Способ получения трифторацетатов замещенных 6-аминоиндолов, обладающих противомикробным действием
METHOD OF PRODUCING TRIFLUOROACETATES OF SUBSTITUTED 6-AMINOINDOLES, HAVING ANTIMICROBIAL ACTION

Изобретение относится к химии солей трифторуксусной кислоты и аминоиндолов, а именно к трифторацетату 2,3,5-триметил-1Н-индол-6-аммония, трифторацетату 1,2,3,5-тетраметил-1Н-индол-6-аммония, трифторацетату 2,3-диметил-5-метокси-1Н-индол-6-аммония, трифторацетату 1,2,3-триметил-5-метокси-1Н-индол-6-аммония, которые могут быть использованы в медицинской практике в качестве средств, обладающих противомикробным действием.
На протяжении всей истории существования патогенных микроорганизмов продолжалась борьба с множеством уже изученных и вновь исследуемых их представителей. Открытие антимикробных агентов привело к успешному лечению и устранению некоторых бактериальных инфекций, однако выявило штаммы, устойчивые к противомикробным препаратам за счет многочисленных механизмов антибиотикорезистентности [1-3]. Проблема антибиотикорезистентности становится все более острой в 21 веке, исследование механизмов приобретения устойчивости к антимикробным агентам лежит в основе разработки новых способов борьбы с данным явлением [4-5]. Резистентность к лекарственным средствам представляет собой растущую глобальную угрозу для общественного здравоохранения, которая затрагивает все основные патогенные микроорганизмы и противомикробные средства [6-7].
При проведении микробиологического мониторинга в течение последних лет отмечена тенденция к увеличению доли полирезистентных штаммов, например, метициллинрезистентные S.aureus отличаются существенно более высокой частотой устойчивости по сравнению с метициллин-чувствительными штаммами, к гентамицину, клиндамицину, рифампицину, тетрациклину, хлорамфениколу, цефтаролину, ципрофлоксацину и эритромицину, P.аeruginosa проявляет нечувствительность к антисинегнойным цефалоспоринам – цефепиму и цефтазидиму, а также пиперациллину-тазобактаму, имипенему, меропенему, представители семейства Enterobacteriaceae устойчивые к трем и более традиционно применяемым антибиотикам, таким как цефотаксим, цефтазидим, цефепим, азтреонам и др. [8-10]
Поиск и разработка новых противомикробных средств один из основополагающих принципов преодоления устойчивости микроорганизмов к антибиотикам. Необходимость поиска новых высокоэффективных и безопасных противомикробных соединений закреплена в Российской Федерации на законодательном уровне [11].
Замещенные аминоиндолы с аминогруппой в бензольном кольце известны как исходные соединения для получения трифторметилзамещенных индолиламидов. Многие из полученных продуктов показывают различного рода биологическую активность. Так у амидов, на основе 4,7-аминоиндолов и трифторацетоуксусного эфира, на основе 7-аминоиндолов и этилового эфира трифторуксусной кислоты обнаружена достаточно высокая противомикробная активность [12-13]. В связи с этим представлялось интересным получение растворимых в воде производных аминоиндолов, содержащих в молекуле трифторметильную группу, из 6-амино-2,3,5-триметил-, 6-амино-1,2,3,5-тетраметил-, 6-амино-2,3-дииметил-5-метокси-, 6-амино-5-метокси-1,2,3-триметилиндолов и трифторуксусной кислоты и их лабораторное исследование на противомикробную активность.
Наиболее близким техническим решением к заявленному изобретению является способ получения трифторметилсодержащих производных аминоиндолов ацилированием этиловым эфиром трифторуксусной кислоты 2,3-диметил- и 1,2,3-триметил-7-аминоиндолов [13].
Недостатком известного способа является то, что получающиеся индолиламиды не растворимы в воде, что является недостатком при использовании противомикробных лекарственных препаратов.
Заявляемые соединения, их противомикробные свойства и способ получения из уровня техники неизвестны.
