Влияние фазового состояния липидного бислоя на проницаемость мембран

19. Quan Zhu, Khan Susmsullah, O’Brien P. Role of cytochrome P-450 in N-nitrose-N-methylaniline inducer hepatocyte /Chem.-Biol. Interact. — 1992, 83, 3, — P.221-233.

20. Sies H., Groot H. de Role of reactive oxygen species in cell toxicity /Toxicol. Lett. — 1992, 64-65, Spec. Issue. — P.547-551.

21. Werringloer J., Estabrook R. The formation of hydrogen peroxfde during microsomal electron transport reactions /Hoppe-Seyler. Z. Physiol. Chem. — 1976, 8, — P. 1063-1064.

Summary

Diinethyhiitrosaimne (DMNA) metabolism in the microsomes to formaldehyde under conditions of exposure to singiet oxigen guenclies, superoxside anion and hydroxyl radical traps were studied in vivo. DMNA metabolism in the microsomal membranes was blocked by superoxide anion radical traps. It was partly suppressed with hydroxyl radical traps. The findings are discussed with reference to the involment of superoxide anion and hydroxil radicals in DMNA metabolism and toxic liver damage.

УДК 577.

ВЛИЯНИЕ ФАЗОВОГО СОСТОЯНИЯ ЛИПИДНОГО БИСЛОЯ НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН

Е.В. Шевченко

Иркутский государственный медицинский университет

Резюме. Обобщены результаты работ автора по исследованию фазовых переходов мембранных липидов из жидкокристаллического состояния (ЖКС) в гель. Показано, что в точке фазового перехода происходит образование пор, время жизни которых зависит от фазового состояния липидов. Оценены параметры этих пор. Суммированы данные о размерах пор, возникающих в мембране при электрическом пробое, осмотическом гемолизе и фазовом переходе. Показана возможность регулирования стабильности мембран изменением фазового состояния.

Биологические мембраны состоят из белков, липидов, воды и неорганических компонентов. Относительное содержание этих составных частей и их природа могут существенно различаться.

Основой биологических мембран является бимолекулярный слой, сформированный молекулами липидов [4]. Стабильность и непрерывность липидного бислоя имеют важное значение для выполнения мембранами одной из основных функций — барьерной.' В последнее время стало очевидно, что такие биологические явления, как эндо- и экзоцитоз, лизис клеток и гемолиз, электропорация и криоконсервация, обусловлены изменениями в липидном бислое мембран. При этом происходит дестабилизация структуры бислоя. Жидкокристаллическая природа бислоя подразумевает существование в нем дефектов, развитие которых приводит к формированию зародыша, далее гидрофобной поры, эволюционирующей в гидрофильную сквозную пору [2]. Поры могут затекать, что приводит к стабилизации мембраны, либо увеличиваться в размерах, что в конечном итоге приводит к разрыву пленки. Когда пора образовалась, ее дальнейшее развитие будет зависеть от целого ряда факторов и прежде

всего от высоты энергетического барьера и критического радиуса [-1].

Определение критических параметров образующихся пор представляет важную задачу биофизики мембран. Наиболее изучены в настоящее время бислойные мембраны в условиях электрического пробоя и действия детергентов [3]. Общая теория дестабилизации мембран была разработана в свое время Дерягиным [2].

Общим недостатком этих исследований, отличающим их от исследования белковых каналов, являются трудности визуализации пор в силу их быстрого затекания или разрушения вместе с мембраной в жидкокристаллическом состоянии.

В начале 80-х годов в лаборатории ионного транспорта МГМУ им.Н.И.Пирогова (научный руководитель — проф.Антонов В.Ф.) при изучении фазовых переходов липидов были обнаружены долгоживущие поры, легко регистрируемые по флуктуациям тока при соответствующей температуре фазового перехода липидов [!]• Одной из очевидных причин длительного существования пор является замедление диффузии липидов при переходе в гель состояние. Дальнейшие исследования были сосредоточены поэтому на изучении бислойных липидных мембран в условиях фазового перехода ЖКС

— гель. Такие исследования позволяют, во-первых, резко замедлить диффузионные процессы, определяющие время жизни мембран с порами, во-вторых, сам процесс фазового перехода, сопровождающийся стрессовыми состояниями, является источником дефектов типа сквозных пор, и, наконец, в отличие от электрического пробоя, поры могут регистрироваться по флуктуациям тока при физиологических напряжениях (0-100 мВ), много меньших напряжения пробоя (-400 мВ).

