СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАНДАРТНОЙ ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ ПАНЕЛИ СЫВОРОТОК КРОВИ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ВИРУСНЫМ РЕСПИРАТОРНЫМ ИНФЕКЦИЯМ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ОРГАНИЗМА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
MANUFACTURE METHOD OF BLOOD SERUM STANDARD POSITIVE PANEL FOR QUALITY CONTROL OF IMMUNOENZYMOMETRIC TEST SYSTEMS DESIGNED FOR DETECTION OF VIRUS-SPECIFIC ANTIBODIES TO VIRAL RESPIRATORY INFECTIONS IN BIOLOGICAL LIQUIDS OF BOVINE ANIMALS

Изобретение относится к области ветеринарии, иммунологии, вирусологии, биотехнологии и может быть использовано в технологии изготовления панелей сывороток, содержащих специфические антитела к антигенам вирусных респираторных инфекций крупного рогатого скота (КРС).
Респираторные болезни крупного рогатого скота распространены практически во всех странах мира. Они наносят серьезный экономический ущерб животноводству, связанный с потерей живой массы скота, снижением молочной продуктивности, нарушением воспроизводства и гибелью молодняка. Вспышки острых респираторных заболеваний крупного рогатого скота (ОРЗ КРС) на протяжении последних лет регистрируются во многих регионах России и представляют постоянную эпизоотическую угрозу.
Эти заболевания представляют значительную проблему в ветеринарии еще и потому, что протекают со сходными клиническими симптомами. По этой причине особенно велика роль лабораторной диагностики указанных выше вирусных болезней крупного рогатого скота.
Вирусологическими исследованиями диагностировали инфекционный ринотрахеит (ИРТ), вирусную диарею-болезнь слизистых (ВД-БС), респираторно-синцитиальную (PC), аденовирусную инфекцию (АВИ) или смешанное вирусное заболевание с участием парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиального вируса (РСВ).
Исследования показывают широкое распространение ИРТ и ВД-БС. В 80% хозяйств выявляют антитела в диагностических титрах к одному или обоим возбудителям. Титр специфических антител в реакции нейтрализации (РН) колеблется от 1:4 до 1:128.
Анализ полученных вирусологическими исследованиями данных свидетельствует о значительном количестве серопозитивных животных. Следует отметить, что в 80% случаев выявляют антитела к вирусу ВД-БС КРС в исследуемом материале с одновременным обнаружением антител к другим вирусным антигенам в различных сочетаниях. Так, в 27% пробах сывороток выявляют антитела только к вирусу ВД-БС КРС. Вируснейтрализующие антитела к антигенам ИРТ и ВД-БС находят у 33% обследованных животных. Только 7% проб содержат антитела к вирусам ИРТ, ПГ-3 и ВД-БС одновременно, в 10% - только к вирусу ИРТ, 7% - только к вирусу PC, 14% - к ПГ-3.
Противовирусные антитела выявляют как у клинически здоровых животных, так и у животных с различной патологией.
Известен способ приготовления контрольных сывороток, включающий подбор иммунных сывороток крови, содержащих специфические антитела к тестируемому антигену в высоких титрах, определенных с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) (1).
Однако все известные способы получения диагностических моно- и поливалентных сывороток имеют общие недостатки, заключающиеся в недостаточной активности сывороток, трудоемкости процесса их получения, низком выходе целевого продукта, обусловленном высокими отходами животных-продуцентов, что не обеспечивает возможности организации массового производства диагностических препаратов.
Технический результат заявляемого изобретения состоит в том, что можно с помощью предлагаемого изобретения просто брать сыворотки крови при убое скота на мясокомбинате и ввиду того, что высок процент серопозитивных животных, получать специфические антитела к антигенам вирусных респираторных инфекций.
Технический результат достигается тем, что для адсорбции специфических антител сыворотку крови животных пропускают в замкнутом цикле через иммуносорбент BrCN сефарозу 4В с иммобилизованными в ее структуре антигенами вирусов, вызывающих респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота, с последующей элюцией специфических антител, причем в качестве положительных сывороток отбирают только сыворотки с оптической плотностью в диапазоне от 0,949 до 1,309 оптических единиц.
Иммуноферментный анализ (ИФА) является одним из высокочувствительных методов диагностики. При его проведении предъявляются высокие требования к технике постановки, оборудованию, оснащению лаборатории. Значительное внимание уделяется обеспечению качества иммуноферментных тест-систем.
