СПОСОБ ИЗУЧЕНИЯ ВЛИЯНИЯ ГЛЮКОЗЫ НА ПРОЦЕСС ОБРАЗОВАНИЯ ЗУБНОГО КАМНЯ
METHOD OF ANALYSIS OF CALCULUS FORMATION SENSITIVITY TO GLUCOSE

Изобретение относится к области медицины, к методам экспериментального моделирования патологических процессов, протекающих в полости рта, в частности процесса образования зубного налета и роста зубного камня.
В настоящее время интенсивно исследуются состав ротовой жидкости в норме и при различных патологиях, а также влияние отдельных компонентов слюны на процессы минерализации в полости рта. Заболевания сердечно-сосудистой, кроветворной, вегетативно-нервной, эндокринной систем, а также патологии обмена веществ приводят к изменению состава слюны, что влияет на состояние слизистых оболочек полости рта и зубов (происходит снижение сопротивляемости околозубных тканей по отношению к бактериям, развитие кариеса и образование зубных камней).
2
4
2
4
2
4
2
3
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ моделирования процесса образования зубного камня [Бельская Л.В., Голованова О.А., Пушкарева А.В., Казанцева Р.В. Способ моделирования процесса образования зубного камня. Патент РФ №2342713. Заявл.: 09.04.2007. Опубл.: 27.12.2008. Бюл. №36]. В данном способе исследовали ротовую жидкость группы людей, имеющих зубные отложения, и группы людей, не имеющих заболеваний полости рта и пародонта, выделяли диагностически значимые параметры ротовой жидкости для создания модельной среды, в которую помещали здоровый зуб. Создают модельную среду следующего состава: CaCl - 0.2575 г/л, (NH)HPO - 0.2376 г/л, KHPO - 1.2107 г/л, NaF - 0.4452 г/л, MgCl - 0.1319 г/л, NaHCO - 0.6216 г/л, KCl - 3.0843 г/л. При этом через 7-14 дней образуется налет на зубе в виде брушита и аморфного фосфата кальция, а через 60-180 дней на зубе, помещенном в модельную систему, образуется гидроксилапатит, который является основным компонентом зубных камней человека.
Данный способ не учитывал влияние органических составляющих ротовой жидкости (в частности, глюкозы) на протекание различных патологических процессов (в том числе и образование зубного камня), а также не моделировал биологическую систему при наличии клинически важного соматического заболевания, например сахарного диабета 2-го типа.
Задачей заявляемого изобретения является разработка модельной системы для изучения влияния глюкозы на процесс образования зубного камня, выявление условий, способствующих камнеобразованию в полости рта, с целью обнаружения предрасположенности к данному заболеванию и последующей выработки профилактических мер возникновения и роста зубного камня.
2
2
4
2
4
2
4
2
2
2
3
Указанный технический результат достигается тем, что в способе изучения влияния глюкозы на процесс образования зубного камня исследуют ротовую жидкость людей без заболеваний полости рта и пародонта, создают модельную среду, в которую помещают здоровый зуб, и проводят наблюдение в течение длительного времени, отличающийся тем, что модельная система имеет следующий состав: CaCl·2HO - 0.6931 г/л, (NH)HPO - 0.2376 г/л, KHPO·3HO - 5.0000 г/л, NaF - 0.4452 г/л, MgCl·6HO - 0.1319 г/л, NaHCO - 0.7844 г/л, KCl - 0.1076 г/л. При этом в модельную среду вводят добавки глюкозы в количестве 0.0108, 0.108 и 1.08 г/л, что отвечает содержанию глюкозы в слюне здорового человека, больного сахарным диабетом 2-го типа, и увеличенной в 10 раз соответственно. Для оценки скорости образования зубного камня используют Ca/P-коэффициент.
Способ поясняется фотографиями:
фиг. 1 - схема модельного эксперимента;
гл
гл
фиг. 2 - рентгенограммы осадков из растворов с глюкозой: A - С=0.108 г/л, Б-С=1.08 г/л;
гл
фиг. 3 - дифрактограмма брушита из раствора с С=0.0108 г/л;
гл
гл
гл
фиг. 4 - ИК-спектры осадков, полученных при: 1) С=0.0108 г/л; 2) С=0.108 г/л; 3) С=1.08 г/л;
фиг. 5 - изменение соотношения Ca/P в осадках во времени.
Способ осуществляется следующим образом.
