Глутатион и глутатиошависимые ферменты в сперматозоидах и семенной плазме мужчин при патоспермии

Быкова М.В.1, Титова Н.М1, Маркова Е.В.2, Светлаков А.В.2

1ЛУТАТИОН И 1ЛУТАТИОНЗАВИСИМЫЕ ФЕРМЕНТЫ В СПЕРМАТОЗОИДАХ И СЕМЕННОЙ

ПЛАЗМЕ МУЖЧИН ПРИ ПАТОСПЕРМИИ 1 - ГОУ ВПО «Сибирский федеральный университет»;

2 - Центр репродуктивной медицины, г. Красноярск

Введение

Трипептид глутатион (г-глутамилцистеинил-глутатион или TSH) является главным неэнзиматическим регулятором внутриклеточного окислительно-восстановительного гомеостаза, повсеместно присутствуя во всех типах клеток в миллимолярной концентрации. TSH - уникальная молекула, свойства которой связаны со способностью легко отдавать электроны благодаря наличию в ее структуре сульфгидрильной группы (SH).

В условиях нормальных клеточных редокс(окислительно-восстановительных) условий, превалирующей является восстановленная форма глутатиона, найденная в ядре, эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях и цитоплазме. TSH может ковалентно связываться с белками через процесс глутатионирования и действовать как кофермент различных ферментов, включенных в защиту клеток. Глутатион может также прямо взаимодействовать с АФК, устраняя их или действовать как субстрат для ГПО и TST при детоксикации Н2О2, гидропероксидов липидов и электрофильных компонентов (Irvine D., 1996).

В семени млекопитающих не ферментативное звено антиоксидантной защиты представлено в основном глутатионом (Drevet J., 2006). Основная функция TSH в семени млекопитающих относится к его взаимодействию с другими системами для предотвращения образования АФК. Интересно, что уровень глутатиона уменьшается во время процессов созревания сперматозоида (Montiel E., 2003).

Данные по содержанию компонентов

глутатионовой системы фрагментарны и противоречивы. Согласно сведениям некоторых авторов Aitken R.J., Fisher H. (1994) восстановленный глутатион отсутствует или содержание его крайне низкое в сперматозоидах, и как следствие, ферменты глутатионовой системы как компоненты антиоксидантной защиты функционируют слабо.

По данным других исследователей Irvine D.(1996), Saleh R.(2002), Sikka S.(1996) зрелые сперматозоиды содержат все компоненты глутатионовой системы. Работ, в которых оценивалось состояние глутатионового звена АОС при патоспермии, на сегодняшний день очень мало.

Цель работы - изучить содержание восстановленного глутатиона и активность ферментов его метаболизма ГПО и TST в сперматозоидах и семенной плазме мужчин при патоспермии (нормо-, астено- и тератоастенозооспермии).

Материалы и методы

Для биохимического анализа использовалась сперма 140 мужчин в возрасте 22-46 (средний возраст 34,5±2) , которые проходили предварительное обследование по причине подозрения на бесплодие в Центре Репродуктивной Медицины г. Красноярска. В зависимости от показателей спермограммы были выделены 3 группы пациентов: с нормозооспермией, астенозооспермией, тератоастенозооспермией по показателям WHO. Обследование включало стандартный спермиологический анализ, включающий оценку концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов, физико-химических свойств эякулята (WHO, 1992). Активность ферментов антиоксидантной системы исследовали в спермиоцитарных лизатах и семенной плазме, для этого нативный эякулят разделяли на сперматозоиды и семенную плазму центрифугированием при 1700g. Содержание восстановленного глутатиона и активность ГПО определяли по методу Beutler E. (1990), активность TST по методу Habig W.H. (1974).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica 7». Достоверность различий исследуемых показателей между группами оценивали непараметрическим критерием Вилкоксона для зависимых выборок. Различия между показателями считали достоверными при значении р?0,05.

