Влияние альфа-токоферола ацетата на экспрессию внутрипочечных ингибиторов кристаллизации при экспериментальном нефролитиазе

Жариков А.Ю., Мотин Ю.Г., Зверев Я.Ф., Брюханов В.М., Лампатов В.В.

Алтайский государственный медицинский университет,

г. Баранаул

ВЛИЯНИЕ а-ТОКОФЕРОЛА АЦЕТАТА НА ЭКСПРЕССИЮ ВНУТРИПОЧЕЧНЫХ ИНГИБИТОРОВ КРИСТАЛЛИЗАЦ1 ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ НЕФРОЛИТИАЗЕ

Цель исследования - изучить влияние а-токоферола ацетата на экспрессию внутрипочечных ингибиторов кристаллизации при экспериментальном нефролитиазе. Эксперименты проведены на 3-х группах беспородных крыс. Крысы первой группы (интактная группа) на протяжении 6 недель получали в виде питья обычную водопроводную воду. Крысы второй группы (контрольная группа) с целью моделирования нефролитиаза в течение 6 недель получали в виде питья 1 % раствор этиленгликоля в виде питья. Крысы третьей группы (подопытная группа) на фоне 6 недельного потребления этиленгликоля, начиная с четвертой недели, на протяжении трех недель получали масляный раствор а-то-коферола ацетата в дозе 300 мк/кг внутрь. Во всех группах по истечении 6 недель оценивались изменения экспрессии в почках протеина Тамма-Хорсфалла, остеопонтина, бикунина. Установлено, что при экспериментальном нефролитиазе происходит увеличение экспресии протеина Тамма-Хорсфалла и снижение экспрессии остеопонтина и бикунина. Применение а-токоферола ацетата нормализует картину экспрессии ингибиторов кристаллизации до уровня здоровых крыс.

Ключевые слова: экспериментальный нефролитиаз; а-токоферола ацетат; ингибиторы кристаллизации; экспрессия.

Zharikov A.Yu., Motin Y.G., Zverev Ya.F., Bryukhanov V.M., Lampatov V.V.

Altay State Medical University, Barnaul

EFFECT OF а-TOCOPHEROL ACETATE ON RENAL CRYSTALLIZATION'S INHIBITORS EXPRESSION

AT THE EXPERIMENTAL NEPHROLITHIASIS

The aim of present investigation was studying of а-tocopherol's effect on intrarenal crystallization's inhibitors expression at the experimental oxalate nephrolithiasis. Experiments were performed on 3 groups of male rats. In the first group during 6 weeks was given same water as a drink for rats. In the second (control group) during 6 weeks was given 1 % solution of eth-ylenglycole (EG) for experimental nephrolithiasis modeling. In the third group (experimental group) during 6 weeks was given Eg and from the 4-th week was being administrated oil solution of а-tocopherol acetate in dose 300 mg/kg. After 6 weeks in all groups was estimated renal expression's changes of Tamm-Horsfall protein, osteopontin and bikunin. At the experimental nephrolithiasis enhanced expression of Tamm-Horsfall protein and decreased expression of osteopontin and bikunin. Administrating of а-tocopherol acetate normalized intrarenal crystallization's inhibitors expression to level of healthy rats.

Key words: experimental nephrolithiasis; crystallization's inhibitors; expression.

Оксалатный нефролитиаз — основная клиническая форма мочекаменной болезни (МКБ), поскольку на его долю приходится более половины всех случаев заболевания.

Установлено, что в образование оксалатных камней весомый вклад вносит процесс свободно-ради-

кального окисления (СРО) в почечной ткани, в связи с чем перспективным направлением фармакологической коррекции нефролитиаза может считаться антиоксидантная терапия [1]. Ранее нами было показано, что применение классического антиоксиданта а-токоферола ацетата сопровождалось существен-

ным облегчением протекания экспериментального нефролитиаза у крыс, о чем наглядно свидетельствовали результаты биохимических и гистологических исследований [2]. Вместе с тем, известно, что важнейшую роль в процессе камнеобразования играют качественные и количественные изменения экспрессии внут-рипочечных ингибиторов кристаллизации: протеина Тамма-Хорсфалла (ПТХ), остеопонтина (ОПН) и би-кунина (БИК), в результате которых они теряют свои ингибирующие свойства или даже становятся стимуляторами литогенеза [3]. Поскольку существуют сведения, согласно которым отчасти это происходит по причине повреждающего воздействия активных форм кислорода (АФК), не исключено, что антиоксиданты могут восстанавливать нарушенные при нефролитиа-зе функции ингибиторов кристаллизации [4].

