АНТИПСИХОТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
ANTIPSYCHOTIC AGENT AND METHOD FOR PREPARING IT

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и касается антипсихотического средства, представляющего собой глицин, иммобилизованный на частицах детонационного наноалмаза.
Ведущее место в лечении шизофрении занимают антипсихотические средства (нейролептики), которые используются в медицине для лечения психотических расстройств более 40 лет [1]. Их разделяют на типичные и атипичные. В свою очередь типичные нейролептики разделяются на слабые (хлорпромазин, тизерцин, сонапакс, хлорпротексен, терален и др.) и сильные (галоперидол, трифлуоперазин, мажептил, модитен и др.). Они эффективны в лечении позитивных острых симптомов шизофрении (галлюцинации, бредовые идеи, расстройства мышления, потерянные ассоциации, амбивалентность или эмоциональная лабильность), но они имеют много побочных неврологических эффектов, в том числе экстрапирамидных проявлений, и слабо влияют на такие симптомы, как сниженная мотивация, отсутствие эмоционального самовыражения, когнитивные нарушения. Атипичные нейролептики (клозапин, рисперидон, оланзапин, кветиапин, лепонекс, зипразидон, фторпентиксол, зипрасидон, арипипразол и др.) обладают отчетливым антипсихотическим действием и существенно реже, чем типичные мощные нейролептики, вызывают экстрапирамидные эффекты в ранние и средние сроки лечения. Атипичные нейролептики, в отличие от типичных, воздействуют не только на продуктивные, но и, особенно эффективно, на негативные симптомы шизофрении (эмоциональную уплощенность, апатию, социальную отгороженность, нарушение логичности мышления, ухудшение когнитивных функций и др.). Атипичные антипсихотики в настоящее время являются препаратами первого выбора при лечении шизофрении. Однако, несмотря на эффективность и более легкую переносимость, атипичные нейролептики вызывают существенные побочные эффекты. Так, клозапин, вызывает уменьшение количества белых клеток крови, поэтому при лечении этим препаратом необходим мониторинг крови каждую неделю в течение первых 6 месяцев лечения. Атипичные нейролептики часто вызывают увеличение веса и способствуют развитию заболеваний, связанных с ожирением [2], а также вызывают гиперпролактинемию, галакторею, опухоли гипофиза [3] и миокардит [4]. Как отрицательная реакция как на типичные, так и на атипичные антипсихотики у больных иногда возникает злокачественный нейролептический синдром - тяжелое и смертельное неврологическое расстройство [5]. Терапевтический эффект типичных нейролептиков связан преимущественно с их способностью блокировать постсинаптические дофаминовые рецепторы в головном мозге, а новые атипичные антипсихотики воздействуют одновременно на целый ряд нейромедиаторных рецепторов: дофаминовые, серотониновые, гистаминовые и др. [6]. Глутаматергическая гипотеза патофизиологии шизофрении постулирует, что в основе шизофрении лежит гипофункция глутаматергической нейропередачи через N-метил-D-аспартатных (NMDA) - рецепторы, связанные с лигандзависимыми ионными каналами [7-9].
В контексте глутаматергической гипотезы, полагающей, что гипофункция NMDA рецепторов играет критическую роль в патофизиологии шизофрении, разрабатываются новые средства лечения этого заболевания. Среди глутаматных рецепторов привлекательной мишенью при поиске новых средств лечения шизофрении и других психических заболеваний являются метаботропные рецепторы (мГлу-р) [10]. В качестве потенциальных антипсихотических средств рассматриваются агонисты мГлу-р II группы, а именно агонисты мГлу2/мГлу3р и потенциаторы мГлу2р. LY-2140023 (Eli Lilly&Co) является пролекарством для LY-404039, который является избирательным агонистом ортостерического метаботропного NMDA глутаматного мГлу2/мГлу3 рецептора. Рандомизированные плацебо-контролированные клинические исследования (II фаза) подтвердили антипсихотическое действие LY-2140023 у больных шизофренией. При этом LY-2140023 не оказывал экстрапирамидных и метаболических побочных эффектов, свойственных большинству применяемых антипсихотических средств [11, 12].
В качестве средств лечения шизофрении рассматриваются позитивные аллостерические модуляторы метаботропных NMDA - глутаматных рецепторов 5 подтипа (мГлу5-р), которые тесно связаны с сигнальными путями [13].
В настоящее время непрямые подходы к активации NMDA-рецептора, включающие увеличение внеклеточного глицина и глутамата и воздействие на глициновые сайты NMDA рецептора, рассматриваются как перспективные подходы к поиску средств лечения шизофрении [14]. Увеличение синаптического уровня глицина путем ингибирования его захвата приводит к усиленной активации NMDA-рецептора, что предполагает возможность использования ингибиторов глициновых транспортеров типа 1 (ГлиТ-1) как средств лечения шизофрении [15-16].
Показано, что использование прямых агонистов глутаматного сайта может привести к избыточному возбуждению и нейротоксичности, тогда как хроническое введение грызунам глицина не вызывает глутаматной эксайтотоксичности [17, 18].
