РАСТИТЕЛЬНАЯ КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ, ПОЛУЧЕННАЯ ИЗ КАМБИЯ ТРАВЯНИСТОГО РАСТЕНИЯ С ЗАПАСАЮЩИМ КОРНЕМ, И СПОСОБ ЕЕ ВЫДЕЛЕНИЯ
PLANT STEM CELL LINE DERIVED FROM CAMBIUM OF HERBACEOUS PLANT WITH STORAGE ROOT AND METHOD FOR ISOLATION THEREOF

Область техники
Настоящее изобретение относится к клеточной линии, полученной из камбия травянистого растения с запасающим корнем, и к способу ее выделения, а более конкретно изобретение относится к способной делиться камбиальной гомогенной клеточной линии, выделение которой из камбий-содержащей ткани травянистого растения с запасающим корнем не связано с применением отдельного процесса дедифференцировки, и к способу выделения этой линии.
Уровень техники
Panax Ginseng CA. Meyer содержит большое количество полезных веществ, таких как гинзенозиды, соединения полиацетиленов, соединения полифенолов, полисахаридосодержащие белки с иммунозащитными функциями, полисахариды с антикомплементарной активностью и кислые полисахариды. Однако его культивация связана с проблемами такими, как загрязнение пестицидами, разрушение окружающей среды и т.п. Кроме того, это очень дорого, т.к. для использования корня в медицинских целях растение необходимо культивировать, по меньшей мере, в течение 4 лет, что, следовательно, связано с большими издержками и с использованием большого количества людских ресурсов.
По этой причине проводятся исследования с применением биоинженерных подходов для получения большого количества клеток женьшеня in vitro или для получения в больших количествах его придаточных корней, волосатых корней и т.п. Сообщалось, что скорость роста клеточной массы (которая называется каллюс), полученной культивацией клеток женьшеня in vitro, с помощью культуральных подходов, выше, чем у растений женьшеня, выращиваемых в полях (Korean Patent Registration 10-0333559), и что содержание сапонина в культивируемых клетках женьшеня не намного ниже, чем в корнях женьшеня (Asaka et al., Plant Med, 59:345, 1993).
Соответственно, полученный культивацией придаточных корней женьшеня материал (женьшень, или настоящий дикий женьшень - Korea Forest Service, CBN Biotech, Neobio, KT&G Research Institute, Microplants Bioscience & Biotechnology, и пр.) или клетки женьшеня (Nitto Denko, Japan, и пр.) используются в качестве сырья при производстве продуктов питания и косметики (Korean Patent Registration 10-0601903, Korean Patent Registration 10-0637342, Korean Patent Registration 10-2004-0014584). По причине редкости и дороговизны настоящего дикого женьшеня, в различных компаниях и исследовательских центрах активно проводятся исследования, сфокусированные на культивации придаточных корней и саженцев женьшеня для получения в больших количествах женьшеньсодержащих продуктов (Korean Patent Registration 10-2005-0078372).
При получении культуры травянистых растений, таких как женьшень, настоящий дикий женьшень и т.п., тканью, используемой в качестве материала для выведения культуры, является корень, а именно запасающий корень. Ткань запасающего корня является частью <растения>, которая, будучи погруженной в почву в течение продолжительного периода времени, формирует различные взаимодействия с почвенными микроорганизмами, вбирает воду и неорганические питательные вещества в почве в течение жизни <растения>. Для того чтобы использовать ткань запасающего корня для получения культуры растительных клеток или для получения культуры ткани, необходима стерилизация ткани. Однако сообщается о множестве проблем, связанных с удалением поверхностной стерилизацией микроорганизмов с ткани корня, т.к. высокая концентрация стерилизующего раствора разрушает ткань, а низкая концентрация стерилизующего раствора приводит к контаминации препарата ткани различными грибами и бактериями. Феномен контаминации становится серьезной проблемой, особенно в случае культивируемого дикого женьшеня и настоящего дикого женьшеня, которые выращиваются в почве в течение длительного периода времени (Korean Patent Registration 10-0478213; Teng, W.L. и др., Plant Cell Tissue Organ Cult., 68:233, 2002).
Кроме того, для получения большого количества клеток из запасающего корня женьшеня, так же как и из запасающих тканей других растений, в любом из известных в настоящее время способов необходимо подвергнуть ткань запасающего корня женьшеня (дифференцированной ткани) процессу дедифференцировки в недифференцированную ткань. При этом процессе неизбежна сомаклональная изменчивость. Другими словами, для того чтобы производить клетки женьшеня в больших количествах с помощью культуры растительной ткани, в целях уменьшения сомаклональной изменчивости в качестве исходного материала необходимо использовать генетически стабильные образцы. В Korean Patent Registration 10-2005-0078372 сообщалось, что сомаклональная изменчивость происходит при использовании любой ткани женьшеня.
Между тем камбий является тканью, которая утолщает ствол и корень, помогая растению увеличиваться в объеме. Ранее сообщалось, что быстрое и массовое получение клеток возможно при использовании камбия, меристемы, в которой происходит наиболее активное деление клеток, в качестве эксплантата для получения культуры растительных клеток (Korean Patent Registration 10-0533120). Исследования структуры и ультраструктуры камбия продвигаются медленно из-за технических сложностей при использовании материала для исследований. Ранее сообщалось, что камбий легко разрушается при выделении, т.к. состоит из нескольких узких, удлиненных и тонкостенных клеточных слоев. Также ранее сообщалось, что сильно вакуолизированные, активные меристемные клетки сложно фиксировать как традиционными способами, используемыми в электронной микроскопии, так и недавно разработанными способами для изучения локализации белков, РНК и других молекул in situ (Lachaud Suzanne et al., Life Science, 633, 1999).
Кроме того, механическое изготовление срезов сплошного камбия не получило широкого распространения, что, как полагают, происходит из-за технических трудностей, связанных с выделением длинных и тонкостенных клеток камбия. Во многих работах форма, размер и расположение клеток камбия характеризовались косвенно, на основе структуры производных камбия, исходя из предположения, что структура вторичной сосудистой ткани отражает структуру камбия (Kitin, P. et al., Ann. Bot, 86:1109, 2000). Другими словами, некоторые исследования подтверждают факты существования множества трудностей, возникающих при использовании камбия непосредственно в качестве материала для исследований в различных областях.
Korean Patent Registration 10-0533120, в разработке которой приняли участие некоторые из авторов настоящего изобретения, раскрывает способ индуцирования каллюса с помощью камбия, полученного из стебля растения. Этот зарегистрированный патент относится к способу культивации растительных клеток для быстрого получения их в больших количествах и упоминает способ культивирования растительных клеток для индукции каллюса с помощью камбия, полученного из стебля растения, а не с помощью общепринятого способа культивации семян. Зарегистрированный патент предлагает способ индукции клеток камбия с помощью камбия из стебля древесного растения с добавлением высоких концентраций ауксина пиклорама и гиббереллиновой кислоты, но в этом зарегистрированном патенте каллюс индуцируется лишь из камбия стебля древесного растения. Т.к. каллюс является тканью, сформированной путем дедифференцировки, то и в случае этого зарегистрированного патента проблема изменчивости, вызванная дедифференцировкой, остается нерешенной.
Кроме того, некоторые из авторов настоящего изобретения работали над разработкой изобретения PCT/KR 2006/001544, которое решает вызванную дедифференцировкой проблему изменчивости, и относится к способу получения стабильно пролиферирующих клеточных линий с высокой генетической стабильностью. В способе, раскрытом в заявке РСТ, используется камбий стебля древесного растения, но, по причине морфологических и физиологических различий травянистых (таких, как женьшень) и древесных растений, появилась необходимость разработать более совершенное изобретение, в котором учтены особенности травянистых растений, необходимые для индукции клеточных линий из камбия ткани запасающего корня травянистого растения.
Соответственно, авторы настоящего изобретения затратили максимум усилий для получения растительной клеточной линии, которая, с одной стороны, являясь гомогенной клеточной линией и обладая способностью к делению, с другой стороны, не претерпела дедифференцировки и, таким образом, не подверглась сомаклональной изменчивости в процессе культивирования. В итоге, авторы настоящего изобретения выделили из камбия клеточную линию путем применения осмотического стресса к камбий-содержащей ткани запасающего корня с последующей культивацией ткани запасающего корня в специфической гормон-содержащей среде для растений и обнаружили, что выделенная клеточная линия гомогенна, способна неограниченно делиться, была изолирована без дедифференцировки, следовательно, не подверглась сомаклональной изменчивости и обладает, таким образом, высокой генетической стабильностью и физиологической однородностью, что делает настоящее изобретение целостным.
