Способ биоконверсии подсолнечной лузги в кормовой продукт с высоким содержанием белка
METHOD FOR BIOCONVERSION OF SUNFLOWER HUSK INTO FEED PRODUCT WITH HIGH PROTEIN CONTENT

Изобретение относится к кормопроизводству и биотехнологии, а именно к биоконверсии подсолнечной лузги, являющейся отходом масложирового производства.
Подсолнечная лузга, как одревесневшая растительная ткань, содержит значительное количество пентозанов (18,4-28,0%), клетчатки (52,0-66,0%), лигнина (24,8-29,1%), целлюлозы (22,6-42,4%), фитомелана (1,4%), поэтому, после соответствующей предобработки с целью повышения биологической ценности, лузга может оказаться перспективным сырьем для получения новых ценных продуктов. В связи с этим предпринимаются попытки использования лузги после ее предобработки в качестве добавки в корм животным; в составе питательной среды для выращивания различных грибов; для выделения из лузги пигмента фитомелана, обладающего антиоксидантной активностью; а также использования лузги в качестве адсорбента для очистки вод от тяжелых металлов, нефтепродуктов и др. Однако все перечисленные разработки пока не рентабельны и промышленного применения не находят. В настоящее время основным способом рециклинга подсолнечной лузги остается ее переработка в топливные пеллеты.
Известен способ получения корма из отходов масложировой промышленности (SU 592403, 1978) путем измельчения и обработки лузги подсолнечника перборатом (0,5-0,7%) и соляной кислотой (3,0-4,0%) при 115-118°С в течение 2 мин с последующей добавкой мочевины (1,0-1,5%) и дополнительной выдержкой при той же температуре в течение 1 мин. Предлагаемый способ снижает содержание клетчатки в подсолнечной лузге с 50 до 37%, повышая, таким образом, кормовую ценность получаемого продукта.
Известен также способ переработки лузги подсолнечника в кормовую добавку (SU 1012870, 1983), характеризующийся тем, что неизмельченную лузгу увлажняют водой или липидной добавкой, полученной из отстоя, образующегося при рафинировании подсолнечного масла. Полученную смесь нагревают до 70-90°С и формуют гранулы.
Имеется патент (RU 2061386, 1996), согласно которому для получения кормовой добавки для сельскохозяйственных животных целлюлозосодержащее сырье (древесные отходы, торф, подсолнечную лузгу и др.) смешивают с жидким птичьим пометом в соотношении 10-1:1. Далее проводят гидробаротермическую обработку смеси при 160-200°С и влажности 50-60% в течение 15-90 мин. Полученный продукт сушат и гранулируют.
Известен способ получения корма для животных на основе лузги подсолнечника (RU 2667784, 2018), характеризующийся тем, что лузгу измельчают с последующей ее химической деструкцией. Затем полученную массу смешивают со шротом подсолнечника и белково-витаминно-минеральной добавкой, после чего формуют вакуумированием с получением готовой продукции, питательная ценность которой составляет 0,24 кормовых единиц в 1 кг корма.
Недостатком всех перечисленных выше способов является использование необогащенной белком подсолнечной лузги. Несмотря на различные методы предобработки лузги, в кормах остается достаточно высокое содержание трудногидролизуемой клетчатки, которая практически не усваивается у моногастричных животных. А питательная ценность кормов складывается в основном за счет других компонентов кормов с лучшей усваиваемостью.
Предложен способ получения корма из подсолнечной лузги (SU 1090322, 1984) путем гидролиза лузги серной кислотой 70-75% при модуле пропитки 1:(0,01-0,1) с последующей нейтрализацией гидролизата щелочными отходами масложировой промышленности (отработанные отбельные глины и соапстоки). Полученный таким способом корм содержит 22-34% легкоусвояемых углеводов. Недостатком способа является использование для гидролиза серной кислоты, а также низкое содержание белков при значительном количестве липидов, присутствие которых сокращает срок хранения корма.
Также известен способ получения кормовой добавки для животных и птиц (RU 2053687, 1996), которая состоит (мас. %) из шрота (9,0-19,0), мясокостной муки (4,0-5,0) минеральных добавок (0,78-0,97) и измельченной до 40 мкм лузги (остальное). Примерно четверть состава этой кормовой добавки составляют шрот и мясокостная мука, которые сами по себе являются ценными высокопротеиновыми кормовыми добавками. Основным же недостатком предложенного способа является большой расход измельченной до 40 мкм лузги, так как процесс размола лузги до такого размера энергозатратен, длителен и требует использования специальных дорогостоящих мельниц (шаровые, планетарные или др.). Лузга в данном составе и состоянии имеет питательную ценность 0,37 кормовых единиц, сама же добавка может быть использована для замены в комбикормах 20% зернофуража.
