ИЗМЕНЕНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ АНТИГЕНА ПУТЕМ УСТРАНЕНИЯ ЭПИТОПОВ, УЗНАВАЕМЫХ NKT-КЛЕТКАМИ
MODULATION OF ANTIGEN IMMUNOGENICITY BY DELETING EPITOPES RECOGNIZED BY NKT-CELLS

Область техники
Настоящее изобретение имеет отношение к пептидам или полипептидам, предназначенным для уменьшения природной иммуногенности или индукции толерантности, и их применению для предотвращения иммунных ответов, вызванных аллофакторами (аллоиммунными факторами), вирусными векторами, использованными для генной терапии или генной вакцинации, антигенами окружающей среды, использованными в продуктах питания или пище, или антигенами, действию которых субъекты подвергаются при вдыхании или соприкосновении, или уменьшения побочных эффектов, связанных с вакцинацией аллергенами или инфекционными агентами.
Известный уровень техники
Во многих случаях введение протеинов в терапевтических целях приводит к иммунному ответу против терапевтических средств, что исключает любое дальнейшее введение указанного терапевтического средства. Таким примером является введение фактора VIII каскада коагуляции субъектам, пораженным гемофилией A: примерно у третьей части субъектов, прошедших лечение, вырабатываются антифактор VIII-антитела, ингибирующие функцию фактора VIII. Введение ферментов, таких как альфа-галактозидаза, субъектам, страдающим от недостаточности обмена гликогена, точно так же сопровождается иммунным ответом против терапевтического средства, исключая любое дальнейшее введение. Третьим примером являются антитела, используемые в качестве терапевтических средств и направленные против молекулы на поверхности лимфоцита, цитокинов или рецепторов цитокинов. В целом, весьма желательно найти новые терапевтические подходы, которые могли бы предотвратить иммунизацию к терапевтическим средствам.
Использование вирусных векторов для генной терапии или генной вакцинации существенно ограничивается тем обстоятельством, что вирусные векторы вызывают иммунный ответ, приводящий к быстрому устранению клеток, трансфицированных вектором, и быстрой потере трансгенной экспрессии. Вирусные векторы вызывают активацию врожденного и адаптивного иммунного ответа с непостоянной степенью интенсивности, зависящей от природы вирусного вектора. Так, например, аденовирусные векторы сильно стимулируют врожденный иммунный ответ, а затем адаптивный иммунный ответ. Аденоассоциированные вирусные векторы инициируют слабый врожденный ответ, однако вызывают выработку антител. Возможности генной терапии и генной вакцинации огромны. Терапевтический подход с использованием врожденного и/или адаптивного ответа на вирусные векторы будет представлять высокозначимый прогресс в данной области.
Многие субъекты страдают от ответа, вызванного белками, действию которых они подвергаются в естественных условиях. Аллергены, содержащиеся в воздухе или продуктах питания, вызывают такие реакции как аллергический ринит, астма, крапивница, экзема и анафилактическая реакция. Причина, по которой у субъектов наблюдаются указанные реакции, объяснена только отчасти. Было бы очень полезно уменьшить природную иммуногенность различных белков, таких как пищевые аллергены, например, белков пшеницы, вызывающих глютеновую болезнь, или таких продуктов, как ферменты, действию которых субъекты подвергаются по профессиональным причинам.
При вакцинации или к аллергическим болезням или к инфекционным агентам терапевтическая эффективность часто ограничивается побочными эффектами, которые вызываются провоспалительными свойствами аллергенов или инфекционных агентов. Такие воспалительные эффекты препятствуют применению высоких доз вакцин и, следовательно, эффективности вакцины, и ориентируют иммунный ответ по направлению к нежелательному клеточному ответу, такому как реакция гиперчувствительности замедленного типа, и выработке антител изотипа, не являющегося оптимальным при рассматриваемых условиях. Достаточный контроль за воспалением при вакцинации мог бы обеспечить намного более эффективное модулирование иммунного ответа, одновременно уменьшая побочные эффекты, связанные с воспалением.
Натуральные Т клетки-киллеры (NKT) составляют отдельную линию дифференцировки необычных Т-лимфоцитов, которые распознают антигены, презентируемые молекулой неклассического MHC комплекса CD1d. В настоящее время описано два подкласса NKT-клеток. Наиболее распространены NKT-клетки типа 1, также называемые инвариантными NKT-клетками (iNKT). Они характеризуются наличием альфа-бета T-клеточного рецептора (TCR), состоящего из инвариантной альфа-цепи, Vальфа14 у мыши и Vальфа24 у человека. Данная альфа-цепь соединена с переменным, хотя и ограниченным, числом бета-цепей. NKT-клетки типа 2 обладают альфа-бета TCR, но с полиморфной альфа-цепью. Однако очевидно, что существуют другие подклассы NKT-клеток, фенотип которых все еще не полностью определен, но которые имеют общие характерные черты, будучи активированными гликолипидами, презентируемыми в случае молекулы CD1d.
Как правило, NKT-клетки экспрессируют сочетания рецепторов клеток - натуральных киллеров (NK), включая NKG2D и NK1.1. NKT-клетки являются частью системы врожденного иммунитета, которую можно отличить от системы адаптивного иммунитета по тому факту, что им не требуется размножения перед достижением полной эффекторной способности. Активация NKT-клеток приводит к различным эффектам. Такие клетки высвобождают предварительно образованные медиаторы, включая большой набор цитокинов (включая IL-4, IFN-гамма, IL-21 и IFN-альфа), который оказывает помощь В-клеткам в выработке антител, и было сделано предположение, что высвобождение цитокинов также может оказывать влияние на CD4+T клетки (Burrows et al Nature Immunology 2009, 10; 669-671). В контексте настоящего изобретения считается, что предотвращение активации B-клеток и активации рестриктированных по главному комплексу гистосовместимости (MHC) класса II CD4+T клеток играет роль в уменьшении или отмене иммуногенности белков.
Единица распознавания для NKT-клеток, молекула CD1d, обладает структурой, близко сходной со структурой молекулы MHC класса I, включая наличие бета-2 микроглобулина. Она характеризуется глубоким углублением, окаймленным двумя альфа-цепями и содержащим высокогидрофобные остатки, которые взаимодействуют с липидной цепью. Углубление открыто с обоих концов, что обеспечивает возможность размещения более длинных цепей. Каноническим лигандом CD1d является синтетический альфа галактозилцерамид (альфа GalCer). Однако было описано множество альтернативных природных лигандов, включая глико- и фосфолипиды, природный липид сульфатид, обнаруженный в миелине, микробные фосфоинозитолманнозид и альфа-глюкуронозилцерамид. Существующее общее мнение сводится к тому (смотри обзоры, например, Matsudaetal, Current Opinion in Immunology 2008, 20: 358-368 и Godfrey et al, Nature reviews Immunology 2010, 11: 197-206), что CD1d связывает только лиганды, содержащие липидные цепи, или в общем обыкновенную структуру, состоящую из липидного хвоста, который углублен в CD1d, и концевой группы остатка сахара, которая выступает из CD1d.
Пептиды не считаются способными активировать NKT-клетки посредством презентирования CD1d. Однако было сделано предположение о том, что длинные гидрофобные пептиды, содержащие объемные аминокислотные остатки, могут связываться с CD1d (Castano et al. Science 1995, 269: 223-226). Наблюдения, сделанные при использовании библиотек фагов, экспрессирующих пептиды произвольных последовательностей с неустановленной физиологической значимостью, обеспечили возможность установления теоретического консенсусного мотива (Castano etal. Science 1995, 269: 223-226 и смотри ниже).
Известно, что Castano et al показали, что активированные клетки представляют собой CD8+T-клетки, а именно рестриктированные по MHC класса I клетки, и не являются NKT клетками. Эти данные сообщают специалисту в данной области техники, что доказательства того, что гидрофобные пептиды презентируются молекулами CD1d, отсутствуют. Физиологическая значимость заявлений, сделанных Castano et al, в дальнейшем подвергалась сомнению вследствие невозможности «вызвать» (образование) NKT клеток по общепринятым протоколам иммунизации (Matsuda et al. Current Opinion in Immunology 2008, 20: 358-368 and Brutkiewicz Journal of Immunology 2006, 177: 769-775). Искусственные системы, такие как иммунизация клетками, трансфицированными для сверхэкспрессии CD1d и загруженными in vitro пептидом, полученным из овальбумина, были способны вызвать образование NKT клеток. Аналогично, внутрикожная иммунизация плазмидной ДНК вместе с мышиным CD1d и костимулирующими молекулами индуцирует цитолитические рестриктированные по CD1d T-клетки (Lee et al, Journal of Experimental Medicine 1998, 187: 433-438). Гидрофобные пептиды, содержащие структурный мотив, состоящий из ароматического остатка в положении P1 и P7 и алифатической цепи в положении P4, заявленные Castano et al (Science 269: 223, 1995), содержат лейтмотив для CD Id-связывающих эпитопов. Как описано выше, выводы, сделанные Castano et al, не подтверждаются данными.
Нами было неожиданно обнаружено, что пептиды, содержащие гидрофобную аминокислотную последовательность, действительно способны вызывать активацию NKT-клеток.
Если эпитопы из белков, введенных с терапевтическими целями, или из белков, воздействию которых субъекты подвергаются в повседневной жизни, или в случае проведения генной терапии или генной вакцинации, или в случае введения в связи с вакцинацией к аллергическим или инфекционным заболеваниям, связываются с CDld, и тем самым активируют NKT-клетки, то изменение указанных белков с помощью мутаций или делеций с целью устранения указанных эпитопов может быть желательно для предотвращения иммуногенности.
Установление таких эпитопов, с последующей мутацией, добавлением или удалением аминокислот для предотвращения активации NKT-клеток, составляет основу настоящего изобретения.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение имеет отношение к применению пептидов или полипептидов для лечения иммунных ответов, вызванных к аллофакторам у субъекта, путем предотвращения такого иммунного ответа на указанные аллофакторы.
Настоящее изобретение также имеет отношение к применению пептидов или полипептидов для лечения иммунных ответов, вызванных к вирусным векторам, использованным с целью генной терапии или генной вакцинации у субъекта, путем предотвращения такого иммунного ответа на указанные вирусные векторы.
Настоящее изобретение также имеет отношение к применению пептидов или полипептидов, полученных с помощью генетически модифицированных организмов для предотвращения у субъекта иммунных ответов, вызванных воздействием естественных белков.
