ПРОТИВОВИРУСНАЯ КОМПОЗИЦИЯ
ANTIVIRAL COMPOSITION

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к композиции, содержащей экстракт растения Ficus arnottiana, обладающего противовирусной активностью. Настоящее изобретение также относится к способу получения композиции. Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции для применения в лечении вирусных инфекций, особенно вызванных вирусом простого герпеса (HSV).
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вирусы являются этиологической причиной многих заболеваний, угрожающих жизни или ухудшающих качество жизни человека. Особое беспокойство вызывают вирусы герпеса, такие как вирус простого герпеса 1 типа (HSV-1), вирус простого герпеса типа 2 (HSV-2), цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирус опоясывающего лишая (VZV) и вирусы герпеса человека 6, 7 и 8 типов (HHV-6, HHV-7 и HHV-8) и т.п.
Простой герпес - это вирусное заболевание, вызванное вирусами простого герпеса (HSV). HSV-1 часто ассоциируется с герпетическим поражением кожи лица, которое известно как герпес губ или простой герпес. Инфекция, вызываемая HSV-1, обычно возникает в слизистой оболочке орофарингеальной зоны, где вирус начинает колонизировать ганглий тройничного нерва и персистирует в нем в латентном состоянии. HSV-2 чаще ассоциируется с генитальным герпесом. HSV-2 обычно передается половым путем и бывает в анусе, прямой кишке, верхнем отделе пищеварительного тракта, а также в области половых органов с диссеминацией в область крестцовых ганглиев. В зависимости от зон контакта оба вируса могут, наоборот, инфицировать слизистую оболочку полости рта или половых органов. Эти вирусы могут проникать в центральную нервную систему, где они реплицируются, и вызывать латентную инфекцию в ганглиях задних корешков.
Заболевания, вызванные HSV, могут становиться угрожающими для жизни пациентов с ослабленным иммунитетом, особенно пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). После первичного инфицирования HSV сохраняется в организме хозяина в течение всей жизни последнего, поэтому инфекция, вызываемая HSV, рассматривается как пожизненная инфекция (The Journal of Infectious Diseases, 2002, 186, S71-S77).
Несколько противовирусных препаратов, которые применяются для лечения герпеса, включают ацикловир, валацикловир, фамцикловир и пенцикловир. Из числа перечисленных противовирусных средств для лечения вирусных инфекций, вызванных HSV-1 и HSV-2, используется ацикловир.
Растение Ficus arnottiana, которое широко распространено в Индии и на Шри-Ланке, представляет собой лиственное дерево средних размеров без воздушных корней. Растение применяют для лечения заболеваний кожи, воспалений, диареи, диабета, чувства жжения, лепры, чесотки и ран в соответствии с традиционной системой медицины Аюрведа (Natural Product Radiance, 2009, 8 (5), 478-482).
По-прежнему существует необходимость в эффективных композициях и способах профилактики и лечения вирусных инфекций, особенно герпетических инфекций. Частота и степень тяжести герпетических инфекций увеличились из-за увеличения числа пациентов с ослабленным иммунитетом, причиной чего являются агрессивные схемы химиотерапии, растущая частота трансплантации органов и увеличение частоты инфицирования ВИЧ.
Насколько нам известно, на сегодняшний день отсутствует информация о каком-либо лекарственном препарате для лечения вирусных инфекций, содержащем экстракт растения Ficus arnottiana.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фигуре 1 представлена хроматограмма образца 23 из примера 4, проанализированного с помощью ВЭЖХ. На хроматограмме представлены два пика биоактивных маркеров (ВМ), а именно ВМ-1 и ВМ-2.
На фигуре 2 представлена хроматограмма состава IB из примера 6, проанализированного с помощью ВЭЖХ. На хроматограмме представлены два пика биоактивных маркеров (ВМ), а именно ВМ-1 и ВМ-2.
На фигуре 3 показана ингибирующая активность образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-1 до инфицирования по сравнению с ингибирующей активностью ацикловира.
На фигуре 4 показана ингибирующая активность образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-2 до инфицирования по сравнению с ингибирующей активностью ацикловира.
На фигуре 5 показан ингибирующий эффект образца 23 из примера 4 в отношении адсорбции HSV-1 по сравнению с ингибирующим эффектом ацикловира.
На фигуре 6 показан ингибирующий эффект образца 23 из примера 4 в отношении адсорбции HSV-2 по сравнению с ингибирующим эффектом ацикловира.
На фигуре 7 показана ингибирующая активность образца 23 из примера 4 в отношении проникновения HSV-1 по сравнению с ингибирующей активностью ацикловира.
На фигуре 8 показана ингибирующая активность образца 23 из примера 4 в отношении проникновения HSV-2 по сравнению с ингибирующей активностью ацикловира.
На фигуре 9 показан вирулицидный эффект образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-1 по сравнению с вирулицидным эффектом ацикловира.
На фигуре 10 показан вирулицидный эффект образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-2 по сравнению с вирулицидным эффектом ацикловира.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество выделенного экстракта растения Ficus arnottiana в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Настоящее изобретение также относится к способу получения экстракта растения Ficus arnottiana и композиции, содержащей выделенный экстракт в качестве активного ингредиента.
Настоящее изобретение также относится к противовирусной активности композиции.
В одном из аспектов настоящего изобретения противовирусная активность композиции представляет собой активность против HSV. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество выделенного экстракта растения Ficus arnottiana и фармацевтически приемлемый носитель, для применения в предупреждении и лечении вирусной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса (HSV).
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения у субъекта вирусной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса (HSV), который включает введение субъекту композиции, содержащей терапевтически эффективное количество выделенного экстракта растения Ficus arnottiana в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество выделенного экстракта растения Ficus arnottiana и фармацевтически приемлемый носитель, для применения в предупреждении вирусной инфекции вместе с использованием презервативов или других барьерных средств контрацепции.
Настоящее изобретение включает композицию, содержащую терапевтически эффективное количество выделенного экстракта растения Ficus arnottiana в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, для применения в предупреждении и лечении вирусных инфекций, вызванных вирусом простого герпеса (HSV).
Настоящее изобретение также включает применение выделенного экстракта растения Ficus arnottiana с целью производства лекарственного препарата для лечения вирусной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса (HSV).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Прежде чем перейти к подробному описанию настоящего изобретения, следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления. Также следует понимать, что использованная в данном документе терминология применяется только для описания конкретных вариантов осуществления и не рассматривается как ограничивающая.
Использованные в описании и формуле изобретения формы единственного числа охватывают также ссылки на множественное число, если в контексте четко не указано другое.
Если не указано другое, все используемые в данном документе технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понимает средний специалист той области, к которой относится настоящее изобретение.
Используемые в данном документе термины "лечение", "лечить" или "обработка" включают превентивное (профилактическое) и паллиативное лечение.
Термин "Ficus arnottiana" также включает синонимы, такие как "Ficus populifolia", "Urostigma arnottianum" или "Urostigma cordifolium ".
Упоминаемые в данном документе "экстракт" или "выделенный экстракт" означают смесь соединений, которые присутствуют в растении, или фракции, полученные из растения Ficus arnottiana. Такие соединения или фракции получают путем экстракции из измельченного целого растения или частей растения Ficus arnottiana, например ствола (ствола с корой), ствола без коры, коры и веток с применением соответствующих растворителей, при этом за этапом экстракции необязательно может следовать дополнительное обогащение. Термины "экстракт" и "выделенный экстракт" могут использоваться взаимозаменяемо.
Упоминаемые в данном документе "противовирусные лекарственные средства" относятся к классу терапевтических средств, применяемых, в частности, для лечения вирусных инфекций, особенно вызванных вирусами простого герпеса, такими как вирус простого герпеса 1 типа (HSV-1), вирус простого герпеса 2 типа (HSV-2), цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирус опоясывающего лишая (VZV) и вирусы герпеса человека 6, 7 и 8 типов (HHV-6, HHV-7 и HHV-8) и т.п.
Упоминаемая в данном документе "композиция" относится к растительной композиции или фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество экстракта или выделенного экстракта растения Ficus arnottiana в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Необходимо отметить, что термин "композиция" следует интерпретировать в широком смысле и он включает любую композицию, предназначенную для достижения терапевтического эффекта, имеющуюся в продаже либо как фармацевтический препарат, например, с маркировкой для назначенного указания к применению, либо имеющуюся в продаже как препарат, отпускаемый без рецепта, либо имеющуюся в продаже как растительный лекарственный препарат.
Используемый в данном документе термин "терапевтически эффективное количество" означает количество экстракта растения Ficus arnottiana, которое дает желаемый терапевтический ответ, такой как облегчение, лечение и/или предупреждение вирусной инфекции или симптомов поражения кожи, свищей, герпеса губ, волдырей, наростов, припухлостей, узелков, папул, сыпи и язв, связанных с вирусной инфекцией или вызванных вирусной инфекцией, особенно вызванных HSV-1 или HSV-2.
Под "фармацевтически приемлемым" подразумевается, что носитель, разбавитель, наполнители и/или соль должны быть совместимы с другими ингредиентами, входящими в состав, и не быть вредными для пациента, их получающего.
Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает нетоксичное, инертное твердое, полутвердое вещество, разбавитель, такой как вода, инкапсулирующий материал или вспомогательное вещество любого типа для лекарственного состава. Некоторые неограничивающие примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, представляют собой сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал, целлюлозу и ее производные, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы, солод, желатин, тальк, кроме того другие нетоксичные совместимые смазывающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, антиадгезивные средства; средства покрытия, подсластители, вкусовые и ароматизирующие средства; консерванты, такие как фенолип, метилпарабен, бутилпарабен и пропилпарабен; антиоксиданты; масла или воски, такие как пчелиный воск, карнаубский воск, твердый воск, желтый воск и цетиловые сложные эфиры; эмульгаторы, такие как моностеарат глицерина; петролатумы, например парафин, ланолиновые спирты, белый вазелин, желтый вазелин, спирты шерстяного жира, нефтяной вазелин и нефтяной воск; гликоли, такие как пропиленгликоль, метилгликоль и метилэтиленгликоль; карбомеры, такие как карбопол 974Р; полиоксиэтиленовые алкиловые эфиры, такие как цетостериловый спирт; пластификаторы, такие как триэтаноламин; растворители и гидрофильные желатинирующие средства также могут присутствовать в композиции согласно решению разработчика рецептуры.