Сущность изобретения
Задача настоящего изобретения заключается в предоставлении полученной из камбия запасающего корня травянистого растения клеточной линии, способной делиться, гомогенной, способной стабильно пролиферировать в процессе культивирования.
Следующая задача настоящего изобретения заключается в предоставлении способа выделения упомянутой клеточной линии без применения процесса дедифференцировки.
Для достижения вышеуказанных задач в одном аспекте настоящее изобретение предоставляет способ для выделения клеточной линии, полученной из камбия травянистого растения с запасающим корнем, состоящий из следующих этапов:
(а) получение ткани запасающего корня, содержащей камбий травянистого растения с запасающим корнем;
(б) индукция камбиальной клеточной линии путем культивации полученной камбий-содержащей ткани запасающего корня в среде, содержащей IAA (индолил-3-уксусную кислоту) или IBA (индолил-3-масляную кислоту), в процессе которой к камбий-содержащей ткани запасающего корня прилагается осмотический стресс в течение, до или после культивирования; и
(в) сбор индуцированной камбиальной клеточной линии.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет клеточную линию, полученную из камбия травянистого растения с запасающим корнем и обладающую следующими характеристиками:
(а) клеточная линия находится в естественно недифференцированном состоянии;
(б) клеточная линия является гомогенной и
(в) клеточная линия морфологически характеризуется многочисленными вакуолями.
В еще одной задаче настоящее изобретение предоставляет способ для сохранения клеточной линии травянистого растения, содержащий этап замораживания клеточной линии, полученной из камбия травянистого растения с запасающим корнем.
Другие особенности и аспекты настоящего изобретения будут видны из последующего детального описания и приложенной формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлено изображение типичного культивируемого в открытом грунте женьшеня, использованного в настоящем изобретении.
На фиг.2 представлено изображение приготовленного эксплантата, содержащего камбий запасающего корня женьшеня среди растительных запасающих тканей.
На фиг.3(a) продемонстрирована обладающая способностью к делению гомогенная клеточная линия, которая была специфично индуцирована в эксплантате, содержащем камбий корня женьшеня, а на фиг.3(b) показано, что при использовании общей системы культивирования клетки индуцировались по всему сечению эксплантата.
На фиг.4(a) перед выделением из среды представлена клеточная линия, полученная из камбия корней женьшеня, который индуцировали, выделяли и наращивали в питательной среде; на фиг.4(b) представлена полученная из камбия клеточная линия, которую выделили и нарастили в большом количестве; на фиг.4(c) представлено оптическое микроизображение полученной из камбия клеточной линии на одноклеточном уровне; и на фиг.4(d) представлено оптическое микроизображение полученного из семядоли женьшеня каллюса на одноклеточном уровне (КСТС 10224).
На фиг.5(a) представлено изображение гомогенной клеточной линии, обладающей способностью к делению, которую специфично индуцировали в камбий-содержащем эксплантате настоящего дикого женьшеня, на фиг.5(b) представлено изображение полученной из камбия клеточной линии, которую выделили и нарастили в больших количествах, и на фиг.5(c) представлена оптическая микрофотография полученной из камбия клеточной линии на одноклеточном уровне.
На фиг.6 представлено изображение гомогенной клеточной линии, полученной из индуцированного камбия камбий-содержащего эксплантата корня моркови.
На фиг.7 показаны кривые роста клеточной линии, полученной из камбия женьшеня (A) и клеточной линии, полученной из семядоли женьшеня (B) за соответствующий культуральный период.
На фиг.8(a) представлено микроскопическое изображение, демонстрирующее одноклеточную популяцию клеточной линии, полученной из камбия женьшеня, а на фиг.8(b) представлено микроскопическое изображение находящейся в виде больших клеточных агрегатов популяции гетерогенной клеточной линии, полученной из семядоли женьшеня.
На фиг.9 представлены фотографии культуры клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня: в культуральной колбе (фиг.9(a)), в 3-литровом биореакторе (фиг.9(b)) и в 20-литровом биореакторе (фиг.9(c)).
На фиг.10 представлена диаграмма, демонстрирующая, как ингибируется экспрессия ММР-1, обычно возрастающая в ответ на облучение ультрафиолетовыми лучами (УФВ), в нормальных человеческих кожных фибробластах (NHF), обработанных перед облучением УФВ различными концентрациями экстракта гомогенной клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня, или различными концентрациями ее культуры. Обозначения фиг.10: сырая биомасса клеток женьшеня, сухая биомасса клеток женьшеня, среда для культивирования клеток женьшеня, Е1: стадия элиситации 1; Е2: стадия элиситации 2; G - стадия роста и RA: ретиноевая кислота.
На фиг.11 представлена графическая диаграмма, демонстрирующая как ингибируется активный кислород, обычно возрастающий в ответ на облучение ультрафиолетовыми лучами (УФВ), экстрактом гомогенной клеточной культуры, полученной из камбия истинно дикого женьшеня или его культуры, в нормальных человеческих фибробластах кожи (NHF), обработанных перед облучением УФВ различными концентрациями экстракта гомогенной клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня, или различными концентрациями ее культуральной среды. Обозначения фиг.11: сырая биомасса клеток женьшеня, сухая биомасса клеток женьшеня, среда для культивирования клеток женьшеня, Е1: стадия элиситации 1; Е2: стадия элиситации 2; G - стадия роста.
Подробное описание изобретения и предпочтительных вариантов воплощения
Если иное не определено, то все использованные здесь технические и научные термины имеют тот же смысл, который вкладывается в них обычным специалистом в данной области. Как правило, определения используемых здесь различных терминов хорошо известны и традиционно используются в данной области.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу для выделения клеточной линии из камбия травянистого растения с запасающим корнем.
Для формирования каллюса, при использовании листьев, стеблей и корней, уже являющихся дифференцированными тканями, необходимо подвергнуть их процессу дедифференцировки, при котором дифференцированная ткань превращается в недифференцированную. В процессе дедифференцировки происходит сомаклональная изменчивость, ведущая к клеточной нестабильности.
Поэтому авторы настоящего изобретения провели исследования на системе растительных клеток либо с небольшой сомаклональной изменчивостью, либо вообще без нее. В результате настоящие исследователи обнаружили, что при индукции клеточной линии только из являющегося меристемой камбия отпадает необходимость проведения дедифференцировки, т.к. меристема сама по себе способна активно делиться, что приводит к отсутствию сомаклональной изменчивости, и, таким образом, в камбии может быть индуцирована высокостабильная генетически и физиологически однородная гомогенная клеточная линия. На основании этих данных авторы настоящего изобретения выделили из камбия клеточную линию. Способ выделения по настоящему изобретению состоит из следующих этапов: (а) получение ткани содержащих камбий запасающих корней травянистого растения; (б) индукция камбиальной клеточной линии путем культивации полученной камбий-содержащей ткани запасающего корня в среде, содержащей IAA (индолил-3-уксусную кислоту) или IBA (индолил-3-масляную кислоту), в процессе которой к камбий-содержащей ткани запасающего корня прилагается осмотический стресс в течение, до или после культивирования; и (в) сбор индуцированной камбиальной клеточной линии.
На этапе (б) предложенного способа применение осмотического стресса проводится в целях индукции клеточной линии именно в камбии. Предпочтительно, чтобы стресс применялся перед культивацией ткани в среде, содержащей IAA или IBA, так чтобы основные ткани (т.е. первичная кора, флоэма, ксилема и паренхима), за исключением камбия, потеряли способность к делению, после чего превратились в некротическую ткань до обработки камбиальными гормонами для деления, такими как IAA или IBA.
Предпочтительно, если этап (в) проводится наращиванием индуцированной камбиальной клеточной линии в среде, содержащей одно или более из перечисленных соединений: 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), picloram и IBA, с последующим сбором камбиальной клеточной линии.
Далее способ по настоящему изобретению будет описан подробно.
(1) Стерилизация и обработка осмотическим стрессом.
