СРЕДСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОГРИБКОВОГО ПЕПТИДНОГО АНТИБИОТИКА, АКТИВНОГО В ОТНОШЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНВАЗИВНЫХ МИКОЗОВ
AGENT FOR PRODUCING AN ANTIFUNGAL PEPTIDE ANTIBIOTIC ACTIVE AGAINST PATHOGENS OF INVASIVE MYCOSES

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано в фармакологии и медицине.
Проблема распространения антибиотикорезистентных штаммов патогенных микроорганизмов является одним из общепризнанных глобальных вызовов системе здравоохранения во всех станах мира, включая и РФ. Широкое применение антибиотиков в последние десятилетия привело к тому, что до 30% случаев инфекционных заболеваний не поддается терапии стандартными препаратами, включая антибиотики последних поколений. Сдерживание экспансии резистентных штаммов, наблюдаемое по всему миру, требует применения комплексных радикальных мер, включающих разработку принципиально новых средств подавления размножения бактерий и грибов в организме человека.
Грибы - одна из самых разнообразных групп живых организмов, тем не менее, к настоящему времени описана только небольшая часть видов грибов грибных видов (около 100000), и из них только менее 1% исследовано на предмет фармакологического потенциала. Продуценты биоактивных соединений выявлены среди многих родов грибов-аскомицетов: Aspergillus, Penicillium, Acremonium, Fusarium, Alternaria, Trichoderma и Phoma (Berdy, 2005).
Традиционно микроорганизмы, продуцирующие антибиотики, выделяли из образцов почвы. Тем не менее, этот источник, по большей части, исчерпан и на первый план в поиске новых антимикробных соединений выходят нетрадиционные биотопы с недавно открытыми организмами (Sanchez, Demain, 2017). Эти биотопы включают в себя засушливые почвы, пещеры, районы с высокими (горячие источники) или низкими температурами, высокой соленостью и щелочностью, глубины морей и океанов и т.д. Выживание в таких условиях инициирует выработку различных метаболитов, имеющих своеобразную биохимию. За прошедшие 10-15 лет было выделено и охарактеризовано более 20000 таких соединений, продуцируемых экстремофильными микроорганизмами (Imhoff, 2016; Butler, Blaskovich, 2017). Несмотря на сложности обнаружения и культивирования экстремофильных грибов, проводимые скрининговые исследования показывают их огромный потенциал в качестве источников новых биоактивных соединений (Ibrar et al., 2020).
Среди различных групп экстремофильных организмов наименее изученной остаются алкалофилы, способные к росту и развитию при высоких значениях рН окружающей среды. Природными биотопами, где складываются такие условия, служат побережья содовых озер в аридных областях Евразии, Африки и Америки. Среди алкалофилов - продуцентов антимикробных соединений большую долю занимают бактерии, в частности, актиномицеты, потенциал же алкалофильных грибов практически не изучен. У алкалотолерантного гриба Paecilomyces lilacinus показан синтез пептидных антибиотиков 1907-II и 1907-VIII с антибактериальной и антифунгальной активностями. Алкалофильный гриб Aspergillus flavus продуцирует койевую кислоту и фомалигол А, обладающие активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. Алкалофильные изоляты двух видов грибов из почв пустыни Египта обладали антибактериальной активностью в отношении грамположительных бактерий (Hozzein et al., 2019). У штаммов алкалофильного гриба Emericellopsis alkalina, изолированных из щелочных засоленных почв, выделен и описан новый липопептаибол - эмерициллипсин А, обладающий антифунгальной, антибактериальной, в том числе и по отношению к грамположительным бактериям, образующим биопленки, а также противоопухолевой активностями (Rogozhin et al., 2018; Sadykova et al., 2020).
