ПУТИ ПРИМЕНЕНИЯ ТРИАЦЕТИЛ-3-ГИДРОКСИФЕНИЛАДЕНОЗИНА В ЛЕЧЕНИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В СОСУДАХ ИЛИ УЛУЧШЕНИИ ФУНКЦИЙ ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ
METHODS FOR USE OF TRIACETYL-3-HYDROXYPHENYLADENOZINE IN TREATMENT OF INFLAMMATORY PROCESSES IN VESSELS OR IMPROVEMENT OF VESSEL ENDOTHELIUM FUNCTIONS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к путям применения триацетил-3-гидроксифениладенозина и содержащей его фармацевтической композиции в получении лекарственных средств для предупреждения и/или лечения воспалительных процессов в сосудах и/или обеспечения улучшения в отношении нарушений функции эндотелия, и относится к области медицины и здравоохранения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Возникновение и прогрессирование сердечно-сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз, гипертензия и диабет и т.д., а также окончательное поражение органов-мишеней в значительной степени связано с воспалительными процессами внутри сосудов и дисфункцией эндотелия (ED). Эндотелиальные клетки регулируют поддержание внутрисосудистого гомеостаза посредством обеспечения вазодилатации, подавления пролиферации гладкомышечных клеток и подавления воспалительных ответов в сосудах, а также ряда защитных эффектов в отношении сосудов. Эти эффекты в основном зависят от эндогенного вазодилататора оксида азота (NO). Нарушения выработки NO могут приводить к дисфункции эндотелия, проявляющейся в виде ослабленной эндотелийзависимой релаксации. Улучшение в отношении дисфункции эндотелия сосудов является чрезвычайно важным для предупреждения возникновения и прогрессирования атеросклероза, гипертензии и диабета и их лечения. Клинические испытания показали, что статины снижают риск возникновения ишемической болезни сердца независимо от их эффектов в отношении уровня липидов в крови путем обеспечения улучшения в отношении дисфункции эндотелия, как тиазолидиндионы, так и ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента снижают риск возникновения сердечно-сосудистого заболевания путем независимого эффекта улучшения в отношении дисфункции эндотелия, следовательно, для снижения риска возникновения сердечно-сосудистого заболевания очень важным является уменьшение воспалительных процессов в сосудах и улучшение в отношении дисфункции эндотелия.
В настоящее время применяемые в клинической практике лекарственные средства, которые могут улучшать функцию эндотелия сосудов, представляют собой, главным образом, статины, метформин, тиазолидиндионы и гипотензивные лекарственные средства, такие как ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента и другие традиционные лекарственные средства для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, которые в основном действуют за счет увеличения активности синтазы оксида азота и увеличения выработки NO. Однако миалгия и другие побочные реакции, вызываемые при долгосрочном применении статинов, затрудняют переносимость у пациентов при длительном приеме, бигуаниды могут вызывать желудочно-кишечные расстройства или иногда вызывать лактоацидоз, а производные тиазолидина могут вызывать серьезные побочные эффекты, такие как гиперволемия или увеличение веса, нарушения функции печени и т.д., поэтому их следует применять с осторожностью.
Триацетил-3-гидроксифениладенозин (патент № ZL 200980101131.6) представляет собой соединение нового структурного типа со значительной регулирующей уровень липидов в крови активностью, выбранное Институтом фармакологии при Китайской академии медицинских наук из производных кордицепина, и при этом оно характеризуется низкими токсическими и побочными эффектами, хорошими фармакокинетическими параметрами и т.д. и в настоящее время находится на стадии доклинического исследования. В настоящее время отсутствуют сообщения о применении данного соединения для уменьшения воспалительных реакций в сосудах и увеличения активности эндотелиальной синтазы оксида азота для обеспечения улучшения в отношении заболеваний, связанных с дисфункцией эндотелия сосудов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Технической задачей, решаемой настоящим изобретением, является обеспечение применения триацетил-3-гидроксифениладенозина, представленного формулой (I), в получении лекарственных средств для предупреждения, уменьшения интенсивности или лечения воспалительных процессов в сосудах или дисфункции эндотелия.
Для решения технической задачи по настоящему изобретению предусмотрено следующее техническое решение.
В первом аспекте технического решения по настоящему изобретению предусмотрено применение триацетил-3-гидроксифениладенозина, представленного формулой (I), в получении лекарственных средств для предупреждения и/или лечения воспаления сосудов,
При этом воспалительные процессы в сосудах включают острые воспалительные процессы в сосудах или хронические воспалительные процессы в сосудах; и при этом хронические воспалительные процессы в сосудах включают обусловленные гиперлипидемией воспалительные процессы в сосудах.
