ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СВЯЗЫВАЮЩИХСЯ С ГЛИКОПРОТЕИНОМ ВИРУСА БЕШЕНСТВА
PREPARATION BASED ON NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES BINDING WITH GLYCOPROTEIN OF RABIES VIRUS

Область техники
Изобретение относится к медицине, биотехнологии, фармацевтике в частности относится к стабильным препаратам моноклональных нейтрализующих антител, специфически связывающихся с гликопротеином вируса бешенства. Может быть использовано для постэкспозиционной профилактики бешенства у людей.
Уровень техники
Бешенство - опасное зоонотическое заболевание, для которого не существует методов лечения после наступления клинических симптомов, в 100% случаев наступает летальный исход. Ежегодно по всему миру регистрируется более 16 млн случаев укусов с подозрением на бешенство, из которых около 60000 заканчиваются смертью [Banyard, А.С, Horton, D.L., Freuling, С., Muller, Т., Fooks, A.R. (2013) Control and prevention of canine rabies: the need for building laboratory-based surveillance capacity, Antiviral Research, 98, 357-64]. Бешенство вызвано одноцепочечным (-)РНК вирусом, относящимся к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae. Понимание инфекционной специфики вируса бешенства дало возможность выработать стратегии экстренной профилактики, основанные на предотвращении проникновения вируса в нервную систему, а также за последние 10 лет активно ведется создание новых классов препаратов, которые лишены многих недостатков своих предшественников.
На сегодняшний день единственным способом предотвращения развития бешенства у людей является пред- и постэкспозиционная профилактика (ПЭП). Предэкспозиционная профилактика включает в себя заблаговременную вакцинацию, которая обязательна для людей, находящихся в условиях повышенного риска заражения. ПЭП должна быть инициирована сразу же после контакта с животным, подозреваемым на бешенство. Данный способ профилактики представлен на сегодняшний день поликлональными сыворотками (ERIG и HRIG) и вакцинами, комбинированное применение которых необходимо для наиболее эффективного подавления развития и уничтожения вирусных частиц, попавших в организм. Проведение пассивной иммунизации посредством поликлональных сывороток обеспечивает кратковременный иммунитет, препятствующий репликации вируса в период времени, необходимый для развития иммунного ответа и появления в организме человека собственных нейтрализующих антител после вакцинации. Однако иммуногенность ERIG, дороговизна и ограниченная доступность HRIG препятствуют их широкому применению. Более того существует опасность передачи инфекционных заболеваний при использовании поликлональных сывороток, а также для них характерна вариабельность от партии к партии.
По вышеуказанным причинам Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует заменить ERIG и HRIG моноклональными антителами человека или гуманизированными антителами, которые могут наилучшим альтернативным препаратом для профилактики развития бешенства у человека в дополнении к вакцинации.
а
Мишенью для нейтрализующих терапевтических мАТ против вируса бешенства является гликопротеин, один из 5 белков, входящих в состав вирусных частиц. Гликопротеин вируса бешенства (ГПВБ) - это поверхностный белок, существующий в виде гомотримеров, который играет ключевую роль при вирусном заражении, опосредуя проникновение вируса в клетку [Gaudin, Y., Ruigrok, R.W., Tuffereau, С., Knossow, M. & Flamand, A. (1992). Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology 187, 627-632]. Зрелая молекула ГПВБ состоит из 505 аминокислотных остатков, которые выделяют в три домена: эктодомен (1-439 а.о.), трансмембранный домен (440-461 а.о.) и цитоплазматический домен (462-505 а.о.). На сегодняшний день в составе ГПВБ установлено восемь антигенных сайтов. Антигенный сайт (AC) I включает в себя как конформационный, так и линейный эпитопы и представлен 226-231 а.о.. AC II представляет собой конформационный эпитоп, включающий 34-42 (IIb) и 198-200 (IIa) а.о. AC III - также конформационный эпитоп, содержащий 330-338 а.о. AC IV включает в себя один а.о. в позиции 251. Минорный сайт , также именуемый G1 локализован в позиции 342-343. AC G5 - линейный эпитоп, включающий 261-264 а.о., в состав которого также входит антигенный сайт VI, описанный ранее как сайт, представленный только одним а.о. в позиции 264. Антигенные характеристики ГПВБ изучают на мутантных вариантах RABV, устойчивых к нейтрализации теми или другими мАТ, т.е. оценивают частоту замен, определенных а.о., входящих в антигенный сайт, а также влияние замен на нейтрализующую активность мАТ, которое ранее проявляло эту способность. Так, наибольшее число полученных нейтрализующих мАТ к RABV связываются с AC II или III [Benmansour, A., Leblois, Н., Coulon, P., Tuffereau, С., Gaudin, Y., et al. (1991) Antigenicity of rabies virus glycoprotein, J Virol, 65, 4198-4203].
