Методические возможности оценки активации лимфоцитов in vitro

ИММУНОПАТОЛОГИЯ и КЛИНИЧЕСКАЯ иммунология

in hereditary hearing loss. Vestnik otorinolaringologii. 2009; 1: 34-6. (in Russian).

6. Dzhemilyoeva L.U., Posukh O.L., Tazetdinov A.M. et al. Analysis of genes 12SrRNA и tRNASer(UCN) mtDNA in patients with nonsyndromic sensorineural hearing loss from different regions of Russia. Genetika. 2009; 7: 982-91(in Russian).

7. Egorov VI. Lazareva L.A., Hanferyan R.A. Immunologic aspects of sudden sensorineural hearing loss. Russian otorinolar-yngology. 2010; 6(49): 77-82 (in Russian).

8. Egorov V.I. Lazareva L.A. State of adaptive immunity in patients with acute sensorineural hearing loss. Russiyskaya otorhinolar-ingologiya. 2010; 6(49): 20-5 (in Russian).

9. Buniel M.C., Geelan-Hansen K.,Weber P.C. Immunosuppressive therapy for autoimmune inner ear disease. Immunotherapy. 2009; 1(3): 425-34.

10. Pham B.N., Rudic M., Bouccara D. et al. Antibodies to myelin protein zero (P0) protein as markers of auto-immune inner ear diseases. Autoimmunity. 2007; 40(3): 202-07.

11. Bonaguri C., Orsoni G., Zavota L. et al. Anti-68 kDa antibodies in autoimmune sensorineural hearing loss: are these autoantibod-

ies really a diagnostic tool? Autoimmunity. 2007; 40(1): 73-8.

12. Tomasi J.P., Lona A., Deggouj N. et al. Autoimmune sensorineural hearing loss in young patients: an exploratory study. Laryngoscope. 2001; 111(11): 2050-53.

13. Yehudai D, Shoenfeld Y, Toubi E. The autoimmune characteristics of progressive or sudden sensorineural hearing loss. Autoimmunity.. 2006; 39(2): 153-58.

14. Passali D. V., Damiani H., Mora R. et al. P0 antigen detection in sudden hearing loss and Meniere’s disease: a new diagnostic marker? Acta Otolaryngol. 2004; 124(10): 1145-48.

15. Fuse T., Hayashi T., Oota N. Immunological responses in acute low-tone sensorineural hearing loss and Meniere’s disease. Acta Otolaryngol. 2003; 123(1): 26-31.

16. Bovo R., Ciorba A., Martini A. The diagnosis of autoimmune inner ear disease: evidence and critical pitfalls. Eur. Arch. Otorhi-nolaryngol. 2009; 266(1): 37-40.

17. Ruckenstein M.J. Autoimmune inner ear disease. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 2004; 12(5): 426-30.

Поступила 02.09.13 Received 02.09.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 612.112.94.083

Семикина Е.Л., Родионова Т.В., Закиров Р.Ш., Филянская Е.Г., Маянский Н.А.

методические возможности оценки активации лимфоцитов in VITRO

ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН РФ, 119991, г. Москва

В работе представлены результаты оценки активации мононуклеаров периферической крови (МПК) тремя современными методами, определенными в одних и тех же пробах клеточных культур у здоровых доноров на 1, 3, 7-е сутки инкубации in vitro. изучали экспрессию мембранных маркеров клеточной активации методом проточной цитофлюорометрии, концентрацию цитокинов в культуральной среде методом мультиплексного анализа, пролиферацию стимулированных клеток с помощью красителя CyQuant с последующим определением количества ДНК. При оценке экспрессии поверхностных маркеров CD69, CD71, CD95 (Fas/Apo-1), CD154 (CD40L), CD25, HLA-DR на T-лимфоцитах/хелперах с фенотипом CD3+CD4+CD45+ в ответ на стимуляцию ФгА выявили, что для всех без исключения маркеров экспрессия значимо повышалась по сравнению с таковой в контроле, но время достижения максимального уровня экспрессии оказалось разным для каждого из них. При исследовании продукции цитокинов мы зарегистрировали синтез всех показателей через 24 ч, в том числе в условиях спонтанного культивирования. индекс стимуляции после 3 сут инкубации возрастал у большинства цитокинов (интерлейкин (IL)-2, IL-4, IL-6, интерферон-у (IFNy), фактор некроза опухоли а, гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) более чем в 2-4 раза. При увеличении срока инкубации отметили, что индекс стимуляции к 7-м суткам снижался для большинства цитокинов, но оставался высоким для IL-6, GM-CSF и IFNy. Пролиферативная активность МПК через 1 сут возрастала более чем в 2 раза (иС = 2,5). Наибольшую активность наблюдали через 3 сут (иС = 5,89). Через 7 сут инкубации она снижалась (иС = 1,7). Представленные методы могут быть полезны для оценки ответа лимфоцитов на воздействие различными агентами in vitro.

