Способ получения полиэлектролитных микрокапсул
METHOD FOR POLYELECTROLITE MICROCAPSULES PREPARATION

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарии и медицине, в частности предлагается способ иммобилизации пептидов из эмбриональных тканей птиц в микрокапсулы методом совместного их соосаждения с противоположно заряженными полиэлектролитами в изоэлектрической точке.
Предлагаемый способ получения микрокапсул позволяет доставлять пептиды из эмбриональных тканей птиц в кишечник, минуя желудочную среду, с сохранением их биологической активности.
Уровень техники
В настоящее время научный и практический интерес вызывают препараты, представляющие собой биологически активные вещества, заключенные в нано- и микрообъекты. Они представляют собой препараты нового поколения. Среди них можно выделить полиэлектролитные комплексы, которые могут быть получены в виде пленок (Yan X.L., 2001), микрокапсул (Devi N., 2009), гелей (Lina W.C., 2005), пористых структур (Sundararajan V.M., 1999), растворов (Изумрудов В.А., 2011) и обладающие рядом интересных свойств. Из них наиболее ярким является полупроницаемость полиэлектролитной оболочки капсул, то есть проницаемость для низкомолекулярных соединений и их мелких агрегатов и непроницаемость для высокомолекулярных веществ и крупных частиц (WO 0217888, 2002; Antipov А.А., 2004).
Традиционные методы включения в микрообъекты фиксированного размера и формы (сферы, капсулы) основываются на физико-химических процессах преципитации, полимеризации, коацервации и т.д. Эти методы предполагают использование органических растворителей, поперечно-сшивающих агентов, что может сказаться на снижении активности вещества, включаемого в микроконтейнеры (Бородина Т.Н., 2007).
Вышеперечисленные данные показывают, что разработка методов включения в такого рода системы позволяет создать не только новые, но и совершенствовать уже имеющиеся формы лекарственных препаратов, а также регулировать их скорость и время действия (Ковалькова М.В. и др., 2011; Краюхина М.А., 2008).
В настоящее время имеется несколько подходов к загрузке пептидов в микрокапсулы.
10-125
Известен способ включения вазоактивного интестинального пептида в липосомы (Gololobov et al., 1998). Смешивали хлороформный раствор фосфатидилхолина яичного желтка, холестерин и фосфатидилглицерол и сушили в роторном испарителе при пониженном давлении. Обезвоживали липиды 0,15М натрия хлоридом, содержащим свободный БСА [TyrI] вазоактивных интестинальных пептидов. Суспензию подвергали нескольким циклам заморозки - оттаивания, доводили объем до 500 мл 0,15М натрия хлоридом и отделяли липосомы от некорпорированных вазоактивных интестинальных пептидов проведением через колонку Sepharose 4В (Pharmacia, Uppsala, Sweden).
Недостатками данного способа являются длительность воспроизведения и малый процент включения пептидов в липосомы (39%).
Известен способ включения глюкагоноподобного пептида-1 в липосомы (Hanato et al., 2009). Липосомальный продукт готовился регидратацией сублимированных полых липосом с водным раствором препарата в соответствии с Kikuchi et al. (1999).
Недостатками данного способа являются техническая сложность выполнения способа и малый процент включения пептидов в липосомы.
Известен способ введения пептидов путем простой диффузии в капсулу с предварительно растворенной сердцевинной частью, содержащую металлические наночастицы, с последующим нагреванием капсулы, вызывающим уменьшение ее объема и размеров пор. Извлечение пептидов в организме осуществляется лазерным импульсом (Palankar et al., 2009).
Недостатком данного способа является применение специального оборудования.
Предложено использование самоорганизующегося в гидрогели пептида МАХ8 для включения полифенола куркумина, растворенного в диметилсульфоксиде. Для этого смешивали раствор куркумина-ДМСО с суспензией клеток в питательной среде и приливали раствор пептида МАХ8 (Altunbas et al., 2011).
Недостатками данного способа являются дороговизна из-за применения клеточных культур и необходимость проведения дополнительных исследований.
Известен способ получения микрокапсул жидкофазных природных веществ. Способ осуществляют путем эмульгирования капсулируемого вещества в растворе полимера (метилцеллюлоза с содержанием метоксильных групп от 27,5 до 32%) и осаждения полимера на поверхности капель эмульсии (Патент RU 2316390).
