Реорганизация ультраструктуры синаптических контактов в ткани головного мозга крысы при парентеральном введении внеклеточной ДНК

001: 10.24411/2071-5315-2018-12034

Реорганизация ультраструктуры синаптических контактов в ткани головного мозга крысы при парентеральном введении внеклеточной ДНК

Л.Е. Фрумкина, И.Л. Конорова, О.П. Александрова, Л.Г. Хаспеков

Исследовали ультраструктуру Ш-У слоя теменно-височной области новой коры крыс после внутривенного введения гомологичной внеклеточной ДНК (вкДНК). Через 24 ч после введения в нейропиле обнаруживались усложненные ак-содендритные и аксошипиковые синапсы дивергентного и конвергентного типов с широкой постсинаптической специализацией, атипичные синаптические контакты, полиморфные тубуловезикулярные структуры в аксоплазме, гигантские митохондрии и другие крупные органеллы. Таким образом, вкДНК при ее парентеральном введении может вызывать пластические перестройки в ткани мозга, направленные на активацию синтеза белка в нейронах и повышение эффективности синаптической передачи, что может способствовать репаративным и компенсаторно-восстановительным процессам при ишемической церебральной патологии.

Ключевые слова: ультраструктура головного мозга, внеклеточная ДНК, пластическая реорганизация нейропиля.

Внеклеточная ДНК (вкДНК) присутствует во всех биологических жидкостях, в том числе в плазме периферической крови, в виде множества форм, включая растворимые фрагменты, связанные и/или входящие в макромолекуляр-ные частицы различного устройства. Источниками вкДНК, предположительно, являются хроматин гибнущих клеток организма и метаболическая ДНК, активно секретируе-мая жизнеспособными клетками и высвобождаемая в виде ДНК-содержащих липопротеиновых комплексов. Установлено, что вкДНК является межклеточным мессенджером и способна переноситься в другие клетки, осуществляя эпигенетическое влияние на их функции [1].

В составе вкДНК обнаружены лиганды трансмембранных рецепторов, экспрессируемых нейронами и другими типами клеток и представляющих собой белки семейства То11-Нке-

Лидия Ефимовна Фрумкина - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории экспериментальной нейро-цитологии отдела исследований мозга ФГБНУ "Научный центр неврологии", Москва.

Ирина Львовна Конорова - докт. биол. наук, профессор кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ФГБОУ ВО "Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова" МЗ РФ. Ольга Петровна Александрова - канд. биол. наук, науч. сотр. лаборатории экспериментальной нейроцитологии отдела исследований мозга ФГБНУ "Научный центр неврологии", Москва.

Леонид Георгиевич Хаспеков - докт. биол. наук, зав. лабораторией экспериментальной нейроцитологии отдела исследований мозга ФГБНУ "Научный центр неврологии", Москва.

Контактная информация: Фрумкина Лидия Ефимовна, lidia.frumkina@mail.ru

рецепторов (TLR), которые под воздействием этих лигандов инициируют каскады внутриклеточных реакций. В нейронах новой коры активно экспрессируются TLR 9-го типа (TLR9), лигандами которых являются неметилированные остатки -CpG-динуклеотиды (CpG - цитозин-фосфат-гуанин), содержащиеся в большом количестве в составе фрагментов вкДНК [2]. Экспрессия нервными клетками TLR как в физиологических условиях, так и при церебральной ишемии позволяет предполагать важную роль этих рецепторов в функционировании центральной нервной системы, на которое в норме и при патологии может оказывать влияние вкДНК [3].

Уровень вкДНК в крови значительно возрастает при инсульте и может служить биомаркером острого ишеми-ческого повреждения клеток мозга, а также являться предиктором отдаленных последствий инсульта [4, 5]. В то же время установлено, что вкДНК играет роль эндогенного постоянно действующего фактора крови, регулирующего гемодинамику мозга как в норме, так и при нарушениях мозгового кровообращения, она активно взаимодействует с различными клетками, в том числе с нейронами [6, 7].

