РАКОВЫЙ АНТИГЕН
CANCER ANTIGEN

Область техники
Настоящее изобретение относится к антигену/антигенам раковых вакцин, иммуногенным против рака, то есть специфичным к ткани/органу, из которого он/они происходят, для применения в воздействии на рак. Изобретение также предоставляет способ получения такого антигена.
Предшествующий уровень техники
Рак вызывается быстро делящимися клетками. Он является основной причиной заболеваемости и смертности. Место происхождения рака представляет собой ткань/орган. Несмотря на тот факт, что он происходит из одиночных ткани/органа, клетки не идентичны (гомологичны). В лечении рака применяют хирургическое удаление, радиотерапию и/или химиотерапию. Установлено также, что полезна пассивная иммунотерапия в форме введения антител. Известно, что присутствие в раке, происходящем из одиночной ткани/органа, гетерогенных клеток приводит к слабому ответу на противораковую терапию, кроме хирургического лечения. Это более важно для лечения рака с помощью иммунотерапии.
Были попытки использовать активную иммунотерапию в форме вакцины для воздействия на рак. Для активной иммунотерапии необходимо использовать антиген, специфичный к раку, подлежащему лечению. Некоторые из специфических к раку антигенов включают ингибиторы металлопротеиназы матрикса, эпидермальный фактор роста, гастрин, целые раковые клетки, белки теплового шока и т.д.
Для создания иммуногенной раковой вакцины с использованием целых клеток были предложены несколько методов. Создаваемый раковой вакциной иммунный ответ часто вызывает аутоиммунную или токсичную реакцию (Blood-2011-01-325-366).
Поэтому, существует потребность иметь раковый антиген, который бы индуцировал иммунную реакцию на раковые антигены, но не на нормальные клетки (аутоиммунитет).
Используемые в качестве антигена раковые клетки либо не обладают иммуногенностью, либо генерируют слабую иммунную реакцию. Известно, что антрациклин и оксалоплатин усиливают иммуногенность раковых клеток, как описано Laurence Zitvogel et. al. в Clin Cancer Res, 2010, 16(12):3100-3104: “In response to some chemotherapeutic agents (such as anthracyclines and oxaliplatin) and ionizing irradiation, tumor cells undergo immunogenic apoptosis, meaning that they trigger a protective immune response when they are injected subcutaneously in the absence of any adjuvant into immunocompetent mice (J. Exp. Med. 2005; 202: 1691-701; Nat. Med. 2007; 13: 54-61.; Immunol. Rev. 2007; 220: 22-34.; Nat. Med. 2007; 13: 1050-1059.; Nat. Med. 2009; 15: 1170-1178.; Cell. Mol. Immunol. 2009; 6: 469-475.; Cancer Immunol. Immunother. 2010; 59: 769-777). In contrast, cells succumbing in response to other anticancer drugs (such as alkylating agents and cisplatin) fail to trigger such an immune reaction (J. Exp. Med. 2005; 202: 1691-1701)".
Задача изобретения состоит в том, чтобы генерировать иммунную реакцию, специфическую для раковых клеток, но без реакции на нормальные клетки и раковые клетки, происходящие из другой ткани/другого органа.
Таким образом, существует неудовлетворенная необходимость предоставить раковую вакцину, обладающую иммуногенностью по отношению к гетерогенной популяции клеток, происходящих из той же самой ткани/того же самого органа, и не действующую на нормальные клетки.
Цель изобретения
Основная цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить антиген/антигены для раковой вакцины/раковых вакцин.
Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить антиген для раковой вакцины, который индуцирует иммунную реакцию на раковые клетки (и гомологичные, и гетерогенные раковые клетки) той же ткани (того же органа), из которой(-ого) они происходят.
Еще одна цель состоит в том, чтобы предоставить раковый антиген для злокачественной опухоли/злокачественных опухолей, который стимулирует клеточную иммунную реакцию на раковые клетки (и гомологичные, и гетерогенные раковые клетки), той ткани (того органа), из которого он происходит.
Еще одна цель состоит в том, чтобы предоставить раковую вакцину для злокачественной опухоли/злокачественных опухолей, которая стимулирует гуморальную иммунную реакцию на раковые клетки (и гомологичные, и гетерогенные раковые клетки) той ткани (того органа), из которого она происходит.
Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить антиген для раковой вакцины для применения в лечении злокачественной опухоли (злокачественных опухолей).
Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить способ приготовления антигена для раковой вакцины.
Краткое описание изобретения
Для целей настоящего изобретения раковые клетки могут быть выделены из опухолевых тканей. Для целей настоящего изобретения используются любые раковые клетки, происходящие из коммерчески доступных установленных клеточных линий или из новых первичных раковых клеток, полученных от пациентов.
Неожиданно, раковые клетки, обработанные цисплатином, паклитакселем, гемцитабином, Mycobacterium w или их комбинацией, имеют измененный белковый профиль. Более того, неожиданно обнаружено, что белковые профили из обработанных клеток имеют по меньшей мере один общий белок (экспрессированный или сверхэкспрессированный во всех клетках), независимо от использованного для обработки агента, например Mycobacterium w, цисплатина, паклитакселя, гемцитабина. Это наблюдение удивительно своей независимостью от того факта, что активности всех этих агентов различны. Обнаружено, что этот белок экспрессируется отлично от других белков после указанных выше обработок в соответствии с настоящим изобретением.
Установлено, что широко экспрессируемый белок в соответствии с настоящим изобретением является иммуногенным и индуцирует иммунную реакцию, воздействующую на раковые клетки, из которых он получен (гомологичные), а также на раковые клетки из той же ткани (того же органа), но имеющие иные клеточные характеристики (гетерогенные).
