Способ дифференциации штаммов Yersinia pestis путем молекулярно-генетического типирования с использованием в качестве генетических маркеров IS-элементов
METHOD FOR DIFFERENTIATION OF YERSINIA PESTIS STRAINS BY MOLECULAR GENETIC TYPING USING IS ELEMENTS AS GENETIC MARKERS

Предполагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и генетической инженерии и может быть использовано в лабораторной диагностике для получения индивидуальной генотипической характеристике штаммов Yersinia pestis на основе маркерных IS-локусов, позволяя дифференцировать штаммы на основные и неосновные подвиды.
Углубленная характеристика штаммов Y. pestis требует необходимости проведения их генотипирования. В настоящее время существует большое количество способов генотипирования штаммов Y. pestis.
Известны способы генотипирования штаммов Y. pestis [1, 2, 3, 4], которые включают метод VNTR типирования, последний основан на получении в ПЦР генотипической характеристики штаммов при использовании праймеров, выявляющих локусы, включающие вариабельные тандемные повторы. Конкретное число тандемных повторов в исследуемых штаммах является одной из генетических особенностей штамма.
Однако при простоте способа в исполнении, он требует больших усилий для правильного учета результатов и определения точной длины амплифицированных продуктов ПЦР. Определить разницу в длине амплифицированных фрагментов у различных штаммов не всегда удается.
Известено SNP-типирование (типирование по единичным нуклеотидным полиморфизмам), включающий генотипирование штаммов возбудителя чумы при сравнении распределения маркерных SNP в геноме Y. pestis [5, 6, 7].
Недостатком этого способа является сложность исполнения, так как требует для прочтения нуклеотидной последовательности геномов их секвенирование, что является затратным в экономическом плане видом анализа и занимает длительное время. Секвенирование проводят квалифицированный персонал диагностических и Референс-центров с помощью дорогостоящих импортных приборов и реактивов к ним.
За прототип выбран способ генетического типирования [8], в котором исследуют распространенность двух IS - элементов (IS100 и IS285) в геномах штаммов возбудителя чумы, который выполняют поэтапно:
- во первых проводят ферментацию эндонуклеазами рестриции хромосомной и плазмидной ДНК;
- во вторых осуществляют пульсгельэлектрофоретическое разделение рестрицированных фрагментов;
- в третьих переносят разделенные фрагменты на мембрану;
- в четвертых проводят гибридизацию фрагментов с зондами, сконструированными на основе ДНК мобильных элементов, которые предварительно помечают радиоактивной меткой 32Р-дЦТФ или химической меткой, например алкалин-фосфотазой [9].
Недостатком прототипа является его сложность в исполнении, высокая себестоимость, трудозатратность и плохая воспроизводимость.
При этом авторы использовали для генотипирования только два IS элемента, что в ряде случаев не является достаточным для эффективной генетической дифференциации штаммов внутри вида.
Кроме того необходимость проведения эксперимента с радиоактивной либо химической меткой, например зонды меченные алкалин-фосфотазой осложняют безопасность исследования.
Технической задачей предполагаемого изобретения является разработка нового доступного лабораториям различного уровня способа генотипирования, позволяющего достоверно, быстро и с невысокой себестоимостью осуществлять дифференциацию штаммов Y. pestis в ПЦР с мишенями на основе IS-маркеров.
