КОМПЛЕКС БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА С ПОЛИСИАЛОВОЙ КИСЛОТОЙ
COMPLEX OF BIOLOGICALLY ACTIVE RECOMBINANT PROTEIN WITH POLYSIALIC ACID

Изобретение относится к области биохимии и может найти применение в медицине при получении биологически активных рекомбинантных белков, обладающих стабильностью и пролонгированным действием, имеющих терапевтическое значение, таких как инсулин человека, альфа- и бета-интерфероны, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и др.
Для повышения устойчивости рекомбинантных белков в составе готовых лекарственных форм используют различные приемы: от ковалентной модификации белков низкомолекулярными и высокомолекулярными агентами до создания комплексов с биополимерами.
Известен способ приготовления препаратов инсулина пролонгированного действия в виде суспензии, образующейся в результате взаимодействия инсулина с протамин-сульфатом. При этом формируются кристаллы в растворе, содержащие в своем составе сам инсулин, протамина сульфат, ионы двухвалентного цинка и фенол. Препарат обладает пролонгированным действием за счет медленного растворения кристаллов в подкожной клетчатке и пролонгированным поступлением свободного инсулина в кровь. Это обеспечивает поддержание уровня глюкозы в крови на протяжении 12-16 часов после подкожного введения препарата протамина-инсулина (Патент РФ №2281756, МПК А61К 9/10, опубл. 2006).
Недостатками полученной пролонгированной формы препарата инсулина являются:
а) необходимость получения кристаллической суспензии, содержащей чужеродный для организма человека белок протамина сульфат;
б) сложность дозирования препарата при введении из-за неоднородности фазового состояния (суспензия кристаллов в растворе).
Известен способ стабилизации биологически активных белков с помощью комплексообразования с природными полисахаридами и аминокислотами (R.S.Brody, S.Alavattam, W.M.Fountain, R.L.Jones. Stabilization of biologically active proteins with mixtures of polysaccharides and amino acid based compounds. US 2008/0219951 A1). Комбинация терапевтически значимого белка со смесью полисахаридов, полученных из растительного сырья, например гуммиарабиком или крахмалом, позволяет повысить стабильность фармацевтической композиции как в растворе, так и в форме геля. Гуммиарабик представляет собой высокоразветвленный полимер, основная цепь которого состоит из остатков D-галактопиранозы, соединенных связью (1→3), а боковые цепи из олигогалоктопиранозных звеньев присоединены связью (1→6). В состав молекул данного полисахарида входят также другие моносахаридные остатки, присоединенные к основной и боковой цепям. Гуммиарабик содержит также около 1% сильногликозилированных белков, таких как оксидазы и пероксидазы, активность которых необходимо дезактивировать перед соединением с белками, для предотвращения нежелательных побочных реакций с функциональными группами белка.
Недостатками получаемых по этому способу соединений являются: а) содержание примесей сильно гликозилированных белков вследствие использования смеси природных полисахаридов, которые практически невозможно отделить от полисахаридов; б) возможные нежелательные иммунные реакции пациентов на примесные белки и иммуногенные полисахариды; в) невозможность стандартизации готового белкового препарата из-за трудностей контроля состава сложных природных смесей. Известен наиболее близкий к заявленному комплекс генно-инженерных белков с сульфатированными полисахаридами (Y.Uemura, Н.Arimura, Н.Morise, S.Funakoshi, Т.Suyama. Process for recovering interferon. US 4314935). Комплекс получают путем взаимодействия раствора интерферона, произведенного клетками человека, с полисахаридом, содержащим отрицательно заряженные сульфогруппы. В качестве полисихарида используют бентонит или SP-сефадекс. Образующийся комплекс нерастворим в воде. При этом белок остается нативным и может быть отделен в виде данного комплекса от других примесей.
Однако данный способ не предназначен для приготовления растворимых в воде комплексов полимерных отрицательно заряженных углеводов с рекомбинантными белками.
Изобретение решает задачу расширения ассортимента стабильных, растворимых в воде биологически активных рекомбинантных белков с пролонгированным действием.
