СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАГЕНТА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МЕЧЕННОГО ТЕХНЕЦИЕМ 99-m НАНОКОЛЛОИДА НА ОСНОВЕ ГАММА-ОКСИДА АЛЮМИНИЯ
METHOD OF OBTAINING REAGENT FOR PREPARATION OF TECHNECIUM 99-m LABELLED NANOCOLLOID BASED ON GAMMA-OXIDE OF ALUMINIUM

2
3
Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения реагента для приготовления меченного технецием-99m наноколлоида на основе оксида AlO, который может быть использован для радионуклидной диагностики, в том числе для проведения лимфосцинтиграфии в онкологии.
99m
99m
99m
В существующей мировой практике наноколлоидные препараты, меченные короткоживущим радионуклидом технецием-99m (Тс), достаточно широко используются для проведения диагностических исследований в онкологии, кардиологии, для обнаружения воспалительных заболеваний опорно-двигательного аппарата, нарушений анатомо-морфологической структуры при опухолях, циррозах, гепатитах и других заболеваний. К числу таких препаратов, серийно выпускаемых в России, относится Тс-Технефит (ООО «Диамед»), представляющий собой коллоидный раствор на основе фитина (солей инозитгексафосфорной кислоты). Кроме того, разработан способ получения наноколлоида для приготовления радиофармпрепаратов на основе сульфида рения [Патент RU №2315624 С2, 27.01.2008]. Данные о наноколлоидных препаратах с Тс, производимых в Европе, представлены в таблице 1 Приложения [Чернов В.И., Афанасьев С.Г., Синилкин А.А. и др. Радионуклидные методы исследования в выявлении «сторожевых» лимфатических узлов // Сибирский онкологический журнал. - 2008. Т.28. -№4.-С.5-10].
99m
В Австралии производится меченный технецием-99m  наноколлоидный препарат на основе фторида олова, используемый более 20 лет в клинической практике для маркировки белых клеток крови при диагностике инфекций и воспалений [С.Tsopelas. The radiopharmaceutical chemistry of Tc-tin fluoride colloid-labeled-leukocytes// The quarterly journal of nuclear medicine and molecular imaging. - 2005. Vol.49, P. 319-324].
nd
Все приведенные наноколлоидные препараты изготавливаются на основе соединений, образующих устойчивые гидрозоли. При этом решающим фактором успеха является не их химический состав, а размер наночастиц. Известно, например, что оптимальный размер частиц для проведения лимфосцинтиграфии составляет 20-100 нм. Такие частицы выводятся из тканей со скоростью, не позволяющей им проникать в кровяное русло. Частицы с размерами менее 20 нм легко проходят в кровяное русло, что препятствует визуализации лимфоузлов [Sampson СВ. Textbook of Radiopharmacy Theory and Practice. Vol.3, 2 ed. London, United Kingdom: Gordon and Breach; 1994: 196]. Наночастицы с размерами более 200 нм (Hepatocis) могут быть использованы для мечения аутолейкоцитов с целью выявления очагов воспалений в кардиологии.
99m
99m
Большая часть из известных наноколлоидных радиофармпрепаратов представляет собой простые неорганические комплексы Тс с сульфидами рения и сурьмы, получаемые по достаточно сложным технологиям. Например, известен способ получения наноколлоида сульфида сурьмы [Lin Y., Zhang X., Li J. et al. Appl. Radiat. Isot, 58 (2003), 347-352], который включает до 10 технологических операций. Примерно столько же стадий включает способ получения Тс-сульфид рениевого наноколлоида [Tsopelas C.J. Nucl.Med., 42 (2001), 3, 460-466].
99m
99m
99m
2
2
2
3
Вместе с тем, проведенные заявителями предварительные исследования показали, что устойчивые коллоидные соединения могут быть получены более простым способом - путем проведения адсорбции восстановленного Тс на гамма-оксиде алюминия [Скуридин B.C., Стасюк Е.С., Садкин В.Л., Чибисов Е.В., Рогов А.С., Чикова И.В. Изучение статической и динамической адсорбции технеция-99 m м на оксиде алюминия// Известия ВУЗов, ж. Физика, -2010. - т.53: -№10/2 - с.294-300]. При этом величина адсорбции радионуклида на поверхности оксида превышает 93%. Для восстановления Tc(VII), присутствующего в исходном элюате Тс, использовалось олово (II) хлорид дигидрат (SnCl·2HO, далее по тексту Sn (II)). Максимум адсорбции наблюдается при рН среды 4-6. На основании этих исследований авторами настоящей заявки был разработан способ получения меченного технецием-99m наноколлоида гамма-оксида AlO [Патент RU 2463075 С1 от 01.07.2011, Бюл. N28, 2012], выбранный в качестве прототипа.