Во втором аспекте технического решения по настоящему изобретению предусмотрено применение триацетил-3-гидроксифениладенозина, представленного формулой (I), в получении лекарственных средств для предупреждения и/или лечения дисфункции эндотелия сосудов,
При этом дисфункция эндотелия сосудов предусматривает гиперлипидемию, атеросклероз, гипертензию, ишемическую болезнь сердца, ожирение, резистентность к инсулину или дисфункцию эндотелия сосудов, обусловленную диабетом типа 2.
Триацетил-3-гидроксифениладенозин по настоящему изобретению улучшает активность эндотелиальной синтазы оксида азота в сосудах и увеличивает выработку NO путем подавления внутрисосудистой воспалительной реакции между лейкоцитами и эндотелиальными клетками, за счет чего обеспечивается улучшение в отношении дисфункции эндотелия и связанных с ней заболеваний.
В третьем аспекте технического решения по настоящему изобретению предусмотрено применение фармацевтической композиции в получении лекарственных средств для предупреждения, уменьшения интенсивности или лечения воспалительных процессов в сосудах или дисфункции эндотелия, при этом фармацевтическая композиция содержит триацетил-3-гидроксифениладенозин формулы (I) и фармацевтически приемлемый носитель,
При этом воспалительные процессы в сосудах включают острые воспалительные процессы в сосудах или хронические воспалительные процессы в сосудах; и дисфункция эндотелия сосудов предусматривает гиперлипидемию, атеросклероз, гипертензию, ишемическую болезнь сердца, ожирение, резистентность к инсулину или дисфункцию эндотелия сосудов, обусловленную диабетом типа 2.
Кроме того, хронические воспалительные процессы в сосудах включают обусловленные гиперлипидемией воспалительные процессы в сосудах.
Фармацевтическая композиция может быть получена в соответствии со способами, известными из уровня техники. Любая лекарственная форма, подходящая для применения у человека или животного, может быть получена путем объединения соединения по настоящему изобретению с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми твердыми или жидкими вспомогательными веществами и/или вспомогательными средствами. Содержание соединения по настоящему изобретению в его фармацевтической композиции обычно составляет от 0,1 до 95% по весу.
Лекарственная форма фармацевтической композиции по настоящему изобретению представляет собой таблетки, капсулы, пилюли, растворы для инъекций, препараты с замедленным высвобождением, препараты с контролируемым высвобождением или различные системы доставки на основе микрочастиц.
Положительный технический эффект
Триацетил-3-гидроксифениладенозин может уменьшать воспалительные процессы в сосудах и увеличивать активность эндотелиальной синтазы оксида азота, а также обеспечивать улучшение в отношении нарушений функции эндотелия сосудов или связанных с ними заболеваний, при этом данный эффект не зависит от его эффекта в отношении уменьшения уровней липидов, т.е. он не коррелирует с эффектом данного соединения в отношении уменьшения уровней липидов.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фиг. 1 показано, что IMM-H007 подавляет TNF-α-индуцированный острый внутрисосудистый воспалительный ответ у мышей.
На фиг. 2 показано, что IMM-H007 уменьшает интенсивность сосудистого воспалительного ответа у получавших корм с высоким содержанием жиров мышей АроЕ-/-.
На фиг. 3 показан эффект IMM-H007 в отношении уровней липидов в крови у мышей АроЕ-/-.
На фиг. 4 показан эффект IMM-H007 в отношении факторов воспаления TNF-α и VCAM-1 в сыворотке крови у мышей АроЕ-/-.
На фиг. 5 показан эффект IMM-H007 в отношении функции эндотелия мезентериальных микрососудов у мышей АроЕ-/-.
На фиг. 6 показан эффект IMM-H007 в отношении функции эндотелия аортальных сосудов у мышей АроЕ-/-.
На фиг. 7 показано, что IMM-H007 улучшает функцию эндотелия посредством пути AMPK-eNOS.
На фиг. 8 показано, что IMM-H007 уменьшает артериальную бляшку у мышей АроЕ-/-.
На фиг. 9 показано, что IMM-H007 улучшает функцию микрососудистого эндотелия у мышей Ob/Ob с ожирением.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Следующие примеры используются для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения, но это не означает каких-либо ограничений в отношении настоящего изобретения.
