СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УЛУЧШЕННЫХ ШТАММОВ СЕМЕЙСТВА Enterobakteriaceae

1. Способ получения L-аминокислот или кормовых добавок, содержащих L-аминокислоту, путем ферментации микроорганизма семейства Enterobacteriaceae, отличающийся тем, что применяют микроорганизм, в котором ослаблен ген proP.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ген proP «выключен».
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что уровень экспрессии гена proP является низким.
4. Способ по одному из пп. 1-3, отличающийся тем, что микроорганизм сверхпродуцирует L-аминокислоту.
5. Способ по одному из пп. 1-3, отличающийся тем, что микроорганизм обеспечивает накопление L-аминокислоты в среде.
6. Способ по одному из пп. 1-3, отличающийся тем, что микроорганизм обеспечивает накопление L-аминокислоты в клетках.
7. Способ по одному из пп. 1-3, отличающийся тем, что L-аминокислота представляет собой серосодержащую аминокислоту, предпочтительно L-метионин, L-цистеин, L-цистин, L-гомоцистеин или L-гомоцистин.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что серосодержащая аминокислота представляет собой L-метионин.
9. Способ по одному из пп. 1-3 и 8, отличающийся тем, что микроорганизм обладает повышенной толерантностью к метионину по сравнению с микроорганизмом без ослабленного гена proP.
10. Способ по одному из пп. 1-3 и 8, отличающийся тем, что микроорганизм семейства Enterobacteriaceae представляет собой бактерию рода Escherichia, Erwinia, Providencia или Serratia, предпочтительно рода Escherichia, наиболее предпочтительно Escherichia coli.
11. Способ по одному из пп. 1-3 и 8, отличающийся тем, что ген proP представляет собой ген, который имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, по существу по меньшей мере на 98, 99 или 100%о, полинуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 1, 3, 5 или 7, наиболее предпочтительно полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1.
12. Способ по одному из пп. 1-3 и 8, отличающийся тем, что ослабленный ген proP представляет собой полинуклеотид, последовательность которого идентична по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, по существу по меньшей мере на 98, 99 или 100%, последовательности полинуклеотида SEQ ID NO: 1 и который кроме того обязательно имеет по сравнению с полинуклеотидом SEQ ID NO: 1 одну или несколько из следующих мутаций:
д) замену триплета, кодирующего L-аргинин в положении 324 SEQ ID NO: 2 или соответствующем положении аминокислотной последовательности, на триплет, кодирующий аминокислоту, выбранную из группы, включающей L-лейцин, L-изолейцин и L-валин, предпочтительно L-лейцин;
е) замену триплета, кодирующего L-тирозин в положении 467 SEQ ID NO: 2 или соответствующем положении аминокислотной последовательности, на триплет, кодирующий аминокислоту, выбранную из группы, включающей L-лизин, L-аргинин и L-гистидин, предпочтительно L-гистидин;
ж) замену триплета, кодирующего L-глутаминовую кислоту в положении 412 SEQ ID NO: 2 или в соответствующем положении аминокислотной последовательности, на триплет, кодирующий стоп-кодон;
з) делецию нуклеотидного основания аденина в положении 854 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1;
и) делецию одного или нескольких нуклеотидных оснований в положениях с 1173 по 1223, предпочтительно делецию всех нуклеотидных оснований в положениях с 1173 по 1223 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1;
к) инсерцию нуклеотидного основания цитозина в положение 842 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1;
л) инсерцию одного или нескольких нуклеотидного(ых) основания(й) в положение 973, предпочтительно инсерцию 19 нуклеотидных оснований в положение 973 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1;
м) инсерцию одного или нескольких нуклеотидного(ых) основания(й) в положение 183, предпочтительно инсерцию 1359 нуклеотидных оснований в положение 183 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1.
13. Способ по одному из пп. 1-3 и 8, отличающийся тем, что ферментацию осуществляют в среде, содержащей неорганический источник серы.
14. Способ по одному из пп. 1-3 и 8, отличающийся тем, что L-аминокислоту накапливают в ферментационном бульоне и затем при необходимости выделяют, собирают и/или очищают.
15. Способ по одному из пп. 1-3 и 8, отличающийся тем, что L-аминокислоту выделяют или собирают вместе с компонентами ферментационного бульона и/или биомассой.
16. Микроорганизм семейства Enterobacteriaceae, который несет ослабленный ген proP, отличающийся тем, что он продуцирует L-аминокислоты и предпочтительно секретирует их в среду.
17. Микроорганизм по п. 16, отличающийся тем, что он обеспечивает накопление L-аминокислоты в клетках.
