Формирование иммунного ответа на тимус-зависимые и тимус-независимые антигены: роль тимуса

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine»

типические изменения, связанные с процессом созревания и активации дендритных клеток.

Таким образом, сульфатированные полисахариды бурых водорослей, являются активаторами врожденного иммунитета, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных адъювантов и лекарственных средств нового поколения для создания противоинфекционной защиты организма.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Работа поддержана научным проектом (0545-2014-0011) ФАНО.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ахматова Н.К., Киселевский М.В. Врожденный иммунитет противоопухолевый и противоинфекци-онный. 2008. - М.: Практическая медицина. - 255 с.

2. Беседнова Н.Н. Морские гидробионты - потенциальные источники лекарств // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2014; 57(3): 4-10.

3. Fitton J.H., Stringer D.N., Karpiniec S.S. Therapies from fucoidan: an update.Mar. Drugs. 2015; 13(9): 5920-5946. doi: 10.3390/md13095920.

4. Kim S-Y., Joo H-G. Evaluation of adjuvant effects of fucoidan for improving vaccine efficacy. J. Vet. Sci. 2015; 16(2): 145-150. doi: 10.4142/jvs.2015.16.2.145.

5. Jun-O Jin, Wei Zhang, Jiang-Yuan Du et al. Fu-coidan can function as an adjuvant in vivo to enhance dendritic cell maturation and function and promote antigen-specific T-cell immune responses. PLoS One. 2014; 9(6): e99396. doi: 10.1371/journal.pone.0099396.

6. Тухватулин А.И., Логунов Д.Ю., Щербинин Д.Н. и соавт. ^П-подобные рецепторы и их адаптор-ные молекулы // Биохимия. 2010; 75(9): 1224-1243.

7. Hochrein H., O'Keeffe M. Dendritic cell subsets and toll-like receptors. Handb. Exp. Pharmacol. 2008; 183: 153-179. doi: 10.1007/978-3-540-72167-3_8.

8. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Chizhov A.O. et al. Water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the developmental conditions. J. Exp. marine Biol. Ecol. 2003; 294(1): 1-13.

9. Lebedynskaya E.A., Makarenkova I.D., Lebedyn-skaya O.V., et al. The effect of sulfated polysaccharides from brown seaweed Laminaria japonica on the morphology of lymfoid organs and functional characteristics of immunocompetent cells. Biochem. Moscow Sup-pl. Ser. B: Biomed Chemistry. 2015; 9(1): 86-94. doi: 10.1134/S1990750815010060.

10. Makarenkova I.D., Logunov D.Yu., Tukhvatulin A.I., et al. Sulfated polysaccharides of brown seaweeds are ligands of toll-like receptors. Biochem. Moscow Suppl. Ser. B: Biomedical Chemistry. 2012; 6(1): 75-80. doi: 10.1134/S1990750812010118.

11. Lutz M.B., Kukutsch N., Ogilvie A.L., et al. .An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 1999; 223(1): 77-92.

12. Meng J., Cao Y., Meng Y., Luo H., Gao X., Shan F. Maturation of mouse bone marrow dendritic cells (BMDCs) induced by Laminaria japonica polysaccharides (LJP). Int. J. Biol. Macromol. 2014; 69: 388-392. doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2014.05.018.

Сведения об авторах

Макаренкова Илона Дамировна - д.м.н., ведущий научный сотрудник НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова. 690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1. Тел. (423)2442-446; e-mail: ilona_m@mail.ru; Ахматова Н.К. - научный сотрудник НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва; Ермакова Т.П. - научный сотрудник Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток;

Беседнова Н.Н. - академик РАН, д.м.н., профессор НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова; Хотимченко М.Ю. - д.м.н., заведующий лабораторией фармакологии и биоиспытаний Школы биомедицины ДВФУ;

Семенова И.Б. - научный сотрудник НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва; Макаренков М.А. - преподаватель Тихоокеанский государственный медицинский университет, Владивосток; Звягинцева Т.Н. - научный сотрудник Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток.

