СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПАРОКСИЗМАЛЬНОЙ НОЧНОЙ ГЕМОГЛОБИНУРИИ
LABORATORY DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR PAROXYSMAL NOCTURNAL HAEMOGLOBINURIA

Изобретение относится к области медицины, а именно клинико-лабораторным методам диагностики, и может быть использовано для скрининг-диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ).
Пароксизмальная ночная гемоглобинурия относится к редким заболеваниям.
ПНГ возникает вследствие мутации PIG-A гена. В результате этого нарушается синтез гликозилфосфатидилиннозитолового (GPI) якоря, осуществляющего фиксацию многочисленных молекул на мембране клеток крови (в том числе CD24 на гранулоцитах, CD14 на моноцитах, CD59 на эритроцитах и их предшественниках), которые защищают клетки крови от воздействия системы комплемента.
Мембрана эритроцитов в наибольшей степени подвержена воздействию мембран атакующего комплекса, и в отсутствие защитного белка CD59 эритроциты подвергаются гемолизу.
Для ПНГ характерны внутрисосудистый гемолиз, анемия, гемоглобинурия, тромботические осложнения, дисфагия, вялость, эректильная дисфункция, хроническая почечная недостаточность, легочная гипертензия.
Помимо этого ПНГ-клон может возникать при апластической анемии, аутоиммунной гемолитической анемии и миелодиспластическом синдроме. Возрастная медиана возникновения ПНГ - 30-35 лет. Заболеваемость пароксизмальной ночной гемоглобинурией от 1 до 10:1 млн человек. Смертность без лечения при пароксизмальной ночной гемоглобинурии составляет около 35% в течение 5 лет от начала заболевания.
В настоящее время появились клеточные технологии, позволившие разработать современные методы лечения этого заболевания.
В связи с этим возникла необходимость создания точных методов диагностики, т.к. эффективность и адекватность лечения зависит от информативности, объективности и доказательности диагностических мероприятий, и полноты полученной информации, позволяющей оценить наличие ПНГ-клона и уточнить постановку диагноза.
Известен способ выявления ПНГ по методу Хема для диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии (Абдулкадыров К.М., Клиническая гематология, Справочник - СПб.: Питер, 2006, с. 82), основанный на стимуляции инактивации системы комплемента в результате подкисления образца крови и повышенной чувствительности к нему эритроцитов больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией. Результат пробы Хема оценивается визуально.
Способ заключается в том, что к сыворотке крови донора, сопоставимой с сывороткой больного по АВО-системе антигенов, добавляется 0,2 нормальный раствор HCl, изменятся ее рН сыворотки до 6,4 и тем самым вызывается активация комплемента (соотношение сыворотки и кислоты 9:1). Далее десять объемов подкисленной сыворотки смешивают с одним объемом 50% суспензии отмытых эритроцитов. Затем производят визуальную оценку получившейся суспензии. При пароксизмальной ночной гемоглобинурии наступает гемолиз эритроцитов и суспензия приобретает красноватую либо красную окраску, в то время как нормальные эритроциты в этих же условиях не гемолизируются.
Однако методика не обладает достаточной чувствительностью для определения минорных клонов ПНГ: минимально определяемый размер клона - 4,2-5%. Метод Хема не дает информации о размере клона.
Все это не дает возможности оценить ПНГ-клон в процентах, что при обнаружении заболевания при скрининге является отправной точкой для последующего мониторинга и адекватного лечения.
Кроме того, методика является весьма трудоемкой, не отвечает современным требованиям к диагностике.
Известен также способ диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии с использованием сахарозного теста («Проблемы гематологии и переливания крови», 1972, август, 17(8)55-7, «Оценка сахарозного теста для диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии», Идельсон Л.И., Бенисович В.И., Савина Л.С., Радживиловская Е.Г.).
Способ основан на повышенной чувствительности эритроцитов больного пароксизмальной ночной гемоглобинурией к белкам системы комплемента,  в данном случае за счет добавления сахарозы.
К эритроцитам больного добавляется свежая сыворотка донора, идентичная по группе крови больного. Эритроциты трижды отмываются в физиологическом растворе (0,145 М NaCl), 100 мкл цитратной или дефибринированной крови добавляется к 900 мл сахарозного раствора и производится инкубация 30 минут при 37°C или 23°C. После этого пробирки центрифугируются, затем супернатант оценивается на предмет видимого гемолиза. Если гемолиз наступает, его степень, выраженная в процентах, высчитывается из концентрации гемоглобина супернатанта, которая определяется цианметгемоглобиновым методом.