Кроме того, настоящее изобретение имеет отношение к применению пептидов или полипептидов с целью вакцинации в тех случаях, когда активация врожденного иммунитета является неблагоприятной.
Настоящее изобретение также имеет отношение к способам установления (распознавания) белков, несущих CD1d-связанные эпитопы, и устранения таких эпитопов с помощью аминокислотной замены или делеции.
Мы неожиданно обнаружили, что существенная часть пептидов или полипептидов несет аминокислотные последовательности, позволяющие им связываться и быть презентированными CD1d детерминантами для активации натуральных клеток-киллеров (NKT). Активация таких клеток приводит к высвобождению цитокинов и, в некоторых случаях, к приобретению или увеличению цитолитических свойств.
В одном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к применению, по меньшей мере, одного выделенного пептида или полипептида, используемого в качестве аллофактора, который модифицируют для того, чтобы устранить, по меньшей мере, один гидрофобный аминокислотный остаток, участвующий в образовании эпитопа, распознаваемого NKT-клетками, в качестве медикамента для предотвращения у субъекта иммунного ответа на указанный аллофактор.
Настоящее изобретение также имеет отношение к применению, по меньшей мере, одного выделенного пептида или полипептида, используемого в качестве вирусного вектора для генной терапии или генной вакцинации, который модифицируется с целью устранения, по меньшей мере, одного гидрофобного аминокислотного остатка, участвующего в образовании эпитопа, распознаваемого NKT-клетками, в качестве медикамента для предотвращения у субъекта иммунного ответа на указанные вирусные векторы.
В одном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к применению, по меньшей мере, одного выделенного пептида или полипептида, выработанного генетически модифицированным организмом, при этом указанный пептид или полипептид является модифицированным с целью устранения, по меньшей мере, одного гидрофобного аминокислотного остатка, участвующего в образовании эпитопа, распознаваемого NKT-клетками, в качестве медикамента для предотвращения у субъекта иммунного ответа на указанный пептид или полипептид при воздействии в его обычном виде.
В одном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к применению, по меньшей мере, одного выделенного пептида или полипептида, использованного в качестве вакцины, который модифицируется с целью устранения, по меньшей мере, одного гидрофобного аминокислотного остатка, участвующего в образовании эпитопа, распознаваемого NKT-клетками, в качестве медикамента для предотвращения у субъекта нежелательного или несоответствующего иммунного ответа на указанную вакцину.
В следующем аспекте настоящее изобретение также включает применение, по меньшей мере, одного выделенного пептида или полипептида, использованного в качестве аллофактора, вирусного вектора, генетически модифицированного организма или вакцины, который модифицируется с целью устранения, по меньшей мере, одного гидрофобного аминокислотного остатка, участвующего в образовании эпитопа, распознаваемого NKT-клетками, в качестве медикамента для предотвращения у субъекта активации, выработки цитокинов, цитолитической активности и подавляющей активности на адаптивные иммунные ответы, осуществляемые CD4+ NKT-клетками у указанного субъекта.
Настоящее изобретение имеет отношение к гидрофобным пептидам или полипептидам, включающим, по меньшей мере, один CD1d-рестриктированный T-клеточный эпитоп, в котором аминокислоты, расположенные как якорные (фиксированные) остатки на CD1d, заменяются альтернативными аминокислотами, или устраняются, что приводит к потере или значительному уменьшению связывания с CD1d и вследствие этого активации NKT-клеток.
Структура CD1d молекулы указывает, что гидрофобные аминокислотные остатки должны занимать два гидрофобных кармана, расположенных на концах CD1d углубления и что алифатический остаток должен занимать положение в середине углубления. Следовательно, как общий пример CD1d-связывающей последовательности, может использоваться мотив [FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH], в котором [FW] указывает, что или F или W может занимать первый якорный остаток (PI), что положение P4 может быть занято или I, L или M, и что P7 может быть занято F, W, T или H. В этой общей модели мотива x означает любую аминокислоту. Специалисту должно быть понятно, что возможны различные комбинации этих аминокислотных остатков. В отдельном варианте осуществления общая модель мотива может быть представлена как повернутая последовательность, такая как [FWTH]-xx-pLM]-xx-[FW]. В другом определенном варианте осуществления, по меньшей мере, одна аминокислота добавляется в CD1d-связывающий мотив, которая разрывает этот мотив, мешает его способности связываться с CD1d и таким образом его способности активировать NKT клетки.
Конкретнее, настоящее изобретение имеет отношение к пептидам или полипептидам, в которых F, W, T, H или Y в положениях PI и P7 заменяются искусственной аминокислотой (например, D-аминокислотой) или органическим соединением.
В любом из вышеперечисленных вариантов использования указанный аллофактор может быть любым пептидом или полипептидом, используемым: (1) для заместительной терапии нарушений коагуляции или фибринолитических дефектов, включая фактор VIII, фактор IX и стафилокиназу; (2) гормонами, такими как гормон роста или инсулин; (3) цитокинами и факторами роста, такими как интерферон альфа, интерферон гамма, GM-CSF и G-CSF; (4) антителами для модулирования иммунных ответов, включая анти-IgE антитела при аллергических болезнях, анти-CD3 и анти-CD4 антитела при отторжении трансплантата и ряде аутоиммунных болезней, анти-CD20 антитела при неходжкинских лимфомах; (5) эритропоэтином при почечной недостаточности и (6) генетически модифицированными антигенами.
В любом из вышеперечисленных вариантов использования указанный вирусный вектор может быть любым пептидом или полипептидом РНК-вирусов (гамма-ретровирусов и лентивируов) или ДНК-вирусов (аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вирусов герпеса и поксвирусов).
В любом из вышеперечисленных вариантов использования указанный генетически модифицированный организм может быть любым организмом растительного или животного происхождения, который используется в качестве пищи или продукта питания, для получения урожая или производства продуктов, или для производства трансгенных животных, предназначенных для питания или животноводства.
В любом из вышеописанного, указанный пептид или полипептид, использованный для вакцинации, может происходить из аллергенов или из инфекционных агентов, включая вирусы, бактерии и паразиты. Аллергены могут быть аллергенами, взвешенными в воздухе, такими как полученные от клещей домашней пыли, от пыльцы или от домашних животных, пищевые аллергены, такие как арахис, яичный альбумин, злаки, фрукты и плоды бобовых, и контактные аллергены, такие как латекс. Болезни, характеризующиеся сенсибилизацией к аллергенам, включают аллергическую астму, аллергический риносинусит, анафилактический шок, крапивницу, атопический дерматит и контактный дерматит.
Настоящее изобретение также имеет отношение к способам установления пептидов или полипептидов, активирующих NKT-клетки, и устранения такой активации посредством изменения CD1d-связывающих эпитопов путем замены, добавления или устранения аминокислот. Указанные способы включают стадии инкубирования указанного пептида или полипептида с клетками, несущими CD1d, с последующим добавлением популяции поликлональных NKT-клеток и определением активации указанных NKT-клеток.
Кроме того, изобретение включает выделенные вирусные векторы, отличающиеся тем, что они содержат, по меньшей мере, один пептид или полипептид аллофактора, модифицированного заменой или делецией, по меньшей мере, одной гидрофобной аминокислоты, или, по меньшей мере, один пептид или полипептид из аллергена или из инфекционного агента, модифицированного заменой или делецией, по меньшей мере, одного гидрофобного аминокислотного остатка. Следует понимать, что сам вирусный вектор также может быть модифицирован заменой или делецией гидрофобных аминокислотных остатков.
Определения
Термин "пептид" при использовании в данном описании относится к молекуле, включающей аминокислотную последовательность, содержащую от 2 до 200 аминокислот, соединенных пептидными связями, но которая может в определенном варианте осуществления содержать структуры, не являющиеся аминокислотами (как, например, сшивающее органическое соединение). Пептиды в соответствии с изобретением могут содержать любые из 20 обычных аминокислот или их модифицированные варианты, или могут содержать не встречающиеся в природе (искусственные) аминокислоты, включенные путем химического пептидного синтеза или с помощью химической или ферментативной модификации. Термин "полипептид" при использовании в данном описании в большинстве случаев относится к более длинным пептидам или белкам.
1
Термин "эпитоп", использующийся в данном описании, относится к одному или нескольким участкам (которые могут определять конформационный эпитоп) белка, который(-ые) специфически узнается(-ются) и связываются антителом или его фрагментом (Fab, Fab2' и т.д.) или рецептором, присутствующим на клеточной поверхности B или T-клеточного лимфоцита, и который способен? с помощью указанного связывания? индуцировать иммунный ответ.
Термин "антиген", использующийся в данном описании, относится к структуре макромолекулы, содержащей один или более гаптенов и/или содержащей один или более T-клеточных эпитопов. Как правило, указанная макромолекула представляет собой белок или пептид (с полисахаридами или без полисахаридов) или состоит из композиции белков и содержит один или более эпитопов; указанная макромолекула в этом описании может альтернативно называться "антигенный белок" или "антигенный пептид".
Термин "аллерген" относится к специфической разновидности антигена, отличающейся способностью вызывать образование антител IgE изотипа у предрасположенных лиц.
Термин "T-клеточный эпитоп" или "T-клеточная антигенная детерминанта" в контексте настоящего изобретения относится к доминирующему, субдоминирующему или второстепенному T-клеточному эпитопу, т.е., части антигенного белка, которая специфически распознается и связывается рецептором клеточной поверхности T-лимфоцита. Является ли эпитоп доминирующим, субдоминирующим или второстепенным - зависит от иммунного ответа, вызванного к данному эпитопу. Доминантность зависит от частоты, с которой такие эпитопы распознаются T-клетками и способны активировать их среди всех возможных T-клеточных эпитопов белка. В частности, T-клеточный эпитоп представляет собой эпитоп, связываемый молекулами MHC класса I или MHC класса II.
Термин "NKT-клеточный эпитоп (детерминанта)" относится к части антигенного белка, которая специфически распознается и связывается рецептором на поверхности клетки T-лимфоцита. В частности, NKT-клеточный эпитоп представляет собой эпитоп, связываемый CD1d молекулами.
