Возрастные изменения специфичности аутоантител к нативной денатурированной ДНК у здоровых лиц

Оригинальные статьи

© 2004, СПб РО РААКИ

ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СПЕЦИФИЧНОСТИ АУТОАНТИТЕЛ К НАТИВНОЙ И ДЕНАТУРИРОВАННОЙ ДНК У ЗДОРОВЫХ ЛИЦ

Коликова Ю.А., Ишмухаметова Д.Г., Винтер В.Г.

Казанский государственный университет, Россия

Резюме. Ранее нами было показано, что аутоантитела к ДНК обнаруживаются в сыворотке крови всех здоровых людей, и уровень их содержания изменяется с возрастом. В данной работе исследована специфичность аутоантител в сыворотке крови 140 практически здоровых лиц к нативной и денатурированной ДНК методом истощения сыворотки соответствующим антигеном. Методом конкурентного иммунофер-ментного анализа установлены различия в возрастной динамике изменения уровня содержания субпопуляций аутоантител, перекрестно реагирующих с нативной и денатурированной ДНК у мужчин и женщин. Предполагается возможность участия аутоантител к ДНК, содержащихся в сыворотке крови здоровых лиц, в физиологических перестройках организма.

Ключевые слова: ААТ, нативная ДНК, денатурированная ДНК, здоровые люди.

Kolikova Yu.О., Ishmukhametova D.G., Vinter V.G.

AGE-RELATED CHANGES IN SPECIFICITY OF ANTIBODIES AGAINST NATIVE AND DENATURATED DNA IN HEALTHY PERSONS

Abstract. Earlier we have shown the presence of anti-DNA autoantibodies in healthy human serum. The level of these antibodies alters with age. In the present work the specificity of autoantibodies to double- and singlestranded DNA in serum of 140 healthy persons is investigated. Using the method of enzyme-linked immunoassay we were found differences in age dynamics of a content of subpopulations of autoantibodies, cross-reacting with double-stranded and single-stranded DNA in male and female. It is supposed that there is a possibility of participation of serum anti-DNA autoantibodies in physiological rearrangements of an organism.

ВвеДеНИе комплекса ААТ-ДНК [11]. Характерной особеннос-

ДНК как антиген обладает рядом особенностей, которые имеют прямое отношение к характеру ее взаимодействия с аутоантителами (ААТ) к ДНК. Мо-

тью молекулы ДНК как антигена является ее выраженная полианионная природа. Различные ААТ к ДНК способны реагировать с нативной ДНК

лекула ДНК имеет одноцепочечную и двуцепочеч- (нДНК), денатурированной ДНК (дДНК), а также с

ную конформацию, она может быть правозакручен- обоими типами ДНК' ААТ’ взаимодействующие иеной (А- и В-конформация) или левозакрученной ключительно с дДНК, мо<ут связываться с состав-

(2-тК). Кроме того, ДНК отличается от большин- шлющими ее азотистыми основаниями, нуклеозида-

ства антигенов белковой природы тем, что она со- ми’ нуклеотидами, олигонуклеотидами, рибозо-фос-

держит повторяющиеся единицы, различающиеся Фатньм остовом ~ то есть с0 всеми структурными

между собой как химически, так и по конформации, единицами дДНК [6]. ААТ, высокоспецифичные к

Такая структура ДНК обусловливает неодинаковую нДНК- связываются с рибозо-фосфатным остовом,

авидность аутоантител к ДНК, что оказывает суще- комплементарными парами азотистых оснований,

ственное влияние на прочность образовавшегося или некоторыми характерными структурами двой-

______________________________________________ ной спирали ДНК [8]. Существуют данные о том, что

Адрес для переписки: ААТ к нДНК сыворотки крови больных системной

Коликова Ю.О. красной волчанкой специфично распознают струк-

Казань 420037, ул. Ленинградская, 34а-86. туры молекулы нДНК, отличные от В-конформации

Тел. (8432)70-85-53. E-mail: julia@ksu.ru [7]. Показано, что ААТ к нДНК способны различать

право- и левозакрученную форму молекулы ДНК [9]. Обнаружена способность ААТ к ДНК взаимодействовать с синтетическими полимерами (поли-А, поли-Т), с двуцепочечной РНК [12, 15]. Некоторые исследователи отмечают, что в норме ААТ, реагирующие исключительно с нДНК, присутствуют в небольших количествах. Большинство ААТ к ДНК, присутствующих в сыворотке крови здоровых людей, способны вступать во взаимодействие как с нДНК, так и с дДНК [6].

