Современные подходы к проблеме введения чужеродных генов в половые клетки животных

УДК 575.22:591.26

N. M. Suraeva

CURRENT APPROACHES TO THE PROBLEM OF FOREIGN GENE INTRODUCTION INTO ANIMAL SEX CELLS

N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow

ABSTRACT

Phenotypic characteristics of a transgene depend on the technique of gene introduction into the animal organism. Due to the fact that exogenic DNA incorporates randomly after microinjection, every transgenic animal is a unique object in terms of the genome and exogenic gene characteristics and expression rate. Similar model of random integration is developed after cell transfection by lipofection and electroporation methods. Determination rate of introduced gene phenotypic expression in the animal organism increases with the use of the technique of gene transfection by homo-logical recombination (gene knock out).

Key words: transgenesis, biotechnology, transfection, cloning, cattle, gene knock out.

Н. М. Cypaeea

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ПРОБЛЕМЕ ВВЕДЕНИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В ПОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ЖИВОТНЫХ

ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

РЕЗЮМЕ

Фенотипические признаки трансгена зависят от технологии введения гена в организм животного. Поскольку при микроинъекции экзогенная ДНК встраивается случайным образом, каждое трансгенное животное представляет из себя уникальный объект в отношении своего генома, характера и уровня экспрессии экзогенного гена. С аналогичным примером случайной интеграции приходится иметь дело и при трансфекции клеток методом липофекции и электропорации. Степень определенности фенотипического проявления встроенного гена в организме животного значительно повышается при использовании технологии переноса гена посредством гомологичной рекомбинации (генетический нокаут).

Ключевые слова: трансгенез, биотехнология, трансфекция, клонирование, домашний скот, генетический нокаут.

ВВЕДЕНИЕ

Последние сотни лет человек успешно использует методы генетической селекции для улучшения хозяйственных признаков домашнего скота. Генетическая инженерия, по-видимому, является логическим продолжением взаимоотношений человека и животных.

Сообщения о введении клонированных генов сельскохозяйственным животным стали возможны в связи с развитием двух фундаментальных методов: техники эмбриологических микроманипуляций и технологии получения рекомбинантных ДНК.

Благодаря этим методам появилась возможность более эффективного использования животных за счет повышения их продуктивности и качества продукции, резистентности к болезням, а также в качестве продуцентов биомедицинских продуктов.

Первые попытки применения транспорта генов у животных были сделаны с целью увеличения продуктивности. Были получены трансгенные мыши по гормону роста с 4-кратным увеличением скорости роста и удвоенной живой массой [51]. Однако у трансгенных свиней [56] и овец [58] не наблюдалось соответствующего ускорения роста.

Различия между трансгенными мышами, с одной стороны, и свиньями и овцами, с другой, по гормону роста обусловлены тем, что в используемых для транспорта генов линиях мышей не велась предварительная селекция по их скорости роста, в то время как используемые в экспериментах овцы и, особенно, свиньи были отобраны из популяций, в которых уже в течение десятилетий велась селекция по оптимизации параметров роста.

По-видимому, в имеющихся популяциях сельскохозяйственных животных генетический потенциал роста находится недалеко от потенциального плато. Поэтому путем введения гена гормона роста в организм сельскохозяйственных животных нельзя добиться сколько-нибудь значимого эффекта.

Ведутся активные исследования по созданию трансгенных животных с повышенной устойчивостью к различным заболеваниям. К примеру, в Голландии получены трансгенные коровы, продуцирующие с молоком лактоферрин, который повышает сопротивляемость организма к заболеваемости маститом. Представляет интерес получение трансгенных животных, содержащих антисмысловой ген, направленный против определенных вирусов. Экспрессия антисмысловой РНК (асРНК) в клетках приводит к гибридизации со смысловой РНК и тем самым к ингибированию репликации вирального генома. Нами были получены трансгенные кролики, которые экспрессировали асРНК против аденовируса Н5 [17].

Трансгенез открывает новые перспективы в направлении улучшения качества и состава продуктов животноводства. Например, наличие в молоке коров рекомбинантного белка человеческого лизоцима или модифицированного бычьего к-казеина влияет на функциональные и физические свойства белковой системы молока и тем самым изменяет технологические свойства молока. Показано, что лизоцим оказывает благоприятное влияние на время свертывания молока и выход сыра. Добавление в молоко бычьего к-казеина также оказывает влияние на физические свойства молока, этот белок повышает термостабильность казеиновых агрегатов и уменьшает размер мицелл [21]. Уменьшение диаметра мицелл увеличивает площадь общей их поверхности, что приводит к увеличению выхода сыра.

Одним из наиболее успешных направлений транс-генеза является генетическая модификация сельскохозяйственных животных для производства рекомби-нантных белков фармацевтического назначения с молоком и белком яйца. Использование трансгенных сельскохозяйственных животных в качестве живых биореакторов по сравнению с другими технологиями производства рекомбинантных белков обусловлены целым рядом преимуществ.

Получение рекомбинантных белков с использованием генетически модифицированных микроорганизмов не обеспечивает посттрансляционных модификаций, таких как гликолизирование, фолдинг белка, что приводит к снижению стабильности и физиологической активности получаемого белка. Несмотря на то, что в культуре клеток млекопитающих происходят все необходимые посттрансляционные процессы в реком-бинантном белке, концентрация последнего очень низкая, а сам процесс культивирования дорогостоящий и требует высокого технологического оборудования.

Эффективность экспрессии рекомбинантных белков, в частности моноклональных гуманизированных антител в молоке трансгенных животных, в 3000 раз

выше, чем в микроорганизмах и в 160 000 раз эффективнее, чем в системе культуры клеток [55]. Стоимость производства 1 г моноклональных антител с использованием системы культуры клеток составляет 300-1000 долларов США в зависимости от выхода белка и мощности биореактора, а затраты на его производство с молоком коз — 40 долларов [23]. По данным F. O. Custro (2000), затраты на производство 1 г неочищенных гуманизированных моноклональных антител в культуре клеток составляет 5-12 тыс. долларов США, а с молоком трансгенных кроликов — 15 долларов.