Во-первых, готовят содержащую камбий ткань запасающего корня травянистого растения и затем подвергают ее стерилизации. При этом стерилизацию осуществляют в два этапа. Затем стерильную камбий-содержащую ткань запасающего корня подвергают обработке осмотическим стрессом таким образом, чтобы в экстремальных условиях основные ткани (т.е. первичная кора, флоэма, ксилема и паренхима), за исключением камбия, потеряли способность к делению и превратились в некротическую ткань до обработки камбиальными гормонами деления, такими как IAA или IBA, и способная делиться гомогенная клеточная линия специфически индуцировалась только в камбии. Здесь в качестве неограничивающих примеров осмотических агентов рассматриваются сахара, такие как сахароза, сахарные спирты, такие как сорбитол, и соли, такие как хлорид натрия.
Здесь, предпочтительно, если осмотический агент используется в концентрации 0,5-2 М, а осмотический стресс применяется на холоде или при комнатной температуре в течение 16-24 часов, после чего вызывающий его агент удаляется. Однако сфера данного изобретения не ограничивается указанным выше, т.к. концентрация, время обработки и температура осмотического агента могут различаться в зависимости от типа растения и состояния ткани.
При этом настоящее изобретения отличается тем, что после обработки осмотическим стрессом проводятся этапы устранения осмотического стресса и адаптации клеток к индуцирующей среде. В целях освобождения от осмотического стресса концентрация осмотического агента резко уменьшается до, например, 0,03-0,05 М и затем применяется к эксплантату. Здесь время обработки предпочтительно составляет 1-15 минут. Также, если эксплантат продолжительно экспонируется при вышеописанной низкой концентрации осмотического агента и низкая концентрация осмотического агента отличается от его концентрации в среде, индуцирующей камбиальную клеточную линию, то это различие может также действовать как осмотический стресс в процессе культивирования. По этой причине желательно в дальнейшем проводить этап адаптации эксплантатов к индукционной среде. Этап адаптации эксплантата к индукционной среде проводят обработкой эксплантата, после снятия осмотического стресса, осмотическим агентом в концентрации подобной концентрации индуцирующей среды. При этом эксплантат предпочтительно обрабатывают осмотическим агентом в концентрации 0,08-0,1 М в течение 1-15 минут.
В одном примере настоящего изобретения обработанную осмотическим стрессом группу сравнивали с контрольной группой, которую не обрабатывали осмотическим стрессом. При этом в контрольной, не обработанной осмотическим стрессом, группе не была выявлена индукция камбиальной клеточной линии, что подтверждает факт того, что этап обработки осмотическим стрессом является необходимым для индукции клеточной линии из камбия травянистого растения с запасающим корнем.
(2) Индукция клеточной линии из камбия травянистого растения с запасающим корнем.
После обработки осмотическим стрессом, в целях индукции клеточной линии из камбия травянистого растения, подвергшуюся осмотическому стрессу ткань помещают в культуральную среду, содержащую IAA и IBA, так чтобы для получения камбиальной клеточной линии клеточное деление специфично индуцировалось только в камбии. Предпочтительно, если содержащие камбий эксплантаты размещаются в среде, содержащей 0,5-3,0 мг/л IAA или IBA.
Если IAA добавляют в среду для индукции клеточной линии, то происходит объединение с содержащейся в растениях эндогенной IAA, что дает синергидный эффект на камбиальную активность. В результате синергидного эффекта гомогенная клеточная линия специфично индуцируется только в камбии, из-за разницы в активности клеточного деления между дифференцированной тканью и меристемой, которой является камбий. Между тем, ранее сообщалось, что IAA является первичным естественным ауксином, в то время как IBA является вторичным естественным ауксином (Andrew et al., Ann. Bot, 95:707, 2005).
В одном примере настоящего изобретения после обработки осмотическим стрессом эксплантат обрабатывали другими растительными гормонами-ауксинами, такими как пиклорам, 2,4-D, CPA и NAA. Однако было показано, что только IAA и IBA эффективны при индукции клеточной линии из камбия травянистого растения с корнем хранения.
(3) Пролиферация клеточной линии, полученной из камбия травянистого растения с корнем хранения.
Камбиальная гомогенная клеточная линия, индуцированная, как описано выше, может быть перенесена в оптимальную питательную среду, содержащую регулятор роста растений ауксин для наращивания гомогенной клеточной линии в больших количествах. При этом в качестве регуляторов роста предпочтительно используют отдельно или вместе 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту), picloram и IBA. Любое из перечисленных, 2,4-D, picloram и IBA, предпочтительно используют в количестве 1-5 мг/л, а более предпочтительно - 2 мг/л.
Среда, используемая в настоящем изобретении, является обычной средой для культивирования растительной ткани, и примеры ее могут включать, не ограничиваясь перечисленным, среду N6, среду SH, среду MS, среду АА, среду LS, среду В5, среду WPM, среду LP, среду White, среду GD, среду DKW, среду DCR и т.д.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к клеточной линии, полученной из камбия травянистого растения с запасающим корнем и обладающей следующими характеристиками:
(а) клеточная линия находится в естественно недифференцированном состоянии;
(б) клеточная линия является гомогенной и
(в) клеточная линия морфологически характеризуется многочисленными вакуолями.
Камбиальная клеточная линия по настоящему изобретению дополнительно характеризуется тем, что: (а) в суспензионной культуре находится в одноклеточном состоянии; (б) имеет слабую чувствительность к механическому стрессу в биореакторе по сравнению с клеточными линиями, полученными из тканей, отличных от камбия травянистого растения с запасающим корнем; и (в) обладает высокой скоростью роста и стабильно культивируется по сравнению с клеточными линиями, полученными из тканей, отличных от камбия травянистого растения с запасающим корнем.
В одном примере настоящего изобретения видно, что камбиальную клеточную линию по настоящему изобретению, можно культивировать в больших масштабах не только в 3-литровом биореакторе, но даже и в 20-литровом биореакторе. Также было отмечено, что камбиальная клеточная линия по настоящему изобретению обладает в 5-9 раз более низкой чувствительностью к механическому стрессу по сравнению с клеточными линиями, полученными из отличных от камбия тканей, и имеет в 3-5 раз более высокую скорость роста по сравнению с клеточными линиями, полученными из отличных от камбия тканей. При этом при культивировании камбиальной клеточной линии в течение 11 месяцев или более было показано, что ее скорость роста отличается максимум в 400 раз от скорости роста клеточных линий, полученных из отличных от камбия тканей.
В другом примере настоящего изобретения было показано, что экстракт клеточной линии и культуральная среда по настоящему изобретению обладают эффектом ингибирования экспрессии ММР-1 (деградирующей коллаген кожи и формирующей морщины на коже), таким образом наводя на мысль о том, что экстракт и среда обладают эффектами предотвращения образования и уменьшения морщин. В еще одном примере настоящего изобретения был подтвержден факт того, что экстракт клеточной линии и культуральная среда ингибируют индуцированный УФ-излучением активный кислород, наводя на мысль о том, что они обладают антиоксидантным эффектом.
В еще одной задаче настоящее изобретение относится к способу сохранения клеточной линии травянистого растения, содержащему этап замораживания клеточной линии, полученной из камбия травянистого растения с запасающим корнем.
В одном примере настоящего изобретения испытания по криоконсервации проводили для клеточной линии, полученной из семядоли женьшеня, и для гомогенной клеточной линии, полученной из камбия женьшеня. В результате было показано, что клеточная линия, полученная из семядоли женьшеня, не восстанавливается после разморозки, в то время как гомогенная клеточная линия, полученная из камбия женьшеня, после разморозки восстанавливается и начинает пролиферировать.
Возможность криоконсервации клеточных линий делает возможным стабильное снабжение сырьем и создание значительного банка клеточных линий. Таким образом, патентоспособная клеточная линия, полученная из камбия травянистого растения с запасающим корнем, позволяет продолжительное и стабильное снабжение клеточной линией травянистого растения.
Мир сейчас находится в состоянии войны за обеспечение безопасности исследовательских материалов (биологических ресурсов), а также за сохранение и идентификацию ставших важной государственной собственностью биологических ресурсов, таких как ткани человека, семена растений, микроорганизмы, клетки и гены, для разработки различных новых лекарственных средств и для улучшения качества пищи. Соответственно, поскольку обеспечение безопасности исследовательских материалов ведет к повышению национальной конкурентоспособности, необходимо создавать банки клеточных линий для развития, сбора, сохранения и распространения клеточных линий, используемых в качестве незаменимых материалов в исследованиях в области бионаук. Таким образом, после создания таких банков растительных клеток, снабжение исследовательскими материалами становится простым, а время исследований с использованием растительных клеточных линий сокращается.
