Получение тест-сывороток для производства холерных диагностических бактериофагов 

2012, Т. 2, № 1-2

Современное лабораторное обеспечение.

и активности данного антигена, применяют холерные эритроцитарные диагностикумы, производимые за пределами России, что определяет актуальность разработок новых систем контроля. Основу таких систем составляют иммунные сыворотки.

Цель исследования: оценка эффективности применения адъювантов при получении иммунных сывороток к энтеротоксину холерного вибриона пригодных для конструирования системы контроля состава холерной вакцины.

Материалы и методы. Антиген — токсин холерный очищенный, содержащий 360 мкг белка в 1 мл и 3400 опытных доз/мл. Продуценты — кролики массой 2,5—3 кг разделили на 3 группы: животных I и II группы иммунизировали полным адъювантом Фрейнда и аминополисахаридом 2-амино-2-дезокси-Р^-глюкан М.м 38,2 кДа соответственно. Животные III группы иммунизировались холерным токсином.

Уровень специфических антител сывороток оценивали в реакции диффузной преципитации с холерным токсином. Антитоксическая активность сывороток животных I и II групп составляла 1:32—1:64, контрольной — 1:8. Однако при применении полного адъюванта Фрейнда у всех животных I группы (100%) на месте введения развивались глубокие дефекты кожного покрова и мышечной ткани, а ухудшение общего состояния явилось причиной приостановления иммунизационного процесса и, как следствие, увеличения срока иммунизации на одну неделю. При введении аминополисахарида отрицательных реакциях со стороны организма животных-продуцентов отмечено не было, поэтому иммунизация проводилась согласно графику.

Выводы. Полученные данные свидетельствуют об эффективности применения адъювантов для получения активных сывороток к холерному токсину. Предпочтение следует отдать аминополисахариду, который характеризуется высокой иммуностимулирующей активностью наряду с низкой реактогенно-стью для животных.

МЕДИЦИНСКОЕ И СОЦИАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ НЕУСТАНОВЛЕННОЙ ЭТИОЛОГИИ В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ

И.В. Овсянникова

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург

В 2011 г. в России было зарегистрировано 496 967 случаев острых кишечных инфекций неустановленной этиологии (ОКИНЭ), причем каждый 15-й из них — в Санкт-Петербурге. Актуальность ОКИНЭ связана с частотой распространения, неуправляемостью, тяжестью течения, возможностью неблагоприятных исходов и значительным экономическим ущербом. Показатель заболеваемости этой нозологической формой в России в 2011 г. составил 350,2 на 100,000. В Санкт-Петербурге этот уровень в 1,5 раза выше среднего по стране (548,6 на 100,000 — в 2011 г.). Показатели заболеваемости ОКИНЭ у детей до 17 лет превышают таковые у взрослых в 3 раза. В 2011 в России у детей до 17 лет показатель заболеваемости ОКИНЭ составил 1127,0 на 100,000, в Санкт-Петербурге — 1837,9 на 100,000. Доля ОКИНЭ в общей структуре инфекций в Санкт-Петербурге в 2010—2011 гг. составила 69—71%.

В последние годы продолжали регистрироваться летальные исходы по причине ОКИНЭ. В 2010 г. в России показатель смертности от ОКИНЭ составил 0,005 на 100,000, в Санкт-Петербурге — 0,22 на 100,000. Проведено изучение 53 случаев смерти от острых гастроэнтероколитов неустановенной этиологии в инфекционном стационаре Санкт-Петербурга в 2009—2011 гг. Умершие от ОКИНЭ были в возрасте от 29 до 93 лет, причем женщин среди них было больше, чем мужчин (60,4% — женщин; 39,6% — мужчин). Доля лиц трудоспособного возраста составила 47% от числа умерших по причине ОКИНЭ, из них менее суток и сутки провели в стационаре 70%. На поздних сроках заболевания поступили в стационар 30 пациентов. Сопутствующие хронические заболевания имели 80% умерших от ОКИНЭ, зависимость от алкоголя отмечалась у 20%. Из сопутствующих заболеваний отмечались сердечно-сосудистая патология, злокачественные новообразования, сахарный диабет, болезни печени и почек. Патолого-анатомическая экспертиза, проведенная в 30 случаях смерти от ОКИНЭ, выявила различной степени выраженности морфологические изменения в тонком и толстом кишечнике, желудке. У 23 умерших от ОКИНЭ по причине отказа родственников от вскрытия диагноз поставлен клинически. Пожилой возраст больных ОКИНЭ, наличие серьезных сопутствующих заболеваний, злоупотребление алкоголем являются факторами риска, способствующими наступлению летального исхода.

