СПОСОБ ОЧИСТКИ БОТУЛИНИЧЕСКОГО ТОКСИНА
METHOD FOR PURIFICATION OF BOTULINUM TOXIN

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу очистки ботулинического токсина и, в частности, к способу очистки, позволяющему получать высокочистый и активный ботулинический токсин с помощью простого процесса, состоящего из катионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии и анионообменной хроматографии.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Ботулинический токсин представляет собой нейротоксический белок, продуцируемый такими бактериями как Clostridium butyricum, Clostridium baratii и Clostridium botulinum. Ботулинический токсин блокирует нервно-мышечную передачу и вызывает нейропаралитические заболевания у человека и животных. В частности, известно, что ботулинический токсин типа А является смертельно опасным для человека. Помимо ботулинического токсина типа А были идентифицированы семь других типов ботулинических токсинов, а именно, В, С1, D, Е, F, G и Н. Каждый тип ботулинического токсина отличается соответствующим типоспецифическим антителом, при этом различаются также тяжесть паралича, вызываемого разными типами, и виды животных, на которых они действуют.
Молекулярная масса белковой молекулы ботулинического токсина составляет приблизительно 150 кДа, включая легкую цепь приблизительно 50 кДа и соединенную с ней тяжелую цепь приблизительно 100 кДа. Однако ботулинический токсин, выделяемый бактериями Clostridium, высвобождается в форме комплекса, содержащего токсиновый белок массой 150 кДа в сочетании с по меньшей мере одним нетоксиновым белком. Например, ботулинический токсин высвобождается в форме комплексов с молекулярными массами 900 кДа, 500 кДа и 300 кДа.

Ботулинический токсин может быть смертельно опасным для человека, однако недавно был разработан ботулинический токсин для лечения целого ряда симптомов, включая нервно-мышечные расстройства, характеризующиеся гиперактивностью скелетных мышц. Например, Botox является товарным знаком ботулинического токсина А, коммерчески разработанным компанией Allergan, Inc., и применяется для облегчения или лечения блефароспазма, косоглазия, дистонии мышц шеи и глабеллярных (лицевых) морщин, в настоящее время также ведутся исследования по разработке способов применения, подходящих для других серотипов, и клиническому применению серотипов.
Ботулинические токсины для клинического применения обычно выделяют из клеточных культур. В этом случае используют различные способы очистки.
Например, ботулинический токсин очищают в форме комплекса, используя последовательность стадий осаждения и тангенциальной поточной фильтрации [см. Schantz Е. J. et al., Microbiol. Rev. 1992 March 56(1): 80-99]. Однако этот способ обычно обеспечивает относительно низкий выход, составляющий менее приблизительно 10%. Другие применяемые способы включают разделение по размеру, ионообменную и/или аффинную хроматографию [см., например, Schmidt J.J. et al., Anal. Biochem. 156: 213, Kannan K. et al., Mov. Disord. 2000; 15 (Suppl 2):20 (2000); Wang Y.C., Dermatol. Las. Faci. Cosm. Surg. 2002; 58, 2002; и патентный документ США No. 2003/0008367].
Еще один способ представляет собой синтез рекомбинантными средствами по отдельности тяжелой или легкой цепей ботулинического токсина вместо полного и биологически активного белка ботулинического токсина [см., например, Zhou L. et al., Biochemistry; 34 (46): 15175 (1995); и Johnson S.K. et al., Protein Expr. and Purif.; 32: 1-9 (2003)]. Однако недостатком таких способов является потребность в дополнительной стадии формирования полного и биологически активного белка ботулинического токсина.
Более современные способы включают использование хроматографии гидрофобного взаимодействия, хроматографии со смешанным режимом и/или ионообменной хроматографии для очистки ботулинических токсинов в форме комплексов (см.: патентные документы США No. 7452697 м 7354740].
Однако в данной области техники по-прежнему сохраняется потребность в усовершенствованном способе очистки для выделения полных ботулинических токсинов, являющихся стабильными и биологически активными. С учетом этого в результате значительных усилий по разработке простого способа очистки, позволяющего выделять высокочистые и активные ботулинические токсины, авторы настоящего изобретения обнаружили, что высокочистый и активный ботулинический токсин может быть очищен с использованием простого процесса катионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии и анионообменной хроматографии и, в частности, ботулинический токсин может быть очищен до чистоты 99% или более при использовании колонки SP в качестве катионообменной смолы, при использовании фенильной колонки в качестве гидрофобной смолы и при использовании колонки Q в качестве анионообменной смолы. На основании данного открытия было выполнено настоящее изобретение.