Пример 1. Триацетил-3-гидроксифениладенозин (IMM-H007) ингибирует ранний внутрисосудистый воспалительный ответ при дисфункции эндотелия у мышей
1. IMM-H007 ингибирует TNF-α-индуцированные острые воспалительные процессы в сосудах у мышей (модель острого воспаления)
Экспериментальные материалы и приборы
IMM-H007 (независимо разработан Институтом фармакологии при Китайской академии медицинских наук), таблетки метформина гидрохлорида (Sino-American Shanghai Squibb Pharmaceuticals Ltd.), A769662 (Shanghai Hanxiang Biological Technology Co., Ltd.), TNF-α мыши (Peprotech, INC), родамин-6G (Sigma), пентобарбитал натрия (Serva) и натрий-карбоксиметилцеллюлоза (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.); Система динамического визуального исследования микрососудов (Gene&I-SMC1)
Животные и план эксперимента
Мышей SPF дикого типа (WT) C57BL/6J (самцы, возраст 6-8 недель, 18-20 г) приобретали у Beijing Huafukang Bioscience Co., Inc.
60 мышей C57BL/6J случайным образом делили на 6 групп в соответствии с весом тела: группа нормального контроля, группа модельного контроля, группа IMM-H007, группа метформина в качестве положительного контроля AMPK-агониста, группа А769662 и группа аторвастатина соответственно, и вводили внутрижелудочно физиологический раствор, IMM-H007 (100 мг/кг), метформин (260 мг/кг) и аторвастатин (липитор, 10 мг/кг) соответственно, и в течение 7 последовательных дней инъецировали внутрибрюшинно А769662 (30 мг/кг, который плохо абсорбируется при пероральном введении). На 8-й день, за исключением группы холостого контроля, которой инъецировали внутрибрюшинно физиологический раствор, всем остальным группам инъецировали внутрибрюшинно TNF-α (0,3 мкг/доза) для индуцирования острых воспалительных процессов в кровеносных сосудах. Через четыре часа после инъекции TNF-α в сосудистое сплетение зрительного нерва вводили внутривенно 100 мкл 0,05% родамин-6G, и при этом обеспечивалось флуоресцентное мечение лейкоцитов. Мышей анестезировали с помощью пентобарбитала натрия. Правый бок каждой мыши фиксировали на столе для наблюдений. Делали небольшой надрез вдоль брюшной полости. Осторожно извлекали сеть мезентериальных сосудов. Тонкий кишечник каждой мыши фиксировали в окне для наблюдений. Включали микроскоп для поиска четкой мезентериальной вены третьего порядка при малом увеличении микроскопа, а затем достигали 20-кратного увеличения для наблюдения, после регулировки яркости и фокусного расстояния до оптимального, белый свет выключали, включали флуоресценцию, и в отношении каждого сегмента сосуда получали видеоролик движения лейкоцитов длиной 1 мин. с использованием программного обеспечения ToumView из Системы динамического визуального исследования микрососудов (Gene & I-SMC1). Скорость движения лейкоцитов и число клеток, подвергшихся лейкоцитарно-эндотелиальной адгезии, отражают воспалительные процессы внутри сосудов и являются ранними признаками дисфункции эндотелия.
Выявляемые показатели
(1) скорость движения лейкоцитов (снижение скорости движения лейкоцитов отражает возникновение воспалительного ответа в кровеносном сосуде, изменения скорости движения лейкоцитов после введения лекарственных средств наблюдали для определения ингибиторного эффекта лекарственных средств в отношении воспалительного ответа). У каждой мыши наблюдали три мезентериальные венулы. Скорость движения лейкоцитов анализировали с помощью image pro 6.0. Для каждого поля наблюдения выбирали по меньшей мере три точки наблюдения, и в конечном итоге подсчитывали по меньшей мере 9 участков наблюдения у каждой мыши. Рассчитывали среднее значение для получения средней скорости движения лейкоцитов.
И (2) число клеток, подвергшихся лейкоцитарно-эндотелиальной адгезии (увеличение числа подвергшихся адгезии лейкоцитов отражает увеличение внутрисосудистого воспалительного ответа, что может вызывать дисфункцию эндотелия): число подвергшихся адгезии лейкоцитов наблюдали для каждого кровеносного сосуда при 200 мкм (адгезия к эндотелиальным клеткам без движения в течение 30 секунд, т.е. адгезия).
Статистические данные
Результаты экспериментов выражали в виде среднего значения X±SD. Определение t-критерия Стьюдента выполняли с использованием программного обеспечения Graphpad Prism. Различия между группами анализировали с помощью однофакторного параметрического анализа ANOVA или непараметрического способа LSD-t. Р<0,05 указывает на статистическое различие, а Р<0,01 указывает на значимое различие.
