ВАКЦИНА АССОЦИИРОВАННАЯ ПРОТИВ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ, РОТАВИРУСНОЙ И КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЭМУЛЬСИОННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ
ASSOCIATED INACTIVATED EMULSION BOVINE VIRAL DIARRHOEA, ROTAVIRUS AND CORONAVIRUS INFECTIONS VACCINE

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается получения и применения вакцины для профилактики пневмоэнтеритов крупного рогатого скота (КРС) и особенно у новорожденных телят.
В структуре заболеваний телят в ранний постнатальный период превалирующее место занимают нарушения функции пищеварительной системы, клинически проявляющиеся диареей, обуславливающей развитие выраженной дегидратации, токсемии, иммунодефицитов, нарушения обмена веществ.
Проблема сохранения новорожденных телят остается актуальной во всех странах мира. В России указанная патология регистрируется у 50-100%, а гибель, как правило, наступает на 2-5 или 7-10 сутки и может достигать 30-50% (1,2,3).
В этиопатогенезе массовых гастроэнтеритов новорожденных телят основная роль принадлежит ассоциации возбудителей, чаще всего ротавирусу, коронавирусу и возбудителю вирусной диареи (ВД) КРС. Специфическая профилактика этих заболеваний сложна, прежде всего, потому, что восприимчивые к ним новорожденные животные имеют недостаточно сформированную иммунную систему. Иммунитет у них в этот период обеспечивается, в основном, антителами, полученными с молозивом матери. Использование вакцин для активной иммунизации новорожденных телят, по-видимому, менее оправдано, так как заболевание у них возникает раньше, чем успевает сформироваться достаточный иммунный ответ после применения вакцины. Поэтому более целесообразна вакцинопрофилактика данных заболеваний через колострум иммунизированных стельных коров.
К настоящему времени известно несколько комбинированных вакцин различной валентности против гастроэнтеритов КРС. Однако их применение не всегда сопровождается положительным эффектом, главным образом, из-за несбалансированности антигенного состава и низкого титра специфических антител в крови стельных коров и в молозиве, выпаиваемом новорожденным телятам.
Важными условиями успешной борьбы с вышеуказанными заболеваниями являются их своевременная и правильная диагностика и проведение специфической профилактики, для которой применяются живые и инактивированные вакцины как в виде моно-, так и ассоциированных препаратов (1, 2, 3, 4).
Преимущество живых вакцин из-за технологичности в производстве и простоты при применении не вызывает сомнений. Однако иммунная реакция у животных при их введении не всегда стабильна и в ряде случаев вызывает осложнения после вакцинации:
вакцина может вызвать повышенную реактогенность, иммуносупрессию, а иногда и гибель до 2% животных при вакцинации в зависимости от условий содержания и наличия коинфекций, проблемы воспроизводства, длительную персистенцию и выделение вакцинного вируса во внешнюю среду. По этой причине они не нашли широкого применения.
Для специфической профилактики указанных заболеваний используют инактивированные вакцины как сорбированные, так и эмульсионные.
Известна ассоциированная вакцина против вирусной диареи - болезни слизистых (ВД-БС), рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма VDV-Oregon-C24 V (CAPM V-293) вируса ВД-БС КРС, из штамма ТМ-91 (CAPM V-279) ротавируса КРС, из штамма BCV-9 (CAPM V-280) коронавируса КРС и из штаммов 3935/1 (CAPM 6233), 4804 (CAPM 6234) и 6304 (CAPM 6235) бактерий Е. coli, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (5).
Известна ассоциированная вакцина против ИРТ, рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма IBR-BK-5-РТОВ-8 INRV №3760 вируса ИРТ КРС, из штамма ТМ-91 (CAPM V-279) ротавируса КРС, из штамма BCV-9 (CAPM V-280) коронавируса КРС и из штаммов 3935/1 (CAPM 6234) и 6304 (CAPM 6235) бактерий Е. coli, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (6).
1
Известна ассоциированная вакцина против ПГ-3, рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма PI-3/T/11 V-30 вируса ПГ-3 КРС, из штамма ТМ-91 (CAPM V-279) ротавируса КРС, из штамма BCV-9 (CAPM V-280) коронавируса КРС и из штаммов 3935/1 (CAPM 6233), 4808 (CAPM 6234) и 6304 (CAPM 6235) бактерий Е. coli, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (7).
Известна ассоциированная вакцина против ИРТ, ПГ-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной инфекции, рота- и коронавирусных заболеваний телят «КОМБОВАК», сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из 6 производственных штаммов вирусов: ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, респираторно-синцитиальной инфекции, рота- и коронавирусных заболеваний КРС, - полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (8).
Известна ассоциированная вакцина против вирусных пневмогастроэнтеритов КРС и телят, сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штаммов В-25 и ТК-А вируса ИРТ КРС, из штаммов ВД-N и ВД-R вируса ВД-БС КРС, из штаммов В-19 и ПТК-45/86 вируса ПГ-3 КРС, из штаммов К-88 и РП-82 ротавируса КРС, из штаммов КВ-90 и К-22 коронавируса КРС и из штаммов PC-89 и PC-71 возбудителя респираторно-синцитиальной инфекции КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (9).
Наиболее близким аналогом является вакцина инактивированная комбинированная против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят «Комбовак-К», которая изготавливается из штаммов трех вирусов: рота-, корона- и вирусной диареи, протективных антигенов эшерихий; соматических 09, 078, 0115; капсульных полисахаридных К 80, К 30; адгезивных антигенов 99, F-41, термостабильных и термолабильных инактивированных энтеротоксинов и предназначена для профилактики вызываемых ими заболеваний (10).
Недостатком известной комбинированной вакцины является относительно невысокий титр инфекционной активности входящих в ее состав вирусных суспензий, в результате чего в прививной дозе не обеспечивается необходимое количество протективных антигенов против указанных болезней.