Кроме глицина, эндогенным агонистом глицинового сайта на NMDA-рецепторе является D-серин [19], а также D-аланин и D-циклосерин (антитуберкулезное средство), которые связываются с модуляторным глициновым сайтом и действуют как частичные агонисты [20]. Уровни общего показателя серин (L- и D- серин)+глицин в плазме и в мозгах у больных шизофренией выше, чем у здоровых контрольных волонтеров, что предполагает анормальность серин гидроксиметилтрансферазы, посредством которой глицин превращается в L-серин [21].
В клинических исследованиях показано, что при комбинации глицина и D-серина с типичными или атипичными антипсихотиками наблюдается существенный лечебный эффект у больных шизофренией, выражающийся в ослаблении негативных симптомов и когнитивных нарушений [22, 23].
В целом, агонисты глицинового аллостерического сайта глутаматного NMDA-рецептора являются перспективными веществами в лечении негативных симптомов и когнитивных нарушений при шизофрении. Потенциальным ограничением глицинового модуляторного участка как мишени является то, что глициновый участок полунасыщается при физиологических условиях, а воздействующие на него вещества теоретически способны только удвоить NMDA нейропередачу. Кроме того, и глицин, и D-серин, чтобы значительно изменить уровень нейропередачи, нужно использовать в дозах на уровне грамма, и попытки модифицировать глицин или D-серин с целью создания синтетических агонистов глицинового сайта до настоящего времени остаются неудачными.
2
2
Известно, что заменимая аминокислота глицин (NHCHCOOH), являясь центральным нейромедиатором тормозного типа действия, проявляет седативное действие и улучшает метаболические процессы в тканях мозга [24]. В современной терапевтической практике глицин применяют как средство, ослабляющее влечение к алкоголю, уменьшающее явления абстиненции, депрессивные нарушения, повышенную раздражительность, нормализующее сон, а также в комплексном лечении нарушений мозгового кровообращения [24]. В основе фармакологического действия глицина лежит эффект амплификации метаболических и нейротрансмиттерных процессов, возникающих за счет усиления его эндогенного синтеза. Увеличить внутриклеточный синтез глицина можно, только используя пути передачи сигнала, обусловленные взаимодействием с рецепторными системами. Его взаимодействие с глициновыми рецепторами приводит к открытию хлорных каналов, гиперполяризации мембраны и распространению торможения. Наряду с этим, глицин способен выступать в роли аллостерического коагониста глутаматных рецепторов. Связываясь в специфическом сайте, он усиливает способность глутамата и N-метил-D-аспарата (NMDA) открывать катионный канал [25, 26].
Применяемый фармакопейный глицин назначают в виде сублингвальных таблеток (по 0,1 г) под язык 3-4 раза в день в качестве мягкого транквилизирующего (противотревожного) средства при различных стрессорных ситуациях и психоэмоциональном напряжении [24].
2
2
2
3
Известен глицин, иммобилизованный на частицах детонационного наноалмаза с размером 2-10 нм, применяемый в качестве связующего компонента в полимерных композитах [27, 28]. Способ его получения заключается в следующем [28]. Навеску наноалмаза помещают в реактор в постоянном токе гелия и отжигают при температуре 150-470°C в течение 3-4 ч. Далее проводят фторирование образцов наноалмаза при температуре 50-500°C в течение 1-24 ч контактированием со смесью газообразных фтора и водорода. Для получения глицина, иммобилизованного на частицах наноалмаза, фторированный наноалмаз обрабатывают ультразвуком в о-дихлорбензоле в течение 20-30 мин, добавляют гидрохлорид этилового эфира глицина (NHCHCOOCHCHHCl) и несколько капель пиридина. Полученную смесь перемешивают при температуре 130-140°C в течение 8-12 ч. Образовавшийся продукт фильтруют, промывают этанолом и сушат под вакуумом при 70°C.
Дополнительной характеристикой этого вещества является размер его частиц в суспензии, равный, по данным динамического рассеяния света (ДРС), 310 нм [28].
св
60
Особенностью данного вещества является наличие на поверхности частиц наноалмаза помимо молекул глицина также атомов фтора. Хотя их количество авторами декларируется менее 1% ат, в действительности экспериментально установлено, что концентрация фтора на поверхности наноалмаза может достигать 14% ат и более. Это обусловлено тем, что связь C-F (Е=115 ккал/г-атом) является прочной и фторпроизводные углерода инертны по отношению ко многим веществам. Поэтому при химической иммобилизации глицина на поверхность наноалмаза, содержащего атомы фтора, молекулы глицина замещаются на атомы фтора лишь частично. При этом известно, что присутствие в органическом веществе фтора и его производных повышает его токсичность и может изменять показатели микросомальной системы биотрансформации ксенобиотиков в печени [29]. Так, наличие атомов фтора в ближайшем наноструктурном аналоге наноалмаза - фуллерене (С) - повышает его общую токсичность в 2,4-5 раз [30]. Кроме того, фтор и его соединения способны накапливаться в различных объектах окружающей среды и присутствовать в них в различных количествах [31]. Поэтому глицин, иммобилизованный на частицах наноалмаза, которые содержат атомы фтора, нежелательно использовать в медицинской практике в качестве лекарственного средства.
Получение глицина, иммобилизованного на частицах детонационного наноалмаза, не содержащих атомов фтора, с повышенной дисперсностью в суспензии, применяемого в качестве лекарственного средства, а также снижение уровня экологической и эндоэкологической опасности, упрощение и удешевление способа его получения, представляют собой актуальную и практически значимую задачу.