В настоящее время получено более 60 фармацевтических рекомбинантных белков с молоком почти всех видов трансгенных животных. Некоторые из них находятся уже на III фазе клинических испытаний.

Кроме практического и коммерческого использования, трансгенные животные оказались не менее интересными для изучения фундаментальных вопросов генома животных [1].

Очевидно, что такое бурное развитие трансгенной технологии привело к разработке различных методов введения чужеродных генов в организм животного, одним из важных критериев которых является введение гена на более ранних стадиях развития эмбриона или непосредственно в половые клетки или органы животного. В данном обзоре рассматриваются современные взгляды на решение данной проблемы.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕТРОВИРУСОВ В КАЧЕСТВЕ ПЕРЕНОСЧИКОВ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК

Вирусная инфекция — это естественный путь введения генетической информации в организм животных, поэтому вирусы и стали первыми объектами для генного переноса. Еще в 1974 г. были получены трансгенные мыши путем микроинъекции ДНК-вируса SV40 в полость бластоцисты и дальнейшей трансплантации инъецированных эмбрионов в яйцеводы ложно-беременных самок [32]. Однако в дальнейшем стало ясно: несмотря на то, что чужеродные гены можно вводить в клетки животных в составе многих вирусов, лишь ретровирусы способны обеспечить высокоэффективную стабильную интеграцию этих генов в геном эукариотической клетки [67].

В настоящее время известно большое количество систем клонирования чужеродных генов в составе генома ретровирусов. Эти гены эффективно и стабильно интегрируются в культивируемых клетках животных, с них идет активная экспрессия [16; 35].

Первые попытки получения трансгенных животных с помощью ретровирусов были сделаны в 1976 г., когда удалось стабильно интегрировать в геном мышей ДНК-вируса лейкемии мышей Молони путем инфицирования этим вирусом 4-8-клеточных эмбрионов. В дальнейших исследованиях было показано, что ретровирус передавался потомкам, а у некоторых мышей даже экспрессировался [33]. Затем ретровирусны-ми векторами со встроенными в них чужеродными генами были инфицированы предымплантированные

эмбрионы мыши [34; 71]. В этих опытах эмбрионы (без зоны пеллюцида) перед трансплантацией реципиенту инкубировались вместе с фибробластными клетками, которые продуцировали высокие титры реком-бинантных вирусов. При инкубации 2-8-клеточных эмбрионов в течение 16-18 ч с продуцирующими вирус фибробластами интеграция клонированных генов достигла 15-40 %, при этом встраивается лишь одна копия рекомбинантной ДНК.

Авторы одной из последних работ использовали репликативно-дефектный ретровирусный вектор SNTZ, содержащий ген бактериальной lacZ с сигналом ядерной локализации, для трансфекции бластодер-мальных клеток кур [47]. Вектор инъецировали в субзародышевую полость неинкубированного яйца. По результатам ПЦР, 8 из 15 вылупившихся цыплят, доживших до половозрелости, содержали ген lacZ в сперме. От одного из них было получено 224 потомка G1, 2 самца из которых также являлись носителями чужеродного гена. Таким образом, частота передачи инъецированного гена составила 0,89 %. Оба самца G1, несущие ген lacZ, дали потомство G2. 46,5 % цыплят этого потомства являлись носителями гена lacZ. Данные результаты согласуются с ожидаемым 50%-м уровнем наследования по Менделю для гетерозиготного доминантного аллеля. Наличие продукта гена lacZ, локализованного в ядре Р-галактозидазы, обнаружили в первичной культуре миобластов, полученной от животных поколения G2, а также в целых эмбрионах поколения G2.

Таким образом, ретровирусы являются очень удобными транспортными системами для переноса генетической информации. Во-первых, техника инфицирования эмбрионов животных очень проста по сравнению, например, с микроинъекцией в пронуклеус зиготы и при этом теоретически может быть достигнута 100%-я интеграция. Во-вторых, инфекции может подвергаться одновременно любое удобное количество клеток или эмбрионов. В-третьих, ретровирусный вектор с чужеродной ДНК встраивается в геном хозяина в количестве одной копии, тогда как при микроинъекции обычно происходит интеграция многих копий введенной ДНК, связанных друг с другом в единый тандем. В-четвертых, хотя интеграция ретровирусных плазмид случайна по отношению к хромосомной ДНК животного, она является направленной с точки зрения вирусного генома, т. к. уже известна структура вводимой ДНК. В-пятых, ретровирусные векторы не оказывают губительного воздействия на клетки хозяина. И наконец, ретровирусы найдены у многих видов млекопитающих, а значит, их можно использовать на различных видах животных.

Однако, несмотря на ряд указанных выше преимуществ, метод введения чужеродных генов с помощью ретровирусов не может пока претендовать на роль ведущего, т. к. существуют определенные препятствия для его широкого использования.

Очищенная РНК ретровирусов неинфекционна, а ДНК-копия этой РНК, образуемая in vivo, высокоин-

фекционна [26]. Кроме того, было обнаружено, что ретровирусы в естественных условиях могут трансдуци-ровать потенциально онкогенные гены клетки-хозяина. Таким образом, к недостаткам ретровирусных векторов можно отнести, во-первых, возможное распространение вирусов-векторов в инфицированных организмах, во-вторых, вероятную активацию клеточных онкогенов посредством вирусных транскрипционных последовательностей [1]. Слабая экспрессия или отсутствие экспрессии введенных генов — также характерный недостаток ретровирусных векторов.

При переносе генов посредством ретровирусных векторов следует обращать внимание на еще одну потенциальную проблему. Даже при применении дефектных ретровирусов, которые не могут существовать как инфекционные вирусные частицы, не исключено, что при рекомбинации с присутствующими в эмбрионах эндогенными ретровирусными последовательностями могут образовываться новые активные формы ретровирусов, хотя, возможно, постоянное усовершенствование ретровирусных систем в будущем может привести к полному исключению имеющегося на сегодняшний день риска.

