Морфологическая характеристика и клиническое значение разных типов сосудов в ткани регионарных лимфатических узлов у больных раком желудка

JOURNAL

OF MALIGNANT TUMOURS

Морфологическая характеристика и клиническое значение разных типов сосудов в ткани регионарных лимфатических узлов у больных раком желудка

ТИШКОВА Е. Ю.

Введение: Особенности ангиогенеза в регионарных лимфатических узлах (РЛУ) у больных РЖ изучены недостаточно.

Поэтому цель нашего исследования - дать морфологическую характеристику и клиническую оценку разным типам сосудов в ткани РЛУ

у больных РЖ.

Материалы и методы: Исследованы гистопрепараты регионарных ЛУ без метастазов у 32 больных РЖ. Срезы окрашивались гематоксилином Майера и эозином и иммуногистохтитчески (ИГХ) с помощью антител к CD34.

Результаты: Установлено, что плотность клеток, экспрессирующих СД34 в ЛФ ЛУ коррелирует с ПМС в корковом слое ЛУ (г=0,483, р=0,005), плотностью клеток в ЛУ (г=0,550, р=0,01), и количеством ЛФ в слизистой оболочке желудка (СОЖ) (г=0,576, р=0,001). Плотность клеток, экспрессирующих СД34 в ЛФ ЛУ была выше, при множественных ЛФ в СОЖ (7,21+2,91 и 13,47+6,45, соответственно при единичных и при множественных ЛФ в СОЖ, р=0,006).

В ткани РЛУ выявлены 3 типа сосудов, имеющих различную морфологию и клиническое значение: капилляры обычного строения, диляти-рованные капилляры и атипичные сосуды. ПМС в корковом слое ЛУ коррелировала со стадией РЖ (г= -0,410, р=0,01) и количеством метастазов в РЛУ (г= -0,440, р=0,01). ПМС была ниже при местно-распространенном РЖ (28,4+4,91, 32,5+13,32 и 23,79+6,193 микрососудов на УЕП, соответственно при стадии Т1-21М0М0, Т31М0М0 и Т2-41М1-2М0, р1 -3=0,02) и множественных метастазах в РЛУ (29,8+8,51, 25,2+5,82 и 22,7+6,63 микрососудов на УЕП, соответственно при отсутствии, единичных и множественных МТБ, р1-3=0,001). Наличие множественных атипичных сосудов также коррелировало со стадией рака желудка (г=0,390, р=0,04) и 3-летней безрецидивной выживаемостью (г=0,630, р=0,002). При этом для начальных стадий РЖ было характерно отсутствие атипичных сосудов в паракортикаль-ном слое. Тогда как при местно-распространенном РЖ чаще выявлялись атипичные сосуды. При наличии множественных атипичных сосудов в ткани РЛУ отмечалось снижение 3-летней безрецидивной выживаемости с 87% до 42,9% (р=0,03). В то время как сохранность синусов в ЛУ связана с ее увеличением (83,8% и 57,1%, соответственно при сохранности и отсутствии синусов в РЛУ, р=0,04). Выводы: Таким образом, полученные данные свидетельствуют о тесной связи лимфопролиферативных процессов в лимфатических узлах и слизистой оболочке желудка между собой и с процессами ангиогенеза. Происхождение атипичных сосудов требует дальнейших исследований.

Ключевые слова: рак желудка, ангиогенез, регионарные лимфатические узлы.

Контактная информация:

Тишкова Евгения Юрьевна - Оренбургская государственная медицинская академия, tishkova_evgeniy@mail.ru, 89226265268.

Актуальность. Рак желудка (РЖ) является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований. Ежегодно в мире регистрируется около 800 тыс. новых случаев и 628 тыс. смертей от этой патологии. Наиболее высокая заболеваемость РЖ наблюдается в Японии, России, Чили, Корее, Китае, Коста-Рике, Филиппинах [4]. В России в структуре онкологической заболеваемости РЖ устойчиво занимает 4-е место у мужчин и 5-е у женщин [5]. Несмотря на то, что в последние десятилетия в России отмечается снижение заболеваемости РЖ, показатель летальности от этой патологии остается высоким, занимая второе место в структуре смертности от злокачественных новообразований [5].

Основной причиной смерти от РЖ, как и от других злокачественных новообразований, является возникновение метастазов. В связи с этим, идентификация маркеров, связанных с метастатическим потенциалом опухоли, важна как для планирования терапии, так и для прогнозирования результатов лечения онкологических больных.

