АКТИВИРУЮЩИЙ NK-КЛЕТКИ СЛИТЫЙ БЕЛОК, NK-КЛЕТКИ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ИХ
NK-CELL ACTIVATING FUSED PROTEIN, NK-CELLS AND A PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THEM

Область техники
Настоящее изобретение относится к новой противоопухолевой терапии иммунными клетками с использованием слитого белка и естественных киллеров для повышения миграции естественных киллеров в рак и максимизации антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения рака с помощью слитого белка, а также различному применению слитого белка.
Уровень техники
in vivo
Естественный киллер (NK) является эффекторной клеткой, действующей в первой линии защитного механизма иммунной системы , например, выполняющей функцию удаления опухолевых клеток и клеток организма–хозяина, инфицированного бактериями, внутриклеточными паразитами или вирусами, без предшествующей сенсибилизации антигенами, отторжения неподходящих трансплантатов костного мозга, регуляции иммунного ответа T–клеток и т.п.
Иммунологическая функция NK–клеток зависит от баланса стимуляторного сигнала для индукции их функции цитолиза и ингибиторного сигнала для ингибирования функции цитолиза. В частности, NK–клетка, получающая сильный стимуляторный сигнал, атакует и удаляет клетку–мишень, и NK–клетка, получающая сильный ингибиторный сигнал, оставляет клетку–мишень живой.
Функция цитолиза NK–клетки представляет собой антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и естественный лизис. Для ADCC и естественного лизиса общей является необходимость активации белковой тирозинкиназы (PTK) и то, что они блокируются ингибиторным сигналом, передаваемым ингибиторным рецептором NK–клетки. Функция цитолиза NK–клетки зависит от баланса стимуляторного сигнала и ингибиторного сигнала, и, таким образом, NK–клетка может различать нормальные клетки–хозяева и инфицированные или злокачественные клетки для их удаления.
dim
dim
bright
dim
bright
bright
The Journal of Immunology
NK–клетки можно классифицировать по уровню экспрессии CD56, и по меньшей мере 90% CD56 NK–клеток являются NK–клетками периферической крови. Известно, что CD56 клетки имеют более высокую цитотоксичность, чем другие CD56–экспрессирующие NK–клетки, и демонстрируют высокую экспрессию Ig–подобных рецепторов естественных киллеров (KIR), являющихся активирующими рецепторами NK–клетки, и перфорина. Также известно, что CD56 NK–клетки более малочисленны и имеют более низкую цитотоксическую активность, чем CD56 NK–клетки. Однако описано, что CD56 NK–клетки обладают не только высокой иммунорегуляторной функцией (ИФН–гамма, ФНО–альфа и т.д.), но также и высокой функцией ADCC (, 2011, 186:6753–6761). В частности, ожидают, что CD56 NK–клетки будут иметь улучшенный эффект при комбинированном лечении в отношении антител и рака.
С другой стороны, хорошо известно, что опухоль может экспрессировать уникальный белок, ассоциированный с их злокачественным фенотипом, или может гиперэкспрессировать конкретный белок в большем количестве, чем нормальные клетки. Экспрессия уникального белка на поверхности опухолевой клетки делает возможным исследование опухоли на идентичность фенотипа и биохимическую композицию и активность, таким образом, обеспечивая возможность диагностики и характеризации заболевания, или также позволяет направленно воздействовать на опухолеспецифический антиген и, таким образом, разрабатывать новый способ терапии опухоли.
in vivo
Известно, что антитело, в случае которого наблюдают реакцию антиген–антитело, специфическую для опухолеспецифического антигена, атакует злокачественные клетки и вызывает гибель клеток посредством индукции различных иммунных ответов  (активность антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), активность комплемент–зависимой клеточной цитотоксичности (CDC) и т.д.). Таким образом, в настоящее время разрабатывают антитело, которое можно использовать в лечении опухоли и т.д., но проводится мало исследований для повышения его терапевтической эффективности.
При этом существует необходимость проведения исследований и разработки способа эффективного лечения рака с использованием NK–клеток и антигенов злокачественных опухолей, специфически экспрессирующихся на поверхности злокачественных клеток.
[Ссылка на известный уровень техники]
[Патентные документы]
Патентная публикация Кореи № 10–2006–0079180
Патентная публикация Кореи № 10–2015–0063145
Подробное описание изобретения
Техническая задача
Настоящее изобретение относится к слитому полипептиду, содержащему:
антитело или его фрагмент, связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном;
линкер и
белок, индуцирующий естественные киллеры (NK), из CXCL16.
Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей слитый полипептид, вектору, содержащему ее, или клетке–хозяину, содержащему вектор.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения рака, содержащей слитый полипептид, содержащий:
антитело или его фрагмент, связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном;
линкер и
белок, индуцирующий NK–клетки, из CXCL16.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения рака, содержащей слитый полипептид, содержащий:
антитело или его фрагмент, связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном;
линкер, и
белок, индуцирующий NK–клетки, из CXCL16,
и NK–клетки.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей слитый полипептид, предназначенной для применения в лечении рака.
Настоящее изобретение также относится к применению слитого полипептида в получении лекарственного средства для рака.
Настоящее изобретение также относится к применению слитого полипептида для лечения рака.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака посредством введения пациенту композиции, содержащей слитый полипептид, в фармацевтически эффективном количестве.
Решение технической задачи
Авторы настоящего изобретения осуществляли исследования и разработку способа эффективного введения естественного киллера (NK), иммуноцитарного терапевтического средства, в злокачественную ткань. В результате, авторы настоящего изобретения определили, что среди рецепторов индуцирующего активность вещества, экспрессирующихся на поверхности NK–клетки, CXCR3 и CXCR6 являются гиперэкспрессированными, а затем определили, что из их лигандов, CXCL16 является эффективным в отношении миграции NK–клеток, и а затем определили, что индуцирование NK–клеток в отношении злокачественного новообразования значительно повышено и, таким образом, имеет значительный эффект в отношении лечения злокачественных опухолей посредством получения и введения слитого белка, специфического для опухолеспецифического антигена, а также CXCL16, имеющего свойства индукции NK–клеток, таким образом, осуществляя настоящее изобретение.
В рамках изобретения термин "опухолеспецифический антиген" означает антиген, не экспрессирующийся на нормальной клетке или гиперэкспрессирующийся только на опухолевой клетке в отличие от нормальной клетки, предпочтительно, специфически экспрессирующийся на поверхности опухолевой клетки, где такой антиген относится к антигенному веществу, продуцируемому опухолевыми клетками.
Опухолеспецифический антиген, специфически экспрессирующийся на опухоли, может включать, в качестве неограничивающих примеров, 4–1BB (CD137), 5T4, AGS–5, AGS–16, ангиопоэтин 2, CD19 (кластер дифференцировки 19), B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), B7DC, B7H1, B7H2, B7H3, BT–062, BTLA, CAIX, карциноэмбриональный антиген, CTLA4, Cripto, ED–B, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFL7, EpCAM, EphA2, EphA3, EphB2, FAP, фибронектин, рецептор фолата, ганглиозид GM3, GD2, глюкокортикоид–индуцируемый рецептор фактора некроза опухоли (GITR), gp100, gpA33, GPNMB, ICOS, IGFIR, интегрин αυ, интегрин αυβ, KIR, LAG–3, антиген Льюиса Y, мезотелин, c–MET, Her2 (EGFR–родственный белок человека 2), карбоангидразу MN IX, MUC1, MUC16, нектин–4, NKGD2, NOTCH, OX40, OX40L, PD–1, PD–L1 (лиганд программируемой гибели 1), PSCA, PSMA, RANKL, ROR1, ROR2, SLC44A4, синдекан–1, TACI, TAG–72, тенасцин, TIM3, TRAILR1, TRAILR2, EGFR, VEGFR–1, VEGFR–2, VEGFR–3 или т.п. В одном из примеров по настоящему изобретению идентифицировали эффект слитого полипептида в отношении мезотелина, PD–L1, Her2, CD19, MUC1, EGFR и VEGFR.
В рамках изобретения термин "антитело" включает целое антитело, фрагмент антитела, сохраняющий способность к распознаванию и связыванию антигена, моноклональное антитело, поликлональное антитело и антитело–подобное вещество. Антитело может являться IgM, IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgD, IgA или IgE.
В рамках изобретения термин "фрагмент антитела" означает часть целого антитела, как правило, молекулу, содержащую антигенсвязывающую или вариабельную область целого антитела. Пример фрагмента антитела включает Fab–, Fab'–, F(ab')2– и Fv–фрагмент и однодоменное антитело.
"Антитело или его фрагмент" могут специфически или предпочтительно связываться с опухолевой клеткой по сравнению с неопухолевой клеткой или нормальной клеткой, предпочтительно, опухолеспецифическим антигеном, специфически экспрессирующимся в опухоли. В настоящем описании термины "специфически связывается" или "предпочтительно связывается" означают, что связывание между двумя партнерами по связыванию (например, антителом и его партнером по связыванию, т.е. антигеном) является селективным в отношении двух партнеров по связыванию, и его можно отличать от нежелательных или неспецифических взаимодействий.
В рамках изобретения термин "одноцепочечный Fv" или "scFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент)" относится к антителу, в котором вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи общепринятого двухцепочечного антитела связываются друг другом с образованием одной цепи. Как правило, между двумя цепями встраивают линкерный пептид, чтобы сделать возможным правильный фолдинг и образование активного участка связывания.
В рамках изобретения термин "антитело, связывающееся с антигеном" относится к антителу, которое можно использовать в качестве терапевтического средства, в котором антитело направленно воздействует на антиген посредством связывания с антигеном с достаточной активностью.
В рамках изобретения термин "линкер" означает пептид, соединяющий первую молекулу (например, антитело или его фрагмент, связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном) со второй молекулой (белком, индуцирующим NK–клетки, из CXCL16) посредством химического связывания и т.д.
В рамках изобретения термин "рак" или "опухоль" означает патологическое состояние у людей, отличающееся неконтролируемой пролиферацией клеток. Рак или опухоль включает, в качестве неограничивающих примеров, карциному, лимфому, бластому и лейкоз. Более конкретные неограничивающие примеры рака включают рак легких (мелкоклеточный и немелкоклеточный), рак молочной железы, рак предстательной железы, карциноид, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак печени (печеночноклеточный), гепатобластому, рак толстого кишечника, плоскоклеточную карциному головы и шеи (HNSCC), рак пищевода, рак яичников, рак шейки матки, соленому, мезотелиому, меланому, саркому, остеосаркому, липосаркому, рак щитовидной железы, десмому, острый миелогенный лейкоз (AML) и хронический миелогенный лейкоз (CML).
В рамках изобретения термин "экспрессирующий вектор" включает нуклеотидную последовательность, кодирующую интересующую молекулу, агонистически связанную с промотором.
