Фармацевтическая композиция на основе PLGA для индукции эффективного мукозального иммунного ответа
PHARMACEUTICAL COMPOSITION BASED ON PLGA FOR THE INDUCTION OF THE EFFECTIVE MUCOSAL IMMUNE RESPONSE

Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и касается способа получения и применения субъединичных вакцин для индукции наиболее эффективного мукозального иммунного ответа с целью специфической профилактики инфекций, вызванных бактериальными и вирусными патогенами, использующими слизистые в качестве ворот инфекции.
Предшествующий уровень техники
Известно, что большая часть патогенных для человека микроорганизмов, использует в качестве ворот инфекции слизистые желудочно-кишечного (например, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio cholerae, и др.), респираторного (например, вирус гриппа, Mycobacterium tuberculosis, риновирус, респираторно-синцитиальный вирус и др.) и генитального тракта (например, вирус простого герпеса, вирус папиломы человека, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae и др.). При этом, для такого типа возбудителей инфекции показано, что иммунная защита обеспечивается в основном не за счет системных иммунных реакций (например, высокие титры IgG антител в сыворотке крови, формирование антиген-специфических клонов CD4+, CD8+ клеток в селезенке), а за счет компонентов мукозального иммунитета, формируемого на поверхности слизистых: секретируемых в слизистый слой IgA антител (в случае V. cholerae, энтеротоксигенной Е. coli) или Th17 поляризованных CD4+ Т лимфоцитов, находящихся в ткани слизистых (показано на примере Н.pylori, вируса простого герпеса, хламидийной инфекции) [Tokuhara D, et al., 2010, Johansson M, et al., 1997, Ermak T.H, et al., 1998, Harandi A.M., et al., 2001].
Таким образом, формирование локальных иммунных реакций на поверхностях слизистых играет важную роль для повышения резистентности организма против целого ряда патогенов, использующих эпителиальные клетки для своей первичной инфекции.
Известно решение согласно патенту US 6793928 В1, в котором для создания протективного иммунитета на поверхностях слизистых используют термолабильный энтеротоксин токсин Escherichiacoli (LTB). Было показано, что совместное введение LTB и антигена, приводит к индукции мукозо-ориентированного иммунного ответа против антигена. Однако высокая токсичность LTB ограничивает его клиническое применение.
Известно несколько решений, предусматривающих использование частиц хитозана для индукции мукозального иммунитета. Так, описано использование наночастицы N-триметилхитозана (ТМС) с инкапсулированным гемагглютинином для индукции иммунитета против вируса гриппа [AmidiM., N-trimethylchitosan (ТМС) nanoparticlesloadedwithinfluenzasubunitantigenforintranasalvaccination: biologicalpropertiesandimmunogenicityinamousemodel. Vaccine. 2007 Jan 2;25(1):144-53. Epub 2006 Aug 4.]. В данной работе было показано, что иммунизация животных вышеописанными частицами на основе хитозана приводит к секреции IgA антител на слизистых респираторного тракта.
В патенте JP 2005525415 A, описана иммуногенная композиция на основе различных антигенов N. meningitidis, упакованных в частицы хитозана, которая приводит к индукции мукозо-ориентированного иммунного ответа против N. meningitidis.
Наночастицы на основе хитозана, способны индуцировать реакции музозального иммунитета, однако, физико-химические особенности хитозана, а также особенности самой технологии получения вакцинных частиц хитозана накладывают ограничение по химической структуре и природе используемых в качестве антигена молекул подлежащих инкапсуляции в эти частицы.
Таким образом, ввиду обозначенных проблем, существует острая необходимость в разработке безопасной вакцинной композиции способной инкорпорировать различные антигенные молекулы, а также индуцировать протективный иммунный отчет против инфекционных агентов, в том числе на поверхностях слизистых.
Решением данной проблемы может стать использование частиц на основе полимера выполненного из эндогенно синтезируемых молекул: молочной и гликолевой кислот (PLGA). Технология получения частиц на основе PLGA позволяет инкорпорировать в них любые антигенные молекулы различной химической природы, структуры, размеров. Полимерная оболочка защищает инкапсулированные антигены от протеолиза и увеличивает их период полувыведения. PLGA частицы подвергаются биодеградации и метаболизируются в водных средах до составляющих их нетоксичных мономеров. В многочисленных исследованиях, в том числе клинических, данные частицы показали свою безопасность. Сфера применения частиц PLGA достаточно широка. В настоящее время одобрено 15 препаратов на основе PLGA частиц [Y. Wang, W. Qu, S. Choi, FDA'sRegulatoryScienceProgramforGenericPLA/ PLGA-BasedDrugProducts, americanpharmaceuticalreview, June 15, 2016]. Ha сегодняшний день опубликованы различные вакцинные формуляции на основе PLGA частиц разных размеров в диапазоне от микро- до нанометров. При этом, отсутствует какая-либо информация об использовании вакцин на основе PLGA частиц для индукции иммунного ответа на поверхностях слизистых.
Так, в патенте US 7,087.236 В1 описан способ получения и парентерального применения субъедниничной вакцины на основе PLGA для формирования выраженного системного Th1 (клеточного) и Th2 (гуморального) иммунного ответа, используя заключенные в частицы антигенные молекулы гемагглютинина (РНА), инактивированного токсина (pHD) возбудителя коклюша Bordetella pertussis. Размеры PLGA частиц указанные авторами в изобретении колеблются в широком пределе, находящемся в микрометровом диапазоне: от 2,4 мкм до 4,3 мкм, причем 50% частиц должна быть меньше, чем 5 мкм.
Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования, выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип.
Однако данное изобретение не позволяет использовать его для эффективной индукции мукозо-ориентированных иммунных реакций для защиты от ряда инфекций, входными воротами которых являются слизистые человека. Авторы при создании используют частицы, размеры которых колеблются в широком пределе, находящемся в микрометровом диапазоне. Такие большие частицы не способны согласно данным авторов данного изобретения вызвать формирования напряженного иммунного ответа на поверхности слизистых. Кроме того, не используют агонистов паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета, позволяющих значительно повысить напряженность иммунных реакций как системно, так и на поверхности слизистых.
Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке эффективного средства доставки вакцинных антигенов, которое было бы способно формировать напряженный иммунный ответ на поверхности слизистых.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является разработка эффективного средства специфической профилактики, позволяющего индуцировать мукозо-ориентированные иммунные реакции.
