Устройство для моделирования статической нагрузки у мелких лабораторных животных
DEVICE FOR MODELING STATIC LOAD IN SMALL LABORATORY ANIMALS

Изобретение относится к медицине, может быть использовано в патологической анатомии, физиологии, спортивной медицине, касается устройств для проведения экспериментальных исследований на лабораторных животных, а именно может быть использовано при моделировании статической нагрузки у мелких лабораторных животных.
Известно устройство, используемое в биомедицинских исследованиях для оценки сохранности физической работоспособности лабораторных животных при фармакологическом воздействии. Для проведения такого теста животное размещается головой вверх на середине закрепленного на штативе на высоте не менее 1 м над полом скользкого стеклянного стержня [Биомедицинское (доклиническое) изучение лекарственных средств, влияющих на физическую работоспособность: Методические рекомендации / Η.Н. Каркищенко, В.Н. Каркищенко, Е.Б. Шустов [и др.]. - Москва: Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства, 2017. - 133 с. - EDN NTMCNP].
Наиболее близким аналогом изобретения является устройство для моделирования статической нагрузки, содержащее ванну, заполненную водой, в центре которой установлена вертикальная стойка, выполненная из двух соосно расположенных с зазором с возможностью продольного перемещения цилиндров, каждый из которых связан с тензодатчиком [Авторское свидетельство SU №1393395, 1988].
Конструктивные технические решения известных устройств имеют трудно устранимые недостатки, связанные с ограничением возможности их использования в эксперименте, так как данные устройства работают либо исключительно с использованием: а) стеклянного шеста, который совершенно не пригоден для долговременного удержания животного, что требуется при моделировании статической нагрузки; б) воды, тогда как мелкие лабораторные животные при невозможности нахождения на вертикальном шесте, попадая в воду, прекрасно держатся в этой среде, поэтому невозможно заставить их долго находиться на шесте.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка устройства для моделирования статической нагрузки у мелких лабораторных животных, обеспечивающего оптимальные условия для долговременного удержания животного на вертикальной стойке.
Технический результат при использовании изобретения - расширение технических возможностей и упрощение устройства.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами: на фиг. 1 - схематично изображено предлагаемое устройство, общий вид; на фиг. 2 - электрическая схема металлической токопроводящей решетки; на фиг. 3 - микрофотографии мышцы m.Plantaris контрольной и опытной групп животных, окраска гематоксилин-эозин, увеличение *400.
Устройство включает в себя короб 1 с прозрачными стенками (например, из прозрачного пластика) размером 400×400×400 мм и съемной крышкой, в центре которой закреплен вертикальный деревянный шест 2 диаметром 8 мм. Для исключения соскальзывания крысы на шест накручен шпагат 3. На дне короба размещена металлическая токопроводящая решетка 4 (ограничивающая среда), подключенная к источнику напряжения 5. Короб установлен на металлический поддон 6 для сбора фекалий и мочи экспериментального животного (фиг. 1). Фекальные (плотные) болюсы попадают между прутьями решетки на поддон, поскольку расстояние между прутьями решетки превосходит размер болюсов.
Решетка выполнена из параллельно расположенных металлических прутков диаметром 4 мм, расстояние между которыми составляет не менее 10 мм. На решетку подается постоянное напряжение величиной 60 вольт. Четные контакты соединены с плюсом, нечетные с минусом. Источник напряжения состоит из трансформатора, умножителя напряжения, блока индикации (фиг. 2). Трансформатор понижает сетевое напряжение до 20 вольт. Переменное напряжение выпрямляется и увеличивается умножителем напряжения на диодах VD1-VD3, конденсаторах С1-С3 до 60 вольт. Выпрямленное напряжение 60 вольт подается на контакты токопроводящей решетки через ограничительный резистор R2. Индикация выполнена на светодиодах HL1, HL2 и резисторах R1, R3. В рабочем режиме горит светодиод HL2, при коротком замыкании между положительными и отрицательными контактами решетки загорается светодиод HL1, при отсутствии напряжения оба светодиода не горят.
