СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАНУЛИРОВАННОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ
METHOD FOR PRODUCING A GRANULATED BIOCATALIZER BASED ON IMMOBILIZED YEAST CELLS FOR ESTER EXCHANGE

Область техники
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения биокатализатора иммобилизацией клеток дрожжей-продуцентов липазы на полимерных носителях, таких как полиакриламид. Такие биокатализаторы могут найти широкое применение, прежде всего в производстве биодизельного топлива и в производствах связанных с получением этиловых эфиров жирных кислот.
Уровень техники
Из существующего уровня техники известны гомогенные катализаторы реакции переэтерификации (минеральные кислоты и щелочи), которые нашли широкое применение в производстве биодизельного топлива. Использование кислот в качестве катализатора переэтерификации характеризуется низкими скоростями реакции и коррозией технологического оборудования. Использование щелочей позволяет проводить реакцию с высокой скоростью, но катализатор весьма чувствителен к содержанию свободных жирных кислот в масле или жире, что приводит к омылению и, как следствие, к снижению выхода и скорости реакции. В этой связи все больший интерес исследователей завоевывают катализаторы на основе ферментов - липаз, которые катализируют реакцию переэтерификации и нечувствительны к высокому содержанию свободных жирных кислот в масле (A. Bajaj, P. Lohan, Р.N. Jha, and R. Mehrotra, "Biodiesel production through lipase catalyzed transesterification: An overview," J. Mol. Catal. В Enzym., vol. 62, no. 1, pp.9-14, Jan. 2010). Ферменты широко используются в современной биотехнологической промышленности по причине их высокой специфичности к субстрату, что позволяет получать необходимый продукт с высокой степенью чистоты, практически избегая образования побочных продуктов реакции. При использовании ферментов в биореакторах, особенно в проточных, возникает необходимость закрепления ферментов на том или ином носителе для предотвращения вымывания и дезактивации молекул фермента. Полученные таким образом биокатализаторы показывают высокую эффективность. Кроме того, существуют методы иммобилизации ферментов на клеточной стенке различных микроорганизмов, что позволяет значительно увеличить эффективность биотехнологических процессов за счет улучшенного доступа субстрата к молекуле фермента. Так, в ФГУП «ГосНИИгенетика» был создан и запатентован рекомбинантный штамм дрожжей Yarrowia lipolytica Y-3600 - продуцент клеточно-связанной липазы. Штамм при выращивании в пробирках способен продуцировать клеточно-связанную липазу в количестве до 2700 единиц/г сухого веса (Е.Ю. Юзбашева, Т.В. Юзбашев, Т.Л. Гордеева, И.А. Лаптев, Т.В. Выборная, С.П. Синеокий, "ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytics - ПРОДУЦЕНТ КЛЕТОЧНО-СВЯЗАННОЙ ЛИПАЗЫ," 2012). Использование штамма, продуцирующего клеточно-связанную липазу, позволяет создавать на его основе эффективные биокатализаторы переэтерификации, так как доступность липазы для субстрата значительно выше, нежели у штаммов с внутриклеточной липазой.
Известен ряд запатентованных технических решений по созданию биокатализаторов на основе иммобилизованных в полимерном носителе микроорганизмов для проведения реакции переэтерификации триглицеридов (Патент РФ №2528778 С2, 2011 "БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ ЖИРОВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ", Патент РФ № RU 2539101 С2, 2013. "БИОКАТАЛИЗАТОР, СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ И СПОСОБ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА").
Авторы работы (Патент РФ №2528778 С2, 2011 "БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ ЖИРОВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ") предложили способ получения биокатализатора, для чего проводили аминирование гранулированного силикагеля или диоксида кремния дисперсностью 0,3-1,0 мм аминопропилтриэтоксисиланом. Полученный аминированный носитель обрабатывали водным раствором глутарового альдегида или глиоксаля концентрацией 2,0 мас. % или 5,0 мас. % в течение 2 ч. Иммобилизовывали на обработанном носителе путем рециркуляции через него раствора термостабильной липазы бактерий Geobacillus lituanicus в фосфатном буфере при температуре 0°C или 4°C при рН 6,5 в течение 12 ч. Полученный биокатализатор промывали водным раствором трис(гидроксиметил)аминометана гидрохлорида.
