ПИЩЕВЫЕ КОМПОЗИЦИИ И ИХ ПОЛУЧЕНИЕ
FOOD COMPOSITIONS AND THEIR PRODUCTION

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение имеет отношение к пищевым композициям, которые содержат липофильный физиологически активный компонент, в частности жирорастворимое питательное вещество (FSN).
Уровень техники
Множество факторов определяют биологическую усвояемость липофильного физиологически активного компонента, такого как питательное вещество, выбираемое из каротиноидов, витаминов A, D и Е. Эти физиологически активные компоненты обычно могут поступать из натуральных фруктовых, овощных и растительных источников. Как правило, биологическая усвояемость липофильных, в особенности жирорастворимых физиологически активных компонентов из сырых растений, довольно низка. Гомогенизирование отдельных частей фруктов, овощей или растений приводит к разрушению клеточных мембран и повышению биологической усвояемости указанных активных компонентов. Щадящее приготовление (например, приготовление на пару, но не интенсивное кипячение) также улучшает их биологическую усвояемость. В конце концов, достоверно установлено, что биологическую усвояемость липофильных, в особенности жирорастворимых физиологически активных компонентов, можно значительно улучшить, если отдельные части овощей, фруктов и растений употреблять вместе с разумным количеством жира, входящего в рацион питания.
Если в качестве добавок в пищу вводят свободные липофильные физиологически активные компоненты, главной проблемой является их биологическая усвояемость, так как введение этих компонентов в свободной форме в еду приводит к их чрезвычайно низкой биологической усвояемости. Известно, что для улучшения биологической усвояемости указанные выше компоненты смешивают с растительным маслом (например, в форме эмульсий или микроэмульсий), так как микрокристаллы захватываются и стабилизируются в пищевом матриксе или с естественными липидными (например, фосфолипидными) агрегатами, такими как липосомы. Известно, что такие методики положительно влияют на биологическую усвояемость указанных выше липофильных физиологически активных компонентов.
В работе Р. Borel, Clin. Chem. Lab. Med. (2003) 41, 979-994, описано, что присутствие жира и структура пищевого матрикса влияют на биологическую усвояемость каротиноидов из пищи.
Е. Li, P. Tso., Curr. Opin. Lipid. (2003) 14, 241-247, описывают, каким образом поглощение витамина А организмом тесно связано с поглощением жиров.
V.Tyssandier et al., Am. J. Physiol. (2003) 284, G913-G923, показывают, что высокая биологическая усвояемость каротиноидов из овощей обеспечивается в том случае, если в пище присутствуют легко усваиваемые жиры. Желудок инициирует перенос каротиноидов из цитоплазматического матрикса овощей в жирную фазу пищи. В кишечнике транспорт каротиноидов из переваренной жирной фазы в мицеллы, поступающие с пищей, происходит быстрее, чем из цитоплазматического матрикса овощей, который обеднен по жирам.
К.Н. van het Hof et al., J. Nutr. (2002) 132, 503-506, демонстрируют, что тип пищевого матрикса является главным фактором, который влияет на биологическую усвояемость каротиноидов. Жир, поступающий с пищей (хотя и в низких количествах), важен для улучшенного поглощения каротиноидов из природных источников.
J.D.RibayaMercado, Nutr. Rew. (2002) 60, 104-110, демонстрирует, что жир, поступающий с пищей, облегчает поглощение каротиноидов.
Были предприняты и другие попытки для получения пищевых композиций с включенным в них липофильным физиологически активным компонентом, который может быть диспергирован в водной фазе. Например, US-A-6426078 описывает микроэмульсию, относящуюся к типу масло-в-воде, которая содержит, по меньшей мере, один полиглицериновый эфир в качестве эмульгатора и, по меньшей мере, одно липофильное соединение в качестве дисперсной фазы. Эмульгатор содержит эфир глицерина и моножирной кислоты, а липофильное соединение относится к группе каротиноидов, в частности к β-каротину, витаминам A, D, Е и К и их производным и полиненасыщенным жирным кислотам.
