СПОСОБ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ВОД И ВОДНЫХ РАСТВОРОВ
METHOD FOR BIOTESTING TOXICITY OF WATER AND AQUEOUS SOLUTIONS

Настоящее изобретение относится к биофизическим методам определения токсичности вод и водных растворов и может быть применено для оперативного биотестирования токсичности природных и сточных вод, а также для установления класса опасности различных отходов при использовании в качестве тест-объекта микроводорослей и других растительных организмов.
Известен способ определения фитотоксичности вод, основанный на регистрации изменения интенсивности миллисекундного фотоиндуцируемого послесвечения (замедленной флуоресценции) хлоропластов или клеток хлореллы под действием химических соединений, содержащихся в тестируемых пробах [авт. свид. СССР №492805, G01N 33/00, опубл. 25.11.75 г.].
Недостатком данного способа является то, что он не обеспечивает высокую точность измерения степени воздействия токсических веществ в анализируемых водах, поскольку интенсивность регистрируемой замедленной флуоресценции (ЗФ) будет зависеть не только от степени токсичности пробы, но и от мутности и цветности тестируемой воды или раствора, а также количества взятого тест-организма.
Наиболее близким техническим решением для способа определения содержания фитотоксических веществ, выбранным в качестве прототипа, является [патент РФ №2069851, G01N 21/64, G01N 33/00, опубл. 27.11.1996 г.], основанный на определении токсичности различных вод и водных растворов путем измерения отношения интенсивностей ЗФ тест-организма в индукционном максимуме на высоком и низком возбуждающем свету. Данный относительный параметр ЗФ не зависит от мутности и цветности анализируемых проб, а также количества взятого тест-организма, поскольку изменение интенсивности свечения во всех случаях будет пропорциональным для обоих световых условий возбуждения и регистрации ЗФ и потому не отражается на величине его относительного параметра.
Недостатком этого способа является трудность подбора интенсивности низкого возбуждающего света, обеспечивающего максимальную чувствительность и точность данного метода. Ситуация усугубляется тем, что этот способ не использует возможности покомпонентной регистрации интенсивности ЗФ, что также оказывает существенное влияние на показатели чувствительности растительных тест-организмов к токсикантам.
Техническим результатом изобретения является повышение точности и чувствительности способа измерения токсичности при биотестировании вод и водных растворов за счет создания новых условий регистрации замедленной флуоресценции хлорофилла растительных объектов.
2
Технический результат достигается тем, что в способе биотестирования токсичности вод и водных растворов, включающем облучение исследуемого образца растительного объекта прерывистым светом высокой интенсивности 100-250 Вт/м от синих светоизлучающих диодов с возбуждением замедленной флуоресценции этого образца и ее регистрации в индукционных максимумах в красной спектральной области фотоприемником между световыми импульсами, причем за счет сокращения длительности световых периодов возбуждения свечения при одновременном увеличении темновых интервалов между ними создают условия низкого светового облучения, а за счет увеличения соотношения длительности световых периодов к темновым создают условия высокого светового облучения, измеряют интенсивность замедленной флуоресценции исследуемого образца в режиме высокого светового облучения в начале каждой кривой затухания, интенсивность в режиме низкого светового облучения измеряют в конце каждой кривой затухания, а о токсичности судят по их отношению.
Заявляемый способ биотестирования вод и водных растворов отличается увеличением диапазона реагирования относительного показателя замедленной флуоресценции хлорофилла растительного тест-организма при воздействии на него поллютантов, что обеспечивает большую точность и чувствительность способа измерения токсического эффекта.
Таким образом, заявляемый способ биотестирования токсичности вод и водных растворов соответствует критерию «новизна».
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данных и смежных областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию «изобретательский уровень».
Изобретение поясняется чертежами. На фиг.1 показаны зависимости интенсивности ЗФ суспензии хлореллы, возбуждаемой в режимах высокого (ЗФв) и низкого (ЗФн) света, от концентрации (в молях/литр) диурона - токсиканта, вызывающего подавление фотосинтетического транспорта электронов. На фиг.2 показаны концентрационные зависимости показателей ЗФ водоросли хлорелла в присутствии ионов кадмия. На фиг.3 показана зависимость относительного показателя ЗФ от концентрации (процента разбавления) тестируемых сточных вод.
Сущность изобретения заключается в том, что токсическое воздействие на тест-организмы оценивается на основе регистрации интенсивности замедленной флуоресценции содержащегося в них хлорофилла с помощью устройства для регистрации ЗФ хлорофилла растительных объектов. При определении токсичности тестируемых вод по относительному показателю (ОП) ЗФ в индукционном максимуме измерение интенсивности свечения тест-организма при возбуждении светом высокой интенсивности производят в начале каждой кривой затухания, а в режиме возбуждения низким светом - в ее конце. При этом условия низкого светового облучения создают посредством сокращения длительности световых импульсов возбуждения при одновременном увеличении длительности темновых интервалов между ними. В свою очередь, формирование условий высокого светового облучения обеспечивают не только путем использования высокоинтенсивного возбуждающего света, но через повышение среднего уровня светового облучения тест-организма за счет увеличения длительности световых периодов и сокращения темновых.
