СПОСОБ ОЦЕНКИ УРОВНЯ ГИСТАМИНА В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ЭНДОМЕТРИЯ МАТКИ КРЫС В ПРОЦЕССЕ ПОЛОВОГО ЦИКЛА
METHOD OF HYSTAMINE RATE ASSESSMENT IN EPITHELIAL CELLS OF RATS ENDOMETRIUM WITHIN SEX CYCLE

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологии и гистохимии.
Покровные и железистые эпителиоциты эндометрия матки содержат гистамин (Гунин А.Г. Локализация гистамина в структурах матки. // Архив АГЭ. - 1988. - №12. - С.66-68), который занимает одно из ведущих мест в регуляции процессов жизнедеятельности организма. Он является тканевым гормоном и медиатором, стимулятором и ингибитором внутриклеточного и тканевого метаболизма (Вайсфельд И.Л., Кассиль Г.Н. Гистамин в биохимии и физиологии. - М.: Наука, 1981). В последние годы существенно расширилось представление о важной роли гистамина в реализации репродуктивной функции женщин, в частности установлено его участие в регуляции процессов оплодотворения и имплантации (Циркин В.И., Хлыбова С.В. Роль гистамина в репродукции. // Вятский медицинский вестник. - 2006. - №3-4). Установлено, что гистамин участвует в стимулированной эстрогенами пролиферации эпителиоцитов эндометрия (Вайсфельд И.Л., Кассиль Г.Н., 1981; Гунин А.Г. Эстроген-индуцированный гистогенез в матке при эндокринном дисбалансе. Авторефер. дис.… д-ра мед. наук. - М., 1996). Имеются данные (Zhao X. et al. Blastocyst H(2) receptor is the target for uterine histamine in implantation in the mouse // Development. - 2000. - Vol.127, №12. - P.2643-2651), что эпителиоциты эндометрия могут быть источником гистамина. Нашими исследованиями установлено наличие этого биоамина в содержимом полости матки (Диндяев С.В., Виноградов С.Ю. Биоаминпозитивные структуры матки крыс в процессе полового цикла. // Вестник Ивановской медицинской академии. - 2006. - Т.11, №3-4. - С.25-30). В связи с вышеизложенным определение уровня гистамина в эпителиальных клетках имеет важное клиническое значение.
Одним из распространенных способов гистохимического выявления гистамина является метод Кросса-Эвена-Роста с ортофталевым альдегидом (Cross S.W.D. et al. A study of the methods available for the cytochemical localization of histamine by fluorescence induced with o-phthalaldehyde or acetaldehyde // Histochem. J. - 1971. - Vol.3. - P.471-476).
Забор материала для флуоресцентно-гистохимического исследования уровня гистамина в структурах эндометрия экспериментальных животных осуществляется после их умерщвления (Гунин А.Г. Влияние эстрадиола на распределение гистамина в структурах матки крыс в норме и при экспериментальном введении гормона. // Проблемы эндокринологии. - 1991. - Т.37, №4. - С.49-51). Дальнейший процесс исследования включает следующие этапы:
1. Изготовление криостатных срезов и монтирование их на покровных стеклах.
2. Выдерживание срезов в парах ортофталевого альдегида в термостате при 100°С в течение 10 секунд. Стеклянный сосуд, содержащий ортофталевый альдегид и плотно закрытый крышкой, предварительно выдерживается в термостате в течение 10 минут.
3. Помещение срезов во влажную камеру (предварительно прогретый в течение 10 минут сосуд, содержащий на дне воду) в термостате при 100°С в течение 1 минуты.
4. Высушивание срезов в термостате с температурным режимом 70-80°С в течение 5 минут.
5. Изучение полученных препаратов под люминесцентным микроскопом. По условиям этой реакции наибольшая концентрация гистамина дает желтое свечение при длине волны 515 нм (Сергеева В.Е. Люминесцентно-гистохимические методы и флуориметрия в морфологических исследованиях. - Чебоксары, 1985. - Деп. в ВИНИТИ. - №6358-85).
Для окончательной идентификации и количественного выражения уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия препарат подвергается цитоспектрофлуориметрии при помощи фотометрической люминесцентной электронной насадки ФМЭЛ-1А для определения в условных единицах регистрирующего прибора концентрации гистамина в биологических структурах. Для определения интенсивности люминесценции гистамина в исследуемых объектах по традиционной методике используется интерференционный светофильтр №7 фотометрической люминесцентной насадки ФМЭЛ-1А (максимальная длина пропускаемой волны 503±14 нм). Световой поток люминесценции от изучаемого участка поля зрения отсекается автоматически аппаратным зондом и преобразуется ФЭУ в силу тока, которая вызывает отклонение стрелки стандартного измерительного прибора, что пропорционально концентрации гистамина под зондом.
К недостаткам указанного способа определения уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия матки можно отнести:
1) негуманность и финансовую затратность, связанные с умерщвлением животного,
2) необходимость наличия криостата.
Технический результат предлагаемого нами способа заключается в том, что в каждую фазу полового цикла определяют содержание гистамина в содержимом влагалища экспериментального животного, сравнивают его с уровнем гистамина, составляющим в стадии раннего эструса 0,50±0,07, позднего эструса - 0,34±0,04, метаэструса 0,68±0,08, раннего диэструса - 0,72±0,12, позднего диэструса - 0,75±0,13, проэструса - 0,87±0,11 усл.ед. регистрирующего прибора, и при значениях содержания гистамина ниже расчетных оценивают уровень гистамина в эпителиальных клетках эндометрия как сниженный, а при значениях выше - как повышенный.
