Studying of import Mechanisms for different length and structure DNA into plant mitochondria

Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 10 No. 4 2014, pp. 77-84 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2014 by Klimenko, Koulintchenko, Grebnev, Dietrich and Konstantinov

ORIGINAL ARTICLE

Studying of Import Mechanisms for Different Length and Structure DNA into Plant Mitochondria

E.S. Klimenko1, M.V. Koulintchenko1, P.A. Grebnev1, A. Dietrich2, Yu.M. Konstantinov1,3

1 Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, PO 317, Irkutsk, 664033, Russia

2 Institute of Plant Molecular Biology CNRS, Strasbourg, France

3 Irkutsk State University, Irkutsk, Russia

*E-Mail: yukon@sifibr.irk.ru

Received November 6, 2014

We investigated import of DNA of various length (109 bp, 269 bp, 717 bp, 1540 bp, 2732 bp, 9000 bp and 11600 bp) into the isolated mitochondria from potato tubers (Solanum tuberosum) and turnip root crops (Brassica rapa). The results imply existence of multiple pathways of DNA transfer into plant mitochondria. It was established that the transport of short length DNA (100-300 bp) is apparently carried out with the participation of several protein carriers which nature is currently unknown. We identified factors that influence the process of DNA transfer into mitochondria. These factors include the length of nucleic acid molecule and the presence of terminal inverted repeats that are specific to linear mitochondrial plasmids of plants.

Key words: mitochondria, DNA import, Solanum tuberosum, linear mitochondrial plasmids, plant mitochondria genome

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

78

Studying of Import Mechanisms ...

ORIGINAL ARTICLE

Изучение импорта ДНК разной длины и структуры в

митохондрии растений

Е.С. Клименко1, М.В. Кулинченко1, П.А. Гребнев1, А. Дитриш2,

1 3

Ю.М. Константинов ’

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, Россия

2 Институт Молекулярной Биологии Растений, Страсбург, Франция

3 Иркутский государственный университет, г. Иркутск, Россия

*E-Mail: yukon@sifibr.irk.ru

Поступила в редакцию 6 Ноября 2014 г.

Исследован импорт ДНК разной длины (109 п.н., 269 п.н., 717 п.н., 1589 п.н., 2732 п.н., 9000 п.н. и 11600 п.н.) в митохондрии, изолированные из клубней картофеля (Solanum tuberosum) и корнеплодов репы (Brassica rapa). Установлено, что транспорт ДНК небольшой длины (100-300 п.н.) осуществляется, по-видимому, с участием нескольких белковых переносчиков, природа которых в настоящее время остается неизвестной. Выявлены факторы, влияющие на перенос ДНК в митохондрии. К таким факторам следует отнести длину молекулы нуклеиновой кислоты, а также наличие концевых инвертированных повторов, характерных для линейных митохондриальных плазмид растений. Полученные результаты позволяют предположить существование нескольких путей переноса ДНК в растительные митохондрии.

Key words: митохондрии, импорт ДНК, Solanum tuberosum, линейные митохондриальные плазмиды, митохондриальный геном растений

Общеизвестно, что горизонтальный перенос генов играет важную роль в эволюции геномов бактерий. Однако позднее установлено, что горизонтальный перенос генов достаточно активно происходит и в растительных митохондриях

(частота этого процесса намного выше по сравнению с митохондриями других представителей эукариот) (Mower et a/., 2012). Сравнительный анализ митохондриальных нуклеотидных последовательностей дает

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Klimenko et al.

79

основания предполагать, что предки высших «природной компетентности митохондрий к

растений обладали компактным митохондриальным поглощению чужеродной ДНК» у высших

геномом (Turmel et al., 2002). Митохондриальный организмов в случае детального выяснения его

геном высших растений имеет значительно молекулярно-биологических механизмов открывает

больший размер (200 кб -11 Мб), чем у животных и широкие перспективы его использования не только

грибов (16-100 кб). Лишь 11-18% в фундаментальных исследованиях по выяснению

митохондриальной ДНК составляют гены, функций митохондриального генома у организмов

кодирующие белки или рибосомальные и разных видов, но также (что не менее важно) в

транспортные РНК, более 5% имеют исследованиях по биотехнологии (клонирование

хлоропластное, ядерное или вирусное целевых генов в митохондриях) и биомедицине

происхождение, а для половины и более (генотерапия митохондриальных болезней и

последовательностей мтДНК остаются неизвестны болезней пожилого возраста). Реализации этих

функции и происхождение. Вполне вероятно, что планов мешает отсутствие эффективных подходов

«избыточное» количество ДНК в митохондриях для целенаправленной доставки ДНК в

связано со способностью этих органелл к митохондрии организмов разных видов в условиях

поглощению и встраиванию в свой геном in vivo.

