ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ И БАКТЕРИЙ И СТИМУЛЯЦИИ РОСТА РАСТЕНИЙ
STRAIN OF PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS BACTERIA FOR PLANT PROTECTION AGAINST PHYTOPATHOGENIC FUNGI AND BACTERIA AND STIMULATING PLANT GROWTH

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии и касается нового бактериального штамма Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D, обладающего способностью подавлять развитие фитопатогенных грибов и бактерий за счет продукции гетероциклического антибиотика феназин-1-карбоксамида и стимулировать рост растений за счет синтеза фитогормонов ауксинов. Предлагаемый штамм может быть использован для получения на его основе бактериального препарата.
В настоящее время одной из наиболее важных мировых проблем остается обеспечение продуктами сельскохозяйственного производства растущего населения планеты. Серьезной проблемой растениеводства являются фитопатогенные микроорганизмы и вредители, приводящие ежегодно к 30% потерям в мировом сельскохозяйственном производстве (Tilman D., Balzer С., Hill J., Beford B.L. Global food demand and the sustainable intensification of agriculture // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2011. - №108. - P. 20260-20264). Поэтому повышение урожайности сельскохозяйственных культур и создание более надежных, эффективных и экологичных способов борьбы с фитопатогенными микроорганизмами становится все более актуальной задачей.
Анализ мирового опыта показывает возрастающую роль биологических средств защиты растений в комплексе природоохранных мероприятий, которые в отличие от химических пестицидов, безвредны для окружающей среды и потребителя. Разработкой и производством коммерческих биопрепаратов для сельского хозяйства на основе PGPR Pseudomonas интенсивно занимаются практически во всех развитых странах (Lucy М., Reed Е., Glick B.R. Applications of free living plant growth-promoting rhizobacteria // Antonie van Leeuwenhoek. - 2004. - V. 86. - P. 1-25).
Известно, что PGPR Pseudomonas способны продуцировать широкий спектр антибиотических веществ, которые ингибируют рост и метаболизм других микроорганизмов при незначительных концентрациях (Haas D., and Défago G. Biological control of soil-born pathogens by fluorescent pseudomonads // Nat. Rev. Microbiol. - 2005. - V. 3(4). - P. 307-319). Наиболее хорошо изученными антибиотиками, играющими важную роль в подавлении болезней растений, являются гетероциклические феназиновые антибиотики. Известно, что феназин-1-карбоновая кислота является относительно слабыми антибиотиком (Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. - Киев; Наук, думка, 1990. - 264 с.). Ее антагонистическое действие зависит от кислотности среды и значительно снижается при повышении pH. Феназин-1-карбоксамид менее подвержен влиянию кислотности среды (Chin-A-Woeng T.F.C., G.V. Bloemberg, A.J. van der Bij, K.M.G.M. van der Drift, J. Schripsema, B. Kroon, et al. Biocontrol by phenazine-1-carboxamide-producing Pseudomonas chlororaphis PCL1391 of tomato root rot caused by Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici // Mol. Plant Microbe Interact. - 1998. - V. 11(11). - P. 1069-1077; Patent US 20140309232). Например, при pH 5.7 феназин-1-карбоксамид был в десять раз активнее в отношении фитопатогена Fusarium oxysporum f. sp. radices-lycopersici по сравнению с феназин-1-карбоновой кислотой. Активность феназин-1-карбоновой кислоты полностью уменьшалась при повышении pH до 5.9-7, в то время как антифунгальная активность феназин-1-карбоксамида сохранялась при всех исследованных значениях pH 3.1-7.
Известен штамм бактерий Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum (Авторское свидетельство СССР №1464468).
Однако этот штамм неэффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium spp. и Helminthosporium sativum.
Известен штамм бактерий Pseudomonas putida ВКМ В-1743Д, подавляющий рост грибов рода Fusarium и предназначенный для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибных патогенов (Патент RU 1805849).
Недостатком штамма является узкий спектр антагонистического действия.
