СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR PULMONARY TUBERCULOSIS

Изобретение относится к клинической медицине, точнее к фтизиатрии и иммунологии, а именно к способам оценки состояния больных туберкулезом легких (ТБ).
В последние годы во многих странах, независимо от уровня их экономического развития, отмечается увеличение заболеваемости и распространения туберкулеза, который все чаще упоминается среди так называемых "возрождающихся" инфекций. Для предотвращения распространения туберкулеза актуальное значение приобретает возможность диагностики этого заболевания, в частности выявления контингента, больного туберкулезом в активной форме, и представляющего опасность для окружающих. Это особенно актуально в условиях широкого распространения латентной формы туберкулеза, не представляющей серьезной опасности для окружающих, и ограниченных возможностях лечебных учреждений.
В настоящее время наиболее широко распространена диагностика заболеваний с использованием пробы Манту и, при наличии положительной реакции, бактериологических методов анализа. Однако результат постановки внутрикожной аллергической пробы Манту учитывают через 72 часа, причем в связи с высоким процентом инфицированности населения ТБ частота подтверждения диагноза заболевания в разных возрастных группах составляет от 25 до 50% (Бородулина Е.А., Бородулин Б.Е. Дифференциальная диагностика поствакцинальной и инфекционной туберкулиновой аллергии у детей с атопическими заболеваниями.//Проблемы туберкулеза и болезней легких. - №1, 2006, - с.9-12). На результаты пробы Манту оказывает влияние предыдущая вакцинация, неконтролируемый прием антибиотиков широкого спектра действия и наличие сопутствующей патологии, в том числе аллергопатологии (Аксенова В.А., Овсянкина Е.С., Александрова Т.М. Методы контроля качества работы при массовой туберкулинодиагностике. // Проблемы туберкулеза. - 2002, №2. - С.3-5). Недостатками бактериологических методов являются низкая частота выявления Mycobacterium tuberculosis (МБТ) и длительный рост МБТ на питательных средах (до 30 дней). Все перечисленное определяет сложность клинико-лабораторной диагностики туберкулеза и обуславливает необходимость разработки более быстрых и надежных способов лабораторной диагностики туберкулезной инфекции.
Известен ускоренный способ бактериологической диагностики туберкулеза по методу Прайса, позволяющий выделить и идентифицировать МБТ через 7-14 дней (Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. / Под ред. А.А. Воробьева. М.: Медицинское информационное агенство, 2004. - 671 с.), однако и эти сроки также достаточно велики, а надежность метода достаточно низка.
Широко используется для диагностики туберкулеза метод иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющий определять наличие туберкулезной инфекции по концентрации (титру) специфических иммуноглобулинов классов А, М, G, Е (Авдеенко В.Г. с соавт. Повышение эффективности иммунодиагностики туберкулеза путем применения моноклональных антител против иммуноглобулина G человека. / Клиническая лабораторная диагностика. - 1999, №6. - С.22-35; Авдеенко В.Г. с соавт. Противотуберкулезные IgE-антитела. Иммунодоминантные антигены. // Проблемы туберкулеза. - 2002, ч.1, №2. - С.30-33). Недостатком данного способа является необходимость повторного исследования сывороток крови через 10-14 дней для выявления нарастания титра антител к МБТ, свидетельствующее об активном инфекционном процессе в организме.
Общим недостатком вышеперечисленных методов является длительность анализа, их недостаточная селективность, невозможность подразделить контингент больных на пациентов с латентной и активной формами туберкулеза, что не позволяет своевременно проводить активные мероприятия с больными второй из вышеперечисленных групп.
Одним из наиболее перспективных направлений диагностики туберкулеза (ТБ) является проведение анализа in vitro с использованием антигенов, специфических для Mycobacterium tuberculosis. Как показывают обобщенные аналитические данные, клеточные тесты in vitro обладают высокой специфичностью: у 99% вакцинированных лиц наблюдаются отрицательные реакции, а у 78% больных туберкулезом - положительные реакции (Menzies Т. Meta-analysis: New tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty and recommendations for research march / Т. Menzies, M. Pai, G. Comstock // Annals. Intern. Med. - 2007. - Vol.146 - P.340-354; Pai M. T-cell based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update / M. Pain, A. Zwerling, D. Menzies // Ann. Intern. Med. - 2008. - Vol.149(3). - P.177-184).
