Эмульсия перфторуглеродных соединений медико-биологического назначения и способ её получения
Emulsion of perfluorocarbon compounds for biomedical purposes and a method for its production

Создание инфузионных сред, обладающих газотранспортными свойствами, является актуальной задачей медико-биологической науки. Изобретение относится к области медицинской биофизики и в частности к лекарственным средствам для применения в комплексной инфузионной терапии при лечении гипоксических состояний, а также в качестве средства, изменяющего (влияющего) на функциональное состояние различных биологических систем организма (клеток крови, плазмы и других органов).
Два свойства ПФУ определили их выбор в качестве основы инфузионной среды, способной транспортировать газы крови: химическая инертность и способность растворять большие объемы газов.
За сравнительно небольшой срок проблема прошла несколько этапов: от выбора объекта исследований (ПФУ, эмульгаторы) и решения ряда технологических вопросов получения эмульсий ПФУ до создания эмульсионных препаратов и их изучения в эксперименте и клинике.
2
2
2
2
Создаваемые препараты Флюозол-ДА (1978 г. Япония), Перфторан (1984 г. Россия) сохраняли свои свойства при хранении в замороженном состоянии. Их изучали на исходно однотипных моделях: обменное замещение крови у животных, перфузия изолированных органов, кровопотеря разной степени тяжести. Общим для этого этапа является доказательство способности ПФУ препаратов доставлять растворенный в них О тканям. Было получено подтверждение их газотранспортной функции. Однако доля переносимого эмульсиями О была мала по сравнению с количеством О, транспортируемого кровью. В препарате Оксигент (2003 г. США) была достигнута высокая кислородная емкость за счет увеличения концентрации фторуглеродной фазы. Используемые для его получения фосфолипиды (ФЛ) обеспечили возможность хранения препарата в охлажденном состоянии ~ +4°С. Препарат прошел все необходимые стадии изучения в опытах на животных. Однако результаты клинических испытаний препарата Оксигент (2005 г. - третья стадия по правилам GMP) не выявили его преимуществ по сравнению с контрольными данными, т.е. теоретическое представление об определяющей роли абсолютного количества О, транспортируемого эмульсиями в живом организме (их кислородной емкости), не подтвердилось.
Препарат Перфторан может храниться только в замороженном состоянии. Его кислородная емкость в 3 раза меньше чем для Оксигента. Перфторан разрешен к клиническому применению в России в 1996 г. Препарат получил положительные отзывы клиницистов. Вместе с тем, используемые дозы Перфторана при различных формах заболеваний довольно произвольны, находятся в интервалах 1-10 мл/кг и, как правило, недостаточно обоснованы. Исследования препарата Перфторан по правилам GMP у нас в стране не проводились.
В Патенте РФ №2259819 [1], который является прототипом настоящего изобретения, (Кузнецова И.Н. - автор и патентовладелец), рассмотрены свойства перфторуглеродных соединений, затронуты основные принципы получения эмульсий ПФУ, проведен анализ других патентов, которые мы рассматривали как аналоги. Характерным для рассмотренных патентов является стремление увеличить КЕ эмульсий за счет увеличения содержания фторуглеродной фазы в этих средах. Это обстоятельство приводит к увеличению фармакологической нагрузки на живой организм, поскольку ПФУ не подвергаются метаболизму, задерживаются в органах, вызывая изменение их функции, и только спустя определенное время покидают организм. Чем больше доза препарата и его КЕ, тем дольше препарат задерживается в органах.
Сложилась ситуация неопределенности: нужна ли повышенная кислородная емкость, какова должна быть доза препарата, каков должен быть состав, как влияет замораживание и размораживание на препарат, насколько ФЛ обеспечивают стабильность препарата и др.
Ранее нами в Патенте РФ №2259819, который мы взяли за прототип, основное внимание было уделено методологическим вопросам оценки стабильности эмульсий ПФУ [1]. Во вступительной части изобретения (сс. 1 20) описаны следующие моменты. Рассмотрены основные коллоидно-химические и технологические вопросы получения и стабилизации эмульсий на основе перфторуглеродов (ПФУ). Сделан акцент на том, что эмульсии, полученные с использованием водорастворимого эмульгатора типа сополимер окиси этилена и окиси пропилена (проксанол, плюроник и др), должны храниться в замороженном состоянии и конечная лекарственная форма препаратов данного типа не выдерживает тепловую стерилизацию. Выделены два аспекта стабильности эмульсий ПФУ. Во-первых, стабильность in vitro сохранение физико-химических параметров, описывающих состояние эмульсии при хранении, во- вторых, стабильность in vivo -сохранение индивидуальности частиц при циркуляции в токе крови, важное для выполнения ими газотранспортной функции. Попадание частиц эмульсии в сосудистое русло рассматривается как стресс-воздействие. Подчеркнута значимость строения поверхностного слоя ПАВ вокруг частиц при их циркуляции в сосудистом русле, т.е. его прочность, важная для стабильности частиц in vivo. Эти вопросы и методические подходы, их решения были разработаны нами ранее [2]. В силу наличия однотипных побочных реакций у пациентов при введении разных препаратов (Флюозол, Оксигент, Перфторан) остается актуальным вопрос более углубленного тестирования качества разрабатываемых эмульсионных препаратов на этапах: обоснование состава и разработки способа их получения с учетом углубленного понимания механизма их действия. Цель настоящего изобретения обосновать теоретически и экспериментально состав препарата и способ его получения, также увеличить срок его хранения. Важным является так же проверить воспроизводимость технологического процесса получения эмульсий заявленного состава.
