CD33-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ РАКА
CD33-SPECIFIC CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS FOR CANCER IMMUNOTHERAPY

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к химерным антигенным рецепторам (CAR), которые представляют собой рекомбинантные химерные белки, обладающие способностью перенаправлять специфичность и реактивность иммунных клеток на CD33, который представляет собой расположенный на клеточной поверхности гликопротеин, присутствующий на большинстве миелоидных клеток, и который применяют для диагностирования у пациентов острого миелоидного лейкоза (AML). CAR, предлагаемые в изобретении, наиболее пригодны для лечения злокачественных клеток, несущих CD33, при экспрессии в T-клетках или NK-клетках. Полученные сконструированные иммунные клетки отличаются высоким уровнем специфичности в отношении злокачественных клеток, обеспечивая безопасность и эффективность иммунотерапии.
Предпосылки создания изобретения
Адаптивная иммунотерапия, в которой применяют перенос аутологичных антигенспецифических T-клеток, созданных ex vivo, представляет собой перспективную стратегию для лечения вирусных инфекций и рака. T-клетки, применяемые для адаптивной иммунотерапии, можно создавать либо путем размножения антигенспецифических T-клеток, либо посредством перенаправления T-клеток с помощью методов генетической инженерии (Park, Rosenberg и др., 2011). Перенос T-клеток, специфических в отношении вирусных антигенов, является хорошо зарекомендовавшей себя процедурой, которую применяют для лечения ассоциированных с трансплантацией вирусных инфекций и редких связанных с вирусами злокачественных заболеваний. Продемонстрировано также, что выделение и перенос специфических в отношении опухоли T-клеток приводит к успеху при лечении меланомы.
in vivo
В T-клетках были успешно созданы новые специфичности посредством генетического переноса трансгенных T-клеточных рецепторов или химерных антигенных рецепторов (CAR) (Jena, Dotti и др., 2010). CAR представляют собой синтетические рецепторы, состоящие из «нацеливающего» фрагмента, ассоциированного с одним или несколькими сигнальными доменами в одной слитой молекуле. В целом, связывающий фрагмент CAR состоит из антигенсвязывающего домена одноцепочечного антитела (scFv), который содержит фрагменты моноклонального антитела, представляющие собой вариабельные домены легкой и тяжелой цепи, соединенные гибким линкером. Успешно применяли также связывающие фрагменты на основе доменов рецептора или лиганда. Сигнальные домены для первого поколения CAR получали из цитоплазматической области дзета-цепей CD3 или гамма-цепей Fc-рецептора. Было продемонстрировано, что первое поколение CAR позволяло успешно перенаправлять T-клеточную цитотоксичность. Однако для них не удалось обеспечить пролонгированное размножение и противоопухолевую активность . Для получения CAR второго и третьего поколений добавляли сигнальные домены из костимуляторных молекул, а также трансмембранные и шарнирные домены, которые в некоторых успешных испытаниях на людях продемонстрировали терапевтическое действие, когда T-клетки удавалось перенаправлять на злокачественные клетки, экспрессирующие CD 19 (June и др., 2011). Однако конкретная комбинация сигнальных доменов, трансмембранных и костимуляторных доменов, которую применяли в случае ScFv, мишенью которого является CD 19, оказалась в большей степени антигенспецифической и непригодной для других антигенных маркеров
+
Острый миелоидный лейкоз (AML) представляет собой второй по частоте встречаемости из наиболее распространенных острых лейкозов, в США ежегодно фиксируется примерно 13300 новых случаев указанного лейкоза, от которого ежегодно умирает 8800 человек. Общепринятая терапия лейкозов включает облучение и/или химиотерапию. Кроме того, в определенных обстоятельствах в качестве дополнительного приемлемого пути рассматривается трансплантация костного мозга. Однако указанные терапии являются относительно токсичными для пациента и очень часто не приводят к полному излечению заболевания. Таким образом, хотя полная ремиссия может достигаться у 65-80% пациентов, получающих химиотерапию, у большинства из этих пациентов происходит рецидив (Cros и др., 2004), поскольку выжившие после химиотерапии клетки обогащены стволовыми клетками, которые являются лейкозными клетками-предшественниками AML (AML-LSC), и представляют собой очень опасный резервуар клеток, обладающих способностью в повторному размножению и способностью приводить к рецидиву. Лейкозные стволовые клетки наиболее хорошо охарактеризованы для острого миелоидного лейкоза. AML-LSC экспрессируют характерный набор антигенов клеточной поверхности, включая среди прочего CD33. Для пациентов старше 60 лет характерен плохой прогноз, согласно которому только 10-15% из них могут рассчитывать на 4-летнюю выживаемость без признаков прогрессирования заболевания (Gardin и др., 2007). Указанный высокий уровень рецидивов у страдающих AML пациентов и плохой прогноз для престарелых пациентов свидетельствуют о настоятельной необходимости в новых терапевтических подходах, направленных главным образом на CD33-клетки.
CD33 (связывающий сиаловую кислоту Ig-подобный лектин 3) или SIGLEC3, обозначенный как Р20138 в базе данных белков в UniProtKB/Swiss-Prot, представляет собой трансмембранный рецептор, который экспрессируется на клетках миелоидной линии дифференцировки. Он, как правило, рассматривается как миелоидспецифический, но он часто присутствует на некоторых лимфоидных клетках. Он связывает сиаловые кислоты, и поэтому является представителем SIGLEC-семейства лектинов.
Ранее использовали различные подходы для создания неконъюгированных моноклональных антител против CD33 с противоопухолевой активностью. Однако эти попытки оказались неудачными с точки зрения специфического воздействия на злокачественные клетки.
В 2000 г. гемтузумабозогамицин (Mylotarg™, GO), представляющий собой конъюгированное с калихеамицином гуманизированное моноклональное антитело к CD33, был одобрен Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA) для лечения пациентов старше 60 лет с рефракторным или рецидивирующим AML. Однако это средство было отозвано с рынка 21 июня 2010 г.; средство GO состояло из гуманизированного антитела к CD33 IgG типа, химически сшитого с цитотоксическим агентом калихеамицином. Исследование, проведенное после одобрения (SWOG S0106), вызвало сомнения касательно безопасности продукта, а в других клинических исследованиях (британские исследования MRC AML-15 и HOVON-43) не удалось продемонстрировать какую-либо клиническую пользу (Maniecki и др., 2011). Обнаруженные побочные действия включали окклюзионное заболевание печеночных вен, легочную токсичность и серьезные реакции гиперчувствительности, в то время как в опытах in vitro продемонстрирована независимая от антигена цитотоксичность в отношении CD33-негативных клеточных линий (Schwemmlein и др., 2006).
Позднее предложены триспецифические полипептидные молекулы, в которых объединены иммуноглобулиновые домены из антител к CD123, CD16 и CD33 (WO 2011/070109), для того, чтобы избегать проблем со специфичностью, ранее установленных для терапевтических средств, мишенью которых является CD33.
+
В качестве альтернативы применяемым ранее стратегиям в настоящем изобретении предложены CD33-специфческие CAR, которые могут экспрессироваться в иммунных клетках, для «нацеливания» на злокачественные CD33-клетки, обладающие значительным клиническим преимуществом.
Краткое изложение сущности изобретения
in vitro
При создании изобретения были разработаны CD33-специфические CAR, обладающие различной структурой и содержащие различные scFV, полученные из различных специфических в отношении CD33 антител. Предпочтительные полипептиды CAR, предлагаемые в изобретении, содержат аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 19-42. Более предпочтительные полипептиды CAR, предлагаемые в изобретении, содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, или последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 68. После неспецифической активации  (например, с использованием покрытых CD3/CD28 гранул и рекомбинантного IL2), T-клетки из доноров трансформировали полинуклеотидами, экспрессирующими указанные CAR, используя вирусную трансдукцию. В некоторых случаях T-клетки подвергали дополнительному конструированию для создания неаллореактивных T-клеток, более конкретно путем разрушения компонента TCR (αβ-цепи T-клеточных рецепторов) для предупреждения реакции «трансплантат-против-хозяина» и еще более конкретно путем разрушения компонента TCR (αβ-цепи T-клеточных рецепторов) и гена CD33.
in vitro
Полученные сконструированные T-клетки обладали разной степенью реактивностью  в отношении CD33-позитивных клеток, что свидетельствует о том, что CAR, предлагаемые в настоящем изобретении, принимают участие в антигензависимой активации, а также пролиферации T-клеток, что делает возможным их применение для иммунотерапии.
В настоящей заявке подробно описаны полипептидные и полинуклеотидные последовательности, которые кодируют CAR, предлагаемые в настоящем изобретении.
Сконструированные иммунные клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, наиболее пригодны для таких терапевтических применений, как лечение B-клеточной лимфомы или лейкоза.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - схематическое изображение сконструированной иммунной клетки, предлагаемой в изобретении. Сконструированная иммунная клетка, представленная на этом чертеже, представляет собой T-клетку, трансдуцированную ретровирусом, кодирующим полипептид CAR. Указанную T-клетку конструировали также для обеспечения улучшенного и более безопасного приживления трансплантата пациенту, что необязательно подпадает под объем настоящего изобретения. Ген X может представлять собой, например, ген, экспрессирующий компонент TCR (TCRальфа или TCRбета), ген Y может представлять собой ген, с которым связана чувствительность T-клетки к иммуносупрессорным лекарственным средствам типа средств, мишенью которых является CD52 (таких как Campath (Кэмпас) или HPRT (таких как 6-тиогуанин);
на фиг. 2 - схематическое изображение различной архитектуры CAR (V1-V6):
на фиг. 3 - схематическое изображение различных CAR со структурой V1, V3 или V5;
+
+
+
на фиг. 4 - данные о дегранулирующей активности (% CD8/CD107a-клеток и средняя интенсивность флуоресценции (MFI) CD107a в популяции CD8-клеток) scFv M195 с тремя архитектурами (v1: шарнир FcgRIII/трансмембранный домен CD8, v3: шарнир CD8/трансмембранный домен CD8, v5: шарнир IgG1/трансмембранный домен CD8), полученные при совместном культивировании CAR-T-клеток в течение 6 ч с экспрессирующими CD33 клетками (U937) или с клетками, которые не экспрессируют CD33 (Jeko). Данные представлены в виде процента (%) дегрануляции и средней интенсивности флуоресценции (MFI);
+
+
+
на фиг. 5 - данные о дегранулирующей активности (% CD8/CD107a-клеток и средняя интенсивность флуоресценции (MFI) CD107a в популяции CD8-клеток) scFv m2H12 и Му9.6 с тремя архитектурами (v1: шарнир FcgRIII/трансмембранный домен CD8, v3: шарнир CD8/трансмембранный домен CD8, v5: шарнир IgG1/трансмембранный домен CD8), полученные при совместном культивировании CAR-T-клеток в течение 6 ч с экспрессирующими CD33 клетками (U937) или с клетками, которые не экспрессируют CD33 (Jeko). Данные представлены в виде процента (%) дегрануляции и средней интенсивности флуоресценции (MFI);
+
+
на фиг. 6 - данные о дегранулирующей активности (% CD8/CD107a-клеток) 7 конструкций: M195-V1, M195-V3, M195-V5, m2H12-V1, m2H12-V3, My9.6-V1 и My9.6-V3 (v1: шарнир FcgRIII/трансмембранный домен CD8, v3: шарнир CD8/трансмембранный домен CD8, v5: шарнир IgG1/трансмембранный домен CD8), полученные при совместном культивировании CAR-T-клеток в течение 6 ч с клетками, экспрессирующими высокие или средние уровни CD33 (U937 и K562 соответственно), или с клетками, которые не экспрессируют CD33 (Jeko-1). Данные представлены в виде процента (%) дегрануляции;
на фиг. 7 - данные о количестве IFN, высвободившегося экспрессирующими анти-CD33 CAR T-клетками при совместном культивировании в течение 24 ч с клетками, экспрессирующими различные уровни CD33 (U937 и K562), или с клетками, которые не экспрессируют CD33 (Jeko-1). Представлены также данные о высвобождении IFN-гамма из T-клеток, культивируемых в таких же условиях индивидуально. Эксперименты осуществляли с использованием образцов трех независимых доноров, и представлены результаты, полученные для одного репрезентативного донора;
на фиг. 8 - данные об удельной цитолитической активности экспрессирующих анти-CD33 CAR T-клеток. Анализы осуществляли через 48 ч после трансфекции мРНК CAR. T-клетки совместно культивировали с клетками U937+Jeko или K562+Jeko в течение 4 ч. Определяли жизнеспособность клеток для каждой клеточной линии в конце периода совместного культивирования и рассчитывали процент удельного клеточного лизиса.
Подробное описание изобретения
Если специально не указано иное, то все технические и научные понятия, использованные в настоящем описании, имеют значение, которое является общепринятым для специалистов в области генной терапии, биохимии, генетики и молекулярной биологии.
Для осуществления на практике или тестирования настоящего изобретения можно применять все методы и материалы, сходные или эквивалентные тем, которые указаны в настоящем описании, при этом в настоящей заявке описаны приемлемые методы и материалы. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. В случае разночтения следует руководствоваться настоящим описанием, включая определения. Кроме того, материалы, методы и примеры представлены только для иллюстрации и не направлены на ограничение объема изобретения, если не указано иное.
При осуществлении на практике настоящего изобретения следует применять, если не указано иное, общепринятые методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, известные специалисту в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе, см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, изд-во Wiley and son Inc, Library of Congress, USA, 2000); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3-е изд. (Sambrook и др., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001); Oligonucleotide Synthesis, под ред. M.J. Gait, 1984; Mullis и др., US №4683195; Nucleic Acid Hybridization (под ред. В.D. Harries и S.J. Higgins, 1984); Transcription And Translation (под ред. В.D. Hames и S.J. Higgins, 1984); Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, изд-во Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (изд-во IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984; серия: Methods In ENZYMOLOGY (под. ред. J. Abelson и M. Simon, изд-во Academic Press, Inc., New York), прежде всего том 154 и том 155 (под ред. Wu и др.) и том 185, «Gene Expression Technology» (под ред. D. Goeddel); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (под ред. J.H. Miller и M.P. Calos, 1987, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (под ред. Mayer и Walker, изд-во Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, тома I-IV (под ред. D.M. Weir и С.С. Blackwell, 1986); и Manipulating the Mouse Embryo, (изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический химерный антигенный рецептор (CAR), идентичный по меньшей мере на 80% одной из полипептидных структур, выбранных из V1, V3 и V5, которые проиллюстрированы на фиг. 2, где указанная структура содержит:
(а) внеклеточный лигандсвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CD33,
(б) шарнир, выбранный из шарнира FcRIIIα, шарнира CD8α и шарнира IgG1,
(в) трансмембранный домен CD8α и
(г) цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.
Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является CD33-специфический CAR, указанный выше, в котором указанная структура V3 содержит шарнир CD8α и трансмембранный домен CD8α.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, указанный выше, в котором указанный шарнир CD8α идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 4.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, указанный выше, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30.
Вариантом осуществления настоящего изобретения является CD33-специфический CAR, указанный выше, в котором указанная структура V1 содержит шарнир FcγRIIIα и трансмембранный домен CD8α.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, указанный выше, в котором указанный шарнир FcγRIIIα идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 3.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, указанный выше, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22.
Вариантом осуществления настоящего изобретения является CD33-специфический CAR, указанный выше, в котором указанная структура V5 содержит шарнир IgG1 и трансмембранный домен CD8α.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, указанный выше, в котором указанный шарнир IgG1 идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 5.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, указанный выше, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, указанный выше, в котором указанная VH идентична по меньшей мере на 80% полипептидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 17, и указанная VL идентична по меньшей мере на 80% полипептидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 18.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, указанный выше, в котором костимуляторный домен из 4-1ВВ идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 8.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, указанный выше, в котором указанный сигнальный домен CD3дзета идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 9.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, указанный выше, в котором указанный трансмембранный домен CD8α идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 6.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, указанный выше, который дополнительно содержит сигнальный пептид.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, указанный выше, в котором указанный сигнальный пептид идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
Одним из вариантом осуществления настоящего изобретения является CD33-специфический CAR, указанный выше, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 48-71, предпочтительно идентичную по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, более предпочтительно идентичную по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, указанный выше, который дополнительно содержит другой внеклеточный лигандсвязывающий домен, который не является специфическим в отношении CD33.
Другим объектом настоящего изобретения является полинуклеотид, кодирующий CAR по одному из указанных выше вариантов осуществления изобретения.
Одним из объектов изобретения является экспрессионный вектор, содержащий указанный выше полинуклеотид.
Одним из объектов настоящего изобретения является сконструированная иммунная клетка, экспрессирующая на поверхности клеточной мембраны CD33-специфический CAR по одному из указанных выше вариантов осуществления изобретения.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, полученной из воспалительных T-лимфоцитов, цитотоксических T-лимфоцитов, регуляторных T-лимфоцитов или хелперных T-лимфоцитов.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, в которой подавляется экспрессия TCR.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, в которой подавляется экспрессия CD33.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, где указанная сконструированная иммунная клетка модифицирована для приобретения устойчивости по меньшей мере к одному иммуносупрессорному или химиотерапевтическому лекарственному средству.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, которая предназначена для применения в терапии.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, которая предназначена для применения в терапии, где пациент представляет собой человека.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, которая предназначена для применения в терапии, где состояние представляет собой предзлокачественное или злокачественное связанное с раком состояние, отличающееся наличием экспрессирующих CD33 клеток.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, которая предназначена для применения в терапии, где состояние представляет собой состояние, отличающееся избыточным количеством экспрессирующих CD33 клеток.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, которая предназначена для применения в терапии, где состояние представляет собой состояние, связанное с гематологическим раком.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, которая предназначена для применения в терапии, где состояние, связанное с гематологическим раком, представляет собой лейкоз.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанный лейкоз выбран из группы, состоящей из острого миелогенного лейкоза (AML), хронического миелогенного лейкоза, мелодиспластического синдрома, острого лимфоидного лейкоза, хронического лимфоидного лейкоза и миелодиспластического синдрома.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанный лейкоз представляет собой острый миелогенный лейкоз (AML).
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанный гематологический рак представляет собой злокачественное лимфопролиферативное нарушение.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанное лимфопролиферативное нарушение представляет собой лимфому.
Настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, указанной выше, которая предназначена для применения в терапии, где указанная лимфома выбрана из группы, состоящей из множественной миеломы, неходжкинской лимфомы, лимфомы Беркитта и фолликулярной лимфомы (мелкоклеточной и крупноклеточной).
Одним из объектов настоящего изобретения является способ нарушения клетки гематологического рака, заключающийся в том, что приводят в контакт указанную клетку гематологического рака со сконструированной иммунной клеткой, указанной выше, в количестве, эффективном для нарушения указанной раковой клетки.
Одним из объектов настоящего изобретения является способ создания иммунной клетки, заключающийся в том, что:
(а) получают иммунную клетку,
(б) осуществляют экспрессию на поверхности указанной клетки по меньшей мере одного CD33-специфического химерного антигенного рецептора, указанного выше.