Учитывая вышесказанное, нас заинтересовала возможность изучения влияния а-токоферола ацетата на экспрессию внутрипочечных ингибиторов кристаллизации при экспериментальном нефролитиазе, что и явилось целью настоящего исследования.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на 30 самцах беспородных крыс массой 200-250 г, находившихся в условиях стандартной лабораторной диеты. Животные были разделены на 3 группы. Крысы первой группы (интактная группа) на протяжении 6 недель получали в виде питья обычную водопроводную воду. Крысы второй группы (контрольная группа) с целью моделирования экспериментального нефролити-аза в течение 6 недель получали в качестве питья

1 % раствор этиленгликоля (ЭГ). Данная методика является общепринятой и адекватно отражает особенности развития нефролитиаза у человека [5]. Крысы третьей группы (подопытная группа) на протяжении 6 недель получали ЭГ. Одновременно, начиная с 4-й недели, в течение последующих трех недель им внутрь через зонд вводился масляный раствор а-то-коферола ацетата в дозе 300 мг/кг.

По истечении шести недель эксперимента крысы всех трех групп декапитировались путем дислокации шейного позвонка под эфирным наркозом с соблюдением требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2000 г.). Материалом исследования послужила почка крысы.

Кальциевые депозиты выявлялись импрегнацией серебром по методу Косса с контролем реакции 0,1 % раствором соляной кислоты [6]. Затем оценивалась топология отложения и распределения кальциевых депозитов, их средние размеры, особенности локализации в тканях почки.

Определение экспрессии протеина Тамма-Хорсфал-ла, остеопонтина и бикунина проводилось при по-

мощи непрямого двухшагового стрептавидин-биоти-нового метода с контролем специфичности реакции. После стандартной процедуры депарафинизации и регидратации выполнялось блокирование эндогенной пероксидазы согласно рекомендациям производителя антител.

Восстановление антигенной специфичности производилось путем предварительной обработки срезов, погруженных в цитратный буфер (рН-6,0), в микроволновой печи при мощности 600 Вт 3 раза по 7 минут [7].

В качестве первичных антител использовали антитела к ПТХ (G-20: sc-19554) - 1 : 80, к ОПН (P-18: sc-10593) - 1 : 80 и к БИК (М-17: sc-21600) - 1 : 80.

Продукт реакции визуализировали с помощью системы Goat ABC Staining system: sc-2023 (Santa Cruz) и диаминобензидина (ДАБ).

Морфометрические исследования проводили с использованием программных пакетов ImageJ 1.43 и AxioVision 3.1. Степень экспрессии оценивали по интенсивности окрашивания ДАБ с применением программы анализа изображений ImageJ 1.43. Для удобства интерпретации результатов полученные данные рассчитывали по формуле: , где Е% — процент экспрессии, 256 - максимум интенсивности окраски, Dx — интенсивность окрашивания ДАБ. Для статистической обработки использовали программу R Commander, рапространяемую под лицензией GNU GPL. Результаты работы представлены в виде значений (средняя), m (ошибка средней). Оценку межгруп-повых различий проводили по критериям Данна и Манна-Уитни, поскольку размер выборок в группах различался, что не позволяло использовать параметрические критерии.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Проведенные эксперименты показали, что в результате шестинедельного потребления ЭГ у крыс контрольной группы развивался выраженный окса-латный нефролитиаз, признаками которого стали характерные морфологические изменения. Так, были выявлены элементы структурной реорганизации почечной ткани по типу гидропической дистрофии эпителия, вплоть до некробиотических изменений, дес-квамация эпителия, а также расширение просвета канальцев и собирательных трубок. При этом в мозговом веществе почки, преимущественно в области основания и средней трети сосочка, наблюдалось значительное количество кальциевых депозитов (22,6 ± 3,23 в поле зрения), средний размер которых составил 10,2 ± 0,76 мкм. В 40 % случаев фиксировались крупные микролиты, обтурировавшие просвет собирательных трубок.