МИКРОИНЪЕКЦИЯ ДНК В ПРОНУКЛЕУС ЗИГОТЫ

В 1981 г. в зиготы лягушек впервые был интегрирован ген кроличьего Р-глобина [61]. Однако самые впечатляющие результаты были получены при инъекции чужеродных генов в пронуклеус зиготы мышей, с которых осуществлялась успешная экспрессия экзогенных белков в клетках кровеносной системы и молочной железы.

Мышь обладает рядом свойств, благодаря которым можно эффективно использовать метод микроинъекции гена. Например, уже давно отработаны методы получения мышиных зигот на стадии 2 пронуклеусов, сами пронуклеусы хорошо видны, инъецированные зиготы отличаются высокой приживляемостью, срок беременности составляет всего 30-32 дня, и, наконец, более детально изучен генотип по сравнению с другими лабораторными животными, особенно домашними.

В отличие от мышей, зиготы свиней, коров, овец имеют цитоплазму с большим количеством желточных гранул, в которой не видны пронуклеусы. Однако эту проблему удалось преодолеть путем центрифугирования зигот [3; 29; 41].

В 1985 г. после центрифугирования зигот с использованием интерфереционной контрастной оптики были получены первые трансгенные кролики, овцы и свиньи [27], в геном которых методом микроинъекции был интегрирован ген гормона роста человека под контролем МТ промотора мыши. В настоящее время данный метод широко используется для получения трансгенных животных с различными полезными для медицины и ветеринарии признаками [56; 58].

К сожалению, процедуры манипуляции с эмбрионами млекопитающих, такие как суперовуляция, пере-

нос эмбрионов и оплодотворение in vitro, не были адаптированы к особенностям физиологии птиц и стандартное оборудование для микроинъекций нельзя было использовать для введения гена в крупную яйцеклетку птиц. Поэтому была разработана технология микроинъекции ДНК в оплодотворенную яйцеклетку кур, извлеченную из яйцевода и затем имплантированную вновь в половые пути птицы [2], и трехстадийная система культивирования вне яйца (ex ovo) от момента оплодотворения до вылупления. Однако в последнем случае для получения одной яйцеклетки приходится жертвовать курицей. В настоящее время с использованием данного метода (ex ovo) группой исследователей был получен петух, который передал ген бактериальной в-галактозидазы 3,6 % своих потомков [42].

Однако вести речь о направленной интеграции и контролируемой экспрессии с помощью микроинъекции, по-видимому, еще рано. Вместе с тем уже в настоящее время выявлены определенные закономерности в отношении введения клонированных генов в геном мышей.

Известно, что от 10 до 40 % беременных самок мышей могут родить трансгенных потомков, способных передавать приобретенный ген в поколениях [30; 57], т. е. эффективность интеграции при использовании метода микроинъекции относительно невысока, хотя уже известны некоторые приемы, позволяющие увеличить процент трансгенных мышей [11]. Оказалось, что частота интеграции повышается в 5 раз при введении линейных молекул ДНК по сравнению с кольцевыми формами. Объем вводимого в пронукле-ус раствора ДНК не должен превышать 1-2 пкл. При этом объем пронуклеуса может увеличиваться вдвое. Оптимальная концентрация вводимой ДНК 1 нг/мкл. Хотя при повышении концентрации увеличивается процент интеграции, жизнеспособность инъецированных эмбрионов мыши понижается. Размеры вводимых молекул ДНК могут варьировать от 0,7 до 50 т.н.п., т. е. метод микроинъекции позволяет использовать практически любые гены. По сравнению с этим методом, например, при ретровирусной инфекции существуют значительные ограничения на размеры встраиваемых участков ДНК в вирусные векторы [52]. Эффективность интеграции зависит от того, какие линии мышей, гибридные или инбредные, используются в опытах, и даже зиготы от одной мыши обладают различными потенциями [7].

До сих пор еще не ясно, что представляют собой основные лимитирующие факторы, влияющие на эффективность интеграции при микроинъекции чужеродных генов. Возможно, что микроинъекция сама по себе, хотя одноклеточная стадия мыши, по-видимому, относительно устойчива к манипуляциям. Более определяющим, скорее всего, является некоторый комплекс событий, который имеет место на одноклеточной стадии, например процессы перестройки хроматина и ядерной мембраны, ведущие к образованию пронук-леусов [80], или синхронность молекулярных преобразований, наблюдаемая сразу после оплодотворения.

ТРАНСГЕНЕЗ С ПОМОЩЬЮ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Следующий подход, позволяющий встроить чужеродную ДНК в геном млекопитающих, базируется на методе клеточно-эмбриональной агрегации [45] или инъекции клеток в бластоцисту реципиента [6; 25].

Стевенс в 1970 г. провел следующие эксперименты: пересадил 3- и 6-дневные эмбрионы мыши в тес-тикулярные мышиные капсулы. После этой операции эмбрионы потеряли присущие им свойства, а их клетки дали рост различным типам тканей, т. е. стали тоти-потентными. Когда эти клетки были инъецированы внутрибрюшинно мышам, они дали рост слою эктодермы, завернутому в эндодерму в виде округлых эм-брионных тел. Эти тела были названы тератомами.

Брингстер [10] пересаживал клетки, извлеченные из сердцевины тератом, в мышиные бластоцисты. Он показал, что родившиеся мыши были мозаичными по окраске шерсти, а значит, инъецированные клетки успешно внедрились в бластоцисту хозяина. Клетки тератом после инъекции в бластоцисты мышей проверялись на тотипотентность и другой группой исследователей [46]. У 3 родившихся мышей был обнаружен клеточный мозаицизм. У одного из химерных животных (самца) тератомные клетки дали рост половым тканям, что было обнаружено после анализа генома его потомков.