18. Микроорганизм по п. 16, отличающийся тем, что он обеспечивает накопление L-аминокислоты в среде.
19. Микроорганизм по одному из пп. 16-18, отличающийся тем, что ген proP «выключен».
20. Микроорганизм по одному из пп. 16-18, отличающийся тем, что уровень экспрессии гена proP является низким.
21. Микроорганизм по одному из пп. 16-18, отличающийся тем, что микроорганизм сверхпродуцирует L-аминокислоту.
22. Микроорганизм по одному из пп. 16-18, отличающийся тем, L-аминокислота представляет собой серосодержащую аминокислоту, предпочтительно L-метионин, L-цистеин, L-цистин, L-гомоцистеин или L-гомоцистин.
23. Микроорганизм по п. 22, отличающийся тем, что серосодержащая аминокислота представляет собой L-метионин.
24. Микроорганизм по одному из пп. 16-18 и 23, отличающийся тем, что он обладает повышенной толерантностью к метионину по сравнению с микроорганизмом без ослабленного гена proP.
25. Микроорганизм по одному из пп. 16-18 и 23, отличающийся тем, что микроорганизм семейства Enterobacteriaceae представляет собой бактерию рода Escherichia, Erwinia, Providencia или Serratia, предпочтительно рода Escherichia, наиболее предпочтительно Escherichia coli.
26. Микроорганизм по одному из пп. 16-18 и 23, отличающийся тем, что ген proP представляет собой ген, который имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, по существу по меньшей мере на 98, 99 или 100%, полинуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, наиболее предпочтительно SEQ ID NO: 1.
27. Микроорганизм по одному из пп. 16-18 и 23, отличающийся тем, что ослабленный ген proP представляет собой полинуклеотид, последовательность которого идентична по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, по существу по меньшей мере на 98, 99 или 100%, полной последовательности полинуклеотида SEQ ID NO: 1 и который дополнительно обязательно имеет по сравнению с полинуклеотидом SEQ ID NO: 1 одну или несколько из следующих мутаций:
н) замену триплета, кодирующего L-аргинин в положении 324 SEQ ID NO: 2 или соответствующем положении аминокислотной последовательности, на триплет, кодирующий аминокислоту, выбранную из группы, включающей L-лейцин, L-изолейцин и L-валин, предпочтительно L-лейцин;
о) замену триплета, кодирующего L-тирозин в положении 467 SEQ ID NO: 2 или соответствующем положении аминокислотной последовательности, на триплет, кодирующий аминокислоту, выбранную из группы, включающей L-лизин, L-аргинин и L-гистидин, предпочтительно L-гистидин;
п) замену триплета, кодирующего L-глутаминовую кислоту в положении 412 SEQ ID NO: 2 или в соответствующем положении аминокислотной последовательности, на триплет, кодирующий стоп-кодон;
р) делецию нуклеотидного основания аденина в положении 854 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1;
с) делецию одного или нескольких нуклеотидных оснований в положениях с 1173 по 1223, предпочтительно делецию всех нуклеотидных оснований в положениях с 1173 по 1223 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1;
т) инсерцию нуклеотидного основания цитозина в положение 842 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1;
у) инсерцию одного или нескольких нуклеотидного(ых) основания(й) в положение 973, предпочтительно инсерцию 19 нуклеотидных оснований в положение 973 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1;
ф) инсерцию одного или нескольких нуклеотидного(ых) основания(й) в положение 183, предпочтительно инсерцию 1359 нуклеотидных оснований в положение 183 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1.
28. Микроорганизм по одному из пп. 16-18 и 23, отличающийся тем, что он обладает повышенной активностью аспартаткиназы/гомосериндегидрогеназы ThrA.
29. Микроорганизм по одному из пп. 16-18 и 23, отличающийся тем, что он обладает повышенной активностью гомосерин О-сукцинилтрансферазы MetA и/или серинацетилтрансферазы CysE.
30. Микроорганизм по одному из пп. 16-18 и 23, отличающийся тем, что он обладает пониженной активностью транскрипционного регулятора биосинтеза L-метионина MetJ и/или S-аденозилметионинсинтазы MetK.
