ГЕТЕРОАРИЛ ПИРИДОНЫ И АЗАПИРИДОНЫ С ЭЛЕКТРОФИЛЬНОЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬЮ
HETEROYRYL PYRIDONES AND AZAPIRIDONS WITH ELECTROPHILIC FUNCTIONALITY

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение в основном относится к соединениям для лечения нарушений, опосредованных тирозинкиназой Брутона (Btk), включая воспаление, иммунологическое и раковое, и более конкретно к соединениям, которые ингибируют активность Btk. Настоящее изобретение также относится к способам применения соединений для in vitro, in situ, и in vivo диагностики или лечения клеток млекопитающих, или ассоциированных патологических состояний.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Протеинкиназы, крупнейший семейство ферментов человека, охватывает более 500 белков. Тирозинкиназа Брутона (Btk) является членом семейства Тес тирозинкиназ и является регулятором раннего развития В-клеток, а также активации сигнализации и выживания зрелых В-клеток.
В-клеточная сигнализация через рецептор В-клеток (BCR) может привести к широкому диапазону биологических эффектов, которые, в свою очередь, зависят от стадии развития В-клетки. Величина и длительность сигналов BCR должны точно регулироваться. Аберрантный BCR-опосредованный сигналинг может привести к разрегуляции активации В-клеток и/или образованию патогенных аутоантител, приводящих к множественным аутоиммунным и/или воспалительным заболеваниям. Мутация Btk в организме человека приводит к сцепленной с X хромосомой агаммаглобулинемии (XLA). Это заболевание связано с нарушением созревания В-клеток, пониженной продукции иммуноглобулинов, аномальным Т-клеточнонезависимым иммунным реакциям и характеризуется ослаблением устойчивого признака кальция при BCR стимуляции. Подтверждение роли Btk при аллергических заболеваниях и/или аутоиммунных заболеваниях и/или воспалительных заболеваниях была установлена на Btk-дефицитных мышиных моделях. Например было показано, что в стандартных доклинических мышиных моделях системной красной волчанки (СКВ) дефицит Btk приводит к заметному облегчению прогрессирования заболевания. К тому же, Btk дефицитные мыши также могут быть устойчивы к развитию индуцированного коллагеном артрита и могут быть менее чувствительны к стафилококк-индуцированному артриту. Большое количество доказательств подтверждает роль В-клеток и гуморальной иммунной системы в патогенезе аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний. Терапевтические средства на основе белков (таких как Ритуксан, Genentech / Biogen Idec), разработанные для уничтожения В-клеток, являются одним из вариантов лечения ряда аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний. Из-за роли Btk в активации В-клеток, ингибиторы Btk могут быть использованы в качестве ингибиторов опосредованной В-клетками патогенной активности (например, образование аутоантител). Btk также экспрессируется в остеокластах, тучных клетках и моноцитах, и было показано, что эта киназа важна для функционирования указанных клеток. Например, дефицит Btk у мышей связан с нарушением активации IgE-опосредованной активацией тучных клеток (заметное уменьшение высвобождения TNF-альфа и других воспалительных цитокинов), а дефицит Btk у людей ассоциируется со значительным уменьшением производства TNF-альфа активированными моноцитами.
Таким образом, ингибирование активности Btk может быть полезным для лечения аллергических заболеваний и/или аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний, таких как: СКВ, ревматоидный артрит, множественные васкулиты, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), миастения, аллергический ринит и астма (Di Paolo et al. (2011) Nature Chem. Biol. 7 (1): 41-50; Liu (2011) Drug Metab. and Disposition 39(10): 1840-1849; Liu et al. (2011) Jour, of Pharm. and Exper. Ther. 338 (1): 154-163; Lou et al. (2012) J. Med. Chem. 55 (10): 4539-4550; Farooqui et al. (2013) Expert Opinion on Orphan Drugs, Volume: 1, Issue: 11: 925-933). Кроме того, сообщалось, что Btk участвует в апоптозе; таким образом, ингибирование активности Btk может быть полезным для рака, а также для лечения В-клеточной лимфомы, лейкемии и других гематологических опухолей (US 7514444). С учетом роли Btk в функционировании остеокластов, ингибирование активности Btk может быть полезным для лечения костных нарушений, таких как остеопороз. Были зарегистрированы специфические ингибиторы Btk (US 7884108, WO 2010/056875; US 7405295; US 7393848; WO 2006/053121; US 7947835; US 2008/0139557; US 7838523; US 2012/0040949; US 2012/0295885; US 2013/0045965; US 7683064; US 7902194; US 7906509; US 8124604; US 2008/0125417; US 2011/0118233; WO 2011/140488; US 2012/0010191; WO 2013/067274; US 2013/0116235; WO 2013/067277; US 2013/0116245; WO 2013/067260; US 2013/0116262; WO 2013/067264; US 2013/0116246.
Необратимые ингибиторы обеспечивают мощное и селективное ингибирование ферментов тирозинкиназ и могут преодолеть резистивность опухоли, встречаемую для обратимых ингибиторов тирозинкиназ (Carmi et al. (2012) Biochem. Pharmacol. 84 (11): 1388-1399). Ощутимые преимущества необратимого связывания мишени посредством образования ковалентной связи ингибитора с мишенью являются эффективность, способность преодолевать конкуренцию и внутриклассовая селективность. Характерные недостатки включают мишень и мутационнозависимые ответы и токсичность. Необратимые ингибиторы инактивируют свою мишень-белок через ковалентное взаимодействие с нуклеофильным остатком цистеина в пределах нуклеотид-связывающего кармана киназного домена. Были разработаны различные необратимые ингибиторы тирозинкиназы, направленные против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), тирозинкиназу Брутона (Btk), рецептора сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR) и тирозинкиназы рецептора фактора роста фибробластов (FGFR) и некоторые из них были использованы клинически в качестве противораковых агентов.
Сообщалось o соединениях, которые образуют ковалентные связи с Btk (US 7514444; US 8088781), включая ибрутиниб (IMBRUVICA, Pharmacyclics, Sunnyvale, СА, Janssen Biotech, Inc., Raritan, NJ) который был одобрен FDA для лечения пациентов с злокачественными В-клеточными опухолями, лимфомы мантийных клеток (MCL). Ибрутиниб также показал клиническую эффективность при хроническом лимфолейкозе (CLL) и мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы (SLL). Также PF-112 (Pfizer, Inc.) представляет собой ковалентно-обратимый ингибитор Btk, который был разработан для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится в основном к гетероарилпиридоновым и аза-пиридоновым амидным соединения с электрофильной функциональностью и активностью модулирования тирозинкиназ Брутона (Btk), обладающим структурой Формулы I:
включая их стереоизомеры, таутомеры, или фармацевтически приемлемые соли. Различные заместители определены в настоящем изобретении.
Одним аспектом настоящего изобретения является соединение Формулы I, которое ковалентно связывается с Btk.
Другим аспектом настоящего изобретения является соединение Формулы I, селективно связывающаяся с Btk и тирозинкиназами, обладающими остатком цистеина в положении, которое является гомологичным положению цистеина 481 в Btk.
В одном воплощении, соединение Формулы I селективно и необратимо ингибирует активированные формы его целевой тирозинкиназы (например, фосфорилированную форму тирозинкиназы). Например, активированная Btk является трансфосфорилированной по тирозину 551. Так, в этих воплощениях необратимый ингибитор Btk ингибирует целевую киназу в клетках, только если целевая киназа в клетках активирована сигнальными событиями.
В одном из воплощений соединение Формулы I обладает группой акцептором Михаэля.
Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая соединение Формулы I и фармацевтически приемлемый носитель, глидант, разбавитель или эксципиент. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать второй терапевтический агент.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения фармацевтической композиции, который включает комбинирование соединения Формулы I с фармацевтически приемлемым носителем, глидантом, разбавителем или эксципиентом.
Другим аспектом изобретения является способ лечения заболевания или нарушения, который включает введение терапевтически эффективного количества соединения Формулы I пациенту с заболеванием или нарушением, выбранным из иммунных нарушений, рака, сердечно-сосудистого заболевания, вирусной инфекции, воспаления, метаболических нарушений/нарушений эндокринной функции и неврологических нарушений, и опосредованной тирозинкиназой Брутона.
Настоящее изобретение включает набор для лечения состояния, опосредованного тирозинкиназой Брутона, содержащий: а) первую фармацевтическую композицию, содержащую соединение Формулы I; и b) инструкцию для применения.
Настоящее изобретение включает соединение Формулы I для применения в качестве лекарственного средства, и для применения в лечении заболевания или нарушения, выбранного из иммунных нарушений, рака, сердечно-сосудистого заболевания, вирусной инфекции, воспаления, метаболических нарушений/нарушений эндокринной функции и неврологических нарушений, и опосредованной тирозинкиназой Брутона.
Настоящее изобретение включает соединение Формулы I для применения в качестве лекарственного средства.
Настоящее изобретение включает соединение Формулы I для применения при лечении заболеваний или нарушений, выбранных из иммунных нарушений, рака, сердечно-сосудистого заболевания, вирусной инфекции, воспаления, метаболических нарушений/нарушений эндокринной функции и неврологических нарушений, и опосредованной тирозинкиназой Брутона.
Настоящее изобретение включает соединение Формулы I для применения в комбинации с дополнительным терапевтическим агентом при лечении заболевания или нарушения.
Настоящее изобретение включает применение соединения Формулы I для производства лекарственного средства для лечения иммунных нарушений, рака, сердечно-сосудистого заболевания, вирусной инфекции, воспаления, метаболических нарушений/нарушений эндокринной функции и неврологических нарушений, и где лекарственное средство опосредует тирозинкиназу Брутона.
Настоящее изобретение включает применение соединения Формулы I для лечения иммунных нарушений, рака, сердечно-сосудистого заболевания, вирусной инфекции, воспаления, метаболических нарушений/нарушений эндокринной функции и неврологических нарушений, и где лекарственное средство опосредует тирозинкиназу Брутона.
Настоящее изобретение включает способы получения соединения Формулы I.
Настоящее изобретение включает изобретение, как здесь описано.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВОПЛОЩЕНИЙ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее будут раскрыты в деталях определенные воплощения изобретения, примеры которого проиллюстрированы в сопутствующих структурах и формулах. Несмотря на то, что изобретение будет описано в отношении перечисленных воплощений, подразумевается, что они не предназначены для ограничения изобретения этими воплощениями. Напротив, изобретение предназначено для того, чтобы охватить все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем настоящего изобретения как определено формулой изобретения. Квалифицированный в уровне техники специалист осознает множество способов и материалов, подобных или эквивалентных описанным в настоящем изобретении, которые могут использоваться в практике настоящего изобретения. Настоящее изобретение никоим образом не ограничено описанными способами и материалами. В случае, когда один или более из использованных литературных источников информации, патентов и подобных им материалов отличаются от или противоречат настоящему описанию, включая, но не ограничиваясь, раскрытыми терминами, использованием терминов, описанными методиками и т.п., толкование согласно настоящему изобретению является основным. Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, обычно понимаемое специалистом в области техники, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то, что способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным здесь, можно использовать на практике или при тестировании изобретения подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, включены в качестве ссылки во всей их полноте. Номенклатура, используемая в данной заявке, основана на систематической номенклатуре ИЮПАК, если не указано иное.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Определения стандартных химических терминов можно найти в референсных работах, включая McMurry "ORGANIC CHEMISTRY Fifth ED." (2000) Brooks/Cole, Pacific Grove.
При указании числа заместителей, термин "один или более" обозначает диапазон от одного заместителя, до максимально возможного числа замещения, т.е. замену одного атома водорода до замены всех атомов водорода на заместители. Термин "заместитель" обозначает атом или группу атомов заменяющих атом водорода на родительской молекуле. Термин "замещенный" означает, что указанная группа несет один или несколько заместителей. Если какая-либо группа может нести несколько заместителей и предложены разные возможные заместители, заместители выбраны независимо и не должны быть одинаковыми. Термин "незамещенный" означает, что указанная группа не несет заместителей. Термин "возможно замещенный" означает, что указанная группа является незамещенной или замещена одним или более заместителями, независимо выбранными из группы возможных заместителей. При указании числа заместителей, термин "один или более" означает от одного заместителя до максимально возможного числа замещения, т.е. от замены одного атома водорода до замены всех атомов водорода на заместители.
1
12
1
8
1
6
3
2
3
2
2
3
3
2
2
2
2
3
2
3
2
3
2
3
3
3
2
2
2
2
3
3
2
2
3
2
3
2
3
2
2
3
3
3
2
2
2
3
2
2
3
2
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
2
3
2
2
3
3
2
2
2
3
3
3
2
3
3
2
3
2
3
2
3
2
2
3
3
2
3
2
3
2
3
3
3
Термин "алкил", как здесь используется, относится к насыщенному линейному или разветвленному моновалентному углеводородному радикалу из одного-двенадцати атомов углерода (C-C), где алкильный радикал может быть возможно замещенным одним или более заместителей, описанных ниже. В другом воплощении, алкильный радикал состоит из одного - восьми атомов углерода (C-C), или одного-шести атомов углерода (C-C). Примеры алкильных групп включают, но не ограничены до, метил (Me, -CH), этил (Et, -CHCH), 1-пропил (n-Pr, n-пропил, -CHCHCH), 2-пропил (i-Pr, изопропил, -CH(CH)), 1-бутил (n-Bu, н-бутил, -CHCHCHCH), 2-метил-1-пропил (i-Bu, изобутил, -CHСН(CH)), 2-бутил (s-Bu, втор-бутил, -CH(CH)CHCH), 2-метил-2-пропил (t-Bu, трет-бутил, -C(CH)), 1-пентил (н-пентил, -CHCHCHCHCH), 2-пентил (-CH(CH)CHCHCH), 3-пентил (-CH(CHCH)), 2-метил-2-бутил (-С(CH)CHCH), 3-метил-2-бутил (-CH(CH)СН(CH)), 3-метил-1-бутил (-CHCHСН(CH)), 2-метил-1-бутил (-CHСН(CH)CHCH), 1-гексил (-CHCHCHCHCHCH), 2-гексил (-CH(CH)CHCHCHCH), 3-гексил (-CH(CHCH)(CHCHCH)), 2-метил-2-пентил (-С(CH)CHCHCH), 3-метил-2-пентил (-CH(CH)СН(CH)CHCH), 4-метил-2-пентил (-CH(CH)CHСН(CH)), 3-метил-3-пентил (-С(CH)(CHCH)), 2-метил-3-пентил (-CH(CHCH)СН(CH)), 2,3-диметил-2-бутил (-С(CH)СН(CH)), 3,3-диметил-2-бутил (-CH(CH)С(CH), 1-гептил, 1-октил, и т.п.
1
12
1
8
1
6
2
2
2
2
2
2
Термин "алкилен", как здесь используется, относится к насыщенному линейному или разветвленному двухвалентному углеводородному радикалу из одного-двенадцати атомов углерода (C-C), где алкиленовый радикал может быть возможно замещенным одним или более заместителей, описанных ниже. В другом воплощении, алкиленовый радикал состоит из одного-восьми атомов углерода (C-C), или одного-шести атомов углерода (C-C). Примеры алкиленовых групп включают, но не ограничены до, метилен (-CH-), этилен (-CHCH-), пропилен (-CHCHCH-), и т.п..
2
8
2
2
2
2
Термин "алкенил" относится к линейному или разветвленному моновалентному углеводородному радикалу из двух-восьми атомов углерода (C-C) с по меньшей мере одним участком ненасыщенности, т.е. углерод-углерод sp двойной связью, где алкениловый радикал может быть возможно замещенным одним или более заместителей описанных здесь, и включает радикалы, обладающие "цис" и "транс" ориентацией, или альтернативно, "Е" и "Z" ориентациями. Примеры включают, но не ограничены до, этиленил или винил (-CH=CH), аллил (-CHСН=CH), и т.п.
2
8
2
2
Термин "алкенилен" относится к линейному или разветвленному дивалентному углеводородному радикалу из двух-восьми атомов углерода (С-C) с по меньшей мере одним участком ненасыщенности, т.е. углерод-углерод sp двойной связью, где алкениловый радикал может быть возможно замещенным одним или более заместителей описанных здесь, и включает радикалы, обладающие "цис" и "транс" ориентацией, или альтернативно, "Е" и "Z" ориентациями. Примеры включают, но не ограничены до, этиленилен или винилен (-C=CH-), аллил (-CHС=CH-), и т.п.
2
8
2
Термин "алкинил" относится к линейному или разветвленному моновалентному углеводородному радикалу из двух-восьми атомов углерода (C-C) с по меньшей мере одним участком ненасыщенности, т.е. углерод-углерод, sp тройной связью, где алкениленовый радикал может быть возможно замещенным одним или более заместителей, описанных здесь. Примеры включают, но не ограничены до, этинил (-С≡СH), пропинил (пропаргил, -CHC≡CH), и т.п.
2
8
2
Термин "алкинилен" относится к линейному или разветвленному дивалентному углеводородному радикалу из двух-восьми атомов углерода (C-С) с по меньшей мере одним участком ненасыщенности, т.е. углерод-углерод, sp тройной связью, где алкениленовый радикал может быть возможно замещенным одним или более заместителей, описанных здесь. Примеры включают, но не ограничены до, этинилен (-C≡С-), пропинилен (пропаргилен, -CHС≡С-), и т.п..
3
12
Термины "карбоцикл", "карбоциклил", "карбоциклическое кольцо" и "циклоалкил" относятся к моновалентному неароматическому, насыщенному или частично насыщенному кольцу, обладающему от 3 до 12 атомов углерода (C-C) в виде моноциклического кольца или от 7 до 12 атомов углерода в виде бициклического кольца. Бициклические карбоциклы, обладающие от 7 до 12 атомами могут быть организованы в виде, например, бицикло [4,5], [5,5], [5,6] или [6,6] систем, и бициклические карбоциклы, обладающие 9-10 кольцевыми атомами могут быть организованы в виде бицикло [5,6] или [6,6] систем, или в виде мостиковых систем, таких как бицикло[2.2.1]гептан, бицикло[2.2.2]октан и бицикло[3.2.2]нонан. Спиро остатки также входят в понятие данного термина. Примеры моноциклических карбоциклов включают, но не ограничены до, циклопропил, циклобутил, циклопентил, 1-циклопент-1-енил, 1-циклопент-2-енил, 1-циклопент-3-енил, циклогексил, 1-циклогекс-1-енил, 1-циклогекс-2-енил, 1-циклогекс-3-енил, циклогексадиенил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил, циклоундецил, циклододецил и т.п. Карбоциклические группы возможно независимо замещены одним или более заместителями, описанными здесь.
6
20
"Арил" означает моновалентный ароматический углеводородный радикал из 6-20 атомов углерода (C-C) образованный удалением одного атома водорода от одиночного атома углерода из исходной ароматической кольцевой системы. Некоторые арильные группы показаны в формулах примеров как "Ar". Арил включает бициклические радикалы, содержащие ароматическое кольцо, конденсированное с насыщенным, частично ненасыщенным кольцом или ароматическим карбоциклическим кольцом. Типичные арильные группы включают, но не ограничены до, радикалы, образованные из бензола (фенил), замещенные бензолы, нафтален, антрацен, бифенил, инденил, инданил, 1,2-дигидронафтален, 1,2,3,4-тетрагидронафтил, и т.п. Арильные группы возможно независимо замещены одним или более заместителями, описанными здесь.
6
20
"Арилен" означает двухвалентный ароматический углеводородный радикал из 6-20 атомов углерода, (C-C), полученный удалением двух атомов водорода от двух кольцевых атомов углерода исходной ароматической системы. Некоторые ариленовые группы представлены в структурах примеров как «Ar». Арилен включает бициклические радикалы, содержащие ароматическое кольцо, конденсированное с насыщенным, частично ненасыщенным или ароматическим карбоциклическим кольцом. Типичные ариленовые группы включают, без ограничения, радикалы, полученные из бензола (фенилен), замещенных бензолов, нафталина, антрацена, бифенилена, инденилена, инданилена, 1,2-дигидронафталина, 1,2,3,4-тетрагидронафтила и другие. Ариленовые группы являются возможно замещенными одним или более заместителями, описанными здесь.
Термин "гетероцикл", "гетероциклил" и "гетероциклическое кольцо" используются здесь взаимозаменяемо и относятся к насыщенному или частично ненасыщенному (т.е. имеющему одну или несколько двойных и/или тройных связей в кольце) карбоциклическому радикалу, содержащему от 3 до 20 атомов в кольце, в котором по меньшей мере один кольцевой атом представляет собой гетероатом, выбранный из азота, кислорода, фосфора и серы, а остальные кольцевые атомы представляют собой C, где один или несколько кольцевых атомов возможно замещены независимо одним или более заместителями, описанными ниже. Гетероцикл может быть моноциклом, содержащим от 3 до 7 кольцевых атомов (от 2 до 6 атомов углерода и от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из N, О, P и S) или бициклом, содержащим от 7 до 10 кольцевых атомов (от 4 до 9 атомов углерода и от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из N, О, Р и S), например: бицикло [4,5], [5,5], [5,6] или [6,6] системы. Гетероциклы описаны у Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), в частности, в главах 1, 3, 4, 6, 7 и 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 по настоящее время), в частности выпуски 13, 14, 16, 19 и 28, а также в J. Am. Chem. Soc. (1960). "Гетероциклил" включает радикалы, где гетероциклические радикалы конденсированы с насыщенным, частично ненасыщенным или ароматическим карбоциклическим или гетероциклическим кольцом. Примеры гетероциклических колец включают, без ограничения, морфолин-4-ил, пиперидин-1-ил, пиперазинил, пиперазин-4-ил-2-он, пиперазин-4-ил-3-он, пирролидин-1-ил, тиоморфолин-4-ил, S-диоксотиоморфолин-4-ил, азокан-1-ил, азетидин-1-ил, октагидропиридо[1,2-а]пиразин-2-ил, [1,4]диазепан-1-ил, пирролидинил, тетрагидрофуранил, дигидрофуранил, тетрагидротиенил, тетрагидропиранил, дигидропиранил, тетрагидротиопиранил, пиперидино, пиперидонил, морфолино, тиоморфолино, тиоксанил, пиперазинил, гомопиперазинил, азетидинил, оксетанил, тиетанил, гомопиперидинил, оксепанил, тиепанил, оксазепинил, диазепинил, тиазипинил, 2-пирролинил, 3-пирролинил, индолинил, 2Н-пиранил, 4Н-пиранил, диоксанил, 1,3-диоксоланил, пиразолинил, дитианил, дитиоланил, дигидропиранил, дигидротиенил, дигидрофуранил, 3-азабицикло[3.1.0]гексанил, 3-азабицикло[4.1.0]гептанил, азабицикло[2.2.2]гексанил, 3Н-индолил хинолизинил и N-пиридил мочевину. Спиро остатки также входят в объем этого определения. Примеры гетероциклических групп, в которых два кольцевых атома замещены оксо (=О) остатками представляют собой пиримидинонил и 1,1-диоксотиоморфолинил. Гетероциклические группы в данном описании, возможно замещены независимо одним или более заместителями, описанными здесь.
Термин "гетероарил" обозначает одновалентный ароматический радикал 5-, 6- или 7-членных колец и включает конденсированные кольцевые системы (по меньшей мере одно из которых является ароматическим) из 5-20 атомов, содержащих один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы. Примерами гетероарильных групп являются пиридинил (включая, например, 2-гидроксипиридинил), имидазолил, имидазопиридинил, пиримидинил (включая, например, 4-гидроксипиримидинил), пиразолил, триазолил, пиразинил, тетразолил, фурил, тиенил, изоксазолил, тиазолил, оксадиазолил, оксазолил, изотиазолил, пирролил, хинолинил, изохинолинил, тетрагидроизохинолинил, индолил, бензимидазолил, бензофуранил, циннолинил, индазолил, индолизинил, фталазинил, пиридазинил, триазинил, изоиндолил, птеридинил, пуринил, оксадиазолил, триазолил, тиадиазолил, тиадиазолил, фуразанил, бензофуразанил, бензотиофенил, бензотиазолил, бензоксазолил, хиназолинил, хиноксалинил, нафтиридинил и фуропиридинил. Гетероарильные группы возможно независимо замещены одним или более заместителями, описанными здесь.
Гетероциклические или гетероарильные группы могут быть присоединены по углероду (углерод-связанные) или по азоту (азот-связанный), где такое возможно. В качестве примера, без ограничения, углерод-связанные гетероциклы или гетероарилы присоединены по положениям 2, 3, 4, 5 или 6 пиридина, положениям 3, 4, 5 или 6 пиридазина, по положениям 2, 4, 5 или 6 пиримидина, по положениям 2, 3, 5 или 6 пиразина, по положениям 2, 3, 4 или 5 фурана, тетрагидрофурана, тиофурана, тиофена, пиррола или тетрагидропиррола, по положениям 2, 4 или 5 оксазола, имидазола или тиазола, по положениям 3, 4 или 5 изоксазола, пиразола или изотиазола, по положениям 2 или 3 азиридина, по положениям 2, 3 или 4 азетидина, по положениям 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 хинолина или положениям 1, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 изохинолина.
В качестве примера, а не ограничения, азот-связанные гетероциклы или гетероарилы присоединены в положении 1 азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2-пирролин-3-пирролина, имидазола, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, пиразола, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индола, индолина, 1Н-индазола, в положении 2 изоиндола или изоиндолина, положении 4 морфолина и положении 9 карбазола или β-карболина.
Термин "группа акцептор Михаэля" относится к функциональной группе, которая может участвовать в реакции Михаэля, где новая ковалентная связь образуется между частью акцепторной группы Михаэля и донорной группой. Акцепторная группа Михаэля представляет собой электрофил и "донорная группа" является нуклеофилом. Группы "Q", представленные в соединениях Формулы I являются неограничивающими примерами акцепторных групп Михаэля.
Термин "нуклеофил" или "нуклеофильный" относится к соединению, богатому электронами, или его группе. Примеры нуклеофилов включают, без ограничения, остаток цистеина или молекулу, такую как, например, Cys 481 киназы Btk.
Термин "электрофил", или "электрофильный" относится к бедной электронами или с недостаточным количеством электронов молекуле, или ее группе. Примеры электрофилов включают, без ограничения, акцепторные группы Михаэля, такие как α,β-ненасыщенные ацильные функциональные группы, такие как акриламиды, акрилатные эфиры, α,β-ненасыщенные кетоны, акрилонитрилы, и α,β-ненасыщенные моноксиды азота.
Термин "необратимый ингибитор" означает целевое соединение, которое образует стабильную ковалентную связь через реакционную функциональную группу и напрямую связано с распознающей группой цели. Необратимые ингибиторы Btk могут инактивировать их Btk цель через ковалентное взаимодействие с нуклеофильным цистеиновым остатком в составе нуклетидсвязывающего кармана киназного домена Btk.
Термины "лечить" и "лечение" относятся к терапевтическому лечению, при котором у объекта замедляют (уменьшают) нежелательные физиологические изменения или нарушения, такие как развитие или распространение артрита или рака. Для целей настоящего изобретения благоприятные или желаемые клинические результаты включают в себя, без ограничения, облегчение симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизирование (т.е. не ухудшение) состояния болезни, задержка или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение состояния заболевания и ремиссию (частичную или полную), как обнаруживаемые, так и не обнаруживаемые. "Лечение" может также означать продление выживаемости по сравнению с ожидаемым выживанием, при котором не получают лечения. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, которые обладают состоянием или расстройством.
Фраза "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения по настоящему изобретению, которое (i) лечит конкретное заболевание, состояния или расстройство, (ii) ослабляет, улучшает или устраняет один или более симптомов конкретного заболевания, состояния или расстройства, или (iii) предотвращает или задерживает начало одного или более симптомов конкретного заболевания, состояния или расстройства, описанного здесь. В случае рака, терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшать число раковых клеток; уменьшать размер опухоли; ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; подавлять, в некоторой степени, рост опухоли и/или облегчать до некоторой степени один или более симптомов, связанных с раком. В зависимости от степени, с которой лекарственное средство может предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, она может быть цитостатической и/или цитотоксической. В случае лечения рака эффективность может быть измерена, например, посредством оценки времени до прогрессирования заболевания (ТТР) и/или определения степени ответа (RR).
"Воспалительное нарушение" как здесь используется, может относиться к любому заболеванию, нарушению, или синдрому при которых избыточный или нерегулируемый воспалительный ответ приводит к избыточным воспалительным симптомам, повреждению ткани хозяина, или потере функции ткани. "Воспалительное нарушение " также относится к патологическому состоянию, опосредованному притоком лейкоцитов и/или хемотаксисом нейтрофилов.