В настоящем изобретении предложен способ создания описанной выше иммунной клетки, заключающийся в том, что:
(а) получают иммунную клетку,
(б) интродуцируют в указанную клетку по меньшей мере один полинуклеотид, который кодирует указанный CD33-специфический химерный антигенный рецептор, указанный выше,
(в) осуществляют экспрессию указанного полинуклеотида в клетке, необязательно экспрессирующей указанный CD33-специфический химерный антигенный рецептор.
В настоящем изобретении предложен способ создания описанной выше иммунной клетки, дополнительно заключающийся в том, что:
(г) ингибируют экспрессию TRC и/или экспрессию CD33.
В одном из вариантов осуществления изобретения иммунная клетка, полученная на стадии (а) описанного выше способа, представляет собой иммунную клетку, в которой ингибируют экспрессию TRC и/или CD33 на клеточной поверхности, и которая необязательно обладает устойчивостью по меньшей мере к одному лекарственному средству, применяемому для лечения рака, прежде всего AML.
В настоящем изобретении предложен способ создания описанной выше иммунной клетки, дополнительно заключающийся в том, что:
(а) интродуцируют по меньшей мере один другой химерный антигенный рецептор, который не является специфическим в отношении CD33.
В настоящем изобретении предложен также способ лечения индивидуума, который нуждается в этом, заключающийся в том, что:
(а) получают иммунную клетку, экспрессирующую на поверхности CD33-специфический химерный антигенный рецептор по одному из указанных выше пунктов;
(б) вводят указанные иммунные клетки указанному пациенту.
Одним из объектов настоящего изобретения является указанный выше способ, в котором указанную иммунную клетку получают из донора.
В настоящем изобретении предложен способ лечения указанного выше индивидуума, нуждающегося в этом, заключающийся в том, что получают указанную иммунную клетку (подлежащую конструированию согласно изобретению) из организма самого пациента.
CD33-специфические химерные антигенные рецепторы
Настоящее изобретение относится к новым конструкциям анти-CD33 химерного антигенного рецептора (CAR или CD33 CAR или CD33-специфический CAR или анти-CD33 CAR), которые содержат внеклеточный лигандсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен трансдукции сигнала.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому CD33-специфическому CAR, который содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CD33, шарнирную область, выбранную из шарнира FcRIIIα, шарнира CD8α и шарнира IgG1, трансмембранный домен CD8α и цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.
V
V
L
H
L
H
Понятие «внеклеточный лигандсвязывающий домен» в контексте настоящего описания обозначает олиго- или полипептид, обладающий способностью связываться с лигандом. Предпочтительно домен должен обладать способностью взаимодействовать с молекулой клеточной поверхности. Например, можно выбирать внеклеточный лигандсвязывающий домен, позволяющий распознавать лиганд, который функционирует в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, ассоциированных с конкретным болезненным состоянием. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный внеклеточный лигандсвязывающий домен содержит одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), содержащий вариабельный фрагмент легкой () и тяжелой () цепи специфического в отношении антигена-мишени моноклонального антитела к CD33, соединенные гибким линкером. Указанные V и V выбирают из антител, обозначенных как М195, m2H12, DRB2 и Му9-6 в таблице 2.
L
H
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные V и V содержат SEQ ID NO: 17 и 18, необязательно гуманизированные.
Они предпочтительно соединены друг с другом с помощью гибкого линкера, содержащего, например, последовательность SEQ ID NO: 10. Другими словами, указанные CAR предпочтительно содержат внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 11 - SEQ ID NO: 18.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный CAR, предлагаемый в изобретении, предпочтительно содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептид, имеющий SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный CAR, предлагаемый в изобретении, предпочтительно содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептид, имеющий SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный CAR, предлагаемый в изобретении, предпочтительно содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептид, имеющий SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный CAR, предлагаемый в изобретении, предпочтительно содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептид, имеющий SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
В контексте настоящего описания понятие «рекомбинантное антитело» означает антитело или фрагмент антитела, созданное/созданный с помощью технологии рекомбинантной ДНК, такое, например, как антитело или фрагмент антитела, экспрессируемое/экспрессируемый бактериофагом, системой экспрессии дрожжей или системой экспрессии клеток млекопитающих. Подразумевается также, что понятие относится к антителу или фрагменту антитела, созданному с помощью синтеза молекулы ДНК, которая кодирует антитело или фрагмент антитела, и эта молекула ДНК экспрессирует белок антитела или фрагмента антитела или аминокислотную последовательность, специфическую для антитела или фрагмента антитела, при этом ДНК или аминокислотную последовательность получали с использованием технологии получения рекомбинантной или синтетической ДНК, или аминокислотной последовательности, которая доступна и хорошо известна в данной области.
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие «консервативные модификации последовательности» или «гуманизация» относится к модификациям аминокислот, которые существенно не влияют или не изменяют характеристики связывания CAR (по сравнению с характеристиками CAR, сконструированного с использованием исходного антитела к CD33) и/или которые не оказывают существенного влияния на активность CAR, содержащего модифицированную аминокислотную последовательность, и снижают или аннулируют ответ в виде человеческого антимышиного антитела (НАМА). Указанные консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции в указанном фрагменте антитела в указанном CAR и/или в любых других частях указанной молекулы CAR. Модификации можно интродуцировать в антитело, во фрагмент антитела или в любую из других частей молекулы CAR, предлагаемой в изобретении, с помощью стандартных технологий, известных в данной области, таких как сайтнаправленный мутагенез, опосредуемый ПЦР мутагенез, или путем применения оптимизированных последовательностей зародышевых линий. Таким образом, в настоящем изобретении предложен (гуманизированный) CD33 CAR, в котором последовательность VH идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 17, а последовательность VL идентична по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 18.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный CAR, предлагаемый в изобретении, предпочтительно содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный CAR, предлагаемый в изобретении, предпочтительно содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный CAR, предлагаемый в изобретении, предпочтительно содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный CAR, предлагаемый в изобретении, предпочтительно содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, известны в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с  боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фениланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в CAR, предлагаемом в изобретении, можно заменять на другие аминокислотные остатки из того же семейства боковых цепей и измененный CAR можно тестировать в отношении способности связывать CD33, используя функциональные анализы, представленные в настоящем описании.
Домен трансдукции сигнала или внутриклеточный сигнальный домен CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, ответствен за внутриклеточную передачу сигнала после связывания внеклеточного лигандсвязывающего домена с мишенью, приводя к активации иммунной клетки и иммунному ответу. Другими словами, домен трансдукции сигнала ответствен за активацию по меньшей мере одной из обычных эффекторных функций иммунной клетки, в которой экспрессируется CAR. Например, эффекторная функция T-клетки может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, включая секрецию цитокинов. Таким образом, понятие «домен трансдукции сигнала» относится к участку белка, который трансдуцирует сигнал эффекторной сигнальной функции и побуждает клетку осуществлять специализированную функцию.
Предпочтительными примерами домена трансдукции сигнала, которые можно применять в CAR, могут являться цитоплазматические последовательности T-клеточного рецептора и корецепторов, совместное действие которых состоит в инициации трансдукции сигнала после контакта с рецептором антигена, а также любое производное или любой вариант указанных последовательностей и любой синтетической последовательности, которая имеет такую же функциональную способность. Домен трансдукции сигнала содержит два различных класса цитоплазматических сигнальных последовательностей, те, которые инициируют антигензависимую первичную активацию, и те, которые действуют независимым от антигена образом, обеспечивая вторичный или костимуляторный сигнал. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность может содержать сигнальные мотивы, известные как мотивы активации иммунных рецепторов на основе тирозина, ITAM. ITAM представляют собой хорошо известные сигнальные мотивы, присутствующие во внутрицитоплазматическом «хвосте» различных рецепторов, которые служат в качестве сайтов связывания для класса syk/zap70 тирозинкиназ. Примерами ITAM, применяемых согласно изобретению, могут служить (но, не ограничиваясь только ими) ITAM, происходящие из TCRдзета, FcRгамма, FcRбета, FcRэпсилон, CD3гамма, CD3дельта, CD3эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В предпочтительном варианте осуществления изобретения домен трансдукции сигнала CAR может содержать происходящий из CD3дзета сигнальный домен, который имеет аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%-99% или 100% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 9.
В конкретном варианте осуществления изобретения домен трансдукции сигнала CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит костимуляторную сигнальную молекулу. Костимуляторная молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от антигенного рецептора или его лигандов, которая требуется для эффективного иммунного ответа. Понятие «костимуляторный лиганд» относится к молекуле на антигенпрезентирующей клетке, которая специфически связывается с когнатной костимуляторной молекулой на T-клетке, создавая тем самым сигнал, который, в дополнение к первичному сигналу, создаваемому, например, при связывании комплекса TCR/CD3 с молекулой ГКГС, загруженной пептидом, опосредует T-клеточный ответ, включая (но, не ограничиваясь только ими) активацию пролиферации, дифференцировку и т.п. Костимуляторный лиганд может включать (но, не ограничиваясь только ими) CD7, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, индуцибельный костимуляторный лиганд (ICOS-L), молекулу межклеточной адгезии (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, М1СВ, HVEM, рецептор лимфотоксина бета, 3/TR6, ILT3, ILT4, агонист или антитело, который/которое связывается с лигандом Толл-рецептора, и лиганд, который специфически связывается с В7-Н3. Под понятие «костимуляторный лиганд» подпадает, среди прочего, антитело, которое специфически связывается с костимуляторной молекулой, присутствующей на T-клетке, такой как (но, не ограничиваясь только ими) CD27, CD28, 4-1ВВ, ОХ40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, антиген-1, ассоциированный с функцией лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, В7-Н3, лиганд, специфически связывающийся с CD83. Понятие «костимуляторная молекула» относится к когнатному связывающему партнеру, присутствующему на T-клетке, который специфически связывается с костимуляторным лигандом, опосредуя тем самым костимуляторный ответ клетки, такой как (но, не ограничиваясь только им) пролиферация. Костимуляторные молекулы включают (но, не ограничиваясь только ими) молекулу ГКГС класса I, BTLA и лиганд Толл-рецептора. Примерами костимуляторных молекул являются CD27, CD28, CD8, 4-1ВВ (CD137), ОХ40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, антиген-1, ассоциированный с функцией лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, В7-Н3 и лиганд, специфически связывающийся с CD83, и т.п.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения домен трансдукции сигнала CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит часть костимуляторной сигнальной молекулы, выбранной из группы, состоящей из фрагмента 4-1ВВ (GenBank: ААА53133.) и CD28 (NP_006130.1). В частности, домен трансдукции сигнала CAR, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8.
CAR, предлагаемый в настоящем изобретении, экспрессируется на поверхности клеточной мембраны. Таким образом, CAR содержит также трансмембранный домен. Отличительными особенностями соответствующих трансмембранных доменов являются способность экспрессироваться на поверхности клетки, согласно настоящему изобретению предпочтительно на поверхности иммунной клетки, прежде всего лимфоцитов или естественных клеток-киллеров (NK), и взаимодействовать друг с другом, направляя клеточный ответ иммунной клетки на заранее определенную клетку-мишень. Трансмембранный домен можно получать как из встречающегося в естественных условиях, так и синтетического источника. Трансмембранный домен можно получать из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка. Примерами трансмембранных полипептидов могут служить (но, не ограничиваясь только ими) субъединица T-клеточного рецептора, такая как α-, β-, γ- или δ-субъединица, полипептид, образующий комплекс с CD3, р55 (α-цепь), р75 (β-цепь) или γ-цепь рецептора IL2, цепь субъединицы Fc-рецепторов, в частности, Fcγ-рецептора III, или CD-белки. Альтернативно этому, трансмембранный домен может быть синтетическим, и он может содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный трансмембранный домен получают из альфа-цепи человеческого CD8 (например, NP_001139345.1). Трансмембранный домен может содержать также шарнирную область между указанным внеклеточным лигандсвязывающим доменом и указанным трансмембранным доменом. В контексте настоящего описания понятие «шарнирная область», как правило, обозначает любой олиго- или полипептид, функция которого заключается в сцеплении трансмембранного домена с внеклеточным лигандсвязывающим доменом. В частности, шарнирную область используют для обеспечения большей гибкости и доступности внеклеточного лигандсвязывающего домена. Шарнирная область может содержать вплоть до 300 аминокислот, предпочтительно от 10 до 100 аминокислот, и наиболее предпочтительно от 25 до 50 аминокислот. Шарнирную область можно получать из полных встречающихся в естественных условиях молекул, или их частей, таких как полная внеклеточная область CD8, CD4 или CD28, или ее часть, или полная константная область антитела или ее часть. Альтернативно этому, шарнирная область может представлять собой синтетическую последовательность, которая соответствует встречающейся в естественных условиях шарнирной последовательности, или может представлять собой полностью синтетическую шарнирную последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная шарнирная область представляет собой часть альфа-цепи человеческого CD8, FcγRIIIα-рецептора или IgG1 соответственно, которые обозначены в настоящем описании как SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, или шарнирные полипептиды, последовательности которых идентичны предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% последовательностям указанных полипептидов.
CAR, предлагаемый в изобретении, как правило, дополнительно содержит трансмембранный домен (ТМ), более конкретно выбранный из CD8α и 4-1ВВ, который идентичен полипептидам, имеющим SEQ ID NO: 6 или 7.
CAR, предлагаемый в изобретении, как правило, содержит трансмембранный домен (ТМ) из CD8α, идентичный на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 6. В предпочтительном варианте осуществления изобретения CAR, предлагаемый в изобретении, как правило, содержит трансмембранный домен (ТМ) из CD8α, идентичный на 100% полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 6.
В раковых клетках часто имеет место понижающая регуляция или мутация антигенов-мишеней, что приводит к появлению так называемых вариантов «потерянных антигенов» (антигенов, ускользающих от иммунологического надзора). Таким образом, для того, чтобы противостоять ускользанию опухоли от иммунологического надзора и придавать иммунной клетке большую специфичность в отношении мишени, CD33-специфический CAR, предлагаемый в изобретении, может содержать другие внеклеточные лигандсвязывающие домены, предназначенные для одновременного связывания с другими элементами на мишени и усиления тем самым активации и функции иммунной клетки. В одном из вариантов осуществления изобретения внеклеточные лигандсвязывающие домены можно размещать тандемно на одном и том же трансмембранном полипептиде и их необязательно можно отделять друг от друга с помощью линкера. В другом варианте осуществления изобретения указанные другие внеклеточные лигандсвязывающие домены можно размещать на различных трансмембранных полипептидах, из которых состоит CAR. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к популяции CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. В частности, настоящее изобретение относится к способу создания иммунных клеток, заключающемуся в том, что получают иммунную клетку и экспрессируют на поверхности указанной клетки популяцию CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. Другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу создания иммунной клетки, заключающемуся в том, что получают иммунную клетку и интродуцируют в указанную клетку полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, из которых состоит популяция CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. Под популяцией CAR подразумевают по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть или большее количество CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. Согласно настоящему изобретению различные внеклеточные лигандсвязывающие домены, предлагаемые в настоящем изобретении, предпочтительно могут связываться одновременно с различными элементами на мишени, усиливая тем самым активацию и функцию иммунной клетки. Настоящее изобретение относится также к выделенной иммунной клетке, которая содержит популяцию CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, который имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1-V6, которые проиллюстрированы на фиг. 2, где структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CD33, шарнирную область, выбранную из шарнира FcRIIIα, шарнира CD8α и шарнира IgG1, трансмембранный домен CD8α и цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, который имеет одну из полипептидных структур, выбранную из V1, V3 и V5, которые проиллюстрированы на фиг. 2, где структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CD33, шарнирную область, выбранную из шарнира FcRIIIα и шарнира CD8альфа (α), трансмембранный домен CD8α и цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.
В настоящем изобретении предложен CD33 CAR, который содержит полипептидную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65? SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, предпочтительно указанный CAR содержит полипептидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, и наиболее предпочтительно указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, и еще более предпочтительно указанный CAR предпочтительно содержит полипептид, имеющий SEQ ID NO: 68.
В настоящем изобретении предложен также:
- CD33-специфический химерный антигенный рецептор (CAR), который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70,
более предпочтительно CAR, который содержит полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70,
еще более предпочтительно CAR, которые содержат полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70.
Предпочтительно в настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, который имеет структуру V1, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CD33, шарнирную область FcRIIIα, трансмембранный домен CD8α и цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.
Предпочтительно в настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, имеющий структуру V1, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CD33, которое выбрано из М195, m2h12 и Му9.6, необязательно гуманизированного, шарнирную область FcRIIIα, трансмембранный домен CD8α и цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.
Более предпочтительно, в настоящем изобретении предложен CD33-специфический химерный антигенный рецептор (CAR), имеющий структуру V1, которая проиллюстрирована на фиг. 2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 66, более предпочтительно указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 66.
Предпочтительно в настоящем изобретении предложен CD33-специфический химерный антигенный рецептор (CAR), имеющий структуру V3, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CD33, шарнир CD8α, трансмембранный домен CD8α и цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.
Предпочтительно в настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, имеющий структуру V3, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CD33, которое выбрано из М195, m2h12, DRB2 и Му9.6, необязательно гуманизированного, шарнир FcRIIIα, трансмембранный домен CD8α и цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.
Более предпочтительно, в настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, имеющий структуру V3, которая проиллюстрирована на фиг. 2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 68, более предпочтительно указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 68.
Предпочтительно в настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, имеющий структуру V5, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CD33, шарнир IgG1, трансмембранный домен CD8α и цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.
Предпочтительно в настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, имеющий структуру V5, которая проиллюстрирована на фиг. 2, где указанная структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CD33, которое выбрано из M195, m2h12, DRB2 и Му9.6, необязательно гуманизированного, шарнир FcRIIIα, трансмембранный домен CD8α и цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.
