УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОЛИГО- И ПОЛИСАХАРИДОВ

Полезная модель относится к области биотехнологии и пищевой промышленности, а именно, к биосенсорным аналитическим устройствам. Биосенсор может быть использован для определения содержания олиго- и полисахаридов, в частности, крахмала в реальных образцах пищевых крахмалосодержащих продуктов: крупы, мука и другие продукты.
Для многих отраслей пищевой промышленности, таких как хлебопекарная, кондитерская, а также бродильное производство необходимо выполнять анализ содержания крахмала в сырье, в готовой продукции и в ходе ферментационного процесса.
Известные методы определения крахмала являются трудоемкими. Наиболее распространены физико-химические методы анализа крахмала. Колориметрический метод основан на свойстве крахмала образовывать ярко окрашенные комплексы с йодом (Рихтер М., Аугустат З., Ширбаум Ф. Избранные методы исследования крахмала. Пер. с нем. М.: "Пищевая промышленность", 1975 г. - стр.122-123). Однако процесс образования полисахарид-йодных комплексов очень специфичен и сильно зависит от внешних условий - температуры, рН, амилозо-амилопектинового соотношения в крахмале.
При применении поляриметрического метода определения крахмала (метод Эверса) необходимо отделять все оптически активные компоненты, например, белки (Авдусь П.Б., Сапожникова А.С. Определение качества зерна, муки и крупы. Изд. 2-е. М.: Колос, 1967. С.166-169).
Существуют также биохимические методы определения крахмала. Для этих целей используются каскадные ферментативные реакции гидролиза крахмала и определения субстратов в гидролизате, например, основанные на амилоглюкозидаз-гексокиназ-глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной
rd
либо на α-амилаз-глюкозидаз-глюкозооксидаз-пероксидазной трансформации (Beutler H. Methods of Enzymatic Analysis, 3 ed., 1984, V.6, P.2-10).
В этих методах применяется спектрофотометрическая детекция конечного продукта. Такие анализы дороги и не могут быть широко использованы в технологических процессах.
Описаны различные биосенсорные подходы для детекции олиго- и полисахаридов. Один из способов заключается в проведении внешнего ферментативного гидролиза образца до глюкозы и определении содержания глюкозы глюкозооксидазным (ГОД) сенсором.
Так, например, для определения содержания р-глюканов в зерновых культурах и крупах β-глюканы экстрагируют из образцов и затем инкубируют с лихеназой и β-глюкозидазой (Boyaci I.H., Şeker U.Ö.Ş., Mutlu M. Determination of β-glucan content of cereals with an amperometric glucose electrode. // Eur. Food Res. Technol. 2002. V.215. P.538-541). После ферментативной инкубации свободную D-глюкозу, образующуюся в результате действия ферментов на Р-глюканы, определяют амперометрическим ГОД электродом. Линейный диапазон детекции β-глюкана составляет 0-8%.
Второй способ детекции крахмала заключается в проведении непосредственного гидролиза крахмала в анализаторе. Для этого в рабочий раствор вводят постоянное количество глюкоамилазы и крахмал. Количество глюкозы, полученное при гидролизе крахмала, определяют ГОД сенсором (Тернер Э., Карубе И., Уилсон Дж. Биосенсоры: основы и приложения. M.: Мир, 1992. 614 с). Данные подходы довольно дороги, ввиду необходимости использовать амилолитические ферменты в достаточно больших количествах.
Более экономичный подход заключается в коиммобилизации глюкозооксидазы и глюкоамилазы для определения сахаридов, проникающих через защитную диализную мембрану, покрывающую биферментный слой (Renneberg R., Scheller F., Rieldel К., Litschko E., Richter
M. Development of anti-interference enzyme layer for α-amylase measurements in glucose containing samples // Anal. Lett. 1983. V.16 (B12). P.877-890). Недостаток метода заключается в использовании довольно сложного способа иммобилизации.
В биосенсорах для детекции продуктов гидролиза крахмала в качестве рецепторных элементов используют также клетки микроорганизмов. Микробный сенсор с использованием клеток бактерий Bacillus subtilis для определения активности бактериальной α-амилазы был разработан Renne-berg с соавт. (Renneberg R., Riedel К., Liebs P., Scheller F. Microbial and hybrid sensors for determination of α-amylase activity // Anal. Lett. 1984. V.17 (B5). P.349-358). Принцип анализа основан на измерении скорости окисления продуктов ферментативного расщепления крахмала микробными клетками. Микробный сенсор на основе клеток Bacillus subtilis предназначен для детекции мальтозы, образующейся при расщеплении крахмала α-амилазой. Для проведения анализа образцы α-амилазы предварительно инкубируют с крахмалом в течение 30 мин, затем, пробу вносят в измерительную ячейку биосенсора. Время анализа одной пробы составляет 30 мин.
В работе (Рыбакова Е.В., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Китова А.Е., Кузмичев А.В., Решетилов А.Н. Биосенсорный анализ крахмала: применение гомогенного гидролиза с детекцией глюкозы ферментным и микробным сенсорами // Сенсорные системы. 2005. Т.19. №1. с.93-99) авторы предложили упрощенную схему анализа крахмала. Содержание крахмала в пробе оценивают путем его гидролиза промышленным ферментным препаратом глюкоамилазы Алкоголазой II 400 (Alltech) непосредственно в измерительной ячейке с одновременной детекцией концентрации образующейся глюкозы биосенсором. Этот биосенсор представляет собой кислородный электрод с биорецептором - иммобилизованными на носителе бактериальными клетками Gluconobacter oxydans subsp. suboxydans B-885. Биосенсор позволяет выполнять анализ крахмала при его содержании в измерительной ячейке от 0.003 до 0.05% (масса/объем).
