СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ПСОРИАЗА
METHODS OF TREATING PSORIASIS

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США No. 60/880767, поданной 16 января 2007; предварительной заявке США No. 60/904022, поданной 27 февраля 2007; предварительной заявке США No. 60/925960, поданной 24 апреля 2007; предварительной заявке США No. 60/961764, поданной 24 июля 2007; и предварительной заявке США No. 60/997012, поданной 28 сентября 2007, полное содержание каждой из которых включено в настоящее описание в виде ссылки.
ОСНОВЫ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Псориаз представляет собой опосредованное T-клетками воспалительное заболевание, которое считается одним из наиболее распространенных аутоиммунных заболеваний, поражающих приблизительно от 2% до 3% взрослых, но при этом распространенность его в той или иной части мира сильно варьирует (Stern R.S., et al., J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2004, 9: 136-39; Davidson A. and Diamond B.N. Engl. J. Med. 2001, 345: 340-50; Langley R.G.B., et al., Ann. Rheum. Dis. 2005, 64(Suppl. II): ii18-23). Псориаз существенно влияет на качество жизни (de Korte J, et al., J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2004, 9: 140-7; Krueger G, et al., Arch. Dermatol. 2001, 137: 280-4; Finlay AY and Coles EC, Br. J. Dermatol. 1995, 132: 236-44) и ассоциирован с целым рядом психологических и психо-социальных проблем (Kimball AB, et al., Am. J.Clin. Dermatol. 2005, 6: 383-92; Russo PA, et al., Australas J. Dermatol. 2004, 45: 155-9). Многочисленные традиционные варианты терапии псориаза оказывают побочное токсическое воздействие; следовательно, их длительное применение имеет ограничения (Lebwohl M. and Ali S., J. Am. Acad. Dermatol. 2001, 45: 487-98; Lebwohl M. and Ali S., J. Am. Acad. Dermatol. 2001, 45: 649-61). Кроме того, многие пациенты с псориазом не удовлетворены традиционной терапией (Stern RS, et al, J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2004, 9: 136-39; Finlay AY and Ortonne JP, J. Cutan. Med. Surg. 2004, 8: 310-20); таким образом, существует очевидная потребность в таких терапевтических подходах, которые являются более безопасными и более легкими для применения и которые могут быть прописаны на долговременной основе.
Интерлейкин-12 (IL-12) и родственный ему цитокин IL-23 являются членами суперсемейства цитокинов IL-12, которые имеют общую субъединицу p40 (Anderson EJR, et al., Springer Semin. Immunopathol. 2006, 27: 425-42). Оба цитокина вносят свой вклад в развитие иммунного ответа хелперных клеток типа 1T (Th1) при псориазе, но каждый из них играет особую роль (Rosmarin D and Strober BE, J. Drugs. Dermatol. 2005, 4: 318-25; Hong K, et al., J. Immunol. 1999, 162: 7480-91; Yawalkar N, et al., J. Invest. Dermatol. 1998, 111: 1053-57). IL-12, прежде всего, стимулирует дифференцировку Th1-клеток и последующую секрецию гамма-интерферона, тогда как IL-23 предпочтительно стимулирует дифференцировку наивных [или интактных] T-клеток в T-хелперные клетки-эффекторы (Th17), которые секретируют IL-17, провоспалительный медиатор. Rosmarin D and Strober BE, J. Drugs Dermatol. 2005, 4: 318-25; Harrington Le, et al., Nature Immunol 2005, 6: 1123-32; Park H, et al. Nature Immunol. 2005, 6: 1132-41). Сверхэкспрессия субъединицы p40 матричной РНК интерлейкина IL-12 и интерлейкина IL-23 при кожных поражениях при псориазе свидетельствует о том, что ингибирование IL-12 и IL-23 нейтрализующим антителом против белка субъединицы p40 IL-12/23 может оказаться эффективным терапевтическим подходом к лечению псориаза (Yawalkar N, et al., J. Invest. Dermatol. 1998, 111: 1053-57; Lee E, et al., J. Exp. Med. 2004, 199: 125-30; Shaker OG, et al., Clin. Biochem. 2006, 39:119-25; Piskin G, et al., J. Immunol. 2006, 176: 1908-15). Такие терапевтические подходы к лечению псориаза крайне необходимы в данной области.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения псориаза, например хронического псориаза, с использованием антитела или его антиген-связывающей части, которое связывается с человеческим IL-12 и/или с человеческим IL-23.
В одном аспекте изобретение обеспечивает способ лечения псориаза у субъекта, включающий введение субъекту один раз в две недели, еженедельное введение или введение однократной дозы антитела или его антиген-связывающей части, направленного против человеческого IL-12 и/или человеческого IL-23.
В одном варианте осуществления ответ на введение один раз в две недели, еженедельное введение или введение однократной дозы антитела или его антиген-связывающей части поддерживается у субъекта в течение длительного периода времени, например, по меньшей мере приблизительно в течение 12 недель или по меньшей мере приблизительно 24 недели.
В другом варианте осуществления у субъекта поддерживается ответ на уровне по меньшей мере PASI-75 (Индекс площади и тяжести псориаза) в течение длительного периода времени после введения указанному субъекту один раз в две недели, еженедельного введения или введения однократной дозы антитела или его антиген-связывающей части, направленного против человеческого IL-12 и человеческого IL-23. В еще одном варианте осуществления по меньшей мере ответ PASI-90 поддерживается у субъекта в течение длительного периода времени после введения указанному субъекту один раз в две недели, еженедельного введения или введения однократной дозы антитела или его антиген-связывающей части, направленного против человеческого IL-12 и человеческого IL-23. В следующем варианте осуществления по меньшей мере ответ PASI-100 поддерживается у субъекта в течение длительного периода времени после введения указанному субъекту один раз в две недели, еженедельного введения или введения однократной дозы антитела или его антиген-связывающей части, направленного против человеческого IL-12 и человеческого IL-23. В одном варианте осуществления доза антитела, направленного против человеческого IL-12 и/или человеческого IL-23, составляет приблизительно 200 мг или приблизительно 100 мг.
В одном варианте осуществления псориаз представляет собой пятнистый псориаз, например хронический пятнистый псориаз. В другом варианте осуществления псориаз представляет собой хронический псориаз, например хронический пятнистый псориаз. Еще в одном варианте осуществления псориаз проявляется в формах от умеренной до тяжелой, например, от умеренной до тяжелой формы пятнистого псориаза, от умеренной до тяжелой формы хронического псориаза или от умеренной до тяжелой формы хронического пятнистого псориаза.
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят путем подкожного введения.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения псориаза у субъекта, включающему следующие стадии: (i) выбор субъекта, который страдает хроническим псориазом; и (ii) введение субъекту антитела или его антиген-связывающей части, которое способно связываться с эпитопом p40-субъединицы IL-12 и/или IL-23; тем самым достигается лечение псориаза у субъекта.
В одном варианте осуществления субъекту поставлен клинический диагноз псориаз по меньшей мере 6 месяцев назад. В другом варианте осуществления субъект имеет пятнистый псориаз на протяжении по меньшей мере 2 месяцев.
Еще в одном из аспектов изобретение обеспечивает способ лечения псориаза у субъекта, предусматривающий следующие стадии: (i) выбор субъекта, у которого ранее не было отмечено состояние, выбранное из группы, состоящей из проведения в прошлом системной или биологической анти-IL-12-терапии; наличия не-пятнистого псориаза; невозможности прервать местную терапию псориаза по меньшей мере за 2 недели до лечения; проведения ультрафиолетовой В-лучевой фототерапии по меньшей мере за 2 недели до лечения; проведения фототерапии псораленом-ультрафиолетовым облучением по меньшей мере за 4 недели до лечения; системной терапии по меньшей мере за 4 недели до лечения; биологической терапии по меньшей мере за 12 недель до лечения; необходимости потребления пероральных или инъецируемых кортикостероидов в процессе лечения; обострения астмы, требующего госпитализации в течение 10-летнего периода до скрининга; инфекции или факторов риска развития тяжелой инфекции; наличия в анамнезе злокачественных заболеваний, кроме успешно излеченной базально-клеточной карциномы, например плоскоклеточной карциномы или карциномы шейки матки in situ; и наличия в анамнезе проявления значительной иммунной реакции, например сывороточной болезни или анафилактоидной реакции, реакции на иммуноглобулин G-содержащее средство, например внутривенный гамма-глобулин, слитый белок или моноклональное антитело; и (ii) введение субъекту антитела или его антиген-связывающей части, которое способно связываться с эпитопом p40-субъединицы IL-12 и/или IL-23; тем самым достигается лечение псориаза у субъекта.
Еще в одном из аспектов изобретение обеспечивает способ лечения псориаза у субъекта, включающий следующие стадии: (i) выбор субъекта, которому в течение 1 месяца не производилась вакцинация средством, содержащим жизнеспособный вирус; и (ii) введение субъекту антитела или его антиген-связывающей части, которое способно связываться с эпитопом p40-субъединицы IL-12 и/или IL-23.
9
9
Еще в одном из дальнейших аспектов изобретение обеспечивает способ лечения псориаза у субъекта, включающий следующие стадии: (i) введение субъекту антитела или его антиген-связывающей части, которое способно связываться с эпитопом p40-субъединицы IL-12 и/или IL-23; (ii) мониторинг субъекта на предмет обнаружения клинически значимого аномального результата лабораторных анализов, выбранного из группы, состоящей из уровней аспартаттрансаминазы или аланинтрансаминазы, более чем в 5 раз превышающих верхнюю границу нормы; уровня общего сывороточного билирубина, более чем в 3 раза превышающего верхнюю границу нормы; уровня сывороточного креатинина, более чем в 3 раза превышающего верхнюю границу нормы; уровня креатинфосфокиназы, более чем в 5 раз превышающего верхнюю границу нормы; уровня гемоглобина, составляющего менее 8 г/дл; клеток белой крови, количество которых составляет менее 2×10/л; и тромбоцитов, насчитывающих менее 75×10/л; и (iii) прекращение введения антитела или его антиген-связывающей части субъекту, у которого обнаружен клинически значимый аномальный результат лабораторных анализов; тем самым достигается лечение псориаза у субъекта.
В одном из вариантов осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят один раз в две недели. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят еженедельно или в однократной дозировке.
В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят в дозе приблизительно 100 мг, 110 мг, 120 мг, 130 мг, 140 мг, 150 мг, 160 мг, 170 мг, 180 мг, 190 мг, 200 мг, 210 мг или 220 мг.
В одном из вариантов осуществлений антитело или его антиген-связывающая часть способно связываться с эпитопом p40-субъединицы, когда p40-субъединица связана с p35-субъединицей IL-12. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть способно связываться с эпитопом p40-субъединицы, когда p40-субъединица связана с p19-субъединицей IL-23. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть способно связываться с эпитопом p40-субъединицы, когда p40-субъединица связана с p35-субъединицей IL-12 и когда p40-субъединица связана с p19-субъединицей IL-23.
В одном из вариантов осуществлений псориаз представляет собой хронический псориаз, например хронический пятнистый псориаз, например, от умеренной до тяжелой форм хронического пятнистого псориаза.
В другом аспекте изобретение обеспечивает способ лечения псориаза у субъекта, включающий введение субъекту антитела или его антиген-связывающей части, которое способно связываться с эпитопом p40-субъединицы IL-12 и/или IL-23, при этом у субъекта поддерживается ответ на уровне по меньшей мере PASI-90 в течение длительного периода времени после первоначального введения антитела или его антиген-связывающей части, тем самым достигается лечение псориаза у субъекта.
В одном из вариантов осуществлений длительный период времении составляет по меньшей мере приблизительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 недели.
В одном из вариантов осуществлений антитело или его антиген-связывающую часть вводят один раз в две недели. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят еженедельно. Еще в одном из вариантов осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят в однократной дозировке.
В одном из вариантов осуществлений антитело или его антиген-связывающую часть вводят в дозе приблизительно 100 мг, 110 мг, 120 мг, 130 мг, 140 мг, 150 мг, 160 мг, 170 мг, 180 мг, 190 мг, 200 мг, 210 мг или 220 мг.
В одном из вариантов осуществлений псориаз представляет собой хронический псориаз, например хронический пятнистый псориаз, например, от умеренной до тяжелой форм хронического пятнистого псориаза.
В другом аспекте изобретение обеспечивает способ лечения псориаза у субъекта, включающий введение субъекту антитела или его антиген-связывающей части, которое способно связываться с эпитопом p40-субъединицы IL-12 и/или IL-23, при этом у субъекта поддерживается нулевой или минимальный уровень PGA (общей оценки пациента) в течение длительного периода времени после первоначального введения антитела или его антиген-связывающей части, тем самым достигается лечение псориаза у субъекта.
В одном из вариантов осуществления длительный период времени составляет по меньшей мере приблизительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 недели.
В одном из вариантов осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят один раз в две недели. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят еженедельно. Еще в одном из вариантов осуществления антитело вводят в однократной дозировке.
В одном из вариантов осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят в дозе приблизительно 100 мг, 110 мг, 120 мг, 130 мг, 140 мг, 150 мг, 160 мг, 170 мг, 180 мг, 190 мг, 200 мг, 210 мг или 220 мг.
В одном из вариантов осуществления псориаз представляет собой хронический псориаз, например хронический пятнистый псориаз, например, от умеренной до тяжелой форм хронического пятнистого псориаза.
Еще в одном из вариантов осуществления изобретение обеспечивает способ лечения псориаза у субъекта, включающий введение субъекту антитела или его антиген-связывающей части, которое способно связываться с эпитопом p40-субъединицы IL-12 и/или IL-23, при этом у субъекта проявляется улучшенный индекс PASI приблизительно на 8 неделе после первоначального введения антитела или его антиген-связывающей части, тем самым достигается лечение псориаза у субъекта.
В одном из вариантов осуществления у субъекта проявляются улучшенные индексы PASI приблизительно через 7 недель, приблизительно через 6 недель, приблизительно через 5 недель, приблизительно через 4 недели, приблизительно через 3 недели, приблизительно через 2 недели, приблизительно через 1 неделю после первоначального введения антитела или его антиген-связывающей части.
В одном из вариантов осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят один раз в две недели. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят еженедельно. Еще в одном из вариантов осуществления антитело вводят в однократной дозировке.
В одном из вариантов осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят в дозе приблизительно 100 мг, 110 мг, 120 мг, 130 мг, 140 мг, 150 мг, 160 мг, 170 мг, 180 мг, 190 мг, 200 мг, 210 мг или 220 мг.
В одном из вариантов осуществления псориаз представляет собой хронический псориаз, например хронический пятнистый псориаз, например, от умеренной до тяжелой форм хронического пятнистого псориаза.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения псориаза у субъекта, включающему введение субъекту антитела или его антиген-связывающей части, которое способно связываться с эпитопом p40-субъединицы IL-12 и/или IL-23, при этом у субъекта поддерживается по меньшей мере ответ PASI-50 в течение длительного периода времени после прекращения введения антитела или его антиген-связывающей части, тем самым достигается лечение псориаза у субъекта.
В близком к указанному выше аспекте изобретение обеспечивает способ лечения псориаза у субъекта, предусматривающий введение субъекту антитела или его антиген-связывающей части, которое способно связываться с эпитопом p40-субъединицы IL-12 и/или IL-23, при этом у субъекта поддерживается по меньшей мере ответ PASI-75 в течение длительного периода времени после прекращения введения антитела или его антиген-связывающей части, тем самым достигается лечение псориаза у субъекта.
Еще в одном близком аспекте изобретение обеспечивает способ лечения псориаза у субъекта, предусматривающий введение субъекту антитела или его антиген-связывающей части, которое способно связываться с эпитопом p40-субъединицы IL-12 и/или IL-23, при этом у субъекта поддерживается по меньшей мере ответ PASI-90 в течение длительного периода времени после прекращения введения антитела или его антиген-связывающей части, тем самым достигается лечение псориаза у субъекта.
В одном из вариантов осуществления длительный период времени после прекращения введения антитела составляет по меньшей мере приблизительно 12 недель.
В одном из вариантов осуществления антитело вводят в течение по меньшей мере приблизительно 12 недель.
В одном из вариантов осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят один раз в две недели. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят еженедельно. Еще в одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят в однократной дозировке.
В одном из вариантов осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят в дозе приблизительно 100 мг, 110 мг, 120 мг, 130 мг, 140 мг, 150 мг, 160 мг, 170 мг, 180 мг, 190 мг, 200 мг, 210 мг или 220 мг.
В одном из вариантов осуществления псориаз представляет собой хронический псориаз, например хронический пятнистый псориаз, например, от умеренной до тяжелой форм хронического пятнистого псориаза.
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, способно связываться с эпитопом p40-субъединицы IL-12.
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть способно связываться с эпитопом p40-субъединицы, когда р40-субъединица связана с р35-субъединицей IL-12. В другом варианте осуществления аонтитело или его антиген-связывающая часть способно связываться с эпитопом р40-субъединицы, когда р40-субъединица связана с р19-субъединицей. В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть способно связываться с эпитопом р40-субъединицы, когда р40-субъединица связана с р35-субъединицей IL-12 и когда р40-субъединица связана с р19-субъединицей.
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть связывается с эпитопом p40-субъединицы IL-12, с которым связывается антитело, выбранное из группы, состоящей из Y61 и J695.
В другом варианте осуществления антитело дополнительно способно связываться с первым гетеродимером, а также способно связываться со вторым гетеродимером, где первый гетеродимер содержит p40-субъединицу IL-12 и p35-субъединицу IL-12 и где второй гетеродимер содержит p40-субъединицу IL-12 и p19-субъединицу.
В следующем варианте осуществления антитело нейтрализует активность первого гетеродимера. В другом варианте осуществления антитело нейтрализует активность второго гетеродимера. Еще в одном варианте осуществления антитело нейтрализует активность первого гетеродимера и второго гетеродимера.
50
50
-9
-10
В следующем варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, ингибируют фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее, или ингибируют продуцирование IFNγ с IC, составляющей 1×10 M или менее.
d
off
-10
-3
-1
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, диссоциирует из комплекса с p40-субъединицей IL-12 с K, составляющей 1×10 M или менее, или с константой скорости k, составляющей 1×10сек или менее, как было определено методом резонансного возбуждения поверхностных плазмонов.
В одном из вариантов осуществления выделенное антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело.
В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, имеет CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
Еще в одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, имеет CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, имеет CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, способно связываться с интерлейкином, содержащим p40-субъединицу. В одном из вариантов осуществления интерлейкин содержит p40-субъединицу и p35-субъединицу, например, интерлейкин представляет собой IL-12. В другом варианте осуществления интерлейкин содержит p40-субъединицу и p19-субъединицу. Еще в одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть нейтрализует активность интерлейкина.
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть связывается с эпитопом p40-субъединицы.
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят субъекту в составе фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антиген-связывающую часть и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может содержать также и дополнительное средство, такое как терапевтическое средство, например, буденозид, эпидермальный фактор роста, кортикостероиды, циклоспорин, сульфазалазин, аминосалицилаты, 6-меркаптопурин, азатиоприн, метронидазол, ингибиторы липоксигеназы, мезаламин, олзалацин, балзалазид, антиоксиданты, ингибиторы тромбоксана, антагонисты рецептора IL-1, моноклональные антитела против IL-1β, моноклональные антитела против IL-6, факторы роста, ингибиторы эластазы, соединения пиридинил-имидазола, антитела или агонисты TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF, антитела против CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 или их лиганды, метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолята мофетил, лефлуномид, NSAID, ибупрофен, кортикостероиды, преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты аденозина, антитромботические средства, ингибиторы комплемента, адренергические средства, IRAK, NIK, IKK, p38, ингибиторы MAP-киназы, ингибиторы IL-1β-превращающего фермента, ингибиторы TNFα-превращающего фермента, ингибиторы T-клеточных сигналов, ингибиторы металлопротеиназ, сульфазалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, растворимые рецепторы цитокинов, растворимый рецептор p55 TNF, растворимый рецептор p75 TNF, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, противовоспалительные цитокины, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGFβ.
В другом варианте осуществления терапевтическое средство в составе фармацевтической композиции, вводимой субъекту, может быть выбрано из группы, состоящей из анти-TNF-антител и их фрагментов, конструкций TNFR-Ig, ингибиторов TACE, ингибиторов PDE4, кортикостероидов, буденозида, дексаметазона, сульфазалазина, 5-аминосалициловой кислоты, олзалацина, ингибиторов IL-1β-превращающего фермента, IL-1ra, ингибиторов тирозинкиназы, 6-меркаптопуринов и IL-11.
В другом варианте осуществления указанное терапевтическое средство может быть выбрано из группы, состоящей из кортикостероидов, преднизолона, метилпреднизолона, азатиоприна, циклофосфамида, циклоспорина, метотрексата, 4-аминопиридина, тизанидина, интерферона-β1a, интерферона-β1b, сополимера 1, гипербарического кислорода, внутривенного иммуноглобулина, клабрибина, антител или агонистов TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, PDGF, антител против CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 или лигандов, метотрексата, циклоспорина, FK506, рапамицина, микофенолята мофетила, лефлуномида, NSAID, ибупрофена, кортикостероидов, преднизолона, ингибиторов фосфодиэстеразы, агонистов аденозина, антитромботических средств, ингибиторов комплемента, адренергических средств, IRAK, NIK, IKK, p38 или ингибиторов MAP-киназы, ингибиторов IL-1β-превращающего фермента, ингибиторов TACE, ингибиторов T-клеточных сигналов, киназных ингибиторов, ингибиторов металлопротеиназ, сульфазалазина, азатиоприна, 6-меркаптопуринов, ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента, растворимых рецепторов цитокинов, растворимого рецептора p55 TNF, растворимого рецептора p75 TNF, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, SIL-13R, анти-P7, p-селектиновый гликопротеиновый лиганд (PSGL), противовоспалительных цитокинов, IL-4, IL-10, IL-13 и TGFβ.
d
off
off
off
-10
-3
-1
-4
-1
-5
-1
В одном из вариантов осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, связывается с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23 и диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23, соответственно, с K, составляющей 1×10 M или менее, и с константой скорости k, составляющей 1×10сек или менее, как было определено методом резонансного возбуждения поверхностных плазмонов. В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23 с константой скорости k, составляющей 1×10сек или менее. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23 с константой скорости k, составляющей 1×10сек или менее.
off
off
off
off
-2
-1
-3
-1
-4
-1
-5
-1
В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть связывается с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23 и диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23 с константой скорости k, составляющей 1×10сек или менее, как было определено методом резонансного возбуждения поверхностных плазмонов. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23 с константой скорости k, составляющей 1×10сек или менее. Еще в одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23 с константой скорости k, составляющей 1×10сек или менее. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23 с константой скорости k, составляющей 1×10сек или менее.
d
d
-10
-11
Еще в одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть связывается с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23 и диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23, соответственно, с K, составляющей 1,34×10 M или менее. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть связывается с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23 и диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23, соответственно, с K, составляющей 9,74×10 M или менее. В одном из вариантов осуществления антитело или его антиген-связывающая часть представляет собой рекомбинантное антитело или его антиген-связывающую часть.
50
50
50
50
50
50
50
50
-9
-10
-11
-7
-8
-10
-11
-12
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, является нейтрализующим антителом, которое, например, нейтрализует активность человеческого IL-12 и/или человеческого IL-23. В одном из вариантов осуществления нейтрализующее антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. В другом варианте осуществления нейтрализующее антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. Еще в одном варианте осуществления нейтрализующее антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. Еще в одном варианте осуществления нейтрализующее антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в фитогемагглютининовом анализе на бласт-пролиферацию (ФГА-анализ) in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. Еще в одном варианте осуществления нейтрализующее антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. Еще в одном варианте осуществления нейтрализующее антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует продуцирование человеческого IFNγ с IC, составляющей 1×10 M или менее. Еще в одном варианте осуществления нейтрализующее антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует продуцирование человеческого IFNγ с IC, составляющей 1×10 M или менее. Еще в одном варианте осуществления нейтрализующее антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует продуцирование человеческого IFNγ с IC, составляющей 1×10 M или менее.
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению,
50
-9
a) ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее;
b) имеет CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; и
c) имеет CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В одном варианте осуществления антитело дополнительно имеет CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
50
50
-10
-11
Еще в одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть дополнительно имеет CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; и CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. Еще в одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть дополнительно ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. Еще в одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть дополнительно ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее.
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, имеет вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.
2
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, содержит константную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE. В одном из вариантов осуществления константная область тяжелой цепи антитела представляет собой IgG1. В другом варианте осуществления антитело представляет собой Fab-фрагмент, F(ab')-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент.
d
-10
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23 с K, составляющей 1×10M или менее, и связывается с эпитопом на p40-субъединице человеческого IL-12 и/или человеческого IL-23.
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, представляет собой человеческое антитело или его антиген-связывающую часть, которое
off
-3
-1
a) диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 с константой скорости k, составляющей 1×10сек или менее, как было определено методом резонансного возбуждения поверхностных плазмонов;
b) имеет CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; и
c) имеет CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
off
off
-4
-1
-5
-1
В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 с константой скорости k, составляющей 1×10сек или менее. Еще в одном варианте осуществления антитело человека или его антиген-связывающая часть диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 с константой скорости k, составляющей 1×10сек или менее.
В одном из вариантов осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, представляет собой человеческое антитело или его антиген-связывающую часть, которое связывается с человеческим IL-12 и содержит
CDR3-домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и
CDR3-домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть имеет вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющую CDR3-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и имеет вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), имеющую CDR3-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть содержит LCVR, дополнительно имеющую CDR2-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и HCVR, дополнительно имеющую CDR2-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. Еще в одном варианте осуществления LCVR дополнительно имеет CDR1-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и HCVR имеет CDR1-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29.
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть связывается с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23 и представляет собой антитело J695 (также обозначаемое ABT-874) или его антиген-связывающую часть.
d
d
50
50
50
50
50
50
50
50
-10
-11
-7
-8
-9
-10
-11
-10
-11
-12
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть связывается с человеческим IL-12 и/или человеческим IL-23 и диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 с K, составляющей 1,34×10M или менее, и нейтрализует человеческий IL-12 и/или человеческий IL-23. В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 и/или с человеческим IL-23 с K, составляющей 9,74×10M или менее. В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. В одном из вариантов осуществления антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует продуцирование человеческого IFNγ с IC, составляющей 1×10 M или менее. В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует продуцирование человеческого IFNγ с IC, составляющей 1×10 M или менее. В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует продуцирование человеческого IFNγ с IC, составляющей 1×10 M или менее.
50
50
50
-9
-10
-11
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах согласно изобретению, ингибирует связывание IL-12 и/или IL-23 с их рецептором в анализе связывания с рецептором IL-12 или IL-23 (RBA), соответственно, с IC, составляющей 1×10 M или менее. В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует связывание IL-12 и/или IL-23 с их рецептором в анализе связывания с рецептором IL-12 или IL-23 (RBA), соответственно, с IC, составляющей 1×10 M или менее. В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть ингибирует связывание IL-12 и/или IL-23 с их рецептором в анализе связывания с рецептором IL-12 или IL-23 (RBA), соответственно, с IC, составляющей 1×10 M или менее.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
e
o
w
На фиг.1 показано распределение пациентов в программе испытаний. (Термин "eow" означает введение лекарственной дозы один раз в две недели - very ther eek.)
P
A
S
I
На фиг.2 показан процент пациентов по меньшей мере с 75% улучшением индекса площади и тяжести псориаза (индекс PASI-75 - soriasis rea and everity ndex) в процессе 12-недельного испытания. К 8 неделе, за исключением той группы, в которой пациентам однократно вводили 200 мг, процент пациентов, у которых поддерживался ответ PASI-75, был статистически значимо выше (p<0,001) в каждой из групп, в которых вводили ABT-874, при каждом сравнении с группой плацебо, что было установлено на основании анализа разброса данных, наблюдаемых в популяции, в которой было реализовано изначально назначенное лечение. (Термин "eow" означает введение лекарственной дозы один раз в две недели.)
На фиг.3 показан средний процент улучшения оценок индекса площади и тяжести псориаза (индекс PASI-75) по сравнению с исходным уровнем. Эти данные показали, что *p<0,001 для каждой из групп, в которых пациентам вводили ABT-874, по сравнению с группой плацебо, в любой временной точке (исключение составляет введение 100 мг eow в первую неделю, p=0,023), что было установлено на основании анализа разброса данных, наблюдаемых в популяции, в которой было реализовано изначально назначенное лечение. (Термин "eow" означает введение лекарственной дозы один раз в две недели.)
На фиг.4A-C показан процент пациентов, у которых поддерживался, соответственно, ответ PASI-50, PASI-75 и PASI-90 на 24 неделе испытаний, т.е. через 12 недель после прекращения введения указанного антитела.
На фиг.4D показан процент пациентов, у которых поддерживался ответ PASI-75 в течение всего 24-недельного периода испытаний.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для того чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, следует прежде всего ввести определения конкретных терминов.
Термин "повышающий активность аминокислотный остаток" включает аминокислотный остаток, который усиливает активность антитела. Следует понимать, что повышающий активность аминокислотный остаток может заменить аминокислотный остаток в положении, где осуществляется контакт, гипермутация или предпочтительный селективный мутагенез, и, кроме того, более чем один аминокислотный остаток внутри одного или нескольких CDR. Повышающий активность аминокислотный остаток включает аминокислотный остаток, который повышает специфичность/аффинность связывания антитела, например связывания человеческого анти-IL-12-антитела с человеческим IL-12. Подразумевается также, что повышающий активность аминокислотный остаток включает аминокислотный остаток, который повышает нейтрализующую способность антитела, например человеческого анти-IL-12-антитела, которое ингибирует человеческий IL-12.
