ШТАММ ВИРУСА ГРАНУЛЁЗА ЯБЛОННОЙ ПЛОДОЖОРКИ Cydia pomonella L., ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
STRAIN OF GRANULOSIS OF APPLE MOTH CYDIA POMONELLA L. WITH INSECTICIDAL ACTIVITY

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, а именно к производству биологических инсектицидов для сельского хозяйства на основе нового штамма вируса гранулеза яблонной плодожорки (ЯП) Cydia pomonella L., являющейся опасным вредителем, повреждающим плоды яблони, груши, айвы и других плодовых культур.
На сегодняшний день применение биологических средств защиты растений является единственным способом рационального природопользования по сравнению с химическими пестицидами. В сравнении с химическими инсектицидами, которые направлены на полное истребление вредителя и часто затрагивают большое количество нецелевых, в том числе и полезных сопутствующих видов, вирусы насекомых регулируют численность и вредоносность только конкретного вредителя, не затрагивая других членов биоценоза. Кроме того, биологическая эффективность вирусного препарата сопоставима с химическими инсектицидами, используемыми в защите растений.
Известны химические инсектициды, используемые для борьбы с яблонной плодожоркой С. pomonella L., например, Неофрал, КЭ (100 г/л альфа-циперметрина), Борей, СК (150 г/л имидаклоприда +50 г/л лямда-цигалотрина), Матч, КЭ (50 г/л люфенурона) и другие. Однако при постоянном неконтролируемом применении они приводят не только к химическому загрязнению агробиоценозов, но и могут быть причиной формирования резистентности у вредителей, против которых применяются. К тому же любые химические средства защиты растений даже при оптимальном использовании способны накапливаться в почве, растениях, в других объектах окружающей среды, а главное в конечных продуктах, создавая угрозу для здоровья человека и животных.
Известны биопрепараты, используемые для борьбы с яблонной плодожоркой С. pomonella L., на основе различных штаммов бактерий и грибов, например, Битоксибациллин, П (Bacillus thuringiensis, var. thuringiensis), Лепидоцид, СК (Bacillus thuringiensis, var. kurstaki), Биостоп, Ж (Bacillus thuringiensis + Streptomyces sp. + Beauveria bassiana), Биослип БВ, Ж (Beauveria bassiana), однако, они обладают недостаточной эффективностью по отношению к целевому виду (66-71%) и их применение лимитируется температурами выше +30°С (Юрченко Е.Г., Подгорная М.Е., Прах С.В. и др., 2018).
12
13
13
Согласно Государственному каталогу пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ по состоянию на 14.01.2020 г., зарегистрировано три биопрепарата на основе разных штаммов вируса гранулеза яблонной плодожорки: ФермоВирин ЯП, СП (GpGV) (3,0×10 гранул/г) (Германия), Мадекс Твин, СК (CpGV isolat V22) (3,0×10гранул/л) (Швейцария) и Карповирусин, СК (CpGV isolat М) (1,0×10гранул/л) (Франция). Вышеуказанные препараты обладают высокой эффективностью (сохранение съемного урожая до 90%) и экологичностью, но при этом весьма дорогостоящие (Юрченко Е.Г., Подгорная М.Е., Прах С.В. и др., 2018).
Штаммов вируса гранулеза яблонной плодожорки, выделенных в Российской Федерации, для получения эффективного инсектицидного препарата из уровня техники не выявлено.
Технической задачей предлагаемого изобретения является выделение нового штамма вируса гранулеза яблонной плодожорки с высокой инсектицидной активностью против гусениц яблонной плодожорки С. pomonella L., который в перспективе может быть использован в качестве штамма-продуцента нового биопрепарата в целях расширения ассортимента биологических средств защиты растений против особо опасного вредителя плодовых культур - яблонной плодожорки С. pomonella L.
Указанный технический результат достигается тем, что выделен штамм BZR 14 вируса гранулеза яблонной плодожорки (Cydia pomonella granulovirus (CpGV)), депонированный в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под регистрационным номером V-986.
Происхождение заявляемого штамма BZR 14.