Более предпочтительно, в настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, имеющий структуру V5, которая проиллюстрирована на фиг. 2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 70, более предпочтительно указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 70.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является CD33-специфический химерный антигенсвязывающий рецептор, который содержит:
- необязательный сигнальный пептид, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 1 или 2. Предпочтительно необязательный сигнальный пептид имеет аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 1. Предпочтительно сигнальный пептид присутствует;
- VH-домен, отделенный от VL-домена линкером, указанные VH и VL принимают участие в связывании с CD33;
- шарнир, происходящий из Fcгамма (γ) RIIIальфа (α), имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 3;
- трансмембранный домен, происходящий из CD8альфа (α), имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 6;
- костимуляторную сигнальную молекулу, происходящую из 4-1ВВ, имеющую аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8;
- внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный домен CD3дзета, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 9.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является CD33-специфический химерный антигенсвязывающий рецептор, который содержит:
- необязательный сигнальный пептид, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 1 или 2. Предпочтительно необязательный сигнальный пептид имеет аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 1. Предпочтительно сигнальный пептид присутствует;
- VH-домен, отделенный от VL-домена линкером, указанные VH и VL принимают участие в связывании с CD33;
- шарнир, происходящий из Fсгамма (γ) RIIIальфа (α), имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 3;
- трансмембранный домен (ТМ), происходящий из 4-1ВВ, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 7;
- костимуляторную сигнальную молекулу, происходящую из 4-1ВВ, имеющую аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8;
- внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный домен CD3дзета, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 9.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является CD33-специфический химерный антигенсвязывающий рецептор, который содержит:
- необязательный сигнальный пептид, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 1 или 2. Предпочтительно необязательный сигнальный пептид имеет аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 1. Предпочтительно сигнальный пептид присутствует;
- VH-домен, отделенный от VL-домена линкером, указанные VH и VL принимают участие в связывании с CD33;
- шарнир, происходящий из альфа-цепи CD8, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 4;
- трансмембранный домен, происходящий из CD8альфа (α), имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 6;
- костимуляторную сигнальную молекулу, происходящую из 4-1ВВ, имеющую аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8;
- внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный домен CD3дзета, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 9.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является CD33-специфический химерный антигенсвязывающий рецептор, который содержит:
- необязательный сигнальный пептид, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 1 или 2. Предпочтительно необязательный сигнальный пептид имеет аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 1. Предпочтительно сигнальный пептид присутствует;
- VH-домен, отделенный от VL-домена линкером, указанные VH и VL принимают участие в связывании с CD33;
- шарнир, происходящий из альфа-цепи CD8, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 4;
- трансмембранный домен (ТМ), происходящий из 4-1ВВ, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 7;
- костимуляторную сигнальную молекулу, происходящую из 4-1ВВ, имеющую аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8;
- внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный домен CD3дзета, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 9.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является CD33-специфический химерный антигенсвязывающий рецептор, который содержит:
- необязательный сигнальный пептид, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 1 или 2. Предпочтительно необязательный сигнальный пептид имеет аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 1. Предпочтительно сигнальный пептид присутствует;
- VH-домен, отделенный от VL-домена линкером, указанные VH и VL принимают участие в связывании с CD33;
- шарнир, происходящий из IgG1, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 5;
- трансмембранный домен, происходящий из CD8альфа (α), имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 6;
- костимуляторную сигнальную молекулу, происходящую из 4-1ВВ, имеющую аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8;
- внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный домен CD3дзета, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 9.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является CD33-специфический химерный антигенсвязывающий рецептор, который содержит:
- необязательный сигнальный пептид, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 1 или 2. Предпочтительно необязательный сигнальный пептид имеет аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 1. Предпочтительно сигнальный пептид присутствует;
- VH-домен, отделенный от VL-домена линкером, указанные VH и VL принимают участие в связывании с CD33;
- шарнир, происходящий из IgG1, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 5;
- трансмембранный домен (ТМ), происходящий из 4-1ВВ, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 7;
- костимуляторную сигнальную молекулу, происходящую из 4-1ВВ, имеющую аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 8;
- внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальный домен CD3дзета, имеющий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 97%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 9.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является по меньшей мере один из следующих CD33-специфических CAR, который имеет указанные ниже последовательности - или 80% указанных ниже последовательностей:
М195-1
М195-2
М195-3
М195-4
М195-5
М195-6
m2H12-l
m2H12-2
m2H12-3
m2H12-4
m2H12-5
m2H12-6
DRB2-1
DRB2-2
DRB2-3
DRB2-4
DRB2-5
DRB2-6
My9.6-1
My9.6-2
My9.6-3
My9.6-4
My9.6-5
My9.6-6
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения являются первичные T-клетки, наделенные (снабженные) по меньшей мере одним из указанных CD33-специфических CAR.
Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является CD33-специфический химерный антигенный рецептор (CAR), последовательность которого по меньшей мере на 80% соответствует последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 48-71, более предпочтительно по меньшей мере на 80% соответствует SEQ ID NO: 68,
и еще более предпочтительно указанные CAR предпочтительно содержат полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68.
Согласно этому варианту осуществления изобретения указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 81% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 82% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 83% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 84% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 85% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 86% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 87% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 88% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 89% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 90% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 91% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 92% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 93% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 94% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 95% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 96% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 97% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 98% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68,
указанный CAR предпочтительно содержит полипептидную последовательность, которая на 99% идентична аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения указанный CAR идентичен на 100% аминокислотным последовательностям, включающим SEQ ID NO: 68.
Настоящее изобретение относится к CAR, которые обладают указанным в настоящем описании процентом идентичности (от 80% до 99%) с любой из последовательностей от SEQ ID NO: 48 до SEQ ID NO: 71.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, который содержит
(а) внеклеточный лигандсвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CD33, необязательно гуманизированного,
(б) шарнир CD8α,
(в) трансмембранный домен CD8α и
(г) цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.
В настоящем изобретении предложен CD33-специфический CAR, который содержит
(а) внеклеточный лигандсвязывающий домен, содержащий VH и VL из моноклонального антитела к CD33, необязательно гуманизированного,
(б) шарнир FcγRIIIα,
(в) трансмембранный домен CD8α и
(г) цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ.
Полинуклеотиды, векторы:
Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, векторам, кодирующим любой из описанных выше CAR, предлагаемых в изобретении.
Настоящее изобретение относится также к полинуклеотиду, который кодирует анти-CD33 CAR, предлагаемый в изобретении, вектору, предпочтительно лентивирусному вектору, который содержит по меньшей мере один из указанных полинуклеотидов, кодирующих анти-CD33 CAR, предлагаемый в изобретении.
Полинуклеотид может содержаться в кассете экспрессии или экспрессионном векторе (например, в плазмиде, предназначенной для интродукции в бактериальную клетку-хозяина, или вирусном векторе, таком как бакуловирусный вектор, предназначенный для трансфекции клетки насекомого-хозяина, или плазмидном или вирусном векторе, таком как лентивирус, предназначенном для трансфекции клетки млекопитающего-хозяина).
В конкретном варианте осуществления изобретения можно включать различные нуклеотидные последовательности в один полинуклеотид или вектор, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую рибосомальную skip-последовательность, такую как последовательность, кодирующую пептид 2А. Пептиды 2А, которые были идентифицированы в подгруппе афтовирусов группы пикорнавирусов, приводят к рибосомальному «перескоку» (skip) от одного кодона к следующему без образования пептидной связи между двумя аминокислотами, кодируемыми кодонами (см. Donnelly и Elliott, 2001; Atkins, Wills и др., 2007; Doronina, Wu и др., 2008). Под «кодоном» понимают три нуклеотида на мРНК (или на смысловой цепи молекулы ДНК), которые транслируются рибосомой в один аминокислотный остаток. Таким образом, можно синтезировать два полипептида из одной непрерывной рамки считывания в мРНК, если полипептиды разделены последовательностью олигопептида 2А, присутствующей в рамке считывания. Такие рибосомальные skip-механизмы хорошо известны в данной области и известно их применение в нескольких векторах для экспрессии нескольких белков, кодируемых одной матричной РНК.
Для направления трансмембранного полипептида в секреторный путь клетки-хозяина, в последовательность полинуклеотида или в последовательность вектора помещают секреторную сигнальную последовательность (известную также как лидерная последовательность, пре-про-последовательность или пре-последовательность). Секреторную сигнальную последовательность функционально связывают с трансмембранной нуклеотидной последовательностью, т.е. две последовательности соединяют в правильной рамке считывания и размещают так, чтобы направлять новый синтезированный полипептид в секреторный путь клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности, как правило, размещают в 5'-направлении относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые секреторные сигнальные последовательности можно размещать и в другом месте представляющей интерес нуклеотидной последовательности (см., например, Welch и др., US №5037743; Holland и др., US №5143830). В предпочтительном варианте осуществления изобретения сигнальный пептид содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 и 2.
Специалистам в данной области должно быть очевидно, что с учетом вырожденности генетического кода могут иметь место значительные вариации последовательности указанных полинуклеотидных молекул. Предпочтительно нуклеотидные последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют оптимизированные кодоны для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно для экспрессии в человеческих клетках. Оптимизация кодонов относится к замене в представляющей интерес последовательности кодонов, встречающихся относительно редко в генах с высоким уровнем экспрессии, на кодоны, которые, как правило, часто встречаются в генах с высоким уровнем экспрессии в указанных видах, такие кодоны кодируют те же аминокислоты, что и подлежащие замене кодоны.
Методы конструирования иммунных клеток, наделенных CAR:
В настоящем изобретении предложен способ получения иммунных клеток для иммунотерапии, заключающийся в том, что интродуцируют ex vivo в указанные иммунные клетки полинуклеотиды или векторы, кодирующие один из описанных ранее CD33-специфических CAR.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные полинуклеотиды включают в лентивирусные векторы, принимая во внимание, что они стабильно экспрессируются в клетках.
В других вариантах осуществления изобретения указанный способ дополнительно включает стадию, на которой генетически модифицируют указанную клетку, делая ее пригодной для аллогенной трансплантации.
Согласно первому объекту изобретения иммунную клетку можно делать менее аллогенной, например, путем инактивации по меньшей мере одного гена, экспрессирующего один или несколько компонентов T-клеточного рецептора (TCR), согласно методу, описанному в WO 2013/176915, что можно объединять с инактивацией гена, кодирующего или регулирующего экспрессию белка HLA или β2m. Таким образом, существенно снижают риск возникновения реакции «трансплантат-против-хозяина» и отторжение трансплантата.
Согласно другому объекту изобретения инактивируют по меньшей мере один ген, обеспечивающий экспрессию одного или нескольких компонентов CD33, в содержащих CD33-специфический CAR иммунных клетках, предлагаемых в изобретении. Ингибирование экспрессии CD33 на поверхности клеток, экспрессирующих анти-CD33 CAR, является частью способа получения экспрессирующих анти-CD33 CAR иммунных клеток, предлагаемых в изобретении.
Общий метод описан в WO 2013/176915. Инактивацию гена CD33 можно объединять с активацией /или инактивацией гена, кодирующего или регулирующего экспрессию CD33, такого как связывающие сиаловую кислоту Ig-подобные лектины (Cao Н., Crocker P.R. Evolution of CD33-related siglecs: regulating host immune functions and escaping pathogen exploitation? Immunology, 132(1), январь 2011 г., cc. 18-26), в результате чего экспрессия CD33 на поверхности иммунных клеток, экспрессирующих анти-CD33 CAR, ингибируется и, как следствие, не изменяет выживаемость или не ингибирует активность экспрессирующих анти-CD33 CAR соседних клеток.
Согласно другому объекту изобретения иммунные клетки можно дополнительно подвергать генетической инженерии для повышения их устойчивости к обработкам иммуносупрессорными лекарственными средствами или химиотерапевтическими средствами, которые применяют в качества стандартной медицинской помощи в случае CD33-позитивных злокачественных клеток. Например, CD52 и глюкортикоидные рецепторы (GR), которые являются мишенями лекарственных средств при лечении алемтузумабом и глюкокортикоидами, можно инактивировать, придавая клеткам устойчивость к указанным обработкам и давая конкурентное преимущество по сравнению с собственными T-клетками пациента, не наделенными CD33-специфическими CAR. Можно также подавлять или снижать экспрессию гена CD3, придавая устойчивость к теплизумабу, который представляет собой другое иммуносупрессорное средство. Согласно изобретению можно также подавлять или снижать экспрессию HPRT, придавая устойчивость к 6-тиогуанину, цитостатическому агенту, обычно применяемому для химиотерапии, прежде всего для лечения острого лимфобластного лейкоза. Можно снижать экспрессию гена «GLI1».
Согласно другому объекту изобретения на иммунные клетки можно дополнительно оказывать воздействие, делая их более активными или ограничивая их истощение, путем инактивации генов, кодирующих белки, которые действуют в качестве «иммунных контрольных точек (чекпойнтов)», такие как регуляторы T-клеточной активации PDCD1 или CTLA-4. Примеры генов, экспрессию которых можно снижать или подавлять, представлены в таблице 9.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный способ дополнительного конструирования иммунных клеток включает интродукцию в указанные T-клетки полинуклеотидов, прежде всего мРНК, кодирующих специфическую редко расщепляющую эндонуклеазу, обладающую способностью осуществлять избирательную инактивацию указанных выше генов путем расщепления ДНК. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные редко расщепляющие эндонуклеазы представляют собой TALE-нуклеазы или эндонуклеазу Cas9. К настоящему времени доказано, что TAL-нуклеазы обладают более высокой специфичностью и эффективностью расщепления по сравнению с другими типами редко расщепляющих эндонуклеаз, поэтому их выбирают в качестве эндонуклеаз для получения сконструированных иммунных клеток при крупномасштабном производстве с постоянным циклом.
Методы доставки
Различные методы, описанные выше, предполагают интродукцию CAR в клетку. Например (но, не ограничиваясь только этим), указанный CAR можно интродуцировать в виде трансгенов, кодируемых одним плазмидным вектором. Указанный плазмидный вектор может содержать также селектируемый маркер, обеспечивающий идентификацию и/или отбор клеток, в которые встроен указанный вектор.
Полипептиды можно синтезировать in situ в клетке в результате интродукции в клетку полинуклеотидов, кодирующих указанные полипептиды. Альтернативно этому, указанные полипептиды можно получать вне клетки и затем интродуцировать в нее. Методы интродукции полинуклеотидных конструкций в клетки известны в данной области и их примерами являются (но, не ограничиваясь только ими) методы стабильной трансформации, в которых полинуклеотидную конструкцию интегрируют в геном клетки, методы кратковременной трансформации, в которых полинуклеотидную конструкцию не интегрируют в геном клетки, и методы, основанные на использовании вирусов. Указанные полинуклеотиды можно интродуцировать в клетку, например, с использованием рекомбинантных вирусных векторов (например, ретровирусов, аденовирусов), липосом и т.п. Например, методы кратковременной трансформации включают микроинъекцию, электропорацию или бомбардировку частицами. Указанные полинуклеотиды можно включать в векторы, более конкретно, в плазмиды или вирусы, с целью экспрессии в клетках.
Сконструированные иммунные клетки
Настоящее изобретение относится также к выделенным клеткам или клеточным линиям, которые можно получать указанным способом создания клеток. В частности, указанная выделенная клетка содержит по меньшей мере один описанный выше CAR. В другом варианте осуществления изобретения указанная выделенная клетка содержит популяцию CAR, каждый из которых содержит различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. В частности, указанная выделенная клетка содержит экзогенную полинуклеотидную последовательность, кодирующую CAR. Активация и пролиферация генетически модифицированных иммунных клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, происходит независимо от механизмов связывания с антигеном.
+
+
+
Под объем настоящего изобретения подпадает также выделенная иммунная клетка, предпочтительно T-клетка, полученная с помощью одного из описанных ранее методов. Указанная иммунная клетка представляет собой клетку, происходящую из гематопоэтической клетки, функционально участвующую в инициации и/или реализации врожденного или адаптивного иммунного ответа. Указанную иммунную клетку, предлагаемую в настоящем изобретении, можно получать из стволовой клетки. Стволовые клетки могут представлять собой зрелые стволовые клетки, нечеловеческие эмбриональные стволовые клетки, более предпочтительно нечеловеческие стволовые клетки, стволовые клетки из пуповинной крови, клетки-предшественники, стволовые клетки костного мозга, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, тотипотентные стволовые клетки или гематопоэтические стволовые клетки. Репрезентативными человеческими клетками являются CD34-клетки. Указанная выделенная клетка может представлять собой также дендритную клетку, дендритную киллерную клетку, тучную клетку, NK-клетку, B-клетку или T-клетку, выбранную из группы, состоящей из воспалительных T-лимфоцитов, цитотоксических T-лимфоцитов, регуляторных T-лимфоцитов или хелперных T-лимфоцитов. В другом варианте осуществления изобретения указанная клетка может иметь происхождение из группы, состоящей из CD4-T-лимфоцитов и CD8-T-лимфоцитов. Перед осуществлением размножения и генетической модификации клеток, предлагаемых в изобретении, из организма индивидуума можно получать источник клеток с помощью различных методов, не ограничивающих объем изобретения. Клетки можно получать из многочисленных источников, включая (но, не ограничиваясь только ими) мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из инфицированной области, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно применять любое количество T-клеточных линий, доступных и известных специалистам в данной области. В другом варианте осуществления изобретения указанную клетку можно получать из организма здорового донора, пациента, у которого диагностирован рак, или пациента, у которого диагностирована инфекция. В другом варианте осуществления изобретения указанная клетка представляет собой часть смешанной популяции клеток, обладающих различными фенотипическими характеристиками. Под объем настоящего изобретения подпадает также клеточная линия, полученная из T-клетки, трансформированной согласно ранее описанному методу. Под объем настоящего изобретения подпадают модифицированные клетки, полученные с помощью ранее описанного метода, которые являются устойчивыми или чувствительными к иммуносупрессорной обработке.
Предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются T-клетки или популяция T-клеток, наделенных CD33 CAR, описанные выше, которые не экспрессируют функциональный TCR и которые обладают реактивностью в отношении CD33-позитивных клеток, предназначенные для их аллогенной трансплантации пациентам.
Более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения являются сконструированные иммунные клетки, предлагаемые в изобретении, включающие T-клетки или популяцию T-клеток, наделенных CD33 CAR, описанные выше, которые не экспрессируют ни функциональный TCR, ни CD33 и которые обладают реактивностью в отношении CD33-позитивных клеток, предназначенные для их аллогенной трансплантации пациентам.
Еще более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения являются сконструированные иммунные клетки, предлагаемые в изобретении, включающие T-клетки или популяцию T-клеток, наделенных CD33 CAR, где указанный CD33 CAR содержит полипептидную структуру, выбранную из V1, V3 и V5, где указанная полипептидная структура содержит внеклеточный лигандсвязывающий домен, который содержит VH и VL из моноклонального антитела к CD33, шарнир, выбранный из шарнира FcRIIIα, шарнира CD8α и шарнира IgG1, трансмембранный домен CD8α и цитоплазматический домен, включающий сигнальный домен CD3дзета и костимуляторный домен из 4-1ВВ. В одном из вариантов осуществления изобретения иммунные клетки, предлагаемые в изобретении, содержат CD33-специфический CAR, который содержит моноклональное антитело к CD33, выбранное из М195, m2h12, DRB2 и Му9.6 или из M195, m2h12 и Му9.6, и необязательно гуманизированное.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный CD33 CAR содержит полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, или содержит полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70.
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения T-клетки, наделенные CD33 CAR, не экспрессируют функциональный TCR и CD33, и указанный CD33 CAR содержит полипептид, имеющий SEQ ID NO: 68, и необязательно является гуманизированным.
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения T-клетки или популяция T-клеток, наделенных CD33 CAR, в частности экспрессирующие анти-CD33 CAR T-клетки, которые не экспрессируют ни функциональный TCR, ни CD33, содержат полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% любой из аминокислотных последовательностей, которые выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, или идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% любой из аминокислотных последовательностей, которые выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, или идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 68.
