АНТИТЕЛА ПРОТИВ CSF-1R ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ANTIBODIES TO HUMAN CSF-1R AND USE THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам против CSF-1R человека (CSF-1R антителам), способам их получения, фармацевтическим композициям указанных антител и к их применению.
Предпосылки создания изобретения
Рецептор CSF-1 (CSF-1R; синонимы: рецептор M-CSF; рецептор 1 колониестимулирующего фактора макрофагов (Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor - CSF-1R), EC 2.7.10.1, протоонкоген Fms, c-fms, Swiss Prot P07333, CD115) известен с 1986 года (Coussens L. и др., Nature 320, 1986, cc.277-280). CSF-1R является фактором роста и кодируется протоонкогеном c-fms (см., например, обзор Roth P. и Stanley E.R., Curr. Top. Microbiol. ImmunoL, 181, 1992, cc.141-167).
CSF-1R является рецептором колониестимулирующего фактора макрофагов (macrophage colony stimulating factor - M-CSF, также обозначаемого CSF-1) и опосредует биологические эффекты этого цитокина (Sherr C.J. и др., Cell, 41, 1985, cc.665-676). Клонирование рецептора 1 колониестимулирующего фактора макрофагов (colony stimulating factor-1 receptor - c-fms) впервые описано в работе Roussel M.F. и др., Nature, 325, 1987, cc.549-552. В этой публикации было описано, что CSF-1R обладает трансформирующим потенциалом, зависящим от изменений в С-конце белка, включая потерю ингибирующего тирозин 969 фосфорилирования, связывающего Cbl и за счет этого регулирующего снижение регуляции рецептора (Lee P.S. и др., Embo J., 18, 1999, cc.3616-3628).
CSF-1R является одноцепочечной трансмембранной рецепторной тирозинкиназой (receptor tyrosine kinase - RTK) и представителем семейства мотивов иммуноглобулина (immunoglobulin - Ig), содержащих ферменты RTK, отличающиеся повторениями доменов Ig во внеклеточной части рецептора. Внутриклеточный домен протеин-тирозинкиназы прерывается уникальным инсертированным доменом, который также имеется у других представителей семейства III класса RTK, которые также включают рецепторы фактора роста тромбоцитов (platelet derived growth factor receptors - PDGFR), рецептор фактора роста стволовых клеток (stem cell growth factor receptor - c-Kit) и рецептор цитокина fins-like (fins-like cytokine receptor - FLT3). Несмотря на структурную гомологию среди представителей семейства рецепторов факторов роста, они проявляют различные тканеспецифичные функции. Преимущественно CSF-1R экспрессируется на клетках, происходящих от моноцитов, а также в половой сфере у женщин и в плаценте. Кроме того, экспрессия CSF-1R описана в клетках Лангерганса в коже, субпопуляции клеток гладкой мускулатуры (Inaba Т. и др., J. Biol. Chem., 267, 1992, cc.5693-5699), в В-клетках (Baker A.H. и др., Oncogene, 8, 1993, cc.371-378) и микроглие (Sawada, M., и др., Brain Res. 509 (1990) 119-124).
Основными биологическими эффектами передачи сигнала CSF-1R являются дифференциация, пролиферация, миграция и выживание кроветворных клеток-предшественниц в линию макрофагов (включая остеокласты). Активирование CSF-1R опосредуется его лигандом, M-CSF. Связывание M-CSF с CSF-1R индуцирует формирование гомодимеров и активирование киназы путем фосфорилирования тирозина (Stanley E.R. и др., Mol. Reprod. Dev., 46, 1997, cc.4-10). Дополнительная передача сигнала опосредуется р85 субъединицей PI3K и Grb2, соединяющимися с метаболическими путями PI3K/AKT и Ras/MAPK, соответственно. Эти два важные метаболические пути передачи сигнала могут регулировать пролиферацию, выживание и апоптоз. К другим передающим сигнал молекулам, которые связывают фосфорилированный внутриклеточный домен в CSF-1R, относятся STAT1, STAT3, PLCy и Cbl (Bourette R.P. и Rohrschneider L.R., Growth Factors, 17, 2000, cc.155-166).
Передача сигнала через CSF-1R выполняет физиологическую роль в иммунном ответе, в реконструкции костей и в репродуктивной системе. Было показано, что у животных с нокаутом M-CSF-1 (Pollard J.W., Mol. Reprod. Dev., 46, 1997, cc.54-61) или CSF-1R (Dai X.M. и др., Blood, 99, 2002, cc.111-120) имеются остеопетрозные, гематопоэтические, связанные с тканевыми макрофагами и репродуктивные фенотипы в соответствии с ролью CSF-1R в соответствующих типах клеток.
Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, cc.1786-1793, описывают некоторые антитела против CSF-1R, которые ингибируют действие CSF-1 (см. Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, cc.1786-1793). Ashum R.A. и др., Blood, 73, 1989, cc.827-837, описывают антитела CSF-1R. Lenda D.M. и др., Journal of immunology, 170, 2003, cc.3254-3262, описывают пониженное восстановление популяции макрофагов, пролиферацию и активирование у мышей с недостаточностью CSF-1, что приводит к пониженному тубулярному апоптозу при воспалении почки. Kitaura Н. и др., Journal of dental research, 87, 2008, cc.396-400, описывают анти-CSF-1 антитело, которое подавляет ортодонтическое движение зуба. В WO 2001/030381 описывают ингибиторы действия CSF-1, включая антисмысловые нуклеотиды и антитела, несмотря на то, что описывают только антисмысловые нуклеотиды. WO 2004/045532 относится к предупреждению метастазов и разрежения костей, а также к лечению метастазирующих форм рака с помощью M-CSF антагониста, описанного только в качестве антагонистических анти-CSF-1-антител. WO 2005/046657 относится к лечению воспалительной болезни кишечника с помощью анти-CSF-1-антител. US 2002/0141994 относится к ингибиторам колониестимулирующих факторов. WO 2006/096489 относится к лечению ревматоидного артрита с помощью анти-CSF-1-антител.
WO 2009/026303 и WO 2009/112245 относятся к анти-CSF-1R антителам.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с CSF-1R человека, отличающееся связыванием с тем же эпитопом, что и депонированное антитело DSMACC2921.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело отличается включением в качестве области CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:1.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело отличается тем, что:
а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6; или
б) вариант антитела по пункту а) имеет пересаженную область CDR, является гуманизированным или у него ослаблен Т-клеточный эпитоп.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело отличается тем, что:
а) аминокислотной последовательностью вариабельного домена тяжелой цепи является последовательность SEQ ID NO:7, и аминокислотной последовательностью вариабельного домена легкой цепи является последовательность SEQ ID NO:8; или
б) вариант антитела по пункту а) имеет пересаженную область CDR, является гуманизированным или у него ослаблен Т-клеточный эпитоп.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, связывающееся с CSF-1R человека и отличающееся указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, относится к подклассу IgG1 человека или подклассу IgG4 человека.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, включающая антитело по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также включает фармацевтическую композицию, отличающуюся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей.
Настоящее изобретение также включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для получения фармацевтической композиции.
Настоящее изобретение также включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения CSF-1R-опосредованных заболеваний.
Настоящее изобретение также включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения рака.
Настоящее изобретение также включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения разрежения костей.
Настоящее изобретение также включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для предупреждения или лечения метастазов.
Настоящее изобретение также включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения воспалительных заболеваний.
Один из объектов настоящего изобретения является антителом, связывающимся с CSF-1R человека, отличающимся включением в качестве области CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи области CDR3, имеющей последовательность SEQ ID NO:1.
Другой объект настоящего изобретения является антителом, связывающимся с CSF-1R человека, который отличается тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6; или
б) вариант антитела по пункту а) имеет пересаженную область CDR, является гуманизированным или у него ослаблен Т-клеточный эпитоп.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело отличается включением:
а) аминокислотной последовательности вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:7, и аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:8; или
б) вариант антитела по пункту а) имеет пересаженную область CDR, является гуманизированным или у него ослаблен Т-клеточный эпитоп.
-8
-12
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению связываются с CSF-1R человека со сродством, составляющим по меньшей мере от 10 моль/л до 10 моль/л.
В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению является гуманизированным антителом.
Другим объектом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи и/или вариабельный домен легкой цепи антитела по настоящему изобретению. Предпочтительно нуклеиновая кислота кодирует тяжелую цепь антитела, связывающуюся с CSF-1R человека, отличающуюся включением в качестве области CDR3 тяжелой цепи область CDR3 с последовательностью SEQ ID NO:1.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по настоящему изобретению, отличается тем, что:
а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6; или
б) вариант антитела по пункту а) имеет пересаженную область CDR, является гуманизированным или у него ослаблен Т-клеточный эпитоп.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает векторы экспрессии, содержащие нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, способные экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы, для рекомбинантного получения такого антитела.
Настоящее изобретение дополнительно включает прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, включающие вектор по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно включает способ получения рекомбинантного гуманизированного антитела по настоящему изобретению, отличающийся экспрессией по настоящему изобретению в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах и выделением указанного антитела из указанных клеток или супернатанта культуры клеток. Настоящее изобретение дополнительно включает антитело, которое можно получить таким способом рекомбинации.
Антитела по настоящему изобретению оказываются полезными для пациентов, нуждающихся в лечении, направленном на CSF-1R. Антитела по настоящему изобретению обладают новыми, обладающими признаками изобретения свойствами, которые полезны для пациента с опухолевым заболеванием, особенно с раком.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ лечения пациента больного раком, включающий введение пациенту, у которого установлен такой диагноз (и который, следовательно, нуждается в такой терапии), эффективного количество антитела, связывающегося с CSF-1R человека по настоящему изобретению. Антитело вводят предпочтительно в фармацевтической композиции.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ лечения больного раком пациента отличается введением пациенту антитела по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает применение антитела по настоящему изобретению для лечения больного раком пациента и для получения фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение включает способ получения фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, включающую антитело по настоящему изобретению, необязательно вместе с буфером и/или адъювантом, применимым для переработки антител в фармацевтических целях.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтические композиции, включающие антитело по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом носителе. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть включена в продукт или в набор.
Описание фигур
Фиг.1. Подавление роста опухолевых клеток BeWo в культуре 3D при лечении разными анти-CSF-1R моноклональными антителами в концентрации 10 мкг/мл. Ось X: жизнеспособность выражена в относительных световых единицах (ОСЕ), соответствующих содержанию АТФ в клетках (метод CellTiterGlo). Ось Y: исследованные пробы: минимальная среда (0,5% ФСБ), IgG1 мыши (mIgG1, 10 мкг/мл), IgG2a мыши (mIgG2a, 10 мкг/мл), только CSF-1, <CSF-1R> 7G5.3B6, и SC-02, клон 2-4А5. Наивысшее подавление роста, индуцированного CSF-1, наблюдают с анти-CSF-1R антителами по настоящему изобретению.
Подробное описание
I. Определения
К понятию «антитело» относятся различные формы антител, включая, но ими перечень не ограничивается, целые антитела, фрагменты антител, гуманизированные антитела, химерные антитела, антитела с делегированным эпитопом Т-клеток и другие генетически сконструированные антитела, если у них сохраняются специфические свойства по настоящему изобретению.
H
L
L
H
«Фрагменты антител» включают часть антитела полной длины, предпочтительно его вариабельный домен, или по меньшей мере его сайт связывания антитела. К примерам фрагментов антител относятся диантитела, молекулы одноцепочечных антител и полиспецифичные антитела, сформированные из фрагментов антител. Антитела scFv описаны, например, Huston J.S., Methods in EnzymoL, 203, 1991, cc.46-88. Кроме того, фрагменты антител включают одноцепочечные пептиды, обладающие свойствами домена V, связывающегося с CSF-1R, то есть способного к сборке вместе с доменом V, или доменом V, связывающимся с CSF-1R, то есть способного к сборке вместе с доменом V для функционального сайта связывания антигена и за этот счет обеспечения определенного свойства.
Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклональных антител» в контексте настоящего изобретения относится к получению молекул антител одной аминокислотной композиции.
Понятие «химерное антитело» относится к моноклональному антителу, включающему вариабельную область, т.е. область связывания, от мыши и по меньшей мере часть константной области, производной от другого источника или вида, обычно полученную методами рекомбинации ДНК. Особенно предпочтительны химерные антитела, включающие вариабельную область мыши и константную область человека. Такие химерные антитела мыши/человека являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулина, включающим сегменты ДНК, кодирующие вариабельные области иммуноглобулина крысы, и сегменты ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулина человека. К другим формам «химерных антител» по настоящему изобретению относятся те формы, у которых класс или подкласс модифицирован или изменен по сравнению с исходным антителом. Такие «химерные» антитела также обозначают «измененные и отнесенные к другому классу антитела». К способам получения химерных антител относятся традиционные способы рекомбинации ДНК и способы генной трансфекции, в настоящее время известные в данной области. См., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81, 1984, cc.6851-6855; US 5202238 и US 5204244.
