СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО МИЦЕЛИЯ БАЗИДИОМИЦЕТА FOMITOPSIS OFFICINALIS
METHOD FOR PREPARING IMMOBILIZED MYCELIUM OF BASIDIOMYCETE FOMITOPSIS OFFICINALIS

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования мицелия базидиальногогриба Fomitopsis officinalis (Vill.:Fr.) Bond. Et Sing.
Ксилотрофный базидиомицет F. officinalis, известный как трутовик лекарственный или лиственничная губка, применяется как источник лекарственных средств. В медицинской практике применяются плодовые тела для получения препаратов, оказывающих слабительное и кровоостанавливающее действие, уменьшающих потоотделение у туберкулезных больных.
_
В плодовых телах гриба F. officinalis содержится агарициновая и эбуриколовая, фумаровая, рициноловая, лимонная и яблочная, органические кислоты; d-глюкозамин; биофлаваноиды, витамины группы В, P, Е, А, эфирные масла, фитостерин, глюкоза и маннит (Feng W, Yang J S.A new drimaneses uiterpenoid and a new triterpene lactone from fungus of Fomes officinalis // J. Asian Nat Prod Res. 2015; 17 (11): 1065-72; WuH. T., Lu F.H., Su Y.C., Ou H.Y., Hung H.C., Wu J.S., Yang Y.C., Chang C. J. In vivo and in vitro antitumor effects of fungal extracts // Molecules. 2014 Feb 21; 19 (2): 2546-56].
Клинические испытания трутовика позволили выделить полисахарид "ланофил", который стимулирует биосинтез ферментов, участвующих в восстановлении нарушенного обмена веществ клетками печении расщепления глюкозы и жиров в организме [Han J, Li L, Zhong J, Tohtaton Z, Ren Q, Han L, Huang X, Yuan T. Officinalonic acids A-H, lanostane triterpenes from the fruiting bodies of Fomes officinalis // Phytochemistry. 2016 Oct; 130: 193-200; Feng W, Yang J, Xu X, Liu Q. Quantitative determination of lanostane triterpenes in Fomes officinalis and their fragmentation study by HPLC-ESI. Phytochem Anal. 2010 Nov-Dec; 21(6): 531-8].
1
2
6
Известен патент РФ №2257222, опубл. 27.07.2005, бюл. №21, A61K 35/84 «Комплексная переработка гриба трутовика лекарственного (Fomitopsis officinalis (Vill.: Fr.) Bond. Et Sing.), характеризующаяся тем, что сырье измельчают до размера частиц 1-3 мм и подвергают четырехступенчатой экстракции, на первой ступени экстрагируют сжиженным диоксидом углерода при давлении 6,0-7,0 МПа, температуре 22-26°С в течение 10-12 ч с выделением углекислотного экстракта, содержащего эфирное масло, жирные ненасыщенные кислоты, каротиноиды, витамины Е, А и стерины, затем на второй ступени остаток экстрагируют диэтиловым эфиром при температуре 34-36°С в течение 2-3 ч с выделением экстракта, содержащего агарициновую кислоту и липидно-каротиноидный комплекс, и остатка, который на третьей стадии экстрагируют 70-96%-ным этиловым спиртом в течение 3-6 ч при температуре 78-80°C с выделением спиртового экстракта, содержащего каротиноиды, биофлавоноиды и витамин K, на четвертой ступени остаток экстрагируют водой при температуре 98-100°С в течение 3-5 ч с последующим настаиванием в течение 10-12 ч при температуре 18-22°C с выделением водного экстракта, содержащего углеводы, часть дубильных веществ, витамины В, В, В, Р.
Известен патент РФ №2404249, опубл. 20.11.2010, бюлл. №32; «Способ получения водорастворимых полисахаридов из плодового тела трутовика лекарственного, обладающих иммунотропной активностью, характеризующийся тем, что плодовое тело гриба трутовика измельчают до размеров частиц не более 3 мм, экстрагируют смесью хлороформа и спирта этилового 95%, которые берут в соотношении 1:2, высушенный шрот экстрагируют трижды горячей водой при соотношениях сырья и экстрагента 1:20, 1:15, 1:10 в течение 6 ч, объединенное извлечение упаривают при температуре 50°С до 1/5 первоначального объема, фильтруют, осаждают 95%-ным спиртом этиловым, центрифугируют, отделяют и очищают.
В настоящее время естественные ресурсы вида F. officinalis уже истощены, поэтому его, как редкий исчезающий вид грибов, планируют включить в Красную книгу России.
