Лабораторная оценка регенерантов пшеницы, полученных в экспериментальной селективной эмбриокультуре in vitro

Изучение семенной продуктивности растений сорта Пермский местный показало, что его потенциальная семенная продуктивность (ПСП) составляла 3304-7327 семязачатков на растение. Реальная семенная продуктивность (РСП) на особь варьировала от 528 до 2089, в зависимости от возраста растения. Основной вклад в разницу между кустами вносили такие показатели, как количество цветков и бобов на соцветие. Также существенно отличалась РСП генеративного побега в зависимости от его порядкового номера. Коэффициент продуктивности (Кпр) составил у побегов второго года жизни 29-34%, у побегов третьего года -всего 16-18%.

Сорт Трио формирует гораздо меньше генеративных побегов на растение, чем сорт Пермский местный, - в среднем 9,4 - 10,8. Также меньше образуется и соцветий на побег - 1,9-2,4. Значительно меньше насчитывается цветков в соцветии (57,8-78,6). В итоге ПСП почти в 2 раза меньше (2053-4092). Но данный сорт отличается ранними сроками цветения, не зависящими от погодных условий, и даже при раннем наступлении осенних холодов - гарантированным созреванием семян. Реальная семенная продуктивность растений сорта Трио варьировала от 434 до 906. Но коэффициент продуктивности оказался близким к первому сорту (20-23), кроме того, не было различий РСП растений разного возраста и генеративных побегов в зависимости от порядкового номера.

Сорт Первенец клевера гибридного значительно отличался по семенной продуктивности от первых двух сортов, относящихся к клеверу луговому. Хотя генеративных побегов на особь образуется меньше и доля их по отношению к общему числу побегов составляет всего 44-67%, существенно возрастает число сформировавшихся бобов на головку и семян на боб. В итоге, коэффициент продуктивности на генеративный побег составил 62-82%.

Заключение. Пути формирования генеративных побегов различны, и в совокупности образуют сложные побеговые системы. Наибольшего разнообразия достигают генеративные побеги, цветущие первыми. Такое разнообразие побеговых систем демонстрирует высокие адаптационные способности вида. Поливариантность развития соцветий разных сортов клевера лугового и гибридного является одним из механизмов приспособления видов к длительному периоду цветения и гарантирует семенное размножение.

Сорт Первенец характеризуется большим разнообразием типов развития соцветий и значительно отличается по урожайности семян от сортов Пермского местного и Трио. Коэффициент продуктивности сорта Первенец составил 62,5-82,4%. Высокая реальная семенная продуктивность на генеративный побег и особь у сорта Первенец, по сравнению с другими исследованными нами сортами, обусловлена увеличением числа бобов на соцветие и семян на боб.

Литература

1. Вайнагий, В.И. О методике изучения семенной продуктивности растений /В.И. Вайнагий// Ботан. журн., -1974. - Т.59,№6. - С.826-831.

2. Вайнагий, В.И. Методика определения семенной продуктивности представителей семейства лютиковых / В.И. Вайнагий // Бюл. Гл. бот. сада. - 1990. - Вып.155. - С.86-90.

3. Современные подходы к описанию структуры растения / Под ред. Н.П. Савиных и Ю.А. Боброва и др. - Киров: ООО «Лобань», 2008. - 355 с.

4. Заугольнова, Л.Б. Особенности популяционной жизни растений / Л.Б. Заугольнова, Л.А. Жукова, Н.И. Шо-рина. // Популяционные проблемы в биогеоценологии. - М., 1988. - С. 24 - 59.

УДК 576.3.7.086.83:58

Н.Н. Круглова, д-р биол. наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Уфимского научного центра РАН

ЛАБОРАТОРНАЯ ОЦЕНКА РЕГЕНЕРАНТОВ ПШЕНИЦЫ, ПОЛУЧЕННЫХ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СЕЛЕКТИВНОЙ ЭМБРИОКУЛЬТУРЕ IN VITRO

Введение реализации адаптивного потенциала растений.