В рамках изобретения термины "полипептид", "пептид" и "белок" используют взаимозаменяемо, и они включают ссылку на полимер аминокислотных остатков. Термины используют не только по отношению к полимерам природных аминокислот, но также и к полимерам искусственных аминокислот, являющихся химическими аналогами природных аминокислот, которым соответствует по меньшей мере один аминокислотный остаток. Термины также используют по отношению к полимерам, содержащим консервативную замену аминокислоты таким образом, что белок может оставаться агонистическим.
Escherichia coli
В рамках изобретения термин "клетка–хозяин" означает клетку, способную поддерживать репликацию или экспрессию экспрессирующего вектора. Клетка–хозяин может представлять собой прокариотические клетки, например, , или эукариотические клетки, например, дрожжи, клетки насекомых, амфибий или млекопитающих.
Что касается роста или прогрессирования опухоли или рака, термины "ингибирующий" и "снижающий" относятся к ингибированию роста, распространения или метастазирования опухоли или злокачественного новообразования пациента на измеримое количество при использовании любого известного в этой области способа. Рост, прогрессирование или распространение опухоли или рака ингибируют или снижают, если размер опухоли снижается по меньшей мере на приблизительно 10%, 20%, 30%, 50%, 80% или 100% по сравнению с размером опухоли, измеряемым, например, до совместного введения слитого полипептида по настоящему изобретению и NK–клеток, иммуноцитарного терапевтического средства, или до введения слитого полипептида.
Настоящее изобретение относится к слитому полипептиду, содержащему: антитело или его фрагмент, связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном, линкер и белок, индуцирующий NK–клетки, из CXCL16.
Слитый полипептид по настоящему изобретению может специфически связываться с поверхностью клетки опухоли благодаря тому, что он содержит антитело или его фрагмент, связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном, и может также индуцировать NK–клетку в отношении опухолевой клетки–мишени посредством CXCL16, т.е. белка, индуцирующего NK–клетку, расщепляемого и высвобождающегося после связывания антигена и антитела.
Слитый полипептид по настоящему изобретению связывается с поверхностным антигеном для таргетинга опухоли благодаря тому, что он содержит антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном. Поверхностный антиген для таргетинга опухоли широко известен в этой области и может представлять собой, в качестве неограничивающих примеров, мезотелин, PD–L1, Her2, CD19, MUC1, EGFR, VEGFR, B7H1, B7H2, B7H3, BT–062, BTLA, CAIX, 4–1BB, 5T4, AGS–5 или AGS–16.
Антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном, включает одноцепочечный Fv (scFv), Fab, Fab', F(ab')2, стабилизированное дисульфидными связями антитело и т.д., и, в частности, может представлять собой одноцепочечный Fv (scFv).
Антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном, можно получать известным в этой области способом получения.
H
L
H
L
В примере варианта осуществления настоящего изобретения антитело является одноцепочечным Fv (scFv). Области V и V антитела scFv содержат одну цепь, свернутую с образованием антигенсвязывающего участка, схожего с участком, обнаруживаемым в двухцепочечном антителе. После фолдинга одноцепочечное антитело стабилизируется посредством нековалентного взаимодействия. В более конкретном примере варианта осуществления scFv образуется посредством рекомбинации. Консервативный вариант антитела по настоящему изобретению можно получать общепринятым образом, и консервативный вариант, используемый в scFv–фрагменте, будет сохранять важный аминокислотный остаток, необходимый для точного фолдинга и стабилизации областей V и V.
В примере варианта осуществления настоящего изобретения scFv является scFv против мезотелина, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и, в частности, его может кодировать последовательность оснований, представленная в SEQ ID NO: 2.
H
L
В другом примере варианта осуществления настоящего изобретения scFv, в качестве неограничивающих примеров, является scFv против PD–L1, который может содержать тяжелую цепь (V) с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, в частности, кодируемой последовательностью основания, представленной в SEQ ID NO: 4; и легкую цепь (V) с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5, в частности, кодируемой последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 6, и опухолеспецифический антиген, т.е. PD–L1, может являться антигеном, кодируемым последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 7.
В другом примере варианта осуществления настоящего изобретения scFv, в качестве неограничивающих примеров, является scFv против Her2, который может содержать тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, в частности, кодируемой последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 9; и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 10, в частности, кодируемой последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 11, и опухолеспецифический антиген, т.е. Her2, может являться антигеном, кодируемым последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 12.
В другом примере варианта осуществления настоящего изобретения scFv, в качестве неограничивающих примеров, является scFv против CD19, который может содержать тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 28, в частности, кодируемой последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 29; и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 30, в частности, кодируемой последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 31.
В другом примере варианта осуществления настоящего изобретения scFv, в качестве неограничивающих примеров, является scFv против MUC–1, который может содержать тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 32, в частности, кодируемой последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 33; и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 34, в частности, кодируемой последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 35.
В другом примере варианта осуществления настоящего изобретения scFv, в качестве неограничивающих примеров, является scFv против EGFR, который может содержать тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 36, в частности, кодируемой последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 37; и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 38, в частности, кодируемой последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 39.
В другом примере варианта осуществления настоящего изобретения scFv, в качестве неограничивающих примеров, является scFv против VEGFR, который может содержать тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 40, в частности, кодируемой последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 41; и легкую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 42, в частности, кодируемой последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 43.
Антитело scFv можно напрямую связывать с пептидным линкером через легкую цепь, и их можно связывать через Fc–область, с которой связан scFv.
В примере варианта осуществления настоящего изобретения Fc (константная область), в качестве неограничивающих примеров, может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 и, в частности, может кодироваться последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 14.
Линкер по настоящему изобретению не будет иметь конкретную биологическую активность, за исключением связывания областей в качестве пептидного линкера или сохранения некоторого минимального расстояния или другой пространственной взаимосвязи между областями, но составляющие его аминокислоты можно выбирать так, чтобы они влияли на некоторые свойства молекул, например, фолдинг, суммарный заряд или гидрофобность. Кроме того, линкер может содержать расщепляемую последовательность таким образом, что CXCL16 может отделяться после связывания антитела с опухолеспецифическим антигеном. Антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном, можно соединять посредством пептидного линкера, имеющего длину не более 50 аминокислот, как правило, не более 40 аминокислот, предпочтительно – не более 30 аминокислот, более предпочтительно – не более 20 аминокислот, и гораздо более предпочтительно – от 1 до 10 аминокислот.
Например, пептидный линкер может содержать последовательность, расщепляемую любой протеазой и, в частности, может являться пептидным линкером, в качестве неограничивающих примеров, содержащим последовательные аминокислотные остатки RVKR, расщепляемого фурином.
В примере варианта осуществления настоящего изобретения слитый полипептид по настоящему изобретению содержит участок расщепления фурином, расщепляемый фурином, т.е. участок расщепления фурином, содержащий последовательные аминокислотные остатки, которые могут расщепляться фурином, таким образом, что белок, индуцирующий NK–клетки, может высвобождаться из злокачественной клетки.
2+
Участок расщепления фурином может являться любым полипептидным участком, который может расщепляться фурином. Как описано Duckert и т.д. ([Duckert et al., Protein Engineering, Design & Selection 17(1):107–112 (2004)], включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), фурин является ферментом "на основе эволюционно консервативной, специфической в отношении двухосновных и одноосновных аминокислот, CA–зависимой сериновой протеазы, также названной субтилизин/кексин–подобной пропротеинконвертазой".
Последовательность участка расщепления фурином, известная из этой статьи и т.д., включена в настоящее описание и, в частности, соответствует аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 и, в качестве неограничивающих примеров, может кодироваться последовательностью оснований, представленной в SEQ ID NO: 16.
Антитело или его фрагмент, связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном, можно связываться последовательность расщепления фурином через амино–конец участка расщепления фурином и его можно напрямую связывать с легкой цепью, тяжелой цепью, Fc (константной областью) или каркасными областями антитела.
Слитый белок по настоящему изобретению содержит белок, индуцирующий NK–клетки, из CXCL16, таким образом, что слитый белок по настоящему изобретению может индуцировать в отношении опухолевой клетке NK–клетку, содержащую антитело, связанное с опухолеспецифическим антигеном.
Термин "белок, индуцирующий NK–клетки" по настоящему изобретению означает белок для индуцирования NK–клетки в отношении опухолевой клетке, т.е. CXCL16, являющийся белком, способным вызывать миграцию NK–клетки к злокачественной клетке посредством хемокина.
В частности, CXCL16 может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17. CXCL16 может кодироваться последовательностью оснований SEQ ID NO: 18.
Белок, индуцирующий NK–клетки, можно связывать с антителом или его фрагментом с помощью пептидного линкера. Линкер по настоящему изобретению не будет иметь конкретную биологическую активность, за исключением связывания областей в качестве пептидного линкера или сохранения некоторого минимального пространства или другой пространственной взаимосвязи между областями, но составляющие его аминокислоты можно выбирать так, чтобы они влияли на некоторые свойства молекул, например, фолдинг, суммарный заряд или гидрофобность. Кроме того, линкер может содержать расщепляемую последовательность, например, последовательность, расщепляемую любой протеазой, таким образом, что CXCL16 может отделяться после связывания антитела с опухолеспецифическим антигеном.
В примере варианта осуществления настоящего изобретения, пептидный линкер содержит участок расщепления фурином, расщепляемый фурином, т.е. участок расщепления фурином, содержащий последовательные аминокислотные остатки, которые могут расщепляться фурином.
Слитый полипептид по настоящему изобретению можно получать нерекомбинантным или рекомбинантным способом, известным в этой области, предпочтительно, рекомбинантным способом.
Другими словами, экспрессирующий вектор можно получать посредством встраивания кДНК, кодирующей антитело или его фрагмент, связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном, линкер и белок, индуцирующий NK–клетки, из CXCL16, в вектор.
В примере варианта осуществления настоящего изобретения экспрессирующий вектор получают посредством встраивания последовательности оснований, содержащей scFv против мезотелина и Fc, в вектор, в частности, вектор pcDNA3.1, и посредством встраивания участка расщепления фурином и последовательности оснований, кодирующей белок, индуцирующий NK–клетки, после последовательности иммуноглобулина. Пример полученного экспрессирующего вектора представлен на фиг. 2.
Escherichia coli
Полученный экспрессирующий вектор можно экспрессировать в бактериальных, растительных и дрожжевых клетках, клетках насекомых и клетках млекопитающих. Специалисты в этой области могут получать слитый полипептид с использованием ряда систем экспрессии, которые можно использовать для экспрессии белков, включая , другие бактериальные клетки–хозяева, дрожжи и различные клетки высших эукариот, например, линии клеток COS, CHO, HeLa и линии клеток миеломы.
В примере варианта осуществления настоящего изобретения слитый полипептид можно получать посредством трансфекции клетки CHO, из которой удален фурин, с использованием экспрессирующего вектора.