ЕР-А-0818225 описывает способ экстракции ликопина и содержащих его экстрактов. Чистый ликопин или содержащие его липофильные экстракты получают из цельных фруктов или Lycopersicum esculentum и похожих видов, которые доступны как побочные продукты в процессах пищевой промышленности. Частично высушенное свежее сырье экстрагируют алифатическими или ароматическими углеводородами или несмешивающимися с водой растворителями в присутствии фосфолипидов в качестве поверхностно-активных средств и стабилизирующих агентов и экстракты концентрируют до состояния масла или фракционируют до желаемой концентрации ликопина.
US-A-6261622 имеет отношение к получению водно-диспергируемого каротиноидного пигмента. Препарат водно-диспергируемого каротиноидного пигмента, который можно добавлять к различным водным композициям с сохранением превосходной дисперсионной стабильности в широком диапазоне температур, получают с помощью экстрагированного волокна соевых бобов как эффективного компонента.
ЕР-А-0602137 имеет отношение к каротиноидной композиции из полностью природных источников, в частности композиция представляет собой эмульсию или высушенный продукт, и к способу получения натуральной каротиноидной композиции.
US-A-3734745 раскрывает создание сухой смеси, включающей желатиновую часть, сахар, жировую часть, в которой жир предпочтительно нанесен на сахар или смешан с сахаром в форме чипсов, эмульгатор жиров, жирорастворимый пищевой краситель и водорастворимый краситель.
JP-A-08/259829 описывает водорастворимый ликопиновый препарат, способный простым образом смешиваться с различными водными композициями без применения поверхностно-активного вещества и имеющий достаточную растворимость и стабильность.
JP-A-05/284232 охватывает добавление вязкого полисахарида, такого как пектин, или ксантановой камеди вместе с каротиноидным пигментом, способ применения водно-диспергируемой порошкообразной композиции каротиноидного пигмента, включающей каротиноидный пигмент, имеющий диаметр частиц менее чем 0,1 мкм и лаурилсульфат натрия.
Другие ссылки в этой области включают способ диспергирования тонкодисперсного каротиноидного пигмента в водной композиции (Japanese Patent Application Laid-open №7-90188), способ включения каротиноидного пигмента, в частности β-каротина, в циклодекстрин и его диспергирования в водной композиции (Japanese Patent Application Laid-open №62-267261) и способ включения ликопина, одного из каротиноидных пигментов, в γ-циклодекстрин и добавление полученного включенного состава в водную композицию вместе с глютеном и/или аскорбиновой кислотой (Japanese Patent Application Laid-open No. 8-259829).
В соответствии с US-A-6267963 растительные стерины, растительные станолы, эфиры растительных стеринов и другие нетоксичные стерины совместно кристаллизуют с эмульгаторами с образованием комплекса растительный стерин/эмульгатор или комплекса растительный станол/эмульгатор, которые можно включить в цельные пищевые продукты, продукты с пониженным содержанием жира, продукты с низким содержанием жира, обезжиренные продукты и пищевые продукты, не содержащие триглицериды. Растительные стерины и растительные станолы можно совместно кристаллизовать с эмульгаторами для получения смеси, у которой температура плавления значительно ниже, чем температура плавления растительного стерина или растительного станола. Такие комплексы могут применяться для включения относительно высокого уровня таких стеринов/станолов в пищевые продукты без неблагоприятного органолептического эффекта, обычно связанного с применением таких растительных стеринов или растительных станолов.
WO-A-2002/064110 описывает способ инкапсуляции в липосомы каротиноидов, в значительной степени не смешивающихся с водой.
US-A-6287615 описывает способ окрашивания пищевых препаратов с помощью каротиноидов путем смешивания эффективного количества препарата каротиноидов с пищевым препаратом, в котором препарат каротиноидов представляет собой водную композицию, включающую от 3,6 до 10% по массе одного или нескольких каротиноидов в форме мицелл.
Раскрытие изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение имеет отношение к композиции, которую можно соответствующим образом применять для включения липофильного физиологически активного компонента в пищевой продукт, эта композиция включает:
(a) первичный липидный компонент, который получают в качестве продукта реакции одной или нескольких карбоновых кислот, по меньшей мере, с одним из соединений, являющихся глицерином и пропиленгликолем;
(b) совместно применяемый липидный компонент, выбираемый, по меньшей мере, из одного соединения, являющегося фосфорсодержащими липидами и гидроксилированными эфирами карбоновой кислоты и моно- и диглицеридов;
(c) липофильный физиологически активный компонент; и
(d) воду.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно имеет рН от 3 до 8.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включают липидную фазу, которая представляет собой кристалл или мезофазу первичных и совместно применяемых липидных компонентов. Липофильный физиологически активный компонент должен присутствовать в композиции скорее в молекулярно-дисперсионном виде, а не в кристаллической или твердой форме, чтобы обеспечить его биологическую усвояемость.
