Способ моделирования асептического перитонита
METHOD FOR MODELING ASEPTIC PERITONITIS

Область техники.
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для моделирования асептического перитонита.
Уровень техники.
Известны различные способы моделирования перитонита в экспериментальных условиях.
Так, для моделирования острого перитонита у различных лабораторных животных в передней брюшной стенке делают отверстия, куда устанавливают катетеры. Через катетеры вводят в брюшную полость аутокровь в объеме 7-10 мл/кг массы тела, через 24 ч осуществляют введение через катетеры в три этапа микробной взвеси из стафилококка, кишечной палочки, палочки сине-зеленого гноя и пептококка в равных соотношениях (патент RU 2151427, опубл. 20.06.2000 Бюл. №17).
Также известен способ моделирования разлитого гнойного перитонита у крыс линии Wistar, включающий введение свежеотфильтрованной каловой аутовзвеси при проведении хирургического вмешательства под фторотановым наркозом, при этом осуществляют некроз купола слепой кишки путем наложения на нее лигатуры и одновременное введение в просвет лигированой кишки свежей отфильтрованной каловой аутовзвеси (патент RU 2634041, опубл. 23.10.2017 Бюл. №30).
Однако, данные методы предполагают использование бактериальных агентов, т.е. являются моделями септического перитонита. Вместе с тем в некоторых случаях требуется изучение влияния небактериальных агентов на брюшину и органы брюшной полости и возможность развития перитонита в отсутствие бактериального загрязнения.
В частности такие процессы характерны для материалов, которые используются в качестве имплантатов.
Наиболее близким аналогом предлагаемого нами способа является способ моделирования асептического перитонита, заключающийся в том, что в качестве раздражающего вещества животному однократно вводят высокодисперсные частицы феррита марганца при рН 5,5-6,5 в количестве 15-75 мг на 100 г массы. Затем наблюдают скорость свертывания крови и появление магнитных частиц в кале. Способ позволяет выделить и исследовать реактивную фазу асептического перитонита (авторское свидетельство №4638556/14, опубл. 15.05.91).
Однако среди недостатков известного способа необходимо отметить, что в данном способе не в полной мере обеспечивается асептика. Также используются магнитные частицы феррита марганца, которые не нашли применение в качестве имплантируемых материалов.
В современных же условиях все более широкое применение получают изделия из титана. В частности, это касается хирургической стоматологии. В настоящее время поверхность дентальных имплантатов рассматривается как единая структура, обладающая различными свойствами, в зависимости от особенностей обработки ее поверхности и состава используемого металлического сплава. Однако, дентальный имплантат, очевидно, следует рассматривать не как монолитное стоматологическое изделие из сплава металла, а как структуру с расположенными в окисном слое наноразмерными металлическими частицами, способными к эмиссии и взаимодействию с органами, тканями и клетками иммунной системы организма человека или животного. В связи с изложенным, актуальным является изучение влияния наноразмерных металлических частиц на органы, ткани, а также клеточные и молекулярные структуры, в частности, иммунокомпетентных органов, при использовании модели асептического перитонита.
Раскрытие сущности изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание модельной системы, предназначенной для исследования миграции металлсодержащих наночастиц, отделяющихся от поверхности дентальных имплантатов при возникновении воспалительных процессов в живом организме.
С этой целью мы разработали способ моделирования асептического перитонита, заключающийся в том, что животному интраперитонеально однократно вводят раствор, содержащий наноразмерные металлические частицы, полученные с дентальных имплантатов, антибиотик, липополисахарид и, в качестве растворителя, воду.
В частном случае осуществления изобретения в качестве растворителя используют бидистиллят.
Техническим результатом изобретения является получение патофизиологической модели асептического перитонита для:
- подтверждения возможности эмиссии металлсодержащих наночастиц с поверхности дентального имплантата
- подтверждения способности указанных наночастиц к миграции в иммунокомпетентные органы на фоне воспалительных процессов в живом организме, что приводит к дополнительному иммунологическому воздействию, требующему дальнейшего изучения.
