Наблюдение за регенерацией фоторецепторов у планарий Girardia tigrina (Platyhelminthes)

НАБЛЮДЕНИЕ ЗА РЕГЕНЕРАЦИЕЙ ФОТОРЕЦЕПТОРОВ У ПЛАНАРИЙ GIRARDIA TIGRINA

Седельников З.Ф., Знобищева А.В*., Крещенко Н.Д.

ФГБУ Институт биофизики клетки РАН *ФГБУ Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Введение. Планарии - свободноживущие плоские черви. Они занимают важное эволюционное положение в ряду билатерально симметричных животных. Наряду с нервной, мышечной, пищеварительной и выделительной системами у них есть простые глаза - фоторецепторы, с помощью которых животные различают интенсивность и направление светового потока и могут ориентироваться в пространстве.

В качестве классического биологического объекта планарии используются при изучении эволюции нервной системы и нейромедиаторов, бесполого размножения, стволовых клеток и феномена регенерации [1]. Мало что известно о структуре и функции фоторецепторов (глаз) у плоских червей, а также о возможности их регенерации. Было установлено, что динамика восстановления функции фоторецепторов была сходной у двуглазых и многоглазых видов планарий, и не зависела от числа глаз [2, 3].

Целью настоящей работы являлась разработка количественных критериев восстановления морфологической структуры глаз в процессе их регенерации.

Материалы и методы. Использовали планарий Girardia tigrina (Turbellaria, Plathelminthes) 9-10 мм длиной, у которых одна пара глаз, расположенных на головном конце тела (Рис. 1). Животных содержали в затемненных аквариумах при 19-21оС, кормили 2 раза в неделю. После отсечения серединного фрагмента тела (примерно 1/3 части планарии) визуально наблюдали за регенерацией глаз в популяции планарий. Изучали строение глаз у интактных (не регенерирующих) планарий с помощью гистологического и иммуноцитохимического методов с использованием тотальных препаратов и замороженных срезов (методики см. [4, 5]). В работе использовали бинокулярный, флуоресцентный и лазерный сканирующий микроскопы Zeiss Stemi DV4, Leica DM 6000B с фотокамерой Leica DFC 490, Leica TCS SP5 (Германия).

Результаты и обсуждение. Простейшие глаза планарий расположены на поверхности переднего конца тела и состоят из фоторецепторных и пигментных клеток, образующих «глазной бокал» (Рис. 1б). Глаза хорошо различимы как при гистологической, так и при иммуноцитохимической окраске. У интактных планарий парные глаза расположены по внутренней поверхности головного нервного ганглия и окружены нервными клетками и волокнами, иммунопозитивными к серотонину и нейропептиду NPF (Рис. 1а, г), Эти нейромедиаторы, вероятно, могут принимать участие в иннервации глазного бокала или тканей его окружающих. Продольные и круговые

мышечные волокна, входящие в состав мускулатуры тела планарий, огибают каждый глазной бокал (Рис. 1в), тонкие миофибриллы его окружают (Рис. 1г).

А, '* '

Рис. 1а. Иммуноокраска анти-серотонином (нейроны, яркие точки) и фаллоидином (мускулатура, серым) тотальных препаратов планарий. Флуоресцентная микроскопия. Темные пятна, вокруг которых расположены серотониновые нейроны -

Рис. 2а. Гистохимическая окраска фаллоидином мускулатуры тела (серым), флуоресцентная микроскопия. Темные пятна на дорзальной поверхности тела - фоторецепторы. Масштаб 300 мкм

Рис. 1б. Пигментные клетки (темным) в составе глазного бокала, замороженные срезы, световая микроскопия. Масштаб 100 мкм

Рис. 2б. Окраска фаллоидином мускулатуры тела (серым). Светлым -иммуноокраска к нейропептиду ЫРГ в нервной системе планарии (головной ганглий и нервные стволы). Глазные впадины (темные) расположены по внутренней поверхности нервного ганглия. Масштаб 100 мкм.

