Совершенствование теплового блока анализатора нуклеиновых кислот

ПРОБЛЕМАТИКА ТРАНСПОРТНЫХ СИСТЕМ

УДК 57.088

Д. А. Белов, Ю. В. Белов, И. Г. Киселев, Ю. О. Водопьянова

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕПЛОВОГО БЛОКА АНАЛИЗАТОРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Дата поступления: 06.07.2018 Решение о публикации: 17.10.2018

Аннотация

Цель: Разработка технических решений, направленных на уменьшение неравномерности температурного поля теплопроводящего элемента в режиме плавления. Методы: Работа анализаторов нуклеиновых кислот основана на методе полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) и методе плавления высокого разрешения (HRMA). Результаты: Разработаны технические решения, обеспечивающие уменьшение неравномерности температурного поля теплопроводящего элемента в режиме плавления. Практическая значимость: Предложенные технические решения обеспечивают уменьшение погрешности измерения температуры плавления ДНК.

Ключевые слова: ПЦР-РВ, плавление ДНК, метод плавления высокого разрешения.

*Dmitriy A. Belov, postgraduate student, onoff_10@mail.ru; Yuriy V. Belov, Cand. Phys. and Math. Sci., associate professor; Igor G. Kiselev, D. Eng. Sci., professor; Yulia O. Vodopyanova, postgraduate student, julua_gazonn@mail.ru (Emperor Alexander I Petersburg State Transport University) THE IMPROVEMENT OF THERMAL ANALYZER BLOCK FOR NUCLEIC ACIDS

Summary

Objective: To develop engineering solutions, aimed at irregularity reduction of temperature field of a heat-conducting element in melting condition. Methods: Functioning of analyzers of nucleic acids is based on the method of real-time polymerase chain reaction (PCR-RT) and high-resolution melting analysis. Results: Engineering solutions which provide for the reduction of irregularity of temperature field of a heat-conducting element in melting condition were developed. Practical importance: The introduced engineering solutions make it possible to reduce errors which occur in the process of measuring the temperature of DNA melting.

Keywords: Real-time polymerase chain reaction (PCR-RT), DNA melting, high-resolution melting method.

Плавление дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) - процесс перехода регулярной двойной спирали линейной молекулы ДНК в клубкообразное состояние под действием температуры [1]. Основанный на этом процессе метод плавления высокого разрешения (High Resolution Melting analysis, HRMA) является методом анализа ДНК, который был разработан в 2002 г. благодаря сотрудничеству между учеными (University of Utah, США) и представителями промышленности (Idaho Technology, США) [2, 3].

HRMA проводится после завершения полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) путем регистрации и последующего анализа флуоресцентного отклика, величина которого изменяется во время постепенного увеличения температуры с шагом 0,008-0,2 °C [4].

Использование метода для решения практических задач многократно доказывало свою эффективность, например, при диагностировании туберкулеза со множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ МБТ): для быстрой детекции мутаций, вызывающих лекарственную устойчивость у микобактерий туберкулеза [5, 6], в эпигенетических исследованиях для определения уровня метилирования фрагментов ДНК [7].

Следует отметить высокую чувствительность и специфичность метода: так, при выявлении МЛУ МБТ чувствительность составляет 80-98,6 % [8], специфичность достигает 100 % [9].

В настоящее время некоторые компании начали выпускать для применения на практике HRMA программное обеспечение и реактивы. Специальное оборудование не требуется: современные анализаторы нуклеиновых кислот позволяют кроме анализа ПЦР-РВ проводить HRMA, в частности приборы 7500 Fast Real-Time PCR System и StepOne Plus компании «Life Technologies», США, CFX 96 Touch™ компании «BIO-RAD», Stratagene MX3005P компании «Agilent», The LightCyclerR 96 System компании «Roche Diagnostics GmbH», DTprime компании «ДНК-технология» и др.

Анализируемые образцы, объем которых составляет 10-30 мкл, помещаются в полипропиленовые пробирки объемом 0,1-0,6 мл или в микро-титраторные планшеты вместимостью от 96 до 384 образцов. Обеспечение температурных циклов осуществляется тепловым блоком. Чаще всего в тепловых блоках используются твердотельные металлические теплопроводящие элементы из алюминия или позолоченного серебра, нагрев и охлаждение производятся элементами Пельтье [10].