Известен штамм бактерий Pseudomonas species В-696, проявляющий антагонистическую активность к фитопатогенным грибам Alternaria spp., Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum, Fusarium gibbosum, Fusarium sumbucinum, и препарат на его основе, используемый для стимуляции роста и защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов (Патент RU 2130261).
Однако отсутствуют сведения о действии этого штамма на такие широко распространенные возбудители болезней растений, как Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium nivale, Fusarium semitectum, Fusarium solani.
Известен штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, проявляющий антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным грибам Alternaria alternata, Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum, Fusarium gibbosum, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium nivale, Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium funiculosum (Патент RU 2203945).
Однако отсутствуют сведения о действии этого штамма на такой широко распространенный возбудитель заболевания корней пшеницы, как Gaeumannomyces graminis var. tritici.
Известен штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens Tx-1 (ATCC 55670) и метод его применения для контроля грибных и бактериальных инфекций растений. Метод основан на применении культуральной жидкости штамма Pseudomonas aureofaciens Tx-1, содержащей бактериальные клетки данного штамма и биологически активные метаболиты, главным образом феназин-1-карбоновую кислоту. Метод применим для обработки двудольных, однодольных и хвойных растений, рассады и семян (Patent US 6,348,193).
Однако отсутствуют сведения о содержании в культуральной жидкости бактериального штамма Pseudomonas aureofaciens Tx-1 других феназиновых производных, в частности феназин-1-карбоксамида.
Известен трансгенный флуоресцирующий штамм бактерий Pseudomonas sp. для биоконтроля грибных болезней растений. Данный штамм содержит локус для биосинтеза феназин-1-карбоновой кислоты, стабильно встроенный в геном и собственные гены для продукции антибиотика 2,4-диацетилфлороглюцина. Таким образом, штамм способен продуцировать два антибиотика - феназин-1-карбоновую кислоту и 2,4-диацетилфлороглюцин. Штамм подавляет фитопатогенные грибы родов Rhizoctonia, Gaeumannomyces graminis и Pythium (Patent US 6,277,625).
Недостатком штамма является то, что он получен в результате генетических манипуляций и представляет собой генетически модифицированный микроорганизм.
Известен биоинженерный штамм Pseudomonas sp., для продукции нового микробиологического фунгицида, главным компонентом которого является феназин-1-карбоксамид. Данный штамм получен в результате трансформации родительского штамма-продуцента феназин-1-карбоновой кислоты Pseudomonas spp. M18 или M18G рекомбинантной плазмидой, несущей ген phzH, в результате чего биоинженерный штамм становится способным продуцировать феназин-1-карбоксамид. Штамм подавляет фитопатогенные грибы родов Pythium, Phytophthora и Rhizoctonia (Patent US 20140309232).
Недостатком штамма является то, что он получен в результате генетических манипуляций и представляет собой генетически модифицированный микроорганизм.
Особенностью изобретения является использование в качестве фунгицида культуральной жидкости (fermentation broth), содержащей феназин-1-карбоксамид или выделенный из нее антибиотик.
Известен штамм Pseudomonas aeruginosa В5 и метод получения из его культуральной жидкости рамнолипида В и оксихлорорафина (феназин-1-карбоксамида). Штамм проявляет антифунгальную активность против фитопатогенных грибов М. grisea, Alternaria mali, Alternaria panax, Alternaria slani, Botryosphaeria dothidia, Cercospora capsici, Botryosphaeria dothidia, Cercospora capsici, Cercospora kikuchi, Cladosporium и т.д. (Patent KR 20010038285).
Недостатком штамма является то, что вид бактерий Pseudomonas aeruginosa относится к условно-патогенным микроорганизмам (4 группа патогенности).
В качестве прототипа выбран штамм Pseudomonas chlororaphis NCIMB 40616, обладающий способностью продуцировать биологически активные антифунгальные метаболиты, подавляющие рост фитопатогенных грибов родов Drechslera, Microdochium, Tilletia и Ustilago, которые вызывают наиболее распространенные инфекционные болезни зерновых культур. Штамм может быть применим для обработки семян растений, вегетирующих растений и среды для выращивания растений (Patent US 5,900,236).