Используемый в данном документе термин "биологически активный маркер" относится к биологически активным химическим соединениям, которые присутствуют в экстракте целого растения или частей растения Ficus arnottiana, таких как ствол (ствол с корой), ствол без коры, кора и ветки. Биологически активные маркеры, выделенные из экстракта ствола растения Ficus arnottiana, проявляют противовирусную активность.
Используемый в данном документе термин "субъект" относится к животному, в частности к млекопитающему, более конкретно к человеку. Используемый в данном документе термин "млекопитающее" относится к теплокровным позвоночным животных класса млекопитающих, включая людей, которые отличаются наличием волосяного покрова на коже и наличием у особей женского пола молочных желез, у которых образуется молоко, для вскармливания потомства. Термин "млекопитающие" включает таких животных как кот, собака, кролик, медведь, лиса, волк, обезьяна, олень, мышь, свинья, а также включает человека.
Растение Ficus arnottiana является широко распространенным видом в Индии и на Шри-Ланке. В различных местах штата Махараштра, Индия, и вблизи этого региона, в Белгауме, Колхапуре, Гоа, собирали целые растения этого вида или части растений, такие как ствол, ствол без коры, кора и ветки. Свежесобранные растения или части растений высушивали. Для определения таксономических характеристик во время цветения и плодоношения собирали образцы гербария и хранили в гербарии под ведомством компании Piramal Healthcare Limited (ранее Piramal Life Sciences Limited), Горегаон, Мумбаи, Индия. На основании морфологических признаков гербарные образцы были отнесены к Ficus arnottiana. Полученные и использованные в данном изобретении экстракты не ограничиваются теми, которые были получены из растений Ficus arnottiana, выращенных в Махараштре, Индия; экстракт может быть получен из любого растения Ficus arnottiana, выращенного в других регионах.
Настоящее изобретение относится к выделенному экстракту из целого растения или одной или нескольких частей растения Ficus arnottiana, полученному путем перемешивания измельченного целого растения или одной или нескольких частей растения с растворителем с последующим концентрированием полученного экстракта и необязательным обогащением экстракта путем разделения растворителем. Части растений, которые могут быть использованы, включают ствол с корой, ствол без коры, кору, листья, ветки, корни, цветки, соцветия, семена и плоды. Предпочтительно, чтобы для применения выбирались такие части растения, как ствол (ствол с корой), ствол без коры, кора и ветки.
Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество выделенного экстракта целого растения или одной или нескольких частей растения Ficus arnottiana в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Настоящее изобретение также относится к способу получения экстракта растения Ficus arnottiana и композиции, содержащей экстракт в качестве активного ингредиента.
Способ получения композиции включает следующие этапы, на которых:
(а) получают экстракт из измельченного целого растения или одной или нескольких частей растения Ficus arnottiana путем перемешивания с растворителем в соотношении от 1:8 до 1:10 вес/объем в течение 3-12 часов при 30-50°C;
(b) концентрируют экстракт, полученный на этапе (а);
(c) необязательно высушивают экстракт, полученный на этапе (b), под высоким вакуумом (0,01-5 мм рт.ст.);
(d) необязательно обогащают экстракт, полученный на этапе (b) или на этапе (с), путем разделения растворителем и
(e) смешивают экстракт, полученный на этапе (b), этапе (с) или этапе (d), с фармацевтически приемлемым носителем с получением композиции.
В одном из аспектов настоящего изобретения экстракт, полученный на этапе (b), этапе (с) или этапе (d), можно применять без фармацевтически приемлемого носителя.
В другом аспекте настоящего изобретения части растения выбирают из ствола, коры, ствола без коры и веток.
В одном из вариантов осуществления композиция настоящего изобретения содержит экстракт ствола растения Ficus arnottiana. Соответственно, представлен способ получения композиции, содержащей экстракт со ствола растения Ficus arnottiana, который включает следующие этапы, на которых:
(a) получают экстракт из ствола растения Ficus arnottiana путем перемешивания с растворителем в соотношении от 1:8 до 1:10 вес/объем в течение 3-12 часов при 30-50°C;
(b) концентрируют экстракт, полученный на этапе (а);
(c) необязательно высушивают экстракт, полученный на этапе (b), под высоким вакуумом (0,01-5 мм рт.ст.);
(d) необязательно обогащают экстракт, полученный на этапе (b) или этапе (с), путем разделения растворителем и
(е) смешивают экстракт, полученный на этапе (b), этапе (с) или этапе (d), с фармацевтически приемлемым носителем и составляют в терапевтические лекарственные формы.
В одном из аспектов настоящего изобретения экстракт, полученный на этапе (b), этапе (с) или этапе (d), может применяться без фармацевтически приемлемого носителя.
Целое растение или одну или несколько частей растения Ficus arnottiana можно измельчать, при этом целое растение или одну или несколько частей растения Ficus arnottiana можно грубо измельчать, или измельчать в порошок, или измельчать до структуры другого типа.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения растворитель для экстракции измельченного целого растения или одной или нескольких частей растения Ficus arnottiana выбирают из метанола, этанола, н-пропанола, изопропанола, н-бутанола, ацетона, этилацетата, дихлорметана, воды или их смесей, предпочтительно смеси метанола и воды.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения экстракт в растворителе перед концентрированием фильтруют.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения концентрирование экстракта в растворителе осуществляют с применением одного или нескольких способов, выбранных из: (i) перегонки при пониженном давлении (150-600 мм рт.ст.) при 30-50°C; (ii) лиофилизации и (iii) высушивания распылением, с получением экстракта.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения растворители для обогащения экстракта посредством разделения растворителем выбирают из воды, петролейного эфира, дихлорметана, хлороформа, этилацетата, метанола, ацетона, ацетонитрила, н-пропанола, изопропанола и бутанола или их смесей.
В одном из аспектов настоящего изобретения из экстракта целого растения или одной или нескольких частей растения Ficus arnottiana выделяют один или несколько биологически активных маркеров.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в экстракте растения Ficus arnottiana идентифицируют два биологически активных маркера. Биологически активные маркеры выделяют из экстракта и конкретно идентифицируют как флоризин и 5,7,4'-тригидроксифлавон.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения из композиции, содержащей экстракт растения Ficus arnottiana, выделяют два биологически активных маркера. Биологически активные маркеры идентифицируют как флоризин и 5,7,4'-тригидроксифлавон.
Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество экстракта растения Ficus arnottiana, содержащего один или несколько биологически активных маркеров, для применения в предупреждении и лечении вирусной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса (HSV).
В одном из вариантов осуществления содержащимся в экстракте биологически активным маркером является флоризин и 5,7,4'-тригидроксифлавон или их смесь.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к биологически активному маркеру(-ам), выделенному из экстракта растения Ficus arnottiana для применения в лечении вирусной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса (HSV), где HSV может быть HSV-1 или HSV-2 и где биологически активный маркер выбирают из флоризина, или 5,7,4'-тригидроксифлавона, или их смесей.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения у субъекта вирусной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса (HSV), который включает введение субъекту композиции, содержащей терапевтически эффективное количество выделенного экстракта растения Ficus arnottiana.
Настоящее изобретение, кроме того, дополнительно относится к способу лечения у субъекта вирусной инфекции, вызванной HSV, где HSV представляет собой HSV-1; при этом способ включает введение субъекту композиции, содержащей терапевтически эффективное количество выделенного экстракта растения Ficus arnottiana.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения у субъекта вирусной инфекции, вызванной HSV, где HSV представляет собой HSV-2; при этом способ включает введение субъекту композиции, содержащей терапевтически эффективное количество выделенного экстракта растения Ficus arnottiana.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество выделенного экстракта растения Ficus arnottiana в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, для применения в предупреждении и лечении вирусной инфекции, вызванной HSV.
Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество выделенного экстракта растения Ficus arnottiana в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, для применения в предупреждении и лечении вирусной инфекции, вызванной HSV, где HSV представляет собой HSV-1.
Настоящее изобретение, кроме того, дополнительно относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество выделенного экстракта растения Ficus arnottiana в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, для применения в предупреждении и лечении вирусной инфекции, вызванной HSV, где HSV представляет собой HSV-2.
Настоящее изобретение также относится к применению терапевтически эффективного количества выделенного экстракта растения Ficus arnottiana в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем с целью производства лекарственного препарата для лечения вирусной инфекции.
В одном из аспектов настоящего изобретения субъектом, подлежащим лечению, или субъектом, на которого направлено применение, является млекопитающее, в частности человек, у которого диагностировали инфекцию, вызванную вирусом. Конкретнее, млекопитающим, подлежащим лечению, является человек, у которого диагностировали инфекцию, вызванную HSV.
В другом аспекте настоящего изобретения субъектом, подлежащим лечению, является млекопитающее, в частности человек, у которого диагностировали инфицирование вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и которому композицию вводят для профилактики коинфицирования HSV-1.
В еще одном аспекте настоящего изобретения субъектом, подлежащим лечению, является млекопитающее, в частности человек, у которого диагностировали инфицирование вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и которому композицию вводят для профилактики коинфицирования HSV-2.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения млекопитающим, подлежащим лечению, является человек, которому композицию вводят для профилактики инфекции, передающейся половым путем (STI).
В другом аспекте настоящего изобретения субъектом, подлежащим лечению, является млекопитающее, в частности человек, у которого диагностировали рецидивирующие инфекции, вызванные HSV.
Настоящее изобретение также предусматривает применение композиции настоящего изобретения в комбинации с другими противовирусными лекарственными средствами, такими как ацикловир, фамцикловир, ганцикловир, имуновир, индинавир или озельтамивир.
В одном из аспектов настоящего изобретения способ лечения вирусной инфекции включает введение вышеописанной композиции с помощью известных способов введения, которые помимо прочего включают нижеследующие.
Композиция может быть введена перорально, например, в виде пилюль, таблеток, таблеток, покрытых оболочкой, капсул, гранул, растворов, эликсиров или сиропа.
В соответствии с настоящим изобретением композиция, составленная для перорального применения (пероральные составы), содержит от приблизительно 5% до приблизительно 99% по весу экстракта растения Ficus arnottiana. Пероральные составы получают путем тщательного смешивания экстракта растения Ficus arnottiana с обычной основой, такой как сахара, крахмалы или смазывающие вещества.
Композиция может применяться для местного или трансдермального применения. Местные композиции настоящего изобретения включают составы, подходящие для местного или трансдермального применения на коже, подходящие для нанесения на слизистые оболочки или введения совместно с презервативом или другим барьерным средством контрацепции. Композиции могут быть составлены в большое разнообразие типов продуктов, которые включают без ограничения лосьоны, крема, гели, палочки, пластыри, вагинальные суппозитории или пессарии, спреи или мази.
