БЕЛОК (ФА), ОБУСЛАВЛИВАЮЩИЙ СВОЙСТВО АУТОАГГЛЮТИНАЦИИ КЛЕТОК ЧУМНОГО МИКРОБА, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

1. Белок (ФА), обуславливающий свойство аутоагглютинации клеток чумного микроба, который расположен на поверхности клетки Y.pestis, и его наличие коррелирует со способностью бактерий к аутоагглютинативному росту в жидких питательных средах и с повышением гидрофобности клеток, характеризующийся:
- молекулярной массой - 17,485 кДа,
- белка - 80%,
- нейтральных углеводов - 6%.
2. Способ получения белка по п.1, включающий следующие стадии:
а) в качестве штамма-продуцента используют Y.pestis КМ 1279 (депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб»), который получен из штамма Y.pestis EV76;
б) Y.pestis КМ 1279 выращивают на 1,5% агаре LB (рН 7,2) при 26°C в течение 48 ч, бактерии смывают холодным забуференным физраствором (ЗФР) и высушивают ацетоном;
в) бакмассу (1 г) отмывают от остатков питательной среды ЗФР и осаждают центрифугированием (8000 об/мин) на холоду (4°C) в течение 15 мин;
г) клеточный осадок суспендируют в 200 мл раствора 5 мМ NaOH (рН 9,0), выдерживают, при встряхивании, при 26°C 2 ч и отделяют клетки центрифугированием (8000 об/мин) при 20°C в течение 15 мин, получают щелочной раствор, в котором содержится ФА, смытый с поверхности клеток;
д) супернатант фильтруют через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм;
е) к фильтрату добавляют нейтрализованный раствор (рН 7,1) сульфата аммония до 25% насыщения, выдерживают 20 ч при 4°C до формирования осадка, последний отделяют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 мин;
ж) осадок освобождают от сульфата аммония, для этого его растворяют в 50 мл 5 мМ NaOH (рН 9,0) и диализуют против 5 мМ NaOH в объеме 2,5-3,0 л при 4°C в течение 24 ч, меняя раствор дважды;
з) к диализованному раствору добавляют соляную кислоту до получения изоэлектрической точки белка ФА (рН 4,6), затем 20 ч инкубируют при 4°C для формирования осадка, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 30 мин, осадок растворяют в 50 мл 5 мМ NaOH, процедуру повторяют трижды, исключая примеси других белков;
и) ФА осаждают ацетоном, для чего осадок растворяют в 50 мл раствора 5 мМ NaOH, добавляют три объема холодного ацетона, выдерживают при -20°C в течение 20 ч с последующим центрифугированием на холоду (4°C) при 10000 об/мин в течение 30 мин;
й) полученный осадок подвергают лиофильному высушиванию, предварительно суспендируя его в 10 мл деионизированной дистиллированной воды и фасуя по ампулам с последующей сушкой.