Эволюция структуры и свойств биокомпозита на основе наноструктурного титана и микродуговых кальций-фосфатных покрытий при взаимодействии с биосредой

Эволюция структуры и свойств биокомпозита на основе наноструктурного титана и микродуговых кальций-фосфатных покрытий при взаимодействии с биосредой

Е.В. Легостаева, И.А. Хлусов1, Ю.П. Шаркеев, А.В. Карлов1, Г.А. Шашкина

В работе представлены результаты исследования морфологии и физико-химических параметров биокомпозита на основе наноструктурного титана и микродуговых кальций-фосфатных покрытий до и после их растворения в биологической жидкости. Методом растровой электронной микроскопии выявлено, что деградация Са-Р-покрытий происходит преимущественно в зонах концентраторов напряжений путем последовательно протекающих процессов разбухания сферолитов, их растворения с формированием мелких структурных элементов и последующего обнажения титанооксидной переходной зоны между покрытием и подложкой. Показано, что размер пор не имеет принципиального значения для прикрепления костных клеток. Согласно физическим и химическим параметрам растворение Са-Р-покрытий протекает по логарифмическому закону с выходом в зону насыщения на 3-5 неделе растворения. Установлено, при растворении Са-Р-покрытий в растворе параллельно с ионами кальция накапливаются фосфатные группы, приводящие к снижению рН, что, по-видимому, связано с преобладанием в микродуговом покрытии нестехиометрических форм фосфатов кальция, способных активно растворяться в биологических жидкостях.

Evolution of the structure and properties of a biocomposite based on nanostructured titanium and microarc calcium-phosphate coatings at interaction with the biomedium

E.V. Legostaeva, I.A. Khlusov1, Yu.P. Sharkeev, A.V Karlov1, and G.A. Shashkina

Institute of Strength Physics and Materials Science SB RAS, Tomsk, 634021, Russia 1 Tomsk Branch of the Russian Ilizarov Research Center for Restorative Traumatology and Orthopedics, Tomsk, 634029, Russia

The paper contains the investigation results for the morphology, physical and chemical parameters of a biocomposite based on nanostructured titanium and microarc calcium-phosphate coatings prior to and after their dissolution in a biological fluid. Scanning electron microscopy has revealed that Са-Р coatings degrade mainly in stress concentrator zones through sequential swelling of spherulites, their dissolution with the formation of fine structural elements and further uncovering of the titanium-oxide transition zone between the coating and substrate. It is shown that the pore size is not critical for bone cell attachment. According to physical and chemical parameters, Са-Р coating dissolution occurs by a logarithmic law and reaches the saturation stage after 3-5 weeks of dissolving. It is found that during Са-Р coating dissolution, along with calcium ions, phosphate groups leading to pH decrease are accumulated in the solution. This is obviously related with the predominance of nonstoichiometric forms of calcium phosphates in the microarc coating, which can easily dissolve in biological fluids.

Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, Томск, 634021, Россия 1 Томский филиал Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» им. ак. Г.А. Илизарова Росздрава, Томск, 634029, Россия

1. Введение

свойства [1, 2]. Пористая структура Са-Р-керамики способствует интенсивному врастанию костной ткани в поверхность имплантата, что обеспечивает его надежную фиксацию [2, 3]. Наряду с процессом костеобразования параллельно должен включаться еще и механизм, связанный с биодеградацией Са-Р-покрытий. Известно,

При лечении заболеваний и дефектов опорно-двигательной системы в настоящее время широко используются титановые имплантаты, на поверхность которых наносят кальций-фосфатные (Са-Р) покрытия, что позволяет существенно улучшить их биологические

© Легостаева Е.В., Хлусов И.А., Шаркеев Ю.П., Карлов А.В., Шашкина. Г.А., 2006

что в зависимости от физико-химических параметров (степень кристалличности, пористость, растворимость, шероховатость поверхности и т.д.) Са-Р-покрытия показывают разную скорость биодеградации. Однако динамика процессов биодеградации конкретных Са-Р-по-крытий во многом остается неясной и является предметом исследований.

В работе представлены результаты исследования морфологии и физико-химических параметров Са-Р-покрытий до и после их растворения в биологической жидкости.

2. Методика эксперимента

Са-Р-покрытия наносились на поверхность образцов из технически чистого титана ВТ1-0 в наноструктурном состоянии. Наноструктурное состояние было получено методом многократного одноосного прессования со сменой оси деформации в пресс-форме с последующей термомеханической обработкой [3]. Са-Р-покрытия наносились с помощью микродугового метода в электролите на основе 20% ортофосфорной кислоты, гидроксилапатита и карбоната кальция на установке, разработанной в Институте физики прочности и материаловедения СО РАН [4, 5], в импульсном режиме при следующих условиях: длительность импульса — 100 мкс; частота следования импульсов — 50 Гц; начальная плотность тока — 0.2...0.25 А/мм2; конечное напряжение — 300В.

