ИНГИБИТОРЫ МУТАНТНОЙ ФОРМЫ КИНАЗЫ KIT
INHIBITORS OF KIT KINASE MUTANT FORM

Настоящее изобретение относится к лечению заболеваний, зависимых от киназы KIT, которые характеризуются мутантной формой KIT, при этом идентифицируют мутант KIT и вводят соответствующий ингибитор указанного мутанта KIT.
Ген c-kit кодирует рецепторную тирозинпротеинкиназу, которая известна под названием киназы KIT, причем известно также название - рецептор фактора роста тучных/стволовых клеток. Аминокислотная последовательность KIT и нуклеотидная последовательность гена c-kit в настоящее время определены (см. Swiss Prot.: P10721). После связывания с лигандом, фактором стволовых клеток, KIT образует димер, который автофосфорилируется и активирует сигнальный каскад, который приводит к росту клеток. Известны мутации, которые приводят к образованию активированной формы KIT, прежде всего формы, активируемой независимо от ее лиганда, при этом считается, что такие мутации играют роль в развитии некоторых пролиферативных заболеваний, таких как заболевания тучных клеток, например мастоцитоз, прежде всего системный мастоцитоз, острый миелогенный лейкоз, желудочно-кишечные стромальные опухоли, синусно-назальная лимфома NK/T-клеток, семиномы и дисгерминомы.
Известно, что иматиниб, который выпускается в виде мезилата под торговым названием Glivec или Gleevec, ингибирует KIT дикого типа и некоторые мутации KIT, например мутации в экзонах, которые обычно наблюдаются при желудочно-кишечных стромальных опухолях (GIST). Однако этот препарат является неактивным или проявляет значительно сниженную активность в отношении некоторых других мутантных форм KIT, например мутация D816V, которая обычно наблюдается при системном мастоцитозе. Настоящее изобретение основано на корреляции лечения заболевания, характеризующегося мутантной формой KIT, с использованием соответствующего альтернативного лекарственного средства, способного ингибировать мутант KIT.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения зависимого от KIT заболевания у пациента, включающему:
(а) идентификацию мутантной формы KIT, ассоциированной с зависимым от KIT заболеванием, и
(б) введение пациенту эффективного ингибирующего мутант KIT количества ингибитора, выбранного из группы, включающей мидостаурин, ваталаниб и соединение А.
Зависимые от KIT заболевания в основном являются пролиферативными заболеваниями, характеризующимися избыточной активностью киназы KIT за счет активирующей мутации киназы KIT. Такие активирующие мутации известны в данной области техники, и методы их идентификации также известны.
Зависимые от KIT заболевания включают заболевания, которые характеризуются следующими известными мутациями KIT: D816F, D816H, D816N, D816Y, D816V, К642Е, Y823D, Del 550-558, Del 557-561, N822K, V654A, N822H, Del 550-558+V654A, Del 557-561+V654A, Ins503AY, V560G, 558NP, Del 557-558, Del VV559-560, F522C, Del 579, R634W, К642Е, T801I, C809G, D820Y, N822K, N822H, Y823D, Y823C и Т6701.
50
В главном варианте осуществления настоящего изобретения зависимым от KIT заболеванием является заболевание, устойчивое к иматинибу. Зависимым от KIT заболеванием, устойчивым к иматинибу, обычно называется зависимое от KIT заболевание, как описано выше, при котором иматиниб, введенный в дозе 400-1000 мг/сут, не обеспечивает достаточного ингибирования мутанта KIT и не проявляет заметное лечебное действие. В основном мутант KIT, устойчивый к иматинибу, характеризуется величиной IC in vitro более приблизительно 3 мкМ. Устойчивые к иматинибу мутации KIT включают D816F, D816H, D816N, D816Y, D816V, T670I и мутантные формы, включающие V654A.
Выбор соединения, ингибирующего мутантную форму KIT, основан на идентификации соединения или ряда соединений, способных ингибировать мутант KIT. Методы определения ингибирующей активности известны в данной области техники и представляются очевидными для специалистов в данной области.