Результаты экспериментов
Факторы воспаления, такие как TNF-α, вызывают снижение скорости движения лейкоцитов, увеличение числа клеток, подвергшихся лейкоцитарно-эндотелиальной адгезии, является важной причиной дисфункции эндотелия, а дисфункция эндотелия может усугубить поражение сосудов. Результаты показали, что острые воспалительные процессы внутри сосудов наблюдались после внутрибрюшинной инъекции TNF-α (0,3 мкг/доза) в течение 4 часов по сравнению с группой нормального контроля, и скорость движения лейкоцитов снижалась, а число лейкоцитов, подвергшихся адгезии, увеличилось в группе модельного контроля. После введения IMM-H007 (100 мг/кг) по сравнению с группой модельного контроля скорость движения лейкоцитов значимо увеличивалась, а число эндотелиальных клеток, подвергшихся адгезии, значимо уменьшалось, что указывает на то, что IMM-H007 может уменьшать внутрисосудистый воспалительный ответ, индуцированный фактором воспаления TNF-α (результаты показаны в таблице 1 и на фиг. 1).
2. IMM-H007 ингибирует внутрисосудистый воспалительный ответ у получавших корм с высоким содержанием жиров мышей АроЕ-/- (модель хронического воспаления)
Экспериментальные материалы и приборы
IMM-H007 (независимо разработан Институтом фармакологии при Китайской академии медицинских наук), таблетки метформина гидрохлорида (Sino-American Shanghai Squibb Pharmaceuticals Ltd.), A769662 (Shanghai Hanxiang Biological Technology Co., Ltd.), родамин-6G (Sigma), пентобарбитал натрия (Serva), натрий-карбоксиметилцеллюлоза (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.); набор для ELISA в отношении TNF-α мыши (Andy gene) и набор для ELISA в отношении VCAM-1 мыши (Andy gene), Система динамического визуального исследования микрососудов (Gene&I-SMC1) и ридер Epoch BioTeK.
Животные и план эксперимента
Мышей АроЕ-/- с генетическим фоном C57BL/6 (самцы, возраст 6-8 недель, 18-20 г) и мышей C57BL/6 приобретали в Научном институте лабораторных животных при Китайской академии медицинских наук (Beijing Huafukang Bioscience Co., Inc.).
После 1 недели адаптивного питания животных случайным образом делили на 4 группы в соответствии с весом тела: группа модельного контроля, группы введения А769662 (30 мг/кг, ip), метформина (260 мг/кг), IMM-H007 (100 мг/кг), по 7 в каждой группе, и содержали на рационе с высоким содержанием жиров (78,6% основного рациона, 10% полутвердого жира, 1,00% холестерина, 10% сухого яичного желтка и 0,4% соли желчной кислоты) и одновременно внутрижелудочно вводили дозу 0,1 мл/10 г веса тела, и непрерывное введение и скармливание осуществляли в течение 8 недель. Мышей анестезировали с помощью пентобарбитала натрия (60 мг/кг веса тела). Правый бок каждой мыши фиксировали на столе для наблюдений. Делали небольшой надрез вдоль брюшной полости. Осторожно извлекали сеть мезентериальных сосудов. Тонкий кишечник каждой мыши фиксировали в окне для наблюдений, включали микроскоп для поиска четкой мезентериальной вены третьего порядка при малом увеличении микроскопа, а затем достигали 20-кратного увеличения для наблюдения, после регулировки яркости и фокусного расстояния до оптимального, белый свет выключали, включали флуоресценцию, и можно было наблюдать движение лейкоцитов в кровеносном сосуде. В отношении каждого сегмента сосуда получали видеоролик движения лейкоцитов длиной 1 мин. с использованием программного обеспечения ToumView из Системы динамического визуального исследования микрососудов (Gene & I-SMC1). Скорость движения лейкоцитов и число клеток, подвергшихся лейкоцитарно-эндотелиальной адгезии, анализировали с помощью image pro 6.0.
Выявляемые показатели
(1) скорость движения лейкоцитов и (2) число клеток, подвергшихся лейкоцитарно-эндотелиальной адгезии
Статистические данные
Результаты экспериментов выражали в виде среднего значения X±SD. Определение t-критерия Стьюдента выполняли с использованием программного обеспечения Graphpad Prism. Различия между группами анализировали с помощью однофакторного параметрического анализа ANOVA или непараметрического способа LSD-t. Р<0,05 указывает на статистическое различие, а Р<0,01 указывает на значимое различие.
Результаты экспериментов
Рацион с высоким содержанием жиров увеличивает уровень холестерина липопротеинов низкой плотности в крови и стимулирует обеспечение эндотелиальными клетками воспалительного ответа, что приводит к снижению скорости движения лейкоцитов и увеличению числа клеток, подвергшихся лейкоцитарно-эндотелиальной адгезии, и вызывает нарушения функции эндотелия, что, в свою очередь, может привести к возникновению атеросклероза. После введения IMM-H007 (100 мг/кг) по сравнению с группой модельного контроля скорость движения лейкоцитов значимо увеличивалась, а число эндотелиальных клеток, подвергшихся адгезии, значительно уменьшалось, что указывает на то, что IMM-H007 в значительной степени ингибирует лейкоцитарно-эндотелиальный воспалительный ответ у получавших корм с высоким содержанием жиров мышей АроЕ-/- и уменьшает воспалительные процессы в сосудах, индуцированные кормом с высоким содержанием жиров (результаты показаны в таблице 2 и на фиг. 2).
