Количественный анализ флавоноидов в растительном средстве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Сибирский медицинский журнал, 2013, № 1

лекарственные растения

© ЛУБСАНДОРЖИЕВА П.Б., БОЛДАНОВА Н.Б., ПОПОВ Д.В. - 2013 УДК 633.88

количественный анализ флавоноидов в растительном средстве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Пунцык-Нима Базыровна Лубсандоржиева1, Наталья Батлаевна Болданова2, Дмитрий Витальевич Попов2

Резюме. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) идентифицированы основные флавоноидные вещества в этилацетатной фракции адаптогенного средства. Установлено количественное содержание в средстве рутина, кверцетина, лютеолина.

Ключевые слова: адаптогенное средство, флавоноиды, метод ВЭЖХ.

the quantitative analysis of flavonoids in vegetable remedy by hplc method

P.B. Lubsandorzhieva1, N.B. Baldanova2, D.V. Popov2

Summary. The basic flavonoid compounds of the adaptogenic remedy Adaptophyte were identified by HPLC method in ethylacetic fraction. The quantitative contents of rutin, quercetin and luteolin have been established in the remedy.

Key words: adaptogenic remedy, flavonoids, HPLC method.

Всевозрастающие требования к стандартизации фитопрепаратов вызывают необходимость развития аналитики природных соединений, в частности, флавоноидов, как наиболее распространенных вторичных метаболитов в растительном мире, и являющихся основными действующими веществами во многих видах лекарственного растительного сырья (ЛРС). Использование информативного приема анализа, как сочетание метода ВЭЖХ с масс-спектрометрией и УФ - спектрофотометрией частично решило проблему надежности и идентификации групповых и индивидуальных компонентов сложных смесей природных соединений.

Цель данной работы - качественное и количественное определение флавоноидов в адаптогенном средстве «Адаптофит» методом ВЭЖХ.

Материалы и методы

В состав «Адаптофита» входят: корневища и корни Inula helenium L., Rhaponticum carthamoides (Willd) DC., Althaea officinalis L., Acorus calamus L., Zingiber officinale Roscoe, соцветия Calendula officinalis L., плоды Elettaria cardamomum Maton., Myristica fragrans Houtt., Punica granatum L., Piper longum L., Juniperus communis L., кора Cinnamomum cassia, трава Polygonum aviculare L., листья черные Bergenia crassifolia (L.) Fritsch., хитозан. Фармакопейные виды сырья, хитозан приобретены в аптечной сети, пряности, плоды P granatum - в торговой сети, листья B. crassifolia собраны в Прибайкальском районе Бурятии в осенний период 2009-2010 гг.

5 г (точная навеска) исходной смеси Адаптофита обработали дважды по 25 мл гексана, затем по 25 мл хлороформа (3-кратная экстракция) для удаления липофильных веществ. Шрот экстрагировали последовательно 80%, 40% спиртом этиловым, водой горячей воды по 50 мл, извлечения отфильтровали, спирт удалили, водный остаток концентрировали до 10-15 мл. Водный остаток обработали 30 мл этилацетата (5-кратно), извлечения отделяли от водного слоя, растворитель удалили, сухой остаток этилацетатной фракции растворили в 25 мл 96 % спирта этилового. Для качественного анализа флавоноидов спиртовый раствор этилацетатной фракции «Адаптофита» очищали на колонке с полиамидом.

Для количественного анализа флавоноидов в плодах P. granatum, одного из основных компонентов Адаптофита, получена этилацетатная фракция путем последовательной экстракции 20,0 г (точная навеска) высушенных плодов горячей водой, этилацетатом. После удаления растворителя сухой остаток этилацетатной фракции растворили в 5 мл 96% спирта этилового.

Качественный и количественный состав биологически активных веществ (БАВ) в исследуемых образцах определяли методом ВЭЖХ-МС, с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа марки «Agilent 1200», с тандем-ным масс-спектрометрическим детектором «ионная ловушка» 6330, способ ионизации электроспрей. Колонка Zorbax Eclipse C18, 5 мкм, 4,6х150мм. Элюирование проводили в градиентном режиме, в качестве подвижной фазы использовали смесь 0,1% раствора муравьиной кислоты и ацетони-трила в соотношении (1:0, 1:9, 9:1). Объемная скорость потока элюента - 1,0 мл/мин, объем вводимой пробы 10 мкл, время элюирования 30 минут. Анализ проводился в режиме регистрации отрицательных ионов, по полному ионному току TIC, по массовым зарядам характеристических (MS) и дочерних (MS2) отрицательных ионов, режим UltraScan 501300 m/z, AutoMS.