Целью изобретения является антипсихотическое средство для профилактики и лечения шизофрении и психопатоподобных состояний без проявления каких-либо побочных эффектов и токсических проявлений и способ его получения, а также расширение номенклатуры антипсихотических средств.
Использование глицина, иммобилизованного на частицах детонационного наноалмаза, как антипсихотического средства в научной и патентной литературе не описано.
Поставленная цель решается с помощью описываемого в соответствии с изобретением антипсихотического средства, представляющего собой глицин, иммобилизованный на частицах детонационного наноалмаза размером 2-10 нм, не содержащих атомов фтора и имеющих оболочку толщиной до 1 нм, с содержанием глицина до 21±3% масс., и способа его получения.
Описываемое антипсихотическое средство в виде глицина, иммобилизованного на частицах детонационного наноалмаза, не содержащих на своей поверхности атомов фтора, представляет собой ультрадисперсный порошок (Фиг.1) темно-серого цвета или темно-серого цвета с зеленоватым или темно-синим оттенками с размером частиц от 2 до 10 нм, имеющих оболочку толщиной до 1 нм (Фиг.2), размером агрегатов в водной суспензии до 100 нм (Фиг.3) и содержанием глицина до 21±3% масс., входящего в состав поверхностной оболочки.
На Фиг.1 отчетливо видно наличие у описываемого антипсихотического средства ультрадисперсной структуры из частиц с размером, меньшим разрешающей способности использованного прибора (от 20 нм).
Микрофотография частиц описываемого антипсихотического средства получена на автоэмиссионном сканирующем электронном микроскопе сверхвысокого разрешения Zeiss Ultra Plus (Carl Zeiss, Германия).
На Фиг.2 видно, что размер частиц описываемого антипсихотического средства, покрытых оболочкой толщиной до 1 нм, равен 2-10 нм.
Микрофотография частиц описываемого антипсихотического средства получена на просвечивающем электронном микроскопе Jeol 1011 (JEOL, Япония).
На Фиг.3. приведена кривая распределения размеров частиц в суспензии описываемого антипсихотического средства, из которой следует, что размеры частиц в суспензии не превышают 100 нм.
Измерение распределения размера частиц описываемого антипсихотического средства в суспензии проводили методом ДРС на приборе ZetaSizer (Malvern Instruments, США). По оси абсцисс отложена логарифмическая шкала размера частиц в нм. По оси ординат - процентное содержание частиц с определенными размерами.
Элементный состав поверхности частиц описываемого антипсихотического средства по данным рентгенофотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) приведен в табл.1.
Таблица 1
Элементный состав и энергии связи поверхностных атомов описываемого антипсихотического средства
Наименование характеристики
Химические элементы
С
О
N
Атомные %,
77,5-94,5
4-14
1,5-8,5
Энергии связи, эВ
285,2±0,5
530,7±0,5
399,8±0,5
-8
Исследование поверхности описываемого антипсихотического средства проводили на приборе LAS-3000 (Riber, Франция), оснащенном полусферическим анализатором ОРХ-150. Для возбуждения фотоэлектронов использовали немонохроматизированное рентгеновское излучение алюминиевого анода (AlKα=1486,6 эВ) при напряжении на трубке 12 кВ и токе эмиссии 20 мА. Калибровку фотоэлектронных пиков проводили по линии углерода С Is с энергией связи 285 эВ. Вакуум в рабочей камере составлял 6,7·10 Па. Для получения высокого вакуума был использован ионный насос.
Количество глицина в описываемом антипсихотическом средстве определяют следующим образом. Готовят смеси наноалмаза с разным содержанием глицина. Берут навески каждой смеси равной массы. Регистрируют их ИК-спектры, выбирают на них наиболее интенсивные характеристические сигналы, которые соотносят с полосами ИК-спектра исходного глицина. Затем строят калибровочные кривые зависимости интенсивности сигнала в ИК-спектре от содержания глицина в навеске. Далее по интенсивности выбранных характеристических полос исследуемого антипсихотического средства по калибровочным кривым определяют количественное содержание в нем глицина. По полученным данным определяют среднее значение величины содержания глицина в описываемом антипсихотическом средстве.
Описываемый способ получения антипсихотического средства заключается в следующем. Детонационный наноалмаз отжигают в токе газообразного водорода при температуре 500-1200°C в течение 1-8 ч, затем подвергают жидкофазному хлорированию молекулярным хлором при фотохимическом воздействии видимым светом при температуре 50-70°C в течение 36-60 ч с последующей промывкой четыреххлористым углеродом, центрифугированием и сушкой под вакуумом. Модифицированный хлором наноалмаз растворяют в полярном растворителе с образованием суспензии. Добавляют третичный амин и глицин и обрабатывают полученную смесь ультразвуком в течение 5-60 мин с последующим выдерживанием при 50-80°C в течение 12-48 ч, центрифугированием, промывкой растворителем и сушкой. Обработку ультразвуком ведут в течение 5-60 мин, в качестве третичного амина используют триэтиламин и в качестве полярного растворителя применяют пиридин, низший алифатический спирт, водно-спиртовую смесь или воду.
