ГЛИКОПЭГИЛИРОВАННЫЙ ГРАНУЛОЦИТАРНЫЙ КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР
GLYCO-PEG GRANULOCYTE COLONY-STIMULATING FACTOR

Перекрестные ссылки на родственные заявки
В настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США № 60/526796, поданной 3 декабря 2003; предварительной заявке на патент США № 60/555813, поданной 23 марта 2004; предварительной заявке на патент США № 60/570282, поданной 11 мая 2004; предварительной заявке на патент США № 60/539387, поданной 26 января 2004; предварительной заявке на патент США № 60/592744, поданной 29 июля 2004; предварительной заявке на патент США № 60/614518, поданной 29 сентября 2004, и предварительной заявке на патент США № 60/623387, поданной 29 октября 2004, каждая из которых во всей своей полноте и для всех целей осуществления изобретения вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Уровень техники
Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) представляет собой гликопротеин, который стимулирует выживание, пролиферацию, дифференцировку и осуществление функций клеток-предшественников нейтрофилов-гранулоцитов и зрелых нейтрофилов. В клинических целях используются две формы рекомбинантного человеческого G-CSF, которые являются сильными стимуляторами гранулопоэза нейтрофилов и имеют продемонстрированную эффективность в предупреждении инфекционных осложнений при некоторых нейтропениях. Они могут быть использованы для ускорения восстановления нейтрофилов после лечения миелодепрессантами.
G-CSF способствует снижению тяжести осложнений, вызываемых противораковой химиотерапией, благодаря уменьшению случаев развития фебрильной нейтропении и тяжести осложнений, вызываемых высокодозовой химиотерапией, проводимой в сочетании с трансплантацией костного мозга, а также способствует уменьшению случаев возникновения и продолжительности инфекционных заболеваний у пациентов с тяжелой хронической нейтропенией. Недавно было продемонстрировано, что G-CSF обладает терапевтическим действием при его введении после начала инфаркта миокарда.
Человеческая форма G-CSF была клонирована исследователями Японии и США в 1986 (см., например, Nagata et al., Nature 319:415-418, 1986). Природный человеческий гликопротеин присутствует в двух формах: одна из них состоит из 175 аминокислот, а другая - из 178 аминокислот. Превалирующая и более активная форма, состоящая из 175 аминокислот, была использована в продуцировании фармацевтических продуктов методом рекомбинантных ДНК.
E.coli
Рекомбинантный человеческий G-CSF, синтезированный в экспрессионной системе , был назван филграстимом. Структура филграстима несколько отличается от структуры природного гликопротеина. Другая форма рекомбинантного человеческого G-CSF называется ленограстимом и была синтезирована в клетках яичника китайского хомячка (СНО).
Nature
hG-CSF представляет собой мономерный белок, который димеризует рецептор G-CSF посредством образования комплекса 2:2 из 2 молекул G-CSF и двух рецепторов (Horan et al., Biochemistry 35(15):4886-96 (1996)). В исследованиях, проводимых с помощью рентгеновской кристаллографии, нижеследующие остатки hG-CSF были идентифицированы как часть контактных областей, связывающихся с рецептором, а именно такие остатки, как G4, P5, A6, S7, S8, L9, P10, Q11, S12, L15, K16, E19, Q20, L108, D109, D112, T115, T116, Q119, E122, E123 и L124 (см., например, Aritomi et al. (1999)  401:713).
Коммерчески доступные формы rhG-CSF имеют кратковременный фармакологический эффект, и в большинстве случаев они должны быть введены более одного раза в день на протяжении всего курса лечения лейкопении. Использование молекулы с более длительным временем полужизни в кровотоке позволяет уменьшить число введений, необходимых для ослабления лейкопении и предупреждения последующих возможных инфекций. Другой проблемой, связанной с использованием существующих в настоящее время продуктов rG-CSF, является возникновение дозозависимой боли в костях. Поскольку боль в костях, возникающая у пациентов, является серьезным побочным эффектом, вызываемым лечением с применением rG-CSF, то было бы желательно получить такой продукт rG-CSF, который не вызывал бы боли в костях, либо использовать такой продукт, который по своей природе не обладает таким эффектом или является эффективным в достаточно малых дозах, не вызывающих боли в костях. Таким образом, необходимость в улучшении свойств рекомбинантных молекул G-CSF является совершенно очевидной.
В литературе сообщалось о получении сконструированных на основе белка вариантов hG-CSF (патенты США № 5581476, 5214132, 5362853, 4904584 и Riedhaar-Olson et al., Biochemistry 35:9034-9041, 1996). Была также описана модификация hG-CSF и других полипептидов, которая заключается во введении, по меньшей мере, одной дополнительной углеводной цепи по сравнению с природным полипептидом (патент США № 5218092). Кроме того, были описаны и исследованы полимерные модификации природного hG-CSF, включая присоединение групп ПЭГ (см., например, Satake-Ishikawa et al. (1992) Cell Structure and Function 17:157; Bowen et al. (1999) Experimental Hematology 27:425; патент США № 5824778; патент США № 5824784, WO 96/11953, WO 95/21629 и WO 94/20069).
Присоединение синтетических полимеров к пептидному остову в целях улучшения фармакокинетических свойств терапевтического гликопротеина известно специалистам. Репрезентативным полимером, который был конъюгирован с пептидами, является полиэтиленгликоль (“ПЭГ”). Было продемонстрировано использование ПЭГ в целях дериватизации терапевтических пептидов для снижения иммуногенности данных пептидов. Так, например, в патенте США № 4179337 (Davis et al.) описаны неиммуногенные полипептиды, такие как ферменты и пептидные гормоны, присоединенные к полиэтиленгликолю (ПЭГ) или к полипропиленгликолю. Увеличение размера ПЭГ-конъюгата рассматриваемых полипептидов, помимо снижения иммуногенности, также приводит к увеличению времени выведения из кровотока.
Основным способом присоединения ПЭГ и его производных к пептидам является неспецифическое связывание посредством аминокислотного остатка пептида (см., например, патент США № 4088538, патент США № 4496689, патент США № 4414147, патент США № 4055635 и РСТ WO 87/00056). Другим способом присоединения ПЭГ к пептидам является неспецифическое окисление гликозильных остатков на гликопептиде (см., например, WO 94/05332).
Эти неспецифические методы предусматривают рандомизированное неспецифическое присоединение полиэтиленгликоля к реакционноспособным остаткам на пептидном остове. Очевидно, что рандомизированное присоединение молекул ПЭГ имеет свои недостатки, включая отсутствие гомогенности конечного продукта и возможное снижение биологической или ферментативной активности такого пептида. Поэтому, для продуцирования терапевтических пептидов, наилучшей стратегией является дериватизация, которая приводит к образованию специфически меченного легко характеризуемого и, по существу, гомогенного продукта. И такие методы были разработаны.
in vitro
Специфически меченные гомогенные пептиды с терапевтическими свойствами могут быть продуцированы  под действием ферментов. В отличие от стандартных неспецифических методов присоединения синтетического полимера или другой метки к пептиду, ферментативный синтез имеет те преимущества, что он является региоселективным и стереоселективным. Двумя основными классами ферментов, используемых в синтезе меченых пептидов, являются гликозилтрансферазы (например, сиалилтрансферазы, олигосахарилтрансферазы, N-ацетилглюкозаминилтрансферазы) и гликозидазы. Эти ферменты могут быть использованы для специфического присоединения сахаров, которые могут быть затем модифицированы так, чтобы они содержали терапевтический фрагмент. Альтернативно, гликозилтрансферазы и модифицированные гликозидазы могут быть использованы для прямого переноса модифицированных сахаров на пептидный остов (см., например, патент США № 6399336 и публикации заявок на патенты США 20030040037, 20040132640, 20040137557, 20040126838 и 20040142856, каждая из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки). Методы комбинирования элементов, полученных химическим и ферментативным синтезом, также известны специалистам (см., например, работу Yamamoto et al. Carbohydr. Res. 305:415-422 (1998) и публикацию заявки на патент США 20040137557, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки).
Для решения проблемы, связанной с необходимостью создания более эффективного терапевтического G-CSF, настоящее изобретение было направлено на получение гликопэгилированного G-CSF, который является терапевтически активным и обладает улучшенными фармакокинетическими параметрами и свойствами по сравнению с идентичными или близкородственными аналогами негликопэгилированного пептида G-CSF. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу высокоэффективного и промышленного синтеза пептидов G-CSF с улучшенными свойствами.
Сущность изобретения
Было обнаружено, что регулируемая модификация гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) одной или несколькими полиэтиленгликолевыми группами позволяет получить новые производные G-CSF с улучшенными фармакокинетическими свойствами по сравнению с соответствующим природным (непэгилированным) G-CSF (фиг.3). Кроме того, фармакологическая активность гликопэгилированного G-CSF является примерно такой же, как активность коммерчески доступного монопэгилированного филграстима (фиг.4).
В репрезентативном варианте изобретения “гликопэгилированные” молекулы G-CSF согласно изобретению получают путем опосредуемого ферментом образования конъюгата, содержащего гликозилированный или негликозилированный пептид G-CSF и ферментативно переносимый сахарный фрагмент, в структуру которой входит остаток полиэтиленгликоля. Остаток ПЭГ присоединен к сахарному фрагменту непосредственно (т.е. посредством одной группы, образованной в результате взаимодействия двух реакционноспособных групп) или посредством линкера, например замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и т.п. Пример переносимой ПЭГ-сахарной структуры приводится на фиг.5.
in vivo
Таким образом, в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему остаток ПЭГ, например ПЭГ и пептид, который обладает  активностью, аналогичной или почти аналогичной активности известного G-CSF. В конъюгате согласно изобретению остаток ПЭГ ковалентно присоединен к пептиду посредством интактной гликозильной линкерной группы. Репрезентативными интактными гликозильными линкерными группами являются молекулы сиаловой кислоты, дериватизированные полиэтиленгликолем (ПЭГ).
В одном из своих репрезентативных аспектов настоящее изобретение относится к пептиду G-CSF, который включает фрагмент:
1
1
1
1
1
-
1
6
1
6
В вышеуказанной формуле, D представляет собой -ОН или R-L-НN-. Символ G означает R-L или С(О)(С-С)алкил. R представляет собой группу, содержащую линейный или разветвленный остаток полиэтиленглиголя, а L означает линкер, который выбран из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила. В общих чертах, если D представляет собой ОН, то G представляет собой R-L, а если G представляет собой -С(О)(С-С)алкил, то D представляет собой R-L-NН-. В модифицированных структурах сиаловой кислоты, описанных в настоящей заявке, СООН также представляет собой СОO и/или его соль.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ПЭГилированного G-CSF, содержащего фрагмент, описанный выше. Способ согласно изобретению включает (а) контактирование субстрата пептида G-CSF с донорным фрагментом “ПЭГ-сиаловая кислота” и с ферментом, переносящим ПЭГ-сиаловую кислоту на аминокислотный или гликозильный остаток G-CSF в условиях, подходящих для такого переноса. Репрезентативный донорный фрагмент “ПЭГ-сиаловая кислота” имеет формулу:
В одном из вариантов изобретения указанным хозяином является клетка млекопитающего. В других вариантах осуществления изобретения клеткой-хозяином является клетка насекомого, растения, бактерий или грибов.
Фармакокинетические свойства соединений согласно изобретению могут быть легко изменены путем изменения структуры, числа или положения сайта(ов) гликозилирования пептида. Таким образом, объем настоящего изобретения включает способ добавления одной или нескольких мутаций, которые вводят сайт О- или N-связанного гликозилирования в пептид G-CSF и которые отсутствуют в молекуле дикого типа. Антитела против этих мутантов и их гликозилированных конечных продуктов и промежуточных соединений также входят в объем настоящего изобретения.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к G-CSF-конъюгату, содержащему набор остатков ПЭГ, например ПЭГ, ковалентно связанного с G-CSF посредством интактной гликозильной линкерной группы. В конъюгате согласно изобретению, по существу, каждый член данного набора связан посредством гликозильной линкерной группы с гликозильным остатком пептида и каждый гликозильный остаток имеет идентичную структуру.
В своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к G-CSF-конъюгату, содержащему набор остатков ПЭГ, например ПЭГ, ковалентно связанного с G-CSF посредством интактной гликозильной линкерной группы. В конъюгате согласно изобретению, по существу, каждый член данного набора связан с аминокислотным остатком пептида и каждый аминокислотный остаток, к которому присоединен данный полимер, имеет идентичную структуру. Так, например, если один из пептидов включает связанный с Thr гликозильный остаток, то, по меньшей мере, примерно 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99,2%, 99,4%, 99,6% или, более предпочтительно, 99,8% пептидов в данном наборе будут иметь одинаковое число гликозильных остатков, ковалентно связанных с одним и тем же остатком Thr. Представленное выше обсуждение в равной степени относится к сайтам О-гликозилирования и N-гликозилирования.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции. Такая композиция включает фармацевтически приемлемый носитель и ковалентный конъюгат, содержащий неприродный остаток ПЭГ и гликозилированный или негликозилированный пептид G-CSF.
Другие цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения.
Описание графического материала
На фиг.1 представлена структура G-CSF, которая иллюстрирует наличие и локализацию потенциального гликозилирования у остатка Thr 133 (Thr 134, если присутствует метионин).
На фиг.2 представлена схема, иллюстрирующая репрезентативный вариант настоящего изобретения, в котором углеводный остаток на пептиде СGS ремоделирован путем ферментативного присоединения группы GаlNac к гликозильному остатку у Thr 133 (Thr 134, если присутствует метионин) с последующим присоединением ПЭГ-дериватизированного сахарного фрагмента.
in vivo
ТМ
На фиг.3 представлены графики, иллюстрирующие сравнение времени пребывания  негликозилированного G-CSF, Neulasta и ферментативно гликопэгилированного G-CSF.
На фиг.4 представлены графики, иллюстрирующие сравнение активностей различных молекул, указанных на фиг.3.
На фиг.5 представлена схема синтеза для продуцирования репрезентативного предшественника “ПЭГ-гликозилированная линкерная группа” (модифицированного сахара) согласно изобретению в целях получения конъюгатов согласно изобретению.
На фиг.6 представлены репрезентативные аминокислотные последовательности G-CSF. SEQ ID NO:1 представляет собой вариант, состоящий из 175 аминокислот, где первой аминокислотой является метионин и где треониновый остаток присутствует в положении 134. SEQ ID NO:2 представляет собой вариант, который содержит 174 аминокислоты и имеет такую же последовательность, как и последовательность, состоящая из 175 аминокислот, за исключением того, что в ней отсутствует инициирующий метионин, а поэтому эта последовательность начинается с Т, а треониновый остаток находится в положении 133.
На фиг.7 проиллюстрированы некоторые репрезентативные содержащие модифицированный сахар нуклеотиды, используемые для осуществления настоящего изобретения.
На фиг.8 проиллюстрированы другие репрезентативные, содержащие модифицированный сахар нуклеотиды, используемые для осуществления настоящего изобретения.
На фиг.9 продемонстрировано продуцирование рекомбинантного G-CSF в бактериях, выращенных в различных средах и индуцированных IPTG.
На фиг.10 проиллюстрирован Вестерн-блот-анализ подвергнутого рефолдингу G-CSF после хроматографии на SР-сефарозе.
На фиг.11 представлена таблица сиалилтрансфераз, которые используются для переноса описанных здесь модифицированной молекулы сиаловой кислоты и немодифицированной сиаловой кислоты на акцептор.
Подробное описание настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов
Сокращения
ПЭГ - полиэтиленгликоль; PPG (ППГ) - полипропиленгликоль; Ara - арабинозил; Fru - фруктозил; Fuc - фукозил; Gal - галактозил; GalNac - N-ацетилгалактозаминил; Glc - глюкозил; GlcNAc - N-ацетилглюкозаминил; Man - маннозил; ManAc - маннозаминилацетат; Xyl - ксилозил; NeuAc - сиалил(N-ацетилнейраминил); М6Р - маннозо-6-фосфат; Sia - сиаловая кислота, N-ацетилнейраминил и их производные и аналоги.
Определения
Если это не определено особо, то все используемые здесь технические и научные термины имеют общепринятое значение, известное специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. В общих чертах, используемая здесь номенклатура и лабораторные процедуры, применяемые в культивировании клеток, молекулярной генетике, органической химии и химии синтеза нуклеиновых кислот, а также в методе гибридизации, являются хорошо известными и подробно описаны в литературе. Для синтеза нуклеиновых кислот и пептидов применяются стандартные методы. Такие методы и процедуры обычно осуществляют стандартными способами, описанными в литературе и в различных общих руководствах (в общих чертах, см. руководство Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, которое вводится в настоящее описание посредством ссылки), и эти способы также описаны в данном документе. Используемая здесь номенклатура и лабораторные процедуры, применяемые в аналитической химии и в химии органического синтеза и описанные ниже, хорошо известны и подробно описаны в литературе. Для химического синтеза и химических анализов применяются стандартные методы или их модификации.
Все описанные здесь олигосахариды имеют названия или сокращения, принятые для невосстанавливающего сахарида (т.е. Gаl) и соответствующие конфигурации гликозидной связи (α или β), связи в кольце (1 или 2) и положению восстанавливающего сахарида в кольце, участвующего в образовании связи (2, 3, 4, 6 или 8), а также названия или сокращения, принятые для восстанавливающего сахарида (т.е. GlcNAc). Каждый из сахаридов предпочтительно является пиранозой. Описание стандартной номенклатуры, используемой в биологии гликозилирования, можно найти в руководстве Essentials of Glycobiology Varki et al., eds. CSHL Press (1999).
Считается, что олигосахариды должны иметь восстанавливающий конец и невосстанавливающий конец, независимо от того, является ли сахарид, находящийся у восстанавливающего конца, действительно восстанавливающим сахаром или нет. В соответствии с общепринятой номенклатурой описанные здесь олигосахариды слева имеют невосстанавливающий конец, а справа - восстанавливающий конец.
1
6
Термин “сиаловая кислота” означает любой член семейства карбоксилированных сахаров из девяти атомов углерода. Наиболее распространенным членом семейства сиаловых кислот является N-ацетил-нейраминовая кислота (2-кето-5-ацетамидо-3,5-дидезокси-D-глицеро-D-галактононулопирано-1-оновая кислота (часто сокращенно называемая Neu5Ac, NeuAc или NANA)). Вторым членом такого семейства является N-гликолил-нейраминовая кислота (Neu5Gc или NeuGc), в которой N-ацетильная группа NeuAc является гидроксилированной. Третьим членом семейства сиаловых кислот является 2-кето-3-дезокси-нонулозоновая кислота (KDN) (Nadano et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:11550-11557; Kanamori et al. J. Biol. Chem. 265:21811-21819 (1990)). В объем настоящего изобретения также входят 9-замещенные сиаловые кислоты, такие как 9-О-С-Сацил-Neu5Ac, например 9-О-лактил-Neu5Ac или 9-О-ацетил-Neu5Ac, 9-дезокси-9-фтор-Neu5Ac и 9-азидо-9-дезокси-Neu5Ac. Описание семейства сиаловых кислот можно найти, например, в публикации Varki, Glycobiology 2:25-40 (1992) Sialic Acids: Chemistry, Methabolism and Function, R. Schauer Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)). Синтез и использование соединений сиаловой кислоты в процедуре сиалилирования описаны в Международной заявке WO 92/16640, опубликованной 1 октября 1992.
Термин “гранулоцитарный колониестимулирующий фактор”, или “пептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора”, или “G-CSF”, или “пептид G-CSF” относится к любому пептиду дикого типа или к мутированному пептиду, к рекомбинантному или нативному G-CSF или любому его фрагменту, обладающему активностью, аналогичной активности нативного G-CSF или имитирующей эту активность. Обычно, этот термин также охватывает непептидные миметики G-CSF. В репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1. В других репрезентативных вариантах изобретения пептид G-CSF имеет последовательность, выбранную из SEQ ID NO:3-11.
Термин “активность гранулоцитарного колониестимулирующего фактора” означает любую активность, включая, но не ограничиваясь ими, связывание с рецептором и активацию рецептора, ингибирование связывания с рецептором или любую биохимическую или физиологическую реакцию, которая обычно происходит под действием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора дикого типа. Активность гранулоцитарного колониестимулирующего фактора может быть индуцирована под действием любого пептида гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, определенного выше.
Термин “пептид” означает полимер, в котором мономеры представляют собой аминокислоты и соединены друг с другом амидными связями и который, альтернативно, называется полипептидом. Кроме того, этот термин также охватывает неприродные аминокислоты, например β-аланин, фенилглицин и гомоаргинин. В настоящем изобретении могут быть также использованы аминокислоты, которые не кодируются генами. Кроме того, в настоящем изобретении могут быть также использованы аминокислоты, которые были модифицированы путем включения реакционноспособных групп, сайтов гликозилирования, полимеров, терапевтических молекул, биомолекул и т.п. Все аминокислоты, используемые в настоящем изобретении, могут быть либо D-изомерами, либо L-изомерами. Обычно, предпочтительным является L-изомер. Кроме того, в настоящем изобретении могут быть также использованы другие пептидомиметики. Используемый здесь термин “пептид” означает гликозилированные и негликозилированные пептиды. Могут быть также использованы пептиды, которые являются неполностью гликозилированными в системе, экспрессирующей данный пептид. Общий обзор можно найти у Spatola A.F. Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p.267 (1983).
Термин “пептидный конъюгат” означает молекулу согласно изобретению, в которой пептид конъюгирован с описанным здесь модифицированным сахаром.
Термин “аминокислота” означает природные и синтетические аминокислоты, а также аналоги и миметики аминокислот, которые имеют такие же функции, как и природные аминокислоты. Природными аминокислотами являются аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые были затем модифицированы, например гидроксипролин, γ-карбоксиглутамин и О-фосфосерин. “Аминокислотные аналоги” означают соединения, которые имеют такую же основную химическую структуру, как и природные аминокислоты, то есть содержат α-углерод, связанный с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Эти аналоги имеют модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но, при этом, сохраняют основную химическую структуру, присущую природной аминокислоте. Термин “аминокислотные миметики” означает химические соединения, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислот, но обладающую функцией, аналогичной функции природной аминокислоты. Используемый здесь термин “аминокислота”, независимо от того, присутствует ли она в линкере или в компоненте пептидной последовательности, означает D- и L-изомер аминокислоты, а также смеси этих двух изомеров.
Используемый здесь термин “модифицированный сахар” означает природный или неприродный углевод, который ферментативно присоединен к аминокислоте или к гликозильному остатку пептида способом согласно изобретению. Модифицированный сахар выбирают из ряда субстратов фермента, включая, но не ограничиваясь ими, сахарсодержащие нуклеотиды (моно-, ди- и трифосфаты), активированные сахара (например, гликозилгалогениды, гликозилмезилаты) и сахара, которые не являются активированными и не содержатся в нуклеотидах. “Модифицированный сахар” ковалентно связан с функциональной “модифицирующей” группой. Подходящими модифицирующими группами являются, но не ограничиваются ими, молекулы ПЭГ, терапевтические молекулы, диагностические молекулы, биомолекулы и т.п. Модифицирующая группа, предпочтительно, не является природным или немодифицированным углеводом. Положение функциональной модифицирующей группы выбирают так, чтобы эта группа не препятствовала образованию “модифицированного сахара” в результате ферментативного присоединения этой группы к пептиду.
Термин “водорастворимый” относится к молекулам, которые обладают определенной детектируемой степенью растворимости в воде. Методы детекции и/или оценки растворимости в воде хорошо известны специалистам. Репрезентативными ПЭГ-частями являются пептиды, сахариды, полиэфиры, полиамины, поликарбоновые кислоты и т.п. Пептиды могут иметь смешанные последовательности или могут состоять из одной аминокислоты, например полилизина. Аналогичным образом, сахариды могут иметь смешанные последовательности или могут состоять из одной сахаридной субъединицы, например декстрана, амилозы, хитозана и полисиаловой кислоты. Примером полиэфира является полиэтиленгликоль. Примером полиамина является полиэтиленимин, а репрезентативной поликарбоновой кислотой является полиакриловая кислота.
Используемый здесь термин “гликозильная линкерная группа” означает гликозильный остаток, к которому ковалентно присоединен агент (например, остаток ПЭГ, терапевтическая молекула, биомолекула). В способах согласно изобретению “гликозильная линкерная группа” ковалентно присоединяется к гликозилированному или к негликозилированному пептиду и тем самым связывает данный агент с аминокислотой и/или гликозильным остатком пептида. “Гликозильная линкерная группа” обычно образуется из “модифицированного сахара” в результате ферментативного присоединения “модифицированного сахара” к аминокислоте и/или к гликозильному остатку данного пептида. Термин “интактная гликозильная линкерная группа” означает линкерную группу, образующуюся из гликозильной части, в которой отдельные сахаридные мономеры, связывающие элементы конъюгата, не разлагаются, например не окисляются, например, под действием метапериодата натрия. “Интактные гликозильные линкерные группы” согласно изобретению могут образовываться из природного олигосахарида путем присоединения гликозильной(ых) единицы(единиц) или удаления одной или нескольких гликозильных единиц из исходной сахаридной структуры.
Используемый здесь термин “нацеливающая молекула” означает молекулу, которая может селективно локализоваться в конкретной ткани или области организма. Такая локализация опосредуется специфическим распознаванием молекулярных детерминант, размером молекулы указанного нацеливающего агента или конъюгата, ионными взаимодействиями, гидрофобными взаимодействиями и т.п. Другие механизмы доставки агента в конкретную ткань или область известны специалистам. Примерами нацеливающих молекул являются антитела, фрагменты антител, трансферрин, НS-гликопротеин, факторы свертывания крови, сывороточные белки, β-гликопротеин, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, ЕРО и т.п.
Используемый здесь термин “фармацевтически приемлемый носитель” включает любой материал, который, при его объединении с конъюгатом, сохраняет активность данного конъюгата и не реагирует с иммунной системой пациента. Примерами таких носителей являются, но не ограничиваются ими, любой стандартный фармацевтический носитель, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, вода, эмульсии, такие как эмульсии типа “масло в воде”, и смачивающие агенты различных типов. Другими носителями могут быть также стерильные растворы, таблетки, включая таблетки с покрытиями и капсулы. Обычно, такие носители содержат наполнители, такие как крахмал, молоко, сахар, глины некоторых типов, желатин, стеариновую кислоту или ее соли, стеарат магния или кальция, тальк, растительные жиры или масла, смолы, гликоли или другие известные наполнители. Такими носителями могут быть также ароматизаторы, красители или другие ингредиенты. Композиции, содержащие такие носители, приготавливают хорошо известными стандартными методами.