Предпочтительно первичный липидный компонент получают в виде реакционного продукта (например, в виде сложного эфира), по меньшей мере, одной из кислот: молочной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, малеиновой кислоты и винной кислоты и, по меньшей мере, одного из соединений, являющихся глицерином и пропиленгликолем.
Как было определено здесь ранее, совместно применяемый липидный компонент выбирают, по меньшей мере, из одного соединения, являющегося фосфорсодержащими липидами и гидроксилированными эфирами карбоновых кислот и моно- и диглицеридов.
Предпочтительные фосфорсодержащие липиды можно выбирать из лецитина, фосфолипидов и лизофосфолипидов и их смесей. Совместно применяемый липидный компонент может дополнительно или альтернативно включать один или несколько гидроксилированных эфиров карбоновых кислот и моно- и диглицеридов, выбираемых из эмульгаторов CITREM (Е472с) и DATEM (Е472е).
Некоторые совместно применяемые липидные компоненты могут принадлежать к одному и тому же классу химических соединений, как те, которые были определены для первичного липидного компонента. Однако необходимым условием настоящего изобретения является то, что фактически в любой композиции настоящего изобретения совместно применяемый липидный компонент должен включать химическую структуру, отличающуюся от любой структуры, которую используют в качестве всего или части первичного липидного компонента.
Термин «липофильный физиологически активный компонент», используемый здесь, относится к любому липофильному соединению, обладающему любым видом физиологической активности при энтеральном введении в организм человека или животного, в частности любым видом активности, которая полезна для здоровья организма указанного человека или животного, или потому, что она необходима для нормального развития, роста и/или функционирования организма человека или животного, или потому, что она может помогать предотвращать или устранять любой тип аномального физиологического состояния в организме человека или животного. Активные компоненты, которые необходимы для нормального развития, роста и/или функционирования, могут, например, включать каротиноиды и витамины A, D и Е. Подходящие примеры активных компонентов, которые хотя и не являются необходимыми для нормального физиологического функционирования, но обладают некоторой полезной активностью, включают, например, некоторые растительные стерины, которые, как известно, обладают полезными эффектами у субъектов, страдающих избыточным весом или гиперхолестеринемией.
ow
Термин «липофильный», используемый здесь, относится к способности вещества растворяться в жирах и/или органических растворителях. Липофильные вещества обычно плохо растворимы в водных системах, но растворимы в жирах и/или органиеских растворителях. Коэффициент распределения молекулы, который определяют в системе вода/н-октанол (при 20°С,) выражаемый в виде logP или logK, принят в качестве стандарта при измерении липофильности. В соответствии с изобретением настоящие липофильные физиологически активные компоненты обычно имеют значение logP, приблизительно равное 3, предпочтительно, по меньшей мере, 3,5.
В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения липофильный физиологически активный компонент представляет собой жирорастворимое питательное вещество, более предпочтительно жирорастворимое питательное вещество, выбираемое из каротиноидов, жирорастворимых витаминов, фитостеринов и их производных, фитостанолов и их производных и их смесей. Предпочтительные каротиноиды и жирорастворимые витамины включают β-каротин, ликопин, лютеин, зеаксантин, витамин А, витамин D, витамин Е и витамин К и их производные. Можно применять любые их смеси. Фитостерины и фитостанолы, хотя и относительно нерастворимы в некоторых жирах, все же относятся к классу жирорастворимых питательных веществ. Однако их растворимые аналоги, которые можно применять, представляют собой их эфиры с жирными кислотами.
В настоящем изобретении липофильный физиологически активный компонент предпочтительно является соединением, которое может быть получено из естественного растительного, фруктового или овощного источника, например, витамин или растительный стерин также относятся к фитостерину.