Понятие «CDR-пересаженный вариант» в контексте настоящего изобретения означает вариабельный домен антитела, включающий области, определяющие комплементарность (области CDR или гипервариабельные области) из одного источника или вида, и каркасные участки (FR) из разных источников или видов, обычно полученный методами рекомбинации ДНК. Предпочтительны CDR-пересаженные варианты вариабельных доменов, включающих области CDR и участки FR человека.
Понятие «вариант с ослабленным эпитопом Т-клеток» в контексте настоящего изобретения означает вариабельный домен антитела, модифицированного для удаления или снижения иммуногенности путем удаления эпитопов Т-клеток человека (пептидные последовательности в вариабельных доменах, способные связывать молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса II). С помощью такого метода выявляют взаимодействия между боковыми цепочками аминокислот вариабельного домена и специфическими карманами связывания со связывающей бороздкой ГКГС II класса. Выявленные иммуногенные области мутируют для элиминации иммуногенности. В целом такие методы описаны, например, в WO 98/52976.
Понятие «гуманизированный вариант» в контексте настоящего изобретения означает вариабельный домен антитела, который восстанавливают из областей, определяющих комплементарность (CDR), происходящих не от человека, например, от другого вида, и от каркасных участков (FR), происходящих от человека, и который дополнительно модифицирован для того, чтобы также восстановить или улучшить связывающее сродство и специфичность исходного вариабельного домена, происходящего не от человека. Такие гуманизированные варианты обычно получают методами рекомбинации ДНК. Восстановление сродства и специфичности исходного вариабельного домена, не являющегося доменом человека, представляет критическую стадию, причем для такого восстановления применяют разные методы. В одном методе определяют, является ли полезной интродукция мутаций, так называемых обратных мутаций, в области CDR, не являющиеся областями человека, а также в участки FR, происходящие от человека. Соответствующие положения для таких обратных мутаций могут быть выявлены, например, путем анализа последовательности или анализа гомологии, выбора каркасного участка человека (метод фиксированных каркасов молекул; гомологичное соответствие или метод оптимального приближения), использования консенсусных последовательностей, отбора участков FR от нескольких разных моноклональных антител (mAb) человека, или замещением остатков, происходящих не от человека, на трехмерной поверхности с наиболее обычными остатками, обнаруженными в mAb человека («перекладка» или «облицовка»).
К антителам по настоящему изобретению также относятся такие антитела, которые обладают «консервативными модификациями последовательности», модификациями нуклеотидной и аминокислотной последовательности, которые не влияют или изменяют указанные выше свойства антитела по настоящему изобретению. Модификации могут быть интродуцированы стандартными методами, известными в данной области, например, сайт-направленным мутагенезом и ПЦР-опосредованным мутагенезом. К консервативным аминокислотным замещениям относятся те, в которых аминокислотный остаток замещен другим аминокислотным остатком со сходной боковой цепью. В данной области определены семейства аминокислотных остатков со сходными боковыми цепями. Эти семейства содержат аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, заранее рассчитанный остаток аминокислоты, не относящейся к числу незаменимых аминокислот, в анти-CSF-1R антителе человека предпочтительно может быть замещен другим аминокислотным остатком из семейства с тем же типом боковой цепи.
Аминокислотные замещения могут быть осуществлены путем мутагенеза, основываясь на молекулярном моделировании согласно описанию Riechmann L. и др., Nature, 332, 1988, cc.323-327, и Queen С.и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,1989, cc.10029-10033.
Обозначение «CSF-1R» в контексте настоящего изобретения относится к CSF-1R человека (SEQ ID No:15) CSF-1R (синонимы: CSF-1 рецептор, M-CSF рецептор; рецептор 1 колониестимулирующего фактора макрофагов, ЕС 2.7.10.1, протоонкоген Fms, c-fms, Swiss Prot P07333, CD115,) и применяется с 1986 года (Coussens L. и др., Nature, 320, 1986, cc.277-280). CSF-1R является фактором роста и кодируется протоонкогеном c-fms (обзор представлен, например, в работе Roth Р. и Stanley E.R., Curr. Top.Microbiol. ImmunoL, 181, 1992, cc.141-167).
CSF-1R является рецептором M-CSF (колониестимулирующего фактора макрофагов, также называемого CSF-1) и опосредует биологические действия этого цитокина (Sherr C.J. и др., Cell, 41, 1985, cc.665-676). Клонирование рецептора колониестимулирующего фактора-1 (также называемого c-fms) впервые описано в работе Roussel M., F., и др., Nature, 325, 1987, cc.549-552. В этой публикации показывают, что CSF-1R обладает трансформирующим потенциалом, зависящим от изменений в С-конце белка, включая утрату ингибирующего фосфорилирования тирозина 969, которое связывает Cbl и тем самым регулирует снижение регуляции рецептора (Lee P.S. и др., Embo J., 18, 1999, cc.3616-3628).
CSF-1R является одноцепочечной трансмембранной рецепторной тирозинкиназой (receptor tyrosine kinase - RTK) и представителем семейства ферментов RTK, содержащих мотив иммуноглобулина (Ig), которые отличаются повторяющимися доменами Ig во внеклеточной части рецептора. Внутриклеточный домен протеин-тирозинкиназы прерывается уникальным инсертированным доменом, который также имеется у других представителей семейства III класса RTK, которые включают рецепторы фактора роста тромбоцитов (platelet derived growth factor receptors - PDGFR), рецептор фактора роста стволовых клеток (stem cell growth factor receptor - c-Kit) и рецептор цитокина fins-like (fins-like cytokine receptor - FLT3). Несмотря на структурную гомологию среди представителей семейства рецепторов факторов роста, они проявляют различные тканеспецифичные функции. Преимущественно CSF-1R экспрессируется в клетках, происходящих от моноцитов, а также в половой сфере у женщин и в плаценте. Кроме того, экспрессия CSF-1R описана в клетках Лангерганса в коже, субпопуляции клеток гладкой мускулатуры (Inaba Т. и др., J. Biol. Chem., 267, 1992, cc.5693-5699), в В-клетках (Baker A.H. и др., Oncogene, 8, 1993, cc.371-378) и в микроглие (Sawada, M., и др., Brain Res. 509 (1990) 119-124).
-8
-9
В контексте настоящего изобретения понятия «связывание с CSF-1R человека», или «который связывается с CSF-1R человека», или «анти-CSF-1R» используют взаимозаменяемо и относят к специфическому связыванию антитела с антигеном в отношении CSF-1R человека. Связывающее сродство представляет KD-величину 1,0×10 моль/л или ниже при 35°С, предпочтительно KD-величину 1,0×10 моль/л или ниже при 35°С. Связывающее сродство определяют стандартным методом связывания, например, методом поверхностного плазменного резонанса (фирма Biacore) (см. пример 4).
Понятие «эпитоп» означает белковый детерминант, способный специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, например, аминокислот или боковых цепей Сахаров, и обычно эпитопы обладают трехмерными структурными свойствами, а также специфическим зарядом. Конформационные и неконформационные эпитопы различают тем, что связывание с первыми вариантами эпитопов, но не со вторыми, утрачиваются в присутствии денатурирующих растворителей. Предпочтительно антитело по настоящему изобретению связывается специфически с нативным, но не денатурированным CSF-1R.
Фраза «связывание с тем же эпитопом, что и депонированное антитело АСС2921» в контексте настоящего изобретения означает анти-CSF-1R антитело по настоящему изобретению, которое связывается с тем же эпитопом на CSF-1R, с которым связывается антитело<CSF-1R>7G5.3B6 (депонировано в коллекции под номером DSM ACC2921). Способность анти-CSF-1R антитела по настоящему изобретению связывать эпитоп может быть определена, используя методы, известные в этой области. Антитело в отношении CSF-1R измеряют при 25°С методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) путем анализа подавления конкурентного связывания in vitro для определения способности исследуемого антитела подавлять связывание антитела <CSF-1R> 7G5.3B6 (депонировано в коллекции под номером DSM ACC2921) с CSF-1R. Исследование может быть выполнено методом BIAcore (фирма Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Швеция), согласно описанному, например, в примере 5. В примере 5 процент (%) ожидаемого связывающего ответа антитела против CSF-1R по настоящему изобретению, конкурирующего со связыванием антитела <CSF-1R> 7G5.3B6 (депонировано в коллекции под номером DSM ACC2921), рассчитывают по формуле «100 × относительный Ответ (общая_ранняя_стабильность)/rMax», где величину rMax рассчитывают по формуле «относительный Ответ (общая_поздняя_стабильность) × молекулярная масса антитела / молекулярная масса антигена» согласно описанному в инструкциях по картированию эпитопа методом BIAcore. Минимальный связывающий ответ также рассчитывают по парам идентичных антител 1 и 2 (см. пример 5). Соответственно, полученную максимальную величину + 100%, предпочтительно 50%, устанавливают в качестве пороговой величины для существенной величины конкуренции, и таким образом, существенное связывание с тем же эпитопом (см. пример 5 по антителу <CSF-1R> 7G5.3B6 рассчитанная пороговая величина составляет 3+3=6, предпочтительно 3+1,5=4,5). Таким образом, связывание антитела с CSF-1R человека, отличающегося «связыванием с тем же эпитопом, что и <CSF-1R> 7G5.3B6 (депонировано в коллекции под номером DSM ACC2921)», обладает процентом (%) ожидаемого ответа по связыванию ниже 6, предпочтительно 4,5 (ожидаемый процент ответа по связыванию <6, предпочтительно <4,5).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению конкурируют с депонированным в коллекции антителом DSM ACC2921 за связывание с С8Р-1Рчеловека. Такое конкурентное связывание может быть определено, используя методы, известные в данной области. Антитело против CSF-1R измеряют при 25°С методом поверхностного плазменного резонанса (ППР) в анализе подавления конкурентного связывания in vitro для определения способности исследуемого антитела ингибировать связывание антитела <CSF-1R> 7G5.3B6 (депонировано в коллекции под номером DSM ACC2921) в отношении CSF-1R. Исследование может быть проведено методом BIAcore (фирма Pharmacia Biosensor AB, Упсала, Швеция), например, в примере 5.
H
Понятие «вариабельный домен» (вариабельный домен легкой цепи (vl), вариабельный домен тяжелой цепи (V)) в контексте настоящего изобретения означает каждую пару доменов легкой и тяжелой цепей, которые участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей имеют одну и ту же общую структуру, и каждый домен включает четыре каркасных участка (framework - FR), последовательности которых высоко консервативны, соединены тремя «гипервариабельными областями» (или областями, определяющими комплементарность (CDR). Каркасные участки принимают конформацию Р-слоя и области CDR могут формировать петли, соединяющие структуру Р-слоя. Области CDR в каждой цепи поддерживаются в свойственной им трехмерной структуре за счет каркасных участков и формируются вместе с областями CDR из сайта связывания антигена другой цепи. Области CDR3 тяжелой и легкой цепей антитела играют весьма важную роль в связывающей специфичности/сродстве антител по настоящему изобретению и соответственно представляют другой объект по настоящему изобретению.
В контексте настоящего изобретения понятие «антигенсвязывающая часть антитела» относится к аминокислотным остаткам антитела, ответственным за связывание антигена. Антигенсвязывающая часть антитела включает аминокислотные остатки от «областей, определяющих комплементарность (complementary determining region - CDR)». В контексте настоящего изобретения понятие «каркасный участок (framework или FR)» относится к тем вариабельным областям домена, которые отличаются от остатков гипервариабельной области. Соответственно вариабельные домены легких и тяжелых цепей антитела включают от N- к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Главным образом область CDR3 тяжелой цепи является той областью, которая наибольшим образом влияет на связывание антигена и определяет свойства антитела. Области CDR и FR определяют в соответствии со стандартным описанием Kabat E.A. и др. в кн.: «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5-е изд., изд-во Public Health Service, Национальные институты здравоохранения, Bethesda, Мэриленд, и/или те остатки, которые происходят из «гипервариабельной петли».
В контексте настоящего изобретения понятия «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» относятся к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно двухцепочечной ДНК.
В контексте настоящего изобретения понятие «аминокислота» означает группу природных карбоновых α-аминокислот, включающую аланин (по трехбуквенному коду: ala, по однобуквенному коду: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновая кислота (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gin, Q), глутаминовая кислота (glu, Е), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серии (sir, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).
Понятие «иммуноконъюгат» означает антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичными молекулами, включая цитотоксический агент, но не только его.
Понятие «индивидуум» или «субъект» подразумевает млекопитающее. К млекопитающим относятся, но ими перечень не ограничивается, домашние животные (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматы (например, люди и другие виды приматов, например, обезьяны), кролики и грызуны (например, мыши и крысы). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения индивидуумом или субъектом является человек.
