Малые молекулы-регуляторы апоптоза клеток синовиальной оболочки у больных ревматоидным артритом

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ - РЕГУЛЯТОРЫ АПОПТОЗА КЛЕТОК СИНОВИАЛЬНОЙ ОБОЛОЧКИ У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ

А.И. Дуби ков Городской ревматологический центр, Городская клиническая больница № 2, Владивосток

Резюме

Цель. Определить интенсивность апоптоза, активность про- и антиапоптотических молекул в морфологических структурах синовиальной оболочки (СО) у больных ревматоидным артритом (РА) на ранней и поздней стадиях заболевания.

Материал и методы. Образцы СО, синовиальной жидкости и сыворотки крови исследованы у 78 больных с достоверным серопозитивным РА (35 больных - ранний РА, 43 - поздний РА). Определяли интенсивность апоптоза синовиальных клеток методом Т1ЖЕЬ, экспрессию молекул Вс1-2 и р -53 - иммуногистохимическим методом, концентрацию растворимого Раз-рецептора (в-РаБ) в синовиальной жидкости и сыворотке крови - иммуноферментным анализом.

Результаты. Установлена низкая интенсивность апоптоза и экспрессии р-53 молекулы на фоне высокой экспрессии Вс1-2 и концентрации э-РаБ в синовильной жидкости у больных ранним РА. Поздняя стадия РА характеризовалась высокой интенсивностью апоптоза и экспрессии р-53 молекулы на фоне низкой концентрации в-Рая в синовиальной жидкости и экспрессии Вс1-2 в СО.

Заключение. Установлена различная интенсивность программированной клеточной смерти клеток СО на ранней и поздней стадиях РА, которая зависит от баланса анти- и проапоптотических молекул на морфологическом (Вс1-2 и р53) и гуморальном уровнях (эРав).

Ключевые слова: ревматоидный артрит, апоптоз, малые молекулы

За последние 50 лет концепция патогенеза РА претерпела значительную эволюцию, что связано с накоплением знаний о так называемых малых молекулах, участвующих в передаче внутриклеточных сигналов и регуляции различных феноменов, в том числе апоптоза - программированной клеточной смерти. Ранние стадии РА характеризуются такими морфологическими изменениями, как гиперплазия СО, неоангиогенез и инфильтрация клетками мо-нонуклеарного ряда [2; 3]. Существенный вклад в эти процессы вносят макрофаго-подобные и фиб-робласто-подобные синовиоциты. Последние характеризуются наличием пренеопластических свойств, высоким инвазивным потенциалом и

.Адрес: 690105, г. Владивосток, ул. Русская, д. 57 ГКБ № 2, Городской ревматологический центр Телефон: (4232) 32-49-33 Е-таП: aihavlad@online.vladivostok.ru

экспрессией протоонкогенов [8]. Морфогенез поздней стадии РА отличается снижением интенсивности пролиферативных процессов и частым развитием соединительной ткани [2]. Одним из объяснений пролиферации ревматоидной синовии является нарушение баланса между интенсивностью клеточной пролиферации и апоптозом. В связи с этим исследование механизмов активации и подавления апоптоза кажется перспективным для разработки новых терапевтических подходов [7].

Целью настоящего исследования явилось определение активности про- и антиапоптотических молекул на ранней и поздней стадиях РА.

Материал и методы

В исследование были включены 78 больных РА (70 жен. и 8 муж.) в среднем возрасте 42,34± 1,49 лет. Диагноз РА у всех больных соответствовал крите-

риям Американской Ревматологической Ассоциации [4]. Во всех случаях имелся "классический" серопозитивный РА, течение которого отличалось стойко сохраняющейся активностью, несмотря на применение нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), и отсутствием спонтанных и лекарственно индуцированных ремиссий. Больные отбирались по мере поступления в стационар, после клинического, лабораторного и инструментального обследования. В этот период проводилась симптоматическая терапия только НПВП. Больных разделяли на две группы: с ранним РА (длительность болезни от 2 мес. до 3 лет) и поздним РА (более 3 лет), соответственно 35 и 43 человека. С помощью гистохимического, иммуно-цитохимического и общеморфологического методов исследовали образцы СО. Материал получали во время артроскопии и синовкапсулэктомии, проведенных согласно показаниям (непрерывно рецидивирующий синовит коленного сустава в течение не менее чем 2 мес.). Информационное согласие было получено от всех пациентов.