В соответствии с особенно предпочтительным воплощением липофильный физиологически активный компонент в соответствии с настоящим изобретением является экстрагируемым стероидным гликозидом, например стероидным гликозидом, экстрагируемым из растений рода Trichocaulon или рода Hoodia, указанный стероидный гликозид обладает активностью, подавляющей аппетит, как описано в международной патентной заявке WO 98/46243, которая включена сюда путем отсылки.
В особенно полезном воплощении изобретения липофильный физиологически активный компонент выбирают из группы, состоящей из стероидных гликозидов, подавляющих аппетит, которые могут быть экстрагированы из растений рода Trichocaulon или рода Hoodia, производных, солей и аналогов указанных стероидных гликозидов и их смесей.
В соответствии с другим предпочтительным воплощением липофильный физиологически активный компонент представляет собой стероидное соединение, имеющее структурную формулу (I) или его соль или эфир:
где
R=алкил;
1
R=Н, алкил, тиглиол, бензоил или любая другая органическая кислотная группа;
2
4
5
5
6
R=Н или один или несколько 6-дезоксиуглеводов, или молекул глюкозы, или их комбинации; и где пунктирная линия указывает на необязательное наличие дополнительной связи между атомами углерода С и С или между атомами углерода С и С.
В соответствии с другим в равной степени предпочтительным воплощением настоящий липофильный физиологически активный компонент является растительным экстрактом из растений группы, включающей род Trichocaulon или род Hoodia, указанный экстракт обладает активностью, подавляющей аппетит. Более предпочтительно указанный растительный экстракт выбирают из группы, состоящей из подавляющих аппетит экстрактов Trichocaulon piliferum, подавляющих аппетит экстрактов Trichocaulon officinale, подавляющих аппетит экстрактов Hoodia currorii, подавляющих аппетит экстрактов Hoodia lugardii и их смесей.
Предпочтительно общее количество первичных липидных компонентов плюс совместно применяемого липидного компонента составляет от 0,01% до 20% по массе от общей массы композиции. Предпочтительно массовое соотношение первичного липидного компонента и совместно применяемого липидного компонента составляет от 1:10 до 100:1, более предпочтительно от 1:10 до 10:1.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением также предпочтительно содержат воду от 75% до 99,9% по массе, более предпочтительно от 80% до 95% по массе. В предпочтительном воплощении композиции настоящего изобретения представляют собой непрерывную водную фазу.
Общее количество липофильного физиологически активного компонента в любой композиции в соответствии с изобретением предпочтительно превышает 0,0001% по массе. Более предпочтительно количество липофильного физиологически активного компонента в композиции составляет от 0,001% до 5% по массе, наиболее предпочтительно от 0,01% до 2,5% по массе.
Композиции в соответствии с первыми аспектами настоящего изобретения могут быть включены в широкий спектр пищевых продуктов, например в напитки, приправы, супы, соусы, подливы, пастообразные продукты или начинки. Количество композиции, включаемой в указанные пищевые продукты, обычно достаточно, чтобы обеспечить от 0,0001%, например, от 0,001%, в частности от 0,01% до 25%, предпочтительно от 0,1% до 10%, по массе от общего количества липофильного физиологически активного компонента в конечном пищевом продукте.
Возможная степень включения также включает такие значения, которые необходимы, чтобы обеспечить от 0,5% или от 1% и до 5% или до 2% или даже до 1% по массе указанного активного компонента в пищевой продукт.
Обычно пищевые продукты, которые включают в себя композиции в соответствии с настоящим изобретением, содержат, по меньшей мере, один компонент, который сам по себе не входит в состав композиции. Способ изготовления такого пищевого продукта в соответствии с изобретением будет включать смешивание в любом порядке композиции в соответствии с первым аспектом изобретения и одного или нескольких других компонентов.
Под продуктом с низким содержанием жира здесь необходимо понимать любой пищевой продукт, содержащий менее чем 1,5% жира, за исключением количества липидов, которые могут быть использованы в качестве совместно применяемых липидов для получения липидной фазы первого аспекта этого изобретения.