2
4
4
Образцы цельной крови смешиваются в пропорции 9:1 с 3,2% цитратом натрия или 0,1М раствором оксалата, цельная кровь дефибринируется путем добавления 4-миллиметрового стеклянного шарика на 2 мл крови. Аликвоты цельной крови и плазмы, свободной от тромбоцитов, смешиваются в различных пропорциях. Изотонический раствор сахарозы подготавливается растворением 0,27 моль специального реагента сахарозы в 91 мл 50 мМ NaHPO и 9 мл NaHPO. рН при необходимости доводится до 6,1 небольшими концентрациями NaOH. В финальный объем заливается 1000 мл воды.
Пробирки центрифугируются, и супернатант оценивается на предмет видимого гемолиза. Процент гемолиза - расчетная величина, высчитывается из концентрации гемоглобина супернатанта, определяемой цианметгемоглобиновым методом. Готовят также две другие аликвоты - 100% гемолиз и «нулевой» гемолиз (без эритроцитов) для оценки образца.
Недостатком способа является недостаточная чувствительность и специфичность для диагностики заболевания: минимально определяемый размер клона - 4,2-5% не дает точного представления о размере клона, в то время как он может присутствовать в крови больного при меньших значениях - менее 4,2%. К недостаткам способа можно также отнести его трудоемкость.
Известен также способ диагностики ПНГ-клона (Rosse WF. Variations in the red cells in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Br J Haematol 1973; 24:327-42. 12), включающий измерение и анализ степени гемолиза при различных концентрациях комплемента. Этот анализ показывает, что ПНГ-клетки лизируются при более низких концентрациях, чем нормальные клетки.
При помощи данного теста определяют популяции клеток с промежуточной чувствительностью к белкам системы комплемента (тип II) между нормальными эритроцитами (тип I) и патологическими эритроцитами при пароксизмальной ночной гемоглобинурии (тип III). Однако способ является трудоемким и трудно стандартизируемым. При использовании теста можно пропустить небольшие популяции аномальных клеток.
Известен способ выделения ретикулоцитов по CD71 для определения ПНГ-клона методом проточной цитометрии среди ретикулоцитов и гранулоцитов (Tsagarakis NJ, Paterakis G. Asimple flow cytometric assay for routine paroxysmal nocturnal hemoglobinuria testing based on immature reticulocytes and granulocytes. - ClinicalCytometry, 07.2012. - C. 259-263) (http://onlinelibrary.wiley.coni/doi/10.1002/cyto.b.21030/full).
Исследуется цельная кровь пациента, которую разводят в фосфатно-солевом буфере 1:100. В две пробирки вносят по 50 мкл разведенной крови, затем производится окрашивание: в первой пробирке 10 мкл моноклональных антител (МКА) к CD71 и 20 мкл МКА к CD59; во вторую пробирку вносится 10 мкл изотипического контроля IgGl. Оценка результатов производится на однопараметрических гистограммах.
Кроме того, в методике анализируются также гранулоциты, используя комбинации МКА: 1) CD59-FITC /CD24-PE /CD45-PE-Cy5/; 2) CD66b-FITC /CD16-PE /CD45-PE-Cy5.
Согласно данному методу чувствительность определения ПНГ-клона среди гранулоцитов составляет 1%, чувствительность определения ПНГ-клона среди ретикулоцитов - 5%. Однако предложенный метод протестирован на небольшом количестве пациентов с пароксизмальной ночной гемоглобинурией (n=8) и с ПНГ-клоном менее 1% (при его оценке на гранулоцитах, и, соответственно, менее 5% при определении на ретикулоцитах) (n=7). Также чувствительность определения клона на ретикулоцитах (5%) не позволяет использовать методику для одновременной оценки клона среди гранулоцитов и ретикулоцитов. При этом среди образцов крови пациентов с подозрением на ПНГ не было таковых с размером клона 1-24%, что не дает полной картины о корреляции значений в этом диапазоне. При таком подходе затруднено гейтирование ретикулоцитов из-за отсутствия в панели панэритроцитарного маркера (CD235a), что особенно необходимо для выделения чистой популяции и отсечки дебриса и дуплетов. Кроме того, для объективной оценки ПНГ-клона необходимо оценивать десятки тысяч клеток. На один тест по предложенному способу затрачивается большое количество антител. Общее количество собранных событий по гейту (по CD71) (2000 событий) может оказаться недостаточным для выявления клона.
