Влияние фитосубстанций, обладающих антиоксидантной активностью, на персистентные свойства микроорганизмов

Є

Влияние фитосубстанций, обладающих антиоксидантной активностью, на персистентные свойства микроорганизмов

О. Л. КАРТАШОВА1, Т. М. УТКИНА1, А. В. ЖЕСТКОВ2, В. А. КУРКИН2, П. Н. ЗОЛОТАРЕВ2

' Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН, Оренбург 2 Самарский государственный медицинский университет, Самара

Effect of Phytosubstances with Antioxidant Activity on Persistence Properties of Microorganisms

O. L. KARTASHOVA, T. M. UTKINA, A. V. ZHESTKOV, V. A. KURKIN, P. N. ZOLOTAREV

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Urals Department of the Russian Academy of Sciences, Orenburg Samara State Medical University, Samara

В эксперименте in vitro изучено влияние фитосубстанций, содержащих флавоноиды и фенилпропаноиды, на антилизоцим-ную активность микроорганизмов различных групп: стафилококков, бацилл, энтеробактерий и неферментирующих бактерий. Установлено, что вторая фракция углекислотного экстракта гвоздики обладает высокой антиоксидантной активностью и наиболее эффективно подавляет способность микроорганизмов разных видов инактивировать лизоцим хозяина. Отобранная фитосубстанция может быть использована в клинической практике в качестве вспомогательного противоми-кробного средства как на этапе этиотропного лечения, так и для профилактики ряда инфекционных заболеваний.

Ключевые слова: фитосубстанции, антиоксидантная активность, антилизоцимная активность микроорганизмов.

The in vitro effect of phytosubstances containing flavonoids and phenylpropanoids on the antilysozyme activity of varioous groups of microorganisms, such as staphylococci, bacilli, enterobacteria and nonfermenting bacteria was studied. The second fraction of the pink carbonic acid extract showed high antioxidant activity and most efficiently inhibited the ability of various microorganisms to inactivate the host lysozyme. The selected phytosubstance could be useful in clinical practice as an additional antimicrobial agent in etiotropic therapy or prophylaxis of some infections.

Key words: phytosubstances, antioxidant activity, antilysozyme activity, microorganisms.

Введение

В настоящее время накоплено достаточно экспериментальных данных, дающих основание сделать вывод о нарастающем распространении резистентных к антибиотикам микроорганизмов, в результате чего большинство давно применяемых антибиотических препаратов не дают должного терапевтического эффекта [1, 2]. Необходим поиск новых препаратов для лечения и профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний, при которых возбудитель обладает набором персистентных свойств, позволяющих ему длительно сохраняться в организме хозяина [3]. В этом плане большой интерес представляют лекарственные растения, которые способны служить не только основой для разработки средств с антимикробной активностью, но и выступать в качестве источника соединений, обладающих необходимой модифицирующей актив© Коллектив авторов, 2009

Адрес для корреспонденции: 460000 Оренбург, ул. Пионерская, 11. Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза

ностью в отношении персистентного потенциала патогена [4].

В экспериментах in vitro выявлена ингибирующая способность фитопрепаратов в отношении антилизоцимного и антиинтерферонового признака энтеробактерий [5]. Установлено также, что различные формы гнойного хирургического заражения сопровождаются усилением свободнорадикального окисления липидов, изменяющего проницаемость мембран [6]. В связи с этим несомненный интерес представляют лекарственные средства на основе растений, содержащие фенилпропаноиды и флавоноиды, обладающие адаптогенным, антиоксидантным и иммуномодулирующими действием [7, 8].

Целью исследования является выявление фитосубстанций, модифицирующих персистентные свойства микроорганизмов и обладающих высокой антиоксидантной активностью.

Материал и методы

Объектом исследования служили 103 штамма микроорганизмов, выделенные из ран при гнойно-воспалительных за-

е

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Изменение выраженности антилизоцимной активности под влиянием фитосубстанций

Препарат AОA, Значение AHA Значение AHA Значение ЛЛЛ Значение AHA Значение ЛЛЛ

ед. кв. м кг/ * О ) м кг/ м л * О ) м кг/ м л * О )

S.aureus S.haemolyticus B.cereus E.coli P.aeruginosa

штамм Б 5581D штамм A B1G27

Контрольное значение признака 0,331 0,191 0,668 0,673 0,943

Элеутерококка колючего экстракт жидкий 0,26 -2 +3 -0 -1 +3

Расторопши пятнистой экстракт жидкий 0,47 -2 +3 -1 -1 -0

Родиолы розовой настойка 0,54 -3 +3 -0 -2 -2

Мелиссы настойка 0,42 +3 +3 -1 +3 +3

Полыни (эстрагон) настойка 0,47 +3 +3 -0 +1 -2

Эхинацеи пурпурной настойка 1,49 -3 +3 +3 +3 +2

Сирени настойка 0,18 +2 +3 -1 -3 +0

Лимонника плодов настойка 1,47 +3 +3 -0 -3 -3

Почек тополя настойка 2,71 +3 +3 -1 +3 +3

Зверобоя настойка 0,82 +2 +3 -0 +3 +2

Березы настойка 0,25 +3 +3 +1 +3 +3

Углекислотный экстракт фенхеля 0,75 +3 +3 -3 -3 +3

Углекислотный экстракт аниса 2,15 +2 +3 -3 -2 +2

Углекислотный экстракт гвоздики 0,16 +0 +3 +0 -0 -2

Вторая фракция углекислотного

экстракта гвоздики 4,55 -3 -3 -3 -3 -2

Примечание. 0 - изменение признака на 0-20%; 1 - изменение признака на 20-40%; 2 - изменение признака на 40-60%; 3 - изменение признака на 60% более; «-» - признак снижался; «+» - признак повышался.