Результаты исследования

Параметры спермограмм в группе пациентов с различными видами патоспермии и контрольной группе - пациентов с нормозооспермией представлены в табл.1.

Обследуемые в работе группы достоверно отличались по содержанию прогрессивноподвижных сперматозоидов и общей концентрации сперматозоидов. Такие параметры как pH эякулята, объем эякулята, количество круглых клеток достоверно не различались между группами.

Таблица 1. Средние показатели спермограмм в обследуемых группах

Группа пациентов Количество сперматозоидов

Концентрация, Млн/мл Прогрессивноподвижные, % Слабоподв иж-ные, % Аномальные, %

Нормозооспер-мия (n=90) 80,0±5,4 57,1±1,0 6,6±0,3 34,0±0,6

Астенозооспермия (n=30) 61,0±7,8* 33,5±1,5* 8,0±0,9 39,0±1,2

Тератоастенозоо-спермия (n=20) 41,1±5,1* 28,6±2,7* 9,0±0,8 57,2±2,0

Примечание: *- р<0,05.

Таблица 2.

Содержание глутатиона и активность глутатионзависимых ферментов в сперматозоидах человека при нормо- и патоспермииспермии

Группа пациентов TSH, мкмоль/мг белка ГПО, мкмоль/мин^ мг белка ^Т, мкмоль/мин^мг белка

Нормозооспермия (n=40) 0,18±0,05 0,61±0,23 8,34±0,44

Астенозооспермия (n=30) 0,10±0,03** 0,33±0,04* 4,81±0,3*

Тератозооспермия (n=20) 0,07±0,002** 0,21±0,01** 4,5±0,7**

Примечание: ** - р<0,01, *- p<0,05

В спермиях человека при астенозооспермии по сравнению с нормозооспермией содержание Г8И снижено на 45%, активность ГПО и Г8Т достоверно снижена на 46% и 42% соответственно. При тератозооспермии по сравнению с нормозооспермией содержание глутатиона снижено на 46,7%, активность ферментов ГПО и Г8Т - на 64% и 42% соответственно(табл.2).

Таблица 3.

Содержание глутатиона и глутатионзависимых ферментов в семенной плазме человека при нормо- и патоспермии

Группа пациентов TSH, мкмоль/мг белка ГПО, мкмоль/мин^ мг белка ГST, мкмоль/мин^ мг белка

Нормозооспермия (n=40) 0,39±0,02 3,25±0,22 47,8±1,7

Астенозооспермия (n=30) 0,21±0,02** 2,64±0,28* 60,2±2,5*

Тератозооспермия (n=20) 0,22±0,02** 0,38±0,03** 28,3±2,5**

В семенной плазме при астенозооспермии по сравнению с нормозооспермией содержание Г8И -достоверно ниже на 46,7%, активность ГПО снижена на 18,7%, тогда как активность Г8Т выше на 20,5%. При тератозооспермии по сравнению с нормозооспермией содержание глутатиона снижено на 46,7%, активность ферментов ГПО и Г8Т - ниже на 64% и 46% соответственно (табл. 3).

Согласно полученным данным, у пациентов с астенозооспермией и тератозооспермией в сперматозоидах и в семенной жидкости, в целом, наблюдается снижение параметров глутатионового звена АОС относительно этих же показателей у пациентов с нормозооспермией, что согласуется с результатами других авторов (РиЩ, 2003). Данный факт предполагает наличие окислительного стресса, как показателя дисфункции про-/антиоксидантного статуса, который характеризуется значительным и