В работе (Патент РФ №RU2539101 С2, 2013. "БИОКАТАЛИЗАТОР, СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ И СПОСОБ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА) предложен способ получения биокатализатора для переэтерификации растительных масел, содержащий в качестве ферментативно-активной субстанции частично разрушенные клетки или клеточные лизаты рекомбинантного штамма-продуцента rE. coli/lip, носитель, состоящий из диоксида кремния и наноструктурированного углерода, и мальтодекстрина или высокомолекулярного полисахарида в качестве влагоудерживающего агента. Биокатализатор готовят путем смешения клеток или клеточных лизатов рекомбинантного штамма-продуцента rE. coli/lip с носителем и влагоудерживающим агентом углеводной природы с последующей сушкой и фракционированием. Способ переэтерификации растительных масел осуществляют как в периодическом режиме в реакторе смешения, так и в непрерывном режиме в проточном реакторе с неподвижным слоем биокатализатора при температуре 60-80°C.
Авторы работ (U. Stottmeister, "Kontinuierliche Citronensauresynthese mit in Polyacrylamidgel immobilisierten Candida Lipolytica-Zellen," Z. Allg. Mikrobiol., vol. 19, no. 10, pp.763-765, 1979) и (R. Berger and G. Langhammer, "Immobilisierung von Candida lipolytica-Zellen in Polyacrylamidgel zwecks Gewinnung von Citronensaure," Z. Allg. Mikrobiol., vol. 20, no. 1, pp.69-72, 1980) иммобилизовывали дрожжи вида Yarrowia lipolytica в полиакриламиде для получения лимонной кислоты из глюкозы. Для этого они использовали модифицированный способ иммобилизации ферментов, описанный в работах (Zaborsky, 1973, Colowick et. al., 1976).
Наиболее близким к заявленному техническому решению является работа (U. Stottmeister, "Kontinuierliche Citronensauresynthese mit in Polyacrylamidgel immobilisierten Candida Lipolytica-Zellen," Z. Allg. Mikrobiol., vol. 19, no. 10, pp.763-765, 1979), опубликованная 12.03.1979.
Для иммобилизации компоненты были взяты в следующих пропорциях: мономер акриламид (10-25%), сшивающий агент персульфат аммония (2,5-10%). Брали навеску влажной биомассы (0,25-1,0 г) и смешивали с 5 мл раствора мономера и сшивающего агента. Синтез полиакриламида проводился в атмосфере азота, так как кислород воздуха препятствует процессу полимеризации. Полученный гель пропускали через сито с диаметром 0,1 мм для получения гранул и промывали стерильным 1% физраствором до значения рН промывной воды не более 7. Процесс иммобилизации происходил в процессе полимеризации акриламида, который является токсичным для большинства микроорганизмов. Кроме того, в процессе иммобилизации использовался инициатор полимеризации - персульфат аммония, который способен денатурировать белки, снижая таким образом ферментативную активность.
Недостатками способа является трудоемкость процесса приготовления биокатализатора, высокая стоимость носителей для иммобилизации, значительное снижение ферментативной активности. При применении в качестве носителя полиакриламида его синтез проводился с использованием мономеров акриламида и сшивающих агентов, которые токсичны для микроорганизмов и приводят к денатурации белков.
Раскрытие изобретения
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является ускорение и упрощение способа получения биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток дрожжей без использования токсичных компонентов.
Техническим результатом, на которое направлено изобретение, являются получение гранул биокатализатора реакции переэтерификации масел на основе иммобилизованных в полиакриламиде клетках дрожжей.