При экспериментальном моделировании ишемической патологии головного мозга in vivo было обнаружено, что CpG-лиганды стимулируют экспрессию TLR9, препятствуя увеличению инфаркта мозга и усиливая, таким образом, его толерантность к ишемии [8]. При этом вкДНК способствует повышению жизнеспособности нервных клеток в зоне пенумбры. В культуре клеток-зерен мозжечка малые дозы вкДНК оказывают нейропротекторный эффект, ингибируя в нейронах продукцию активных форм кислорода в условиях глутаматной эксайтотоксичности [9].

Рис. 1. Ультраструктурная реорганизация нейропиля после внутривенного введения ДНК. а - конвергентный синапс, образованный 4 аксонами на одном дендрите; б - дивергентные перфорированные синапсы, образованные крупной аксонной терми-налью с 2 шипиками; в - перфорированные аксошипиковые синапсы с открытыми перфорациями (стрелки); г - широкая пост-синаптическая специализация (стрелка) в зоне контакта с шипиковым аппаратом аксошипикового синапса. Масштаб 0,5 мкм. Здесь и на рис. 2, 3: Ак - аксон, Ас - астроцит, Д - дендрит, МХ - митохондрия, Ш - шипик, ША - шипиковый аппарат.

Рис. 2. Ультраструктурная реорганизация нейропиля после внутривенного введения ДНК. а - инвагинация шипика в глубь аксона в аксошипиковом синапсе; б - тубуловезикулярные структуры (здесь и на рис. 2в, 2г обозначены буквой Т), в том числе перфорированные, в аксонах; в - симметричный аксоглиальный контакт (стрелка); г - десмосомовидные точечные контакты (стрелки). Масштаб 0,5 мкм.

Нейропротекторные свойства вкДНК позволили предположить, что одной из вероятных причин их проявления может быть перестройка ультраструктуры нейронов и си-наптических связей, активирующая механизмы, которые в условиях ишемии могут играть защитную роль. Ранее нами было выявлено, что парентеральное введение вкДНК приводит к ультраструктурным перестройкам в нейронах новой коры головного мозга крысы, направленным на усиление синтеза белка и энергетического метаболизма, а также на повышение эффективности синаптической передачи, что может способствовать активации репаративных и компенсаторно-восстановительных процессов при ишемической патологии головного мозга [10]. В настоящей работе мы исследовали изменения ультраструктуры нейропиля новой коры головного мозга крысы под воздействием вкДНК.

Материал и методы

Самцам крыс М^аг массой 250-300 г (п = 3) внутривенно со скоростью 0,06 мл/мин однократно вводили раствор гомологичной вкДНК, выделенной из ткани мозга, в дозе 7,7 х 10-5 г/кг, а контрольным животным (п = 6) - равный объем изотонического (0,9%) раствора хлорида натрия. Через

1 сут под хлоралгидратным наркозом мозг прижизненно фиксировали при помощи внутрисердечного введения раствора 2,5% глутаральдегида с 2% раствором параформаль-дегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4). После декапи-тации из мозга выделяли фрагменты теменно-височной области новой коры, содержащие все ее слои, дополнительно фиксировали в 1% растворе тетрооксида осмия, проводили по общепринятой для электронной микроскопии схеме и заливали в эпон-812. Исследовали нейропиль в III-V слое, просматривая ультратонкие срезы на микроскопе Hitachi Н-600.

Результаты

Для нейропиля исследованных слоев новой коры после введения вкДНК было характерно появление синапсов с усложненной ультраструктурой. Наряду с конвергентными аксодендритными синапсами, содержащими 2 аксонные терминали, на одном дендрите или шипике локализуются контакты с 3-4 аксонами (рис. 1а). Дивергентные синапсы, образованные одной крупной аксонной терминалью на двух шипиках (рис. 1б), были представлены перфорированными контактами, отдельные перфорации в которых были открыты и содержали синаптические пузырьки (рис. 1в). В обла-

Л

Рис. 3. Ультраструктурная реорганизация нейропиля после внутривенного введения ДНК. а - симметричный аксодендритный синапс, образованный аксоном с дендритной филоподией (Ф; стрелка); б - крупная тубуловезикулярная структура (Т) в аксоне; в - разветвленные крупные митохондрии, окруженные многочисленными мелкими органеллами. Масштаб 1 мкм (а, б), 2 мкм (в).

