Способ лечения нерубцовой алопеции
METHOD FOR TREATING NONSCARRING ALOPECIA

Изобретение относится к эстетической медицине и может быть использовано для лечения алопеций.
2
Известен способ лечения нарушения роста волос [RU 2381786, С2, А61K 8/37, 20.02.2010], включающий введение пациенту алкилового эфира никотиновой кислоты с алкильной группой с прямой цепью или разветвленной цепью, содержащей от приблизительно 6 до приблизительно 22 СН групп в количестве, достаточном для снижения или для прекращения выпадения волос у указанного субъекта.
Недостатком способа является относительно низкая эффективность лечения.
Известен также способ [RU 2295304, С2, А61В 17/00, 20.03.2007], основанный на том, что в затылочной области головы пациента вырезают кожную полоску с волосяными фолликулами, ушивают донорскую рану, из кожной полоски формируют фолликулярные объединения-графты, для пересадки заготовленных графтов в затылочной области головы и на макушке формируют микроотверстия, направления каналов которых соответствуют направлению роста волос, причем для формирования отверстий разрезы производят параллельно донорской ране.
Недостатком этого способа также является относительно низкая эффективность лечения.
Кроме того, известен способ [RU 2550428, C1, А61В 17/00, 10.05.2015], включающий забор фрагмента кожного имплантата из волосистой области, наложение на образовавшийся дефект косметического шва, деление вырезанного фрагмента на фолликулярные графты, образование микронадрезов на реципиентной области и пересадку в них фолликулярных графтов, при этом перед забором фрагмента кожного имплантата с помощью компьютерной программы TrichoSciencePro v 1.1 рассчитывают площадь реципиентной области, проводят фототрихограмму, оценивая жизнеспособность волосяных фолликулов, на основании полученных данных определяют требуемое количество волосяных фолликулов, затем на реципиентную область наносят «шаблон», после чего на 30% реципиентной области формируют микронадрезы диаметром 1,0 мм для пересадки 2-х и 3-х жизнеспособных фолликулярных графтов и одиночных волосяных фолликулов, которые вводят с помощью одноразовых игл диаметром 0,8-1,0 мм.
Недостатком этого технического решения является относительно низкая эффективность, обусловленная малой приживаемостью волос.
Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ [IBRAHIM ZA et al. Stem cell therapy as a novel therapeutic intervention for resistant cases of alopecia areata and androgenetic alopecia. J. Dermatolog Treat. 2016, Aug., 24:1-30; ZHAO J. et al. Treatment of alopecia by transplantation of hair follicle steam cells and dermal papilla cells encapsulated in algenate gels. Med. Hypotheses. 2008; 70(5): 1014-6], включающий использование мезенхимальных стволовых клеток, в том числе из волосяных фолликулов кожи, в т.ч. для интрадермального введения.
Недостатком указанных выше технических решений является относительно узкий арсенал способов лечения нерубцовой алопеции, что не всегда обеспечивает выбор эффективного способа.
Задачей предложенного способа является расширение арсенала способов лечения нерубцовой алопеции и обеспечения на этой основе выбора эффективного способа лечения путем обеспечения восстановления волосяных луковиц, переход веллусных волос в терминальные, а также утолщение волос в зоне проведенной процедуры.
Требуемый технический результат заключается в расширении арсенала способов лечения нерубцовой алопеции.
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что, в способе лечения нерубцовой алопеции, включающем введение в мезодермальный слой кожи мезенхимальных стволовых клеток, согласно изобретению, эти клетки выделяют из биоптата кожи с волосистой части головы взрослого донора, кроме того, дополнительно выделяют мезенхимальные стволовые клетки из плаценты, после этого указанные клетки смешивают в соотношении от 3:1 до 1:3, доводят объем смеси до 2-4 мл и вводят ее в мезодермальный слой кожи человека в зоне облысения на глубину 2-3 мм через каждые 2-3 мм при объеме каждой инъекции, равном 0,02 мл.
На чертеже представлен образец паспорта клеточного материала.
Способ лечения нерубцовой алопеции реализуется следующим образом.