Недостатком данного способа являются разброс по размерам капсул и отсутствие описания поведения данных капсул в растворах, имитирующих жедудочно-кишечную среду.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту авторами принят за прототип способ иммобилизации белков в полиэлектролитные микрокапсулы, образуемые путем послойной адсорбции полиэлектролитов на кальций карбонатную матрицу (Патент RU 2369386). Основными стадиями данного способа являются предварительное формирование ядра капсулы - матрицы, в виде микросферолитов карбоната кальция, с включенным в них белком и последующая за этим послойная адсорбция полиэлектролитов на матрицу до достижения желаемого количества слоев. Заключительной стадией капсулирования белка является удаление кальция хлорида из капсулы путем добавления ЭДТА или другого хелатного агента или подкислением среды.
С помощью вышеописанного способа можно получить полиэлектролитные микрокапсулы, загруженные белками с сохранением до 50% их активности.
Недостатками данного способа являются использование карбоната кальция в качестве матрицы-ядра, что требует применения жестких условий для его растворения; длительность; процент сохранения активности капсулированных пептидов достигает не более 50%.
Раскрытие изобретения
Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого способа, сводится к получению наполненных пептидами из эмбриональных тканей птиц каррагинан-хитозановых микрокапсул, способных достигнуть кишечника с сохранением биологической активности пептидов.
Для достижения технического результата нами предложен способ совместного соосаждения данных пептидов с противоположно заряженными полиэлектролитами (каррагинан/хитозан) в изоэлектрической точке, включающий поочередное смешение растворов поликатиона и полианиона с раствором пептидов, их 30-минутное перемешивание и центрифугирование при 400-500 об/мин 10-15 мин с последующим удалением супернатанта, промывкой осадка раствором хлорида натрия, хранением готовых частиц в виде суспензии или в лиофилизированном состоянии при плюс 2-4°C.
Сущность способа получения полиэлектролитных микрокапсул с применением каррагинана и хитозана, загруженных пептидами из эмбриональных тканей птиц, заключается в следующем. Готовят растворы поликатиона каррагинана с концетрацией 8,0-12,0 мг/мл, полианиона хитозана с концетрацией 8,0-12,0 мг/мл в буферном растворе с рН 4.7-4.8 и раствор пептидов с концентрацией 3,5-4,5 мг/мл. К раствору каррагинана приливают раствор пептидов, перемешивают и приливают раствор хитозана (соотношение 1:5:1). Повторно приливают растворы полиэлектролитов в порядке очередности в соотношении 1:1 до достижения прочного полиэлектролитного комплекса. Полученный раствор перемешивают в течение 30 минут, а затем центрифугируют при 400-500 об/мин 10-15 мин с последующим удалением супернатанта и промывкой осадка 0,5М раствором хлорида натрия. Полученные микрокапсулы хранят в виде суспензии или в лиофильно высушенном состоянии при плюс 2-4°C.
Примеры конкретного выполнения опытов получения полиэлектролитных микрокапсул с применением каррагинана и хитозана, загруженных пептидами из эмбриональных тканей птиц в изоэлектрической точке.
Пример 1. Готовят растворы полиэлектролитов каррагинана с концетрацией 8,0-12,0 мг/мл и хитозана с концетрацией 8,0-12,0 мг/мл в буферном растворе с рН 4.7-4.8 и раствор пептидов из эмбриональных тканей птиц с концентрацией 5,5-6,5 мг/мл. К 1 мл раствора каррагинана приливают 5 мл раствора пептидов. К полученной смеси добавляют 1 мл раствора хитозана. Повторно приливают растворы полиэлектролитов в порядке очередности в соотношении 1:1 до достижения прочного полиэлектролитного комплекса. Полученный раствор перемешивают в течение 30 минут, а затем центрифугируют при 400-500 об/мин 10-15 мин, удаляют супернатант и осуществляют промывку осадка 0,5М раствором хлорида натрия. Полученные микрокапсулы хранят в виде суспензии или в лиофильно высушенном состоянии при плюс 2-4°C.
Предлагаемый способ обладает недостатком: высокий уровень потерь пептидов.
Пример 2.
Проводят аналогично примеру 1, но раствор пептидов из эмбриональных тканей птиц готовят с концентрацией 1,5-2,5 мг/мл.
Предлагаемый способ обладает недостатками: малое наполнение микрокапсул пептидами, низкая антиоксидантная активность.
Пример 3.
Проводят аналогично примеру 1, но раствор пептидов из эмбриональных тканей птиц готовят с концентрацией 3,5-4,5 мг/мл.
Предлагаемый способ позволяет получить микрокапсулы с высоким процентом включения пептидов из эмбриональных тканей птиц, минимальными потерями и значительной антиоксидантной активностью в среде, характерной для кишечника.