Используемый здесь термин “введение” означает пероральное введение, введение в виде суппозиториев, введение путем местного контакта, внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, внутримышечное введение, введение в пораженный участок, интраназальное введение или подкожное введение либо имплантацию индивидууму устройства пролонгированного высвобождения, например миниосмотического насоса. Введение может быть осуществлено любым способом, включая парентеральное и трансмукозальное введение (например, пероральное, интраназальное, вагинальное, ректальное или трансдермальное введение). Парентеральное введение включает, например, внутривенное, внутримышечное, интраартериолярное, внутрикожное, подкожное, внутрибрюшинное, интравентрикулярное и внутричерепное введение. Кроме того, если инъекцию вводят в целях уничтожения опухоли, например в целях индуцирования апоптоза, то такое введение может быть осуществлено непосредственно в опухоль и/или в ткани, окружающие опухоль. Другими способами введения являются, но не ограничиваются ими, использование липосомных препаратов, внутривенное вливание, использование чрезкожных пластырей и т.п.
Термин “облегчение” или “облегчать” означает любой признак положительной динамики в лечении патологии или состояния, включая объективные или субъективные параметры, такие как ослабление, ремиссия или уменьшение симптомов заболевания, или улучшение физического или психического состояния пациента. Облегчение симптомов может быть основано на объективных или субъективных параметрах, включая результаты обследования физического и/или психического состояния пациента.
Термин “терапия” означает “лечение” или “устранение” заболевания или состояния, включая предупреждение данного заболевания или состояния у животного, которое может иметь предрасположенность в развитию данного заболевания, но у которого еще отсутствуют или пока не обнаружены симптомы заболевания (профилактическое лечение), подавление развития заболевания (замедление или прекращение его развития), ослабление симптомов или побочных эффектов заболевания (включая паллиативное лечение) и улучшение динамики заболевания (приводящей к регрессии, т.е. к обратному развитию заболевания).
Термин “эффективное количество”, или “количество, эффективное для...”, или “терапевтически эффективное количество”, или любой грамматически эквивалентный термин означает количество, которое, при его введении животному для лечения заболевания, является достаточным для эффективного лечения такого заболевания.
Термин “выделенный” относится к материалу, который, по существу или в основном, не содержит компонентов, используемых для получения такого материала. Что касается пептидных конъюгатов согласно изобретению, то термин “выделенный” относится к материалу, который, по существу или в основном, не содержит компонентов, которые обычно присутствуют вместе с этим материалом в смеси, используемой для получения пептидного конъюгата. Термины “выделенный” и “чистый” являются взаимозаменяемыми. Выделенные пептидные конъюгаты согласно изобретению обычно имеют уровень чистоты, выражаемый, предпочтительно, в виде интервала значений. Нижняя граница интервала значений чистоты для пептидных конъюгатов составляет примерно 60%, примерно 79% или примерно 80%, а верхняя граница интервала значений чистоты для пептидных конъюгатов составляет примерно 70%, примерно 80%, примерно 90% или более чем примерно 90%.
Если пептидные конъюгаты имеют чистоту более чем примерно 90%, то их чистота также, предпочтительно, выражена в виде интервала значений. Нижняя граница этого интервала значений чистоты для пептидных конъюгатов составляет примерно 90%, примерно 92%, примерно 94%, примерно 96% или примерно 98%. Верхняя граница интервала значений чистоты для пептидных конъюгатов составляет примерно 92%, примерно 94%, примерно 96%, примерно 98% или примерно 100%.
Чистоту определяют хорошо известными аналитическими методами (например, по интенсивности полосы на окрашенном серебром геле, с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, с помощью ВЭЖХ или аналогичными методами).
Используемый здесь термин “в основном, каждый член популяции” описывает свойства популяции пептидных конъюгатов согласно изобретению, в которых множество идентичных акцепторных сайтов на пептиде содержит выбранный процент модифицированных сахаров, присоединенных к пептиду. Термин “в основном, каждый член популяции”, упоминаемый в связи с “гомогенностью” этих сайтов на пептиде, конъюгированном с модифицированным сахаром, относится к конъюгатам согласно изобретению, которые являются гомогенными, по меньшей мере, примерно на 80%, предпочтительно, примерно, по меньшей мере, на 90%, а более предпочтительно, примерно, по меньшей мере, на 95%.
Термин “гомогенность” относится к структурному составу всей популяции акцепторных фрагментов, с которыми конъюгированы модифицированные сахара. Так, например, говорят, что пептидный конъюгат согласно изобретению, в котором каждый фрагмент модифицированного сахара конъюгирован с акцепторным сайтом, имеющим такую же структуру, как и акцепторный сайт, с которым конъюгирован любой другой модифицированный сахар, является гомогенным примерно на 100%. Гомогенность обычно выражена в виде интервала значений. Нижняя граница интервала гомогенности для пептидных конъюгатов составляет примерно 60%, примерно 70% или примерно 80%, а верхняя граница интервала частоты для пептидных конъюгатов составляет примерно 70%, примерно 80%, примерно 90% или более чем примерно 90%.
Если пептидные конъюгаты имеют гомогенность, равную или составляющую примерно более 90%, то их гомогенность также, предпочтительно, выражена в виде интервала значений. Нижняя граница интервала гомогенности для пептидных конъюгатов составляет примерно 90%, примерно 92%, примерно 94%, примерно 96% или примерно 98%. Верхняя граница интервала гомогенности для пептидных конъюгатов составляет примерно 92%, примерно 94%, примерно 96%, примерно 98% или примерно 100%. Чистоту пептидных конъюгатов обычно определяют одним или несколькими методами, известными специалистам, например, с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), лазерной десорбционной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDITOF), капиллярного электрофореза и т.п.
Термины “по существу, однородная гликозилированная форма” или “по существу, однородная картина гликозилирования”, если они относятся к гликопептидам, означают процент акцепторных фрагментов, гликозилированных под действием представляющей интерес гликозилтрансферазы (например, фукозилтрансферазы). Так, например, в случае α-1,2-фукозилтрансферазы, по существу, однородная картина фукозилирования наблюдается в том случае, когда в пептидном конъюгате согласно изобретению фукозилированы почти все (как определено ниже) фрагменты Gаlβ1,4-GlcNac-R и их сиалилированные аналоги. Для специалистов в этой области очевидно, что исходный материал может содержать гликозилированные акцепторные фрагменты (например, фукозилированные молекулы Gаlβ1,4-GlcNac-R). Таким образом, вычисленный процент гликозилирования означает число акцепторных фрагментов, гликозилированных способами согласно изобретению, а также число акцепторных фрагментов, которые уже были гликозилированы в исходном материале.
Слово “по существу”, входящее в вышеуказанное определение термина “по существу, однородный”, обычно означает, что акцепторные фрагменты для конкретной гликозилтрансферазы гликозилированы, по меньшей мере, примерно на 40%, по меньшей мере, примерно на 70%, по меньшей мере, примерно на 80% или, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 90%, а еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 95%.
2
2
Если группы-заместители определяются их стандартными химическими формулами, записанными слева направо, то они в равной степени включают химически идентичные заместители, имеющие структурную формулу, которая должна быть записана справа налево, например -СНО- также означает -ОСН-.
1
10
Термин “алкил”, сам по себе или составляющий часть другого заместителя, если это не оговорено особо, означает радикал с линейной или разветвленной цепью, или циклический углеводородный радикал, или их комбинацию, которые могут быть полностью насыщенными, моно- или полиненасыщенными и могут включать ди- и поливалентные радикалы, имеющие указанное число атомов углерода (то есть С-С имеет от одного до десяти атомов углерода). Примерами насыщенных углеводородных радикалов являются, но не ограничиваются ими, такие группы, как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, втор-бутил, циклогексил, (циклогексил)метил, циклопропилметил и их гомологи и изомеры, например н-пентил, н-гексил, н-гептил, н-октил и т.п. Ненасыщенной алкильной группой является алкильная группа, имеющая одну или несколько двойных или тройных связей. Примерами ненасыщенных алкильных групп являются, но не ограничиваются ими, винил, 2-пропенил, кротил, 2-изопентенил, 2-(бутадиенил), 2,4-пентадиенил, 3-(1,4-пентадиенил), этинил, 1- и 3-пропинил, 3-бутинил и высшие гомологи и изомеры. Термин “алкил”, если это не оговорено особо, также означает производные алкила, более подробно определенные ниже, такие как “гетероалкил”. Алкильные группы, ограниченные углеводородными группами, называются “гомоалкилами”.
2
2
2
2
Термин “алкилен” сам по себе или составляющий часть другого заместителя, если это не оговорено особо, означает происходящий от алкана двухвалентный радикал, примерами которого являются, но не ограничиваются ими, -СНСНСНСН- и который, кроме того, включает группы, определенные ниже как “гетероалкилен”. Обычно, алкильная (или алкиленовая) группа имеет от 1 до 24 атомов углерода, однако согласно настоящему изобретению предпочтительными являются группы, имеющие 10 или менее атомов углерода. “Низший алкил” или “низший алкилен” представляет собой алкильную или алкиленовую группу с более короткой цепью, обычно имеющей восемь или менее атомов углерода.
Термины “алкокси”, “алкиламино” или “алкилтио” (или тиоалкокси) используются в их общепринятом смысле и означают алкильные группы, присоединенные к остальной части молекулы посредством атома кислорода, аминогруппы или атома серы соответственно.
2
2
3
2
2
3
2
2
3
3
2
2
3
2
2
3
2
2
2
3
3
3
3
2
3
3
3
2
3
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Термин “гетероалкил”, сам по себе или в комбинации с другим термином, означает, если это не оговорено особо, стабильный радикал с линейной или разветвленной цепью, или циклический углеводородный радикал, или их комбинации, состоящие из указанного числа атомов углерода и, по меньшей мере, одного гетероатома, выбранного из группы, состоящей из О, N, Si и S, где атомы азота и серы могут быть, но необязательно, окисленными, а гетероатом азота может быть, но необязательно, кватернизирован. Гетероатом(ы) О, N, S и Si может (могут) находиться в любом внутреннем положении гетероалкильной группы или в положении, в котором алкильная группа присоединена к остальной части молекулы. Примерами таких групп являются, но не ограничиваются ими, -СН-СН-О-СН, -СН-СН-NH-СН, -СН-СН-N(СН)-СН, -СН-S-СН-СН, -СН-СН, -S(O)-СН, -СН-СН-S(O)-СН, -СН=СН-О-СН, -Si(СН), -СН-СН=N-OСН и -СН=СН-N(СН)-СН. Два гетероатома могут быть расположены друг за другом, например -СН-NН-ОСН и -СН-О-Si(СН). Аналогичным образом, термин “гетероалкилен”, сам по себе или как часть другого заместителя, означает происходящий от гетероалкила двухвалентный радикал, примерами которого являются, но не ограничиваются ими, -СН-СН-S-СН-СН- и -СН-S-СН-СН-NН-СН-. В случае гетероалкиленовых групп гетероатомы могут также присутствовать на любом конце или на обоих концах цепи (например, в алкиленокси-, алкилендиокси-, алкиленамино-, алкилендиаминогруппах и т.п.). Кроме того, в случае алкиленовых и гетероалкиленовых линкерных групп ориентация линкерных групп не должна обязательно соответствовать направлению, в котором записана формула такой линкерной группы. Так, например, формула -С(О)R' представляет структуру, которая может быть записана формулами -С(О)R' и -R'С(О)-.
Термины “циклоалкил” и “гетероциклоалкил”, сами по себе или в комбинации с другими терминами, означают, если это не оговорено особо, циклические варианты “алкила” и “гетероалкила” соответственно. Кроме того, в случае гетероциклоалкила гетероатом может находиться в положении, в котором указанный гетероцикл присоединен к остальной части молекулы. Примерами циклоалкила являются, но не ограничиваются ими, циклопентил, циклогексил, 1-циклогексенил, 3-циклогексенил, циклогептил и т.п. Примерами гетероциклоалкилов являются, но не ограничиваются ими, 1-(1,2,5,6-тетрагидропиридил), 1-пиперидинил, 2-пиперидинил, 3-пиперидинил, 4-морфолинил, 3-морфолинил, тетрагидрофуран-2-ил, тетрагидрофуран-3-ил, тетрагидротиен-2-ил, тетрагидротиен-3-ил, 1-пиперазинил, 2-пиперазинил и т.п.
1
4
Термины “галогено” или “галоген” сами по себе или как часть другого заместителя означают, если это не оговорено особо, атом фтора, хлора, брома или иода. Кроме того, термины, такие как “галогеналкил”, означают моногалогеналкил и полигалогеналкил. Так, например, термин “галоген(С-С)алкил” включает, но не ограничивается ими, трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, 4-хлорбутил, 3-бромпропил и т.п.
Термин “арил” означает, если это не оговорено особо, полиненасыщенный ароматический заместитель, который может представлять собой одиночное кольцо или множество колец (предпочтительно, от 1 до 3 колец), которые являются либо конденсированными, либо ковалентно связанными друг с другом. Термин “гетероарил” означает арильные группы (или кольца), содержащие от одного до четырех гетероатомов, выбранных из N, O и S, где атомы азота и серы могут быть, но необязательно, окисленными, а атом(ы) азота является(ются), но необязательно, кватернизированным(ыми). Гетероарильная группа может быть присоединена к остальной части молекулы посредством гетероатома. Неограничивающими примерами арильных и гетероарильных групп являются фенил, 1-нафтил, 2-нафтил, 4-бифенил, 1-пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил, 3-пиразолил, 2-имидазолил, 4-имидазолил, пиразинил, 2-оксазолил, 4-оксазолил, 2-фенил-4-оксазолил, 5-оксазолил, 3-изоксазолил, 4-изоксазолил, 5-изоксазолил, 2-тиазолил, 4-тиазолил, 5-тиазолил, 2-фурил, 3-фурил, 2-тиенил, 3-тиенил, 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 2-пиримидил, 4-пиримидил, 5-бензотиазолил, пуринил, 2-бензимидазолил, 5-индолил, 1-изохинолил, 5-изохинолил, 2-хиноксалинил, 5-хиноксалинил, 3-хинолил, тетразолил,
бензо[b]фуранил, бензо[b]тиенил, 2,3-дигидробензо[1,4]диоксин-6-ил, бензо[1,3]диоксол-5-ил и 6-хинолил. Заместители для каждой из вышеописанных арильных и гетероарильных циклических систем выбраны из группы приемлемых заместителей, описанных ниже.
Для краткости, термин “арил”, если он используется в комбинации с другими терминами (например, арилокси, арилтиокси, арилалкил), включает арильные и гетероарильные кольца, определенные выше. Так, например, термин “арилалкил” означает радикалы, в которых арильная группа присоединена к алкильной группе (например, бензил, фенетил, пиридилметил и т.п.), включая алкильные группы, в которых атом углерода (например, метиленовая группа) заменен, например, атомом кислорода (например, феноксиметил, 2-пиридилоксиметил, 3-(1-нафтилокси)пропил и т.п.).
Каждый из вышеуказанных терминов (например, “алкил”, “гетероалкил”, “арил” и “гетероарил”) означает как замещенные, так и незамещенные формы указанного радикала. Предпочтительные заместители для каждого типа радикала описаны ниже.
2
2
2
2
2
2
3
2
3
3
3
2
3
Заместители для алкильных и гетероалкильных радикалов (включая такие группы, которые часто называются алкиленом, алкенилом, гетероалкиленом, гетероалкенилом, алкинилом, циклоалкилом, гетероциклоалкилом, циклоалкенилом и гетероциклоалкенилом) имеют общее родовое название “заместители алкильных групп”, и эти заместители могут представлять собой одну или несколько различных групп, выбранных из групп, но не ограничивающихся ими, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R”, -SR', галоген, -SiR'R”R”', -ОС(О)R', -C(O)R', -COR', -CONR'R”, -ОС(О)NR'R”-, NR”C(O)R', -NR'-C(O)NR”R”', -NR”C(O)R', -NR-C(NR'R”R”')=NR””, -NR-C(NR'R”)=NR”', -S(O)R', -S(O)R', -S(O)NR'R”, -NRSOR', -CN и -NO, где число заместителей составляет от 0 до 2m'+1, а m' означает общее число атомов углерода в таком радикале. Каждый из R', R”, R”' и R”” независимо и предпочтительно означает водород, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, например арил, замещенный 1-3 галогенами, замещенной или незамещенной алкильной, алкокси или тиоалкоксигруппами или арилалкильными группами. Если соединение согласно изобретению, например, включает более чем одну группу R, то каждая группа R независимо выбрана из групп R', R”, R”' и R””, если присутствует более чем одна из этих групп. Если R' и R” присоединены к одному и тому же атому азота, то эти группы, вместе с атомом азота, образуют 5-, 6- или 7-членное кольцо. Так, например, -NR'R” включает, но не ограничивается ими, 1-пирролидинил и 4-морфолинил. Исходя из вышеупомянутого обсуждения заместителей очевидно, что термин “алкил” означает группы, включающие атомы углерода, связанные с группами, не являющимися водородными группами, такие как галогеналкил (например, -CF и -СНСF) и ацил (например, -С(О)СН, -С(О)СF, -С(О)СНОСН и т.п.).
2
2
2
2
2
2
3
2
1
4
1
4
Аналогично заместителям, описанным для алкильного радикала, заместители для арильных и гетероарильных радикалов имеют общее родовое название “заместители арильных групп”. Такие заместители выбраны, например, из галогена, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R”, -SR', -галогена, -SiR'R”R”', -ОС(О)R', -C(O)R', -COR', -CONR'R”, -ОС(О)NR'R”-, NR”C(O)R', -NR'-C(O)NR”R”', -NR”C(O)R', -NR-C(NR'R”R”')=NR””, -NR-C(NR'R”)=NR”', -S(O)R', -S(O)R', -S(O)NR'R”, -NRSOR', -CN и -NO, -R', -N, -CH(Ph), фтор(С-С)алкокси и фтор(С-С)алкила, где число заместителей составляет в пределах от 0 до общего числа свободных валентностей на ароматической системе, где R', R”, R”' и R”” предпочтительно и независимо выбраны из водорода, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероарила. Если соединение согласно изобретению, например, включает более чем одну группу R, то каждая группа R независимо выбрана из групп R', R”, R”' и R””, если присутствует более чем одна из этих групп. В приведенных ниже схемах символ Х представляет собой “R”, определенный выше.
q
2
r
2
2
S
d
2
2
1
6
Два заместителя на смежных атомах арила или гетероарила могут быть, но необязательно, заменены заместителем формулы -Т-С(О)-(CRR')-U, где T и U независимо представляют собой -NR-, -O, -CRR' или простую связь, а q равно целому числу от 0 до 3. Альтернативно, два заместителя на смежных атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть, но необязательно, заменены заместителем формулы А-(СН)-В-, где А и В независимо представляют собой -CRR'-, -О-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)-, -S(O)NR' или простую связь, а r равно целому числу от 1 до 4. Одна из простых связей образованного таким образом нового кольца может быть, но необязательно, заменена двойной связью. Альтернативно, два заместителя на смежных атомах арильного или гетероарильного кольца могут быть, но необязательно, заменены заместителем формулы (CRR')-Х-(CR”R”'), где s и d независимо равны целому числу от 0 до 3, а Х представляет собой -О-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)- или S(O)NR'-. Заместители R, R', R” и R”', предпочтительно, независимо выбраны из водорода или замещенного или незамещенного (С-С)алкила.
Используемый здесь термин “гетероатом” означает кислород (О), азот (N), серу (S) и кремний (Si).
Введение
Настоящее изобретение относится к способу модификации гликановой структуры на G-CSF. G-CSF хорошо известен специалистам как цитокин, продуцируемый активированными Т-клетками, макрофагами, эндотелиальными клетками и стромальными фибробластами. G-CSF действует, главным образом, на костный мозг и повышает уровень продуцирования воспалительных лейкоцитов, и, кроме того, этот цитокин функционирует как эндокринный гормон, инициируя пополнение нейтрофилов, израсходованных в процессе воспалительных реакций. G-CSF также находит клиническое применение в восстановлении костного мозга после химиотерапии.
Настоящее изобретение относится к конъюгату гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF). Настоящее изобретение также относится к конъюгатам гликозилированных и негликозилированных пептидов, обладающих гранулоцитарной колониестимулирующей активностью. Такие конъюгаты могут быть также модифицированы путем дополнительного конъюгирования с другими молекулами, такими как терапевтические молекулы, диагностические молекулы, молекулы для нацеленной доставки и т.п.
Настоящее изобретение также относится к способу ремоделирования и/или модификации G-CSF. G-CSF является ценным средством для лечения различных заболеваний, но, как было указано выше, его клиническая эффективность ограничена его относительно плохой фармакокинетикой.
В репрезентативных вариантах изобретения пептид G-CSF согласно изобретению может быть введен для предупреждения инфекции у раковых пациентов, подвергающихся лучевой терапии определенного типа, химиотерапии и трансплантации костного мозга, в целях мобилизации клеток-предшественников для сбора трансплантированных клеток-предшественников периферической крови, для лечения тяжелой хронической или относительной лейкопении, независимо от вызвавшей ее причины, и для поддерживающей терапии пациентов с острым миелоидным лейкозом. Кроме того, полипептидный конъюгат или композиция согласно изобретению могут быть использованы для лечения СПИДа или других иммунодефицитных заболеваний, а также бактериальных инфекций.
G-CSF был клонирован и секвенирован. В репрезентативном варианте изобретения G-CSF имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1. Для любого специалиста совершенно очевидно, что настоящее изобретение не ограничивается описанными здесь последовательностями, а также вариантами G-CSF, обсуждаемыми выше.
Так, например, настоящее изобретение также охватывает варианты G-CSF, хорошо известные специалистам. В качестве примера, не ограничивающего настоящее изобретение, может служить вариант G-CSF, рассматриваемый в патенте США № 6166183, в котором описан G-CSF, содержащий природный комплемент лизиновых остатков и присоединенный к одной молекуле или к двум молекулам полиэтиленгликоля. Кроме того, в патентах США № 6004548, 5580755, 5582823 и 5676941 описан вариант G-CSF, в котором один или несколько цистеиновых остатков в положении 17, 36, 42, 64 и 74 заменены аланином или, альтернативно, серином. В патенте США № 5416195 описана молекула G-CSF, в которой цистеин в положении 17, аспарагиновая кислота в положении 27 и серины в положениях 65 и 66 заменены серином, серином, пролином и пролином соответственно. Специалистам хорошо известны и другие варианты, и эти варианты описаны, например, в патенте США № 5399345. Другие варианты имеют аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:3-11.
4
3
3
2
Экспрессия и активность модифицированной молекулы G-CSF согласно изобретению может быть проанализирована методами, хорошо известными специалистам и описанными, например, в патенте США № 4810643. Так, например, активность может быть измерена с помощью анализов на поглощение радиоактивно меченного тимидина. Вкратце, костный мозг, взятый от здорового человека, разрезают в градиенте плотности фиколла-гипака (1,077 г/мл, Pharmacia Piscataway, NJ) и клетки с низкой плотностью суспендируют в среде Исков (GIBCO, La Jolla, CA), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку, глутамин и антибиотики. Примерно 2×10 клеток человеческого костного мозга инкубируют либо с контрольной средой, либо с G-CSF согласно изобретению в 96-луночном плоскодонном планшете примерно при 37°С в атмосфере воздуха с 5% СО в течение примерно 2 дней. Затем на культуры в течение примерно 4 часов подают импульсы 0,5 мкКи/лунку Н-тимидина (New England Nuclear, Boston, Mass.) и измеряют уровень поглощения, как описано, например, в работе Ventua et al. (1983, Blood 61:781). Увеличение уровня включения Н-тимидина в клетки костного мозга человека, по сравнению с клетками костного мозга, обработанного контрольным соединением, является показателем активности и стабильности соединения G-CSF.
Как описано выше, конъюгаты согласно изобретению образуются посредством ферментативного присоединения модифицированного сахара к гликозилированному или негликозилированному пептиду G-CSF. Модифицированный сахар, если он находится между пептидом G-CSF и модифицирующей группой на сахаре, будет образовывать группу, которая может называться здесь, например, “интактной гликозильной линкерной группой”. С применением способа согласно изобретению, в котором предусматривается использование в высокой степени селективных ферментов, таких как гликозилтрансферазы, можно получить пептиды, несущие нужную группу в одном или нескольких специфических положениях. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением модифицированный сахар присоединяют непосредственно в выбранном сайте пептидной цепи G-CSF, или, альтернативно, модифицированный сахар присоединяют к углеводной части гликопептида. Пептиды, в которых модифицированные сахара связаны с углеводом гликопептида и непосредственно связаны с аминокислотным остатком пептидного остова G-CSF, также входят в объем настоящего изобретения.
В отличие от известных стратегий химического и ферментативного синтеза пептидов способы согласно изобретению дают возможность получать пептиды и гликопептиды, которые имеют, по существу, гомогенный характер дериватизации; причем ферменты, используемые в настоящем изобретении, являются, по существу, селективными к конкретному аминокислотному остатку или к комбинации аминокислотных остатков пептида G-CSF. Такие способы также позволяют осуществлять крупномасштабное продуцирование модифицированных пептидов и гликопептидов. Таким образом, способы согласно изобретению могут найти практическое применение в крупномасштабном синтезе гликопептидов, имеющих предварительно выбранный однородный характер дериватизации. Эти способы являются особенно подходящими для модификации терапевтических пептидов, включая, но не ограничиваясь ими, гликопептиды, которые не полностью гликозилируются в процессе их синтеза в клеточных культурах (например, в клетках млекопитающих, насекомых, растений, грибов, дрожжей или прокариотов) или в трансгенных растениях или животных.
Настоящее изобретение также относится к конъюгатам гликозилированных и негликозилированных пептидов G-CSF с повышенным терапевтическим временем полужизни, что обусловлено, например, пониженной скоростью клиренса или пониженной скоростью поглощения иммунной или ретикулоэндотелиальной системой (РЭС). Кроме того, способы согласно изобретению позволяют осуществлять маскировку антигенных детерминант на пептидах, что приводит к снижению или предотвращению вырабатывания иммунного ответа хозяина против данного пептида. Селективное присоединение агентов для нацеленной доставки может также применяться для доставки пептида в конкретную ткань или на рецептор клеточной поверхности, который является специфичным по отношению к конкретному нацеливающему агенту.
Конъюгаты
В первом своем аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату, состоящему из селективной модифицирующей группы и пептида G-CSF.
Связь между пептидом G-CSF и выбранным фрагментом включает интактную гликозильную линкерную группу, расположенную между пептидом и выбранным фрагментом. Как обсуждается в настоящем описании, выбранным фрагментом может быть, по существу, любой фрагмент, который способен присоединяться к сахаридному звену, в результате чего образуется “модифицированный сахар”, распознаваемый соответствующим ферментом трансферазой, который присоединяет модифицированный сахар к пептиду G-CSF. Сахаридный компонент модифицированного сахара, если он расположен между пептидом G-CSF и выбранным фрагментом, становится “интактной гликозильной линкерной группой”. Такая гликозильная линкерная группа образуется из любого моно- или олигосахарида, который после модификации выбранным фрагментом представляет собой субстрат для соответствующей трансферазы.