ДОКУМЕНТ УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Патентный документ
Выложенный патентный документ США No. 2003/0008367
Патентный документ США No. 7452697
Патентный документ США No. 7354740
Непатентный документ
Schantz Е J, et al, Properties and use botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine (Свойства и применение ботулинического токсина и других микробных нейротоксинов в медицине), Microbiol. Rev. 1992 March 56(1): 80-99
Schmidt J.J., et al., Purification of type E botulinum neurotoxin by high-performance ion exchange chromatography (Очистка ботулинического нейротоксина типа Е с помощью высокоэффективной ионообменной хроматографии), Anal. Biochem. 1986 July; 156(1): 213-219
Kannan K. et al., Methods development for the biochemical assessment of NeuroBloc (botulinum toxin type В) (Разработка методов биохимической оценки NeuroBloc (ботулинического токсина типа В), Mov. Disord. 2000; 15(Suppl 2): 20
Wang Y.С., The preparation and quality of botulinum toxin type A for injection (BTXA) and its clinical use (Получение и качественная оценка ботулинического токсина типа А (ВТХА) для инъекций и его клиническое применение), Dermatol. Las. Faci. Cosm. Surg. 2002; 58
Zhou L. et al., Expression and очистка of the light chain of botulinum neurotoxin A: A single mutation abolishes its cleavage of SNAP-25 and neurotoxicity after reconstitution with the heavy chain (Экспрессия и очистка легкой цепи ботулинического нейротоксина А: одиночная мутация отменяет расщепление NeuroBloc-25 и нейротоксичность после реконструкции с тяжелой цепью), Biochemistry 1995; 34(46): 15175-81
Johnson S.K., et al., Scale-up of the fermentation and очистка of the recombination heavy-chain fragment С of botulinum neurotoxin serotype F expressed in Pichia pastoris (Масштабирование ферментации и очистки рекомбинантного С фрагмента тяжелой цепи ботулинического нейротоксина серотипа F, экспрессированного в Pichia pastoris), Protein Expr, b Purif, 2003; 32: 1-9
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Таким образом, настоящее изобретение было создано с учетом указанных выше проблем, целью настоящего изобретения является предложение способа очистки высокочистого и активного ботулинического токсина с использованием простого процесса.
В соответствии с аспектом настоящего изобретения, указанной выше и других целей можно достичь с помощью предложенного способа очистки ботулинического токсина, включающего в себя (а) предварительную обработку культурального раствора, содержащего ботулинический токсин, (b) очистку предварительно обработанного ботулинического токсина с использованием катионообменной хроматографии, (с) очистку ботулинического токсина с использованием гидрофобной хроматографии и (d) очистку ботулинического токсина с использованием анионообменной хроматографии.
Эффекты изобретения
Настоящее изобретение позволяет улучшать чистоту ботулинического токсина после очистки и может поддерживать его активность при использовании только простого процесса, включающего в себя катионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию и анионообменную хроматографию, и вследствие этого может применяться для получения ботулинического токсина.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Указанные выше и прочие цели, особенности и другие преимущества настоящего изобретения будут более понятны из следующего подробного описания во взаимосвязи с прилагаемыми графическими материалами, на которых:
На Фиг. 1 показаны результаты анализа методом FPLC (англ. Fast Protein Liquid Chromatography - жидкостная экспресс-хроматография белков) и методом SDS-PAGE (англ. Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) ботулинического токсина в элюенте после катионообменной хроматографии в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;
На Фиг. 2 показаны результаты анализов методами FPLC и SDS-PAGE ботулинического токсина в элюенте после гидрофобной хроматографии в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;
На Фиг. 3 показаны результаты анализов методами FPLC и SDS-PAGE ботулинического токсина в элюенте анионообменной хроматографии в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;
На Фиг. 4 показан результат анализа методом SDS-PAGE для определения степени очистки ботулинического токсина в соответствии с настоящим изобретением и коммерчески доступного ботулинического токсина;
На Фиг. 5 показан результат определения чистоты ботулинического токсина, очищенного при помощи способа очистки в соответствии с заявкой на патент Кореи No. 10-2013-0092024; и
На Фиг. 6 показан результат определения чистоты ботулинического токсина, очищенного при помощи способа очистки в соответствии с заявкой на патент США No. 11/932789; и
На Фиг. 7 показан результат определения чистоты ботулинического токсина, очищенного в соответствии с настоящим изобретением.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют значения, понятные специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В целом, используемая в настоящем документе номенклатура хорошо известна в данной области техники и является общепринятой.