Поставленная задача достигается тем, что в способе дифференциации штаммов Y. pestis путем молекулярно-генетического типирования с использованием в качестве генетических маркеров IS-элементов, включающем выделение ДНК из исследуемого штамма, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет реакции с помощью электрофореза, отличие заключается в том, что выявляют в ДНК исследуемого штамма, на основе мобильных генетических элементов, восемь IS-маркеров, для этого при проведении ПЦР готовят восемь пробирок объемом 0,6 мкл, куда вносят реакционную смесь и по одной паре в каждую пробирку следующие олигонуклеотидные праймеры:
1) Bfrn/1541E2 в гене ферредоксина (bacterioferritin-associated ferredoxin)
Forward: GCTTTGCGAATGACTTTGTCAGA
Reverse: GTGAGCAACTCTCGATCCCGTAT
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 290 пар оснований;
2) Bfrn/100S в гене ферредоксина (bacterioferritin-associated ferredoxin)
Forward: GCTTTGCGAATGACTTTGTCAGA
Reverse: GCTACTCATTCCCTGCTTGTGC
3) YPO2034/1541E2 в гене YPO_2034 (putative ABC transporter ATP-binding protein)
Forward: GGGAAATCGGTCAACAGCCT
Reverse: GTGAGCAACTCTCGATCCCGT
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 278 пар оснований;
4) Phage-psgen/285E в одном из фаговых генов (putative phage domain protein)
Forward: CAGCATCTTGGCAATAATCAAAGAA
Reverse: AGGTTGTTTATTTGGCGATCAAGG
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 202 пар оснований;
5) FlgF/1541Е2 в гене флагеллярного белка YPO_0726
Forward: CAGCCTGTCACAACAACAGATCC
Reverse: GTGAGCAACTCTCGATCCCGT
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 236 пар оснований;
6) YPO0781/100S в псевдогене YPO_0781
Forward: GCCTTACCGCGATATTGCAAT
Reverse: GCTACTCATTCCCTGCTTGTGC
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 169 пар оснований;
7) Chemotac/100S в гене белка хемотаксиса (methyl-accepting chemotaxis protein)
Forward: GGACTACCGTGCCATCAGGTT
Reverse: GCTACTCATTCCCTGCTTGTGC
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 230 пар оснований;
8) PbpC/285Е в гене пенициллин-связуещего белка (penicillin-binding protein PbpC)
Forward: GGTACGCCAAGCGATATCTTTATC
Reverse: AGGTTGTTTATTTGGCGATCAAGG
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 269 пар оснований, при этом после проведения ПЦР реакционные смеси из 8-и пробирок, наносят на 2% агарозный гель и разделяют амплифицированные фрагменты путем электрофореза с окрашиванием этидиум бромидом в присутствии маркеров молекулярных весов и при визуализации в проходящем УФ-свете, учет результатов проводят по набору фрагментов с определенным молекулярным весом для каждой пары праймеров и устанавливают уникальный генотип по восьми IS-маркерам, затем полученные результаты сравнивают с идентификационной таблицей и дифференцируют штаммы Y. pestis по их генетическим группам на основные и неосновные подвиды.
При этом ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит:
10 мкл 2,5 кратного буфера,
2
1,0 мМ MgCl,
0,25 mM смеси dNTP,
0,5 ед Tag DNA полимеразы,
25 нг исследуемой ДНК в объеме 5 мкл.
Кроме того ПЦР проводят с соблюдением следующих этапов и режимов:
- 95°С этап денатурации - 3 мин,
- 95°С этап денатурации - 15 сек,
- 57°С этап отжига праймеров - 15 сек,
- 72°С этап элонгации - 15 сек,
- Повтор 2, 3 и 4 этапов 35 раз,
- 72°С этап элонгации - 5 мин.
Обоснование выбора праймеров.
Поиск мобильных генетических элементов в геномах штаммов Yersinia pestis с помощью веб-ресурса KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes kegg.jp) позволил выявить наличие либо отсутствие ряда мобильных генетических элементов (МГЭ) у различных штаммов микроорганизмов этого вида в гомологичных локусах. Было выбрано несколько референтных штаммов, в которых определены маркерные локусы присутствия в геномах IS и других мобильных элементов: Y. pestis CO92, Y. pestis Antiqua, Y. pestis Harbin35, Y. pestis Microtus 9100, Y. pestis Pestoides F. В исследованных локусах изучалось наличие ряда генетических элементов либо их остатков, таких как IS 100, IS285, IS 1541, IS1661, IS1400, профаг, Duf 433, tnp10, tnp11. На основании результатов этого анализа было обнаружено 70 локусов, содержащих маркеры МГЭ. Для детекции МГЭ с помощью ПЦР в выявленных локусах были сконструированы пары олигонуклеотидных праймеров (см. таблица 1).