Термин "антитело" включает молекулу иммуноглобулина, состоящую из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей, соединенных друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (обозначаемой здесь как HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области (обозначаемой здесь как LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL могут, кроме того, быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, так называемые «определяющие комплементарность области, или (CDR)», перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными, так называемыми каркасными областями (FR). Каждая область VH и VL состоит из трех областей CDR и четырех областей FR, расположенных от амино-концевой части до карбокси-концевой части указанных областей, в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В одном варианте осуществления антитело, используемое в композициях и способах согласно изобретению, представляет собой антитело, описанное в патенте США No. 6914128, включенном в настоящее описание в виде ссылки. В другом варианте осуществления антитело, используемое в композициях и способах согласно изобретению, представляет собой антитело ABT-874 (обозначаемое также J695; Abbott Laboratories).
2
2
Термин "антиген-связывающая часть" антитела (или "часть антитела") включает фрагменты антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, hIL-12). Показано, что антиген-связывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином "антиген-связывающая часть" антитела, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и CH1-доменов; (ii) F(ab')-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком вблизи шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из VH- и CH1-доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из VL- и VH-доменов одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al, (1989) Nature 341: 544-546), который состоит из VH-домена; и (vi) изолированная определяющая комплементарность область (CDR). Кроме того, несмотря на то что два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются раздельными генами, их можно соединить, используя рекомбинантные методы, с помощью синтетического линкера, который позволит им быть представленными в виде одной белковой цепи, в которой VL- и VH-области спарены, образуя моновалентные молекулы (известные как одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. ScL USA 85: 5879-5883). Подразумевается, что такие одноцепочечные антитела также охватываются термином "антиген-связывающая часть" антитела. Другие формы одноцепочечных антител, такие как диантитела (diabody), также считаются включенными в это понятие. Диантитела являются бивалентными, биспецифическими антителами, в которых VH- и VL-домены экспрессированы на единственной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы допустить спаривание между этими двумя доменами, находящимися на одной и той же цепи, вынуждая, тем самым, эти домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи, с образованием двух антиген-связывающих участков (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Более того, антитело или его антиген-связывающая часть может являться частью более крупных иммуноадгезивных молекул, образованных в результате ковалентного или нековалентного связывания антитела или его антиген-связывающей части с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких иммуноадгезивных молекул получены с использованием области стрептавидинового ядра, с образованием тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101), и с использованием цистеинового остатка, маркерного пептида и C-концевой полигистидиновой метки, с образованием бивалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov, SM., et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058). Части антител, такие как Fab- и F(ab')-фрагменты, могут быть получены из целых антител с помощью общеизвестных технологий, таких как расщепление целых антител, соответственно, папаином или пепсином. Кроме того, антитела, части антител и иммуноадгезивные молекулы могут быть получены с использованием описанных здесь стандартных технологий рекомбинантных ДНК. Предпочтительными антиген-связывающими частями являются полноразмерные домены или пары полноразмерных доменов.
Термин "обратная мутация" относится к процессу, в котором некоторые или все из подвергнутых соматической мутации аминокислот человеческого антитела заменены соответствующими остатками зародышевой линии из гомологичной последовательности антитела зародышевой линии. Последовательности тяжелой и легкой цепей человеческого антитела согласно изобретению отдельно выровнены с последовательностями зародышевой линии из базы данных VBASE для идентификации последовательностей с наиболее высокой степенью гомологии. Отличия в последовательности человеческого антитела устраняют, возвращая ее к последовательности зародышевой линии, путем образования мутаций, определяемых положениями нуклеотидов, кодирующих такие отличающиеся аминокислотные остатки. Роль каждой аминокислоты, идентифицированной таким образом в качестве кандидата для обратной мутации, должна быть изучена на предмет ее непосредственной или опосредованной роли в связывании антигена, и любая аминокислота, которая будет оказывать нежелательное влияние на требуемую характеристику человеческого антитела, не должна быть включена в конечное человеческое антитело; в качестве примера, повышающий активность аминокислотный остаток, идентифицированный на основе принципа селективного мутагенеза, не будет являться объектом для обратной мутации. Чтобы минимизировать число аминокислот, подвергаемых обратной мутации, при обнаружении тех аминокислотных положений, которые отличаются от наиболее близкой последовательности зародышевой линии, но идентичны соответствующей аминокислоте во второй последовательности зародышевой линии, их можно оставить без изменения, полагая, что вторая последовательность зародышевой линии идентична и коллинеарна последовательности человеческого антитела согласно изобретению на отрезке по меньшей мере из 10, предпочтительно из 12 аминокислот на обеих обсуждаемых аминокислотных последовательностях. Обратная мутация может осуществляться на любой стадии оптимизации антитела; предпочтительно, чтобы обратная мутация была произведена непосредственно перед или после осуществления селективного мутагенеза. Более предпочтительно, чтобы обратная мутация была произведена непосредственно перед осуществлением селективного мутагенеза.
Фраза "человеческий интерлейкин-12" (обозначаемый здесь как hIL-12, или IL-12), используемая в настоящем описании, включает человеческий цитокин, который в первую очередь секретируется макрофагами и дендритными клетками. Этот термин включает гетеродимерный белок, содержащий субъединицу в 35 кДа (p35) и субъединицу в 40 кДа (p40), которые связаны друг с другом дисульфидным мостиком. Указанный гетеродимерный белок обозначается как "p70-субъединица". Структура человеческого IL-12 более подробно описана, например, у Kobayashi, et al. (1989) J. Exp Med. 170: 827-845; Seder, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10188-10192; Ling, et al. (1995) J. Exp Med. 154: 116-127; Podlaski, et al. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294: 230-237. Подразумевается, что термин человеческий IL-12 включает рекомбинантный человеческий IL-12 (rh IL-12), который может быть получен стандартными методами рекомбинантных технологий.
Термины "нумерация Кабата", "определения Кабата" и "маркировка Кабата" являются здесь взаимозаменяемыми. Эти термины, являющиеся общепринятыми в данной области, относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными), чем другие аминокислотные остатки в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи антитела или его антиген-связывающей части (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190: 382-391 и Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health и Human Services, NIH Publication No. 91-3242). В случае вариабельной области тяжелой цепи гипервариабельная область заключена в положениях аминокислот 31-35 в случае CDR1, в положениях аминокислот 50-65 в случае CDR2 и в положениях аминокислот 95-102 в случае CDR3. Что касается вариабельной области легкой цепи, гипервариабельная область заключена в положениях аминокислот 24-34 в случае CDR1, в положениях аминокислот 50-56 в случае CDR2 и в положениях аминокислот 89-97 в случае CDR3.
Здесь нумерация Кабата используется для указания положений аминокислотных модификаций, произведенных в антителах согласно изобретению. Например, в анти-IL-12-антителе, Y61, может иметь место мутация серина (S) на глутаминовую кислоту (E) в положении 31 CDR1 тяжелой цепи (H31S→E) или мутация глицина (G) на тирозин (Y) в положении 94 CDR3 легкой цепи (L94G→Y).
Термин "человеческое антитело" включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, соответствующие последовательностям человеческого иммуноглобулина зародышевой линии, как описано у Kabat et al. (см. Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health и Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Человеческие антитела согласно изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, образованные в результате случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или в результате соматической мутации in vivo), например, в CDR-областях, и в частности, в CDR3. Предпочтительно мутации производят, используя описанный здесь принцип "селективного мутагенеза". Человеческое антитело может иметь замену аминокислотного остатка по меньшей мере в одном положении, например, повышающего активность аминокислотного остатка, который не кодируется последовательностью, кодирующей человеческий иммуноглобулин зародышевой линии. Человеческое антитело может иметь вплоть до двенадцати замен аминокислотных остатков, которые заменены аминокислотными остатками, которые не являются частью последовательности человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. В другом варианте осуществления замены насчитывают вплоть до десяти, вплоть до пяти, вплоть до трех или вплоть до двух положений. В предпочтительном варианте осуществления, как подробно описано ниже, эти замены имеют место внутри CDR-областей. Однако описанный здесь термин "человеческое антитело" не предназначен для обозначения таких антител, в которых последовательности CDR получены из зародышевой линии млекопитающего другого вида, такого как мышь, и перенесены на человеческие каркасные последовательности.
Фраза "рекомбинантное человеческое антитело" включает человеческие антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или изолированы рекомбинантным путем, например антитела, экспрессируемые рекомбинантным экспрессирующим вектором, трансфицированным в клетки-хозяине (дополнительно описаны в разделе II, ниже), антитела, изолированные из библиотеки рекомбинантных комбинаторных антител человека (дополнительно описаны в разделе III, ниже), антитела, изолированные из организма животного (например, мыши), которые являются трансгенными для иммуноглобулиновых генов человека (см., например, Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или изолированные любым другим способом, который включает сплайсинг последовательностей человеческих иммуноглобулиновых генов с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные области и константные области, полученные из иммуноглобулиновых последовательностей человеческой зародышевой линии (см. Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health и Human Services, NIH Publication No. 91-3242). В определенных вариантах осуществления, однако, такие рекомбинантные человеческие антитела подвергаются мутагенезу in vitro (или, когда используется животное, трансгенное в отношении последовательностей Ig человека, подвергаются соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хоть и получены из VH- и VL-последовательностей человеческой зародышевой линии и являются родственными им, могут в природе и не встречаться в репертуаре антител человеческой зародышевой линии in vivo. В определенных вариантах осуществления, однако, такие рекомбинантные антитела являются результатом методов селективного мутагенеза или обратной мутации, или же и того, и другого.
"Изолированное антитело" включает антитело, которое по существу свободно от примесей других антител, имеющих различные антигенные специфичности (например, изолированное антитело, которое специфически связывается с hIL-12, по существу свободно от примесей антител, которые специфически связываются с антигенами, отличными от hIL-12). Изолированное антитело, которое специфически связывается с hIL-12, может связывать молекулы IL-12 из других видов (что будет более подробно обсуждаться ниже). Более того, изолированное антитело может быть по существу свободно от примесей другого клеточного материала и/или химических веществ.
"Нейтрализующее антитело" (или "антитело, которое нейтрализует активность hIL-12") включает антитело, связывание которого с hIL-12 приводит к ингибированию. Это ингибирование биологической активности hIL-12 может быть оценено путем измерения одного или более индикаторов биологической активности hIL-12, такой как ингибирование человеческой фитогемагглютининовой бласт-пролиферации в анализе фитогемагглютининовой (ФГА) бласт-пролиферации, или ингибирование связывания рецептора в анализе связывания человеческого рецептора IL-12 (см. пример 3 - анализ индукции гамма-интерферона - в Патенте США No. 6914128). Эти индикаторы биологической активности hIL-12 могут быть оценены одним или более из нескольких стандартных анализов in vitro или in vivo, известных в данной области (см. пример 3 в Патенте США No. 6914128).
Термин "активность" включает такие активности, как специфичность/аффинность связывания антитела с антигеном, например анти-hIL-12-антитела, которое связывается с антигеном IL-12, и/или нейтрализующая способность антитела, например анти-hIL-12-антитела, связывание которого с hIL-12 ингибирует биологическую активность hIL-12, например ингибирование ФГА-бласт-пролиферации или ингибирование связывания рецептора в анализе связывания человеческого рецептора IL-12 (см. пример 3 в Патенте США No. 6914128).
Фраза "резонансное возбуждение поверхностных плазмонов" включает оптическое явление, которое позволяет подвергать анализу биоспецифические взаимодействия в режиме реального времени путем регистрации изменений в белковой концентрации внутри биосенсорного матрикса, например, с помощью системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). В качестве дополнительного описания см. Пример 5 в Патенте США No. 6914128 и Jönsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; и Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277.
off
Под термином "K" здесь подразумевается константа скорости диссоциации антитела из комплекса антиген/антитело.
d
Под термином "K" здесь подразумевается константа диссоциации при конкретном взаимодействии антиген/антитело.
Фраза "молекула нуклеиновой кислоты" включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно она представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК.
Фраза "изолированная молекула нуклеиновой кислоты", используемая в настоящем описании, относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитела или части антител (например, VH, VL, CDR3, которые связываются с hIL-12, включая "изолированные антитела"), включает молекулу нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело или часть антитела, свободны от других последовательностей, кодирующих антитела или части антител, которые связываются с антигенами, отличными от hIL-12, и эти другие последовательности в природе могут фланкировать нуклеиновую кислоту в геномной ДНК человека. Таким образом, например, изолированная нуклеиновая кислота согласно изобретению, кодирующая VH-область анти-IL-12-антитела, не содержит никаких других последовательностей, кодирующих другие VH-области, которые связываются с антигенами, отличными от hIL-12. Подразумевается также, что фраза "изолированная молекула нуклеиновой кислоты" включает последовательности, кодирующие бивалентные, биспецифические антитела, такие как диантитела, в которых VH- и VL-области не содержат никаких других последовательностей, отличных от последовательностей этого диантитела.
Термин "вектор" включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, к которой она присоединена. Одним из типов векторов является "плазмида", которая относится к петле кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом векторов является вирусный вектор, в котором сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они встроены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) при введении в клетку-хозяина могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина и, таким образом, могут реплицироваться вместе (в составе) с геномом-хозяином. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. В настоящем описании такие векторы называются "рекомбинантными экспрессирующими векторами" (или же просто "экспрессирующими векторами"). Обычно экспрессирующие векторы, используемые в технологии рекомбинантных ДНК, часто представлены в виде плазмид. В настоящем описании термины "плазмида" и "вектор" могут быть использованы как взаимозаменяемые, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако подразумевается, что настоящее изобретение включает также и другие формы экспрессирующих векторов, такие как вирусные векторы (например, дефективные по репликации ретровирусы, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
Фраза "рекомбинантная клетка-хозяин" (или же просто "клетка-хозяин") включает клетку, в которую встроен рекомбинантный экспрессирующий вектор. Следует понимать, что под такими терминами подразумевается не только конкретная клетка, о которой идет речь, но и потомство такой клетки. В силу того, что определенные модификации могут возникать в последующих генерациях в результате либо мутации, либо под влиянием окружающей среды, фактически такое потомство может оказаться неидентичным родительской клетке, но тем не менее считается, что используемый здесь термин "клетка-хозяин" включает также и эти клетки.
Используемый здесь термин "модифицирующий" относится к изменению одной или более аминокислот в антителах или их антиген-связывающих частях. Такое изменение может быть вызвано путем добавления, замены или удаления аминокислоты в одном или нескольких положениях. Такое изменение может быть произведено с использованием известных технологий, таких как ПЦР-мутагенез.
Фраза "положение, где осуществляется контакт" включает положение аминокислоты в областях CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, которое занято аминокислотой, которая контактирует с антигеном в одной из известных двадцати шести структур антиген-антитело. Если CDR-аминокислота в одной из известных разрешенных двадцати шести структур комплексов антиген-антитело контактирует с антигеном, тогда может считаться, что такая аминокислота занимает положение, где осуществляется контакт. В положениях, где осуществляется контакт, существует более высокая вероятность того, что они заняты аминокислотой, которая находится в контакте с антигеном, чем в положениях, где не осуществляется контакт. Предпочтительно, чтобы положение, где осуществляется контакт, было CDR-положением, которое содержит аминокислоту, которая находится в контакте с антигеном более чем в 3 из 26 структур (>11,5 %). Наиболее предпочтительно, чтобы положение, где осуществляется контакт, было CDR-положением, которое содержит аминокислоту, которая находится в контакте с антигеном более чем в 8 из 25 структур (>32%).
Термин "положение гипермутирования" включает аминокислотный остаток, который занимает положение в области CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, для которого, как считается, существует высокая частота или вероятность соматической гипермутации в процессе созревания аффинности антитела in vivo. "Высокая частота или вероятность соматической гипермутации" включает частоты или вероятности от 5 приблизительно до 40% вероятности, что именно этот остаток будет подвергнут соматической гипермутации в процессе созревания аффинности антитела in vivo. Подразумевается, что всякие колебания внутри указанной области также входят в объем настоящего изобретения, например, от 5 приблизительно до 30%, например, от 5 приблизительно до 15%, например, от 15 приблизительно до 30%.
Термин "предпочтительное положение селективного мутагенеза" включает аминокислотный остаток, который занимает положение в области CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, который можно считать находящимся как в положении, где осуществляется контакт, так и в положении гипермутирования.
Фраза "принцип селективного мутагенеза" включает способ улучшения активности антитела путем селекции и осуществления индивидуальной мутации CDR-аминокислот по меньшей мере в одном предпочтительном положении селективного мутагенеза, гипермутирования и/или положении, где осуществляется контакт. Человеческое антитело, подвергнутое "селективной мутации", представляет собой антитело, которое содержит мутацию в положении, выбранном с использованием принципа селективного мутагенеза. В другом варианте осуществления принцип селективного мутагенеза предусматривает способ получения предпочтительной мутации индивидуально отобранных аминокислотных остатков в областях CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (далее указаны как H1, H2 и H3, соответственно) или в областях CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области легкой цепи (указаны далее как L1, L2 и L3, соответственно) антитела. Аминокислотные остатки могут быть выбраны из предпочтительных положений селективного мутагенеза, положений, где осуществляется контакт, или положений гипермутирования. Индивидуальные аминокислоты выбирают на основе их положения в вариабельной области легкой цепи или вариабельной области тяжелой цепи. Следует иметь в виду, что положение гипермутирования может являться также и положением, где осуществляется контакт. В одном из вариантов осуществления принцип селективного мутагенеза представляет собой "направленный подход". Под "направленным подходом" подразумевается способ предпочтительного мутагенеза индивидуально выбранных аминокислотных остатков в области CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи или в области CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела направленным образом, например, "направленным на группу подходом" или "CDR- направленным подходом". В "направленном на группу подходе" селективные мутации нацелены на индивидуальные аминокислотные остатки в конкретных группах, включая группы I (включающую L3 и H3), II (включающую H2 и L1) и III (включающую L2 и H1), где указанные группы перечислены в порядке предпочтения в отношении направленности на них мутагенеза. В "CDR-направленном подходе" селективные мутации направлены на индивидуальные аминокислотные остатки в конкретных областях CDR, которые, в порядке предпочтения, представляют собой следующий ряд: H3, L3, H2, L1, H1 и L2. Выбранный аминокислотный остаток подвергают мутации, например, [путем замены] по меньшей мере [на] два других аминокислотных остатка, и затем определяют влияние мутации на активность антитела. Активность измеряют как изменение специфичности/аффинности связывания антитела и/или нейтрализующей способности антитела. Следует учитывать, что принцип селективного мутагенеза может быть использован для оптимизации антитела, полученного из любого источника, включая фаговый дисплей, трансгенных животных с генами IgG человеческой зародышевой линии, человеческие антитела, изолированные из B-клеток человека. Предпочтительно, чтобы принцип селективного мутагенеза был использован в отношении антител, которые не могут быть более оптимизированы с помощью технологии фагового дисплея. Следует понимать, что антитела из любого источника, включая фаговый дисплей, трансгенных животных с генами IgG человеческой зародышевой линии, человеческие антитела, изолированные из B-клеток человека, могут быть подвергнуты обратной мутации перед или после метода селективного мутагенеза.
Термин "повышающий активность аминокислотный остаток" включает аминокислотный остаток, который улучшает активность антитела. Следует понимать, что повышающий активность аминокислотный остаток может заменить аминокислотный остаток в предпочтительном положении селективного мутагенеза, в положении, где осуществляется контакт, или положении гипермутирования, и, кроме того, более чем один повышающий активность аминокислотный остаток может присутствовать внутри одного или более участков CDR. Повышающий активность аминокислотный остаток включает аминокислотный остаток, который улучшает специфичность/аффинность связывания антитела, например связывания человеческого анти-IL-12-антитела с человеческим IL-12. Подразумевается также, что повышающий активность аминокислотный остаток включает аминокислотный остаток, который улучшает нейтрализующую способность антитела, например человеческого антитела против IL-12, которое ингибирует человеческий IL-12.
Термин "дозирование" относится здесь к введению вещества (например, антитела против IL-12, антитела против IL-23) с терапевтической целью (например, для лечения ревматоидного артрита).
e
o
w
Термины "дозирование один раз в две недели", "дозирование раз в две недели" и "введение раз в две недели", используемые в настоящем описании, относятся к временному курсу введения вещества (например, анти-IL-12-антитела, анти-IL-23-антитела) субъекту для достижения терапевтического эффекта, где временной курс введения составляет введение один раз в две недели - very ther eek (eow). Режим введения один раз в две недели не включает еженедельное введение. Предпочтительно, чтобы вещество вводили каждые 9-19 дней, более предпочтительно каждые 11-17 дней, еще более предпочтительно каждые 13-15 дней и наиболее предпочтительно каждые 14 дней.
Термин "комбинация" (или "сочетание"), как, например, в выражении "первое средство в сочетании со вторым средством", включает совместное введение первого средства и второго средства, которые могут быть растворены или смешаны в одном и том же фармацевтически приемлемом носителе, или введение первого средства, затем второго средства, или же введение второго средства, а вслед за этим введение первого средства. Настоящее изобретение, следовательно, включает способы комбинирования терапевтических воздействий и комбинирования фармацевтических композиций.
Термин "сопутствующий", как, например, в выражении "сопутствующее терапевтическое воздействие", включает введение одного средства в присутствии второго средства. Способ сопутствующего терапевтического воздействия включает способы, в которых первое, второе, третье или дополнительные средства вводятся совместно. Способ сопутствующего терапевтического воздействия включает также способы, в которых первое или дополнительные средства вводятся в присутствии второго или дополнительных средств, при этом второе средство или дополнительные средства могут, например, быть введены заранее. Способ сопутствующего терапевтического воздействия может быть осуществлен постепенно разными участниками. Например, один участник может вводить субъекту первое средство, а второй участник может вводить субъекту второе средство, и стадии введения могут быть осуществлены одновременно или приблизительно в одно и то же время, или же с некоторым интервалом, пока первое средство (и дополнительные средства) после введения сохраняются, присутствуя при введении второго средства (и дополнительных средств). Указанный участник и указанный субъект могут быть одним и тем же лицом (например, человеком).
Термин "комбинированная терапия" относится в настоящем описании к введению двух или более терапевтических веществ, например анти-IL-12-антитела, анти-IL-23-антитела и другого лекарственного средства. Другое лекарственное средство (средства) может быть введено совместно, до или после введения анти-IL-12-антитела, анти-IL-23-антитела.
Используемый в настоящем описании термин "набор" относится к расфасованному продукту, содержащему компоненты, в состав которых вводится анти-IL-12-, анти-IL-23-антитело согласно изобретению для лечения IL-12-ассоциированного заболевания. Такой набор предпочтительно содержит коробку или контейнер, в котором находятся компоненты указанного набора. Коробка или контейнер снабжены наклейкой или способом применения, одобренным Управлением США по надзору за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами (FDA). Коробка или контейнер содержит компоненты согласно изобретению, которые предпочтительно заключены в пластиковый, полиэтиленовый, полипропиленовый, этиленовый или пропиленовый сосуды. Такими сосудами могут быть закрывающиеся пробирки или флаконы. Набор может также включать инструкции по введению анти-IL-12-, анти-IL-23-антител.
Различные аспекты настоящего изобретения в дальнейших подробностях описаны в последующих разделах.
I. Человеческие антитела, которые связываются с человеческим IL-12
Настоящее изобретение относится к способам применения человеческих антител или их антиген-связывающих частей и содержащим их композициям, которые связываются с человеческим IL-12, для лечения псориаза. Настоящее изобретение включает также способы и композиции с применением антитела, которое связывается как с IL-12, так и с IL-23. Предпочтительно, чтобы человеческие антитела, используемые в настоящем изобретении, представляли собой рекомбинантные нейтрализующие человеческие анти-hIL-12-антитела.
В одном варианте осуществления антитело, используемое в настоящем изобретении, представляет собой антитело ABT-874 (см. патент США No. 6914128). ABT-874 является полностью человеческим антителом против интерлейкина-12 (IL-12) и IL-23. Оно с высокой аффинностью связывается с субъединицей p40, общей для IL-12 и IL-23, признанными мишенями при лечении псориаза (Ps).
L
H
L
H
off
-1
Антитела, которые связываются с человеческим IL-12, могут быть подвергнуты селекции, например, путем скрининга одной или более библиотек кДНК человеческих V и V с помощью hIL-12, например, с использованием технологии фагового дисплея, как описано в примере 1 патента США No. 6914128. Скрининг библиотек кДНК человеческих V и V сначала позволил идентифицировать серию анти-IL-12-антител, из которых одно антитело, обозначаемое здесь как "Joe 9" (или "Joe 9 дикого типа"), было отобрано для дальнейшей работы. Joe 9 представляет собой относительно низкоаффинное человеческое антитело против IL-12 (его K, например, составляет приблизительно 0,1 сек), но при этом такое, что его все еще можно использовать для специфического связывания и детектирования hIL-12. Аффинность антитела Joe 9 была улучшена путем проведения мутагенеза областей CDR тяжелой и легкой цепи с получением панели вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, которые были "смешаны и типированы" и подвергнуты дополнительному мутагенезу, что привело к образованию дополнительных анти-hIL-12-антител с повышенной аффинностью в отношении hIL-12 (см. пример 1, таблицу 2 (см. приложение A в патенте США No. 6914128 и выравнивание последовательностей на фиг.1, A-D, в патенте США No. 6914128)).
off
-4
-1
Из всех этих антител человеческое анти-hIL-12-антитело, обозначаемое здесь как Y61, обладало, как оказалось, значительно улучшенной аффинностью связывания (его K, например, составляет приблизительно 2×10сек). Анти-hIL-12-антитело Y61 было отобрано для дальнейшей работы по улучшению его аффинности путем индивидуального мутагенеза специфических аминокислотных остатков в областях тяжелой и легкой цепей CDR. Аминокислотные остатки антитела Y61 были выбраны для получения сайт-специфической мутации (один из подходов селективного мутагенеза) на основе аминокислотного остатка, занимающего предпочтительное положение для селективного мутагенеза, предпочтительное положение, где осуществляется контакт, и/или предпочтительное положение гипермутирования. Суммарная информация по заменам в избранных положениях в областях тяжелой и легкой цепей CDR показана на фиг.2A-2H патента США No. 6914128. Предпочтительное рекомбинантное человеческое нейтрализующее антитело согласно изобретению, обозначаемое здесь как J695 (также обозначаемое как ABT-874 (Abbott Laboratories), было получено в результате замены Gly на Tyr в положении 50 легкой цепи CDR2 антитела Y61 и замены Gly на Tyr в положении 94 легкой цепи CDR3 антитела Y61.
Варианты выравнивания аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей панели анти-IL-12-антител, используемых в данном изобретении, в ряду от Joe 9 дикого типа до J695, показаны на фиг.1A-1D патента США No. 6914128. Такое выравнивание последовательностей позволило идентифицировать консенсусные последовательности в области вариабельных участков тяжелой и легкой цепей антител согласно изобретению, которые связываются с hIL-12, а также консенсусные последовательности для CDR3, CDR2 и CDR1 в ряду от Joe 9 до J695. Кроме того, анализ мутагенеза Y61, суммируемый на фиг.2A-2H, позволил идентифицировать консенсусные последовательности в области вариабельных участков тяжелой и легкой цепей, которые связываются с hIL-12, а также консенсусные последовательности для CDR3, CDR2 и CDR1, которые связываются с hIL-12 в ряду от Y61 до J695, которые охватывают последовательности с модификациями из Y61, которые все еще сохраняют хорошие характеристики в отношении связывания с hIL-12. Предпочтительные последовательности CDR, VH и VL согласно изобретению (включая консенсусные последовательности), как определено с помощью идентификаторов последовательностей в прилагаемом списке последовательностей, суммированы ниже.
