АВТОНОМНОЕ УСТРОЙСТВО ДЛЯ ВИТРИФИКАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРИОГЕННОГО ХЛАДАГЕНТА
SELF-CONTAINED DEVICE FOR VITRIFICATION OF BIOLOGICAL OBJECTS USING CRYOGENIC COOLANT

Изобретение относится к устройствам для витрификации биологических систем (вирусов, клеток, тканей, органов, целостных живых организмов, а также частей и компонентов вышеуказанных систем, например, клеточных органелл или продуктов жизнедеятельности биологических систем и их отдельных компонент или фрагментов, например антигенов, антител, гормонов), здесь и далее для краткости «биообъектов», с использованием жидкого криогенного хладагента, при котором охлаждение контейнера с биообъектами осуществляется в одном криогенном сосуде, например в сосуде Дьюара, после чего осуществляется операция перемещения контейнера в переносной криогенный сосуд для дальнейшего исследования хранения биообъектов.
В криобиологии витрификация представляет собой метод сверхбыстрого замораживания (криоконсервации) биообъектов без образования кристаллов льда, которые являются губительными для многих видов биообъектов. Обеспечить витрификацию в существующих технологиях удается при помощи высоких концентраций специальных веществ - криопротекторов. Однако криопротекторы сами негативно влияют на биообъекты. Критическая скорость охлаждения, необходимая для витрификации, обратно пропорциональна (функция близкая к обратному отрицательному логарифму) скорости охлаждения. Поэтому чем выше скорость охлаждения данных биообъектов, тем меньше необходимо криопротектора для обеспечения процесса витрификации, а значит как результат это ведет к лучшему качеству биоматериала после оттаивания (отогрева) биообъекта.
Одним из способов увеличения скорости охлаждения контейнера с биообъектами, а значит уменьшения криопротектора, является интенсивное перемещение контейнера в объеме жидкого криогенного хладагента.
Известно автономное устройство для витрификации биообъектов, имеющее коаксиальную конструкцию, включающую цилиндрический корпус, внутри которого установлена цилиндрическая аксиально удлиняемая опора, конец которой соединен с цанговым зажимом, обеспечивающим фиксацию трубки контейнера с биообъектами, пусковую пружину, которая взаимодействует с цилиндрической опорой и обеспечивает перемещение контейнера с биообъектами в сосуд с криогенным хладагентом через его горловину, цилиндрический теплоизоляционный экран с подвижной крышкой, защитный дисковый экран, фиксируемый на наружных выступах цилиндрического корпуса, и расположенную в верхней части устройства управляющую кнопку [1].
В этом устройстве имеется электродвигатель с источником питания, который обеспечивает вращение контейнера с биообъектами. Однако для обеспечения необходимой мощности на преодоление сил сопротивления вращению контейнера в криогенной жидкости габариты электродвигателя и источника питания должны быть значительны, что увеличивает вес и габариты всего устройства.
При быстром перемещении контейнера с биообъектами из комнатной температуры в криогенную жидкость, например жидкий азот, на границе их взаимодействия образуется так называемая «паровая рубашка» (эффект Лейденфроста), которая обладает теплоизоляционными свойствами и препятствует высокой скорости охлаждения контейнера. Если контейнер вращается электродвигателем на одном месте, как это происходит в известном устройстве, значительная (близкая к сои вращения) часть криоконтейнера все время находится в этой «паровой рубашке» и скорость его охлаждения невысока. Кроме того, это создает значительный градиент скорости охлаждения вдоль радиуса вращения, что может привести к неоднородности в качестве оттаиваемого биоматериала внутри контейнера, что является серьезным технологическим недостатком.
Кроме того, устройство не может обеспечить увеличение аксиальной длины опоры более чем в 2 раза, что затрудняет практическое его использование при наличии глубокого сосуда Дьюара или низком уровне криогенной жидкости.
Устройство негармонично и ненадежно за счет наличия нескольких управляющих кнопок, каждая из которых осуществляет лишь одну функцию.
В известном устройстве цилиндрический экран подвешивается на тонких проволочках - направляющих элементах, а его крышка управляется тонкими проволочками - подвижными тягами, что делает конструкцию ненадежной. Этому же способствует соединение крышки с цилиндрическим экраном на небольшом участке.