Осуществление изобретения
Способ осуществляется следующим образом:
Для осуществления заявленной модели асептического перитонита предварительно получали раствор, содержащий наноразмерные металлические частицы. Данные частицы извлекали из дентальных имплантатов «Nobel Replace» или «Alpha BiO» по следующей методике.
Дентальные имплантаты в стерильных условиях были помещены в пробирки с 2 мл бидистиллированной воды. Инкубацию образцов проводили в течение 5 дней в термостате при температуре 37,2°С. В дальнейшем пробирки с супернатантами подвергались обработке ультразвуком 35 кГц в течение 20 минут.
Полученные таким образом супернатанты, подвергали дальнейшим исследованиям. Определение размеров и формы имеющихся в супернатантах наноразмерных частиц проводили с использованием прибора фирмы 90 Plus Partical Size Analyzer (Brookhaven instruments corporation, США) в мультимодальном режиме для выявления наноразмерных частиц. Измерения проводили при температуре 25°С и фиксированном угле рассеяния света лазера -90° при длине волны 661 нм. Для определения размера частиц использовали автоматическую функцию 90Plus/BI-MAS. Кроме того, была использована функция прибора «dust cut-off» для удаления из учитываемых наноразмерных частиц очень крупных объектов, а именно, пыль. В данном эксперименте значение фильтра было зафиксировано и составляло 20. Частицы, содержащиеся в полученных супернатантах, имели размер от 50 до 120 нм. Элементный анализ полученых наночастиц проводили на приборе FEI TECNAI G2 F20 (S-TWTN, США). Данный анализ показал содержание в наночастицах следующих металлов: Si, Со, Fe, Al и Ti.
Затем готовили раствор антибиотика. В исследовании был использован антибиотик Бициллин-5 с концентрацией 300000 ЕД. Он был выбран в связи с удобством его применения, 1 инъекция в 14-21 день. Концентрацией, необходимой для мелких животных является 30000 ЕД на 1 килограмм массы тела. В нашем случае мыши весили от 13 до 14 граммов, поэтому необходимая концентрация антибиотика 30 000X0,013 = 390 или 30 000X0,014 = 420 ЕД. Для округления среднего значения было взято значение равное 400 единицам. Используя стерильный инструментарий и 5 мл чистой воды, получаемой двукратной дистилляцией воды (бидистиллята) в качестве растворителя, проводили разведение указанного антибиотика. Забрав 1 миллилитр антибиотика, растворяли его в 4 миллилитрах инъекционной жидкости, создав концентрацию в 5 миллилитрах равную 60 000 (300000/5 = 60000). Забрав в следующую пробирку 1 миллилитр раствора с концентрацией 60000, добавляем опять 4 миллилитра инъекционной жидкости, создав тем самым концентрацию 12000 (600000/5 = 12000). Проведя точно такие же манипуляции, мы приходим к концентрации равной 2400 (12000/5 = 2400). Взяв 1 миллилитр с концентрацией 2400, мы добавляем 5 миллилитров бидистиллята, добившись концентрации, необходимой в исследовании (2400/6 = 400).
Также готовили раствор из лиофилизированного порошка липополисахарида из E.coli O111: В4 (Merck) в концентрации 100 мкг сухого вещества на 1 мл бидистиллята.
В качестве групп исследования использовались 12 инбредных мышей BALB/cJ, которые были разделены на группы: контроль (группа 1), группа исследования (группа 2) и группа исследования в условиях индукции воспаления (группа 3).
В группе 1 выделены 2 подгруппы мышей: 1 подгруппа - две мыши, которым внутрибрюшинно вводили бидистиллят в количестве 1,5 мл и 0,5 мл приготовленного раствора антибиотика, 2 подгруппа - две мыши, которым вводили внутрибрюшинно липополисахарид () -0,5 мл, бидистиллят 1 мл и антибиотик 0,5 мл. Всего 2 мл раствора.