Нерубцовая алопеция - самый распространенный вид облысения на сегодняшний день, который не всегда хорошо поддается лечению обычными методами трихологии, но при этом доставляет пациенту массу неудобств и проблем эстетического характера. Применение предложенной клеточной мезотерапии заболевания показала хороший результат и является эффективной альтернативой медикаментозному лечению нерубцовой алопеции.
Сущность способа подразумевает доставку клеточного материала непосредственно в мезодерму, что позволяет введенным стволовым клеткам запустить регенеративные процессы в проблемной зоне. При мезотерапии клеточным материалом на основе аутологичных мезенхимальных стволовых клеток волосяного фолликула и мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека не только усиливается синтез гиалуроновой кислоты и коллагена, но восстанавливаются волосяные луковицы, если речь идет о волосистой части головы. Результаты фототрихограммы пациентов, применивших данный способ лечения, показывают переход веллусных волос в терминальные, а также утолщение волос в зоне проведенной процедуры.
Предварительные и основные операции предложенного способа реализуются следующим образом.
Получение мезенхимальных стволовых клеток из волосяных фолликулов кожи человека.
Получение биоптата кожи.
Забор биоптата осуществляется с волосистой части головы взрослого донора при помощи инструмента для биопсии кожи, например типа Dermo Punch (Sterylab, Италия). Предварительно производится местная анестезия в месте надреза кожи. В месте забора биоптата делается надрез при помощи инструмента для биопсии кожи вращательными движениями по часовой стрелке и против часовой стрелки, слегка нажимая при этом на кожу, что позволит инструменту проникнуть в ткань. Глубина захвата кожи составляет 0,3-0,5 см. Полученный кусочек кожи при помощи пинцета и скальпеля отрезается и помещается в стерильную центрифужную пробирку, заполненную полностью раствором Хенкса (ПанЭко, РФ) с добавлением антибиотика/антимикотика («Gibco», США), который помещается на лед в термос (температура +2°-+8°C). Транспортировка биоптата может осуществляться до пяти суток при условии соблюдения герметичности, стерильности и температурного режима. К транспортируемому биоптату прилагаются результаты диагностики крови донора (пациента) на отсутствие инфекционных заболеваний (в соответствии с приказным списком).
Выделение мезенхимальных стволовых клеток из волосяных фолликулов кожи человека и их культивирование.
Все манипуляции по выделению и культивированию мезенхимальных стволовых клеток из волосяных фолликулов кожи человека проводятся стерильно в условиях специально оборудованного культурального бокса. Полученный кусочек кожи промывается от крови. Для этого он помещается в изопропиленовую пробирку объемом 15 мл, заполненную 5-7 мл раствора Хенкса с добавлением антибиотика и антимикотика (Gibco, США), и энергично встряхивается. Промытые кусочки ткани измельчаются и инкубируются 1-2 ч при 37°C в 0,1% растворе коллагеназы I-го типа в чашках Петри диаметром 3 см из расчета 1 кусочек ткани: 1 чашка Петри: 5 мл раствора фермента. Полученная суспензия из каждой чашки Петри переносится в отдельную изопропиленовую пробирку объемом 15 мл и осаждается центрифугированием (5 мин, 300 g). Осадок ресуспендируется в 5 мл ростовой среды: DMEM: F12; 10% фетальная телячья сыворотка; p-p гентамицин/стрептомицин/глутамина (все - Gibco, США); 0,25 мг ципрофлоксацина.
2
2
Содержимое пробирки переносится в культуральный флакон площадью 25 см и культивируется со сменой ростовой среды (состав см. выше) каждые 3 дня до достижения полученной первичной культурой клеток 80%-ной конфлюэнтности. При достижении монослоем 80%-ной конфлюэнтности клетки переводятся в суспензию с использованием раствора 0,25%-го трипсина с версеном (1:1) и переносятся в культуральный флакон, площадью 75 см, и далее культивируются уже в них.
Подготовка и длительное хранение (криоконсервация) мезенхимальных стволовых клеток из волосяных фолликулов кожи человека.
Замораживание клеток проводят на уровне не старше V пассажа для создания запаса клеток, которые можно впоследствии восстановить, или для сохранения невостребованных клеток. Все манипуляции по криоконсервации клеточных линий, предназначенных для длительного хранения, проводятся стерильно в условиях специально оборудованного культурального бокса.