Исследования на растворение Са-Р проводили в стационарных условиях, моделирующих зону асептического воспаления, неизбежно возникающего после имплантации любых изделий: кислая среда, отсутствие на-

правленного движения жидкости (отек ткани). Растворение Са-Р-покрытий проводилось в условиях их 5-недельного культивирования в 0.9% стерильном растворе хлорида натрия согласно требованиям ISO 10993-5 (1992 г.). Каждый образец помещали в пластиковую пробирку с растворителем, содержащим антибиотик гентамицин в дозе 100 мг/л, и затем культивировали в термостате при 37 °С. В конце 1, 2, 3, 4, 5 недели культивирования группу образцов вынимали, сушили при 120 °С в течение 1 ч. Растворы собирали, в них определяли pH, а также концентрацию ионизированного (биологически активного) кальция методом амперометрического титрования [6].

Морфологию поверхности Са-Р-покрытий исследовали методом растровой электронной микроскопии (РЭМ) на электронном микроскопе SEM 515 Phillips. В качестве количественного параметра были выбраны размеры структурных элементов: сферолитов, пор и осколочных элементов, формирующихся при нанесении микродуговых покрытий, морфология которых изменяется в процессе их растворения в биологической жидкости.

3. Результаты эксперимента и обсуждение

Типичная структура микродуговых Са-Р-покрытий представлена на рис. 1, а. Основными элементами структуры Са-Р-покрытия являются сферолиты и чешуйчато-осколочные элементы, которые формируют слоистую структуру покрытия. Сферолиты имеют внутренние полости, переходящие в глубокие поры сферической формы. Исследование морфологии поверхности Са-Р-покрытий продемонстрировало, что растворение

Рис. 1. РЭМ-изображения Са-Р-покрытий в исходном состоянии

25

с;

о

20

15"

У

1~а~

0 10 20 30 40

Размер сферолитов, мкм

п—1—I—1—I 1 I 1 I

10 20 30

Размер пор, мкм

0

1—1—Г-1—I—1—I—1—Г~

10 20 30 40

Размер осколков, мкм

Рис. 2. Гистограммы распределения структурных элементов в Са-Р-покрытий в исходном состоянии

происходит преимущественно в зонах концентраторов напряжений (рис. 1, б-е). В начальный период растворения (до 3-й недели включительно) в этих зонах изменяется морфология покрытия — сферолиты, являющиеся основным компонентом покрытия, разрушаются, образуя осколочные элементы (рис. 1, б, в), а в дальнейшем происходит обнажение титанооксидной переходной зоны между покрытием и подложкой (рис. 1, д). Необходимо отметить, что даже после 5 недель взаимодействия Са-Р-покрытий с биологической жидкостью в центральной части образца пористая структура покрытия сохраняется.

Компьютерная морфометрия блоков РЕМ-изображений в различные сроки позволила выявить качественные изменения, происходящие в покрытиях при растворении (рис. 2, 3). Так, до химической деградации (рис. 2) наибольшее количество сферолитов имело средний диаметр порядка 10 мкм (диапазон вариаций 2...20 мкм), размер пор и осколков варьировал от 1 до 12 мкм и преимущественно составлял 5 мкм.

За 5 недель растворения Са-Р-покрытий диаметр пор практически не менялся. Однако изменение размеров сферолитов и осколков имело неоднозначный харак-

тер. В начальный период (до 3-й недели включительно) в Са-Р-покрытиях увеличивалось количество крупных сферолитов и осколочных элементов (рис. 3, а, б). Впоследствии (4-5-я недели исследования) возрастала доля мелких сфер и осколков (рис. 3, в).

Логичной интерпретацией полученных данных может быть следующая цепочка событий: деградация мелких структур в покрытии (1-2 недели), разбухание сферолитов и осколков (1-4 недели), сопровождающееся фазовой перестройкой аморфных кальций-фосфатов, и последующее их растворение (4-5 недель). Подобная динамика согласуется с результатами, представленными на рис. 4, где видно, что на 3-4-й неделях уменьшаются потеря массы покрытий и выход ионов кальция в раствор.