Понятие «выделенное» антитело относится к антителу, выделенному из свойственной ему природной среды. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело очищено более чем до 95% или 99% чистоты, что подтверждают, например, электрофорезом (например, SDS-PAGE, изоэлектрическим фокусированием (isoelectric focusing - IEF), капиллярным электрофорезом) или хроматографически (например, ионообменная ВЭЖХ или ВЭЖХ обратной фазы). Обзор методов оценки чистоты антитела см., например, в публикации Flatman и др., J. Chromatogr. В, 848, 2007, cc.79-87.
Понятие «выделенная» нуклеиновая кислота относится к нуклеиновой кислоте, выделенной из свойственной ему природной среды. К выделенным нуклеиновым кислотам относятся молекулы нуклеиновой кислоты, содержащиеся в клетках, которые обычным образом содержат молекулы нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или локализована в хромосоме, но эта локализация отличается от природной хромосомальной локализации.
Фраза «выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая анти-CSF-1R антитело» относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим тяжелую и легкую цепи антитела (или его их фрагменты), включая такую молекулу (молекулы) нуклеиновой кислоты в одном векторе или в разных векторах, и такая молекула (молекулы) нуклеиновой кислоты содержится в одной или в нескольких локализациях в клетке-хозяине.
Понятие «нативные антитела» относится к природным молекулам иммуноглобулина различной структуры. Например, нативные IgG антитела являются гетеротетрамерными гликопротеинами массой примерно 150000 Да, состоящими из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые связаны дисульфидными связями. От N- к С-концу каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (VH), также называемую вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, затем три константных домена (СН1, СН2 и СН3). Сходным образом от N- к С-концу каждая легкая цепь содержит вариабельную область (VL), также называемую вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, затем константный домен легкой цепи (CL). Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ) исходя из аминокислотной последовательности константного домена.
Понятие «вкладыш» в контексте настоящего изобретения означает инструкции, которые обычно содержатся в коммерческих упаковках лекарственных средств и содержат информацию о назначении, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаний и/или предостережений, касающихся применения таких лекарственных средств.
В контексте настоящего изобретения понятие «процент идентичности аминокислотной последовательности» применительно к полипептидной последовательности определяют в виде процента аминокислотных остатков в исследуемой последовательности, которая идентична аминокислотным остаткам в контрольной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и интродукции гэпов, в случае необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и, не рассматривая каких-либо консервативных замещений в виде составляющей идентичности последовательности. Выравнивание для целей определения процента аминокислотной идентичности может быть достигнуто разными путями, известными специалистам в данной области, например, используя общедоступное программное обеспечение, например, BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в этой области могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая какие-либо алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения получают показатели % идентичности аминокислотных последовательностей, используя компьютерную программу ALIGN-2 для сравнения последовательностей. Компьютерная программа ALIGN-2 для сравнения последовательностей разработана фирмой Genentech, Inc., и исходный код зарегистрирован документально в Бюро регистрации авторских прав в США (U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559), где она зарегистрирована под номером U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программа ALIGN-2 общедоступна от фирмы Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния, или может быть компилирована по исходному коду. Программу ALIGN-2 следует компилировать для применения в операционной системе UNIX, включая цифровую систему UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей устанавливают с помощью программы ALIGN-2 и они не варьируются.
В тех случаях, когда программу ALIGN-2 используют для сравнения аминокислотных последовательностей, % аминокислотной идентичности данной аминокислотной последовательности А относительно, с или против данной аминокислотной последовательности Б (которая может в другом варианте называться аминокислотной последовательностью А, которая обладает или представляет определенный процент идентичности аминокислотной последовательности относительно, с или против данной аминокислотной последовательности Б), рассчитывают следующим образом:
100 раз фракция X/Y
где Х означает число аминокислотных остатков, которые оценены в качестве идентичных совпадений с помощью программы выравнивания последовательностей ALIGN-2 в таком выравнивании с помощью программы А и Б, и где Y означает общее число аминокислотных остатков в Б. Следует учесть, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности Б, % аминокислотной идентичности А относительно Б может быть неравным % аминокислотной идентичности Б к А. Если специально не определено иначе, все показатели % аминокислотной идентичности, указанные в настоящем изобретении, получают согласно описанию непосредственно в предыдущем разделе, используя компьютерную программу ALIGN-2.
II. Композиции и способы
В другом варианте осуществления объект настоящего изобретения основан, в частности, на том же эпитопе, что и антитело, депонированное в коллекции под номером DSM ACC2921. Антитела по настоящему изобретению применимы, например, для диагностики или лечения рака, воспалительных заболеваний или разрежения костей, или для предупреждения или лечения метастазов.
Примеры анти-CSF-1R антител
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитела, которые связываются с CSF-1R человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-CSF-1R антитело отличается связыванием с тем же эпитопом, что и антитело DSM ACC2921.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, связывающееся с CSF-1R человека, отличающееся тем,что:
а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6; или
б) вариант антитела по пункту а) имеет пересаженную область CDR, является гуманизированным или у него ослаблен Т-клеточный эпитоп.
Другим объектом настоящего изобретения является антитело, связывающееся с CSF-1R человека, отличающееся тем, что:
а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6; или
б) вариант антитела по пункту а) имеет пересаженную область CDR, является гуманизированным или у него ослаблен Т-клеточный эпитоп, и
обладающее одним или несколькими из следующих свойств (определенных в исследованиях, описанных в примерах 2, 3, 4, 6, 7 и 8):
- анти-CSF-1R антитело подавляет связывание CSF-1 с CSF-1R с величиной IC50 25 нг/мл или ниже, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величиной IC50 20 нг/мл или ниже;
- анти-CSF-1R антитело подавляет CSF-1-индуцированное фосфорилирование CSF-1R (в рекомбинантных клетках NIH3T3-CSF-1R) с величиной IC50 100 нг/мл или ниже, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с величиной IC50 50 нг/мл или ниже;
- анти-CSF-1R антитело подавляет рост рекомбинантных клеток NIH3T3, экспрессирующих CSF-1R человека (SEQ ID No:15) на 80% или более (по сравнению с положением, при котором отсутствует антитело), предпочтительно на 90% или более;
- анти-CSF-1R антитело подавляет рост опухолевых клеток BeWo (ATCC CCL-98) на 80% или более (при концентрации антитела Юмкг/мл по сравнению с положением, при котором отсутствует антитело), предпочтительно на 90% или более;
- анти-CSF-1R антитело подавляет дифференциацию макрофагов (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-CSF-1R антитело подавляет выживание моноцитов с величиной IC50 1,5 нМ или ниже, предпочтительно с величиной IC50 1,0 нМ или ниже); или
-9
- анти-CSF-1R антитело связывается с CSF-1R человека со связывающим сродством KD=1,0×10 моль/л или ниже при 35°С.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-CSF-1R антитело по настоящему изобретению включает в последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH) а) область CDR1H, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:3, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:3, б) область CDR2H, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:2, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:2, и в) область CDR3H, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:1, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), включающая а) область CDR1H, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:3, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:3, б) область CDR2H, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:2, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:2, и в) область CDR3H, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:1, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:1, содержит замещения (например, консервативные замещения), инсерции или делеции относительно контрольной последовательности, но анти-CSF-1R антитело, включающее такую последовательность, сохраняет способность связываться с CSF-1R.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-CSF-1R антитело по настоящему изобретению включает в последовательности вариабельного домена легкой цепи (VL) а) область CDR1L, обладающую аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности SEQ ID NO:6, или включающую замещения 1, 2 или 3 аминокислотных остатков относительно последовательности SEQ ID NO:6, б) область CDR2L, обладающую аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности SEQ ID NO:5, или включающую замещения 1, 2 или 3 аминокислотных остатков относительно последовательности SEQ ID NO:5, и в) область CDR3L, обладающую аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности SEQ ID NO:4, или включающую замещения 1, 2 или 3 аминокислотных остатков относительно последовательности SEQ ID NO:4.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), включающая а) область CDR1L, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:6, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:6, б) область CDR2L, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:5, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:5, и в) область CDR3L, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:4, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:4, содержит замещения (например, консервативные замещения), инсерции или делеции относительно контрольной последовательности, но анти-CSF-1R антитело, включающее такую последовательность, сохраняет способность связываться с CSF-1R.
В другом объекте настоящего изобретения анти-CSF-1R антитело по настоящему изобретению
- включает в последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH) а) область CDR1H, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:3, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:3, б) область CDR2H, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:2, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:2, и в) область CDR3H, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:1, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:1, а также включает последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL) г) имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:6, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:6, д) область CDR2L, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:5, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:5, и е) область CDR3L, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:4, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:4.
В другом объекте настоящего изобретения анти-CSF-1R антитело по настоящему изобретению
- включает в последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH)
а) область CDR1H, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную
последовательности SEQ ID NO:3, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно
последовательности SEQ ID NO:3, б) область CDR2H, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную
последовательности SEQ ID NO:2, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно
последовательности SEQ ID NO:2, и в) область CDR3H, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную
последовательности SEQ ID NO:1, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно
последовательности SEQ ID NO:1, а также включает в последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL) г) область CDR1L, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную
последовательности SEQ ID NO:6, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:6, д) область CDR2L, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную
последовательности SEQ ID NO:5, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:5, и е) область CDR3L, имеющую аминокислотную последовательность, идентичную
последовательности SEQ ID NO:4, или включающую 1, 2 или 3 аминокислотных замещения относительно последовательности SEQ ID NO:4; и
- анти-CSF-1R антитело имеет одно или несколько из следующих свойств (определенных в исследованиях, описанных в примерах 2, 3, 4, 6, 7 и 8):
- анти-CSF-1R антитело ингибирует связывание CSF-1 с CSF-1R с величиной IC50=25 нг/мл или ниже, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с величиной IC50 20 нг/мл или ниже;
- анти-CSF-1R антитело подавляет индуцированное CSF-1 фосфорилирование CSF-1R (в рекомбинантных клетках NIH3T3-CSF-1R) с величиной IC50=100 нг/мл или ниже, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с величиной IC50=50 нг/мл или ниже;
- анти-CSF-1R антитело подавляет рост рекомбинантных клеток NIH3T3, экспрессирующих CSF-1R человека (SEQ ID No:15) на 80% или более (по сравнению с положением, при котором отсутствует антитело), предпочтительно на 90% или более;
- анти-CSF-1R антитело подавляет рост опухолевых клеток BeWo (ATCC CCL-98) на 80% или более (при концентрации антитела 10 мкг/мл; и по сравнению с положением, при котором отсутствует антитело), предпочтительно на 90% или более;
- анти-CSF-1R антитело подавляет дифференциацию макрофагов (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-CSF-1R антитело подавляет выживание моноцитов с величиной IC50=1,5 нМ или ниже, предпочтительно с величиной IC50=1,0 нМ или ниже); или
-9
- анти-CSF-1R антитело связывается с CSF-1R человека с величиной связывающего сродства KD=1,0×10 моль/л или ниже при 35°С.
Методы рекомбинации и композиции
Антитела по настоящему изобретению предпочтительно получают методами рекомбинации. Такие методы широко известны в данной области и включают экспрессию белка в клетках прокариот и эукариот с последующим выделением полипептида антитела и обычно очистку до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии белка экспрессирующие нуклеиновые кислоты, кодирующие легкие и тяжелые цепи или их фрагменты, инсертируют в векторы экспрессии стандартными методами. Экспрессию проводят в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, например, клетках СНО, клетках NSO, клетках SP2/0, клетках НЕК293, клетках COS, дрожжах или в клетках Е. coli, и антитело выделяют из этих клеток (из супернатанта или после лизиса клеток).
Рекомбинантное получение антител известно в данной области и описано, например, в обзорных статьях Makrides S.C., Protein Expr. Purif., 17, 1999, cc.183-202; Geisse S. и др., Protein Expr. Purif., 8, 1996, cc.271-282; Kaufman R.J., Mol. BiotechnoL, 16, 2000, cc.151-161; Werner R.G., Drug Res., 48, 1998, cc.870-880.
Антитела могут быть в целых клетках, в клеточном лизате или находиться в частично очищенной или в существенно очищенной форме. Очистку проводят для уничтожения других клеточных компонентов или других контаминантов, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая щелочную/SDS обработку, центрифугирование в градиенте CsCI, колоночную хроматографию, агарозный гель-электрофорез, а также другими известными в данной области методами. См. кн.: Ausubel F. и др. «Current Protocols in Molecular Biology», 1987, изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, Нью-Йорк.