"Воспаление" как здесь используется, относится к локализованному защитному ответу, вызванному повреждением или разрушением тканей, который предназначен для разрушения, разбавления или закупорки (секвестр) как повреждающего агента, так и поврежденной ткани. Воспаление, в частности, связано с притоком лейкоцитов и/или хемотаксисом нейтрофилов. Воспаление может быть результатом инфицирования патогенными организмами и вирусами, а также неинфекционными причинами, такими как травма или реперфузия после инфаркта миокарда или инсульта, иммунный ответ на чужеродный антиген, и аутоиммунный ответ. Соответственно, воспалительные нарушения, поддающиеся лечению соединениями Формулы I, охватывают нарушения, связанные со специфической иммунной системой, а также с реакциями неспецифической иммунной системы.
"Специфическая иммунная система" относится к компоненту иммунной системы, которая реагирует на присутствие специфических антигенов. Примеры воспалений, возникающие в результате реакции специфической иммунной системы, включают классический ответ на чужеродные антигены, аутоиммунные заболевания, а также реакции гиперчувствительности замедленного типа, опосредованных Т-клетками. Хронические воспалительные заболевания, отторжение пересаженной твердых тканей и органов, например, трансплантаты почек и костного мозга, и реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) являются дополнительными примерами воспалительных реакций специфической иммунной системы.
Термин "неспецифическая иммунная система", как здесь используется, относится к воспалительным заболеваниям, которые опосредованы лейкоцитами, неспособными к иммунологической памяти (например, гранулоциты и макрофаги). Примеры воспалений, которые являются результатом, по крайней мере частично, ответа неспецифической иммунной системы, включают воспаление, связанное с такими состояниями как взрослый (острый) респираторный дистресс-синдром (ОРДС) или синдром мультиорганной недостаточности; реперфузионное повреждение; острый гломерулонефрит; реактивный артрит; дерматит с острыми воспалительными компонентами; острый гнойный менингит или другие воспалительные заболевания центральной нервной системы, такие как инсульт; термическую травму; воспалительное заболевание кишечника; синдромы связанные с трансфузией гранулоцитов; и цитокин-индуцированная токсичность.
"Аутоиммунное заболевание", как здесь используется, относится к любой группе нарушений, при которых повреждение ткани связано с гуморальным или клеточно-опосредованным ответом на части собственного организма.
"Аллергическое заболевание" как здесь используется, относится к каким-либо симптомам, повреждению тканей или потере функции ткани в результате аллергии. "Артрит" как здесь используется, относится к любому заболеванию, которое характеризуется воспалительным поражением суставов, обусловленным различной этиологией. "Дерматит" как здесь используется, относится к любому из большого семейства заболеваний кожи, которые характеризуются воспалением кожи, обусловленным различной этиологией. "Отторжение трансплантата" как здесь используется, относится к любой иммунной реакции, направленной против пересаженной ткани, такой как органы или клетки (например, костного мозга), характеризующихся потерей функции пересаженной и окружающих тканей, болью, отеком, лейкоцитозом и тромбоцитопенией. Терапевтические способы настоящего изобретения включают способы лечения нарушений, связанных с активацией воспалительных клеток.
"Активация воспалительных клеток» относится к индукции раздражителем (включая, без ограничения, цитокины, антигены или аутоантитела) пролиферативного клеточного ответа, продукции растворимых медиаторов (включая, без ограничения, цитокины, кислородные радикалы, ферменты, простаноиды или вазоактивные амины), или экспрессии на клеточной поверхности новых или увеличения числа медиаторов (включая, без ограничения, антигены главного комплекса гистосовместимости или молекулы клеточной адгезии) в воспалительных клетках (включая, без ограничения, моноциты, макрофаги, Т лимфоциты, В-лимфоциты, гранулоциты (т.е. полиморфно-ядерные лейкоциты, такие как нейтрофилы, базофилы и эозинофилы,), тучные клетки, дендритные клетки, клетки Лангерганса и эндотелиальные клетки). Специалистам в данной области техники очевидно, что активация одного или комбинации этих фенотипов в указанных клетках может способствовать инициации, закреплению или обострению воспалительного нарушения.
Термин "НПВП" является аббревиатурой для "нестероидные противовоспалительные препараты» и представляет собой терапевтическое средство с обезболивающим, жаропонижающим (снижением повышенной температуры тела и облегчением боли без ущерба для сознания) и, в более высоких дозах, противовоспалительными эффектами (уменьшение воспаления). Термин "нестероидные" используется, чтобы отличать эти препараты от стероидов, которые (среди широкого круга других эффектов), имеют аналогичное противовоспалительное действие, снижая эйкозаноиды. Как анальгетики, НПВП необычны тем, что они не являются наркотическими веществами. НПВП включают аспирин, ибупрофен и напроксен. НПВП, как правило, показаны для лечения острых или хронических состояний, когда присутствуют боль и воспаление. НПВП обычно показаны для облегчения симптомов при следующих состояниях: ревматоидный артрит, остеоартрит, воспалительные артропатии (например, анкилозирующий спондилоартрит, псориатический артрит, синдром Рейтера, острая подагра, дисменорея, метастатическая боль в костях, головная боль и мигрень, послеоперационная боль, легкая и умеренная боль вследствие воспаления и повреждения ткани, лихорадка, кишечная непроходимость и почечные колики). Большинство НПВП действуют как неселективные ингибиторы фермента циклооксигеназа, ингибирующего изоферменты, как циклооксигеназу-1 (СОХ-1), так и циклооксигеназу-2 (СОХ-2). Циклооксигеназы катализирует образование простагландинов и тромбоксана из арахидоновой кислоты (сами по себе полученные из фосфолипидов клеточного бислоя фосфолипазой А2). Простагландины действуют (среди прочего) в качестве молекулы-посредника в процессе воспаления. Ингибиторы СОХ-2 включают целекоксиб, эторикоксиб, лумиракоксиб, парекоксиб, рофекоксиб, рофекоксиб и вальдекоксиб.
Термин «рак» относится к или описывает физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым клеточным ростом. «Опухоль» включает одну или больше раковых клеток. Примеры рака включают, без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкемию или лимфоидные злокачественные образования. Более конкретно, примеры таких опухолей включают плоскоклеточный рак (например, плоскоклеточный рак эпителия), рак легкого, включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточную карциному легкого (NSCLC), аденокарциному легких и плоскоклеточный рак легкого, рак брюшной полости, гепатоцеллюлярный рак желудка или рак желудка, включая желудочно-кишечный рак, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, толстой кишки, рак прямой кишки, рак толстой и подвздошной кишок, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почек, ренальный рак, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, анальную карциному, рак полового члена, а также рак головы и шеи.
"Гемобластозами" (Британские орфографические "Гематологические" злокачественные новообразования) являются виды рака, которые затрагивают кровь, костный мозг и лимфатические узлы. Поскольку три вышеуказанных системы тесно связаны через иммунную систему, заболевание, поражающее одну из трех систем будет также часто влиять на другие: несмотря на то, что лимфома представляет собой заболевание лимфатических узлов, оно часто распространяется на костный мозг, затрагивая а кровь. Гемобластозами являются злокачественные новообразования ("рак"), и они, как правило, лечатся специалистами в области гематологии и/или онкологии. В некоторых центрах "Гематологии/онкологии" существует единственная подспециальность внутренней медицины, в то время как в других странах они считаются отдельными подразделениями (существуют также хирургические и радиационные онкологи). Не все гематологические нарушения являются злокачественными ("раковыми"); эти другие состояния крови также могут лечиться гематологами. Гемобластозы могут происходить от любого из двух основных линий клеток крови: миелоидных и лимфоидных клеточных линий. Клетки миелоидной линии обычно дают гранулоциты, эритроциты, тромбоциты, макрофаги и тучные клетки; лимфоидная клеточная линия дает В, Т, NK и клетки плазмы. Лимфома, лимфоцитарная лейкемия и миелома происходят из лимфоидной линии, в то время как острый и хронический миелоидный лейкоз, миелодиспластические синдромы и миелопролиферативные заболевания обладают миелоидным происхождением. Лейкозы включают острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелолейкоз (АМЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), хронический миелолейкоз (СМЛ), острый моноцитарный лейкоз (ОМЛ) и малую лимфоцитарную лимфому (SLL). Лимфомы включают лимфомы Ходжкина (все четыре подтипа) и неходжкинские лимфомы (НХЛ, все подтипы), лимфому клеток мантии, диффузную В-клеточную лимфому и фолликулярную лимфому. Гемобластозы также включают макроглобулинемию Вальденстрема и множественную миелому.
"Химиотерапевтическое средство" представляет собой химическое соединение, используемое для лечения рака, независимо от механизма действия. Химиотерапевтические средства включают следующие классы, без ограничения: алкилирующие агенты, антиметаболиты, веретенный яд растительных алкалоидов, цитотоксические/противоопухолевые антибиотики, ингибиторы топоизомеразы, антитела, фотосенсибилизаторы и ингибиторы киназ. Химиотерапевтические средства включают соединения, используемые в «целевой терапии» и традиционной химиотерапии. Примеры химиотерапевтических средств включают: ибрутиниб (IMBRUVICA, PCI-32765, Pharmacyclics Inc.; CAS Reg. No. 936563-96-1, US 7514444), иделалисиб (ранее CAL-101, GS 1101, GS-1101, Gilead Sciences Inc.; CAS Reg. No. 1146702-54-6), эрлотиниб (TARCEVA, Genentech/OSI Pharm.), Доцетаксел (Таксотер, Sanofi-Aventis), 5-FU (фторурацил, 5-фторурацил, CAS №51-21-8), гемцитабин (GEMZAR, Lilly), PD- 0325901 (CAS №391210-10-9, Pfizer), цисплатин (цис- диамин, дихлорплатина (II), CAS №15663-27-1), карбоплатин (CAS No 41575 - 94-4), паклитаксел (таксол, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), трастузумаб (Герцептин, Genentech), темозоломид (4-метил-5-оксо-2,3,4,6,8-пентазабицикло[4.3.0]нона-2,7,9-триен-9-карбоксамид, CAS №85622-93-1, TEMODAR, ТЕМОДАЛ, Schering Plough), тамоксифен ((Z)-2-[4-(1,2-дифенилбут-1-енил) фeнoкcи]-N,N-диметилэтанамин, NOLVADEX, ISTUBAL, VALODEX) и доксорубицин (ADRIAMYCIN), Akti -1/2, HPPD и рапамицин.
Химиотерапевтические агенты включают ингибитор Bcl-2, ингибитор Btk, ингибитор JAK, ингибитор Syk; ингибитор Tyk, и антитела к CD20.
Ингибитор bcl-2 для применения в комбинации с соединением настоящего изобретения представляет собой венетоклакс (CAS Reg. No. 1257044-40-8; АВТ-199; GDC-0199; RG-7601, AbbVie Inc., Genentech Inc.). Венетоклакс представляет собой так называемый ВН3-миметик, разработанный для блокирования функции белка Bcl 2 и находится на Фазе 3 клинических исследований для лечения множественной миеломы, хронического лимфолейкоза, волчанки, диффузной большой В-клеточной лимфомы, острого миелобластного лейкоза и неходжкинской лимфомы (Souers et al. Nat Med. 2013 Jan 6. doi: 10.1038/nm.3048). Венетоклакс обладает названием по ИЮПАК: 4-(4-{[2-(4-хлорфенил)-4,4-диметилциклогекс-1-ен-1-ил]метил}пиперазин-1-ил)-N-({3-нитро-4-[(тетрагидро-2Н-пиран-4-илметил)амино]фенил}сульфонил)-2-(1Н-пирроло[2,3-b]пиридин-5-илокси)бензамид.
Антитело к CD20 для применения в комбинации с соединением по изобретению представляет собой обинутузумаб (CAS Reg. No. 949142-50-1; GAZYVA, Genentech Inc.), принятый US FDA в 2013, для лечения хронического лимфолейкоза в комбинации с химиотерапией у пациентов не подвергавшихся лечению. Обинутузумаб нацелен на В-лимфоцитарный антиген CD20 и лечит хронический лимфолейкоз, диффузную большую В-клеточную лимфому, неходжкинскую лимфому, фолликулярную лимфому и лимфому из клеток мантии.
Дополнительные примеры химиотерапевтических средств включают: оксалиплатин (Элоксатин, Sanofi), бортезомибом (VELCADE, Millennium Pharm), сутент (сунитиниб, SU11248, Pfizer), летрозол (FEMARA, Novartis), иматиниба мезилат (Gleevec, Novartis), XL -518 (МЕK ингибитор, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY -886 (МЕK ингибитор, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF- 1126 (ингибитор PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ -235 (ингибитор PI3K, Novartis), XL -147 (ингибитор PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), фулвестрант (Faslodex , AstraZeneca), лейковорин (фолиевая кислота), рапамицин (сиролимус, Rapamune , Wyeth), лапатиниб (Tykerb , GSK572016, Glaxo Smith Kline), лонафарниб (Capacap™, SCH 66336, Schering Plough), сорафениб (Нексавар, BAY43 -9006, Bayer Labs), гефитиниб (IRESSA, AstraZeneca), иринотекан (CAMPTOSAR , CPT-11, Pfizer), типифарниб (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE ™ (свободная от кремофора), композиции наночастиц паклитаксела с инженерным альбумином (American Pharmaceutical Partners,, Schaumberg, II), вандетаниб (rINN, ZD6474, ZACTIMA, AstraZeneca), хлорамбуцил, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), темсиролимус (Torisel, Wyeth), пазопаниб (GlaxoSmithKline), канфосфамид (TELCYTA, Telik), тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN , NEOSAR ); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметиломеламин; ацетогенины (в частности буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин, СС-1065 (включая его адозелезин, карзелезин и бизелезин синтетические аналоги), криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; мустины, такие как хлорамбуцил, хломафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтаминоксида гидрохлорид, мельфалан, новембехин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, калихеамицин гамма1I, калихеамицин омегаI1 (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33: 183-186); динемицин, динемицин A; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые хромофоры энедииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, каминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, морфолино-доксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин-доксорубицин и деоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, неморубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ), аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренергетики, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; эльформитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидайнин; майтанзиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофилиновая кислота, 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK комплекс полисахаридов (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманиум; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно Т-2 токсин, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-С"); циклофосфамид; тиотепа; 6-тиогуанин, меркаптопурин, метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорельбин (Navelbine); новантрон; тенипозид; эдатрексат; даунорубицин, аминоптерин; капецитабин (XELODA, Roche); ибандронат, СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (ДМФО); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота и их фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из указанных выше.
Также включенными в определение «химиотерапевтический агент» являются: (i) анти-гормональные препараты, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецептора эстрогена (СМРЭ), включая, например, тамоксифен (в том числе NOLVADEX; тамоксифена цитрат), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и FARESTON (цитрат торемифина), (ii), ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, регулирующий выработку эстрогена в надпочечниках, таких как, например, 4 (5)-имидазолы, аминоглютетимид, MEGASE (мегестролацетат), аромазина (экземестан, Pfizer), форместатин, фадрозол, RIVISOR (ворозол), FEMARA  (летрозол; Novartis) и Аримидекс (анастрозол; AstraZeneca), (iii), антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин, а также троксацитабин (1,3-диоксолан нуклеозид цитозиновый аналог), (iv), ингибиторы протеинкиназы, такие как ингибиторы МЕK (WO 2007/044515); (v) ингибиторы липидкиназы; (vi) антисмысловые олигонуклеотиды, в частности те, которые ингибируют экспрессию генов сигнальных путей, вовлеченных в аберрантную пролиферацию клеток, например, РKС-альфа, Ralf и H-Ras, такие как облимерсен (GENASENSE, Genta Inc.); (vii) рибозимы, такие как ингибиторы экспрессии VEGF (например, ANGIOZYME) и ингибиторы экспрессии HER2, (viii), вакцины, такие как вакцины генной терапии, например, ALLOVECTIN, LEUVECTIN и VAXID; Пролекин рИЛ-2; ингибиторы топоизомеразы-I, такие как LURTOTECAN; абареликс rmRH; (ix) антиангиогенные агенты, такие как бевацизумаб (Avastin, Genentech), и их фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из указанных выше.
Также включены в определение "химиотерапевтическое средство" терапевтические антитела, такие как алемтузумаб (Campath), бевацизумаб (Avastin, Genentech), цетуксимаб (ERBITUX , Imclone); панитумумаб (Vectibix , Amgen), ритуксимаб (RITUXAN , Genentech / Biogen Idec), пертузумаб (OMNITARG ™, 2С4, Genentech), трастузумаб (Герцептин , Genentech), тозитумомаб (Веххаr, Corixia) и конъюгат антитела лекарства гемтузумаб озогамицин (MYLOTARG, Wyeth).
Гуманизированные моноклональные антитела с терапевтическим потенциалом в качестве химиотерапевтических средств в комбинации с ингибиторами Btk по изобретению, включают: алемтузумаб, аполизумаб, аселизумаб, атлизумаб, бапинейзумаб, бевацизумаб, биватузумаб мертансин, кантузумаб мертансин, седелизумаб, цертолизумаб пегол, цидфузитузумаб, цидтузумаб, даклизумаб, экулизумаб, эфализумаб, эпратузумаб, эрлизумаб, фелвизумаб, фонтолизумаб, гемтузумаб озогамицин, инотузумаб озогамицин, ипилимумаб, лабетузумаб, линтузумаб, матузумаб, меполизумаб, мотавизумаб, мотовизумаб, натализумаб, нимотузумаб, ноловизумаб, нумавизумаб, окрелизумаб, омализумаб, паливизумаб, пасколизумаб, пекфузитузумаб, пектузумаб, пертузумаб, пекселизумаб, раливизумаб, ранибизумаб, ресливизумаб, реслизумаб, ресивизумаб, ровелизумаб, руплизумаб, сибротузумаб, сиплизумаб, сонтузумаб, такатузумаб тетраксетан, тадоцизумаб, тализумаб, тефибазумаб, тоцилизумаб, торализумаб, трастузумаб, тукотузумаб цельмолейкин, токузитузумаб, умавизумаб, уртоксазумаб и визилизумаб.
«Метаболит» представляет собой продукт, продуцированный в организме из специфического соединения или его соли. Метаболиты соединений могут быть идентифицированы с использованием обычных методов, известных в уровне техники, при этом их активность определялась с использованием тестов, которые, например, описаны в настоящем изобретении. Такие продукты могут образовываться в результате окисления, восстановления, гидролиза, амидирования, дезамидирования, этерификации, деэтерификации, ферментативного расщепления и т.д. введенного соединения. Промежуточное соединение также может быть образовано обратной реакцией присоединения Михаэля тиола цистеина киназы Btk к электрофильной группе соединения Формулы I. Соответственно, настоящее изобретение включает метаболиты соединений Формулы I по настоящему изобретению, включая соединения, образовавшиеся в результате процесса, включающего контактирование соединения настоящего изобретения с млекопитающим в течение времени, достаточного для образования его метаболического продукта.
Термин «листок-вкладыш» используется для обозначения инструкции, включенной перед продажей в упаковку с терапевтическим продуктом, который содержит информацию o показании, использовании, дозах, введении, противопоказаниях и/или предупреждениях относительно использования такого терапевтического продукта.
Термин «хиральный» обозначает молекулы, которые обладают свойством неспособности наложения зеркальных партнеров, при этом термин «ахиральный» обозначает молекулы, которые являются налагаемыми на их партнеров в зеркальном отражении.
Термин «стереоизомеры» относится к соединениям, которые обладают идентичным химическим составом, но различаются положением их атомов или групп в пространстве.
«Диастереомер» относится к стереоизомеру с двумя и более центрами хиральности, при этом их молекулы не являются зеркальными отражениями друг друга. Диастереомеры обладают различными физическими свойствами, например, температурой плавления, точкой кипения, спектральными свойствами и реакционной способностью. Смеси диастереомеров могут быть разделены аналитическими методами с высоким разрешением, такими как кристаллизация, электрофорез и хроматография.
«Энантиомеры» относятся к двум стереоизомерам соединений, которые не являются взаимоналагаемыми зеркальными отражениями друг друга.
Стереохимические определения и соглашения, используемые в настоящем изобретении, главным образом взяты из S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; и Eliel, E. и Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Соединения по настоящему изобретению могут содержать центры асимметрии или хиральности и, таким образом, существовать в виде различных стереоизомерных форм. Подразумевается, что все стереоизомерные формы соединений настоящего изобретения, включая, но не ограничиваясь, диастереомеры, энантиомеры и атропизомеры, также как и их смеси, такие как рацемические смеси, являются частью настоящего изобретения. Многие органические соединения существуют в виде оптически активных форм, т.е. они обладают способностью вращать плоскость плоско-поляризованного света. В описании оптически активных соединений используются префиксы D и L, или R и S для обозначения абсолютных конфигураций молекул вокруг их хирального(ых) центра(ов). Префиксы d и l или (+) и (-) употребляются для обозначения знака вращения плоско-поляризованного света соединением, где (-) или 1 означают, что соединение является левовращающим. Соединение с префиксом (+) или d является правовращающим. Для данных химических структур эти стереоизомеры идентичны, за исключением того, что они являются зеркальными отражениями друг друга. Определенные стереоизомеры также могут быть названы как энантиомеры, и смесь таких изомеров часто называют смесью энантиомеров. Смесь с соотношением энантиомеров 50:50 называется рацемической смесью или рацематом, которая может образовываться в случае нестереоселективности или нестереоспецифичности химической реакции или процесса. Термины «рацемическая смесь» и «рацемат» обозначают оптически неактивную эквимолярную смесь двух видов энантиомеров. Энантиомеры могут быть выделены из рацемической смеси посредством хиральных способов разделения, таких как сверхкритическая жидкостная хроматография (СКЖХ).
Присваивание конфигурации в хиральных центрах у разделенных энантиомеров может быть предварительной, и показано в структурных формулах таблицы 1 для иллюстративных целей, в то время как для определение стереохимии нуждается в, например, рентгеновских кристаллографических данных.
Термин «таутомер» или «таутомерная форма» относится к структурным изомерам с различной энергией, которые являются взаимопереходящими друг в друга через низкоэнергетический барьер. Например, протонные таутомеры (также известные как прототропные таутомеры) включают интерконверсию через миграцию протона, такую как кето-енольная или имин-енаминная изомеризация. Валентные таутомеры охватывают взаимопревращение путем реорганизации некоторых связывающих электронов.
Термин "фармацевтически приемлемые соли" обозначает соли, которые не являются биологически или иным образом нежелательными. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли, а также основно-аддитивные соли. Фраза "фармацевтически приемлемый" обозначает, что вещество или композиция должны быть совместимыми химически и/или токсикологически с другими ингредиентами, составляющими композицию и/или млекопитающим, подвергающимся лечению
Термин "фармацевтически приемлемая кислотно-аддитивная соль" означает те фармацевтически приемлемые соли, которые образованы с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, угольная кислота, фосфорная кислота, и органическими кислотами, выбранными из алифатических, циклоалифатических, ароматических, аралифатических, гетероциклических, карбоновых и сульфоновых органических кислот, таких как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, глюконовая кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, яблочная кислота, малеиновая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, аспарагиновая кислота, аскорбиновая кислота, глутаминовая кислота, антраниловая кислота, бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, эмбоновая кислота, фенилуксусная кислота, метансульфоновая кислота, «мезилалат», этансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота и салициловая кислота.
Термин "фармацевтически приемлемые основно-аддитивная соль" означает те фармацевтически приемлемые соли, которые образованы с органическим или неорганическим основанием. Примеры приемлемых неорганических оснований, включают соли натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, цинка, меди, марганца и алюминия. Соли, полученные из фармацевтически приемлемых органических нетоксичных оснований включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, включая природные замещенные амины, циклических аминов и основных ионообменных смол, таких как изопропиламин-, триметиламин-, диэтиламин-, триэтиламин-, трипропиламин-, этаноламин-, 2-диэтиламиноэтанол-, триметамин-, дициклогексиламин-, лизин-, аргинин-, гистидин-, кофеин-, прокаин-, гидрабамин-, холин-, бетаин-, этилендиамин-, глюкозамин-, метилглюкамин-, теобромин-, пурин-, пиперазин-, пиперидин-, N-этилпиперидин-, и полиаминовые смолы.
«Сольват» обозначает ассоциацию или комплекс одной или более молекул растворителя и соединения по изобретению. Примеры растворителей, которые могут образовывать сольваты, включают, не ограничиваясь, воду, изопропанол, этанол, метанол, ДМСО, этилацетат, уксусная кислота и этаноламин. Термин «гидрат» обозначает комплекс, в котором молекулой растворителя является вода.
50
Термин "ЕС" представляет собой половину максимальной эффективной концентрации и обозначает концентрацию в плазме конкретного соединения, необходимой для получения 50% от максимума конкретного эффекта in vivo.
Термин "Ki" представляет собой константу ингибирования и обозначает абсолютное сродство связывания конкретного ингибитора с рецептором. Она измеряется с помощью анализа конкурентного связывания и равна концентрации, при которой специфичный ингибитор будет занимать 50% рецепторов, при отсутствии конкурирующего лиганда (например, радиоактивный лиганд). Значения Ki могут быть преобразованы логарифмически в рK значения (-logKi), для которых более высокие значения указывают экспоненциально большую эффективность.
Термин "IC50" представляет собой половину максимальной ингибирующей концентрации и означает концентрацию конкретного соединения, необходимую для получения 50%-ного ингибирования биологического процесса in vitro. Значения IC50 могут быть логарифмически преобразованы в рIС50 значения (-LogIС50), для которых более высокие значения указывают на экспоненциально большую эффективность. Значение IC50 не является абсолютным значением, а зависит от условий эксперимента, например, концентраций. Значение IC50 может быть преобразовано в абсолютную константу ингибирования (Ki), используя уравнение Ченга-Прусоффа (Biochem. Pharmacol. (1973) 22: 3099). Может быть рассчитан другой параметр ингибирования, такой как IC70, IC90, и т.д.
Термины "соединение настоящего изобретения" и "соединения по настоящему изобретению» и «соединения формулы I" включают соединения формул I и их стереоизомеры, геометрические изомеры, таутомеры, сольваты, метаболиты и фармацевтически приемлемые соли и пролекарства.
Все формулы или структуры, приведенные здесь, включая соединения формулы I, также предназначены для обозначения гидратов, сольватов и полиморфных форм таких соединений и их смесей.
Все формулы или структуры, приведенные здесь, включая соединения формулы I, предназначены как для обозначения меченных изотопами форм соединений, так и для немеченых форм. Меченные изотопами соединения имеют структуры, представленные формулами, приведенными здесь, исключением того, что один или более атомов заменены атомами, имеющими выбранную атомную массу или массовое число. Примеры изотопов, которые могут быть включены в соединения по изобретению, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора и хлора, такие как, без ограничения, 2Н (дейтерий, D) 3Н (тритий), 11С, 13С, 14С, 15N, 18F, 31Р, 32Р, 35S, 36Cl и 125I. Различные меченные изотопами соединения по настоящему изобретению, например те, в которые включены радиоактивные изотопы, такие как 3Н, 13С и 14С входят в объем настоящего изобретения. Такие меченные изотопами соединения могут быть полезны при исследованиях метаболизма, исследованиях кинетики реакций, методах детекции или визуализации, таких как позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) или однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ), включая анализ распределения лекарств или субстратов в тканях, или при радиационном лечении пациентов. Меченные или замещенные дейтерием терапевтические соединения по изобретению могут обладать улучшенными DMPK (метаболизм и фармакокинетика лекарственного средства) свойства, по отношению к распределению, метаболизму и экскреции (ADME). Замещение более тяжелыми изотопами, такими как дейтерий, может давать определенные терапевтические преимущества в результате большей метаболической стабильности, например, увеличенный в естественных условиях период полураспада или сниженная дозировка. 18 F-меченое соединение может быть полезным для ПЭТ или ОФЭКТ исследований. Меченные изотопами соединения по данному изобретению и их пролекарства могут быть получены путем проведения техник, описанных в схемах и в примерах и препаратах, данных ниже, заменой на легко доступный меченный изотопом реагент немеченого изотопом реагента. Кроме того, замещение более тяжелыми изотопами, в частности, дейтерием (т.е. 2Н или D), может давать определенные терапевтические преимущества в результате большей метаболической стабильности, например, увеличенный в естественных условиях период полураспада или снижение требований дозировки или улучшение терапевтического индекса. Необходимо понимать, что дейтерий в этом контексте рассматривается в качестве заместителя в соединении формулы (I). Концентрация таких тяжелых изотопов, в частности, дейтерия, может определяться фактором изотопного обогащения. В соединениях по данному изобретению любой атомом, специально не указанный в качестве конкретного изотопа, предназначен для обозначения любого стабильного изотопа атома. Если не указано иное, когда радикал обозначен специально как "Н" или "водород", радикал понимается как водороде с его изотопным составом природного состава. Соответственно, в соединениях по настоящему изобретению любой атом специально обозначены как дейтерий (D) предназначен для обозначения дейтерия.
