КОНСОРЦИУМ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД И СЕДИМЕНТОВ БАЛТИЙСКОГО МОРЯ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ
CONSORTIUM OF MICROORGANISMS FOR CLEANING WATERS SURFACE AND SEDIMENTS OF THE BALTIC SEA FROM OIL AND OIL PRODUCTS

Описание изобретения
Изобретение относится к области экологической биотехнологии и может быть использовано при очистке поверхностных вод и седиментов Балтийского моря от нефти и нефтепродуктов.
6
7
2
Изобретение представляет собой консорциум непатогенных микроорганизмов, утилизирующих углеводороды нефти в широком диапазоне температур (от 6°С до 30°С), в воде Балтийского моря соленостью 3-7‰ и продуцирующих биологически-активные вещества. В состав консорциума входят пять мезофильных бактериальных штаммов - Pseudomonas abietaniphila 30W - ВКМ В-3174D, Delftia tsuruhatensis 40S - ВКМ В-3175D, Sphingobacterium siyangense 13S - ВКМ В-3176D, Rhodococcus erythropolis 66S - ВКМ Ac-2778D, Rhodococcus erythropolis 29S - ВКМ Ac-2777D. В зависимости от уровня загрязнения, для эффективной очистки поверхности моря численность вносимых микроорганизмов должна быть не менее 1×10-10 КОЕ/м.
Оценка эффективности микробного консорциума осуществляется путем измерения остаточного содержания углеводородов нефти в сравнении с контролем (без микроорганизмов) для оценки абиотической убыли. Технический результат заключается в снижении концентрации углеводородов нефти в воде Балтийского моря. Использование микробного консорциума для ремедиация загрязненных нефтью и нефтепродуктами акваторий является доступным, экологически безопасным и перспективным подходом к ликвидации последствий нефтеразливов.
Область техники
Изобретение относится к области экологической биотехнологии и может быть использовано in situ и ex situ при очистке акватории Балтийского моря от последствий разливов нефти и нефтепродуктов.
Объемы перевозки нефтепродуктов, как и темпы судоходства, все время возрастают, соответственно, и риск аварийного разлива нефти при ее транспортировке через акватории тоже растет. Это является большой проблемой для экологического состояния Балтийского моря, которое характеризуется большим объемом впадающей речной воды, что делает его менее соленым по сравнению с другими морями. Кроме того, для солености и температуры морской воды характерны сезонные колебания, а также данные параметры меняются с глубиной. Балтийское море непрерывно подвергается хроническому загрязнению нефтепродуктами из-за больших объемов судоходства водного транспорта, в том числе лодок, яхт и катеров. Несмотря на то, что предлагаемый консорциум микроорганизмов может иметь широкое применение для очистки водных экосистем, тем не менее, его основное предназначение - ремедиация акватории Балтийского моря. Бактерии, входящие в состав консорциума, изолированы из проб воды и донных отложений Балтийского моря и способны утилизировать нефть в широком диапазоне температур (от 6°С до 30°С), pH = 6.0-7.0 и солености воды 3-7‰.
Уровень техники
Объемы перевозки нефтепродуктов, как и темпы судоходства, все время возрастают, соответственно и риск аварийного разлива нефти при ее транспортировке через акватории тоже растет. Патентный поиск показал, что существуют коммерческие биопрепараты как на основе монокультур, так и консорциумов микроорганизмов применяемые для очистки водных экосистем. Однако биопрепаратов предназначенных для очистки непосредственно Балтийского моря от нефтезагрязнений, в состав которых входят только аборигенные штаммы, не найдено.
Известен патент РФ №RU2268934 «Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 для деструкции нефтяных углеводородов солоноватоводных экосистем», заявитель: ООО "Лукойл-Нижневолжскнефть" (ru), Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования астраханский государственный технический университет (ФГОУ ВПО АГТУ) (RU). Описан новый бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, для очистки солоноватоводных экосистем. Штамм выделен из морских вод Северного Каспия в районе разведочного бурения нефтяных скважин. Штамм выращивают на стандартных средах и средах с добавлением морской соли. Деструктивная активность препарата на основе штамма против углеводородов нефти и нефтепродуктов составляет 54,5-96% в диапазоне солености морской воды 0,05-20%.