В настоящем изобретении было установлено, что при очистке культурального раствора ботулинического токсина с использованием последовательности процессов катионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии и анионообменной хроматографии может быть выделен и очищен активный ботулинический токсин высокой степени чистоты в однородной форме с молекулярной массой приблизительно 900 кДа в отличие от ботулинического токсина, полученного обычным способом. В частности, было установлено, что при использовании колонки SP в качестве катионообменной смолы, фенильной колонки в качестве гидрофобной смолы и колонки Q в качестве анионообменной смолы ботулинический токсин может быть очищен до чистоты 99% или более.
В соответствии с этим, согласно одному из аспектов, настоящее изобретение направлено на способ очистки ботулинического токсина, включающий в себя (а) предварительную обработку культурального раствора, содержащего ботулинический токсин, (b) очистку предварительно обработанного ботулинического токсина с использованием катионообменной хроматографии, (с) очистку ботулинического токсина с использованием гидрофобной хроматографии и (d) очистку ботулинического токсина с использованием анионообменной хроматографии.
В настоящем изобретении катионообменная смола предпочтительно представляет собой колонку SP, смола для гидрофобной хроматографии предпочтительно представляет собой фенильную колонку, а анионообменная смола предпочтительно представляет собой колонку Q.
В настоящем изобретении колонка SP представляет собой колонку, заполненную материалом, имеющим сульфопропильную функциональную группу, фенильная колонка представляет собой колонку, заполненную материалом, имеющим фенильную группу, а колонка Q представляет собой колонку, заполненную материалом, имеющим четвертичную аммониевую (Q) функциональную группу.
Культуральный раствор, содержащий ботулинический токсин, на стадии (а) настоящего изобретения может представлять собой культуральный раствор штамма Clostridium botulinum, полученный с помощью обычного способа, известного в данной области, и может быть приготовлен культивированием с использованием стандартной среды, применяемой для культивирования, в частности, с использованием среды, не содержащей компонента животного происхождения, предпочтительно, например, среды PYG (содержащей картофельный пептон 3%, дрожжевой экстракт 1% и глюкозу 1%).
Штамм, продуцирующий ботулиниический токсин, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой Clostridium botulinum или его вариант и, наиболее предпочтительно, Clostridium botulinum типа A, NCTC13319, но не ограничивается этим. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что можно использовать любой штамм, способный продуцировать ботулинический токсин.
Согласно конкретному варианту осуществления, предварительная обработка культурального раствора на стадии (а) настоящего изобретения может представлять собой осаждение кислотой или ультрафильтрацию культурального раствора, подвергнутого стерилизации (например, при помощи глубинной фильтрации и/или стерилизующей фильтрации), но не ограничивается этим.
Осаждение кислотой может представлять собой осаждение под действием серной кислоты или осаждение под действием соляной кислоты, но не ограничивается этим. Иначе говоря, осаждение кислотой на стадии (а) настоящего изобретения может представлять собой осаждение кислотой культурального раствора, содержащего ботулинический токсин, с помощью кислоты, такой как серная кислота, согласно одному из вариантов осуществления, или соляная кислота, согласно другому варианту осуществления, таким образом, чтобы после завершения культивирования величина рН составляла от 3,0 до 4,5, предпочтительно, от 3,3 до 4,0 и, наиболее предпочтительно, от 3,4 до 3,6.
Ультрафильтрационная мембрана может быть мембраной кассетного типа или половолоконной, но не ограничивается этим. Иначе говоря, на стадии (а) настоящего изобретения ультрафильтрация может представлять собой ультрафильтрацию с использованием мембраны с размером пор от 50 кДа до 500 кДа, предпочтительно, от 100 кДа до 300 кДа, для сбора культурального раствора, содержащего ботулинический токсин.
Кроме того, во время предварительной обработки можно необязательно использовать ДНКазу, РНКазу, нуклеазу и/или бензоназу для удаления нуклеиновых кислот, но изобретение не ограничивается этим.
