Штамм бактерий Pseudomonas azotoformans для биоконверсии углеводородов из загрязненных нефтью и нефтепродуктами вод в источник биодизеля
BACTERIAL STRAIN PSEUDOMONAS AZOTOFORMANS FOR BIOCONVERSION OF HYDROCARBONS FROM OIL-CONTAMINATED AND OIL-PRODUCT-CONTAMINATED WATER TO A BIODIESEL SOURCE

Штамм бактерий Pseudomonas azotoformans для биоконверсии углеводородов из загрязненных нефтью и нефтепродуктами вод в источник биодизеля
Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D, предназначенного для активизации биодеструкции твердых парафинов и полициклических ароматических соединений в почве,  воде, жидких шламах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами в условиях пониженных температур и для трансформации углеводородных ксенобиотиков в биомассу липидных метаболитов, используемые в качестве источника биотоплива – биодизеля.
Известен штамм Pseudomonas putida 36, обладающий способностью к биодеградации нефти и нефтепродуктов [Дядечко В.Н. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья / В.Н. Дядечко, Л.Е. Толстокорова, С.Н. Гашев, М.Н. Гашева, А.В. Соромотин, Е.Б. Жданова // Почвоведение. – 1990. – № 9. – С. 148-151].
Известен штамм Bacillus species 739 [Авторское свидетельство СССР №1743019, 1989] и полученный на его основе бактериальный препарат «Бациспецин» [Патент РФ №2 077 397, опубл. 1997], используемый для рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.
Известен способ очистки воды и почвы от нефти, нефтепродуктов и полимерных добавок в буровом растворе, включающий внесение микроорганизмов, отличающийся тем, что из микроорганизмов используют ассоциацию штаммов бактерий Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1339D, Bacillus subtilis BKM B-1742D и Pseudomonas putida BKM 1301 [Патент РФ №2 093 478, опубл. 20.10.1997].
Известен консорциум микроорганизмов-деструкторов: Alcaligenes sp. Г0401ВТ №17, Micrococcus nishomyaensis Г0402ВТ №16, Brevibacterium iodinum Г0403ВТ №15, Pseudomonas aeruginosa Г0404ВТ №14, Pseudomonas facilis Г0405ВТ №13, Brevibacterium linens Г0406ВТ №12, Bacillus subtilis Г0407ВТ №11, Flavobacterium aquatile Г0408ВТ №10, Clostridium butyricum Г0409ВТ №9, используемый для очистки природных и сточных вод, почв и почвогрунтов от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности [Патент РФ №, 2 376 084, опубл. 20.12.2009].
Известен консорциум штаммов микроорганизмов Acinetobacter sp. ВКМ В-2753D и Ochrobactrum sp. ВКМ В-2754D, обладающий нитрогеназной активностью. Консорциум способен к фиксации атмосферного азота и обладает высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам при их высоком содержании в субстрате [Патент РФ № 2 553 540, опубл. 20.06.2015].
Известен способ обработки нефтяного шлама [Патент РФ №2 198 747, опубл. 2000], заключающийся в том, что нефтяной шлам смешивают с микроорганизмами и биостимулятором. Для этого в нефтяной шлам добавляют чистую почву и древесные опилки в массовом соотношении 1:2:1, в качестве микроорганизмов используют штамм бактерий Bacillus sр. ВНИИСХМ 132, а в качестве биостимулятора – белковую кормовую добавку «Биотрин», после периода инкубации микроорганизмов (не менее 50 суток) проводится дополнительная обработка почвы биостимулятором.
Известен способ обезвреживания грунтов от нефтепродуктов [Патент РФ №2 075 447, опубл. 1997], в котором производится сбор зараженного грунта, разделение и переработка шлама культивированными биологическими штаммами аэробных и анаэробных микроорганизмов.
Основные заявленные способности штаммов и консорциумов микроорганизмов, в представленных патентах, это очистка почв, сточных вод, почвогрунтов, шламонакопителей от нефтепродуктов с утратой энергетического ресурса (без выхода вторичного сырья).
