СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРУПНОЗЕРНЫХ ФОРМ У АПОМИКТИЧНЫХ ГИБРИДОВ КУКУРУЗЫ
METHOD OF PRODUCTION OF BIG GRAIN FORMS OF APOMIXIC HYBRIDS OF MAIZE

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано при возделывании гибридов кукурузы.
В селекционной практике известны способы увеличения крупности семян злаков путем обработки посевного материала химическими мутагенами.
2
3
Известен способ получения крупнозерных форм овса путем обработки семян N-нитрозометилмочевиной (Ксенда Т.В., Азовцева А.П. Изменчивость хозяйственно-ценных признаков овса под влиянием химических мутагенов. // Химический мутагенез и селекция. - М.: Наука, 1971. С.307-312). Для этого сухие семена овса (сорт Орел) в течение 20 часов обрабатывали N-нитрозометилмочевиной (НММ) в концентрации 0,012% и 0,006% и диметилсульфатом (ДМС) - 0,05% и 0,025%. ДМС оказался эффективнее по влиянию на признак крупнозерности. При использовании ДМС в концентрации 0,025% в поколении M выделено в три раза больше крупнозерных форм, чем при обработке НММ. В М выделена семья (№12711), у которой вес 1000 зерен на 6 г превысил контроль (необработанные мутагеном семена), что составило 19,4%.
Известен способ увеличения содержания запасных белков в зерновках у сильных сортов яровой мягкой пшеницы путем обработки последних 5-азацитидином (Ванюшин Б.Ф. и др. Увеличение белковости зерновок пшениц под влиянием 5-азацитидина - ингибитора метилирования ДНК. // Изв. АН СССР. Сер. биол., 1990. №1. С.75-83.). 5-Азацитидин вводили в растения на стадиях колошения и цветения несколькими способами: 1) опрыскивая колос и флаговый лист из пульверизатора раствором 5-азацитидина с концентрацией 2,5 мкг/мл; 2) инъекцией в соломину (верхнее междоузлие) 0,5 мл раствора 5-азацитидина с концентрацией 0,1-5 мкг/мл; 3) погружая надрезанный флаговый лист на несколько дней в раствор 5-азацитидина с концентрацией 1-5 мкг/мл. У всех подвергнутых тому или иному воздействию 5-азацитидина растений пшеницы по сравнению с контролем содержание суммарного белка в зерне увеличено в 1,2-1,5 раза.
Недостатком известного способа является то, что индуцированное 5-азацитидином увеличение содержания запасных белков в зерновках не сопровождается возрастанием их веса (получением крупнозерных форм).
Известно, что метилирование ДНК играет особую роль в регуляции экспрессии генов, репликации генома и клеточной дифференцировке у растений и животных (Патрушев Л.И. Экспрессия генов. - М.: Наука, 2000. 527 с.). Для экспрессии многих генов необходимо, чтобы они были неметилированы. У высших растений ДНК сильно метилирована по остаткам цитозина. Синтетический нуклеозид 5-азацитидин при репликации может включаться в ДНК, замещая в ней цитозиновые остатки. В местах такой замены, метилирование ДНК с образованием остатков 5-метилцитозина, становится невозможным (Jones P.F., Taylor S.M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. // Cell. 1980. V.20. P.85.).
6
10
Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ получения крупнозерных форм кукурузы Zea mays L. (Моргун В.В. Экспериментальный мутагенез и его использование в селекции кукурузы. - Киев: Наук. думка, 1983. 280 с.). Константную инбредную линию ВИР 27 обрабатывали рядом мутагенов: N-нитрозоэтилмочевиной (концентрация - 0,0001%), 1,4-бис-диазоацетилбутаном (0,1%), стрептомицином (10 мкг/мл). Время экспозиции 24 часа. Вес 1000 семян у выделенных мутантных линий кукурузы относительно контроля возрос на 20,8-24,8% (средние по поколениям М-М). Линия ЧК 218, полученная при обработке стрептомицином, была использована в качестве родительского компонента при создании сорта кукурузы Юбилейный 60 (скрещивание гибрида (CG 10×F115) с линией ЧК 218), который был районирован в 1982 году в Черкасской области (Каталог впервые предлагаемых к районированию с 1982 года сортов сельскохозяйственных культур. - М., 1981).