Заявляемое изобретение обеспечивает получение контрольных образцов, содержащих специфические антитела, обладающих высокой специфичностью, детектируемостью, и в то же время стандартных и экономически доступных. Забор крови для получения контрольных образцов, содержащих специфические антитела к вирусным респираторным инфекциям КРС, осуществляют при забое скота на мясокомбинате.
Основным критерием чувствительности диагностикумов для серологических анализов служит значение аналитического сигнала контрольной положительной сыворотки. При этом обязательным условием работоспособности тест-систем является уровень этого аналитического сигнала, который не должен быть ниже аттестованной величины.
При производстве тест-систем традиционно применяют в качестве контроля образцы сыворотки крови животных, содержащие антитела, аналогичные определяемым в организме с перенесенным или текущим инфекционным заболеванием. Образование специфических антител является ответной реакцией организма на циркулирование биологических агентов, вызывающих данное инфекционное заболевание.
Содержащий специфические антитела контрольный образец сыворотки крови должен отвечать следующим требованиям: специфичностью (способность связываться с антигеном) и детектируемостью (возможность определения иммуноглобулинов КРС с использованием антивидового иммунопероксидазного коньюгата).
Способ осуществляют следующим образом.
Пример 1. Приготовление антигена вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и синтез на его основе иммуносорбента.
50
3
В заявляемом методе антиген вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) готовится следующим способом: монослой перевиваемой линии клеток МДВК после репродукции вируса ИРТ штамма ТК-А (ВИЭВ) В2 с активностью 7,5-8,5 lg ТЦД/см осаждают центрифугировагием и ресуспендируют в 0,01 М калийфосфатном буфере, содержащем 0,15 М натрия хлористого, 1% тритона Х-100, pH 7,2-7,4. Полученную суспензию обрабатывают ультразвуком на аппарате типа УЗДН-21 мощностью 22 кГц импульсивно 6 раз по 30 секунд. После дезинтеграт центрифугируют при 5 тыс.об/мин в течение 25-30 мин. Образовавшийся осадок отбрасывают, а супернатант разводят в 10 объемах калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, pH 7,2-7,4. Полученную антигенсодержащую суспензию наносят на колонку с иммуносорбентом (BrCN сефароза с иммобилизованными в качестве лиганда специфическими антителами к антигенам вируса ИРТ). После часовой инкубации в режиме реактора колонку промывают 10 объемами калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, 0,1% тритона Х-100, pH 7,2-7,4 и 5 объемами калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, pH 7,2-7,4. После промывки колонки антигены элюируют 0,1 М глициновым буфером, pH 2,2. Полученный таким образом антиген вируса ИРТ является комплексом гликопротеинов с молекулярной массой от 54 до 180 килодальтон.
СИНТЕЗ ИММУНОСОРБЕНТА.
3
Антиген вируса ИРТ продиализовывают сутки при +4°С против 0,1 М NaHCO, содержащем 0,5 М NaCl pH 8,2 в объеме 11 мл и общей концентрацией белка 21,6 мг.
Берут 5 г BrCN-сефарозы 4В, заливают 20 мл 1 мМ HCl, pH 3,0 и перемешивают стеклянной палочкой 1-3 минуты, переносят гель на стеклянный фильтр и промывают 1 л 1 мМ HCl pH 3,0.
3
Обработанный гель отжимают с помощью водоструйного насоса и переносят в центрифужный пластиковый стакан, смешивают гель с 25 мл раствора вирусного антигена ИРТ (2,0 мг/мл) в 0,1 М NaHCO, содержащем 0,5 М NaCl pH 8,2.
Колбу укрепляют с помощью зажима на ротационной мешалке и перемешивают суспензию 2 часа при температуре 20-25°С.
Затем суспензию переносят на стеклянный фильтр и промывают гель последовательно растворами:
3
1. 0,1 М NaHCO, содержащем 0,5 М NaCl pH 8,2;
2. 0,05 М ацетатный буфер с 1,0 М или 0,5 М NaCl pH 4,0;
3. 0,1 М глицин-HCl буфер pH 2,0;
3
4. 0,1 М NaHCO, содержащем 0,5 М NaCl pH 8,2.
280
Каждым раствором гель промывают пятикратно, порциями по 20 мл. Измеряют на спектрофотометре СФ-26 Д во всех порциях промывных растворов и определяют по материальному балансу количество иммобилизованного вирусного антигена.
Переносят гель в круглодонную колбу и заливают его 1 М моноэтаноламином pH 8,0, перемешивают полученную суспензию на роторной мешалке в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего промывают гель на стеклянном фильтре 100 мл физиологического раствора, забуференного фосфатами pH 7,2-7,4 (10 мМ фосфат с 0,15 М NaCl) - ЗФР.
