СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ С МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К СОЧЕТАНИЯМ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
METHOD FOR DETECTION OF MICROORGANISMS SENSITIVITY WITH MULTIPLE MEDICINAL RESISTANCE TO COMBINATIONS OF ANTIBACTERIAL PREPARATIONS

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, и используется для определения чувствительности выделенных из патологического материала (паренхиматозные органы, носовые, влагалищные смывы, сперма, молоко и т.д.) микроорганизмов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью, к сочетаниям антибактериальных препаратов.
Широкое, часто неконтролируемое применение антибактериальных препаратов в ветеринарной практике сопровождается увеличением устойчивости микроорганизмов к этим препаратам. Более половины культур возбудителей, выделенных от павших и больных животных, оказались одновременно устойчивыми к 14-16 препаратам [Ефанова Л.И., Транькова А.С., Давыдова В.В., Иванова Ю.В., Панина Т.А. Чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам при смешанных инфекциях животных. Материалы первого съезда ветеринарных фармакологов 21-23 июня 2007 года, с.280-285: Зыкин Л.Ф., Хапцев З.Ю. Клиническая микробиология для ветеринарных врачей. М., «Колос», 2006].
В ветеринарной практике для антибактериальной терапии, поэтому часто используют комплексные препараты, эффективность применения которых, так же как и отдельных препаратов, определяется чувствительностью к ним выделенных возбудителей инфекционных болезней.
Для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам используют два основных способа.
Способ диффузии в агар с применением дисков, содержащих определенное количество (5, 10, 15, 30, 150, 300 мкг-ЕД) антибактериального препарата [МУК по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней животных. Утверждено ГУВМСХ СССР 30.09.1971, Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М., 1982, Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофурановые препараты в ветеринарии: Справочник/ В.Ф.Ковалев, И.Б.Волков, Б.В.Виолин и др. - М.: Агропромиздат, 1988].
Способ серийных разведений в двух модификациях на жидкой и плотной питательных средах [МУК по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней животных. Утверждено ГУВМСХ СССР 30.09.1971, Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М., 1982, Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофурановые препарты в ветеринарии: Справочник/ В.Ф.Ковалев, И.Б.Волков, Б.В.Виолин и др. - М.: Агропромиздат, 1988].
Способ с использованием дисков прост в исполнении, но дает информацию только о бактериостатической активности конкретного антибактериального препарата. Он позволяет по диаметру зоны задержки роста определить минимальную подавляющую концентрацию антибактериального препарата в отношении испытуемой культуры возбудителя и классифицировать микроорганизмы на чувствительные, с промежуточной чувствительностью и устойчивые. Однако с помощью этого способа нельзя определить чувствительность резистентных микроорганизмов к действию широко используемых в ветеринарной практике комплексных препаратов из-за отсутствия стандартных бумажных дисков, содержащих одновременно два и более препарата.
Способ серийных разведений в жидкой и плотной питательной средах позволяет установить не только минимальную ингибирующую концентрацию, но и определить бактерицидную концентрацию испытуемого препарата в отношении выделенного микроорганизма. Используя этот способ, определяется минимальная ингибирующая концентрация и бактерицидная концентрация вновь создаваемых комплексных препаратов в отношении различных культур микроорганизмов, в том числе с множественной лекарственной устойчивостью.
Способ серийных разведений заключается в том, что выделенная культура микроорганизма засевается в определенный объем среды - 7-10 пробирок или чашек Петри на одну культуру, содержащей убывающие (от 125-500 до 0,03-0,1 мкг/мл) концентрации антибактериального препарата (нескольких препаратов).
Способ серийных разведений в жидкой питательной среде используется при исследовании чувствительности небольшого количества культур микроорганизмов, при этом устанавливается минимальная ингибирующая концентрация антибактериального препарата. Для определения бактерицидной концентрации необходим дополнительный посев из пробирок с наибольшим разведением препарата, где нет видимого роста культур на мясопептонный агар. Отсутствие роста на мясопептонном агаре свидетельствует о бактерицидном действии соответствующей концентрации препарата.
Способ серийных разведений в плотной питательной среде применяют для исследования чувствительности одновременно до 10 культур к тому или иному препарату. Он позволяет определить не только минимальная ингибирующая концентрация, но и бактерицидной концентрации препарата, но требует более сложных подготовительных манипуляций, чем способ серийных разведений на жидкой питательной среде.
В целом способ серийных разведений более трудоемкий в исполнении и затратный в сравнении со способом диффузии в агар с использованием бумажных дисков.
Имеются модификации способа серийных разведений [Зыкин Л.Ф., Хапцев З.Ю. Клиническая микробиология для ветеринарных врачей. М., «Колос», 2006]:
1) использование мясопептонного бульона с глюкозой и реактивом Андреде вместо мясопептонного бульона, что позволяет выявить рост испытуемого микроорганизма по изменению цвета питательной среды;
2) микротитрационный способ, более экономичный, так как при определении чувствительности микроорганизмов используются микрообъемы питательной среды - 0,1 мл вместо 1-10 мл с разными концентрациями препарата.