Для определения параметров ротовой жидкости были проведены следующие исследования. Материалом исследования служила слюна 120 пациентов. Забор слюны осуществляли утром, натощак, до чистки зубов в стерильную пробирку с плотно закрывающейся крышкой. Собранную слюну центрифугировали в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин в лабораторной медицинской центрифуге ОПЛ-8. Для определения физико-химических параметров ротовой жидкости использовались методики, адаптированные в стоматологии для изучения ротовой жидкости [Питаева А.Н., Коршунов А.П., Дистель В.А. и др. «Физико-химические методы исследования смешанной слюны в клинической и экспериментальной стоматологии» (учебное пособие) - Омск, 2001]. Определение содержания глюкозы проводили йодометрическим методом [ГОСТ 3628-78].
Осмотр полости рта осуществлялся с помощью стандартного набора стоматологических инструментов (зонда, зеркала и пинцета). У участников исследования проводилось выявление кариозных полостей, пломб и удаленных зубов, оценка состояния тканей пародонта, определение уровня гигиены полости рта, оценка состояния пломб. Интенсивность кариеса описывают индексом КПУ как сумма количеств кариозных (К), пломбированных (П) и удаленных (У) зубов. Индекс КПУП включает в себя сумму всех кариозных полостей, пломбированных кариозных полостей и удаленных зубов. Для оценки гигиенического состояния полости рта визуально с помощью зубоврачебного зонда определяли зубной налет и зубной камень на губных поверхностях 11 и 13, щечных поверхностях 16 и 26 и язычных поверхностях 36 и 46. Оценку зубного налета (ЗН) проводили по четырехбалльной системе: 0 - ЗН не обнаружен, 1 - мягкий ЗН покрывает 1/3 зуба или плотный коричневый налет в любом количестве, 2 - мягкий ЗН покрывает 2/3 поверхности зуба, 3 - мягкий ЗН покрывает более 2/3 поверхности зуба. ИЗН=(сумма показателей шести зубов): 6. Оценку зубного камня (ЗК) также проводили по четырехбалльной системе: 0 - ЗК не обнаружен, 1 - наддесневой ЗК покрывает 1/3 поверхности зуба, 2 - наддесневой ЗК покрывает 2/3 поверхности зуба или имеется поддесневой ЗК в виде отдельных конгломератов, 3 - наддесневой ЗК покрывает более 2/3 зуба или поддесневой ЗК окружает пришеечную часть зуба. ИЗК=(сумма показателей шести зубов): 6. Состояние пародонта оценивали с помощью папиллярно-маргинально-альвеолярного индекса (РМА).
В ходе дальнейшего исследования были выделены три группы людей:
1) группа 1 - больные сахарным диабетом (СД) типа 2-40 человек (33.3%). Количественная характеристика индексов, характеризующих состояние органов и тканей полости рта при СД у различных возрастных групп, представлена в таблице 1.
Таблица 1
Индексная оценка состояния полости рта у больных СД в различных возрастных группах
Изучаемые показатели
Значения изучаемых показателей
30-39 лет
40-49 лет
50-59 лет
КПУ
10,77±5
9,31±4
7,93±4
КПУП
12,69±3
11,00±3
9,71±1
РМА, %
67,69±10
70,31±8
63,21±10
ИГР-У, баллы
2,1±0,5
2,1±0,5
1,99±0,6
ИЗН, баллы
0,85±0,6
0,75±0,3
0,98±0,1
ИЗК, баллы
1,26±0,6
1,29±0,4
1,21±0,4
2) группа 2 - люди, имеющие зубные отложения в полости рта. Исследована слюна 40 человек (33.3%). Результаты клинического обследования состояния полости рта у лиц с наличием зубного камня выявили нарушения состояния твердых тканей зубов кариозного и некариозного происхождения, а также изменение состояния тканей пародонта (табл.2).
Таблица 2
Индексная оценка состояния полости рта у лиц с наличием зубного камня в различных возрастных группах
Изучаемые показатели
Значения изучаемых показателей
30-39 лет
40-49 лет
50-59 лет
КПУ
6,08±2
4,69±3
4,07±2
КПУП
6,92±2
6,77±3
6,21±3
РМА, %
28,62±7
30,69±7
29,79±10
ИЗН, баллы
0,64±0,5
0,54±0,2
0,45±0,3
ИЗК, баллы
0,62±0,3
0,58±0,2
0,61±0,4
3) группа 3 - контрольная группа - 40 человек (33.3%). Взятую в качестве сравнения группу лиц, резистентных к заболеваниям, составили люди с одинаковым соматическим статусом «практически здоровые», а также без заболеваний пародонта и слизистой оболочки полости рта.
