К ВОПРОСУ ФОРМИРОВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ НАСЕКОМЫХ К BACILLUS THURINGIENSIS

Вестник защиты растений, 2, 2008

19

УДК 575.126:632.3

К ВОПРОСУ ФОРМИРОВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ НАСЕКОМЫХ К BACILLUS THURINGIENSIS

Т.И. Патыка, В.П. Ермолова, Н.В. Кандыбин

Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии, Санкт-Петербург

В нашей стране, как и во всем мире, особенно широко и успешно ведутся поисковые исследования по разработке микробных препаратов на основе оригинальной группы бактерий Bacillus thuringiensis. Во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии создана серия биопрепаратов энтомопатогенного действия на основе Bt с различным спектром назначения, которые нашли широкое применение в микробиологической и сельскохозяйственной практике: биток-сибациллин, бактокулицид, бацикол и другие. В связи с этим возникла необходимость изучения возможного формирования у популяций вредных насекомых резистентности к этим бактериям и биопрепаратам на их основе.

Для продуктивного сельскохозяйственного производства требуется постоянное применение средств защиты растений от вредителей, сорняков и возбудителей болезней сельскохозяйственных культур. В настоящее время значительную долю средств защиты растений составляют пестициды химического синтеза. Однако массированное применение пестицидов в растениеводстве приводит к тому, что многие из них, попадая в почву, водоемы, накапливаясь там в больших количествах или трансформируясь в метаболиты, разрушают эволю-ционно сложившиеся биоценотические связи (в большей или меньшей мере, в зависимости от регламентов их использования), сдвигая экологический гомео-стаз и нарушая всю экосистему в целом. Происходит не только загрязнение окружающей среды, но и снижение качества и конкурентоспособности получаемого продовольствия, наносится тем самым ощутимый вред здоровью людей (Черников и др., 2000; Indicators and Environmental Impact Assessment, 2001).

В последнее время выявился еще один очень существенный негативный фактор широкого применения инсектицидов, а именно - формирование в ареалах популяций насекомых-вредителей с разноуровневой резистентностью: групповой, множественной к тем или иным группам инсектицидов, а также с перекрестной (кросс-резистентностью) к нескольким препаратам, что в свою оче-

редь требует увеличения доз препаратов и кратности обработок при их применении. Возникли такие выражения, как "ДДТ-устойчивые мухи, комары". Если в 1945 г. были обнаружены резистентные популяции членистоногих, относящихся к 12 видам, то к середине 1980-х годов -уже более 500 видов. В 1990 г. было зарегистрировано 198 видов членистоногих, имеющих эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение, у которых отмечались популяции, резистентные к различным по химической структуре ин-сектоакарицидам (Keiding, Jespersen, 1991; Vector Resistance to pesticides, 1992; Сухорученко, 2001; Еремина, Рославцева, 2006). Идет интенсивное формирование устойчивых популяций членистоногих к длительно применяемым инсектоакари-цидам. Около 50 видов насекомых-фитофагов перешли из разряда второстепенных в категорию экономически значимых вредителей с повышенной опасностью для возделываемых культур (Коваленков, Соколов, 1999; Коваленков, Столяров, 2000). Зарегистрировано 12 видов, которые стали повреждать несвойственные для них сельскохозяйственные культуры (Коваленков, Тюрина, 2001). На сегодняшний день известно более 700 видов насекомых, которые приобрели резистентность к разным группам инсектицидов.

Таким образом, идет процесс формирования устойчивых популяций на сельскохозяйственных культурах, носящий

непрерывный характер. Насекомые демонстрируют существенную генетическую пластичность.

Наличие в агроценозах резистентных вредителей исключает возможность оптимизировать фитосанитарную обстановку при помощи только химического метода, необходимы его упорядочение и привлечение современного набора биологических и других средств, освоение многовариантной тактики биоценотиче-ского контроля (Захаренко и др., 2005; Павлюшин, 2006). Надежной альтернативой инсектицидам наряду с агротехническими приемами и энтомофагами, несомненно, выступают микробиологические средства, которые по экологической целесообразности, стабильности значительно превосходят инсектициды (Кандыбин и др., 1989; Кандыбин, 1991; Патыка, 2007).