Задачей настоящего изобретения является улучшение качества эмульсии за счет снижения фармакологической нагрузки на организм и тем самым увеличение безопасности препарата, а также увеличение стабильности эмульсии заявленного состава до 2-х лет хранения в незамороженном состоянии (не менее).
Особенности функциональной активности ПФУ эмульсий в живом организме. Способность к доставке газов частицами при совместной циркуляции с эритроцитами определяется временем их пребывания в сосудистом русле. В этом заключается основное отличие от других препаратов, когда ставится задача найти формулу вещества для попадания его в соответствующую мишень - основной механизм такого действия «ключ/замок».
Другая особенность ПФУ препаратов-их чужеродность. Речь идет не о токсичности, которую оценивают в опытах на животных и которая зависит от характеристик качества препарата, в первую очередь от степени дисперсности препарата. Речь идет о частицах ПФУ, которые не метаболизируют в организме и которые по определению, как чужеродные, должны оказывать раздражающее действие на другие системы организма. В первую очередь на кровь. В сосудистом русле частицы просто не могут существовать независимо от форменных элементов крови.
В связи с этим возникает важный вопрос, как совместить два противоположных и неразрывно связанных свойства (транспорт газов и чужеродность) при выборе состава и технологии получения наиболее эффективного ПФУ препарата. Следствием сказанного прогресс в создании новых ПФУ препаратов связан во- первых, с развитием и углубленным пониманием механизмов их действия, т.е. как проявляется их функциональная активность в живом организме; во- вторых, с пониманием и развитием общебиологических закономерностей влияния чужеродных (не подвергающихся метаболизму) частиц ПФУ на живой организм при внутривенном введении.
Как достичь компромисс между двумя противоположными свойствами ПФУ при создании новых препаратов ?. С одной стороны - активация метаболизма за счет доставки кислорода клеткам, с другой стороны - угнетение функции ряда важных систем из-за чужеродности по отношению к целостному организму частиц ПФУ. Эти вопросы в столь явном виде в различных литературных источниках не поднимались и не рассматривались.
2
2
2
Особенности механизма газотранспортной функции смешанной системы кровь/эмульсия ПФУ (теория и эксперимент). В самом начале создания инфузионных сред, содержащих ПФУ, сложилось теоретическое представление об определяющей роли абсолютного количества О, транспортируемого эмульсиями в живом организме - их кислородной емкости (КЕ). До настоящего времени принят подход сопоставлять газотранспортные свойства эмульсий ПФУ и крови, который основывается на количественном сравнении особенностей кривых диссоциации О этих сред. Содержание кислорода в эмульсиях ПФУ пропорционально его парциальному давлению, поскольку химическая связь «ПФУ↔газ» отсутствует. Это линейная зависимость. Для крови это сигмоидная кривая, отражающая кооперативное взаимодействие гемоглобина с О. Названные зависимости отражают содержание кислорода, которое определяют в опытах in vitro. И не касаются условий доставки кислорода в условиях in vivo.
2
2
Реальные условия применения эмульсий ПФУ в клинике предполагает совместную циркуляцию частиц ПФУ с достаточно большим количеством эритроцитов. Поэтому функциональную активность эмульсий необходимо рассматривать в связи с газотранспортными свойствами крови, что не вполне является общепринятой точкой зрения. Процесс доставки газов кровью определяется «микрокинетикой», т.е. скоростью диффузии молекул О от эритроцитов к тканям и молекул СО в противоположном направлении. Схематически этот процесс представлен на рис. 1. [3]. Частицы находятся на пути диффузии молекул О2 и СОг от эритроцитов к тканям и, теоретически, могут оказывать влияние на этот процесс.
Пример 1. Влияние эмульсий перфторуглеродов на скорость оксигенации и деоксигенации крови [4]
2
2
а
Частицы ПФУ занимают определенный объем на пути диффузионных потоков О и СО при совместной циркуляции с эритроцитами. Теоретически они могут изменить условия доставки газов кровью: ускорить или замедлить диффузию газов от кислорода от эритроцитов к тканям и углекислоты в противоположном направлении. В этом случае присутствие эмульсии в токе крови должно сказаться на скоростях оксигенации и деоксигенации эритроцитов. Экспериментально этот процесс был изучен нами на установке, моделирующей циркуляцию крови при гемодилюции в присутствии эмульсии (Гт=25-30%, Cv~=1% по объему,  ~=010 мкм). В физическом эксперименте установлен феномен увеличения скоростей оксигенации и деоксигенации эритроцитов при их совместной циркуляции с частицами ПФУ (рис. 2 и рис. 3). То есть доказан эффект изменения условий транспорта кислорода эритроцитами в присутствии небольшого объема эмульсии ПФУ: присутствие эмульсии в водной среде увеличивает скорость диффузии молекул O2. Вследствие этого и был установлен феномен увеличения скоростей оксигенации и деоксигенации эритроцитов.
