Исследование срочных механизмов регуляции микрореологии эритроцитов: роль ионных мембранных каналов

УДК 612.1+612.014

А. В. Муравьёв, В. Л. Комлев, И. А. Баканова, А. А. Муравьёв, Н. В. Кислов

Исследование срочных механизмов регуляции микрореологии эритроцитов: роль ионных мембранных каналов

Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение 14.B37.21.0214, гранта РФФИ№12-04-00550-а и при поддержке ведомственной целевой

программы № 01201276739

Микрореологические свойства эритроцитов могут изменяться при активации долгосрочных и срочных регуляторных механизмов. Наряду с мембранными рецепторами и ферментными системами мембрана эритроцитов содержит большое число ионных каналов. При исследовании деформируемости и агрегации эритроцитов было показано, что ингибирование ионного котранспорта катионов Na+, K+ и анионов - C1-, дигоксином и фурасемидом, приводит к выраженному приросту агрегации эритроцитов и некоторому уменьшению их деформируемости. Усиление входа Са2+ в клетку сопровождается сходными изменениями микрореологии эритроцитов. С другой стороны, блокирование поступление этого иона в клетку, напротив - улучшало микрореологические свойства эритроцитов. Таким образом, изменение ионного баланса может быть срочным механизмом регуляции микрореологии эритроцитов.

Ключевые слова: микрореология эритроцитов, деформируемость, агрегация, мембранные ионные каналы, кальций. A. V. Muraviov, V. L. Komlev, I. A. Bakanova, A. A. Muraviov, N. V. Kislov

Study of Short-Term Regulatory Mechanisms of Erythrocyte Microrheology: a Role of Ionic

Membrane Channels

The microrheological erythrocyte properties may be changed under activation of long- and short-term regulatory mechanisms. It is known that the erythrocyte membrane contains many ionic channels together with the membrane receptors and the enzyme systems. It was shown that inhibition of the Na+, K+/Cl- co-transport with digoxin and furosemide leads to the significant erythrocyte aggregation increase and small deformability decrease. It was found that Ca2+ cell entry was accompanied by the similar red cell microrheology alterations. Whereas the blocking of Ca2+ influx resulted in the cell microrheology improvement. Taken together the obtained data showed clearly that the alteration of the ionic balance might be considered as a short-term regulatory mechanism of the erythrocyte microrheology change.

Keywords: erythrocyte microrheology, deformability, aggregation, membrane ionic channels, calcium.

Введение

Поскольку в капиллярах стенки лишены сократительных элементов и вазомоторной иннервации [1], то здесь ведущая роль в перфузии тканей, принадлежит реологическим свойствам клеток крови и особенно деформируемости и агрегации эритроцитов [3, 19]. Кроме того, по мнению ряда авторов, повышение ригидности эритроцитов и их высокая агрегация могут стать ведущим звеном расстройств микроциркуляции [9]. Имеется ряд работ, в которых сообщается о том, что под влиянием внеклеточных сигнальных факторов изменяется микрореология эритроцитов [3, 7, 10, 12, 16, 17]. Наиболее вероятными молекулярными механизмами срочной регуляции микрореологических свойств эритроцитов являются функции ионных каналов плазма-

тической мембраны клетки [8]. Следовательно, гипотеза о срочном регуляторном изменении микрореологии эритроцитов может быть проверена при стимулировании или ингибировании элементов молекулярных сигнальных путей эритроцитов, в опытах in vitro.

Материал и методы исследования

Исследования проводились на эритроцитах венозной крови доноров - добровольцев (n=36). Кровь для анализа (объем, 10 мл. с гепарином в качестве антикоагулянта) брали из локтевой вены в асептических условиях клинической лаборатории опытным медперсоналом. Для исследований использовали эритроциты после отделения их от плазмы центрифугированием и 3-хкратным отмыванием в изотоническом растворе хлорида натрия (NaCl). Вязкость полученных

© Муравьёв А. В., Комлев В. Л., Баканова И. А., Муравьёв А. А., Кислов Н. В., 2013

Исследование срочных механизмов регуляции микрореологии эритроцитов: роль ионных мембранных каналов

суспензий измеряли на полуавтоматическом капиллярном вискозиметре при шести напряжениях сдвига (0,196-1,96 Н-м"2).

