Испытание апатогенного вируса гриппа H5N3 в качестве живой ветеринарной вакцины

11. Shirvan A.N., Moradi M., Aminian M., Madani R. Preparation of neuraminidase-specific antiserum from the H9N2 subtype of avian influenza virus. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 2007; 31(4): 219-23.

12. Rowe T., Abernathy R.A., Hu-Primmer J., Thompson W.W., Lu X., Lim W. et al. Detection of antibody to avian influenza A(H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J. Clin. Microbiol. 1999; 37(4): 937-43.

13. Lu X., Renshaw M., Tumpey T.M., Kelly G.D., Hu-Primmer J., Katz J. M. Immunity to influenza A H9N2 viruses induced by infection and vaccination. J. Virol. 2001; 75: 4896-901.

14. Johnson P. R., Feldman S., Thompson J. M., Mahoney J. D., Wright P. F. Immunity to infuenza A virus infection in young children: a comparison of natural infection, live cold-adapted and inactivated vaccines. J. Infect. Dis. 1986; 154: 121-6.

15. Rudenko L.G., Arden N. H., Grigorieva E., Naychin A., Rekstin A., Kli-mov A. et al. Immunogenicity and efficacy of Russian live attenuated

and U.S. inactivated influenza vaccines used alone and in combination in nursing home residents. Vaccine. 2001; 19: 308-18

16. Stephenson I., Nicholson K.G., Glück R., Mischler R., Newman R.W., Palache A. M. et al. Safety and antigenicity of whole virus and subunit influenza A/Hong Kong/1073/99(H9N2) vaccine in healthy adults: phase I randomized trial. Lancet. 2003; 362: 1959-66.

17. Chen H., Subbarao K., Swayne D., Chen Q., Lu X., Katz J. et al. Generation and evaluation of a high-growth reassortant H9N2 influenza A virus as a pandemic vaccine candidate. Vaccine. 2003; 21:1974-9.

18. Karron R.A., Callahan K., Luke C., Thumar B., Mc Auliffe J., Schappell E. et al. A live attenuated H9N2 influenza vaccine is well tolerated and immunogenic in healthy adults. J. Infect. Dis. 2009; 199(5): 711-6.

19. Todd S., de Bruin E., Nhat N.T., Koopmans M., Boni M.F. Potential for H9-positive serological signals in humans due to cross-reactivity among influenza subtypes. J. Infect. Dis. 2014; 210(1) 161-3.

Поступила 17.03.14

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДк 615.371:578.832.1].036.8

Боравлева Е.Ю.1, Чвала И.А.2, Ломакина Н.Ф.1, Репин П.И.2, Мудрак Н.С.2, РуденкоЛ.Г.3, Гамбарян А.С.1,

Дрыгин В.В.2

Испытание апатогенного вируса гриппа H5N3 в качестве живой

ветеринарной вакцины

1ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», 142782, г. Москва; 2 ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», 600901, г. Владимир; 3ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», 197376, г. Санкт-Петербург

Сравнивали 4 экспериментальных штамма, сконструированных в лаборатории молекулярной биологии вирусов гриппа ФГБНУ «ИПВЭ им. М.П. Чумакова», с апатогенным Н5Ш-вирусом A/duck/Moscow/4182/2010 (dk/4l82) в качестве живой ветеринарной вакцины. Экспериментальные штаммы содержали Н5-гемагглюти-нин от вакцинного штамма VNH5N1-PR8/CDC-RG (VN-PR8) или аттенуированного вируса, полученного путем селекции из высоковирулентного Afchicken/Kurgan/3/2005 (H5N1). Внутренние гены и нейраминидаза экспериментальных штаммов были либо от холодоадаптированного донора аттенуации A/Leningrad/134/17/57 (H2N2), либо от непатогенного Н6№-вируса A/gull/Moscow/3100/2006. В опытах на мышах было показано, что все испытанные штаммы непатогенны для мышей, после однократной вакцинации вызывают высокий прирост антител и хорошо защищают от последующего заражения высоковирулентным вирусом H5N1. Индекс патогенности на курах всех экспериментальных штаммов равен нулю при значении 2,89 для вируса А/ ehicken/Kurgan/3/2005 (H5N1). Сравнивали разные схемы вакцинации цыплят. Штамм dk/4182 при аэрозольной вакцинации 1-дневных цыплят был апатогенен, обеспечивал высокий и равномерный прирост антител и полную защиту от последующего заражения вирусом A/сhicken/Kurgan/3/2005.

К л ю ч е в ы е с л о в а : вирус гриппа; H5N1;ветеринарная вакцина.

