Изоляция и молекулярно-генетическая характеристика вируса клещевого энцефалита от иксодовых клещей с острова Русский (Приморский край)

Кроме того, на территории Западной Сибири впервые выявлены природные очаги трансмиссивных про-тозоозов (бабезиоз), а так же бартонеллезов и их сочетанные очаги.

Приведенные материалы свидетельствуют о необходимости дальнейшей разработки проблемы клещевых природно-очаговых инфекций в Российской Федерации с целью обеспечения эпидемиологического благополучия населения по этой группе заболеваний.

Из числа клещевых инфекций в настоящее время специфическая вакцинопрофилактика разработана

ЛИТЕРАТУРА

1. Рудаков Н.В., Ястребов В.К. Омский научноисследовательский институт природно-очаговых инфекций: история и достижения (к 90-летию со дня основания) // Современные аспекты природной очаговости болезней: Материалы Всероссийской конференции с международным участием. - Омск, 2011. - С. 11-15.

2. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Ястребов В.К. и др. Выявление новых генотипов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки на юге Урала, в Сибири, на Дальнем

только в отношении КВЭ.

Что касается объемов вакцино- и иммуноглобулино-профилактики КВЭ, то они должны конкретизироваться на каждой административной территории с учетом степени риска заражения различных групп населения [4]. Вакцинопрофилактику целесообразно проводить в группах населения, систематически посещающих очаговые территории в период эпидсезона по профессиональным и бытовым причинам, а так же лицам, систематически выезжающим в период эпидсезона на территории, эндемичные по КВЭ.

Востоке и в Казахстане // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2005. - №1. - С.23-27.

3. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Ястребов В.К. и др. Новые данные о выявлении эрлихий и анаплазм в искодовых клещах в России и Казахстане // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2004. - №2. - С.10-14.

4. Ястребов В.К., Хазова Т.Г. Оптимизация системы эпидемиологического надзора и профилактики клещевого вирусного энцефалита // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. - 2012. - №1. - С.19-24.

Информация об авторах: Ястребов Владимир Константинович - д.м.н., заместитель директора по научной работе, Омский НИИ природно-очаговых инфекций, 644080, г. Омск, Проспект Мира, 7, тел. (3812) 651281;

Рудаков Николай Викторович - д.м.н., профессор, директор института, e-mail: rickettsia@mail.ru;

Шпынов Станислав Николаевич - д.м.н., ученый секретарь, е-mail: stan63@inbox.ru.

© АНДАЕВ Е.И., БОРИСОВА Т.И., СИДОРОВА Е.А., АДЕЛЬШИН Р.В., НИКИТИН А.Я., БАЛАХОНОВ С.В. - 2012 УДК: 616.995.42:575

ИЗОЛЯЦИЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА ОТ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ С ОСТРОВА РУССКИЙ

Евгений Иванович Андаев, Татьяна Ивановна Борисова, Елена Александровна Сидорова,

Ренат Викторович Адельшин, Алексей Яковлевич Никитин, Сергей Владимирович Балахонов

Резюме. В работе представлены результаты исследования на зараженность вирусом клещевого энцефалита (КЭ) иксодовых клещей, собранных с растительности при комплексном эпизоотолого-эпидемиологическом обследовании на природно-очаговые инфекции острова Русский, проведенного в связи с предстоящим саммитом АТЭС (2012 г.). Имаго клещей Ixodes persulcatus, I. pavlovskyi, Haemaphysalis concinna, H. japonica douglasi индивидуально исследованы методами ПЦР (455 экз.) и ИФА (259 экз.). Зараженность клещей составила соответственно 7,5% и 1,5%. В культуре клеток СПЭВ из 190 индивидуальных суспензий клещей изолировано 9 (4,7%) штаммов вируса клещевого энцефалита. Все штаммы изолированы от клещей, собранных в одном природном биотопе, окружающем бухту Рында. По результатам секвенирования гена Е длиной 1330 п.н. выявлено, что они принадлежат к сибирскому генотипу.

Ключевые слова: клещевой энцефалит, вирус клещевого энцефалита, ген белка Е, секвенирование.

