Систематический обзор и метаанализ исследований генетических ассоциаций при идиопатических рецидивирующих спонтанных абортах

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ОБЗОРЫ

Систематический обзор и метаанализ исследований генетических ассоциаций при идиопатических рецидивирующих спонтанных абортах*

Переза Н.1, Остойик С.1, Каповиц М.1, Петерлин Б.2

1 Факультет биологии и медицинской генетики, медицинский факультет университета Риеки, Хорватия

2 Университетский медицинский центр, Клинический институт медицинской генетики, отделение акушерства и гинекологии, Любляна, Словения

Цели - провести первый всесторонний систематический обзор исследований генетических ассоциаций (ИГА) при идиопатических рецидивирующих спонтанных абортах (ИРСА); проанализировать исследования в соответствии с определением рецидивирующего спонтанного аборта (РСА) и объемом выборки для пациентов и группы контроля (контрольных субъектов); выполнить метаанализ ассоциации генов-кандидатов с ИРСА.

Дизайн. Систематический обзор и метаанализ.

Исследовательские центры. Не предусмотрены.

Пациенты. Пары с ИРСА и их эмбрионы, полученные после спонтанного аборта.

Вмешательства. Суммарные отношения шансов (ОШ) были рассчитаны с помощью моделей с фиксированным или случайным эффектом.

Основные параметры оценки. Ассоциации генетических вариантов с ИРСА.

Результаты. В систематический обзор было включено 428 исследований типа «случай-контроль» (1990-2015 гг.), которые существенно различались по определению РСА, клинической оценке пациентов и выбору контрольных субъектов. Было исследовано 472 варианта в 187 генах. Метаанализ проводили для 36 вариантов в 16 генах. Ассоциация с ИРСА, определяемая как >3 спонтанных аборта (СА), была выявлена для 21 варианта генов, участвующих в иммунном ответе (IFNG, IL10, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, MBL, TNF), коагуляции (F2, F5, PAI-1, PROZ), метаболизме (GSTT1, MTHFR) и ангиогенезе (NOS3, VEGFA). Однако ОШ были невысокими (0,51-2,37), с умеренной или слабой эпидемиологической достоверностью. Незначительные различия в суммарных ОШ были обнаружены между ИРСА, определяемых как >2 или как >3 СА. Партнеры мужского пола были включены в 12,1% исследований, 1 исследование включало данные об эмбрионах, полученных в результате СА.

Заключение. Исследования генов-кандидатов показывают умеренную ассоциацию с ИРСА. Из-за больших различий в определениях РСА и критериях отбора участников, необходимо достижение консенсуса в данном вопросе. Будущие ИГА должны включать данные как партнеров-мужчин, так и данные эмбрионов, полученных в результате СА. Рекомендуется использовать полногеномные исследования ассоциаций и широкомасштабные репликации выявленных ассоциаций.

Ключевые слова:

ген-кандидат, доказательная медицина, генетический полиморфизм, метаанализ, выкидыш

* Опубликовано Elsevier Inc. по поручению Американского общества репродуктивной медицины ASRM. Настоящая статья находится в открытом доступе в соответствии с лицензией CC BY-NC-ND (http:// creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). http://dx.doi. org/10.1016/j.fertnstert.2016.10.007. Вы можете обсудить эту статью с авторами и другими членами ASRM по ссылке: https://www. fertstertdialog.com/users/ 16110-fertility-and-sterility/posts/12553-22260.

Systematic review and meta-analysis of genetic association studies in idiopathic recurrent

spontaneous abortion

Pereza N.1, Ostojic S.1, 1 Department of Biology and Medical Genetics, Faculty of Medicine,

Kapovic М.1, Peterlin B.2 University of Rijeka, Rijeka, Croatia

2 Clinical Institute of Medical Genetics, Department of Gynecology and

Obstetrics, University Medical Center, Ljubljana, Slovenia

Aims. To perform the first comprehensive systematic review of genetic association studies (GASs) in idiopathic recurrent spontaneous abortion (IRSA); to analyze studies according to recurrent spontaneous abortion (RSA) definition and selection criteria for patients and control subjects; and to perform meta-analyses for the association of candidate genes with IRSA.

Design. Systematic review and meta-analysis.

Setting. Not applicable.

Patients. Couples with IRSA and their spontaneously aborted embryos.

Interventions. Summary odds ratios (ORs) were calculated by means of fixed- or random-effects models.

Main Outcome Measures. Association of genetic variants with IRSA.

Results. The systematic review included 428 case-control studies (1990-2015), which differed substantially regarding RSA definition, clinical evaluation of patients, and selection of control subjects. In women, 472 variants in 187 genes were investigated. Meta-analyses were performed for 36 variants in 16 genes. Association with IRSA defined as three or more spontaneous abortions (SAs) was detected for 21 variants in genes involved in immune response (IFNG, IL10, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, MBL, TNF), coagulation (F2, F5, PAI-1, PROZ), metabolism (GSTT1, MTHFR), and angiogenesis (NOS3, VEGFA). However, ORs were modest (0.51-2.37), with moderate or weak epidemiologic credibility. Minor differences in summary ORs were detected between IRSA defined as two or more and as three or more SAs. Male partners were included in 12.1% of studies, and one study included spontaneously aborted embryos.

Conclusions. Candidate gene studies show moderate associations with IRSA. Owing to large differences in RSA definition and selection criteria for participants, consensus is needed. Future GASs should include both partners and spontaneously aborted embryos. Genome-wide association studies and large-scale replications of identified associations are recommended.

Keywords:

сandidate gene, evidence-based medicine, genetic polymorphism, meta-analysis, miscarriage

Fertil Steril. 2017; 107: 150-9. doi: 10.1016/j.fertnstert.2016.10.007.

Рецидивирующий спонтанный аборт (РСА), выявляемый у 1% фертильных пар, представляет собой осложнение беременности с неоднородными номенклатурой [привычное невынашивание беременности (ПНБ), привычное невынашивание, привычный аборт] и определением. Согласно клиническим руководствам по исследованию и лечению пар с ПНБ, данное состояние определяется Европейским обществом репродукции человека и эмбриологии (ESHRE) и Королевским колледжем акушеров и гинекологов (RCOG) как >3 последовательных спонтанных аборта (СА). При этом Американское общество репродуктивной медицины (ASRM) определяет его как >2 СА, хотя рекомендует, чтобы в эпидемиологические исследования включались только пары с >3 СА [1-3]. Во всех 3 руководствах известные причины РСА включают антифосфолипидный синдром (АФС), анатомические аномалии развития матки (ААРМ) у женщин и хромосомные аномалии (ХА) у обоих партнеров. И хотя были протестированы различные гипотезы, причинные факторы в оставшихся парах (~50%) не установлены.