Для цитирования: Вопросы вирусологии. 2015; 60(4): 44-49.

Boravleva E.Y.1, Chvala I.A.2, Lomakina N.F.1, Repin P.I.2, Mudrak N.S.3, Rudenko L.G.3, Gambaryan A.S.1,

Drygin V.V.2

Testing of apathogenic influenza virus H5N3 as a poultry live vaccine

1 M.P. Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides, 142782, Moscow, Russia; 2Federal Center for Animal Health (FGBI "ARRIAH"), 600901,Vladimir, Russia; institute of Experimental Medicine, 197376, St. Petersburg,

Russia

Four H5N2 experimental vaccine strains and the apathogenic wild duck H5N3 influenza virus A/duck/ Moscow/4182/2010 (dk/4182) were tested as a live poultry vaccine. Experimental strains had the hemagglutinin of the A/Vietnam/1203/04 strain lacking the polybasic Ha cleavage site or the hemagglutinin from attenuated virus (Ku/ at) that was derived from the highly pathogenic influenza virus A/chicken/Kurgan/3/2005 (H5N1). The hemagglutinin of the Ku-at has the amino acid substitutions Asp54/Asn and Lys222/Thr in HA1 and Val48/ile and Lys131/Thr in HA2, while maintaining the polybasic HA cleavage site at an invariable level. The other genes of these experimental strains were from the H2N2 cold-adapted master strain A/Leningrad/134/17/57 (VN-Len and Ku-Len) or from the apathogenic H6N2 virus A/gull/Moscow/3100/2006 (VN-Gull and Ku-Gull). A single immunization of mice with all tested strains elicited a high level of serum antibodies and provided complete protection against the challenge with the lethal dose of Afchicken/Kurgan/3/05. The pathogenicity indexes of the Ku-at and the other strains for chicken were virtually zero, whereas the index of the parent H5N1 virus A/chicken/Kurgan/3/2005 was 2.98. intravenous, intranasal, and aerosol routes of vaccination were compared. it was shown that the strain dk/4182 was totally apathogenic for one-day-old chicken and provided complete protection against the highly pathogenic H5N1 virus.

Key words: influenza virus A; H5N1; poultry vaccine.

Gtation: Voprosy virusologii. 2015; 60

For correspondence: Aleksandra Gambarya, MD, PhD,ScD; e-mail: al.gambaryan@gmail.com

Received 30.11.13

Для корреспонденции: Гамбарян Александра Сергеевна, д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярной биологии вирусов гриппа; e-mail: al.gambaryan@gmail.com

Введение

Широкое распространение высоковирулентных вирусов гриппа кур H5N1 в странах Юго-Восточной Азии и Африки не только наносит колоссальный ущерб птицеводству этих стран, но и является источником постоянной опасности как для местного населения, так и для всего человечества. Если вирус приобретет способность передаваться от человека к человеку, возможна пандемия, сравнимая по последствиям с пандемией «испанки» 1918 г

Созданы вакцины, которые должны обеспечить защиту людей в случае пандемии гриппа H5N1. Однако еще более благоприятным сценарием было бы прекращение циркуляции этих опасных вирусов за счет широкой вакцинации домашней птицы. Методами обратной генетики создано множество штаммов-продуцентов H5N1 для производства инактивиро-ванных вакцин [1]. Такие вакцины демонстрируют высокую эффективность в эксперименте, но по каким-то причинам не обеспечивают надежной защиты птиц при практическом применении в ветеринарии [2]. Кроме того, они слишком дороги для поголовной превентивной вакцинации домашней птицы.

Живые гриппозные вакцины требуют значительно меньших количеств антигена, чем инактивированные, поэтому они дешевле и при острой необходимости могут быть быстро наработаны в достаточных количествах [3]. Живые ат-тенуированные вакцины против болезней Марека, Ньюкасла, Гамборо, микоплазмоза, инфекционного ларинготрахеита и энцефаломиелита птиц успешно применяются в птицеводстве [4-6].

В ряде лидирующих лабораторий мира не прекращаются попытки создания живых ветеринарных вакцин против H5N1. Очень распространены живые химерные вакцины [7-9].

Так, М. Park и соавт. сконструировали химерные вакцины со встроенным доменом гемагглютинина Н7 на базе вируса NDV и встроенным эктодоменом NDV на базе вируса H5N1 [8]. L. Cornelissen и соавт. сконструировали штамм NDV, экс-прессирующий растворимый тример гемагглютинина Н5 [7]. Вышеперечисленные вакцины были эффективны против как патогенных вирусов NDV, так и вирусов птичьего гриппа.