Особенно интересны представители недавно описанного рода Sodiomyces (Plectosphaerellaceae), для которых подтвержден облигатно-алкалофильный тип адаптации (Grum-Grzhimaylo et al., 2013). Показано, что в геноме S. alkalinus есть последовательности, кодирующие основные ферменты, необходимые для биосинтеза бета-лактамных антибиотиков (Grum-Grzhimaylo et al., 2018). При этом известно, что бета-лактамы быстро разлагаются при высоких значениях рН (Deshpande et al., 2004).
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по спектру антибиотической активности, который следует принять за ближайший аналог, является штамм алкалофильного микромицета Emericellopsis alkalina, депонированный в ВКПМ под номером F-1428, который продуцирует комплекс антимикробных липопептидов эмерициллипсинов А-Е с высокой фунгицидной активностью, в том числе к резистентным микроскопическим и дрожжевым патогенным грибам и к условно-патогенным грамположительным бактериям, препятствуя образованию у них биопленок (патенты РФ №2704421 и №2710377).
Предложен штамм алкалофильного гриба Sodiomyces alkalinus, депонированный в ВКМ под номером F-3762, который продуцирует соединение пептидной природы - гидрофобии II класса с высокой фунгицидной активностью, в том числе к резистентным микроскопическим и дрожжевым патогенным грибам.
Гидрофобины известны только для высших мицелиальных грибов (надотдел Dikaryomycotera) и, как сообщается, являются одними из самых поверхностно-активных белков в природе. Они секретируются в растворимой форме и спонтанно локализуются и самоорганизуются на поверхности раздела гидрофильно/гидрофобных фаз, спор и апикальных гиф грибов, где они собираются в нерастворимые амфипатические эластичные водоотталкивающие оболочки, позволяя грибным гифам адаптироваться к ограничениям в среде обитания, вызванным межфазными силами. Гидрофобины очень эффективно понижают поверхностное натяжение воды, позволяя гифам покидать водную среду и расти на воздухе (Bayry et al., 2012; Aimanianda, Latge, 2010). Функциональные свойства гидрофобинов включают устойчивость к стрессу, поверхностно-активные взаимодействия с растениями-хозяевами у фитопатогенных грибов (Zhang et al., 2011; Cai et al., 2020). В последние годы одним из наиболее перспективных направлений использования гидрофобинов считается их применение в качестве пенообразующих и пеностабилизирующих агентов в пищевой промышленности, при этом эффект, вызываемый гидрофобинами, намного выше, чем у всех известных в настоящее время стабилизаторов пены. Однако в литературе до настоящего времени нет упоминаний об их антимикробных свойствах.
Техническим результатом изобретения является штамм облигатно алкалофильного микроскопического гриба Sodiomyces alkalinus, продуцирующий гидрофобии II класса с высокой активностью к плесневым и дрожжевым патогенным грибам, включая клинические изоляты, с мультирезистентностью к полиенам и азолам, применяющимся в медицинской практике для лечения оппортунистических микозов, в том числе криптококкозов и кандидозов.
Пример 1. Определение видовой принадлежности штамма
Объект патентования - штамм ВКМ F-3762 вида Sodiomyces alkalinus Grum-Grzhim., Debets & Bilanenko (Plectosphaerellaceae, Glomerellales, Hypocreomycetidae, Sordariomycetes, Pezizomycotina, Ascomycota). Этот штамм является типовым для вида, депонирован также в CBS (CBS 110278).
Культурально-морфологические признаки.
Макроморфологические признаки.
S. alkalinus является облигатным алкалофилом, т.е. не способен к росту при кислых значениях рН среды. При культивировании на щелочной среде (ЩА) для штамма ВКМ F-3762 отмечены максимальные скорости роста (по сравнению со средами с кислыми и нейтральными значениями рН) и в полной мере выражены все характерные для него морфолого-культуральные признаки (рис. 1, А). Колонии на ЩА довольно быстро растут, достигая 38-40 мм за 10 дней; сначала белые, затем с черными концентрическими зонами вследствие интенсивного образования плодовых тел. Колонии бархатистые до шерстистых. Обратная сторона не окрашена или чуть желтоватая. Запах приятный, напоминает цветочный. При околонейтральных значениях рН среды (6-7) гриб значительно снижает скорость роста, при этом слабо развито или отсутствует бесполое и половое спороношение, воздушный мицелий слабовыраженный, а гифы часто имеют деформированный вид с многочисленными вздутиями (рис. 1, Б).
