Антилизоцимная активность в ассоциации облигатно-анаэробных микросимбионтов кишечника человека

Учредители:

Уральское отделение РАН Оренбургский научный центр УрО РАН

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2014, № 3 © Коллектив авторов, 2014 УДК 579.61

А.В. Салгина, Е.В. Иванова, Т.А. Бондаренко, Н.Б. Перунова

АНТИЛИЗОЦИМНАЯ АКТИВНОСТЬ В АССОЦИАЦИИ ОБЛИГАТНОАНАЭРОБНЫХ МИКРОСИМБИОНТОВ КИШЕЧНИКА ЧЕЛОВЕКА

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург, Россия

Цель исследования: оценить изменения антилизоцимной активности в ассоциации облигатно-анаэробных бактерий.

Материалы и методы: Выделение и идентификация анаэробных микроорганизмов проводилась в соответствии с руководством. Видовую идентификацию бактерий осуществляли с помощью MALDI TOF MS серии Microflex LT (Bruker Daltoniсs, Германия). Исследование антилизоцимной активности (АЛА) [14] облигатно-анаэробных микроорганизмов в условиях межмикробных взаимодействий проводили при добавлении стерильных супернатантов (продуктов жизнедеятельности) в питательный бульон. Данные исследования статистически обработаны с использованием непараметрических методов вариационной статистики [15].

Результаты: Изменение АЛА в ассоциации облигатных анаэробов позволило предположить наличие два основных типа связи между микросибионтами: синергидного и антагонистического.

Заключение: Полученные данные расширяют представления о механизмах меж-микробных взаимоотношений, основанных на изменении АЛА облигатно-анаэробных микросимбионтов в микросимбиоценозе кишечника при ассоциативном симбиозе человека.

Ключевые слова: облигатно-анаэробные микроорганизмы, межмикробные взаимодействия, антилизоцимная активность.

A. V. Salgina, E. V. Ivanova, T.A. Bondarenko, N.B. Perunova

ANTILYSOZYME ACTIVITY ASSOCIATION OBLIGATE ANAEROBIC MICROSYMBIONTS HUMAN INTESTINAL

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, UrB RAS, Orenburg, Russia

Aim: To evaluate the changes of anti-lysozyme activity of obligate anaerobic bacteria in their interaction in the association.

Materials and Methods: Isolation and identification of anaerobic microorganisms was carried out in accordance with the instruction. Identification of bacterial species was carried out by MALDI TOF MS. Аntilysozyme activity (ALA) of obligate anaerobes in terms of crossspecies interactions were performed by adding sterile supernatants (waste products) in nutrient broth. These studies are statistically processed using nonparametric methods.

Results: Change in ALA association obligate anaerobes suggesting the presence of two main types of communication between mikrosibionts: synergistic and antagonistic.

Conclusion: The data obtained are expanding understanding of the mechanisms of crossspecies interaction based on the change in ALA obligate anaerobic microsymbionts mikrosymbi-ocenosis in the intestine in human associative symbiosis.

Key words: obligately anaerobic organisms, cross-species interaction, antilysozyme activity.

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2014, № 3

Введение

В настоящее время благодаря современным методам молекулярногенетических исследований значительно расширились представления относительно видового состава микробиоты человека, однако неизменным остается тот факт, что облигатно-анаэробные бактерии составляют превалирующую по численности группу в биотопе дистального отдела толстого кишечника [1-3]. Не исключено, что высокая численность облигатно-анаэробной микробиоты обусловлена их важной ролью для организма хозяина: обеспечение колонизационной резистентности, участие в деградации токсинов, ферментов агрессии и защиты патогенных микроорганизмов, продукция витаминов, участие в метаболических и ферментативных процессах и др. [4, 5].

