Повышение эффективности нековалентной иммобилизации гемоглобина при формировании нанокомпозита «Гемоглобин/ углеродные нанотрубки»

размеры внутренних элементов, изменяют характер их посадки.

Библиографический список

1. Лакеенко, М. Н. Повышение геометрической точности вала якоря тягового электродвигателя / М. Н Лакеенко, В. И. Глухов, С. Н. Должиков // Инновации для транспорта : сб. науч. ст. с междунар. участием : в 3 ч. / М-во транспорта РФ ; Федер. агентство ж.-д. транспорта ; ОмГУПС. — ОмГУПС, 2010. - Ч. 2. - С. 51-57.

2. Лакеенко, М. Н. Измерительный комплекс для контроля отклонений от соосности элементов вала относительно общей оси / М. Н Лакеенко, В. И. Глухов, С. Н Должиков // Проблемы разработки, изготовления и эксплуатации ракетно-космической и авиационной техники : материалы V Всерос. науч. конф., посвящ. памяти гл. конструктора ПО «Полет» А. С. Клиныш-кова. - ОмГТУ, 2010. - С. 210-212.

3. Глухов, В. И. Открытие различной информативности осей координат в системах отсчета геометрических величин деталей машин и приборов / В. И. Глухов // Омский научный вестник. Сер. Приборы, машины и технологии. - 2010. -№3 (93). - С. 193-196.

4. Глухов, В. И. Геометрические характеристики изделий. Комплексные нормы взаимозаменяемости : моногр. / В. И. Глухов. - Омск : Изд-во ОмГТУ, 2015. - 160 с.

5. Пат. 109844 и1 (Ш), С01В 5/24. Устройство для измерения геометрических параметров / М. Н. Лакеенко (ИИ), С. Н. Должиков (ИИ), В. И. Глухов (ИИ), А. Н. Головаш (ИИ) ; патентообладатель Головаш А. Н. (Ш). - № 2011122059/28 ; заявл. 31.05.2011 ; опубл. 27.10.2011, Бюл. № 30.

ГЛУХОВ Владимир Иванович, доктор технических наук, профессор кафедры нефтегазового дела, стандартизации и метрологии, заведующий секцией метрологии и приборостроения Омского государственного технического университета. ЛАКЕЕНКО Максим Николаевич, кандидат технических наук, главный метролог Омского опытно-инструментального завода «Транспорт». ДОЛЖИКОВ Сергей Николаевич, кандидат технических наук, доцент (Россия), доцент кафедры локомотивов Омского государственного университета путей сообщения. Адрес для переписки: mips@omgtu.ru

Статья поступила в редакцию 10.10.2016 г. © В. И. Глухов, М. Н. Лакеенко, С. Н. Должиков

УДК 546.26:577.322:544.723.2:620.187

Н. Л. ДАВЛЕТКИЛЬДЕЕВ Е. Ю. МОСУР В. В. БОЛОТОВ И. А. ЛОБОВ

Омский научный центр СО РАН

Омский государственный университет им. Ф. М. Достоевского

ПОВЫШЕНИЕ

ЭФФЕКТИВНОСТИ НЕКОВАЛЕНТНОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА ПРИ ФОРМИРОВАНИИ НАНОКОМПОЗИТА «ГЕМОГЛОБИН/ УГЛЕРОДНЫЕ НАНОТРУБКИ»_

Исследована эффективность нековалентной иммобилизации гемоглобина (НЬ) на нелегированные и легированные азотом углеродные нанотрубки (УНТ). Установлено, что адсорбция НЬ н а легированные УНТ существенно у величивается при значениях рН ниже изоэлектрической точки белка. Показано, что легированные азотом УНТ адсорбируют гемоглобин с большей эффективностью, чем нелегированные, благодаря наличию дополнительного электростатического взаимодействия между белком и нанотрубкой.

Ключевые слова: гемоглобин, у глеродные нанотрубки, нанокомпозит, спектрофотомет-рия, физическая адсорбция.

