Способ идентификации холерных вибрионов O1 серогруппы биоваров Classical и El Tor
METHOD FOR IDENTIFICATION OF CHOLERA VIBRIO O1 SEROGROUPS OF BIOVARS CLASSICAL AND EL TOR

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике и может быть использовано для разработки новых диагностических препаратов позволяющих идентифицировать холерные штаммы O1 серогруппы биоваров Classical и El Tor.
В настоящее время актуальной остается проблема обнаружения, при ежегодных мониторинговых исследованиях холеры, на фоне эпизодических выделений единичных токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1 биовара El Tor из объектов окружающей среды и от человека (заносы), в связи с этим большое значение придают лабораторной диагностике возбудителя холеры, и в частности фагодиагностике.
Известны холерные бактериофаги (1), которые используются для идентификации и фаготипирования холерных вибрионов. Однако поиск новых методов в бактериологической диагностике холеры остается значимым, и в первую очередь связан с необходимостью выделять специфические свойства микроорганизма простым и достоверным способом.
8
Известен способ обнаружения микроорганизма вида Vibrio parahaemolyticus (2), включающий использование индикаторного штамма Vibrio parahaemolyticus КМ-97, из которого готовят диагностический фаг путем смешивания 1,0 мл фага ФК-44 и 1,0 мл фага ФК-46 в соотношении 1:1, в титре n⋅10 БОЕ/мл, после этого проводят посев исследуемого штамма на газон культуры и наносят каплю полученного диагностического препарата фага в центр чашки, посевы выдерживают при температуре 37°С в течение 20-24 часов и по наличию лизиса фагом исследуемого штамма подтверждают принадлежность микроорганизма к виду Vibrio parahaemolyticus.
Однако этот метод не может быть применен для обнаружения бактерий вида Vibrio cholerae, так как препарат эффективен только в отношении штамма Vibrio parahaemolyticus. Важной особенностью бактериофага является то, что он строго специфичен. Из этого следует, что парагемолитический бактериофаг не может лизировать возбудителя холеры.
8
Известен способ идентификации Yersinia enterocolitica (3), заключающийся в том, что применяют кишечноиерсинеозный фаг ФК-100, который наносят в виде дорожки на двухслойный газон, нижний слой которого представляет собой агаровую среду (рН 7,1) с добавлением ампицелина в концентрации 50 мкг/мл, а верхний получают из исследуемого штамма, который выращивают на 1,5% агаре Хоттингера при 28°С в течение суток засевают в 4,5 мл бульона Хоттингера, сутки инкубируют при 28°С до конечной концентрации n⋅10 м.к./мл, затем из полученной культуры берут 0,3 мл и смешивают с 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°С 0,7% агара Хоттингера с 50 мкг/мл ампициллина и выливают вторым слоем на пластинки агара (рН 7,1), после этого посев инкубируют и проводят идентификацию по наличию зоны фаголизиса.
Недостатком способа является невозможность его применения для диагностики холеры, так как фаг ФК-100 лизирует возбудителя иерсинеоза - Y. enterocolitica, холерные вибрионы могут лизировать только холерные фаги.
Таким образом, фагодиагностика, используемая в известном способе, заключается в применении определенного ФК-100 фага, чувствительного к Y. enterocolitica.
Техническая задача предполагаемого изобретения состояла в изыскании штамма холерного бактериофага, позволяющего с высокой степенью достоверности проводить идентификацию холерных вибрионов O1 серогруппы биоваров Classical и El Tor.
Поставленная задача достигается тем, что в способе идентификации холерных вибрионов O1 серогрупп биоваров Classical и EL Tor включающем использование лизабельности микроба диагностическим фагом на агаровой среде, применяют штамм бактериофага Rostov-6, который наносят в виде дорожки на поверхность чашки Петри, заполненной предварительно подготовленным раствором, состоящим из исследуемой культуры, которую вносят в бульон Мартена объемом 4,5 мл рН 7,7, оставляют в термостате на 4 часа при температуре 37°С, затем из этой смеси берут 0,1 мл и вносят в 4,5 мл 0,7% растопленного и охлажденного до 45°С агара Мартена, смесь в пробирке перемешивают круговыми движениями и быстро выливают на поверхность чашки Петри с 1,5% раствором агара, равномерно распределяют его по поверхности, после подсыхания на последнюю наносят каплей препарат бактериофага Rostov-6, посев инкубируют в термостате при температуре 37°С, в течение 24 часов, проводят идентификацию на выросшей культуре, по наличию зоны фаголизиса, которая подтверждает присутствие холерных вибрионов O1 серогрупп биоваров Classical и EL Tor или их отсутствие.