Наиболее близким к заявляемому по технической сущности относится микробиологический способ увеличения содержания светлых и масляных фракций в нефти, в нефтепродуктах и другом углеводородном сырье с одновременной изомеризацией бензиновой фракции [Патент РФ № 2 405 825, 10.12.2010]. Предложенное изобретение позволяет улучшить качество получаемых нефтепродуктов за счет увеличения содержания светлых и масляных углеводородных фракций, снижения содержания темных фракций, мазута и кокса, что в свою очередь обеспечивает улучшение качества и эксплуатационных характеристик получаемых нефтяных фракций.
Таким образом, в данных патентах заявленных свойств у известных штаммов и консорциумов микроорганизмов – трансформация углеводородных ксенобиотиков в биомассу липидных метаболитов не обнаружено.
Задача изобретения - получение штамма Pseudomonas azotoformans, обеспечивающего активизацию биодеструкции твердых парафинов и полициклических ароматических соединений в почве,  воде, жидких шламах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами с одновременной трансформацией углеводородных ксенобиотиков в биомассу липидных метаболитов, используемые в качестве источника биотоплива – биодизеля.
В этом состоит технический результат.
3
2
4
4
2
Для достижения технического результата из нефтезагрязненных почв Усинского района Республики Коми была получена накопительная культура Pseudomonas azotoformans на среде следующего состава: на 1000 мл воды: 30 г, NaNO– 3,0 г; KHPO – 1,0 г; KCl – 0,5 г; MgSO×5HO - 0,5 г; 15-25°С, 3-5 суток в условиях жидкофазной ферментации.
Штамм характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками:
Грамотрицательные прямые подвижные палочки с полярно расположенными жгутиками.
Колонии на мясо-пептонном агаре, средах Чапека-Докса и Эшби мелкие округлой формы с ровными краями, выпуклые, полупрозрачные,
На МПА колонии желтоватые, на Чапека-Докса и Эшби белесые с желтоватым оттенком.
Консистенция слизистая.
Выделяет в среду дифундирующий флюоресцирующий желто-зеленый пигмент на 3-4 сутки, на среде Эбши – на седьмые.
Аэроб, факультиативный анаэроб, способен к денитрификации.
Лактозоотрицательный, при 37°С не растет. Каталазный тест положительный.
Предпочтительная среда культивирования – мясо-пептонный агар.
Данные молекулярно-генетического анализа:
Уровень сходства последовательности фрагмента гена 16S rRNA штамма 1Y-2014 с последовательностями ближайших типов штаммов
Уровень сходства последовательностей фрагмента гена gyrB и белковой последовательности штамма 1Y-2014  с последовательностями ближайших типов штаммов
В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно- эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.
3
2
4
4
2
Режим хранения штамма – длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) – периодические пересевы – 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды: сахароза – 30 г, NaNO– 3,0 г; KHPO – 1,0 г; KCl – 0,5 г; MgSO×5HO - 0,5 г; агар микробиологический – 20,0 г; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.
Нефтеокисляющую способность штамма Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D и способность штамма к утилизации нефтепродуктов в липидные метаболиты изучали в лабораторных экспериментах с модельной нефтезагрязненной средой. Результаты приведены в примерах ниже.
Пример 1. Исследован штамм Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D на изменение содержания нефтепродуктов и ПАУ в условиях жидкофазного культивирования на среде Чапека, обогащенной нефтью.
3
2
4
4
2
В колбы вместимостью 250 мл готовили неагаризованную среду Чапека без сахарозы, следующего состава: на 1000 мл воды – NaNO– 3.0 г; KHPO – 1.0 г; KCl – 0.5 г; MgSO×5HO – 0.5 г, стерилизовали. Добавляли нефть по 0.5 г и 5 мл наработанного штамма. Культивировали в течение 7 суток в при температуре +23°С и при температуре +6°С, 220 об/мин. В качестве контроля было определено содержание нефтепродуктов, ПАУ, в среде Чапека с добавлением нефти без биомассы штамма.