F - Forvard - прямой, R - Reverse - обратный
Из 70 локусов, после проведения ПЦР, отобрали 8 локусов, представлявших псевдогены, содержащие в своем составе МГЭ. Тестирование штаммов Y. pestis с помощью праймеров на основе выбранных 8 локусов в ПЦР позволило эти штаммы по наборам амплификационных
фрагментов разделить на 6 генетических групп. Распределение штаммов по генетическим группам имело корреляцию с подвидами и биоварами Y. pestis. В соответствии с результатами была составлена «Идентифицирующая таблица» включающая полученные генетические группы с определением, к каким группам принадлежит тот либо иной биовар и ряд подвидов (таблица 2),
Идентифицирующая таблица 2 отражает результаты ПЦР с использованием праймеров, сконструированных на основе IS-маркеров и ДНК штаммов Y, pestis.
Дополнительно было установлено, что прайм еры Bfrn/1541E2 и Bfrn/100S позволяют дифференцировать африканские и среднеазиатские штаммы биовара antiqua. Африканские штаммы Y. pestis положительно взаимодействуют в ПЦР с праймерами Bfrn/100S и не взаимодействуют с праймерами Bfrn/1541E2 в то время как среднеазиатские штаммы показывают противоположный результат. Результаты исследований, представленных в Идентификационной таблице, свидетельствуют о том, что с помощью предложенного способа генотипирования штаммы Y. pestis разделяются на генетические группы, которые представляют отдельные биовары. К 1-3 генетическим группам относятся штаммы основного подвида, опасные для человека, тогда как в 4-6 генетические группы находятся штаммы возбудителя чумы неосновных подвидов для человека неопасные. При этом в ряде случаев существует возможность различать группы штаммов внутри биоваров.
Способ осуществляется следующим образом.
Перед постановкой способа дифференциации штаммов Y. pestis выделяют ДНК исследуемой культуры. Бактериальную суспензию штамма в дистиллированной воде вносят в микропробирку объемом 0,6 мл, после чего проводят обеззараживание материала и выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [10]. Затем в ПЦР в отдельных пробирках проводят амплификацию выделенной ДНК со следующими праймерами:
1) Bfrn/1541E2 в гене ферредоксина (bacterioferritin-associated ferredoxin)
Forward: GCTTTGCGAATGACTTTGTCAGA
Reverse: GTGAGCAACTCTCGATCCCGTAT
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 290 пар оснований;
2) Bfrn/100S в гене ферредоксина (bacterioferritin-associated ferredoxin)
Forward: GCTTTGCGAATGACTTTGTCAGA
Reverse: GCTACTCATTCCCTGCTTGTGC
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 334 пар оснований;
3) YPO2034/1541E2 в гене YPO_2034 (putative ABC transporter ATP-binding protein)
Forward: GGGAAATCGGTCAACAGCCT
Reverse: GTGAGCAACTCTCGATCCCGT
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 278 пар оснований;
4) Phage-psgen/285E в одном из фаговых генов (putative phage domain protein)
Forward: CAGCATCTTGGCAATAATCAAAGAA
Reverse: AGGTTGTTTATTTGGCGATCAAGG
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 202 пар оснований;
5) FlgF/1541Е2 в гене флагеллярного белка YPO_0726
Forward: CAGCCTGTCACAACAACAGATCC
Reverse: GTGAGCAACTCTCGATCCCGT
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 236 пар оснований;
6) YPO0781/100S в псевдогене YPO_0781
Forward: GCCTTACCGCGATATTGCAAT
Reverse: GCTACTCATTCCCTGCTTGTGC
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 169 пар оснований;
7) Chemotac/100S в гене белка хемотаксиса (methyl-accepting chemotaxis protein)
Forward: GGACTACCGTGCCATCAGGTT
Reverse: GCTACTCATTCCCTGCTTGTGC
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 230 пар оснований;
8) PbpC/285Е в гене пенициллин-связуещего белка (penicillin-binding protein PbpC)
Forward: GGTACGCCAAGCGATATCTTTATC
Reverse: AGGTTGTTTATTTGGCGATCAAGG
направляющих синтез олигонуклеотида длиной 269 пар оснований. Условия проведения реакции амплификации
2
Готовят восемь пробирок для реакционных смесей ПЦР. Реакционные смеси объемом по 25 мкл включают: олигонуклеотидные праймеры представленные в таблице 1, по каждой паре на отдельную пробирку (смесь), 2,5 × ПЦР-буфер - 10 мкл, MgCl - 1,0 мМ, смесь dNTP - 0,25 мМ, Taq DNA полимеразу - 0,5 ед., исследуемую ДНК - 25 нг в объеме 5 мкл.