Экспрессию в клетках NSO описывают, например, Barnes L.M. и др., Cytotechnology, 32, 2000, cc.109-123; Barnes L.M. и др., Biotech. Bioeng., 73, 2001, cc.261-270. Временную экспрессию описывают, например, Durocher Y. и др., Nucl. Acids. Res., 30, 2002, с.Е9. Клонирование вариабельных доменов описывают Orlandi R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1989, cc.3833-3837; Carter Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1992, cc.4285-4289; Norderhaug L. и др., J. Immunol. Methods, 204, 1997, cc.77-87. Предпочтительную систему временной экспрессии (НЕК 293) описывают Schlaeger E.-J., Christensen K., Cytotechnology, 30, 1999, cc.71-83, а также Schlaeger E.-J., J. Immunol. Methods, 194, 1996, cc.191-199.
Контрольные последовательности, применимые для прокариот, включают, например, промотор, необязательно последовательность оператора и сайт связывания рибосомы. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, энхансеры и сигналы полиаденилирования.
Нуклеиновая кислота является «оперативно связанной», если она помещена в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК предпоследовательности или секреторного лидера оперативно связана с ДНК полипептида, если он экспрессируется в качестве препротеина, участвующего в секреции полипептида; промотор или энхансер, оперативно связанный с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы, оперативно связанный с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, что облегчает трансляцию. В целом понятие «оперативно связанный» означает, что будучи связанными последовательности ДНК соприкасаются и, в случае секреторной лидерной последовательности, соприкасаются в рамке считывания. Однако энхансеры не должны соприкасаться. Связывание сопровождается лигированием по соответствующим сайтам рестрикции. Если таких сайтов нет, синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры применяют в соответствии с обычной практикой.
Моноклональные антитела соответствующим образом отделяют от культуральной среды обычными способами очистки иммуноглобулинов, например, с применением белка А-сефарозы, хроматографии на гидроксилапатите, гель-электрофореза, диализа или аффинной хроматографии. ДНК и РНК, кодирующие моноклональные антитела, легко выделять и секвенировать, используя обычные методы. Клетки гибридомы могут служить в качестве источника такой ДНК и РНК. Будучи выделенной, ДНК может быть инсертирована в векторы экспрессии, которые затем трансфецируют в клетки-хозяева, например, клетки НЕК 293, клетки СНО или клетки миеломы, которые иначе не вырабатывают иммуноглобулиновый белок, для получения синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты аминокислотной последовательности анти-CSF-1R антитела, получены разными методами, известными в данной области. К этим методам относятся, но ими перечень не ограничивается, выделение из природного источника (в случае природных вариантов аминокислотной последовательности) или получение олигонуклеотид-опосредованным (или сайт-направленным) мутагенезом, ПЦР-мутагенез и кассетный мутагенез ранее полученного варианта или версии без вариантов гуманизированного анти-CSF-1R антитела.
Вариабельные домены тяжелой и легкой цепи по настоящему изобретению комбинируют с последовательностями промотора, сайта инициации трансляции, константной области, 3’-нетранслируемой области, полиаденилирования и терминации транскрипции для формирования конструкций вектора экспрессии. Конструкции экспрессии тяжелой цепи и легкой цепи могут быть объединены в одном векторе, трансформироваться одновременно, трансфецироваться сериями или трансфецироваться по отдельности в клетки-хозяева, которые затем гибридизируют для формирования единых клеток-хозяев, экспрессирующих обе цепи.
В контексте настоящего изобретения понятия «клетки», «линия клеток» и «культура клеток» применяют взаимозаменяемо и все перечисленные понятия также относятся к потомству клеток. Таким образом, понятия «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первичные клетки субъекта и культуры клеток, полученные из них, независимо от числа пересевов. Также следует понимать, что все потомство клеток может быть не строго идентичным по содержанию ДНК из-за случайных или непреднамеренных мутаций. К этим понятиям также относятся варианты потомства клеток, у которых имеется та же функция или биологическое действие, которые были подвергнуты скринингу среди первоначально трансформированных клеток.
Обозначение «часть Fc» относится к части антитела, которая непосредственно не участвует в связывании антитела с антигеном, но проявляет различные эффекторные функции. Понятие «часть Fc антитела» известно специалистам в данной области и связано с расщеплением антител папаином. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей антитела или иммуноглобулины делятся на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно поделены на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgAl и IgA2. По константным областям тяжелой цепи разные классы иммуноглобулинов называют α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Часть Fc антитела непосредственно участвует в антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC) и комплемент-зависимой цитотоксичности (complement dependent cytotoxicity- CDC), основанной на активировании комплемента, связывании C1q и связывании рецептора Fc. Активирование комплемента (CDC) инициируется связыванием фактора комплемента C1q с частью Fc большинства подклассов IgG антител. Хотя влияние антитела на систему комплемента зависит от определенных условий, связывание с C1q вызывается определенными сайтами связывания в части Fc. Такие сайты связывания известны в данной области и описаны, например, Boackle R.J. и др., Nature, 282, 1979, cc.742-743, Lukas T.J. и др., J. ImmunoL, 127, 1981, cc.2555-2560, Brunhouse R., Cebra J.J., Mol. ImmunoL, 16, 1979, cc.907-917, Burton D.R. и др., Nature, 288, 1980, cc.338-344, Thommesen J.E. и др., Mol. ImmunoL, 37, 2000, cc.995-1004, Idusogie E.E. и др., J. ImmunoL, 164, 2000, cc.4178-4184, Hezareh M. и др., J. Virology, 75, 2001, cc.12161-12168, Morgan A. и др., Immunology, 86, 1995, cc.319-324, ЕР 0307434. Такими сайтами, например, являются L234, L235, D270, N297, Е318, К320, К322, Р331 и Р329 (нумерация индекса EU по Kabat E.A., см. ниже). Антитела подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 обычно проявляют активирование комплемента и связывание C1q и С3, но антитела подкласса IgG4 не активируют систему комплемента и не связывают C1q и C3.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению включает часть Fc, происходящую от человека, и предпочтительно все другие части константных областей человека. В контексте настоящего изобретения понятие «часть Fc, происходящая от антитела человека» означает часть Fc антитела человека, которая или является частью Fc антитела человека подкласса IgG1, IgG2, IgG3, или IgG4, предпочтительно частью Fc антитела человека подкласса IgG1, мутантную часть Fc антитела человека подкласса IgG1 (предпочтительно с мутацией по положениям L234A+L235A), часть Fc антитела человека подкласса IgG4 или мутантную часть Fc антитела человека подкласса IgG4 (предпочтительно с мутацией по положению S228P). Наиболее предпочтительны константные области тяжелой цепи человека последовательности SEQ ID NO:11 (подкласс IgG1 человека), SEQ ID NO:12 (подкласс IgG1 человека с мутациями по положениям L234A и L235A), SEQ ID NO:13 (подкласс IgG4 человека) или SEQ ID NO:14 (подкласс IgG4 человека с мутацией по положению S228P).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению отличается тем, что константные цепочки происходят от антител человека. Такие константные цепочки известны в данной области и описаны, например, Kabat Е.А. (см., например, Johnson G., Wu Т.Т., Nucleic Acids Res., 28, 2000, cc.214-218). Например, соответствующая константная область тяжелой цепи человека включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9. Например, соответствующая константная область легкой цепи человека включает аминокислотную последовательность константной области легкой цепи каппа SEQ ID NO:10. Также предпочтительно, чтобы антитело происходило от антитела мыши и включало основу вариабельной последовательности антитела мыши по Kabat.
Иммуноконъюгаты
Настоящее изобретение также предусматривает иммуноконъюгаты, включающие анти-CSF-1R антитело по настоящему изобретению, конъюгированное с одним или несколькими цитотоксическими агентами, например, химиотерапевтическими агентами или лекарственными средствами, агентами - ингибиторами роста, токсинами (например, белковыми токсинами, токсинами ферментативного действия бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или их фрагментами) или радиоактивными изотопами.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгатом является конъюгат антитела с лекарственным средством, в котором антитело конъюгировано с одним или несколькими лекарственными средствами, включая, но, не ограничиваясь ими, майтанзиноид (см. US 5208020, 5416064 и ЕР 0425235 В1); ауристатин, например, монометилауристатиновые части молекулы DE и DF (ММАЕ и MMAF) (см. US 5635483, 5780588 и 7498298); доластатин; калихиамицин или его производное (см. US 5712374, 5714586,5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296; Hinman и др., Cancer Res., 53, 1993, cc.3336-3342; Lode и др., Cancer Res., 58, 1998, cc.2925-2928); антрациклин, например, дауномицин или доксорубицин (см. Kratz и др., Current Med. Chem., 13, 2006, cc.477-523; Jeffrey и др., Bioorganic & Med. Chem. Letters, 16, 2006, cc.358-362; Torgov и др., Bioconj. Chem., 16, 2005, cc.717-721; Nagy и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 2000, cc.829-834; Dubowchik и др., Bioorg. & Med. Chem. Letters, 12, 2002, cc.1529-1532; King и др., J. Med. Chem., 45, 2002, cc.4336-4343; US 6630579); метотрексат; виндезин; таксан, например, доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел и ортатаксел; трихотецин; и СС1065.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат включает антитело, которое согласно описанию настоящего изобретения конъюгировано с ферментативно активным токсином или его фрагментом, включая, но ими не ограничиваясь, цепочку А дифтерийного токсина, несвязывающиеся действующие фрагменты дифтерийного токсина, цепочку А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosd), цепочку А рицина, цепочку А абрина, цепочку А модексина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецины.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
В другом варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат включает антитело, которое согласно описанию настоящего изобретения конъюгировано с радиоактивным атомом для формирования радиоконъюгата. Множество радиоактивных изотопов доступно для получения радиоконъюгатов. К примерам относятся At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu. Если радиоконъюгат применяют для обнаружения, он может представлять радиоактивный атом для сцинтиографических исследований, например, tc99m или 1123, или спиновую метку для томографии ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) (также называемую магнитно-резонансной томаграфией (МРТ)), например, йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганей или железо.
Конъюгаты антитела и цитотоксический агент могут быть получены, используя разнообразные бифункциональные соединяющее белок агенты, например, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитил)пропионат, сукцинимидил-4-(Н-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан, бифункциональные производные имидоэфиров (например, диметиладипимидат HCl), действующие сложные эфиры (например, дисукцинимидил суберат), альдегиды (например, глутаральдегид), бис-азидо соединения (например, бис(р-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (например, бис-(р-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (например, толуол 2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин может быть получен согласно описанию Vitetta и др., Science, 238, 1987, с.1098. Углерод-14-меченая 1-изотиосианатобензил-3-метилдиэтилен триаминпентауксусная кислота является примером хелатирующего агента для конъюгации радионуклида с антителом. См. WO 94/11026. Линкер может быть «расщепляемым линкером», облегчающим высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетку. Например, могут применяться кислотолабильный линкер, чувствительный к пептидазам линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari и др., Cancer Res., 52, 1992, cc.127-131; US 5208020).
В контексте настоящего изобретения детально рассматриваются иммуноконъюгаты или ADC, но перечень не ограничивается конъюгатами, полученными с реагентами перекрестного скрещивания, включая, но ими не ограничиваясь, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, и коммерческий продукт (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат) (например, фирмы Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Иллинойс, США).
Способы лечения и композиции
Настоящее изобретение включает способ лечения пациента, нуждающегося в таком лечении, отличающийся введением пациенту терапевтически эффективного количества антитела по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение включает применение антитела по настоящему лечению для терапии.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены CSF-1R антитела по настоящему изобретению для применения в лечении «заболеваний, опосредованных CSF-1R,» или CSF-1R антитела по настоящему изобретению для применения при получении лекарственного средства, предназначенного для лечения «заболеваний, опосредованных CSF-1R», которые могут быть описаны следующим образом:
Имеется 3 разных механизма, с помощью которых передача сигнала CSF-1R вероятно участвует в росте опухоли и метастазов. Первый механизм заключается в том, что экспрессию CSF-лиганда и рецептора выявляют в опухолевых клетках, возникающих в женской репродуктивной системе (грудь, яичники, эндометрий, шейка матки) (Scholl S.M. и др., J. Natl. Cancer Inst., 86, 1994, cc.120-126; Kacinski B.M., Mol. Reprod. Dev., 46, 1997, cc.71-74; Ngan H.Y. и др., Eur. J. Cancer, 35, 1999, cc.1546-1550; Kirma N. и др., Cancer Res, 67, 2007, cc.1918-1926), и экспрессия ассоциирована с ростом ксенотрансплантата рака груди, а также с плохим прогнозом у пациентов с раком груди. Обнаружены две точечные мутации в CSF-1R примерно у 10-20% исследованных в одном эксперименте пациентов с острым миелоцитным лейкозом, хроническим миелоцитным лейкозом и миелодисплазией, и обнаружена одна из мутаций, нарушающая оборот рецептора (Ridge S.A. и др., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87, 1990, cc.1377-1380). Однако данные по этим мутациям нельзя было подтвердить в последующих исследованиях (Abu-Duhier F.M. и др., Br. J. HaematoL, 120, 2003, cc.464-470). Мутации также были обнаружены в некоторых случаях гепатоклеточного рака (Yang D.H. и др., Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 3, 2004, cc.86-89) и идиопатического миелофиброза (Abu-Duhier F.M. и др., Br. J. HaematoL, 120, 2003, cc.464-470).