Настоящее изобретение отличается использованием камбия запасающего корня и применимо ко всем видам травянистых растений с основными запасающими корнями. Другими словами, хотя в одном примере настоящего изобретения клеточные линии изолировали из камбия запасающего корня женьшеня, из камбия запасающего корня настоящего дикого женьшеня и из камбия запасающего корня моркови, специалисту в данной области будет очевидно, что способ настоящего изобретения может быть применен к любому травянистому растению, в том случае если травянистое растение обладает запасающим корнем. Примеры травянистых растений с запасающими корнями включают в том числе Codonopsis lanceolata, Ostericum koreanum KITAGAWA, Platycodon grandiflorum, Pueraria thunbergiaana, Aralia contonentalis Kitagawa, Ledebouriella seseloides, Angelica gigas NAKAI, морковь, сладкий картофель, мака, маниоку, женьшень, настоящий дикий женьшень, женьшень, культивируемый в открытом грунте, и т.д. Также под патентоспособной камбий-содержащей запасающей тканью травянистого растения с запасающим корнем подразумевается не только ткань запасающего корня грунтового растения, но и культуры тканей (придаточные корни и клеточные линии, полученные из придаточного корня).
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Далее по тексту настоящее изобретение будет описано более подробно с отсылкой на примеры. Для специалиста в данной области будет очевидно, что эти примеры приведены исключительно для иллюстративных целей и не должны трактоваться с ограничением сферы применения настоящего изобретения, т.к. эти примеры могут модифицироваться в другие различные формы.
Пример 1. Выделение клеточной линии, полученной из камбия травянистого растения с запасающим корнем: (I) - женьшень
1-1: Подготовка растительного материала
На фиг.1 представлено изображение типичного культивируемого в открытом грунте женьшеня, использованного в настоящем изобретении. Как видно по фиг.1, отобрали и собрали только гладкий и неповрежденный женьшень. Собранный женьшень отмыли в проточной воде для удаления с внешней поверхности женьшеня почвы и других загрязнителей. Затем тонкие корни женьшеня удаляли, чтобы оставить только главный корень и поверхность главного корня отмывали с помощью жидкого детергента и затем главный корень оставляли в проточной воде. Отмытую ткань помещали в ламинаре в стерильный флакон и стерилизовали 70% этанолом в течение от 30 секунд до 1 минуты. Затем ткань промывали стерильной дистиллированной водой и дезинфицировали в 1-1,5% растворе гипохлорита натрия (Junsei, Япония) в течение 5-8 минут. Затем дезинфицирующий раствор удаляли и ткань промывали один или несколько раз стерильной дистиллированной водой и затем вторично обрабатывали дезинфицирующим раствором в течение около 5-8 минут. При этом для проникновения дезинфицирующего раствора в ткань к дезинфицирующему раствору добавляли несколько капель TWEEN 20 (Полиоксиэтиленсорбитан монолаурат, Junsei, Япония), после чего обработанную ткань промывали 3-5 раз стерильной дистиллированной водой. Затем, в целях предотвращения потемнения стерилизованной ткани, стерилизованный основной корень помещали в содержащую антиоксиданты среду для ингибирования потемнения (BIM) и инкубировали со встряхиванием в течение от около 30 мин до 1 часа. Затем удаляли из ткани влагу с помощью стерилизованной фильтровальной бумаги.
Таблица 1
Состав и концентрация среды для ингибирования потемнения (BIM) (соли добавляли в количестве, соответствующем 1/4 суммарной концентрации)
Компонент
Концентрация
соль McCown WPM
1/4 суммарной
Сахароза
1% (в/о)
Поливинилпирролидон
0,5% (в/о)
Аскорбиновая кислота
100 мг/л
Лимонная кислота
150 мг/л
pH до 5,8
Затем, в целях предотвращения потемнения материала, основной корень помещали в стерильную чашку, содержащую CS-раствор (cutting solution) с антиоксидантом, представленный в таблице 2 ниже, после чего основной корень тонко очищали и разрезали на две части. Заготовки нарезались тонкими слоями размером 0,5-0,7 см (ширина)×0,5-0,7 см (длина)×0,2-0,5 мм (высота), так чтобы в заготовки попадал способный активно делиться камбий. На фиг.2 показан содержащий камбий эксплантат, подготовленный нарезанием запасающего корня женьшеня в заданных выше размерах.
Таблица 2
CS-раствор (cutting solution)
Компонент
Концентрация
Поливинилпирролидон
0,5% (в/о)
Аскорбиновая кислота
100 мг/л
Лимонная кислота
150 мг/л
1-2: Обработка содержащего камбий эксплантата основного корня женьшеня с помощью осмотического агента
Подготовленный в примере 1-1 эксплантат подвергали осмотическому стрессу в целях некротизации дифференцированных тканей (флоэмы, ксилемы, паренхимы и т.д.) для исключительной индукции камбия (меристемы). Содержащий камбий эксплантат промокали в преинокуляционной среде (среда 1), размещали затем на фильтровальной бумаге и помещали во флакон, содержащий 1 М раствор сахарозы (Duchefa, Нидерланды), после чего подвергали осмотическому стрессу на холоде в течение 16-24 часов. Затем эксплантат обрабатывали 0,05 М раствором сахарозы в течение 5 минут и 0,1 М раствором сахарозы в течение 5 минут для снятия стресса, вызванного сильноконцентрированной сахарозой. Содержащий камбий эксплантат после осмотического стресса помещали в преинокуляционную среду (среда 1), после чего промокали фильтровальной бумагой для удаления влаги.
Прекультуральная среда (среда 1)
Состав
мМ
мг/л
Макроэлементы
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>
2,35
471,26
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
5,00
400,00
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1,50
180,54
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
5,68
990,00
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O
0,65
72,50
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,25
170,00
Состав
мкМ
мг/л
Микроэлементы
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O
131,94
22,3
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
29,91
8,60
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
1,03
0,25
H<sub>2</sub>BO<sub>3</sub>
100,27
6,20
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
1,00
0,25
FeNa-EDTA
100,00
36,70
Витамины
Глицин
26,64
2,00
мио-инозитол
554,94
100,00
Никотиновая кислота
4,06
0,50
Пиридоксин-HCl
2,43
0,50
Тиамин-HCl
2,96
1,00
1-3: Индукция камбиальной гомогенной клеточной линии в камбий-содержащем эксплантате основного корня женьшеня
Для того чтобы индуцировать камбиальную гомогенную клеточную линию, обладающую способностью к делению, подвергнутый осмотическому стрессу в примере 1-2 эксплантат перенесли в среду для индукции клеточной линии (среда 2). Композиция использованной среды представлена в таблице 4 ниже. Перенесенный эксплантат культивировали в темноте при температуре 22±1°С.
Таблица 4
Состав среды для индукции камбиальной гомогенной клеточной линии (среда 2)
Компонент
Концентрация и состояние
Соль
полная концентрация WPM
Сахароза
3% (в/о)
IAA (индолил-3-уксусная кислота)
2 мг/л
pH
5,8
Гелрит
0,3% (в/о)
Аскорбиновая кислота
100 мг/л
Лимонная кислота
150 мг/л
После приложения и снятия описанного выше осмотического стресса было отмечено, что в инокулированном в среду для индукции камбиальной клеточной линии (среда 2) эксплантате гомогенная клеточная линия специфично индуцировалась исключительно в камбии, в отсутствие какой-либо индукции в других тканях. Это наблюдение представлено в таблице 5 ниже. В частности, было отмечено, что, после приложения и снятия осмотического стресса в перенесенном в среду эксплантате, камбий начинал принимать светло-желтый цвет после 3-7 дней культивирования, а через 7-14 дней после начала индукции круглоклеточной линии цвет части клеток изменился на светло-желтый. На фиг 3(a) представлено изображение гомогенной клеточной линии, специфически индуцированной в камбии камбий-содержащего эксплантата корня женьшеня.
