Процессы клеточного обновления и их взаимосвязь с герпетическим поражением при тяжелой цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки

ПРОЦЕССЫ КЛЕТОЧНОГО ОБНОВЛЕНИЯ И ИХ ВЗАИМОСВЯЗЬ С ГЕРПЕТИЧЕСКИМ ПОРАЖЕНИЕМ ПРИ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕРВИКАЛЬНОЙ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ НЕОПЛАЗИИ И РАКЕ

ШЕЙКИ МАТКИ

ЛЕСНИЧАЯ О.В.,* КРЫЛОВ Ю.В.,**

СЕМЕНОВ Д.М.,* ГРИБ А.К.***

УО «Витебский государственный медицинский университет»», Витебское областное клиническое патологоанатомическое бюро**,

УО «Гродненский государственный медицинский университет»»**

Резюме. Статья посвящена изучению влияния герпетической инфекции на процессы апоптоза и пролиферации при цервикальной интраэпителиальной неоплазии тяжелой степени и раке шейки матки. В работе представлен комплексный клинико-морфологический анализ экспрессии фактора пролиферации Ki-67, ингибитора апоптоза Bcl-2 и мутантного онкопротеина p53 с использованием иммуногистохимического и морфометрического методов исследования. Установлены благоприятные и неблагоприятные прогностические маркеры предракового состояния и опухолевого роста в шейке матки.

Ключевые слова: Ki-67, Bcl-2, p53, цервикальная интраэпителиальная неоплазия, рак шейки матки, вирус простого герпеса.

Abstract. Article is devoted to studying of herpetic infection influence on apoptosis and proliferation processes at heavy degree cervical intraepithelial neoplasia and uterus neck cancer. In the work the complex clinicomorphological analysis of proliferation factor Ki-67, inhibitor of apoptosis Bcl-2 and mutant oncoprotein p53 expression with the usage of immunohistochemical and morphometric research methods is presented. Favorable and unfavorable prognostic markers of precancerous condition and tumor growth in uterus neck were determined.

Keywords: herpes simplex virus, cervical intraepithelial neoplasia, cervical carcinoma.

Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь, 210023, г. Витебск, пр-т Фрунзе, 27, Витебский государственный медицинский университет, тел. раб. 22-41-82, тел. домашний 53-58-61, тел. моб. +375-29-511-45-28. -Лесничая О.В.

Актуальность.

Рак шейки матки (РШМ) является одной из наиболее серьезных медицинских и социальных проблем женского репродуктивного здоровья. По данным Белорусского канцер-регистра, в республике наблюдается рост заболеваемости раком шейки матки с 15,2 в 1999-2003 году, до 15,8 в 2004-2008 году на 100 тыс. женского населения [1]. Максимальные уровни заболеваемости раком шейки матки фиксируются в группе женщин 45-55 лет. В то же время анализ повозрастных показателей заболеваемости указывает на увеличение числа больных младших возрастных групп [2].

В настоящее время имеется достаточно данных, подтверждающих причинную связь папилломавирусной инфекции с предопухолевыми заболеваниями и раком шейки матки. Доказано, что при папилломавирусной инфекции риск прогрессии цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН) II степени в рак in situ равен 1% за год наблюдения, а риск прогрессии ЦИН II в ЦИН III за два года равен 1б% [3]. Многочисленные исследования свидетельствуют также о наличии связи между герпетической инфекцией гениталий и онкологическими заболеваниями шейки матки [4]. Однако прямых доказательств этиологической роли ВПГ в развитии рака шейки матки нет.

Несмотря на то, что существуют различные мнения о продолжительности латентного периода озлокачествления (от 2 до 12 лет и более), в настоящее время надежные морфологические критерии, которые позволяли бы судить о прогнозе ЦИН разной степени тяжести, отсутствуют.