Таким образом, известный способ был протестирован на небольшом количестве пациентов с пароксизмальной ночной гемоглобинурией и ПНГ-клоном, клетки, неспецифически связавшиеся с МКА к CD71, вероятнее всего, будут искажать результаты анализа. Кроме того, для данного анализа используются 6 видов моноклональных антител, 2 из них используются дважды, что отражается на высокой стоимости используемой панели МКА. Способ был испытан на 8 пациентах с ПНГ, 7 из них имели значение клона ниже порога чувствительности (1% для гранулоцитов, 5% для ретикулоцитов). Этот способ не решает задачи достоверного выявления минорных ПНГ-клонов и не является доказательным высокой чувствительности метода.
В качестве ближайшего аналога известен способ диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии методом проточной цитометрии, предложенный международной ассоциацией клинической цитометрии (ICCS). (Michael J. Borowitz, Fiona E. Craig, Joseph A. DiGiuseppe, Andrea J. Illingworth, Wendell Rosse, D. Robert Sutherland, Carl T. Wittwer, Stephen J. Richards. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry, онлайн: 28 APR 2010.DOI:10.1002/cyto.b.20525).
Способ включает исследование наличия GPI-связанных белков на гранулоцитах, моноцитах и эритроцитах. Исследование состоит из двух этапов: подготовка образцов и последующий анализ на проточном цитометре.
Для анализа эритроцитов цельная кровь разводится фосфатно-солевым буфером в соотношении 1:100, 10 мкл цельной крови вносятся в 990 мкл фосфатно-солевого буфера; Далее в промаркированную пробирку добавляется 40 мкл полученной клеточной суспензии. Для окрашивания эритроцитов к клеточной суспензии добавляются моноклональные антитела, конъюгированные с флуорохромами CD235FITC-меченый и CD59 меченый РЕ соответственно. После инкубации с моноклональными антителами 30 минут в темноте производится отмывка образцов от несвязавшихся моноклональных антител. Для анализа эритроцитов отмывание производится дважды путем центрифугирования образца в 4 мл фосфатно-солевого буфера при 1500 об 5 минут, далее отбирается супернатант, клетки ресуспендируются, добавляется 500 мкл фосфатно-солевого буфера для проведения дальнейшего анализа.
Для сбора и анализа эритроцитов на проточном цитометре при помощи программного обеспечения прибора строятся графики:
График-FS(log) vs (против) SS(log), на котором выделяется популяция эритроцитов (создают гейт RBC) и отсеиваются дебрис, тромбоциты и агрегаты эритроцитов;
На графике CD235a(log) vs FS(log) отражаются события из гейта RBC для более четкого выделения популяции эритроцитов, позитивной по маркеру CD235a популяции эритроцитов, создают новый гейт (CD235a+)
-CD59(log) vs CD235a, (на гистограмме показываются события, гейтированные по CD235a+). На гистограмме отражается уровень экспрессии CD59 на эритроцитах. Клетки без дефицита CD59 - I тип это нормальные эритроциты, клетки с частичным дефицитом экспрессии CD59 - ПНГ-клон II типа, клетки, неэкпрессирующие CD59, то есть эритроциты с полным дефицитом CD59 - это ПНГ-клон III типа.
Согласно методике собирается не менее 50000 цитометрических событий.
Для подготовки к анализу гранулоцитов и моноцитов в две промаркированные пробирки добавляют по 100 мкл периферической крови. Далее для окрашивания мечеными моноклональными антителами в каждую пробирку добавляют свою комбинацию меченых моноклональных антител:
комбинацию меченых моноклональных антител для определения ПНГ-клона среди гранулоцитов FLAER(AlexaFluor700) /CD15(PE)/CD24(PerCP)/CD45(PE-Cy7) (гейтирующие маркеры: CD45 и CD15, GPI - связанные маркеры FLAER и CD24);
комбинацию меченых моноклональных антител для определения ПНГ-клона среди моноцитов FLAER(AlexaFluor700) /CD14PE/CD64PerCP/CD45PE-Cy7, где гейтирующие маркеры: CD45 и CD64, GPI - связанные маркеры FLAER и CD14;
(стандартная панель рекомендована в 2010 г. Международным Обществом Клинической Цитометрии (ICCS)).