Другой способ утилизации подсолнечной лузги (RU 2120765, 1998), предназначенный для получения кормового продукта для жвачных животных, заключается в термообработке лузги при добавлении аммиака в количестве 1-2% от массы лузги при 65-75°С в течение 18-20 ч. Это позволяет получать кормовой продукт повышенной питательной ценности (0,41-0,55 кормовых единиц в 1 кг), но с низким содержанием белка (не более 20%).
Существует ряд способов получения различных белковых добавок из подсолнечного шрота (RU 2268613, 2006; RU 2340203, 2008). Большинство этих способов предусматривают экстракцию белка из подсолнечного шрота с последующим его неоднократным осаждением и сушкой. Себестоимость таких продуктов получается довольно высокой.
Известны также способы получения кормовых добавок для сельскохозяйственных животных на основе мицелиального гриба Trichoderma viride (RU 2499417, 2013; RU 2518305, 2014). В качестве субстрата для культивирования гриба используют подсолнечную лузгу, предварительно экструдированную при 110-130°С, смешанную с отрубями или свекловичным жомом и суслом. Основным недостатком приведенных способов является длительность процесса культивирования мицелиальных грибов (6-8 сут). Так как культивирование осуществляют поверхностным способом, данный способ культивирования требует наличия специально оборудованных производственных площадей.
Предложен способ утилизации подсолнечной лузги, отрубей и древесных опилок с получением углеводных гидролизатов и глюкозы в качестве полезного побочного продукта (RU 2645121, 2018). Способ отличается тем, что целлюлозасодержащие отходы измельчают на специально разработанном устройстве, способном обеспечить степень измельчения сырья до 15 мкм, с последующей обработкой размолотого сырья мультиэнзимным комплексом Роксазим G2. Показана возможность использования полученных углеводных гидролизатов в комплексе с источниками азота, фосфора, микроэлементами и витаминами в составе питательной среды для выращивания пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Однако полученная биомасса авторами никак не охарактеризована ни по питательной ценности ни по содержанию в ней белка.
Известно много способов переработки растительного сырья с повышенным содержанием целлюлозы и лигнина, такого как древесные опилки, солома, стебли лубяных растений, кукурузные початки и др. (RU 2144087, 2000; RU 2518305, 2014; RU 2539144, 2015; RU 2543661, 2015; RU 2545392, 2015; RU 2575616, 2016; RU 2601122, 2016; RU 2666769, 2018), включающих размол, химическое разрушение и ферментативный гидролиз лигноцеллюлозных материалов. Получаемые ферментолизаты, обогащенные смесью легкоперевариваемых моно- и олигосахаридов, используются в дальнейшем как питательные компоненты кормов или как компоненты питательных сред для выращивания различных культур, таких как Saccharomyces cerevisiae, Cellulosimicrobium funkei, Trichosporon mycotoxinivorans, Pichia stipitis или др., способных к биосинтезу белка или спиртовому брожению. Однако все перечисленные способы не лишены недостатков, основным из которых остается невысокое содержание белка в получаемых кормах/невысокий выход спирта. Так, при оптимальных условиях через сутки культивирования содержание сырого протеина в биомассе выращиваемых культур не превышает 32,4-40,0%.
Наиболее близким по технической сущности к заявленному способу является патент «Способ получения кормовых дрожжей» (SU 507632, 1976), в котором предусмотрено дополнительное введение целлюлолитических ферментов в питательную среду, содержащую делигнифицированное целлюлозосодержащее растительное сырье (подсолнечную лузгу) и минеральные соли. После этого питательную среду засевают культурой Candida guilliermondii и ведут ферментолиз лузги одновременно с процессом выращивания на ней дрожжей при 37°С в течение 40-48 ч. Однако в биомассе выросшей культуры дрожжей белка накапливается не более 20%.
Недостатком наиболее близкого аналога является низкая питательная ценность полученного продукта, и, в первую очередь, низкое содержание в корме белка.
Таким образом, анализируя различные способы получения кормов и кормовых добавок на основе переработки отходов перерабатывающей промышленности, можно сделать вывод либо о повышенной себестоимости предлагаемых кормов либо о недостаточной их питательной ценности, и, в первую очередь, о низком содержании в таких кормах белка.
Разработанный способ биоконверсии подсолнечной лузги, являющейся отходом масложирового производства, в кормовой продукт с высоким содержанием белка включает стадии измельчения, делигнификации и ферментативный гидролиз (ферментолиз) подсолнечной лузги, отделение жидкого ферментолизата и использование его для культивирования продуцентов белка с последующим сепарированием, плазмолизом и сушкой обогащенной белком биомассы. В результате скрининга продуктивных по белку культур дрожжей на минимальных питательных средах с подсолнечной лузгой отобраны два лучших продуцента, относящиеся к родам Debaryomyces и Kluyveromyces. Инновационность заявленного способа заключается в специально подобранных штаммах, комбинации стадий и условий их проведения, необходимых для биоконверсии подсолнечной лузги в кормовой продукт с высоким до 65% содержанием сырого протеина, из которого истинный белок составляет не менее 80%. Готовый кормовой продукт с высоким содержанием белка может использоваться как самостоятельно, так и в качестве кормовой добавки.