Термин "CD4+ эффекторные клетки" относится к клеткам, принадлежащим к подклассу CD4-положительных T-клеток, функцией которых является обеспечение содействия другим клеткам, таким как, например, B-клетки. Эти эффекторные клетки обычно называются Th-клетками (T-хелперные клетки), при наличии различных подклассов, таких как ThO, Th1, Th2 и Thl7 клетки.
Термин "NKT-клетки" относится к клеткам системы врожденного иммунитета, характеризующимся тем фактом, что они несут рецепторы, такие как NK1.1 и NKG2D, и распознают эпитопы, презентируемые молекулой CD1d. В контексте настоящего изобретения, NKT-клетки могут принадлежать как к подклассу типа 1 (инвариантные), так и типа 2.
"Молекула CD1d" относится к молекуле, не происходящей от MHC, состоящей из 3 альфа цепей и антипараллельного набора бета цепей, сгруппированных в глубокий гидрофобный желобок, открытый с обеих сторон и способный презентировать липиды, гликолипиды или гидрофобные пептиды NKT-клеткам.
Термин "иммунные расстройства" или "иммунные заболевания" относится к заболеваниям, при которых реакция иммунной системы несет ответственность за или поддерживает нарушение функции или нефизиологическое состояние в организме. Иммунные расстройства в контексте настоящего изобретения относятся к патологии, вызванной инфекционными агентами, и иммунологическому надзору за опухолями.
Термин "аллофактор" относится к белку, пептиду или фактору (т.е. любой молекуле), проявляющей полиморфизм при сравнении между двумя индивидуумами одного и того же вида, и в самых общих чертах, любому белку, пептиду или фактору, вызывающему (аллореактивный) иммунный ответ у субъекта, получившего аллофактор. Обобщая, аллофакторы также включают генетически модифицированные белки, служащие в качестве питания.
Термин "аллоантиген" или "антиген аллотрансплантата", использованный в описании, относится к антигену, полученному из (распространенному от и/или присутствующему в) клетки или ткани, который при переносе (пересадке) от донора к реципиенту может распознаваться или связываться антителом B или T-клеточного рецептора реципиента. Аллоантигены, как правило, представляют собой продукты полиморфных генов. Аллоантиген является белком или пептидом, который при сравнении между донором и реципиентом (относящихся к одному виду), демонстрирует небольшие структурные различия. Присутствие такого антигена донора в организме реципиента может вызвать иммунный ответ у реципиента. Такой аллореактивный иммунный ответ является специфическим к аллоантигену.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение предоставляет способы предотвращения у субъекта иммунного ответа на аллофакторы, на вирусные векторы, используемые для генной терапии или генной вакцинации, на белки, используемые в продуктах питания или пище, на белки, воздействию которых указанный субъект подвергается при дыхании или укусах насекомых, или для предотвращения у субъекта нежелательной активации врожденного иммунитета при использовании вакцин против аллергенов или инфекционных агентов.
В частности, изобретение предоставляет способы предотвращения размножения (экспансии) и функциональной активности CD4+ NKT-клеток. Такие клетки обычно подразделяют на два разных подкласса, а именно тип 1 NKT-клеток, несущих неизменную TCR альфа цепь (Vальфа14 у мыши, Vальфа24 у человека), или тип 2 NKT-клеток, которые представляют другой состав альфа цепи. Однако недавно было предложено доказательство существования альтернативных подклассов NKT-клеток, которые не подходят к типу 1 или типу 2. Цель настоящего изобретения - включить эти необычные NKT-клетки, при условии, что они содержат CD4 корецептор. После презентирования антигена, связанного с CD1d, NKT-клетки быстро активируются и секретируют целый ряд цитокинов, как полагают, являющихся определяющими, чтобы влиять на другие клетки врожденной и адаптивной иммунной систем. В некоторых обстоятельствах указанные активированные NKT-клетки приобретают или повышают свои цитотоксические свойства. При других дополнительных обстоятельствах указанные активированные NKT-клетки подавляют или уменьшают возникновение адаптивного иммунного ответа путем взаимодействия с CD4+ Т клетками, рестриктированными по классу II.
2
3
5
6
В контексте настоящего изобретения нами было сделано неожиданное наблюдение, что пептиды могут презентироваться молекулой CD1d. Характерной чертой молекулы CD1d является то, что она состоит из встречно-параллельных альфа цепей, образующих углубление наверху платформы (площадки) сделанной из двух встречно-параллельных бета цепей. Углубление узкое и глубокое и принимает только гидрофобные остатки, как классически полагают, являющиеся исключительно липидами. Это углубление может размещать последовательность из 7 аминокислот, характеризующуюся гидрофобным остатком в положении (P) 1 и 7 и алифатическим остатком в P4. P1 обязательно является гидрофобным остатком, таким как F, W, Н или Y. Однако, P7 является необязательным и может содержать альтернативные остатки, при условии что они не являются полярными. Остатки в P4 предпочтительно являются алифатическими, но являются необязательными. Соответственно, общая последовательность CD1d-связывающего мотива представляет собой [FWTHY]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY]. Однако специалистам в данной области техники должно быть понятно, что мотив является симметричным, и что P7 может рассматриваться как PI, a PI может рассматриваться как P7. Общая последовательность CD1d-связывающего мотива предоставляется в описании в качестве указания, без какого-либо ограничения. Пептиды и полипептиды, рассматриваемые для применения согласно настоящему изобретению, определяются по их способности активировать NKT-клетки путем презентирования на CD1d молекуле.
Гидрофобные пептиды или полипептиды, способные активировать NKT клетки и, соответственно, несущие CD1d-связывающий мотив, обнаружены в аллофакторах, вирусных векторах, белках служащих продуктами питания или пищей, белках, воздействию которых указанный субъект подвергается при дыхании или укусах насекомых, генетически модифицированных белках и аллергенах, посредством этого наделяющие указанный аллофактор, вирусный вектор, генетически модифицированный белок или аллерген способностью активировать CD4+ NKT клетки.
Настоящее изобретение имеет отношение к получению пептидов или полипептидов, содержащих CD1d-связывающий мотив(ы), который наделяет их способностью активировать NKT-клетки, и которые модифицируют заменой гидрофобных остатков в PI и/или P7, необязательно с заменой или удалением алифатических остатков в P4, или любой их комбинацией, что в результате приводит к потере или значительному уменьшению способности пептидов или полипептидов связываться с CD1d, и таким образом приводит к утрате или значительному уменьшению способности указанных пептидов или полипептидов активировать NKT клетки.
В конкретном варианте осуществления F, W, T, H или Y в положениях P1 и/или P7 замещаются негидрофобным аминокислотным остатком, или необязательно I, L, M или V в положении P4 замещается неалифатическим остатком, или любой их комбинацией.
В другом конкретном варианте осуществления гидрофобные остатки, расположенные в положении P1 и/или P7, или необязательно алифатические остатки, расположенные в P4, или любая их комбинация замещаются, по меньшей мере, одной искусственной аминокислотой, отличной от искусственных F, W, T, H, Y, или неароматическим органическим соединением.
В еще одном конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, одна аминокислота добавляется в CD1d-связывающий мотив в любом положении последовательности в пределах P1-P7, которая разрывает мотив, предотвращает его способность связываться с CD1d и таким образом его способность активировать NKT клетки.
В предпочтительном варианте осуществления искусственные аминокислоты представляют собой D-аминокислоты.
Настоящее изобретение также имеет отношение к получению пептидов или полипептидов, содержащих CD Id-связывающий мотив(ы), который наделяет их способностью активировать NKT-клетки, и которые модифицируют удалением гидрофобных остатков в P1 и/или P7, или необязательно удалением алифатических остатков в P4, или любой их комбинацией, что приводит к потере или значительному уменьшению способности пептидов или полипептидов связываться с CD1d и таким образом приводит к потере или значительному уменьшению способности указанных пептидов или полипептидов активировать NKT-клетки.
После введения субъекту такие пептиды или полипептиды не «загружаются» на CD1d и тем самым предотвращается активирование NKT-клеток.
В дополнительном аспекте изобретение также включает применение, по меньшей мере, одного выделенного пептида или полипептида, содержащего, по меньшей мере, одну замену или делецию F, W, T, H или Y в положениях P1 или P7, для предотвращения у субъекта иммунного ответа на введение аллофактора, введение вирусного вектора, белков, воздействию которых субъект подвергается посредством пищи, продуктов питания, системным или ингаляционным путем, или на аллергены или инфекционные агенты, использованные при вакцинации.
В другом дополнительном аспекте изобретение включает применение, по меньшей мере, одного выделенного пептида или полипептида, содержащего, по меньшей мере, одну замену или делецию F, W, T, H или Y в положениях P1 или P7, для предотвращения у субъекта активации NKT-клеток в ответ на введение аллофактора, введение вирусного вектора, белков, воздействию которых субъект подвергается посредством пищи, продуктов питания, системным или ингаляционным путем, или на аллергены или инфекционные агенты, использованные при вакцинации.
В другом дополнительном аспекте изобретение также включает применение, по меньшей мере, одного выделенного пептида или полипептида, содержащего, по меньшей мере, одну замену или делецию F, W, T, H или Y в положениях P1 или P7 в качестве медикамента для предотвращения у субъекта иммунного ответа на введение аллофактора, введение вирусного вектора, белков, воздействию которых субъект подвергается посредством пищи, продуктов питания, системным или ингаляционным путем, или на аллергены или инфекционные агенты, использованные при вакцинации.
Количество CD1d-связывающих мотивов, присутствующих в пептиде или полипептиде, очень ограничено. Примеры таких пептидов или полипептидов предоставлены ниже. Как правило, полипептид включает от одного до пяти таких мотивов.
Дополнительное преимущество настоящего изобретения заключается в том, что CD1d молекула дает очень ограниченную степень полиморфизма. Для специалиста в данной области очевидно, что некоторые аминокислотные замены, добавления или делеции согласно настоящему изобретению предоставляют пептиды или полипептиды, пригодные для всех или значительного большинства субъектов. Это находится в резком противоречии с пептидными и полипептидными мотивами, связанными с молекулами MHC класса II, где может быть описано большое число пептидов, содержащих подходящую последовательность. Это объясняется минимальными ограничениями, наложенными на пептиды, связывающиеся с MHC класса II, и большим полиморфизмом молекул класса II.