а
Основным AC G-белка, который узнают 70% перспективных мАТ, является AC И. Второй по значимости - AC III, с которым взаимодействует ~20% антител к ГПВБ [Lafon et al. (1983) Antigenic sites on the CVS rabies virus glycoprotein: analysis with monoclonal antibodies, J. Gen. Virol, 64, 843-851; Muller, Т., Dietzschold, В., Ertl, H., Fooks, A.R., Freuling, C, et al. (2009) Development of a Mouse Monoclonal Antibody Cocktail for Post-exposure Rabies Prophylaxis in Humans, PLoS Negl. Trop. Dis., 3(11), е542]. Также стоит выделить AC I и минорный сайт , все остальные сайты считаются второстепенными. Важность того или иного АС для эффективной нейтрализации терапевтическими антителами широкого спектра вариантов RABV связана с его консервативностью. Наиболее консервативными можно назвать сайты I, II и III. Каждый АС характеризуется различным уровнем вариабельности а.о. В AC I аминокислотная позиция 231 является наиболее вариабельной, для сайта II наибольшая вариабельность отмечена для 36, 37 и 199-й а.о., сайт III также содержит несколько вариабельных позиций - 332, 333, 336, 338 а.о. [Paola De Benedictis et al. (2016) Development of broad-spectrum human monoclonal antibodies for rabies post-exposure prophylaxis, EMBO Molecular Medicine, 8, 407-421; Kuzmina, N.A., Kuzmin, I.V., Ellison, J.A., Rupprecht, Ch.E. (2013) Conservation of binding epitopes for Monoclonal Antibodies on the rabies virus glycoprotein, J. Antivir. Antiretrovir., 5(2), 37-43]. Таким образом, наиболее предпочтительны для терапевтического использования те антитела, на специфическое связывание которых перечисленные выше вариабельные а.о. оказывают минимальное влияние.
Большое разнообразие штаммов вируса по всему миру, отличающихся между собой точечными мутациями, локализованными, в т.ч. в антигенных сайтах приводит к высокой степени вариации эпитопов. Таким образом, применение мАТ для ПЭП должно основываться на комбинировании как минимум двух антител различной специфичности, что позволит нейтрализовать большинство или все известные штаммы.
На сегодняшний день известно 3 препарата для ПЭП бешенства, которые представляют собой смесь двух мАТ: CL184 (человеческое мАТ CR57 и мАТ CR4098) [de Kruif J., Bakker A.B., Marissen W. E., Kramer R. A., Throsby M., Rupprecht C.E., Goudsmit J. «A Human Monoclonal Antibody Cocktail as a Novel Component of Rabies Postexposure Prophylaxis» // Annu. Rev. Med. 2007. V. 58. P. 359-368.], Rabimabs (мышиное мАТ M777-16-3 и мышиное мАТ 62-71-3) [Tsekoa TL, Lotter-Stark T, Buthelezi S, Chakauya E, Stoychev SH, Sabeta C, et al. (2016) Efficient In Vitro and In Vivo Activity of Glyco-Engineered Plant-Produced Rabies Monoclonal Antibodies E559 and 62-71-3. PLoS ONE 11(7): e0159313. doi:10.1371/journal.pone.0159313], SYN023 (гуманизированное мАТ CTB011 и гуманизированное мАТ СТВ012) [Chao T.-Y, Ren S, Shen E, Moore S, Zhang S-f, Chen L, et al. (2017) SYN023, a novel humanized monoclonal antibody cocktail, for post-exposure prophylaxis of rabies. PLoS Negl Trop Dis 11(12): e0006133. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006133].