© Коллектив авторов, 2017 г doi: 10.5281/zenodo.817827

Удк 611.42:612.42

А.В. Полевщиков1'2, Е.Л. Прозоровская1, И.В. Кудрявцев12, М.К. Серебрякова1

формирование иммунного ответа на тимус-зависимые и тимус-независимые антигены: роль тИМУСА

1 ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург

2 Дальневосточный федеральный университет, Владивосток

Работа посвящена оценке роли тимуса в формировании тимус-зависимого и тимус-независимого иммунного ответа. Целью исследования была была оценка уровней экспрессии костимулирующей молекулы CD28 и её функционального антагониста CTLA-4 (CD152) на субпопуляциях тимоцитов в ответ на иммунизацию эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), бактериальным липополисаридом (ЛПС) и введение полиоксидония. Материалы и методы. Работа выполнена на мышах линии СВА. Основным методом исследования стала многоцветная проточная цитометрия. Полученные результаты. В ответ на иммунизацию ЭТС и ЛПС на сроках 48-96 ч изменялась структура субпопуляций тимоцитов. При этом в ответ на тимус-зависимый антиген ЭТС на разных субпопуляциях возрастал уровень экспрессии CD28, а на иммунизацию тимус-независимым ЛПС - CD152 на поверхности и в цитоплазме тимоцитов. Вывод. Иммунный ответ на любые антигены все равно связан с тимусом, формирование иммунного ответа сопровождается изменением физиологической активности тимоцитов и косвенно свидетельствует о проникновении антигенов в тимус по ходу иммунного ответа. Характер ответа может определяться уровнем экспрессии молекул CD28 и CD152 на тимоцитах в процессе их созревания и дифференцировки.

Ключевые слова: тимус, иммунный ответ, CD28, CD152.

A.V. Polevshchikov1'2, E.L. Prozorovskaya1, I.V. Kudryavtsev12, M.K. Serebryakova1 THE FORMATION OF THE IMMUNE RESPONSE TO THYMUS-DEPENDENT AND THYMUS-INDEPENDENT ANTIGENS: THE ROLE OF THE THYMUS

1 Institute of Experimental Medicine, Saint-Petersburg, Russia

2 Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russia

The work deals with the evaluation of the role of the thymus in the formation of thymus-dependent and thymus-independent immune response. The aim of the study was to assess the expression levels of costimulatory molecules CD28 and its functional antagonist CTLA-4 (CD152) on subpopulations of thymocytes in response to immunization with fetal calf serum (FCS), bacterial lipopolysaccharide (LPS) and the introduction of polyoxidonium. Materials and methods. The work was performed on CBA mice. The main research method was multi-color flow cytometry. The results obtained. In response to immunization FCS and LPS on the time period 48-96 hrs changes the structure of subpopulations of thymocytes. At the same time in response to thymus-dependent antigen FCS on different subpopulations increased the level of expression of CD28, and the immunization with the thymus-independent LPS - CD152 on the surface and in the cytoplasm of thymocytes. Conclusion. The immune response to any antigens is still associated with the thymus, the formation of the immune response is accompanied by changes in the physiological activity of thymocytes and indirect evidence of the penetration of antigens in the thymus during immune response. The nature of the response can determine the level of expression of CD28 and CD152 molecules on the thymocytes during their maturation and differentiation.

Keywords: Thymus, immune response, CD28, CD152.

Введение. Разделение антигенов (АГ) на тимус-зависимые (ТЗ) и тимус-независимые (ТНЗ) проведено ещё в конце 1960-х гг. и основано на концептуальном анализе Дж.Миллера и Д.Особа [1]. Считается, что гуморальный ответ на ТЗ-АГ сопровождается Т-В-клеточной кооперацией и полностью соответствует современным представлениям о закономерностях гуморального иммунного ответа, в то время как на ТНЗ-АГ протекает за счет прямой активации В-лимфоцитов и не требует участия Т-клеток. Вместе с тем, исходные представления о наличии на ТЗН-АГ различных детерминант, обеспечивающих одновременное связывание и кластеризацию В-клеточного рецептора, В-клеточного ко-рецепторного комплекса CD19:CD21:CD81 и цито-киновых рецепторов не подтверждаются результатами исследования структуры бактериальных липополиса-харидов (ЛПС) и иных факторов, вызывающих тимус-независимый ответ [2].