Предлагаемое устройство используется следующим образом: Лабораторное животное помещается в короб, под крышку, на вертикальный шест. Животное располагают на стойке таким образом, чтобы его передние конечности ухватились за вертикальный шест. Крышка предупреждает перемещение животного вдоль стойки вверх. Металлическая токопроводящая решетка, подключенная к источнику напряжения, предупреждает перемещение животного вниз. При опускании вниз крыса замыкает своими лапами контакты разной полярности, через ее тело протекает электрический ток, что заставляет животное взбираться на вертикальный деревянный шест. Статическую физическую нагрузку образует тяжесть тела самого животного. Животные выводятся из эксперимента по истечению заданного времени или при наступлении утомления, когда они уже не способны к удержанию на шесте.
Преимущества, обеспечивающие расширение технических возможностей и упрощение предлагаемого устройства:
1. Использование токопроводящей металлической решетки и ограничивающего перемещение короба позволяет избегать воздействия внешних, посторонних для этого рефлекса раздражителей и способствует быстрому формированию стойкого рефлекса избегания. Источник напряжения находится снаружи короба, что позволяет экспериментатору включать/отключать устройство незаметно для животного и, тем самым, не создавая тормозящих выработку рефлекса влияний. Все это позволяет уменьшить продолжительность моделирования, поскольку исключается возможность: а) животного покинуть устройство до окончания эксперимента и б) торможения данного рефлекса.
2. Использование деревянного шеста со шпагатом обеспечивает долговременное, надежное и удобное для животного нахождение на вертикальной стойке.
3. Устройство снабжено поддоном для сбора мочи и фекалий экспериментального животного, а расстояние между прутками решетки превосходят размер болюсов, что облегчает уборку устройства и сокращает ее время.
4. Стенка короба прозрачная, что дает возможность адаптироваться после помещения в устройство, так как это снимает ощущение замкнутости пространства.
5. Устройство адаптировано для мелких лабораторных животных.
6. Устройство безопасно для человека, так как электрическая схема изолирована от сети 220 В, а источник напряжения обладает малой мощностью.
Известно, что длительная статическая нагрузка для некоторых скелетных мышц является несвойственной и приводит к значительным деструктивным морфологическим и биохимическим изменениям, которые затрагивают как структурные, так и функциональные параметры. В немногочисленных исследованиях, посвященных исследованию мышц при длительной статической нагрузке, было показано, что в этих условиях появляется существенная гетерогенность в размерах мышечных волокон (MB), а также появление гигантских волокон-мишеней [Резвяков, Н.П. Морфологическая и морфометрическая характеристика скелетных мышц после длительной статической нагрузки / Н.П. Резвяков, Ф.А. Абдулхаев, А. Р. Абдуллин // Архив анат., гистол. и эмбриол. - 1980. - С. 57-64].
Исследование проведено на половозрелых самцах крыс линии Wistar. Всех подопытных крыс случайным образом разделили на 2 группы по 6 крыс в каждой. Крысы, находящиеся в условиях свободной двигательной активности, составили контрольную группу, вторую группу составили самцы, которые подвергались статической нагрузке. Всех животных содержали в одинаковых условиях вивария на стандартном сбалансированном рационе, при свободном доступе к воде и пище, в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Длительность эксперимента составила 28 дней. Для моделирования статической физической нагрузки крысы опытной группы ежедневно помещались в предлагаемое устройство. Сначала животные помещались в устройство для кратковременного пребывания в условиях выполнения исследования для обучения - выработки у животного заданной стереотипной поведенческой реакции - длительному нахождению на вертикальном шесте. В первые дни крысы находились в вынужденном вертикальном положении в течение 3-4 минут. В ходе ежедневной тренировки в три повторности, длительность нахождения в вертикальном положении у крыс увеличивалась. Кратность занятий по обучению определяется сформированностью нужного двигательного навыка, как правило, достаточно пяти-семи дней для формирования стойкого поведенческого акта. На 8-28 день эксперимента время нахождения составляло от 35 до 60 минут. На 28 день эксперимента крыс наркотизировали и умерщвляли путем декапитации с соблюдением основных требований к эвтаназии, изложенных в Приложении №4 к «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных». С каждой пары конечностей извлекали m.Plantaris. Для проведения гистологического исследования изолированные мышцы фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Заливку в парафин осуществляли по стандартной методике. Готовили серийные парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование и визуализацию препаратов проводили с использованием микроскопа Axiolmager Z1 (C.Zeiss, Германия).