Другие аспекты изобретения относятся к способу улучшения биологической усвояемости липофильного физиологически активного компонента, указанный способ включает введение липофильного физиологически активного компонента, как было определено ранее, в композицию, включающую:
(a) первичный липидный компонент, который получают в качестве продукта реакции одной или нескольких карбоновых кислот, по меньшей мере, с одним из соединений, являющихся глицерином и пропиленгликолем;
(b) совместно применяемый липидный компонент, выбираемый, по меньшей мере, из одного соединения, являющегося фосфорсодержащими липидами и гидроксилированными эфирами карбоновой кислоты и моно- и диглицеридов;
(c) воду;
где указанная композиция предпочтительно является непрерывной водной фазой;
и к применению указанной выше композиции для улучшения биологической усвояемости, в особенности биологической усвояемости при пероральном введении липофильного физиологически активного компонента, как было определено выше.
Теперь настоящее изобретение будет разъяснено более детально с помощью примеров, приведенных ниже, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1
6 мг β-каротина и 2 г сложного эфира лактилированной жирной кислоты + продукта реакции глицерин/пропиленгликоля (LFEGPG) растворяли при 55°С в 10 мл этанола. Этот раствор добавляли по каплям в 200 мл интенсивно перемешиваемого Tris-буфера (0,1 г). Через 15 минут перемешивания раствор охлаждали и рН доводили до 4,0 с помощью 1 М НCl. Осадок затем фильтровали и липидную фазу LFEGPG, содержащую молекулярно-дисперсный β-каротин, использовали далее в этом эксперименте.
Осадок добавляли в сосуд USP24 (тест на растворение II типа), заполненный 900 мл раствора экстракта желчи в водном буфере при 37°С. В качестве контроля 6 мг свободного кристаллического β-каротина добавляли к тому же забуференному раствору желчи в сосуде USP24. После перемешивания в USP24 в течение 60 минут неожиданно было обнаружено, что в то время, как растворимость свободного β-каротина была равна почти 0, растворимость β-каротина из липидной фазы LFEGPG в растворе желчи была более 26% от начального количества (6 мг).
Пример 2
Морковный сок с LFEGPG и лецитином, а также со смешанными липидными фазами LFEGPG-лецитин с различным соотношением LFEGPG и лецитина получали, как описано ниже.
Добавление LFEGPG к соку
Определенное количество расплавленного LFEGPG (55°C) добавляют к морковному соку, предварительно прогретому до 55°С (свежий морковный сок 97% чистоты, Zonnatura B.V Zoetermeer, Netherlands), в колбе Эрленмейера. LFEGPG медленно выливают в сок при перемешивании. Сок затем оставляют на 20 минут при интенсивном перемешивании в бане при 50°С. Затем сок выливают в химический стакан для гомогенизирования в течение 1 минуты. Эту стадию проводят с помощью гомогенизатора Silverson L4RT-A при 5000 об/мин (с мелкоячеистой сеткой). Сок затем вновь помещают в колбу Эрленмейера на водяной бане при 50°С для перемешивания на 10 минут. Колбу Эрленмейера затем оставляют при комнатной температуре при перемешивании приблизительно на 2 часа.
Затем 315 мл сока быстро смешивают с буфером, желчью и панкреатином в аппарате для растворения USP Type II, имитируя условия желудочно-кишечного тракта.
Добавление лецитина к соку
Способ в точности такой же, как было описано выше. Тем не менее, лецитин добавляют к соку холодным и в твердом состоянии. Используемый лецитин представляет собой фосфатидилхолин от фирмы "Degussa-Bioactives" (Epikuron 200, 92%-ный ненасыщенный фосфатидилхолин, экстрагированный из сои).
Добавление смеси LFEGPG/лецитин к соку
Протокол такой же, как был описано выше в двух предыдущих способах. Вначале к соку при 50° добавляют лецитин (как описано выше) и через 2 минуты расплавленный LFEGPG. Сок затем гомогенизируют, как описано выше.