Введение. Актуальность исследования взаимодействия молекул гемоглобина (НЬ) с углеродными нанотрубками (УНТ) обусловлена перспективностью нанокомпозитов «НЬ/УНТ» для биосенсорных приложений [1]. Связывание гемоглобином О2, N0 и СО

приводит к изменению его электрических свойств, что позволяет использовать НЬ в качестве активного компонента электрохимических биосенсоров. УНТ, обладая уникальными электрическими свойствами и морфологией, могут выступать в роли носителя

для молекул НЬ и служить медиатором переноса заряда от белка к электрохимическому электроду [2, 3].

Для закрепления молекул белков на поверхности УНТ применяются различные методы ковалентной и нековалентной иммобилизации [4]. Считается, что нековалентная иммобилизация имеет преимущества перед ковалентной, так как вносит минимальные искажения в конформационную структуру биомолекул и электронную структуру внешних стенок УНТ. Недостатком методов нековалентного связывания является нестабильность закрепления молекул на УНТ и их возможная потеря в процессе эксплуатации структур белок/УНТ.

В связи с этим актуальным является поиск способов эффективного и стабильного закрепления НЬ на УНТ с использованием методов нековалентной иммобилизации. Перспективным способом повышения эффективности иммобилизации НЬ на УНТ является легирование УНТ различными примесями. При этом в стенке УНТ формируются заряженные дефекты, на которых возможно эффективно и стабильно иммобилизовать молекулы НЬ посредством эле ктр о статич е с ко го вз аимо де йствия.

Ранее было получено прямое подтверждение физической адсорбции молекул НЬ на поверхности легированных азотом многостенных УНТ по данным атомно-силовой и сканирующей электронной микроскопии [5].

Цель данной работы заключается в определении эффективности прямой физической адсорбции гемоглобина на нелегированные и легированные азотом углеродные нанотрубки.

Материалы и методы. Многостенные нелегированные и легированные азотом УНТ синтезировались методом химического парофазного осаждения на установке СУБ-4 (ИНХ СО РАН, Россия). В результате пиролиза паров толуола (для нелегированных УНТ) и ацетонитрила (для Ы-легированных УНТ) при 850 °С с добавлением в качестве источника катализатора Бе ферроцена в соотношении (100:2), на подложках 8Ю2/81 формировался плотный слой вертикально расположенных УНТ толщиной 15 — 25 мкм. По данным рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии концентрация азота в легированных УНТ составила 4 ат. %.

В качестве препарата молекул гемоглобина использовался готовый водный раствор НЬ с концентрацией 150 г/л (НПЦ «Эко-Сервис», Россия).

Из слоев УНТ готовилась водная суспензия, для чего навески УНТ диспергировались ультразвуком в деионизованной воде в течение 5 часов. К суспензии УНТ с рН 5,4 и 8,3 (корректировались 0,1 Н растворами НС1 или КОН, контролировались рН-метром рН-150МИ) добавляли 0,5 мл водного раствора НЬ, затем встряхивали в течение 10 минут в вортексе, после чего выдерживали в течение 1 часа для осаждения УНТ с адсорбированным НЬ. Надо-садочная фракция раствора отбиралась дозатором и использовалась для определения концентрации неадсорбированного белка. Для исследования кинетики адсорбции НЬ при рН 5,4 суспензии УНТ с НЬ встряхивали в вортексе в течение 10, 20, 30 минут, затем выдерживали в течение 1 часа для осаждения УНТ с адсорбированным НЬ.