Описание сущности предлагаемого способа
Каждую фазу на протяжении полового цикла в утреннее время (в 9.00) с помощью металлической петли осуществляется забор влагалищного содержимого крысы. Полученное содержимое размазывается на 2 предметных стеклах (мазок №1 и мазок №2).
Последовательность дальнейшего приготовления препаратов
1. Выдерживание мазка №1 в стеклянном сосуде с парами ортофталевого альдегида, а мазка №2 в аналогичном сосуде без ортофталевого альдегида в термостате при 100°С в течение 10 секунд.
2. Помещение мазков в раздельные влажные камеры, предварительно прогретые в течение 10 минут, в термостате при 100°С в течение 1 минуты.
3. Высушивание мазков в термостате с температурным режимом 70-80°С в течение 5 минут.
Изучение полученных препаратов осуществляется под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ-2А. С помощью интерференционного светофильтра №7 фотометрической люминесцентной насадки ФМЭЛ-1А определяются средние уровни специфической люминесценции мазка №1 (величина А) и аутолюминесценции мазка №2 (величина В) в условных единицах регистрирующего прибора.
Концентрация гистамина в содержимом влагалища определяется по разнице величин А и В. Результаты представлены в таблице 1.
У этих же крыс во время эфирного наркоза извлекалась матка, из тела которой изготавливались криостатные срезы. Полученные криостатные срезы обрабатывались в соответствии с методом Кросса-Эвена-Роста. Микроспектрофлуориметрически в покровных и железистых эпителиоцитах эндометрия определена средняя концентрация гистамина в каждую фазу полового цикла (таблица 2).
В результате рангового корреляционного анализа Спирмена установлена высокая положительная сопряженность (R=0,829) изменений концентраций гистамина в содержимом влагалища с колебаниями концентрации этого биоамина в покровных и железистых эпителиоцитах эндометрия.
Ниже приводятся 2 примера определения уровня гистамина в эпителиоцитах эндометрия по результатам исследования влагалищных мазков.
Пример 1
Крыса №1
Поля зрения
ранний эструс
поздний эструс
метаэструс
ранний диэструс
поздний диэструс
проэструс
1
0,40
0,35
0,70
0,75
0,80
1,10
2
0,55
0,35
0,60
0,85
0,70
0,80
3
0,45
0,40
0,65
0,75
0,65
0,80
4
0,40
0,35
0,55
0,65
0,70
0,75
5
0,55
0,30
0,60
0,60
0,60
0,85
6
0,55
0,30
0,70
0,60
0,80
0,80
7
0,55
0,25
0,65
0,80
0,80
0,80
8
0,45
0,35
0,60
0,80
0,80
0,80
9
0,60
0,30
0,75
0,60
0,60
1,00
10
0,50
0,30
0,70
0,80
0,70
0,85
Средняя концентрация
0,500±0,0671
0,325±
0,650±
0,72±
0,715±
0,855±
0,0403
0,0592
0,0923
0,0776
0,1036
Сравнение полученных результатов с данными, представленными в таблице 1, показывает их сходство, что позволяет оценивать уровень гистамина в эпителиоцитах эндометрия матки крысы №1 как соответствующий его нормальному содержанию в течение полового цикла.
Пример 2
Крыса №2
Поля зрения
ранний эструс
поздний эструс
метаэструс
ранний диэструс
поздний диэструс
проэструс
1
0,60
0,50
0,90
1,05
0,95
1,10
2
0,75
0,50
0,80
0,85
1,00
1,00
3
0,65
0,60
0,85
1,00
1,00
1,20
4
0,60
0,50
0,80
0,95
0,95
1,10
5
0,55
0,30
0,60
0,60
0,60
0,85
6
0,75
0,50
0,80
0,90
1,00
1,20
7
0,75
0,65
0,75
0,80
0,80
0,90
8
0,65
0,55
0,85
0,80
0,80
1,00
9
0,60
0,50
0,90
0,90
1,00
1,00
10
0,70
0,50
0,90
1,10
1,05
1,00
Средняя концентрация
0,680±0,064
0,530±
0,825±
0,925±
0,945±
1,050±
0,051
0,064
0,096
0,082
0,092
Результаты этого исследования показывают во все стадии полового цикла большее содержание гистамина в содержимом влагалища по сравнению с контрольными данными.
Таблица 1
Содержание гистаминов в мазках содержимого влагалища крыс в различные фазы полового цикла (в усл.ед.)
ранний эструс
поздний эструс
метаэструс
ранний диэструс
поздний диэструс
проэструс
Гистамин
0,507±0,069
0,341±0,036
0,683±0,080
0,722±0,121
0,749±0,130
0,865±0,114
Таблица 2
Содержание гистамина в эпителиоцитах эндометрия тела матки крыс в различные фазы полового цикла (в усл.ед.)
ранний эструс
поздний эструс
метаэструс
ранний диэструс
поздний диэструс
проэструс
ЭП
3,198±0,47
2,765±0,36
2,710±0,42
3,672±0,45
6,060±0,44
6,945±0,94
ЭЖ
3,348±0,48
3,058±0,33
2,945±0,41
3,769±0,92
5,963±0,60
7,616±0,77
ЭП - эпителиоциты покровные, ЭЖ - эпителиоциты железистые