Во второй группе исследования мышей также разделили на 2 подгруппы, в 1 подгруппе двум мышам вводили внутрибрюшинно: 0,5 мл антибиотика, 0,5 мл раствора, содержащего наноразмерные металлические частицы, полученные с поверхности дентальных имплантатов «Nobel Replace» и 1 мл бидистиллята. Во 2 подгруппе двум другим мышам вводили внутрибрюшинно: 0,5 мл антибиотика, 0,5 мл раствора, содержащего наноразмерные металлические частицы, полученные из дентальных имплантатов «Alpha BiO» и 1 мл бидистиллята. Всего 2 мл раствора.
В третьей группе также выделили 2 подгруппы: 1 подгруппа - две мыши, которым вводили внутрибрюшинно 0,5 мл липополисахарида, 0,5 мл антибиотика, 0,5 мл раствора, содержащего наноразмерные металлические частицы, полученные из дентальных имплантатов «Nobel Replace)), 0,5 мл бидистиллята. Всего 2 мл раствора.
2 подгруппа - две мыши, которым вводили внутрибрюшинно 0,5 мл раствора, содержащего наноразмерные частицы, полученные из дентальных имплантатов системы «Alpha BiO», 0,5 мл липополисахарида, 0,5 мл антибиотика и 0,5 мл бидистиллята.
Через 10 дней выводили мышей из эксперимента методом декапитации и проводили забор органов: печени, селезенки и почки у каждой мыши в 10% раствор формальдегида (Порядок работы, содержание животных и их выведение из эксперимента выполняли в соответствии с приложением к приказу министра здравоохранения СССР №755 от 12.08.1977 года «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». При этом принимали во внимание положения Хельсинской декларации и рекомендации; содержащиеся в Директивах Европейского сообщества (86/609 ЕС).
Фиксированные формалином образцы отмывали в воде в течение суток, после вырезки размещали в промаркированных гистологических кассетах, дегидратировали в 7 порциях 99,7% изопропанола (Isoprep, Biovitrum), пропитывали в 2 порциях парафиновой среды (Histomix, Biovitrum) и заливали в нее. Срезы толщиной 3 мкм готовили на ротационном микротоме, монтировали на предметных стеклах и окрашивали гематоксилином Карацци и эозином по рутинному протоколу, а Также с помощью метода Перлса с покраской сафранином (на железо, поскольку ранее была показана возможность выявления этим методом железосодержащих наночастиц - Plotnikov EY, Pul'kova NV, Silachev DN, Manskikh VN, Khryapenkova TG, Zorov DB, Sukhikh GT. Methods of detection of mesenchymal stem cells in the kidneys during therapy of experimental renal pathologies. Bull Exp Biol Med. 2012 154(1): 145-151) и на алюминий ауринтрикарбоновой кислотой (алюминоном) по прописи Лилли без докраски метиленовым синим (описание методов см. Р. Лилли, Патогистологическая техника и практическая гистохимия, М., Мир, 1969 г., 645 с.). Параллельно производилось контрольная качественная реакция на алюминий путем смешивания используемых реактивов с сульфатом алюминия на предметном стекле и окрашивание на железо среза селезенки крысы с гемосидерозом. Положительной реакцией на алюминий считалось появление продукта реакции, окрашенного в красный цвет, частицы, содержащие железо, приобретали при специфической окраске синий цвет. Препараты изучали с помощью микроскопа AxioScope A1 (Carl Zeiss), фотографировали с помощью камеры MRc5 (Carl Zeiss) и программмы Axio Vision 3.0 (Carl Zeiss). Выявленные патологические изменения квалифицировали согласно общепринятой номенклатуре (В.Н. Манских, Патоморфология лабораторной мыши, Т. 1, Москва, ВАКО, 2016 г., 208 с., Т. 3, 2017 г., 434 с.).
Примеры осуществления изобретения.
Согласно заявленной методике, был смоделирован перитонит на 12 инбредных мышах BALB/cJ, которых разделили на соответствующие группы и подгруппы.
Установлено, что после вскрытия патологоанатомическая картина характеризуется следующим:
В 1 и 2 группах наблюдалась умеренная гиперемия и отечность брюшины, наличие небольшого количества выпота.
В 3 группе наблюдалась выраженная гиперемия и отечность брюшины, наличие выпота с наличием нитей фибрина, инфильтрация париетальной брюшины лимфоцитами и нейтрофильными гранулоцитами.
