Перепрограммирование соматических клеток человека возможно только с помощью овоцитов человека

И I II II

тп

Новости клеточных технологий

Перепрограммирование соматических клеток человека возможно только с помощью овоцитов человека

Овоцит^ клетка организма, с помощью которой возможно возвратить ядро терминально дифференцированной соматической клетки к тотипотентному состоянию

[1]. Перенос ядра соматической клетки в яйцеклетку вызывает процесс перепрограммирования, который включает в себя цепь молекулярных событий, согласованно происходящих за короткий период времени. Результатом этих событий является полное изменение паттерна экспрессии генома донорского ядра и возвращение его в состояние ядра оплодотворенной яйцеклетки, которая способна дать начало всему эмбриону.

Проведено множество исследований, в которых была показана возможность межвидового перепрограммирования, то есть переноса ядра дифференцированной клетки, полученной от организма одного вида, в овоцит организма другого вида, вслед за чем следовало возвращение донорскому ядру свойства тотипотентности и развития гибридного эмбриона до доимплантационной стадии [2, 3]. При этом, чем более близко родство этих видов, тем больше делений способна претерпеть гибридная клетка [4—6]. Этот феномен послужил основой мнения, что овоциты животных возможно использовать для получения аутогенных «эмбриональных стволовых клеток» ИСК) из соматических клеток человека. Такие гибридные ЭСК могли бы стать основой клеточной терапии самых разных заболеваний, являясь альтернативой индуцированным плюрипотентным клеткам (iPS-клеткам), для получения которых требуется вирусная трансфекция соматических клеток, и настоящим ЭСК, в случае которых невозможно получить аутогенный материал. Получение аутогенных «ЭСК» путем терапевтического клонирования с помощью овоцитов животных могло бы также помочь избежать этических сложностей, вызываемых использованием яйцеклеток человека.

На сегодняшний день не существует никаких экспериментальных подтверждений того, что с помощью межвидового переноса ядра соматической клетки (¡SCNT, от interspecies somatic cell nuclear transfer) можно получить стволовые клетки человека. Неясно также, можно ли в принципе соотносить перепрограммирование ядра соматической клетки человека в цитоплазме яйцеклетки человека и яйцеклетки животного. Лишь в одной работе было показано, что при переносе ядра из дифференцированной клетки человека в овоцит кролика можно получить жизнеспособные стволовые клетки, идентичные эмбриональным [7], но эти результаты не удалось повторить в других лабораториях [8, 9]. Существуют свидетельства, что паттерны метилирования и деметилирования геномной ДНК строго видоспецифичны [10], а это значит, что в цитоплазме овоцита животного, даже стоящего близко к человеку по эволюционной лестнице, ДНК человека не подвергнется всем необходимым эпигенетическим модификациям, и полученная гибридная клетка никогда не наст начало человеческим ЭСК.

Недавно в журнале Cloning and Stem Cells была опубликована работа научной группы Y. Chung (группа Robert Lanza), в которой исследователи дали вполне исчерпывающие ответы на эти вопросы. С помощью микрочипо-вой технологии (microarray) и тотального скрининга ДНК было показано, в какой мере происходит перепрограм-

мирование генома соматической клетки человека при переносе ее ядра в овоциты человека, кролика, коровы и мыши. Донорами ядер послужили клетки кумулюса — фолликулярные эпителиоциты. В качестве контроля в этой работе были использованы клетки из бластоцист человека, полученных путем экстракорпорального оплодотворения, а также клетки кумулюса.

После переноса ядра и активации эмбрионы культивировали, а затем проводили генотипирование образовавшихся из них бластомеров. Эмбрионы, полученные путем переноса ядра в овоцит человека, генотипировали на стадии морулы. При переносе ядра в овоцит животных генотипирование проводили на разных стадиях: от стадии восьми клеток до стадии морулы. Эта разница связана с тем, что эмбрионы, полученные при межвидовом переносе ядра, менее жизнеспособны, нежели при внутривидовом переносе, и развиваются, в зависимости от вида донора овоцита, до разных стадий. Так, при переносе ядра человеческой клетки в человеческий овоцит шестнадцатиклеточный зародыш развивается в 39% случаев, в овоцит коровы либо кролика — в 36% случаев, а в овоцит мыши — никогда, и лишь 46% зародышей достигало двухклеточной стадии. По этой причине клоны на основе мышиных яйцеклеток в сравнительном анализе не учитывали. Помимо тотального скрининга генома авторы провели анализ единичных нуклеотидных полиморфизмов (SNP-анализ), анализ митохондриальной ДНК бластомеров и кариотипирование.

