ЛЕЧЕНИЕ ПИГМЕНТНОГО РЕТИНИТА

ORF15
ORF15
1. Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую изоформу ORF15 регулятора ГТФазы пигментного ретинита (RPGR), при этом кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность была кодон-оптимизирована для повышения точности репликации последовательности, и где нуклеотидная последовательность: (i) содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 98% идентичность в SEQ ID NO: 3; (ii) функционально связана с полинуклеотидом, содержащим промотор родопсин-киназы (GRK1); и (iii) содержит сайт полиаденилирования.
ORF15
2. Полинуклеотид по п. 1, отличающийся тем, что кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность была кодон-оптимизирована для уменьшения числа пуриновых нуклеотидов в сравнении с последовательностью дикого типа.
ORF15
ORF15
3. Полинуклеотид по п. 1 или 2, отличающийся тем, что закодированный белок RPGR представляет собой человеческий RPGR.
ORF15
4. Полинуклеотид по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность не содержит пуриновые нуклеотиды в положениях, соответствующих нуклеотидам 33, 58, 59, 114, 123, 129, 181, 182, 213, 219, 226, 227, 237, 267, 285, 306, 309, 315, 324, 330, 339, 400, 401, 444, 456, 478, 480, 510, 594, 606, 618, 639, 697, 726, 744, 777, 807, 852, 877, 879, 888, 891, 921, 930, 960, 1042, 1050, 1116, 1140, 1183, 1184, 1194, 1197, 1221, 1249, 1251, 1257, 1273, 1276, 1281, 1290, 1293, 1357, 1372, 1373, 1413, 1446, 1452, 1464, 1474, 1475, 1482, 1519, 1520, 1542, 1584, 1590, 1599, 1608, 1653, 1668, 1674, 1689, 1692, 1734, 1761, 1776, 1788, 1803, 1824, 1845, 1854, 1881, 1893, 1902, 1909, 1910, 1929, 1932, 1960, 1987, 1988, 1992, 1998, 2020, 2031, 2047, 2049, 2062, 2067, 2076, 2121, 2167, 2169, 2190, 2193, 2208, 2229, 2259, 2283, 2298, 2323, 2343, 2346, 2361, 2373, 2382, 2388, 2403, 2409, 2410, 2412, 2448, 2457, 2472, 2476, 2478, 2505, 2520, 2547, 2574, 2622, 2634, 2661, 2673, 2706, 2712, 2763, 2775, 2796, 2811, 2817, 2832, 2838, 2871, 2886, 2892, 2898, 2910, 2922, 2931, 2937, 2958, 2970, 2997, 3033, 3039, 3069, 3075, 3117, 3129, 3156, 3166, 3235, 3246, 3273, 3285, 3306, 3321, 3369, 3399, 3405 и/или 3438 в SEQ ID NO: 2.
ORF15
5. Полинуклеотид по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность не содержит пуриновые нуклеотиды в положениях, соответствующих нуклеотидам 1689 и/или 3438 в SEQ ID NO: 2.
ORF15
6. Полинуклеотид по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность содержит нуклеотид T в положении, соответствующем положению 3405 в SEQ ID NO: 2.
ORF15
7. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность не содержит пуриновые нуклеотиды по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 или во всех из нуклеотидных положений, перечисленных в п. 4.
ORF15
8. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность не содержит пуриновые нуклеотиды по меньшей мере во всех из нуклеотидных положений, перечисленных в п. 4.
ORF15
9. Полинуклеотид по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичность с SEQ ID NO: 3.
ORF15
10. Полинуклеотид по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.
ORF15
11. Полинуклеотид по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 80% идентичности с SEQ ID NO: 1.
12. Полинуклеотид по п. 11, при этом указанная аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности с SEQ ID NO: 1.
13. Полинуклеотид по п. 11, где указанная аминокислотная последовательность имеет 100% идентичности с SEQ ID NO: 1.
ORF15
14. Полинуклеотидная последовательность по любому из предшествующих пунктов, при этом кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность содержит один или более нуклеотидов, выбранных из: C в положении, соответствующем положению 30 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 33 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 966 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 969 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 1011 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 1014 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 1029 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 1299 в SEQ ID NO: 2, C в положении, соответствующем положению 1689 в SEQ ID NO: 2, G в положении, соответствующем положению 3363 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 3405 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 3408 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 3409 в SEQ ID NO: 2, G в положении, соответствующем положению 3410 в SEQ ID NO: 2, G в положении, соответствующем положению 3432 в SEQ ID NO: 2, C в положении, соответствующем положению 3438 в SEQ ID NO: 2, и A в положении, соответствующем положению 3456 в SEQ ID NO: 2.