Эванс и Кауфман [20] в 1981 г. сообщили о получении культивируемых in vitro «плюрипотентных» клеток из эмбрионов мыши. Они вымывали 4- и 6-дневные эмбрионы мышей, обработанные прогестином, и затем культивировали их в плашках. После того как трофо-бласт прикреплялся ко дну плашки, внутренняя клеточная масса, образовавшая структуру в виде цилиндра, удалялась и культивировалась отдельно. Эти клетки стали называться ЕК-клетками в честь исследователей, впервые их получивших, или эмбриональными стволовыми клетками (ES). ES-клетки тоже могли образовывать тератомы, были стабильны, имели нормальный хромосомный набор и обладали способностью образовывать химеры после их инъекции в бластоцисты мышей [9], причем 50 % родившихся потомков (из 330) были химерными, а у 20 % (7 из 35) половые клетки имели геном ЕК-клеток.

Интересно, что процесс инъекции тотипотентных клеток не оказывал значительного губительного воздействия на жизнеспособность бластоцист мышей, т. к. большинство (около 80 %) из них продолжали деление и развивались в морфологически нормальные химеры [6; 43; 46; 68].

При инъекции в бластоцисты мышей ES-клеток, несущих экзогенные гены, были получены трансгенные животные [19].

ES-подобные клеточные линии были получены у овец, свиней и крупного рогатого скота [5; 76]. Клеточные линии свиней и крупного рогатого скота образовывали химеры при инъекции в соответствующую бластоцисту хозяина [14; 54; 65; 76]. Однако до сих пор не поступило сообщений о получении половых химер.

ТРАНСГЕНЕЗ С ПОМОЩЬЮ БЛАСТО-ДЕРМАЛЬНЫХ И ПЕРВИЧНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК КУР

В настоящее время повышается интерес к продукции трансгенной птицы так же, как и к сохранению генофонда в птицеводстве. Эта цель может быть достигнута путем создания половых химер.

Разработка технических приемов получения половых химер стала возможной благодаря пониманию базовых биологических вопросов, таких как механизм определения и дифференциации зародышевых клеток в спермии либо в яйцеклетки.

Первичные половые клетки кур (ППК), выделенные из бластодиска сразу же после откладки яйца, на стадии 5-7 зародышевого серпа, из крови эмбриона на стадии 13-17 и развивающихся гонад на стадии 25-27, могут быть использованы в качестве потенциальных клеток-мишеней для внедрения чужеродной ДНК в половую линию птиц.

В зародышевом серпе было обнаружено от 100 до 250 ППК, в крови — от 1 до 45 ППК на 1 мкл крови, в гонадах 6-дневного эмбриона — 1500-2000 ППК [4]. Изолированные ППК с помощью микроинъекции вводили в кровоток эмбриона реципиента на соответствующей стадии развития (стадии 13-17) через небольшое окошко в скорлупе и подскорлуповой оболочке. Донорские ППК циркулировали в кровеносной системе реципиента, заселяли гонаду и дифференцировались в гаметы.

Бластодермальные клетки

Первые половые химеры кур были получены при пересадке клеток из неинкубированного яйца [53], затем — из зародышевого серпа, крови и ранних гонад [69; 79].

Культивирование в течение 48 ч и замораживание бластодермальных клеток не влияли на эффективность продукции как соматических, так и половых химер [18; 36]. Радиоактивное облучение бластодермальных клеток реципиента повышало процент химер, развившихся из донорских необлученных клеток [12].

Трансфекцию бластодермальных клеток проводили с помощью репликативно-дефектных ретровирусных векторов [8] или липофекции [22]. Бластодермальные клетки по сравнению с ППК, полученными из крови и гонад, технически легче выделить и трансфецировать, но, с другой стороны, эффективность продукции половых химер значительно ниже, поэтому необходимы большие материальные затраты на содержание птиц. Необходимо также отметить, что бластодермальные клетки до сих пор не охарактеризованы в качестве самостоятельной клеточной линии.

ППК из зародышевого серпа и крови

В крови эмбриона на стадии 13-14 ППК составляют 0,048 % всех клеток [79]. Было показано, что инъекцию донорных клеток необходимо проводить на определенной стадии развития. При инъекции ППК из крови цыпленка на стадии 13-14 в кровь реципиента

перепела на стадии 15-16 до 90 % ППК заселяли гонады реципиента. Оставшиеся 10 % эктопически локализовались в голове, туловище и конечностях. Инъекция кровяных ППК в эмбрионы на более поздних стадиях развития давала все меньшее число мигрировавших в гонады ППК. Только 6 % ППК из крови, инъецированные в реципиент на стадии 20, мигрировали к гонадам. Эти результаты подтверждают существование довольно узкого временного интервала, когда ППК способны к миграции к развивающимся гонадам [49].

Было также показано, что для успешного переноса кровяных ППК необходимо сконцентрировать их. Была предложена методика использования градиента Фи-колла [79], причем сообщалось об увеличении концентрации ППК с 0,048 до 3,9 % от всех клеток крови. Половые химеры были также успешно получены после инъекции 100 ППК из крови с применением данной методики [69].

Позднее были объединены методики по концентрированию ППК крови в градиенте Фиколла с удалением эндогенных ППК путем слива 4-10 мкл крови реципиента [48]. Этот прием позволил с большей эффективностью получать половые химеры. Удаление эндогенных ППК путем сливания собственной крови реципиента повышало частоту получения потомков от доноров с 14 до 23 % для химер-самцов.

У 3 % эмбрионов была обнаружена экзогенная ДНК после инъекции трансфецированных ППК из крови репликативно-дефектным ретровирусом некроза селезенки [72]. В другой работе ППК, выделенные из зародышевого серпа, также были трансфецированы репликативно-дефектным ретровирусным вектором, и уже потомки от полученных химер содержали чужеродный ген [28].