По истечении семи суток нефть извлекали из ферментационных колб экстракцией гексаном и анализировали фракции углеводородов. Разделение экстрактов проводили методом колоночной хроматографии. На колонке с оксидом алюминия отделяли фракцию н-алканов и полициклических ароматических соединений (фракция F1) от полярных соединений. Далее на колонке с силикагелем фракцию F1 разделяли на фракции н-алканов (F2) и полициклических ароматических соединений (F3) [Габов Д.Н. Насыщенные углеводороды в фоновых и загрязненных почвах Предуралья / Д.Н. Габов, В.А. Безносиков, Б.М. Кондратенок, И.В. Груздев // Почвоведение. – 2010. – № 10. – С. 1–7].
В основу определения ПАУ в почве положена методика М 03-04-2002 – измерение массовой доли бенз[a]пирена в пробах почв, грунтов донных отложений и твердых отходов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием анализатора “Флюорат-02” в качестве флуориметрического детектора [Габов Д.Н. Закономерности формирования полициклических ароматических углеводородов в почвах Северной и Средней тайги / Д.Н. Габов, В.А. Безносиков, Б.М. Кондратенок, Е.В. Яковлева // Почвоведение. – 2008. – № 11. – С. 1334–1343].
Визуальный осмотр колб до и после культивирования в нефтезагрязненной среде биомассы штамма Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D при температуре +6°С зафиксировал эмульгацию углеводородов нефти (о чем свидетельствует изменение цвета) по сравнению с колбой, в которой находилась нефтезагрязненная среда без обработки штаммом (Контроль) (рис.1, 2).
На Рис. 1. Начало эксперимента: а) Контроль, б) Вариант с добавлением биомассы штамма Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D.
На Рис.2.Эксперимент спустя 7 суток: а) Контроль, б) Вариант с добавлением биомассы штамма Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D.
Эффективность очистки подтвердилась снижением концентрации нефтепродуктов в пробах после экспозиции в течении 7 суток как при комнатной температуре, так и при температуре +6°С (табл.1).
Таблица 1. Изменение концентрации нефтепродуктов (мг) в пробах после экспозиции в течение 7 суток
Вариант опыта
Масса нефтепродуктов в пробе после экспозиции при комнатной температуре, мг
Масса нефтепродуктов в пробе после экспозиции при температуре +6°С, мг
Контроль
300,0
182,0
Штамм Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D
195,0
172,0
Внесение культуры испытуемого штамма после семидневной инкубации в нормальных условиях показало значительное снижение количества вещества 3-4-ядерных ПАУ, тогда как статистически достоверных изменений в количестве 5-6-ядерных ПАУ отмечено не было (Табл.2).
Таблица 2. Количество вещества ПАУ (мкмоль) в опыте в нормальных условиях в течение 7 суток
ПАУ
Контроль
Штамм Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D
флуорен
4992
1166
фенантрен
644
240
антрацен
10,67
3,78
пирен
106,44
15,04
бенз[а]антрацен
19,12
3,07
бенз[b]флуорантен
29,96
10,83
бенз[а]пирен
2,74
3,11
дибенз[a,h]антрацен
4,78
12,09
бенз[ghi]перилен
1,70
0,00
Сумма ПАУ
5811,97
1454,96
В результате инкубации в условиях +6°С отмечено преимущественное разложение фенантрена, незначительное накопление бенз[b]флуорантена и бенз[ghi]перилена, а также элиминация из системы бенз[а]пирена, обладающего высокой канцерогенной активностью. Иных статистически достоверных изменений в содержании полиаренов не отмечено (Табл.3).
Таблица 3. Количество вещества ПАУ (мкмоль) в опыте в течение 7 суток при экспозиции при температуре +6°С
ПАУ
Контроль
Штамм Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D
флуорен
72
72
фенантрен
239
61
антрацен
5,06
7,47
пирен
16,44
14,85
бенз[а]антрацен
6,71
8,55
бенз[b]флуорантен
10
19
бенз[а]пирен
6,98
0,00
дибенз[a,h]антрацен
0,00
0,00
бенз[ghi]перилен
7,90
15,11
Сумма ПАУ
365,10
198,31
3
2
4
4
2
Пример 2. Исследован штамм Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D  на изменение жирнокислотного состава в условиях культивирования на среде Чапека, обогащенной нефтью. В колбы на 250 мл готовили неагаризованную среду Чапека без сахарозы, следующего состава: на 1000 мл воды - NaNO– 3.0 г; KHPO – 1.0 г; KCl – 0.5 г; MgSO×5HO – 0.5 г, стерилизовали. Добавляли нефть по 0.5 г и 5 мл наработанного штамма. Культивировали в течение 7 суток в инкубаторе при 24 градусах и при 220 об/мин. В качестве контроля было определено содержание жирных кислот в накопленной биомассе штамма Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D на среде Чапека без добавления нефти, а также содержание жирных кислот в среде Чапека с добавлением только нефти (табл. 4). Жирные кислоты выделяли по методу Синяка с соавторами [Авторское свидетельство № 542932 СССР, G 01 N 1/28, 1977, Бюл. №2.].