Определенное количество лецитина добавляют к предварительно прогретому (50°С) и постоянно перемешиваемому морковному соку (свежий морковный сок 97% чистоты, Zonnatura B.V Zoetermeer, Netherlands). Затем к соку при перемешивании при 50°С медленно добавляют Durlac. Сок затем оставляют при интенсивном перемешивании на бане при 50°С на 20 минут. Затем сок выливают в химический стакан для 1-минутного гомогенизирования. Это гомогенизирование проводят с помощью гомогенизатора Silverson L4RT-A при 5000 об/мин (с мелкоячеистой сеткой). Сок затем вновь помещают в колбу Эрленмейера на водяной бане при 50°С для перемешивания на 10 минут. Колбу Эрленмейера затем оставляют при комнатной температуре при перемешивании приблизительно на 2 часа. Затем 315 мл сока быстро смешивают с буфером, желчью и панкреатином в аппарате для растворения USP Type II, имитируя условия желудочно-кишечного тракта.
Неожиданно биологическая усвояемость β-каротина, выраженная в процентах по отношению к общему количеству каротиноидов, солюбилизированных в раствор желчи, оказывается самой высокой для смешанной липидной фазы LFEGPG/лецитин (см. табл.1 и табл.2). Это значение выше, чем для свободного лецитина или свободного LFEGPG, и оптимальное соотношение между лецитином и LFEGPG близко к 3:1 соответственно).
Таблица 1Процентное содержание каротиноидов, перенесенных из морковного сока в биодоступный объем мицелл в течение 60 мин, в USP-тесте на растворимость с применением смесей NPL/совместно применяемый липид
композиция (%) смеси NPL (LFEGPG)/coвместно применяемый липид (lec)
% в объеме мицелл (среднее±SD)
1+0
11,5±1,2
0,75+0,25
20,7±0,1
0,50+0,50
31,0±0,2
0,25+0,75
33,7±0,3
0+1
24,0±0,5
Таблица 2Процентное содержание каротиноидов, перенесенных из морковного сока в биодоступный объем мицелл в течение 60 мин, в USP-тесте на растворимость с использованием только совместно применяемых липидов
композиция (%) совместно применяемый липид (lec)
% в объеме мицелл (среднее±SD)
0
15,6±0,3
0,25
21,9±0,1
0,50
24,5±0,6
0,75
24,4±0,4
1
24,0±0,5
Пример 3
Эффективность гомогенизирования оказывает влияние на биологическую усвояемость каротиноидов. В этом примере одну дисперсную систему получали с помощью Ultra Turrax T25 (IСА Labortechnik), другую - с помощью гомогенизатора Silverson, оба образца гомогенизировали в течение 1 минуты. Пример 3 демонстрирует влияние эффективности гомогенизирования на солюбилизацию β-каротина, включенного в смешанную липидную фазу лецитин-LFEGPG в соотношении 3:1. Гомогенизатор Silverson обеспечивает меньшие размеры частиц липидной фазы и, кроме того, более быструю гидратацию липидов.
Пример 4
Этот пример показывает, что в смешанных системах лецитин-LFEGPG порядок добавки липидов к соку может быть важен. Если лецитин добавляют до LFEGPG, как описано в примере 1, то солюбилизация β-каротина желчными мицеллами из липидной фазы выше, чем в том случае, когда LFEGPG добавляют до лецитина. Если к желчным мицеллам добавляют смешанную пленку лецитин-LFEGPG, полученную путем растворения LFEGPG и лецитина в органическом растворителе, то извлечение β-каротина самое низкое.
Пример 5
Стандартный протокол, описанный для смешивания лецитина и LFEGPG с соком, состоит из нескольких стадий. Вначале лецитин добавляют к соку, уравновешенному при 50°С. Затем добавляют расплавленный LFEGPG и гомогенизируют с помощью Silverson в течение 20 минут. Затем гомогенизированный сок оставляют на 10 минут для того, чтобы некоторые каротиноиды обменивались между матриксом сока и липидной фазой лецитин-LFEGPG. Этот промежуток в 10 минут затем был увеличен до 24 часов, чтобы исследовать любое влияние времени на этой стадии. Использовали продувку азотом (поток азота), чтобы предотвратить явление окисления за это время. С учетом стандартного отклонения увеличение времени экстракции от 10 минут до 24 часов не приводит к повышению солюбилизации β-каротина желчными мицеллами in vitro.
Пример 6
Включение β-каротина в модельные системы
(1) А. 1 г LFEGPG и 2,4 мг очищенного β-каротина добавляли к 100 мл воды с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в течение 1 часа при 50°С. С помощью спектрофотометрии в УФ- и видимой области спектра после центрифугирования и экстракции β-каротина из объединенной липидной фазы гексаном обнаруживали 1,7 мг β-каротина/г сухого LFEGPG.