ISOLATION AND MOLECULAR-GENETIC CHARACTERIZATION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS FROM IXODES TICKS AT RUSSIAN ISLAND

E.I. Andaev, T.I. Borisova, Е.А. Sidorova, R.V Adelshin, А.Ya. Nikitin, S.V. Balakhonov

Summary. Ixodes ticks collected from plants were examined for tick-borne encephalitis virus infections during epizootological-epidemiological examination at the Russian island in connection with forthcoming APEC summit in 2012. The results of this investigation are presented in this work. Imago ticks of four species (Ixodes persulcatus, I. pavlovskyi, Haemaphysalis concinna, H. japonica douglasi) were individually examined by PCR (n = 455) and ELISA (n = 259). Infected ticks were 7,5% and 1,5%, respectively. Nine (4,7%) strains of tick-borne encephalitis virus were isolated from 190 individual tick suspensions in cell cultures. All of them were isolated from ticks collected in one natural biotope surrounding Rynda Bay. The strains belonged to the Siberian subtype have been defined by the results of gene Е 1330 bp sequencing.

Key words: tick-borne encephalitis, tick-borne encephalitis virus, gene Е, nucleotide sequence.

Заболеваемость клещевым энцефалитом (КЭ) встречается на обширной территории Российской Федерации от западных областей до дальневосточного региона, ежегодно регистрируется около или более трех тысяч случаев [10]. Дальневосточный регион имеет собственные эпидемиологические особенности КЭ, отличные от Сибири и европейской части России, обусловлен-

ные, прежде всего циркуляцией высокопатогенных для человека вариантов вируса [7,8]. Во второй половине ХХ века на Дальнем Востоке болезнь протекала тяжело, летальность достигала 30% [7]. В настоящее время здесь регистрируется 1,7% больных от общероссийского показателя. В последние годы наметилась тенденция увеличения удельного веса неочаговых форм на фоне

относительно низких показателей заболеваемости. Среднемноголетний (2009-2011 гг.) интенсивный показатель заболеваемости составляет 0,8. Однако в сравнении с другими регионами сохраняется высокая летальность (10,7%) [10].

Эпидемиологическая ситуация по КЭ в г. Владивостоке считается благополучной (интенсивный показатель

0,82 при среднемноголетнем 1,95). В 2011 г. выявлено два случая заболевания КЭ в результате присасывания клещей, когда пострадавшие находились на о. Русский [9].

Для вируса КЭ характерен высокий уровень генетической гетерогенности [2]. Установлена преимущественная циркуляция вируса дальневосточного генотипа на Дальнем Востоке, европейского - в европейской части страны, тогда как на территории Урала, Сибири преобладает сибирский генотип [1,3,7]. По современным представлениям сибирский генотип неоднороден, а образует две клады: азиатскую и европейскую [4].

Г.Н. Леоновой с соавт. выявлено, что на Дальнем Востоке преобладающая часть популяции вируса при попадании в организм не вызывает манифестную инфекцию, другая, меньшая часть, вызывает острые формы заболевания с типичной картиной КЭ и летальными исходами [6,7,8].

Известно, что на о. Русский существуют самостоятельные природные очаги инфекционных болезней [12]. Несмотря на близость острова к г. Владивостоку, его территория остается недостаточно изученной в отношении КЭ. В связи с этим представляет интерес мониторинг острова с оценкой инфицированности иксо-довых клещей вирусом КЭ, изоляция вируса и изучение его молекулярно-генетических свойств. В данной работе представлены результаты исследования на КЭ, проведенного в рамках Программы эпизоотолого-эпидемиологического обследования о. Русский (май 2011 г.) на комплекс природно-очаговых инфекционных болезней в связи с предстоящим саммитом АТЭС (2012 г.).

Цель работы: оценка инфицированности иксодовых клещей на острове Русский, изоляция вируса КЭ и изучение его молекулярно-генетических свойств.

Материалы и методы

Имаго иксодовых клещей пяти видов: Ixodes persulcatus, I. pavlovskyi, Haemaphysalis concinna, H. japonica douglasi, Dermacentor silvarum в количестве 497 экземпляров (102 особи Ixodes persulcatus, 34 - I. pavlovskyi, 323 - Haemaphysalis concinna, 17 - H. japonica, 3 - Dermacentor silvarum) были собраны с растительности на флаг в природных биотопах, окружающих бухты Воеводиха, Рында и на п-ове Саперный, в мае 2011 г. сотрудниками Приморской противочумной станции (А.В. Алленов, В.Н. Краснощеков, Е.А. Борисенко, Н.С. Гордейко, Т.В. Зверева, О.Г. Шалейко) и Иркутского научно-исследовательского противочумного института. Координаты точек массовых сборов клещей определены по GPS-навигатору «Garmin»: N 43,00° E 131,79°; N 43,02° E 131,80о; N 42,98о E 131,91о.