Таблица 4. Массовая доля жирных кислот для комплекса 1У–2014, %
Кислоты
Среда + штамм Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D
Среда +нефть + штамм Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D
Контроль (нефть)
С 12:0
0,0
2,6
6,4
С 14:0
0,0
10,3
1-
С 16:0
75,0
52,6
48,2
С 16:1
4,2
0,0
-
С 18:0
16,7
19,2
8,2
С 18:1 (11)
0,0
3,8
1,8
С 18:2 cis
4,2
11,5
16,4
Название кислот: С12:00 - лауриновая; С14:0 – миристиновая; С16:0 – пальмитиновая; С16:1 – пальмитолеиновая; С18:0 – стеариновая; С18:1 (11) –вакценовая; С18:2 – линолевая;
±∆ - доверительный интервал абсолютной погрешности при P = 0,95
Жирнокислотный состав липидов штамма Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D проведен с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (Smartline, Knauer, Германия) и газовой хроматографии (газовый хроматограф Кристалл 2000 М (Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Идентификацию липидов осуществляется методом хромато-масс-спектрометрии на приборе Finnigon Trase DSQ Thermo-Electron (CША). Эти современные методы анализа дают качественное и количественное определение жирных кислот даже при низких концентрациях лимитирующих компонентов.
В отсутствии нефтепродуктов основной синтез метаболитов жиров комплекса (штамм Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D) приходится на насыщенные жирные кислоты: С16:00-пальмитиновую (75%) и С18:00 стеариновую (16,7%), лимитирующими кислотами являются ненасыщенные С16:1 – пальмитолеиновая и С18:02 линолевая, массовая доля которых составила 4,2%.
При утилизации нефтепродуктов происходит смена метаболизма комплекса (1Y 2014). Начинается синтез новых кислот, таких как С12:00 – лауриновой, С14:00 – миристиновой и С18:01 – олеиновой. Увеличился в два раза синтез С18:02 линоленовой кислоты.
Синтез лауриновой и миристиновой кислот связан с необходимостью бактерий в эмульгации нефтепродуктов, в результате которой происходит увеличение поверхности соприкосновения бактерий с нефтью и улучшение ее утилизации. Лауриновая кислота обладает антимикробными и антибактериальными свойствами, таким образом, микроорганизмы стерилизуют среду, в которой находятся.
Биотопливо – биодизель состоит из смеси эфиров жирных кислот [Atadashi, I.M. High quality biodiesel and its diesel engine application: A review / I.M. Atadashi, M.K. Aroua, A. Abdul Aziz // Renewable Sustainable Energy Rev. – 2010. – V. 14. – P. 1999-2008]. Основной характеристикой работы современных дизельных двигателей является цетановое число от 45 до 55. Стандартное топливо характеризуется цетановым числом 48-51, а топливо высшего качества (премиальное) имеет цетановое число 51-55. Согласно российским стандартам, цетановое число летнего и зимнего дизтоплива должно быть не менее 48 единиц  [ГОСТ 305-82. Топливо дизельное; ГОСТ Р 52709]. Содержание жирных кислот указывает на объемную долю цетана. При расчете характеристик биодизеля [http://brteam.ir/analysis/#id02] на основании состава и содержания индивидуальных жирных кислот (табл.4) выявлено, что штамм Pseudomonas azotoformans ВКМ В-3254D  способен трансформировать углеводородные ксенобиотики в биомассу липидных метаболитов-источников биодизеля.