УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ КОНТАМИНАЦИИ ПАСТБИЩНЫХ ЛАНДШАФТОВ ЛИЧИНКАМИ ГЕОГЕЛЬМИНТОВ
DEVICE FOR INSPECTION OF LEYLAND CONTAMINATION BY EGGS OF SOIL-TRANSMITTED HELMINTHES

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской гельминтологии, в частности к оборудованию биологических, ветеринарных, медицинских и фитолабораторий, где существует необходимость определять степень контаминации пастбищных ландшафтов личинками геогельминтов - стронгилят, возбудителей трихостронгилидозов жвачных животных - гемонхоза, остертагиоза, нематодироза, трихостронгилеза овец, коз, крупного рогатого скота, сайгаков, диктиокаулеза овец, стронгилятозов лошадей и т.д.
Предложенное устройство позволяет моделировать, в лабораторной обстановке условия, аналогичные естественным природным метеорологическим факторам внешней среды - на них можно варьировать температуру, влажность, аэрацию и т.д., обеспечивать создание для личинок различных видов геогельминтов как оптимальных, так и экстремальных жизненных условий.
Данное изобретение позволяет выявить особенности вертикальной миграции инвазионных личинок синхронно в почве, по корням и надземным частям растений сверху вниз и снизу вверх, что особенно актуально в зонах на сухостепных, полупустынных и пустынных пастбищах (аридная зона).
Теоретической основой для изобретения предлагаемого устройства явилось открытие нами механизма миграции инвазионных личинок геогельминтов не через почву, а по корням растений аридной зоны (Лазарев Г.М, 2000) [4]. Американские ученые в начале XX века установили, что инвазионные личинки гельминтов в почве быстро погибают: в сухой почве они прилипают к частичкам почвы, высыхают и гибнут; в избыточно влажной почве падают между частицами почвы и тоже быстро погибают. Они мигрируют вверх и горизонтально только в том случае, если почва умеренно влажная - личинка движется внутри тонкого слоя воды, окутывающей частицы почвы. Она опирается, с одной стороны, на субстрат частиц, а с другой стороны, - на поверхностную пленку на границе воды с воздухом, находящимся между частицами почвы (F.K.Payne, 1923, цитата по И.В.Орлову, 1997) [2]. Такое состояние почвы часто бывает в гумидных зонах с выпадением осадков 700-1000 и более мм/год, с интервалом между дождями 3-5 дней.
В аридной зоне, где уровень осадков 200-300 мм/год, а ливневые дожди идут с интервалом 15-30 дней, почва обычно сухая, травостой изреженный, но личинки в почве сохраняются. При раздельном исследовании растений (отдельно - трава, отдельно - корни), мы выявили, что в пастбищный сезон (весна, лето, осень) большинство личинок геогельминтов сохраняется на корнях, где есть все оптимальные условия - влага, умеренное тепло, аэрация. Сразу после дождя часть личинок мигрирует на траву, а при высыхании мигрируют вниз. Общая биомасса растений в полупустыне и сухой степи около 10-12 т/га сухой массы; ежегодный прирост - около 1,0-1,5 т/га, в том числе около 20% зеленой массы (трава), а 80% - подземная масса - корни. Более 70% корней растений в аридной зоне расположено в горизонте почвы 10-60 см.
Таким образом, наибольшее количество инвазионных паразитических личинок находится в подземной части почвы: весной, при высокой влажности почвы, около 80%, летом, при засухе, до 100%, как в низинах, так и на вершинах балок. Постоянное наличие паразитических личинок геогельминтов на корнях растений создает угрозу заражения овец и других животных даже летом, поскольку достаточно выпадения небольшого дождя или росы, чтобы личинки начали миграцию по корням на надземную часть растений (см. таблицу 1).
Таблица 1
Контаминация надземной и подземной частей травы (аридная зона, полупустыня, 2000 г.)
