ПОЛУЧЕНИЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ

УДК 57.085.23

Долганова О.М.

канд.мед.наук, доцент ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России

г. Новосибирск, РФ

ПОЛУЧЕНИЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ

Аннотация

Мезенхимальные стволовые клетки являются наиболее перспективными для использования в клеточной терапии. Жировая ткань взрослого человека в настоящее время рассматривается как источник получения мультипотентных стволовых клеток, альтернативный костному мозгу. В работе рассмотрены условия для получения мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани.

Ключевые слова

Мезенхимальные стволовые клетки, жировая ткань, культивирование, клеточная терапия

Регенеративная терапия является одним из динамически развивающихся направлений медицинской науки. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются наиболее перспективными для использования в клеточной терапии.

Универсальным источником получения МСК является костный мозг. Однако, к настоящему времени накоплен достаточно большой материал, указывающий на целесообразность выделения СМК из жировой ткани.

Жировая ткань взрослого человека представляет источник, альтернативный костному мозгу, получения мультипотентных стволовых клеток. В составе клеток жировой ткани выделяют аципоциты (жировые клетки) и клетки стромально-васкулярной фракции, состоящей из преадипоцитов, эндотелиальных, гладкомышечных клеток кровеносных сосудов, периваскулярных фибробластов и поддерживающей волокнистой коллагеновой стромы. Популяция стволовых/прогениторных клеток, имеющую мультилинейный потенциал дифференцировки, и во многом сходных с МСК костного мозга, обнаружена в строме [17]. МСК жировой ткани обладают высокой пластичностью и способностью к дифференцировке. Показана способность МСК in vitro к индуцированной дифференцировке в адипогенном, остеогенном, хондрогенном направлении, а также эндотелиальном, миогенном, гепатическом, эпителиальном и нейрогенном направлениях [3, 6, 10, 14]. В отличие от костного мозга жировая ткань имеет ряд преимуществ в более простом способе забора ткани для выделения и в количестве выделенных клеток из единицы объема [8, 15].

Впервые Zuk Р.А. с соав. (2002) провели выделение МСК жировой ткани, которые назвали «стволовые клетки обработанного липоаспирата» (processed lipoaspirate, PLA). В связи с незначительными модификациями метода в литературе встречается несколько названий МСК жировой ткани: адгезивные клетки стромы из жира человека (human adipose-derived adherent stromal, hADAS) [7]; стромальные клетки, происходящие из жира (adipose-derived stromal cells, ASCs) [9]; происходящие из жировой ткани стволовые клетки взрослых (adipose derived adult stem cells, ADAS); мезенхимальные стволовые клетки, происходящие из жира (adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ATD-MSC) [4, 12].

Выделение МСК жировой ткани согласно Mahmoudifar N., Doran P. (2015) [11]. Жировую ткань получают (300 мл и более) под местной анестезией при косметической липосакции, липоаспирации подкожного жира или путем эксцизии жировых отложений. Полученные образцы помещают во флаконы с базовой культуральной средой DMEM, содержащей 4,5 г/л глюкозы, 2мМ глутамин, и транспортируют во льду к месту выделения. Образцы должны быть использованы незамедлительно, допускается хранение в течение дня при 4 0С._Фрагменты полученной жировой ткани отмывают фосфатно-солевым буфером, измельчают и инкубируют с 0,075 % раствором коллагеназы I типа при 37 °С в течение 30-60 мин для дезинтеграции клеток. Инактивацию коллагеназы проводят добавлением равного объема культуральной среды DMEM, содержащую 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (FBS). Полученную суспензию

клеток центрифугируют при 400 х g в течение 5 мин, с получением двух фракции: в верхней располагаются адипоциты, а в осадке - стромально-васкулярные клетки с примесью гемопоэтических клеток. Полученный осадок ресуспендируют в среде DMEM/10% FBS и фильтруют через 100-цт нейлонный фильтр для удаления клеточного дебриса. Фильтрат центрифугируют повторно. Удаление эритроцитов проводят с помощью инкубации в лизирующем растворе хлорида аммония. Оценивают жизнеспособность полученных клеток с витальным красителем (трипановый синий), подсчитывают количество клеток