Вирус гранулеза яблонной плодожорки BZR 14 выделен в лаборатории создания микробиологических средств защиты растений и коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений», г. Краснодар, из гусениц, собранных в яблоневом саду учебно-опытного хозяйства «Кубань» ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина», г. Краснодар. Сбор гусениц осуществлен с помощью ловчих поясов 13.08.2019 г. Со времени выделения исходного изолята до времени патентования штамм BZR 14 последовательно прошел 1 пассаж на гусеницах природной популяции яблонной плодожорки С. pomonella L., 1 пассаж на гусеницах лабораторной популяции яблонной плодожорки С. pomonella L., 2 пассажа на гусеницах лабораторной популяции большой восковой моли (БВМ) Galleria mellonella L., через пероральное заражение.
Идентификация штамма осуществлялась на основе сравнительной оценки формы, размеров и плавучей плотности вирусных телец-включений в суспензии и в полученном урожае после инкубации на насекомом-накопителе, в качестве которого выступала большая восковая моль.
Морфологическое описание. Изучение морфологии вирусных гранул проводили с помощью световой оптической микроскопии с использованием компьютерных программ ZEN 2012, Axio Vision Rel. 4.8. Для этого микроскопировали мазок вирусной суспензии на предметном стекле, который был предварительно окрашен по методике О.И. Швецовой (Митрофанов В.Б., Смирнов О.В., 1998). Размеры гранул (мкм): 0,6-0,9. Оптимальной культурой насекомых для культивирования штамма являются гусеницы средних возрастов из лабораторных популяций яблонной плодожорки С. pomonella L. и большой восковой моли G. mellonella L.
8
Штамм обладает следующей репродукционной активностью: выход вируса составляет 5×10 гранул/мл при его культивировании на личинках большой восковой моли G. mellonella L. 3-4 возрастов.
Не патогенен для теплокровных животных. Высокопатогенен для гусениц яблонной плодожорки С. pomonella L.
Культивирование вируса. Штамм бакуловируса BZR 14 размножают путем инокуляции суспензии из вирусных телец-включений в порцию искусственной питательной среды (ИПС) и скармливают либо гусеницам яблонной плодожорки 2-3 возраста, либо гусеницам большой восковой моли 3-4 возраста. Зараженных насекомых инкубируют при +25-27°С и влажности 60% (БВМ) или при +25-26°С и влажности 70-80% (ЯП). Сбор наработанных личиночных эквивалентов вирусного штамма производят по мере гибели объектов - обычно через 4-5 суток в течение 10-15 дней. Состав ИПС при использовании яблонной плодожорки: агар-агар - 12 г, кукурузная мука - 45 г, отруби пшеничные - 45 г, солодовые ростки - 54 г, соевая мука - 40 г, аскорбиновая к-та - 5,4 г, лимонная кислота - 4,5 г, сорбиновая кислота -0,81 г, формалин 20% - 4,5 мл; все компоненты смешиваются и разводятся водой до получения 1 кг ИПС (Митрофанов В.Б., 1990). Состав ИПС при использовании большой восковой моли: отруби пшеничные - 210 г, мука пшеничная - 80 г, молоко сухое - 40 г, дрожжи сухие - 65 г, воск - 40 г, мед -50 г, глицерин - 50 мл + вода - 50 мл (ГОСТ 21108-75).
Вирус инактивируется под действием УФ-лучей и нагревания до +60-70°С.
Серологические свойства
Белки гранул являются хорошими антигенами. При передаче другим насекомым белки гранул, образуемых данным вирусом у других насекомых серологически идентичны.
Условия длительного хранения штамма. Лиофильное высушивание и дальнейшее хранение при минус 70°С. Хранение в погибших гусеницах, помещенных в 70% водный раствор глицерина при минус 70°С.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Технология получения суспензии штамма BZR 14.
Технология получения вирусов гранулеза in vivo осуществляется по следующей схеме: выращивание насекомых, культивирование в них вирусов, сбор погибших гусениц, выделение вирусной биомассы и очистка телец-включений.