Тем не менее продолжает существовать потребность в новых вируснейтрализующих препаратах, имеющих высокий потенциал для постэкспозиционной профилактики, особенно в отношении подтипов вируса, наиболее распространенных в России.
Раскрытие изобретения
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является получение препарата для ПЭП бешенства на основе двух мАТ, человеческого мАТ RabD4 и гуманизированного мАТ 1С5.
Техническим результатом является получение нового препарата на основе двух нейтрализующих мАТ IgG1-изотипа, способных к связыванию с ГПВБ и характеризующихся разной эпитопной специфичностью, что позволит снизить вероятность ухода от нейтрализации отдельных мутантных штаммов вируса бешенства. Также доля мышиных аминокислотных остатков, которые могут вызвать иммунный ответ в заявляемом препарате значительно ниже, за счет того, что мАТ RabD4 - 100% человеческое, а гуманизированное мАТ С5 на 90-95% человеческое.
Также техническим результатом является расширение арсенала средств аналогичного назначения, а именно получение нового препарата, включающего в качестве активного вещества два нейтрализующих антитела, мАТ 1С5 и мАТ RabD4.
Поставленная проблема решается композицией двух данных мАТ 1С5 и мАТ RabD4, связывающихся с разными антигенными сайтами в составе ГПВБ. Композиция для связывания с ГПВБ, представляющая собой смесь двух нейтрализующих антител, человеческого мАТ RabD4 и гуманизированного мАТ 1С5. При этом человеческое антитело мАТ RabD4 включает вариабельные участки тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей, где вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) включает последовательность гипервариабельных регионов CDRH1, CDRH2 и CDRH3, при чем CDRH1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDRH2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и CDRH3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; а вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (VL) включает последовательность гипервариабельных регионов CDRL1, CDRL2 и CDRL3, при этом CDRL1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDRL2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и CDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Композиция может представлять собой лиофильно высушенные антитела, при этом молярное соотношение двух антител в смеси составляет от 5:1 до 1:5. Полученную смесь антител используют для приготовления фармацевтической композиции для пред- и постэкспозиционной профилактики бешенства. Для приготовления фармацевтической композиций для пред- и постэкспозиционной профилактики бешенства, используют любой фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно композиция представляет собой стерильный инъекционный раствор в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, при этом концентрация каждого антитела в композиции составляет от 0,1 до 2,0 мг/мл.
Человеческое мАТ RabD4 получено путем in vitro стимуляции В-лимфоцитов человека рекомбинантным ГПВБ, с последующим слиянием иммунных В-лимфоцитов человека с клетками мышиной миеломы путем соматической гибридизации с применением полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000 и селекцией полученных гетерогибридом, продуцирующих нейтрализующие моноклональные антитела к рекомбинантному ГПВБ вируса бешенства.
Нейтрализующее мАТ человека - RabD4, селективно связывающего ГПВБ, включает вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), который содержит последовательность гипервариабельных регионов CDRH1, CDRH2 и CDRH3, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 соответственно, и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (VL), который содержит последовательность гипервариабельных регионов CDRL1, CDRL2 и CDRL3, при чем CDRL1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDRL2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и CDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
Нейтрализующее моноклональное антитело человека, селективно связывающее ГПВБ, настоящего изобретения характеризуется тем, что вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела содержит:
(i) CDR1 с последовательностью аминокислот NHAMS (SEQ ID NO: 1);
(ii) CDR2 с последовательностью аминокислот TISGSGGRTYYTDSVAG (SEQ ID NO: 2);
(iii) CDR3 с последовательностью аминокислот DIIPLAGTGLDY (SEQ ID NO: 3).