SEQ ID No:
Цепь антитела
Область
Последовательность
1
КонсенсусJoe 9 с J695
CDR H3
(H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y)
2
КонсенсусJoe 9 с J695
CDR L3
Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)-(S/G/Y)-(L/F/T/S)-(R/S/T/W/H)-(G/P)-(S/T/A/L)-(R/S/M/T/L)-(V/I/T/M/L)
3
КонсенсусJoe 9 с J695
CDR H2
F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G
4
КонсенсусJoe 9 с J695
CDR L2
(G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S
5
КонсенсусJoe 9 с J695
CDR H1
F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H
6
КонсенсусJoe 9 с J695
CDR L1
(S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/A)-(N/G/Y)-(T/D)-V-(K/H)
7
КонсенсусJoe 9 с J695
VH
(полная VH-последовательность; см. список последовательностей)
8
КонсенсусJoe 9 с J695
VL
(полная VL-последовательность; см. список последовательностей)
9
КонсенсусJoe 9 с J695
CDR H3
H-(G/V/C/H)-(S/T)-(H/T/V/R/I)-(D/S)-(N/K/A/T/S/F/W/H)
10
КонсенсусJoe 9 с J695
CDR L3
Q-S-Y-(D/S)-(Xaa)-(G/D/Q/L/F/R/H/N/Y)-T-H-P-A-L-L
11
КонсенсусJoe 9 с J695
CDR H2
(F/T/Y)-I-(R/A)-Y-(D/S/E/A)-(G/R)-S-(Xaa)-K-(Y/E)-Y-A-D-S-V-K-G
12
КонсенсусJoe 9 с J695
CDR L2
(G/Y/S/T/N/Q)-N-D-Q-R-P-S
13
КонсенсусJoe 9 с J695
CDR H1
F-T-F-(Xaa)-(Xaa)-(Y/H)-(G/M/A/N/S)-M-H
14
КонсенсусJoe 9 с J695
CDR L1
S-G-G-R-S-N-I-G-(S/C/R/N/D/T)-(N/M/I)-(T/Y/D/H/K/P)-V-K
15
КонсенсусJoe 9 с J695
VH
(полная VH-последовательность; см. список последовательностей)
16
КонсенсусJoe 9 с J695
VL
(полная VL-последовательность; см. список последовательностей)
17
Y61
CDR H3
H-G-S-H-D-N
18
Y61
CDR L3
Q-S-Y-D-R-G-T-H-P-A-L-L
19
Y61
CDR H2
F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G
20
Y61
CDR L2
G-N-D-Q-R-P-S
21
Y61
CDR H1
F-T-F-S-S-Y-G-M-H
22
Y61
CDR L1
S-G-G-R-S-N-I-G-S-N-T-V-K
23
Y61
VH
(полная VH-последовательность; см. список последовательностей)
24
Y61
VL
(полная VL-последовательность; см. список последовательностей)
25
J695
CDR H3
H-G-S-H-D-N
26
J695
CDR L3
Q-S-Y-D-R-Y-T-H-P-A-L-L
27
J695
CDR H2
F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G
28
J695
CDR L2
Y-N-D-Q-R-P-S
29
J695
CDR H1
F-T-F-S-S-Y-G-M-H
30
J695
CDR L1
S-G-S-R-S-N-I-G-S-N-T-V-K
31
J695
VH
(полная VH-последовательность; см. список последовательностей)
32
J695
VL
(полная VL-последовательность; см. список последовательностей)
d
off
off
off
50
-1
-5
-1
-4
-1
-5
-1
-6
-11
-10
-11
Антитела, продуцируемые при созревании аффинности Joe 9 дикого типа, проверяли на предмет их функциональной характеристики методом резонансного возбуждения поверхностных плазмонов с целью определения показателей K и K. Была получена серия антител с константой скорости K в области приблизительно от 0,1 сек до 1×10сек и более предпочтительно с K, приблизительно составляющей от 1×10сек до 1×10сек или менее. Антитела были охарактеризованы in vitro на предмет их способности ингибировать фитогемагглютининовую (ФГА) бласт-пролиферацию, как описано в примере 3 патента США No. 6914128. Была получена серия антител, имеющих значение IC в области приблизительно от 1×10 M до 1×10 M, более предпочтительно приблизительно от 1×10 M до 1×10 M или менее.
off
50
off
50
off
50
off
50
off
50
off
50
-1
-6
-2
-1
-7
-3
-1
-8
-4
-1
-9
-5
-1
-10
-5
-1
-11
Соответственно, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам и композициям, в которых используется изолированное антитело или его антиген-связывающая часть, которое связывается с человеческим IL-12 и диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 с константой скорости K порядка 0,1 сек или менее, определяемой методом резонансного возбуждения поверхностного плазмона, или которое ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в анализе фитогемагглютининовой бласт-пролиферации (ФГА-анализ) in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. В предпочтительных вариантах осуществления изолированное человеческое анти-IL-12-антитело или его антиген-связывающая часть диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 с константой скорости K порядка 1×10сек или менее или ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. В более предпочтительных вариантах осуществления изолированное человеческое анти-IL-12-антитело или его антиген-связывающая часть диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 с константой скорости K порядка 1×10сек или менее или ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. В более предпочтительных вариантах осуществления изолированное человеческое анти-IL-12-антитело или его антиген-связывающая часть диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 с константой скорости K порядка 1×10сек или менее или ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. В еще более предпочтительных вариантах осуществления изолированное человеческое анти-IL-12-антитело или его антиген-связывающая часть диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 с константой скорости K порядка 1×10сек или менее или ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее. В еще более предпочтительных вариантах осуществления изолированное человеческое анти-IL-12-антитело или его антиген-связывающая часть диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 с константой скорости K порядка 1×10сек или менее или ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющей 1×10 M или менее.
off
Константа скорости диссоциации (K) антитела против IL-12 может быть определена методом резонансного возбуждения поверхностных плазмонов (см. пример 5 в патенте США No. 6914128). Обычно методом анализа резонансного возбуждения поверхностных плазмонов в режиме реального времени измеряют взаимодействия между лигандом (рекомбинантный IL-12, иммобилизованный на биосенсорном матриксе) и анализируемым веществом (антитела в растворе) путем резонанса поверхностных плазмонов (SPR) с помощью системы BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Анализ поверхностных плазмонов может быть выполнен также путем иммобилизации анализируемого вещества (антитела на биосенсорном матриксе) и представления лиганда (рекомбинантный IL-12 в растворе). Нейтрализующая активность IL-12-антител или их антиген-связывающей части может быть установлена с помощью одного или нескольких соответствующих анализов in vitro (см. пример 3 в патенте США No. 6914128).
В данной области хорошо известно, что участки CDR тяжелой и легкой цепей антитела играют важную роль в специфичности/аффинности связывания антитела с антигеном. Соответственно, настоящее изобретение охватывает человеческие антитела, имеющие участки CDR тяжелой и легкой цепей антитела Joe 9, а также других антител, имеющих участки CDR, которые модифицированы с целью улучшения специфичности/аффинности связывания антитела. Как показано в примере 1 в патенте США No. 6914128, серия модификаций участков CDR легкой и тяжелой цепей приводит к созреванию аффинности человеческих анти-hIL-12-антител. Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей серии человеческих антител в ряду от Joe 9 дикого типа до J695, которые связываются с человеческим IL-12, показано на фиг.1A-1D в патенте США No. 6914128. Мотивы консенсусных последовательностей областей CDR антител могут быть определены на основании выравнивания последовательностей. Например, консенсусный мотив для VH CDR3, в ряду от Joe 9 до J695, содержит аминокислотную последовательность (HZS)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y) (SEQ ID NO: 1), которая включает аминокислоты от положения 95 до 102 консенсусной HCVR, показанной в SEQ ID NO: 7. Консенсусный мотив для VL CDR3 содержит аминокислотную последовательность Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)-(S/G/Y)-(L/F/T/S)-(R/S/T/W/H)-(G/P)-(S/T/A/L)-(R/S/M/T/L-V/I/T/M/L) (SEQ ID NO: 2), которая включает аминокислоты от положения 89 до 97 консенсусной LCVR, показанной в SEQ ID NO: 8.
Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способам и композициям, связанным с изолированным человеческим антителом или его антиген-связывающей частью, которое имеет следующие характеристики:
50
-6
a) ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC порядка 1×10 M или менее;
b) имеет CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и
c) имеет CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
В предпочтительном варианте осуществления антитело дополнительно содержит VH CDR2, содержащую аминокислотную последовательность F-I-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G (SEQ ID NO: 3) (которая включает аминокислоты от положения 50 до 65 консенсусной HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7), и дополнительно содержит VL CDR2, содержащую аминокислотную последовательность (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S (SEQ ID NO: 4) (которая включает аминокислоты от положения 50 до 56 консенсусной LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8).
В другом предпочтительном варианте осуществления антитело дополнительно содержит VH CDR1, содержащую аминокислотную последовательность F-T-F-S-(SZE)-Y-G-M-H (SEQ ID NO: 5) (которая включает аминокислоты от положения 27 до 35 консенсусной HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7), и дополнительно содержит VL CDR1, содержащую аминокислотную последовательность (S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/A)-(N/G/Y)-(T/D)-V-(K/H) (SEQ ID NO: 6) (которая включает аминокислоты от положения 24 до 34 консенсусной LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8).
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления антитело, используемое в настоящем изобретении, содержит HCVR, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и LCVR, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
оff
Дополнительные консенсусные мотивы могут быть определены на основе мутационного анализа, проведенного на антителе Y61, которое привело к образованию антитела J695 (суммировано на фигурах 2A-2H патента США No. 6914128). Как показано на графиках, приведенных на фиг.2A-2H патента США No. 6914128, определенные остатки областей CDR тяжелой и легкой цепей Y61 были подвергнуты замене без значительного ослабления свойств антитела в отношении связывания hIL-12. Например, индивидуальные замены в положении 30 в CDR H1 двенадцатью различными аминокислотными остатками не привели к значительному уменьшению значения K антитела, что указывает на то, что это положение является подходящим для замены его целым набором различных аминокислотных остатков. Таким образом, на основе мутационного анализа (т.е. положений внутри Y61, которые были подходящими для замены их другими аминокислотными остатками) определяли консенсусные мотивы. Консенсусные мотивы для участков CDR3 тяжелой и легкой цепей приведены в SEQ ID NO: 9 и 10, соответственно, консенсусные мотивы для участков CDR2 тяжелой и легкой цепей показаны в SEQ ID NO: 11 и 12, соответственно, и консенсусные мотивы для участков CDR1 приведены в SEQ ID NO: 13 и 14, соответственно. Консенсусные мотивы для VH- и VL- участков CDR3 показаны в SEQ ID NO: 15 и 16, соответственно.
Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение включает изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающую часть, которое имеет следующие свойства:
50
-9
a) ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC, составляющим порядка 1×10 M или менее;
b) имеет CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и
c) имеет CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
В предпочтительном варианте осуществления антитело дополнительно включает VH CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и дополнительно включает VL CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
В другом предпочтительном варианте осуществления антитело дополнительно включает VH CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и дополнительно включает VL CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления антитело, используемое в настоящем изобретении, включает HCVR, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и LCVR, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.
Предпочтительное антитело, используемое в настоящем изобретении, человеческое анти-hIL-12-антитело Y61, может быть продуцировано в результате созревания аффинности антитела Joe 9 дикого типа путем ПЦР-мутагенеза CDR3 (как описано в примере 1 патента США No. 6914128). Y61 имело улучшенную специфичность/аффинность связывания, определяемую методом резонанса поверхностных плазмонов и путем анализа нейтрализации in vitro. Участки CDR3 тяжелой и легкой цепей Y61 показаны, соответственно, в SEQ ID NO: 17 и 18, CDR2 тяжелой и легкой цепей Y61 показаны, соответственно, в SEQ ID NO: 19 и 20, и CDR1 тяжелой и легкой цепей Y61 показаны, соответственно, в SEQ ID NO: 21 и 22. VH-область антитела Y61 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и VL-область антитела Y61 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 (выравнивание этих последовательностей с Joe9 также показано на фиг.1A-1D патента США No. 6914128).
Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к применениям изолированного человеческого антитела или его антиген-связывающей части, которое
50
-9
a) ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC порядка 1×10 M или менее;
b) имеет CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; и
c) имеет CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
В предпочтительном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах и композициях согласно изобретению, имеет CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 и CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
В другом предпочтительном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах и композициях согласно изобретению, имеет CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах и композициях согласно изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.
В определенных вариантах осуществления полноразмерное антитело содержит константную область тяжелой цепи, такую как константные области IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE, и любой их аллотипический вариант, как описано у Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health и Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Предпочтительно, чтобы константной областью тяжелой цепи антитела была константная область тяжелой цепи IgG1. Альтернативно, частью антитела может быть Fab-фрагмент, F(ab'2)-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент.
Модификации индивидуальных остатков Y61 приводят к продуцированию панели антител, показанных на фиг.2A-2H патента США No. 6914128. Специфичность/аффинность связывания каждого антитела определяли методом резонанса поверхностных плазмонов и/или путем анализа нейтрализации in vitro.
Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к изолированному человеческому антителу или его антиген-связывающей части, которое
50
-9
a) ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC порядка 1×10 M или менее;
b) имеет CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 404 - SEQ ID NO: 469; и
c) имеет CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 534 - SEQ ID NO: 579.
В предпочтительном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в способах и композициях согласно изобретению, имеет CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:335 - SEQ ID NO: 403; и имеет CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 506 - SEQ ID NO: 533.
В другом предпочтительном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть имеет CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 288 - SEQ ID NO: 334; и CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 470 - SEQ ID NO: 505.
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.
2
В определенных вариантах осуществления полноразмерное антитело содержит константную область тяжелой цепи, такую как константные области IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE, и любой их аллотипический вариант, как описано у Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health и Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Предпочтительно, чтобы константной областью тяжелой цепи антитела была константная область тяжелой цепи IgG1. Альтернативно, частью антитела может быть Fab-фрагмент, F(ab')-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент.
Особенно предпочтительное нейтрализующее антитело, J695, которое может быть использовано в настоящем изобретении, было получено путем сайт-направленного мутагенеза в положении аминокислоты, где осуществляется контакт, и в положении аминокислоты, где осуществляется гипермутирование антитела Y61 (см. пример 2 в патенте США No. 6914128 и раздел III ниже). J695 отличается от Y61 заменой Gly на Tyr в Y61 в положении 50 в CDR2 легкой цепи и заменой Gly на Tyr в положении 94 CDR3 тяжелой цепи. Участки CDR3 тяжелой и легкой цепей J695 показаны в SEQ ID NO: 25 и 26, соответственно, участки CDR2 тяжелой и легкой цепей J695 показаны в SEQ ID NO: 27 и 28, соответственно, и участки CDR1 тяжелой и легкой цепей J695 показаны в SEQ ID NO: 29 и 30, соответственно. Область VH антитела J695 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, а область VL антитела J695 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32 (на фиг.1A-1D патента США No. 6914128 показано также выравнивание этих последовательностей с Joe9).
50
-9
Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к изолированному человеческому антителу или его антиген-связывающей части, которое a) ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC порядка 1×10 M или менее; b) имеет участок CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; и c) имеет участок CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В предпочтительном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в настоящем изобретении, имеет участок CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и участок CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
В другом предпочтительном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в настоящем изобретении, имеет участок CDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и участок CDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
В еще одном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, используемое в настоящем изобретении, имеет вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.
2
В определенных вариантах осуществления полноразмерное антитело содержит константную область тяжелой цепи, такую как константные области IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE, и любой их аллотипический вариант, как описано у Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health и Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Предпочтительно, чтобы константной областью тяжелой цепи антитела была константная область тяжелой цепи IgG1. Альтернативно, частью антитела может быть Fab-фрагмент, F(ab')-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент.
Дополнительные мутации в предпочтительных консенсусных последовательностях участков CDR3, CDR2 и CDR1 антител в ряду от Joe 9 до J695 или в ряду от Y61 до J695 могут быть произведены для получения дополнительных анти-IL-12-антител согласно изобретению. Такие способы модификации могут быть выполнены с использованием стандартных технологий молекулярной биологии, например с помощью ПЦР-мутагенеза, направленного на индивидуальные аминокислотные остатки в положениях, где осуществляется контакт, и в положениях гипермутирования, в областях CDR легкой и/или тяжелой цепей, с последующим кинетическим и функциональным анализом модифицированных антител, как указано в настоящем описании (например, путем анализа нейтрализации, описанного в примере 3 патента США No. 6914128, и путем анализа BIAcore, как описано в примере 5 патента США No. 6914128).
Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения используется изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, которое
50
-6
a) ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC порядка 1×10 M или менее;
off
b) содержит область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, или их мутант, имеющий одну или более аминокислотных замен в предпочтительном для селективного мутагенеза положении или в положении гипермутирования, где указанный мутант имеет константу скорости K не более чем в 10 раз выше, чем антитело, содержащее область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и
off
c) содержит область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или их мутант, имеющий одну или более аминокислотных замен в предпочтительном положении для селективного мутагенеза или в положении гипермутирования, где указанный мутант имеет константу скорости K не более чем в 10 раз выше, чем антитело, содержащее область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В другом аспекте настоящего изобретения используется изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, которое
50
-9
a) ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC порядка 1×10 M или менее;
off
b) содержит область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, или их мутант, имеющий одну или более аминокислотных замен в предпочтительном для селективного мутагенеза положении, в положении, где осуществляется контакт, или в положении гипермутирования, где указанный мутант имеет константу скорости K не более чем в 10 раз выше, чем антитело, содержащее область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и
off
c) содержит область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, или их мутант, имеющий одну или более аминокислотных замен в предпочтительном для селективного мутагенеза положении, в положении, где осуществляется контакт, или в положении гипермутирования, где указанный мутант имеет константу скорости K не более чем в 10 раз выше, чем антитело, содержащее область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.
Рядовому специалисту в данной области должно быть понятно, что дополнительные мутации в CDR-областях антитела, например, антител Y61 или J695, могут быть вызваны с целью получения дополнительных анти-IL-12-антител согласно изобретению. Такие способы модификации могут быть предприняты с помощью стандартных технологий молекулярной биологии, как описано выше. Функциональный и кинетический анализ модифицированных антител может быть осуществлен, как описано в примере 3 патента США No. 6914128 и в примере 5 патента США No. 6914128, соответственно. Модификации индивидуальных остатков антитела Y61, которые ведут к отождествлению его с антителом J695, показаны на фиг.2A-2H патента США No. 6914128 и описаны в примере 2 патента США No. 6914128.
Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения используется изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, которое
50
-9
a) ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC порядка 1×10 M или менее;
off
b) содержит область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, или их мутант, имеющий одну или более аминокислотных замен в предпочтительном положении для селективного мутагенеза или в положении гипермутирования, где указанный мутант имеет константу скорости K не более чем в 10 раз выше, чем антитело, содержащее область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и
off
c) содержит область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, или их мутант, имеющий одну или более аминокислотных замен в предпочтительном положении для селективного мутагенеза или в положении гипермутирования, где указанный мутант имеет константу скорости K не более чем в 10 раз выше, чем антитело, содержащее область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
В другом аспекте настоящего изобретения используется изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, которое
50
-9
a) ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в ФГА-анализе in vitro с IC порядка 1×10 M или менее;
off
b) содержит область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, или их мутант, имеющий одну или более аминокислотных замен в предпочтительном положении для селективного мутагенеза или в положении гипермутирования, где указанный мутант имеет константу скорости K не более чем в 10 раз выше, чем антитело, содержащее область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; и
off
c) содержит область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, или их мутант, имеющий одну или более аминокислотных замен в предпочтительном для селективного мутагенеза положении или в положении гипермутирования, где указанный мутант имеет константу скорости K не более чем в 10 раз выше, чем антитело, содержащее область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению изолированных человеческих антител или их антиген-связывающих частей, которые нейтрализуют активность человеческого IL-12 и по меньшей мере IL-12 одного дополнительного примата, выбранного из группы, состоящей из IL-12 павиана, IL-12 мартышки, IL-12 шимпанзе, IL-12 макаки циномолгус и IL-12 макаки резус, но которые не нейтрализуют активность мышиного IL-12.
II Отбор человеческих рекомбинантных антител
TM
9
3
246
348
12
226
352
89
9
19
88
Рекомбинантные человеческие антитела, которые можно использовать в настоящем изобретении, могут быть изолированы путем скрининга библиотеки комбинаторных рекомбинантных антител, предпочтительно библиотеки фагового дисплея scFv, полученных с использованием кДНК VL и VH, образованной на основе мРНК, полученной из лимфоцитов человека. Способы идентификации антител, которые могут быть использованы в способах и композициях согласно изобретению, описаны в патенте США No. 6914128, включенном в настоящее описание в виде ссылки. Методологии получения и скрининга библиотек известны в данной области. Помимо коммерчески доступных наборов для получения библиотек фагового дисплея (например, Система Рекомбинантных Фаговых Антител, Pharmacia, с каталожным номером no. 27-9400-01; и набор фагового дисплея SurfZAP, Stratagene, с каталожным номером no. 240612), примеры способов и реагентов, особенно пригодных для применения в выработке и скрининге библиотек антительного дисплея, могут быть найдены, например, у Kang et al. в публикации PCT No. WO 92/18619; у Winter et al. в публикации PCT No. WO 92/20791; Breitling et al. в публикации PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al. в публикации PCT No. WO 92/01047; Garrard et al. в публикации PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology : 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas : 81-85; Huse et al. (1989) Science : 1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) : 552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J : 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. : 889-896; Clackson et al. (1991) Nature : 624-628; Gram et al. (1992) PNAS : 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology : 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res : 4133-4137; и Barbas et al. (1991) PNAS : 7978-7982.
Библиотеки антител, используемые в указанном способе, предпочтительно являются библиотеками scFv, полученными из кДНК человеческих VL и VH. Библиотеки scFv-антител предпочтительно подвергают скринингу с использованием рекомбинантных человеческих IL-12 в качестве антигена для отбора последовательностей человеческих тяжелых и легких цепей, обладающих связывающей активностью в отношении IL-12. Для отбора антител, специфичных в отношении субъединицы p35 или гетеродимера p70 интерлейкина IL-12, были предприняты анализы скрининга в присутствии избыточного количества свободной субъединицы p40. Предпочтительные субъединицы могут быть определены, например, путем микротитрования по Б.Фриге, как описано в примере 1 патента США No. 6914128.
off
off
Сразу же после отбора первоначальных сегментов человеческих VL и VH предпринимают эксперименты "mix и match", в которых различные пары отобранных сегментов VL и VH подвергают скринингу на предмет их связывания с IL-12, с целью отбора предпочтительных пар комбинаций VL/VH (см. пример 1 в патенте США No. 6914128). Кроме того, для дальнейшего улучшения аффинности и/или снижения константы скорости K связывания hIL-12 сегменты VL и VH предпочтительной пары (пар) VL/VH могут быть подвергнуты случайному мутагенезу, предпочтительно области CDR3 участка VH и/или VL, в процессе, аналогичном процессу соматической мутации in vivo, ответственному за созревание аффинности антител в ходе созревания аффинности антител во время естественно протекающего иммунного ответа. Такое созревания аффинности in vitro может быть достигнуто путем амплификации областей VH и VL с помощью ПЦР-праймеров, комплементарных, соответственно, VH CDR3 или VL CDR3, где указанные праймеры включены в «произвольную» смесь из четырех нуклеотидных оснований в определенных положениях, так, чтобы полученные в результате продукты ПЦР кодировали сегменты VH и VL, в областях CDR3 VH и/или VL которых внесены случайные мутации. Эти подвергнутые случайным мутациям сегменты VH и VL могут быть вновь отобраны и повторно подвергнуты скринингу на предмет их связывания с hIL-12 и могут быть отобраны последовательности, которые обнаруживают высокую аффинность и низкую константу скорости K в отношении связывания IL-12. В таблице 2 (см. приложение A патента США No. 6914128) приведены антитела, которые проявляют измененную специфичность/аффинность связывания, полученную в результате созревания аффинности in vitro.
После селекции, выделения и скрининга анти-hIL-12-антитела согласно изобретению из библиотеки дисплеев рекомбинантного иммуноглобулина, нуклеиновая кислота может быть восстановлена из фаговой частицы (частиц) (например, из фагового генома) и субклонирована в другие экспрессирующие векторы с помощью стандартных технологий рекомбинантной ДНК. Если это требуется, указанную нуклеиновую кислоту можно обработать для создания других форм антитела согласно изобретению (например, связанных с нуклеиновой кислотой, кодирующей дополнительные иммуноглобулиновые домены, такие как дополнительные константные области). Для экспрессии рекомбинантного человеческого антитела, изолированного путем скрининга комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую антитело, клонировали в рекомбинантный экспрессирующий вектор и вводили в клетки-хозяева млекопитающих, как более подробно описано ниже в разделе IV.
Способы селекции человеческих антител, связывающихся с IL-12, с использованием технологии фагового дисплея и созревания аффинности отобранных антител путем случайного или сайт-направленного мутагенеза CDR-областей подробно описаны в примере 1 в патенте США No. 6914128.
H
Как описано в примере 1 в патенте США No. 6914128, путем скрининга библиотек кДНК человеческих VL и VH идентифицировали серию анти-IL-12-антител, из которых для дальнейшего усовершенствования выбрали антитело Joe 9. Сравнение вариабельной области тяжелой цепи Joe 9 с последовательностями тяжелой цепи зародышевой линии, выбранными из базы данных VBASE, показало, что последовательности Joe 9 сходны с последовательностью COS-3 зародышевой линии. COS-3 относится к семейству последовательностей V3 зародышевых линий.
H
H
H
H
H
H
H
H
Семейство V3 является частью репертуара человеческих VH зародышевой линии, который делится на группы из семи семейств, V1-V7, на основе гомологии нуклеотидных последовательностей (Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798; и Cook et al. (1995) Immunology Today, 16, 237-242). Семейство V3 содержит наибольшее количество членов и вносит наибольший вклад в репертуар зародышевой линии. Для любой данной последовательности человеческого антитела V3 зародышевой линии степень идентичности аминокислотных последовательностей внутри полного семейства V3 высока (см., например, Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798; и Cook et al. (1995) Immunology Today, 16, 237-242). Степень идентичности аминокислотных последовательностей между любыми двумя VH- последовательностями зародышевой линии семейства V3 колеблется от 69 до 98 остатков приблизительно на 100 остатков VH (т.е. имеет место 69-98% гомология аминокислотных последовательностей между любыми двумя VH-последовательностями зародышевой линии). Большинство пар последовательностей зародышевой линии имеют по меньшей мере 80 или более идентичных аминокислотных остатков (т.е. по меньшей мере 80%-ную гомологию аминокислотных последовательностей). Следствием высокой степени гомологии аминокислотных последовательностей между членами семейства V3 является то, что на ключевых участках областей CDR и областей рамки считывания VH-цепи располагаются определенные аминокислотные остатки. Эти аминокислотные остатки и придают структурные свойства областям CDR.
H
Исследования структур антител показали, что конформации CDR могут быть сгруппированы в семейства канонических структур CDR на основе ключевых аминокислотных остатков, которые занимают определенные положения в областях CDR и рамки считывания. Следовательно, в различных антителах имеют место сходные локальные конформации CDR, которые имеют канонические структуры с идентичными ключевыми аминокислотными остатками (Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 и Chothia et al. (1989) Nature, 342, 877-883). Внутри семейства V3 имеет место консервативность на уровне идентичности аминокислотных остатков на ключевых участках канонических структур CDR1 и CDR2 (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 799-817).
H
H
Ген VH зародышевой линии COS-3 является членом семейства V3 и является вариантом аллеля 3-30 (DP-49) зародышевой линии VH. COS-3 отличается от аминокислотных последовательностей VH антитела Joe9 только в 5 положениях. Высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей между VH Joe9 и COS-3, а также между VH Joe9 и другими членами семейства V3, придает также высокую степень структурной гомологии и областям CDR (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 799-817; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 и Chothia et al. (1989) Nature, 342, 877-883).
H
H
Специалистам должно быть понятно, что на основе высокой степени сходства аминокислотных последовательностей и канонических структур с антителом Joe 9 могут быть использованы также и другие члены семейства V3 для получения антител, которые связываются с человеческим IL-12. Этого можно достичь, например, путем селекции соответствующей VL в результате переборки цепей (chain-shuffling techniques) (Winter et al. (1994) Annual Rev. Immunol., 12, 433-55) или в результате пересадки участков CDR грызунов или остальных человеческих антител, включая участки CDR антител согласно изобретению, в рамку считывания семейства V3.
λ
λ
λ
Репертуар человеческой зародышевой линии V-лямбда сгруппировали в 10 семейств на основе гомологии нуклеотидных последовательностей (Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264, 220-232). Сравнение вариабельной области легкой цепи антитела Joe 9 с последовательностями легкой цепи зародышевой линии, выбранными из базы данных VBASE, позволило выявить, что Joe 9 сходно с зародышевой линией DPL8-лямбда. Область VL антитела Joe9 отличается от последовательности DPL8 лишь четырьмя положениями в рамке считывания и является высокогомологичной последовательностям рамки считывания других членов семейства V1. На основе высокой степени гомологии аминокислотных последовательностей и сходства канонических структур с антителом Joe 9 могут быть использованы также и другие члены семейства V1 для получения антител, которые связываются с человеческим IL-12. Этого можно достичь, например, путем селекции соответствующей VH в результате переборки цепей (Winter et al., выше), или в результате пересадки участков CDR грызунов или других человеческих антител, включая участки CDR антител согласно изобретению, в рамку считывания семейства V1.
H
λ
H
λ
Подразумевается, что способы согласно изобретению относятся к рекомбинантным антителам, которые связываются с человеческим IL-12, включающим вариабельную область тяжелой цепи, полученную из последовательностей члена семейства V3 зародышевой линии, и вариабельную область легкой цепи, полученную из последовательностей члена семейства V1 зародышевой линии. Более того, специалистам должно быть понятно, что любая последовательность тяжелой цепи V3 может быть скомбинирована с любой последовательностью легкой цепи члена семейства V1.
Специалистам в данной области должно быть понятно также и то, что внутри популяции (например, человеческой популяции) могут существовать полиморфизмы ДНК-последовательностей, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях зародышевой линии. Такой генетический полиморфизм в последовательностях зародышевой линии может существовать среди индивидуумов внутри популяции в результате природной вариации аллелей. Обычно такие природные аллельные вариации могут быть результатом 1-5%-ной вариабельности нуклеотидной последовательности гена. Любая и все такие нуклеотидные вариации и полученные в результате аминокислотные полиморфизмы в последовательностях зародышевой линии, являющихся результатом природных аллельных вариаций, считаются включенными в объем настоящего изобретения.
Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к изолированному человеческому антителу или его антиген-связывающей части, которое обладает следующими характеристиками:
off
50
-1
-6
a) связывается с человеческим IL-12 и диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 с константой скорости k, составляющей 0,1 сек или менее, определяемой на основании плазмонного резонанса, или которое ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в анализе in vitro (ФГА-анализ) с IC порядка 1×10 M или менее;
H
b) имеет вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из члена семейства V3 зародышевой линии, где вариабельная область тяжелой цепи содержит мутацию аминокислотного остатка в положении, где осуществляется контакт, или в положении гипермутирования на повышающий активность аминокислотный остаток;
λ
c) имеет вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из члена семейства V1 зародышевой линии, где вариабельная область легкой цепи содержит мутацию аминокислотного остатка в предпочтительном для селективного мутагенеза положении, в положении, где осуществляется контакт, или в положении гипермутирования, на повышающий активность аминокислотный остаток.
В предпочтительном варианте осуществления указанное изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть содержит мутацию в области CDR3 тяжелой цепи. В другом предпочтительном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть содержит мутацию в области CDR3 легкой цепи. В другом предпочтительном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть содержит мутацию в области CDR2 тяжелой цепи. В другом предпочтительном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть содержит мутацию в области CDR2 легкой цепи. В другом предпочтительном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть содержит мутацию в области CDR1 тяжелой цепи. В другом предпочтительном варианте осуществления изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть содержит мутацию в области CDR1 легкой цепи.