сти активной зоны синапса обнаруживалась широкая пост-синаптическая специализация, плотно контактирующая с шипиковым аппаратом (рис. 1г). В аксошипиковых контактах появились глубокие инвагинации, в результате чего кривизна пресинаптической мембраны при внедрении ши-пика в глубь аксона изменилась, увеличивая поверхность активной зоны синапса (рис. 2а, 2б).

Необходимо отметить факт обнаружения в нейропиле атипичных, отсутствующих в контроле форм синапсов, таких как аксоглиальные (рис. 2в), точечные десмосомовид-ные, асимметричные или симметричные аксо-аксональные контакты (рис. 2г), симметричные синапсы, сформированные аксоном на дендритных филоподиях (рис. 3а). Наряду с этим в аксоплазме выявлялось большое количество разнообразных по форме и размеру, в том числе крупных, тубу-ловезикулярных структур (см. рис. 2б-2г, 3б). В них видны перфорации, а также везикулы, размеры которых сопоставимы с размерами синаптических пузырьков (см. рис. 2б). Кроме того, обнаруживались гигантские митохондрии и другие крупные органеллы, снабженные перетяжками и соседствующие с мелкими митохондриями (рис. 3в).

Обсуждение

Полученные нами в предыдущем исследовании результаты свидетельствуют о том, что парентеральное введение вкДНК вызывает гетерогенную перестройку ультраструктуры корковых нейронов, в частности структуры ядра и цитоплазмы [10]. Обнаруженные многочисленные ядерные поры и глубокие инвагинации ядерной оболочки можно рассматривать как усиление тесных ядерно-цитоплазма-тических взаимоотношений и гиперсинтез белка. О пластической реорганизации цитоплазмы нейронов также свидетельствует появление крупных полисомальных частиц и энергезированных митохондрий. Выявленные контакты типа десмосом и щелевых соединений между нейронами указывают на обеспечение эффекта спонтанной синхронизации через электрические синапсы.

Проведенный в настоящей работе анализ субклеточной реорганизации нейропиля под воздействием вкДНК позволил выявить ультраструктурные изменения, также

указывающие на пластическую перестройку синапсов, которая направлена на повышение их информативности и эффективности синаптической передачи. Об этом свидетельствуют увеличение протяженности активной зоны аксошипиковых контактов, наличие многочисленных более сложно организованных конвергентных и дивергентных синапсов с широкой постсинаптической специализацией, находящейся в тесном контакте с шипиковым аппаратом дендритов, появление нетипичных синапсов, характерных для раннего нейрогенеза. Выявленная аккумуляция постсинаптического материала в аксошипиковых синапсах может быть связана со стабильностью и увеличением продолжительности жизни шипиков и усилением нейротрансмиссии [11, 12]. Наличие атипичных форм синапсов (см. рис. 2), подобных обнаруженным нами ранее в нейропиле новой коры крыс в процессе развития как in vivo, так и in vitro, по-видимому, может быть проявлением нейропластичности и ассоциироваться с включением реактивного синаптогенеза в ответ на введение вкДНК [13, 14]. Его результатом является активация астроцитарной глии, о чем свидетельствует полное или частичное окружение ее отростками синаптических контактов. Астроцитарная сеть играет важную роль в функциональной реорганизации нейронов и интегративную роль в пластических процессах [15, 16]. Синапсы, окруженные отростками астроцитов, обладают повышенной активностью [15, 17, 18]. Астроциты стимулируют морфологические и молекулярные изменения в нейронах и синапсах, в частности инициируя экспрессию молекул внеклеточного матрикса [19].

