СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОЧАСТИЦ НОЛЬ-ВАЛЕНТНОГО ЖЕЛЕЗА, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ АГЕНТОМ
METHOD OF PRODUCING ZINC-VALENT IRON MICROPARTICLES IMMOBILIZED WITH THERAPEUTIC AGENT

Изобретение относится к изготовлению металлических порошков восстановлением металлических соединений и может быть использовано в медицине при диагностике органических изменений в организме с использованием ультразвуковых волн.
Известен способ получения микрочастиц ноль-валентного железа [Junhong Wang, Xianzhao Shao, Guanghui Tian, Zhizhou Li, Weiren Bao Preparation and properties of α-Fe microparticles with high stability - V. 192, - 2017. - P. 36-39], включающий термолиз порошка железа аммония цитрата при 700°С, в атмосфере азота. В результате образуются микрочастицы ноль-валентного железа, устойчивые к окислению.
Недостатком этого способа является использование высоких температур при термолизе.
Известен способ получения микросфер на основе полиакриловой кислоты для транскатетерной артериальной эмболизации с возможностью МРТ визуализации [Huan Wang Xiao-Ya Qin Zi-Yuan Li Li-Ying Guo Zhuo-Zhao Zheng Li-Si Liu Tian-Yuan Fan. Preparation and evaluation of MRI detectable poly (acrylic acid) microspheres loaded with superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transcatheter arterial embolization - International Journal of Pharmaceutics - V. 511, Issue 2, 2016. - P. 831-839]. Микросферы получают методом обратной полимеризации. Микросферы разделяют на фракции 100-300, 300-500, 500-700 и 700-900 мкм. Необходимую фракцию микросфер выдерживают в растворе солей железа (III) хлорида и железа (II) сульфата. Затем, для начала осаждения, добавляют раствор натрия гидроксида, тем самым получая наночастицы железа оксида. Во время процесса осаждения солей железа происходит загрузка наночастиц в микросферы.
Способ является многостадийным и не предусматривает введение терапевтического агента в микросферы, что необходимо для повышения эффективности эмболизирующей терапии.
Известен способ получения магнитных наночастиц железа оксида, применяемых для терапии и диагностики злокачественных новообразований. [US 5427767 А, опубл. 27.06.1995]. Магнитные наночастицы получают методом осаждения из раствора смеси солей Fe(II) и Fe(III). Способ получения включает приготовление водного раствора хондроитин-4-сульфата при нагревании в атмосфере азота. Железо (II) хлорид растворяют в 1М растворе соли железа (III) хлорида в атмосфере азота. Свежеприготовленный раствор солей Fe(II)/Fe(III) хлоридов, медленно и по каплям добавляют в нагретый до 75°С раствор хондроитин-4-сульфата, так, чтобы осадок, образовавшийся в точке капания, немедленно растворялся. Процесс проводят в атмосфере азота. Далее, медленно добавляют заранее приготовленный и дегазированный ЗН раствор натрия гидроксида. Затем раствор титруют до рН=10. Сразу же после этого, раствор нейтрализуют до рН=7 и кипятят в течение 3 часов. После охлаждения до комнатной температуры раствор центрифугируют. Полученный супернатант подвергают диализу, используя половолоконный картридж с размером пор 3 кДа и упаривают на роторном испарителе до 250 мл, фильтруют через 0,2 мкм фильтр и автоклавируют при 121°С.
Таким способом невозможно получение микрочастиц ноль-валентного железа.
3
Известен способ получения наночастиц, состоящих из железного ядра, покрытого слоем оксида железа (II) и слоем цетил триметил аммония бромида, в качестве поверхностно активного вещества [WO 2012036978 А1, опубл. 22.03.2012]. Наночастицы получают методом осаждения из раствора, железа (III) хлорида путем добавления раствора натрия борогидрида в среде азота. Раствор натрия борогидрида добавляют капельно, далее, после осаждения осадок наночастиц промывают водой и ацетоном. После промывки, проводят пассивацию поверхности частиц в атмосфере воздух/аргон. Далее проводят отжиг наночастиц при низких температурах 150-300°С, в результате чего образовывались наночастицы состава Fe/Fe04 (ядро/оболочка).
Способ не позволяет получать частицы микронных размеров и не предусматривает введение терапевтического агента.