Пептиды или полипептиды, являющиеся целью настоящего изобретения, определяются, как описано ниже:
2
3
5
6
(1) аминокислотная последовательность пептида или полипептида, необязательно, оценивается в отношении присутствия, по меньшей мере, одного CD1d мотива, содержащего гидрофобный остаток в P1 и P7, и алифатический остаток в P4. Общая последовательность такая как [FWTHY]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY] может использоваться во время применения алгоритмов, известных в данной области техники, таких как, http://expasy.org/tools/scanprosite/
Эту общую последовательность следует рассматривать как инструмент, способствующий установлению того, какая последовательность(и) в указанном пептиде или полипептиде содержит мотив, дающий возможность указанному пептиду или полипептиду активировать NKT-клетки.
(2) способность пептида или полипептида связываться с CD1d и активировать NKT-клетки проверяется in vitro с использованием линии клеток, экспрессирующих CD1d-молекулу. Примеры таких клеточных линий известны в данной области техники (например, клетки JAWS2). В предпочтительном варианте осуществления клеточная линия не презентирует молекулы MHC класса II и преобразуется (трансфектируется) с целью получения сверхэкспрессии CD1d с помощью вирусного вектора, содержащего ДНК-последовательность CD1d, или любых других способов, известных в данной области техники, чтобы ввести ген в клетку. Способы трансдукции (переноса гена в клетки) известны в данной области техники. При культивировании клеточной линии вводится пептид или полипептид, или синтетический пептид, включающий соответствующую последовательность. Такие синтетические пептиды легко получить с помощью синтеза, используя, например, frnoc-твердофазный синтез, хорошо известный в данной области техники. Затем эффективность презентирования пептида, полипептида или соответствующего синтетического пептида CD1d-молекулами оценивается путем измерения активации NKT-клеток. Такие клетки можно получить из периферической крови, например, с помощью магнитной сортировки клеток, и поддерживать в культуре со стимуляторами, такими как альфа-гал-церамид (галактозилцерамид), в присутствии цитокинов, таких как IL-2, IL-15 или IL-7. Эти методы описаны в данной области техники (смотри, например, Godfrey et al. Nature Reviews. Immunology 2010, 11; 197-206). Для оценки активации NKT-клеток может использоваться, например, метод оценки выработки цитокинов.
Альтернативно, пептиды, фактически презентированные APC на CD1d-молекулах, можно элюировать и отделить с помощью разных хроматографических методов. Полное описание такого метода можно найти в Scott et al. Immunity, 12: 711-720, 2000. Затем указанные пептиды секвенируют, чтобы установить какие аминокислотные остатки располагаются в P1 и P7.
Альтернативно, указанные синтетические пептиды могут быть «загружены» на тетрамеры CD1d-молекулы для обнаружения NKT-клеток, специфических для такого пептида. Одним из возможных вариантов является использование флуоресцентно-меченых тетрамеров и обнаружение методом флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (facs).
(3) аминокислотные последовательности, способные активировать NKT-клетки и необязательно определенные с помощью алгоритмов, затем модифицируют с помощью или замены или делеции. В предпочтительном варианте осуществления F, W, T, H или Y в положениях P1 и/или P7 заменяются, по меньшей мере, одной аминокислотой, отличной от F, W, T, H, Y. Природные аминокислоты могут быть модифицированы с помощью посттранскрипционных модификаций или замещений химическими группами, такими как метальные группы. В другом предпочтительном варианте осуществления F, W, T, H или Y в положениях P1 и/или P7 заменяются любой подходящей искусственной аминокислотой. Примерами искусственных аминокислот являются D-аминокислоты. В еще одном варианте осуществления F, W, T, H или Y в положениях P1 и/или P7 заменяются, по меньшей мере, одной аминокислотой, отличной от F, W, T, H, Y. В другом предпочтительном варианте осуществления F, W, T, H или Y в положении P1 заменяется, по меньшей мере, одной аминокислотой, отличной от F, W, T, H, Y, любой подходящей альтернативной искусственной аминокислотой или неароматическим органическим соединением. Подобные аминокислотные замены получают с помощью хорошо известных в данной области техники методов. В еще одном предпочтительном варианте осуществления F, W, T, H или Y в положении Р1 удаляется. В еще одном предпочтительном варианте осуществления F, W, T, H или Y в положениях P1 и P7 удаляются. Способы осуществления указанных удалений хорошо известны в данной области техники. В другом определенном варианте осуществления, по меньшей мере, одна аминокислота добавляется в CD1d-связывающий мотив в любом положении последовательности в пределах от P1 до P7.
В соответствии с настоящим изобретением рассматриваются медикаменты для лечения болезней, при которых требуется введение аллофакторов, таких как:
(1) врожденный или приобретенный дефицит факторов, связанных с коагуляцией (таких как фактор VIII, фактор IX или фактор X) или фибринолизом, с дефектом ферментов, связанных с метаболизмом полисахаридов или гликогена (как при болезни Помпе), или с дефектом в выработке гормона (такого как инсулин при диабете или гормон роста при карликовости);
(2) острые или хронические состояния, при которых полезно вводить такое лечебное средство, как тромболитические средства, включая стафилокиназу и микроплазмин;
(3) нарушения иммунной системы, при которых необходимо введение цитокинов (или их рецепторов) или факторов роста (таких как интерферон-альфа, интерферон-бета, интерферон-гамма, G-CSF, GM-GSF, KGF или эритропоэтин);
(4) болезни, характеризующиеся хроническим воспалением или несоответствующими иммунными ответами, при которых должны вводиться терапевтические антитела, включая фактор, вызывающий некроз опухолей, анти-CD3 или анти-CD4 антитела при аутоиммунных болезнях и отторжении трансплантата, антитела к маркерам на поверхности лимфоцитов (таким как анти-CD20 антитела при лимфомах неходжкинского типа), или антитела к фактору VIII при предотвращении тромбоза. Список терапевтических антител быстро увеличивается, и настоящее изобретение включает применение любых антител, используемых с терапевтическими целями вообще.
Согласно настоящему изобретению также рассматриваются медикаменты для использования при генной терапии и генной вакцинации, при которой используются вирусные векторы, и при которой иммунный ответ на указанные векторы предотвращает экспрессию трансгена.
Согласно настоящему изобретению рассматриваются медикаменты для лечения болезней, вызванных воздействием белков из окружающей среды, таких как:
(1) белки, воздействию которых указанный субъект подвергается посредством продуктов питания или пищи. Примерами являются злаки, такие как пшеница, кукуруза, соя, рис и рапс, овощи, такие как картофель и свекла, фрукты, такие как розоцветные, орехи и авокадо, ферменты, противовирусные или антибактериальные лекарственные средства.
(2) белки, воздействию которых указанный субъект подвергается при вдыхании, системным путем или при укусах насекомых. Примерами являются аллергические реакции на пыльцу, реакция на контакт с латексом или укусы перепончатокрылых насекомых.
Согласно настоящему изобретению также рассматриваются медикаменты для иммунизации (вакцинации), такой как:
(1) вакцинации против аллергенов;
(2) вакцинации против инфекционных агентов, включая вирусы, бактерии и паразитов.
И в тех и в других обстоятельствах может быть полезным предотвращение активации врожденной иммунной системы, для того, чтобы предотвратить избыток воспаления и его пагубные последствия на результат указанной вакцинации. Другое преимущество в условиях вакцинации к аллергенам или инфекционным агентам заключается в том, что устранение активации NKT-клеток предотвращает подавляющий эффект активированных NKT-клеток на развитие адаптивного ответа на указанные аллергены или указанные инфекционные агенты.
Следует признать, что приведенный выше список не является исчерпывающим, и что изобретение включает вновь вводимые продукты, такие как антитела, цитокины, факторы роста или пептиды и полипептиды, используемые для замещения при врожденных или приобретенных дефицитах, и генетически модифицированные белки.
Должно быть понятно, что любые из пептидов или полипептидов, перечисленных выше, могут быть введены в виде гена для переноса генов, который может осуществляться с использованием вирусных векторов или других способов, известных специалистам в данной области техники. В таком случае собственно вирусный вектор может быть модифицирован согласно настоящему изобретению путем устранения CD1d-связывающих мотивов.
Медикамент изобретения, как правило, но не обязательно, представляет собой (фармацевтическую) композицию, содержащую в качестве активного ингредиента, по меньшей мере, один из пептидов или полипептидов изобретения или генотерапевтический вектор, способный экспрессировать указанные пептиды и полипептиды. Помимо активного ингредиента(ов) такая композиция будет содержать по меньшей мере один (фармацевтически приемлемый) разбавитель.
Значительным исключением к этому правилу является использование белков из генетически модифицированных организмов в продуктах питания, воздействие через дыхание или системным путем.
В общем, введение пептидов или полипептидов изобретения предотвращает активацию врожденной иммунной системы, конкретнее активацию NKT-клеток, конкретнее выработку цитокинов, связанных с активацией NKT-клеток.
Способ введения пептидов или полипептидов настоящего изобретения может варьировать в соответствии с показанием и/или природой пептидов или полипептидов. Примерами являются внутривенное введение факторов коагуляции, подкожное введение инсулина или пероральное введение генетически модифицированных белков. Настоящее изобретение включает все другие способы введения, такие как интраназальный, подъязычный, чрескожный, внутримышечный, интраректальный или интравагинальный.
Как подробно объясняется далее, пептиды или полипептиды настоящего изобретения можно получить с помощью химического синтеза, который в дальнейшем делает возможным введение искусственных аминокислот. Пептиды или полипептиды настоящего изобретения также можно получить с использованием методов, известных в данной области техники, производства рекомбинантных белков при помощи рекомбинантных систем, таких как бактериальные клетки, клетки дрожжей, клетки насекомых, растительные клетки или клетки млекопитающих.
Другой аспект настоящего изобретения имеет отношение к способам создания пептидов и полипептидов настоящего изобретения, описанных в документе. Такие методы включают установление NKT-клеточных эпитопов аллофакторов, вирусных векторов, белков, воздействию которых указанный субъект подвергается посредством пищи, продуктов питания, системным или ингаляционным путем, аллергенов или специфических инфекционных агентов. Способы in vitro и in silico установления NKT-клеточных эпитопов широко известны в данной области техники, а некоторые аспекты конкретизируются в дальнейшем.