В соответствии с настоящим изобретением обработка линии клеток рака поджелудочной железы любым из указанных выше агентов приводит к экспрессии белка, который вызывает иммунную реакцию на те же самые (гомологичные) клетки, а также на отличающиеся (гетерогенные) клетки, притом, что они происходят из той же самой ткани (того же самого органа). Например, белок, экспрессируемый после обработки клеточной линии Mia-pa-ca-2, будет индуцировать иммунную реакцию на клетки Mia-pa-ca-2 (гомологичные), а также на клетки Panc-1, AsPc-1, SW 1990 и т.д. (гетерогенные). Иммунная реакция по природе может быть как клеточной, так и гуморальной.
Вызванная таким способом иммунная реакция способна обеспечить как профилактическое, так и терапевтическое действие на рак поджелудочной железы.
Вызванный с помощью линии клеток рака поджелудочной железы иммунный ответ не может вызывать иммунный ответ на другие типы рака.
Установлено, что введение белка/белков млекопитающим безопасно.
Краткое описание фигур
На Фиг. 1 продемонстрирована индукция клеточно-опосредованной иммунной реакции широко экспрессированным (сверхэкспрессированным) раковым антигеном.
На Фиг. 2 продемонстрирована индукция гуморальной иммунной реакции широко экспрессированным (сверхэкспрессированным) раковым антигеном. Схема нанесения представляет собой следующую:
Полоса 1: Предварительно окрашенный маркер молекулярной массы;
Полоса 2: Сыворотка мышей, иммунизированных обработанными клетками Mia-ра-са-2, экспрессирующими белок 45 кДа, в качестве первичных антител;
Полоса 3: Сыворотка нормальных мышей в качестве первичных антител.
На Фиг. 3 показано сравнение групп без введения и с введением вакцины.
На Фиг. 4 показана иммунная реакция, вызванная широко экспрессированным (сверхэкспрессированным) белком, являющаяся специфичной для раковой ткани (ракового органа), из которого он происходит.
Схема нанесения на гель-1
полоса 1: пустой контроль
полоса 2: лизат клеток Mia-pa-ca-2
полоса 3: лизат клеток SW-1990
полоса 4: лизат клеток SAsPC-1
полоса 5: лизат клеток HEK 293
Схема нанесения на гель-2
полоса 1: лизат клеток РС-3 (рак простаты)
полоса 2: лизат клеток MCF-7 (рак молочной железы)
полоса 3: лизат клеток А549 (рак легких)
полоса 4: лизат клеток РА-1 (рак яичников)
полоса 5: лизат клеток А375 (меланома)
полоса 6: неокрашенный маркер белка
Подробное описание изобретения
Установлено, что если раковые клетки обработать Mycobacterium w (Mw), происходит изменение белкового профиля раковых клеток. Изменение белкового профиля сопровождается появлением насыщенной линии одного белка при анализе электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).
Неожиданно обнаружили, что этот же белок экспрессируется, когда клетки обрабатывают цисплатином, паклитакселем, гемцитабином. Белок, который так экспрессируется, определен как широко экспрессируемый (сверхэкспрессируемый) белок.
Экспрессируемый таким образом белок может быть выделен с помощью известных методов, как описано John Е. Coligan et al. в Current Protocols in Protein Science.
Неожиданно обнаружили, что этот белок генерирует иммунную реакцию на гомологичные и на гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа, из которых он происходит. При введении млекопитающим этот белок не вызывает иммунной реакции на нормальные клетки/ткани.
Неожиданно обнаружили также, что обработка раковых клеток такими соединениями, как цисплатин, паклитаксель, гемцитабин, также приводит к экспрессии белка, который экспрессируется, если клетки обрабатывают Mycobacterium w.
Таким образом, согласно настоящему изобретению, белок (белки), который (которые) широко экспрессируются/сверхэкспрессируются при обработке клеток Mw, цисплатином, паклитакселем и гемцитабином или их комбинацией, вызывают иммунную реакцию на гомологичные и на гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа, из которых он (они) происходят.
Широко экспрессированный/сверхэкспрессированный белок, индуцирующий иммунную реакцию, выделяют из раковых клеток. Для целей настоящего изобретения нет необходимости обрабатывать раковые клетки различными агентами, чтобы вызвать их гибель. Для выделения широко экспрессированного белка нет необходимости в том, чтобы клетки были живыми.
Общий белок настоящего изобретения индуцирует также иммунную реакцию, специфичную по отношению к гетерогенным раковым клеткам, специфичным к ткани/органу.
Введение общего белка в соответствии с настоящим изобретением индуцирует клеточную иммунную реакцию. Общепринятые методы, разработанные для измерения клеточной иммунной реакции, представляют собой FACS (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции), ELISPOT (иммуноферментный спот-анализ), определение эффекторной функции и др.
Введение общего белка в соответствии с настоящим изобретением индуцирует гуморальную иммунную реакцию. Общепринятые методы, разработанные для этой цели, представляют собой FACS, вестерн-блот, ELISA (ИФА) и др.
Эффективность ракового антигена определяется по его способности индуцировать иммунную реакцию на гомологичные, а также гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа, из которых он происходит.
Эффективность раковой вакцины в индукции иммунной реакции изучали путем определения опосредованной клетками иммунной реакции как меры увеличения числа клеток, продуцирующих интерферон-гамма в ответ на антиген, измеряемого методом ELISPOT.