Ключевые слова: активация лимфоцитов; проточная цитофлюориметрия; bio-plex.

SemikinaE.L., Rodionova T.V., ZakirovR.S., FilyanskayaE.G., Mayanskiy N.A.

METHODICAL POSSIBILITIES OF EvALUATING THE ACTUATION OF LYMPHOCYTES IN VITRO

Scientific Center Children’s Health, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

The paper presents estimates of the activation of peripheral blood mononuclear three modern methods defined in the same samples of cell cultures of healthy donors on 1st, 3rd, 7th day incubation in vitro.

Determined the expression of membrane markers of cell activation by flow of cytofluorometry, the concentration of cytokines in the culture medium by the method of a multiplex analysis, the proliferation of stimulated cells by dye CyQuant with subsequent determination of the amount of DNA. When evaluating the expression of surface markers CD69, CD71, CD95 (Fas/Apo-1), CD154 (CD40L), CD25, HLA-DR on T-lymphocytes/hellers phenotype CD3+CD4+CD45 in response to stimulation of PHA, it was found that for all markers expression level was significantly increased compared with the control, but the time to reach the maximum level of expression was different for each of them. In the study of cytokine production we registered synthesis of all investigated parameters in 24 hours including in the conditions of spontaneous cultivation. Stimulation index after 3 days of incubation increased in most determined of cytokines (IL-2, IL-4, IL-6, INF-y, TNF-a, GM-CSF) more than 2-4 times. When increasing the incubation period we noted that the stimulation index to 7 days decreased for most of cytokines, but remained high for IL-6, GM-CSF and INF-y. Proliferative activity of blood lymphocytes through the day grew more than 2 times (IP = 2,5). The greatest activity was noted in 3 days (IP = 5,89). After 7 days of incubation it decreased (IP = 1,7). The methods can be useful to evaluate the response of lymphocytes to the impact of various agents in vitro.

Key words: activation of lymphocytes; flow cytofluometry; bio-plex.

Семикина Елена Леонидовна, д-р мед. наук, зав. централизованной клинико-диагностической лабораторией НЦЗД РАМН, 119991, Москва, Ломоносовский проспект, д. 2, т. 499-134-03-59, el-mail: semikinaelena@yandex.ru

- 85 -

ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2014

Введение. Используемые в настоящее время в клинической лабораторной диагностике методы определения активности иммунного ответа в основном позволяют оценить показатели гуморального иммунитета, в первую очередь уровень иммуноглобулинов разных классов, в том числе специфических к различным инфекционным агентам. Методы оценки клеточных иммунных реакций применяют в рутинной диагностике гораздо реже. Это связано с трудоемкостью и значительной вариабельностью результатов активации лимфоцитов в культуре, что в первую очередь объясняется недостаточной разработанностью методик оценки активации. В последнее время в практической лабораторной диагностике появились высокотехнологичные методы, позволяющие стандартизованно изучить процессы активации клеток иммунной системы in vitro и таким образом расширить рутинное применение тестов, оценивающих клеточные иммунные реакции. Данные лабораторные методики выбраны как наиболее стандартизованные и удобные для клинического использования.

Материалы и методы. Исследовали гепаринизированную венозную кровь 6 здоровых взрослых добровольцев (1 мужчина и 5 женщин), каждую пробу исследовали параллельно тремя методами.