S. Pavlova и соавт. получили рекомбинант аттенуированно-го вируса ларинготрахеита кур, устойчиво экспрессирующий ген гемагглютинина Н5. Данный вакцинный штамм защищал кур от высоковирулентных H5N1 вирусов различных эволюционных ветвей [9].

Н. Cui и соавт. получили рекомбинант авирулентного вируса болезни Марека (MDV), экспрессирующий гемагглютинин высоковирулентного H5N1 вируса. Полученный штамм показал высокую эффективность против как летальных MDV, так и высоковирулентных H5N1 вирусов [10].

Традиционным подходом к созданию аттенуированных противогриппозных вакцин является получение реассортан-тов антигенно-актуального вируса с другим вирусом гриппа, так называемым донором аттенуации, которым может быть либо холодоадаптированный вирус, либо апатогенный вирус диких птиц. Однако в работах [11, 12] показано, что реассор-танты с холодоадаптированными внутренними генами недостаточно иммуногенны для кур.

В последние годы становится популярной идея конструирования живых вакцин для домашней птицы на основе птичьих вирусов. Так, H.Shi и соавт. методом обратной генетики создали штамм H5N1, в гемагглютинине которого удален сайт нарезания, а все внутренние гены происходят от апато-генного H9N2 вируса А/сЫскеп/Г798 [13].

Аналогичный реассотрант с внутренними генами от апа-тогенного H6N2 вируса чайки получен Е.Ю. Боравлевой и соавт. [14].

W.Zhang и соавт. разработали новый температурочувстви-тельный донор аттенуации на базе апатогенного Н9№-вируса утки. Реассортанты H5N1 с формулой 6x2 с внутренними генами от этого донора хорошо защищали кур от летальной H5N1 инфекции [15].

Появились новые подходы, базирующиеся на понимании молекулярных механизмов патогенности вирусов гриппа и методе обратной генетики [16, 17].

После того как было показано, что неструктурный белок вируса гриппа NS1 подавляет клеточный ответ на интерферон 1 [18], началась разработка так называемых дельта-NSl-вакцин (delNSl), лишенных белка NS1 частично или полностью [19-22].

Несмотря на множество наработок, использование живых анти- Н5№-вакцин в ветеринарии не практикуется по двум причинам. Во-первых, одним из затруднений является невозможность исследовать эпидемиологическую ситуацию серологически, поскольку невозможно отличить антитела, вызванные внешней инфекцией, от антител к вакцине.

Для преодоления этого затруднения используют стратегию «дифференцирования вакцинированных и инфицированных животных» (DIVA), а именно введение в вакцину специальных антигенных маркеров, отличающих ее от дикого вируса. Одним из приемов стратегии DIVA является введение в вакцинный штамм нейраминидазы, отличной от нейраминидазы циркулирующего вируса [23].

Во-вторых, имеются опасения утечки вируса в окружающую среду с восстановлением высокой патогенности за счет мутаций или реассортаций с другими вирусами [24]. Действительно, трудно исключить возможность того, что вирус, лишенный гена NS1, не приобретет этот ген при совместном заражении клетки вакцинным и диким вирусом. В то же время делеция гена NS1 настолько хорошо аттенуирует вирус, что остальные гены могут, не проявляя этого, нести в себе множественные факторы патогенности. В таком случае ре-ассортант, восстановивший ген NS1, может оказаться весьма опасным вирусом.

Живая вакцина, не вызывающая такого опасения, должна быть аттенуирована не по одному принципу или одному гену, а желательно по всем генам, тогда она не сможет служить причиной возникновения опасных реассортантов. Теоретически можно допустить, что апатогенные Н5 вирусы диких уток могут служить живой анти-Н5- вакциной. В ходе долгой совместной эволюции со своими хозяевами они приспособились хорошо размножаться, не причиняя вреда инфицированной птице [25]. Однако в литературе мало данных, касающихся иммуногенности утиных вирусов для кур, более того, по данным T.Ito и соавт., вирус H5N2 диких уток вообще не способен инфицировать кур [26].