Для изучения влияния на микрореологические свойства эритроцитов веществ, влияющих на трансмембранный транспорт ионов в клетках, проводили in vitro исследование. Для этого эритроциты инкубировали 15 мин. при 370С с фуро-семидом в концентрации 2,4-10-8 М, дигоксином (6,4 10-8 М), кальциевым июнофором (А23187; 3,0 М), хелатором Са2+ - ЭГТА (1,0 цМ) и блока-тором кальциевых каналов мембраны клеток -верапамилом (10-5М).

Для исследования деформируемости эритроцитов определяли индекс их удлинения (ИУЭ) в проточной микрокамере оригинальной собственной конструкции [15]. Главное преимущество данного метода по сравнению с широко применяемыми лазерными анализаторами и методом фильтрации заключается в возможности визуализировать процесс регистрации клеток (в том числе контролировать форму эритроцитов).

Степень агрегации эритроцитов определяли с помощью метода оптической микроскопии с регистрацией изображения и его компьютерным анализом [4]. Для оценки процесса агрега-тообразования эритроциты суспендировали в обедненной тромбоцитами аутологичной плазме при гематокрите 0,5 %. Этот метод позволял рассчитать отношение числа агрегатов к числу

неагрегированных клеток, которое рассматривали как показатель агрегации эритроцитов (ПА).

Статистическую обработку полученных цифровых материалов и все виды анализа результатов, включая корреляционный, проводили на РС IBM, используя табличный редактор Microsoft Excel. Проверку выборочного распределения на нормальность проводили с помощью теста Шапиро-Уилка. Если выборка подчинялась закону нормального распределения, достоверность различий в исследуемых группах определяли с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования

Для исследования агрегационного эффекта, при нарушениях ионного баланса, эритроциты инкубировали с дигоксином (6,4 10-8М) и фуро-семидом (2,4-10"8М). Известно, что фуросемид, как и все петлевые диуретики, блокирует сопряженный Ка+-К+-СГ-котранспорт [13, 18].

При анализе полученных данных выявили высокий проагрегационный эффект фуросемида (табл. 1). Так, показатель агрегации возрос на 74 % (p<0,01), при этом значительно увеличилось и количество клеток в агрегате с 5,12±0,18 до 6,93±0,30, разница составила 35 % (p<0,01). При этом наблюдали снижение деформируемости эритроцитов - вязкость суспензии эритроцитов, после инкубации с фуросемидом, возросла на 15 % (p<0,05).

Таблица 1. Изменения микрореологических показателей эритроцитов

Показатели Контроль (без препарата) Фуросемид 2,4-10-8 М

Пс, мПа-с 3,76±0,17 4,32±0,19*

ПА, отн.ед. 0,232+0,057 0,404+0,035*

Ч/А 5,12+0,18 6,93+0,30**

ИИА, отн.ед. 1,190+0,220 2,582+0,118**

Обозначения: пс - вязкость суспензии эритроцитов (Ис1=40%) при напряжении сдвига 1,96 Н-м-2; ПА - показатель агрегации; Ч/А - число эритроцитов, приходящихся на один агрегат; ИИА - интегральный индекс агрегации; ИУЭ - индекс удлинения эритроцитов

** - означает, что различия достоверны при р<0,01

Действие дигоксина (табл. 2) на эритроциты сопровождалось почти двукратным увеличением их агрегации, прирост составил 89 % (р<0,05), число эритроцитов, приходящихся на один агре-

гат возросло на 39 % (р<0,01). Также отмечалось и достоверное увеличение ригидности эритроцитов. На это указывало повышение вязкости суспензии эритроцитов на 7 % (р<0,05).

Таблица 2. Изменения микрореологических показателей эритроцитов

Показатели Контроль (без препарата) Дигоксин 6,4 10-8 М

Пс, мПа-с 3,94±0,22 4,21±0,24

ПА, отн.ед. 0,153±0,07 0,290±0,060

Ч/А 5,6±0,29 7,8±0,42**

ИИА, отн.ед. 0,857±0,122 2,262±0,116**

Обозначения те же, что в табл. 1 ** - различия достоверны при р<0,01.