Микробиологические средства (биопрепараты) в отличие от инсектицидов химического синтеза обладают строгой селективностью действия. Микроорганизмы, как продуценты биопрепаратов, в силу закона биологической буферности не могут накапливаться в почве, водоемах, не загрязняют агроландшафтов.

В ассортименте биологических препаратов фитозащитного назначения ведущее положение занимают энтомопатоге-ны Bacillus thuringiensis (Bt) (Кандыбин, Барбашова, 1976; Кандыбин, 1989,1990, 2005), обладающие уникальными особенностями и многосторонним действием на насекомых-вредителей. Разностороннее действие биоагентов Bt складывается из параметров, обусловленных взаимоотношением "патоген-хозяин", то есть сопровождается целым спектром прямых и последовательных воздействий патогена на своего хозяина (антифидантное, мета-токсическое действие, состоящее из физиологического, тератогенного, дерепро-дукционного эффектов, а также эпизо-отологические возможности).

Специфичность механизма действия энтомопатогенов Bt позволяет сохранять нецелевые объекты (полезную энтомо-фауну, рыб, теплокровных животных), гарантирует безопасность человека и ок-

Вестник защиты растений, 2, 2008 ружающей среды (Кандыбин и др., 1977; Кандыбин, 1980; Кандыбин и др., 1992).

Токсикологические исследования, проводимые в течение 40 лет во всем мире, показали безопасность этих микроорганизмов и их метаболитов, включая инсектицидные белки и другие вещества, что позволяет широко их использовать в практике биологического контроля насекомых (Knowles, Ellar, 1984; Hofte, Whitely, 1989; Knowles, 1994; Baum at all, 1999; Велчев, 2000; Кандыбин, Тихонович, 2000).

Микробные препараты на основе Bt технологичны в производстве и применении, имеют неисчерпаемые ресурсы для их производства и широкого использования (Кандыбин, 1991,2006; Ткачева, 1999).

В настоящее время существующие Bt-разновидности включают более 70 вариантов (серотипов), обладающих различным спектром действия и уникальной селективностью в отношении широкого круга насекомых-хозяев из отрядов Lepidoptera, Hymenoptera, Díptera, Coleoptera (Кандыбин, Лысенко, 1978; Лысенко и др., 1979; Schnepf, Crickmore, 1998; Кандыбин, 2005,2006). Подобная избирательность непосредственно связана с функциональными характеристиками эн-томотоксинов Bt и определенной биохимической структурой как самих токсинов, так и инфицированных насекомых.

Скрининг штаммов Bt и изучение их вариабельности с энтомоспецифичными токсинами во всем мире продолжается. Генетическое разнообразие токсинов Bt, несомненно, играет важнейшую экологическую и эволюционную роль: оно способствует развитию высокой адаптивной возможности и выживанию подвидов эн-томопатогенной бактерии в различных биоценозах.

Определение уровня чувствительности насекомых к используемым и рекомендуемым инсектицидам является необходимым элементом при планировании и осуществлении программ фитозащитных мероприятий. Резистентность - динамичное явление, развивающееся в различных пределах у разных видов и даже у одного и того же вида при различной нагрузке

Вестник защиты растений, 2, 2008 применяемых инсектицидов. Для выявления и последующего мониторинга возможной резистентности насекомых в природных условиях необходимо пользоваться относительно простыми методами, позволяющими ограниченному по численности персоналу проводить исследования в короткие сроки. В качестве руководства могут быть использованы диагностические (дискриминирующие) концентрации (дозы), которые усовершенствованы применительно к регионам, виду членистоногих и локальным популяциям.

По-видимому, характер и механизмы формирования резистентности к энтомо-патогенам совершенно иные, чем при интоксикации инсектицидами. Материалов на этот счет очень мало, да к тому же они противоречивы (Кандыбин, 2006). Эти механизмы не обеспечивают действие всего естественного потенциала устойчивости. Есть лишь несколько примеров фактических экспериментов на лабораторных линиях насекомых, в частности на моли капустной (Plutellidae, Plutella xylostella L.J, которая пока является единственным видом, у которого выявлено развитие резистентности к биопестицидам, в том числе и к Bt ssp. kurstaki, в полевых условиях. После 10 генераций этого вредителя отмечен процесс формирования резистентности, хотя механизмы пока изучены недостаточно. Существенное отличие инсектицидов от энтомопато-генов в том, что первые вызывают токсикоз, а вторые инфекционную патологию, сопровождаемую токсическим и септическим процессами. Отсюда пути и методы преодоления энтоморезистентности тоже различны.