В интактной группе описанных признаков зафиксировано не было, гистологическая картина почечных срезов в целом соответствовала норме, кальциевые депозиты гистохимически не верифицированы.

В подопытной группе морфометрически выявлены характерные признаки облегчения экспериментальной патологии. Количество кальциевых депози-

Корреспонденцию адресовать:

ЖАРИКОВАлександр Юрьевич,

656038, г. Барнаул, пр. Ленина, 40.

Тел.: раб. 8(3852)26-08-29; сот. +7-913-082-54-77. E-mail: zharikov_a_y@mail.ru

тов в области почечного сосочка, по сравнению с контролем, уменьшилось на 22 % (р < 0,001), а их средний размер — в 1,9 раза (р < 0,001).

На этом фоне наблюдались изменения экспрессии изучаемых протеинов. Так, у крыс интактной группы экспрессия протеина Тамма-Хорсфалла отмечалась преимущественно в цитоплазме и на апикальных мембранах клеток эпителия дистальных канальцев коркового вещества и толстого восходящего отдела петли Генле наружной зоны мозгового вещества. В почках крыс контрольной группы наблюдалась сходная локализация экспрессии ПТХ, но дополнительно отмечалась экспрессия данного белка в интерстиции почечного сосочка, максимально выраженная в области основания и средней трети, т.е. в местах преимущественного отложения кальциевых депозитов. При этом в количественном отношении уровень экспрессии ПТХ у больных животных достоверно увеличился на 4,6 % (р < 0,001 относительно интактной группы). У крыс, получавших лечение, происходила нормализация экспрессии ПТХ. Интерстициальной локализации белка в области почечного сосочка не выявлялось, топология экспрессии в целом соответствовала таковой в интактной группе, а уровень экспрессии был на 3,4 % ниже контрольных значений (р < 0,001) и не отличался от показателей интактных крыс.

Изучение особенностей почечной экспрессии ос-теопонтина показало, что она фиксируется главным образом в цитоплазме эпителиоцитов канальцев неф-рона, собирательных трубок, переходного эпителия чашечно-лоханочной системы без топологической разницы между группами. Однако количественно в процессе длительного употребления ЭГ экспрессия ОПН, по сравнению с показателями интактных животных, ослаблялась на 3,2 % (р < 0,001). В то же время, после проведенного курса антиоксидантной терапии экспрессия ОПН существенно превосходила не только уровень контрольных животных, но и несколько превышала показатели интактных крыс.

Относительно бикунина отметим, что у крыс ин-тактной группы наблюдалась умеренно выраженная экспрессия его цитоплазменной локализации в эпителии канальцев нефрона и собирательных трубок и отсутствие таковой в интерстиции. В почках крыс контрольной группы, при схожей в целом локализации, дополнительно выявлялась экспрессия БИК в интерстиции почечного сосочка, т.е. в месте преимущественного отложения кальциевых депозитов.

Примечательно, что после трех недель применения а-токоферола ацетата топология экспрессии БИК соответствовала таковой у интактных крыс, а в интер-стиции сосочка присутствие БИК не выявлялось. При этом уровень экспрессии БИК в количественном отношении претерпевал следующие изменения: в контрольной группе — незначительное увеличение относительно интактной группы, а в опытной группе — существенное снижение по сравнению с интактны-ми животными и относительно контроля.

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенных экспериментов получена четкая гистологическая картина развития оксалатного нефролитиаза у крыс контрольной группы, шесть недель потреблявших этиленгликоль. Как известно, ЭГ — это низкомолекулярный двухатомный спирт, одним из продуктов метаболизма которого в организме является оксалат-ион. Установлено, что длительное употребление ЭГ провоцирует накопление оксалат-ионов в организме, которые, экс-кретируясь в большом количестве с мочой, создают условия для образования почечных конкрементов и развития нефролитиаза [5]. При этом трехнедельное применение а-токоферола ацетата ожидаемо привело к облегчению течения экспериментальной патологии, что проявлялось в виде уменьшения количества и размеров кальциевых депозитов.

