Способ лечения анемии с применением композиции ЕРО длительного действия
METHOD OF TREATING ANEMIA WITH USE OF ERO COMPOSITION OF LONG-TERM EFFECT

Данное изобретение относится к способу лечения анемии с применением композиции эритропоэтина (в дальнейшем ЕРО) длительного действия. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу лечения анемии, включающему введение слитого полипептида, который включает в себя ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, пациенту, страдающему анемией, а также к способу коррекции или поддержания уровня гемоглобина в крови у пациента с анемией.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
ЕРО представляет собой гликопротеиновый гормон, способствующий образованию красных кровяных телец. Он образуется почками в зависимости от концентрации кислорода in-vivo и хорошо известен как фактор, регулирующий эритропоэз. Красные кровяные тельца представляют собой клетки крови, незаменимые для переноса кислорода in-vivo. У пациентов с почечной недостаточностью может развиться нарушение высвобождения ЕРО, что будет влиять на эритропоэз и, следовательно, будут наблюдаться симптомы анемии.
В соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) анемию определяют, как концентрацию гемоглобина в крови ниже 13,0 г/дл для взрослых мужчин и женщин в постменопаузе или ниже 12,0 г/дл для женщин в пременопаузе (Всемирная Организация Здравоохранения. Алиментарные анемии: Доклад научной группы ВОЗ. Женева, Швейцария: Всемирная Организация Здравоохранения, 1968). На основании вышеуказанных стандартов, гемоглобин крови ниже 10 г/дл встречается у 90% или более пациентов с анемией, имеющих скорость клубочковой фильтрации (СКФ) < 25-30 мл/мин (четвертая стадия почечной недостаточности) (Kazmi WH, Kausz AT, Khan S, et al.Anemia: an early complication of chronic renal insufficiency. AmJKidneyDis 2001; 38: 803).

Улучшения при анемических состояниях можно добиться благодаря введению агентов ЕРО для облегчения симптомов анемии. Для этой цели компанией Amgenln были выпущены продукты ЕРО первого поколения, полученные путем генетической рекомбинации, такие как EPOGEN и NEORECORMON. Однако эти продукты первого поколения были неудобны, поскольку из-за короткого времени их полужизни их требовалось вводить три раза в неделю. Соответственно, для большего удобства пациентов, в 2000 годах были выпущены продукты ЕРО длительного действия, такие как ARANESP и MICERA, которые можно вводить один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в месяц. Однако по-прежнему существует необходимость в разработке продуктов ЕРО с более продолжительным периодом полужизни для удобства пациентов, а также существует необходимость в разработке биологически совместимых и длительно действующих продуктов ЕРО, полученных без химического присоединения. Кроме того, при разработке длительно действующих агентов ЕРО, помимо необходимости долговременного поддержания in-vivo их эффективности для большего удобства пациентов, особое внимание уделяют необходимости минимизации риска неблагоприятных сердечно-сосудистых эффектов вследствие быстрого повышения или частого изменения уровней гемоглобина.
Авторы настоящего изобретения разработали слитый полипептид EPO-hyFc (патент US 7867491, содержание которого включено путем ссылки), в котором слиты белок ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, и подтвердили, что при введении слитого полипептида EPO-hyFc здоровым взрослым людям продолжительность действия in-vivo сохранялась без каких-либо серьезных неблагоприятных воздействий лекарства, как и у существующих обычных продуктов (Clinical Drug Investigation June 2014, Volume 34, Issue 6, pp 373-382).
Однако, поскольку результаты были получены на здоровых взрослых людях, не было уверенности, будет ли лекарство демонстрировать такой же терапевтический эффект на пациентах с анемией. Кроме того, результаты только подтвердили безопасность однократного введения лекарства и не позволили выяснить ничего о необходимом интервале между введениями лекарства, что необходимо при долгосрочной терапии. Кроме того, поскольку у здоровых взрослых людей существуют физиологические регуляторные механизмы поддержания гомеостаза, невозможно точно подтвердить изменения уровня гемоглобина, который является фармакодинамическим параметром для EPO-hyFc, когда введение агента ЕРО приводит к повышению концентрации гемоглобина выше нормального физиологического диапазона. Следовательно, влияние однократного введения агента ЕРО можно предсказать только по изменениям, затрагивающим ретикулоциты, являющихся предшественниками эритроцитов, как опережающему индикатору.
Таким образом, лечение анемии требует разработки более безопасного и более надежного способа введения слитого полипептида EPO-hyFc с соответствующими эффективной дозой и интервалом между введениями.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача
Авторы настоящего изобретения предприняли попытку разработать безопасный и более надежный способ лечения анемии. В результате, когда авторы изобретения вводили слитый белок, включающий в себя ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, пациентам с анемией, авторы изобретения нашли оптимальные дозу и интервал между введениями слитого белка, оказывающие существенное воздействие, которые не были подтверждены ранее и составляют суть данного изобретения.
Техническое решение
Задачей настоящего изобретения является разработка способа лечения анемии путем введения безопасного и длительно действующего слитого полипептида, включающего в себя ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, в эффективной дозе и с эффективным интервалом между введениями.
Другой задачей настоящего изобретения является разработка способа коррекции или поддержания уровня гемоглобина в крови у пациента с анемией, при помощи введения, описанного выше.
Преимущества изобретения
Настоящее изобретение относится к оптимальной дозе введения и оптимальному интервалу между введениями слитого полипептида, включающего в себя ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, демонстрирующего постепенное повышение уровней гемоглобина, при этом демонстрирующего превосходную безопасность и продолжительность действия in-vivo сроком до одного месяца. Способ введения слитого полипептида, включающего в себя ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, используя оптимальную вводимую дозу и оптимальный интервал между введениями, можно эффективно применять для лечения пациентов с анемией.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1А-1Г представляют графики, иллюстрирующие изменения уровней гемоглобина и ретикулоцитов у здоровых взрослых людей после внутривенного введения и подкожного введения слитого полипептида EPO-hyFc, соответственно, где на Фиг. 1А и Фиг. 1В показаны результаты внутривенного введения, а на Фиг. 1Б и Фиг. 1Г показаны результаты подкожного введения.