31. Полинуклеотид, идентичный по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, по существу по меньшей мере на 98, 99 или 100%, последовательности SEQ ID NO: 1, отличающийся тем, что полинуклеотид обязательно имеет по сравнению с полинуклеотидом SEQ ID NO: 1 одну или несколько мутаций, выбранных из группы, включающей:
х) замену триплета, кодирующего L-аргинин в положении 324 SEQ ID NO: 2 или соответствующем положении аминокислотной последовательности, на триплет, кодирующий аминокислоту, выбранную из группы, включающей L-лейцин, L-изолейцин и L-валин, предпочтительно L-лейцин;
ц) замену триплета, кодирующего L-тирозин в положении 467 SEQ ID NO: 2 или соответствующем положении аминокислотной последовательности, на триплет, кодирующий аминокислоту, выбранную из группы, включающей L-лизин, L-аргинин и L-гистидин, предпочтительно L-гистидин;
ч) замену триплета, кодирующего L-глутаминовую кислоту в положении 412 SEQ ID NO: 2 или в соответствующем положении аминокислотной последовательности, на триплет, кодирующий стоп-кодон;
ш) делецию нуклеотидного основания аденина в положении 854 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1;
щ) делецию одного или нескольких нуклеотидных оснований в положениях с 1173 по 1223, предпочтительно делецию всех нуклеотидных оснований в положениях с 1173 по 1223 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1;
э) инсерцию нуклеотидного основания цитозина в положение 842 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1;
аа) инсерцию одного или нескольких нуклеотидного(ых) основания(й) в положение 973, предпочтительно инсерцию 19 нуклеотидных оснований в положение 973 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1;
бб) инсерцию одного или нескольких нуклеотидного(ых) основания(й) в положение 183, предпочтительно инсерцию 1359 нуклеотидных оснований в положение 183 гена proP, имеющего SEQ ID NO: 1.
32. Полинуклеотид по п. 31, отличающийся тем, что он гибридизуется с одним или несколькими полинуклеотидами, выбранными из группы, которая состоит из полинуклеотида, комплементарного SEQ ID NO: 1, полинуклеотида, комплементарного SEQ ID NO: 3, и полинуклеотида, комплементарного SEQ ID NO: 5, предпочтительно комплементарного SEQ ID NO: 1.
33. Вектор, содержащий полинуклеотид по п. 31 или п. 32.
34. Полипептид, идентичный по меньшей мере на 80%, предпочтительно но меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, по существу всего по меньшей мере на 98, 99 или 100%, последовательности SEQ ID NO: 2, отличающийся тем, что полипептид обязательно имеет по сравнению с полипептидом SEQ ID NO: 2 одну или несколько мутаций, выбранных из группы, включающей:
вв) замену L-аргинина в положении 324 SEQ ID NO: 2 или соответствующем положении аминокислотной последовательности на аминокислоту, выбранную из группы, включающей L-лейцин, L-изолейцин и L-валин, предпочтительно L-лейцин;
гг) замену L-тирозина в положении 467 SEQ ID NO: 2 или соответствующем положении аминокислотной последовательности на аминокислоту, выбранную из группы, включающей L-лизин, L-аргинин и L-гистидин, предпочтительно L-гистидин;
дд) делецию 17 аминокислот в положениях с 392 по 408 SEQ ID NO: 2 или в соответствующих положениях аминокислотной последовательности;
ее) делецию вплоть до 420 аминокислот на С-конце последовательности SEQ ID NO: 2, предпочтительно делецию 88, 163, 202, 212 или 420 аминокислот на С-конце аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
35. Рекомбинантный микроорганизм несущий полинуклеотид по п. 31 или п. 32 и/или вектор по п. 33, и/или полипептид по п. 34.
36. Способ идентификации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, которые обладают улучшенной способностью продуцировать серосодержащие L-аминокислоты и которые несут ослабленный ген proP, включают стадии, на которых:
жж) осуществляют скрининг микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, обладающих способностью продуцировать серосодержащие L-аминокислоты, предпочтительно L-метионин, в отношении толерантности к метионину;
зз) выделяют и размножают мутантов, полученных на стадии а);
ии) необязательно получают нуклеиновые кислоты из мутантов, полученных на стадии б);
кк) необязательно получают молекулу нуклеиновой кислоты с помощью полимеразной цепной реакции, используя в качестве исходной нуклеиновую кислоту, полученную на стадии в), и пару праймеров, состоящую из первого ираймера, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов из числа нуклеотидов, находящихся в положениях с 1 по 1000 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 38, и второго праймера, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов из числа нуклеотидов, находящихся в положениях с 2504 по 3503 нуклеотидной последовательности, комплементарной SEQ ID NO: 38;
лл) необязательно определяют нуклеотидную последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, полученной на стадии г), и определяют кодируемую аминокислотную последовательность;
мм) необязательно сравнивают аминокислотную последовательность, определенную на стадии д), с SEQ ID NO: 2; и
нн) необязательно идентифицируют полученный мутант proP.