Апоптоз, индуцированный Канглайтом для инъекций, и его связь с экспрессией р53 и Bcl-2 в клеточной линии рака почки

_ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ_Щ

УДК616.61-006.6-092.419:577.24

APOPTOSIS INDUCED BY KLT INJECTION AND ITS RELATION WITH EXPRESSION OF P53, BCL-2 IN RENAL CANCER CELL LINES

Wang Junjei, Sun Xinchen, Shen Wenjiang Cancer Therapy Center of Beijing Medical University

ABSTH4CT

Purpose: To study the anticancer effect of KLT injection (К LT) on renal cancer cell lines (GRC-1). Methods: The inhibitive effect of KLT on GRC-1 was measured by MTT. Apoptosis was tested by TUNEL. The expression of p53 and Bcl-2 genes was determined by immunohisto-chemical staining. Results: KLT could inhibit the GRC-1 cell growth: the IC50 value was 19.31 ц1/т1. When it was exposed to 5 ц1/т1 and 10 (il/ml of KLT for 48 hours, the apoptotic percentages of renal cancer cell lines were 31,30 % and 89,76 % respectively, and it was less than 10% at the concentration of 15-20 ц1/т1. The expression level of bcl-2 gene was lowered significantly at the concentration of 5-20 ц1/т1 than that of the control group. Conclusion: KLT injection can induce apoptosis in renal cancer cells. It may increase the p53 gene expression but inhibits the Bcl-2 gene expression.

АПОПТОЗ, ИНДУЦИРОВАННЫЙ КАНГЛАЙТОМ ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ, И ЕГО СВЯЗЬ С ЭКСПРЕССИЕЙ Р53 И BCL-2 В КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ РАКА ПОЧКИ

Ват Джунджей, Сун Ксинчен, Шеи Венъянг Центр терапии рака Пекинского медицинского университета

РЕЗЮМЕ

Исследована противоопухолевая активность Канглайта для инъекций (КЛТ) на клеточной линии рака почки GRC-1. Ингнбируюшнй эффект КЛТ на клеточную линию рака почки выявляли с помощью МТТ теста. Апоптоз тестировали методом TUNEL. Экспрессию продуктов генов р53 и Bcl-2 определяли иммуногистохи-мическим методом. В результате исследования было доказано, что КЛТ ингибирует рост клеток рака почки линии GRC-1. индуцирует их апоптоз, повышает экспрессию гена р53, ингибирует экспрессию гена Bcl-2.

Введение

Канглайт для инъекций (КЛТ) — новый противоопухолевый лекарственный препарат, экстрагированный из семян Коикса (Semen Coicis). Экспериментальные и клинические исследования показали его иигиби-рующее влияние на рост многих видов опухолей, но механизм этого действия пока ешедо Конца не изучен. В представленном исследовании была использована клеточная линия рака почки для изучения механизма противоопухолевого действия КЛТ, что дало возможность включить препарат в комбинированную терапию злокачественных новообразований.

Материалы н методы

J. Реактивы, клеточные культуры и оборудование. 10%-ньш раствор КЛТ и чистая контрольная эмульсия предоставлены Zhejiang Kanglaite Pharmaceutical Co. Ltd. 3-(4.5 диметил-2-тиазолнл)-2,5-дифенил-2Н тетра-золий бромистый (МТТ) производства Sigma Company

(США). Диметилсульфоксид (ДМСО) приобретен в Bowman Pharm Inc.(CÜJA).

Почечно-клеточная линия GRC-1 предоставлена Пекинским медицинским университетом. Клетки росли в культуральной среде RPMI-1640 с 15 %-ной сывороткой крупного рогатого скота при 37°С в инкубаторе с 5 % СО,.

Экспрессию антигенов определяли на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickson. США).

2. M TT тест. В каждую лунку 96-луночной платы помешали по 0,2 мл клеток в логарифмической фазе роста в концентрации 1х 107мл. Исследовали следующие группы: 1 ) контроль-инкубация клеток с физиологическим раствором; 2) экспериментальные группы — клетки с различными концентрациями КЛТ. В каждой группе было по 6 дублированных лунок. Клетки с препаратами инкубировали при 37°С в 5% СО, в течение 72 ч, затем добавляли МТТ ( рабочий раствор 5 мг/мл) по 10 мкл в каждую лунку за 4 ч до окончания эксперимента. Посте удаления культуральной среды добавляли 200

№3/том2/2003

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

68

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОГЕРА ПИЯ

мил ДМСО в каждую лунку и измеряли оптическую плотность на спекрофотометре при длине волны 570 нм. Коэффициент ннгибирования роста опухолевых клеток рассчитывался по формуле:

Средняя ОП экспсрименталь-

Коэффиииент , ной группы

1 — i < V 1 rtf) о /

ннгибирования. '» Средняя ОП контрольной

группы

50 %-ную ингибирующую концентрацию (1С5;1) лекарственного препарата рассчитывали логарифмическим графическим методом.

