Анализ статуса метилирования генов контроля клеточного цикла (p14ARF, CDKN2B и RM) при раке молочной железы

моноцентрическим раком молочной железы после органосохраняющего лечения.

Материал и методы. Проведен ретроспективный анализ историй болезни 320 больных как мультицентрическим, так и моноцентрическим раком молочной железы, получивших лечение на базе отделения радиохирургии РОНЦ им. Н.Н. Блохина и Челябинского областного онкологического диспансера за период с 1975 по 2003 г. Разделение больных на группы зависело от множественности опухолевого поражения молочных желез и характера хирургического лечения. Таким образом было сформировано три группы: больные с клинически выявленным мультицентрическим раком молочных желез Т1-2К0-2Ы0, которым было проведено органосохранное хирургическое лечение (п=61); больные с клинически выявленным мультицентрическим раком молочных желез Т1-2К0-2М0, которым проводилась радикальная мастэктомия (п=75); больные моноцентрическим раком молочных желез Т1-2К0-2М0, которым выполнено органосберегающее хирургическое лечение (п=184).

Результаты. Из 1520 больных раком молочной железы, которым было выполнено органосохранное лечение с 1975 по 2003 г. в отделении радиохирургии РОНЦ им. Н.Н. Блохина, 4 % составили больные мультицентрическим раком молочной железы. Частота выявления мультицентрического рака молочной железы по

Челябинской области за 1993-1997 гг. составила 3,7 %. Общая, безрецидивная выживаемость и выживаемость без местного рецидива в течение 10 лет у больных моноцентрическим раком молочной железы Т12К0 2М0 после органосохраняющего лечения составила соответственно 79,2 ± 3,5; 66,9 ± 3,9 и 92,4 ± 2,3 %. Общая, без-рецидивная выживаемость и выживаемость без местного рецидива в течение 10 лет у больных мультицентрическим раком молочной железы Т1-2К0-2М0 после радикальной мастэктомии составила соответственно 77,3 ± 5,8 %, 66,7 ± 6,3 % и 91,2 ± 5,4 %. Общая, безрецидивная выживаемость и выживаемость без местного рецидива в течение 10 лет у больных мультицен-трическим раком молочной железы Т12К0 2М0 после органосохраняющего лечения составила соответственно 84 ± 5,6 %, 80,3 ± 5,7 % и 92,7 ± 3,5 %. Статистически значимых различий по всем видам выживаемости между группами больных получено не было.

Выводы. Показатели 10-летней выживаемости (общей, безрецидивной и без местного рецидива) у больных мультицентрическим раком молочной после органосохраняющего лечения сопоставимы с таковыми у больных с моноцентрическим раком молочной железы после органосохраняющего лечения и у больных с мультицентрическим раком молочной железы после органоуносящего лечения.

АНАЛИЗ СТАТУСА МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОВ КОНТРОЛЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА (p14ARF, CDKN2B И RB1) ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

О.В. ВАСИЛЬЕВА1, Е.Н. ТОЛМАЧЁВА1, Е.А. МАЛИНОВСКАЯ2, Е.В. ДЕНИСОВ2,

И.Н. ЛЕБЕДЕВ1

ГУ «НИИ медицинской генетики Томского научного центра СО РАМН»1 ГУ «НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН»2

Актуальность. Рак молочной железы (РМЖ) в многостадийном процессе образования опухо-

занимает первое место среди всех онкологиче- лей нарушение функций клеточных генов может

ских заболеваний у женщин. Развитие новых происходить не только в результате генетических

методов ранней диагностики РМЖ является событий (точечные мутации, делеции, ампли-

необычайно актуальной и важной задачей. В фикация), но и в результате эпигенетических

последнее десятилетие было установлено, что изменений, в том числе локального гипермети-

лирования ДНК. В последнее время разработаны методы идентификации гиперметилированных районов ДНК, основанные на дифференциальном статусе метилирования CpG-островков в нормальных и опухолевых клетках.

Цель исследования. Изучение характера метилирования промоторных и регуляторных областей генов контроля клеточного цикла при спорадическом РМЖ. Для характеристики профиля метилирования при спорадическом РМЖ были выбраны геныp14ARF, CDKN2B и Rbl.