Конъюгаты согласно изобретению обычно соответствуют общей структуре:
в которой символы а, b, с, d и s означают положительное целое число, не равное нулю, а t равно 0 или является положительным целым числом. Термин “агент” обычно означает водорастворимый фрагмент, например остаток ПЭГ. Термин “линкер” может включать широкий набор любых связывающих групп, см. ниже. Альтернативно, линкер может представлять собой простую связь или “линкер нулевого порядка”.
В репрезентативном варианте изобретения выбранной модифицирующей группой является водорастворимый полимер, например м-ПЭГ. Такой водорастворимый полимер ковалентно связан с пептидом G-CSF посредством гликозильной линкерной группы, которая ковалентно присоединена к аминокислотному остатку или к гликозильному остатку пептида G-CSF. Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, в которых аминокислотный остаток и гликозильный остаток модифицированы гликозильной линкерной группой.
Репрезентативным водорастворимым полимером является полиэтиленгликоль, например метоксиполиэтиленгликоль. Полиэтиленгликоль, используемый в настоящем изобретении, не ограничен какой-либо конкретной формой или молекулярной массой. Для неразветвленных молекул полиэтиленгликоля молекулярная масса, предпочтительно, составляет 500-100000. Предпочтительная молекула имеет молекулярную массу 2000-60000, а более предпочтительно, примерно от 5000 до 30000.
В другом варианте изобретения указанный полиэтиленгликоль представляет собой разветвленный ПЭГ, имеющий более чем один присоединенный остаток ПЭГ. Примеры разветвленных ПЭГ описаны в патентах США № 5932462, 5342940, 5643575, 5919455, 6113906, 5183660; в WO 02/09766 и у Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5:283-288 (1994) и Yamasaki et al., Agric. Biol. Chem., 52:2125-2127, 1998. Другие подходящие разветвленные структуры ПЭГ описаны в настоящей заявке.
В репрезентативных вариантах изобретения молекулярная масса каждого разветвленного полиэтиленгликоля (ПЭГ) равна или превышает примерно 2000, 5000, 10000, 15000, 20000, 40000 или 60000 дальтон.
Пептиды согласно изобретению включают, по меньшей мере, сайт N- или О-связанного гликозилирования. Помимо конъюгатов, которые образуются посредством ферментативно присоединяемой гликозильной линкерной группы, настоящее изобретение относится к конъюгатам, которые являются в высокой степени гомогенными по своему характеру замещения. С применением способов согласно изобретению могут быть получены пептидные конъюгаты, в которых почти все модифицированные сахарные группы по всей популяции конъюгатов согласно изобретению присоединены к множеству копий структурно идентичных аминокислотных или гликозильных остатков. Таким образом, во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, имеющему совокупность водорастворимых полимерных фрагментов, которые ковалентно связаны с пептидом G-CSF посредством интактной гликозильной линкерной группы. В предпочтительном конъюгате согласно изобретению, по существу, каждый член такой группы связан через гликозильную линкерную группу с гликозильным остатком пептида G-CSF, а каждый гликозильный остаток пептида G-CSF, к которому присоединена гликозильная линкерная группа, имеет идентичную структуру.
Настоящее изобретение также относится к пептидному конъюгату, имеющему группу водорастворимых полимерных фрагментов, ковалентно связанных друг с другом посредством гликозильной линкерной группы. В предпочтительном варианте изобретения, по существу, каждый член группы водорастворимых полимерных фрагментов связан с аминокислотным остатком пептида G-CSF посредством гликозильной линкерной группы, а каждый аминокислотный остаток, содержащий присоединенную гликозильную линкерную группу, имеет идентичную структуру.
Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, аналогичным конъюгатам, описанным выше, в которых пептид G-CSF конъюгирован с терапевтической молекулой, диагностической молекулой, нацеливающей молекулой, молекулой токсина или т.п. посредством интактной гликозильной линкерной группы. Каждая из вышеуказанных молекул может представлять собой небольшую молекулу, природный полимер (например, полипептид) или синтетический полимер.
По существу, любой пептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора или агент, имеющий любую последовательность, может быть использован в качестве пептидного компонента конъюгатов согласно изобретению. Был клонирован и секвенирован гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. В репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:1:
В другом репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:2:
В другом репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF имеет последовательность, представленную ниже в SEQ ID NO:3-11:
Настоящее изобретение не ограничивается представленными здесь последовательностями.
В репрезентативном варианте изобретения пептиды G-CSF согласно изобретению включают, по меньшей мере, один сайт О-связанного гликозилирования, который гликозилирован гликозильным остатком, включающим фрагмент ПЭГ. ПЭГ ковалентно связан с пептидом G-CSF посредством интактной гликозильной линкерной группы. Такая гликозильная линкерная группа ковалентно связана либо с аминокислотным остатком, либо с гликозильным остатком пептида G-CSF. Альтернативно, гликозильная линкерная группа присоединена к одному или нескольким гликозильным звеньям гликопептида. Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, в которых гликозильная линкерная группа присоединена к аминокислотному остатку и к гликозильному остатку.
ПЭГ-часть присоединена к интактному гликозильному линкеру непосредственно или посредством негликозильного линкера, например замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила.
В предпочтительном варианте изобретения пептид G-CSF содержит группу, имеющую формулу I.
Формула I
1
1
1
1
1
-
1
6
1
6
где D выбран из -ОН и R-L-НN; G выбран из R-L или С(О)(С-С)алкил; R представляет собой группу, содержащую фрагмент, выбранный из линейных или разветвленных остатков полиэтиленглиголя, а L означает линкер, который выбран из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила, при условии, что если D представляет собой ОН, то G представляет собой R-L, а если G представляет собой С(О)(С-С)алкил, то D представляет собой R-L-NН-. В описанных здесь модифицированных структурах сиаловой кислоты СООН также представляет собой СОO и/или его соль.
1
В одном из вариантов изобретения R-L имеет формулу:
где а равно целому числу от 0 до 20.
1
В репрезентативном варианте изобретения R имеет структуру, которая выбрана из:
1
где е и f независимо равны целым числам, выбранным из 1-2500, а q равно целому числу от 1 до 20. В других вариантах изобретения R имеет структуру, которая представляет собой член, выбранный из:
где е, f и f' равны целым числам, независимо выбранным из 1-2500, а q и q' означают целые числа, независимо выбранные из 1-20.
1
В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к конъюгату пептида фактора IX, где R имеет структуру, которая выбрана из:
где е, f и f' независимо равны целым числам, выбранным из 1-2500, а q, q' и q” равны целым числам, независимо выбранным из 1-20.
1
В других вариантах изобретения R имеет структуру, которая выбрана из:
где е и f независимо равны целым числам, выбранным из 1-2500.
В еще одном своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к пептиду, содержащему группу, имеющую формулу:
где Gal может быть присоединен к аминокислотному или к гликозильному остатку, который непосредственно или опосредованно (например, через гликозильный остаток) присоединен к аминокислоте.
В других вариантах изобретения молекула имеет формулу:
где GalNac может быть присоединен к аминокислотному или к гликозильному остатку, который непосредственно или опосредованно (например, через гликозильный остаток) присоединен к аминокислоте.
В еще одном репрезентативном варианте изобретения пептид содержит группу формулы:
где AA представляет собой аминокислотный остаток указанного пептида, а в каждой из вышеуказанных структур D и G являются такими, как они были определены в описании настоящего изобретения.
Репрезентативным аминокислотным остатком пептида G-CSF, в котором одна или несколько вышеуказанных молекул могут быть конъюгированы, является серин и треонин, например треонин 133 SEQ ID NO:1.
В другом своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к конъюгату G-CSF, который включает гликозильный остаток, имеющий формулу:
где а, b, c, d, i, r, s, t и u независимо равны целым числам, выбранным из 0 и 1. Индекс q равен 1. Индексы е, f, g и h независимо равны целым числам, выбранным из целых чисел от 0 до 6. Индексы j, k, l и m равны целым числам, независимо выбранным из целых чисел от 0 до 100. Индексы v, w, x и y независимо равны числу, выбранному из 0 и 1, а, по меньшей мере, один из v, w, x и y равен 1. Символ AA означает аминокислотный остаток пептида G-CSF.
Символ Sia-(R) означает группу, имеющую формулу:
1
1
1
1
1
1
6
1
6
где D выбран из -ОН и R-L-HN. Символ G означает R-L- или -С(О)(С-С)алкил. R представляет собой группу, которая включает линейный или разветвленный остаток полиэтиленгликоля. L представляет собой линкер, который выбран из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила. В общих чертах, если D означает ОН, то G означает R-L, и если G означает -С(О)(С-С)алкил, то D означает R-L-NH-.
В другом репрезентативном варианте изобретения ПЭГ-модифицированный фрагмент сиаловой кислоты в конъюгате согласно изобретению имеет формулу:
где индекс “s” означает целое число от 0 до 20, а n равно целому числу от 1 до 2500. В предпочтительном варианте изобретения s равно 1, а м-ПЭГ-часть имеет молекулярную массу примерно 20 кД.
В еще одном репрезентативном варианте изобретения ПЭГ-модифицированная сиаловая кислота имеет формулу:
где L представляет собой замещенную или незамещенную алкильную или замещенную или незамещенную гетероалкильную линкерную группу, соединяющую молекулу сиаловой кислоты и молекулу ПЭГ.
В предпочтительном варианте изобретения, по меньшей мере, два, более предпочтительно, три, а еще более предпочтительно, четыре вышеупомянутых аспарагиновых остатка функционализированы вышеуказанной N-связанной гликановой цепью.
Конъюгаты согласно изобретению включают интактные гликозильные линкерные группы, которые являются одновалентными или поливалентными (например, “антенные” структуры). Так, например, конъюгаты согласно изобретению включают обе молекулы, в которых выбранная группа присоединена к пептиду посредством одновалентной гликозильной линкерной группы и поливалентной линкерной группы. Настоящее изобретение также включает конъюгаты, в которых более чем одна выбранная молекула присоединена к пептиду посредством поливалентной линкерной группы.
Модифицированные сахара
Настоящее изобретение относится к модифицированным сахарам, к модифицированным сахарсодержащим нуклеотидам и к конъюгатам модифицированных сахаров. В модифицированных сахарсодержащих соединениях согласно изобретению сахарная группа, предпочтительно, представляет собой сахарид, дезоксисахарид, аминосахарид или N-ацилсахарид. Термин “сахарид” и его эквиваленты, “сахарил”, “сахар” и “гликозил” означают мономеры, димеры, олигомеры и полимеры. Такая сахарная группа также функционализирована модифицирующей группой. Эта модифицирующая группа конъюгирована с сахарной группой, обычно, посредством конъюгирования с амином, сульфгидрилом или гидроксилом, например с первичным гидроксилом на указанном сахаре. В репрезентативном варианте изобретения модифицирующая группа присоединена к сахару посредством аминогруппы, например посредством амида, уретана или мочевины, которая образуется в результате реакции амина с реакционноспособным производным модифицирующей группы.
В качестве сахарного “остова” конъюгатов согласно изобретению может быть использован любой сахар. Репрезентативными сахарами, которые могут быть использованы для получения композиций согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, глюкоза, галактоза, манноза, фукоза и сиаловая кислота. Другими подходящими сахарами являются аминосахара, такие как глюкозамин, галактозамин, маннозамин, 5-аминовый аналог сиаловой кислоты и т.п. Указанный сахарный остов может иметь структуру, обнаруживаемую в природе, либо он может быть модифицирован с образованием сайта для конъюгирования с модифицирующей группой. Так, например, в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, содержащему производное сиаловой кислоты, в котором 9-гидроксигруппа заменена амином. Этот амин легко дериватизируется активированным аналогом выбранной модифицирующей группы.
В обсуждении настоящего изобретения проиллюстрировано использование выбранных производных сиаловой кислоты. Специалистам в данной области очевидно, что такое обсуждение приводится лишь в иллюстративных целях и что описанные здесь структуры и композиции, по существу, могут быть применены ко всем видам сахаридных групп, модифицированных сахаридных групп, активированных модифицированных сахаридных групп и конъюгатов модифицированных сахаридных групп.
В своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, содержащему амино-модифицированный сахар, имеющий формулу:
1
1
1
1
1
1
2
2
где G представляет собой гликозильную группу, L представляет собой связь или линкер, а R представляет собой модифицирующую группу. Репрезентативной связью является связь, которая образуется между NH на гликозильной части и группой с соответствующей реактивностью на модифицирующей группе. Таким образом, репрезентативными связями являются, но не ограничиваются ими, NHR, ОR, SR и т.п. Так, например, если R включает группу карбоновой кислоты, то эта группа может быть активирована и связана с группой NH- на гликозильном остатке с образованием связи, имеющей структуру NHC(O)R. Аналогичным образом, группы ОН и SH могут быть превращены в соответствующие эфирные или тиоэфирные производные соответственно.
1
Репрезентативными линкерами являются алкильные и гетероалкильные группы. Такими линкерами являются связывающие группы, например ацилсвязывающие группы, например -С(О)NH-, -ОС(О)NH- и т.п. Линкерные группы представляют собой связи, образованные между компонентами молекулы согласно изобретению, например, между гликозильной группой и линкером (L) или между линкером и модифицирующей группой (R). Другими линкерными группами являются эфиры, тиоэфиры и амины. Так, например, в одном из вариантов изобретения указанным линкером является аминокислотный остаток, такой как глициновый остаток. Группу карбоновой кислоты глицина превращают в соответствующий амид путем взаимодействия с амином на гликозильном остатке, а амин глицина превращают в соответствующий амид или уретан путем взаимодействия с активированной карбоновой кислотой или карбонатом модифицирующей группы.
1
1
Другим репрезентативным линкером является молекула ПЭГ или молекула ПЭГ, функционализированная аминокислотным остатком. Такой ПЭГ связан с гликозильной группой посредством аминокислотного остатка на одном конце ПЭГ и с R на другом конце ПЭГ. Альтернативно, этот аминокислотный остаток связан с R, а конец ПЭГ, не связанный с аминокислотой, присоединен к гликозильной группе.
1
Репрезентативная молекула NН-L-R имеет формулу:
2
а
s
2
b
2
2
с
2
d
t
2
1
s
t
а
b
d
с
-NН{С(О)(СН)NН}{С(О)(СН)(ОСНСН)О(СН)NH}R, где индексы  и  независимо равны 0 или 1. Индексы ,  и  независимо равны целым числам от 0 до 20, а  равно целому числу от 1 до 2500. Другие аналогичные линкеры получают на основе молекул, в которых группа -NН заменена, например, на -S, -О и -СН.
1
Более конкретно, настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, содержащему соединения, в которых NН-L-R представляет собой:
2
а
2
b
2
2
с
2
d
1
NНС(О)(СН)NНС(О)(СН)(ОСНСН)О(СН)NHR,
2
b
2
2
с
2
d
1
NНС(О)(СН)(ОСНСН)О(СН)NHR,
2
b
2
2
с
2
d
1
NНС(О)О(СН)(ОСНСН)О(СН)NHR,
2
а
2
b
2
2
с
2
d
2
а
1
1
NНС(СН)NНС(О)(СН)(ОСНСН)О(СН)NHR, NНС(О)(СН)NНR,
2
а
1
1
а, b
d
с
NН(СН)NНR и NНR. В этих формулах индексы  и  независимо выбраны из целых чисел от 0 до 20, а предпочтительно, от 1 до 5. Индекс  равен целому числу от 1 до 2500.
В иллюстративном варианте изобретения G представляет собой сиаловую кислоту, а выбранные соединения согласно изобретению имеют формулы:
Как очевидно для специалистов в данной области, молекула сиаловой кислоты в описанных выше репрезентативных соединениях может быть заменена любым другим аминосахаридом, включая, но не ограничиваясь ими, глюкозамин, галактозамин, маннозамин, их N-ацетильные производные и т.п.
В другом иллюстративном варианте изобретения первичная гидроксильная группа сахара функционализирована модифицирующей группой. Так, например, 9-гидроксил сиаловой кислоты может быть превращен в соответствующий амин и функционализирован с получением соединений согласно изобретению. Соединения согласно этому варианту изобретения имеют формулы:
В другом своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, содержащему модифицированные сахара, в которых гидроксигруппа в 6 положении превращена в соответствующую аминогруппу, несущую кластер “линкер - модифицирующая группа”, такой как кластер, описанный выше. Репрезентативными сахарными группами, которые могут быть использованы в качестве остова этих модифицированных сахаров, являются Gаl, GаlNac, Glc, GlcNac, Fuc, Xyl, Man и т.п. Репрезентативный модифицированный сахар согласно этому варианту изобретения имеет формулу:
3
5
7
6
1
1
1
3
3
где R-R и R представляют собой члены, независимо выбранные из Н, ОН, С(О)СН, NH и NHC(O)СН, а R представляет собой ОR, NHR или NH-L-R, определенные выше.
Выбранные конъюгаты согласно изобретению получены на основе маннозы, галактозы или глюкозы или на основе молекул, имеющих стереохимическую структуру маннозы, галактозы или глюкозы.
Эти конъюгаты имеют общие формулы:
В другом своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к описанным выше соединениям, которые были активированы в виде соответствующих сахаров, содержащихся в нуклеотидах. Репрезентативными сахарсодержащими нуклеотидами, используемыми в настоящем изобретении в их модифицированной форме, являются моно-, ди- или трифосфаты нуклеотидов или их аналоги. В предпочтительном варианте изобретения модифицированный сахарсодержащий нуклеотид выбран из УДФ-глюкозы, ЦМФ-гликозида или ГДФ-гликозида. Еще более предпочтительно, чтобы сахарная часть модифицированного сахарсодержащего нуклеотида была выбрана из УДФ-галактозы, УДФ-галактозамина, УДФ-глюкозы, УДФ-глюкозамина, ГДФ-маннозы, ГДФ-фукозы, ЦМФ-сиаловой кислоты или ЦМФ-NeuAc. В репрезентативном варианте изобретения фосфат нуклеотида присоединен к С-1.
Таким образом, в своем иллюстративном варианте, где гликозильная группа представляет собой сиаловую кислоту, настоящее изобретение относится к пептидным конъюгатам, которые были получены с использованием соединений, имеющих формулы:
1
1
1
где L-R имеет значения, определенные выше, а L-R представляет собой линкер, связанный с модифицирующей группой. Как и в случае L, репрезентативная линкерная молекула в соответствии с L включает связь, алкильные или гетероалкильные группы. Репрезентативные нуклеотидные соединения, содержащие модифицированный сахар согласно этим вариантам изобретения, представлены на фиг.1 и фиг.2.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к конъюгату, образованному модифицированным сахаром согласно изобретению и субстратом, например пептидом, липидом, агликоном и т.п., а более конкретно, модифицированным сахаром и гликозильным остатком гликопетида или гликолипида. В этом варианте изобретения сахарная часть указанного модифицированного сахара становится гликозильной линкерной группой, расположенной между субстратом и модифицирующей группой. Репрезентативной гликозильной линкерной группой является интактная гликозильная линкерная группа, в которой гликозильная часть или части, образующие линкерную группу, не расщепляются под действием химических (например, под действием метапериодата натрия) или ферментативных (например, оксидазных) реакций. Выбранные конъюгаты согласно изобретению включают модифицирующую группу, которая присоединена к аминогруппе аминосахарида, например маннозамина, глюкозамина, галактозамина, сиаловой кислоты и т.п. Репрезентативный кластер “модифицирующая группа - интактная гликозильная линкерная группа” согласно этому варианту получен на основе структуры сиаловой кислоты, такой как структура, имеющая формулы:
1
1
2
где, в вышеуказанной формуле, R, L и L имеют значения, указанные выше.
В еще одном репрезентативном варианте изобретения конъюгат был образован субстратом и сахарной группой в 1 положении, и в этом конъюгате модифицирующая группа присоединена посредством линкера у атома углерода в 6 положении сахарной группы. Таким образом, иллюстративные конъюгаты согласно этому варианту изобретения имеют формулы:
где указанные радикалы являются такими, как они были описаны выше. Для специалистов в данной области очевидно, что модифицированные сахарные группы, представленные выше, могут быть также конъюгированы с субстратом у атомов углерода в положениях 2, 3, 4 или 5.
Иллюстративные соединения согласно этому варианту изобретения имеют формулы:
где группы R и индексы являются такими, как они определены выше.
1
Настоящее изобретение также относится к сахарсодержащим нуклеотидам, модифицированным группой L-R у атома углерода в 6 положении. Примером такой молекулы согласно этому варианту изобретения является:
где группы R и L представляют собой группы, обсуждаемые выше. Индекс “у” равен 0, 1 или 2.
Другой репрезентативный сахарсодержащий нуклеотид согласно изобретению имеет в своей основе стереохимическую структуру ГДФ-маннозы. Репрезентативная молекула согласно этому варианту изобретения имеет структуру:
В еще одном своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к конъюгату, основанному на стереохимической структуре УДФ-галактозы. Репрезентативное соединение согласно этому варианту изобретения имеет структуру:
В другом репрезентативном варианте изобретения сахарсодержащий нуклеотид имеет в своей основе стереохимическую структуру глюкозы. Репрезентативная молекула согласно этому варианту изобретения имеет формулы:
1
Модифицирующая группа R представляет собой любую группу, включая, но не ограничиваясь ими, водорастворимые полимеры, не растворимые в воде полимеры, терапевтические агенты, диагностические агенты и т.п. Природа репрезентативных модифицирующих групп более подробно обсуждается ниже.
Модифицирующие группы
Водорастворимые полимеры
Многие водорастворимые полимеры известны специалистам и могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения. Термин “водорастворимый” полимер охватывает такие молекулы, как сахариды (например, декстран, амилозу, гиалуроновую кислоту, полисиаловую кислоту, гепараны, гепарины и т.п.); полиаминокислоты, например полиаспарагиновую кислоту и полиглутаминовую кислоту; нуклеиновые кислоты; синтетические полимеры, например полиакриловую кислоту, полиэфиры, например полиэтиленгликоль; пептиды, белки и т.п. Настоящее изобретение может быть осуществлено с применением любого водорастворимого полимера, однако с одним лишь условием, что такой полимер должен иметь положение, у которого может быть присоединена остальная часть конъюгата.
Описание методов активации полимеров можно также найти в WO 94/17039, в патенте США № 5324844, в WO 94/18247, в WO 94/04193, в патенте США № 5219564, в патенте США № 5122614, в WO 90/13540, в патенте США № 5281698, а также в WO 93/15189, и в литературе также описаны методы конъюгирования активированных полимеров с пептидами, например фактором свертывания крови VIII (WO 94/15625), гемоглобином (WO 94/09027), молекулой, несущей кислород (патент США № 4412989), рибонуклеазой и супероксид-дисмутазой (Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11:141-45 (1985)).
Предпочтительными водорастворимыми полимерами являются полимеры, в которых основная часть полимерных молекул в образце полимера имеет приблизительно идентичную молекулярную массу, и такие полимеры называются “гомодисперсными”.
Настоящее изобретение также проиллюстрировано на конъюгате полиэтиленгликоля. Существует ряд статей и монографий, в которых описаны функционализация и конъюгирование ПЭГ. См., например, Harris, Macronol. Chem. Phys. C25:325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135:30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14:866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6:150-165 (1995) and Bhadra et al., Pharmazie, 57:5-29 (2002). Методы получения реакционноспособных молекул ПЭГ и конъюгатов с использованием таких реакционноспособных молекул известны специалистам. Так, например, в патенте США № 5672662 описан водорастворимый и выделяемый конъюгат активного сложного эфира полимерной кислоты, выбранной из линейных или разветвленных полиалкиленоксидов, полиоксиэтилированных полиолов, полиолефиновых спиртов и полиакриломорфолина.
В патенте США № 6376604 описан метод получения водорастворимого сложного эфира 1-бензотриазолилкарбоновой кислоты водорастворимого и непептидного полимера путем взаимодействия концевого гидроксила данного полимера с ди(1-бензотриазолил)карбонатом в органическом растворителе. Активный сложный эфир используется для получения конъюгатов с биологически активным агентом, таким как белок или пептид.
В WO 99/45964 описан конъюгат, содержащий биологически активный агент и активированный водорастворимый полимер, включающий полимерный остов, который, по меньшей мере, у одного своего конца связан с другим полимерным остовом посредством стабильной связи, где, по меньшей мере, один конец содержит разветвляющую группу, имеющую проксимальные реакционноспособные группы, присоединенные к такой разветвляющей группе, и где указанный биологически активный агент связан, по меньшей мере, с одной из проксимальных реакционноспособных групп. Другие разветвленные полиэтиленгликоли описаны в WO 96/21469. В патенте США № 5932462 описан конъюгат, образованный разветвленной молекулой ПЭГ, которая имеет разветвленный конец, содержащий реакционноспособные функциональные группы. Свободные реакционноспособные группы могут реагировать с биологически активной молекулой, такой как белок или пептид, с образованием конъюгатов полиэтиленгликоля и биологически активной молекулы. В патенте США № 5446090 описан бифункциональный линкер ПЭГ, и описано его использование для получения конъюгатов, содержащих пептид на каждом конце линкера ПЭГ.
Конъюгаты, включающие разлагаемые ПЭГ-связи, описаны в WO 99/34883 и в WO 99/14259, а также в патенте США № 6348558. Такие разлагаемые линкеры могут быть использованы в настоящем изобретении.
Хорошо известные методы активации полимеров, описанные выше, используются в контексте изобретения для получения описанных здесь разветвленных полимеров, а также для конъюгирования этих разветвленных полимеров с другими молекулами, например сахарами, сахарсодержащими нуклеотидами и т.п.
Репрезентативными молекулами полиэтиленгликоля, используемыми в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, молекулы, имеющие формулу:
8
1
1
9
1
1
10
1
1
11
12
9
10
11
12
2
2
2
q
2
q
2
q
2
2
p
2
р
2
s
v
2
где R представляет собой Н, ОН, NH, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, например ацеталь, -ОНС-, HN-(СН)-, HS-(СН) или -(СН)С(Y)Z. Индекс “е” равен целому числу от 1 до 2500. Индексы b, d и q независимо равны целым числам от 0 до 20. Символы Z и Z независимо представляют собой ОН, NH, удаляемые группы, например имидазол, п-нитрофенил, НОВТ, тетразол, галогенид, -S-R, спиртовую часть активированных сложных эфиров; -(СН)С(Y)V или -(СН)U(СН)C(Y). Символ Y представляет собой Н(2), =О, =S, =N-R. Символы X, Y, Y, A и U независимо представляют собой О, S, N-R. Символ V представляет собой ОН, NH, галоген, S-R, спиртовой компонент активированных сложных эфиров, аминовый компонент активированных амидов, сахарсодержащих нуклеотидов и белков. Индексы p, q, s и v равны целым числам, независимо выбранным из 0-20. Символы R, R, R и R независимо представляют собой Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил и замещенный или незамещенный гетероарил.