В еще более предпочтительном указанном варианте осуществления изобретения T-клетки, наделенные CD33 CAR, не экспрессируют функциональный TCR и CD33 и содержат полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% любой из аминокислотных последовательностей, которые выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, или полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% любой из аминокислотных последовательностей, которые выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 68, или полипептидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 68.
Предпочтительно указанная экспрессирующая анти-CD33 CAR T-клетка представляет собой TCRальфа KO (т.е. с «выключенным» TCRальфа) и CD33 KO (т.е. с «выключенным» CD33) T-клетку и обладает устойчивостью по меньшей мере к одному из лекарственных средств, применяемых для лечения AML.
Экспрессирующая анти-CD33 CAR T-клетка, предлагаемая в изобретении, представляет собой выделенные иммунные T-клетки, наделенные анти-CD33 CAR, предпочтительно иммунные T-клетки TCR-альфа KO и/или CD33 KO, наделенные анти-CD33 CAR клетки, и более предпочтительно иммунные T-клетки TCRальфа KO и/или CD33 KO, наделенные анти-CD33 CAR клетки, которые обладают устойчивостью по меньшей мере к одному из лекарственных средств, применяемых для лечения AML. Предпочтительно экспрессирующая анти-CD33 CAR T-клетка, относящаяся к предлагаемым в изобретении T-клеткам, содержит анти-CD33 CAR, который имеет любую из последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 48-SEQ ID NO: 71, более предпочтительно анти-CD33 CAR, который идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 48-SEQ ID NO: 71, и еще более предпочтительно идентичен по меньшей мере на 80% SEQ ID NO: 68. Сконструированная иммунная клетка (или экспрессирующие анти-CD33 CAR T-клетки) согласно изобретению означает любую из сконструированных иммунных клеток, предлагаемых в изобретении, которые описаны выше.
Активация и размножение T-клеток
in vitro
in vivo
Как до, так и после осуществления генетической модификации T-клеток, даже в том случае, если активация и пролиферация генетически модифицированных иммунных клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, не зависит от механизмов связывания с антигеном, иммунные клетки, прежде всего T-клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, можно подвергать дополнительной активации и размножать с помощью методов, описанных, например, в US №№6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7067318; 7172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041 и публикации заявки на патент США №2006/0121005. T-клетки можно размножать  или .
Как правило, T-клетки, предлагаемые в изобретении, размножают путем приведения в контакт с агентом, который стимулирует комплекс CD3 TCR, и костимуляторной молекулой на поверхности T-клеток с целью создания сигнала активации для T-клетки.
Например, для создания сигнала активации для T-клетки можно применять химические соединения, такие как ионофор кальция А23187, форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА), или митогенные лектины, такие как фитогемагглютинин (ФГА).
in vitro
2
Например (но, не ограничиваясь только этим), популяции T-клеток можно стимулировать  путем приведения в контакт с антителом к CD3 или его антигенсвязывающим фрагментом, или антителом к CD2, иммобилизованным на поверхности, или путем приведения в контакт с активатором протеинкиназы С (например, бриостатином) в сочетании с ионофором кальция. Для костимуляции вспомогательной молекулы на поверхности T-клеток используют лиганд, который связывается с вспомогательной молекулой. Например, популяцию T-клеток можно приводить в контакт с антителом к CD3 и антителом к CD28 в условиях, обеспечивающих стимуляцию пролиферации T-клеток. Условия, пригодные для культивирования T-клеток, включают соответствующие среды (например, минимальную поддерживающую среду или среду RPMI 1640, или X-vivo 5, (фирма Lonza)), которые могут содержать факторы, необходимые для обеспечения пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку (например, фетальную бычью сыворотку или человеческую сыворотку), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, -2, 1L-15, TGFp и TNF, или любые другие добавки для роста клеток, известные специалисту в данной области. Другие добавки для роста клеток включают (но, не ограничиваясь только ими) сурфактант, плазманат и восстановители, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут представлять собой RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, а-МЕМ, F-12, Х-Vivo 1 и Х-Vivo 20, Optimizer, содержащие в качестве добавок аминокислоты, пируват натрия и витамины, они могут быть бессывороточными или могут содержать в качестве добавок в определенном количестве сыворотку (или плазму) или определенный набор гормонов, и/или цитокин(ы) в количестве, достаточном для роста и размножения T-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включают только в экспериментальные культуры, но не в культуры клеток, которые предназначены для введения путем инфузии индивидууму. Клетки-мишени поддерживают в условиях, необходимых для поддержания роста, например, при соответствующей температуре (например, при 37°C) и атмосфере (например, в воздухе плюс 5% СО). Клетки, которые подвергали стимуляции в течение различных промежутков времени, могут обладать различными характеристиками.
in vivo
В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанные клетки можно размножать путем совместного культивирования с тканью или клетками. Указанные клетки можно размножать также , например, в крови индивидуума после введения указанной клетки индивидууму.
Терапевтические применения
В другом варианте осуществления изобретения выделенные клетки, полученные различными методами, или клеточную линию, полученную из указанной выделенной клетки, согласно описанному ранее методу, можно применять в качестве лекарственного средства. В другом варианте осуществления изобретения указанное лекарственное средство можно применять для лечения рака, прежде всего для лечения B-клеточных лимфом и лейкозов у пациента, нуждающегося в этом. В другом варианте осуществления изобретения указанную выделенную клетку, предлагаемую в изобретении, или клеточную линию, полученную из указанной выделенной клетки, можно применять для изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака у пациента, нуждающегося в этом.
Другой объект настоящего изобретения относится к способам лечения пациентов, нуждающихся в этом, где указанный способ заключается в том, что осуществляют по меньшей мере одну из следующих стадий, на которых:
(а) получают иммунную клетку, которую можно создавать с помощью одного из ранее описанных способов;
(б) вводят указанные трансформированные иммунные клетки указанному пациенту.
in vivo
В одном из вариантов осуществления изобретения указанные T-клетки, предлагаемые в изобретении, можно подвергать интенсивному T-клеточному размножению  и их можно сохранять в течение продолжительного периода времени.
Другим объектом настоящего изобретения являются способы лечения пациентов, которые нуждаются в этом, заключающиеся в том, что осуществляют по меньшей мере одну из следующих стадий:
(а) получают иммунную клетку, которую можно создавать с помощью одного из ранее описанных способов, предлагаемых в изобретении, которые предназначены для получения экспрессирующей анти-CD33 CAR иммунной клетки (или любой сконструированной иммунной клетки, предлагаемой в изобретении),
in vivo
(б) вводят указанные экспрессирующие анти-CD33 CAR иммунные клетки указанному пациенту; необязательно указанную CD33 CAR T-клетку, предлагаемую в изобретении, можно подвергать интенсивному T-клеточному размножению  и их можно сохранять в течение продолжительного периода времени, в частности, они могут связываться с CD33 в течение продолжительного периода времени.
Указанное лечение может быть облегчающим, терапевтическим или профилактическим. Оно может представлять собой либо составную часть аутологичного иммунотерапевтического лечения, либо составную часть аллогенного иммунотерапевтического лечения. Понятие «аутологичный» означает, что клетки, клеточная линия или популяция клеток, применяемые для лечения пациентов, получают из организма указанного пациента или из организма совместимого по человеческому лейкоцитарному антигену (HLA) донора. Понятие «аллогенный» означает, что клетки или популяция клеток, применяемые для лечения пациентов, не получают из организма указанного пациента, но получают из организма донора.
Одним из вариантов осуществления изобретения является экспрессирующая анти-CD33 CAR T-клетка, предлагаемая в изобретении, которая предназначена для применения в качестве лекарственного средства.
Конкретным вариантом осуществления изобретения является экспрессирующая анти-CD33 CAR T-клетка, предлагаемая в изобретении, которая предназначена для применения в качестве лекарственного средства, содержащая полипептид, выбранный из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, и более предпочтительно полипептид, идентичный по меньшей мере на 80% полипептиду, выбранному из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38.
Еще более предпочтительно указанная экспрессирующая указанный анти-CD33 CAR T-клетка, которая предназначена для применения в качестве лекарственного средства, содержит полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, или содержит полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70; где указанные CAR могут быть гуманизированными.
В одном из вариантов осуществления изобретения экспрессирующая анти-CD33 CAR T-клетка, предлагаемая в изобретении, которая предназначена для применения в качестве лекарственного средства, содержит полипептид, имеющий SEQ ID NO: 68, или полипептид, идентичный по меньшей мере на 80% полипептиду, имеющему SEQ ID NO: 68, необязательно гуманизированному.
Другими словами, изобретение относится к экспрессирующей анти-CD33 CAR T-клетке, предлагаемой в изобретении, которая содержит полипептид, идентичный по меньшей мере на 80% любому из полипептидов, выбранных из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 70, необязательно гуманизированному, который предназначен для применения в качестве лекарственного средства.
В предыдущих разделах описаны сконструированные иммунные клетки, которые можно применять в качестве лекарственного средства или в сочетании с описанными способами. Предпочтительно сконструированные иммунные клетки могут содержать первичные T-клетки, в которых изменена экспрессия CD33, изменена экспрессия TCR, необязательно устойчивые по меньшей мере к одному из лекарственных средств, применяемых для лечения гематологического рака.
В целом, указанное лекарственное средство можно применять для лечения обусловленного экспрессирующей CD33 клеткой патологического состояния или состояния, характеризующегося прямой или косвенной активностью экспрессирующей CD33 клетки, т.е. состояния, связанного с активностью экспрессирующих CD33 клеток.
Указанное лекарственное средство можно применять для лечения пациентов, у которых диагностировано предзлокачественное или злокачественное связанное с раком состояние, отличающееся наличием экспрессирующих CD33 T-клеток, прежде всего избыточным количеством экспрессирующих CD33 T-клеток. Указанные состояния имеют место при гематологических видах рака, таких как лейкоз или злокачественные лимфопролиферативные нарушения, такие как B-клеточные лимфопролиферативные нарушения.
Другим примером обусловленного экспрессирующей CD33 клеткой патологического состояния или состояния, характеризующегося прямой или косвенной активностью экспрессирующей CD33 клетки, т.е. состояния, связанного с активностью экспрессирующей CD33 клетки, которое можно лечить с помощью экспрессирующей анти-CD33 CAR T-клетки, предлагаемой в изобретении, является болезнь Альцгеймера.
Лимфопролиферативное нарушение может представлять собой лимфому, в частности, множественную миелому, неходжскинскую лимфому, лимфому Беркитта и фолликулярную лимфому (мелкоклеточную и крупноклеточную).
Любое обусловленное CD33 заболевание и заболевание, в котором принимает участие CD33, в частности злокачественное лимфопролиферативное нарушение или лейкоз, можно лечить и состояние здоровья пациента, страдающего указанным патологическим состоянием можно улучшать с помощью экспрессирующих анти-CD33 CAR T-клеток, предлагаемых в настоящем изобретении.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения рак, который можно лечить с помощью экспрессирующих анти-CD33 CAR T-клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой лейкоз, заболевание, ассоциированное с лейкозом, или являющееся его осложнением, в частности AML, подтип AML, связанное с AML осложнение и связанные с AML состояния.
Лейкоз, который можно также предупреждать или лечить с помощью экспрессирующих анти-CD33 CAR T-клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, может представлять собой острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз, мелодиспластический синдром, острый лимфоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз и миелодиспластический синдром.
AML или подтипы AML, которые можно лечить с помощью экспрессирующих анти-CD33 CAR T-клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, могут представлять собой, в частности, острый миелобластный лейкоз, минимально-дифференцированный острый миелобластный лейкоз, острый миелобластный лейкоз без созревания (клеток), острый миелобластный лейкоз с созреванием гранулоцитов, промиелоцитарный или острый промиелоцитарный лейкоз (APL), острый миеломоноцитарный лейкоз, миеломоноцитарный лейкоз в сочетании с эозинофилией костного мозга, острый монобластный лейкоз (М5а) или острый моноцитарный лейкоз (M5b), острый эритроидный лейкоз, включая эритролейкоз (М6а) и очень редкий чистый эритроидный лейкоз (M6b), острый мегакариобластный лейкоз (М7), острый базофильный лейкоз, острый панмиелоз с миелофиброзом, в которых участвуют CD33-позитивные клетки.
AML1/ETO
MYH11
PML/RARα
MLLT3/MLL
DEK/NUP214
RPN1/EVI1
Подтипы AML, которые можно лечить с помощью экспрессирующих анти-CD33 CAR T-клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, включают также AML с t (8;21) (q22;q22), (), AML с inv (16) (p13;q22) или t (16;16) (p13;q22), (CBFβ/), AML с t (15;17) (q22;q12), () и их варианты, AML с t(9;11)(p22;q23), (), AML с t(6;9)(p23;q34) (), AML с inv(3)(q21q26) или t(3;3)(q21;q26), (), AML с t(1;22)(p13;q13) (RBM15/MKL1) (мегакариоцитарный), AML с ассоциированными с миелодисплазией изменениями, включая AML, возникающий из предшествующего MDS или MDS/MPN, AML с ассоциированной с MDS цитогенетической аномалией, и AML с мультилинейной дисплазией, ассоциированный с алкилирующим агентом /облучением AML, минимально-дифференцированный AML (известный также как AML-M0), AML без созревания (известный также как AML-M1), AML с созреванием (известный также как AML-M2), острый миеломоноцитарный лейкоз (известный также как AML-M4), острый монобластный/моноцитарный лейкоз (известный также как AML-M5), острый эритроидный лейкоз (известный также как AML-M6) и чистый эритроидный лейкоз.
Таким образом, AML, классифицированные как AML со специфическим генетическими аномалиями, представляют собой состояния, которые можно лечить с помощью экспрессирующих анти-CD33 CAR T-клеток, предлагаемых в настоящем изобретении. Классификация основывается на возможности прогнозировать на основе кариотипа ответ на индукционную терапию, риск рецидива, продолжительность жизни.
Таким образом, AML, которые можно лечить с помощью экспрессирующих анти-CD33 CAR T-клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, могут представлять собой AML с транслокацией между хромосомами 8 и 21, AML с транслокацией или инверсией в хромосоме 16, AML с транслокацией между хромосомами 9 и 11, APL (М3) с транслокацией между хромосомами 15 и 17, AML с транслокацией между хромосомами 6 и 9, AML с транслокацией или инверсией в хромосоме 3, AML (мегакариобластный) с транслокацией между хромосомами 1 и 22.
Настоящее изобретение является наиболее ценным для лечения AML, ассоциированного с указанными конкретными цитогенетическими маркерами.
транс
В настоящем изобретении предложена также экспрессирующая анти-CD33 CAR T-клетка для лечения пациентов со специфическими цитогенетическими субпопуляциями AML, например, пациентов с t(15;17)(q22;q21), идентифицированных с помощью полностью -ретиноевой кислоты (ATRA), и для лечения пациентов с t(8;21)(q22;q22) или inv(16)(p13q22)/t(16;16)(pl3;q22), идентифицированных с помощью повторяющихся высоких доз цитарабина.
Предпочтительно в настоящем изобретении предложена экспрессирующая анти-CD33 CAR T-клетка для лечения пациентов с аберрациям, такими как -5/del(5q), -7, аномалиями 3q или комплексным кариотипом, у которых обнаружены плохие уровни полной ремиссии и выживаемости.
Группа пациентов
Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является медикаментозное лечение лейкоза, в частности, у страдающих AML пациентов, возрастом старше 60 лет, пациентов возрастом моложе 20 лет, в частности у детей.
Более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является педиатрическое лечение, в частности педиатрическое лечение AML или ассоциированных с AML заболеваний или осложнений.
Еще более предпочтительным вариантом осуществления изобретения является применение для лечения страдающих AML пациентов с низким, плохим или неблагоприятным статусом, основой для определения которого является прогнозируемая выживаемость, составляющая менее 5 лет. В этой группе пациенты, страдающие AML со следующими цитогенетическими характеристиками: -5; 5q; -7; 7q-; 11q23; non t(9;11); inv(3); t(3;3); t(6;9); t(9;22), имеют статус, ассоциированный с риском неблагоприятного исхода (Byrd J.С. и др., Blood, 100 (13), 15 декабря 2002 г.; и для них прежде всего пригодно лечение, предлагаемое в настоящем изобретении, или лечение на основе объекта настоящего изобретения.
В одном из вариантов осуществления изобретения экспрессирующую анти-CD33 CAR T-клетку, предлагаемую в настоящем изобретении, можно применять в случае рецидива AML или в случае рефрактерного или устойчивого AML. Предпочтительно T-клетки, содержащие по меньшей мере один гуманизированный анти-CD33 CAR, предлагаемый в изобретении, который содержит или состоит из SEQ ID NO: 1 и полипептида, выбранного из полипептида, который по меньшей мере на 80%-100% идентичен SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, или их комбинации, применяют для пациентов с рецидивом AML или рефрактерным или устойчивым AML, более предпочтительно в сочетании по меньшей мере с одним другим противораковым лекарственным средством.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанную по меньшей мере одну экспрессирующую анти-CD33 CAR T-клетку, предлагаемую в изобретении, применяют для предупреждения развития раковых клеток, что имеет место, в частности, после противоракового лечения, в процессе деплеции (очистки) костного мозга или перед трансплантацией костного мозга, после разрушения костного мозга.
Связанные с AML осложнения
Одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения является лекарственное средство, которое улучшает состояние здоровья пациента, в частности, пациента с осложнениями, связанными с AML. Более предпочтительно указанная сконструированная экспрессирующая анти-CD33 CAR T-клетка, предлагаемая в изобретении, экспрессирует по меньшей мере один анти-CD33 CAR, содержащий SEQ ID NO: 1 и полипептид, который по меньшей мере на 80% идентичен SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, или их комбинацию, и ее применяют в качестве лекарственного средства для лечения осложнения, связанного с AML.
Одним из конкретных вариантов осуществления изобретения является лекарственное средство, которое улучшает состояние здоровья пациента, страдающего AML, в частности, пациента с осложнениями, связанными с AML, где указанное лекарственное средство содержит экспрессирующую анти-CD33 CAR T-клетку, предлагаемую в изобретении, содержащую полипептид, который по меньшей мере на 80% идентичен полипептиду, выбранному из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 70.
Осложнение или заболевание, связанное с AML, может включать предшествующую миелодисплазии фазу, вторичный лейкоз, в частности, вторичный AML, высокое содержание лейкоцитов и отсутствие палочек Ауэра. Среди прочего, в качестве осложнения или заболевания, связанного с AML, рассматриваются лейкостаз и затрагивающий центральную нервную систему (ЦНС) гиперлейкоцитоз, остаточные явления болезни.
Ассоциированные с AML заболевания
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является также экспрессирующая анти-CD33 CAR T-клетка, предназначенная для лечения патологического состояния, связанного с AML. Предпочтительно в настоящем изобретении предложна клетка, экспрессирующая по меньшей мере один анти-CD33 CAR, который содержит полипептид, идентичный по меньшей мере на 80% полипептиду, выбранному из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, и SEQ ID NO: 70, для лечения патологического состояния, связанного с AML.