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении ассоциированной вакцины против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС эмульсионной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных различных половозрастных групп по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах на территории РФ.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вакцин, эмульсионных инактивированных против инфекционных болезней КРС, сопровождающихся поражением органов дыхания и желудочно-кишечного тракта, а также в повышении стабильности, антигенной и иммуногенной активности ассоциированной вакцины и создании напряженного и длительного иммунитета у привитых животных.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины ассоциированной против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС эмульсионной инактивированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.
Предлагаемая вакцина содержит в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» (авторское наименование) вируса ВД КРС, из штамма «№101 ВНИИЗЖ» (авторское наименование) ротавируса КРС и из штамма «ВНИИЗЖ» (авторское наименование) коронавируса КРС, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность в организме животного при введении ему целевого препарата, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективном соотношении. Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Вакцина, ассоциированная против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионная инактивированная.
2. Активное вещество в виде смеси авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, из штамма «№101 ВНИИЗЖ» (авторское наименование) ротавируса КРС и из штамма «ВНИИЗЖ» (авторское наименование) коронавируса КРС, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме животного при введении ему целевого препарата.
3. Целевые добавки.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Вакцина, ассоциированная против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионная инактивированная.
2. Активное вещество.
3. Целевые добавки.
По сравнению с вакциной-прототипом существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС и из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.
2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (Таурус-2), в эффективном количестве.
50
2
3
3. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД/см и активностью в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) не менее 6,65 lоg до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
4. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (RBT), в эффективном количестве.
50
2
3
5. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД/см и активностью в ИФА не менее 6,65 log до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
6. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки сайги (ПС), в эффективном количестве.
50
2
3
7. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток ПС с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД/см и активностью в ИФА не менее 6,65 lоg до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
8. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.
9. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), в эффективном количестве.
50
2
3
10. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток СПЭВ с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД/см и активностью в ИФА не менее 4,0 lоg до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
11. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2, в эффективном количестве.
50
2
3
12. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД/см и активностью в ИФА не менее 4,0 lоg до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
13. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки (Vero), в эффективном количестве.
50
3
14. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Vero с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД/см и активностью в ИФА не менее 4,0 log2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
15. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона макаки (Маrс-145), в эффективном количестве.
50
2
3
16. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма«№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Магс-145 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД/см и активностью в ИФА не менее 4,0 log до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
17. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.
18. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT, в эффективном количестве.
50
2
3
19. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД/см и активностью в реакции гемагглютинации (РГА) не менее 8,0 log до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
20. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (MDBK), в эффективном количестве.
50
2
3
21. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД/см и активностью в РГА не менее 8,0 log до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
22. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре Таурус-2, в эффективном количестве.
50
2
3
23. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД/см и активностью в РГА не менее 8,0 log до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
24. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре Vero, в эффективном количестве.
50
2
3
25. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Vero с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦЦ/см и активностью в РГА не менее 8,0 log до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
26. Из целевых добавок масляный адъювант.
27. Масляный адъювант в количестве 69,6 мас.%.
28. Из целевых добавок дополнительно адъювант сапонин.
29. Сапонин в количестве 0,4 мас.%.
30. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС и из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученных в перевиваемых культурах клеток млекопитающих и целевые добавки масляный адъювант и сапонин в соотношении, мас.%:
50
2
50
50
3
3
3
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма«NАDL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, взятой из группы, содержащей культуру клеток Таурус-2, культуру клеток RBT и культуру клеток ПС с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД/см и активностью в ИФА не менее 6,65 lоg до инактивации 10,0. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, взятой из группы, содержащей культуру клеток СПЭВ, культуру клеток Таурус-2, культуру клеток Vero и культуру клеток Маrс-145 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД/см и активностью в ИФА не менее 4,0 log2 до инактивации 10,0. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, взятой из группы, содержащей культуру клеток RBT, культуру клеток MDBK, культуру клеток Таурус-2 и культуру клеток Vero с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД/см и активностью в РГА не менее 8,0 log2 до инактивации 10,0. Масляный адъювант, 69,6 Сапонин, 0,4. В результате проведенных исследований авторами установлено, что между антигенами, входящими в состав предлагаемой вакцины, отсутствует конкуренция. Авторами обнаружено также явление синергизма при соединении указанных антигенов в предлагаемой вакцине, что позволило снизить их количественное содержание в препарате при сохранении такой же напряженности и длительности иммунитета у вакцинированных животных, как и при использовании для иммунизации соответствующих монопрепаратов.
Источником для получения производственного штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС послужил референсный штамм «NADL» вируса ВД КРС, полученный ФГУ «ВНИИЗЖ» 11.08.2004 г. из коллекции типовых культур АТСС (США).
Производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных биологических системах культивирования.
Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» адаптирован к перевиваемой культуре клеток млекопитающих, выбранной из группы, содержащей монослойную перевиваемую культуру клеток почки сайги (ПС), монослойную перевиваемую культуру клеток почки теленка (Таурус-2) и монослойную перевиваемую культуру клеток почки теленка (RBT), имеет стабильные биологические свойства, которые позволяют использовать его в качестве производственной расплодки для получения антигенного материала для вакцины против ВД КРС эмульсионной инактивированной.
Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС депонирован 4 августа 2009 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» - ДЕП вируса диареи КРС (11).
По сравнению с исходным штаммом штамм «NADL-ВНИИЗЖ» имеет генетические и фенотипические особенности. В отличие от штамма «NADL» штамм «NADL-ВНИИЗЖ» репродуцируется в перевиваемых культурах клеток RBT, ПС и Таурус-2, обладает инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняет высокую антигенную и иммуногенную активность после инактивации.
Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС характеризуется следующими признаками и свойствами (11).
Морфологические признаки
Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ВД КРС: сферический вирион диаметром 40-60 нм состоит из нуклеокапсида икосаэдрической симметрии, содержащего позитивную одноцепочечную РНК.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм «NADL-ВНИИЗЖ» относится к первому генотипу.
Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.
2
2
2
2
2
2
Вирус реагирует с антителами переболевших или иммунизированных животных в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При вакцинации лабораторных и естественно-восприимчивых животных инактивированный вирус индуцирует образование вирусспецифических и вируснейтрализующих антител в организме морских свинок в титрах от 10,9 до 11,2 log в ИФА и 7,0 log в РМН, у кроликов - от 10,8 до 11,4 log (ИФА) и от 6,0 до 7,1 log (РМН), у телят и коров - от 10,2 до 10,7 log (ИФА) и от 7,6±0,40 до 7,3±0,31 log(РМН).
Генотаксономическая характеристика
Геном штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС представлен позитивной одноцепочечной РНК размером около 12500 нуклеотидов с единственной открытой рамкой считывания. Открытая рамка считывания начинается с 386 нуклеотида. Вся информация о протеинах содержится в одной рамке считывания.
Выделено и охарактеризовано 10 протеинов: 4 структурных и 6 неструктурных. Одноцепочечная РНК связана с капсидным протеином р14/С, окруженным наружными гликопротеинами (gр25/Е1, gр53/Е2, gр48/Е0), и липидной оболочкой.
Наружный гликопротеин gр53/Е2 индуцирует в организме животных выработку вируснейтрализующих антител в высоких титрах. Протеин gр48/Е0 способен индуцировать у инфицированных животных высокий уровень антител, но с низкой вируснейтрализирующей активностью. У инфицированных животных антитела к gр25/Е1 вырабатываются в низких титрах.
Методом ОТ-ПЦР был амплифицирован участок генома вируса диареи КРС, включающий 149 н.о. 5'-нетранслируемой области.
В результате проведенных исследований было установлено, что штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС является близкородственным референтному штамму «NADL», от которого отличается на анализируемом участке одним нуклеотидом.
Такие единичные замены в структуре белка, предположительно, привели к существенным изменениям в антигенных свойствах вируса.
Биотехнологическая характеристика
4
2
Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки теленка (MDBK, Таурус-2, ПТ, RBT), перевиваемой линии культуры клеток ПС, перевиваемой линии культуры клеток слизистой кишечника КРС (FBI) и внутривидовой гибридной перевиваемой линии культуры клеток почки эмбриона свиньи со спленоцитами свиньи (АС).
Результаты адаптации вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» к культурам клеток Таурус-2, RBT и ПС представлены в таблицах 1,2,3. Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС является стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).
Физические свойства
3
Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозы находится в диапазоне 1,12-1,13 г/см, коэффициент седиментации вирионной РНК составляет 138S.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС наиболее устойчив при рН 7,4. Вирус хорошо сохраняется в нативном виде при 4°С, минус 20°С и минус 40°С. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, трипсину, кислому значению рН (3,0) и дезоксихалату натрия; при 37°С погибает через 5 дней.
Инактивированный вирус ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» устойчив при хранении при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированной вакцины.
Лиофилизация почти не влияет на его активность, однако многократное замораживание и оттаивание снижают вирулентность и иммуногенность вируса.
Дополнительные признаки и свойства
Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток Таурус-2, RBT, ПС в течение 10 серийных пассажей.
Патогенность - не патогенен для морских свинок, кроликов и белых мышей.
Вирулентность - выражена. Контагиозность - выражена.
Онкогенность - отсутствует.
Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.
3
3
Для получения антигенного материала из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно монослойные культуры клеток Таурус-2, RBT и ПС, выращенные в 1,5 дм матрасах или вращающихся сосудах объемом 3 дм. Полученный вируссодержащий материал освобождают от клеточного детрита и других балластных примесей низкоскоростным центрифугированием или любым другим известным методом.
Для инактивации вируса ВД штамма «NADL-ВНИИЗЖ» используют АЭЭИ, который вносят в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,15%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36÷37°С в течение 24 часов при значении рН 7,6-7,8 с периодическим перемешиванием суспензии (каждые 5-6 часов по 3-5 минут). По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденную до 2÷8°С суспензию антигена добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.
50
2
3
Для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины используют антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД/сми активностью в ИФА не менее 6,65 log до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
Исходный вирус для получения штамма «№101 ВНИИЗЖ» выделен из патологического материала телят, павших на территории Украины.
Производственный штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС получен путем многократных последовательных пассажей в чувствительных биологических системах (MDBK, Vero, Mark-145). Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, государственного учреждения «Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (ВГНКИ) 12 марта 2001 года под регистрационным шифром «№101 ВНИИЗЖ-ДЕП».
Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС характеризуется следующими признаками и свойствами (12).
Морфологические свойства
Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС относится к семейству Reoviridae, роду Rotavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ротавирусной инфекции КРС:
сферическая форма диаметром 65-75 нм, имеющая вид «колеса». Вирион состоит из сердцевины, внутреннего и наружного капсида. Сердцевина диаметром 40-45 нм имеет гексагональную форму и состоит из 3-х белков (VP1,VP2 и VP3) и РНК. Внутренний капсид (диаметр 15-20 нм) имеет икосаэдрическую форму и построен из 260 морфологических единиц, каждая из которых представлена белком VP6. Наружный капсид представлен белком VP7. На поверхности наружного капсида расположены «шипики», представленные димером белка VP4.
Антигенные свойства
Антиген ротавируса КРС штамма «№101 ВНИИЗЖ» индуцирует в организме иммунизированных морских свинок и кроликов образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции диффузионной преципитации (РДП) в разведениях от 1:16 до 1:64. В ИФА сыворотки положительно реагировали в разведениях от 1:128 до 1:2048, в реакции связывания комплемента (РСК) от 1:40 до 1:160.
2
2
2
В сыворотках крови глубокостельных коров через 10 дней после второй вакцинации антитела к ротавирусу КРС в ИФА выявляли в титрах от 8,2 до 10,8 log, в молозиве от вакцинированных коров титры антител к ротавирусу в ИФА составляли 8,8-14,0 log. Скармливание такого молозива обеспечивает высокий уровень колостральных антител (7,0-8,5 log) в организме телят.
Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС обладает широким антигенным спектром и доминантностью. Средний показатель двустороннего антигенного родства (R%) используемого штамма в реакции нейтрализации (РН) с 12 эталонным и эпизоотическими штаммами ротавируса КРС составил 56,3%.
Генотаксономическая характеристика
Геном ротавируса КРС состоит из 11 фрагментом 2-спиральной РНК. Ротавирусу КРС присуща значительная вариабельность вирулентности и антигенности. Известны 3 серотипа возбудителя и, кроме того, у КРС выявлены AT к 3-серотипам ротавируса человека. Кроме существования 3-х серотипов вируса не исключается возможность циркуляции атипичных ротавирусов.
Биотехнологические характеристики
6
8
3
Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС адаптирован к культурам клеток MDBK, СПЭВ, КСТ, Vero и Маrс-145 и репродуцируется в них в течение 18-48 часов при 37°С со степенью накопления от 10 до 10 вирусных частиц/см. Результаты исследований по адаптации штамма «№101 ВНИИЗЖ» к указанным культурам клеток представлены в таблице 4.
Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в указанных культурах на протяжении 20 пассажей (срок наблюдения).
Физические свойства
3
3
Плавучая плотность полных вирионов ротавируса КРС в градиенте хлористого цезия составляет 1,36 г/см, а однокапсидных частиц 1,38 г/см. Коэффициент седиментации полных частиц составляет 500-530 S, а однородных частиц 380÷400 S.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС устойчив к хлороформу, фреону, эфиру, кислой (рН 4,0) и щелочной (рН 8,0) средам. Возбудитель устойчив к воздействию трипсина.
Инактивированный антиген ротавируса КРС штамма «№101 ВНИИЗЖ» устойчив в процессе хранения при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированных вакцинных препаратов. Дополнительные признаки и свойства
Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированных вакцинных препаратов, препарата для гипериммунизации доноров диагностических сывороток и антительных лечебных препаратов.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в перевиваемых культурах клеток на протяжении 20 пассажей (срок наблюдения).
Патогенность - не патогенен для морских свинок, кроликов и белых мышей.
Контагиозность - выражена.
Онкогенность - отсутствует.
Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и другими вирусами.
Для получения антигенного материала из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно культуры клеток СПЭВ.
При необходимости для получения антигенного материала из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС можно использовать культуры клеток Таурус-2, Vero и Маrс-145.
Полученный вируссодержащий материал освобождают от клеточного детрита и других балластных примесей низкоскоростным центрифугированием или любым другим известным методом.
Для инактивации ротавируса используют АЭЭИ, который вносят в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,15%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36-37°С в течение 24 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию антигена тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.
50
2
3
Для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины используют антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в культуре клеток СПЭВ, или Таурус-2, или Vero или Магс-145 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД/см и активностью в ИФА не менее 4,0 lоg до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения производственного штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, выделен из фекалий новорожденного теленка с нарушением функции желудочно-кишечного тракта. Производственный штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС адаптирован к культурам клеток MDBK, Таурус-1, КСТ и Vero.
Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС депонирован 12 марта 2001 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, государственного учреждения «Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (ВГНКИ) под регистрационным наименованием «ВНИИЗЖ-ДЕП».
Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС характеризуется следующими признаками и свойствами (13).
Морфологические признаки
Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС относится к семейству Coronaviridae, роду Coronavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя коронавирусной инфекции КРС: сферический или плеоморфный вирион диаметром 80-100 нм состоит из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются булавовидные выступы длиной 18-24 нм, образующие подобие солнечной короны. В составе вирионов обнаружены три структурных белка: пепломерный гликопротеин Е2 (180-200 кД), нуклеокапсидный фосфопротеин N (50-60 кД) и матриксный гликопротеин Е1 (23-30 кД).
Антигенные свойства
2
2
2
2
Антиген коронавируса КРС штамма «ВНИИЗЖ» индуцирует в организме морских свинок и кроликов образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В сыворотках крови вакцинированных кроликов уровень антител колеблется от 5,4±0,25 до 7,25±0,47 log (в среднем 6,32±0,39 log), а в сыворотках крови иммунизированных морских свинок - от 5,4±0,38 до 8,2±0,8 log (в среднем 6,1±0,49 log).
2
В сыворотках крови проб, отобранных за 10÷15 дней до отела, дважды вакцинированных коров выявляются антитела в РТГА в титрах от 7,9±0,35 до 8,9±0,47 log.
2
Своевременное скармливание такого молозива обеспечивает высокий уровень колостральных антител (до 8,0 log) в организме новорожденных телят.
Генотаксономическая характеристика
Геном вируса представлен однонитевой, фрагментированной РНК.
Биотехнологические характеристики
8
3
Коронавирус КРС штамма «ВНИИЗЖ» репродуцируется в культурах клеток почек теленка (MDBK, Таурус-1), коронарных сосудов теленка (КСТ) и в гетерологичной культуре клеток почек обезьяны (Vero). При 37°С в течение 3-4 суток инкубирования вирус накапливается в количестве до 10 вирусных частиц/см (данные электронномикроскопического исследования). Результаты исследований по адаптации коронавируса КРС штамма «ВНИИЗЖ» к культурам клеток RBT, MDBK, Таурус-2 и Vero представлены в таблице 5.
Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС обладает способностью в культуре клеток MDBK репродуцироваться с такой же степенью накопления при 34°С. Срок репродукции при этой температуре увеличивается почти на сутки, однако позволяет получать двойной урожай вируса путем смены поддерживающей среды. «Слив» обладает высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью.