Известно, что при сосуществование микроорганизмов в биотопе между ними формируются различные взаимоотношения - конкурентные или кооперативные, благодаря которым образуется специфический микросимбиоценоз [6]. Исследованию механизмов межмикробных взаимоотношений между различными видами облигатных анаэробов посвящено ряд работ. Так, S. Bar-tosch et al. [7] и F.E. Rey et al. [8] установили, что сокультивирование штаммов Bifidobacterium bifidum и B. lactis приводит к увеличению их роста, а Bac-teroides thetaiotaomicron стимулировал рост B. hydrogenotrophica. Кроме того, в ассоциации облигатно-анаэробных бактерий происходит обмен генетическим материалом, как это показано на примере Bacteroides spp. и Clostridium spp. [9]. Формирование синергидных связей при совместной утилизации питательных субстратов выявлено на моделях B. longum/B. thetaiotaomicron; Bacteroides spp. /Clostridium spp.; B. adolescentis/Roseburia spp. и B. adolescentis/E. rectale [10-12].

Очевидно, что при рассмотрении межмикробных взаимоотношений с позиции ассоциативного симбиоза, включающего не только микросимбионтов, но и хозяина с его защитно-регуляторными системами, необходимо учитывать персистентный потенциал микробиоты. В частности, антилизоцимная активность было определена как «биомишень», посредствам которой оценивали характер межмикробных взаимоотношений при ассоциативном симбиозе человека [13].

Однако в настоящее время данные об изменении антилизоцимной активности в ассоциации облигатно-анаэробных бактерий отсутствуют, что и определило цель нашей работы.

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2014, № 3

Цель работы - оценка изменения антилизоцимной активности облигатно-анаэробных бактерий при их взаимодействии.

Материалы и методы

Материалом для исследования послужили 35 штаммов облигатноанаэробных бактерий родов Bifidobacterium, Eubacterium, Clostridium, Propio-nibacterium, Bacteroides. Выделение и идентификация анаэробных микроорганизмов проводилась в соответствии с руководством «Wadsworth-KTL anaerobic bacteriology manual» (2002) общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных и культуральных свойств. Видовую идентификацию бактерий осуществляли по прямому белковому профилированию с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с матричноактивированной лазерной десорбцией/ионизацией с использованием масс-спектрометра MALDI TOF MS серии Microflex LT с программным обеспечением Maldi BioTyper 3,0 (Bruker Dalton^s, Германия). Идентификацию микроорганизмов с расчетом коэффициента достоверности (Score) проводили с использованием программного обеспечения Maldi BioTyper 3,0.

Для выявления антилизоцимной активности (АЛА) бактерий использовали фотометрический метод О.В. Бухарина с соавт. [14]. Облигатноанаэробные микроорганизмы культивировали в жидкой питательной среде Schaedler (BBL, США) в анаэробном термостате (Binder, Г ермания) при 370С в течение 48 часов. Затем проводили измерение оптической плотности (OD) бульонной культуры против бульона (Y) на фотометре Elx808 (BioTek, США), длина волны 450 нм. Супернатант отделяли от микробных клеток центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут.

В качестве тест-штамма для определения АЛА использовали ацетони-рованную агаровую культуру Micrococcus luteus ATCC 15307. Культуру ре-суспензировали в физиологическом растворе, доводили оптическую плотность (ОП) тест-штамма до 0,30 (0,28-0,32).

На 1/15М фосфатном буфере (рН=6,2) готовили раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл.

Супернатант исследуемых микроорганизмов объёмом 0,9 мл смешивали с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубировали 60-120 мин при 370С. Затем 50 мкл смеси супернатанта с лизоцимом помещали в поли-стеролловый планшет по вертикальным рядам. Верхняя и нижняя лунки -

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2014, № 3 контроли: смесь питательного бульона и лизоцима. В лунки каждого ряда планшета вносили по 200 мкл суспензии микрококка многоканальной пипеткой. Замер оптической плотности проводили через 30 и 150 сек. после внесения в лунки микрококка.

По степени лизиса суспензии тест-штамма рассчитывали антилизоцим-ную активность исследуемой культуры по формуле:

А_Г1*С*

А~ Г2^Г ’где

A - антилизоцимная активность в микрограммах инактивированного лизоцима/мл супернатанта.

V! - объём (0,1 мл) раствора лизоцима исходной концентрации (20 мкг/мл).

V2 - объём (0,9 мл) супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма.

С - исходная концентрация лизоцима (20 мкг/мл).

У - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности.

А П0 - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 секунд.

АРк - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 секунд.

