СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
METHOD OF TREATING MALIGNANCIES IN MAMMALS

Изобретение относится к экспериментальной онкологии и биотехнологии и предназначено для лечения злокачественных опухолей у млекопитающих.
Онкологические заболевания представляют собой серьезную проблему для здравоохранения. Современное состояние терапии онкологических заболеваний таково, что развитие новых походов происходит без революционных прорывов, постепенно, шаг за шагом, с длительным и внимательным контролем каждого вносимого нововведения. Большинство из применяемых для лечения рака способов являются высокотоксичными для организма в целом (Суохами Р., Тобайас Дж. Рак и его лечение. М.: БИНОМ, 2009). Таким образом, достоверное улучшение уже существующих способов терапии и разработка новых подходов, базирующихся, в том числе, и на совершенно новых препаратах, становится реальным шагом к созданию комплексных способов терапии рака.
Для оценки преимуществ, которые может дать новый способ лечения, проводится сравнительный анализ кривых выживания основной и контрольной групп. Случаи кардинального улучшения способов лечения в онкологии очень редки. Тем не менее, и незначительные улучшения могут играть большую роль в клинической практике. Так, применяемый в клинической практике при лечении рака молочной железы препарат тамоксифен увеличивает выживаемость пациенток на 8%, что составляет снижение смертности от рака в Европе на 64 тыс.жизней ежегодно (Суохами Р., Тобайас Дж. Рак и его лечение. М.: БИНОМ, 2009).
В случае опухолей, для которых характерно присутствие рецепторов эстрогенов и других стероидных гормонов, существует "адресная" стратегия ингибирования процессов злокачественного роста путем применения антител, блокирующих передачу внешнего сигнала в клетку. Так, известен способ ингибирования роста опухолей у мышей с помощью препаратов белковой природы, представляющих собой моноклональные антитела к внешним доменам erbB-2 рецепторов тирозинкиназы. Введение моноклональных антител FSP77 осуществляют внутривенно в дозе 2,5 мг/кг в течение 10 дней ежедневно. Способ позволяет добиться практически полного подавления роста опухоли в период инъекций и еще в течение 12 дней после прекращения инъекций (Harwerth I.M. et al., Monoclonal antibodies directed to the erbB-2 receptor inhibit in vivo tumor cell growth. Br. J. Cancer, 1993, Vol.68, p.1140-1145).
Недостатками способа являются его ограниченные функциональные возможности, поскольку действие препарата ограничено опухолями, экспрессирующими подобные рецепторы, а прекращение его приема ведет к возобновлению роста опухоли. Кроме того, длительный прием антител вызывает падение кровяного давления, аллергические реакции и скопление жидкости в легких.
Известен способ ингибирования роста карциномы толстой кишки у мышей nude путем использования рекомбинантного белка Apo2L (TRAIL). Препарат вводят животным внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг/день с помощью мини-насоса в течение 3 дней (Ashkenazi A. et al., Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand. J. Clin. Invest., 1999, V.104, p.155-162). Способ обеспечивает уменьшение размера опухоли на 25% по сравнению с контрольной группой.
Недостатком способа является невысокая противоопухолевая активность препарата in vivo, т.к. в настоящее время эффективного подавления роста опухолей у животных с помощью Аро2 удается добиться только в комбинации с другими известными химиопрепаратами, например с 5-фторурацилом (5-FU).
Апоптоз (программируемая гибель клеток) - процесс, необходимый для поддержания численности и функциональности клеток многоклеточного организма в норме, а также для удаления дефектных, онко- и вирустрансформированных клеток при проявлении патологии. Известно, что именно сбой программы апоптоза в генетически дефектных клетках становится причиной развития многих злокачественных опухолей, традиционные способы лечения которых в настоящее время являются недостаточно эффективными. Поиск новых подходов к терапии и возможность индукции апоптоза раковых клеток белковыми факторами, специфичными к клеткам опухоли, положена в основу создания ряда современных противораковых фармакологических средств.
В настоящее время число препаратов белковой природы, применяемых в клинике для терапии злокачественных опухолей, невелико. Большинство белковых препаратов, стимулирующих апоптоз раковых клеток, создаются на основе провоспалительных цитокинов: фактора некроза опухолей TNF-a и его гомологов FasL, TRAIL (Buescher Е.S., McWilliams-Koeppen P. Soluble tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) receptors in human colostrum and milk bind to TNF-alpha and neutralize TNF-alpha bioactivity. Pediatr. Res., 1998, V.44(1), p.37-42). Кроме того, при некоторых типах опухолей относительную эффективность проявляют интерфероны: интерферон-альфа и интерферон-бета (Cho D.V. Focus on cell apoptosis research // Nova Biomedical Books. New York. 2006).