Для повышения чистоты получаемого в результате ботулинического токсина настоящее изобретение может включать в себя дополнительную очистку. В настоящем изобретении такая очистка представляет собой стадию дополнительного удаления примесей из осадка, образующегося при воздействии кислоты, и может быть выполнена обычным способом, таким как известные микрофильтрация, ультрафильтрация, прецизионная фильтрация или глубинная фильтрация. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, может быть выполнена микрофильтрация с использованием полых волокон от 0,1 до 0,4 мкм.
На стадии (b) настоящего изобретения катионообменная хроматография включает в себя связывание с катионообменной хроматографической колонкой предварительно обработанного ботулинического токсина, растворенного в буфере с концентрацией и величиной рН, подходящими для связывания ботулинического токсина с колонкой, и затем элюирование буферным раствором, имеющим повышенную концентрацию соли. При катионообменной хроматографии удаляют ботулинический токсин в некомплексной форме.
В способе очистки ботулинического токсина в соответствии с настоящим изобретением колонка, используемая для катионообменной хроматографии, предпочтительно представляет собой колонку, заполненную смолой, имеющей функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из карбоксиметильной (СМ), сульфоэтильной (SE), сульфопропильной (SP) групп, фосфата (Р) и сульфоната (S).
Исходя из требований удаления примесей и поддержания высокой активности ботулинического токсина, согласно настоящему изобретению, катионообменную хроматографию можно выполнять с использованием колонки SP, предпочтительно, колонки SP Sepharose HP, колонки SP Sepharose FF, колонки Capto S или тому подобного, и более предпочтительно, колонки SP Sepharose HP, но изобретение не ограничивается этим.
В настоящем изобретении колонка SP Sepharose HP представляет собой колонку, заполненную смолой, содержащей сульфопропильную функциональную группу, имеющей матрицу на основе 6% сферической поперечно-сшитой агарозы, имеющей DBC (англ. dynamic binding capacity - емкость динамического связывания) 55 мг/мл в расчете на рибонуклеазу А и размер частиц 34 мкм.
Ботулинический токсин на стадии (b) растворяют в буфере, содержащем от 10 до 30 мМ цитрата натрия, имеющем величину рН от 4,5 до 5,3, и затем вводят в колонку SP.
Ботулинический токсин на стадии (b) элюируют буфером, содержащим от 10 до 30 мМ цитрата натрия, имеющим величину рН от 4,5 до 5,5, с добавлением от 0,5 до 1,5 М хлорида натрия, но изобретение не ограничивается этим.
На стадии (с) настоящего изобретения гидрофобная хроматография включает в себя связывание с гидрофобной хроматографической колонкой раствора, содержащего ботулинический токсин, элюированный во время катионообменной хроматографии на стадии (b), растворенный в буфере с концентрацией и величиной рН, подходящими для связывания раствора с гидрофобной хроматографической колонкой, и затем элюирование буферным раствором, имеющим пониженную концентрацию соли. При гидрофобной хроматографии также удаляют ботулинический токсин в некомплексной форме.
В способе очистки ботулинического токсина в соответствии с настоящим изобретением колонка, используемая для гидрофобной хроматографии, представляет собой колонку, заполненную смолой, имеющей функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из простой эфирной группы, изопропильной, бутильной, октильной и фенильной групп, но не ограничивается этим.
В настоящем изобретении для эффективного отделения некомплексного белка при проведении гидрофобной хроматографии можно использовать фенильную колонку, предпочтительно, колонку Phenyl Sepharose HP, колонку Phenyl Sepharose FF (Fast Flow), колонку Capto Phenyl или тому подобное и, более предпочтительно, колонку Phenyl Sepharose HP, но изобретение не ограничивается этим.
Колонка Phenyl Sepharose HP, используемая в настоящем изобретении, представляет собой колонку, заполненную смолой, имеющей матрицу на основе 6% сильно поперечно-сшитой агарозы, и имеющей степень замещения 25 мкмоль фенильных групп/мл и размер гранул 34 мкм.
На стадии (с) ботулинический токсин может быть растворен в буфере, содержащем от 30 до 70 мМ фосфата натрия, имеющем величину рН от 5,7 до 6,7, с добавлением от 1,8 до 2,2 М хлорида натрия и затем введен в фенильную колонку, но изобретение не ограничивается этим.