Участки пастбища
Дата
Число личинок нематод в 1 кг
всего
живых
паразитических
1
2
3
4
5
1. Низина, разнотравье, выпас овец, трава
18.05
5,736
3,704
2,786
корни
18.05
25059
22456
10188
2. Низина, разнотравье, выпас овец, трава
15.06
360
0
0
корни
15.06
2740
94,6
602
3. Низина, разнотравье, выпас овец, трава
10.08
304
0
0
корни
10.08
1572
786
547
4. Вершина, мятлик, выпас овец трава
15.06
210
0
0
корни
15.06
2345
596
382
Характеристика аналогов. Особенности миграции инвазионных личинок наиболее опасных геогельминтозов изучались и изучаются многими паразитологами в России и в других странах. Создано много приборов, большинство которых представляют собой цилиндры из различных материалов. Диаметр их колеблется от 25 до 300 мм и более, длина от 100 до 2000 мм и более. Полость цилиндров, как правило, заполняется почвой изучаемого участка пастбищ.
Инвазионных личинок выращивают в термостатах при температуре 20-26°С в пробах фекалий спонтанно зараженных животных с известным количеством яиц геогельминтов. Через 15-20 дней взвесь инвазионных личинок высевают на поверхности почвы или на определенной глубине почвы в цилиндре.
Цилиндры помещают либо в лаборатории при комнатной температуре, либо вне помещения (на балконе, на опытном поле и т.д.). Миграцию личинок определяют при исследовании почвы на определенной глубине по методу Бермана [5]. В отдельных случаях вместо взвеси инвазионных личинок на поверхности почвы в цилиндре (или на определенной глубине в цилиндре) помещают свежие пробы фекалий с заранее определенным количеством яиц геогельминтов. В данном случае процесс развития и миграции личинок геогельминтов идет более естественно.
К недостаткам всех существующих приборов относится то, что почва, которой заполняют полость приборов, не дезинвазируется. В ней находятся яйца и личинки не только изучаемых видов паразитических геогельминтов, но и яйца и личинки сапрофитных нематод. В цилиндрах очень сложно поддерживать естественную температуру и влажность, да и структура, химический состав почвы и аэрация не стандартизированы, что отражается на развитии личинок и их выживаемости.
Характеристика прототипа. В качестве прототипа избран прибор, описанный американскими учеными (Krecek B.C., Murell K.D., 1988). Они проводили изучение глубины миграции личинок остертагий в цилиндрах диаметром 300 мм, длиной 350-450 мм, которые закапывали в почву разных типов: 9 цилиндров располагались на расстоянии 1000 мм друг от друга. Пробы фекалий от спонтанно зараженных овец, содержавшие по 200000 яиц, закладывали на глубину 50, 100 и 150 мм, контрольные пробы размещали на поверхности почвы цилиндров.
Инвазионные личинки на траве и почве в контроле находили через 2 недели, а из проб, находившихся на глубине 50, 100 и 150 мм, личинки мигрировали на поверхность сосудов через 5 недель после закладки опыта.
В травостое преобладал мятлик луговой. Авторы пишут в заключение, что личинки остертагий способны мигрировать вертикально через почву, а после достижения поверхности почвы мигрируют по траве. Большинство личинок находили в надземной части травы, а не на поверхности почвы (цит. по реферату Р.Т.Сафиуллина, 1989).
Этот прибор наиболее близок к устройству, которое предлагается нами. При этом необходимо заметить, что с описанием прибора американских авторов мы ознакомились уже после испытания большинства своих приборов.
Достоинства прототипа
1. Это крупный стационарный аппарат, позволяющий выявить миграцию личинок остертагий на типичном пастбищном участке.
2. Развитие личинок от начала до конца происходит в условиях, максимально приближенных к естественным природным условиям: почва, осадки, растительность, температура, скорость ветра и другие показатели в ходе опыта практически не меняются исследователями.
Критика прототипа
1. Основным недостатком прибора прототипа является его специализация на выявление миграции инвазионных личинок геогельминтов в гумидной зоне с обильным выпадением осадков (1000-1500 мм/год и более) на естественных пастбищных участках в вегетационный период. Здесь почти всегда умеренная влажность, постоянно идет рост травы и корней, развитие и миграция личинок происходит через почву, по корням и стеблям растений. В аридной, засушливой зоне относительно влажный период длится с мая до середины июня, осадков выпадает 200-300 мм/год, в вегетационный период преимущественно в виде ливней с интервалом 10-20 дней, почва постоянно сухая в горизонте 0-10 см, личинки не мигрируют, а находятся в состоянии анабиоза или погибают. Только на корнях растений в горизонтах 10-20, 10-40 см сохраняется запас инвазии, после дождей личинки мигрируют вверх.
