СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕННОГО ГИСТОПЛАЗМОЗНОГО И КОКЦИДИОИДОМИКОЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА
METHOD OF PRODUCING ERYTHROCYTIC DIAGNOSTIC HISTOPLASMOSIS AND COCCIDIODOMYCOSIS ANTIGEN

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к производству диагностикумов, используемых для выявления антител к возбудителям гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза в реакции непрямой гемагглютинации.
Для определения антител к возбудителям особо опасных микозов известны диагностикумы, приготовленные с применением бараньих эритроцитов, обработанных танином [1, 4], с последующей конъюгацией их с полисахаридным антигенным комплексом, выделенным из клеток микромицетов бета-нафтольным методом [2].
1. Наиболее близким аналогом является препарат, описанный в статье Липницкого А.В. с соавт. [1] (прототип).
Однако известные препараты отличает относительно низкая стабильность, недостаточная воспроизводимость способа приготовления диагностикума, а также трудоемкость и длительность процесса выделения антигенов из клеточной массы грибов - возбудителей особо опасных микозов [2].
На сегодняшний день остается актуальным создание высокочувствительных эритроцитарных диагностикумов, пригодных для применения в условиях чрезвычайных ситуаций.
Цель изобретения - выделение антигенного комплекса, не требующего дополнительных этапов очистки, общего для возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза, и создание на его основе антигенного эритроцитарного диагностикума, характеризующегося стабильностью и воспроизводимостью получаемых результатов.
Поставленная цель достигается за счет использования в качестве сенситина не полисахаридных антигенов, экстрагированных из клеточной массы грибов (см. прототип), а экстрацеллюлярного комплекса, общего для возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза, способ выделения которого и сенсибилизация им эритроцитов характеризуются тем, что для оптимального образования и выделения экстрацеллюлярных антигенов культуру H.capsulatum G185 Р в мицелиальной фазе роста культивируют на синтетической безбелковой солевой среде Смита при температуре 28°С в течение 3 месяцев, после чего биомассу отделяют фильтрованием через ватно-марлевые фильтры и стерилизуют через мембранные фильтры, осуществляют контроль стерильности, а затем осаждают находящиеся в среде культивирования антигены охлажденным до -20°С двух-трехкратным объемом ацетона; полученный осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают при тех же соотношениях новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают при 37°С, определяют оптимальную сенсибилизирующую дозу выделенного антигена и используют последний при получении эритроцитарного диагностикума.
Полученный антиген не требует лиофилизации, относительно легко поддается точному дозированию, не содержит остатков дезинфицирующих средств, длительно хранится без потери серологической активности и обеспечивает высокую воспроизводимость метода. Таким образом, единовременно приготовленный в достаточном количестве экстрацеллюлярный антигенный комплекс может обеспечить получение стандартного диагностикума со стабильными свойствами в течение ряда лет.
В качестве жидкой питательной среды культивирования используют синтетическую солевую среду Смита [3]. Такой бульон не содержит в своем составе белково-пептонных компонентов питательной среды, что позволяет получить экстрацеллюлярный антиген для его дальнейшего использования без дополнительных этапов очистки. Сухой антиген для сенсибилизации растворяют в 0,01 М фосфатно-буферном растворе, рН 5,9. Коньюгацию проводят на водяной бане при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч при постоянном перемешивании. Фиксацию осуществляют добавлением 1 об.% формалина с дополнительной инкубацией при тех же условиях в течение 30 мин. Данные параметры оптимизируют сенсибилизацию эритроцитов, улучшают качество препарата и, в конечном итоге, повышают чувствительность РИГА.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Выделение антигенного комплекса из культурального фильтрата H.capsulatum G185P. Культивирование штамма проводят в синтетической солевой среде Смита, приготовленной по следующей прописи:
1. L-аспаргин
7,0 г
2. Хлористый аммоний
7,0 г
3. Калий фосфорнокислый однозамещенный
1,31 г
4. Цитрат натрия
0,9 г
5. Магний сернокислый
1,5 г
6. Железо лимоннокислое
0,3 г
7. Глюкоза
10 г
8. Глицерин
25 г
9. Вода
до 1 л
Среду стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15 минут.
6
Приготовленную среду разливают по 600-800 мл в бактериологические матрацы, куда вносят культуру H.capsulatum G185P в мицелиальной фазе роста 5 мл в концентрации 5-10×10 м.т./мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им Л.А.Тарасевича. Матрацы в горизонтальном положении инкубируют в термостате при 26-28°С в течение 3 месяцев. Биомассу отделяют от среды методом фильтрования через ватно-марлевый и мембранный стерилизующий фильтры. После проведения контроля стерильности комплекс антигенов осаждают из фильтрата путем добавления к последнему 2-3 объемов охлажденного до -20°С ацетона. Осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают в термостате при 37°С.