Целью настоящей работы было сравнение апатогенного H5N3 вируса дикой утки и ряда штаммов, аттенуированных по разным принципам, в качестве живой ветеринарной вакцины против H5N1. Ранее мы описали получение 4 реассор-тантных штаммов с формулой H5N2 [12, 14]. Источниками Н5-гемагглютинина для рекомбинантов служили вакцинный штамм A/Vietnam/1203/04-PR8/CDC-RG (VN-PR8) либо ат-тенуированный вирус H5N1, полученный путем селекции из высоковирулентного А/сЫскеп/Кш£ап/3/2005 [27]. Внутренние гены и нейраминидаза экспериментальных штаммов были либо от холодоадаптированного донора аттенуации A/ Leningrad/134/17/57 (H2N2), либо от непатогенного вируса A/gull/Moscow/3100/2006 (H6N2) [28]. В данной работе приводятся результаты сравнительных испытаний на мышах и курах вышеописанных штаммов и апатогенного вируса дикой утки A/duck/Moscow/4182/2010 (H5N3).

Материалы и методы

Вирусы. Н6№-вирус A/gull/Moscow/3100/2006 (gull/3100) и H5N3- вирус A/duck/Moscow/4182/2010 (dk/4182) выделены из фекалий соответственно чайки и утки с московского пруда и хранятся в коллекции Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова [28]. Вирус VNH5N1-PR8/CDC-RG (VN-PR8) любезно предоставлен д-ром Р. Донисом (CDC, США). Холодоадаптированный вирус A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) был получен в Институте экспериментальной медицины (Санкт-Петербург).

Работа с высоковирулентным вирусом А/сЫскеп/Kur-gan/3/2005 проводилась в условиях третьего уровня биологической безопасности. Вирусы выращивали в 10-дневных куриных эмбрионах. Инфекционность вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) определяли титрованием на эмбрионах и выражали в ЭИД50.

Аттенуированный вариант А/chicken/Kurgan/ 3654at/2005 (Ku/at) был получен из высоковирулентного вируса A/chicken/Kurgan/3/2005 (H5N1) культивированием в условиях, имитирующих жизненный цикл вирусов гриппа диких уток, как описано в [27].

Получение холодоадаптированных реассортантов VN-Len и Ku-Len, а также реассортантов VN-Gull и Ku-Gull описано в [14]. Генный состав реассортантов установлен секвенированием определенных фрагментов генома либо в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с дифференцирующими праймерами [14]. Номера нуклеотидных последовательностей, зарегистрированных в GenBank: EU152234-EU152241, DQ323672-DQ323679, HQ724520-HQ724527, CY120776, KF885672-KF885679.

Определение индекса патогенности вирусов на курах. Внутривенно каждому из 10 6-недельных неиммунных цыплят вводили по 0,1 мл исследуемой стерильной вируссодержащей суспензии в разведении 1:10 на стерильном фосфатно-солевом буфере (ФБР). Отсутствие специфических антител в крови цыплят подтверждали в реакции торможения гемагглютина-ции (РТГА).

За птицами устанавливали ежедневное наблюдение в течение 10 сут и рассчитывали индекс патогенности (IVPI) как описано в [11].

Все экспериментальные исследования на мышах и курах проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Аэрозольная вакцинация и контрольное заражение цыплят. Цыплят помещали в 20-литровый контейнер, к которому была подведена трубка от ультразвукового распылителя «Муссон» (изготовитель - Алтайский приборостроительный завод, г Барнаул). Отводящая трубка была направлена на HEPA-фильтр. Создавали аэрозоль из свежей ВАЖ. Цыплят выдерживали в аэрозольной атмосфере 30 мин. После обработки цыплят 10 мин облучали ультрафиолетом и рассаживали по клеткам, после чего ежедневно взвешивали, собирали фекалии и контролировали падеж. Через 14 дней брали пробы крови из подключичной вены на определение антител, а через 30 дней проводили контрольное заражение (КЗ) вирусом гриппа А/сЫскет* Kurgan/3/2005 (H5N1) также аэрозольным способом.

Определение вируса в фекалиях кур. С 3-го по 6-й день после инфицирования или после КЗ цыплят по одному пересаживали из клетки, где содержалась вся группа, в коробки с чистой фильтровальной бумагой на дне. Через полчаса собирали свежие фекалии с фильтровальной бумаги, суспендировали в двойном объеме ФБР с добавлением антибиотиков (0,4 мг/мл гентамицина, 0,1 мг/мл канамицина, 0,01 мг/мл нистатина и 2% раствора MycoKill AB («PAA Laboratories GmbH»)), центрифугировали при 4 тыс. об/мин 10 мин и заражали суперна-тантом 10-дневные куриные эмбрионы. Через 48 ч инкубации собирали аллантоисную жидкость и определяли наличие вируса гриппа по реакции гемагглютинации.

Иммунизация и контрольное заражение мышей, а также определение антител к вирусам гриппа в сыворотках мышей и цыплят описаны в [14].