H
λ
H
λ
H
λ
Рядовому специалисту в данной области должно быть понятно, что, в силу высокой степени подобия между членами семейства V3 зародышевой линии или между членами семейства V1 зародышевой линии, такие мутации в последовательностях зародышевых линий могут обеспечить возможность получения дополнительных антител, которые будут связываться с человеческим IL-12. В таблице 1 патента США No. 6914128 (см. также приложение А в патенте США No. 6914128) приведены последовательности членов семейства V3 зародышевой линии и показана значительная степень гомологии последовательностей внутри членов этого семейства. В таблице 1 патента США No. 6914128 представлены также последовательности членов семейства V1 зародышевой линии. Последовательности тяжелой и легкой цепей Joe 9 приведены для сравнения. Мутации в последовательностях членов семейства V3 или V1 зародышевой линии могут быть произведены, например, в тех же самых положениях аминокислотных остатков, что и в антителах согласно изобретению (например, мутации в Joe 9). Такие модификации могут быть предприняты с помощью стандартных технологий молекулярной биологии, таких как ПЦР-мутагенез, нацеливание на определенные аминокислотные остатки в последовательностях зародышевой линии, с последующим анализом кинетики и функциональным анализом модифицированных антител, как описано выше (например, анализ нейтрализации, описанный в примере 3 патента США No. 6914128, и BIAcore-анализ, описанный в примере 5 патента США No. 6914128).
Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения используется изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, которое имеет следующие характеристики:
a) имеет вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 595-667, где указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит мутацию аминокислотного остатка в предпочтительном для селективного мутагенеза положении, в положении, где осуществляется контакт, или в положении гипермутирования, [с заменой его] на повышающий активность аминокислотный остаток;
b) имеет вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 669-675, где указанная вариабельная область легкой цепи содержит мутацию аминокислотного остатка в предпочтительном для селективного мутагенеза положении, в положении, где осуществляется контакт, или в положении гипермутирования, [с заменой его] на повышающий активность аминокислотный остаток.
Рядовому специалисту в данной области должно быть понятно, что, в силу высокой степени подобия между Joe 9 и последовательностью тяжелой цепи зародышевой линии COS-3 и между Joe 9 и последовательностью зародышевой линии DPL8-лямбда, другие мутации в областях CDR этих последовательностей зародышевой линии могут обеспечить возможность получения дополнительных антител, которые будут связываться с человеческим IL-12. Такие способы модификации могут быть предприняты с помощью стандартных технологий молекулярной биологии, как описано выше.
Соответственно, в одном из аспектов настоящего изобретения используется изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, которое имеет следующие характеристики:
off
50
-1
-6
a) связывается с человеческим IL-12 и диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 с константой скорости k, составляющей 0,1 сек или менее, определяемой на основании плазмонного резонанса, или которое ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в анализе in vitro (ФГА-анализ) с IC порядка 1×10 M или менее;
b) имеет вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность зародышевой линии COS-3, где вариабельная область тяжелой цепи содержит мутацию аминокислотного остатка в предпочтительном положении для селективного мутагенеза, положении, где осуществляется контакт, или положении гипермутирования, [с заменой его] на повышающий активность аминокислотный остаток;
c) имеет вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность зародышевой линии DPL8, где вариабельная область легкой цепи содержит мутацию аминокислотного остатка в предпочтительном положении для селективного мутагенеза, положении, где осуществляется контакт, или положении гипермутирования, [с заменой его] на повышающий активность аминокислотный остаток.
Благодаря тому что определенные аминокислотные остатки занимают ключевые положения в районах CDR и рамки считывания в вариабельных областях легкой и тяжелой цепей, они придают этим областям их структурные свойства. В частности, области CDR2 и CDR1 поддаются каноническим структурным классификациям. В силу высокой степени гомологии аминокислотных последовательностей между членами семейства эти канонические признаки присутствуют в ряду членов семейства. Специалистам в данной области должно быть понятно, что модификации тех аминокислотных остатков, которыми обусловлены указанные канонические структуры, могли бы обеспечить возможность получения дополнительных антител, которые будут связываться с человеческим IL-12. Такие модификации могут быть предприняты с помощью стандартных технологий молекулярной биологии, как описано выше.
Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения используется изолированное человеческое антитело или его антиген-связывающая часть, которое имеет следующие характеристики:
off
50
-1
-6
a) связывается с человеческим IL-12 и диссоциирует из комплекса с человеческим IL-12 с константой скорости k, составляющей 0,1 сек или менее, определяемой на основании плазмонного резонанса, или ингибирует фитогемагглютининовую бласт-пролиферацию в анализе in vitro (ФГА-анализ) с IC, составляющей 1×10 M или менее;
H
H
H
b) имеет вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из члена семейства V3 зародышевой линии, где вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR2, которая структурно сходна с областями CDR2 из других членов семейства V3 зародышевой линии, и CDR1, которая структурно сходна с областями CDR1 из других членов семейства V3 зародышевой линии, и где вариабельная область тяжелой цепи содержит мутацию аминокислотного остатка в предпочтительном положении для селективного мутагенеза, положении, где осуществляется контакт, или положении гипермутирования, [с заменой его] на повышающий активность аминокислотный остаток;
λ
λ
λ
c) имеет вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из члена семейства V1 зародышевой линии, где вариабельная область легкой цепи содержит область CDR2, которая структурно сходна с областями CDR2 из других членов семейства V1 зародышевой линии, и область CDR1, которая структурно сходна с областями CDR1 из других членов семейства V1 зародышевой линии, и где вариабельная область легкой цепи содержит мутацию аминокислотного остатка в предпочтительном положении для селективного мутагенеза, положении, где осуществляется контакт, или положении гипермутирования, [с заменой его] на повышающий активность аминокислотный остаток.
Рекомбинантные человеческие антитела, используемые в настоящем изобретении, имеют вариабельную и константную области, которые гомологичны иммуноглобулиновым последовательностям человеческой зародышевой линии, выбранным из базы данных VBASE. Мутации в рекомбинантных человеческих антителах (например, в результате случайного мутагенеза или ПЦР-мутагенеза) приводят к появлению аминокислот, которые не кодируются иммуноглобулиновыми последовательностями человеческой зародышевой линии. Также и библиотеки рекомбинантных человеческих антител, которые получены от людей-доноров, будут содержать последовательности антител, отличающиеся от соответствующих им последовательностей зародышевой линии благодаря нормальному процессу соматической мутации, который происходит в процессе развития B-клеток. Следует отметить, что если последовательности "зародышевой линии", полученные путем ПЦР-амплификации, кодируют аминокислоты, отличающиеся в областях рамки считывания от истинной конфигурации зародышевой линии (т.е. получаются различия в амплифицируемой последовательности по сравнению с истинной последовательностью зародышевой линии), может возникнуть необходимость произвести обратную замену указанных отличающихся аминокислот для возврата к последовательностям зародышевой линии (т.е. "обратную мутацию" остатков рамки считывания к конфигурации зародышевой линии). Таким образом, настоящее изобретение необязательно может включать стадию проведения обратной мутации. Для этого аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи, кодируемые зародышевой линией (которые можно найти, например, в базе данных VBASE), сначала сравнивают с аминокислотными последовательностями рамки считывания тяжелой и легкой цепи мутантного иммуноглобулина, чтобы в последовательности рамки считывания мутантного иммуноглобулина идентифицировать аминокислотные остатки, которые отличаются от наиболее близких последовательностей зародышевой линии. Затем соответствующие нуклеотиды последовательности мутантного иммуноглобулина подвергают обратной мутации, чтобы они соответствовали таковым последовательности зародышевой линии, используя генетический код для установления того, какие нуклеотидные замены должны быть осуществлены. Мутагенез последовательности рамки считывания мутантного иммуноглобулина проводят стандартными методами, такими как ПЦР-опосредованный мутагенез (при котором мутантные нуклеотиды встраивают в ПЦР-праймеры, так, чтобы продукт ПЦР содержал нужные мутации) или сайт-направленный мутагенез. Роль каждой аминокислоты, идентифицируемой в качестве кандидата на обратную мутацию, должна быть исследована на предмет прямого или опосредованного влияния, оказываемого ею на связывание антигена, и те аминокислоты, в отношении которых после мутации обнаруживается, что они воздействуют на какую бы то ни было из желательных характеристик человеческого антитела, не должны быть включены в состав конечного человеческого антитела; в качестве примера, обратной мутации не должны подвергаться повышающие активность аминокислоты, идентифицируемые на основе принципа селективного мутагенеза. Анализы по определению характеристик антитела, полученного в результате мутагенеза, могут включать ELISA, конкурентный метод ELISA, анализы нейтрализации in vitro и in vivo (см., например, пример 3 в патенте США No. 6914128) и/или иммуногистохимический анализ тканевых срезов из различных источников (включая человека, приматов и/или другие виды).
Чтобы минимизировать число аминокислот, подвергаемых обратной мутации, аминокислоты в тех положениях, которые отличаются от таковых в ближайшей последовательности зародышевой линии, но идентичны соответствующей аминокислоте во второй последовательности зародышевой линии, можно сохранить, при условии, что вторая последовательность зародышевой линии идентична и коллинеарна последовательности человеческого антитела согласно изобретению на участке протяженностью по меньшей мере в 10, предпочтительно в 12 аминокислот по обе стороны от представляющей интерес аминокислоты. Это будет гарантией того, что любой пептидный эпитоп, представленный иммунной системе специализированными антигенпредставляющими клетками, у субъекта, обработанного человеческим антителом согласно изобретению, не будет являться чужеродным, а будет идентичен собственному антигену, т.е. что иммуноглобулин кодируется указанной второй последовательностью зародышевой линии. Обратная мутация может происходить на любой стадии оптимизации антитела; предпочтительно, чтобы обратная мутация имела место непосредственно перед или после проведения селективного мутагенеза. Более предпочтительно, чтобы обратная мутация имела место непосредственно перед проведением селективного мутагенеза.
Модификации в положениях предпочтительного селективного мутагенеза, положениях, где осуществляется контакт, и/или положениях гипермутирования
III.
Обычно отбор антител с улучшенной аффинностью может быть осуществлен с привлечением методов фагового дисплея, как описано в разделе II выше и в патенте США No. 6914128, включенном в настоящее описание в виде ссылки. Это может быть достигнуто путем комбинирования случайных мутаций остатков CDR и получения обширных библиотек, содержащих антитела с различными последовательностями. Однако для того, чтобы такие методы отбора работали, реакция антиген-антитело должна иметь тенденцию к равновесию, чтобы со временем сохранялось предпочтительное связывание с антигеном антител с более высокой аффинностью. Условия селекции, которые позволили бы установить равновесие, не удавалось определить (по-видимому, в силу дополнительных неспецифических взаимодействий между антигеном и фаговой частицей), когда для улучшения аффинности селектируемых анти-IL-12-антител методы фагового дисплея использовали по достижении определенного уровня аффинности (т.е. такого, как у антитела Y61). Соответственно, отбирать антитела даже с более высокой аффинностью методами фагового дисплея не удавалось. Таким образом, по меньшей мере для определенных антител или антигенов возможности методов фагового дисплея ограничены в отношении осуществления с их помощью селекции антител с существенно улучшенной специфичностью/аффинностью связывания. Соответственно, в настоящем изобретении был отработан способ, называемый принципом селективного мутагенеза (Selective Mutagenesis Approach), в котором не требуется созревания антител с использованием фагового дисплея. Несмотря на то что указанный принцип селективного мутагенеза был создан для того, чтобы обойти ограничения, возникающие при использовании системы фагового дисплея, следует отметить, что этот метод может быть использован также и совместно с системой фагового дисплея. Более того, принцип селективного мутагенеза может быть использован для улучшения активности любого антитела.
Для того чтобы улучшить активность (например, аффинность или нейтрализующую активность) антитела, в идеальном случае надо было бы вызывать мутацию в каждом положении CDR как в тяжелой, так и в легкой цепях, заменяя его любым другим аминокислотным остатком. Однако поскольку в антителе в среднем содержится около 70 положений CDR, такой подход потребовал бы очень больших временных затрат и финансовых расходов. Соответственно, способ согласно изобретению позволяет улучшить активность антитела в результате мутации лишь определенных, выборочных остатков внутри участков CDR тяжелой и/или легкой цепей. Более того, способ согласно изобретению позволяет улучшить активность антитела, не влияя при этом на другие свойства, предъявляемые к данному антителу.
Определение того, какие именно аминокислотные остатки вариабельной области антитела находятся в контакте с антигеном, невозможно в точности предсказать на основе первичной последовательности или их положений внутри вариабельной области. Тем не менее, выравнивание последовательностей антител, имеющих различную специфичность, проведенное Kabat et al., позволило идентифицировать CDR в виде локальных участков внутри вариабельной области, которые значительно отличаются от антитела к антителу (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190: 382-393; Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health и Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Исследования структуры показали, что площадь связывания с антигеном образована аминокислотными остатками, находящимися в областях CDR. Известно, что другие аминокислотные остатки, находящиеся вне области CDR, также играют структурную роль или же непосредственно участвуют в связывании антигена. Следовательно, для каждой пары антиген-антитело могут быть важны аминокислотные остатки, находящиеся как внутри, так и вне областей CDR.
Исследования Tomlison et al. по выравниванию последовательностей позволили идентифицировать ряд положений на участках CDR1 и CDR2 тяжелой и легкой цепей и в части CDR3 каппа-цепи, которые являются сайтами, часто повергающимися соматической мутации (Tomlison et al. (1996) J. Mol. Biol. 256: 813-817). В частности, положения H31, H31B, H33, H33B, H52B, H56, H58, L30, L31, L31A, L50, L53, L91, L92, L93 и L94 были идентифицированы как сайты, часто повергающиеся соматической мутации. Однако в этом анализе исключены важные участки CDR3 тяжелой цепи и отрезки CDR3 легкой цепи, которые, как известно, расположены в центре участка связывания антитела и потенциально обеспечивают важные взаимодействия с антигеном. Помимо этого, Tomlison et al. предположили, что соматическое различие само по себе необязательно позволяет предсказать роль специфической аминокислоты в связывании антигена, и предложили консервативные аминокислотные остатки, которые контактируют с антигеном, и другие аминокислотные остатки, которые не контактируют с антигеном. Это заключение дополнительно подтверждено исследованиями мутагенеза на уровне выяснения роли соматических мутаций в аффинности антитела (Sharon, (1990), PNAS, 87:4814-7). Девятнадцать соматических мутаций в высокоаффинном антителе против p-азофениларсоната (Ars) были заменены одновременно соответствующими им остатками зародышевой линии, с получением версии анти-Ars-антитела зародышевой линии, которое оказалось в двести раз менее активным. Полную аффинность анти-Ars-антитела можно было восстановить путем восстановления всего лишь трех из девятнадцати остатков, в которых произошли соматические мутации, что свидетельствует о том, что могут быть дозволены многие соматические мутации, которые не вносят своего вклада в антиген-связывающую активность. Этот результат отчасти можно объяснить природой изменчивости антитела как таковой. Незрелые B-клетки могут продуцировать антитела с первоначально низкой аффинностью, которые распознают целый ряд собственных или чужеродных антигенов. Кроме того, в процессе созревания аффинности антитела могут подвергаться изменениям, проявляющимся в вариациях их последовательности, которые могут вызывать аутореактивность. Гипермутирование таких низкоаффинных антител может вызвать упразднение такой аутореактивности ("отрицательная селекция") и повышение аффинности в отношении чужеродного антигена. Следовательно, анализ данных о первичной структуре большого числа антител не обеспечивает возможности предсказания ни (1) роли сайтов гипермутирования в процессе созревания аффинности антитела вместо процесса уменьшения аффинности в отношении нежелательных антигенов, ни (2) того, каким образом данная аминокислота вносит свой вклад в свойства специфической пары антиген-антитело.
Другие попытки выяснения роли специфических аминокислотных остатков в распознавании антигена были предприняты путем анализа числа кристаллических структур в комплексах антиген-антитело (MacCallum et al. (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745). Была указана потенциальная роль положений, локализованных внутри и вне участков CDR. Положения в CDR, участвующие в связывании антигена, более чем в 10 из 26 подвергнутых анализу структурах включали положения H31, H33, H50, H52, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98 и H100 в тяжелой цепи и L30A, L32, L91, L92, L93, L94, L96 в легкой цепи. Однако авторы отмечали, что предсказанные положения, участвующие в осуществлении контактов с антигеном, с помощью этих и других структурных данных могут оказаться выше и ниже положений, где осуществляется контакт, что приводит к спекулятивному суждению, что к различным антигенам следует применять разную стратегию.
У Pini с соавт. описано рандомизирование множества остатков в CDR-последовательностях в обширной библиотеке фагового дисплея с целью быстрого повышения аффинности антитела (Pini et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776). Однако высокоаффинные антитела, обсуждаемые Pini с соавторами, имеют мутации всего в восьми положениях, и упрощенный анализ того, какие изменения являются абсолютно необходимыми для улучшения аффинности антитела, становится непрактичным в силу большого количества возможных комбинаций, которые подлежат тестированию в случае наименьшего количества необходимых аминокислот.
Кроме того, рандомизирование множества остатков необязательно позволит сохранить другие желательные свойства антитела. Желательными свойствами или характеристиками антитела являются таковые, принятые в данной области, и включают, например, сохранение отсутствия перекрестной реактивности, например, с другими белками или тканями человека, и сохранение последовательностей с улучшенными возможностями нейтрализации, которые близки человеческим иммуноглобулиновым последовательностям зародышевой линии. Другие желательные свойства или характеристики включают способность сохранения видовой перекрестной реактивности, способность сохранения специфичности в отношении эпитопа и способность сохранения высоких уровней экспрессии белка в клетках млекопитающего. Требуемые свойства или характеристики могут быть обнаружены или измерены с помощью общепринятых в данной области технологий, включая, но не ограничиваясь перечисленным, метод ELISA, конкурентный метод ELISA, анализы нейтрализации in vitro и in vivo (см., например, пример 3 в патенте США No. 6914128), иммуногистохимический анализ тканевых срезов из разных источников, включая человека, приматов, или из других источников, в соответствии с потребностями, и исследования экспрессии в клетках млекопитающего с использованием транзитной экспрессии или стабильной экспрессии.
Кроме того, способ Pini с соавторами предусматривает введение большего количества изменений, чем минимальное их количество, действительно необходимое для улучшения аффинности, и может привести к образованию антител, запускающих процесс образования античеловеческого антитела (HAMA) в организме человека. Кроме того, как описано в других источниках, метод фагового дисплея или другие родственные методы, включая метод рибосомного дисплея, могут оказаться неудовлетворительными при достижении определенного уровня аффинности между антителом и антигеном, и условия, необходимые для достижения равновесия, могут не быть установлены в течение оптимального отрезка времени в силу дополнительных взаимодействий, включая взаимодействия с другими компонентами фагов или рибосом и антигеном.
Рядовой специалист в данной области может найти интересующую его научную информацию о природе изменчивости антител из цитируемых выше источников. В настоящем изобретении, однако, предложен способ повышения аффинности антитела для специфической пары антиген-антитело при сохранении других релевантных признаков или требуемых характеристик антитела. Это особенно важно при учете необходимости придания антителу множества различных характеристик, связанных со специфичностью антитела, включая связывание антигена.
Если исходное антитело обладает требуемыми свойствами или характеристиками, которые необходимо сохранить, принцип селективного мутагенеза может оказаться наилучшей стратегией для сохранения этих требуемых свойств, наряду с улучшением активности антитела. Например, при мутагенезе антитела Y61 целью являлось увеличение аффинности в отношении hIL-12 и улучшение нейтрализующей способности антитела, при условии сохранения требуемых свойств. Требуемые свойства в случае Y61 включали (1) сохранение отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, (2) способность сохранения высокой специфичности в отношении эпитопа, т.е. распознавание эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 (p40/p35), предотвращая, таким образом, помехи для связывания со свободным растворимым p40; и (3) получение антитела с аминокислотными последовательностями тяжелой и легкой цепей, которые были бы наиболее близки соответствующим им последовательностям иммуноглобулина зародышевой линии.
В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению связан с принципом селективного мутагенеза в качестве стратегии для сохранения требуемых свойств или характеристик антитела, наряду с улучшением его аффинности и/или нейтрализующей способности. Термин "принцип селективного мутагенеза" имеет смысл, указанный выше, и включает способ образования индивидуальной мутации выбранных аминокислотных остатков. Аминокислотные остатки, которые будут подвергнуты мутации, сначала могут быть отобраны из остатков в положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, затем из остатков в положениях, где осуществляется контакт, и затем в положениях гипермутирования.
Остаток в индивидуально выбранном положении может быть заменен по меньшей мере двумя другими аминокислотными остатками, и затем определяется эффект произведенной мутации как в отношении сохранения требуемых свойств антитела, так и в отношении улучшения его активности.
Принцип селективного мутагенеза включает следующие стадии:
селекцию положений-кандидатов в следующем порядке: 1) положения, предпочтительные для селективного мутагенеза; 2) положения, где осуществляется контакт; 3) положения гипермутирования и ранжирование указанных положений на основе локализации положения внутри вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела (CDR3 предпочтительнее CDR2 предпочтительнее CDR1);
осуществление индивидуальных мутаций остатков в положениях-кандидатах, в положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, в положениях гипермутирования и/или в положениях, где осуществляется контакт, на любые возможные отличающиеся аминокислотные остатки и изучение влияния указанных индивидуальных мутаций на активность антитела, с тем, чтобы обнаружить повышающие активность аминокислотные остатки;
в случае необходимости, поэтапное создание комбинаций индивидуальных повышающих активность аминокислотных остатков и изучение влияния различных таких комбинаций на активность антител; осуществление селекции мутантных антител, содержащих повышающие активность аминокислотные остатки, и ранжирование мутантных антител на основе локализации и идентичности аминокислотных замен с точки зрения их иммунологического потенциала. Первое место в такой иерархии предоставляется мутантным антителам, которые содержат аминокислотную последовательность, которая почти идентична последовательности вариабельной области, представленной в базе данных зародышевой линии, или имеет аминокислотную последовательность, которая сравнима с таковой других человеческих антител. Следом в иерархии идут мутантные антитела, содержащие аминокислотную замену, которая редко встречается как в последовательностях зародышевой линии, так и в последовательностях других человеческих антител. Самыми низкими по ранжиру считаются мутантные антитела с аминокислотной заменой, которая не встречается ни в последовательностях зародышевой линии, ни в последовательностях других человеческих антител. Как указано выше, мутантные антитела, содержащие по меньшей мере один повышающий активность аминокислотный остаток, локализованный в области CDR3, являются предпочтительнее, чем в области CDR2, которые, в свою очередь, предпочтительнее, чем в области CDR1. Участки CDR вариабельных областей тяжелой цепи являются более предпочтительными, чем таковые вариабельной области легкой цепи.
1
2
1
2
Мутантные антитела можно также изучать на предмет улучшения их активности, например, путем их сравнения с соответствующим родительским антителом. Улучшение активности мутантного антитела может быть определено, например, путем анализа нейтрализующей способности или анализа специфичности/аффинности связывания методом резонанса поверхностных плазмонов (см. пример 3 в патенте США No. 6914128). Предпочтительно, чтобы улучшение активности было по меньшей мере в 2-20 раз выше, чем у родительского антитела. Улучшение активности может быть по меньшей мере от "x" до "x" раз выше, чем у родительского антитела, где "x" и "x" являются целыми числами между 2 и 20, включая и эти значения, а также включая область значений внутри этого интервала, например, 2-15, например, 5-10.
Мутантные антитела с повышающим активность аминокислотным остатком можно исследовать также с целью определения того, сохранилось ли по меньшей мере какое-нибудь одно желательное свойство после мутации. Например, анти-hIL-12-антитела тестировали с целью определения (1) сохранения ими отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, (2) сохранения ими способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 (p40/p35), предотвращая, таким образом, помехи для связывания со свободным растворимым p40; и (3) возможности получения антител с аминокислотными последовательностями тяжелой и легкой цепей, которые были бы как можно более близки соответствующим им последовательностям иммуноглобулина зародышевой линии, и определения того, которое из них могло бы с наибольшей вероятностью обеспечить иммунный ответ у человека, на основе числа отличий от последовательности зародышевой линии. Такие же наблюдения могут быть сделаны в отношении антитела, имеющего более чем один повышающий активность аминокислотный остаток, например, по меньшей мере два или по меньшей мере три повышающих активность аминокислотных остатка, с целью определения того, имеет ли место сохранение требуемого свойства или характеристики.
Один из примеров применения "принципа селективного мутагенеза" описан ниже как мутагенез Y61. Каждая из индивидуальных мутаций H31S→E, L50→Y или L94G→Y улучшала нейтрализующую активность антитела. Однако при тестировании комбинации клонов активность комбинированного клона H31S→E+L50→Y+L94G→Y оказалась не лучше, чем L50→Y+L94G→Y(J695). Следовательно, изменение аминокислотного остатка зародышевой линии Ser на Glu в положении 31 области CDR1 не было необходимым для улучшения активности J695 по сравнению с Y61. Следовательно, принцип селективного мутагенеза позволяет идентифицировать минимальное количество изменений, которые вносят свой вклад в конечную активность, снижая, таким образом, иммуногенный потенциал конечного антитела, и сохранить другие желательные свойства антитела.
Изолированная ДНК, кодирующая VH и VL, продуцируемые в соответствии с принципом селективного мутагенеза, может быть превращена в гены цепей полноразмерного антитела, в гены Fab-фрагментов, также как и в ген scFV, как описано в разделе IV. Для экспрессии областей VH и VL, продуцируемых согласно принципу селективного мутагенеза, экспрессирующие векторы, кодирующие тяжелую и легкую цепь, могут быть трансфицированы в различные клетки-хозяева, как подробно описано в разделе IV. Предпочтительные клетки-хозяева включают либо прокариотические клетки-хозяева, например, E. coli, либо эукариотические клетки-хозяева, например дрожжевые клетки, например, S. cerevisae. Наиболее предпочтительными эукариотическими клетками-хозяевами являются клетки-хозяева млекопитающих, подробно описанные в разделе IV.
Принцип селективного мутагенеза обеспечивает способ продуцирования антител с улучшенными активностями без предварительного созревания аффинности антитела какими бы то ни было средствами. Принцип селективного мутагенеза обеспечивает способ продуцирования антител с улучшенной аффинностью, которые подвергают обратным мутациям. Принцип селективного мутагенеза обеспечивает также способ улучшения активности антител после созревания их аффинности.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что принцип селективного мутагенеза может быть использован в стандартных технологиях манипуляций с антителами, известных в данной области. Примеры включают, но не ограничены перечисленным, антитела с привитыми CDR, химерные антитела, scFV-фрагменты, Fab-фрагменты полноразмерных антител и человеческих антител из других источников, например, из трансгенных мышей.
Быстрые широкомасштабные анализы созревания антител включают транскрипцию и трансляцию in vitro с использованием технологии рибосомного дисплея (см., например, Hanes et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 4937-4942; Dall Acqua et al., (1998) Curr. Opin. Struc. Biol. 8: 443-450; He et al., (1997) Nucleic Acid Res. 25: 5132-5134), и патенты США No. 5643768 и 5658754, выданные на имя Kawasaki. Принцип селективного мутагенеза обеспечивает также способ продуцирования антител с улучшенными активностями, которые могут быть отобраны с помощью технологии рибосомного дисплея.
В способах согласно изобретению антитела или их антиген-связывающие части подвергают дополнительной модификации путем изменения индивидуальных положений остатков на участках CDR областей HCVR и/или LCVR. Несмотря на то что эти модификации могут быть выполнены с антителами, полученными методом фагового дисплея, данный способ дает преимущества в том, что он может быть применен к антителам, которые экспрессируются в других типах систем клеток-хозяев, таких как экспрессирующие системы бактериальных, дрожжевых клеток или клеток млекопитающих. Индивидуальные положения остатков внутри областей CDR отбирают для модифицирования среди положений, где осуществляется контакт, и/или положения гипермутирования.
Предпочтительные положения, где осуществляется контакт, и положения гипермутирования, как определено в настоящем описании, приведены в таблице 3 патента США No. 6914128 (см. приложение A в патенте США No. 6914128), а их модификация в соответствии со способом согласно изобретению подробно описана в примере 2 патента США No. 6914128. Предпочтительные положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96. Предпочтительные положения гипермутирования выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 и L93. Более предпочтительные аминокислотные остатки (называемые "предпочтительными положениями для селективного мутагенеза") являются остатками одновременно и в положениях, где осуществляется контакт, и в положениях гипермутирования, и они выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. Особо предпочтительные положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из L50 и L94. Предпочтительные повышающие активность аминокислотные остатки заменяют аминокислотные остатки, локализованные в положениях, выбранных из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96. Более предпочтительные повышающие активность аминокислотные остатки заменяют аминокислотные остатки, локализованные в положениях H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. В частности, предпочтительные повышающие активность аминокислотные остатки заменяют аминокислотные остатки, локализованные в положениях, выбранных из группы, состоящей из L50 и L94.
off
В целом способ согласно изобретению включает отбор особо предпочтительных для селективного мутагенеза положений, положений, где осуществляется контакт, и/или положений гипермутирования в области CDR тяжелой или легкой цепи представляющего интерес родительского антитела или его антиген-связывающей части, осуществление случайного мутагенеза в этих индивидуальных положениях (например, генетическими методами с использованием мутагенного олигонуклеотида, с получением "мини-библиотеки" модифицированных антител) или осуществление мутагенеза в положении представляющих особый интерес аминокислот, с идентификацией экспрессиии повышающих активность аминокислотных остатков, и очистку модифицированных антител (например, в хозяйской системе, отличной от фагового дисплея), измерение активности модифицированных антител в отношении антигена (например, путем измерения скоростей k, используя BIAcore-анализ), повторение, в случае необходимости, этих стадий для других положений CDR и комбинирование индивидуальных мутаций, приведших к улучшению активности, и проверку того, действительно ли комбинация (комбинации) дает в результате антитело с еще большей активностью (например, аффинностью или нейтрализующей способностью), чем родительское антитело или его антиген-связывающая часть.