Полученные клетки помещают в культуральные 225-см2 Т-флаконы с плотностью 20 тыс. клеток на см2 и культивируют в 35 мл базовой среды DMEM/FBS (10%), с добавлением 1% антибиотика/антимикотика в СО2-инкубаторе при 37 0С, 5% СО2 и относительной влажности 95 %. Через 3 дня проводят смену культуральной среды. Первичная культура адгезивных клеток жировой ткани состоит из морфологически различающихся клеток, что связано с разнообразием исходного клеточного состава. В процессе монослойного культивирования происходит постепенное удаление слабоадгезивных клеток, и на 5-е сутки культивирования наблюдают равномерный рост клеток по всей поверхности культурального пластика. На 10-12-е сутки культивирования адгезивные клетки стромально-васкулярной фракции жировой ткани формируют 70-80% конфлюэнтного монослоя [2]. После достижении конфлюентного монослоя клетки снимают с подложки, используя 0,25% раствор трипсина-ЭДТА, обозначают как пассаж Р0 и пересевают для дальнейшей экспансии. В ходе субкультивирования время достижения конфлюентного монослоя составляет в среднем 3 суток на протяжении 5 пассажей. При этом гетерогенность исходной суспензии постепенно снижается, и уже после 3-4 пассажей культура МСК жировой ткани представлена популяцией преимущественно фибробластоподобных клеток. В ходе каждого пассажа количество клеток увеличивается в среднем в 2 раза [2, 17].

Для хранения МСК жировой ткани снятые с подложки клетки пассажа Р0 осаждают центрифугированием при низких скоростях, затем ресуспендируют в базовой среде DMEM/FBS (10%), делят на 3 объема, и помещают в пробирки с раствором для криоконсервации, содержащий DMEM/FBS (80%), диметилсульфоксид (ДМСО). Все процедуры проводят в стерильных условиях. Пробирки с клетками замораживают температуре при -80 0С в течение суток, затем перемещают в жидкий азот для хранения.

Для возобновления клеточной культуры МСК из замороженных клеток пассажа 0, пробирки быстро размораживают на водяной бане при температуре 37 С0. Клеточную суспензию делят на 3 культуральных Т-флакона 225см2 и культивируют в среде DMEM/10% FBS в СО2-инкубаторе при 37 0С, 5% СО2 и относительной влажности 100 % в течении 24 часов. Затем проводят смену культуральной среды для удаления ДМСО (содержащегося в среде для криоконсервации), продолжают культивировать до достижения конфлюэнтного монослоя, проводят смену среду каждые 3 суток.

Для характеристики клеточного фенотипа МСК жировой ткани проводят анализ экспрессии поверхностных белков и внутриклеточных маркеров с использованием методов проточной цитофлуометрии. Показано, что МСК костного мозга и жировой ткани имеют сходную фиброласто-подобную морфологию и характерный клеточный фенотип CD 90+, CD 105+, CD 44+, CD 119+, CD 34-, CD 45-, CD 31 -, CD14- [1]. Noel D. с соав. показали одинаковую способность к дифференцировке в остеогенном и хондрогенном направлениях МСК жировой ткани и костного мозга in vitro и in vivo [13]. Однако некоторыми авторами отмечается разная способность МСК к дифференцировке. Так, Bochev I. c соав., исследуя МСК костного мозга и жировой ткани в одинаковых условиях in vitro, установили, что они демонстрируют практически идентичные морфологические, иммунофенотипические, колониеобразующие свойства и способность к дифференцировке в адипогенном направлении [5]. Однако, МСК жировой ткани проявляли меньший потенциал к дифференцировке в остеогенном направлении, чем МСК костного мозга. Сходные данные о меньшем остеогенном потенциале МСК жировой ткани были получены и в работе [16].