Микроморфологические признаки при культивировании на щелочном агаре.
Плодовые тела темно-коричневые, образуются на поверхности субстрата, шаровидные, замкнутые, 120-250 мкм в диаметре. Оболочка плодового тела (перидий) псевдопаренхиматозная, со складчатой поверхностью, состоит из 3-5 слоев угловатых (чаще шестиугольных) клеток. Парафизы отсутствуют. Сумки тонкостенные, оболочка сумок расплывается до созревания аскоспор, и аскоспоры находятся в слизистой массе внутри плодового тела (рис. 1, В). Аскоспоры освобождаются после разрыва оболочки плодового тела. Аскоспоры овальные или эллипсоидальные, 12-15 х 5-7 мкм, с одной перегородкой в середине, без перетяжки в месте расположения септы, толстостенные, светлокоричневые, гладкие (рис. 1, Г).
Бесполое спороношение Acremonium-тюдобное. Стелющиеся вегетативные гифы тонкостенные, бесцветные, толщиной 0,5 - 2,0 мкм. Образование конидий обильное, конидиеносцы отходят главным образом от одиночных воздушных гиф, иногда от тяжей воздушных гиф. Ветвление конидиеносцев базитонно-мутовчатое, присутствуют также и одиночные веточки (рис. 1, Д, Е). Фиалиды 15-60 мкм длиной, постепенно сужающиеся к концу, довольно тонкостенные. Конидии образуются в слизистых головках, чаще шаровидных, иногда коротко-цилиндрических. Конидии полушаровидные или широко эллипсоидальные, 4,5-5,5 х 4,1-4,6 мкм, неокрашенные. Хламидоспоры отсутствуют.
Молекулярно-генетические признаки.
Идентификация проведена на основе анализа последовательностей нескольких генетических локусов: LSU, SSU, ITS, 5,8S rDNA, RPB2, TEF1-α (Grum-Grzhimaylo et al., 2013). Все последовательности размещены в GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Sodiomyces+alkalinus).
Физиолого-биохимические признаки.
Способен продуцировать щелочные гемицеллюлолазы и целлюлазы (Grum-Grizhmailo et al., 2018) и гидрофобины 2 класса с противогрибковыми свойствами.
Пример 2. Определение фунгицидной активности штамма в отношении штаммов условно-патогенных мицелиальных и дрожжевых грибов
2
3
3
3
2
4
2
Для изучения антимикробной активности выбрана щелочная среда на буферной основе, позволяющая поддерживать при культивировании рН 10,5: минеральная основа: NaCO-24, NaHCO-6, NaCl-6, KNO-1, KHPO-1; солодовый экстракт (15°Б) - 200 мл, дрожжевой экстракт-1, агар-20; HO диет.800 мл.
В качестве посевного материала используют 5-ти суточную культуру гриба, полученную на щелочном сусло-агаре. Штамм выращивают в специализированной жидкой щелочной среде (300 мл) с рН 10,5 в стационарных условиях в колбах на 500 мл в течение 14 суток при 25°С. Биомассу мицелия и спор отделяют центрифугированием на центрифуге. Антибиотические вещества из отфильтрованной культуральной жидкости (кж) и грибной биомассы экстрагируют этилацетатом (при соотношении экстрагента и культуральной жидкости 5:1). Полученные экстракты упаривают в вакууме на роторном испарителе  (Швейцария) досуха при 42°С, сухой остаток - препарат хранят при 4°С. Для определения антибиотической активности используют диско-диффузионный метод (Егоров, 2004). Диски пропитывают препаратом, растворенным в 60% водном растворе этанола, и сушат их на воздухе в стерильных условиях. Антимикробную активность определяют в исходной культуральной жидкости, в спиртовых концентратах КЖ с помощью стерильных бумажных дисков (бумага фильтровальная Ф ГОСТ 12026-76, Россия), смоченных в экстрактах и высушенных в стерильных условиях.