Однако в патенте отсутствуют сведения о химической природе продуцируемых антифунгальных метаболитов. Из описания не ясно, имеются ли в культуральной жидкости бактериального штамма Pseudomonas chlororaphis NCIMB 40616 феназиновые производные, в частности феназин-1-карбоксамид. Отсутствуют сведения о действии этого штамма на такой широко распространенный возбудитель пшеницы, как Gaeumannomyces graminis var. tritici, а также на фитопатогенные грибы родов Pythium, Fusarium и Rhizoctonia.
Кроме того, во всех перечисленных аналогах и прототипе нет сведений о способности штаммов-антагонистов фитопатогенных грибов продуцировать ауксины (фитогормоны растений).
Образование фитогормонов (стимуляторов роста растений) - одно из важнейших свойств ризосферных бактерий, относящихся к группе PGPR (сокращение от Plant Growth-Promoting Rhizobacteria - ризосферные бактерии, стимулирующие/улучшающие рост растений). Хорошо известно, что способность PGPR бактерий к синтезу фитогормонов может положительно влиять на рост и развитие растений (Patten C.L., Glick B.R. Role of Pseudomonas putida indoleacetic acid in development of the host plant root system // Appl. Environ. Microbiol. - 2002. - V. 68(8). - P. 3795-3801).
Задачей изобретения является выделение нового природного штамма бактерий, используемого для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий за счет синтеза гетероциклического антибиотика феназин-1-карбоксамида и стимуляции роста растений за счет синтеза фитогормонов ауксинов.
Техническим эффектом, который может быть получен при использовании предлагаемого штамма, является улучшение урожайности сельскохозяйственных культур и качества сельскохозяйственной продукции за счет подавления грибных и бактериальных инфекций растений.
Поставленная задача достигается выявлением и использованием бактериального штамма Pseudomonas chlororaphis Or3-3, выделенного из ризосферы растений пижмы обыкновенной, растущих на сельскохозяйственных почвах Орловской области (д. Снецкая Лука).
Штамм Pseudomonas chlororaphis Or3-3 имеет лабораторный номер BS1507 и депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ B-2956D.
Штамм Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D характеризуется следующими признаками.
Среды культивирования
2
4
4
2
2
4
2
4
4
4
2
Штамм хорошо растет на следующих средах (г/л, мл/л): LB (бактотриптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, хлористый натрий - 10, pH 7.2); Кинга Б (пептон - 20, KHPO - 1.5, MgSO×7HO - 1.5, глицерин - 10); триптозо-соевом агаре (триптозо-соевый экстракт - 30); минеральной синтетической среде М9 (NaHPO - 6, KHPO - 3, NHCl - 1, NaCl - 0.5, 1М MgSO - 2, 1M CaCl - 1, глюкоза - 2).
Морфология колоний
Морфологию колоний на питательных средах определяли после 4-5 сут роста при 28°C.
Колонии на среде LB круглые с ровными краями, гладкие, слабовыпуклые, непрозрачные, бежевые, не слизистой консистенции, диаметр 5-6 мм, пигмент не выражен.
На среде Кинга Б колонии зеленые, пигмент интенсивно-зеленый флуоресцирующий, диффундирует в среду.
Культурально-морфологические признаки
Клетки подвижные, палочковидные, с полярными жгутиками, грамотрицательные, спор не образуют.
Физиолого-биохимические признаки
Облигатный аэроб, температурный оптимум роста 24-30°C, растет при 4°C, растет в пределах pH среды от 5.2 до 8.0; оптимальное для роста значение pH 6.8-7.4.
В дополнительных факторах роста не нуждается (прототроф).
В качестве источника углерода использует глюкозу, сахарозу, декстрозу, трегалозу, глицерин, янтарную кислоту, бензойную кислоту, фенилуксусную кислоту, антранилат, мезоинозид.
Разжижает желатин.
Проверенные неиспользуемые источники углерода: ксилоза, гиппуровая кислота, салицилат, нафталин, фенантрен.