Поиск новых источников для получения лекарственных препаратов на основе мицелия F. officinalis является одной из приоритетных задач ресурсосберегающих технологий, стоящих перед отечественной наукой ["Химический и биологический синтез лекарственных средств и пищевых продуктов", Постановление Правительства РФ №2727/п-П8 от 21 июля 1996 г.].
Известно, что биологически активные вещества высших грибов содержатся не только в базидиомах, но и в вегетативном мицелии гриба, получаемом путем жидкофазного и твердофазного культивирования. Важным преимуществом получения биомассы мицелия с помощью биотехнологических методов являются: неограниченная возможность и безотходность производства препаратов, недефицитность сырьевых ресурсов.
Мицелий различных штаммов вида F. officinalis интенсивно исследуется в качестве источника биологически активных веществ [Сидоренко М.Н. Оценка возможности использования лиственничной губки в качестве источника биологически активных веществ. Перспективы развития инноваций в биологии: Материалы Всероссийской научной школы для молодежи Владивосток, 2010, с. С. 99-103].
Известен патент РФ №2375439, опубл. 10.12.2009 г.«Штамм базидиального гриба Fomitopsis officinalis, проявляющий антибактериальную активность в отношении бактерий.
Мицелий ксилотрофных базидиомицетов трудно культивируется в условиях жидкофазного культивирования, но лучше растет на твердых субстратах [Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре. / Г.В. Ильина, Д.Ю. Ильин. Пенза: РИО ПГСХА, 2013. - 224 с.].
В работе [Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Биологические свойства и продуктивность нового штамма базидиомицета Tyv-2006 Fomitopsis officinalis (Will.) Bond. Et Singer // Вестник КрасГАУ. - Красноярск, 2009. - №1. - С - 68-75] показано, что скорость роста мицелия лиственничной губки на различных натуральных, комплексных и синтетических агаризованных средах относительно невелика (средняя суточная скорость линейного роста составляет 2-4 мм). Для получения инокулюма требуется 12-14 дней, а посевного мицелия на твердых субстратах - около 20 суток. Однако эта величина не является постоянной. Она изменяется не равномерно, в зависимости от возраста культуры и состава среды.
С использованием подобранных условий получения жидкого инокулюма (состава и рН сред, температура инкубации, аэрация, освещение, скорость перемешивания) сроки получения посевного мицелия первой генерации могут быть сокращены до 10-12 суток.
Однако продуктивность биомассы мицелия базидиомицетов в условиях жидкофазного культивирования составляет от 5 г/л абсолютно сухого вещества (а.с.в.), поэтому до настоящего времени не налажено крупнотоннажное производство мицелия продуцентов этого вида.
При культивировании штаммов-продуцентов Fomitopsis officinalis на твердых растительных субстратах возникает проблема отделения биомассы мицелия от растительных остатков, в связи с чем, такую биомассу целесообразно использовать только в кормовых целях.
Для получения пищевых и фармацевтических препаратов на основе мицелия штаммов Fomitopsis officinalis необходимо разработать принципиально новые подходы к способам культивирования, обеспечивающим получение чистого продукта без примесей растительных остатков.
Проблемой, решаемой изобретением, является поиск новых источников для получения лекарственных препаратов на основе мицелия F. officinalis.
Технический результат состоит в повышении продуктивности мицелия трутовика лекарственного Fomitopsis officinalis, определяемой на основе абсолютно сухого веса биомассы мицелия (а.с.в.).
2
4
2
4
4
2
4
Поставленная проблема решается способом получения иммобилизованного мицелия базидиального гриба Fomitopsis officinalis, заключающимся в культивировании штамма Fomitopsis officinalis (ВКПМ F-961) совместно со штаммом-продуцентом бактериальной целлюлозы Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 (ВКПМ В-10547) на синтетической среде состава, г/л: глюкоза - 70.0, дрожжевой экстракт - 5.0, NaHPO - 0.27, KHPO - 0.2, (NH)SO - 0.3, моногидрат лимонной кислоты - 0.115, рН среды 6,5.
Известен штамм бактерии Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 -продуцент бактериальной целлюлозы, [Патент РФ №2464307. опубл. 20.10.2012. Бюлл.№29].
Бактериальная целлюлоза является наноматериалом, имеющим микропоры размером от 5×10 до 50×100 нм, на котором хорошо иммобилизуются клетки прокариот и эукариот [Gromovykh T.I., Sadykova V.S., Lutcenko S.V., Dmitrenok A.S., Feldman N.B., Danilchuk T.N., Kashirin V.V. // PrikladnayaBiokhimiya i Mikrobiologiya, 2017, Vol. 53, No. 1, pp. 69-75; NimeskernL, Martinez AvilaH, SundbergJ, GatenholmP, MiillerR, StokKS. Mechanical evaluation of bacterial nanocellulose as an implant material for ear cartilage replacement. J Mech Behav Biomed. - 2013. - 22:12-21]. Кроме того, она нетоксична, обладает высокими адсорбционными свойствами, является биоразлагаемым и биосовместимым полимером.