Описываемое антипсихотическое средство не содержит атомов фтора (табл.1), а также атомов других галогенов в количестве, превышающем ошибку прибора (0,1% ат), так как в процессе получения антипсихотического средства все атомы хлора заменяются на молекулы глицина и уходят с поверхности наноалмаза в виде молекул HCl.
В процессе фармакологических исследований была проведена работа по изучению специфического антипсихотического действия описываемого лекарственного средства и его безвредности в сравнении с фармакопейным глицином.
Оценку антипсихотического эффекта проводили согласно Методическим указаниям по изучению активности веществ, обладающих нейропсихотропной активностью, изложенных в [32].
Исследование антипсихотической активности проводили с использованием теста апоморфиновой вертикализации (феномена клаймбинга), вызванной введением апоморфина мышам. Тест апоморфиновой вертикализации у мышей имеет большое прогностическое значение для выявления собственно антипсихотического действия веществ и в этом тесте оказывают эффект как типичные, так и атипичные нейролептики.
Исследование выполнено на белых беспородных половозрелых мышах самцах массой 23-28 г.
Статистическая обработка результатов была проведена с помощью программного обеспечения BioStat для Windows. Рассчитывали средние показатели по группе и стандартные ошибки показателей.
Установлено, что контрольные животные после введения апоморфина показывают 76,05 балла вертикализации за час (количество лап животного на прутьях) (табл.3). Фармакопейный глицин в дозе 1 мг/кг не оказывал статистически достоверного влияния на феномен вертикализации (табл.3). Описываемое антипсихотическое средство в диапазоне доз от 0,5 до 5 мг/кг статистически достоверно уменьшало число баллов апоморфиновой вертикализации за час по сравнению с контролем. Максимальный эффект антипсихотическое средство показало в дозе 3 мг/кг (табл.3).
Таким образом, описываемое антипсихотическое средство обладает нейролептической активностью в тесте апоморфиновой вертикализации (апоморфинового клаймбинга), что выражается в статистически достоверном уменьшении баллов вертикализации по сравнению с контролем (введение апоморфина). Фармакопейный глицин не обладает нейролептической активностью в тесте апоморфинового клаймбинга.
Исследование острой токсичности описываемого антипсихотического средства было проведено согласно Методическим указаниям по изучению острой токсичности, изложенным в [33].
При проведении эксперимента регистрировались следующие показатели: характер шерстяного покрова, изменение состояния слизистых оболочек, птоз верхнего века, повышенная уринация, повышенная дефекация, повышенная саливация, пилоэрекция, вокализация, боковое положение, ритм и глубина дыхательных движений, агрессивность, пугливость, тремор, судороги, изменение порогов болевой реакции, изменение позы, каталепсия, нарушение координации движений в тесте вращающегося стержня, удерживание в течение 5 секунд на перевернутой сетчатой платформе, перелезание с перевернутой сетчатой платформы наверх, наличие пинеального, роговичного рефлексов, седации, стереотипии и груминга, гибель животного.
Статистическая обработка результатов была осуществлена с помощью статистических пакетов "BioStat" для Windows. Рассчитывали средние показатели по группе и стандартные ошибки показателей.
Полученные результаты убедительно показывают, что описываемое антипсихотическое средство при внутрибрюшинном введении мышам в дозах 75, 150 и 225 мг/кг, также как и фармакопейный глицин не вызывало признаков интоксикации и гибели животных на протяжении 14 сут наблюдения.
В результате проведенного фармакологического исследования установлено наличие у описываемого антипсихотического средства выраженного специфического антипсихотического эффекта, превосходящего антипсихотическое действие фармакопейного глицина, и отсутствие побочных эффектов и токсического действия.
Описываемое антипсихотическое средство не только позволяет повысить терапевтическую эффективность фармакопейного препарата глицина, но и расширить ассортимент эффективных и безопасных антипсихотических средств.
Краткое описание графических материалов
Фиг.1 - электронная микрофотография описываемого антипсихотического средства, полученная на сканирующем электронном микроскопе.
Фиг.2 - электронная микрофотография описываемого антипсихотического средства, полученная на просвечивающем электронном микроскопе.
Фиг.3 - распределение размеров частиц описываемого антипсихотического средства в водной суспензии по данным метода ДРС.
Фиг.4 - ИК-спектры смесей наноалмаза с глицином, используемых для построения калибровочных кривых. I, II, III - спектры смесей с содержанием глицина 1:1,75:2,5 соответственно. В рамках выделены характеристические пики.