Предположение о генетической предрасположенности к идиопатическому РСА (ИРСА) основано на 3 наблюдениях: 1) частота СА у братьев и сестер пациентов с ИРСА выше, чем у субъектов в контрольной популяции [4-6]; 2) риск возникновения СА увеличивается с их количеством [7, 8] и 3) СА в парах с ИРСА рецидивирует на одном и том же сроке беременности (у ~90% на сроках до 12 нед беременности) [9]. Были проверены многочисленные генетические факторы, в том числе метилирование ДНК, асимметричная инактивация Х-хромосомы, хромосомные гетероморфизмы, фрагментация ДНК в сперме и генетическая вариативность, но ни один из них не был единогласно признан в качестве основного фактора риска возникновения ИРСА. Исследования генетических ассоциаций (ИГА) представляют собой крупное число научных работ, опубликованных в данной области, их большая часть посвящена исследованию генов-кандидатов, проведенных у неродственных субъектов, дизайн которых разработан на основе гипотез [10]. Однако, как ранее подчеркивали авторы, проведение сравнительного анализа

осложнено по причине больших различий между исследованиями, из-за различных определений РСА (минимальное количество, последовательность и срок беременности при СА), видов диагностических процедур, выполняемых у пациентов, чтобы исключить известные причины РСА, разных определений контрольной группы [11, 12]. Кроме того, аналогично ограничениям ИГА при других распространенных заболеваниях результаты часто противоречивы, не воспроизводятся и/или основаны на небольшом числе участников [13]. Также ограничения имеют некоторые опубликованные качественные обобщения. Например, критерии оценки и включения исследований, в частности метаана-лизов, редко основаны на профессиональных рекомендациях по оценке пар с РСА, а процесс отбора исследований часто осуществляется не в соответствии с предлагаемыми критериями [11, 12].

Поэтому, чтобы рассмотреть текущее состояние дел в данной области и помочь более глубокому пониманию роли генетических вариаций в развитии ИРСА, авторы провели оценку доказательств ассоциации различных генов-кандидатов с ИРСА у пар и их потомства с введением следующих конкретных целей: 1) провести всесторонний систематический обзор всех ИГА, опубликованных на английском языке, анализируя ассоциацию между генетическими вариантами (полиморфизмы и мутации) и ИРСА; 2) проанализировать исследования в соответствии с определением ИРСА и критериями отбора пациентов и контрольных субъектов; 3) выполнить метаанализы и сравнить сводные оценки для каждого генетического варианта среди 3 категорий исследований: минимальные (все исследования с указанием частоты генотипов), промежуточные (исследования, определяющие ИРСА как >2 СА) и полные (исследования, определяющие ИРСА как >3 СА) критерии - с другими строгими критериями отбора, применяемыми для последних двух категорий.

Материал и методы

Стратегия поиска

Был проведен систематический обзор публикаций с использованием электронных баз данных PubMed и Scopus, в которых были опубликованы статьи об ассоциации между генетическими вариантами (полиморфизмы и мутации) и ИРСА с 1 января 1990 г. по 1 января 2015 г. (25 лет). Были использованы следующие ключевые слова: «привычное невынашивание беременности», «рецидивирующий аборт» или «рецидивирующий спонтанный аборт» в сочетании с «мутацией генов» или «полиморфизмом». Поскольку PubMed и Scopus являются медицинские базами данных с наилучшей зоной покрытия [14, 15], дополнительно поиск ссылок из извлеченных статей вручную не выполняли. Поиск публикаций независимо проводили 2 автора, и все извлеченные статьи сравнивали, чтобы избежать дублирования. Любые разногласия обсуждались и решались достижением консенсуса. Систематический обзор и метаанализ проводили в соответствии с клиническими рекомендациями PRISMA (предпочтительные сообщения о результатах исследований для систематических обзоров и метаанализов). Учитывая, что данное

исследование представляет собой систематический обзор с метаанализом, одобрение Институциональным ревизионным советом по вопросам этики не требовалось.

Выбор исследования

Цель заключалась в том, чтобы отобрать в анализ исследования типа «случай-контроль», в которых изучалась связь между аллелями (полиморфизмы и мутации) и ИРСА с использованием следующих критериев исключения: исследования «случай-контроль» (обзоры, отчеты о клинических случаях, метаанализы, когортные исследования, главы книг и т.д.); исследования, проведенные среди пациентов с РСА с известной причиной или пациентов с ИРСА, диагностированной в сочетании с другими патологиями (например, пузырный занос), или пациентов с ИРСА, прошедших анализ на наличие других генетических факторов (вариации числа копий генов, инактивация Х-хромосомы, эпигенетические модификации, варианты митохондриальной ДНК, исследованием ассоциаций между геномными вариантами, микроде-леции Y-хромосомы) и исследования, не связанные с ИРСА (другие патологии). Было применено ограничение по языку публикации: учитывали только сообщения на английском языке. Тезисы заседаний конгресса включали в анализ в том случае, если доложенные результаты исследований не совпадали с результатами, опубликованными в оригинальных документах.

Метаанализы

Учитывая, что нет универсальных критериев для определения РСА, критерии включения исследований в метаанализы отдельных генетических вариантов были разделены на 3 категории для проведения сравнительного анализа сводных расчетов:

1. Минимальные критерии: метаанализы были выполнены для всех выявленных исследований, в которых сообщалось о частотах генотипов, независимо от определения РСА, критериев включения пациентов и контрольных субъектов или отклонения частот генотипов от закона Харди-Вайнберга (HWE) в контрольной группе.

2. Промежуточные критерии: метаанализы были выполнены для исследований, в которых ИРСА определяли как >2 СА (включая >3 СА) и которые отвечали строгим критериям включения, описанным ниже.

3. Полные критерии: метаанализы были выполнены для исследований, в которых ИРСА определяли как >3 СА и которые отвечали строгим критериям включения, описанным ниже.

