ЭКСПРЕСС-СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ СОБАК ПЕЧЕНОЧНОГО (LALP) И СТЕРОИДИНДУЦИРОВАННОГО (CALP) ИЗОФЕРМЕНТОВ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ
EXPRESS METHOD OF DETECTING LIVER (LALP) AND CORTICOSTEROID-INDUCED (CALP) ISOZYMES OF ALKALINE PHOSPHATASE ON BLOOD SERUM OF DOGS

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к биотехнологии, и может быть использовано в иммуно-ферментном анализе.
Известен способ определения общей активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови животного, заключающийся в селективном ингибировании, при котором вклад конкретного изофермента в общую активность оценивается на основании изменения кинетических характеристик ферментативной реакции до и после применения селективного ингибитора. Наиболее часто в качестве ингибитора применяется препарат левамизол. Исследования показали, что: 1- в сыворотке здоровых собак доминирует костный (BALP) изофермент щелочной фосфатазы, имеются следы печеного (LALP) изофермента и отсутствует стероидиндуцированный (CALP) изофермент; 2- активность печеночного (LALP) изофермента повышается при заболеваниях печени; 3- активность стероидиндуцированного (CALP) изофермента повышается при спонтанном или индуцированном гиперадренокортицизме; 4- костный (BALP) изофермент чувствителен к температурному воздействию и быстро теряет свою активность, в то время как LALP и CALP изоферменты дольше сохраняют свою активность при нагревании; 5- BALP и LALP изоферменты высоко чувствительны к ингибированию левамизолом, в то время как CALP изофермент устойчив (см. 1. Бокарев А.В., Стекольников А.А., Суворов О.Н. ВИДЫ ИНГИБИРУЮЩЕГО ВЛИЯНИЯ ЛЕВАМИЗОЛА НА ALP В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ИЗОФЕРМЕНТНОГО СОСТАВА ЕЕ СЫВОРОТОЧНОГО ПУЛА. Структурно-функциональные особенности биосистем севера (особи, популяции, сообщества). Материалы конференции (26-30 сентября 2005 года, г. Петрозаводск). Часть 1 (А-Л). Петрозаводск. Издательство ПетрГУ. 2005 г., с. 50-52.
2. Стекольников А.А., Бокарев А.В. ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПЕЧЕНОЧНОГО ИЗОФЕРМЕНТА ALP ПРИ ЛЕЧЕНИИ СОБАК ЦИКЛОФОСФАНОМ. Структурно-функциональные особенности биосистем севера (особи, популяции, сообщества). Материалы конференции (26-30 сентября 2005 года, г. Петрозаводск). Часть 2 (М-Я). Петрозаводск. Издательство ПетрГУ. 2005 г., с.152-154.
3. Бокарев А.В., Стекольников А.А. Активность щелочной фосфатазы и концентрация сиаловых (нейраминовых) кислот в сыворотке крови у собак с некоторыми патологиями костной системы. Актуальные проблемы ветеринарной медицины: сборник научных трудов №134 - СПбГАВМ. 2002 г., с.31-33).
Задача изобретения - быстрая, более точная и дифференциальная диагностика субклинических форм гепатопатологии, а также экспресс-диагностики гиперадренокортицизма.
Технический результат поставленной задачи достигается тем, что в экспресс-способе обнаружения в сыворотке крови собак печеночного (LALP) и стероидиндуцированного (CALP) изоферментов щелочной фосфатазы, заключающемся в определении общей активности щелочной фосфатазы (TALP) в сыворотке крови обследуемого животного, предлагается исследуемую сыворотку инактивировать при 60°С в течение 10 минут, и по окончании тепловой обработки моментально перенести в ледяную баню, при этом количество сыворотки, используемое при инактивации, должно соответствовать количеству сыворотки, используемому для определения активности фермента, затем кинетическим способом определить активность фермента в инактивированной сыворотке.
Экспресс-способ обнаружения в сыворотке крови собак печеночного (LALP) и стероидиндуцированного (CALP) изоферментов щелочной фосфатазы осуществляется следующим образом.
1. Определяем общую активность щелочной фосфатазы (TALP) в сыворотке крови обследуемого животного.
2. Инактивируем исследуемую сыворотку при 60°С в течение 10 минут и по окончании тепловой обработки моментально переносим в ледяную баню. Следует учитывать, что в процессе нагревания часть воды, содержащейся в сыворотке, может испаряться, что приведет к концентрации биологического материала и искуственному увеличению удельной активности фермента. Поэтому количество сыворотки, используемое при инактивации, должно соответствовать количеству сыворотки, используемому для определения активности фермента.
3. Определяем активность фермента в инактивированной сыворотке. Учитывая, что сыворотка после термической обработки мутнеет, определение активности фермента следует проводить кинетическим способом (а не по «конечной точке»), поскольку в кинетических способах не используется контрольная проба, мутность которой отличается от опытной пробы.
4. Высчитываем остаточную величину активности фермента в % по формуле
- Величина остаточной активности свыше 2±1.00% является показателем того, что в сыворотке крови присутствует LALP или CALP изофермент.
- Величина остаточной активности свыше 29±3.46% является показателем того, что в сыворотке крови точно присутствует CALP изофермент.
- Величина остаточной активности 72±7.17% и выше является показателем того, что в данном образце сыворотке крови практически 100% ферментативной активности обусловлено CALP изоферментом.
-4
5. В том случае если величина остаточной активности фермента свыше 2±1.00% и имеет место необходимость дифференциации LALP и CALP изоферментных активностей, повторно определяем активность фермента в инактивированной сыворотке в присутствии левамизола (10 М).
6. Высчитываем остаточную величину активности фермента в % по формуле
В том случае, если левамизол подавляет активность щелочной фосфатазы термоинактивированной сыворотки менее чем на 70%, следует считать, что в сыворотке присутствует активность CALP изофермента.
Положительный эффект заявляемого изобретения состоит в возможности быстрой диагностики и дифференциальной диагностики субклинических форм гепатопатологии, а также экспресс-диагностики гиперадренокортицизма. Способ можно использовать для изучения метаболизма изоферментов щелочной фосфатазы в организме собак в различных условиях патологии и нормы.