Создание универсального метода выделения МСК из жировой ткани, оптимизации культивирования выделяемых клеток позволит более широко использовать уникальные возможности стволовых клеток в клинической практике специалистов разных профилей медицинской деятельности.

Список использованной литературы:

1. Зафранская М.М., Ламовская Н.В., Нижегородова Д.Б. и др. Морфология, кинетика роста и фенотип мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и жировой ткани человека// Иммунология, аллергология, инфектология- 2010.-Т. 4.-С. 86-93.

2. Петренко А. Ю., Петренко Ю. А., Скоробогатова Н. Г. и др. Стромальные клетки предшественники жировой ткани: выделение, фенотипические и дифференцировочные свойства при монослойном культивировании // Журн. АМН Украши. - 2008. -Т. 14, №2. - С. 354-365.

3. Adam J. Katz, Ashok Tholpady, Sunil S. Tholpady et al. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal cells // Stem Cells.- 2005.-V. 23.-Р.412-423.

4. Astori G., Vignati F., Bardelli S. et al. «In vitro» and multicolor phenotypic characterization of cell subpopulations identified in fresh human adipose tissue stromal vascular fraction and in the derived mesenchymal stem cells //J. Transpl. Med. - 2007. - V. 5, N1. - P. 55.

5. Bochev I., Elmadjian G., Kyurkchiev D. et al. Mesenchymal stem cells from human bone marrow or adipose tissue differently modulate mitogen-stimulated B-cell immunoglobulin production in vitro // Cell Biol. Int. -2008. - V. 32, N4. - P. 384-393.

6. Di Rocco G, Iachininoto M.G., Tritarelli A. et al. Myogenic potential of adiposetissue-derived cells // Journal of Cell Science 2006.-V.119:2 - P. 945-2952.

7. Katz A. J., Tholpady A., Tholpady S. S. et al. Cell surface and transcriptional characterization of human adiposederived adherent stromal cells // Stem cells. - 2005. - V. 23. -P. 412-423.

8. Kern S., Eichler H., Stoeve J. et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue // Stem Cells. - 2006. - May;24(5): 1294-301. Epub 2006 Jan 12

9. Lin Y., Tian W., Chen X. et al. Expression of exogenous or endogenous green fluorescent protein in adipose tissue-derived stromal cells during chondrogenic differentiation// Mol. Cell Biochem. - 2005. - V. 277. - P. 181-190.

10. Miranville А., Heeschen C., Sengenes C.et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells // Circulation 2004. - V.110-P.349-355.

11. Mahmoudifar N., Doran P.. Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Adipose Tissue // Methods Mol Biol. 2015;1340:53-64. doi: 10.1007/978-1-4939-2938-2_4.

12.Nathan S., Das De S., Thambyah A. et al. Cell based therapy in the repair of osteochondral defects: a novel use for adipose tissue // Tissue Eng. - 2003. - V. 9 . - P. 733-744.

13.Noel D., Caton D., Roche S. et al. Cell specific differences between human adipose-derived and mesenchymal-stromal cells despite similar differentiation potentials // Exp. Cell. Res. - 2008. - V. 314, N7. - P. 1575-1584.

14. Planat-Benard V., Menard, M.Andre C.et al. Spontaneous Cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells //Circ Res 2004.94:223-229

15. Strem BM, Hicok KC, Zhu M et al (2005) Multipotential differentiation of adipose tissue- derived stem cells. Keio J Med 54: 132-141.

16. Zaminy A., Ragerdi Kashani I., Barbarestani M. et al. Osteogenic differentiation of rat mesenchymal stem cells from adipose tissue incomparison with bone marrow mesenchymal stem cells: melatonin as a differentiation factor // Iran Biomed. J. - 2008. - V. 12, N3. - P. 133-141.

17.Zuk P. A., Zhu M., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells // Mol. Biol. Cell. - 2002. - V. 13. -P. 4279-4295.

©Долганова О.М., 2021