Известен, способ получения наночастиц ноль-валентного железа с ковалентно модифицированной органическими функциональными группами поверхностью [RU 2584288 С2, МПК (2006.01) B22F 9/24, B22F 1/00, C01G1/00, В82В 3/00, B82Y 30/00, опубл. 20.05.2016], принятый за прототип, включающий восстановление водного раствора соли гексагидрата железа (III) хлорида раствором натрия борогидрида с последующим in situ взаимодействием с водными или водно-органическими растворами 4-алкибензилдиазониевых солей для формирования ковалентной связи между органическими функциональными группами и поверхностью наночастиц.
Известный способ не может быть использован для получения микрочастиц ноль-валентного железа.
Техническим результатом предложенного способа является получение микрочастиц ноль-валентного железа, содержащих терапевтический агент.
Способ получения микрочастиц ноль-валентного железа, иммобилизованных терапевтическим агентом, также как в прототипе, включает восстановление водного раствора гексагидрата железа (III) хлорида раствором натрия борогидрида при перемешивании с последующим in situ взаимодействием с водным раствором соли 4-карбоксибензолдиазоний тозилата, магнитное сепарирование в постоянном магнитном поле, декантирование раствора, отмывание оставшихся микрочастиц последовательно водой, этанолом и ацетоном и высушивание до постоянной массы порошка.
Согласно изобретению смешивают одну часть водного раствора гексагидрата железа (III) хлорида и одну часть водного раствора натрия борогидрида в атмосфере аргона. К полученной смеси добавляют оставшиеся части водного раствора гексагидрата хлорида железа (III) и водного раствора натрия борогидрида и перемешивают в атмосфере аргона. В полученную суспензию добавляют водный раствор соли 4-карбоксибензолдиазоний тозилата и перемешивают, осаждают полученные микрочастицы в постоянном магнитном поле, раствор удаляют методом декантирования. После отмывки оставшихся микрочастиц и высушивания до постоянной массы, из порошка готовят суспензию в дистиллированной воде. Параллельно готовят растворы терапевтического и стабилизирующего агентов в дистиллированной воде. К раствору стабилизирующего агента по каплям добавляют раствор терапевтического агента, а затем добавляют приготовленную суспензию микрочастиц ноль-валентного железа. Полученную смесь тщательно перемешивают, после чего микрочастицы ноль-валентного железа осаждают воздействием постоянного магнитного поля. Супернатант отделяют от осадка методом декантирования. Осадок суспендируют в дистиллированной воде. Полученную суспензию разделяют магнитной сепарацией, осадок высушивают до постоянной массы порошка.
Предпочтительно использовать водный раствор гексагидрата железа (III) хлорида с концентрацией 2,0-5,9% и водный раствор натрия борогидрида с концентрацией 0,9-2,9%.
Предпочтительно использовать водный раствор соли 4-карбоксибензолдиазоний тозилата с концентрацией 0,8-2,5%).
Для получения раствора терапевтического агента в дистиллированной воде с концентрацией не менее 0,05% может быть использован или доксорубицин, или дактиномицин, или блеомицин, или даунорубицин.
Для приготовления раствора стабилизирующего агента может быть использован 0,05% раствор низкомолекулярного хитозана в дистиллированной воде с добавлением уксусной кислоты до рН, равного 4,16, который готовят при постоянном перемешивании и нагревании до температуры 40°С.
Для приготовления раствора стабилизирующего агента может быть использован 0,05% раствор или поли-L-лизина, или поли-D-лизина, или поли-L-орнитина, или полиэтиленимина в дистиллированной воде.
Предложенный способ позволяет получить микрочастицы ноль-валентного железа с размерами от 50 до 1000 μm с присоединенными к ним терапевтическим и стабилизирующим агентами за счет электростатических взаимодействий, обеспечиваемых наличием в их структуре функциональных групп, имеющих разноименные заряды.
Полученные микрочастицы ноль-валентного железа обладают способностью контролируемого высвобождения терапевтического агента при воздействии ультразвукового поля, а так же могут быть использованы как контрастное средство в ультразвуковой диагностике. Кроме того, размеры полученных микрочастиц ноль-валентного железа делают их перспективными для использования в качестве средства для транскатетерной артериальной хемоэмболизации при лечении гепатоцеллюлярной карциномы, а так же в качестве средства для локальной гипертермической терапии, исходя из их магнитных свойств ноль-валентного железа по сравнению с оксидами железа (таблица 1) [Анчаров А.А., Витязь П.А., Ворсина И.А., Григорьева Т.Ф., Киселева Т.Ю., Ляхов Н.З., Новакова А.А., и др. / Механокомпозиты - прекурсоры для создания материалов с новыми свойствами. / Новосибирск: Издательство сибирского отделения российской академии наук, 2010. - С. 76].