Окрашенные образцы инкубируются 30 минут при комнатной температуре в темноте, после чего для избавления от эритроцитов к образцу добавляется 1 мл лизирующего раствора. После инкубации с лизирующим раствором образцы центрифугируются 5 мин при 1500 оборотов, после центрифугирования сливается супернатант, лейкоциты на дне пробирки ресуспендируются. Далее производится отмывка образцов от лизирующего раствора путем добавления к пробе 2 мл фосфатно-солевого буфера и последующего центрифугирования 5 минут при 1500 оборотов. После центрифугирования супернатант сливается, клетки ресуспендируются, далее добавляется 500 мкл фосфатно-солевого буфера для проведения дальнейшего анализа.
Для анализа и сбора гранулоцитов и моноцитов на проточном цитометре при помощи программного обеспечения прибора строятся следующие графики:
На графике CD45(log) vs SS, выделяются области лимфоцитов CD45+LY (клетки области высокой экспрессии CD45, низких значений SS), моноцитов СD45+MON (клетки области средней экспрессии CD45, более высоких значений SS) и гранулоцитов CD45+GRAN (клетки области невысокой экспрессии CD45, высоких значений SS).
Для анализа ПНГ-клона среди гранулоцитов строится график CD 15 (log) vs SS в зависимости от гейта (CD45+GRAN). С помощью гейта CD15+ выделяется популяция гранулоцитов без дебриса и клеток, не связавшихся с моноклональными антителами к CD15;
Гистограмма FLAER(log) vs CD24(log) (строится в зависимости то гейта CD15+. На данном графике строится гейт PNH GRAN, захватывающий зону, негативную по экспрессии CD24 и FLAER. Отсутствие этих маркеров на гранулоцитах указывает на принадлежность клеток к ПНГ-клону.
Для оценки ПНГ-клона среди моноцитов строится график -CD64(log) vs SS в зависимости от гейта CD45 MON. На этом графике С064-позитивные события ограничиваются гейтом CD64+MON. В зависимости от гейта CD64+MON строится график -FLAER(log) vs CD14(log) (в зависимости от выделенной популяции моноцитов CD64+ - гейта). На данном графике строится гейт PNH MON, захватывающий зону, негативную по экспрессии CD14 и FLAER. Отсутствие этих маркеров на моноцитах указывает на принадлежность клеток к ПНГ-клону.
Согласно рекомендациям ICCS для стандартного исследования оценивается 50000 гранулоцитов, для исследования ПНГ-клона методом высокочувствительной цитометрии не менее 500000 клеток.
Значение ПНГ-клона - это процент клеток (гранулоцитов, моноцитов, эритроцитов), среди которых наблюдается отсутствие GPI-связанных якорных белков.
Исследование ПНГ-клона согласно международному протоколу является «золотым стандартом» в диагностике ПНГ. Однако исследование является дорогостоящим и трудоемким. На подготовку и проведение анализа согласно данному способу затрачивается не менее 2,5-3 часов.
В связи с тем, что ПНГ относится к редким заболеваниям, по разным данным им страдают от 1 до 10 человек на 1 миллион населения, большая часть пациентов, направленных для диагностики ПНГ-клона, не будет являться ПНГ позитивными. Следовательно, трудоемкий и дорогостоящий анализ согласно международному протоколу пациентам с отсутствием ПНГ делать нецелесообразно, а достаточно только ответить на вопрос, присутствует ПНГ-клон или нет. При стоимости меченых моноклональных антител от 500 у.е. за одно наименование полный набор антител и реагентов для диагностики ПНГ согласно международному подходу будет стоить от 5000 у.е. Учитывая короткий срок годности для некоторых из требующихся реагентов, даже в городе с населением в 1 миллион человек с помощью одного набора в год могут быть обследованы от 10 до 100 пациентов, соответственно, себестоимость одного исследования может доходить до 500 у.е.
Задачей изобретения является создание точного, чувствительного и доказательного способа лабораторной диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии, обладающего простотой исполнения, доступностью и позволяющего проводить скрининг пароксизмальной ночной гемоглобинурии с минимальными материальными затратами.