В силу перечисленных выше свойств молекулы ДНК как антигена, ААТ к ДНК отличаются от других ААТ высокой гетерогенностью. Вопрос о том, каким образом ААТ способны распознавать определенные конформации молекулы ДНК и специфично реагировать с ней, остается до сих пор открытым. Связывание ААТ с ДНК зависит от множества факторов, так как взаимодействие ДНК-ААТ может обеспечиваться различными механизмами: электростатическим притяжением, вандерваальсовыми и гидрофобными силами [2]. Существует предположение о том, что определенный вклад в процесс связывания ААТ с различными типами ДНК вносят и полисахаридные компоненты молекулы АТ [14].

Условно ААТ сыворотки крови по специфичности к нативной и денатурированной ДНК можно разделить на три типа. К первому типу относятся естественные ААТ [5], связывание которых с нуклеиновыми кислотами имеет, как правило, низкоаффинный характер. Специфичность таких ААТ в отношении нуклеиновых кислот разнообразна: они могут взаимодействовать с нативной и денатурированной ДНК, различными синтетическими нуклеотидными полимерами, двуцепочечной РНК и т.д. Второй и третий типы - ААТ, высоко специфичные либо к нДНК, либо к дДНК, практически не вступающие в реакции со структурно неродственными антигенами [13].

Ранее нами было показано, что ААТ к ДНК выявляются в сыворотке крови всех обследованных здоровых людей [3]. Уровень содержания ААТ к ДНК у здоровых лиц изменяется с возрастом. Примечательно то, что возрастная динамика уровня содержания ААТ к нДНК отличается от таковой для ААТ к дДНК. Мы предполагаем, что в разные периоды онтогенеза в организме здорового человека могут вырабатываться субпопуляции ААТ, предпочтительно взаимодействующих с нативной или с денатурированной ДНК, либо способных реагировать как с нД НК, так и с дД НК. Для выяснения данного предположения нами исследована специфичность ААТ сыворотки крови здоровых лиц к нативной и денатурированной ДНК.

Материалы и методы

Объект исследования. В работе использованы образцы сыворотки венозной крови 140 практичес-

ки здоровых людей (100 женщин, 40 мужчин в возрасте от 4 до 82 лет, проходящих плановые профилактические осмотры в различных лечебных учреждениях г. Казани, не страдающих аутоиммунными и инфекционными заболеваниями, не являющихся носителями ВИЧ. Исключались образцы сыворотки крови женщин, имеющих беременность на момент взятия крови для исследования. В качестве положительного стандарта использована сыворотка крови больных системной красной волчанкой -пациентов Республиканской клинической больницы №2. Образцы сыворотки хранили при -20°С, которые перед анализом прогревали при 56°С в течение 40 мин.

Определение содержания ААТ к ДНК. Содержание ААТ к ДНК определяли методом иммунофер-ментного анализа (ИФА) согласно методике, модифицированной ранее в нашей лаборатории [4]. В качестве антигена использовали нДНК эритроцитов цыплят (Serva, Germany), дДНК получали методом тепловой денатурации. В качестве вторичных антител в работе применены конъюгированные с перок-сидазой антитела против иммуноглобулинов человека (Vector-BEST, Россия). ИФА проводили по следующей схеме. В лунки планшетов, предварительно активированных ультрафиолетовым светом (в течение 2 часов), вносили раствор ДНК (10 мкг/ мл) на 0,1 М фосфат - 0,05М цитратном буфере pH 5,0 (ЦФБ) и инкубировали в течение 16-18 ч при комнатной температуре. Несорбированную ДНК 3 раза отмывали фосфатно-солевым буфером с твином (ФСБТ: 0,01М фосфатный буфер, pH 7,2; 0ДМ NaCl;