Соответственно, в одном из вариантов осуществления изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение родительского антитела или его антиген-связывающей части;
b) отбор, в следующем порядке, 1) положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, 2) положения, где осуществляется контакт, или 3) положения гипермутирования в пределах определяющей комплементарность области (CDR), для осуществления мутации, идентифицируя таким образом выбранные предпочтительные для селективного мутагенеза положения, положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования;
c) осуществление индивидуальных мутаций в этих выбранных положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, для осуществления контакта или для гипермутирования, [с заменой их] по меньшей мере на два других аминокислотных остатка, с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью;
e) необязательно повторение стадий от a) до d) по меньшей мере для одного другого положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, для осуществления контакта или для гипермутирования;
f) комбинирование в родительском антителе или его антиген-связывающей части индивидуальных мутаций, приводящих к подтвержденной улучшенной активности, с образованием комбинированных антител или их антиген-связывающих частей; и
g) оценку активности комбинированных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью; до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью. Предпочтительно, чтобы отобранное антитело или антитела имели улучшенную активность, но без потери или с сохранением по меньшей мере одной желательной характеристики или свойства родительского антитела, как указано выше. Желательная характеристика или свойство могут быть измерены или обнаружены специалистами в данной области с помощью общеизвестных в данной области технологий.
Предпочтительные положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96. Предпочтительные положения для гипермутирования выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 и L93. Более предпочтительные положения для селективного мутагенеза выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 и L94. Особо предпочтительные положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из L50 и L94.
В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение родительского антитела или его антиген-связывающей части;
b) отбор положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования в пределах определяющей комплементарность области (CDR), для осуществления мутации;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанных отобранных положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, для осуществления контакта или для гипермутирования, по меньшей мере на два других аминокислотных остатка, с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) необязательно повторение стадий от a) до d) по меньшей мере для одного другого положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, для осуществления контакта или для гипермутирования;
f) комбинирование в родительском антителе или его антиген-связывающей части двух индивидуальных повышающих активность аминокислотных остатков, приводящих к подтвержденной улучшенной активности, с образованием комбинированных антител или их антиген-связывающих частей; и
g) оценку активности комбинированных антител или их антиген-связывающих частей с двумя повышающими активность аминокислотными остатками по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью; до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
Предпочтительные положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96. Предпочтительные положения для гипермутирования выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 и L93. Более предпочтительные положения для селективного мутагенеза выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 и L94. Особо предпочтительные положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из L50 и L94.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение родительского антитела или его антиген-связывающей части;
b) отбор положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования в пределах определяющей комплементарность области (CDR), для осуществления мутации;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанных отобранных положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, для осуществления контакта или для гипермутирования, [с заменой их] по меньшей мере на два других аминокислотных остатка, с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) необязательно повторение стадий от a) до d) по меньшей мере для одного другого положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, для осуществления контакта или для гипермутирования;
f) комбинирование в родительском антителе или его антиген-связывающей части трех индивидуальных повышающих активность аминокислотных остатков, приводящих к подтвержденной улучшенной активности, с образованием комбинированных антител или их антиген-связывающих частей; и
g) оценку активности комбинированных антител или их антиген-связывающих частей с двумя повышающими активность аминокислотными остатками по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью; до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
Предпочтительно, чтобы повышающий активность аминокислотный остаток заменял аминокислотные остатки, локализованные в положениях, выбранных из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96.
После мутагенеза остатков в индивидуально выбранных положениях мутантные клоны можно секвенировать с целью идентификации того, какие именно остатки были встроены в выбранных положениях в каждом из клонов. Для секвенирования может быть выбрано малое количество клонов (например, приблизительно 24), из которых выход, согласно статистике, должен составить 10-15 уникальных антител, тогда как большее количество клонов (например, более чем 60) может быть секвенировано для того, чтобы убедиться, что идентифицированы антитела с каждой из возможных замен в выбранных положениях.
В одном из вариантов осуществления для мутагенеза в первую очередь выбирают положения, где осуществляется контакт, и/или положения гипермутирования в пределах CDR3 областей тяжелой и/или легкой цепей. Однако для антител с уже созревшей аффинностью in vitro путем случайного мутагенеза CDR3 областей в результате селекции фагового дисплея может оказаться предпочтительным выбрать в первую очередь положения, где осуществляется контакт, и/или положения гипермутирования внутри областей CDR1 или CDR2 тяжелой и/или легкой цепей.
В более предпочтительном варианте осуществления для мутагенеза в первую очередь выбирают положения, предпочтительные для селективного мутагенеза, в пределах CDR3-областей тяжелой и/или легкой цепей. Однако для антител с уже созревшей аффинностью in vitro путем случайного мутагенеза CDR3-областей в результате селекции фагового дисплея может оказаться предпочтительным в первую очередь выбрать положения, предпочтительные для селективного мутагенеза, внутри областей CDR1 или CDR2 тяжелой и/или легкой цепей.
В другом предпочтительном варианте осуществления оптимизацию антитела, отобранного по принципу селективного мутагенеза, производят последовательно следующим образом: предпочтительные для селективного мутагенеза положения, выбранные из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94, сначала подвергают мутации, заменяя каждое из них по меньшей мере 2 другими аминокислотами (предпочтительно 5-14 другими аминокислотами), и полученные в результате антитела охарактеризовывают в отношении их повышенной аффинности, нейтрализующей способности (а возможно также и в отношении сохранения ими по меньшей мере одной другой характеристики или свойства, обсуждаемых выше). Если мутация в единственном положении, предпочтительном для селективного мутагенеза, совсем не повышает аффинность или нейтрализующую способность или не повышает ее существенно, и если даже комбинация множества повышающих активность аминокислот, заменяющих аминокислоты в положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, не приводит к образованию антитела, обладающего целевой активностью (включая аффинность и/или нейтрализующую способность), для селективного мутагенеза должны быть выбраны дополнительные аминокислотные остатки из группы, состоящей из H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A и L96, каждый из которых заменяют по меньшей мере 2 другими аминокислотами (предпочтительно 5-14 другими аминокислотами), и полученные в результате антитела охарактеризовывают в отношении их повышенной аффинности, нейтрализующей способности (а возможно также и в отношении сохранения ими по меньшей мере одной другой характеристики или свойства, обсуждаемых выше).
Если мутация в единственном положении, выбранном из группы, состоящей из H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A и L96, совсем не повышает активность (включая аффинность и/или нейтрализующую способность) или не повышает ее существенно, и если даже комбинация множества повышающих активность аминокислот, заменяющих аминокислоты в тех положениях, которые не приводят к образованию антитела, обладающего целевой активностью (включая аффинность и/или нейтрализующую способность), для селективного мутагенеза должны быть выбраны дополнительные аминокислотные остатки из группы, состоящей из H33B, H52B, L31A, каждый из которых заменяют по меньшей мере 2 другими аминокислотами (предпочтительно 5-14 другими аминокислотами), и полученные в результате антитела охарактеризовывают в отношении их повышенной аффинности, нейтрализующей способности (а возможно также и в отношении сохранения ими по меньшей мере одной другой характеристики или свойства, обсуждаемых выше).
Следует учесть, что способ последовательного селективного мутагенеза может завершиться на любой из указанных выше стадий, как только будет идентифицировано антитело с требуемой активностью (включая аффинность и/или нейтрализующую способность). Если мутагенез в предварительно выбранных положениях даст возможность идентифицировать повышающие активность аминокислотные остатки, но комбинированное антитело все еще не будет обладать набором целевых активностей (включая аффинность и/или нейтрализующую способность), и/или если идентифицированные повышающие активность аминокислотные остатки воздействуют также и на другие желательные характеристики антитела и, следовательно, являются неприемлемыми, мутагенезу могут быть подвергнуты остальные остатки в CDR (см. раздел IV).
Способ согласно изобретению может быть использован для улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части для достижения предварительно намеченной целевой активности (например, аффинности и/или нейтрализующей способности, и/или желательного свойства или характеристики).
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части для достижения предварительно намеченной целевой активности, включающий
a) получение родительского антитела или его антиген-связывающей части;
b) отбор положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, выбранного из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанных выбранных положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, [с заменой их] по меньшей мере на два других аминокислотных остатка, с созданием, таким образом, первой панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей;
d) оценку активности первой панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей с целью определения того, продуцирует ли мутация в единственном положении, предпочтительном для селективного мутагенеза, антитело или его антиген-связывающую часть с предварительно намеченной целевой активностью или частичной целевой активностью;
e) пошаговое комбинирование в родительском антителе или его антиген-связывающей части индивидуальных мутаций, приводящих к подтвержденной улучшенной активности, с образованием комбинированных антител или их антиген-связывающих частей;
f) оценку активности комбинированных антител или их антиген-связывающих частей с целью определения того, обладают ли комбинированные антитела или их антиген-связывающие части предварительно намеченной целевой активностью или частичной целевой активностью;
g) если стадии d) или f) не приводят к образованию антитела или его антиген-связывающей части, обладающих предварительно намеченной целевой активностью, или приводят к образованию антитела или его антиген-связывающей части, обладающих лишь частичной целевой активностью, мутагенезу подвергают дополнительные аминокислотные остатки, выбранные из группы, состоящей из H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A и L96, которые заменяют по меньшей мере 2 другими аминокислотами, с созданием второй панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей;
h) оценку активности второй панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей с целью определения того, приводит ли мутация в единственном положении аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A и L96, к образованию антитела или его антиген-связывающей части, имеющих предварительно намеченную целевую активность или частичную целевую активность;
i) пошаговое комбинирование в родительском антителе или его антиген-связывающей части индивидуальных мутаций со стадии g), приводящих к подтвержденной улучшенной активности, с образованием комбинации антител или их антиген-связывающих частей;
j) оценку активности комбинации антител или их антиген-связывающих частей с целью определения того, обладает ли комбинация антител или их антиген-связывающих частей предварительно намеченной целевой активностью или частичной целевой активностью;
k) если стадии h) или j) не приводят к образованию антитела или его антиген-связывающей части, обладающих предварительно намеченной целевой активностью, или приводят к образованию антитела или его антиген-связывающей части, обладающих лишь частичной целевой активностью, мутагенезу подвергают дополнительные аминокислотные остатки, выбранные из группы, состоящей из H33B, H52B и L31A, которые заменяют по меньшей мере 2 другими аминокислотами, с созданием третьей панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей;
l) оценку активности третьей панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей с целью определения того, приводит ли мутация в единственном положении аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из H33B, H52B и L31A, к образованию антитела или его антиген-связывающей части, имеющих предварительно намеченную целевую активность или частичную целевую активность;
m) пошаговое комбинирование в родительском антителе или его антиген-связывающей части индивидуальных мутаций со стадии k), приводящих к подтвержденной улучшенной активности, с образованием комбинации антител или их антиген-связывающих частей;
n) оценку активности комбинации антител или их антиген-связывающих частей с целью определения того, обладает ли комбинация антител или их антиген-связывающих частей предварительно намеченной целевой активностью, с продуцированием, таким образом, антитела или его антиген-связывающей части с предварительно намеченной целевой активностью.
Можно использовать целый ряд способов мутагенеза, включая ПЦР-сборку, олигонуклеотид-направленный мутагенез по Кункелю (dut-ung-) и с использованием тиофосфата (Amersham Sculptor kit).
Можно использовать широкий спектр хозяйских экспрессирующих систем для экспрессии мутантных антител, включая бактериальные, дрожжевые, бакуловирусные экспрессирующие системы и системы млекопитающих (а также экспрессирующие системы фагового дисплея). Примером подходящего бактериального экспрессирующего вектора является pUC119(Sfi). Другие системы экспрессии антител хорошо известны в данной области и/или описаны ниже в разделе IV.
Модифицированные антитела или их антиген-связывающие части, продуцируемые способом согласно изобретению, могут быть идентифицированы без использования селектируемых методов фагового дисплея. Соответственно, способ согласно изобретению является особенно успешным для улучшения активности рекомбинантного родительского антитела или его антиген-связывающей части, которое было получено путем селекции в системе фагового дисплея, но активность которого нельзя более улучшить посредством мутагенеза в системе фагового дисплея.
Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения аффинности антитела или его антиген-связывающей части, включающй
a) получение рекомбинантного родительского антитела или его антиген-связывающей части, которое было получено путем селекции в системе фагового дисплея, но активность которого нельзя более улучшить посредством мутагенеза в системе фагового дисплея;
b) отбор положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования в пределах определяющей комплементарность области (CDR), для осуществления мутации, с идентификацией, таким образом, положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанных отобранных положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, для осуществления контакта или для гипермутирования, по меньшей мере на два других аминокислотных остатка, с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей, и экспрессирование указанной панели в системе нефагового дисплея;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью;
e) необязательно повторение стадий от b) до d) по меньшей мере для еще одного другого положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, для осуществления контакта или для гипермутирования;
f) комбинирование в родительском антителе или его антиген-связывающей части индивидуальных мутаций, приводящих к подтвержденной улучшенной активности, с образованием комбинированных антител или их антиген-связывающих частей; и
g) оценку активности комбинированных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью; до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
Предпочтительные положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96. Предпочтительные для гипермутирования положения выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 и L93. Более предпочтительные для селективного мутагенеза положения выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 и L94. Особенно предпочтительные положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из L50 и L94.
Как обсуждалось выше, с помощью доступных в настоящее время способов невозможно или исключительно трудно получить антитело с повышенной аффинностью связывания и нейтрализующей способностью, которое при этом сохраняло бы другие свойства. Однако способом согласно изобретению такие антитела можно с легкостью идентифицировать. Антитела, к которым применяется способ согласно изобретению, могут происходить из любого источника.
Следовательно, в другом варианте осуществления изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение рекомбинантного родительского антитела или его антиген-связывающей части;
b) отбор положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования в пределах определяющей комплементарность области (CDR), для осуществления мутации, с идентификацией, таким образом, отобранного положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанных выбранных положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, положениях, где осуществляется контакт, или положениях гипермутирования, по меньшей мере на два других аминокислотных остатка, с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей, и экспрессирование указанной панели в соответствующей экспрессирующей системе;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) оценку панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, в отношении по меньшей мере еще одного другого свойства или характеристики, где указанное свойство или характеристика является одним из таковых, которые должны быть сохранены у указанного антитела;
до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью и по меньшей мере с одним сохраненным свойством или характеристикой по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
В предпочтительном варианте осуществления положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96, а другая характеристика выбрана из группы, состоящей из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В другом предпочтительном варианте осуществления положения гипермутации выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 и L93, а другая характеристика выбрана из группы, состоящей из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В более предпочтительном варианте осуществления положения для селективного мутагенеза выбраны из предпочтительных для селективного мутагенеза положений, выбранных из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94, а другая характеристика выбрана из группы, состоящей из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В более предпочтительном варианте осуществления положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из L50 и L94, а другая характеристика выбрана из группы, состоящей из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
Следовательно, если необходимо улучшить аффинность антитела в отношении специфического антигена, а метод фагового дисплея (или родственной системы, включая рибосомный дисплей) более неприменим, но при этом нужно сохранить другие желательные свойства или характеристики антитела, можно использовать способ согласно изобретению. Соответственно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение рекомбинантного родительского антитела или его антиген-связывающей части, которое было получено путем селекции в системе фагового дисплея, но активность которого не удается более улучшить путем мутагенеза в указанной системе фагового дисплея;
b) отбор положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования в пределах определяющей комплементарность области (CDR), для осуществления мутации, с идентификацией, таким образом, выбранного положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанных выбранных положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, положениях, где осуществляется контакт, или положениях гипермутирования, [с заменой их] по меньшей мере на два других аминокислотных остатка, с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей, и экспрессирование указанной панели в системе нефагового дисплея;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) оценку панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, в отношении по меньшей мере еще одного другого свойства или характеристики, где указанное свойство или характеристика является одним из таковых, которые должны быть сохранены у указанного антитела, до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью и по меньшей мере с одним сохраненным свойством или характеристикой по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью;
f) необязательно повторение стадий от a) до e) по меньшей мере для одного другого положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, для осуществления контакта или для гипермутирования;
g) комбинирование в родительском антителе или его антиген-связывающей части по меньшей мере двух индивидуальных повышающих активность аминокислотных остатков, которое приводит к подтвержденной улучшенной активности и к сохранению по меньшей мере одного свойства или характеристики, с образованием комбинированных антител или их антиген-связывающих частей; и
h) оценку активности комбинированных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью; до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью и сохраненным по меньшей мере одним свойством или характеристикой по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
В предпочтительном варианте осуществления положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96, а другая характеристика выбрана из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно, в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В другом предпочтительном варианте осуществления положения гипермутирования выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 и L93, а другая характеристика выбрана из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В более предпочтительном варианте осуществления остатки для селективного мутагенеза выбраны из положений, предпочтительных для селективного мутагенеза, из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94, а другая характеристика выбрана из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из L50 и L94, а другая характеристика выбрана из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение рекомбинантного родительского антитела или его антиген-связывающей части, которое было получено путем селекции в системе фагового дисплея, но активность которого не удается далее улучшить путем мутагенеза в указанной системе фагового дисплея;
b) отбор положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования в пределах определяющей комплементарность области (CDR), для осуществления мутации, с идентификацией, таким образом, отобранного положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанных выбранных положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, положениях, где осуществляется контакт, или положениях гипермутирования, [с заменой их] по меньшей мере на два других аминокислотных остатка, с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей, и экспрессирование указанной панели в системе нефагового дисплея;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) оценку панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, в отношении по меньшей мере еще одного другого свойства или характеристики, где указанное свойство или характеристика является одним из таковых, которые должны быть сохранены у указанного антитела, до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью и по меньшей мере с одним сохраненным свойством или характеристикой по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
В предпочтительном варианте осуществления положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96, а другая характеристика выбрана из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В другом предпочтительном варианте осуществления положения гипермутирования выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 и L93, а другая характеристика выбрана из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или 3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В более предпочтительном варианте осуществления остатки для селективного мутагенеза выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94, а другая характеристика выбрана из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или 3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В более предпочтительном варианте осуществления положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из L50 и L94, а другая характеристика выбрана из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение рекомбинантного родительского антитела или его антиген-связывающей части, которое было получено путем селекции в системе фагового дисплея, но активность которого не удается далее улучшить путем мутагенеза в указанной системе фагового дисплея;
b) отбор положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования в пределах определяющей комплементарность области (CDR), для осуществления мутации, с идентификацией, таким образом, отобранного положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанных выбранных положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, положениях, где осуществляется контакт, или положениях гипермутирования, по меньшей мере на два других аминокислотных остатка, с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей, и экспрессирование указанной панели в системе нефагового дисплея;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) оценку панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, в отношении по меньшей мере еще одного другого свойства или характеристики, где указанное свойство или характеристика является одним из таковых, которые должны быть сохранены у указанного антитела, до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью и по меньшей мере с одной сохраненной характеристикой по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью;
f) необязательно повторение стадий от a) до e) по меньшей мере для одного другого положения, предпочтительного для селективного мутагенеза, для осуществления контакта или для гипермутирования;
g) комбинирование в родительском антителе или его антиген-связывающей части по меньшей мере двух индивидуальных повышающих активность аминокислотных остатков, которое приводит к подтвержденной улучшенной активности и к сохранению по меньшей мере одного свойства или характеристики, с образованием комбинированных антител или их антиген-связывающих частей; и
h) оценку активности комбинированных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью; до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью и сохраненным по меньшей мере одним свойством или характеристикой по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
В предпочтительном варианте осуществления положения, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96, а другая характеристика выбрана из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В другом предпочтительном варианте осуществления положения гипермутирования выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 и L93, а другая характеристика выбрана из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В более предпочтительном варианте осуществления остатки для селективного мутагенеза выбраны из группы, состоящей из H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94, а другая характеристика выбрана из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
В более предпочтительном варианте осуществления остатки, где осуществляется контакт, выбраны из группы, состоящей из L50 и L94, а другая характеристика выбрана из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
IV. Модификации других остатков CDR
В конечном счете, все остатки CDR в рассматриваемой паре антиген-антитело тем или иным способом идентифицировали как необходимые в качестве повышающих активность остатков и/или прямо или косвенно необходимые для связывания с антигеном и/или для сохранения желательных свойств или характеристик антитела. Такие остатки CDR называются "предпочтительными для осуществления селективного мутагенеза положениями". Следует отметить, что в особых обстоятельствах эти предпочтительные для осуществления селективного мутагенеза положения могут быть идентифицированы также и другими способами, включая совместную кристаллизацию антитела с антигеном и молекулярное моделирование.
Если основные усилия для идентификации повышающего активность аминокислотного остатка сосредоточить на положениях, предпочтительных для осуществления селективного мутагенеза, тогда описанные выше положения, где осуществляется контакт, или положения гипермутирования окажутся излишними, или же в случае, если требуется дальнейшее улучшение, остальные остатки CDR могут быть модифицированы, как описано выше. Следует понимать, что антитело может быть уже модифицировано в любом каком-нибудь одном или более положениях, где осуществляется контакт, или положениях гипермутирования, в соответствии с описанными выше вариантами осуществления, но при этом могут быть нужны дальнейшие его усовершенствования. Следовательно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение родительского антитела или его антиген-связывающей части;
b) выбор аминокислотного остатка в пределах определяющей комплементарность области (CDR) для осуществления мутации, отличной от H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанном выбранном положении, например, [с заменой его] по меньшей мере на два других аминокислотных остатка, с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей;
d) оценку активности мутантного антитела или панели мутантных антител, или их антиген-связывающих частей, по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) оценку мутантного антитела или панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, в отношении изменения по меньшей мере еще одного другого свойства или характеристики, до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
Предпочтительно, чтобы указанная другая характеристика или свойство были выбраны из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
Если мутагенеза одного-единственного остатка недостаточно, могут быть включены и другие остатки; следовательно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение родительского антитела или его антиген-связывающей части;
b) выбор аминокислотного остатка в пределах определяющей комплементарность области (CDR) для осуществления мутации, отличной от H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанном выбранном положении, например, [с заменой его] по меньшей мере на два других аминокислотных остатка, с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) повторение стадий от b) до d) по меньшей мере для одного другого положения в CDR, которое не является ни положением, выбранным из b), ни положением H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
f) комбинирование в родительском антителе или его антиген-связывающей части по меньшей мере двух индивидуальных повышающих активность аминокислотных остатков, которое приводит к подтвержденной улучшенной активности, с образованием комбинированных антител или их антиген-связывающих частей; и
g) оценку активности комбинированных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью; до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
Если преимущественные попытки идентифицировать повышающие активность аминокислотные остатки, сосредоточенные на положениях, где осуществляется контакт, или положениях гипермутирования, исчерпаны, или же если требуется дополнительное улучшение, а представляющее интерес антитело более невозможно оптимизировать путем мутагенеза и способами фагового дисплея (или сходного с ним рибосомного дисплея), остальные остатки CDR могут быть модифицированы, как описано выше. Следует иметь в виду, что антитело могло уже быть модифицировано в каком-нибудь одном или нескольких положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, положениях, где осуществляется контакт, или положениях гипермутирования, согласно вариантам осуществления, указанным выше, но при этом могут быть необходимы дальнейшие его усовершенствования.
Следовательно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение рекомбинантного родительского антитела или его антиген-связывающей части, которое было получено путем селекции в системе фагового дисплея, но активность которого не удается далее улучшить путем мутагенеза в указанной системе фагового дисплея;
b) выбор селективного аминокислотного остатка в пределах определяющей комплементарность области (CDR) для осуществления мутации, отличной от H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанных отобранных положениях, где осуществляется контакт, или положениях гипермутирования, по меньшей мере на два других аминокислотных остатка, с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей, и экспрессирование указанной панели в системе нефагового дисплея;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) оценку указанной панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, в отношении изменений по меньшей мере еще одного другого свойства или характеристики, до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью и по меньшей мере с одним сохраненным свойством или характеристикой по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
Предпочтительно, чтобы указанная другая характеристика или свойство были выбраны из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
Если мутагенеза единственного остатка недостаточно для повышения аффинности антитела, в мутагенез могут быть вовлечены и другие остатки. Следовательно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение родительского антитела или его антиген-связывающей части, которое было получено путем селекции в системе фагового дисплея, но активность которого не удается далее улучшить путем мутагенеза в указанной системе фагового дисплея;
b) выбор аминокислотного остатка в пределах определяющей комплементарность области (CDR) для осуществления мутации, отличной от H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанном выбранном положении по меньшей мере на два других аминокислотных остатка с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей и экспрессией в системе нефагового дисплея;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) повторение стадий от b) до d) по меньшей мере для одного другого положения в CDR, которое не является ни положением согласно b), ни положением H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94;
g) комбинирование в родительском антителе или его антиген-связывающей части по меньшей мере двух индивидуальных повышающих активность аминокислотных остатков, которое приводит к подтвержденной улучшенной активности, с образованием комбинированных антител или их антиген-связывающих частей; и
h) оценку активности или другого свойства или характеристики комбинированных антител или их антиген-связывающих частей по меньшей мере с двумя повышающими активность аминокислотными остатками, по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью; до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
Предпочтительно, чтобы указанная другая характеристика или свойство были выбраны из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
Преимущественные попытки идентифицировать повышающие активность аминокислотные остатки, сосредоточенные на описанных выше положениях, предпочтительных для селективного мутагенеза, положениях, где осуществляется контакт, или положениях гипермутирования, могут быть исчерпаны, или же могут потребоваться дополнительные улучшения, и при этом важно сохранить другие свойства или характеристики антитела.
Следовательно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части без изменения других его характеристик, включающий
a) получение родительского антитела или его антиген-связывающей части;
b) выбор аминокислотного остатка в пределах определяющей комплементарность области (CDR) для осуществления мутации, отличной от H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанном выбранном положении [с заменой его] по меньшей мере на два других аминокислотных остатка с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) оценку панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью на предмет изменений какого-нибудь одного другого его свойства или характеристики до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью и сохраненным другим свойством или характеристикой, по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
Предпочтительно, чтобы указанная другая характеристика или свойство были выбраны из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
Если мутагенеза единственного остатка недостаточно, могут быть вовлечены и другие остатки; следовательно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение родительского антитела или его антиген-связывающей части;
b) выбор аминокислотного остатка в пределах определяющей комплементарность области (CDR) для осуществления мутации, отличной от H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанном выбранном положении по меньшей мере на два других аминокислотных остатка, с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) оценку панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью на предмет изменений какого-нибудь одного другого свойства или характеристики;
e) повторение стадий от b) до e) по меньшей мере для одного другого положения в CDR, которое не является ни положением согласно b), ни положением H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
f) комбинирование в родительском антителе или его антиген-связывающей части по меньшей мере двух индивидуальных повышающих активность аминокислотных остатков, которое приводит к подтвержденной улучшенной активности и не влияет по меньшей мере на какое-нибудь одно другое свойство или характеристику, с образованием комбинированных антител или их антиген-связывающих частей; и
g) оценку активности и сохранения по меньшей мере какого-нибудь одного другого свойства или характеристики комбинированных антител или их антиген-связывающих частей с двумя повышающими активность аминокислотными остатками, по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью; до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью и по меньшей мере каким-нибудь одним другим свойством или характеристикой по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
Мутагенез в положении, предпочтительном для селективного мутагенеза, в положении остатков, где осуществляется контакт, или остатков гипермутирования может не давать достаточно удовлетворительного повышения аффинности антитела, а возможности способа мутагенеза и фагового дисплея (или сходного с ним метода рибосомного дисплея) могут быть уже исчерпаны, но при этом будет необходимость сохранения по меньшей мере одной другой характеристики или свойства антитела.
Следовательно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения аффинности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение родительского антитела или его антиген-связывающей части, которое было получено путем селекции в системе фагового дисплея, но активность которого не удается далее улучшить путем мутагенеза в указанной системе фагового дисплея;
b) выбор аминокислотного остатка в пределах определяющей комплементарность области (CDR) для осуществления мутации, отличной от H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанном выбранном положении по меньшей мере на два других аминокислотных остатка с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей и экспрессией в системе нефагового дисплея;
d) оценку активности панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) оценку панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью в отношении изменений по меньшей мере одного другого свойства или характеристики до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
Предпочтительно, чтобы указанная другая характеристика или свойство были выбраны из 1) сохранения отсутствия перекрестной реактивности с другими белками или тканями человека, 2) сохранения способности распознавания эпитопа, т.е. распознавания эпитопа p40, предпочтительно в контексте гетеродимера p70 p40/p35, предотвращая помехи для связывания со свободным растворимым p40, и/или (3) получения антитела с последовательностью, наиболее близкой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии.