В настоящее время прошел сертификацию тест T-SPOT, являющийся экспресс-аналогом стандартной диагностики туберкулеза на основе кожных реакций замедленного типа (Кожная проба с препаратом "ДИАСКИНТЕСТ" - новые возможности идентификации туберкулезной инфекции. Под ред. Академика РАН и РАМН М.А. Пальцева. Второе издание, переработанное и дополненное. - М.: Издательство "Шико", 2011. 256 с). Способ иммунологической диагностики и мониторинга туберкулезной инфекции Т-SPOT (Oxford Immunotec, USPTO Applicaton №20070196878) основан на определении количества клеток, продуцирующих интерферон-гамма (IFNγ) в присутствии таких специфических индукторов, как белки ESAT-6 (ранний секретируемый антиген) и CFP-10 (белок культурального фильтрата), которые отсутствуют у микобактерий вакцинного штамма М. bovis (BCG) и большинства нетуберкулезных микобактерий окружающей среды, за исключением Mycobacterium marinum и Mycobacterim kansasii. При этом предварительная БЦЖ-вакцинация не оказывает значительного влияния на результаты индукции IFNγ in vitro, а повышение его количества свидетельствует о наличии туберкулезной инфекции (Мордовская Л.И.  Индукция IFNγ в образцах цельной венозной крови in vitro - тест для определения туберкулезного инфицирования детей и подростков. / Л.И. Мордовская, М.А. Владимирский, В.А. Аксенова, Е.Е. Ефремов, Г.И. Игнашенкова, Т.Н. Власик // Проблемы туберкулеза и болезней легких. -2009. -№6. - С.19-24).
Основными недостатками этого теста является его сложность и трудоемкость, необходимость культивирования клеток в стерильных условиях, а также невозможность на его основе диагностировать носит ли заболевание латентный или активный характер.
Наиболее близким по своей сущности к методу, предлагаемому в данном изобретении, является способ с использованием тест-системы "QuantiFERON-TB Gold In-Tube" ("Cellestis", Австралия), основанный на измерении уровня продукции IFNγ  клетками периферической крови при стимуляции образцов крови антигенами микобактерий. В качестве антигенов используют белки ESAT-6, CFP-10 и ТВ 7.7 (р4) (Мордовская Л.И. Индукция IFNγ  в образцах цельной венозной крови in vitro - тест для определения туберкулезного инфицирования детей и подростков. / Л.И. Мордовская, М.А. Владимирский, В.А. Аксенова, Е.Е. Ефремов, Г.И. Игнашенкова, Т.Н. Власик // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2009. - №6. - С.19-24). Способ диагностики включает в себя взятие крови у пациента, последующее культивирование каждого образца цельной крови, стабилизированной гепарином, при 37°C в течение 18-24 часов в трех пробирках: первая (антигениндуцированная продукция) - в присутствии антигенов микобактерий, вторая (спонтанная продукция) - без антигенов, третья (митогениндуцированная продукция) - в присутствии митогена (последняя проба используется в качестве положительного контроля). После окончания культивирования пробирки центрифугируют, отбирают плазму и определяют в них содержание IFNγ методом иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты оцениваются с помощью программного обеспечения QFT 2.62, предоставляемого производителем. Результаты теста считаются положительными, если разность между антигениндуцированной и спонтанной продукций IFNγ более 0,35 МЕ/мл и разница между митогениндуцированной и спонтанной продукцией IFNγ более 0,5 МЕ/мл.
Основным недостатком этого метода является то, что он не позволяет проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и латентной туберкулезной инфекции (ЛТБИ), что представляется актуальным в условиях широкого (по разным оценкам до 80%) распространения туберкулезного инфицирования.