Одновременно установлена роль костимуляционных молекул CD28 и CD152 в регуляции иммунного отве-

та [3]. Если связывание CD28 с лигандами (молекулы В7.1/7.2, или CD80/86) преимущественно повышает активацию Т-клеток, то связывание его гомолога С1ЪА-4 (CD152) оказывает ингибирующее воздействие. Ранее получены экспериментальные данные, свидетельствующие о более глубокой, чем считалось ранее, вовлеченности тимуса в процесс иммунного ответа [4, 5] и изменениях популяционного состава тимуса в ответ на индукцию апоптоза или введение ТЗ-АГ [6].

Целью работы была оценка уровней экспрессии костимулирующей молекулы CD28 и её функционального антагониста С^А-4 (CD152) на субпопуляциях тимоцитов в ответ на иммунизацию эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), ЛПС и введение полиоксидония (ПО).

Материалы и методы. Исследование проведено на 60 мышах линии СВА массой 18-20 г и возрастом 8-10 нед. Животных содержали в стандартных условиях при неограниченном доступе к воде и пище. Работу с животными вели в соответствии с правилами

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine» •

гуманного обращения с лабораторными животными. Мышей разделили на равные группы и иммунизировали внутрибрюшинно 0,1 мл ЭТС, либо 10 мкг ЛПС Salmonella typhimurium в объеме 0,1 мл, либо 25 мкг ПО в объеме 0,1 мл. Отдельная группа животных за 48 ч до иммунизации ЭТС получали внутрибрюшинно 1 мл раствора высокополимерного декстрана (60-80 кД) в объеме 1 мл. Контрольная группа получала 0,1 мл забуференного фосфатами 0,14 М апирогенного раствора NaCl. Тимусы мышей получали на точках 48, 72 и 96 ч после иммунизации и после гомогенизации и пробоподготовки оценивали экспрессию CD28, поверхностного и внутриклеточного CD152 на разных субпопуляциях тимоцитов методом проточной цито-метрии. Разделение тимоцитов на субпопуляции проводили с использованием панели моноклональных антител (CD4, CD8, CD25, CD28, CD44, CD45, CD152). Многоцветный анализ проводили на проточном цито-метре Navios™ (Beckman Coulter, США). Для каждого из образцов анализировали не менее 30000 одиночных клеток, исключая из анализа клеточные агрегаты путем учета данных по времени пролета частицы в осях прямого (FS) или бокового (SS) светорассеяния. Из статистических методов в работе применяли вычисление средних арифметических и ошибки среднего, а сравнение выборок проводили с использованием t-критерия Стьюдента, при этом достоверными считали различия между показателями при p<0,05 и менее.

Полученные результаты. Установлено, что в ответ на иммунизацию ЭТС (тимус-зависимый АГ) на сроках 48-96 ч изменялась структура субпопуляций тимоцитов. Достоверный прирост дважды негативных (CD4-CD8-) DN-тимоцитов формировался за счет субпопуляций DN1 и DN2, но не DN3 или DN4. Объём популяции дважды позитивных (CD4+CD8+) DP-тимоцитов оказался в целом весьма консервативным показателем, тем не менее, отмечен достоверный прирост объёма этой популяции через 48 ч после иммунизации ЭТС. Субпопуляции зрелых тимоцитов (CD4+ SP Т-хелперов и CD8+ SP Т-цитотоксических) увеличивалась в объеме в тимусе в 2-3 раза на сроках 48 и 96 ч после иммунизации. Экспрессия CD28 достоверно повышалась после иммунизации на субпопуляциях DN2-4, CD4+SP и CD8+SP на всех точках наблюдения после иммунизации, но не изменялась на DN1 и DP. Напротив, экспрессия поверхностного, и гораздо сильнее цитоплазматического CD152 после иммунизации тимус-зависимым АГ, хотя и была низкой, но достоверно снижалась ещё больше. Предварительное введение декстрана ускоряло прирост уровня экспрессии CD28 в ответ на ЭТС на 24 ч и повышало его амплитуду.