Применение элементов Пельтье имеет ряд преимуществ [11]: отсутствие движущихся, изнашивающихся частей, вибрации и шума; высокая охлаждающая способность на единицу веса и объема - до 150 Вт/г и до 100 Вт/см 3; возможность плавного и высокоточного регулирования холодопроизводитель-ности и температурного режима; малая инерционность, быстрый переход из режима охлаждения в режим нагрева; отсутствие рабочих жидкостей и газов; практически неограниченный ресурс работы; произвольная ориентация

в пространстве и поле тяжести; устойчивость к динамическим и статическим перегрузкам; экологическая чистота.

При проведении анализа методом ПЦР-РВ важны скорости изменения температуры. Обычно они варьируют от 1 до 6 ^ в секунду, при этом охлаждение происходит значительно медленнее, чем нагрев [10].

Для увеличения скорости изменения температуры в режиме охлаждения авторами ранее было предложено ввести в состав теплового блока гидравлическую систему, которая обеспечивает дополнительный сток теплоты за счет протекания жидкости в каналах теплопроводящего элемента [12].

При работе гидравлической системы в циклическом режиме (рис. 1) с помощью контроллера поршневые или мембранные насосы 1 и 2 через клапаны 2 и 4 в течение времени стабилизации температуры на нижнем уровне, нагрева и стабилизации температуры на верхнем уровне заполняются с выходов емкости 1 соответственно воздухом и жидкостью. В режиме охлаждения насос 2 через клапан 3 обеспечивает заполнение жидкостью и проточный режим каналов держателя пробирок. В конце режима охлаждения насос 2 останавливается, а насос 1 через клапан 1 обеспечивает удаление жидкости из каналов держателя пробирок в емкость 2. Через отверстия в перегородке выравниваются уровни жидкости в емкостях 1 и 2. Температурные циклы многократно повторяются.

При всех температурных режимах активно работают термоэлектрические элементы. Температура заполняющей емкости жидкости с помощью радиаторов поддерживается на уровне температуры окружающей среды.

Рис. 1. Схема гидравлической системы

При протекании жидкости через внутренние каналы теплопроводящего элемента активно происходит теплообмен между нагретым теплопроводящим элементом с пробирками и жидкостью, обладающей значительно меньшей температурой.

Одной из основных причин погрешностей измерения температуры плавления ДНК является разность температур соседних пробирок. Уменьшение погрешностей измерения возможно благодаря методам обработки кривых плавления [13], получаемых в результате анализа, и путем компенсации неравномерности температурного поля теплопроводящего элемента [14].

Для выравнивания неравномерности температурного поля в режиме плавления известная гидравлическая система [12] дополнительно содержит насос 3 и электромагнитный или обратный клапан 5.

Режим плавления выполняется с помощью непрерывного или ступенчатого изменения температуры теплопроводящего элемента благодаря работе термоэлектрического элемента 1. С помощью насоса 3 через клапан 5 жидкость усредненной температуры поступает на входы внутренних каналов теплопроводящего элемента. При протекании жидкости через каналы активно происходит теплообмен между теплопроводящим элементом и жидкостью. Потоки жидкости с выходов внутренних каналов смешиваются.

Круговое движение жидкости в каналах обеспечивает выравнивание температуры всех пробирок, содержащих реакционную смесь. Таким образом, достигается уменьшение разброса результатов анализа в режиме плавления.

Для устранения краевого эффекта циркуляция воды в теплопроводящем элементе происходит в соответствии с рис. 2.

Вход воды—>

с;

Вход воды—>

оооооооо =оо=о=оо=ооо= оооооооо оооооооо

->

)

-> Выход воды

)

Рис. 2. Схема движения воды в каналах теплопроводящего элемента

На основе анализатора нуклеиновых кислот АНК-32, который серийно выпускается в Институте аналитического приборостроения РАН (ИАП РАН, Санкт-Петербург), разработан экспериментальный образец теплового блока, при испытании которого получены следующие результаты: разброс температур по пробиркам уменьшился более чем в 3 раза.

Новизна предложенных технических решений подтверждена патентом на изобретение [15].

Работа выполнена в ИАП РАН в рамках НИР по государственному заказу 0074-2014-0010, государственный регистрационный номер: АААА-А16-116041310008-3.

Библиографический список

1. Веденов А. А. Переход спираль-клубок в ДНК / А. А. Веденов, А. М. Дыхне, М. Д. Франк-Каменецкий // Успехи физ. наук. - 1971. - Т. 105, вып. 3. - С. 479-519.

2. Wittwer C. T. High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen / C. T. Wittwer, G. H. Reed, C. N. Gundry, J. G. Vandersteen, R. J. Pryor // Clin Chem. -2003. - Vol. 49. - P. 853-860.