На стадии (с) ботулинический токсин может быть элюирован буфером, содержащим от 30 до 70 мМ фосфата натрия, имеющим величину рН от 5,7 до 6,7, но не ограничивается этим.
На стадии (d) настоящего изобретения анионообменная хроматография включает в себя связывание с анионообменной хроматографической колонкой ботулинического токсина, элюированного во время гидрофобной хроматографии, растворенного в буфере с концентрацией и величиной рН, подходящими для связывания ботулинического токсина с колонкой, и затем элюирование буферным раствором, имеющим повышенную концентрацию соли. При анионообменной хроматографии удаляются другие примеси и повышается чистота ботулинического токсина массой 900 кДа.
В способе очистки ботулинического токсина в соответствии с настоящим изобретением колонка, используемая для анионообменной хроматографии, представляет собой колонку, заполненную смолой, имеющей функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из диэтиламиноэтильной (DEAE), четвертичной аминоэтильной (QAE) и четвертичной аммониевой (Q) групп, но не ограничивается этим.
Согласно настоящему изобретению, для удаления других примесей и особенно для повышения чистоты ботулинического токсина с молекулярной массой 900 кДа при анионообменной хроматографии можно использовать колонку Q, предпочтительно, колонку Capto Q ImpRes, колонку Toyopearl Super Q 650M, колонку Q Sepharose FF, колонку Q Sepharose High-Performance (Q Sepharose HP) или тому подобное и, более предпочтительно, колонку Capto Q ImpRes.
Колонка Capto Q ImpRes, используемая в настоящем изобретении, представляет собой колонку, заполненную смолой, имеющей высокопроизводительную матрицу на основе агарозы, содержащей четвертичную аммониевую (Q) функциональную группу, с общей ионной емкостью от 0,15 до 0,18 ммоль (Cl-)/мл, DBC 55 мг/мл в расчете на BSA (англ. bovine serum albumin - бычий сывороточный альбумин) и размером гранул 40 мкм.
Ботулинический токсин на стадии (d) растворяют в буфере, содержащем от 40 до 60 мМ фосфата натрия, имеющем величину рН от 5,7 до 6,7, и затем вводят в колонку Q, но изобретение не ограничивается этим.
На стадии (d) ботулинический токсин может быть элюирован буфером, содержащим от 40 до 60 мМ фосфата натрия, имеющим величину рН от 5,7 до 6,7, с добавлением от 0,8 до 1,2 М хлорида натрия, но не ограничивается этим.
Ботулинический токсин, очищенный при помощи описанного выше способа, может представлять собой ботулинический токсин типа А с чистотой по меньшей мере 99%, при этом очищенный ботулинический токсин может иметь более высокую чистоту, чем ботулинический токсин, очищенный обычным способом.
Ботулинический токсин может быть получен из Clostridium botulinum типа А, NCTC13319, но не ограничивается этим.
При использовании в данном контексте термин "фракция" относится к группе проходящих веществ, содержащих по меньшей мере одну целевую молекулу, которую отделяют и собирают с помощью способа разделения, где по меньшей мере одна целевая молекула (такая как ботулинический токсин), содержащаяся вместе с одной или более примесями в биофармацевтическом агенте, проходит через вещество, связывающееся с одной или более примесями, при этом целевая молекула обычно не связывается с этим веществом (т.е. проходит через вещество) либо связывается с ним, а затем элюируется.
Используемый в контексте настоящего изобретения термин "очистка" относится к процессу повышения чистоты путем удаления сопутствующих примесей из определенного вещества, в данном описании очистка относится к выделению ботулинического токсина, образующегося при гибели разросшихся ботулинических бактерий, из культурального раствора ботулинических бактерий и означает способ повышения чистоты в процессе получения ботулинического токсина.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Однако для специалистов в данной области будет очевидно, что эти примеры предназначены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения и их не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1
Приготовление образцов и экспериментальных материалов
1-1. Приготовление образцов
Штамм ботулина, использованный в настоящем изобретении, представлял собой Clostridium botulinum типа A, NCTC13319, штамм сначала инокулировали в 500 мл среды PYG (картофельный пептон - 3%, дрожжевой экстракт - 1%, глюкоза - 1%) и культивировали в анаэробных условиях при температуре 34±1°С в инкубаторе ReadytoProcess WAVE 25 в течение от 12 часов до 24 часов. После культивирования, когда развитие штамма достигало логарифмической фазы, 100 мл штамма инокулировали в 5 л среды PYG и культивировали в анаэробных условиях в инкубаторе Readyto Process WAVE 25 в течение от 40 до 72 часов. Культуральный раствор стерилизовали с использованием стерилизующего фильтра и извлекали только культуральный раствор. Культуральный раствор титровали до рН 3,5 с помощью 3N серной кислоты, при этом наблюдалось образование осадка, полученный результат хранили в замороженном состоянии в течение 16 ч или более.