Первоначально антифунгальную активность штаммов оценивают методом диффузии в агар на тест-культурах условно-патогенных микроорганизмов грибов. Спектр антимикробной активности культуральной жидкости, экстрактов и индивидуальных соединений определяют на тест-культурах мицелиальных и дрожжевых микроскопических грибов и бактерий из коллекции культур «Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе»: условно-патогенные плесневые и дрожжевые тест-культуры грибов: Aspergillus flavus 7К, A. fumigatus КБП F-37, A. oryzae IK, A. niger INA 00760, A. terreus 4К, Fusarium solani 890, Penicillium brevicompactum VKM F-4481, P. chrysogenum VKM F-4499, Candida albicans ATCC 2091, C. tropicales INA 00763 (таблица 1).
Пример 3. Выделение и идентификация гидрофобина Sa-HFBl из этилацетаной фракции КЖ штамма
Разделение активных фракций проводят путем аналитической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) с использованием колонки XBridge 5 мкм 100А размером 250x4.6 мм «Waters» (США) в растущем линейном градиенте концентрации ацетонитрила в качестве подвижной фазы (элюент А - 0.1%-ная трифторуксусная кислота, ТФУ, в воде MQ, элюентом В - 80%-ный ацетонитрил с 0.1%-ной водной ТФУ) при скорости потока 950 мкл/мин. Для ОФ-ВЭЖХ используют ультраградиентный ацетонитрил фирмы «Panreac» (Испания) и ТФУ производства «Sigma-Aldrich» (США). Детектирование разделяемых веществ осуществляли при трех длинах волн (214, 247 и 280 нм) в градиенте концентрации элюента В: 16-28% - за 12 мин; 28-55% - за 27 мин; 55-75% - за 20 мин и 75-85% - за 10 мин с последующим изократическим элюированием в течение 25 мин. В результате получают профиль компонентов активного концентрата штамма, насчитывающий три преобладающие фракции (рис. 3,4) с различной степенью гидрофобности.
С целью масштабирования получения индивидуального компонента, полученные в ходе ОФ-ВЭЖХ фракции, соответствующие отдельным пикам, собирают вручную, затем избыток органического растворителя (ацетонитрила) удаляют упариванием на вакуумной центрифуге SpeedVac «Savant» (США) и лиофилизируют «Labconco» (США) для удаления остаточных количеств ТФУ (рис. 3).
Молекулярную массу активного соединения устанавливают на MALDI времяпро летном масс-спектрометре Auto Speed MALDI TOF/TOF «BrukerDaltonics» (Германия), оснащенном УФ лазером 355 нм (Nd:YAG) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона. На мишени смешивают по 1 мкл раствора образца и 1 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) с концентрацией 10 мг/мл в 20%-ном ацетонитриле с 0.5%-ной ТФУ кислотой, полученную смесь высушивают на воздухе. С помощью МАЛДИ масс-спектрометрического анализа устанавливают среднюю молекулярную массу соединения - 7918,4 Да (рис. 3). Характер распределения сигналов m/z с шагом более чем в 100 Да свидетельствует о фрагментации молекулы посредством гидролиза гликозидных связей, что определяет разницу в молекулярной массе с агликоном (7586,34 Да) примерно в 332 Да, что предположительно соответствует наличию остатков сахаров (рис. 4).
Спектры поглощения снимают с использованием спектрофотометра UV-1800 («Shimadzu», Япония) и кварцевых кювет на 2 мл с длиной оптического пути 1 см.