0,05% твин-20) и вносили в трех повторах образцы сыворотки крови, разведенные ФСБТ в соотношении 1:100. Сыворотку инкубировали в течение 1,5 ч при 37°С, а затем еще 0,5 ч при 4°С. После инкубации планшеты 3 раза промывали ФСБТ и добавляли вторичные антитела в ФСБТ. Инкубацию со вторичными антителами проводили в течение 1 ч при 37°С, затем - 20 мин при 4°С. Планшеты трижды отмывали ФСБТ, несколько раз ополаскивали дистиллированной водой, после чего вносили субстратную смесь (0,05% НО 0,4 мкг/мл орто-фенилен-диамина в ЦФБ) и инкубировали в течение 0,5 ч в темноте при комнатной температуре. Уровень ответа реакции ИФА измеряли на спектрофотометре Multiskan (Flow, England) при длине волны 492 нм (ОП ).

тт492

Для стандартизации результатов всей серии экспериментов параллельно анализировали одну и ту же положительно реагирующую сыворотку с высоким содержанием ААТ к ДНК - “стандарт”. Содержание ААТ к ДНК в сыворотке крови оценивали в относительных единицах (ОЕ), которые вычисляли как отношение ОП опыта/ОП стан-

492 492

дарта. Результаты исследования каждого образца сыворотки представляли как среднее из 4 повто-

ров и доверительный интервал для уровня значимости 0,05.

Исследование специфичности ААТ к ДНК.

Для исследования специфичности ААТ к ДНК анализировали реактивность ААТ к нативной и денатурированной ДНК методом предварительного истощения сыворотки крови соответствующими антигенами в диапазоне концентраций истощающего антигена 0,3-10 мкг/мл. С этой целью сыворотку, разбавленную ФСБТ в соотношении 1:100, инкубировали с растворами нДНК и дДНК в течение 1 ч при 37°С с непрерывным мягким перемешиванием, затем еще 0,5 ч при 4°С. Истощенную таким образом сыворотку вносили в четырех повторах на планшет с иммобилизованной ДНК, далее реакцию ИФА проводили, как описано выше. В качестве контроля использовали неистощенный образец этой же сыворотки, инкубированный в аналогичных условиях. Специфичность ААТ к ДНК выражали в процентах истощения, которые вычисляли по следующей формуле:

М ИСТ

% истощения = (1 —==--------—)х100 ,

где М

ист.

М

уровень ответа реакции у каждого

из повторов истощенной сыворотки, д/ НЕИСТ “ среднее арифметическое уровня ответа реакции ИФА повторов того же образца неистощенной сыворотки. Вычисленные таким образом показатели специфичности представляли в виде среднего и доверительного интервала для уровня значимости 0,05.

Результаты

Нами исследована специфичность связывания ААТ к нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови 140 практически здоровых лиц различного возраста. Исследование проводилось в 6 возрастных группах согласно физиологическим границам определенных возрастных периодов жизни человека [1]. Пулы образцов сыворотки крови мужчин и женщин 6 возрастных групп истощали растворами либо нДНК, либо дДНК, в диапазоне концентраций истощающего антигена 0,3-10 мкг/мл. Вследствие предварительной инкубации сыворотки с раствором антигена содержащиеся в ней антитела к нДНК взаимодействовали со «своим» антигеном, т.е. с нДНК. Аналогичная ситуация происходила при взаимодействии ААТ к дДНК с дДНК, добавленной в сыворотку крови. В ходе указанных взаимодействий уровень ответа на «свой» антиген в реакции ИФА снижался. Таким образом, показателем специфичности анализируемых антител является степень угнетения цветной реакции ИФА вследствие истощения ААТ, специфично связавшихся со «своим» антигеном.

Специфичность ААТ к нативной ДНК в сыворотке крови здоровых женщин разных возрастных групп представлена в табл. 1. ААТ к нДНК истощаются «своим» антигеном в каждой возрастной подгруппе по-разному. Достоверное снижение уровня ответа реакции ИФА в подгруппах 4-10 лет, 44-59 лет и старше 60 лет отмечается, начиная с концентрации истощающей нДНК 0,32 мкг/мл (Р<0,05). В подгруппах 36-43 и 11-15 лет ответ реакции достоверно снижается при концентрации истощающей нДНК 5 мкг/мл.