Эффективность раковой вакцины в индукции иммунной реакции изучали путем определения гуморальной иммунной реакции по присутствии специфических антител, реагирующих на антиген, в сыворотках мышей, иммунизированных клетками, экспрессирующими/сверхэкспрессирующими антиген, и мышей, иммунизированных только одним антигеном.
Подобным же образом определяли индуцированную иммунную реакцию на гетерогенные раковые клетки, специфичные для ткани/органа. Гетерогенную реакцию оценивали для клеточной реакции с помощью определения интерферона-гамма методом ELISPOT, а для гуморальной реакции методом вестерн-блотирования.
Клеточные линии для целей настоящего изобретения могут быть получены из разных хранилищ, подобных Американской коллекции типовых культур (США) (American Type Culture Collection); Клеточному банку Австралии (Cell bank Australia); Хранилищу клеточных культур Coriell, Нью-Джерси, США (Coriell Cell Repositories, New Jersey, USA); Европейской коллекции клеточных культур (Великобритания) (European Collection of Cell Cultures, ЕСАСС); Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Германия) (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures); Японской коллекции исследовательских биоресурсов (Япония) (Japanese Collection of Research Bioresources, JCRB); Корейскому клеточному банку (Korean Cell bank, Korea); Центру биоресурсов RIKEN (Япония) (RIKEN Biresource Centre, Japan); Центру ресурсов генетики человека (США) (Human Genetics Resource Center, USA); Национальному центру клеточных наук (Индия) (National Centre for Cell Science, India); Региональным центрам ресурсов мутантных мышей (США) (MMRRC: Mutant Mouse Regional Resource Centers (USA); Национальному хранилищу человеческих нейрональных стволовых клеток (США) (National Human Neural Stem Cell Resource, USA); Банку стволовых клеток Великобритании (UK Stem Cell Bank) и NCCS (India).
7
Методы сбора раковых клеток и их сохранения или размножения хорошо известны. Эти методы можно использовать как для аутологичных, так и для аллогенных клеток. Эти или новые клеточные линии или специфические раковые клетки могут быть выделены, как описано Eton О. et al. (Clinical cancer research, March 1998, Vol. 4, 619-627). Свежие опухоли получали во время хирургической операции из лаборатории замороженных срезов и фрагментировали разрезанием на слои. Для получения максимального выхода жизнеспособных опухолевых клеток для приготовления вакцины массу опухоли разъединяли с помощью коллагеназы 1-го типа (2 мг/мл) и ДНКазы IV типа (0,4 мг/мл), Sigma chemical Co., St Loius, МО; ссылка 25. Эти ферменты могут изменять иммуногенность получаемого клеточного препарата. Диссоциированные клетки промывали HBSS и гентамицином, ресуспендировали в равных объемах HBSS и охлажденной смеси 10% ДМСО + 4% человеческого сывороточного альбумина. Аликвоты, содержащие 1,5-2×10 жизнеспособных опухолевых клеток, хранили под жидким азотом.
Далее описан процесс получения широко экспрессируемого белка согласно настоящему изобретению.
1. Раковые клетки суспендируют в подходящей среде для культивирования клеток, такой как DMEM, ЕМЕМ, Hanks F12 и др.
2. К клеткам добавляют любой из следующих агентов, таких как цисплатин, паклитаксель, гемцитабин и Mycobacterium w.
3. Известно, что все эти агенты убивают раковые клетки, однако для целей настоящего изобретения для получения широко экспрессируемого белка нет необходимости убивать раковые клетки обработкой любым или всеми из этих агентов. Подобным же образом убивание клеток не приводит к утрате раковыми клетками свойства экспрессировать общий целевой белок и не изменяет его иммунных характеристик.
4. Нижеследующая таблица показывает предпочтительные количества различных подлежащих использованию агентов.
5. Клетки отбирают после указанной выше обработки.
6. Белковый профиль собранных клеток определяют с помощью известных методов, таких как электрофорез, ВЭЖХ и т.д.
7. Экспрессируемый широко белок идентифицируют путем наложения белковых профилей, полученных после обработки с использованием различных агентов, как указано выше.
8. Идентифицированный белок может быть получен в масштабированных количествах с помощью методов очистки белков.
Полученные, как описано выше, раковые клетки обрабатывали клетками Mw в соотношении от 1:10 до 1:1000, предпочтительно в отношении 1:100. Обработку проводили в подходящей среде, предпочтительно в поддерживающей рост среде без сыворотки. Обработку проводили при температурах в диапазоне от 20°C до 40°C, предпочтительно при 37°С. Обработанные клетки лизировали одним из известных в данной области методов, для получения протеомного профиля применяли электрофорез SDS-PAGE. Полученный таким образом профиль сравнивали с белковым профилем необработанных клеток. Отмечали расположение линии отличающимся образом экспрессированного белка.
Раковые клетки обрабатывали цисплатином при концентрации в диапазоне от 0,1 мкг/мл до 100 мкг/мл, предпочтительно при 5 мкг/мл. Обработку проводили в подходящей среде, предпочтительно в поддерживающей рост среде без сыворотки. Обработку проводили при температурах в диапазоне от 20°C до 40°C, предпочтительно при 37°C. Обработанные клетки лизировали одним из известных в данной области методов, для получения протеомного профиля применяли электрофорез SDS-PAGE. Полученный таким образом профиль сравнивали с белковым профилем необработанных клеток. Отмечали расположение линий отличающимся образом экспрессированных белков.