ГЕТЕРОАРИЛПИРИДОНОВЫЕ И АЗА-ПИРИДОНОВЫЕ АМИДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ С ЭЛЕКТРОФИЛЬНОЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬЮ
В настоящем изобретении предложены гетероарилпиридоновые и азапиридоновые амидные соединения Формулы I, включая Формулы Ia-Id, и их фармацевтические композиции, которые потенциально полезны при лечении заболеваний, состояний и/или нарушений, модулируемых Btk.
Соединения Формулы I обладают структурой:
или их стереоизомеры, таутомеры, или фармацевтически приемлемые соли, где:
1
1
X представляет собой CR или N;
2
2
X представляет собой CR или N;
3
3
X представляет собой CR или N;
1
2
3
2
3
3
2
3
2
3
2
2
1
3
R, R и R независимо выбраны из Н, F, Cl, CN, -NH, -NHCH, -N(CH), -ОН, -ОCH, -ОCHCH, -ОCHCHОН, и C-C алкила;
4
5
6
7
X, X, X, и X независимо выбраны из СН и N;
1
2
Y и Y независимо выбраны из СН и N;
1
3
Z представляет собой O или NR, где R представляет собой Н или C-Cалкил;
Q выбран из группы, обладающей структурой:
;
4
5
2
3
2
2
3
1
3
где R выбран из -CH=CH, -С(CH)=CH, -C(CN)=CH, -С≡СCH, и -С≡СН; a R выбран из Н и С-С алкила;
6a
6b
7a
7b
,
2
3
3
2
3
2
3
2
2
1
3
R R, R и R независимо выбраны из Н, F, Cl, CN, -NH, -NHCH, -N(CH), -ОН, -ОCH, -ОCHCH, -ОCHCHОН, и С-С алкила;
6a
7a
или R и R образуют пяти-, шести- или семичленное карбоциклическое или гетероциклическое кольцо;
5
6a
или R и R образуют пяти-, шести- или семичленное гетероциклическое кольцо;
7a
6a
или если Z представляет собой азот, тогда Z и R, или Z и R образуют пяти-, шести- или семичленное гетероциклическое кольцо;
8
2
3
3
2
3
2
2
2
2
3
2
3
3
2
2
3
3
2
3
3
2
3
2
2
R выбран из Н, F, Cl, CN, -CHОН, -CH(CH)ОН, -С(CH)ОН, -CH(CF)OH, -CHF, -CHF, -CHCHF, -CF, -C(O)NH, -C(O)NHCH, -C(O)N(CH), -NH, -NHCH, -N(CH), -NHC(O)CH, -OH, -OCH, -OCHCH, -OCHCHOH, циклопропила, циклопропилметила, 1-гидроксициклопропила, имидазолила, пиразолила, 3-гидрокси-оксетан-3-ила, оксетан-3-ила, и азетидин-1-ила;
9
R выбран из структур:
где волнистая линия обозначает точку присоединения; и
3
2
3
3
2
2
3
2
2
2
3
2
2
3
2
3
2
3
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
2
3
2
2
3
3
2
2
2
3
2
3
2
3
3
3
2
3
3
2
3
2
2
2
3
3
2
3
3
3
2
3
3
3
2
2
3
2
2
2
3
2
3
2
3
2
2
3
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
3
2
3
3
где алкил, карбоциклил, гетероциклил, арил и гетероарил возможно замещены одной или более группами, независимо выбранными из F, Cl, Br, I, -CN, -CH, -CHCH, -CH(CH), -CHСН(CH), -CHОН, -CHОCH, -CHCHОН, -С(CH)ОН, -CH(ОН)СН(CH), -С(CH)CHОН, -CHCHSOCH, -CHОР(O)(ОН), -CHF, -CHF, -CF, -CHCF, -CHCHF, -CH(CH)CN, -C(CH)CN, -CHCN, -COH, -COCH, -COCH, -COC(CH), -COCH(OH)CH, -CONH, -CONHCH, -CON(CH), -C(CH)CONH, -NH, -NHCH, -N(CH), -NHCOCH, -N(CH)COCH, -NHS(O)CH, -N(CH)C(CH)CONH, -N(CH)CHCHS(O)CH, -NO, =O, -OH, -OCH, -OCHCH, -OCHCHOCH, -OCHCHOH, -OCHCHN(CH), -OP(O)(OH), -S(O)N(CH), -SCH, -S(O)CH, -S(O)H, циклопропила, оксетанила, азетидинила, 1-метилазетидин-3-ил)окси, N-метил-N-оксетан-3-иламино, азетидин-1-илметила, пирролидин-1-ила и морфолино.
Иллюстративные воплощения соединений Формулы I включают те, где:
1
X представляет собой N;
2
X представляет собой N;
3
X представляет собой N;
1
3
1
2
2
3
X и X представляют собой N, X и X представляют собой N, или X и X представляют собой N;
1
3
2
X и X представляют собой СН, и X представляет собой CF;
4
X представляет собой N;
4
5
X и X представляют собой N;
1
2
Y представляет собой СН и Y представляет собой N;
1
2
Y представляет собой N и Y представляет собой СН;
1
2
Y и Y каждый представляет собой СН;
4
2
R представляет собой -CH=CH;
5
3
R представляет собой Н или -CH;
6a
6b
7a
7b
R, R, R, и R представляют собой Н; или
8
2
R представляет собой -CHОН.
9
Иллюстративные воплощения соединений Формулы I включают те, где R выбран из:
и .
Иллюстративные воплощения соединений Формулы I включают соединения Формул Ia-d:
Иллюстративные воплощения соединений Формулы I включают те, где группа
выбрана из:
6a
Иллюстративные воплощения соединений Формулы I включают те, где Z представляет собой азот, и Z и R образуют пяти-, шести- или семичленное гетероциклическое кольцо, и гетероциклическое кольцо представляет собой пирролидинил.
Иллюстративные воплощения соединений Формулы I включают соединения из Таблицы 1.
Несмотря на то, что объем настоящего изобретения не ограничен каким-либо конкретным механизмом действия, связывающими свойствами или взаимодействием соединений по настоящему изобретению с киназой-мишенью, такой как Btk, электрофильная функциональная группа соединений Формулы I может образовывать ковалентную связь с Btk. Образованная таким образом ковалентная связь может быть образована обратимо или необратимо.
Соединения формулы I по изобретению могут содержать асимметричные или хиральные центры и, следовательно, существуют в различных стереоизомерных формах. Предполагается, что все стереоизомерные формы соединений по изобретению, включая, без ограничения, диастереомеры, энантиомеры и атропизомеры, а также их смеси, такие как рацемические смеси, составляют часть настоящего изобретения.
Кроме того, настоящее изобретение охватывает все геометрические и позиционные изомеры. Например, если соединение формулы I содержит двойную связь или конденсированное кольцо, цис- и транс- формы, а также их смеси включены в объем настоящего изобретения. Как единичные позиционные изомеры, так и смеси позиционных изомеров, входят в объем настоящего изобретения.
В структурах, показанных здесь, в которых стереохимия любого конкретного хирального атома не указана, все стереоизомеры рассматриваются и включены в соединения по изобретению. Если стереохимия задается цельным конусом или пунктирной линией, отражающей определенную конфигурацию, то, этот стереоизомер прямо указан и определен.
Соединения по настоящему изобретению могут существовать в несольватированных, а также в сольватированных формах с фармацевтически приемлемыми растворителями, такими как вода, этанол и другие, и это означает, что изобретение охватывает как сольватированные, так и несольватированные формы.
Соединения по настоящему изобретению могут также существовать в различных таутомерных формах, и все такие формы включены в объем настоящего изобретения. Термин "таутомер" или "таутомерная форма" относится к структурным изомерам различных энергий, которые взаимопревращаемы через низкий энергетический барьер. Например, протонные таутомеры (также известные как прототропные таутомеры) включают взаимопревращения через миграцию протона, такие как кето-енольная и имин-енамин изомеризация. Валентные таутомеры включают взаимопревращения путем реорганизации некоторых связывающих электронов.
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
50
50
50
50
90
Относительная эффективность соединений Формулы I в качестве ингибиторов ферментативной активности (или другой биологической активности) может быть установлены путем определения концентраций, при которых каждое соединение ингибирует активность в заранее определенной степени и последующим сравнением результатов. Как правило, предпочтительно определяют концентрацию, которая ингибирует 50% активности в биохимическом анализе, т.е. 50% ингибирующая концентрация, или "IС". Определение значений IC может быть выполнено с использованием традиционных методов, известных в данной области техники. В общем случае, IC может быть определена путем измерения активности данного фермента в присутствии диапазона концентраций исследуемого ингибитора. Экспериментально полученные значения активности фермента затем наносятся на график по отношению к используемой концентрации ингибитора. Концентрация ингибитора, которая показывает 50% активность фермента (по сравнению с активностью в отсутствие какого-либо ингибитора) принимается в качестве значения IC. Аналогично, другие ингибирующие концентрации могут быть установлены с помощью соответствующих определений активности. Например, в некоторых условиях может быть желательным установить ингибирующую концентрацию на 90%, т.е. IC, и т.д.
Соединения Формулы I тестировались с помощью биохимического анализа киназы Btk (Пример 901).
Общей методикой для обычного клеточного анализа киназы Btk, которая может быть использована для тестирования соединений Формулы I является анализ Ramos Cell Btk Assay (Пример 902).
Обычный клеточный анализ пролиферации В-клеток может быть использован для тестирования соединений Формулы I с помощью В-клеток, очищенных из селезенки мышей Balb/c (Пример 903).
Обычный анализ пролиферации Т клеток может быть использован для тестирования соединений Формулы I с помощью Т-клеток, очищенных из селезенки мышей Balb/c (Пример 904).
Анализ ингибирования CD86 может быть проведен для соединений Формулы I на ингибирование активности В клеток и использованием всех спленоцитов мышей, очищенных из селезенок 8-16 недельных мышей Balb/c (Пример 905).
Анализ выживания клеток B-ALL может быть выполнен для соединений Формулы I для измерения количества жизнеспособных клеток B-ALL в культуре (Пример 906).
2
70
Анализ CD69 в цельной крови может быть выполнен для соединений Формулы I для определения способности соединений ингибировать продукцию CD69 В лимфоцитами в цельной крови человека, активированными посредством кросс-связывания поверхностных IgM с козьим F(ab') против IgM человека (Пример 907). CD69 представляет собой лектин типа II С, участвующий в миграции лейкоцитов и секреции цитокинов. CD69 экспрессия является одним из наиболее ранних доступных показателей активации лейкоцитов и ее быстрая индукция происходит посредством транскрипционной активации (Vazquez et al. (2009) Jour. of Immunology Published October 19, 2009, doi:10.4049/jimmunol.0900839). Концентрационно-зависимое ингибирование стимуляции антигенного рецептора посредством селективных ингибиторов Btk индуцирует экспрессию маркера активации лимфоцитов CD69 на клеточной поверхности (Honigberg et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (29): 13075-13080). Таким образом, ингибирование CD69 селективными ингибиторами Btk может коррелировать с терапевтической эффективностью для некоторых В-клеточных нарушений. Значения IC для CD69 Hu Blood FACS показаны для некоторых соединений Формулы I в Таблицах 1 и 2.
50
50
Цитотоксическая или цитостатическая активность иллюстративных соединений Формулы I может быть измерена посредством: создания пролиферирующей линии опухолевых клеток у млекопитающих в клеточной культуральной среде, добавления соединения формулы I, культивирования клеток в течение периода от приблизительно 6 часов до приблизительно 5 дней; и измерения жизнеспособности клеток (Пример 908). Клеточные анализы in vitro используются для измерения жизнеспособности, т.е. пролиферации (IC), цитотоксичности (ЕС) и индукции апоптоза (активации каспазы) и могут быть полезны при прогнозировании клинической эффективности против гематологических опухолей и солидных опухолей.

In vitro эффективность комбинаций соединений Формулы I с химиотерапевтическими агентами может быть измерена с помощью анализа клеточной пролиферации 908 Примера; CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, коммерчески доступный от компании Promega Corp., Madison, WI. Этот гомогенный метод анализа основан на экспрессии рекомбинантной люциферазы Coleoptera (US 5583024, US 5674713, US 5700670), и определяет число жизнеспособных клеток в культуре на основе количественного анализа присутствующего АТФ, индикатора метаболически активных клеток (Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160: 81-88; US 6602677). Анализ CellTiter-Glo был проведен в 96 или 384-луночном формате, что делает его доступным для автоматизированного скрининга с высокой пропускной способностью (HTS) (Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6: 398-404). Методика гомогенного анализа включает добавление единственного реагента (CellTiter-Glo реагент) непосредственно к клеткам, культивируемым в сывороточной среде. Промывание клеток, удаление среды и несколько пипетирований не требуются. Система обнаруживает всего лишь 15 клеток на лунку в 384-луночном формате в течение 10 минут после добавления реагента и смешивания.
Гомогенный формат "добавили-смешали-измерили" приводит к лизису клеток и генерации пропорционального количеству присутствующего АТФ люминесцентного сигнала. Количество АТФ прямо пропорционально количеству клеток, присутствующих в культуре. Анализ CellTiter-Glo генерирует люминесцентный сигнал "тлеющего типа", генерируемый реакцией люциферазы, который имеет период полужизни в целом больше пяти часов, в зависимости от типа клеток и используемой среды. Жизнеспособные клетки выражены в относительных единицах люминесценции (RLU). Субстрат, люциферин жука, подвергается окислительному декарбоксилируется рекомбинантной люциферазой светлячка с сопутствующим превращением АТФ до АМФ и генерацией фотонов. Увеличенный период полужизни устраняет необходимость в использовании инжекторов для реагентов и обеспечивает гибкость для непрерывного или порционного режима обработки нескольких планшет. Этот анализ клеточной пролиферации может быть использован с различными луночными форматами, например, 96 или 384 луночным форматом. Данные могут быть записаны с помощью люминометра или ПЗС-камеры. Выход люминесценции представлен в виде относительных световых единиц (RLU), измеренных в течение определенного времени.
50
Антипролиферативная эффективность иллюстративных соединений формулы I и их комбинаций с химиотерапевтическими агентами измеряются с помощью анализа Celltiter-Glo (Пример 908) против некоторых гематологических опухолевых клеточных линий. Значения EC устанавливаются для тестируемых соединений и комбинаций.
Дозирование соединений Формулы I для лечения аутоиммунных заболеваний может быть оценено на модели мышиного ревматоидного артрита. В этой модели артрит индуцируют у мышей Balb/C путем введения анти-коллагеновых антител и липополисахарида. См Nandakumar et al. (2003), Am. J. Pathol 163: 1827-1837. В другом примере, дозирование соединений Формулы I для лечения В-клеточных пролиферативных расстройств может быть определено, например, на модели ксенотрансплантата человека к мыши, в которой клетки лимфомы В-клеток человека (например, клетки Ramos) имплантируют в иммунодефицитных мышей (например, "nude" мышей) как описано, например, в Pagel et al. (2005), Clin Cancer Res 11 (13): 4857-4866.
Терапевтическая эффективность соединения Формулы I для одного из вышеуказанных заболеваний может быть оптимизирована в течение курса лечения. Например, субъект, проходящий лечение, может пройти диагностическую оценку для соотнесения облегчения симптомов заболевания или патологии и ингибирования Btk активности in vivo, достигаемого при введении данной дозы соединения формулы I. Клеточные анализы, известные в данной области, могут быть использованы для определения активности Btk in vivo в присутствии или отсутствии соединений формулы I. Например, так как активированная Btk фосфорилируется по тирозину 223 (Y223) и тирозину 551 (Y551), фосфо-специфическое иммуноцитохимическое окрашивания P-Y223 или P-Y551-положительных клеток может применяться для обнаружения или определения активации Btk в популяции клеток, например с помощью FACS анализа окрашеных по сравнению с неокрашенными клетками (Nisitani et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci, USA 96: 2221-2226). Таким образом, количество соединения Формулы I, которое вводится субъекту может быть увеличено или уменьшено по мере необходимости так, чтобы поддерживать уровень ингибирования Btk оптимальным для лечения болезненного состояния субъекта.
50
Как правило, соединение Формулы I, применяемое в способах, описанных в настоящем изобретении, определено или охарактеризовано с помощью in vitro анализа, например, бесклеточного биохимического анализа или клеточного функционального анализа. Такие анализы могут быть использованы для определения in vitro IC для соединения Формулы I. Например, бесклеточный анализ киназы может быть использован для определения активности Btk после инкубации киназы в отсутствие или в присутствии различных концентраций кандидатного соединения необратимого ингибитора Btk. Если соединение Формулы I действительно является необратимым ингибитором Btk, активность киназы Btk не будет восстанавливаться после повторной промывки свободной от ингибитора средой (Smaill, et al. (1999), J. Med. Chem. 42 (10): 1803-1815). Кроме того, образование ковалентного комплекса между Btk и кандидатным необратимым ингибитором Btk является полезным показателем необратимого ингибирования Btk, который может быть легко определен с помощью ряда способов, известных в данной области техники (например, масс-спектрометрия). Например, некоторые соединения необратимые ингибиторы Btk могут образовывать ковалентную связь с Cys 481 Btk (например, посредством реакции Михаэля). Клеточные функциональные анализы ингибирования Btk включают измерения одного или нескольких клеточных конечных критериев в ответ на стимуляцию Btk-опосредованного пути в клеточной линии (например, активация BCR в клетках Ramos) в отсутствие или в присутствии различных концентраций соединений формулы I. Полезные конечные критерии для определения ответа на активацию BCR включают, например, аутофосфорилирование Btk, фосфорилирование белка-мишени Btk (например, PLC-gamma), и цитоплазматический ток кальция.
Против панели киназ (Blk, Bmx, Btk, EGFR, ErbB2, ErbB4, Fgr, Itk, JAK1, JAK2, JAK3, Lck, Lyn, SLK, Src, TEC, и TXK) с остатком Cys в таком же положении, как у Btk, Соединение 101 показало лучшую селективность по отношению к Btk, чем ибрутиниб, измеренную в % ингибирования при при концентрации лекарства 1 мкМ.
С помощью пептдиного картирования и детекции ЖХМС, было определено, что ибрутиниб и Соединение 101 необратимо связываются только с диким типом Btk, но не с мутантной Btk Cys-481 Ser (S481C), показывая, что Cys-481 является существенным для их необратимого связывания. Было установлено, что соединение 102 обратимо связывается с Btk дикого типа.
Иллюстративные соединения Формулы I в Таблицах 1 и 2 синтезировали, охарактеризовали и тестировали на ингибирование Btk в соответствии со способами настоящего изобретения, и они обладают следующими структурами и соответствующими названиями (ChemDraw Ultra, Version 9.0.1, и ChemBioDraw, Version 11.0, CambridgeSoft Corp., Cambridge MA). В случае, когда с соединением Формулы I или промежуточным соединением связано более чем одно название, структура определяет соединение.
Соединение 119 получили в виде восстановленного аналога соединения 101 с насыщенной двойной связью.
С помощью масс-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа было показано, что соединение 101 ковалентно связывается с ВТK. Нельзя было ожидать, что соединение 119 будет связываться ковалентно с ВТK (ВТK LC3K (Ki=0.000963 мкМ).
ВВЕДЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ФОРМУЛЫ I
Соединения по изобретению могут быть введены любым способом, соответствующим состоянию, подлежащему лечению. Подходящие способы включают пероральный, парентеральный (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрикожное, интратекальное и эпидуральное введение), трансдермальный, ректальный, назальный, местный (включа буккальный и сублингвальный), вагинальный, внутрибрюшинный, внутрилегочный и интраназальный. Для местной иммуносупрессивной терапии соединения могут быть введены внутриочаговым способом, в том числе перфузией или иным способом контактирования трансплантата с ингибитором перед трансплантацией. Следует понимать, что предпочтительный путь может изменяться в зависимости от, например, состояния реципиента. Когда соединение вводят перорально, оно может быть приготовлено в виде пилюли, капсулы, таблетки и т.д. вместе с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом. В случае, когда соединение вводят парентерально, его можно приготовить с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем и в единичной дозированной формы для инъекций, как подробно описано ниже.
Доза для лечения людей может составлять от приблизительно 10 мг до приблизительно 1000 мг соединения формулы I. Обычная доза может составлять от приблизительно 100 мг до приблизительно 300 мг соединения. Доза может быть введена один раз в день (QID), два раза в день (BID) или чаще, в зависимости от фармакокинетических и фармакодинамических свойств, включая всасывание, распределение, метаболизм и выведение конкретного соединения. Кроме того, на дозировку и режим введения могут оказывать влияние факторы токсичности. При пероральном введении пилюли, капсулы или таблетки могут поступать в организм ежедневно или реже в течение определенного периода времени. Лечение можно повторить в виде нескольких циклов терапии.
СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ С ПОМОЩЬЮ СОЕДИНЕНИЙ ФОРМУЛЫ I
Способы, описанные здесь, включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей терапевтически эффективное количество соединения Формулы I. Безотносительно какой-либо теории, многообразие ролей, которые играет сигнализация Btk в различных гемопоэтических клеточных функциях, например, активация рецептора В-клеток, предполагает, что небольшие молекулы ингибиторов Btk полезны для снижения риска или лечения различных заболеваний, затронутых или влияющих ни многие типы клеток гемопоэтической линии, включая, например, аутоиммунные заболевания, гетероиммунные состояния или заболевания, воспалительные заболевания, рак (например, В-клеточные пролиферативные нарушения) и тромбоэмболические заболевания. Кроме того, соединения - необратимые ингибиторы Btk, описанные здесь, могут применяться для ингибирования небольшого пула других тирозинкиназ, которые обладают гомологичностью с Btk из-за наличия остатка цистеина (в том числе остатка Cys 481), который может образовывать ковалентную связь с необратимым ингибитором.
Соединения формулы I настоящего изобретения являются полезными для лечения пациентов людей или животных, страдающих заболеванием или расстройством, возникающим из-за аномального роста клеток, функции или поведения, ассоциированных с Btk, таких как иммунные нарушения, сердечно-сосудистые заболевания, вирусная инфекция, воспаления, нарушения обмена веществ/эндокринные нарушения или неврологические нарушения, которые могут, таким образом, подвергаться лечению способом, который включает введение соединения настоящего изобретения как определено выше. Пациенты человека или животного, страдающие от рака, также могут подвергаться лечению способом, включающим введение ему соединения настоящего изобретения, как определено выше. Состояние пациента таким образом, может быть улучшено или смягчено.
Соединения формулы I могут быть полезны для in vitro, in situ, и in vivo диагностики или лечения клеток млекопитающих, организмов или ассоциированных патологических состояний, таких как системное и местное воспаление, иммуно-воспалительные или аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, подавление иммунитета, отторжение трансплантационных органов, аллергия, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, дерматит, астма, системная красная волчанка, экстра-почечная волчанка, синдром Шегрена, рассеянный склероз, склеродермия/системный склероз, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), антинейтрофильные цитоплазматические антитела (ANCA) васкулит, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), псориаз, псориатический артрит, остеоартрит, болезнь Стилла, ювенильный артрит, сахарный диабет, миастения, тиреоидит Хашимото, тиреоидит Орда, базедова болезнь, синдром Шегрена, рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре, острый диссеминированный энцефаломиелит, болезнь Аддисона, синдром опсоклонус-миоклонус, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, апластическая анемия, аутоиммунный гепатит, глютеновая болезнь, синдром Гудпасчера, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, неврит зрительного нерва, склеродермия, первичный билиарный цирроз печени, синдром Рейтера, синдром Такаясу, височный артериит, теплая аутоиммунная гемолитическая анемия, гранулематоз Вегенера, общая алопеция, болезнь Бехчета, хроническая усталость, вегетативная дистония, эндометриоз, интерстициальный цистит, нейромиотония, склеродермия и вульводиния.
Способы по изобретению также включают лечение таких заболеваний, как артритные заболевания, такие как ревматоидный артрит, односуставный артрит, остеоартрит, подагрический артрит, спондилит; болезнь Бехчета; сепсис, септический шок, эндотоксический шок, грамотрицательный сепсис, грамположительный сепсис, синдром токсического шока; синдром множественного повреждения органов, вторичной по отношению к септицемии, травмы или кровоизлияния; офтальмологические нарушения, такие как аллергический конъюнктивит, весенний конъюнктивит, увеит, и эндокринная офтальмопатия; эозинофильная гранулема; легочные или респираторные заболевания, такие как астма, хронический бронхит, аллергический ринит, РДСВ, хронические воспалительные заболевания легких (например, хроническая обструктивная болезнь легких), силикоз, легочный саркоидоз, плеврит, альвеолит, васкулит, эмфизема, пневмония, бронхоэктазия и легочная кислородная интоксикаця; реперфузионное повреждение миокарда, головного мозга или конечностей; фиброзы, такие как муковисцидоз; келоидные образования или образования рубцовой ткани; атеросклероз; аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка (СКВ), аутоиммунный тиреоидит, множественный склероз, некоторые формы диабета и синдрома Рейно; и расстройства отторжение трансплантата, такие как РТПХ и отторжение аллотрансплантата; хронический гломерулонефрит; воспалительные заболевания кишечника, такие как хроническое воспалительное заболевание кишечника (CIBD), болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и некротический энтероколит; воспалительные дерматозы, такие как контактный дерматит, атопический дерматит, псориаз или крапивница; лихорадка и миалгия вследствие инфекции; воспалительные заболевания центральной или периферической нервной системы, такие как менингит, энцефалит, и повреждения головного мозга или спинного мозга вследствие незначительной травмы; синдром Шегрена; заболевания, связанные с диапедезом лейкоцитов; алкогольный гепатит; бактериальная пневмония; заболевания опосредованные комплексом антиген-антитело; гиповолемический шок; сахарный диабет I типа; острая гиперчувствительность и гиперчувствительность замедленного типа; болезненные состояния, связанные с лейкоцитарной дискразией и метастазированием; термическая травма; синдромы, связанные с трансфузией гранулоцитов; и цитокин-индуцированная токсичность.
В других воплощениях способы, описанные здесь, могут применяться для лечения рака, например, В-клеточных пролиферативных нарушений, включающих, без ограничения, диффузную В-крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому, хроническую лимфоцитарную лимфому, хронический лимфоцитарный лейкоз, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфоплазмацитарную лимфому/ макроглобулинемию Вальденстрема, лимфому селезеночной маргинальной зоны, плазмоцитарную миелому, плазмоцитому, экстранодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны, узловая В-клеточная лимфома маргинальной зоны, мантийноклеточная лимфома, средостеническая (тимуса) В-крупноклеточная лимфома, внутрисосудистая В-крупноклеточная лимфома, первичная выпотная лимфома, лимфома/лейкемия Беркитта, и лимфоматозный гранулематоз.
Способы по изобретению также включают лечении солидных опухолей и гематологических опухолей. Типы рака, которые можно лечить соединениями формулы I включают рак груди, яичников, шейки матки, простаты, семенников, мочеполового тракта, пищевода, гортани, глиобластомы, нейробластомы, рак желудка, кожи, кератоакантому, рак легких, плоскоклеточный рак, крупноклеточный рак, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), мелкоклеточный рак, аденокарциному легкого, рак кости, толстой кишки, аденому, рак поджелудочной железы, аденокарциному, рак щитовидной железы, фолликулярную карциному, недифференцированный рак, папиллярный рак, семиному, меланому, саркому, рак мочевого пузыря, рак печени и желчных проток, рак почки, рак поджелудочной железы, миелоидные нарушения, лимфома, волосатоклеточный рак, рак ротовой полости, носоглоточный, рак глотки, губ, языка, рта, тонкой кишки, колоректальный, толстой кишки, прямой кишки, мозга и центральной нервной системы, болезнь Ходжкина, лейкоз, рак бронхов, щитовидной железы, печени и внутрипеченочных желчных протоков, гепатоцеллюлярный, желудка, глиому/глиобластому, рак эндометрия, меланому, почек и почечных лоханок, мочевого пузыря, тела матки, шейка матки, множественную миелому, острый миелобластный лейкоз, хронический миелолейкоз, лимфолейкоз, хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), миелолейкоз, рак полости рта и глотки, неходжкинскую лимфому, меланому, и ворсинчатую аденому толстой кишки.