2. В аридной зоне Юга России основные источники инвазии - овцематки и коровы (они традиционно не дегельминтизируются) выделяют с фекалиями соответственно 100-200 и 10-30 яиц геогельминтов в 1 г фекалий, поэтому для «высева» 200000 яиц в прибор нужно поместить около 2 кг свежих фекалий овец или в 5-10 раз больше фекалий крупного рогатого скота, что явно невозможно.
3. Для использования в лаборатории прибор слишком громоздкий - аппарат диаметром 300 мм и длиной 300-450 мм вмещает 30-50 кг (литров) почвы.
4. Почву в приборе очень трудно дезинвазировать.
5. В таких приборах трудно оценить миграцию личинок на корнях и почве.
Цель изобретения - создание компактного устройства для синхронного определения миграции личинок геогельминтов в надземной части растения (стебли и листья травы), в подземной части растений (прикорневая часть и корни) и в почве (в горизонтах 0-20, 0-30 и 0-50 см) как в естественных, природных условиях, так и в лаборатории при моделировании природных метеорологических и почвенных условий.
Теоретическое обоснование для создания подобного устройства - установление нами в аридной зоне особенностей сохранения и миграции инвазионных паразитических личинок не в почве (она сухая), а на корнях и по корням растений (Лазарев Г.М., 2000) [4]. Позже, в 2000-2004 гг., соотношение живых инвазионных личинок на траве и корнях было весной 1:1,7; летом 1:4,1; осенью 1:5,4. В почве, даже отряхнутой с корней, паразитических личинок было мало.
Необходимо было иметь портативный аппарат, который можно было бы помещать и использовать как в естественных природных условиях, так и в лаборатории - при комнатной температуре, в климатической камере (при любой температуре и влажности), на балконе и т.д. В приборе можно было бы изучать миграцию личинок не только сверху вниз, но и снизу-вверх; на поверхности прибора можно было бы высевать злаковые и бобовые травы.
Описание предлагаемого устройства. Прибор для изучения миграции инвазионных личинок геогельминтов состоит из 5 пластиковых цилиндров с параметрами - диаметр 100 мм, высота 100 мм. Цилиндры соединяются между собой липкой лентой шириной 40-50 мм в два-три слоя. Общая высота прибора 500 мм. Нижняя поверхность устройства представляет собой полиэтиленовой лист толщиной 1-2 мм и диаметром 100 мм, который закрепляется липкой лентой (скотч) шириной 40-50 мм в 2-3 слоя.
Внутри собранного цилиндра строго по центру размещается два-три живых целых на всем протяжении корневища пырея ползучего Agropyron repens (L.) или свинороя пальчатого Cynodon dactylon (L.), дезинвазированных раствором Люголя. Внутренняя полость прибора между стенками прибора и корневищами заполняется мелким строительным песком, дезинвазированным крутым кипятком и высушиванием на раскаленном противне. Песок после остывания увлажняется дистиллированной или остывшей кипяченой водой.
Прибор закрепляется штативом в вертикальном положении.
Для аэрации внутреннего содержимого в местах соединения цилиндров (звеньев) тонкой иглой делают 15-30 отверстий (через каждые 1-2 см). Закладка инвазионного материала (свежих фекалий или взвеси инвазионных личинок) производится в момент сборки прибора в соответствии с методикой опыта.
Устройство характеризуется следующими признаками:
1. Высота устройства 500 мм.
2. Диаметр 100 мм.
3. Звенья прибора 5 шт. (высота 100 мм, диаметр 100 мм) (фиг.1).
4. Нижняя поверхность звена (дно) - лист толщиной 1-2 см и диаметром 100 мм. (фиг.2).
5. Материалом для изготовления каркаса прибора служит пластик, можно использовать стекло или любой высокопрочный и легкий материал.