Табл.1. УРОВЕНЬ ОТВЕТА (В ОТН. ЕД.) РЕАКЦИИ ИФА ПРИ ИСТОЩЕНИИ СЫВОРОТКИ КРОВИ НАТИВНОЙ ДНК

Возрастные Сывор. без Концентрация истощающей нДНК, мкг/мл

группы истощения 0,32 0,63 1,25 2,50 5,00 10

Женщины

от 4 до 10 лет 0,266±0,040 0.193±0.005 0.179±0.015 0.169±0.011 0.169±0.005 0.169±0.001 0.154±0.007

от 11 до 15 лет 0,261 ±0,005 0,249±0,023 0,262±0,003 0,247±0,016 0,260±0,012 0.232±0.001 0.198±0.012

от 16 до 35 лет 0,422±0,122 0,446±0,007 0,351 ±0,047 0,364±0,017 0,351 ±0,031 0,337±0,051 0,319±0,020

от 36 до 43 лет 0,438±0,080 0,420±0,057 0,502±0,016 0,464±0,020 0,408±0,115 0.329±0.027 0,342±0,046

от 44 до 59 лет 0,270±0,028 0.211 ±0.003 0.189±0.004 0.199±0,031 0,189±0,020 0,187±0,017 0.184±0.058

старше 60 лет 0,141 ±0,007 0.096±0.016 0.089±0.007 0.080±0.008 0.079±0.003 0.080±0.011 0.080±0.010

Мужчины

от 4 до 10 лет 0,341 ±0,009 0.319±0.001 0,346±0,009 0,319±0,013 0,306±0,006 0.298±0.001 0.303±0,016

от 11 до 15 лет 0,434±0,026 0.361 ±0.007 0,386±0,007 0.346±0.011 0.357±0.049 0.254±0.002 0.232±0.004

от 16 до 35 лет 0,189±0,012 0,177±0,027 0,173±0,005 0,165±0,014 0,189±0,003 0,182 ±0,007 0,179±0,007

от 36 до 43 лет 0,097±0,009 0,089±0,005 0,096±0,011 0,088±0,009 0,097±0,010 0,091 ±0,018 0,095±0,037

от 44 до 59 лет 0,606±0,102 0.420±0.022 0,479±0,041 0.335±0,025 0,321 ±0,011 0,327±0,018 0,222±0,009

старше 60 лет 0,142±0,014 0,129±0,007 0,134±0,004 0,144±0,015 0,124±0,004 0.106±0.003 0,059±0,091

Примечание: - подчеркивание означает статистически значимое различие с показателями неистощенной сыворотки (Р<0,05).

Рис.1. Специфичность ДАТ сыворотки крови здоровых лиц разного возраста к нативной ДНК. Возрастные подгруппы: 1 - от 4до Юлет, Г— от 11 до 15,3-от 16до35,4— от36до43, 5-от44 до 59, 6- старше 60 лет.

У мужчин снижение уровня ответа реакции ИФА при истощении сыворотки нДНК наблюдается в возрастных подгруппах 4-10, 11-15, 44-59 лет, начиная с наименьшей концентрации истощающей нДНК (0,32 мкг/мл). В подгруппах 16-35 и 36-43 лет снижения уровня реакции ИФА после истощения нДНК не происходит.

Выявленное различие в характере истощения ААТ к нДНК в сыворотке крови мужчин и женщин свидетельствует о неодинаковой специфичности у них ААТ к нДНК. Специфичность ААТ к нДНК в

сыворотке крови мужчин и женщин разного возраста, выраженная в процентах истощения, представлена на рис.1. У женщин специфичность ААТ к нДНК наиболее высока в детском возрасте (4-10 лет) и в возрасте старше 60 лет. В период полового созревания и в последующий активный детородный период специфичность ААТ к нДНК заметно снижается. У мужчин, в отличие от женщин, в 4-10 лет ААТ к нДНК истощаются всего на 14,1+6,3%. В подростковом возрасте этот показатель увеличивается до 47,3±0,9%, затем резко снижается и достигает практически нулевого уровня в возрасте 36-43 лет. В подгруппе 44-59 лет ААТ обладают максимальной специфичностью к нДНК. После 60 лет специфичность ААТ снижается до 26,4±7,2%.

