Эффективность липосомального гентамицина сульфата при синегнойной инфекции

УДК 576.8

( .

К.А.Ротов, Е.А.Снатенков, Н.П.Храпова, В.В.Алексеев, Л.В.Ломова, А.А.Замарин, Н.Г.Плеханова

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛИПОСОМАЛЬНОГО ГЕНТАМИЦИНА СУЛЬФАТА ПРИ СИНЕГНОЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

На основании данных о возможности фосфолипидных везикул осуществлять доставку химиопрепаратов внутрь клеток, пролонгировать действие лекарственных веществ, а также снижать их токсическое воздействие на организм сделан вывод о возможности применения липосомального гентамицина сульфата как протективно-го агента при синегнойной инфекции. Установлено, что иммобилизация гентамицина сульфата в липосомы повысила его протективное действие в 1,5 раза, при этом ЕД50 препарата снизилось в 1,62 раза.

Антимикробная терапия синегнойной инфекции наталкивается на трудности, обусловленные как природой этой инфекции, так и ограниченным числом антибиотиков, к которым этот возбудитель чувствителен. Применение этих препаратов при синегнойной инфекции не всегда приемлемо из-за их быстрой элиминации и невозможности поддерживать высокие концентрации в крови. Длительное, повторное введение больших доз антибиотиков может вызывать токсические явления.

Одним из перспективных путей решения данного вопроса является применение липосом в качестве носителя антимикробных препаратов. Они биосовместимы, не вызывают аллергических, пиро-генных, иммунологических реакций, обеспечивают проникновение антибиотиков внутрь клетки и увеличивают время их пребывания в организме до 72-96 ч [2]. Поэтому липосомальные формы антибиотиков обладают большей терапевтической ценностью по сравнению с неиммобилизованными препаратами.

Ранее установлено, что применение липосо-мальных антибактериальных препаратов повышало эффективность лечения экспериментальной стафилококковой пневмонии, при этом увеличивало сроки средней продолжительности жизни и повышало процент выживших животных в опытных группах в сравнении со свободной формой препарата [4].

Таким образом, исследования по разработке новых протективных агентов, иммобилизованных в липосомы, актуальны.

Целью нашей работы является создание липо-сомальной формы гентамицина сульфата и изучение его протективности на модели экспериментальной синегнойной инфекции.

Материалы и методы исследования

Липосомы готовили из хроматографически чистых лецитина (Харьковский завод бактерийных препаратов), холестерина (Serva, ФРГ) и децитил-фосфата в молярном соотношении 7:2:1.

Иммобилизацию антибиотика в липосомы осуществляли методом обращения фаз [7, 9]. Материалом для включения внутрь липосом служил гентамицина сульфат (Пензенское АО «Биосинтез»). Размеры фосфолипидных везикул определяли при помощи электронной микроскопии. Степень окис-

ления липидов мембраны липосом оценивали по перекисному индексу Клейна, равному для неокис-ленных липидов 1,3+0,2. Полученные липосомы эмульгировали в 0,1 мл 0,1 М растворе хлористого калия и добавляли 3 мл абсолютного этилового спирта. Полученные пробы фотометрировали на фотоэлектрокалориметре КФК - 2МП кювете' с толщиной стенки 1 см против трансформирующего раствора при длине волны 215 нм и 233 нм.'; Расчет индекса перекисного окисления Клейна проводили по формуле: Индекс Клейна = А233/А215 [10].

Исследования острой токсичности липосомального гентамицина сульфата в сравнении со свободной формой антибиотика проводили в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения РФ 1993,' 1998 гг. к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ. Исследования проводили на 48 половозрелых крысах самцах массой 160-180 г. Препараты вводили животным внутрибрюшинно от Ю0'мг/кг в возрастающих дозах. Статистическая обработка проводилась по Керберу [], 6]. Экспериментальную синегнойную инфекцию моделировали на мышах линии BALB/C массой 16-18 г путем внутрибрю-шинного введения суточной культуры P. aeruginosa 103Р [3]. Для изучения протективности каждого препарата использовали 4 группы животных по 10 особей в каждой. Препараты вводили за 4 ч до заражения в дозах 0,5; 1; 2; 4 мг/мышь для свободной и иммобилизованной форм. Терапевтический индекс (ТИ) рассчитывали по формуле: ТИ = ED50 препарата / LD30 препарата.

Результаты исследования

I

Методом обращения фаз получены липосомы с высоким содержанием в них гентамицина сульфата. Иммобилизация антибиотиков внутрь липосом соответствовала (71 ±2,1) % от исходной дозы препарата. Перекисный индекс Клейна при этом соответствовал 1,1 ±0,2 условной единице, что является нормальным значением для неокисленных липидов. Средний размер везикул, содержащих антибиотик, 1000 нм (800-1200 нм).

В ходе сравнительного изучения острой токсичности липосомального гентамицина и свободной формы данного препарата выявлено, что антибиотик, иммобилизованный в фосфолипидные везику-

лы, в 1,5 раза менее токсичен обычной формы гентамицина сульфата (табл. 1).

Таблица I

Острая токсичность гентамицина сульфата в свободной и липосомалыюй формах

| ! Препарат | Величина 1Х>5», мг/кг 1

Геитамицина сульфат в липосомах 730

Г еитамицина сульфат 440

Иммобилизация гентамицина сульфата в липо-сомы в дозе 4 мг позволила повысить его протек-тивность в 1,5 раза. Введение гентамицина сульфата в липосомальной форме в дозе 1 мг/мышь увеличивало среднюю продолжительность жизни до 3,1 сут, в то время как применение свободного препарата в той же дозе не оказывало значительного увеличения средней продолжительности жизни животных и составляло всего 1,3 сут. Введение гентамицина сульфата в липосомах увеличило его эффективность в 1,62 раза, при этом его терапевтический индекс (ТИ) увеличился в 2,35 раза в сравнении с неиммо-билизованным препаратом (табл. 2).