Основным недостатком препаратов на основе провоспалительных цитокинов является то, что они вызывают серьезные побочные эффекты, такие как лейкопения и иммуносупрессия, которые ограничивают их применение и стимулируют поиск новых белков, способных индуцировать апоптоз раковых клеток.
Ранее был обнаружен и исследован природный пептид, названный лактаптином, обладающий апоптотической активностью в отношении культур клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 (Патент RU 2317304, оп. 20.02.082). Этот пептид, являющийся фрагментом каппа-казеина из человеческого молока, имеет молекулярную массу около 8,6 кДа и содержит установленную последовательность из 74 аминокислотных остатков, в которую входит протеолитический фрагмент каппа-казеина с 63 по 123 аминокислотный остаток.
Основным недостатком препарата на основе природного каппа-казеина человека является дороговизна и ограниченность источника сырья для его производства. Эта же причина делает невозможным производство такого препарата в достаточных количествах для клинического применения, в связи с чем необходима разработка рекомбинантного аналога каппа-казеина человека.
Таким образом, поиск новых белков, способных селективно подавлять рост и вызывать апоптотическую гибель раковых клеток, является актуальной задачей.
2
Наиболее близким к заявленному способу - прототипом является способ лечения злокачественных опухолей у мышей с помощью препарата «HAMLET», представляющего собой комплекс альфа-лактальбумина человеческого молока с олеиновой кислотой. Противоопухолевый эффект препарата HAMLET исследовали на перевиваемой карциноме МВ49 мышей, трансплантированной в мочевой пузырь мышам линии C57B L/6. Введение раствора HAMLET в фосфатном буфере осуществляли непосредственно в мочевой пузырь в дозе 100 мг/кг с помощью катетера курсом из 5-ти введений (Mossberg А.-К. et al., HAMLET treatment delays bladder cancer development. J. Urol., 2010, V.183, p.1590-1597). В результате лечения в среднем размер опухолей у животных, принимавших HAMLET, был на 24% меньше, чем у животных в контрольной группе (1,9 и 2,5 см, соответственно).
Очевидными недостатками прототипа являются трудоемкость способа введения препарата, ограниченный спектр опухолей, доступных для такого способа терапии (т.к. достижение лекарственного эффекта предполагает непосредственный контакт препарата с клетками опухоли), и его невысокая эффективность.
Технической задачей предлагаемого изобретения является упрощение известного способа лечения злокачественных опухолей у млекопитающих, расширение спектра опухолей, доступных для терапии, и повышение его эффективности.
Поставленная техническая задача достигается тем, что в качестве лекарственного средства используют рекомбинантный пептид, являющийся аналогом фрагмента каппа-казеина человека, обладающего высокой эффективностью и низкой токсичностью, в экспериментально подобранном оптимальном режиме. Данный пептид является рекомбинантным аналогом природного пептида из молока человека - лактаптина.
Предлагаемый способ заключается в следующем. Млекопитающему внутривенно вводят рекомбинантный пептид, являющийся аналогом фрагмента каппа-казеина человека (RL2) в дозе 8-100 мг/кг веса, ежедневно, в течение 2-6 дней. Перед введением, рекомбинантный пептид растворяют в любом фармацевтически приемлемом растворителе, например, в 0,9% растворе хлорида натрия или в 0,5% растворе новокаина.
Определяющим отличием предлагаемого способа от прототипа является то, что в качестве лекарственного средства используют рекомбинантный пептид, являющийся аналогом фрагмента каппа-казеина человека в экспериментально подобранном, оптимальном режиме, а именно: внутривенно, в дозе 8-100 мг/кг веса, ежедневно, в течение 2-6 дней, что позволяет упростить способ, повысить эффективность лечения и расширить спектр опухолей, доступных для терапии.
Рекомбинантный пептид, являющийся аналогом фрагмента каппа-казеина человека (RL2), получают путем его продукции в клетках Echerichia coli и выделяют способом, описанным в (патент RU №2401307, опубл. 10.10.2010). Рекомбинантный пептид имеет молекулярную массу около 16 кДа, состоит из остатка метионина, фрагмента каппа-казеина человека с 24 по 134 аминокислотный остаток и C-концевого гистидинового тракта. Используемый рекомбинантный пептид (RL2) вызывает гибель раковых клеток по пути апоптоза, при этом гибель раковых клеток сопровождается активацией инициаторных каспаз 8 и 9 и включает в себя стадию диссипации трансмембранного потенциала митохондрий (Δψ), что непосредственно указывает на участие в гибели клеток как митохондриальных апоптотических факторов, так и факторов, ассоциированных с апоптотическими рецепторами [Semenov et al., Recombinant analogs of a novel milk pro-apoptotic peptide, lactaptin, and their effect on cultured human cells. Protein J., 2010, Vol.3, p.174-180].