Для прогнозирования течения предопухолевого и опухолевого процесса имеет большое значение определение баланса пролиферативной активности и апоптоза. В основе иммуногистохимической оценки пролиферации лежит использование антител к Kí-67 [5]. Нарушения механизма развития апоптоза могут наступать тогда, когда ключевой ген этого процесса wt р53 теряет свою функцию. Это может наступить в результате мутации гена wt р53 с образованием мутантного онкопротеина - mt р53, что наблюдается в условиях патологии или в результате блокады wt р53 другими протеинами, к которым, в первую очередь, относится Bcl-2. Установлено, что онкопротеин Bcl-2 является одним из главных ингибиторов апоптоза [5]. Нарушение генетически запрограммированных процессов клеточной гибели может привести к неуправляемому со стороны гормональной системы организма клеточному росту и развитию в шейке матки неоплазии либо рака, в связи с чем, исследования, направленные на изучение экспрессии факторов апоптоза в эпителиальных клетках эктоцервикса, считаются весьма перспективными [б]. Выраженность процессов пролиферации и апоптоза при дисплазиях многослойного плоского эпителия (МПЭ) и РШМ (с учетом экспрессии Ki-67, p53, Bcl-2) активно обсуждается в литературе, но характеризуется отсутствием цифровых данных или их большим разбросом и даже противоречивостью [7].

Цель исследования - установить влияние герпетической инфекции на экспрессию Ki-67, Bcl-2, p53 при раке шейки матки и тяжелой цервикальной интраэпителиальной неоплазии.

Методы

Исследовано 45 биоптатов шейки матки женщин, состоявших на учете в Витебском областном клиническом онкодиспансере по поводу ЦИН III и рака шейки матки. Средний возраст женщин составил 46,2±1,88 года. Для клинической характеристики пациенток с раком шейки матки были использованы данные канцер-регистра и данные амбулаторных карт Витебского областного онкологического диспансера.

Основой для анализа предраковых и опухолевых состояний шейки матки служила Гистологическая классификация опухолей женского полового тракта Всемирной организации здравоохранения [8]. Гистологический диагноз ЦИН устанавливался на основании следующих морфологических критериев: изменение размеров и формы клеток и ядер, появление гиперхромных ядер, увеличение числа митозов, нарушение ядерно-цитоплазматического соотношения [9]. Учитывая, что ЦИН III является собирательным понятием, объединяющим дисплазию III степени и cancer in situ, к цервикальной интраэпителиальной неоплазии III степени (тяжелой дисплазии многослойного плоского эпителия) были отнесены случаи, когда патологический процесс локализовался в верхней трети эпителия, но не поражал всю толщину эпителиального пласта [9]. Критерием для постановки диагноза карцинома in situ являлось поражение всего пласта с наличием выраженной атипии клеток и ядер, митозов, в том числе патологических, на разных уровнях эпителия [10]. Заключение о поражении вирусом простого герпеса (ВПГ) ставилось на основании внутриядерных включений I и II типа, наличия феноменов «тутовой ягоды», и «пустых ядер» [11].

Для морфологической характеристики из архивных парафиновых блоков делались срезы толщиной 5 мкм, которые депарафинировались в ксилоле, спиртах и окрашивались гематоксилином и эозином.

Оценка морфологических параметров проводилась с использованием светового оптического микроскопа «Carl Zeiss» Axiostar 40 при увеличении 100, 200 и 400. При исследовании срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, оценивались такие морфологические параметры, как степень ЦИН и степень дифференцировки рака, наличие герпетических включений.