Раковые клетки обрабатывали паклитакселем при концентрации в диапазоне от 5 мкг/мл до 500 мкг/мл, предпочтительно при 5 мкг/мл. Обработку проводили в подходящей среде, предпочтительно в поддерживающей рост среде без сыворотки. Обработку проводили при температурах в диапазоне от 20°C до 40°C, предпочтительно при 37°C. Обработанные клетки лизировали одним из известных в данной области методов, для получения протеомного профиля применяли электрофорез SDS-PAGE. Полученный таким образом профиль сравнивали с белковым профилем необработанных клеток. Отмечали расположение линий отличающимся образом экспрессированных белков.
Раковые клетки обрабатывали гемцитабином при концентрации в диапазоне от 10 нМ до 1000 нМ, предпочтительно при 800 нМ. Обработку проводили в подходящей среде, предпочтительно в поддерживающей рост среде без сыворотки. Обработку проводили при температурах в диапазоне от 20°C до 40°C, предпочтительно при 37°C. Обработанные клетки лизировали одним из известных в данной области методов, для получения протеомного профиля применяли электрофорез SDS-PAGE. Полученный таким образом профиль сравнивали с белковым профилем необработанных клеток. Отмечали расположение линий отличающимся образом экспрессированных белков.
Измененные белковые профили, полученные для каждого из указанных выше режимов обработки, сопоставляли друг с другом. В раковых клетках Mia-pa-са-2 был отмечен (были отмечены) (идентифицированы) широко экспрессированный белок (экспрессированные белки) с молекулярной массой в диапазоне 40-50 кДа.
Обработанные и необработанные раковые клетки ресуспендировали в PBS с рН от 6,5 до 7,5. Клетки обрабатывали ультразвуком (УЗ) в течение 500-1500 с в режиме: 5-15 с озвучивание, 5-15 с перерыв, предпочтительно обрабатывали УЗ в течение 900 с в режиме: 9 с обработка, 10 с перерыв. В лизате определяли общий белок методом Lowry. Рассчитывали общее содержание белка и в каждую ячейку геля наносили 20 мкг белка. Для выделения белка применяли электрофорез в 5-20% полиакриламидном геле, предпочтительно в 10% полиакриламидном геле с поверхностно-активным веществом, таким как SDS, но не ограничиваясь им. Электрофорез проводили при постоянном напряжении 100-300 В, предпочтительно при 200 В, в течение 30-90 мин, предпочтительно 60 мин. Гель окрашивали красящим раствором кумасси синего R250 в течение 15-60 мин и отмывали от красителя отмывающим раствором (40% метанола + 10% уксусной кислоты + 50% воды) до обесцвечивания фона и проявления линий в геле. Белковые профили сопоставляли линия за линией и отмечали общий экспрессированный (сверхэкспрессированный) белок в ответ на обработку Mw, цисплатином, паклитакселем и гемцитабином.
После идентификации содержащий интересующую линию гель разрезали на кусочки, элюировали элюирующим буфером (20 мМ трис-Cl, рН 7,7, 150 мМ NaCl, 0,2% SDS, 2 мМ EDTA) и помещали во встряхивающий аппарат для взбалтывания при комнатной температуре в течение как минимум 6-8 ч или в течение ночи. Собирали надосадочную жидкость, для осаждения белка добавляли ледяной ацетон (в соотношении белок : ацетон = 1:4) и выдерживали для осаждения при -20°C в течение 1-2 ч. Осадок отделяли центрифугированием при 15000 g в течение 45 мин при 4°C, промывали ацетоном (соотношение ацетон : вода = 4:1) и ресуспендировали в нужном объеме PBS. Общий белок определяли методом Лоури (Lowry), его специфичность анализировали с помощью полученной авторами мышиной сыворотки, содержащей антитела к интересующему белку. Для идентификации этого особенным образом экспрессированного белка проводили двумерный электрофорез в геле. Белок обнаруживался в геле в виде большого пятна в месте, соответствующем молекулярной массе 45 кДа при сравнении с положением стандартного маркера молекулярной массы белка, подвергнутого электрофорезу в том же геле.
Экспрессированный широко белок вводили инъекцией мышам. У мышей возникала специфическая иммунная реакция по отношению к раковым клеткам. Гуморальную иммунную реакцию измеряли путем детектирования антител, специфичных к широко экспрессированному/сверхэкспресированному белку. Анализ проводили с помощью стандартных приемов для вестерн-блотирования, дот-блотирования и ИФА.
Опосредованную клетками иммунную реакцию (cell mediated immune response = CMI) измеряли путем определения числа клеток, продуцирующих интерферон-гамма и/или гранзим (granzyme), и/или процента убивания клеток-мишеней (раковых клеток).
Приготовленная в соответствии с настоящим изобретением вакцина при введении животным с опухолями (мышам, млекопитающим) приводит к регрессии опухолей, если вакцина и опухоль происходят из той же самой ткани, например, вакцина с белком из меланомы для меланомы.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение, но никоим образом не ограничивают область охвата изобретения.
Пример 1: Метод идентификации широко экспрессируемых белков
1. Рак поджелудочной железы
Клетки Mia-pa-ca-2 обрабатывали клетками Mw при соотношении Mw к клеткам 1:500, цисплатином при 5 мкг/мл, паклитакселем при 150 мкг/мл и гемцитабином при 800 нМ. Обработку проводили в среде без сыворотки при 37°C. Клетки лизировали, для получения протеомного профиля проводили электрофорез SDS-PAGE. Проводили наложение полученных таким образом профилей на белковый профиль необработанных клеток. Наблюдали белковый профиль для каждой обработки. Особым образом экспрессированный белок был идентифицирован в положении, соответствующем 45 кДа.