Фиг. 2А и 2Б относятся к слитому полипептиду EPO-hyFc, где на Фиг. 2А показана схема и структура слитого полипептида EPO-hyFc, а на Фиг. 2Б показана аминокислотная последовательность слитого полипептида EPO-hyFc. Ha Фиг. 2Б курсивом выделена часть, представляющая шарнирный участок IgD, подчеркнута часть, представляющая СН2 домен IgD, а жирным выделена часть, представляющая СН2 и СН3 домены IgG4.
На Фиг. 3 приведена схема клинического исследования, разработанного для подтверждения изменения уровня гемоглобина после введения каждой дозы слитого полипептида EPO-hyFc пациенту с хронической почечной недостаточностью и анемией, где ГД обозначает гемодиализ, ПД обозначает перитонеальный диализ, ХПН обозначает хроническую почечную недостаточность, Q1W обозначает введение с интервалом 1 неделя, Q2W обозначает введение с интервалом 2 недели, a Q4W обозначает введение с интервалом 4 недели, соответственно.
На Фиг. 4А и 4Б показаны графики, иллюстрирующие диапазон колебаний уровней гемоглобина в зависимости от дозы, где слитый полипептид EPO-hyFc вводили пациенту с хронической почечной недостаточностью, анемией, где BL означает исходный уровень.
Предпочтительные воплощения изобретения
Для решения вышеуказанных задач в одном аспекте данного изобретения предложен способ лечения анемии, включающий введение слитого полипептида, включающего в себя ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, в дозе от 4 мкг/кг до 9 мкг/кг с интервалом от 2 недель до 4 недель.
В настоящем изобретении установлены оптимальные вводимая доза и интервал между введениями слитого полипептида, который включает ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, способные корректировать или поддерживать гемоглобин в крови на нормальном уровне при введении пациенту с анемией. Соответственно, введение пациентам с анемией слитого полипептида в установленной в данном изобретении вводимой дозе и с установленным в данном изобретении интервалом между введениями может корректировать или поддерживать уровень гемоглобина крови у пациента в нормальном диапазоне и, в конечном счете, лечить анемию. Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
В данном описании термин «эритропоэтин (ЕРО)», который представляет собой гликопротеиновый гормон, относится к цитокинам, задействованным в эритропоэзе. ЕРО может происходить от различных биологических видов, например, человека, яванского макака, мыши, крысы и кролика, однако его происхождение не ограничивается этими биологическими видами, при условии, что он может повышать уровень гемоглобина в крови.
В частности, ЕРО может состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию 70% и более, в частности, 80% или более, более конкретно, 90% или более, еще более конкретно, 95% или более, или еще более конкретно, 98% или более, и наиболее конкретно, 99% или более, без ограничения.
Очевидно, что аминокислотные последовательности, в которых произведена делеция, модификация, замена или вставка части последовательности, также могут входить в объем данного изобретения, при условии, что они гомологичны вышеупомянутым последовательностям и обладают такой же или аналогичной биологической активностью, как и белок с последовательностью SEQ ID NO:1.
В данном описании термин «гомология» относится к степени идентичности заданной аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности и может выражаться в процентах. В данном описании гомологичные последовательности, имеющие одинаковую или схожую активность с заданной аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью, могут указываться с использованием термина «% гомологии». Например, % гомологии может подтверждаться с использованием стандартного программного обеспечения, например, BLAST 2.0 для расчета таких параметров, как индекс, идентичность и сходство, или путем сравнения последовательностей в экспериментах с гибридизацией по Саузерну в строго определенных условиях. Соответствующие условия гибридизации можно определить способом, известным специалисту в области техники (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).
Используемый в данном документе термин «Fc фрагмент иммуноглобулина» или «Fc иммуноглобулина» относится к белку, который включает константную область тяжелой цепи (СН) иммуноглобулина, за исключением вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, и константный участок легкой цепи (CL) иммуноглобулина. Fc область иммуноглобулина может дополнительно включать шарнирный участок и, применительно к целям настоящего изобретения, может включать 2 константный участок тяжелой цепи (СН2) и 3 константный участок тяжелой цепи (СН3) и может включать или не включать 1 константный участок тяжелой цепи (СН1).
Кроме того, Fc фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может быть представлен формой, имеющей нативные углеводные цепи или повышенное или пониженное количество углеводных цепей по сравнению с нативной формой или может быть представлен дегликозилированной формой. Увеличение, уменьшение или удаление углеводных цепей Fc иммуноглобулина может достигаться способами, обычно используемыми в области техники, такими как химический способ, ферментативный способ и генноинженерный способ, в котором используют микроорганизмы. Удаление углеводных цепей в Fc области приводит к резкому снижению аффинности связывания с C1q участком первого компонента комплемента С1 и снижению или потере антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), и, следовательно, не вызывает ненужных иммунных ответов in-vivo. В связи с этим, Fc фрагмент иммуноглобулина в дегликозилированной или агликозилированной форме может лучше подходить в качестве носителя лекарства для решения задач настоящего изобретения.
В данном документе термин «дегликозилирование» относится к ферментативному удалению углеводных компонентов Fc фрагмента, а термин «агликозилирование» относится к продуцированию негликозилированного Fc фрагмента прокариотами, предпочтительно, Е.coli.
Fc иммуноглобулина может представлять собой любую из Fc областей IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Кроме того, Fc иммуноглобулина может быть модифицирован для предупреждения связывания FcR и/или связывания комплемента. В частности, в настоящем изобретении в качестве Fc иммуноглобулина использовали гибридный Fc и обозначали его «гибридный F иммуноглобулина». В настоящем изобретении термин «гибридный Fc иммуноглобулина» используют взаимозаменяемо с «hyFc».