Широкая распространенность ОКИНЭ, непредсказуемость эпидемической ситуации, в ряде случаев тяжесть течения заболевания и возможность летальных исходов определяют их медицинское и социальное значение. Своевременное обращение за медицинской помощью при кишечных дисфункциях будет способствовать уменьшению их неблагоприятных последствий.

ПОЛУЧЕНИЕ ТЕСТ-СЫВОРОТОК ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ХОЛЕРНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ БАКТЕРИОФАГОВ

М.В. Овчинникова, Т.В. Аленкина, Г.И. Коровкина, М.Н. Киреев, А.К. Никифоров

ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Роспотребнадзора, г. Саратов

Основным условием получения высокоактивных и стабильных антифаговых сывороток является высокая иммуногенность антигена-бактериофага, которая напрямую зависит от концентрации фаговых частиц. Для образования антител к бактериофагам в организме лабораторного животного необходима концентрация бактериофага не менее пх1010—пх10п БОЕ/мл.

Цель работы: определение эффективности применения адъювантов при получении антифаговых тест-сывороток, используемых для проверки чистоты линий маточных культур в производстве диагностических бактериофагов.

Материалы и методы. Антиген — монофаг холерный эльтор Лх- 348/1102, в концентрации пх107— пх108 БОЕ/мл, входящий в состав бактериофага диагностического холерного эльтор йх-. Для усиления иммунного ответа использовали полный адъювант Фрейнда и низкомолекулярный ацетилирован-ный биополимер. Животные-продуценты кролики

Материалы X съезда ВНПОЭМП, Москва, 12-13 апреля 2012 г.

Инфекция и иммунитет

массой 2,5—3 кг разделены на 3 группы. Кроликов группы I иммунизировали монофагом с 0,5% биополимера, группы II — монофагом с ПАФ, группы III (контроль) — только монофагом. Динамику накопления антител определяли в реакции нейтрализации с антигеном-монофагом в концентрации пх107—пх108

Специфическая активность сывороток для I и II группы составила 1:600 и 1:500 соответственно. Активность сывороток без адъюванта, составила 1:300. Все полученные сыворотки были высокоспецифичны — не проявляли нейтрализующей активности в отношении других монофагов, входящих в состав бактериофага ctx-. Однако при применении полного адъюванта Фрейнда у всех животных (100%) на месте введения развивались глубокие дефекты кожного покрова и мышечной ткани, что увеличило срок иммунизации на одну неделю. Введение биополимера не приводило к негативным реакциям.

Выводы. Результаты исследований свидетельствуют о целесообразности использования адъю-вантов для получения высокоактивных сывороток к бактериофагам в низкой концентрации. При этом предпочтение отдается низкомолекулярному ацети-лированному биополимеру, который являясь менее реактогенным, позволяет получать активные антифаговые сыворотки.

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ РАСШИФРОВКИ ВСПЫШЕК ПИЩЕВЫХ ТОКСИКОИНФЕКЦИЙ В РЕСПУБЛИКЕ ДАГЕСТАН

Э.Я. Омариева1, А.В. Милихина2

Управление Роспотребнадзора по Республике Дагестан; 2ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Дагестан», г. Махачкала

В последние годы расширились возможности использования современных методов исследования, в том числе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, при расшифровке этиологии вспышек острых кишечных инфекций и пищевых отравлений бактериальной и вирусной этиологии.