Поставленная задача решается за счет стабильного комплекса биологически активного рекомбинантного белка с полисиаловой кислотой, обладающего продолжительным терапевтическим действием, общей формулы:
где: m=20-110; n=1-4; Р - биологически активный рекомбинантный белок.
Полисиаловая кислота - природный биополимер, входящий в состав молекул адгезии нервных клеток млекопитающих и являющийся компонентом клеточной стенки некоторых бактерий (Gregoriadis G., McCormack В., Wang Z. et al. // FEBS Lett. 1993. V.315. P.271). Она не обладает иммуногенностью, узнается сиалидазами организма, расщепляющими ее до остатков нейраминовой кислоты, и выводится из организма. Полисиаловую кислоту используют для ковалентной модификации белков (S.Jain, Р.Laing, G.Gregoriadis, D.H.Hreczuk-Hrist, Y.P.apaoannou. Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation. WO 2005016974), но нековалентные комплексы этой кислоты с белками, являющиеся предметом данного изобретения, не известны.
Комплекс полисиаловой кислоты с белками получают смешением растворов каждого из компонентов при определенном значении рН, обычно ниже 6.0, перемешиванием в течение некоторого времени с последующим доведением рН до определенных для данной лекарственной формы значений, обычно 7.4. Полисиаловую кислоту перед введением в состав комплекса активируют, подкислением ее водного раствора с последующим разделением на сефадексе G25. В отдельных случаях активацию полисиаловой кислоты проводят непосредственно перед приготовлением комплекса без стадии фильтрации через колонку с сефадексом. Полученные комплексы полисиаловой кислоты и белка могут храниться как в растворе, так и в виде лиофильно высушенного кристаллического препарата. Образование комплекса полисиаловая кислота-белок может быть зарегистрировано прямыми наблюдениями с помощью атомно-силового микроскопа. Пролонгированное действие рекомбинантных белков в составе комплекса с полисиаловой кислотой подтверждается данными биологических испытаний in vivo. Сохранение специфической биологической активности белка в комплексе с полисиаловой кислотой следует из данных экспериментов на культурах клеток, чувствительных к данным белкам. Повышение стабильности белковой молекулы к действию природных веществ, индуцирующих агрегацию, продемонстрировано специальным экспериментом.
Таким образом, заявляемое изобретение решает задачу повышения стабильности и длительности фармакологического действия генно-инженерных белков путем их введения в состав нековалентного комплекса с природной полисиаловой кислотой.
Изобретение иллюстрируют графические материалы.
Фиг.1. АСМ-изображение комплексов инсулина с полисиаловой кислотой. Масштаб 60 нм. А - молекулы инсулина.
Фиг.2. Электрофореграмма разделения в полиакриламидном геле. Полиакриламидный гель, неденатурирующие условия, без концентрирующего геля, рН 8.8, 8%Т, окрашивание EZBlue (Сигма, США). 1 - нативный интерферон β, 2 - комплекс из примера 7, 3 - нативный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, 4 - комплекс из примера 6, 5-7 - маркеры молекулярной массы, 5 - карбангидраза, 6 - α-лактоглобулин, 7 - БСА.
Фиг.3. Электрофореграмма инсулина и его комплекса с полисиаловой кислотой после инкубации с арахидоноилдофаминхиноном (AA-DAQ). Полиакриламидный гель, денатурирующие условия без восстановления, Трициновый буфер. 1 - комплекс инсулина с полисиаловой кислотой из примера 2, 2 - комплекс инсулина с полисиаловой кислотой из примера 2+AA-DAQ, 3 - инсулин + AA-DAQ, М - маркер.
Фиг.4. Влияние препаратов интерферона-альфа 26 на пролиферацию клеток линии Daudi. 1 - комплекс интерферона и полисиаловой кислоты 22 кДа, полученный, как указано в примере 5,2, стандартный образец интерферона альфа 2в.