Анализ геномной ДНК показал существенные различия паттернов генетической экспрессии между соматическими клетками, нормальными эмбрионами и эмбрионами, полученными путем терапевтического клонирования. Разница между экспрессией генома соматической клетки человека и бластомеров, развившихся после внутривидового переноса ядра, заключалась в различной экспрессии 6178 генов. При этом активность 5200 из них была подавлена, а у остальных, наоборот, сильно повышена. Экспрессия генов-маркеров плюрипотентности Oct-4, Sox-2 и Nanog [11] была также повышена в клонах и в нормальных эмбрионах человека, полученных путем экстракорпорального оплодотворения. Подавлялась экспрессия тканеспецифических генов (для клеток кумулюса такими генами являются гены рецептора фолликулостимулирующего гормона fshr, гиалуронан-синтазы-2 has2, и белка star). Таким образом, внутривидовой перенос ядра дифференцированной клетки в овоцит радикальным образом изменил экспрессионный паттерн геномной ДНК. Клоны, полученные путем внутривидового переноса ядра, имели нормальный диплоидный набор хромосом.

Иным образом обстояло дело при межвидовом переносе ядер. При переносе ядра в овоцит кролика только 73% эмбрионов сохраняло нормальный диплоидный кариотип. При переносе ядра в овоцит коровы эта цифра составила 67%, а в овоцит мыши — 60%. В сравнении с клеткам кумулюса человека в гибридных эмбрионах, полученных с помощью овоцитов коровы, 4629 генов имели иной паттерн экспрессии, овоцитов кролика — 3008 генов. Экспрессия 70% из этих генов была в обоих случаях подавлена. В сравнении с нормальными эмбрионами человека в клонах из коровьих эмбрионов

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 2, 2009

I I I I I I

I I I

Новости клеточных технологий

2950 генов имели иную экспрессию, из кроличьих — 2379. Таким образом, несмотря на то, что факторы, содержащиеся в цитоплазме яйцеклеток животных, были способны поддерживать жизнеспособность эмбриона в течение ограниченного времени, частично перепрог-раммируя ядро соматической клетки человека, специфического перепрограммирования и получения нормальных ЗСК не наблюдалось ни в одном случае. Только «ЗСК», полученные на основе яйцеклеток человека, имели паттерн экспрессии генов, практически не отличимый от паттерна экспрессии генома нормальных человеческих эмбриональных стволовых клеток. Анализ митохондриальной ДНК клеток клонированных эмбрионов также показал, что при межвидовом переносе ядра в образующихся бластомерах присутствуют митохондрии как с ДНК человека, так и с ДНК вида-донора овоцита.

Результат этой работы нельзя называть оптимистичным, поскольку в связи с дефицитом овоцитов человека овоциты животных являлись весьма привлекательным источником специфических для пациента стволовых клеток [12]. В то же время, этот результат, на наш взгляд, был достаточно предсказуем: в цитоплазме яйцеклетки данного вида присутствуют факторы, обеспечивающие видоспецифические эпигенетические модификации геномной ДНК. Авторы работы делают вывод, что для получения человеческих ЗСК не подходят яйцеклетки коровы, кролика и мыши. Однако из результата работы можно сделать и более общее предположение — по-видимому, межвидовой перенос ядер в принципе не может обеспечить получения нормальных, аутогенных для данного человека эмбриональных стволовых клеток.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Cibelli J., Lanza R.P., Campbell K.H.S. et al. Principles of Cloning. Academic Press, San Diego 2002.

2. Beyhan Z., Lager A.E., Cibelli J.B. Interspecies nuclear transfer: implications for embryonic stem cell biology. Cell Stem Cell 2DD7 ; 1: 5D2.