Специфичность ААТ к дДНК оценивали аналогичным способом. Результаты изменения уровня ответа реакции ИФА при истощении образцов сыворотки денатурированной ДНК представлены в табл.2. Как видно из таблицы, ААТ к дДНК в сыворотке крови у женщин всех возрастных подгрупп истощаются дД НК, о чем свидетельствует дозозависимое снижение уровня ответа реакции ИФА после истощения сыворотки дДНК в возрастающих концентрациях.

У мужчин истощение сыворотки крови дДНК также приводит к снижению уровня ответа реакции ИФА во всех возрастных подгруппах. В отличие от женщин, в подгруппах 4-10 лет и старше 60 лет снижение уровня ответа реакции ИФА выходит на плато при достижении концентрации исто-

Табл. 2. УРОВЕНЬ ОТВЕТА (В ОТН. ВД.) РЕАКЦИИ ИФА ПРИ ИСТОЩЕНИИ СЫВОРОТКИ КРОВИ ДЕНАТУРИРОВАННОЙ ДНК

Возрастные Сывор. без Концентрация истощающей дДНК, мкг/мл

группы истощения 0,32 0,63 1,25 2,50 5,00 10

Женщины

от 4 до 10 лет 0,465±0,006 0.315±0.006 0.280±0.022 0.275±0.007 0.263±0.005 0.197±0.009 0.191 ±0.006

от 11 до 15 лет 0,568±0,007 0,570±0,018 0,487±0.010 0.484±0.008 0.507±0.045 0,453±0,004 0,415±0,010

от 16 до 35 лет 0,662±0,160 0,474±0.006 0,474±0.007 0.468±0.014 0.463±0.040 0,377±0.004 0,359±0,009

от 36 до 43 лет 0,681 ±0,040 0.357±0.014 0.359±0.013 0.370±0.011 0,364±0,009 0.321 ±0.007 0.292±0.003

от 44 до 59 лет 0,679±0,030 0.581 ±0.010 0.575±0.002 0.530±0.005 0.457±0.007 0.413±0.010 0.359±0.005

старше 60 лет 0,648±0,024 0.439±0.049 0.377±0.017 0.415±0.001 0.318±0.017 0.263±0.002 0.226±0.010

Мужчины

от 4 до 10 лет 0,665±0,103 0.518±0.008 0,570±0,027 0.498±0.002 0.521 ±0.003 0.453±0.026 0.457±0.008

от 11 до 15 лет 0,836±0,006 0.370±0.005 0.491 ±0.006 0.446±0.032 0,384±0.021 0,334±0.019 0.286±0.012

от 16 до 35 лет 0,577±0,026 0,549±0.012 0,535±0.012 0.460±0.003 0.418±0.013 0.356±0.028 0.301 ±0.021

от 36 до 43 лет 0,322±0,005 0.294±0.001 0,296±0,037 0.252±0.014 0.221 ±0.016 0.195±0.003 0.160±0.002

от 44 до 59 лет 0,881 ±0,048 0.403±0.002 0.489±0.016 0.449±0.007 0.449±0.010 0.383±0.014 0.331 ±0.026

старше 60 лет 0,413±0,057 0.332±0.009 0,353±0,011 0.337±0.027 0.277±0.008 0.245±0.029 0.242±0.036

Примечание: - подчеркивание означает статистически значимое различие с показателями неистощенной сыворотки

щающей дДНК 5 мкг/мл. Кроме того, у мужчин в возрастных подгруппах 16-35 и 36-43 лет достоверное снижение уровня ответа реакции ИФА выявляется, начиная с концентрации истощающего антигена 1,25 мкг/мл.

По данным табл. 2, специфичность ААТ к дДНК в сыворотке крови здоровых людей изменяется с возрастом. Динамика возрастных изменений специфичности ААТ к дДНК у мужчин и женщин представлена на рис.2. В сыворотке крови женщин в детском возрасте выявляется высокая специфичность ААТ к дДНК (59,2±1,4% истощения идентичным антигеном). В период полового созревания специфичность ААТ к дДНК снижается (27,1 ± ± 2,3%).