В. 1 г LFEGPG и 2,4 мг очищенного β-каротина растапливали вместе и добавляли по каплям к 100 мл воды с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в течение 20 минут при 50°С. Для гомогенизирования образца использовали Ultra Turrax, затем образец перемешивали на магнитной мешалке еще в течение 10 минут при 50°С. С помощью спектрофотометрии в УФ- и видимой области спектра после центрифугирования и экстракции гексаном обнаруживали 2,2 мг β-каротина.
(2) А. 3 г LFEGPG и 15 мг β-каротина растапливали вместе при 65°С на водяной бане и добавляли по каплям к 300 мл воды при 65°С (водяная баня), гомогенизируя смесь в это время с помощью гомогенизатора Silverson.
В. 0,3 г Span 60 (эфир сорбита и моностеарата) растворяли в 300 мл воды при 65°С. Расплав 3 г LFEGPG и 15 мг β-каротина (65°С) гомогенизировали с помощью гомогенизатора Silverson, как описано в разделе А.
Микроскоп: Значительно сниженное число кристаллов свободного β-каротина в образце В.
(3) 0,9 г LFEGPG, 5 мг β-каротина и 0,1 г одного из указанных ниже совместно применяемых липидов CITREM (сложные эфиры лимонной кислоты и моно- и диглицеридов). Span 60 (эфир сорбита и моностеарата) или Epikuron 100 G (обезжиренный гранулированный лецитин соевых бобов) растворяли при 55°С в 10 мл этанола. Этот раствор добавляли по каплям к 200 мл интенсивно перемешиваемого Tris-буфера (0,1 г). Через 15 минут перемешивания раствор охлаждали и рН доводили до 4,0 с помощью 1 М НС1. Получали полиморфные и мезоморфные липидные фазы, содержащие молекулярно-дисперсный β-каротин (оценивали по их появлению в поле микроскопа, однако также обнаружили несколько кристаллов свободного β-каротина, таким образом не было достигнуто полной молекулярной дисперсии).
(4) Так как растворимость β-каротина в этаноле ограничена, полную молекулярную дисперсию β-каротина достигали путем использования непищевых растворителей, таких как хлороформ. 1 г LFEGPG и 3 мг β-каротина растворяли в 5 мл хлороформа и добавляли в 100 мл воды при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке при 60°С. Раствор держали при 60°С в течение 30 минут. Липидную фазу исследовали с помощью оптического светового микроскопа и кристаллы β-каротина не обнаруживали.
(5) 0,2 г LFEGPG и 2 мг β-каротина, а также 0,2 г смеси LFEGPG/DATEM (сложные эфиры диацетилвинной кислоты с моно- и диглицеридами) (93/7 по массе) и 2 мг β-каротина растворяли в хлороформе. Липидные смеси высушивали в потоке аргона и держали при пониженном давлении в течение ночи для полного удаления хлороформа. Высушенные липидные пленки гидратировали раствором, забуференным фосфатом (20 мМ Na-фосфат, 130 мМ NaCl, рН 6,1), в течение 30 минут при 60°С. Микрофотографии показали, что при использовании этого способа часть β-каротина оказывается молекулярно-дисперсной и что смешивание с DATEM в качестве совместно применяемого липида уменьшает количество кристаллов свободного β-каротина.
(6) Точно такой же способ получения, как был описан выше (5), применяли для смеси 80% LFEGPG и 20% Epikuron 200 (очищенный лецитин соевых бобов с минимальным содержанием фосфатидилхолина 92%) и различающихся количеств β-каротина (от 4 до 6 мг β-каротина/г липида). Микрофотографии показали отсутствие кристаллов свободного (β-каротина в образце, содержащем 4 мг β-каротина, присутствие нескольких кристаллов свободного β-каротина в образце, содержащем 5 мг β-каротина, но относительно высокое содержание кристаллов свободного β-каротина в образце, содержащем 6 мг β-каротина.