2
Причина этого явления обусловлена повышенной растворимостью газов крови во фторуглеродной фазе эмульсии и увеличением коэффициента массопереноса О частицами [2], поскольку толщина оболочки ПАВ вокруг частиц не препятствует возможности свободного прохождения газов через частицы. Следует отметить, что скорость оксигенации в моделируемых условиях (в установке) в ~100 раз меньше, чем в организме. Поэтому скорость оксигенации in vivo может быть больше, чем полученная в условиях in vitro.
О чужеродности эмульсий перфторуглеродов и их влияний на организм
Согласно требованиям Фармакопеи существующие критерии выбора состава препарата основываются на оценке их эффективности и безвредности в опытах на животных. Что справедливо, но недостаточно, поскольку частицы имеют собственный объем и могут влиять на собственную структуру крови. Кроме того, в силу химической инертности ПФУ частицы ПФУ не перевариваются ферментными системами и являются чужеродными для организма. В различных острых опытах на животных было установлено, что эмульсии ПФУ продлевают жизнь животных за счет их газотранспортной функции. Однако при внутривенном введении этих сред наблюдаются изменения различных биологических систем организма. Подробные результаты исследований этих изменений при замещении крови эмульсиями перфторуглеродов приведены в монографии [5]. Авторы наблюдали: изменение клеточного состава крови, снижение числа эритроцитов, сдвиг формулы для лейкоцитов, изменение клеточного состава костного мозга и активности ряда ферментных систем. С увеличением срока наблюдений (не менее 2-х недель или месяца) за экспериментальными животными это раздражающее действие снижалось по причине компенсаторных реакций, характерных для живого организма.
Причиной этих изменений является чужеродность частиц. Термин «чужеродность» редко применяется применительно к частицам ПФУ. Речь идет не об их токсичности. В настоящее время качество ПФУ для целей биологии и медицины достигло высокого уровня. ЛД50 составляет не менее 5-10 г/кг. В данном случае при изучении качества разрабатываемого ПФУ препарата до тестирования на животных необходимо проверить его влияние на кровь in vitro. Выполнение этого условия позволяет уточнить, точнее проверить, биосовместимость новой инфузионной среды с кровью, т.е. с сохранением биологических свойств форменных элементов крови при достаточно длительной циркуляции с эмульсионным препаратом. Здесь действует фактор, который отличает эмульсии ПФУ от других препаратов: эффективность эмульсий ПФУ, как средства, как препарата, доставляющего кислород тканям, определяется продолжительностью времени циркуляции частиц в сосудистом русле.
3
Наши расчеты показали, что при внутривенном введении 10% (по объему) эмульсии ПФУ в дозе ~ 5÷10 мл/кг число частиц в мм на несколько порядков превышает число клеток в том же объеме крови [3]. Клетки крови в сосудистом русле двигаются как бы в окружении мелких ПФУ частиц, которые могут (или должны) оказывать влияние на специфическую активность форменных элементов крови. Закономерности этого влияния условиях in vivo могут быть нивелированы (или изменены) за счет компенсаторных реакций живого организма. Постановка эксперимента in vitro, позволяет изучить непосредственное воздействие ПФУ препарата на клетки крови в строго определенных условиях (концентрация ингредиентов, постоянство температурного режима и времени инкубации в термостате и др.).
С учетом этого обстоятельства в опытах in vitro было изучено влияние стабильной эмульсии заданно состава на морфофункциональное состояние клеток крови: эритроцитов, нейтрофилов, тромбоцитов. В отдельных опытах была проверена стабильность применяемых эмульсий (сохранение размера и поверхностных свойств частиц). Состав приведен в таблице 5, код исследуемых ПФУ эмульсии AT или АТ-300. По физико-химическим параметрам эмульсии ПФУ отвечали медико-биологическим требованиям, предъявляемым к этим средам.
Пример 2. Влияние эмульсий перфторуглеродов на индуцируемую агрегацию тромбоцитов [6].
О характере влияния эмульсий ПФУ на агрегационную активность тромбоцитов донорской крови судили, используя фотометрический метод Борна. Метод основан на непрерывной регистрации изменения светопропускания перемешиваемой и термостатируемой суспензии. Запись процесса агрегации тромбоцитов в плазме крови здоровых лиц проводили на агрегометре Solar АР 2110 с программным обеспечением для регистрации результатов. Использовали следующие параметры для оценки агрегационной функции тромбоцитов: L - латентный период (сек), V - скорость агрегации на 30-й секунде (%/мин), МА - максимальная амплитуда (%).
По результатам изучения влияния эмульсии ПФУ на светопропускание богатой тромбоцитами плазмы сделано заключение, что исследуемые эмульсии не являются индуктором агрегации тромбоцитов.