В основу экспериментальных исследований

была положена регистрация электрических параметров бислойных липидных мембран в области фазового перехода индивидуальных липидов. Полученные данные сопоставлялись с данными дифференциальной сканирующей калориметрии для определения термодинамических параметров фосфолипидов в области фазового перехода. В работе использовались синтетические и природные липиды. Химический синтез липидов позволил провести широкую модификацию липидов как в жирнокислотных цепях, так и в головках. В результате были получены динасыщенные гликофосфолипиды с разной температурой фазового перехода в положительной области температур [6]. Были синтезированы как цвиттерионные липиды (например, дипальмитоилфосфатидилхолин — ДПФХ и дистеароилфосфатидилхолин —

2,5 пА

20 *

Ю

jTlJ Ціл-

ії

О її

20 -

10

ЗО, г>См

Л

О і 20-

10 •

50, пСм

50, ОСИ

10

м

т—I—

50, nCfi

J\UlflrJKw

10 •

50, пСи

Рис.1. Флуктуации трансмембранного тока и гистограммы проводимостей в плоской бислойной липидной мембране при температуре фазового перехода индивидуальных липидов, зарегистрированные при замораживании мембран. Слева — флуктуации тока, справа — гистограммы проводимостей. Липидный состав БЛМ: а — ДПФХ (Т = 42Х), б — ДСФХ (Т = 59*0, в - ДПФК (pH 4,5 Т, = 59'С), г - гидрированный яичный лецитин (Та — 51*С). Темпеоатуры фазового перехода определены методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСХ

ДСФК), так и заряженные (например, диполь-митоилфосфатидная кислота — ДПФК). Использование положительно и отрицательно заряженных липидов позволило регулировать заряд мембраны, а также катион-анионную селективность формируемых пор. Особый интерес представляют фосфатидные кислоты. Фос-фатидная кислота — это отрицательно заряженный липид с двумя титруемыми группами, что позволит менять заряд молекулы от О до 2е. В исследованиях впервые были сформированы устойчивые плоские бислои из фосфа-тидных кислот.

Плоские бислои, сформированные при температуре, превышающей температуру фазового перехода липидов, обладают высоким сопротивлением и стабильностью. Это позволяет исследовать свойства таких мембран в условиях фазового перехода. При сканировании температуры в области фазового перехода проводимость изменяется скачком на 1,5-2 порядка [1].

О появлении пор свидетельствуют флуктуации тока, наблюдаемые в режиме фиксации потенциала на мембране. Типичные картины развития трансмембранного тока для мембран, сформированных из разных липидов, представлены на рис.1 (слева). Справа на этом рисунке представлены соответствующие этим флуктуациям гистограммы распределения пор по проводимости. Сопоставление рисунков показывает, что во всех случаях реализации тока приблизительно одинаковы. Анализ распределения говорит о том, что при фазовом переходе появляются поры с проводимостью, амплитуда которых варьирует в довольно широких пределах — от 10 до 50 пСм. Это означает, что поры в отличие от белковых каналов типа грамици-диновых, не имеют жесткой структуры.

Принципиально новый результат представлен на рис.2. В этом случае фазовый переход в мембране из ДПФК индуцировался при постоянной температуре добавлением двухвалентных ионов. Следует подчеркнуть, что характер и форма флуктуаций тока близки к флуктуациям, регистрируемым при термотропном фазовом переходе. Справа на рис.2 показаны гистограммы амплитудного распределения проводимостей пор. Отметим, что при хемотропном фазовом переходе распределения более упорядочены, как правило, высокоамплитудные флуктуации отсутствуют.

Считая каждую отдельную флуктуацию соответствующей одиночной поре с омической проводимостью, мы оценили радиус образовавшихся пор. Расчеты дали значения радиуса 0,4 нм, наиболее вероятным проводимостям соответствуют поры радиусом 1,2 нм. Независимая оценка размера пор может быть получена путем исследования предложенной нами модели формирования пор [6]. Эта оценка дает значения 1,2-1,6 нм, что удовлетворительно совпадает с экспериментальными значениями.

В живой клетке фазовым переходам при обычных температурах подвержены 2 компонента: вода и фосфолипиды. Фазовое поведе-

ние воды изучено в настоящее время достаточно полно. В отношении фазового перехода мембранных фосфолипидов известно, что большинство клеточных мембран находится в жидкокристаллическом состоянии [3]. Если бы мембрана состояла только из диненасыщенных фосфолипидов, to фазовый переход из жидкокристаллического состояния в гель-фазу происходил бы при отрицательных температурах, в случае динасыщенных липидов эта точка смещается в положительную область, достигая у дистеароилфосфатидилхолина +59 С. Реальные клеточные мембраны состоят из смеси фосфолипидов с промежуточной температурой фазового перехода. Прямые опыты дают для мембран эритроцитов Тп = 7 : -15'С [4]. Каким же образом обеспечивается жидкокристаллическое состояние мембранных липидов?