1-2. Приготовление экспериментальных материалов
В настоящем изобретении использовали следующие экспериментальные материалы: очищенную воду (особо чистую воду или воду, качество которой эквивалентно или превышает качество особо чистой воды), Butyl Sepharose HP (GE Healthcare, 175432), Q Sepharose HP (GE Healthcare, 171014), Phenyl Sepharose HP (GE Healthcare, 171082), Q Sepharose FF (GE Healthcare, 170510), SP Sepharose FF (GE Healthcare, 170729), DEAE-FF (GE Healthcare, 170709), SP Sepharose HP (GE Healthcare, 171087), Capto Q ImpRes (GE Healthcare, 175470), лимонную кислоту (Merck, 1.37002.,5000), дигидрат трехзамещенного цитрата натрия (Merck, 1.37042.5000), одноосновный фосфат натрия (Merck, 1.06349.1000), двухосновный фосфат натрия (Merck, 1.06585) и хлорид натрия (Merck, 1.37017.5000).
Пример 2
Очистка ботулинического токсина
2-1. Микрофильтрация
Включали систему для микрофильтрации AKTA flux 6 (GE Healthcare) и подсоединяли к ней полые волокна 0,2 мкм. В систему добавляли 5 л дистиллированной воды, оборудование и полые волокна дважды промывали при ТМР (англ. transmembrane pressure - трансмембранное давление) 0,3. 5 л полученного в Примере 1-1 осадка, образовавшегося при воздействии серной кислоты на культуральный раствор ботулинического токсина, вводили в оборудование для микрофильтрации, и повторяли 5 раз две стадии концентрирования до 1 л при ТМР 0,3 и дополнительного концентрирования от 3 л до 1 л после добавления 2 л DW (англ. distilled water - дистиллированная вода). Добавляли 500 мл 200 мМ раствора цитрата натрия (рН 5,5) и экстрагировали при циркуляции в течение 1 ч 30 мин. Экстракт извлекали через линию для пермеата оборудования для микрофильтрации и к оборудованию для микрофильтрации подсоединяли полые волокна с отсечкой 300 кДа. Добавляли экстракт и концентрировали до 500 мл при ТМР 0,3 бар, продукт извлекали и хранили при температуре 4°С.
2-2. Катионообменная хроматография
Колонку HiScale 50/20 (GE Healthcare, 28964445) набивали смолой SP-HP до высоты от 8 до 12 см и затем устанавливали в систему AKTA Pure. Колонку уравновешивали пропусканием уравновешивающего/промывочного буфера (20 мМ раствора цитрата натрия, рН 4,8). Величину рН образца, полученного в Примере 2-1, доводили до рН 4,8 с помощью 1 М раствора лимонной кислоты и разводили 5-кратно в 2000 мл дистиллированной воды. Образец вводили в колонку со скоростью 15 мл/мин. После инъекции колонку промывали 380 мл уравновешивающего/промывочного буфера (20 мМ раствора цитрата натрия, рН 4,8). После промывки вводили уравновешивающий/элюирующий буфер в соответствии с пунктом 1) 5 CV (англ. column volume - объем колонки), с градиентом 30% (линейный градиент), и пунктом 2) 3 CV, с градиентом 100% (ступенчатый градиент), и последовательно получали фракции по 50 мл (см. Таблицу 1). В общей сложности последовательно получали 31 фракцию, каждую фракцию идентифицировали методом SDS-PAGE (англ. Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия).
Результаты показаны на Фиг. 1. НА33 был обнаружен во фракциях с 10 по 21 из общего числа 31 фракции, и ботулинический токсин в форме комплекса с молекулярной массой 900 кДа очищали из соответствующих фракций.