В случае АДФ-индуцированного процесса агрегации тромбоцитов выявлено разнонаправленное влияние эмульсии ПФУ на агрегационную активность тромбоцитов в зависимости от используемой дозы Таблица 1.
Добавление эмульсии ПФУ в конечной концентрации 4% вызывало повышение активности тромбоцитов, что характеризовалось увеличением максимальной амплитуды, скорости реакции, степени дезагрегации и времени достижения максимальной амплитуды. При увеличении концентрации эмульсии до 10% наблюдали постепенное торможение процесса агрегации тромбоцитов: падение скорости и максимальной амплитуды, уменьшение процента дезагрегации тромбоцитов. При достижении конечной концентрации 15% процессы торможения прогрессировали - скорость агрегации и процент дезагрегации снижались по сравнению с исходным уровнем. Латентный период агрегации не зависел от концентрации эмульсии в образце.
Интересно отметить, что в одной из плазм с исходно повышенной агрегационной активностью тромбоцитов (кровь пациента, не донорская кровь; двуволновая агрегационная кривая) добавление эмульсии в концентрации 4% не приводило к дополнительной активации тромбоцитов, а оказывало скорее «нормализующий» эффект - исчезала вторая волна агрегации тромбоцитов. Увеличение концентрации эмульсии до 10, и затем до 15% приводило к снижению интенсивности процесса агрегации почти до нормальных величин.
Таким образом, исследуемые эмульсии ПФУ/ФЛ оказывают дозозависимое влияние на сложный процесс индуцируемой агрегации тромбоцитов донорской крови при содержание эмульсии в пробе ≤20 об. %. Главный результат - полученные эмульсии не являются индуктором агрегации нормальных тромбоцитов.
Пример 3.Влияние эмульсий перфторуглеродов на эритроциты и нейтрофильные гранулоциты [7]
Оценка влияния эмульсии АТ-300 на состояние мембраны эритроцитов осуществлялась путем подсчета эхиноцитов (недискоидной формы клеток) в мазке крови (на 1000 эритроцитов) после 60-минутной инкубации при 37°С. -Гемолиз эритроцитов оценивали в соответствии с инструкцией, принятой в Службе крови. Функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов оценивалась по их способности восстанавливать краситель «нитросиний тетразолий» в НСТ-тесте. В параллельных опытах оценивали перекисное окисление липидов (ПОЛ) по содержанию малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови.
Количество эхиноцитов в пробе крови постепенно увеличивалось с увеличением содержания эмульсии в крови (таблица 2). Отсутствие видимого гемолиза эритроцитов сохранялось в диапазоне концентраций от 100:1 до 10:5. И только в условиях запредельно высокой концентрации эмульсии (1:1 и 1:2) появляется видимый массивный гемолиз («лаковая кровь»). Свободный гемоглобин в плазме при этом колеблется от 0,926 г/л до 3,42 г/л - соответственно, в отличие от предельно допустимых величин (не более 0,1 г/л).
Учитывая взаимосвязь процессов активации кислородзависимого метаболизма нейтрофилов с перекисным окислением липидов (ПОЛ), была проведена сравнительная оценка активности этих процессов под влиянием эмульсии АТ-300 в различных концентрациях «in vitro».(Табл. 3)
Увеличение НСТ - теста при соотношениях кровь /эмульсия ≤10/2 можно расценивать как закономерную реакцию нейтрофилов на чужеродный агент- частицы ПФУ. Частицы ПФУ как внешний раздражитель поглощаются нейтрофилами. И активация нейтрофилов в данном случае является результатом фагоцитоза. Однако, при этом активированные нейтрофилы сохраняют способность к фагоцитозу (проверено на микробной культуре золотистого стафилококка). Величины МДА в указанном диапазоне содержания эмульсии в пробе крови не превышают исходных значений этого параметра. Увеличение относительного содержания эмульсии в пробе крови приводит к подавлению естественного процесса активации нейтрофилов, а также к возрастанию воздействия частиц ПФУ на мембрану разных клеток. Об этом свидетельствует увеличение содержания МДА, который является тестом на перекисное окисление липидов мембраны клеток.
Таким образом, результаты изучения морфофункциональных характеристик эритроцитов и нейтрофильных гранулоцитов при взаимодействии их с эмульсией АТ-300 в различных концентрациях «in vitro» позволяют выбрать наиболее благоприятный диапазон соотношения кровь/эмульсия ~=10/2 (не более), т.е. низкие значения содержания эмульсии в крови ≤20% являются предпочтительными.
Неоднозначность связей между изменениями морфофункциональных свойств форменных элементов крови под влиянием различной концентрации эмульсии ПФУ свидетельствует о сложности процессов взаимодействия крови с эмульсией. В первую очередь это связано с изменением связей между структурными элементами собственно крови. Эта сложная картина может найти отражение в таком макропараметре как реология крови: изменении ее реологических параметров под влиянием эмульсии.
Пример 4. Влияние эмульсий перфторуглеродов на реологические параметры крови [7].