Сущность изобретения состоит в том, что в способе лабораторной диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии, включающем окрашивание цельной крови пациента моноклональными антителами в фосфатно-солевом буфере, инкубирование, отмывку клеток крови от несвязавшихся моноклональных антител путем центрифугирования, ресуспендирование готового образца, последующее проведение оценки размера клона или его отсутствия в программе проточного цитометра по отсутствию или наличию защитных белков, для окрашивания исследуемого образца крови используют трехцветную комбинацию моноклональных антител CD235a (FITC)/CD59(PE)/CD71 (АРС), которые добавляют в пробирку с образцом, наличие ПНГ-клона среди эритроцитов и ретикулоцитов оценивают по отсутствию защитного белка CD59 на мембране ретикулоцитов, выделенных по гейту CD235a - панэритроцитарному маркеру и CD71-рецептору к трансферрину, для оценки ПНГ-клона среди ретикулоцитов в гейте CD71+ собирают не менее 20000 событий, в зависимости от гейта CD71+ строят график FSC(log) vs SSC(log), на котором с помощью дополнительного гейта CD71str выделяют ретикулоциты, очищая таким образом популяцию ретикулоцитов от дебриса и дуплетов методом последовательного гейтирования, полученные значения показателей сравнивают с критериями нормы, и при наличии 100% положительных по CD59 ретикулоцитов судят об отсутствии ПНГ-клона и диагностируют отсутствие заболевания пароксизмальной ночной гемоглобинурии. При выявлении у пациента с клиническими симптомами негативных CD59-ретикулоцитов и значении полученных показателей более 1% дают диагностическое заключение о наличии ПНГ-клона и для подтверждения диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии рекомендуют дополнительное исследование по международному стандартизованному протоколу, при выявлении негативных по CD59-ретикулоцитов и значении полученных показателей 0,1-1% судят о наличии минорного ПНГ-клона и рекомендуют повторное определение ПНГ-клона через 6 мес на предмет увеличения его значения и развития пароксизмальной ночной гемоглобинурии, при подтверждении такого размера клона диагностируют субклиническую форму пароксизмальной ночной гемоглобинурии без клинических признаков.
Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.
Предлагаемый способ выявления ПНГ-клона обладает высокой достоверностью, точностью и чувствительностью - 0,1%, сопоставимой с международной стандартизированной методикой, и является доказательным.
Он позволяет определить наличие ПНГ-клонов как значительного размера у пациентов с истинной пароксизмальной ночной гемоглобинурией, так и минорных - от 0,01 до 1%, у пациентов с апластической анемией и при миелодиспластическом синдроме.
Способ является более простым в выполнении, не требует больших материальных затрат по сравнению с международной стандартизированной методикой.
Технология определения ПНГ-клона дает возможность использовать минимальное количество (три) моноклональных антитела при скрининге ПНГ (CD235a, CD71, CD59).
Для исследования крови одного пациента используют только одну пробирку, что также упрощает и ускоряет проведение анализа.
Затраты времени на проведение одного теста составляют 40-50 минут. Использование меньшего количества антител без применения лизирующих растворов делает анализ дешевле примерно на 75% за одно исследование. При этом сохраняется высокая чувствительность и точность диагностики.
В большинстве случаев способ позволяет избежать дополнительных затрат, связанных с применением большего количества антител, поскольку, в виду редкой встречаемости заболевания, часто результат оказывается отрицательным. Методика хорошо подходит для скрининга пациентов и является доступной для медицинских учреждений разного профиля, а также для всех категорий граждан.
Конечный результат анализа в предлагаемом способе представляется в виде процента эритроцитов и ретикулоцитов с дефектом GPI-связанных белков, то есть ПНГ-клон. Методика дает возможность определить повышенный риск тромбообразования, исходя из процента выявленного ПНГ-клона.
Предлагаемый способ является предпочтительным в сравнении с некоторыми другими известными методами - пробой Хема, сахарозным тестом, измерением степени гемолиза при различных концентрациях белков системы комплемента.
Технический результат достигается за счет разработанной авторами новой технологии определения ПНГ-клона при пароксизмальной ночной гемоглобинурии при помощи проточной цитометрии, алгоритм которой предусматривает определение данного клона на ретикулоцитах и эритроцитах (в отличие от стандартно определяемого на нейтрофилах, моноцитах и эритроцитах). При этом авторы впервые используют комбинацию антител CD235a(FITC)/CD59 (PE)/CD71(APC). Согласно предлагаемому методу в момент анализа данных используют дополнительную процедуру многопараметрического гейтирования CD71+ клеток и исключения из анализа дебриса, дублетов и избавления от неспецифически-связавшихся моноклональных антител.