Физические свойства
3
Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозы составляет 1,15÷1,18 г/см.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС проявляет максимальную устойчивость в диапазоне рН 6,0÷7,2. Кислая (рН 3,0) и щелочная (рН 11,0) среды оказывает на вирус инактивирующее действие. Возбудитель устойчив к воздействию трипсина. Вирус разрушается жирорастворителями: хлороформом, метиленхлоридом, эфиром, твином и тритоном Х-100. Инактивированный антиген коронавируса КРС штамма «ВНИИЗЖ» устойчив в процессе хранения при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированных вакцин.
Дополнительные признаки и свойства
Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток MDBK в течение 30 пассажей (срок наблюдения).
Патогенность - не патогенен для морских свинок кроликов и белых мышей.
Контагиозность - выражена.
Онкогенность - отсутствует.
Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и другими гемагглютинирующими вирусами.
Для получения антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно культуру клеток RBT и Таурус-2.
При необходимости для получения антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС можно использовать культуры клеток MDBK и Vero.
Полученный вируссодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.
Для инактивации вируса используют АЭЭИ, который вносят в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,10%. Инактивацию вируса ведут при 37°С в течение 24 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию антигена тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.
50
2
3
Для изготовления предлагаемой вакцины используют в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в культуре клеток RBT, или MDBK, или Таурус-2 или Vero с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД/см и активностью в РГА не менее 8,0 log до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его реализации и использования.
Пример 1
Для приготовления ассоциированной вакцины против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС эмульсионной инактивированной используют производственные штаммы вирусов: штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС и штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС.
Технологический процесс состоит из следующих технологических этапов:
- получения вирусных суспензий из штаммов вируса ВД КРС «NADL-ВНИИЗЖ», ротавируса КРС «№101 ВНИИЗЖ» и коронавируса КРС «ВНИИЗЖ»;
- определения активности каждой вирусной суспензии;
- инактивации вируссодержащих культуральных жидкостей каждого штамма отдельно;
- объединения полученных инактивированных суспензий вирусов;
- добавления адъюванта;
- смешивания всех компонентов вакцины с последующей расфасовкой готового продукта.
Стадия получения вирусных суспензий согласно изобретению основывается на системе посевных материалов (Seed lot system) - это система, при которой последовательные серии производственного штамма получают из главного посевного материала (Master seed) при определенном количестве пересевов (пассажей). В текущем производстве из главного посевного материала готовится производственный штамм посевного материала. Производственное сырье культурального вируса производится из рабочего посевного материала (Working seed) или его следующей генерации - рабочей расплодки. При этом число пересевов из главного посевного материала не должно превышать значений, установленных для каждого конкретного микроорганизма или биопрепарата, изготовленного на их основе.
Процесс получения системы посевных материалов каждого вируса включает несколько этапов:
- подбор кондиционных культур клеток;
- освежение главного посевного материала;
- сбор инфекционного материала;
- контроль стерильности и биологической активности главного посевного материала;
- расфасовка и хранение главного посевного материла;
- приготовление рабочего посевного материала;
- сбор инфекционного материала;
- контроль стерильности и биологической активности рабочего посевного материала;
- расфасовка и хранение рабочего посевного материала.
Посевной материал, используемый для изготовления вакцины, получают в перевиваемых культурах клеток.
3
3
3
Для изготовления вакцины ассоциированной против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС эмульсионной инактивированной используют культуральный вирус ВД КРС, выращенный в 1,5 дм матрасах или в роллерных сосудах, культуральный ротавирус КРС, выращенный в 1,5 дм матрасах или в роллерных сосудах, и культуральный коронавирус КРС, выращенный в 1,5 дм матрасах или в роллерных сосудах. В составе вакцины должно содержаться:
50
2
3
1. Антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2, или RBT или ПС с инфекционной активностью, не менее 6,0 lg ТЦД/см и активностью в ИФА не ниже 6,65 log в количестве 10,0 мас.%.;
50
2
3
2. Антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток СПЭВ, или Таурус-2, или Vero или Маrс-145 с ифекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД/см и активностью в ИФА не ниже 4,0 log в количестве 10,0 мас.%.;
50
2
3
3. Антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток RBT, или MDBK, или Таурус-2 или Vero с инфекционной активностью, не менее 5,0 lg ТЦД/см и активностью в РГА не ниже 8,0 log в количестве 10,0 мас.%.;
4. Масляный адъювант в количестве 69,6 мас.%;
5. Сапонин в количестве 0,4 мас.%.
Содержимое матрасов и роллерных сосудов сливают в отдельные емкости и охлаждают при температуре 2÷8°С, освобождают от клеточного детрита известным способом, используя низкоскоростное центрифугирование. Освобожденная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розового цвета. Затем из емкости отбирают пробу для производственного контроля вирусного сырья.
Производственная серия вируса ВД КРС должна иметь:
50
3
- инфекционную активность не менее 6,0 lg ТЦД/см;
2
- активность в ИФА не ниже 6,65 lоg.
Производственная серия ротавируса КРС должна иметь:
50
3
- инфекционную активность не менее 6,0 lg ТЦД/см
2
- активность в ИФА не ниже 4,0 lоg.
Производственная серия коронавируса КРС должна иметь:
50
3
- инфекционную активность не менее 5,0 lg ТЦД/см;
2
- активность в РГА не ниже 8,0 lоg.
Инактивацию вирусного сырья осуществляют с помощью 6%-ного раствора аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ), вносимого в вирусную суспензию каждого вируса до конечной концентрации 0,10-0,15 мас.%. Инактивацию проводят при температуре 37,0°С в течение 24 часов с периодическим перемешиванием (каждые 5-6 часов по 3-5 мин).
По окончании инактивации антигенный материал каждого вируса охлаждают до температуры 2-8°С и отбирают пробы для определения рН, стерильности и полноты инактивации.
Для нейтрализации АЭЭИ в суспензию антигенного материала добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.
Полученный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС и штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС используют для изготовления эмульсионной формы вакцины против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС.
Для этого антигенный материал тщательно эмульгируют с масляным адъювантом и сапонином в соотношении, мас.%: 10,0:10,0:10,0:69,6:0,4 соответственно.