Если мутагенеза единственного остатка недостаточно, могут быть вовлечены и другие остатки; следовательно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения активности антитела или его антиген-связывающей части, включающий
a) получение родительского антитела или его антиген-связывающей части, которое было получено путем селекции в системе фагового дисплея, но активность которого не удается далее улучшить путем мутагенеза в указанной системе фагового дисплея;
b) выбор аминокислотного остатка в пределах определяющей комплементарность области (CDR) для осуществления мутации, отличной от H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
c) осуществление индивидуальных мутаций в указанном выбранном положении по меньшей мере на два других аминокислотных остатка с созданием, таким образом, панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей и экспрессией в системе нефагового дисплея;
d) оценку активности и сохранения по меньшей мере какого-нибудь одного другого свойства или характеристики панели мутантных антител или их антиген-связывающих частей по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, с идентификацией, таким образом, повышающего активность аминокислотного остатка;
e) повторение стадий от b) до d) по меньшей мере для одного другого положения в CDR, которое не является ни положением согласно b), ни положением H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 и L96;
f) комбинирование в родительском антителе или его антиген-связывающей части по меньшей мере двух индивидуальных повышающих активность аминокислотных остатков, которое приводит к подтвержденной улучшенной активности и не влияет по меньшей мере на одно другое свойство или характеристику, с образованием комбинированных антител или их антиген-связывающих частей; и
g) оценку активности или сохранения по меньшей мере какого-нибудь одного другого свойства или характеристики комбинированных антител или их антиген-связывающих частей по меньшей мере с двумя повышающими активность аминокислотными остатками, по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью, до тех пор, пока не будет получено антитело или его антиген-связывающая часть с улучшенной активностью и по меньшей мере с одной другой характеристикой или свойством по сравнению с родительским антителом или его антиген-связывающей частью.
V. Экспрессия антител
Антитело или часть антитела согласно изобретению могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяина трансфицировали одним или более рекомбинантными экспрессирующими векторами, несущими фрагменты ДНК, кодирующие иммуноглобулиновые легкую и тяжелую цепи антитела, таким образом, чтобы легкая и тяжелая цепи экспрессировались в клетке-хозяине и чтобы они предпочтительно секретировались в среду, в которой культивируются клетки-хозяева и из которой могут быть получены антитела. Для получения генов тяжелой и легкой цепей используются стандартные методологии рекомбинантной ДНК, полученные гены встраивают в рекомбинантные экспрессирующие векторы, и эти векторы вводят в клетки-хозяева, так, как это описано в публикациях Sambrook, Fritsch и Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) и в патенте США No. 4816397, Boss et al.
Для получения фрагмента ДНК, кодирующего вариабельную область легкой и тяжелой цепей антитела Joe 9 wt или родственного ему Joe 9 wt, антитела, специфичные в отношении человеческого IL-12, из человеческих библиотек подвергали скринингу и мутациям, как описано в разделе II. Сразу же после получения фрагментов ДНК, кодирующих сегменты VH и VL антитела Joe 9 wt или родственного ему Joe 9 wt, выполняют мутагенез этих последовательностей стандартными методами, такими как ПЦР-сайт-направленный мутагенез (ПЦР-опосредованный мутагенез, при котором мутантные нуклеотиды встраивают в ПЦР-праймеры, так, чтобы продукт ПЦР содержал мутации), или же другими методами сайт-направленного мутагенеза. Затем человеческие IL-12-антитела, обладающие требуемым уровнем активности и специфичности/аффинности связывания, например J695, обрабатывали в соответствии со стандартными технологиями рекомбинантной ДНК, например, для превращения генов вариабельной области в гены полноразмерной цепи антитела, в гены Fab-фрагмента или в ген scFv. В процессе этих манипуляций VL- или VH-кодирующий фрагмент ДНК функционально связывают с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или шарнирный линкер. Под термином "функционально связанный" в данном контексте подразумевают, что два фрагмента ДНК связаны таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые этими двумя фрагментами ДНК, остаются в рамке считывания.
Изолированная ДНК, кодирующая область VH, может быть превращена в ген полноразмерной тяжелой цепи антитела путем функционального связывания VH-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CH1, CH2 и CH3). Последовательности генов человеческой константной области тяжелой цепи хорошо известны в данной области (см., например, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health и Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены путем стандартной ПЦР-амплификации. Константной областью тяжелой цепи может быть константная область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD и любой их аллотипический вариант, как описано у Kabat (Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health и Human Services, NIH Publication No. 91-3242), но наиболее предпочтительной является константная область IgG1 или IgG4. В случае гена Fab-фрагмента тяжелой цепи VH-кодирующая ДНК может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область CH1 тяжелой цепи.
Изолированная ДНК, кодирующая область VL, может быть превращена в ген полноразмерной легкой цепи антитела (также как и в ген Fab легкой цепи) путем функционального связывания VL-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, CL. Последовательности генов человеческой константной области легкой цепи хорошо известны в данной области (см., например, Kabat, E.A., et al. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health и Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены путем стандартной ПЦР-амплификации. Константной областью легкой цепи может быть константная область каппа или лямбда, причем наиболее предпочтительной является константная область лямбда.
3
Для создания scFv-гена VH- и VL-кодирующие фрагменты ДНК функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим шарнирный линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4-Ser), так, чтобы последовательности VH и VL могли быть экспрессированы в виде непрерывного одноцепочечного белка с VH- и VL-областями, соединенными шарнирным линкером (см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554).
Для получения антитела или частей антитела согласно изобретению молекулы ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкую и тяжелую цепи, полученные, как описано выше, встраивают в экспрессирующие векторы, так, чтобы эти гены были функционально связаны с последовательностями, контролирующими транскрипцию и трансляцию. В этом контексте под термином "функционально связанный" подразумевается то, что ген антитела лигирован в вектор так, чтобы последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию внутри вектора, выполняли предназначенную для них функцию регуляции транскрипции и трансляции указанного гена антитела. Последовательности экспрессирующего вектора и последовательности, осуществляющие регуляцию экспрессии, выбраны таким образом, чтобы они были совместимы с экспрессией в клетке-хозяине. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть встроены в раздельные векторы или, чаще всего, оба гена встроены в один и тот же экспрессирующий вектор. Гены антитела встраивают в экспрессирующий вектор согласно стандартным методикам (например, лигирование комплементарных рестрикционных сайтов фрагмента гена антитела и вектора или лигирование тупых концов, если рестрикционные сайты отсутствуют). Экспрессирующий вектор может содержать последовательности константной области антитела еще до встраивания последовательностей тяжелой или легкой цепи антитела J695 или родственного ему антитела. Например, одним из подходов для превращения VH- и VL-последовательностей антитела J695 или родственного ему антитела в полноразмерные гены антитела является встраивание их в экспрессирующие векторы, уже кодирующие, соответственно, константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи, так, чтобы VH-сегмент был функционально связан с CH-сегментом(сегментами) внутри вектора, а VL-сегмент был функционально связан с CL-сегментом внутри этого вектора. Помимо этого или же альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор, так, чтобы сигнальный пептид был связан внутри рамки считывания с амино-концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть иммуноглобулиновым сигнальным пептидом или гетерологичным сигнальным пептидом (т.е. сигнальным пептидом из неиммуноглобулинового белка).
Помимо генов цепи антитела, рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно изобретению несут регуляторные последовательности, которые осуществляют контроль экспрессии генов цепи антитела в клетке-хозяине. Подразумевается, что термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие регулирующие экспрессию элементы (например, сигналы полиаденилирования), которые осуществляют контроль транскрипции и трансляции генов антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, у Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Специалистам в данной области должно быть понятно, что конструирование экспрессирующего вектора, включающее селекцию регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, необходимый уровень экспрессии белка и т.д. Предпочтительные для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих регуляторные последовательности включают вирусные элементы, которые направляют высокий уровень белковой экспрессии в клетках млекопитающего, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV) (такой как промотор/энхансер CMV), вируса обезьяны 40 (SV40) (такой как промотор/энхансер SV40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и полиомы. Для дальнейшего ознакомления с вирусными регуляторными элементами и их последовательностями см., например, патент США No. 5168062, Stinski, патент США No. 4510245, Bell et al., и патент США No. 4968615, Schaffner et al., патент США No. 5464758, Bujard et al., и патент США No. 5654168, Bujard et al.
-
Помимо генов цепи антитела и регуляторных последовательностей, рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетке-хозяине (например, ориджин репликации), и гены селектируемых маркеров. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые встроен вектор (см., например, патенты США No. 4399216, 4634665 и 5179017, авторами всех из которых являются Axel et al.). Например, обычно ген селектируемого маркера придает резистентность к лекарственным средствам, таким как G418, гидромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую встроен указанный вектор. Предпочтительные гены селектируемого маркера включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в клетках-хозяевах dhfr с амплификацией/селекцией с помощью метотрексата) и ген neo (для селекции G418).
-
Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессирующий вектор (векторы), кодирующий тяжелую и легкую цепи, с использованием стандартной технологии трансфицировали в клетку-хозяина. Различные формы термина "трансфекция" предназначены для того, чтобы охватить множество разнообразных технологий, используемых обычно для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например электропорацию, кальций-фосфатную преципитацию, DEAE-декстрановую трансфекцию и т.п. Хотя антитела согласно изобретению теоретически можно экспрессировать либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках-хозяевах, однако экспрессия антител в эукариотических клетках, наиболее предпочтительно в клетках-хозяевах млекопитающего, является самой предпочтительной, поскольку в таких эукариотических клетках, в частности в клетках млекопитающего, сборка и секреция иммунологически активного антитела, имеющего правильную пространственную упаковку, более вероятна, чем в прокариотических клетках. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающего для экспрессии рекомбинантных антител согласно изобретению включают клетки яичника китайского хомячка (клетки CHO) (включая клетки CHO dhfr, описанные в публикации Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4220, где был использован селектируемый маркер DHFR, например, как описано у R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающего, антитела продуцируют путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для реализации экспрессии антитела в клетках-хозяевах, или более предпочтительно секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть получены из такой культуральной среды с использованием стандартных методов очистки белков.
Клетки-хозяева могут быть использованы также для продуцирования частей интактных антител, таких как Fab-фрагменты или молекулы scFv. Должно быть понятно, что те или иные вариации указанного выше способа должны считаться входящими в объем, охватываемый настоящим изобретением. Например, может потребоваться трансфицировать клетку-хозяина молекулой ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь (но не обе этих цепи) антитела согласно изобретению. Технология рекомбинантной ДНК может быть использована также для удаления некоторых или же всех молекул ДНК, кодирующих либо одну, легкую или тяжелую, цепь, либо обе этих цепи, которые не являются необходимыми для связывания с hIL-12. Молекулы, экспрессируемые на основе таких усеченных молекул ДНК, также считаются включенными в число антител, охватываемых настоящим изобретением. Кроме того, могут продуцироваться бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая и одна легкая цепи являются антителом согласно изобретению, а другая тяжелая и легкая цепи являются специфичными в отношении антигена, отличного от hIL-12, путем поперечного связывания антитела согласно изобретению со вторым антителом стандартными методами поперечного химического связывания.
-
20
В системе, предпочтительной для рекомбинантной экспрессии антитела или его антиген-связывающей части согласно изобретению, рекомбинантный экспрессирующий вектор, кодирующий как тяжелую цепь антитела, так и легкую цепь антитела, вводят в клетки CHO dhfr путем трансфекции, опосредованной фосфатом кальция. Внутри рекомбинантного экспрессирующего вектора каждый из генов - ген тяжелой цепи и ген легкой цепи антитела - функционально связан с регуляторными элементами энхансер/промотор (например, полученными из аденовирусов SV40, CMV и т.п., например, с регуляторным элементом энхансер CMV/промотор AdMLP или регуляторным элементом энхансер SV40/промотор AdMLP), чтобы управлять высокими уровнями транскрипции этих генов. Рекомбинантный экспрессирующий вектор несет также ген DHFR, который способствует селекции клеток CHO, которые были трансфицированы вектором с использованием амплификации/селекции с помощью метотрексата. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивировали, чтобы добиться экспрессии тяжелой и легкой цепей антитела, и из культуральной среды получали антитело. Для получения рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфекции клеток-хозяев, селекции трансформантов, культивирования клеток-хозяев и получения из культуральной среды антитела использовали стандартные технологии молекулярной биологии. Антитела или их антиген-связывающие части согласно изобретению могут быть экспрессированы у животного (например, у мыши), которое является трансгенным в отношении генов иммуноглобулина человека (см., например, Taylor, L.D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. : 6287-6295). Клетки растений также могут быть модифицированы с целью создания трансгенных растений, которые экспрессируют антитело или его антиген-связывающую часть согласно изобретению.
В связи со сказанным выше другой аспект настоящего изобретения относится к нуклеиновой кислоте, вектору и композициям клеток-хозяев, которые могут быть использованы для рекомбинантной экспрессии антител и частей антител согласно изобретению. В предпочтительном варианте изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют участки CDR антитела J695 или же вариабельную область полной тяжелой цепи и/или полной легкой цепи антитела J695. Соответственно, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к изолированным нуклеиновым кислотам, кодирующим такую вариабельную область тяжелой цепи антитела, которая кодирует CDR3 тяжелой цепи антитела J695, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25. Предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела, дополнительно кодировала CDR2 тяжелой цепи антитела J695, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. Более предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела, дополнительно кодировала CDR1 тяжелой цепи антитела J695, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29. Еще более предпочтительно, чтобы изолированная нуклеиновая кислота кодировала вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 (полноразмерную область VH антитела J695).
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к изолированной нуклеиновой кислоте, кодирующей такую вариабельную область легкой цепи антитела, которая кодирует CDR3 легкой цепи антитела J695, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. Предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела, дополнительно кодировала CDR2 легкой цепи антитела J695, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. Более предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела, дополнительно кодировала CDR1 легкой цепи антитела J695, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. Еще более предпочтительно, чтобы изолированная нуклеиновая кислота кодировала вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32 (полноразмерную область VL антитела J695).
Настоящее изобретение относится также к рекомбинантным экспрессирующим векторам, кодирующим обе цепи антитела, тяжелую цепь и легкую цепь. Например, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному экспрессирующему вектору, кодирующему
a) тяжелую цепь антитела, имеющую вариабельная область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; и
b) легкую цепь антитела, имеющую вариабельная область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.
Настоящее изобретение относится также к клеткам-хозяевам, в которые введены один или более рекомбинантных экспрессирующих векторов согласно изобретению. Предпочтительно, чтобы клетками-хозяевами были клетки-хозяева млекопитающих, более предпочтительно, чтобы клеткой-хозяином была клетка CHO, клетка NSO или клетка COS. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ синтезирования рекомбинантного человеческого антитела согласно изобретению путем культивирования клетки-хозяина согласно изобретению в соответствующей культуральной среде до тех пор, пока не будет синтезироваться рекомбинантное человеческое антитело согласно изобретению. Способ может дополнительно включать выделение рекомбинантного человеческого антитела из культуральной среды.
VI. Фармацевтические композиции и фармацевтическое введение
Антитела и части антител согласно изобретению могут быть введены в состав фармацевтических композиций, подходящих для введения субъекту. Обычно фармацевтическая композиция содержит антитело или часть антитела согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Здесь термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любой какой-нибудь и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие абсорбцию средства и т.п., которые являются физиологически приемлемыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или более компонентов, выбранных из воды, физиологического раствора, забуференного фосфатом физиологического раствора, декстрозы, глицерина, этанола и т.п., а также их комбинаций. Во многих случаях предпочтительным является включение в композицию изотонических средств, например сахаров, полиспиртов, таких как маннит, сорбит или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие средства или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые увеличивают срок годности или эффективность антитела или части антитела.
Антитела и части антител согласно изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения. Предпочтительно, чтобы антитело или части антитела были представлены в виде раствора для инъекций, содержащего 0,1-250 мг/мл антитела. Инъекционный раствор может быть составлен либо из жидкой, либо из лиофилизированной лекарственной форм в твердом или мягком флаконе, ампуле или предварительно наполненном шприце. Буфером может служить L-гистидин (1-50 мM), оптимально - 5-10 мM, при pH от 5,0 до 7,0 (оптимально - pH 6,0). Другие подходящие буферы включают, но не ограничиваются перечисленным, сукцинат натрия, цитрат натрия, фосфат натрия или фосфат калия. Хлорид натрия может быть использован для модификации токсичности раствора при концентрации 0-300 мM (оптимально - 150 мM для жидких лекарственных форм). Криоконсерванты, преимущественно 0-10% сахарозы (оптимально - 0,5-1,0%), могут быть включены в лиофилизированную лекарственную форму. Другие подходящие криоконсерванты включают трегалозу и лактозу. В лиофилизированную лекарственную форму могут быть включены наполнители, преимущественно 1-10% маннита (оптимально - 2-4%). Стабилизаторы могут быть использованы как в жидких, так и в лиофилизированных лекарственных формах, преимущественно 1-50 мM L-метионина (оптимально - 5-10 мM). Другие подходящие наполнители, включая глицин, аргинин, могут быть включены в виде 0-0,05% полисорбата-80 (оптимально - 0,005-0,01%). Дополнительные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются перечисленным, полисорбат-20 и поверхностно-активные вещества BRIJ.
В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает антитело в количестве приблизительно от 100 мг до 200 мг.
Композиции согласно изобретению могут быть представлены в различных формах. Последние включают, например, жидкую, полутвердую и твердую лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, инъецируемый и инфузируемый растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтение той или иной форме отдается в зависимости от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Обычно предпочтительные композиции представлены в виде инъецируемых или инфузируемых растворов, таких как композиции, сходные с теми, которые используются для пассивной иммунизации человека другими антителами. Предпочтительным является парентеральный способ введения (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В предпочтительном варианте осуществления антитело вводят путем подкожной инъекции.
Обычно терапевтические композиции должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой предписанной структуры, подходящей для высокого содержания лекарственного средства. Стерильные инъецируемые растворы могут быть получены путем включения активного соединения (т.е. антитела или части антитела) в требуемом количестве в соответствующий раствор с одним ингредиентом или сочетанием ингредиентов, перечисленных выше, в случае необходимости, с последующей стерилизацией путем пропускания через фильтр. Обычно дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие ингредиенты из таковых, перечисленных выше. В случае стерильных лиофилизированных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и сушка с распылением, в результате которых получают порошок из активного ингредиента плюс любого необходимого ингредиента из его раствора, ранее пропущенного через стерильный фильтр. Необходимую текучесть раствора можно поддерживать, например, с помощью покрытия, такого как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута путем включения в композицию средства, которое задерживает абсорбцию, например, соли моностеарата и желатин.
Антитела и части антител согласно изобретению можно вводить разными известными в данной области способами, хотя для многих терапевтических применений предпочтительным путем/способом введения являются подкожная инъекция, внутривенная инъекция или инфузия. Специалистам в данной области должен быть понятно, что путь и/или способ введения будут варьировать в зависимости от требуемых результатов. В определенных вариантах осуществления активное соединение может быть получено в сочетании с носителем, который будет препятствовать быстрому высвобождению этого соединения, так, как в композиции с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, чрескожные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биодеградируемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких композиций запатентованы или, как правило, известны специалистам в данной области. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
В определенных вариантах осуществления антитело или часть антитела согласно изобретению можно вводить пероральным путем, например, в составе с инертным разбавителем или ассимилируемым пищевым носителем. Такое соединение (а также, если требуется, и другие ингредиенты) может быть заключено также и в твердую или мягкую желатиновую капсулу, спрессовано в таблетки или непосредственно включено в диету субъекта. Для терапевтического введения пероральным путем соединения могут быть включены в состав со вспомогательными веществами и использованы в виде глотательных таблеток, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, вафель и т.п. Для введения соединения путем, отличным от парентерального введения, может оказаться необходимым покрытие соединения - или совместное введение с соединением - материала, защищающего его от инактивации.
В такие композиции могут быть включены также и дополнительные активные соединения. В определенных вариантах осуществления антитело или часть антитела согласно изобретению составляют в композицию совместно - и/или вводят совместно - с одним или более дополнительными терапевтическими средствами, которые эффективны при лечении нарушений, при которых активность IL-12 является пагубной. Например, анти-hIL-12-антитело или часть антитела согласно изобретению могут быть составлены в композицию совместно - и/или введены совместно - с одним или более дополнительными антителами, которые связываются с другими мишенями (например, антителами, которые связываются с другими цитокинами или которые связываются с молекулами клеточной поверхности). Кроме того, одно или более антител согласно изобретению могут быть использованы в сочетании с двумя или более указанными выше терапевтическими средствами. В таких терапевтических комбинациях могут быть успешно использованы более низкие дозировки терапевтических средств, что дает, таким образом, возможность избежать возможной токсичности или осложнений, ассоциированных с разными монотерапевтическими схемами лечения. Специалистам, практикующим в данной области, должно быть понятно, что когда антитела согласно изобретению используются как часть комбинированной терапии, могут потребоваться более низкие дозировки антител, чем те, которые используются при индивидуальном введении антитела субъекту (например, синергического терапевтического эффекта можно достичь, применяя комбинированную терапию, которая, в свою очередь, позволяет использовать более низкую дозу антитела для достижения требуемого терапевтического эффекта).
Интерлейкин-12 играет критическую роль в патологии, ассоциированной со спектром заболеваний, в которых участвуют иммунные и воспалительные элементы. Такие заболевания включают, но не ограничиваются перечисленным, ревматоидный артрит, остеоартрит, хронический ювенильный артрит, артрит Лайма, псориатический артрит, реактивный артрит, спондилоартропатию, системную красную волчанку, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, инсулино-зависимый сахарный диабет, тиреоидит, астму, аллергические заболевания, псориаз, склеродермию, атопический дерматит, болезнь трансплантат против хозяина, отторжение трансплантата органа, острое или хроническое иммунное заболевание, ассоциированное с трансплантацией органа, саркоидоз, атеросклероз, диссеминированное внутрисосудистое свертывание, болезнь Кавазаки, болезнь Грава, нефротический синдром, синдром хронической усталости, гранулематоз Вегенера, пурпура Шенлейна-Геноха, микроскопический васкулит почек, хронический активный гепатит, увеит, септический шок, синдром токсического шока, септический синдром, кахексию, инфекционные заболевания, паразитарные заболевания, синдром приобретенного иммунодефицита, острый поперечный миелит, хорею Хантингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, инсульт, первичный билиарный цирроз, гемолитическую анемию, злокачественные заболевания, сердечную недостаточность, инфаркт миокарда, болезнь Аддисона, спорадический полигландулярный дефицит типа I и полигландулярный дефицит типа II, синдром Шмидта, (острый) респираторный дистресс-синдром у взрослых, алопецию, гнездную алопецию, серонегативную артропатию, артропатию, болезнь Рейтера, псориатическую артропатию, артропатию при язвенном колите, энтеропатический синовит, артропатию, ассоциированную с хламидией, иерсинией и сальмонеллой, спондилоартропатию, атероматозное заболевание/артериосклероз, атопическую аллергию, аутоиммунное буллезное заболевание, пузырчатку обыкновенную, эксфолиативную пузырчатку, пемфигоид, IgA-зависимый линеарный дерматоз, аутоиммунную гемолитическую анемию, гемолитическую анемию с положительной реакцией Кумбса, приобретенную пернициозную анемию, ювенильную пернициозную анемию, миалгический энцефалит/миалгический энцефаломиелит, хронический кожно-слизистый кандидоз, гигантоклеточный артерит, первичный склерозирующий гепатит, криптогенный аутоиммунный гепатит, синдром приобретенного иммунодефицита, болезни, связанные с синдромом приобретенного иммунодефицита, гепатит C, обычный изменчивый иммунодефицит (общую вариабельную гипогаммаглобулинемию), дилатационную кардиомиопатию, женское бесплодие, нарушение овуляции, раннее нарушение овуляции, легочный фиброз, криптогенный фиброзирующий альвеолит, поствоспалительное интерстициальное заболевание легких, интерстициальный пневмонит, болезнь соединительной ткани, ассоциированную с интерстициальным заболеванием легких, смешанное заболевание соединительной ткани, ассоциированное с болезнью легких, системный склероз, ассоциированный с болезнью легких, ревматоидный артрит, ассоциированный с интерстициальным заболеванием легких, системную красную волчанку, ассоциированную с заболеванием легких, болезнь легких, ассоциированную с дерматомиозитом/полимиозитом, болезнь Шегрена, ассоциированную с заболеванием легких, анкилозирующий спондилит, ассоциированный с болезнью легких, васкулитное диффузное заболевание легких, гемосидероз-ассоциированное заболевание легких, лекарственно-индуцированное интерстициальное заболевание легких, радиационный фиброз, облитерирующий бронхиолит, хроническую эрзинофильную пневмонию, лимфоцитарную инфильтрирующую болезнь легких, постинфекционное интерстициальное заболевание легких, подагрический артрит, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный гепатит типа 1 (классический аутоиммунный, или волчаночный, гепатит), аутоиммунный гепатит типа 2 (гепатит с анти-LKM-антителами), гипогликемию, обусловленную аутоиммунными нарушениями, инсулинорезистентность типа B с акантокератодермией, гипопаратироидизм, острое иммунное заболевание, ассоциированное с трансплантацией органа, хроническое иммунное заболевание, ассоциированное с трансплантацией органа, остеоартроз, первичный склерозирующий холангит, идиопатическую лейкопению, аутоиммунную нейтропению, почечное заболевание NOS, гломерулонефриты, микроскопический васкулит почек, болезнь Лайма, дискоидную красную волчанку, идиопатическое мужское бесплодие, или NOS, аутоиммунность в отношении спермы, рассеянный склероз (всех подтипов), инсулино-зависимый сахарный диабет, симпатическую офтальмию, вторичную легочную гипертерзию при заболевании соединительной ткани, синдром Гудпасчера, легочную манифестацию при узелковом полиартериите, острую ревматическую лихорадку, ревматоидный спондилит, болезнь Стилла, системный склероз, болезнь Такаяши/артериит, аутоиммунную тромбоцитопению, идиопатическую тромбоцитопению, аутоиммунное тиреоидное заболевание, гипертироидизм, зобный аутоиммунный гипотироидизм (болезнь Хашимото), атрофический аутоиммунный гипотироидизм, первичная микседема, факогенный увеит, первичный васкулит и витилиго. Человеческие антитела и части антител согласно изобретению могут быть использованы для лечения аутоиммунных заболеваний, в частности, тех, которые ассоциированы с воспалением, включая ревматоидный спондилит, аллергию, аутоиммунный диабет, аутоиммунный увеит.
Предпочтительно, чтобы антитела согласно изобретению или их антиген-связывающие части были использованы для лечения ревматоидного артрита, болезни Крона, рассеянного склероза, инсулино-зависимого сахарного диабета и псориаза, как более подробно описано в разделе VII.
Человеческое антитело или часть антитела согласно изобретению можно вводить также с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, используемыми для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний.
Антитела согласно изобретению или их антиген-связывающие части могут - отдельно или в сочетании - быть использованы для лечения таких заболеваний. Следует понимать, что антитела против IL-12 согласно изобретению или их антиген-связывающие части могут быть использованы отдельно или в сочетании с дополнительным средством, например терапевтическим средством, где указанное дополнительное средство выбирает специалист в данной области в соответствии с поставленной им целью. Например, дополнительным средством может быть терапевтическое средство, которое признано в данной области полезным для лечения заболевания или состояния, которое лечится антителом согласно изобретению. Добавочное средство может быть также таким средством, которое придает благоприятное свойство терапевтической композиции, например средство, которое влияет на вязкость композиции.
Кроме того, следует понимать, что комбинации, которые включены в объем настоящего изобретения, являются такими комбинациями, которые полезны с точки зрения их предполагаемого назначения. Средства, указанные ниже, приведены всего лишь в качестве иллюстрации в отношении цели их применения, но вовсе не ограничены перечисленным. Комбинации, которые составляют часть настоящего изобретения, могут состоять из антител согласно изобретению и по меньшей мере одного добавочного средства, выбранного из приведенного ниже списка. Такая комбинация может также включать более одного добавочного средства, например, два или три добавочных средства, если эта комбинация является такой, что образованная композиция может выполнять свое предполагаемое назначение. Кроме того, описанные здесь добавочные средства, используемые в сочетании с антителом против IL-12, не ограничены тем нарушением, для лечения которого они прописаны.
Предпочтительными комбинациями являются нестероидные противовоспалительные средства(средство), также называемые NSAIDS, которые включают лекарственные средства наподобие ибупрофена. Другими предпочтительными комбинациями являются кортикостероиды, включая преднизолон; хорошо известные побочные эффекты применения стероидов могут быть ослаблены или даже исключены путем уменьшения необходимой дозы стероидов при лечении пациентов ими в сочетании с анти-IL-12-антителами согласно изобретению. Неограничивающие примеры терапевтических средств для лечения ревматоидного артрита, с которыми можно комбинировать антитело или часть антитела согласно изобретению, включают следующие: вызывающие супрессию цитокина противовоспалительные средства(средство) (CSAID); антитела или антагонисты других человеческих цитокинов или факторов роста, например, TNF (включая адалимумаб/HUMIRA), LT, IL-I, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF. Антитела согласно изобретению или их антиген-связывающие части можно комбинировать с антителами к молекулам клеточной поверхности, таким как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, или их лигандам, включая CD 154 (gp39 или CD40L).
TM
TM
Предпочтительные комбинации терапевтических средств могут в различных отношениях препятствовать развитию каскада аутоиммунных и последующих воспалительных явлений; предпочтительные примеры включают антагонисты TNF, такие как химерные, гуманизированные или человеческие антитела против TNF, D2E7 (заявка США с серийным номером 08/599226, поданная 9 февраля 1996), cA2 (Remicade), CDP 571, фрагменты анти-TNF-антитела (например, CDP870), а также растворимые рецепторы TNF, p55 или p75, их производные, (p75TNFRIgG (Enbrel) или p55TNFRIgG (Lenercept), растворимый рецептор IL-13 (sIL-13), а также ингибиторы TNFα-превращающего фермента (TACE); сходным образом, ингибиторы IL-1 (например, ингибиторы интерлейкин-1-превращающего фермента, такие как Vx740 или IL-IRA и пр.) могут быть эффективны по тем же причинам. Другие предпочтительные комбинации включают интерлейкин-11, анти-P7 и p-селектиновый гликопротеиновый лиганд (PSGL). Еще одно предпочтительное сочетание составляют другие ключевые участники аутоиммунного ответа, которые могут действовать параллельно, в зависимости от или согласованно с функцией IL-12; особенно предпочтительными являются антагонисты IL-18, включая IL-18-антитела или растворимые рецепторы IL-18, или IL-18-связывающие белки. Показано, что IL-12 и IL-18 обладают перекрывающимися, но разными функциями, и комбинация антагонистов против них обоих может оказаться наиболее эффективной. Еще одним предпочтительным сочетанием являются не истощающие анти-CD4-ингибиторы. Еще одно предпочтительное сочетание включает антагонисты ко-стимуляторного пути CD80 (B7.1) или CD86 (B7.2), включая антитела, растворимые рецепторы или антагонистические лиганды.