Способы настоящего изобретения могут быть полезны для лечения пациентов, которые являются или могут быть подвержены реперфузионному повреждению, т.е. повреждению вследствие ситуации, при которых ткань или орган переживает период ишемии с последующей реперфузией. Термин "ишемия" относится к локализованной анемии ткани вследствие закупорки притока артериальной крови. Преходящая ишемия с последующей реперфузией характерно приводит к активации и трансмиграции нейтрофилов через эндотелий кровеносных сосудов в зоне поражения. Накопление активированных нейтрофилов в свою очередь, приводит к образованию реактивных метаболитов кислорода, которые повреждают компоненты пораженной ткани или органа. Это явление «реперфузии» обычно ассоциируется с такими состояниями, как инсульт сосудов (в том числе глобальная и фокальная ишемия), геморрагический шок, ишемия или инфаркт миокард, трансплантация органов и церебральный вазоспазм. Для проиллюстрации, реперфузионная травмы происходит при окончании сердечных процедур обхода или во время остановки сердца, когда сердце после того, как было блокировано от получения крови, подвергается реперфузии. Предполагается, что ингибирование активности Btk может привести к снижению количества реперфузионных повреждений в подобных ситуациях.
Симптомы, диагностические тесты и прогностические тесты для каждого из вышеупомянутых состояний известны в данной области техники. См, например, "Harrison's Principles of Internal Medicine" 16th ed., 2004, The McGraw-Hill Companies, Inc. Dey et al. (2006), Cytojournal 3(24), и систему классификации "Revised European American Lymphoma" (REAL) (см, например, веб-сайт поддерживаемый Национальным институтом рака). Ряд животных моделей полезны для создания диапазона терапевтически эффективных доз соединений Формулы I для лечения любого из вышеуказанных заболеваний.
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ
Для того чтобы использовать соединение по настоящему изобретению для терапевтического лечения млекопитающих, включая человека, оно обычно приготовлено в соответствии со стандартной фармацевтической практикой в виде фармацевтической композиции. В соответствии с этим аспектом изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая соединение по настоящему изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.
Фармацевтические препараты, описанные здесь, включают, без ограничения, водные жидкие дисперсии, самоэмульгирующиеся дисперсии, твердые растворы, липосомные дисперсии, аэрозоли, твердые лекарственные формы, порошки, препараты с немедленным высвобождением, препараты с контролируемым высвобождением, быстроплавящиеся препараты, таблетки, капсулы, пилюли, препараты с задержанным высвобождением, препараты с длительным высвобождением, препараты с пульсирующим высвобождения, мультичастичные препараты, а также смешанные препараты с немедленным и контролируемым высвобождением.
Фармацевтические композиции, включающие соединения, описанные здесь, могут быть получены обычным способом, таким как, только с целью примера, обычное смешивание, растворение, гранулирование, изготовление драже, растирание в порошок, эмульгирование, сушка распылением, инкапсулирование, способы захвата или сжатия, дражирование, гранулирование из расплава, гранулирование, сушка в псевдоожиженном слоем распылением или покрытие (например, методом Вюрстера), тангенциальное покрытие, наружное опрыскивание, таблетирование, экструдирование и т.д., типичный препарат готовят путем смешивания соединения настоящего изобретения и носителя, разбавителя или эксципиента. Подходящие носители, разбавители и эксципиенты хорошо известны специалистам в данной области техники и включают материалы, такие как углеводы, воски, водорастворимые и/или набухающие в воде полимеры, гидрофильные или гидрофобные материалы, желатин, масла, растворители, воду и т.п. Использование конкретного носителя, разбавителя или эксципиента будет зависеть от средств и цели, для которой соединение по настоящему изобретению применяется. Растворители обычно выбирают на основе растворителей, признанных специалистами в данной области техники как безопасные (GRAS) для введения млекопитающим. В общем, безопасные растворители являются нетоксичными водными растворителями, такими как вода и другие нетоксичные растворители, которые растворяются или смешиваются с водой. Подходящие водные растворители включают воду, этанол, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль (например, ПЭГ 400, ПЭГ 300), и т.д. и их смеси. Композиции могут также включать один или более буферов, связующих, стабилизирующих агентов, противопенных агентов, поверхностно-активных веществ, смачивающих агентов, смазывающих агентов, эмульгаторов, суспендирующих агентов, консервантов, антиоксидантов, кроющие агенты, скользящие вещества, технологические добавки, красители, подсластители, отдушки, ароматизаторы и другие известные добавки, обеспечивающие стабильные или улучшенные потребительские качества препарата (то есть, соединения по настоящему изобретению или его фармацевтической композиции) или помощь в изготовлении фармацевтического продукта (т.е. лекарственного средства).
Связующие вещества, придающие когезионных свойств включают в себя, например, альгиновую кислоту и ее соли; производные целлюлозы, такие как карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза (например, Methocel), гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза (например, Klucel), этилцеллюлоза (например, Ethocel) и микрокристаллическая целлюлоза (например, Avicel); микрокристаллическая декстроза; амилоза; силикат магния и алюминия; полисахаридные кислоты; бентониты; желатин; поливинилпирролидон/винилацетат; кросповидон; повидон; крахмал; желатинизированный крахмал; трагакант, декстрин, сахар, такой как сахароза (например, Dipac), глюкоза, декстроза, патока, маннит, сорбит, ксилит (например, Xylitab) и лактоза; натуральная или синтетическая камедь, такая как аравийская камедь, трагакант, гхатти камедь, клейковина лузги, поливинилпирролидон (например, Polyvidone CL, Kollidon CL, Polyplasdone XL-10), арабогалактана лиственница, Veegum, полиэтиленгликоль, воски, альгинат натрия, и т.д.. В общем, содержание связующего вещества 20-70% используется в составах желатиновых капсул заполненных порошком. Содержание использования связующего в препаратах таблеток меняется от способа прямого прессования, влажного гранулирования, вальцевания или применения других вспомогательных веществ, таких как наполнители, которые сами по себе могут выступать в качестве умеренного связующего вещества. Изготовители препаратов - специалисты в данной области техники могут определить содержание связующего для препаратов, однако содержание связующего вещества до 70% в препаратах таблеток является распространенным явлением.
Композиции могут быть приготовлены с использованием обычных процедур растворения и смешивания. Например, нерасфасованная лекарственная форма (например, соединение по настоящему изобретению или стабилизированные формы соединения (например, комплекс с производным циклодекстрина или другим известным агентом комплексообразования) растворяют в подходящем растворителе в присутствии одного или более эксципиентов, описанных выше. Соединение по настоящему изобретению обычно приготавливают в виде фармацевтических дозированных форм для обеспечения легко контролируемую дозировку препарата и обеспечить соблюдение пациентом предписанного режима.
Фармацевтическая композиция (или состав) для применения могут быть упакованы различными способами, в зависимости от способа, используемого для введения препарата. Как правило, товар для распространения включает в себя контейнер, с размещенной в нем для хранения фармацевтической композиции в соответствующей форме. Подходящие контейнеры хорошо известны специалистам в данной области техники и включают такие материалы, как бутылки (пластик и стекло), саше, ампулы, пластиковые мешки, металлические цилиндры, и т.п. Контейнер может также включать в себя защитный механизм для предотвращения неосторожного доступа к содержимому упаковки. Кроме того, на контейнере может находиться этикетка, которая описывает содержимое контейнера. Этикетка может также включать соответствующие предупреждения.
Фармацевтические композиции соединений по настоящему изобретению могут быть получены для различных путей и типов введения. Например, соединение формулы I, имеющее желаемую степень чистоты, возможно может быть смешано с фармацевтически приемлемыми разбавителями, носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.), в виде лиофилизированной композиции, измельченного порошка или водного раствора. Композиция может быть получена путем смешивания при температуре окружающей среды при соответствующем рН и в нужной степени чистоты, с физиологически приемлемым носителем, то есть носители, которые являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях. РН композиции в основном зависит от конкретного применения и концентрации соединения, но может варьироваться от примерно 3 до примерно 8. Композиция в ацетатном буфере при pH 5 является подходящим воплощением.
Соединение обычно может храниться в виде твердой композиции, лиофилизированной композиции или в виде водного раствора.
Фармацевтические композиции по изобретению будут приготовлены, дозированы и введены таким образом, т.е. в количествах, концентрации, графиках, курсами, носителями и путями введения, в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в данном контексте включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, конкретного млекопитающего, подвергаемого лечению, клиническое состояние конкретного пациента, причину расстройства, место доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам. "Терапевтически эффективное количество" соединения для введения будет определяться указанными факторами и минимальным количеством, необходимым для облегчения или лечения гиперпролиферативных заболеваний.
В качестве общего предложения, начальное фармацевтически эффективное количество ингибитора, вводимого парентерально на одну дозу будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,01-100 мг/кг, в частности от приблизительно 0,1 до 20 мг/кг веса тела пациента в день, при этом типичный первоначальный диапазон используемого соединения от 0,3 до 15 мг/кг/день.
Приемлемые разбавители, носители, эксципиенты и стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты, антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехол, резорцин, циклстексанол, 3-пентанол и м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (приблизительно менее 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу и декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белок), и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, или PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Подходящие носители для применения в твердых лекарственных формах, описанных здесь, включают, без ограничения, аравийскую камедь, желатин, коллоидный диоксид кремния, глицерофосфат кальция, лактат кальция, мальтодекстрин, глицерин, силикат магния, казеинат натрия, соевый лецитин, хлорид натрия, трикальцийфосфат, дикалия фосфат, стеароиллактилат натрия, каррагенан, моноглицерид, диглицерид, прежелатинизированный крахмал, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозы стеарата ацетат, сахарозу, микрокристаллическую целлюлозу, лактозу, маннит и т.д. Подходящие наполнители для применения в твердых лекарственных формах, описанных здесь, включают, без ограничения, лактозу, карбонат кальция, фосфат кальция, двухосновный фосфат кальция, сульфат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, порошок целлюлозы, декстрозу, декстраты, декстран, крахмалы, предварительно желатинизированный крахмал, гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы стеарат ацетат (САГПМЦ), сахарозу, ксилит, лактит, маннит, сорбит, хлорид натрия, полиэтиленгликоль, и т.д.
Активные фармацевтические ингредиенты могут быть также заключены в микрокапсулы, полученные, например, способами коацервации или путем межфазной полимеризации, например гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии.. Such techniques are disclosed in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1975; Libetman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Willins 1999).
Могут быть получены препараты соединений формулы I с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие соединение формулы I, где матрицы находятся в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (US 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата, неразлагающийся этилен-винилацетат, разлагаемые сополимеры молочной и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислот и ацетата лейпролида), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.
Композиции включают такие, которые подходят для способов введения описанных в настоящем изобретении. Композиции могут быть удобно представлены в виде единичной дозированной форме и могут быть приготовлены любым из способов, хорошо известных в области фармацевтики. Способы и композиции, в основном, можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Такие способы включают стадию ассоциации активного ингредиента с носителем, который состоит из одного или нескольких вспомогательных ингредиентов. В общем, композиции получают путем равномерного и тщательного смешивания активного ингредиента с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или и теми и другими, а затем, если необходимо, формованием продукта.
Композиции соединение формулы I, пригодные для перорального введения могут быть приготовлены в виде отдельных единиц, таких как пилюли, капсулы, сашеты или таблетки, каждая из которых содержит определенное количество соединения формулы I.
Прессованные таблетки могут быть получены прессованием в соответствующем аппарате активного ингредиента в свободно-текучей форме, такой как порошок или гранулы, возможно смешанного со связующим веществом, смазывающим веществом, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным или диспергирующим агентом. Формованные таблетки могут быть изготовлены формованием в соответствующем аппарате смеси порошкообразного активного ингредиента, увлажненного инертным жидким разбавителем. Таблетки необязательно можно покрывать оболочкой или наносить на них бороздки и, возможно, приготовить таким образом, чтобы обеспечить замедленное или контролируемое высвобождение активного ингредиента из них.
Таблетки, пастилки, таблетки для рассасывания, водные или масляные суспензии, диспергируемые порошки или гранулы, эмульсии, твердые или мягкие капсулы, например желатиновые капсулы, сиропы или эликсиры могут быть приготовлены для перорального применения. Композиции соединений формулы I, предназначенные для перорального применения, могут быть получены в соответствии с любым способом, известным в данной области для производства фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать один или более агентов, в том числе подсластители, ароматизаторы, красители и консерванты для обеспечения приятного вкуса препарата. Таблетки, содержащие активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемым эксципиентом, который подходит для изготовления таблеток, являются приемлемыми. Эти наполнители могут представлять собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция или карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или натрия; гранулирующие и дезинтегрирующие агенты, такие как кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связующие агенты, такие как крахмал, желатин или камедь; и смазывающие агенты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть непокрытыми или могут быть покрыты оболочкой известными способами, в том числе микрокапсулирования для задержки дезинтеграции и адсорбции в желудочно-кишечном тракте и, тем самым, обеспечения пролонгированного действия в течение более длительного периода. Например, может быть использован материал для временной задержки, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, самостоятельно или вместе с воском.
"Дезинтегрирующие агенты" или дезинтеграторы облегчают распад или дезинтеграцию веществ. Примеры дезинтегрирующих агентов включают крахмал, например природный крахмал, такой как крахмал зерновых или картофельный крахмал, желатинизированный крахмал, такой как, например, National 1551 или Amijel, или натрия крахмалгликолят, такой как Promogel или Explotab, целлюлозу, например древесный продукт, метилкристаллическую целлюлозу, Avicel, Elceme, Emcocel, Vivacel, Ming Tia, и Solka-Floc, метилцеллюлозу, кроскармеллозу или перекрестно сшитую целлюлозу, например перекрестно сшитую натрий-карбоксиметилцеллюлозу (Ac-Di-Sol), перекрестно сшитую карбоксиметилцеллюлозу или перекрестно сшитую кроскармеллозу, перекрестно сшитый крахмал, например натрия крахмалгликолят, перекрестно сшитый полимер, такой как кросповидон, перекрестно сшитый поливинилпирролидон, альгинат, например альгиновую кислоту или соль альгиновой кислоты, например натрия альгинат, глину, например Veegum HV (алюмосиликат магния), камедь, например, агар, гуаровую камедь, камедь рожкового дерева, камедь Карайи, пектин или трагакант, натрия крахмалгликолят, бентонит, природную губку, поверхностно-активное вещество, смолу, например катионообменную смолу, мякоть цитруса, натрия лаурилсульфат, натрия лаурилсульфат в комбинации с крахмалом и т.п.
"Диспергирующие агенты" и/или "агенты, модулирующие вязкость" включают вещества, которые контролируют диффузию через жидкую среду и однородность лекарственного средства, или метод грануляции, или метод смешивания. В некоторых воплощениях такие агенты также облегчают эффективность нанесения покрытия или разрушения матрикса. Примеры веществ, облегчающих диффузию/диспергирующих агентов, включают, например, гидрофильные полимеры, электролиты, Tween-60 или -80, ПЭГ, поливинилпирролидон (ПВП; известный на рынке как Plasdone) и основанные на углеводах диспергирующие агенты, такие как, например, гидроксипропилцеллюлозы (например, ГПЦ, ГПЦ-SL и ГПЦ -L), гидроксипропилметилцеллюлозы (например, ГПМЦ K100, ГПМЦ K4М, ГПМЦ K15М и ГПМЦ K100М), карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлозы фталат, гидроксипропилметилцеллюлозы ацетата стеарат (ГПМЦАС), некристаллическая целлюлоза, алюмосиликат магния, триэтаноламин, поливиниловый спирт (ПВС), сополимер винилпирролидон/винилацетат (S630), полимер 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенола с этиленоксидом и формальдегидом (также известный как тилоксапол), полоксамеры (например, Pluoronics, представляющие собой блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида) и полоксамины (например, Tetronic 908, также известный как Poloxamine 908, представляющий собой тетрафункциональные блок-сополимеры, полученные при последовательном добавлении пропиленоксида и этиленоксида к этилендиамину (BASF Corporation, Parsippany, NJ.)), поливинилпирролидон K12, поливинилпирролидон K17, поливинилпирролидон K25 или поливинилпирролидон K30, сополимер поливинилпирролидон/винилацетат (S-630), полиэтиленгликоль, например полиэтиленгликоль может иметь молекулярный вес примерно от 300 до примерно 6000, или примерно от 3350 до примерно 4000, или примерно от 7000 до примерно 5400, натрия карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, полисорбат-80, натрия альгинат, камеди, такие как, например, камедь трагаканта и камедь акации, гуаровая камедь, ксантаны, в том числе ксантановая камедь, сахара, целлюлозные полимеры, такие как, например, натрия карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, натрия карбоксиметилцеллюлоза, полисорбат-80, натрия альгинат, полиэтоксилированный сорбитан монолаурат, полиэтоксилированный сорбитан монолаурат, повидон, карбомеры, поливиниловый спирт (ПВС), альгинаты, хитозаны и их комбинации. Пластифицирующие вещества, такие как целлюлоза или триэтилцеллюлоза, также можно применять как диспергирующие агенты. Диспергирующими агентами, в частности, применяемыми в липосомальных дисперсиях и самоэмульгирующих дисперсиях, являются димиристоилфосфатидилхолин, природный фосфатидилхолин из яиц, природный фосфатидилглицерол из яиц, холестерол и изопропил миристат..
"Смазывающие вещества" и "глиданты" представляют собой соединения, которые предотвращают, уменьшают или ингибируют адгезию или трение веществ. Примеры смазывающих веществ включают, в частности, стеариновую кислоту, кальция гидроксид, тальк, натрия стеарифумерат, углеводороды, например минеральное масло или гидрогенизированное растительное масло, например гидрогенизированное соевое масло (Sterotex), высшие жирные кислоты и соли щелочных металлов и щелочноземельных металлов, таких как алюминий, кальций, магний, цинк, стеариновая кислота, натрия стеараты, глицерол, тальк, воск, Stearowet, борная кислота, натрия бензоат, ацетат натрия, хлорид натрия, лейцин, полиэтиленгликоль (например, ПЭГ 4000) или метоксиполиэтиленгликоль, как, например, Carbowax, натрия олеат, натрия бензоат, глицерилбегенат, полиэтиленгликоль, магний или натрий лаурилсульфат, коллоидный кремнезем, такой как Syloid, Cab-O-Sil, крахмал, например зерновой крахмал, силиконовое масло, поверхностно-активное вещество и т.п.
Для лечения глаз или других наружных тканей, например рта и кожи, композиции предпочтительно применяются в качестве местной мази или крема, содержащих активный ингредиент(ы) в количестве, например, от 0,075 до 20% мас./мас. При приготовлении в виде мази, активные ингредиенты могут быть использованы либо с парафиновой или смешивающейся с водой мазевой основой. Альтернативно, активные ингредиенты могут быть приготовлены в виде крема с основой масло-в-воде.
Если необходимо водная фаза кремовой основы может содержать многоатомный спирт, т.е. спирт, имеющий две или более гидроксильные группы, такие как пропиленгликоль, бутан-1,3-диол, маннит, сорбит, глицерин и полиэтиленгликоль (включая ПЭГ 400) и их смеси. Композиции для местного применения могут при необходимости включать соединение, которое увеличивает поглощение или проникновение активного ингредиента через кожу или другие пораженные участки. Примеры таких усилителей проникновения через кожу включают диметилсульфоксид и родственные аналоги.
Масляная фаза эмульсий по настоящему изобретению может быть составлена из известных ингредиентов известным способом. В то время как фаза может содержать только эмульгатор, она желательно содержит смесь по меньшей мере одного эмульгатора с жиром или маслом, или и с жиром и маслом. Предпочтительно, гидрофильный эмульгатор включают вместе с липофильным эмульгатором, который действует в качестве стабилизатора. Также предпочтительно включение как масла, так и жира. Вместе эмульгатор(ы) с или без стабилизатора(ов) образует так называемый эмульгирующий воск и воск вместе с маслом и жиром образуют так называемую эмульгирующую основу мази, которая образует масляную дисперсную фазу кремовых композиций. Эмульгаторы и стабилизаторы эмульсии, пригодные для использования в композиции по изобретению, включают Tween 60, Span 80, цетостеариловый спирт, бензиловый спирт, миристиловый спирт, глицерилмоностеарат и лаурилсульфат натрия.
Водные суспензии соединений формулы I содержат активные вещества в смеси с эксципиентами, подходящими для получения водных суспензий. Такие эксципиенты включают суспендирующий агент, такой как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, кроскармеллоза, повидон, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и гуммиарабик, и диспергирующие или смачивающие агенты, такие как природные фосфатиды (например, лецитин), продукты конденсации алкиленоксида с жирной кислотой (например, полиоксиэтиленстеарат), продукт конденсации этиленоксида с длинноцепочечным алифатическим спиртом (например, гептадекаэтиленоксицетанол), продукты конденсации этиленоксида с неполным эфиром жирной кислоты и гекситангидрида (например, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана). Водная суспензия может также содержать один или более консервантов, таких как этил- или н-пропил- п-гидроксибензоат, один или более красителей, один или более ароматизирующих агентов и один или более подсластителей, таких как сахароза или сахарин.
Фармацевтические композиции соединений формулы I могут быть в форме стерильного инъекционного препарата, например стерильной водной или маслянистой суспензии для инъекций. Эти суспензии могут быть получены в соответствии с известными способами с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов, которые были упомянуты выше. Стерильный инъекционный препарат может также представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например раствор в 1,3-бутандиоле или приготовлен в виде лиофилизированного порошка. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые можно использовать, можно указать воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, обычно могут быть использованы стерильные нелетучие масла в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для данной цели может быть использовано любое мягкое нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, также могут быть использованы при получении препаратов для инъекций.
Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя для получения единичной дозированной формы, будет варьироваться в зависимости от подвергаемого лечению субъекта и конкретного способа введения. Например, композиция с замедленным высвобождением, предназначенная для перорального введения человеку, может содержать приблизительно от 1 до 1000 мг активного вещества, смешанного с соответствующим и подходящим количеством материала носителя, которое может варьировать от примерно 5 до примерно 95% от общей композиции (мас. : мас.). Фармацевтическая композиция может быть приготовлена для предоставления легко измеримых количеств для введения. Например, водный раствор, предназначенный для внутривенной инфузии может содержать от приблизительно 3 до 500 мкг активного ингредиента на миллилитр раствора для проведения инфузии подходящего объема со скоростью примерно 30 мл/ч.
Композиции, пригодные для парентерального введения включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические факторы и растворенные вещества, которые придают композиции изотоничность с кровью предполагаемого реципиента, а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители.
Композиции, пригодные для местного введения в глаз, включают также глазные капли, в которых активный ингредиент растворен или суспендирован в подходящем носителе, особенно в водном растворителе для активного ингредиента. Активный компонент предпочтительно присутствует в таких композициях в концентрации от приблизительно 0,5 до 20% мас./мас., например, приблизительно от 0,5 до 10% мас./мас., например, приблизительно 1,5% мас./мас.
Композиции, пригодные для местного применения в полости рта, включают таблетки для рассасывания, содержащие активный ингредиент в ароматизированной основе, обычно сахарозе и гуммиарабике или трагаканте, пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахарозе и гуммиарабике; и растворы полоскания, содержащие активный ингредиент в соответствующем жидком носителе.
Композиции для ректального введения могут быть представлены в виде суппозиториев с подходящим основанием, содержащих, например, масло какао или салицилат.
Композиции, подходящие для внутрилегочного или назального введения обладают, например, размером частиц в диапазоне от 0,1 до 500 мкм (в том числе размером частиц в диапазоне между 0,1 и 500 мкм с шагом, таким как 0,5, 1, 30 мкм, 35 мкм, и т.д.), которые вводят путем быстрой ингаляции через носовой ход или при вдыхании через рот так, чтобы достигать альвеолярных мешочков. Подходящие композиции включают водные или масляные растворы активного ингредиента. Композиции, пригодные для аэрозольного введения или введения в виде сухого порошка могут быть получены в соответствии с обычными способами и могут доставляться с другими терапевтическими агентами, такими как соединения, до сих пор использующиеся при лечении или профилактике расстройств, как описано ниже.
Композиции, пригодные для вагинального введения, могут быть представлены в виде вагинальных суппозиториев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или спреев, содержащих в дополнение к активному ингредиенту такие носители, которые известны в данной области техники как подходящие.
Композиции могут быть упакованы в однодозовый или в многодозовый контейнеры, например, запечатанные ампулы и флаконы, и могут храниться в высушенном сублимацией (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды, для инъекций непосредственно перед использованием. Приготовленные для немедленного приема растворы и суспензии для инъекций получают из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного вида. Предпочтительные единичные дозированные формы представляют собой те, которые содержат дневную дозу или единичную дневную суб-дозу, как описано выше, или соответствующую ее часть, активного ингредиента.
В настоящем изобретении также предложены ветеринарные композиции, содержащие по меньшей мере один активный ингредиент, как определено выше, вместе с ветеринарным носителем. Ветеринарными носителями являются вещества, используемые для введения композиции, они могут быть твердыми, жидкими или газообразными веществами, которые также являются инертным или приемлемыми в ветеринарии и совместимыми с активным ингредиентом. Эти ветеринарные композиции могут быть введены парентерально, перорально или любым другим желаемым способом.
КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ
Соединения формулы I могут применяться самостоятельно или в комбинации с дополнительными терапевтическими агентами для лечения заболевания или расстройства, описанного здесь, например, воспаления или гиперпролиферативных расстройств (например, рака). В некоторых воплощениях соединение формулы I комбинируют в фармацевтической комбинированной композиции или режиме дозирования в качестве комбинированной терапии, с дополнительным, вторым терапевтическим соединением, которое обладает противовоспалительными или противогиперпролиферативными свойствами или которое является полезным для лечения воспаления, нарушений иммунного ответа или гиперпролиферативных расстройств (например, рака). Дополнительным терапевтическим агентом может быть ингибитор Bcl-2, ингибитор Btk, ингибитор JAK, антитело к CD20, противовоспалительное средство, иммуномодулирующее средство, химиотерапевтический агент, усилитель апоптоза, нейротропный фактор, средство для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, средство для лечения заболеваний печени, противовирусный агент, средство для лечения нарушений крови, средство для лечения диабета, средство для лечения иммунодефицитных состояний. Вторым терапевтическим агентом может быть НСПВП противовоспалительный агент. Вторым терапевтическим агентом может быть химиотерапевтическое средство. Второе соединение фармацевтической комбинированной композиции или режима дозирования предпочтительно имеет взаимодополняющую активность по отношению к соединению формулы I, таким образом, что они не оказывают отрицательного влияния друг на друга. Такие соединения предпочтительно присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для заданных целей. В одном воплощении композиция по изобретению включает соединение формулы I или его стереоизомер, таутомер, сольват, метаболит, или его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство в комбинации с терапевтическим агентом, таким как НСПВП.
Комбинированное лечение можно проводить в виде одновременного или последовательного режима. При последовательном введении комбинации можно вводить в два или более приемов. Комбинированное введение включает совместное введение с использованием отдельных препаратов или одного фармацевтического препарата и последовательное введение в любом порядке, где предпочтительно имеется период времени, когда оба (или все) активные средства одновременно проявляют свои биологические активности.
Подходящие дозировки для любого из вышеуказанных совместно вводимых агентов являются такими, как здесь применяются и могут быть снижены за счет комбинированного действия (синергии) нового идентифицированного агента и других терапевтических агентов или лечения.
Комбинированная терапия может обеспечить "синергию" и оказаться "синергичной", т.е. достигнутый эффект в случае, когда активные ингредиенты используются вместе, больше, чем сумма эффектов полученных при использовании соединений по отдельности. Синергетический эффект может достигаться в случаях, когда активные ингредиенты являются: (1) совместно приготовлены и введены одновременно или доставлены в комбинированной единичной дозированной форме, (2) доставляются чередованием или одновременно в виде отдельных препаратов, или (3) при некоторых других режимах. При доставке чередующейся терапией, синергетический эффект может быть достигнут при последовательных введении или доставке соединений, например, разными инъекциями с помощью отдельных шприцов, отдельными таблетками или капсулами, или отдельными инфузиями. В общем, во время чередующейся терапии эффективную дозу каждого активного ингредиента вводят последовательно, то есть сериями, тогда как в комбинированной терапии, эффективные дозы двух или более активных ингредиентов вводят вместе.
В одном из воплощений терапии, соединение формулы I, или его стереоизомер, таутомер, сольват, метаболит или фармацевтически приемлемая соль или пролекарство, могут быть комбинированы с другими терапевтическими агентами, гормональными агентами или антителами, такими как описано здесь, а также в комбинации с хирургической терапией и лучевой терапией. Комбинированная терапия по настоящему изобретению включает, таким образом, введение, по меньшей мере, одного соединения формулы I, или его стереоизомера, таутомера, сольвата, метаболита или фармацевтически приемлемой соли или пролекарства, а также использование по меньшей мере одного другого способа лечения рака. Количества соединения(ий) формулы I и другого фармацевтически активного терапевтического агента(ов) и относительный временной режим введения будут выбраны для достижения желаемого комбинированного терапевтического эффекта.