Для выявления пролиферативной активности клеток использовалось им-муногистохимическое окрашивание гистологических срезов с применением моноклональных антител к ядерному протеину Ki-67, который экспрессируется при активных фазах клеточного цикла. Для выявления мутантного p53 протеина (являющегося продуктом мутации опухолевого гена-супрессора p53, блокирующего прохождение клеток по митотическому циклу и индуцирующего апоптоз) использовали моноклональные мышиные антитела. Для выявления подавления апоптоза использовали антитела к Bcl-2 онкопротеину. Антигены ВПГ II типа выявлялись с помощью поликлональных кроличьих антител (фирма «DAKO»). Из парафиновых блоков готовились срезы толщиной 5 микрон, переносились на предметные стекла, покрытые L-полилизином. Срезы в вертикальном положении высушивали 18 часов при комнатной температуре, помещали в термостат на 30 мин. при температуре 60°С [12]. После депарафинации

предметные стекла со срезами переносились в цитратный буфер pH 6.0, и помещались в водяную баню при температуре 98oC на 30 мин. С первичными антителами в стандартном разведении срезы инкубировались в течение 30 минут при комнатной температуре. В качестве визуализирующей системы использовали комплекс вторичных антител LSAB фирмы «DAKO» с диаминбензидином (ДАБ). Ставились положительные контроли.

Для морфометрического исследования микропрепараты фотографировали в 5 полях зрения (объектив 40) с разрешением 2592 на 1944 пикселей при помощи микроскопа Axiostar 40 и цифровой камеры Canon Power Shot A95. Снимки конвертировали в бинарный вид и проводили морфометрический просчет ДАБ-положительных клеток при помощи анализатора изображений WCIF ImageJ и Aperio Image Scope [13].

Результаты и обсуждение

В исследованных нами 23 биоптатах шейки матки у женщин с верифицированным раком шейки матки преобладали случаи со степенью злокачественности Грейд II (18 женщин (78±0,09%)), у 16 пациенток (70±0,1%) имело место вовлечение в патологический процесс более одной локализации, у 8 женщин (35±0,1%) наблюдались лимфогенные и гематогенные метастазы. Анализ структуры онкологической патологии свидетельствует о достаточно агрессивном течении рака шейки матки. Только у 5 пациенток (22±0,09%) имела место высокая степень дифференцировки (Грейд I) и у 7 (30±0,1%) - поражение ограничивалось только эктоцервиксом.

С целью определения особенностей апоптоза и клеточной пролиферации при опухолях шейки матки была проанализирована связь экспрессии исследуемых маркеров со степенью дифференцировки плоскоклеточного рака (таблица 1).

Таблица 1

Среднее количество позитивных клеток при раке шейки матки __________различной степени дифференцировки __________________

Степень дифференцировки опухоли Ki-67 Bcl-2 p53

Плоскоклеточный рак шейки матки, Грейд I 240,20±34,09 5б,б0±42,54 20,40±10,23

Плоскоклеточный рак шейки матки, Грейд II 405,5б±45,0б б3,39±22,45 107,11±21,70

На основании проведенных исследований, установлено, что средняя экспрессия К1-67 при плоскоклеточном раке, Грейд I, была 240,20±34,09 на 1000 клеток, при степени злокачественности Грейд II плоскоклеточного рака этот показатель составил 405,56±45,06. Средний уровень экспрессии Вс1-2 и р53 при Грейд I был 56,60±42,54 и 90,00±25,34 соответственно, а при плоскоклеточном раке, Грейд II - 63,39±22,45 и 87,78±23,06 на 1000 клеток.

Полученные данные были проанализированы с помощью и-критерия Манна-Уитни. Экспрессия фактора пролиферации Кь67 в плоскоклеточном ра-

ке шейки матки высокой степени дифференцировки (Грейд I) была статистически значимо ниже, чем в биоптатах с умеренно дифференцированной опухолью (Грейд II), р=0,037. Статистически значимо более высокий уровень накопления мутантного p53 наблюдался при Грейд II степени злокачественности плоскоклеточного рака шейки матки (p=0,006). Не было статистически значимых различий в экспрессии ингибитора апоптоза Bcl-2 (p= 0,29).

Таким образом, нами установлено, что при снижении степени дифферен-цировки рака шейки матки, имеет место увеличение пролиферативной активности и накопления мутантного p53, что позволяет отнести гиперэкспрессию Ki-67 и p53 к неблагоприятным прогностическим маркерам.