2-3. Гидрофобная хроматография
Колонку HiScale 26/20 (GE Healthcare, 28964514) набивали смолой Phenyl HP до высоты от 7 до 11 см и затем устанавливали в систему AKTA Pure. Колонку уравновешивали пропусканием уравновешивающего/промывочного буфера (50 мМ раствор фосфата натрия, 2 М раствор хлорида натрия, рН 6,2). Собирали в общей сложности 600 мл фракций с 10 по 21, элюированных из колонки SP Sepharose HP в Примере 2-2, величину рН доводили до 6,2 1 М раствором двухосновного фосфата натрия. Образец с добавлением 600 мл 50 мМ раствора фосфата натрия и 4 М раствора хлорида натрия при рН 6,2 вводили со скоростью 8 мл/мин. После инъекции колонку промывали 94 мл уравновешивающего/промывочного буфера (50 мМ раствор фосфата натрия, 2 М раствор хлорида натрия, рН 6,2). После промывки вводили уравновешивающий/элюирующий буфер в соответствии с пунктом 1) 10 CV, с градиентом 100% (линейный градиент), и пунктом 2) 3 CV, с градиентом 100% (ступенчатый градиент), получали последовательно в общей сложности 27 фракций по 23 мл, каждую фракцию идентифицировали методом SDS-PAGE.
Результаты показаны на Фиг. 2, ботулинический токсин в виде комплекса с молекулярной массой 900 кДа был обнаружен во фракциях с 16 по 23 из общего числа 27 фракций.
2-4. Анионообменная хроматография
Колонку Omnifit 6.6/25 (Diba, 006EZ0625AA) набивали смолой Capto-Q ImpRes до высоты от 8 до 12 см и затем устанавливали в систему AKTA Pure. В общей сложности 168 мл фракций с 16 по 23, элюированных из колонки Phenyl Sepharose HP в Примере 2-3, подвергали диафильтрации (DF) до 100 раз с буфером, содержащим 50 мМ фосфата натрия (рН 6,2), с использованием диализной мембраны (Spectra/Por, 132680). Колонку уравновешивали пропусканием уравновешивающего/ промывочного буфера (50 мМ раствор фосфата натрия, рН 6,2). Образец, приготовленный в Примере 2-3, вводили со скоростью 1 мл/мин. После инъекции колонку промывали 18 мл уравновешивающего/промывочного буфера (50 мМ раствор фосфата натрия, рН 6,2). После промывки вводили уравновешивающий/элюирующий буфер в соответствии с пунктом 1) 2 CV, 15% ступенчатый градиент, пунктом 2) 2 CV, 20% ступенчатый градиент, пунктом 3) 2 CV, 30% ступенчатый градиент, и пунктом 4) 2 CV, 100% ступенчатый градиент, и затем элюировали. Последовательно получали в общей сложности 29 фракций по 1 мл, каждую фракцию идентифицировали методом SDS-PAGE.
Результаты показаны на Фиг. 3, ботулинический токсин в виде комплекса с молекулярной массой 900 кДа, не содеражщего примесей (красные кружки), был обнаружен во фракциях с 7 по 10 из общего числа 29 фракций.
Пример 3
Сравнение стандартного и очищенного продукта
Фракции с 7 по 10, содержащие ботулинические токсины, очищенные в Примере 2, и коммерчески доступный ботулинический токсин C-BoNT/A1 (Cat. No. # 3102, miprolab) разводили каждую до концентрации 1 мг/мл в буфере, содержащем 50 мМ фосфата натрия (рН 6,2). Образцы для внесения готовили в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, как показано в Таблице 4. Образцы подвергали электрофорезу в 10-луночном планшете Novex WedgeWell с 4-20% раствором трис-глицина (Invitrogen, NP04200BOX), добавляли приблизительно 30 мл красителя Instant Blue stain и окрашивали на шейкере в течение 60 минут. Краситель полностью удаляли, образец промывали 5 или более раз на шейкере, в который добавляли приблизительно 30 мл очищенной воды, в течение 30 минут. Когда фон был достаточно удален и можно было идентифицировать полосу, гель анализировали с использованием анализатора изображений.
В результате, как показано на Фиг. 4, ботулинический токсин, очищенный при помощи способа очистки по настоящему изобретению, был идентифицирован в том же положении, что и коммерчески доступный ботулинический токсин, что указывает на возможность точной очистки с помощью способа по настоящему изобретению только представляющего интерес целевого белка.