Настоящее изобретение относится к лекарственному средству для связанных с AML миелоидных неоплазм, острого миелоидного лейкоза и миелодиспластического синдрома, лечения рецидивирующего или рефракторного миелоидного лейкоза, лечения рецидивирующего или рефракторного острого промиелоцитарного лейкоза у взрослых, лечения острого промиелоидного лейкоза, лечения острого миелоидного лейкоза у взрослых возрастом старше 60 лет.
Другим объектом настоящего изобретения является композиция, предназначенная для лечения ассоциированных с AML заболеваний, в частности, гематологических злокачественных связанных с AML заболеваний.
Гематологические злокачественные связанные с AML состояния включают миелодиспластический синдром (MDS, ранее известный как «предлейкоз»), который представляет собой широкий спектр гематологических состояний, объединенных неэффективным производством (или дисплазией) миелоидных клеток крови и риск трансформации в AML.
Другим вариантом осуществления изобретения является лекарственное средство, предлагаемое в изобретении, которое улучшает состояние здоровья пациента, страдающего множественной миеломой.
Другие патологические состояния или генетические синдромы, ассоциированные с риском AML, можно улучшать посредством соответствующего применения настоящего изобретения, указанные генетические синдромы включают синдром Дауна, трисомию, анемию Фанкони, синдром Блума, атаксию-телеангиэктазию, анемию Даймонда-Блекфена, синдром Швахмана-Даймонда, синдром Ли-Фраумени, нейтрофиброматоз типа 1, серьезную врожденную нейтропению (которую называют также синдромом Костмана).
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является экспрессирующая анти-CD33 CAR T-клетка, предназначенная для лечения болезни Альцгеймера. В настоящем изобретении предложены клетки, которые можно применять в сочетании со способами, описанными в предыдущем разделе, предпочтительно клетки, которые представляют собой экспрессирующие анти-CD33 CAR T-клетки и более предпочтительно экспрессирующие TCR и CD33 KO анти-CD33 CAR T-клетки. Указанное лечение можно применять для лечения пациентов с диагностированным предзлокачественным или злокачественным связанным с раком состоянием, характеризующимся присутствием экспрессирующих CD33 клеток, прежде всего избыточным количеством экспрессирующих CD33 клеток. Указанные состояния имеют место при гематологических формах рака, таких как лейкоз или злокачественные лимфопролиферативные нарушения.
Лейкоз может представлять собой острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, мелодиспластический синдром, острый лимфоидный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз и миелодиспластический синдром.
Лимфопролиферативное нарушение может представлять собой лимфому, в частности, множественную миелому, неходжскинскую лимфому, лимфому Беркитта и фолликулярную лимфому (мелкоклеточную и крупноклеточную).
Типы рака, которые можно лечить, включают несолидные опухоли (такие как гематологические опухоли, включая (но, не ограничиваясь только ими) пре-В ALL (при педиатрических показаниях), ALL взрослых, лимфому из клеток мантии, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому и т.п. Типы рака, которые можно лечить с помощью CAR, предлагаемых в изобретении, включают (но, не ограничиваясь только ими) некоторые типы лейкозов или лимфоидных злокачественных заболеваний. Они включают также опухоли/типы рака взрослых и детские опухоли/типы рака.
Лечение с помощью сконструированных иммунных клеток, предлагаемых в изобретении, можно осуществлять в сочетании с применением одного или нескольких типов противораковой терапии, выбранных из группы, включающей терапию на основе антител, химиотерапию, цитокиновую терапию, терапию с использованием дендритных клеток, генную терапию, гормональную терапию, свето-лазерную терапию и лучевую терапию.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения указанное лечение можно применять для пациентов, подвергающихся иммуносупрессорной терапии. Фактически, настоящее изобретение основано предпочтительно на применении клеток или популяции клеток, которые приобрели устойчивость по меньшей мере к одному иммунодепрессанту в результате инактивации гена, кодирующего рецептор для такого иммунодепрессанта. С этой точки зрения, иммуносупрессорная терапия должна способствовать отбору и размножению T-клеток, предлагаемых в изобретении, в организме пациента.
Композиции
В настоящем изобретении предложна композиция, содержащая экспрессирующие анти-CD33 T-клетки, предлагаемые в изобретении, и фармацевтически приемлемый наполнитель.
Одним из вариантов осуществления изобретения является указанная композиция, предназначенная для применения в качестве лекарственного средства.
В другом варианте осуществления изобретения указанная композиция предназначена для применения в качестве лекарственного средства для лечении состояний, характеризующихся наличием экспрессирующих CD33 клеток, в частности, избыточным количеством экспрессирующих CD33 клеток. Такие состояния имеют место при гематологических формах рака, таких как лейкоз или злокачественные лимфопролиферативные нарушения, такие как B-клеточные лимфопролиферативные нарушения.
+
+
Одним из объектов настоящего изобретения является композиция, которая содержит экспрессирующие анти-CD33 T-клетки, предлагаемые в изобретении, и фармацевтически приемлемый наполнитель, предназначенная для лечения опосредуемых CD33-клеток заболеваний. Указанные опосредуемые CD33-клетками заболевания включают предзлокачественное или злокачественное связанное с раком состояние, воспаление, аутоиммунные заболевания, болезнь Альцгеймера.
Согласно одному из объектов изобретения экспрессирующая CD33 клетка гематологического рака, который можно лечить с помощью композиции, предлагаемой в изобретении, может представлять собой экспрессирующую CD33 стволовую клетку гематологического рака, включая (но, не ограничиваясь только ими) экспрессирующую CD33 раковую клетку при лейкозе (таком как острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз, острый лимфоидный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, включая лимфому (такую как множественная миелома, неходжскинская лимфома, лимфома Беркитта и мелкоклеточная и крупноклеточная фолликулярная лимфома), или связанные с ними осложнения.
Композицию, содержащую экспрессирующие анти-CD33 T-клетки, предлагаемые в изобретении, и фармацевтически приемлемый наполнитель, можно применять в способе снижения количества, ингибирования пролиферации и/или активности экспрессирующих CD33 клеток гематологического рака у пациента. Приведенный в качестве примера способ заключается в том, что приводят в контакт популяцию клеток, содержащую экспрессирующую CD33 клетку, с экспрессирующей CD33 CAR T-клеткой, предлагаемой в изобретении, которая связывается с экспрессирующей CD33 клеткой.
Более конкретным объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая экспрессирующие анти-CD33 T-клетки, предлагаемые в изобретении, и фармацевтически приемлемый наполнитель, предназначенная для применения, в частности, в способе ингибирования пролиферации или снижения численности популяции раковых клеток, которые экспрессируют CD33, у пациента, где способы заключаются в том, что приводят в контакт популяцию клеток, содержащую экспрессирующую CD33 клетку, с экспрессирующей CD33 CAR T-клеткой, предлагаемой в изобретении, которая связывается с экспрессирующей CD33 клеткой, связывание экспрессирующей CD33 CAR T-клетки, предлагаемой в изобретении, с экспрессирующей CD33 клеткой приводит к разрушению экспрессирующих CD33 раковых клеток.
Согласно некоторым объектам изобретения композиция, содержащая экспрессирующую CD33 CAR T-клетку, предлагаемую в изобретении, снижает уровень, число, количество или процент клеток и/или раковых клеток по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% (до неподдающегося обнаружению уровня) у индивидуума или на животной модели миелоидного лейкоза или другого вида рака, ассоциированного с экспрессирующими CD33 клетками, относительно отрицательного контроля.
В настоящем изобретении предложен также способ предупреждения, лечения и/или контроля нарушения или состояния, ассоциированного с экспрессирующими CD33 клетками (например, ассоциированного с гематологическим раком, AML), способы заключаются в том, что вводят индивидууму, который нуждается в этом, композицию, которая содержит экспрессирующую CD33 CAR T-клетку, предлагаемую в изобретении, которая связывается с экспрессирующей CD33 клеткой, в частности, композицию, которая содержит экспрессирующие анти-CD33 T-клетки, предлагаемые в изобретении, и фармацевтически приемлемый наполнитель. Согласно одному из объектов изобретения индивидуум представляет собой человека. Примеры нарушений, ассоциированных с экспрессирующими CD33 клетками, включают (но, не ограничиваясь только ими) воспалительные нарушения (такие как аллергии, воспалительные заболевания кишечника BD, болезнь Альцгеймера) и различные вида рака (например, виды гематологического рака, в частности, AML или связанные с AML осложнения).
В настоящем изобретении предложена также композиция, предназначенная для применения, или способ лечения заболевания, включающий ее применение, которая содержит T-клетку, экспрессирующую анти-CD33 CAR, предлагаемый в изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель, предпочтительно указанный анти-CD33 CAR содержит SEQ ID NO: 1 и полипептид, идентичный по меньшей мере на 80%-100% полипептиду, выбранному из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, и их комбинацию, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Согласно одному из объекту изобретения заболевание выбирают из указанных в настоящем описании заболеваний, в частности, оно представляет собой гематологический рак, более конкретно, рак из стволовых клеток, включая (но, не ограничиваясь только ими) лейкоз (такой как острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз, острый лимфоидный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, включая лимфому (такую как множественная миелома, неходжскинская лимфома, лимфома Беркитта и мелкоклеточная и крупноклеточная фолликулярная лимфома), или связанные с ними осложнения.
В настоящем изобретении предложена также композиция, которая содержит T-клетку, экспрессирующую анти-CD33 CAR, предлагаемый в изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель, предназначенная для применения в способе ингибирования пролиферации или снижения численности популяции экспрессирующих CD33 клеток или их активности в пациента. Приведенный в качестве примера способ заключается в том, что приводят в контакт популяцию клеток, содержащую экспрессирующую CD33 клетку, с экспрессирующей CD33 CAR T-клеткой, предлагаемой в изобретении, которая связывается с экспрессирующей CD33 клеткой, предпочтительно указанный анти-CD33 CAR содержит SEQ ID NO: 1 и полипептид, который идентичен по меньшей мере на 80%-100% полипептиду, выбранному из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, и их комбинацию.
В настоящем изобретении предложена также композиция, которая содержит экспрессирующие анти-CD33 T-клетки, предлагаемые в изобретении, и фармацевтически приемлемый наполнитель, предназначенная для применения в способе предупреждения, лечения и/или контроля нарушения или состояния, ассоциированного с экспрессирующими CD33 клетками (например, ассоциированного с гематологическим раком), способы заключаются в том, что вводят индивидууму, который нуждается в этом, композицию, предлагаемую в изобретении, в которой указанный анти-CD33 CAR содержит SEQ ID NO: 1 и полипептид, идентичный по меньшей мере на 80%-100% полипептиду, выбранному из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO; 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, и их комбинацию, который связывается с экспрессирующей CD33 клеткой. Согласно одному из объектов изобретения индивидуум представляет собой человека. Примеры нарушений, ассоциированных с экспрессирующими CD33 клетками, включают (но, не ограничиваясь только ими) аутоиммунные нарушения (такие как волчанка), воспалительные нарушения (такие как аллергии, IBD и астма) и различные виды рака (например, виды гематологического рака, в частности, AML или связанные с AML осложнения).
В настоящем изобретении предложена также композиция, содержащая экспрессирующую анти-CD33 CAR T-клетку, предлагаемую в изобретении, и фармацевтически приемлемый наполнитель, предназначенная для применения, или способ ее применения для лечения заболевания, в которой предпочтительно указанный анти-CD33 CAR содержит полипептид, идентичный по меньшей мере на 80%-100% полипептиду, выбранному из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 70. Согласно одному из объектов изобретения заболевание представляет собой заболевание, указанное в настоящем описании, предпочтительно гематологический рак, более предпочтительно рак из стволовых клеток, включая (но, не ограничиваясь только ими) лейкоз (такой как острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз, острый лимфоидный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз и миелодиспластический синдром) и злокачественные лимфопролиферативные состояния, включая лимфому (такую как множественная миелома, неходжскинская лимфома, лимфома Беркитта и мелкоклеточная и крупноклеточная фолликулярная лимфома), или связанные с ними осложнения.
В настоящем изобретении предложена также композиция, которая содержит экспрессирующие анти-CD33 T-клетки, предлагаемые в изобретении, и фармацевтически приемлемый наполнитель, предназначенная для применения в способе ингибирования пролиферации или снижения численности популяции экспрессирующих CD33 клеток или их активности у пациента. Приведенный в качестве примера способ заключается в том, что приводят в контакт популяцию экспрессирующих CD33 клеток с экспрессирующими CD33 CAR T-клетками, предлагаемыми в изобретении, которые связываются с экспрессирующей CD33 клеткой, предпочтительно указанный анти-CD33 CAR содержит полипептид, который идентичен по меньшей мере на 80% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 70.
В настоящем изобретении предложена также композиция, которая содержит экспрессирующие анти-CD33 T-клетки, предлагаемые в изобретении, и фармацевтически приемлемый наполнитель, предназначенная для применения в способе предупреждения, лечения и/или контроля нарушения или состояния, ассоциированного с экспрессирующими CD33 клетками (например, ассоциированного с гематологическим раком), способы заключаются в том, что вводят индивидууму, который нуждается в этом, композицию, предлагаемую в изобретении, в которой указанный анти-CD33 CAR содержит полипептид, идентичный по меньшей мере на 80%-100% полипептиду, выбранному из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 70.
Согласно одному из объектов изобретения индивидуум представляет собой человека. Примеры нарушений, ассоциированных с экспрессирующими CD33 клетками, включают (но, не ограничиваясь только ими) аутоиммунные нарушения (такие как волчанка), воспалительные нарушения (такие как аллергии, IBD и астма) и различные вида рака (например, виды гематологического рака, в частности, AML или связанные с AML осложнения).
В настоящем изобретении предложена также композиция, которая содержит экспрессирующие анти-CD33 T-клетки, предлагаемые в изобретении, и фармацевтически приемлемый наполнитель, предназначенная для применения в способе предупреждения, лечения и/или контроля нарушения или состояния, ассоциированного с экспрессирующими CD33 клетками, где способ заключается в том, что вводят индивидууму, который нуждается в этом, композицию, предлагаемую в изобретении, которая связывается с экспрессирующей CD33 клеткой. В указанном варианте осуществления изобретения указанный анти-CD33 CAR содержит полипептид, идентичный по меньшей мере на 80%-100% полипептиду, выбранному из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, и SEQ ID NO: 70. Согласно одному из объектов изобретения индивидуум представляет собой человека. Примеры нарушений, ассоциированных с экспрессирующими CD33 клетками, включают (но, не ограничиваясь только ими) острый миелоидный лейкоз (AML), миелодисплазию, B-клеточный острый лимфоидный лейкоз, T-клеточный острый лимфоидный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, неоплазм из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток, хронический миелоидный лейкоз, лимфому Ходжкина.
В настоящем изобретении предложена также композиция, которая содержит экспрессирующие анти-CD33 T-клетки, предлагаемые в изобретении, и фармацевтически приемлемый наполнитель, предназначенная для применения в способе лечения или предупреждения рецидива рака, ассоциированного с экспрессирующими CD33 клетками, где способ заключается в том, что вводят индивидууму, который нуждается в этом, композицию, предлагаемую в изобретении, в которой указанный анти-CD33 CAR содержит полипептид, идентичный по меньшей мере на 80%-100% полипептиду, выбранному из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 70, который связывается с экспрессирующей CD33 клеткой. Согласно другому объекту изобретения способы заключаются в том, что вводят индивидууму, который нуждается в этом, в эффективном количестве композицию, предлагаемую в изобретении, в сочетании с применяемой в эффективном количестве другой терапией.
Одним из объектов изобретения являются композиции и способы, предназначенные для лечения индивидуумов, которых подвергают лечению по поводу заболевания или нарушения, ассоциированного с повышенными уровнями экспрессии CD 19, и которые имеют заболевание или нарушение, ассоциированное с повышенными уровнями CD33.
Введение клеток или популяции клеток, предлагаемых в настоящем изобретении, можно осуществлять любым пригодным методом, включая ингаляцию аэрозоля, инъекцию, прием внутрь, трансфузию, имплантацию или трансплантацию. Композиции, представленные в настоящем описании, можно вводить пациенту подкожно, внутрикожно, внутрь опухоли, интранодально, интрамедуллярно, внутримышечно, путем внутривенной или внутрилимфатической инъекции, или внутрибрюшинно. В одном из вариантов осуществления изобретения клеточные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, предпочтительно вводят путем внутривенной инъекции.
4
9
5
6
Введение клеток или популяции клеток может заключаться во введении 10-10 клеток/кг веса тела, предпочтительно от 10 до 10 клеток/кг веса тела, включая все целочисленные количества клеток в указанных диапазонах. Клетки или популяцию клеток можно вводить в виде одной или нескольких доз. В другом варианте осуществления изобретения указанное эффективное количество клеток вводят в виде однократной дозы. В другом варианте осуществления изобретения указанное эффективное количество клеток вводят в виде более чем одной дозы в течение некоторого периода времени. График введения находится в компетенции лечащего врача и зависит от клинического состояния пациента. Клетки или популяцию клеток можно получать из любого источника, такого как банк крови или донор. Поскольку индивидуальные потребности варьируются, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств рассматриваемого типа клеток для конкретного заболевания или состояний, находится в компетенции специалиста в данной области. Эффективное количество представляет собой количество, которое обеспечивает терапевтическое или профилактическое полезное действие. Вводимая доза должна зависеть от возраста, состояния здоровья и веса реципиента, вида одновременно применяемого лечения, если это имеет место, частоты обработки и природы требуемого действия.
В другом варианте осуществления изобретения клетки или композицию, содержащую эти клетки, вводят в указанном эффективном количестве парентерально. Указанное введение может представлять собой внутривенное введение. Указанное введение можно осуществлять непосредственно путем инъекции в опухоль.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки вводят пациенту в сочетании с осуществлением (например, до, одновременно или после) любого количества соответствующих форм лечения, включая (но, не ограничиваясь только ими) лечение с помощью средств противовирусной терапии, таких как цидофовир и интерлейкин-2, цитарабин (известный также под названием ARA-C), или лечение натализумабом пациентов с MS (рассеянный склероз), или лечение эфализумабом пациентов с псориазом, или другие виды лечения пациентов с PML (прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия). В других вариантах осуществления изобретения T-клетки, предлагаемые в изобретении, можно применять в сочетании с химиотерапией, лучевой терапией, иммунодепрессантами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антителами или другими иммунодеструктивными агентами, такими как САМРАТН, антитела к CD3, или с другими видами терапии на основе антител, цитоксином, флударибином, циклоспорином, FK506, рапамицином, микофеноловой кислотой, стероидами, FR901228, цитокинами и облучением. Эти лекарственные средства ингибируют или кальций-зависимую фосфатазу, кальцинеурин (циклоспорин и FK506), или ингибируют киназу p70S6, которая важна для индуцируемой фактором роста передачи сигнала (рапамицин) (Henderson, Naya и др., 1991; Liu, Albers и др., 1992; Bierer, Hollander и др., 1993). В другом варианте осуществления изобретения клеточные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, вводят пациенту в сочетании с (например, до, одновременно или после) трансплантацией костного мозга, T-клеточной абляционной терапией с использованием либо химиотерапевтических средств, таких как флударабин, либо внешней лучевой терапии (XRT), циклофосфамида, либо антител, таких как ОКТ3 или САМРАТН. В другом варианте осуществления изобретения клеточные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, вводят после осуществления B-клеточной абляционной терапии с использованием агентов, которые взаимодействуют с CD20, таких, например, как ритуксан. Например, в одном из вариантов осуществления изобретения индивидуумов можно подвергать стандартной обработке химиотерапевтическими средствами в высокой дозе с последующей трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В некоторых вариантах осуществления изобретения после трансплантации индивидуумам вводят путем инфузии размноженные иммунные клетки, предлагаемые в настоящем изобретении. В еще одном варианте осуществления изобретения размноженные клетки вводят до или после хирургического вмешательства.