В других репрезентативных вариантах изобретения молекула полиэтиленгликоля выбрана из:
Полиэтиленгликоль, используемый для получения конъюгата согласно изобретению, является либо линейным, либо разветвленным. Разветвленными молекулами полиэтиленгликоля, подходящими для использования в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, молекулы формулы:
8
8
8
1
2
1
1
1
где R и R' независимо выбраны из групп, определенных выше для R. А и А независимо выбраны из групп, определенных выше для А. Индексы е, f, o и q определены выше. Z и Y также определены выше. Х и Х' независимо выбраны из S, SС(О)NН, НNC(O)S, SC(O)O, O, NH, NHC(O), (O)CNH, NHC(O)O и ОС(О)NН.
В других репрезентативных вариантах изобретения разветвленный ПЭГ получают на основе цистеинового, серинового или дилизинового остова. Так, например, другими репрезентативными разветвленными ПЭГ являются:
В другом варианте изобретения разветвленная молекула ПЭГ основана на пептиде, содержащем трилизин. Такой трилизин может быть моно-, ди-, три- или тетраПЭГилированным. Репрезентативные молекулы согласно этому варианту изобретения имеют формулы:
где е, f и f' независимо выбраны из целых чисел от 1 до 2500, а q, q' и q” независимо выбраны из целых чисел от 1 до 20.
2
В репрезентативных вариантах изобретения ПЭГ представляет собой м-ПЭГ (5 кД, 10 кД или 20 кД). Репрезентативным разветвленным ПЭГ является серин- или цистеин-(м-ПЭГ), где м-ПЭГ имеет массу 20 кД.
Как очевидно специалистам, разветвленные полимеры, используемые в настоящем изобретении, включают варианты молекул, описанных выше. Так, например, описанный выше конъюгат “дилизин - ПЭГ” может включать три полимерных субъединицы, где третья субъединица, связанная с α-амином, показана в вышеприведенной структуре как немодифицированная. Аналогичным образом, использование в данном полимере трех лизинов, функционализированных тремя или четырьмя полимерными субъединицами, входит в объем настоящего изобретения.
Конкретными вариантами настоящего изобретения являются:
и их карбонаты и активные сложные эфиры, такие как:
Другими активирующими или удаляемыми группами, подходящими для активации линейных ПЭГ, используемых для получения описанных здесь соединений, являются, но не ограничиваются ими, следующие группы:
Молекулы ПЭГ, которые активируются этими и другими молекулами, и методы получения активированных ПЭГ описаны в WO 04/083259.
2
2
10
Специалистам в данной области очевидно, что одна или несколько ветвей м-ПЭГ разветвленного полимера могут быть заменены ПЭГ-частью с различными концами, например с ОН, СООН, NH, С-Салкилом и т.п. Кроме того, вышеуказанные структуры могут быть легко модифицированы путем встраивания алкильных линкеров (или удаления атомов углерода) между α-углеродным атомом и функциональной группой боковой цепи. Таким образом, “гомо”-производные и высшие гомологи, а также низшие гомологи входят в объем остовов для разветвленных ПЭГ, используемых в настоящем изобретении.
Представленные здесь разветвленные молекулы ПЭГ могут быть легко получены методами, проиллюстрированными в нижеследующей схеме:
а
где Х представляет собой О или S, а r равно целому числу от 1 до 5. Индексы е и f независимо выбраны из целых чисел от 1 до 2500.
а
in situ
Таким образом, в соответствии с этой схемой природную или неприродную аминокислоту подвергают контакту с активированным производным м-ПЭГ, в данном случае с тозилатом, в результате чего путем алкилирования гетероатома Х боковой цепи получают соединение 1. Монофункционализированную аминокислоту м-ПЭГ подвергают N-ацилированию реакционноспособным производным м-ПЭГ, в результате чего получают разветвленный м-ПЭГ 2. Для специалистов в данной области очевидно, что удаляемая группа тозилата может быть заменена любой подходящей удаляемой группой, например галогеном, мезилатом, трифлатом и т.п. Аналогичным образом, реакционноспособный карбонат, используемый для ацилирования амина, может быть заменен активным сложным эфиром, например N-гидроксисукцинимидом и т.п., либо кислота может быть активирована  c использованием дегидратирующего агента, такого как дициклогексилкарбодиимид, карбонилдиимидазол и т.п.
В репрезентативном варианте изобретения указанной модифицирующей группой является группа ПЭГ, однако любая модифицирующая группа, например водорастворимый полимер, не растворяющийся в воде полимер, терапевтическая молекула и т.п., может быть включена в гликозильную часть посредством соответствующей связи. Модифицированный сахар получают ферментативными методами, химическими методами или их комбинацией. В репрезентативном варианте изобретения сахара подвергают реакции замещения с активным амином в любом положении, что позволяет присоединять модифицирующую группу, а также позволяет использовать сахар в качестве субстрата для фермента, способного присоединять модифицированный сахар к пептиду G-CSF. В репрезентативном варианте изобретения, если галактозамин представляет собой модифицированный сахар, то аминовая часть присоединяется у атома углерода в 6 положении.
Молекулы, модифицированные водорастворимым полимером
В настоящем изобретении используются молекулы сахаров нуклеотидов, модифицированных водорастворимым полимером, в которых сахарная группа модифицирована указанным водорастворимым полимером. Репрезентативный модифицированный сахарсодержащий нуклеотид несет сахарную группу, модифицированную аминогруппой на указанном сахаре. В способах согласно изобретению могут быть также использованы модифицированные сахарсодержащие нуклеотиды, например сахариламиновые производные сахарсодержащего нуклеотида. Так, например, сахариламин (без модифицирующей группы) может быть ферментативно конъюгирован с пептидом (или с другой молекулой), а затем свободная сахариламиногруппа может быть конъюгирована с нужной модифицирующей группой. Альтернативно, модифицированный сахарсодержащий нуклеотид может функционировать как субстрат для фермента, который переносит модифицированный сахар на сахарный рецептор на субстрате, например на пептиде, гликопептиде, липиде, агликоне, гликолипиде и т.п.
5
В одном из вариантов изобретения, в котором сахаридным остовом является галактоза или глюкоза, R представляет собой NHC(O)Y.
В репрезентативном варианте изобретения модифицированный сахар получают на основе 6-амино-N-ацетилгликозильной молекулы. Как показано ниже для N-ацетилгалактозамина, 6-аминосахарная молекула может быть легко получена стандартными методами.
В вышеуказанной схеме индекс n означает целое число от 1 до 2500, предпочтительно, от 10 до 1500, а более предпочтительно от 10 до 1200. Символ “А” означает активирующую группу, например галоген, компонент активированного сложного эфира (например, N-гидроксисукцинимидоэфир), компонент карбоната (например, п-нитрофенилкарбоната) и т.п. Для специалистов в данной области очевидно, что этими и аналогичными методами могут быть легко получены и другие сахара нуклеотидов, модифицированных ПЭГ-амидом.
В других репрезентативных вариантах изобретения амидная группа заменена такой группой, как уретан или мочевина.
1
В других вариантах изобретения R представляет собой разветвленный ПЭГ, один из которых, например, описан выше. Иллюстративными соединениями согласно этому варианту изобретения являются
4
где Х означает связь или О.
Кроме того, как обсуждается выше, настоящее изобретение относится к пептидным конъюгатам, полученным с использованием сахарсодержащих нуклеотидов, модифицированных водорастворимым полимером, который имеет либо линейную, либо разветвленную цепь. Так, например, в объем настоящего изобретения входят соединения, имеющие формулы, представленные ниже:
4
где Х означает О или связь.
Аналогичным образом, настоящее изобретение относится к пептидным конъюгатам, полученным с использованием сахарсодержащих нуклеотидов, имеющих молекулу модифицированного сахара, в которой атом углерода в 6 положении является модифицированным:
4
где Х означает связь или О.
Настоящее изобретение также относится к конъюгатам пептидов и гликопептидов, липидов и гликолипидов, которые включают композиции настоящего изобретения. Так, например, настоящее изобретение относится к конъюгатам, имеющим нижеследующие формулы:
Полимеры, нерастворимые в воде
В другом варианте изобретения, аналогичном вариантам, обсуждаемым выше, модифицированные сахара включают вместо водорастворимого полимера полимер, не растворяющийся в воде. Конъюгаты согласно изобретению могут также включать одни или несколько не растворимых в воде полимеров. Этот вариант изобретения проиллюстрирован на примере применения конъюгата в качестве носителя, который обеспечивает регулируемую доставку терапевтического пептида. Системы доставки конъюгированных с полимером лекарственных средств известны специалистам. См., например, Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol.469, American Chemical Society, Washington, DC. 1991. Для специалистов в данной области очевидно, что к конъюгатам согласно изобретению может быть применена, по существу, любая известная система доставки лекарственного средства.
Репрезентативными не растворимыми в воде полимерами являются, но не ограничиваются ими, полифосфазины, поливилиновые спирты, полиамиды, поликарбонаты, полиалкилены, полиакриламиды, полиалкиленгликоли, полиалкиленоксиды, полиалкилентерефталаты, поливиниловые простые эфиры, поливиниловые сложные эфиры, поливинилгалогениды, поливинилпирролидон, полигликоли, полисилоксаны, полиуретаны, полиметилметакрилат, полиэтилметакрилат, полибутилметакрилат, полиизобутилметакрилат, полигексилметакрилат, полиизодецилметакрилат, полилаурилметакрилат, полифенилметакрилат, полиметилакрилат, полиизопропилакрилат, полиизобутилакрилат, полиоктадецилакрилат, полиэтилен, полипропилен, полиэтиленгликоль, полиэтиленоксид, полиэтилентерефталат, поливинилацетат, поливинилхлорид, полистирол, поливинилпирролидон, плюроники и поливинилфенол и их сополимеры.
Синтетически модифицированными природными полимерами, подходящими для использования в конъюгатах согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, алкилцеллюлозы, гидроксиалкилцеллюлозы, простые эфиры целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы и нитроцеллюлоза. Особенно предпочтительными членами широкого класса синтетически модифицированных природных полимеров являются, но не ограничиваются ими, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксибутилметилцеллюлоза, ацетат целлюлозы, пропионат целлюлозы, ацетат-бутират целлюлозы, ацетат-фталат целлюлозы, карбоксиметилцеллюлоза, триацетат целлюлозы, натриевая соль сульфата целлюлозы и полимеры сложных эфиров акриловой и метакриловой кислоты и альгиновой кислоты.
Эти и другие обсуждаемые здесь полимеры могут быть легко получены из коммерчески доступных источников, таких как Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), Polysciences (Warrenton, PA), Aldrich (Milwaukee, WI), Fluka (Ronkonkoma, NY) и BioRad (Richmond, CA), или они могут быть синтезированы стандартными методами из мономеров, закупленных у этих поставщиков.
Репрезентативными биологически разлагаемыми полимерами, используемыми в конъюгатах согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, полилактиды, полигликолиды и их сополимеры, полиэтилентерефталат, полимасляная кислота, поливалериановая кислота, сополимер лактида и капролактона, сополимер лактида и гликолида, полиангидриды, полиортоэфиры, их смеси и сополимеры. Особенно подходящими являются композиции, образующие гели, такие как гели, включающие коллаген, плюроники и т.п.
Полимерами, используемыми в настоящем изобретении, являются “гибридные” полимеры, которые включают нерастворимые в воде материалы, содержащие, по меньшей мере, в части своей структуры биологически ресорбируемую молекулу. Примером такого полимера является полимер, который представляет собой нерастворимый в воде сополимер, имеющий биологически ресорбируемую область, гидрофильную область и множество перекрестносшиваемых функциональных групп на одну полимерную цепь.
В соответствии с настоящим изобретением термин “нерастворимые в воде материалы” включают материалы, которые, по существу, не растворяются в воде или в водных средах. Таким образом, хотя некоторые области или сегменты сополимера могут быть гидрофильными или даже водорастворимыми, однако, в целом, такая полимерная молекула, по существу, не растворяется в воде.
В соответствии с настоящим изобретением термин “биологически ресорбируемая молекула” включает область, способную подвергаться метаболизму или разлагаться в организме и ресорбироваться и/или элиминироваться этим организмом по обычным экскреторным путям. Предпочтительно, чтобы такие метаболиты или продукты распада были, в основном, нетоксичными для организма.
Биологически ресорбируемая область может быть либо гидрофобной, либо гидрофильной, при условии, что сополимерная композиция, в целом, не является водорастворимой. Так, например, биологически ресорбируемую область выбирают, предпочтительно, так, чтобы данный полимер, в целом, оставался не растворимым в воде. В соответствии с этим относительные свойства, то есть тип функциональных групп, содержащихся в указанной биологически ресорбируемой области, и относительное содержание биологически ресорбируемой области и гидрофильной области выбирают так, чтобы используемые биологически ресорбируемые композиции оставались не растворимыми в воде.
Репрезентативными ресорбируемыми полимерами являются, например, синтетически продуцируемые ресорбируемые блок-сополимеры поли(α-гидрокси-карбоновая кислота)/поли(оксиалкилен)(см. Cohn et al., патент США № 4826945). Эти сополимеры не являются сшитыми, но являются водорастворимыми, а поэтому расщепленные блок-сополимерные композиции могут выводиться из организма. См. Younes et al., J. Biomed. Mater. Res. 21:1301-1316 (1987) и Cohn et al., J. Biomed. Mater. Res. 22:993-1009 (1988).
Предпочтительными биологически ресорбируемыми полимерами согласно изобретению являются один или несколько компонентов, выбранных из полиэфиров, полиоксикислот, полилактонов, полиамидов, полиэфироамидов, полиаминокислот, полиангидридов, полиортоэфиров, поликарбонатов, полифосфазинов, полифосфоэфиров, политиоэфиров, полисахаридов и их смесей. Еще более предпочтительно, чтобы биологически ресорбируемый полимер включал компонент полиоксикислоту. Из этих полиоксикислот предпочтительными являются полимолочная кислота, полигликолевая кислота, поликапроновая кислота, полимасляная кислота, поливалериановая кислота и их сополимеры и смеси.
in vivo
Предпочтительные полимерные покрытия, используемые в способах согласно изобретению, помимо того, что они образуют фрагменты, которые абсорбируются  (“биологически ресорбируются”), могут также образовывать и экскретируемые и/или подвергающиеся метаболизму фрагменты.
В настоящем изобретении могут быть также использованы сополимеры высшего порядка. Так, например, в патенте США № 4438253, выданном 20 марта 1984, Casey et al., описаны трехкомпонентные блок-сополимеры, полученные из полигликолевой кислоты и гидроксиконцевого полиалкиленгликоля путем переэтерификации. Эти описанные композиции предназначены для использования в качестве ресорбируемых моноволокнистых шовных материалов. Эластичность таких композиций регулируется введением ароматического ортокарбоната, такого как тетра-п-толилортокарбонат, в структуру сополимера.
Могут быть также использованы и другие полимеры, полученные на основе молочной и/или гликолевой кислот. Так, например, в патенте США № 5202413, выданном 13 апреля 1993, Spinu, описаны биологически разлагаемые многокомпонентные блок-сополимеры, содержащие последовательно расположенные блоки полилактида и/или полигликолида, продуцированные путем полимеризации с раскрытием кольца из лактида и/или гликолида с образованием либо олигомерного диола, либо диаминового остатка и последующего удлинения цепи с помощью бифункционального соединения, такого как диизоцианат, диацилхлорид или дихлорсилан.
Биологически ресорбируемые области полимерных покрытий, используемых в настоящем изобретении, могут быть сконструированы так, чтобы они были гидролитически и/или ферментативно расщепляемыми. В соответствии с настоящим изобретением термин “гидролитически расщепляемый” относится к восприимчивости данного сополимера, а особенно биологически ресорбируемой области, к гидролизу в воде или в водной среде. Аналогичным образом, используемый здесь термин “ферментативно расщепляемый” относится к восприимчивости сополимера, а особенно биологически ресорбируемой области, к расщеплению эндогенными или экзогенными ферментами.
При введении в организм гидрофильная область может процессироваться с образованием экскретируемых и/или подвергающихся метаболизму фрагментов. Таким образом, гидрофильная область может включать, например, полиэфиры, полиалкиленоксиды, полиолы, поливинилпирролидин, поливиниловый спирт, полиалкилоксазолины, полисахариды, углеводы, пептиды, белки и их сополимеры и смеси. Кроме того, гидрофильной областью может быть также, например, полиалкиленоксид. Такими полиалкиленоксидами могут быть, например, полиэтиленоксид, полипропиленоксид и их смеси и сополимеры.
В настоящем изобретении могут быть также использованы полимеры, которые являются компонентами гидрогелей. Гидрогели представляют собой полимерные материалы, способные абсорбировать относительно большое количество воды. Примерами гидрогельобразующих соединений являются, но не ограничиваются ими, полиакриловые кислоты, натрийсодержащая карбоксиметилцеллюлоза, поливиниловый спирт, поливинилпирролидин, желатин, карагенан и другие полисахариды, гидроксиэтиленметакриловая кислота (НЕМА), а также их производные и т.п. Могут быть получены гидрогели, которые являются стабильными, биологически разлагаемыми и биологически ресорбируемыми. Кроме того, гидрогелевые композиции могут включать субъединицы, обладающие одним или несколькими из указанных свойств.
Macromolecules
Биологически совместимые гидрогелевые композиции, целостность которых может регулироваться посредством образования поперечных связей (сшивания), являются известными и предпочтительными для использования в способах согласно изобретению. Так, например, в патенте США № 5410016, выданном 25 апреля 1995, и в патенте США № 5529914, выданном 25 июня 1996, Hubbell et al., описаны водорастворимые системы, которые представляют собой сшитые блок-сополимеры, имеющие водорастворимый центральный блок-сегмент, расположенный по типу “сэндвича” между двумя гидролитически лабильными удлиняющими сегментами. Такие сополимеры “кэпированы” по концу фотополимеризуемыми акрилатными функциональными группами. При сшивании такие системы образуют гидрогели. Водорастворимый центральный блок таких сополимеров может включать полиэтиленгликоль, тогда как гидролитически активные удлиняющие фрагменты могут представлять собой поли-α-гидроксикислоту, такую как полигликолевая или полимолочная кислота. См. Sawhney et al.,  26:581-587 (1993).
В другом предпочтительном варианте изобретения указанным гелем является термообратимый гель. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными являются термообратимые гели, включающие такие компоненты, как плюроники, коллаген, желатин, гиалуроновая кислота, полисахариды, полиуретановый гидрогель, гидрогель, состоящий из полиуретана-мочевины, и их комбинации.
В еще одном репрезентативном варианте изобретения конъюгат согласно изобретению включает такой компонент, как липосомы. Липосомы могут быть получены методами, известными специалистам, например, как описано Eppstein et al. в патенте США № 4522811, выданном 11 июня 1985. Так, например, липосомные композиции могут быть получены путем растворения соответствующего липида(ов) (такого, как стеароилфосфотидилэтаноламин, стеароилфосфатидилхолин, араходоилфосфатидилхолин и холестерин) в неорганическом растворителе, который затем выпаривают, после чего на поверхности сосуда остается тонкая пленка из сухого липида. Затем в этот сосуд вводят водный раствор активного соединения или его фармацевтически приемлемой соли. После этого содержимое сосуда встряхивают вручную для отделения липидного материала от боковых стенок сосуда и для диспергирования липидных агрегатов, в результате чего получают липосомную суспензию.
Вышеупомянутые микрочастицы и способы получения таких микрочастиц описаны здесь в качестве примеров и не должны рассматриваться как ограничение объема микрочастиц, используемых в настоящем изобретении. Для специалистов в данной области очевидно, что в настоящем изобретении может быть использован набор микрочастиц, полученных различными способами.
Структурные формы, обсуждаемые выше в связи с водорастворимыми полимерами, имеющими как линейную, так и разветвленную цепь, в общих чертах, могут быть применимы также и к полимерам, которые не растворяются в воде. Так, например, разветвленные остовы, состоящие из цистеина, серина, двух лизинов и трех лизинов, могут быть функционализированы двумя не растворимыми в воде полимерными молекулами. Методы, используемые для продуцирования таких полимеров, по существу, аналогичны методам, используемым для получения водорастворимых полимеров.
in vivo
in vivo
in vivo
in vivo
2
Время полужизни терапевтических гликопептидов  может быть также увеличено с использованием ПЭГ-молекул, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Так, например, химическая модификация белков с помощью ПЭГ (ПЭГилирование) приводит к увеличению размера молекул и к снижению доступности их поверхности и функциональных групп, где каждое из этих свойств зависит от размера ПЭГ, присоединенного к белку. Это способствует увеличению времени полужизни этих белков в плазме и устойчивости к протеолизу, а также снижению уровней иммуногенности и поглощения печенью (Chaffee et al., J. Clin. Invest. 89:1643-1651 (1992); Pyatak et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 29:113-127 (1980)). Сообщалось, что ПЭГилирование интерлейкина-2 повышает его противоопухолевую эффективность  (Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:1487-1491 (1987)), а ПЭГилирование фрагмента F(ab'), происходящего от моноклонального антитела А7, способствует улучшению его локализации в опухоли (Kitamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 28:1387-1394 (1990)). Таким образом, в другом предпочтительном варианте изобретения время полужизни  пептида, дериватизированного молекулой ПЭГ способом согласно изобретению, увеличивается по сравнению с временем полужизни  недериватизированного пептида.
in vivo
Увеличение времени полужизни пептида  лучше всего выражать как интервал процента увеличения его количества. Нижний конец указанного интервала процента увеличения составляет примерно 40%, примерно 60%, примерно 80%, примерно 100%, примерно 150% или примерно 200%. Верхний конец такого интервала составляет примерно 60%, примерно 80%, примерно 100%, примерно 150% или более чем примерно 250%.
В своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к ПЭГилированному FSH (фиг.1, фиг.2 и фиг.5).
Способы
Помимо обсуждаемых выше конъюгатов, настоящее изобретение относится к способам получения этих и других конъюгатов. Так, например, в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ковалентного конъюгата, состоящего из выбранного фрагмента и пептида G-CSF. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам доставки конъюгатов согласно изобретению в конкретную ткань или область организма.
В репрезентативных вариантах изобретения указанный конъюгат образован молекулой ПЭГ (или ферментативно переносимой гликозильной частью, содержащей молекулу ПЭГ) и гликозилированным или негликозилированным пептидом. ПЭГ конъюгирован с пептидом G-CSF посредством интактной гликозильной линкерной группы, которая располагается между ними, и ковалентно связан с пептидом G-CSF и с группой ПЭГ или с конструкцией “ПЭГ-негликозильный линкер” (таким линкером является, например, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил). Данный способ включает контактирование пептида G-CSF со смесью, содержащей модифицированный сахар и гликозилтрансферазу, для которой субстратом является указанный модифицированный сахар. Указанную реакцию проводят в условиях, достаточных для образования ковалентной связи между модифицированным сахаром и пептидом G-CSF. Сахарную часть модифицированного сахара предпочтительно выбирают из сахарсодержащих нуклеотидов, активированных сахаров и сахаров, которые не являются компонентами нуклеотидов и не являются активированными.
de novo
E.coli
Пептид-акцептор (гликозилированный или негликозилированный) обычно синтезируется  или рекомбинантно экспрессируется в прокариотических клетках (например, в бактериальных клетках, таких как ) или в эукариотических клетках, таких как клетки млекопитающих, дрожжей, насекомых, грибов или растений. Пептидом G-CSF может быть либо полноразмерный белок, либо его фрагмент. Кроме того, пептидом G-CSF может быть пептид дикого типа или мутированный пептид. В репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF включает мутацию, которая добавляет один или несколько сайтов N- или О-связанного гликозилирования в пептидную последовательность.
В репрезентативном варианте изобретения фактор IX подвергают О-гликозилированию и функционализации водорастворимым полимером в соответствии с методом, описанным ниже. Пептид продуцируют либо с использованием доступного сайта гликозилирования аминокислот, либо, если он является гликозилированным, то гликозильную часть “обрезают” для обеспечения доступности аминокислоты. Так, например, серин или треонин подвергают α-1-N-ацетиламино-галактозилированию (GalNAc), а NAc-галактозилированный пептид подвергают сиалилированию путем взаимодействия с кластером “сиаловая кислота - модифицирующая группа” с использованием ST6GalNAcT1. Альтернативно, NAc-галактозилированный пептид подвергают галактозилированию с использованием части “остов - 1-GalT-1” и полученный продукт подвергают сиалилированию путем взаимодействия с кластером “сиаловая кислота - модифицирующая группа” с использованием ST3GalT1. Репрезентативный конъюгат, полученный этим способом, имеет следующие связи: Thr-α-1-GalNAc-β-1,3-Gal-α2,3-Sia*, где Sia* означает кластер “сиаловая кислота - модифицирующая группа”.
В способах согласно изобретению, например, описанных выше и осуществляемых с использованием множества ферментов и сахарных доноров, отдельные стадии гликозилирования могут быть проведены отдельно или в комбинации с реакций “в одном сосуде”. Так, например, в реакции с участием трех ферментов, описанных выше, GalNAc-трансфераза, GalТ и SiaT и их доноры могут быть объединены в одном сосуде. Альтернативно, реакция GalNac может быть проведена отдельно с последующим добавлением GalТ и SiaT и соответствующих сахарных доноров в одну стадию. Другой способ проведения реакции включает последовательное добавление фермента и соответствующего донора и осуществление реакции в одном сосуде. Для получения соединений согласно изобретению могут быть использованы комбинации каждого из вышеописанных способов.
В конъюгатах согласно изобретению, а в частности гликопэгилированных N-связанных гликанов, кластер “Sia-модифицирующая группа” может быть присоединен к Gal в положении α-2,6- или α-2,3-связи.
Способ согласно изобретению также включает модификацию неполностью гликозилированных пептидов, продуцируемых рекомбинантными методами. В способе согласно изобретению, проводимом с использованием модифицированного сахара, пептид G-CSF может быть затем одновременно гликозилирован и дериватизирован, например, молекулой ПЭГ, терапевтическим агентом или т.п. Сахарной частью модифицированного сахара может быть остаток, который должен быть соответствующим образом конъюгирован с акцептором в полностью гликозилированном пептиде, или другая сахарная часть с нужными свойствами.