Однако, как показано в таблице 5 ниже, в эксплантатах, перенесенных в среду для индукции камбиальной клеточной линии (среда 2) без проведения этапа обработки осмотическим стрессом примера 1-2, желтая цветная реакция развивалась в камбии на начальном этапе (2-3 дня) после переноса в среду, и затем с течением времени весь эксплантат желтел. Эксплантат с желтым камбием субкультивировали в оптимальной среде для выделения и пролиферации камбиальной клеточной линии (среда 3), для того чтобы индуцировать и нарастить камбиальную клеточную линию, но потемнение стало столь серьезным, что с течением времени не наблюдалось никакой другой цветной реакции, кроме коричневой. Это говорит о том, что этап обработки осмотическим стрессом необходим для индукции камбиальной клеточной линии.
Таблица 5
Сравнение реакции между эксплантатом, подвергнутым осмотическому стрессу, и эксплантатом, не подвергнутым осмотическому стрессу
Обработка
Без обработки
обработанный 16 часов
обработанный 20 часов
обработанный 24 часа
аспект
Желтая окраска развилась в камбии на начальной стадии после инокуляции, после чего окраска распространилась по всему эксплантату. Затем в эксплантате, включая камбий, развилась сильная коричневая реакция, и индукции камбиальной гомогенной линии далее не было показано
Было видно, что клетки специфически индуцировались исключительно в камбии. Одинаковые результаты были продемонстрированы при разных периодах обработки эксплантата осмотическим стрессом. Другими словами, не было никакой разницы между периодами обработки.
Между тем, в целях изучения влияния используемого в индуцирующей среде гормона, эксплантат культивировался в содержащей 2,4-D среде, которая не является индукционной средой для камбиальной клеточной линии и была использована в обычном культивировании основного женьшеня. В этом случае было отмечено, что весь эксплантат начал желтеть через 7-10 дней культивирования, и через около 7-14 дней клетки индуцировались во всем объеме (фиг.3(b)). Другими словами, видно, что при использовании 2,4-D клеточная линия индуцировалась во всех тканях, а не только в камбии.
Как показано на фиг.3(b), при использовании содержащей 2,4-D основной культуральной системы клетки индуцировались в различных тканях (первичная кора, флоэма, ксилема, камбий, паренхима и т.п.), присутствующих во всем объеме, и различные клетки смешивались друг с другом. Таким образом, индуцированные и пролиферирующие клетки были гетерогенными. Однако, как показано на фиг.3(a), при применении патентоспособного способа, содержащего обработку эксплантата осмотическим стрессом; снятие осмотического стресса; и перенос эксплантата в среду для индукции камбиальной клеточной линии, клетки специфически индуцировались только в камбии, и таким образом клеточная линия состояла только из клеток камбия. Таким образом, индуцированные клетки обладали гомогенностью.
1-4: Пролиферация камбиальной гомогенной клеточной линии, полученной из камбий-содержащего эксплантата основного корня женьшеня
Как показано на фиг.3(a), после того как эксплантат культивировали в среде 2 примера 1 для некротизации отличных от камбия тканей, его субкультивировали в среде 3. Среда 3 является оптимальной средой для пролиферации камбиальной клеточной линии и основана на базовой солевой композиции, представленной в таблице 6. Она представлена в таблице 7.
Таблица 6
Базовый солевой состав оптимальной среды для пролиферации камбиальной клеточной линии
Состав
мМ
мг/л
Макроэлементы
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O
2,99
332,02
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,25
170,00
KNO<sub>3</sub>
18,79
1900,00
MgSO<sub>4</sub>
1,50
180,54
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
20,61
1650,00
Состав
мкМ
мг/л
Микроэлементы
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
0,11
0,025
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
0,10
0,03
FeNa-EDTA
100,00
36,70
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
100,27
6,20
KI
5,00
0,83
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O
100,00
16,90
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
1,03
0,25
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
29,91
8,60
Витамины
Глицин
26,64
2,00
мио-инозитол
554,94
100,00
Никотиновая кислота
4,06
0,50
Пиридоксин-HCl
2,43
0,50
Тиамин-HCl
0,30
0,10
Таблица 7
Состав оптимальной среды для пролиферации камбиальной клеточной линии (среды 3)
Компонент
Концентрация и состояние
Соль
полная концентрация MS
Сахароза
3% (в/о)
2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота)
2 мг/л
pH
5,8
Гелрит
0,3% (в/о)
Аскорбиновая кислота
100 мг/л
Лимонная кислота
150 мг/л
На фиг.4(a) показана гомогенная клеточная линия, специфически индуцированная в камбии перенесенных в среду 2 камбий-содержащих эксплантатов, которую субкультивировали и наращивали в представленной в таблице 7 среде 3.
Затем камбиальную гомогенную клеточную линию, обладающую способностью к делению, культивировали в среде 3, где она постоянно делилась и пролиферировала. Через около 10-20 дней культивирования камбиальную клеточную линию выделяли и выделенную клеточную линию наращивали снова в подобной среде (среде 3).
На фиг.4(b) показано, что выделенную камбиальную клеточную линию нарастили в среде 3, представленной в таблице 7. Между тем, если клеточную линию культивировали в питательной среде, содержащей IAA, а не 2,4-D, то линия не пролиферировала и демонстрировала тенденцию к дифференциации, подтверждая тот факт, что IAA не может использоваться в питательной среде. На фиг.4(c) представлена оптическая микрофотография камбиальной гомогенной клеточной линии на одноклеточном уровне, а на фиг.4(d) представлена оптическая микрофотография полученного из семядоли женьшеня каллюса (КСТС 10224) на одноклеточном уровне.
Пример 2. Индукция и пролиферация клеточной линии, полученной из камбия травянистого растения с запасающим корнем: (2) настоящий дикий женьшень
2-1: Индукция клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня
Настоящий дикий женьшень приготовили и стерилизовали поверхностно, как и в примере 1-1. Также придаточный корень 100-летнего настоящего дикого женьшеня, поддерживаемого в биореакторе, приготовили и поместили в стерильную чашку, содержащую CS-раствор таблицы 2, и, таким образом, получили камбий-содержащий эксплантат из настоящего дикого женьшеня описанным выше способом. Затем два приготовленных образца подвергли осмотическому стрессу, так же как в примере 1-2 и примере 1-3, и затем индуцировали камбиальные гомогенные клеточные линии.
В результате было отмечено, что в обоих случаях, в случае эксплантата, содержащего камбий настоящего дикого женьшеня, и в случае эксплантата, содержащего камбий из придаточного корня настоящего дикого женьшеня, после обработки осмотическим стрессом, снятия осмотического стресса и переноса в среду для индукции гомогенной клеточной линии, так же как и в примере 1 с использованием женьшеня, были специфично индуцированы только клетки камбия без индукции других тканей. На фиг.5(a) показано, что индукция гомогенной клеточной линии, обладающей способностью к делению, была проведена специфично в камбии камбий-содержащего эксплантата настоящего дикого женьшеня.
2-2: Пролиферация клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня
Как показано на фиг.5(a), после специфической индукции гомогенной клеточной линии в камбии путем применения осмотического стресса и среды 2, гомогенную клеточную линию, индуцированную в камбий-содержащем эксплантате настоящего дикого женьшеня, субклонировали в среде 3 таблицы 7 таким же образом, как и в примере 2. В результате, камбиальная гомогенная клеточная линия, обладающая способностью к делению, постоянно делилась и пролиферировала, и, таким образом, через около 10-20 дней культивирования, камбиальную гомогенную клеточную линию, обладающую способностью к делению, можно было выделять. Выделенную гомогенную клеточную линию, полученную из камбия настоящего дикого женьшеня, нарастили вновь в той же среде. На фиг.5(b) представлена наращенная в среде 3, таблица 7, выделенная камбиальная гомогенная клеточная линия. Также на фиг.5(c) представлена оптическая микрофотография гомогенной клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня, на одноклеточном уровне.
Между тем, в эксплантате, содержащем камбий придаточных корней настоящего дикого женьшеня из примера 2-1, клеточную линию наращивали таким же образом, как и в примере 2, за исключением того, что вместо 2,4-D в таблице 7 была использована IBA. В результате, при культивировании в среде, содержащей IAA, клеточная линия не дифференцировала и демонстрировала тенденцию к дифференцировке, в то же время, при культивировании в среде, содержащей IBA, клеточная линия не дифференцировала и пролиферировала таким же образом, как и в случае использования среды, содержащей 2,4-D.