Пример 7
Включение каротиноидов в LFEGPG in situ
(1) 1 г LFEGPG добавляли к 100 мл холодного морковного сока (свежий морковный сок 97% чистоты, Zonnatura B.V Zoetermeer, Netherlands). Смесь нагревали до 50°С и держали при этой температуре в течение 30 минут при перемешивании на магнитной мешалке. Гомогенизирование проводили с помощью гомогенизатора Silverson приблизительно при 5500 об/мин, затем проводили еще одну стадию гидратации в течение 5 мин при 50°С.
Фазу LFEGPG фильтровали, собирали и растворяли в гексане. Содержание β-каротина, равное 0,68 мг β-каротина/г сухой липидной фазы (с поправкой на содержание воды в гидратированной фазе LFEGPG, равное 30%), определяли спектрофотометрически (поглощение при 448 нм).
(2) 2 г LFEGPG расплавляли при 50°С и добавляли по каплям к 100 мл морковного сока, выдержанного при 50°С. Перемешивали на магнитной мешалке в течение 1 часа при 50°С, затем раствор гомогенизировали с помощью гомогенизатора Silverson (4500 об/мин в течение 1 минуты) и перемешивали на магнитной мешалке в течение еще одного часа при 50°С. Фазу LFEGPG собирали фильтрованием и растворяли в гексане. Содержание β-каротина, равное 1,5 мг β-каротина/г сухого LFEGPG, определяли спектрофотометрически (поглощение при 448 нм). Такую же процедуру воспроизводили для раствора томатного сока и томатной пасты и получили сходный результат, что свидетельствует о том, что этот способ не является эксклюзивным для морковного сока, но также может быть использован и в других форматах для обогащения натуральных FSN.
(3) 1 г LFEGPG расплавляли при 50°С и добавляли по каплям к 100 мл морковного сока, выдержанного при 50°С. Перемешивали на магнитной мешалке в течение 20 минут при 50°С, затем раствор гомогенизировали с помощью гомогенизатора Silverson (4500 об/мин в течение 1 минуты) и перемешивали на магнитной мешалке в течение еще 10 минут при 50°С. Фазу LFEGPG собирали фильтрованием и растворяли в гексане. Содержание β-каротина, равное 2,0 мг β-каротина/г сухого LFEGPG, определяли спектрофотометрически (поглощение при 448 нм).
Пример 8
Включение экстракта, включающего снижающие аппетит стероидные гликозиды
2
4
2
0,1 г экстракта Hoodia (PYM 50987) смешивали с 0,4 г смеси липидов, включающей 90% Durlac 300 и 10% Lactem, и растворяли в 3 мл абсолютного этанола приблизительно при 80°С. Горячий раствор добавляли по каплям в 100 мл нагретого до 60°С водного раствора (0,1 М NaHPO·2HO, pH 9), который интенсивно перемешивали на магнитной мешалке. Дисперсию медленно охлаждали до комнатной температуры и рН снижали до приблизительно нейтральных значений добавлением НСl. Дисперсию затем фильтровали через бумажный фильтр и кашицу высушивали на воздухе и вновь диспергировали в воде с помощью интенсивного перемешивания миксером Ultra-Turrax. При наложении энергии (например, при обработке ультразвуком в течение 20 мин) из этой повторно полученной дисперсии образовывалась мезофаза (подтвержденная с помощью поляризационной световой микроскопии по появлению типичных «мальтийских крестов» при скрещенных поляризаторах).
Максимальное содержание активных веществ Hoodia, которое можно включить в би-слой липидной мезофазы, исследовали с помощью очищенных модельных соединений с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Образцы получали из 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC, Sigma P4329), который спонтанно собирался в би-слои при диспергировании в полярных растворителях, и экстракта Hoodia PYM50027 (содержащий 73% активных веществ). Типичный пик, наблюдаемый для DPPC приблизительно при 42°С (условия: рН 7,4, 20 мМ PBS, 150 мМ NaCl) для перехода из фазы геля в липидно-кристаллическую фазу (обе фазы являются «мезофазой»), отчетливо изменяется после добавления экстракта Hoodia. Из максимального количества экстракта Hoodia, которое все еще индуцирует значительное изменение формы пика, наблюдаемого с помощью DSC, было определено, что максимальное количество активных веществ Hoodia, равное 25 мол. %, может быть включено в би-слой DPPC. Для мезофаз, образованных другими липидами, можно ожидать сходные значения.