В РФ и за рубежом сведений о лечении онкологических заболеваний с помощью рекомбинантного пептида (RL2) (рекомбинантного аналога лактаптина) не обнаружено.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.
Пример 1.
5
Гепатома ГА-1 мышей была трансплантирована внутривенно в количестве 1,5×10 опухолевых клеток мышам линии A/Sn возрастом 14-16 недель. На 2-ой день после трансплантации животные в группах ежедневно получали внутривенную инъекцию RL2 в дозе 0,4-150 мг/кг веса. Курс лечения состоял из 2-х инъекций. На фиг.1 представлены результаты влияния препарата RL2 на продолжительность жизни животных в зависимости от вводимой дозы препарата. Из фиг.1 видно, что введение животным RL2 в дозах 8-100 мг/кг веса приводит к достоверному увеличению продолжительности жизни животных. Например, при введении животным RL2 в дозе 100 мг/кг веса продолжительность жизни последних увеличилась до 40%. Увеличение дозы препарата до 150 мг/кг веса не вело к дальнейшему увеличению продолжительности жизни животных по сравнению с дозой 100 мг/кг. Доза препарата менее 8 мг/кг веса не увеличивала продолжительность жизни по сравнению с контролем.
Пример 2.
6
3
Опухоль Кребс-2 была трансплантирована внутримышечно в количестве 5×10 клеток самцам мышей линии GR возрастом 14-16 недель. Начиная с 10-го дня после трансплантации, когда опухоль достигла в среднем размера 1 см, животным ежедневно внутривенно вводили RL2 в дозе 14 мг/кг веса, в течение 6 дней. Показано (фиг.2), что лечение RL2 указанным курсом снижает рост опухоли на 27%.
Пример 3.
5
Гепатома ГА-1/2 мышей была трансплантирована подкожно в районе лопатки мышам линии A/Sn в возрасте 14-16 недель в количестве 2x10 опухолевых клеток. Начиная с 15-ого дня после трансплантации, когда размер опухоли в среднем составлял не менее 10 мм, мышам ежедневно внутривенно вводили RL2 в дозе 40 мг/кг веса животного курсом 3 дня. На 32-й день после трансплантации мыши были препарированы, опухоли изъяты и взвешены. Ингибирующий эффект препарата RL2 на подавление роста опухоли представлен на фиг.3. Из фиг.3 видно, что лечение животных указанным способом позволяет добиться регрессии опухоли на 61% по сравнению с контрольной группой.
Пример 4.
6
3
Гепатома ГА-1 мышей была трансплантирована подкожно в районе лопатки мышам линии A/Sn в возрасте 14-16 недель в количестве 5×10 опухолевых клеток. Начиная с 15-ого дня после трансплантации, когда размер опухоли в среднем составлял не менее 10 мм, мыши были разбиты на группы и получали ежедневную внутривенную инъекцию RL2 в дозе 40 мг/кг веса животного. Курс терапии в разных группах состоял из 1-го, 2-х, 5-ти или 6-ти введений препарата. В процессе лечения размер опухолей у животных измерялся штангенциркулем (длина×ширина). Показано, что в процессе лечения происходит стабильное подавление роста опухоли (фиг.4А). Увеличение курса лечения с 2-х до 6-ти инъекций RL2 способствует достоверному снижению темпа роста опухолей: до 62% по сравнению с контрольной группой. Дальнейшее продление курса (7 и более инъекций) не ведет к повышению терапевтического эффекта на опухоль.
На 21-й день после трансплантации опухолевых клеток мыши были взвешены, препарированы, опухоли изъяты и взвешены. На фиг.4 (Б) представлены данные по изменению веса животных в группах. Видно, что лечение RL2 не вызывает токсических эффектов, выражающихся в снижении массы тела животных.
Предлагаемый способ лечения злокачественных опухолей у млекопитающих с использованием рекомбинантного пептида (RL2) в экспериментально подобранном, оптимальном режиме обеспечивает упрощение известного способа, значительно повышает эффективность лечения и расширяет спектр злокачественных опухолей млекопитающих, доступных для терапии.
Использование предлагаемого способа позволит:
- повысить эффективность лечения за счет использования для лечения злокачественных опухолей совершенно нового препарата - рекомбинантного аналога лактаптина в диапазоне доз 8-100 мкг/кг массы при краткосрочном курсе лечения;
- проводить терапию широкого круга опухолей за счет малотравматичного способа введения препарата через кровяное русло;
- исключить побочные осложнения, в частности общетоксические реакции и снижение массы тела;
- расширить ассортимент противоопухолевых препаратов природного происхождения белковой природы.