Задача решается за счет того, что создана фармацевтическая композиция на основе PLGA, состоящая из антигена, упакованного внутрь полимерных частиц PLGA, оболочка которых состоит из полимера молочной-ко-гликолевой кислот, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит агонист или сочетание агонистов паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета, причем размер частиц составляет менее 180 нм. Показано применение фармацевтической композиции для индукции мукозального иммунного ответа в респираторном тракте за счет последовательной внутримышечной и интраназальной иммунизации. Показано также применение фармацевтической композиции для индукции мукозального иммунного ответа в желудочно-кишечном тракте за счет последовательной внутримышечной иммунизации. При этом агонист паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета для фармацевтической композиции выбирают из агонистов Toll-подобных рецепторов и/или агонистов NOD рецепторов и/или агонистов лектинов С-типа. Причем агонист Toll-подобных рецепторов врожденного иммунитета выбирают из липополисахарида и/или его производных, содержащих липид А и/или участков ДНК, богатых цитозином и гуанином. А агонист NOD рецепторов врожденного иммунитета выбирают из пептидогликана, содержащего в своей структуре мурамилдипептид и/или диаминопимелиновую кислоту. При этом агонист лектинов С-типа врожденного иммунитета выбирают из полисахаридов, содержащих бета-1,3-гликан или α-маннозу или трегалозу-6,6-димиколят или трегалозу-6,6-дибегенат.
Для разработки данного средства авторами патента была выбрана система доставки вакцинных антигенов на основе частиц PLGA. Данная система обладает высокой эффективностью и безопасностью, а кроме того, позволяет инкапсулировать антигены различной природы (как водорастворимые, так и жирорастворимые) и размера. Авторами патента были проведены оригинальные исследования, результаты которых показали, что при парентеральном введении вакцины на основе PLGA ключевым фактором, определяющим формирование мукозо-ориентированного иммунного ответа, является размер частиц. Было показано, что частицы PLGA, размером меньше 180 нм, приводят к развитию мукозо-ориентированного иммунного ответа (что характеризуется повышенной секрецией IgA антител).
В интерстециальном пространстве, куда частицы попадают после инъекции, они начинают перемещаться под действием жидкостной конвекции - которая приводится в движение лимфатическим дренажем, вызванным градиентом давления между кровью и лимфатическими сосудами. Однако архитектура внеклеточной матрицы препятствует перемещению крупных частиц, в результате чего они задерживаются в месте введения. Тогда как более мелкие частицы (меньше 180 нм) с током лимфы переносятся в лимфатические узлы и далее проникают непосредственно в подслизистые слои тканей, где могут поглощаться антиген-презентирующими клетками (например, дендритными клетка ми). Захват большего количества частиц дендритными клетками определяет повышенние напряженности иммунных реакций.
Помимо этого, результаты исследований, проведенных авторами патента, показывают, частицы меньших размеров (<180 нм) по сравнению с более крупными частицами (>180 нм) более эффективно фагоцитируются дендритными клетками, что дополнительно инициирует развитие более мощного иммунного ответа. Кроме того, авторы предлагают различные схемы иммунизации вакцинным препаратом на основе PLGA частиц, позволяющие индуцировать формирование мукозальных иммунных реакций на слизистых либо дыхательного, либо кишечного тракта.
Краткое описание фигур
На фиг. 1
представлена схема эксперимента по оценке влияния размера частиц PLGA на скорость фагоцитоза данных частиц дендритными клетками. Черные клетки содержат частицы PLGA. Серые клетки не содержат частицы PLGA.
На фиг. 2
представлены результаты эксперимента по оценке влияния размера частиц PLGA на скорость фагоцитоза данных частиц дендритными клетками. Столбики отражают значение среднего арифметического интенсивности флуоресценции в каждой группе. Планки погрешности обозначают стандартное отклонение значений интенсивности флуоресценции. Символом «*» обозначена статистически достоверная разница между значениями в группе PLGA-ova<180нм и другими группами (р<0,05 по t критерию Стьюдента).
Ось абсцисс - интенсивность флуоресценции (условные единицы).
Ось ординат - экспериментальные группы.
На фиг. 3 (А, В)
представлен план эксперимента по оценке эффективности различных схем иммунизации мышей панелью PLGA частиц различного размера. На фиг. 3А отображена схема эксперимента с экспериментальными группами 1.1, 1.2, 2.1, 2.2, а на фиг. 3В - 3.1, 3.2, 4.1, 4.2.
На фиг. 4
представлены результаты эксперимента по определению титра IgA антител к овальбумину в бронхоальвеолярных лаважах мышей, иммунизированных PLGA частицами с инкапсулированным овальбумином.
Ось абсцисс - реципрокный титр IgA антител. Точками обозначены титры антител для каждой мыши в группе. Горизонтальной линиейсреднее геометрическое титра в каждой группе. Символом «*» обозначена статистически достоверная разница между значениями в группе 1.2 и другими группами (р<0,05 по t критерию Стьюдента). Символом «<25» обозначено реципрокное значение титра антител меньше чем 1:25.
Ось ординат - экспериментальные группы:
1.1 - двукратная подкожная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-1) с размером частиц <180 нм;
1.2 - последовательная подкожная и интраназальная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-1) с размером частиц <180 нм;
2.1 - двукратная подкожная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-2) с размером частиц 180-300 нм;
2.2 - последовательная подкожная и интраназальная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-2) с размером частиц 180-300 нм;
3.1 - двукратная подкожная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-3) с размером частиц >300 нм;
3.2 - последовательная подкожная и интраназальная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-3) с размером частиц >300 нм;
4.1 - двукратное подкожное введение фосфатного буфера (отрицательный контроль);
4.2 - последовательное подкожное и интраназальное введение фосфатного буфера (отрицательный контроль).
На фиг. 5
представлены результаты эксперимента по определению титра IgA антител к овальбумину в кишечных лаважах мышей, иммунизированных PLGA частицами с инкапсулированным овальбумином. Ось абсцисс - реципрокный титр IgA антител. Точками обозначены титры антител для каждой мыши в группе. Горизонтальной линией среднее геометрическое титра в каждой группе. Символом «*» обозначена статистически достоверная разница между значениями в группе 1.1 и другими группами (р<0,05 по t критерию Стьюдента). Символом «<25» обозначено реципрокное значение титра антител меньше чем 1:25.