Задачей, решаемой авторами, являлась разработка достаточно быстрого и надежного способа диагностики туберкулеза, позволяющего проводить дифференциальную диагностику активного туберкулеза и латентной туберкулезной инфекции. Указанная задача решалась путем установления круга белков, продуцируемых клетками крови у инфицированных туберкулезом больных в присутствии антигенов Mycobacterium tuberculosis, отбора специфичных цитокинов и определения пороговых значений, позволяющих диагностировать наличие у больного активной формы туберкулеза и латентную туберкулезную инфекцию.
AG
NIL
AG
Технический результат достигался культивированием крови больных с подозрением на туберкулез в присутствии коммерчески выпускаемой смеси белков ESAT-6, CFP-10, ТВ 7.7 (из набора "QuantiFERON-TB Gold In-Tube") в качестве антигенов, последующим определением в плазме крови интерферона-гамма (IFNγ), интерлейкина-6 (IL-6) и трансформирующего ростового фактора-альфа (TGFα), и диагностирования активной формы туберкулеза при достижении хотя бы одним из цитокинов порогового значения, которое составляет для: IFNγ - 6,4 МЕ/мл, для TGFα - 17,0 пг/мл и для IL-6 - 2039 пг/мл, а при значениях ниже пороговых по всем трем показателям - латентную туберкулезную инфекцию.
Предложенные критерии подобраны на основании клинических исследований 53 пациентов, у которых установлено наличие заражения МБТ. В состав группы входили 27 больных с впервые выявленным, преимущественно инфильтративным туберкулезом легких, подтвержденным культуральным методом до начала специфической противотуберкулезной терапии (13 женщин и 14 мужчин в возрасте от 18 до 64 лет, средний возраст - 36 лет), и 26 лиц с латентной инфекцией (ЛТБИ), которые являлись сотрудниками стационаров противотуберкулезных учреждений (n=26).
Изучалась спонтанная (NIL) и антигениндуцированная (AG) продукция различных цитокинов, в частности эпидермального ростового фактора (EGF), макрофагального воспалительного протеина - 1β (MIP-β), эндотелиального фактора роста (VEGF), интерлейкина-2 (IL-2), интерлейкина-4 (IL-4), интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-1альфа (IL-1α), интерферона-альфа2 (IFN-α2), трансформирующего ростового фактора-альфа (TGFα), фактора некроза опухоли-альфа (TNFα), а также растворимого рецептора интерлейкина-2-альфа(sIL-2Rα) и растворимой формы лиганда CD40 (sCD40L). Исследования проводились с использованием магнитных частиц "Milliplex Mag" и анализатора "MagPix" ("Millipore", США) по технологии хМар.
Для статистических расчетов использовали значения спонтанной (NIL) продукции исследуемых биомаркеров, антигениндуцированной (AG) продукции и разности между ними (AG-NIL). Статистическую обработку проводили с помощью программы SPSS (версия 15.0). Для сравнения групп использовали критерий Манна-Уитни.
В таблице 1 приведены показатели, характеризующие различия в концентрациях цитокинов для сравниваемых групп.