Гибридный Fc иммуноглобулина может быть получен в результате комбинации подклассов IgG или комбинации IgD человека и IgG человека. Например, Fc область может включать в себя в направлении от N-конца к С-концу шарнирный участок, СН2 домен и СН3 домен. В частности, шарнирный участок может включать в себя шарнирный участок IgD человека. Кроме того, СН2 домен может включать в себя аминокислотные остатки IgD человека и СН2 домен IgG4. Кроме того, СН3 домен может включать в себя аминокислотные остатки СН3 домена IgG4 человека.
В частности, гибридный Fc иммуноглобулина может состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию 70% и более, в частности, 80% или более, более конкретно, 90% или более, еще более конкретно, 95% или более, или еще более конкретно, 98% или более, и наиболее конкретно, 99% или более, без ограничения.
Очевидно, что аминокислотные последовательности, в которых произведена делеция, модификация, замена или вставка части последовательности, также могут входить в объем данного изобретения, при условии, что они гомологичны вышеупомянутым последовательностям и обладают такой же или аналогичной биологической активностью, как и белок с последовательностью SEQ ID NO: 2.
Когда гибридный Fc иммуноглобулина связывается с белком ЕРО, он может увеличивать время полужизни в ЕРО в сыворотке, при этом не ингибируя его активность.
В данном описании термин «слитый полипептид, включающий белок ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина» относится к слитому белку, в котором Fc иммуноглобулина слит с белком ЕРО. В настоящем изобретении термин «слитый полипептид, включающий ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина» используют взаимозаменяемо со «слитым полипептидом ЕРО-hyFc». В частности, слитый полипептид может представляет собой полипептид, в котором N-конец гибридного Fc иммуноглобулина и С-конец ЕРО связаны друг с другом, но не ограничивается ими. Кроме того, слитый белок может представлять собой белок, в котором гибридный Fc иммуноглобулина и ЕРО связаны посредством линкера.
В частности, гибридный Fc иммуноглобулина может состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию 70% и более, в частности, 80% или более, более конкретно, 90% или более, еще более конкретно, 95% или более, или еще более конкретно, 98% или более, и наиболее конкретно, 99% или более, без ограничения.
Очевидно, что аминокислотные последовательности, в которых произведена делеция, модификация, замена или вставка части последовательности, также могут входить в объем данного изобретения, при условии, что они гомологичны вышеупомянутым последовательностям и обладают такой же или аналогичной биологической активностью, как и белок с последовательностью SEQ ID NO: 3.
Слитый полипептид, включающий в себя ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, очень безопасен in-vivo, поскольку после введения слитого полипептида пациентам с анемией не наблюдается образования антител, и время полужизни слитого полипептида может поддерживаться на уровне от 138 часов до 158 часов, что приблизительно в 19 раз выше, чем у ЕРО продуктов первого поколения, у которых оно составляет приблизительно 8 часов (Sports Med 2003; 33 (4): 301-315).
В приведенном в качестве примера воплощении настоящего изобретения разработали схему исследования для подтверждения диапазона эффективности слитого полипептида EPO-hyFc в результате изменения уровней гемоглобина у пациентов с хронической почечной недостаточностью и анемией при многократных введениях слитого полипептида EPO-hyFc (Фиг. 3).Кроме того, подтвердили вводимую дозу и интервал между введениями слитого полипептида EPO-hyFc, которые можно эффективно применять для лечения анемии, снизив риск сердечно-сосудистых побочных эффектов благодаря предупреждению быстрой ответной реакции при одновременном сохранении надежности (Таблица 1).
Таким образом, подтвердили, что анемию можно эффективно лечить путем введения пациентам с анемией слитого полипептида EPO-hyFc в дозе от 4 мкг/кг до 9 мкг/кг с интервалом от 2 недель до 4 недель, корректируя уровень гемоглобина крови или поддерживая его на нормальном уровне.
В данном документе термин «анемия» относится к недостаточному количеству эритроцитов и/или недостаточному уровню гемоглобина, которые возникают в результате ненадлежащей продукции функциональных белков ЕРО продуцирующими ЕРО клетками пациента и/или ненадлежащего высвобождения белков ЕРО в систему циркуляции и/или недостаточного ответа эритробластов костного мозга на белки ЕРО. Пациенты с симптомами анемии не способны к поддержанию гомеостаза эритроцитов. В целом, анемию может вызывать нарушение или потеря почечной функции (например, хроническая почечная недостаточность), относительный дефицит ЕРО, хроническая сердечная недостаточность, миелосупрессивная терапия, такая как химиотерапия или антивирусная терапия (например, AZT), немиелогенный рак, вирусные инфекции, такие как ВИЧ, аутоиммунные заболевания (например, ревматоидный артрит), заболевания печени, полиорганная недостаточность и т.д., без ограничения.
В настоящем изобретении пациентами с анемией могут быть пациенты, которым периодически проводят перитонеальный диализ или гемодиализ, без ограничения. В частности, пациентами могут быть люди, но не только.
В данном документе термин «лечение» относится к любому действию, связанному с улучшением или благоприятными изменениями симптомов анемии при введении слитого полипептида EPO-hyFc по настоящему изобретению или содержащей его фармацевтической композиции. Введение относится к обеспечению пациента конкретным материалом любым соответствующим способом, и путь введения слитого полипептида EPO-hyFc по настоящему изобретению может не ограничиваться каким-либо конкретным при условии, что слитый полипептид поступит в ткань-мишень. Например, введение слитого полипептида EPO-hyFc по настоящему изобретению может быть внутрисуставным, внутрибрюшинным, внутривенным, внутримышечным, подкожным, внутрикожным, пероральным, поверхностным, интраназальным, внутрилегочным и интраректальным, и, в частности, внутривенным или подкожным.
Способ лечения анемии, предложенный в настоящем изобретении, можно осуществлять путем введения пациенту с анемией, слитого полипептида EPO-hyFc в дозе от 4 мкг/кг до 9 мкг/кг с интервалами от 2 недель до 4 недель.