3. Reed G. H. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics / G. H. Reed, J. O. Kent, C. T. Wittwer // Pharmacogenomics. - 2007. - Vol. 8. -P. 597-608.

4. Никитина Д. И. Использование высокоразрешающего анализа кривых плавления ДНК в диагностике наследственных заболеваний / Д. И. Никитина, М. А. Маретина, А. А. Егорова, А. Б. Масленников, А. В. Киселев // Медицинская генетика. - 2017. - № 16 (5). -С. 26-33.

5. Hoek K. G. Fluorometric assay for testing rifampin susceptibility of Mycobacterium Tuberculosis Complex / K. G. Hoek, N. C. Gey van Pittius, H. Moolman-Smook, K. Carelse-Tofa, A. Jordaan, G. D. van der Spuy, E. Streicher, T. C. Victor, P. D. van Helden, R. M. Warren // J. Clin. Microbiol. - 2008. - Vol. 46. - Р. 1369-1373.

6. Choi G. E. High-resolution melting curve analysis for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium Tuberculosis clinical isolates / G. E. Choi, S. M. Lee, J. Yi, S. H. Hwang, H. H. Kim, E. Y. Lee, E. H. Cho, J. H. Kim, H. J. Kim, C. L. Chang // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48, N 11. - Р. 3893-3898.

7. Wojdacz T. K. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation / T. K. Wojdacz, A. Dobrovic // Nucleic Acids Res. - 2007. - N 35 (6). - Р. 41-48.

8. Galarza M. High-resolution melting analysis for molecular detection of multidrug resistance tuberculosis in Peruvian isolates / M. Galarza, M. Fasabi, K. S. Levano, E. Castillo, N. Barreda, M. Rodriguez, H. Guio // MC Infectious Diseases. - December 2016. - P. 260-266.

9. Лаврова О. И. HRM - новый молекулярный метод определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза / О. И. Лаврова, М. В. Альварес Фигероа, М. Г. Тво-рогова // Клиническая лабораторная диагностика. - 2014. - № 7. - С. 62-64.

10. Магданов Э. Г. Современное приборное оснащение количественной и цифровой ПЦР / Э. Г. Магданов, Д. А. Чемерис, А. В. Чемерис // Биомика. - 2011. - Т. 1, № 1. -С. 15-60.

11. Алексеев В. С. Самосогласованная краевая задача тепломассопереноса и термоэлектрического охлаждения / В. С. Алексеев // Вестн. Саратов. гос. техн. ун-та. - 2012. -№ 1 (66). - С. 11-15.

12. Патент RU2640186, МПК: G01N35/00, G01N33/68, G01N33/48, G01N21/64 (РФ). Устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества ампли-фикаций нуклеиновой кислоты / Д. А. Белов, Ю. В. Белов, С. В. Коновалов, Я. И. Алексеев ;

патентообладатель : «Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН)». - Заявл. 19.11.2015 г. - Опубл. 26.12.2017 г. - Бюл. № 36.

13. Белов Д. А. Новая методика обработки флуоресцентного отклика плавления ДНК / Д. А. Белов, Ю. В. Белов, В. Е. Курочкин // Научное приборостроение. - 2018. - Т. 28, № 1. - С. 3-10.

14. Белов Д. А. Методика определения разброса температур по лункам анализаторов нуклеиновых кислот / Д. А. Белов, А. C. Альдекеева, Ю. В. Белов, И. Г. Киселев // Научное приборостроение. - 2017. - Т. 27, № 4. - С. 34-39.

15. Патент RU2666209, МПК: G01N33/68, G01N1/10, G01N21/64, G01N35/00 (РФ). Устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества ампли-фикаций нуклеиновой кислоты / Д. А. Белов, Ю. В. Белов ; патентообладатель : «Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН)». - Заявл. 22.09.2016 г. - Опубл. 06.09.2018 г. -Бюл. № 25.

References

1. Vedenov A.A., Dykhne A. M. & Frank-Kamenetskiy M. D. Perekhod spiral-klubok v DNK [Helix-coil transition in DNA]. Uspekhy phys. nauk [The achievements of phys. sciences], 1971, vol. 105, issue 3, pp. 479-519.

2. Wittwer C. T., Reed G. H., Gundry C. N., Vandersteen J. G. & Pryor R. J. High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen. Clin Chem., 2003, vol. 49, pp. 853-860.