При проведении анализа связи экспрессии исследуемых маркеров с распространенностью опухолевого процесса было установлено, что средний уровень экспрессии фактора пролиферации, Ki-67, был выше при раке шейки матки, занимающем более одной локализации, и составил 379,00±45,22 на 1000 клеток (Таблица 2).

Таблица 2

Среднее количество позитивных клеток при раке шейки матки с различной распространенностью опухолевого процесса____________

Клинико-морфологические критерии Ki-67 Bcl-2 p53

Поражение только эктоцервикса 307,29±57,95 122,29±49,95 б3,00±18,11

Поражение, занимающее более одной локализации 379,00±45,22 29,05±13,30 90,25±23,9б

При поражении, не выходящем за пределы эктоцервикса, средний показатель пролиферативной активности составил 307,29±57,95. Наблюдалась та же тенденция к повышению накопления мутантного типа р53 в плоскоклеточном раке, выходящем за пределы эктоцервикса (90,25±23,96), по сравнению с нераспространенным опухолевым ростом (63,00±18,11). Экспрессия ингибитора апоптоза Ьс1-2 была выше при раке шейки матки, ограниченном эктоцервиксом (122,29±49,95). При опухоли, занимающей более одной локализации, среднее количество Ьс1-2 положительных клеток составило 29,05±13,30.

Сравнение связи экспрессии маркеров с распространенностью опухолевого процесса проводилось также с помощью и-критерия Манна-Уитни. В исследуемых группах не было выявлено статистически значимых различий в степени пролиферативной активности (р=0,193) и в уровне накопления мутантного р53 (р=0,789).

При анализе экспрессии ингибитора апоптоза была обнаружено, что при раке шейки матки, не выходящем за пределы эктоцервикса, уровень Вс1-2 был статистически значимо выше, чем при распространенных опухолях (р=0,007). Это позволяет предположить, что высокий и средний уровень экспрессии ингибитора апоптоза (более 50 на 1000 клеток при увеличении х400) является относительно благоприятным прогностическим маркером, который может свидетельствовать об ограниченном процессе.

При исследовании пролиферативной активности клеток с определением Кь67, мутантного р53 протеина и Вс1-2 онкопротеина при раке шейки матки с различным метастатическим потенциалом опухоли установлены следующие закономерности (Таблица 3).

Таблица 3

Среднее количество позитивных клеток при раке шейки матки с различным метастатическим потенциалом опухоли__________________

Клинико-морфологические критерии Ю-67 Bcl-2 p53

Рак шейки матки с метастазами 345,11±64,62 14,33±4,43 61,82±16,25

Рак шейки матки без метастазов 443,43±47,57 85,13±29,72 97,54±26,42

При сопоставлении двух групп по морфометрическим показателям экспрессии Кі-67 и уровня накопления мутантного р53 с помощью И-критерия Манна-Уитни, не было обнаружено статистически значимых различий (р=0,243 и р=0,361 соответственно) в биоптатах рака шейки матки с метастазами и без метастазов. Экспрессия ингибитора апоптоза Вс1-2 была статистически значимо выше в группе пациентов с раком шейки матки без метастазов (р=0,018). Полученные данные позволяют предположить, что высокий и средний уровень экспрессии ингибитора апоптоза (более 50 на 1000 клеток при увеличении х400) является относительно благоприятным прогностическим маркером, который предполагает отсутствие метастазов опухоли.

При исследовании 23 биоптатов шейки матки у женщин с верифицированным раком шейки матки установлена высокая частота герпетической инфекции. Светооптические признаки герпетического поражения были установлены в 11 биоптатах, что составило 48±0,11% случаев, в 12 (52±0,11%) биоптатах включения вируса простого герпеса отсутствовали.

При исследовании пролиферативной активности клеток с определением Кі-67, мутантного р53 протеина и Вс1-2 онкопротеина установлены следующие закономерности.