N-концевое секвенирование по методу Эдмана осуществляют с использованием автоматического секвенатора белков и пептидов PPSQ-33A («Shimadzu», Япония) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Для обработки полученных данных используют официальное программное обеспечение LabSolution («Shimadzu», Япония).
Выделенное активное соединение Sa-HFB1 по совокупности выявленных структурных особенностей (молекулярная масса, соотношение поглощения на определенных длинах волн) соответствует полипептидному соединению из группы гидрофобинов II класса.
Пример 4. Определение фунгицидной активности этилацетатной фракции штамма в отношении клинических изолятов мицелиальных и дрожжевых грибов, резистентных к азолам
Опыт проводят согласно примеру 2, но в качестве тест-объектов используют клинические изоляты дрожжевых грибов, возбудителей инвазивных кандидозов с множественной резистентностью к применяемым антибиотикам - азолам: Candida albicans 1582 м - возбудитель кандидоза пищевода на фоне туберкулеза с легочным компонентом, туберкулезом селезенки и ВИЧ, С.glabrata 1402 м - возбудитель кандидоза легких на фоне туберкулеза и ВИЧ, С.krusei 1447 м - фиброзно-кавернозный туберкулез легких, С.tropicalis 156 м - возбудитель кандидоза легких на фоне туберкулеза и ВИЧ. Также используют изоляты мицелиальных грибов - возбудителей инвазивных аспергиллезов с множественной резистентностью к применяемым антибиотикам - азолам: Aspergillus fumigatus 390 м - фиброзно-кавернозный туберкулез легких; A. niger 219 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких; Cryptococcus neoformans 297 м - фиброзно-кавернозный туберкулез легких, криптококкоз с распадом легких, вторичный иммунодефицит (таблица 2).
Sa-HFB 1 проявляет выраженную антифунгальную активность к дрожжевым грибам, в том числе клиническим изолятам - возбудителям инвазивных микозов (рис. 2, таблицы 2, 3).
МПК Sa-HFB 1 для Cryptococcus neoformans 297 м составляет 1 мкг/мл, а в концентрации 16 мкг/мл он ингибирует С. albicans 1582 м, 8 мкг/мл A. fumigatus 390 м (таблица 3).
Список литературы:
1. Aimanianda, V.; Latge, J.P. Fungal hydrophobins form a sheath preventing immune recognition of airborne conidia // Virulence. 2010. V. 1. T. 3. P. 185-187.
2. Bayry, J.; Aimanianda, V.; Guijarro, J.I.; Sunde, M.; Latge, J.P. Hydrophobins-unique fungal proteins // PLoS Pathog. 2012. V. 8. T. 5. el002700.
3. Berdy, J. Bioactive microbial metabolites. A personal view. // J. Antibiot. 2005. V. 58. Т. LP. 1-26.
4. Butler, M.S; Blaskovich, M.A.; Cooper, M.A. Antibiotics in the clinical pipeline at the end of 2015 // The Journal of Antibiotics. 2017. V. 70. Т. LP. 3-24.
5. Cai, F.; Gao, R.; Zhao, Z.; Ding, M.; Jiang, S.; Yagtu, C; Zhu, H.; Zhang, J.; Ebner, Т.; Mayrhofer-Reinhartshuber, M.; Kainz, P.; Chenthamara, K.; Akcapinar, G.B.; Shen, Q.; Druzhinina, I.S. Evolutionary compromises in fungal fitness: hydrophobins can hinder the adverse dispersal of conidiospores and challenge their survival // The ISME Journal. 2020. V. 14. T. 10. P. 2610-2624.Егоров, H.C. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров - Москва : Наука, 2004. - 528 с.
6. Deshpande, A.D.; Baheti, K.G.; Chatterjee, N.R. Degradation of b-lactam antibiotics // Current science. 2004. V. 87. T. 12. P. 1684-1695.