В связи с вышеизложенным правомерно поставить вопрос - возможно ли аналогичное массовое формирование резистентности или иммунитета у насекомых к энтомопатогенам и биопрепаратам на их основе. В известной нам специальной литературе такие данные фрагментарны и разноречивы, а, следовательно, возникает необходимость уделить особое внимание состоянию этого вопроса в отношении некоторых видов насекомых.

Для определения уровня резистентности пользуются следующими показателями:

- летальной дозой, соответствующей количеству микробных клеток, которые при определенном способе заражения вызывают гибель 95%, 70%, 50% чувствительных организмов определенного вида, массы и возраста на протяжении определенного времени (LDg5, LD70, LD5o);

- показателями резистентности (ПР), которые рассчитывают как отношение ЛК5о (ЛКд5) в процентах или ЛД5о (ЛДд5) в мкг/г для природной популяции к аналогичному параметру для чувствительной популяции.

По ряду причин первоначальные исследования мы начали с экзотоксиноген-ными штаммами: Bac. thuringiensis var. thuringiensis (BtH±) и Bac. thuringiensis var. darmstadiensis (BtHw) и в качестве тест-насекомого избрали комнатную муху (Musca domestica L.) лабораторной популяции.

У популяций M. domestica, являющихся санитарно-эпидемиологическим объектом, подвергающимся систематическому инсектицидному прессингу, уже давно установлено формирование резистентности к инсектицидам (например, к хлорорганическим - ДДТ, гексахлорану и др.).

Методика исследований включала три основные позиции.

1) Определение биологической активности BtH¡, BtH¡0 по отношению к преимаги-нальной (личиночной) стадии развития лабораторной линии Musca domestica в зависимости от экзотоксинообразования (в-экзотоксина), выраженной в ЛК5о.

2) Сравнительная оценка ЛК5о контактной и интактной популяций M. domestica от 1 до 10 поколения.

3) Отбор пупариев контактной и ин-тактной популяций до 800-1000 экз. для каждого поколения с целью выявления признаков нарушения метаморфоза.

Контактную популяцию имаго M. domestica получали следующим образом: сублетальной дозой патогена Bt (разведение КЖ 1:32) заражали личинок 2-суточного возраста интактной популя-

ции. Указанная доза соответствовала 3.12 мкл препарата на 1 г корма и вызывала 30-50% гибели личинок.

Выжившая часть личинок развивалась до стадии окукливания. Собранные пупарии помещали в изолированный садок до вылета имаго и получения следующей контактной генерации. Обычно готовили 25-30 повторностей варианта с сублетальной дозой заражения на личинках мух с целью получения контактной популяции имаго в необходимом количестве, способном обеспечить непрерывное проведение опытов до 10 поколения включительно.

В питательную среду постоянного состава для содержания контрольной ин-тактной популяции M. domestica добавля-

Вестник защиты растений, 2, 2008 ли стерильную воду, параллельно использовался контрольный вариант с добавлением в корм стерильной питательной среды, предназначенной для культивирования энтомопатогенов Bt.

На рисунке 1 представлена блок-схема последовательного инфицирования и оценки восприимчивости генераций контактной популяции Musca domestica к энтомопатогенам BtHi и BtH¡Q.

Важно отметить, что селекция на устойчивость к Bt в лабораторных условиях сильно отличается от селективного отбора в поле. Механизмы формирования резистентности лабораторной популяции, несомненно, адекватны искусственным условиям обитания и развития популяции.

Рис. 1. Блок-схема последовательного инфицирования энтомопатогенами BtH1 и BtHw контактных популяций M. domestica и оценки биологической активности по ЛК50.

Тем не менее, мы считаем, что лабораторные эксперименты как во всяком исследовании очень полезны и существенны для выбора путей и методов широкомасштабных исследований в данном направлении.