Установление NKT-клеточных эпитопов в рамках настоящего изобретения известно специалисту в данной области техники. Например, последовательности пептидов, выделенных их аллофакторов, вирусных векторов, белков, воздействию которых указанный субъект подвергается через пищу, продукты питания, системным или ингаляционным путем, генетически модифицированных белков, аллергенов или специфических инфекционных агентов исследуют, например, с помощью методов NKT-клеточной биологии, чтобы определить, вызывают ли последовательности пептидов NKT-клеточный ответ. Последовательности пептидов, вызывающие NKT-клеточный ответ, определяются, как обладающие активностью, стимулирующей NKT-клетки. Активность, стимулирующая NKT-клетки млекопитающих, дополнительно может быть исследована путем культивирования NKT-клеток, полученных от индивидуума, сенсибилизированного к аллофактору, вирусному вектору, белкам, воздействию которых указанный субъект подвергается через пищу, продукты питания, системным или ингаляционным путем, генетически модифицированному белку, аллергену или инфекционному агенту, и установления факта, что пролиферация NKT-клеток происходит в ответ на пептид/эпитоп, что можно оценить, например, по поглощению клетками тимидина, меченного тритием. Индексы стимуляции NKT-клеток в ответ на пептиды/эпитопы можно вычислить как максимальное значение CPM в ответ на пептид/эпитоп, деленное на контрольное значение CPM. Индекс стимуляции NKT-клеток (ST.) равный исходному или в два раза больший, чем исходный уровень считается "положительным". Положительные результаты используются для вычисления среднего значения индекса стимуляции для каждого пептида/эпитопа в рамках группы проверенных пептидов/эпитопов. В некоторых случаях искусственные NKT-клеточные эпитопы могут быть дополнительно исследованы в отношении их способности связываться с CD1dd-молекулами. Связывание искусственных NKT-клеточных эпитопов с CD1d-молекулами может осуществляться разными способами. Например, получают растворимые молекулы CD1d и создают тетрамеры путем синтеза и/или химического связывания. Молекулы CD1d очищают при помощи аффинной хроматографии. Растворимые молекулы CD1d инкубируют с меченым биотином эталонным пептидом, полученным в соответствии с его сильной способностью связываться с указанной молекулой CD1d. Пептиды, подлежащие оценке на связывание с CD1d, затем инкубируют в различных концентрациях, а их способность вытеснять эталонный пептид из связи с CD1d вычисляют путем добавления нейтравидина. Описание методов, касающихся пептидов, презентируемых молекулой главного комплекса гистосовместимости класса II, можно найти, например, в Texier et al, (2000) J. Immunology 164, 3177-3184), однако данный метод можно легко применить к рестриктированным по CD1d T-клеточным эпитопам. Иммуногенные пептиды и полипептиды изобретения обладают средним индексом стимуляции NKT-клеток, большим или равным 2. Иммуногенный пептид, имеющий индекс стимуляции NKT-клеток больше чем или равный 2, считается пригодным в качестве кандидата для осуществления замены или делеции гидрофобных аминокислотных остатков, или добавления аминокислот в последовательность CD1d-связывающего мотива, как описано в настоящем изобретении.
Если обнаружено, что две или больше аминокислотных последовательности, разделяющие область перекрытия в природном пептиде или полипептидной последовательности, обладают стимулирующей активностью в отношении NKT-клеток, что установлено с помощью методов T-клеточной биологии, мутация или устранение гидрофобных аминокислотных остатков может осуществляться в отношении остатков, принадлежащих к одной или обеим последовательностям.
Пептиды или полипептиды изобретения могут быть получены при помощи рекомбинантной экспрессии, например, в бактериальных клетках (например, Escherichia coli), дрожжевых клетках (например, видах Pichia, видах Hansenula, видах Saccharomyces или Schizosaccharomyces), клетках насекомых (например, из Spodoptera frugiperda или Trichoplusia ni), клетках растений или млекопитающих (например, клетках CHO, COS). Соответственно создание необходимых подходящих векторов экспрессии (включающих дополнительную информацию, такую как промоторная и терминальная последовательности) предполагает использование стандартных технологий рекомбинантных ДНК. Рекомбинантные пептиды или полипептиды изобретения могут быть получены из более крупного белка-предшественника, например, путем ферментативного расщепления сайтов ферментативного расщепления, введенных рядом с N- и/или C-концом пептида или полипептида, с последующей подходящей очисткой.
Принимая во внимание ограниченную длину некоторых пептидов или полипептидов изобретения, их можно получить с помощью химического синтеза пептидов, при котором пептиды получают путем соединения различных аминокислот друг с другом. В частности, химический синтез подходит для введения, например, D-аминокислот, аминокислот с не встречающимися в природе боковыми цепями или природных аминокислот с модифицированными боковыми цепями, таких как метилированный цистеин. Способы химического синтеза пептидов хорошо описаны, и пептиды можно заказать у таких компаний, как Applied Biosystems, и других компаний. Синтез пептидов может осуществляться как твердофазный синтез пептидов (SPPS) или как синтез пептидов в жидкой фазе. Наиболее хорошо известными методами SPPS являются твердофазный синтез пептидов по t-Boc и Fmoc методам, которые хорошо известны специалисту. Кроме того, пептиды можно сшить друг с другом с образованием более длинных пептидов, используя стратегию лигирования (хемоселективное соединение двух незащищенных пептидных фрагментов), как первоначально описано в Kent (Schnolzer & Kent (1992) Int. J. Pept. Protein Res. 40, 180-193) и анализируется, например, в работе Tarn et at (2001) Biopolymers 60, 194-205. Это обеспечивает потенциальные возможности для достижения белкового синтеза, выходящего за пределы SPPS. Множество белков размером 100-300 остатков были успешно синтезированы с использованием этого способа.
Физические и химические свойства искомого пептида или полипептида (например, растворимость, устойчивость) проверяются для того, чтобы определить, подходит ли пептид и/или будет ли подходить пептид для использования в терапевтических композициях. Как правило, оптимизацию осуществляют путем корректировки последовательности пептида. В некоторых случаях пептид можно модифицировать после синтеза (химические модификации, например, введение и/или удаление функциональных групп) с помощью известных в данной области техники методов.
Получение генетически модифицированных пептидов или полипептидов основывается на способах, хорошо известных специалисту в данной области техники, включая клонирование, сайт-специфический мутагенез и культивирование (growth).
Настоящее изобретение также относится к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим пептиды или полипептиды изобретения, и способам их использования, например, для рекомбинантной экспрессии или в генной терапии. В частности, указанные нуклеиновокислотные последовательности способны экспрессировать пептиды изобретения.
В генной терапии рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие пептиды или полипептиды настоящего изобретения, могут быть использованы в виде депротеинизированной ДНК или в липосомах или других липидных системах для доставки в клетки-мишени. Специалистам в данной области техники хорошо известны другие способы прямого переноса плазмидной ДНК в клетки для использования в генной терапии человека, которые предполагают нацеливание ДНК на рецепторы на клетках путем образования комплексов плазмидной ДНК с белками. В самой простой форме перенос гена может осуществляться путем введения малых количеств ДНК в ядро клетки с помощью микроинъекции. Когда рекомбинантные гены вводятся в клетку, они могут распознаваться нормальными клеточными механизмами транскрипции и трансляции, после чего будет экспрессироваться продукт гена. Также были опробованы другие способы введения ДНК в большие количества клеток. Эти способы включают:
трансфекцию, при которой ДНК осаждается с фосфатом кальция и попадает в клетки путем пиноцитоза; электропорацию, при которой клетки подвергаются действию высоковольтных импульсов для образования пор в мембране; липофекцию и/или слияние липосом, при которой ДНК упакована в липофильные везикулы, которые сливаются с клеткой-мишенью; и бомбардировку частицами с использованием ДНК, связанной с небольшими «частицами-пулями». Другой способ введения ДНК в клетки представляет собой соединение ДНК с химически модифицированными белками.
Аденовирусные белки способны дестабилизировать эндосомы и увеличивать поглощение ДНК клетками. Смешивание аденовируса с растворами, содержащими ДНК-комплексы, или связывание ДНК с полилизином, ковалентно связанным с аденовирусом при помощи сшивающих белки агентов, значительно улучшает поглощение и экспрессию рекомбинантного гена. Аденоассоциированные вирусные векторы также могут использоваться для доставки гена в васкулярные клетки. В данном описании "перенос генов" подразумевает процесс введения чужеродной молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, который в большинстве случаев осуществляется для того, чтобы обеспечить возможность экспрессии определенного продукта, закодированного геном. Указанный продукт может включать белок, полипептид, антисмысловую ДНК или РНК или ферментативно активную РНК. Перенос генов может проводиться в культивируемых клетках или путем прямого введения млекопитающим. В другом варианте осуществления предоставляется вектор, содержащий последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид согласно изобретению. В отдельных вариантах осуществления вектор создается таким образом, что последовательность молекулы нуклеиновой кислоты экспрессируется только в конкретной ткани. Способы достижения тканеспецифической экспрессии гена хорошо известны в данной области техники, например, путем «помещения» последовательности, кодирующей иммуногенный пептид изобретения, под контроль промотора, который специфически направляет экспрессию пептида в одной или более тканей или органов. Векторы экспрессии, полученные на основе вирусов, таких как ретровирусы, вирус коровьей оспы, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирусы герпеса, РНК-вирусы или вирус папилломы крупного рогатого скота, могут использоваться для доставки нуклеотидных последовательностей (например, кДНК), кодирующих пептиды, их гомологи или производные в соответствии с изобретением, в ткани-мишени или популяции клеток. Для создания рекомбинантных вирусных векторов, содержащих такие кодирующие последовательности, можно использовать хорошо известные специалистам в данной области техники методы. Альтернативно, в генной терапии могут использоваться сконструированные клетки, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид в соответствии с изобретением.
Медикамент изобретения, как правило, но не обязательно, представляет собой (например, белки, полученные с помощью генетически модифицированных организмов, которые используются в качестве продуктов питания или воздействию которых указанный субъект подвергается системным или ингаляционным путем), (фармацевтическую) композицию, содержащую в качестве активного ингредиента, по меньшей мере, один из пептидов или полипептидов изобретения, генотерапевтический вектор, способный экспрессировать указанный пептид или полипептид. Помимо активного ингредиента(-ов), такая композиция будет содержать, по меньшей мере, один (фармацевтически приемлемый) разбавитель. Как правило, фармацевтически приемлемые соединения можно найти, например, в руководстве «Фармакопея» (Pharmacopeia handbook) (например, Американская, Европейская или Международная фармакопея). Медикамент, или фармацевтическая композиция изобретения, обычно содержит (профилактически или терапевтически) эффективное количество активного ингредиента(-ов), при этом эффективность имеет отношение к состоянию или нарушению, которое необходимо предотвратить или лечить.