-1
Фиг.5 - калибровочные кривые для каждой характеристической полосы ИК-спектра смеси наноалмаза с глицином, а, б, в - калибровочные кривые для полос 1407, 1332 и 504 см соответственно.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
4
2
4
2
2
300 мг исходного детонационного наноалмаза отжигают в токе газообразного водорода со скоростью 3,0 л/ч при температуре 1000°C в течение 6 ч. Затем отожженный наноалмаз подвергают жидкофазному хлорированию молекулярным хлором, растворенным в 40 мл CCl до 6% масс. Cl. Реакцию хлорирования проводят при фотохимическом воздействии видимым светом в течение 60 ч при температуре 60°C. Затем образец промывают CCl с центрифугированием суспензии при 6000 об/мин и высушивают под давлением 0,1 мм рт.ст. до постоянного веса. Затем из хлорированного наноалмаза получают суспензию, используя 40 мл водно-спиртовой смеси (вода:метанол=1:1), в которую вносят 300 мг глицина в виде свободной аминокислоты (NHCHCOOH) с добавлением 1 мл триэтиламина. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком (50 Вт) в течение 60 мин и выдерживают при постоянном перемешивании при температуре 65°C в течение 30 ч. Полученный продукт промывают большим количеством этанола, центрифугируют и высушивают под вакуумом при 70°C в течение всей ночи. Остаточная влажность продукта составляет 2,2%. Выход целевого продукта составляет 279 мг (93%). Продукт представляет собой темно-серый с синеватым оттенком ультрадисперсный порошок (Фиг.1) с размерами первичных частиц 2-10 нм (Фиг.2), имеющих оболочку поверхностного слоя до 1 нм. В суспензии размер частиц порошка не превышает 100 нм (Фиг.3). Элементный состав поверхности частиц полученного продукта приведен в табл.2.
Таблица 2
Данные РФЭС полученного продукта
Наименование характеристики
Химические элементы
С
O
N
Атомные %,
80,1±0,1
11,5±0,1
8,4±0,1
Энергии связи, эВ
285,2±0,5
530,7±0,5
399,6±0,5
-1
-5
Для определения массовой доли глицина в полученном продукте готовят три смеси наноалмаза с глицином с содержанием последнего 1:1,75:3,5 соответственно. Для каждой смеси берут навеску массой 0,0035 г и тщательно перетирают в ступке с 0,090 г KBr. 0,070 г полученной смеси прессуют в таблетку и снимают ее ИК-спектр (Фиг.4). Характеристические полосы выбирают при 1407, 1332 и 504 см соответственно и строят для них калибровочные графики (Фиг.5). Интенсивность соответствующих характеристических полос на ИК-спектре полученного образца массой 0,0035 г составила 0,23, 0,22 и 0,10 о.е. соответственно. Из калибровочных кривых а, б, в на Фиг.5 определяют величину содержания глицина в полученном образце, которая составляет 0,00057±8·10 г. Следовательно, массовая доля глицина в навеске образца составляет 21±3% масс.
Пример 2
Исследование специфической антипсихотической активности описываемого средства
Исследование выполнено на белых беспородных половозрелых мышах-самцах массой 23-28 г. Животных в количестве 60 голов разделили на 6 групп по 10 мышей в каждой.
Животных получали из Центрального питомника лабораторных животных «Столбовая», Московская область. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96), нормативному документу «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию вивариев», утвержденных Главным Государственным санитарным врачом 06.04.1973 г. №1045-73, и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997 г.). Животные содержались в виварии при температурном режиме 20-22°C, при световом цикле - 12 часов светлый и 12 часов темный периоды, в пластмассовых клетках Т/4А размером 580×375×200 мм с верхней крышкой из нержавеющей стали и подстилкой обеспыленной из деревянной стружки. Животные содержались при постоянном доступе к корму и воде с использованием полного рациона экструдированного брикетированного корма (ГОСТ на корм Р 50258-92) и питьевой воды. При проведении экспериментов учитывались требования Комиссии по проблеме этики отношения к животным Российского национального Комитета по биоэтике при Российской академии наук и этические нормы, изложенные в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985 г.). Опыты проводили в первую половину дня.
Изучение специфической антипсихотической активности продукта, полученного в примере 1, проводили с использованием теста апоморфиновой вертикализации (феномена клаймбинга), вызванной введением апоморфина мышам.
В тесте апоморфиновой вертикализации животных помещали в цилиндрические стандартные камеры с плексиглазовым дном, высотой 14 и диаметром 12 см, изготовленные из проволочного прутка толщиной 2 мм и расстоянием между прутьями 1 см. Апоморфин вводили в дозе 5 мг/кг подкожно. Исследуемые вещества вводили однократно внутрибрюшинно за 10 мин до введения апоморфина. Через 10 мин после введения апоморфина начинали регистрацию стереотипного поведения, проявляющегося в вертикализации. Регистрацию вертикализации проводили многократно каждые 2 мин на протяжении 1 ч. Фиксировали суммарное число баллов, которое соответствовало количеству лап животного на прутьях - феномен вертикализации (клаймбинг). Сначала подсчитывали среднее значение у каждого животного за 2 мин и за 1 ч, а затем вычисляли средний показатель по группе.
Найдено, что контрольные животные после введения апоморфина показывают в среднем 76,05 балла вертикализации за 1 ч (количество лап животного на прутьях) (табл.3). Описываемое антипсихотическое средство в диапазоне доз от 0,5 до 5 мг/кг статистически достоверно уменьшало число баллов апоморфиновой вертикализации за час по сравнению с контролем и показало максимальный эффект в дозе 3 мг/кг (табл.3). При этом фармакопейный глицин в дозе 1 мг/кг не оказывал статистически достоверного влияния на феномен вертикализации (табл.3).