При этом вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит:
(i) CDR1 с последовательностью аминокислот SGSSSNIRDNTVH (SEQ ID NO: 4);
(ii) CDR2 с последовательностью аминокислот SDNQRPS (SEQ ID NO: 5);
(iii) CDR3 с последовательностью аминокислот AAWDDSLNGLYV (SEQ ID NO: 6).
Нейтрализующее мАТ человека, селективно связывающее ГПВБ, включает вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела, содержащего последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 7; а вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 8.
Нейтрализующее моноклональное антитело человека получено путем in vitro иммунизации В-лимфоцитов человека рекомбинантным ГПВБ, получением гетерогибридом иммунных В-лимфоцитов человека и клеток мышиной миеломы путем соматической гибридизации с применением полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000 и селекцией гетерогибридом, продуцирующих нейтрализующие моноклональные антитела к рекомбинантному ГПВБ вируса бешенства, анализа аффинности и специфичности отобранного мАТ, определения нуклеотидной и аминокислотной последовательности его вариабельных доменов.
Моноклональное антитело мАТ 1С5 было получено в результате гуманизации мышиного антитела методом пересадки гипервариабельных участков данного антитела на каркасные области человеческого иммуноглобулина. Исходные нуклеотидные последовательности вариабельных доменов Lc и Не мАТ 1С5 были выделены из соответствующей линии мышиной гибридомы, продуцирующей антитела против ГПВБ [Беневоленский, С.В., Зацепин, С.С, Клячко, Е.В., Морозкина, Е.В., Позднякова, Л.П., Свешников, П.Г., Солопова, О.Н., Шемчукова, О.Б., Ягудин, О.Б. (2012) Гуманизированные антигенсвязывающие фрагменты (Fab) против вируса бешенства, изолированный фрагмент днк, кодирующий Fab против вируса бешенства, клетка дрожжей, трансформированная фрагментом днк, и способ получения Fab против вируса бешенства с использованием дрожжей, RU2440412 (С2)].
Фармацевтическая композиция по изобретению, содержит комбинацию мАТ в качестве активного вещества в терапевтически эффективном количестве и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Вещества, входящие в состав, могут быть в твердом виде, например замороженные или лиофилизованные, но предпочтительно жидкие, например водные. Композиция содержит мАТ RabD4 с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и легкой цепью SEQ ID NO: 10 или его фрагменты (например, Fab, F(ab')2, Fv-фрагменты иммуноглобулина) и мАТ 1С5 с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи SEQ ID NO: 11 и легкой цепью SEQ ID NO: 12 или его фрагменты.
В качестве фармацевтически приемлемых носителей используют нетоксические материалы, который не взаимодействует с действием активного компонента фармацевтической композиции. Композиции, подходящие для парентерального введения, обычно включают стерильный водный или неводный препарат активного соединения, который предпочтительно является изотоническим по отношению к крови реципиента. Композиции, включающие комбинацию мАТ, используются в виде стерильного инъекционного раствора в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе. Буферные растворы, консерванты, антиоксиданты и т.д. могут быть включены в состав композиции при необходимости.
В конкретном варианте осуществления композиция, соответствующая изобретению, обладает нейтрализующей активностью против вируса бешенства в диапазоне концентраций примерно от 250 МЕ/мл до примерно 1500 МЕ/мл, например, примерно от 300 МЕ/мл до примерно 1400 МЕ/мл, как правило, примерно от 380 МЕ/мл до 1350 МЕ/мл. Специалист в данной области легко может измерить степень нейтрализации вируса бешенства. Нейтрализация, например, может быть измерена, как описано в Лабораторных методиках по бешенству, Edited by: F.-X. Meslin, M. M. Kaplan and H. KoproWski (1996), 4th edition, Chapters 15-17, World Health Organization, Geneva. Подходящими и известными методами анализа нейтрализующей активности является флюоресцентный вируснейтрализующий тест (fluorescent antibody virus neutralization, FAVN) или тест быстрого торможения фокуса флюоресценции (rapid fluorescent foci inhibition, RFFIT).