Пример 2. Триацетил-3-гидроксифениладенозин (IMM-H007) улучшает функцию эндотелия сосудов
Экспериментальные материалы и приборы
IMM-H007 (независимо разработан Институтом фармакологии при Китайской академии медицинских наук), А769662 (Shanghai Hanxiang Biological Technology Co., Ltd.), таблетки метформина гидрохлорида (Sino-American Shanghai Squibb Pharmaceuticals Ltd.), пентобарбитал натрия (Serva), натрий-карбоксиметилцеллюлоза (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.), хлорид натрия, хлорид калия, сульфат магния, бикарбонат натрия, глюкоза, EDTA и ацетилхолин (Sigma), нитропруссид натрия (VETEC), R-(-)фенилэфрин (J&K Scientific LTD.), набор для ELISA в отношении TNF-α мыши (Andy gene), набор для ELISA в отношении VCAM-1 мыши (Andy gene), набор для анализа триглицеридов, набор для анализа общего холестерина, набор для анализа холестерина липопротеинов высокой плотности и набор для анализа холестерина липопротеинов низкой плотности (BioSino Bio-Technology & Science Inc.), а также набор для анализа свободных жирных кислот (Sekisui Medical Technology LTD.); аналитические весы, стереомикроскоп Olympus SZ51, встряхиватель, сшиватель, система для миографии сосудов под давлением Pressure Myography System-120СР, тонкий пинцет для микрохирургических вмешательств, тонкие ножницы для микрохирургических вмешательств, смесь 95% 02 и 5% С02 и силиконовый диск для хирургических операций.
Животные и план эксперимента
Мышей АроЕ-/- с генетическим фоном C57BL/6 (самцы, возраст 6-8 недель, 18-20 г) и мышей C57BL/6 приобретали у Beijing Huafukang Bioscience Co., Inc.
После 1 недели адаптивного питания животных случайным образом делили на 7 групп в соответствии с весом тела: группа нормального контроля, группа модельного контроля, группа введения А769662 (30 мг/кг), группа введения метформина (260 мг/кг), группы введения IMM-H007 в низких, средних и высоких дозах (50, 100, 200 мг/кг), по 8 в каждой группе, и содержали на рационе с высоким содержанием жиров (78,6%) основного рациона, 10% полутвердого жира, 1,0% холестерина, 10% сухого яичного желтка и 0,4%) соли желчной кислоты) и одновременно внутрижелудочно вводили дозу 0,1 мл/10 г веса тела, и непрерывное введение и скармливание осуществляли в течение 8 недель для создания модели атеросклероза.
Выявляемые показатели
(1) Эффект IMM-H007 в отношении уровней липидов в крови у мышей АроЕ-/-: общий холестерин (ТС), триглицериды (ТГ), холестерин липопротеинов низкой плотности (LDL), холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL) и свободные жирные кислоты (FFA);
определяли в соответствии с инструкциями к набору.
(2) Эффект IMM-H007 в отношении факторов воспаления TNF-α и VCAM-1 в сыворотке крови у мышей АроЕ-/-;
определяли в соответствии с инструкциями к набору.