Пигментный виллонодулярный синовит и теносиновиальные гигантоклеточные опухоли могут быть результатом транслокации, которая приводит к слиянию гена M-CSF с геном коллагена COL6A3 и выражается в сверхэкспрессии M-CSF (West R.B. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 2006, cc.690-695). Предполагают, что эффект места ответственен за образуемую опухолевую массу, которая состоит из клеток моноцитов, привлеченных клетками, которые экспрессируют M-CSF. Теносиновиальные гигантоклеточные опухоли являются более мелкими опухолями, которые можно относительно легко удалить с пальцев, на которых они в большинстве случаев располагаются. Пигментный виллонодулярный синовит более агрессивен, поскольку он может заново возникнуть в крупных суставах и от него не так легко избавиться хирургически.
Второй механизм основан на блокировании передачи сигнала через М-CSF/CSF-1R в местах расположения метастазов в костях, которые вызывает остеокластогенез, разрежение костей и остеолитические костные язвы. Установлено, что рак груди, множественная миелома и рак легких являются примерами рака, который формирует метастазы к костям и вызывают остеолитическую костную болезнь, приводящую к осложнениям в состоянии скелета. M-CSF, высвобождаемый клетками опухоли и стромой, вызывает дифференциацию кроветворных клеток - предшественниц миелоидных моноцитов, в зрелые остеокласты, действуя совместно с активатором рецептора активатора фактора транскрипции каппа В (receptor activator of nuclear factor-kappa В ligand - RANKL). В ходе этого процесса M-CSF действует в качестве пермиссивного фактора путем передачи сигнала о выживании на остеокласты (Tanaka S. и др., J. Clin. Invest., 91, 1993, cc.257-263). Подавление активности CSF-1R в ходе дифференциации и созревания остеокластов анти-CSF-1R антителом предположительно нарушает сбалансированные действия остеокластов, которые вызывают остеолитическое заболевание и ассоциированные связанные со скелетом изменения в метастазирующей опухоли. Если рак груди, рак легких и множественная миелома обычно приводят к остеолитическим повреждениям, метастазы к костям при раке простаты первоначально имеют остеобластическое происхождение, в ходе которого повышенное действие по формированию костей приводит к «незрелым костям», которая отличается от типичной пластинчатой структуры здоровых костей. При прогрессировании заболевания костные разрушения проявляют существенный остеолитический компонент, а также высокие уровни в сыворотки разрежения костей, и подтверждают, что может быть полезной терапия, направленная на разрежение костей. В настоящее время показано, что биофосфанаты подавляют формирование остеолитических язв и снижают число связанных со скелетом событий только у мужчин с метастатическим раком простаты, неподдающимся лечению гормонами, но на этой стадии их воздействие на остеобластические повреждения сомнительно и бисфосфанаты не были эффективны в предупреждении метастазирования костей или у пациентов с метастатическим раком простаты, отвечающим на лечение гормонами. Продолжается исследование в клинике эффекта антирезорбтивных агентов при смешанном остеолитическом/остеобластическом раке простаты (Choueiri M.B. и др., Cancer Metastasis Rev., 25, 2006, cc.601-609; Vessella R.L. и Согеу Е., Clin. Cancer Res., 12 (20 часть 2), 2006, cc.6285s-6290s).
Третий механизм основан на предшествующем наблюдении, заключающемся в том, что опухоль-ассоциированные макрофаги, обнаруженные в плотных злокачественных опухолях груди, простаты, яичника и шейки матки, коррелируют с плохим прогнозом (Bingle L. и др., J. PathoL, 196, 2002, cc.254-265; Pollard J.W., Nat. Rev. Cancer, 4, 2004, cc.71-78). Макрофаги рекрутируются к опухоли действием M-CSF и других хемокинов. Макрофаги затем могут участвовать в прогрессировании опухоли через секрецию ангиогенных факторов, протеаз и других факторов роста и цитокинов и могут быть блокированы путем ингибирования передачи CSF-1R сигнала. Ранее Zins K. и др. (Zins K. и др., Cancer Res., 67, 2007, cc.1038-1045) показали, что экспрессия миРНК фактора некроза опухоли альфа (TNF-альфа), M-CSF или их обоих может снизить рост опухоли в модели ксенотрансплантата мыши от 34% до 50% после внутриопухолевой инъекции соответствующей миРНК. Нацеливающаяся на фактор TNF-альфа, секретируемый клетками SW620 человека, миРНК снижает уровни M-CSF мыши и приводит к уменьшению макрофагов в опухоли. Кроме того, лечение ксенотрансплантата опухоли MCF7 антигенсвязывающим фрагментом, направленным против M-CSF, действительно приводит к 40% подавлению роста опухоли, отменяет устойчивость к химиотерапевтическим средствам и улучшает выживаемость мышей при введении в комбинации с химиотерапевтическими средствами (Paulus Р. и др., Cancer Res., 66, 2006, cc.4349-4356).
Тумор-связанные макрофаги (ТАМ) являются только одним из примеров возникающей связи между хроническим воспалением и раком. Имеется дополнительное доказательство связи между воспалением и раком, поскольку многие хронические заболевания ассоциированы с повышенным риском возникновения рака, причем рак возникает в местах хронического воспаления и химические медиаторы воспаления обнаружены во многих формах рака; делеция клеточных медиаторов воспаления подавляет развитие экспериментальных форм рака и длительное применение противовоспалительных агентов снижает риск возникновения некоторых форм рака. Связь с раком имеется у ряда воспалений, среди которых бактерия Н. pylori, индуцирующая гастрит, связана с раком желудка, шистосомоз связан с раком мочевого пузыря, HHVX связан с саркомой Капоши, эндометриоз связан с раком яичника и простатит связан с раком простаты (Balkwill F. и др., Cancer Cell, 7, 2005, cc.211-217). Макрофаги являются ключевыми клетками в хроническом воспалении и по-разному реагируют на окружающую микросреду. Имеется два типа макрофагов, которые считают крайними в континууме функциональных состояний: макрофаги Ml участвуют в реакциях 1 типа. Эти реакции включают активирование микробными продуктами и последующее уничтожение патогенных микроорганизмов, что приводит к образованию реакционноспособных кислородсодержащих интермедиантов. Другую крайность представляют макрофаги М2, участвующие в реакциях 2 типа, которые индуцируют клеточную пролиферацию, состояние воспаления и адаптивный иммунитет и индуцируют ремоделирование тканей, ангиогенез и репарацию (Mantovani А. и др., Trends Immunol., 25, 2004, cc.677-686). Хроническое воспаление, приводящее к устойчивой неоплазии, обычно ассоциируется с макрофагами М2. Основным цитокином, опосредующим воспалительные реакции, является фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа), который, что следует из его названия, может стимулировать противоопухолевый иммунитет и геморрагический некроз в высоких дозах, но ранее также было установлено, что он экспрессируется опухолевыми клетками и действует в качестве промотора опухоли (Zins K. и др., Cancer Res., 67, 2007, cc.1038-1045; Balkwill R, Cancer Metastasis Rev., 25, 2006, cc.409-416). Специфическая роль макрофагов в отношении опухоли все еще нуждается в лучшем понимании, включая потенциальную пространственную и временную зависимость от их функции и значимости для определенных типов опухолей.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения описаны CSF-1R антитела по настоящему изобретению для применения в лечении рака. Понятие «рак» в контексте настоящего изобретения может означать, например, рак легких, немелкоклеточный рак легких (НМРЛ), бронхоальвеолярный рак легких, рак костей, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную форму меланомы, рак матки, рак яичника, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак в области желудка, рак толстой кишки, рак груди, рак матки, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидных желез, рак надпочечников, карциному мягких тканей, рак уретры, рак пениса, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, рак почки, рак почечной лоханки, мезотелиому, гепатоклеточный рак, рак желчного пузыря, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), формы рака спины, глиому стволовой части мозга, мультиформную глиобластому, астроцитому, шваному, эпендимому, медуллобластому, менингиому, плоскоклеточную карциному, аденому гипофиза, лимфому, лимфолейкоз, в том числе устойчивые формы какой-либо из указанных выше форм рака или комбинацию одной или нескольких указанных выше форм рака. Предпочтительно такая форма рака является раком груди, яичника, шейки матки, легких или простаты. Предпочтительно такие формы рака дополнительно отличаются экспрессией или сверхэкспрессией CSF-1 или CSF-1R. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения представлены CSF-1R антитела по настоящему изобретению для применения в одновременном лечении первичных опухолей и новых метастазов.
Таким образом, в другом варианте осуществления настоящего изобретения антитела против CSF-1R по настоящему изобретению предусмотрены для применения в лечении периодонтита, гистиоцитоза X, остеопороза, болезни Педжета, разрежения костей из-за лечения рака, околопротезного остеолизиса, индуцированного глюкокортикоидом остеопороза, ревматоидного артрита, псориатического артрита, остеоартрита, воспалительного артридита и воспаления.
Rabello D. и др., Biochem. Biophys. Res. Commun., 347, 2006, cc.791-796, показывают, что единичные нуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphism - SNP) в гене CSF1 проявляют положительную связь с агрессивным периодонтитом: воспалительным заболеванием околозубных тканей, приводящим к потере зубов из-за рассасывания альвеолярного отростка.
Гистиоцитоз Х (также называемый гистиоцитозом клеток Лангерганса) является пролиферативным заболеванием дендритных клеток Лангерганса, которые проявляют дифференциацию в остеокласты в костях и внекостных повреждений гистиоцитозных клеток Лангерганса. Клетки Лангерганса происходят от циркулирующих моноцитов. Повышенные уровни M-CSF, измеренные в сыворотке и в повреждениях, коррелируют с тяжестью заболевания (da Costa С.Е. и др., J. Exp.Med., 201, 2005, cc.687-693). Это заболевание первоначально распространяется среди пациентов детского и подросткового возраста и его начинают лечить с помощью химиотерапии, если заболевание становится системным или рецидивирующим.
Патофизиология остеопороза опосредуется утратой остеобластов, формирующих кости, и повышенным зависящим от остеокластов рассасыванием костей. Вспомогательные данные, описанные Cenci и др., показывают, что инъекция анти-M-CSF антитела сохраняет плотность костей и подавляет рассасывание костей у мышей с удаленными яичниками (Cenci S. и др., J. Clin. Invest., 105, 2000, cc.1279-1287). В последнее время выявлена потенциальная связь постклимактерического разрежения костей из-за недостаточности эстрогенов и установлено, что наличие Т-клеток, вырабатывающих TNF-альфа, влияет на костный метаболизм (Roggia С.и др., Minerva Med., 95, 2004, cc.125-132). Возможным механизмом может быть индукция M-CSF под действием TNF-альфа in vivo. Важную роль M-CSF в TNF-альфа-индуцированном остеокластогенезе подтверждают действием антитела, направленным против М-CSF, в результате чего блокируется индуцированный TNF-альфа остеолизис у мышей и тем самым вызывается образование ингибиторов потенциальных мишеней передачи сигнала через CSF-1R для воспалительного артрита (Kitaura Н. и др., J. Clin. Invest, 115, 2005, cc.3418-3427).
Болезнь Педжета является вторым наиболее распространенным метаболическим расстройством костей после остеопороза, при котором фокальные нарушения повышенных костных изменений приводят к осложнениям, например, костной боли, деформации, патологическим переломам и глухоте. Мутации в четырех генах были установлены и показано, что они регулируют нормальную функцию остеокластов и способствуют развитию у индивидуума болезни Педжета и других родственных расстройств: мутации по типу инсерций в гене TNFRSF11A, который кодирует активатор рецептора ядерного фактора (nuclear factor - NF) kappaB (RANK) - критического регулятора функции остеокластов, инактивирующие мутации гена TNFRSF11B, который кодирует остеопротегерин (ложный рецептор для лиганда RANK.), мутации в гене sequestosome I (SQSTM1), который кодирует важный каркасный белок в метаболическом пути NFkappaB и мутации в гене валозин-содержащего белка (VCP). Этот ген кодирует VCP, который участвует в нацеливании ингибитора NFkappaB для разрушения протеасомами (Daroszewska А. ис1 Ralston S.H., Nat. Clin. Pract. Rheumatol., 2, 2006, cc.270-277). Нацеленные на CSF-1R ингибиторы обеспечивают благоприятную возможность для непосредственного блокирования дерегулирования передачи сигнала через RANKL и привносят дополнительное лечение к применяемым в настоящее время бисфосфонатам.