При проведении корреляционного анализа с использованием непараметрического критерия Спирмена имеет место обратная корреляция между степенью экспрессии Кі-67 и Вс1-2 при раке шейки матки без светооптических признаков герпеса, коэффициент корреляции, г3, при этом составил -0,6, р=0,04. При раке шейки матки без светооптических признаков герпетического поражения уровень экспрессии Кі-67 коррелировал с р53: г3=0,88, р=0,0003 (таблица

Таблица 4

Корреляционная связь экспрессии Ш-67, Bcl-2 и p53 при раке шейки

матки

Показатель n Spearman t(N-2) Уровень p

Кі-67 и Вс1-2 при раке шейки матки без светооптических признаков герпеса 12 -0,609458 -2,43092 0,035395

Кі-67 и р53 при раке шейки матки с наличием светооптических признаков герпеса 11 0,880665 5,576895 0,000344

Полученные данные подтверждают связь возрастания пролиферативной активности клеток при раке шейки матки с увеличением содержания мутантного p53 протеина.

Обращает на себя внимание наличие корреляционной зависимости между увеличением пролиферативной активности и нарастанием экспрессии мутантного p53 (p=0,003) у пациенток с раком шейки матки в биоптатах у которых выявлены светооптические признаки ВПГ II. Выявленная корреляционная зависимость свидетельствует, что наличие герпетической инфекции у пациенток с раком шейки матки способствует увеличению пролиферативной активности, и блокированию апоптоза, что способствует прогрессированию опухолевого процесса.

В исследованных нами 22 биоптатах шейки матки у женщин с верифицированным диагнозом цервикальная интраэпителиальная неоплазия III степени, у 14 (64±0,11%)т пациенток была выявлена тяжелая дисплазия многослойного плоского эпителия и у 8 (36±0,11%) - cancer in situ.

При микроскопическом исследовании биоптатов женщин с тяжелой ЦИН установлен высокий уровень инфицированности вирусом простого герпеса. Так, герпетические включения имелись в 9 образцах шейки матки с тяжелой дисплазией и в 5 биоптатах с cancer in situ, что составило 64±0,13% и 63±0,18% соответственно. В 5 (36±0,13%) случаях с дисплазией МПЭ и в 3 (38±0,18%) - с раком in situ морфологических признаков герпетического поражения обнаружено не было.

Для выявления корреляционных зависимостей между экспрессией Ki-67, Bcl-2, p53 и ВПГ II при ЦИН III (тяжелой дисплазии и cancer in situ шейки матки) использовался непараметрический критерий Гамма. Было установлено, что при дисплазии тяжелой степени уровень экспрессии Bcl-2 коррелировал с экспрессией антигенов вируса простого герпеса II типа: rG=0,63, p=0,03. Обратная корреляция наблюдалась при раке in situ при оценке связи экспрессии Bcl-2 и p53: rG=-0,57, p=0,04.

Наличие прямой корреляционной зависимости между экспрессией антигенов вируса простого герпеса II типа и Bcl-2 при дисплазии III степени шейки матки свидетельствует об активации антиапоптозных программ при герпетиче-

ском инфицировании на данном этапе предраковой трансформации. По мере прогрессирования неопластических изменений, влияние фактора, блокирующего апоптоз снижается, в то время как приобретает значение мутация ^ р53 гена-онкосупрессора с накоплением мутантного онкопротеина р53.

Заключение

1. При снижении степени дифференцировки рака шейки матки, имеет место увеличение пролиферативной активности (р=0,037) и накопления мутантного р53 (р=0,006), что позволяет отнести гиперэкспрессию Кь67 и р53 к неблагоприятным прогностическим маркерам.

2. Более высокая экспрессия Вс1-2 наблюдалась при раке шейки матки без метастазов (р=0,018) и при опухолевом процессе, не выходящем за пределы эк-тоцервикса (р=0,007) по сравнению с метастатически агрессивным и распространенным злокачественным процессом. Полученные данные позволяют предположить, что высокий и средний уровень экспрессии ингибитора апопто-за (более 50 на 1000 клеток при увеличении х400) является относительно благоприятным прогностическим маркером, который предполагает отсутствие метастазов и может свидетельствовать об ограниченном опухолевом процессе.