Внутриклеточный ионизированный Са2+ регулирует ряд мембранных функций эритроцитов, в том числе поддержание формы, липидного состава и мембранной проницаемости [2, 20]. Повысить концентрацию Са2+ в клетке можно путем

инкубации эритроцитов с кальциевым ионофо-ром, снизить - с помощью блокады кальциевых каналов и/или связывания кальция в среде (например, ЭГТА).

Таблица 3. Изменения микрореологических показателей эритроцитов

Показатели Контроль (без препарата) ЭГТА 1,0 цМ

Пс, мПа-с 3,84±0,16 3,36±0,18

ИУЭ, отн. ед. 0,202±0,005 0,270±0,006**

ПА, отн. ед. 0,173±0,022 0,121±0,013*

Ч/А 5,49±0,18 4,70±0,30*

ИИА 0,950±0,077 0,569±0,085**

Обозначения те же, что в табл. 1; ИУЭ - индекс удлинения эритроцитов. * - различия достоверны при р<0,05; ** - различия достоверны при р<0,01.

Связывание кальция в среде с помощью хела-тора Са2+ - ЭГТА (табл. 3) привело к выраженному снижению агрегации эритроцитов, о чем свидетельствуют уменьшение ПА и интегрального индекса агрегации эритроцитов соответствен-

но на 30 % (р<0,05) и 40 % (р<0,01) относительно контроля. Деформируемость эритроцитов, напротив, возросла, что отражается приростом ИУЭ (рис. 1) на 33 % (р<0,01) и снижением вязкости суспензии эритроцитов на 13 %.

Контроль ЭГТА

»V

Рис. 1. Изменение деформируемости эритроцитов под влиянием инкубации клеток с ЭГТА (1,0 цМ). Микрофото,

объектив 40х, цифровой окуляр

Влияние различных режимов легочной вентиляции на вертикальную устойчивость спортсменов

При блокировании кальциевых каналов вера- снижение вязкости суспензий на 10%. Агрегация

памилом (Табл. 4) отмечали достоверное повы- эритроцитов под влиянием верапамила снизи-

шение пластичности эритроцитов, о чем свиде- лась на 18%. тельствовал прирост ИУЭ на 20% (р<0,01) и

Таблица 4. Изменения микрореологических показателей эритроцитов

Показатели Контроль (без препарата) Верапамил 10,0 цМ

Пс, мПа-с 3,96±0,32 3,56±0,27

ИУЭ, отн. ед. 0,198±0,006 0,238±0,004**

ПА, отн. ед. 0,109±0,054 0,089±0,036

Ч/А 4,94±0,10 4,82±0,28

ИИА 0,538±0,094 0,429±0,088

Обозначения те же, что в табл. 1; ИУЭ - индекс удлинения эритроцитов. ** - различия достоверны при р<0,01.

„2+

Повышение уровня Са в эритроцитах в ре- эритроцитов, но существенно стимулировало их зультате инкубации клеток с ионофором А23187 агрегацию (Табл. 5). Прирост показателя агрега-практически не повлияло на деформируемость ции составил 59% (р<0,01).

Таблица 5. Изменения микрореологических показателей эритроцитов

Показатели Контроль (без препарата) А23187 3,0 цМ

Пс, мПа-с 4,54±0,28 4,42±0,34

ИУЭ, отн. ед. 0,216±0,005 0,218±0,007

ПА, отн. ед. 0,119±0,009 0,189±0,011**

Ч/А 4,97±0,45 5,66±0,78

ИИА, отн. ед. 0,591±0,06 1,07±0,12**

Обозначения те же, что в табл. 1; ИУЭ - индекс удлинения эритроцитов. ** - различия достоверны при р<0,01.

Обсуждение результатов

В нашем исследовании снижение поступления Са2+ в эритроциты блокированием кальциевых каналов верапамилом, а также связывание кальция в среде с помощью хелатора Са2+ - ЭГТА приводило к достоверному увеличению деформируемости эритроцитов и снижению их агрегатообразования.