В частности, способ лечения анемии может представлять собой введение слитого полипептида EPO-hyFc в дозе от 5 мкг/кг до 8 мкг/кг и, более конкретно, 5 мкг/кг или 8 мкг/кг. Кроме того, способ может представлять собой введение слитого полипептида EPO-hyFc с интервалами 2 недели или 4 недели. Более конкретно, способ может представлять собой введение слитого полипептида EPO-hyFc в дозе 5 мкг/кг с интервалами 2 недели, в дозе 8 мкг/кг с интервалами 2 недели, в дозе 5 мкг/кг с интервалами 4 недели или в дозе 8 мкг/кг с интервалами 4 недели.
Способ лечения анемии может представлять собой коррекцию или поддержание уровня гемоглобина крови у пациента с анемией в нормальном диапазоне путем введения слитого полипептида EPO-hyFc.
В данном описании термин «коррекция» относится к действию, вызывающему возврат аномального состояния к нормальному состоянию, а «поддержание» относится к действию, сохраняющему нормальное состояние. Таким образом, коррекция или поддержание уровня гемоглобина крови в нормальном диапазоне относится к индукции возврата аномального уровня гемоглобина крови к норме или к сохранению нормального уровня гемоглобина крови.
Согласно недавним рекомендациям организаций, регулирующих сферу обращения лекарственных средств, всех стран, включая Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США, введение терапевтических агентов для лечения анемии должно быть осторожным и сопровождаться тщательным мониторингом, поскольку существует повышенный риск развития побочных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы, когда происходит быстрое повышение уровней гемоглобина, и, в частности, организации рекомендуют введение агентов ЕРО пациентам с тяжелой анемией. Согласно клиническим рекомендациям (клинические рекомендации по анемии при хронических заболеваниях почек (улучшение глобальных исходов лечения пациентов с заболеваниями почек) 2012, с. 304), целью первоначального введения агентов ЕРО, которые применяют для лечения пациентов с почечной недостаточностью и анемией, предпочтительно, является повышение уровней гемоглобина от 1 г/дл до 2 г/дл в течение четырех недель после введения. Однако, согласно фактическому клиническому отчету, увеличение уровней гемоглобина происходило в диапазоне от 0,7 г/дл до 2,5 г/дл.
Целью лечения анемии у пациентов с почечной недостаточностью является поддержание уровня гемоглобина крови в диапазоне от 10 г/дл до 12 г/дл. Согласно докладу, когда уровень гемоглобина крови повышается до 13 г/дл или более, существует повышенный риск возникновения побочных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы и смерти, и поэтому недавно были выпущены новые рекомендации, согласно которым при повышении уровня гемоглобина крови до 11 г/дл или выше введение агентов ЕРО прекращают или корректируют дозу (2011, Сведения о лекарственной безопасности Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств: Модифицированные рекомендации по дозировкам для улучшения безопасности применения агентов, стимулирующих эритропоэз при хронических заболеваниях почек).
Кроме того, согласно рекомендациям Национального фонда заболеваний почек США / Инициативы по качеству лечения заболеваний почек (NFK-K/DOQI) от 2007 г, людям, имеющим концентрацию гемоглобина 11,0 г/дл или ниже, рекомендована терапия агентами ЕРО, целевая концентрация гемоглобина при лечении находится в диапазоне от 11,0 г/дл до 12,0 г/дл, а измерение концентрации гемоглобина рекомендуется проводить по меньшей мере один раз в месяц (KDOQI clinical practice guidelines and clinical practice recommendations for anemia in chronic kidney disease. Am J Kidney Dis 2006; 47(5 suppl 3): S11-145).Согласно рекомендациям KDIGO от 2012 г, пациентам с 5 стадией почечной недостаточности рекомендуется прием агентов ЕРО, когда концентрация гемоглобина находится в диапазоне от 9,0 г/дл до 10,0 г/дл, а в случае поддерживающей терапии рекомендованная концентрация гемоглобина крови не должна превышать 11,5 г/дл (Klinger AS, Foley RN, Goldfarb DS, et al. KDOQI US commentary on the 2012 KDIGO clinical practice guideline for anemia in CKD. Am J Kidney Dis 2013).
В настоящем изобретении коррекцию анемии можно определить, как введение слитого полипептида EPO-hyFc пациентам с анемией, имеющим уровень гемоглобина крови ниже нормального диапазона, чтобы уровень гемоглобина крови у пациента мог достигнуть нормального уровня, а поддержание можно определить, как введение слитого полипептида EPO-hyFc пациенту с анемией, имеющему уровень гемоглобина крови в нормальном диапазоне, для продолжения его сохранения в нормальном состоянии.
Во избежание побочных эффектов при коррекционной терапии очень важное значение может иметь скорость достижения нормального уровня гемоглобина от аномального уровня гемоглобина крови. В частности, скорость может быть такой, когда уровень гемоглобина повышается от 0,7 г/дл до 2,5 г/дл в течение четырех недель после введения, но не ограничивается им.
При поддерживающей терапии может быть важным поддерживать нормальный уровень гемоглобина крови, варьирующий в небольшом диапазоне. В частности, поддерживающая терапия может представлять собой постоянное поддержание уровня гемоглобина крови в нормальном диапазоне, незначительно колеблющегося в пределах от ± 1,1 г/дл до 1,3 г/дл (J Am Soc Nephrol, 2009, 20: 479-487), но диапазон колебаний не ограничивается этими значениями.
Нормальный уровень гемоглобина крови может находиться, например, в диапазоне от 10 г/дл до 12 г/дл, но диапазон может быть соответствующим образом изменен специалистом в области техники в зависимости от таких факторов, как состояние здоровья пациента, способ введения, внешние условия и т.д., и не обязательно ограничивается ими. Кроме того, специалист в области техники также может сделать соответствующий выбор между коррекцией или поддержанием уровней гемоглобина у пациента путем контролирования интервала между введениями или дозы слитого полипептида EPO-hyFc по настоящему изобретению, с учетом состояния здоровья пациента, и они не обязательно ограничиваются одной вводимой дозой или одним интервалом между введениями.