Для обнаружения вируса КЭ в клещах применяли параллельно три метода. Антиген вируса КЭ в индивидуальных суспензиях клещей выявляли в ИФА на тест-системе ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирская область п. Кольцово в соответствии с инструкцией изготовителя. Результаты учитывали на спектрофотометре «Мультискан» ^scent) при длине волны 450 нм. Детекцию РНК вируса КЭ проводили с помощью мультиплексной ПЦР тест-системы для выявления РНК/ ДНК возбудителей инфекций, передаваемых клещами (АмплиСенс ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, Москва), согласно инструкции.

Изоляцию вируса из индивидуальных суспензий клещей осуществляли на перевиваемой культуре клеток СПЭВ, выращенной во флаконах «Linbro». При первичном заражении каждую суспензию клещей иноку-лировали в два флакона. После адсорбции в течение 60

мин во флаконы вносили среду поддержки Игла МЕМ с 2% сыворотки плода коров и помещали в термостат при 37оС. При появлении цитопатогенного эффекта (ЦПЭ) флаконы замораживали при минус 70оС. В случае отсутствия ЦПЭ проводили еще два слепых пассажа.

Изоляты вируса идентифицировали непрямым методом флюоресцирующих антител (НМФА). Инфицированный клеточный монослой снимали с помощью версен-трипсина и из суспензии клеток готовили слайд-антигены по общепринятой методике. После инкубации с иммунной сывороткой и антивидовым флюоресцирующим иммуноглобулином просматривали при помощи люминесцентного микроскопа «MT 6300H» (Meiji Techno). Ярко-изумрудное свечение гранул в цитоплазме клеток оценивали как положительный результат.

Выделение РНК из вируссодержащей культуральной жидкости осуществляли набором реагентов «Рибо-преп», обратную транскрипцию - набором «Реверта^-100» производства АмплиСенс (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Амплификацию кДНК проводили набором реагентов АмплиСенс с праймерами, соответствующими гену Е длиной 1491 п.н., любезно предоставленными Л.С. Карань. Расшифровку нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе «ABI Prism DNA Seq^ncer 3130» (Applied Biosystems, США) с набором реактивов «ABI Prism Big Dye Terminator Kit v.3.1.». Полученные нуклеотидные последовательности анализировали с помощью программы BioEdit v.7.0.9.0. Филогенетический анализ проводили с помощью программы MEGA v.5 методом Maximum Likelihood. Для сравнения использовали последовательности гена Е вируса КЭ разных подтипов, взятые из GenBank. Для статистической обработки материалов использованы стандартные методы вариационной статистики [11].

Результаты и обсуждение

Остров Русский расположен в заливе Петра Великого в Японском море, административно входит во Фрунзенский район г. Владивостока. Является крупнейшим островом в российской акватории Японского моря. Население - 5,2 тысячи человек. Берег острова изрезан бухтами, крупнейшая из которых Новик, делит его территорию на две части: юго-западную (более крупную) и северо-восточную, носящую название полуостров Саперный.

Обследованные биотопы по характеру растительных комплексов разделены на две группы. Первая - лугополевая зона включает территорию освоенных земель, находится в непосредственной близости к населенным пунктам. Для нее характерен обедненный травянокустарниковый состав растительности. Вторая группа представлена вторичными широколиственными лесами (основной вид - дуб монгольский с примесью берез маньчжурской и даурской).

Иксодовые клещи в сборах с растительности представлены: I. persulcatus - 21,2%, I. pavlovskyi - 7,1%, H. concinna - 67,4%, H. japonica - 3,5%, D. silvarum - 0,6%.

Результаты определения вирусофорности клещей различными методами представлены в таблице 1. Для выявления вируса КЭ индивидуально исследованы клещи четырех видов методами ПЦР (455 экз.) и ИФА (259 экз.). Методом биопробы в культуре клеток изучены клещи двух видов - I. persulcatus (72 экз.) и H. mncinna -118 экз. Инфицированность отдельных особей по данным ПЦР значительно выше, чем в ИФА и биопробе и составила 7,5% от общего количества исследованных клещей. С наибольшей частотой (21,2%) РНК вируса КЭ обнаружена в клещах I. persulcatus и I. pavlovskyi (11,5%), с наименьшей у H. ^ncinna - 2,8% (при большем числе исследованных особей - n=318).