Трансфекция ППК крови in vivo технически более простой метод [74]. Катионный комплекс липосо-ма-ДНК, содержащий ген бактериальной lacZ, инъецировали в эмбрион на стадии 10-15. Спустя 24 ч после инъекции активность Р-галактозидазы была зарегистрирована в клетках крови, эндотелия и эндокарде сердца всех опытных эмбрионов. Через 2-3 дня после инъекции активность в-галактозидазы была зарегистрирована в 4 % эмбрионов, инъецированных конструкцией RSV-lacZ, и в 40 % эмбрионов, несущих конструкцию Р-актин-lacZ.

ППК из гонад

Гонадные клетки, выделенные из 6-дневных эмбрионов, были трансфецированы in vitro плазмидой pCMVP, содержащей ген бактериальной Р-галактози-дазы под цитомегаловирусным промотором, с помощью электропорации и липофекции [31]. Эффективность трансфекции с помощью электропорации с применением ДМСО составила 80 %, в то время как при липофекции всего 17 %. В этой же работе ППК после трансфекции с помощью электропорации инъецировали в 2,5-дневные эмбрионы (стадия 17). Наличие чужеродного гена было зарегистрировано в гонадах 6-, 10-дневных эмбрионов и у вылупившихся цыплят со-

ответственно в 100, 67 и 41 % случаев. Таким образом, электропорация является эффективным средством трансфекции гонадных ППК для получения трансгенных птиц.

Как и ППК крови, гонадные ППК также можно хранить в жидком азоте без потери ими способности давать половые химеры [69].

Таким образом, инфекция ППК ретровирусами или трансфекция с помощью невирусной ДНК — успешно применяемые методики для получения трансгенного потомства у птиц. Однако анализ потомков трансгенных животных, проводимый в некоторых работах, показывает, что передача чужеродного гена не происходит по законам Менделя, как это ожидается для ДНК, встроившейся в геном [75]. Чужеродная ДНК, по-видимому, передается при делении клеток эписомно, и неизвестно пока, каким образом происходит ее репликация. Доказательства эписомного расположения чужеродной ДНК наблюдали при получении трансгенных птиц после микроинъекции ДНК в цитоплазму одноклеточного оплодотворенного яйца [62], переноса гена с помощью спермы [50] и баллистической трансфекции in vivo [40]. Возможно, присутствие у многих видов птиц большого количества микрохромосом создает условия для эписомной репликации молекул чужеродной ДНК.

Эписомная передача трансгена наблюдалась и у других трансгенных животных. Экстрахромосомная репликация ДНК, инъецированной в цитоплазму, была показана у нематоды, морского urchin, шпорцевой лягушки, рыб и мыши.

Еще одной проблемой при получении химер является невозможность идентифицировать принадлежность полученной особи к половой химере, если, конечно, не выполнено обратное скрещивание.

ПЕРЕСАДКА ЯДЕР ИЗ ТРАНСФЕЦИРО-ВАННЫХ КЛЕТОК

Благодаря фундаментальным исследованиям по изучению механизма клеточного цикла в 1997 г. впервые был сделан успешный перенос донорского ядра из соматической клетки в неоплодотворенную яйцеклетку овцы на стадии метафазы, из которой было удалена ДНК [66; 77]. После трансплантации клонированного эмбриона был получен потомок — генетическая копия донора. Аналогичные эксперименты по клонированию были проведены на крупном рогатом скоте, козах и свиньях [70; 78].

Благодаря данной технологии появилась возможность переноса чужеродного гена через донорское ядро соматической клетки после предварительного отбора in vitro трансфецированных клонов клеток [15].

Действительно, в 2000 г. были получены первые трансгенные клонированные овцы после пересадки ядер из трансфецированных экзогенной плазмидой (а1-проколлагеновый ген) эмбриональных фибробас-тов [44]. Из 470 реконструированных эмбрионов было получено 20 зародышей (из низ 14 родившихся живыми ягнят), проанализированы 16 потомков, 15 оказа-

лись трансгенными. Похожие результаты были получены и на свиньях [37] с использованием трансфецированных геном альфа-1,3-галактозилтрансферазы эмбриональных фибробластов. Было получено 338 реконструированных эмбрионов, после трансплантации которых родились 7 живых поросят. У 4 поросят было обнаружено трансгенное ДНК.

Таким образом, клонирование потенциально способно обеспечить такой же высокий уровень трансгенных манипуляций на любых животных, как и использование стволовых клеток у мышей. Однако существуют и ограничения, связанные с низкой рождаемостью потомков от числа трансплантированных реконструированных эмбрионов. Например, у овец было получено 3,6 % трансгенных ягнят, а у свиней — 1,2 % [37]. Кроме того, у клонированных животных очень часто встречаются нарушения в развитии, приводящие к эмбриональной или постнатальной смерти. Так, из 14 упомянутых выше клонированных ягнят [44] 7 погибли через 30 ч после рождения, и еще 4 — в течение 12 нед. Несмотря на идентичность генотипа соматической и генеративной клеток (за исключением лимфоцитов) и возможность клонирования животных, скорее всего, именно эпигенетические нарушения в донорном ядре являются основными причинами нарушений в дальнейшем развитии реконструированного эмбриона [64; 73; 80]. Изучение механизмов эпигенетического репро-грамирования ядра, очевидно, поможет решить проблему выживаемости клонированных животных.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СПЕРМАТОЗОИДОВ В КАЧЕСТВЕ ПЕРЕНОСЧИКОВ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК

В связи с тем, что основной ролью сперматозоидов является перенос ДНК в яйцо, были исследованы подходы к использованию спермиев в трансгенезе.

Первые работы по переносу ДНК с использованием спермы мышей [38] и свиней [39] и получением трансгенных особей были проведены в единственной лаборатории, тогда как другая лаборатория не смогла повторить этих результатов [24].