7. Grum-Grzhimaylo, A.A.; Debets, A.J.M.; van Diepeningen, A.D.; Georgieva, M.L.; Bilanenko, E.N. Sodiomyces alkalinus, a new holomorphic alkaliphilic ascomycete within the Plectosphaerellaceae // Persoonia. 2013. V. 31. P. 147-158.
8. Grum-Grzhimaylo, A.A.; Falkoski, D.L.; van den Heuvel, J.; Valero-Jiménez, C.A.; Min, В.; Choi, I.-G.; Lipzen, A.; Daum, C.G.; Aanen, D.K.; Tsang, A.; Henrissat, В.; Bilanenko, E.N.; de Vries, R.P.; van Kan, J.A.L.; Grigoriev, I.G.; Debets, A.J.M. The obligate alkalophilic soda-lake fungus Sodiomyces alkalinus has shifted to a protein diet // Mol. Ecol. 2018. V. 27. P. 4808-4819.
9. Hozzein, W.N.; Ali, M.I.A.; Ahmed, M.S. Antimicrobial activities of some alkaliphilic and alkaline-resistant microorganisms isolated from Wadi Araba, the eastern desert of Egypt. // Life Science Journal. 2013. V. 4. Т. 1. P. 1823-1828.
10. Ibrar, M.; Ullah, M.W.; Manan, S.; Farooq, U.; Rafiq, M.; Hasan F. Fungi from the extremes of life: an untapped treasure for bioactive compounds // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2020. V. 104. T. 7. P. 2777-2801.
11. Imhoff, J.F. Natural Products from Marine Fungi - Still an Underrepresented Resource // Marine Drugs. 2016. V. 14. Т. 1. P. 19-37.
12. Rogozhin, E.A.; Sadykova, V.S.; Baranova, A.A.; Vasilchenko, A.S.; Lushpa, V.A.; Mineev, K.S.; Georgieva, M.L.; Kul'ko, A.B.; Krasheninnikov, M.E.; Lyundup, A.V.; Vasilchenko, A.V.; Andreev, Y. A. A novel lipopeptaibol Emericellipsin A with antimicrobial and antitumor activity produced by the extremophilic fungus Emericellopsis alkalina II Molecules. 2018. V. 23 (11). T. 2785. P. 1-12.
13. Sadykova V.S., Gavryushina I.A., Kuvarina A.E., Markelova N.N., Sedykh N.G., Georgieva M.L., Barashkova A.C. and Rogozhin E.A. Antimicrobic activity of the lipopeptide emericellipsin A isolated from Emericellopsis alkalina against biofilm-forming bacteria // Applied Biochemistry and Microbiology. 2020. V. 56. N. 3. P. 292-297.
14. Sánchez, S.; Demain, A.L. The amazing world of antibiotics. // Biochemical Pharmacology. 2017. V. 133. T. 1-3. P. 1-11.
15. Zhang, S.; Xia, Y.X.; Kim, В.; Keyhani, N.O. Two hydrophobins are involved in fungal spore coat rodlet layer assembly and each play distinct roles in surface interactions, development and pathogenesis in the entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana II Mol. Microbiol. 2011. V. 80. P. 811-826.
16. Садыкова, B.C.; Рогожин, E.A.; Баранова, A.A.; Георгиева, М.Л.; Биланенко, Е.Н.; Васильченко, A.C. Штамм Emericellopsis alkalina Bilanenko & Georgieva - продуцент антибиотиков - пептаиболов с антигрибной и антибактериальной активностью // Патент на изобретение RU 2704421 С1, 28.10.2019. Заявка №2019113489 от 06.05.2019.
17. Садыкова, B.C.; Рогожин, Е.А.; Баранова, А.А.; Георгиева, М.Л.; Биланенко, Е.Н.; Гаврюшина, И.А.; Васильченко, А.С.Способ получения противогрибкового антибиотика Эмерициллипсина А // Патент на изобретение RU 2710377 С1, 26.12.2019. Заявка №2019104723 от 20.02.2019.