Пример 3. Индукция и пролиферация клеточной линии, полученной из камбия травянистого растения с запасающим корнем: (3) - морковь
Морковь (Daucus carota L.) приготовили и поверхностно стерилизовали таким же образом, как и в примере 1-1. Затем подготовленный образец подвергали осмотическому стрессу таким же образом, как в примере 1-2 и в примере 1-3, и затем индуцировали камбиальную клеточную линию из моркови.
В результате, так же как и в примерах 1 и 2, было отмечено, что ткани, отличные от камбия, некротизировались и что обладающая способностью к делению камбиальная гомогенная клеточная линия индуцировалась. На фиг.6 представлена камбиальная гомогенная клеточная линия, индуцированная в моркови и обладающая способностью к делению.
Также другие растительные гормоны-ауксины, включая IAA, IBA, picloram, 2,4-D, CPA и NAA, были использованы в подобной концентрации для проверки влияния использованного в индуцирующей среде гормона. В таблице 8 представлены результаты, полученные при использовании в индуцирующей среде различных типов ауксинов.
Таблица 8
Паттерны индукции клеточной линии при обработке моркови различными типами ауксинов в одинаковой концентрации
тип гормона
IAA
IBA
Picloram
CPA
2,4-D
NAA
Реакция в отношении камбия
++++
++++
-
-
-
-
Дополнения
Гомогенная клеточная линия была индуцирована в камбии
Клеточная линия была индуцирована по всему эксплантату
Клеточная линия была индуцирована по всему эксплантату. Со временем вокруг камбия образовались корни
+: положительный; -: отрицательный
В таблице 8 показано, что при использовании в индуцирующей среде IAA и IBA гомогенная клеточная линия индуцировалась только в камбии, а при использовании в индуцирующей среде пиклорама, CPA, 2,4-D или NAA клеточная линия индуцировалась во всем эксплантате, а не только в камбии.
А при использовании в индуцирующей среде NAA было отмечено, что с течением времени (после около 4 недель) в камбии индуцировался и дифференцировался корень. Таким образом, было подтверждено, что выбор гормона для индукции камбиальной клеточной линии ограничивается IAA или IBA.
Пример 4. Изучение характеристик изолированной клеточной линии
4-1: Создание долговременной культуры камбиальной клеточной линии
Белые и рыхлые клетки, обладающие высокой скоростью деления, из числа полученных в примере 1 камбиальных гомогенных клеточных линий женьшеня, обладающих способностью к делению, субкультивировали с заменой среды на оптимальную питательную среду (среду 3 из таблицы 7) с 14-дневным интервалом. В качестве контрольной группы субкультивировали гетерогенную клеточную линию, полученную из семядоли женьшеня, в оптимальной питательной среде с заменой среды с 28-дневным интервалом.
В результате, белые и рыхлые клетки камбиальной гомогенной клеточной линии непрерывно пролиферировали в культуре вплоть до 11 месяцев. К тому же, даже когда клетки культивировались 11 месяцев или более, клетки стабильно сохраняли без изменений скорость роста, паттерн роста, степень агрегации и демонстрировали скорость роста, в около 400 раз более высокую, чем у полученной из семядоли женьшеня гетерогенной клеточной линии.
С другой стороны, полученная из семядоли женьшеня гетерогенная клеточная линия, являющаяся группой желтых, больших и рыхлых клеток, была желтоватой в начальной стадии культивирования и демонстрировала тенденцию к 2-кратному увеличению клеточной популяции за 4 недели, но после 5 месяцев культивирования скорость ее роста стала уменьшаться. Далее линия показала менее чем 1,5-кратное увеличение клеточной популяции, а в дополнение к желтым клеткам появились белые или светло-серые водянистые клетки, коричневые клетки и т.п. Такие клетки уже не пролиферировали, оставаясь интактными, и умирали при индукции больших количеств коричневого материала. Соответственно, при культивации в течение 11 месяцев полученной из семядоли женьшеня гетерогенной клеточной линии скорость роста последней демонстрировала тенденцию к уменьшению.
На фиг.7 представлены кривые роста долгоживущей культуры камбиальной клеточной линии женьшеня и гетерогенной клеточной линии, полученной из семядоли женьшеня.
4-2: Создание суспензионной клеточной культуры
Клеточные линии, полученные из камбия женьшеня и камбия настоящего дикого женьшеня из примеров 1 и 2, помещали в колбы с жидкой средой, представленной в таблице 9. Затем клеточные линии в колбах культивировали на вращающемся шейкере со скоростью 100 об/мин в темноте при температуре 25±1°C. При этом клеточные линии, полученные из камбия женьшеня и камбия настоящего дикого женьшеня, культивировали с 2,4-D, а клеточную линию, полученную из камбия придаточных корней настоящего дикого женьшеня, культивировали с IBA. Интервал субкультивирования был равен 2 неделям, так чтобы культивируемые клетки всегда поддерживали высокую живучесть и находились в экспоненциальной фазе роста. При этом каллюс, полученный из семядоли женьшеня (КСТС 10224), являющийся гетерогенной клеточной линией, также культивировали в среде 4, представленной в таблице 9, с тем чтобы сравнить с патентоспособными камбиальными гомогенными клеточными линиями, обладающими способностью к делению.
Таблица 9
Суспензионная культуральная среда для камбиальных клеточных линий
Компонент
Концентрация и состояние
Соль
полная концентрация MS
Сахароза
3% (в/о)
2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) или IBA
2 мг/л
pH
5,8
Количественная оценка клеточной агрегации проводилась с помощью оптической микроскопии (биологический микроскоп СХ31, Olympus, Япония), и, в результате, было видно, что, как показано в таблице 10, камбиальные клеточные линии по настоящему изобретению в суспензионной культуре находились в одноклеточном виде. При этом более чем 90% клеточных линий, полученных из семядоли женьшеня, находились в виде больших клеточных агрегатов, и менее чем 1% клеток присутствовал в виде одиночных клеток. На фиг.8(a) представлена оптическая микрофотография, демонстрирующая одноклеточную популяцию клеток линии, полученной из камбия женьшеня, а на фиг.8(b) представлена оптическая микрофотография, демонстрирующая большие клеточные агрегаты в популяции клеток гетерогенной линии, полученной из семядоли женьшеня.
Таблица 10
Типы клеточных агрегатов камбиальных линий при долговременном культивировании
Большие клеточные агрегаты
Средние клеточные агрегаты
Малые клеточные агрегаты
Одноклеточная популяция
Источник эксплантата
90%
7%
2%
1%
семядоля
0
0
5%
95%
камбий женьшеня
0
0
5%
95%
камбий настоящего дикого женьшеня (обработка 2,4-D)
5%
10%
25%
60%
камбий настоящего дикого женьшеня (обработка IBA)
Большие клеточные агрегаты, размер больше чем 1,5×10<sup>3</sup> мкм
Средние клеточные агрегаты, 1×10<sup>3</sup> мкм
Малые клеточные агрегаты, 4×10<sup>2</sup> мкм < размер <1×10<sup>3</sup> мкм
Между тем, при наблюдении под микроскопом, как это можно увидеть на фиг.4(c) и фиг.5(c), камбиальная клеточная линия по настоящему изобретению обладала морфологическим признаком в виде множества вакуолей и находилась в недифференцированном состоянии. При этом, как показано на фиг.4(d), результаты наблюдений каллюса, полученного из семядоли женьшеня (КСТС 10224), говорят о том, что наблюдалось либо незначительное число вакуолей, либо вообще одна большая вакуоль.
4-3: Масштабное культивирование
В целях проверки возможности масштабирования культуры гетерогенный каллюс, полученный из семядоли женьшеня, и камбиальные клеточные линии из примеров 2 и 3 культивировали в аэрлифтном биореакторе (Sung-Won Cytec, Корея) с внутренним объемом 3 литра. При культивировании в темноте при температуре 25±1°C использовалась жидкая среда, представленная в таблице 9.