8
8
Отродившихся из яиц гусениц большой восковой моли доращивают до 3-4 возраста и инфицируют вирусом гранулеза яблонной плодожорки (штамм BZR 14). Для этого ИПС в чашках Петри (ЧП) опрыскивают водной суспензией штамма BZR 14 из расчета 1 мл суспензии на 1 г среды (титр суспензии 4,2×10 полиэдров/мл) и скармливают гусеницам большой восковой моли, которых помещают в ЧП по 10 шт. в каждой. Инфицированных таким образом гусениц большой восковой моли содержат при температуре +25-27°С и влажности 60%. Время инкубирования инфицированных гусениц 10-12 дней. Затем их собирают в стеклянную посуду, размельчают с помощью гомогенизатора. Полученный гомогенат фильтруют от остатков хитина, добавляют воду из расчета 1 мл воды на 1 личиночный эквивалент насекомого и хранят при температуре +5-10°С в закрытой таре не более одного года. Для очистки вируса массу центрифугируют на глицериновой подушке с использованием 75%-ного глицерина. Центрифугирование осуществляется при 8000 об./мин в течение 30 мин. Полученную в верхней части пробирки суспензию собирают дозатором и используют для дальнейших манипуляций (Колосов А.В., 2011). Титр вирусов в полученной суспензии составляет не менее 1×10 гранул/мл. Титр суспензии определяется с помощью камеры Горяева.
Пример 2. Сравнительные данные инсектицидной активности заявляемого штамма BZR 14 с эталонным препаратом Фермовирин ЯП, СПи коллекционным штаммом BZRL-7.
Для получения сравнительных данных измеряли и сравнивали инсектицидную активность штамма BZR 14, штамма BZRL-7 из Биоресурсной коллекции ФГБНУ ВНИИБЗР «Государственная коллекция энтомоакарифагов и микроорганизмов» и эталона, в качестве которого выступал коммерческий препарат Фермовирин ЯП, СП (действующее вещество штамм вируса гранулеза яблонной плодожорки), на гусеницах 3 возраста целевого объекта (С. pomonella L.) и на гусеницах 4-5 возраста тест-объекта (G. mellonella L.). В контрольном варианте использовали воду.
Для этого гусеницам скармливали ИПС, однократно обработанную вирусной суспензией или водой, и в ходе эксперимента подсчитывали количество погибших особей насекомых. Замену среды не производили (Ахмедова З.Ю., Хашимова М.Х., Хамраев А.Ш. и др., 2015). Математическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартных компьютерных программ (Microsoft Excel). Данные приведены в таблице.
Сравнительный анализ инсектицидного действия заявляемого штамма и штаммов-аналогов
Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый штамм BZR 14 патогенен для гусениц яблонной плодожорки, его эффективность превышает эталонный препарат Фермовирин ЯП, СП на 15% и составляет 86%.
Таким образом, штамм вируса гранулеза яблонной плодожорки С. pomonella L. BZR 14 является новым, с высокой инсектицидной активностью по отношению к гусеницам яблонной плодожорки и в перспективе может быть использован для разработки энтомопатогенного препарата с целью расширения ассортимента биологических средств защиты растений.
Источники информации
1. Юрченко Е.Г., Подгорная М.Е., Прах С.В., Черкезова С.Р. Эффективность микробиологических инсектицидов в контроле доминирующих вредителей садов и виноградников / Научные труды СКФНЦСВВ. - 2018. Том 15. С. 91-100.
2. Митрофанов В.Б. Смирнов О.В. Энтомопатогенные вирусы в защите растений. Производство экологически безопасной продукции растениеводства / под ред. Е.П. Угрюмова - Пущино, 1998, 253 с.
3. Колосов А.В. Разработка и испытание вирусных энтомопатогенных препаратов для защиты растений: дис. канд. биол. наук / Колосов, Алексей Владимирович. - Кольцево, 2011. 131 с.
4. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2019 год. Министерство сельского хозяйства Российской Федерации (Минсельхоз России).
5. Ахмедова З.Ю., Хашимова М.Х., Хамраев А.Ш., Рустамов К.Ж., Колосов А.В. Бакуловирусный препарат вирин хек против хлопковой совки / Защита и карантин растений. - 2015. №1. С. 51-52.