(3) Эффект IMM-H007 в отношении функции эндотелия мезентериальных микрососудов у мышей АроЕ-/-
-10
-5
-10
-3
1
2
3
Растворы PSS и KPSS составляли в соответствии с инструкциями и использовали в тот же день. Раствор PSS извлекали перед началом эксперимента и предварительно насыщали кислородом в течение примерно 20 мин. Мышей АроЕ-/-, которым скармливали корм с высоким содержанием жиров и которых одновременно обрабатывали в течение 10 недель, анестезировали с помощью пентобарбитала натрия. Мышей помещали в положение на спину и фиксировали. Брюшную полость вскрывали по срединной линии. Извлекали сеть мезентериальных сосудов и помещали в буфер PSS, предварительно насыщенный кислородом в течение 20 минут. Под стереомикроскопом осторожно отделяли мезентериальную артерию третьего порядка длиной приблизительно 3 мм. Вначале кровеносный сосуд прикрепляли к стеклянной канюле Р1 и затягивали катушку. Примечание: проксимальный конец должен быть соединен с концом Р1, а конец Р2 сосуда должен быть закреплен, и катушка должна быть затянута. Камеру помещали на предметный столик микроскопа и проверяли данные соединения между камерой и интерфейсом. Крышку ванны закрывали и вводили кислород, чтобы вывести воздух в трубки. Под микроскопом находили кровеносный сосуд, а затем микроскоп переводили в режим съемки. (Ручку со стороны окуляра поворачивали по кривой.) Открывали программное обеспечение MyoVIEW. Открывали окно камеры Capture для отображения изображения кровеносного сосуда. Уравновешивание кровеносных сосудов медленно выполняли от 10 мм рт.ст. до 60 мм рт.ст., при этом каждый шаг составлял 300 с. После завершения процедуры уравновешивания раствор в ванне сливали. Кровеносные сосуды стимулировали (10 мл) в течение 2 мин. с применением предварительно нагретого до 37°С раствора KPSS и наблюдали изменения в вазоконстрикции, а затем кровеносные сосуды промывали с помощью раствора PSS до исходного уровня. Кровеносные сосуды уравновешивали при 60 мм рт.ст. при 37°С в течение 45 минут, за это время жидкость заменяли каждые 20 минут. Эксперимент начинали: наблюдали вазодилатационный ответ, обусловленный 10-10 М Ach после предварительного сжатия с помощью 2 мкМ фенилэфрина, для оценки эффекта лекарственных средств в отношении функции эндотелия сосудов. В конце эксперимента выполняли замену на свежий предварительно нагретый до 37°С буфер PSS для уравновешивания в течение 30 мин и вводили 10 М - 10 М нитропруссида натрия для индуцирования вазодилатационного ответа после предварительного сжатия с помощью 2 мкМ фенилэфрина для оценки эффекта лекарственных средств в отношении функции гладких мышц сосудов. LD представлял собой диаметр кровеносного сосуда после релаксации путем введения различных концентраций ACh или нитропруссида натрия, LD представлял собой диаметр кровеносных сосудов после предварительного сокращения с помощью фенилэфрина, и LD представлял собой максимальный диастолический диаметр кровеносного сосуда без обработки каким-либо стимулятором.
1
2
3
2
Релаксационный ответа на Ach и нитропруссид натрия после предварительного сжатия с помощью фенилэфрина выражали в виде процентного увеличения диаметра сосуда: % релаксации = (LD-LD)/(LD-LD)×100.
(4) Эффект IMM-H007 в отношении функции эндотелия грудной аорты у мышей АроЕ-/-
-10
-5
-10
-4
Мышей анестезировали. Грудную аорту быстро извлекали после бережного удаления окружающих тканей, вырезали сосудистое кольцо длиной приблизительно 3 мм. Сосудистое кольцо аккуратно подвешивали на тонопреобразователе при начальном растяжении 0,5 g и уравновешивали в течение 90 минут или дольше. В ходе процесса уравновешивания жидкость заменяли каждые 20 минут, поддерживали аэрацию и температуру 37°С. Сосудистое кольцо уравновешивали в течение приблизительно 1 часа и дважды стимулировали насыщенным KCl (60 мМ) для выявления того, активен ли кровеносный сосуд. После стабилизации вазоконстрикции KCl сразу смывали. После последней замены жидкости сосудистое кольцо уравновешивали в течение 20 минут, добавляли 1 мкМ фенилэфрина для стимуляции вазоконстрикции и после стабилизации вазоконстрикции в нарастающей концентрации вводили ацетилхолин (Ach, 1×10-1×10) и нитропруссид натрия (SNP, 10-10 М) для регистрации кривой вазодилатации.
Уровень вазодилатации = [индуцированный РЕ тонус сосудов (g) - растяжение сосудов после добавления ACh (g)] ÷ [индуцированное РЕ растяжение (g) - базальный тонус сосудов (g)] × 100%.
(5) Обсуждение механизма улучшения функции эндотелия с помощью IMM-Н007
Уровни экспрессии белков АМРК, рАМРК, peNOS, eNOS, Caveolin-1 анализировали и измеряли с помощью вестерн-блоттинга для определения общей активности синтазы оксида азота в сыворотке крови.
(6) Эффект IMM-H007 в отношении площади бляшки у мышей АроЕ-/-
Корень аорты окрашивали масляным красным О и аорту по всей длине окрашивали масляным красным О. Изображения с патологиями анализировали с помощью программ Photoshop, Image J и Image-Pro Plus. Данные оценки патологии статистически анализировали с использованием критерия Хи-квадрат. После сравнения Р<0,05, Р<0,01 показывали статистическое различие.
Статистические данные
Результаты экспериментов выражали в виде среднего значения X±SD. Определение t-критерия Стьюдента выполняли с использованием программного обеспечения Graphpad Prism. Различия между группами анализировали с помощью однофакторного параметрического анализа ANOVA или непараметрического способа LSD-t. Р<0,05 указывает на статистическое различие, а Р<0,01 указывает на значимое различие.