Ось ординат - экспериментальные группы:
1.1 - двукратная подкожная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-1) с размером частиц <180 нм;
1.2 - последовательная подкожная и интраназальная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-1) с размером частиц <180 нм;
2.1 - двукратная подкожная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-2) с размером частиц 180-300 нм;
2.2 - последовательная подкожная и интраназальная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-2) с размером частиц 180-300 нм;
3.1 - двукратная подкожная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-3) с размером частиц >300 нм;
3.2 - последовательная подкожная и интраназальная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-3) с размером частиц >300 нм;
4.1 - двукратное подкожное введение фосфатного буфера (отрицательный контроль);
4.2 - последовательное подкожное и интраназальное введение фосфатного буфера (отрицательный контроль).
На фиг. 6
представлены результаты эксперимента по определению титра IgG антител к овальбумину в сыворотке крови мышей, иммунизированных PLGA частицами с инкапсулированным антигеном.
Ось абсцисс - реципрокный титр IgG антител. Точками обозначены титры антител для каждой мыши в группе. Горизонтальной линией среднее геометрическое титра в каждой группе. Символом «*» и скобкой обозначена статистически достоверная разница между значениями в группах сравнения (р<0,05 по t критерию Стьюдента). Так, например, значения титров в группе 1.1. и 1.2. статистически больше, чем значения титров в группах 2.1, 2.2, 3.1, 3.2, 4.1, 4.2. Символом «н.д.» и скобкой обозначена статистически недостоверная разница между значениями в группах сравнения (р>0,05 по t критерию Стьюдента). Символом «<128» обозначено реципрокное значение титра антител меньше чем 1:128.
Ось ординат - экспериментальные группы:
1.1 - двукратная подкожная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-1) с размером частиц <180 нм;
1.2 - последовательная подкожная и интраназальная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-1) с размером частиц <180 нм;
2.1 - двукратная подкожная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-2) с размером частиц 180-300 нм;
2.2 - последовательная подкожная и интраназальная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-2) с размером частиц 180-300 нм;
3.1 - двукратная подкожная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-3) с размером частиц >300 нм;
3.2 - последовательная подкожная и интраназальная иммунизация модельной вакцинной формуляцией (PLGA-ova-3) с размером частиц >300 нм;
4.1 - двукратное подкожное введение фосфатного буфера (отрицательный контроль);
4.2 - последовательное подкожное и интраназальное введение фосфатного буфера (отрицательный контроль).
На фиг. 7
представлены результаты эксперимента по определению титра IgA антител к гемагглютинину в бронхоальвеолярных лаважах мышей, иммунизированных последовательно подкожно и интраназально PLGA частицами с инкапсулированным гемагглютинином.
Ось абсцисс - реципрокный титр IgA антител к гемагглютинину. Точками обозначены титры антител для каждой мыши в группе. Горизонтальной линией среднее геометрическое титра в каждой группе. Символом «*» обозначена статистически достоверная разница между значениями в группе PLGA-HA-1 <180 нм и другими группами (р<0,05 по t критерию Стьюдента). Символом «<25» обозначено реципрокное значение титра антител меньше чем 1:25.
Ось ординат - экспериментальные группы.
На фиг. 8
представлены результаты по оценке выживаемости мышей, иммунизированных последовательно подкожно и интраназально PLGA частицами с инкапсулированным гемагглютинином и зараженных вирусом гриппа. Символом «*» обозначена статистически достоверная разница между значениями выживаемости мышей в группе №1 (мышам вводили PLGA-HA-1 <180 нм) по сравнению с значениями выживаемости остальных групп (р<0,05 по Манна-Уитни).
Ось абсцисс - количество животных в процентах от исходного.
Ось ординат - дни после заражения животных вирусом гриппа.
(1) мышам вводили PLGA-HA-1 <180 нм.
(2) мышам вводили PLGA-HA-2 180-300 нм.
(3) мышам вводили PLGA-HA-3 >300 нм.
(4) мышам вводили фосфатный буфер в качестве контроля.
На фиг. 9
представлены результаты эксперимента по определению титра IgA антител к антигену ESAT6 Mycobacteriumtuberculosis в бронхоальвеолярных лаважах мышей, иммунизированных последовательно подкожно и интраназально PLGA частицами с инкапсулированным ESAT6.
Ось абсцисс - реципрокныйтитр IgA антител к ESAT6. Точками обозначены титры антител для каждой мыши в группе. Горизонтальной линией среднее геометрическое титра в каждой группе. Символом «*» обозначена статистически достоверная разница между значениями титра IgA антител в группе PLGA-ESAT6 <180 нм и другими группами (р<0,05 по t критерию Стьюдента). Символом «<25» обозначено реципрокное значение титра антител меньше чем 1:25.
Ось ординат - экспериментальные группы.
На фиг. 10
представлены результаты по микробной нагрузке в легких (титрам Mycobacteriumtuberculosis) мышей иммунизированных последовательно подкожно и интраназально PLGA частицами с инкапсулированным ESAT6 и зараженных Mycobacteriumtuberculosis штамма H37Rv 8 недель после последней иммунизации. Символом «*» обозначена статистически достоверная разница между значениями КOEMycobacteriumtuberculosis в группе PLGA-ESAT6 <180 нм и другими группами (р<0,05 по t критерию Стьюдента).
Ось абсцисс - количество КОЕ Mycobacteriumtuberculosis.
Ось ординат - опытные группы.
На фиг. 11
представлены результаты эксперимента по определению титра IgA антител к антигену флагелину сальмонелы в кишечных лаважах мышей, иммунизированных двухкратно подкожно PLGA частицами с инкапсулированным флагелином.
Ось абсцисс - реципрокный титр IgA антител к флагеллину. Точками обозначены титры антител для каждой мыши в группе. Горизонтальной линией среднее геометрическое титра в каждой группе. Символом «*» обозначена статистически достоверная разница между значениями в группе PLGA-FI <180 нм и другими группами (р<0,05 по t критерию Стьюдента).
Ось ординат - экспериментальные группы.
На фиг. 12
представлены результаты по оценке выживаемости мышей, и иммунизированных двукратно подкожно PLGA частицами с инкапсулированным флагелином и зараженных S. typhimurium. Символом «*» обозначена статистически достоверная разница между значениями выживаемости мышей в группе №1 (мышам вводили PLGA-FI-1 <180 нм) по сравнению с значениями выживаемости остальных групп (р<0,05 по Манна-Уитни). Символом «<25» обозначено реципрокное значение титра антител меньше чем 1:25.