Подготовка клеток к замораживанию.
Клетки отделяют от пластика смесью растворов версена и трипсина в отношении 1:1 и переносят в центрифужную пробирку (15-50 мл в зависимости от полученного объема клеточной суспензии) и центрифугируют (5 мин, 300 g). Осадок ресуспендируют в среде для криозаморозки (90% фетальной телячьей сыворотки, 10% диметилсульфоксида (DMSO)).
Подсчитывают количество клеток в полученной суспензии и разбавляют ее средой для криозаморозки до конечной концентрации 1 млн клеток/мл. Полученную клеточную суспензию разливают в криопробирки требуемых объемов и сразу начинают процесс замораживания.
Режим криозамораживания.
Для замораживания криопробирки с клетками переносят в контейнер для замораживания пробирок Mr. Frosty™ (Thermo Scientific, США) и помещают его в низкотемпературный холодильник (-80°C). Через сутки ампулы с клетками переносят в сосуд Дьюара с жидким азотом (-196°C).
Разморозка криоконсервированного клеточного материала.
2
2
2
Клетки восстанавливают при температуре 37-40° на водяной бане до таяния льда. Замороженные клетки достаточно хрупкие, плохо переносят пипетирование, взбалтывание и потому требуют особенно аккуратного обращения. Все манипуляции, связанные с размораживанием клеток, следует проводить максимально быстро и не допускать передержки клеток в размороженном криоконсерванте. Содержимое криопробирки переносится в культуральный флакон 75 см с фильтром, содержащий 10 мл полной ростовой среды. Клетки культивируются 24 ч в СО-инкубаторе (37°С, 5% СО, 80% влажности). Затем старая среда, содержащая криоконсервант, удаляется и заменяется на 10 мл свежей полной ростовой среды. Полученные клетки культивируются со сменой ростовой среды каждые 3 дня до достижения полученной первичной культурой клеток 80%-ной конфлюэнтности.
Далее работы с размороженными мезенхимальными стволовыми клетками производятся в соответствии с процедурой получения клеток.
Получение мезенхимальных стволовых клеток из плаценты человека.
Получение плаценты.
Забор плаценты должен осуществляться сразу после родов.
Плацента помещается в стерильный герметичный контейнер, который помещается на лед в сумку-холодильник (температура +2°-+8°С). Транспортировка плаценты может осуществляться до трех суток при условии соблюдения герметичности, стерильности и температурного режима.
К транспортируемой плаценте прилагается следующий пакет документов: анамнез донора (матери) плаценты, результаты диагностики крови донора (матери) плаценты на вирусы (в соответствии с приказным списком).
Выделение мезенхимальных стволовых клеток из плаценты человека и их культивирование.
Все манипуляции по выделению и культивированию мезенхимальных стволовых клеток из плаценты человека проводятся стерильно в условиях специально оборудованного культурального бокса. Амнион плаценты вместе с неглубоким захватом хориона нарезается на небольшие кусочки, достаточные для помещения в изопропиленовую пробирку объемом 50 мл. Полученные кусочки ткани энергично промываются от крови. Для этого каждый кусочек помещается в отдельную изопропиленовую пробирку объемом 50 мл, заполненную 40 мл раствора Хенкса с добавлением антибиотика и антимикотика (Gibco, США) и энергично встряхивается.
Промытые кусочки ткани измельчаются и инкубируются 1-2 ч при 370°С в 0,1% растворе коллагеназы I-го типа в чашках Петри диаметром 10 см из расчета 1 кусочек ткани : 1 чашка Петри : 10 мл раствора фермента.
Полученная суспензия из каждой чашки Петри переносится в отдельную изопропиленовую пробирку объемом 50 мл и осаждается центрифугированием (5 мин, 300 g). Полученные осадки ресуспендируются каждый в 15 мл ростовой среды: DMEM:F12; 10% фетальная телячья сыворотка; p-p гентамицин/стрептомицин/глутамина (все - Gibco, США); 0,25 мг ципрофлоксацина.