Ключевым моментом является проведение исследования ретикулоцитов, которые по разработанной авторами технологии выделяются с использованием антител к CD71 и исследуются при помощи подобранной авторами комбинации трех моноклональных антител CD235a(FITC)/CD59(PE)/CD71(APC). ПНГ-клон среди ретикулоцитов отражает истинное значение ПНГ-клона, авторами проведено сравнение полученных значений ПНГ-клонов среди ретикулоцитов со значениями, полученными при помощи стандартизированного международного подхода к диагностике ПНГ. Корреляция объема ПНГ-позитивных ретикулоцитов с моноцитами составляет 0,95, с гранулоцитами - 0,93. Процент ПНГ-позитивных эритроцитов согласно предлагаемой методике, измеряется с более высокой чувствительностью, по сравнению с международным стандартизованным подходом, т.к. с помощью предлагаемого метода исследуются не менее 1000000 эритроцитов, а согласно ICCS только 500000.
Впервые проведено исследование ПНГ-клона на ретикулоцитах с использованием комбинации моноклональных антител CD235a/CD71/CD59, позволившей оценить размер этого клона с чувствительностью 100%.
В результате появилась возможность при использовании трех моноклональных антител проводить скрининг ПНГ. Использование дополнительного этапа выделения ретикулоцитов и «отсечения» неспецифически связавшихся с моноклональными антителами клеток (на графике FS vs SS, рис. ) дают точный результат, что позволяет на основании скрининга подтвердить диагноз ПНГ и провести эффективное адекватное лечение.
Способ осуществляется следующим образом.
2
Для проведения исследования венозную кровь пациента берут в пробирку с антикоагулянтом KEDTA. Пробирка доставляется в лабораторию из процедурного кабинета лечебно-профилактического учреждения (ЛПУ).
Для анализа эритроцитов и ретикулоцитов цельную кровь разводят в отдельной полистирольной пробирке. Для разведения фосфатно-солевым буфером в соотношении 1:10 50 мкл цельной крови вносят в 450 мкл фосфатно-солевого буфера и тщательно перемешивают в течение 5 сек на вортексе, далее 40 мкл полученной клеточной суспензии вносят в промаркированную пробирку.
Для окрашивания образца применяют трехцветную комбинацию моноклональных антител - CD235a(FITC)/CD59(PE)/CD71(APC). Окрашивание производят путем внесения в образец последовательно по 3 мкл меченых моноклональных антител, после чего пробирку встряхивают в течение 5 сек на вортексе. Далее производят инкубацию в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре.
Затем клетки крови отмывают дважды в 4 мл фосфатно-солевого буфера в режиме центрифугирования в течение 5 мин с частотой 1500 об/мин. После каждого центрифугирования с помощью пипетки аккуратно собирают супернатант таким образом, чтобы клетки остались на дне пробирки.
Готовый образец ресуспендируют 5 секунд на вортексе и добавляют 750 мкл фосфатно-солевого буфера, после чего образец готов для исследования на проточном цитометре.
Далее проводят оценку и учет результатов с использованием многоцветной проточной цитометрии. Анализ возможно проводить на любых проточных цитометрах, оснащенных детекторами не менее чем для трех флюоресцентных каналов.
Измерения проводят на проточном цитометре BD FACSCanto™ II Becton-Dickinson (США).
Оценку наличия или отсутствия ПНГ-клона на эритроцитах и ретикулоцитах, а также размер ПНГ-клона осуществляют на проточном цитометре, используя специальное программное обеспечение.
Для оценки ПНГ-клона среди эритроцитов и ретикулоцитов строят график - FSC(log) vs SSC(log), с помощью логического ограничения выделяют область эритроцитов, исключая дебрис и дуплеты (фиг. 1а).
Затем на графике FSC(log) vs CD235a (фиг. 1b) строят гейт CD235a+, тем самым ограничивая позитивные клетки и исключая события, неспецифически связавшиеся с CD235a (дебрис и клетки, не относящиеся к популяции CD235a+).
События, вошедшие в гейт CD235a+, анализируют на графике CD71 vs FSC(log) (фиг. 1е), на нем выделяется популяция, позитивная по CD71.
Для объективной оценки ПНГ-клона среди ретикулоцитов в гейте CD71+ собирают не менее 20000 событий.
В зависимости от гейта CD71+ строят график FSC(log) vs SSC(log) (фиг. 1f), на котором при помощи дополнительного гейта CD71str выделяют ретикулоциты и таким образом, популяцию окончательно очищают от дебриса и дуплетов методом последовательного гейтирования.
Далее строится график CD235a vs CD59 (фиг. 1g) в зависимости от гейта CD71str (выделенные ретикулоциты). На этом графике выделяют две области Norm°Ret и PNH°Ret (фиг. 1g), это границы нормальных и ПНГ-позитивных ретикулоцитов соответственно. Статистические данные отражают в абсолютных значениях и % от гейта (фиг. 1d и 1h).