Стандартные образцы кверцетина, рутина, лютеолина, лютеолина-7-глюкозида готовили в концентрации 10 мкг/мл. В хроматограф вводили по 20 мкл исследуемых растворов и раствора стандартных образцов, хроматографировали в выше приведенных условиях. Идентификацию веществ проводили по данным УФ-, МС-спектроскопии по сравнению с библиотечными данными и вышеперечисленными стандартными образцами.

Расчёт количественного содержания отдельных флаво-ноидов производили методом абсолютной калибровки.

УФ-спектры поглощения этилацетатной фракции, 70% этанольного извлечения из Адаптофита регистрировали на спектрофотометре СФ-2000 (Ломо) в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Общее содержание флавоноидов определяли спектрофотометрическим методом c использованием 2% раствора алюминия хлористого [1].

Результаты и обсуждение

В таблице 1 приведены данные хроматографическо-го обнаружения основных флавоноидных соединений «Адаптофита».

Нахроматограммеэтилацетатнойфракции«Адаптофита», очищенной на колонке с полиамидом, доминируют флаво-ноиды C. officinalis. Наличие в масс-спектрах иона с m/z 301, 315, 317, 285 указывало, что обнаруженные соединения относятся к производным кверцетина, изорамнетина и лютео-лина. Кверцетин, рутин, лютеолин, лютеолин-7-глюкозид идентифицированы по сравнении с временем удерживания, УФ-, МС-спектральными данными стандартных образцов. Кверцетин, рутин содержатся в C. officinalis [5], P. aviculare

Сибирский медицинский журнал, 2013, № 1

Таблица 1

Основные флавоноиды Адаптофита, идентифицированные методом ВЭЖХ

№ Наименование мин Основные ионы в масс-спектре, m/z УФ-спектр, Л , нм max'

1 изорамнетина-3-О-рутинозилрамнозид 9,7 695,5; 769,3; 298,9 225, 253, 356

2 Рутин 9,8 609,2; 463,1; 299,9 255, 300 пл, 358

3 изокверцитрин 10,0 463,1; 300,9 255, 267 пл., 358

4 нарциссин 10,1 623,1; 479; 317 258 пл, 268 пл, 358

5 кемпферола-рамноглюкозид 10,2 593,1; 623,1; 284,9 252, 268 пл, 300, 360

6 изоскутелляреина-7-О-в-ксилопиранозид 10,8 417; 284,9 278 пл, 308, 328

7 кверцетин 12,0 301,1; 270,9 256, 370

8 изорамнетин 12,1 315; 299 270 пл, 300 пл

9 лютеолина-7-глюкозид 10,9 447,7; 447,2; 284,9 257, 268 пл, 351

10 лютеолин 11,8 285; 198,8 260, 356

[8], P. granatum [9], B. crassifolia [3], лютеолин - в P avicularis [8], P granaum [9], лютеолина-7-глюкозид - в Z. officinale [4].

В МС-спектре вещества со временем удерживания 9,7 мин (табл. 1) присутствуют сигналы ионов с m/z 769,3 и фрагменты с m/z 695,5, 479, соответствующие потере углеводной части, фрагмент иона с m/z 314,9 соответствует агли-кону - изорамнетину. Соединение идентифицировано как изорамнетин-3-О-рутинозилрамнозид, выделенное ранее из соцветий C. officinalis [5].

Вещество со временем удерживания 10,0 мин (табл. 1) по спектральным данным соответствует одному из основных флавоноидов C. officinalis - изокверцитрину [2,5]. Фрагмент в масс-спектре с m/z 463,1 соответствует молекулярной формуле изокверцитрина - СНО, m/z 300,9 соответствует агликону - кверцетину [2,5].

У флавоноида со временем удерживания 10,1 мин (табл. 1) в масс-спектре присутствуют фрагмент с m/z 623,1, соответствующий молекулярной формуле нарциссина - С28Н32О16, фрагмент иона с m/z 479,1 соответствует потере углеводной части, с m/z 317 и 299 соответствует изорамнетину и потере молекулы воды, соответственно [2,5].

Кемпферола рамноглюкозид со временем удерживания 10,2 мин (табл. 1), ранее выделенный из P granatum [6] и J. communis [7], идентифицирован по сравнению со спектральными данными [6,7].