Повышение эффективности и рентабель- Биотехнологический метод эмбриокультуры ности использования основной хлебной куль- in vitro позволяет наиболее полно выявить и туры - яровой мягкой пшеницы - как биоло- реализовать различные онтогенетические (в гического ресурса во многом базируется на том числе и адаптивные) программы развития

зародыша, а, значит и растения в целом, поскольку зародыш обладает всеми потенциями взрослого организма [1, 2].

Засуха - основной неблагоприятный климатический фактор на Южном Урале. За последние 10 лет средняя температура воздуха в регионе повысилась на 1,2% и имеет тенденцию к дальнейшему повышению. Перед селекционерами остро стоит проблема создания новых засухоустойчивых сортов яровой мягкой пшеницы, перспективных для районирования на Южном Урале в условиях глобального потепления.

Один из биотехнологических подходов к получению засухоустойчивых растений предполагает получение регенерантов из зародышей, находящихся в критической стадии автономности, в экспериментальных условиях культуры in vitro на селективной питательной среде, имитирующей дефицит влаги путем введения в состав среды полиэтиленгликоля ПЭГ 6000 [3, 4]. Такой подход позволяет дать экспресс-оценку каждому вновь создаваемому сорту по устойчивости к стресс-фактору «засуха» [5, 6].

Цель работы состояла в получении расте-ний-регенерантов яровой мягкой пшеницы из автономных зародышей в экспериментальных модельных условиях культуры in vitro, селективных по фактору «засухоустойчивость», и лабораторной оценке таких регенерантов.

Методика

Объектом исследования послужили 10 новых гибридных комбинаций яровой мягкой пшеницы поколения F1, полученных в лаборатории селекции яровой пшеницы Селекционного центра по растениеводству ГНУ «Башкирский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии» (г. Уфа): Боевчанка х Ирень, Л42938 х Салават Юлаев, Дуэт х Башкирская 28, Э43018 х Ту-лайковская золотистая, Л42809 х Л42866, Л42875 х Экада 70, Башкирская 26 х Экада 70, Л42875 х 76/98a, Воронежская 16 х Л42833, Боевчанка х Башкирская 26. Семена для исследования предоставлены согласно договору о творческом сотрудничестве на 2011-2015 гг. Донорные растения выращивали в полевых условиях научного стационара Института биологии Уфимского НЦ РАН (Уфимский район).

В работе использовали метод эмбриокультуры in vitro яровой мягкой пшеницы с учетом эмбриологических и физиологических нюансов, в авторской разработке [7, 8]. Критическую стадию автономности выявляли по способности зародышей, изолированных на последовательных стадиях эмбриогенеза, завершить эмбриогенез и дать нормальные про-

ростки в условиях in vitro на простой безгор-мональной среде [1], при этом использовали авторскую периодизацию эмбриогенеза пшеницы [9]. Оценку засухоустойчивости автономных зародышей проводили по их отзывчивости в культуре in vitro в селективных условиях, имитирующих дефицит влаги, путем введения в состав среды осмотика полиэти-ленгликоль молекулярной массой 6000 Да (ПЭГ 6000), понижающего осмотический потенциал питательной среды, но не проникающего в растительные клетки [3]. Использовали ПЭГ 6000 в концентрации 25%, существенно ингибирующей рост клеток [4]. Цитогенетическую оценку регенерантов проводили согласно общепринятому методу [10]. Статистическую обработку полученных результатов вели с применением программы Excel, учитывая основные статистические параметры.

Результаты

Экспериментально выявили критическую стадию автономности зародыша изучаемых гибридных комбинаций пшеницы, соответствующую стадии сформированного зародыша. Морфометрические, временные и морфологические показатели зародышей изучаемых гибридных комбинаций пшеницы в критической стадии автономности следующие: длина зародыша 2.1-2.2 мм; 17.5-20.0 сут после опыления; наличие всех типичных для зародышей злаков органов: щиток (семядоля), лигула (вырост щитка), дифференцированная почечка, состоящая из апекса побега и первого листа, колеоптиль, эпибласт, колеориза, зародышевый корень.