Согласно приведенному в качестве примера воплощению настоящего изобретения, когда уровень гемоглобина в крови у пациента с анемией, у которого уровень гемоглобина крови ниже случайным образом выбранного нормального уровня гемоглобина крови, достигает нормальных значений при введении пациенту конкретной дозы слитого полипептида EPO-hyFc с конкретным интервалом между введениями в целях коррекции уровня гемоглобина, дозу вводимого слитого полипептида EPO-hyFc и интервал между введениями можно изменить в целях поддержания уровня гемоглобина, а когда определяют, что уровень гемоглобина излишне повышается, введение можно временно прекратить.
В настоящем изобретении коррекционная терапия может осуществляться путем введения слитого полипептида, включающего ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина в дозе от 5 мкг/кг до 8 мкг/кг и введение слитого полипептида может осуществляться с интервалами от 2 недель до 4 недель, но не ограничивается ими. В частности, коррекционная терапия может представлять собой введение слитого полипептида, включающего ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина в дозе от 5 мкг/кг до 8 мкг/кг и введение слитого полипептида может представлять собой введение с интервалами 2 недели или 4 недели. Более конкретно, коррекционная терапия может представлять собой введение слитого полипептида, который содержит ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, в дозе 5 мкг/кг или 8 мкг/кг с интервалами 2 недели или введение слитого полипептида, который содержит ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, в дозе 8 мкг/кг с интервалами 4 недели.
В настоящем изобретении поддерживающая терапия может представлять собой введение слитого полипептида, включающего ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина в дозе от 5 мкг/кг до 8 мкг/кг и может представлять собой введение слитого полипептида с интервалами 4 недели, но не ограничивается ими. В частности, поддерживающая терапия может представлять собой введение слитого полипептида, включающего ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина в дозе 5 мкг/кг или 8 мкг/кг. Более конкретно, поддерживающая терапия может представлять собой введение слитого полипептида, включающего ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, в дозе 5 мкг/кг или 8 мкг/кг с интервалами 4 недели.
Кроме того, в частности, способ лечения анемии может включать: а) коррекцию путем введения пациенту с анемией, у которого уровень гемоглобина крови ниже нормального диапазона, слитого полипептида, включающего в себя ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, в дозе 5 мкг/кг или 8 мкг/кг с интервалами 2 недели; или введения слитого полипептида в дозе 8 мкг/кг с интервалами 4 недели; и б) поддержание путем введения пациенту с анемией, у которого уровень гемоглобина крови скорректирован до нормального диапазона на стадии а), слитого полипептида, включающего в себя ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, в дозе 5 мкг/кг или 8 мкг/кг с интервалами 4 недели.
В приведенном в качестве примера воплощении настоящего изобретения слитый полипептид EPO-hyFc по настоящему изобретению многократно вводили пациентам с почечной недостаточностью в дозе 3 мкг/кг, 5 мкг/кг или 8 мкг/кг с интервалами 2 недели и непрерывно наблюдали за уровнем гемоглобина крови (Фиг. 4А и Таблица 1).
В результате, при введении слитого полипептида EPO-hyF в дозе 3 мкг/кг уровень гемоглобина в момент времени через 6 недель после введения повышался на 0,74 г/дл и достигал 9,5 г/дл, что незначительно ниже нормального диапазона. Напротив, когда слитый полипептид EPO-hyF вводили в дозе 5 мкг/кг уровень гемоглобина повышался до 9,74 г/дл, что соответствует повышению 1,14 г/дл; а когда слитый полипептид EPO-hyF вводили в дозе 8 мкг/кг, уровень гемоглобина повышался до 10,13 г/дл, что соответствует повышению 1,23 г/дл; и, таким образом, подтвердили, что при введении слитого полипептида EPO-hyF в дозе 5 мкг/кг или 8 мкг/кг с интервалами 2 недели уровень гемоглобина корректировался, приближаясь к нормальному уровню.
Приведенные выше результаты подтверждают, что при введении слитого полипептида EPO-hyFc по настоящему изобретению пациентам с анемией с интервалами 2 недели, для коррекции уровней гемоглобина целесообразно производить введение в дозе 5 мкг/кг или 8 мкг/кг.
В другом приведенном в качестве примера воплощении настоящего изобретения слитый полипептид EPO-hyFc по настоящему изобретению многократно вводили пациентам с почечной недостаточностью в дозе 3 мкг/кг, 5 мкг/кг или 8 мкг/кг с интервалами 4 недели и непрерывно наблюдали за уровнем гемоглобина крови (Фиг. 4Б и Таблица 2).
В результате, когда слитый полипептид EPO-hyFc вводили в дозе 3 мкг/кг, уровень гемоглобина в момент времени через 8 недель после введения снижался на 0,74 г/дл, что подтверждало ухудшение симптомов и отсутствие какого-либо терапевтического эффекта, вопреки ожиданиям. Напротив, когда слитый полипептид EPO-hyFc вводили в дозе 5 мкг/кг уровень гемоглобина понижался на 0,01 г/дл и достигал 9,23 г/дл, что подтверждало сохранение того уровня гемоглобина, каким он был до введения. Кроме того, когда слитый полипептид EPO-hyFc вводили в дозе 8 мкг/кг уровень гемоглобина повышался на 0,79 г/дл и достигал 10,17 г/дл, что подтверждало коррекцию уровня гемоглобина или поддержание его на нормальном уровне.
Приведенные выше результаты подтверждают, что при введении слитого полипептида EPO-hyFc по данному изобретению пациентам с анемией с интервалами 4 недели целесообразно проводить введение в дозе 5 мкг/кг для поддержания уровня гемоглобина и в дозе 5 мкг/кг или 8 мкг/кг для коррекции или поддержания уровней гемоглобина.
В еще одном приведенном в качестве примера воплощении данного изобретения способ коррекции или поддержания уровня гемоглобина крови у пациента с анемией в концентрации от 10 г/дл до 12 г/дл включает введение слитого полипептида, включающего в себя эритропоэтин (ЕРО) и гибридный Fc иммуноглобулина, в дозе от 4 мкг/кг до 9 мкг/кг с интервалами от 2 недель до 4 недель.