Полученная вакцина представляет собой эмульсию белого или бело-розового цвета слегка вязкой консистенции. При хранении допускается незначительное отслоение минерального масла в верхней и уплотнение эмульсии в нижней части флакона. При тщательном взбалтывании эмульсия приобретает однородную структуру.
Вакцину контролируют на стерильность, стабильность, полноту инактивации (авирулентность), безвредность и антигенную активность, а затем фасуют в стерильные флаконы.
Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085.
Контроль вакцины на стабильность эмульсии осуществляют посредством центрифугирования при 400 g в течение 10 минут с последующей визуальной оценкой однородности эмульсии.
Полноту инактивации препарата определяют методом трехкратных последовательных пассажей вакцины в перевиваемой культуре клеток по отсутствию ЦПД, а также в РГА (для коронавируса).
3
3
Определение безвредности вакцины проводят на белых мышах или на естественно восприимчивых животных - телятах 2÷3-месячного возраста. Для этого препарат вводят подкожно в область спины в дозе 0,1 см десяти белым мышам или внутримышечно в области средней трети шеи по 4 см двум телятам (две прививные дозы).
Вакцина считается безвредной, если телята и лабораторные животные в течение 10 суток наблюдения остаются клинически здоровыми без каких-либо патологических изменений. На месте введения допускается местная тканевая реакция.
3
Антигенность вакцины проверяют на кроликах. В опыт берут 7 кроликов массой 2,0-2,5 кг. Вакцину вводят 5 кроликам подкожно в области спины по 2 см. Перед вакцинацией и через 28 сут после двукратного введения вакцины с интервалом 20-25 сут у кроликов берут кровь, выдерживают при температуре (37±0,5)°С, отделяют сыворотку и исследуют на наличие антител к вирусу ВД КРС в ИФА или в реакции нейтрализации (РН) или в реакции микронейтрализации (РМН), к ротавирусу КРС в реакции ИФА или в реакции РН и к коронавирусу в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). У невакцинированных (контрольных) животных (2 головы) кровь отбирают и исследуют одновременно с вакцинированными животными. Серию вакцины считают прошедшей контроль на антигенную активность, если титр специфических антител к вирусу ВД КРС в ИФА ≥ 1:50, или в РН ≥ 1:4, или в РМН ≥ 1:2, к ротавирусу в ИФА ≥ 1:64 или в РН ≥ 1:2, к коронавирусу в РТГА ≥ 1:32.
Из полученного антигенного материала была приготовлена серия вакцины ассоциированной против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС эмульсионной инактивированной, содержащей, мас.%:
Авирулентный и очищенный антигенный
материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ»
вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой
культуре клеток RBT с инфекционной активностью
50
2
3
6,5 lgТЦД/см и активностью в ИФА 6,65 log
до инактивации (далее «Антигенный материал»)
10,0
Авирулентный и очищенный антигенный
материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС,
полученного в перевиваемой культуре клеток СПЭВ
50
3
с инфекционной активностью 7,0 lgТЦД/см
до инактивации (далее «Антигенный материал»)
10,0
Авирулентный и очищенный антигенный
материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС,
полученного в перевиваемой культуре клеток RBT
50
3
с инфекционной активностью 6,0 lgТЦД/см
и активностью в РГА 8,0 lоg<sub>2</sub> до инактивации (далее «Антигенный материал»)
10,0
Масляный адъювант
69,6
Сапонин
0,4
Пример 2
Проведены испытания антигенной активности предлагаемой вакцины ассоциированной против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС эмульсионной инактивированной, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Антигенный материал
30,0
Масляный адъювант
69,6
Сапонин
0,4
3
Антигенную активность вакцины ассоциированной против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС эмульсионной инактивированной проверяли на кроликах, которым вводили вакцину в дозе 2,0 см. Животных иммунизировали двукратно с интервалом 20-25 суток. Через 28 суток после двукратного введения вакцины, у животных отбирали кровь, отделяли сыворотку и исследовали на наличие антител: к вирусу ВД в ИФА, к ротавирусу в реакции ИФА, к коронавирусу в РТГА. Результаты исследований представлены в табл.6.
2
2
2
2
Из данных табл.6 видно, что подкожный способ введения вакцины способствует образованию более высокого уровня антител у привитых животных. В сыворотках крови кроликов, иммунизированных подкожным способом, титр вируснейтрализующих антител после ревакцинации (на 35 день) к вирусу ВД КРС составлял 11,9±0,35 lоg и был на 1,0 lоg выше, чем у животных, иммунизированных внутримышечно, к ротавирусу КРС титр антител на 35 день составлял 7,0±0,29 lоg, к коронавирусу КРС титр антител на 35 день после вакцинации составил 8,2±0,33 lоg.
Таким образом, результаты, полученные на лабораторных животных, свидетельствуют о высокой антигенной активности вакцины, ассоциированной против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионной инактивированной.
Пример 3
Проведены испытания антигенной активности предлагаемой вакцины, ассоциированной против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионной инактивированной, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Антигенный материал
30,0
Масляный адъювант
69,6
Сапонин
0,4
3
С целью изучения эффективности вакцины против ВД, рота- и коронавирусной инфекций КРС в производственных условиях вакцину применяли в неблагополучных по данным инфекциям хозяйствах для профилактики ВД, рота- и коронавирусной инфекций КРС у молодняка КРС. Вакцинации подлежали клинически здоровые животные. Вакцину вводили внутримышечно в области средней трети шеи двукратно с интервалом 21 сутки в объеме 2 см.
До вакцинации в хозяйстве отмечали массовые заболевания среди телят 1-месячного возраста со следующей клинической картиной: угнетение, ухудшение аппетита, серозные истечения из носа, кашель, пневмония, диарея. Количество молодняка КРС в хозяйстве составляло 700 голов, гибель среди заболевшего молодняка достигала 14%. На долю желудочно-кишечной и респираторной патологии приходилось по 50% павших животных. В пробах патологического материала обнаружены геномы вируса ВД, рота- и коронавирусной инфекций КРС.