Другие определения
- Если специально не указано иное, то множественное число и единственное число и понятие «по меньшей мере один» используются взаимозаменяемо и означают «один» или «более чем один».
- Аминокислотные остатки в полипептидной последовательности обозначают в настоящем описании с помощью однобуквенного кода, согласно которому, например, Q обозначает Gln или остаток глутамина, R обозначает Arg или остаток аргинина и D обозначает Asp или остаток аспарагиновой кислоты.
- Аминокислотная замена обозначает замену одного аминокислотного остатка на другой, например, замена остатка аргинина на остаток глутамина в пептидной последовательности представляет собой аминокислотную замену.
- Нуклеотиды обозначают следующим образом: однобуквенный код используют для обозначения основания нуклеозида: а обозначает аденин, t обозначает тимин, с обозначает цитозин и g обозначает гуанин. Для вырожденных нуклеотидов r обозначает g или а (пуриновые нуклеотиды), k обозначает g или t, s обозначает g или с, w обозначает а или t, m обозначает а или с, у обозначает t или с (пиримидиновые нуклеотиды), d обозначает g, а или t, v обозначает g, а или с, b обозначает g, t или с, h обозначает a, t или с и n обозначает g, a, t или с.
- В контексте настоящего описания понятия «нуклеиновая кислота» или «полинуклеотиды» относятся к нуклеотидам и/или полинуклеотидам, таким как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), олигонуклеотидам, фрагментам, созданным с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), и фрагментам, созданным путем лигирования, расщепления, обработки эндонуклеазами и обработки экзонуклеазами. Молекулы нуклеиновой кислоты могут состоять из мономеров, которые являются встречающимися в естественных условиях нуклеотидами (такими как ДНК или РНК) или аналогами встречающихся в естественных условиях нуклеотидов (например, энантиомерными формами встречающихся в естественных условиях нуклеотидов), или представляют собой их комбинацию. Модифицированные нуклеотиды могут иметь изменения в сахарных фрагментах и/или во фрагментах, содержащих пиримидиновые или пуриновые основания. Модификации сахаров включают, например, замену одной или нескольких гидроксильных групп на галогены, алкильные группы, амины и азидогруппы, или сахара могут быть функционализированы до простых или сложных эфиров. Кроме того, весь сахарный фрагмент может быть заменен стерически и электронно сходными структурами, такими как аза-сахара и карбоциклические аналоги Сахаров. Примерами модификаций во фрагменте, представляющем собой основание, могут служить алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины или другие хорошо известные гетероциклические заместители. Мономеры нуклеиновой кислоты могут быть сшиты фосфодиэфирными связями или аналогами таких связей. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными.
- Под химерным антигенным рецептором (CAR) подразумевают молекулы, в которых объединен связывающий домен, направленный против компонента, присутствующего на клетке-мишени, например, присущую антителу специфичность в отношении требуемого антигена (например, опухолевого антигена), с активирующим T-клеточный рецептор внутриклеточным доменом, в результате чего образуется химерный белок, обладающий специфической клеточной иммунной активностью в отношении мишени. Как правило, CAR состоит из внеклеточного одноцепочечного антитела (scFvFc), слитого с внутриклеточным сигнальным доменом дзета-цепи комплекса T-клеточный антиген-рецептор (scFvFc:ζ), и при экспрессии в T-клетках он обладает способностью перенаправлять распознавание антигена благодаря специфичности моноклонального антитела. Одним из примеров CAR, применяемого в настоящем изобретении, является CAR, направленный против антигена CD33, и он может, например, содержать (но, не ограничиваясь только ими) аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 19-42 и предпочтительно аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 48-71.
- Под V1-структурой подразумевают молекулы, в которых объединены
- сигнальный пептид CD8альфа,
- VH-домен, отделенный от VL-домена линкером, указанные VH и VL принимают участие в связывании с CD33,
- шарнир из Fcгамма (γ) RIIIальфа (α),
- трансмембранный домен, происходящий из CD8альфа(α),
- цитоплазматический домен, происходящий из 4-1ВВ и CD3дзета (ζ).
- Под V2-структурой подразумевают молекулы, имеющие V1-структуру и в которых трансмембранный домен происходит из 4-1ВВ.
- Под V3-структурой подразумевают молекулы, в которых объединены
- сигнальный пептид CD8альфа,
- VH-домен, отделенный от VL-домена линкером, указанные VH и VL принимают участие в связывании с CD33,
- шарнир из CD8альфа(α),
- трансмембранный домен, происходящий из CD8альфа(α),
- цитоплазматический домен, происходящий из 4-1ВВ и CD3дзета (ζ).
- Под V4-структурой подразумевают молекулы, имеющие V3-структуру и в которых трансмембранный домен происходит из 4-1ВВ.
- Под VS-структурой подразумевают молекулы, в которых объединены
- сигнальный пептид CD8альфа,
- VH-домен, отделенный от VL-домена линкером, указанные VH и VL принимают участие в связывании с CD33,
- шарнир из IgG1,
- трансмембранный домен, происходящий из CD8альфа(α),
- цитоплазматический домен, происходящий из 4-1ВВ и CD3дзета (ζ).
- Под V6-структурой подразумевают молекулы, имеющие V5-структуру и в которых трансмембранный домен происходит из 4-1ВВ.
Структуры CAR, предлагаемые в изобретении, проиллюстрированы на фиг. 2, предпочтительно на фиг. 3.
- Понятие «химиотерапия» относится к любой терапии, в которой используют химические агенты, прежде всего те, которые применяют против рака.
- Понятие «эндонуклеаза» относится к ферменту дикого типа или его варианту, обладающему способностью катализировать гидролиз (расщепление) связей между нуклеиновыми кислотами в молекуле ДНК или РНК, предпочтительно в молекуле ДНК. Эндонуклеазы не расщепляют молекулу ДНК или РНК независимо от ее последовательности, но они распознают и расщепляют молекулу ДНК или РНК в специфических полинуклеотидных последовательностях, в дальнейшем обозначенных как «последовательности-мишени» или «сайты-мишени». Эндонуклеазы можно классифицировать как редко расщепляющие эндонуклеазы, для которых, как правило, полинуклеотидный сайт распознавания имеет длину более 12 пар оснований (bp), более предпочтительно 14-55 пар оснований. Редко расщепляющие эндонуклеазы значительно повышают гомологичную рекомбинацию (HR), индуцируя двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) в определенном локусе (Perrin, Buckle и др., 1993; Rouet, Smih и др., 1994; Choulika, Perrin и др., 1995; Pingoud и Silva, 2007). Редко расщепляющие эндонуклеазы могут представлять собой, например, хоминг-эндонуклеазу (Paques и Duchateau, 2007), химерную нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN), образованную слиянием сконструированных доменов «цинковых пальцев» с каталитическим доменом рестриктазы, такой как FokI (Porteus и Carroll, 2005), эндонуклеазу Cas9 из системы CRISPR (Gasiunas, Barrangou и др., 2012; Jinek, Chylinski и др., 2012; Cong, Ran и др., 2013; Mali, Yang и др., 2013) или химическую эндонуклеазу (Eisenschmidt, Lanio и др., 2005; Arimondo, Thomas и др., 2006). В химических эндонуклеазах химический или пептидный расщепляющий компонент конъюгируют либо с полимером нуклеиновой кислоты, либо с другой ДНК, распознающей специфическую последовательность-мишень, тем самым обеспечивая направление расщепляющей активности на специфическую последовательность. Химические эндонуклеазы включают также синтетические нуклеазы типа конъюгатов ортофенантролина, ДНК-расщепляющей молекулы и триплекс-образующих олигонуклеотидов (TFO), которые, как известно, связываются со специфическими последовательностями ДНК (Kalish и Glazer, 2005). Такие химические эндонуклеазы подпадают под понятие «эндонуклеазы» в контексте настоящего изобретения.
- Под «TALE-нуклеазой» (TALEN) понимают слитый белок, который состоит из связывающего нуклеиновую кислоту домена, как правило, происходящего из подобного активатору транскрипции эффектора (TALE), и одного нуклеазного каталитического домена для расщепления последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Каталитический домен предпочтительно представляет собой нуклеазный домен и более предпочтительно домен, обладающий эндонуклеазной активностью, например, типа I-TevI, ColE7, NucA и Fok-I. В конкретном варианте осуществления изобретения домен TALE может быть слит с мегануклеазой, например, типа I-CreI и I-OnuI, или ее функциональным вариантом. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная нуклеаза представляет собой мономерную TALE-нуклеазу. Мономерная TALE-нуклеаза представляет собой TALE-нуклеазу, которая не требует димеризации для специфического распознавания и расщепления, например, в виде слияний сконструированных повторов TAL с каталитическим доменом I-TevI, описанным в WO 2012/138927. Подобные активатору транскрипции эффекторы (TALE) представляют собой белки из видов бактерий рода Xanthomonas, содержащие несколько повторяющихся последовательностей, где каждый повтор содержит di-остатки (двойные остатки) в положениях 12 и 13 (RVD), обладающие специфичностью в отношении каждого нуклеотидного основания последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Связывающие домены, обладающие сходными модульными свойствами связывания нуклеиновых кислот по типу основание-с основанием («base-per-base») (MBBBD) могут быть получены также из новых модульных белков, недавно обнаруженных заявителями в различных видах бактерий. Преимущество новых модульных белков заключается в том, что они характеризуются большей вариабельностью последовательности, чем TAL-повторы. Предпочтительно RVD, ассоциированные с распознаванием различных нуклеотидов, представляют собой HD для распознавания С, NG для распознавания Т, NI для распознавания А, NN для распознавания G или A, NS для распознавания А, С, G или Т, HG для распознавания Т, IG для распознавания Т, NK для распознавания G, НА для распознавания С, ND для распознавания С, HI для распознавания С, HN для распознавания G, NA для распознавания G, SN для распознавания G или А и YG для распознавания Т, TL для распознавания А, VT для распознавания А или G и SW для распознавания А. В другом варианте осуществления изобретения имеющие решающее значение аминокислоты 12 и 13 можно изменять путем мутации на другие аминокислотные остатки для модуляции их специфичности в отношении нуклеотидов А, Т, С и G и, прежде всего, для повышения их специфичности. Ранее уже была описана TALE-нуклеаза, и ее применяют для стимуляции генного нацеливания и генных модификаций (Boch, Scholze и др., 2009; Moscou и Bogdanove, 2009; Christian, Cermak и др., 2010; Li, Huang и др., 2011). Сконструированные TAL-нуклеазы поступают в продажу под товарным знаком TALEN™ (фирма Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013, Париж, Франция).
C
R
I
S
p
R
Редко расщепляющая эндонуклеаза, предлагаемая в настоящем изобретении, может представлять собой также эндонуклеазу Cas9. В последние годы был разработан новый инструмент для генетической инженерии на основе РНК-направляемой нуклеазы Cas9 (Gasiunas, Barrangou и др., 2012; Jinek, Chylinski и др., 2012; Cong, Ran и др., 2013; Mali, Yang и др., 2013) из адаптивной иммунной системы CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (lustered egularly nterspaced hort alindromic epeats)) типа II прокариот (см. обзор Sorek, Lawrence и др., 2013). CRISPR-ассоциированная (Cas) система впервые была обнаружена в бактериях, и ее функция состоит в защите от чужой вирусной или плазмидной ДНК. При осуществлении опосредуемой CRISPR генетической инженерии сначала проводят отбор последовательности-мишени, часто фланкированной короткой последовательностью мотива, который обозначают как примыкающий к протоспейсеру мотив (РАМ). После отбора последовательности-мишени конструируют специфическую crРНК (CRISPR-РНК), комплементарную указанной последовательности-мишени. Для систем CRISPR типа II требуется трансактивирующая crРНК (tracrРНК), спаренная с crRNA и связанная с внесенным белком Cas9. Cas9 функционирует в качестве молекулярного якоря, облегчающего спаривание оснований tracРНК с сРНК (Deltcheva, Chylinski и др., 2011). В этом тройном комплексе двойная структура tracrРНК : crРНК функционирует в качестве направляющей РНК, которая направляет эндонуклеазу Cas9 к когнатной последовательности-мишени. Распознавание мишени комплексом Cas9-tracrРНК : crРНК инициируется путем сканирования последовательности-мишени для обнаружения гомологии между последовательностью-мишенью и crРНК. Помимо комплементарности последовательности-мишени и crРНК, нацеливание ДНК требует присутствия короткого мотива, примыкающего к протоспейсеру (примыкающий к протоспейсеру мотив - РАМ). После спаривания двойной РНК и последовательности-мишени Cas9 интродуцирует «тупой» двухцепочечный разрыв на расстоянии 3 пар оснований в обратном направлении относительно мотива РАМ (Garneau, Dupuis и др., 2010).
CreI
Редко расщепляющая эндонуклеаза может представлять собой хоминг-эндонуклеазу, также известную под названием мегануклеаза. Такие хоминг-эндонуклеазы хорошо известны в данной области (Stoddard, 2005). Хоминг-эндонуклеазы распознают последовательность ДНК-мишени и создают одноцепочечный или двухцепочечный разрыв. Хоминг-эндонуклеазы обладают высокой специфичностью, распознавая сайты ДНК-мишени длиной от 12 до 45 пар оснований (bp), как правило, длиной от 14 до 40 пар оснований. Хоминг-эндонуклеаза, предлагаемая в изобретении, может соответствовать, например, эндонуклеазе LAGLIDADG, эндонуклеазе HNH или эндонуклеазе GIY-YIG. Предпочтительно хоминг-эндонуклеаза, предлагаемая в настоящем изобретении, может представлять собой вариант I-.
- Под «вектором для доставки» или «векторами для доставки» понимают любой доставляющий вектор, который можно применять согласно настоящему изобретению для приведения в контакт с клеткой (т.е. для «контактирования») или доставки внутрь клетки или в субклеточные компартменты (т.е. для «интродукции») агентов/химических веществ и молекул (белков или нуклеиновых кислот), требующихся для осуществления настоящего изобретения. К ним относятся (но, не ограничиваясь только ими) липосомальные векторы для доставки, вирусные векторы для доставки, векторы для доставки лекарственного средства, химические носители, полимерные носители, липоплексы, полиплексы, дендримеры, микропузырьки (ультразвуковые контрастные агенты), наночастицы, эмульсии или другие пригодные векторы для переноса. Такие векторы для доставки позволяют доставлять молекулы, химические вещества, макромолекулы (гены, белки) или другие векторы, такие как плазмиды, пептиды, разработанные фирмой Diatos. В этих случаях векторы для доставки представляют собой молекулы-носители. Под «вектором для доставки» или «векторами для доставки» понимают также методы доставки, предназначенные для осуществления трансфекции.
- Понятия «вектор» или «векторы» относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, обладающей способностью транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она сцеплена. К «векторам», применяемым согласно настоящему изобретению, относятся (но, не ограничиваясь только ими) вирусный вектор, плазмида, РНКовый вектор или молекула линейной или кольцевой ДНК или РНК, которые могут состоять из хромосомальных, нехромосомальных, полусинтетических или синтетических нуклеиновых кислот. Предпочтительными векторами являются векторы, которые способны автономно реплицировать (эписомальный вектор) и/или экспрессировать нуклеиновые кислоты, с которыми они сцеплены (экспрессионные векторы). Специалистам в данной области известно большое количество пригодных векторов, которые поступают в продажу.
К вирусным векторам относятся ретровирус, аденовирус, парвовирус (например, аденоассоциированный вирусы), коронавирус, РНК-вирусы с негативной цепью, такие как ортомиксовирус (например, вирус гриппа), рабдовирус (например, вирус бешенства и вирус везикулярного стоматита), парамиксовирус (например, вирус кори и вирус Сендай), РНК-вирусы с позитивной цепью, такие как пикорнавирус и альфавирус, и вирусы с двухцепочечной ДНК, включая аденовирус, вирус герпеса (например, вирус герпеса простого типов 1 и 2, вирус Эпштейна-Барра, цитомегаловирус) и вирус оспы (например, вирус коровьей оспы, вирус оспы птиц и вирус оспы канарейки). Другие вирусы включают, например, вирус Норвалк, тогавирус, флавивирус, реовирусы, паповирус, гепаднавирус и вирус гепатита. Примерами ретровирусов являются: вирус птичьего лейкоза-саркомы, вирусы млекопитающих С-типа, B-типа, вирусы D-типа, группа HTLV-BLV, лентивирус, спумавирус (Coffin J.М., Retroviridae: The viruses and their replication, в: Fundamental Virology, 3-е изд., под ред. В.N. Fields и др., изд-во Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
- Под «лентивирусным вектором» подразумевают лентивирусные векторы на основе ВИЧ, которые являются очень перспективными с точки зрения доставки гена благодаря их относительно большой способности к упаковке, пониженной иммуногенности и их способности стабильно трансдуцировать с высокой эффективностью большой спектр различных типов клеток. Лентивирусные векторы, как правило, создают посредством кратковременной трансфекции клеток-продуцентов тремя (упаковывающая плазмида, оболочечная плазмида и плазмида переноса) или большим количеством плазмид. Подобно ВИЧ, лентивирусные векторы проникают в клетку-мишень посредством взаимодействия гликопротеинов вирусной поверхности с рецепторами на клеточной поверхности. После проникновения вирусная РНК подвергается обратной транскрипции, опосредуемой комплексом вирусной обратной транскриптазы. Продуктом обратной транскрипции является двухцепочечная линейная вирусная ДНК, которая служит субстратом для вирусной интеграции в ДНК инфицированных клеток. Понятие «интегрирующие лентивирусные векторы (или LV)» обозначает, например (но, не ограничиваясь только ими), такие векторы, которые способны интегрироваться в геном клетки-мишени. В противоположность этому, понятие «неинтегрирующие лентивирусные векторы (или NILV)» обозначает эффективные векторы для доставки генов, которые не интегрируются в геном клетки-мишени под действием вирусной интегразы.