В результате было выяснено, что, как показано в таблице 11, время удвоения патентоспособной камбиальной гомогенной клеточной линии, обладающей способностью к делению, составляло 3-6 дней, и оно не отличалось от времени удвоения в колбах, а скорее даже было короче по сравнению со временем удвоения в колбах, тогда как время удвоения гетерогенной клеточной линии, полученной из семядоли женьшеня, составляло 21 день в колбе и 28 дней в биореакторе. Другими словами, было видно, что при культивировании в колбах камбиальная клеточная линия по настоящему изобретению демонстрировала в около 3-5 раз более высокую скорость роста по сравнению с клеточными линиями, полученными из других тканей, а при культивации в реакторе камбиальная клеточная линия по настоящему изобретению демонстрировала в 5-9 раз более высокую скорость роста по сравнению с клеточными линиями, полученными из отличных от камбия тканей. Считается, что так происходит, потому что жизнеспособность клеток гетерогенной клеточной культуры быстро уменьшается из-за образования кольца роста в реакторе, из-за агрегации растительных клеток в культуре и из-за чувствительности твердых клеточных стенок к механическому стрессу.
Патентоспособная камбиальная клеточная линия, обладающая способностью к делению и являющаяся гомогенной, формирует очень небольшие по площади кольца роста в биореакторе, и эти кольца на внутренней стенке легко удалялись встряхиванием среды в биореакторе. Также было показано, что у патентоспособной клеточной линии низкая способность к агрегации, она содержит большое количество вакуолей и, таким образом, обладает низкой чувствительностью к механическому стрессу, так что жизнеспособность клеток не уменьшается. Другими словами, было видно, что камбиальная клеточная линия по настоящему изобретению обладает низкой чувствительностью к механическому стрессу, который является результатом встряхивания биореактора для поточного производства, и, таким образом, в биореакторе данная клеточная линия может производиться быстро и в больших количествах. Соответственно, видно, что камбиальная клеточная линия по настоящему изобретению обладала в 5-9 раз более низкой чувствительностью к механическому стрессу по сравнению с клеточными линиями, полученными из отличных от камбия тканей.
Таблица 11
Время удвоения в жидкой суспензионной культуре и в биореакторе камбиальной клеточной линии и гетерогенной клеточной линии, полученной из семядоли женьшеня
Источник эксплантата
время удвоения (дни)
колба
биореактор
семядоля
21
28
камбий женьшеня
5
3-4
камбий настоящего дикого женьшеня (обработка 2,4-D)
5
3-4
камбий настоящего дикого женьшеня (обработка IBA)
7
5-6
Кроме того, было отмечено, что камбиальная клеточная линия по настоящему изобретению может также культивироваться в аэрлифтном биореакторе (Sung-Won Cytec, Корея) с внутренним объемом 20 литров (фиг.9) и, таким образом, может культивироваться в еще больших количествах.
4-4: Криоконсервация
Криоконсервация является идеальным способом для безопасного сохранения полезной клеточной линии, отобранной для промышленного применения в течение продолжительного периода времени.
Способ безопасного сохранения полезной клеточной линии заключается в следующем. Полученный из семядоли женьшеня гетерогенный каллюс и камбиальную клеточную линию подвергли криоконсервации. Суспензионную культуру инкубировали в течение 6-8 дней, после чего перенесли ее в среду-криоконсервант, содержащую 0,5 М глицерол (DUCHEFA, Нидерланды) и 0,5 М ДМСО (DUCHEFA, Нидерланды), после чего поместили в 5 мл криопробирки (Duran, США). Концентрация перенесенных в криоконсервант клеток составляла 200 мг/мл. Обработанные криоконсервантом клетки суспензии замораживали путем помещения их в холодильник на 30 минут, помещения в холодильник глубокой заморозки на 3 часа и затем в жидкий азот.
Далее, для оттаивания, культивируемые клетки, выдержанные в жидком азоте в течение 20 или более минут, вынимали, помещали в водяную баню с постоянной, равной 40°C, температурой и размораживали 1-2 минуты. Для возобновления роста клеток клеточную суспензию фильтровали через стерильные воронку и фильтровальную бумагу. Отфильтрованные клетки помещали на твердую питательную среду с фильтровальной бумагой, стабилизировали при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем переносили на свежую твердую питательную среду.
В результате, полученная из семядоли женьшеня гетерогенная клеточная линия не восстановилась, а камбиальная клеточная линия, напротив, начала расти и пролиферировать через 4 недели без какой-либо заметной разницы в скорости роста до и после криоконсервации.
Обработка элиситором
Клеточную линию, полученную из камбия настоящего дикого женьшеня, культивировали в суспензии в содержащей 2,4-D среде в течение 14 дней, как описано в примере 4-2, после чего разделили на три группы для экспериментов.
Другими словами, каждая из (1) линий клеток (стадия роста) культивировалась в суспензии в течение 14 дней, (2) клеточная линия (Элиситация 1), полученная культивацией 14-дневной суспензионно культивируемой клеточной линии в среде (содержащей стерильную воду, 3-5% по массе нерафинированного сахара и 100 мкМ метилжасмоната) в темноте в течение 14 дней, и (3) клеточная линия (Элиситаци 2), полученная культивацией 14-дневной суспензионно культивируемой клетки в среде (содержащей 100 мкМ метилжасмонат) в темноте в течение 14 дней, были собраны и подвергнуты следующему тесту.
Пример 5. Анализ омолаживающего и антиоксидантного эффектов изолированной клеточной линии
5-1: Подготовка экстракта клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня.
Экстракт приготовили из клеточной линии примера 4-5 следующим образом. 500 г каждой клеточной линии без культуральной среды (сырая биомасса) и лиофилизированной клеточной линии (сухая биомасса) растворяли в 500 мл ДМСО при 50°C в течение 6 часов при перемешивании. Конечный раствор центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и супернатант отбирали для получения растворимого в дистиллированной воде материала. Полученный растворимый в ДМСО материал концентрировали с помощью ротационного вакуумного испарителя, концентрированный образец высушивали с помощью лиофилизатора, что привело таким образом к получению ДМСО экстракта.
5-2: Анализ омолаживающих эффектов культуральной среды и экстракта клеточной линии, полученной из настоящего дикого женьшеня: анализ эффекта ингибирования экспрессии ММР-1, вызванной УФ
При увеличении в ответ на воздействие УФ количества металлопротеаз увеличивается деградация металлопротеазами кожного коллагена, что приводит к образованию морщин на коже. Таким образом, следующий тест был проведен с целью проверки, ингибируется ли экспрессия ММР-1, повышающаяся в ответ на УФ излучение, экстрактом или культуральной средой гомогенной клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня.
2
Использованные в тесте NHF (нормальные человеческие фибробласты) изолировали из фетальной крайней плоти и культивировались. Культуральная среда была приготовлена добавлением к среде ДМЕМ (Invitroge Gibco life tech. Вена, Австрия) 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Hyclone, Логан, Юта, США), инактивированной нагреванием при 56°C в течение 30 минут, 100 ед. /мл пенициллина, 100 мкг/л стрептомицина и 300 мкг/л глутамина. Клетки культивировали в среде в термостате с 5% содержанием CO при температуре 37°C и при влажности 95% и пересевали с интервалом в 3-4 дня, непосредственно перед тем как клетки были слиты друг с другом.
Клетки NHF (р6) разливали в 12-луночные плашки с плотностью 75000 клеток на лунку и оставляли в истощенной среде на 24 часа. Затем клетки облучали 40 mJ УФВ и обрабатывали различными концентрациями каждого образца в течение 48 часов. Затем эксперимент проводили с помощью кита (Amersham, RPN 2610). Для группы положительного контроля использовали 10 мкМ ретиноевую кислоту.
Элиситация 1: ДМСО-экстракт клеточной линии примера 5-3, обработанного 3-5% по массе (г/л) нерафинированного сахара и 100 мкМ метилжасмонатом; Элиситация 2: ДМСО-экстракт клеточной линии примера 5-4, обработанного 100 мМ метилжасмонатом; Рост: ДМСО-экстракт 14-дневной культивируемой в суспензии клеточной линии (Стадия роста) примера 5-4; Сырая биомасса: ДМСО-экстракт клеточной линии с удаленной культуральной средой; Сухая биомасса: ДМСО-экстракт лиофилизированной клеточной линии; и Среда: культуральная среда, удаленная в процессе подготовки экстракта клеточной линии.