Известно, что планарии могут регенерировать целый организм из небольшого фрагмента тела. В процессе регенерации у них полностью восстанавливается нервная система, а также другие органы и ткани [6]. По нашим данным, в регенерирующих фрагментах тела планарий О. tigrina глаза начинают появляться с 3 по 5 дни после их отсечения. При визуальном наблюдении за регенерацией глаз мы выделили 4 стадии их дифференцировки (см. таблицу). Степень дифференцированности глаз у планарий могла варьировать, однако, в среднем, к 5 дню у большинства регенерирующих животных оба глаза были хорошо сформированы (76%), у 14% планарий один глаз из двух был лучше выражен, у примерно 4% особей наблюдали только один глаз, и у 6% - глаза вовсе отсутствовали.

Таблица

Стадии дифференцировки глаз на 5 день регенерации у планарий С1гаЫ1а tigrina. Количество особей и их процент от общего числа животных

Дата постановки опыта Стадии регенерации Число особей

Два глаза выражены хорошо Два глаза, один выражен слабее Один глаз Без глаз

21/05/12 58 - 69.9% 5 - 6.0% 5 - 6.0% 15 - 18.1% п=83

15/04/14 64 - 80.0% 12 - 15.0% 2 - 2.5% 2 - 2.5% п=80

23/04/15 83 - 77.6% 21 - 19.6% 3 - 2.6% 0 п=107

Среднее±8Б Суммарное число особ. 68.3±13.1 п2=205 - 75.9% 12.7±8.0 п2=38 -14.1% 3.3±1.6 п2=10 - 3.7% 5.7±8.1 п2=17 -6.3% п2=27 0

В работе впервые показано, что регенерация фоторецепторов в популяции планарий - процесс, растянутый во времени и продолжающийся с 3-го по 6-й дни после отсечения серединных фрагменов тела, у которых наблюдали за регенерацией глаз. За это время регенерирующие фоторецепторы претерпевают несколько стадий развития. Сначала может появляться один глаз, а затем второй; в случае, если появляются сразу оба глаза - один из них, как правило, слабее развит. Затем степень дифференцированности глаз становится более выраженной. В ходе регенерации, очевидно, происходит постепенное добавление пигментных, и/или фоторецепторных клеток в глазном бокале. Установлено, что, несмотря на всю субъективность визуальных наблюдений, регенерация глаз у планарий вполне поддается количественному описанию при использовании достаточного количества животных в выборке. Таким образом, регенерация фоторецепторов может служить еще одной количественной морфогенетической моделью у плоских червей, планарий.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 15-04-05948а.

Литература: l.Karami A., Tebyanian H., Goodarzi V., Shiri S.//International Journal of Stem Cells. - 2015. - V.8. - N.2. -P. 128-133. 2.Туровская М.В., Седельников З.Ф., Крещенко Н.Д.//Сб.матер.научн.конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М. - 2015. - Вып. 16.- С. 432-435. З.Шейман И.М., Крещенко Н.Д., Нетреба М.В.// Биофизика. - 2010. - Т.55. -С. 680-685. 4.Kreshchenko N., Sedelnikov Z., Sheiman I., et al. // Cell and Tiss. Res. - 2008. - V. 331. - P. 739-750. 5. Tolstenkov О., Terenina Т, Kreshchenko N, Gustafsson M.//Belg. J. Zool. - 2010. - V. 144. P. 133-136. 6.Tanaka E.M., Reddien P.W. // Developmental Cell. - 2011. - V. 21. - P. 172-185.

Observation on photoreceptor regeneration in planarians Girardia tigrina (Plathelminthes). Sedelnikov Z.F., Znobishcheva A.V., Kreshchenko N.D. Institute of Cell Biophysics; Institute of Fundamental and Experimental Biophysics.

Summary. The morphological criteria of photoreceptor regeneration were developed using in vivo observation and microscopic investigation of free-living flatworm G. tigrina. Different stages of photoreceptor regeneration were observed.