3
Были сформированы 2 группы телят. Первой группе (7 голов) вакцину вводили внутримышечно в дозе 2 см. Вторая группа (2 головы) служила контролем. За животными вели наблюдение в течение 35 дней. Сыворотку крови животных исследовали на наличие антител к вирусу ВД и ротавирусу в ИФА, к коронавирусу в РТГА. Отбор проб сывороток крови проводили по следующей схеме: до вакцинации, перед ревакцинацией на 21 день и после ревакцинации на 35 день (табл.7).
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Из табл.7 видно, что в опытной группе после ревакцинации на 35 день происходил значительный подъем уровня антител к вирусу ВД до 10,5±0,35 log, к ротавирусу до 8,1±0,32 log и к коронавирусу до 7,7±0,34 log. Таким образом, прирост титра антител к 35 дню после вакцинации к вирусу ВД составлял 2,1 log, к ротавирусу - 1,4 log, к коронавирусу - 1,4 log. В контрольной группе животных титр антител к 21 дню после начала опыта постепенно снижался и составлял 5,6 logк вирусу ВД, 3,9 log к ротавирусу и 3,0 log к коронавирусу КРС.
Применение вакцины позволило снизить падеж молодняка в хозяйстве с 14% до 7,5%. Заболевание отдельных животных протекало с менее выраженной клинической картиной.
Пример 4
Проведены испытания антигенной активности предлагаемой вакцины, ассоциированной против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионной инактивированной, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Антигенный материал
30,0
Масляный адъювант
69,6
Сапонин
0,4
Антигенная активность вакцины ассоциированной против ВД, рота- и коронавирусной инфекций КРС эмульсионной инактивированной была также проверена на 33 глубокостельных коровах, в одном из хозяйств Владимирской области.
3
Были сформированы 2 группы коров. Первой группе (25 голов) вакцину вводили внутримышечно в дозе 2 см. Вторая группа (8 голов) служила контролем. За животными вели наблюдение в течение 35 дней. Сыворотку крови животных исследовали на наличие антител к вирусу ВД и ротавирусу в ИФА, к коронавирусу - в РТГА. Отбор проб сывороток крови проводили по следующей схеме: до вакцинации, перед ревакцинацией на 21 день и после ревакцинации на 35 день. Динамика нарастания титров антител представлена в табл.8.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Из табл.8 видно, что в опытной группе после ревакцинации на 35 день происходил значительный подъем уровня антител к вирусу ВД КРС до 10,5±0,38 log, к ротавирусу КРС до 8,7±0,41 log и к коронавирусу КРС до 9,8±0,40 log. Таким образом, прирост титра антител к 35 дню после вакцинации к вирусу ВД КРС составлял 2,4 log, к ротавирусу - 1,0 log, к коронавирусу - 1,3 log. В контрольной группе животных титр антител к 21 дню после начала опыта постепенно снижался и составлял 5,6 log к вирусу ВД КРС, 3,9 log к ротавирусу КРС и 4,0 log к коронавирусу КРС.
Применение вакцины, ассоциированной против ВД, рота- и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионной инактивированной, способствует выработке достаточно высокого уровня антител, что в свою очередь способствует защите поголовья от данных инфекций. Содержание высокого уровня антител в молозиве коров способствует профилактике данных инфекций у телят при условии своевременной выпойки молозива.
Таким образом, вакцина ассоциированная против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионная инактивированная, обладает высокой антигенной активностью, а титры антител, полученные в результате двукратной иммунизации животных, достигали достаточного уровня, чтобы защитить животное от данных инфекций.
Пример 5
Проведены испытания эффективности предлагаемой вакцины, ассоциированной против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионной инактивированной, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:
Антигенный материал
30,0
Масляный адъювант
69,6
Сапонин
0,4
В 14 животноводческих хозяйствах была испытана предлагаемая вакцина. В табл.9 приведены результаты исследований сывороток крови от КРС, привитого вакциной, ассоциированной против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионной инактивированной. Эти данные свидетельствуют об эффективности указанного препарата.
Таким образом, показана возможность оздоровления стада от желудочно-кишечных заболеваний вирусной этиологии посредством применения ассоциированной вакцины против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионной инактивированной.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина ассоциированная против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС эмульсионная инактивированная»
1. Литвин В.П., Поживал А.И. Инфекционные и инвазионные болезни телят. - Киев, 1991. - 207 с.
2. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М., ВНИИТИБН, 1998, 928 с.
3. Гаффаров Х.З., Иванов А.В., Непоклонов Е.А. Равилов А.З. Моно- и смешанные диареи новорожденных телят. - Казань: ФЭН, 2002. - 590 с.
4. Инфекционная патология животных: В 2 т./под ред. А.Я.Самуйленко, Б.В.Соловьева, Е.А.Непоклонова, Е.С.Воронина. - М.: «Академкнига», 2006. - Т.1. - 911 с.
5. Пат. ЧССР №249880; А61К 39/295, 39/108; 16.04.1987 г.
6. Пат. ЧССР №250849; А61К 39/295, 39/108; 14.05.1987 г.
7. Пат. ЧССР №250850; А61К 39/295, 39/108; 14.05.1987 г.
8. Наставление по применению вакцины инактивированной комбинированной против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, коронавирусных болезней телят Комбовак, №13-3-04/0703 от 20.03.2003 г., утвержденное Департаментом ветеринарии 20.03.2003 г.
9. Пат. РФ №2261111; А61К 39/295, 27.09.2005 г.
10. Инструкция по применению вакцины инактивированной комбинированной против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят «Комбовак-К», утвержденная Департаментом ветеринарии 30.03.2007 г.
11. Пат. РФ №2449013, C12N 7/00, А61 К39/12; 27.04.2012 г.
12. Пат. РФ №2264458; C12N 7/00, А61К 39/15; 20.11.2005 г.