В 2011 г. (с 17 по 19 октября) зарегестрирована вспышка пищевой токсикоинфекции в производственной столовой аэропорта «Уйташ» в Республике Дагестан с числом пострадавших — 37 человек. Исследования проведены в соответствии с МУ 4.2.2746-10 «Порядок применения молекулярно-генетических методов при обследовании очагов острых кишечных инфекций с групповой заболеваемостью» методом ПЦР в режиме реального времени с использованием тест систем ООО ИнтерЛабСервис «Ампли-СенсОКИ-скрин—Fl» и для выявления патогенов в продуктах: «Ампли-Сенс Salmonella spp.—Fl.», «Ампли-Сенс Campilobacter spp.—Fl», «Ампли-Сенс Shigella spp. и EIEC—Fl», а также бактериологическим методом.

Всего исследовано 37 проб фекалий от больных, в том числе от 6 работников пищеблока, 17 проб продуктов, отобранных в очаге отравления, и 30 смывов с оборудования пищеблока столовой.

Скрининговые ПЦР-исследования показали следующие результаты. У 29 больных, у 4 сотрудников столовой в фекалиях и промывных водах обнаружена ДНК сальмонеллы (89,2%). Смывы с тушек кур (2 пробы), замороженный компот, хранивший-

ся вместе с тушками кур (17,6%), а также 2 смыва с разделочных досок пищеблока (6,7%) также дали положительные результаты ПЦР-исследований на сальмонеллы. В последующем, в бактериологической лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Дагестан» выделены и идентифицированы культуры Salmonella enteritidis. Региональный центр по диагностике ОКИ, ФГУН ЦНИИЭ, подтвердил полученные результаты исследований и определил принадлежность всех выделенных от больных и из внешней среды культур Salmonella enteritidis к фаготипу 1.

Вспышка пищевой токсикоинфекции в производственной столовой аэропорта «Уйташ» показала, что использование метода ПЦР позволяет в течение 5 часов ориентировочно расшифровать этиологию вспышки и упростить бактериологические исследования по выделению и идентификации культур.

КОНСТРУИРОВАНИЕ И ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ НОВОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРЫ

H.А. Осина, Т.В. Бугоркова, В.Е. Куклев,

А.С. Абдрашитова, И.В. Шульгина, О.А. Лобовикова, С.А. Щербакова, В.В. Кутырев

ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», г. Саратов

Одним из перспективных направлений в совершенствовании генной диагностики холеры является разработка новых препаратов, направленных не только на детекцию эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов в биологическом материале и объектах окружающей среды, но и одновременно на характеристику вибрионов по таксономическому положению (принадлежность к О1, О139 серогруп-пам, биовар).

Нами сконструирован «Набор реагентов для выявления и ускоренной идентификации ДНК Vibrio cholerae методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Ген Vibrio cholerae — идентификация — РЭФ)», который может быть использован:

I. для определения эпидемической значимости выделенных культур холерных вибрионов; 2. для дифференцирования V. cholerae О1 серогруппы классического и эльтор биоваров; 3. для идентификации V. cholerae О139 серогруппы; 4. для индикации возбудителей холеры в биологическом материале и объектах окружающей среды. Для решения первой задачи предусмотрено проведение амплификации с реакционной смесью «ctx-tcp», содержащей праймеры, комплементарные ctxA и tcpA генам, второй задачи — с реакционной смесью «О1-биовар», включающей праймеры, подобранные на основе wbeN и hlyA генов, третьей — с реакционной смесью «О139», в состав которой входят праймеры фланкирующие фрагмент wbfR гена, а для последней — со всеми реакционными смесями, но в отдельных пробирках.

С целью внедрения набора в практику здравоохранения были проведены его технические и медицинские испытания. Установлено, что чувствительность препарата при исследовании чистых культур составила 1 х 104 м.к./мл в 100% случаях, 1 х 103 м.к./мл в 95,7% случаях, 1 х 102 м.к./мл в 50% случаях; при исследовании искусственно контаминированных проб