СПОСОБЫ И ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ТРАНСФЕКЦИИ КЛЕТОК

1. Синтетическая молекула РНК, содержащая три или более неканонических нуклеотидов, каждый из которых содержит одну или более из следующих замен: пиримидина в позиции 2C, пиримидина в позиции 4C, пиримидина в позиции 5C, пурина в позиции 6C, пурина в позиции 7N и пурина в позиции 8C.
2. Синтетическая молекула РНК по п. 1, отличающаяся тем, что синтетическую молекулу РНК получают путем in vitro транскрипции.
3. Синтетическая молекула РНК по п. 1, которая дополнительно содержит по меньшей мере один следующий элемент: 5′-кэп, 5′-кэп 1 структуру и 3′-поли(A) хвост.
4. Синтетическая молекула РНК по п. 1, отличающаяся тем, что по меньшей мере два неканонических нуклеотида являются пиримидинами.
5. Синтетическая молекула РНК по п. 1, отличающаяся тем, что неканонические нуклеотиды содержат по меньшей мере одно из следующих соединений: псевдоуридин, 2-тиоуридин, 4-тиоуридин, 5-азауридин, 5-гидроксиуридин, 5-аминоуридин, 5-метилуридин, 2-тиопсевдоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 5-гидроксипсевдоуридин, 5-метилпсевдоуридин,
5-аминопсевдоуридин, псевдоизоцитидин, 5-метилцитидин, N4-метилцитидин, 2-тиоцитидин, 5-азацитидин, 5-гидроксицитидин, 5-аминоцитидин, N4-метилпсевдоизоцитидин, 2-тиопсевдоизоцитидин, 5-гидроксипсевдоизоцитидин, 5-аминопсевдоизоцитидин, 5-метилпсевдоизоцитидин, Ν6-метиладенозин, 7-деазааденозин, 6-тиогуанозин, 7-деазагуанозин, 8-азагуанозин, 6-тио-7-деазагуанозин, 6-тио-8-азагуанозин, 7-деаза-8-азагуанозин и 6-тио-7-деаза-8-азагуанозин.
6. Синтетическая молекула РНК по п. 1, отличающаяся тем, что по меньшей мере два неканонических нуклеотида содержат менее чем 20% синтетической молекулы РНК каждый.
7. Синтетическая молекула РНК по п. 1, отличающаяся тем, что неканонические нуклеотиды содержат:
а. по меньшей мере одно из следующих соединений: псевдоуридин, 2-тиоуридин, 4-тиоуридин, 5-азауридин, 5-гидроксиуридин, 5-аминоуридин, 5-метилуридин, 2-тиопсевдоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 5-гидроксипсевдоуридин, 5-метилпсевдоуридин и 5-аминопсевдоуридин, и
б. по меньшей мере одно из следующих соединений: псевдоизоцитидин, 5-метилцитидин, N4-метилцитидин, 2-тиоцитидин, 5-азацитидин, 5-гидроксицитидин, 5-аминоцитидин, N4-метилпсевдоизоцитидин, 2-тиопсевдоизоцитидин, 5-гидроксипсевдоизоцитадин, 5-аминопсевдоизоцитидин и 5-метилпсевдоизоцитидин.
8. Синтетическая молекула РНК по п. 7, отличающаяся тем, что неканонические нуклеотиды дополнительно содержат по меньшей мере одно из следующих соединений: N6-метиладенозин, 7-деазааденозин, 6-тиогуанозин, 7-деазагуанозин, 8-азагуанозин, 6-тио-7-деазагуанозин, 6-тио-8-азагуанозин, 7-деаза-8-азагуанозин и 6-тио-7-деаза-8-азагуанозин.
9. Синтетическая молекула РНК, которая
а. содержит неканонический нуклеотид, и
б. кодирует генно-редактирующий белок.
10. Терапевтический состав, содержащий синтетическую молекулу РНК по любому из пп. 1-9.
11. Терапевтический состав, содержащий синтетическую молекулу РНК, которая кодирует генно-редактирующий белок, и трансфекционный реагент.
12. Способ трансфекции клетки нуклеиновой кислотой, включающий приведение клетки в контакт с синтетической молекулой РНК по любому из пп. 1-9.
13. Способ индукции экспрессии клеткой млекопитающего представляющего интерес белка, включающий приведение клетки в контакт с синтетической молекулой РНК по любому из пп. 1-9.
14. Способ перепрограммирования клетки, включающий приведение клетки в контакт с синтетической молекулой РНК по любому из пп. 1-9.
15. Способ генного редактирования клетки, включающий приведение клетки в контакт с синтетической молекулой РНК по любому из пп. 1-9.
16. Способ трансфекции клетки нуклеиновой кислотой, включающий:
а. приведение клетки в контакт со средой, содержащей гидрокортизон и/или альбумин, причем альбумин обработан ионообменной смолой или древесным углем, и
б. приведение клетки в контакт с нуклеиновой кислотой.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что альбумин обработан короткоцепочечной жирной кислотой.
18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что альбумин нагрет до температуры, составляющей по меньшей мере 40°C.
19. Способ по п. 16, дополнительно включающий приведение клетки в контакт с трансфекционным реагентом.
20. Способ по п. 16, отличающийся тем, что клетка является клеткой млекопитающего, а в клетке млекопитающего индуцируют экспрессию представляющего интерес белка.
21. Способ по п. 16, дополнительно включающий повторение этапа (б) по меньшей мере дважды в течении 5 последовательных дней.
22. Способ по п. 16, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота кодирует перепрограммирующий белок.