МЕТАБОЛИТЫ СОЕДИНЕНИЙ ФОРМУЛЫ I
Кроме того, подпадающими под объем настоящего изобретения являются продукты метаболизма in vivo соединений формулы I, описанных здесь. Такие продукты могут быть результатом, например, окисления, восстановления, гидролиза, амидирования, дезамидирования, этерификации, деэтерификации, обратной реакции присоединения Михаэля, ферментативного расщепления и т.п., вводимого соединения. Соответственно, изобретение включает метаболиты соединений формулы I, в том числе соединений, полученных способом, включающим контактирование соединения по настоящему изобретению с млекопитающим в течение времени, достаточном для получения его метаболического продукта.
14
3
Метаболиты обычно определяются путем получения меченого (например, С или Н) изотопом соединения по настоящему изобретению, его введения парентерально в детектируемой дозе (например, больше чем примерно 0,5 мг/кг) животному, такому как крыса, мышь, морская свинка, обезьяна или человеку, выдерживание достаточного времени для обмена веществ (обычно около от 30 секунд до 30 часов) и выделения продуктов его переработки из мочи, крови или других биологических образцов. Эти продукты легко выделить поскольку они являются мечеными (другие выделяют с помощью антител, способных связывать эпитопы, оставшиеся в метаболитах). Структуры метаболитов определяются обычным образом, например, MS, LC/MS или ЯМР-анализом. В общем, анализ метаболитов осуществляется таким же образом, как и обычные исследования метаболизма лекарств, хорошо известные специалистам в данной области техники. Метаболиты, до тех пор, пока для них не нашли другого в живом организме, применяют в диагностических анализах для терапевтического дозирования соединений по изобретению.
ГОТОВЫЕ ИЗДЕЛИЯ
В другом воплощении изобретения предложено изделие, или "набор", содержащие вещества, пригодные для лечения заболеваний и расстройств, описанных выше. В одном воплощении, набор включает контейнер, содержащий соединение формулы I или его стереоизомер, таутомер, сольват, метаболит, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство. Этот набор может дополнительно включать этикетку или листок-вкладыш на или вместе с контейнером. Термин "листок-вкладыш" используется для обозначения инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, использовании, дозировке, введении, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.
Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, блистерную упаковку и т.п. Контейнер может быть выполнен из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер может содержать соединение формулы I или их композицию, которые являются эффективными для лечения состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой соединение формулы I. На этикетке или вкладыше указывается, что композиция используется для лечения выбранного состояния, такого как рак. Кроме того, этикетка или вкладыш могут указывать, что пациент, подлежащий лечению, обладает расстройством, таким как гиперпролиферативные расстройства, нейродегенерация, гипертрофия сердца, боль, мигрень или нейротравматические заболевания или случаи. В одном варианте осуществления этикетка или вкладыш указывает, что композиция, содержащая соединение формулы I, может быть использована для лечения расстройства являющегося результатом аномального роста клеток. На этикетке или вкладыше также может быть показано, что композиция может быть использована для лечения других расстройств. Альтернативно или дополнительно, изделие может также включать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие вещества, желательные с коммерческой точки зрения и точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Набор может дополнительно содержать инструкции по введению соединения формулы I, и, если присутствует, второй фармацевтической композиции. Например, если набор содержит первую композицию, содержащую соединение формулы I, и вторую фармацевтическую композицию, набор может дополнительно содержать инструкции для одновременного, последовательного или раздельного введения первой и второй фармацевтических композиций пациенту, нуждающемуся в этом.
В другом воплощении, наборы подходят для доставки твердых пероральных форм соединения формулы I, например, таблеток или капсул. Такой набор предпочтительно включает множество единичных доз. Такие наборы могут включать в себя карты, содержащие дозы, ориентированные в порядке их предполагаемого использования. Примером такого набора является "блистер". Блистерные упаковки хорошо известны в упаковочной промышленности и широко используются для упаковки фармацевтических единичных дозированных форм. При желании может быть предложена памятка, например, в виде цифр, букв или другой маркировки или с календарем-вкладышем, обозначающим дни в графике лечения, согласно которому могут вводиться дозы.
Согласно одному воплощению набор может включать: (а) первый контейнер, с соединением формулы I, содержащиеся в нем, и, возможно, (б) второй контейнер со второй фармацевтической композицией, содержащейся в нем, причем вторая фармацевтическая композиция содержит второе соединение с анти-гиперпролиферативной активностью. Альтернативно или дополнительно, набор может также содержать третий контейнер, включающий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая воде для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие вещества, желательные с коммерческой точки зрения или точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
В некоторых других воплощениях, где набор содержит композицию формулы I и второй терапевтический агент, набор может включать контейнер для содержания отдельных композиций, такой как разделенный флакон или разделенный пакет из фольги, однако, отдельные композиции могут также содержаться в одном, цельном контейнере. Обычно набор включает инструкции по введению отдельных компонентов. Форма в виде набора особенно желательна, когда отдельные компоненты предпочтительно вводить в различных дозированных формах (например, пероральной и парентеральной), вводятся с различными интервалами дозирования, или при необходимости титрования отдельных компонентов комбинации лечащим врачом.
ПОЛУЧЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ФОРМУЛЫ I
Соединения формулы I могут быть синтезированы способами синтеза, которые включают процессы аналогичные хорошо известным в области химии, в частности, в свете содержащегося здесь описания, и процессы, описанные для других гетероциклов в: Comprehensive Heterocyclic Chemistry II, Editors Katritzky и Rees, Elsevier, 1997, например Volume 3; Liebigs Annalen der Chemie, (9): 1910-16, (1985); Helvetica Chimica Acta, 41: 1052-60, (1958); Arzneimittel-Forschung, 40 (12): 1328-31, (1990), каждый из которых полностью включен посредством ссылки. Исходные материалы, как правило, доступны из коммерческих источников, таких как Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI) или могут быть легко получены с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области (например, получение способами, в основном, описанными в Louis F. Fieser и Маrу Fieser, Reagents for Organic Synthesis, v. 1-23, Wiley, N.Y. (1967-2006 ed.), или Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin, включая дополнения (также доступно через онлайн базу данных Beilstein).
rd
Превращения синтетической химии и методологии защитных групп (протекция и депротекция) полезные при синтезе соединений Формулы I и необходимые реагенты и промежуточные соединения известны в уровне техники и включают, например, те, которые описаны в R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene and P. G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3 Ed., John Wiley and Sons (1999); и L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) и последующих их изданиях.
Соединения формулы I могут быть получены отдельно или в виде библиотек соединений, содержащих по меньшей мере 2, например от 5 до 1000 соединений, или от 10 до 100 соединений. Библиотеки соединений формулы I могут быть получены путем комбинаторного подхода «разделение и смешивание» или несколькими параллельными синтезами с использованием либо жидкофазной либо твердофазной химии, по методикам, известным специалистам в данной области. Таким образом, согласно еще одному аспекту изобретения предложена библиотека соединений, содержащая по меньшей мере два соединения или их фармацевтически приемлемые соли.
Примеры предлагают иллюстративные способы для получения соединений формулы I. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что другие способы синтеза могут быть использованы для синтеза соединений Формулы I. Несмотря на то, что конкретные исходные вещества и реагенты изображены и описаны на Фигурах и Примерах, исходные материалы и реагенты легко могут быть заменены другими аналогичными для получения различных производных и/или условий реакции. Кроме того, многие соединения примеров, полученные описанными способами, могут быть далее модифицированы в свете данного описания с использованием обычных химических реакций, хорошо известных специалистам в данной области.
При получении соединений формулы I, может быть необходима защита функциональных групп (например, первичных или вторичных аминов) промежуточных соединений. Необходимость такой защиты будет варьироваться в зависимости от природы функциональной группы и условий способов получения. Подходящие амино-защитных группы включают ацетил, трифторацетил, трет-бутоксикарбонил (ВОС), бензилоксикарбонил (Cbz) и 9-флуоренметиленоксикарбонил (Fmoc). Необходимость в такой защите может быть легко определена специалистом в данной области. Для общего описания защитных групп и их использования, см. Т.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.
Если не указано иного, используются обычные методы масс-спектроскопии, ЯМР, ВЭЖХ, белковой химии, биохимии, технологии рекомбинантной ДНК и фармакологии, в пределах квалификации в данной области техники. Если не указаны специальные определения, номенклатура используется в связи с ними, и лабораторные процедуры и методики аналитической химии, химии органического синтеза и медицинской и фармацевтической химии, описанные здесь, являются теми, которые известны в данной области техники. Стандартные методы могут быть использованы для химического синтеза, химических анализов, фармацевтических препаратов, композиций и доставки и лечения пациентов. Реакции и способы очистки могут быть выполнены, например, с использованием наборов фирмы-изготовителя или так, как это обычно осуществляется в данной области, или как здесь описано. Вышеприведенные методы и процедуры могут быть выполнены в основном обычными способами, хорошо известными в данной области и так, как описано в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в настоящем описании.
Экспериментальные методики, промежуточные соединения и реагенты, применяемые для получения соединений Формулы I могут быть найдены в WO 2011/140488; US 2012/0010191; WO 2013/067274; US 2013/0116235; WO 2013/067277; US 2013/0116245; WO 2013/067260; US 2013/0116262; WO 2013/067264; US 2013/0116246, которые включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.
ОБЩИЕ МЕТОДИКИ ПОЛУЧЕНИЯ
Реакция связывания по типу Сузуки применяется для образования связей углерод-углерод для соединения колец соединений Формулы I и промежуточных соединений, таких как А-3 (Suzuki (1991) Pure Appl. Chem. 63: 419-422; Miyaura and Suzuki (1979) Chem. Reviews 95 (7): 2457-2483; Suzuki (1999) J. Organometal. Chem. 576: 147-168). Связывание Сузуки представляет собой катализируемую палладием реакцию кросс-сочетания гетероарилгалида, такого как В-2 или В-4, с боронатным эфиром, таким как А-1 или А-2. Например, В-2 может быть объединен с приблизительно 1.5 эквивалентами 4,4,4',4',5,5,5',5'-октаметил-2,2',-би(1,3,2-диоксаборолана), и растворен в приблизительно 3 эквивалентах карбоната натрия в виде 1 молярного раствора в воде и эквивалентном объеме ацетонитрила. Добавляют каталитическое, или более, количество низковалентного реагента палладия, такого как бис(трифенилфосфин)палладий(II) дихлорид. В некоторых случаях вместо карбоната натрия используют ацетат калия для доведения pH водного слоя. Затем реакционную смесь нагревают до приблизительно 140-150°C под давлением в микроволновой печи (Biotage АВ, Uppsala, Sweden) в течение 10-30 минут. Содержимое экстрагируют этилацетатом или другим органическим растворителем. После эвапорации органического слоя бороновый эфир А-1 может быть очищен на силикагеле или посредством обратно-фазовой ВЭЖХ. Заместители являются такими, как определено, или их защищенными формами или предшественниками. Аналогично, промежуточное соединение бромида В-4 может быть боронилировано с получением А-2.
5
Связывание Сузуки соединения В-2 и А-2, или соединения А-1 и В-4 дает соединение Формулы I или промежуточное соединение А-3. Бороновый эфир (или кислоту) (1.5 экв.) А-1 или А-2, и палладиевый катализатор, такой как бис(трифенилфосфин)палладий(II) хлорид (0.05 экв.) добавили в смесь промежуточного галосоединения (1 экв.) В-2 или В-4 в ацетонитриле и 1 М водного раствора карбоната натрия (объем, эквивалентный ацетонитрилу). Реакционную смесь нагревали до приблизительно 150°C в микроволновой печи в течение приблизительно 15 мин. ЖХ/МС показывает, завершилась ли реакция или необходимо дополнительное время или реагенты. Воду добавляют в смесь, и преципитировавшийся продукт фильтруют и очищают с помощью ВЭЖХ с получением продукта А-3. Заместители могут быть такими, как определено, или их защищенными формами или предшественниками. R представляет собой группу, такую как алкил или арил, используемую для промежуточных соединений для получения соединений Формулы I.
2
2
2
2
3
2
3
2
2
2
3
4
2
3
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
3
3
2
3
2
3
2
2
2
2
2
3
2
2
6
6
3
2
2
2
2
2
2
2
Различные низковалентные Pd(II) и Pd(0) палладиевые катализаторы, прекатализаторы и лиганды могут быть использованы на стадии связывания по Сузуки или Сузуки/Мияура (Miyaura, N. (2002) Top. Curr. Chem., 219: 11-59; Kotha, S. et al. (2002) Tetrahedron, 58: 9633-9695; Bellina, F. et al. (2004) Synthesis, 15: 2419-2440; Hassan, J. et al. (2002) Chem. Rev. 102:1359-1470; Littke, A.F. et al. (2002) Angew. Chem., Int. Ed. 41: 4176-4211; Barder, Т.E. et al. (2005) J. Am. Chem. Soc., 127: 4685-4696; Walker, S.D. et al. (2004) Angew. Chem., Int. Ed., 43: 1871-1876; Yin, J. et al. (2002) J. Am. Chem. Soc., 124: 1162-1163), включая PdCl{PtBu(p-R-Ph)} (Guram et al. (2006) Organic Letters 8 (9): 1787-1789), PdCl(PPh), Pd(t-Bu), PdCl dppf CHCl, Pd(PPh), Pd(OAc)/PPh, ClPd[(Pet)], Pd(DIPHOS), ClPd(Bipy), [PdCl(PhPCHPPh)], ClPd[P(o-tol)], Pd(dba)/P(o-tol), Pd(dba)/P(фypил), ClPd[Р(фурил)], ClPd(PMePh), ClPd[P(4-F-Ph)], ClPd[P(CF)], ClPd[P(2-COOH-Ph)(Ph)], ClPd[P(4-COOH-Ph)(Ph)], и инкапсулированные катализаторы Pd EnCat™ 30, Pd EnCat™ TPP30, и Pd(II)EnCat™ BINAP30 (US 2004/0254066).
Иллюстративными воплощениями низковалентных Pd(II) и Pd(0) палладиевых катализаторов, прекатализаторов и лигандов являются катализаторы "Бухвальда", палладациклы и лиганды, включая 2-Дициклогексилфосфино-2,4,6-триизопропилбифенил (X-Phos, CAS Reg. No. 564483-18-7) и Хлоро(2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропил-1,1'-бифенил)[2-(2'-амино-1,1'-бифенил)]палладий(II) (X-Phos аминобифенилпалладий хлоридный прекатализатор, CAS Reg. No. 1310584-14-5), коммерчески доступные (Johnson Matthey, West Deptford, NJ; Sigma-Aldrich Fine Chemicals, и другие поставщики). См. US 7223879, US 6395916, US 6307087.
Взаимодействие гетероарилгалида, такого как В-2, или арилгалида, такого как В-4, и бороновой кислоты или боронового эфира, с образованием соединений А-1 и А-2, соответственно, может быть проведена в условиях катализируемой палладием реакции Бухвальда с помощью прекатализатора Бухвальда палладицикла и лиганда из Таблицы 3 и как описано в: Biscoe et al. (2008) J. Am. Chem. Soc. 130: 6686-6687; Kinzel et al. (2010) J. Am. Chem. Soc. 132: 14073-14075; Molander et al. (2012) J. Am. Chem. Soc. 134: 11667-11673; Walker et al. (2004) Angew. Chem. Int. Ed. 43: 1871; Billingsley et al. (2007) Angew. Chem. Int. Ed. 46:5359-5363; US 6946560; US 7026498; US 7247731; US 7560582; US 6307087; US 6395916; US 7223879; US 7858784, которые включены посредством ссылок. Такие реагенты являются коммерчески доступными (Johnson Matthey Inc., Wayne, PA; Sigma Aldrich Fine Chemical, St. Louis, MO; Strem Chemicals, Inc., Newburyport, MA).
СПОСОБЫ РАЗДЕЛЕНИЯ
В способах получения соединений Формулы I, может быть предпочтительным разделение продуктов реакции друг от друга и/или от исходных материалов. Целевые продукты каждой стадии или ряда стадий отделяют и/или очищают до желаемой степени однородности по общим методикам в данной области. Обычно такое разделение включает многофазную экстракцию, кристаллизацию из растворителя или смеси растворителей, дистилляцию, сублимацию или хроматографию. Хроматография может включать в себя любое количество способов, включая, например, обратнофазовую и с нормальной фазой; гель-фильтрацию, ионнообменную, высокого, среднего и низкого давления жидкостную хроматографию и устройства; аналитическую в малом масштабе; хроматографию псевдодвижущегося слоя (SMB) и препаративную тонкослойную хроматографию, а также способы тонкослойной хроматографии малого масштаба и флеш-хроматографию.
Другой класс способов разделения включает обработку смеси реагентом, избирательно связывающим или другим способом, делающим желаемый продукт, непрореагировавший исходный материал, продукт реакции т.п. отделяемым. Такие реагенты включают адсорбенты или абсорбенты, такие как активированный уголь, молекулярные сита, ионообменные среды и т.п. В альтернативном варианте реагенты могут быть кислотами в случае оснований, оснований, в случае кислотного материала, связывающими реагентами, такими как антитела, белки, селективными хелатирующими агентами, такими как краун-эфиры, жидкими/ жидкими ионными реагентами экстракции (LIX) и т.п.
Выбор соответствующих способов разделения, зависит от природы используемых материалов, таких как температура кипения и молекулярный вес при дистилляции и сублимации, наличие или отсутствие полярных функциональных групп при хроматографии, стабильность материалов в кислой и щелочной среде в многофазной экстракции, и т.п.
Смеси диастереомеров могут быть разделены на индивидуальные диастереомеры на основе их физических и химических различий способами, хорошо известными специалистам в данной области техники, например, с помощью хроматографии и/или фракционной кристаллизации. Энантиомеры могут быть разделены путем превращения энантиомерной смеси в диастереомерную смесь реакцией с соответствующим оптически активным соединением (например, хиральным вспомогательным агентом, таким как хиральный спирт или хлорангидрид кислоты Мошера), разделением диастереомеров и преобразованием (например, гидролизом) отдельных диастереомеров в соответствующие чистые энантиомеры. Кроме того, некоторые из соединений по настоящему изобретению могут быть атропизомерами (например, замещенные биарилы) и рассматриваются в рамках объема настоящего изобретения. Энантиомеры могут быть разделены с использованием колонки хиральной ВЭЖХ.
Отдельный стереоизомер, например, энантиомер, по существу свободный от его стереоизомеров может быть получен разделением рацемической смеси с использованием такого способа, как образование диастереомеров с использованием оптически активного разделяющего агента (Eliel, Е. and Wilen, S. "Stereochemistry of Organic Compounds," John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994; Lochmuller, С.H., (1975) J. Chromatogr., 113 (3): 283-302). Рацемические смеси хиральных соединений по изобретению могут быть разделены и выделены любым подходящим способом, включая: (1) формирование ионных диастереомерных солей с хиральными соединениями и разделение путем фракционной кристаллизации или других способов, (2) образование диастереомерных соединений с хиральными дериватизирующими реагентами, разделение диастереомеров и превращение в чистые стереоизомеры, и (3) разделение, по существу чистых или обогащенных стереоизомеров непосредственно в хиральных условиях. См. "Drug Stereochemistry, Analytical Methods and Pharmacology," Irving W. Wainer, Ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1993).
По способу (1), диастереомерные соли могут быть получены реакцией энантиомерно чистых хиральных оснований, таких как бруцин, хинин, эфедрин, стрихнин-метил-б-фенилэтиламина (амфетамин), и т.п. с асимметричными соединениями, несущими кислотную функциональную группу, таких как карбоновые кислоты и сульфоновые кислоты. Диастереомерные соли могут быть активированы для разделения фракционной кристаллизацией или ионной хроматографией. Для разделения оптических изомеров аминосоединений, добавление хиральных карбоновых или сульфоновых кислот, таких как камфорсульфоновой кислоты, винной кислоты, миндальной кислоты или молочной кислоты может привести к образованию диастереомерных солей.
Альтернативно, по способу (2), субстрат для разделения подвергают взаимодействию с одним энантиомером хирального соединения с образованием диастереомерной пары (Е. and Wilen, S. "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., 1994, p. 322). Диастереомерные соединения могут быть получены реакцией ассиметричных соединений с энантиомерно чистыми хиральными дериватизирующими реагентами, такими как ментилпроизводные, с последующим разделением диастереомеров и гидролизом с получением чистого или обогащенного энантиомера. Способ определения оптической чистоты включает получение хиральных сложных эфиров, например, ментиловых эфиров, например, (-)ментилхлорформиата, в присутствии основания, или эфира Мошера, альфа-метокси-альфа-(трифторметил)фенилацетата (Jacob III. J. Org. Chem. (1982) 47: 4165) и анализа спектра ЯМР 1Н в присутствии двух атропизомерных энантиомеров или диастереомеров. Стабильные диастереомеры атропизомерных соединений могут быть разделены и выделены нормальной и обращеннофазовой хроматографией в соответствии со способами разделения атропизомерных нафтил-изохинолинов (WO 96/15111). По способу (3), рацемическая смесь двух энантиомеров может быть разделена с помощью хроматографии с использованием хиральной неподвижной фазы ("Chiral Liquid Chromatography" (1989) W.J. Lough, Ed., Chapman and Hall, New York; Okamoto, J. Chromatogr., (1990) 513: 375-378). Обогащенные или очищенные энантиомеры можно выделить способами, используемыми для разделения других хиральных молекул с асимметричными атомами углерода, такими как оптическое вращение и круговой дихроизм.
ПРИМЕРЫ
2,6
Пример 101 N-{2-[(6-{[5-(2-{4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.0]додека-2(6),7-диен-10-ил}-3-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил]амино}пиридин-2-ил)окси]этил}проп-2-енамид 101
Стадия 1: 5-бромо-3-(6-гидроксипиридин-2-иламино)-1-метилпиридин-2(1Н)-он 101а
2
3
2
+
100 мл круглодонную колбу, оснащенную обратным холодильником, заполнили 6-аминопиридин-2-олом (1.1 г, 10.0 ммоль), 3,5-дибромо-1-метилпиридин-2(1Н)-оном (2.67 г, 10.0 ммоль), карбонатом цезия (6.52 г, 20.0 ммоль), ксантфосом (576 мг, 1.0 ммоль), Pd(dba) (460 мг, 0.50 ммоль), и ДМФ (35 мл). Систему подвергли трем циклам продувки вакуум/аргон и нагревали при 100°C в течение 3 ч. Затем ее охладили до комнатной температуры и отфильтровали. Фильтрат разбавили с помощью ДХМ (500 мл) и промыли НO (80 мл×3). Органический слой высушили и сконцентрировали при пониженном давлении. Оставшийся осадок очистили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, с элюцией с помощью ДХМ/МеОН (30:1 до 15:1) с получением 101а (580 мг, 20%) в виде желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 296.0
Стадия 2: Трет-бутил 2-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)этил карбамат 101b
3
2
+
К смеси трет-бутил 2-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)-пиридин-2-илокси)этилкарбамата (500 мг, 1.70 ммоль), трет-бутил 2-гидроксиэтилкарбамат а (1.1 г, 6.8 ммоль), и PPh (1.78 г, 6.8 ммоль) при 0°C в безводном ТГФ (40 мл) добавили по каплям раствор диизопропилазодиформиата (1.37 г, 6.8 ммоль). Эту смесь нагревали при 40°C в течение 3 ч. Затем ее охладили до комнатной температуры и сконцентрировали при пониженном давлении. Остаток разделили между НO и ДХМ. Объединенный органический слой высушили и сконцентрировали при пониженном давлении. Оставшийся осадок очистили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с элюцией с помощью ДХМ/МеОН (60:1 до 40:1) с получением 101b (520 мг, 70%) в виде желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 438.9
2,6
Стадия 3: [4-(5-{[6-(2-{[(Трет-бутокси)карбонил]амино}этокси)пиридин-2-ил]амино}-1-метил-6-оксо-1,6-дигидропиридин-3-ил)-2-{4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.0]додека-2(6),7-диен-10-ил}пиридин-3-ил]метилацетат 101d
2,6
+
3
4
2
3
2
2
50 мл круглодонную колбу, оснащенную обратным холодильником, заполнили соединением 101b (500 мг, 1.14 ммоль), [4-(дигидроксиборанил)-2-{4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.0]додека-2(6),7-диен-10-ил}пиридин-3-ил]метилацетатом 101с (452 мг, 1.14 ммоль), KPO (483 мг, 2.28 ммоль), NaOAc (187 мг, 2.28 ммоль), Pd(dppf)Cl (42 мг, 0.057 ммоль), и CHCN/HO (20.0/0.5 мл). Систему подвергли трем циклам продувки вакуум/аргон, затем нагревали при 95°C в атмосфере N в течение 1 ч. Реакционную смесь охладили до комнатной температуры и сконцентрировали при пониженном давлении. Остаток очистили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с элюцией с помощью ДХМ/МеОН (70:1 до 30:1) с получением 101d (400 мг, 50%) в виде желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 712.3
2,6
Стадия 4: [4-(5-{[6-(2-аминоэтокси)пиридин-2-ил]амино}-1-метил-6-оксо-1,6-дигидро-пиридин-3-ил)-2-{4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.0]додека-2(6),7-диен-10-ил}пиридин-3-ил]метилацетат 101е
+
К раствору соединения 101d (400 мг, 0.56 ммоль) в ДХМ(15 мл) добавили по каплям 3М HCl (в диоксане). Эту смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Смесь сконцентрировали при пониженном давлении. Оставшийся желтый осадок промыли этилацетатом и высушили под вакуумом с получением соединения 101е (290 мг, 80%) в виде желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 612.3
2,6
Стадия 5: (2-{4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.0]додека-2(6),7-диен-10-ил}-4-[1-метил-6-оксо-5-({6-[2-(проп-2-енамидо)этокси]пиридин-2-ил}амино)-1,6-дигидропиридин-3-ил]пиридин-3-ил)метилацетат 101f
+
К раствору соединения 101е (250 мг, 0.387 ммоль) и TEA (78 мг, 0.77 ммоль) в ДХМ (10 мл) добавили по каплям раствор акрилоилхлорида (42 мг, 0.46 ммоль) в ДХМ. Эту смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Смесь сконцентрировали при пониженном давлении с получением 101f в виде желтого осадка (неочищенный), который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. MS-ESI: [М+Н] 666.4
2
2
4
3
+
1
Стадия 6: К раствору соединения 101f (257 мг, 0.387 ммоль) в ТГФ/i-PrOH/HO (5.0/3.0/2.0 мл) добавили LiOH (46 мг, 1.95 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч. Смесь разбавили водой (15 мл) и экстрагировали с помощью ДХМ (15 мл×3). Объединенный органический слой промыли солевым раствором (10 мл), высушили над NaSO, отфильтровали, и сконцентрировали при пониженном давлении. Оставшийся осадок очистили с помощью обратно-фазовой препаративной ВЭЖХ с получением соединения 101 (95 мг, 39% две стадии) в виде белого осадка. MS-ESI: [М+Н] 624.2. Н NMR (500 MHz, CDCl) δ 8.74 (d, J=2.0 Hz, 1H), 8.53 (d, J=5.0 Hz, 1H), 9.70 (s, 1H), 7.73 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.50-7.48 (m, 1H), 7.29-7.27 (m, 1H), 6.85 (s, 1H), 6.46-6.44 (m, 2H), 6.27-6.23 (m, 2H), 6.05-6.00 (m, 1H), 5.61-5.59 (m, 1H), 4.98-4.96 (m, 1H), 4.72-4.70 (m, 1H), 4.55-4.53 (m, 1H), 4.39-4.29 (m, 3H), 4.19-4.16 (m, 2H), 3.96-3.94 (m, 1H), 375-3.73 (m, 4H, перекрывание), 3.64-3.60 (m, 1H), 2.61-2.59 (m, 2H), 2.53-2.51 (m, 2H), 1.30 (s, 6H).
2,6
Пример 102 N-(цианометил)-1-(4-{[5-(2-{4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.0]додека-2(6),7-диен-10-ил}-3-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил]амино}пиримидин-2-ил)пирролидин-3-карбоксамид 102
Стадия 1: 1-(4-аминопиримидин-2-ил)пирролидин-3-карбоновая кислота 102а
+
100 мл круглодонную колбу, оснащенную магнитной мешалкой и обратным холодильником, заполнили пирролидин-3-карбоновой кислотой (1.20 г, 10 ммоль), 2-хлоропиримидин-4-амином (1.30 г, 10 ммоль), изопропиловым спиртом (IPA, 40 мл), и TEA (6 мл). Смесь нагревали при 80°C в течение ночи (О/N). После этого времени реакционную смесь охладили до комнатной температуры (КТ). Затем ее отфильтровали и фильтрационный остаток промыли с помощью ДХМ с получением соединения 102а (1.4 г, 67%) в виде светло-желтого осадка. MS: [М+Н] 209.1
2,6
Стадия 2: 1-(4-{[5-(2-{4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.0]додека-2(6),7-диен-10-ил}-3-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил]амино}пиримидин-2-ил)пирролидин-3-карбоновая кислота 102с.