Полученный сухой антигенный комплекс используют при определении оптимальной сенсибилизирующей дозы антигена и получения диагностикума.
Пример 2. Приготовление диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного. Определение оптимальной сенсибилизирующей дозы антигенного комплекса.
Определение оптимальной сенсибилизирующей дозы антигенного комплекса проводят с использованием формалинизированных танизированных эритроцитов барана. Осадок, полученный из 5 мл 2,5% взвеси эритроцитов, суспендируют в таком же объеме 0,01 М фосфатно-буферного раствора, рН 5,9, в который добавлены навески 50, 100, 200, 400 мкг/мл сухого антигенного комплекса соответственно. Коньюгацию проводят на водяной бане при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч при постоянном перемешивании. Фиксацию осуществляют добавлением 1 об.% формалина с дополнительной инкубацией при тех же условиях в течение 30 мин. После трехкратного отмывания эритроциты доводят до концентрации 2,5 об.% в 0,15 М растворе хлористого натрия, рН 7,2, и используют в реакции непрямой гемагглютинации. Оптимальная сенсибилизирующая доза составила 100 мкг/мл, которая обусловливала чувствительность РИГА с контрольной гистоплазмозной сывороткой серии 2-1 в титрах 1:20480 с четкими отрицательными контролями.
Приготовление рабочих серий диагностикума проводят по вышеописанной методике при больших объемах реагентов. При этом оптимальную сенсибилизирующую дозу увеличивают в 2 раза (до 200 мкг/мл). Полученный диагностикум расфасовывают в ампулы в виде суспензии 10 об.% в протективной среде высушивания и подвергают лиофилизации.
Пример 3. Определение специфической активности диагностикума
Гистоплазмозные и кокцидиоидомикозные козьи иммунные сыворотки получали путем многоцикловой иммунизации продуцентов. Антигенами для иммунизации служили обеззараженные клетки мицелиальной фазы возбудителей H.capsulatum и C.immitis. При постановке РИГА сыворотки разводили 1:10 0,15 М раствором натрия хлорида, титровали двукратным шагом в объеме 0,4 мл в 1 об.% НКС и вносили одну каплю 2,5 об.% взвеси диагностикума. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Данные таблицы свидетельствуют о возможности применения диагностикума для определения уровня антител в иммунных сыворотках как к возбудителю гистоплазмоза (в титре до 1:40960), так и к возбудителю кокцидиоидомикоза (при некотором снижении титра).
Пример 4. Определение специфичности диагностикума
Для оценки специфичности были использованы иммунные сыворотки лабораторных животных (баранов, козлов, лошади), содержащие антитела к возбудителям сапа, мелиоидоза, чумы, а также сыворотки людей, больных микотическими инфекциями (кандидозом или инвазивным аспергиллезом), и нормальная сыворотка человека.
Гетерологичные сыворотки разводили 1:10 с помощью 0,15 М раствора натрия хлорида, титровали двукратным шагом в объеме 0,4 мл и использовали для постановки РИГА в макроварианте. Полученные результаты представлены в таблице 2 и свидетельствуют о том, что диагностикум, изготовленный по предложенному способу, способен выявлять группоспецифические антитела к возбудителям гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза в титре от 1:160 и выше. Титры с более высокой концентрацией до 1:80 обусловлены перекрестно реагирующими антителами к гетерологичным антигенам, не имеющим диагностического значения.
Источники информации
1. Липницкий А.В., Валькова Е.Р., Вальков Б.Г. Разработка и применение реакции пассивной гемагглютинации и реакции нейтрализации антител при глубоких микозах. / Диагностика особо опасных инфекций. - Ростов на Дону. - 1968. - С.54-57 (прототип).
2. Дроздов А.И. Методы выделения антигенов из патогенных грибов (Методическое пособие). - Ленинград, 1971, 33 с.
3. Smith CD. Nutritional factors that are requaired for the grows and sporulation of Histoplasma capsulatum. / In ′Histoplasmosis′. Proceeding of the Suond national conference / Ed. By A. Balows. - Springfild. - 1971. - P.64-70.
4. Валькова E.P., Липницкий A.B. Серологические показатели при экспериментальных глубоких микозах. // Ж. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. - 1970. - №12. - С.55-59.