Таблица 3
Изучение нейролептической активности описываемого антипсихотического средства в тесте апоморфиновой вертикализации
Вещества
Доза средства, мг/кг
Число баллов вертикализации за 1 ч
Контроль, Апоморфин
-
76,05±2,16
Антипсихотическое средство+апоморфин
0,5
61,0±5,11*
Антипсихотическое средство+апоморфин
1
67,6±5,74*
Антипсихотическое средство+апоморфин
3
50,3±6,1*
Антипсихотическое средство+апоморфин
5
66,5±2,4*
Фармакопейный глицин+Апоморфин
1
71,2±6,92
* - р<0,05 достоверность отличий по критерию Манна-Уитни по сравнению с группой, получавшей апоморфин.
Таким образом, антипсихотическое средство обладает нейролептической активностью в тесте апоморфиновой вертикализации (апоморфинового клаймбинга), что выражается в статистически достоверном уменьшении баллов вертикализации по сравнению с контролем (введение апоморфина). Фармакопейный глицин не обладает нейролептической активностью в тесте апоморфинового клаймбинга.
Пример 3
Изучение побочных эффектов и токсического действия описываемого антипсихотического средства
Исследование проводили на белых беспородных половозрелых мышах-самцах массой 20-24 г возрастом 2-3 месяца. Экспериментальные животные содержались аналогично примеру 2. Всего использовалось 42 животных - 7 групп по 6 мышей.
Регистрацию изменения поведения, рефлексов, возможных побочных эффектов, признаков интоксикации и гибели животных проводили через 1, 4, 24 ч, 4, 10 и 14 сут после внутрибрюшинного введения описываемого антипсихотического средства в сравнении с фармакопейной субстанцией глицина в тех же дозах.
В результате исследования было установлено, что описываемое антипсихотическое средство при внутрибрюшинном введении мышам в дозах 75, 150 и 225 мг/кг не вызывало признаков интоксикации и гибели животных на протяжении 14 сут (табл.4-6). При этом описываемое антипсихотическое средство также не вызывало у мышей изменения шерстяного покрова, состояния слизистых оболочек. Также отсутствовали птоз верхнего века, повышенная уринация, дефекация, саливация, пилоэрекция, вокализация, боковое положение. В пределах нормы были ритм и глубина дыхательных движений, отсутствовали агрессивность, пугливость, тремор, судороги, каталепсия, стереотипия и груминг. Не наблюдалось изменения позы. У животных были сохранены пинеальный, роговичный и болевой рефлексы. На протяжении всех 14 сут наблюдения животные удерживались на перевернутой сетчатой платформе в течение 5 с (табл.4-6).
Таблица 4
Изучение возможных побочных эффектов и гибели мышей через 1 час после введения фармакопейного глицина и описываемого антипсихотического средства (показатель изменения в группе в %)
Группы
Показатели
Контроль
Антипсихотическое средство/доза, мг/кг
Фармакопейный глицин/доза, мг/кг
75
150
225
75
150
225
Изменение характера шерстяного покрова
0
0
0
0
0
0
0
Изменение состояния слизистых оболочек
0
0
0
0
0
0
0
Птоз верхнего века
0
0
0
0
0
0
0
Повышенная уринация
0
0
0
0
0
0
0
Повышенная дефекация
0
0
0
0
0
0
0
Повышенная саливация
0
0
0
0
0
0
0
Наличие пилоэрекция
0
0
0
0
0
0
0
Наличие вокализации
0
0
0
0
0
0
0
Наличие бокового положения
0
0
0
0
0
0
0
Нарушение ритма и глубины дыхательных движений
0
0
0
0
0
0
0
Наличие агрессивности
0
0
0
0
0
0
0
Изменение реакции на постукивание по клетке
0
0
0
33,3*
0
0
33,3*
Повышенная пугливость
0
0
0
0
0
0
0
Наличие тремора
0
0
0
0
0
0
0
Наличие судорог
0
0
0
0
0
0
0
Изменение порогов болевой реакции
0
66,7*
100*
100*
0
100*
100*
Изменение позы, каталепсия
0
0
0
0
0
0
0
Нарушение координациидвижений в тесте вращающегося стержня
0
16,7
50*
50*
33,3*
33,3*
50*
Удерживание 5 с на перевернутой сетчатой платформе
100
100
100
100
100
100
100
Перелезание с перевернутой сетчатой платформы наверх
100
66,7*
66,7*
50*
66,7*
66,7*
66,7*
Наличие пинеального рефлекса
100
100
100
100
100
100
100
Наличие роговичного рефлекса
100
100
100
100
100
100
100
Наличие седации
0
66,7*
100*
100*
0
100*
100*
Наличие стереотипии
0
0
0
0
0
0
0
Группы
Показатели
Конт-
Антипсихотическое средство/доза, мг/кг
Фармакопейный глицин/доза, мг/кг
роль
75
150
225
75
150
225
Наличие груминга
0
0
0
0
0
0
0
Гибель животного
0
0
0
0
0
0
0
*- Р<0,05 - относительно контроля по критерию χ2
Таблица 5