Зародыши в критической стадии автономности инокулировали в условия культуры in vitro на селективную питательную среду I, составленную по прописи [11], в состав которой вводили осмотик ПЭГ 6000 в концентрации 25%.

Установлено, что в условиях выполненных экспериментов происходило существенное ингибирование развития и постепенная деградация зародышей гибридных комбинаций Боевчанка х Ирень, Дуэт х Башкирская 28, Л42809 х Л42866, Воронежская 16 х Л42833, Боевчанка х Башкирская 26. Автономные зародыши гибридных комбинаций Э43018 х Тулайковская золотистая, Л42875 х Экада 70, Л42875 х 76/98a, Башкирская 26 х Экада 70, Л42938 х Салават Юлаев оказались способны к формированию проростков в модельных условиях имитации засухи in vitro. В таблице 1 в качестве примера приведены данные по формированию или отсутствию формирования проростков через 9 суток культивирования автономных зародышей in vitro.

Таблица 1

Формирование 9-суточных проростков из автономных зародышей гибридных комбинаций пшеницы в селективных условиях эмбриокультуры in vitro

Г ибридная комбинация Количество проростков, % от инокулированных автономных зародышей

Э43018 х Тулайковская золотистая 11.9±3.42

Л42875 х Экада 70 8.3±3.32

Л42875 х 76/98а 3.2±0.62

Башкирская 26 х Экада 70 3.Ш.31

Л42938 х Салават Юлаев 2.5±0.93

Боевчанка х Ирень 0

Дуэт х Башкирская 28 0

Л42809 х Л42866 0

Воронежская 16 х Л42833 0

Боевчанка х Башкирская 26 0

----------------1----------------------------------2-----------------------------------5----------------------------------

Примечание'. - значимо на 0.1%-ном уровне, - значимо на 1.0%-ном уровне, - значимо на 5.0%-ном уровне

Таким образом, гибридные комбинации пшеницы Э43018 х Тулайковская золотистая, Л42875 х Экада 70, Л42875 х 76/98a, Башкирская 26 х Экада 70, Л42938 х Салават Юлаев следует оценить как перспективные стресс-толерантные, автономные зародыши которых способны к формированию проростков в модельных условиях имитации засухи в культуре in vitro.

После переноса проростков стресс-толерантных гибридных комбинаций на питательную среду II, составленную по прописи Blaydes [12], и их культивирования in vitro в течение 30-35 сут получили растения-регенеранты.

В фенофазе кущения регенеранты извлекали из пробирок, и вели их цитогенетический анализ путем подсчета числа хромосом в ме-тафазной пластинке клеток кончика одного из корней. Для дальнейших экспериментов отбирали только те регенеранты, которые прошли цитогенетический тест на диплоидность.

Диплоидные растения переносили в условия ex vitro в сосуды со специально подобран-

ной почвенной смесью. Дальнейшая вегетация таких растений-регенерантов проходила на лабораторной светоплощадке при щадящем температурном режиме (+20-220С) и в условиях освещенности, приближенных к условиям светового дня (16-18 тыс люкс, 16 час света/8 час темноты).

Развитие растений-регенерантов в условиях ex vitro шло типично для развития растений яровой мягкой пшеницы в естественных условиях [1, 13] как по последовательности прохождения фенофаз: выхода в трубку, стеблевания, колошения, цветения, молочной, восковой и полной спелости зерна, так и по продолжительности этих фенофаз.

В фенофазе полной спелости зерна провели лабораторную оценку всхожести зерновок полученных растений-регенерантов путем их проращивания в чашках Петри при +270С в темноте. Полученные результаты демонстрируют высокую лабораторную всхожесть зерновок растений-регенерантов всех изученных гибридных комбинаций (табл. 2).