Медикамент, или фармацевтическая композиция изобретения, может вводиться субъекту как часть профилактического или терапевтического режима, включающего множество введений указанного медикамента, или композиции. Указанные множественные введения обычно осуществляются последовательно, а временной интервал между двумя введениями может варьировать и будет определяться природой активного ингредиента и природой состояния, которое необходимо лечить или предотвратить. Количество активного ингредиента, назначенное субъекту, нуждающемуся в единственном введении, также может варьировать и будет зависеть от таких факторов, как физическое состояние субъекта (как, например, вес и возраст), текущего состояния заболевания, которое необходимо предотвратить или лечить, и опыта лечащего врача, терапевта или медсестры.
Термин "разбавитель" относится, например, к физиологическим растворам. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" подразумевает любое вещество или материал, вместе с которым активный ингредиент заключается в состав композиции, предназначенный для облегчения его применения или распространения в место, нуждающееся в лечении, например, путем растворения, диспергирования или диффузии указанной композиции, и/или для облегчения его хранения, транспортировки или перемещения без ухудшения его эффективности. Они включают любые возможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты (например, фенол, сорбиновую кислоту, хлорбутанол), изотонические агенты (такие, как сахара или хлорид натрия) и тому подобное. Дополнительные ингредиенты могут быть включены для того, чтобы контролировать продолжительность действия активного ингредиента в композиции. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой твердое вещество или жидкость или газ, который был сжат с образованием жидкости, т.е. композиции этого изобретения могут использоваться в виде концентратов, эмульсий, растворов, гранулятов, порошков, спреев, аэрозолей, суспензий, мазей, кремов, таблеток, драже или пудр.
Фармацевтические носители, подходящие для использования в указанных фармацевтических композициях и их составе, хорошо известны специалистам в данной области техники, и не существует особого ограничения для их выбора в пределах настоящего изобретения. Также они могут включать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие вещества, диспергирующие вещества, клейкие вещества, связывающие вещества, эмульгирующие вещества, растворители, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства (например, фенол, сорбиновая кислота, хлорбутанол), изотонические средства (такие как сахара или хлорид натрия) и тому подобное, при условии, что применение всех этих веществ соответствует фармацевтической практике, т.е. носители и вспомогательные вещества не вызывают необратимых повреждений у млекопитающих. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть приготовлены любым известным способом, например путем гомогенного смешивания, нанесения покровного слоя или измельчения активных ингредиентов, с помощью одностадийного или многостадийного метода, вместе с выбранным веществом-носителем и, при необходимости, другими вспомогательными веществами, такими как поверхностно-активные вещества. Они также могут быть приготовлены путем микронизации, например, с целью получения их в форме микросфер, как правило, имеющих диаметр примерно от 1 до 10 мкм, т.е. для производства микрокапсул с контролируемым или пролонгированным высвобождением активных ингредиентов.
Пептиды или полипептиды, их гомологи или производные согласно настоящему изобретению (и все их физиологически приемлемые соли или фармацевтические композиции, включенные в термин "активные ингредиенты") могут вводиться любым способом, соответствующим состоянию, которое необходимо предотвратить или лечить, и подходящим для соединений, в данном случае пептида или полипептида, который должен быть введен. Возможные способы включают регионарный, системный, пероральный (в виде твердой формы или ингаляции), ректальный, назальный, местный (включая глазной, защечный и подъязычный), вагинальный и парентеральный (включая подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрикожный, внутриартериальный, подоболочечный и эпидуральный). Предпочтительный способ введения может варьировать, например, в зависимости от состояния реципиента или от состояния, которое необходимо предотвратить или лечить.
Композиции могут быть удобно представлены в стандартной лекарственной форме и могут быть приготовлены любым из способов, хорошо известных в области фармацевтики. Композиции настоящего изобретения, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде отдельных единиц, таких как капсулы, облатки или таблетки, каждая из которых содержит заранее установленное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водосодержащей жидкости или неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или жидкой эмульсии вода-в-масле. Активный ингредиент также может быть представлен в виде шарика, электуария или пасты. Таблетки можно изготавливать прессованием или формовкой необязательно с одним или более вспомогательным ингредиентом. Прессованные таблетки могут быть изготовлены с помощью подходящей машины путем сжатия (прессования) активного ингредиента в сыпучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанной со связующим веществом, смазывающим веществом, инертным разбавителем, консервирующим веществом, поверхностно-активным или диспергирующим веществом. Формованные таблетки могут быть изготовлены с помощью подходящей машины путем формования порошкообразной смеси, смоченной инертным жидким разбавителем. На таблетки необязательно может быть нанесено покрытие или метка, и они могут быть изготовлены таким образом, чтобы обеспечить медленное или контролируемое высвобождение активного ингредиента.
Вирусные векторы в целях генной терапии или генной вакцинации легко поддаются модификациям с помощью технологии рекомбинантных нуклеиновых кислот. Ввиду вышеизложенного, специалист может легко предусмотреть возможность устранения вирусного вектора NKT-клеточного эпитопа в отношении пептидов или полипептидов и их применения согласно изобретению непосредственно в вирусном векторе. Следовательно, изобретение дополнительно включает модифицированные вирусные векторы, определенные как изолированные вирусные векторы, отличающиеся тем, что CD1d-связывающие мотивы устраняются заменой или делецией аминокислоты.
Теперь настоящее изобретение будет проиллюстрировано с помощью следующих примеров, предоставленных без какого-либо ограничения. Кроме того, все ссылки, описанные здесь, включаются в описание путем отсылки.
Примеры
Пример 1. Фактор коагуляции VIII
Пациенты, страдающие от гемофилии A, испытывают недостаток необходимого количества фактора VIII (FVIII), что является причиной склонности к неконтролируемому кровотечению. Таких пациентов лечат вливаниями FVIII, выделенного из плазмы или полученного с помощью рекомбинантной технологии. Введение FVIII приводит к образованию специфических антител, которые примерно в 30% случаев ингибируют функцию FVIII как кофактора коагуляции.
2
3
5
6
При помощи алгоритма мы установили в пределах последовательности молекулы FVIII 3 последовательности, несущие CD1d-связывающую последовательность, которая соответствовала последовательности мотива [FWTHY]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY]. Эти мотивы располагаются в доменах A1 и A3, соответственно:
FCHISSH в A1 домене (аминокислоты 309-315, SEQ ID1)
FWKVQHH в A3 домене (аминокислоты 1816-1822, SEQ ID2)
FHAINGY в A3 домене (аминокислоты 1918-1924, SEQ ID3)
В целом, эти последовательности имеют (подчеркнутый) ароматический остаток (фенилаланин, F) в положении 1, алифатический остаток (изолейцин, I, или валин, V) в положении 4 и ароматический остаток (гистидин, H, или тирозин, Y) в положении 7.
Для того чтобы определить, могут ли эти последовательности активировать NKT-клетки in vivo, FVIII (2 IU) внутривенно вводили мышам с гемофилией A за 4 приема с однонедельными интервалами. У мышей с гемофилией A не вырабатывается FVIII из-за стоп-кодона, введенного в ген FVIII в экзон 16. Через 10 дней после последней инъекции мышей забивали, из селезенки получали CD4+ T клетки с использованием сортировки на магнитных шариках. NKT-клетки характеризуются экспрессией CD4 и распознаванием антигена, презентированного CD1d-молекулой. Тетрамер CD1d получали от частного поставщика и нагружали FVIII пептидами, длиной 15 аминокислот, которые включали пептиды, содержащие SEQ ID1, SEQ ID2 и SEQ ID3. Наблюдалось значительное связывание CD1d тетрамеров, нагруженных этими пептидами, свидетельствуя, что эти 3 пептида были способны связываться с CD Id, и что такая инъекция FVIII вызывала активацию NKT-клеток. Характерные результаты показаны на фигуре 1.
Кроме того, прямой иммунизации пептидами, содержащими CD1d мотив (пептиды SEQ ID1, SEQ ID2 или SEQ ID3), было достаточно, чтобы вызвать активацию NKT-клеток и выработку антител к FVIII. Наблюдалась значительная активация при использовании пептида SEQ ID1. Характерные результаты показаны на фигуре 2.
Были созданы костномозговые химеры, при этом мышей с гемофилией А сначала облучали, а потом «восстанавливали», используя костный мозг мышей, лишенных NKT-клеток, а именно CD1d-нокаутных мышей. При отсутствии NKT-клеток мыши были неспособны вырабатывать значительное количество антител к FVIII, при этом антитела, ингибирующие функцию FVIII, практически отсутствовали (фигура 3).
Домен A1 FVIII был получен с помощью рекомбинантной технологии в его природной последовательности или с использованием замены F309 и H315 на серии (полипептид SEQ ID4). Для иммунизации отдельных групп мышей использовали FVIII A1 домены в природной последовательности или SEQ ID4. Результаты показали, что замены F309 и H315 на S (SEQ ID4) было достаточно для предотвращения активации NKT-клеток, что оценивалось по CD4+ T-клеткам селезенки, как описано выше.
Домен A3 FVIII был получен с помощью рекомбинантной технологии в его природной последовательности или с использованием замены F1816 и H1822 на серин (полипептид SEQ ID 5). Для иммунизации отдельных групп мышей использовали FVIII A3 домены в природной последовательности или SEQ ID5. Результаты показали, что замены F1816 и HI822 на S (SEQ ID5) было достаточно для предотвращения активации NKT-клеток, что оценивалось по CD4+ T-клеткам селезенки, как описано выше.
Молекула FVIII с удаленным В доменом в природной последовательности вызывала активацию NKT-клеток (смотри выше). Была получена молекула FVIII с 4 аминокислотными заменами, содержащая F309S, H315S, F1816S и F1918S (SEQ ID6). Внутривенные инъекции такого мутированного FVIII у мышей с гемофилией A не приводили к образованию антител к FVIII и, соответственно, отсутствовали антитела, ингибирующие функцию FVIII.