Исследования проводили в модельных условиях гемодилюции крови Гт=25, Эмульсию ПФД/ПФТБА (соотношение 7/3) получали методом гомогенизации при давлении 300-500 атм согласно разработанным методам. Использовали эмульгатор - проксанол - 4%, содержание фторуглеродной фазы составляло - 8,6 об %, средний диаметр частиц - 0,12±0,03. Из экспериментальных данных находили предел текучести параметр, отражающий начало течения исследуемой среды, и вычисляли коэффициент агрегации А--показатель характеризующий способность красных клеток крови образовывать агрегаты [9].
Получены результаты, согласно которым степень агрегации эритроцитов зависит от содержания эмульсии в пробе крови (таблица 4): при содержании эмульсии в пределах ~ 1-2 об. % наблюдаются низкие значения коэффициента агрегации. С увеличением содержания фторуглеродной фазы эмульсии отмечено возрастание А. Это обстоятельство свидетельствовало об образовании новых структур, обусловленных дополнительным взаимодействием частиц ПФУ и эритроцитов в смеси кровь/эмульсия (таблица 4).
Таким образом, только низкое содержание частиц эмульсии в пробе крови (≤10 об. %) оказывает дезагрегирующее действие на эритроциты: низкие значения параметра А, сопоставимые с действием эмульгатора, который не содержит собственной объемной ПФУ субстанции.
Об оптимизации состава нового кислородпереносящего кровезаменителя.
Полученные нами результаты (примеры 1-5) служат основанием для пересмотра существующей точки зрения о необходимости иметь высокую кислородную емкости разрабатываемого ПФУ препарата. Во-первых, в физическом эксперименте показано, что при совместной циркуляции небольшого объема эмульсии ~ 1 об % (сравнительно с количеством эритроцитов гематокрит ~ 25÷30 %) происходит увеличение скоростей оксигенации и деоксигенации эритроцитов. Этот факт доказывает, что эмульсия в небольшом объеме в токе крови увеличивает скорость диффузии кислорода от эритроцитов в ткани (пример 1). Во -вторых, в биологических и биофизическом тестах (примеры 2-4) подтвержден факт влияния эмульсии на морфо-функциональное состояние клеток крови (тромбоциты, эритроциты, нейтрофилы). Причем, степень этого влияния зависит от дозы эмульсии в пробе крови. Выбрано оптимальное содержание (объем) эмульсии в пробе крови: оптимальный объем эмульсии в смеси кровь /эмульсия составляет ~ 20% от общего объема смеси кровь/эмульсия. По данным биофизического эксперимента содержание эмульсии в крови не должно превышать 10%. Эти результаты свидетельствуют о целесообразности снижения концентрации фторуглеродной фазы в эмульсии, т.е. снижении ее кислородной емкости.
Задачей настоящего изобретения является улучшение качества заявляемой эмульсии ПФУ/ФЛ и увеличение ее стабильности. Понятие «качество» подразумевает минимальное нежелательное воздействие эмульсии на биологические системы организма и в частности на кровь. В обобщенном виде это требование означает биосовместимость эмульсии с биологической средой. В силу неопределенности и многозначности понятия «биосовместимость» качество эмульсии необходимо тестировать, используя представление о структуре эмульсии, поскольку сохранение структуры частиц при попадании в сосудистое русло обеспечивает эмульсиям ПФУ выполнение газотранспортной функции. Контроль за прочностью структуры включает определение следующих параметров [2]:
- Размер и распределение частиц по размерам. (Это общепринятый подход. Используют различные методы и приборы. В наших опытах использован метод спектра мутности).
эксп
расч.
- Однородность природы частиц в эмульсии, которая связана с особенностью природы ПФУ жидкостей: ПФУ практически не растворимы в воде и являются плохими растворителями для большого числа веществ (в том числе и для ФЛ). Вследствие этого в эмульсии могут присутствовать два типа частиц: частицы с прочной связью ФЛ с фторуглеродным ядром частиц и свободные или липосомальные ФЛ. Однородность природы частиц характеризуется совпадением (в пределах погрешности измерений) экспериментальных и расчетных значений мутности: τ и τ).
- Сохранение поверхностных свойств частиц в определенном интервале значений Kτ (индекса взаимодействия с модифицированной сывороткой крови).
Наблюдение за комплексом названных параметров характеризует сохранение (или изменение) целостности структуры частиц. Этот разработанный нами подход [2] использован в Прототипе [1].
*Cv-содержание фторуглеродной фазы (об. %). Код эмульсии : эмульсия AT или AT 300.
ПМ - подсолнечной масло; СМ - Масло сои; КМ - касторовое масло.