Задачей предлагаемого изобретения является повышение надежности и уменьшение массы устройства, увеличение его аксиальной длины при пуске контейнера с биообъектами в сосуд Дьюара и увеличение скорости его охлаждения.
Поставленная задача решается за счет того, что в известном автономном устройстве для витрификации биообъектов с использованием криогенного хладагента, имеющем коаксиальную конструкцию, включающую цилиндрический корпус, внутри которого установлена цилиндрическая аксиально удлиняемая опора, конец которой соединен с цанговым зажимом, обеспечивающим фиксацию трубки контейнера с биообъектами, пусковую пружину, которая взаимодействует с цилиндрической опорой и обеспечивает перемещение контейнера с биообъектами в сосуд с криогенным хладагентом через его горловину, цилиндрический теплоизоляционный экран с подвижной крышкой, защитный дисковый экран, фиксируемый на наружных выступах цилиндрического корпуса, и расположенную в верхней части устройства управляющую кнопку, в соответствии с предлагаемым изобретением и корпус, и опора телескопического типа содержат наружную и внутреннюю секции, между которыми расположена, по крайней мере, одна промежуточная секция, наружная секция корпуса соединена с дисковым основанием, а его внутренняя секция соединена с цилиндрическим теплоизоляционным экраном при помощи наружного кольца, причем между дисковым основанием и наружным кольцом установлена фиксирующая пружина, наружная секция опоры соединена с коаксиально установленной управляющей кнопкой, а ее внутренняя секция при помощи внутреннего кольца соединена с цанговым зажимом, наружное и внутреннее кольца расположены в одной плоскости так, что во внутренних пазах наружного кольца расположены наружные зубцы внутреннего кольца с возможностью аксиального перемещения внутреннего кольца относительно наружного кольца, подвижная крышка цилиндрического теплоизоляционного экрана выполнена в виде диафрагмы с поворотными лепестками, регулирующими диаметр отверстия, управляющая кнопка расположена над дисковым основанием и соединена с ним при помощи возвратной пружины, которая охвачена рядом защитных стенок, расположенных с возможностью перемещения в отверстиях дискового основания, пусковая пружина, установленная внутри опоры и соединенная с управляющей кнопкой и внутренним кольцом, удерживается в сжатом состоянии изменяющим свои радиальные размеры упругим фиксатором, который соединен с пусковой ручкой, расположенной в выемке управляющей кнопки, защитный дисковый экран установлен на наружной секции корпуса и выполнен из прозрачного теплоизоляционного материала.
Кроме того, дисковое основание выполнено с расширенной частью, предназначенной для захвата ее пальцами руки оператора.
Кроме того, защитный дисковый экран выполнен из органического стекла.
Кроме того, наружный диаметр защитного дискового экрана превышает диаметр горловины сосуда Дьюара с криогенным хладагентом.
Кроме того, пружины выполнены цилиндрическими винтовыми.
Кроме того, упругий фиксатор соединен с пусковой ручкой при помощи троса, который расположен внутри центральной трубки.
Кроме того, обращенная к пусковой ручке стенка фиксатора расположена под углом около 90° к оси, а его стенка, обращенная к внутреннему кольцу, расположена под углом около 45° к оси.
Кроме того, пусковая ручка выполнена с возможностью поворота в плоскости, перпендикулярной и параллельной оси устройства.
Кроме того, в качестве криогенного хладагента используется жидкий азот.
Отсутствие электродвигателя и источника питания повышает надежность и уменьшает массу устройства.
Выполнение и корпуса и опоры телескопического типа позволяет кратно, по крайней мере, в 3 раза увеличивать их аксиальную длину за счет последовательного расположения наружной и внутренней секций, между которыми расположена, по крайней мере, одна промежуточная секция.
Управление устройством осуществляется при помощи одной управляющей кнопки, которая обеспечивает фиксацию контейнера с биообъектами, линейное возвратно-поступательное его перемещение в криогенной жидкости, и открытие отверстия цилиндрического экрана. Возвратно-поступательное перемещение контейнера увеличивает скорость его охлаждения, поскольку он постоянно перемещается из области с «паровой рубашки» в жидкость, которая ее охлаждает.