Было показано, что плазмиды с различными структурными генами могут специфично связываться со спермой кролика, быка и петуха [59] при помощи липофекции, трансгенез был продемонстрирован в эмбрионах и потомках у кроликов и крупного рогатого скота. Попытки создания трансгенных кур с использованием спермы не привели к получению трансгенных кур с менделевским распределением наследования чужеродного гена [50; 60]. Позже было представлено подтверждение эписомного присутствия чужеродной ДНК в клетках животных, полученных после оплодотворения трансгенной спермой [59]. Авторы трансформировали сперму тремя разными плазмидами с помощью липофекции. Во всех случаях чужеродный ген обнаруживали только в эмбрионах, но не в тканях вылупившихся цыплят или взрослых животных.

При использовании технологии REMI (Restriction Enzyme Mediated Insertion — интеграция, опосредо-

ванная рестрнктазой) была получена трансгенная сперма быка [63]. Такой спермой провели оплодотворение in vitro и получили морулы, 30 % которых экспрессиро-вали ген GFP. Также было подтверждено наличие экзогенной ДНК в лимфоцитах рожденных телят.

Было показано, что чужеродная ДНК способна агрегировать с антителами. Трансфецированной таким образом спермой мышей и свиней проводили искусственное осеменение соответствующих самок. В результате проведенных экспериментов были получены трансгенные мыши и свиньи [13]. Исследователи также предположили, что аналогичный прием может быть использован и для спермы петуха.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы помощью такой модели, как мышь, удалось достичь значительных успехов в изучении механизма интеграции, экспрессии и наследования введенных генов, однако описанные выше методы введения чужеродных генов, так успешно применяемые на мышах, еще не адаптированы в полной мере для сельскохозяйственных животных. Очевидно, что те успехи, которые были достигнуты в изучении генома человека, помогут разработать методологические подходы к проблеме создания эффективных генных конструкций и усовершенствования методов их введения.

Особенно интенсивно в последнее время развиваются методы трансгенеза с использованием технологии клонирования и получения культуры стволовых клеток. Возможность культивирования, например, гонадных ППК птиц без потери ими способности к производству половых химер позволит применить технику введения генов, разработанную для эмбриональных стволовых клеток мыши. Однако необходимо в дальнейшем определить, не повлияет ли длительная селекция ППК с интеграцией чужеродного гена в хромосоме на способность их мигрировать к гонаде реципиента и заселять ее.

ЛИТЕРАТУРА

1. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве. — М., 1995.

2. Карапетян Р. В. Получение трансгенных кур методом микроинъекции ДНК в яйцеклетки / Сб. науч. тр. «Генно-инженерные сельскохозяйственные животные». — 1995. — С. 214-223.

3. Сураева Н. М., Трухан Р. С. Некоторые методологические приемы введения чужеродного гена в зиготы животных / Сб. науч. тр. «Генно-инженерные сельскохозяйственные животные». — 1995. — С. 227-243.

4. Сураева Н. М., Толмазова А. Г. Выделение и характеристика первичных половых клеток из гонад 6-9-дневных эмбрионов кур с целью совершенствования метода получения трансгенных птиц // Доклады РАСХН. — 2004. — № 2. — С. 29-32.

5. Anderson G. B. Embryonic stem cells in agricultural species. In: Transgenic Animals in Agriculture / J. D. Murray, G. B. Anderson, A. M. Oberbaur, M. M. McGloughlin (eds.). — New York: CABI Publ., 1999. — P. 57-66.

6. Babinet C. A. Simplified method for mouse blastocyst injection // Exp. Cell. Res. — 1980. — Vol. 130. — P. 15-19.

7. Bolton V. N., Dades P. G., Johnson M. N. The relationship between cleavege DNA replications and activation of transcription in the mouse 2-cell embryo // J. Embryol. Exp. Morph. — 1984. — Vol. 79. — P. 139-164.

8. Bosselman R. A., Hsu R. Y., Boggs T. et al. Germline transmission of exogenous genes in the chicken // Science. — 1989.

— Vol. 243. — P. 533-535.

9. Bradley A., Evans M. N., Kaufman M. N., Robertson E. Formation of germ in chimaeras from embryo-derived ter-atocarcinoma cell lines // Nature. — 1984. — Vol. 309. — P. 255-256.

10.Brinster R. L. The effect of cells transferred into the mouse blastocyst on subsequent development // J. Exp. Med. — 1974. — Vol. 40. — P. 109-1056.

11. Brinster R. L., Chen Y. Y., Trumbaner M. F. et al. Factors effecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1985. — Vol. 82. — P. 4438-4442.

12.Carsience R. S., Clark M. E., Verrinder Gibbions A. M., Etches R. J. Germline chimeric chiken from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos // Development. — 1993. — Vol. 117. — P. 669-670.

13.Chang K., Qian J., Jiang M. S. et al. Effective generation of transgenic pigs and mice by linker based sperm-mediated gene transfer // BMC Biotechnol. — 2002. — Vol. 2. — P. 5-10.

14.Cibelli J. B., Stise S. L., Golueke P. L. et al. Transgenic bovine chimeric offspring produced from somatic cell-derived stem like cells // Nat. Biotechnol. — 1998. — Vol. 16. — P. 642-646.

15.Clarc A. J., Burl S., Denning C., Dickinson P. Gene targeting in livestock: a preview // Transgen. Res. — 2000. — Vol. 9, No. 4-5. — P. 263-275.

16.Doehmer J., Barinaga M., Vale W. Introduction of a rat growth hormone gene into mouse fibroblasts via retroviral DNA vector // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1982. — P. 2268-2272.

17.Ernst L. K., Zakharchenko V. I., Suraeva N. M. et al. Treansgenic rabbits with antisense RNA gene targeted at ade-novirus H5 // Theriogenology. — 1991. — Vol. 35. — P. 1257-1271.

18.Etches R. J., Clark M. E., Toner A. et al. Contribution to somatic and germline lineges of chicken blastodermal cells maintained in culture // Mol. Reprod. Dev. — 1996. — Vol. 45. — P. 291-293.

