УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СВЕТОВОЙ АКТИВНОСТИ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ IN VITRO

Полезная модель относится к оборудованию для решения задач фотобиологии и медицины в области исследований световой активности широкой группы препаратов (фотосенсибилизаторов) для фотодинамической терапии.
При разработке препаратов для фотодинамической терапии необходимым этапом является исследование их функциональных свойств на клеточных культурах. Анализ световой, или фотодинамической, активности в системе in vitro позволяет проводить скрининг потенциальных фотосенсибилизаторов, осуществлять подбор концентраций, а также оценивать дозу оптического излучения, необходимую для проявления фотодинамического эффекта.
Эффективность исследования световой активности фотосенсибилизаторов in vitro в значительной степени зависит от выбора источника освещения клеточных культур с фотосенсибилизатором в связи с высокими требованиями поддержания режима освещения.
Известно использование для указанного освещения источников широкополосного излучения, таких как газоразрядные галогеновые лампы, лампы накаливания, «белые» светодиоды (см., например статью автора Жуковой О.С. Модели in vitro для скрининга противоопухолевых соединений различной природы. - «Российский биотерапевтический журнал». 2004, Т. 3, №3, с. 12-18; и статью на англ. яз. авторов Mroz P., Bhaumik J., Dogutan D.K., Aly Ζ., Kamal Ζ., Khalid L, Kee H.L, Bocian D.F., Holten D., Lindsey J.S., Hamblin M.R. Imidazole metalloporphyrins as photosensitizers for photodynamic therapy: role of molecular charge, central metal and hydroxyl radical production. - «Cancer Lett». 2009, V. 282, №.1, p. 63-76).
У них есть ряд недостатков, важнейшим из которых является избыточная световая мощность, воздействующая на клеточную культуру, поскольку спектр излучения источников белого света в несколько раз шире спектра поглощения фотосенсибилизаторов: типичная ширина полосы поглощения около 50 нм (см., например статьи на англ. яз. авторов Sakamoto К., Ohno-Okumura Ε. Syntheses and Functional Properties of Phthalocyanines. - «Materials». 2009, V. 2, №3, p. 1127-1179; и авторов Wang X., Wang P., Tong W., Liu Q. Comparison of pharmacokinetics, intracellular localizations and sonodynamic efficacy of endogenous and exogenous protoporphyrin IX in sarcoma 180 cells. - «Ultrasonics». 2010, V. 50, №8, p. 803-810). Излучение, выходящее за границы этой спектральной полосы, может приводить к нежелательному нагреву клеток и побочным фотохимическим реакциям, что, в свою очередь, может существенно затруднить интерпретацию результатов эксперимента.
Для выделения необходимой области спектра могут быть использованы методы дополнительной спектральной фильтрации, однако источники освещения с такой фильтрацией значительно усложняют устройства для исследования световой активности фотосенсибилизаторов in vitro (см., например устройство для исследования фотодинамической активности фотосенсибилизаторов in vitro в описании изобретения к патенту РФ №2160897, G01N 33/48, A61B 10/00, G01N 35/00, 2000).
В клинической практике при проведении процедур фотодинамической терапии используются также узкополосные лазерные и светодиодные источники излучения (см., например статью авторов Странадко Е.Ф., Армичев А.В., Гейниц А.В. Источники света для фотодинамической терапии. - «Лазерная медицина». 2011, Т. 15, №3, с. 63-69). Это обусловлено относительной простотой направленной доставки такого излучения посредством гибких оптических волокон при обеспечении необходимой спектральной плотности мощности. Узкополосные источники представляется методологически верным использовать, также при работе на клеточных культурах, что позволяет исследовать световую активность препаратов в условиях, максимально приближенных к клиническим (см., например статьи на англ. яз. авторов Butler M.С, Itotia P.Ν., Sullivan J.Μ. A high-throughput biophotonics instrument to screen for novel ocular photosensitizing therapeutic agents. - «Invest Ophthalmol Vis Sci». 2010, V. 51, №5, p. 2705-2720; и авторов Zheng G., Chen J., Stefflova K., Jarvi M., Li H., Wilson B.C. Photodynamic molecular beacon as an activatable photosensitizer based on protease-controlled singlet oxygen quenching and activation. - «Proc Natl Acad Sci USA». 2007, V. 104, №21, p. 8989-8994).