Ось абсцисс - количество животных.
Ось ординат - дни после заражения животных вирусом гриппа.
(1) мышам вводили PLGA-FI-1 <180 нм.
(2) мышам вводили PLGA-FI-2 180-300 нм.
(3) мышам вводили PLGA-FI-3 >300 нм.
(4) мышам вводили фосфатный буфер в качестве контроля.
На фиг. 13
представлены результаты по определению титра IgA антител к овальбумину в бронхоальвеолярных лаважах мышей, иммунизированных последовательно подкожно и интраназально PLGA частицами в комбинации с различными агонистами паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета. Символом «*» обозначена статистически достоверная разница между значениями в группе животных, иммунизированных вакцинной формуляцией с добавлением индивидуальных агонистов (PLGA-ova-MDP, PLGA-ova-MPLA, PLGA-ova-Curdlan) и значениями в контрольной группе животных, иммунизированных вакцинной формуляцией без агонистов (PLGA-ova) (р<0,05 по t критерию Стьюдента). Символом «**» обозначена статистически достоверная разница между значениями в группах животных, иммунизированных вакцинными формуляциями с добавлением комбинации агонистов (PLGA-ova-MDP- MPLA, PLGA-ova-MDP-Curdlan, PLGA-ova-Curdlan-MPLA) и контрольными группами животных, иммунизированных вакцинной формуляцией без агонистов (PLGA-ova) или формуляциями, содержащими какой-либо один агонист рецепторов врожденного иммунитета (PLGA-ova-MDP, PLGA-ova-MPLA, PLGA-ova-Curdlan) (р<0,05 по t критерию Стьюдента). Символом «<25» обозначено реципрокное значение титра антител меньше чем 1:25.
Ось абсцисс - реципрокный титр IgA антител к овальбумину.
Ось ординат - экспериментальные группы.
На фиг. 14
представлены результаты по определению титра IgA антител к овальбумину в кишечных лаважах мышей, иммунизированных последовательно подкожно и интраназально PLGA частицами в комбинации с различными агонистами паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета. Символом «*» обозначена статистически достоверная разница между значениями в группе животных, иммунизированных вакцинной формуляцией с добавлением индивидуальных агонистов (PLGA-ova-MDP, PLGA-ova-MPLA, PLGA-ova-Curdlan) и значениями в контрольной группе животных, иммунизированных вакцинной формуляцией без агонистов (PLGA-ova) (р<0,05 по t критерию Стьюдента). Символом «**» обозначена статистически достоверная разница между значениями в группах животных, иммунизированных вакцинными формуляциями с добавлением комбинации агонистов (PLGA-ova-MDP- MPLA, PLGA-ova-MDP-Curdlan, PLGA-ova-Curdlan-MPLA) и контрольными группами животных, иммунизированных вакцинной формуляцией без агонистов (PLGA-ova) или формуляциями, содержащими какой-либо один агонист рецепторов врожденного иммунитета (PLGA-ova-MDP, PLGA-ova-MPLA, PLGA-ova-Curdlan) (р<0,05 по t критерию Стьюдента). Символом «<25» обозначено реципрокное значение титра антител меньше чем 1:25.
Ось абсцисс - реципрокный титр IgA антител к овальбумину.
Ось ординат - экспериментальные группы.
Заявленное изобретение подтверждается примерами.
Пример 1
Получение полимерных частиц PLGA - частиц полимера молочной-ко-гликолевой кислоты различного размера
PLGA-частицы размером менее 180 нм получили по следующему протоколу:
Водный раствор очищенного антигена (5 мг/мл) смешивали с раствором полимера PLGA (2 мг/мл) в этилацетате в соотношении 1:10 с образованием эмульсии типа «вода/масло». Эмульгирование проводили с помощью источника ультразвука (30 секунд при амплитуде 45-50% и времени озвучивания/покоя 5/10 секунд). Первичную эмульсию затем приливали к внешней водной фазе, которая содержала стабилизатор поливиниловый спирт (ПВС) (4 мг/мл), и гомогенизировали с помощью источника ультразвука (1 минуту 45-50% и времени озвучивания/покоя 5/10 секунд). Реакционную смесь выдерживали на льду в течение 12 ч при непрерывном перемешивании для дальнейшего удаления растворителя и затвердевания частиц. Далее суспензию центрифугировали 1000×g в течение 10 мин. Супернатант переливали в другую пробирку и центрифугировали на скорости 2000×g в течение 30 мин. Супернатант отбирали в новую пробирку, разбавляли деионизированной водой до 40 мл и центрифугировали 16000×g 1,5 часа. Затем супернатант удаляли, а образовавшийся осадок растворяли в 5 мл mQ с помощью ультразвуковой бани. Полученную суспензию 5 раз отмывали от избыточного ПВС, путем разбавления водой и ультрацентрифугирования. Контроль размера частиц производился с помощью лазерного анализатора Malvern ZetaSizer Nano S.
PLGA-частицы размером 180-300 нм получали по следующему протоколу:
Водный раствор очищенного антигена (5 мг/мл) смешивали с раствором полимера PLGA (20 мг/мл) в этилацетате в соотношении 1:10 с образованием эмульсии типа «вода/масло». Эмульгирование проводили с помощью источника ультразвука (30 секунд при амплитуде 35-40% и времени озвучивания/покоя 5/10 секунд). Первичную эмульсию затем приливали к внешней водной фазе, которая содержала стабилизатор ПВС (4 мг/мл), и гомогенизировали на льду с помощью источника ультразвука (1 минуту 35-40% и времени озвучивания/покоя 5/10 секунд). Реакционную смесь выдерживали на льду в течение 12 ч при непрерывном перемешивании для дальнейшего удаления растворителя и затвердевания частиц. Далее суспензию центрифугировали 1000×g в течение 10 мин. Супернатант переливали в другую пробирку и центрифугировали на скорости 2000×g в течение 30 мин. Супернатант отбирали в новую пробирку, разбавляли деионизированной водой до 40 мл и центрифугировали 16000×g 1,5 часа. Затем супернатант удаляли, а образовавшийся осадок растворяли в 5 мл mQ с помощью ультразвуковой бани. Полученную суспензию 5 раз отмывали от избыточного ПВС, путем разбавления водой и ультрацентрифугирования. Итоговую суспензию лиофильно высушивали и хранили при температуре +4°С до момента использования. В день экспериментальной работы к осадку добавляли фосфатно-солевой буфер доводя концентрацию суспензии до необходимой. Контроль размера частиц в суспензии производился с помощью лазерного анализатора Malvern ZetaSizer Nano S.