Суспензией геля заполняют колонку 0,9×15 см или 1,5×30 см.
Синтезированный иммуносорбент хранят при +4°С в физиологическом буферном растворе (ФБР), содержащем 0,01% мертиолята.
Полученный таким образом иммуносорбент используют для аффинного выделения специфических анти-ИРТ антител не только из сыворотки естественно переболевших животных, но и из сыворотки крови животных при убое на мясокомбинатах.
Элюирование специфических антител.
После заполнения колонки иммуносорбентом с вирусными белками ИРТ его трижды промывают 0,1 М глицин-HCl pH 2,0 и ЗФР, затем уравновешивают забуференным физиологическим раствором (ЗФР), содержащим 0,1% тритон Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускают сыворотку крови в режиме замкнутого реактора в течение 18 часов при +4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюируют специфические антитела к вирусным белкам ИРТ 0,1 М глицин HCl, pH 2,4. Элюат немедленно нейтрализуют 1 М NaOH.
После элюирования специфических антител колонки с иммуносорбентом используют многократно для адсорбции.
Пример 2. Приготовление антигена респираторно-синцитиального вируса (PC) и синтез на его основе иммуносорбента.
50
Берут PC-вирус, штамм «Randall», с титром инфекционности 3,5-3,9 lg ТЦД/мл, репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки теленка - ПТ-80 или перевиваемой линии ВНК-21.
Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляют на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.
Концентрирование PC-вируса проводят осаждением полиэтиленгликолем (ПЭГ), высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием.
В работе по очистке PC-вируса от балластных белков используют ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяют на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля используют дезинтегрированные ультразвуком незараженные PC-вирусом клетки ПТ-80.
Белки PC-вируса штамма «Randall» отщепляют путем обработки вируссодержащей суспензии тритоном Х-100.
Для изучения белков, входящих в состав PC-вируса КРС, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), антигенную активность препарата подтверждают в иммуноблотинге (ИБ). ДСН-ПААГ проводят в буферной системе Laemmi в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 B.
Вирусные белки, индуцирующие выработку антивирусных антител у восприимчивых к PC инфекции животных, определяют посредством иммуноблотинга (ИБ). Для постановки ИБ белки после электрофоретического разделения не окрашивают, а переносят на нитроцеллюлозную мембрану "Immobilon-NC" (Millipore) в «полусухой» буферной системе при постоянной силе тока 200 мА в течение часа при комнатной температуре. Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляют с помощью непрямого ИФА с соблюдением всех его стадий. В качестве основных иммунологических реагентов, обеспечивающих формирование нерастворимого иммунного комплекса на мембране, используют вирусоспецифическую положительную сыворотку и аффинно-очищенные антитела к Ig G крупного рогатого скота, меченые пероксидазой хрена.
Концентрированные и очищенные белки PC-вируса, отщепленные тритоном Х-100, иммобилизуют на BrCN сефарозу 4В по стандартной методике, как описано в примере 1 - синтез иммуносорбента.
Полученный таким образом иммуносорбент используют для аффинного выделения специфических анти-РСВ антител не только из сыворотки естественно переболевших животных, но и из сыворотки крови животных при убое на мясокомбинатах.
Элюирование специфических антител.
После заполнения колонки иммуносорбентом с вирусными белками PC инфекции КРС его трижды промывают 0,1 М глицин-HCl pH 2,0 и забуференным физиологическим раствором (ЗФР), затем уравновешивают ЗФР, содержащим 0,1% тритон Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускают сыворотку крови в режиме замкнутого реактора в течение 10 часов при +4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюируют специфические антитела к вирусным белкам PC инфекции КРС 0,1 М глицин HCl, pH 2,4. Элюат немедленно нейтрализуют 1 М NaOH.
После элюирования специфических антител колонки с иммуносорбентом используют многократно для адсорбции.
Пример 3. Приготовление антигена вируса аденовирусной инфекции (АВИ) и синтез на его основе иммуносорбента.
50
Вирус АВИ, штамм «Bovine 10» (серотип 1), с титром инфекционности 4,0-4,5 Ig ТЦД/мл репродуцируют в перевиваемой культуре клеток почки теленка - Т-1.
Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляют на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.
Концентрирование вируса АВИ проводят осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием.
В работе по очистке вируса АВИ от балластных белков используют ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяют на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля используют дезинтегрированные ультразвуком незараженные вирусом АВИ клетки Т-1.
Белки вируса АВИ штамма «Bovine 10» отщепляют путем обработки вируссодержащей суспензии тритоном Х-100.