После этого осуществляют постановку реакции амплификации в амплификаторе, в котором заданы следующие условия амплификации:
1) 95°С этап денатурации - 3 мин,
2) 95°С этап денатурации - 15 сек,
3) 57°С этап отжига праймеров - 15 сек,
4) 72°С этап элонгации - 15 сек,
5) Повтор 2, 3 и 4 этапов 35 раз,
6) 72°С этап элонгации - 3 мин.
Учет результатов типирования проводят визуально после электрофоретического разделения фрагментов, полученных в ПЦР, в 2% агарозном, либо 10% полиакриламидном геле в присутствии маркеров молекулярных весов, позволяющих при окраске ДНК этидиум бромидом либо другими интеркалирующими агентами в геле оценить молекулярные веса полученных амплификатов в проходящем УФ-свете.
Анализ результатов заключается в получении для каждого исследуемого штамма набора из восьми фрагментов амплификации определенного размера и в зависимости от набора этих фрагментов относят штамм к одной из генетических групп (IS-типу), которая характеризуется тождественным по молекулярным весам набором амплификатов, представленным в идентификационной таблице 2. Включение исследуемого штамма в одну из генетических групп свидетельствует о родстве этого штамма с теми, которые находятся в этой группе.
Сущность изобретения поясняется примерами.
Пример 1. Типирование штамма Y. pestis 231 в модельном эксперименте. Штамм получен из коллекции ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора.
Выделение ДНК штамма Y. pestis 231 проводят согласно стандартной методике [10]. Основным этапом является постановка ПЦР с выделенной ДНК в амплификаторе с использованием восьми пар праймеров. ПЦР проводят при использовании программы амплификации: 1) 95°С - 3 мин, 2) 95°С - 15 сек, 3) 57°С - 15 сек, 4) 72°С - 15 сек, 5) повтор 2 и 3 и 4 этапов 35 раз, 6) 72°С - 3 мин. После проведенной ПЦР реакционные смеси 8 пробирок, каждая из которых содержит одну из пар предложенных праймеров и ДНК штамма Y. pestis 231 наносят на 2% агарозный гель и разделяют амплифицированные фрагменты с помощью электрофореза с окрашиванием этидиум бромидом в присутствии маркеров молекулярных весов и визуализацией в проходящем УФ-свете. При учете результатов ПЦР (таблица 3) определился набор фрагментов с определенными молекулярными весами для каждой пары праймеров:
Сравнение полученных результатов с идентификационной таблицей 2 свидетельствует о том, что штамм Y. pestis 231 имеет набор фрагментов амплификации характерный для генетической группы 1 с и, относится к штаммам основного подвида, биовара antique, выделенного в Средней Азии.
Пример 2. Типирование вакцинного штамма Y. pestis EV1290 НИИЭГ в модельном эксперименте. Штамм получен из коллекции ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора.
Выделение ДНК штаммов Y. pestis EV1290 НИИЭГ проводят согласно стандартной методике [10]. Основным этапом является постановка ПЦР с выделенной ДНК в амплификаторе с использованием восьми пар праймеров.