Технология получения эмульсии базируется на общем принципе диспергирования жидких ПФУ в водном растворе эмульгирующего компонента при использовании гомогенизатора высокого давления. В Прототипе (автор Кузнецова И.Н.) отражены конкретные примеры реализации получения эмульсий ПФУ/ФЛ, компоненты которых и в Прототипе и в Заявке не имеют принципиального отличия (от заявленного состава эмульсий). Поэтому нами была поставлена новая задача. Показать надежность использования заявляемых технологических этапов наработки эмульсий одного состава. Для этого необходимо было во-первых, проверить экспериментально воспроизводимость значений комплекса параметров качества нарабатываемых эмульсий от серии к серии, а также их сохранность в течение заявленного срока хранения при ~ +4°С. Во- вторых, изучить совместимость эмульсий с различными кровезаменителями. Это связано с тем, что эмульсии ПФУ не обладают гемодинамическим действием. Поэтому на практике при лечении гипоксических (критических) состояний их используют совместно с кровезаменителями. Третья задача, изучить возможность увеличения срока хранения полученных эмульсий до двух лет хранения при сохранении их качества, т.е. целостности структуры.
В качестве тестируемого объекта был выбран состав эмульсии, в которой Cv составляет 5 об. % (№3 в таблице 5, Код эмульсия AT или AT 300).
Пример 5. О воспроизводимости параметров характеризующих качество эмульсий от серии к серии, а также их стабильности при хранении [10].
Эмульсии получали в соответствии с заявленным способом. В таблице 6 приведен состав и физико-химические параметры 17 серий эмульсий, в таблице 7- размер частиц фракционированных частей тех же серий.
Содержание фторуглеродной фазы составляло 5,2±0,4. Относительная вязкость (относительно воды) изученных серий эмульсий AT находилась в интервале 1,24-1,62 и во всех случаях не превышали вязкости плазмы (1,57-1,75). Кислотность исследованных эмульсий AT была близкой к физиологической норме - рН находился в пределах 7,10-7,4, содержание фтор иона не превышало пределов 10-40 мкМ.
Размер частиц от серии к серии колебался в узких пределах (0,11-0,16 мкм) и не менялся при разведении эмульсии водой, как дополнительное стресс-воздействие. Эмульсии были практически монодисперсны, поскольку при изучении ширины распределения частиц по размерам в них не обнаружено частиц диаметром более 0,2 мкм. Причем характер распределения частиц по размерам сохранялся спустя год хранения при +4°С (таблица 7).
а
Таблица 7. Величины волнового экспонента (n) и среднего диаметра частиц (), характеризующие ширину распределения частиц по размерам для эмульсий ПФУ/ФЛ разных сроков хранения.
На рисунке 4 приведены величины коэффициента взаимодействия (Kτ) различных серий эмульсий AT с сывороткой крови. Видно, что значения этого параметра от серии к серии находились в достаточно узком интервале (1,5-3,0). Причем этот интервал практически не менялся с увеличением срока хранения эмульсий до 1 года (рисунок 5).
τ
τ
Получено совпадение значений экспериментальных и расчетных значений мутности, что свидетельствует об однородности природы частиц в эмульсиях AT (таблица 8). Значения параметра К косвенным образом характеризуют поверхностные свойства частиц - сохранение или изменение их «микроструктуры». Узкий интервал колебаний К для каждой серии при хранении и сопоставимые значения изменений этого параметра от серии к серии свидетельствовали о стандартности поверхностных свойств частиц и о сохранении их «микроструктуры».
Таким образом, доказана воспроизводимость физико-химических параметров различных серий получаемых эмульсий фиксированного состава, а также их стабильность в течение года хранения в незамороженном состоянии. Общий КОД всех серий эмульсий обозначен как AT или АТ-300, поскольку в пределах погрешности измерений все серии не отличаются друг от друга.
Таблица 8. Экспериментальные и расчетные значения мутности (τ) для нативных и разведенных водой эмульсий ПФУ/ФЛ разных сроков хранения.
Пример 6. О совместимости эмульсии ПФУ/ФЛ с различными кровезаменителями сывороткой крови [11].
В клинической практике часто используют различные кровезаменители. В результате происходит разведение крови (гемодилюция). Значение гематокрита уменьшается до 25-35%, что приводит к значительному снижению скорости диффузии кислорода от эритроцитов к клеткам. В этих условиях важно было показать, что частицы сохраняют свою корпускулярную природу (структуру) в модельных условиях «эмульсия + кровезаменитель» и «эмульсия + кровезаменитель + плазма крови».
В таблице 9 приведены результаты определения среднего диаметра частиц в исходных эмульсиях и после их смешения с различными инфузионными средами.
В таблице 10 - результаты определения ширины распределения частиц по размерам в тех же смесях.
Средний диаметр частиц не менялся при смешении эмульсии AT с кровезаменителями. Добавление сыворотки крови к 2-х компонентной смеси также не вызывало изменения этого параметра (таблица 11). Не отмечено изменение ширины распределения частиц по размерам (таблица 12) и не обнаружено появление крупных частиц при фракционировании эмульсий в сочетании с кровезаменителями и сывороткой крови.
τ
τ
τ
τ
На рисунке 6 представлены величины К для исходной эмульсии в сравнении со значениями этого параметра для 2-х и 3-х компонентных смесей. Добавление исследованных коллоидных КЗ не оказывало влияния на поверхностные свойства частиц, поскольку коэффициенты взаимодействия К для 2-х компонентных сред практически не менялись. Наличие сыворотки в 3-х компонентной смеси не приводило к увеличению К. Аналогичная динамика изменения К отмечена в случае солевого физиологического раствора.