Протоколы сбора данных настраивают один раз, в последующем необходима лишь небольшая корректировка.
Гейт CD235a+ на первом этапе сбора данных является стоп-гейтом, т.е. в нем собирают 1000000 событий. Гейт CD235a+ применяют к графику CD235a vs CD59 (фиг. 1с). Если в регионах PNH Type II и PNH Type III на графике CD235a vs CD59 суммарно оказывается не более 10 событий, сбор данных прекращают и делают вывод об отсутствии ПНГ-клона.
При большем количестве событий суммарно в этих регионах исследование продолжают.
ПНГ-клон среди ретикулоцитов - это выраженное в процентах количество ретикулоцитов, на которых отсутствует защитный белок CD59.
При наличии 100% положительных по CD59 ретикулоцитов судят об отсутствии ПНГ-клона и диагностируют отсутствие заболевания пароксизмальной ночной гемоглобинурии.
При выявлении у пациента с клиническими симптомами негативных CD59-ретикулоцитов и значении полученных показателей более 1% дают лиагностическое заключение о наличии ПНГ-клона и для подтверждения диагностики пароксизмальной ночной гемоглобинурии рекомендуют дополнительное исследование по международному стандартизованному протоколу (Michael J. Borowitz, Fiona E. Craig, Joseph A. DiGiuseppe, Andrea J. Illingworth, Wendell Rosse, D. Robert Sutherland, Carl T. Wittwer, Stephen J. Richards. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry).
При выявлении негативных no CD59-ретикулоцитов и значении полученных показателей 0,1-1% судят о наличии минорного ПНГ-клона. В этом случае рекомендуется повторное определение ПНГ-клона через 6 мес на предмет увеличения его значения и развития пароксизмальной ночной гемоглобинурии.
При подтверждении такого размера клона методом проточной цитометрии согласно международному протоколу диагностируют субклиническую форму пароксизмальной ночной гемоглобинурии без клинических признаков или судят о ПНГ-клоне, сопутствующем АА и МДС при постановке соответствующих диагнозов согласно рекомендациям (International PNH Interest Group (I-PIG)).
Способ прошел клинические испытания на кафедре клинической лабораторной диагностики РМАПО. Были обследованы 572 пациента, направленные из различных ЛПУ с предварительным диагнозом или подозрением на пароксизмальную ночную гемоглобинурию (ПНГ), апластическую анемию (АА), миелодиспластический синдром (МПС), аутоиммунной гемолитической анемией (АИГА), в возрасте от 12 до 82 лет.
Всем пациентам проведена диагностика по предлагаемому способу с использованием метода многоцветной проточной цитометрии, а также согласно международному стандартизованному подходу.
Определено отсутствие защитного белка CD59 на мембране ретикулоцитов, выделенных по CD235a (панэритроцитарный маркер) и CD71 (рецептор к трансферрину) и дополнительно очищенных методом последовательного гейтирования по параметрам светорассеяния FS/SS, доказана высокая корреляция объема ПНГ-клона, измеренного среди ретикулоцитов, согласно предложенному способу с ПНГ-клоном среди гранулоцитов и моноцитов, измеренными согласно международному стандартизованному подходу.
Обследовано 572 человека в возрасте от 15 до 64 лет, из них 248 мужчин и 324 женщины. Из 572 обследованных ПНГ-клон обнаружен у 175 пациентов, значения варьировали от 0,1% до 99,7% (медиана 41,6%). Среди них 78 мужчин и 97 женщин. Всем пациентам проведены параллельные исследования ПНГ-клона согласно международному стандартизованному подходу и с помощью предлагаемого способа. Корреляция между значением ПНГ-клона среди ретикулоцитов и гранулоцитов составила 0,93, среди ретикулоцитов и моноцитов 0,95 соответственно. Чувствительность метода составила 98,9%, специфичность 99,8%, общая точность 99,7%.
В основном при апластической анемии и миелодиспластическом синдроме ПНГ-клон составляет менее 1%. Согласно рекомендациям, клоны такого размера необходимо исследовать в динамике с периодичностью 1 раз в 6 мес. При увеличении размера клона и соответствующих клинических признаках идет речь о постановке диагноза ПНГ.
Пример. Пациент М., 34 лет, находился под наблюдением гематолога. После перенесенного ОРВИ наблюдались усиление слабости, желтуха, потемнение мочи.