19.Evans M. J., Bradley A., Kuelm M. R. The ability of EK cells to form chimera after selection of clones in G418 and some observations on the integration of retroviral vector proviral DNA into EK cells // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.

— 1985. — Vol. 50. — P. 691-700.

20.Evans M. J., Kaufman M. H. Establishment in culture of pluripotential cell from mouse embryos // Nature. — 1981. — Vol. 292. — P. 154-156.

21.Fox P. F. Heat-induced coagulation of milk / Developments in Dairy Chemistry Fox P.E. (Ed.). — Applied Sci. Pub., New York, 1982. — P. 189-223.

22.Fraser R. A., Carsience R. S., Clark M. F. et al. Efficient incorporation of transfected blastodermal cells into chimeric chicken embryos // Int. J. Dev. Biol. — 1993. — Vol. 37. — P. 381.

23.Fulton S. P. Transgenic production of therapeutics. In biopharmaceutical process economics and optimization.

— Washington DC: International business communications, 1999.

24.Gandolfi F. Sperm-mediated transgenesis // Theriogenology.

— 2000. — Vol. 53. — P. 127-137.

25.Gardner R. L. Mouse chimaeras obtained by the injection of cell into the blastocyst // Nature. — 1968. — Vol. 220. — P. 596-597.

26.Gautsch J. W. Lack of retrovirus gene expression in teratocar-cinoma stem cells is limited to the nucleus // Somat. Cell. Genet. — 1982. — Vol. 8. — P. 143-149.

27.Hammer R. E., Pursel V. G., Rexroad C .E. et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection // Nature. — 1985. — Vol. 315. — P. 680-683.

28.Han J.Y., Shoffner R. N., Guise K. S. Gene transfer by manipulation of primordial germ cells (PGCs) in the chicken // As.-Aus. J. Anim. Sci. — 1994. — Vol. 7. — P. 427-434.

29.Hill K. G., Curry J., DeMayo F. J. et al. Production of trans-genic cattle by pronuclear injection // Theriogenology. — 1992. — Vol. 37. — P. 22.

30.Hogan B., Beddington R., Constantin F., Lacy E. Manipulating the Mouse Embryo. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1994.

31.HondY.H., Moon Y.K., LeongD.K., HanJ.Y. Improved tran-sjection efficiency of chiken gonadal primordial germ cells for the production of transgenic poultry // Transgenic Research. — 1998. — V. 7. — P. 247-252.

32.Jaenisch R., Mintz A. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of health adult mice derived from preimplantation blas-tocysts injected with viral DNA// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

— 1974. — Vol. 71. — P. 1250-1254.

33.JahnerD., JaenischR. Integration of Moloney leukemia virus into the gerline of mice: Correlation between site of integration and virus activation // Nature. — 1980. — Vol. 287. — P. 456-458.

34.Jahner D., Haase R., Mulligan R., Jaenisch R. Insertion of the bacterial gpt gene into the germ line of mice by retroviral infection // Prog. Natl. Acad. Sci. USA. — 1985. — Vol. 82.

— P. 6927-6931.

35.Joyner A. L., Bersnstein A. Retrovirus transduction: Generation of integration retroviruses expressing dominant and selectable genes is associated with in vivo recombination and deletion event // Mol. Cell. Biol. — 1983. — Vol. 3. — P. 2180-2190.

36.Kino K., Pain B., Leibo S.P. et al. Production of chicken chimearas from injection of frozen-thawed blastodermal cells // Poult. Sci. — 1997. — Vol. 76. — P. 753.

37.Lai L. X., Kolber-Simonds D., ParkK. W. et al. Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning // Science. — 2002. — Vol. 295 (5557). — P. 1089-1092.

38.Lavitrano M., Camaioni A., Fazio V. M. et al. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: Genetic transformation of mice // Cell. — 1989. — Vol. 57. — P. 717-723.

39.Lavitrano M., Forni M., Varzi V. et al. Sperm-mediated gene transfer: Production of pigs transgenic for a human regulator of complement activation // Transplant. Proc. — 1997. — Vol. 29. — P. 3508-3509.

40.Li Y., Behnam J., Simkiss K. Ballistic transfection of avian primordial germ cells in vivo // Transgen. Res. — 1995. — Vol. 4. — P. 26-29.

41.Loskutoff N. M., CorenB. R., BarrisD. R. et al. Gene microinjection in bovine embryos facilitated by centrifugation // Theriogenology. — 1986. — Vol. 25. — P. 168-173.

42.LoveJ., Gribbin C., Mather C., SangH. Transgenic bird by DNA microinjection // Bio/Technology — 1994. — V. 12. — P. 63-65.

43.Martin G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryo cultured in medium conditioned by teratocar-cinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1981. — Vol. 78. — P. 7634-7636.

44.Mccreath K. J., Howcroft J., Campbell K. H. S. et al. Production of genetargered sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells // Nature. — 2000. — Vol. 405 (6790).

— P. 1066-1069.

45.Mintz B. Preimplantation stages pregnancy // Ciba Found. Symp. — 1965. — P. 194-207.

46.Mintz B., Illimensee K. Normal genetically mosaic mice produced from malignant teratocarcinoma cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1975. — Vol. 72. — P. 3585-3589.

47. Mozdziak P. E., Borwornpinyo S., McCoy D. W., Petitte J.N. The development of transgenic chickens expressing bacterial beta-galactosidase // Dev. Dyn. — 2003. — Vol. 226. — P. 439-445.

48.Naito M., Tajima A., Kuwana T. Production of germline chimeric chickens, with high transmission rate of donor-derived gametes, produced by transfer of primordial germ cells // Mol. Reprod. Dev. — 1994. — Vol. 39. — P. 153-161.

49.Nakamura M., Maeda H., Fujimoto T. Behavior of chick primordial germ cells injected into the blood stream of quail embryos // Okajimas Folia Anat. Jap. — 1991. — Vol. 67. — P. 473-478.

50.Nakanishi A., Iritani A. Gene transfer in the chicken by sperm-mediated methods // Mol. Repr. Dev. — 1993. — Vol. 36. — P. 258-261.