Результаты гистологического исследования полученных от каждой мыши печени, почки и селезенки показали следующее.
Группа 1, мышь из 1 подгруппы (контроль).
Резко выраженные явления экстрамедуллярного гемопоэза в красной пульпе селезенки, слабо выраженный экстрамедуллярный гемопоэз (гранулоцитопоэз) в печени, почка - без морфологических изменений. Депозиты частиц, содержащих алюминий и железо, в исследованных образцах не обнаружены. В образцах селезенки в красной пульпе отмечаются депозиты формалинового пигмента коричневого цвета. Слабо выраженный экстрамедуллярный гемопоэз (гранулоцитопоэз) в печени. Группа 2, мышь из 1 подгруппы.
Резко выраженные явления экстрамедуллярного гемопоэза в красной пульпе селезенки, слабо выраженный экстрамедуллярный гемопоэз (гранулоцитопоэз) в печени, почка - без морфологических изменений. Депозиты частиц, содержащих алюминий и железо, в исследованных образцах не обнаружены. В образцах селезенки в красной пульпе отмечаются депозиты формалинового пигмента коричневого цвета.
Группа 2, мышь из 2 подгруппы.
Резко выраженные явления экстрамедуллярного гемопоэза в красной пульпе селезенки, слабо выраженный экстрамедуллярный гемопоэз (гранулоцитопоэз) в печени, почка - без морфологических изменений. Депозиты частиц, содержащих алюминий и железо, в исследованных образцах не обнаружены. В образцах селезенки в красной пульпе отмечаются депозиты формалинового пигмента коричневого цвета. Слабо выраженный экстрамедуллярный гемопоэз (гранулоцитопоэз) в печени. Группа 3, мышь из 1 подгруппы. Резко выраженные явления экстрамедуллярного гемопоэза в красной пульпе селезенки, слабо выраженный экстрамедуллярный гемопоэз (гранулоцитопоэз) в печени, почка - без морфологических изменений. В маргинальной зоне фолликулов белой пульпы селезенки выявлены многочисленные клетки (макрофаги), содержащие в цитоплазме депозиты коричневого цвета, состоящие из вариабельного размера (менее 1 мкм) частиц, дающих резкую положительную реакцию Перльса на железо и окрашивающихся алюминоном в красно-оранжевый цвет. В образцах селезенки в красной пульпе отмечаются депозиты формалинового пигмента коричневого цвета.
Группа 3, мышь из 2 подгруппы. Резко выраженные явления экстрамедуллярного гемопоэза в красной пульпе селезенки, слабо выраженный экстрамедуллярный гемопоэз (гранулоцитопоэз) в печени, почка - без морфологических изменений. В маргинальной зоне фолликулов белой пульпы селезенки выявлены многочисленные клетки (макрофаги), содержащие в цитоплазме депозиты коричневого цвета, состоящие из вариабельного размера (менее 1 мкм) частиц, дающих резкую положительную реакцию Перльса на железо и окрашивающихся алюминоном в красно-оранжевый цвет. В образцах селезенки в красной пульпе отмечаются депозиты формалинового пигмента коричневого цвета.
Таким образом, только в случае группы 3 исследования наблюдалась картина острого перитонита, также в селезенке были выявлены частицы, которые по своей локализации (маргинальная зона - обычное место локализации циркулировавших в кровотоке инородных частиц, захваченным макрофагами) и гистохимическим свойствам могут быть интерпретированы как наночастицы экзогенного происхождения. Морфологические проявления иммуногенеза в селезенке при этом отсутствовали.
Исходя из проведенных нами исследований, можно сделать вывод о том, что наноразмерные частицы в составе разработанных нами супернатантов, имеют свойство в условиях индуцированного воспаления участвовать в иммунологических реакциях, что подтверждается их способностью к миграции через системный кровоток, и, в частности, обнаруживаться в иммунокомпетентном органе, таком как селезенка. Эти данные указывают на эффективность разработанной нами патофизиологической мышиной модели и делает возможным использовать ее в дальнейших иммунологических разработках.