- Векторы для доставки и векторы можно объединять или комбинировать с любыми методами клеточной пермеабилизации, такими как сонопорация или электропорация, или вариантами этих методов.
in vitro
- Под клеткой или клетками подразумевают любые эукариотические живые клетки, первичные клетки и клеточные линии, выведенные из указанных организмов для получения культур .
in vitro
- Под «первичной клеткой» или «первичными клетками» подразумевают клетки, взятые непосредственно из живой ткани (т.е. материал, полученный путем биопсии) и подготовленные для выращивания , в популяции которых имело место лишь небольшое количество удвоений, и следовательно они являются более репрезентативными с точки зрения основных функциональных компонентов и характеристик тканей, из которых они происходят, по сравнению с непрерывно поддерживаемыми или искусственно иммортализованными онкогенными клеточными линиями.
Примерами таких клеточных линий могут являться (но, не ограничиваясь только ими) клеточные линии, выбранные из группы, состоящей из клеток линии СНО-K1; клеток линии HEK293; клеток линии Сасо2; клеток линии U2-OS; клеток линии NIH 3Т3; клеток линии NSO; клеток линии SP2; клеток линии CHO-S; клеток линии DG44; клеток линии K-562, клеток линии U-937; клеток линии MRC5; клеток линии IMR90; клеток линии Jurkat; клеток линии HepG2; клеток линии HeLa; клеток линии HT-1080; клеток линии HCT-116; клеток линии Hu-h7; клеток линии Huvec; клеток линии Molt 4.
Все эти клеточные линии можно модифицировать с помощью способа, предлагаемого в настоящем изобретении, создавая модели клеточных линий для получения, экспрессии, количественной оценки, обнаружения, изучения представляющего интерес гена или белка; эти модели можно применять также для скрининга представляющих интерес биологически активных молекул для исследовательских и промышленных целей в различных областях, например, таких как (но, не ограничиваясь только ими) химия, биотопливо, терапевтические средства и агрономия.
- Под «мутацией» подразумевают замену, делецию или инсерцию одного/одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати, пятнадцати, двадцати, двадцати пяти, тридцати, сорока, пятидесяти или большего количества нуклеотидов/аминокислот в полинуклеотидной (кДНК, ген) или полипептидной последовательности. Мутация может влиять на кодирующую последовательность гена или его регуляторную последовательность. Она может влиять также на структуру геномной последовательности или структуру/стабильность кодируемой мРНК.
- Под «вариантом(ами)» подразумевают вариант повтора, вариант, ДНК-связывающий вариант, вариант TALE-нуклеазы, вариант полипептида, полученный в результате мутации или замены по меньшей мере одного остатка в аминокислотной последовательности родительской молекулы.
- Под «функциональным вариантом» подразумевают обладающий каталитической активностью мутант белка или домена белка; такой мутант может обладать такой же активностью, что и родительский белок или домен белка, или дополнительными свойствами, или более высокой или более низкой активностью.
- Понятие «идентичность» относится к идентичности последовательностей двух молекул нуклеиновых кислот или полипептидов. Идентичность можно оценивать путем сравнения положений в каждой из последовательностей, которые можно выравнивать для целей сравнения. Если положение в сравниваемой последовательности занято тем же самым основанием, то молекулы являются идентичными в этом положении. Степень сходства или идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями является функцией количества идентичных или совпадающих нуклеотидов в положениях нуклеотидных последовательностей. Для расчета идентичности двух последовательностей можно использовать различные алгоритмы и/или программы сравнительного анализа первичной структуры последовательностей, включая FASTA или BLAST, которые доступны в виде компонента пакета программ анализа последовательностей GCG (Университет Висконсина, Мэдисон, шт. Висконсин), и их можно применять, например, с использованием задаваемых по умолчанию параметров. Например, можно рассматривать полипептиды, обладающие идентичностью, составляющей по меньшей мере 70%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, с конкретными полипептидами, представленными в настоящем описании, и предпочтительно обладающие практически такими же функциями, а также полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды. Если не указано иное, определение степени сходства базируется на применении матрицы BLOSUM62. При использовании BLASTP процент сходства основан на рассчитанном программой BLASTP балле положительных оценок, а процент идентичности последовательностей основан на рассчитанном BLASTP балле идентичности. Рассчитанные с помощью BLASTP «идентичности» представляют собой количество и пропорцию идентичных остатков относительно общего количества остатков в парах последовательностей с высокими баллами; а рассчитанные с помощью BLASTP «положительные оценки» представляют собой количество и пропорцию остатков, для которых полученные при сравнительном анализе первичной структуры последовательностей баллы являются положительными, и которые сходны друг с другом. В настоящей заявке предложены и подпадают под объем изобретения аминокислотные последовательности, имеющие указанные степени идентичности или сходства, или любую промежуточную степень идентичности или сходства с представленными в настоящем описании аминокислотными последовательностями. Полинуклеотидные последовательности сходных полипептидов выводят с использованием генетического кода и их можно получать с помощью общепринятых методов, в частности, путем обратной трансляции их аминокислотных последовательностей с использованием генетического кода.
- Понятия «домен трансдукции сигнала» или «костимуляторный лиганд» относятся к молекуле на антигенпрезентирующей клетке, которая специфически связывается с когнатной костимуляторной молекулой на T-клетке, обеспечивая тем самым сигнал, который в дополнение к первичному сигналу, обеспечиваемому, например, связыванием комплекса TCR/CD3 с молекулой ГКГС, загруженной пептидом, опосредует T-клеточный ответ, включая (но, не ограничиваясь только ими) активацию пролиферации, дифференцировку и т.п. Костимуляторным лигандом могут служить (но, не ограничиваясь только ими) CD7, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, индуцибельный костимуляторный лиганд (ICOS-L), молекула межклеточной адгезии (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, М1СВ, HVEM, рецептор лимфотоксина бета, 3/TR6, ILT3, ILT4, агонист или антитело, который/которое связывается с лигандом Толл-рецептора, и лиганд, который специфически связывается с В7-Н3. Костимуляторный лиганд включает также, среди прочего, антитело, которое специфически связывается с костимуляторной молекулой, присутствующей на T-клетке, такой как (но, не ограничиваясь только ими) CD27, CD28, 4-1ВВ, ОХ40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, ассоциированный с функцией лимфоцитов антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, В7-Н3, лиганд, который специфически связывается с CD83.
Понятие «костимуляторная молекула» относится к когнатному связывающему партнеру на T-клетке, который специфически связывается с костимуляторным лигандом, опосредуя тем самым костимуляторный ответ клетки, такой как (но, не ограничиваясь только им) пролиферация. Костимуляторные молекулы включают (но, не ограничиваясь только ими) молекулу ГКГС класса I, BTLA и лиганд Толл-рецептора.
В контексте настоящего описания понятие «костимуляторный сигнал» относится к сигналу, который в сочетании с первичным сигналом, таким как сигнал, обусловленный сцеплением TCR/CD3, приводит к пролиферации T-клеток и/или повышающей или понижающей регуляции имеющих решающее значение молекул.
- В контексте настоящего описания понятие «внеклеточный лигандсвязывающий домен» обозначает олиго- или полипептид, который обладает способностью связываться с лигандом. Предпочтительно домен должен обладать способностью взаимодействовать с молекулой клеточной поверхности. Например, можно выбирать внеклеточный лигандсвязывающий домен для распознавания лиганда, который функционирует в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, ассоциированных с конкретным болезненным состоянием. Так, примерами маркеров клеточной поверхности, которые могут функционировать в качестве лигандов, являются маркеры, ассоциированные с вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, аутоиммунным заболеванием и раковыми клетками.
В контексте настоящего описания понятие «индивидуум» или «пациент» включает всех представителей царства животных, в том числе приматов кроме человека и человека.
Понятие «лекарство, применяемое для лечения рака, прежде всего AML» относится к лекарственным средствам, применяемым для лечения рака, прежде всего AML, и они описаны, например, в РСТ/ЕР2015/055848.
В представленном выше описании изобретения изложены подход и способ его осуществления и применения, так что любой специалист в данной области способен осуществлять и применять его, эта возможность относится, прежде всего, к сущности изобретения, изложенной в прилагаемой формуле изобретения, которая представляет собой составную часть исходного описания.
Если в настоящем описании указаны численные пределы или численный диапазон, то они включают их границы. Кроме того, считается, что включены все значения и поддиапазоны, находящиеся в указанных пределах или указанном численном диапазоне, как если бы они были специально указаны.
Приведенное выше описание представлено для того, чтобы дать возможность специалисту в данной области осуществлять и применять изобретение, и оно изложено в контексте конкретного применения и требуемых для этого условий. Специалистам в данной области должны быть очевидны различные модификации предпочтительных вариантов осуществления изобретения, и общие принципы, указанные в нем могут быть применены для других вариантов осуществления изобретения и применений без отклонения от сущности и объема изобретения. Таким образом, не следует считать, что настоящее изобретение ограничено представленными вариантами осуществления изобретения, напротив, оно соответствует наиболее широкому объему, согласующемуся с принципами и отличительными признаками, указанными в настоящем описании.
Общие методы
Инактивация специфического(их) гена(ов) в первичных T-клетках
Инактивацию специфического(их) гена(ов) в первичных T-клетках можно осуществлять до или после интродукции CAR в T-клетки.
По меньшей мере один ген, т.е. один ген или два гена, можно инактивировать на одной стадии или на последовательных стадиях. В предпочтительном варианте осуществления изобретения можно одновременно инактивировать два гена, предпочтительно ген TCRальфа и ген CD33.
В целом, конструируют и получают гетеродимерную TALE-нуклеазу, нацеленную на две длинные последовательности (которые обозначают как полумишени), разделенные спейсером в гене-мишени.
Каждую конструкцию TALE-нуклеазы можно клонировать в приемлемом экспрессионном векторе млекопитающих. мРНК, кодирующую TALE-нуклеазу, которая расщепляет геномную последовательность-мишень, можно синтезировать с использованием плазмиды, несущей кодирующую последовательность, которая расположена в прямом направлении относительно промотора.
Клетки представляют собой очищенные T-клетки, предварительно активированные покрытыми антителом к CD3/CD28 гранулами. Клетки трансфектируют каждой из двух мРНК, кодирующих обе половины TALE-нуклеаз, в частности обе половины TALE-нуклеаз и спейсера. Клетки можно реактивировать растворимым антителом к CD28 для измерения клеточной пролиферации, и определять маркер активации CD25 для оценки статуса активации клеток.
Химерные антигенные рецепторы
Нуклеиновые кислоты-векторы
Нуклеиновую кислоту (мРНК или лентивирусный вектор), кодирующую анти-CD33 CAR, предлагаемый в изобретении, конструируют с получением архитектуры, представленной на фиг. 2 или фиг. 3.
Несущие анти-CD33 CAR лентивирусные векторы можно получать, например, с помощью метода, описанного ранее в WO 2013/176915, WO 2013/176916 или WO 2014/130635, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Лентивирусные векторы получают на фирме Vectalys SA (Тулуза, Франция).
мРНК CAR можно получать с помощью мРНК-полимеразы Т7 и трансфекции осуществлять с использованием технологии Cytopulse.
Скрининг и селекция анти-CD33 CAR
Культуры первичных T-клеток
T-клетки очищают из образцов лейкоцитарных пленок, полученных на фирме EFS (Etablissement Francais du Sang, Париж, Франция), используя среду с градиентом плотности фиколла. Выделяют слой РВМС и T-клетки очищают, используя поступающий в продажу набор для обогащения T-клеток. Очищенные T-клетки активируют в среде X-Vivo™-15 (фирма Lonza), используя человеческий IL-2 и гранулы Dynabeads с активатором человеческих T-клеток CD3/CD28.
Трансфекция мРНК CAR
Трансфекции с использованием мРНК CAR, которая кодирует различные конструкции CAR, осуществляют в день 4 или день 11 после очистки и активации T-клеток.
Трансдукция T-клеток рекомбинантными лентивирусными векторами, обеспечивающими экспрессию CAR
Трансдукцию T-клеток рекомбинантными лентивирусными векторами осуществляют через 3 дня после очистки/активации T-клеток. Лентивирусные векторы получают на фирме Vectalys SA (Тулуза, Франция) путем трансфекции геномными и хелперными плазмидами клеток линии HEK-293. Трансдукции можно осуществлять, используя различную множественность заражения (MOI), в частности, MOI, составляющую 5. Обнаружение CAR на поверхности T-клеток осуществляют, используя рекомбинантный белок, который состоит из внеклеточного домена человеческого белка CD33, слитого с Fc-фрагментом мышиного IgG1 (который получают на фирме LakePharma).
Связывание указанного белка с молекулой CAR определяют с помощью конъюгированного с РЕ (фикоэритрин) вторичного антитела (фирма Jackson Immunoresearch), мишенью которого является белок мышиного Fc-фрагмента.
Анализ дегрануляции (мобилизация CD107a)
+
+
+
T-клетки инкубируют с равным количеством клеток, экспрессирующих различные уровни белка CD33. Совместные культуры поддерживают в течение по меньшей 6 ч. Окрашивание CD107a осуществляют в процессе стимуляции клеток, добавляя флуоресцентное антитело к CD107a в начале совместного культивирования. После периода инкубации, составляющего 6 ч, клетки окрашивают фиксирующим витальным красителем и конъюгированным с флуорохромом антителом к CD8 и анализируют с помощью проточной цитометрии. Дегранулирующую активность определяют в виде % CD8/CD107a-клеток и на основе определения средней интенсивности сигнала флуоресцении (MFI) для окрашивания CD107a в популяции CD8-клеток.
Анализы дегрануляции осуществляют через 24 ч после трансфекции мРНК.
Анализ высвобождения IFN гамма
Через 24 ч после трансфекции мРНК T-клетки, экспрессирующие анти-CD33 CAR, инкубируют вместе с клеточными линиями, экспрессирующими различные уровни белка CD33, в течение 24 ч при 37°C. Супернатанты выделяют и определение IFN гамма в супернатанта клеточных культур осуществляют с помощью ELISA-анализа.
Анализ цитотоксичности
+
-
Экспрессирующие CD33 CAR T-клетки инкубируют вместе с клетками-мишенями (экспрессирующими различные уровни CD33) или (CD33neg)-клетками в одной и той же лунке. CD33-клетки-мишени и контрольные CD33-клетки-мишени метят флуоресцентными внутриклеточными красителями (например, CFSE или Cell Trace Violet) перед совместным культивированием в течение 4 ч при 37°C. После указанного периода инкубации клетки метят фиксирующим витальный красителем и анализируют с помощью проточной цитометрии. Определяют жизнеспособность каждой клеточной популяции (клетки мишени или контрольные CD33neg-клетки) и рассчитывают % удельного клеточного лизиса. Анализы токсичности осуществляют через 48 ч после трансфекции мРНК
Мышиная модель для оценки противоопухолевого действия
+
+
Мышам с иммунодефицитом линии NOG инъецируют внутривенно (iv) клетки, экспрессирующие CD33-люциферазу. Необязательно мышей подвергают противоопухолевой обработке перед инъекцией анти-CD33 CAR-T-клеток. Затем мышам инъецируют iv (например, через 2 или 7 дней после инъекции линии опухолевых клеток) анти-CD33 CAR-T-клетки в тестируемых различных дозах или T-клетки, не трансдуцированные несущим CAR лентивирусным вектором. Биолюминесцентые сигналы определяют в день инъекции T-клеток (D0), в D7, 14, 21, 28 и 40 после инъекции T-клеток, для отслеживания развития опухолей у различных животных.
Имея общее описание настоящего изобретения, можно достигать более полного понимания после ознакомления с некоторыми конкретными примерами, которые представлены в настоящем описании только для целей иллюстрации и не направлены на ограничение объема изобретения, если специально не указано иное.
Примеры
Конструирование CD33 CAR с использованием фрагментов различных антител к CD33
Создавали различные архитектуры CAR (фиг. 3), а именно, V1-V6. В качестве первой стадии создавали 4 различных scFv из антител M195, DRB2, m2H12 и Му9.6 для получения химерных антигенных рецепторов (CAR) (SEQ ID NO: 48-SEQ ID NO: 71) в T-клетках.
Пример 1: Пролиферация клеток с инактивированным TCRальфа, экспрессирующих CD33-CAR
Культуры первичных T-клеток
T-клетки очищали из образцов лейкоцитарных пленок, полученных на фирме EFS (Etablissement  du Sang, Париж, Франция), используя среду с градиентом плотности фиколла. Выделяли слой РВМС и T-клетки очищали, используя поступающий в продажу набор для обогащения T-клеток (фирма Stem Cell Technologies). Очищенные T-клетки активировали в среде X-Vivo™-15 (фирма Lonza), дополненной человеческим IL-2 в концентрации 20 нг/мл, человеческой сывороткой в концентрации 5% и гранулами Dynabeads с активатором человеческих T-клеток CD3/CD28 при соотношении гранулы : клетки 1:1 (фирма Life Technologies). После активации клетки выращивали и поддерживали в среде X-Vivo™-15 (фирма Lonza), дополненной человеческим IL-2 в концентрации 20 нг/мл и человеческой сывороткой в концентрации 5%.
Трансфекция мРНК CAR
2
Трансфекции с использованием каждого CD33 CAR, созданного с использованием фрагментов различных антител к CD33, осуществляли в день 4 или день 11 после очистки и активации T-клеток. 5 миллионов клеток трансфектировали 15 мкг мРНК, кодирующих различные конструкции CAR. мРНК CAR получали, применяя набор mMESSAGE mMACHINE Т7 (фирма Life Technologies) и очищали, используя вращающиеся колонки RNeasy Mini (фирма Qiagen). Трансфекции осуществляли, используя технологию Cytopulse, применяя два импульса по 0,1 мс при 3000 В/см с последующими 4 импульсами по 0,2 мс при 325 В/см в кюветах с расстоянием между электродами 0,4 см в конечном объеме 200 мкл буфера Т для цитопорации («Cytoporation buffer Т») (устройство ВТХ Harvard). Клетки немедленно разводили в среде X-Vivo™-15 (фирма Lonza) и инкубировали при 37°C в атмосфере с 5% СО. IL-2 добавляли через 2 ч после электропорации в концентрации 20 нг/мл.
Трансдукция первичных T-клеток
T-клеточная трансдукция
Трансдукцию T-клеток рекомбинантными лентивирусными векторами, экспрессирующими анти-CD33 CAR, осуществляли через 3 дня после очистки/активации T-клеток. Применяли лентивирусные векторы, полученные на фирме Vectalys SA (Тулуза, Франция). Обнаружение анти-CD33 CAR на поверхности T-клеток осуществляли, используя рекомбинантный белок, который состоит из внеклеточного домена человеческого белка CD33, слитого с Fc-фрагментом мышиного IgG1 (полученного на фирме LakePharma). Связывание указанного белка с молекулой анти-CD33 CAR определяли с помощью конъюгированного с РЕ вторичного антитела (фирма Jackson Immunoresearch), мишенью которого является белок мышиного Fc-фрагмента, и анализировали с помощью проточной цитометрии.