Из полученного слитого полипептида можно получать целевой слитый полипептид посредством очистки способом, стандартным в этой области, включая осаждение сульфатом аммония, использованием аффинной колонки, хроматографию на колонках и т.д.
Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей слитый полипептид.
Настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый полипептид. В частности, вектор по настоящему изобретению может представлять собой экспрессирующий вектор, имеющий структуру, показанную на фиг. 2, которая может иметь последовательность оснований SEQ ID NO: 19.
Настоящее изобретение относится к клетке–хозяину, содержащей экспрессирующий вектор. В частности, такая клетка–хозяин может являться клеткой, в качестве неограничивающих примеров, выбранной из линий клеток COS, CHO, HeLa и линий клеток миеломы.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения рака, содержащей слитый полипептид, содержащий: антитело или его фрагмент, связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном, линкер и белок, индуцирующий NK–клетки, из CXCL16.
Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения рака по настоящему изобретению является иммуноцитарным терапевтическим средством, в частности, где такая композиция имеет значительный эффект в отношении профилактики или лечения рака посредством индуцирования NK–клеток в отношении к раку. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения рака по настоящему изобретению не только имеет прямой терапевтический эффект, но также действует как противоопухолевый адъювант.
dim
bright
bright
dim
В примере варианта осуществления настоящего изобретения определено, что распределение NK–клеток изменяется с CD56 на CD56под действием CXCL16 из слитого полипептида, полученного по настоящему изобретению, а также определено, что фармацевтическая композиция по настоящему изобретению эффективна для профилактики или лечения рака благодаря дифференцировке в CD56 клетки, имеющие более высокий эффект ADCC по сравнению с CD56.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения рака, содержащей слитый полипептид, содержащий: антитело или его фрагмент, связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном, линкер и белок, индуцирующий NK–клетки, из CXCL16, и NK–клетки.
По настоящему изобретению совместное введение слитого полипептида вместе с NK–клетками, иммуноцитарным терапевтическим средством, значительно повышает миграцию NK–клеток в рак, таким образом, имея значительный эффект в отношении профилактики или лечения рака.
Фармацевтическую композицию, предназначенную для использования в настоящем изобретении, можно составлять в лекарственной форме стандартным способом с использованием по меньшей мере одного физиологически приемлемого носителя или эксципиента. Подходящий фармацевтический носитель описан в настоящем изобретении и литературе (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins (2005)).
Такую фармацевтическую композицию можно составлять в лекарственной форме таким образом, что слитый полипептид и/или NK–клетки по изобретению можно вводить любым подходящим путем, например, ингаляционным, местным, назальным, пероральным, парентеральным или ректальным путем. Таким образом, введение фармацевтической композиции, упомянутой выше, можно осуществлять внутрикожным, подкожным, внутривенным, внутримышечным, интраназальным, ингаляционным, внутримозговым, эндотрахеальным, внутриартериальным, интраперитонеальным, внутрипузырным, внутриплевральным, внутрикоронарным путем, посредством подкожной или внутриопухолевой инъекции или с использованием шприца или других устройств. Также рассматривают чрезкожное введение вместе с ингаляцией или аэрозольным введением. Таблетку и капсулу можно вводить перорально, ректально или вагинально.
Фармацевтическая композиция будет содержать слитый полипептид или слитый полипептид и NK–клетки, который общепринятым образом растворяют в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно, водном носителе. Слитый полипептид и NK–клетки можно предоставлять вместе или раздельно. Можно использовать различные водные носители, например, забуференный водный раствор соли, и т.д. такой раствор обладает бактерицидными свойствами и, как правило, не содержит нежелательные вещества. Такую композицию можно стерилизовать общепринятым, широко известным способом стерилизации. Композиция может содержать фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, необходимое для соответствия физиологическим условиям, например, регулятор pH и буфер, корректирующее токсичность вещество, и т.д. например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и т.д. Концентрация слитого полипептида в такой лекарственной форме может варьироваться в широких пределах, и ее можно выбирать, в основном, с учетом объема жидкости, вязкости, массы и т.д. в соответствии с выбранным путем введения и потребностями пациента.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению подходит для парентерального введения, включая внутривенное или интрацеломическое введение.
Слитый полипептид и/или NK–клетки по настоящему изобретению можно составлять в лекарственной форме для парентерального введения посредством инъекции, например, болюсной или непрерывной инъекции. Лекарственная форма для инъекции может находиться вместе с добавочным консервантом в однодозовом контейнере, например, ампуле, или многодозовом контейнере. Инъецируемая композиция, предпочтительно, является водным изотоническим раствором или суспензией, и суппозиторий, предпочтительно, получают из липидной эмульсии или суспензии. Композицию можно стерилизовать, и/или она может содержать вспомогательное вещество, например, консервант, стабилизатор, увлажнитель или эмульгатор, усилитель растворимости, осморегуляторную соль и/или буфер. С другой стороны, активный компонент может находиться в форме порошка, который составляют перед использованием с помощью подходящего носителя, например, стерильной воды, не содержащей пирогены. Кроме того, активный компонент может содержать другие терапевтически значимые вещества. Композиции получают общепринятым способом смешивания, грануляции или покрывания, соответственно, и они содержат приблизительно от 0,1 до 75%, предпочтительно – от 1 до 50% активного компонента.
В случае перорального введения фармацевтическая композиция или лекарственное средство могут иметь форму таблетки или капсулы, получаемой, например, общепринятыми способами, вместе с фармацевтически приемлемым эксципиентом. Предпочтительно, такая фармацевтическая композиция или лекарственное средство должна быть таблеткой и желатиновой капсулой, содержащей активный компонент, т.е. композицию по настоящему изобретению вместе с: (a) дилюентом или наполнителем, например, лактозой, декстрозой, сахарозой, маннитом, сорбитом, целлюлозой (например, этилцеллюлозой и микрокристаллической целлюлозой), глицином, пектином, полиакрилатом и/или гидроортофосфатом кальция и сульфатом кальция; (b) смазочным средством, например, диоксидом кремния, тальком, стеариновой кислотой, ее магниевой или кальциевой солью, стеаратом металла, коллоидным диоксидом кремния, гидрогенизированным растительным маслом, кукурузным крахмалом, бензоатом натрия, ацетатом натрия и/или полиэтиленгликоля; кроме того, в случае таблетки (c) связывающим средством, например, силикатом магния алюминия, крахмальной пастой, желатином, трагакантовой камедью, метилцеллюлозой, натрий–карбоксиметилцеллюлозой, поливинилпирролидоном и/или гидроксипропилметилцеллюлозой; в некоторых случаях (d) средством для повышения распадаемости, например, крахмалом (например, картофельным крахмалом или крахмалгликолятом натрия), гликолятом, агаром, альгиновой кислотой или ее натриевой солью или шипучей смесью; (e) увлажнителем, например, лаурилсульфатом натрия и/или (f) абсорбентом, красителем, ароматизатором и подсластителем.
По настоящему изобретению фармацевтическую композицию вводят пациенту в терапевтически эффективной дозе для профилактики, лечения или ингибирования заболевания, такого как рак или злокачественное состояние. Фармацевтическую композицию вводят пациенту в количестве, достаточном для вызывания эффективного терапевтического или диагностического ответа у пациента. Термин "эффективный терапевтический или диагностический ответ" относится к ответу, который по меньшей мере частично ингибирует или замедляет развитие симптомов или осложнений заболевания или злокачественного состояния. Подходящее количество для осуществления такого введения определяют как "терапевтически эффективное количество".
Доза слитого полипептида и/или NK–клеток, подлежащих введению, варьируется в зависимости от вида млекопитающего, массы, возраста, состояния индивидуума, площади поверхности области, подлежащей лечению, и типа введения. Величину дозы также можно определять по наличию, свойствам и степени любого побочного эффекта у конкретного пациента, сопутствующего введению конкретного соединения.
5
7
Единица дозирования, подлежащая введению млекопитающему массой приблизительно от 50 до 80 кг, предпочтительно, человеку, может содержать слитый полипептид в количестве приблизительно от 1 мг/кг до 5 мг/кг и NK–клетки в количестве приблизительно от 1×10 клеток/кг до 2×10 клеток/кг.
Как правило, доза композиции по настоящему изобретению является дозой, достаточной для достижения целевого эффекта. Оптимальный режим введения можно определять посредством измерения слитого полипептида и/или NK–клеток и вычисления их накопления в организме пациента. Такую композицию можно вводить по меньшей мере раз в сутки, неделю, месяц или год. Специалисты в этой области легко могут определять оптимальную дозу, способ введения и частоту повторений. Специалисты в этой области могут определять оптимальное введение слитого полипептида и/или NK–клеток людям общепринятым способом, известным в этой области и представленным в настоящем описании. Однако следует понимать, что точную дозу эффективного компонента следует определять с учетом различных факторов, таких как заболевание, подлежащее лечению, тяжесть заболевания, способ введения, масса пациента, возраст, пол и т.п., и, таким образом, дозу не следует истолковывать как ограничение объема настоящего изобретения в каком–либо аспекте.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей слитый полипептид, предназначенной для применения в лечении рака.
Настоящее изобретение также относится к применению слитого полипептида в получении лекарственного средства для лечения рака.
Настоящее изобретение также относится к применению слитого полипептида для лечения рака.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака посредством введения композиции, содержащей слитый полипептид, пациенту в фармацевтически эффективном количестве. Способ терапии рака можно осуществлять посредством совместного введения NK–клеток, таким образом, достигая улучшенного терапевтического эффекта.
Объекты, упомянутые в отношении применения, композиции и терапевтического способа по настоящему изобретению, используют в равной степени, если они не противоречат друг другу.
Полезные эффекты
Слитый белок для профилактики или лечения рака по настоящему изобретению содержит слитый полипептид, содержащий: антитело или его фрагмент, связывающиеся с опухолеспецифическим антигеном, линкер и белок, индуцирующий NK–клетки, из CXCL16, где совместное введение слитого полипептида с NK–клетками, иммуноцитарным терапевтическим средством, значительно повышает миграцию NK–клеток в злокачественное новообразование, экспрессирующее конкретный антиген, таким образом, имея значительный эффект в отношении профилактики или лечения рака.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 является графиком, на котором показаны результаты определения степени миграции выращенных естественных киллеров (NK) в зависимости от типа хемокина.
Фиг. 2 является схемой, на которой показан экспрессирующий вектор для получения слитого полипептида по настоящему изобретению.
Фиг. 3 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что слитый полипептид, полученный по настоящему изобретению, распознает и связывается с мезотелином, присутствующим на поверхности линии клеток рака поджелудочной железы, с помощью мезотелин–распознающего участка.
Фиг. 4 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что слитый полипептид, полученный по настоящему изобретению, распознает и связывается с PD–L1, присутствующим на поверхности линии клеток рака поджелудочной железы, с помощью PD–L1–распознающего участка.