Противораковая терапия вызывает разрежение костей, особенно у пациентов с раком груди и раком простаты, что является дополнительным указанием на то, что нацеленный на CSF-1R ингибитор может препятствовать разрежению костей (Lester J.E. и др., Br. J. Cancer, 94, 2006, cc.30-35). При улучшенном прогнозе на ранней стадии рака груди долгосрочные последствия адъювантных терапий становятся более важными, поскольку некоторые типы терапии, включая химиотерапию, облучение, ингибиторы ароматазы и удаление яичников, влияют на метаболизм костей путем снижения минеральной плотности костей, приводя к повышенному риску остеопороза и ассоциированных переломов (Lester J.E. и др., Br. J. Cancer, 94, 2006, cc.30-35). Эквивалентом адъювантной терапии с применением ингибитора ароматазы при раке груди является терапия, направленная на удаление андрогенов при раке простаты, которая приводит к уменьшению минеральной плотности костей и существенно увеличивает риск связанных с остеопорозом переломов (Stoch S.A. и др., J. Clin. Endocrinol. Metab., 86, 2001, cc.2787-2791).
Направленное подавление сигнального пути CSF-1R вероятно полезно при других показаниях, а также когда к типам нацеливаемых клеток относятся остеокласты и макрофаги, например, лечение специфических осложнений в ответ на замену сустава в качестве последствия ревматоидного артрита. Перелом трансплантата из-за околопротезного разрежения кости и последующей утраты протеза является тяжелым осложнением при замене сустава и требует повторного хирургического вмешательства, что представляет большую социально-экономическую нагрузку для конкретного пациента и для системы здравоохранения. В настоящее время нет одобренной медикаментозной терапии для предупреждения или подавления околопротезного остеолизиса (Drees P. и др., Nat. Clin. Pract. RheumatoL, 3, 2007, cc.165-171).
Индуцированный глюкокортикоидами остеопороз, который является другим показателем к применению ингибитора CSF-1R, способного предупредить разрежение кости после длительного применения глюкокортикоида, которое получают в качестве результата различных состояний, среди которых хроническое обструктивное заболевание легких, астма и ревматоидный артрит (Guzman-Clark J.R. и др., Arthritis Rheum., 57, 2007, cc.140-146; Feldstein A.C. и др., Osteoporos. Int., 16, 2005, cc.2168-2174).
Ревматоидный артрит, псориатический артрит и воспалительный артрит по сути являются потенциальными показателями применения ингибиторов передачи сигнала через CSF-1R, поскольку они состоят из макрофагового компонента и представляют разную степень костной деструкции (Ritchlin С.Т. и др., J. Clin. Invest., Ill, 2003, cc.821-831). Остеоартрит и ревматоидный артрит являются воспалительным аутоиммунным заболеванием, вызванным накоплением макрофагов в соединительной ткани и инфильтрацией макрофагов в синовиальную жидкость, которое по меньшей мере частично опосредуется М-CSF. Campbell I.K. и др., J. Leukoc. Biol., 68, 2000, cc.144-150, показали, что М-CSF вырабатывается клетками ткани сустава человека (хондроцитами, синовиальными фибробластами) in vitro и выявляется в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом, подтверждая, что он участвует в пролиферации синовиальной ткани и инфильтрации макрофагов, ассоциированной с патогенезом заболевания. Подавление передачи сигнала через CSF-1R предположительно контролирует число макрофагов в суставе и облегчает боль от ассоциированного разрушения кости. Для минимизации побочных эффектов и для дополнительного объяснения воздействия передачи сигнала CSF-1R при таких симптомах, один из способов заключается в специфическом подавлении CSF-1R без нацеливания бесчисленного множества других киназ, например, киназы Raf.
В предшествующей литературе сообщают о корреляции повышенной циркуляции M-CSF с плохим прогнозом и прогрессированием атеросклероза при хроническом поражении коронарной артерии (Saitoh Т. и др., J. Am. Coll. CardioL, 35, 2000, cc.655-665; Ikonomidis I. и др., Eur. Heart. J., 26, 2005, cc.1618-1624); M-CSF влияет на процесс атеросклероза, способствуя формированию пенистых клеток (макрофагов с захваченным окисленным липопротеидом низкой плотности (LDL)), которые экспрессируют CSF-1R и представляют исходную бляшку (Murayama Т. и др., Circulation, 99, 1999, cc.1740-1746).
Экспрессия и передача сигнала M-CSF и CSF-1R обнаружены в активированной микроглие. Микроглия, которая постоянно присутствует в макрофагах центральной нервной системы, может быть активирована различными повреждениями, включая инфекцию и травмы. M-CSF рассматривают в качестве ключевого регулятора воспалительных ответов в мозге, и уровни M-CSF повышены при инфекции ВИЧ-1, энцефалите, болезни Альцгеймера и опухолях мозга. Микроглиоз в качестве последствия аутокринной передачи сигнала через M-CSF/CSF-1R приводит к индукции воспалительных цитокинов и оксидов азота, которые высвобождаются, что было показано, например, используя экспериментальную модель поражения нейронов (Нао A.J. и др., Neuroscience, 112, 2002, cc.889-900; Murphy G.M., Jr., и др., J. Biol. Chem., 273, 1998, cc.20967-20971). Установлено, что микроглия, которая обладает повышенной экспрессией CSF-1R, окружает бляшки при болезни Альцгеймера и у трансгенных мышей с предшественником амилоидного белка V717F, представляющих модель болезни Альцгеймера (Murphy G.M., Jr., и др., Am. J. PathoL, 157, 2000, cc.895-904). С другой стороны, у мышей линии ор/ор с умеренной микроглией в мозге происходит фибриллярное отложение белка А-бета и утрата нейронов по сравнению с нормальным контролем, из чего следует предположение, что микроглия действительно несет нейропротекторную функцию при развитии болезни Альцгеймера, поскольку она утрачена у мышей линии ор/ор (Kaku М. и др., Brain Res. Brain Res. Protoc., 12, 2003, cc.104-108).
Экспрессия и передача сигнала M-CSF и CSF-1R ассоциированы с воспалительной болезнью кишечника (WO 2005/046657). Понятие «воспалительная болезнь кишечника» относится к тяжелым хроническим расстройствам пищеварительного тракта, отличающимся хроническим воспалением в разных местах желудочно-кишечного тракта, и особенно включает язвенный колит и болезнь Крона.
Антитело по настоящему изобретению отличается тем, что антитело, связывающееся с CSF-1R человека, отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения рака.
Антитело по настоящему изобретению отличается тем, что антитело, связывающееся с CSF-1R человека, отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения разрежения костей.
Настоящее изобретение представляет антитело, отличающееся связыванием с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для предупреждения или лечения метастазов.
Настоящее изобретение представляет антитело, отличающееся связыванием с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения воспалительных заболеваний.
Настоящее изобретение включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения рака или в другом варианте для получения лекарственного средства для лечения рака.
Настоящее изобретение включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения разрежения костей или в другом варианте для получения лекарственного средства для лечения разрежения костей.
Настоящее изобретение включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для предупреждения или лечения метастазов или в другом варианте для получения лекарственного средства для предупреждения или лечения метастазов.
Настоящее изобретение включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения воспалительных заболеваний или в другом варианте для получения лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению подавляет связывание CSF-1 с CSF-1R с величиной IC50=25 нг/мл или ниже, предпочтительно с величиной IC50=20 нг/мл или ниже. Величина IC50 по подавлению связывания CSF-1 с CSF-1R может быть определена согласно указанному в примере 2.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению подавляют CSF-1-индуцированное фосфорилирование CSF-1R (в рекомбинантных клетках NIH3T3-CSF-1R) с величиной IC50=100 нг/мл или ниже, предпочтительно с величиной IC50=50 нг/мл или ниже, более предпочтительно с величиной IC50=25 нг/мл или ниже. Величина IC50 CSF-1-индуцированного фосфорилирования CSF-1R может быть определена согласно указанному в примере 3.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела подавляют рост рекомбинантных клеток NIH3T3, экспрессирующих CSF-1R человека (SEQ ID No:15), на 80% или более (по сравнению с положением, при котором отсутствует антитело), предпочтительно на 90% или более. Процент подавления роста определяют согласно указанному в примере 6, в котором измеряют процент выживания. По проценту выживания рассчитывают процент подавления роста следующим образом: % подавления роста=100 -% выживания. Например, <CSF-1R> 7G5.3B6 демонстрирует подавление роста клеток NIH3T3, экспрессирующих CSF-1R, на 100-0=100%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению стимулируют рост рекомбинантных клеток NIH3T3, экспрессирующих мутантный CSF-1R L301S Y969F человека (SEQ ID No:16), на 5% или более (по сравнению с положением, при котором отсутствует антитело), предпочтительно на 20% или более. Процент стимуляции роста определяют согласно указанному в примере 6, в котором измеряют процент выживаемости. Исходя из процента выживаемости, рассчитывают процент стимуляции следующим образом: % стимуляции роста=-(100-%выживания). Например, <CSF-1R> 7G5.3B6 показывает стимуляцию роста мутантного CSF-1R человека, экспрессирующего клетки NIH3T3-(100-0)=-(100-140) %=+40%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению ингибируют рост опухолевых клеток BeWo (ATCC CCL-98) на 80% или более (при концентрации антитела 10 мкг/мл; и по сравнению с положением, при котором отсутствует антитело), предпочтительно на 90% или более. Процент подавления роста определяют согласно указанному в примере 7. Например, <CSF-1R> 7G5.3B6 демонстрирует подавление роста опухолевых клеток BeWo на 101%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению ингибируют дифференциацию макрофагов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению подавляют выживание моноцитов с величиной IC50=1,5 нМ или ниже, предпочтительно с величиной IC50=1,0 нМ или ниже. Подавление выживаемости моноцитов определяют согласно указанному в примере 8.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения антитела против CSF-1R, который отличается тем, что последовательность нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую цепь антитела человека класса IgG1, связывающегося с SF-1R человека по настоящему изобретению, причем указанная модифицированная нуклеиновая кислота и нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь указанного антитела, инсертированы в вектор экспрессии, и указанный вектор инсертирован в эукариотические клетки-хозяева, а кодируемый белок экспрессируется и выделяется из клеток-хозяев или из супернатанта.
Фармацевтические составы
Понятие «фармацевтический состав» относится к препарату, который представлен в такой форме, что она допускает эффективность биологического действия действующего ингредиента, содержащегося в ней, и которая не содержит дополнительных компонентов, которые неприемлемо токсичны для субъекта, которому могут ввести состав.
В другом объекте настоящего изобретения предусматривают композицию, например, фармацевтическую композицию, содержащую одно моноклональное антитело или комбинацию моноклональных антител, или антигенсвязывающую часть моноклонального антитела по настоящему изобретению, которые переработаны вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
Понятие «фармацевтически приемлемый носитель» в фармацевтическом составе в отличие от действующего ингредиента нетоксичен для субъекта. К фармацевтически приемлемым носителям относятся, но ими перечень не ограничивается, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант. В контексте настоящего изобретения к понятию «фармацевтически приемлемый носитель» относятся какие-либо или все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и отсрочивающие абсорбцию/ресорбцию агенты и др., которые физиологически совместимы. Предпочтительно носитель применим для инъекции или инфузии.
Композицию по настоящему изобретению можно вводить разными способами, известными в данной области. Специалистами признано, что путь и/или способ введения может варьировать в зависимости от желаемого результата.
К фармацевтически приемлемым носителям относятся стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Применение таких сред и агентов для фармацевтически действующих веществ известно в данной области. Помимо воды носителем может быть, например, изотонический буферный солевой раствор.
Независимо от выбранного способа введения соединения по настоящему изобретению, которые можно применять в соответствующей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции по настоящему изобретению перерабатывают в фармацевтически приемлемые дозированные формы обычными методами, известными специалистам в данной области.
Реальные уровни дозирования действующих ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут варьировать таким образом, чтобы получить количество действующего ингредиента, эффективное для достижения требуемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способы введения без токсичности для пациента (эффективного количества). Выбранные уровни дозирования могут зависеть от различных фармакокинетических факторов, включая действие определенных применяемых композиций по настоящему изобретению, или их сложных эфиров, солей или амидов, способа введения, времени введения, темпов экскреции определенного применяемого соединения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, применяемых в комбинации с определенными применяемыми композициями, от возраста, пола, массы тела, состояния, общего состояния здоровья и предшествующей истории болезни пациента, подвергаемого лечению, и от других факторов, известных в данной области медицины.
Настоящее изобретение включает применение антител по настоящему изобретению для лечения пациента, больного раком, особенно раком толстой кишки, легких или поджелудочной железы.
Настоящее изобретение также включает способ лечения пациента с таким заболеванием.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ получения фармацевтической композиции, включающей эффективное количество антитела по настоящему изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем, и применение антитела по настоящему изобретению применительно к такому способу.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает антитело по настоящему изобретению в эффективном количестве для получения фармацевтического агента, предпочтительно вместе с фармацевтически приемлемым носителем, для лечения пациента больного раком.