Повышению надежности устройства способствуют: отсутствие тонких проволочек (направляющих элементов и тяг), фиксированная конструкция цилиндрического теплоизоляционного экрана и конструкция его крышки в виде поворотной диафрагмы.
Выполнение защитного дискового экрана из прозрачного теплоизоляционного материала, например из органического стекла, наружный диаметр которого превышает диаметр горловины сосуда Дьюара с криогенным хладагентом, позволяет устанавливать его на горловину сосуда и наблюдать за процессом охлаждения контейнера с биообъектами.
Пусковая ручка, управляющая упругим фиксатором, может вытягиваться при необходимости и прятаться в выемке управляющей кнопки за счет возможности поворота в плоскости, перпендикулярной и параллельной оси устройства.
За счет того что обращенная к пусковой ручке стенка фиксатора расположена под углом около 90° к оси, а его стенка, обращенная к внутреннему кольцу, расположена под углом около 45° к оси, обеспечивается фиксация сжатой пусковой пружины и свободное ее перемещение от разжатого в сжатое состояние.
Использование в качестве криогенного хладагента жидкого азота позволяет обеспечить высокую скорость охлаждения и высокую безопасность.
На фиг. 1 представлен пропитанный криопротектором контейнер (который в данном случае проницаем к криопротекторам и воде) для биообъектов;
на фиг. 2 - контейнер, наполненный биообъектами;
на фиг. 3 - автономное устройство для витрификации биообъектов при помощи криогенного хладагента (в дальнейшем именуемое «устройство») в исходном состоянии;
на фиг. 4 - часть устройства в момент отпускания пусковой пружины;
на фиг. 5 - устройство в рабочем положении, при котором контейнер с биообъектами находится внутри сосуда Дьюара с криогенным хладагентом;
на фиг. 6 - устройство на фиг. 5 без сосуда Дьюара и криогенного хладагента;
на фиг. 7 - устройство на фиг. 6 в момент опускания контейнера с биообъектами вниз;
на фиг. 8 - устройство, вынутое из сосуда Дьюара с криогенным хладагентом;
на фиг. 9 - устройство в положении, при котором контейнер с биообъектами находится в переносном криогенном сосуде;
на фиг. 10 - контейнер с биообъектами в закрытом переносном криогенном сосуде;
на фиг. 11 - вид А на фиг. 7;
на фиг. 12 - вид С на фиг. 3;
на фиг. 13 - вид Б на фиг. 6.
на фиг. 14 - вид В на фиг. 3;
на фиг. 15 - вид Г на фиг. 8 при несколько приоткрытой крышке цилиндрического экрана;
на фиг. 16 - сечение Α-A на фиг. 7;
на фиг. 17 - положение пусковой пружины и упругого фиксатора на фиг. 3 в увеличенном виде в исходном состоянии;
на фиг. 18 - вид на фиг. 17 при разжатой пусковой пружине в рабочем состоянии.
Автономное устройство для витрификации биообъектов с использованием криогенного хладагента (в дальнейшем именуемое «устройство») состоит из контейнера 1, пропитанного криопротектором, который соединен с трубкой 2, предназначенной для перемещений контейнера и наполнения его биообъектами 3.
Устройство имеет коаксиальную конструкцию. Цилиндрический корпус устройства 4 телескопического типа содержит наружную секцию 4а и внутреннюю секцию 4б, между которыми могут быть расположены, одна, например 4в, или несколько промежуточных секций. Телескопическая конструкция позволяет уменьшать или увеличивать длину наружного корпуса за счет перемещения внутренней секции 4б внутри промежуточной секции 4в, а последней - внутри наружной секции 4а.
Наружная секция 4а корпуса соединена с дисковым основанием 5, в котором имеется расширенная часть 5а, предназначенная для захвата ее пальцами руки оператора, который работает с устройством (на фиг.  не показан). Внутренняя секция 4б корпуса соединена с цилиндрическим теплоизоляционным экраном 6 при помощи наружного кольца 7.
Внутри цилиндрического корпуса 4 расположена цилиндрическая опора 8 телескопического типа, которая содержит наружную секцию 8а и внутреннюю секцию 8б, между которыми могут быть расположены, одна, например 8в, или несколько промежуточных секций. Телескопическая конструкция позволяет уменьшать или увеличивать длину опоры 8 за счет перемещения внутренней секции 8б внутри промежуточной секции 8в, а последней - внутри наружной секции 8а.