чужеродной ДНК. Нами предположено, что в MATERIALS AND METHODS

горизонтальном переносе генов в митохондрии Выделение митохондрий из картофельных

активную роль играет обнаруженный нами клубней

природный механизм активного поглощения ДНК Митохондрии изолировали из клубней

митохондриями (“импорт ДНК”), который картофеля согласно стандартному протоколу

распространен не только у растений, но также у (Neuburger et al., 1982). Концентрацию

млекопитающих и дрожжей (Koulintchenko et al., митохондриального белка определяли методом

2003; Koulintchenko et al., 2006; Weber-Lotfi et al., Бредфорда. Оценку дыхательной активности

2009). Важно подчеркнуть, что импортируемая в митохондрий и определение их дыхательного

митохондрии ДНК может транскрибироваться, контроля проводили с использованием

подвергаться репарации и интегрировать в геном, кислородного электрода и ячейки производства

т.е. активно включается в генетические процессы в фирмы «Hansatech».

этих органеллах (Boesch et al., 2009, 2010; Импорт ДНК в митохондрии

Mileshina et al., 2011). В отличие от импорта белков Импорт ДНК в митохондрии (200 мкг белка),

и тРНК биологическая роль и молекулярный проводили в буфере, содержащем 0,4 M сахарозу

механизм импорта ДНК в митохондрии растений и 40 мМ фосфат калия, pH 7.0 (буфер импорта), в

остаются малоизученными. Наличие феномена течение 40 мин при 25°С и постоянном

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

80

Studying of Import Mechanisms ...

помешивании. По окончании инкубации, неимпортированную ДНК удаляли посредством отмывки 1 мл среды, содержащей 10 мM фосфат калия, 0,3 M сахарозу,0.1 % БСА, 5 мM глицин, pH 7.5 (СП). Далее осадок митохондрий

ресупендировали и проводили обработку митохондрий ДНКазой (Fermentas, 1ед. активности фермента на пробу) в течение 20 мин в присутствии 10 mM MgCl2. Двухкратную отмывку от ДНКазы проводили в 1 мл СП, содержащей дополнительно 10 мM ЭДТА+10 мM ЭГТА. Экстракция ДНК из митохондрий

Экстракцию ДНК проводили, с

использованием одного объёма буфера, содержащего 10 мM Трис-HCl, 1 мM ЭДТА, 1 % (в/о) ДСН, pH 7.5, и одного объёма фенола. Нуклеиновые кислоты, содержавшиеся после центрифугирования в водной фазе, осаждали этанолом и разделяли электрофоретически в 1 % (в/о) агарозном геле, с последующим переносом в щелочных условиях (в 0,4 М NaOH) на нейлоновую мембрану (Hybond N+, Amersham Biosciences). Перед переносом нуклеиновых кислот на мембрану гель инкубировали последовательно в 0,25 М HCl, с целью апуринизации ДНК, в течение 20 мин, затем в 0,4 М NaOH, 30 мин. По окончании переноса нейлоновую мембрану использовали для радиоавтографии, экспонируя ее с рентгеновской пленкой (Fuji X-Ray Film, "Super RX”).

Экстракцию ДНК из митохондрий для анализа с помощью ПЦР-РВ проводили с использованием метода термообработки. Полученные осадки митохондрий ресуспендировали в 50 мкл раствора,

содержащего 0,5% NP-40, 2,5 мкМ EDTA, затем прогревали при 98°С 12 минут. После этого проводили осаждение центрифугированием и отбирали супернатант для ПЦР-РВ. Нуклеотидные последовательности праймеров и флуоресцентных зондов представлены в таблице 1.

Реакцию проводили в объеме 15 мкл. Реакционная смесь содержала: 1 ед.акт. Taq-полимеразы (Fermentas), буфер для Taq-полимеразы (650 мМ трис-HCl, pH 8.8, 160 мМ (NH4)2SO4, 0.5% Tween 20), 1 мМ dNTP, 8 мМ MgCl2, праймеры 0.6 mМ, зонды 0.3 mМ, 2,5 мкл образца ДНК. Амплификацию проводили в следующем режиме: 4.5 мин - 95°С, 1 цикл; 15 с -95°С, 15 с - 60°С, 40 циклов на CFX96 (Bio-Rad). Данные анализировали при помощи программного обеспечения CFX96 (Bio-Rad). Для дизайна праймеров и зондов использовали программное обеспечение PrimerExpress (Applied Biosystems).. Для построения калибровочной кривой использовали рекомбинантные плазмиды, содержащие ампликоны gfp и cox2. Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрически (SmartSpec Plus, Bio-Rad). Чистоту препарата оценивали по соотношению А260/А280.