Исходя из вышеизложенного, был сделан вывод, что:
(1) FVIII в естественных условиях содержит несколько CD1d-связывающих мотивов;
(2) эти CD1d-мотивы являются функциональными и вызывают активацию NKT-клеток,
(3) активация NKT-клеток необходима для выработки антител к FVIII;
(4) удаления CD1d-мотивов путем замены аминокислоты достаточно, для того, чтобы исключить выработку анти-FVIII антител.
Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что изобретение также распространяется на трансгенных животных, созданных с целью производства факторов коагуляции, таких как фактор IX.
Подробное описание чертежей
Фигура 1
NKT клетки распознают эпитопы фактора VIII, презентированного CD1d
Мышей с гемофилией A иммунизировали 2 IU фактора VIII за 4 приема с интервалом в одну неделю. Затем получали CD4+ T клетки из селезенки с использованием сортировки на магнитных шариках. Тетрамер CD1d, меченный флюорохромом, получали от частного поставщика и нагружали FVIII пептидами, длиной 15 аминокислот, которые включали пептиды, содержащие SEQ ID1, ID2 и ID3. Нагрузку осуществляли при комнатной температуре в течение ночи в темноте. Затем тетрамеры инкубировали в течение 30 минут при 4°C с популяцией CD4+ Т клеток и анализировали клеточную суспензию при помощи Facs.
Фигура показывает, что CD1d тетрамеры, нагруженные пептидом SEQ ID1 (44pept на фигуре), распознаются NKT-клетками. CD1d ctl(-) показывает процент NKT-клеток, распознающих ненагруженные тетрамеры. CD1d ctl(+) показывает процент NKT-клеток, распознающих тетрамеры, нагруженные альфа-гал-церамидом, который рекрутирует все NKT-клетки. Вплоть до 45% NKT-клеток распознает 44pept, который соответствует отсутствию полиморфизма на уровне CD1d и очень ограниченному полиморфизму на уровне NKT T клеточного рецептора.
Фигура 2
Иммунизация мышей с гемофилией A CD1d-рестриктированными пептидами вызывает образование антифактор VIII антител
Мышей, с гемофилией A иммунизировали 3 раза подкожно 50 мкг эквимолярной смеси пептида SEQ ID1 (44pept) и пептида SEQ ID2 (256pept), адсорбированных на гидроксиде алюминия. Контрольная группа получала физиологическую сыворотку вместо пептидов. Плазму собирали через 10 дней после последней иммунизации и оценивали на присутствие антифактор VIII-антител, используя метод прямого связывания. Коротко, фактор VIII (10 IU/мл) был переведен в нерастворимую форму на полистирольных планшетах, которые промывали и инкубировали с плазмой при разведении 1/10. После дополнительной промывки, добавили HRP-меченую козью антимышь антисыворотку, а затем ферментный субстрат. Цветное проявление определяли в виде OD.
Фигура показывает, что у мышей с гемофилией А, иммунизированных пептидами SEQ ID1 и SEQ ID2, вырабатываются антитела к фактору VIII.
Фигура 3
Мыши с гемофилией A, «восстановленные» костным мозгом от мышей CD1d КО, не производят антитела к фактору VIII.
6
Мышей с гемофилией облучали летальной дозой и «восстанавливали» костным мозгом мышей CD1d КО (5×10/мышь), у которых отсутствуют NKT-клетки. Через 6 недель после восстановления костного мозга мыши получали 4 внутривенные инъекции 2 IU/мл с интервалом в одну неделю. Через 10 дней после последней иммунизации мышей обескровливали, а плазму оценивали на присутствие антифактор VIII антител, используя метод прямого связывания, как описано в подписи к фигуре 2. Контрольную группу облученных мышей с гемофилией A «восстанавливали» нормальным костным мозгом.
Фигура показывает, что в то время как у контрольных мышей продуцируются высокие концентрации анти-FVIII антител после четвертой инъекции фактора VIII (левая панель), у мышей, «восстановленных» костным мозгом мышей, дефицитных по NKT-клеткам, не продуцируются (правая панель).
Пример 2. Вирусные векторы аденовируса 5
Вирусные векторы обычно используются для генной терапии и генной вакцинации. Один из самых распространенных из этих вирусных векторов происходит из аденовируса серотипа 5. Аденовирусы (Ad) являются вирусами без оболочки, обладающими линейным двухцепочечным ДНК-геномом примерно 35 kb. Человеческий Ad5 имеет капсиду, состоящую из 3 основных структурных белков: гексона, пентона и нити (fiber). Нейтрализующие антитела вырабатываются к белкам гексонам. Такие антитела являются широко распространенными вследствие вирусной инфекции. Присутствие таких антител блокирует вход вирусного вектора и, соответственно, предотвращает экспрессию трансгенного белка, предоставляемого вектором. Анти-AdS антитела вырабатываются во время адаптивного ответа, который зависит от активации CD4+ T клеток, специфических для эпитопов, презентированных в тесной связи с молекулами MHC класса II.
Известно, что Ad5 активирует врожденную иммунную систему, хотя точный механизм, с помощью которого это происходит, остается неясным. Однако? активация врожденной иммунной системы может быть необходимым этапом для образования нейтрализующих антител.
2
3
5
6
С помощью алгоритмов мы установили 7 аминокислотных последовательностей, соответствующих общему мотиву [FWTHY]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY] CD1d-связывающей последовательности (SEQ ID, с подчеркнутыми мотивами) в гексоне 6.
9
Мышам вводили внутривенно 10 PFU Ad5 вектора за 3 приема с 10-дневными интервалами. Затем получали CD4+ T клетки из селезенки с использованием сортировки на магнитных шариках. CD4+ T клетки инкубировали с CD1d тетрамерами, нагруженными пептидами, соответствующими каждой из 7 установленных последовательностей. Было показано, что значительная часть (±10%) CD4+ NKT клеток была помечена тетрамерами, показывая, что инъекции Ad5-вектора активировали NKT-клетки, специфические для пептида SEQ ID7. Кроме того, такие мыши продуцировали специфические антитела IgG2a изотипа, характерные для нейтрализующих антител у мыши.
Был получен вирусный вектор, содержащий замену [FW] на серин S для каждой из 7 установленных аминокислотных последовательностей. Этот мутированный вирусный вектор (SEQ ID8, с подчеркнутыми мотивами) использовали для иммунизации животных в соответствии с описанным выше протоколом для природной последовательности. Доля NKT-клеток, оцененная с использованием тетрамеров, нагруженных пептидом в природной последовательности (SEQ ID7), составляла <1%, а концентрация антител, специфических к Ad5 вирусу, была значительно понижена (до 10 раз).
Поэтому был сделан вывод, что замены F на S в каждом местоположении P1 CD1d-связывающих мотивов было достаточно, чтобы уменьшить активацию NKT-клеток и тем самым уменьшить выработку анти-AdS антител.
Пример 3. Генетически модифицированные белки
Белки, воздействию которых субъекты подвергаются при вдыхании или проглатывании, часто вызывают нежелательные реакции у предрасположенных субъектов. Аллергическая астма поражает миллионы людей по всему миру. С другой стороны, широкое распространение имеет пищевая аллергия ±2,5% в общей популяции. Любые аллергены из воздуха, проглоченные или оказывающие воздействие на кожу могут иметь общие свойства, посредством которых они активируют NKT-клетки.
2
3
5
6
Одним из наиболее распространенных пищевых аллергенов является яблоко (Malus domesticus), причем аллергенность почти исключительно связана с белком Mal d 1, длиной 159 аминокислот, который защищает растение от инфекционных агентов. С помощью алгоритмов была установлена последовательность мотива, которая соответствует общему мотиву [FWTHY]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY] CD1d-связывающей последовательности.
FKLIESY соответствующий аминокислотам 144-150 Mai d 1 (SEQ ID9)
Рекомбинантная форма Mal d 1, в которой F144 и Y150 были изменены на S, была получена с помощью генной инженерии. Поэтому рекомбинантная форма Mal d 1 включает пептид с последовательностью:
SKLIESS(SEQ ID10)
Были получены синтетические пептиды, соответствующие SEQ ID9 и SEQ ID10. Их способность активировать NKT-клетки была определена in vitro с использованием человеческих дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови индивидуума, сенсибилизированного к Mal d 1. Дендритные клетки, нагруженные каждым из двух пептидов, инкубировали в присутствии NKT-клеток, полученных от того же самого индивидуума сортировкой периферических лимфоцитов с помощью специфических маркеров, таких как CD4 и NKG2D. Было обнаружено, что NKT-клетки, инкубированные с пептидом SEQ ID9, активировали значительную часть NKT-клеток, в то время как мутированные пептиды SEQ ID10 не активировали. В дополнение к этому, человеческие CD1d тетрамеры, нагруженные пептидами SEQ ID9, распознавались значительной частью NKT-клеток, однако тетрамеры, нагруженные мутированным пептидом SEQ ID10, распознавались менее, чем 1% NKT-клеток.
Две мутации F144S и Y150S вводили непосредственно в клональные клетки с помощью сайт-направленного мутагенеза. Затем был получен полный организм с помощью общепринятых стратегий роста. Яблоки, полученные с помощью этого генетически модифицированного организма (GMO), не вызывают аллергических реакций.
Одной специфической областью применения пептидов или полипептидов настоящего изобретения является глютеновая болезнь (непереносимость клейковины). Эта болезнь относится к числу наиболее распространенных у людей и связана с активацией T-клеток к эпитопам глиадина, которые презентируются в тесной связи с детерминантами MHC класса II. Описана генетическая чувствительность, причем люди, несущие детерминанту HLA-DQ2 или DQ8 класса II, являются предрасположенными к болезни. Эти детерминанты класса II представляют пептиды, подвергающиеся дезаминированию трансглутаминазой. Однако эти события являются результатом воспалительной реакции в кишечнике, вероятно связанной с врожденной иммунной системой.
Глиадины (белки клейковины) представляют собой мономеры, состоящие из 250-300 аминокислотных остатков. С помощью поиска общего мотива [FW]-XX-[ILM]-XX-[FWTHY] CD1d-связывающей последовательности с использованием компьютерных алгоритмов была установлена такую последовательность (SEQ ID11, смотри список последовательностей) в альфа-глиадине. Затем была получена мутированная форма альфа-глиадина, в которой F остаток мотива был заменен остатком S (SEQ ID12, см. приложение).