В клинической ветеринарной микробиологии способ серийных разведений и его модификации имеют ограниченное применение из-за трудоемкости и громоздкости, тем более что чувствительность выделенных возбудителей необходимо определить не к одному, а к 6-18 препаратам.
Прототипом предлагаемого способа является способ серийных разведений в жидкой питательной среде, с помощью которого возможно определить чувствительность исследуемой культуры к сочетанию антибактериальных препаратов, но это требует больших затрат времени питательных сред, а так же не позволяет использовать готовые бумажные диски с антибиотиками, что является более трудоемким.
Техническим результатом изобретения является ускорение и снижение трудоемкости определения чувствительности микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью к сочетаниям антибактериальных препаратов [Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М., «Медицина», 1973 г., с.177-178].
Технический результат достигается использованием способа определения чувствительности микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью, к сочетанию антибактериальных препаратов, в ходе которого производится посев в пробирку с мясопептонным бульоном исследуемой культуры микроорганизмов, внесение пропитанных антибактериальным препаратом стандартных бумажных дисков, инкубирование в течение 12-18 часов в термостате, при температуре 36±1°С. При визуальном отсутствии мутности в исследуемой пробирке делают вывод о чувствительности микроорганизмов к сочетанию антибактериальных препаратов.
Использование способа позволяет определить чувствительность выделенной культуры к комплексу антибактериальных препаратов с меньшей затратой времени и количеством питательных сред, результат оценивают по мутности содержимого в пробирке, считая, что отсутствие мутности соответствует чувствительности микроорганизмов к сочетанию антибиотиков.
Сущность способа поясняется примерами.
Пример 1. Определение чувствительности культур с множественной лекарственной устойчивостью, выделенных из патологического материала от павших цыплят, к сочетаниям антибактериальных препаратов.
Исследован патологический материал от 100 павших, ослабленных цыплят разного возраста из 25 цехов. В 11 цехах диагностированная смешанная кишечная инфекция была вызвана микроорганизмами (энтеропатогенная Е.Coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella pullorum, реже другие), устойчивыми одновременно к 16 антибактериальным препаратам: ампициллин, цефазолин, гентамицин, тилозин, тетрациклин, рифампицин, полимиксин, энрофлоксацин, фуразолидон, фурагин, эритромицин, левомицетин, норфлоксацин, сизомицин, стрептомицин, неомицин.
С учетом наличия зоны задержки роста вокруг диска с антибактериальным препаратом (меньше, чем для чувствительного микроорганизма, либо наличие в зонах задержки роста отдельных колоний, «пленки», совместимости (синергидный либо аддитивный эффект) антибактериальных препаратов были подобраны и испытаны по предлагаемому способу следующие комбинации препаратов (таблица 1).
Каждая из выделенных культур возбудителя засевалась в 6 пробирок с мясопептонным бульоном, в 5 из которых помещали по 2 диска с разными антибактериальными препаратами; в шестую, контрольную, - диски не вносили. Пробирки помещали на 12-18 часов в термостат при температуре 36±1°С. При выраженном росте возбудителя в контрольной пробирке, интенсивное помутнение, учитывали чувствительность его к сочетаниям антибактериальных препаратов.
Таблица 1
Результаты определения чувствительности культур с множественной лекарственной устойчивостью, выделенных из патологического материала, к сочетаниям антибактериальных препаратов
Сочетание
Концентрация препарата, мкг (ЕД), в
Кол-во исследованных культур
Чувствительные к сочетанию
Устойчивые к сочетанию
диске
1 мл среды
Ампициллин
30
7,5
16
11
5
+
+
+
полимиксин
300
75
Ампициллин
30
7,5
20
13
7
+
+
+
гентамицин
10
2,5
Гентамицин
10
2,5
16
14
2
+
+
+
энрофлоксацин
5
1,25
Полимиксин
300
75
12
5
7
+
+
+
рифампицин
5
1,25
Энрофлоксацин
5
1,25
14
9
5
+
+
+
фуразолидон
300
75
Чувствительность возбудителей с множественной лекарственной устойчивостью к комбинированным препаратам оказалась различной: наиболее эффективными были в конкретной ситуации сочетания гентамицин + энрофлоксацин (87,5% культур), ампициллин+полимиксин (69%), несколько меньше - ампициллин + гентамицин и энрофлоксацин+фуразолидон (65 и 64% соответственно); наименьшей была чувствительность к сочетанию рифампицин+полимиксин (42%). В целом из 54 культур возбудителей с множественной лекарственной устойчивостью, выделенных от цыплят, чувствительными к сочетаниям антибактериальных препаратов оказались 46 культур (85,2%), то есть около 15% культур были устойчивыми и к нескольким сочетаниям препаратов, что требует использования в таких случаях альтернативных средств терапии с выраженными дезинфицирующими свойствами, а также применения пробиотиков и т.д.