Средняя потеря массы покрытий при 1-5-недельном растворении варьирует в пределах 1.09...2.08 мг, что не превышает 22...24 % от исходного значения (рис. 4, а). Это сопровождается понедельным накоплением в растворе концентрации ионизированного кальция в диапазоне 468...594 мкМоль/л (рис. 4, б). Параллельно протекает закисление растворов (рис. 4, в). Величина рН за 5 недель статистически значимо снижается с 3.30 до

0 10 20 30 40

Размер сферолитов, мкм

10 20 30

Размер пор, мкм

115

се

10"

о

£ 5

Н

О

к

10 20 30 40

Размер осколков, мкм

Рис. 3. Гистограммы распределения структурных элементов в Са-Р-покрытий после растворения в биологической жидкости: 1

ш .5

580

&£ ° © Р

=Г о £

3 m К

g I =[ ^ ф -Q

О 2

ш 1 2 3 4 5

О Время растворения покрытия, недели

540 -

500

460 -

1.0 1.4 1.8 2.2

Средняя потеря массы покрытия, мг

О Среднее значение pH растворов

Рис. 4. Изменение физико-химических параметров Са-Р-покрытий при растворении в биологической жидкости

3.03 единиц (для контроля растворителя (точка 0) рН составляет 3.95 единиц). Корреляционный анализ показал наличие тесной зависимости изменения рН и насыщенности растворов с растворением кальций-фосфат-ных покрытий. При этом корреляционная зависимость потери массы покрытий от уровня рН раствора — обратная, от концентрации кальция в растворе — прямая.

Полученные нами ранее данные продемонстрировали высокую (80 %) остеоиндуктивную (костеобразующую) активность микродуговых покрытий в тесте эктопического костеобразования [7, 8]. Однако, возвращаясь к процессам биодеградации Са-Р-покрытий, необходимо отметить, что размеры остеокластов и остеобластов — основных составляющих костной ткани — составляют десятки микрометров [1]. В то же время, представленные результаты свидетельствуют о том, что в процессе растворения Са-Р-покрытий размер пор остается неизменным и составляет порядка 5 мкм. Это, вопреки существующим положениям, позволяет заключить, что размер пор не имеет принципиального значения для прикрепления клеток костной ткани. По-видимому, клетки костной ткани располагаются между сфе-ролитами, формирующими основной рельеф поверхности, о чем также свидетельствуют результаты исследования влияния шероховатости поверхности Са-Р-по-крытий на процессы костеобразования [8].

4. Выводы

Выявлено, что деградация Са-Р-покрытий происходит преимущественно в зонах концентраторов напряжений путем последовательно протекающих процессов разбухания сферолитов и их растворения с формированием мелких структурных элементов.

Установлено, что при растворении Са-Р-покрытий в растворе параллельно с ионами кальция накапливаются фосфатные группы, приводящие к снижению рН, что, по-видимому, связано с преобладанием в микродуговом покрытии нестехиометрических форм фосфатов каль-

ция, способных активно растворяться в биологических жидкостях.

Показано, что размер пор Са-Р-покрытий не имеет принципиального значения для прикрепления клеток косной ткани. По-видимому, они располагаются между сферолитами, формирующими основной рельеф поверхности

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 05-03-32617) и Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» (проект№ 12.7).

Литература

1. Карлов А.В., Шахов В.П. Системы внешней фиксации и регуляторные механизмы оптимальной биомеханики. - Томск: STT, 2001.- 478 с.

2. An introduction to bioceramics / Ed. by L.L. Hench and J. Wilson. -Singapore: World Scientific, 1993. - 386 р.

3. Kay J.F., Cook S.D. Biologic profile of calcium-phosphate coatings // Hydroxylapatite Coatings in Orthopaedic Surgery. - New-York: Raven Press, 1993. - P. 89-106.

4. Шашкина ГА., Иванов М.Б., Легостаева Е.В., Колобов Ю.Р., Хлусов И.А., Поженъко Н.С., Карлов А.В. Биокерамические покрытия с высоким содержанием кальция для медицины // Физ. мезомех. -

2004. - Т.7. - Спец. выпуск. - 4.2. - С. 123-126.

5. Шашкина Г.А., Шаркеев Ю.П., Колобов Ю.Р., Карлов А.В. Кальций-фосфатное покрытие на титане и титановых имплантатах и способ его нанесения // Положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение, заявка № 2005116663/02(019006) от 31.05.2005 г.

6. Сонгина О.А. Амперометрическое (полярометрическое) титрование. - М.: Химия, 1967. - 388 с.

7. Шаркеев Ю.П., Колобов Ю.Р., Карлов А.В., Хлусов И.А., Легостае-

ва Е.В., Шашкина Г.А. Структура, механические характеристики и остеогенные свойства биокомпозиционного материала на основе субмикрокристаллического титана и микродугового кальций-фос-фатного покрытия // Физ. мезомех. - 2005. - Т. 8.- Спец. выпуск. -С. 83-86.

8. Хлусов И.А., Карлов А.В., Шаркеев Ю.П., Пичугин В.Ф., Колобов Ю.Р., Шашкина Г.А., Иванов М.Б., Легостаева Е.В., Сухих Г. Т. Остеогенный потенциал мезенхимальных стволовых клеток костного мозга in situ: роль физико-химических свойств искусственных поверхностей // Клеточные технологии в биологии и медицине. -

2005. - № 3. - С. 164-173.