Фиг. 5 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что слитый полипептид, полученный по настоящему изобретению, распознает и связывается с Her2, присутствующим на поверхности линии клеток рака поджелудочной железы, с помощью Her2–распознающего участка.
Фиг. 6 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что слитый полипептид, полученный по настоящему изобретению, связывается с линией клеток рака поджелудочной железы с высвобождением CXCL16.
Фиг. 7 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к миграции повышается при обработке различных линий злокачественных клеток слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с мезотелином.
Фиг. 8 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что миграция NK–клеток повышается при обработке линии клеток Panc–1 слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с PD–L1.
Фиг. 9 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что миграция NK–клеток повышается при обработке линии клеток HT–29 слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с PD–L1.
Фиг. 10 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что миграция NK–клеток повышается при обработке линии клеток Panc–1 слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с Her2.
Фиг. 11 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что миграция NK–клеток повышается при обработке линии клеток MCF7 слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с Her2.
Фиг. 12 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к миграции повышается при обработке различных линий злокачественных клеток слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с CD19.
Фиг. 13 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к миграции повышается при обработке различных линий злокачественных клеток слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с MUC–1.
Фиг. 14 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к миграции повышается при обработке различных линий злокачественных клеток слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с EGFR.
Фиг. 15 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к миграции повышается при обработке различных линий злокачественных клеток слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с VEGFR.
Фиг. 16 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к инвазии повышается при обработке различных линий злокачественных клеток слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с мезотелином.
Фиг. 17 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к инвазии повышается при обработке линии клеток Panc–1 слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с PD–L1.
Фиг. 18 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к инвазии повышается при обработке линии клеток HT–29 слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с PD–L1.
Фиг. 19 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к инвазии повышается при обработке линии клеток Panc–1 слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с Her2.
Фиг. 20 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к инвазии повышается при обработке линии клеток MCF7 слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с Her2.
Фиг. 21 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к инвазии повышается при обработке различных линий злокачественных клеток слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с CD19.
Фиг. 22 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к инвазии повышается при обработке различных линий злокачественных клеток слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с MUC–1.
Фиг. 23 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к инвазии повышается при обработке различных линий злокачественных клеток слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с EGFR.
Фиг. 24 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к инвазии повышается при обработке различных линий злокачественных клеток слитым полипептидом по настоящему изобретению, содержащим антитело, связывающееся с VEGFR.
Фиг. 25 является графиком, на котором показаны результаты определения того, что способность NK–клеток к инвазии повышают с помощью слитого полипептида (NRP–антитела scFv против Her2), полученного для распознавания Her2 по настоящему изобретению.
Фиг. 26 является графиком, на котором показана индукция NK–клеток в отношении злокачественной ткани при введении слитого полипептида, полученного по настоящему изобретению, а также NK–клеток.
Фиг. 27 является графиком, на котором показаны результаты определения терапевтического эффекта посредством введения слитого полипептида scFv против мезотелина, полученного по настоящему изобретению, в модели на животных с трансплантированными клетками рака поджелудочной железы вместе с NK–клетками.
Фиг. 28 является графиком, на котором показаны результаты определения терапевтического эффект посредством введения слитого полипептида scFv против PD–L1, полученного по настоящему изобретению, в модели на животных с трансплантированными клетками рака поджелудочной железы вместе с NK–клетками.
Фиг. 29 является графиком, на котором показаны результаты определения терапевтического эффекта посредством введения слитого полипептида scFv против Her2, полученного по настоящему изобретению, в модели на животных с трансплантированными клетками рака поджелудочной железы вместе с NK–клетками.
Фиг. 30 является графиком, на котором показано изменение распределения NK–клеток после обработки NK–клеток CXCL16 и ИЛ–2 в течение короткого периода времени.
Фиг. 31 является графиком, на котором показано изменение распределения NK–клеток после обработки NK–клеток CXCL16 и ИЛ–2 в течение длительного периода времени
bright
+
Фиг. 32 является графиком, на котором показаны результаты определения повышения гибели клеток посредством CD56CD16 NK–клеток, распространяющихся после обработки NK–клеток слитым полипептидом, полученным по настоящему изобретению.
Принцип изобретения
Далее в настоящем описании настоящее изобретение будет подробно описано с помощью предпочтительных примеров для лучшего понимания настоящего изобретения. Однако следующие примеры представлены исключительно для иллюстрирования настоящего изобретения, и, таким образом, настоящее изобретение не ограничено ими.
<Пример 1> Определение миграции выращенных естественных киллеров с помощью хемокина
5
2
Для определения степени миграции выращенных естественных киллеров (NK) в зависимости от типа хемокина выращенные NK–клетки собирали и центрифугировали при 1500 об./мин. Затем удаляли супернатант и промывали их PBS, после чего подсчитывали количество клеток. Хемокины CXCL9, CXCL10, CXCL11 и CXCL16 добавляли по 10 нМ на нижний слой камеры Бойдена, а выращенные NK–клетки в количестве 2×10 клетки добавляли на верхний слой камеры Бойдена. После этого полученные клетки культивировали в инкубаторе с CO при 37°C в течение двух часов, затем собирали нижний слой и центрифугировали при 1500 об./мин. Затем промывали PBS, окрашивали CD56–PE при 4°C в течение 30 минут и промывали PBS. Для анализа FAC частицы Count Bright Absolute Counting Beads (Invitrogen) разделяли на аликвоты по 50 мкл и осуществляли анализ FACS.
Результаты показаны на фиг. 1.
Как показано на фиг. 1, определяли, что CXCL16 имел значительный эффект в отношении миграции выращенных NK–клеток по сравнению с другими типами хемокинов.
<Пример 2> Получение и очистка слитого полипептида [антитела с белком для рекрутирования NK–клеток (NRP)]
Получали рекомбинантный вектор, с которым связывали следующее: последовательность scFv для распознавания антигена для таргетинга рака; последовательность фурина в качестве линкера и CXCL16 (белка для рекрутирования NK–клеток; NRP) для индукции миграции NK–клеток с наибольшей эффективностью.
Структура конкретного рекомбинантного вектора, с которым связана последовательность scFv для распознавания мезотелина в качестве антигена–мишени, показана на фиг. 2.
Вектор pcDNA3.1 расщепляли ферментом Sfi1 в течение двух часов и очищали для получения вектора для лигирования. Для получения scFv против мезотелина осуществляли амплификацию посредством ПЦР с использованием последовательности праймеров, представленных в следующей таблице 1, для получения последовательности оснований scFv против мезотелина SEQ ID NO: 2, после чего смешивали вектор, образец вставки и лигазу T4 и культивировали при 25°C в течение двух часов для осуществления лигирования вектора и вставки. Полученный продукт встраивали в участок фермента Sfi1 в векторе pcDNA3.1.
[Таблица 1]
Последовательность праймеров для получения scFv против мезотелина
Последовательность
ScFv против мезотелинаПрямой праймер
5’–GGCCCAGCCGGCCATGCAGGTACAACTGCAGCAG–3’(SEQ ID NO: 20)
ScFv против мезотелинаОбратный праймер
5’–GGCCCTTGGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTTC–3’(SEQ ID NO: 21)
Для получения scFv против PD–L1 осуществляли амплификацию посредством ПЦР с использованием последовательности праймеров, представленных в следующей таблице 2, для получения последовательности оснований scFv против PD–L1, содержащей тяжелую цепь SEQ ID NO: 4 и легкую цепь SEQ ID NO: 6, после чего осуществляли лигирование вектора и вставки тем же способом, что и для получения указанного вектора, с которым связан scFv против мезотелина, таким образом, что полученный продукт встраивали в участок фермента Sfi1 в векторе pcDNA3.1.
[Таблица 2]
Последовательность праймеров для получения PD–L1 scFv
Последовательность
scFv против PD–L1Прямой праймер
5’–GGCCCAGCCGGCCATGCAGGTCCAACTTGTGCAGTC–3’(SEQ ID NO: 22)
scFv против PD–L1Обратный праймер
5’–GGCCCTTGGTGGACCAAGCTGGAGATCAAA–3’(SEQ ID NO: 23)
Для получения scFv против Her2 осуществляли амплификацию посредством ПЦР с использованием последовательности праймеров, представленных в следующей таблице 3, для получения последовательности оснований scFv против Her2, содержащей тяжелую цепь SEQ ID NO: 9 и легкую цепь SEQ ID NO: 11, после чего осуществляли лигирование вектора и вставки тем же способом, что и для получения указанного вектора, с которым связан scFv против мезотелина, таким образом, что полученный продукт встраивали в участок фермента Sfi1 в векторе pcDNA3.1.
[Таблица 3]
Последовательность праймеров для получения Her2 scFv
Последовательность
scFv против Her2Прямой праймер
5’–GGCCCAGCCGGCCATGGAGGTTCAGCTGGTGGA–3’(SEQ ID NO: 24)
scFv против Her2Обратный праймер
5’–GGCCCTTGGTACCAAGGTGGAGATCAAA–3’(SEQ ID NO: 25)
Кроме того, для получения scFv против CD19, MUC–1, EFGR и VEGFR, осуществляли синтез последовательности оснований scFv (scFv CD19, содержащего тяжелую цепь SEQ ID NO: 29 и легкую цепь SEQ ID NO: 31; scFv против MUC–1, содержащего тяжелую цепь SEQ ID NO: 33 и легкую цепь SEQ ID NO: 35; scFv против EGFR, содержащего тяжелую цепь SEQ ID NO: 37 и легкую цепь SEQ ID NO: 39; и scFv против VEGFR, содержащего тяжелую цепь SEQ ID NO: 41 и легкую цепь SEQ ID NO: 43) с учетом аминокислотной последовательности каждого scFv, после чего осуществляли лигирование вектора и вставки тем же способом, что и для получения указанного вектора, с которым связан scFv против мезотелина, таким образом, что полученный продукт встраивали в участок фермента Sfi1 в векторе pcDNA3.1.
CXCL16 и участок расщепления фурином амплифицировали посредством ПЦР с учетом последовательности праймеров, представленных в следующей таблице 4, и использовали участок фермента Not1 после последовательности иммуноглобулина, находящейся в векторе. Вектор, в который встраивают scFv для распознавания антигена–мишени, расщепляли ферментом Not1 в течение двух часов и очищали, после чего смешивали вектор, вставку, т.е. образец CXCL16, и фермент лигазу и культивировали при 25°C в течение двух часов для осуществления лигирования вектора и вставки.