Наружная секция 8а опоры 8 соединена с управляющей кнопкой 9, а внутренняя секция 8б опоры при помощи внутреннего кольца 10 соединена с цанговым зажимом 11, который позволяет захватывать и фиксировать трубку 2 контейнера 1. Захваты (на фиг.  не показаны) цангового зажима 11 выполнены с конусообразным расширением на конце. Это позволяет, прикладывая аксиальное усилие прижатия, вставлять в них трубку 2 и фиксировать контейнер 1 в цанговом зажиме 11.
В исходном положении наружное 7 и внутреннее 10 кольца расположены в одной плоскости (фиг. 3). Наружное кольцо 7 выполнено с упорядоченно расположенными внутренними пазами 7а, в которых расположены наружные зубцы 10а внутреннего кольца 10 (фиг. 13). Зубцы 10а расположены в пазах 7а с возможностью свободного аксиального перемещения внутреннего кольца 10 относительно наружного кольца 7.
Крышка 6а цилиндрического экрана 6 выполнена в виде диафрагмы, поворотные лепестки 6б которой позволяют регулировать диаметр отверстия 6в от максимального (фиг. 14) до нулевого. (Поворотная диафрагма конструктивно выполнена аналогично оптической диафрагме фотоаппарата.)
На наружной секции 4а цилиндрического корпуса выполнены выступы 12, в которые вставляется защитный дисковый экран 13. Защитный экран 13 выполнен из прозрачного материала. Он предназначен для наблюдения за процессом охлаждения контейнера в криогенном хладагенте при обеспечении защиты рук оператора от криогенного хладагента.
Управляющая кнопка 9 соединена с дисковым основанием 5 при помощи возвратной пружины 14, которая охвачена снаружи рядом защитных стенок 9а, упорядочено расположенных в тангенциальном направлении (фиг. 16). Защитные стенки 9а, предназначенные для предотвращения контакта рук оператора с возвратной пружиной 14, расположены в отверстиях 5б дискового основания 5. Защитные стенки 9а кнопки выполнены с возможностью свободного тангенциального перемещения внутри отверстий 5б при повороте кнопки 9 относительно центральной оси 15 устройства.
Внутри цилиндрической опоры 8 установлена пусковая винтовая пружина 16, которая соединена с управляющей кнопкой 9 и внутренним кольцом 10. В исходном сжатом состоянии пусковая пружина 16 удерживается упругим фиксатором 17 (фиг. 3). Фиксатор 17 соединен с пусковой ручкой 18 при помощи троса 19, который расположен внутри центральной трубки 20 (фиг. 17). Обращенная к пусковой ручке 18 стенка 17а фиксатора 17 расположена под углом около 90° к оси 15, а его стенка 17б, обращенная к внутреннему кольцу 10, расположена под углом около 45° к оси 15.
Пусковая ручка 18 расположена в выемке 21 управляющей кнопки 9 и выполнена с возможностью поворота в плоскость, перпендикулярную оси 15 (ручка утоплена в кнопке) (фиг. 11), и в плоскость, параллельную оси 15 (ручка готова к работе) (фиг. 12).
При оттягивании ручки 18 вверх из выемки 21 управляющей кнопки 9 трос 19 втягивает упругий фиксатор 17 в центральную трубку 20, так что его радиальные размеры уменьшаются (фиг. 18).
Для витрификации биообъектов используется сосуд Дьюара 22 с жидким криогенным хладагентом 23, например жидким азотом, и переносной криогенный сосуд 24 с криогенным хладагентом 23, закрываемый крышкой 25.
При этом наружный диаметр защитного дискового экрана 13 больше диаметра горловины 22а сосуда Дьюара 22 (фиг. 5).
Между дисковым основанием 5 и наружным кольцом 7 установлена фиксирующая пружина 26.
Цилиндрические корпус 4 и опора 8 телескопического типа выполнены из прочного плохопроводящего металла, например из нержавеющей стали. Защитный дисковый экран 13 выполнен из прозрачного пластика, например из органического стекла. Цилиндрический теплоизоляционный экран 6 выполнен из теплоизоляционного материала, например пластмассы. Управляющая кнопка 9, пусковая ручка 18 и дисковое основание 5 выполнены из декоративной пластмассы.