В ряде случаев осуществление изобретения относится к составам согласно изобретению, в которых фосфатный буфер, например буферный раствор хлорида натрия (80 мг/мл)/хлорида калия (2 мг/мл)/гидрофосфат калия (2,72 мг/мл)/натрия гидрофосфат гептагидрат (11,5 мг/мл), присутствует в концентрации примерно от 5 мМ до примерно 25 мМ, предпочтительно от 7 мМ до 20 мМ, более предпочтительно от 8 мМ до 15 мМ и особенно от 9 мМ до 12 мМ. В оптимальном варианте осуществления фосфатный буфер присутствует в концентрации около 10 мМ.
В ряде случаев осуществление изобретения относится к составам согласно изобретению, где значение рН составляет от 6,6 до 8,0, предпочтительно от 7,0 до 7,6, более предпочтительно от 7,1 до 7,5 и особенно от 7,2 до 7,4. В оптимальном варианте осуществления рН равен 7,3.
Концентрация каждого антитела в композиции изобретения предпочтительно составляет от 0,1 до 2,0 мг/мл, как правило, 0,1 и 1 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация каждого антитела может составлять 0,15 мг/мл. В других вариантах осуществления каждое антитело присутствует в концентрации 0,3 мг/мл (т.е. всего 0,6 мг/мл для двух антител).
В некоторых вариантах осуществления изобретения соотношение двух антител составляет от 5:1 до 1:5, предпочтительно от 2:1 до 1:2 и особенно 1:1.
Кроме того, композиция данного изобретения может содержать другие наполнители, включая, но не ограничиваясь этим, аминокислоты и их соли, сахара, белки, разбавители, солюбилизирующие агенты, рН-модификаторы, дополнительные буферы, другие неорганические или органические соли, антиоксиданты или тому подобное. Однако предпочтительно, чтобы состав по настоящему изобретению не содержал никаких других добавок помимо фосфатного буфера.
В определенных вариантах осуществления композиция подходит для введения в место укуса путем внутримышечного, внутрикожного, подкожного или комбинируя несколько способов введения. Препарат стерильный. Способы приготовления стерильных растворов хорошо известны в данной области и включают фильтрацию через стерильные фильтрующие мембраны, или автоклавирование ингредиентов состава, за исключением антител, например при температуре около 120°С в течение 30 мин.
Подходящий диапазон дозировки может составлять, например 10-30 МЕ/кг массы тела.
Необходимость использования комбинации данных антител связана с тем фактом, что гуманизированная природа мАТ 1С5 оставляет вероятность развития иммуногенной реакции на данное мАТ при повторном введении препарата. Это может привести к его быстрому выведению из организма, при этом нейтрализация вируса не будет успешно выполнена. Поэтому дополнительно к мАТ 1С5 в состав препарата входит полностью человеческое мАТ RabD4, являющееся минимально иммуногенным, таким образом применение препарата, включающего комбинацию антител будет эффективнее, чем применение отдельных антител.
Нейтрализующая активность была установлена с помощью флуоресцентного вируснейтрализующего теста (FAVN), который является стандартным методом, наряду с тестом быстрого торможения фокуса флюоресценции (RFFIT), установленных ВОЗ для изучения антирабической активности мАТ или сывороток. Полученные результаты являются основой для определения перспективности использования препарата в рамках ПЭП бешенства у человека.
Результаты конкурентного ИФА показывают, что мАТ 1С5 конкурирует с мАТ CR4098, что указывает на то, что мАТ 1С5 взаимодействует с AC III ГПВБ, который является одним из наиболее консервативных эпитопов. Было показано, что мАТ RabD4 не взаимодействует с I и III антигенными сайтами ГПВБ, таким образом оно не конкурирует с мАТ 1С5 за связывание с ГПВБ, и следовательно, может быть использовано в комбинации с мАТ 1С5. Данный факт очень важен для постэкспозиционной профилактики, так как комбинация из двух нейтрализующих антител обладает широкой специфичностью и снижает вероятность ускользания от нейтрализации отдельных мутантных вариантов вируса бешенства, при снижении риска развития иммуногенной реакции.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показан результат сэндвич ИФА с нативным ГПВБ и пероксидазным конъюгатом-мАТ 1С5, где  Rab D4,  1С5 rec.