Пациент с анемией, слитый полипептид и введение описаны выше.
В частности, коррекция может представлять собой введение слитого полипептида, включающего в себя ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, в дозе 5 мкг/кг или 8 мкг/кг с интервалами 2 недели; или введение слитого полипептида, который содержит ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, в дозе 8 мкг/кг с интервалами 4 недели; а поддержание может представлять собой введение слитого полипептида, который содержит ЕРО и гибридный Fc иммуноглобулина, в дозе 5 мкг/кг или 8 мкг/кг с интервалами 4 недели.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно на Примерах. Данные Примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Способ с многократными введениями слитого полипептида EPO-hyFc пациентам с почечной недостаточностью и анемией
1-1) Получение слитого полипептида EPO-hyFc
Слитый полипептид EPO-hyFc получали таким же образом, как описано в Примере 3 и Примере 4 патента US 7867491, предыдущего патента авторов данного изобретения (Фиг. 2А). Полная последовательность слитого полипептида EPO-hyFc (SEQ ID NO: 3) приведена на Фиг. 2Б.
1-2) Способ с однократным введением
Для подтверждения фармакодинамического и фармакокинетического ответов на слитый полипептид EPO-hyFc, полученный, как описано выше, слитый полипептид EPO-hyFc вводили здоровым взрослым мужчинам. Введение осуществляли однократно внутривенно в соответствующих дозах (0,3 мкг/кг, 1 мкг/кг, 3 мкг/кг, 5 мкг/кг или 8 мкг/кг) и однократно подкожно в соответствующих дозах (1 мкг/кг, 3 мкг/кг, 5 мкг/кг или 8 мкг/кг) и определяли уровень гемоглобина (Фиг. 1А и 1Б).
last
last
max
last
last
max
Результаты внутривенного и подкожного введений слитого полипептида EPO-hyFc продемонстрировали стабильность во всех исследуемых дозах. При внутривенном введении воздействие in-vivo повышалось с увеличением дозы. При подборе дозы не наблюдалось различия между дозами по показателю Сmax, однако по показателю AUC с увеличением дозы наблюдалось существенное различие в суммарной концентрации препарата в плазме крови in-vivo в течение всего времени наблюдения (значение Р<0,001). При подборе дозы в группе с подкожным введением GC1113 не наблюдалось различий по показателю Cmax в зависимости от дозы, однако в случае AUC наблюдалось существенное статистически достоверное изменение в зависимости от дозы (значение Р=0,016). Сравнение фармакодинамической/фармакокинетической корреляции выявило существование корреляции между показателями C, AUC и калиброванными относительно исходных значений Emax, AUEC, а в случае подкожного введения простой корреляции между Cmax, AUC и калиброванными относительно исходных значений E, AUEC не наблюдалось (значение р>0,05).

Выработки антител после введения не наблюдалось, а в группе с внутривенным введением (в/в) GC1113 в дозе 1 мкг/кг и в группе с внутривенным введением (в/в) 30 мкг NESP воздействие in-vivo было одинаковым. При подсчете ретикулоцитов, которые служили фармакодинамическим параметром, в группе с в/в введением в дозе от 3 мкг/кг до 5 мкг/кг и в группе с в/в введением 30 мкг NESP показатели были одинаковыми (Фиг. 1В и 1Г). В случае подкожного введения динамика изменения ретикулоцитов с течением времени отличалась от группы, где вводили 30 мкг NESP. Изменения количества ретикулоцитов и значений AUEC с течением времени подтвердили, что в группах, получавших низкие дозы (1 мкг/кг и 3 мкг/кг), максимальный эффект, выражавшийся в увеличении количества ретикулоцитов, был меньше и проявлялся позже, чем в группе, получавшей 30 мкг NESP, тогда как в группах, получавших высокие дозы (5 мкг/кг и 8 мкг/кг), максимальный эффект, выражавшийся в увеличении количества ретикулоцитов, был сопоставим с эффектом NESP и был более продолжительным.
1-3) Способ с многократными введениями
Для подтверждения изменений уровней гемоглобина у пациентов с хронической почечной недостаточностью и анемией под влиянием слитого полипептида EPO-hyFc, полученного, как описано выше, и последующего влияния на лечение анемии, слитый полипептид вводили пациентам с хронической почечной недостаточностью и анемией в дозе и с интервалом, представленными на Фиг. 3.
В части А пациентам с почечной недостаточностью (группы по 10 пациентов, получавших соответствующую дозу с соответствующим интервалом между введениями), которым на рутинной основе проводили диализ, вводили соответствующие дозы (3 мкг/кг, 5 мкг/кг или 8 мкг/кг) с интервалами 2 недели или 4 недели, и регистрировали изменения уровня гемоглобина по сравнению с его уровнем до введения, отбирали две группы, показавшие наиболее высокие результаты, и сравнивали с группой, получавшей активный контроль, в части Б исследования.
В случае, когда пациенты получали существующие агенты ЕРО, их включали в исследование после периода вымывания. Период вымывания проводили в течение по меньшей мере 8 недель. Однако, когда у пациентов, уже прошедших период вымывания в течение по меньшей мере 4 недель, уровень гемоглобина оказывался ниже 10 г/дл по меньшей мере в 3 определениях, их включали в исследование даже если период вымывания длительностью по меньшей мере 8 недель еще не был окончен.
1-4) Способ введения пациентам, находящимся на перитонеальном диализе
Для исследования изменений количества гемоглобина в организме пациентов, которым на рутинной основе проводили перитонеальный диализ, проводили следующие клинические исследования.
Пациентам с почечной недостаточностью (группы по 10 пациентов, получавших соответствующую дозу с соответствующим интервалом между введениями), которых на рутинной основе подвергали перитонеальному диализу, вводили соответствующие выбранные дозы (3 мкг/кг, 5 мкг/кг или 8 мкг/кг) подкожно 3 раза (1 сутки, 15 сутки и 29 сутки) или два раза (1 сутки и 29 сутки) с интервалами 2 недели или 4 недели, исследовали изменение уровня гемоглобина на 6 неделе или 8 неделе после введения и сравнивали с показателями до введения. Затем оценивали длительность действия in-vivo и эффективность слитого полипептида EPO-hyFc по изменениям уровней гемоглобина в организме.