Результаты

Для аттенуации высоковирулентного Н5№-вируса AсЫcken/ Kurgan/3/2005 мы проводили селекцию в условиях, имитирующих жизненный цикл вирусов диких уток, а именно выдерживали вирус в кислой среде, обрабатывали инфекционный материал протеазами, а на последнем этапе отбирали живых эмбрионов после 3-дневного культивирования. В ходе селекции в гемаплютинине Ku/at появились 4 аминокислотные замены, 3 из которых являются реверсиями к последовательности, характерной для непатогенных вирусов гриппа птиц [27].

Путем реассортации Ku/at с холодоадаптированным донором аттенуации A/Leningrad/134/17/57(H2N2) (Len) был получен штамм Ku-Len. Аналогичным образом из вакцинного штамма VNH5N1-PR8/CDC-RG (VN-PR8) получен реассор-тант VN-Len.

Затем путем реассортации штаммов Ku-Len и VN-Len с

Выживаемость мышей после вакцинации и контрольного заражения и прирост антител после вакцинации

Препараты: Доза, мкг НА/мышь Выживаемость* Антитела** Протектив-ность***

IgG1 IgG2a

Инактивированные вакцины (VN-PR8):

цельновирионная 0,5 97 ± 3 2 3,2 76 ± 12

цельновирионная 2 96 ± 4 2,5 3,6 95 ± 3

сплит 0,5 96 ± 4 < 2 < 2 17 ± 18

сплит 2 97 ± 3 < 2 2,2 72 ± 8

Живые (штаммы) ЭИД50/мышь

Ku/05 102 0 - - -

Ku/at 106 85 ± 12 3,1 4,2 98 ± 2

Ku-Len 107 95 ± 5 3 3,3 92 ± 6

Ku-Gull 106 90 ± 7 3,2 4,1 95 ± 5

VN-PR8 106 20 ± 10 3,5 3,9 96 ± 3

VN-Len 107 96 ± 3 2,9 3,2 94 ± 4

VN-Gull 106 91 ± 5 3,4 3,9 97 ± 2

dk/4182 106 96 ± 4 3,1 3,8 95 ± 4

Контроль без имму- - 97 ± 3 - - 0

П р и м е ч а н и е. Приводятся данные, усредненные по трем опытам. Каждая группа состояла из 20 мышей; * - % выживших после заражения испытуемым штаммом; ** - среднегеометрический титр, *** - % выживших на 14-й день после КЗ высоковирулентным вирусом А/сЫскеп/Кш^ап/3/2005 (Н5Ш) в дозе 100 LD50.

апатогенным вирусом чайки A/gull/Moscow/3100/2006 получены реассортанты Ku-Gull и VN-Gull. Во всех 4 реассор-тантах ген гемагглютинина соответствовал гемагглютинину Н5, а все остальные гены соответствовали генам доноров аттенуации - A/Leningrad /134/17/57 для Ku-Len и VN-Len и A/gull/Moscow/3100/2006 для Ku-Gull и VN-Gull, т. е. формула всех штаммов была H5N2 [14]. В качестве сравнения с искусственными штаммами в испытания был включен вирус дикой утки A/duck/Moscow/4182/2010 (H5N3).

Безопасность, иммуногенность и протективная активность штаммов на мышах

Как видно из табл. 1, вирулентность для мышей аттенуиро-ванного вируса Ku/at по сравнению с исходным вирусом Ku/05 снижена на много порядков; она ниже, чем у американского вакцинного штамма VN-PR8. Патогенность реассортантов Ku-Gull и VN-Gull еще ниже, а холодоадаптированных реассортантов Ku-Len и VN-Len, как и вируса dk/4182, - практически нулевая.

Все экспериментальные штаммы вызывали у мышей высокий и сбалансированный по содержанию IgG1/IgG2a прирост антител к Н5 геммагглютинину вируса гриппа.

Протективный эффект любого из экспериментальных штаммов сопоставим с эффектом высокой дозы инактиви-рованной цельновирионной вакцины и существенно выше, чем у сплит-вакцины. Однократное инфицирование любым из них приводит почти к 100% защите от последующего КЗ 100 ЛД50 вируса А/сhicken/Kurgan/3/2005.

Индекс патогенности экспериментальных штаммов при внутривенном заражении кур

Для определения индексов патогенности были сформированы 8 групп цыплят в возрасте 42 сут по 10 голов в каждой. Группы цыплят содержали в индивидуальных изолирующих боксах.