3. Наличие корреляция между увеличением пролиферативной активности и нарастанием экспрессии мутантного р53 (р=0,003) при раке шейки матки с наличием светооптических признаков ВПГ II, а также обратная корреляционная связь между увеличением экспрессии Кь67 и снижением уровня ингибитора апоптоза Вс1-2 (р=0,03) при карциноме без герпетических включений свидетельствует о том, что наличие герпетической инфекции эктоцервикса у пациенток с раком шейки матки утяжеляет течение онкологического заболевания и приводит к нарастанию пролиферативной активности раковых клеток.

4. При тяжелой дисплазии шейки матки, которая сопровождается герпетическим поражением многослойного плоского эпителия, наблюдается активация антиапоптозных программ, что подтверждается прямой корреляционной зависимостью между экспрессией антигенов вируса простого герпеса II типа и Вс1-2 (р=0,03).

Литература

1. Злокачественные новообразования в Беларуси / С.М. Поляков [и др.]; под ред. И.В. Малаховой, И.В. Залуцкого. - Минск: РНПЦ М.Т., 2009. - 205 с.

2. Максимов, С.Я. Комбинированное лечение рака шейки матки / С.Я. Максимов, К. Д. Гусейнов // Практическая онкология. - 2002. - Т. 3, № 3. - С 200-210.

3. Natural history of dysplasia of the uterine cervix / P. Holowaty [et al.] // J. Natl. Cancer Inst. - 1999. - Vol. 3, N 91(3). - P. 252-358.

4. Малярская, М.М. Проблема генитального герпеса в гинекологии и акушерстве / М.М. Малярская // Литобзор. Москва 1997 [Электронный ресурс].

- 1997 - Режим доступа: http://www.med2000.ru/perevod/article261.htm. - Дата доступа: 13.07.2007.

5. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / под ред. С.В. Петрова, Н.Г. Райхмана.- Казань, 2000. - 287 с.

6. Sheets E.E., Crum C.P., Yeh J. Association between cervical neoplasia and apoptosis as detected by in citu nuclear labeling. // Gynecol.Oncol. - 1996. - Vol. 63, N 1. - P. 94-100.

7. Роговская, С.И. Апоптоз при патологии шейки матки ассоциированный с вирусом папилломы человека // Гинекология. - 2005. - № 4. - С. 48-53.

8. Histologocal typing of female genital tract tumors / R.E. Scally [et al.]. - 2nd ed. - Berlin: Heidelberg, 1994.

9. Кондриков, Н.И. Патология матки: иллюстрир. рук-во / Н.И. Кондри-ков. - Москва: Практическая медицина, 2008. - 334 с.

10. Железнов, Б.И. Ультраструктура эпителия шейки матки при дисплазии / Б.И. Железнов, Л.С. Ежова, Л.А. Беляева // Арх. патологии. 1989. - Вып. 6.

- С. 56-62.

11. Недзьведь, М.К. Морфологическая характеристика герпетической инфекции у человека / М.К. Недзьведь, С. А. Гузов // Актуальные проблемы биологии и медицины: сборник тр. сотр. МГМИ. - Минск, 1996. - С. 107-108.

12. Гуревич, Л.Е. Использование в иммуногистохимических исследованиях метода восстановления антигенной специфичности, воздействием на ткани, фиксированные формалином. / Л.Е. Гуревич, В. А. Исаков // Архив патологии. -1999. - № 2. - С. 48-50.

13. Гриб, А.К. Оценка прогностического значения ангиогенеза в раке предстательной железы по данным иммуногистохимического и морфометрического исследования / А.К. Гриб, В. А. Басинский, А. В. Проворов // Журнал ГрГМУ. - 2007. - № 2. - С. 59-62.