Строгие критерии включения для метаанализов исследований, которые соответствуют промежуточным и полным критериям: 1) исследование «случай-контроль», в котором генотипирование проводилось у женщин и/или мужчин с ИРСА и женщин и/или мужчин из группы контроля; 2) диагностика ИРСА проводилась на основе рекомендаций ESHRE, RCOG и ASRM (исключение АФС у женщин, кариотипирование обоих партнеров для исключения хромосомных аномалий, УЗИ и/или гистероскопия для исключения ААРМ) [1-63]; 3) контрольная группа, определяемая как женщины/пары с рождением по крайней мере одного живого ребенка и без

СА в анамнезе; 4) сообщаются все частоты генотипов; 5) отсутствие отклонения частот генотипа от HWE в контрольной группе. Согласно ранее опубликованным кратким обзорам крупномасштабных исследований, при других патологиях выполняли сравнительный анализ для каждого генетического варианта, если >3 исследования соответствовали всем критериям включения [16].

Авторы ввели категорию минимальных критериев, поскольку заметили, что в некоторых ранее опубликованных метаанализах все выявленные исследования, в которых сообщалось о частоте генотипа, были включены в количественный синтез независимо от качества исследований [11, 12]. Их целью было объективизировать, что результаты такого анализа могут дезориентировать.

Если было отобрано несколько публикаций одного и того же автора, в метаанализ были включены только те из них, в которых было наибольшее количество участников или где были зарегистрированы все частоты генотипов. Для мета-анализа были рассмотрены генетические варианты, которые не являются биаллельными или имеют сложную аллельную структуру (например, HLA, ApoE, ANXA5 и т.д.), если частоты генотипа/аллеля/гаплотипа были единообразно зарегистрированы между исследованиями.

Извлечение данных

Для каждого исследования, включенного в систематический обзор и метаанализ, были получены следующие данные: авторы, год публикации, исследуемая популяция, диагностирование РСА, число пациентов и контрольных субъектов (женщины, мужчины, оплодотворенная яйцеклетка, полученная в результате самопроизвольного аборта), оценка результатов диагностики, выполненная у пар с ИРСА (исключены АФС, ХА, ААРМ и другие возможные причины), определение контрольной группы и исследуемых аллелей. Кроме того, если аллели тестировали в >3 исследованиях, проходила экстракция частоты генотипов и аллелей, и для каждого исследования рассчитывали HWE для частот генотипа в контрольной группе. Если в публикации сообщалось о частотах генотипа, стратифицированных по количеству СА, все эти количества извлекали.

Статистический анализ

Соответствие частот генотипа закону HWE в контрольной группе было протестировано с использованием простого калькулятора Харди-Вейнберга в лаборатории Court (ветеринарный колледж при Вашингтонском университете). Отклонение от HWE определялось p<0,05.

Метаанализ проводили с использованием ПО Comprehensive Meta-analysis, версия 2.2.064 (Biostat). Для каждого исследования были рассчитаны отдельные и суммарные отношения шансов (ОШ) и соответствующие 95% доверительные интервалы (ДИ) в рамках доминантных и/или рецессивных генетических или специальных моделей (например, HLA, KIR и т.д.). Ассоциации подтверждались значениями p<0,05. Проверка статистической неоднородности проводилась для каждого метаанализа с использованием Q-критерия Кохрена. При p<0,05 применяли модель с фиксированными эффектами. В противном случае - модель со

случайными эффектами. Поскольку в метаанализах, проводимых по полным критериям, не выявлено выраженной статистической неоднородности, анализ чувствительности не проводили. Систематическую ошибку, связанную с предпочтительной публикацией положительных результатов исследования, оценивали по полным критериям с использованием воронкообразной диаграммы и регрессионных критериев Эггера для ассоциаций с p<0,05.

Оценка кумулятивных эпидемиологических доказательств

Кумулятивные эпидемиологические данные для аллелей по полным критериям оценивали с использованием критериев Venice [17]. Эпидемиологическую достоверность каждого метаанализа оценивали на 3 уровнях: количество доказательств, степень репликации и защита от ошибки случайной выборки. Количество доказательств оценивали по общему количеству копий минорных аллелей (MAC) в группе исследования и контрольной группе для каждого варианта (степень A: общее количество MAC >1000, степень B: общее количество MAC=100-1000, степень C: общее количество MAC <100). Степень репликации оценивали по величине статистической неоднородности, измеренной с помощью I2 (степень A: I2 <25%; степень B: I2=25-50%; степень C: I2 >50%). Учитывая, что авторы стремились отбирать хорошо разработанные исследования для включения в метаанализ по полным критериям (например, схожее определение фенотипа, соответствующие методы генотипирования, отсутствие отклонений от HWE), защиту от ошибок случайной выборки оценивали по величине ассоциации, незначительным различиям в определении ИРСА и различий в популяции. Степень A присваивали при суммарном ОШ >1,15 с единообразными определениями ИРСА и сходными популяциями, вовлеченными в анализ; степень B присваивали при суммарном ОШ >1,15, но присутствовали незначительные различия в определении ИРСА (например, последовательные/непоследовательные СА) или в анализ были вовлечены разные популяции; степень С присваивали при ОШ <1,15 или если имела место систематическая ошибка, связанная с предпочтительной публикацией положительных результатов исследования. Итоговые категории для достоверности совокупных эпидемиологических данных присваивали, согласно Ioannidis и соавт. [17].

Результаты

Всего было отобрано 428 исследований типа «случай-контроль» на английском языке, в которых исследовали связь между генетическими вариантами и ИРСА в рамках всестороннего поиска литературы (дополнительный рис. 1, дополнительные рис. 1 и 2, дополнительные таблицы 1-6 и дополнительное приложение 1 доступны по ссылке www.fertstert. org). Распределение этих исследований за последние 25 лет показано в дополнительной табл. 2, а число участников исследования представлено в дополнительной табл. 1. Из-за широты охвата настоящего систематического обзора авторы приводят в таблицах только описательные данные. Полный

Блок-схема PRISMA, в которой подробно изложены критерии включения и исключения, а также количество исследований, включенных и исключенных на каждом этапе поиска публикаций

Таблица 1. Определение рецидивирующего спонтанного аборта (СА) в отобранных исследованиях в порядке убывания