Настоящее изобретение также предусматривает применение антитела по настоящему изобретению в эффективном количестве для получения фармацевтического агента, предпочтительно вместе с фармацевтически приемлемым носителем, для лечения пациента больного раком.
Продукты
В другом объекте настоящего изобретения предусматривают продукт, содержащий материалы, применимые для лечения, предупреждения и/или диагностики описанных выше расстройств. Продукт включает контейнер и этикетку или вкладыш на поверхности или предоставляемый вместе с контейнером. Соответствующими контейнерами могут быть, например, бутыли, флаконы, шприцы, пакеты для внутривенного раствора и др. Контейнеры могут быть сделаны из различных материалов, например, из стекла или пластика. Контейнер содержит композицию, которая может быть представлена отдельно или в комбинации с другой композицией, эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностики состояния и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может быть пакетом для внутривенного раствора или флаконом с пробкой, которую можно проколоть подкожной инъекционной иглой). По меньшей мере один действующий агент в композиции является антителом по настоящему изобретению. Этикетка или вкладыш указывают, что композиция применима для лечения состояния выбора. Кроме того, продукт может включать (а) первый контейнер с заключенной в нем композицией и (б) второй контейнер с заключенной в нем композицией, которая включает другой цитотоксический или иной терапевтический агент. Продукт в этом варианте осуществления настоящего изобретения может дополнительно содержать вкладыш в упаковку, извещающий, что композиции могут применяться для лечения определенного состояния. В другом варианте или дополнительно продукт также может включать второй (или третий) контейнер, включающий фармацевтически приемлемый буфер, например, бактериостатическую воду для инъекции, фосфатно-солевой буфет, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие материалы, требуемые с позиций коммерции или исходя из нужд потребителя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Следует иметь в виду, что какие-либо из указанных выше продуктов могут включать иммуноконъюгат по настоящему изобретению вместо анти-CSF-1R антитела или дополнительно помимо него.
Приведенные ниже примеры и последовательности предназначены для лучшего понимания настоящего изобретения, область охвата которого обозначена формулой изобретения. Следует учитывать, что модификации могут быть осуществлены в указанных ниже методах без отклонения от духа настоящего изобретения.
Депонирование антител
Линия клеток
Номер депонирования в коллекции
Дата депонирования
<CSF-1R> 7G5.3B6
DSMACC2921
10.06.2008
Описание последовательностей
SEQ ID NO:1 - CDR3 тяжелой цепи, <CSF-1R> 7G5.3B6
SEQ ID NO:2 - CDR2 тяжелой цепи, <CSF-1R> 7G5.3B6
SEQ ID NO:3 - CDR1 тяжелой цепи, <CSF-1R> 7G5.3B6
SEQ ID NO:4 - CDR3 легкой цепи, <CSF-1R> 7G5.3B6
SEQ ID NO:5 - CDR2 легкой цепи, <CSF-1R> 7G5.3B6
SEQ ID NO:6 - CDR1 легкой цепи, <CSF-1R> 7G5.3B6
SEQ ID NO:7 - вариабельный домен тяжелой цепи, <CSF-1R> 7G5.3B6
SEQ ID NO:8 - вариабельный домен легкой цепи, <CSF-1R> 7G5.3B6
SEQ ID NO:9 - константная область тяжелой цепи гамма 1
SEQ ID NO:10 - константная область легкой цепи к
SEQ ID NO:11 - константная область тяжелой цепи, производная от IgG1 человека
SEQ ID NO:12 - константная область тяжелой цепи, производная от IgG1 человека с мутациями по положениям L234A и L235A
SEQ ID NO:13 - константная область тяжелой цепи, производная от IgG4 человека
SEQ ID NO:14 - константная область тяжелой цепи, производная от IgG4 человека с мутацией по положению S228P
SEQ ID NO:15 - CSF-1R (wt CSF-1R) дикого типа
SEQ ID NO:16 - CSF-1R L301S Y969F мутантная.
Последующие примеры, последовательности и фигуры предусмотрены для лучшего понимания настоящего изобретения, истинная область охвата которого определяется приводимой формулой настоящего изобретения. Следует учитывать, что модификации могут быть получены в ходе установленных ниже процедур, не отклоняясь от духа настоящего изобретения.
III. Примеры
Пример 1. Получение линии гибридомных клеток, вырабатывающих анти-CSF-1R антитела
Процедура иммунизации мышей NMRI
Мышей NMRI иммунизируют вектором экспрессии pDisplay™ (фирма Invitrogen, США), кодирующим внеклеточный домен huCSF-1R, с помощью электропорации. Каждую мышь 4 раза иммунизируют 100 мкг ДНК. Если установлено, что титры анти-huCSF-1R в сыворотке достаточны, дополнительно однократно иммунизируют с помощью 50 мкг смеси 1:1 huCSF-1R ECD/химеры huCSF-1R ECDhuFc в 200 мкл ФСБ внутривенно за 4 и 3 суток до слияния.
Антиген-специфичный метод ELISA
Анти-CSF-1R титры в сыворотки иммунизированных мышей определяют с помощью антиген-специфичного метода ELISA
2
0,3 мкг/мл химеры huCSF-1R-huFc (растворимого внеклеточного домена) захватывают пластиной со страптавидином (фирма MaxiSorb; MicroCoat, Делавэр, номер в каталоге 11974998/МС1099) с 0,1 мг/мл биотинилизированного анти-Fcγ (фирма Jackson ImmunoResearch., номер в каталоге 109-066-098) и пероксидазой хрена (horse radish peroxidase - НРР)-конъюгированного F(ab’) против IgG мыши (фирма GE Healthcare, Великобритания, номер в каталоге NA9310V), разведенного 1/800 в ФСБ/0,05% Tween20/0,5% БСА. Сыворотку из всех пункций разводят 1/40 в ФСБ/0,05% Tween20/0,5% БСА и серийно разводят до 1/1638400. Разведенную сыворотку добавляют в лунки. Разведенную сыворотку добавляют во все лунки. Сыворотку до получения пункции используют в качестве отрицательного контроля. Серийные разведения мышиного Mab3291 против CSF-1R человека (фирма R&D Systems, Великобритания) от 500 нг/мл до 0,25 нг/мл используют в качестве положительного контроля. Все компоненты инкубируют вместе в течение 1,5 ч, лунки промывают 6 раз с помощью ФСБТ (ФСБ/0,2% Tween20) и проводят исследования со свежеприготовленным раствором ABTS (1 мг/мл) (ABTS: 2,2’-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) в течение 10 мин при комнатной температуре. Поглощение измеряют при 405 нм.
Получение гибридом
4
Лимфоциты мышей могут быть выделены и гибридизированы с линией клеток миеломы мыши, используя основанные на ПЭГ стандартные протоколы для получения гибридом. Получаемые гибридомы затем подвергают скринингу на выработку специфичных к антигену антител. Например, суспензии из отдельных клеток лимфоцитов, полученных из селезенки иммунизированных мышей, гибридизируют с клетками миеломы мыши P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL-1580), не секретирующими Ag8, с 50% ПЭГ. Клетки высевают в количестве примерно 10 в плоскодонные 96-луночные планшеты для микротитрования с последующим двухнедельным инкубированием в селективной среде. Затем отдельные лунки подвергают скринингу методом ELISA для выявления анти-CSF-1R моноклональных IgM и IgG антител человека. В случае интенсивного роста гибридом секретирующие антитело гибридомы пересевают, повторяют скрининг и в случае подтверждения положительного результата по IgG человека анти-CSF-1R моноклональные антитела могут быть субклонированы методом FACS. Стабильные субклоны затем культивируют in vitro для выработки антитела в среду для культуры ткани для описания.
Культуры гибридом
2
Полученные гибридомы muMAb культивируют в среде RPMI 1640 (фирма PAN, номер в каталоге Р04-17500), обогащенной 2 мМ L-глутамином (фирма GIBCO, номер в каталоге 35050-038), 1 мМ Na пирувата (фирма GIBCO, номер в каталоге 11360-039), 1×NEAA (фирма GIBCO, номер в каталоге 11140-035), 10% ФСТ (фирма РАА, номер в каталоге А 15-649), 1×пенициллина-стрептомицина (Pen Strep, фирма Roche, номер в каталоге 1074440), 1×Nutridoma CS (фирма Roche, номер в каталоге 1363743), 50 мкМ меркаптоэтанола (фирма GIBCO, номер в каталоге 31350-010) и 50 ЕД/мл IL-6 мыши (фирма Roche, номер в каталоге 1 444 581) при 37°С и 5% CO.
Пример 2. Ингибирование связывания CSF-1 с CSF-1R (метод ELISA)
Исследование проводят в 384-луночных планшетах для микротитрований (фирма MicroCoat, Делавэр, номер в каталоге 464718) при комнатной температуре. После каждой стадии инкубирования планшеты промывают трижды ФСБТ.
2
Вначале на планшеты наносят 0,5 мг/мл козьего биотинилированного анти-Fcγ F(ab’) (фирма Jackson ImmunoResearch., номер в каталоге 109-006-170) в течение 1 ч.

Затем лунки блокируют ФСБ, обогащенным 0,2% Tween-20 и 2% БСА (фирма Roche Diagnostics GmbH, Делавэр) в течение 0,5 ч. Иммобилизуют 75 нг/мл химеры huCSF-1R-huFc (растворимого внеклеточного домена) на планшете в течение 1 ч. Затем разведения очищенных антител в ФСБ/0.05% Tween 20/0,5% БСА инкубируют в течение 1 ч. После добавления смеси 3 нг/мл CSF-1 (фирма Biomol, Делавэр, номер в каталоге 60530), 50 нг/мл биотинилированного анти-CSF-1 клона BAF216 (фирма R&D Systems, Великобритания) и 1:5000 разведенного стрептавидина HRP (фирма Roche Diagnostics GmbH, Делавэр, номер в каталоге 11089153001) в течение 1 ч планшеты промывают 6 раз с помощью ФСБТ. Анти-CSF-IR SC-02 антитело, клон 2-4А5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США), которое ингибирует взаимодействие лиганда-рецептора, применяют в качестве положительного контроля. Планшеты обрабатывают свежеприготовленным субстратным раствором ВМ blue POD (продукт ВМ blue: 3,3’-5,5’-тетраметилбензидин, фирма Roche Diagnostics GmbH, Делавэр, номер в каталоге 11484281001) в течение 30 мин при комнатной температуре. Поглощение измеряют при 370 нм. Все анти-CSF-1R антитела показывают существенное подавление связывания CSF-1 с CSF-1R (см. табл.1). Анти-CSF-IR SC-02 антитело, клон 2-4А5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США), которое подавляет взаимодействие лиганда-рецептора, применяют в качестве контроля.
Таблица 1
Расчет величин IC50 по подавлению взаимодействия CSF-1/CSF-1R
Антитело
Подавление IC50 CSF-1 /CSF-1R [нг/мл]
<CSF-1R> 7G5.3B6
18,8
SC-02, клон 2-4А5
30,9
Пример 3. Подавление CSF-1 -индуцированного фосфорилирования CSF-1R в рекомбинантных клетках NIH3T3-CSF-1R
3
4,5×10 клеток NIH 3Т3, инфицированных ретровирусным вектором экспрессии с CSF-1R полной длины, культивируют в среде DMEM (фирма РАА номер в каталоге Е 15-011), с 2 мМ L-глутамина (фирма Sigma, номер в каталоге G7513, 2 мМ натрия пирувата, 1×аминокислотами, не являющимися незаменимыми, 10% FKS (фирма РАА, номер в каталоге А 15-649) и 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина (фирма Sigma, номер в каталоге Р4333 [10 мг/мл]) до полного слияния. Затем клетки промывают в среде DMEM без сыворотки (фирма РАА номер в каталоге Е15-011), обогащенной натрием селенитом [5нг/мл] (фирма Sigma, номер в каталоге S9133), трансферрином [10 мкг/мл] (фирма Sigma, номер в каталоге Т8158), БСА [400 мкг/мл] (фирма Roche Diagnostics GmbH, номер в каталоге 10735078), 4 мМ L-глутамином (фирма Sigma, номер в каталоге G7513), 2 мМ натрием пируватом (фирма Gibco, номер в каталоге 11360), 1×аминокислотами, не являющимися незаменимыми, (фирма Gibco, номер в каталоге 11140-035), 2-меркаптоэтанолом [0,05 мМ] (фирма Merck, номер в каталоге М7522), 100 мкг/мл пенициллина-стрептамицина (фирма Sigma, номер в каталоге Р4333), и инкубируют в 30 мкл той же среды в течение 16 ч, чтобы допустить повышенную регуляцию рецептора. Добавляют 10 мкл разведенных анти-CSR-lR антител к клеткам в течение 1,5 ч. Затем клетки стимулируют 10 мкл 100 нг/мл huM-CSF-1 (фирма Biomol номер в каталоге 60530) в течение 5 мин. После инкубирования супернатант удаляют, клетки промывают дважды 80 мкл ледяного ФСБ и добавляют 50 мкл свежеприготовленного ледяного лизирующего буфера (150 мМ NaCl/20 мМ Tris рН 7,5/1 мМ EDTA/1 мМ EGTA/1% Triton X-100/1 таблетка ингибитора протеазы (фирма Roche Diagnostics GmbH номер в каталоге 1836170) на 10 мл буфера/10 мкл/мл ингибитора фосфатазы коктейля 1 (фирма Sigma номер в каталоге Р-2850, 100×Stock)/10 мкл/мл ингибитора протеазы 1 (фирма Sigma номер в каталоге Р-5726, 100×исходный раствор)/10 мкл/мл 1 М NaF). Через 30 мин на льду планшеты интенсивно встряхивают на шейкере для планшетов в течение 3 мин и затем центрифугируют 10 мин при 2200 об/мин (в центрифуге Heraeus Megafuge 10).