Технический результат заключается в получения новых водорастворимых трифторметилсодержаших в молекуле соединений индольного ряда, обладающих эффективной противомикробной активностью.
Указанный технический результат достигается за счет использования в качестве трифторметилсодержащего агента в реакции более доступного соединения – трифторуксусной кислоты, что также позволяет получить целевые соединения трифторацетатов замещенных 6-аминоиндолов с более высоким выходом.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения трифторацетатов замещенных 6-аминоиндолов, обладающих противомикробным действием, общей формулы (1):
,                        (1)
3
1
3
3
где R=H, CH, R=CH, ОCHс целью получения водорастворимых трифторметилзамещенных производных аминоиндолов, соединения общей формулы (2):
,                           (2)
1
где R и R имеет указанные значения, в нагретом до кипения бензоле подвергают взаимодействию с трифторуксусной кислотой общей формулы (3):
(3)
Полученные соединения трифторацетаты 2,3,5-триметил-1Н-индол-6-аммония, 1,2,3,5-тетраметил-1Н-индол-6-аммония, 2,3-дииметил-5-метокси-1Н-индол-6-аммония, 1,2,3-триметил-5-метокси-1Н-индол-6-аммония могут найти применение в качестве водорастворимых синтетических противомикробных препаратов.
Сведения, подтверждающие достижение технического результата, представлены в нижеследующих примерах.
Пример 1. Трифторацетат 2,3,5-триметил-1Н-индол-6-аммония (Х-1)
.
f
13
15
2
3
2
max
пл
6
3
3
3
уш
3
6
max
1
19
К нагретому до кипения раствору 0,1 г (0,57 ммоль) 2,3,5-триметил-6-аминоиндола в 50 мл бензола добавляют  0,078 г (0,68 ммоль) трифторуксусной кислоты в 10 мл бензола и нагревают до кипения. Выпавший при охлаждении осадок отфильтровывают, промывают бензолом, за тем  горячим гексаном. Выход трифторацетата 2,3,5-триметил-1Н-индол-6-аммония 84 %. Т разл. > 190 ºС, R=0,20. Найдено, %: C 53,99; Н 5,06. CHNFO. Вычислено, %: C 54,16; Н 5,24. УФ спектр (этанол) λ(lg ε): 207(4,26), 233(4,52), 395(3,76); спектр ЯМРН (ДМСО-d): 2,13 (3Н, с, 3-СН), 2,29 (3Н, с, 2-СН), 2,36 (3Н, с, 5-СН), 7,26 (1Н, с, Н-4), 7,30 (1Н, с, Н-7), 9,69 (3Н, с, 6-NН), 10,81 (Н, с, Н-1) м.д., спектр ЯМРF (ДМСО-d): -73,58 м.д. Масс-спектр Jm/z (% к J): 174(100,00), 173(86,00), 159(30,00), 69(53,00), 45(73,00).