Белок 45 кДа представляет собой широко сверхэкспрессируемый белок, если клетки рака поджелудочной железы обработаны Mw, цисплатином, паклитакселем, гемцитабином или их комбинацией.
2. Меланома (рак кожи)
Клетки меланомы В16 обрабатывали цисплатином при 5 мкг/мл, паклитакселем при 150 мкг/мл и гемцитабином при 800 нМ. Обработку проводили в среде без сыворотки при 37°C. Клетки лизировали, для получения протеомного профиля проводили электрофорез SDS-PAGE. Проводили наложение полученных таким образом профилей на белковый профиль необработанных клеток. Наблюдали белковый профиль для каждой обработки. Особым образом экспрессированный белок был идентифицирован в положении, соответствующем 36 кДа.
Белок 36 кДа представляет собой широко сверхэкспрессируемый белок, если клетки меланомы обработаны Mw, цисплатином, паклитакселем, гемцитабином или их комбинацией.
3. Рак легких
6
Различные линии клеток рака легких (А549 и L132) обрабатывали Mw при соотношении Mw к клеткам 1:100. Каждая обрабатываемая группа содержала 4×10 клеток. Обработанные Mw клетки инкубировали 4 ч при 37°C. После обработки клетки осаждали центрифугированием, надосадочную жидкость отбрасывали. Затем клетки ресуспендировали в DPBS (400 мкл) и обрабатывали УЗ в течение 15 мин (импульсы по 10 с и перерывы 20 с). В полученном лизате определяли количество белка биуретовым методом (ВСА Protein assay). Количество белка нормировали таким образом, чтобы наносить 30 мкг белка в каждую ячейку. После этого для определения белкового профиля проводили электрофорез SDS-PAGE в восстанавливающих условиях в 12% геле, гуморальную реакцию определяли вестерн-блотированием. Полученный профиль сопоставляли с белковым профилем необработанных клеток. У обеих линий клеток обнаружен общий белок с молекулярной массой 43 кДа.
4. Меланома кожи
6
Различные линии раковых клеток меланомы кожи (А375, B16F1 и B16F10) были обработаны Mw при соотношении Mw к клеткам 1:100. Каждая обрабатываемая группа содержала 4×10 клеток. Обработанные Mw клетки инкубировали 4 ч при 37°C. После обработки клетки осаждали центрифугированием, надосадочную жидкость отбрасывали. Затем клетки ресуспендировали в DPBS (400 мкл) и обрабатывали УЗ в течение 15 мин (импульсы по 10 с и перерывы 20 с). В полученном лизате определяли количество белка методом ВСА Protein assay. Количество белка нормировали таким образом, чтобы наносить 30 мкг белка в каждую ячейку. После этого для определения белкового профиля проводили электрофорез SDS-PAGE в восстанавливающих условиях в 12% геле, гуморальную реакцию определяли вестерн-блотированием. Полученный профиль сопоставляли с белковым профилем необработанных клеток.
В гелях были обнаружены 2 белка с молекулярной массой 36 кДа и 170 кДа. Интересно, что при блотировании с антителами, полученными с помощью обработанных клеток В16, оба белка проявляли перекрестную реактивность по отношению к А375, B16F1 и B16F10, если же антитела были получены с помощью обработанных клеток А375, реакционно-способным был только белок 36 кДа.
5. Рак толстой кишки
6
Различные линии клеток рака толстой кишки (НСТ15 и Colo205) были обработаны Mw при соотношении Mw к клеткам 1:100. Каждая обрабатываемая группа содержала 4×10 клеток. Обработанные Mw клетки инкубировали 4 ч при 37°C. После обработки клетки осаждали центрифугированием, надосадочную жидкость отбрасывали. Затем клетки ресуспендировали в DPBS (400 мкл) и обрабатывали УЗ в течение 15 мин (импульсы по 10 с и перерывы 20 с). В полученном лизате определяли количество белка методом ВСА Protein assay. Количество белка нормировали таким образом, чтобы наносить 30 мкг белка в каждую ячейку. После этого для определения белкового профиля проводили электрофорез SDS-PAGE в восстанавливающих условиях в 12% геле, гуморальную реакцию определяли вестерн-блотированием. Полученный профиль сопоставляли с белковым профилем необработанных клеток. В обеих линиях клеток был обнаружен общий белок с молекулярной массой в диапазоне между 10-15 кДа и 26 кДа.
Пример 2: Способ выделения широко экспрессированного (сверхэкспрессированного) белка (ракового антигена)
Собирали осадок клеток Mia-pa-ca-2 и промывали стерильным DPBS с центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин. Клетки были обработаны так, как описано в пунктах 1 и 2. Осадок обработанных клеток ресуспендировали в DPBS и обрабатывали УЗ в течение 15 мин. Общее содержание белка в лизате определяли методом Фолина-Лоури. В каждую ячейку 10% геля наносили 20 мкг лизата и проводили электрофорез SDS-PAGE в течение 45 мин при 200 В. Гель окрашивали красителем Coomassie Brilliant Blue R250. Была обнаружена белковая линия 45 кДа при сравнении с белковым маркером молекулярной массы. Кусок геля с линией был вырезан, измельчен и инкубирован в лизирующем буфере (20 мМ трис-HCl рН 7,7, 150 мМ NaCl, 0,2% SDS, 2 мМ EDTA) со встряхиванием при комнатной температуре в течение ночи. Белок элюировали из геля центрифугированием лизата при 15000 g в течение 45 мин при 4°C. Надосадочную жидкость смешивали с ледяным ацетоном в отношении 1:4 и инкубировали при -20°C в течение приблизительно 1 ч. Полученный осадок отделяли цетрифугированием при 15000 g в течение 45 мин при 4°C. Осадок промывали смесью ацетон:вода 3:2 и центрифугировали при 15000 g в течение 45 мин при 4°С.Полученный осадок ресуспендировали в DPBS, содержащие белка определяли методом Фолина-Лоури. Был получен белок со степенью чистоты около 90%.