Автономное устройство для витрификации биообъектов с использованием криогенного хладагента работает следующим образом.
До начала работы подготавливают устройство следующим образом.
На наружной секции 4а цилиндрического корпуса в выступы 12 вставляют и фиксируют защитный дисковый экран 13.
Крышку 6а цилиндрического экрана 6 устанавливают с максимальным отверстием 6в. Для этого, фиксируя дисковое основание 5, поворачивают управляющую кнопку 9 вокруг оси 15. При этом телескопическая опора 8 поворачивается относительно корпуса 4. Внутренне кольцо 10 своими зубцами 10а через пазы 7а поворачивает наружное кольцо 7 (фиг. 13) и поворотные лепестки 6б крышки 6а цилиндрического экрана 6 открывают отверстие 6в диафрагмы.
Управляющую кнопку 9 надавливают вниз относительно дискового основания 5, немного поворачивают относительно оси 15 и отпускают. При этом наружные зубцы 10а внутреннего кольца 10 выходят из внутренних пазов 7а наружного кольца 7. Внутреннее кольцо 10 устанавливается снизу наружного кольца 7, упираясь в него своими зубцами 10а.
После этого прикладывают аксиально сжимающее усилие между дисковым основанием 5 и цилиндрическим экраном 6. Сжимая пусковую пружину 16 и фиксирующую пружину 2б, складывают корпус 4 и опору 8. При этом витки пусковой пружины 16 легко проходят через стенку 17б упругого фиксатора 17. После того как пусковая пружина 16 полностью сжалась, ее витки удерживаются в сжатом состоянии стенкой 17а упругого фиксатора 17. В телескопической опоре 8 внутренняя секция 8б размещается внутри промежуточной секции 8в, которая, в свою очередь, размещается внутри наружной секции 8а. В телескопическом корпусе 4 внутри наружной секции 4а размещается промежуточная секция 4в, внутри которой размещается внутренняя секция 4б.
Помещают контейнер 1 в витрифицируемый раствор (на фиг.  не показан) при комнатной температуре на определенное время, например, 1 час, давая возможность контейнеру «пропитаться», т.е. проникнуть в середину. После этого при помощи трубки 2 переносят контейнер 1 в холодную зону с температурой 0°С.
Через 5-10 мин добавляют криопротектор в биообъекты 3 вне контейнера. При этом происходит насыщение криопротектором биообъектов.
После этого через трубку 2 загружают контейнер 1 биообъектами 3 (фиг. 2).
Вставляют конец трубки 2 в конусообразное расширение захватов цангового зажима 11 и, прикладывая аксиальное усилие, заводят трубку в захваты, которые фиксируют контейнер 1 с биообъектами 3 в цанговом зажиме 11 (фиг. 3).
После этого устройство устанавливают напротив горловины 22а сосуда Дьюара 22. При этом защитный прозрачный экран 13 можно фиксировать на этой горловине и наблюдать за последующим процессом снаружи, не боясь получить термического повреждения рук оператора.
Оператор оттягивает вверх пусковую ручку 18. При этом соединенный с ручкой 18 трос 19 втягивает в центральную трубку 20 упругий фиксатор 17, так что его наружный диаметр уменьшается (фиг. 18). Пусковая пружина 16 выходит из зацепления упругого фиксатора 17 и стремительно разжимается. При этом пусковая пружина 16 толкает внутреннюю секцию 8б телескопической опоры 8, а фиксирующая пружина 2б толкает внутреннюю секцию 4б телескопического корпуса 4.
Таким образом, осевые длины опоры 8 и корпуса 4 увеличиваются, и контейнер 1 с теплоизоляционным экраном 6 оказывается в криогенном хладагенте 23 сосуда Дьюара 22 (фиг. 5).
После чего управляющую кнопку 9 поворачивают вокруг оси 15 так, что наружные зубцы 10а внутреннего кольца 10 совпадают с внутренними пазами 7а наружного кольца 7.