3. Оценка апоптоза методом TUN EL и метод n\t-мунофлуоресцентного окрашивания. Линию клеток рака почки культивировали стандартным образом. К монослою клеток добавляли КЛТ в концентрациях 0; 5; 10: 15 и 20 мкл/мл соответственно. Клетки продолжали культивировать в течение 48 ч, затем их снимали с поверхности, дважды отмывали PBS, доводили до концентрации 1х 10* клеток/мл и фиксировали 5 %-ным формальдегидом в течение 15 мин. после чего снова отмывали PBS. К 50 мкл клеток добавляли раствор TUNEL, инкубировали 1 ч при 37° С на водяной бане, отмывали один раз PBS. добавляли 20 мкл пропидиум нодита и оставляли при комнатной температуре на 30 мин. Затем клетки анализировали на проточном флуороцнтометре.

4. Илшуногистохимический аиашз. Клетки в логарифмической фазе роста обрабатывались 10 мкл/мл КЛТ или чистой контрольной эмульсией в течение 48 ч. затем их снимали с поверхности флаконов. Для приготовления мазков клетки помещали во влажный бокс при 37°С на 5 ч. дважды отмывали PBS и фиксировали холодным ацетоном в течение 15 мин. Для оценки экспрессии использовали SPTM test box. монокло-нальные антитела против р53 и Вс!-2. Экспрессию продуктов генов оценивали по интенсивности окрашивания. Желто-коричневое окрашивание ядра свидетельствовало о позитивной экспрессии гена р53; желтое окрашивание цитоплазмы указывало на позитивную экспрессию Вс1-2. Подсчет клеток проводили в 5 полях при увеличении "400. Высчитывали индекс окрашивания (НО) по формуле:

Количество положительных клеток ИО= -—- х 100.

Обшее количество клеток

Результаты н обсуждение

Изучение ингибирующего действия КЛТ на клетки линии GRC-1. происшедшей из почечно-клеточно-го рака, проведенное в МТТ-тесте. показало, что КЛТ может угнетать рост клеток линии GRC-1. При инкубации клеток с препаратом в течение 48 ч коэффициент ннгибирования (IC50) был равен 19.31 мкл/мл.

Исследование влияния КЛТ на индукцию апоптоза в клетках линии GRC-1 TUNEL-методом показало, что после воздействия КЛТ в течение 48 ч. часть клеток входит в апоптоз. Эффект был дозозависимым. КЛТ в концентрации 5 мкл/мл индуцировал апоптоз 31,30 %, а при увеличении дозы до 10 мкл/мл процент позитивных клеток составлял 89,76%. В контрольной группе апоптоз был зарегистрирован в 1,02 % клеток. Однако

когда дозу КЛТ увеличили до 15 и 20 мкл/мл, процент апоптотнческих клеток составил 1,76 % и 8 % соответственно. В сравнении с контрольной группой — это незначительная разница.

Было изучено влияние КЛТ на экспрессию продуктов генов р53 и Вс1-2 в клетках ОЯС-1. Контрольные клетки не содержали р53 см. таблицу. В клетках ОЯС-1. культивированных в присутствии 10 мкг/мл КЛТ. обнаружили 16,8 % клеток, реагирующих с монокло-нальными антителами против р53.

Влиянне КЛТ на экспрессию р53 и Вс1-2 в клетках линии GRC-1

Маркер Процент антигенположитсльных клеток

Контрольная эмульсия КЛТ

р53 0,00±0,00 16,80±3,77

Вс1-2 25,00±2,67 6,60±2,30

Необработанные клетки GRC-1 экспрессировалн Вс1-2 на уровне 25 %. Моноклональные антитела окрашивали цитоплазму клеток. Инкубация клеток в присутствии 10 мкг/мл КЛТ снижала экспрессию Bcl-2 до 6 % (см. таблицу). Эффект был дозозависимым.

Результаты химиотерапии у 87 % больных раком почки не удовлетворительны из-за экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости.

Апоптоз, или программированная клеточная смерть, происходит в результате расщепления хроматина ДНК активированными эндонуклеазами на фрагменты по 200 bp, хорошо регистрируемыми по «ДНКо-вой лестнице» на электрофорезе [1]. Более современный метод регистрации апоптоза — метод TUNEL, в котором фрагменты ДНК с помощью концевой диок-ашуклеотидил-трансферазы (TdT) метятся FITC-dUTR [2]. Этот метод высокочувствителен и специфичен, он может показывать количество клеток, находящихся в апоптозе, а также отличать апоптоз от некроза.