На фиг. 2 показан результат конкурентного ИФА с нативным ГПВБ и пероксидазным конъюгатом мАТ 1С5, где  мАТ RV1,  мАТ CR4098,  мАТ 1С5,  мАТ CR57.
На фиг. 3 показан результат конкурентного ИФА с нативным ГПВБ и пероксидазным конъюгатом-мАТ CR4098, где  мАТ RV1, мАТ CR4098, мАТ 1С5,  мАТ CR57.
Осуществление изобретения
Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.
Пример 1. Получение моноклонального антитела человека против ГПВБ - RabD4.
2
2
Для получения IgG-секретирующих В-лимфоцитов требуется три популяции клеток от одного донора (аутологичных): моноциты, CD4+ Т-лимфоциты, В-лимфоциты. Для получения этих популяций была взята свежая кровь здорового донора в пробирки с антикоагулянтом К+ ЭДТА, при процедурах были соблюдены условия, обеспечивающие стерильность крови. Субпопуляции получали с использованием наборов для выделения клеток RosetteSep (StemCell Technologies Inc, США). Клетки выделяли по следующей методике: 1) к цельной крови с антикоагулянтом К+ ЭДТА добавляли препарат RosetteSep, из расчета 50 мкл препарата на 1 мл крови, хорошо перемешивали; 2) инкубировали 20 минут при комнатной температуре (15-25°С); 3) разбавляли образец равным объемом фосфатно-солевого буфера с добавлением 2%-ной фетальной телячьей сыворотки и 1 мМ ЭДТА, осторожно перемешивали; 4) полученный образец аккуратно наслаивали на раствор Ficoll-Paque Plus, (StemCell Technologies Inc, США), избегая перемешивания; 5) центрифугировали в течение 20 минут при комнатной температуре и 1200g (угловую скорость вращения центрифуги-обороты в минуту или RPM-рассчитывали по формуле: RPM=√RCF/((1,118×10-5) × радиус), где RCF- относительная центробежная сила в g, радиус- радиус вращения ротора в см, в итоге для получения центробежной силы 1200g понадобилась угловая скорость 3361 об/мин), центрифугировали без принудительной остановки ротора; 6) осторожно отбирали слой клеток между плазмой и раствором Ficoll-Paque Plus, забирая часть фиколла для более полного извлечения клеток; 7) клетки промывали дважды раствором ФСБ с добавлением 2% фетальной телячьей сыворотки и 1 мМ ЭДТА; 8) клетки подсчитывали в камере Горяева, аликвоты клеток замораживали в среде, содержащей 40% ФСБ и 10% ДМСО. Всего было выделено и заморожено: 4,1 млн CD4+ Т-лимфоцитов; 2,8 млн В-лимфоцитов; 3 млн моноцитов. Активацию CD4+ Т-лимфоцитов осуществляли посредством инкубации их со зрелыми дендритными клетками человека, нагруженными гликопротеидом вируса бешенства, путем инкубации моноцитов с ГПВБ в присутствии цитокинов. Моноциты высевали в 6-луночный планшет по 170 тыс клеток в лунку в 3 мл среды Cell Gro с добавлением 500 ед/мл ИЛ-4 и 800 ед/мл ГМ-КСФ, культивировали в течение 5 суток при 37°С в атмосфере 5% углекислого газа, после чего в результате изучения морфологии клеток под микроскопом было установлено, что клетки соответствуют незрелым дендритным клеткам. К этим незрелым дендритным клеткам добавляли антирабическую вакцину Рабипур (Rabipur, концентрация 2,5 МЕ в мл, Индия) до разведения 1:200, либо коммерческий рекомбинантный ГПВБ (MyBioSource, США, штамм ERA) до конечной концентрации 5 мкг/мл. Для получения продуцентов антител против ГПВБ В-лимфоциты были стимулированы in vitro. В-лимфоциты размораживали в количестве 2,8 млн клеток, центрифугировали в течение 10 мин при 1020g, ресуспендировали в среде Cell Gro и высевали в лунки 6-луночного планшета. Затем добавляли либо вакцину Рабипур до разведения 1:200, либо ГПВБ до конечной концентрации 5 мкг/мл и культивировали в течение 4 ч. По истечении 4 ч разморозили CD4+ Т-лимфоциты в количестве 4,1 млн. клеток, центрифугировали в течение 10 мин при 1020g, ресуспендировали в среде Cell Gro и высевали в 2 культуральных флакона площадью 25 см. Образовавшиеся из моноцитов дендритные клетки снимали скребком со дна 6-луночного планшета и добавляли к CD4+ Т-лимфоцитам в количестве 70 тыс.