ПЦР проводят при использовании программы амплификации: 1) 95°С - 3 мин, 2) 95°С - 15 сек, 3) 57°С- 15 сек, 4) 72°С - 15 сек, 5) повтор 2 и 3 и 4 этапов 40 раз, 6) 72°С - 3 мин. После проведенной ПЦР реакционные смеси 8 пробирок, каждая из которых содержит одну из пар предложенных праймеров и ДНК штамма Y. pestis 231 наносят на 2% агарозный гель и разделяют амплифицированные фрагменты с помощью электрофореза с окрашиванием этидиум бромидом в присутствии маркеров молекулярных весов и визуализацией в проходящем УФ-свете. При учете результатов ПЦР (таблица 4) определился набор фрагментов с определенными молекулярными весами для каждой пары праймеров.
Сравнение полученных результатов с идентификационной таблицей 2 свидетельствует о том, что штамм Y. pestis EV1290 НИИЭГ имеет набор фрагментов амплификации характерный для генетической группы 3 и, относится к штаммам основного подвида, биовара orientalis.
Использование предлагаемого изобретения позволяет достоверно, быстро, с низкой себестоимостью, дифференцировать штаммы за счет применения набора праймеров. В результате предложенного набора получают индивидуальную генотипическую характеристику штамма на основе восьми маркерных IS-локусов, совокупность которых составляет самостоятельную генетическую группу. Это позволяет дифференцировать штаммы по биоварам, различать штаммы основного и неосновных подвидов и проводить деление на более мелкие генетические группы.
Применять способ возможно в лабораторной диагностике при исследованиях как вновь выявленных штаммов Y. pestis, так и штаммов находящихся в коллекциях культур учреждений, занимающихся их
Информационные источники
1. Fleche, F. A tandem repeats data base for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis / F. Fleche, Y. Hauk, L. Onteniente, A. Prieur, et al. // BMC Microbiol. - 2001. - V. 1-2.
2. Klevytska, A.M. Identification and characterization of variable-namber tandem repeats in the Yersinia pestis genome / A.M. Klevytska, L.B. Price, J.M. Schupp, P.L. Worsham, J. Wong, P. Keim // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 3179-3185.
3. Pourcel, C. Tandem repeats analysis for the high resolution phylo-genetic analysis of Yersinia pestis I C. Pourcel, F. Andre-Mazeaud, H. Neubauer, F. Ramisse, G. Vergnaud // BMC Microbiol. - 2004. 4:22.
4. Евсеева B.B. Сравнительный анализ MLVA25- И MLVA7-типирования по способности определять очаговую принадлежность штаммов Yersinia pestis на примере изолятов из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы / В.В. Евсеева, М.Е. Платонов, И.Г. Говорунов, Д.В. Ефременко, И.В. и др. // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. - 2016. - №1, - С. 37-40.
5. Achtman М., Morelli G., Zhu P. et al. Microevolution and history of the plague bacillus, Yersinia pestis. PNAS. 2004; 101:17837-432.
6. Touchman J. W., Wanger D.M., Hao J. et al. A North American Yersinia pestis draft genom sequence: SNPs and phylogenetic analysis. PLoS ONE. 2007; 2(2):e220.
7. Kutyrev V.V. Phylogeny and classification of Yersinia pestis through the lens of strains from the plague foci of Commonwealth of Inde-pendent States / V.V. Kutyrev, G.A. Eroshenko, V.L. Motin et al. // Front. Microbiol. - 2018. - V. 9. - P. 1-11.
8. Бобров, А.Г. Распространенность IS285 и IS 100 в геномах Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis. I А.Г., Бобров, А.А. Филиппов // Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 1997; - V.2. - Р. 36-40.
9. Huang, X-Z. Genotyping of a homogeneous group of Yersinia pestis strains isolated in the United States / X-Z. Huang, M.C. Chu, D.M. Engelthaler, L.E. Lindler // J Clinical Microbiol. - 2002. - Vol.40. - No. 4. - P. 1164-1173.
10. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности: Методические указания. МУ 1.3.2569-09. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2009. - 35 с.