Чтобы избежать перехода липидного бислоя в гель-состояние природой предусмотрена специальная система структурной стабилизации. Во-первых, природные фосфолипиды устроены таким образом, что из двух жирнокислотных хвостов один представлен полиненасыщенной жирной кислотой, что существенно сдвигает Т

Sf* g I пСм

•WAV

IhnL

]Ь_Пл

Ч. >*С-

Рис.2. Флуктуации трансмембранного тока и гистограммы проводимостей в мембранах из ДПФК при фазовом переходе, индуцированном добавками двухвалентных ионов (стрелками показан момент добавки ионов к бислоям в жидкокристаллическом состоянии). Слева — трансмембранный ток через бислой, справа — гистограмма проводимостей. Добавлены хлориды следующих ионов: а — Са, б — Сс1, в — Мд, г — вг, д — Ва.

липида в область более низких температур. Эта особенность обеспечивает высокую жидко-стность липидного бислоя во всем диапазоне физиологических температур.

Во-вторых, структурные перестройки при фазовом переходе ЖКС-гель существенно сглаживаются в присутствии молекул холестерина, что способствует сохранению липидного бислоя в жидкокристаллическом состоянии.

В-третьих, нарушению структуры бислоя в результате перекисного окисления липидов препятствует целая система мембранных антиоксидантов.

И, наконец, в мембране содержится большое количество специфических ферментов — фосфолнпаз и десатураз, которые способны существенно влиять на фосфолипидный состав мембраны, модифицируя как жирнокислотные радикалы, так и полярные головки.

Совершенно очевидно, что отказ какой-либо системы стабилизации переводит биологическую мембрану в состояние патологии.

Каким же образом связана проницаемость клеточных мембран с фазовыми переходами мембранных липидов в тех случаях, когда она выражена? До последнего времени единственный эффект, обсуждаемый в литературе, заключался в изменении микровязкости в липидном матриксе мембраны [10]. Переход в гель-состояние сопровождался возрастанием вязкости, а это сказывалось на диффузии жирорастворимых веществ через мембрану и скорости конформационных перестроек транспортных белковых систем [10]. Речь идет, таким образом, об опосредованном через изменение вязкости влиянии фазового перехода на транспорт веществ.

Однако опыты, проведенные в лаборатории ионного транспорта [1], выявили неожиданный эффект, связанный с изменением проницаемости. При исследовании электрической проводимости бислойных липидных мембран, сформированных из синтетического фосфолипида ДСФХ, был обнаружен скачок проводимости в области фазового перехода (температура +59 С). Этот эффект был подтвержден на большом количестве природных и специально синтезированных липидов [!]• Выяснилось, что скачок проводимости обусловлен появлением в бислое долгоживущих ионных пор [8,11]. Их проводимость не имела постоянного значения, длительность составляла -1 с (рис.1). В дальнейших исследованиях впервые было установлено, что заморозить бислойную липидную мембрану, т.е, вызвать фазовый переход из жидкокристаллического состояния в гель, возможно и не понижая температуру [1]. В мембранах, сформированных из кислых липидов и имеющих на поверхности отрицательные заряды, под влиянием добавки ионов кальция или других двухвалентных ионов, появляются флуктуации тока, идентичные тем, которые появлялись при температурном фазовом переходе. Прямые калориметрические исследования подтвердили переход бислойных ламеллярных

Таблица 1

Размеры липидных пор в модельных и клеточных мембранах

Радиус Соотношение Условие

поры Объект радиусов определения Ссылка

R, нм пор радиуса пор

3,0-4,0 эритроцит r1>r;>r электрический пробой [7]

2,0 эритроцит RL>R осмотический гемолиз [14]

0,7-1,2 эритроцит R'«.>R**>R электрический пробой [12]

1,2-2.0 L-клетки R* >R* >R •КС ЭЛ электрический пробой [5]

0,2-2,0 липоеомы RL>R осмотический лизис [15]

0,6-0,8 лилосомы R" >R‘ >R •КС Г«ЛЬ фазовый переход [13]

0,5-2,0 липоеомы RL>RL>>R фазовый переход [9]

1,2-1,8 БЛМ RLc>R"«h>R> Rrwb+эг Фазовь,И ПЄрЄХОД [6]

— критический радиус поры в жидкокристаллическом состоянии липидного' бислоя

I?* — критический радиус поры в гель-состоянии липидного

бислоя

Р*ж — критический радиус поры при электрическом пробое липидного бислоя

^*.ль+эо — критический радиус поры при замораживании

мембраны с последующим электрическим пробоем

структур из жидкокристаллического состояния в гелеобразное [6].