клеток в каждый флакон. Инкубировали 3,5 ч при 37°С в атмосфере 5% углекислого газа. По истечении 3,5 ч В-лимфоциты добавляли в культуральные флаконы с CD4+ Т-лимфоцитами и дендритными клетками в соответствии с добавленными антигенами, затем добавляли цитокины ИЛ-2 до конечной концентрации 20 ед/мл, ИЛ-4 до конечной концентрации 500 ед/мл, ИЛ-6 до конечной концентрации 1800 ед/мл, ИЛ-10 до конечной концентрации 2 ед/мл и митоген pokeweed из растения Phytolacca americana до конечной концентрации 4 мкг/мл. Инкубировали 3 суток при 37°С в атмосфере 5% углекислого газа. По истечении 3 суток наблюдали образование клеточных синапсов в культуральных флаконах. Клетки переносили в центрифужные пробирки, центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 минут. Супернатанты отбирали для дальнейшего тестирования. Клеточный осадок использовали для получения гетерогибридом. Полученные иммунные В-лимфоциты гибридизовали с использованием ПЭГ 4000 с предварительно полученной гетерогибридомой человек-мышь (была использована мышиная миелома NS1 и лимфоциты периферической крови человека), утратившей способность к антителопродукции. Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты с предварительно высеянными перитонеальными макрофагами в ростовой среде DMEM с добавлением фетальной бычьей сыворотки до концентрации 8%, L-глутамина, пирувата, гентамицина, а также гипоксантина, тимидина и аминоптерина (HAT) в концентрациях, рекомендованных производителями добавок (полная селективная ростовая среда). Планшеты культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО в течение недели, рост клеточных колоний оценивали визуально. Всего было получено около 2000 НАТ-устойчивых гибридомных клонов. Супернатанты тестировали методом непрямого ИФА с сорбцией ГПВБ в ФСБ в концентрации 1 мкг/мл и методом «сэндвич» ИФА с использованием антирабических вакцин Рабипур (Индия) и Рабикан (Россия) и мышиного моноклонального антитела 1С5 против ГПВБ (ОАО «ВНЦМДЛ», Россия). Наработку супернатантов проводили, культивируя гибридомные клетки в полной ростовой среде. После клонирования наращивание клеточной массы производили в 96-луночных культуральных планшетах с перитонеальными макрофагами, постепенно увеличивая общий объем культивирования.
Пример 2. Получение моноклонального антитела человека против ГПВБ - мАТ 1С5. На основании последовательностей вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей гуманизированного мАТ 1С5 [Беневоленский, С.В., Зацепин, С.С., Клячко, Е.В., Морозкина, Е.В., Позднякова, Л.П., Свешников, П.Г., Солопова, О.Н., Шемчукова, О.Б., Ягудин, О.Б. (2012) Гуманизированные антигенсвязывающие фрагменты (Fab) против вируса бешенства, изолированный фрагмент днк, кодирующий Fab против вируса бешенства, клетка дрожжей, трансформированная фрагментом днк, и способ получения Fab против вируса бешенства с использованием дрожжей, RU2440412 (С2)] было получено полноразмерное мАТ 1С5 (Tsekoa TL, Lotter-Stark Т, Buthelezi S, Chakauya E, Stoychev SH, Sabeta C, et al. (2016) Efficient In Vitro and In Vivo Activity of Glyco-Engineered Plant-Produced Rabies Monoclonal Antibodies E559 and 62-71-3. PLoS ONE 11(7): e0159313.doi:10.1371/journal.pone.0159313).