После этого оператор двумя пальцами одной руки (на фиг.  не показаны), удерживая расширенную часть 5а дискового основания 5, свободным пальцем интенсивно нажимает на управляющую кнопку 9 (фиг. 7). При этом возвратная пружина 14 сжимается, а защитные стенки 9а кнопки заходят в отверстия 5б дискового основания 5. Телескопическая опора 8 вместе с контейнера 1 перемещается относительно корпуса 4 и опускается вниз, что обеспечивает его интенсивное охлаждение криогенным хладагентом 23.
После опускания кнопки 9 вниз до упора (витки пружины контактируют друг с другом) оператор сразу же отпускает кнопку 9. Под действием возвратной пружины 14 опора 8 вместе с контейнером 1 поднимаются вверх до исходного положения (фиг. 6). После этого оператор опять нажимает на управляющую кнопку 9 и процесс повторяется до тех пор, пока процесс охлаждения контейнера 1 с биообъектами 3 завершается.
Циклическое возвратно-поступательное аксиальное перемещение контейнера 1 относительно криогенного хладагента 23 способствует уменьшению эффекта Лейденфроста и способствует интенсификации охлаждения. В процессе охлаждения вокруг контейнера 1 наблюдается интенсивное парообразование, сопровождаемое бурлением криогенного хладагента 23. После полного охлаждения контейнера 1 бурление прекращается. Весь процесс охлаждения оператор контролирует через прозрачный защитный экран 13.
После охлаждения контейнера 1 с биообъектами 3, удерживая дисковое основание 5, поворачивают управляющую кнопку 9 вокруг оси 15. При этом телескопическая опора 8 вместе с контейнером 1 поворачивается относительно корпуса 4. Внутренне кольцо 10 своими зубцами 10а через пазы 7а поворачивает наружное кольцо 7 (фиг. 13), и поворотные лепестки 6б крышки 6а цилиндрического экрана 6 закрывают отверстие 6в диафрагмы. Таким образом, часть криогенного хладагента 23 находится внутри цилиндрического экрана 6, образующего замкнутую емкость.
После этого вынимают устройство с криогенным хладагентом 23 из сосуда Дьюара 22 и переносят в иное место, например в стерильную комнату или под ламинарный бокс (на фиг.  не показаны). Поскольку контейнер находится в криогенном хладагенте 23 (фиг. 8), то его температура сохраняется продолжительное время, что важно при относительно продолжительном процессе переноса.
После этого устройство опускают в переносной криогенный сосуд 24 с криогенным хладагентом 23 (фиг. 9). Удерживая дисковое основание 5, поворачивают управляющую кнопку 9 вокруг оси 15 в направлении, противоположному предыдущему. При этом телескопическая опора 8 вместе с контейнером 1 поворачивается относительно корпуса 4. Внутренне кольцо 10 своими зубцами 10а через пазы 7а поворачивает наружное кольцо 7, и поворотные лепестки 6б крышки 6а цилиндрического экрана 6 открывают отверстие 6в диафрагмы (фиг. 14).
Затем цанговым зажимом 11 отпускают трубку 2 с контейнера 1. Для этого управляющую кнопку 9 надавливают вниз относительно дискового основания 5, немного поворачивают относительно оси 15 и отпускают. При этом наружные зубцы 10а внутреннего кольца 10 выходят из внутренних пазов 7а наружного кольца 7. Внутреннее кольцо 10 находится снизу наружного кольца 7, упираясь в него своими зубцами 10а. После этого управляющую кнопку 9 оттягивают вверх относительно дискового основания 5, осуществляя раскрытие захватов цангового зажима 11.
Трубка 2 контейнера 1 с биообъектами 3 освобождается и опускается на дно криогенного сосуда 24, а устройство вынимается из этого сосуда. Управляющую кнопку 9 поворачивают вокруг оси 15 так, что наружные зубцы 10а внутреннего кольца 10 совпадают с внутренними пазами 7а наружного кольца 7. Криогенный сосуд 24 закрывают крышкой 25 и отправляют на дальнейшее хранение или исследование контейнера 1 с биообъектами 3.
Источники информации
1. US Patent Application Publication №US 2015/0150241 A1. - Int. C1. A01N 1/02. Portable Device and Method for Cryopreservation of Cells Encapsulated in Immunoisolating Devices. - Provisional application №61/910,263, filed 01.12, 2014. - Pub. Date 04.06.2015.