Материал, поясняющий сущность изобретения, представлен двумя чертежами и двумя фотографиями.
Испытание устройства. Для изучения вертикальной и горизонтальной миграции, личинок паразитических гельминтов необходимо выращивать в термостате. Для этого берут свежие фекалии ректально у спонтанно или специально инвазированных животных, которых исследуют методом флотации по Фюллеборну, подсчитывают количество яиц кишечных нематод и личинок диктиокаулов в 1 г фекалий. Эти пробы закладывают в термостат и культивируют при температуре 25-27°С в течение 14-20 дней. После этого фекалии помещают в аппарат Бермана, оставляют их на 2-3 часа в теплой воде в 2-4-слойном марлевом мешочке и определяют под микроскопом род и вид гельминтов, численность личинок в 1 мл взвеси.
Подготовка устройства. Пять цилиндров диаметром 100 мм, длиной 100 мм, изготовленных из пластика, тщательно моют кипятком и высушивают, затем соединяются вместе липкой лентой (скотч). Нижняя часть устройства закрывается полиэтиленовым листом толщиной 1-2 мм, диаметром 100 мм и тоже закрепляется липкой лентой в 2-3 слоя. В цилиндры, состоявшие из 5 секций (звеньев) длиной 100 мм, высотой 500 мм осторожно, строго посередине поместили свежие корневища пырея (по два корневища, скрепленных нитками), дезинвазированных раствором Люголя. Корневища были целыми на всем протяжении. Полость прибора осторожно заполнили просеянным мелким песком, дезинвазированным нагреванием на противне после ошпаривания крутым кипятком. После этого в цилиндры поместили свежие фекалии от лошадей, содержащие в 1 г 2685 яиц стронгилят (всего около 10000). Для аэрации в местах соединения цилиндров тонкой иглой сделали 15-30 отверстий через 1-2 см.
В первом устройстве фекалии поместили внизу для изучения миграции «снизу вверх», во втором - вверху для исследования миграции «сверху вниз». В оба цилиндра сверху на глубине 2-5 см высеяли семена ячменя.
В ходе опыта в песке поддерживалась влажность, аналогичная влажности почвы в горизонте 0-500 мм.
2
2
Закладку опыта провели 23 января 2009 года, итоги изучали 20 мая 2010 года. Устройство поместили в лаборатории внутри комнаты, на полу закрепленное вертикально к штативу. Верхний слой периодически орошали водой в количестве, равном выпадению осадков в данной местности. Расчет искусственного орошения почвы в устройстве делается по формуле В=πR×p, где В - необходимое количество воды для орошения, πR - площадь поверхности прибора, R - радиус окружности цилиндра, π - число 3,14; р - количество осадков в этот или иной день. В лаборатории можно регулировать и температуру воздуха (в термостате или с применением кондиционера, холодильника и т.д.).
К этому времени на поверхности песка в обоих приборах надземная зеленая масса ячменя достигла высоты 25-30 см. Пробы травы, корней, корневищ и песка исследовали послойно. Траву в горизонтах 0-100 мм и 101 мм и выше; корни ячменя и корневища пырея в горизонтах 0-100 мм, 101-200 мм, 201-300 мм, 301-400 мм и 401-500 мм. За 0 принимали верхний уровень почвы (песка).
Траву и корни взвешивали и исследовали по методу Бермана. Песок в горизонтах (слои по 100 мм) взвешивали, после тщательного размешивания отбирали пробы по 100 г и исследовали методом Бермана.
Инвазионных личинок в траве регистрировали как подвижных, так и в анабиозе: на корнях и в песке - только подвижных.