Таким образом, для исследования предлагаемым способом чувствительности 78 культур устойчивых микроорганизмов к пяти сочетаниям препаратов потребовалось 468 пробирок, 1872 мл мясопептонного бульона, 780 готовых дисков с антибактериальными препаратами. Для определения чувствительности такого количества культур к антибактериальным препаратам методом серийных разведений в жидкой питательной среде количество пробирок увеличивается в 8,3 раза (3900 пробирок), мясопептонный бульон в - 9,4 раза (17550 мл); потребуется не менее 390 мг антибактериальных препаратов.
Пример 2. Определение чувствительности культур с множественной лекарственной устойчивостью, выделенных из спермы и влагалищных смывов.
Исследовано 28 проб спермы хряков и 16 проб влагалищных смывов свиноматок с признаками вагинита - эндометрита, ранее осемененных этой спермой, но оказавшихся холостыми. В 10 пробах (35,7%) хряков обнаружены устойчивые к 16 антибактериальным препаратам культуры микроорганизмов (Е.Coil, Enterococcus faecalis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa). Множественной лекарственной устойчивостью обладали и Е.Coli, и Enterococcus faecalis, изолированные из 7 проб (44%) влагалищных смывов свиноматок (таблица 2).
Таблица 2
Результаты определения чувствительности устойчивых культур микроорганизмов, выделенных из спермы и влагалищных смывов, к сочетаниям антибактериальных препаратов.
Сочетание
Концентрация в диске/ мл среды, мкг/мл (ЕД)
Культуры микроорганизмов, выделенные из
Итого
спермы
влагалищных смывов
всего иссл.
чувст.
не чувст.
всего иссл.
чувст.
не чувст.
всего иссл.
чувст.
не чувст.
Полимиксин
300/75
+
+
10
1
9
8
3
5
18
4
14
Гентамицин
10/2,5
Пенициллин
10/2,5
не исслед.
не исслед.
не исслед.
+
+
10
3
7
10
3
7
Канамицин
30/7,5
+
+
Полимиксин
300/75
Рифампицин
5/1,25
не исслед.
не исслед.
не исслед.
+
+
10
4
6
10
4
6
Полимиксин
300/75
Рифампицин
5/1,25
+
+
10
2
8
8
2
6
18
4
14
Доксициклин
10/2,5
Энрофлоксац
5/1,25
ин
+
10
8
2
8
7
1
18
15
3
+
Фуразолидон
300/75
Гентамицин
10/2,5
+
+
10
10
-
8
7
1
18
17
1
Энрофлоксацин
5/1,25
Среди микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью к сочетаниям препаратов чувствительными оказалось от 22,2% (полимиксин + гентамицин, рифампицин + доксициклин) до 83-94,4% (энрофлоксацин + фуразолидон; гентамицин+энрофлоксацин).
Параллельно с предлагаемым способом методом последовательных серийных разведений в жидкой питательной среде определена чувствительность 10 культур микроорганизмов к сочетаниям полимиксин + гентамицин, гентамицин + энрофлоксацин.
Установлено, что минимальная ингибирующая концентрация в одном случае была равна 75 МЕ/мл полимиксина + 2,5 мкг/мл гентамицина, в двух - 300 МЕ/мл полимиксина + 10 мкг/мл гентамицина, в остальных семи эти концентрации оказались не эффективными в отношении выделенных микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью.
Все 10 культур были чувствительными к сочетанию гентамицин+энрофлоксацин, взятых в концентрациях 2,5 мкг/мл + 1,25 мкг/мл соответственно, при этом в семи случаях минимальная ингибирующая концентрация была при содержании 1,25 мкг/мл гентамицина + 0,62 мкг/мл энрофлоксацина, бактерицидной концентрации препарата этого сочетания препаратов в восьми случаях была равна 2,5 мкг/мл гентамицина + 1,25 мкг/мл энрофлоксацина, в двух случаях - 5 мкг/мл гентамицин + 2,5 мкг/мл энрофлоксацина.
Таким образом, результаты определения чувствительности микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью предлагаемым способом подтверждены результатами, полученными при определении чувствительности методом серийных разведений. Хотя последний дает возможность определить более широкий диапазон, минимальная ингибирующая концентрация, что важно для научных исследований, он более громоздкий и трудоемкий в исполнении.
Следовательно, предлагаемый способ определения чувствительности микроорганизмов позволяет выбрать для лечения больных животных, от которых изолированы возбудители с множественной лекарственной устойчивостью, оптимальное сочетание препаратов, а в случае устойчивости - заменить альтернативными методами и способами. Устойчивость выделенных от больных и павших животных возбудителей к комплексным (сочетаниям) препаратам свидетельствует о необходимости проведения лабораторного контроля за эффективностью их применения, как и при использовании отдельных препаратов. Предлагаемый способ позволяет проводить подобные исследования в условиях обычных лабораторий с наименьшими затратами времени и средств.