Фиг.5. Влияние препаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (ГКСФ) на пролиферацию клеток HL60, дифференцированных диметилсульфоксидом. 1 - препарат сравнения филграстим, 2 - комплекс ГКСФ и полисиаловой кислоты 22 кДа, полученный в примере 6.
Фиг.6. Влияние препаратов интерферона-бета 1б на пролиферацию клеток линии Daudi. 1 - комплекс интерферона и полисиаловой кислоты 22 кДа, полученный как указано в примере 7, 2, стандартный образец интерферона бета 1б.
Изобретение иллюстрируют примеры.
Пример 1. Получение активированной полисиаловой кислоты.
К 110 мг полисиаловой кислоты 22 кДа (m=75) прибавляют 1.72 мл воды и перемешивают при комнатной температуре (23°С) 15 мин, измеряют рН. Значение 7.0. Прибавляют 70 мкл 0.5 М HCl, результирующий рН раствора 4.5. Колонку PD-10, заполненную сефадексом G25 (GE Healthcare, Англия), промывают водой, детектируя элюат при 240 нм. Наносят раствор полисиаловой кислоты и продолжают элюировать водой. Собирают фракции по поглощению при 240 нм. Основное вещество выходит в первой фракции, рН раствора 4.9. Эту фракцию (3.9 мл) переносят в круглодонную колбу и лиофилизуют. Получают 86 мг сухого кристаллического вещества. Хранят при температуре ниже -18°С.
Пример 2. Получение комплекса полисиаловой кислоты (m=50) с инсулином.
В сосуд с магнитной мешалкой помещают 250 мг полисиаловой кислоты с массой 15 кДа (m=50) и растворяют в 5 мл воды при перемешивании. Измеряют значение рН полученного раствора (обычно находится в пределах 6.5-5.5) и дотитровывают раствор до значения 4.5 0.5 М HCl. Одновременно приготавливают раствор субстанции генно-инженерного инсулина человека из 96 мг полипептида и 4 мл воды при рН 2.0. К полученному прозрачному раствору полисиаловой кислоты прибавляют при постоянном перемешивании порциями раствор инсулина в воде. Немедленно образуется объемный белый осадок. Перемешивают при комнатной температуре (23°С) 30 мин и доводят рН раствора до значения 6.75-7.0. Полученный раствор стерильно фильтруют через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм и лиофилизуют. Получают 300 мг белого кристаллического вещества. Соотношение полисиаловая кислота - белок 1:1 (n=1).
Пример 3. Получение комплекса полисиаловой кислоты (m=20) с инсулином.
В сосуд с магнитной мешалкой помещают 250 мг полисиаловой кислоты с массой 6 кДа (m=20) и растворяют в 5 мл воды при перемешивании. Измеряют значение рН полученного раствора (обычно находится в пределах 6.5-5.5) и дотитровывают раствор до значения 4.5 0.5 М HCl. Одновременно приготавливают раствор субстанции генно-инженерного инсулина человека из 60 мг полипептида и 3 мл воды при рН 2.0. К полученному прозрачному раствору полисиаловой кислоты прибавляют при постоянном перемешивании порциями раствор инсулина в воде. Перемешивают при комнатной температуре (23°С) 30 мин и доводят рН раствора до значения 6.75-7.0. Полученный раствор стерильно фильтруют через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм и лиофилизуют. Получают 280 мг белого кристаллического вещества. Соотношение полисиаловая кислота - белок 4:1 (n=4).
Пример 4. Получение комплекса полисиаловой кислоты (m=110) с инсулином.
В сосуд с магнитной мешалкой помещают 456 мг полисиаловой кислоты с массой 32 кДа (m=110) и растворяют в 9 мл воды при перемешивании. Измеряют значение рН полученного раствора (обычно находится в пределах 7.3-6.5) и дотитровывают раствор до значения 4.5±0.1 0.5 М HCl. Одновременно приготавливают раствор субстанции генно-инженерного инсулина человека из 73 мг полипептида и 3.2 мл воды при рН 2.0. К полученному прозрачному раствору полисиаловой кислоты прибавляют при постоянном перемешивании порциями раствор инсулина в воде. Немедленно образуется объемный белый осадок. Перемешивают при комнатной температуре (23°С) 30 мин и доводят рН раствора до значения 7.15±0.1. Полученный раствор стерильно фильтруют через Millex фильтр 0.22 мкм и лиофилизуют. Получают 495 мг белого кристаллического вещества. Соотношение полисиаловая кислота - белок 1:1 (n=1).