В соответствии с настоящим изобретением композиция, составленная для местного или трансдермального применения, содержит от приблизительно 5% до приблизительно 99%, предпочтительно от 5 до 50% по весу экстракта растения Ficus arnottiana. Состав для местного или трансдермального применения получают путем смешивания экстракта растения Ficus arnottiana с обычной основой, такой как масла, воски или гликоли.
Экстракт растения Ficus arnottiana содержится в композиции настоящего изобретения в таком количестве, которое является эффективным для достижения желаемого терапевтического ответа у конкретного пациента, не проявляя при этом токсичности по отношению к пациенту и не вызывая у него тяжелых побочных эффектов. Эффективное количество будет зависеть от множества факторов, включающих активность экстракта, использованного в настоящем изобретении, способ введения, время применения, скорость экскреции конкретной используемой композиции, длительность лечения, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и прошлую историю болезни пациента, подлежащего лечению, и подобные факторы, хорошо известные в области медицины.
Эффективность экстракта растения Ficus arnottiana устанавливали с помощью биологических анализов, которые подробно описаны в нижеследующих примерах. Эти примеры приведены в данном документе только с целью пояснения и не должны ограничивать объем настоящего изобретения.
Примеры
[Примечание: вода, используемая в протоколах экспериментов, является деминерализованной водой.]
Пример 1
Получение экстракта Ficus arnottiana с применением смеси дихлорметана (DCM) и метанола (1:1)
Свежесобранные стволы Ficus arnottiana высушивали с использованием осушителя и измельчали в порошок. Грубо измельченный материал (150 г) вымачивали в 1500 мл смеси DCM:метанол (1:1) при постоянном помешивании в течение 3 часов в круглодонной колбе, которую помещали на водяную баню, поддерживаемую при температуре 40°C±5°C. Экстракт фильтровали, а остаток вымачивали в 1500 мл смеси DCM:метанол (1:1) в течение 3 часов при 40°C±5°C и фильтровали. Экстракты соединяли и концентрировали с использованием роторного испарителя при 45°C в условиях линейного вакуума (приблизительно 500 мм рт.ст.) с получением 5,0 г первичного экстракта (обозначено как образец 1).
Экстракты из других частей растения, таких как кора ствола, ствол без коры и ветка, получали с использованием смеси DCM:метанол (1:1), следуя тому же способу, который применяли касательно ствола. Выходы экстрактов следующие:
(i) 2,5 г экстракта получили из 50 г коры (обозначено как образец 2);
(ii) 2,0 г экстракта получили из 50 г ствола без коры (обозначено как образец 3);
(iii) 16,3 г экстракта получили из 300 г ветки (обозначено как образец 4).
Пример 2
Обогащение образца 1, образца 2, образца 3 и образца 4 из примера 1
Этап 1. Образец 1 (1 г) суспендировали в 30 мл смеси вода:метанол (9:1) при комнатной температуре (25°C±5°C), обрабатывали ультразвуком для растворения и разделяли последовательно 3 раза с применением 30 мл петролейного эфира (60°C-80°C). Слой петролейного эфира концентрировали на роторном испарителе в условиях линейного вакуума с получением 0,5 г фракции петролейного эфира (обозначено как образец 5).
Этап 2. Водный фильтрат, полученный на этапе 1, разделяли последовательно 3 раза с помощью 30 мл хлороформа. Слой хлороформа концентрировали на роторном испарителе в условиях линейного вакуума с получением 0,10 г фракции хлороформа (обозначено как образец 6).
Этап 3. Водный слой, полученный на этапе 2, затем разделяли последовательно 3 раза с помощью 30 мл этилацетата. Слой этилацетата концентрировали на роторном испарителе в условиях линейного вакуума с получением 0,07 г фракции этилацетата (обозначено как образец 7).
Этап 4. Водный слой, полученный на этапе 3, затем концентрировали на роторном испарителе в условиях линейного вакуума для удаления остаточных органических растворителей и лиофилизировали с получением 0,24 г водной фракции (обозначено как образец 8).
Обогащение экстрактов других частей растения, таких как кора ствола, ствол без коры и ветки, осуществляли тем же способом, что и для экстракта ствола. Выходы экстрактов следующие:
(i) 1 г образца 2 обогащали с получением 0,06 г фракции петролейного эфира (обозначено как образец 9); 0,16 г фракции хлороформа (обозначено как образец 10); 0,07 г фракции этилацетата (обозначено как образец 11) и 0,24 г водной фракции (обозначено как образец 12);
(ii) 1 г образца 3 обогащали с получением 0,21 г фракции петролейного эфира (обозначено как образец 13); 0,19 г фракции хлороформа (обозначено как образец 14); 0,29 г фракции этилацетата (обозначено как образец 15) и 0,28 г водной фракции (обозначено как образец 16);
(iii) 1 г образца 4 обогащали с получением 0,64 г фракции петролейного эфира (обозначено как образец 17); 0,15 г фракции хлороформа (обозначено как образец 18); 0,03 г фракции этилацетата (обозначено как образец 19) и 0,08 г водной фракции (обозначено как образец 20).
Пример 3
Получение метанольного экстракта растения Ficus arnottiana
Свежесобранный ствол Ficus arnottiana высушивали и измельчали в порошок. Грубо измельченный материал (50 г) вымачивали в 500 мл метанола при перемешивании в течение 3 часов в круглодонной колбе, которую помещали на водяную баню, поддерживаемую при температуре 40°C±5°C. Экстракт фильтровали, а остаток вымачивали в 500 мл метанола в течение 3 часов при 40°C±5°C и фильтровали. Экстракты соединяли и концентрировали с применением роторного испарителя в условиях линейного вакуума с получением 2,06 г экстракта (обозначено как образец 21).
Мстанольный экстракт из веток растения Ficus arnottiana получали, следуя тому же способу, который применяли касательно ствола. Из 50 г веток получили 3,95 г экстракта (обозначено как образец 22).
Пример 4
Получение метанольного:водного (1:1) экстракта растения Ficus arnottiana
Свежесобранный ствол Ficus arnottiana высушивали и измельчали в порошок. Грубо измельченный материал (100 г) вымачивали в 1 л смеси метанол:вода (1:1) при постоянном помешивании в течение 3 часов в кругл одонной колбе, которую помещали на водяную баню, поддерживаемую при температуре 40°C±5°C. Экстракт фильтровали, а остаток вымачивали в 800 мл смеси метанол:вода (1:1) в течение 3 часов при 40°C±5°C и фильтровали. Экстракты соединяли и концентрировали с применением роторного испарителя в условиях линейного вакуума и лиофилизировали с получением 5,67 г метанол-водного экстракта (обозначено как образец 23).
Метанол-водный экстракт веток растения Ficus arnottiana получали, следуя тому же способу, который применяли касательно ствола. Из 50 г веток получили 4,03 г экстракта (обозначено как образец 24).
Пример 5
Получение водного экстракта растения Ficus arnottiana
Свежесобранный ствол Ficus arnottiana высушивали и измельчали в порошок. Грубо измельченный материал (50 г) вымачивали в 500 мл воды при постоянном помешивании в течение 3 часов в круглодонной колбе, которую помещали на водяную баню, поддерживаемую при температуре 45°C±5°C. Экстракт фильтровали и лиофилизировали с получением 1,04 г экстракта (обозначено как образец 25).
Водный экстракт ветки растения Ficus arnottiana получали, следуя тому же способу, который применяли касательно ствола. Из 50 г ветки получили 1,11 г экстракта (обозначено как образец 26).
Пример 6
Получение состава
Общий способ получения крема
Необходимое количество метилпарабена и пропилпарабена при слабом нагревании растворяли в пропиленгликоле и воде (см. таблицу 1) в подходящем сосуде из стекла/нержавеющей стали. В сосуд добавляли образец 23 из примера 4 и растворяли/диспергировали с применением механической мешалки. Температуру поддерживали на уровне от 60°C до 75°C. В этот раствор при постоянном перемешивании добавляли глицерилмоностеарат и пропиленгликоль. Расплавляли пчелиный воск, белый мягкий парафин и глицерилмоностеарат и добавляли в вышеуказанный сосуд при постоянном перемешивании. Температуру медленно понижали до комнатной температуры.
Таблица 1
состав IA, состав IB и состав IC
№
Ингредиенты
Состав IA
Состав IB
Состав IC
% вес./вес.
% вес./вес.
% вес./вес.
1
Образец 23 из примера 4
10
20
30
2
Пчелиный воск
2
2
2
3
Белый мягкий парафин
76,8
61,8
46,8
4
Глицерилмоностеарат
3
3
3
5
Пропиленгликоль
3
3
3
6
Метилпарабен
0,18
0,18
0,18
7
Пропилпарабен
0,02
0,02
0,02
8
Вода
5
10
15
Всего
100
100
100
Пример 7
Аналитический анализ
Часть А: оценка образца 23 из примера 4
4
Растворяли 100 мг образца 23 из примера 4 в 1 мл смеси метанол:вода (1:1); обрабатывали 1 мл 0,04 М KMnO и оставляли на 15 минут при комнатной температуре. Смесь разбавляли разбавителем [метанол:вода (1:1)], фильтровали через фильтр из поливинилиденфторида (PVDF) с диаметром пор 0,45 мкм и анализировали фильтрат с помощью ВЭЖХ.
Условия аналитической ВЭЖХ:
Колонка: Unisphere aqua С 18, 150×4,6 мм, 3 мкм
Подвижная фаза А: 0,1% трифторуксусная кислота
Подвижная фаза В: ацетонитрил
Градиент: время (минуты)/% А: 0/90, 25/60, 30/20, 35/20, 36/90, 40/90
Время прогона: 40 минут
Концентрация: 10 мг/мл
Разбавитель: метанол:вода (1:1)
Длина волны: 270 нм
Результат
На фигуре 1 изображена аналитическая хроматограмма образца 23 из примера 4. На хроматограмме проиллюстрированы пики двух биологически активных маркеров, обозначенных как ВМ 1 (биологически активный маркер 1) и ВМ 2 (биологически активный маркер 2), при времени удерживания 14,3 и 21,8, соответственно. Биологически активные маркеры проявляли противовирусную активность. ВМ 1 и ВМ 2 выделяли и очищали, как описано в части С.
Часть В: оценка состава IB из примера 6
Растворяли 1 г состава IB из примера 6 в 15 мл смеси метанол:вода (1:1) и нагревали при 60°C в течение 20 минут. Полученный в результате раствор разводили разбавителем до объема 20 мл, фильтровали через фильтр из поливинилиденфторида (PVDF) с диаметром пор 0,45 мкм и анализировали фильтрат с помощью ВЭЖХ.