2
Важным параметром является размер области светового воздействия, который определяет возможность работы с культуральными сосудами разной площади. Облучение клеток в чашках Петри диаметром 35-60 мм с использованием распределенных источников света при размере светового пятна более 1 см (см., например статью на англ. яз. авторов Pogue B.W., Ortel В., Chen Ν., Redmond R.W., Hasan T. A photobiological and photophysical-based study of phototoxicity of two chlorins. - «Cancer Res». 2001, V. 61, №2, p.717-724) в значительной степени затрудняет проведение экспериментов с большим числом биологических повторностей. В этом случае требуется большой объем используемых расходных материалов и существенные временные затраты, связанные с невозможностью одновременного облучения набора экспериментальных образцов. В связи с этим более удобным представляется использование многолуночных планшетов (см., например, статьи на англ. яз. авторов Vrouenraets M.В., Visser G.W.M., Stigter M., Oppelaar H., Snow G.В., van Dongen G.A.M.S. Targeting of Aluminum (III) Phthalocyanine Tetrasulfonate by Use of Internalizing Monoclonal Antibodies. - «Cancer Research». 2001. V. 61, №5, p.1970-1975; и авторов Song К., Li J., Li L., Zhang P., Geng F., Dong R., Yang Q., Qu X., Kong B. Intracellular metabolism, subcellular localization and phototoxicity of HMME/HB in ovarian cancer cells. - «Anticancer Res». 2011. V. 31, №10, p. 3229-3235).
В качестве наиболее близкого аналога заявляемого устройства (прототипа) заявителем выбрано известное устройство для исследования световой активности фотосенсибилизаторов in vitro (см. статью на англ. яз. авторов Butler M.С, Itotia P.Ν., Sullivan J.Μ. A high-throughput biophotonics instrument to screen for novel ocular photosensitizing therapeutic agents. - «Invest Ophthalmol Vis Sci». 2010, V. 51, №5, p. 2705-2720 на сайте в сети Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19834043), содержащее прозрачный многолуночный культуральный планшет, светодиодную панель (LED array), выполненную из узкополосных светодиодов с соблюдением условия освещения каждым ее светодиодом клеточной культуры с фотосенсибилизатором или без него, расположенной в соответствующей лунке культурального планшета, и размещенную под культуральным планшетом, и блок регулирования мощности излучения указанной светодиодной панели, выполненный с возможностью регулирования общей мощности излучения светодиодной панели без выборочного включения/выключения светодиодов, ухудшающей эксплуатационные свойства (производительность исследований и функциональные возможности) устройства в связи с отсутствием возможности выборочного освещения клеточной культуры, расположенной в отдельных группах лунок с различным временем освещения для проведения эффективного скрининга фотосенсибилизаторов в микропланшетном формате.
Технический результат заявляемой полезной модели - повышение эффективности исследований световой активности фотосенсибилизаторов in vitro за счет повышения производительности исследований и расширения функциональных возможностей предлагаемого устройства в результате обеспечения возможности выборочного светодиодного освещения клеточной культуры с фотосенсибилизатором или без него, расположенной в отдельных лунках или группах лунок культурального планшета при различном времени освещения, экономии затрат электроэнергии и повышении ресурса светодиодов.
Кроме того, использование светодиодов со встроенными фокусирующими линзами повышает эффективность освещения за счет оптического сбора излучения.
Для достижения указанного технического результата в устройстве для исследования световой активности фотосенсибилизаторов in vitro, содержащем многолуночный культуральный планшет, светодиодную панель, выполненную из узкополосных светодиодов с соблюдением условия освещения каждым ее светодиодом клеточной культуры с фотосенсибилизатором или без него, расположенной в соответствующей лунке культурального планшета, и блок регулирования мощности излучения светодиодной панели, светодиодная панель размещена над упомянутым планшетом и выполнена с возможностью выборочного включения/выключения ее светодиодов для обеспечения локализованного освещения указанной клеточной культуры в отдельных лунках или группах лунок культурального планшета с исключением освещения остальных лунок, а блок регулирования мощности излучения светодиодной панели соединен с указанными светодиодами через блок коммутации этих светодиодов.
В частном случае для повышения эффективности светодиодного освещения светодиодная панель может быть выполнена из светодиодов спектрального диапазона 400-700 нм с шириной спектра излучения 20 нм, снабженных каждый своей встроенной фокусирующей линзой, блок регулирования мощности излучения светодиодной панели - с возможностью регулирования общей мощности светодиодной панели, а блок коммутации светодиодов светодиодной панели - с возможностью матричного включения/выключения отдельных полурядов светодиодов.
Для повышения удобства и автоматизации проведения исследований блок регулирования мощности излучения светодиодной панели может быть выполнен на основе цифрового управления мощностью с клавиатурно-дисплейным заданием указанной мощности и таймерным включением/выключением светодиодов.
На фиг. 1 схематически изображено заявляемое устройство для исследования световой активности фотосенсибилизаторов in vitro; на фиг. 2 представлена блок-схема питания светодиодной панели в составе устройства на фиг. 1.
Предлагаемое устройство для исследования световой активности фотосенсибилизаторов in vitro (см. фиг. 1) содержит многолуночный культуральный планшет 1, размещенный в посадочном углублении 2 основания 3, и светодиодную панель 4, состоящую из 96 малогабаритных узкополосных диодов 5, и блок 6 регулирования мощности излучения светодиодной панели 4.
