Влияние обработки NO-содержащей холодной плазмой на уровень нитротирозина крови in vitro

МЕДИ^

УДК 577.112.4:598/599+591.1

ВЛИЯНИЕ ОБРАБОТКИ NO-СОДЕРЖАШЕЙ ХОЛОДНОЙ ПЛАЗМОЙ НА УРОВЕНЬ НИТРОТИРОЗИНА КРОВИ IN VITRO

Целью исследования служила оценка уровня лабораторных признаков нитрозативного стресса при обработке крови газовым потоком, содержащим NO. Объектом исследования явились образцы цельной консервированной крови здоровых доноров (n=14), разделенные на 3 порции (по 5 мл). Первую порцию обрабатывали NO-содержащей холодной плазмой (аппарат «Плазон»; 100 мл) путем барботажа в пробирке, вторую пробу барботировали 100 мл потока холодной плазмы, предварительно разведенной воздухом (1:9). Уровень нитротирозина сыворотки крови определяли с применением тест-системы ELISA («Hycult Biotech»). Установлено, что обработка крови NO способствует развитию в крови явлений нитрозативного стресса лишь при использовании высоких концентраций агента (800 мкг/л).

Ключевые слова: оксид азота, плазма крови, нитротирозин, нитрозативный стресс.

The aim of this work is estimation of nitrosative stress laboratory marker (nitrotyrosine) at blood processing by gas flow with nitric oxide. We used samples of whole blood of 14 healthy people. They were divided in 3 parts (at 5 ml.). First portion of blood was processed by 100 ml. of NO-contained cold plasma (by «Plazon» apparatus), second portion was treated by 100 ml. of cold plasma, diluted by atmospheric air (1 : 9), third one was control. Nitrotyrosine level was tested with ELISA kit («Hycult Biotech»). It was stated, that blood processing by NO-contained cold plasma leads to nitrosative stress signs only at high NO concentration (800 mcg/l) use.

Key words: nitric oxide, blood plasma, nitrotyrosine, nitrosative stress.

А.К. Мартусевич, А.Г. Соловьева, С.П. Перетягин, Н.В. Диденко,

ФГБУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии»

Мартусевич Андрей Кимович -e-mail: cryst-mart@yandex.ru

Исследованиями последних десятилетий было показано, что монооксид азота (NO) играет многогранную роль в биологических системах, оказывая как позитивное, биорегуляторное влияние, так и обладая способностью к повреждению клеток и тканей организма [1-4]. Биорегуляторное действие NO преимущественно связано с вазотропными эффектами соединения, с учетом чего данное вещество предлагается на роль «endothelium-relaxating factor» [1, 2, 4]. Негативные эффекты NO в том числе обусловлены образованием пероксинитрита и в определенных условиях совокупностью кислородсодержащих кислот азота [2, 3].

Следует отметить, что большинство эффектов NO показано на уровне организма или ткани, тогда как действие соединения на жидкие биосистемы изучено лишь фрагментарно [1, 4]. Известно, что одним из общих путей реализации негативного действия NO (как при синтезе перокси-нитрита, так и при образовании нитритно-нитратной смеси) является развитие нитрозативного стресса [4]. Учитывая то обстоятельство, что побочным продуктом нитроксилирования биосубстратов выступает процесс нитрозилирования белков, количественной мерой выраженности указанного вида биорадикального стресса может выступать содержание нитротирозина [5, 6]. Поэтому ЦЕЛЬЮ ДАННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ служила оценка уровня лабораторных признаков нитрозативного стресса при обработке крови газовым потоком, содержащим NO.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования явились образцы цельной консервированной крови здоровых доноров (n=14). Каждый образец был разделен на три порции (по 5 мл). Первую порцию обрабатывали NO-содержащей холодной плазмой (100 мл) путем барботажа в пробирке, вторую пробу барботировали 100 мл газовой смеси, в которой поток NO-содержащей плазмы был предварительно разведен атмосферным воздухом (1 : 9). Генерацию холодной плазмы производили с помощью аппарата «Плазон», использовали среднюю мощность прибора. В выбранных условиях концентрация NO в газовом потоке составила 800 мкг/л. Продолжительность барботажа - 2 минуты. Уровень нитротирозина сыворотки крови определяли с применением тест-системы ELISA («Hycult Biotech») [5, 6]. Результаты обрабатывали с использованием Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования позволяют заключить, что нитроксилирование крови оказывает влияние на уровень рассматриваемого параметра (рис.). При этом имеет место дозозависимый эффект NO на жидкую биосистему. Так, при обработке биожидкости содержащим оксид азота газовым потоком, поступающим из манипулятора генератора, концентрация нитротирозина в сыворотке крови существенно возрастает (на 95,2% относительно контроля; p<0,05), а при 10-кратном разбавлении уровень соединения нарастает лишь незначительно.

16 меди@ ь № 4 (9) сентябрь 2013

МЕДИ Ш

РИС.

Уровень нитротирозина сыворотки крови при ее обработке оксидом азота (* - значимость различий с контрольным образцом p<0,05).

На основании этих данных можно предположить, что высокие концентрации газообразного N0 (800 мкг/л) способны оказывать негативное нитрозилирующее действие на белки и аминокислоты плазмы крови, создавая предпосылки для развития нитрозативного стресса. В то же время снижение концентрации изучаемого агента при разведении атмосферным воздухом, происходящее как за счет разбавления, так и вследствие протекания реакции соединения с компонентами воздуха, прежде всего с кислоро-

дом, с образованием смеси оксидов азота более высокой степени окисления. Это приводит к частичной «компенсации» негативного эффекта исходно высокой концентрации NO в отношении тирозинсодержащих аминокислот и белков плазмы крови. Следовательно, снижение действующей концентрации данного агента предотвращает реализацию нитрозативного стресса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлено, что обработка крови монооксидом азота способствует развитию в крови явлений нитрозативного стресса лишь при использовании высоких концентраций агента (800 мкг/л).

ЛИТЕРАТУРА

1. Ванин А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях. Вестник Российской академии медицинских наук. 2000. № 4. С. 3-5.

2. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств. М.: Вузовская книга, 2004. 360 с.

3. Hall C.N., Garthwaite J. What is the real physiological NO concentration in vivo? Nitric Oxide Biol. Chem. 2009. № 12 (2). Р. 92-103.

4. Nitric Oxide. Basic Research and Clinical Application / е<± R.J. Gryglewsky, P. Minuz. Amsterdam; Berlin; Oxford; Tokyo; Washington: IOS Press, 2001.

5. Steege J. et al. Nitrotyrosine in plasma of celiac disease patients as detected by a new sandwich ELISA. Free Rad. Biol. Med. 1998. № 25. 953 р.

6. Whiteman M. et al. Lack of tyrosine nitration by hypochlorous acid in the presence of physiological concentrations of nitrite. Implication for the role of nitryl chloride in tyrosine nitration in vivo. J. Biol. Chem. 2003. № 278. 8380 р.

17 МЕЛЯ ЛЬ № 4 (9) сентябрь 2013