Индекс патогенности исходного вируса A/thicken/ Kurgan/3/2005 составил 2,89, в то время как у всех цыплят, внутривенно зараженных штаммами VN-Len, VN-Gull, Ku/at, Ku-Len, Ku-Gull, gull/3100 и dk/4182, в течение 10 сут наблюдений не отмечали каких-либо клинических признаков заболевания, и по результатам эксперимента все штаммы были признаны низковирулентными (IVPI=0).

Выживание цыплят разного возраста при разных способах заражения

Способ заражения

Штамм Внутривенный

Ku/05 0/10* 0/5 0/5

Ku/at 10/10 8/11 -

Ku-Len 10/10 20/20 19/19

Ku-Gull 10/10 14/17 1/13

VN-Len 10/10 19/19 12/12

VN-Gull 10/10 9/10 6/10

dk/4182 10/10 8/8 26/26

gull/3100 10/10 8/8 8/8

*Число выживших/число зараженных.

Сравнение патогенности экспериментальных штаммов при разныьх схемах заражении кур

Выживаемость инфицированных цыплят зависит от их возраста и пути введения вируса. 6-недельные цыплята выживали даже после внутривенного введения экспериментальных вакцинных штаммов (табл. 2). 5-дневные и 1-дневные цыплята частично гибли при инфицировании штаммами Ku/at, Ku-Gull и VN-Gull. Штаммы Ku-Len, VN-Len и природные изоляты dk/4182 и gull/3100 не вызвали ни одного случая падежа.

Иммуногенность экспериментальным штаммов для цыплят

Для оценки иммуногенности разных штаммов через 2 нед после инфицирования у каждого цыпленка брали по 200 мкл крови из подключичной вены и определяли титр специфических антител в сыворотках методом иммуноферментного анализа (ИФА). Антигенами служили соответствующие очищенные вирусы (VN-PR8 для определения антител к НА/Н5 и gull/3100 для НА/Н6). На рис.1 представлены титры антител в сыворотках крови индивидуальных цыплят после инфицирования реассортантными штаммами и вирусами гриппа диких птиц: A/duck/Moscow/4182/2010 (H5N3) и А/gull/ Moscow/3100/2006 (H6N2).

У цыплят, вакцинированных вирусами Ku-Len и VN-Len, среднегеометрические титры лежат между значениями 100 и 200, причем разброс титров от сыворотки к сыворотке достигает 20. Примерно у половины цыплят титры анти-Н5-антител ниже 100, что меньше защитной величины. Вирусы Ku-Gull и VN-Gull вызывают примерно в 10 раз более высокий и более равномерный прирост антител, надежно превышающий защитный уровень у всех инфицированных цыплят. Среднегеометрические титры в группах вакцинированных dk/4182 либо gull/3100 ниже, чем в группах Ku-Gull и VN-Gull, но даже в самых «слабых» сыворотках титр превышает защитный уровень (около 200). Соотношение им-муногенности реассортантов Ku-Len и VN-Len, с одной стороны, и Ku-Gull и VN-Gull - с другой, коррелирует с их патогенностью. Однако природные изоляты dk/4182 и gull/3100 обеспечивают высокий и равномерный прирост антител, не вызывая у цыплят клинических признаков заболевания.

Патогенность и протективная активность экспериментальным штаммов при аэрозольном заражении цыплят Выделение вируса с фекалиями

Сравнение внутривенной, интра-назальной и аэрозольной вакцинации (табл. 2) дало основание заключить, что наиболее жестким способом инфицирования является аэрозольная вакцина-

ция 1-дневных цыплят. Кроме того, чем моложе цыплята, тем они чувствительнее к КЗ, поэтому такая схема опыта лучше всего способна выявить слабые стороны экспериментальных вакцин. В табл. 3 и на рис. 2 приводятся результаты типичного опыта по аэрозольной вакцинации 1-дневных цыплят с последующим заражением 100 LD ШШ-вируса A^icken/ Kurgan/3/2005. Штаммы Ku-Gull и VN-Gull вызывают существенный падеж цыплят и выделяют вакцинный вирус с фекалиями, т. е. не пригодны для использования в качестве живой вакцины. Штаммы Ku-Len и VN-Len не вызывают признаков заболевания, нет падежа и кривая массы тела совпадает с кривой массы тела интактных цыплят; также нет выделения вируса. Однако эти штаммы недостаточно иммуногенны, и защита от последующего КЗ невелика. Наилучшие результаты получены с вирусом A/duck/Moscow/4182/2010, который не вызывал падежа и видимых признаков заболевания цыплят, но тем не менее обеспечивал высокий и равномерный прирост антител и 100% защиту от высоковирулентного вируса H5N1. После вакцинации вирус dk/4182 выделяется с фекалиями, однако возможная его утечка в окружающую среду не должна вызывать опасений, этот вирус и так циркулирует с утками как в дикой природе, так и в городских прудах. Важнее то, что куры, вакцинированные вирусом dk/4182, не выделяют вирус A/сhicken/Kurgan/3/2005 после КЗ. Иными словами, подобная вакцинация способна не только сохранять поголовье домашних птиц, но и тормозить распространение H5N1 вирусов.