Способ осуществляют следующим образом.
2
4
2
4
4
2
4
Культивирование штамма мицелия базидиомицета Fomitopsis officinalis (ВКПМ F-961) проводят совместно с продуцентом бактериальной целлюлозы Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 (ВКПМ В-10547) на синтетической среде следующего состава, г/л: глюкоза - 70.0, дрожжевой экстракт - 5.0, NaHPO - 0.27, KHPO - 0.2, (NH)SO - 0.3, моногидрат лимонной кислоты - 0.115. Культивирование проводят в течение 30 суток при температуре 28±2°С. Полученные пленки иммобилизованного мицелия Fomitopsis officinalis на матрице бактериальной целлюлозы отделяют от питательной среды и определяют содержание белка и агарициновой кислоты.
Содержание белка в мицелии базидиомицета Fomitopsis officinalis, полученного как в монокультуре, так и на матрице бактериальной целлюлозы, определяют методом М. Брэдфорда [Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254].
Для определения количества белка в образцах мицелия навеску массой 0,05 г, предварительно высушенного в сухожаровом шкафу при температуре 60°С до постоянной массы, растирают в гранитной ступке. Растертый мицелий пересыпают в колбу с притертой крышкой, заливают 60 мл детергента - 6М раствора мочевины, взбалтывают и оставляют на сутки в теплом месте при температуре 20-22°С. Настоявшуюся суспензию взбалтывают, затем отбирают дозатором 1 мл суспензии в пробирку и центрифугируют 60 секунд при 12000 об/мин, после чего отбирают супернатант для проведения анализа. Концентрацию белка определяют по калибровочному графику, построенному с использованием бычьего сывороточного альбумина (БСА) в качестве стандарта. По количеству белка, содержащегося в иммобилизованном мицелии, рассчитывают процент мицелия (долю) в образцах.
Идентичность белкового состава образцов мицелия подтверждают методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях [Стручкова И.В., Кальясова Е.А. Теоретические и практические основы проведения электрофореза белков в полиакриламидном геле. Нижний Новгород: НГУ им Н.И. Лобачевского. 2012-60 с.].
Определение агарициновой кислоты в мицелии проводят согласно методу, разработанному в патенте №2330676 РФ «Способ получения агарициновой кислоты», опубл. 10.08.2008, бюл. №22.
Пример 1. Способ по изобретению.
2
4
2
4
4
2
4
Жидкофазное стационарное культивирование смешанной культуры мицелия базидиомицета штамма TYV- 2006 Fomitopsis officinalis (Vill.:Fr.) Bond. Et Sing (ВКПМ F-961) и продуцента бактериальной целлюлозы штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 (ВКПМ В-10547) проводят на синтетической питательной среде следующего состава, г/л: глюкоза - 70.0, дрожжевой экстракт - 5.0, NaHPO- 0.27, KHPO- 0.2, (NH)SO- 0.3, моногидрат лимонной кислоты - 0.115, рН среды доводят до значения 6,0-6,5 с помощью 0,1 М раствора NaOH.
2
4
2
4
4
2
4
Среду разливают в колбы Эрленмейера объемом 250 мл и стерилизуют при остаточном давлении 0,5 атм в течение 30 минут. Посевной материал продуцента Ghansenii выращивают при перемешивании 120 об/мин в течение 5 суток на жидкой среде Н5 следующего состава, г/л: глюкоза - 70.0, дрожжевой экстракт -5.0, NaHPO - 2.7, KHPO - 2.0, (NH)SO - 3.0, моногидрат лимонной кислоты - 1.15, спирт - 5.0, рН=4.0.
8
3
Проводят посев продуцента бактериальной целлюлозы штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 суспензией с титром 10 КОЕ/мл в объеме 10 см и культивируют в стационарных условиях в течение 48 часов до появления тонкой пленки бактериальной целлюлозы.
3
2
Посевной материал продуцента F.officinalis выращивают на агаровой среде Maltax-10 в концентрации 5%. Посев проводят агаровым блоком газонной культуры мицелия F. officinalis размером 10×10×5 мм. Через 48 часов культивирования Ghansenii GH-1/2008 в колбы вносят инокулят агарового блока мицелия F.officinalis площадью 1 см и проводят дальнейшее культивирование в течение 30 суток в термостате при температуре 30±1°С.