При добавлении к эмульсии коллоидных КЗ вязкость смеси определялась исходными значениями вязкости компонентов: увеличивалась или уменьшалась в зависимости от вязкости добавляемого кровезаменителя. Введение сыворотки в 2-х компонентную смесь приводило, как правило, к снижению вязкости, что являлось дополнительным подтверждением несостоятельности высказанного ранее предположения о возможной агрегации частиц в данном случае.
Таким образом, добавление к эмульсии AT разного типа кровезаменителей и сыворотки крови (модельные условия) не влияло существенным образом на изменение физико-химических параметров этих сред. Это обстоятельство свидетельствовало о сохранении качества эмульсии AT в смесях «эмульсия + КЗ» и «эмульсия + КЗ + сыворотка крови», т.е. о совместимости эмульсии AT с инфузионными средами.
Пример 7.06 увеличении срока хранения полученных эмульсий ПФУ/ФЛ до 2-х лет хранения при температуре ~ +4°С.
Были получены новые эмульсии идентичного состава эмульсии-АТ-4 серии. (Состав см. пример 6). Для оценки полученных результатов о стабильности полученных эмульсий длительных сроков хранения и о воспроизводимости технологического процесса использовали статистические методы (описательный, дисперсионный, регрессионный анализы). Статистический анализ и графическое отображения полученных результатов, проводили с использованием функций открытого статистического пакета «R» (http://cran.r-project.org). Эти исследования проведены А.Ю. Лянгузовым с использованием оборудования ресурсного центра «Обсерватория экологической безопасности» Научного парка СПбГУ.
В течении всего срока хранения эмульсий средний диаметр частиц находился в пределах 0,10-0,15 мкм и не менялся при разведении эмульсий водой. Значения среднего диаметра частиц для верхней и средней фракций нативной и разведенной водой эмульсий при фракционировании составляли 0,12-0,13 мкм. Для нижней фракции средний диаметр частиц был несколько выше, 0,14-015 мкм (рис. 7).
Сопоставление экспериментальных и расчетных значений мутности (τ) для изученных нативных и разведенных водой эмульсий (рис. 8) показало их хорошее совпадение для всего срока наблюдений (р>0,05). Эти результаты свидетельствуют о сохранении однородности природы частиц ПФУ/ФЛ, что обусловлено прочностью связи эмульгатора (ФЛ) с фторуглеродным ядром частиц.
τ
Подтверждением этого положения служат данные о поверхностных свойствах частиц. Результаты дисперсионного анализа показали, что статистически значимых изменений величин индексов взаимодействия эмульсий с сывороткой крови, а также экспериментальных и расчетных значений мутности (τ) не обнаружено, р>0,05. Среднее значение K за период наблюдений равно 2,45±0,11. Величины указанных индексов находятся в установленных нами ранее пределах (1,5÷3,0) (пример 6, Фиг. 4 и 5).
τ
Сохранение параметров K и экспериментальных и расчетных значений мутности (τ) во все сроки хранения эмульсий соответствует данным о стабильности ФЛ, находящихся в поверхностном слое вокруг эмульгированных частиц, поскольку уровень малонового диальдегида спустя год хранения не отличался (в пределах погрешности определений) от исходных значений этого параметра [10].
Основные физико-химические параметры эмульсий (макропараметры) оставались в пределах, допустимых для физиологических значений крови: значения рН находились в пределах 7,0-7,2. Относительная вязкость (относительно воды) не превышала вязкости плазмы ~1,7 и составляла 1,45-1,49, что соответствовало сохранению размера и структуры частиц. Результаты бактериологического контроля показали, что все испытанные серии эмульсий ПФУ/ФЛ после 5 и 23 месяцев хранения стерильны.
Таким образом, изучение комплекса параметров, характеризующих качество эмульсий ПФУ/ФЛ, заявленного состава, показало воспроизводимость физико-химических параметров от серии к серии, а также их сохранение при хранении в незамороженном состоянии в течение 1-1,5 лет (первый этап, пример 5). В дальнейшем в другой группе наработанных эмульсий была подтверждена воспроизводимость изучаемых параметров и срок хранения увеличен до двух лет (второй этап, пример 7). Эти результаты свидетельствуют о прочности структуры частиц при хранении в незамороженном состоянии в течение 2-х лет.
Прочность структуры настолько значима, что добавление к эмульсии кровезаменителей (модельные условия: стресс воздействия при попадании в сосудистое русло) не сказывалось на параметрах качества эмульсий (пример 6). Это обстоятельство свидетельствует о совместимости эмульсий с кровезаменптелями.
τ
Статистический анализ полученных результатов показал, что полученные эмульсии ПФУ/ФЛ в течение ~ двух лет хранения при +4°С сохраняют следующие физико-химические параметры: средний диаметр и распределение частиц по размерам, однородность природы эмульгированных частиц, корпускулярную структуру частиц (или структуру двухслойного шара; интервал для K=1÷3). Эти результаты свидетельствуют о прочности оболочки эмульгатора (структурно-механического барьера) вокруг частиц in vitro (пример 8). Мы не встретили работ, в которых был бы достигнут подобный уровень стабильности эмульсий ПФУ/ФЛ.