В данных условиях были изучены особенности экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации — протеина Тамма-Хорсфалла, остеопонтина и бикунина. Оказалось, что при моделировании экспериментального нефролитиаза происходят четкие изменения топологии указанных белков и уровня их экспрессии. Так, если в интактной группе экспрессия ПТХ наблюдалась главным образом в цитоплазме и на апикальных мембранах нефроцитов дистальных канальцев и толстого восходящего отдела петли Генле, то у больных животных она дополнительно выявлялась в интерстиции почечного сосочка. Данный факт вполне объясним, поскольку именно в области почечного сосочка происходит основное формирование кальциевых депозитов. Так что экспрессия ПТХ здесь, по-видимому, носит компенсаторный характер, направленный на сдерживание камнеобразо-вания. Подтверждением этому может служить зафиксированный рост уровня экспрессии ПТХ на 4,6 % по сравнению со здоровыми животными.

Сведения об авторах:

ЖАРИКОВ Александр Юрьевич, канд. биол. наук, доцент, кафедра фармакологии, ГОУ ВПО «АГМУ Росздрава», г. Барнаул, Россия. E-mail: zharikov_a_y@mail.ru

МОТИН Юрий Григорьевич, канд. мед. наук, ассистент, кафедра гистологии, ГОУ ВПО «АГМУ Росздрава», г. Барнаул, Россия. E-mail: ymotin@mail.ru

ЗВЕРЕВ Яков Федорович, доктор мед. наук, профессор, кафедра фармакологии, ГОУ ВПО «АГМУ Росздрава», г. Барнаул, Россия. E-mail: zver@asmu.ru

БРЮХАНОВ Валерий Михайлович, доктор мед. наук, профессор, зав. кафедрой фармакологии, ГОУ ВПО «АГМУ Росздрава», г. Барнаул, Россия. E-mail: rector@asmu.ru

ЛАМПАТОВ Вячеслав Витальевич, доктор биол. наук, профессор, кафедра фармакологии, ГОУ ВПО «АГМУ Росздрава», г. Барнаул, Россия. E-mail: lampatov@asmu.ru

Показательной на этом фоне выглядит картина экспрессии ПТХ после проведенного курса антиок-сидантной терапии. В почках крыс, 3 недели получавших а-токоферола ацетат, интерстициальной локализация ПТХ в области почечного сосочка не выявлялась, экспрессия белка ослаблялась вплоть до интактного уровня. Не исключено, что на фоне действия препарата, ослабившего интенсивность камне-образования, адаптивного усиления экспрессии ПТХ почкам не потребовалось, поэтому она осталась на уровне здоровых животных. В данном контексте следует добавить, что в некоторых исследованиях продемонстрирована модификация ПТХ под влиянием активных радикалов кислорода, вследствие чего ПТХ сам становился стимулятором литогенеза [4]. Поэтому применение а-токоферола ацетата могло предотвратить качественное преобразование ПТХ и, тем самым, внести дополнительный вклад в общий пул ан-тилитогенных эффектов.

Изучение особенностей почечной экспрессии ос-теопонтина показало, что ее интенсивность за шесть недель моделирования нефролитиаза достоверно снизилась на 3,2 % относительно уровня интактных животных. Вероятно, это свидетельствует об истощении подконтрольных ОПН защитных ресурсов, которые могли израсходоваться на длительное противодействие отложению кальциевых кристаллов в тканях почки. В подтверждение высказанного предположения можно привести ряд клинических наблюдений, в которых было выявлено существенное снижение содержания ОПН в моче пациентов, страдающих МКБ [8, 9]. Вместе с тем, в почках крыс, получавших лечение, указанного ослабления экспрессии ОПН выявлено не было. Логично предположить, что это так-

ЛИТЕРАТУРА:

же явилось следствием применения препарата, на фоне которого ОПН не расходовался, сохраняясь на уровне здоровых животных.