Номер СА, Последовательность СА Срок бере- Рождение живого ребенка Другое Иссле-

опреде- n последова- непоследо- СА с тем же менности первого второго дова-

ления тельный вательный партнером ния, n

1 >2 + 33

2 >2 22

3 >2 + <20 НБ 9

4 >2 <20 НБ 8

5 >2 + + + 7

6 >2 + + 7

7 >2 + <12 НБ 7

8 >2 + + 6

9 >2 + 6

10 >2 + + + СА или МР 5

11 >2 I триместр 4

12 >2 + <25 НБ 3

13 >2 + <24 НБ + 3

14 >2 + <12 НБ + 3

15 >2 + + 2

16 >2 СА или МР 2

17 >2 + <22 НБ 2

18 >2 + <20 НБ + 2

19 >2 + + 5-12 НБ + 2

20 >2 + I триместр 2

21 >2 Во время беременности 2

22 >2 + 1

Продолжение табл. 1

Номер СА, Последовательность СА Срок бере- Рождение живого ребенка Другое Иссле-

опреде- п последова- непоследо- СА с тем же менности первого второго дова-

ления тельный вательный партнером ния, п

23 >2 + + Клинический СА 1

24 >2 + <25 НБ + 1

25 >2 <20 НБ + 1

26 >2 <20 НБ + 1

27 >2 + <20 НБ + + 1

28 >2 + <20 НБ <35 лет от роду 1

29 >2 + + <20 НБ 1

30 >2 + + <20 НБ 1

31 >2 + + <20 НБ + 1

32 >2 <17 НБ 1

33 >2 + + <17 НБ 1

34 >2 + <17 НБ 1

35 >2 + + <15 НБ 1

36 >2 + + <14 НБ 1

37 >2 + <14 НБ + 1

38 >2 <13 НБ + + Клинический СА 1

39 >2 + + 8-12 НБ 1

40 >2 + 6-10 НБ 1

41 >2 + I триместр + 1

42 >2 + Во время беременности 1

43 >2 + Ранний срок беременности + 1

44 >2 + Максимум, рождение одного живого ребенка

45 >3 25

46 >3 + 20

47 >3 + 16

48 >3 + + <20 НБ 14

49 >3 + <20 НБ 11

50 >3 <20 НБ 9

51 >3 I триместр + 8

52 >3 + Ранний срок беременности + + 8

53 >3 I триместр 7

54 >3 + <20 НБ + 5

55 >3 + + I триместр + + 5

56 >3 + + 4

57 >3 + + + 4

58 >3 + + <24 НБ 4

59 >3 <20 НБ 4

60 >3 + + <20 НБ + 4

61 >3 + + I триместр 4

62 >3 + 3

63 >3 + + 3

64 >3 + 5-30 НБ 3

65 >3 <24 НБ 3

66 >3 + 5-21 НБ 3

II три-

67 >3 + <13 НБ местр, ВУСП 3

68 >3 <12 НБ + 3

69 >3 + + <12 НБ 3

Продолжение табл. 1

Номер СА, Последовательность СА Срок бере- Рождение живого ребенка Другое Иссле-

опреде ления п последова- непоследо- СА с тем же тельный вательный партнером менности первого второго дова-ния, п

70 >3 + I триместр 3

71 >3 + + 2

72 >3 + + + 2

73 >3 + + <30 НБ 2

74 >3 + <24 НБ 2

75 >3 + <22 НБ + + 2

76 >3 <20 НБ Максимум, рождение одного живого ребенка 2

77 >3 <12 НБ 2

78 >3 + <10 НБ 2

79 >3 + I триместр 2

80 >3 + I триместр + + 2

81 ^ " 2 триместры

82 >3 + + 1

83 >3 + + + + 1

84 >3 <30 НБ 1

85 >3 + <30 НБ + + 1

86 >3 <28 НБ + + 1

87 >3 <28 НБ + + + МР 1

88 >3 + <28 НБ + + 1

89 >3 + <28 НБ + + + МР 1

90 >3 + <25 НБ 1

91 >3 <23 НБ 1

92 >3 + <23 НБ 1

93 >3 + <22 НБ 1

94 >3 + <22 НБ 1

95 >3 + 5-21 НБ + + 1

96 >3 + + <20 НБ + + 1

97 >3 + + 6-20 НБ 1

98 >3 10-20 НБ 1

99 >3 + + <14 НБ 1

100 >3 + 5-14 НБ Клинический СА 1

101 >3 + 6-13 НБ 1

102 >3 <12 НБ 1

103 >3 + + <12 НБ + + 1

104 >3 + + I триместр + 1

105 >3 + I триместр + + 1

106 >3 Любой триместр 1

107 >3 + + I и II триместры 1

108 1-5 1

109 >4 1

110 >5 1

111 НО 12

Особые критерии

112 >2 СА в I триместре или >1 СА на позднем сроке 3

113 >2 последовательных СА или 3-6 непоследовательных СА на раннем сроке 3

114 >2 последовательных СА или 3-6 непоследовательных СА на раннем сроке (8-12 НБ) 2

115 >2 последовательных СА или >3 непоследовательных СА на раннем сроке (8-12 НБ) 2

116 >3 последовательных СА <12 НБ или >1 СА на позднем сроке (>12 НБ) 2

117 >2 СА <24 НБ или >1 ВУСП >24 НБ и максимум рождение 1 живого ребенка 1

118 >2 СА <12 НБ или 1 СА >12 НБ 1

119 >2 СА <10 НБ или >1 в II триместре или ВУСП в III триместре и/или ЗВУР 1

Окончание табл. 1

Особые критерии

120 >2 последовательных СА >21 НБ с тем же партнером или >1 СА >21 НБ 1

121 >2 последовательных СА в I триместре или >3 СА в I триместре (>16 НБ) 1

122 >3 СА в I триместре или >2 СА во II или в III триместре 1

123 >3 СА в любом триместре или 1 СА во II или в III триместре 1

124 > 3 последовательных СА <12 НБ и отсутствие данных о потере плода на позднем сроке или >1 СА на позднем сроке (>12 НБ) 1

125 >3 последовательных СА в I триместре или 2 последовательных СА во II триместре или >1 ВУСП 1

126 >3 последовательных СА или >2 непоследовательных СА с последующей тяжелой ЗВУР или отслойкой плаценты, первичной/вторичной 1

127 >3 последовательных СА <10 НБ или 2 последовательных СА на сроке >10 НБ 1

128 >3 последовательных СА <12 НБ или 2 СА на сроке >12 НБ 1

129 >3 последовательных первичных/вторичных СА <12 НБ или > 2 СА на позднем сроке (>12 НБ) 1

130 неясно: >2 СА <20 НБ (далее в тексте >3 первичных СА) 1

Примечание. ВУСП - внутриутробная смерть плода; ЗВУР - задержка внутриутробного развития; НО - не определено; СА -спонтанный аборт; МР - мертворождение; НБ - неделя беременности.