Известен патент РФ№ RU2555541 «Штамм Microbacterium species для очистки пресноводных водоемов и их донных отложений от нефти и нефтепродуктов», заявитель: Открытое акционерное общество "Нефтяная компания "ЛУКОЙЛ" (RU). Штамм Microbacterium species BKM Ac-2614D предложен для очистки загрязненных и хронически загрязненных пресноводных объектов в температурном диапазоне от +2°C до +25°C. Изобретение позволяет осуществлять очистку воды и донных отложений от нефтяных углеводородов при низкой концентрации кислорода в воде и в условиях высоких широт.
Известен патент на штамм бактерий Pseudomonas stutzeri MEV-Sl, выделенный из чернозема обыкновенного, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, г. Москва под номером В-8277 (патент РФ № 2228952). Штамм утилизирует нефть, мазут, дизельное топливо; полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), содержащие от 2 до 4 бензольных колец: нафталин, фенантрен, пирен, флуорен, фенол. Он устойчив к ионам тяжелых металлов: Pb, Zn, Mo, Fe, Hg. Культура Pseudomonas stutzeri MEV-S1 продуцирует биологические поверхностно-активные вещества (биосурфактанты). Биопрепарат на основе этого штамма может быть использован для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод при попадании нефти и продуктов ее переработки в окружающую среду, а также при комбинированном загрязнении углеводородами нефти и металлами.
Общим недостатком всех вышеперечисленных биопрепаратов является то, что в состав входит монокультура микроорганизмов, но один штамм бактерий не обладает широкой субстратной специфичностью. Как известно, использование в биопрепарате микроорганизмов, относящихся к разным таксономическим группам способствует более эффективному утилизированию нефти и нефтепродуктов.
o
Известна ассоциация, осуществляющая деструкцию углеводородов нефти в широком диапазоне солености (0,05-10%) (оптимальная соленость среды 3-5%) и температур (8-35°C) (оптимальная температура 25-27C), состоящая из R-диссоциантов штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д. Данная ассоциация составляет основу биопрепарата «Родер», (RU 2174496, кл. С2 от 10.10.2001). Недостатком этого биопрепарата является неспособность входящих в его состав микроорганизмов деградировать нефть при пониженных температурах и низкие скорости роста. А также то, что в состав биопрепарата входят представители только одного рода Rhodococcus, что сужает спектр соединений, окисляемых в процессе ремедиации. Как известно биопрепараты, состоящие из микроорганизмов разных таксономических групп, являются более эффективными в отношении утилизации нефти и нефтепродуктов. Кроме того, в патенте отсутствует информация о способности бактерий продуцировать биоэмульгаторы (поверхностно-активные вещества), которые повышают эффективность биодеструкции трудноразлагаемых фракций нефти.
8
Известен патент РФ №2241032 «Способ очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения», заявитель: Закрытое акционерное общество Научно-производственное предприятие «Биомедхим». Изобретение может быть использовано для очистки поверхности воды от разлитой нефти и нефтепродуктов. Для осуществления способа в загрязненную нефтью и нефтепродуктами воду вносят бактериальную культуру, представляющую собой консорциум клеток микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 в виде культуральной жидкости с общим титром не менее 10 КОЕ/мл. Указанный консорциум штаммов бактерий выделен из серой лесной почвы, искусственно загрязненной дизельным топливом, и депонирован в Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН. Способ позволяет эффективно производить очистку водной поверхности при высоком содержании нефти или нефтепродуктов в воде. Эффективность очистки препаратом «Ленойл» составляет от 98,5 до 99,6%.
К недостаткам данного биопрепарата также можно отнести отсутствие способности микроорганизмов к продукции биосурфактантов, а также неспособность к деградации нефти и нефтепродуктов в присутствии морской соли (3-5%).