Эффективность нековалентной иммобилизации НЬ на УНТ определялась на основе измерения концентрации неадсорбированного белка в растворе после экспозиции с УНТ. Для определения концентрации белка измерялись спектры оптической плот-

- Контроль

510 530 550 570 590 610 Длина волны, нм

630

650

Рис. 1. Спектры оптической плотности контрольного раствора гемоглобина и растворов гемоглобина после взаимодействия с нелегированными УНТ при различных значениях рН

510 530 550 570 590 610 Длина волны, нм

630

650

Рис. 2. Спектры оптической плотности контрольного раствора гемоглобина и растворов гемоглобина после взаимодействия с легированными азотом УНТ

ности контрольного раствора НЬ (готовился добавлением 0,5 мл исходного раствора НЬ в 5 мл деионизованной воды) и надосадочной фракции раствора, содержащей неадсорбированный НЬ. Спектры регистрировались на спектрофотометре СФ-56 (ЛОМО, Россия) в диапазоне длин волн 510^650 нм в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм.

Расчет общей концентрации и содержания основных производных НЬ (оксигемоглобина (НЬО2), дезоксигемоглобина (НЬ), карбоксигемоглобина (НЬСО) и метгемоглобина (МеШЬ)) производился посредством оригинальной программы «НешоБрес-1г» (ОмГУ, Россия) [6].

Результаты. На рис. 1. представлены типичные спектры оптической плотности растворов гемоглобина до и после адсорбции НЬ на нелегированные УНТ при рН выше и ниже изоэлектрической точки белка (р1НЬ = 6,8). В легенде к спектрам представлены концентрации НЬ. Концентрация гемоглобина в растворе после взаимодействия с нелегированными УНТ заметно снижается. При этом уменьшение концентрации НЬ не зависит от величины рН.

На рис. 2 представлены типичные спектры оптической плотности растворов гемоглобина до и после адсорбции НЬ на легированные азотом УНТ при рН выше и ниже изоэлектрической точки НЬ. После взаимодействия с легированными УНТ концентрация гемоглобина в растворе существенно снижается, причем максимального снижения достигает при рН=5,4, то есть при величине меньше изоэлектрической точки белка.

Таблица 1

Основные производные гемоглобина в растворах до и после взаимодействия с нелегированными и легированными УНТ

5000

НЬ на нелегированных УНТ

НЬ на N-легированных УНТ

На рис. 3. показаны рассчитанные средние величины адсорбции Hb на нелегированные и легированные азотом УНТ при pH выше и ниже изоэлектриче-ской точки белка. Адсорбция Hb на нелегированные УНТ практически не зависит от величины pH раствора. Адсорбция белка на легированные УНТ заметно выше при обеих величинах pH, но наиболее существенна при pH ниже изоэлектрической точки, когда суммарный заряд белка имеет положительный заряд.

В табл. 1 представлены доли содержания основных производных гемоглобина в контрольном растворе (Hb) и в растворах после взаимодействия с нелегированными (CNT+Hb) и легированными (N-CNT + Hb) УНТ. Из табл. 1 видно, что в растворе доминирует метгемоглобин. Кроме того, после взаимодействия с УНТ раствор насыщается кислородом, о чем свидетельствует увеличение доли оксигемогло-бина. Это может быть как следствием встряхивания раствора при проведении процедуры иммобилизации, так и результатом взаимодействия Hb с молекулярным кислородом, адсорбированным на стенках УНТ.

На рис. 4 показана кинетика адсорбции Hb на нелегированные и легированные УНТ. Масса адсорбированного гемоглобина увеличивается с ростом времени экспозиции. Рассматривая процесс адсорбции гемоглобина на УНТ как обратимую адсорбцию, можно заключить, что и для нелегированных и для легированных УНТ адсорбция превалирует над десорбцией. Однако, в отличие от нелегированных УНТ, легированные азотом УНТ адсорбируют гемоглобин быстрее. Это может быть связано с более высокой эффективностью и/или стабильностью адсорбции на них.