В части А применительно к пациентам с почечной недостаточностью, нуждающимся в перитонеальном диализе, пациентам предписывали 6 посещений и при каждом посещении с 1-го до 5-го у пациентов брали образцы крови для оценки эффекта повышения гемоглобина, а также в ходе каждого визита оценивали потерю крови или необходимость трансфузии.
Затем, чтобы подтвердить влияние продолжительности действия in-vivo слитого полипептида EPO-hyFc на изменения уровней гемоглобина у человека при многократных введениях соответствующей дозы пациентам с почечной недостаточностью, которых подвергали перитонеальному диализу (25 пациентов на группу), подкожно вводили две дозы, выбранные в части А, и изучали изменение уровня гемоглобина через 12 недель после введения по сравнению с уровнем до введения.
В части Б пациентам назначали всего 10 посещений, интервал между 2 и 8 посещениями, в ходе которых осуществляли введения, составлял 2 недели. При каждом посещении с 1-го до 9-го у пациентов брали образцы крови для оценки эффекта повышения гемоглобина и в ходе каждого визита оценивали потерю крови или необходимость трансфузии.
1-5) Способ введения в группах пациентов, находящихся на гемодиализе
Для подтверждения изменений уровней гемоглобина в организме пациентов, которых периодически подвергали гемодиализу, а также терапевтического эффекта введения слитого полипептида при лечении анемии проводили следующие клинические исследования.
Для подтверждения влияния продолжительности действия in-vivo слитого полипептида EPO-hyFc при многократном введении человеку в соответствующих дозах, каждую из доз, выбранных в части А в условиях перитонеального диализа (5 мкг/кг и 8 мкг/кг), пациентам вводили внутривенным путем (в/в) 13 раз (1 сутки, 8 сутки, 15 сутки, 22 сутки, 29 сутки, 36 сутки, 43 сутки, 50 сутки, 57 сутки, 64 сутки, 71 сутки, 78 сутки и 85 сутки) или 7 раз (1 сутки, 15 сутки, 29 сутки, 43 сутки, 57 сутки, 71 сутки и 85 сутки) с интервалами 1 или 2 недели, и на 13 и 14 неделе определяли изменение уровня гемоглобина через 12 недель после начала введения и сравнивали с показателями до введения. Затем оценивали длительность действия in-vivo и эффективность слитого полипептида EPO-hyFc по изменениям уровней гемоглобина в организме.
В части Б пациентам назначали всего 16 посещений (введения пациентам осуществляли с интервалом 1 неделя) или 10 посещений (введения пациентам осуществляли с интервалом 2 недели), интервал между 2 и 14 посещениями, в ходе которых осуществляли введения, составлял 1 или 2 недели. При каждом посещении с 1-го до 15-го у пациентов брали образцы крови для оценки влияния повышения гемоглобина и в ходе каждого визита оценивали потерю крови или необходимость трансфузии.
Пример 2. Изменение уровней гемоглобина у пациентов с хронической почечной недостаточностью и анемией при многократном введении EPO-hyFc
В соответствии с каждым способом введения, описанным в Примере 1, осуществляли многократное введение слитого полипептида EPO-hyFc и в каждом образце крови пациентов исследовали содержание гемоглобина с помощью автоматического гематологического анализатора, и, таким образом, подтверждали изменения уровней гемоглобина при введении слитого полипептида. В результате, были отмечены следующие изменения уровней гемоглобина, приведенные ниже в Таблицах 1 и 2.
1)
Для проверки статистической значимости использовали знаковый ранговый критерий Уилкоксона.
Результаты интерпретировали с учетом того, что рекомендованные изменения уровней гемоглобина в крови через 4 недели после введения, согласно клиническим рекомендациям, составляют от 1 г/дл до 2 г/дл, и что изменения согласно фактическому клиническому отчету составляют от 0,7 г/дл до 2,5 г/дл.
В частности, целевым уровнем гемоглобина крови при коррекционной терапии являлся нормальный диапазон от 10 г/дл до 12 г/дл по такому показателю, как уровень гемоглобина через 12 недель после введения, и анализ данных проводили по этому же показателю.
В группе, получавшей 3 введения слитого полипептида EPO-hyFc в дозе 3 мкг/кг с интервалом 2 недели, результаты итогового анализа изменений уровней гемоглобина через 6 недель после введения выявили повышение уровня гемоглобина в среднем на 0,74 г/дл и достижение 9,50 г/дл, что ниже нормального уровня гемоглобина. Однако в группе, получавшей введение слитого полипептида EPO-hyFc в дозе 5 мкг/кг с интервалом 2 недели на протяжении того же периода было показано среднее увеличение на 1,14 г/дл, а в группе, где слитый полипептид EPO-hyFc вводили в дозе 8 мкг/кг с интервалом 2 недели, среднее увеличение составило 1,23 г/дл. Приведенные выше результаты подтверждают, что введение слитого полипептида EPO-hyFc пациентам с хронической почечной недостаточностью и анемией может вызывать дозозависимое увеличение уровня гемоглобина и, в частности, уровень гемоглобина может восстанавливаться до нормальных значений, когда пациентам вводят слитый полипептид EPO-hyFc в дозах 5 мкг/кг и 8 мкг/кг, соответственно.
Эти результаты свидетельствуют, что введение в дозах 5 мкг/кг и 8 мкг/кг с интервалом 2 недели позволяет осуществлять лечение анемии, не вызывая каких-либо быстрых изменений уровней гемоглобина. У пациентов, которым вводили существующие агенты ЕРО, наблюдалось снижение уровней гемоглобина ниже 9 г/дл после прохождения периода вымывания в течение 8 недель. Однако, после 3-кратного введения слитого полипептида EPO-hyFc в дозах 5 мкг/кг и 8 мкг/кг с интервалом 2 недели уровни гемоглобина у пациентов восстанавливались до уровней, существовавших до периода вымывания (Фиг. 4А). На основании данных результатов специалист в области техники может выбрать дозы и способы введения, вызывающие изменения с надлежащей скоростью, в зависимости от уровней гемоглобина и обстоятельств, с учетом диапазона колебаний для каждой дозы.