Использовали ту же самую процедуру, как для Mal d 1, чтобы показать, что в то время как полипептид SEQ ID11 активировал значительную часть NKT-клеток во время его презентирования антигенпредставляющими дендритными клетками, мутированная форма полипептида (SEQ ID12) оказалась неспособна сделать это. Как и в случае Mal d 1, человеческие CD1d тетрамеры, нагруженные синтетическим пептидом, представляющим мотив, установленный в полипептиде SEQ ID11, распознавались NKT-клетками, в то время как тетрамеры, нагруженные мутированной формой мотива, как показано в SEQ ID12, не распознавались.
Мутация была введена непосредственно в клональные клетки с помощью сайт-направленного мутагенеза. Затем был получен полный организм с помощью общепринятых стратегий роста. Зерновые культуры, содержащие мутированную форму глиадина, не вызывают реакций непереносимости.
Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что настоящее изобретение также может применяться к протеинам, которые вводятся, например, в генетически модифицированные организмы для увеличения их устойчивости к инсектицидам, пестицидам, или любым другим модификациям, считающимся полезными. Такие модификации несут риск создания новых CD1d-связывающих мотивов.
Дополнительными примерами генетически модифицированных белков с уменьшенной аллергенностью/иммуногенностью являются:
пищевые аллергены, такие как соевые бобы, арахис и фрукты семейства Rosaceous (Розоцветные);
белки молока;
ингаляционные аллергены, такие как латекс (Hevea brasiliensis), пыльца трав, такой как райграс многолетний (Lolium perenne), тимофеевка (Phleum pratense) или голубая трава Кентукки (Poa pratensis);
рыбий парвальбумин;
фосфолипаза A2 медоносной пчелы.
Кроме того, специалисту в данной области техники должно быть понятно, что изобретение распространяется на способы, с помощью которых получают пептиды или полипептиды изобретения, включая получение трансгенных растений и животных.
Пример 4. Аллерген Der p 1
2
3
5
6
Der p 1 представляет собой цистеиновую протеазу, являющуюся основным аллергеном так называемого клеща домашней пыли (HDM), D. pteronyssinus. Вне всяких сомнений сенсибилизация к HDM является наиболее общим инициирующим фактором аллергической астмы и ринита во всем мире. Der p 1 содержит 3 мотива, соответствующих общему CD1d-связывающему мотиву [FWTHY]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY], как установлено с помощью компьютерных алгоритмов, и которые представляют собой:
SEQ ID13: FSGVAAT аминокислоты 38-44 Der p 1
SEQ ID14: HSAIAAVI аминокислоты 135-141 Der p 1
SEQ ID15: YPYWIL аминокислоты 216-222 Der p 1
Были синтезированы пептиды SEQ ID13, SEQ ID14 и SEQ ID15, которые использовали для нагрузки CD1d тетрамеров.
Мышам BALB/c интраназально вводили Der p 1, используя 50 мкл физраствора, содержащего 100 мкг Der p 1. Эту процедуру повторяли дважды в течение трех следующих подряд дней с интервалом в одну неделю. Через 5 дней после последней назальной инстилляции мышей забивали и извлекали селезенку. Получали CD4+ T клетки с использованием сортировки на магнитных шариках и инкубировали их в присутствии CD1d тетрамеров, нагруженных пептидами SEQ ID13, SEQ ID14 или SEQ ID15. С помощью клеточного сортера с активацией флуоресценции (facs) было обнаружено, что значительный процент клеток (±10%) был окрашен тетрамерами, что определяет их как CD4+ NKT-клетки. Поэтому был сделан вывод, что пептиды SEQ ID13, SEQ ID14 и SEQ ID15 были функциональными при связывании с CD1d и распознавались NKT-клетками.
CD4+ T-клетки, полученные при проведении вышеуказанных экспериментов, инкубировали в культуральной среде в присутствии антигенпредставляющих клеток, экспрессирующих CD1d-молекулу. Такие клетки являются коммерчески доступными, например, как клетки JAWS2, которые не экспрессируют детерминанты MHC класса II. Клетки JAWS2 нагружали Der p 1 и оценивали CD1d-презентирование эпитопов, полученных от Der p 1, путем определения выработки цитокинов, таких как IFN-гамма и EL-4 в качестве маркеров NKT-активации. Наблюдалась значительная выработка цитокинов, подтверждая, что Der p 1 содержал эпитопы, презентируемые CD1d-молекулами.
Затем, с помощью генной инженерии была создана мутированная форма Der p 1, в которой 3 аминокислотных остатка, предположительно находящиеся в положении P1 для CD Id-связывания пептидов SEQ ID13, SEQ ID14 и SEQ ID15, были заменены на серии. Мутированный Der p 1 (SEQ ID16) использовали для назальной инстилляции, как описано выше, вместе с Der p 1 в природной последовательности (SEQ ID17). В таком случае не наблюдалось значительного связывания CD4+ T спленоцитов при инкубации с тетрамерами, нагруженными пептидом SEQ ID13, пептидом SEQ ID14 или пептидом SEQ ID15, указывая, что мутированный Der p 1 потерял свою способность активировать NKT-клетки, специфические к этим пептидам.
Кроме того, мутированный Der p 1 (SEQ ID 16) использовали для нагрузки клеток JAWS2 и проверяли его способность активировать NKT-клетки. В этом эксперименте использовали NKT-клетки, полученные от мышей, иммунизированных Der p 1 в его природной или мутированной конфигурации. Показателем NKT-активации служила выработка IFN-гамма и IL-4. Было обнаружено, что NKT-клетки, полученные от мышей, иммунизированных природной последовательностью Der p 1, не активировались при инкубации в присутствии клеток JAWS2, нагруженных мутированным Der p 1.
Был сделан вывод о том, что Der p 1 в природной последовательности содержал функциональные T-клеточные эпитопы, рестриктированные по CD1d, активирующие NKT-клетки. Кроме того, устранения таких функциональных CD1d-рестриктированных эпитопов с помощью мутации было достаточно для исключения активации NKT-клеток.
Пример 5. Антитела
Антитела используются в качестве терапевтических средств при целом ряде заболеваний, от хронических воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (например, анти-TNF-альфа антитела) или аллергическая астма (например, анти-IgE антитела), до опухолей (например, анти-CD20 антитела). В настоящее время более 120 терапевтических антител находится на различных стадиях испытаний (от предклинической до третьей фазы) с целью одобрения их применения в клинической практике.
Терапевтические антитела представляют собой или химерные, или полностью гуманизированные антитела, которые содержат последовательность чужеродного происхождения только в гипервариабельных участках вариабельных областей. Меньшая часть таких антител происходит из человеческого набора и как таковые они считаются слабоантигенными. Однако антитела к терапевтическим антителам, даже в том случае, когда непосредственно происходят из человеческого набора, вырабатываются у большинства пациентов при лечении, в значительной части случаев, вместе с продукцией антител, нейтрализующих активность терапевтического средства.
Поиск эпитопов, соответствующих CD1d-связывающему мотиву в последовательности человеческого IgG антитела, проводили с использованием компьютерного алгоритма. Один из таких мотивов был установлен в CH2 участке (второй домен константного участка тяжелой цепи) каждого из 4 IgG подклассов (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) и второй мотив был установлен в CH3 петле IgG1, IgG2 и IgG4:
SEQ ID18: YRVVSVL (CH2 IgG1 и IgG4)
SEQ ID19: FRVVSVL (СН2 IgG2 и IgG3)
SEQ Г020: HEALHNH (CH3 петля IgG1, IgG2 и IgG4)
Получили синтетические пептиды, соответствующие SEQ ID18, SEQ ID19 и SEQ ID20, и использовали их для нагрузки человеческих CD1d тетрамеров, как в примерах приведенных выше (смотри, например, пример 4 для аллергена Der p 1). Клетки периферической крови получали с помощью венепункции пациентов, получавших инъекцию терапевтического антитела в течение предыдущих 5 дней. CD4+ T-клетки получили с использованием сортировки на магнитных шариках. Затем клетки инкубировали с тетрамерами, нагруженными пептидами SEQ ID18, SEQ ID19 или SEQ ID20. Анализ с применением facs показывает наличие значительной части NKT-клеток (±10%), меченых тетрамерами.
Моноклональные человеческие антитела IgG4 изотипа получали из B-лимфоцитов периферической крови путем трансформации вирусом Эпштейна-Барр. Геномные последовательности таких антител были получены от трансформированных B-клеток. Был создан вирусный вектор, содержащий соответствующую последовательность кДНК, который использовался для трансфекции CHO-клеток. Все эти методы известны в данной области техники (смотри, например, Jacquemin et al Blood 92: 496-506, 1998).
Гидрофобные аминокислотные остатки, расположенные в положении 1 в пептидах SEQ ID18 и SEQ ID20, были изменены на серин, при этом трансфицированные CHO-клетки продуцировали мутированное антитело.
CD4+T-клетки периферической крови, полученные как указано выше, были подвергнуты действию в культуральной среде человеческих дендритных клеток (полученных из моноцитов периферической крови человека с помощью известных в данной области техники методов) и нагружены или антителами в естественной конфигурации (SEQ ID21) или их мутированным аналогом (SEQ ID22). После культивирования клеток с CD4+ T-клетками в течение 5-7 дней оценивали популяцию CD4+ T-клеток, активированных или естественным или мутированным антителом. CD4+ NKT клетки отделяли от CD4+ T клеток с использованием антитела к NKG2D, поверхностному маркеру, связанному только с NK или NKT-клетками.
Было обнаружено, что CD4+ T клетки и NKT-клетки были активированы при использовании антитела в его природной последовательности (SEQ ID21), в то время как мутированная форма антитела (SEQ ID22) активировала только рестриктированные по классу II CD4 +T клетки и не активировала NKT-клетки.
2
3
5
6
Мы пришли к выводу о том, что человеческие IgG антитела содержали эпитопы, соответствующие мотиву [FWTHY]-XX-[ILMV]-XX-[FWTHY], обладающему способностью распознаваться и активировать NKT-клетки. Кроме того, мутации ключевых гидрофобных аминокислотных остатков в пределах такого мотива было достаточно для предотвращения активации NKT-клеток.
Должно быть понятно, что представленные в описании примеры не являются исчерпывающими, и что могут предусматриваться комбинации белков или пептидов, содержащих разное количество аминокислотных замен или делеций. Например, в примере 1, могут быть описаны разные комбинации замены гидрофобных аминокислот.