3. Reed G. H., Kent J. O., Wittwer C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics, 2007, vol. 8, pp. 597-608.

4. Nikitina D. I., Maretina M.A., Egorova A.A., Maslennikov A. B. & Kiselev A. V. Ispol-zovaniye vysokorazreshayushchego analiza krivykh plavleniya DNK v diagnostike nasled-stvennykh zabolevaniy [Application of high-resolution analysis of DNA melting curves in diagnostics of hereditary diseases]. Meditsinskaya genetika [Medical genetics], 2017, no. 16

5. Hoek K. G., Gey van Pittius N. C., Moolman-Smook H., Carelse-Tofa K., Jordaan A., van der Spuy G. D., Streicher E., Victor T. C., van Helden P. D. & Warren R. M. Fluorometric assay for testing rifampin susceptibility of Mycobacterium Tuberculosis Complex. J. Clin. Microbiol., 2008, vol. 46, pp. 1369-1373.

6. Choi G. E., Lee S. M., Yi J., Hwang S. H., Kim H. H., Lee E. Y., Cho E. H., Kim J. H., Kim H. J. & Chang C. L. High-resolution melting curve analysis for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium Tuberculosis Clinical Isolates. J. Clin. Microbiol., 2010, vol. 48, no. 11, pp. 3893-3898.

7. Wojdacz T. K. & Dobrovic A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res., 2007, no. 35 (6), pp. 41-48.

8. Galarza M., Fasabi M., Levano K. S., Castillo E., Barreda N., Rodriguez M. & Guio H. High-resolution melting analysis for molecular detection of multidrug resistance tuberculosis in Peruvian isolates. BMC Infectious Diseases, 2016, pp. 260-266.

9. Lavrova O. I., Alvares Figeroa M. V., Tvorogova M. G. HRM - noviy molekulyarniy me-tod opredeleniya lekarstvennoy ustoichivosty mikobakteriy tuberkuleza [HRM - the new molecular method for determining drug resistance of Mycobacterium tuberculosis]. Klinicheskaya laborator-naya diagnostika [Clinical laboratory diagnostics], 2014, no. 7, pp. 62-64.

10. Magdanov E. G., Chemeris D.A. & Chemeris A. V. Sovremennoye pribornoye osnash-cheniye kolichestvennoy i tsifrovoy PTsR [Modern instrumentation for quantitative and digital PCR]. Biomika, 2011, vol. 1, no. 1, pp. 15-60.

11. Alekseyev V. S. Samosoglasovannaya krayevaya zadacha teplomassoperenosa i ter-moelektricheskogo okhlazhdeniya [Self-consistent boundary value problem of heat and mass transfer and thermoelectric cooling]. Vestnik Saratovskogo gosudarstvennogo tekhnicheskogo univer-siteta [Bulletin of Saratov State Technical University], 2012, no. 1

12. Belov D.A., Belov Y. V., Konovalov S. V. & Alekseyev Y. I. Ustroistvo dlya odnovre-mennogo kontrolya v realnom masshtabe vremeny mnozhestva amplifikatsiy nukleinovoy kisloty [An appliance designed for simultaneous real-time monitoring of a multitude of nucleic acid based amplifications]. Patent RU2640186, IPC: G01N35/00, G01N33/68, G01N33/48, G01N21/64,

13. Belov D. A., Belov Y. V. & Kurochkin V. E. Novaya metodika obrabotky fluo-restsentnogo otklika plavlenia DNK [A new processing technique of fluorescent response to DNA melting]. Nauchnoye priborostroyeniye [Research engineering], 2018, vol. 28, no. 1, pp. 3-10.

14. Belov D.A., Aldekeyeva A. S., Belov Y. V. & Kiselev I. G. Metodika opredeleniya raz-brosa temperature po lunkam analizatorov nukleinovykh kislot [A technique for determining the temperature spread in the wells of nucleic acid analyzers]. Nauchnoye priborostroyeniye [Research engineering], 2017, vol. 27, no. 4, pp. 34-39.

15. Belov D. A. & Belov Y. V. Ustroistvo dlya odnovremennogo kontrolya v realnom masshtabe vremeny mnozhestva amplifikatsiy nukleinovoy kisloty [An appliance designed for simultaneous real-time monitoring of a multitude of nucleic acid based amplifications]. Patent RU2666209, IPC: G01N33/68, G01N1/10, G01N21/64, G01N35/00,

*БЕЛОВ Дмитрий Анатольевич - аспирант, onoff_10@mail.ru; БЕЛОВ Юрий Васильевич -канд. физ.-мат. наук, доцент; КИСЕЛЕВ Игорь Георгиевич - д-р техн. наук, профессор; ВОДОПЬЯНОВА Юлия Олеговна - аспирант, julua_gazonn@mail.ru (Петербургский государственный университет путей сообщения Императора Александра I).