В заключение следует сказать о следующих преимуществах заявленного изобретения перед прототипом и аналогами.
В настоящем изобретении дано научное обоснование состава и способа получения эмульсии ПФУ. Содержанием изобретения является системный подход при рассмотрении природы заявленной эмульсии как основы кровезаменителя. Во-первых, рассмотрен механизм газо-транспортной функции эмульсии при совместной циркуляции частиц ПФУ с кровью. Частицы ПФУ, занимая определенный объем на пути молекул кислорода от эритроцитов к тканям и углекислоты в противоположном направлении, ускоряют этот процесс диффузии газов. Этот фундаментальный процесс доказан на установке, моделирующей циркуляцию крови в организме. Во-вторых, основываясь на расчетных результатах о числе частиц в единице объема крови при внутривенном введении в организм пациента ~10 мл на кг массы тела эмульсии (10 об %) показано, что все клетки крови движутся в сосудистом русле в окружении нано частиц ПФУ. Это обстоятельство может и должно оказать влияние на их функциональное состояние. В третьих, изучение влияния заявленной эмульсии на морфофункциональное состояние клеток крови (тромбоциты, эритроциты, нейтрофилы) in vitro позволило высказать предположение практического характера об оптимальном соотношении эмульсии и крови in vivo: объем вводимой эмульсии не должен превышать ~ 20% от объема крови.
Решающее значение для практического применения эмульсии ПФУ/ФЛ имеют также сведения о сроках хранения этой среды в течение двух лет в незамороженном состоянии, а также воспроизводимость технологических режимов наработки эмульсий, доказанные на большом экспериментальном материале. Изобретение иллюстрируется на прилагаемых фигурах:
2
2
Фиг. 1 - Иллюстрация биофизического процесса доставки О и СО кровью при совместной циркуляции ПФУ частиц и эритроцитов.
Фиг. 2 - Зависимости скорости оксигенации dα/dt от степени оксигенации α при медленно (а) и быстродекарбоксилированной крови (б) при добавлении физраствора (1), эмульсии (2) и чистого эмульгатора (3).
Фиг. 3 - Зависимости скорости деоксигенации dα/dt от степени оксигенации α при быстро (а) и медленно декарбоксилированной крови (б) при добавлении физраствора (1), эмульсии (2).
τ
Фиг. 4 - Индексы взаимодействия (К) различных серий эмульсии AT с модифицированной сывороткой крови. По оси абсцисс- номера серий; по оси ординат-величины Кф.
τ
τ
Фиг. 5 - Значения индексов взаимодействия с сывороткой крови (К) для тех же серий эмульсий ПФУ/ФЛ разных сроков хранения в незамороженном состоянии. По оси абсцисс-срок хранения (месяц); по оси ординат-величины К.
τ
Фиг. 6 - Параметры К  для смесей эмульсии с кровезаменителями и сывороткой крови. Содержание полиоксидина (ПОК), полиоксифумарина (ПОФ) и рефортана (Реф) 10%, содержание NaCl 50%. Во всех случаях содержание сыворотки крови 10%.
Фиг. 7 - Изменение размеров частиц разных фракций полученных серий эмульсии ПФУ/ФЛ: сплошная линия - средняя фракция, пунктир - верхняя фракция, точечная - нижняя фракция. А - нативная эмульсия, Б - разведение 1:1. Средняя и верхняя фракции статистически неотличимы во все сроки хранения.
Фиг. 8 - Изменение мутности полученных серий эмульсии ПФУ/ФЛ в течение хранения. А -нативная эмульсия; Б - разбавленная 1:1 эмульсия. Сплошная линия - экспериментально найденные значения, пунктир-расчетные значения.
Цель и задача изобретения сравнительно с прототипом и аналогами выполнены.
Источники информации
1. Патент РФ 2259819 кл. 7 А61К 31/02, 9/107, А61Р 7/00.
2. И.Н. Кузнецова, Автореф. дис. док. биол. наук «Функциональная активность и стабильность эмульсий перфторуглеродов», С.-Петербург 1999 г., 38 с.
3. И.Н. Кузнецова//Перфторорганические соединения в биологии и медицине. Пущино, 2001. - с. 70-76.
4. Журнал физической химии 1993, т. 67, №3, с. 591-594.
5. A.M. Голубев и др. Реакции биологических систем при замещении крови эмульсиями перфторуглеродов. - М.: ТЕИС, 1993 г. 137 с.
5. Вестн. службы крови. - 2009. - №3, - С. 25-30.
6. Вестн. службы крови. - 2009. - №2. - С. 23-26.
7. Биофизика, 2001, т. 46, №4, с. 761-764.
8. Physiol. Rev. 1969. V. 49, №4, Р. 863.
9. Химико-фармацевтический журнал 2012, т. 46, №2, с. 52-56.
10. Химико-фармацевтический журнал 2013, т. 47, №6, С. 25-29.