Вещество со временем удерживания 10,8 мин. (табл. 1) показывает интенсивный пик с m/z 417, соответствующий молекулярной формуле С20Н18О10, фрагмент иона с m/z 284,9 соответствует агликону - 5,7,8,4'-тетрагидроксифла-

вону, а полосы поглощения в УФ спектре при 278, 308 и 328 нм подтверждают, что вещество имеет скелет флавона. Флавоноидное вещество идентифицировано как изоскутелляреина-7-О-р-ксилопиранозид, ранее выделенный из J. communis [7].

В таблице 2 приведены данные количественного анализа флавоноидных веществ в Адаптофите и P granatum.

Содержание кверцетина в Адапто фите в 2 раза выше, чем рутина (табл. 2). Для определения аналитической длины волны при определении общего содержания флавоноидов спектрофотометрическим методом сняты УФ спектры извлечений. В УФ спектре этилацетатной фракции Адаптофита имеются полосы поглощения при 217±3, 260±3, 340-350 пл. нм, в дифференциальном

Таблица 2

Количественное содержание флавоноидных веществ в Адаптофите и Punica granatum L.

№ Наименование R, мин. Содержание, мкг/г

P. granatum Адаптофит

1 рутин 9,8 0,11 57,23

2 Кверцетин 12,0 - 122,43

3 Лютеолин 11,8 - 1,99

4 Лютеолин-7-глюкозид 10,9 0,19 -

Примечание: прочерк означает, что вещества в данном извлечении не обнаружены.

спектре с добавлением алюминия хлористого - 236±2, 279±2, 398±2 нм. Дифференциальный спектр 70% этанольного извлечения Адаптофита с добавлением алюминия хлористого имеет полосу поглощения при 405±2 нм. Аналитической длиной волны для определения флавоноидов в Адаптофите выбрана полоса поглощения при 405 нм, стандартом для пересчета - рутин. Общее содержание флавоноидов в исходной смеси Адаптофита в пересчете на рутин, определенное спектрофотометрическим методом, составляет 0,47-0,62% от массы абс. сухого сырья.

Таким образом, методом ВЭЖХ установлено присутствие основных флавоноидных веществ в этилацетатной фракции адаптогенного средства. Установлено количественное содержание в Адаптофите рутина, кверцетина, лютеолина.

ЛИТЕРАТУРА

1. Государственная фармакопея СССР: вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1990. - 400 с.

2. Комиссаренко Н.Ф., Чернобай В.Т., Деркач А.И. Флавоноиды соцветий Calendula officinalis // Химия природных соединений. - 1988. - №6. - С.795-800.

3. Лубсандоржиева П.Б. Бадан толстолистный. Серия. Лекарственные растения тибетской медицины. - Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, 2003. - 90 с.

4. Харчилава И.А. Фитохимическое изучение корневищ имбиря аптечного и разработка сухого экстракта на его основе: Автореф. дис. ... канд. фарм. наук. - М., 2011. - 23 с.

5. Bilia A.R., Bergansi M.C., Gallori S., et al. Stability of the constituents of Calendula, Milk-thistle and Passionflower tinctures by LC-DAD and LC-MC. // J. Pharm. and Biomed. Analysis. - 2002. - Vol. 30. - P.613-624.

6. Elswijk D.A., Schobel U.P., Lansky E.P., et al. Rapid dereplication of estrogenic compounds in pomegranate (Punica granatum) using on-line biochemical detection coupled to mass spectrometry // Phytochemistry. - 2004. - Vol. 65. -P.233-241.

7. Naganishi T., Iida N., Inatomi Y., et al. Neolignan and flavonoid glycosides in Juniperus communis var. depressa // Phytochemistry. - 2004. - Vol. 65. - P.207-213.

8. Prestos C., Boziaris I.S., Kapsokefalou M., Komaitis M. Natural antioxidant constituents from selected aromatic plants and their antimicrobial activity against selected pathogenic microorganisms // Food Technol. Biotechnol. - 2008. - Vol. 46. - P.151-156.

9. Vishal Jain, Murugananthan G., Deepak M., et al. Isolation and standartization of various phytochemical constituents from methanolic extracts of fruit rinds of Punica granatum // Chinese Journal of Natural Medicines. - 2011. - Vol. 9. - P.414-420.

Информация об авторах: Лубсандоржиева Пунцык-Нима Базыровна - старший научный сотрудник, к. фарм.н., 670047, Улан-Удэ, Сахъяновой ул., 6. ИОЭБ СО РАН, bpunsic@mail.ru; Болданова Наталья Батлаевна - старший научный сотрудник, к.м.н.; Попов Дмитрий Витальевич - аспирант.