Оценку включения пептидов в микрокапсулы осуществляли спектрофотометрическим методом по разнице содержания пептидов в исходном растворе и в супернатанте с промывными водами по ГОСТ 13805-76 при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовались микрокапсулы без включения пептидов.
Процент иммобилизации пептидов в микрокапсулы согласно выбранному способу составил около 73%.
Оценку антиоксидантной активности пептидов после включения в микрокапсулы проводили in vitro. Для этого пептиды, иммобилизованные в микрокапсулы, предварительно провели через растворы, имитирующие среду желудочно-кишечного тракта, согласно методам Gil-Izquierdo А. (2001), McDougall G.J. (2005), Li X. (2012), с некоторыми модификациями. Для этого доводили рН суспензии до значения pH 2.0 с помощью 1Н соляной кислоты и инкубировали смесь с пепсином при 800 Ед/мл в ванне с перемешиванием в течение 2 ч при 37°C при скорости перемешивания 100 оборотов в минуту. Затем образец нейтрализовали 1М натрия гидроксидом до рН 7.0, добавляли панкреатин в дозировке 2 мг/мл и экстракт желчной смеси в количестве 0,3 мг/мл и инкубировали еще 2 часа. Завершали «переваривание» путем 10-минутного кипячения.
R+
Затем проводили оценку антиоксидантной активности иммобилизованных в микрокапсулы пептидов с помощью набора реагентов «ФитХем». Принцип метода заключался в инкубировании полученного после «переваривания» раствора с АБТС «2,2-азино-бис-[3-этилбенз-тиазолин-6-сульфакислоты]-диаммонийной соли с медмиоглобином и пероксидом водорода для образования радикала AБTC. Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре при длине волны 600-735 нм.
Антиоксидантная активность пептидов, включенных в микрокапсулы, в кислой среде, имитирующей желудочную, составила менее 3%, в то время как в нейтрально-слабощелочной среде, имитирующей кишечную - 80-85%, что обусловлено спецификой оболочек микрокапсул раскрываться в слабощелочной среде, минуя кислую среду.
Таким образом, проведенное исследование позволяет сделать вывод о том, что предлагаемый способ иммобилизации пептидов из эмбриональных тканей птиц в микрокапсулы является экспрессным, имеет высокий процент включения пептидов с минимальными потерями, благодаря специфике каррагинан-хитозаной оболочки растворяться в слабощелочной среде, минуя кислую среду, сохраняя при этом биологическую активность заключенных в нее пептидов.
Литература
Бородина Т.Н. Полиэлектролитные микрокапсулы как системы доставки биологически активных веществ / Т.Н. Бородина, Румш Л.Д., Кунижев С.М., Сухоруков Г.Б., Ворожцов Г.Н. и др. // Биомедицинская химия. - 2007. - №53(5). - С. 557-565.
Зайцева-Золотова Д.С. Микрокапсулы на основе хитозана и его производных для получения мультиклеточных раковых сфероидов / Д.С. Зайцева-Золотова, Г.В. Хмелев, А.О. Чернышенко, Т.А. Акопова, А.Н. Зеленецкий, Т.Н. Ерохина, Е.А. Марквичева // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы Восьмой Международной конференции. М.: Изд-во ВНИРО, 2006. С. 200-204.
Изумрудов В.А. Водорастворимые нестехиометричные полиэлектролитные комплексы модифицированного хитозана / В.А. Изумрудов, И.Ф. Волкова, Э.С. Григорян, М.Ю. Горшкова // Высокомолекулярные соединения. - 2011. Т. 53. №4. - С. 515-524.
Ковалькова М.В. Иммобилизация гемоглобина в полиэлектролитные капсулы / Ковалькова М.В., Пшеничная Э.Н., Воробьева О.В., Аванесян С.С. // Вестник Ставропольского государственного университета. 2011. - 74. С. 34-39.
Краюхина М.А., Самойлова П.А., Ямсков И.А. Полиэлектролитные комплексы хитозана: формирование, свойства и применение // Успехи химии. - 2008. Т. 77. №9. С. 854-869.
Патент RU 2316390. Способ получения микрокапсул // Кунижев С.М., Бородина Т.Н., Воробьева О.В., Денисова Е.В., Андрусенко С.Ф. Опубл. 10.02.2008.
Патент RU 2369386. Способ получения загруженных белком полиэлектролитных нано- и микрокапсул / Сухоруков Б.И., Сабурова Е.А., Шабарчина Л.И., Дубровский А.В., Тихоненко С.А. Опубл. 10.10.2009.
Altunbas A. Encapsulation of curcumin in self-assembling peptide hydrogels as injectable drug delivery vehicles / A. Altunbas, S.J. Гее b, Sigrid A. Rajasekaran b, Joel P. Schneider c, Darrin J. Pochan // Biomaterials. - 2011. 32 P. 5906-5914.