При этом светодиодная панель 4 размещена над многолуночным планшетом 1 с соблюдением условия освещения каждым светодиодом 5 клеточной культуры с фотосенсибилизатором или без него, расположенной в соответствующей лунке 7 культурального планшета 1.
Светодиодная панель 4 и блок 6 регулирования мощности излучения светодиодной панели 4 выполнены в соответствии с показанной на фиг. 2 блок-схемой питания светодиодной панели 4, обеспечивающей возможность выборочного включения/выключения светодиодов 5 с помощью блока 8 коммутации светодиодов 5, соединенного своими многоканальным выходом с полурядами светодиодов 5 и входом с выходом блока 6 регулирования мощности излучения светотодиодной панели 4, который в свою очередь соединен своим входом с выходом источника питания 9 (на фиг.1 блок 6 выполнен совмещенно с блоками 8 и 9), для обеспечения локализованного освещения указанной выше клеточной культуры, расположенной, например в выделенных на фиг.1 двух отдельных полурядах 10 лунок 7 с различным временем их освещения с помощью выделенных на фиг. 1 двух отдельных полурядов 11 светодиодов 5 с исключением освещения остальных лунок 7.
Для включения блока 6 предусмотрен тумблер включения 12, для регулирования общей мощности включенных полурядов светодиодов 5 светодиодной панели 4 предусмотрена поворотная ручка регулирования мощности 13 и для включения/выключения в настоящем примере отдельных полурядов светодиодов 5 предусмотрены тумблеры включения/выключения 14, реализующие в настоящем примере блок 8 коммутации светодиодов 5.
В качестве узкополосных светодиодов 5 могут быть использованы малогабаритные светодиоды для поверхностного монтажа (SMD) производства фирмы High Power Lighting Corporation серии HPL-H44 с размерами основания 4,4 мм × 4,4 мм и встроенными фокусирующей линзой со спектральным диапазоном 400-700 нм с шириной спектра излучения 20 нм.
Предлагаемое устройство предусматривает возможность его исполнения с блоком 6 регулирования мощности излучения светодиодной панели 4, имеющим цифровое управление мощностью с клавиатурно-дисплейным заданием указанной мощности и таймерным включением/выключением светодиодов 5 (на фигурах 1 и 2 не показано).
Предлагаемое устройство используют следующим образом.
В лунки 7 культурального планшета 1 в настоящем примере помещается суспензия опухолевых клеток в культуральной среде, например среде DMEM (отечественный изготовитель - ООО «Компания «ПанЭко»), и через 12 часов добавляется фотосенсибилизатор, например «Фотосенс» (отечественный изготовитель - ГНЦ «НИОПИК»).
После чего подготовленные указанным выше образом опухолевые клетки в лунках 7 культурального планшета 1 инкубируются в течение 12 часов, затем указанные клетки отмываются от культуральной среды с добавленным ранее фотосенсибилизатором и в лунки 7 с этими клетками добавляется свежая культуральная среда DMEM, далее планшет размещается в посадочное углубление 2 основания 3, содержимое этих лунок (а также лунок с указанной клеточной культурой без фотосенсибилизатора для контрольного сравнения) освещается с помощью светодиодной панели 4 и через 48 часов производится оценка жизнеспособности освещенных опухолевых клеток с помощью теста на жизнеспособность, например МТТ-теста (см. руководство автора Фрешни Р.Я. Культура животных клеток: практическое руководство. М., «БИНОМ. Лаборатория знаний», 2010, с. 413-416).
В процессе поведения изложенного исследования световой активности фотосенсибилизатора in vitro предлагаемое устройство повышает эффективность указанного исследования (повышает производительность исследований и расширяет функциональные возможности заявляемого устройства) за счет оптимизации освещения клеточных культур с фотосенсибилизатором в результате осуществления возможности включения/выключения отдельных групп светодиодов 5, например отдельных полурядов светодиодов 5 в матричном порядке (в двух взаимно перпендикулярных направлениях) или отдельных светодиодов 5 или их групп в ином порядке, обеспечивающей освещение клеточной культуры в отдельных лунках 7 или группах лунок 7 культурального планшета 1 с исключением освещения остальных лунок 7 с их различным временем освещения и подготовкой в них различных клеточных культур, вместо загрузки повторного многолуночного планшета в случае прототипа для изменения времени освещения (уменьшающего производительность исследований) и для изменения клеточной культуры (сужающего функциональные возможности устройства в связи с резким уменьшением точности исследований при этом, отрицательно влияющим на целесообразность подготовки повторного многолуночного планшета с измененной клеточной культурой).
Предлагаемое устройство допускает возможность использования культурального планшета как с прозрачным, так и непрозрачным дном лунок, что повышает технологичность его изготовления.