Таблица 2. Исключение известных причин рецидивирующих спонтанных абортов в извлеченных исследованиях

АФС ХА 1 ААРМ 1 Не исключалось, если плюс 1 Число исследований, п

+ + + 220

+ + 103

НО НО НО 37

+ 16

+ (АФС, ХА, ААРМ) 15

+ 15

+ + 9

+ (АФС) 5

+ (ХА) 3

+ + (АФС, ХА) 2 3

Примечание. АФС - антифосфолипидный синдром; ХА - хромосомная аномалия; НО - не определено; ААРМ - анатомическая

аномалия развития матки.

54 52 50 48 46 44 42 40 38 36

= 34 =§ 32 £ 30 " 28 1 26 о 24 5 22 " 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Распределение опубликованных исследований генетических ассоциаций идиопатического рецидивирующего спонтанного аборта с 1 января 1990 г. по 1 января 2015 г.

X Г

-гт-

-< — -

- У Л- - -

г« - У I- 1 — — - — -

1 с—п т III -: 1ЛЖ11 1Ё ТЕ : — -

1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014

Год публикации

Таблица 3. Критерии отбора для контрольной группы женщин/пар в отобранных исследованиях

СА, п Рождение живого ребенка, п Нет других осложнений беременности Исследования, п

0 >2 104

0 >1 95

0 >1 + 41

0 >2 + 37

НО >2 19

0 Многородящая 17

НО >1 17

0 НО 15

НО Многородящая 9

0 Многородящая + 6

НО НО + 5

0 НО + 4

<1 >2 4

НО >1 + 3

<1 >1 2

НО >2 + 2

НО Многородящая + 1

Особые критерии

Женщины с венозной тромбоэмболией, маточно-плацентарной дисфункцией или атеротромботическим заболеванием и женщины без СА, венозной тромбоэмболии, маточно-плацентарной дисфункции или атеротромботического заболевания 1

>1 нормальной по всем показателям беременности, завершившейся рождением доношенного (>37 нед) живого ребенка с нормальной для гестационного возраста массой тела, исключая женщин с >2 СА или смертью плода на позднем сроке и неанглоязычных женщин 1

Небеременные женщины без акушерских осложнений или СА, включая женщин с рождением живого ребенка и без 1

>1 успешной беременности и без РСА или бесплодие 1

Рожавшие женщины без РСА или тромбоза 1

Примечание. НО - не определено; РСА - рецидивирующий спонтанный аборт; СА - спонтанный аборт.

список публикаций доступен в дополнительном приложении 1: http://www.fertstert.org/articLe/S0015-0282(16) 62924-2/fuLLtext#appsec.

Определение рецидивирующего спонтанного аборта

Различные определения РСА в отобранных исследованиях представлены в табл. 1. Определение оценивали по количеству, очередности СА и сроку беременности на момент возникновения, независимо от того, произошло СА с одним и тем же человеком, количества детей, рожденных живыми, и другим критериям включения. Авторы выявили крупные различия между исследованиями. В общей сложности было отмечено 130 различных определений: в 160 исследованиях РСА определяли как >2 СА (37,4%), в 227 исследованиях РСА определяли как >3 СА (53,0%), в 29 (6,8%) исследованиях были отмечены специальные критерии для определения РСА, а в 12 (2,8%) исследованиях определение РСА не указано. В рамках отмеченных категорий исследования также сильно отличались по другим критериям.

Исключение известных причин рецидивирующих спонтанных абортов

Все 3 известные причины РСА (АФС, ХА, ААРМ) были исключены в 220 (51,4%) исследованиях (табл. 2). Другие диагностические процедуры, проведенные у пациентов из группы ИРСА (в основном женщины, а не их партнеры),

были широкомасштабными и, как правило, включали анализ на наследственные и приобретенные тромбофилии, а также эндокринные, аутоиммунные и метаболические нарушения.

Критерии отбора для группы контроля

Критерии отбора для контрольной группы представлены в табл. 3. Авторы выявили 23 различных сочетания критериев включения относительно количества СА и живорожденных детей, а также информации о том, не было ли других осложнений беременности.

Аллели, исследуемые у женщин

У женщин с ИРСА было исследовано 472 варианта в 187 генах, которые чаще всего были связаны с иммунным ответом, коагуляцией, метаболизмом, ангиогенезом, эндокринной системой и регуляцией сосудистой функции (дополнительная табл. 2: http://www.fertstert.org/article/ S0015-0282(16)62924-2/fuLLtext#appsec2). Кроме того, для 8 генов исследуемые варианты не указаны, а результаты секвенирования по 12 генам были слишком обширными для индивидуального отображения либо не указаны идентифицированные варианты. Всего в рамках одного исследования было проверено 305 (64,6%) вариантов в 142 генах и 4 неуточненных варианта в 4 генах. Еще 131 (27,8%) вариант в 79 генах были протестированы по меньшей мере

<

Е

m "О п Ч ш О

I

m

/\

О >

О

х

О ш О п

X

го

I

О

СП <

х го

X

I4J I4J О

СО

Таблица 4. Результаты метаанализов вариантов генов, показывающих ассоциацию с идиопатическим рецидивирующим спонтанным абортом у женщин при применении полных критериев

Вариация гена Минимальные критерии Промежуточные критерии Полные критерии

ген вариант иссле- участники, генетическая ОШ Р иссле- участники, ОШ Р иссле- участники, ОШ I2 критерии

дова- п (Wp:Wc) модель (95% ДИ), дова- п (Wp:Wc) (95% ДИ) дова- п (Wp:Wc) (95% ДИ); Р Venice8

ния, п Р ния, п Р ния, п Р

F2 G20210Ab 71/54° 6,790:6,327 Доминантная АА+Ав против се 1,75

F5 Leiden13 91/72° 10,286:9,132 Доминантная АА+Ав против вв 2,19

GSTT1 Отсутствующий/ присутствующий 7 1,016:1,026 Отсутствующий или присутствующий ген 1,26

IFNG +874 А/Т 7 683:787 Доминантный ТТ+АТ в сравнении сАА 1,27

ILIO -1082 13/11° 1,724:1,739 Рецессивный 1,54 (1,12- 55,7; 3 549:680 1,95(1,35- 0,0; 3 549:680 1,95 0,0; ВАВ (умерен-

G/A вв в сравнении с Ав+АА 2,12); 0,009 0,012 2,80); 0,000 1,000

KIR KIR2DS2 5/4 1,58 (1,16- 0,0; 3 272:320 1,68(1,20- 0,0; 3 272:320 1,68 0,0; ВАВ (умерен-