Известен биопрепарат фирмы "Полиинформ" (патент РФ №2138451). Биопрепарат включает аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель. В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий содержится консорциум мезофильных бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus species ПИ Ку-1 и консорциум психрофильных бактериальных штаммов Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-3, Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-8, Xanthomonas species ПИ ЛБХ-7. В качестве минеральных добавок используют источники азота, фосфора, калия. В качестве наполнителя используют стерильный торф. Недостатком биопрепарата является сложный состав ассоциации микроорганизмов (мезофильные и психрофильные штаммы бактерий), а также требует внесения дополнительных минеральных добавок для увеличения эффективности очистки, что затрудняет и удорожает процесс наработки данного биопрепарата.
Несмотря на присутствие на российском рынке различных биопрепаратов для очистки водных экосистем, по находящейся в открытом доступе информации, отсутствуют биопрепараты предназначенные для очистки конкретно Балтийского моря от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.
Сущность изобретения
Технической задачей данного изобретения является разработка эффективного микробного консорциума для использования в процессе биоремедиации поверхностных вод и седиментов Балтийского моря от нефти и нефтепродуктов.
Технический результат может быть достигнут использованием в составе предлагаемого изобретения - консорциума микроорганизмов, продуцирующих биологические поверхностно-активные вещества, способных утилизировать углеводороды нефти в широком диапазоне температур окружающей среды (6 - 30 °С) и морской воде соленостью 3-7‰.
Принимая во внимание тот факт, что в Балтийское море впадает большой объем речной воды, влияя на его соленость (повышая в летний период и снижая в зимний), и, кроме того, для него характерны сезонные и глубинные колебания температур, при разработке консорциума были использованы аборигенные микроорганизмы, изолированные из проб воды и седиментов Балтийского моря. Данные микроорганизмы присутствуют как в зимних, так и в летних пробах, способны утилизировать углеводороды нефти при солености морской воды 3-7‰ и температуре окружающей среды от 6 до 30 °С.
Действующая основа микробного консорциума - штаммы бактерий Pseudomonas abietaniphila 30W, Delftia tsuruhatensis 40S, Sphingobacterium siyangense 13S, Rhodococcus erythropolis 66S, Rhodococcus erythropolis 29S, выделенные из седиментов и поверхностных вод Балтийского моря, являются новыми. Анализ литературных данных и известных технических решений показал, что отсутствуют сведения об использовании бактерий рода Delftia в биопрепаратах для очистки водных экосистем от нефтезагрязнений. Следовательно, условию патентоспособности "новизна" заявляемое изобретение соответствует.
Штаммы были депонированы во «Всероссийской коллекции микроорганизмов» под следующими номерами: Pseudomonas abietaniphila 30W - ВКМ В-3174D, Delftia tsuruhatensis 40S - ВКМ В-3175D, Sphingobacterium siyangense 13S - ВКМ В-3176D, Rhodococcus erythropolis 66S - ВКМ Ac-2778D, Rhodococcus erythropolis 29S - ВКМ Ac-2777D.
В состав консорциума для очистки поверхностных вод и седиментов Балтийского моря от нефти и нефтепродуктов входят микроорганизмы-деструкторы как ароматической, так и алифатической фракций нефти. Бактерии родов Rhodococcus и Sphingobacterium продуцируют биологические поверхностно-активные вещества, улучшающие биодоступность углеводородов нефти для микроорганизмов консорциума. Эффективность разработанного консорциума подтверждена с помощью модельного эксперимента при культивировании в воде Балтийского моря соленостью 7‰ и pH 6.0 в присутствии 10% нефти. Деградация нефти консорциумом составила 30,78% за 1 месяц по сравнению с контролем.
Морфологические и физиолого-биохимические свойства штаммов, входящих в консорциум:
Штамм Pseudomonas abietaniphila 30W - ВКМ В-3174D выделен из седиментов возле порта Усть-Луга (Финский залив Балтийского моря), не опасен, не патогенен.
Культурально-морфологические признаки
Прямые или слегка изогнутые палочки. Неспорообразующий. Бежевые колонии на минеральной среде (Эванс, М9), на полноценных (5/5, ЛБ) приобретают желтовато-бежевую окраску. Грамотрицательные, подвижные за счет одного или нескольких полярных жгутиков.
Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Оксидазный тест отрицательный. Каталазный тест положительный. Используемые источники углерода: нафталин, нефть. Проверенные неиспользуемые источники углерода: фенантрен, антрацен, толуол, октан, декан, гексадекан, дизельное топливо, этилбензол, протокатехат. Отношение к рН: 5-9. Отношение к NaCl: 3-5%. Отношение к температуре: 6-30°С. Оптимальная температура культивирования: 28 °С.
Штамм Pseudomonas abietaniphila 30W содержит плазмиду деградации нафталина Р-9 группы несовместимости, что подтверждается наличием генов катехол-2,3-диоксигеназы и нафталин-1,2-диоксигеназы и способностью минерализовать нафталин.
Штамм Delftia tsuruhatensis 40S - ВКМ В-3175D, выделен из морской воды возле порта Усть-Луга (Финский залив Балтийского моря), не опасен, не патогенен.
Культурально-морфологические признаки
Прямые или слегка изогнутые палочки. Неспорообразующий. Прозрачные колонии на минеральной среде (Эванс, М9), на полноценных (5/5, ЛБ) приобретают желтовато-бежевую окраску. Грамотрицательные, подвижные за счет одного или нескольких полярных жгутиков.
Физиолого-биохимические признаки.
Аэроб. Оксидазный тест отрицательный. Каталазный тест положительный. Используемые источники углерода: нафталин, дизельное топливо, нефть. Проверенные неиспользуемые источники углерода: фенантрен, антрацен, толуол, октан, декан, гексадекан, этилбензол, протокатехат. Отношение к рН: 5-9. Отношение к NaCl: 3-5%. Отношение к температуре: 6-30°С. Оптимальная температура культивирования: 28 °С.
Микроорганизм Delftia tsuruhatensis 40S способен к деградации нафталина, что подтверждается наличием генов салицилат-5-гидроксилазы и нафталин-1,2-диоксигеназы.
Штамм Sphingobacterium siyangense 13S - ВКМ В-3176D, выделен из седиментов возле поселка Кандикюля (Финский залив Балтийского моря), не опасен, не патогенен.
Культурально-морфологические признаки
Прямые или слегка изогнутые палочки. Неспорообразующий. Светлые колонии на минеральной среде (Эванс, М9), на полноценных (5/5, ЛБ) приобретают бежевую окраску. Грамотрицательные, подвижные за счет одного или нескольких полярных жгутиков.
Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Оксидазный тест отрицательный. Каталазный тест положительный. Используемые источники углерода: фенантрен, гексадекан, дизельное топливо, нефть, протокатехат. Проверенные неиспользуемые источники углерода: нафталин, антрацен, толуол, октан, декан, этилбензол. Отношение к рН: 5-9. Отношение к NaCl: 3-5%. Отношение к температуре: 6-30°С. Оптимальная температура культивирования: 28 °С.
Sphingobacterium siyangense 13S способен к деградации фенантрена, гексадекана, протокатехата, дизельного топлива и нефти. Штамм Sphingobacterium siyangense 13S способен продуцировать биологические поверхностно-активные вещества при росте в жидкой минеральной среде с гидрофобным углеводородным субстратом.
Штамм Rhodococcus erythropolis 66S - ВКМ Ac-2778D, выделен из седиментов возле поселка Кандикюля (Финский залив Балтийского моря), не опасен, не патогенен.
Культурально-морфологические признаки
Прямые или изогнутые палочки, часто культура распадается на кокковые формы. Неспорообразующий. Светлые колонии на минеральной среде (Эванс, М9), на полноценных (5/5, ЛБ) приобретают светло-кремовую окраску. Грамположительные, неподвижные.
Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Оксидазный тест отрицательный. Каталазный тест положительный. Используемые источники углерода: декан, гексадекан, дизельное топливо, нефть, протокатехат. Проверенные неиспользуемые источники углерода: нафталин, фенантрен, антрацен, толуол, октан, этилбензол. Отношение к рН: 5-9. Отношение к NaCl: 3-5%. Отношение к температуре: 6-30°С. Оптимальная температура культивирования: 28 °С.