Условия аналитической ВЭЖХ:
Колонка: Unisphere aqua С 18, 150×4,6 мм, 3 мкм
Подвижная фаза А: 0,1% трифторуксусная кислота
Подвижная фаза В: ацетонитрил
Градиент: время (минуты)/% А: 0/90, 25/60, 30/20, 35/20, 36/90, 40/90
Время прогона: 40 минут
Концентрация: 50 мг/мл
Разбавитель: метанол:вода (1:1)
Длина волны: 270 нм
Результат
На фигуре 2 изображена аналитическая хроматограмма состава IB из примера 6. На хроматограмме проиллюстрированы пики двух биологически активных маркеров, обозначенных как ВМ 1 и ВМ 2, при времени удерживания 14,3 и 21,8, соответственно. Биологически активные маркеры проявляли противовирусную активность. ВМ 1 и ВМ 2 выделяли и очищали, как описано в части С.
Часть С: выделение биологически активных маркеров
В 1,6 л метанола растворяли 85,0 г образца 23 из примера 4, обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут и оставляли отстаиваться на 30 минут. Надосадочную жидкость сливали и фильтровали с получением фильтрата №1. Нерастворимую часть промывали 200 мл метанола. Надосадочную жидкость фильтровали с получением фильтрата №2. Фильтраты №1 и №2 объединяли и высушивали на роторном испарителе с получением 26,18 г образца. Полученный в результате образец, 13,0 г, растворяли в 36 мл смеси метанол:вода (75:25, объем/объем), обрабатывали ультразвуком, центрифугировали. Надосадочную жидкость загружали на колонку LH-20 (5×80 см) и проводили элюирование смесью метанол:вода (75:25, объем/объем). Еще одну порцию из 13,0 г образца обрабатывали с помощью способа, описанного выше. Собирали фракции и анализировали с помощью ВЭЖХ.
Условия аналитической ВЭЖХ:
Колонка: Unisphere С18, 250×4,6 мм, 5 мкм
Подвижная фаза А: 0,1% трифторуксусная кислота
Подвижная фаза В: ацетонитрил
Градиент: время (минуты)/% А: 0/90, 30/20, 35/20, 36/90, 40/90
Время прогона: 40 минут
Объем вводимой пробы: 10 мкл
Длина волны: 270 нм
Фракции из двух колонок LH-20 объединяли и концентрировали до сухости при 40°C под вакуумом с получением 100 мг биологически активного маркера 1 и 135 мг биологически активного маркера 2. Высушенные образцы биологически активных маркеров 1 и 2 по отдельности подвергали С-18-флэш-хроматографии для дополнительной очистки.
Условия хроматографирования для флэш-хроматографии:
Колонка: Redisep С18, 14×2 см
Подвижная фаза А: 0,1% трифторуксусная кислота
Подвижная фаза В: ацетонитрил
Градиент: время (минуты)/% А: 0/90, 30/20, 35/20, 36/90, 40/90
Поток: 30 мл/мин
Длина волны: 270 нм
Биологически активный маркер 1
Фракции, полученные с помощью флэш-хроматографии, проверяли с помощью ВЭЖХ. Фракции, содержащие биологически активный маркер 1, объединяли и выпаривали при 40°C под вакуумом до сухости с получением 30 мг получистого биологически активного маркера 1, который дополнительно очищали с применением полупрепаративной ВЭЖХ на кремниевых колонках с получением 5,3 мг биологически активного маркера 1. Биологически активный маркер 1 присутствовал в образце 23 из примера 4 в диапазоне от 0,02 до 0,8%.
Условия хроматографирования для полупрепаративной ВЭЖХ на кремниевой колонке:
Колонка: Grace, кремниевая, 5 мкм (250×10 мм)
Подвижная фаза: метанол : дихлорметан (10:90); объем : объем
Поток: 5 мл/мин
Длина волны: 270 нм
Концентрация образца: 20 мг/мл
21
24
10
На основании данных о массе и ЯМР биологически активный маркер 1 идентифицировали как флоризин. Молекулярной формулой флоризина является CHO, а молекулярная масса составляет 436,41.
Биологически активный маркер 2
15
10
5
Фракции, полученные с помощью флэш-хроматографии, проверяли с помощью ВЭЖХ. Из фракций получали кристаллы биологически активного маркера 2. Кристаллы отделяли посредством декантирования и высушивали с получением 20 мг биологически активного маркера 2. На основании данных о массе и ЯМР биологически активный маркер 2 идентифицировали как 5,7,4'-тригидроксифлавон. Молекулярной формулой 5,7,4'-тригидроксифлавона является CHO, а молекулярная масса составляет 270,05. Биологически активный маркер 2 присутствует в образце 23 из примера 4 в диапазоне от 0,01 до 0,1%.
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
Анализ противовирусной активности in vitro
Пример 8
Получение штамма вируса
Используемые материалы:
Клеточная линия: Vero (эпителиальные клетки почек из клеточной линии почек африканской зеленой мартышки под № CCL-81 в Американской коллекции типовых культур (АТСС))
Вирус: HSV-1 (штамм АТСС VR-1493 и клинический штамм из Национального института вирусологии, Пуна, Индия); HSV-2 (штамм АТСС VR-734 и клинический штамм из Национального института вирусологии,
Пуна, Индия)
Среда: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM, Gibco, США, № в каталоге: 12430)
Сыворотка: фетальная бычья сыворотка (FBS, Gibco, США, № в каталоге: 16000-044)
Раствор трипсин-EDTA: 0,25% трипсин-этилендиаминтетрауксусная кислота (трипсин-EDTA, Gibco, США, № в каталоге: 25200)
Стандартное соединение: ацикловир (Medicorp, Хайдарабад, Индия)
2
Изделия из пластика: матрасы для культуры ткани, 25 см (Nunc, США, № в каталоге: 156367);
2
матрасы для культуры ткани, 75 см (Nunc, США, № в каталоге: 156499);
пробирки для центрифуги, 15 мл (Nunc, США, № в каталоге: 366060);
пробирки для центрифуги, 50 мл (Nunc, США, № в каталоге: 373687);
96-луночные планшеты с плоским дном (Nunc, США, № в каталоге: 167008)
Краситель: кристаллический фиолетовый (Sigma, США, № в каталоге: C3886-25G)
Смесь антибиотик-антимикотик 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид: (Gibco, США, № в каталоге: 15240)
Реагент (МТТ): (Trevigen Inc, Гейтерсбург, штат Мэриленд, США, № в каталоге 4890-25-01)
Реагент детергент: (Trevigen Inc, Гейтерсбург, штат Мэриленд, США, № в каталоге 4890-25-02)
Этап 1
Поддержание клеточной линии
Поддержание клеточной линии осуществляли, как описано в Antiviral Research, 2005, 67, 24-30, который включен в данный документ посредством ссылки на описанный в нем способ.
2
Клеточную линию Vero, полученную от АТСС, культивировали в полной питательной среде, т.е. в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавкой 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и смеси антибиотик-антимикотик (1х). Для субкультивирования выбрали матрас для культуры ткани Т-25 с монослоем клеток. Из матраса удаляли DMEM и недолго промывали DMEM без сыворотки, чтобы удалить все следы сыворотки, которая содержит ингибитор трипсина. В матрас добавляли 1 мл раствора трипсин-EDTA и наблюдали под инвертированным микроскопом до диспергирования монослоя клеток (как правило, в течение 3-5 минут). Немедленно добавляли 14 мл полной питательной среды и клетки осторожно отсасывали пипеткой. Соотношение для субкультивирования 1:3 получали путем добавления по 5 мл клеточной суспензии в 3 различные матрасы для культуры ткани Т-25. Матрасы поддерживали при температуре 37°C и 5% СО.
Этап 2 Размножение вирусов (HSV-1 и HSV-2)
Размножение вирусов осуществляли, как описано в Antiviral Research, 2005, 67, 24-30, который включен в данный документ посредством ссылки на описанный в нем способ.
2
2
HSV-1 и HSV-2 размножали в клетках Vero. Вкратце, клетки Vero выращивали в DMEM с добавкой 10% FBS, пенициллина и стрептомицина (полная среда) при 37°C и 5% СО. Когда клетки достигали 80-90% конфлюэнтности, полученный монослой промывали простой DMEM и инфицировали вирусом в соответствующем разведении. Вирусу позволяли адсорбироваться к монослою в течение 1 часа при 37°C и 5% СО. Через один час вирусный инокулят удаляли и добавляли 10 мл DMEM с добавкой 2% FBS, после чего матрас инкубировали в течение еще 48 часов до полного разрушения монослоя клеток. Матрас исследовали под микроскопом два раза в день на цитопатический эффект (СРЕ). К СРЕ относятся изменения в клеточной морфологии, такие как округление и расширение клеток, образование синцитий и включений, вызванных вирусом. После 48 часов инкубирования матрас подвергали 2-3 циклам замораживания-оттаивания для полного лизиса клеток и высвобождения вируса в культуральную среду. Клеточный дебрис удаляли путем центрифугирования при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут при 4°C. Полученную надосадочную жидкость хранили в виде аликвот при -80°C. Титр вирусного штамма определяли с применением следующих способов.
Этап 3 (А)
Определение титра вируса с применением анализа цитопатического эффекта (СРЕ)
Анализ проводили, как описано в World J. GastroenteroL, 2006, 12: 4078-4081, который включен в данный документ посредством ссылки на описанный в нем способ.
50
2
2
50
50
4
-1
-8
Титр вируса определяли посредством анализа цитопатического эффекта (СРЕ) и выражали в виде дозы, инфицирующей 50% культуры ткани (TCID). Клетки Vero (полученные на этапе 1) высевали в 96-луночный планшет при плотности 2×10 клеток/100 мкл/лунка, а затем инкубировали при 37°C и 5% CO в течение 24 часов для 80-90% конфлюэнтности. Серийное разведение вирусного штамма (полученного на этапе 2) проводили (от 10 до 10) в поддерживающей среде (DMEM с 2% FBS). Питательную среду из культуральных планшетов удаляли и для инфицирования клеток Vero применяли 100 мкл каждого разведения вируса. В качестве контроля служили клетки Vero только в поддерживающей среде. После инфицирования клеток культуральный планшет инкубировали при 37°C в CO-инкубаторе в течение 48 часов. После 48 часов инкубации СРЕ оценивали под инвертированным микроскопом в лунках, инокулированых вирусом в разных разведениях. Когда вирусные контроли показывали максимальный СРЕ, среду удаляли, а инфицированный монослой фиксировали и окрашивали в течение 30 минут с применением раствора, содержащего формалин (10%) и кристаллический фиолетовый (1%). По истечении 30 минут краситель отсасывали и ополаскивали планшет дистиллированной водой до смывания всех излишков красителя. Планшет оставляли сохнуть в течение ночи. Титр вируса (TCID) рассчитывали, как описано в Am. J. Hyg., 1938, 27, 493-497. TCID обозначает дозу, которая вызывает СРЕ у 50% инокулированных культур.
