-3826

4. Kopreski MS, Benko FA, Kwak LW, Gocke CD: Detection of tumor messenger RNA in serum of patients with malignant melanoma. Clin Cancer Res 1999, 5:1961-1965

5. Muller-Schottle F, Classen-Linke I, Beier-Hellwig K, Sterzik K, Beier HM: Uteroglobin expression and release in the human endometrium. Ann NY Acad Sci 2000, 923:332-335.

6. Nunez-Villar M.J., Martinez-Arribas F., Pollan M. et al. Elevated mammaglobin (h-MAM) expression in breast cancer is associated with clinical and biological features defining a less aggressive tumour phenotype. Breast Cancer Res. 2003 v.5 p.R65- R70

7. O'Brien N, Maguire TM, O'Donovan N, Lynch N, Hill AD, McDermott E, O'Higgins N, Duffy MJ. Mammaglobin a: a promising marker for breast cancer. Clin Chem. 2002 v.48 p.1362-1364

8. Sjödin A, Guo D, Lund-Johansen M, Krossnes BK, Lilleng P, Henriksson R, Hedman H. Secretoglobins in the human pituitary: high expression of lipophilin B and its down-regulation in pituitary adenomas. Acta Neuropathol (Berl). 2005;109:381-386.

9. Span P.N., Waanders E., Manders P. et al. Mammaglobin is associated with low-grade, steroid receptor-positive breast tumors from postmenopausal patients, and has independent prognostic value for relapse-free survival time. J. Clin. Oncol. 2004 v.22 p.691-698

10. Stoeckelhuber M, Messmer EM, Schmidt C, Xiao F, Schubert C, Klug J. Immunohistochemical analysis of secretoglobin SCGB 2A1 expression in human ocular glands and tissues. Histochem Cell Biol. 2006 Jul;126(1):103-9.

11. Watson MA, Dintzis S, Darrow CM, Voss LE, DiPersio J, Jensen R, Fleming TP: Mammaglobin expression in primary, metastatic, and occult breast cancer. Cancer Res 1999, 59 : 3028-3031.

12. Watson MA, Fleming TP. Isolation of differentially expressed sequence tags from human breast cancer. Cancer Res 1994;54:4598-4602

13. Watson MA, Fleming TP. Mammaglobin, a mammary-specific member of the uteroglobin gene family, is overexpressed in human breast cancer. Cancer Res 1996;56:860-865

14. Wong SC, Lo SF, Cheung MT at all, : Quantification of plasma beta-catenin mRNA in colorectal cancer and adenoma patients. Clin Cancer Res 2004, 10:1613-1617 Перейти в оглавление статьи >>>

© Вестник РНЦРР Минздрава России © Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России