Лабораторная всхожесть зерновок растений-регенерантов гибридных комбинаций яровой мягкой пшеницы

Таблица 2

Г ибридная комбинация Лабораторная всхожесть зерновок, %

Э43018 х Тулайковская золотистая 95.1±1.4

Л42875 х Экада 70 88.7±5.3

Л42875 х 76/98a 93.8±3.6

Башкирская 26 х Экада 70 98.1±6.2

Л42938 х Салават Юлаев 92.4±3.7

Примечание: все показатели значимы на 5.0%-ном уровне

Выводы

На основании формирования проростков ности, что и исходные (донорные) растения

из автономных зародышей в модельных усло- яровой мягкой пшеницы. Регенераты форми-

виях культивирования in vitro на селективных руют зерновки высокого качества, что под-

питательных средах, имитирующих засуху тверждается лабораторными наблюдениями

введением осмотика полиэтиленгликоль ПЭГ по их всхожести.

6000 в концентрации 25%, выявлены 5 пер- Работа выполнена при поддержке гран-спективных стресс-толерантных гибридных та по Программе фундаментальных исследо-

комбинаций яровой мягкой пшеницы. ваний Отделения биологических наук РАН

Растения-регенеранты в своем развитии в «Биологические ресурсы России: динамика в

условиях in vitro и ex vitro проходят те же фе- условиях глобальных климатических и антро-

нофазы и практически той же продолжитель- погенных воздействий» (2012-2014 гг.).

Литература

1. Батыгина, Т.Б. Хлебное зерно: Монография./ Т.Б. Батыгина; Л.: Наука, 1987. 103 с.

2. Терёхин Э.С. Зародыш // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 2: Семя / Э.С. Терёхин, ред. Т.Б. Батыгина. СПб.: Мир и семья, 1997. C. 294-297.

3. Долгих Ю.И. Сомаклональная изменчивость растений и возможности ее практического использования (на примере кукурузы): автореф. ... д-ра биол. наук. М., 2005. 45 с.

4. Круглова Н.Н. Клеточное и тканевое воздействие ПЭГ 6000 как имитатора засухи на органы автономного зародыша пшеницы в условиях in vitro // Материалы междунар. конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 17-19 апреля 2012 г.). Казань, 2012. С. 17-20.

5. Круглова Н.Н. Оценка коллекции генотипов яровой мягкой пшеницы по устойчивости автономных зародышей in vitro на селективных средах, имитирующих засуху // Известия Самарского НЦ РАН. 2012. Т. 16. № 1. С. 2243-2245.

6. Круглова Н.Н., Никонов В.И. Оценка экспланта для биотехнологических разработок в целях адаптационной селекции яровой мягкой пшеницы в засушливых условиях Южного Урала // Известия Уфимского НЦ РАН. 2012. №

3. С. 15-18.

7. Круглова Н.Н. Культура in vitro разновозрастных зародышей яровой мягкой пшеницы на основе эмбриологических и цитофизиологических данных / Методические рекомендации. Уфа, 2012. 45 с.

8. Круглова Н.Н. К вопросу о выявлении автономности зародыша пшеницы для биотехнологических целей // Достижения и проблемы генетики, селекции и биотехнологии: Сборник научных трудов. Т. 4. Киев: Логос, 2012. С. 542-546.

9. Круглова Н.Н. Периодизация эмбриогенеза пшеницы как методологический аспект биотехнологических разработок // Известия Уфимского НЦ РАН. 2012. № 1. С. 56-61.

10. Абрамова, З.В. Руководство к практическим занятиям по генетике. / З.В. Абрамова, О.А. Карлинский; Л.: Колос, 1968. 192 с.

11. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. № 3. P. 473-497.

12. Blaydes D.F. Interaction of kinetin and various inhibitors in the growth of soybean // Physiol. Plant. 1966. V. 19. № 3. P. 748-753.

13. Челак В.Р. Система размножения пшеницы Triticum L. Кишинев: Штиинца, 1991. 320 с.