Материал и методы. В качестве объекта исследовались 39 опухолей РМЖ. ДНК была выделена из опухолевых образцов с использованием набора GenElute™ Mammalian Genomic DNA («Sigma», США). Метилспецифическую ПЦР проводили с использованием праймеров на промоторные регионы генов (Xing et al., 1999; Roncalli et al., 2002; Gonzalez-Gomez et al., 2003). Бисульфитную модификацию ДНК проводили в течение 1 ч при 95 °С. Модифицированную ДНК очищали с помощью набора «Wizard DNA Clean-up System» («Promega», США) в соответствии с рекомендациями производителя. Фрагменты ДНК фракционировали с помощью гель-электрофореза в 2,5 % агарозном геле и визуализировали в проходящем свете на установке «GelDoc» («Bio-Rad», США).

Результаты. Анализ статуса метилирования генар14^кр дал следующие результаты: 19 образцов из 33 имели как метилированный, так и неме-тилированный аллель, что составило около 58 % от общего количества исследуемых образцов; в четырех случаях наблюдали только метилированный аллель, что составило 12 % от общего количества. В целом аберрантное метилирование гена обнаружено в 70 % случаев. Ядерный белок р14 обладает способностью стабилизировать и активировать белок р53 - «хранитель генома», за счет инактивации белка MDM2, который вызывает деградацию р53. В то же время увеличение количества активного р53 подавляет экспрессию р14^р и активизирует транскрипцию MDM2. Таким образом, в клетке существует авторегуля-торная «петля», которая действует по механизму обратной связи и связывает экспрессию ряда генов (р53, р14АКР и MDM2). Гиперметилирование промоторной области гена р14А№ обнаружено при раке пищивода (15 %) (Xing E. et al., 1999), легкого (8 %) (Zochbauer-Muller S. et al., 2001) и

толстой кишки (28 %) (Esteller M. et al., 2001). Ген р14АКРлокализован в регионе 9p21, в одном районе с генами р16/INK4a/CDKN2А и p15/ INK4b/CDKN2В в пределах 50 тыс. п. о. Статус метилирования гена CDKN2B в опухолях РМЖ составил около 8 % (3 из 39 исследуемых образцов, причём все имели как метилированный, так и неметилированный аллель). Ген CDKN2B расположен вблизи CDKN2A, обладает с ним высокой гомологией, а его продукт, как и CDKN2A, ингибирует циклинзависимую протеинкиназу cdk4. В отличие от CDKN2A ген CDKN2B экспрессируется не постоянно, а только в ответ на действие трансформирующего фактора роста ß (TGF-ß). Гиперметилирование CDKN2B -доминирующий способ инактивации этого гена-супрессора в опухолях системы кроветворения. Частота метилирования CDKN2B при В-клеточных острых лимфолейкозах составляет 64 %, при Т-клеточных острых лимфолейкозах - 44 % и при лимфомах - 62 % (Baur A.S. et al., 1999). В солидных опухолях метилирование CDKN2B встречается редко. Статус метилирования гена Rbl был проанализирован в 36 опухолях РМЖ. Аберрантного метилирования гена Rbl в нашем исследовании не было обнаружено. Отмечен вклад аномального метилирования этого гена в происхождение других опухолей. В частности, метилирование гена Rb1 отмечено в 25 % образцов глиобластомы, а с помощью иммуногистохимических методов установлено снижение его экспрессии (Nakamura M. et al., 2001). Негативное влияние метилирования на экспрессию Rb1 показано и при раке легкого (Geradts J. et al., 1999).

Выводы. При анализе статуса метилирования трех генов контроля клеточного цикла в опухолях РМЖ наибольшая частота аберрантного метилирования промоторного региона была выявлена для гена р14АЯР (70 %), аномальное метилирование гена CDKN2B встречается редко (8%) и не обнаружено гиперметилирования гена Rb1. Метилирование промотора р14АКР снижает экспрессию гена и, таким образом, способно нарушить механизм регуляции р53-пути в клетке и, соответственно, приводить к развитию опухоли.

Работа выполнена в рамках интеграционного проекта СО РАМН «Молекулярно-генетические механизмы формирования и прогрессии РМЖ»