В предыдущих исследованиях было показано, что КЛТ обладает заметной цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток как in vivo, так и in vitro. Изучите влияния на клеточный цикл показало. что КЛТ замедляет рост клеток в G.+M фазе клеточного цикла и уменьшает фазу синтеза клеточной ДНК (S-фаза). Отмечено [3], что КЛТ в концентрации 10 мкл/мл вызывает апоптоз клеток К-562. происшедших из эритробластного варианта хронического миелоидного лейкоза, после воздействия в течение 6 ч. Увеличение апоптотнческих клеток при увеличении дозы КЛТ было зарегистрировано с помощью пропидиум иодита, однако также было отмечено и увеличение количества некротических клеток. Изучение апоптоза на клетках человеческого рака тонкой кишки линии SW1116 с помощью TUN'EL-ме-тода показало, что КЛТ в дозе 10 мкл/мл может индуцировать апоптоз.

Мы обнаружили значительный ингибируюший эффект на пролиферацию клеток линии GRC-1 рака поч-

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

№3/том2/2003

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ

ки после инкубации с КЛТ. 1С. был равен 19,3 мкл/мл. Индуцируемый КЛТ апоптоз составил 31,3 % и 89,76 % при дозе КЛТ 5 мкл/мл и 10 мкл/мл соответственно. Дальнейшее увеличение дозы КЛТ вызвало снижение числа апоптотических клеток, очевидно, увеличивая число некротических клеток. Следовательно, индивидуальный выбор дозы КЛТ может дать важный терапевтический эффект при комбинированном лечении опухолей с химио- и радиотерапией.

Дикий тип гена р53 (ир 53) контролирует пролиферацию и трансформацию клеток, давая сигнал к апоп-тозу при серьезных нарушениях в процессе клеточного цикла. Сигнал клеточного повреждения может вызвать увеличение уровня транскрипции \vp53. увеличение экспрессии р21. которая ингибирует активность СОК, задерживает клеточный цикл в фазах в/Б. Клетка или исправляет нарушения, или вступает в процесс программированной клеточной смерти. В нашем исследовании мы показали, что КЛТ влияет на регулирующее действие р53, усиливая экспрессию дикого типа р53. которая содействует индукции апоптоза.

Вс1-2 — антиапоптотический ген. ингнбируюший апоптоз. Противоопухолевая активность многих хи-миотерапевтических препаратов, таких, как адриами-цин и цисплатин, обусловлена регуляцией уровня экспрессии гена Вс1-2 [4: 5]. Многие авторы считают, что разница в чувствительности к химиотерапевтическим препаратам при лечении лейкоза зависит от уровня экспрессии гена Вс1-2. Угнетение уровня экспрессии Вс1-2 у больных острым мнелоидном лейкозом с помощью интерлейкнна-6. гранулощггароного колониести-

мулируюшего фактора, глюкокортикоида и дексоме-тазоиа увеличивает апоптоз при лечении цитараби-ном и адриамишшом. Мы доказали, что КЛТ в дозе 10 мкл/мл угнетает экспрессию гена Вс1-2 в клетках рака почки линии GRC-1. Результаты многих клинических исследований показали, что комбинирование КЛТ с радиотерапией и химиотерапией обладает синергизмом, повышает противоопухолевый терапевтический эффект радиотерапии и химиотерапии. Механизм этот может быть связан с ингибированием экспрессии гена Вс1-2 в опухолевых клетках.

ЛИТЕРА ТУРА

1. A rends M.J.. Morris R.G.. Wyttte А.Н. Apoptosis: the role ofendonuclease//Am. J. Pathol. — 1990. — Vol. 136. — P. 593.

2. Dolzhanskiy A.. Basch R.S. Flow cytomctric determination of apoptosis in heterogenous cells II J. Immunol. Methods. — 1995 —Vol. 180.— P. 131.

3. Yung Hiia, WangXiunping, Yu Linlinei al. A study ofTUNEL and Anncxin V labelling Assay on K562 cell treated with Kanglaite Injection-Flow cytometry Analysis Collection of Thesis on the Study of Kanglaite for Anti-Tumor Treatment II Hangzhou: Zhejiang University Publishing House. 1998. — P 10.

4. Evans D.L.. Dive C. Effects of cisplatin on the induction of apoptosis in proliferating hepatoma cells and nonproliferating immature thymocytes II Cancer Res. — 1993.—Vol. 53 —P. 2133

5. Zhang Xiaodong. Wang Wenliang. A Hepatic cancer cell Apoptosis Mode Induced by Adriamycin // Chinese Journal of Oncology. — 1997. — Vol. 19. — P. 260.

№3/tom2/2003

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