Устойчивость к антибиотикам
Штамм проявляет устойчивость к стрептомицину (100 мкг/мл), тетрациклину (30 мкг/мл), карбеницилину (1000 мкг/мл), цефтазидиму (20 мкг/мл), цефепиму (20 мкг/мл). Чувствителен к канамицину (100 мкг/мл), гентамицину (20 мкг/мл), хлорамфениколу (100 мкг/мл), меропенему (20 мкг/мл).
Хромосомная устойчивость к тяжелым металлам
Штамм обладает исходным уровнем хромосомной устойчивости к цинку и меди. Максимальная толерантная концентрация (МТК) цинка - 2.0 мМ, меди - 1.5 мМ.
Принципиальные физиологические свойства
Штамм обладает фунгицидными и бактерицидными свойствами.
Принципиальные специфические продукты
Штамм синтезирует гетероциклический феназиновый антибиотик феназин-1-карбоксамид, цианид водорода (HCN), сидерофоры, индолил-3-уксусную кислоту (ИУК).
Сведения по биологической безопасности
Штамм не патогенен для теплокровных животных и человека. Не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.
Штамм бактерий Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D хранят на чашках со средой LB при 4-7°C. Пересевы на свежие среды - один раз в месяц. Может храниться не менее 1 года в 15% глицерине при -20°C, не более 10 лет под вазелиновым маслом в полужидкой среде следующего состава (г/л): питательный бульон (Difco) - 4, NaCl - 5, агар - 6, pH 6.8.
Штамм бактерий Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D угнетает рост следующих фитопатогенных грибов: Gaeumannomyces graminis var. tritici штамм Ggt 1818, Gaeumannomyces graminis var. tritici штамм 119(2), Gaeumannomyces graminis var. tritici штамм PIT, Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Fusarium oxysporum, Fusarium geterosporum, Fusarium culmorum, Fusarium sporotrichum, Fusarium solani ВКМ F-2316, Rhizoctonia solani, Verticillium alba-artrum, Verticillium dahliae ВКМ F-933, Sclerotonia sclerotiorum, Alternaria brassicae ВКМ F-4284.
Штамм бактерий Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D угнетает рост фитопатогенных бактерий Pseudomonas siringae ВКМ B-1546D.
Штамм бактерий Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D может быть использован для защиты растений от широкого круга фитопатогенных инфекций.
Возможность осуществления предлагаемых объектов изобретений подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1. Получение биомассы бактериального штамма Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D.
9
Штамм выращивают в течение 24 ч при 24-30°C с аэрацией до титра 10 КОЕ/мл на среде LB следующего состава (г/л): пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, натрий хлористый - 10, вода водопроводная - 1 л. При необходимости суспензию клеток разводят водой до необходимого титра.
Пример 2. Антагонистическая активность штамма Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D в отношении фитопатогенных грибов родов Gaeumannomyces, Fusarium, Rhizoctonia, Verticillium, Sclerotonia, Alternaria.
Штамм бактерий Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D выращивают в жидкой среде LB 18 ч. На чашку Петри с агаризованной средой Каннера сеют 5 мкл бактериального штамма Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D (пятном диаметром 5 мм на расстоянии 3-3.5 см от центра чашки) и выращивают в течение 2 суток для достижения полного синтеза вторичных метаболитов. Затем в центр чашки Петри на поверхность агара помещают сегмент мицелия (диаметром 5-10 мм) грибного штамма. Мицелий гриба выращивают заранее на глюкозо-картофельном агаре при комнатной температуре в течение 7 суток.
Чашки Петри заклеивают парафильмом для поддержания необходимой влажности и инкубируют при комнатной температуре в течение 5-10 суток, после чего визуально оценивают наличие зоны подавления роста фитопатогенов (таблица 1, фиг. 1).
Из таблицы 1 следует, что бактериальный штамм Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D ингибирует, в той или иной степени, все используемые в данном эксперименте фитопатогенные грибы.