Не вызывает сомнения общность происхождения липидных пор, выявляемых при фазовом переходе липидов, электрическом пробое и осмотическом гемолизе (табл.1).

В таблице суммированы данные о липидных порах, обнаруженных в клеточных и модельных мембранах. Радиусы пор во всех случаях довольно значительно различаются, однако с учетом того, что все случаи, кроме (8), соответствуют жидкокристаллическому состоянию, все эти значения меньше критического радиуса (критический радиус — это значение радиуса, при котором пора способна залечиваться [6]). Из этого следует, что мембрана сохраняет свою стабильность, поскольку поры залечиваются. Действительно известно, что оставшиеся после гемолиза тени эритроцитов сохраняют свои барьерные функции [4]. В случае обратимого электрического пробоя поры также способны самозалечиваться [5]. Причиной появления пор является развитие дефектов жидкокристаллической структуры липидного бислоя в гидрофильные поры. Судьба мембраны после этого определяется критическими параметрами — критическим радиусом поры и высотой энергетического барьера поры. Переход мембранных липидов из жидкокристаллического состояния в гель или увеличение мембранного потенциала выше 400 мВ сопровождается резким снижением высоты энергетического барьера и критического радиуса поры [1]. Стабильность мембраны значительно снижается. Однако этим процессом можно управлять. Быстрый нагрев мембраны до температуры выше температуры фазового перехода или сброс мембранного потенциала повышает критические параметры и, соответственно, стабильность мембраны. Поскольку критические параметры

мембраны определяются поверхностным натяжением липидного бислоя и краевым натяжением поры, то все химические воздействия, приводящие к изменениям этих параметров, могут сопровождаться структурными перестройками липидного бислоя типа фазового перехода с появлением трансмембранных пор. Принципиально важным является экспериментально обнаруженный процесс самозалечивания липидных пор, что обеспечивает стабилизацию мембраны.

ЛИТЕРАТУРА

1. Антонов В.Ф., Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В. Липидные мембраны при фазовых превращениях. — М., Наука, 1992, — 136 с.

2. Дерягин Б.В. Теория устойчивости коллоидов и тонких пленок. — М., Наука, 1986, — 205 с.

3. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя. — С., Наука, 1982,

— 294 с.

4. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. — М., Наука, 1982, — 224 с.

5. Сухарев С.И., Черномордик Л.В., Абидор И.Г. Обратимый электрический пробой холестеринсодержащих бислойных липидных мембран, модифицированных голотурином А. — Биофизика, 1983, т.28, —С.423-426.

6. Шевченко Е.В. Поры и стабильность бислойных липидных мембран в области фазового перехода гель — жидкий кристалл /Дисс. ... докт.биол.-наук. — М., МГУ, 1993, — С.7.

7. Benz R., Zimmermann U. The resealing process of lipid bilayers after reversible electrical breakdown /Biochem. Biohpys. Acta. — 1981, V.640, — P.169-178.

8.Bogeim G., Hanke W., Eibl H. Solid phase transition in planar bilayer membranes and its effect on carrier and pore mediated ion transport /Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. — 1980, V.77, —P.3403-3407.

9. Braganza L.E., Blott B.H. Coe T.I., Meville D.Dye permeability of phase transition in single binary component phospholipid bilayers /Biochem. Bio-phys. Acta. — 1983, V.731, — P.137-144.

10. Cevc G. Reviews on biomembranes /Biochem. Bio-phys. Acta. — 1990, V.1031, — P.331-382.

11. Kaufmann K., Silman I. The induction by protons of ion channels through lipid bilayer membranes / Biophys. Chem. — 1983, V.18- — P.89-99.

12. Kinosita K., Tsong T.Y. Formation and resealing of pores of controlled sizes in human erythrocyte membranes /Nature. — 1997, V.268, — P.438-441.

13 Papahadjopoulos D., Kumelberg H.K. Phospholipid vesicles (liposomes) as model for biological membranes: their properties and interaction with cholesterol and protein /Progr. Surfase Sci. — 1973, V.4, — P. 141-232.

14. Rand R.P., Luzzatti V. X-ray diffraction study in water of lipid axtracted from human erythrocytes /Biophys. J. — 1968, V.8, № 1, — P.125-137.

15. Taupin C., Dvolaitzky М., Sauterey C. The osmotic pressure induced pores in phospholipid vesicles /Biochem. — 1975, V.14, № 21, — P.4771-4775.