Ингибиторы KIT по настоящему изобретению включают мидостаурин, ваталаниб и соединение А. Мидостаурин (US 5093330) и ваталаниб (WO 98/35958) известны в данной области техники. Соединение А характеризуется формулой
Указанное соединение можно получить по методике, как описано в заявке WO 04/005281.
Соответствующие дозы мидостаурина, ваталаниба и соединения А определяют стандартными способами.
Соответствующую дозу мидостаурина вводят, например, один, два или три раза в сутки, общая доза составляет 25-300, предпочтительно 50-300, более предпочтительно 50-100, наиболее предпочтительно 100-300 мг/сут, например два или три раза в сутки в общей дозе 150-250 мг, предпочтительно 225 мг в сутки.
Соответствующая суточная доза ваталаниба находится в диапазоне 300-4000 мг, например в диапазоне 300-2000 мг/сут или 300-1500 мг/сут, прежде всего 300, 500, 750, 1000, 1250, 1500 или 2000 мг/сут, прежде всего 1250 мг/сут.
Суточная доза соединения А для субъекта массой 70 кг составляет приблизительно 0,05-5 г, предпочтительно приблизительно 0,25-1,5 г.
Примеры
Ген KIT человека, кодирующий аминокислотный фрагмент 544-976, клонировали в донорной плазмиде бакуловируса pFB-GST-01. Эту кодирующую последовательность вырезали с использованием рестрикционных эндонуклеаз Bam H1 и EcoR1, затем лигировали с донорным вектором Bac-to-Bac pFB-GEX-Р1, содержащим совместимые концевые фрагменты. Затем стандартными методами вводили требуемые мутации в ген KIT. За счет сдвига рамки считывания в исходной плазмиде, которую использовали для получения последовательностей, кодирующих мутанты, мутантные вставки в плазмиде вырезали и вставляли в донорный вектор Bac-to-Bac pFB-GST-01 с использованием ректрикционных ферментов BamH1-EcoR1 для каждого мутанта, как показано на чертеже. Правильность секвенции в каждой мутантной плазмиде подтверждали методом автоматического секвенирования.
ДНК из бакулоплазмиды получали из 10 колоний каждого типа клеток DH10Bac, трансформированных клонами мутантной плазмиды pFB-GO1-KIT, как описано в разделе «Материалы и методы», и полученными препаратами трансфектировали клетки Sf9. Трансфектированные клетки осаждали и полученный рекомбинантный бакуловирус, присутствующий в супернатанте, амплифицировали. Для подтверждения экспрессии гибридного белка GST-c-KIT вирусными клонами лизат из клеточного осадка анализировали методом вестерн-блоттинга и иммунодетектирования с использованием антител против KIT и GST.
Условия анализа: 1 мкМ АТФ, 5 мгк/мл поли-EY, инкубация при комнатной температуре в течение 10 мин.
2
7
2
Среду, содержащую вирус, выделяли из трансфектированной культуры клеток и использовали для инфицирования с целью повышения титра вируса. Среду, содержащую вирус, получали после двух пассажей инфицирования и использовали для препаративной экспрессии белка. С этой целью в круглые планшеты для культуральных тканей размером 100 см высеивали 5×10 клеток на планшет и инфицировали при добавлении 1 мл вируссодержащей среды (приблизительно 5 КОЕ). Через 3 сут клетки отделяли от планшета и центрифугировали при 50 об/мин в течение 5 мин. Осадок клеток из 10-20 планшет размером 100 см ресуспендировали в 50 мл охлажденного льдом буферного раствора для лизиса (25 мМ трис-HCl, рН 7,5, 2 мМ EDTA, 1% NP-40, 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF). Клетки перемешивали на льду в течение 15 мин и затем центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин.
Центрифугированный клеточный лизат наносили на колонку с глютатионсефарозой объемом 2 мл (фирмы Pharmacia) и промывали 3 раза по 10 мл 25 мМ трис-HCl, рН 7,5, 2 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 200 мМ NaCl. Затем элюировали меченные GST белки 10 раз по 1 мл буферного раствора 25 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ восстановленного глютатиона, 10 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 10% глицерина и хранили при -70°С.