Недостатком известного способа является случайный характер мутационного эффекта и его зависимость от многих факторов, а также изменение первичной последовательности нуклеотидов в геноме кукурузы.
Технической задачей изобретения является увеличение веса семян апомиктичных гибридов кукурузы при сохранении первичной последовательности нуклеотидов в ее геноме.
Поставленная техническая задача достигается заявляемым способом, заключающимся в следующем.
1
2
Сухие семена апомиктичных гибридов кукурузы замачивают при комнатной температуре в водном растворе 5-азацитидина с концентрацией 0,08-0,24 мкг/мл при массовом соотношении семена - раствор 5-азацитидина, равном 1:(4-6). Время экспозиции продолжается до стадии прорастания. По мере уменьшения количества раствора его добавляют до начального объема. В поколениях М-М отбирают семьи с увеличенной крупностью семян (крупнозерные формы) в сравнении с контролем (необработанные семена) и используют для дальнейшего получения урожаев. Способ позволяет увеличить вес семян у апомиктичных гибридов кукурузы и половых растений на 13-29%.
Определяющим отличием заявляемого способа, по сравнению с прототипом, является то, что для получения крупнозерных форм у апомиктичных гибридов кукурузы используют водный раствор синтетического нуклеозида 5-азацитидина в концентрации 0,08-0,24 мкг/мл, который препятствует метилированию ДНК при эпигенетическом маркировании генов и позволяет увеличить вес семян до 13-29%. Использование эпимутагена 5-азацитидина, блокирующего метилирование ДНК, позволяет сохранить структуру гена (сохраняется первичная последовательность нуклеотидов), включив при этом экспрессию отдельных генов, что позволяет увеличить хозяйственно-полезные признаки у апомиктичных гибридов кукурузы, конкретно, вес семян.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
Материалом служили 39-хромосомные (30Zm+9Td) апомиктичные гибриды кукурузы Zea mays L. с гамаграссом Tripsacum dactyloides L. Сухие семена замачивали при комнатной температуре в бюксах с раствором 5-азацитидина концентрации 0,24 мкг/мл в массовом соотношении 1:4 и выдерживали до стадии прорастания (2-3 дня) с периодическим подливанием раствора до исходного объема. Проклюнувшиеся зерновки переносили в чашки Петри с фильтровальной бумагой, смоченной дистиллированной водой, и проращивали в термостате при температуре 27°С. Контрольные семена (необработанные) проращивали в чашках Петри, замачивая их в дистиллированной воде.
В таблице 1 представлены данные по влиянию 5-азацитидина (AZ) на выживаемость проростков. Из табл.1 видно, что при обработке 5-азацитидином гибнет около 30% проростков, что говорит о токсическом действии данного препарата, наблюдаемом также и при обработке классическими химическими мутагенами.
Пример 2.
Сухие семена 39-хромосомных (30Zm+9Td) апомиктичных гибридов кукурузы Zea mays L. с гамаграссом Tripsacum dactyloides L. замачивали при комнатной температуре в бюксах с раствором 5-азацитидина концентрации 0,08 мкг/мл в массовом соотношении 1:6 и выдерживали до стадии прорастания (2-3 дня) с периодическим подливанием раствора до исходного объема. Проклюнувшиеся зерновки переносили в чашки Петри с фильтровальной бумагой, смоченной дистиллированной водой, и проращивали в термостате при температуре 27°С. Контрольные семена (необработанные) проращивали в чашках Петри, замачивая их в дистиллированной воде.
1
2
Влияние 5-азацитидина на крупность зерна изучали на взрослых растениях поколений М (на парниках селекционно-генетического комплекса ИЦиГ СО РАН, г.Новосибирск) и М (на экспериментальном участке КНИИСХ им. П.П.Лукьяненко, г.Краснодар). Контролем служили растения, выросшие из необработанных семян.