23. Способ по п. 16, отличающийся тем, что клетку перепрограммируют.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что клетка является клеткой кожи, и дополнительно включающий культивирование клетки кожи в условиях, которые способствуют росту по меньшей мере одного из следующих видов клеток: клеток кожи, полипотентных стволовых клеток, глюкозозависимых инсулин-продуцирующих клеток, гемопоэтических клеток, сердечных клеток и ретинальных клеток, при этом клетку кожи перепрограммируют в клетку, выбранную из: клетки кожи, полипотентной стволовой клетки, глюкозозависимой инсулин-продуцирующей клетки, гемопоэтической клетки, сердечной клетки и ретинальной клетки.
25. Способ по п. 16, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота кодирует белок Oct4.
26. Способ по п. 25, дополнительно включающий приведение клетки в контакт с нуклеиновой кислотой, которая кодирует по меньшей мере один из белков: белок Sox2, белок Klf4 и белок с-Мус.
27. Способ по п. 25, дополнительно включающий приведение клетки в контакт с одной или более нуклеиновыми кислотами, которые кодируют белок Sox2, белок Klf4 и белок c-Мус.
28. Способ по п. 16, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота кодирует генно-редактирующий белок.
29. Способ по п. 16, отличающийся тем, что клетка является генетически отредактированной.
30. Способ по п. 16, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота кодирует белок, который, действуя отдельно или в комбинации с одной или более другими молекулами, создает одноцепочечный или двухцепочечный разрыв в молекуле ДНК.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что одноцепочечный или двухцепочечный разрыв составляет около 5,000,000 оснований сайта инициации транскрипции гена, выбранного из: CCR5, CXCR4, GAD1, GAD2, CFTR, HBA1, HBA2, НВВ, HBD, FANCA, XPA, XPB, ХРС, ERCC2, POLH, HTT, DMD, SOD1, АРОЕ, APP, LRRK2, PRNP, BRCA1 и BRCA2, или его аналога, варианта или представителя семейства.
32. Способ по п. 16, дополнительно включающий приведение клетки в контакт с по меньшей мере одним соединением из: поли-L-лизина, поли-L-орнитина, RGD-пептида, фибронектина, витронектина, коллагена и ламинина, или его биологически активным фрагментом, функциональным вариантом или представителем семейства.
33. Способ по п. 16, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота является синтетической молекулой РНК.
34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что синтетическая молекула РНК содержит по меньшей мере одно соединение из: псевдоуридина, 5-метилпсевдоуридина и 5-метилцитидина.
35. Способ по п. 16, дополнительно включающий приведение клетки в контакт с фактором дифференцировки.
36. Способ по п. 16, дополнительно включающий получение клетки от пациента.
37. Способ по п. 16, дополнительно включающий доставку клетки пациенту.
38. Среда, содержащая альбумин, при этом альбумин является:
а. рекомбинантным, и
б. обработанным ионообменной смолой или древесным углем.
39. Среда по п. 38, дополнительно содержащая буферный солевой раствор и аминокислоты.
40. Среда по п. 38, дополнительно содержащая один или более компонент из инсулина, трансферрина и селена.
41. Среда по п. 38, дополнительно содержащая холестерин.
42. Среда по п. 38, дополнительно содержащая стероид.
43. Среда по п. 41, отличающаяся тем, что стероид является гидрокортизоном.
44. Среда по п. 38, дополнительно содержащая иммунодепрессант.
45. Среда по п. 38, отличающаяся тем, что иммунодепрессант является B18R.
46. Набор инструментов, содержащий:
а. гидрокортизон и/или альбумин, причем альбумин обработан ионообменной смолой или древесным углем, и
б. синтетическую молекулу РНК.
47. Набор инструментов по п. 46, отличающийся тем, что синтетическая молекула РНК кодирует по меньшей мере один из белок: белок Oct4, белок Sox2, белок Klf4, белок c-Мус, белок Nanog, белок Lin28 и белок Utf1.
48. Набор инструментов по п. 46, дополнительно содержащий трансфекционный реагент.
49. Набор инструментов, содержащий синтетическую молекулу РНК по любому из п. 1-9.
50. Набор инструментов по п. 49, отличающийся тем, что набор инструментов является набором инструментов для перепрограммирования.
51. Набор инструментов по п. 49, отличающийся тем, что набор инструментов является набором инструментов для генного редактирования.
52. Комплекс из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента, содержащий нуклеиновую кислоту и трансфекционный реагент, при этом комплекс из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента отвержден путем охлаждения.
53. Комплекс из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента по п. 52, отличающийся тем, что указанный комплекс отвержден путем приведения в контакт комплекса из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента с жидким азотом в жидком и/или парообразном состоянии.
54. Способ трансфекции клетки, включающий приведение клетки в контакт с комплексом из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента по п. 52.
55. Устройство для трансфекции клеток, содержащее приспособления для приведения клеток в контакт с трансфекционной средой и приспособления для приведения клеток в контакт с комплексами из нуклеиновой кислоты и трансфекционного реагента.
56. Устройство по п. 54, отличающееся тем, что атмосфера, окружающая клетки, содержит около 5% углекислого газа.
57. Устройство по п. 54, отличающееся тем, что атмосфера, окружающая клетки, содержит около 5% кислорода.
58. Клетка, полученная способом по любому из пп. 12-37 или 54.
59. Организм, полученный способом по любому из пп. 12-37 или 54.
60. Терапевтический состав, содержащий клетку, полученную способом по любому из пп. 12-37 или 54.
61. Терапевтический состав, приготовленный согласно способу по любому из пп. 12-37 или 54.