1)
Для проверки статистической значимости использовали знаковый ранговый критерий Уилкоксона.
В конечном итоге, анализ изменений уровней гемоглобина показал, что в группе, получавшей 2-кратное введение в дозе 3 мкг/кг с интервалом 4 недели, наблюдалось среднее снижение уровня гемоглобина на 0,68 г/дл; в группе, получавшей 2-кратное введение в дозе 5 мкг/кг с интервалом 4 недели, наблюдалось среднее снижение уровня гемоглобина на 0,01 г/дл; а в группе, получавшей 2-кратное введение в дозе 8 мкг/кг с интервалом 4 недели, наблюдалось среднее увеличение уровня гемоглобина на 0,79 г/дл. В частности, введение в дозе 5 мкг/кг поддерживало уровень гемоглобина 9,23 г/дл, который совпадает с уровнем до введения, а введение в дозе 8 мкг/кг повышало уровень гемоглобина до 10,17 г/дл.
По мере прохождения 8-недельного периода вымывания у вышеупомянутых пациентов наблюдалось постоянное снижение уровня гемоглобина, однако, когда они получали 2 введения слитого полипептида EPO-hyFc с интервалом 4 недели, паттерн снижения изменялся на паттерн поддерживания (при дозе 5 мкг/кг) или паттерн повышения (при дозе 8 мкг/кг) (Фиг. 4Б). Таким образом, быстрое снижение уровня гемоглобина, наблюдавшееся во время периода вымывания, демонстрировало улучшение, замедляясь или трансформируясь в противоположный паттерн.
Вышесказанное подтверждает, что 2-кратное введение слитого полипептида EPO-hyFc пациентам с хронической почечной недостаточностью и анемией на протяжении 4 недель (2-кратное введение с интервалом 4 недели) оказывало дозозависимое влияние на уровень гемоглобина. Кроме того, подтвердили, что при введении во всех дозах повышение уровня гемоглобина было не быстрым, а достаточно медленным или уровень гемоглобина поддерживался.
Данные результаты позволяют предположить, что, регуляцию вводимой дозы слитого полипептида EPO-hyFc и интервала между введениями можно использовать в качестве способа коррекции уровней гемоглобина у пациентов с анемией, у которых уровни гемоглобина находятся ниже целевого значения (например, 11 г/дл) или в качестве способа поддержания уровней гемоглобина у пациентов с анемией, у которых целевые уровни гемоглобина уже достигнуты. Таким образом, в случае введения с интервалами 4 недели, способ введения можно использовать либо в качестве способа коррекции, либо в качестве способа поддержания, в зависимости от выбранных доз.
Пример 3. Подтверждение безопасности многократного введения EPO-hyFc in-vivo
Осуществив многократное введение слитого полипептида EPO-hyFc в соответствии со способом, описанным в Примере 1, подтвердили безопасность многократного введения EPO-hyFc, основываясь на клинических синдромах, симптомах и т.д., на которые жаловались пациенты. В результате, подтвердили частоту побочных реакций, приведенных в Таблице 3 ниже.
По результатам оценки всех побочных реакций, наиболее частыми побочными реакциями, согласно предпочитаемой терминологии системы классификации побочных действий лекарственных препаратов MedDRA, оказались перитонит (6 пациентов, 10,00%), кашель (4 пациента, 6,67%), анемия (4 пациента, 6,67%), назофарингит (4 пациента, 6,67%) и головная боль (4 пациента, 6,67%), в указанном порядке.
Помимо перечисленных выше побочных действий препарата, которые продемонстрировали корреляцию с введением EPO-hyFc, иных побочных действий не наблюдалось. Кроме того, не было обнаружено каких-либо клинически значимых результатов, касающихся результатов физического обследования или показателей жизненно важных функций, а также исследований in-vitro, у которых прогнозировалась корреляция с вводимой дозой или интервалами между введениями.
Учитывая то, что пациенты с хронической почечной недостаточностью относятся к группе пациентов с неудовлетворительным состоянием здоровья, и что не было зафиксировано каких-либо побочных действий препарата, которые предположительно коррелировали бы с введением EPO-hyFc, установили, что особого внимания для обеспечения безопасности при введении EPO-hyFc не требуется. Кроме того, на основании наблюдавшихся частоты и тяжести побочных реакций или тяжелых побочных реакций, результатов исследований in-vitro, результатов физического обследования или показателей жизненно важных функций при введении EPO-hyFc, пришли к выводу, что дозы или интервал между введениями EPO-hyFc не влияют на безопасность введения.

Приведенные выше результаты подтвердили, что EPO-hyFc имеет длительное время полужизни по сравнению с NESP, существующим продуктом ЕРО длительного действия, и не обладает какими-либо побочными действиями, что свидетельствует о его безопасности. Таким образом, введение слитого полипептида EPO-hyFc пациентам с анемией в дозе от 5 мкг/кг до 8 мкг/кг с интервалами от 2 недель до 4 недель может обеспечивать повышенный уровень безопасности по сравнению с существующими препаратами ЕРО длительного действия, а также может эффективно применяться в качестве терапевтического средства длительного действия.
Специалистам в области техники очевидно, что возможны и другие конкретные воплощения настоящего изобретения, без отклонения от сущности или существенных признаков изобретения. Описанные воплощения следует считать только иллюстративными во всех аспектах, но не ограничивающими изобретение. Таким образом, объем настоящего изобретения определяется нижеприведенной формулой, а не описанием, приведенным выше. Все изменения, охватываемые значениями и диапазоном эквивалентности формулы изобретения, следует считать входящими в объем настоящего изобретения.