Активация клеток in vitro. Мононуклеары периферической крови (МПК) выделяли на одноступенчатом градиенте плотности фиколла (удельный вес 1,077 г/см3) (ООО «ПанЭко», Россия), отмывали двукратно избытком среды RPMI-1640 (Gibco, Invitrogeh, Sigma, США). Далее взвесь МПК разбавляли средой RPMI-1640 до конечной концентрации 1 • 106 клеток/мл и оценивали жизнеспособность с использованием автоматического счетчика и анализатора жизнеспособности клеток (ТС-10, Bio-Rad, США) в соответствии с методикой производителя. Жизнеспособность составила не менее 95%. Клетки культивировали в 96-луночных плоскодонных планшетах по 200 мкл клеточной суспензии в лунку в среде RPMI-1640 с добавлением 2% фетальной инактивированной телячьей сыворотки 10%, L-глютамина (0,3 мг/мл) и гентамицина (20 Ед/мл) при 37оС во влажной атмосфере, содержащей 5% СО В качестве стимулятора использовали добавление ФГА (Sigma, США) в конечной концентрации 5 мкг/мл. Контрольные культуры инкубировали в отсутствие митогена. Длительность инкубации составила 1, 3 и 7 сут, по окончании инкубации культуры центрифугировали и супернатанты собирали для последующего определения концентрации

Активационные маркеры

100 -| 100 и

80- 80-

Е

>%

+о 60- 60-

,о

+о

° 40- ° о- ' 40-

£

20- 20 -

=

0 ^ Lai—г-р 1 1 1 у— оJ

1-е 3-и 7-е 1-е 3-и 7-е

Контроль РИА

CD69 -о- CD71 - о- CD95 ->У- - CD154

CD25 HLA-DR

Рис. 1. Уровень экспрессии мембранных маркеров активации на Т-лимфоцитах/хелперах с фенотипом CD4+CD3+CD45+ у здоровых доноров в контроле и в ответ на стимуляцию ФГА на 1-е, 3-и, 7-е сутки. Здесь и на рис. 2, 3: по оси абсцисс - время инкубации, в сут.

цитокинов, осажденные клетки использовали для оценки активации и пролиферации.

Оценка продукции цитокинов на анализаторе Bio-Plex 200 (Bio-Rad, сША). Супернатанты в количестве 150 мкл собирали и хранили при температуре -70оС. Концентрацию цитокинов оценивали методом мультиплексного анализа на 2-лучевом лазерном автоматическом анализаторе (Bio-Plex 200, Bio-Rad, США), используя коммерческие тест-системы в соответствии с методикой производителя; рабочий диапазон концентраций от 1 до 32 000 пкг/мл. Определяли концентрацию следующих цитокинов: интерлейкина (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора (GM-CSF), интерферона-у (INFy), фактора некроза опухоли a (TNFa). Концентрацию исследуемых цитокинов устанавливали по стандартным калибровочным разведениям с помощи программного обеспечения Bio-Plex Manager 5.0. Индекс стимуляции (ИС) рассчитывали как отношение продукции цитокинов в культуре стимулированных клеток к продукции цитокинов в культуре нестимулированных клеток.

Оценка экспрессии мембранных антигенов активации. проточная цитофлюорометрия. Оценивали процент Т-лимфоцитов/хелперов с фенотипом CD4+CD3+CD45+, эк-прессирующих следующие поверхностные маркеры: CD69, CD71, CD95 (Fas/Apo-1), CD154 (CD40L), CD25, HLA-DR - с использованием соответствующей панели антител, меченных флюорохромами FITC, PE, PerCP, Pe-Cy7 (Becton Dickinson, США). Фенотип лейкоцитов определяли методом проточной цитофлюорометрии на цитофлюорометре BD canto II (Bec-ton Dickinson, США). В каждом образце анализировали не менее 10 000 клеток. Особенности фенотипа исследовали после предварительного гейтирования СD45+-клеток (лимфоциты). Анализ проводили в программе BD FACSDiva v.6 (Becton Dickinson, США).

Оценка пролиферации клеток с помощью красителя

cyQuant. Для определения количества ДНК планшеты с клеточной культурой замораживали при -700С; для каждой временной точки использовали свой планшет. Использовали методику и реагенты CyQuant Cell Proliferation Assay Kit, Molecular Probes (США) в соответствии с инструкциями производителя. После размораживания среду удаляли путем промокания и клетки лизировали в буфере для лизиса, содержащем зеленый флюоресцентный краситель CyQuant GR, который связывается с нуклеиновыми кислотами. Количество связавшегося красителя определяет интенсивность полученной флюоресценции, которая таким образом пропорциональна количеству нуклеиновой кислоты в пробе. Образцы инкубировали в течение 5 мин в отсутствие света, после чего определяли флюоресценцию образца на микропланшетном

Рис. 2. Продукция МПК цитокинов в ответ на стимуляцию ФГА (5 мкг/мл) на 1-е, 3-и, 7-е сутки инкубации.