В заявленном способе впервые реализована комбинация методов предобработки отхода масложировых производств, подсолнечной лузги, и отработаны условия ее биоконверсии в кормовой продукт с высоким содержанием белка.
Задачей изобретения является создание ресурсосберегающей технологии биоконверсии подсолнечной лузги в качественные недорогие корма с высоким содержанием белка. Именно на решение данной проблемы направлено данное изобретение.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в увеличении содержания белка до 65% в биомассе дрожжей, культивируемых на ферментолизате подсолнечной лузги.
Технический результат изобретения достигается тем, что способ переработки подсолнечной лузги, отхода масложирового производства, в кормовой продукт с высоким содержанием белка, согласно изобретению предусматривает последовательные стадии измельчения, делигнификации и ферментолиза подсолнечной лузги, отделения жидкого ферментолизата и культивирования его продуктивных по белку культур дрожжей с последующим сепарированием, плазмолизом и сушкой обогащенной белком биомассы, при этом для делигнификации из лузги готовят 10-15% суспензию, в которой в качестве дисперсионной среды используют 2-6% раствор гидроксида натрия, полученную суспензию выдерживают при температуре 125-130°С в течение 30-60 мин, а ферментолиз делигнифицированной лузги проводят целлюлолитическим ферментом из расчета 30-60 единиц целлюлазной активности (ед. ЦлС) на 1 г сухой делигнифицированной лузги в течение 18-24 ч, в качестве продуктивных по белку культур дрожжей используют культуры Debaryomyces hansenii или Kluyveromyces marxianus.
При этом, подсолнечную лузгу могут измельчать до размера частиц не более 100 мкм.
4
2
4
2
4
4
Дополнительно в полученный фильтрат вносят минеральные соли: NHHPO, KHPO, MgSO.
Подсолнечную лузгу подсушивают до влажности не более 8%, подвергают измельчению до размера частиц не более 100 мкм и для делигнификации из лузги готовят 10-15% суспензию, в которой в качестве дисперсионной среды используют 2-6% раствор гидроксида натрия, полученную суспензию выдерживают при температуре 125-130°С в течение 30-60 мин. После выдержки суспензию охлаждают, доводят рН до 4,5-5,5 и фильтруют. Полученный фильтрат может служить источником фитомеланов, а твердый осадок суспендируют до изначального объема и подвергают ферментативному гидролизу. Ферментативный гидролиз делигнифицированной лузги проводят целлюлолитическим ферментом из расчета 30-60 единиц целлюлазной активности (ед. ЦлС) на 1 г сухой делигнифицированной лузги в течение 18-24 ч. Полученный фильтрат ферментативного гидролиза, содержащий сухих веществ 6-8%, из которых редуцирующие вещества составляют 40-55%, используют для промышленного культивирования дрожжей. В качестве продуктивных по белку культур дрожжей используют культуры Debaryomyces hansenii или Kluyveromyces marxianus.
Ферментолиз проводят препаратами целлюлолитических ферментов, такими как ЦеллоЛюкс-F (ООО ПО «Сиббиофарм»), Целлюкласт 1,5 Л (АО «Новозаймс А/С»), Ровабио (ООО «Адиссео Евразия») или другими аналогичного действия из расчета 30-60 единиц целлюлазной активности (ед. ЦлС) на 1 г сухой делигнифицированной лузги при оптимальных условиях действия (рН 4,5-5,5; 45-55°С) в течение 18-24 ч. Полученный фильтрат ферментолизата, содержащий сухих веществ 6-8%, из которых редуцирующие вещества составляют 40-55%, используют для промышленного культивирования дрожжей.
4
2
4
2
4
4
Для обогащения фильтрата в него можно вносить минеральные соли: NHHPO; KHPO; MgSO.
В качестве посевного материла (5-10% к объему) используют 20-часовые культуры дрожжей Debaryomyces hansenii или Kluyveromyces marxianus, выращенные на жидкой глюкозо-пептонной среде.
D. hansenii относят к факультативным психрофилам, его оптимальная температура роста составляет (25-27)°С, тогда как K. marxianus является мезофилом с оптимумом роста при (38-40)°С. Культивирование проводят в аэробных условиях в ферментерах при поддержании следующих условий: рН-статирование 4,5-5,5 (в качестве титранта используют раствор аммиака 10%); расход воздуха - 1 об/об питательной среды в мин; скорость вращения мешалки - от 300 до 600 об/мин. Собранную на стационарной фазе роста (18-24 ч) культуральную жидкость подвергают 2-х ступенчатому сепарированию, дрожжевую биомассу - плазмолизу и сушке.