Антилизоцимную активность выражали в мкг/мл*ОР.

Данные исследования статистически обработаны с использованием непараметрических методов [15].

Результаты и обсуждение

Супернатанты Вifidobacterium spp. увеличивали АЛА у 75,0±1,2% штаммов бактероидов (с 0,9±0,01 до 1,55 мкг/мл*ОР) и пропионибактерий (с 0,8±0,01 до 1,9±0,01 мкг/мл*ОР), у 55,0±1,8% штаммов бифидобактерий (с 0,9±0,02 до 1,55 мкг/мл*ОР) и эубактерий (с 1,0±0,02 до 1,6 мкг/мл*ОР). Снижение АЛА отмечалось у 17,0±1,0 % клостридий (с 0,8±0,01 до 0,1±0,01 мкг/мл* ОР).

При изучении влияния супернатантов Bacteroides spp. на АЛА наблюдалось увеличение данного свойства у 87,0±2,0% бифидобактерий (с 0,99±0,02 до 1,5±0,01 мкг/мл* ОР), у 75±1,4% пропионибактерий (с 1,2±0,01

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2014, № 3 до 1,6±0,01 мкг/мл*OD) и у 65±2,3% эубактерий (с 1,1±0,03 до 1,7±0,01 мкг/мл*OD). Снижение АЛА отмечалось у 21,0±2,0% бактероидов (с 0,95±0,01 до 0,1±0,01 мкг/мл*OD).

При изучении влияния супернатантов Propionibacterium spp. на АЛА

облигатных анаэробов отмечалось увеличение свойства у 68,0±1,5% эубактерий (с 1,1±0,02 до 1,4±0,02 мкг/мл*OD), у 50±1,5% штаммов бифидобактерий (с 0,95±0,01 до 1,55± мкг/мл*OD) и пропионибактерий (с 1,3±0,01 до 1,55±0,01 мкг/мл*OD), а также бактероидов (с 0,9±0,02 до 1,72±0,01 мкг/мл*OD). Ингибирующий эффект встречался у 50,0±4,0% клостридий (с 0,8±0,03 до 1,62±0,01 мкг/мл*OD) и 33,0±2,8% бактероидов.

Супернатанты эубактерий увеличивали АЛА у 90,0±2,8% эубактерий (с 1,1±0,03 до 1,62±0,01 мкг/мл*OD), у 78,0±1,8% бифидобактерий (с 0,9±0,1 до 1,62±0,2 мкг/мл*OD) и у 65,0±1,4% пропионибактерий (с 1,2±0,2 до 1,7±0,1 мкг/мл*OD). Ингибирующий эффект наблюдался у 50,0±1,9% клостридий (с 0,8±0,1 до 1,62±0,1 мкг/мл*OD) и у 33,0±1,4% бактероидов (с 0,9±0,1 до 1,62±0,01 мкг/мл*OD).

При изучении влияния супернатантов клостридий на АЛА регистрировалось увеличение свойства у 77,0±2,7% бифидобактерий (с 0,9±0,1 до 1,5±0,1 мкг/мл*OD) и у 87,0±4,2% клостридий (с 0,8±0,1 до 1,62±0,1 мкг/мл*OD). Снижение АЛА наблюдалось у 67,0±1,8% эубактерий (с 1,0±0,1 до 1,5±0,1 мкг/мл*OD), у 33,0±1,2% бактероидов (с 0,9±0,1 до 1,62±0,1 мкг/мл*OD) и у 25,0±1,0% штаммов пропионибактерий (с 1,2±0,1 до 2,0±0,1 мкг/мл*OD).

Анализ полученных результатов можно представить в виде схемы (рис.). На рисунке видно, что по изменению АЛА в ассоциации облигатных анаэробов можно предположить наличие двух типов связей между микроси-бионтами: синергидного и антагонистического. Синергидная связь формировалась в ассоциации Bifidobacterium spp ./Bifidobacterium spp.; Bifidobacterium spp./Bacteroides spp.; Propionibacterium spp./Eubacterium spp.; Eubacterium spp./Eubacterium spp.; Eubacterium spp./Bifidobacterium spp., в которых происходило увеличение АЛА анаэробных бактерий под действием супернатантов микросимбионтов. Антагонистический тип был характерен для Propionibac-terium spp. /Clostridium spp. и Eubacterium spp ./Clostridium spp., при этом в

5

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2014, № 3 ассоциации бактерий отмечалось снижение АЛА микросимбионтов.