Появление под влиянием вкДНК в нейропиле и нейронах многочисленных, разнообразных по форме и размеру тубу-ловезикулярных структур, вероятно, связано с эндоцитозом вкДНК нервными клетками [10, 20]. Экспрессия белка TLR9, заключенного в эндосомах, в виде случайного мелкоточечного иммуногистохимического окрашивания цитоплазмы нейронов в интактном и подвергнутом ишемии полушарии мышей продемонстрирована в работе Y. Ji et al. [3]. Не исключено, что выявленные нами тубуловезикулярные структуры также представляют собой морфологические разновидности эндосомальных органелл, имеющих сфериче-

скую или тубулярную форму, которые выполняют функцию переносчиков синаптических пузырьков [21, 22]. Появление множества тубуловезикулярных эндосомальных структур может играть транспортную роль и способствовать ускорению доставки синаптических пузырьков путем аксонального транспорта из цитоплазмы нейронов в зону синаптического контакта и, следовательно, повышать эффективность си-наптической передачи [20]. Весьма вероятно, что увеличение количества этих структур как поставщиков синаптических пузырьков служит косвенным доказательством усиления нейротрансмиссии под воздействием вкДНК.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что вкДНК при ее парентеральном введении вызывает значительные пластические перестройки в ткани мозга, направленные на активацию синтеза белка в нейронах, повышение эффективности синаптической передачи и функциональные изменения межнейронных связей мозга в целом, что потенциально может способствовать репаративным и компенсаторно-восстановительным процессам в условиях ишемической патологии головного мозга.

Авторы благодарят канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаборатории молекулярной биологии Медико-генетического научного центра (рук. - докт. биол. наук Н.Н. Вейко) К.В. Глебову за предоставленную вкДНК.

Список литературы

1. Peters DL, Pretorius PJ. Origin, translocation and destination of extracellular occurring DNA - a new paradigm in genetic behavior Clinica Chimica Acta 2011 May;412(11-12):806-11.

2. Shintani Y Kapoor A, Kaneko M, Smolenski RT, D'Acquisto F, Cop-pen SR, Harada-Shoji N, Lee HJ, Thiemermann C, Takashima S, Yashiro K, Suzuki K. TLR9 mediates cellular protection by modulating energy metabolism in cardiomyocytes and neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 2013 Mar;110(13):5109-14.

3. Ji Y Zhou Y Pan J, Li X, Wang H, Wang Y. Temporal pattern of Tolllike receptor 9 upregulation in neurons and glial cells following cerebral ischemia reperfusion in mice. The International Journal of Neuroscience 2016;126(3):269-77.

4. Glebova KV, Veiko NN, Nikonov AA, Porokhovnik LN, Kostuyk SV. Cell-free DNA as a biomarker in stroke: current status, problems and perspectives. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 2018 Jan;55(1):55-70.

5. Vajpeyee A, Wijatmiko T, Vajpeyee M, Taywade O. Cell free DNA: a novel predictor of neurological outcome after intravenous thrombolysis and/or mechanical thrombectomy in acute ischemic stroke patients. Neurointervention 2018 Mar;13(1):13-9.

6. Конорова И.Л., Максимова М.Ю., Смирнова И.Н., Болотова Т.А., Ершова Е.С., Вейко Н.Н., Суслина З.А. Циркулирующая в плазме крови внеклеточная ДНК в патогенезе ишемического

инсульта: роль транскрибируемой области рибосомного повтора. Патологическая физиология и экспериментальная терапия 2014;58(2):13-23.

7. Gahan PB. Current developments in circulating nucleic acids in plasma and serum. In: Circulating nucleic acids in plasma and serum: Proceedings of the 6th International Conference on Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum held on 9-11 November 2009 in Hong Kong. Gahan PB, editor. London: Springer; 2010: 3-14.

8. Aravalli RN, Peterson PK, Lokensgard JR. Toll-like receptors in defense and damage of the central nervous system. Journal of Neu-roimmune Pharmacology 2007 Dec;2(4):297-312.

9. Конорова И.Л., Глебова К.В., Барсков И.В., Вейко Н.Н., Хаспе-ков Л.Г. Внеклеточная ДНК - потенциальный участник нейро-пластичности. В сб.: Функциональная межполушарная асимметрия и пластичность мозга. Материалы Всероссийской конференции с международным участием. Под общ. ред. Ил-лариошкина С.Н., Фокина В.Ф. Москва, 13-14 декабря 2012. М.: Научный мир; 2012: 296-301.