Пептиды G-CSF, модифицированные методами согласно изобретению, могут быть синтетическими пептидами или пептидами дикого типа, продуцированными известными методами, такими как сайт-направленный мутагенез. Гликозилирование пептидов обычно бывает либо N-связанным, либо О-связанным. Примером N-связывания является присоединение модифицированного сахара к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности “аспарагин-Х-серин” и “аспарагин-Х-треонин”, где Х представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, представляют собой последовательности, распознаваемые ферментом для присоединения углеводной части к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде приводит к образованию потенциального сайта гликозилирования. О-связанное гликозилирование означает присоединение одного сахара (например, N-ацетилгалактозамина, галактозы, маннозы, GlсNAc, глюкозы, фукозы или ксилозы) к боковой гидроксицепи гидроксиаминокислоты, предпочтительно серина или треонина, хотя может быть также использован и 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Так, например, в одном из вариантов изобретения G-CSF экспрессируют в системе млекопитающих и модифицируют путем обработки сиалидазой для удаления концевых остатков сиаловой кислоты с последующим ПЭГилированием с использованием SТ3Gal3 и донорной ПЭГ-сиаловой кислоты.
В другом репрезентативном варианте изобретения G-CSF, экспрессируемый в клетках млекопитающих, сначала обрабатывают сиалидазой для удаления концевых остатков сиаловой кислоты, а затем подвергают ПЭГилированию с использованием SТ3Gal3 и донорной ПЭГ-сиаловой кислоты и сиалилированию с использованием SТ3Gal3 и донорной сиаловой кислоты.
G-CSF, экспрессируемый в системе млекопитающих, может быть также обработан сиалидазой и галактозидазой для удаления остатков сиаловой кислоты и галактозы, а затем подвергают галактозилированию с использованием галактозы-донора и галактозилтрансферазы, после чего его подвергают ПЭГилированию с использованием SТ3Gal3 и донорной ПЭГ-сиаловой кислоты.
В еще одном репрезентативном варианте изобретения G-CSF сначала не подвергают обработке сиалидазой, а подвергают глигопэгилированию путем проведения реакции переноса сиаловой кислоты с использованием кластера “модифицирующая группа-сиаловая кислота” и фермента, такого как SТ3Gal3.
В другом репрезентативном варианте изобретения G-CSF экспрессируют в клетках насекомых и модифицируют в соответствии со следующей процедурой: N-ацетилглюкозамин сначала присоединяют к G-CSF с использованием соответствующего донорного N-ацетиглюкозамина и одного или нескольких из GnТ-I, II, IV и V, а затем подвергают ПЭГилированию с использованием донорной ПЭГ-галактозы и галактозилтрансферазы.
G-CSF, продуцированный в дрожжах, может быть также гликопэгилирован. Так, например, G-CSF сначала обрабатывают эндогликаназой для удаления гликозильных групп, подвергают галактозилированию с использованием галактозы-донора и галактозилтрансферазы, а затем ПЭГилируют с использованием SТ3Gal3 и донорной ПЭГ-сиаловой кислоты.
Присоединение сайтов гликозилирования к пептиду или к другой структуре обычно осуществляют путем введения модификации в аминокислотную последовательность так, чтобы эта последовательность содержала один или несколько сайтов гликозилирования. Такое присоединение может быть также осуществлено путем включения в последовательность пептида G-CSF одной или нескольких молекул, презентирующих группу -ОН, а предпочтительно, сериновых или треониновых остатков (для сайтов О-связанного гликозилирования). Такое присоединение может быть осуществлено путем введения мутации или путем проведения полного химического синтеза пептида G-CSF. Аминокислотную последовательность пептида G-CSF предпочтительно модифицируют путем внесения изменений на уровне ДНК, а в частности путем мутации ДНК, кодирующей этот пептид, в предварительно выбранных нуклеотидах для создания кодонов, которые будут транслироваться в нужные аминокислоты. Мутацию(и) ДНК осуществляют, предпочтительно, методами, известными специалистам.
В репрезентативном варианте изобретения сайт гликозилирования присоединяют путем “перетасовки” полинуклеотидов. Полинуклеотиды, кодирующие пептид-кандидат, могут быть модулированы в соответствии с протоколами “перетасовки” ДНК. Перетасовка ДНК представляет собой процесс рекурсивной рекомбинации и мутации, осуществляемой посредством рандомизированной фрагментации пула родственных генов с последующей сборкой фрагментов способом, подобным полимеразной цепной реакции. См., например, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994) и патенты США № 5605793, 5837458, 5830721 и 5811238.
Настоящее изобретение также относится к способу присоединения (или удаления) одного или нескольких выбранных гликозильных остатков к пептиду с последующим конъюгированием модифицированного сахара, по меньшей мере, с одним из выбранных гликозильных остатков данного пептида. Этот вариант настоящего изобретения может быть использован, например, в том случае, если необходимо конъюгировать модифицированный сахар с выбранным гликозильным остатком, который либо не присутствует в пептиде, либо присутствует в недостаточном количестве. Так, например, перед присоединением модифицированного сахара к пептиду выбранный гликозильный остаток конъюгируют с пептидом G-CSF путем ферментативного или химического присоединения. В другом варианте изобретения перед конъюгированием модифицированного сахара характер гликозилирования гликопептида изменяют путем удаления углеводного остатка из гликопептида. См., например, WO 98/31826.
Добавление или удаление любых углеводных молекул, присутствующих на гликопептиде, осуществляют либо химическим, либо ферментативным способом. Химическое дегликозилирование осуществляют, предпочтительно, путем обработки полипептидного варианта соединением трифторметансульфоновой кислоты или эквивалентным соединением. Такая обработка приводит к отщеплению большинства или всех сахаров, за исключением связывающего сахара (N-ацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина), но при этом сам пептид остается интактным. Химическое дегликозилирование описано у Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) и у Edge et al., Anal. Biochem. 118:131(1998). Ферментативное отщепление углеводных молекул на полипептидных вариантах может быть осуществлено с использованием различных эндо- и экзогликозидаз, как описано в работе Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350 (1987).
Химическое присоединение гликозильных остатков осуществляют любым известным методом. Ферментативное присоединение сахарных молекул, предпочтительно, осуществляют описанными здесь способами, модифицированными путем замены модифицированных сахаров, используемых в настоящем изобретении, природными гликозильными звеньями. Другие методы присоединения сахарных групп описаны в патентах США № 5876980, 6030815, 5728554 и 5922577.
Репрезентативными положениями присоединения для выбранных гликозильных остатков являются, но не ограничиваются ими, (а) консенсусные сайты для N- и О-гликозилирования; (b) концевые гликозильные группы, которые являются акцепторами для гликозилтрансферазы; (с) аргинин, аспарагин и гистидин; (d) свободные карбоксильные группы; (е) свободные сульфгидрильные группы, такие как группы цистеина; (f) свободные гидроксильные группы, такие как группы серина, треонина или гидроксипролина; (g) ароматические остатки, такие как фенилаланин, тирозин или триптофан; или (h) амидная группа глутамина. Репрезентативные способы, используемые в настоящем изобретении, описаны в заявке WO 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987, и у Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., p.259-306 (1981).
Способы
Помимо обсуждаемых выше конъюгатов настоящее изобретение относится к способам получения этих и других конъюгатов. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам предупреждения, лечения или ослабления патологического состояния путем введения конъюгата согласно изобретению пациенту, подверженному риску развития такого заболевания, или пациенту, уже страдающему указанным заболеванием.
Так, например, настоящее изобретение относится к способу получения ковалентного конъюгата, состоящего из выбранной молекулы и пептида G-CSF.
В репрезентативных вариантах изобретения указанный конъюгат образован водорастворимым полимером, терапевтической молекулой, молекулой для направленной доставки или биомолекулой и гликозилированным или негликозилированным пептидом G-CSF. Полимер, терапевтическая молекула или биомолекула конъюгированы с пептидом G-CSF посредством гликозильной линкерной группы, которая располагается между ними, и ковалентно связаны с указанным пептидом и с модифицирующей группой (например, с водорастворимым полимером). Данный способ включает контактирование пептида G-CSF со смесью, содержащей модифицированный сахар и фермент, например гликозилтрансферазу, опосредующую конъюгирование модифицированного сахара с субстратом (например, пептидом, агликоном, гликолипидом). Такую реакцию проводят в условиях, подходящих для образования ковалентной связи между модифицированным сахаром и пептидом G-CSF.
de novo
E.coli
Акцепторный пептид G-CSF обычно синтезируется  или рекомбинантно экспрессируется в прокариотических клетках (например, в бактериальных клетках, таких как ) или в эукариотических клетках, таких как клетки млекопитающих, дрожжей, насекомых, грибов или растений. Пептидом G-CSF может быть либо полноразмерный белок или его фрагмент. Кроме того, пептидом G-CSF может быть пептид дикого типа или мутированный пептид. В репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF включает мутацию, которая добавляет один или несколько сайтов N- или О-связанного гликозилирования в пептидную последовательность.
Способ согласно изобретению также предусматривает модификацию неполностью гликозилированных пептидов G-CSF, которые продуцируют рекомбинантными методами. Многие рекомбинантно продуцированные гликопротеины являются неполностью гликозилированными и имеют доступные углеводные остатки, которые могут обладать нежелательными свойствами, например иммуногенностью, то есть могут распознаваться РЭС. В способе согласно изобретению, в котором используется модифицированный сахар, данный пептид может быть затем одновременно гликозилирован и дериватизирован, например, водорастворимым полимером, терапевтическим агентом или т.п. Сахарной частью модифицированного сахара может быть остаток, который должен быть соответствующим образом конъюгирован с акцептором в полностью гликозилированном пептиде, или другая сахарная часть с нужными свойствами.
Репрезентативные способы получения модифицирующих пептидов, используемые в настоящем изобретении, описаны в заявках WO 04/099231, WO 03/031464 и в цитируемых там работах.
В своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к способу получения ПЭГилированного G-CSF, содержащего молекулу:
1
1
1
1
1
1
6
1
6
где D представляет собой -ОН и R-L-HN. Символ G означает R-L- или -С(О)(С-С)алкил. R представляет собой группу, содержащую линейный или разветвленный полиэтиленгликолевый остаток. Символ L означает линкер, выбранный из связи, замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила. В общих чертах, если D представляет собой ОН, то G представляет собой R-L, и, если G представляет собой -С(О)(С-С)алкил, то D представляет собой R-L-NH-. Способ согласно изобретению включает: (а) контактирование пептида G-CSF, являющегося субстратом, с донорной ПЭГ-сиаловой кислотой и ферментом, который способен переносить молекулу ПЭГ-сиаловой кислоты от донора на пептид-субстрат G-CSF.
Репрезентативным донорной ПЭГ-сиаловой кислотой является сахар нуклеотида, имеющий формулу:
и фермент, который переносит ПЭГ-сиаловую кислоту на аминокислоту или гликозильный остаток пептида G-CSF в условиях, благоприятствующих такому переносу.
В одном из вариантов изобретения пептид-субстрат G-CSF экспрессируется в клетке-хозяине перед образованием конъюгата согласно изобретению. Репрезентативной клеткой-хозяином является клетка млекопитающего. В других вариантах изобретения клеткой-хозяином является клетка насекомого, растения, бактерии или грибка.
Описанный здесь способ может быть применен к каждому из конъюгатов G-CSF, описанных в предыдущих разделах.
Пептиды G-CSF, модифицированные методами согласно изобретению, могут быть синтетическими пептидами или пептидами дикого типа, продуцированными известными методами, такими как сайт-направленный мутагенез. Гликозилирование пептидов обычно бывает либо N-связанным, либо О-связанным. Примером N-связывания является присоединение модифицированного сахара к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности “аспарагин-Х-серин” и “аспарагин-Х-треонин”, где Х означает любую аминокислоту, за исключением пролина, представляют собой последовательности, распознаваемые ферментом, опосредующим присоединение углеводной части к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде приводит к образованию потенциального сайта гликозилирования. О-связанное гликозилирование означает присоединение одного сахара (например, N-ацетилгалактозамина, галактозы, маннозы, GlсNAc, глюкозы, фукозы или ксилозы) к боковой гидроксицепи гидроксиаминокислоты, предпочтительно серина или треонина, хотя могут быть также использованы и редкие или неприродные аминокислоты, например 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Присоединение сайтов гликозилирования к пептиду или к другой структуре обычно осуществляют путем введения модификации в аминокислотную последовательность так, чтобы эта последовательность содержала один или несколько сайтов гликозилирования. Такое присоединение может быть также осуществлено путем включения в последовательность пептида G-CSF одной или нескольких молекул, презентирующих группу -ОН, а предпочтительно сериновых или треониновых остатков (для сайтов О-связанного гликозилирования). Это присоединение может быть осуществлено путем внесения мутации или путем проведения полного химического синтеза пептида. Аминокислотную последовательность данного пептида предпочтительно модифицируют путем внесения изменений на уровне ДНК, а в частности путем введения мутации в ДНК, кодирующую этот пептид, в предварительно выбранные нуклеотиды, так, чтобы происходило генерирование кодонов, которые будут транслироваться в нужные аминокислоты. ДНК-мутацию(и) осуществляют, предпочтительно, методами, известными специалистам.
В репрезентативном варианте изобретения сайт гликозилирования присоединяют путем “перетасовки” полинуклеотидов. Полинуклеотиды, кодирующие пептид-кандидат, могут быть модулированы в соответствии с протоколами “перетасовки” ДНК. Перетасовка ДНК представляет собой процесс рекурсивной рекомбинации и мутации, осуществляемой посредством рандомизированной фрагментации пула родственных генов с последующей сборкой фрагментов способом, подобным полимеразной цепной реакции. См., например, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:10747-10751 (1994); Stemmer, Nature 370:389-391 (1994) и патенты США № 5605793, 5837458, 5830721 и 5811238.
Репрезентативные способы присоединения или удаления сайтов гликозилирования и добавления или удаления гликозильных структур или подструктур подробно описаны в заявках WO 04/099231, WO 03/031464, в родственных заявках США и в заявках РСТ.
Настоящее изобретение также относится к способу присоединения (или удаления) одного или нескольких выбранных гликозильных остатков к пептиду G-CSF с последующим конъюгированием модифицированного сахара, по меньшей мере, с одним из выбранных гликозильных остатков данного пептида. Такие способы могут быть использованы, например, в том случае, если необходимо конъюгировать модифицированный сахар с выбранным гликозильным остатком, который либо не присутствует в пептиде, либо присутствует в недостаточном количестве. Так, например, перед присоединением модифицированного сахара к пептиду выбранный гликозильный остаток конъюгируют с пептидом G-CSF путем ферментативного или химического присоединения. В другом варианте изобретения перед конъюгированием модифицированного сахара характер гликозилирования гликопептида изменяют путем удаления углеводного остатка из гликопептида. См., например, WO 98/31826.
Репрезентативными положениями присоединения для выбранных гликозильных остатков являются, но не ограничиваются ими, (а) консенсусные сайты для N-связанного гликозилирования и сайты для О-связанного гликозилирования; (b) концевые гликозильные группы, которые являются акцепторами для гликозилтрансферазы; (с) аргинин, аспарагин и гистидин; (d) свободные карбоксильные группы; (е) свободные сульфгидрильные группы, такие как группы цистеина; (f) свободные гидроксильные группы, такие как группы серина, треонина или гидроксипролина; (g) ароматические остатки, такие как фенилаланин, тирозин или триптофан; или (h) амидная группа глутамина. Репрезентативные способы, используемые в настоящем изобретении, описаны в WO 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987, и у Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., p.259-306 (1981).
ПЭГ-модифицированные сахара конъюгируют с гликозилированным или негликозилированным пептидом с использованием соответствующего фермента, опосредующего такое конъюгирование. При этом, предпочтительно, чтобы концентрации модифицированного донорного сахара, фермента и акцепторного пептида выбирали так, чтобы реакция гликозилирования проходила до тех пор, пока не будет достигнута нужная степень модификации акцептора. Хотя представленное ниже обсуждение и относится к сиалилтрансферазе, однако, по существу, оно может также относиться и к другим гликозилтрансферазным реакциям.
Некоторые методы с использованием гликозилтрансфераз для синтеза нужных олигонуклеотидных структур являются хорошо известными и, по существу, могут применяться в настоящем изобретении. Такие методы описаны, например, в WO 96/32491, Ito et al., Pure Appl. Chem. 65:753 (1993), в патентах США № 5352670, 5374541, 5545553 и в совместных патентах США № 6399336 и 6440703, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Настоящее изобретение осуществляют с использованием одной гликозилтрансферазы или комбинации гликозилтрансфераз. Так, например, может быть использована комбинация сиалилтрансферазы и галактозилтрансферазы. В этих вариантах с использованием более чем одного фермента указанные ферменты и субстраты предпочтительно объединяют с получением исходной реакционной смеси либо указанные ферменты и реагенты для второй ферментативной реакции добавляют в реакционную среду сразу после того, как первая ферментативная реакция полностью завершится или почти завершится. При последовательном проведении двух ферментативных реакций в одном сосуде можно улучшить общий выход по сравнению с выходом, достигаемым при проведении процедур, в которых выделяют промежуточные молекулы. Кроме того, это упрощает удаление и устранение избыточных растворителей и побочных продуктов.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения первым и вторым ферментом является гликозилтрансфераза. В другом предпочтительном варианте изобретения одним из таких ферментов является эндогликозидаза. В другом предпочтительном варианте изобретения для сборки модифицированного гликопротеина согласно изобретению используются более чем два фермента. Эти ферменты используют для модификации сахаридной структуры на пептиде G-CSF в любом положении до или после присоединения модифицированного сахара к данному пептиду.
В другом варианте изобретения указанный способ включает использование одной или нескольких экзо- или эндогликозидаз. Гликозидаза обычно представляет собой мутант, который сконструирован так, что в нем гликозильные связи образуются, а не разрушаются. Мутантная гликаназа обычно включает замену кислотного аминокислотного остатка активного центра на другой аминокислотный остаток. Например, если эндогликоназой является эндо-Н, то замененными остатками активного центра обычно являются Asp в положении 130, Glu в положении 132 или их комбинации. Такие аминокислоты обычно заменены серином, аланином, аспарагином или глутамином.
Мутантный фермент катализирует реакцию, обычно, в стадии синтеза, которая аналогична обратной реакции стадии гидролиза эндогликоназой. В этих вариантах изобретения гликозильная донорная молекула (например, нужная олиго- или моносахаридная структура) содержит удаляемую группу, и эта реакция протекает с присоединением донорной молекулы к остатку GlсNAc на белке. Так, например, удаляемой группой может быть галоген, такой как фторид. В других вариантах изобретения удаляемой группой является Asn или молекула Asn-пептид. В других вариантах изобретения остаток GlсNAc на гликозильной донорной молекуле является модифицированным. Так, например, остаток GlсNAc может содержать 1,2-оксахолиновую группу.
В предпочтительном варианте изобретения каждый из ферментов, используемых для получения конъюгата согласно изобретению, присутствует в каталитическом количестве. Каталитическое количество конкретного фермента варьируется в зависимости от концентрации субстрата фермента, а также от реакционных условий, таких как температура, время проведения реакции и значение рН. Методы определения каталитического количества данного фермента для предварительно выбранных концентраций субстрата и реакционных условий хорошо известны специалистам.
Температура, при которой осуществляется вышеуказанная реакция, может варьироваться в пределах от температуры, чуть превышающей точку замерзания, до температуры денатурации большинства чувствительных ферментов. Предпочтительная температура варьируется примерно от 0°С до 55°С, а более предпочтительно, примерно от 20°С до 37°С. В другом репрезентативном варианте изобретения один или несколько стадий способа согласно изобретению проводят при повышенной температуре с использованием термофильного фермента.
Реакционную смесь поддерживают в течение периода времени, достаточного для гликозилирования акцептора, в результате чего образуется нужный конъюгат. В большинстве случаев некоторые из этих конъюгатов могут быть детектированы через несколько часов; причем выделяемые количества обычно получают через 24 часа или менее. Для специалистов в данной области очевидно, что скорость реакции зависит от ряда различных факторов (например, от концентрации фермента, концентрации донора, концентрации акцептора, температуры, объема растворителя), которые могут быть оптимизированы для выбранной системы.
Настоящее изобретение также относится к крупномасштабному продуцированию модифицированных пептидов. Используемое здесь понятие “крупномасштабный” относится к получению, по крайней мере, одного грамма конечного очищенного конъюгата.
Как обсуждается ниже, настоящее изобретение проиллюстрировано на примере конъюгирования модифицированных молекул сиаловой кислоты с гликозилированным пептидом. Репрезентативная модифицированная сиаловая кислота помечена ПЭГ. Нижеследующее обсуждение, касающееся использования ПЭГ-модифицированной сиаловой кислоты и гликозилированных пептидов, приводится лишь для иллюстрации, и при этом не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается конъюгированием этих двух компонентов. Специалистам в данной области понятно, что такое обсуждение, по существу, касается и присоединения модифицированных гликозильных групп, не являющихся сиаловой кислотой. Кроме того, такое обсуждение в равной степени касается и модификации гликозильного звена агентами, не являющимися ПЭГ, например, включающими другие молекулы ПЭГ, терапевтические молекулы и биомолекулы.
Для селективного введения ПЭГилированных или ППГилированных углеводов в пептид или гликопептид может быть использован ферментативный метод. Такой метод предусматривает использование модифицированных сахаров, содержащих ПЭГ, ППГ или маскированную реакционноспособную функциональную группу и их комбинации с соответствующей гликозилтрансферазой или гликосинтазой. Путем выбора гликозилтрансферазы, которая образует нужную углеводную связь, и использования модифицированного сахара в качестве донорного субстрата, ПЭГ или ППГ могут быть введены непосредственно в пептидный остов G-CSF, в присутствующие сахарные остатки гликопептида или в сахарные остатки, которые были присоединены к пептиду.
На пептиде G-CSF, модифицируемом способами согласно изобретению, присутствует акцептор для сиалилтрансферазы либо в виде природной структуры, либо в виде структуры, полученной рекомбинантными, ферментативными или химическими методами. Подходящими акцепторами являются, например, галактозильные акцепторы, такие как Galβ1,4GlcNAc, Galβ1,4GalNAc, Galβ1,3GalNAc, лакто-N-тетраоза, Galβ1,3GlсNAc, Galβ1,3Ara, Galβ1,6GlсNAc, Galβ1,4Glс (лактоза), и другие акцепторы, известные специалистам в данной области (см., например, Paulson et al., J. Biol. Chem. 253:5617-5624 (1978)).
in vivo
В одном из вариантов изобретения акцептор для сиалилтрансферазы присутствует на гликопептиде, модифицированном после  синтеза гликопептида. Такие гликопептиды могут быть сиалилированы с применением заявленных способов без предварительной модификации характера гликозилирования гликопептида. Альтернативно, способы согласно изобретению могут применяться для сиалилирования пептида, который не включает подходящий акцептор, при этом сначала пептид G-CSF модифицируют известными методами, так чтобы он включал акцептор. В репрезентативном варианте изобретения остаток GalNAc присоединяется под действием GalNAc-трансферазы.
В репрезентативном варианте изобретения сборку галактозильного акцептора осуществляют путем присоединения галактозного остатка к соответствующему рецептору, связанному с пептидом G-CSF, например GlсNAc. Этот метод включает инкубирование модифицируемого пептида G-CSF с реакционной смесью, содержащей подходящее количество галактозилтрансферазы (например, galβ1,3 или galβ1,4) и подходящего галактозильного донора (например, УДФ-галактозы). Реакционную смесь оставляют для прохождения реакции, в основном, вплоть до ее завершения или, альтернативно, эту реакцию завершают добавлением предварительно выбранного количества галактозного остатка. Специалистам в данной области очевидно, что существуют и другие методы сборки выбранного сахаридного акцептора.
В еще одном варианте изобретения связанные с гликопептидом олигосахариды сначала “отрезают” либо полностью, либо частично, обнажая, тем самым акцептор для сиалилтрансферазы или часть, к которой могут быть присоединены один или несколько соответствующих остатков, в результате чего получают подходящий акцептор. Для проведения реакций присоединения и отщепления могут быть использованы такие ферменты, как гликозилтрансферазы и эндогликозидазы (см., например, патент США № 5716812).
Как обсуждается ниже, способ согласно изобретению проиллюстрирован на примере использования модифицированных сахаров, содержащих присоединенную к ним молекулу ПЭГ. Это обсуждение приводится для лучшей иллюстрации настоящего изобретения. Специалистам в данной области понятно, что такое обсуждение в равной степени относится к тем вариантам изобретения, в которых модифицированный сахар содержит терапевтическую молекулу, биомолекулу или т.п.
В репрезентативном варианте изобретения, в котором углеводный остаток “отрезают” перед присоединением модифицированного сахара, высокомолекулярную маннозу “урезают” с получением биантенной структуры первой генерации. Модифицированный сахар, несущий молекулу ПЭГ, конъюгируют с одним или несколькими сахарными остатками, обнаженными в результате “урезания”. В одном из примеров ПЭГ-часть добавляют посредством GlсNAc-части, конъюгированной с этой ПЭГ-частью. Модифицированный GlсNAc присоединяют к одной или двум концевым маннозным остаткам биантенной структуры. Альтернативно, немодифицированный GlсNAc может быть присоединен к одному или двум концам разветвленных молекул.
В другом варианте изобретения ПЭГ-часть присоединяют к одному или обоим концевым маннозным остаткам биантенной структуры посредством модифицированного сахара, имеющего галактозный остаток, который конъюгирован с остатком GlсNAc, присоединенным к концевым маннозным остаткам. Альтернативно, немодифицированный Gal может быть присоединен к одному или к обоим концевым остаткам GlсNAc.
В другом варианте изобретения ПЭГ-часть присоединяют к остатку Gal с использованием модифицированной сиаловой кислоты.
В другом варианте изобретения высокомолекулярную структуру маннозы “урезают” до маннозы, от которой ответвляется биантенная структура. В одном из примеров молекулу ПЭГ присоединяют посредством GlcNAc, модифицированного полимером. Альтернативно, немодифицированную GlcNAc присоединяют к маннозе, а затем присоединяют Gal со связанной молекулой ПЭГ. В еще одном варианте изобретения немодифицированные остатки GlcNAc и Gal последовательно присоединяют к маннозе, а затем присоединяют молекулу сиаловой кислоты, модифицированную группой ПЭГ.
В другом репрезентативном варианте высокомолекулярную структуру маннозы “урезают” до GlcNАc, к которому присоединена первая манноза. GlcNАc конъюгируют с остатком Gal, несущим молекулу ПЭГ. Альтернативно, немодифицированный Gal присоединяют к GlcNАc, а затем присоединяют сиаловую кислоту, модифицированную водорастворимым сахаром. В еще одном примере концевой GlcNАc конъюгируют с Gal, а затем GlcNАc подвергают фукозилированию модифицированной фукозой, несущей группу ПЭГ.