Пример 3: Фармацевтический препарат
Фармацевтический препарат с широко экспрессированным белком для рака поджелудочной железы и рака меланомы готовили, как указано ниже.
1. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 10 мкг
фосфатный буфер
50 мМ
NaCl
150 мМ
наполнитель
достаточное количество
2. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 50 мкг
фосфатный буфер
50 мМ
NaCl
150 мМ
наполнитель
достаточное количество
3. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 100 мкг
фосфатный буфер
50 мМ
NaCl
150 мМ
наполнитель
достаточное количество
4. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 10 мкг
ацетатный буфер
50 мM
NaCl
150мМ
наполнитель
достаточное количество
5. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 50 мкг
ацетатный буфер
50 мM
NaCl
150 мМ
наполнитель
достаточное количество
6. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 100 мкг
ацетатный буфер
50 мM
NaCl
150 мМ
наполнитель
достаточное количество
7. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 100 мкг
фосфатный буфер
10 мМ
NaCl
300 мМ
наполнитель
достаточное количество
8. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 1 мкг
фосфатный буфер
10 мМ
NaCl
300 мМ
наполнитель
достаточное количество
9. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 10 мкг
фосфатный буфер
50 мМ
NaCl
150 мМ
наполнитель
достаточное количество
10. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 100 мкг
фосфатный буфер
50 мМ
NaCl
150 мМ
наполнитель
достаточное количество
11. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 500 мкг
фосфатный буфер
50 мМ
NaCl
150 мМ
наполнитель
достаточное количество
12. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 1 мкг
ацетатный буфер
50 mM
NaCl
150 мМ
наполнитель
достаточное количество
13. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 500 мкг
ацетатный буфер
50 mM
NaCl
150 мМ
наполнитель
достаточное количество
14. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 50 мкг
фосфатный буфер
10 мМ
NaCl
300 мМ
наполнитель
достаточное количество
15. Белок 45 кДа из клеток рака поджелудочной железы - 500 мкг
трис-буфер
50 мМ
наполнитель
достаточное количество
16. Белок 36 кДа из раковых клеток меланомы - 500 мкг
трис-буфер
50 мМ
наполнитель
достаточное количество
Указанная выше рецептура применяется как таковая или в комбинации по усмотрению с адъювантом для получения необходимой иммунной реакции при подходящем способе введения.
Пример 4: Индукция клеточной иммунной реакции широко экспрессированным (сверхэкспрессированным) раковым антигеном: Иммуногенность ракового антигена
7
Иммунологическую реакцию в ответ на широко экспрессированный (сверхэкспрессированный) белок 45 кДа оценивали, иммунизируя мышей внутрикожно в дни 0 и 21 рецептурой 1 из примера 3 (10 мкг белка 45 кДа). Контрольным мышам вводили PBS. Для определения количества клеток, продуцирующих интерферон-гамма, методом ELISPOT на 28-й день исследования готовили суспензии спленоцитов (10 клеток в 1 мл) из индивидуальных мышей. Определение методом ELISPOT выполняли на спленоцитах мышей как в контрольной, так и в тестовой группе.
Регистрацию изображений на планшете проводили с помощью сканера CTL Spot Reader. Сигналы от каждой ячейки регистрировались автоматически. Количественные значения определяли на основе параметров чувствительности и фона, проводился анализ результатов. Как показано на фиг. 1, было обнаружено двукратное увеличение высвобождения интерферона-гамма в ответ на иммунизацию белком 45 кДа.
Пример 5: Индукция гуморальной иммунной реакции широко экспрессированным (сверхэкспрессированным) раковым антигеном: Иммуногенность ракового антигена
a. Оценивали создание гуморального иммунитета в ответ на раковый антиген. Мыши были случайным образом распределены (рандомизированы) по двум группам. Первую группу мышей в дни 0 и 21 иммунизировали внутрикожно рецептурой 15 из примера 3, а вторую группу, т.е. контрольную группу, иммунизировали PBS. У всех мышей на 28-й день исследования отбирали пробы сыворотки для определения появления антител к вакцине. Был проведен вестерн-блот анализ лизатов Mia-pa-ca-2 с сыворотками мышей, иммунизированных обработанными клетками Mia-pa-ca-2, экспрессирующими белок 45 кДа, и иммунизированных PBS (контроль). Для определения первичных антител, связавшихся с белком лизата, были использованы конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антитела к мышиному IgG с DAB (диамино-бензидин) в качестве окрашивающего агента. Вестерн-блот анализ показал, что иммунизация раковой вакциной Mia-pa-ca-2 вызывает образование антител к раковому антигену (фиг. 2).
b. Для создания высоких титров антител у кроликов антиген рака меланомы в рецептуре 10 из примера 3 (белок 36 кДа) вводили в дни 0, 7 и 14 совместно с адъювантом Фрейнда. На 21-й день у кроликов была взята кровь, и титры антител измеряли с помощью «dot blot» анализа, помещая антиген на нитроцеллюлозную мембрану и используя в качестве первичных антител сыворотки иммунизированных кроликов. Пятна проявляли конъюгатом вторичных антител с пероксидазой хрена. Было установлено, что титр антител к антимеланомному антигену был более 10000.
c. Для образования антител к антигену рака поджелудочной железы кроликов иммунизировали рецептурой 8 из примера 3 с антигеном рака поджелудочной железы (белок ~45 кДа) с полным адъювантом Фрейнда, а на 15-й день с неполным адъювантом Фрейнда. На 30-й день у кроликов была взята кровь, и титры антител измеряли с помощью «dot blot» анализа, помещая антиген на нитроцеллюлозную мембрану и используя в качестве первичных антител сыворотки иммунизированных кроликов. Пятна проявляли конъюгатом вторичных антител с пероксидазой хрена. Было установлено, что титр антител к антигену рака поджелудочной железы был более 50000.