10. Фрумкина Л.Е., Конорова И.Л., Александрова О.П., Боголе-пов Н.Н., Хаспеков Л.Г Реорганизация ультраструктуры нейронов новой коры головного мозга крыс под воздействием внеклеточной ДНК. Морфология 2015;147(2):7-11.

11. Cane M, Maco B, Knott G, Holtmaat A. The relationship between PSD-95 clustering and spine stability in vivo. The Journal of Neuroscience 2014 Feb;34(6):2075-86.

12. Meyer D, Bonhoeffer T, Scheuss V. Balance and stability of synaptic structure during synaptic plasticity. Neuron 2014 Apr;82(2):430-43.

13. Боголепов Н.Н., Фрумкина Л.Е., Яковлева Н.И., Королева С.К. Возможные механизмы формирования синапсов в онтогенезе. Архив анатомии, гистологии и эмбриологии 1987;92(5):20-7.

14. Широкова О.М., Фрумкина Л.Е., Ведунова М.В., Митроши-на Е.В., Захаров Ю.Н., Хаспеков Л.Г, Мухина И.В. Морфофунк-циональные закономерности развития нейронных сетей в диссоциированных культурах клеток гиппокампа. Современные технологии в медицине 2013;5(2):6-13.

15. Bernardinelli Y, Muller D, Nikonenko I. Astrocyte-synapse structural plasticity. Neural Plasticity 2014;2014:232105.

16. Frischknecht R, Gundelfinger ED. The brain's extracellular matrix and its role in synaptic plasticity. Advances in Experimental Medicine and Biology 2012;970:153-71.

17. Baldwin KT, Eroglu C. Molecular mechanisms of astrocyte-in-duced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology 2017 Aug;45:113-20.

18. Sofroniew MV, Vinters HV. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica 2010 Jan;119(1):7-35.

19. Dityatev A, Schachner M, Sondergger P. The dual role of the extracellular matrix in synaptic plasticity and homeostasis. Nature Reviews Neuroscience 2010 Nov;11(11):735-46.

20. Matteoli M, Coco S, Schenk U, Verderio K. Vesicle turnover in developing neurons: how to build a presynaptic terminal. Trends in Cell Biology 2004 Mar;14(3):133-40.

21. Korber C, Horstmann H, Satzler K, Kuner T. Endocytic structures and synaptic vesicle recycling at a central synapse in awake rats. Traffic (Copenhagen, Denmark) 2012 Dec;13(12):1601-11.

22. Waites CL, Leal-Ortiz SA, Okerlund N, Dalke H, Fejtova A, Altrock WD, Gundelfinger ED, Garner CC. Bassoon and Piccolo maintain synapse integrity by regulating protein ubiquitination and degradation. The EMBO Journal 2013 Apr;32(7):954-69.

Reorganization of the Synaptic Ultrastructure in the Rat Brain Tissue After Parenteral Administration of Extracellular DNA

L.E. Frumkina, I.L. Konorova, O.P. Aleksandrova, and L.G. Khaspekov

The ultrastructure of neuropil of III—V layers of the parieto-temporal neocortex of rat after intravenous administration of the homologous cell-free DNA was investigated. Twenty four hours after the injection, complicated axodendritic and axospinous synapses of divergent and convergent types with a wide postsynaptic specialization, as well as atypical synaptic contacts, polymorphic tubulovesicular structures in the axoplasm, giant mitochondria and other large organelles were observed. The data obtained suggest that injection of cell-free DNA induces pronounced ultrastructural reorganization in neocortical neuropil directed at enhancing synaptic transmission efficiency and protein synthesis activation, as well as at intensifying energy metabolism contributing to reparative and compensatory restorative processes in cerebral pathology. Key words: brain ultrastructure, injection of extracellular DNA, plastic reorganization of neuropil.

Л