Изучение возможных побочных эффектов и гибели мышей через 24 часа после введения фармакопейного глицина и описываемого антипсихотического средства (показатель изменения в группе в %)
Группы
Показатели
Конт-
Антипсихотическое средство/доза, мг/кг
Фармакопейный глицин/доза, мг/кг
роль
75
150
225
75
150
225
Изменение характера шерстяного покрова
0
0
0
0
0
0
0
Изменение состояния
0
0
0
0
0
0
0
слизистых оболочек
Птоз верхнего века
0
0
0
0
0
0
0
Повышенная уринация
0
0
0
0
0
0
0
Повышенная дефекация
0
0
0
0
0
0
0
Повышенная саливация
0
0
0
0
0
0
0
Наличие пилоэрекция
0
0
0
0
0
0
0
Наличие вокализации
0
0
0
0
0
0
0
Наличие бокового положения
0
0
0
0
0
0
0
Нарушение ритма и глубины дыхательных движений
0
0
0
0
0
0
0
Наличие агрессивности
0
0
0
0
0
0
0
Изменение реакции на
0
0
0
0
0
0
0
постукивание по клетке
Повышенная пугливость
0
0
0
0
0
0
0
Наличие тремора
0
0
0
0
0
0
0
Наличие судорог
0
0
0
0
0
0
0
Изменение порогов болевой реакции
0
0
0
0
0
0
0
Изменение позы, каталепсия
0
0
0
0
0
0
0
Нарушение координации
движений в тесте
0
0
0
0
33,3*
16,7
33,3*
вращающегося стержня
Удерживание 5 с на перевернутой сетчатой платформе
100
100
100
100
100
100
100
Перелезание с перевернутой сетчатой платформы наверх
100
100
100
100
100
100
100
Группы
Показатели
Контроль
Антипсихотическое средство/доза, мг/кг
Фармакопейный глицин/доза, мг/кг
75
150
225
75
150
225
Наличие пинеального рефлекса
100
100
100
100
100
100
66,6*
Наличие роговичного рефлекса
100
100
100
100
100
100
100
Наличие седации
0
0
0
0
0
0
0
Наличие стереотипии
0
0
0
0
0
0
0
Наличие груминга
0
0
0
0
0
0
0
Гибель животного
0
0
0
0
0
0
0
*- Р<0,05 - относительно контроля по критерию χ2
Таблица 6
Изучение возможных побочных эффектов и гибели мышей через 14 сут после введения фармакопейного глицина и описываемого антипсихотического средства (показатель изменения в группе в %)
Группы
Показатели
Контроль
Антипсихотическое средство/доза, мг/кг
Фармакопейный глицин/доза, мг/кг
75
150
225
75
150
225
Изменение характера шерстяного покрова
0
0
0
0
0
0
0
Изменение состояния слизистых оболочек
0
0
0
0
0
0
0
Птоз верхнего века
0
0
0
0
0
0
0
Повышенная уринация
0
0
0
0
0
0
0
Повышенная дефекация
0
0
0
0
0
0
0
Повышенная саливация
0
0
0
0
0
0
0
Наличие пилоэрекция
0
0
0
0
0
0
0
Наличие вокализации
0
0
0
0
0
0
0
Наличие бокового положения
0
0
0
0
0
0
0
Нарушение ритма и глубины дыхательных движений
0
0
0
0
0
0
0
Наличие агрессивности
0
0
0
0
0
0
0
Изменение реакции на постукивание по клетке
0
0
0
0
0
0
0
Повышенная пугливость
0
0
0
0
0
0
0
Наличие тремора
0
0
0
0
0
0
0
Наличие судорог
0
0
0
0
0
0
0
Изменение порогов болевой реакции
0
0
0
0
0
0
0
Изменение позы, каталепсия
0
0
0
0
0
0
0
Нарушение координации движений в тесте
0
0
0
0
0
0
0
Показатели
Группы
Контроль
Антипсихотическое средство/доза, мг/кг
Фармакопейный глицин/доза, мг/кг
75
150
225
75
150
225
вращающегося стержня
Удерживание 5 с на перевернутой сетчатой платформе
100
100
100
100
100
100
100
Перелезание с перевернутой сетчатой платформы наверх
100
100
100
100
100
100
66,7*
Наличие пинеального рефлекса
100
100
100
100
100
100
100
Наличие роговичного рефлекса
100
100
100
100
100
100
100
Наличие седации
0
0
0
0
0
0
0
Наличие стереотипии
0
0
0
0
0
0
0
Наличие груминга
0
0
0
0
0
0
0
Гибель животного
0
0
0
0
0
0
0
*- Р<0,05 - относительно контроля по критерию χ2
Список литературы
1. Б.Г.Катцунг. Базисная и клиническая фармакология: В 2 т. Т. 1. / Пер. с англ. - 2-е изд., перераб. и доп.-М.; СПб.: Изд-во Бином, Изд-во «Диалект», 2007. С.556-570.
2. J.A.Lieberman, T.S.Stroup, J.P.McEvoy et al. Effectiveness of antipsychotic drugs in patients with chronic schizophrenia // N. Engl. J. Med. 2005. V. 353 №12, P. 1209-1223.
3. R.A.Dickson, J.T.Dalby, R.Williams, A.L.Edwards. Risperidone-induced prolactin elevations in premenopausal women with schizophrenia// Am. J. Psychiatry. 1995. V. 152. №7. P. 1102-1103.
4. S.J.Haas, R.Hill, H.Krum. Clozapine-associated myocarditis: a review of 116 cases of suspected myocarditis associated with the use of clozapine in Australia during // Drug Safety. 2007. V. 30 P. 47-57.
5. J.Ananth, S.Parameswaran, S.Gunatilake et al. Neuroleptic malignant syndrome and atypical antipsychotic drugs // J. Clin. Psychiatry. 2004. V. 65. №4. P. 464-470.