Antipov A.A., Sukhorukov G.B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability // Advances in Colloid and Interface Science. 2004. V. 111, №1-2. P. 49-61.
Devi N., Maji Т.К. A novel microencapsulation of neem (Azadirachta indica A. Juss.) seed oil (NSO) in polyelectrolyte complex of i-carrageenan and chitosan // J. Appl. Polym. Sci. 2009. Vol. 133, N 3. P. 1576-1583.
Fery A., Mohwald H., Sukhorukov G.B. Intelligent micro- and nanocapsules // Prog.Polym. Sci. - 2005. V. 30. P. 885-897.
Gil-Izquierdo A. In vitro availability of flavonoids and other phenolics in orange juice / A. Gil-Izquierdo, M.I. Gil, F. Ferreres, F. Tomas-Barberan // Journal of Agriculture and Food Chemistry. 2001.49. P. 1035-1041.
Gololobov G. Stabilization of vasoactive intestinal peptide by lipids / G. Gololobov, Y. Noda, S. Sherman, I. Rubinstein, J. Baranowska-Kortylewicz, S. Paul // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1998. 285. P. 753-758.
Hanato J. Liposomal formulations of glucagon-like peptide-1: improved bioavailability and anti-diabetic effect / J. Hanato, K. Kuriyama, T. Mizumoto, K. Debari, J. Hatanaka, S. Onoue, S. Yamada // Int. J. Pharm. 2009. Vol. 382, Is. 1-2. P. 111-6.
Kikuchi H. Gene delivery using liposome technology / H. Kikuchi, N. Suzuki, K. Ebihara, H. Morita, Y. Ishii, A. Kikuchi, S. Sugaya, T. Serikawa, K. Tanaka // J. Control. Release. - 1999. 62. - P. 269-277.
Li X. Chicken embryo extracts enhance spleen lymphocyte and peritoneal macrophages function / X. Li, Y. Su, J. Sun, Y. Yang // Journal of Ethnopharmacology. 2012. Vol. 144. - P. 255-260.
Lina, W.C., Yub D.G., Yanga M.C. pH-sensitive polyelectrolyte complex gel microspheres composed of chitosan/sodium tripolyphosphate/dextran sulfate: swelling kinetics and drug delivery properties // Colloids Surf. В Biointerfaces. - 2005. Vol. 44, N 2-3. P. 143-151.
McDougall G.J. Anthocyanins from red wine-their stability under simulated gastrointestinal digestion / G.J. McDougall, S. Fyffe, P. Dobson, D. Stewart // Phytochemistry. - 2005. 66. - P. 2540-2548.
Donath E. and Sukhorukov G.B. Multilayer thin films. Sequential Assembly of Nanocomposite Materials (Ed. By G. Decher and J.B. Schlenoff) // Wiley-VCH. 2002. P. 363-392.
Palankar R. Controlled Intracellular Release of Peptides from Microcapsules Enhances Antigen Presentation on MEIC Class I Molecules / R. Palankar, A.G. Skirtach, O. Kreft, M. Bedard, M. Garstka, K. Gould, H. Mohwald, G.B. Sukhorukov, M. Winterhaltcr, S. Springer // Small. 2009. 5, No. 19. - 2168-2176.
Radtchenko I.L., Sukhorukov G.B., Mohwald H. A novel method for encapsulation of poorly water-soluble drugs: precipitation in polyelectrolyte multilayer shells. // Intern. J. Pharmaceutics. 2002. Vol. 242 (1-2). - P. 219-223.
Sundararajan V.M., Howard W.Т.M. Porous chitosan scaffolds for tissue engineering // Biomaterials. 1999. Vol. 20, N 12. P. 1133-1142.
Volodkin D.V. Matrix polyelectrolyte microcapsules: new system for macromolecule encapsulation / D.V. Volodkin, A.I. Petrov, M. Petrov, G.B. Sukhorukov // Langmuir. 2004. V. 20, 8. P. 3398-3406.
WO 2002017888 A3. Controlled and sustained release properties of polyelectrolyte multilayer capsules / Antipov A.A., Viera, E., Ibarz G., Sukhorukov G., Daehne L., Gao C, Donath E., Moehwald H. - 25. 07. 2002.
Yan X.L., Khor E., Lim E.Y. Chitosan-alginate films prepared with chitosans of different molecular weights // J. Biomed. Mater. Res. Part В Appl. Biomater. - 2001. Vol. 58, N 4. - P. 358-365.