Для этого был предложен способ получения гранулированного биокатализатора на основе иммобилизованных клеток дрожжей, характеризующийся тем, что включает наращивание биомассы дрожжей вида Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3600 - продуцента клеточно-связанной липазы, отделение биомассы, лиофильную сушку биомассы, приготовление суспензии биомассы путем добавления натрий-фосфатного буфера к биомассе, получение полиакриламидного геля с иммобилизованной биомассой, причем для этого осуществляют смешение сузпензии биомассы с гранулированным порошком полиакриламида марки Superfloc N-300, и последующее добавление додецилового спирта к полиакриламидному гелю с биомассой для образования гранул с иммобилизованной биомассой. Кроме того, смешение суспензии биомассы с полиакрил амидом осуществляют путем добавления суспензии биомассы в полиакриламид в соотношении 0,7 мл на 0,1 г; смешение суспензии биомассы с полиакриламидом осуществляют путем добавления полиакриламида в суспензию биомассы в соотношении 0,1 г на 0,7 мл; обработку полиакриламидного геля с иммобилизованной биомассой додециловым спиртом проводят в течение не менее 24 часов при периодическом перемешивании не менее 2 раз; обработку полиакриламидного геля с иммобилизованной биомассой додециловым спиртом проводят через 15-20 мин после иммобилизации биомассы в полиакриламидном геле.
Данные концентрации были определены исходя из эксперимента, в ходе которого была определена оптимальная концентрация биомассы в грануле полиакриламида. Оптимальная концентрация значит, что вся биомасса прочно захватывалась носителем (ПАА) и структура образующегося геля была однородной, т.е. без включений гранул ПАА, не затронутых гелеобразованием. Таким образом, были определены соотношения биомассы, натрий-фосфатного буфера и ПАА. Оптимальная концентрация лиофильно высушенной биомассы в ПАА составила 0,3 г/г, оптимальное соотношение суспензии (натрий-фосфатный буфер с биомассой) / ПАА составило 0,7 мл на 0,1 г. Минимальное время проведения процесса гелеобразования также было определено экспериментально: были взяты гранулы ПАА и к ним добавлялся фосфатный буфер и через разные промежутки времени при заданных соотношениях фиксировалось время, необходимое для образования однородной структуры геля. Минимальное время на образования геля при заданных концентрациях составило 15 минут.
Краткое описание чертежей
Признаки и сущность заявленного изобретения поясняются в последующем детальном описании, иллюстрируемом фигурами, где показано следующее.
На фиг. 1 - Методика приготовления гранул биокатализатора
где:
1 - приготовление суспензии биомассы добавлением натрий-фосфатного буфера к лиофильно высушенной биомассе;
2 - помещение полиакриламида в пробирку;
3 - добавление суспензии биомассы в пробирку с полиакриламидом;
4 - образование геля полиакриламида с включенной в него биомассой;
5 - добавление додецилового спирта и выдерживание в течение суток;
6 - удаление додецилового спирта и извлечение гранул.
На фиг. 2 - Методика приготовления гранул биокатализатора, где
1 - приготовление суспензии биомассы добавлением натрий-фосфатного буфера к лиофильно высушенной биомассе;
3' -дозирование суспензии биомассы в пробирку;
2' - добавление полиакриламида в пробирку с суспензией биомассы;
4 - образование геля полиакриламида с включенной в него биомассой;
5 - добавление додецилового спирта и выдерживание в течение суток;
6 - удаление додецилового спирта и извлечение гранул.
Осуществление и пример реализации изобретения
Приведенные ниже примеры иллюстрируют варианты заявленного изобретения, но не ограничивают его.
Пример 1
В качестве организма-продуцента липазы были выбраны дрожжи вида Yarrowia lipolytica рекомбинантный штамм Y-3600.
Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3600 характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки. Суточная культура в жидкой YPD среде (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2. глюкоза - 2, вода - остальное) представлена овальными, удлиненно-овальными, округлыми клетками размером 4.6-6.0×4.5-12.5 мкм. Почкование полярное или латеральное, на узком основании. К третьим суткам большинство клеток почкуются и образуют псевдомицелий.
Клетки хорошо растут на простых питательных средах. Колонии на мальтоагаре (возраст 1 неделя) кремового цвета, пастообразные, слегка приподнятые в центре, морщинистые, с фестончатым краем. Штрих на мальтоагаре непрерывный, плоский, блестящий, кремово-белого цвета, пастообразный, края ровные, со временем становится складчатым. Спор не образует.
Физиолого-биохимические признаки. Облигатный аэроб. Сахара не сбраживает.