У пациентов, не имеющих в полости рта зубных отложений, при анализе состояния полости рта установлено следующее (табл.3):
Таблица 3
Индексная оценка состояния полости рта у лиц с отсутствием зубного камня в различных возрастных группах
Изучаемые показатели
Значения изучаемых показателей
30-39 лет
40-49 лет
50-59 лет
КПУ
3,62±3
4,38±4
5,21±3
КПУП
6,23±5
6,08±4
6,57±3
РМА, %
8,15±7
5,15±4
7,93±2
ИЗН, баллы
0,8±0,5
0,74±0,3
0,96±0,7
Сравнительная оценка состояния полости рта у лиц с наличием и отсутствием зубных отложений (табл.1-3) показала, что при наличии зубных камней повышается значение индекса РМА, характеризующего состояние тканей пародонта, т.е. происходит ухудшение состояния тканей пародонта и гигиенического состояния полости рта. Индексы КПУ и КПУП характеризуют распространенность и интенсивность кариеса. Результаты клинического исследования свидетельствуют, что наиболее неблагоприятная ситуация в полости рта складывается у больных СД. У таких пациентов отмечаются максимальные значения индекса РМА, хуже гигиеническое состояние полости рта.
Выявленные нами некоторые особенности индексной характеристики состояния органов и тканей полости рта у лиц с наличием и отсутствием зубных отложений позволили предположить, что их характер может зависеть от ситуации в полости рта, определяемой составом и свойствами ротовой жидкости.
глюк
Одними из важных компонентов слюны человека являются моносахариды, в частности глюкоза, сахароза и другие. Концентрация глюкозы в слюне здорового человека составляет 0.0108 мг/л. Увеличение содержания сахара в крови и, как следствие, в слюне (С=0.0906 мг/л) наблюдается при сахарном диабете. Для людей с этой патологией отмечена склонность к камнеобразованию в полости рта. Вероятно, это связано с повышенным содержанием глюкозы в среде, из которой возможна кристаллизация фосфатов кальция.
Далее осуществили постановку модельного эксперимента для определения возможности образования зубных камней в гипотетическом растворе, моделирующем состав ротовой жидкости. Процесс кристаллизации изучали in vitro в среде, по электролитному составу приближенной к слюне здорового человека. Концентрация глюкозы в трех сериях модельных растворов была создана равной 0.0108, 0.108 и 1.08 г/л.
В качестве исходных реагентов использовались соли марки ч.д.а. и х.ч. и дистиллированная вода. Выбор исходных реагентов и их соотношение в растворе определялись таким образом, чтобы концентрации ионов и ионная сила раствора были максимально приближены к данным параметрам моделируемой системы, а именно ротовой жидкости.
3
2
2
4
2
4
2
4
2
2
2
3
Для каждой серии экспериментов были подготовлены растворы, содержащие катионы и анионы, при совместном присутствии которых в данных условиях не образуются малорастворимые соединения. После смешения эквивалентных объемов растворов производили корректировку значений pH путем добавления 6 М раствора NaOH или концентрированной HCl. С целью предотвращения уменьшения концентрации в растворе карбонат ионов (за счет гидролиза в кислой среде) необходимое количество NaHCO добавляли при pH 5.5-6.0. После корректировки pH моделируемого раствора до необходимого значения добавляли определенную массу кристаллического KCl, рассчитанную таким образом, чтобы ионная сила раствора была максимально приближена к моделируемой системе (см. фиг.1). Готовый раствор состава CaCl·2HO - 0.6931 г/л, (NH)HPO - 0.2376 г/л, KHPO·3HO - 5.0000 г/л, NaF - 0.4452 г/л, MgCl·6HO - 0.1319 г/л, NaHCO - 0.7844 г/л, KCl - 0.1076 г/л помещали в стакан, в модельную систему подвешивали зуб и оставляли для кристаллизации в течение определенного времени (7, 14, 21, 28, 60, 90, 120, 150, 180 дней).
Для установления фазового и химического состава полученных твердых фаз были использованы методы рентгенофазового анализа (РФА), ИК-спектроскопии и методы химического анализа. При этом соотношение катионов и анионов в твердой фазе оценивали по разности начальных и конечных концентраций осадкообразующих ионов в модельном растворе по методикам химического анализа.
α
гл
Согласно данным РФА твердые фазы, выделенные из модельных растворов с концентрацией глюкозы, превышенной относительно физиологической величины, представлены преимущественно гидроксилапатитом (см. фиг.2). Из анализа дифрактограмм видно, что пики гидроксилапатита в области 30°-35° по 2Θ (CuK) для осадков из системы, моделирующей состав слюны больных сахарным диабетом, разрешены в меньшей степени (см. фиг.2A), чем соответствующие рефлексы для соединения из раствора с С=1.08 г/л (см. фиг.2Б). Следовательно, окристаллизованность полученных соединений различается в зависимости от исходного количества глюкозы в растворе. Осадок из раствора, моделирующего состав слюны здорового человека, представлен брушитом (см. фиг.3).