Полученные пленки иммобилизованного на бактериальной целлюлозе мицелия отделяют от культуральной жидкости на бумажном фильтре, высушивают в сухожаровом шкафу при t=60°С до постоянной массы (рисунок 1, г и е). Определяют абсолютно сухой вес биомассы мицелия (а.с.в.), который составляет 11,4 г/л. Среднесуточная продуктивность составляет 0,38 г/л*сут. Определяют количество белка и агарициновой кислоты в образцах.
Технический результат предлагаемого способа - повышение выхода и продуктивности мицелия - достигается при совместном способе культивирования базидиального гриба F. officinalis и продуцента бактериальной целлюлозы штамма G. hansenii, выращиваемых на синтетической среде. Продуктивность мицелия рассчитывают по количеству белка в образцах иммобилизованного мицелия на бактериальной целлюлозе, следующим образом:
А - количество мицелия в образце, %, В - количество белка в образце мицелия, полученном в монокультуре, %; С - количество белка в иммобилизованном мицелии на бактериальной целлюлозе, полученного в смешанной культуре, %, тогда количество мицелия в нем будет составлять:
А=В×100/С.
Биомасса мицелия F. officinalis в смешанной культуре с продуцентом бактериальной целлюлозы G. hansenii на среде Maltax составляет 9,2 г/л, что выше, чем при культивировании чистой культуры продуцента в 1.9 раза; биомасса мицелия F. officinalis в смешанной культуре с продуцентом бактериальной целлюлозы G. hansenii на синтетической среде составляет - 11.4 г/л, в чистой культуре - 3,5, что выше в 3.2 раза (таблица 1).
На Фиг. 2 представлена электрофореграмма белков экстрактов из образцов мицелия штамма F. officinalis, полученного в различных условиях культивирования: 2 - F. officinalis на среде Maltax, 5%, 3 -иммобилизованный мицелий F. officinalis на матрице бактериальной целлюлозы (среда Maltax. 5%), 4 - иммобилизованный мицелий F. officinalis на матрице бактериальной целлюлозы (синтетическая среда); 5 - F. officinalis на синтетической среде; 1,6 - маркеры молекулярной массы: а - бычий сывороточный альбумин (Мм=67000 Да), 6 - химотрипсиноген А (Мм=25000 Да), в - рибонуклеаза А (13700 Да)
Представленные данные подтверждают идентичность белкового состава в супернатантах,: полученных экстракцией всех исследуемых образцов мицелия (на Фиг. 2: 2, 3, 4 и 5); полосы идентичны, с молекулярной белков массой в пределах 60000-65000 Да.
Пример 2.
2
4
2
4
4
2
4
Жидкофазное стационарное культивирование чистой культуры мицелия базидиомицета штамма TYV- 2006 Fomitopsis officinalis (Vill.:Fr.) Bond. Et Sing (ВКПМ F-961) и продуцента бактериальной целлюлозы штамма Gluconacetobacter hansenii GH-1/2008 (ВКПМ В-10547) проводят на синтетической питательной среде следующего состава, г/л: глюкоза - 70.0, дрожжевой экстракт - 5.0, NaHPO - 0.27, KHPO - 0.2, (NH)SO - 0.3, моногидрат лимонной кислоты - 0.115, рН среды доводят до значения 6,0 -6,5 с помощью 0,1 М раствора NaOH.
3
Среду разливают в колбы Эрленмейера объемом 250 мл и стерилизуют при остаточном давлении 0,5 атм. в течение 30 минут. Посевной материал продуцента F.officinalis выращивают на агаровой среде Maltax в концентрации 5%. Посев проводят агаровым блоком газонной культуры мицелия F. officinalis размером 10×10×5 мм. Жидкофазное стационарное культивирование мицелия F.officinalis проводят в термостате при температуре 28±1°С в течение 30 суток.
Пленки культуры, выращенные стационарным способом на жидкой среде, отделяют от культуральной жидкости на бумажном фильтре, высушивают в сухожаровом шкафу при t=60°С до постоянной массы.
Определяют абсолютно сухой вес биомассы мицелия (а.с.в.), которые составляет на синтетической среде 3,5 г/л.
Среднесуточная продуктивность составляет 0,12 г/л*сут.
На Фиг. 1 представлен рост мицелия F. officinalis и пленки, полученные при жидкофазном стационарном культивировании на средах: а - Maltax-10 (концентрация 5%), б - синтетической среде, в - рост и д - пленка - при совместном культивировании с Gluconacetobacter hansenii на среде Maltax-10, г - рост и е - пленка, полученная при совместном культивировании с Gluconacetobacter hansenii на синтетической среде. Определяют количество белка и агарициновой кислоты в образцах.