Для изучения белков, входящих в состав вируса АВИ КРС, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), антигенную активность препарата подтверждают в иммуноблотинге (ИБ). ДСН-ПААГ проводят в буферной системе Laemmi в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 B.
Вирусные белки, индуцирующие выработку антивирусных антител у восприимчивых к АВИ животных, определяют посредством иммуноблотинга (ИБ). Для постановки ИБ белки после электрофоретического разделения не окрашивают, а переносят на нитроцеллюлозную мембрану "Immobilon-NC" (Millipore) в «полусухой» буферной системе при постоянной силе тока 200 мА в течение часа при комнатной температуре. Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляют с помощью непрямого ИФА с соблюдением всех его стадий. В качестве основных иммунологических реагентов, обеспечивающих формирование нерастворимого иммунного комплекса на мембране, используют вирусоспецифическую положительную сыворотку и аффинно-очищенные антитела к Ig G крупного рогатого скота, меченые пероксидазой хрена.
Концентрированные и очищенные белки вируса АВИ, отщепленные тритоном Х-100, иммобилизуют на BrCN сефарозу 4В по стандартной методике, как описано в примере 1 - синтез иммуносорбента.
Полученный таким образом иммуносорбент используют для аффинного выделения специфических анти-АВИ антител из сыворотки крови естественно переболевших животных или из сывороток крови животных при убое на мясокомбинатах.
Элюирование специфических антител.
После заполнения колонки иммуносорбентом его трижды промывают 0,1 М глицин-HCl pH 2,0 и ЗФР, затем уравновешивают ЗФР, содержащим 0,1% тритон Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускают сыворотку крови в режиме замкнутого реактора в течение 10 часов при +4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюируют специфические антитела к вирусным белкам АВИ 0,1 М глицин HCl, pH 2,4. Элюат немедленно нейтрализуют 1 М NaOH.
После элюирования специфических антител колонки с иммуносорбентом используют многократно для адсорбции.
Пример 4. Приготовление антигена вируса парагриппа-3 (ПГ-3) и синтез на его основе иммуносорбента.
50
Вирус парагриппа-3 штамма «3КСМ», с титром инфекционности 6,0-7,0 lg ТЦД/мл репродуцируют в перевиваемой культуре клеток почки теленка - ПТ-80.
Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляют на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.
Концентрирование вируса ПГ-3 проводят осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием.
В работе по очистке вируса ПГ-3 от балластных белков используют ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяют на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля используют дезинтегрированные ультразвуком незараженные вирусом ПГ-3 клетки ПТ-80.
Белки вируса ПГ-3 штамма «Randall» отщепляют путем обработки вируссодержащей суспензии тритоном Х-100.
Для изучения белков, входящих в состав вируса ПГ-3 КРС, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), антигенную активность препарата подтверждают в иммуноблотинге (ИБ). ДСН-ПААГ проводят в буферной системе Laemmi в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 B.
Вирусные белки, индуцирующие выработку антивирусных антител у восприимчивых к ПГ-3 животных, определяют посредством иммуноблотинга (ИБ). Для постановки ИБ белки после электрофоретического разделения не окрашивают, а переносят на нитроцеллюлозную мембрану "Immobilon-NC" (Millipore) в «полусухой» буферной системе при постоянной силе тока 200 мА в течение часа при комнатной температуре. Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляют с помощью непрямого ИФА с соблюдением всех его стадий. В качестве основных иммунологических реагентов, обеспечивающих формирование нерастворимого иммунного комплекса на мембране, используют вирусоспецифическую положительную сыворотку и аффинно-очищенные антитела к Ig G крупного рогатого скота, меченые пероксидазой хрена.
Концентрированные и очищенные белки вируса ПГ-3, отщепленные тритоном Х-100, иммобилизуют на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике, как описано в примере 1 - синтез иммуносорбента.
Полученный таким образом иммуносорбент используют для аффинного выделения специфических анти-ПГ-3 антител из сыворотки естественно переболевших животных или из сывороток крови животных при убое скота на мясокомбинате.
Элюирование специфических антител.
После заполнения колонки иммуносорбентом с нагруженными на нем вирусными белками ПГ-3 КРС его трижды промывают 0,1 М глицин-HCl pH 2,0 и ЗФР, затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0,1% тритон Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускают сыворотку крови животных в режиме замкнутого реактора в течение 10 часов при +4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюируют специфические антитела к вирусным белкам ПГ-3 0,1 М глицин HCl, pH 2,4. Элюат немедленно нейтрализуют 1 М NaOH.