6
50
Результат: титр вируса HSV-1, определенный путем анализа цитопатического эффекта (СРЕ), составлял 5,88×10 TCID/мл;
7
50
титр вируса HSV-2, определенный путем анализа цитопатического эффекта (СРЕ), составлял 1,58×10 TCID/мл.
Этап 3 (В)
Определение титра вируса с применением анализа бляшкообразования
Анализ проводили, как описано в Antiviral Res., 2005, 67(1); 24-30, который включен в данный документ посредством ссылки на описанный в нем способ.
5
-2
-7
2
2
Титр вируса также определяли путем анализа бляшкообразования и выражали как количество бляшкообразующих единиц на мл (БОЕ/мл). Клетки Vero (полученные на этапе 1) обрабатывали трипсином, считали и высевали в 24-луночный планшет при плотности 2×10 клеток/мл/лунка, после чего инкубировали при 37°C и 5% СО в течение 24 часов для 80-90% конфлюэнтности. Серийные разведения вируса (вирусного штамма, полученного на этапе 2) готовили в диапазоне от 10 до 10 с применением поддерживающей среды (DMEM с 2% FBS). Из планшета удаляли питательную среду и в каждую лунку добавляли по 0,2 мл каждого разведения вируса, стараясь при этом не нарушить клетки. Инфицированные монослои инкубировали при 37°C и 5% СО в течение 1 часа, встряхивая каждые 15 минут. После инкубационного периода в каждую лунку добавляли 1% CMC в объеме 1 мл и инкубировали планшет в течение 48 часов, после чего клетки фиксировали и окрашивали в течение 30 минут раствором, содержащим формалин (10%) и кристаллический фиолетовый (1%). По истечении 30 минут краситель отсасывали и планшет ополаскивали с применением дистиллированной воды до смывания всех излишков красителя. Планшет оставляли сохнуть в течение ночи. Подсчитывали бляшки, чтобы оценить титр вируса, который выражали как количество бляшкообразующих единиц на мл (БОЕ/мл).
Титр вируса =(число образованных бляшек × разведение вируса × объем инокулята).
8
Результат: титр вируса HSV-1, определенный путем анализа бляшкообразования, составлял 2,1×10 БОЕ/мл;
7
титр вируса HSV-2, определенный путем анализа бляшкообразования, составлял 1,65×10 БОЕ/мл.
Пример 9
Первичный скрининговый тест на противовирусную активность осуществляли с применением анализа подавления СРЕ (способ окрашивания кристаллическим фиолетовым).
Анализ был предназначен для обнаружения средств (в данном случае экстрактов), проявляющих активность на любой стадии репродуктивного цикла вируса. Анализ проводили, как описано в Indian J. Med. Res., 2004, 120: 24-29, который включен в данный документ посредством ссылки на описанный в нем способ.
4
4
3
2
50
50
Клетки Vero (полученные на этапе 1 из примера 8) размножали при плотности 1×10 клеток/лунка в 96-луночном планшете и инкубировали при 37°C в СО-инкубаторе в течение 24 часов для образования монослоя. Образцы 1-26 тестировали посредством добавления раствора с концентрацией 50 мкг/мл и 100 мкг/мл (исходный раствор DMSO с концентрацией экстракта 20 мг/мл разбавляли до 50 мкг/мл и 100 мкг/мл средой DMEM, содержащей 2% FBS) до конечного объема культуры 200 мкл/лунка. Включали соответствующие контроли, такие как клетки Vero сами по себе (клеточный контроль), клетки Vero с вирусом (вирусный контроль) и клетки Vero с вирусом и стандартным соединением, ацикловиром (имеющееся в продаже противовирусное лекарственное средство). Ацикловир тестировали при следующих концентрациях (исходный раствор DMSO с концентрацией ацикловира 20 мг/мл разбавляли до 100 мкг/мл с помощью DMEM, содержащей 2% FBS): 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 3,125 мкг/мл, 1,5 мкг/мл и 0,78 мкг/мл по отношению к HSV-1 и 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл и 3,125 мкг/мл по отношению к HSV-2. Экстракты, которые подлежали анализу, добавляли за 1 час до инфицирования, чтобы обеспечить максимальную чувствительность и дать предварительное представление о потенциальных ингибиторах ранних этапов репликации, таких как адсорбция или проникновение. Через один час клетки инфицировали 100 мкл соответствующей дозы вируса на лунку [HSV-1 при множественности инфекции (MOI) 10 TCID или HSV-2 при MOI 10 TCID] с применением вирусного штамма, полученного на этапе 2 из примера 8. Инфицированные клетки инкубировали в поддерживающей среде (DMEM с 2% FBS) в течение еще 48-50 часов. Когда вирусные контроли показывали максимальный СРЕ, среду отсасывали, а клетки промывали 0,85% физиологическим раствором, после чего окрашивали 0,1% раствором кристаллического фиолетового в течение 30 минут. Отсасывали окрашивающий раствор и планшеты ополаскивали с применением дистиллированной воды до смывания всех излишков красителя. Планшеты оставляли сохнуть в течение 24 часов. После окрашивания бляшек визуально и микроскопически оценивали СРЕ и классифицировали в соответствии с процентом подавления СРЕ по сравнению с контролями. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Образец
Подавление СРЕ, % (HSV-1)
Подавление СРЕ, % (HSV-2)
50 мкг/мл
100 мкг/мл
50 мкг/мл
100 мкг/мл
Образец 1
-
-
+
-
Образец 2
-
++++
++++
++++
Образец 3
-
-
-
-
Образец 4
+
++
+
++++
Образец 5
-
-
-
-
Образец 6
+
-
+++
+
Образец 7
-
-
-
-
Образец 8
++++
++++
++++
++++
Образец 9
-
-
-
-
Образец 10
++
-
+
-
Образец 11
++++
+
+++
+
Образец 12
-
-
+
-
Образец 13
-
-
-
-
Образец 14
-
-
-
-
Образец 15
-
-
-
-
Образец 16
++
-
+
-
Образец 17
-
-
-
-
Образец 18
+
++
++
+++
Образец 19
-
-
-
++
Образец 20
++++
+
++++
++++
Образец 21
-
+
++++
+++
Образец 22
+++
++++
++++
++++
Образец 23
++++
++++
++++
++++
Образец 24
+++
-
+++
++++
Образец 25
-
++
++++
++++
Образец 26
-
-
-
+++
Результаты, полученные с ацикловиром, показаны в таблице 3.
Таблица 3
Концентрация ацикловира, мкг/мл
Подавление СРЕ, % (HSV-1)
Подавление СРЕ, % (HSV-2)
0,78
+
nd
1,5
++
nd
3,125
+++
+
6,25
+++
++
12,5
++++
+++
25
nd
++++
Символы, используемые в приведенных выше таблицах 2 и 3, имеют следующее значение
Символы
Подавление СРЕ, %
Символы
Подавление СРЕ, %
nd
не проводили;
-
0-10% подавление СРЕ;
+
11-25% подавление СРЕ;
++
26-50% подавление СРЕ;
+++
51-75% подавление СРЕ;
++++
76-100% подавление СРЕ.
Пример 10
Анализ подавления СРЕ - способ с применением МТТ
50
50
IC определяли для экстрактов, которые демонстрировали хороший дозозависимый эффект по отношению к HSV-1 и HSV-2. IC оценивали путем анализа подавления СРЕ (способ с применением МТТ).
Анализ был направлен на обнаружение средств (в данном случае экстрактов), действующих на какой-либо стадии репродуктивного цикла вируса. Анализ проводили, как описано в World J. GastroenteroL, 2006, 12: 4078-4081, который включен в данный документ посредством ссылки на описанный в нем способ.
50
Анализ проводили согласно описанному в примере 9 способу анализа подавления СРЕ с окрашиванием, за исключением того, что анализ с применением 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) осуществляли без окрашивания клеток красителем кристаллический фиолетовый. Клетки Vero (полученные на этапе 1 из примера 8) в 96-луночных планшетах с плоским дном обрабатывали поддерживающей средой (DMEM с 2% FBS), содержащей образец 1 из примера 1 или ацикловир, в течение 1 часа. Затем клетки инфицировали вирусом (с применением штамма вируса, полученного на этапе 2 из примера 8) при MOI, составляющей 100 TCID. Через 48 часов инкубирования при 37°C количество жизнеспособных клеток определяли (поглощение при 570 нм измеряли с применением ридера для ELISA для 96-луночных планшетов) посредством анализа с применением МТТ. Данные анализировали путем построения графика зависимости между концентрацией образца (мкг/мл) и расчетным % жизнеспособности клеток Vero (обработанных вирусом и контролей), который позволяет количественно оценить изменения в пролиферации клеток. Противовирусную активность определяли согласно следующей формуле:
T
HSV
где (OD): поглощение, измеренное при определенной концентрации экстракта в клетках, инфицированных HSV;
C
HSV
(OD): относится к поглощению, измеренному для контрольных необработанных клеток, инфицированных HSV; и
C
mock
(OD): относится к поглощению, измеренному для контрольных необработанных клеток с имитацией инфицирования.
50
На основании этих данных было рассчитано значение IC как концентрация, необходимая для подавления половины максимального цитопатического эффекта HSV-1 и HSV-2.
50
Результат: значение IC образца 1 из примера 1 по отношению к HSV-1 составляло 15,48 мкг/мл;
50
значение IC образца 1 из примера 1 по отношению к HSV-2 составляло 17 мкг/мл.
Пример 11
Анализ цитотоксичности
Анализ проводили, как описано в World J. Gastroenterol., 2006, 12: 4078-4081, который включен в данный документ посредством ссылки на описанный в нем способ.