На фиг. 1 показан пример подавления роста мицелия фитопатогенных грибов Fusarium graminearum (а) и Gaeumannomyces graminis var. tritici (штамм Ggt 1818) (б) предлагаемым штаммом бактерий Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D (1) и ризосферными штаммами бактерий (2-5), не являющимися продуцентами феназин-1-карбоксамида. Хорошо видно наличие зоны подавления роста тест-гриба около штамма Pseudomonas chlororaphis ВКМ В-2956D. Ризосферные штаммы (2-5) не оказывают ингибирующего влияния на формирование мицелия исследуемых тест-грибов. Зон подавления вокруг них нет.
Пример 3. Способность бактериального штамма Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D продуцировать феназин-1-карбоксамид.
Качественный анализ феназиновых антибиотиков проводят с использованием метода тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для экстрагирования феназинов бактериальные культуры выращивают в течение 72 ч при 24°C в 10 мл триптозно-соевого бульона или среды Кинга Б. После осаждения клеток (5 мин, 8000 об/мин) супернатант подкисляют с помощью HCl до pH 2 и экстрагируют равным объемом хлороформа. После центрифугирования отбирают хлороформенную фракцию и выпаривают.
Для ТСХ пробы растворяют в 20 мкл ацетонитрила. 3-5 мкл раствора наносят на силикагелевые пластины с флуоресцентным анализатором (Fluka, Германия) и применяют систему растворителей хлороформ:этилацетат:муравьиная кислота (5:4:1). В качестве стандарта используют феназин-1-карбоновую кислоту и феназин-1-карбоксамид (Sigma, США).
На фиг. 2 приведена тонкослойная хроматография экстрактов культуральной жидкости ризосферных штаммов бактерий - продуцентов феназиновых антибиотиков.
Видно, что контрольный штамм бактерий Pseudomonas fluorescens 2-79 (1) продуцирует феназин-1-карбоновую кислоту, контрольный штамм бактерий Pseudomonas chlororaphis PCL1391 (2) продуцирует феназин-1-карбоксамид. Предлагаемый штамм бактерий Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D (3) продуцирует феназин-1-карбоксамид (5) и незначительные количества феназин-1-карбоновой кислоты (4).
При длительном выращивании штамма возможно выпадение феназин-1-карбоксамида в виде сине-зеленых кристаллов в среде культивирования.
Пример 4. Способность бактериального штамма Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D улучшать рост растений в условиях искусственного фитопатогенного фона.
Для создания искусственного фитопатогенного фона используют гриб Rhizoctonia solani, патогенность которого описана более чем на 200 видах растений.
2
5
2
Фитопатогенный гриб Rhizoctonia solani выращивают на агаризованной среде Каннера в течение 10 суток. Мицелий снимают шпателем и суспендируют в среде Мурашига-Скуга (Sigma, США). В пластиковые сосуды для выращивания растений вносят 100 г плодородного грунта для рассады «Богатырь» (ООО «Лама торф»), имеющего в своем составе торф верховой, торф низинный, песок, доломитовую муку, комплексное минеральное удобрение. Содержание доступных для растений элементов: азот 150-350 мг/л, фосфор (PO) 30 мг/л, калий (KO) 250-400 мг/л, микроэлементы: S, Mg, Ca, B, Fe, Zn, Mo, Cu, Mn; pH 5.5-6.5. Суспензией грибного мицелия увлажняют грунт из расчета 2 г сырого мицелия на 1 кг грунта. Влажность грунта составляет 60%. Грунт тщательно перемешивают и разравнивают.
Накануне экспериментов на влажной фильтровальной бумаге в чашке Петри в течение 18 ч проращивают семена огурца сорта «Изящный» фирмы «СеДек».
Накануне колонию штамма бактерий Pseudomonas chlororaphis ВКМ В-2956D петлей засевают в пробирку с 10 мл жидкой среды LB, выращивают при 28°C на термостатируемой качалке (150 об/мин). Через 18 ч роста бактериальную культуру разводят в 100 раз: в пробирку, содержащую 9.9 мл 10 мМ раствора сульфата магния, вносят 0.1 мл исходной культуры. Концентрацию бактерий в культуре определяют методом серийных разведений.