В таблице 1 представлено сравнение магнитных характеристик железа и его оксидов.
В таблице 2 представлены примеры осуществления изобретения.
На фиг. 1 изображен результат рентгенофазного анализа образцов микрочастиц ноль-валентного железа, где кривая 1 - результат анализа свежеполученного образца, кривая 2 - результат анализа образца после хранения в течение 6 месяцев.
На фиг. 2 изображен РЖ-спектр микрочастиц ноль-валентного железа.
На фиг. 3 изображен процесс получения микрочастиц ноль-валентного железа.
На фиг. 4 представлены изображения микрочастиц полученные с использованием метода сканирующей электронной микроскопии.
На фиг. 5 представлен график высвобождения доксорубицина под влиянием ультразвука (серые столбцы) и без него (черные столбцы) в растворах с различными значениями рН.
На фиг. 6 представлены снимки, полученные при ультразвуковом исследовании свиной печени с искусственно созданной кистой, где А - киста заполнена физиологическим раствором, не содержащим микрочастиц ноль-валентного железа, а В - киста, заполнена суспензией микрочастиц ноль-валентного железа в физиологическом растворе.
Пример 1.
10 мл раствора гексагидрата хлорида железа (III) с концентрацией 4,1% приготовили в трехгорлой колбе с использованием магнитной мешалки при непрерывном перемешивании. 10 мл раствора натрия борогидрида с концентрацией 1,7% приготовили в химическом стакане с использованием магнитной мешалки при непрерывном перемешивании.
Смешали по 5 мл полученных растворов и оставили при постоянном перемешивании в течение 10 минут в атмосфере аргона, поступающего из баллона с газом, подсоединенного к трехгорлой колбе.
К полученной смеси добавили оставшиеся 5 мл раствора гексагидрата железа (III) хлорида и 5 мл раствора натрия борогидрида и снова оставили при постоянном перемешивании в атмосфере аргона в течение 10 минут, получив суспензию.
Затем в химическом стакане приготовили 20 мл раствора 4-карбоксибензолдиазоний тозилата с концентрацией 1,5%, добавили полученный раствор в приготовленную суспензию и оставили при постоянном перемешивании в течение 40 минут.
Колбу с полученным полупродуктом поместили на неодимовый магнит с постоянным магнитным полем 0,3 Т для сепарирования микрочастиц. Раствор декантировали. Оставшиеся частицы последовательно отмыли водой, этанолом и ацетоном от избытка соли 4-карбоксибензолдиазоний тозилата и продуктов ее восстановления и высушили на воздухе при 60°С в течение 3 часов до постоянной массы порошка.
Полученные микрочастицы порошка исследовали методом рентгенофазового анализа с помощью рентгеновского дифрактометра Shimadzu XRD-7000S. Анализировали свежий образец микрочастиц и образец, хранившийся на воздухе в течение 6 месяцев. Результаты анализа (кривая 1 и 2 на фиг. 1) показали отсутствие протекания окислительных процессов в образцах, что подтверждает стабильность полученных микрочастиц ноль-валентного железа и образование фазы ноль-валентного железа, благодаря отсутствию на спектре полос колебаний Fe-О и ОН, характерных для оксидов железа.
-1
Инфракрасный спектр микрочастиц ноль-валентного железа, полученный с помощью спектрометра NICOLET-5700, содержит полосы колебаний валентных связей, характерные для карбоксильной группы (1700, 1600, 1410 см) (фиг. 2).
Далее, полученные микрочастицы ноль-валентного железа суспендировали в дистиллированной воде, получив суспензию микрочастиц с концентрацией 0,3%.
Параллельно приготовили раствор доксорубицина с концентрацией 0,1% в дистиллированной воде.
Раствор низкомолекулярного хитозана с концентрацией 0,05% приготовили в химическом стакане в дистиллированной воде с добавлением уксусной кислоты до значения рН, равного 4,16, при постоянном перемешивании и нагревании на магнитной мешалке с подогревом до температуры 40°С.Значение рН определяли с помощью электронного рН-метра.
Далее, к раствору хитозана по каплям добавили раствор доксорубицина и оставили при перемешивании на магнитной мешалке на 5 минут.
К образовавшейся смеси добавили суспензию микрочастиц ноль-валентного железа и оставили перемешиваться в течение 2 часов, после чего микрочастицы ноль-валентного железа отделили магнитной сепарацией, используя неодимовый магнит.