Bifidobacterium spy

Propioniba cterium spp. Clostridium spp

* Синергидный эффект

Антагонистический эф ф ект

Рис. Типы взаимодействий между облигатно-анаэробными бактериями кишечника человека в отношении антилизоцимной активности.

Заключение

Формирование микрофлоры регулируется сложной системой межмик-робных взаимодействий и макроорганизмом в процессе его жизни [16].

Полученные данные расширяют представления о механизмах межмик-робных взаимоотношений, основанных на изменении АЛА облигатноанаэробных микросимбионтов в микросимбиоценозе кишечника, при ассоциативном симбиозе человека.

ЛИТЕРАТУРА

1. Шестаков С.В. Метагеномика микробиома человека. Усп. соврем. биологии 2010. 30 (6): 531-543.

2. Duerden B.I. The isolation and identification of Bacteroides spp from the normal human faecal flora. J.Med.Microbiol. 1980. 13: 69-78.

3. Borriello S.P. Bacteria and Gastrointestinal Secretion and Motility. Scand. J. Gastroenterology. 1984. 93: 92-94.

4. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. М.: ГРАНТЪ, 1998. Т 1: 288 .

5. Ley R.E., Peterson D.A. et al. Ecological and evolutionary forses shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 2006. 124: 837-848.

6. Симбиоз и его роль в инфекции / Под ред. О.В. Бухарина. Екатеринбург: УрО РАН,

Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2014, № 3 2011. 300.

7. Bartosch S., Woodmansey E.J., Paterson J.C.M. et al. Microbiological effects of consuming a synbiotic containing Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, and oligofructose in elderly persons, determined by real-time polymerase chain reaction and counting of viable bacteria. Clin Infect Dis. 2005. 147: 238

8. Rey F.E, Faith J.J., Bain J. et al. Dissecting the in vivo metabolic potential of two human gut acetogens. The Journal of biological chemistry. 2010. 67: 210

9. Shoemaker, N. B., Vlamakis H., Hayes K., Salyers A.A. Evidence for extensive resistance gene transfer among Bacteroides spp. and among Bacteroides and other genera in the human colon. Appl. Environ. Microbiol. 2001. 74: 150.

10. Sonnenburg J.L. et al. Glycan foraging in vivo by an intestine-adapted bacterial symbiont. Science. 2005. 49: 17-26.

11. Scott K.P., Martin J.C., Chassard C. et al. Substrate-driven gene expression in Roseburia in-

ulinivorans: importance of inducible enzymes in the utilization of inulin and

starch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011. 79: 145.

12. Belenguer A. et al. Two routes of metabolic cross-feeding between Bifidobacterium adoles-centis and butyrate-producing anaerobes from the human gut. Appl. Environ. Microbiol., 2006. 72: 72-79.

13. Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Симбиотические взаимоотношения человека имикроор-ганизмов. Физиология человека. 2012. 38 (1): 128-138.

14. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина. 1999. 365 с.

15. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика. 1999. 459 с.

16. Янковский Д.С., Дымент Г.С. Микрофлора и здоровье человека. К.: ТОВ «Червона Ру-та-Турс». 2008. 552 с.

Поступила 1.08.2014

(Контактная информация: Салгина Анастасия Владимировна - аспирант Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, 460052, г. Оренбург, ул. Салмышская 10, кв. 55; 8(922)-896-41-49;

Иванова Елена Валерьевна - к.м.н., ведущий научный сотрудник Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН 460052, г. Оренбург, ул. Джангильдина 15, кв. 126; 8(961)-929-18-72;

Бондаренко Таисия Александровна - научный сотрудник Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН 460026, г. Оренбург, ул. Карагандинская 86, кв. 36; 8(922)-816-73-01;

Перунова Наталья Борисовна - д.м.н., заведующий лабораторией Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН; адрес: 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, тел. 8