KIR2DS3 5/4 2,16); 0,004 0,518 3 272:320 2,37); 0,003 0,451 3 272:320 (1,20- 0,451 но выражен-

KIR2DS4 5/4 1,70

MBL -550 H/L -221X/Y ко дон 52 кодон 54 кодон 57 4/3° 333:408 Низкий против среднего + высокий0 1,92

ы о -о

> >

о

S fS

о

CD >

X >

о о

о ^

> г

>

s

о >

х S1

^ тз

m cd

S ш

> х

S -

ГО о

о

X : о

О g

i§

> J=

> Й

Ю

vi

Окончание табл. 4

Вариация гена Минимальные критерии Промежуточные критерии Полные критерии

ген вариант исследования, п участники, n (Wp:Wc) генетическая модель ОШ (95% ДИ), Р Р исследования, п участники, n (Wp:Wc) ОШ (95% ДИ) Р Р исследования, п участники, n (Wp:Wc) ОШ (95% ДИ); Р I2 Р критерии Venice8

MTHFR С677Т 79/56° 7,097:5,911 Доминантный ТТ+СТ 1,26(1,08-1,48); 73,0; 0,000 21 3,413:2,912 1,22(1,00-1,48); 66,8; 0,000 13 1,685:1,491 1,31(1,13-1,53); 28,8; 0,155 ABB (умеренно выражен-

против СС 0,004 0,052 0,000 ный)

79/61° 7 354:6 517 Рецессивный ТТ против СТ+СС 1,50

А1298С 29/20° 2 973:2 618 Рецессивный СС против. АС+АА 1,86

N0S3 +894 G/T 10 1,984:1,612 Доминантный ТТ+СТ против вв 1,38

PROZ 79G/A 4 420:433 Рецессивный АА против АС+вв 2,37

SERPINE1 4G/5G 28/21° 3,722:2,948 Доминантный 4С4в+4С5в против в5в 1,47

TNF -308 G/A 18/15° 2,111:2,294 Доминантный АА+Ав против вв 1,25

VEGFA -1154 G/A 12/11° 1,929:2,139 Рецессивный АА против Ав+вв 1,71

-634 G/C 7 1,065:1,469 Рецессивный СС против Св+вв 1,41

Примечание. ДИ - доверительный интервал; Olli - отношение шансов; Wp - женщины-пациенты; Wc - женщины-пациенты в контрольной группе;а - первая буква представляет собой количество доказательств, вторая буква - степень ауторепликации, третья буква - защита от систематической ошибки оценки;" - равновесие Харди-Вайнберга не было рассчитано, поскольку мутация является доминантной, а частоты мутированных гомозигот и гетерозигот часто отображаются вместе;с - число после косой черты указывает количество исследований, в которых были представлены частоты генотипов и для которых выполнялись метаанализы;" - равновесие Харди-Вайнберга не было рассчитано, поскольку генотипы были сгруппированы в 3 категории.

в 2 исследованиях, но метаанализ не проводили, потому что >2 исследований соответствовали полным критериям (дополнительная табл. 3: http://www.fertstert.org/ articLe/S0015-0282(16)62924-2/fuLLtext#appsec2). Наконец 150 метаанализов были выполнены для 36 вариантов (7,6%) в 16 генах.

Полные критерии. Связь с ИРСА, определяемая как >3 СА, была выявлена для 21 варианта в 13 генах (табл. 4; дополнительные табл. 4 и 5). Таким образом, аллели продемонстрировали умеренное влияние на ИРСА, при этом ОШ варьировало от 0,51 до 2,37. Ни одна ассоциация не достигла сильной эпидемиологической достоверности. Была выявлена систематическая ошибка, связанная с предпочтительной публикацией положительных результатов исследования, для однонуклеотидного полиморфизма MTHFR C677T в рецессивной генетической модели (t=2,6; df=10; р=0,028).

Сравнение итоговых оценок между категориями критериев. Независимо от категории критериев, отношения рисков (ОР), достигшие статистической значимости, были невысокими (табл. 4; дополнительная табл. 4). Тем не менее возникло несколько различий при сравнении 3 категорий.

Различия между метаанализами, выполненными по минимальным и полным критериям, наиболее очевидны в отношении статистической гетерогенности, которая достигла статистической значимости в 22 метаанализах по минимальному критерию, но не была статистически значимой в 11 метаанализах по полному критерию. Это было особенно заметно для метаанализа, который включал наибольшее количество исследований (например, F2 G20210A, F5 Leiden, MTHFR C677T, MTHFR A1298C). Ассоциация с ИРСА была обнаружена для отсутствующего/присутствующего варианта GSTT1 при использовании полных, но не минимальных критериев. И наоборот, по сравнению с минимальным критерием, связь с РСА была потеряна для 8 вариантов при использовании полных критериев (отсутствующий/ присутствующий вариант GSTM1, HLA-G I/D 14-bp, IL10 -1082 G/A, MTHFR A1298C, NOS3 +894 G/T, PAI-1 4G/5G, TNF -308 G/A, VEGFA +936 C/T).

Сравнение средних и полных критериев было возможно для 18 метаанализов. Статистическая гетерогенность и ОР были схожи между этими категориями. Однако при использовании полных критериев, варианты GSST1 (отсутствующий/присутствующий), MTHFR C677T и PAI-1 4G/5G стали ассоциироваться с ИРСА, тогда как ассоциация для варианта IFNG +874 A/T была утрачена.

Генетические варианты, исследованные у мужчин и детей

Генетические варианты, изучаемые у партнеров женщин с ИРСА, представлены в дополнительной табл. 6. В 52/428 исследований (12,1%) было исследовано 73 варианта в 42 генах. Кроме того, для 5 генов исследуемые варианты не указаны, а результаты секвенирования 3 генов были слишком обширными или выявленные варианты не указаны. Метаанализы не выполняли.

У детей, родившихся живыми от пар с ИРСА, исследовали варианты генов C4A, C4B, CFB, CGB5, HLA (A, B, C, DRB, DQA,

DQB, DPA, DPB) и LTA в 4 исследованиях, тогда как у эмбрионов, полученных в результате СА, исследовали только вариант MTHFR A1298C.