Таблица 2

Изучение протективных свойств липосомалыюй формы гентамицина сульфата в свободной и иммобилизованной форме при экспериментальной синсгнойпой инфекции

Препарат Доза, мг Выжив- шие/ всего Средняя продолжительность жизни животных, сут * Защита, % ЕД50 препарата, мг/мышь ти'

Гентами- 4 4/10 ’ 6,0 40 ' 3,71 2,71

цина 2 2/10 4,2 20

сульфат 1 0/10 1,3 • 0

0,5 0/10 1,3 0

Г ентами- 4 6/10 14,8 60 2,29 6,37

цина суль- 2 3/10 6,4 30

фат в липо- 1 3/10 3,1 30

сомах 0,5 1/10 1,2 10

Примечание. Заражающая доза P. aeruginosa 103Р - 10'1 м.к., LD50 = 7,9-107 м.к. для белых мышей.

Обсуждение результатов

Используемый в работе метод обращения фаз позволил приготовить препараты липосом с высоким содержанием гентамицина сульфата. Полученные нами данные согласуются с результатами ряда исследователей, которые, применяя данный метод иммобилизации антибиотиков, в липосомы, получали при этом везикулы с высоким содержанием в них химиопрепаратов (60-85 %) от исходной дозы. Данный метод перспективен для приготовления. липосом с максимальным содержанием в .них лекарственных препаратов.

Иммобилизация антибиотиков в липосомы позволяет снизить их токсичность. В наших исследованиях по изучению острой токсичности липосомаль-ный антибиотик в 1,6 раза менее токсичен, чем его свободная форма. Снижение острой токсичности препарата в липосомах обусловлено тем, что препарат ограничен мембраной фосфолипидных везикул, которая не позволяет антибиотику воздействовать на чувствительные к нему клетки макроорганизма. При

этом препарат, постепенно высвобождаясь вследствие разрушения липосом, не достигает критических для макроорганизма концентраций [5,6].

Применение липосомального гентамицина сульфата в качестве протективного агента при синегнойной инфекции показало его большую эффективность в сравнении со свободной формой препарата. Снизилась в 1,62 раза ЕД50 препарата, увеличился в 1,5 раза процент защиты экспериментальных животных, более чем в 2 раза увеличилась средняя продолжительность жизни животных.

Увеличение протективных свойств иммобилизованного антибиотика обусловлено его более длительным нахождением в органах и тканях (до 72 ч). Постепенное высвобождение антибактериального препарата из везикул вследствие разрушения мембран липосом способствует поддержанию постоянных бактерицидных концентраций. Внутриклеточная направленность липосом, содержащих антибиотики, позволяет воздействовать на возбудителей, находящихся внутри макрофагов [8].

Таким образом, иммобилизация гентамицина сульфата в липосомы позволила повысить его про-тективные свойства при синегнойной инфекции в эксперименте, при этом значительно снизив его токсичность.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ашмарин И.П.,- Воробьев А-А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л.: Медгиз, 1962. - 180 с. - 2. Грегориадис Г. // Липосомы в биологических системах: Пер. с англ. / Под ред. Грегориадис Г., Аллисон А. - М.: Медицина, 1983. - С. 36—93. - 3. Гришина И. А., Галанкин В.Н. // ЖМЭИ. - 1982, - №2. - С. 82-85. -4. Перепелкин А.И., Ротов К. А., Тихонов Н.Г. и др.// Антибиотики и химиотерапия. - 1996. - Т. 41, № 10. - С. 28-29.- 5. Посте Дж. // Липосомы в биологических системах: Пер. с англ. / Под ред. Грегориадис Г., Аллисон А. - М.: Медицина, 1983. - С. 107-155. - 6. Рахман И.Е. // Там же. -С. 269-274. - 7. Ротов К. А. // Акт. вопр. эксперимент., кли-нич. и профилакт. медицины: Тез. науч. докл. на X обл. конф. мол. ученых - медиков и врачей. - Волгоград, 1988. - С. 60. -

8.Ротов К.А., Тихонов Н.Г., Васильев В.П. и др. // Генет. и биохим.' вирулентн. возбудит, особо, опасных инф.: Матер. Российск. науч. конф. - Волгоград, 1992. - С. 204. -

9. Экспериментальное изучение эффективности ли-посомальных форм антибиотиков для лечения некоторых бактериальных особо опасных инфекций (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва): Отчет о НИР (заключит.). - Волгоград, 1994. - С. 26-28. - 10. Klein R. А.//Biochim. Biophys. Acta. -1970. - N 21. - Р. 486-489.

K.A.Rotov, E.A.Snatenkov, N.P.Khrapova, V.V.Alekseyev, L.V.Lomova, A.A.Zamarin, N.G.Plekhanova

Efficiency of Liposomal Gentamycin Sulfate against the Pyocyanlc Infection

Volgograd Anti-Plague Research Institute

Based on the capability .of phospholipid vesicles to deliver chemical drugs inside the cells, to prolong the activity of therapeutic substances as well as to decrease their toxic effects upon the organism it was inferred that liposomal gentamycin sulfate could become a useful protective agent in the case of pyocyanic infection. Immobilization of gentamycin sulfate within the liposomes raised its protective action 1.5 fold, its ED50 dose being decreased 1.62 times. , 1

Поступила 17.12.04