Важнейшим фактором, связанным с прогрессией злокачественных новообразований является ангиогенез. В настоящее время оценка его активности рассматривается как важнейший маркер прогноза течения заболевания, наличия метастазов и чувствительности к противоопухолевой терапии [10,16]. При раке желудка плотность микрососудов в опухоли и уровень экспрессии VGFR (фактор роста эндотелия сосудов) коррелировали с глубиной инвазии опухоли, наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы и отдалёнными результатами лечения (авторы). В то же время проведенные исследования свидетельствуют о том, что сосуды в опухоли гетерогенны по происхождению, морфологии и клинической значимости и разные типы сосудов могут по-разному отвечать на проводимую антиангиогенную терапию [14].

Следует отметить, что изучение особенностей ан-гиогенеза при раке желудка касается преимущественно исследования его активности в ткани опухоли и в прилежащей слизистой оболочке желудка. Исследование осо-

Журнал «Злокачественные опухоли»

Отечественные исследования в области фундаментальной и клинической онкологии

бенностей ангиогенеза в регионарных лимфатических узлах у больных раком желудка освещены недостаточно, что и послужило целью настоящего исследования.

Материалы и методы. Материалом для исследования послужили лимфатические узлы большого сальника, расположенные на расстоянии 2-5 см от стенки желудка у 32 больных РЖ, радикально оперированных в Оренбургском областном клиническом онкологическом диспансере, без признаков метастатического поражения. Мужчин было 15 (46,9%), женщин -17 (53,1%). Средний возраст пациентов 60,6 +10,5 лет.

Материал для исследования забирали сразу же после удаления операционного препарата, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и подвергали рутинной гистологической обработке. Иммуногистохимиче-ские исследования проводились с использованием антител фирмы «Thermo Scientific»: CD34 Ab-1 (Clone QBEnd/10). Срезы толщиной 4 мкм, наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37 °C в течение 18 часов. Депарафинизацию и демаскировку антигенов проводили в РТ-модуле при температуре 121 °C в течение 20 мин. с последующим остыванием 90 мин. В качестве системы визуализации применялась Ultra Vision LP Detection System HRP Polymer & DAB Plus Chromogen.

Распределение больных по локализации опухоли, гистологическому типу и степени дифференцировки опухоли, количеству метастазов в РЛУ (стадия N), стадии заболевания представлены в таблице № 1.

В ткани РЛУ на условную единицу площади проводили подсчет плотности:

• микрососудов (капилляры обычного строения) в корковом слое лимфатического узла;

• лимфоцитов в лимфоидных фолликулах (ЛФ);

• клеток, экспрессирующих СД34 в лимфоидных фолликулах лимфатического узла.

Полуколичественным способом оценивали:

• количество ЛФ в ткани РЛУ (отсутствуют, расположены только в корковом веществе, расположены по всей площади РЛУ);

• наличие герминативных центров (ГЦ) в них (нет, есть);

• сохранность синусов (нет, есть);

• количество дилятированных капиллляров и атипичных сосудов (нет, единичные, множественные).

Полученные данные сопоставлены с клиническими особенностями РЖ: локализацией, гистологическим типом, степенью дифференцировки опухоли, глубиной инвазии (Т) и наличием метастазов в РЛУ (N), стадией заболевания. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием программы «Статистика 6.0». Сравнение показателей между группами проводили параметрическим и непараметрическими методами (LSD Test и Mann-Whitney тесты). Взаимосвязь между различными показателями определяли, используя параметрический метод (Pearson) и непараметрические методы (ранговой корреляции по Spearman и гамма). Достоверность различий частот признаков в изучаемых группах оценивали с помощью критерия х2. Анализ общей и безрецидивной 3-х летней выживаемости выполняли по методу Каплана-Майера (Kaplan-Meier). Сравнение показателей выживаемости между группами больных проводили с использованием Long-Rank теста. Различия между показателями считали достоверными при p<0,05.

Результаты. В результате проведенного исследования было установлено, что в ткани РЛУ встречается несколько типов сосудов, отличающихся по морфологии, клинической значимости. Нами были выделены следующие типы сосудов:

• капилляры обычного строения;

• дилятированные капилляры;

• атипичные сосуды.

Дилятированные капилляры отличались от капилляров обычного строения большим диаметром (50-100 мкм), неправильной формой, локализацией не только в кортикальном слое, но и в центральной части РЛУ (Рис.1).