PLGA-частицы размером более 300 нм получали по следующему протоколу:
Водный раствор очищенного антигена (5 мг/мл) смешивали с раствором полимера PLGA (20 мг/мл) в хлороформе в соотношении 1:10 с образованием эмульсии типа «вода/масло». Эмульгирование проводили с помощью источника ультразвука (30 секунд при амплитуде 35-40% и времени озвучивания/покоя 5/10 секунд). Первичную эмульсию затем приливали к внешней водной фазе, которая содержала стабилизатор ПВС (4 мг/мл), и гомогенизировали с помощью источника ультразвука (1 минуту 35-40% и времени озвучивания/покоя 5/10 секунд). Реакционную смесь выдерживали на льду в течение 12 ч при непрерывном перемешивании для дальнейшего удаления растворителя и затвердевания частиц. Далее суспензию центрифугировали 1000×g в течение 10 мин. Супернатант переливали в другую пробирку и центрифугировали на скорости 2000×g в течение 30 мин. Осадокресуспензировали в 5 мл mQ воды с помощью ультразвуковой бани. Полученную суспензию 5 раз отмывали от избыточного ПВС, путем разбавления водой и ультрацентрифугирования. Итоговую суспензию лиофильно высушивали и хранили при температуре +4°С до момента использования. В день экспериментальной работы к осадку добавляли фосфатно-солевой буфер доводя концентрацию суспензии до необходимой. Контроль размера частиц в суспензии производился с помощью лазерного анализатора Malvern ZetaSizer Nano S.
С использованием вышеописанных методик было получено 5 панелей частиц PLGA различного размера, содержащих следующие антигены: овальбумин, овальбумин конъюгированный с флуоресцентной молекулой рНrhodo, гемагглютинин вируса гриппа, ESAT6 Mycobacteriumtuberculosis, флагеллин сальмонеллы. Полученные частицы PLGA в дальнейшем были охарактеризованы по количеству инкорпорированного белка и по остаточному количеству ПВС.
Пример 2
Характеристики полученных частиц
Для того, чтобы оценить количество антигена, упакованного в PLGA-частицы, лиофилизат (полученный в примере 1) разводили лизирующим агентом (0,1М NaOH) до концентрации 6 мг/мл и инкубировали при 37°С на шейкере в течение 12 ч. Для количественной оценки белка использовали коммерческий набор Bicinchroninic Acid Protein Assay (AppliChem).
2
4
2
2
Затем, в соответствии с рекомендациями производителя, последовательно вносили в каждую лунку 96-луночного планшета 75 мкл реагента А (тартрат в алкалиновом карбонатном буфере), 72 мкл реагента В (4% бицинхининовая кислота в HO), 3 мкл регента С (4% CuSO*5HO в HO) и 150 мкл анализируемого образца или антигена с известной концентрацией (для построения калибровочной кривой). В качестве референсного препарата использовали серию разведений белка овальбумина в 0,1М NaOH. Затем планшет инкубировали в течение 2 ч на орбитальном шейкере при 300 об/мин, +37°С. Оптическую плотность раствора оценивали с использованием спектрофотометра Biotek Synergy Н4 при длине волны 562 нм. Затем строили калибровочную кривую по которой определяли концентрацию белка в образце.
Контроль размера частиц в суспензии производился с помощью лазерного анализатора Malvern ZetaSizer Nano S.
Определение количества PLGA-частиц в полученных препаратах проводили с помощью лазерного анализатора Malvern NanosightNS300.
Результаты представлены в таблице 1.
Перед использованием все PLGA частицы были нормализованы по количеству белка (антигена).
Пример 3
Определение влияния размеров частиц PLGA на фагоцитарный захват PLGA дендритными клетками
Дендритные клетки являются одним из важнейших модуляторов иммунной системы. Они способны инициировать, поддерживать и регулировать развитие целого спектра иммунных реакций. При этом одним из ключевых событий, определяющих дальнейшее развитие иммунного ответа, является эффективность фагоцитоза антигена дендритными клетками, в процессе которого поглощенный антиген расщепляется в кислой среде фагосомы и презентируется на поверхность клетки в виде пептидов.
Для оценки фагоцитоза PLGA дендритными клетками были использованы частицы PLGA содержащие овальбумин, маркированный рН-чувствительным красителем pHrodoRed: PLGA-ova-pHRhodo-1 (<180 нм), PLGA-ova-pHRhodo-2(180-300 нм), PLGA-ova-pHRhodo-3(>300 нм). Данный краситель при нейтральном рН не является флуоресцентным, но при рН<7 способен способен проявлять флуоресцентные свойства. Это свойство позволяет использовать его как специфический индикатор закисления фагосомы после фагоцитоза, что помогает надежно различать интернализованные частицы от частиц, связавшихся с клеткой на ее поверхности.
2
5
Дендритные клетки, необходимые для эксперимента, были дифференцированы из пролиферирующих предшественников полученных из костного мозга мышей C57BL/6, с помощью добавления в культуральную среду гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) (R & D Systems, США) в концентрации 20 нг/мл в течение 6 дней. Клетки культивировали при 37°С, 5% CO в 24-луночных планшетах, содержащих 5×10 клеток/мл в 1 мл полной среды RPMI с 10% инактивированной эмбриональной бычьей сыворотки, 0,1875% бикарбоната натрия, 0,05 мМ меркаптоэтанола (Thermo Fisher Scientific, США), 20 нг / мл GM-CSF. Затем к дендритным клеткам добавили частицы PLGA различного размера из расчета по 10 мкг белка на лунку. Общая схема проведения эксперимента представлена на фиг. 1. Частицы каждого размера добавляли в три лунки, в качестве контроля добавляли фосфатный буфер. Результаты оценивали через 4 часа путем измерения флуоресценции (поглощение - 560 нм, испускание - 585 нм). Полученные данные представлены на фиг. 2. Результаты определенной интенсивности флуоресценции pHrodored (ось абсцисс) в разных группах, свидетельствуют о том, что эффективность фагоцитоза частиц меньшего размера (<180 нм) достоверно выше эффективности фагоцитоза частиц больших размеров. Таким образом, можно сделать вывод, что инкорпорирование антигена в частицы PLGA размером менее 180 нм позволит достичь более высоких уровней фагоцитоза вакцинных частиц.