Морфометрические исследования заключались в оценке площади поперечного сечения MB, а также числа ядер на 100 мкм длины MB. Статистическую обработку данных производили в пакете прикладных программ STATISTICA V.7.0 ("StatsoftInc", США). Для всех имеющихся выборок проводили анализ соответствия вида распределения количественных признаков закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. Сравнительный анализ групп проводился с помощью параметрических методов (t - критерий Стьюдента). Количественные данные представлены в виде Μ ± m, где Μ - выборочное среднее, m - стандартная ошибка средней. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Проведенное нами морфологическое изучение m.Plantaris животных контрольной группы выявило их стандартное строение: плотно прилегающие MB имеют примерно одинаковые размеры (фиг. 3), которые окружены эндомизием с многочисленными кровеносными сосудами и ядрами на периферии MB. Следует отметить, схожесть большинства MB по форме и размерам, что свидетельствует о низкой степени гетерогенности MB у крыс в контрольной группе. На поперечных срезах мышечной ткани определяются гомогенные по форме и размерам MB с округлым профилем.
При изучении структурных особенностей m.Plantaris крыс, находившихся в условиях длительной статической нагрузки, выявлено большое число «гигантских» MB, которые на поперечных срезах имеют угловатую, призматическую форму. Данный факт согласуется с результатами исследований, в которых показано, что при длительной статической нагрузке выявляются существенная гетерогенность в размерах MB, а также гигантские волокна-мишени, что свидетельствует о неблагоприятном воздействии статической нагрузки на мышцу. Отчетливо видно появление в мышечной ткани более мелких волокон, что свидетельствует о том, что происходит их расщепление. Известно, что под влиянием длительной статической нагрузки - регенерация мышц, т.е. появление новых волокон, осуществляется как за счет продольного расщепления толстого гипертрофированного волокна на несколько тонких, так и за счет миосателлитов [Студитский, А.Н. Восстановительная функция мышечной ткани / А.Н. Студитский // Успехи современной биологии. - 1980. - Вып. 3 (б). - С. 419-439].
Таким образом, наблюдаемые нами реактивные изменения MB в условиях в экспериментальной модели, свидетельствует о том, что мышца действительно испытывает предельную физическую статическую нагрузку.
Полученные данные о структурных особенностях мышц под влиянием длительной статической нагрузки нашли отражение и в результатах морфометрического исследования, которые представлены в таблице.
У всех животных отмечалась гетерогенность MB, появление гигантских волокон - мишеней (фиг. 3), изменение морфометрических показателей, свидетельствующих о развитии стойких реактивных изменений ткани мышц, характерных для нагрузок статического типа (таблица).
Таким образом, использование предлагаемого устройства обеспечивает получение экспериментальной модели статической нагрузки, которая может быть воспроизведена на большом количестве животных, не требуя больших затрат и времени на ее выполнение. Техника моделирования проста, повторить ее легко.
Сущность изобретения поясняется следующим примером. Прошедший карантин самец крысы линии Wistar массой 180 г помещен в предлагаемое устройство для предварительного обучения длительному нахождению на вертикальном шесте с целью моделирования статической нагрузки. Через 1-3 минуты животное начинает спускаться с вертикального шеста. Оказавшись на полу на металлической токопроводящей решетке, животное получает удар током (электроболевое воздействие) и вынуждено снова взбираться на вертикальный шест (реакция избегания). В течение 7 дней животное помещалось в устройство для кратковременного пребывания в условиях выполнения исследования для обучения - выработки у животного заданной стереотипной поведенческой реакции - длительному нахождению на вертикальном шесте. В первые 7 дней животное находилось в вынужденном вертикальном положении в течение 3-4 минут. В ходе ежедневной тренировки в три повторности, длительность нахождения в вертикальном положении у животного увеличилась и составила на 8 день - 35 минут, на 15 день - 45 минут, на 27 день - 60 минут. На 28 день крысу наркотизировали и умертвили путем декапитации.
При проведении морфологического исследования в m.Plantaris были обнаружена гетерогенность MB, появление гигантских волокон-мишеней, изменение морфометрических показателей, свидетельствующих о развитии стойких реактивных изменений ткани мышц, характерных для нагрузок статического типа.