Конструировали и получали гетеродимерную TALE-нуклеазу, нацеленную на две последовательности длиной 17 пар оснований (которые обозначали как полумишени), разделенные состоящим из 15 пар оснований спейсером в гене константной области альфа-цепи T-клеточного рецептора (TRAC). Каждая из полумишеней распознавалась повторами половин TALE-нуклеаз, представленными в таблице 10.
Каждую конструкцию TALE-нуклеазы субклонировали с использованием расщепления рестриктазами в экспрессионном векторе млекопитающих под контролем промотора Т7. мРНК, кодирующую TALE-нуклеазу, которая расщепляла геномную последовательность TRAC, синтезировали с использованием плазмиды, несущей кодирующую последовательность, расположенную в прямом направлении относительно промотора Т7.
NEG
Очищенные T-клетки, предварительно активированные в течение 72 ч покрытыми антителом к CD3/CD28 гранулами, трансфектировали каждой из 2 мРНК, кодирующих обе половины TRAC_T01 TALE-нуклеаз. Через 48 ч после трансфекции различные группы T-клеток из одного и того же донора соответственно трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим один из ранее описанных CD33 CAR (SEQ ID NO: 19-42). Через 2 для после трансдукции CD3-клетки очищали с использованием покрытых антителом к CD3 магнитных гранул и через 5 дней после трансдукции клетки реактивировали растворимым антителом к CD28 (5 мкг/мл).
Мониторинг клеточной пролиферации осуществляли в течение периода времени вплоть до 30 дней после реактивации, подсчитывая количество клеток 2 раза в неделю. Обнаружено увеличение пролиферации клеток с инактивированным TCR альфа, экспрессирующих CD33 CAR, прежде всего в том случае, когда их реактивировали антителом к CD28, по сравнению с нетрансдуцированными клетками.
Для изучения вопроса о том, находятся ли человеческие T-клетки, экспрессирующие CD33 CAR, в активированном состоянии, анализировали экспрессию маркера активации CD25 с помощью FACS через 7 дней после трансдукции. Очищенные клетки, трансдуцированные лентивирусным вектором, кодирующим CD33 CAR, экспрессировали значительно в большем количестве CD25 на своей поверхности, чем нетрансдуцированные клетки. Повышенный уровень экспрессии CD25 обнаружен как в условиях после реактивации антителом к CD28, так и в условиях без реактивации.
В настоящем изобретении предложна экспрессирующая CD33-специфический CAR T-клетка, у которой количество TCR на клеточной поверхности находится на уровне ниже предела обнаружения.
Пример 2
Инактивация гена CD33
Для инактивации гена CD33 конструировали и получали гетеродимерную TALE-нуклеазу, нацеленную на две последовательности (обозначенные как последовательность, связывающаяся левой TALEN, и последовательность, связывающаяся правой TALEN, см. таблицу), разделенные состоящим из 10 или 15 пар оснований спейсером, в гене CD33, согласно описанному ниже методу. Каждая из полумишеней распознавалась повторами TALE-нуклеаз, представленными в таблице 11. Затем конструкции одновременно интродуцировали в T-клетки и вместе с конструкциями, созданными для инактивации гена TCR альфа.
В образовавшихся клетках внеклеточный домен CD33 укорочен. Двойное окрашивание образовавшихся клеток и анализ методом проточной цитометрии продемонстрировали снижение уровня экспрессии на клеточной поверхности CD33 и TCR по сравнению с контрольными (трансфектированными имитатором) клетки.
Альтернативно этому, для инактивации CD33 можно применять очищенные TCR KO T-клетки, предварительно активированные в течение 72 ч покрытыми антителом к CD3/CD28 гранулами. Для определения активированного состояния человеческих TCR KO T-клеток и CD33 KO T-клеток, экспрессирующих CD33 CAR, экспрессию маркера активации CD25 анализировали с помощью FACS через 7 дней после трансфекции.
Можно получать экспрессирующие анти-CD33 CAR T-клетки и анти-CD33 CAR T-клетки, в которых инактивирован ген TCR альфа и/или CD33 и в которых CAR соответствует архитектурами V1, V3 и V5.
Для удобства клетки обозначали как «T-клетки» или «CD33 CAR».
Пример 3
Дегранулирующая активность CD33 CAR, созданных с использованием фрагментов различных антител к CD33
Активность описанных выше конструкций V1, V3 и V5 M195, m2H12 и Му9.6 сначала определяли после кратковременной экспрессии в человеческих первичных T-клетках.
Анализ дегрануляции (мобилизация CD 107а)
2
+
+
+
Затем T-клетки инкубировали в 96-луночных планшетах (40000 клеток/лунку) вместе с равным количеством клеток, экспрессирующих различные уровни белка CD33. Совместные культуры поддерживали в конечном объеме 100 мкл среды X-Vivo™-15 (фирма Lonza) в течение 6 ч при 37°C в атмосфере с 5% СО. Окрашивание CD 107а осуществляли в процессе стимуляции клеток, добавляя флуоресцентное антитело к CD 107а в начале совместного культивирования, вместе с антителом к CD49d в концентрации 1 мкг/мл, антителом к CD28 в концентрации 1 мкг/мл, и 1-кратным раствором монензина. После периода инкубации, составляющего 6 ч, клетки окрашивали фиксирующим витальным красителем и конъюгированным с флуорохромом антителом к CD8 и анализировали с помощью проточной цитометрии. Дегранулирующую активность определяли в виде % CD8/CD107a-клеток и на основе определения средней интенсивности сигнала флуоресцении (MFI) для окрашивания CD 107а в популяции CD8-клеток. Анализы дегрануляции осуществляли через 24 ч после трансфекции мРНК.
Из сконструированных молекул CAR, проиллюстрированных на фиг. 3, девять тестировали в отношении их дегранулирующей активности (фиг. 4 - фиг. 6) и семь из них подвергали дополнительным тестам оценки активности: высвобождение интерферона гамма и клеточный лизис (фиг. 7 и фиг. 8).
+
Измеряли дегранулирующую активность каждого из CAR, содержащего scFv М195, m2H12 или Му9.6 в одной из трех архитектур (v1: шарнир FcgRIII/трансмембранный домен CD8, v3: шарнир CD8/трансмембранный домен CD8 или v5: шарнир IgG1/трансмембранный домен CD8), при совместном культивировании CAR-T-клеток в течение 6 ч с экспрессирующими CD33 клетками (U937) или клетками с неподдающимся обнаружению уровнем CD33 (Jeko или Jeko-1). Результаты проиллюстрированы на фиг 4-фиг. 6.
+
+
+
На фиг. 4 представлены данные о дегранулирующей активности (% CD8/CD107a-клеток и MFI CD 107а в CD8-клетках) scFv M195 с тремя архитектурами (v1: шарнир FcgRIII/трансмембранный домен CD8, v3: шарнир CD8/трансмембранный домен CD8, v5: шарнир IgG1/трансмембранный домен CD8), полученные при совместном культивировании CAR-T-клеток в течение 6 ч с экспрессирующими CD33 клетками (U937) или с клетками, которые не экспрессируют CD33 (Jeko). Данные представлены в виде процента (%) дегрануляции и средней интенсивности флуоресценции (MFI).
+
+
+
На фиг. 5 представлены данные о дегранулирующей активности (% CD8/CD107a-клеток и MFI CD 107а в CD8-клетках) scFv m2H12 и Му9.6 с тремя архитектурами (v1: шарнир FcgRIII/трансмембранный домен CD8, v3: шарнир CD8/трансмембранный домен CD8, v5: шарнир IgG1/трансмембранный домен CD8), полученные при совместном культивировании CAR-T-клеток в течение 6 ч с экспрессирующими CD33 клетками (U937) или с клетками, которые не экспрессируют CD33 (Jeko). Данные представлены в виде процента (%) дегрануляции и средней интенсивности флуоресценции (MFI).
+
+
На фиг. 6 представлены данные о дегранулирующей активности (% CD8/CD107a-клеток) 7 конструкций: M195-V1, M195-V3, M195-V5, m2H12-V1, m2H12-V3, My9.6-V1 и My9.6-V3 (v1: шарнир FcgRIII/трансмембранный домен CD8, v3: шарнир CDS/трансмембранный домен CD8, v5: шарнир IgG1/трансмембранный домен CD8), полученные при совместном культивировании CAR-T-клеток в течение 6 ч с клетками, экспрессирующими высокие или средние уровни CD33 (U937 и K562 соответственно), или с клетками, которые не экспрессируют CD33 (Jeko-1). Данные представлены в виде процента (%) дегрануляции и среднего уровня флуоресценции.
Высвобождение интерферона гамма и лизис клеток, индуцированный T-клетками, которые экспрессируют CD33 CAR, созданный с использованием scFv-фрагментов антител к CD33, полученных из М195, М2Н12 и Му9.6
Для указанной цели выделяли T-клетки из различных доноров, используя образцы лейкоцитарных пленок, и активировали, применяя CD3/CD28-гранулы. Клетки кратковременно трансфектировали мРНК, которые кодируют различные кандидаты, в D11 после активации.
Активность CAR оценивали, измеряя высвобождение IFN-гамма и цитотоксическую активность при совместном культивировании с клетками, экспрессирующими различные уровни CD33, следующим образом.
Анализ высвобождения IFN гамма
2
T-клетки, экспрессирующие анти-CD33 CAR, инкубировали в 96-луночных планшетах (40000 клеток/лунку) вместе с клеточными линиями, экспрессирующими различные уровни белка CD33. Совместные культуры поддерживали в конечном объеме 100 мкл среды X-Vivo™-15 (фирма Lonza) в течение 24 ч при 37°C в атмосфере с 5% СО. После указанного периода инкубации планшеты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин и супернатанты переносили в новый планшет. Обнаружение IFN гамма в супернатантах клеточных культур осуществляли с помощью ELISA-анализа. Анализы высвобождения IFN гамма осуществляли в начале совместного культивирования клеток через 24 ч после трансфекции мРНК.
На фиг. 7 представлены данные о количестве IFN, высвободившегося экспрессирующими анти-CD33 CAR T-клетками при совместном культивировании в течение 24 ч с клетками, экспрессирующими различные уровни CD33 (U937 и K562), или с клетками, которые не экспрессируют CD33 (Jeko-1). Представлены также данные о высвобождении IFN-гамма из популяции T-клеток, культивируемых в таких же условиях индивидуально. Эксперименты осуществляли с использованием образцов трех независимых доноров, и представлены результаты, полученные для одного репрезентативного донора.
+
Затем тестировали T-клетки, экспрессирующие CD33 CAR, для создания которых использовали scFv фрагменты антител к CD33, полученные из M195, М2Н12 и Му9.6, в отношении их способности вызывать лизис экспрессирующих CD33 (CD33) раковых клеток-мишеней (U937: клетка человеческой лейкемической моноцитарной лимфомы и K562: клетка человеческого лейкоза, полученная из пациента с хроническим миелогенным лейкозом (CML)) следующим образом.
Анализ цитотоксичности
+
2
T-клетки, экспрессирующие анти-CD33 CAR, инкубировали в 96-луночных планшетах (100000 клеток/лунку) вместе с 10000 клеток-мишеней (экспрессирующих CD33) и 10000 контрольных (CD33neg) клеток в одной и той же лунке. Клетки-мишени и контрольные клетки метили флуоресцентными внутриклеточными красителями (CFSE или Cell Trace Violet) перед их совместным культивированием с CAR-T-клетками. Совместные культуры инкубировали в течение 4 ч при 37°C в атмосфере с 5% СО. После указанного периода инкубации клетки метили фиксирующим витальным красителем и анализировали с помощью проточной цитометрии. Определяли жизнеспособность каждой клеточной популяции (клетки-мишени или контрольные CD33neg-клетки) и рассчитывали % удельного клеточного лизиса. Анализы цитотоксичности осуществляли через 48 ч после трансфекции мРНК.
На фиг. 8 представлены данные об удельной цитолитической активности экспрессирующих CD33 CAR T-клеток. Анализы осуществляли через 48 ч после трансфекции мРНК CAR. T-клетки совместно культивировали с клетками U937+Jeko или K562+Jeko в течение 4 ч. Определяли жизнеспособность клеток для каждой клеточной линии в конце периода совместного культивирования и рассчитывали процент удельного клеточного лизиса.
Установлено, что все конструкции обладали активностью, при этом для Му9.6 V3 (Му9.6-3, SEQ ID NO: 68) CAR обнаружена более высокая общая активность относительно контроля, чем в случае других CAR.
В вышеприведенных примерах продемонстрировано, что приведенные в качестве примера структуры CAR (V1, V3 и V5), которые содержат последовательность VH-линкер-VL, связывающуюся с CD33, обладали активностью во всех анализах.
Установлено, что CAR, имеющие структуры V1 и V3, оказались наиболее активными при оценке с помощью анализа дегранруляции, анализа высвобождения INFγ и анализа цитотоксичности (см. фиг. 4-8).
Таким образом, в настоящем изобретении предложны экспрессирующие анти-CD33 CAR T-клетки, обладающие активностью в отношении раколвых клеток.
Примеры полипептидных последовательностей CAR:
М195-1
М195-2
М195-3
М195-4
М195-5
М195-6
m2H12-l
m2H12-2
m2H12-3
m2H12-4
m2H12-5
m2H12-6
DRB2-1
DRB2-2
DRB2-3
DRB2-4
DRB2-5
DRB2-6
My9.6-1
My9.6-2
My9.6-3
My9.6-4
My9.6-5
My9.6-6
Ссылки
Arimondo Р.В., С.J. Thomas и др., "Exploring the cellular activity of camptothecin-triple-helix-forming oligonucleotide conjugates", Mol Cell Biol 26(1), 2006, cc. 324-333.
Atkins J.F., N.M. Wills и др., "A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go)", Rna 13(6), 2007, cc. 803-810.
Bierer В.E., G. Hollander и др., "Cyclosporin A and FK506: molecular mechanisms of immunosuppression and probes for transplantation biology", Curr Qpin Immunol 5(5), 1993, cc. 763-773.
Boch J., H. Scholze и др., "Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors", Science 326(5959), 2009, cc. 1509-1512.
Choulika A., A. Perrin и др., "Induction of homologous recombination in mammalian chromosomes by using the I-SceI system of Saccharomyces cerevisiae", Mol Cell Biol 15(4), 1995, cc. 1968-1973.
Christian M., T. Cermak и др., "Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases", Genetics 186(2), 2010, cc. 757-761.
Cong L., F.A. Ran и др., "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems", Science 339(6121), 2013, cc. 819-823.
Cros E. и др., "Problems related to resistance to cytarabine in acute myeloid leukemia", Leukemia & Lymphoma. 45(6), 2004, cc. 1123-1132.
Deltcheva E., K. Chylinski и др., "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III". Nature 471(7340). 2011, cc. 602-607.
Donnelly M. и G. Elliott, "Nuclear localization and shuttling of herpes simplex virus tegument protein VP13/14", J Virol 75(6), 2001, cc. 2566-2574.
Doronina V.A., C. Wu и др., "Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon", Mol Cell Biol 28(13), 2008, cc. 4227-4239.
Eisenschmidt K., T. Lanio и др., "Developing a programmed restriction endonuclease for highly specific DNA cleavage", Nucleic Acids Res 33(22), 2005, cc. 7039-7047.
Gardin С. и др., "Postremission treatment of elderly patients with acute myeloid leukemia in first complete remission after intensive induction chemotherapy : results of the multicenter randomized Acute Leukemia French Association (ALFA) 9803 trial", Blood. 109(12), 2007, cc. 5129-5135.
Garneau J.E., M.E. Dupuis и др., "The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA", Nature 468(7320), 2010, cc. 67-71.
Gasiunas G., R. Barrangou и др., "Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria", Proc Natl Acad Sci USA 109(39), 2012, cc. E2579-2586.
Henderson D.J., I. Naya и др., "Comparison of the effects of FK-506, cyclosporin A and rapamycin on IL-2 production", Immunology 73(3), 1991, cc. 316-321.
Jena В., G. Dotti и др., "Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor", Blood 116(7), 2010, cc. 1035-1044.
Jinek M., K. Chylinski и др., "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity", Science 337(6096), 2012, cc. 816-821.
June С.H. и др., "T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia", Sci. Transl. Med. 3(95):ra73, 2011.
Kalish J.M. и P.M. Glazer, "Targeted genome modification via triple helix formation", Ann N Y Acad Sci 1058, 2005, cc. 151-161.
Li Т., S. Huang и др., "TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain", Nucleic Acids Res 39(1), 2011, cc. 359-372.
Liu J., M.W. Albers и др., "Inhibition of T cell signaling by immunophilin-ligand complexes correlates with loss of calcineurin phosphatase activity", Biochemistry 31(16). 1992, cc. 3896-38901.
Mali P., L. Yang и др., "RNA-guided human genome engineering via Cas9", Science 339(6121), 2013, cc. 823-826.
Maniecki M.B. и др., "Is hepatotoxicity in patients treated with gemtuzumabozogamicin due to specific targeting of hepatocytes?", Leukemia Research. 2011, cc. e84-e86.
Moscou M.J. и A.J. Bogdanove, "A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors", Science 326(5959), 2009, c. 1501.
Paques F. и P. Duchateau, "Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy", Curr Gene Ther 7(1), 2007, cc. 49-66.
Park T.S., S.A. Rosenberg т др., "Treating cancer with genetically engineered T cells", Trends Biotechnol 29(11), 2011, cc. 550-557.
Peipp M., D. Saul и др., "Efficient eukaryotic expression of fluorescent scFv fusion proteins directed against CD antigens for FACS applications", J Immunol Methods 285(2), 2004, cc. 265-280.
Perrin A., M. Buckle и др., "Asymmetrical recognition and activity of the I-Scel endonuclease on its site and on intron-exon junctions", Embo J 12(7), 1993, cc. 2939-2947.
Pingoud А. и G.H. Silva, "Precision genome surgery", Nat Biotechnol 25(7), 2007), cc. 743-744.
Porteus M.H. и D. Carroll, "Gene targeting using zinc finger nucleases", Nat Biotechnol 23(8), 2005, cc. 967-973.
Rouet P., F. Smih и др, "Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease", Mol Cell Biol 14(12), 1994, cc. 8096-8106.
Schwemmlein M. и др., "A CD33-specific single-chain immunotoxin mediates potent apoptosis of cultured human myeloid leukaemia cells", British Journal of Haematology. 133(2), 2006, cc. 141-151
Sorek R., С.M. Lawrence и др., "CRISPR-mediated Adaptive Immune Systems in Bacteria and Archaea", Annu Rev Biochem., 2013.
Stoddard B.L., "Homing endonuclease structure and function", Q Rev Biophys 38(1), 2005, cc. 49-95.
Vitale С. и др., «Surface expression and function of p75/AIRM-1 or CD33 in acute myeloid leukemias: engagement of CD33 induces apoptosis of leukemic cells», PNAS 98. 2001, cc. 5764-5769.