Проведенные исследования по выяв-

лению возможного формирования энто-морезистентности у комнатной мухи к ВШ^ и ВШю при инфицировании личинок сублетальными дозами показали, что на протяжении десяти генераций резистентность не возникла. Восприимчи-

Вестник защиты растений, 2, 2008

23

вость личинок интактной и контактных популяций до десятой генерации была примерно на одном уровне (рис. 2). Незначительная разница по ЛК5о, с учетом объема выборки опыта, скорее свидетель-

4 -,

3 -

2 -

1 -

LK50 мкл/г корма

123456789 Генерации

интактная линия  контактная линия

BtHi

ствует о том, что на протяжении десяти генераций процесс формирования устойчивости в популяциях насекомых к действующему началу препаратов Bt не обнаруживается.

4 и ЬК5(мкл/г корма

2

3

8

9

4 5 6 7 Генерации

интактная линия  контактная линия

BtH10

Рис. 2. Динамика восприимчивости контактных популяций M. domestica

к BtH1 и BtH10

3

2

0

0

10

10

Учитывая способность Bt к синтезу 5 типов белковых энтомотоксинов с последующей их кристаллизацией, можно с некоторой долей вероятности предполагать, что формирование резистентности если и возможно, то только на уровне модификационной изменчивости популя-

ции. Для подтверждения этого предположения необходимы дальнейшие исследования в этом направлении. При этом мы намерены, во-первых, увеличить число инфицированных генераций, во-вторых, включить в эти исследования другие виды насекомых и другие серотипы Bt.

Велчев М. Bt-защищенный картофель Newleaf. Безопасность и преимущества растений, защищенных от насекомых-вредителей с использованием Bacillus thuringiensis (Bt-защищенных растений). /Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку. РАН, М., 2000, с.129-138.

Еремина О.Ю., Рославцева С.А. Новое в определении уровня резистентности насекомых к средствам дезинсекции. /Тез. докл. на-учно-практич. конф. по гигиене, эпидемиологии и дезинфектологии. М., 2006, с.72.

Захаренко В.А., Павлюшин В.А., Воронин К.Е. Биоценотическая регуляция - основа биологической защиты растений в агроэкоси-стемах. /Биологические средства защиты растений, технологии их изготовления и применения, СПб, ВИЗР, 2005, с.4-17.

Кандыбин Н.В. Микробные препараты для борьбы с вредителями сельскохозяйственных растений. /Биопрепараты в сельском хозяйстве.

Кандыбин Н.В., Барбашова Н.М. Эффек-

тивность битоксибациллина (БТБ-202) против колорадского жука, совок и др. вредных насекомых. /Тр. ВНИИСХМ, 45, 1976, с.78-96.

Кандыбин Н.В., Рыбина Л.М., Лескова А.Я. Действие битоксибациллина на пчел. /Использование микроорганизмов и их метаболитов в сельском хозяйстве. Л., 45, 1977, с.113-117.

Кандыбин Н.В., Лысенко О. Образование токсинов у разных штаммов бактерий группы Bac. cereus - thuringiensis и их патогенность для разных видов насекомых. /Условия и перспективы биологического метода борьбы против насекомых. Прага, 1978, с.47-51.

Кандыбин Н.В. Экологический эффект действия микробиологических средств защиты растений. /Микроорганизмы и продуктивность сельского хозяйства. Рига, 1980, с.64.

Кандыбин Н.В., Ермолова В.П., Смирнов О.В. Сравнение бактокулицида с зарубежными аналогами. /Пути совершенствования микробиологического метода борьбы с вредителями. Тезисы докл. Всесоюзной конф., Ве-легож, 1989, с.308.

Кандыбин Н.В. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми. М., Агропромиздат, 1989, 176 с.

Кандыбин Н.В. Экологическая целесообразность изыскания и использования микробиологических средств в борьбе с грызунами и насекомыми. /Микробные аспекты охраны среды обитания в условиях интенсивного земледелия. Тр. ВНИИСХМ, 60, 1990, с.126-130.

Кандыбин Н.В. Биопестициды. Теория и практика. /Защита растений, 1, 1991, с.10-13.

Кандыбин Н.В., Ермолова В.П., Смирнов О.В., Сергеева М.В., Чегодаев Ф.Н. Сертификат на бактокулицид. СПб, Пушкин, 1992, 50 с.