Что касается атипичных сосудов, расположенных в паракортикальной зоне, то они имели различный диаметр и форму. Главной особенностью их было то, что их стенки были выстланы клетками с крупными, светлыми ядрами разной формы и размеров, иногда с хорошо заметными ядрышками (Рис.2). Клетки вплотную прилежат друг к другу, имеют узкий ободок цитоплазмы, экспресси-рующей СД34. Базальная мембрана четко не прослеживается. Иногда встречались группы клеток без просвета (Рис.3). В некоторых сосудах отсутствовало содержимое, в отдельных наблюдались эритроциты.

Также в ткани РЛУ встречались отдельные клетки, экспрессирующие СД34.

Таблица 1. Распределение больных по локализации опухоли, гистологическому типу и степени дифференцировки опухоли, количеству метастазов в РЛУ (стадия ОД, стадии заболевания.

Локализация Гистологический тип и степень дифференцировки Количество метастазов Стадия заболевани я

n % n % n n %

Верхняя треть 6 19,0 Высокодифференцированный рак 7 21,9 N0 18 56,0 Т1-2N0M0 12 37,5

Средняя треть 8 25,0 Умереннодифференцированный рак 6 18,75 N1 6 19,0 T3N0M0 6 18,75

Нижняя треть 17 53,0 Перстневиднокле-точный рак 15 46,9 N2 8 25,0 T2-4N1-2M0 14 43,75

тотальный 1 3,0 Низкодифференци-рованный рак 4 12,5

Морфологическая характеристика и клиническое значение разных типов сосудов в ткани регионарных лимфатических узлов у больных раком желудка

Рисунок 1. Дилятированный капилляр в корковом слое РЛУ: ИГХ окраска с антителами к CD34 (х400).

Рисунок 3. Атипичные сосуды в кортикальном слое РЛУ. Клетки вплотную прилежат друг к другу, имеют узкий ободок цитоплазмы, экспрессирующей СД34. Базальная мембрана четко не прослеживается: ИГХ окраска с антителами к CD34 (х400).

Рисунок 1. Атипичные сосуды. Выражен ядерный полиморфизм выстилающих клеток, ядра с хорошо заметными ядрышками (х400).

Рисунок 4. Плотность микрососудов в корковом слое ЛУ в зависимости от стадии РЖ..

Рисунок 5. Плотность микрососудов в корковом слое ЛУ в зависимости от количества регионарных метастазов.

Рисунок 6. 3-летняя безрецидивная выживаемость пациентов РЖ в зависимости от наличия синусов в РЛУ.

Журнал «Злокачественные опухоли»

Отечественные исследования в области фундаментальной и клинической онкологии

3-летняя безрецидивная выживаемость пациентов раком желудка в зависимости от наличия синусов в РЛУ. о Complete •:• Censored

! j i

n i I

.....1.......

:

.. i ;

I :

180 360 540 720 900 10S0 1260 1440 Дни

Рисунок 7. 3-летняя безрецидивная выживаемость пациентов РЖ в зависимости от наличия атипичных сосудов.

Таблица 2. Атипичные сосуды в зависимости от стадии РЖ.

Проведенный анализ показал, что плотность отдельных клеток, экспрессирующих СД34 в ЛФ РЛУ коррелирует с плотностью микрососудов в корковом слое РЛУ (г=0,483, р=0,005), плотностью лимфоцитов в РЛУ (г=0,550, р=0,01).

Установлены отрицательные корреляции между ПМС в корковом слое РЛУ и стадией заболевания (г= -0,410; р=0,005). Наиболее низкие показатели наблюдались при наличии метастазов в РЛУ, высокие показатели были характерны для раннего РЖ (соответственно, 28,4+4,91, 32,5 + 13,32; и 23,79+6,193 микрососудов на УЕП при стадии Т1-2ШМ0, Т3ШМ0 и Т2-4Ш-2М0, р1-3=0,02) (рис.7).

ПМС также была выше при множественных метастазах, чем при единичных или их отсутствии и множественных метастазах в РЛУ (29,8 + 8,51, 25,2 + 5,82 и 22,7+6,63 микрососудов на УЕП, соответственно при отсутствии, единичных и множественных MTS, р1-3 = 0,001) (Рис. 8).

В отличие от капилляров обычного строения атипичные сосуды чаще встречались при местно-распро-страненном РЖ, нежели при начальных стадиях (соответственно, 8,33%, 33,3% и 28,5% при Т1-2Ш, Т3Ш и Т2-4Ш-2) (Таблица 2).