Показатели представлены в виде ИС, который рассчитывали как отношение концентрации цитокинов в стимулированной ФГА культуре клеток к контрольной.

Здесь и на рис. 2: по оси ординат - ИС (в усл. ед.).

- 86 -

ИММУНОПАТОЛОГИЯ и КЛИНИЧЕСКАЯ иммунология

Су QUANT Cell proliferation Assay

Рис. 3. Пролиферативный ответ в ответ на стимуляцию ФГА (5 мкг/ мл) на 1-е, 3-и, 7-е сутки инкубации (ИС).

ридере Infinite m200 (Tecan, Aвстрия) при длине волны 480 нм и излучении при 520 нм. Количество нуклеиновой кислоты в каждом образце вычисляли по стандартной кривой, построенной с использованием известных концентраций. Для оценки пролиферативной активности мононуклеарных клеток (МНК) индекс стимуляции (ИС) рассчитывали как отношение индуцированной пролиферации в присутствии ФГА к спонтанной пролиферации (культура без стимулятора).

Полученные данные статистически обрабатывали с помощью пакета «Statistica 6.0» (StatSoft, США). Данные представлены в виде медианы (Me) и интерквартильных диапазонов (Q1-Q3).

Результаты и обсуждение. При оценке экспрессии поверхностных маркеров QD69, CD71, cD95 (Fas/ Apo-1), cD154 (GD40L), cD25, HLA-DR на t-лимфоцитах/ хелперах с фенотипом QD3+cD4+cD45+ в ответ на стимуляцию Т-митогеном ФГА выявили, что для всех без исключения маркеров экспрессия значимо повышалась по сравнению с таковой в контроле, но время достижения максимального уровня экспрессии оказалось разным для каждого из них (рис.1), что известно из экспериментальных исследований [1]. Для маркера ранней активации QD69 это время составило 1 сут, для остальных рецепторов - 3 сут (см. таблицу).

Оценка экспрессии рецептора CD69 наиболее информативна для начальных этапов активации, так как этот антиген, являясь молекулой костимуляции для Т-клеточной активации и пролиферации, участвует в активации генов, ответ-

ственных за синтез IL-2, и сигналы, поступающие с CD69, вызывают увеличение как продукции этого цитокина, так и количества рецепторов к нему на клетках (CD25+ - a-цепь рецептора IL-2) [2,3]. IL-2, синтезируемый преимущественно Т-лимфоцитами, необходим для пролиферации Т-хелперов, Т-супрессоров, Т-киллеров. Активация Т-лимфоцитов сопровождается синтезом ими IL-2 и повышением экспрессии CD25, что ведет к дальнейшей ауто- и паракринной стимуляции иммунного ответа. Активация лимфоцитов сопровождается экспрессией комплекса маркеров, в числе которых антиген II класса большого комплекса гистосовместимости HLA-DR, характеризующий относительно поздние этапы активации лимфоцитов, а также рецептор трансферрина CD71, который появляется на пролиферирующих лимфоцитах. Однако, как было показано ранее [1], по уровню экспрессии de novo рецептора IL-2 CD25, а также CD71 и HLA-DR точно оценить цитокиновый и пролиферативный ответ нельзя, можно лишь косвенно судить о его уровне, и для оценки пролиферативной и цитокинпродуцирующей активности необходимо применение других методов.

С клинической точки зрения наиболее информативным для оценки активации иммунной системы и интенсивности воспалительных реакций должно быть непосредственное определение уровня цитокинов в крови у пациента. Однако существенным недостатком определения концентрации цитокинов в сыворотке крови являются короткий период их жизни и способность быстро связываться с различными сывороточными белками, что значительно снижает значимость измерения их уровня. Учитывая это, мы выбрали для исследования метод определения концентрации цитокинов в культуре МНК периферической крови, культивируемых как без стимуляции, так и со стимуляцией ФГА. Достоинствами мультиплексного метода определения концентрации цитокинов являются не только возможность стандартизации и точность измерения большого количества аналитов в минимальном объеме материала, но и широкий диапазон определяемых концентраций. Диагностические возможности мультиплексной технологии лучше всего изучены при септических состояниях и инфекционно-воспалительных заболеваниях разной этиологии [4-6]. Возможности метода в оценке специфических клеточных иммунных реакций менее изучены и вызывают в настоящее время большой интерес, так как именно мультиплексный анализ потенциально информативен для регистрации ответа иммунизацию [7].