Напротив, в ответ на введение ЛПС уровень экспрессии CD28 падал для всех субпопуляций, но повышался уровень экспрессии CD152, особенно в цитоплазме (прирост примерно в 300 раз), особенно для всех SP. Важно, что в ответ на введение тимус-не-

зависимого антигена ЛПС наблюдался прирост всех DN-тимоцитов, а также CD8+, но снижался уровень CD4+ Т-хелперов и особенно драматически - DP-тимоцитов. Именно на двух последних субпопуляциях и был найден прирост экспрессии цитоплазмати-ческого CD152 от 0,01 до 27-29% позитивных клеток.

В ответ на введение ПО выраженных отличий от контроля не наблюдалось. Это касается как объема всех субпопуляций тимоцитов, так и уровня экспрессии CD28 и CD152, отмечена лишь слабая тенденция (р>0,05) изменений, сходных с ответом на тимус-независимый ЛПС.

Обсуждение. При анализе результатов, полученных после иммунизации животных различными антигенами, нельзя не обратить внимания на изменение объема популяций, при этом изменения происходят при введении всех антигенов, кроме ПО. Иными словами, результаты работы ещё раз подтверждают факт, что тимус гораздо сильнее вовлечен в иммунный ответ, чем постулирует современная теория. Существенно, что независимо от того, на каких сроках происходит уменьшение или увеличение DP-тимоцитов, эти события всегда сопровождаются противоположно направленным изменением DN1-4 и SP CD4+ и SP CD8+ субпопуляций. Показанная динамика, возможно, связана с созреванием CD4+ и CD8+ Т-клеток в ответ на введение антигена и необходимостью пополнения пула DP-тимоцитов за счет деления DN1-4, а обнаруженная закономерность отражает последовательность процессов, сопровождающих переход клеток из одной субпопуляции в другую. Однако процесс носит прерывистый, а не плавный характер, что косвенно указывает на различные механизмы сигнализации на разных стадиях созревания тимоцитов.

В соответствии с литературными данными, экспрессия CD28 впервые обнаружена на стадии DN3 [7], однако по нашим данным, полученным на ин-тактных животных, около 60% DN1 клеток мышей линии СВА и 30% DN1 клеток белых беспородных мышей также несут на своей поверхности этот маркер. При этом в ходе созревания DN-тимоцитов уровень экспрессии немного снижается на стадии DN3 и восстанавливается на стадии DN4. Максимальный уровень экспрессии CD28 отмечен на стадии DP, где 95-98% клеток позитивны по данному антигену. После введения различных антигенов наблюдаются изменения в уровне экспрессии CD28 во всех популяциях тимоцитов, кроме DP, в которых уровень экспрессии не меняется. Исключение составляет DP популяция после иммунизации ЛПС, где происходит резкое снижение не только объема популяции, но и экспрессии CD28. Взаимосвязь уровня экспрессии CD28 по субпопуляциям тимоцитов и введение ЭТС или декстран+ЭТС не выявлена, в отличие от иммунизации ЛПС. После введения ЛПС снижение экспрессии CD28 наблюдается на популяциях тимоцитов, где происходит резкое увеличение CD152.

Традиционно появление CD152 на поверхности клеток связывают с активацией Т-лимфоцитов и соответственно обнаруживают только на поверхности зрелых SP клеток [8]. В группе интактных животных небольшая поверхностная экспрессия отмечена на стадиях DN2 и DN3, однако маркер впоследствии исчезает на стадии DN4 и вновь появляется на стадии зрелых SP CD4+ и SP CD8+ клеток. При этом позитивных по CD152 DN3-клеток существенно выше по сравнению со стадией SP. В ответ на тимус-независимый ЛПС происходят очень существенные изменения структуры субпопуляций тимоцитов и набора их маркеров. Повышение уровня экспрессии CD152 на покидающих тимус зрелых CD4+ Т-клетках как раз и может быть механизмом развития «тимус-независимости», когда антиген-специфические CD4+, несущие CD152, оказываются не способными к пролиферации, что предопределяет развитие ответа исключительно через активацию и пролиферацию В-лимфоцитов и последующую продукцию ^М-антител.