а
а
Высокомолекулярная манноза может быть также урезана до первого GlcNАc, присоединенного к Asn данного пептида. В одном примере GlcNАc остатка GlcNАc-(Fuc) конъюгируют с GlcNАc, несущим водорастворимый полимер. В другом примере GlcNАc остатка GlcNАc-(Fuc) модифицируют Gal, несущим водорастворимый полимер. В еще одном варианте изобретения GlcNАc модифицируют Gal, с последующим конъюгированием с Gal сиаловой кислоты, модифицированной молекулой ПЭГ.
Другие репрезентативные варианты описаны в публикациях совместных заявок на патент США: 20040132640; 20040063911; 20040137557; в заявках на патент США: № 10/369079, 20/410913, 10/360770, 10/410945 и РСТ/US02/32263, каждая из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Эти представленные выше примеры приводятся лишь в целях иллюстрации эффективности описанных здесь способов. В соответствии с описанными здесь способами можно “урезать” и наращивать углеводные остатки с получением, по существу, любой нужной структуры. Модифицированный сахар может быть присоединен по концам описанной выше углеводной молекулы, либо он может занимать промежуточное положение между пептидным остовом и концом углевода.
В репрезентативном варианте изобретения присутствующую сиаловую кислоту отщепляют от гликопептида G-CSF с использованием сиалидазы, демаскируя, тем самым, все или большинство нижерасположенных галактозильных остатков. Альтернативно, пептид или гликопептид метят галактозными остатками или олигосахаридным остатком, который является концевым в галактозном звене. Для присоединения модифицированной сиаловой кислоты после демаскировки или присоединения галактозных остатков используют соответствующую сиалилтрансферазу. Этот способ проиллюстрирован на схеме I.
В еще одном способе, систематизированном на схеме 2, маскированная реакционноспособная функциональная группа присутствует на сиаловой кислоте. Предпочтительно, чтобы эта маскированная реакционноспособная группа не подвергалась воздействию условий, используемых для присоединения модифицированной сиаловой кислоты к G-CSF. После ковалентного присоединения модифицированной сиаловой кислоты к пептиду G-CSF маскировку удаляют и пептид G-CSF конъюгируют с таким агентом, как ПЭГ. Этот агент специфически конъюгируют с пептидом посредством его реакции с немаскированной реакционноспособной группой на модифицированном сахарном остатке.
Любой описанный здесь модифицированный сахар может быть использован вместе с его соответствующей гликозилтрансферазой, в зависимости от концевых сахаров олигосахаридных боковых цепей гликопептида (таблица 1). Как обсуждалось выше, концевой сахар данного гликопептида, необходимый для введения ПЭГилированной структуры, может быть введен в процессе природной экспрессии, либо он может быть продуцирован после экспрессии под действием соответствующей гликозидазы, гликозилтрансферазы или смеси гликозидазы и гликозилтрансферазы.
В другом репрезентативном варианте изобретения конъюгат УДФ-галактоза-ПЭГ подвергают взаимодействию с β1,4-галактозилтрансферазой коровьего молока, что позволяет переносить модифицированную галактозу на соответствующую концевую N-ацетилглюкозаминовую структуру. Концевые остатки GlcNАc на гликопептиде могут быть продуцированы в процессе экспрессии, которая может осуществляться в таких экспрессионных системах, как клетки млекопитающих, насекомых, растений или грибов, но, если это необходимо, они могут быть также продуцированы путем обработки гликопептида сиалидазой, и/или гликозидазой, и/или гликозилтрансферазой.
В другом варианте изобретения GlcNАc-трансфераза, такая как GNТ1-5, используется для переноса ПЭГилированного GlcN на концевой маннозный остаток гликопептида. В еще одном репрезентативном варианте изобретения N- и/или О-связанные гликановые структуры ферментативно удаляют из гликопептида, в результате чего становятся доступными аминокислотный или концевой гликозильный остаток, которые затем конъюгируют с модифицированным сахаром. Так, например, в целях обеспечения доступа к концевому GlcNАc в виде GlcNАс-Asn на гликопептиде используют эндогликаназу для удаления N-связанных структур гликопептида. Для введения функциональной ПЭГ-галактозы в доступный GlcNАc используют УДФ-Gal-ПЭГ и соответствующую галактозилтрансферазу.
В альтернативном варианте изобретения модифицированный сахар присоединяют непосредственно к пептидному остову G-CSF с использованием гликозилтрансферазы, которая, как известно, переносит сахарные остатки на пептидный остов. Такой репрезентативный вариант представлен на схеме 3. Примерами гликозилтрансфераз, используемых для осуществления настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, GalNac-трансферазы (GalNac Т1-14), GlcNАc-трансферазы, фукозилтрансферазы, глюкозилтрансферазы, ксилозилтрансферазы, маннозилтрансферазы и т.п. Применение этого способа позволяет непосредственно присоединять модифицированные сахара к пептидам, в которых отсутствуют любые углеводы, или, альтернативно, к присутствующим гликопептидам. В обоих случаях присоединение модифицированного сахара происходит в специфических положениях на пептидном остове, как было определено по специфичности гликозилтрансферазы к субстрату, но не произвольно, как это происходит в процессе модификации пептидного остова белка химическими методами. В белки или гликопептиды, в которых отсутствует пептидная последовательность, являющаяся субстратом для гликозилтрансферазы, может быть введен ряд агентов путем конструирования соответствующей аминокислотной последовательности в полипептидной цепи.
В каждом из описанных выше репрезентативных вариантах изобретения после конъюгирования модифицированного сахара с пептидом могут быть проведены одна или несколько дополнительных стадий химической или ферментативной модификации. В репрезентативном варианте изобретения фермент (например, фукозилтрансферазу) используют для присоединения гликозильного звена (например, фукозы) к концевому модифицированному сахару, присоединенному к пептиду G-CSF. В другом примере ферментативную реакцию используют для “кэпирования” сайтов, с которыми модифицированный сахар не может конъюгироваться. Альтернативно, химическую реакцию проводят для изменения структуры конъюгированного модифицированного сахара. Так, например, конъюгированный модифицированный сахар подвергают взаимодействию с агентами, которые стабилизируют или дестабилизируют его связь с пептидным компонентом, к которому присоединен модифицированный сахар. В другом примере, после конъюгирования компонента модифицированного сахара с пептидом, защиту у этого компонента снимают. Специалистам в данной области известно, что существует ряд ферментативных и химических процедур, которые могут применяться в способах согласно изобретению на стадии, проводимой после конъюгирования модифицированного сахара с пептидом G-CSF. Последующее усовершенствование конъюгата “модифицированный сахар - пептид” входит в объем настоящего изобретения.
Ферменты
Помимо ферментов, обсуждаемых выше в связи с получением ацилсвязанного конъюгата, характер гликозилирования конъюгата и исходных субстратов (например, пептидов, липидов) может быть улучшен, скорректирован или как-либо иначе модифицирован методами с использованием других ферментов. Методы ремоделирования пептидов и липидов с использованием ферментов, переносящих донорный сахар на акцептор, очень подробно обсуждается в заявке DeFrees, WO 03/031464 А2, опубликованной 17 апреля 2003. Краткое описание выбранных ферментов, используемых в способе согласно изобретению, приводится ниже.
Гликозилтрансферазы
2
3
9
Гликозилтрансферазы катализируют постадийное присоединение активированных сахаров (донорных NDP- или NМР-сахаров) к белку, гликопептиду, липиду или к гликолипиду, или к невосстанавливающему концу растущего олигосахарида. N-связанные гликопептиды синтезируют посредством трансферазы и связанного с липидом донорного олигосахарида Dol-PP-NAGGlcMan путем переноса блоком с последующим “подравниванием” остова. В этом случае природа “остовного” сахарида будет несколько отличаться от природы присоединенных впоследствии групп. Специалистам известно очень большое число гликозилтрансфераз.
Гликозилтрансферазой, используемой в настоящем изобретении, может быть любая гликозилтрансфераза при условии, что она способна утилизовать модифицированный сахар в качестве донорного сахара. Примерами таких ферментов являются гликозилтрансфераза пути Лелуара, такая как галактозилтрансфераза, N-ацетилглюкозаминилтрансфераза, N-ацетилгалактозаминилтрансфераза, фукозилтрансфераза, сиалилтрансфераза, маннозилтрансфераза, ксилозилтрансфераза, глюкурононилтрансфераза и т.п.
(http://www.vei.co.uk/TGN/gt.guide.htm)
Для ферментативного синтеза сахаридов, который включает гликозилтрансферазные реакции, гликозилтрансфераза может быть клонирована или выделена из любого источника. Многие клонированные гликозилтрансферазы, а также кодирующие их полинуклеотидные последовательности являются известными. См., например, “The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases” . Аминокислотные последовательности гликозилтрансферазы и нуклеотидные последовательности, кодирующие гликозилтрансферазы, из которых могут происходить данные аминокислотные последовательности, также имеются в различных доступных базах данных, включая Genbank, Swiss-Prot, EMBL и др.
Гликозилтрансферазами, которые могут быть использованы в способах согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, галактозилтрансферазы, фукозилтрансферазы, глюкозилтрансферазы, N-ацетилгалактозаминилтрансферазы, N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, глюкуронилтрансферазы, сиалилтрансферазы, маннозилтрансферазы, (глюкуроновая кислота)трансферазы, (галактуроновая кислота)трансферазы и олигосахарилтрансферазы. Подходящими гликозилтрансферазами являются гликозилтрансферазы, полученные из эукариотов, а также из прокариотов.
ДНК, кодирующая гликозилтрансферазы, может быть получена путем химического синтеза, путем скрининга обратных транскриптов мРНК из соответствующих клеток или культур клеточных линий, путем скрининга геномных библиотек из соответствующих клеток или путем проведения комбинированных процедур. Скрининг мРНК или геномной ДНК может быть осуществлен с использованием олигонуклеотидных зондов, генерированных из генной последовательности гликозилтрансфераз. Зонды могут быть помечены детектируемой группой, такой как флуоресцентная группа, радиоактивный атом или хемилюминесцентная группа в соответствии с известными процедурами, и использованы в стандартных анализах методом гибридизации. Альтернативно, генные последовательности гликозилтрансфераз могут быть получены с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидных ПЦР-праймеров, продуцированных из генной последовательности гликозилтрансфераз. См. патент США № 4683195, Mullis et al. и патент США № 4683202, Mullis.
Гликозилтрансфераза может быть синтезирована в клетках хозяина, транформированных векторами, содержащими ДНК, кодирующую фермент гликозилтрансферазу. Векторы используются для амплификации ДНК, кодирующей фермент гликозилтрансферазу, и/или для экспрессии ДНК, кодирующей фермент гликозилтрансферазу. Экспрессионным вектором является реплицируемая ДНК-конструкция, в которой ДНК-последовательность, кодирующая фермент гликозилтрансферазу, функционально присоединена к подходящим регуляторным последовательностям, способным осуществлять экспрессию фермента гликозилтрансферазы в подходящем хозяине. Необходимость в присутствии таких регуляторных последовательностей варьируется в зависимости от выбранного хозяина и от выбранного метода трансформации. В общих чертах регуляторные последовательности включают транскрипционный промотор; необязательную операторную последовательность для регуляции транскрипции; последовательность, кодирующую подходящие мРНК-сайты связывания с рибосомой; и последовательности, регулирующие терминацию транскрипции и трансляции. Векторам для амплификации не требуется домен регуляции экспрессии. Все, что требуется для данного вектора, это - способность реплицироваться в хозяине, обычно сообщаемая ориджином репликации, и присутствие селективного гена для облегчения идентификации трансформантов.
Critical Reviews in Microbiology
rfa
E.coli
Salmonella typhimurium
E.coli
S. typhimurium
E.coli
rfaJ)
E.coli
S. typhimurium))
rfa
E.coli
rfa
Klebsiella pneumoniae
E.coli
Salmonella typhimurium
Salmonella enterica
Yersinia enterocolitica
Mycobacterium
leprosum
rhl
Pseudomonas aeruginosa
В репрезентативном варианте изобретения используется прокариотический фермент. Гликозилтрансферазами являются ферменты, участвующие в синтезе липоолигосахаридов (ЛОС), которые продуцируются многими грамотрицательными бактериями (Preston et al.,  23(3):139-180 (1996)). Такими ферментами являются, но не ограничиваются ими, белки оперонов  таких видов, как  и , которые включают β1,6-галактозилтрансферазу и β1,3-галактозилтрансферазу (см., например, EMBL Accesion № M80599 и М86935 (), EMBL Accesion № S56361 ()), глюкозилтрансферазу (Swiss-Prot Accesion № Р25470 ()), β1,2-глюкозилтрансферазу ( (Swiss-Prot Accesion № P27129 () и Swiss-Prot Accesion № Р19817 ( и β1,2-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу (K)(EMBL Accesion № U00039 ()). Другими гликозилтрансферазами с известными аминокислотными последовательностями являются ферменты, которые кодируются оперонами, такими как В и которые были охарактеризованы в микроорганизмах, таких как , , , , , , и опероном .
k
k
k
Neisseria gonorrhoeae
N. meningitidis
N. meningitidis
N. gonorrhoeae
N. meningitidis
N. gonorrhoeae
N. meningitidis
lgtA
lgtB
lgE
lgtB
lgtA
N. gonorrhoeae
lgtD
lgtС
N. meningitidis
lgtС
Neisseria
Helicobacter pylori
Campylobacter jejuni
~
Ферментами, подходящими для использования в настоящем изобретении, также являются гликозилтрансферазы, которые участвуют в образовании структур, содержащих лакто-N-неотетраозу, D-галактозил-β-1,4-N-ацетил-D-глюкозаминил-β-1,3-D-галактозил-β-1,4-D-глюкозу и трисахаридную последовательность группы крови P, D-галактозил-α-1,4-D-галактозил-β-1,4-D-глюкозу, которые были идентифицированы в ЛОС патогенов  и  слизистой (Scholten et al., J. Med. Microbiol. 41:236-243 (1994)). Гены  и , которые кодируют гликозилтрансферазы, участвующие в биосинтезе этих структур, были идентифицированы в иммунотипах L3 и L1  (Jennings et al., Mol. Microbiol. 18:729-740 (1995)) и в мутанте F62  (Gotshlich, J. Exp. Med. 180:2181-2190 (1994)). В  локус, состоящий из трех генов, ,  и , кодирует гликозилтрансферазы, необходимые для присоединения последних трех сахаров в лакто-N-неотетраозной цепи (Wakarchuk et al., J. Biol. Chem. 271:19166-73 (1996)). Недавно была продемонстрирована ферментативная активность генных продуктов и , которая является первым прямым свидетельством их предполагаемой гликозилтрансферазной функции (Wakarchuk et al., J. Biol. Chem. 271(45):28271-276 (1996)). В  имеются два дополнительных гена: , который присоединяет β-D-GalNAc в 3 положении концевой галактозы лакто-N-неотетраозной структуры, и , который присоединяет концевую α-D-Gal к лактозному элементу усеченного ЛОС, образуя, тем самым, антигенную структуру группы крови Р (Gotshlich (1994), см. выше). В , отдельный иммунотип L1 также экспрессирует антиген группы крови Р, и было показано, что он несет ген  (Jennings et al. (1995), см. выше). Гликозилтрансферазы  и ассоциированные с ними гены также описаны в патенте США № 5545553 (Gotschlich). Были также охарактеризованы гены α1,2-фукозилтрансферазы и α1,3-фукозилтрансферазы  (Martin et al., J. Biol. Chem. 272:21349-21356 (1997)). В настоящем изобретении могут быть также использованы гликозилтрансферазы  (см., например, http://afmb.cnrs-mrs.fr/pedro/CAZY/gtf_42.html).
Фукозилтрансферазы
В некоторых вариантах изобретения гликозилтрансферазой, используемой в способе согласно изобретению, является фукозилтрансфераза. Фукозилтрансферазы известны специалистам. Репрезентативными фукозилтрансферазами являются ферменты, которые переносят L-фукозу из ГДФ-фукозы в гидроксиположение акцепторного сахара. В настоящем изобретении также используются фукозилтрансферазы, переносящие ненуклеотидные сахара на акцептор.
В некоторых вариантах изобретения акцепторный сахар представляет собой, например, GlcNАc в Galβ(1→3,4)GlcNАcβ-группе в гликозиде олигосахарида. Фукозилтрансферазами, подходящими для этой реакции, являются Galβ(1→3,4)GlcNАcβ1-α(1→3,4)фукозилтрансфераза (FТIII ЕС № 2.4.1.65), которая была впервые выделена из человеческого молока и охарактеризована (см. Palcic et al., Carbohydrate Res. 190:1-11 (1989); Prieels et al., J. Biol. Chem. 256:10456-10463 (1981) & Nunez et al., Can. J. Chem. 59:2086-2095 (1981)), и Galβ(1→4)GlcNАcβ-α-фукозилтрансферазы (FТIV, FTV, FTVI), которые были обнаружены в человеческой сыворотке. Была также охарактеризована FТVII (ЕС № 2.4.1.65), сиалил-α(2→3)Galβ(1→3)GlcNАcβ-фукозилтрансфераза. Кроме того, была охарактеризована рекомбинантная форма Galβ(1→3,4)GlcNAcβ-α(1→3,4)-фукозилтрансферазы (см. Dumas et al., Bioorg. Med. Letters 1:425-428 (1991) & Kukowska-Latallo et al., Genes and Development 4:1288-1303 (1990)). Другими примерами фукозилтрансфераз являются, например, α1,2-фукозилтрансфераза (ЕС № 2.4.1.69). Ферментативное фукозилирование может быть осуществлено методами, описанными в работе Mollicone et al., Eur. J. Biochem. 191:169-176 (1990) или в патенте США № 5374655. Клетки, которые используются для продуцирования фукозилтрансферазы, также включают систему ферментативного синтеза ГДФ-фукозы.
Галактозилтрансферазы
В другой группе вариантов изобретения указанной гликозилтрансферазой является галактозилтрансфераза. Примерами галактозилтрансфераз являются α(1,3)-галактозилтрансферазы (ЕС № 2.4.1.151, см., например, Dabkowski et al., Transplant Proc. 25:2921 (1993) и Yamamoto et al. Nature 345:229-233 (1990)), коровья галактозилтрансфераза (GenBank j04989, Joziasse et al. J. Biol. Chem. 264:14290-14297 (1989)), мышиная галактозилтрансфераза (GenBank m26925; Larsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8227-8231 (1995)) и свиная галактозилтрансфераза (GenBank L36152; Strahan et al., Immunogenetics 41:101-105 (1995)). Другой подходящей α1,3-галактозилтрансферазой является галактозилтрансфераза, которая участвует в синтезе антигенов человеческой группы крови В (ЕС 2.4.1.37, Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 265:1146-1151 (1990)). Еще одним примером галактозилтрансферазы является Gal-T1 остова.
Schizosaccharomyces pombe,
В способах согласно изобретению могут быть также использованы β(1,4)-галактозилтрансферазы, которыми являются, например, ЕС 2.4.1.90 (LacNAc-синтетаза) и ЕС 2.4.1.22 (лактозо-синтетаза), коровья (D'Agostaro et al., Eur. J. Biochem. 183:211-217 (1989)), человеческая (Mastri et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157:657-663 (1998)) и мышиная галактозилтрансферазы (Nakazawa et al., J. Biochem. 104:165-168 (1988)), а также ЕС 2.4.1.38 и церамид-галактозилтрансфераза (ЕС 2.4.1.45, Stahl et al., J. Neurosci. Res. 38:234-242 (1994)). Другими подходящими галактозилтрансферазами являются, например, α1,2-галактозилтрансферазы (выделенные, например, из  Chapell et al., Mol. Biol. Cell. 5:519-528 (1994)).
Сиалилтрансферазы
Сиалилтрансферазы представляют собой гликозилтрансферазы другого типа, которые могут быть использованы в рекомбинантных клетках и в реакционных смесях согласно изобретению. Клетки, продуцирующие рекомбинантные сиалилтрансферазы, также продуцируют ЦМФ-сиаловую кислоту, которая является донорной сиаловой кислотой для сиалилтрансфераз. Примерами сиалилтрансфераз, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются ST3GalIII (например, крысиные или мышиные ST3GalIII), ST3GalIV, ST3GalI, ST3GalII, ST6GalI, ST3GalV, ST6GalII, ST6GalNAcI, ST6GalNAcII и ST6GalNAcIII (номенклатура, используемая для обозначения сиалилтрансфераз, имеется у Tsuji et al., Glycobiology 6:v-xiv (1996)). Репрезентативная α(2,3)сиалилтрансфераза, называемая α(2,3)сиалилтрансферазой (ЕС 2.4.99.6), переносит сиаловую кислоту на невосстанавливающий концевой Gal дисахарида или гликозида Galβ1→3Glc. См. Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256:3159 (1981), Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257:13845 (1985) и Wen et al., J. Biol. Chem. 267:21011 (1992). Другая репрезентативная α2,3-сиалилтрансфераза (ЕС 2.4.99.4) также переносит сиаловую кислоту на невосстанавливающий концевой Gal дисахарида или гликозида, см. Rearick et al., J. Biol. Chem. 254:4444 (1979) и Gillespie et al., J. Biol. Chem. 267:21004 (1992). Еще одним репрезентативным ферментом является Gal-β-1,4-GlcNAc-α-2,6-сиалилтрансфераза (см. Kurosawa et al., Eur. J. Biochem. 219:375-381 (1994)).
Для гликозилирования углеводов гликопептидов предпочтительно, чтобы сиалилтрансфераза обладала способностью переносить сиаловую кислоту на последовательность Galβ1,4GlcNAc-, то есть на наиболее распространенную последовательность, являющуюся предпоследней последовательностью перед концевой сиаловой кислотой на полностью сиалилированных углеводных структурах (см. таблицу 2).
<b>Таблица 2</b><u>Сиалилтрансферазы, которые используют последовательность Galβ1,4GlcNAc в качестве субстрата-акцептора</u>
<b>Сиалилтрансфераза</b>
<b>Источник</b>
<b>Образуемая последовательность</b>
<b>сс.</b>
SТ6Gal I
Млекопитающее
NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNАc
1
SТ3Gal III
Млекопитающее
NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNАc- NeuAcα2,3Galβ1,3GlcNАc
1
SТ3Gal IV
Млекопитающее
NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNАc- NeuAcα2,3Galβ1,3GlcNАc
1
SТ6Gal II
Млекопитающее
NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNАc
1
SТ6Gal II
Фотобактерия
NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNАc
2
SТ3Gal V
<i>N. meningitidis</i><i>N. gonorrhoeae</i>
NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNАc
3
1) Goochee et al., Bio/Technology 9:1347-1355 (1991).
2) Yamamoto et al., J. Biochem. 120:104-110 (1996).
3) Gilbert et al., J. Biol. Chem. 271:28271-28276 (1996).
Примером сиалилтрансферазы, которая используется в заявленных способах, является SТ3GalIII, которая также называется α(2,3)сиалилтрансферазой (ЕС 2.4.99.6). Этот фермент катализирует перенос сиаловой кислоты на Gal гликозида Galβ1,3GlcNAc или Galβ1,4GlcNAc (см., например, Wen et al., J. Biol. Chem. 267:21011 (1992); Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256:3159 (1991)) и является ответственным за сиалилирование связанных с аспарагином олигосахаридов в гликопептидах. Данная сиаловая кислота связывается с Gal, в результате чего между двумя сахаридами образуется α-связь. Связывание (присоединение) сахаридов происходит между 2 положением NeuAc и 3 положением Gal. Этот конкретный фермент может быть выделен из печени крыс (Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257:13845 (1982)); причем кДНК (Sasaki et al. (1993), J. Biol. Chem. 268:22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994), J. Biol. Chem. 269:1394-1401) и геномная ДНК-последовательности человеческого фермента (Kitagawa et al. (1996), J. Biol. Chem. 271:931-938) являются известными, что облегчает продуцирование этого фермента посредством рекомбинантной экспрессии. В предпочтительном варианте изобретения заявленные способы сиалилирования предусматривают использование крысиного SТ3GalIII.
Другими репрезентативными сиалилтрансферазами, используемыми в настоящем изобретении, являются сиалилтрансферазы, выделенные из Campylobacter jejuni, включая CST-1 и CST-II, и сиалилтрансферазы, образующие α(2,3)-связи. См., например, WO 99/49051.
1
1
Для проведения недорогостоящих и эффективных крупномасштабных процедур сиалилирования гликопептидов, имеющих важное коммерческое значение, могут быть также использованы и другие сиалилтрансферазы, не перечисленные в таблице 2. Самым простым тестом для определения эффективности этих других ферментов является проведение реакции различных количеств каждого из этих ферментов (1-100 мЕд/мг белка) с асиало-α-АГФ (при 1-10 мг/мл) для сравнения способности представляющей интерес сиалилтрансферазы сиалилировать гликопептиды со способностью к такому сиалилированию коровьей ST6GalI, ST3GalIII или обеих сиалилтрансфераз. Альтернативно, для такой оценки вместо асиало-α-АГФ могут быть использованы и другие гликопептиды или N-связанные олигосахариды, ферментативно высвобождаемые из пептидного остова. Сиалилтрансферазы, обладающие способностью более эффективно сиалилировать N-связанные олигосахариды гликопептидов, чем ST6GalI, могут быть использованы для проведения крупномасштабных процедур сиалилирования пептидов.
Эти и другие сиалилтрансферазы представлены на фиг.11, где приводится таблица сиалилтрансфераз, которые используются для переноса на акцептор модифицированных молекул сиаловой кислоты, описанных в настоящей заявке, и немодифицированной сиаловой кислоты.
GalNac-трансферазы
N-ацетилгалактозаминилтрансферазы используются для осуществления настоящего изобретения, а в частности для связывания молекулы GalNac с аминокислотой сайта О-связанного гликозилирования пептида. Подходящими N-ацетилгалактозаминилтрансферазами являются, но не ограничиваются ими, α(1,3)N-ацетилгалактозаминилтрансферазы, β(1,4)N-ацетилгалактозаминилтрансферазы (Nagata et al., J. Biol. Chem. 267:12082-12089 (1992) и Smith et al., J. Biol. Chem. 269:15162 (1994)) и полипептид N-ацетилгалактозаминилтрансфераза (Homa et al., J. Biol. Chem. 268:12609 (1993)).
I-ХХ
in vitro
Получение белков, таких как фермент GalNAc Т, из клонированных генов путем генной инженерии хорошо известно специалистам. См., например, патент США № 4761371. Один из методов включает сбор достаточного числа образцов, а затем определение аминокислотной последовательности фермента путем N-концевого секвенирования. Такая информация может быть затем использована для выделения кДНК-клона, кодирующего полноразмерную (мембраносвязанную) трансферазу, которая после ее экспрессии в клеточной линии насекомых Sf9 позволяет синтезировать полностью активный фермент. Специфичность этого фермента к акцептору затем определяют с помощью полуколичественного анализа аминокислот, окружающих известные сайты гликозилирования в 16 различных белках, после чего проводят исследования  гликозилирования синтетических пептидов. В этой работе было продемонстрировано, что некоторые аминокислотные остатки присутствуют в гликозилированных пептидных сегментах в избыточном количестве и что остатки в специфических положениях, окружающих гликозилированный сериновый и треониновый остатки, могут оказывать более заметное влияние на эффективность акцептора, чем другие аминокислотные остатки.