Пример 4
Сравнение активности стандартного продукта и очищенного продукта ботулинического токсина по настоящему изобретению

Сравнивали активность ботулинического токсина, очищенного в Примере 2, и коммерчески доступного ботулинического токсина Botox (Allergan Inc., 100 единиц).
5
5
50
Каждый образец сначала разводили от 2x10 до 3x10 кратно, в зависимости от его концентрации, и 1,45 мл разбавленного образца разводили в 4,4 мл физиологического раствора. После разведения 10 групп таким же образом, как указано выше, по 0,1 мл образца вводили внутрибрюшинно 10 самкам мышей ICR (18-22 г) в каждой группе и измеряли летальность в течение 3 дней. LD определяли с помощью статистического пробит-анализа.
Результат показал, что активность 1 нг ботулинического токсина, очищенного по настоящему изобретению, и ботулинического токсина компании Allergan Inc. составила 40,73 единиц и 25,32 единиц, соответственно, и способ очистки в соответствии с настоящим изобретением может быть выполнен без снижения активности ботулинического токсина.
Пример 5
Сравнение чистоты при использовании способа очистки другой компании
Была проанализирована чистота ботулинического токсина, очищенного в соответствии со способом очистки, описанным в заявке на патент Кореи No. 10-2013-0092024, поданной компанией Allergan Inc., ведущим производителем ботулинического токсина.
В результате, как показано на Фиг. 5, помимо основного пика были обнаружены примеси меньшего размера, причем белок с молекулярной массой 900 кДа не удалось эффективно отделить от белка с молекулярной массой 150 кДа, 300 кДа или 500 кДа.
Кроме того, была проанализирована чистота ботулинического токсина, очищенного в соответствии со способом очистки по заявке на патент США No. 11/932789, поданной компанией Allergan Inc. В результате, как показано на Фиг. 6, помимо основного пика были обнаружены более крупные примеси. Это означает, что произошло образование нежелательных осадков, и можно ожидать, что процесс очистки повлиял на структуру белка.
Напротив, как показывают результаты, представленные на Фиг. 7, настоящее изобретение позволяет осуществлять специфическую очистку только токсинов с молекулярной массой приблизительно 900 кДа, при этом изменение токсинов во время очистки сведено к минимуму.
Чистоту ботулинического токсина анализировали методом ВЭЖХ (англ. HPLC, high performance liquid chromatography - высокоэффективная жидкостная хроматография) в условиях, указанных в Таблице 5.
Пример 6
Сравнение трехстадийного хроматографического способа более ранних патентов и способа очистки по настоящему изобретению
Сравнивали чистоту и титр ботулинического токсина, очищенного способами очистки с использованием смолы, применяемыми для очистки ботулинического токсина, раскрытыми в более ранних патентах (в публикации патента США No. 2019-0201505 и патенте США No. 7452697), и способом очистки по настоящему изобретению с использованием различных типов смол (Таблица 6).
Чистоту определяли методом ВЭЖХ в соответствии со способом, указанным в Таблице 5, а титр рассчитывали с помощью статистического пробит-анализа с использованием CombiStats на основании количества мышей, погибших в течение 3 дней при концентрации белка 1 мг/мл при анализе на мышах.
Типы колонок и условия очистки, использованные, соответственно, в 5 Экспериментальных примерах и Сравнительных примерах, представлены в Таблицах с 7 по 8.
В результате, как видно из Таблицы 9, ботулинический токсин, очищенный в соответствии с Экспериментальным примером, представляющим собой способ очистки по настоящему изобретению, имел высокую чистоту 99,4%, а ботулинический токсин, очищенный в соответствии со Сравнительным примером 1, имел более низкие чистоту и титр, чем в случае Экспериментального примера. Сравнительный пример 2 имел очень низкие чистоту и титр. Таким образом, полученные результаты показали, что ботулинический токсин, очищенный при помощи способа по настоящему изобретению, имеет значительно более высокие чистоту и титр, чем очищенный при использовании обычного способа.
Несмотря на то, что подробно были описаны конкретные конфигурации настоящего изобретения, специалистам в данной области будет понятно, что данное описание представлено для изложения предпочтительных вариантов осуществления в иллюстративных целях и его не следует рассматривать, как ограничивающее объем настоящего изобретения. Вследствие этого действительный объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.