Результаты экспериментов
(1) Эффект IMM-H007 в отношении уровней липидов в крови у мышей АроЕ-/-
Результаты показали, что после 8 недель содержания на рационе с высоким содержанием жиров уровни общего холестерина, триглицеридов, холестерина липопротеинов низкой плотности и свободных жирных кислот увеличивались, а уровень холестерина липопротеинов высокой плотности уменьшался в группе модельного контроля по сравнению с группой нормального контроля. Введение IMM-H007 в дозе 50 мг/кг не влияло на уровни общего холестерина, триглицеридов, холестерина липопротеинов низкой плотности, свободных жирных кислот и холестерина липопротеинов высокой плотности; введение IMM-H007 в дозе 100 мг/кг не влияло на уровни холестерина, триглицеридов, холестерина липопротеинов низкой плотности и холестерина липопротеинов высокой плотности и в некоторой степени уменьшало уровень свободных жирных кислот; и в группе введения IMM-H007 в дозе 200 мг/кг уровни общего холестерина, холестерина липопротеинов низкой плотности и свободных жирных кислот уменьшались по сравнению с группой модельного контроля (результаты показаны в таблице 3 и на фиг. 3).
(2) Эффект IMM-H007 в отношении факторов воспаления TNF-α и VCAM-1 в сыворотке крови у мышей АроЕ-/-
Результаты показали, что по сравнению с группой модельного контроля IMM-Н007 в дозе 50, 100 или 200 мг/кг может снижать уровень VCAM-1 в сыворотке крови у мышей АроЕ-/-, и IMM-H007 в дозе 50 мг/кг уменьшал экспрессию TNF-α в сыворотке крови у мышей АроЕ-/-, что указывает на то, что введение IMM-Н007 может снижать уровни родственных факторов воспаления в сыворотке крови (результаты показаны в таблице 4 и на фиг. 4).
(3) Эффект IMM-H007 в отношении функции эндотелия мезентериальных микрососудов у мышей АроЕ-/-
-10
-5
Результаты показали, что после предварительного введения 2 мкМ фенилэфрина для предварительного сокращения кровеносных сосудов, вазодилатационный ответ, обусловленный различными концентрациями (10-10 М) ацетилхолина, может помочь оценить эффект лекарственных средств в отношении функции эндотелия сосудов. По сравнению с группой модельного контроля введение IMM-H007 в дозе 50 мг/кг может обеспечить значительное улучшение в отношении дисфункции микрососудистого эндотелия, обусловленной рационом с высоким содержанием жиров, не влияя на уровни липидов в крови; введение IMM-H007 в дозе 100 мг/кг может обеспечить значительное улучшение в отношении индуцированного ацетилхолином эндотелийзависимого релаксационного ответа и улучшение в отношении дисфункции эндотелия, не влияя на уровни холестерина, триглицеридов, холестерина липопротеинов низкой плотности или холестерина липопротеинов высокой плотности. Результаты показали, что IMM-H007 может обеспечить улучшение в отношении дисфункции микро сосуд истого эндотелия независимо от его эффекта в отношении уменьшения уровней липидов (результаты показаны в таблицах 5 и 6 и на фиг. 5).
(4) Эффект IMM-H007 в отношении функции эндотелия грудной аорты у мышей АроЕ-/-
-10
-5
Результаты показали, что после предварительного введения 1 мкМ фенилэфрина для предварительного сокращения кровеносных сосудов, вазодилатационный ответ, обусловленный различными концентрациями (10-10 М) ацетилхолина, может помочь оценить эффект лекарственных средств в отношении функции эндотелия сосудов. По сравнению с группой модельного контроля введение IMM-H007 в дозе 50 мг/кг может обеспечить значительное улучшение в отношении индуцированной ацетилхолином эндотелийзависимой релаксации аорты, обусловленной рационом с высоким содержанием жиров, и улучшение в отношении дисфункции эндотелия, не влияя на уровни липидов в крови, что указывает на то, что IMM-H007 может обеспечивать улучшение в отношении дисфункции эндотелия сосудов независимо от его эффекта в отношении уменьшения уровней липидов (результаты показаны в таблицах 7 и 8 и на фиг. 6).
(5) IMM-H007 улучшает функцию эндотелия посредством пути AMPK-eNOS
Уровни экспрессии белков AMPK, pAMPK, peNOS, eNOS, Caveolin-1 анализировали и измеряли с помощью вестерн-блоттинга для определения общей активности синтазы оксида азота в сыворотке крови. Анализировали потенциальный механизм улучшения функции эндотелия с помощью IMM-Н007, не зависящего от гиполипидемического эффекта. Экспериментальные выводы: ГММ-Н007, в основном за счет активации пути AMPK-eNOS, улучшает активность синтазы оксида азота, увеличивает выработку NO и улучшает функцию кровеносных сосудов (результаты показаны на фиг. 7).