Пример 6: Убивание in vitro гетерогенных и гомогенных раковых клеток спленоцитами иммунизированных мышей: анализ эффекторной функции
А. Иммунная реакция на гомологичные раковые клетки
В исследовании использовали 20 мышей-самцов линии Balb/C в возрасте 6-8 недель. Животные были рандомизированы по массе тела и распределены в 2 группы по 10 животных в каждой. Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 21 внутрикожно рецептурой 7 с раковым антигеном в дозе 100 мкг/мышь (широко экспрессированный белок 45 кДа, выделенный из клеток Mia-pa-ca-2, как описано в примере 1), а вторую группу (контроль) иммунизировали PBS.
2
Спленоциты из иммунизированных животных распределяли в полипропиленовые пробирки, содержащие клетки-мишени Mia-pa-ca-2. Добавляли спленоцитные эффекторы с соблюдением отношения эффектора к мишени 5:1 и 1:1. Пробирки инкубировали при 37°C в атмосфере 6% CO в течение 4 ч. Через 4 ч клетки осаждали центрифугированием при 300 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок фиксировали 1% (масса к объему) раствором пара-формальдегида и дважды промывали DPBS с центрифугированием. Добавляли 70% этанол, клетки оставляли на льду на 30 мин. Клетки хранили для последующего анализа при -20°C.
Цитолитическую активность Т-клеток оценивали, определяя гибель клеток-мишеней эффекторными клетками с помощью протокола BD АРО BrdU Kit. Набор APO-BrdU kit - это метод двойного окрашивания разрывов ДНК и общей клеточной ДНК для детектирования апоптозных клеток методом проточной цитометрии. Клетки из иммунизированных раковым антигеном (широко экспрессируемый белок 45 кДа) при отношении эффектора к мишени 5:1 гораздо активнее лизировали гомологичные клетки-мишени (раковые клетки Mia-pa-ca-2) по сравнению с клетками контрольной группы.
В. Иммунная реакция на гетерогенные (гетерологичные) раковые клетки
В исследовании использовали 20 мышей-самцов линии Balb/C в возрасте 6-8 недель. Животные были рандомизированы по массе тела и распределены в 2 группы по 10 животных в каждой. Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 21 внутрикожно рецептурой 5 из примера 3 в дозе 50 мкг/мышь (широко экспрессированный белок 45 кДа, выделенный из клеток Mia-pa-ca-2, как описано в примере 1), а вторую группу (контроль) иммунизировали PBS.
2
Спленоциты иммунизированных животных из соответствующих групп помещали в полипропиленовые пробирки, содержащие клетки-мишени Panc-1, AsPC-1 или SW1990. Добавляли спленоцитные эффекторы с соблюдением отношения эффектора к мишени 5:1 и 1:1. Пробирки инкубировали при 37°C в атмосфере 6% CO в течение 4 ч. Через 4 ч. клетки осаждали центрифугированием при 300 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок фиксировали 1% (масса к объему) раствором пара-формальдегида и дважды промывали DPBS с центрифугированием. Добавляли 70% этанол, клетки оставляли на льду на 30 мин. Клетки хранили для последующего анализа при -20°C.
Цитолитическую активность Т-клеток оценивали, определяя гибель клеток-мишеней под действием эффекторных клеток с помощью протокола BD АРО BrdU Kit. Набор APO-BrdU kit представляет собой метод двойного окрашивания разрывов ДНК и общей клеточной ДНК для детектирования апоптозных клеток методом проточной цитометрии. Клетки из иммунизированных раковым антигеном (широко экспрессированный белок 45 кДа) при отношении эффектора к мишени 5:1 гораздо активнее лизировали гетерогенные клетки-мишени рака поджелудочной железы (Panc-1, AsPC-1 или SW1990) по сравнению с клетками контрольной группы.
Пример 7: Регрессия опухолей in vivo в функциональном анализе мышей
5
3
1. В исследовании использовали 30 мышей-самцов линии Balb/C в возрасте 6-8 недель. Животные были рандомизированы по массе тела. Индукцию опухолей у мышей производили подкожной инъекцией в заднюю лапу 1×10 клеток B16-F1. После развития у мышей опухолей со средним размером ~100-150 мм их распределяли случайным образом по размеру опухолей в 2 группы по 10 животных в каждой. Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 10 после рандомизации внутрикожно рецептурой меланомной вакцины 13 из примера 3 в дозе 500 мкг/мышь (широко экспрессированный белок 36 кДа), а вторую группу мышей (контроль) не иммунизировали. Дважды в неделю регистрировали рост опухолей, пока опухоль не достигала 10% от массы тела животного.
Сравнение с контрольной группой (фиг. 3) показывает, что объем опухолей в опытной группе не увеличивался. В действительности в опытной группе зарегистрировано уменьшение размера опухолей, что указывает на ослабление болезненного статуса. Вообще в опытной группе увеличилась выживаемость и уменьшился размер опухолей.