(TM)
Анти-IL12-антитела или их антиген-связывающие части можно также комбинировать с такими средствами, как метотрексат, 6-MP, азатиоприн-сульфазалазин, мезалазин, олзалацин-хлорохинин/гидроксихлорохинин, пеницилламин, ауротиомалат (внутримышечно и перорально), азатиоприн, колхицин, кортикостероиды (перорально, в виде ингаляций и локальной инъекции), агонисты бета-2-адренорецептора (салбутамол, тербуталин, салметерал), ксантины (теофиллин, аминофиллин), хромогликат, недокромил, кетотифен, ипратропиум и окситропиум, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолят мофетила, лефлуномид, ряд NSAID, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты аденозина, антитромботические средства, ингибиторы комплемента, адренергические средства, средства, которые препятствуют передаче сигнала провоспалительными цитокинами, такими как TNFα или IL-1 (например, ингибиторы IRAK, NIK, IKK, p38 или MAP-киназы), ингибиторы IL-1β-превращающего фермента (например, V×740), анти-P7, p-селектиновый гликопротеиновый лиганд (PSGL), ингибиторы TNFα-превращающего фермента (TACE), ингибиторы передачи сигнала T-клеток, такие как киназные ингибиторы, ингибиторы металлопротеиназ, сульфазалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные (например, растворимые рецепторы TNF p55 или p75 и их производные P75TNFRIgG (Энбрел)и p55TNFRIgG (ленерцепт), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, растворимый рецептор IL-13 (sIL-13)) и противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGFβ). Предпочтительные комбинации включают метотрексат или лефлуномид и, в умеренных или тяжелых случаях ревматоидного артрита, циклоспорин.
Неограничивающие примеры терапевтических средств в случае воспалительного заболевания кишечника, с которыми можно сочетать анти-IL-12-антитело или часть антитела, включают следующее: буденозид; эпидермальный фактор роста; кортикостероиды; циклоспорин, сульфазалазин; аминосалицилаты; 6-меркаптопурин; азатиоприн; метронидазол; ингибиторы липоксигеназы; мезаламин; олзалацин; бальзалозид; антиоксиданты; ингибиторы тромбоксана; антагонисты рецептора IL-1; моноклональные анти-IL-1β-антитела; моноклональные анти-IL-6-антитела; факторы роста; ингибиторы эластазы; соединения пиридинил-имидазола; антитела к другим человеческим цитокинам или факторам роста или антагонисты этих веществ, например, TNF (включая адалимумаб/HUMIRA), LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF. Антитела согласно изобретению или их антиген-связывающие части можно сочетать с антителами к молекулам клеточной поверхности, таким как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90, или их лигандам. Антитела согласно изобретению или их антиген-связывающие части можно также сочетать с такими средствами, как метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолят мофетила, лефлуномид, различные NSAID, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты аденозина, антитромботические средства, ингибиторы комплемента, адренергические средства, средства, которые препятствуют передаче сигнала провоспалительными цитокинами, такими как TNFα или IL-1 (например, ингибиторы IRAK, NIK, IKK, p38 или MAP-киназы), ингибиторы IL-1β-превращающего фермента (например, Vx740), анти-P7, p-селектиновый гликопротеиновый лиганд (PSGL), ингибиторы TNFα-превращающего фермента, ингибиторы передачи сигнала T-клеток, такие как киназные ингибиторы, ингибиторы металлопротеиназ, сульфазалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные (например, растворимые рецепторы TNF p55 или p75, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, растворимый рецептор IL-13 (sIL-13)) и противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGFβ).
(TM)
(TM)
Предпочтительные примеры терапевтических средств для лечения болезни Крона, с которыми можно сочетать антитело или его антиген-связывающую часть, включают следующее: антагонисты TNF, например, анти-TNF-антитела, D2E7 (адалимумаб/HUMIRA), cA2 (ремикад, CDP 571, фрагменты анти-TNF-антитела (например, CDP870), конструкции TNFR-Ig (p75TNFRIgG (Энбрел и p55TNFRIgG (ленерцепт)), анти-P7, p-селектиновый гликопротеиновый лиганд (PSGL), растворимый рецептор IL-13 (sIL-13) и ингибиторы PDE4. Антитела согласно изобретению или их антиген-связывающие части можно комбинировать с кортикостероидами, например будезонидом и дексаметазоном. Антитела можно также комбинировать с такими средствами, как сульфазалазин, 5-аминосалициловая кислота и олзалацин, и средствами, которые препятствуют синтезу или действию провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, например, ингибиторы IL-1β-превращающего фермента (например, Vx740) и IL-1ra. Антитела или их антиген-связывающие части можно использовать также с ингибиторами передачи сигналов T-клеток, например тирозинкиназными ингибиторами 6-меркаптопуринами. Антитела или их антиген-связывающие части можно комбинировать с IL-11.
Неограничивающие примеры терапевтических средств в случае рассеянного склероза, с которыми можно сочетать антитело или его антиген-связывающую часть, включают следующее: кортикостероиды; преднизолон; метидпреднизолон; азатиоприн; циклофосфамид; циклоспорин; метотрексат; 4-аминопиридин; тизанидин; интерферон-β1a (авонекс; Biogen); интерферон-β1b (бетазерон; Chiron/Berlex); сополимер 1 (Cop-1; копаксон; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); гипербарический кислород; внутривенный иммуноглобулин; клабрибин; антитела или антагонисты других человеческих цитокинов или факторов роста, например, TNF, LT, IL-I, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF. Антитела согласно изобретению или их антиген-связывающие части можно комбинировать с антителами к молекулам клеточной поверхности, таким как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 или их лигандам. Антитела согласно изобретению или их антиген-связывающие части можно также комбинировать с такими средствами, как метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолят мофетила, лефлуномид, различные NSAID, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты аденозина, антитромботические средства, ингибиторы комплемента, адренергические средства, средства, которые препятствуют передаче сигнала провоспалительными цитокинами, такими как TNFα или IL-1 (например, ингибиторы IRAK, NIK, IKK, p38 или MAP-киназы), ингибиторы IL-1β-превращающего фермента (например, Vx740), анти-P7, p-селектиновый гликопротеиновый лиганд (PSGL), ингибиторы TACE, ингибиторы передачи сигнала T-клеток, такие как киназные ингибиторы, ингибиторы металлопротеиназ, сульфазалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные (например, растворимые рецепторы TNF p55 или p75, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, растворимый рецептор IL-13 (sIL-13)) и противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-13 и TGFβ).
Предпочтительные примеры терапевтических средств в случае рассеянного склероза являются такие, когда антитело или его антиген-связывающую часть можно комбинировать с интерфероном-β, например с IFNβ1a и IFNβ1b; копаксоном, кортикостероидами, ингибиторами IL-1, ингибиторами TNF и антителами против CD40-лиганда и против CD80.
Антитело, часть антитела могут быть использованы в сочетании с другими средствами для лечения кожных нарушений. Например, антитело, часть антитела или другой ингибитор IL-12 согласно изобретению комбинируют с PUVA-терапией. PUVA представляет собой сочетание воздействия псоралена (P) и длинноволнового ультрафиолетового излучения (UVA), которое используется для лечения различных кожных нарушений. Антитела, части антител или другие ингибиторы IL-12 согласно изобретению можно также комбинировать с пимекролимусом. В другом варианте осуществления антитела согласно изобретению используются для лечения псориаза, где указанные антитела вводят в сочетании с такролимусом. В другом варианте осуществления такролимус и ингибиторы IL-12 вводят в сочетании с метотрексатом и/или циклоспорином. Еще в одном варианте осуществления ингибитор IL-12 согласно изобретению вводят в сочетании с эксимерным лазерным воздействием для лечения псориаза.
Фармацевтические композиции согласно изобретению могут включать "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" антитела или части антитела согласно изобретению. Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в таких дозировках и в течение таких периодов времени, которые необходимы для достижения требуемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество, антитела или части антитела может варьировать в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и вес индивида, а также способности антитела или части антитела вызвать требуемый ответ в организме индивида. Терапевтически эффективное количество является также таким количеством, при котором любые токсические или иные вредные эффекты антитела или части антитела превосходят благотворные терапевтические эффекты. Термин "профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в таких дозировках и в течение таких периодов времени, которые необходимы для достижения требуемого профилактического результата. Обычно, поскольку профилактическая доза используется у субъектов до наступления заболевания или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество меньше терапевтически эффективного количества.
Режимы дозировок можно подбирать для получения оптимального требуемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, можно ввести однократный болюс, можно ввести несколько дробных доз, разнесенных во времени, или же вносимая доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, в зависимости от потребностей, продиктованных лечебной ситуацией. Особенно благотворно составление парентеральных композиций в единичной лекарственной форме для облегчения введения и постоянства дозировок. Здесь под единичной лекарственной формой подразумеваются физически дискретные порции, подходящие в качестве одноразовых дозировок для лечения млекопитающих субъектов; каждая единичная доза содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанного с учетом того, чтобы получить требуемый терапевтический эффект в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Описание единичных лекарственных форм согласно изобретению продиктовано и непосредственно зависит от (a) особых характеристик активного соединения и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которых предполагается достичь, и (b) ограничений, известных в области создания таких активных соединений для лечения индивидуальной чувствительности.
В одном из вариантов осуществления антитело против IL-12 или его антиген-связывающую часть вводят в режиме введения раз в две недели, включая, например, колебание дозы введения раз в две недели приблизительно от 50 до 300 мг, колебание дозы введения приблизительно от 100 мг до 200 мг и колебание дозы введения приблизительно от 125 до 175 мг. Альтернативно, антитело против IL-12 может быть введено в виде единовременной дозы, включая, например, дозу приблизительно в 200 мг, дозу приблизительно в 100 мг. В другом варианте осуществления антитело против IL-12 можно вводить в режиме еженедельного введения, включая, например, колебание дозы введения приблизительно от 50 до 300 мг, колебание дозы приблизительно от 100 мг до 200 мг и колебание дозы приблизительно от 125 до 175 мг. Следует отметить, что здесь включены также и дозы, заключенные внутри указанных интервалов, например, 85 мг, 97 мг и т.д.
В другом варианте осуществления человеческое антитело против IL-12 или его антиген-связывающую часть вводят в режиме введения однократной дозы субъекту, имеющему нарушение, при котором активность IL-12 является неблагоприятной, например псориаз, что приводит к необходимости лечения. Ответ на воздействие антитела к IL-12 или его антиген-связывающей части может поддерживаться у субъекта в течение длительного периода времени. Может быть осуществлен мониторинг поддержания ответа в соответствии с заболеванием, которое подвергают лечению. Например, поддержание ответа с IL-12-антителом или его антиген-связывающей частью для лечения псориаза может быть определено у субъекта по развитию ответа PASI-75 во времени.
Следует отметить, что дозы могут варьировать в зависимости от типа и тяжести состояния, которое требует лечения. Кроме того, следует понимать, что для любого конкретного субъекта со временем приходится подбирать специфические режимы дозирования в соответствии с индивидуальной потребностью и с решением специалиста, делающего назначения или ведущего наблюдение за введением композиций, а также то, что указанный здесь интервал изменения дозировок является лишь приблизительным и не предназначен для ограничения объема или области практического применения заявленной композиции.
VII. Применение изобретения
Настоящее изобретение относится к способам ингибирования активности IL-12 у субъекта, страдающего нарушением, при котором активность IL-12 является неблагоприятной. В одном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения псориаза, предусматривающему введение однократной дозы антитела против IL-12 или его антиген-связывающей части.
IL-12 участвует в патофизиологии широкого спектра различных нарушений (Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996; Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-314; Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347-367; Fais et al. (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238; Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150: 823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology. 112: 1169-1178, и Berrebi et al., (1998) Am. J. Path. 152: 667-672; Parronchi et al (1997) Am. J. Path. 150: 823-832). Изобретение обеспечивает способ ингибирования активности IL-12 у субъекта, страдающего таким нарушением, при этом указанный способ предусматривает введение субъекту антитела или его антиген-связывающей части согласно изобретению, с целью ингибирования у субъекта активности IL-12. Предпочтительно, чтобы IL-12 был человеческим IL-12, а субъектом был человек. В альтернативном случае субъектом может быть млекопитающее, экспрессирующее IL-12, с которым перекрестно реагирует антитело согласно изобретению. Помимо этого, субъектом может быть млекопитающее, в организм которого привнесен hIL-12 (например, путем введения hIL-12 или путем экспрессии трансгена hIL-12). Антитело согласно изобретению может быть введено субъекту-человеку в терапевтических целях (что дополнительно обсуждается ниже). Кроме того, антитело согласно изобретению может быть введено не являющемуся человеком млекопитающему, у которого экспрессируется IL-12, с которым антитело перекрестно реагирует, в ветеринарных целях или же с целью создания животной модели человеческого заболевания. Что касается последнего, такие животные модели могут оказаться полезными для оценки терапевтической эффективности антитела согласно изобретению (например, при тестировании дозировок и временных параметров введения).
Здесь подразумевается, что фраза "нарушение, при котором активность IL-12 является неблагоприятной", включает заболевания и другие нарушения, при которых показано, что наличие IL-12 у субъекта, страдающего таким нарушением, либо фактически, либо предположительно является причиной патофизиологии нарушения или фактором, который участвует в усугублении тяжести нарушения. Соответственно, нарушение, при котором активность IL-12 является неблагоприятной, представляет собой такое нарушение, при котором можно рассчитывать, что ингибирование активности IL-12 ослабит симптомы и/или прогрессирование заболевания. При таких нарушениях может наблюдаться, например, увеличение концентрации IL-12 в биологической жидкости субъекта, страдающего таким нарушением (например, увеличение у субъекта концентрации IL-12 в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости и т.д.), которое можно обнаружить, например, с помощью анти-IL-12-антитела, как описано выше. Существует целый ряд примеров нарушений, при которых активность IL-12 является неблагоприятной. В одном из вариантов осуществления антитела согласно изобретению или их антиген-связывающие части могут быть использованы в терапии для лечения описанных выше заболеваний или нарушений. В другом варианте осуществления такие антитела или их антиген-связывающие части могут быть использованы для производства лекарственных средств для лечения описанных выше заболеваний или нарушений. Применение антител и частей антител согласно изобретению при лечении целого ряда нарушений, не ограниченных перечисленными здесь конкретными нарушениями, обсуждается ниже.
A. Ревматоидный артрит
:
41
Показано, что интерлейкин-12 участвует в развитии воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит. Индуцибельный IL-12p40-посредник был обнаружен в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом, и было показано, что в синовиальной жидкости, полученной у пациентов с ревматоидным артритом, присутствует IL-12 (см., например, Morita et al, (1998) Arthritis and Rheumatism : 306-314). Было обнаружено, что IL-12-положительные клетки присутствуют в низлежащем слое синовиальной выстилки при ревматоидном артрите. Человеческие антитела согласно изобретению и их антиген-связывающие части и могут быть использованы для лечения, например, ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, артрита Лайма, ревматоидного спондилита, остеоартрита и подагрического артрита. Обычно антитело или его антиген-связывающую часть вводят системно, хотя и в случае определенных нарушений может оказаться благоприятным локальное введение антитела или части антитела. Антитело или часть антитела согласно изобретению может быть введено также и в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, используемыми при лечении аутоиммунных заболеваний.
c
i
a
При коллаген-индуцированном артрите (ollagen nduced rthritis, CIA) у мышей, являющемся мышиной моделью ревматоидного артрита, лечение мышей моноклональными анти-IL-12-антителами (крысиное моноклональное антитело против мышиного IL-12, C17.15) до развития артрита основательно тормозило запуск и уменьшало количество случаев возникновения и степень тяжести заболевания. Обработка моноклональным антителом против IL-12 вскоре после запуска артрита уменьшало степень тяжести артрита, однако более поздняя после запуска заболевания обработка мышей моноклональным анти-IL-12-антителом оказывала минимальное воздействие на тяжесть артрита.
B. Болезнь Крона
Интерлейкин-12 играет роль также и при воспалительном заболевании кишечника, болезни Крона. Повышенная экспрессия IFN-γ и IL-12 имеет место в слизистой кишечника пациентов с болезнью Крона (см., например, Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238; Parronchi et al., (1997) Amer. J. Pathol. 150: 823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178; Berrebi et al., (1998) Amer. J. Pathol. 152: 667-672). Было показано, что анти-IL-12-антитела вызывают супрессию заболевания на мышиных моделях колита, например колита, индуцированного TNBS, у мышей с удаленным геном IL-2, а позже - у мышей с удаленным геном IL-10. Соответственно, антитела и части антител согласно изобретению могут быть использованы при лечении воспалительных заболеваний кишечника.
C. Рассеянный склероз
Было показано, что интерлейкин-12 является ключевым медиатором рассеянного склероза. Экспрессия индуцибельного IL-12p40-посредника или самого IL-12 была обнаружена в участках повреждений у пациентов с рассеянным склерозом (Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996, Drulovic et al., (1997) J. Neurol. Sci. 147: 145-150). У пациентов с хронически прогрессирующим рассеянным склерозом повышен уровень циркулирующего IL-12. Исследования T-клеток и антигенпредставляющих клеток (APC), полученных у пациентов с рассеянным склерозом, выявили целую серию самоподдерживающихся иммунных взаимодействий как основу прогрессии рассеянного склероза, приводящей к иммунной реакции Th1-типа. Повышенная секреция IFN-γ из Т-клеток приводит к повышенной продукции IL-12 антигенпредставляющими клетками (APC), который постоянно поддерживает цикл, ведущий к хроническому состоянию иммунной активации Th1-типа и заболеванию (Balashov et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 599-603). Роль IL-12 при рассеянном склерозе исследовали с помощью мышиной и крысиной модели экспериментального аллергического энцефаломиелита (EAE), являющихся моделями рассеянного склероза. На возвратно-ремиттирующей EAE-модели рассеянного склероза у мышей, предварительно обработанных моноклональными анти-IL-12-антителами, отмечались явления отсроченного паралича и ослабленных клинических признаков. Обработка моноклональными анти-IL-12-антителами на пике паралича или в процессе последующего периода ремиссии способствовала ослаблению клинических признаков. Соответственно, антитела согласно изобретению или их антиген-связывающие части могут служить для облегчения симптомов, ассоциированных с рассеянным склерозом у человека.
D. Инсулино-зависимый сахарный диабет
Было показано, что интерлейкин-12 является важным медиатором инсулино-зависимого сахарного диабета (IDDM). IDDM был индуцирован у мышей NOD путем введения IL-12, тогда как анти-IL-12-антитела обладали защитным эффектом на модели IDDM, полученного при адоптивном переносе. У пациентов с ранним началом IDDM часто наблюдается так называемый "медовый месяц", в течение которого поддерживается функция некоторых остаточных островковых клеток. Эти остаточные островковые клетки продуцируют инсулин и регулируют уровни глюкозы в крови лучше, чем вводимый инсулин. Введение таким пациентам с ранним началом IDDM анти-IL-12-антитела может предотвратить дальнейшую деструкцию островковых клеток, поддерживая, таким образом, эндогенный источник инсулина.
E. Псориаз
Было показано, что интерлейкин-12 (IL-12) и родственный ему цитокин IL-23 являются ключевыми медиаторами при псориазе. Псориаз включает острые и хронические кожные повреждения, которые ассоциированы с профилем экспрессии цитокина TH1-типа (Hamid et al. (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1: 225-231; Turka et al. (1995) Mol. Med. 1: 690-699). Оба цитокина, IL-12 и IL-23, вносят свой вклад в развитие иммунного ответа хелперных клеток типа 1T (Th1) при псориазе. Кроме того, в местах псориатических кожных повреждений отмечена повышенная экспрессия матричной РНК, соответствующей IL-12p40 и IL-23p40. Соответственно, антитела согласно изобретению или их антиген-связывающие части могут служить для облегчения таких кожных нарушений, как псориаз.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения псориаза. Часто лечение псориаза включает местное применение кортикостероидов, аналогов витамина D и местное или пероральное применение ретиноидов, или их комбинации. В одном варианте осуществления антитело против IL-12 и/или IL-23 вводят в сочетании или на фоне одного из указанных обычно используемых терапевтических воздействий. Дополнительные терапевтические средства, которые можно сочетать с антителом против IL-12 и/или IL-23 для лечения псориаза, более подробно описаны ниже.
Диагноз псориаза обычно основан на кожных проявлениях. Кроме того, для исключения других кожных нарушений может потребоваться биопсия кожи или соскоб и культивирование лоскутков кожи. Рентгеновское облучение может быть использовано для тестирования на предмет возможного псориатического артрита при наличии связанной и персистирующей боли.
Мониторинг улучшений состояния при псориазе может быть осуществлен у субъектов на основе индекса площади и тяжести псориаза (PASI). Способ определения PASI описан Fredriksson & Pettersson (1978) Dermatologica 157: 238, а также Marks et al. (1989) Arch. Dermatol. 125: 235. Вкратце, указанный индекс основан на оценке четырех анатомических сайтов, включая голову, верхние конечности, туловище, и нижние конечности, в отношении эритемы, уплотнения и шелушения, с использованием 5-разрядной шкалы (0 = отсутствие симптомов; 1 = слабые симптомы; 2 = умеренные симптомы; 3 = значительные симптомы; 4 = очень выраженные симптомы). На основе степени выраженности поражений в данном анатомическом сайте пораженной области приписывают числовое значение (0=0; 1=<10%; 2=10-29%; 3=30-49%; 4=50-69%; 5=70=89%; 6=90-100%). Затем рассчитывают сумму баллов PASI, при этом возможные колебания баллов PASI составляют от 0,0 до 72,0, где наиболее высокое количество баллов соответствует полной эритродермии самой высокой степени.
В одном из вариантов осуществления данного изобретения антитело против IL-12 и/или IL-23 используют для лечения псориаза, включая хронический пятнистый псориаз, каплевидный псориаз, псориаз кожных складок, пустулезный псориаз, обыкновенная пузырчатка, эритродермический псориаз, псориаз, ассоциированный с воспалительным заболеванием кишечника (IBD), и псориаз, ассоциированный с ревматоидным артритом (RA). В другом варианте осуществления антитело против IL-12 и/или IL-23, такое как J695/ABT-874, используют для лечения субъектов, у которых псориаз сочетается с PsA (псориатический артрит). Специфические типы псориаза, включенные в способы лечения согласно изобретению, подробно описаны ниже:
a. Хронический пятнистый псориаз
Хронический пятнистый псориаз (также называемый вульгарным (или обыкновенным) псориазом) является наиболее распространенной формой псориаза. Хронический пятнистый псориаз характеризуется образованием гиперемированных пятен на коже, размер которых колеблется от размера монеты до значительно больших размеров. При хроническом пятнистом псориазе могут наблюдаться одиночные или множественные кожные пятна, размер которых может варьировать от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров. Обычно пятна являются красными, с чешуйчатой поверхностью, и при легком почесывании начинают отражать свет, создавая впечатление "серебристости". Поражения (которые зачастую являются симметричными) при хроническом пятнистом псориазе возникают на всем теле, но с преобладанием их на поверхностях разгибательных мышц, включая колени, локти, пояснично-крестцовую область, скальп и ногти. Изредка хронический пятнистый псориаз может возникать также на пенисе, вульве и складках, однако масштабных размеров это обычно не принимает. Диагноз пациентов с хроническим пятнистым псориазом основан обычно на описанных выше клинических признаках. Хронический пятнистый псориаз характеризуется, в частности, распределением, цветом и типичной серебристой чешуйчатостью кожных поражений.
b. Каплевидный псориаз
Каплевидный псориаз относится к форме псориаза с характерными чешуйчатыми пятнами, имеющими форму водяной капли. Выпуклость кожных поражений при каплевиднoм псориазе обычно сопровождается инфекцией, из которых наиболее значительной является стрептококковая инфекция гортани. Диагноз каплевиднoго псориаза основан обычно на кожных проявлениях, а также на частых жалобах на боли в горле.
c. Псориаз кожных складок
Псориаз кожных складок представляет собой такую форму псориаза, при которой у пациента наблюдаются гладкие, обычно влажные участки кожи, которые являются красными и воспаленными, что не похоже на проявления, ассоциированные с чешуйчатым псориазом. Псориаз кожных складок называют также интертригинозный псориаз или псориаз на изгибах. Псориаз кожных складок чаще всего имеет место при артритах в подмышечных впадинах, в паховой области, под грудью и в других кожных складках вокруг половых органов и ягодиц, и, как результат локализации проявлений, трение и потение могут раздражать пораженные области.
d. Пустулезный псориаз
Пустулезный псориаз, называемый также ладонно-подошвенным псориазом, представляет собой форму псориаза, при которой образуются заполненные гноем волдыри разного размера и локализации, но часто возникающие на ладонях и стопах. Волдыри могут быть локализованными или могут распространяться на обширных участках поверхности тела. Пустулезный псориаз может вызывать как легкую, так и значительную боль, может вызывать повышение температуры.
e. Другие псориатические нарушения
Другие примеры псориатических нарушений, которые можно лечить антителом против IL-12 и/или IL-23, включают эритродермический псориаз, вульгарныый псориаз, псориаз, ассоциированный с воспалительным заболеванием кишечника (IBD), и псориаз, ассоциированный с артритом, включая ревматоидный артрит.
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрировано следующими примерами, которые никоим образом не предназначены для ограничения объема заявленного изобретения. Содержание всех цитируемых ссылок, включая литературные ссылки, патенты и опубликованные патентные заявки, приведенных в описании настоящей заявки, считаются включенными в настоящее описание в виде ссылки. Кроме того, следует понимать, что содержание всех прилагаемых здесь таблиц (см. приложение A к патенту США No. 6914128), также как и полное содержание патента США No. 6914128, включены в настоящее описание в виде ссылки.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Эффективность полностью человеческого моноклонального антитела против IL-12/IL-23, ABT-874, в лечении от умеренной до тяжелой форм пятнистого псориаза
ABT-874 представляет собой полностью человеческое антитело против интерлейкина-12 (IL-12) и IL-23. Оно с высокой аффинностью связывается с субъединицей p40, общей для IL-12 и IL-23, оба из которых являются подтвержденными мишенями при лечении псориаза (Ps).
Задачей следующего исследования была оценка эффективности подкожных инъекций ABT-874 при лечении пациентов с пятнистым псориазом от умеренной до тяжелой форм.
b
s
a
P
A
S
I
e
o
w
P
G
A
Взрослых пациентов с Ps, у которых вначале, на момент обследования, было поражено ≥10% площади поверхности тела, по шкале BSA (ody urface rea), а индекс площади и тяжести псориаза, по шкале PASI (soriasis rea and everity ndex), составлял ≥12 баллов, отбирали для последующего 12-недельного двойного, слепого, плацебо-контролируемого исследования. Пациентов случайным образом определяли в 1 из 6 групп: 1) по 100 мг ABT-874 раз в две недели (ach ther eek (eow)) в течение 12 недель; 2) одну дозу в 200 мг ABT-874 в неделю 0; 3) по 200 мг ABT-874 еженедельно в течение 4 недель; 4) по 200 мг ABT-874 eow в течение 12 недель; 5) по 200 мг ABT-874 еженедельно в течение 12 недель; или 6) плацебо. Первым рубежом был ответ ≥PASI-75 на 12-й неделе. Другие оценки эффективности включали ответ PASI-50 и общую оценку пациента (hysician's lobal ssessment (PGA)). Пациентов, прошедших первый рубеж, включали в 36-недельную фазу слепого/повторного лечения и проводили мониторинг в течение периода времени, необходимого для утраты ответа [на лечение].
Всего в это исследование было включено 180 пациентов, по 30 в каждой группе. Исходные характеристики были сходны между группами и ориентировочно соответствовали псориазу (Ps) от средней до тяжелой форм (все индексы средние, за исключением % мужчин): возраст - 46 лет, 74% мужчин; продолжительность Ps - 21 год; PASI-19; и 25% BSA. К 12-й неделе процент пациентов, достигших индекса ≥PASI75 [что означает ≥75%-ное улучшение как результат реакции на лечение], был статистически значительно большим в каждой из 5 групп больных, принимавших ABT-874, чем в группе плацебо (соответственно, 93%, 63%, 90%, 93%, 90%, вместо 3%, p<0,001, ITT). Кроме того, процент пациентов, достигших индекса ≥PASI50, был статистически значительно выше в каждой из 5 групп больных, принимавших ABT-874, чем в группе плацебо (100%, 77%, 97%, 97%, и 100%, вместо 17%, p<0,001). Средний процент уменьшения индекса PASI (т.е. улучшения состояния больных) на 12 неделе в группах, принимавших ABT-874, составлял, соответственно, 90%, 70%, 92%, 92% и 90%, а в группе плацебо - 26%. Сходным образом, процент пациентов с нулевым/минимальным PGA составлял, соответственно, 83%, 50%, 73%, 87% и 87% в группе пациентов, принимавших ABT-874, и 3% - в группе плацебо.
Можно заключить, что ABT-874 был значительно более эффективен, чем плацебо, в лечении пятнистого псориаза, от умеренного до тяжелого.