[Таблица 4]
Последовательность праймеров для получения CXCL16 и участка расщепления фурином
Последовательность
CXCL16, участок расщепления фуриномПрямой праймер
5’–CACACTGGCGGCCGCACGGGTGAAGCGGAACGAGGGCAG–3’(SEQ ID NO: 26)
CXCL16, участок расщепления фуриномОбратный праймер
5’–AATCTCGAGCGGCCGCCTAAGGAAGTAAATGCTTCTGGTG–3’(SEQ ID NO: 27)
Слитый полипептид (NRP–антитело) массово получали посредством трансфекции клеток CHO (яичника китайского хомяка), из которых удаляли фурин, с использованием полученного экспрессирующего вектора. Клетки CHO, трансфицированные с использованием указанного экспрессирующего вектора, культивировали в планшете 150 мм, затем культивировали в инкубаторе для роллерных бутылей в течение 72 часов, а затем собирали их. Собранную культуральную жидкость центрифугировали, после чего супернатант очищали с использованием колонки с протеином A–агарозой из системы очистки белков AKTA (GE Healthcare Life Sciences), таким образом, что получали слитый полипептид.
<Пример 3> Определение связывания слитого полипептида с антигеном
5
Мезотелин–распознающий слитый полипептид (NRP–антитело с scFv против мезотелина) (0,1–2 мкг/мл), полученный в примере 2 выше, добавляли к 2×10клеток Panc–1, являющихся линией клеток рака поджелудочной железы, и культивировали при 4°C в течение 20 минут. После этого клетки собирали и промывали PBS, после чего к ним добавляли антитела FC (1 мкг/мл), с которыми связан FITC, и культивировали при 4°C в течение 20 минут. После этого клетки снова собирали, промывали PBS, а затем анализировали посредством FACS.
Результаты показаны на фиг. 3.
Как показано на фиг. 3, определяли, что мезотелин, присутствующий на поверхности линии клеток рака поджелудочной железы, распознается мезотелин–распознающим участком слитого полипептида, полученного в примере 2 выше, таким образом, что слитый полипептид связывается с поверхностью клеток.
Кроме того, для определения того, что слитый полипептид по настоящему изобретению связывается с поверхностью целевой линии клеток, даже если антиген–распознающие участки отличаются, осуществляли анализ FACS с использованием слитого полипептида с scFv против PD–L1 и слитого полипептида с scFv против Her2, полученных в примере 2 выше, в тех же условиях, что и эксперименте по связыванию антигена указанным слитым полипептидом с scFv против мезотелина, результаты показаны на фиг. 4 (NRP–антитело с scFv против PD–L1) и фиг. 5 (NRP–антитело с scFv против Her2).
Как показано на фиг. 4 и 5, определяли, что NRP–антитело с scFv против PD–L1 и NRP–антитело с scFv против Her2 распознают PD–L1 или Her2, присутствующие на поверхности линии клеток рака поджелудочной железы соответственно, с помощью антиген–распознающего участка, и слитый полипептид специфически связывается с поверхностью клеток, и, таким образом, для слитого полипептида по настоящему изобретению определено, что антитело, специфически связывающееся с антигеном–мишенью, можно по–разному использовать в зависимости от целевого опухолеспецифического антигена.
<Пример 4> Определение характеристик высвобождения CXCL16
С помощью ELISA на CXCL16 человека определяли, расщепляется ли участок расщепления фурином в слитом полипептиде (NRP–антителе), полученном в примере 2 выше, фурином из линии злокачественных клеток, и высвобождается ли CXCL16.
ELISA на CXCL16 осуществляли способом с использованием набора ELISA на CXCL16 человека (#DCX160) (R&D system). Для анализа ELISA слитый полипептид с scFv против мезотелина (NRP–антитело с scFv против мезотелина) добавляли в количестве 0,5 мкг/мл и 50 мкл/лунку в 96–луночный планшет для ELISA (R&D) и оставляли при комнатной температуре на два часа, таким образом, что для анализа использовали абсорбированный белок. Указанный планшет промывали, после чего в него добавляли пероксидазную метку в количестве 200 мкл/лунку в виде вторичного антитела и оставляли при комнатной температуре на два часа. Указанный планшет промывали Tween–PBS, после чего в него добавляли раствор субстрата ABTS для проявления цвета, таким образом, что измеряли поглощение при OD 415 нм с использованием спектрофотометра для чтения планшетов.
Результаты показаны на фиг. 6.
Как показано на фиг. 6, определяли, что слитый полипептид (NRP–антитело) связывается с мезотелином из линии клеток рака поджелудочной железы, т.е. Panc–1, после чего участок расщепления фурином в слитом полипептиде расщепляется фурином из злокачественной клетки, таким образом, что высвобождается CXCL16.
<Пример 5> Определение повышения способности NK–клеток к миграции в зависимости от CXCL16, высвобождающегося из слитого полипептида
Для определения того, распознает ли слитый полипептид, полученный в примере 2 выше, и связывается ли со злокачественным новообразованием, экспрессирующим антиген–мишень, после чего CXCL16, белок для индукции миграции NK–клеток, высвобождается для повышения миграции NK–клеток, использовали систему камеры Бойдена.
5
5
2
2
2
Линии клеток HPDE, Panc–1 (ATCC, кат. № CRL–1469), HCT116 (ATCC, кат. № CCL–247), MCF7 (ATCC, кат. № HTB–22) и HT–29 (ATCC, кат. № HTB–38) добавляли в количестве 2×10 на нижний слой камеры Бойдена (Fisher Scientific, #07–200–155) и культивировали в инкубаторе с CO при 37°C в течение двух часов. Слитый полипептид с scFv против мезотелина добавляли в количестве 1 мкг/мл в каждую из указанных выше линий клеток и культивировали в инкубаторе с COпри 37°C в течение четырех часов. NK–клетки метили CFSE (BioLegend, #RUO 423801), затем добавляли в количестве 2×10 на верхний слой, а затем культивировали в инкубаторе с CO при 37°C в течение четырех часов. После этого клетки собирали из нижнего слоя и с помощью FACS определяли распределение CFSE–меченых NK–клеток.
Результаты показаны на фиг. 7.
Как показано на фиг. 7, определяли, что способность выращенных NK–клеток человека к миграции повышалась под действием CXCL16, высвобождающегося из слитого полипептида с scFv против мезотелина, и дополнительно определяли, что степень повышения миграции NK–клеток варьируется в зависимости от типа линии злокачественных клеток.
Кроме того, слитый полипептид с scFv против PD–L1 и слитый полипептид с scFv против Her2, полученные в примере 2 выше, добавляли к линиям клеток Panc–1, HT–29 или MCF7 и, таким образом, определяли, что миграция NK–клеток в системе камеры Бойдена повышается в тех же условиях, что и в эксперименте с указанным слитым полипептидом с scFv против мезотелина, результаты показаны на фиг. 8 (NRP–антитело с scFv против PD–L1 в случае Panc–1), фиг. 9 (NRP–антитело с scFv против PD–L1 в случае HT–29), фиг. 10 (NRP–антитело с scFv против Her2 в случае Panc–1) и фиг. 11 (NRP–антитело с scFv против Her2 в случае MCF7).
Как показано на фиг. 8–11, определяли, что способность выращенных NK–клеток человека к миграции повышалась под действием CXCL16, высвобождающегося из каждого слитого полипептида, так же, как и в случае слитого полипептида с scFv против мезотелина.
Кроме того, слитые полипептиды с scFv против CD–19, MUC–1, EGFR и VEGFR, полученные в примере 2 выше, добавляли к линиям клеток HPDE, K562 (ATCC, кат. № CCL–243), HCT116 (ATCC, кат. № CCL–247), Panc–1 (ATCC, кат. № CRL–1469) или MCF7 (ATCC, кат. № HTB–22) и, таким образом, определяли, повышена ли миграция NK–клеток или нет в тех же условиях, что и в эксперименте с указанным слитым полипептидом с scFv против мезотелина в системе камеры Бойдена, результаты показаны на фиг. 12 (NRP–антитело с scFv против CD19), фиг. 13 (NRP–антитело с scFv против MUC–1), фиг. 14 (NRP–антитело с scFv против EGFR) и фиг. 15 (NRP–антитело с scFv против VEGFR), соответственно.
Как показано на фиг. 12–15, определяли, что способность выращенных NK–клеток человека к миграции повышалась под действием CXCL16, высвобождающегося из слитого полипептида, и дополнительно определяли, что степень повышения миграции NK–клеток варьируется в зависимости от типа линии злокачественных клеток.
<Пример 6> Определение способности NK–клеток к инвазии в зависимости от CXCL16, высвобождающегося из слитого полипептида
Анализ инвазии использовали для определения того, распознает ли каждый слитый полипептид, полученный в примере 2 выше, и связывается ли с антигеном–мишенью, экспрессирующимся на злокачественной клетке, после чего CXCL16, белок для индукции миграции NK–клеток, высвобождается для повышения способности NK–клеток к инвазии в злокачественные клетки.
5
5
2
2
В частности, линии клеток HPDE, Panc–1, HCT116, MCF7, HT–29 и K562 добавляли в количестве 2×10на нижний слой камеры Бойдена (Fisher Scientific, #07–200–155) и культивировали в инкубаторе с CO при 37°C в течение двух часов, после чего слитый полипептид, полученный в примере 2, добавляли в количестве 1 мкг/мл к каждой из указанных выше линий клеток. Верхний слой обрабатывали матригелем (BD, #354234), после чего к нему добавляли NK–клетки в количестве 2×10 и культивировали в инкубаторе с CO при 37°C в течение 48 часов. После этого, собирали верхний слой и окрашивали кристаллвиолетом в течение одного часа, после чего делали фотографии трех частей верхнего слоя, таким образом, что измеряли способность NK–клеток к инвазии с помощью программного обеспечения ImageJ.
Результаты для каждого слитого полипептида показаны на фиг. 16–24, соответственно.
Как показано на фиг. 16–24, определяли, что инвазивность выращенных NK–клеток человека повышалась под действием CXCL16, высвобождающегося из слитого полипептида, и дополнительно определяли, что степень повышения способности NK–клеток к инвазии варьируется в зависимости от типа линии злокачественных клеток.
<Пример 7> Определение индуцированной гибели линий злокачественных клеток под действием индуцированных NK–клеток
Определяли эффективность антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) в отношении индукции гибели линий злокачественных клеток под действием NK–клеток, индукция которых повышалась после высвобождения CXCL16 из слитого полипептида, полученного в примере 2 выше.
5
5
2
2
2
Линии клеток Panc–1 добавляли в количестве 2×10 в 96–луночный планшет и культивировали в инкубаторе с CO при 37°C в течение двух часов. Клетки–мишени обрабатывали слитым полипептидом с scFv против мезотелина в количестве 1 мкг/мл и культивировали в инкубаторе с CO при 37°C в течение двух часов. NK–клетки добавляли в количестве 2×10 для достижения соотношения клеток–мишеней и эффекторных клеток 1:1 и культивировали в инкубаторе с CO при 37°C в течение четырех часов. Клетки собирали, затем промывали PBS, затем окрашивали аннексином V (1 мкг/мл) и PI (1 мкг/мл) в течение 30 минут, а затем анализировали посредством FACS.
Результаты показаны на фиг. 25.