ORF15
15. Полинуклеотидная последовательность по любому из предшествующих пунктов, при этом кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность содержит один или более нуклеотидов, выбранных из: C в положении, соответствующем положению 30 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 33 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 48 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 57 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 60 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 69 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 72 в SEQ ID NO: 2, C в положении, соответствующем положению 171 в SEQ ID NO: 2, C в положении, соответствующем положению 189 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 441 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 537 в SEQ ID NO: 2, C в положении, соответствующем положению 546 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 786 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 792 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 966 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 969 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 990 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 1011 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 1014 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 1029 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 1299 в SEQ ID NO: 2, C в положении, соответствующем положению 1689 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 3355 в SEQ ID NO: 2, G в положении, соответствующем положению 3357 в SEQ ID NO: 2, G в положении, соответствующем положению 3363 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 3403 в SEQ ID NO: 2, C в положении, соответствующем положению 3404 в SEQ ID NO: 2, T в положении, соответствующем положению 3405 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 3408 в SEQ ID NO: 2, A в положении, соответствующем положению 3409 в SEQ ID NO: 2, G в положении, соответствующем положению 3410 в SEQ ID NO: 2, G в положении, соответствующем положению 3432 в SEQ ID NO: 2, C в положении, соответствующем положению 3438 в SEQ ID NO: 2, и A в положении, соответствующем положению 3456 в SEQ ID NO: 2.
ORF15
ORF15
16. Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую изоформу ORF15 регулятора ГТФазы пигментного ретинита (RPGR), при этом кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность была кодон-оптимизирована для повышения точности репликации последовательности, и где нуклеотидная последовательность: (i) содержит SEQ ID NO: 3; (ii) функционально связана с полинуклеотидом, содержащим промотор родопсин-киназы (GRK1); и (iii) содержит сайт полиаденилирования.
ORF15
17. Полинуклеотид по п. 16, где кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO: 1.
18. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что промотор GRK1 представляет собой промотор GRK1 человека.
19. Полинуклеотид по п. 18, отличающийся тем, что указанный промотор GRK1 содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7 или функциональный вариант, имеющий по меньшей мере 90 или 95% идентичности с ней.
ORF15
ORF15
20. Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую изоформу ORF15 регулятора ГТФазы пигментного ретинита (RPGR), при этом кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность была кодон-оптимизирована для повышения точности репликации последовательности, и где нуклеотидная последовательность: (i) содержит SEQ ID NO: 3; (ii) функционально связана с полинуклеотидом, содержащим промотор родопсин-киназы (GRK1), который содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7; и (iii) содержит сайт полиаденилирования.
ORF15
21. Полинуклеотид по п. 20, отличающийся тем, что кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 80% идентичность с SEQ ID NO: 1.
22. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что сайт полиаденилирования содержит сигнал полиаденилирования (поли-A) бычьего гормона роста (BGH).
23. Полинуклеотид по п. 22, отличающийся тем, что сигнал поли-А BGH содержит последовательность SEQ ID NO: 5.
ORF15
24. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что кодирующая RPGR нуклеотидная последовательность содержит менее 165 динуклеотидов CpG и/или содержит не более двух CpG-островков.
ORF15
25. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, имеющий по существу такую же, или повышенную, точность репликации в сравнении с эквивалентным полинуклеотидом, содержащим человеческий RPGR дикого типа с SEQ ID NO: 2.
ORF15
26. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, имеющий повышенную стабильность и/или менее подверженный мутациям, возникающим в процессе циклов репликации полинуклеотида, в сравнении с эквивалентным полинуклеотидом, содержащим человеческий RPGR дикого типа с SEQ ID NO: 2.
ORF15
27. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, обеспечивающий более высокие скорости трансляции и/или экспрессии белка в сравнении с эквивалентным полинуклеотидом, содержащим человеческий RPGR дикого типа с SEQ ID NO: 2.
ORF15
28. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, способствующий уменьшению или предотвращению образования альтернативно сплайсированных вариантов и/или укороченных белков в сравнении с эквивалентным полинуклеотидом, содержащим человеческий RPGR дикого типа с SEQ ID NO: 2.
ORF15
29. Вирусный вектор для доставки изоформы ORF15 регулятора ГТФазы пигментного ретинита (RPGR), содержащий полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов.
30. Вирусный вектор по п. 29, представляющий собой аденоассоциированный вирусный (AAV), ретровирусный, лентивирусный или аденовирусный вектор.
31. Вирусный вектор по п. 29 или 30, представляющий собой AAV вектор.
32. Вирусный вектор по любому из пп. 29-31, имеющий форму вирусной частицы.
33. Вирусный вектор по п. 32, представляющий собой транскапсидированный AAV вектор.
34. Вирусный вектор по п. 25, содержащий геном AAV2 и капсидные белки AAV5 (AAV2/5) или AAV8 (AAV2/8).
35. Вирусный вектор по п. 32 или 33, представляющий собой AAV вектор, содержащий геном AAV2 и/или капсидный белок AAV8.
36. Вирусный вектор по п. 35, отличающийся тем, что капсид AAV представляет собой AAV8/Y733F капсидный белок.
37. Вирусный вектор по п. 35, где геном AAV2 или его производное содержат два инвертированных концевых повтора (ITR).
38. Вирусный вектор по любому из пп. 29-37, где вектор дополнительно содержит одну или более дополнительных регуляторных последовательностей, где одна или более дополнительных регуляторных последовательностей содержит сайт полиаденилирования, и где сайт полиаденилирования содержит сигнал полиаденилирования (поли-A) бычьего гормона роста (BGH).