В ИФА антиген обнаружен только в 4 (4,08%) особях

Результаты изучения вирусофорности клещей разными методами

Вид клещей Методы изучения вирусофорности клещей

ПЦР ИФА биопроба в культуре клеток

всего исследовано/ из них положительные (%) /доверительный интервал* всего исследовано/ из них положительные (%) /доверительный интервал* всего исследовано/ из них положительные (%) /доверительный интервал*

I. persulcatus 1 9 2 2 2 2 2 2 ' 00 1: 80 С* 72/1/1,4 / 0 4 4,1

I. pavlovskyi 2 / • 1 • 3 2 1 ^ 1 'w5 27/0/ н.и.

H. concinna 318/9/2,8 1,0 4- 4,6 121/0/ 118/9/7,6 0 4 22,7

H. japonica COLO ОО' LO 1/ 2 13/0/ н.и.

Всего \ с* 5 + LO ^ LO LO ^ 1 LO О 2 190/9/4,7/ 1,8 4 7,6

Таблица 1 та гена белка Е длиной 1330 п.н. изученные штаммы отнесены к сибирскому генотипу вируса КЭ (рис. 1). Филогенетический анализ полученных последовательностей показал, что все штаммы внутри сибирского генотипа группируются с прототипным штаммом Vasilchenko (AF069066) - гомология 99,5-99,7%. Кроме того, штаммы расположились в единой кладистической группе со штаммом Aina (JN003206) с бутстреп-поддержкой 100%. У штаммов RusIsl-370 и RusIs-331 обнаружена синонимичная замена в позиции 206 гена Е (CTG^TTG), оба триплета

С Bashkiria-351-09 Chelyabinsk-357-09 ;aterinburg-5-09

----Ekaterinburg-716-09

яп I— Ekaterinburg-37-3-06 1 I Kemerovo-134-08 100 I- Kemerovo-167 -------Kurgan-373-09

i------vc

Примечание: н.и. - не исследовали; * - возможные границы изменения доли зараженных особей при доверительной вероятности 0,95.

I. регеика^. Средний уровень суммарной инфициро-ванности всех видов клещей по результатам ИФА составил 1,54% и соответствует данным, полученным при изучении клещей, снятых с людей: в Приморском крае - учреждениями Роспотребнадзора (по среднемноголетним наблюдениям 2,4-4,5%), на о. Русский - исследователями НИИЭМ СО РАМН г. Владивосток (от 0 до 4,1% в 2007-2011 гг.) и специалистами Роспотребнадзора в 2011 г (4,5%) [9,12].

Из 190 образцов суспензий клещей разных видов из различных биотопов в культуре клеток изолировано 9 штаммов вируса КЭ - один от I. репикаШз и 8 - от Н. сопсгппа.

Репродукция вируса в клетках сопровождалась ЦПЭ, появляющимся на третьи сутки на втором-третьем пассажах. В НМФА на слайд-антигенах выявлено характерное для вируса КЭ ярко-изумрудное свечение гранул в цитоплазме инфицированных клеток в лунках с рабочими разведениями иммунной сыворотки 1:64-1:128. Титр вируса на 6-7 сутки после заражения культуры клеток составил от 1045 до 1060 ТЦПД50/мл.

Анализ территориальной приуроченности мест сбора клещей показал, что все штаммы изолированы от клещей, собранных в одном биотопе в окружающей бухту Рында лугополевой зоне в непосредственной близости к населенному пункту, площадь территории сбора клещей составила около 1500 м2. Изоляция вируса КЭ преимущественно из клещей Н. сопсгппа может быть объяснена их преобладанием в сборах на этом участке.

Для изучения структуры популяции вируса КЭ на острове Русский проведено молекулярно-генетическое исследование всех выделенных штаммов вируса КЭ. По результатам анализа нуклеотидных последовательностей фрагмен-

— Ekaterinburg-612-09

Zausaev

— Ekaterinburg-992-09 Vologda-658-75

.g 11--Kurgan-371-07

72'----Vologda-157-08

— Kemerovo-67-08

Kolarovo-2008

Aina

- Vasilchenko

Ruslsl- 445 RusIsl-381

100

RusIsl-419

RusIsl-370

- R us Is 1-448  Rusls 1-331 Ruslsl- 363

- RusIsl-437 Ruslsl- 434

Vologda-509-75 j Kurgan-272-07 I Kurgan-273-07

Vologda-911-74

— Yaroslavl-140-98 Ekaterinburg-153-09 Vologda-173-08 Yaroslavl-Bel-08 --------------Oshima 5-10

hi

100

' Neudoerfl

Dalnegorsk

- Sofjin-HO

— OHF

Рис. 1. Филогенетическое древо вируса клещевого энцефалита. Построено на основе нуклеотидной последовательности фрагмента гена белка Е (1330 п.н.) с помощью метода Maximum Likelihood. Изученные штаммы выделены полужирным курсивом.

кодируют аминокислоту лейцин. Замена полярной аминокислоты аспарагин на неполярный изолейцин в позиции 381 отмечена у штамма RusIs-363 и не встречается у других, взятых в анализ штаммов вируса КЭ. Все девять штаммов имеют замену (Arg^His) в позиции 216, что отличает их от прототипного штамма Vasilchenko, но не от Aina.