5
3
2. В исследовании использовали 20 мышей-самцов линии С57 в возрасте 6-8 недель. Животные были рандомизированы по массе тела. Индукцию опухолей у мышей производили подкожной инъекцией в заднюю лапу 1×10 клеток Pan 02 (линия клеток рака поджелудочной железы). После развития у мышей опухолей со средним размером ~200 мм их распределяли случайным образом по размеру опухолей в 2 группы по 10 животных в каждой. Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 10 после рандомизации рецептурой вакцины рака поджелудочной железы 4 из примера 3 (общий экспрессированный белок 45 кДа) в дозе 10 мкг/мышь, контрольную группу не иммунизировали. Дважды в неделю регистрировали рост опухолей, пока опухоль не достигала 10% от массы тела животного.
По сравнению с контрольной группой объем опухолей в опытной группе не увеличивался. Вообще в опытной группе увеличилась выживаемость и уменьшился размер опухолей. В опытной группе обнаружена задержка в увеличении массы опухолей по сравнению с животными в контрольной группе.
5
3. В этом исследовании использовали 10 мышей-самцов линии С57 в возрасте 6-8 недель. Животные были рандомизированы по массе тела. Первую группу мышей иммунизировали в дни 0 и 10 после рандомизации внутрикожно рецептурой 15 из примера 3 вакцины рака поджелудочной железы (широко экспрессированный белок 45 кДа) в дозе 500 мкг/мышь, а вторую группу (контроль) не иммунизировали. На 10-й день после 1-й инъекции раковой панкреатической вакцины производили у мышей индукцию опухолей подкожной инъекцией в заднюю лапу 1×10 клеток Pan 02 (линия клеток рака поджелудочной железы). Дважды в неделю регистрировали рост опухолей, пока опухоль не достигала 10% от массы тела животного.
По сравнению с контрольной группой объем опухолей в опытной группе не увеличивался. Вообще в опытной группе увеличилась выживаемость. В опытной группе зарегистрирована задержка в развитии опухолей по сравнению с контрольной группой.
Пример 8: Иммунная реакция, создаваемая широко экспрессированным (сверхэкспрессированным) белком специфична по отношению к раковой ткани (органу), из которых он происходит
Мышей в дни 0 и 21 иммунизировали внутрикожно рецептурой ракового антигена 5 из примера 3 (общий экспрессированный белок 45 кДа) в дозе 50 мкг/мышь. На 28-й день исследования у мышей отбирали пробы сывороток. В лизатах клеток Mia-pa-ca-2, AsPC-1, SW-1990 и рака различного происхождения, как HEK-293 (почки), РС-3 (простата), MCF-7 (молочная железа), А549 (легкие), РА-1 (яичники) проводили вестерн-блотирование с первичными антителами, полученными у мышей к терапевтической раковой вакцине. Для определения связывания первичных антител с антигеном (антигенами) лизата использовали конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антитела к мышиному IgG с DAB в качестве окрашивающего/детектирующего агента. Результаты вестерн-блотирования показывают (фиг. 4), что антитела, образовавшиеся вследствие иммунизации широко экспрессированным белком 45 кДа, имеют гетерогенную реактивность по отношению к лизатам раковых клеток, происходящих из поджелудочной железы (гетерогенных), но не реагируют с лизатами раковых клеток, происходящих из другой ткани (другого органа). На фиг. 4 полосы с 2 по 4 на Геле 1 - для лизатов раковых клеток из различных тканей (органов), показывающие реакционную способность сывороток мышей, иммунизированных раковым антигеном (широко экспрессированным белком 45 кДа), что указывает на гетерогенную реакционную способность по отношению к раковым клеткам, происходящим из данной ткани (данного органа). В то же время полосы с 1 по 5 на Геле 2 показывают отсутствие реакционной способности по отношению к раковым клеткам, происходящим из другой ткани (другого органа), - а именно простаты, молочной железы, легких, яичников и кожи, что иллюстрирует безопасность вакцины, содержащей раковый антиген (широко экспрессированный белок).
Резюме
Настоящее изобретение непредсказуемо обнаружило, что раковые клетки, обработанные цисплатином, паклитакселем, гемцитабином, Mycobacterium w или их комбинацией, имеют измененный белковый профиль. Более того, установлено, что белковые профили обработанных клеток имеют по меньшей мере один белок, общий (широко экспрессированный/сверхэкспрессированный), независимо от того, какой агент был использован для обработки, например, Mycobacterium w, цисплатин, паклитаксель, гемцитабин. Белок (широко экспрессированный/сверхэкспрессированный) отличается от белков раковых клеток, происходящих из различных органов (различных тканей).
Установлено, что широко экспрессированный белок, введенный в рецептуру в количестве более 1 мкг, является иммуногенным и индуцирует иммунную реакцию на раковые клетки, из которых он происходит (гомологичные), а также на раковые клетки той же самой ткани (того же самого органа), но с отличными клеточными характеристиками (гетерогенные), как описано в примере выше. Иммунная реакция, вызванная при использовании линии клеток рака поджелудочной железы, не инициирует иммунный ответ на другие типы рака. Установлено, что введение белка (белков) безопасно для млекопитающих. Для дополнительного усиления иммунной реакции эти белки по усмотрению можно перед введением млекопитающему комбинировать с адъювантом.
Вызванная таким образом иммунная реакция способна обеспечить как профилактическое, так и терапевтическое воздействие на рак поджелудочной железы.