3
В ходе культивирования дрожжами потребляется сухих веществ 55-65%, съем биомассы составляет 25-35 г сухих дрожжей с 1 дм питательной среды. В биомассе дрожжей накапливается до 65% сырого протеина в пересчете на абсолютно сухой вес (АСВ).
Пример 1
3
3
3
3
Подсолнечную лузгу с влажностью 6% измельчают на роторно-ударной мельнице, в результате чего 95% полученных частиц имеют размер менее 70 мкм. Готовят суспензию лузги при гидромодуле 1:8,5, использовав в качестве дисперсионной среды раствор гидроксида натрия 6%, выдерживают при 121°С в течение 1 ч. Суспензию нейтрализуют, в качестве ферментного препарата используют ЦеллоЛюкс-F (ООО ПО «Сиббиофарм») с активностью 2000 ед. ЦлС/г. Для ферментолиза используют ферментный препарат из расчета 3% по отношению к массе лузги (60 ед. ЦлС/гАСВ). Ферментолиз ведут при рН 5,0; 50°С; при постоянном перемешивании в течение 20 ч. Ферментолизат содержит сухих веществ 8%, из которых редуцирующие вещества составляют 53%. К фильтрату ферментолизата добавляют дрожжевой экстракт и минеральные соли, полученную ферментационную среду засевают посевным материалом Debaryomyces hansenii Y-3863 (коллекция Национального биоресурсного центра всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт»). Культивирование ведут в лабораторном ферментере с полным объемом 0,5 дм, объем заполнения средой - 0,3 дм. Отработаны следующие условия культивирования: расход воздуха 0,3 дм/мин; скорость мешалки - 600 об/мин, термостатирование (25-27)°С; рН-статирование 5,0 (в качестве раствора для подержания рН используют раствор аммиака 10%), продолжительность культивирования - 18 ч. Полученную биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин, биомассу промывают водопроводной водой при гидромодуле 1:5 и повторно центрифугируют. Сушку биомассы осуществляют в вакуум-сушильном шкафу при 45-50°С. В результате получают сухих дрожжей 37 г/дм с содержанием сырого протеина 68%, истинного белка - 55%.
Пример 2
3
Технологический процесс ведут аналогично примеру 1, но в качестве дрожжевой культуры используют Kluyveromyces marxianus Y-4570 (коллекция Национального биоресурсного центра всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт»), культивирование проводят при (38-40)°С. Выход сухих дрожжей составляет 32 г/дм, содержание сырого протеина - 65%, истинного белка - 52%.
Пример 3
3
Технологический процесс ведут аналогично примеру 1, но изменяют условия предобработки и ферментативного гидролиза подсолнечной лузги. Готовят суспензию лузги при гидромодуле 1:8,5, используя в качестве дисперсионной среды раствор гидроксида натрия 2%, выдерживают при 121°С в течение 1 ч. Суспензию нейтрализуют, в качестве ферментного препарата используют Ровабио (ООО «Адиссео Евразия») с активностью 2000 ед. ЦлС/г. Для ферментолиза используют ферментный препарат из расчета 3% по отношению к массе лузги (60 ед. ЦлС/гАСВ). Ферментолиз ведут при рН 5,0; 50°С; при постоянном перемешивании в течение 20 ч. Ферментолизат содержит сухих веществ 6%, из которых редуцирующие вещества составляют 48%. При культивировании Kluyveromyces marxianus Y-4570 получают сухих дрожжей 27 г/дм, содержание сырого протеина - 63%, истинного белка - 54%.
Пример 4
3
Технологический процесс ведут аналогично примеру 1, но используют ферментный препарат Целлюкласт 1,5 Л (АО «Новозаймс А/С»). Для ферментолиза используют ферментный препарат из расчета 5% по отношению к массе лузги (50 ед. ЦлС/гАСВ). Ферментолизат содержит сухих веществ 6,5%, из которых редуцирующие вещества составляют 40%. При культивировании Kluyveromyces marxianus Y-4570 получают сухих дрожжей 25 г/дм, содержание сырого протеина составляет 65%, истинного белка - 57%.
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет увеличить содержание белка в кормовых дрожжах, полученных на ферментолизате подсолнечной лузги, до 57%, что по сравнению с аналогами в 1,5-2 раза больше, чем в аналогичных изобретениях. Тем самым достигается заявленный технический результат накопления в дрожжевой биомассе до 65% сырого протеина и до 57% истинного белка.