болеваниях мягких тканей, среди них: Staphylococcus aureus — 34 штамма, Staphylococcus haemolyticus — 23, Bacillus cereus — 7, Escherichia coli — 21 и Pseudomonas aeroginosa — 18 штаммов.

Идентификацию микроорганизмов проводили на основе изучения морфологических, тинкториальных и биохимических свойств с использованием автоматического бактериологического анализатора «MiniAPI» ( BioMerieux, Франция).

Антилизоцимную активность (АЛА) у микроорганизмов определяли фотометрическим методом [3].

В эксперименте были использованы фитосубстанции, содержащие флавоноиды и фенилпропаноиды: настойки — из эхинацеи пурпурной, сирени, родиолы розовой, мелиссы, почек тополя, зверобоя, березы, полыни эстрагона, плодов лимонника; экстракты жидкие — из расторопши, ивы остролистной (разработки кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета), элеутерококка колючего, родиолы; углекислотные экстракты — из аниса, гвоздики, фенхеля (заводское производство), вторая фракция углекислотного экстракта гвоздики, полученная в результате вакуумной дистилляции в токе азота при разряжении давления с постепенным повышением температуры кипения [9, 10].

Суточные бульонные культуры получали при культивировании с суббактерицидной концентрацией исследуемых фитосубстанций (1 часть фитосубстанции и 3 части питательного бульона) в течение 1 ч при 37°С; надосадочную жидкость, содержащую продукты жизнедеятельности микроорганизма и исследуемые настои и экстракты, отделяли от клеток путем центрифугирования в течение 15 мин при 3000 об/мин. Далее определяли АЛА бактерий. В качестве контроля вместо исследуемых настоев и экстрактов использовали спирт и стерильный изотонический раствор хлорида натрия. При изменении персистентных характеристик на 20% и более, по сравнению с контролем, вещество считалось действенным [11].

Антиоксидантную активность (АОА) изучаемых фитосубстанций определяли амперометрическим методом на анализаторе «ЦветЯуза-ААА-01» (НПО «Химавтоматика», Москва) и выражали в единицах кверцетина (ед. кв.).

Достоверность различий оценивали непараметрическим методом [12].

Результаты исследований

Изученные фитосубстанции обладали разнонаправленным влиянием на антилизоцимную активность бактерий.

Как видно из таблицы, максимальное подавление АЛА штаммов S.aureus (снижение признака на 60% и более) оказывали препараты, содержащие родиолу розовую, эхинацею пурпурную и вторую фракцию углекислотного экстракта гвоздики. Снижение антилизоцимного признака на 40—60% отмечено под влиянием препаратов, содержащих элеутерококк колючий и расторопшу пятнистую; остальные препараты, содержащие лекарственные растения, повышали АЛА у S.aureus.

Большинство исследованных настоек и экстрактов лекарственных растений повышали антилизо-цимный признак у штаммов S.haemolyticus на 60% и более, вторая фракция углекислотного экстракта (УЭ) гвоздики подавляла способность стафилококка инактивировать лизоцим хозяина на 60%.

Изученные настойки и экстракты разнонаправленно влияли на АЛА у штамма B.cereus: так, жидкий экстракт элеутерококка и настойки родиолы розовой, полыни эстрагона, плодов лимонника и зверобоя, а также эфирное масло гвоздики не изменяли его антилизоцимную активность. Наиболее эффективно подавляли антилизоцимную активность B.cereus углекислотный экстракт фенхеля (на 66,8%), углекислотный экстракт аниса (на 73,9%) и вторая фракция углекислотного экстракта гвоздики (на 80,8%). Умеренным ингибирующим эффектом (на 20—40%) обладали: расторопши экстракт жидкий и настойки мелиссы, сирени, почек тополя. Стимулировали АЛА

B.cereus настойки эхинацеи пурпурной (на 86,2%), березы (на 29,3%) и углекислотный экстракт гвоздики (на 20%).

Антилизоцимную активность кишечной палочки эффективно подавляли (на 72—82%) препараты, содержащие кору сирени, плоды лимонника, углекислотный экстракт фенхеля и вторую фракцию углекислотного экстракта гвоздики; умеренное ингибирующее действие проявляли экстракты родиолы розовой и углекислотный экстракт аниса (на 46,1 и 55,1% соответственно); повышали признак (на 60% и более) настойки мелиссы, эхинацеи пурпурной, почек тополя, зверобоя и березы.