Таблица 1
Результаты определения специфической активности диагностикума
№ п/п
№ продуцента
Серия (цикл иммунизации)
Вид сыворотки
Серия диагностикума
Титр в РИГА
Контроль
1
2
1
Гистоплазмозная
2
1:40960
-
3
1:20480
-
4
1:20480
-
2
2
3
Гистоплазмозная
2
1:5120
-
3
1:1280
-
4
1:5120
-
3
2
4
Гистоплазмозная
2
1:10240
-
3
1:5120
-
4
1:10240
-
4
16
1
Гистоплазмозная
2
1:2560
-
3
1:2560
-
4
1:2560
-
5
16
2
Гистоплазмозная
2
1:10240
-
3
1:2560
-
4
1:10240
-
6
16
3
Гистоплазмозная
2
1:10240
-
3
1:5120
-
4
1:10240
-
7
18
1
Гистоплазмозная
2
1:5120
-
3
1:2560
-
4
1:2560
-
8
18
3
Гистоплазмозная
2
1:40960
-
3
1:5120
-
4
1:10240
-
9
18
5
Гистоплазмозная
2
1:40960
-
3
1:20480
-
4
1:20480
-
10
20
1
Гистоплазмозная
2
1:1280
-
3
1:1280
-
4
1:1280
-
20
2
Гистоплазмозная
2
1:5120
-
11
3
1:1280
-
4
1:2560
-
12
20
3
Гистоплазмозная
2
1:1280
-
3
1:320
-
4
1:2560
-
13
1
1
Кокцидиоидомикозная
2
1:1280
-
3
1:320
-
4
1:1280
-
14
1
3
Кокцидиоидомикозная
2
1:640
-
3
1:320
-
4
1:640
-
Продолжение таблицы 1
№ п/п
№ продуцента
Серия(цикл иммунизации)
Вид сыворотки
Серия диагностикума
Титр в РНГА
Контроль
Кокцидиоидомикозная
2
1:320
-
15
1
4
3
1:160
-
4
1:320
-
Кокцидиоидомикозная
2
1:10240
-
16
9
1
3
1:5120
-
4
1:5120
-
Кокцидиоидомикозная
2
1:5120
-
17
9
5
3
1:2560
-
4
1:5120
-
Кокцидиоидомикозная
2
1:2560
-
18
9
10
3
1:640
-
4
1:1280
-
Кокцидиоидомикозная
2
1:640
19
9
15
3
1:320
-
4
1:2560
-
Кокцидиоидомикозная
2
1:2560
-
20
9
20
3
1:640
-
4
1:1280
-
Кокцидиоидомикозная
2
1:2560
-
21
17
1
3
1:640
-
4
1:1280
-
Кокцидиоидомикозная
2
1:2560
-
22
17
3
3
1:1280
-
4
1:2560
-
Кокцидиоидомикозная
2
1:2560
-
23
17
6
3
1:640
-
4
1:1280
-
Кокцидиоидомикозная
2
1:2560
-
24
19
1
3
1:640
-
4
1:1280
-
Условные обозначения: - отрицательный результат РИГА.
Примечание. Данные взяты из таблиц «Акта комиссионных испытаний диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного сухого», ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ Роспотребнадзора от 05 июня 2009 г.
Таблица 2
Результаты определения специфичности диагностикума
№ п/п
№ продуцента
Серия (цикл иммунизации)
Вид сыворотки
Серия диагностикума
Титр в РНГА
Контроль
5574 (козел)
Мелиоидозная
2
1:80
-
1
2
3
1:40
-
4
1:80
-
5 (козел)
Мелиоидозная
2
1:40
-
2
14
3
1:20
-
4
1:40
-
7 (козел)
Мелиоидозная
2
1:20
-
3
21
3
-
-
4
1:20
-
6518 (баран)
Сапная
2
-
-
4
4
3
-
-
4
-
-
6518 (баран)
Сапная
2
-
-
5
12
3
-
-
4
-
-
2801 (козел)
Сапная
2
-
-
6
9
3
-
-
4
-
-
10 (баран)
Чумная
2
1:40
-
7
4
3
1:20
-
4
1:40
-
10 (баран)
Чумная
2
-
-
8
9
3
-
-
4
-
-
Кокетка (лошадь)
коммерческая
Чумная
2
1:20
-
9
3
-
-
4
-
-
Сыворотка больного
Клинич. диагноз: кандидоз
2
40
-
10
3
20
-
4
40
-
Сыворотка больного
Клинич. диагноз: кандидоз
2
40
-
11
3
1:20
-
4
1:40
-
Сыворотка больного
Клинич. диагноз: кандидоз
2
1:20
-
12
3
1:20
-
4
1:20
-
Сыворотка больного
Клинич. диагноз: аспергиллез
2
1:20
-
13
3
1:20
-
4
1:20
-
Нормальная сыворотка человека
-
2
1:20
-
14
3
-
-
4
1:20
-
Условные обозначения: - отрицательный результат РНГА.
Примечание. Данные взяты из таблиц «Акта комиссионных испытаний диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного сухого» ФГЗУ Волгоград НИПЧИ Роспотребнадзора от 05 июня 2009 г.