Анализ выживаемости в зависимости от изучаемых факторов показал, что с 3-летней безрецидивной выжа-ваемостью коррелировало наличие синусов (г=0,539, р=0,005) и атипичных сосудов в РЛУ (г=0,630, р = 0,002). При наличии синусов 3-х летняя безрецидивная выживаемость пациентов РЖ была выше, чем при их отсутствии (83,3% и 57,1% соответственно, р=0,09) (Рис. 9).

При множественных атипичных сосудах отмечается снижение 3-летней безрецидивной выживаемости с 87,5% до 42,9% (р = 0,03) (Рис. 10).

Обсуждение

В настоящее время ангиогенез рассматривается как важнейший маркер прогноза течения заболевания, наличия метастазов и чувствительности к противоопухолевой терапии (Kovaliova О.1. ег а1., 2010).

Описано несколько типов ангиогенеза: почкование -образование новых сосудов из эндотелиальных ростков; кооптация - образование новых сосудов за счет находящихся вблизи сосудов; опухолевая мимикрия - выстилка стенки сосуда опухолевыми клетками; интусуспективный ангиогенез - деление просветов капилляров за счет втяже-ния их стенок внутрь сосуда с образованием перегородок; васкулогенез - образование сосудов из ангиобластов.

Следует отметить, что большинство исследований при РЖ и злокачественных новообразованиях других локализаций касается оценки ангиогенеза в опухоли или прилежащих тканях. Особенности ангиогенеза в регионарных лимфатических узлах (РЛУ) у больных РЖ изучены недостаточно. Данные об особенностях ангиогенеза в основном касаются изучения экспрессии VEGF в ткани РЛУ [13,15,17]. При злокачественных новообразованиях ряд авторов наблюдали реактивные изменения со стороны РЛУ. Эти изменения касались синусов РЛУ и выстилающих их клеток. Увеличение экспрессии VEGF наблюдалось не только в ткани опухоли, но и в ткани РЛУ, что коррелировало с наличием метастазов в них. Повышение экспрессии VEGF в опухолевых клетках вызывало гиперплазию перитуморальных лимфатических сосудов и увеличивало скорость потока лимфы на 40%. При этом количество опухолевых клеток, обнаруживаемых в ткани РЛУ, увеличивалось почти в 200 раз и в 4 раза возрастало количество метастазов в РЛУ [13]. Эти данные свидетельствуют о том, что процессы метастазирования в РЛУ тесно связаны с процессами неоангиогенеза в них, что может быть использовано в лечебной тактике.

У пациентов с немелкоклеточным раком легкого прослеживалась корреляция с наличием метастазов в РЛУ, экспрессией VEGF и рецепторов к нему (VEGF-ре-цептор-3) [15].

Нами были выявлены различные типы сосудов. Капилляры обычного строения, дилятированные капилляры, которые отличались от капилляров обычного строения большим диаметром (50-100 мкм), неправильной формой, локализацией не только в кортикальном слое, но и в центральной части РЛУ. А также атипичные сосуды, расположенные в паракортикальной золи, имеющие различный диаметр и форму. Стенки этих сосудов были выстланы клетками с крупными, светлыми ядрами разной формы и размеров, иногда с хорошо заметными ядрышками. Клетки прилежат вплотную друг к другу, имеют узкий ободок цитоплазмы экспрессирующей СД34. Базальная мембрана четко не прослеживается.

Плотность капилляров обычного строения была выше при начальных стадиях РЖ, в то время как атипичные сосуды чаще встречались у больных с метастазами. Кроме того, при наличии множественных атипичных сосудов отмечалось снижение 3-летней безрецидивной выживаемости, а сохранность синусов связана с её увеличением.

Происхождение атипичных сосудов остается неясным и требует дальнейших исследований.

Атипичные сосуды Стадия РЖ

Т 1-2 N0 T3N0 T2-4N1-2

Нет,% 66,67 50,0 35,7

Единичные,% 25,0 16,7 35,7

Множественные,%о 8,33 33,3 28,5

Морфологическая характеристика и клиническое значение разных типов сосудов в ткани регионарных лимфатических узлов у больных раком желудка

Считаем необходимым продолжить изучение связи плотности микрососудов в корковом слое ЛУ и сохранности синусов в них с факторами прогрессии РЖ.

Выводы

Плотность клеток, экспрессирующих СД34 тесно связана с активностью лимфопроли-феративных процессов в СОЖ и ткани РЛУ.