В качестве контроля использовались образцы СО и хряща 7 здоровых мужчин в возрасте от 21 до 50 лет, погибших от комбинированной травмы (забор материала производился в течение не более 2 часов после наступления смерти). Забор синовиальной жидкости для контроля проведен у 10 пациентов (4 муж. и 6 жен. в возрасте от 25 до 55 лет) во время эксплоративной артротомии коленного сустава по поводу предполагавшегося повреждения менисков. Образцы сыворотки крови и синовиальной жидкости немедленно после забора замораживались при температуре -70°С. Изучение апоптоза проводилось иммуноцитохимическим методом TUNEL (terminal deoxynucleotidil transferase-mediated dUTP nick end-labeling), основанного на выявлении фрагментированных цепочек ДНК. Для выявления TUNEL-окрашенных структур использовали набор реактивов ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon). Количественную оценку TUNEL-позитивных ядер проводили с помощью окуляр-морфометрической сетки на участках ткани хряща и синовии размерами 100x100 мкм. Апоптотический индекс (АИ) определяли как отношение общего числа TUNEL- позитивных ядер (Ntunel) к количеству клеток, окрашенных то-луидиновым синим и имеющих видимое непикно-тизированное ядро (Nt) по формуле AH=(Ntunel xlOO)/ Nt. На образцах СО коленного сустава человека изучали локализацию Вс1-2 и р-53. Срезы толщиной 20 мкм помещали в фосфатный буфер. Им-муноцитохимическое окрашивание срезов включало несколько последовательных этапов: преинкуба-ция, обработка в растворе первичных антител, обработка вторичными антителами и постановка им-мунопероксидазной реакции с использованием реагентов ImmunoCruz Staining System (Santa Crus).

Количественное определение расворимого Fas-рецептора в исследуемых сыворотках крови и пробах синовиальной жидкости проводилось методом твёрдофазного иммуноферментного анализа с использованием набора Bender MedSystems.

Статистическая обработка осуществлялась с помощью пакета программ "Статистика 6" для Windows с использованием приложения Biostat.

Результаты

Наши наблюдения показывают, что интенсивная флюоресценция ядер апоптотических клеток, окрашенных с помощью метода TUNEL, обнаруживается как на ранних, так и на поздних стадиях РА. Отличие заключается в количестве маркированных клеток. В контрольной группе у практически здоровых людей реакция клеток с TUNEL отсутствует.

Ядра синовиоцитов, окрашенные с помощью реагентов TUNEL, выглядят как флюоресцирующие точки (апоптотические тельца), которые, сливаясь, образуют кольца, полукольца, а также сплошные однородные конгломераты. Они локализуются на месте презумтивногоядра, равномерно распределяются по цитоплазме, смещаются к цитоплазматической мембране, либо группируются у одного из полюсов клеточной сомы. На ранней стадии воспаления TUNEL-позитивные клетки концентрируются, главным образом, в периваскуляр-ных пространствах, где их локализация совпадает с положением воспалительных инфильтратов. Среди них на срезах, окрашенных толуидиновым синим, идентифицируются лимфоциты. При этом стенки микрососудов с TUNEL не реагируют. В покровном слое СО отмечается флюоресценция фрагментированных ядер единичных синовиоцитов, которые иногда формируют скопления или кластеры.

Результаты, полученные нами, указывают на низкую интенсивность апоптоза на ранних стадиях РА (табл. 1). Распространенность апоптоза коррелирует с длительностью и выраженностью воспалительной инфильтрации СО. На поздней стадии РА выявлена значительная активизация апоптоза.

Таблица 1

АПОПТОТИЧЕСКИЙ ИНДЕКС КЛЕТОК ХРЯЩА

И СИНОВИАЛЬНОЙ ОБОЛОЧКИ КОЛЕННОГО СУСТАВА ЧЕЛОВЕКА ПРИ РА

Клеточные элементы Контроль Ранний РА Поздний РА

Хондробласты - 0,07 ± 0,05 0,4 ± 0,09 ♦

Хондроциты - - 0,01 ±0,03

Синовиальные лимфоциты - - 0,03 ±0,01

Синовиоциты - 2,1 ±0,5 5,8 ± 0,2

Примечание: ♦ - достоверность различия р<0,05.

Морфологический профиль апоптотических структур здесь смещается в сторону фибробластов стро-мального слоя гипертрофированной СО. В пери-васкулярных инфильтратах также отмечается повышенная плотность TUNEL-позитивных клеток, однако локализуются они чаще всего в субпокровном слое синовии.

Обращает на себя внимание высокий апоптотический индекс хондробластов. Они локализуются преимущественно в поверхностной зоне хряша, объединяются в изогенные группы, каждая содержит от 1го до Зх ядер апоптотических клеток. В глубине хряша, где активность пролиферативных процессов существенно ниже, TUNEL маркирует очень редкие единичные ядра хондроцитов.