1
2
1
1
2
Кукурузно-трипсакумные гибриды имеют вегетационный период более 5 месяцев, поэтому в условиях Новосибирской области проростки сначала сажали в горшочки с землей в теплице, а затем растения высаживали в парник. С каждого растения М семена убирались отдельно. Семена поколения M высевали в полевых условиях по семьям (потомство каждого растения М). Так как апомиктичные гибриды являются мужскостерильными, то для формирования эндосперма зерновок необходимо оплодотворение центральной клетки зародышевого мешка пыльцой кукурузы. В качестве опылителей использовали тетраплоидные формы кукурузы - Тестер пурпуровый (г.Новосибирск) и С-435 (г.Краснодар). В поколениях М-М отбирали семьи с увеличенным весом семян (крупнозерные формы) по сравнению с контролем.
1
2
1
2
В таблице 2 представлены данные по среднему весу семян в поколениях М-М растений апомиктичного кукурузно-трипсакумного гибрида (2n=39=30Zm+9Td), выросших из обработанных 5-азацитидином (AZ) семян, при опылении тетраплоидной формой кукурузы (2n=4x=40). Из табл.2 видно, что в поколении М у двух семей (№90 и №116) из четырнадцати средний вес семян достоверно выше, чем в контроле (на 28,4% и 13,6% соответственно). При посеве поколения М в полевых условиях у этих семей он также достоверно выше (№90 - на 28,8%; №116 - на 12,5%). Во втором поколении и в других семьях выявлялись достоверные отличия от контроля как в сторону увеличения веса зерновок (№88, №106), так и уменьшения (№114).
2
На чертеже представлены распределения по признаку "вес семян" в M лучших семей, обработанных 5-азацитидином, и в контроле. Из чертежа видно, что при обработке 5-азацитидином, по сравнению с контролем, достоверна не только разница средних, но и частотный характер опытных и контрольных распределений по этому признаку, что подтверждается сравнением по методу Колмогорова - Смирнова. При этом в семьях, обработанных 5-азацитидином, относительно контроля наблюдалось возрастание частот классов с максимальным значением признака "вес семян" (распределения сдвинуты вправо).
1
2
Полученные результаты позволяют говорить о возможности действия 5-азацитидина на экспрессию импринтинга и разблокировании генов, полученных зиготой от матери. При этом эффект увеличения веса семян в разных семьях составляет 12,5-28,8% и обнаруживается как в M, так и М.
Использование заявляемого способа позволит получать крупнозерные формы у апомиктичных гибридов кукурузы при сохранении первичной последовательности нуклеотидов в ее геноме.
Таблица 1
Способ получения крупнозерных форм у апомиктичных гибридов кукурузы
Опыт-1
Опыт-2
Контроль
AZ
Контроль
AZ
Заложено зерновок
24
37
20
33
Проклюнулось зерновок
24
36
20
33
Погибло в чашках Петри
0
6
0
3
Погибло после посадки
0
6
1
7
Погибло всего
0 (0%)
12 (33%)
1 (5%)
10 (30%)
Взрослых растений
24
24
19
23
Таблица 2
Способ получения крупнозерных форм у апомиктичных гибридов кукурузы
№ растения
M<sub>1 </sub>(AZ)
M<sub>2</sub> (AZ)
Вес зерновки, г
Лимиты, мг
n
Вес зерновки, г
Лимиты, мг
n
87
0,094±0,007
7-155
36
88
0,084±0,006
3-140
37
0,094±0,004**
4-170
167
90
0,113±0,006***
15-165
34
0,103±0,003***
2-195
231
94
0,061±0,006
4-115
26
0,078±0,003
2-175
183
95
0,091±0,007
10-145
33
0,098±0,003***
2-175
226
97
0,097±0,005
4-140
43
0,092±0,006
5-175
68
98
0,081±0,005
3-130
59
99
0,084±0,005
3-135
39
103
0,080±0,006
7-140
60
0,085±0,004
3-185
122
106
0,088±0,006
3-145
45
0,099±0,003***
2-175
168
108
0,088±0,005
6-125
61
0,072±0,008
4-130
27
114
0,067±0,006*
3-125
45
0,062±0,004**
2-140
102
115
0,090±0,004
3-145
73
0,089±0,004
4-165
102
116
0,100±0,006*
3-150
58
0,090±0,003**
2-170
204
Z
0,090±0,002
3-165
705
0,091±0,001***
2-195
1600
Контроль
0,088±0,002
1-170
578
0,080±0,003
2-170
156
Примечание. Звездочками отмечена достоверность отличий от контроля: *Р<0,05; **Р<0,01; ***P<0,001.