Пример 4
Выбор схемы иммунизации животных
На следующем этапе работы был проведен подбор схемы иммунизации, наиболее оптимальной для индукции мукозального иммунного ответа. Для этого было опробовано две различные схемы иммунизации: первая предполагала две последовательные подкожные иммунизации, а вторая схема - последовательные подкожную и интраназальную иммунизацию. Схема эксперимента представлена на фиг. 3А и 3В. На фиг. 3А отображена схема эксперимента с экспериментальными группами 1.1, 1.2, 2.1, 2.2, а на фиг. 3В - 3.1, 3.2, 4.1, 4.2. В качестве модельного антигена был выбран белок овальбумин, как наиболее полно изученный и имеющий большое количество Т и В клеточных эпитопов.
Таким образом, были составлены следующие экспериментальные группы животных (по 10 животных на группу):
1.1 - PLGA-ova-1<180 нм подкожно, PLGA-ova-1<180 нм подкожно;
1.2 - PLGA-ova-1<180 нм подкожно, PLGA-ova-1<180 нм интраназально;
2.1 - PLGA-ova-2 180-300 нм подкожно, PLGA-ova-2 180-300 нм подкожно;
2.2 - PLGA-ova-2 180-300 нм подкожно, PLGA-ova-2 180-300 нм интраназально;
3.1 - PLGA-ova-3>300 нм подкожно, PLGA-ova-3>300 нм подкожно;
3.2 - PLGA-ova-3>300 нм подкожно, PLGA-ova-3>300 нм интраназально;
4.1 - PBS подкожно, PBS подкожно (отрицательный контроль);
4.2 - PBS подкожно, PBS интраназально (отрицательный контроль).
2
Сухие частицы PLGA разводили фосфатным буфером до необходимого объема и вводили животным в дозах из расчета 10 мг белка/мышь. Объем одной дозы для подкожного введения составил 100 мкл, для интраназального - 20 мкл. Через 14 дней после последней иммунизации осуществляли эвтаназию животных CO, после чего проводили бронхоальвеолярный и кишечный лаваж, а также проводили отбор крови из хвостовой вены. Технология проведения бронхоальвеолярного лаважа включала в себя введение катетера в трахею и 4-кратную промывку 0,8 мл фосфатного буфера, содержащего ингибиторы протеаз (согласно протоколу производителя, Sigma-Aldrich, ФРГ) и 10 мМ азид натрия (ПанЭко, Россия). После этого, промывочную жидкость центрифугировали на скорости 800×g, при +4°С. Надосадочную жидкость использовали для определения титра IgA антител методом иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты эксперимента представлены на фиг. 4. Как видно из представленных данных, IgA антитела к овальбумину в респираторном тракте были обнаружены только после последовательной подкожной и интраназальной иммунизации. При этом введение частиц PLGA размером менее 180 нм приводило к максимальным значениям титров IgA антител, статистических достоверно отличающихся от значений в других группах (*, р<0,05 по t критерию Стьюдента).
Технология проведения кишечного лаважа включала в себя вскрытие животного, введение шприца в кишечник и промывку содержимого кишечника фосфатным буфером, содержащим ингибиторы протеаз (согласно протоколу производителя, Sigma-Aldrich, ФРГ) и 10 мМ азид натрия (ПанЭко, Россия). После этого, промывочную жидкость центрифугировали на скорости 800×g, при +4°С. Надосадочную жидкость использовали для определения титра IgA антител методом иммуноферментного анализа. Полученные данные представлены на фиг. 5. Как видно из результатов эксперимента IgA антитела к овальбумину в кишечных смывах были обнаружены только после двукратной подкожной иммунизации. При этом введение частиц PLGA размером менее 180 нм приводило к максимальным значениям титров IgA антител, статистических достоверно отличающихся от значений в других группах (*, р<0,05 по t критерию Стьюдента).
Из полученной крови приготавливали сывороку. Для этого образцы крови каждой мыши помещали в центрифужных пробирках в термостат при +37°С на 20 минут. Далее кровь подвергали центрифугированию при 1500об./мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость (сывороку) использовали для определения титра IgG антител методом иммуноферментного анализа. Полученные данные представлены на фиг. 6. Как видно из результатов эксперимента наибольшие (статистически достоверно отличающиеся) титры IgG антитела к овальбумину в крови мышей были обнаружены в группах иммунизированных вакцинными частицами PLGA размером меньше 180 нм. При этом, для формирования IgG антител в сыворотки крови антител выбор схемы иммунизации мышей: подкожно-подкожно или подкожно-интраназально (группы 1.1. и 1.2.) не имел значения.
Таким образом, результаты проведенных экспериментов показали, что размер PLGA частиц имеет критическое значение для формирования мукозального IgA, но не центрального IgG иммунитета. Максимальное повышение уровня IgA антител как в респираторном, так и в кишечном тракте было обнаружено только при введении PLGA частиц размером менее 180 нм. Значения титров антител были достоверно выше значений в других опытных группах.
Кроме того, было показано, что при изменении схемы иммунизации возможно сдвинуть фокус формирования мукозального иммунитета с одного типа слизистой на другой. Так, например, двукратная подкожная иммунизация частицами PLGA приводит к индукции IgA антител в кишечнике, тогда как последовательная подкожная и интраназальная иммунизация стимулирует мукозальный иммунный ответ в респираторном тракте.
Пример 5
Получение кандидатной вакцины на основе частиц PLGA против гриппа
Для данного эксперимента была получена панель частиц PLGA различного размера, с инкапсулированным гемагглютинином вируса гриппа H1N1/California/2009 (метод получения частиц описан в примере 1).
Мыши линии Balb/c самки весом 18 г были случайным образом распределены на 4 группы по 20 голов. Были сформированы следующие группы животных:
Группа №1 PLGA-HA-1 <180 нм.
Группа №2PLGA-HA-2 180-300 нм.
Группа №3PLGA-HA-3 >300 нм.