Для осуществления способа используют бактериофаг Rostov-6, штамм которого хранится в коллекции-депозитарии фагов ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.
Бактериофаг Rostov-6 г был выделен из окружающей среды в качестве компонента водных экосистем. Чистая линия фага Rostov-6 была получена путем многократного пассирования негативных колоний на штамме Vibrio cholerae 19546.
Бактериофаг относится к III морфологической группе по А.С. Тихоненко (1968 г.) и типу С семейства Podoviridae. Данный фаг имеет многогранную головку размером 45,3×51,0 нм и короткий несократимый отросток размером 11,0 нм (см. чертеж).
Геном Vibrio phage Rostov-6 доступен в международной базе GenBank (NCBI) под номером МН105773.
Способ осуществляют на штаммах Vibrio cholerae O1 биовара El Tor и Classical.
Пример 1.
Лизис бактериофагом Rostov-6 штаммов №437, №1123, №11093, и индикаторный (контрольный штамм) №19546. Опытные штаммы относятся к штаммам O1 серогруппы биовара Classical. Культуры были взяты из коллекции музея ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.
Исследуемую культуру бактериологической петлей вносят в пробирку с бульоном Мартена (рН 7,7) объемом 4,5 мл и ставят в термостат на 4 часа при 37°С. Затем 0,5 мл полученной смеси, переносят в пробирку с 4,5 мл 0,7% растопленного и охлажденного до 45°С агара Мартена.
После этого смесь в пробирке перемешивают круговыми движениями и быстро выливают на поверхность чашки Петри с 1,5% агаром Мартена и равномерно распределяют по ней, осторожно покачивая чашку.
После подсыхания агара наносят препарат бактериофага Rostov-6. Посев инкубируют в термостате при 37°С 24 часа.
Учитывают результат идентификации по наличию и степени лизиса (см. таблицу 1).
Из таблицы видно, что все три штамма имеют высокую степень лизиса, а именно штаммы: №437, №11093 имели зону лизиса на четыре креста, а штамм №1123 - три креста, т.е. бактериофаг Rostov-6 достоверно показал присутствие в исследуемых штаммах холерных вибрионов O1 серогруппы биовара Classical.
Пример 2
Исследование штаммов холерных вибрионов O1 серогруппы биовара El Tor №18335, №18372, №18748/2 на чувствительность к бактериофагу Rostov-6. Все штаммы взяты из музея коллекции штаммов ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. Посев штаммов и все последующие действия производятся так же, как и в примере 1.
Результаты лабораторных испытаний фагового препарата Rostov-6 для идентификации холерных вибрионов O1 серогруппы биовара El Tor (см. таблицу 2).
Из таблицы видно, что все штаммы имеют высокую степень лизиса (4+) бактериофагом Rostov-6, подтверждая присутствие холерных вибрионов O1 серогруппы биовара El Tor.
Пример 3
Исследование проб, взятых из воды на чувствительность к бактериофагу Rostov-6.
Штаммы холерных вибрионов O1 серогруппы биовара El Tor №23, №53, №127 получены в результате мониторинга в 2016 году. Посев штаммов и все последующие действия производятся так же, как и в примере 1.
Результаты лабораторных испытаний фагового препарата Rostov-6 для идентификации холерных вибрионов O1 серогруппы биовара El Tor выделенных из воды (см. таблицу 3).
Из таблицы видно, что все три штамма имеют высокую степень лизиса, а именно штаммы: №437, №11093 имели зону лизиса на четыре креста, а штамм №1123 - три креста, т.е. бактериофаг Rostov-6 достоверно показал присутствие в исследуемых штаммах холерных вибрионов 01 серогруппы биовара El Tor.
Использование предполагаемого изобретения позволяет достоверно осуществлять идентификацию холерных вибрионов O1 серогруппы биоваров Classical и El Tor с помощью бактериофага Rostov-6. Данный препарат может широко применяться в лабораторных исследованиях для идентификации микроорганизмов, а так же при мониторинге холеры в противочумных учреждениях.
Источники информации:
1. Дрожевкина М.С., Арутюнов Ю.И. Типирование холерных вибрионов новым набором фагов // Журн. гигиены, эпидемиол., микробиол. и иммунобиол. - Прага, 1979. - Т. 23, №3. - С. 306-312.
2. «Способ обнаружения микроорганизма вида Vibrio parahaemolyticus». - Пат. №2531236, кл. С12 №7/00, G01 №33/50. - Опубл. 20.10.2014, Бюл. №29.
3. Способ идентификации Yersinia enterocolitica». - Пат. №2460802, кл. C12Q 1/08. - Опубл. 10.09.2012, Бюл. №25.