Summary

The problem of structure of bilayer lipid membranes at the phase transition gel-liquid crystalline state has been considered. It was shown that the pores are formed at the phase transition point. The life time depends on lipid phase state. The sizes of these pores are estimated. The dates about pores are summarized inducing in the membranes during the electrical breakdown, the osmotic hemolisis and the phase transition.

Редколлегия нашла нужным опубликовать ре. цо.нзию и отпет по статье Е. И. Шевченко

Рецензия на статью Е.В.Шевченко “Влияние фазового состояния липидного бислоя на проницаемость мембран”

Статья Е.Г.Шевченко освещает одну из сторон фундаментальной проблемы современной биологии и медицины — морфо-функциональ-ные особенности организации липидного компонента биологических мембран.

На модели липидного бислоя с помощью современных методических подходов автором убедительно показана зависимость образования пор в мембране от фазового состояния липидов. Выявлено, что образовавшиеся поры не имеют жесткой структуры и могут “самозале чиваться”.

С биологической точки зрения чрезвычайно важным является описанный автором факт, что фазовый переход в мембране может быть следствием не только температурных изменений, но и изменений заряда ионогенных групп липидов. Такие ситуации могут возникать при ряде биохимических нарушений, связанных с изменением транспорта электронов белковыми компонентами мембран (ферментами), при свободно-радикальном перекисном окислении липидов, аномальном катализе окислительно-вос-становительных реакций ионами металлов с переменной валентностью. Показанные автором изменения могут лежать в основе регуляции и нарушения мембранной проницаемости в ходе биохимических процессов и иметь определяющее значение для механизмов деградации мембранных структур при развивающейся внутриклеточной патологии.

В этом плане данные, полученные Е.В.Шевченко, представляют безусловный научный интерес. Статья написана хорошим литературным языком, достаточно иллюстрирована и может быть опубликована в печати. Вместе с тем некоторые дополнения, на наш взгляд, улучшили бы восприятие материала читателем.

1. В первом предложении английского ре-

зюме (Summary) результаты оказываются не привязанными к объекту исследования.

2. Для неспециалиста в области мембрано-логии фраза “Основой биологических мембран является бимолекулярный слой, сформированный молекулами липидов” несет в себе ряд вопросов. Мембрана в клетках действительно представлена липидным бислоем с погруженными в него белковыми (ферментными) ансамблями, имеющими центры связывания как с липидами и белками, так и с субстратами их функционирования. Поэтому на стабильность мембраны, на характеристики пор в ней и механизмы их “залечивания” значительное влияние оказывает белковый компонент. Этот момент было бы рационально отметить, поскольку он определял бы объективность и меру переноса экспериментальных данных, полученных на искусственных мембранах, на нативные структуры клетки.

Док. мед. наук проф. Б.Г.Осипенко

Ответ рецензенту

Автор благодарен рецензенту за доброжелательную рецензию.

На Ваши замечания можно ответить следующее:

1. С первым замечанием автор согласен. В английское резюме добавлена фраза, поясняющая смысл работы.

2. Второе замечание носит характер пожелания. Действительно, биологическая мембрана имеет сложное строение, но бислойная липидная мембрана (BJIM) является наиболее адекватной моделью природных мембран. В настоящее время известны опыты на БЛМ, воспроизводящие все основные функции мембран. Безусловно, что белковые компоненты оказывают влияние на все процессы в мембране, в том числе и на фазовые переходы и фазовое состояние мембран.

Автор оставляет за собой право не изменять данную статью и учтет пожелание рецензента при написании следующих статей.

1.4 ноября 1905 г. Док. биол. наук

Е. В. Шевченко

УДК 616.441-008.64-002.3

ВЛИЯНИЕ ГИПОТИРЕОЗА НА ДИНАМИКУ ФОРМООБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В ОЧАГЕ ГНОЙНОГО ВОСПАЛЕНИЯ

Семинский И.Ж., Клейн К.Л.

Иркутский государственный медицинский университет (ректор — проф.А.А.Майбррода) Кафедра общей биологии, зав.каф. — проф.А.А.Майборода

Резюме. Изучено влияние дефицита гормонов щитовидной железы на течение воспаления. На модели гнойного воспаления у крыс показано, что динамика формообразовательных процессов в очаге повреждения при гипо и эутиреоЗе в целом сходна. Последовательность событий соответствует классической схеме: повреждение — отек — лейкоцитарный вал — макрофагическая

инфильтрация — фиброзирооание. Однако при гипотиреозе, вследствие снижения энергетического статуса клеток, реализующих воспаление, все стадии процесса протекают медленно, и воспаление переходит в хроническую форму.

В настоящее время морфология воспалительного процесса изучена достаточно полно. Уста-