Наличие фосфорилированного и суммарного рецептора CSF-1 в лизате клеток исследуют методом ELISA. Для обнаружения фосфорилированного рецептора применяют набор фирмы R&D Systems (номер в каталоге DYC3268-2) по инструкциям производителя. Для обнаружения суммарного CSF-1 R иммобилизуют 10 мкл лизата на планшете за счет применения иммобилизованного антитела, содержащегося в наборе. Затем добавляют разведенное 1:750 биотинилированное анти-CSF-1R антитело BAF329 (фирма R&D Systems) и разведенный 1:1000 конъюгат стрептавидина-HRP. Через 60 мин обрабатывают свежеприготовленным раствором ABTS и определяют поглощение. Результат рассчитывают в виде процента положительного контроля без антитела и выражают соотношение величин фосфо/общего рецептора. Отрицательный контроль определяют без добавления M-CSF-1. Анти-CSF-1R SC-02, клон 2-4А5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США, см. также Sherr C.J. и др., Cell, 41, 1985, cc.665-676), который ингибирует взаимодействие лиганда-рецептора, применяют в качестве контроля.
Таблица 2
Расчет величин IC<sub>50</sub> по ингибированию фосфорилирования рецептора CSF-1
Антитело
IC50 фосфорилирования CSF-1 R [нг/мл]
<CSF-1R> 7G5.3B6
<11,0
SC-02, клон 2-4А5
412,0
Пример 4. Определение сродства анти-CSF-1R антител с CSF-1 R

Инструмент: BIACORE A100
Чип: СМ5 (Biacore BR-1006-68)
Соединение: соединение с амином
Буфер: ФСБ (Biacore BR-1006-72), рН 7,4, 35°С
Для измерений сродства 36 мкг/мл антител против Fey мыши (козьих, фирма Jackson Immuno Reasearch JIR115-005-071) соединяют с поверхностью чипа для захвата антител против CSF-1R. CSF-1R ECD (фирма R&D-Systems 329-MR или самостоятельно субклонированный вектор pCMV-presS-HisAvitag-hCSF-1R-ECD) добавляют в раствор в разных концентрациях. Ассоциацию измеряют с помощью инъекции CSF-1R в течение 1,5 мин при 35°С; диссоциацию измеряют промывкой поверхности чипа буфером в течение 10 мин при 35°С. Анти-CSF-IR SC-02, клон 2-4А5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США; см. также Sherr C.J. и др., Cell, 41, 1985, cc.665-676), которое ингибирует взаимодействие лиганда-рецептора, применяют в качестве контроля.
Для расчета кинетических параметров применяют модель Langmuir 1:1.
Таблица 3
Данные по сродству, полученные методом ППР (BIACORE<sup></sup> А100) при 35°С
Антитело
K<sub>D</sub> (нМ)
k<sub>a</sub> (1/мсек)
k<sub>d</sub> (1/сек)
t<sub>1/2</sub> (мин)
<CSF-1R> 7G5.3B6
0,61
8,ОЕ+06
4.9Е-03
2,37
SC-02, клон 2-4А5
2,73
5.09Е+05
1.39Е-03
8,31
Пример 5. Картирование эпитопа анти-CSF-1R моноклональных антител, основанное на перекрестной конкуренции, за счет использования метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР)

Инструмент: BIACORE A100
Чип: СМ5 (Biacore BR-1006-68)
Соединение: соединение с амином
Буфер: ФСБ (Biacore BR-1006-72), рН 7,4, 25°С

Для анализа картирования эпитопа путем перекрестной конкуренции 36 мкг/мл антител против Fey мыши или антител против Fey крысы (козьи, фирмы Jackson Immuno Research, номера в каталоге 115-005-071 и 112-005-071) соединяют с поверхностью сенсорного чипа для презентации антитела против CSF-1R. После иммобилизации из 5 мкг/мл анти-CSF-1R моноклональных антител свободные связывающие способности захваченных антител блокируют с помощью 250 мкг/мл мышиных или крысиных иммуноглобулинов (фирма Pierce, номера в каталоге 31202 и 31233), с последующей инъекцией 12,5 мкг/мл CSF-1R (фирма R&D-Systems, номер в каталоге 329-MR) в течение 2 мин. Связывание второго анти-CSF-1R антитела исследуют путем инъекции в течение 2 мин, диссоциацию измеряют путем промывки буфером в течение 5 мин. Анализ и измерения проводят при 25°С. Специфическое связывание второго анти-CSF-1R антитела сопоставляют с пятном с той же установкой чипа, но только без инъекции CSF-1R. Данные по перекрестной конкуренции подсчитывают в процентах (%) от ожидаемого связывающего ответа второго анти-CSF-1R антитела. Показатель «процент (%) ожидаемого связывающего ответа» для связывания второго антитела рассчитывают по формуле «100×относительный Ответ (общая_ранняя_стабильность)/rMax», где величину rMax рассчитывают по формуле «относительный Ответ(общая_поздняя_стабильность)×молекулярная масса антитела/молекулярная масса антигена» согласно описанному в инструкциях по картированию эпитопа методом BIAcore (для прибора BIACORE А100).
Минимальный связывающий ответ также рассчитывают по парам идентичных антител 1 и 2. Из этого следует, что полученную максимальную величину+100%, предпочтительно 50%, устанавливают в качественной пороговой величины для значительной связывающей конкуренции (см. таблицу Х например для антитела <CSF-1R> 7G5.3B6 рассчитанный порог составляет 3+3=6, предпочтительно 3+1,5=4,5). Таким образом, «связывание анти-CSF-1R антитела с тем же эпитопом, что и <CSF-1R> 7G5.3B6», имеет процент (%) ожидаемого ответа по связыванию <6, предпочтительно <4,5.
Анти-CSF-1R SC-02, клон 2-4А5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США, см. также Sherr C.J. и др., Cell, 41, 1985, cc.665-676), которое ингибирует взаимодействие лиганда-рецептора, применяют в качестве контроля.
Таблица 4
Картирование эпитопа по данным перекрестной конкуренции анти-CSF-1R антител.
Антитело 1
Антитело 2
<CSF-1R> 7G5.3B6
SC-02, клон 2-4А5
<CSF-1R> 7G5.3B6
3
36
SC-02, клон 2-4А5
62
-2
Результаты показывают, что антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и <CSF-1R> 7G5.3B6, связываются с другим эпитопом, отличным от SC-02, клон 2-4А5.
Пример 6. Подавление роста рекомбинантных клеток NIH3T3-CSF-1R в культуре 3D при лечении анти-CSF-1R моноклональными антителами (CellTiterGlo-метод)
Клетки NIH 3Т3, инфицированные ретровирусом или вектором экспрессии полной длины дикого типа CSF-1R (SEQ ID No:15) или мутантного типа CSF-1R L301S Y969F (SEQ ID No:16), культивируют в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (фирма РАА, Pasching, Австрия), обогащенной 2 мМ L-глутамином, 2 мМ натрием пируватом, аминокислотами, не являющимися незаменимыми, и 10% фетальной сыворотки теленка (фирма Sigma, Taufkirchen, Германия), в планшетах с покрытием из поли-НЕМА (поли(2-гидроксиэтилметакрилата)) (фирма Polysciences, Warrington, Пенсильвания, США)) для предупреждения адгезии к пластиковой поверхности. Клетки высевают в среду, замещая сыворотку на 5 нг/мл натрия селенита, 10 мг/мл трансферрина, 400 мкг/мл БСА и 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола. При лечении с помощью 100 нг/мл huCSF-1 (фирма Biomol, Hamburg, Германия) wtCSF-1R дикого типа экспрессирующие клетки формируют плотные сфероиды, которые растут трехмерно - свойство, которое называют независимостью от прикрепления. Такие структуры в значительной степени напоминают трехмерную архитектуру и организацию солидных опухолей in situ. Мутантные CSF-1R рекомбинантные клетки способны формировать сфероиды, независимо от лиганда CSF-1. Сфероидные культуры инкубируют в течение 3 суток в присутствии 10 мкг/мл антитела. Исследование CellTiterGlo проводят для обнаружения жизнеспособности клеток путем измерения содержания в клетках АТФ.
Таблица 5
Антитело
Выживание экспрессирующих клеток NIH3T (%)
Выживание экспрессирующих клеток NIH3T (%)
<CSF-1R> 7G5.3B6
0
140
SC-02, clone 2-4A5
62**
66***
** средний результат по 15 разным экспериментам,*** средний результат по 6 разным экспериментам
Пример 7. Подавление роста опухолевых клеток BeWo в культуре 3D при обработке анти-CSF-1R моноклональными антителами (метод CellTiterGlo)
4
Клетки хориокарциномы BeWo (ATCC CCL-98) культивируют в среде F12K (фирма Sigma, Steinheim, Германия), обогащенной 10% ФСБ (фирма Sigma) и 2 мМ L-глутамином. Высевают по 5×10 клеток/лунку в 96-луночные планшеты с поли-НЕМА (поли(2-гидроксиэтилметакрилат)) покрытием, содержащие среду F12K, обогащенную 0,5% ФСБ и 5% БСА. Одновременно добавляют по 200 нг/мл huCSF-1 и 10 мкг/мл разных анти-CSF-1R моноклональных антител и инкубируют в течение 6 суток. Метод CellTiterGlo применяют для обнаружения жизнеспособности клеток путем измерения содержания АТФ в клетках и выражения в относительных световых единицах (ОСЕ). Если сфероидные культуры BeWo обрабатывают с помощью анти-CSF-1R антител (10 мкг/мл), наблюдают подавление индуцированного CSF-1 роста. Для подсчета обусловленного антителом подавления вычитают среднюю величину ОСЕ клеток BeWo без стимуляции из всех образцов. Среднюю величину ОСЕ клеток, простимулированных CSF-1, произвольно принимают за 100%. Средние величины ОСЕ клеток, простимулированных CSF-1 и обработанных анти-CSF-1R антителами, рассчитывают в процентах стимулированных CSF-1 ОСЕ. Табл.6 представляет рассчитанные данные; фиг.1 показывает средние величины ОСЕ. Каждую среднюю величину получают от трех повторов.
Таблица 6
Подавление дифференциации макрофагов/выживания моноцитов при лечении анти-CSF-1R моноклональными антителами (CellTiterGlo-assay)
Антитело
Подавление (%) при концентрации антитела 10 мкг/мл
Только CSF-1
0
<CSF-1R> 7G5.3B6
101
SC-02, клон 2-4А5
40
Пример 8. Подавление дифференциации макрофагов/выживания моноцитов при обработке анти-CSF-1R моноклональными антителами (метод CellTiterGlo)
4
2
50
Моноциты выделяют из периферической крови, используя смесь RosetteSep™ Human Monocyte Enrichment Cocktail (фирма StemCell Tech., номер в каталоге 15028). Обогащенные популяции моноцитов высевают в 96-луночные планшеты для микротитрования (2,5×10 клеток/лунку) в 100 мкл среды RPMI 1640 (фирма Gibco, номер в каталоге 31870), обогащенной 10% ФСТ (фирма GIBCO, номер в каталоге 011-090014М), 4 мМ L-глутамина (фирма GIBCO, номер в каталоге 25030) и 1×антибиотики пенициллин/стрептамицин (PenStrep, фирма Roche, номер в каталоге 1074440) при 37°С и 5% СО. Если добавляют в среду 150 нг/мл huCSF-1, можно наблюдать четкую дифференциацию среди прикрепленных макрофагов. Такая дифференциация может подавляться добавлением анти-CSF-1R антител. Одновременно выживание моноцитов подвергается воздействию и может быть исследовано методом CellTiterGlo (CTG). От концентрации зависит подавление выживания моноцитов путем обработки антителом. Величину IC рассчитывают (см. табл.7).
Таблица 7
Антитело
IC<sub>50</sub> [НМ]
<CSF-1R> 7G5.3B6
0,4
SC-02, клон 2-4А5
2,4