Как показано на фиг. 25, определяли, что гибель злокачественных клеток значительно повышалась под действием NK–клеток, индукция которых повышалась после высвобождения CXCL16.
<Пример 8> Определение терапевтической эффективности слитого полипептида в модели на животных с трансплантированными злокачественными клетками
in vivo
Слитый полипептид, полученный в примере 2, инъецировали в модели на животных с трансплантированными злокачественными клетками для определения их эффекта .
in vivo
Для эксперимента  использовали самок мышей NSG (NOD.Cg–PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) возрастом шесть недель. С животными обращались в соответствии с требованиями Комитета по содержанию и использованию животных Центра по содержанию лабораторных животных Корейского исследовательского института бионауки и биотехнологии. Panc–1 инъецировали в поджелудочную железу мыши, после чего опухоль образовывалась в течение двух недель, и интраперитонеально инъецировали слитый полипептид с scFv против мезотелина, PD–L1 или Her2 (5 мг/кг) с интервалом в пять дней.
7
7
Для эксперимента по росту опухоли NK–клетки инъецировали I.V. в количестве 1×10/мышь. Для наблюдения за ростом опухоли наблюдали за ростом Panc–1, экспрессирующих люциферазу, с использованием программного обеспечения IVIS Living Image 3.0. Для эксперимента по способности NK–клеток к миграции NK–клетки, окрашенные DiR, внутривенно инъецировали в количестве 1×10/мышь и определяли их с использованием программного обеспечения IVIS Fluorescence Image и FACS.
Результаты показаны на фиг. 26–29. На фиг. 26 показана индукция NK–клеток в отношении злокачественной ткани в зависимости от введения слитого полипептида, полученного в примере 2 выше, а также NK–клеток, и на фиг. 27, 28 и 29 показаны результаты определения терапевтического эффекта посредством введения NRP–антитела с scFv против мезотелина, NRP–антитела с scFv против PD–L1 и NRP–антитела с scFv против Her2, соответственно, вместе с NK–клетками.
Как показано на A на фиг. 26, миграция NK–клеток в злокачественную ткань значительно повышалась под действием NRP–антитела. Как показано на B на фиг. 26, такой агонистический эффект возникал только при добавлении NRP–антитела.
Кроме того, как показано на фиг. 27–29, в случае введения слитого полипептида, полученного в примере 2, вместе с NK–клетками, значительно ингибировали рост опухоли и значительно повышали миграцию NK–клеток в опухолевую ткань.
Учитывая представленные выше результаты, определяли, что слитый полипептид по настоящему изобретению повышает миграцию NK–клеток, иммуноцитарного терапевтического средства, таким образом, демонстрируя значительный эффект в отношении лечения злокачественных опухолей.
<Пример 9> Определение характерного изменения NK–клеток в зависимости от обработки CXCL16
dim
bright
bright
Для определения характерного изменения NK–клеток с помощью CXCL16, высвобождающегося из слитого полипептида, NK–клетки обрабатывали ИЛ–2 и CXCL16, способствующими росту NK–клеток, в концентрации 200 Ед. и 100 нМ, соответственно, в течение 0, 1, 2, 8 или 16 часов и определяли распределение CD56 и CD56 посредством FACS, результаты показаны на фиг. 30, и клетки в квадрате наверху справа соответствуют CD56 клеткам.
dim
bright
Как показано на фиг. 30, определяли, что распределение клеток изменяли с CD56на CD56 с помощью обработки CXCL16 в зависимости от времени обработки.
Кроме того, обработку ИЛ–2 и CXCL16 осуществляли одновременно в течение длительного периода времени (14 дней) аналогично экспериментальному способу, описанному выше, после чего определяли изменение экспрессии CD56, результаты показаны на фиг. 31.
bright
Как показано на фиг. 31, изменение в CD56 клетки определяли в экспериментальной группе, которой совместно вводили ИЛ–2 и CXCL16 (ИЛ–2+CXCL16 на фиг. 31A и CXCL16 на фиг. 31B).
dim
bright
Учитывая указанные выше результаты, определяли, что CXCL16 изменяет CD56 в CD56, имеющие значительный эффект ADCC, таким образом, оказывая влияние на характеристики NK–клеток.
<Пример 10> Характерное изменение NK–клеток в зависимости от обработки слитым полипептидом (NRP–антителом)
Определяли изменение эффективности ADCC, индуцирующей гибели злокачественных клеток, в зависимости от распределения NK–клетки, измененного с помощью CXCL16.
5
5
2
2
Линию клеток Panc–1 в количестве 2×10 добавляли в 96–луночный планшет и культивировали в инкубаторе с COпри 37°C в течение двух часов. К ним добавляли NK–клетки в количестве 2×10 для достижения соотношения клеток–мишеней и эффекторных клеток 1:1 и культивировали в инкубаторе с CO при 37°C в течение четырех часов. Клетки собирали, промывали PBS, окрашивали аннексином V (1 мкг/мл) и PI (1 мкг/мл) в течение 30 минут, а затем анализировали посредством FACS.
Результаты показаны на фиг. 32.
bright
+
Как показано на фиг. 32, определяли, что гибель злокачественных клеток повышалась под действием CD56CD16 NK–клеток, повышенных с помощью CXCL16 из слитого полипептида.
--->
<110>    Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120>    АКТИВИРУЮЩИЙ NK-КЛЕТКИ СЛИТЫЙ БЕЛОК, NK-КЛЕТКИ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ
КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ИХ
<130>    P18013-KRI
<150>    KR 10/2017/0043988
<151>    2017-04-05
<160>    43
<170>    KoPatentIn 3.0
<210>    1
<211>    242
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    scFV против мезотелина
<400>    1
Met Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly
1               5                  10                  15
Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly
20                  25                  30
Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys
50                  55                  60
Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65                  70                  75                  80
Tyr Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115                 120                 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala
130                 135                 140
Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr
165                 170                 175
Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val
180                 185                 190
Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr
195                 200                 205
Ile Ser Ser Val Glu Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210                 215                 220
Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
225                 230                 235                 240
Ile Lys
<210>    2
<211>    723
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    scFV против мезотелина
<400>    2
atgcaggtac aactgcagca gtctgggcct gagctggaga agcctggcgc ttcagtgaag         60
atatcctgca aggcttctgg ttactcattc actggctaca ccatgaactg ggtgaagcag        120
agccatggaa agagccttga gtggattgga cttattactc cttacaatgg tgcttctagc        180
tacaaccaga agttcagggg caaggccaca ttaactgtag acaagtcatc cagcacagcc        240
tacatggacc tcctcagtct gacatctgaa gactctgcag tctatttctg tgcaaggggg        300
ggttacgacg ggaggggttt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca        360
ggtgtaggcg gttcaggcgg cggtggctct ggcggtggcg gatcggacat cgagctcact        420
cagtctccag caatcatgtc tgcatctcca ggggagaagg tcaccatgac ctgcagtgcc        480
agctcaagtg taagttacat gcactggtac cagcagaagt caggcacctc ccccaaaaga        540
tggatttatg acacatccaa actggcttct ggagtcccag gtcgcttcag tggcagtggg        600
tctggaaact cttactctct cacaatcagc agcgtggagg ctgaagatga tgcaacttat        660
tactgccagc agtggagtgg ttaccctctc acgttcggtg ctgggacaaa gttggaaata        720
aaa                                                                      723
<210>    3
<211>    118
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Тяжелая цепь scFv против PD-L1
<400>    3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Asp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Leu His Ala Asp Thr Gly Ile Thr Lys Phe Ser Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Arg Ile Gln Leu Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>    4
<211>    354
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Тяжелая цепь scFv против PD-L1
<400>    4
caggtccaac ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt         60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact agctatgatg tacattgggt gcgccaggcc        120
cccggacaaa ggcttgagtg gatgggatgg ctccacgctg acactggtat cacaaaattt        180
tcacagaagt tccagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac        240
atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gagggagagg        300
atacagctat ggtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca              354
<210>    5
<211>    107
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Легкая цепь scFv против PD-L1
<400>    5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>    6
<211>    321
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Легкая цепь scFv против PD-L1
<400>    6
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc         60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca        120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca        180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct        240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag        300
gggaccaagc tggagatcaa a                                                  321
<210>    7
<211>    1353
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    PD-L1
<400>    7
aacataaccg gacagagcca ccaccctaca ggtcttcctc agagatcagc ttctgctcga         60
attccacgag gctggctcct ccacgcagca cggtcacttt tgtgccggtg ccgaacactc        120
tggtgctgct gcttgtgtag ctgctgcagt agtagtcggc ctcgtcctcg gcctgcagtc        180
cgctgatggt caggctggcg gtgttgccgc tcttgctgcc gctgaatctg ttggacacgc        240
cgctgggccg gttggacacg tcgtagatca tcagcttggg ggccttgccg gggtgctgct        300
gataccagga cacgtagttg tagccgccca cgtcgctgct ggtgcctgtg cagctgatgg        360
tgatgctctg gccagggctg ccggacacgc tggcaggctg tgtcagggcg ctctgggaac        420
ccacaccgct ggatccaccg gagcctcctc cgccactacc tcctcctccg aggcccccga        480
ggccagagga cacggtgacc agggtgccct ggccccagta gtccacggtg gtcacggtgc        540
ccagcttgat ccgggcgcag tagtacacgg cggtgtcctc ggcccgcagg ctgttcatct        600
gcaggtacag ggtgttcttg ctgttgtccc ggctgatggt gaaccggccc ttcacggtgt        660
cggcgtagaa ggtgatgccg ccgctggggt agatgctgga cacccattcc aggcccttgc        720
caggggcctg tcggacccac atcatgatat agctgctgaa tgtgaagccg ctggcggcgc        780
aagacagtct caggctgccg ccaggctgca ccagtcctcc gccgctttcc agcagctgca        840
cctcggccat ggccggctgg gccgcgagta ataacaatcc agcggctgcc gtaggcaata        900
ggtatttcat gatttgccct cgttatctag aaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc        960
tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg       1020
taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttga ggtgggctgc       1080
aaaacaaaac ggcctcctgt caggaagccg cttttatcgg gtaccgctca ctggccgctt       1140
tccagtcggg aaacctgtct tgccagctgc attaatgaat cggccaaccc ccggggaaaa       1200
ggcggttttc gttttggggg cccagggggg tttttttttt tccccgggga acgggggaca       1260
acctgatatg ccctttaccg cctgggcccc ggaaaaaatt taaaaaaagg ggccacccct       1320
ggtttgcccc acaagggaaa aaacttgtgt ttg                                    1353
<210>    8
<211>    120
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Тяжелая цепь scFv против Her2
<400>    8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Asx Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>    9
<211>    363
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Тяжелая цепь scFv против Her2
<400>    9
atggaggttc agctggtgga gtctggcggt ggcctggtgc agccaggggg ctcactccgt         60
ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaacatt aaagacacct atatacactg ggtgcgtcag        120
gccccgggta agggcctgga atgggttgca aggatttatc ctacgaatgg ttatactaga        180
tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc        240
tacctgcaga tgaacagcct gcgtgctgag gacactgccg tctattattg ttctagatgg        300
ggaggggacg gcttctatgc tatggacgtg tggggtcaag gaaccctggt caccgtctcc        360
tcg                                                                      363
<210>    10
<211>    107
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Легкая цепь scFv против Her2
<400>    10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>    11
<211>    321
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Легкая цепь scFv против Her2
<400>    11
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc         60
atcacctgcc gtgccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acagaaacca        120
ggaaaagctc cgaaactact gatttactcg gcatccttcc tcgagtctgg agtcccttct        180
cgcttctctg gatccagatc tgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg        240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa cattatacta ctcctcccac gttcggacag        300
ggtaccaagg tggagatcaa a                                                  321
<210>    12
<211>    3768
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Her2
<400>    12
atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc         60
gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag        120
acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg        180
gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg        240
cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg        300
attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga        360
gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg        420
cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag        480
ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct        540
ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag        600
ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt        660
gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt        720
gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac        780
agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag        840
tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc        900
tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa        960
gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga       1020
gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat       1080
atccaggagt ttgctggctg caagaagatc tttgggagcc tggcatttct gccggagagc       1140
tttgatgggg acccagcctc caacactgcc ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt       1200
gagactctgg aagagatcac aggttaccta tacatctcag catggccgga cagcctgcct       1260
gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta atccggggac gaattctgca caatggcgcc       1320
tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa       1380
ctgggcagtg gactggccct catccaccat aacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg       1440
ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac caagctctgc tccacactgc caaccggcca       1500
gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc       1560
tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc       1620
gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt       1680
ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag       1740
gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc       1800
cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag       1860
ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag       1920
ggctgccccg ccgagcagag agccagccct ctgacgtcca tcgtctctgc ggtggttggc       1980
attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc tttgggatcc tcatcaagcg acggcagcag       2040
aagatccgga agtacacgat gcggagactg ctgcaggaaa cggagctggt ggagccgctg       2100
acacctagcg gagcgatgcc caaccaggcg cagatgcgga tcctgaaaga gacggagctg       2160
aggaaggtga aggtgcttgg atctggcgct tttggcacag tctacaaggg catctggatc       2220
cctgatgggg agaatgtgaa aattccagtg gccatcaaag tgttgaggga aaacacatcc       2280
cccaaagcca acaaagaaat cttagacgaa gcatacgtga tggctggtgt gggctcccca       2340
tatgtctccc gccttctggg catctgcctg acatccacgg tgcagctggt gacacagctt       2400
atgccctatg gctgcctctt agaccatgtc cgggaaaacc gcggacgcct gggctcccag       2460
gacctgctga actggtgtat gcagattgcc aaggggatga gctacctgga ggatgtgcgg       2520
ctcgtacaca gggacttggc cgctcggaac gtgctggtca agagtcccaa ccatgtcaaa       2580
attacagact tcgggctggc tcggctgctg gacattgacg agacagagta ccatgcagat       2640
gggggcaagg tgcccatcaa gtggatggcg ctggagtcca ttctccgccg gcggttcacc       2700
caccagagtg atgtgtggag ttatggtgtg actgtgtggg agctgatgac ttttggggcc       2760
aaaccttacg atgggatccc agcccgggag atccctgacc tgctggaaaa gggggagcgg       2820
ctgccccagc cccccatctg caccattgat gtctacatga tcatggtcaa atgttggatg       2880
attgactctg aatgtcggcc aagattccgg gagttggtgt ctgaattctc ccgcatggcc       2940
agggaccccc agcgctttgt ggtcatccag aatgaggact tgggcccagc cagtcccttg       3000
gacagcacct tctaccgctc actgctggag gacgatgaca tgggggacct ggtggatgct       3060
gaggagtatc tggtacccca gcagggcttc ttctgtccag accctgcccc gggcgctggg       3120
ggcatggtcc accacaggca ccgcagctca tctaccagga gtggcggtgg ggacctgaca       3180
ctagggctgg agccctctga agaggaggcc cccaggtctc cactggcacc ctccgaaggg       3240
gctggctccg atgtatttga tggtgacctg ggaatggggg cagccaaggg gctgcaaagc       3300
ctccccacac atgaccccag ccctctacag cggtacagtg aggaccccac agtacccctg       3360
ccctctgaga ctgatggcta cgttgccccc ctgacctgca gcccccagcc tgaatatgtg       3420
aaccagccag atgttcggcc ccagccccct tcgccccgag agggccctct gcctgctgcc       3480
cgacctgctg gtgccactct ggaaagggcc aagactctct ccccagggaa gaatggggtc       3540
gtcaaagacg tttttgcctt tgggggtgcc gtggagaacc ccgagtactt gacaccccag       3600
ggaggagctg cccctcagcc ccaccctcct cctgccttca gcccagcctt cgacaacctc       3660
tattactggg accaggaccc accagagcgg ggggctccac ccagcacctt caaagggaca       3720
cctacggcag agaacccaga gtacctgggt ctggacgtgc cagtgtga                    3768
<210>    13
<211>    235
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    FC
<400>    13
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                  10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Phe Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly Lys Ile Leu Gln Ile Ser Ile Thr Leu
225                 230                 235
<210>    14
<211>    705
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    FC
<400>    14
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc         60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca        120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac        180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag cggcgggagg agcagtacaa cagcacgtac        240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag        300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa        360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag        420
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag        480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc        540
gacggctcct tcttcttcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg        600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc        660
ctctccctgt ctccgggtaa aattctgcag atatccatca cactg                        705
<210>    15
<211>    4
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Фурин
<400>    15
Arg Val Lys Arg
1
<210>    16
<211>    13
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Фурин
<400>    16
acgggtgaag cgg                                                            13
<210>    17
<211>    89
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    CXCL16
<400>    17
Asn Glu Gly Ser Val Thr Gly Ser Cys Tyr Cys Gly Lys Arg Ile Ser
1               5                  10                  15
Ser Asp Ser Pro Pro Ser Val Gln Phe Met Asn Arg Leu Arg Lys His
20                  25                  30
Leu Arg Ala Tyr His Arg Cys Leu Tyr Tyr Thr Arg Phe Gln Leu Leu
35                  40                  45
Ser Trp Ser Val Cys Gly Gly Asn Lys Asp Pro Trp Val Gln Glu Leu
50                  55                  60
Met Ser Cys Leu Asp Leu Lys Glu Cys Gly His Ala Tyr Ser Gly Ile
65                  70                  75                  80
Val Ala His Gln Lys His Leu Leu Pro
85
<210>    18
<211>    270
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    CXCL16
<400>    18
aacgagggca gcgtcactgg aagttgttat tgtggtaaaa gaatttcttc cgactccccg         60
ccatcggttc agttcatgaa tcgtctccgg aaacacctga gagcttacca tcggtgtcta        120
tactacacga ggttccagct cctttcctgg agcgtgtgtg gaggcaacaa ggacccatgg        180
gttcaggaat tgatgagctg tcttgatctc aaagaatgtg gacatgctta ctcggggatt        240
gtggcccacc agaagcattt acttccttag                                         270
<210>    19
<211>    8748
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Экспрессирующий вектор для слитого белка
<400>    19
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg         60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg        120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc        180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt        240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata        300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc        360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc        420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt        480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt        540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca        600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg        660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc        720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg        780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca        840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc        900
gagctcggat ccatgggatg gagctatatc atcctctttt tggtagcaac agctacagat        960
gtccactcgg cccagccggc catggccgac caggtacaga tgcagctggt agagtctggg       1020
gctgaagtga agaagcctgg ggcttcagtg aagctgtcct gcaaggcttc tggctacacc       1080
ttcagcagct actggatgca ctgggtgcgc caggcccctg gacaacgcct tgagtggatg       1140
ggagagatta atcctggcaa cggtcatact aactacaacg agaagttcaa gtcacgcgtg       1200
acaatcactg tagacaaatc cgcgagcaca gcctacatgg agctcagcag cctgagatct       1260
gagaacacgg cggtctatta ctgtgcaaga tcttttacta cggcacgggc gtttgcttac       1320
tggggccaag ggactctggt caccgtctcc tcaggcctcg gatgcaggta caactgcagc       1380
agtctgggcc tgagctggag aagcctggcg cttcagtgaa gatatcctgc aaggcttctg       1440
gttactcatt cactggctac accatgaact gggtgaagca gagccatgga aagagccttg       1500
agtggattgg acttattact ccttacaatg gtgcttctag ctacaaccag aagttcaggg       1560
gcaaggccac attaactgta gacaagtcat ccagcacagc ctacatggac ctcctcagtc       1620
tgacatctga agactctgca gtctatttct gtgcaagggg gggttacgac gggaggggtt       1680
ttgactactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc aggtgtaggc ggttcaggcg       1740
gcggtggctc tggcggtggc ggatcggaca tcgagctcac tcagtctcca gcaatcatgt       1800
ctgcatctcc aggggagaag gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca       1860
tgcactggta ccagcagaag tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca       1920
aactggcttc tggagtccca ggtcgcttca gtggcagtgg gtctggaaac tcttactctc       1980
tcacaatcag cagcgtggag gctgaagatg atgcaactta ttactgccag cagtggagtg       2040
gttaccctct cacgttcggt gctgggacaa agttggaaat aaaagggccc atcggccggt       2100
gggccctggt gccgcgcggc agcgctagcg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag       2160
cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc       2220
tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc       2280
ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc       2340
ggcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc       2400
aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc       2460
ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc       2520
tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag       2580
gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact       2640
acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcttctac agcaagctca       2700
ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg       2760
ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa attctgcaga       2820
tatccatcac actggcggcc gcacgggtga agcggaacga gggcagcgtc actggaagtt       2880
gttattgtgg taaaagaatt tcttccgact ccccgccatc ggttcagttc atgaatcgtc       2940
tccggaaaca cctgagagct taccatcggt gtctatacta cacgaggttc cagctccttt       3000
cctggagcgt gtgtggaggc aacaaggacc catgggttca ggaattgatg agctgtcttg       3060
atctcaaaga atgtggacat gcttactcgg ggattgtggc ccaccagaag catttacttc       3120
cttaggcggc cgctcgagat tccgcccctc tccctccccc ccccctaacg ttactggccg       3180
aagccgcttg gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg tgattttcca ccatattgcc       3240
gtcttttggc aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag       3300
gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt       3360
tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa       3420
ccccccacct ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc       3480
aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg       3540
gctctcctca agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat       3600
gggatctgat ctggggcctc ggtgcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa       3660
acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt tgaaaaacat cgatgataat       3720
atggttcgac cattgaactg catcgtcgcc gtgtcccaaa atatggggat tggcaagaac       3780
ggagacctac cctggcctcc gctcaggaac gagttcaagt acttccaaag aatgaccaca       3840
acctcttcag tggaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaggaaaac ctggttctcc       3900
attcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaatcaata tagttctcag tagagaactc       3960
aaagaaccac cacgaggagc tcattttctt gccaaaagtt tggatgatgc cttaagactt       4020
attgaacaac cggaattggc aagtaaagta gacatggttt ggatagtcgg aggcagttct       4080
gtttaccagg aagccatgaa tcaaccaggc cacctcagac tctttgtgac aaggatcatg       4140
caggaatttg aaagtgacac gtttttccca gaaattgatt tggggaaata taaacttctc       4200
ccagaatacc caggcgtcct ctctgaggtc caggaggaaa aaggcatcaa gtataagttt       4260
gaagtctacg agaagaaaga ctaatctaga gggccctatt ctatagtgtc acctaaatgc       4320
tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc       4380
ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa       4440
tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg       4500
gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg       4560
ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agggggtatc cccacgcgcc       4620
ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact       4680
tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc       4740
cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg catcccttta gggttccgat ttagtgcttt       4800
acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc       4860
ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt       4920
gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat       4980
tttggggatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa       5040
ttaattctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccaggcagg       5100
cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg       5160
ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc       5220
gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca       5280
tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct ctgagctatt       5340
ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc       5400
ttgtatatcc attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga       5460
acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga       5520
ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg       5580
gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga       5640
ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt       5700
tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct       5760
gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct       5820
gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg       5880
agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca       5940
ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga       6000
tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt       6060
ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt       6120
ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct       6180
ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt       6240
cttctgagcg ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca       6300
cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg       6360
gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc       6420
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca       6480
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct       6540
tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg       6600
tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata       6660
aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca       6720
ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc       6780
gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg       6840
cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta       6900
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc       6960
aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag       7020
catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac       7080
caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc       7140
ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt       7200
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc       7260
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga       7320
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta       7380
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta       7440
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga       7500
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg       7560
cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag       7620
tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc       7680
tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact       7740
tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt       7800
cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta       7860
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta       7920
tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc       7980
gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat       8040
agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt       8100
atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg       8160
tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca       8220
gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta       8280
agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg       8340
cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact       8400
ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg       8460
ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt       8520
actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga       8580
ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc       8640
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa       8700
caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc                    8748
<210>    20
<211>    34
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер для scFV против мезотелина
<400>    20
ggcccagccg gccatgcagg tacaactgca gcag                                     34
<210>    21
<211>    39
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер scFV против мезотелина
<400>    21
ggcccttggt ggaggcactc gagacggtga ccagggttc                                39
<210>    22
<211>    36
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер для scFv против PD-L1
<400>    22
ggcccagccg gccatgcagg tccaacttgt gcagtc                                   36
<210>    23
<211>    30
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер для scFv против PD-L1
<400>    23
ggcccttggt ggaccaagct ggagatcaaa                                          30
<210>    24
<211>    33
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер для scFv против Her2
<400>    24
ggcccagccg gccatggagg ttcagctggt gga                                      33
<210>    25
<211>    28
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер scFv против Her2
<400>    25
ggcccttggt accaaggtgg agatcaaa                                            28
<210>    26
<211>    39
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер для CXCL16, участка расщепления фурином
<400>    26
cacactggcg gccgcacggg tgaagcggaa cgagggcag                                39
<210>    27
<211>    40
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер для CXCL16, участка расщепления фурином
<400>    27
aatctcgagc ggccgcctaa ggaagtaaat gcttctggtg                               40
<210>    28
<211>    119
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Тяжелая цепь scFv против CD19
<400>    28
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>    29
<211>    357
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Тяжелая цепь scFv против CD19
<400>    29
caggtgcagc tgcagcagag cggcccggaa ctggtgaaac cgggcgcgag cgtgaaaatt         60
agctgcaaag cgagcggcta tgcgtttagc agcagctgga tgaactgggt gaaacagcgc        120
ccgggcaaag gcctggaatg gattggccgc atttatccgg gcgatgaaga taccaactat        180
agcggcaaat ttaaagataa agcgaccctg accgcggata aaagcagcac caccgcgtat        240
atgcagctga gcagcctgac cagcgaagat agcgcggtgt atttttgcgc gcgcagcctg        300
ctgtatggcg attatctgga ttattggggc cagggcacca ccctgaccgt gagcagc           357
<210>    30
<211>    107
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Легкая цепь scFv против CD19
<400>    30
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Phe Leu Thr Ile Asn Asn Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ile Asn Pro Leu Thr
85                  90                  95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100                 105
<210>    31
<211>    321
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Легкая цепь scFv против CD19
<400>    31
cagattgtgc tgacccagag cccggcgatt atgagcgcga gcccgggcga aaaagtgacc         60
atgacctgca gcgcgagcag cagcgtgagc tatatgcatt ggtatcagca gaaaagcggc        120
accagcccga aacgctggat ttatgatacc agcaaactgg cgagcggcgt gccggatcgc        180
tttagcggca gcggcagcgg caccagctat tttctgacca ttaacaacat ggaagcggaa        240
gatgcggcga cctattattg ccagcagtgg aacattaacc cgctgacctt tggcgcgggc        300
accaaactgg aactgaaacg c                                                  321
<210>    32
<211>    118
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Тяжелая цепь scFv против MCU-1
<400>    32
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser
115
<210>    33
<211>    353
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Тяжелая цепь scFv против MCU-1
<400>    33
caggtgaaac tgcagcagag cggcaccgaa gtggtgaaac cgggcgcgag cgtgaaactg         60
agctgcaaag cgagcggcta tatttttacc agctatgata ttgattgggt gcgccagacc        120
ccggaacagg gcctggatgg attggctgga tttttccggg cgaaggcagc accgaatata        180
acgaaaaatt taaaggccgc gcgaccctga gcgtggataa aagcagcagc accgcgtata        240
tggaactgac ccgcctgacc agcgaagata gcgcggtgta tttttgcgcg cgcggcgatt        300
attatcgccg ctattttgat ctgtggggcc agggcaccac cgtgaccgtg agc               353
<210>    34
<211>    109
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Легкая цепь scFv против MCU-1
<400>    34
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Arg Tyr Ile
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Tyr Asp
35                  40                  45
Thr Ser Asn Val Ala Pro Gly Val Pro Phe Arg Phe Ser Gly Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Arg Met Glu Ala Glu Asp
65                  70                  75                  80
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe
85                  90                  95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Ala
100                 105
<210>    35
<211>    327
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Легкая цепь scFv против MCU-1
<400>    35
gatattgaac tgacccagag cccggcgatt atgagcgcga gcccgggcga acgcgtgacc         60
atgacctgca gcgcgagcag cagcattcgc tatatttatt ggtatcagca gaaaccgggc        120
agcagcccgc gcctgctgta tgataccagc aacgtggcgc cgggcgtgcc gtttcgcttt        180
agcggcagcg gcagcggcac cagctatagc ctgaccatta accgcatgga agcggaagat        240
gcggcgacct attattgcca ggaatggagc ggctatccgt atacctttgg cggcggcacc        300
aaactggaac tgaaacgcgc ggcggcg                                            327
<210>    36
<211>    129
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Тяжелая цепь scFv против EGFR
<400>    36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Leu Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
35                  40                  45
Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp
100                 105                 110
Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ser
<210>    37
<211>    387
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Тяжелая цепь scFv против EGFR
<400>    37
caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt         60
agctgcaaag gcagcggcta tagctttacc agctattggc tggcgtgggt gcgccagatg        120
ccgggcaaag gcctggaata tatgggcctg atttatccgg gcgatagcga taccaaatat        180
agcccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgtggata aaagcgtgag caccgcgtat        240
ctgcagtgga gcagcctgaa accgagcgat agcgcggtgt atttttgcgc gcgccatgat        300
gtgggctatt gcagcagcag caactgcgcg aaatggccgg aatattttca gcattggggc        360
cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc                                            387
<210>    38
<211>    111
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Легкая цепь scFv против EGFR
<400>    38
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                  10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100                 105                 110
<210>    39
<211>    333
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Легкая цепь scFv против EGFR
<400>    39
cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtg agcgcggcgc cgggccagaa agtgaccatt         60
agctgcagcg gcagcagcag caacattggc aacaactatg tgagctggta tcagcagctg        120
ccgggcaccg cgccgaaact gctgatttat ggccatacca accgcccggc gggcgtgccg        180
gatcgcttta gcggcagcaa aagcggcacc agcgcgagcc tggcgattag cggctttcgc        240
agcgaagatg aagcggatta ttattgcgcg gcgtgggatg atagcctgag cggctgggtg        300
tttggcggcg gcaccaaact gaccgtgctg ggc                                     333
<210>    40
<211>    227
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Тяжелая цепь scFv против VEGFR
<400>    40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His
225
<210>    41
<211>    681
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Тяжелая цепь scFv против VEGFR
<400>    41
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcctg         60
agctgcgcgg cgagcggctt taccattagc gattattgga ttcattgggt gcgccaggcg        120
ccgggcaaag gcctggaatg ggtggcgggc attaccccgg cgggcggcta tacctattat        180
gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agcgcggata ccagcaaaaa caccgcgtat        240
ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcggtgt attattgcgc gcgctttgtg        300
ttttttctgc cgtatgcgat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc        360
gcgagcacca aaggcccgag cgtgtttccg ctggcgccga gcagcaaaag caccagcggc        420
ggcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc        480
tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcagagcagc        540
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccgagca gcagcctggg cacccagacc        600
tatatttgca acgtgaacca taaaccgagc aacaccaaag tggataaaaa agtggaaccg        660
aaaagctgcg ataaaaccca t                                                  681
<210>    42
<211>    214
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Легкая цепь scFv против VEGFR
<400>    42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Thr Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>    43
<211>    642
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Легкая цепь scFv против VEGFR
<400>    43
gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc         60
accacctgcc gcgcgagcca ggatgtgagc accgcggtgg cgtggtatca gcagaaaccg        120
ggcaaagcgc cgaaactgct gatttatagc gcgagctttc tgtatagcgg cgtgccgagc        180
cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg        240
gaagattttg cgacctatta ttgccagcag agctatacca ccccgccgac ctttggccag        300
ggcaccaaag tggaaattaa acgcaccgtg gcggcgccga gcgtgtttat ttttccgccg        360
agcgatgaac agctgaaaag cggcaccgcg agcgtggtgt gcctgctgaa caacttttat        420
ccgcgcgaag cgaaagtgca gtggaaagtg gataacgcgc tgcagagcgg caacagccag        480
gaaagcgtga ccgaacagga tagcaaagat agcacctata gcctgagcag caccctgacc        540
ctgagcaaag cggattatga aaaacataaa gtgtatgcgt gcgaagtgac ccatcagggc        600
ctgagcagcc cggtgaccaa aagctttaac cgcggcgaat gc                           642
<---