Анализ токсичности проводили для того, чтобы оценить, являлся ли какой-либо из наблюдаемых противовирусных эффектов результатом общего воздействия на жизнеспособность клеток. Клетки Vero (полученные на этапе 1 из примера 8) для анализов токсичности культивировали в 96-луночных планшетах и обрабатывали экстрактами по той же схеме, которую применяли для оценок противовирусной активности без добавления вируса. Жизнеспособные клетки анализировали с применением красителя МТТ. Токсические эффекты образца 1 из примера 1 рассчитывали как процент снижения числа жизнеспособных клеток в присутствии экстракта растения по сравнению с числом жизнеспособных клеток, наблюдаемым при отсутствии экстракта растения.
Применяли следующую формулу:
где А представляет собой поглощение, измеряемое на ридере для ELISA.
На основании этих данных рассчитывали концентрацию, оказывающую цитотоксическое воздействие на 50% клеток (СС50).
50
50
50
50
Индекс селективности (SI), также называемый терапевтическим индексом, оценивали как соотношение СС и IC, и полученные результаты приведены в таблице 5. Для того чтобы определить, обладает ли образец 1 из примера 1 достаточной противовирусной активностью, которая превышает его уровень токсичности, рассчитывали SI согласно CC/IC.
Для настоящего исследования значение индекса SI>5 принималось как эффективное для экстрактов. Полученные результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4
Образец
*IC<sub>50</sub> (мкг/мл)
CC<sub>50</sub> (мкг/мл)
SI (CC<sub>50</sub>/IC<sub>50</sub>)
Образец 1 из примера 1 (по отношению к HSV-1)
15,48
483,33
31,2
Образец 1 из примера 1 (по отношению к HSV-2)
17
483,33
28,4
* Значение IC<sub>50</sub> получено из примера 10.
Пример 12
Оценка эффекта образца 23 из примера 4 на репликацию HSV-1 и HSV-2 в разные моменты времени после инфицирования
Целью данного исследования было определить стадию репликации HSV-1/HSV-2, которая могла бы блокироваться образцом 23 из примера 4. Потенциальное противовирусное лекарственное средство может специфически подавлять и проявлять направленное действие в отношении этого вируса на любой стадии его репликативного цикла, такой как адсорбция, слияние, сбрасывание оболочки, обратная транскрипция, интеграция, синтез нуклеиновых кислот и созревание (Methods in Molecular Medicine, 1998, vol.10, 387-405). Эти стадии имели место в разные моменты времени жизненного цикла вируса, охватывающего период от 1 часа - начало адсорбции - до 24 часов - завершение одного репликативного цикла HSV. Стадия адсорбции в жизненном цикле вируса представляет собой первоначальное прикрепление вируса герпеса к клеткам-хозяевам, что включает взаимодействие gC и gD (консервативных гликопротеинов), расположенных на поверхности вируса, с рецепторами поверхности клетки, такими как сульфат гепарина. Стадия прикрепления в жизненном цикле вируса представляет собой стабильное прикрепление, обеспечивающее тесную связь вируса с клеткой. Стадия жизненного цикла вируса, следующая за стадиями адсорбции и прикрепления, известна как постинфекционная стадия.
4
4
6
3
6
50
50
2
2
Клетки Vero высевали на 96-луночные планшеты с плоским дном с плотностью 2,2×10 клеток/лунка в питательной среде DMEM с 10% FBS. Через 20-24 часа конфлюэнтные монослои инфицировали с добавлением 100 мкл/лунка вируса в разведении 1:10 (клинический штамм HSV-1) (TCID 5,88×10/мл) или HSV-2 в разведении 1:10 (TCID 2,43×10/мл) и планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°C и 5% CO. Готовили двукратные серийные разведения образца 23 из примера 4 и ацикловира в поддерживающей среде DMEM с 2% FBS для получения восьми концентраций 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200 и 400 мкг/мл и по 100 мкл каждого разведения добавляли в лунки в трех повторностях через 0, 1, 3, 5, 7, 16 и 24 часа после инфицирования. В 0 часов образец 23 из примера 4 и разбавленные растворы ацикловира добавляли одновременно с вирусом. Поддерживающую среду добавляли в лунки для вирусного контроля (разбавленный раствор вируса + поддерживающая среда) и клеточного контроля (только поддерживающая среда). Планшеты дополнительно инкубировали в течение 48-50 часов при 37°C. После инкубации содержимое планшета удаляли, а планшет промывали один раз DMEM. В планшет добавляли 100 мкл/лунка реактива МТТ, разведенного в соотношении 1:10 в поддерживающей среде DMEM с 2% FBS, и инкубировали в течение 4 часов, пока не становилось видно пурпурный оттенок. Затем добавляли по 100 мкл детергента на лунку. Планшет оставляли в инкубаторе на ночь при 37°C и 5% СО. После окончания инкубации крышку планшета снимали и измеряли поглощение в каждой лунке при 570 нм на планшет-ридере (BIO-TEK, Synergy НТ).
Результаты, полученные в исследованиях, включающих вирус простого герпеса HSV-1
- В момент времени 0 часов, который соответствует стадии адсорбции, при 50 мкг/мл наблюдали 52% противовирусную активность, при 100 мкг/мл - 77% и при 200 мкг/мл - 64%.
- Через 1 час после инфицирования (p.i.), что соответствует стадии прикрепления, при 100 мкг/мл наблюдали 80% противовирусный эффект и при 200 мкг/мл - 64%.
- Через 3 часа p.i., что соответствует началу репликации, при 100 мкг/мл наблюдали 90% противовирусный эффект и при 200 мкг/мл - 70%.
- Через 5 часов p.i., что соответствует стадии синтеза ДНК вируса HSV, при 100 мкг/мл наблюдали 83% противовирусный эффект и при 200 мкг/мл - 68%.
- Через 7 часов p.i., что соответствует более поздним стадиям синтеза ДНК вируса HSV, при 100 мкг/мл наблюдали 77% противовирусный эффект и при 200 мкг/мл - 73%.
- Через 16 часов p.i., что соответствует максимальной эффективности репликации, при 100 мкг/мл наблюдали 75% противовирусный эффект и при 200 мкг/мл - 71%.
- Через 24 часов p.i., что соответствует стадии выхода вириона HSV (высвобождения зрелых вирионов из клетки-хозяина после репликации), при 100 мкг/мл наблюдали 36% противовирусный эффект и при 200 мкг/мл - 37%.
Ацикловир демонстрировал сильный противовирусный эффект по отношению к HSV-1 при всех концентрациях от 3,125 до 200 мкг/мл в течение 0-7 часов. Эта активность резко снижалась до приблизительно 17% через 16-24 часа, что соответствует более поздним стадиям репликации и выхода вириона. Таким образом, результаты этого исследования указывают на то, что ацикловир был не эффективен на более поздних стадиях репликации HSV-1.
Вывод: противовирусная активность образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-1, таким образом, достигала максимального значения через 3 часа p.i. Эта активность была сильной от 0 до 16 часов p.i. и существенно снижалась через 24 часа p.i.
Результаты, полученные в исследованиях, включающих вирус простого герпеса HSV-2
- В момент времени 0 часов, который соответствует стадии адсорбции, при 50 мкг/мл наблюдали 77% противовирусную активность, при 100 мкг/мл - 76% и при 200 мкг/мл - 51%.
- Через 1 час p.i., что соответствует стадии прикрепления, при 100 мкг/мл наблюдали 66% противовирусный эффект и при 200 мкг/мл - 52%.
- Через 3 часа p.i., что соответствует началу репликации, при 100 мкг/мл наблюдали 74% противовирусный эффект и при 200 мкг/мл - 55%.
- Через 5 часов p.i., что соответствует стадии синтеза ДНК вируса HSV, при 100 мкг/мл наблюдали 79% противовирусный эффект и при 200 мкг/мл - 63%.
- Через 7 часов p.i., что соответствует более поздним стадиям синтеза ДНК вируса HSV, при 100 мкг/мл наблюдали 83% противовирусный эффект и при 200 мкг/мл - 67%.
- Через 16 часов p.i., что соответствует максимальной эффективности репликации и началу высвобождения вириона, при 100 мкг/мл наблюдали 83% противовирусный эффект и при 200 мкг/мл - 67%.
- Через 24 часа p.i. не наблюдали никакого противовирусного эффекта.
Ацикловир демонстрировал сильный противовирусный эффект по отношению к HSV-2 при всех концентрациях от 3,125 до 200 мкг/мл в течение 0-7 часов. Через 16-24 часа p.i., что соответствует более поздним стадиям репликации и выхода вириона, эта активность отсутствовала. Таким образом, результаты этого исследования указывают на то, что ацикловир был не эффективным на более поздних стадиях репликации HSV-2.
Вывод: противовирусная активность образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-2 достигала максимального значения через 7-16 часов p.i. Эта активность была сильной в течение 0-16 часов p.i.
Пример 13
Оценка противовирусной активности образца 23 из примера 4 по отношению к вирусам простого герпеса, HSV-1 и HSV-2, до инфицирования
Для того чтобы вирусы герпеса попали в целевую клетку, должно произойти слияние липидной мембраны оболочки вируса с липидной мембраной клетки. Этот сложный механизм проникновения вируса происходит при участии по меньшей мере трех консервативных гликопротеинов (gC, gB и gD) и опосредован их способностью связывать рецепторы на поверхности клеток, такие как нектины и медиатор проникновения вируса герпеса (HVEM) (Cell. Mol. Life Sci, 2008, 65, 1653-1668). Целью этого исследования предварительной обработки было установить, может ли образец 23 из примера 4 вызвать ингибирование вируса за счет взаимодействия со структурами оболочки вириона, такими как гликопротеины, или рецепторами на поверхности клетки, например гепарансульфат (HS), которые необходимы для адсорбции или проникновения в клетки Vero.
5
8
7
2
2
2
2
50
Клетки Vero высевали на 24-луночные планшеты с плотностью 1,8×10 клеток/лунка. Планшеты инкубировали в течение 20-24 часов при 37°C и 5% CO. Серийные двукратные разведения образца 23 из примера 4 и ацикловира, оба в диапазоне концентраций 3,125-400 мкг/мл, добавляли в соответствующие лунки (200 мкл/лунка) в двух повторах и инкубировали при 37°C и 5% CO в течение 1 часа. Через 1 час эти разбавленные растворы отсасывали, а клетки Vero один раз промывали PBS и затем инфицировали с добавлением 200 мкл/лунка суспензии вируса HSV-1 с титром 2,1×10 БОЕ/мл или суспензии вируса HSV-2 с титром 1,65×10 БОЕ/мл. Планшеты оставляли для адсорбции вируса на 1 час при 37°C и 5% СО, после чего их промывали PBS. Затем в каждую лунку добавляли по 1 мл покровной питательной среды (1% карбоксиметилцеллюлоза +DMEM с 2% FBS) и планшеты дополнительно инкубировали при 37°C и 5% СО в течение 49 часов. По окончании инкубирования планшеты промывали 0,85% физиологическим раствором и окрашивали 0,13% раствором кристаллического фиолетового. Подсчитывали число вирусных бляшек и рассчитывали значение IC для образца 23 из экстракта примера 4.