2,6
+
2
3
2
3
100 мл круглодонную колбу, оснащенную магнитной мешалкой и обратным холодильником заполнили 10-[4-(5-бромо-1-метил-6-оксо-1,6-дигидропиридин-3-ил)-3-(гидроксиметил)пиридин-2-ил]-4,4-диметил-1,10-диазатрицикло[6.4.0.0]додека-2(6),7-диен-9-оном 102b (497 мг, 1.0 ммоль), 102а (312 мг, 1.5 ммоль), Pd(dba) (92 мг, 0.10 ммоль), Ксантфосом (4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантеном, CAS Reg. No. 161265-03-8, 116 мг, 0.20 ммоль), CsCO (652 мг, 2.0 ммоль), и ДМФ (20 мл). После трех циклов вакуум/аргон, смесь нагревали при 80°C в течение 4 ч. После этого времени реакционную смесь охладили до комнатной температуры. Затем ее отфильтровали, и фильтрат эвапорировали при пониженном давлении. Остаток очистили с помощью обратно-фазовой препаративной ВЭЖХ с получением соединения 102с (82 мг, 13%) в виде белого осадка. MS: [М+Н] 625.4
+
1
6
Стадия 3: 50 мл круглодонную колбу, оснащенную магнитной мешалкой и обратным холодильником, заполнили соединением 102с (100 мг, 0.16 ммоль), N,N,N',N'-тетраметил-O-(7-азабензотриазол-1-ил)урония гексафторфосфатом (HATU, 152 мг, 0.40 ммоль), триэтиламином (TEA, 8 капель), ТГФ (10 мл), и 2-аминоацетонитрилом (5 капель). Смесь нагревали при 30°C в течение 5 ч. После этого времени реакционную смесь охладили до комнатной температуры. Затем ее отфильтровали и фильтрат эвапорировали при пониженном давлении. Остаток очистили с помощью обратно-фазовой препаративной ВЭЖХ с получением соединения 102 (30 мг, 28%) в виде белого осадка. MS: [М+Н] 663.2. Н NMR (500 MHz, DMSO-d) δ 8.88 (d, J=6.0 Hz, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 8.47 (d, J=5.0 Hz, 1H), 7.95 (d, J=5.5 Hz, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.35 (d, J=4.5 Hz, 1H), 6.58-6.55 (m, 2H), 5.02 (s, 1H), 4.53-4.51 (m, 1H), 4.43-4.40 (m, 1H), 4.23-4.15 (m, перекрывание, 5H), 3.86-3.84 (m, 1H), 3.72-3.69 (m, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.60-3.56 (m, 1H), 3.51-3.43 (m, 2H), 3.10-3.08 (m, 1H), 2.62-2.54 (m, 2H), 2.43 (s, 2H), 2.18-2.16 (m, 1H), 2.06-2.04 (m, 1H), 1.22 (s, 6H).
Пример 103 N-[2-[[6-[[5-[5-фтор-2-(гидроксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиридазин-3-ил)фенил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]окси]этил]проп-2-енамид 103
Стадия 1: 3-(6-(2-аминоэтокси)пиридин-2-иламино)-5-бромо-1-метилпиридин-2(1Н)-она гидрохлорид 103а
3
2
4
К смеси трет-бутил 2-гидроксиэтилкарбамата (6.4 г, 40 ммоль) и EtN (7.2 мл, 52 ммоль) в ДХМ (50 мл) добавили пара-толуолсульфонилхлорид, TsCl (8.4 г, 44 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре (КТ) в течение ночи (ON). Реакционную смесь сконцентрировали и остаток разделили между ЕА и водой. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили с помощью хроматографии на силикагеле (РЕ/ЕА = 5/1) с получением 2-(трет-бутоксикарбониламино)этил 4-метилбензолсульфоната (10.0 г, 79%) в виде белого осадка.
2
3
2
3
Смесь 3,5-дибромо-1-метилпиридин-2(1Н)-она (2.67 г, 10.0 ммоль), 6-аминопиридин-2-ола (1.1 г, 10.0 ммоль), Pd(dba) (460 мг, 0.5 ммоль), Ксантфоса (576 мг, 1.0 ммоль) и CsCO (6.52 г, 20.0 ммоль) в ДМФ (40 мл) перемешивали при 100°C в течение ночи. Смесь сконцентрировали и остаток обработали с помощью ДХМ. Преципитат собрали посредством фильтрации и высушили с получением 5-бромо-3-(6-гидроксипиридин-2-иламино)-1-метилпиридин-2(1Н)-она 101а (4.0 г неочищенный) в виде коричневого осадка.
2
3
2
4
+
Смесь соединения 101а (7.0 г, 23.75 ммоль), 2-(трет-бутоксикарбониламино)этил 4-метилбензолсульфоната (3.0 г, 9.5 ммоль) и CsCO (3.7 г, 11.4 ммоль) в ДМФ (40 мл) перемешивали при 100°C в течение 4 ч. Реакционную смесь сконцентрировали. Остаток обработали ЕА и отфильтровали. Фильтрат промыли водой. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали с получением трет-бутил 2-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)этилкарбамата 101b (650 мг, 15% за две стадии) в виде желтого осадка. Смесь соединения 101b (700 мг, 1.6 ммоль) в HCl (5 мл, 4М в 1,4-диоксане, 20 ммоль) перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь сконцентрировали с получением соединения 103а (550 мг, 83%) в виде желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 341.0
Стадия 2: 3-(6-(2-аминоэтокси)пиридин-2-иламино)-5-бромо-1-метилпиридин-2(1Н)-она гидрохлорид 103b
3
2
4
+
К смеси соединения 103а (900 мг, 2.4 ммоль) и EtN (0.83 мл, 6.0 ммоль) в ДХМ (15 мл) добавили акрилоилхлорид (0.23 мл, 2.88 ммоль). Смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч и погасили водой. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали с получением соединения 103b (620 мг, 66%) в виде светло-желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 393.1
Стадия 3: N-(2-(6-(1-метил-2-оксо-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)этил)акриламид 103с
2
2
2
3
2
+
Смесь 103b (250 мг, 0.64 ммоль), 4,4,4',4',5,5,5',5'-октаметил-2,2',-би(1,3,2-диоксаборолана), PinB (570 мг, 2.23 ммоль), Pd(dba) (116 мг, 0.128 ммоль), Xphos (122 мг, 0.256 ммоль) и KОАс (125 мг, 1.28 ммоль) в диоксане (16 мл) перемешивали при 65°C в течение 4 ч в атмосфере N. Реакционную смесь сконцентрировали с получением соединения 103с (825 мг неочищенный) в виде коричневого осадка. Этот материал сразу использовали на следующей стадии. MS-ESI: [М+Н] 441.2
2
3
4
2
3
1
+
Стадия 4: Смесь 103с (250 мг, 0.57 ммоль), 6-(3-бромо-5-фтор-2-(гидроксиметил)фенил)-6,7,8,9-тетрагидродибензо[b,d]тиено[3,2-d]пиридазин-7(6Н)-она 103d (193 мг, 0.47 ммоль), Pd(dppf)Cl (71 мг, 0.094 ммоль) и KPO (250 мг, 1.18 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) и воде (1 мл) перемешивали при 90°C в течение 5 ч в атмосфере N. Смесь отфильтровали и фильтрат сконцентрировали. Остаток очистили посредством препаративной ВЭЖХ с получением соединения 103 (40 мг, 10% за две стадии) в виде белого осадка. Н NMR (500 MHz, CDCl): δ 8.64 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.52-7.49 (m, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.27-7.25 (m, 1H), 7.14 (m, 1H), 6.61 (s, 1H), 6.47 (m, 1H), 6.23-6.22 (m, 1H), 5.98-5.92 (m, 1H), 5.51 (d, J=10.0 Hz, 1H), 4.40 (s, 2H), 4.29-4.27 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.52 (s, 2H), 3.00-2.98 (m, 2H), 2.88-2.87 (m, 2H), 1.99-1.97 (m, 4H). MS-ESI: [M+H] 643.2
Пример 104 N-[2-[[6-[[5-[2-(6-трет-бутил-8-фтор-1-оксо-фталазин-2-ил)-3-(гидроксиметил)-4-пиридил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]окси]этил]проп-2-енамид 104
Стадия 1: (2-(6-трет-бутил-8-фтор-1-оксофталазин-2(1Н)-ил)-4-хлорпиридин-3-ил)метилацетат 104b
3
2
4
+
К смеси 6-трет-бутил-2-(4-хлор-3-(гидроксиметил)пиридин-2-ил)-8-фторфталазин-1(2Н)-она 104а (150 мг, 0.42 ммоль) и триэтиламина, EtN (0.12 мл, 0.84 ммоль) в тетрагидрофуране, ТГФ (2.5 мл) добавили ацетилхлорид, AcCl (44 мкл, 0.62 ммоль). Смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и погасили водой, экстрагировали этилацетатом, ЕА. Объединенные органические слои высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали с получением 104b (160 мг) в виде бесцветного масла. MS-ESI: [М+Н] 404.1
Стадия 2: 3-(ацетоксиметил)-2-(6-трет-бутил-8-фтор-1-оксофталазин-2(1Н)-ил)пиридин-4-илбороновая кислота 104с
2
2
2
2
+
Смесь 104b (150 мг, 0.37 ммоль), 4,4,4',4',5,5,5',5'-октаметил-2,2',-би(1,3,2-диоксаборолана), PinB (379 мг, 1.48 ммоль), Pd(dppf)Cl (28 мг, 0.037 ммоль), Xphos (35 мг, 0.074 ммоль) и KОАс (108 мг, 1.11 ммоль) в диоксане (5 мл) перемешивали при 65°C в течение 15 ч в атмосфере N. Реакционную смесь сконцентрировали. Остаток промыли с помощью ДХМ/РЕ (1 мл/20 мл) и отфильтровали. Фильтрат сконцентрировали с получением соединения 104с (100 мг, 66%) в виде желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 414.2
Стадия 3: (4-(5-(6-(2-акриламидоэтокси)пиридин-2-иламино)-1-метил-6-оксо-1,6-дигидропиридин-3-ил)-2-(6-трет-бутил-8-фтор-1-оксофталазин-2(1Н)-ил)пиридин-3-ил)метилацетат 104d
2
3
4
2
Смесь 104с (256 мг, 0.62 ммоль), 3-(6-(2-аминоэтокси)пиридин-2-иламино)-5-бромо-1-метилпиридин-2(1Н)-она гидрохлорида 103b (120 мг, 0.31 ммоль), Pd(dppf)Cl (47 мг, 0.062 ммоль) и KPO (131 мг, 0.62 ммоль) в ацетонитриле (2 мл) и воде (0.2 мл) перемешивали при 90°C в течение 3 ч в атмосфере N. Смесь отфильтровали и фильтрат сконцентрировали. Остаток промыли петролейным эфиром, РЕ, с получением соединения 104d (160 мг) в виде коричневого осадка. Этот материал сразу использовали на следующей стадии.
2
4
3
1
+
Стадия 4: Смесь 104d (140 мг, 0.21 ммоль) и LiOH (44 мг, 1.05 ммоль) в ТГФ/i-PrOH/воде (2.0 мл/1.2 мл/0.8 мл) перемешивали при КТ в течение 1 ч. Смесь экстрагировали ЕА. Объединенные органические слои высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили посредством препаративной ВЭЖХ с получением соединения 104 (10 мг, 10% за две стадии) в виде светло-желтого осадка. Н NMR (500 MHz, CDCl): δ 8.72-8.66 (m, 2Н), 8.33 (s, 1Н), 7.91 (s, 1Н), 7.59-7.47 (m, 6Н), 6.51 (s, 1Н), 6.44 (d, J=10.0 Hz, 1H), 6.24-6.16 (m, 2H), 5.99-5.94 (m, 1H), 5.50 (d, J=10.0 Hz, 1H), 4.58-4.48 (m, 2H), 4.28-4.21 (m, 2H), 3.99-3.57 (m, 5H), 1.43 (s, 9H). MS-ESI: [M+H] 640.3
Пример 105 N-[2-[[6-[[5-[5-фтор-2-(гидроксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиридазин-3-ил)фенил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]амино]этил]проп-2-енамид 105
2
3
1
Стадия 1: Смесь 6-бромопиридин-2-амина (17.2 г, 100 ммоль), ВосO (45.9 мл, 200 ммоль), EtN (40.4 мл, 300 ммоль), DMAP (610 мг, 5.0 ммоль) и t-BuOH(200 мл) перемешивали при 60°C в течение 16 ч. Реакционную смесь охладили до 0°C, отфильтровали и высушили с получением N,N-бис-Вос 6-бромопиридин-2-амина 105а (24.0 г, 65%) в виде белого осадка. Н NMR (500 MHz, CDCl3): δ 7.58-7.25 (m, 3Н), 1.46 (s, 18Н).
2
3
2
3
+
Стадия 2: Смесь 105а (3.72 г, 10 ммоль), трет-бутил 2-аминоэтилкарбамата (1.60 г, 10 ммоль), Pd(dba) (91.6 мг, 0.1 ммоль) Ксантфоса (116 мг, 0.2 ммоль), CsCO (9.78 г, 30 ммоль) в диоксане(100 мл) дегазировали и перемешивали при 95°C в течение 6 ч в атмосфере азота. Реакционную смесь сконцентрировали и остаток очистили с помощью хроматографии на силикагеле (ЕА/РЕ = 1/1) с получением N,N-бис-Вос 6-(2-N-Вос-аминоэтил)пиридин-2-амина 105b (2.62 г, 58%) в виде желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 453.3
Стадия 3: К смеси 105b (4.52 г, 10 ммоль) в диоксане (50 мл) добавили HCl (4М в диоксане, 10 мл, 40 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч и сконцентрировали с получением N2-(2-аминоэтил)пиридин-2,6-диамина гидрохлорида 105с (1.27 г, 84%) в виде желтого осадка.
Стадия 4: Смесь 105с (1.88 г, 10 ммоль), акриловой кислоты (720 мг, 10 ммоль), HATU (3.80 г, 10 ммоль) и DIPEA (6.97 мл, 40 ммоль) в ДХМ (50 мл) перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционную смесь сконцентрировали и остаток очистили с помощью хроматографии на силикагеле (ЕА/МеОН = 4/1) с получением N-(2-(6-аминопиридин-2-иламино)этил)акриламида 105d (1.07 г, 52%) в виде бледно-желтого масла.
2
3
2
3
+
Стадия 5: Смесь 105d (2.06 г, 10 ммоль), 3,5-дибромо-1-метилпиридин-2(1Н)-она (2.65 г, 10 ммоль), Pd(dba) (91.6 мг, 0.1 ммоль) Xant-phos (116 мг, 0.2 ммоль), CsCO (9.78 г, 30 ммоль) в диоксане (100 мл) дегазировали и перемешивали при 100°C в течение 16 ч в атмосфере азота. Реакционную смесь сконцентрировали и остаток очистили с помощью хроматографии на силикагеле (ЕА/РЕ = 5/1) с получением N-(2-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-иламино)этил)акриламида 105е (2.54 г, 65%) в виде желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 394.1.
2
3
4
2
+
Стадия 6: Смесь 105е (235 мг, 0.601 ммоль), (4-фтор-2-{6-оксо-8-тиа-4,5-диазатрицикло[7.4.0.02,7]тридека-1(9),2(7),3-триен-5-ил}-6-(тетра-метил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)метилацетата 108с (299 мг, 0.601 ммоль), Pd(dppf)Cl (42.8 мг, 0.06 ммоль) и KРO (382 мг, 1.80 ммоль) в ACN(10 мл) и HO (2 мл) дегазировали и перемешивали при 85°C в течение 4 ч в атмосфере азота. Реакционную смесь сконцентрировали и остаток очистили с помощью хроматографии на силикагеле (ЕА/РЕ = 4/1) с получением N-[2-[[6-[[5-[5-фтор-2-(ацетоксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиридазин-3-ил)фенил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]амино]этил]проп-2-енамида 105f (125 мг, 31%) в виде коричневого осадка. MS-ESI: [М+Н] 684.3
2
2
2
4
6
1
+
Стадия 7: К смеси 105f (125 мг, 0.183 ммоль) в ТГФ (6 мл), i-PrOH (2 мл) и НO (2 мл) добавили LiOH⋅HO (37 мг, 0.915 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч и сконцентрировали. Остаток разделили между водой и ДХМ. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток промыли с помощью ЕА и высушили с получением соединения 105 (73 мг, 60%) в виде серого осадка. Н NMR (500 MHz, DMSO-d): δ 8.56 (s, 1Н), 8.48 (s, 1Н),), 8.20 (s, 1Н), 8.12 (s, 1Н), 7.42 (s, 1Н), 7.38-7.32 (m, 2Н), 7.23 (t, J=8.0 Hz, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.35 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.21-6.15 (m, 1H), 6.05-6.02 (m, 1H), 5.95 (d, J=8.0 Hz, 1H), 4.73 (s, 1H), 4.33 (s, 2H), 3.59 (s, 3H), 3.28-3.25 (m, 5H), 2.93 (bs, 2H), 2.84 (bs, 2H), 1.88 (bs, 4H). ESI-ЖХМС: m/z=642 [C34H34FN7O5+H]
Пример 106 N-[2-[[6-[[5-[5-фтор-2-(гидроксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиридазин-3-ил)фенил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]окси]этил]бут-2-инамид 106
2
3
4
2
Стадия 1: Смесь N-(2-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)этил)бут-2-инамида 116а (224 мг, 0.45 ммоль), (4-фтор-2-{6-оксо-8-тиа-4,5-диазатрицикло[7.4.0.02,7]тридека-1(9),2(7),3-триен-5-ил}-6-(тетра-метил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)метилацетата 108с (240 мг, 0.59 ммоль), Pd(dppf)Cl (90 мг, 0.12 ммоль) и KPO (250 мг, 1.18 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) и воде (1 мл) перемешивали при 90°C в течение 3 ч в атмосфере N. Смесь отфильтровали и фильтрат сконцентрировали с получением N-[2-[[6-[[5-[5-фтор-2-(ацетоксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиридазин-3-ил)фенил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]окси]этил]бут-2-инамида 106а (330 мг неочищенный) в виде коричневого осадка. ESI-ЖХМС: m/z=696.8. Этот материал сразу использовали на следующей стадии.
2
2
4
3
1
Стадия 2: Смесь 106а (330 мг, 0.47 ммоль) и LiOH⋅HO (196 мг, 4.67 ммоль) в ТГФ/i-PrOH/воде (5.0 мл/3.0 мл/2.0 мл) перемешивали при КТ в течение 1 ч. Смесь экстрагировали ЕА. Объединенные органические слои высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили посредством препаративной ВЭЖХ с получением соединения 106 (30 мг, 8% за две стадии) в виде белого осадка. Н NMR (500 MHz, CDCl): δ 8.52 (s, 1Н), 8.26 (s, 1Н), 7.52 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.13-7.10 (m, 1H), 6.69 (s, 1H), 6.52 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.22 (d, J=8.5 Hz, 1H), 4.34 (s, 2H), 4.27 (t, J=5.0 Hz, 2H), 2.98-2.97 (m, 2H), 2.87-2.85 (m, 2H), 1.99-1.96 (m, 4H), 1.86 (s, 3H). ESI-ЖХМС: m/z=655 [C34H31FN6O5S + H]+
Пример 107 N-[(1S)-2-[[6-[[5-[2-(7,7-диметил-4-оксо-1,2,6,8-тетрагидроциклопента[3,4]пирроло[3,5-b]пиразин-3-ил)-3-(гидроксиметил)-4-пиридил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]окси]-1-метил-этил]проп-2-енамид 107
Стадия 1: (S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)пропил метансульфонат 107а
3
2
4
1
К охлажденной на льду смеси (S)-трет-бутил 1-гидроксипропан-2-илкарбамата (3.0 г, 17.1 ммоль) и EtN (4.8 мл, 34.2 ммоль) в ДХМ (50 мл) добавили метансульфонилхлорид, MsCl (1.33 мл, 17.1 ммоль) по каплям. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч, разбавили с помощью ДХМ, промыли водой. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали с получением соединения 107а (3.72 г, 86%) в виде белого осадка. Н NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 4.044-4.033 (d, 2Н), 3.164 (s, 3Н), 1.385 (s, 9Н), 1.065-1.051 (d, 3Н)
Стадия 2: (S)-трет-бутил 1-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)пропан-2-ил карбамат 107b
2
3
2
4
+
Смесь 107а (964 мг, 5.5 ммоль), 5-бромо-3-(6-гидроксипиридин-2-иламино)-1-метилпиридин-2(1Н)-она 101а (4 г неочищенный, 16.5 ммоль), CsCO (5.38 г, 11 ммоль) в ДМФ (20 мл) перемешивали при 95°C в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавили с помощью ДХМ, промыли водой. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили с помощью хроматографии на силикагеле (DCM/MeOH = 20/1) с получением 107b (550 мг, 22%) в виде коричневого осадка. MS-ESI: [М+Н] 453.1
Стадия 3: (S)-3-(6-(2-аминопропокси)пиридин-2-иламино)-5-бромо-1-метилпиридин-2(1Н)-она гидрохлорид 107с
2
3
2
4
+
Смесь 107b (550 мг, 1.21 ммоль) в ДХМ (10 мл) обработали HCl (4 M в диоксоне, 3 мл, 12 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч и погасили с помощью насыщ. NaCO, экстрагировали с помощью ДХМ. Объединенные экстракты высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали с получением 107с (400 мг, 1.03 ммоль) в виде коричневого осадка. MS-ESI: [М+Н] 352.9
Стадия 4: (S)-N-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)пропан-2-ил)акриламид 107d
2
4
+
К охлажденной на льду смеси соединения 107с (390 мг, 1.0 ммоль) и TEA (0.53 мл, 3.0 ммоль) в ДХМ (20 мл) добавили акрилоилхлорид (0.23 мл, 2.0 ммоль) по каплям. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч и погасили водой. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили с помощью хроматографии на силикагеле (DCM/MeOH = 10/1) с получением соединения 107d (284 мг, 70%) в виде коричневого осадка. MS-ESI: [М+Н] 409.0
Стадия 5: 4-(4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.02,6]додека-2(6),7-диен-10-ил)[1,2]оксабороло[4,3-с]пиридин-1(3Н)-ол 107g
2,6
2,6
4
2
4
2
3
2
4
4-хлор-2-{4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.0]додека-2(6),7-диен-10-ил}пиридин-3-карбальдегид 107е получили в соответствии с методикой для промежуточного соединения 108а в US 8716274, Пример 108, Фигура 8, и из 4,4-диметил-1,10-диазатрицикло[6.4.0.0]додека-2(6),7-диен-9-она из US 8729072, Пример 103е. В раствор 107е (12.0 г, 35.0 ммоль) в МеОН (40 мл) и ДХМ (40 мл) добавили NaBH (1.83 г, 38.4 ммоль) по порциям при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч, погасили водой и сконцентрировали. Остаток разделили между ЕА и солевым раствором. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Неочищенный продукт 4-хлор-2-{4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.02,6]додека-2(6),7-диен-10-ил}пиридин-3-карбинол 107f использовали на следующей стадии без дополнительной очистки (9.6 г, 80%). Смесь соединения 107f (9.6 г, 27.8 ммоль), тетрагидроксидиборана, тетрагидроксидибора (7.43 г, 83.5 ммоль), Xphos-Pd-G2 (218 мг, 0.278 ммоль), Xphos (321 мг, 0.556 ммоль) и KOAc (6.85 г, 83.5 ммоль) в EtOH (200 мл) нагревали до 80°C в течение 1 ч и сконцентрировали. Остаток растворили в насыщ. KCO (100 мл) и экстрагировали с помощью ДХМ 4 раза. Органическую фазу отбросили и водный слой нейтрализовали концентрированной HCl. Образовался белый преципитат и суспензию экстрагировали с помощью ДХМ. Органический слой объединили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали с получением соединения 107g в виде серого осадка (6.21 г, 53%).
2
3
4
6
1
Стадия 6: Смесь 107d (150 мг, 0.37 ммоль), 107g (125 мг, 0.37 ммоль), Pd(dppf)Cl (27 мг, 10 ммоль%) и KPO (235 мг, 1.11 ммоль) в ацетонитриле (20 мл) и воде (5 мл) перемешивали при 85°C в течение 4 ч в атмосфере азота. Реакционную смесь охладили до КТ и сконцентрировали. Остаток очистили с помощью препаративной ТСХ (ДХМ/МеОН = 30/1) с получением соединения 107 (80 мг, 34%) в виде желтого осадка. Н NMR (400 MHz, DMSO-d): δ 8.61-8.58 (m, 2Н), 8.10 (bs, 1Н), 7.52-7.45 (m, 3Н), 7.38-7.34 (m, 2Н), 6.86 (d, J=7.6Hz, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.15 (bs, 2H), 6.15-6.01 (m, 1H), 5.56 (bs, 1H), 4.97 (bs, 1H), 4.39-4.33 (m, 2H), 4.19-4.03 (m, 6H), 3.87 (bs, 1H), 3.61 (s, 3H), 2.56-2.42 (m, 4H), 1.21 (s, 6H), 0.97-0.91 (m, 3H). ESI-ЖХМС: m/z=638 [C35H39N7O5 + H]+
Пример 108 N-[(1S)-2-[[6-[[5-[5-фтор-2-(гидроксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиридазин-3-ил)фенил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]окси]-1-метил-этил]проп-2-енамид 108
Стадия 1: (4-фтор-2-{6-оксо-8-тиа-4,5-диазатрицикло[7.4.0.02,7]тридека-1(9),2(7),3-триен-5-ил}-6-(бромо)фенил)метилацетат 108b
2,7
+
3
2
4
8-тиа-4,5-диазатрицикло[7.4.0.0]тридека-1(9),2(7),3-триен-6-он получили в соответствии с методиками US 8716274, Пример 191d и конвертировали в (4-фтор-2-{6-оксо-8-тиа-4,5-диазатрицикло[7.4.0.02,7]тридека-1(9),2(7),3-триен-5-ил}-6-(бромо)фенил)карбинол 108а. К смеси 108а (4.1 г, 10 ммоль) и EtN (1.95 мл, 14 ммоль) в ТГФ (50 мл) добавили AcCl (0.85 мл, 12 ммоль). Смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч, разбавили водой и экстрагировали ЕА. Объединенные органические слои высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали с получением соединения 108b (4.0 г) в виде желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 451.0
Стадия 2: (4-фтор-2-{6-оксо-8-тиа-4,5-диазатрицикло[7.4.0.02,7]тридека-1(9),2(7),3-триен-5-ил}-6-(тетра-метил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)метилацетат 108с
2
2
2
2
+
Смесь соединения 108b (4.5 г, 10 ммоль), 4,4,4',4',5,5,5',5'-октаметил-2,2'-би(1,3,2-диоксаборолана), PinB (7.6 г, 30 ммоль), Pd(dppf)Cl (378 мг, 0.5 ммоль) и KOAc (2.9 г, 30 ммоль) в диоксане (80 мл) перемешивали при 90°C в течение 5 ч в атмосфере N. Реакционную смесь сконцентрировали. Остаток суспендировали с помощью РЕ/ЕА (40 мл/2 мл) и отфильтровали с получением соединения 108с (3.5 г, 70%) в виде желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 498.9
Стадия 3: N-[(1S)-2-[[6-[[5-[5-фтор-2-(ацетоксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиридазин-3-ил)фенил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]окси]-1-метил-этил]проп-2-енамид 108d
2
3
4
Смесь (S)-N-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)пропан-2-ил)акриламида 107d (150 мг, 0.37 ммоль), 108с (200 мг, 0.40 ммоль), Pd(dppf)Cl (27 мг, 10 моль %) и KРO (235 мг, 1.11 ммоль) в ацетонитриле (20 мл) и воде (5 мл) перемешивали при 85°C в течение 4 ч в атмосфере азота. Реакционную смесь охладили до КТ и сконцентрировали. Остаток очистили с помощью препаративной ТСХ (ДХМ/МеОН=30/1) с получением 108d (70 мг неочищенный) в виде желтого осадка
2
2
6
1
Стадия 4: К смеси 108d (70 мг, 0.1 ммоль) в ТГФ (6 мл), i-PrOH(2 мл) и HO (2 мл) добавили LiOH⋅HO (42 мг, 1 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч и сконцентрировали. Остаток очистили посредством препаративной ВЭЖХ с получением соединения 108 (20 мг, 8% за две стадии) в виде желтого осадка. Н NMR (500 MHz, DMSO-d): δ 8.61 (d, J=10 Hz, 2H), 8.49 (s, 1H), 8.04-8.03 (m, 1H), 7.52-7.50 (m, 2H), 7.40-7.35 (m, 2H), 6.87 (d, J=8 Hz, 1H), 6.21-6.15 (m, 2H), 6.05-6.02 (m, 1H), 5.54 (d, J=10 Hz, 1H), 4.73 (bs, 1H), 4.30 (bs, 2H), 4.15 (bs, 2H), 4.02 (bs, 1H), 3.61 (s, 3H), 2.93 (bs, 2H), 2.84 (bs, 2H), 1.86 (bs, 4H), 0.97 (bs, 3H). ESI-ЖХМС: m/z=657.3 [C34H33FN6O5S + H]+
Пример 109 N-[2-[[6-[[5-[2-(7,7-диметил-4-оксо-1,2,6,8-тетрагидроциклопента[3,4]пирроло[3,5-b]пиразин-3-ил)-3-(гидроксиметил)-4-пиридил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]амино]этил]проп-2-енамид 109
2
3
4
2
6
1
Смесь N-(2-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-иламино)этил)акриламида 105е (100 мг, 0.255 ммоль), 4-(4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.02,6]додека-2(6),7-диен-10-ил)[1,2]оксабороло[4,3-с]пиридин-1(3Н)-ола 107g (86 мг, 0.255 ммоль), Pd(dppf)Cl (20 мг, 10 моль %), Xant-phos (30 мг, 20 моль %) и KPO (160 мг, 0.765 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) и НO (2 мл) перемешивали при 85°C в течение 4 ч в атмосфере азота. Реакционную смесь сконцентрировали и остаток очистили посредством препаративной ВЭЖХ с получением 109 (10 мг, 6%) в виде желтого осадка. Н NMR (500 MHz, DMSO-d): δ 8.69 (d, J=2.0 Hz, 1H), 8.46 (d, J=5.0 Hz, 1H), 8.22 (t, J=5.0 Hz, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.35 (d, J=5.0 Hz, 1H), 7.24 (t, J=8.0 Hz, 1H), 6.57 (s, 1H), 6.44 (bs, 1H), 6.38 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.19-6.14 (m, 1H), 6.06-6.02 (m, 1H), 5.96 (d, J=8.0 Hz, 1H), 5.55 (d, J=12.5 Hz, 1H), 5.09 (bs, 1H), 4.52-4.43 (m, 2H), 4.25-4.19 (m, 3H), 3.86-3.84 (m, 1H), 3.61 (s, 3H), 3.29-3.27 (m, 2H), 3.24-3.22 (m, 2H), 2.59-2.51 (m, 2H), 2.42 (s, 2H), 1.22 (s, 6H). ESI-ЖХМС: m/z=623.0 [C34H38N8O4 + H]+
Пример 110 N-[2-[[6-[[5-[2-(7,7-диметил-4-оксо-1,2,6,8-тетрагидроциклопента[3,4]пирроло[3,5-b]пиразин-3-ил)-3-(гидроксиметил)-4-пиридил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]-метил-амино]этил]проп-2-енамид 110
2
3
2
3
2
2
4
Стадия 1: Смесь N,N-бис-Вос 6-бромопиридин-2-амина 105а (5.0 г, 13.4 ммоль), трет-бутил 2-(метиламино)этилкарбамата (3.5 г, 20.0 ммоль), Pd(dba) (610 мг, 0.67 ммоль), Ксантфоса (774 мг, 1.34 ммоль) и CsCO (10.9 г, 31.5 ммоль) в ДМФ (50 мл) перемешивали при 95°C в течение 7 ч в атмосфере N. Смесь отфильтровали и фильтрат разбавили ЕА (50 мл), промыли водой. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили с помощью хроматографии на силикагеле (РЕ/ЕА = 9/1) с получением смеси N,N-бис-Вос, 6-(2-N-Вос-1-метиламиноэтил)пиридин-2-амина 110а (ESI-ЖХМС: m/z=467.3), и N-Boc, 6-(2-N-Вос-1-метиламиноэтил)пиридин-2-амина 110b (ESI-ЖХМС: m/z=367.3), 2.0 г, 40%, в виде желтого осадка.