По нашим наблюдениям, локализация р53 и Вс1-2 молекул в СО человека не совпадает и зависит от стадии патологического процесса.

При раннем РА р53 молекула выявляется в единичных скоплениях синовиоцитов покровного слоя. Они имеют округлую или овальную форму и, по всей видимости, принадлежат к популяции пришлых клеток или синовиоцитов типа А. Однако в позднем периоде РА р53-иммунореактивные клетки становятся многочисленнее, большая их часть выявляется в стромальном слое синовии (табл. 2).

Таблица 2

ОТНОСИТЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ Р53-ИММУНОРЕАКТИВНЫХ КЛЕТОК В СИНОВИАЛЬНОЙ ОБОЛОЧКЕ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ РА У ЧЕЛОВЕКА

Картина распределения Вс1-2-иммунореактив-ных синовиоцитов имеет противоположную тенденцию (табл. 3). Их абсолютное большинство выявляется на ранней стадии РА, где они обнаруживаются практически повсеместно. По мере хрониза-ции воспаления количество маркируемых клеток снижается.

Преимущественной локализацией молекулы Вс1-2, по нашим данным, являются лимфоцитарные инфильтраты, поверхностный слой СО, гладкомышечные клетки синовиальных сосудов. На поздней стадии характер локализации Вс1-2 не изменялся, однако интенсивность значительно снижалась.

Мы сопоставили экспрессию молекулярных посредников апоптоза на морфологическом и гуморальном уровнях. Исследование концентрации

sFas рецептора, препятствующего активизации Fas-зависимого пути апоптоза через связывание лиганда Fas, в системном кровотоке и синовиальной жидкости позволило установить следующую тенденцию: в группе "позднего" РА концентрация в сыворотке крови (Fas-ser) была достоверно выше в сравнении с группой "раннего" РА (табл. 3). Динамика уровня sFas в синовиальной жидкости (Fas-sin) характеризовалась противоположной направленностью. Содержание sFas в синовиальной жидкости неуклонно снижалось от "раннего” РА к "позднему".

Обсуждение

Нарушения механизмов индукции апоптоза, ведущие к его ингибированию или, наоборот, к излишнему активированию, могут быть важным звеном в патогенезе РА. Согласно полученным нами результатам, можно говорить о различной интенсивности апоптоза клеточных структур СО у больных на ранней и поздней стадиях РА: низкая апоп-тотическая активность СО у больных с ранним РА и высокая у больных с поздним РА. Есть все основания полагать, что процессы регуляции апоптоза лежат в основе профессии ревматоидного синовита, что на клиническом уровне означает различную терапевтическую стратегию в зависимости от стадии РА [18].

Патологическая реорганизация синовии человека при РА протекает одновременно с уменьшением плотности хондробластов, которые подвергаются апоптозу в условиях длительного ревматоидного воспаления. Не исключено, что эти эффекты, инициированные предшествующим синовитом, способны ограничивать рост и регенерацию хряша, оставляя свой деструктивный след в виде вторичного остеоартроза.

Морфотипическая гетерогенность TUNEL-реактивных клеток детерминирована различным механизмом их программированной гибели. В этой связи предполагается наличие альтернативных путей, запускающих апоптоз |9, 21]. Один из них, митохондриальный, индуцируется выработкой тран-скрипторного фактора р53, дефект которого ведет к опухолеподобной пролиферации синовиоцитов [10]. Другой механизм апоптоза развивается в лимфоцитах и блокируется фактором Вс1-2 [18].

Мы обнаружили закономерный стереотип экспрессии Вс1-2 в синовиальной ткани в зависимости от стадии РА: от гиперэкспрессии на ранней стадии до гипоэкспрессии на поздней. Можно полагать, что экспрессия Вс!-2 на ранней стадии РА лимитирует количество апоптотических клеток, создает благоприятный фон для пролиферации, выживания и активного функционирования соответствующих воспалительных элементов. Наши результаты подтверждаются сведениями о более высоком уровне экспрессии Вс1-2 в гладкомышечных

Клетки Контроль Ранний РА Поздний РА

Лимфоциты воспалительных инфильтратов 2,7 ± 0,5 5,1 ±0,3 ♦

Синовиоциты * 4,8 ± 1,5 12,3 ±0,5 ♦

Примечание: ♦ - достоверность различия р<0,05.