бесконтрольным в сперматозоидах преобладанием свободнорадикальных процессов, в частности, перекисного окисления липидов. Известно, что мембраны клеток спермы содержат высокий уровень полиненасыщенных жирных кислот, исключительно восприимчивых к перекисному окислению (Aitken R.J., 2000). При ослабленной АОС происходит накопление продуктов ПОЛ в цитозоле и окислительные процессы передаются на мембраны митохондрий - основного места выработки АТФ. Нарушение транспорта электронов по дыхательной цепи, а также повреждения структуры АТФсинтазы, снижает выработку энергии, а значит и подвижность сперматозоидов (Ford W., 2004). Вероятно, на этом фоне при дефиците энергетических источников происходит снижение синтеза TSH, который осуществляется с помощью АТФ-зависимых ферментов: г-глутамилцистеинилсинтетазы и глутатионсинтетазы (Irvine D., 1996, Saleh R., 2002). Концентрация восстановленного глутатиона в сперматозоидах при астенозооспермии и тератозооспермии, возможно, снижается в результате непосредственного привлечения значительного количества тиола в процессы защиты клетки от гидроксильных и алкоксильных свободных радикалов, а также от источников их образования. Отчасти поэтому происходит снижение активностей ферментов ГПО и TST в сперматозоидах, поскольку TSH для данных энзимов является дефицитным коферментом.

Продолжительное и интенсивное образование свободных радикалов приводит к усиленному расходованию на их обезвреживание эндогенных антиоксидантов, к модуляции активности, а в конечном счете - ингибированию антиоксидантных ферментов ГПО и TST. Снижение мощности глутатионовой системы может приводить к радикальной перестройке процессов жизнедеятельности клетки: изменению активности ферментов, проницаемости клеточных мембран, интенсивности метаболических процессов и других, которые имеют большое значение в генезе различных форм патоспермии.

Выводы

Согласно проведенным исследованиям, содержание глутатиона и активность ферментов глутатионовой АОС как в сперматозоидах, так и в семенной плазме у пациентов с астено-, терато- и тератоастенозооспермией по сравнению с нормозооспермией существенно снижались. Особенно выраженное снижение мощности глутатионовой системы наблюдалось при сочетанной патологии тератоастенозооспермии.

Литература

1. Aitken R.J., Fisher H. Reactive oxygen generation and human spermatozoa: the balance of benefit and risk. Biossays 1994; 16: 259-267.

2. Aitken R.J. Possible redox regulation of sperm motility activation. J Androl 2000; 4: 491-496.

3.Beutler E. Red cell metabolism a manual of bio chemical methods. E.Beutler//Grune&Station, Orlando.-1990.-P.131-134.

4. Drevet J. The antioxidant glutathione peroxidase family and spermatozoa: complex story. Mol Cel Endocrinol. 2006; 250:70-79.

5. Ford W. Regulation of sperm function by reactive oxygen species. Human Reprod Update 2004; 5: 387-399.

6. Fujii J., Iuch Y., Matsuki et al. Cooperative function of antioxidant stress in male reproductive tissues. As J Androl 2003; 1: 1-12.

7.Habig W.H. Glutathione-S-transferases. The enzymes step mercapturic acid formation/ W.H. Habig, M.J. Pabst, W.B.Jacoby J Biol Chem 1974; 249: 7130-7139.

8. Irvine D. Glutathione as a treatment for male infertility. Reviews of Reprod 1996; 1: 6-12.

9. Montiel E., Huidobro C., Castellon E. Glutatione-related enzymes in cell cultures from different regions of human epididymis. Arch Androl. 2003 ;49: 95-105.

10. Luberda Z. The role of glutathione in mammalian gametes. Reprod Biol. 2005; 5(1): 5-17

11. Ochsendorf F., Buhl R. et al. Glutathione in spermatozoa and seminal plasma of infertile men. Hum Reprod. 1998; 13(2): 353-359.

12. Saleh R., Agarwal A. Oxidative stress and male infertility: from research bench to clinical practice . J Androl 2002; 6: 737-752.

13. Sikka S. Oxidative stress and role of antioxidants in normal and abnormal sperm function. Front in Bioscience 1996; 1: 78-86.

14. World Health Organization. Laboratory Manual For The Examination Of Human Semen And Sperm Cervis Mucus Interaction 1992 - Cambridge, Univ Press -378p.