Обсуждение

Авторы провели первый всеобъемлющий систематический обзор и метаанализ всех ИГА при ИРСА, опубликованных за последние 25 лет (1990-2015 гг.) для получения количественных сводных оценок влияния генетических вариантов на вероятность ИРСА. Авторы оценили 428 исследований «случай-контроль», включив самое большое на сегодняшний день количество пар с ИРСА и контрольных субъектов в качественный и количественный анализ.

Характеристики выявленных исследований

Важнейшей детерминантой качества любого метаанализа является включение хорошо разработанных оригинальных исследований с идентичными или почти идентичными критериями отбора пациентов и контрольных субъектов, что минимизирует неоднородность и смещение сводных оценок. Хотя первоначально цель исследования состояла исключительно в том, чтобы сравнить сводные оценки между различными категориями исследований, в данном систематическом обзоре было выявлено много других вопросов, которые необходимо решить в последующих исследованиях. Наиболее важный из них - отбор пациентов в соответствии с определением РСА.

Несмотря на наличие профессиональных клинических руководств, авторы с удивлением обнаружили 130 различных комбинаций минимального количества, последовательности и срока беременности на момент СА, количества живых детей и других критериев, необходимых для определения РСА. Также наблюдались многочисленные комбинации критериев включения в контрольную группу, однако рекомендаций по определению контрольной группы для исследований пациентов с ИРСА нет. Наконец, обязательные диагностические процедуры для пар с РСА были выполнены только в половине выявленных исследований. В то же время женщины/пары обследовались на множество других нарушений даже при отсутствии клинических показаний.

Огромное количество различных критериев отбора для пациентов с ИРСА и контрольных групп указывает на огромные расхождения между исследованиями, что затрудняет сравнение и требует установления срочного консенсуса по РСА. Выявленные проблемы в наибольшей степени были отмечены в небольшом числе исследований, включенных в метаанализ с использованием полных критериев.

Авторы также хотели бы подчеркнуть, что в некоторых публикациях пункты, описывающие критерии отбора участников, были написаны так запутанно, что требовалось прочитывать их несколько раз. Если определенные данные (например, частоты генотипов, критерии отбора для пациентов и контрольных субъектов и т. д.) отсутствовали или не были четко представлены в оригинальной статье, с авторами не связывались, поскольку, согласно рекомендациям STREGA (улучшение отчетности об исследованиях генетиче-

ских ассоциаций), эту информацию следует сообщать [18]. Отсутствие таких данных должно побуждать будущих исследователей выполнять рекомендации STREGA для повышения прозрачности отчетности и обеспечения будущего кумулятивного синтеза результатов.

Ассоциация генетических вариантов с идиопатическим рецидивирующим спонтанным абортом у женщин

Большинство (64,6%) из 472 идентифицированных вариантов изучались только в одном исследовании, а дополнительные 27,8% вариантов невозможно было включить в метаанализ, что помешало авторам сделать выводы об их ассоциации с ИРСА. Ассоциация с ИРСА, определяемая как >3 СА, была обнаружена для 21 варианта в 13 генах. Что касается функции этих генов, они участвуют в иммунном ответе (IFNG, IL10, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, MBL, INF), коагуляции (F2, F5, PAI-1, PROZ), метаболизме (GSTT1, MTHFR) и ангиогенезе (NOS3, VEGFA). Однако ОР всех ассоциаций были невысокими. Кроме того, хотя эти системы теоретически были ассоциированы с ИРСА, патофизиологические механизмы того, каким образом конкретные генетические варианты могут способствовать возникновению СА, не изучены.

Принимая во внимание продолжающуюся дискуссию о минимальном количестве CA, необходимом для постановки диагноза (>2 СА против >3 СА), авторы провели сравнительный анализ для каждого генетического варианта, включенного в метаанализ, чтобы оценить, существует ли разница в сводной оценке между женщинами с >2 СА в сравнении >3 СА. Существенных различий в статистической гетерогенности и ОР не выявлено, хотя при применении полных критериев наблюдалась ассоциация с ИРСА для 3 вариантов, тогда как для одного варианта ассоциация утрачивалась.

В то же время присутствовали очевидные и многочисленные различия между метаанализами, выполненными по минимальным и полным критериям. Наиболее очевидное различие касалось ассоциации с ИРСА, статистическая значимость которой изменилась для 9 генетических вариантов при применении полных критериев. Еще одно очевидное различие касалось снижения статистической гетерогенности при применении полных критериев, что является следствием сокращения систематической ошибки отбора. Поэтому в количественный синтез следует включать только исследования с хорошо охарактеризованными пациентами и группами контроля, поскольку результаты исследований без прозрачных критериев отбора участников могут быть ложноположительными или ложноотрицательными.

Ассоциация генетических вариантов с идиопатическим рецидивирующим спонтанным абортом у мужчин-партнеров и их детей

Полученные результаты показывают, что партнеры женщин с ИРСА в значительной мере недостаточно представлены в ИГА (12,1% исследований). К сожалению, концепция, что неуспешная беременность является женской проблемой, по-прежнему преобладает - с точки зрения авторов, также подтверждают повторяющиеся информационные запросы

со стороны референтов. Поэтому авторы решили включить в анализ данные партнеров-мужчин. Оценить связь изученных генетических вариантов с ИРСА у партнеров-мужчин не представляется возможным из-за небольшого числа исследований, которые отвечали полным критериям для включения в метаанализ. Кроме того, авторы обнаружили только 1 исследование, в ходе которого были исследованы эмбрионы, полученные в результате СА. Обескураживающие статистические данные о вовлечении партнеров-мужчин и эмбрионов, полученных в результате СА, в ИГА подчеркивают необходимость в изменении представлений о беременности в целом.

Ограничения и сильные стороны исследования

Ограничения настоящего исследования в основном связаны с ограничениями оригинальных исследований. Из-за разнообразия диагностических критериев метаанализ по полным критериям проводился на небольшом числе исследований. Поэтому анализ подгрупп в разных популяциях не проводился, хотя в метаанализах, в которые было включено наибольшее количество исследований, популяции в основном были европеоидной расы. Кроме того, из-за большого числа определений РСА в оригинальных исследованиях авторы определяли РСА только как >2 и >3 СА согласно промежуточным и полным критериям без учета последовательности СА или срока беременности на момент СА.