Таблица 3

ЭКСПРЕССИЯ ВСЬ-2 И в-РАБ В СТРУКТУРАХ СИНОВИАЛЬНОЙ ОБОЛОЧКИ, ЖИДКОСТИ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ РА

Клетки Контроль Ранний РА Поздний РА

Лимфоциты воспалительных инфильтратов 7,6 ± 1,1 0,8 ±0,1*

Синовиоциты 1,21 ±0,10 10,4 ± 0,5 ♦ 1,1 ±0,2*

s-Fas-sin (n-10) 210,42 ± 55,90 2665,21 ± 262,27 ♦ I381,00 ± 16,52*Ф

Примечание: * - достоверность различия между

группами р<0,01; ♦ - достоверность различия с контролем р<0,05.

клетках сосудов СО, полученной от больных РА [16] и более высокой концентрации иРНК Вс1-2 в синовиальной ткани больных РА в сравнении с больными остеоартрозом [11].

Поскольку основной мишенью Вс1-2 семейства является митохондрия, то можно предполагать заинтересованность преимущественно митохондриального пути апоптоза при РА. В митохондриальном апоптозе молекула р53 играет важную роль в изменении стабильности мембраны митохондрий и непосредственно в запуске программированной клеточной смерти [17, 20]. В мембране митохондрий был обнаружен белок (р53А1Р1), опосредующий р53-зависимый путь апоптоза [12].

Рассматривая взаимоотношения р53 и Вс1-2, мы выявили определенную закономерность: при интенсивной экспрессии Вс1-2 на ранней стадии РА и в острой фазе адьювантного артрита [1] отмечается низкая экспрессия проапоптотической молекулы р53 и, соответственно, низкий апоптотический индекс. Напротив, на поздней стадии РА и в хронической фазе адьювантного артрита резко возрастала экспрессия р53 и критически снижалась экспрессия Вс1-2, что сопровождалось интенсивным апоп-тозом клеточных элементов суставной среды.

Некоторые авторы ранее высказывались в пользу способности р53 репрессировать ген-промоутер Вс1-2 [13] и способности Вс1-2, в свою очередь, суп-рессировать проапоптотическую функцию р53 [18].

ЛИТЕРАТУРА

1. Дубиков А.И. Ревматоидный артрит, апоптоз, оксид азота: новые аспекты патогенеза. Владивосток, Изд-во Дальневост. ун-та, 2004, 132.

2. Копьева Т.Н., Веникова М.С. Клиническая морфология артритов при ревматических заболеваниях. М., РАМН, 1992, 219.

3. Насонова В.А., Бунчук Н.В. Ревматические болезни. М., Медицина, 1997, 520.

4. Arnett F.C., Edworthy S.М., Bloch D.A. et al. The American Rheumatism Association 1987 revised

Следовательно, в процессе эволюции РА "работает" молекулярный реостат Вс1-2/р53, который может в значительной мере определять апоптоти-ческую активность клеток синовиальной среды сустава.

Экспрессия Вс1-2 молекулы исследовалась при многих заболеваниях, но практически ничего неизвестно о клиническом значении этой молекулы при РА. Высокий уровень экспрессии Вс1-2 ассоциировался с плохим прогнозом при карциноме мочевого пузыря [5], болезни Ходжкина [19], раке предстательной железы [14]. Кроме того, коэффициент Вс1-2/Вах показал хорошие прогностические характеристики при химиотерапии острого миело-лейкоза [6], рака желудка [15].

Согласно нашим данным, повышенная экспрессия Вс1-2 молекулы коррелировала с числом воспаленных суставов (г=0,67, р<0,05) и функциональным классом больных РА (г=0,71, р<0,05). Это позволяет говорить о прогностической ценности антиапоптотического маркера и, одновременно, о новой мишени терапевтических воздействий.

Стереотип изменения концентрации в-Рав, антиапоптотического фактора соответствовал направленности изменений экспрессии р53, Вс1-2 молекул и интенсивности апоптоза. С увеличением индекса апоптоза на поздней стадии РА снижался уровень Б-Иав в синовиальной жидкости. При отмеченных связях з-Иаз со степенью активности РА (г=0,62, р<0,05) и функциональным классом больных РА (г=0,83, р<0,05), а также апоптотическим индексом (г= - 0,74, р<0,05) 5-Раз может быть использован как интегративный показатель напряженности и характера происходящих в СО процессов программированной клеточной смерти.

Заюгючение

Нам удалось показать различную интенсивность программированной клеточной смерти клеток СО на ранней и поздней стадиях РА, которая зависит от баланса анти- и проапоптотических молекул на морфологическом (Вс1-2 и р53) и гуморальном уровнях (бРаз).

criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthr. Rheum., 1988, 31, 315 - 324.

5. Atug F., Turkeri L., Ozyurek M., Akdas A. Bcl-2 and p53 overexpression as associated risk factors in transitional cell carcinoma of the bladder. Intern. Urol. Nephrol., 1998, 30 (4), 455 - 461.