2
Содержимое каждой пробирки переносится в отдельный культуральный флакон площадью 75 см и культивируется со сменой ростовой среды (состав см. выше) каждые 3 дня до достижения полученной первичной культурой клеток 80%-ной конфлюэнтности. При достижении монослоем 80%-ной конфлюэнтности клетки переводятся в суспензию с использованием раствора 0,25%-го трипсина с версеном (1:1) и рассеваются в культуральные флаконы площадью 75 см в соотношении 1:3.
Подготовка и длительное хранение (криоконсервация) мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из плаценты человека.
Замораживание клеток проводят на уровне не старше V пассажа для создания запаса клеток, которые можно впоследствии восстановить, или для сохранения невостребованных клеток. Все манипуляции по криоконсервации клеточных линий, предназначенных для длительного хранения, проводятся стерильно в условиях специально оборудованного культурального бокса.
Подготовка клеток к замораживанию.
Клетки отделяют от пластика смесью растворов версена и трипсина в отношении 1:1 и переносят в центрифужную пробирку (15-50 мл в зависимости от полученного объема клеточной суспензии) и центрифугируют (5 мин, 300 g). Осадок ресуспендируют в среде для криозаморозки (90% фетальной телячьей сыворотки, 10% диметилсульфоксида (DMSO)).
Подсчитывают количество клеток в полученной суспензии и разбавляют ее средой для криозаморозки до конечной концентрации 1 млн клеток/мл. Полученную клеточную суспензию разливают в криопробирки требуемых объемов, и сразу начинают процесс замораживания.
Режим криозамораживания.
Для замораживания криопробирки с клетками переносят в контейнер для замораживания пробирок Mr. Frosty™ (Thermo Scientific, США) и помещают его в низкотемпературный холодильник (-80°С). Через сутки ампулы с клетками переносят в сосуд Дьюара с жидким азотом (-196°С).
Разморозка криоконсервированного клеточного материала.
Клетки восстанавливают при температуре 37-40° на водяной бане до таяния льда. Замороженные клетки достаточно хрупкие, плохо переносят пипетирование, взбалтывание и потому требуют особенно аккуратного обращения. Все манипуляции, связанные с размораживанием клеток, следует проводить максимально быстро и не допускать передержки клеток в размороженном криоконсерванте.
2
2
2
Содержимое криопробирки переносится в культуральный флакон 75 см с фильтром, содержащий 10 мл полной ростовой среды. Клетки культивируются 24 ч в CO-инкубаторе (37°C, 5% CO, 80% влажности). Затем старая среда, содержащая криоконсервант, удаляется и заменяется на 10 мл свежей полной ростовой среды. Полученные клетки культивируются со сменой ростовой среды каждые 3 дня до достижения полученной первичной культурой клеток 80%-ной конфлюэнтности. Далее работы с размороженными мезенхимальными стволовыми клетками производятся в соответствии с процедурой получения клеток.
Паспортизация клеточного материала.
Паспортизация является необходимой процедурой, документирующей результаты контроля состава, качества и безопасности клеточного материала.
Общая структура паспорта клеточного материала включает в себя четыре обязательных блока:
1. Общая информация: научное название клеток; происхождение клеточного материала; маркировка образца; информация о доноре клеток.
2. Жизнеспособность клеток, внешний вид образца: жизнеспособность клеток, %; стерильность; величина pH; цвет и консистенция образца; общая концентрация клеток, кл/мл; объем образца; время выдачи; срок годности, условия хранения.
3. Результаты тестирования образца на отсутствие инфекционных агентов из списка, общего для всех типов клеток.
4. Результаты тестирования образца на отсутствие инфекционных агентов, специфических для данного типа клеток.