39. Вирусный вектор по п. 38, отличающийся тем, что сигнал поли-А BGH содержит последовательность SEQ ID NO: 5.
40. Вирусный вектор по п. 38 или 39, где вектор дополнительно содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE). 41. Система продуцирования вирусного вектора, содержащая набор полинуклеотидов, кодирующих компоненты, необходимые для продуцирования вирусного вектора, при этом геном вирусного вектора содержит полинуклеотид по любому из пп. 1-28.
42. Конструкция ДНК для применения в системе продуцирования вирусного вектора по п. 41, содержащая полинуклеотид по любому из пп. 1-28.
43. Клетка, продуцирующая вирусный вектор, которая содержит полинуклеотид по любому из пп. 1-28, систему продуцирования вирусного вектора по п. 41 или конструкцию ДНК по п. 42.
44. Способ продуцирования вирусного вектора, включающий введение полинуклеотида по любому из пп. 1-28 в клетку и культивирование клетки в условиях, подходящих для продуцирования вирусного вектора.
45. Вирусный вектор, получаемый с применением продуцирующей вирусный вектор клетки по п. 43 или способа по п. 44.
46. Клетка, трансфицированная полинуклеотидом по любому из пп. 1-28 или трансдуцированная вирусным вектором по любому из пп. 29-40 или 45.
47. Способ по п. 44 или клетка по п. 46, при этом указанная клетка представляет собой клетку HEK293 или HEK293T.
48. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения пигментного ретинита, содержащая полинуклеотид по любому из пп. 1-28, вирусный вектор по любому из пп. 29-40 или 45, или клетку по п. 46 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.
9
13
49. Фармацевтическая композиция по п. 48, отличающаяся тем, что вектор представляет собой вектор AAV, и AAV вектор находится в суспензии в концентрации примерно от 1-2×10 до 1-2×10 геномных частиц (гч) в миллилитре (мл).
50. Применение полинуклеотида по любому из пп. 1-28 или вирусного вектора по любому из пп. 29-40 или 45 для лечения или предотвращения пигментного ретинита.
51. Применение полинуклеотида по любому из пп. 1-28 или вирусного вектора по любому из пп. 29-40 или 45 для уменьшения гибели фоторецепторных клеток у субъекта, страдающего от, или имеющего риск развития, пигментного ретинита.
52. Применение по п. 50 или 51, при этом пигментный ретинит представляет собой X-связанный пигментный ретинит.
53. Применение по любому из пп. 50-52, при этом вирусный вектор вводят в глаз субъекта субретинальной, прямой ретинальной или интравитреальной инъекцией.
9
10
11
54. Применение по любому из пп. 50-53, отличающееся тем, что вирусный вектор представляет собой вектор AAV, и AAV вектор вводится в дозе по меньшей мере 2×10, по меньшей мере 2×10или по меньшей мере 2×10 геномных частиц (гч) на глаз.
55. Применение по любому из пп. 50-54, где вирусный вектор представляет собой вектор AAV, и вектор AAV вводится в объеме примерно 1-500 мкл.
56. Применение по п. 55, где объем составляет примерно 1, 2, 5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 мкл.
57. Применение по любому из пп. 50-56, при этом субретинальная инъекция включает этапы:
(a) введения раствора субъекту субретинальной инъекцией в количестве, эффективном для по меньшей мере частичного отслоения сетчатки, с образованием субретинального пузыря, при этом раствор не содержит полинуклеотид или вирусный вектор; и
(b) введения лекарственной композиции субретинальной инъекцией в пузырь, образованный на этапе (a), при этом лекарственная композиция содержит полинуклеотид или вирусный вектор.
58. Применение по любому из пп. 50-57, при этом вирусный вектор вводят субъекту одной дозой.
59. Применение по любому из пп. 50-58, при этом дегенерация фоторецепторных клеток вследствие пигментного ретинита по существу предотвращается на всем протяжении жизни субъекта.
60. Применение по любому из пп. 50-59, при этом зрительная функция по существу восстанавливается или сохраняется в получающем лечение глазу.
61. Применение полинуклеотида по любому из пп. 1-28 или вирусного вектора по любому из пп. 29-40 или 45 для:
ORF15
ORF15
(a) уменьшения или предотвращения образования альтернативно сплайсированных вариантов и/или укороченных белков RPGR в сравнении с вектором или полинуклеотидом, содержащим ген RPGR дикого типа,
ORF15
ORF15
(b) повышения стабильности и/или точности репликации нуклеотидной последовательности, содержащей ген RPGR, в сравнении с нуклеотидной последовательностью, содержащей ген RPGR дикого типа,
ORF15
ORF15
(c) повышения скоростей трансляции и/или экспрессии белка RPGR в сравнении с вектором или полинуклеотидом, содержащим ген RPGR дикого типа, и/или
ORF15
ORF15
(d) увеличения продуцирования кодирующей RPGR нуклеотидной последовательности в сравнении с нуклеотидной последовательностью, содержащей ген RPGR дикого типа.