Стадия 2: Смесь 110а и 110b (2.0 г, 4.3 ммоль) в HCl (10 мл, 4 М в 1,4-диоксане, 40 ммоль) перемешивали при КТ в течение 7 ч. Реакционную смесь сконцентрировали с получением трет-бутил 6-((2-аминоэтил)(метил)амино)пиридин-2-илкарбамата гидрохлорида 110с (1.2 г, 93%) в виде желтого осадка, который сразу использовали на следующей стадии. ESI-ЖХМС: m/z=267.2
2
4
Стадия 3: Смесь 110с (1.2 г, 4.5 ммоль), акриловой кислоты (0.37 мл, 5.4 ммоль), HATU (2.05 г, 5.4 ммоль) и DIPEA (4.6 мл, 10.8 ммоль) в ДХМ (30 мл) перемешивали при КТ в течение ночи. Смесь промыли водой. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали с получением трет-бутил 6-((2-акриламидоэтил)(метил)амино)пиридин-2-илкарбамата 110d (1.2 г, 75%) в виде коричневого масла. Материал сразу использовали на следующей стадии. ESI-ЖХМС: m/z=321.3
2
4
Стадия 4: Смесь 110d (2.0 г, 6.25 ммоль) и ТФУ (2.0 мл) в ДХМ (10.0 мл) перемешивали при КТ в течение ночи. Смесь сконцентрировали и разбавили ЕА (30 мл), нейтрализовали с помощью 1М NaOH. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили с помощью препаративной ТСХ (РЕ/ЕА = 1/1) с получением N-(2-((6-аминопиридин-2-ил)(метил)амино)этил)акриламида 110е (550 мг, 40%) в виде желтого масла. ESI-ЖХМС: m/z=221.2
2
3
2
3
2
2
4
Стадия 5: Смесь 110е (400 мг, 1.82 ммоль), 3,5-дибромо-1-метилпиридин-2(1Н)-она (534 мг, 2.0 ммоль), Pd(dba) (83 мг, 0.091 ммоль), Ксантфоса (105 мг, 0.182 ммоль) и CsCO (1.48 г, 4.55 ммоль) в ДМФ (10 мл) перемешивали при 95°C в атмосфере N в течение 7 ч. Смесь разбавили ЕА (50 мл) и отфильтровали. Фильтрат промыли водой, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили с помощью хроматографии на силикагеле (РЕ/ЕА = 1/2) с получением N-(2-((6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-ил)(метил)амино)этил)акриламида 110f (160 мг, 22%) в виде желтого осадка. ESI-ЖХМС: m/z=408.0
2
3
4
2
3
1
Стадия 6: Смесь 110f (80 мг, 0.20 ммоль), 4-(4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.02,6]додека-2(6),7-диен-10-ил)[1,2]оксабороло[4,3-с]пиридин-1(3Н)-ола 107g (83 мг, 0.22 ммоль), Pd(dppf)Cl (15 мг, 0.02 ммоль) и KPO (106 мг, 0.5 ммоль) в ацетонитриле (5 мл) и воде (1 мл) перемешивали при 90°C в атмосфере N в течение 7 ч. Смесь отфильтровали и фильтрат сконцентрировали. Остаток очистили с помощью препаративной ТСХ (ЕА/МеОН = 20/1) с получением соединения 110 (60 мг, 48%) в виде светло-желтого осадка. Н NMR (400 MHz, CDCl): δ 8.63 (s, 1Н), 8.46-8.45 (d, J=4.8 Hz, 1Н), 7.81 (s, 1Н), 7.75 (s, 1Н), 7.41-7.34 (m, 1Н), 6.83 (s, 1Н), 6.65 (s, 1Н), 6.19-6.18 (d, J=7.2 Hz, 1H), 6.03-5.95 (m, 2H), 5.72-5.65 (m, 1H), 5.42-5.39 (d, J=10.4 Hz, 1H), 4.96-3.98 (m, 7H), 3.71 (s, 3H), 3.53-3.22 (m, 3Н), 2.99 (s, 3Н), 2.57 (s, 2H), 2.51 (s, 2H), 1.27 (s, 6H). ESI-ЖХМС: m/z=637 [C35H40N8O4 + H]+
Пример 111 N-[2-[[6-[[5-[5-фтор-2-(гидроксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиридазин-3-ил)фенил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]-метил-амино]этил]проп-2-енамид 111
2
3
4
2
Стадия 1: Смесь N-(2-((6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-ил)(метил)амино)этил)акриламида 110f (120 мг, 0.3 ммоль), (4-фтор-2-{6-оксо-8-тиа-4,5-диазатрицикло[7.4.0.02,7]тридека-1(9),2(7),3-триен-5-ил}-6-(тетра-метил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)метилацетата 108с (179 мг, 0.36 ммоль), Pd(dppf)Cl (23 мг, 0.03 ммоль) и KPO (159 мг, 0.75 ммоль) в ацетонитриле (5 мл) и воде (1.0 мл) перемешивали при 90°C в атмосфере N в течение 7 ч. Смесь отфильтровали и фильтрат сконцентрировали. Остаток очистили с помощью препаративной ТСХ (ЕА/МеОН = 25/1) с получением N-[2-[[6-[[5-[5-фтор-2-(ацетоксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиpидaзин-3-ил)фeнил]-1-мeтил-2-oкco-3-пиpидил]aминo]-2-пиpидил]-мeтил-амино]этил]проп-2-енамида 111а (150 мг, 60%) в виде светло-желтого осадка. ESI-ЖХМС: m/z=698.2
2
2
4
3
1
Стадия 2: Смесь 111а (130 мг, 0.186 ммоль) и LiOH⋅HO (40 мг, 0.93 ммоль) в ТГФ/i-PrOH/воде (2.0 мл/1.0 мл/1.0 мл) перемешивали при КТ в течение 2 ч. Смесь экстрагировали ЕА. Объединенные органические слои высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили с помощью препаративной ТСХ (ДХМ/МеОН = 20/1) с получением соединения 111 (40 мг, 33%) в виде белого осадка. Н NMR (400 MHz, CDCl): δ 8.53 (s, 1Н), 8.25 (s, 1Н), 7.77 (s, 1Н), 7.47 (s, 1Н), 7.39-7.35 (t, J=8.4 Hz, 1Н), 7.26-7.23 (m, 1Н), 7.10-7.08 (m, 1Н), 6.64 (s, 1Н), 6.18-6.16 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.08-6.00 (m, 2H), 5.85-5.79 (m, 1H), 5.47-5.44 (d, J=10.4 Hz, 1H), 4.30-4.28 (d, J=6.4 Hz, 2H), 4.02-3.99 (t, J=6.4 Hz, 1H), 3.75-3.69 (m, 5H), 3.47-3.45 (m, 2H), 3.02-2.98 (m, 5H), 2.86 (m, 2H), 1.98 (m, 4H). ESI-ЖХМС: m/z=656 [C34H34FN7O4S + H]+
Пример 112 N-[2-[[6-[[5-[2-(7,7-диметил-4-оксо-1,2,6,8-тетрагидроциклопента[3,4]пирроло[3,5-b]пиразин-3-ил)-3-(гидроксиметил)-4-пиридил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]окси]этил]-N-метил-проп-2-енамид 112
2
2
4
Стадия 1: К смеси 2-(метиламино)этанола (5.0 г, 66.6 ммоль) в ДХМ (100 мл) добавили раствор (Вос)O (15.0 г, 67.9 ммоль) в ДХМ (20 мл). Смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч, разбавили ЕА (100 мл) и промыли водой. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали с получением трет-бутил 2-гидроксиэтил(метил)карбамата 112а (10.0 г, 86%) в виде бесцветного масла.
3
Стадия 2: К смеси 112а (9.0 г, 51 ммоль), и EtN (18.6 мл, 51 ммоль) в ДХМ (100 мл) добавили TsCl (9.77 г, 51 ммоль). Смесь перемешивали при КТ в течение 4 ч и сконцентрировали. Остаток разбавили ЕА, промыли водой. Органический слой высушили и сконцентрировали с получением 2-(трет-бутоксикарбонил(метил)амино)этил 4-метилбензолсульфоната 112b (10.0 г, 61%) в виде светло-желтого масла. ESI-ЖХМС: m/z=230.0
2
3
2
4
Стадия 3: Смесь 112b (3.3 г, 10 ммоль), 5-бромо-3-(6-гидроксипиридин-2-иламино)-1-метилпиридин-2(1Н)-она 101а (7.4 г, 25 ммоль) и CsCO (4.1 г, 12.5 ммоль) в ДМФ (40 мл) перемешивали при 100°C в течение 4 ч. Смесь разделили между ЕА и водой. Органический слой отделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали с получением трет-бутил 2-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)этил(метил)карбамата 112с (1.0 г, 22%) в виде желтого осадка. ESI-ЖХМС: m/z=454.9
Стадия 4: Смесь 112с (900 мг, 1.99 ммоль) в HCl (5 мл, 4M в 1,4-диоксане, 20 ммоль) перемешивали при КТ в течение 2 ч. Реакционную смесь сконцентрировали с получением 5-бромо-1-метил-3-(6-(2-(метиламино)этокси)пиридин-2-иламино)пиридин-2(1Н)-она гидрохлорида 112d (660 мг, 85%) в виде желтого осадка. Этот материал сразу использовали на следующей стадии. ESI-ЖХМС: m/z=354.9 (свободное основание).
3
2
4
Стадия 5: К смеси 112d (800 мг, 2.27 ммоль) и EtN (0.79 мл, 5.67 ммоль) в ДХМ (20 мл) добавили акрилоилхлорид (0.23 мл, 2.84 ммоль). Смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч и погасили водой. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали с получением N-(2-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)этил)-N-метилакриламида 112е (250 мг, 27%) в виде светло-желтого осадка. ESI-ЖХМС: m/z=407.0
2
3
4
2
6
1
Стадия 6: Смесь 112е (200 мг, 0.5 ммоль), 4-(4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.02,6]додека-2(6),7-диен-10-ил)[1,2]оксабороло[4,3-с]пиридин-1(3Н)-ола 107g (185 мг, 0.55 ммоль), Pd(dppf)Cl (37 мг, 0.05 ммоль) и KPO (265 мг, 1.25 ммоль) в ацетонитриле (5 мл) и воде (1 мл) перемешивали при 90°C в течение 16 ч в атмосфере N. Смесь отфильтровали и фильтрат сконцентрировали. Остаток очистили с помощью препаративной ТСХ (ЕА/МеОН = 25/1) с получением соединения 112 (70 мг, 22%) в виде светло-желтого осадка. Н NMR (300 MHz, DMSO-d, 80°C): δ 8.47-8.45 (m, 2Н), 8.34 (s, 1Н), 7.51 (t, J=7.5 Hz, 2Н), 7.32 (d, J=5.1 Hz, 1H), 6.80 (d, J=5.1 Hz, 1H), 6.69-6.58 (m, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.19 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.03-5.97 (m, 1H), 5.53 (bs, 1H), 4.76 (t, J=5.1 Hz, 1H), 4.48-4.46 (m, 2H), 4.32 (t, J=5.4 Hz, 2H), 4.21-4.17 (m, 2H), 3.67 (t, J=5.1 Hz, 2H), 3.61 (s, 3H), 3.04 (s, 3H), 2.88 (bs, 2H), 2.57 (s, 2H), 2.44 (s, 2H), 1.23 (s, 6H). ESI-ЖХМС: m/z=638.0 [C35H39N7O5 + H]+
Пример 113 N-[2-[[6-[[5-[5-фтор-2-(гидроксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиридазин-3-ил)фенил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]окси]этил]-N-метил-проп-2-енамид 113
2
3
4
2
+
Стадия 1: Смесь N-(2-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)этил)-N-метилакриламида 112е (100 мг, 0.25 ммоль), (4-фтор-2-{6-оксо-8-тиа-4,5-диазатрицикло[7.4.0.02,7]тридека-1(9),2(7),3-триен-5-ил}-6-(тетра-метил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)метилацетата 108с (187 мг, 0.375 ммоль), Pd(dppf)Cl (19 мг, 0.025 ммоль) и KPO (133 мг, 0.625 ммоль) в ацетонитриле (5 мл) и воде (0.5 мл) перемешивали при 90°C в течение 6 ч в атмосфере N. Смесь отфильтровали и фильтрат сконцентрировали. Остаток очистили с помощью препаративной ТСХ (РЕ/ЕА = 1/4) с получением N-[2-[[6-[[5-[5-фтор-2-(ацетоксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиpидaзин-3-ил)фeнил]-1-мeтил-2-oкco-3-пиpидил]aминo]-2-пиpидил]oкcи]этил]-N-метил-проп-2-енамида 113а (100 мг, 57%) в виде светло-желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 699.2
2
2
4
6
1
Стадия 2: Смесь 113а (80 мг, 0.115 ммоль) и LiOH⋅HO (24 мг, 0.573 ммоль) в TГФ/i-PrOH/воде (3.0 мл/1.0 мл/1.0 мл) перемешивали при КТ в течение 6 ч. Смесь экстрагировали ЕА. Объединенные органические слои высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили с помощью препаративной ТСХ (ЕА/МеОН = 25/1) с получением 113 (50 мг, 67%) в виде белого осадка. Н NMR (300 MHz, DMSO-d, 80°C): δ 8.42 (s, 2Н), 8.35 (s, 1Н), 7.52 (t, J=8.1 Hz, 1Н), 7.43 (d, J=2.4 Hz, 1H), 7.33-7.30 (m, 2H), 6.81 (d, J=8.1 Hz, 1H), 6.68-6.59 (m, 1H), 6.19 (d, J=8.1 Hz, 1H), 6.05-5.99 (m, 1H), 5.56 (m, 1H), 4.37-4.32 (m, 2H), 3.68 (t, J=5.4 Hz, 2H), 3.62 (s, 3H), 3.07 (s, 3H), 2.95-2.86 (m, 6H), 1.91-1.89 (m, 4H). ESI-ЖХМС: m/z=657.3 [C34H33FN6O5S + H]+
Пример 114 N-[(3S)-1-[6-[[5-[2-(7,7-диметил-4-оксо-1,2,6,8-тетрагидроциклопента[3,4]пирроло[3,5-b]пиразин-3-ил)-3-(гидроксиметил)-4-пиридил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]-3-пиперидил]проп-2-енамид 114
2
3
2
3
2
2
4
Стадия 1: Смесь N,N-бис-Вос 6-бромопиридин-2-амина 105а (5.0 г, 13.4 ммоль), (S)-трет-бутил пиперидин-3-илкарбамата (4 г, 20.0 ммоль), Pd(dba) (610 мг, 0.67 ммоль), Ксантфоса (774 мг, 1.34 ммоль) и CsCO (10.9 г, 31.5 ммоль) в ДМФ (50 мл) перемешивали при 95°C в течение 7 ч в атмосфере N. Смесь отфильтровали и фильтрат разбавили ЕА (50 мл), промыли водой. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили с помощью хроматографии на силикагеле (РЕ/ЕА = 9/1) с получением смеси (S)-N-Вос-6-(3-(бис-Вос-амино)пиперидин-1-ил)пиридин-2-амина 114а и (S)-N-Вос-6-(3-(Вос-амино)пиперидин-1-ил)пиридин-2-амина 114b (2.3 г, 35%) в виде желтого осадка.
Стадия 2: Смесь 114а и 114b (2.3 г, 4.69 ммоль) в HCl (10 мл, 4 М в 1,4-диоксане, 40 ммоль) перемешивали при КТ в течение 7 ч. Реакционную смесь сконцентрировали с получением (S)-трет-бутил 6-(3-аминопиперидин-1-ил)пиридин-2-илкарбамата гидрохлорида 114с (1.39 г, 90%) в виде желтого осадка, который сразу использовали на следующей стадии.
2
4
Стадия 3: Смесь 114с (1.39 г, 4.22 ммоль), акриловой кислоты (0.3 мл, 4.5 ммоль), HATU (1.7 г, 4.5 ммоль) и DIPEA (3.8 мл, 9 ммоль) в ДХМ (30 мл) перемешивали при КТ в течение ночи. Смесь промыли водой. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали с получением (S)-трет-бутил 6-(3-акриламидопиперидин-1-ил)пиридин-2-илкарбамата 114d (880 мг, 60%) в виде коричневого масла. Материал сразу использовали на следующей стадии.
2
4
+
Стадия 4: Смесь 114d (880 мг, 2.53 ммоль) и ТФУ (2.0 мл) в ДХМ (10.0 мл) перемешивали при КТ в течение ночи. Смесь сконцентрировали и разбавили ЕА (30 мл), нейтрализовали с помощью 1М NaOH. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили с помощью препаративной ТСХ (РЕ/ЕА = 1/1) с получением (S)-N-(1-(6-аминопиридин-2-ил)пиперидин-3-ил)акриламида 114е (440 мг, 70%) в виде желтого масла. MS-ESI: [М+Н] 247.2
2
3
2
3
2
2
4
+
Стадия 5: Смесь 114е (440 мг, 1.79 ммоль), 3,5-дибромо-1-метилпиридин-2(1Н)-она (534 мг, 2.0 ммоль), Pd(dba) (83 мг, 0.091 ммоль), Ксантфоса (105 мг, 0.182 ммоль) и CsCO (1.48 г, 4.55 ммоль) в ДМФ (10 мл) перемешивали при 95°C в атмосфере N в течение 7 ч. Смесь разбавили с помощью ЕА и отфильтровали. Фильтрат промыли водой, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили с помощью хроматографии на силикагеле (РЕ/ЕА=1/2) с получением (S)-N-(1-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-ил)пиперидин-3-ил)акриламида 114f (220 мг, 28%) в виде желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 433.3
2
3
4
2
Стадия 6: Смесь 114f (86 мг, 0.20 ммоль), 4-(4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.02,6]додека-2(6),7-диен-10-ил)[1,2]оксабороло[4,3-с]пиридин-1(3Н)-ола 107g (83 мг, 0.22 ммоль), Pd(dppf)Cl (15 мг, 0.02 ммоль) и KPO (106 мг, 0.5 ммоль) в ацетонитриле (5 мл) и воде (1 мл) перемешивали при 90°C в атмосфере N в течение 7 ч. Смесь отфильтровали и фильтрат сконцентрировали.
1
6
Остаток очистили посредством препаративной ВЭЖХ с получением соединения 114 (25 мг, 19%) в виде серого осадка. Н NMR (300 MHz, DMSO-d, 80°C): δ 8.39 (s, 1Н), 8.00 (s, 1Н), 7.82 (d, J=6.6 Hz, 1Н), 7.32-7.46 (m, 6Н), 6.51 (s, 1Н), 6.42 (d, J=8.1 Hz, 1H), 6.03-6.24 (m, 3H), 5.54 (d, J=13.5 Hz, 1H), 4.65 (bs, 1H), 4.41 (bs, 2H), 4.21-4.07 (m, 3H), 3.94-3.77 (m, 4H), 3.60 (s, 3H), 2.95 (bs, 2H), 2.58 (s, 2H), 2.44 (s, 2H), 1.85 (bs, 1H), 1.63-1.48 (m, 3H), 1.24 (s, 6H). ESI-ЖХМС: m/z=663 [C37H42N8O4 + H]+
Пример 115 N-[(3S)-1-[6-[[5-[5-фтор-2-(гидроксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиридазин-3-ил)фенил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]-3-пиперидил]проп-2-енамид 115
2
3
4
2
+
Стадия 1: Смесь (S)-N-(1-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-ил)пиперидин-3-ил)акриламида 114f (127 мг, 0.3 ммоль), (4-фтор-2-{6-оксо-8-тиа-4,5-диазатрицикло[7.4.0.02,7]тридека-1(9),2(7),3-триен-5-ил}-6-(тетра-метил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)метилацетата 108с (179 мг, 0.36 ммоль), Pd(dppf)Cl (23 мг, 0.03 ммоль) и KPO (159 мг, 0.75 ммоль) в ацетонитриле (5 мл) и воде (1.0 мл) перемешивали при 90°C в атмосфере N в течение 7 ч. Смесь отфильтровали и фильтрат сконцентрировали. Остаток очистили с помощью препаративной ТСХ (ЕА/МеОН = 25/1) с получением N-[(3S)-1-[6-[[5-[5-фтор-2-(ацетоксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиpидaзин-3-ил)фeнил]-1-мeтил-2-oкco-3-пиpидил]aминo]-2-пиpидил]-3-пиперидил]проп-2-енамида 115а (73 мг, 33%) в виде желтого осадка. MS-ESI: [М+Н] 724.3
2
2
4
6
1
Стадия 2: Смесь 115а (73 мг, 0.1 ммоль) и LiOH⋅HO (40 мг, 1 ммоль) в ТГФ/i-PrOH/воде (2.0 мл/1.0 мл/ 1.0 мл) перемешивали при КТ в течение 2 ч. Смесь экстрагировали ЕА. Объединенные органические слои высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток очистили посредством препаративной ВЭЖХ с получением соединения 115 (20 мг, 29%) в виде серого осадка. Н NMR (300 MHz, DMSO-d, 80°C): δ 8.42 (s, 1Н), 8.40 (s, 1Н), 8.00 (s, 1Н), 7.77 (d, J=4.5 Hz, 1Н), 7.41-7.29 (m, 5Н), 6.44 (d, J=3 Hz, 1H), 6.25-6.17 (m, 2H), 5.55-5.50 (m, 1H), 4.35 (s, 2H), 3.98-3.76 (m, 3H), 3.61 (s, 3H), 3.09-2.87 (m, 7H), 1.93-1.87 (m, 6H), 1.71 (bs, 1H), 1.49-1.45 (m, 2H). ESI-ЖХМС: m/z=682 [C36H36FN7O4S + H]+
Пример 116 N-[2-[[6-[[5-[2-(7,7-диметил-4-оксо-1,2,6,8-тетрагидроциклопента[3,4]пирроло[3,5-b]пиразин-3-ил)-3-(гидроксиметил)-4-пиридил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]окси]этил]бут-2-инамид 116
2
4
Стадия 1: Смесь 3-(6-(2-аминоэтокси)пиридин-2-иламино)-5-бромо-1-метилпиридин-2(1Н)-она гидрохлорида 103а (1.0 г, 2.66 ммоль), бут-2-иновой кислоты (268 мг, 3.19 ммоль), HATU (1.21 г, 3.19 ммоль) и DIPEA (1.14 мл, 6.65 ммоль) в ДМФ (10 мл) перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавили ЕА и промыли водой. Органический слой разделили, высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали. Остаток промыли с помощью РЕ/ЕА (2 мл/20 мл) и высушили с получением N-(2-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)этил)бут-2-инамида 116а (800 мг, 74%) в виде светло-желтого осадка. ESI-ЖХМС: m/z=404.9
2
3
4
2
3
1
Стадия 2: Смесь 116а (150 мг, 0.37 ммоль), 4-(4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.02,6]додека-2(6),7-диен-10-ил)[1,2]оксабороло[4,3-с]пиридин-1(3Н)-ола 107g (150 мг, 0.445 ммоль), Pd(dppf)Cl (28 мг, 0.037 ммоль) и KРO (196 мг, 0.925 ммоль) в ацетонитриле (5 мл) и воде (1 мл) перемешивали при 90°C в течение 16 ч в атмосфере N. Смесь отфильтровали и фильтрат сконцентрировали. Остаток очистили посредством препаративной ВЭЖХ с получением соединения 116 (20 мг, 10%) в виде светло-желтого осадка. Н NMR (500 MHz, CDCl): δ 8.66 (s, 1Н), 8.56-8.55 (m, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.48 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.38 (s, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.49 (s, 1H), 6.44 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.26 (d, J=8.0 Hz, 1H), 5.05-3.97 (m, 8H), 3.72 (s, 3H), 3.59-3.57 (m, 2H), 2.57 (s, 2H), 2.51 (s, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.27 (s, 6H). ESI-ЖХМС: m/z=636.9 [C35H37N7O5 + H]+
Пример 117 2-циано-N-[2-[[6-[[5-[5-фтор-2-(гидроксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиридазин-3-ил)фенил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]окси]этил]проп-2-енамид 117
Стадия 1: Смесь 3-(6-(2-аминоэтокси)пиридин-2-иламино)-5-бромо-1-метилпиридин-2(1Н)-она 103а (480 мг, 1.42 ммоль), 2-цианоакриловой кислоты (790 мг, 2.84 ммоль), DIPEA (1.2 мл, 7.12 ммоль) и HATU (810 мг, 2.13 ммоль) в ДХМ (10 мл) перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционную смесь сконцентрировали и очистили с помощью хроматографии на силикагеле (РЕ/ЕА = 1/2) с получением N-(2-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)этил)-2-цианоакриламида 117а (400 мг, 67%) в виде зеленого осадка. ESI-ЖХМС: m/z=420.0
2
2
Стадия 2: Смесь 117а (300 мг, 0.72 ммоль), (4-фтор-2-{6-оксо-8-тиа-4,5-диазатрицикло[7.4.0.02,7]тридека-1(9),2(7),3-триен-5-ил}-6-(тетра-метил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)метилацетата 108с (430 мг, 0.86 ммоль), Pd(dppf)Cl (52 мг, 0.072 ммоль), KF (125 мг, 2.16 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) и НO (2 мл) перемешивали при 75°C в течение 3 ч в атмосфере азота. Реакционную смесь сконцентрировали и остаток очистили с помощью хроматографии на силикагеле (РЕ/ЕА=1/3) с получением 2-циано-N-[2-[[6-[[5-[5-фтор-2-(ацетоксиметил)-3-(4-оксо-6,7,8,9-тетрагидробензотиофено[2,3-d]пиридазин-3-ил)фенил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]окси]этил]проп-2-енамида 117b (80 мг, 15%) в виде белого осадка. ESI-ЖХМС: m/z=709.8
2
2
3
1
Стадия 3: К смеси 117b (80 мг, 0.112 ммоль) в ТГФ (5 мл) добавили LiOH⋅HO (10 мг, 0.224 ммоль) в НO (5 мл) до pH 10-11. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 4 ч и сконцентрировали. Остаток очистили посредством препаративной ВЭЖХ с получением соединения 117 (12 мг, 16%) в виде белого осадка. Амидная связь частично расщепилась в щелочной среде. Н NMR (500 MHz, CDCl): δ 8.57 (s, 1Н), 8.29 (s, 1Н), 7.99 (bs, 1Н), 7.49 (t, J=8 Hz, 2H), 7.26-7.24 (m, 1H), 7.12 (d, J=10 Hz, 1H), 6.48 (d, J=8 Hz, 1H), 6.26 (d, J=8 Hz, 1H), 4.41 (t, J=5 Hz, 2H), 4.31 (bs, 2H), 4.00-3.98 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.63 (t, J=5.5 Hz, 1H), 3.58-2.56 (m, 1H), 2.99 (t, J=5 Hz, 2H), 2.87 (t, J=5 Hz, 2H), 2.00-1.96 (m, 4H). ESI-ЖХМС: m/z=668.0 [C34H30FN7O5S + H]+
Пример 118 2-циано-N-[2-[[6-[[5-[2-(7,7-диметил-4-оксо-1,2,6,8-тетрагидроциклопента[3,4]пирроло[3,5-b]пиразин-3-ил)-3-(гидроксиметил)-4-пиридил]-1-метил-2-оксо-3-пиридил]амино]-2-пиридил]окси]этил]проп-2-енамид 118
2
2
6
1
Смесь N-(2-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)этил)-2-цианоакриламида 117а (60 мг, 0.144 ммоль), 4-(4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.02,6]додека-2(6),7-диен-10-ил)[1,2]оксабороло[4,3-с]пиридин-1(3Н)-ола 107g (58 мг, 0.173 ммоль), Pd(dppf)Cl (11 мг, 0.0144 ммоль) и KF (25 мг, 0.432 ммоль) в ацетонитриле (5 мл) и воде (0.5 мл) перемешивали при 75°C в течение 6 ч в атмосфере N. Смесь отфильтровали и фильтрат сконцентрировали. Остаток очистили с помощью препаративной ТСХ с помощью РЕ/ЕА (1/5) с получением соединения 118 (20 мг, 22%) в виде светло-желтого осадка. Н NMR (300 MHz, DMSO-d, 80°C): δ 8.43 (s, 1Н), 8.34 (s, 1Н), 7.56-7.32 (m, 6Н), 6.81 (d, J=7.5 Hz, 1Н), 6.53 (s, 1Н), 6.23 (d, J=7.5 Hz, 1H), 4.66-3.99 (m, 8Н), 3.62 (s, 3Н), 3.52-3.43 (m, 3Н), 2.58 (s, 2Н), 2.45 (s, 2Н), 1.24 (s, 6Н). ESI-ЖХМС: m/z=649 [C35H36N8O5 + Н]+
2,6
Пример 119 N-{2-[(6-{[5-(2-{4,4-диметил-9-оксо-1,10-диазатрицикло[6.4.0.0]додека-2(6),7-диен-10-ил}-3-(гидроксиметил)пиридин-4-ил)-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил]амино}пиридин-2-ил)окси]этил}пропанамид 119
3
Стадия 1: К смеси 3-(6-(2-аминоэтокси)пиридин-2-иламино)-5-бромо-1-метилпиридин-2(1Н)-она гидрохлорида 103а (250 мг, 0.66 ммоль) и EtN (0.23 мл, 6.0 ммоль) в ДХМ (15 мл) добавили пропионилхлорид (70 мкл, 0.79 ммоль). Смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Смесь промыли водой (20 мл*2). Органический слой высушили и сконцентрировали с получением N-(2-(6-(5-бромо-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-иламино)пиридин-2-илокси)этил)пропионамида 119а (140 мг, 54%) в виде светло-желтого осадка. ESI-ЖХМС: m/z=395.1.