Обсуждение

Вирусы H5N1 привлекли внимание широкой общественности в 1997 г после случаев смертельных заболеваний людей в Гонконге, где методом борьбы с опасным вирусом стало поголовное уничтожение всей домашней птицы, и эта мера принесла свои плоды - данная эволюционная ветвь вирусов H5N1 была полностью уничтожена. Вплоть до 2003 г. случаев заболевания людей не отмечали. Однако другие варианты вирусов H5N1 продолжали циркулировать среди домашней птицы, и начиная с 2003 г. эпизодически вызывали заболевания людей, часто со смертельным исходом. В 2005 г вирус распространился по всей южной части Евразии и в Африке. С вирусом ведется перманентная борьба - уничтожается поголовье птиц в местах вспышек, проводится вакцинация домашней птицы, но все эти меры оказываются недостаточными. По не совсем понятным причинам даже трехкратная вакцинация кур инактивированными вакцинами не предотвращает последующее заболевание и распространение вируса [2]. Непрекращающиеся усилия добиться полного антигенного соответствия вакцин циркулирующему вирусу приводят к ускорению эволюции вируса и изменению антигенных характеристик, что вызывает потребность в очередной модернизации вакцинных штаммов [29]. Одним из способов вырваться из этого порочного круга было бы использование живых вакцин, способных привести к гораздо более широкой перекрестной защите, чем инактивированные вакцины.

Ku-Len

155 anti-H5

Ku-Gull VN-Len VN-Gull dk/4182 gull/3100

2696 167 2063 1423 585

anti-H5 anti-H5 anti-H5 anti-H5 anti-H6

Рис. 1. Титры анти-Н5- либо анти-Н6-антител в сыворотках индивидуальных цыплят, инфицированных вирусами Ku-Len, Ku-Gull, VN-Len, VN-Gull, dk/4182 либо gull/3100.

Под названиями штаммов приведены значения среднегеометрических титров для всей группы и

специфичность антител.

Патогенность, выделение вируса с фекалиями и протектив-ность экспериментальных штаммов при аэрозольной вакцинации 1-дневных цыплят

После вакцинации После КЗ

Штамм доза ЭИД 50 выживаемость, %* вирус в фекалиях** выживаемость, % вирус в фекалиях

Ku-Len 106 100 - 25 +/-

Ku-Gull 105 20 + 100 -

VN-Len 106 100 - 20 +/-

VN-Gull 105 40 + 100 -

dk/4182 105 100 +/- 100 -

Контроль без имму- - 100 0 +/-

низации

П р и м е ч а н и е.* - выживаемость к стартовой величине после заражения испытуемым штаммом и после КЗ 100 LD50 вируса А/ сhicken/Kurgan/3/2005 (H5N1); ** - обнаружение вакцинного вируса (до КЗ) или вируса Ku/05 (после КЗ) в фекалиях на 3 - 6-й день после инфицирования. + - всегда, - - никогда, +/- - иногда.

В данной работе мы испытали в качестве живых ветеринарных вакцин 5 штаммов с гемагглютинином трех эволюционных ветвей субтипа Н5. Наши результаты подтвердили данные А. Suguitan и соавт. [11] о том, что вирусы с внутренними генами холодоадаптированного донора чрезмерно атте-нуированы для кур и не обеспечивают надежной защиты. В то же время все 3 штамма с внутренними генами от вирусов диких птиц обеспечивали полную защиту от КЗ высоковирулентным вирусом A/chicken/Kurgan/3/2005 (H5N1), несмотря на то, что гемагглютинин штамма VN-Gull относится к другой кладе H5N1- вирусов, а гемагглютинин вируса А/duck/ Moscow/4182/2010 - к отдаленной эволюционной ветви вирусов субтипа Н5 [30]. Результаты испытаний реассортантов Ku-Gull и VN-Gull дают информацию о механизмах патоген-ности ЮШ-вирусов. Оба этих штамма имеют 7 генов вируса gull/3100, полностью безопасного для цыплят. Гемагглю-тинин Ku-Gull несет 4 аттенуирующие мутации, снижающие рН конформационного перехода гемагглютиниа от 5,6 до 5,1. Тем не менее этот реассортант вызывает гибель 1-дневных цыплят, очевидно, за счет сохранения полиосновного сайта нарезания, который считается основным маркером патоген-ности вирусов гриппа птиц. Гемагглютинин VN-Gull лишен полиосновного сайта, однако этот реассортант также вызывает гибель 1-дневных цыплят, по-видимому, за счет высокого рН конформационного перехода. На зависимость инфекцион-ности ЮШ-вируса от рН конформационного перехода указывали также В. Krenn и соавт [20]. Иными словами, только молекула гемагглютинина ЮШ-вирусов обеспечивает как минимум два механизма повышения патогенности для кур.