Пример 1
3
3
3
2
В 6 кювет из материала с низким уровнем послесвечения (ЗФ) вносят по 4 см суспензии водоросли хлореллы с оптической плотностью 0,040, измеренной при длине волны 560 нм и толщине слоя 2 см. В первую из них добавляют 0,1 см дистиллированной воды (контроль), а в остальные по 0,1 см раствора диурона различных концентраций. После этого кюветы загружают в устройство для регистрации замедленной флуоресценции хлорофилла растительных объектов и производят измерение ЗФ в двух световых режимах. На фиг.1 показаны зависимости интенсивности ЗФ суспензии хлореллы, возбуждаемой в режимах высокого (ЗФв) и низкого (ЗФн) света, от концентрации (в молях/литр) диурона - токсиканта, вызывающего подавление фотосинтетического транспорта электронов. Первый режим достигают тем, что относительно длительные импульсы (20 мсек) возбуждающего света высокой интенсивности (100-250 Вт/м) чередуют со сравнительно короткими темновыми интервалами (5 мсек), во время которых, в первую миллисекунду, регистрируют ЗФ. Режим низкого света получен благодаря тому, что столь же яркий импульс возбуждения подают в течение 1-4 мсек, после которого следует более длительный темновой интервал (50 мсек). При этом интенсивность ЗФ измеряют не сразу после окончания светового возбуждения, а с задержкой 20-30 мсек. Поскольку в этот промежуток быстрые компоненты успеют полностью затухнуть, то в конце кривой затухающего свечения остаются и регистрируются только медленные компоненты.
В связи с тем, что интенсивность этих компонент у контрольной тест-культуры водоросли в отсутствие токсикантов в несколько сотен раз ниже, чем быстрых компонент, то при переходе в режим низкого света чувствительность системы регистрации автоматически увеличивается в 100 раз. Поэтому для реального представления о величине ОП ЗФ его значения, показанные на фиг.3, надо увеличить в 100 раз. Чтобы интенсивность свечения могла быть измерена в его индукционных максимумах, световые импульсы возбуждения, чередующиеся периодами, регистрируется ЗФ, подаются в течение 2-3 секунд.
Представленные на фиг.1 данные показывают, что интенсивность ЗФв тест-культуры водоросли хлорелла с ростом концентрации токсиканта многократно снижается. В этих условиях ЗФн столь же значительно возрастает. При этом относительный показатель ЗФ, в виде отношения интенсивностей свечений в режимах высокого и низкого возбуждающего света, уменьшается в 100 и более раз.
Пример 2
В кюветы, аналогичные примеру 1, вместо диурона вносят различные концентрации ионов кадмия. Согласно рекомендациям [патент РФ №2222003, G01N 21/64, опубл. 20.01.2004 г.] тестируемые пробы, для большего проявления действия данного тяжелого металла на клетки водоросли, в течение 1 часа подвергают световой экспозиции. Интенсивность светового облучения кювет с тест-культурой водоросли составляет 60 Вт/м. На фиг.2 показаны концентрационные зависимости показателей ЗФ водоросли хлорелла в присутствии ионов кадмия, измеренные в условиях, аналогичных указанным в примере 1. Хорошо видно, что и этот токсикант вызывает значительное снижение интенсивности ЗФв и увеличение ЗФн. Величина отношения этих показателей ЗФ также многократно снижается.
Пример 3
3
3
2
В кюветы, аналогичные примеру 1, вносят по 3,6 см сточных вод целлюлозно-бумажного комбината (ЦБК) и сточных вод на выходе городских очистных сооружений (ОС), разбавленные дистиллированной водой в ряд кратный двум. В качестве контроля используют дистиллированную воду. В каждое разведение сточных вод добавляют по 0,4 см культуры водоросли хлорелла с оптической плотностью 0,4. После 1-часовой световой экспозиции с интенсивностью светового облучения 60 Вт/м производят измерение интенсивности замедленной флуоресценции в режимах высокого и низкого светового облучения. На фиг.3 показана зависимость относительного показателя ЗФ от концентрации (процента разбавления) тестируемых сточных вод (параметры замера ЗФ, как в примере 1). Сточная вода после очистных сооружений практически не вызывает изменения относительного показателя ЗФ культуры водоросли, что свидетельствует о ее нетоксичности. И наоборот, стоки ЦБК проявляют достаточно высокую токсичность, которая снимается только после их 8-кратного разбавления чистой водой.
Преимущество заявляемого способа биотестирования токсичности вод и водных растворов заключается в повышении точности и чувствительности измерения токсичности вод при биотестировании вследствие увеличения диапазона реагирования относительного показателя замедленной флуоресценции хлорофилла растительного тест-организма при воздействии на него поллютантов, за счет создания новых условий регистрации замедленной флуоресценции хлорофилла растительных тест-организмов.