Группа №4фосфатно-солевой буфер (ФСБ).
Частицы различных размеров были нормализованы по содержанию антигена, дозана одно животное составила 1 мкг. Объем одной дозы для подкожного введения составил 100 мкл, для интраназального - 20 мкл. Животные были иммунизированы PLGA частицами двукратно (внутримышечно, а затем интраназально) с интервалом 14 дней. Через 2 недели после последней иммунизации у 10 животных в каждой группе определяли титр IgA антител в бронхоальвеолярных лаважах. Бронхоальвеолярный лаваж проводили согласно методике, описанной в примере 3. Титр IgA антител к гемагглютинину определяли методом иммуноферментного анализа. Результаты представлены на фиг. 7. Оставшихся 10 животных в каждой группы заражали вирусом гриппа H1N1/California/2009, в дозе 50LD50, после чего в течение 15 дней оценивали их выживаемость. Результаты представлены на фиг. 8.
Согласно полученным результатам эксперимента, только введение PLGA частиц размером менее 180 нм приводило к достоверной защите животных от гриппозной инфекции. При введении частиц других размеров выживаемость животных достоверно не отличалась от контрольной группы. Полученные данные коррелируют с результатами оценки титра IgA антител в респираторном тракте, согласно которым максимальное повышение титра IgA антител к гемагглютинину вируса гриппа было обнаружено в группе животных, которым вводили частицы PLGA размером менее 180 нм. Определенные значения титра IgA антител в этой группе статистически достоверно отличались от значений титров антител в других группах животных.
Таким образом, результаты данного эксперимента показывают, что размер частиц имеет решающее значение для формирования эффективного протективного иммунитета против патогена вирусной природы (вирус гриппа).
Пример 6
Получение кандидатной вакцины на основе частиц PLGA против туберкулеза
Для данного эксперимента использовали мышей линии Balb/c, самок, массой 18 г по 20 животных на группу. Иммунизацию проводили панелью частиц PLGA с инкорпорированным белком ESAT6-антигеном M.tuberculosis (получение данных частиц описано в примере 1). Частицы различных размеров были нормализованы по содержанию антигена, концентрация в каждой дозе вводимой животному составила 10 мкг. Объем одной дозы для подкожного введения составил 100 мкл, для интраназального - 20 мкл. Животных иммунизировали дважды: подкожно, а затем, через 14 дней интраназально. Доза из расчета вводимого антигена составила1-мкг/мышь. Через 14 дней после последней иммунизации у 10 животных из каждой группы проводили отбор бронхоальвеолярного лаважа, в котором определяли титр IgA антител. Методика проведения бронхоальвеолярного лаважа описана в примере 4. Результаты эксперимента представлены на фиг. 9. Оставшихся 10 животных внутрилегочно заражали Mycobacteriumtuberculosis в дозе 100 КОЕ. Через 8 недель после заражения определялимикробную нагрузку в легких (титры Mycobacteriumtuberculosis) методом высева на твердые питательные среды. Результаты эксперимента представлены на фиг. 10.
Согласно полученным результатам эксперимента, только введение PLGA частиц размером менее 180 нм приводило к достоверному снижению титров Mycobacteriumtuberculosis в легких животных. При введении частиц других размеров титры Mycobacteriumtuberculosis достоверно не отличалась от контрольной группы. Полученные данные коррелируют с результатами оценки титра IgA антител в респираторном тракте, согласно которым максимальное повышение титра IgA антител к ESAT6 Mycobacteriumtuberculosis было обнаружено в группе животных, которым вводили частицы PLGA размером менее 180 нм. Определенные значения титра IgA антител в этой группе статистически достоверно отличались от значений титров антител в других группах животных.
Таким образом, результаты данного эксперимента показывают, что размер частиц имеет решающее значение для формирования эффективного протективного иммунитета против бактерии, использующей в качестве ворот инфекции слизистые респираторного тракта.
Пример 7
Получение кандидатной вакцины на основе частиц PLGA против сальмонеллеза
Для данного эксперимента была получена панель частиц PLGA различного размера, с инкапсулированным белком флагеллином (метод получения частиц описан в примере 1). Частицы различных размеров были нормализованы по содержанию антигена. Количество антигена в каждой дозе вводимой животному составило 10 мкг. Объем одной дозы для подкожного введения составил 100 мкл.
Мыши линии Balb/c самки весом 18 г были случайным образом распределены на 4 группы по 20 шт. Животные были иммунизированы PLGA частицами двукратно подкожно с интервалом 14 дней.
Группа №1 PLGA-FI-1 <180 нм.
Группа №2 PLGA-FI-2 180-300 нм.
Группа №3 PLGA-FI-3 >300 нм.
Группа №4 PBS.
Через 2 недели после последней иммунизации у 10 животных в каждой группе отбирали кишечные лаважи в которых определяли титр IgA антител. Кишечный лаваж проводили согласно методике, описанной в примере 4. Титр IgA антител к флагеллину определяли методом иммуноферментного анализа. Результаты представлены на фиг. 11. Остальных животных(по 10 животных из каждой группы) заражали 20LD50 Salmonellaentericaserovartyphimurium, после чего в течение 30 дней оценивали их выживаемость. Результаты представлены на фиг. 12.
Согласно полученным результатам эксперимента, только введение PLGA частиц размером менее 180 нм приводило к достоверной защите животных от сальмонелезной инфекции. При введении частиц других размеров выживаемость животных достоверно не отличалась от контрольной группы. Полученные данные коррелируют с результатами оценки титра IgA антител в кишечном тракте, согласно которым максимальное повышение титра IgA антител к флагеллину Salmonellaentericaserovartyphimurium было обнаружено в группе животных, которым вводили частицы PLGA размером менее 180 нм. Определенные значения титра IgA антител в этой группе статистически достоверно отличались от значений титров антител в других группах животных.
Таким образом, результаты данного эксперимента показывают, что размер частиц имеет решающее значение для формирования эффективного протективного иммунитета против бактерии, использующей в качестве ворот инфекции слизистые кишечного тракта.
Пример 8
Использование агонистов паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета в составе фармацевтической композиции для дополнительной индукции мукозального иммунитета респираторного тракта
Повышение иммуногенности и эффективности разработанной авторами фармацевтической композиции достигается с помощью инкапсулирования внутрь частиц PLGA агонистов паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета. Агонист или сочетание агонистов рецепторов врожденного иммунитета выбрано из агонистов Toll-подобных рецепторов и/или агонистов NOD рецепторов и/или агонистов лектинов С-типа.