Пример 2. Трифторацетат 1,2,3,5-тетраметил-1Н-индол-6-аммония (С-1)
f
14
17
2
3
2
max
пл
6
3
3
3
3
уш
3
6
max
1
19
Получают аналогично из 0,10 г (5,3 ммоль) 6-амино-1,2,3,5- тетраметилиндола и 0,68 г (6,0 ммоль) трифторуксусной кислоты. Выход трифторацетата 1,2,3,5-тетраметил-1Н-индол-6-аммония 80,5 %, Т разл. > 173 °С, R=0,38. Найдено, %: C 55,50; Н 5,59. CHNFO. Вычислено, %: C 55,63; Н 5,67. УФ спектр (этанол) λ(lg ε)): 210(4,28), 235(4,53), 300(3,83), спектр ЯМРН (ДМСО-d): 2,16 (3Н, с, 3-СН), 2,31 (3Н, с, 2-СН), 2,38 (3Н, с, 5-СН), 3,59 (3Н, с, 1-СН), 7,31 (1Н, с, Н-4), 7,33 (1Н, с, Н-7), 9,69 (3Н, с, 6-N Н), спектр ЯМРF (ДМСО-d): -73,66 м.д. Масс-спектр Jm/z (% к J): 188(100,00), 187(71,00), 173(39,00), 69(43,00), 45(78,00), 28(61,00), 17(12,00)
Пример 3. Трифторацетат 2,3-диметил-5-метокси-1Н-индол-6-аммония (Х-2)
f
13
15
2
3
3
max
пл
6
3
3
3
уш
3
6
max
1
19
Получают аналогично из из 0,15 г (0,79 ммоль) 6-амино-2,3-диметил-5-метоксииндола и 0,097 г (0,85 ммоль)  трифторуксусной кислоты. Выход трифторацетата 2,3-диметил-5-метокси-1Н-индол-6-аммония 54 %. Т разл.> 161 ºС. R=0,24. Найдено, %: C 53,99; Н 5,06. СНNFO. Вычислено, %: C 54,16; Н 5,24. УФ спектр (этанол) λ(lg ε): 207(4,42), 230(4,55), 303(4,03); спектр ЯМРН (ДМСО-d): 2,15 (3Н, с, 3-СН), 2,29 (3Н, с, 2-СН), 3,90 (3Н, с, 5-ОСН), 7,08 (1Н, с, Н-4), 7,26 (1Н, с, Н-7), 9,56 (3Н, с, 6-NН), 10,75 (Н, с, Н-1) м.д., спектр ЯМРF (ДМСО-d): -73.56 м.д.  Масс-спектр Jm/z (% к J): 191(18,32), 190(100,00), 176(12,01), 175(95,90), 147(69,47), 145(13,71), 69(20,72), 45(24,22), 28(10,81).
Пример 4. Трифторацетат 1,2,3-триметил-5-метокси-1Н-индол-6-аммония (С-2)
f
13
15
2
3
3
max
пл
6
3
3
3
3
уш
3
6
max
1
19
Получают аналогично из 0,14 г (6,8 ммоль) 6-амино-5-метокси-1,2,3-триметилиндола и 0,08 г (7,0 ммоль) трифторуксусной кислоты. Выход трифторацетата 1,2,3-триметил-5-метокси-1Н-индол-6-аммония 71,1 %, Т разл.> 160 ºС. R=0,46. Найдено, %: C 52,69; Н 5,21. СНNFO. Вычислено, %: C 52,83; Н 5,38. УФ спектр (этанол) λ(lg ε): 213(4,63), 230(4,60), 300(4,06); спектр ЯМРН (ДМСО-d): 2,18 (3Н, с, 3-СН), 2,31 (3Н, с, 2-СН), 3,59 (3Н, с, 1-СН), 3,91 (3Н, с, 5-ОСН), 7,13 (1Н, с, Н-4), 7,30 (1Н, с, Н-7), 9,44 (3Н, с, 6-NН) м.д., спектр ЯМРF (ДМСО-d): 73,63 м.д.  Масс-спектр Jm/z (% к J): 205(15,12), 204(100,00), 190(11,31), 189(73,67), 161(46,65), 160(10,21), 69(12,31), 45(11,61), 28(8,41).
6
f
Спектры ЯМР 1Н записаны на мультиядерном спектрометре ядерного магнитного резонанса «Joel JNM-ECX400» (400 МГц) в ДМСО-d. Электронные спектры получены на приборе «LEKI SS2109UV» в этаноле. Масс-спектры зарегистрированы на масс-спектрометре «Finnigan MAT INCOS-50» с прямым вводом образца в ионный источник при энергии ионизации 70 эВ. Элементный анализ проводился на элементном анализаторе vario MICRO cube. Названия аминам, солям  даны по правилам компьютерной программы ACD/LABS IUPAC Name Generator. Структурные формулы соединений нарисованы в компьютерной программе ISIS Draw 2,4. Контроль за чистотой полученных соединений, определение R осуществляли с помощью ТСХ на пластинках Silufol UV-254 в системе бензол-этилацетат-метанол 1:1:0,1.