Другие гены тоже несут многочисленные факторы патогенности (эта тема обсуждается в работе [27]). Это необходимо иметь в виду, конструируя вакцинные штаммы H5N1. В последние годы методом обратной генетики создано много экспериментальных живых вакцин путем внесения в геном вируса одного или ряда изменений, радикально устраняющих отдельные факторы патогенности. Полученные штаммы глубоко аттенуированы при сохранении хорошей иммуногенности [19-22]. Однако генетическая стабильность таких конструкций может вызывать сомнения. В случае реассортации, рекомбинации или реверсии может возникнуть вирус с нежелательными характеристиками. Не случайно в последнее время снова становится популярной старая идея В. Murphy - использовать гены авирулентных вирусов диких птиц как доноры аттенуации при создании вакцин [12-15, 31]. Вирусы гриппа диких птиц тысячелетиями подвергались стабилизирующему естественному отбору по признаку авирулентности. Лишь в противоестественных условиях птицеводческих ферм с круглогодичной скученностью птицы повышение вирулентности перестает

30 -I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-

0 1 23456789 10 11 12 Дни после вакцинации

—•—Контроль  dk4182 О Ku-Gull - X - Ku-Len —I—VN-Gull -A- VN-Len

Рис. 2. Динамика массы тела цыплят после аэрозольного заражения штаммами VN-Len, VN-Gull, Ku-Len, Ku-Gull и dk/4182.

быть препятствием для распространения вируса. За годы циркуляции в домашних курах у Н5Ш-вирусов практически во всех генах накопилось множество мутаций, повышающих их патогенность.

Логическим завершением идеи В. Murphy является использование в качестве живой вакцины природного авирулентно-го вируса целиком. Наш опыт показывает, что вирус H5N3 дикой утки хорошо работает в качестве живой ветеринарной вакцины против вирусов H5N1. Такая вакцина должна быть генетически стабильной. Возможная утечка вакцинного вируса во внешнюю среду не должна представлять проблемы, так как этот вирус и так свободно в ней циркулирует. Дополнительными преимуществами такой вакцины являются простота производства, дешевизна и отсутствие необходимости покупки патентов на использование.

Выводы

1. Получены аттенуированные реассортанты вирусов гриппа H5N1, перспективные в качестве продуцентов инактиви-рованных и живых вакцин.

2. Выбран штамм, который можно рассматривать как кандидат на ветеринарную живую вакцину против высоковирулентных вирусов H5N1.

Благодарности

Авторы выражают благодарность д.б.н. С.С. Ямниковой за предоставление штамма А/сhicken/Kurgan/3/2005, к.б.н. М.А. Циванюк и к.б.н. А.В. Щербакову (ФГБУ «ВНИИЗЖ») за участие в отдельных этапах работы и д-ру R.Donis (Центры по контролю и профилактике заболеваний, Атланта, Джорджия, США) за предоставление вакцинного штамма VNH5N1-PR8/CDC-RG. Работа поддержана грантами РФФИ 11-04-00517-а, 14-04-00547.

ЛИТЕРАТУРА

3. Гендон Ю.З. Преимущества и недостатки инактивированной и живой вакцины против гриппа. Вопросы вирусологии. 2004; 49(4): 4-12.

14. Боравлева Е.Ю., Ломакина Н.Ф., Кропоткина Е.А., Руднева И.А., Дрыгин В.В., Гамбарян А.С. и др. Упрощенный способ получения реассортанта вируса гриппа с Н5 гемагглютинином и остальными генами от апатогенного H6N2 вируса. Испытание полученного штамма на мышах и курах. Вопросы вирусологии. 2011; 56(6): 9-14.