Согласно современным представлениям [4], доминирующим типом нековалентного взаимодействия нефункционализированных УНТ с белками является гидрофобное взаимодействие (гидрофобные участки белка могут присоединяться к гидрофобным стенкам нанотрубки). Повышение эффективности прямой нековалентной иммобилизации белка на легированные УНТ может происходить за счет увеличения вклада электростатического взаимодействия молекул с заряженными дефектами в стенке УНТ (протониро-ванные аминогруппы белка взаимодействуют с дефектами на поверхности нанотрубки). Действительно, в легированных азотом УНТ атом азота, замещая атом углерода в стенке нанотрубки (в пири-диноподобном или графитоподобном положении), формирует квазисвязанное донорное состояние, которое локально увеличивает электронную плотность и создает на поверхности УНТ аналог отрицательно заряженной функциональной группы. При pH<pIHb молекулы Hb в растворе имеют положительный заряд. Электростатическое взаимодействие

5.4 8.3

Величина рН Рис. 3. Величины адсорбции НЬ на нелегированные и легированные азотом УНТ при рН ниже (5,4) и выше (8,3) изоэлектрической точки белка

Рис. 4. Зависимость адсорбции гемоглобина на нелегированные и легированные азотом УНТ от времени

положительно заряженной молекулы белка с отрицательно заряженными участками локализации атомов азота в стенке УНТ может приводить к эффективному и стабильному связыванию гемоглобина с УНТ.

Заключение. Исследовано влияние легирования азотом на эффективность нековалентной иммобилизации гемоглобина на углеродные нанотрубки. Показано, что величина адсорбции Hb на нелегированные нанотрубки не зависит от величины pH раствора. Адсорбция белка на легированные азотом УНТ выше при всех величинах pH и достигает наибольшего значения при pH ниже изоэлектрической точки белка, когда суммарный заряд молекулы имеет положительный знак. Показано, что для нелегированных и легированных УНТ процесс адсорбции гемоглобина преобладает над десорбцией. Легированные азотом УНТ адсорбируют гемоглобин с большей эффективностью, что обусловлено наличием дополнительного электростатического взаимодействия между белком и нанотрубкой.

Библиографический список

1. Yuan-Di Zhao, The interface behavior of hemoglobin at carbon nanotube and the detection for H2O2 / Yuan-Di Zhao, Yan-Hua Bi, Wei-De Zhang, Qing-Ming Luo // Talanta. - 2005. -Vol. 65. - P. 489-494.

2. Jun Hong, Direct electrochemistry of hemoglobin immobilized on a functionalized multi-walled carbon nanotubes and gold nanoparticles nanocomplex-modified glassy carbon electrode / Jun Hong, Ying-Xue Zhao, Bao-Lin Xiao, Ali Akbar Moosavi-

Movahedi, Hedayatollah Ghourchian, Nader Sheibani // Sensors. — Омского научного центра СО РАН (ОНЦ СО РАН);

2013. — Vol. 13. — P. 8595 — 8611. доцент кафедры прикладной и медицинской физики

3. Huijun Wan, Direct electrochemistry and voltammetric Омского государственного университета им. Ф. M. До-determination of midecamycin at a multi-walled carbon nanotube стоевского (ОмГУ).

coated gold electrode. / Huijun Wan, Faqiong Zhao, Baizhao МОСУР Евгений Юрьевич, кандидат физико-матема-

Zeng // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. — 2011. — тических наук, доцент (Россия), старший научный

Vol.86. — P. 247—250. сотрудник Комплексного научно-исследователь-

4. N. Saifuddin, Carbon nanotubes: A review on structure ского отдела региональных проблем ОНЦ СО РАН, and their interaction with proteins / N. Saifuddin, A. Z. Raziah, доцент кафедры прикладной и медицинской физики A. R. Junizah // Journal of Chemistry. - 2013. - V. 2013. ОмГУ.