Результат
50
На фигуре 3 проиллюстрирована значительная ингибирующая активность образца 23 из примера 4 при 200-400 мкг/мл, на что указывает 63-88% ингибирование HSV-1. Расчетное значение IC для образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-1 составляло 171,25 мкг/мл. Наблюдаемый ингибирующий эффект образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-1 был сильным по сравнению со слабым ингибирующим эффектом, 10-40%, который проявлял ацикловир в диапазоне концентраций 3,125-400 мкг/мл.
50
На фигуре 4 проиллюстрировано 60-86% ингибирование HSV-2 образцом 23 из примера 4 при концентрации 200-400 мкг/мл. Расчетное значение IC для образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-2 составило 202,5 мкг/мл. Ацикловир в диапазоне концентраций 3,125-400 мкг/мл проявлял слабый ингибирующий эффект по отношению к HSV-2, 10-20%.
Вывод
Предварительная обработка образцом 23 из примера 4 привела к значительному ингибированию проникновения HSV-1 и HSV-2 в клетки Vero (ингибирование адсорбции и прикрепления) сразу же после контакта с вирусом, что указывает на профилактический эффект. Этот ингибирующий эффект был значительно более сильным, чем у ацикловира.
Пример 14
Анализ адсорбции вируса
Потенциальные кандидаты на противовирусные лекарственные средства могут действовать на различных этапах жизненного цикла вируса, таких как адсорбция, слияние, сбрасывание оболочки, обратная транскрипция, интеграция, синтез нуклеиновых кислот и созревание. Результаты анализа адсорбции, таким образом, смогут помочь в определении надежности образца 23 из примера 4 в отношении ингибирования HSV-1 или HSV-2 на стадии адсорбции их цикла инфицирования, где гликопротеин С (gC) и гликопротеин D (gD), расположенные на поверхности вируса, взаимодействуют с рецепторными гликозаминогликанами (GAG) на поверхности клетки, такими как гепарансульфат (HS).
5
8
7
2
2
2
50
Клетки Vero высевали на 24-луночные планшеты с плоским дном в концентрации 1,8×10 клеток/лунка. Планшеты инкубировали в течение 20-24 часов при 37°C и 5% СО до образования конфлюэнтных моношаров. Двукратные серийные разведение образца 23 из примера 4 и ацикловира готовили для получения концентраций в диапазоне от 3,125 до 400 мкг/мл. Готовили суспензию вируса HSV-1 с концентрацией 2,1×10 БОЕ/мл или HSV-2 с концентрацией 1,65×10 БОЕ/мл. Равные объемы каждого разбавленного раствора образца 23 из примера 4/ацикловира и суспензии вируса HSV-1/HSV-2 помещали в стерильные пробирки типа «Эппендорф» и инкубировали составы при 37°C в течение 1 часа. Затем к монослоям клеток Vero добавляли 200 мкл этих смесей, чтобы обеспечить абсорбцию вируса в присутствии экстракта в течение 1 часа при 37°C и 5% СО. После этого планшеты один раз промывали PBS для удаления неприкрепленных вирусов и в каждую лунку добавляли 1 мл покровной питательной среды (1% карбоксиметилцеллюлоза; CMC), приготовленной в поддерживающей среде DMEM с 2% FBS. После дополнительного инкубирования в течение 49 часов при 37°C и 5% СО под постоянным наблюдением планшеты промывали 0,85% физиологическим раствором и окрашивали 0,13% раствором кристаллического фиолетового. Подсчитывали число вирусных бляшек и рассчитывали значение IC.
Результат
50
На фигуре 5 показано, что образец 23 из примера 4 мог вызвать 100% ингибирование адсорбции вируса HSV-1 при концентрации 100-400 мкг/мл, которое снижается до 65% при концентрации 50 мкг/мл. IC для образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-1 составляло 44 мкг/мл.
На фигуре 6 показано 100% ингибирование адсорбции вируса HSV-2 образцом 23 из примера 4 при концентрации 50-400 мкг/мл, которое снижается до 92% при концентрации 25 мкг/мл.
50
IC для образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-2 составляла 15 мкг/мл.
Активность образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-1 и HSV-2 была немного лучше, чем активность ацикловира. Образец 23 из примера 4 был эффективен, когда присутствовал как до, так и во время фазы адсорбции вирусной инфекции HSV-1 и HSV-2 в диапазоне концентраций 50-400 мкг/мл, и не проявлял оцениваемого микроскопически цитотоксического действия при этих концентрациях.
Пример 15
Анализ проникновения вируса
Проникновение HSV в клетки-хозяева может быть определено как этап, следующий за начальным связыванием с поверхностью клетки-хозяина, которое запускает слияние оболочки вириона с плазматической мембраной. Это требует многократных взаимодействий, происходящих, подобно каскаду, с участием различных гликопротеинов (gB, gD и gH/gL) и компонентов поверхности клеток (Cell. Mol. Life Sci, 2008, 65, 1653-1668). Целью анализа проникновения вируса было установить в условиях in vitro, будет ли образец 23 из примера 4 ингибировать проникновение вирусов HSV-1 и HSV-2 в клетки Vero.
5
8
7
2
2
50
Клетки Vero высевали на 24-луночные планшеты с плотностью 1,8×10 клеток/лунка. Планшеты инкубировали в течение 20-24 часов при 37°C и 5% CO. Планшеты с конфлюэнтным монослоем примерно за полчаса до начала эксперимента помещали в условия с температурой 4°C, чтобы позволить клеткам Vero акклиматизироваться к условиям пониженной температуры, поскольку последующие этапы проводили при 4°C. Готовили суспензию вируса HSV-1 с титром 2,1×10 БОЕ/мл или вируса HSV-2 с титром 1,65×10 БОЕ/мл и добавляли 200 мкл к конфлюэнтным монослоям. Клетки инкубировали при 4°C в течение 2 часов, чтобы обеспечить прикрепление вируса. Серийные двукратные разведения образца 23 из примера 4 и ацикловира, оба в диапазоне концентраций от 3,125 до 400 мкг/мл, добавляли в соответствующие лунки при комнатной температуре и инкубировали планшеты при 37°C и 5% СО в течение 10 минут. Разведенные растворы образца 23 из примера 4 и ацикловира затем отсасывали, а монослой клеток быстро промывали PBS (рН 3,75), чтобы инактивировать вирионы, которые не проникли в клетки. После этого клетки промывали PBS (рН 11,0), чтобы нейтрализовать окружающую среду с кислым рН. Затем в каждую лунку добавляли 1 мл покровной питательной среды (1% CMC в поддерживающей среде DMEM с 2% FBS) и инкубировали планшеты при 37°C в течение 48-50 часов. После этого планшеты промывали 0,85% физиологическим раствором и окрашивали 0,13% раствором кристаллического фиолетового. Подсчитывали число бляшек и рассчитывали значение IC для образца 23 из примера 4.
Результат
50
На фигуре 7 продемонстрировано 80-95% ингибирование вируса HSV-1 образцом 23 из примера 4 при концентрациях от 50 до 400 мкг/мл, которое снижается при более низких концентрациях (3,125-25 мкг/мл). Расчетная IC Для образца 23 из примера 4 по отношению к вирусу HSV-1 составляет 30 мкг/мл.
50
На фигуре 8 продемонстрировано 100% ингибирование вируса HSV-2 образцом 23 из примера 4 при концентрациях от 200 до 400 мкг/мл, которое снижается до 90% при концентрации 100 мкг/мл и до 71% при концентрации 50 мкг/мл. Расчетная IC для образца 23 из примера 4 по отношению к вирусу HSV-2 составляет 36,1 мкг/мл.
Ацикловир по сравнению с образцом 23 из примера 4 показал ингибирующую активность по отношению к HSV-1 и HSV-2 от слабой до средней.
Вывод
Результаты указывают на то, что образец 23 из примера 4 мог существенно ингибировать проникновение вируса HSV-1 и HSV-2 в клетки Vero по сравнению с ацикловиром, который не сильно ингибировал этап проникновения вируса HSV-1 и HSV-2 в клетки-хозяева Vero.
Пример 16
Оценка вирулицидной активности образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-1 и HSV-2
50
В анализе вирулицидной активности зачастую требуется продолжительное присутствие противовирусного лекарственного средства для блокирования инфекционности вирусной частицы по отношению к культивируемым клеткам, при этом разведенный раствор комплексов вирус-экстракт может диссоциировать, высвобождая вирус, обладающий способностью к инфицированию (Antiviral research, 2010, 86, 196-203). Если образец не может снизить инфекционность вируса при IC или при других эффективных концентрациях, тогда противовирусная активность не связана с его вирулицидной способностью. Целью данного исследования было оценить в условиях in vitro, связана ли ингибирующая активность образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-1 и HSV-2 с его противовирусным эффектом или с вирулицидным эффектом.
5
10
9
2
2
2
Клетки Vero высевали на 24-луночные планшеты с плоским дном при концентрации 1,8×10 клеток/лунка. Планшеты инкубировали в течение 20-24 часов при 37°C и 5% СО. Двукратные серийные разведения образца 23 из примера 4 и ацикловира готовили для получения концентраций в диапазоне от 25 до 400 мкг/мл. Готовили суспензию вируса HSV-1 с концентрацией приблизительно 10 БОЕ/мл и HSV-2 с концентрацией 10 БОЕ/мл. Равные объемы каждого разбавленного раствора образца 23 из примера 4/ацикловира и суспензии вируса HSV-1/HSV-2 помещали в стерильные пробирки типа «Эппендорф» и составы инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Эти смеси затем разбавляли в десять раз (1:100) с получением конечной концентрации в диапазоне от 0,25 до 4 мкг/мл, соответствующей 25-400 мкг/мл. После этого к монослоям клеток Vero добавляли по 200 мкл этих смесей, чтобы обеспечить абсорбцию вируса в течение 1 часа при 37°C и 5% СО. Планшеты затем промывали один раз PBS для удаления несвязанных вирусов и в каждую лунку добавляли 1 мл покровной питательной среды (1% карбоксиметилцеллюлоза, CMC), приготовленной в поддерживающей среде DMEM с 2% FBS. После дополнительного инкубирования в течение 48-50 часов при 37°C и 5% СО планшеты промывали 0,85% физиологическим раствором и окрашивали 0,13% раствором кристаллического фиолетового. Затем подсчитывали число вирусных бляшек.