Недостатком биосенсора является узкая субстратная специфичность используемого штамма.
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель - создание устройства для определения содержания олиго - и полисахаридов, в том числе, крахмала.
Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой полезной модели, заключается в том, что предлагаемый биосенсор обладает более широкой субстратной специфичностью по отношению к ди- и трисахаридам.
Сущность полезной модели заключается в том, что биосенсор для определения олиго- и полисахаридов включает электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки штамма бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industries В-1280.
Биосенсор чувствителен к наличию олигосахаридов - целлобиозы, мальтозы, мелибиозы - и может быть использован для их определения.
На фиг.1 представлена схема устройства для определения полисахарида - крахмала. Показан увеличенный фрагмент электрода Кларка с иммобилизованным на носителе биорецептором.
Предлагаемое устройство для определения олиго- и полисахаридов состоит из следующих элементов: биосенсора, состоящего из преобразователя - электрода Кларка (1), на котором размещен биорецептор (2), представляющий собой иммобилизованные на носителе клетки штамма бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industries В-1280, а также измерительной кюветы (3) и магнитной мешалки (4).
Для регистрации сигнала биосенсора используют прибор, определяющий зависимость тока от времени - Electrochemical testing system IPC2000, подключаемый к кислородному электроду и компьютеру.
Для формирования микробного биосенсора используют штамм бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industries В-1280 (получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов).
Для получения биомассы бактерий используют питательную среду, содержащую сорбит и дрожжевой экстракт (г/л): сорбит - 20, дрожжевой экстракт - 2.
Иммобилизацию клеток штамма Gluconobacter oxydans subsp. industries В-1280 осуществляют физической сорбцией на фильтрах из стекловолокна (тип GF/A, Whatman).
Биосенсор работает следующим образом.
Электрод Кларка с размещенным на нем биорецептором, содержащим иммобилизованные клетки штамма Gluconobacter oxydans subsp. industries В-1280, погружают в измерительную ячейку объемом 2 мл с 30 мМ калий-фосфатным буфером (рН 6.6) и регистрируют силу тока, отражающего содержание кислорода в среде (фоновое). Затем, вносят 5 мкл раствора глюкоамилазы и анализируемую пробу, содержащую крахмал (100 мкл). Глюкоза, образующаяся в результате ферментативного гидролиза крахмала, окисляется бактериальными клетками на поверхности электрода Кларка.
Измерения проводят при непрерывном перемешивании при комнатной температуре.
После регистрации сигнала биосенсора (зависимость силы тока от времени) кювету промывают буферным раствором. Рассчитывают величину максимальной скорости потребления кислорода (ответ сенсора) (dI/dt, нА/с) и определяют концентрацию крахмала по предварительно построенной калибровочной кривой.
На фиг.2 приведен вид сигнала биосенсора на введение пробы, содержащей крахмал.
На фиг.3 представлена калибровочная зависимость биосенсора на основе клеток штамма бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industries B-1280 для определения крахмала, отражающая зависимость ответа биосенсора от концентрации крахмала в водном растворе.
Для построения калибровочной зависимости при определении крахмала в измерительную кювету сенсора вносят различные количества крахмала при постоянной концентрации раствора глюкоамилазы.
Диапазон детекции крахмала составляет 0.003-0.05%, время анализа (время ответа, включая время отмывки) - 10-15 мин.
Для проведения гидролиза крахмала и крахмалсодержащих образцов используют промышленный препарат глюкоамилазы - Алкоголазу II 400 (Alltech). Декларированная активность составляет 400 ГлА. В экспериментах используют диализованную глюкоамилазу.
Стандартный раствор крахмала готовят с соответствии с методикой (Рухлядева А.П., Полыгалина Г.В. Методы определения активности гидролитических ферментов. - М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1981, стр.220).
Предварительную пробоподготовку муки осуществляют следующим образом. Навеску образцов муки, массой 0.5 г, помещают в коническую колбу на 100 мл, при взбалтывании приливают 100 мл горячей дистиллированной воды, отмечают на стенке колбы уровень жидкости и выдерживают в термостате при 70°С в течение 2 часов (содержимое колбы необходимо тщательно перемешивать каждые 5 мин).
В качестве референтного метода используют поляриметрический, основанный на стандартном методе Эверса (ГОСТ 10845-98 Зерно и продукты его переработки. Метод определения крахмала).
Содержание крахмала, определенное методом Эверса, в пшеничной муке составляет 70.2±0.6%, в ржаной муке - 56.3±0.6% (число измерений n=6). Содержание крахмала, определенное при помощи микробного сенсора, составляет 69±1% в пшеничной муке и 55±1% в ржаной муке. Статистически значимых различий между результатами, полученными поляриметрическим и биосенсорным методами, не выявлено (расхождения в результатах определения этими методами не превышают 1.3%).
Анализ содержания олигосахаридов (целлобиозы, мальтозы и мелибиозы) выполняют в аналогичных условиях без добавления глюкоамилазы.
Для расчета концентрации олигосахаридов используют калибровочные кривые, построенные аналогично описанному для крахмала. Диапазон детекции целлобиозы и мелибиозы составляет 0.05-5 мМ, мальтозы - 0.1-5 мМ.
Таким образом, предлагаемый биосенсор обеспечивает быстрое определение содержания крахмала без использования сложного дорогостоящего оборудования.
По сравнению с ранее использованным штаммом Gluconobacter охуdans subsp. suboxydans используемый в предлагемом биосенсоре штамм бактерий обеспечивает быстрое определение содержания крахмала при использовании ферментативного гидролиза с помощью глюкоамилазы, а также целлобиозы, мальтозы и мелибиозы (без использования ферментативного гидролиза).