Таблица 12
Ингибирующий эффект экстракта гомогенной клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня, на экспрессию ММР-1, вызванную УФ-излучением
Образец
Этап
Концентрация (частиц на миллион или %)
% от контроля
Без УФ
100
Контроль УФ
230
Ретиноевая кислота
10 мкМ
85
Образец
Этап
Концентрация (частиц на миллион или %)
% от контроля
Сырая биомасса (частиц на миллион)
Элиситация 1
100
125
10
130
Элиситация 2
100
125
10
135
Рост
100
140
10
160
Сухая биомасса (частиц на миллион)
Элиситация 1
50
120
10
140
Элиситация 2
50
135
10
180
Рост
50
100
10
165
Среда (%)
Элиситация 1
1/10
60
1/20
130
Элиситация 2
1/10
60
1/20
200
Рост
1/10
230
1/20
250
В результате, как показано в таблице 12 и на фиг.10, экстракт клеточной линии и культуральная среда по настоящему изобретению эффективно ингибировали экспрессию ММР-1 по сравнению с группой отрицательного контроля (УФ-контроль), наводя на мысль о том, что они обладают эффектами предотвращения и уменьшения морщин. В особенности, это видно, когда клетки NHF(p6) обрабатывались 0,1% культурой клеточной линии Элиситации 1 (обработка нерафинированным сахаром и метилжасмонатом) и Элиситации 2 (обработка только метилжасмонатом), причем культуральная среда этих клеточных линий демонстрировала отличный эффект даже по сравнению с ретиноевой кислотой, которая, как известно, обладает наиболее сильным, сокращающим морщины эффектом среди веществ, известных в данной области.
5-3: Анализ антиоксидантных эффектов культуральной среды и экстракта клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня: анализ ингибирующего эффекта на активный кислород, вызванный УФ-излучением
Для того чтобы проверить ингибируется ли активный кислород, который увеличивается в ответ на УФ-излучение, экстрактом или культуральной средой гомогенной клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня, клетки НаСаТ разливали в 96-луночную черную плашку с плотностью 30000 клеток на лунку и обрабатывали различными концентрациями каждого из образцов в течение 3 часов. После 3 часов плашку отмывали однократно с помощью HBSS, обрабатывали каждую лунку 50 мкМ DCF и инкубировали при 37°C в течение 20 минут. После этого плашку отмывали дважды с помощью HBSS и измеряли начальное поглощение клеток с помощью люминатора. Клетки облучали 30 mJ УФВ, культивировали при 37°C в течение 2 часов и затем вновь измеряли поглощение. Контроль: группа, которая не обрабатывалась образцом и УФВ; УФВ: группа, обработанная только УФВ без добавления образца.
Таблица 13
Ингибирующий эффект экстракта или культуральной среды гомогенной клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня, на активный кислород, вызванный УФ-облучением
Образец
этап
Концентрация (частиц на миллион или %)
% от контроля
Контроль
100
УФВ
140
Сырая биомасса (частиц на миллион)
Элиситация 1
100
80
10
170
Элиситация 2
100
140
10
135
Рост
100
150
10
170
Сухая биомасса (частиц на миллион)
Элиситация 1
50
50
10
135
Элиситация 2
50
140
10
135
Рост
50
105
10
145
Среда (%)
Элиситация 1
10
100
1
130
Элиситация 2
10
130
1
105
Рост
10
110
1
120
В результате, как показано в таблице 13 и на фиг.11, в случае где использовалась патентоспособная клеточная линия, из которой была удалена культуральная среда (сырая биомасса) и где использовалась лиофилизированная патентоспособная клеточная линия (Сухая биомасса), экстракт клеточной линии Элиситации 1 продемонстрировал прекрасный антиоксидантный эффект. При этом экстракты Элиситации 2 и Стадии роста продемонстрировали схожие антиоксидантные эффекты. Также группа, обработанная 50 частями на миллион экстракта лиофилизированной клеточной линии Элиситации 1, продемонстрировала наилучший антиоксидантный эффект.
5-4: Анализ гинзенозидных компонентов
Известно, что гинзенозидные компоненты экстракта настоящего дикого женьшеня эффективны в предотвращении старения кожи и являются эффективными антиоксидантами. Таким образом, для того чтобы проверить, могут ли быть отнесены эффекты омоложения кожи и антиоксидантные эффекты экстракта клеточной линии и культуральной среды по настоящему изобретению к эффектам гинзенозидных компонентов, измеряли содержание гинзенозидов. А именно, приготовленная в примере 2 гомогенная клеточная линия, полученная из камбия настоящего дикого женьшеня, и настоящий дикий женьшень были лиофилизированы и 20 мг лиофилизированной клеточной линии экстрагировали 600 мкл метанола в течение 1 часа. Экстракт центрифугировали и супернатант отбирали. Содержание гинзенозидов в выделенном экстракте измеряли с помощью UPLC, и измеренное содержание показано в сравнении со стандартными значениями для Re, Rb1, Rb2 и Rd. Также культуральную среду Элиситации 1 фильтровали с помощью 0,2 мкм шприцевого фильтра и содержание гинзенозидов в ней измеряли с помощью UPLC. Измеренное содержание было показано в сравнении со стандартными значениями для Re, Rb1, Rb2 и Rd.
Таблица 14
Сравнение содержания гинзенозидов в гомогенной клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня, в культуральной среде и в настоящем диком женьшене
клеточная линия, полученная из камбия настоящего дикого женьшеня
Культуральная среда
Настоящий дикий женьшень
Рост
Элиситация 1
Элиситация 2
Гинзенозиды (Re, Rb1, Rb2 и Rd)
0,000%
0,003%
0,018%
0,000%
3,000%
В результате, как видно из таблицы 14, клеточная линия Элиситации 2 продемонстрировала наивысшее содержание гинзенозидов среди исследованных гомогенных клеточных линий, полученных из камбия настоящего дикого женьшеня, но при этом содержание гинзенозидов в экстракте настоящего дикого женьшеня (в контроле) было в 167 раз выше, чем содержание гинзенозидов в гомогенной клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня. Также не было обнаружено гинзенозидов в находящейся в стадии роста клеточной линии, полученной из камбия настоящего дикого женьшеня, или в культуральной среде клеточной линии. Это наводит на мысль о том, что эффект предотвращения старения кожи и антиоксидантный эффект экстракта клеточной линии и культуральной среды по настоящему изобретению не связаны с гинзенозидами и что клеточная линия, выделенная в соответствии со способом настоящего изобретения, содержит активные ингредиенты, отличающиеся от активных ингредиентов обычных клеток настоящего дикого женьшеня. При этом эффект предотвращения старения кожи и антиоксидантный эффект экстракта клеточной линии и культуральной среды по настоящему изобретению были превосходными даже при сравнении с ретиноевой кислотой, известным в данной области соединением, обладающим сильнейшим уменьшающим морщины эффектом, наводя на мысль о том, что экстракт клеточной линии и культуральная среда по настоящему изобретению обладают значительно более сильными эффектами по сравнению с обычными экстрактами настоящего дикого женьшеня.
Промышленная применимость
Как описано выше, патентоспособная клеточная линия, полученная из камбия травянистого растения с запасающим корнем, способна активно делиться и является гомогенной. Также она стабильна в культуре, потому что не подвергалась процессу дедифференцировки. Таким образом, благодаря оптимизации ее пролиферации клеточная линия получает возможность пролиферировать в больших количествах за короткий период времени. Соответственно, патентоспособная клеточная линия, полученная из камбия травянистого растения с запасающим корнем, позволит получать большие количества полезных растений, которые сложно культивировать на открытом воздухе из-за различных проблем, связанных с периодом культивации, выбором земель для культивации, стоимостью культивации и т.п.
Более того, патентоспособная клеточная линия, полученная из камбия травянистого растения с запасающим корнем, продемонстрировала антиоксидантный эффект при ингибировании активного кислорода, вызванного воздействием УФ-излучения, который является основной причиной старения кожи, что означает, что клеточная линия может эффективно ингибировать факторы, связанные со старением, или уменьшать их содержание. Таким образом, полученная из камбия клеточная линия по настоящему изобретению является полезным инструментом для предотвращения и ингибирования старения кожи.
Хотя настоящее изобретение описано в деталях со ссылкой на специфические особенности, для специалиста в данной области будет очевидно, что это описание является всего лишь предпочтительным воплощением и не лимитирует сферу применения настоящего изобретения. Таким образом, реальная сфера применения настоящего изобретения будет определяться приложенной формулой изобретения или ее эквивалентами.