Результат
На фигуре 9 показан 100% вирулицидный эффект образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-1 при концентрациях от 200 до 400 мкг/мл и 94% ингибирование при концентрации 100 мкг/мл. Ацикловир по отношению к HSV-1 в диапазоне концентраций от 25 до 400 мкг/мл показал слабый вирулицидный эффект в пределах 0-32%.
На фигуре 10 показан 100% вирулицидный эффект образца 23 из примера 4 по отношению к HSV-2 при концентрации 400 мкг/мл и 92-97% ингибирование при концентрации 50-200 мкг/мл. Ацикловир по отношению к HSV-2 в диапазоне концентраций от 25 до 400 мкг/мл показал слабый вирулицидный эффект в пределах 11-38%.
Вывод
Образец 23 из примера 4 по сравнению с ацикловиром проявлял сильный вирулицидный эффект по отношению к вирусам HSV-1 и HSV-2.
Анализ противовирусной активности in vivo
Содержание животных, которых использовали в экспериментах, и уход за ними проводили в соответствии с действующими нормами, опубликованными CPCSEA (Комитет по контролю и надзору за экспериментами на животных), Тамил Наду, Индия. Способы с применением лабораторных животных были утверждены ICAE (Комитет по формированию этики в отношении животных) из Piramal Healthcare Limited, Горегаон, Мумбаи, Индия.
Пример 17
Модель герпетиформного распространения инфекции HSV-1 у мышей
Анализ проводили, как описано в Antimicrobial Agents and Chemotherapy, июнь 2002 г., стр.1766-1772, который включен в данный документ посредством ссылки на описанный в нем способ.
Для исследования использовали самок мышей линии Balb/c в возрасте от 6 до 8 недель, не беременных и ранее не рожавших. Всем животным брили правую серединную часть спины с помощью электрической машинки для стрижки волос, после чего непосредственно перед контрольным заражением вирусом на выбритом участке делали несколько горизонтальных скарификаций стерильной иглой с размером 26.
3
Перед контрольным заражением вирусом скарифицированный участок кожи каждой мыши протирали ватным тампоном, смоченным в 70% спирте, а затем обрабатывали участок ватным тампоном, смоченным в стерильной DMEM. Затем мышей заражали через скарифицированный участок вирусом HSV-1 с титром 8,27×10 БОЕ/животное. Животные получали состав IA, состав IB, состав IC/ацикловир/плацебо путем местного применения к очагу инфекции через 1 час после заражения. Животных обрабатывали три раза в день с интервалом обработки 4 часа. Всех животных во всех группах обрабатывали в течение 5 дней. Животные, получавшие плацебо (кремовая основа) и ацикловир (225 мг/кг/день), служили в качестве контролей, а животных группы вирусного контроля не обрабатывали.
Оценивали следующие составы, которые описаны в примере 6:
(a) состав IA;
(b) состав IB;
(c) состав IC.
Состав IA, состав IB и состав IC применяли местно три раза в день в течение 5-дневного периода. Дозе 225 мг/кг соответствует 15 мг состава IA; дозе 450 мг/кг соответствует 15 мг состава IB; дозе 675 мг/кг соответствует 15 мг состава IC и дозе 750 мг/кг соответствует 25 мг состава IB, что оценивали на животных.
Животных ежедневно, в течение 21 дня после инфицирования, осматривали в отношении заболеваемости, смертности и внешнего вида очага инфекции.
Тяжесть вирусного заболевания (экстравагинальные признаки заболевания) определяли количественно с применением общепринятой шкалы оценки поражений следующим образом:
0: отсутствие явных признаков инфекции;
1: образование пузырьков;
2: образование больших участков опоясывающего лишая;
3: сливающиеся сегменты опоясывающего лишая;
4: паралич задних конечностей.
Герпетиформные поражения относятся к лентовидным односторонним поражениям кожи, локализованным вдоль позвоночника или ветвей тройничных нервов.
Наблюдения
У животных из всех групп, получавших разные дозы, ранние признаки герпетиформных поражений появлялись ко дню 2 после инфицирования.
1. Группа, которую обрабатывали плацебо:
(a) тяжелые проявления инфекции начинались у животных ко дню 6 после инфицирования;
(b) все мыши погибли ко дню 8 после инфицирования.
2. Группа, которую обрабатывали ацикловиром:
(a) все мыши выздоровели от герпетиформных поражений ко дню 7 после инфицирования;
(b) во время эксперимента не погибла ни одна мышь.
3. Группа, которую оставили без обработки (инфекционный контроль):
(a) тяжелые проявления инфекции начинались у животных ко дню 6 после инфицирования;
(b) все мыши погибли ко дню 10 после инфицирования.
4. Группа, которую обрабатывали составом IB (750 мг/кг/день):
(a) мыши, которых обрабатывали составом IB (750 мг/кг/день), показали выживаемость 90%;
(b) выжившие животные выздоровели от герпетиформных поражений ко дню 9 после инфицирования.
5. Группа, которую обрабатывали составом IC (675 мг/кг/день):
(a) мыши, которых обрабатывали составом IC при дозе 675 мг/кг/день, показали выживаемость 80%;
(b) выжившие животные выздоровели от герпетиформных поражений ко дню 10 после инфицирования.
6. Группа, которую обрабатывали составом IB (450 мг/кг/день):
(a) мыши, которых обрабатывали составом IB при дозе 450 мг/кг/день, показали выживаемость 60%;
(b) выжившие животные выздоровели от герпетиформных поражений ко дню 10 после инфицирования.
7. Группа, которую обрабатывали составом IA (225 мг/кг/день):
(a) мыши, которых обрабатывали составом IA при дозе 225 мг/кг/день, показали выживаемость 20%, при этом большинство случаев смертельного исхода приходилось на день 8 после инфицирования;
(b) выжившие животные выздоровели от герпетиформных поражений ко дню 9 после инфицирования.
Результат: состав IB и состав IC проявляли хорошую противовирусную активность при более высоких концентрациях, 750 и 675 мг/кг/день, в модели герпетиформного распространения инфекции HSV-1 у мышей.
Пример 18
Модель вагинального распространения инфекции HSV-2 у мышей
Анализ проводили, как описано в Antiviral Research, 2006, 69:77-85, который включен в данный документ посредством ссылки на описанный в нем способ.
5
Для исследования использовали самок мышей линии Balb/c в возрасте от 6 до 8 недель, не беременных и ранее не рожавших. Самок мышей линии Balb/c использовали для вагинального заражения HSV-2. За пять дней до интравагинального (IVAG) контрольного заражения мышам в верхнюю часть спины подкожно вводили 2 мг прогестерона (Depo-Provera; Pfizer, Бельгия), применяя иглу с размером 29. В день контрольного заражения мышей интравагинально заражали вирусом HSV-2 с титром 1,14×10 БОЕ. IVAG введение вируса производили посредством микропипетки с общим объемом DMEM 20 мкл. Через 30 минут после заражения животные интравагинально получали состав IA, состав IB, состав IC/ацикловир/плацебо путем местного применения. Животных обрабатывали три раза в день с интервалом обработки 4 часа. Всех животных во всех группах обрабатывали в течение 5 дней. Обработку ацикловиром (225 мг/кг/день) проводили в качестве положительного контроля. Плацебо-контроль включал животных, которые получали основу для крема (плацебо) в те же моменты времени, а животные группы вирусного контроля не получали никакой обработки.
Оценивали следующие составы, которые описаны в примере 6:
(a) состав IA;
(b) состав IB;
(c) состав IC.
Состав IA, состав IB и состав IC наносили местно три раза в день в течение 5-дневного периода. Дозе 225 мг/кг соответствуют 15 мг состава IA; 15 мг состава IB соответствуют дозе 450 мг/кг и 15 мг состава IC соответствуют дозе 675 мг/кг, которые оценивали на животных.
Животных ежедневно осматривали в отношении экстравагинальных признаков заболевания и оценивали выживаемость в течение периода 21 день после инфицирования.
Тяжесть вирусного заболевания (экстравагинальные признаки заболевания) оценивали количественно с применением общепринятой шкалы оценки поражения следующим образом:
0: отсутствие явных признаков инфекции;
1: небольшое количество отдельных пузырьков и легкое покраснение ткани в экстравагинальной зоне;
2: небольшое количество отдельных пузырьков, язв и/или струпьев и/или припухлость и покраснение ткани в экстравагинальной зоне;
3: многочисленные слившиеся язвы/струпья, средняя степень припухлости и покраснения ткани в экстравагинальной зоне с распространением на прилегающие ткани;
4: изъязвление с сильным покраснением и припухлостью ткани в экстравагинальной зоне с распространением на прилегающие ткани, паралич задних лап.
Наблюдения
1. Группа, которую обрабатывали плацебо:
(a) самые ранние признаки экстравагинальной инфекции проявлялись в день 7;
(b) 90% мышей погибли ко дню 14.
2. Группа, которую обрабатывали ацикловиром:
(a) ни у одной мыши не наблюдали признаки экстравагинального заболевания;
(b) во время эксперимента не погибла ни одна мышь.
3. Группа, которую обрабатывали составом IA (225 мг/кг/день):
(a) мыши, которых обрабатывали составом IA при дозе 225 мг/кг/день, показали выживаемость 90%;
(b) у одной из десяти мышей обнаружили проявления клинических поражений ко дню 8 после инфицирования, при этом позже это животное погибло; все остальные животные в ходе эксперимента не проявляли никаких характерных признаков индуцированного вирусом экстравагинального заболевания в какой-либо момент времени.
4. Группа, которую обрабатывали составом IB (450 мг/кг/день):
(a) мыши, которых обрабатывали экстрактом состава IB при дозе 450 мг/кг/день, показали выживаемость 90%;
(b) у двух из десяти мышей обнаружили проявления клинических поражений ко дню 14 после инфицирования, при этом одно из этих животных позже погибло; все остальные животные в ходе эксперимента не проявляли никаких характерных признаков индуцированного вирусом экстравагинального заболевания в какой-либо момент времени.
5. Группа, которую обрабатывали составом IC (675 мг/кг/день):
(a) ни у одной из мышей не обнаружили признаки экстравагинального заболевания;
(b) во время эксперимента ни одна мышь не погибла.
Результат: состав IA, состав IB и состав IC проявляли противовирусную активность при концентрациях 225, 450 и 675 мг/кг/день в вагинальной модели инфекции HSV-2 мышей.