Выводы. Иммунный ответ на любые (как ТЗ, так и ТНЗ) АГ все равно связан с тимусом, формирование иммунного ответа сопровождается изменением физиологической активности тимоцитов и косвенно свидетельствует о проникновении антигенов в тимус по ходу иммунного ответа. Есть основание предполагать, что феномен «тимус-независимости» связан с повышением уровня экспрессии CD152 в цитоплазме и на поверхности созревающих и покидающих тимус Т-клеток, в то время как при ответе на тимус-зависимые АГ на тимоцитах различной степени зрелости повышается уровень экспрессии ко-активационной молекулы CD28.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №15-04-05093 и 17-04-01760.

ЛИТЕРАТУРА

1. Miller J.F., Osoba D. Current concepts of the immunological function of the thymus. Physiol. Rev. 1967; 47(3): 437-520.

2. Lindroth K., Fernández Mastache E., Roos I., González Fernández Á., Fernández C. Understanding thymus-independent antigen-induced reduction of thymus-dependent immune responses. Immunology. 2004; 112(3): 413-419. doi: 10.1111/j.1365-2567.2004.01894.x.

3. Sharpe A.H. Mechanisms of Costimulation. Immunol. Rev. 2009; 229(1): 5-11. doi: 10.1111/j.1600-065X.2009.00784.x.

4. Васильев К.А., Полевщиков А.В. Повышение уровня экспрессии генов rag1 и tdt в тимусе в ответ на иммунизацию // Доклады Академии Наук. 2015; 462(6): 716-718. doi: 10.7868/S0869565215180231.

5. Зассеева М.Д., Полевщиков А.В. Анализ гистологических изменений тимуса при комбинированном введении гидрокортизона и антигена // Современные проблемы науки и образования. 2016; 2: 100-108. doi: 10.17513/spno.24306.

6. Старская И. С., Кудрявцев И.В., Гусельникова В.В., Серебрякова М. К., Полевщиков А.В. Уровень апоптоза Т-лимфоцитов, созревающих в интактном тимусе // Доклады Академии Наук. 2015; 462(2): 238-240. doi: 10.7868/S0869565215140273.

7. Williams J.A., Hathcock K.S., Klug D., Harada Y., Choudhury B., Allison J.P., Abe R., Hodes R.J. Regulated costimulation in the thymus is critical for T cell development: Dysregulated CD28 costimulation can bypass the pre-TCR checkpoint. J. Immunol. 2005; 175(7): 4199-4207.

8. Maszyna F., Hoff H., Kunkel D., Radbruch A., Brunner-Weinzierl M.C. Diversity of clonal T cell proliferation is mediated by differential expression of CD152 (CTLA-4) on the cell surface of activated individual T lymphocytes. J. Immunol. 2003; 171(7): 3459-3466.

Сведения об авторах

Полевщиков Александр Витальевич - д.б.н., профессор, профессор Департамента фундаментальной и клинической медицины Школы Биомедицины ДВФУ, ведущий научный сотрудник отдела иммунологии Института экспериментальной медицины, 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12; тел. +7(921)9527438; e-mail: ALEXPOL512@yandex.ru;

Прозоровская Екатерина Львовна - старший лаборант отдела иммунологии Института экспериментальной медицины, 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12, ИЭМ, отдел иммунологии;

Кудрявцев Игорь Владимирович - к.б.н., старший научный сотрудник отдела иммунологии Института экспериментальной медицины, старший научный сотрудник Департамента фундаментальной и клинической медицины Школы Биомедицины ДВФУ, 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12, ИЭМ, отдел иммунологии, тел. +7(921)6338021; e-mail: igorek1981@yandex.ru;

Серебрякова Мария Константиновна - научный сотрудник отдела иммунологии Института экспериментальной медицины, 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12, ИЭМ, отдел иммунологии, тел. +7(921)3287225; e-mail: m-serebryakova@yandex.ru.