Штамм Rhodococcus erythropolis 66S способен продуцировать биологические поверхностно-активные вещества при росте в жидкой минеральной среде с гидрофобным углеводородным субстратом.
Штамм Rhodococcus erythropolis 29S - ВКМ Ac-2777D, выделен из седиментов возле порта Усть-Луги (Финский залив Балтийского моря), не опасен, не патогенен.
Культурально-морфологические признаки
Прямые или изогнутые палочки, часто культура распадается на кокковые формы. Неспорообразующий. Светлые колонии на минеральной среде (Эванс, М9), на полноценных (5/5, ЛБ) приобретают светло-кремовую окраску. Грамположительные, неподвижные.
Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Оксидазный тест отрицательный. Каталазный тест положительный. Используемые источники углерода: декан, гексадекан, дизельное топливо, нефть. Проверенные неиспользуемые источники углерода: нафталин, фенантрен, антрацен, толуол, октан, этилбензол, протокатехат. Отношение к рН: 5-9. Отношение к NaCl: 3-5%. Отношение к температуре: 6-30°С. Оптимальная температура культивирования: 28 °С.
Штамм Rhodococcus erythropolis 29S способен продуцировать биологические поверхностно-активные вещества при росте в жидкой минеральной среде с гидрофобным углеводородным субстратом. Штамм Rhodococcus erythropolis 29S способен к деградации декана и гексадекана, что подтверждается наличием гена алкан-гидроксилазы.
Разработанный микробный консорциум можно использовать для ремедиации загрязненной нефтью и нефтепродуктами акватории Балтийского моря, в частности Финского залива.
Изобретение может быть применено для очистки поверхностных вод и седиментов Балтийского моря от углеводородов нефти и представлено консорциумом микроорганизмов-нефтедеструкторов. В состав консорциума входят пять штаммов в равных долях - два штамма бактерий рода Rhodococcus и по одному штамму бактерий родов Pseudomonas, Delftia и Sphingobacterium; эффективен в широком диапазоне температур (6-30°С), солености  и рН 6.0-7.0. Оптимальная рабочая температура консорциума - 24°С. Эффективность изобретения была подтверждена в лабораторных модельных системах (микрокосмах) с водой Балтийского моря.
Изобретение подтверждается результатами лабораторного эксперимента: В колбу со стерильной водой Балтийского моря (рН=6.0, соленость ) добавляли нефть в качестве единственного источника углерода и энергии до конечной концентрации 10% и инокулят микробного консорциума.
8
7
Для получения инокулята микробного консорциума индивидуальные чистые культуры бактерий выращивали в пробирках, содержащих бульон Лурия-Бертани, в течение 12 часов при температуре 24°С. Биомассу клеток микроорганизмов осаждали в центрифуге Hettich Rotanta 460R (Германия) в течение 5 минут при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, а полученную концентрированную суспензию клеток растворяли в физиологическом растворе до концентрации микроорганизмов не менее 1×10 КОЕ/мл с использованием стандарта мутности. Для получения инокулята микроорганизмы консорциума смешивали в равном соотношении по КОЕ. Инокулят микробного консорциума вносился в колбы с конечной концентрацией бактерий 1×10 КОЕ/мл.
В качестве контроля использовали такую же систему, но без внесения микроорганизмов.
Модельные системы закрывали, чтобы исключить попадание посторонней микрофлоры, но не герметично (для обеспечения испарения). Эксперимент проводили при температуре 24°С и непрерывном перемешивании.
Суммарное массовое содержание остаточных нефтепродуктов в микрокосмах определяли ИК-спектрофотометрическим методом на концентратомере АН-2 в соответствии с ПНД Ф 14.1:2:4.168-2000. В лабораторных микрокосмах в условиях, приближенных к окружающей среде Балтийского моря, эффективность деградации нефти консорциумом составила 30,78% за 1 месяц по сравнению с контролем.