Связанные с клетками гликозилтрансферазы
В другом варианте изобретения ферментами, используемыми в способе согласно изобретению, являются связанные с клетками гликозилтрансферазы. Хотя известно много растворимых гликозилтрансфераз (см., например, патент США № 5032519), однако эти гликозилтрансферазы, при их связывании с клетками, в основном, присутствуют в мембраносвязанной форме. Многие из исследованных таким образом мембраносвязанных ферментов, в основном, считаются внутренними белками, то есть они не высвобождаются из мембран при обработке ультразвуком, и для их солюбилизации требуются детергенты. Поверхностные гликозилтрансферазы были идентифицированы на поверхностях клеток позвоночных и беспозвоночных, и было также установлено, что эти поверхностные трансферазы сохраняют каталитическую активность в физиологических условиях. Однако более известной функцией таких гликозилтрансфераз клеточной поверхности является внутриклеточное распознавание (Roth, Molecular Approaches to Supracellular Phenomena, 1990).
Были разработаны способы модификации гликозилтрансфераз, экспрессируемых клетками. Так, например, в работе Larsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:8227-8231 (1989) описан генетический метод выделения клонированных кДНК-последовательностей, которые определяют уровень экспрессии олигосахаридных структур клеточной поверхности и их когнатных гликозилтрансфераз. кДНК-библиотека, генерированная из мРНК, выделенной из мышиной клеточной линии, которая, как известно, экспрессирует УДФ-галактозу: β-D-галактозил-1,4-N-ацетил-D-глюкозаминид-α-1,3-галактозилтрансферазу, была трансфицирована в клетки СОS-1. Затем трансфицированные клетки культивировали и анализировали на α-1,3-галактозилтрансферазную активность.
Proc. Natl. Acad. Sci., USA
Esсherichia coli
В работе Francisco et al., , 89:2713-2717 (1992) описан метод заякоривания β-лактамазы на внешней поверхности . Был продуцирован трехкомпонентный гибрид, состоящий из (i) сигнальной последовательности внешнего мембранного белка, (ii) трансмембранной части внешнего мембранного белка и (iii) полноразмерной зрелой β-лактамазной последовательности и образующий активную молекулу β-лактамазы, связанную с клеточной поверхностью. Однако метод Франциско ограничивается только прокариотическими клеточными системами, и, как известно авторам, для правильного функционирования этой лактамазы необходим полный трехкомпонентный гибрид.
Сульфотрансферазы
Настоящее изобретение также относится к способам получения пептидов, которые содержат сульфатированные молекулы, включая, например, сульфатированные полисахариды, такие как гепарин, сульфат гепарана, карагенан и родственные соединения. Подходящими сульфотрансферазами являются, например, хондротин-6-сульфотрансфераза (куриная кДНК, описанная Fukuta et al., J. Biol. Chem. 270:18575-18580 (1995); GenBank, рег.№ D49915), гликозаминогликан-N-ацетилглюкозамин-N-деацетилаза/N-сульфотрансфераза 1 (Dixon et al., Genomics 26:239-241 (1995); UL18918) и гликозаминогликан-N-ацетилглюкозамин-N-деацетилаза/N-сульфотрансфераза 2 (мышиная кДНК, описанная Orellana et al., J. Biol. Chem. 269:2270-2276 (1994) и Eriksson et al., J. Biol. Chem. 269:10438-10443 (1994); и человеческая кДНК, имеющаяся в Genbank Accession No. U2304).
Гликозидазы
Настоящее изобретение также относится к использованию гликозидаз дикого типа и мутантных гликозидаз. Было продемонстрировано, что мутантные β-галактозидазы катализируют образование дисахаридов посредством связывания α-гликозилфторида с галактозильной акцепторной молекулой (Withers, патент США № 6284494, выданный 4 сентября 2001). Другими гликозидазами, используемыми в настоящем изобретении, являются, например, β-глюкозидазы, β-галактозидазы, β-маннозидазы, β-ацетилглюкозаминидазы, β-N-ацетилгалактозаминидазы, β-ксилозидазы, β-фукозидазы, целлюлазы, ксиланазы, галактаназы, маннаназы, гемицеллюлазы, амилазы, глюкоамилазы, α-глюкозидазы, α-галактозидазы, α-маннозидазы, α-N-ацетилглюкозаминидазы, α-N-ацетилгалактозаминидазы, α-ксилозидазы, α-фукозидазы и нейраминидазы/сиалидазы.
Иммобилизованные ферменты
Настоящее изобретение также относится к использованию ферментов, иммобилизованных на твердом и/или растворимом носителе. В своем репрезентативном варианте настоящее изобретение относится к гликозилтрансферазе, которая конъюгирована с ПЭГ посредством интактного гликозильного линкера способами согласно изобретению. Конъюгат “ПЭГ-линкер-фермент” присоединяют, но необязательно, к твердому носителю. Использование ферментов на твердых носителях в способах согласно изобретению упрощает обработку реакционной смеси и очистку реакционного продукта, а также облегчает восстановление фермента. В способах согласно изобретению используют гликозилтрансферазный конъюгат. Специалистам известны и другие комбинации ферментов и носителей.
Гибридные белки
В других репрезентативных вариантах в способах согласно изобретению используются гибридные белки, обладающие более чем одной ферментативной активностью, участвующей в синтезе нужного гликопептидного конъюгата. Гибридные полипептиды могут состоять, например, из каталитически активного домена гликозилтрансферазы, который присоединен к каталитически активному домену вспомогательного фермента. Каталитический домен вспомогательного фермента может, например, катализировать стадию образования сахара нуклеотида, который является донором для гликозилтрансферазы, или катализировать реакцию, участвующую в гликозилтрансферазном цикле. Так, например, полинуклеотид, кодирующий гликозилтрансферазу, может быть присоединен, с сохранением рамки считывания, к полинуклеотиду, кодирующему фермент, участвующий в синтезе сахара нуклеотида. Затем полученный гибридный белок может катализировать не только синтез сахара нуклеотида, но также и переносить сахарную группу на акцепторную молекулу. Гибридный белок может состоять из двух или нескольких ферментов, участвующих в данном цикле и связанных с одной экспрессируемой нуклеотидной последовательностью. В других вариантах изобретения этот гибридный белок включает каталитические активные домены двух или более гликозилтрансфераз. См., например, патент 5641668. Модифицированные гликопептиды согласно изобретению могут быть легко сконструированы и изготовлены с использованием различных подходящих гибридных белков (см., например, патентную заявку РСТ/СА98/01180, опубликованную 24 июня 1999 под номером WO 99/31224).
Получение модифицированных сахаров
В общих чертах сахарная часть или кластер “сахарная часть - линкер” и группа ПЭГ или группы кластера “ПЭГ-линкер” связаны друг с другом посредством реакционноспособных групп, которые, в процессе реакции присоединения, обычно превращаются в новую органическую функциональную группу или в нереакционноспособную группу. Реакционноспособная(ые) функциональная(ые) группа(ы) сахара локализована(ы) в любом положении сахарной части. Обычно, для осуществления настоящего изобретения используются реакционноспособные группы и класс реакций, которые хорошо известны специалистам в области химии биоконъюгатов. Наиболее предпочтительными в настоящее время классами реакций с реакционноспособными сахарными группами являются реакции, которые протекают в относительно мягких условиях. Такими реакциями являются, но не ограничиваются ими, нуклеофильные замещения (например, реакции аминов и спиртов с ацилгалогенидами, активными сложными эфирами), электрофильные замещения (например, реакции с енаминами) и реакции присоединения с образованием углерод-углеродных и углерод-гетероатомных кратных связей (например, реакция Михаэля, реакция присоединения Дильса-Альдера). Эти и другие подходящие реакции обсуждаются, например, в публикациях March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996 и у Feeney et al., Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol.198, American Chemical Society, Washington, DC, 1982.
Используемыми реакционноспособными функциональными группами, ответвляющимися от сахарного ядра, или модифицирующими группами являются, но не ограничиваются ими:
(а) карбоксильные группы и их различные производные, включая, но не ограничиваясь ими, N-гидроксисукцинимидоэфиры, эфиры N-гидроксибензотриазола, галогенангидриды кислоты, ацилимидазолы кислот, сложные тиоэфиры, п-нитрофениловые эфиры, алкиловые, алкениловые, алкиниловые и ароматические сложные эфиры;
(b) гидроксильные группы, которые могут превращаться, например, в сложные эфиры, в простые эфиры, в альдегиды и т.п.;
(с) галогеналкильные группы, где галогенид может быть затем замещен нуклеофильной группой, такой как, например, амин, анион карбоксилата, анион тиола, карбанион или ион алкоксида, с ковалентным присоединением новой группы к функциональной группе, которой является атом галогена;
(d) диенофильные группы, которые могут участвовать в реакциях Дильса-Альдера, такие как, например, малеимидогруппы;
(е) альдегидные или кетоновые группы, которые могут затем подвергаться дериватизации посредством образования карбонильных производных, таких как, например, имины, гидразоны, полукарбазоны или оксимы, или посредством таких механизмов, как реакция присоединения Гриньяра или реакция присоединения алкиллития;
(f) сульфонилгалогенидные группы для последующей реакции с аминами, например, с образованием сульфонамидов;
(g) тиоловые группы, которые могут, например, превращаться в дисульфиды или реагировать с ацилгалогенидами;
(h) аминогруппы или сульфгидрильные группы, которые могут быть, например, ацилированными, алкилированными или окисленными;
(i) алкены, которые могут подвергаться, например, реакции циклоприсоединения, ацилирования, реакции присоединения Михаэля и т.п.;
(j) эпоксиды, которые могут реагировать, например, с аминами и гидроксильными соединениями.
Реакционноспособные функциональные группы могут быть выбраны так, чтобы они не участвовали в реакциях или не препятствовали реакциям, которые необходимы для сборки реакционноспособного сахарного ядра или модифицирующей группы. Альтернативно, реакционноспособная функциональная группа может быть защищена от участия в реакции благодаря присутствию защитной группы. Специалистам в данной области хорошо известен способ защиты конкретной функциональной группы, который позволяет предотвращать ее участие в выбранной серии реакций, проводимых в определенных условиях. Примеры подходящих защитных групп можно найти, например, в руководстве Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.
Ниже обсуждается ряд конкретных примеров модифицированных сахаров, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения. В репрезентативных вариантах изобретения производное сиалиловой кислоты используется в качестве сахарного ядра, к которому присоединена модифицирующая группа. Обсуждение производных сиаловой кислоты приводится лишь для иллюстрации и не должно рассматриваться как ограничение объема изобретения. Специалистам в данной области понятно, что различные другие сахарные группы могут быть активированы и дериватизированы методами, аналогичными методам с использованием сиаловой кислоты, описанным в качестве примера. Так, например, существует множество методов, подходящих для модификации галактозы, глюкозы, N-ацетилгалактозамина и фукозы, не говоря уже о других сахарных субстратах, и такая модификация может быть легко осуществлена известными методами. См., например, Elhalabi et al., Curr. Med. Chem. 6:93 (1999) и Schafer et al., J. Org. Chem. 65:24 (2000).
В репрезентативном варианте изобретения пептид G-CSF, модифицированный способом согласно изобретению, представляет собой гликопептид, который продуцируется в клетках млекопитающих (например, в клетках СНО) или в трансгенном животном, а поэтому он содержит цепи N- и/или О-связанного олигосахарида, являющиеся неполностью сиалилированными. Олигосахаридные цепи гликопетида, не содержащие сиаловой кислоты, но содержащие концевой галактозный остаток, могут быть ПЭГилированы, ППГилированы или как-либо иначе модифицированы модифицированной сиаловой кислотой.
Как показано на схеме 4, аминогликозид 1 обрабатывают активным сложным эфиром защищенного производного аминокислоты (например, глицина), в результате чего аминовый остаток сахара превращается в соответствующий защищенный амидный продукт присоединения аминокислоты. Этот продукт присоединения обрабатывают альдолазой и получают α-гидроксикарбоксилат 2. Соединение 2 превращают в соответствующее производное ЦМФ под действием ЦМФ-СК-синтетазы с последующим каталитическим гидрированием производного ЦМФ и с получением соединения 3. Амин, введенный в результате образования продукта присоединения глицина, используют в качестве сайта присоединения ПЭГ посредством взаимодействия соединения 3 с активированным производным ПЭГ или ППГ (например, ПЭГ-С(О)NНS, ПЭГ-ОС(О)О-п-нитрофенилом), в результате чего получают такие соединения, как 4 или 5, соответственно.
В таблице 3 представлены репрезентативные примеры монофосфатов сахаров, дериватизированных молекулой ПЭГ. Некоторые из этих соединений таблицы 3 получают методом, проиллюстрированным на схеме 4. Другие производные получают хорошо известными методами. См., например, Keppler et al., Glycobiology 11:11R (2001) и Charter et al., Glycobiology 10:1049 (2000). Другие реагирующие с амином аналоги ПЭГ и ППГ являются коммерчески доступными, либо они могут быть получены методами, легко осуществляемыми специалистами в данной области.
Модифицированные фосфаты сахаров, используемые для осуществления настоящего изобретения, могут быть замещены в других положениях, а также в положениях, указанных выше. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными замещениями сиаловой кислоты являются замещения, проиллюстрированные в нижеследующей формуле:
2
2
1
5
1
2
3
4
5
где Х представляет собой линкерную группу, предпочтительно, выбранную из -О-, -N(Н)-, -S, СН- и N(R), где каждый из R представляет собой член, независимо выбранный из R-R. Каждый из символов Y, Z, А и В означает группу, выбранную из групп, указанных выше для Х. Каждый из Х, Y, Z, А и В является независимо выбранным, а поэтому эти группы могут быть одинаковыми или различными. Символы R, R, R, R и R означают Н, фрагмент ПЭГ, терапевтический фрагмент, биомолекулу или другой фрагмент. Альтернативно, эти символы означают линкер, связанный с фрагментом ПЭГ, терапевтическим фрагментом, биомолекулой или другим фрагментом.
х
Репрезентативными фрагментами, связанными с описанными здесь конъюгатами, являются, но не ограничиваются ими, производные ПЭГ (например, ацил-ПЭГ, ацил-алкил-ПЭГ, алкил-ацил-ПЭГ, карбамоил-ПЭГ, арил-ПЭГ), производные ППГ (например, ацил-ППГ, ацил-алкил-ППГ, алкил-ацил-ППГ, карбамоил-ППГ, арил-ППГ), терапевтические фрагменты, диагностические фрагменты, маннозо-6-фосфат, гепарин, гепаран, SLе, манноза, маннозо-6-фосфат, сиалил-Lewis-Х, FGF, VFGF, белки, хондротин, кератан, дерматан, альбумин, интегрины, антенные олигосахариды, пептиды и т.п. Методы конъюгирования различных модифицирующих групп с сахаридной группой легко доступны для специалистов в данной области (Poly(Ethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed., Plenum Pub. Corp., 1992; Poly(Ethylene Glycol) Chemical and Biological Applications, J. Milton Harris, Ed., ACS Symposium Series № 680, American Chemical Society, 1997; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996 & Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol.469, American Chemical Society, Washington, DC. 1991).
Линкерные группы (перекрестносшивающие группы)
Получение модифицированного сахара, используемого в способах согласно изобретению, включает присоединение фрагмента ПЭГ к сахарному остатку, а предпочтительно, образование стабильного продукта присоединения, который является субстратом для гликозилтрансферазы. Так, например, для получения конъюгата ПЭГ и сахара часто предпочтительно использовать линкер, например линкер, образующийся в результате реакции ПЭГ и сахарной группы с перекрестносшивающим агентом. Репрезентативными бифункциональными соединениями, которые могут быть использованы для присоединения модифицирующих групп к углеводным фрагментам, являются, но не ограничиваются ими, бифункциональные полиэтиленгликоли, полиамиды, простые полиэфиры, сложные полиэфиры и т.п. Общие методы присоединения углеводов к другим молекулам известны из литературы. См., например, Lee et al., Biochemistry 28:1856 (1989); Bhatia et al., Anal. Biochem. 178:408 (1989); Janda et al., J. Am. Chem. Soc. 112:8886 (1990) и Bednarski et al., WO 92/18135. Ниже обсуждаются реакционноспособные группы, обработанные так, чтобы это благоприятно влияло на рост сахарной цепи модифицированного сахара. Это обсуждение приводится лишь в целях иллюстрации. Специалистам в данной области понятно, что обсуждение, касающееся реакционноспособных групп, также относится и к модифицирующим группам.
Для модификации компонентов модифицированного сахара с внутримолекулярными химическими поперечными связями используются различные реагенты (описание перекрестносшивающих реагентов и процедур сшивания можно найти в работах Wold F., Meth Enzymol. 25:623-651, 1972; Weetall H.H., & Cooney D.A., In: Enzymes as Drugs (Holcenberg & Roberts, eds), p.395-442, Wiley, New York, 1981; Ji T.H., Meth. Enzymol. 91:580-609, 1983; Mattson et al., Mol. Biol. Rep. 17:167-183, 1993, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Предпочтительные перекрестносшивающие реагенты происходят от различных реагентов нулевого порядка, гомобифункциональных и гетеробифункциональных перекрестносшивающих реагентов. Перекрестносшивающими реагентами нулевого порядка являются реагенты для прямого конъюгированния двух внутренних химических групп без введения внешних реагентов. К этой категории относятся агенты, катализирующие образование дисульфидной связи. Другими примерами являются реагенты, индуцирующие реакцию конденсации карбоксильной и первичной аминогруппы с образованием амидной связи, и такими реагентами являются карбодиимиды, этилхлорформиат, реагент Вудварда К (2-этил-5-фенилизоксазолий-3'-сульфонат) и карбонилдиимидазол. Помимо этих химических реагентов в качестве перекрестносшивающего реагента нулевого порядка может быть использован фермент трансглутаминаза (глутамил-пептид-γ-глутамилтрансфераза; ЕС 2.3.2.13). Этот фермент катализирует реакции переноса ацила на карбоксамидные группы связанных с белком глутаминильных остатков, обычно, с использованием первичной аминогруппы в качестве субстрата. Предпочтительные гомо- и гетеробифункциональные реагенты содержат два идентичных или два отличающихся сайта соответственно, которые могут реагировать с аминогруппой, с сульфгидрильной группой, с гуанидиногруппой, с индоловой группой или с неспецифической группой.
Очистка конъюгатов G-CSF
Рефолдинг нерастворимого G-CSF
Многие рекомбинантные белки, экспрессируемые в бактериях, экспрессируются в виде нерастворимых агрегатов в бактериальных тельцах включения. Тельца включения представляют собой отложения белка, обнаруживаемые в цитоплазматическом и в периплазматическом пространстве бактериальной клетки (см., например, Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)). Рекомбинантные белки G-CSF экспрессируются в бактериальных тельцах включения, и в настоящей заявке описаны способы осуществления рефолдинга этих белков в целях продуцирования активных белков G-CSF.
А. Условия для рефолдинга активного G-CSF
2
Для продуцирования активных белков G-CSF из бактериальных клеток белки G-CSF подвергают экспрессии в бактериальных тельцах включения, после чего бактерии собирают, подвергают дизрупции, а тельца включения выделяют и промывают. В одном из вариантов изобретения осуществляют три промывки: первую промывку проводят в буфере при рН 6,0-9,0, содержащем одновалентную соль, например хлорид натрия, неионогенный детергент, например тритон Х-100, ионогенный детергент, например дезоксихолат натрия, и EDTA; вторую промывку проводят в буфере, не содержащем детергента; а третью промывку проводят в HO. Затем белки в тельцах включения солюбилизируют. Солюбилизация может быть проведена с использованием денатурирующих агентов, хлорида гуанидиния или мочевины, при крайних значениях рН; либо детергентов или любых их комбинаций. В одном из вариантов изобретения для солюбилизации G-CSF используют 5-6М гуанидин-HCl или мочевину. В другом варианте изобретения добавляют ДТТ.
После солюбилизации денатурирующие агенты удаляют из смеси белка G-CSF. Удаление денатурирующего агента может быть проведено различными методами, включая разведение в буфере для рефолдинга или методами буферного обмена. Методы буферного обмена включают диализ, диафильтрацию, гель-фильтрацию и иммобилизацию белка на твердом носителе (см., например, Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)). Для удаления денатурирующих агентов может быть применена комбинация любого из вышеописанных методов.
Образование дисульфидной связи в белках G-CSF стимулируют добавлением буфера для рефолдинга, содержащего окислительно-восстановительную пару. Окислительно-восстановительными парами являются восстановленный и окисленный глутатион ((-JSF-I/GSSG), цистеин/цистин, цистеамин/цистамин, DTT/GSSG и DTE/GSSG (см., например, Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)). В одном из вариантов изобретения окислительно-восстановительной парой является GSH/GSSG в отношении 10:1.
Рефолдинг может быть осуществлен в буфере с рН в пределах, например, от 6,0 до 10,0. Буферы для рефолдинга могут включать и другие добавки для усиления рефолдинга, например L-аргинин (0,4-1М); ПЭГ; денатурирующие агенты в низких концентрациях, такие как мочевина (1-2М) и хлорид гуанидиния (0,5-1,5 М), и детергенты (например, Chaps, ДСН, СТАВ, лаурилмальтозид, Твин-80 и тритон Х-100).
После рефолдинга белок G-CSF может быть диализован для удаления окислительно-восстановительной пары или других нежелательных буферных компонентов. В одном из вариантов изобретения диализ проводят с использованием буфера, включающего ацетат натрия, глицерин и неионогенный детергент, например твин-80. После диализа белок G-CSF может быть дополнительно очищен и/или подвергнут концентрированию с помощью ионообменной хроматографии. В одном из вариантов изобретения используют катионообменную смолу SР-сефарозу.
Специалистам в данной области известно, что “правильный” рефолдинг белка происходит в том случае, если такой подвергаемый рефолдингу белок обладает детектируемой биологической активностью. Биологическая активность белка G-CSF может быть измерена различными методами. Так, например, биологически активные белки G-CSF являются субстратами для О-связанного гликозилирования, описанного в заявке на патент США 60/535284, поданной 8 января 2004; заявке 60/544411, поданной 12 февраля 2004, и в заявке, имеющей регистрационный номер, присвоенный патентным поверенным, 019957-018820US и поданной 20 февраля 2004, каждая из которых во всей своей полноте и для всех целей осуществления изобретения вводится в настоящее описание посредством ссылки. Активность белка G-CSF может быть измерена с помощью анализов на пролиферацию клеток или анализов лейкоцитарной формулы для крыс (такие анализы также описаны в заявке на патент США 60/535284, поданной 8 января 2004; в заявке 60/544411, поданной 12 февраля 2004, и в заявке, имеющей регистрационный номер, присвоенный патентным поверенным, 019957-018820US, поданной 20 февраля 2004, каждая из которых во всей своей полноте и для всех целей осуществления изобретения вводится в настоящее описание посредством ссылки. Анализы на пролиферацию и анализы лейкоцитарной формулы могут быть проведены до или после О-связанного гликозилирования подвергнутых рефолдингу белков G-CSF.
Другие способы выделения конъюгатов согласно изобретению
Альтернативно, продукты, полученные вышеуказанными способами, могут быть использованы без очистки. Однако обычно предпочтительно, чтобы данный продукт был выделен. Для этого могут быть применены стандартные хорошо известные методы выделения гликозилированных сахаридов, такие как тонкослойная и толстослойная хроматография, колоночная хроматография, ионообменная хроматография или мембранная фильтрация. При этом, для выделения, предпочтительно, проводить мембранную фильтрацию, а более предпочтительно использовать обратную осмотическую мембрану или один или несколько методов колоночной хроматографии, как обсуждалось ранее и в цитируемой здесь литературе. Так, например, для удаления белков, таких как гликозилтрансферазы, может быть использована мембранная фильтрация, где мембраны имеют молекулярную массу с отсечкой примерно от 3000 до 10000. Затем для удаления солей и/или для очистки сахаридных продуктов могут быть использованы нанофильтрация или обратный осмос (см., например, WO98/15581). Нанофильтровальные мембраны представляют собой класс обратноосмотических мембран, которые пропускают одновалентные соли, но удерживают поливалентные соли и незаряженные растворенные вещества, имеющие молекулярную массу более чем примерно 100-2000 Дальтон, в зависимости от используемой мембраны. Таким образом, в типичных применениях, сахариды, полученные способами согласно изобретению, будут удерживаться в мембране, а контаминирующие соли будут проходить через мембрану.
Если модифицированный гликопротеин продуцируется внутри клетки, как в первой стадии, то дебрис крупных частиц, либо клеток-хозяев, либо лизированных фрагментов, удаляют, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации, и этот белок, но необязательно, может быть концентрирован с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрации белков с последующим отделением полипептидных вариантов от других примесей в одной или нескольких стадиях, выбранных из стадий проведения иммуноаффинной хроматографии, фракционирования на ионообменной колонке (например, на диэтиламиноэтиле (DEAE) или на матрицах, содержащих карбоксиметильные или сульфопропильные группы), хроматографии на Blue-сефарозе, СМ-Blue-сефарозе, хроматографии на MONO-Q, MONO-S, хроматографии на лектине чечевицы-сефарозе, хроматографии на WGA-сефарозе, хроматографии на Con A-сефарозе, хроматографии на эфире-Toyopearl, на бутил-Toyopearl, фенил-Toyopearl или на белок А-сефарозе, хроматографии в ДСН-ПААГ, хроматографии на двуокиси кремния, хроматофокусирования, обращенно-фазовой ВЭЖХ (например, на силикагеле, к которому присоединены алифатические группы), гель-фильтрации, например на Сефадексе и молекулярных ситах, или эксклюзионной хроматографии, хроматографии на колонках, селективно связанных с полипептидом, и преципитации этанолом или сульфатом аммония.
Модифицированные гликопептиды, продуцированные в культуре, обычно сначала выделяют путем экстракции из клеток, ферментов и т.п., а затем проводят одну или несколько стадий концентрирования, высаливания, водной ионообменной хроматографии или эксклюзионной хроматографии. Кроме того, модифицированный гликопротеин может быть очищен аффинной хроматографией. И, наконец, для проведения конечных стадий очистки может быть применена ВЭЖХ.
В любые из предыдущих стадий может быть включен ингибитор протеазы, например метилсульфонилфторид (PMSF) для ингибирования протеолиза, а для предотвращения попадания случайных примесей могут быть включены антибиотики.