В ткани РЛУ выявлены 3 типа сосудов, имеющих различную морфологию и клиническое значение. Нали-

чие множественных атипичных сосудов в ткани РЛУ связано со снижением 3-летней безрецидивной выживаемости с 87% до 42,9% (р=0,03). В то время как сохранность синусов в ЛУ связана с ее увеличением (83,8% и 57,1%, соответственно при сохранности и отсутствии синусов в РЛУ, р=0,04).

Со стадией РЖ были связаны ПМС и количество атипичных сосудов в ткани РЛУ. При этом для начальных стадий РЖ была характерна наибольшая ПМС и отсутствие атипичных сосудов в паракортикальном слое. Тогда как при местно-распространенном РЖ отмечается наименьшая ПМС и чаще выявлялись атипичные сосуды.

Литература:

1. Давыдов М. И., Аксель Е. М. Заболеваемость злокачественными новообразованиями и смертность от них в странах СНГ в 2005 году // Вестник РАМН.- 2007.- № 11.- С. 45-49.

2. Давыдов М. И., Аксель Е. М. Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2001 году. М.: Медицинское информационное агентство, 2003.

С. 95-97, 223-224.

3. Давыдов М. И., Туркин И. Н., Полоцкий Б. Е. и др. Результаты хирургии раннего рака желудка // Вестник Московского онкологического общества. 2008. № 9. С. 2-8.

4. Давыдов М. И., Тер-Ованесов М. Д. Современная стратегия хирургического лечения рака желудка // Современная онкология. 2000. Т. 2, № 1. С. 4-10.

5. Каприн АД, Старинский В. В., Петрова Г. В., ред. Злокачественные новообразования в России

в 2012 году (заболеваемость и смертность). М.: ФГБУ «МНИОИ им. П. А. Герцена»; 2014.

6. Степанов И. В., Завьялова М. В., Григорьева Е. С., Букурова Ю. А., Афанасьев С. Г., Чердынцева Н. В. Клинико-морфологические

и молекулярно-генетические особенности интерстициального и диффузного типов карцином желудка // Сибирский онкологический журнал. 2010. № 4 (40). С. 56-60.

7. Folkman J., Watson K., Ingber D.. Hanahan D. //Nature. 1989. V. 339. P. 58.

8. Folkman J., Merler E., Abernathy C., Williams C. Isolation of a tumour factor responsible for angiogenesis // J. Exp. Med., 1971, V.133.P.275-288.

9. Kovaliova O. I., Khomeriki S. G., Lazebnik L. B. Markers of angiogenesis in gastric mucosa in patients with

H. pylori-associated chronic gastritis // Helicobacter. - 2010.- V.15, № 4.- P. 352-353.

10. Lazar D., Taban S., Raika M., Sporea I., Cornianu M., Goldi§ A. et al. Immunohistochemical evaluation of the tumor neoangiogenesis as a prognostic factor for gastric cancers. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 2008; 49 (2): 137-148.

11. Shubik P. Vascularization of tumours: a review //

J. Cancer Res. Clin. Oncol., 1982, v.103. P.211-222.

12. Schor A. M., Schor S. L. Tumor angiogenesis // J. Pathology, 1983, v.141 P.385-413.

13. Hoshida T1, Isaka N, Hagendoorn J. et al. Imaging steps of lymphatic metastasis reveals that vascular endothelial growth factor-C increases metastasis by increasing delivery of cancer cells to lymph nodes: therapeutic implications // Cancer Res. 2006.- № 66 (16).- p.75-80.

14. Nagy J. A., Dvorak H. F. Heterogeneity of the tumor vasculature: the need for new tumor blood vessel type-specific targets. Clin Exp Metastasis. 2012; 29 (7): 657-62.

15. Nwogu CE1, Yendamuri S, Tan W, Kannisto E, Bogner P. et al. Lung cancer lymph node micrometastasis detection using real-time polymerase chain reaction: correlation with vascular endothelial growth factor expression // J Thorac Cardiovasc Surg.- 2013 Mar.- № 145 (3).- p.185-189.

16. Wang Y. D., Wu P., Mao J. D., Huang H., Zhang F. Relationship between vascular invasion and microvessel density and micrometastasis. World J Gastroenterol. 2007; 46 (13): 6269-6273.

17. Zeng Y1, Opeskin K, Baldwin ME, Horvath LG, et al. Expression of vascular endothelial growth factor receptor-3 by lymphatic endothelial cells is associated with lymph node metastasis in prostate cancer // Clin Cancer Res.- 2004 Aug 1.- № 10 (15).- p. 218-225.