Ассимилирует: сахарозу, глюкозу, D-галактозу (медленно), L-сорбозу, D-рибозу, этанол, глицерин, эритрит, адонит, D-маннит, сорбит и молочную, янтарную, лимонную, глюконовую кислоты.
Не ассимилирует: мальтозу, лактозу, целлобиозу,трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, D-ксилозу, L- и D-арабинозу, раммозу, дульцит, инозит, D-глюкозамин и глюкуроновую, 2-кетоглюконовую, 5-кетоглюконовую кислоты. Не ассимилирует нитраты. Не растет в безвитаминной среде, требует присутствия в среде тиамина, не требует биотина.
Оптимальное значение рН дня роста 5,5-7,0. Не растет при 37°C. Максимальная температура роста 35°C. Разжижает желатин. Растет на алканах. Гидролизует мочевину.
Штамм при выращивании в пробирках способен продуцировать клеточно-связанную липазу в количестве до 2700 единиц/г сухого веса (Е.Ю. Юзбашева, Т.В. Юзбашев, Т.Л. Гордеева, И.А. Лаптев, Т.В. Выборная, С.П. Синеокий, "ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica - ПРОДУЦЕНТ КЛЕТОЧНО-СВЯЗАННОЙ ЛИПАЗЫ," 2012.)
Липазную активность биомассы дрожжей определяли пара-нитрофенилбутиратным (pNPB) методом с использованием фотометрической детекции при длине волны 405 нм (P. Pickers, J.М. Nicaud, С. Gaillardin, J. Destain, and P. Thonart, "Carbon and nitrogen sources modulate lipase production in the yeast Yarrowia lipolytica").
Наращивание биомассы
Предварительно дрожжи выращивают на агаризованной богатой среде (г/л: глюкоза - 20, триптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 10, агар - 20) в течение 1 суток при температуре 30°C.
Инокулят выращивают на аналогичной жидкой среде без добавления агара в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 5 мл при соответствующих температурах в течение 20 часов.
2
4
2
4
4
2
4
2
4
5
Культивирование проводят в колбах (250 мл) с рабочим объемом 50 мл при соответствующих температурах и постоянном перемешивании (250 об/мин) в течение 5 суток на среде следующего состава (масс. %): KHPO - 0.085, KHPO - 0.015, MgSO - 0.05, NaCl - 0.01, CaCl - 0.01, (NH)SO- 0.2, дрожжевой экстракт - 0.1, глюкоза - 9, 100 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6.8. Засев питательной среды проводят из расчета 5×10 клеток на мл. В процессе культивирования осуществляют контроль рН среды, при снижении рН ниже 4.5 добавляют мел в концентрации 1 мас. %.
Отделение биомассы от культуральной жидкости
По прошествии 5 суток культуральную жидкость с дрожжами центрифугируют в течение 10 минут при 10000 об/мин. Культуральную жидкость отделяют от осадка биомассы декантированием.
Полученную биомассу промывают натрий-фосфатным буфером и снова центрифугируют в течение 10 минут при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют декантацией и биомассу замораживают при температуре -70°C.
Лиофильную сушку биомассы проводят в течение 48 часов в пенициллиновых флаконах.
Дальнейшие стадии осуществления способа показаны на Фиг. 1.
Стадия 1 - приготовления суспензии биомассы. Берут навеску лиофильно высушенной биомассы массой 2,143 г и помещают в мерную колбу объемом 50 мл. Затем в колбу добавляют натрий-фосфатный буфер (рН 7.2) до метки.
Полученный объем суспензии позволяет получить гранулы в количестве не менее 70 штук с концентрацией биомассы в грануле 0,3 г/г ПАА.
Стадия 2 - помещают полиакриламид (ПАА) в пробирку.
Берут навеску гранулированного порошка полиакриламида Superfloc N-300, которую помещают в пластиковые круглодонные пробирки объемом 15 мл.
Стадия 3 - добавление сузпензии биомассы в пробирку с ПАА. В пробирки пипеткой добавляют 0,7 мл суспензии биомассы.