Пациент поступил в отделение лечебно-профилактического учреждения (ЛПУ) с жалобами на слабость и потемнение мочи.
Проведено плановое обследование в поликлиническом отделении ЛПУ. При объективном обследовании выявлены иктеричность кожных покровов и видимых слизистых оболочек. Пациент госпитализирован в гематологическое отделение с жалобами на общую слабость, недомогание, одышку, тахикардию, темный цвет мочи, снижение количества гемоглобина и эритроцитов.
2
Пробирка с образцом стабилизированной КЭДТА периферической крови направлена на кафедру клинической лабораторной диагностики РМАПО в референс-центр по изучению ПНГ для выявления ПНГ-клона методом проточной цитометрии. Анализ ПНГ-клона среди гранулоцитов, моноцитов и эритроцитов был сделан согласно международному протоколу, также исследование ПНГ-клона проводилось с помощью предлагаемой методики на эритроцитах и ретикулоцитах.
Одновременно производилось исследование ПНГ клона согласно международному протоколу и по предлагаемой методике (повторение предыдущего предложения!). Согласно международному протоколу образец был окрашен для выявления ПНГ-клона среди гранулоцитов, моноцитов и эритроцитов, а согласно предлагаемой авторами методике для выявления ПНГ-клона среди эритроцитов и ретикулоцитов. По предлагаемой методике образец был окрашен с помощью моноклональных антител к CD235a(FITC)/CD59(PE)/CD71(APC) путем их поочередного внесения в 40 мкл разведенной 1:10 цельной крови.
После инкубации 15 минут в темноте клетки отмывали дважды в 4 мл фосфатно-солевого буфера в режиме центрифугирования в течение 5 мин с частотой 1500 об/мин.
После каждого центрифугирования отбирался супернатант, при этом клетки оставались на дне пробирки.
Готовый образец ресуспендировался 5 секунд на вортексе и добавлялось 750 мкл PBS.
Далее готовые образцы анализировались на проточном цитометре BD FACSCanto™ II Becton-Dickinson (США):
Для исследования эритроцитов и ретикулоцитов на графике FSC(log) vs SSC(log) выделялась область эритроцитов за исключением дебриса и дуплетов.
Затем на графике FSC(log) vs CD235a выделялись CD235a - позитивные клетки, исключая дебрис и клетки, не относящиеся к популяции CD235a+, неспецифически связавшие моноклональные антитела к CD235a. События, вошедшие в гейт CD235a+, анализировались на графике CD71 vs FSC(log), на нем выделили популяцию, позитивную по CD71.
Для объективной оценки ПНГ-клона среди ретикулоцитов в гейте CD71+ собрали не менее 20000 событий.
В зависимости от гейта CD71+ строили график FSC(log) vs SSC(log). Затем на этом графике с помощью дополнительного гейта CD71str выделяли популяцию ретикулоцитов, которая таким образом была очищена от дебриса и дуплетов методом последовательного гейтирования.
Далее на графике CD235a vs CD59 в зависимости от гейта CD71str (выделенные ретикулоциты) оценивали ретикулоциты на предмет наличия GPI-связанного белка CD59 на мембранах ретикулоцитов, соответственно, ПНГ-позитивные и ПНГ-негативные клетки. Статистические данные отражались в абсолютных значениях и % от гейта.
При выделении ретикулоцитов по CD71 и последующей очистке от дебриса, клетки CD59- популяции составили 97,6%. Таким образом, с помощью предлагаемого способа обнаружен ПНГ-клон.
Исследование согласно мждународному протоколу выявления ПНГ подтвердило, что ПНГ-клон присутствует на гранулоцитах, моноцитах и эритроцитах в размере 99,2%, 97,6% и 71,0% соответственно, что говорит о воспроизводимости результатов предлагаемой и стандартной методики. Проведение данного теста послужило основанием для постановки диагноза пароксизмальной ночной гемоглобинурии.
Клинические испытания показали, что предлагаемый способ обладает высокой достоверностью, точностью и чувствительностью (0,1% ПНГ-клона), позволяет определить наличие как высоких значений клона у пациентов с пароксизмальной ночной гемоглобинурией, так и минорных значений (от 0,1%) у пациентов с апластической анемией, миелодиспластическом синдромом. Предложенная методика является простой в выполнении, не требует больших материальных затрат, проведение одного теста занимает 40-50 минут.
Методика хорошо подходит для скрининга пациентов и является доступной для медицинских учреждений разного профиля, а также для всех категорий граждан.