Известно, что первичным событием, определяющим развитие большинства иммунных реакций организма, является взаимодействие паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета с собственными агонистами. Было установлено, что эти рецепторы, в отличие от Т- и В-клеточных рецепторов адаптивного иммунитета, узнают не уникальные эпитопы антигенов, а определенные высококонсервативные молекулярные структуры, находящиеся в составе микроорганизмов. Сегодня идентифицировано несколько классов паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета: мембраносвязанные Toll-подобные рецепторы (TLR) и лектиновые рецепторы С-типа (CLR), цитозольные RIG-подобные (RLR) и NOD-подобные (NLR), а также секретирующиеся во внеклеточную среду пентраксины, коллектины, фикколины и др.
Авторами патента в предыдущих экспериментах было установлено, что при добавление агониста или сочетания агонистов паттерн-распознающих рецепторов различных классов, вызывает значительное повышение иммунных реакций.
Для того, чтобы оценить возможность использования агонистов паттерн-распознающих рецепторов и их комбинаций были получены частицы PLGA размером менее 180 нм, содержащие модельный антиген овальбумин (ova) и различные комбинации агонистов Тоll-подобного рецептора - липид A (MPLA), NOD-подобного рецептора - мурамилдипептид (MDP) и лектинового рецептора С-типа - бета-1,3-гликан (Curdlan).
1) PLGA-ova.
2) PLGA-ova-MDP.
3) PLGA-ova-MPLA.
4) PLGA-ova-Curdlan.
5) PLGA-ova-MDP-MPLA.
6) PLGA-ova-MDP-Curdlan.
7) PLGA-ova-Curdlan-MPLA.
8) PBS.
2
Мыши линии Balb/c самки 18 г были двукратнопоследовательно иммунизированы (подкожно, а затем интраназально) полученными частицами PLGA с интервалом в 14 дней. Объем одной дозы для подкожного введения составил 100 мкл, для интраназального - 20 мкл. Доза рассчитывалась исходя из количества антигена - 10 мкг/животное. Через 14 дней после последней иммунизации осуществляли эвтаназию животных CO, после чего проводили бронхоальвеолярный лаваж. Методика проведения лаважа описана в примере 4. Полученный смыв использовали для определения титра IgA антител к овальбумину методом иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты эксперимента представлены на фиг. 13.
Как видно из представленных данных, добавление агонистов паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета усиливало реакции мукозального иммунитета респираторного тракта. Однако, потенцирование иммунного ответа (многократное увеличение титра IgА антител) наблюдалось при использовании комбинации из нескольких агонистов паттерн-распознающих рецепторов (при совместной стимуляции TLR и NLR, TLR и CLR, CLR и NLR). Специалисту среднего уровня должно быть очевидно, что данные агонисты паттерн-распознающих рецепторов могут быть заменены в фармацевтической композиции любыми другими агонистами соответствующих рецепторов.
Пример 9
Использование агонистов паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета в составе фармацевтической композиции для дополнительной индукции мукозального иммунитета кишечного тракта
Иммуногенность и эффективность разработанной авторами фармацевтическая композиция повышается с помощью инкапсулирования внутрь PLGA частиц дополнительно к антигену агонистов паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета. В предыдущих экспериментах (пример 8) было обнаружено, что по сравнению с частицами PLGA содержащими только лишь модельный антиген (овальбумин) введение в состав частицы агонистов паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета статистически достоверно повышает мукозальные иммунные реакций в респираторном тракте. Целью данной работы было определение способности вышеперечисленных комбинаций агонистов рецепторов врожденного имуннитета, усиливать иммунные реакции в кишечном тракте. Для этого были получены частицы PLGA размером менее 180 нм, содержащие модельный антиген овальбумин и различные агонисты TLR (MPLA), NLR(MDP) и CLR (Curdlan) и их комбинации.
1) PLGA-ova.
2) PLGA-ova-MDP.
3) PLGA-ova-MPLA.
4) PLGA-ova-Curdlan.
5) PLGA-ova-MDP-MPLA.
6) PLGA-ova-MDP-Curdlan.
7) PLGA-ova-Curdlan-MPLA.
8) PBS.
2
Мыши линии Balb/c самки 18 г были двукратно подкожно иммунизированы полученными частицами PLGA с интервалом в 14 дней. Объем одной дозы для подкожного введения составил 100 мкл. Доза рассчитывалась исходя из количества антигена - 10 мкг/животное. Через 14 дней после последней иммунизации осуществляли эвтаназию животных CO, после чего проводили кишечный лаваж. Методика проведения лаважа описана в примере 4. Полученный смыв использовали для определения титра IgA антител к овальбумину методом иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты эксперимента представлены на фиг. 14.
Как видно из представленных данных, добавление агонистов усиливало реакции мукозального иммунитета кишечного тракта. Однако, потенцирование иммунного ответа (многократное увеличение титра IgA антител) наблюдалось при использовании комбинации из нескольких агонистов паттерн-распознающих рецепторов (при совместной стимуляции TLR и NLR, TLR и CLR, CLR и NLR). Специалисту среднего уровня должно быть очевидно, что данные агонисты паттерн-распознающих рецепторов могут быть заменены в фармацевтической композиции любыми другими агонистами соответствующих рецепторов.
Поставленная задача, а именно: разработка эффективного средства специфической профилактики, позволяющего индуцировать мукозо-ориентированные иммунные реакции, решена в данном изобретении. Все приведенные примеры подтверждают выполнение поставленной задачи.
Промышленная применимость также подтверждается приведенными в описании примерами.
Перечень сокращений
КОЕ - колониеобразующая единица,
CD - кластер дифференцировки,
CLR - Лектиновый рецептор С типа,
2
CO - углекислый газ,
FI - флагеллин,
GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор,
IgA - иммуноглобулины класса А,
IgG - иммуноглобулины класса А,
LD - летальная доза,
MDP - мурамилдипептид,
NLR - НОД-подобный рецетпор,
ova - овальбумин,
рН - водородный показатель,
PLGA - поли(молочная-ко-гликолиевая) кислота,
TLR - Толл-подобные рецептор,
ТМС - N-триметилхитозан.