2
3
4
3
2
Стадия 2: Смесь 119а (120 мг, 0.30 ммоль), соединения 9 (111 мг, 0.33 ммоль), Pd(dppf)Cl (23 мг, 0.03 ммоль) и KPO (160 мг, 0.75 ммоль) в CHCN (5 мл) и воде (1 мл) перемешивали при 90°C в атмосфере N в течение 7 ч. Смесь отфильтровали и фильтрат сконцентрировали с получением неочищенного продукта. Его очистили посредством препаративной ВЭЖХ с получением соединения 119 (40 мг, 21%) в виде белого осадка. ESI-ЖХМС: m/z=626.3
Пример 901 Биохимический анализ Btk
3
4
2
50
2
2
Общая методика для стандартного биохимического анализа киназы Btk может быть использована для тестирования соединений Формулы I как изложено далее. Мастер-микс минус фермент Btk получают содержащей 1Х Клеточный сигнальный киназный буфер (25 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 5 мМ бета-глицерофосфат, 2 мМ дитиотрейтол, 0.1 мМ NaVO, 10 мМ MgCl), 0.5 мкМ Promega РТК биотинилированный пептидный субстрат 2, и 0.01% БСА. Мастер-мик плюс фермент Btk получают содержащей 1Х Клеточный сигнальный киназный буфер, 0.5 мкМ Promega РТК биотинилированный пептидный субстрат 2, и 0.01% БСА и 100 нг/лунка (0.06 мЕд/лунка) фермента Btk. Фермент Btk готовят следующим образом: полноцепочечную киназу человека дикого дипа Btk (номер доступа NM-000061) с С-терминальными V5 и 6х His метками субклонируют в вектор pFastBac (Invitrogen/Life Technologies) для создания бакуловируса, несущего эту Btk с меченым эпитопом. Создание бакуловируса завершают на основании инструкции компании Invitrogen, подробно изложенной в опубликованном протоколе "Bac-to-Вас Baculovirus Expression Systems" (Invitrogen/Life Technologies, Cat. Nos. 10359-016 and 10608-016). 3 пассаж вируса используют для инфицирования клеток Sf9 с целью сверхэкспрессии рекомбинантного белка Btk. Белок Btk затем очищают до гомогенности с использованием колонки Ni-NTA. Чистота конечного белкового препарата составляет более чем 95% по данным чувствительной окраски Sypro-Ruby. Раствор 200 мкМ АТФ готовят в воде и доводят до pH 7.4 с помощью 1 н NaOH. 1.25 мкл соединений в 5% ДМСО переносят в 96-луночные полистирольные планшеты половинной пощади. Соединения тестируют поодиночке и с помощью 11-точененой кривой доза-ответ (стартовая концентрация составляет 10 мкМ; разведение 1:2). 18.75 мкл мастер-микса минус фермент (в качестве отрицательного контроля) и мастер-микса плюс фермент переносят в соответствующие лунки полистирольного 96-луночного планшета ½ площади costar. 5 мкл 200 мкМ АФТ добавили к этой смеси в 96-луночные полистирольные планшеты ½ площади Costar для достижения конечной концентрации АТФ 40 мкМ. Реакционной смеси дали инкубироваться в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакцию остановили с помощью 1Х детекционного буфера Perkin Elmer, содержащего 30 мМ ЭДТА, 20 нМ SA-APC, и 1 нМ РТ66 Ab. Планшет считывали, используя флуоресценцию с разрешением по времени с помощью Perkin Elmer Envision с использованием фильтра возбуждения 330 нм, фильтра эмиссии 665 нм, и второго фильтра эмиссии 615 нм. Значения IC впоследствии рассчитывали. Альтернативно, анализ Lanthascreen может быть использован для оценки активности Btk посредством подсчета его фосфорилированного пептидного продукта. FRET (Резонансный перенос энергии флуоресценции), который происходит между флуоресцеином на пептидном продукте и тербием на антителе детекции снижается при добавлении ингибиторов Btk, которые уменьшают фосфорилирование пептида. В конечном реакционном объеме 25 мкл, Btk (ч) (0.1 нг/25 мкл реакционной смеси) инкубируют с 50 мМ Hepes рН 7.5, 10 мМ MgCl, 2 мМ MnCl, 2 мМ DTT, 0.2 мМ NaVO4, 0.01% БСА, и 0.4 мкМ флуоресцеин поли-GAT. Реакцию запускают посредством добавления АТФ до 25 мкМ (Km АТФ). После инкубирования в течение 60 минут при комнатной температуре, реакционную смесь останавливают посредством добавления конечной концентрации 2 нМ Tb-PY20 антитела детекции в 60 мМ ЭДТА в течение 30 минут при комнатной температуре. Детекцию проводят на Perkin Elmer Envision при возбуждении 340 нм и эмиссии при 495 нм и 520 нм.
2
Альтернативно, может быть проведен биохимический анализ in vitro ВТK, который подсчитывает ВТK-катализируемое фосфорилирование синтетического пептида по тирозину, по детекции с использованием микроструйного анализатора сдвига подвижности LabChip 3000 (PerkinElmer; Waltham, MA). Пептидный субстрат, ProfilerPro FL-Peptide 22 (Продукт №760366; PerkinElmer), обладает аминоконцевой флуоресцентной 5-карбоксифлуоресцеиновой группой (5-FAM) и остатком тирозина, который может быть фосфорилирован посредством ВТК: 5-FAM-EEPLYWSFPAKKK-NH. Очищенный рекомбинантный полноцепочечный каталитически активный белок ВТK человека получили от компании Carna Biosciences (Product No. 08-080; Kobe, Japan).
Смеси для анализа ВТK содержали 50 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты буфер (pH 7.5), 10 мМ хлорид магния, 0.01% Triton Х-100, 1 мМ дитиотрейтол, 1 мкМ FL-Peptide 22, 45 мкМ АТФ, 1 нМ ВТK, и титровали до 10,000 нМ тестовых соединений в конечной концентрации 0.5% (объем к объему [об/об]) ДМСО. В экспериментах по титрованию каждая из концентраций тестируемых соединений (10 или 12 концентраций) тестировалась в повторе. Чистые реакции содержали АТФ, пептид и ДМСО, но не ВТK или тестовое соединение, при этом неингибированный контроль содержал АТФ, пептид, ВТK, и ДМСО, но не тестируемые соединения.
Реакционные смеси инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре (22°C-23°C) в конечном объеме 20 мкл на лунку в 384-луночных планшетах. Десять микролитров ВТK плюс пептидной смеси добавили к 10 мкл смеси АТФ и тестового соединения (или носителя) для запуска реакций. Реакции останавливали добавлением 10 мкл 0.25 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при pH 8.0 в каждую лунку. В каждой реакции, остаточный субстрат FL-пептид 22 (S) и образовавшийся фосфо-пептидный продукт (Р) разделили с использованием прибора LabChip 3000. Электрофоретическое разделение молекул продукта и молекул субстрата достигалось с использованием сниженного и повышенного напряжения -500 и -2250 V, соответственно, при рабочем давлении -1 фунт/кв. дюйм. 5-FAM группа, присутствующая как на субстрате, так и на пептиде-продукте облучалась при 488 нм; флуоресценция детектировалась при 530 нм и пиковые вершины записывались.
Анализ данных: Степень (или процент) конверсии субстрата в продукт рассчитывалась из соответствующей высоты пиков на электрофореграмме с использованием программного обеспечения HTS Well Analyzer, версия 5.2 (PerkinElmer) и следуя уравнению:
% конверсии = [(Р) ÷ (S+Р)] × 100
i
o
i
o
где S и Р отражают высоту пиков субстрата и продукта, соответственно. После того, как любой базовый сигнал от чистых лунок, не содержащих ВТK вычитался от сигнала всех тестовых лунок, % данных конверсии конвертировали в функциональную активность, как показано в Уравнении 2, где v и v представляют собой % конверсии в присутствии и отсутствии, соответственно, тестируемого соединения. % конверсии, наблюдаемый в неингибируемых контрольных реакционных лунках, содержащих ВТK и ДМСО носитель, но не тестовые соединения, задавался как обладающий относительной активностью = 1 (в данном случае без присутствия тестовых соединений, v=v), где чистые лунки, не содержащие ВТK задавались как имеющие относительную активность = 0. Относительная активность строилась против концентрации тестируемых соединений и данные аппроксимировались с использованием программного обеспечения Genedata Screener (Genedata; Basel, Switzerland) до прочного связывания кажущейся константы ингибирования  уравнения Моррисона [Williams, J.W. and Morrison, J.F. (1979) The kinetics of reversible tight-binding inhibition. Methods Enzymol 63: 437-67]. Следующее уравнение использовали для расчета относительной активности и :
T
T
где [Е] и [I] представляют собой полные концентрации активного фермента (фиксированное значение 0.001 мкМ = 1 нМ) и тестируемого соединения (например, ингибитор; изменяющийся параметр), соовтетственно.
50
Иллюстративные значения IC ингибирования Btk показаны в Таблице 1.
Пример 902 Анализ Btk на клетках Ramos
7
2
Другой распространенной методикой для обычного клеточного киназного анализа Btk, которая может быть использована для тестирования соединений Формулы I является следующая. Клетки Ramos инкубируют при плотности 0.5×10 клеток/мл в присутствии тестового соединения в течение 1 ч при 37°C. Затем клетки стимулируют инкубированием с 10 мкг/мл F(ab) к IgM человека в течение 5 минут при 37°C. Клетки осаждают, лизируют и выполняют белковый анализ на очищенном лизате. Эквивалентные количества белка каждого образца подвергают ДCH-ПААГ-электрофорезу и вестерн-блоттингу либо с антителом против фосфоBtk(Tyr223) (Epitomics, cat. #2207-1) или антителом против фосфоBtk(Tyr551) (BD Transduction Labs #558034) для оценки аутофосфорилирования Btk или антителом против Btk (BD Transduction Labs #611116) для контроля общего количества Btk в каждом лизате.
Пример 903 Анализ пролиферации В-клеток
5
3
3
2
Распространенной методикой обычного клеточного анализа пролиферации В-клеток, которая может быть использована для тестирования соединений Формулы I, является следующая. В-клетки очищают из селезенки 8-16 недельных мышей Balb/c с использованием набора для выделения В-клеток (Miltenyi Biotech, Cat # 130-090-862). Тестируемые соединения разбавляют в 0.25% ДМСО и инкубируют с 2.5×10 очищенных мышиных В-клеток селезенки в течение 30 мин перед добавлением 10 мкг/мл козьих F(ab') против мышиных антител IgM (Southern Biotech Cat # 1022-14) в конечном объеме 100 мкл. После 52 ч инкубирования, добавляют 1 μCi Н-тимидин и планшеты инкубируют дополнительные 16 ч перед сбором клеток с использованием протокола производителя для системы анализа поглощения SPA[H] тимидина (Amersham Biosciences # RPNQ 0130). Флуоресценция на основе SPA-шариков подсчитывается в сцинтиляционном счетчике Microbeta (Wallace Triplex 1450, Perkin Elmer).
Пример 904 Анализ пролиферации T клеток
5
3
3
Распространенной методикой обычного клеточного анализа пролиферации Т-клеток, которая может быть использована для тестирования соединений Формулы I, является следующая. Т клетки очищаются из селезенки 8-16 недельных мышей Balb/c с использованием набора для выделения Т-клеток Pan (Miltenyi Biotech, Cat # 130-090-861). Тестируемые соединения разбавляют в 0.25% ДМСО и инкубируют с 2.5×10 очищенных мышиных T клеток из селезенки в конечном объеме 100 мкл в планшетах с плоским прозрачным дном, предварительно покрытых в течение 90 мин при 37°C 10 мкг/мл каждого из антител к CD3 (BD # 553057) и к CD28 (BD # 553294). После 24 ч инкубирования, добавляют 1 μ Ci Н-тимидин и планшеты инкубируют дополнительные 16 ч перед сбором клеток с использованием протокола производителя для системы анализа поглощения SPA[H] тимидина (Amersham Biosciences # RPNQ 0130). Флуоресценция на основе SPA-шариков подсчитывается в сцинтиляционном счетчике Microbeta (Wallace Triplex 1450, Perkin Elmer).
Пример 905 Анализ ингибирования CD86
6
+
-
2
2
Распространенной методикой для обычного анализа ингибирования активности B клеток, которая может быть использована для тестирования соединений Формулы I, является следующая. Все спленоциты мыши очищают из селезенок 8-16 недельных мышей Balb/c с помощью лизиса красных кровяных клеток (BD Pharmingen #555899). Тестируемые соединения разбавляются до 0.5% ДМСО и инкубируются с 1.25×10 спленоцитов в конечном объеме 200 мкл в планшетах с плоским прозрачным дном (Falcon 353072) в течение 60 мин при 37°C. Затем клетки стимулируют дополнительными 15 мкг/мл козьих F(ab') к мышиным IgM (Southern Biotech Cat #1022-14), и инкубируют в течение 24 ч при 37°C, 5% СO. После 24 ч инкубирования клетки переносят 96-луночные планшеты с коническим прозрачным дном лунок и собирают центрифугированием при 1200×g×5 мин. Клетки предварительно блокируют CD16/CD32 (BD Pharmingen #553142), с последующим тройным окрашиванием с помощью CD19-FITC (BD Pharmingen #553785), CD86-PE (BD Pharmingen #553692), и 7AAD (BD Pharmingen #51-68981E). Клетки сортируют на проточном цитометре BD FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) и отбирают на CD19/7AAD популяцию. Уровень поверхностной экспрессии CD86 на отобранной популяции измеряют по отношению к концентрации тестируемого соединения.
Пример 906 Анализ выживаемости клеток B-ALL
Далее предложена методика обычного исследования выживаемости для клеток B-ALL (острый лимфобластный лейкоз) с использованием ХТТ считывания для измерения жизнеспособных клеток. Этот анализ может быть использован для тестирования соединений Формулы I на их способность ингибировать выживание клеток B-ALL в культуре. Одной из возможных линий В-клеток острого лимфобластного лейкоза, которая может быть использована, является SUP-B15, линия Pre-В-клеток ALL человека, которая доступна из АТСС.
5
2
SUP-B15 pre-B-ALL клетки помещают в 96-луночные микротитровальные планшеты в 100 мкл среды Искова + 20% ФБС при концентрации 5×10 клеток/мл. Затем добавили тестовые соединения с конечной концентрацией 0.4% ДМСО. Клетки инкубировали при 37°C с 5% CO в течение до 3 дней. Через 3 дня клетки разделили 1:3 в свежие 96-луночные планшеты, содержащие тестовые соединения и им дали расти дополнительные 3 дня. Через каждый 24 ч период добавляли 50 мкл раствора ХТТ в один из повторных 96-луночных планшетов и поглощение считывали через 2, 4 и 20 часов в соответствии с указаниями производителя. Считывания брали с OD для клеток, обработанных только ДМСО с последующим только линейным диапазоном анализа (0.5-1.5) и процент жизнеспособных клеток в лунках, обработанных соединением измеряли по отношению к клеткам, обработанным только ДМСО.
Пример 907 Анализ CD69 цельной крови
Человеческую кровь получили от здоровых добровольцев, со следующими ограничениями: 1 неделя без приема каких-либо лекарств, некурящие. Кровь (приблизительно 20 мл на тестирование 8 соединений) собрали венопункцией в пробирку вакутайнер  (Becton, Dickinson and Со.) с гепарином натрия.
2
2
2
2
2
Растворы соединений Формулы I при 10 мМ в ДМСО разбавили 1:8 в 100% ДМСО, затем разбавили посредством трехкратных серийных разведений в 100% ДМСО для десятиточечной кривой доза-ответ. Соединения дополнительно развели 1:12.5 в НО и затем аликвоту 5.5 мкл каждого соединения добавили в повторе в 2 мл 96-луночный глубоколуночный планшет с квадратным верхом/конусным V-образным дном (Catalog No. 59623-23; Analytical Sales and Services; Pompton Plains, NJ); 5.5 мкл 8% ДМСО в HO добавили в качестве контроля и лунок без стимула. Цельную кровь человека - HWB (100 мкл) добавили в каждую лунку. После перемешивания планшеты инкубировали при 37°C, 5% CO, 100% влажности в течение 60 минут. Козьи F(ab') к IgM человека (Southern Biotech Cat# 2022-14, 10 мкл 500 мкг/мл раствор, 50 мкг/мл конечная концентрация) добавили в каждую лунку (за исключением нестимулируемых лунок) при перемешивании и планшеты инкубировали в течение дополнительных 16 часов. В конце 16-часового инкубирования, образцы инкубировали с флуоресцентно-мечеными антителами в течение 30 минут, при 37°C, 5% СO, 100% влажности. Включили индуцированный контроль, неокрашенный и один раз окрашенный для компенсации выравниваний и первоначальной настройки напряжения. Затем образцы лизировали с помощью PharM Lyse™ (BD Biosciences Pharmingen) в соответствии с инструкциями производителя и фиксировали в 1% параформальдегида в ФСБ, содержащем 1% бычий сывороточный альбумин. Затем образцы переместили в 96 луночный планшет, подходящий для считывания на BD Biosciences HTS 96 луночном аппарате LSRII системы. Представленные данные и значения средней интенсивности флуоресценции получили с использованием программного обеспечения BD Biosciences DIVA. Результаты первоначально анализировали с помощью аналитического программного обеспечения FACS (Flow Jo). Ингибирующие концентрации (IC50, IC70, IC90, и т.д.) для тестируемых соединений определяли как концентрацию, которая уменьшает, например на 50%, среднюю интенсивность флуоресценции экспрессии CD69 на клетках, которые также являются положительными по CD19 и отрицательными по CD27 стимулированными с помощью анти-IgM. Значения IC70 рассчитывались с помощью Genedata Screener, с использованием аппроксимации нелинейной регрессионной кривой и они показаны в Таблицах 1 и 2.
Пример 908 Анализ клеточной пролиферации in vitro

Эффективность соединений Формулы I измеряется посредством анализа клеточной пролиферации, использующего следующий протокол (Mendoza et al. (2002) Cancer Res. 62:5485-5488). Люминесцентный анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Glo, включающий реагенты и методику, является коммерчески доступным (Promega Corp., Madison, WI, Technical Bulletin TB288). Анализ оценивает способность соединений проникать в клетки и ингибировать пролиферацию клеток. Принцип анализа основан на определении количества присутствующих жизнеспособных клеток посредством подсчета АТФ, присутствующей в гомогенном анализе, при котором добавление реагента Cell-Titer Glo приводит к лизису клеток и генерации люминесцентного сигнала посредством взаимодействия с люциферазой. Люминесцентный сигнал является пропорциональным количеству присутствующей АТФ.

Панель клеточных линий В-клеточной лимфомы (например, BJAB, SUDHL-4, TMD8, OCI-Ly10, OCI-Ly3, WSU-DLCL2) помещают в 384-луночный планшет в обычную ростовую среду, и серийно разведенные ингибиторы ВТK или один ДМСО добавляют в каждую лунку. Жизнеспособность клеток оценивается после 96 часовой инкубации с CellTiter-Glo (Promega). Данные могут быть представлены в виде относительной клеточной жизнеспособности в обработанных ингибитором ВТK клетках по отношению к обработанным ДМСО контрольным клеткам. Точки данных являются средним 4 повторов для каждого уровня дозы. «Усы» отражают стандартное отклонение от среднего.
2
Методика: День 1 - Засевание планшетов клетками (384-луночные черные, с прозрачным дном, microclear, ТС планшеты с крышкой от Falcon #353962), сбор клеток, засевание клеток при концентрации 1000 клеток на 54 мкл на лунку в 384 луночные Клеточные Планшеты для 3 дневного анализа. Питательная среда клеток: RPMI или DMEM с высоким содержанием глюкозы, 10% фетальная бычья сыворотка, 2 мМ L-глутамин, P/S. Инкубирование в течение ночи при 37°C, 5% СO.
День 2 - Добавление соединения к клеткам, разведение соединений ДМСО Планшеты (серийное 1:2 для 9 точек), Добавление 20 мкл соединений при 10 мМ во 2ой столбец 96 луночного планшета. Выполнение серийного разведения 1:2 в ширину планшета (10 мкл + 20 мкл 100% ДМСО) для всего 9 точек с использованием 96-луночных планшетов из полипропилена Precision Media Plate с коническим дном от компании Nunc (cat.# 249946) (1:50 разведение) Добавление 147 мкл Среды во все лунки. Переносят 3 мкл ДМСО + соединение из каждой лунки ДМСО Планшета в каждую соответствующую лунку Media Plate с использованием Rapidplate.
2
Добавление лекарства к клеткам, Клеточный Планшет (1:10 разведение), Добавляют 6 мкл среды + соединение сразу к клеткам (54 мкл среды уже с клетками). Инкубируют 3 дня при 37 C, 5% CO в инкубаторе, который открывают нечасто.
День 5 - Детектирование Планшетов, Разморозили буфер Cell Titer Glo при комнатной температуре. Убрали Клеточные Планшеты из 37°C и довели до комнатной температуры в течение приблизительно 30 минут. Добавили буфер Cell Titer Glo к Субстрату Cell Titer Glo (бутылка в бутылку). Добавили 30 мкл реагента Cell Titer Glo (Promega cat. # G7572) в каждую лунку с клетками. Поместили на шейкер для планшетов на приблизительно 30 минут. Считывали люминесценцию на планшетном ридере Analyst НТ (полсекунды на лунку).
Анализ клеточной жизнеспособности и комбинационный анализ: Клетки засеяли при 1000-2000 клеток на лунку в 384-луночные планшеты в течение 16 ч. На второй день сделали 9 серийных разведений соединений в ДМСО в 96 луночном планшете. Соединения дополнительно разбавили в ростовой среде с использованием робота Rapidplate (Zymark Corp., Hopkinton, MA). Разбавленные соединения затем добавили в четырех повторах в лунки в 384-луночные клеточные планшеты и инкубировали при 37°C и 5% СO2. Через 4 дня измеряли количество жизнеспособных клеток посредством люминесценции с помощью Cell-Titer Glo (Promega) в соответствии с инструкцией производителя и считывали на Wallac Multilabel Reader (PerkinElmer, Foster City). Значения EC50 рассчитывали с использованием программного обеспечения Prism 4.0 (GraphPad, San Diego). Соединения Формулы I и химиотерапевтические агенты добавлялись одновременно или с разделением в 4 часа (один за другим) во все анализах.
Дополнительный иллюстративный анализ клеточной пролиферации in vitro включает следующие стадии:
4
1. Аликвоту 100 мл клеточной культуры, содержащей приблизительно 10 клеток помещают в каждую лунку 384-луночного планшета с непрозрачными стенками.
2. Контрольные лунки готовят содержащими среду и без клеток.
3. Соединение добавляют в экспериментальные лунки и инкубируют в течение 3-5 дней.
4. Планшеты доводят до комнатной температуры в течение приблизительно 30 минут.
5. Добавляют реагент CellTiter-Glo в объеме, эквивалентном объему клеточной культуральной среды, присутствующей в каждой лунке.
6. Содержимое смешивают в течение 2 минут на орбитальном встряхивателе для индукции лизиса клеток.
7. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут для стабилизации люминесцентного сигнала.
8. Люминесценцию записывают и строят графики в виде ОЕД = относительных единиц флуоресценции.
Несмотря на то что настоящее изобретение было описано в некоторых деталях с целью иллюстрации и примеров для ясности понимания, описание и Примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Соответственно, все подходящие модификации и эквиваленты могут рассматриваться как входящие в объем изобретения как определено формулой изобретения. Раскрытие всех патентов и научной литературы, приведенные здесь, специально включены во всей своей полноте посредством ссылки.