Далее с возрастом специфичность ААТ к дДНК увеличивается, и в возрасте старше 60 лет достигает максимального уровня - 65,4± 1,9% истощения. У мужчин наблюдается противоположная возрастная динамика изменения специфичности ААТ к дДНК: в период 4-10 лет ААТ к дДНК истощаются лишь на 32,1±1,3%. В возрасте 11-14 лет наблюдается резкое увеличение специфичности ААТ (66,5+1,6% истощения), затем специфичность ААТ кдДНК несколько снижается и стабилизируется на этом уровне до 43 лет. В возрасте 44-59 лет специфичность ААТ достигает показателей подросткового возраста с дальнейшим снижением в пожилом возрасте.

Параллельно с оценкой специфичности мы исследовали способность ААТ к нДНК перекрестно реагировать с дДНК, а ААТ к дДНК - вступать в перекрестные взаимодействия с нДНК. Наличие такой перекрестной реактивности характеризует полиспецифичность ААТ, иными словами, способность ААТ вступать в реакцию с «чужим» антигеном. Для исследования полиспецифичности ААТ к нДНК образцы сыворотки крови перед внесением на планшет с иммобилизованной нДНК пред-

А

Рис.З. Зависимость полиспецифичности ААТ к нативной (А) и

1- от 4 до 10 лет, 2-от 11 до 15, 3-от 16 до 35, 4- от 36 до 43, 5

варительно инкубировали с дДНК. Полиспецифичность ААТ к дДНК определяли аналогичным образом, с тем отличием, что сыворотку предварительно инкубировали с нДНК.

На рис.З (А и В) приведены данные по возрастной динамике изменения полиспецифичности ААТ к ДНК в группах мужчин и женщин. ААТ к нДНК (рис.ЗА)в сыворотке крови женщин в возрастной группе 4-10 лет истощаются дДНК на 64,6±1,7%. В период 11-15 лет специфичность анти-нДНК ААТ несколько снижается (51,6±2,5%). На протяжении периода от 16 до 43 лет этот показатель стабилизируется в пределах 30-33%. В 44-59 лет степень полиспецифичности указанных ААТ вновь увеличивается до 54,7±3,1% и стабилизируется на этом уровне. У мужчин в возрасте 4-10 лет ААТ к нДНК истощаются дДНК всего лишь на 8,1+2,1%. В подростковый период наблюдается резкое увеличение полиспецифичности ААТ (64,3±0,2% истощения), после чего

возрастные подгруппы

Рис.2. Специфичность ААТ сыворотки крови здоровых лиц разного возраста к денатурированной ДНК. Возрастные подгруппы: /-от4до 10 лет, 2-от 11 до 15,3-от 16 до 35,4-от 36 до 43, 5- от 44 до 59, 6 - старше 60 лет.

возраст*

в

.енатурированной (В) ДНК от возраста. * - возрастные подгруппы: от 44 до 59, 6 - старше 60 лет.

на протяжении периода от 16 до 43 лет перекрестная активность анти-нДНК ААТ в отношении дДНК снижаетя до 25-28%. В 44-59 лет полиспецифичность ААТ к нДНК вновь увеличивается, достигая показателей подросткового возраста. После 60 лет ААТ к нДНК истощаются дДНК на 45,0±4,6%.

Полиспецифичность ААТ к дДНК у мужчин и женщин представлена на рис.ЗВ. ААТ к дДНК в детском возрасте у женщин истощаются нДНК на 25,2+2,9%. В подростковый период степень перекрестного взаимодействия ААТ с нДНК снижается и составляет всего 13,2±1,6%, а затем увеличивается и стабилизируется на протяжении периода 16-43 лет в пределах 18-20%. В 44-59 лет полиспецифичность ААТ к дДНК резко снижается до 9,4±1,8%. После 60 лет показатели истощения вновь возвращаются к уровню значений подгруппы 4-10 лет. У мужчин в 4-10 лет перекрестная активность ААТ к дДНК невелика, ААТ истощаются на 8,3±1,6%. В подростковом возрасте отмечается существенное увеличение полиспецифичности, в этот период истощение ААТ достигает 39,4±3,9%. В 16-35 лет истощение ААТ снижается до уровня 17,6%. В период 36-43 года ААТ к дДНК не вступают в реакцию с нДНК. В 44-59 лет наблюдается резкое увеличение полиспецифичности ААТ к дДНК, истощение достигает 47,2±2,3%, снижаясь в пожилом возрасте до 37,5±3,7%.