В другом варианте изобретения супернатанты из систем, которые продуцируют модифицированный гликопептид согласно изобретению, сначала концентрируют с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрации белков, например устройства для ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon. После проведения стадии концентрирования концентрат может быть нанесен на подходящую матрицу для очистки. Так, например, подходящая аффинная матрица может содержать лиганд для пептида, лектин или молекулу антитела, связанные с подходящим носителем. Альтернативно, может быть использована анионообменная смола, например матрица или субстрат, имеющие боковые группы DЕАЕ. Подходящими матрицами являются акриламид, агароза, декстран, целлюлоза и вещества других типов, обычно применяемые для очистки белка. Альтернативно, может быть проведена стадия катионообменной хроматографии. Подходящими катионообменниками являются различные нерастворимые матрицы, содержащие сульфопропильные или карбоксиметильные группы. Особенно предпочтительными являются сульфопропильные группы.
И, наконец, для дополнительной очистки композиции полипептидного варианта могут быть проведены одна или несколько ОФ-ВЭЖХ-стадий, в которых используются гидрофобные ОФ-ВЭЖХ-среды, например силикагель, имеющий боковые метильные или другие алифатические группы. Для получения гомогенного модифицированного гликопротеина могут быть также проведены некоторые или все вышеупомянутые стадии очистки в различных комбинациях.
Модифицированный гликопептид согласно изобретению, полученный в результате проведения крупномасштабной ферментации, может быть очищен методами, аналогичными методам, описанным Urdal et al., J. Chromatog. 296:171 (1984). В этой работе описаны две последовательные ОФ-ВЭЖХ-стадии очистки рекомбинантного человеческого IL-2 на препаративной ВЭЖХ-колонке. Альтернативно, для очистки модифицированного гликопротеина могут быть применены такие методы, как аффинная хроматография.
Фармацевтические композиции
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции. Эта фармацевтическая композиция включает фармацевтически приемлемый разбавитель и ковалентный конъюгат, содержащий неприродную молекулу ПЭГ, терапевтическую молекулу или биомолекулу и гликозилированный или негликозилированный пептид. Указанный полимер, терапевтическую молекулу или биомолекулу конъюгируют с пептидом G-CSF посредством интактной гликозильной линкерной группы, расположенной между ними и ковалентно связанной с пептидом G-CSF и полимером, терапевтической молекулой или биомолекулой.
Remington's Pharmaceutical Sciences
Science
Фармацевтические композиции согласно изобретению являются подходящими для их использования в различных системах доставки лекарственных средств. Композиции, подходящие для использования в настоящем изобретении, можно найти в руководстве , Maсе Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed (1985). Краткий обзор методов доставки лекарственных средств можно найти у Langer,  249:1527-1533 (1990).
Фармацевтические композиции могут быть приготовлены для любого подходящего способа введения, включая, например, местное, пероральное, интраназальное, внутривенное, внутричерепное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Носитель для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, предпочтительно, содержит воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения может быть использован любой из вышеуказанных носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрийсодержащий сахарин, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. В качестве носителей для фармацевтических композиций согласно изобретению могут быть также использованы биологически разлагаемые микросферы (например, полилактат-полигликолят). Подходящие биологически разлагаемые микросферы описаны, например, в патентах США № 4897268 и 5075109.
Обычно, фармацевтические композиции вводят парентерально, например внутривенно. Таким образом, настоящее изобретение относится к композициям для парентерального введения, содержащим соединение, растворенное или суспендированное в приемлемом носителе, предпочтительно, в водном носителе, например в воде, в забуференной воде, в физиологическом растворе, PBS и т.п. Такие композиции могут содержать фармацевтически приемлемые добавки, необходимые для коррекции физиологических условий, такие как рН-корректирующие агенты и забуферивающие агенты, а также агенты, придающие тоничность, смачивающие агенты, детергенты и т.п.
Эти композиции могут быть стерилизованы стандартными методами, либо они могут быть подвергнуты стерильной фильтрации. Полученные водные растворы могут быть упакованы для непосредственного использования в том виде, в каком они были получены, или лиофилизованы; причем лиофилизованный препарат, перед его введением, может быть разведен стерильным водным носителем. рН данного препарата обычно составляет от 3 до 11, более предпочтительно, от 5 до 9, а наиболее предпочтительно, от 7 до 8.
В некоторых вариантах изобретения гликопептиды согласно изобретению могут быть введены в липосомы, полученные из стандартных образующих везикулы липидов. Для получения липосом существует ряд методов, описанных, например, в работе Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), в патентах США № 4235871, 4501728 и 4837028. Доставка липосом с использованием различных нацеливающих агентов (например, сиалилгалактозидов согласно изобретению) хорошо известна специалистам (см., например, патенты США № 4957773 и 4604044).
Могут быть использованы стандартные методы присоединения нацеливающих агентов к липосомам. Эти методы обычно включают введение в липосомы липидных компонентов, таких как фосфатидилэтаноламин, которые могут быть активированы для присоединения нацеливающих агентов или дериватизированных липофильных соединений, таких как дериватизированные липидом гликопептиды согласно изобретению.
Механизмы доставки обычно требуют, чтобы агенты для направленной доставки находились на поверхности липосомы в таком положении, в котором такие молекулы будут доступны для взаимодействия с мишенью, например с рецептором клеточной поверхности. Углеводы согласно изобретению могут быть присоединены к липидной молекуле перед образованием липосом методами, известными специалистам (например, путем алкилирования или ацилирования гидроксильной группы, присутствующей на углеводе, длинноцепочечным алкилгалогенидом или жирной кислотой соответственно). Альтернативно, липосома может быть получена таким образом, чтобы в мембрану, во время ее формирования, сначала была введена связывающая часть. Такая связывающая часть должна иметь липофильную часть, которая прочно погружена в мембрану и заякорена на ней. Эта связывающая часть должна иметь реакционноспособную часть, которая является химически доступной на водной поверхности липосомы. Эту реакционноспособную часть выбирают так, чтобы, по своей химической структуре, она могла образовывать стабильную химическую связь с нацеливающим агентом или с углеводом, добавляемыми позже. В некоторых случаях нацеливающий агент можно присоединять непосредственно к соединяющей молекуле, но в большинстве случаев более предпочтительно использовать третью молекулу, действующую как химический мостик, который позволяет присоединять связывающую молекулу, находящуюся на мембране, к нацеливающему агенту или к углеводу, который выступает за пределы поверхности везикулы в окружающее пространство.
125
14
Соединения, полученные способами согласно изобретению, могут быть также использованы в качестве диагностических реагентов. Так, например, меченые соединения могут быть использованы для определения локализации областей воспаления или опухолевых метастазов у пациента с подозрением на воспаление. Для такого применения соединения могут быть помечены I, С или тритием.
~
~
in vivo
Активный ингредиент, используемый в фармацевтических композициях согласно изобретению, представляет собой гликопэгилированный G-CSF или его производные, обладающие биологическими свойствами фолликулостимулирующего гормона, стимулирующими, например, овуляцию. Композицию G-CSF согласно изобретению, предпочтительно, вводят парентерально (например, i.v., i.m., s.c. или i.p.). Очевидно, что эффективные дозы могут значительно варьироваться в зависимости от состояния, подвергаемого лечению, и от способа введения, однако предполагается, что эти дозы будут составлять в пределах примерно от 0,1 (7 ед.) до 100 (7000 ед.) мкг активного вещества/кг массы тела. Для лечения анемии предпочтительные дозы составляют примерно от 50 до 300 единиц/кг и вводятся три раза в неделю. Поскольку настоящее изобретение относится к G-CSF с увеличенным временем пребывания , то, при введении композиции согласно изобретению, указанные дозы могут быть, но необязательно, снижены.
Нижеследующие примеры приводятся для иллюстрации конъюгатов и способов их получения согласно изобретению, однако эти примеры не должны рассматриваться как ограничение заявленного изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Гликопэгилирование G-CSF, продуцированного в клетках СНО
а. Получение асиало-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF)
2
3
3
Vibrio choleraе
G-CSF, продуцированный в клетках СНО, растворяли при плотности 2,5 мг/мл в 50 мМ трис-HCl, рН 7,4, 0,15 М NаСl, 5 мМ СаCl и концентрировали до 500 мкл на фильтрующей центрифуге Centricon Plus 20. Полученный раствор инкубировали с 300 мЕд/мл нейраминидазы II () в течение 16 часов при 32°С. Для мониторинга данной реакции небольшую аликвоту реакционной смеси разводили соответствующим буфером и проводили изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) в геле. Затем реакционную смесь добавляли к предварительно промытому конъюгату “N-(п-аминофенил)оксаминовая кислота-агароза” (800 мкл/мл объема реакционной смеси) и промытые сферы слегка перемешивали вращением в течение 24 часов при 4°С. Смесь центрифугировали при 10000 об/мин и супернатант собирали. Сферы 3 раза промывали буфером Трис-EDTA, один раз - 0,4 мл буфера Трис-EDTA и один раз 0,2 мл буфера Трис-EDTA и все супернатанты объединяли. Супернатант диализовали при 4°С против 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1М NаСl, 0,05% NаN, а затем еще два раза против 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1М NаСl, 0,05% NаN. После этого диализованный раствор концентрировали на фильтрующей центрифуге Centricon Plus 20 и хранили при -20°С. ИЭФ в геле проводили в условиях, соответствующих процедурам и реагентам от Invitrogen. Образцы нативного и десиалилированного G-CSF диализовали против воды и анализировали с помощью MALDI-TOF-МS.
b. Получение G-CSF-(альфа2,3)-сиалил-ПЭГ
3
Десиалилированный G-CSF растворяли при плотности 2,5 мг/мл в 50 мМ Трис-HCl, 0,15 М NаСl, 0,05% NаN, рН 7,2. Полученный раствор инкубировали с 1 мМ ЦМФ-сиаловая кислота-ПЭГ и 0,1 мЕд/мл SТ3Gal1 при 32°С в течение 2 дней. Для мониторинга включения сиаловой кислоты-ПЭГ к небольшой аликвоте реакционной смеси ЦМФ-СК-ПЭГ добавляли флуоресцентный лиганд и метку, включенную в пептид, отделяли от свободной метки с помощью гель-фильтрации на аналитической колонке Toso Haas G3000SW с использованием буфера PBS (рН 7,1). Включение флуоресцентной метки в пептид количественно оценивали с помощью подключенного флуоресцентного детектора. Через 2 дня реакционную смесь очищали на препаративной колонке Toso Haas G3000SW с использованием буфера PBS (рН 7,1) и фракции собирали исходя из УФ-поглощения. Продукт реакции анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и ИЭФ-анализ проводили с применением процедур и реагентов от Invitrogen. Образцы нативного и ПЭГилированного G-CSF диализовали против воды и анализировали с помощью MALDI-TOF-МS.
с. Получение G-CSF-(альфа2,8)-сиалил-ПЭГ
3
G-CSF, продуцированный в клетках СНО и содержащий альфа2,3-сиалилированный О-связанный гликан, растворяли при плотности 2,5 мг/мл в 50 мМ Трис-HCl, 0,15 М NаСl, 0,05% NаN, рН 7,2. Полученный раствор инкубировали с 1 мМ конъюгата ЦМФ-сиаловая кислота-ПЭГ и 0,1 Ед/мл СSТ-II при 32°С в течение 2 дней. Для мониторинга включения сиаловой кислоты-ПЭГ к небольшой аликвоте реакционной смеси ЦМФ-СК-ПЭГ добавляли флуоресцентный лиганд и метку, включенную в пептид, отделяли от свободной метки с помощью гель-фильтрации на аналитической колонке Toso Haas G3000SW с использованием буфера PBS (рН 7,1). Включение флуоресцентной метки в пептид количественно оценивали с помощью подключенного флуоресцентного детектора. Через 2 дня реакционную смесь очищали на препаративной колонке Toso Haas G3000SW с использованием буфера PBS (рН 7,1) и фракции собирали исходя из УФ-поглощения. Продукт реакции анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и ИЭФ-анализ проводили с применением процедур и реагентов от Invitrogen. Образцы нативного и ПЭГилированного G-CSF диализовали против воды и анализировали с помощью MALDI-TOF-МS.
d. Получение G-CSF-(альфа2,6)-сиалил-ПЭГ
3
G-CSF, содержащий только О-связанный GalNAc, растворяли при плотности 2,5 мг/мл в 50 мМ трис-HCl, 0,15 М NаСl, 0,05% NаN, рН 7,2. Полученный раствор инкубировали с 1 мМ конъюгата ЦМФ-сиаловая кислота-ПЭГ и 0,1 Ед/мл SТ6GalNAc I или II при 32°С в течение 2 дней. Для мониторинга включения сиаловой кислоты-ПЭГ к небольшой аликвоте реакционной смеси ЦМФ-СК-ПЭГ добавляли флуоресцентный лиганд и метку, включенную в пептид, отделяли от свободной метки с помощью гель-фильтрации на аналитической колонке Toso Haas G3000SW с использованием буфера PBS (рН 7,1). Включение флуоресцентной метки в пептид количественно оценивали с помощью подключенного флуоресцентного детектора. Через 2 дня реакционную смесь очищали на препаративной колонке Toso Haas G3000SW с использованием буфера PBS (рН 7,1) и фракции собирали исходя из УФ-поглощения. Продукт реакции анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и ИЭФ-анализ проводили с применением процедур и реагентов от Invitrogen. Образцы нативного и ПЭГилированного G-CSF диализовали против воды и анализировали с помощью MALDI-TOF-МS.
G-CSF, продуцированный в клетках СНО, обрабатывали сиалидазой бактерии рода Arthrobacter, после чего очищали эксклюзионной хроматографией на Superdex 75 и обрабатывали SТ3Gal1 или SТ3Gal2, а затем конъюгатом ЦМФ-СК-ПЭГ, 20 кДа. Полученную молекулу очищали ионообменной хроматографией и гель-фильтрацией, и анализ, проведенный с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, указывал на завершение ПЭГилирования. Это является первым свидетельством гликопэгилирования О-связанного гликана.
Пример 2
Экспрессия, рефолдинг и очистка рекомбинантного G-CSF
- Клетки собирают путем центрифугирования, и супернатант отбрасывают. Результаты культивирования на различных средах представлены на фиг.9.
- Клеточный осадок ресуспендируют в 10 мл/г буфера для лизиса, содержащего 10 мМ Трис рН 7,4, 75 мМ NаСl, 5 мМ EDTA.
- Клетки подвергают микрофлюидизации (с использованием также пресса Френча).
- Клетки центрифугируют в течение 30 минут, при 4°С и при 5000 об/мин, и супернатант отбрасывают.
- Осадок ресуспендируют в буфере для лизиса и центрифугируют, как описано выше.
- IB промывают в 25 мМ Трис, рН 8, 100 мМ NаСl, 1% ТХ-100, 1% NаDОС, 5 мМ EDTA. Осадки ресуспендируют путем пипетитирования и встряхивания. Затем его центрифугируют 15 минут при 4°С и при 5000 об/мин. Эту стадию повторяют еще один раз (всего две промывки).
- Осадки два раза промывают в 25 мМ трис, рН 8, 100 мМ NаСl, 5 мМ EDTA для удаления детергентов и центрифугируют, как описано выше.
2
- Осадки ресуспендируют в dHO для разделения на аликвоты и центрифугируют, как описано выше. Осадки замораживают при -20°С.
- IB ресуспендируют при 20 мг/мл в 6М гуанидин-HCl, 5 мМ EDTA, 100 мМ NаСl, 100 мМ Трис, рН 8, 10 мМ ДТТ, с использованием пипеттора с последующим перемешиванием в течение 2-4 часов при комнатной температуре.
- Солюбилизированный IB центрифугируют в течение 1 мин при комнатной температуре при 14000 об/мин. Супернатант сохраняют.
- Супернатант разводят 1:20 буфером для рефолдинга, содержащим 50 мМ MES, рН 6, 240 мМ NаСl, 10 мМ.
- Затем добавляют буфер, содержащий КСl, 0,3 мМ лаурилмальтозид, 0,055% ПЭГ3350, 1 мМ GSН, 0,1М GSSG, 0,5М аргинин, и проводят рефолдинг на ротационном шейкере в течение ночи при 4°С.
- Смесь для рефолдинга переносят на змеевик Pierce с отсечкой молекулярной массы (MWCO) 7 кДа для диализа. Диализ проводят в буфере, содержащем 20 мМ NаОАс, рН 4, 50 мМ NаСl, 0,005% Твин-80, 0,1 мМ EDTA. Диализ проводят всего 3 раза против, по меньшей мере, 200-кратного избытка, при 4°С.
- После диализа материал пропускают через 0,45 мкМ-фильтр.
- Колонку с SР-сефарозой уравновешивают буфером для диализа и наносят образец. Колонку промывают буфером для диализа и элюируют буфером для диализа, содержащим солевой градиент до 1М NаСl. Белок обычно элюируют при 300-400 мМ NаСl.
- Материал анализируют с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (см., например, фиг.10).
Пример 3
Метод с использованием двух ферментов в двух сосудах
В нижеследующем примере проиллюстрировано получение G-CSF-GalNAc-SA-PEG в двух последовательных стадиях, где каждый промежуточный продукт очищали перед его использованием в следующей стадии.
Получение G-CSF-GalNAc (рН 6,2) из G-CSF и UDP-GalNAc с использованием GalNAc-Т2
а.
3
2
G-CSF (960 мкг) в 3,2 мл буфера для упаковки концентрировали путем ультрафильтрации с использованием УФ-фильтра (MWCO 5K), а затем разводили 1 мл 25 мМ буфера МЕS (рН 6,2, 0,005% NаN). Затем добавляли UDP-GalNAc (6 мг, 9,24 мМ), GalNAc-Т2 (40 мкл, 0,04 ед.) и 100 мМ MnCl (40 мкл, 4 мМ) и полученный раствор инкубировали при комнатной температуре.
280
Через 24 часа MALDI-анализ указывал на завершение реакции. Реакционную смесь подвергали прямой ВЭЖХ-очистке с использованием SЕС (Superdex 75 и Superdex 200) и буфера для элюирования, содержащего PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 4,9, и 0,005% Твин 80). Собранный пик G-CSF-GalNAc концентрировали с использованием фильтра Centricon с MWCO 5 кДа до концентрации 150 мкл и объем доводили до 1 мл с использованием PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 4,9, и 0,005% Твин 80). Конечная концентрация белка составляла 1 мг/мл (А), выход 100%. Образец хранили при 4°С.
b. Получение G-CSF-GalNAc-СК-ПЭГ с использованием очищенных G-CSF-GalNAc, ЦМФ-СК-ПЭГ (20 КДа) и мышиного SТ6GalNAc-Т1 (рН 6,2)
3
2
В растворе G-CSF-GalNAc, содержащем 1 мг белка, буфер заменяли 25 мМ буфером МЕS (рН 6,2, 0,005% NаN) и добавляли ЦМФ-СК-ПЭГ (20 КДа)(5 мг, 0,25 мкмоль). После растворения добавляли MnCl (100 мкл, 100 мМ раствор) и SТ3GalNAc-1 (100 мкл, мышиный фермент) и реакционную смесь медленно перемешивали при 32°С в течение трех дней. Затем реакционную смесь концентрировали путем ультрафильтрации (MWCO 5K) и проводили одну замену буфера на 25 мМ NаОАс (рН 4,9), после чего концентрировали до объема всего 1 мл. Затем продукт очищали с использованием SР-сефарозы (А: 25 мМ NаОАс+0,005% Твин-80, рН 4,5; В: 25 мМ NаОАс+0,005% Твин-80, рН 4,5+2М NаСl) при времени удерживания 13-18 минут и SЕС (Superdex 75; PBS-рН 7,2, 0,005% твин-80) при времени удерживания 8,6 минут (Superdex 75; скорость потока 1 мл/мин). Нужные фракции собирали, концентрировали до 0,5 мл и хранили при 4°С.
Пример 4
Метод получения G-CSF-GalNAc-СК-ПЭГ в одном сосуде с одновременным добавлением ферментов
В нижеследующем примере проиллюстрировано получение G-CSF-GalNAc-СК-ПЭГ в одном сосуде с одновременным добавлением ферментов.
1. Реакция в одном сосуде с использованием мышиного SТ6GalNAc-1 (рН 6,0)
3
2
280
G-CSF (960 мкг белка, растворенного в 3,2 мл буфера для приготовления продукта) концентрировали путем ультрафильтрации (MWCO 5K) до 0,5 мл, а затем разводили 25 мМ буфера МЕS (рН 6,0, 0,005% NаN) до объема всего примерно 1 мл или до концентрации белка 1 мг/мл. Затем добавляли UDP-GalNAc (6 мг, 9,21 мкмоль), GalNAc-Т2 (80 мкл, 80 мЕд), ЦМФ-СК-ПЭГ (20 кДа)(6 мг, 0,3 мкмоль), после чего добавляли мышиный фермент SТ6GalNAc-1 (120 мкл) и 100 мМ MnCl (50 мкл). Полученный раствор перемешивали при 32°С в течение 48 часов и очищали в стандартных условиях хроматографии на SР-сефарозе. Было получено всего 0,5 мг белка (А), или общий выход составлял примерно 50%. Структуру продукта подтверждали с помощью анализа MALDI и электрофореза в ДСН-ПААГ.
2. Реакция в одном сосуде с использованием куриного SТ6GalNAc-1 (рН 6,0)
3
2
280
14,4 мг G-CSF концентрировали до конечного объема 3 мл, а затем буфер заменяли 25 мМ буфером МЕS (рН 6,0, 0,05% NаN, 0,004% Твин-80) и объем доводили до 13 мл. Затем добавляли UDP-GalNAc (90 мг, 150 мкмоль), GalNAc-Т2 (0,59 ед.), ЦМФ-СК-ПЭГ (20 кДа)(90 мг), куриный SТ6GalNAc-1 (0,44 ед) и 100 мМ MnCl (600 мкл). Полученную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 60 часов. Затем реакционную смесь концентрировали путем ультрафильтрации (MWCO 5K) и центрифугировали. Остаток (примерно 2 мл) растворяли в 25 мМ буфера NаОАс (рН 4,5) и снова концентрировали до конечного объема всего 5 мл. Этот образец очищали с использованием SР-сефарозы в течение примерно 10-23 минут, SЕС (Superdex 75; 17 минут, скорость потока 0,5 мл/мин) и снова SЕС (Superdex 200; 23 минуты, скорость потока 0,5 мл/мин), в результате чего получали 3,6 мг (общий выход 25%) G-CSF-GalNAc-СК-ПЭГ (20 кДа)(А и ВСА-метод).
Пример 5
Метод получения G-CSF-GalNAc-Gal-СК-ПЭГ в одном сосуде с последовательным добавлением ферментов
В нижеследующем примере проиллюстрировано получение G-CSF-GalNAc-Gal-СК-ПЭГ в одном сосуде с последовательным добавлением ферментов.
1. Получение исходя из GalNAc-G-CSF
Получение G-CSF-GalNAc (рН 6,2) из G-CSF и UDP-GalNAc с использованием GalNAc-Т2
а.
3
2
G-CSF (960 мкг) в 3,2 мл буфера для упаковки концентрировали на фильтре для ультрафильтрации (MWCO 5K), а затем разводили 1 мл 25 мМ буфера МЕS (рН 6,2, 0,005% NаN). Затем добавляли UDP-GalNAc (6 мг, 9,24 мМ), GalNAc-Т2 (40 мкл, 0,04 ед) и 100 мМ MnCl (40 мкл, 4 мМ) и полученный раствор инкубировали при комнатной температуре.
b. Получение G-CSF-GalNAc-Gal-СК-ПЭГ из G-CSF-GalNAc, УДФ-галактозы, СК-ПЭГ (20 КДа) и соответствующих ферментов
2
280
УДФ-галактозу (4 мг, 6,5 мкмоль), конъюгат “остов -1-Gal-Т” (320 мкл, 160 мЕд), ЦМФ-СК-ПЭГ (20 кДа) (8 мг, 0,4 мкмоль), ST3Gal2 (80 мкл, 0,07 мЕд) и 100 мМ MnCl (80 мкл) непосредственно добавляли к неочищенной реакционной смеси G-CSF-GalNAc (1,5 мг) в 1,5 мл 25 мМ буфера MES (pH 6,0) вышеуказанной стадии (а). Полученную смесь инкубировали при 32°С в течение 60 часов. Реакционную смесь центрифугировали и раствор концентрировали с помощью ультрафильтрации (MWCO 5K) до 0,2 мл, а затем снова растворяли в 25 мМ NaOAc (pH 4,5) до конечного объема 1 мл. Продукт очищали на SP-сефарозе (время удерживания 10-15 минут), а затем фракцию пика концентрировали на фильтрующей центрифуге (MWCO 5K) и остаток снова очищали с использованием SEC (Superdex 75, время удерживания 10,2 мин). После концентрирования на фильтрующей центрифуге (MWCO 5K) белок разводили до 1 мл с использованием буфера для получения композиции, содержащей PBS, 2,5% маннита, 0,005% полисорбата, рН 6,5, и получали композицию при концентрации 850 мкг белка на 1 мл продукта (А). Общий выход составлял 55%.
Пример 6
Метод получения G-CSF-GalNAc-Gal-СК-ПЭГ в одном сосуде с одновременным добавление ферментов
а. Получение исходя из G-CSF
3
2
280
~
G-CSF (960 мкг, 3,2 мл) концентрировали путем ультрафильтрации (MWCO 5K), а затем разводили 25 мМ буфера МЕS (рН 6,0, 0,005% NаN). Полный объем раствора G-CSF доводили примерно до 1 мг/мл. Затем добавляли UDP-GalNAc (6 мг), GalNAc-Т2 (80 мкл, 80 мкЕд), UDP-Gal (6 мг), конъюгат “остов 1-GalT” (160 мкл, 80 мкЕд), ЦМФ-СК-ПЭГ(20K) (6 мг), 2,3-(О)-сиалилтрансферазу (160 мкл, 120 мкЕд) и 100 мМ MnCl (40 мкл). Полученную смесь инкубировали при 32°С в течение 48 часов. Очистку проводили, как описано ниже с применением ИЭФ и SEC. Полученную фракцию, содержащую продукт, концентрировали путем ультрафильтрации (MWCO 5K) и объем доводили примерно до 1 мл добавлением буфера. Концентрация белка, как было определено по А, составляла 0,392 мг/мл, а общий выход из расчета G-CSF составлял 40%.
Очевидно, что описанные здесь примеры и варианты приводятся лишь в иллюстративных целях, и исходя из описания настоящего изобретения специалист в данной области может внести различные модификации или изменения, которые не выходят за рамки объема и сущности настоящего изобретения и прилагаемой формулы изобретения. Все цитируемые здесь публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте и для всех целей осуществления изобретения вводятся в настоящее описание посредством ссылки.