При исследовании продукции цитокинов in vitro мы заре-

Экспрессия маркеров активации на T-лимфоцитах/хелперах CD3+CD4+CD45+

Маркер Время инкубации, сутки

1 е 3 и 7 е

контроль PHA контроль PHA контроль PHA

CD69 Me 0,6 57,4 0,6 54,0 6,0 20,8

Q1-Q3 0,4 1,5 40,7 89,2 0,4 1,8 41,5 64,6 0,3 2,0 19,4 34,2

cD71 Me 0,9 31,3 1,0 91,6 1,7 60,8

Q1-Q3 1,6 1,3 18,6 64,8 0,6 1,6 83,3 99,2 1,2 2,1 57,6 74,2

cD95 Me 44,2 42,7 41,0 97,6 48,0 98,8

Q1-Q3 39,1 54,2 34,5 59,0 33,2 54,7 97,1 100,0 34,8 68,5 98,5 99,4

cD154 Me 1,0 4,2 0,6 4,5 1,7 1,5

Q1-Q3 0,9 1,0 2,3 14,0 0,4 1,5 2,3 18,1 1,2 2,5 1,4 2,2

cD25 Me 8,0 35,4 7,5 94,2 9,7 90,3

Q1-Q3 6,0 9,6 26,4 78,3 6,7 12,5 93,2 97,0 8,6 13,0 82,5 98,1

HLA-DR Me 8,6 50,1 7,2 71,8 7,2 41,4

Q1-Q3 7,4 10,8 49,9 50,6 4,7 13 54,6 84,0 4,7 13,0 34,1 57,8

Примечание. Уровень экспрессии (медиана Me и интерквартильный диапазон Q1-Q3) поверхностных маркеров активации (CD69, CD71, CD95, CD154, CD25, HLA-DR) на T-лимфоцитах/хелперах CD3+CD4+CD45+ здоровых доноров в контроле и в ответ на стимуляцию ФГА (5 мкг/мл) на 1-е, 3-и, 7-е сутки (подчеркнуты максимальные значения уровня экспрессии маркера).

- 87 -

ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2014

гистрировали синтез всех исследованных медиаторов через 24 ч даже в условиях спонтанного культивирования. Вероятно, запуск активной продукции цитокинов в нестимулированных культурах МНК реализуется через механизмы ауто- и паракринной регуляции. Сравнительный анализ спонтанной и индуцированной продукции цитокинов у здоровых доноров представлен в таблице. Пик продукции большинства цитокинов приходился на более поздние сроки. ИС после 3 сут инкубации возрастал у большинства определяемых цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, INFg, TNFa, GM-CSF) более чем в 2-4 раза.

При увеличении срока инкубации отметили, что к 7-м суткам ИС снижался для большинства цитокинов, но оставался высоким для IL-6, GM-CSF и INFg. Выявленные изменения ИС представлены на рис. 2. Изменения в динамике продукции цитокинов в стимулированных культурах подтверждают, что клетки крови у здоровых доноров функционально полноценны в течение 24-72 ч культивирования [4], а для некоторых цитокинов и в течение более длительного времени.

Значительный эффект стимуляции наблюдали в продукции IL-8, который превышал определяемую флюоресценцию как при спонтанной, так и при индуцированной продукции цитокинов. Известно, что спонтанная продукция IL-8 in vitro значительно выше, чем у других цитокинов [8]. В данной серии исследований для выявления оптимального времени регистрации клеточного ответа мы применяли сильный митоген (максимальная стимуляция) и получили при этом сверхвысокие концентрации IL-8 в культуральной жидкости, для характеристики которых условно приняли концентрацию более 80 000 пкг/мл. Высокая спонтанная и индуцированная продукция IL-8, вероятно, снижает точность оценки ИС при использовании сильных митогенов в эксперименте, но в практической диагностической работе при оценке активации в ответ на более слабые стимулы (например, бактериальные или вирусные антигены) определение уровня именно этого цитокина может иметь преимущественную информативность.

Для оценки пролиферативной активности клеток предложили несколько методов: подсчет живых клеток, неокрашивающихся трипановым синим до и после культивирования; определение активности клеточных метаболических ферментов, коррелирующей со степенью пролиферации; определение ДНК-делящихся клеток с помощью различных ядерных красителей. С нашей точки зрения, метод оценки по включению связывающегося с нуклеиновыми кислотами флюоресцентного красителя CyQuant оптимален, так как сочетает достаточную точность и информативность с практическим удобством выполнения исследований. Оцененная с помощью этого метода пролиферативная активность моно-нуклеаров крови в культуре после стимуляции ФГА через 1 сут возрастала более чем в 2 раза (ИС = 2,5). Наибольшая активность отметили через 3 сут (ИС = 5,89). Через 7 сут инкубации она снижалась (ИС = 1,7) (рис. 3).