Настоящее исследование также имеет несколько сильных сторон. Поиск публикаций носил всеобъемлющий и систематический характер. Чтобы обратить внимание на важность надлежащего дизайна оригинальных исследований, количественный анализ проводился по 3 категориям критериев (минимальные, промежуточные и полные). Независимо от наличия статистической гетерогенности в метаанализах по полным критериям, которая может отражать различия в популяциях, систематическая ошибка отбора сводится к минимуму. Однородность исследуемой популяции увеличилась за счет применения строгих критериев отбора исследований, основанных на руководствах ESHRE, RCOG и ASRM. Наконец, авторы впервые объективно представили различия между исследованиями, заключающиеся в определении РСА, исключении известных причин РСА и критериях отбора контрольной группы.

Будущие исследования

Настоящие результаты представляют текущую ситуацию в данной области. Авторы настоятельно рекомендуют разработать клинические руководства для ИГА при ИРСА. Такие руководства уже существуют для преждевременных родов [19]. В оригинальных исследованиях указаны количество, последовательность СА и срок беременности при возникновении, а также число живых детей и произошел ли СА с одним и тем же партнером. Кроме того, в исследованиях, в которых РСА определяется как >2 СА, результаты для женщин/пар >3 СА должны быть представлены отдельно. Также авторы рекомендуют разработать универсальные профессиональные руководства для оценки и лечения РСА. Исследователи также должны соблюдать рекомендации STREGA.

Будущие ИГА должны сосредоточиться на наиболее перспективных ассоциациях и исследованиях без определения гипотез. В ходе поиска авторы выявили только 2 геномных исследования ассоциаций, но с разными локусами риска [6, 20]. Также рекомендуется повторить хорошо скоррек-тиванный анализ отдельных исследований, в котором были выявлены ассоциации генетических вариантов с ИРСА. Наконец, необходимы исследования экспрессии генов для уточнения функциональной роли генетических вариантов при ИРСА.

Заключение

Исследования генов-кандидатов показывают умеренную ассоциацию с ИРСА у женщин. Из-за больших различий между исследованиями в определении РСА и критериях отбора участников, необходим консенсус. Будущие ИГА должны включать данные обоих партнеров с ИРСА и эмбрионов, полученных в результате СА. Необходимо выполнить полногеномные исследования ассоциаций и широкомасштабные ауторепликации выявленных ассоциаций.

СВЕДЕНИЯ О ВЕДУШЕМ АВТОРЕ

Переза Нина - доктор медицины, врач, факультет биологии и медицинской генетики, медицинский факультет университета Риеки

Е-таН: nina.pereza@ medri.uniri.hr

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Jauniaux E., Farquharson R.G., Christiansen O.B., Exalto N. Evidence-based guidelines for the investigation and medical treatment of recurrent miscarriage. Hum Reprod. 2006; 21: 2216-22.

2. Royal College of Obstetricians and Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage (Green-Top Guideline N 17). London: RCOG Press, 2011.

3. Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertil Steril. 2012; 98: 1103-11.

4. Christiansen O.B., Mathiesen O., Lauritsen J.G., Grunnet N. Idiopathic recurrent spontaneous abortion. Evidence of a familial predisposition. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 1990; 69: 597-601.

5. Christiansen O.B., Pedersen B., Mathiesen O., Husth M., et al. Maternal HLA class II alleles predispose to pregnancy losses in Danish women with recurrent spontaneous abortions and their female relatives. Am J Re-prod Immunol. 1996; 35: 239-44.

6. Kolte A.M., Nielsen H.S., Moltke I., Degn B., et al. A genome-wide scan in affected sibling pairs with idiopathic recurrent miscarriage suggests genetic linkage. Mol Hum Reprod. 2011; 17: 379-85.

7. Nybo Andersen A.M., Wohlfahrt J., Christens P., Olsen J., et al. Maternal age and fetal loss: population based register linkage study. BMJ. 2000; 320: 1708-12.

8. Brigham S.A., Conlon C., Farquharson R.G. A longitudinal study of pregnancy outcome following idiopathic recurrent miscarriage. Hum Re-prod. 1999; 14: 2868-71.

9. Heuser C., Dalton J., Macpherson C., Branch D.W., et al. Idiopathic recurrent pregnancy loss recurs at similar gestational ages. Am J Obstet Gynecol. 2010; 203: 343.e1-5.

10. Rull K., Nagirnaja L., Laan M. Genetics of recurrent miscarriage: challenges, current knowledge, future directions. Front Genet. 2012; 3: 34.

11. Pereza N., Peterlin B., Volk M., Kapovic M., et al. A critical update on endothelial nitric oxide synthase gene variations in women

with idiopathic recurrent spontaneous abortion: genetic association study, systematic review and meta-analyses. Mol Hum Reprod. 2015; 21: 466-78.

12. Pereza N., Ostojic S., Zdravcevic M., Volk M., et al. Insertion/deletion polymorphism in intron 16 of ACE gene in idiopathic recurrent spontaneous abortion: case-control study, systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online. 2016; 32: 237-46.

13. Sagoo G.S., Little J., Higgins J.P.; Human Genome Epidemiology Network. Systematic reviews of genetic association studies. PLoS Med. 2009; 6: e28.

14. Falagas M.E., Pitsouni E.I., Malietzis G.A., Pappas G. Comparison of Pubmed, Scopus, Web of Science, and Google Scholar: strengths and weaknesses. FASEB J. 2008; 22: 338-42.

15. Bramer W.M., Giustini D., Kramer B.M., Anderson P. The comparative recall of Google Scholar versus Pubmed in identical searches for biomedical systematic reviews: a review of searches used in systematic reviews. Syst Rev 2013; 2: 115.

16. Staines-Urias E., Paez M.C., Doyle P., Dudbridge F., et al. Genetic association studies in pre-eclampsia: systematic meta-analyses and field synopsis. Int J Epidemiol. 2012; 41: 1764-75.

17. Ioannidis J.P., Boffetta P., Little J., O'Brien T.R., et al. Assessment of cumulative evidence on genetic associations: interim guidelines. Int J Epidemiol. 2008; 37: 120-32.

18. Little J., Higgins J.P., Ioannidis J.P., Moher D., et al. Strengthening the Reporting of Genetic Association Studies (STREGA) - an extension of the STROBE statement. Genet Epidemiol. 2009; 33: 581-98.

19. Pennell C.E., Jacobsson B., Williams S.M., Buus R.M., et al. Genetic epidemiologic studies of preterm birth: guidelines for research. Am J Obstet Gynecol. 2007; 196: 107-18.

20 Wang Li, Zeng Chan Wang, Cui Xie, Xiao Feng Liu, et al. Genome-wide screening for risk loci of idiopathic recurrent miscarriage in a Han Chinese population: a pilot study. Reprod Sci. 2010; 17: 578-84