Наличие ионных каналов на эритроцитах, также дает возможность использовать эти системы для регуляции микрореологических свойств эритроцитов. Ингибирование прироста агрегации после обработки ЭДТА позволяет предположить участие мембраносвязанного кальция в процессе агрегатообразования эритроцитов [7]. Известно, что снижение транспорта Са2+ в эритроциты сопровождается повышением их фильтруемости [17] и снижением вязкости их суспензии [5].

Стимулирование входа в эритроциты Са2+ путем их инкубации с кальциевым ионофором "108

А23187 практически не повлияло на деформируемость эритроцитов, но в отношении агрегации эритроцитов наблюдали ее выраженный прирост. Сходный эффект кальцимицина был отмечен и другими авторами [7, 11].

Ингибиторы транспортных систем эритроцитов, использовавшиеся нами, оказывали сходное влияние на процесс агрегатообразования. Так, инкубация эритроцитов с дигоксином действие, которого связано с ингибирующим влиянием на №+-К+-АТФ-азу мембраны клеток, (это ведет к увеличению внутриклеточного содержания ионов натрия и снижению ионов калия), способствовала почти двукратному повышению агрегации эритроцитов и достоверному снижению их деформируемости [14]. Инкубация эритроцитов с фуросемидом, блокирующим Ка+-К+-СГ -котранспорт, также приводила к существенному приросту агрегации эритроцитов (рис. 2).

Na+/K+/Cl-

котранспорт са

+ фурасемид

А23187

Стимулирование агрегации эритроци-

2+

Рис. 2. Влияние ингибирования активности Ка+-К+-С1- -котранспорта и стимулирования входа Са2+

в эритроциты на агрегацию клеток

Можно полагать, что активация Ка-К-СГ -котранспорта сочетается с изменением интенсивности входа Са2+ в эритроциты [6]. Последнее ведет к выраженному приросту агрегации эритроци-

тов [4, 7]. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об изменении агрегируемости эритроцитов и их деформируемости при изменениях ионного гомеостаза красных клеток крови.

Библиографический список

1. Куприянов, В. В., Караганов, Я. Л., Козлов, В. И. Микроциркуляторное русло [Текст] / В. В. Куприянов, Я. Л. Караганов, В. И. Козлов. - М.: Медицина, 1975. - 216 с.

2. Левин, С. В. Структурные изменения клеточных мембран [Текст] / С. В. Левин. - Ленинград: Наука, 1976. - 198 с.

3. Муравьев, А. В., Зайцев, Л. Г., Муравьев, А. А., Замышляев, А. В. Микрореологические свойства разных популяций эритроцитов у людей с повышенным артериальным давлением и у физически активных людей [Текст] / А. В. Муравьев, Л. Г. Зайцев, А. А. Муравьев, А. В. Замышляев. // Физиология человека. - 2000. - Т. 26. - №4. - С. 101-108.

4. Муравьев, А. В., Муравьев, А. А. Вне- и внутриклеточные механизмы изменения агрегации эритроцитов [Текст] / А. В. Муравьев, А. А. Муравьев. // Физиология человека. - 2005. - Т. 31. - № 4. - С. 108-112.

5. Муравьев, А. В., Тихомирова, И. А., Булае-ва, С. В., Маймистова, А. А., Петроченко, Е. П. Изменение микрореологических свойств эритроцитов с возрастом: роль Са2+ [Текст] / А. В. Муравьев, Е. П. Петроченко // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2007. - Т. 6. - № 4. - С. 60-63.

6. Теппермен, Дж., Теппермен, Х. Физиология обмена веществ и эндокринная система [Текст] / Дж. Теппермен, Х. Теппермен. - М.: Мир, 1989. - 656 с.

7. Тихомирова, И. А., Муравьев, А. В., Гусева, Е. П. Адренореактивность организма и агрегатные свойства эритроцитов в норме и при патологии [Текст] / И. А. Тихомирова, А. В. Муравьев, Е. П. Гусева // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. -2006. -Т. 5. - № 2.- С. 63-68.

8. Ткачук, В. А. Гормональная регуляция транспорта Са2+ в клетках крови и сосудов [Текст] / В. А. Ткачук // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. - 1998. - Т. 84. - №10. - С. 1006-1018.

9. Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, W., Meiselman, H. J. Handbook of hemorheology and He-modinamics. - IOS Press, 2007. - 456 p.