Проведено исследование противомикробной активности трифторацетата 2,3,5-триметил-1Н-индол-6-аммония, трифторацетата 1,2,3,5-тетраметил-1Н-индол-6-аммония, трифторацетата 2,3-диметил-5-метокси-1Н-индол-6-аммония, трифторацетата 1,2,3-триметил-5-метокси-1Н-индол-6-аммония.
При проведении микробиологического эксперимента исследуемые соединения использовали в виде раствора (в качестве растворителя применяли стерильную воду для инъекций). В качестве тест-микроорганизмов при изучении противомикробной активности полученных соединений  использовали музейные штаммы: Staphylococcus aureus 6538-Р АТСС, Staphylococcus aureus 43300 АТСС (МRSА), Escherichia coli 25922 АТСС, Pseudomonas aeruginosa 27853 АТСС, Streptococcus pyogenes 19615 АТСС. Музейные штаммы, используемые в работе, получены из коллекции музея живых культур ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Becton Dickinson France S.A.S. Определение антимикробной активности полученных соединений проводили методом серийных разведений в бульоне (макрометодом «пробирочным») [14-16]. В качестве препарата сравнения использовался противомикробный препарат диоксидин (производное ди-N-оксихиноксалина) (производство «Биосинтез», раствор для местного применения, эндотрахеального и внутривенного введения, 10 мг/мл), широко применяемый в лечебной практике. Этот препарат обладает высокой химиотерапевтической активностью in vivo на модельных инфекциях, близких по патогенезу к патологическим процессам у человека (гнойные менингиты, пиелонефриты, септикопиемии) и вызванных штаммами анаэробных бактерий, устойчивых (в том, числе полирезистентных) к препаратам других классов, включая штаммы синегнойной палочки и метициллинустойчивых стафилококков. Диоксидин характеризуется широким антибактериальным спектром с бактерицидным действием, активен также в отношении грамположительных и грамотрицательных аэробных условно-патогенных бактерий. Показана активность диоксидина в отношении микобактерий туберкулеза. Для препарата сравнения диоксидина МПК относительно штаммов Staphylococcus spp. составляет 125,0-1000,0 мкг/мл,  Escherichia coli 8,0-250,0 мкг/мл, Pseudomonas spp. 125,0-1000,0 мкг/мл, Streptococcus spp. 64,0-1000,0 мкг/мл [17].
8
8
Для оценки чувствительности микроорганизмов использовали Мюллер-Хинтон бульон (МХБ), разрешенный к применению в Российской Федерации в установленном порядке и по своим характеристикам удовлетворяющий требованиям. Внутрилабораторный контроль качества среды проводили при использовании всех сред, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке. Концентрация суспензии исследуемого микроорганизма составляла 1,5x10 КОЕ/мл. Оптическая плотность бактериальной суспензии с концентрацией 1,5x10 КОЕ/мл при визуальном контроле соответствовала стандарту мутности 0,5 по Мак-Фарланду. В работе использовали коммерческий стандарт мутности. Бактериальную суспензию готовили из агаровых культур. Для приготовления инокулюма использовали чистую суточную культуру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбирали несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносили незначительное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором, доводя плотность инокулюма точно до 0,5 по стандарту Мак-Фарланда. Инокулюм использовали в течение 15 мин после приготовления.