Объемное соотношение суспензии микрочастиц ноль-валентного железа, раствора низкомолекулярного хитозана и раствора доксорубицина гидрохлорида в реакционной смеси составило 1:2:1.
Супернатант отделили от осадка методом декантирования для определения концентрации доксорубицина, на поверхности микрочастиц.
Количество доксорубицина переносимого микрочастицами рассчитали по разности между изначально взятым его количеством и количеством, оставшемся в супернатанте, полученном после разделения реакционной смеси [Y. Oh, M.S. Moorthy, P. Manivasagan, S. Bharathiraja, J. Oh, Magnetic hyperthermia and pH-responsive effective drug delivery to the sub-cellular level of human breast cancer cells by modified CoFe2O4 nanoparticles, Biochimie (2017), doi: 10.1016/j.biochi.2016.11.012.].
Количество переносимого доксорубицина составило 0,179 мг на 1 мг микрочастиц ноль-валентного железа.
Осадок повторно суспендировали в дистиллированной воде, получая суспензию микрочастиц ноль-валентного железа с концентрацией 0,1%, затем, суспензию снова разделили методом магнитной сепарации.
Далее, полученные микрочастицы ноль-валентного железа высушили на воздухе при постоянной температуре 40°С в течение 12 часов в термостате. Схема получения микрочастиц ноль-валентного железа представлена на фиг. 3.
Морфологию полученных микрочастиц ноль-валентного железа изучали методом сканирующей электронной микроскопии (сканирующий электронный микроскоп Phenom ProX) (фиг. 4). Размеры полученных микрочастиц составили 50-1000 шп.
Исследование высвобождения терапевтического агента проводили при нормальных условиях и под воздействием ультразвукового поля при трех различных значениях рН. Высвобождение доксорубицина проводили при постоянной температуре 37°С и перемешивании 100 об/мин. Для проведения эксперимента использовали инкубатор Stuart SI 500 (Stuart, Великобритания). Изучение высвобождения доксорубицина проводили при трех различных значениях рН, а именно 3,3; 5,5; 7,4. Величина значений кислотности изменялась последовательно. Для проведения эксперимента готовили два раствора суспензии полученных микрочастиц ноль-валентного железа объемом 10 мл с концентрацией 0,1%. В качестве растворителя использовали смесь KCl/НCl со значением рН=3,3. Исследуемые образцы помещали в инкубатор и через установленные промежутки времени проводили отбор проб, предварительно центрифугируя образец при 7500 об/мин в течение 5 минут. Объем отбираемой пробы составлял 2 мл. После того, как проба была отобрана, проводили определение концентрации доксорубицина в ней методом УФ-спектроскопии при длине волны 480 нм. Отобранный объем замещали эквивалентным объемом свежего раствора КО/НО и продолжали изучение высвобождения. Изменение значений рН также проводили в установленные промежутки времени непосредственно в анализируемом растворе путем добавления 0,1 М раствора натрия гидроксида до достижения необходимого значения.
Изучение высвобождения доксорубицина под воздействием ультразвука проводили параллельно при условиях, аналогичных описанным выше. Отличие заключалось во внесении исследуемого образца в ультразвуковое поле с частотой 75 кГц и удельной мощностью 2 Вт/см2 на 30 секунд. Обработку ультразвуком осуществляли непосредственно перед центрифугированием и отбором проб. В качестве источника ультразвукового излучения использовали ультразвуковую ванну Elmasonic S10Н (Elma, Германия).
Сравнение результатов высвобождения доксорубицина под влиянием ультразвука и без него в растворах с различными значениями рН показывает, что ультразвук оказывает положительное влияние на высвобождение доксорубицина вне зависимости от значения рН и времени отбора проб после начала высвобождения (фиг. 5).
Для исследования контрастных свойств полученных микрочастиц использовали аппарат УЗИ Samsung SonoAce Х6. Снимок печени, на которой киста, заполнена физиологическим раствором, содержащим микрочастицы ноль-валентного железа (В на фиг. 6) демонстрирует увеличение контрастных свойств по сравнению с изображением печени, заполненной только физиологическим раствором (А на фиг. 6).
В других примерах осуществления способа, представленных в таблице 2, используют 0,05% растворы стабилизирующих агентов поли-L-лизина, поли-D-лизина, поли-L-орнитина, полиэтиленимина в дистилированной воде.