99m
99m
2
3
2
3
В соответствии с этим способом задача получения наноколлоида Тс-АlО с заданными размерами (80% частиц имеют размер в интервале 20-100 нм при радиохимической чистоте препарата не менее хуже 90%) решается следующим образом. В водную суспензию, приготовленную из наноразмерного порошка гамма-оксида AlO с диаметром частиц 7-10 нм и концентрацией 0,5-0,7 мг/мл, после доведения рН среды до 4-5, вводят элюат Тс, а затем, последовательно аскорбиновую кислоту, Sn(II) и желатин в количествах из расчета на 1 мл смеси, мг: 0,20-0,25; 0,00875-0,0175 и 2,5-4,0, соответственно. Полученную смесь нагревают на водяной бане (70-80°С) в течение 30 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры в ультразвуковой ванне и пропускают через стерилизующий фильтр (0,22 мкм). Полученный раствор наноколлоида фасуют в асептических условиях в стерильные флаконы и используют в течение 4 часов.
2
3
2
2
4
99m
-
К недостаткам способа следует отнести необходимость приготовления непосредственно перед получением меченного технецием-99m оксида алюминия большого количества растворов реагентов: водной суспензии наноразмерного порошка гамма-оксида AlO с заданной концентрацией, растворов олова (II) хлорида дигидрата (SnCl·2HO), аскорбиновой кислоты, желатина, раствора для корректировки рН среды до требуемого значения. Все перечисленные растворы должны быть свежеприготовленными. Например, уже после выдержки на воздухе в течение 5-6 часов происходит практически полное окисление олова (II) до 4-валентного состояния, что делает его непригодным для восстановления пертехнетат-ионов TcO . Наряду с этим наблюдается и частичная коагуляция наноколлоида.
99m
2
3
Новая техническая задача - получение устойчивого при хранении реагента для приготовления меченного технецием-99m наноколлоида, при смешивании которого с элюатом технеция-99m будет получаться наноколлоидный радиофармпрепарат Тс-А1O, пригодный для проведения лимфосцинтиграфии и других диагностических исследований.
2
3
2
3
Для решения поставленной задачи в способе получения реагента для приготовления меченного технецием-99m наноколлоида на основе оксида А1O, включающем приготовление смеси, состоящей из 1 мл водной суспензии, приготовленной из наноразмерного порошка гамма-оксида АlO с диаметром частиц 7-10 нм и концентрацией 0,5-0,7 мг/мл, аскорбиновой кислоты, Sn (II) и желатина в количествах из расчета на 1 мл смеси, мг: 0,20-0,25; 0,00875-0,0175 и 2,5-4,0, соответственно, полученный раствор замораживают при температуре жидкого азота, помещают в камеру сублиматора и подвергают лиофильной сушке при заданных параметрах лиофилизатора: Т=-50°С, вакуум - 0,0015 Торр, в течение 20,5 часов, с последующим перемещением в верхнюю лиофильную камеру и досушиванием в течение 5,5 ч при температуре +15°С.
2
Новым в предлагаемом способе является лиофилизация раствора смеси, включающая в себя заморозку раствора при Т=-50°С, выдерживание в вакуумной камере при давлении 0,0015 Торр, где происходит возгонка растворителя и удаление основной массы НО, с последующим удалением связанной влаги при температуре при +15°С (досушивание).
Способ осуществляют следующим образом.
2
3
Приготавливают смесь, состоящую из 1 мл водной суспензии, приготовленной из наноразмерного порошка гамма-оксида АlO с диаметром частиц 7-10 нм и концентрацией 0,5-0,7 мг/мл, аскорбиновой кислоты, Sn (II) и желатина в количествах из расчета на 1 мл смеси, мг: 0,20-0,25; 0,00875-0,0175 и 2,5-4,0, соответственно, полученный раствор замораживают при температуре жидкого азота, помещают в камеру сублиматора и подвергают лиофильной сушке при заданных параметрах лиофилизатора: Т=-50°С, вакуум - 0,0015 Торр, в течение 20,5 часов, с последующим перемещением в верхнюю лиофильную камеру и досушиванием в течение 5,5 ч при температуре +15°С.
Далее, для приготовления меченного технецием-99m наноколлоида реагент вводят в емкость с лиофилизатом элюата из генератора  технеция-99m, нагреванием смеси на водяной бане (70-80°С) в течение 30 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры в ультразвуковой ванне и производят фильтрацию через стерилизующий фильтр (0,22 мкм) в асептических условиях в стерильный флакон. Сущность изобретения поясняется следующим примером.