Пример 5. Получение комплекса полисиаловой кислоты с интерфероном альфа 2б.
457 мг активированной полисиаловой кислоты 22 кДа, полученной, как описано в примере 1, растворяют в 75 мл очищенной воды. Перемешивают при комнатной температуре (23-25°С) до полного растворения. Проверяют значение рН. В случае необходимости дотировывают 0.5 М раствором соляной кислоты до значения 4.6±0.1 под контролем рН-метра. К полученному раствору при перемешивании со скоростью 300±50 оборотов в минуту приливают 100 мл раствора белка с концентрацией интерферона 2±0.1 мг в мл, полученного на стадии перемешивают при комнатной температуре 30 мин. Доводят рН до значения 7.0 0.1 N NaOH и стерильно фильтруют. Соотношение полисиаловая кислота - белок 2:1.
Пример 6. Получение комплекса гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (ГКСФ) и полисиаловой кислоты.
Получают раствор комплекса ГКСФ и активированной полисиаловой кислоты 22 кДа, как описано в примере 4, из 745 мг полисиаловой кислоты и 28 мл раствора белка с концентрацией ГКСФ 9 мг в мл. Полученный раствор комплекса количественно вводят в хроматографическую колонку PD-50, заполненную сефадексом G50 (GE Healthcare, Англия). Колонку промывают не менее чем тремя объемами фосфатно-солевого буфера, рН 7.4. Контроль элюата осуществляют по нарастанию поглощения при 240 нм с помощью УФ-детектора. Фракции, соответствующие фронту, вершине и основной спадающей части пика собирают в полиэтиленовые пробирки на 15 мл. Фракции, предшествующие пику вещества, а также соответствующие его хвостовой части, отбрасывают. Измеряют объем раствора комплекса ГКСФ с полисиаловой кислотой после гель-хроматографии. Отбирают пробу 500 мкл для анализа содержания белка. По данным анализа рассчитывают количество фосфатно-солевого буфера (рН 7.4), которое требуется для получения концентрации 0.54-0.66 мг/мл и добавляют к раствору комплекса. Полученный раствор субстанции стерилизуют, пропуская через стерилизующий фильтр в асептических условиях. Соотношение полисиаловая кислота - белок 2:1.
Пример 7. Получение комплекса полисиаловой кислоты с интерфероном бета-1б.
В флакон из темного стекла на 4.5 мл помещают 2 мл готового раствора интерферона, содержащего 0.89 мг/мл белка в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7.3), содержащем 2% маннита. К данному раствору при перемешивании при комнатной температуре (20°С) прибавляют одной порцией раствор полисиаловой кислоты 22 кДа с концентрацией 27 мг/мл (рН 4.6). Перемешивают при этой температуре 35 мин. Дотитровывают до значения 7.2 0.1 М NaOH. Полученный раствор перемешивают 30 мин при комнатной температуре. Определяют концентрацию белка. При необходимости разбавляют 10 мМ фосфатным буфером (рН 7.3) до концентрации 0.25 мг/мл. Стерильно фильтруют. Соотношение полисиаловая кислота - белок 3:1.
Пример 8. Визуализация комплекса полисиаловой кислоты и инсулина человека с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ).
На поверхность свежесколотого высокоориентированного пиролитического графита (ВОПГ) наносят 40 мкл раствора-модификатора графита «GM» фирмы «Нанотюнинг» (Россия). После 10 мин инкубации каплю сдувают сжатым аргоном. На подготовленную таким образом поверхность ВОПГ наносят каплю водного раствора комплексов инсулин-полисиаловая кислота, полученного в примере 2 с концентрацией 0,1 мкг/мл. После инкубации в течение 5 мин каплю сдувают сжатым аргоном. АСМ-изображнения получены в прерывисто-контактном режиме с использованием сверхострых кантилеверов высокого разрешения производства «Нанотюнинг» (Россия) на приборе Solver Р-47 bio фирмы «НТ-МДТ» (Россия).