RESULTS AND DISCUSSION

Исследования эффективности импорта ДНК разной длины и структуры в различных условиях были проведены с использованием митохондрий из клубней картофеля (Solanum tuberosum) и корнеплодов репы (Brassica rapa). Анализ импорта ДНК малой (100 - 300 п.н.) средней (700 - 2700 п.н.) и большой (от 9000 п.н.) длины проводили с

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Klimenko et al.

81

использованием двух методов детекции: ПЦР в порина (VDAC)- основного многофункционального

реальном времени (Klimenko et al., 2011) и белка внешней мембраны митохондрий. Рутений не

радиоактивно меченой ДНК

2003). длины ингибирующего действия, более того, был

Как было показано ранее (Koulintchenko et al., выявлен стимулирующий эффект этого агента на

2003) в транспорте нуклеиновых кислот через транспорт ДНК в митохондрии, примерно в 5-7 раз.

митохондриальные мембраны у растений Для ДНК средней (717-2700 п.н.) длины

участвуют порин (VDAC) и обработка рутением приводила к торможению

адениннуклеотидтранслоказа (АНТ). В наших импорта ДНК по сравнению с контрольными

экспериментах использовали изолированные необработанными митохондриями.

митохондрии картофеля и репы, обработанные Таким образом, нами получены данные в

ингибитором порина рутением красным и поддержку гипотезы о существовании

ингибиторами адениннуклеотидтранслоказы (АНТ) множественных путей переноса ДНК разной длины

атрактилозидом и карбоксиатрактилозидом, а в митохондрии растительного происхождения.

также обработку протеазами. Такая обработка Один из этих путей трансмембранного переноса

позволяет судить об участии экспонированных на проявляет сходство с таковым, показанным ранее

внешней поверхности мембраны белков в импорте для импорта ДНК длиной от 1 до 3 т.п.н., и

ДНК. Так, предобработка изолированных происходит c участием классических

митохондрий картофеля протеиназой К не митохондриальных переносчиков: (1) зависимого

оказывает существенного влияния на транспорт от напряжения анионного канала (VDAC, от

ДНК малой (109-269 п.н.) длины, но ингибирует “voltage dependent anion channel”) наружной

транспорт ДНК средней (717-1540 п.н.), примерно, мембраны и (2) переносчика адениновых

на 90%. Такие ингибиторы АНТ как атрактилозид и нуклеотидов (АНТ) внутренней мембраны

карбоксиатрактилозид не влияли на транспорт митохондрий (Рис 1, А и Б). ДНК малой и средней

ДНК малой длины, но для ДНК средней (717-2700 длины импортируется в митохондрии частично

п.н.) длины наблюдалось снижение перекрывающимися, но не совпадающими

эффективности импорта ДНК. На основании этих полностью путями. Транспорт в митохондрии малых

данных можно предположить, что для ДНК малой ДНК может эффективно осуществляться с

(109-269 п.н.) длины АНТ не является участием ряда альтернативных белковых

единственным белковым переносчиком на уровне переносчиков и/или мембранных каналов, природа

внутренней мембраны митохондрий. Рутений которых остается пока неизвестной.

красный, согласно литературным данным, является Установлено, что растительные митохондрии

агентом, модулирующим транспортную активность обладают специфичным транспортным

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

82

Studying of Import Mechanisms ...

механизмом в отношении длинных молекул ДНК (от 9 т.п.н. и больше), обладающих такими структурными особенностями как наличие концевых инвертированных повторов (327 п.н.) плазмиды 11,6 т.п.н. из B. napus (Handa, 2008). Митохондрии B. rapa импортируют длинные молекулы (порядка 9 т.п.н.), различающиеся в своей структуре наличием или отсутствием концевых инвертированных повторов, с большей эффективностью по сравнению с митохондриями S. tuberosum. При этом импорт молекул большой длины в митохондрии обоих растительных видов имеет сходную специфичность: наличие на концах молекул концевых инвертированных повторов обусловливает большую эффективность импорта

ДНК (Рис 1, В и Г).

Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют в пользу существования нескольких путей переноса ДНК в растительные митохондрии. Обнаружено, что транспорт ДНК малой (100-300 п.н.) длины осуществляется, по-видимому, с участием нескольких белковых переносчиков, природа которых пока остается неустановленной. Установлены факторы, влияющие на перенос ДНК в митохондрии. К таким факторам следует отнести длину молекулы нуклеиновой кислоты, а также наличие концевых инвертированных повторов, характерных для линейной плазмиды 11,6 т.п.н митохондрий Brassica napus.