В пробирку с разведенной бактериальной суспензией помещают проросшие семена. Для контроля 15 семян помещают в пробирку с 10 мл раствора 10 мМ сульфата магния без бактерий. Семена инкубируют 1 ч.
Схема эксперимента:
1. Проростки, инокулированные суспензией штамма бактерий Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D; чистый грунт - 3 сосуда по 5 растений.
2. Проростки, инокулированные суспензией штамма бактерий Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D; грунт, зараженный Rhizoctonia solani (2 г мицелия/кг грунта) - 3 сосуда по 5 растений.
3. Неинокулированные проростки; грунт, зараженный Rhizoctonia solani (2 г мицелия/кг грунта) - 3 сосуда по 5 растений.
4. Неинокулированные проростки; чистый грунт - 3 сосуда по 5 растений.
Растения выращивают в течение 3 недель. По окончании эксперимента взвешивают корни и надземную часть каждого растения. По 15 экземплярам определяют среднюю массу корня и надземной части растения ± стандартное отклонение. Все необходимые расчеты проводят с помощью программы Excel.
Из таблицы 2 видно, что в условиях искусственного фитопатогенного фона (2 г мицелия Rhizoctonia solani/кг почвы, опыт №3) неинокулированные растения отстают от растений, выращенных в чистом грунте (опыт №4), по массе корней на 11% и надземной части на 22%.
В условиях фитопатогенного фона инокуляция проростков предлагаемым бактериальным штаммом Pseudomonas chlororaphis ВКМ В-2956D дает прирост массы корней на 16% и надземной части на 15% по сравнению с неинокулированными растениями (опыт №3). В чистом грунте без внесения Rhizoctonia solani (опыт №1) инокуляция проростков огурца предлагаемым штаммом Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D обеспечивает прирост массы корней на 17% и надземной части на 30% по сравнению с неинокулированными растениями (опыт №4).
Пример 5. Способность бактериального штамма Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D продуцировать фитогормоны ауксины.
3
Определение уровня продукции ауксинов проводят колориметрическим методом (Gordon S.A., Weber R.P. Colorimetric estimation of indole-acetic acid // Plant Physiol. - 1951. - V. 26. - P. 192-195). Бактерии выращивают в жидкой среде Кинг Б при 30°C. Клетки осаждают центрифугированием при 14000 об/мин 5 минут. К 1 объему супернатанта добавляют 0.5 объема реактива Сальковского (0.05 М FeCl в 35%-ной хлорной кислоте). Оптическую плотность определяют через 1 час при длине волны 540 нм на спектрофотометре Шимадзу UV-160A (Shimadzu, Япония). Определение содержания ауксинов в супернатанте проводят с помощью калибровочной кривой.
Калибровочную кривую строят с использованием раствора синтетической индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) (Sigma, США), которая является наиболее распространенным ауксином, широко применяющимся в растениеводстве. Готовят матричный раствор ИУК - 1 мг/мл в 96% спирте. Делают серию калибровочных растворов и концентрацией ИУК от 3 до 50 мкг/мл в среде Кинга Б и реактивом Сальковского. В качестве контроля используют среду Кинга Б без добавления ИУК с реактивом Сальковского.
Из таблицы 3 видно, что предлагаемый бактериальный штамм Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D способен продуцировать около 11 мкг/мл ауксинов, что сравнимо с продукцией ауксинов у штамма Pseudomonas aureofaciens BS1393, который является основой коммерческого, зарегистрированного в России биопрепарата «Псевдобактерин-2».
Таким образом, предлагаемый бактериальный штамм Pseudomonas chlororaphis ВКМ B-2956D обладает способностью к подавлению роста широкого круга фитопатогенов и продукции ауксинов. Штамм не токсичен для растений в рекомендуемых для обработок концентрациях. Он может быть использован для создания на его основе специального препарата, предназначенного для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий и стимуляции роста растений за счет синтеза фитогормонов ауксинов.