6. Bincoletto C., Saad S.T., da Silva E.S., Queiroz M.L. Haematopoietic response and bcl-2 expression in patients with acute myeloid leukaemia. Europ. J. Hematol., 1999, 62 (1), 38 - 42.

7. Catrina A.I., Ulfgren A.K., Lindblad S. et al. Low levels of apoptosis and high FLIP expression in early rheumatoid arthritis synovium. Ann. Rheum. Dis. 2002,61 (10), 934- 936.

8. Firestein G.S. Invasive fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Passive responders or transformed aggressors? Arthr. Rheum., 1996, 39 (11), 1781 - 1790.

9. Firestein G.S., Yeo M., Zvaifler N.J. Apoptosis in rheumatoid arthritis synovium. J. Clin. Investig., 1995, 96 (3), 1631 - 1638.

10. Itoh K., Hase H., Kojima H. et al. Central role of mitochondria and p53 in Fas-mediated apoptosis of rheumatoid synovial fibroblasts. Rheum., 2004, 43 (3), 277 - 285.

11. Liang H.Y., Jiang M., Chen H.M., Wang Y.C. Overexpression of proto-oncogene bcl-2 in rheumatoid synovium. Brit. J. Rheum., 1996, 35 (8), 803 -804.

12. Matsuda K., Yoshida K., Taya Y. et al. p53AJPl regulates the mitochondrial apoptotic pathway. Cancer Res., 2002, 62 (10), 2883 - 2889.

13. Miyashita T., Harigai M., Hanada M., Reed J.C. Identification of a p53-dependent negative response element in the bcl-2 gene. Cancer Res., 1994, 54 (12), 3131-3135.

14. Moul J.W. Angiogenesis, p53, bcl-2 and Ki-67 in the progression of prostate cancer after radi-

cal prostatectomy. Europ. Urol., 1999, 35 (5-6), 399 - 407.

15. Nakata B., Muguruma K., Hirakawa K. et al. Predictive value of Bcl-2 and Bax protein expression for chemotherapeutic effect in gastric cancer. A pilot study. Oncol., 1998, 55 (6), 543 - 547.

16. Perlman H., Georganas C., Pagliari L.G. et al. Bcl-2 expression in synovial fibroblasts is essential for maintaining mitochondrial homeostasis and cell viability. J. Immunol., 2000, 164, 5227 - 5235.

17. Rich Т., Allen R.L., Wyllie A.H. Defying death after DNA damage. Nature, 2000, 407 (6805), 777 - 783.

18. Smith M.D., Walker J.G. Apoptosis a relevant therapeutic target in rheumatoid arthritis? Rheum., 2004, 43 (4), 405 - 407.

19. Smolewski P., Niewiadomska H., Blonski J.Z. et al. Expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and p53, bcl-2 or C-erb B-2 proteins on Reed-Stembeig cells: prognostic significance in Hodgkin's disease. Neoplasma, 1998, 45 (3), 140 -147.

20. \busden K.H. p53: death star. Cell, 2000, 103 (5), 691 - 694.

21. Yao Q., Wang S., Gambotto A. et al. Intra-articular adenoviral-mediated gene transfer of trail induces apoptosis of arthritic rabbit synovium. Gen. Therap., 2003, 10 (12), 1055 - 1060.

Поступила 10.01.06.

Abstract

A.I. DubikovSmall

molecules regulators of synovial cell apoptosis in patients withrheumatoid arthritis

Objective. To analyze intensity of apoptosis and expression of Bcl-2, p-53 and soluble Fas receptor (s-Fas) in synovial tissue (ST) of pts with early and late stages of (rheumatoid arthritis) RA.

Materials and methods. Immunohistochemical examination of ST from 35 pts with early and 43 pts with late RA was performed. Synovial cells apoptosis intensity was evaluated with TUNEL method, Bcl-2 and p-53 expression - with immunohistochemical and s-Fas in serum and synovial fluid - with immunoenzyme assay.

Results. Low intensity of apoptosis and p53 expression accompanied by high Bcl-2 expression and s-Fas concentration was revealed in synovial fluid of pts with early RA. Late RA was characterized by high apoptosis intensity and p-53 expression in combination with low synovial fluid s-Fas concentration and ST Bcl-2 expression.

Conclusion. The study revealed different intensity of synovial cells apoptosis in early and late RAthat depends on anti- and proapoptotic molecules balance at morphological (Bcl-2 and p-53) and humoral (s-Fas) levels

Key words: rheumatoid arthritis, apoptosis, small molecules