В результате проведенных исследований все изолированные нами от клещей штаммы с о. Русский отнесены к сибирскому генотипу (прототипный штамм Vasilchenko) с высоким уровнем гомологии со штаммом Aina, достигающим у некоторых из них 100%. Штаммы Aina и Vasilchenko имеют близкое эволюционное проис-

ЛИТЕРАТУРА

1. Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Верхозина М.М. и др. Генотипирование вируса клещевого энцефалита в природных и антропургических очагах Евразии по результатам мультилокусной гибридизации // Инфекции, передаваемые клещами в Сибирском регионе / Под ред. В.В. Власов, В.Е. Репин; Рос. акад. наук, Сиб. отд-ние, Ин-т хим. биол. и фунд. медицины. - Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2011. - 395 с.

2. Злобин В.И., Беликов С.И., Джиоев Ю.П. и др. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита. -Иркутск: РИО ВСнЦ СО РАМН, 2003. - 272 с.

3. Злобин В.И., Верхозина М.М., Демина Т.В. и др. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. - 2007. - № 6. - С.4-13.

4. Карань Л.С., Шопенская Т.А., Платонов А.Е. и др. Молекулярные методы в алгоритме мониторинга очагов клещевых трансмиссивных инфекций // Генодиагностика инфекц. болезней - 2007: Сб. трудов VI Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием - М., 2007. - Т.2. - С.316-317.

5. Кулакова Н.В., Беликов С.И., Андаев Е.И. и др. Полногеномный анализ штамма Айна - прототипного варианта сибирского субтипа вируса клещевого энцефалита // Современные аспекты природной очаговости болезней: матер. Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, по-свящ. 90-летию ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора (1-2 ноября 2011., Омск) // Национальные приоритеты России. - Омск, 2011. - № 2(5). Спецвыпуск. - С.145.

хождение, несмотря на временные и территориальные различия их выделения [5].

Таким образом, от клещей, собранных в природном биотопе, окружающем бухту Рында, изолированы штаммы вируса КЭ сибирского генотипа. Впервые получены данные о генетической структуре природной популяции вируса на территории о. Русский. В связи с преобладанием в Приморье дальневосточного подтипа, вызывающего тяжелые формы болезни, представляет интерес дальнейшее изучение биологических свойств изолятов сибирского генотипа, что позволит оценить их эпидемиологическую значимость.

6. Леонова Г.Н., Майстровская О.С., Борисевич В.Б. и др. Антигемия у людей, инфицированных вирусом клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. - 1996. - №6. - С.260-263.

7. Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит в Приморском крае. Вирусологические и эколого-эпидемиологические аспекты. -Владивосток: Дальнаука, 1997. - 190 с.

8. Леонова Г. Н., Беликов С. И., Павленко Е. В. И др. Биологическая и молекулярно-генетическая характеристика дальневосточной популяции вируса клещевого энцефалита и ее патогенное значение // Вопросы вирусологии. - 2007. -№6. - С.13-17.

9. Маслов Д.В., Полякова М.В., Духова А.Ю. Об организации государственного надзора за объектами саммита АТЭС за 9 месяцев 2011 г. // Матер. расшир. засед. Коллегии при Управл. Роспотребнадзора по Приморскому краю. -Владивосток, 2011. - С.3-27.

10. Носков А.К., Никитин А.Я., Пакскина Н.Д. и др. Эпидемиологическая ситуация по клещевому вирусному энцефалиту в Российской Федерации (2009-2011 гг.) и прогноз на 2012 г. // Пробл. особо опасных инф. - 2012. - Вып. 111 (1). - С.30-34.

11. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. - Минск: Вышэйшая школа, 1967. - 328 с.

12. Сомова Л.М. Задачи НИИЭМ СО РАМН по обеспечению эпидемиологического благополучия в период проведения саммита АТЭС в 2012 году // Матер. расшир. засед. Коллегии при Управл. Роспотребнадзора по Приморскому краю. - Владивосток, 2011. - С.61-73.

Информация об авторах: Андаев Евгений Иванович - заместитель директора по общим вопросам и организационнометодической работе, заведующий лабораторией, 664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78, тел. (3952) 220134, e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru; Борисова Татьяна Ивановна - к.б.н., с.н.с., Сидорова Елена Александровна - м.н.с.; Адельшин Ренат Викторович - к.б.н., ст.н.с., тел. (3952) 220139; Никитин Алексей Яковлевич - д.б.н., вед.н.с., Балахонов Сергей Владимирович - д.м.н., профессор, директор, тел. (3952) 220137.