На фиг.1 представлены типичные АСМ-изображения комплексов инсулина с полисиаловой кислотой. Молекулы полисиаловой кислоты выглядят на АСМ-изображениях хорошо расправленными. Стрелками на фиг.1 указаны молекулы инсулина, имеющие большую высоту по сравнению с молекулами полисиаловой кислоты. Измеряемая в АСМ высота молекул полисиаловой кислоты - 0,3-0,5 нм, средняя длинна молекул - около 10-20 нм, что соответствует молекулярному весу 23 кД, с учетом сокращения длины молекулы за счет образования спиральных участков и изгибов. Взаимодействие носит специфичный характер, так как молекулы инсулина распределены неравномерно по всей длине молекулы полисиаловой кислоты и связаны преимущественно с одним из концов молекулы. Высота молекул инсулина, измеряемая при помощи АСМ, соответствует 0,7-1 нм.
Пример 9. Характеристика комплексов белков с полисиаловой кислотой с помощью электрофореза в полиактиламидном геле в неденатурирующих условиях.
Разделение проводят без концентрирующего геля, рН 8.8, 8%Т, окрашивание EZBlue (Сигма, США).
На фиг.2 показана типичная электрофореграмма комплексов белков с полисиаловой кислотой 22 кДа, полученных, как описано в примерах 6 и 7. Видно, что подвижность комплексов отличается от подвижности нативного белка.
Пример 10. Устойчивость комплексов рекомбинантных белков с полисиаловой кислотой к действию модифицирующих агентов.
Окисленная форма нейротрансмиттера дофамина (n-этиламино-о-бензохинон) предполагается в качестве повреждающего агента при болезни Паркинсона, причем известно, что она способна образовывать ковалентные аддукты с остатками цистеина и лизина различных белков. Для проверки устойчивости генно-инженерных белков в комплексе с полисиаловой кислотой к действию дофаминхинона используют его жирно-кислотное производное (арахидоноилдофаминхинон, AA-DAQ), обладающее большей стабильностью в водных растворах по сравнению с немодифицированным дофаминхиноном. Рекомбинантные белки (КСФ, интерфероны альфа 2б и бета 1б, а также инсулин) и их комплексы с полисиаловой кислотой инкубируют с пятикратным молярным избытком (относительно суммарной концентрации лизинов и аргининов) AA-DAQ при рН 7.4 или 6.5 в течение часа при 37°С и анализируют методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях. В отсутствие полисиаловой кислоты инкубация указанных белков в с AA-DAQ приводят к образованию олигомеров белков. Доминирующим продуктом является димер, за ним следуют тример и незначительное количество тетрамера. Комплексообразование с полисиаловой кислотой существенно снижает образование олигомеров. На фиг.3 представлена электрофореграмма типичного эксперимента с инсулином и его комплексом с полисиаловой кислотой. Электрофоретическое разделение проводили в денатурирующих условиях без восстановления с использованием Трицинового буфера согласно опубликованной методике (Judd R.C. Electrophoresis of Peptides // Methods in Molecular Biology. V. 32 Basic Protein and Peptide Protocols, Humana Press, 1994). Видно практически полное отсутствие олигомерных форм белка в образце, содержащем комплекс с полисиаловой кислотой.
Пример 11. Испытание биологической активности препарата инсулина на кроликах.
Биологическую активность и пролонгированное действие препарата определяют по снижению содержания глюкозы в крови у кроликов.