-1
3-
-1
2-
-1
-1
-1
-1
-
-1
-1
4
3
Исследование полученных соединений методом ИК-спектроскопии позволяет установить, что в состав всех образцов помимо минерального компонента входит глюкоза (см. фиг.4). На ИК-спектрах всех образцов обнаруживаются полосы поглощения колебаний связи неорганических и органических групп: 1010-1050, 600, 570, 480 см - валентные и деформационные колебания связи O-P-O PO -ионов; 1420, 1460, 1550 см -O-C-O CO -ионов; 1710 см -C=O; 1650 см - N-H; 2926, 2854 см- C-H, 640 см - OH. В ближней области спектра интенсивность 1650 см, в дальней области широкая полоса 3150-3400 см соответствуют колебаниям молекулярной воды.
По интенсивности поглощения колебаний связи C-H можно провести полуколичественную оценку содержания органического вещества в составе осадка. Наибольшее количество глюкозы регистрируется в образце из раствора с физиологической ее концентрацией, в котором происходит кристаллизация брушита. Значительно меньшее количество органических молекул включается в состав твердой фазы, представленной гидроксилапатитом.
После 30 суток выдерживания при комнатной температуре отмечено достоверное увеличение массы полученной твердой фазы из модельных растворов с добавками глюкозы (табл.4). При дальнейшем выдерживании модельных растворов масса осадков продолжала нарастать, но влияние глюкозы постепенно ослабевало, масса твердых фаз выравнивалась.
Таблица 4
Характеристики твердых фаз из растворов с глюкозой
Концентрация глюкозы в модельном растворе, г/л
Масса осадка, г
Величина соотношения Ca/P в осадке
0.0108
0.37
1.20
0.1080
0.54
1.55
1.0800
0.90
1.74
8
2
4
6
2
4
2
При исследовании состава образцов метод АЭС-ИСП показал, что с увеличением концентрации глюкозы в растворе наблюдается рост отношения атомных количеств кальция и фосфора в твердой фазе (табл.4). При физиологической концентрации глюкозы из раствора кристаллизуется твердая фаза, для которой величина отношения Ca/P=1.20. Данное значение характеристики кальциево-фосфатного соединения, отличное от такового для чистых брушита (Ca/P=0.96-1.01) и октакальция фосфата (Ca/P=1.29-1.36), вероятно обусловлено присутствием смеси двух солей в образце. CaH(PO)·5HO и CaHPO·2HO согласно термодинамическим расчетам имеют близкие значения индексов пересыщения, поэтому могут одновременно осаждаться из раствора, к тому же оба вещества согласно данным могут выступать в качестве фаз-предшественников при кристаллизации гидроксилапатита. Методами ИК-спектроскопии и РФА фаза октакальция фосфата не была зафиксирована, вероятно, это связано с тем, что оба вещества имеют схожий вид ИК-спектров и положения пиков на дифрактограммах.
5
4
3
Для стехиометрического гидроксилапатита с идеальной формулой Ca(PO)OH соотношение Ca/P равно 1.67 и по значению этой характеристики принято судить об окристаллизованности гидроксилапатита разного происхождения. Установленная экспериментально тенденция изменения соотношения Ca/P в осадках (табл.4, строки 3 и 4) может косвенно свидетельствовать об изменении степени их кристалличности вследствие возрастания количества добавленной глюкозы. При увеличении времени выдерживания осадка под маточным раствором наблюдается постепенный рост Ca/P-го коэффициента с выходом на плато (см. фиг.5). Наиболее значительное его увеличение происходит при переходе от нормальной концентрации глюкозы в модельном растворе к увеличенной в 10 раз (как при сахарном диабете). Причем в этом случае отмечается приближение соотношения атомных количеств Ca/P к данной величине для зубных камней (1.85).
По нашему мнению, улучшение кристалличности осадка и увеличение его количества происходит под влиянием глюкозы, присутствующей в растворах. Это может быть обусловлено образованием комплексов глюкозы с ионами кальция и увлечением их в твердую фазу. Можно предположить, что глюкоза промотирует процесс кристаллизации гидроксилапатита. Поскольку гидроксилапатит является наиболее распространенной фосфатной солью кальция в составе зубных камней человека, то аналогичное воздействие глюкоза может оказывать и на образование зубных камней.
Полученные результаты указывают на то, что глюкоза выполняет промотирующую роль, способствуя формированию гидроксилапатита. Наличие ее в модельных системах в концентрациях, превышенных относительно нормы (0.108 г/л и 1.080 г/л), приводит к увеличению скорости кристаллизации твердой фазы, представленной преимущественно гидроксилапатитом.
Таким образом, заявляемый способ позволяет выявить параметры, которые при отклонении от нормы вызывают образование зубного камня, и создать модельную систему, с помощью которой можно изучать эффективность воздействия лекарственных препаратов для профилактики возникновения и роста зубного камня.