3. Tecirlioglu R.T., Jitong G., Trounson A.O. Interspecies somatic cell nuclear transfer and preliminary data for horse-cow/mouse iSCNT. Stem Cell Reviews 2006; 2: 277-88.

4. Lanza R.P., Cibelli J.B., Diaz F. et al. Cloning of an endangered species [Bos gaurus] using interspecies nuclear transfer. Cloning 2000; 2: 79-90.

5. Li Y., Dai Y., Dol W. et al. Cloned endangered species takin [Budorcas taxicolor] by inter-species ncuelar transfer and comparison of the blastocyst development with yak [Bos grunniens] and bovine. Mol. Reprod. Dev. 2006; 73: 189-95.

6. Meirelles F.V., Bordignon V., Watanabe Y. et al. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Genetics 2001 ; 158: 351.

7. Chen Y., He Z.X., Liu A. et al. Embryonic stem cells generated by nuclear transfer of human somatic nuclei into rabbit oocytes. Cell Res. 2003; 13: 251-63.

8. Jingjuan J., Tonghang G., Xianhong T. et al. Experimental cloning of embryos through human—rabbit interspecies nuclear transfer. Zool. Res. 2005; 26: 416-21.

9. Vogel G. Stem cells: ethical oocytes, available for a price. Science 2006; 313: 155.

10. Chen T., Zhang Y.-L., Jiang X. et al. Interspecies nuclear transfer reveals that déméthylation of specific repetitive sequences is determined by recipient ooplasm but not by donor intrinsic property in cloned embryos. Mol. Reprod. Dev. 2006; 73: 313—7.

11. Yu J., Vodyanik M.A., Smago-Otto K. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells Science 2007; 318: 1917-20.

12. Lanza R.P., Cibelli J.B., West M.D. Prospects for the use of nuclear transfer in human transplantation. Nat. Biotechnol. 1999; 17: 1171—4.

Подготовила А,С, Гоигорян

По материалам: Chung Y„ Bishop C.E., Treff N.R, et al. Reprogramming of human somatic cells using human

and animal oocytes. Cloning and Stem Cells 2009; 11

Применение MMCK при распространенных гнойных инфекциях

Наряду с экспериментальными исследованиями, направленными на использование дифференцировочных потенций мезенхимальных мультипотентных стромаль-ных клеток (ММСК), активно разрабатывается направление, занимающееся вопросом возможности применения принципиально иного свойства ММСК — воздействия на иммунную систему [1, 2]. В целом, результаты различных исследований свидетельствуют, что для ММСК характерны иммунорегуляторные потенции, реализующиеся через супрессию образования и активации ТЫ -хел-перов [3], натуральных киллеров [4] и В-лимфоцитов в ответ на антигенную стимуляцию [5], ингибирование дифференцировки и функции дендритных клеток [6], увеличение пула регуляторных Т-клеток [7]. В этой связи ММСК применяются для ослабления реакции «трансплантат против хозяина» [8], а также исследуется возможность их применения при аутоиммунных заболеваниях [9, 10].

Несмотря на установленное влияние ММСК на иммунный ответ, остаются не ясными в полной мере ме-

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 2, 2009

ханизмы этого эффекта. Полагают, что воздействие ММСК на иммунокомпетентные клетки реализуется как посредством клеточно-клеточных, так и гуморальных влияний, опосредованных, в частности, трансформирующим фактором роста-р1, фактором роста гепатоцитов

[11], простагландинами Е2 (ПГ-Е2) [12].

Особый интерес представляет исследование К. Nemeth с соавт. (2009), направленное не только на идентификацию механизмов иммуномодулирующего действия ММСК, но и на поиск возможности его использования в лечении пациентов при перитоните с септическим состоянием.

В качестве экспериментальной модели авторами был применен широко распространенный метод — перевязка слепой кишки в сочетании с её перфорацией [13, 14]. Следует отметить, что эта операция, прежде всего, моделирует перитонит, приобретающий разлитой характер и при отсутствии адекватного лечения часто осложняющийся сепсисом из-за высокой сорбционной способности брюшины. Перитонит представляет собой очаг инфекции, а выход бактерий и их токсинов в кровь

А