Стадия 4 - образование геля полиакриламида с иммобилизованной биомассой в течение 15 минут. Для образования геля с включенной в него биомассой пробирки оставляют на время не менее 15 минут
Стадия 5 - добавление додецилового спирта к гелю. В пробирки пипеткой добавляют 10 мл додецилового спирта, закупоривают крышкой и оставляют на сутки с периодическим встряхиванием не менее двух раз в сутки. Через сутки на дне пробирки в растворе додецилового спирта образуются гранулы с иммобилизованной биомассой.
Стадия 6 - удаление додецилового спирта из пробирки. Додециловый спирт удаляется из пробирки пипеткой и гранулы помещаются в 50 мл подсолнечного масла для постепенного вытеснения додецилового спирта из гранул.
В результате было приготовлено 50 гранул с концентрацией биомассы 0,3 г/г ПАА
В качестве полимера использовался неионный промышленный флокулянт на основе полиакриламида Superfloc N-300 (производитель - Kemira, Финляндия)
Пример 2
Стадии осуществления способа показаны на Фиг. 2.
Стадия 1 - приготовления суспензии биомассы. Берут навеску лиофильно высушенной биомассы массой 2,143 г и помещают в мерную колбу объемом 50 мл. Затем в колбу добавляют натрий-фосфатный буфер (рН 7.2) до метки.
Стадия 3' - дозирование суспензии биомассы в пробирку. В круглодонные пластиковые пробирки объемом 15 мл пипеткой помещают 0,7 мл суспензии биомассы.
Стадия 2' - добавление полиакриламида в пробирку. В пробирку добавляется 0,1 г полиакриламида. Берут навеску гранулированного порошка полиакриламида Superfloc N-300, которую помещают в пластиковые круглодонные пробирки объемом 15 мл.
Стадии 4-6 осуществляются, как в примере 1.
В результате было приготовлено 50 гранул с концентрацией биомассы 0,3 г/г ПАА.
После двух суток отстаивания в подсолнечном масле гранулы биокатализатора, полученные по примеру 1 и 2, загружались в проточный биореактор для проведения реакции переэтерификации этиловым спиртом.
Переэтерификации подсолнечного масла проводилась в проточном биореакторе объемом 50 мл с загрузкой гранул биокатализатора в количестве 80 штук. Концентрация биомассы в грануле составляла 0,3 г/г полиакриламида. Рабочий объем подсолнечного масла составлял 200 мл. Этиловый спирт добавлялся ступенчато до конечного молярного соотношения масло/спирт 1:4. Процесс переэтерификации проводился при температуре реактора 25°C, расход спирто-масляной смеси - 200 мл/мин. Продолжительность процесса переэтерификации составила 48 часов.
Опеределение степени конверсии триглицеридов в этиловые эфиры жирных кислот проводилось методом тонкослойной хроматографии с использованием программного комплекса для анализа хроматограмм Sorbfil (Краснодар, Россия). Степень конверсии по примерам 1, 2 и 3 составила 33, 28 и 14% соответственно.
Таким образом, предложен способ получения биокатализатора для проведения реакции переэтерификации растительного масла этанолом с получением биодизельного топлива, позволяющий предотвратить образование экологически опасных отходов при производстве и проводить реакцию переэтерификации в проточном режиме.
Используемый в способе Флокулянт Superfloc N-300 доступен по цене и содержит в своем составе полностью полимеризованный полиакриламид без содержания мономеров, что продиктовано жесткими требованиями безопасности к флокулянтам в процессах водоподготовки.
Гранулы полиакриламида получались с использованием додецилового спирта, который обладает значительно более слабым денатурирующим действием на белки, чем, например, этиловый и метиловый спирты. Таким образом процесс приготовления гранул ведется с наименьшим воздействием на ферменты, что позволяет получать более активный катализатор. Полученные гранулы стабильны в таких растворителях, как гексан, диэтиловый эфир, хлороформ. Гранулы являются предпочтительной формой катализатора для использования в проточных системах, так как обладают наименьшим гидродинамическим сопротивлением, хорошей устойчивостью к деформации в потоке и обеспечивают эффективный массообмен между средой и активным компонентами в носителе. Кроме того, гранулированные катализаторы удобно дозировать при заполнении реакторов и так же легко выгружать, в отличие от монолитных катализаторов. Гранулированный катализатор данным способом получен в едином технологическом процессе и не требует трудоемкого изготовления, как в прототипе.