Используют кроликов одного пола массой 2.5÷3.5 кг, содержащихся на стандартном рационе вивария. В опыт берут не менее 18 животных, которых способом случайного отбора распределяют на две равные группы. Одной группе подкожно вводят неразведенный ИП (испытуемый препарат), другой группе - такую же дозу основного раствора СО (стандартного образца растворимого инсулина), соответствующей видовой специфичности. Рекомендуемый диапазон доз составляет 0.5÷0.8 МЕ/кг. Взятие крови из ушной вены кролика проводят непосредственно перед инъекцией и через 1.5; 3.0; 4.5 и 6.0 ч после нее. Определение содержания глюкозы в сыворотке крови проводят глюкозоксидазным методом с использованием набора «Глюкоза» (Human, Германия).
За контрольную временную точку принимают момент времени, когда средняя концентрация глюкозы в крови животных, получивших основной раствор СО, вернулась к исходному уровню (100%). В этой точке для каждого кролика, получившего СО или ИП, рассчитывают индивидуальную относительную концентрацию глюкозы в крови в процентах от исходного уровня у данного животного. Если за 6 ч средняя концентрация глюкозы в крови кроликов, получивших СО, не вернулась к исходному уровню, то в качестве контрольной временной точки принимают момент времени, в который средний уровень глюкозы в данной группе максимально приблизился к исходному.
ИП считают прошедшим испытание, если в контрольной временной точке средняя относительная концентрация глюкозы в крови животных, получивших ИП, рассчитанная из индивидуальных относительных концентраций, достоверно ниже, чем в крови животных, получивших основной раствор СО. Достоверность различия проверяют с помощью критерия Стьюдента при p<0,05. Результаты испытаний представлены в таблице 1.
Таблица 1
Испытание биологической активности комплекса инсулина с полисиаловой кислотой на кроликах
Описание образца
% снижения глюкозы через промежуток времени, ч
1.5
3
45
6
СО (Стандартный образец инсулина), 40 МЕ/мл
37
21
0
0
ИП (Комплекс инсулина с полисиаловой кислотой из примера 2), 40 МЕ/мл
43
30
18
21
Пример 12. Испытание биологической активности препарата инсулина на мышах.
Биологическую активность и пролонгированное действие препарата определяют по снижению содержания глюкозы в крови у мышей.
В опыт берут не менее 30 мышей с отклонением массы тела не более ±1.0 г. Мышей распределяют на 3 равные группы способом случайного отбора и метят по порядку каждую особь внутри группы.
Животным первой группы через каждые 15 секунд подкожно в холку вводят рабочий раствор стандартного образца (СО), приготовленный из основного раствора СО, в объеме 0,1 мл/10 г массы тела животного. Рабочий раствор СО готовят непосредственно перед экспериментом в концентрации 0,1 МЕ/мл.
Животным второй группы вводят рабочий раствор испытуемого препарата (ИП), в объеме 0,1 мл/10 г массы тела. Рабочий раствор ИП готовят аналогичным образом, непосредственно перед экспериментом, с концентрацией 0,1 МЕ/мл.
Временной интервал между введением каждого рабочего раствора должен составлять не менее двух минут.
Третьей (контрольной) группе вводят раствор, не содержащий инсулин (плацебо), в том же объеме и по той же схеме, что и опытным животным.
Взятие крови (около 50 мкл) проводят из орбитального венозного синуса с помощью стерильного гепаринизированного капилляра или пастеровской пипетки через 40±1 мин, 90±2 мин и 120±3 мин после инъекции инсулина в соответствии с номером каждого животного внутри группы, соблюдая те же временные интервалы, что и при введении растворов. Определение содержания глюкозы в сыворотке крови проводят глюкозоксидазным методом с использованием набора «Глюкоза» (Human, Германия). Рассчитывают среднее содержание глюкозы в крови у мышей каждой из трех групп в каждой временной точке. Определяют разность между средней концентрацией глюкозы в крови животных третьей, контрольной группы и средней концентрацией глюкозы в крови первой (получившей раствор СО) и второй (получившей раствор ИП) групп. Тест считается удовлетворительным, если полученные значения статистически значимы (р<0,05). ИП считают прошедшим испытание, если в контрольной временной точке 120 мин средняя концентрация глюкозы в крови животных второй группы (получивших раствор ИП) не менее чем на 10% ниже, чем в крови животных первой группы (получивших раствор СО). Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Испытание биологической активности комплекса инсулина с полисиаловой кислотой на мышах
Описание образца
% снижения глюкозы через промежуток времени, мин
40
90
120
180
Контрольный раствор (плацебо)
0
0
0
0
СО (стандартный образец инсулина), 40 МЕ/мл
62
31
6
0
ИП (Комплекс инсулина с полисиаловой кислотой из примера 2), 40 МЕ/мл
68
38
32
27
Пример 13. Испытание биологической активности комплекса интерферона альфа 2б человека и полисиаловой кислоты на клеточных культурах.