6. H.M.Jones, L.S.Pilowsky. Dopamine and antipsychotic drug action revisited // Br. J. of Psychiatry. 2002 V. 181. P. 271-275.
7. J.W.Olney, N.B.Farber. Glutamate receptor dysfunction and schizophrenia // Arch. Gen. Psychiatry. 1995 V. 52. P. 998-1007.
8. J.T.Coyle. The glutamatergic dysfunction hypothesis for schizophrenia // Harv. Rev. Psychiatry. 1996. V. 3. P. 241-253.
9. G.Tsai, J.T.Coyle. Glutamatergic mechanisms in schizophrenia // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002 V. 42. P. 165-179.
10. S.Chaki, H.Hikichi. Targeting of metabotropic glutamate receptors for the treatment of schizophrenia // Curr. Pharm. Des. 2011. V. 17. №2. P. 94-102.
11. M.Mezler, H.Geneste, L.Gault, G.J. Marek. LY-2140023, a prodrug of the group II metabotropic glutamate receptor agonist LY-404039 for the potential treatment of schizophrenia // Curr. Opin. Investig. Drugs. 2010 V. 11. №7. P. 833-845
12. S.T.Patil, L.Zhang, F.Martenyi et al. Activation of mGlu2/3 receptors as a new approach to treat schizophrenia: a randomized Phase 2 clinical trial // Nature Medicine. 2007. V. 13. P. 1102-1107.
13. K.Kanuma, T.Aoki, Y.Shimazaki. Recent patents on positive allosteric modulators of the metabotropic glutamate 5 receptor as a potential treatment for schizophrenia // Recent Pat. CNS Drug Discov. 2010 V. 5. №1. P. 23-34.
14. K. Hashimoto. The NMDA receptor hypofunction hypothesis for schizophrenia and glycine modulatory sites on the NMDA receptors as potential therapeutic drugs // Clin. Psychopharmacol. Neurosci. 2006. V. 4. P. 3-10.
15. K.Hashimoto. Glycine Transport Inhibitors for the Treatment of Schizophrenia // Open Med. Chem. J. 2010. V. 4. P. 10-19.
16. G.G.Kinney, C.Sur. Glycine site modulators and glycine transporter-1 inhibitors as novel therapeutic targets for the treatment of schizophrenia. Curr. Neuropsychopharmacol. 2005. V. 3. P. 35-43.
17. S.Shoham. High dose glycine nutrition affects glial cell morphology in rat hippocampus and cerebellum // Int. J. Neuropsychopharmacol. 1999. V. 2. P. 35-40.
18. S.Shoham. Chronic high-dose glycine nutrition: effects on rat brain cell morphology // Biol Psychiatry. 2001. V. 49. P. 876-885.
19. J.P.Mothet et al. D-serine is an endogenous ligand for the glycine site of the N-methyl-D-aspartate receptor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 4926-4931.
20. W.F.Hood. D-cycloserine: a ligand for the N-methyl-D-aspartate coupled glycine receptor has partial agonist characteristics // Neurosci. Lett. 1989. V. 98. P. 91-95.
21. R.Waziri, S.Baraiah, A.D.Sherman. Abnormal serine-glycine metabolism in the brains of schizophrenics // Schizophrenia Res. 1992. V. 8. P. 233-243.
22. D.C.Javitt. Is the glycine site half saturated or half unsaturated? Effects of glutamatergic drugs in schizophrenia patients // Curr. Opin. Psychiatry. 2006. V. 19. P. 151-157.
23. G.E.Tsai. D-serine added to clozapine for the treatment of schizophrenia // Am J. Psychiatry. 1999. V. 156. P. 1822-1825.
24. М.Д.Машковский. Лекарственные средства. -16-е изд., перераб., исправ. и доп.-М.: Новая волна: Издатель Умеренков, 2012. С.661.
25. И.А.Комиссарова, Я.Р.Нарциссов. Молекулярные механизмы действия лекарственного препарата «Глицин» // Terra medica. 2001. №1. С.23-25.
26. А.Ю.Беспалов, Э.Э.Звартау. Нейропсихофармакология антагонистов NMDA-рецепторов. - СПб.: Невский Диалект, 2000. 297 с.
27. USPat 7820130 В2, 24.11.2004.
28. Y.Liu, Zh.Gu, J.L.Margrave, V.N.Khabashesku. Functionalization of Nanoscale Diamond Powder: Fluoro-, Alkyl-, Amino-, and Amino Acid-Nanodiamond Derivatives // Chem. Mater. 2004. V.16. P. 3924-3930.
29. Российская энциклопедия по охране труда. В 3 т. 2-е изд., перераб. и доп. Т. 3. -М.: Изд-во. НЦ ЭНАС.2007. С.181.
30. Н.Н.Каркищенко. Биомедицина, 2009. №2. С.5-26.
31. Т.И.Шалина, Л.С.Васильева. Общие вопросы токсического действия фтора// Сибирский медицинский журнал. 2009. №5. С.5-9.
32. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/ Под ред. Р.У.Хабриева. -М., 2005. С.230-243.
33. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств 4.1. ФГБУ «НЦЭМСП». -М., Изд-во Гриф и К, 2012. 244 с.