Article ID 676815. 18 p. D0l:10.1155/2013/676815. БОЛОТОВ Валерий Викторович, доктор физико-

5. В. В. Болотов. Физическая адсорбция гемоглобина на математических наук, профессор (Россия), главный поверхности легированных углеродных нанотрубок / В. В. Бо- научный сотрудник Комплексного научно-исследо-лотов, Н. А. Давлеткильдеев, Е. Ю. Мосур // Журнал физи- вательского отдела региональных проблем ОНЦ СО ческой химии. — 2014. — Т. 88. — С. 1632-1634. РАН, профессор кафедры прикладной и медицин-

6. HemoSpectr : свидетельство об официальной регистрации ской физики ОмГУ.

программы для ЭВМ № 2001610571 РФ / Мосур Е. Ю. ; заяви- ЛОБОВ Иван Андреевич, аспирант кафедры при-

тель ОмГУ. — № 2001610305 ; заявл. 19.03.2001 ; зарегистр. кладной и медицинской физики ОмГУ; инженер-

в Реестре программ для ЭВМ 17.05.2001. технолог Комплексного научно-исследовательского

отдела региональных проблем ОНЦ СО РАН. Адрес для переписки: LI_87@mail.ru

ДАВЛЕТКИЛЬДЕЕВ Надим Анварович, кандидат

физико-математических наук, доцент (Россия), Статья поступила в редакцию 11.10.2016 г.

старший научный сотрудник Комплексного научно- © н. А. Давлеткильдеев, Е. Ю. Мосур, В. В. Болотов,

исследовательского отдела региональных проблем и. А. Лобов

Книжная полка

Янгулов, В. С. Детали машин. Волновые и винтовые механизмы и передачи : учеб. пособие для магистратуры и студентов вузов по направлению подгот. 200100 - Приборостроение и специальности 200101 - Приборостроение / В. С. Янгулов. - М. : Юрайт, 2016. - 183 с.

Серия «Университеты России» позволит высшим учебным заведениям нашей страны использовать в образовательном процессе учебники и учебные пособия по различным дисциплинам, подготовленные преподавателями лучших университетов России и впервые опубликованные в издательствах университетов. Все представленные в этой серии учебники прошли экспертную оценку учебно-методического отдела издательства и публикуются в оригинальной редакции. В пособии приводятся сведения о волновых и винтовых механизмах и передачах, которые находят широкое применение в различных областях техники. Одним из основных направлений применения этих механизмов является использование их в приводах с высокими значениями параметров по точности перемещений выходного звена и по долговечности. Приведенные методики расчетов апробированы при создании реальных конструкций редукторов, которые внедрены в состав космических аппаратов. Методики обеспечивают качественный расчет параметров передач на стадии проектирования. Для студентов, обучающихся по магистерской программе «Системы ориентации, стабилизации и навигации», аспирантов, преподавателей вузов, специализирующихся в данной области техники, и может использоваться инженерами-практиками, занимающимися разработкой высокоточных редукторов с длительным ресурсом.

Егоров, П. Метрология, стандартизация и сертификация в инфокоммуникациях : учеб. пособие / П. Егоров. - М. : Academia, 2015. - 352 с. - ISBN 978-5-4468-0331-6.

Учебное пособие создано в соответствии с Федеральным государственным образовательным стандартом по направлению подготовки 210700 «Инфокоммуникационные технологии и системы связи» (квалификация «бакалавр»). Рассмотрены основы метрологии как науки об измерениях и ее роли в повышении эффективности научных исследований и создании новых инфокоммуникационных технологий. Представлены основные понятия метрологии, методах и средствах измерений, эталонах основных единиц электрических величин. Изложены основы теории погрешностей и статистической обработки результатов измерений. Приведены сведения об основах государственного регулирования обеспечения единства измерений, метрологических службах и организациях, поверке и калибровке средств измерений. Описаны методы измерений, устройство и принцип действия основных измерительных приборов. Рассмотрены законодательная и нормативная база стандартизации и подтверждения соответствия в Российской Федерации, основные системы сертификации, функции и организация работы органов по сертификации и испытательных лабораторий. Дана информация о стандартизации и сертификации в зарубежных странах. Для студентов учреждений высшего образования.