Стандартное обследование клеточного материала после пассирования in vitro включает в себя тестирование методом ПЦР мезенхимальных клеток, выделенных из кожи и плаценты человека на отсутствие следующих инфекционных агентов:
- вирусов иммунодефицита 1-го и 2-го типов (Retroviridae, Orthoretrovirinae, Lentivirus);
- вирусов гепатита В (Hepadnaviridae, Orthohepadnavirus) и гепатита С (Flaviviridae, Hepacivirus);
- вирусов простого герпеса 1 го и 2 го типов (Herpesviridae, Alphaherpesvirinae, Simplexvirus); цитомегаловируса (Herpesviridae, Betaherpesvirinae, Cytomegalovirus); вируса Эпштейна-Барр (Herpesviridae, Gammaherpesvirinae, Lymphocryptovirus);
- Treponema pallidum (Spirochaetales, Spirochaetacea); Mycoplasma sp. (Mycoplasmatales, Mycoplasmataceae); Toxoplasma sp. (Eucoccidiorida, Sarcocystidae);
- папилломавирусов человека (Papillomaviridae) из рода Alphapapillomavirus (типы: 2, 6, 7, 10, 16, 18, 26, 32, 34, 53, 54, 61, 71, cand90);
- Ureaplasma sp. (Mycoplasmatales, Mycoplasmataceae);
- Chlamydia sp. (Chlamydiales, Chlamydiaceae).
Исключение инфекционных агентов в мезенхимальных стволовых клетках выполняется в клинико-диагностической лаборатории однократно. Стандартное обследование проводится после пассирования in vitro образца клеточной линии в количестве не менее 500 тыс. клеток.
Приготовление клеточного материала для транспортировки и медицинского применения.
2
Отобранные образцы клеточных культур не старше V пассажа переводятся в суспензию с использованием раствора 0,25%-го трипсина с версеном (1:1). Для этого ростовая среда удаляется, а монослой дважды промывается физиологическим растворо, а затем инкубируется в растворе 0,25%-го трипсина с версеном (1:1) при 37°C из расчета 3 мл раствора на культуральный флакон площадью 75 см.
Полученная суспензия переносится в изопропиленовую пробирку объемом 50 мл, после чего осуществляется подсчет количества в ней клеток при помощи камеры Горяева. Далее суспензия промывается физиологическим раствором. Для этого клетки осаждаются центрифугированием (5 мин 300 g), а осадок ресуспендируется в физиологическом растворе. Манипуляция повторяется дважды. Полученный осадок клеток ресуспендируется в стерильной среде транспортировки, состоящей из физиологического раствора и разрешенного к применению лекарственного средства, обеспечивающего лучшую выживаемость клеток и улучшение лечебных характеристик технологии. Процент жизнеспособных клеток в препарате определяется с помощью окраски трипановым синим и подсчетом в камере Горяева. Для медицинского применения необходим уровень не ниже 80% жизнеспособных клеток в суспензии.
Полученная суспензия (далее клеточный материал) переносится стерильно в вакуумную пробирку для забора крови (вакутейнер, Gibco, США). Все манипуляции проводятся отдельно для каждого вида клеток. Затем клетки смешиваются в соотношении от 3:1 до 1:3 (мезенхимальные стволовые клетки волосяного фолликула человека : мезенхимальные стволовые клетки плаценты человека) в зависимости от показаний врача, который учитывает возраст пациента и степень тяжести заболевания.
Эти границы установлены эмпирически. Врач учитывает анамнез и возраст пациента при определении соотношения, устанавливает пропорции между клетками в смеси, в некоторых случаях имеет смысл добавить больше фолликулярных, в других - больше плацентарных. При меньших количествах тех или иных клеток их действие нивелируется, становится не ощутимым. Собственно, гомологичный клеточный материал тоже используется для лечения облысения, но в нашем случае интересен именно коктейль двух типов стволовых клеток, при использовании которого наблюдается их бинарное действие. При больших количествах тех или иных клеток происходит их излишне большой расход.
Полученная смесь доводится до объема 2-4 мл. Экспериментально установлено, что такого объема вполне достаточно для наиболее распространенных размеров тех зон, для которых разработан способ лечения. Верхняя граница может быть увеличена до 10 мл при больших зонах облысения, которые на практике встречаются крайне редко.
Клеточный материал вводится через каждые 2-3 мм, с той частотой, какой на коже обычно размещены фолликулы, а объем каждой инъекции одинаковый и равен 0,02 мл. Необходимый объем установлен на практике: 2 мл достаточно для наименьшей встречающейся площади облысения, а 4 мл - для наибольшей практической площади.
Транспортировка и временное хранение клеточного материала.
Вакутейнер с готовым клеточным материалом помещается в термос со льдом и транспортируется к месту назначения. Транспортировка и хранение клеточного материала осуществляется стерильно при температурном режиме +2°-+8°C. Срок годности клеточного материала для медицинского применения указан в сопровождающем его паспорте клеточного материала.