Пример 2: Безопасность и эффективность полностью человеческого моноклонального антитела ABT-874 против IL-12/IL-23 в лечении от умеренной до тяжелой форм пятнистого псориаза
ABT-874 представляет собой полностью человеческое антитело против интерлейкина-12 (IL-12) и IL-23. Оно с высокой аффинностью связывается с субъединицей p40, общей для IL-12 и IL-23, оба из которых являются подтвержденными мишенями при лечении псориаза (Ps). Задачей фазы II этого исследования было изучение эффективности и безопасности подкожных инъекций ABT-874 при лечении пациентов с пятнистым псориазом (Ps) от умеренной до тяжелой форм.
Взрослых пациентов с Ps, у которых по шкале BSA было поражено ≥10% площади поверхности тела, а индекс по шкале PASI составлял ≥12 баллов, отбирали для текующего 12-недельного двойного, слепого, плацебо-контролируемого исследования. Пациентов случайным образом определяли в 1 из 6 групп: 1) по 100 мг ABT-874 раз в две недели (eow) в течение 12 недель; 2) одну дозу в 200 мг ABT-874 в неделю 0; 3) по 200 мг ABT-874 еженедельно в течение 4 недель; 4) по 200 мг ABT-874 eow в течение 12 недель; 5) по 200 мг ABT-874 еженедельно в течение 12 недель; или 6) плацебо. Первым рубежом был ответ ≥PASI75 на 12-й неделе. Пациентов, прошедших первый рубеж, включали в 36-недельную фазу слепого/повторного лечения и проводили мониторинг в течение такого периода времени, пока не утрачивался ответ [на лечение]. У всех пациентов безопасность лечения оценивали в течение 54-недельного периода.
a
e
Всего участвовало 180 пациентов, по 30 в каждой группе. Базовые характеристики были сходны между группами и ориентировочно соответствовали псориазу (Ps) от средней до тяжелой форм (все индексы средние, за исключением % мужчин): возраст - 46 лет, 74% мужчин; продолжительность Ps - 21 год; PASI=19; и 25%-ное поражение, по оценке BSA. На 12-й неделе % пациентов, достигших индекса ≥PASI75, был статистически достоверно большим в каждой из 5 групп больных, принимавших ABT-874, чем в группе плацебо (соответственно, 93%, 63%, 90%, 93%, 90%, вместо 3%, p<0,001, ITT). В течение 12 недель двойной/слепой(DB) фазы испытаний неблагоприятные эффекты (dverse ffects, AE) инфекции в группах ABT-874 наблюдались в 23-43% случаев, а в группе плацебо они составляли 23%, причем наиболее часто это были назофарингеальные проявления (7-17% в группах ABT-874; 3% в группе плацебо). Статистически значимого различия между группами не обнаружено. Случаев серьезных неблагоприятных эффектов (AE) инфекций, также как и смертельных исходов, зарегистрировано не было.
Таким образом, ABT-874 оказался значительно более эффективен, чем плацебо, в лечении пятнистого псориаза, от умеренного до тяжелого, и, по-видимому, имеет более предпочтительный профиль безопасности.
Пример 3: Поддержание ответа полностью человеческим моноклональным антителом ABT-874 против IL-12/IL-23 в лечении от умеренной до тяжелой форм пятнистого псориаза
Эффективность и безопасность ABT-874 оценивали в 12-недельном (фаза II) рандомизированном, контролируемом испытании и в последующей 36-недельной фазе. Задачей следующего примера было изучение поддержания ответа после приостановки лечения в течение второго 12-недельного периода этой фазы II подкожных инъекций ABT-874 при лечении пациентов с пятнистым псориазом (Ps) от умеренной до тяжелой форм.
b
s
a
Взрослых пациентов с Ps, с поражением ≥ 10% площади поверхности тела, по шкале BSA (ody urface rea), и индексем PASI ≥12 баллов, отбирали для этого 12-недельного двойного, слепого, плацебо-контролируемого исследования. Пациентов случайным образом определяли в 1 из 6 групп:
1) по 100 мг ABT-874 раз в две недели (eow) в течение 12 недель;
2) одну дозу в 200 мг ABT-874 в неделю 0;
3) по 200 мг ABT-874 еженедельно в течение 4 недель;
4) по 200 мг ABT-874 eow в течение 12 недель;
5) по 200 мг ABT-874 еженедельно в течение 12 недель; или
6) плацебо.
Первым рубежом был ответ ≥ PASI75 на 12-й неделе. Пациентов, достигших первого рубежа, включали в 36-недельную фазу слепого/повторного лечения. Лечение исследуемым лекарственным средством приостанавливали и проводили мониторинг в течение такого периода времени, пока не утрачивался ответ на лечение (снижение оценки по шкале PASI в любое время в течение указанного последующего 36-недельногоо периода до <PASI 50). Поддержание ответа PASI оценивали в течение 24 недель.
Всего участвовало 180 пациентов, по 30 в каждой группе. Базовые характеристики были сходны между группами (все индексы средние, за исключением % мужчин): возраст - 46 лет, 74% мужчин; продолжительность Ps - 21 год; PASI=19; и 25%-ное поражение, по оценке BSA.
На 12-й неделе % пациентов с индексом ≥PASI75 был статистически достоверно выше в каждой из 5 групп больных, принимавших ABT-874, чем в группе плацебо (таблица 1). На 24-й неделе у значительной части реактивных пациентов (отвечающих на лечение) с PASI 75 в группах активного лечения поддерживался ответ по меньшей мере на уровне PASI 50.
<u>Таблица 1</u>
24-недельная эффективность ABT-874
≥PASI75 на 12-й неделе
Поддержание ответа PASI: 24-ая нед. По сравнению с 12-ой нед.
100 мг eow, 12 недель
28/30 (93%)*
24/28 (86%)
200 мг, одна доза
19/30 (63%)*
15/19 (79%)
200 мг, еженедельно, 4 недели
27/30 (90%)*
23/27 (85%)
200 мг eow, 12 недель
28/30 (93%)*
26/28 (93%)
200 мг, еженедельно, 12 недель
27/30 (90%)*
26/27 (96%)
Плацебо
1/30 (3%)
-
*p<0,001 по сравнению с плацебо, NRI
Таким образом, ABT-874 оказался значительно более эффективным, чем плацебо, в лечении пятнистого псориаза, от умеренного до тяжелого. У значительной части реактивных пациентов с PASI 75 такой ответ поддерживался на 24-й неделе после прерывания активной терапии.
Пример 4: Безопасность и эффективность ABT-874, полностью человеческого моноклонального антитела против IL-12/IL-23, в лечении от умеренной до тяжелой форм пятнистого псориаза
Задачей следующего примера было продемонстрировать эффективность и безопасность области изменения доз человеческого моноклонального антитела против IL-12/IL-23 (ABT-874) по сравнению с плацебо при лечении пациентов с клинически стабильным пятнистым псориазом от умеренной до тяжелой форм.
I. Материалы и методы
A. План исследования:
Следующее исследование было 12-недельным мультицентровым рандомизированным, двойным-слепым, фазы II, плацебо-контролируемым испытанием, которое проводили в 24 центрах в США (16 центров) и Канаде (8 центров). ABT-874 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) является человеческим моноклональным антителом с созданными генно-инженерным путем комплементарность определяющими областями, имеющими высокую аффинность в отношении белка p40-субъединицы IL-12/23. Пациентов рандомизировали в соотношении 1:1:1:1:1:1, с тем, чтобы они получали 1 из 6 вариантов лечения: 200 мг ABT-874, 1 дозу в неделю 0 (200 мг × 1); 100 мг ABT-874 раз в две недели (eow) в течение 12 недель (100 мг eow); 200 мг ABT-874 еженедельно в течение первых 4 недель (200 мг × 4); 200 мг ABT-874 eow в течение 12 недель (200 мг eow); 200 мг ABT-874 еженедельно в течение 12 недель (200 мг еженедельно); или плацебо. Через 12 недель все пациенты, у которых был достигнут ответ в виде по меньшей мере 75%-ного уменьшения площади участков, пораженных псориазом, и индекса тяжести заболевания (PASI 75), были включены в фазу 36-недельного продолжения слепого наблюдения/повторного лечения.
B. Пациенты
: Пациенты были выбраны в возрасте ≥18 лет с клиническим диагнозом псориаза, продолжающегося по меньшей мере 6 месяцев (что определяли на основании опроса пациентов и подтверждения диагноза путем физического осмотра исследователем), стабильного пятнистого псориаза, продолжающегося по меньшей мере 2 месяца перед скринингом и являющегося, как было определено по данным первоначального опроса субъектов, пятнистым псориазом от умеренной до тяжелой форм, характеризующимся поражением ≥10% площади поверхности тела (BSA), имеющим место при первоначальном визите, индексом PASI ≥12 баллов при первоначальном визите и, согласно общей оценке врача (PGA), имеющим при первоначальном визите по меньшей мере умеренную степень заболевания.
Пациентов признавали неподходящими, если они ранее испытывали на себе воздействие системной или биологической анти-IL-12-терапии; имели не-пятнистый псориаз; не имели возможности прервать следующие виды лечения до первоначального визита к врачу: проводили местную терапию псориаза по меньшей мере за 2 недели до визита к врачу, фототерапию ультрафиолетовым B-облучением по меньшей мере за 2 недели до визита к врачу, фототерапию псораленом - ультрафиолетовым облучением по меньшей мере за 4 недели до визита к врачу, системную терапию по меньшей мере за 4 недели до визита к врачу и биологическую терапию по меньшей мере за 12 недель до визита к врачу; имели необходимость потребления пероральных или инъецируемых кортикостероидов в процессе проведения исследования (ингалируемые кортикостероиды для стабилизации состояния здоровья были дозволены); имели обострение астмы, требующее госпитализации, в течение 10-летнего периода до скрининга; имели инфекцию или факторы риска для развития тяжелой инфекции; имели в анамнезе злокачественные заболевания, кроме успешно проведенного лечения базально-клеточной карциномы (пациентов, имеющих в анамнезе плоскоклеточную карциному, признавали неподходящими) или цервикальной карциномы in situ; или имели в анамнезе проявление значительной иммунной реакции (например, сывороточную болезнь или анафилактическую реакцию) на иммуноглобулин G-содержащего средства (например, внутривенного гамма-глобулина, слитого белка или моноклонального антитела).
Пациентам было позволено продолжать лечение лечебными шампунями, которые не содержат кортикостероидов, смягчающими средствами (не содержащими бета- или альфа-гидроксикислот) или местными кортикостероидами низкой степени разведения классов VI или VII, наносимыми на ладони, ступни, лицо, воспаленные области и паховые области в течение исследования. Нанесение указанных средств для местного лечения псориаза следовало отменять за 24 часа до визита к врачу. Недозволенной считалась вакцинация средством, содержащим жизнеспособные вирусы, в течение 1-месячного периода перед началом лечения антителом ABT-874, в процессе проведения испытаний или спустя 1 месяц после последнего введения дозы тестируемого лекарственного средства.
9
9
Появление одного из следующих клинически значимых аномальных результатов лабораторных анализов сопровождалось немедленным исключением пациента из числа испытуемых: уровень аспартаттрансаминазы или аланинтрансаминазы, более чем в 5 раз превышающий верхнюю границу нормы; уровень общего билирубина сыворотки, более чем в 3 раза превышающий верхнюю границу нормы; уровень сывороточного креатинина, более чем в 3 раза превышающего верхнюю границу нормы; уровень креатинфосфокиназы, более чем в 5 раз превышающий верхнюю границу нормы; гемоглобин <8 г/дл; количество лейкоцитов, составляющее <2×10/л; или количество тромбоцитов, составляющее <75×10/л.
C. Оценка эффективности
: Первичную оценку эффективности связывали с процентом пациентов, у которых на 12-ой неделе был достигнут ответ PASI 75, определяемый как по меньшей мере 75%-ое снижение индексов по шкале PASI относительно исходных индексов. PASI является мерой тяжести псориатических поражений (имеются в виду эритема, уплотнение и шелушение) и степени вовлечения BSA. Индексы по шкале PASI изменяются от 0 (отсутствие псориаза) до 72 (тяжелая степень тяжести заболевания) (Fredriksson T, Pettersson U. Dermatologica 1978; 157: 238-44). Другие способы оценки эффективности включают процент пациентов, которые достигли по меньшей мере PASI 75 на 1, 2, 4 и 8-ой неделях; процент пациентов, которые достигли по меньшей мере PASI 50 или PASI 90 на 1, 2, 4, 8 и 12-ой неделях; и процент пациентов, которые по шкале PGA достигли оценки «отсутствие» псориаза или «минимальная выраженность» псориаза на 12-ой неделе и на 1, 2, 4 и 8-ой неделях. Индекс PGA отражает тяжесть заболевания по 6-разрядной шкале, изменяющейся от 0 (отсутствие заболевания, или «чисто») до 5 (очень тяжелая степень) (Ko H-S. Clinical trial design in psoriasis. Presented at: 49th Meeting of the Dermatologic and Ophthalmologic Advisory Committee; March 20, 1998; Bethesda, MD).
D. Оценка безопасности
: В процессе исследования оценивали неблагоприятные явления (AE), лабораторные данные и жизненные показатели. Пациентов тщательно контролировали на предмет обнаружения признаков инфекционного, злокачественного заболевания и иммунологической реакции. Внезапные неблагоприятные явления (AE) определяли как такие явления, которые возникали между 0 и 45 днями после введения последней дозы лекарственного средства согласно схеме испытаний, или за 1 день до введения первой дозы повторного лечения (для тех пациентов, которые продолжили свое участие в 36-недельном испытании).
E. Статистический анализ:

Размер пробы рассчитывали с помощью программы nQuery Advisor4.0 (Statistical Solutions, Saugus, MA). Предполагая, что 15% пациентов в группе плацебо достигнут к 12-й неделе уровня ответа PASI 75, разработчики испытаний определили, что размер пробы 26 для каждой группы, в которой проводится лечение, должен быть адекватен для детектирования по меньшей мере 45%-ных различий между группами при сравнении с использованием точного критерия Фишера с 90% вероятностью в двустороннем тесте, с уровнем значимости, составляющим 0,05. В испытании участвовало приблизительно 180 пациентов, по 30 пациентов в каждой группе.
В популяцию пациентов, которым предполагалось начать лечение, включали всех пациентов, рандомизированных в 0-ю неделю и принимавших по меньшей мере 1 инъекцию тестируемого лекарственного средства; эту популяцию использовали для анализов эффективности. Все тесты были выполнены при α=0,05. Во всех анализах эффективности использовали условное отсутствие реактивности; любой пациент, у которого при любом по счету посещении врача, была пропущена оценка по шкале PASI или PGA, считался ареактивным при данном визите к врачу. Для оценки влияния пропущенных данных анализ чувствительности данных, полученных на 12-й неделе, завершали, используя метод переноса данных последнего наблюдения вперед. Первичный анализ ответа PASI 75 на 12-й неделе проводили, используя следующий порядок проведения множественных сравнений: 200 мг еженедельно с группой плацебо, 200 мг eow с группой плацебо, 100 мг eow с группой плацебо, 200 мг × 4 с группой плацебо и 200 мг × 1 с группой плацебо. Различие, получаемое при сравнении результатов каждого введения ABT-874 в группе пациентов, получающих лечение, с группой плацебо, на уровне среднего процента изменения оценки по шкале PASI, устанавливали с помощью вариационной статистики, с учетом индексов исходного (базового) уровня по шкале PASI. Анализ безопасности проводили на уровне популяционной безопасности, которая включала всех пациентов, получавших по меньшей мере 1 инъекцию тестируемого лекарственного средства.
II. Результаты
A. Пациенты
: Всего участвовало 180 пациентов, которых рандомизировали в 1 из 6 рассматриваемых групп (Фигура 1). Основная часть пациентов (76,7% пациентов, получавших плацебо, и 98% всех пациентов из групп, получавших ABT-874) завершила 12-недельную часть испытаний.
Пациентов распределяли по группам в соответствии с демографическими характеристиками и активностью заболевания (таблица 1). Пациентами были в основном представители мужского пола (74,4%) и белокожие (92,2%). Среднее значение вовлеченности BSA составляло 25%, а среднее значение по шкале PASI составляло 18,8.
B. Эффективность
: Процент пациентов, достигших первого рубежа в ответе PASI 75 на 12-й неделе, был статистически значительно более высоким (p<0,001) во всех группах, где вводили ABT-874 (200 мг × 1: 63,3%, 19 из 30; 100 мг eow: 93,3%, 28 из 30; 200 мг × 4: 90,0%, 27 из 30; 200 мг eow: 93,3%, 28 из 30; 200 мг еженедельно: 90,0%, 27 из 30), чем в группе плацебо (3,3%, 1 из 30). Для относительно короткого периода времени проведения этих испытаний ответы PASI 75 во всех группах ABT-874 были весьма схожи друг с другом, за исключением группы однократного введения 200 мг (200 мг × 1) (фиг.2).
Анализ подгрупп по демографическим показателям (пол, возраст, раса и вес), базовым характеристикам заболевания (анамнез псориатического артрита, оценка по шкале BSA и PASI) и базовой схемы лечения псориаза в течение 12 месяцев в период испытаний (системного биологического и небиогического, местного и фототерапевтического) показали, что у пациентов, которых в составе различных подгрупп лечили антителом ABT-874, неизменно удавалось достичь высоких уровней ответа PASI 75 на 12-й неделе.
Около 100% пациентов в группах, где вводили повышенные дозировки ABT-874, достигали по меньшей мере уровня ответа PASI 50 на 12-ой неделе (200 мг × 1: 76,7%, 23 из 30; 100 мг eow: 100,0%, 30 из 30; 200 мг eow × 4: 96,7%, 29 из 30; 200 мг eow: 96,7%, 29 из 30; 200 мг еженедельно: 100,0%, 30 из 30; плацебо: 16,7%, 5 из 30; p<0,001 при сравнении каждой из групп с группой плацебо). Процент пациентов, достигших на 12-ой неделе по меньшей мере ответа PASI 90, был статистически значим для всех групп, где больных лечили антителом ABT-874 (p<0,001), кроме одной (200 мг × 1), в отличие от группы плацебо: 200 мг × l: 16,7%, 5 из 30; 100 мг eow: 53,3%, 16 из 30; 200 мг × 4: 63,3%, 19 из 30; 200 мг eow: 76,6%, 23 из 30; 200 мг еженедельно: 53,3%, 16 из 30; и плацебо: 0%, 0 из 30. Кроме того, к 12-ой неделе значительно больше (p<0,001) пациентов во всех группах ABT-874 достигали нулевого или минимального уровня PGA (общей оценки пациента), чем в группе плацебо: 200 мг × 1: 50,0%, 15 из 30; 100 мг eow: 83,3%, 25 из 30; 200 мг × 4: 73,3%, 22 из 30; 200 мг eow: 86,7%, 26 из 30; 200 мг еженедельно: 86,7%, 26 из 30; против группы плацебо: 3,3%, 1 из 30.
Процент пациентов, достигших первого рубежа в ответе PASI 100 на 12-й неделе, был статистически значительно более высоким (p<0,001) в следующих группах, где производили лечение антителом ABT-874 (200 мг eow: 46,7%, 14 из 30; 200 мг еженедельно: 36,7%, 11 из 30), по сравнению с группой плацебо (0%, 0 из 30).
Ответ на ABT-874 был быстрым. Средний процент улучшения по шкале PASI от базовой линии повышался со временем во всех группах ABT-874 (фиг.3) и был статистически значительно более высоким для каждой из групп лечения ABT-874 по сравнению с группой плацебо во всех временных точках (p<0,001), за исключением группы 100 мг eow на 1-ой неделе, p=0,023).
C. Безопасность
: Терапия антителом ABT-874 была в основном весьма толерантной (таблица 2). Один (0,7%) пациент, которого лечили ABT-874, покинул испытания ввиду локального обеспечивания кожи; 2 (6,7%) пациента, которых лечили плацебо, вышли из программы испытаний, 1 по причине псориатической артропатии и 1 из-за обнаруженного рака яичников. У двух (1,1%) пациентов обнаружились серьезные неблагоприятные явления (AE); у 1 пациентки, получавшей плацебо, на 37-й день был диагностирован рак яичника, и 1 у одного пациента, которого лечили ABT-874 (200 мг × 1), на 10-й день был диагностирован реберный хондрит. Ни у одного пациента не обнаруживали инфаркт миокарда или церебральный инфаркт, и не было ни одного смертельного случая.
Пациенты, которым вводили любую из дозировок ABT-874, были значительно (p=0,033) более, чем пациенты, которым вводили плацебо, подвержены возникновению у них неблагоприятных явлений (AE), по меньшей мере, возможно, связанных с исследуемым лекарственным средством (ABT-874: 36,0%, 54 из 150; плацебо: 10,0%, 3 из 30; таблица 2); большинство из этих AE было связано с местом инъекции (реакция на месте инъекции, эритема, зуд или раздражение).
Большая часть этих AE была слабовыраженной (слабовыраженные AE имели место у 46,0% [у 69 из 150] пациентов, которых лечили ABT-874, и у 30,0% [у 9 из 30] пациентов, которых лечили плацебо). Наиболее частым проявлением AE была реакция на месте инъекции, возникавшая у 16,7% (у 25 из 150) пациентов, которых лечили любой из доз ABT-874 (в группе пациентов, которых лечили плацебо, никаких реакций на месте инъекции замечено не было; p=0,028; таблица 3). Не отмечено статистически значимых различий между другими случаями AE в группе пациентов, которых лечили ABT-874, и группой пациентов, которых лечили плацебо. Следующими наиболее часто встречавшимися AE были назофарингиты и инфекции верхних дыхательных путей.
Об инфекционных AE сообщили 32,8% (59 из 180) из всех участвующих в испытаниях пациентов (плацебо: 23,3%, 7 из 30; пациенты из всех групп, в которых производилось лечение ABT-874: 34,7%, 52 из 150). Наиболее частыми инфекционными AE, о которых сообщали участники любой из групп ABT-874-терапии, были назофарингиты (12,0%, 18 из 150), инфекции верхних дыхательных путей (10,7%, 16 из 150) и бронхиты и вирусные инфекции (в обоих случаях 2,7%, 4 из 150). Никаких серьезных инфекционных AE отмечено не было.
У двух пациентов в процессе испытаний были обнаружены злокачественные заболевания. У одного пациента из группы плацебо был диагностирован рак яичника, который был обнаружен на 129-й день. У одного пациента из группы ABT-874 (200 мг × 4) был диагностирован не являющийся меланомой рак кожи (плоскоклеточная карцинома), который был удален на 133-й день. В истории болезни этого пациента было удаление доброкачественной опухоли кожи в марте 2005.
Не было отмечено клинически значимых изменений гематологических, химических (включая концентрации глюкозы в крови) или жизненно важных функций по сравнению с группой плацебо.
III. Заключение
В фазе II многоцентрового, рандомизированного, двойного, слепого, плацебо-контролируемого испытания, описанного в данном примере, была продемонстрирована статистически и клинически значимая эффективность ABT-874 в лечении хронического псориаза, от умеренной до тяжелой форм. За исключением лечебной группы ABT-874, 200 мг × 1, у 90% или более пациентов во всех группах ABT-874 на 12-ой неделе был достигнут результат PASI 75 или выше, в отличие от 3,3% в группе пациентов, которых лечили плацебо. Даже в группе пациентов, которые получили только 1 дозу исследуемого лекарственного средства (200 мг × 1), у большинства (63,3%) пациентов на 12-ой неделе был по меньшей мере достигнут результат PASI 75. Кроме того, почти у 100% пациентов, которых лечили ABT-874, был достигнут результат PASI 50 или выше, который рассматривается как значительное клиническое улучшение состояния (Carlin CS, Feldman SR, Krueger JG, Menter A, Krueger GG. J.Am. Acad. Dermatol. 2004; 50: 859-66) на 12-ой неделе. Результаты, связанные с достижением вторичных рубежей, таких как PASI 90, и такие как «нулевая» или «минимальная» оценки PGA, находились в соответствии и подтверждались первичным анализом эффективности лечения.
Ответ на ABT-874 был быстрым. Статистически значимое различие между лечением пациентов с помощью плацебо и ABT-874 возникало уже в 1 неделю, согласно среднему проценту улучшения состояния по шкале PASI. Улучшение было продолжительным, длящимся в течение 12-недельного срока испытаний, даже у пациентов в группах принимаемых дозировок ABT-874, 200 мг × 1 и 200 мг × 4.
ABT-874 обладал существенной толерантностью, и большинство из неблагоприятных проявлений (AE) носили слабо выраженный характер. Несмотря на то что у пациентов, которых лечили ABT-874, вероятность возникновения AE, которые могут быть как-то связаны с тестируемым лечебным средством, была значительно выше, большинство из них было связано с AE, возникающими на месте инъекции (реакция, эритема, зуд или раздражение на месте инъекции). Не было отмечено никаких заметных ассоциаций между повышением дозы ABT-874 и повышением количества случаев AE. Следует особо отметить отсутствие миокардиальных или церебральных инфарктов.
Иммунологически-связанные явления представляют интерес в случае пациентов, принимающих антитела против IL-12/23. Наиболее часто проявляемыми AE, связанными с инфекцией, были назофарингиты, инфекция верхних дыхательных путей, бронхиты и вирусная инфекция. Никаких серьезных инфекционных AE в течение клинических испытаний обнаружено не было. Из 2 диагностированных в период испытаний злокачественных заболеваний одно, связанное с раком яичника, было диагностировано у пациента, которого лечили с помощью плацебо, а другое, связанное с не являющимся меланомой раком кожи, было диагностировано у пациента, которого лечили ABT-874, но у которого в анамнезе была зарегистрирована доброкачественная опухоль кожи.
Таким образом, была продемонстрирована статистически и клинически значимая эффективность средства ABT-874 в лечении от умеренной до тяжелой форм хронического псориаза, а также его значительная толерантность.
Пример 5: Поддержание ответа полностью человеческим моноклональным антителом ABT-874 против IL-12/IL-23 в лечении от умеренной до тяжелой форм пятнистого псориаза
Эффективность и безопасность ABT-874 оценивали в 12-недельном (фаза II) рандомизированном, контролируемом испытании и в последующей 36-недельной фазе. Задачей следующего примера было изучение поддержания ответа после приостановки лечения в течение второго 12-недельного периода этой фазы II подкожных инъекций ABT-874 при лечении от умеренной до тяжелой форм пятнистого псориаза (Ps).
b
s
a
Взрослых пациентов с Ps, с поражением ≥10% площади поверхности тела, по шкале BSA (ody urface rea), и индексем PASI ≥ 12 баллов, отбирали для этого 12-недельного двойного, слепого, плацебо-контролируемого исследования. Пациентов случайным образом определяли в 1 из 6 групп:
1) по 100 мг ABT-874 раз в две недели (eow) в течение 12 недель;
2) одну дозу в 200 мг ABT-874 в неделю 0;
3) по 200 мг ABT-874 еженедельно в течение 4 недель;
4) по 200 мг ABT-874 eow в течение 12 недель;
5) по 200 мг ABT-874 еженедельно в течение 12 недель; или
6) плацебо.
Первым рубежом был ответ ≥PASI 75 на 12-й неделе. Пациентов, достигших первого рубежа, включали в 36-недельную фазу слепого/повторного лечения. Лечение тестируемым лекарственным средством прерывали и в различное время в течение 36-недельного периода проводили мониторинг пациентов по шкале PASI, включая ответы PASI 50, PASI 75 и PASI 90. Поддержание ответа PASI оценивали в течение 24 недель.
Всего участвовало 180 пациентов, по 30 в каждой группе. Базовые характеристики были сходны между группами (все индексы средние, за исключением % мужчин): возраст - 46 лет, 74% мужчин; продолжительность течения Ps - 21 год; PASI=19; и 25%-ное поражение, по оценке BSA.
На 12-й неделе % пациентов с индексом ≥PASI 75 был статистически достоверно выше в каждой из 5 групп больных, принимавших ABT-874, чем в группе плацебо (таблица 4). На 24-й неделе у значительной части реактивных пациентов (отвечающих на лечение) с PASI 75 в группах активного лечения поддерживался ответ PASI по меньшей мере на уровне ≥PASI 50. Кроме того, у значительной части реактивных пациентов с PASI 75 в группах активного лечения поддерживался также ответ по меньшей мере на уровне ответа по шкале PASI, составляющего ≥PASI 75, а также ответ по шкале PASI, составляющий ≥PASI 90 (таблица 4 и фиг.4A-C). Процент пациентов, у которых ответ поддерживался на уровне PASI 75 в течение 24-недельного периода, отражен на фиг.4D.
<u>Таблица 4</u>
<u>24-недельная эффективность ABT-874</u>
≥PASI 75 на 12-й неделе
Поддержание ответа ≥PASI 50: 24-ая неделя по сравнению с 12-ой неделей
Поддержание ответа ≥PASI 75: 24-ая неделя по сравнению с 12-ой неделей
Поддержание ответа ≥PASI 90: 24-ая неделя по сравнению с 12-ой нед.
100 мг eow, 12 недель
93%*
71%
60%
33%
200 мг, одна доза
63%*
68%
23%
7%
200 мг, еженедельно, 4 недели
90%*
82%
60%
23%
200 мг eow, 12 недель
93%*
89%
73%
53%
200 мг, еженедельно, 12 недель
90%*
85%
83%
57%
Плацебо
3%
-
7%
7%
*p<0,001 по сравнению с плацебо, NRI.
Таким образом, ABT-874 оказался значительно более эффективным, чем плацебо, в лечении от умеренной до тяжелой форм пятнистого псориаза. У значительной части реактивных пациентов с PASI 75 ответ на уровне ≥PASI 50, ≥PASI 75 и ≥PASI 90 поддерживался на 24-й неделе после того, как активная терапия была прервана.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Специалистам в данной области должны быть известны, или же они должны смочь выявить, не выходя за рамки рутинных экспериментов, множество эквивалентов специфическим вариантам осуществления описанного здесь изобретения. Подразумевается, что все эти эквиваленты входят в объем, охватываемый следующей далее формулой изобретения.