Метод серийных разведений в бульоне – макрометод (пробирочный)
5
6
5
Тестирование проводили в объеме 1 мл каждого разведения исследуемого соединения с конечной концентрацией исследуемого микроорганизма примерно 5х10 КОЕ/мл. МХБ для определения чувствительности разливали по 0,5 мл в каждую пробирку. Количество пробирок составило девять штук плюс одна для постановки «отрицательного» контроля, то есть десять. Рабочий раствор исследуемого соединения готовили из основного раствора с использованием жидкой питательной среды – МХБ. Затем рабочий раствор в количестве 0,5 мл при помощи микропипетки со стерильным наконечником вносили в первую пробирку, содержащую 0,5 мл бульона. Тщательно перемешивали и новым стерильным наконечником переносили 0,5 мл раствора исследуемого соединения в бульоне во вторую пробирку, содержавшую первоначально 0,5 мл бульона. Эту процедуру повторяли, пока не был приготовлен весь необходимый ряд разведений. Из последней пробирки 0,5 мл бульона удаляли. Таким образом, получали ряд пробирок с растворами исследуемого соединения, концентрации которых отличались в соседних пробирках в 2 раза. Для инокуляции использовали стандартную микробную взвесь эквивалентную 0,5 по стандарту Мак-Фарланда, разведенную в 100 раз на МХБ, после чего концентрация микроорганизма в  ней составляла примерно 10 КОЕ/мл. По 0,5 мл инокулюма вносили в каждую пробирку, содержащую по 0,5 мл соответствующего разведения исследуемого соединения, и в одну пробирку с 0,5 мл МХБ без антибиотика («отрицательный» контроль). Конечная концентрация микроорганизма в каждой пробирке составила примерно 5x10 КОЕ/мл. Инокулюм вносили в пробирки с разведениями исследуемого соединения не позднее 15-30 мин с момента приготовления. Пробирки закрывали стерильными ватно-марлевыми пробками и все, кроме пробирки «отрицательный» контроль, инкубировали в обычной атмосфере при температуре 37 °С в течение 16-20 или 20-24 ч (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма). Пробирку «отрицательный» контроль помещали в холодильник при температуре 4 °С, где хранили до учета результатов. Для определения наличия роста микроорганизма пробирки с посевами просматривали в проходящем свете. Рост культуры в присутствии исследуемого соединения сравнивали с референтной пробиркой («отрицательный» контроль), содержащей исходный инокулюм и хранившейся в холодильнике. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) определяли по наименьшей концентрации исследуемого соединения, которая подавляет видимый рост микроорганизма.
Относительно тест-штаммов микроорганизмов трифторацетат 2,3,5-триметил-1Н-индол-6-аммония (Х-1) проявляет следующую активность: для S.aureus 6538-Р АТСС МПК исследуемого соединения составила 1,96 мкг/мл; Staphylococcus aureus 43300 АТСС (МRSА) 1,96 мкг/мл; E.coli 25922 АТСС – 0,98 мкг/мл; P.aeruginosa 27853 АТСС – 0,98 мкг/мл; S.pyogenes 19615 АТСС – 0,98 мкг/мл; трифторацетат 1,2,3,5-тетраметил-1Н-индол-6-аммония (С-1): для S.aureus 6538-Р АТСС МПК исследуемого соединения составили 7,9 мкг/мл; Staphylococcus aureus 43300 АТСС (МRSА) 7,9 мкг/мл; E.coli 25922 АТСС – 0,98 мкг/мл; P.aeruginosa 27853 АТСС – 3,9 мкг/мл; S.pyogenes 19615 АТСС – 31,3 мкг/мл; трифторацетат 2,3-диметил-5-метокси-1Н-индол-6-аммония (Х-2): для S.aureus 6538-Р АТСС МПК исследуемого соединения составили 31,2 мкг/мл; Staphylococcus aureus 43300 АТСС (МRSА) 31,2 мкг/мл; E.coli 25922 АТСС – 0,98 мкг/мл; P.aeruginosa 27853 АТСС – 7,9 мкг/мл; S.pyogenes 19615 АТСС – 125 мкг/мл; трифторацетат 1,2,3-триметил-5-метокси-1Н-индол-6-аммония (С-2): для S.aureus 6538-Р АТСС МПК исследуемого соединения составили 125 мкг/мл; Staphylococcus aureus 43300 АТСС (МRSА) 125 мкг/мл; E.coli 25922 АТСС – 0,98 мкг/мл; P.aeruginosa 27853 АТСС – 1,96 мкг/мл; S.pyogenes 19615 АТСС – 0,98 мкг/мл, что превышает противомикробную активность препарата сравнения – диоксидин.