Таблица 1
Сравнительная характеристика показателей спонтанной и стимулированной секреции цитокинов у больных с активной и латентной формами ТБ
Показатель
Больные с активной формой ТБ (n=27), Me (min, max)
Лица с латентной формой ТБ (n=26), Me (min, max)
р*
Пороговое значение
Чувствительность, %
Специифичность, %
AUC**
IFNγ<sub>AG</sub>, МЕ/мл
6.4 (1.6-10.2)
1.7 (1.0-3.6)
0.008
4.3
56
81
0.71
IFNγ<sub>AG-NIL</sub>МЕ/мл
5.3 (1.2-10.0)
1.6 (0.7-3.5)
0.014
3.9
56
81
0.70
TGFα<sub>NIL,</sub> пг/мл
12.7 (10.0-18.4)
9.6 (5.6-11.7)
0.002
12.2
60
81
0.75
TGFα<sub>AG</sub>, пг/мл
17.3 (15.1-20.5)
12.5 (8.0-15.1)
0.000
15.6
67
81
0.80
IFNα2<sub>AG</sub>, пг/мл
7.4 (3.0-11.5)
3.0 (3.0-3.0)
0.041
6.0
56
81
0.66
TNFα<sub>AG</sub>, пг/мл
141.7 (86.0-360.2)
94.9 (39.7-195.8)
0.039
223.2
37
81
0.67
sIL2-Rα<sub>NIL</sub>, пг/мл
18.6 (3.0-46.9)
3.0 (3.0-11.0)
0.006
13.7
63
81
0.72
sIL2-Rα<sub>AG</sub>, пг/мл
30.0 (5.9-76.7)
3.0 (3.0-13.2)
0.005
26.3
56
81
0.73
sIL2-Rα<sub>AG-NIL</sub>, пг/мл
6.7 (0.0-13.0)
0.0 (0.0-13.1)
0.041
4.2
52
81
0.66
IL-<sub>NIL</sub>, пг/мл
627.7 (214.8-1640.8)
212.9 (125.3-827.2)
0.037
887.2
45
81
0.67
IL-<sub>АG</sub>, пг/мл
1463.0 (650.7-2973.6)
604.7 (306.3-1023.4)
0.018
257.0
56
81
0.69
Примечание: *р - достоверность различия между группой больных и контактных лиц, рассчитанная с использованием критерия Манна-Уитни.
**AUC - площадь под характеристической ROC-кривой.
AG
NIL
AG
Для оценки диагностической ценности анализируемых цитокинов с помощью программы SPSS 15.0 был проведен анализ характеристической кривой (receiver-operating-characteristic curve-ROC) при фиксированном значении специфичности (81%). Были рассмотрены графические изображения характеристических кривых и значения площади под кривой - AUC (Area Under Curve). Данные анализа показали, что самостоятельно ни один из выделенных показателей не обладает высокой чувствительностью, что исключает возможность их изолированного использования с диагностической целью. В результате был применен метод построения деревьев решений в программе JMP 9.0, на основе полученных результатов которого было установлено, что совместное определение трех маркеров: IFNγ, TGFα и IL-6 при пороговых значениях соответственно 6,4 МЕ/мл; 17,0 пг/мл и 2039 пг/мл является достаточным для отбора лиц в группу больных с активным ТБ и латентной туберкулезной инфекцией (ЛТБИ). Использование данной комбинации биомаркеров позволяет достигнуть 96,3% (26 из 27) селективности выявления случаев активного туберкулеза (Значение площади под ROC кривой в данном случае достигает 0,9.).
AG
NIL
AG
На фиг.1 приведена кривая операционной характеристики при использовании комбинации трех биомаркеров (IFNγ, TGFα и IL-6) для разделения лиц, инфицированных МБТ с активной и с латентной туберкулезной инфекцией.
AG
NIL
AG
AG-NIL
NIL
AG
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Образцы цельной крови лиц (1000 мкл), инфицированных МБТ, стабилизированной гепарином (50 ед/мл), культивируют при 37°С в течение 18-24 часов в присутствии смеси антигенов микобактерий - белков ESAT-6, CFP-10, ТВ 7.7 и в нулевой контрольной пробирке (без антигенов). После окончания культивирования пробы центрифугируют, отделяют супернатант и определяют в нем количество IFNγ, TGFα и IL-6 с помощью мультиплексного или иммуноферментного анализа по стандартным методикам. Затем сравнивают полученные значения содержаний цитокинов с пороговыми: 6,4 МЕ/мл для IFNγ, 17,0 пг/мл для TGFα и 2039 пг/мл для IL-6. При достижении пороговых значений хотя бы одним из показателей делают вывод о наличии активной формы ТБ, при значениях ниже пороговых по трем показателям одновременно - констатируют латентную туберкулезную инфекцию.
Сущность и преимущества способа иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1. Больная Ф. Диагноз: инфильтративный туберкулез легких в фазе распада. Результат посева мокроты положительный. Результат теста на инфицирование М. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): положительный.