Кандыбин Н.В., Тихонович И.А. Микро-биометод защиты растений от колорадского жука. /Генетическая инженерия и экология. М., 2000, с.50-54.

Кандыбин Н.В. Фундаментальные и прикладные исследования микробиометода защиты растений от вредителей. Состояние и перспективы. /Биологическая защита растений -основа стабилизации агроэкосистем. Краснодар, 4, 2006, с.32 - 44.

Коваленков В.Г., Соколов М.С. Проблема смены форм вредителей и тактика защиты. /Агро XXI, 7, 6, 1999, с.6-7.

Коваленков В.Г., Столяров В.Д. Особенности фитосанитарного состояния агросистем Ставрополья. /Защита и карантин растений, 4, 2000, с.13-14.

Коваленков В.Г., Тюрина Н.М. Резистентность фитофагов к инсектоакарицидам и био-ценотические принципы долговременного контроля ее развития. /Вестник защиты растений, 2, 2001, с.3-16.

Лысенко О., Кандыбин Н.В., Стусь А.А. Токсичность и энтомопатогенность разных штаммов бактерий группы Bac. cereus -thuringiensis. /Докл. ВАСХНИЛ, 2, 1979, с.17-18.

Павлюшин В.А. Особенности биологической защиты растений в адаптивно-ландшафтном и интенсивном земледелии. /Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэко-систем. Краснодар, 4, 2006, с.30-31.

Патыка В.Ф., Патыка Т.И. Экология

Вестник защиты растений, 2, 2008 Bacillus thuringiensis. Киев, ПГАА, 2007, 217 с.

Сухорученко Г.И. Резистентность вредных организмов к пестицидам - проблема защиты растений второй половины ХХ столетия в странах СНГ. /Вестник защиты растений, 1, 2001, с.18-37.

Ткачева Л.Б. Производство и применение биологических средств защиты растений в России. /Агро ХХ! 76, 1999.

Черников В.А., Алексахин Р.М., Голубев А.В., Грингоф И.Г., Ивонин В.М. и др. Агроэкология /Под ред. В.А.Черникова,

A.И.Чекереса. М., Колос, 2000, 536 с.

Baum J.A., Johnson B.C. Carlton. Bacillus thuringiensis naturaland recombinant bioinsecticide products. /Method in Biotechnology, 5, 1999, p.189-209.

Hofte H., Whitely H.R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. /Microbiol. Rev., 53, 1989, p.242-255.

Indicators and Environmental Impact Assessment. UNEP/CBD/SBSTTA/7/12,

September 20, 2001, p.21.

Knowles B.H., Ellar D.J. Colloid-osmotic lysis a general feature of the mechanisms of action of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins with different insect specificity. /Biochem. Biophys. Acta, 924, 1984, p.509-518.

Knowles B.H. Mechanism of action of

B.thuringiensis insecticidal delta-endotoxins. Advanse in Insect Physiology, 24 (ed. P.D.Evans), 1994, Academic Press, London, p.275-308.

Keiding J., Jespersen J.B. Critical review of the status of house fly and tsetse fly resistance to pesticides, methods of detection and impact or control programmes. /DPIL Report, 8, 1991, р.1-8.

Schnepf E., Crickmore N., Vanrie J., Lereclus D., Baum J., Feitelson J., Zeigler D.R., and D.H. Dean. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. /Microbiology and molecular biology reviews, 62, 3, 1998, p.775-806.

Vector Resistance to pesticides. /Tech. Report Ser. WHO, 818, 1992, р.1-62.

TO THE QUESTION ON FORMATION OF INSECT RESISTENCY TO BACILLUS

THURINGIENSIS T.I.Patyka, V.P.Ermolova, N.V.Kandybin In our country, as well as all over the world, basic researches on working out microbiologic preparations on the basis of natural bacterial group Bacillus thuringiensis are especially widely and successfully conducted. In the All-Russian Research Institute of Agricultural Microbiology a series of biological products of entomopathogenic action is created on the basis of Bt with a various spectrum of appointment, which have found wide application in microbiological and agricultural practice. In this connection a problem of possible formation in insect pest populations of resistance to those bacteria and to biological products on their basis has appeared.