2
2
3
4
3
4
3
4
3
4
50
33
33
33
Киназную активность в 200-500 нг различных мутантов KIT определяли в присутствии или отсутствии ингибиторов в буферном растворе (20 мМ трис-HCl, рН 7,6, 3 мМ MnCl, 3 мМ MgCl, 1 мМ DTT, 10 мкМ NаVO, 3 мкг/мл поли(Glu,Туr), 4:1, 1% ДМСО, 1,5 мкМ АТФ (γ-[Р]-АТФ, 1 мкКи)). Анализ (30 мкл) проводили в 96-луночных планшетах при комнатной температуре в течение 30 мин и реакцию останавливали добавлением 20 мкл 125 мМ EDTA. Затем 30 мкл реакционной смеси переносили на мембрану Immobilon-PVDF (фирмы Millipore, Bedford, MA, США), которую предварительно пропитывали метанолом в течение 5 мин, промывали водой, затем пропитывали 0,5% НРO в течение 5 мин и помещали в вакуумную ячейку с отключенным вакуумным насосом. После нанесения всех образцов включали вакуумный насос и каждую лунку промывали 200 мкл 0,5% НРO. Мембраны извлекали и промывали на качалке 4 раза 1,0% НРО и 1 раз метанолом. После высушивания мембран при комнатной температуре и добавления в каждую лунку по 10 мкл сцинтилляционного раствора Microscint (Packard) определяли радиоактивность в 96-луночной ячейке в счетчике радиоактивности Packard TopCount. Величины IС рассчитывали методом линейного регрессионного анализа в виде процента ингибирования для каждого соединения в двух повторах при 4 концентрациях (обычно 0,01, 0,1, 1 и 10 мкМ). Одна единица киназной активности означает 1 нмоль Р, перенесенного из γ-[Р]-АТФ на белок-субстрат в минуту на мг белка при комнатной температуре.
Мутация KIT
Ваталаниб средняя величина IС<sub>50</sub> (мкМ)
Соединение А средняя величина IС<sub>50</sub> (мкМ)
D816F
>10
>10
D816H
>10
>10
D816N
>10
<10
D816Y
>10
>10
D816V
>10
>10
К642Е
<1
<10
Y823D
<1
<1
Del 550-558
<1
<2
Del 557-561
<1
<2
N822K
<2
<10
V654A
>10
>10
N822H
<2
<10
Del 550-558+V654A
<10
<10
Del 557-561+V654A
>10
>10
Мидостаурин
Препарат HIS
средняя величина IС<sub>50</sub> мкМ
Станд. откл.
Число измерений
HT-KIT-TA23 wt
1,7
0,15
2
HT-KIT TA23-D820G
0,084
0,05
2
HT-KIT TA23-T670I
0,89
0,21
2
Препарат GST
средняя величина IC<sub>50</sub> мкМ
Станд. откл.
Число измерений
GST-KIT wt
1,8
0,26
10
GST-KIT Del 557-561
0,32
0,042
3
GST-KIT Del 550-558
0,53
0,057
3
GST-KIT Del 550-558+V654A
0,27
0,079
5
GST-KIT Del 557-561+V654A
0,34
0,11
5
GST-KIT V654A
0,46
0,16
5
GST-KIT K642E
0,64
0,036
4
GST-KIT R634W
0,33
0,13
2
GST-KIT T670I+Del 550-558
0,11
0,05
2
GST-KIT D816F
0,41
0,055
5
GST-KIT D816H
0,35
0,078
5
GST-KIT D816N
0,74
0,25
5
GST-KIT D816Y
0,29
0,11
9
GST-KIT D816V
0,25
0,039
3
GST-KIT D816H+R634W
0,08
0,04
2
GST-KIT N822H
0,37
0,12
5
GST-KIT N822K
0,15
0,058
5
GST-KIT Y823D
0,13
0,0075
3