Таким образом, мы отметили, что при культивировании МПК in vitro со стимуляцией ФГА экспрессия антигенов активации на Т-лимфоцитах/хелперах, пролиферативная активность клеток и продукция цитокинов хорошо согласуются между собой, давая отчетливую картину активации после 3 сут инкубации. Именно в этой точке исследования мы наблюдали высокие ИС. При более длительном сроке инкубации картина активации снижается по ряду показателей, что позволяет считать инкубацию культуры мононуклеаров в течение 3 сут оптимальной для применения в практической диагностической работе.

С нашей точки зрения, определение экспрессии мембранных маркеров клеточной активации, ИС синтеза цитокинов

и ИС пролиферативного ответа, проведенное с помощью описанных методов, дает широкие возможности для оценки функциональных резервов клеток иммунной системы и может быть успешно использовано в исследовательской и диагностической работе.

ЛИТЕРАТУРА

1. Caruso A., Licenziati S. et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 1997; 27: 71-6.

2. Testi R., D’Ambrosio D., De Maria R., Santoni A. The CD69 receptor: a multipurpose cell-surface trigger for hematopoietic cells. Immunol. Today. 1994; 15 (10): 479-83.

3. Marzio R., Mauol J., Betz-Corradin S. CD69 and regulation of the immune function. Immunopharmacol. and Immunotoxicol. 1999; 21 (3): 565-82.

4. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и патологии. Иммунология. 1997; 5: 7-14.

5. Железникова Г.Ф. Цитокины как предикторы течения и исхода инфекций. Цитокины и воспаление. 2009; 8 (1): 10-7.

6. Маянский Н.А, Мельничук О.С., Филянская Е.Г., Зиновьева А.Е., Куличенко Т.В. Мультиплексный анализ цитокинов у детей с фебрильными инфекциями. Вопросы диагностики в педиатрии. 2011; 3 4: 15-9.

7. Топтыгина А.П. Специфический Т-клеточный иммунный ответ: методы оценки. Вопросы диагностики в педиатрии. 2012; 4 (6): 5-10.

8. Коненков В.И., Ракова И.Г., Авдошина В.В., Гельфгат Е.Л. Комплексная оценка уровня спонтанной продукции цитокинов в культуре мононуклеарных клеток периферической крови здорового человека. Цитокины и воспаление. 2005; 4 (2): 33-7.

REFERENCES

1. Caruso A., Licenziati S. et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 1997; 27: 71-6.

2. Testi R., D’Ambrosio D., De Maria R., Santoni A. The CD69 receptor: a multipurpose cell-surface trigger for hematopoietic cells. Immunol. Today. 1994; 15 (10): 479-83.

3. Marzio R., Ma^l J., Betz-Corradin S. CD69 and regulation of the immune function. Immunopharmacol. and Immunotoxicol. 1999; 21 (3): 565-82.

4. Yarilin A.A. System of cytokines and principles of its functioning in norm and pathology. Immunologiya. 1997; 5: 7-14 (in Russian).

5. Zheleznikova G.F. Cytokines as predictors of course and outcome of infections. Tsitokiny i vospaleniye. 2009; 8 (1): 10-7 (in Russian).

6. Mayanskiy N.A., Melnichuk O.S., Filyanskaya E.G., Zinovieva A.E., Kulichenko T.V Multiplex analysis of cytokines in children with febrile infections. Voprosy dignostiki v pediatrii. 2011; 3 (4): 15-9 (in Russian).

7. Toptygina A.P. Specific T-cell immune response: methods of assessment. Voprosy diagnostiki v pediatrii. 2012; 4 (6): 5-10 (in Russian).

8. Konenkov VI., Rakova I.G., Avdoshina V.V., Gel’fgat E.L. Comprehensive assessment of the level of spontaneous cytokine production in the culture of peripheral blood mononuclear cells of healthy humans. Tsitokiny i vospaleniye. 2005; 4 (2): 33-7 (in Russian).

Поступила 23.03.13 Received 23.03.13

- 88 -