В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров:
AG
NIL
AG
IFNγ - 24 МЕ/мл, TGFα - 14 пг/мл и IL-6- 598 пг/мл.
Отмечено превышение уровня концентрации IFNγ по сравнению с
пороговым значением (6,4 МЕ/мл).
Заключение: активный туберкулезный процесс, что подтверждает клинический диагноз.
Пример 2. Больная Т. Диагноз: инфильтративный туберкулез верхней доли левого легкого в фазе распада. Результат посева мокроты положительный. Результат теста на инфицирование М. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): положительный.
В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров:
AG
NIL
AG
IFNγ - 22, 6 МЕ/мл, TGFα - 9,75 пг/мл и IL-6 - 10000 пг/мл.
Сравниваем полученные значения с пороговыми:.
AG
AG
По двум показателям (IFNγ, IL-6) наблюдаем превышение пороговых значений (IFNγ - 6,4 МЕ/мл, 2039 пг/мл для IL-6).
Заключение: активный туберкулезный процесс.
Пример 3. Больная С. Диагноз: инфильтративный туберкулез легких в фазе распада и обсеменения. Результат посева мокроты положительный. Результат теста на инфицирование М. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): положительный.
В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров:
AG
NIL
AG
IFNγ- 6,89 МЕ/мл, TGFα - 22,2 пг/мл и IL-6- 755 пг/мл
AG
NIL
По двум показателям (IFNγ, TGFα) наблюдаем превышение пороговых
значений (IFNγ - 6,4 МЕ/мл, 17,0 пг/мл для TGFα).
Заключение: активный туберкулезный процесс.
Пример 4. Сотрудник противотуберкулезного диспансера Т. Результат теста на инфицирование М. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): положительный.
Результаты рентгенологического обследования: изменений в легочной ткани не выявлено. Жалоб нет. Клинические признаки туберкулеза отсутствуют. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров:
AG
NIL
AG
IFNγ- 4,9 МЕ/мл, TGFα - 11,6 пг/мл и IL-6- 220 пг/мл.
Сравниваем полученные значения с пороговыми: IFNγ - 6,4 МЕ/мл, 17,0
пг/мл для TGFα и 2039 пг/мл для IL-6.
Заключение: латентная инфекция М. tuberculosis без признаков заболевания.
Пример 5. Сотрудник противотуберкулезного диспансера М. Результат теста на инфицирование М. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): положительный. Результаты рентгенологического обследования: изменений в легочной ткани не выявлено. Жалоб нет. Клинические признаки туберкулеза отсутствуют.
В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров:
AG
NIL
AG
IFNγ- 3,1 МЕ/мл, TGFα - 0,1 пг/мл и IL-6 - 162 пг/мл.
Полученные значения ниже пороговых по всем трем показателям.
Заключение: латентная инфекция М. tuberculosis без признаков заболевания.
Пример 6. Больная Т. Диагноз: инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого. Результат посева мокроты положительный. Результат теста на инфицирование М. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): положительный.
В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров:
AG
NIL
AG
IFNγ - 2,22 МЕ/мл, TGFα - 25,28 пг/мл и IL-6 - 3998 пг/мл.
NIL
AG
NIL
По двум показателям (TGFα, IL-6) наблюдали превышение пороговых значений (TGFα- 17 пг/мл, 2039 пг/мл для IL-6).
Заключение: активный туберкулезный процесс.
Преимуществами предлагаемого способа по сравнению с традиционными методами является то, что при анализе небольшого количества периферической крови достигается высокая диагностическая значимость в дифференциации между лицами с активным туберкулезом и лицами с латентной туберкулезной инфекцией. Риск для пациента от применения данного способа сведен к минимуму, так как не требует введения инородных агентов в организм пациента. Способ не влияет на здоровье пациентов и позволяет ускорить, стандартизировать и автоматизировать процесс получения окончательного результата диагностики. Несомненным преимуществом является удобство для пациента, так как для оценки результатов не требуется повторного посещения врача.