10. Bree, F., Gault, I., P. d'Athis and Tillement J. P. Beta - adrenoceptors of human red cells, determination of their subtypes // Biochem. Pharmacol. - 1984. -Vol. 33. - P. 4045-4050.

11. Friederichs, E., Winkler, H., Tillman, W. Influence of the red blood cell Ca2+-ion concentration on the erythrocyte aggregation in stasis // Biochem. Med. Metab. Biol. - 1989. - Vol. 41. - № 2. - P. 85-92.

12. Carvalho, F. A., Maria, A. V., Bras Nouguei-ra, J. M., Guerra, J., Martins-Silva, J., Saldanha, C. The relation between the erythrocyte nitric oxide and hemor-heological parameters // Clin. Hemorheol. and Microcirc. -2006. - Vol. 35. - P. 341-347.

Влияние различных режимов легочной вентиляции на вертикальную устойчивость спортсменов

13. Geck, P., Pietrzyk, C., Burckhardt B.-C. et al. Electrically silent co-transport of Na+, K+ and Cl- in Ehrlich cells // Biochim. Biophys. Acta. - 1980. - Vol. 600. - P. 432-447.

14. Muravyov, A. V., Yakusevich, V. V., Ka-banov, A. V., Petrochenko, A. S. Ihe effect of diuretics on red blood cell microrheological parameters in female hypertensive patients // Clinical Hemorheology and Microcirculation. - 2005. - T 33. - № 2. - P. 121-126.

15. Muravyov, A. V., Cheporov, S. V., Kislov, N. V., Volkova, E. L. Hemorheological changes in solid tumor patients after treatment with recombinant erythropoetine // Clinical Hemorheology and Microcirculation. - 2009. -^ 41. - № 1. - P. 39-47.

16. S. de Oliveira, A. S. Silva-Herdade, C. Saldanha, Modulation of erythrocyte deformability by PKC activity //

Clin. Hemorheol. Microcirc. - 2008. - Vol.393. - P. 63373.

17. Oonishi, T., Sakashita, K., Uyesaka, N. Regulation of red blood cell filterability by Ca2+ influx and cAMP-mediated signaling pathways // Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 1997. - Vol. 273, N 42. - P. 1828-1834.

18. Russell, J. M. Sodium-Potassium-Chloride Cotrans-port // Physiol. Rev. - 2000. - Vol. 80. - № 1. - P. 211-276.

19. Stoltz, J. F. Clinical hemorheology: past, present and future // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 1995. -Vol. 15. - N 3. - P. 399-600.

20. Wiley, J. S., McCulloch K. E. Calcium ions, drug action and the red cell membrane // Pharmacol. Ther. -1982. - Vol. 18. - N 2. - P. 271-292.

Bibliograficheskij spisok

1. Kuprijanov, V. V., Karaganov, Ja. L., Kozlov, V. I. Mikrocirkuljatornoe ruslo [Tekst] / V. V. Kuprijanov, Ja. L. Karaganov, V. I. Kozlov. - M.: Medicina, 1975. - 216 s.

2. Levin, S. V. Strukturnye izmenenija kletochnyh membran [Tekst] / S. V. Levin. - Leningrad: Nauka, 1976. - 198 s.

3. Murav'ev, A. V., Zajcev, L. G., Murav'ev, A. A., Za-myshljaev, A. V. Mikroreologicheskie svojstva raz-nyh pop-uljacij jeritrocitov u ljudej s povyshennym arterial'nym dav-leniem i u fizicheski aktivnyh ljudej [Tekst] / A. V. Murav'ev, L. G. Zajcev, A. A. Murav'ev, A. V. Zamyshljaev. // Fiziologija che-loveka. - 2000. - T. 26. - №4. - S. 101-108.

4. Murav'ev, A. V., Murav'ev, A. A. Vne- i vnutri-kletochnye mehanizmy izmenenija agregacii jeritroci-tov [Tekst] / A. V. Murav'ev, A. A. Murav'ev. // Fizio-logija cheloveka. - 2005. - T. 31. - № 4. - S. 108-112.