Оценка влияния фитосубстанций на АЛА P.aeruginosa показала, что наиболее эффективно снижала признак настойка плодов лимонника (на 65,9%); умеренным подавляющим действием (на 40,4—56,2%) характеризовались экстракт жидкий родиолы, настойка полыни эстрагона, а также вторая фракция УЭ гвоздики. Вместе с тем экстракт элеутерококка жидкий, настойки мелиссы, почек тополя и береза, а также УЭ фенхеля усиливали (на 60% и более) антилизоцимный признак у P.aeruginosa, тогда как настойка сирени и экстракт жидкий расторопши не оказывали влияния на антилизоцимный признак микроорганизмов.

Таким образом, изучение возможности регуляции фитосубстанциями антилизоцимного признака у бактерий в эксперименте in vitro позволило установить, что максимальное снижение (на 60% и более) способности микроорганизмов различных групп инактивировать лизоцим хозяина происходило под действием второй фракции УЭ гвоздики. Изучение антиоксидантной активности фитосубстанций позволило разделить их на три группы: низкие значения отмечены у препа-

ЛИТЕРАТУРА

1. Бурмистрова А. Л. Антибиотики и антибиотикорезистентность. Проблемы и пути решения. Челябинск, 2004; 176.

2. Страчунский. Л. С., Белоусов Ю. Б., Козлов С. Н. Антибактериальная терапия: практическое руководство. М.: 2000; 192.

3. Бухарин О. В. Персистенция патогенных бактерий. М.: 1999; 365.

4. Бухарин О. В., Челпаченко О. Е., Усвяцов Б. Я. И др. Влияние лекарственных растений на антилизоцимную активность микроорганизмов. Антибиотики и химиотер 2003; 5: 11—14.

5. Челпаченко О. Е. Экспериментальное обоснование рациональной терапии пиелонефрита у детей под контролем маркеров персистен-ции возбудителя. Автореф.... канд. мед. наук. Челябинск, 1993: 150.

6. Зиятдинова Г. К., Погорельцев В. И., Будников Г. К. Оценка состояния антиоксидантной защиты организма человека при наличии воспалительных процессов по данным кулонометрических измерений. Вопр биол мед и фарм хим 2005;1: 42—44.

7. Куркин В. А. Создание и стандартизация фитопрепаратов на основе лекарственных растений, содержащих флавоноиды и фенилпропа-ноиды. Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств. Фундаментальные науки новым лекарствам. М.: 2008; 106—107.

8. Золотарев П. Н. Выявление и определение антибактериальных свойств фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды, и ин-

ратов, разработанных на основе сырья гвоздики, сирени, березы, элеутерококка колючего, мелиссы, расторопши пятнистой, полыни, эхинацеи, родиолы розовой, фенхеля и зверобоя (от 0,16 ед. кв. до 0,82 ед. кв.), средние значения — у препаратов на основе лимонника (1,47 ед. кв.), аниса (2,15 ед. кв.) и тополя (2,71 ед. кв.), высоким значением антиоксидантной активности характеризовались фракция УЭ гвоздики (4,55 ед. кв.).

Обсуждение результатов

Выявление персистентных свойств у бактерий разных видов позволяет проводить поиск лекарственных средств, ослабляющих этот потенциал, затрудняющих их паразитирование в организме хозяина и способствующих быстрой элиминации из очага воспаления [3]. Одним из значимых факторов персистенции является антилизоцимная активность, которая встречается у подавляющего большинства условно'-патогенных и патогенных микроорганизмов [13].

Результаты представленных исследований показали, что наибольшую антилизоцимная активность исследуемых культур выявлена у второй фракции УЭ гвоздики, которая также обладала наиболее высокой антиоксидантной активностью. Полученные результаты подтверждают данные А. В. Тарасевича [14], показавшего, что максимальной способностью подавлять АЛА энтеробактерий обладали растения, богатые антиоксидантами.

Таким образом, полученные данные могут служить экспериментальным обоснованием целесообразности использования эффективной фитосубстанции в клинической практике в качестве вспомогательного антимикробного средства.

дивидуальных веществ. Медицинский вестник Башкортостана. Специальный выпуск. 2006; 1: 131—135.

9. Золотарев П. Н. Разработка способа получения продукта растительного происхождения, обладающего антимикробной активностью. Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы». Саратов, 2006; 76.

10. Куркин В. А., Запесочная Г. Г., Авдеева Е. В., Ежков В. Н. Фенилпропаноиды как самостоятельный класс биологически активных соединений. Самара, 2005; 128.

11. Шеенков Н. В. Роль антилизоцимной активности бактерий в развитии инфекционного процесса и пути ее регуляции. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Челябинск, 1993.

12. Гублер Е. В., Генкин А. А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Ленинград. 1973; 158.

13. Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект). Екатеринбург: УрО РАН, 1996; 206.

14. Тарасевич А. В. Регуляция антилизоцимной активности энтеробактерий эндогенными факторами желудочно-кишечного тракта и разработка рациональных подходов к диагностике и коррекции дисбиоза кишечника: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Оренбург, 2004.