Обсуждение

Как показано нами ранее, уровень содержания анти-нДНК и анти-дДНК ААТ в сыворотке кро-

ви здоровых лиц на протяжении жизни претерпевает существенные изменения [3]. Более того, характер возрастной динамики содержания ААТ к нДНК не идентичен таковому для ААТ к дДНК. Это наводит на мысль о различии в функциональных характеристиках ААТ к нативной и денатурированной ДНК. Кроме того, не исключено, что физиологические изменения, происходящие в организме с возрастом, могут быть связаны с изменением субпопуляционного состава ААТ к нативной и денатурированной ДНК. Представляло интерес выяснить, в какой мере в эти возрастные колебания вовлечены субпопуляции ААТ, реагирующих преимущественно либо с нДНК, либо с дДНК.

Полученные нами результаты показывают, что специфичность ААТ как к нДНК, так и к дДНК, на протяжении жизни неодинакова, причем характер этих изменений у мужчин и женщин также различен (рис.1 и 2). Однако не следует упускать из внимания тот факт, что ААТ к ДНК отличаются высокой гетерогенностью и содержат в своем составе как субпопуляции ААТ, способных реагировать либо с нДНК, либо с дДНК, так и субпопуляции, в равной мере взаимодействующие с обоими типами ДНК. Для выявления последних нами был применен конкурентный вариант ИФА, в котором сыворотка истощалась одним антигеном, а на планшете присутствовал другой.

При обобщении полученных данных на основе вычисления отношения долей субпопуляций ААТ, специфичных к нДНК, либо дДНК и ААТ, способных вступать во взаимодействие как с нДНК, так и с

Табл.З. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ СООТНОШЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ААТ К ДНК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛИЦ

пол возраст ААТ к нДНК ААТкдЦНК ААТ к Н-, дДНК

М 4-10 лет 20 36 44

У 11-15 лет 37 58 5

Ж 16-35 лет 18 74 8

36-43 лет 1 98 1

44-59 лет 43 52 5

от 60 лет 38 53 9

Ж 4-10 лет 30 60 10

Е 11-15 лет 28 68 4

Н 16-35 лет 21 70 9

36-43 лет 24 51 25

44-59 лет 16 63 21

от 60 лет 25 56 19

дДНК (табл. 3), нами было обнаружено, что у мужчин в период детства преобладают полиспецифич-ные ААТ, способные взаимодействовать как с нДНК, так и с дДНК. С возрастом доля таких ААТ значительно снижается и стабилизируется в пределах 10%. У женщин отмечается обратная тенденция. В период до 36 лет содержание полиспецифичных ААТ, реагирующих как с нДНК, так и с дДНК, не превышает 10%. Далее содержание этих ААТ возрастает более чем в два раза и стабилизируется на уровне 20%.

Содержание ААТ, специфичных к дДНК, у женщин отличается стабильностью, в течение жизни оно изменяется незначительно. Также не подвержено существенным колебаниям содержание ААТ, специфичных преимущественно к нДНК - оно варьирует в пределах 20-30%. У мужчин содержание ААТ, специфичных к дДНК, на протяжении жизни постепенно возрастает, достигая максимума в возрасте 36-43 лет, после чего вновь снижается и стабилизируется в пределах 52-53%. Содержание ААТ, преимущественно реагирующих с нДНК, у мужчин в возрасте от 4 до 35 лет колеблется в пределах 18-37%, затем снижается до минимума в возрасте 36-43 лет, после чего содержание этих ААТ вновь возрастает и стабилизируется в пределах 38-43%.

Чем объясняется изменение соотношения перекрестно реагирующих ААТ к ДНК с возрастом? В литературе практически отсутствуют исследования возрастных изменений субпопуляций ААТ к ДНК, перекрестно реагирующих с нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови здоровых людей. Существует лишь предположение о том, что изменение характера аутореактивности с возрастом может быть связано с возникновением соматических мутаций в генах, кодирующих V-области ААТ. На это косвенно указывают данные, полученные Ray и др. [10], которые обнаружили возрастные изменения способности ААТ к ДНК сыворотки крови мышей к перекрестному реагированию.