13. Пат. РФ №2268937; C12N 7/00, А61К 39/215, А61Р 31/12; 27.01.2006 г.
Таблица 1
Результаты адаптации вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» к культуре клеток Таурус-2
№ пассажа
Время культивирования(ч)
Титр вируса в культуре клеток (lgТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>)
Титр вируса в ИФА (log2)
1-й
96-120
3,8
4,3
2-й
96-120
4,5
5,3
3-й
96-120
6,5
6,9
5-й
72-96
6,8
7,1
7-й
72-96
6,6
7,0
Таблица 2
Результаты адаптации вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» к культуре клеток RBT
№ пассажа
Время культивирования (ч)
Титр вируса в культуре клеток (lgТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>)
Титр вируса в ИФА (log<sub>2</sub>)
1-й
96-120
6,5
7,0
2-й
96-120
6,0
6,9
3-й
72-96
6,8
7,1
5-й
72-96
6,8
7,2
7-й
72-96
6,4
6,6
Таблица 3
Результаты адаптации вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» к культуре клеток ПС
№ пассажа
Время культивирования (ч)
Титр вируса в культуре клеток (lgТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>)
Титр вируса в ИФА (log<sub>2</sub>)
1-й
96-120
4,1
4,9
2-й
96-120
4,5
5,0
3-й
96-120
5,5
5,9
5-й
72-96
6,8
7,0
7-й
72-96
6,6
7,0
Таблица 4
Сравнение продуктивности различных клеточных культур при заражении штаммом «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС
Культура клеток
№№ пассажа
Время культивирования (ч)
Титр вируса в культуре клеток (lgТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>)
Титр вируса в ИФА (log<sub>2</sub>)
СПЭВ
1
42
6,8-7,3
5,0-6,0
2
42
7,3-7,5
8,0
3
24
7,2-7,5
7,0-8,0
4
24
7,2-7,5
7,0-8,0
Таурус-2
1
24
7,0-7,3
6,0
2
24
7,3-8,0
6,0-7,0
3
24
7,5-8,0
6,0-7,0
4
24
6,8-7,3
5,0-6,0
Маrc-145
1
24
7,0-7,5
6,0-7,0
2
24
7,5-7,6
7,0-8,0
3
24
7,0-7,5
7,0
4
24
6,7-7,0
6,0-7,0
Таблица 5
Чувствительность перевиваемых культур клеток к коронавирусу КРС, штамма «ВНИИЗЖ»
Культура клеток
Время культивирования (ч)
Титр вируса в культуре клеток (lgТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>)
Титр вируса в РГА (log<sub>2</sub>)
RBT
48-72
5,0-7,5
8,0-9,0
MDBK
72-96
-
7,0-8,5
Таурус-2
48-72
5,0-6,0
8,0-9,0
Таблица 6
Антигенная активность вакцины ассоциированной против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионной инактивированной для кроликов
Способ вакцинации
Иммунный статус животных
Средний титр антител (log<sub>2</sub>) к вирусам
ВД
Рота-
Корона-
Подкожный
до вакцинации
0
0
0
перед ревакцинацией
9,4±0,52
7,0±0,51
6,4±0,51
после ревакцинации
11,9±0,35
7,0±0,29
8,2±0,33
Внутримышечный
до вакцинации
0
0
0
перед ревакцинацией
9,1±0,47
7,5±0,51
5,7±0,52
после ревакцинации
10,9±0,29
7,2±0,28
7,6±0,29
Таблица 7
Антигенная активность вакцины против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций, эмульсионной инактивированной у молодняка КРС
Иммунный статус
Средний титр антитела к вирусам
ВД
Рота-
Корона-
До вакцинации Процент антителосодержащих сывороток (%)
22,2
55,6
44,4
Средний титр антител (log<sub>2</sub>)
8,4±0,83
6,7±0,83
6,3±0,94
Перед ревакцинации Процент антителосодержащих сывороток (%)
66,6
100
66,7
Средний титр антител (log<sub>2</sub>)
9,1±0,51
7,8±0,49
6,9±0,54
После ревакцинации Процент антителосодержащих сывороток (%)
88,8
100
88,9
Средний титр антител (log<sub>2</sub>)
10,5±0,35
8,1±0,32
7,7±0,34
Таблица 8
Антигенная активность вакцины против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионной инактивированной для глубокостельных коров
Иммунный статус
Средний титр антитела к вирусам
ВД
Рота-
Корона-
До вакцинации Процент антителосодержащих сывороток (%)
12,1
81,8
100
Средний титр антител (lоg<sub>2</sub>)
8,1±0,84
7,7±0,93
8,5±0,84
Перед ревакцинации Процент антителосодержащих сывороток (%)
75,8
94,0
100
Средний титр антител (lоg<sub>2</sub>)
8,9±0,61
8,0±0,59
9,4±0,57
После ревакцинации Процент антителосодержащих сывороток (%)
84,8
97,0
100
Средний титр антител (lоg<sub>2</sub>)
10,5±0,38
8,7±0,41
9,8±0,40
Таблица 9
Исследования сывороток крови КРС, иммунизированного предлагаемой вакциной ассоциированной против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионной инактивированной
№№ п/п
Возраст животных во время вакцинации
Показатели
ВД
рота-
корона-
ДО вакцинации
после вакцинации
до вакцинации
после вакцинации
до вакцинации
после вакцинации
1
коровы
кол-во сывороток
33
33
33
33
33
33
в т.ч. антитело-содержащих (%)
33,1
100
45,1
100
25,4
100
2
коровы
кол-во сывороток
15
15
15
15
15
15
в т.ч. антитело-содержащих (%)
12,1
100
45,8
100
50,0
100
3
телята
кол-во сывороток
18
18
18
18
18
18
в т.ч. антитело-содержащих (%)
24,0
100
55,0
100
44,3
100
4
телята
кол-во сывороток
10
10
10
10
10
10
в т.ч. антитело-содержащих (%)
32,8
100
33,0
100
41,1
88,9