Биологическая активность рекомбинантного интерферона альфа 2б человека в составе нековалентного нанокомплекса с полисиаловой кислотой определяют по способности этого препарата подавлять пролиферацию клеточной линии Дауди, полученной из лимфомы Беркита и являющейся стандартной моделью изучения антипролиферативного эффекта препаратов группы интерферонов.
Аликвоты растворов комплекса интерферона альфа 2б человека и полисиаловой кислоты 22 кДа, полученного, как указано в примере 5, и препарата сравнения в фосфатно-солевом буфере прибавляют к культуральной среде ARPMI 1640 с клетками Дауди с таким расчетом, чтобы конечная концентрация белка составила от 0.064 до 250 нг на мл среды. Клетки инкубируют с веществами в течение 72 часов. По истечении указанного срока определяют число жизнеспособных клеток в каждой пробе по сравнению с интактной клеточной линией. Каждый тест воспроизводят не менее пяти раз.
После инкубации определяли число жизнеспособных клеток с использованием колориметрического МТТ-анализа. Учет результатов по 3-4 измерениям для каждой концентрации каждого препарата производят по относительному количеству клеток линии Дауди в МТТ-тесте через 72 ч после внесения образцов.
Как видно из фиг.4, комплекс интерферона и полисиаловой кислоты оказывают стойкий антипролиферативный эффект, наблюдаемый при концентрации выше 1 нг/мл и полностью сопоставимый с таковым у стандартного препарата интерферона, что подтверждается и статистически по отсутствию достоверных различий между результатами испытаний.
Пример. 14. Испытание биологической активности комплекса гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (ГКСФ) человека и полисиаловой кислоты на клеточных культурах.
Испытание препарата комплекса рекомбинантного ГКСФ человека и полисиаловой кислоты 22 кДа проводят аналогично примеру 13, с тем отличием, что вместо клеток линии Daudi используют клетки линии миелоидной лейкемии человека - HL60, дифференцированные диметилсульфоксидом. Препаратом сравнения в данном случае выступало официальное лекарственное средство на основе рекомбинантного ГКСФ - Филграстим. Действие каждой навески препарата изучают при 3-кратном определении при том, что эксперимент воспроизводят трижды. Результаты пролиферативного действия испытуемых препаратов представлены на фиг.5.
На чертеже видно, что ГКСФ в составе нековалентного нанокомплекса с полисиаловой кислотой в полной мере обеспечивает пролиферативный эффект в отношении клеток миелоидного ростка кроветворения и при концентрации в культуральной среде выше 0.4 нг/мл не уступает в этом отношении официальному лекарственному средству.
Пример. 15. Испытание биологической активности комплекса интерферона бета 1б и полисиаловой кислоты на клеточных культурах.
Испытание препарата комплекса рекомбинантного интерферона бета 1б человека и полисиаловой кислоты 22 кДа проводят аналогично примеру 13. Препаратом сравнения являлся нативный интерферона бета 1б. Действие каждой навески препарата изучают при 3-кратном определении, при том, что эксперимент воспроизводят трижды. Результаты антипролиферативного действия испытуемых препаратов представлены на фиг.6.
Как видно из фиг.6, комплекс интерферона и полисиаловой кислоты оказывает стойкий антипролиферативный эффект, наблюдаемый при концентрации выше 10 нг/мл и полностью сопоставимый с таковым у стандартного препарата интерферона, что подтверждается и статистически по отсутствию достоверных различий между результатами испытаний.