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров и флуоресцентных зондов

Олигонуклеотид Нуклеотидная последовательность

gfp Rev 5 - CGGGGCATGGCACTCTTGA-3’

For 5 - CTGTTCCTTGGCCACACT-3’

Зонд Cy5~5-TGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGA -3’~BHQ2

cox2 Rev 5-AGCCTGCAATGTCCGATAAC -3’

For 5 - CCCATTCCGAAAGGTTACTG-3’

Зонд R6G~5 -TGGTATACAACTTTGGACCTAACAGCC -3’~BHQ2

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

Klimenko et al.

83

S.tuberoBum B.rapa

Б

RuR

CATR

ATR

Протеиназа К

0 100 200

300 400 500

600

700

1540

717

269

109

800 900 1000

Эффективность импорта ДНК, % от контроля

Г Эффективность импорта разноразмерных молекул ДНК в изолированные митохондрии S.tuberosum

120 п

2732 пн 9тпн

Рисунок 1. А и Б. Импорт ДНК разной длины в изолированные митохондрии S. tuberosum (А и Б) и B. rapa (А) имеет различную чувствительность к влиянию ингибиторов митохондриальных мембранных переносчиков (VDAC и АНТ). В качестве субстратов ДНК использовали фрагменты ДНК длиной 109 (Б), 269 (А и Б), 717 (Б), 1589 (Б) и 2732 (А) п.н. Анализ эффективности импорта проводили с использованием радиоактивно меченых субстратов (А) или методом ПЦР в реальном времени (Б). Использованные ингибиторы: для АНТ - карбоксиатрактилозид, 10 ^М (CATR), атрактилозид, 100 ^М (ATR), для VDAC - рутений красный, 5 ^М (RuR); Необр -необработанные митохондрии. В и Г. Митохондрии, изолированные из клубней картофеля, импортируют ДНК длиной 9 т.п.н., имеющую в структуре своей последовательности концевые инвертированные повторы (КИП) линейной митохондриальнйо плазмиды 11,6 т.п.н из B. napus. Анализ эффективности импорта проводили с использованием радиоактивно меченых субстратов.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014

84

Studying of Import Mechanisms ...

ACKNOWLEDGMENT permeability transition pore complex. EMBO J.,

Работа выполнена при финансовой поддержке 22(6), 1245-1254.

грантов РФФИ 12-04-01400, 12-04-01027 и Koulintchenko M., Temperley R.J., Mason P.A.,

междисциплинарного интеграционного проекта СО Dietrich A., Lightowlers R.N. (2006) Natural

РАН №59. competence of mammalian mitochondria allows

REFERENCES the molecular investigation of mitochondrial gene

Boesch P., Ibrahim N., Dietrich A., Lightowlers R.N. expression. Human Mol. Genetics, 15(1), 143-

(2010) Membrane association of mitochondrial 154.

DNA facilitates base excision repair in Mileshina D., Koulintchenko M., Konstantinov Yu.,

mammalian mitochondria. Nucleic Acids Res., Dietrich A. (2011) Transfection of plant

38(5), 1478-1488. mitochondria and in organello gene integration.

Boesch P., Ibrahim N., Paulus F., Cosset A., Nucleic Acid Res., 39(17), e115.

Tarasenko V., Dietrich A. (2009) Plant Mower J.P., Jain K., Hepburn N.J. (2012) The role of

mitochondria possess a short-patch base horizontal transfer in shaping the plant

excision DNA repair pathway. Nucleic Acids mitochondrial genome. Advances in Botanical

Res., 37(17), 5690-5700. Res., 63. 41-64.

Handa H. (2008) Linear plasmids in plant Turmel M., Otis C., Lemieux C. (2002). The complete

mitochondria: Peaceful coexistence or malicious mitochondrial DNA sequence of Mesostigma

invasions? Mitochondrion, 8, 15-25. viride identifies this green alga as the earliest

Klimenko E.S., Mileiko V.A., Morozkin E.S., Laktionov green plant divergence and predicts a highly

P.P., Konstantinov Yu.M. (2011) Study of DNA compact mitochondrial genome in the ancestor of

Import and Export in Potato (Solanum all green plants. Mol. Biol. Evol. 19, 24-38.

tuberosum) Mitochondria Using Quantitative Weber-Lotfi F., Ibrahim N., Boesch P., Paulus F.,

PCR. Biochemistry (Moscow) Supplement Cosset A., Konstantinov Y., Lightowlers R.N.,

Series A: Membrane and Cell Biology, 5(2), Dietrich A. (2009) Developing a genetic approach

170-176. to investigate the mechanism of mitochondrial

Koulintchenko M., Konstantinov Y., Dietrich A. (2003) competence for DNA import. Biochim. Biophys.

Plant mitochondria actively import DNA via the Acta, 1787, 320-327.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 10 No. 4 2014