На наш взгляд, в основе возрастных изменений уровня ААТ к разным типам ДНК могут лежать качественные изменения субпопуляционно-го состава этих ААТ. В частности, эти изменения могут быть обусловлены флуктуациями содержания субпопуляции ААТ, способных перекрестно реагировать как с нативной, так и с денатурированной ДНК. Иллюстрацией такой возможности являются представленные нами данные (табл.З) об увеличении уровня содержания перекрестно реагирующих ААТ к ДНК у женщин старше 36 лет. Преобладание в сыворотке крови здоровых лиц в определенные возрастные периоды субпопуляций ААТ, перекрестно реагирующих с нДНК и дДНК свидетельствует о том, что они, по-види-

мому, играют определенную роль в физиологических перестройках организма в онтогенезе.

Список литературы

1. Аршавский И.А. Физиологические механизмы и закономерности индивидуального развития -М.:Наука, 1982. - 270 с.

2. Генералов И.И., Новиков Д.К. Поликлональные каталитические антитела и их возможное биологическое значение //Успехи современной биологии,-1998.-N2.-C. 178-193.

3. Коликова Ю.О., Фурманова П.В., Ишмухаме-това Д.Г. Аутоантитела к ДНК: половой диморфизм и возрастная динамика их содержания в сыворотке крови здоровых лиц // Иммунология.-2003.-N5.-С.304-306.

4. Саттарова Л.И., Гафиятуллина Л.А., Аглиул-лина Д.Г. и соавт. Оптимизация иммуноферментной тест-системы для определения антител к ДНК // Биотехнология.-1994.-N11-12.-С.38-41.

5. Coutinho A., Kazatchkine M.D., Avrameas S. Natural autoantibodies // Curr. Opin. Immunol.-1995,-Vol.7.-P.812-818.

6. Hahn B.H. Antibodies to DNA // N. Engl. J. Med.-1998.-Vol.338.-P. 1359-1368.

7. Herrmann М., Winkler Т.Н., Fehr H. Preferential recognition of specific DNA motifs by anti-double-stranded DNA autoantibodies // Eur. J. Immunol.-

1995.-Vol.25.-P. 1897-1904.

8. Kalsi J.K., Martin A.C., Hirabayashi Y. Functional and modeling studies of the binding of human monoclonal anti-DNA antibodies to DNA // Mol. Immunol.-

1996.-Vol.33.-P.471-483.

9. Krishna P., Fritzler M.J., Vande Sande J.H. Interactions of anti-DNA antibodies with Z-DNA // Clin. Exp. Immunol.-1993.-Vol.92.-P.51-57.

10. Ray S.K., Putterman C., Diamond B. Pathogenic autoantibodies are routinely generated during the response to foreign antigen: a paradigm for autoimmune disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1996.-Vol.93,-P.2019-2024.

11. Smeenk R.J.T., Van Rooijen A., Swaak T.J.D. Dissociation studies of DNA/anti-DNA complexes in relation to anti-DNA avidity // J. Immunol. Meth.-1988.-Vol.l09.-P.27-35.

12. Swanson P.C., Ackroyd C., Glick G.D. Ligand recognition by anti-DNA autoantibodies. Affinity, specificity, and mode of binding // Biochemistry.-1996.-Vol.35.-P. 1624-1633.

13. Wang Y., Mi J., Cao X. Anti-DNA antibodies exhibit different binding motif preferences for single stranded or double stranded DNA // Immunol. Lett.-2000.-Vol.73.-P.29-34.

14. Yamada E., Tsukamoto Y., Sasaki R. Structural changes of immunoglobulin G oligosaccharides with age in healthy human serum // Glycoconjugate J.-1997.-Vol.l4.-P.401-405.

15. Zouali М., Jeffries R., Eyquem A. IgG subclass distribution of autoantibodies to DNA and nuclear ri-

bonucleoproteins in autoimmune diseases // Immunol-ogy.-1984.-Vol.51.-P.595-600.

поступила в редакцию 05.04.2004 отправлена на доработку 27.04.2004 принята к печати 11.05.2004