Таким образом, соединения в заявленном изобретении обладают противомикробной активностью, превышающей активность препарата сравнения – диоксидин.
Источники информации:
1. Parhizgari N, Gouya MM, Mostafavi E. Emerging and re-emerging infectious diseases in Iran. Iranian Journal of Microbiology. 2017; 9 (3): 122-142.
2. Yokoyama M, Stevens Е, Laabei М, Bacon L, Heesom K, Bayliss S et al. Epistasis analysis uncovers hidden antibiotic resistance-associated fitness costs hampering the evolution of MRSA. Genome Biology. 2018; 19 (1): 94.
3. Kumarasamy KK, Toleman MA, Walsh TR, Bagaria J, Butt F, Balakrishnan R et al.  Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study. The Lancet Infectious Diseases. 2010; 10 (9):597-602).
4. McKeegan KS, Borges-Walmsley MI, Walmsley AR. Microbial and viral drug resistance mechanisms. Trends in Microbiology. 2002; (10): 8-14.
5. Savjani JK, Gajjar AK, Savjani KT. Mechanisms of resistance: useful tool to design antibacterial agents for drug - resistant bacteria. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 2009; 9 (2): 194-205.
6. Yadav N, Dubey A, Shukla S, Saini CP, Gupta G, Priyadarshini R et al. Graphene Oxide-Coated Surface: Inhibition of Bacterial Biofilm Formation due to Specific Surface-Interface Interactions. ACS Omega. 2017; 2 (7): 3070-3082.
7. Obayiuwana A, Ogunjobi M, Yang M, Ibekwe М. Characterization of Bacterial Communities and Their Antibiotic Resistance Profiles in Wastewaters Obtained from Pharmaceutical Facilities in Lagos and Ogun States. Nigeria International Journal of Environmental Research and Public Health. 2018; 15 (7):1365.
8. Козлов Р.С. Антибиотикорезистентность грамположительных возбудителей осложненных интраабдоминальных инфекций в России. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2015; 17(3): 227-234.
9. Романов А.В. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Staphylococcus aureus в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «Марафон» 2013-2014. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2017; 19 (1): 57-62.
10. Сухорукова М.В. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «Марафон» 2013-2014. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2017; 19 (1): 49-56.
11. Распоряжение Правительства Российской Федерации от 25 сентября 2017 г. N 2045-р «О стратегии предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 г.».
12. Stepanenko I. S. A new group of compounds derived from 4-, 5-, 6- and 7-aminoindoles with antimicrobial activity / I. S. Stepanenko, S. A.Yamashkin, Y. A. Kostina, A. A. Batarsheva, M. A. Mironov (2018) // Research Results in Pharmacology 4(3); 17-26 UDC:615.331 DOI 10.3897/rrpharmacology.4.29905.
13. Пат. 2675806 Российская Федерация, МПК, C07D209/40, A61K1/404, A61P31/00. Способ получения N-(индолил)трифторацетамидов, обладающих противомикробным действием / И.С. Степаненко, С.А. Ямашкин; заявитель и патентообладатель федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва». – 2018121537; заявл. 20.07.2018, опубл. 25.12.2018, Бюл. № 36.
14. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания МУК 4.2.1890-04. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2004; 6 (4);
15. Миронов А.Н., Бунятян Н.Д., Васильев А.Н., Верстакова О.Л., Журавлева М.В., Лепахин В.К. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К, 2012. – 944 с.
16. Козлов Р. С., Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В., Иванчик Н.В., Склеенова Е.Ю., Тимохова А.В. и др. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам: клинические рекомендации. Смоленск: Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии, 2018. – 206 с.
17. Падейская Е.Н. Антибактериальный препарат диоксидин: особенности биологического действия и значение в терапии различных форм гнойной инфекции / Е.Н. Падейская // Инфекции и антимикробная терапия. – 2011.  – Т.3 – № 5.– С.105-155.