(6) IMM-H007 уменьшает площадь бляшки у мышей АроЕ-/-
Повышенный уровень белка AMPK-eNOS и улучшение в отношении дисфункции эндотелия сосудов являются благоприятными для уменьшения частоты возникновения и развития атеросклероза. В данном исследовании мышей АроЕ-/- модели атеросклероза содержали на рационе с высоким содержанием жиров в течение 10 недель для наблюдения накопления бляшек по всей длине аорты и в корне артерии, а затем для наблюдения эффекта IMM-H007 в отношении атеросклероза. Результаты эксперимента показали, что IMM-H007 может в значительной степени уменьшать накопление бляшек в дуге аорты и по всей длине аорты, и путем окрашивания среза корня аорты выявили уменьшение накопления липидов на месте бляшки, что свидетельствует о том, что IMM-H007 обеспечивает улучшение в отношении дисфункции эндотелия, что уменьшает интенсивность прогрессирования атеросклероза (результаты показаны в таблице 9 и на фиг. 8).
Пример 3. Триацетил-3-гидроксифениладенозин (IMM-H007) улучшает функцию эндотелия сосудов у мышей Ob/Ob с ожирением
Экспериментальные материалы и приборы
2
2
IMM-H007 (независимо разработан Институтом фармакологии при Китайской академии медицинских наук), натрий-карбоксиметилиеллюлоза (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.), хлорид натрия, хлорид калия, сульфат магния, бикарбонат натрия, глюкоза, EDTA и ацетилхолин (Sigma), нитропруссид натрия (VETEC), R-(-)фенилэфрин (J&K Scientific LTD.), набор для анализа триглицеридов, набор для анализа общего холестерина, набор для анализа холестерина липопротеинов высокой плотности и набор для анализа холестерина липопротеинов низкой плотности (BioSino Bio-Technology & Science Inc.), а также набор для анализа свободных жирных кислот (Sekisui Medical Technology LTD.); инсулин, глюкоза, тестовые полоски для определения глюкозы в крови Roche, аналитические весы, стереомикроскоп Olympus SZ51, встряхиватель, сшиватель, система для миографии сосудов под давлением Pressure Myography System- 120СР, тонкий пинцет для микрохирургических вмешательств, тонкие ножницы для микрохирургический вмешательств, смесь 95% O и 5% CO и силиконовый диск для хирургических операций.
Животные и план эксперимента
Мышей Ob/Ob с ожирением (самцы, возраст 4 недели) приобретали в Исследовательском центре модельных животных Нанкинского университета.
После 1 недели адаптивного питания животных случайным образом делили на две группы в соответствии с весом тела: группа модельного контроля и группа IMM-H007 (400 мг/кг), по 10 в каждой группе, и содержали на нормальном корме и одновременно вводили внутрижелудочно дозу 0,1 мл/10 г веса тела, и непрерывное введение и скармливание осуществляли в течение 9 недель. Регистрировали изменения в отношении потребления пищи и веса тела и измеряли стандартные биохимические показатели, такие как уровни липидов в крови и уровень глюкозы в крови и т.д. Через 9 недель из каждой группы выбирали 3 животных, и мезентериальные артериолы извлекали для измерения функции эндотелия сосудов таким же образом, как в примере 2.
Выявляемые показатели: (1) стандартные биохимические показатели и (2) функция эндотелия сосудов
Статистические данные
Результаты экспериментов выражали в виде среднего значения X±SD. Определение t-критерия Стьюдента выполняли с использованием программного обеспечения Graphpad Prism. Различия между группами анализировали с помощью однофакторного параметрического анализа ANOVA или непараметрического способа LSD-t. Р<0,05 указывает на статистическое различие, а Р<0,01 указывает на значимое различие.
Результаты экспериментов
Результаты показали, что после содержания мышей Ob/Ob с ожирением на нормальном корме в течение 9 недель определение уровней глюкозы и инсулина в крови показало, что сформировалась модель резистентности к инсулину, а резистентность к инсулину является важной причиной нарушений функции эндотелия, следовательно, авторы настоящего изобретения определяли функцию микрососудистого эндотелия у 9-недельных мышей Ob/Ob. В ходе исследования обнаружили, что в группе введения дозы IMM-H007 (400 мг/кг) улучшается функция микрососудистого эндотелия (результаты эксперимента показаны в таблицах 10, 11 и 12 и на фиг. 9).