51.Palmitier R. D., Brinster R. L., Hammer R. E. et al. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothioneingrowth hormone fusion genes // Nature. — 1982. — Vol. 300. — P. 611-615.

52.Palmiter R. D., Brinster R. L. Transgenic mice // Cell. — 1985. — Vol. 41. — P. 343-451.

53.Petitte J. N., Clark M. E., Liu G. et al. Producing of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells // Development. — 1990. — Vol. 108. — P. 185-189.

54.Piedrahita, J. A., Moore, K., Oetama B. et al. Generation of trasgenic porcine chimeras using primordial germ cell-derived colonies // Biol. Reprod. — 1998. — Vol. 58. — P. 1321-1329.

55.Pollock D. P., Kutzko J. P., Brick-Wilson E. et al. Transgenic milk as a method for production of recombinant antibodies // J. Immunol. Methods. — 1999. — Vol. 231. — P. 147-157.

56.Pursel V. G., CampbellR. G., Miller K. F. et al. Growth potential of transgenic pigs expressing a bovine growth hormone gene // J. Anim. Sci. — 1988. — Vol. 66. — P. 267-271.

57.Renard J. P., Bahinet C. Genetic engineering in farm animal the lessons from the genetic mouse model // Theriogenology.

— 1987. — Vol. 27. — P. 181-200.

58.Rexroad C. E., Hammer R. E., Behringer R. R. et al. Insertion, expression and physiology of growth-regulating genes in ruminants // J. Reprod. Fertil. — 1990. — Vol. 41. — Suppl. 119-124.

59.Rottmann O., Antes R., Hofer P. et al. Liposome-mediated gene transfer via sperm cells. High transfer efficiency and persistance of transgenes by use of liposome and sperm cells and a murine amplification element // J. Anim. Breed.Gener.

— 1996. — Vol. 113. — P. 401-411.

60.Rottmann O. J., Antes R., Hoefer P., Maierhofer G. Liposome mediated gene transfer via spermatozoa into avian egg cells // J. Anim. Breed. Gen. — 1992. — Vol. 109. — P. 64-70.

61.Rusconi S., Schafner W. Transformation of frog embryos with a rabbit-globin gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1981. — Vol. 7. — P. 5051-5055.

62.Sang H., Perry M. M. Episomal replication of cloned DNA injected into the fertilised ovum of the hen, Gallus domesticus // Mol. Reprod. Dev. — 1989. — Vol. 1. — P. 98-106.

63.Shemesh M., Gurevich M., Harel-Markowitz E. et al. Gene integration into bovine sperm genome and its expression in transgenic offspring // Mol. Reprod. Dev. — 2000. — Vol. 56.

— P. 306-308.

64.Shi W., Zakhartchenko V., Wolf E. Epigenetic reprogramming in mammalian nuclear transfer // Differentiation. — 2002. — Vol. 71. — P. 1-23.

65.Shim H., Gutierres-Adan A., Chen L. R. et al. Isolation pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells // Biol. Reprod. — 1997. — Vol. 57. — P. 1089-1095.

66.Shnieke A. E., KindA. J., Ritchie W.A. et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from trans-fected fetal fibroblasts // Science. — 1997. — Vol. 278(5346).

— P. 2130-2133.

67.Sorge J., Hughes S.H. Retrovirus vectors independent of selectable markers // Cold Spring Harbor. — 1982. — N 1. — P. 127-132.

68.Stewart T.A., MintzB. Successive generations of mice produced from aestablished culture line deuploid teratocarcino-ma cells // Proc. Nat.Acad. Sci. USA. — 1981. — Vol. 78. — P. 6314-6317.

69. Tajima A., Naito M., Yasuda Y., Kuwana T. Producing of germline chimeras by transfer of primordial germ cells in the domestic chicken // Theriogenology. — 1993. — Vol. 40. — P. 509-519.

70. Tsunoda Y., Kato Y. The recent progress on nuclear transfer in mammals // Zool. Sci. — 2000. — Vol. 17(9). — P. 1177-1184.

71. Van der Putten, BotteriH., Miller F. M. et al. Efficient insertion of genes into the mouse germ line via retroviral vectors // Proc. Natl. Acad. USA. — 1985. — Vol. 82. — P. 6148-6152.

72. Vick L. E., Ying L., Simkiss K. Transgenic birds from transformed primordial germ cells // Proc. R. Soc. Lond. S. B. — 1993. — Vol. 251. — P. 179-182.

73. Wakayama T., Yanagimachi R. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age type // Mol. Reprod. Dev. — 2001. — Vol. 58 (4). — P. 376-383.

74. Watanabe M., Naito M., Sasaki E. et al. Liposome-mediated DNA transfer into chicken primordial germ cells in vivo // Mol. Reprod. Dev. — 1994. — Vol. 38. — P. 268-274.

75.Wentworth B., Tsal H., Wentworth A. et al. Primordial germ cells for genetic modulation of poultry // American Society of Animal Sci., Savoy, Illinois, 1995. — P. 202-227.

76. Wheeler M. B. Development and validation of swine embryonic stem cells: a review // Reprod. Fertil. Dev. — 1994. — Vol. 6. — P. 563-568.

77.Wilmut J., Shnieke A. E., McWhir J. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells // Nature. — 1997. — Vol. 385(6619). — P. 810-813.

78.Wolf E., Shernthaner W., Zakhartchenko V. et al. Transgenic technology in farm animals-progress and perspectives // Exp. Physiol. — 2000. — Vol. 85(6). — P. 615-625.

79. Yasuda Y., Tajima A., Fujimoto T., Kuwana T. A method to obtain avian germline chimeras using isolated primordial germ cells // J. Repr. Fert. — 1992. — Vol. 96. — P. 521-528.

80. Yanagimachi R. Mechanisms of fertilization in mammals // Acad. New York. — 1981. — P. 82-182.