Пример 3. Проведение сэндвич-ИФА теста. Для выполнения сэндвич-ИФА мАТ 1С5 было конъюгировано с пероксидазой хрена (ПХ) периодатным методом [Tijssen P., Kurstak Е. II Analytical biochemistry. 1984. V. 136. P. 451-457]. Полученные конъюгаты проверяли на способность связывать целевой антиген в непрямом ИФА. Для этого сорбировали нативный ГПВБ в концентрации 5 мкг/мл на ночь при +4°С в ФСБ. После трехкратной отмывки ФСБ-Т, все конъюгаты титровали от 1/1000 с шагом 3 и инкубировали 1 час при 37°С. После инкубации отмывали пять раз ФСБ-Т и наносили субстратный буфер ТМБ. Реакцию останавливали H2SO4. Результаты измеряли на спектрофотометре Multiscan при длине волны 450 нм. В качестве контроля и для определения неспецифической сорбции конъюгаты проверяли на связывание с ФСБ и по несорбированному планшету. По результатам титрования конъюгатов мАТ с пероксидазой хрена выбирали оптимальные разведения, дающие максимальное значение оптической плотности при минимальном фоне, что составило 1/5000.
Для проведения сэндвич-ИФА мАТ Rab D4 и мАТ 1С5 сорбировали в течение ночи при +4°С в ФСБ в концентрации 5 мкг/мл, отмывали трижды в ФСБ-Т. Очищенный ГПВБ в серийных разведениях (от 1/100 в ФСБ-AT с шагом 2) инкубировали 1 час при 37°С. Отмывали три раза в ФСБ-Т. Пероксидазные конъюгаты антител разводили в ФСБ-AT 1/5000 и инкубировали 1 час при 37°С, отмывали пять раз в ФСБ-Т. После, наносили субстратный буфер ТМБ. Реакцию останавливали 10% H2S04. Результаты измеряли на спектрофотометре Multiscan при длине волны 450 нм (фиг. 1).
Пример 4. Определение участка связывания ГПВБ человеческим мАТ RabD4 и гуманизированным мАТ 1С5 с помощью конкурентного ИФА.
мАТ CR57, CR4098, RabD4 и 1С5 конъюгировали с пероксидазой хрена периодатным методом-[Tijssen P., KurstakE. // Analytical biochemistry. 1984. V. 136. P. 451- 457]. RABVG сорбировали в концентрации 10 мкг/мл в ФСБ в течение ночи при температуре 4°С, затем планшет промывали ФСБ-Т. Антитела титровали в планшете, начиная с концентрации 10 мкг/мл, используя трехкратные разведения. К ним добавляли пероксидазные конъюгаты антител (мАТ - ПХ) с постоянной концентрацией. Конъюгаты антител предварительно титровали в прямом ИФА, по результатам которого выбирали оптимальные разведения. Смесь антител с конъюгированными антителами переносили на планшет с RABVG, и инкубировали 1 ч при температуре 37°С. После этого планшет промывали раствором 0.05% ФСБ-Т пять раз и добавляли раствор субстрата ТМБ. Реакцию останавливали 10% раствором серной кислоты. Оптическое поглощение измеряли на спектрофотометре Multiscan (Thermo Scientific, США) при длине волны 450 нм. Кривые конкуренции строили по зависимости В/Во от концентрации неконъюгированных антител для каждого конъюгата, где В - оптическое поглощение в присутствии конкурирующего антитела, Во - оптическое поглощение при использовании конъюгата без добавления конкурирующего антитела.