Таблица 2
Вертикальная миграция личинок по корням и почве «сверху вниз», по траве «снизу-вверх» (цилиндр 1)
№№ пп
Вектор миграции
Горизонт
Масса, г
Количество личинок
Общая масса почвы, г
Всего (в т.ч. живых)
В 1 кг всего (живых)
I. Надземная часть (трава)
1
Снизу вверх
10 см и выше
4,5
5 (3)
1111 (607)
2
0-10 см
1,8
25 (19)
13889 (10550)
2. Подземная часть растений (корни)
1
Снизу вверх
0-10
1,2
26
21667
2
11-20
4,6
81
17609
3
21-30
2,0
214
107000
4
31-40
3,2
124
38750
5
41-50
5,0
694
138000
3. Подземная часть (почва, песок)
1
Снизу вверх
0-10
100,0
156
1560
1190
2
11-20
100,0
119
1190
1120
3
21-30
100,0
64
640
1431
4
31-40
100,0
43
430
1457
5
41-50
100,0
155
1550
1533
Таблица 3
Миграция личинок «снизу-вверх» по корням, почве и траве (цилиндр 2)
№ п/п
Вектор миграции
Горизонт
Масса, г
Количество личинок
Всего (в т.ч. живых)
В 1 кг всего (живых)
1. Надземная часть (трава)
1
Снизу вверх
10 см и выше
5,9
6 (2)
1017 (339)
2
0-10 см
2,0
15 (12)
7500 (6000)
II. Подземная часть растений (корни)
1
Снизу вверх
0-10
33
50
17879
2
11-20
6,0
152
25303
3
21-30
1,9
157
82632
4
31-40
23
320
139130
5
41-50
8,0
207
15275
III. Подземная часть (почва, песок)
1
Снизу вверх
0-10
100,0
18
180
2
11-20
100,0
21
210
3
21-30
100,0
41
410
4
31-40
100,0
292
2920
5
41-50
100.0
160
1600
Данный опыт свидетельствует о том, что инвазионные личинки стронгилят лошадей, во-первых, провели миграцию за 115 дней не только по корням «сверху вниз» на 500 мм, но и «снизу вверх» на траву на 20 и более см; во-вторых, число личинок на корнях (в пересчете на 1 кг массы) в несколько раз превышало их количество на траве и тем более в почве; в-третьих, количество инвазионных личинок стронгилят в траве на высоте 0-10 и 11-20 см, а также на корнях в горизонтах 0-10 и 20-80 см в обоих случаях было практически одинаково независимо от места закладки яиц (проб фекалий).
В результате изучения вертикальной миграции инвазионных личинок стронгилят в цилиндрах диаметром 100 мм и длиной 500 мм более удобно и информативно, чем в аппаратах с меньшими (50, 75 мм) и большими (200, 300 мм) параметрами.
Изучение контаминации пастбищных ландшафтов с применением данного устройства позволяет более объективно оценивать уровень инвазированности пастбищ в различных хозяйствах любой зоны. Она дает возможность определять скорость и интенсивность вертикальной и горизонтальной миграции в различных направлениях. Миграция происходит в основном по живым корням, в меньшей степени по траве и совсем незначительно через почву (песок). Дело в том, что основная масса влаги в почве в засушливых зонах и соответственно основная масса корней и корневищ в среднем находятся в горизонтах 0-500 мм. При помощи данного прибора можно моделировать миграцию инвазионных личинок при различных метеорологических условиях (умеренная и обильная влажность, засуха и т.п.) путем искусственной регуляции орошения и температуры.
Источники информации
1. Орлов И.В. Смена пастбищ как метод профилактики гельминтозов в овцеводческих хозяйствах. // Москва-Ленинград, 1937.
2. Payne F.K. (1923). Investigations on the control of hoohworm disease, XIV. Field experiments on the vertical migration of hoohworm]arwae // Amer.J. Hyg.3. - №I - p.46-58 (цит. по И.В.Орлову).
3. Krecek R.C.; Murrell K.D. Observations on the ability of larval Ostertagia ostertagi: to migrate through pasture soil || Proc. Helminthol. Soc. Wash. 1988. 55.1:24-27 (цит. по реф. P.T.Сафиуллин. Р.Ж. «Ветеринария». - М. - 1989. - №6. - C.48; BE 2247).
4. Лазарев Г.М. Новый метод определения контаминации пастбищной травы личинками паразитических нематод в аридной зоне. // Наука и высшая школа Калмыкии. - 2000. - 3-4 (5-6). - С.313-315.
5. Ершов B.C. Справочник по ветеринарной гельминтологии. - М.: Колос. - 1964. - 268 с.