В отношении установленных особенностей экспрессии бикунина заметим, что после шести недель потребления крысами контрольной группы ЭГ были зафиксированы признаки интерстициальной локализации БИК в области почечного сосочка, чего не наблюдалось у интактных животных. Учитывая, что именно здесь преимущественно откладываются кальциевые депозиты, можно предположить адаптивный характер экспрессии БИК, направленной на сдерживание литогенных процессов. В этих условиях прослеживалась тенденция к увеличению уровня экспрессии БИК, по сравнению с интактными животными, что хорошо согласуется с литературными данными, показывающими рост экспрессии мРНК бикунина при длительных сроках моделирования нефролитиаза [10]. На этом фоне после применения а-токоферола ацетата интерстициальная локализация БИК отсутствовала, а уровень экспрессии белка достоверно снизился, как относительно контрольной группы, так и по сравнению с интактными животными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Трехнедельное применение а-токоферола ацетата в дозе 300 мг/кг на фоне экспериментального неф-ролитиаза нормализует картину почечной экспрессии ингибиторов кристаллизации при сопутствующем уменьшении количества и размеров кальциевых депозитов. Данные изменения следует рассматривать в качестве важного признака антилитогенной эффективности а-токоферола ацетата.

1. Механизм формирования кристаллов при оксалатном нефролити-азе /А.Ю. Жариков, Я.Ф. Зверев, В.М. Брюханов и др. //Нефрология. - 2009. - Т. 13, № 4. - С. 37-50.

2. Роль антиоксидантной терапии в фармакологической коррекции экспериментального нефролитиаза /А.Ю. Жариков, О.С. Талалаева, Я.Ф. Зверев и др. //Нефрология. - 2010. - Т. 14, № 4. - С. 53-58.

3. Современные представления о модуляторах оксалатного нефролитиаза. Ингибиторы кристаллизации /Я.Ф. Зверев, А.Ю. Жариков, В.М. Брюханов и др. //Нефрология. - 2010. - Т. 14, № 1. - С. 29-49.

4. Benefecial effect of vitamin E supplementation on the biochemical and kinetic properties of Tamm-Horsfall glycoprotein in hyperten-

sive and hyperoxaluric patients /K. Sumitra, V. Pragasam, R. Sak-thivel et al. //Nephrol. Dial. Transplant. - 2005. - V. 20. - P. 14071415.

5. Современные методы моделирования оксалатного нефролитиаза /А.Ю. Жариков, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. //Нефрология. -2008. - Т. 12, № 4. - С. 28-35.

6. Armed forces institute of pathology laboratory methods in histotechno-logy /E.B. Prophet, B. Mills, J.B. Arrington et al. //American registry of pathology. - Washington, 1992. - P. 197.

7. Гуревич, Л.Е. Использование в иммуногистохимических исследованиях метода восстановления антигенной специфичности воз-

Information about authors:

ZHARIKOV Alexander Yurievich, candidate of biology sciences, docent, pharmacology's departament, Altay State Medical University, Barnaul, Russia. E-mail: zharikov_a_y@mail.ru

MOTIN Yuriy Grigorievich, candidate of medical sciences, assistant, histology's departament, Altay State Medical University, Barnaul, Russia. E-mail: ymotin@mail.ru

ZVEREVYakov Feodorovich, doctor of medical sciences, professor, pharmacology's departament, Altay State Medical University, Barnaul, Russia. E-mail: zver@asmu.ru

BRYUKHANOV Valeriy Michajlovich, doctor of medical sciences, professor, chief of pharmacology's departament, Altay State Medical University, Barnaul, Russia. E-mail: rector@asmu.ru

LAMPATOV Vyacheslav Vitaljevich, doctor of biology sciences, professor, pharmacology's departament, Altay State Medical University, Barnaul, Russia. E-mail: lampatov@asmu.ru

действием микроволн на ткани, фиксированные формалином и заключенные в парафин /Л.Е. Гуревич, А.В. Исаков //Арх. патологии. - 1999. - № 2. - С. 48-50.

8. Urinary concentration of osteopontin and association with urinary supersaturation and crystal formation /H. Tsuji, U. Tohru, U. Hirotsugu et al. //Int. J. Urol. - 2007. - V. 14, N 7. - P. 630-634.

9. Quantification of osteopontin in the urine of healthy and stone-forming men /T. Yasui, K. Fujita, Y. Hayashi et al. //Urol. Res. - 1999. -V. 27. - P. 225-230.

10. Temporal changes in mRNA expression for bikunin in the kidneys of rats during calcium oxalate nephrolithiasis /S. lida, A.B. Peck, J. Johnson-Tardieu et al. //J. Am. Soc. Nephrol. - 1999. - V. 10. - P. 986-996.