Противопоказания: онкологические заболевания, тревожные психические расстройства или острые психозы, острые инфекционные заболевания, хронические заболевания в момент обострения, инфекционные заболевания волосистой части головы, противопоказания к мезотерапии.
Материально-техническое обеспечение.
1. Помещение для использования под лабораторию, отвечающее лицензионным требованиям.
2
2. Оборудование: центрифуга, СО-инкубатор, ламинарный шкаф, инвертированный микроскоп, автоматическая пипетка, микропипетка, замораживатель, сосуд Дьюара, низкотемпературный холодильник, бытовой холодильник, камера Горяева, водяная баня, термос, инструмент для биопсии кожи.
3. Реактивы: антибиотики, антимикотики, питательная среда ДМЕМ/F12, фетальная телячья сыворотка, Версен, 0,25%-ный раствор трипсина, ДМСО, раствор Хенкса, физиологический раствор, коллагеназа 1-го типа, трипановый синий.
4. Расходные материалы: одноразовая культуральная пластиковая посуда (флаконы, пробирки, серологические пипетки, чашки Петри, наконечники для микропипеток, криопробирки); покровные стекла, набор медицинских инструментов (пинцет, хирургические ножницы, глазные ножницы, скальпель, шпатель, карцанг), вакутейнеры.
Введение клеточного материала.
Клеточный материал вводится в мезодермальный слой кожи в зоне облысения, как обычный мезотерапевтический коктейль. При введении используется папульная техника, при этом формируются папулы различного диаметра, что позволяет клеточному материалу действовать постепенно, поступая малыми порциями из депо, максимально пролонгируя свой регенеративный эффект. Рассасывание папул при процедуре происходит от нескольких часов до нескольких дней. Размер папул может колебаться от 2 до 4 мм, глубина введения клеточного материала 2-3 мм, угол наклона иглы составляет 45 градусов. Клеточный материал вводится через каждые 2-3 мм, с той частотой, какой на коже обычно размещены фолликулы.
Результаты лечения нерубцовой алопеции способом введения клеточного материала на основе аутологичных мезенхимальных стволовых клеток волосяного фолликула и мезенхимальных стволовых клеток плаценты человека.
При предложенном способе лечения аутологичные мезенхимальные стволовые клетки волосяного фолликула выделяются, культивируются и вводятся вместе с обычными фибробластами кожи, т.е. в привычном для них микроокружении. Клетки пациента в условиях культуры, когда на них не оказывается воздействие организма в целом, значительно омолаживаются, становятся ювенильными. Возвращаясь в кожу, они не только сами оказывают омолаживающее воздействие, но и способны запустить обратные процессы у стареющих или поврежденных клеток кожи. Добавление к ним аллогенных клеток из плаценты еще более усиливает этот механизм. Мезенхимальные стволовые клетки плаценты человека уже давно зарекомендовали себя с наилучшей стороны в эстетической медицине. Они не только улучшают состояние кожи, но и способствуют росту капиллярной сети в зоне введения, а значит, улучшают кровоснабжение проблемной зоны.
Таким образом, в предложенном изобретении достигается требуемый технический результат, заключающийся в расширении арсенала способов лечения нерубцовой алопеции.
2
Для оценки динамики лечения у пациентов проводился анализ фототрихограммы теменной зоны. Учитывалось общее количество волос на см (терминальные или веллусные) и фазы роста (анаген или телоген). Далее учитывался процент веллуса среди анагеновых и телогеновых волос. Это основной показатель, по которому мы учитывали динамику изменений при лечении алопеции предложенным способом. Кроме этого, учитывалось соотношение волос в зависимости от их толщины.
Пример. Пациентка И., 27 лет. Диагноз: андрогенетическая алопеция.
Данные фототрихограммы представлены в таблице.
Как следует из представленных данных, на фоне проводимого лечения у пациентки наблюдается увеличение плотности волос, их утолщение и нормализация выпадения. Несмотря на то что процент выпадающих волос по-прежнему высокий, такие изменения даже лучше, чем просто остановка выпадения волос. Это доказывает эффективность предложенного способа лечения.