После элюирования специфических антител колонки с иммуносорбентом используют многократно для адсорбции.
Пример 5. Приготовление антигена вируса вирусной диареи-болезни слизистой (ВД-БС) и синтез на его основе иммуносорбента.
50
Вирус ВД-БС, штамм «Oregon C24 V», с титром инфекционности 5,5-6,5 lg ТЦД/мл репродуцируют в перевиваемой культуре клеток МДВК.
Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляют на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.
Концентрирование вируса ВД-БС проводят осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием.
В работе по очистке вируса ВД-БС от балластных белков используют ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяют на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля используют дезинтегрированные ультразвуком незараженные вирусом ВД-БС клетки МДВК.
Белки вируса ВД-БС штамма «Oregon C24 V» отщепляют путем обработки вируссодержащей суспензии тритоном Х-100.
Для изучения белков, входящих в состав вируса ВД-БС КРС, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), антигенную активность препарата подтверждают в иммуноблотинге (ИБ). ДСН-ПААГ проводят в буферной системе Laemmi в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 B.
Вирусные белки, индуцирующие выработку антивирусных антител у восприимчивых к ВД-БС животных, определяют посредством иммуноблотинга (ИБ). Для постановки ИБ белки после электрофоретического разделения не окрашивают, а переносят на нитроцеллюлозную мембрану "Immobilon-NC" (Millipore) в «полусухой» буферной системе при постоянной силе тока 200 мА в течение часа при комнатной температуре. Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляют с помощью непрямого ИФА с соблюдением всех его стадий. В качестве основных иммунологических реагентов, обеспечивающих формирование нерастворимого иммунного комплекса на мембране, используют вирусоспецифическую положительную сыворотку и аффинно-очищенные антитела к Ig G крупного рогатого скота, меченые пероксидазой хрена.
Концентрированные и очищенные белки вируса ВД-БС, отщепленные тритоном Х-100, иммобилизуют на BrCN сефарозу 4В по стандартной методике, как описано в примере 1 - синтез иммуносорбента.
Полученный таким образом иммуносорбент с вирусными белками ВД-БС КРС используют для аффинного выделения специфических анти-ВД-БС антител из сыворотки естественно переболевших животных или сывороток крови животных при убое скота на мясокомбинате.
Элюирование специфических анти-ВД-БС антител.
После заполнения колонки иммуносорбентом его трижды промывают 0,1 М глицин-HCl pH 2,0 и ЗФР, затем уравновешивают ЗФР, содержащим 0,1% тритон Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускают сыворотку крови животных в режиме замкнутого реактора в течение 10 часов при +4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюируют специфические анти-ВД-БС антитела 0,1 М глицин HCl, pH 2,4. Элюат немедленно нейтрализуют 1 М NaOH.
После элюирования специфических антител колонки с иммуносорбентом используют многократно для адсорбции.
Пример 6. Определение допустимых величин оптической плотности (ОП) контрольных сывороток.
Для получения достоверных результатов при тестировании сывороток по одному разведению необходимо было определить допустимые величины оптической плотности контрольных сывороток. Для исследования брали 17 повторных проб положительной и отрицательной контрольных сывороток в разведении 1:400. Получили, что значения оптической плотности контрольных сывороток в диапазоне от 0,949 до 1,309 для положительного контроля и от 0,102 до 0,142 для отрицательного контроля являются оптимальными (Таблица).
Если значения оптической плотности контрольных сывороток выходят за рамки допустимых значений, то результаты реакции будут считаться сомнительными, и пробы должны быть исследованы заново.
Таблица
Допустимые значения ОП контрольных сывороток.
Показатели
Положительный контроль (Р)
Отрицательный контроль (N)
Разница между контролями (P-N)
Среднее значение стандартного отклонения ±&
1,129±0,18
0,122±0,02
1,006±0,135
Доверительный интервал
0,949-1,309
0,102-0,142
0,871-1,141
Источники информации
1. Абекромби Д., Алленмарк С., Дин П., Джонсон У. Аффинная хроматография. М., Мир. - 1988. - 200 с.
2. Технические условия 19.10.97-89 «Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота», утвержденные ГУВ Госагропрома СССР от 1.08.89.
3. Технические условия 46-21-78-85 «Временная инструкция по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных ферментом пероксидазой», утвержденные ГУВ МСХ СССР 09.12.85.
4. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. - 1970 - V.227, - p.680-685.
5. RU 2122741. Способ получения стандартной панели сывороток для контроля качества тест-систем и иммуноблотов, используемых для серологической диагностики антител к вирусным инфекциям. (прототип).