2
3
Пример 1. Во флакон вместимостью 20 мл вносят навеску гамма-оксида АlO с диаметром частиц 7-10 нм массой ~5 мг и разводят ее в 10 мл воды для инъекций. Затем доводят рН среды 0,05 М раствором НСl до значения 4-5.
2··
2
1 мл полученной суспензии переносят в отдельный флакон вместимостью 10 мл и к ней последовательно добавляют 100 мкл родного раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 10 мг/мл, 10 мкл свежеприготовленного раствора Sn (II) (концентрация 7 мг/мл по SnClHO) и 100 мкл водного раствора желатина с концентрацией 10 мг/мл.
Флакон с полученной смесью замораживают при температуре жидкого азота, помещают в камеру сублиматора и подвергают лиофильной сушке при заданных параметрах лиофилизатора: Т=-50°С, вакуум - 0,0015 Торр, в течение 20,5 часов, с последующим перемещением в верхнюю лиофильную камеру и досушиванием в течение 5,5 ч при температуре +15°С.
99m
Для проверки качества приготовленного реагента во флакон с лиафилизатом вводят 2 мл элюата Тс с активностью 1,5-2 ГБк. После интенсивного перемешивания смесь нагревают на водяной бане (70-80°С) в течение 30 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры в ультразвуковой ванне и фильтрацией через стерилизующий фильтр (0,22 мкм) в асептических условиях в стерильный флакон.
99m
Радиохимический выход продукта с размером частиц менее 100 нм относительно общей активности приготовленного препарата определяли путем фильтрации исходной смеси через фильтр с диаметром пор 100 нм. Содержание фракции с размерами менее 20 нм контролировали по данным накопления Тс в крови через 1 час после введения препарата экспериментальным животным. В рассмотренном примере введенные количества аскорбиновой кислоты, Sn (II) и желатина в пересчете на 1 мл приготовленной смеси, соответственно, равны 0,25; 0,0175 и 4,0 мг. Выход продукта с размерами менее 100 нм составил 84%, а фракции менее 20 нм - 6%. Радиохимическая чистота препарата равна 92% и остается на этом уровне в течение 4 часов.
В целом предлагаемый способ позволяет получать реагент для приготовления меченного технецием-99m наноколлоидного препарата на основе гамма-оксида алюминия, пригодного для проведения гамма-сцинтиграфических исследований. Полученные с этим препаратом лимфосцинтиграммы показывают, что уровень накопления радиофармпрепарата в лимфоузле экспериментальных животных (крысах) через 1 час после введения составляет 1,6±1%, что соответствует стандартным требованиям.
2
3
Лиофилизация смеси растворов исходных компонентов способствует созданию реагента для приготовления радиофармпрепарата на основе меченого технецием-99m оксида АlО с большим сроком годности.
99m
2
3
Определение срока годности реагентов при их хранении проводилось на опытной партии из 24 флаконов. Образцы хранились при температуре от +2 до +10°С. Из приготовленных образцов реагента получали радиофармпрепарат с последующим определением в нем радиохимического выхода наноколлоида с размером частиц менее 100 нм и его радиохимической чистоты (РХЧ). Исследования проводили с интервалом 3 суток. Результаты представлены в табл.2, в которой приведены данные по определению радиохимического выхода фракции 100 нм и РХЧ в препарате «Тс- АlO» в течение срока хранения реагента.
2
3
Из результатов таблицы 2 следует, что заявляемый способ в отличие от известного имеет преимущество, заключающееся в увеличении срока годности реагента для приготовления радиофармпрепарата на основе меченого технецием-99m оксида АlO, по крайней мере, в течение 1 месяца.
Таблица 1
Радиофармпрепарат
Производитель
Размеры частиц
Nanocoll
GE Amersham
<80 нм
<sup>99m</sup>Tc-nanocolloid
GE, Uppsala, Sweden
<80 нм
Nanocis
CIS bio International
~100 нм
Hepatocis
CIS bio International
~500 нм
Microlite
DuPont,
~10 нм
Sulfur colloid
CIS bio International
40-10000 нм
Таблица 2
№ пробы
Срок испытаний реагента, сутки
РХЧ, %
Выход фракции 100 нм, %
1
3
94
86
2
92
84
3
6
93
82
4
91
84
5
9
92
80
6
93
81
7
12
90
85
8
91
86
9
15
92
84
10
91
85
11
18
93
81
12
92
83
13
21
92
82
14
91
84
15
24
94
86
16
93
87
17
27
95
85
18
93
83
Приложение