5. Murav'ev, A. V., Tihomirova, I. A., Bulaeva, S. V., Majmistova, A. A., Petrochenko, E. P. Izmenenie mik-roreologicheskih svojstv jeritrocitov s vozrastom: rol' Sa2+ [Tekst] / A. V. Murav'ev, E. P. Petrochenko // Re-gionarnoe krovoobrashhenie i mikrocirkuljacija. - 2007. -T. 6. - № 4. - S. 60-63.

6. Teppermen, Dzh., Teppermen, H. Fiziologija ob-mena veshhestv i jendokrinnaja sistema [Tekst] / Dzh. Teppermen, H. Teppermen. - M.: Mir, 1989. - 656 s.

7. Tihomirova, I. A., Murav'ev, A. V., Guseva, E. P. Adrenoreaktivnost' organizma i agregatnye svojstva jeritrocitov v norme i pri patologii [Tekst] / I. A. Tihomirova, A. V. Murav'ev, E. P. Guseva // Regionarnoe krovoobrash-henie i mikrocirkuljacija. - 2006. -T. 5. - № 2.- S. 63-68.

8. Tkachuk, V. A. Gormonal'naja reguljacija transporta Sa2+ v kletkah krovi i sosudov [Tekst] / V. A. Tkachuk // Possijskij fiziologicheskij zhurnal im. I. M. Sechenova. - 1998. - T. 84. - №10. - S. 1006-1018.

9. Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, W., Meiselman, H. J. Handbook of hemorheology and He-modinamics. - IOS Press, 2007. - 456 p.

10. Bree, F., Gault, I., P. d'Athis and Tillement J. P. Beta - adrenoceptors of human red cells, determina-tion of their

subtypes // Biochem. Pharmacol. - 1984. - Vol. 33. - P. 4045-4050.

11. Friederichs, E., Winkler, H., Tillman, W. Influence of the red blood cell Ca2+-ion concentration on the eryth-rocyte aggregation in stasis // Biochem. Med. Me-tab. Biol. - 1989. - Vol. 41. - № 2. - P. 85-92.

12. Carvalho, F. A., Maria, A. V., Bras Nouguei-ra, J. M., Guerra, J., Martins-Silva, J., Saldanha, C. The relation between the erythrocyte nitric oxide and hem-orheological parameters // Clin. Hemorheol. and Micro-circ. - 2006. - Vol. 35. - P. 341-347.

13. Geck, P., Pietrzyk, C., Burckhardt B.-C. et al. Electrically silent co-transport of Na+, K+ and Cl- in Ehr-lich cells // Biochim. Biophys. Acta. - 1980. - Vol. 600. - P. 432-447.

14. Muravyov, A. V., Yakusevich, V. V., Ka-banov, A. V., Petrochenko, A. S. The effect of diuretics on red blood cell microrheological parameters in female hypertensive patients // Clinical Hemorheology and Microcirculation. - 2005. - T. 33. - № 2. - P. 121-126.

15. Muravyov, A. V., Cheporov, S. V., Kislov, N. V., Volkova, E. L. Hemorheological changes in solid tumor patients after treatment with recombinant erythropoetine // Clinical Hemorheology and Microcirculation. - 2009. -T. 41. - № 1. - P. 39-47.

16. S. de Oliveira, A. S. Silva-Herdade, C. Saldanha, Modulation of erythrocyte deformability by PKC activity // Clin. Hemorheol. Microcirc. - 2008. - Vol.393. - P. 63-373.

17. Oonishi, T., Sakashita, K., Uyesaka, N. Regulation of red blood cell filterability by Ca2+ influx and cAMP-mediated signaling pathways // Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 1997. - Vol. 273, N 42. - P. 1828-1834.

18. Russell, J. M. Sodium-Potassium-Chloride Co-transport // Physiol. Rev. - 2000. - Vol. 80. - № 1. - P. 211-276.

19. Stoltz, J. F. Clinical hemorheology: past, present and future // Clin. Hemorheol. and Microcirc. - 1995. - Vol. 15. - N 3. - P. 399-600.

20. Wiley, J. S., McCulloch K. E. Calcium ions, drug action and the red cell membrane // Pharmacol. Ther. - 1982. - Vol. 18. - N 2. - P. 271-292.