ЖИВОТНЫЕ, ОТЛИЧНЫЕ ОТ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБНЫЕ К DH-DH-ПЕРЕГРУППИРОВКЕ СКОНСТРУИРОВАННЫХ ГЕННЫХ СЕГМЕНТОВ, И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

H
H
1. Нуклеотидная молекула, содержащая сконструированный определяющий вариабельность генный сегмент тяжелой цепи (D), который содержит по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной последовательностью сигнала рекомбинации (RSS).
H
H
H
2. Нуклеотидная молекула по п. 1, где нуклеотидная последовательность содержит сконструированную D-область, содержащую (i) по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS, и (ii) неперегруппированный генный сегмент D, фланкированный с одной стороны 12-мерной RSS и с другой стороны другой 12-мерной RSS, и
H
H
H
H
где (i) по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS, и (ii) неперегруппированный генный сегмент D, фланкированный с одной стороны 12-мерной RSS и с другой стороны другой 12-мерной RSS, функционально связаны таким образом, что (i) и (ii) могут соединиться при событии рекомбинации D-D в соответствии с правилом 12/23,
H
H
где необязательно сконструированная D-область содержит только человеческие генные сегменты D.
3. Нуклеотидная молекула по п. 2, где нуклеотидная молекула дополнительно содержит:
H
H
(a) по меньшей мере один неперегруппированный вариабельный (V) генный сегмент тяжелой цепи иммуноглобулина, который находится выше и функционально связан со сконструированной D-областью,
H
H
(b) по меньшей мере один неперегруппированный соединяющий (J) генный сегмент тяжелой цепи иммуноглобулина, который находится ниже и функционально связан со сконструированной D-областью, или
(с) комбинацию (a) и (b).
H
H
H
H
4. Нуклеотидная молекула по п. 3, где по меньшей мере один генный сегмент V содержит неперегруппированный человеческий генный сегмент V6-1, по меньшей мере один генный сегмент Jсодержит неперегруппированный человеческий генный сегмент J6 или их комбинацию.
H
H
H
H
5. Нуклеотидная молекула по п. 3 или 4, где по меньшей мере один неперегруппированный генный сегмент J содержит неперегруппированный человеческий генный сегмент J4, неперегруппированный человеческий генный сегмент J5 и неперегруппированный человеческий генный сегмент J6.
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
6. Нуклеотидная молекула по любому из пп. 3-5, где по меньшей мере один неперегруппированный генный сегмент J содержит неперегруппированный человеческий генный сегмент J1, неперегруппированный человеческий генный сегмент J2, неперегруппированный человеческий генный сегмент J3, неперегруппированный человеческий генный сегмент J4, неперегруппированный человеческий генный сегмент J5 и неперегруппированный человеческий генный сегмент J6, где необязательно неперегруппированные человеческие генные сегменты J1, J2, J3, J4, J5 и J6 находятся в конфигурации зародышевой линии.
H
H
H
H
7. Нуклеотидная молекула по любому из пп. 3-6, где по меньшей мере один неперегруппированный генный сегмент V содержит полный репертуар функциональных неперегруппированных человеческих генных сегментов V, охватывающих и содержащих неперегруппированные человеческие генные сегменты V3-74 и V1-6, необязательно в конфигурации зародышевой линии.
H
H
8. Нуклеотидная молекула по любому из предыдущих пунктов, которая дополнительно содержит один или более функциональных генов Adam6 грызуна, где необязательно один или более функциональных генов Adam6 грызуна расположены между человеческим генным сегментом V1-2 и человеческим генным сегментом V6-1 и/или заменяют человеческий ген Adam6.
H
9. Нуклеотидная молекула по любому из предыдущих пунктов, где 23-мерная RSS является смежной с 5’-концом по меньшей мере одного генного сегмента D.
H
10. Нуклеотидная молекула по любому из предыдущих пунктов, где 23-мерная RSS является смежной с 3’-концом по меньшей мере одного генного сегмента D.
H
11. Нуклеотидная молекула по любому из предыдущих пунктов, где по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS, содержит:
H
H
(a) человеческий генный сегмент D3-3, функционально связанный с 23-мерной RSS, где необязательно 23-мерная RSS является смежной с 5’-концом генного сегмента D3-3,
H
H
(b) человеческий генный сегмент D2-2, функционально связанный с 23-мерной RSS, где необязательно 23-мерная RSS является смежной с 3’-концом генного сегмента D2-2,
H
H
(c) человеческий генный сегмент D2-8, функционально связанный с 23-мерной RSS, где необязательно 23-мерная RSS является смежной с 3’-концом генного сегмента D2-8,
H
(d) человеческий генный сегмент 2-15, функционально связанный с 23-мерной RSS, где необязательно 23-мерная RSS является смежной с 3’-концом генного сегмента D2-15, или
(e) любую комбинацию (a)-(d).
12. Нуклеотидная молекула по любому из предыдущих пунктов, содержащая нуклеотидную последовательность, содержащую последовательность, представленную под SEQ ID NO:52.
13. Нуклеотидная молекула по любому из пп. 1-11, содержащая нуклеотидную последовательность, содержащую последовательность, представленную под SEQ ID NO:61.
14. Нуклеотидная молекула по любому из пп. 1-13, содержащая нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную под SEQ ID NO:70.
15. Нуклеотидная молекула по любому из пп. 1-14, содержащая нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную под SEQ ID NO:71.
16. Нуклеотидная молекула по любому из пп. 1-15, содержащая нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную под SEQ ID NO:72.
17. Нуклеотидная молекула, содержащая в функциональной связи от 5’-конца к 3’-концу:
H
(a) один или более неперегруппированных человеческих генных сегментов V;
H
(b) сконструированную D-область, содержащую от 5’-конца к 3’-концу
H
H
(i) один или более неперегруппированных человеческих генных сегментов D, где каждый из одного или более человеческих генных сегментов D фланкирован на своих 5’- и 3’-концах 12-мерной RSS, и
H
H
(ii) по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS, содержащий человеческий генный сегмент D3-3, функционально связанный на своем 5’-конце с 23-мерной RSS; и
H
(c) один или более неперегруппированных человеческих генных сегментов J.
18. Нуклеотидная молекула, содержащая в функциональной связи от 5’-конца к 3’-концу:
H
(a) один или более неперегруппированных человеческих генных сегментов V;
H
H
(b) сконструированную D-область, где сконструированная D-область содержит от 5’-конца к 3’-концу
H
H
H
H
H
H
(i) по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS, содержащий по меньшей мере один человеческий генный сегмент D2, функционально связанный на своем 3’-конце с 23-мерной RSS, где необязательно по меньшей мере один человеческий генный сегмент D2, функционально связанный на своем 3’-конце с 23-мерной RSS, содержит человеческий генный сегмент D2-2, функционально связанный на своем 3’-конце с 23-мерной RSS, человеческий генный сегмент D2-8, функционально связанный на своем 3’-конце с 23-мерной RSS, человеческий генный сегмент D2-15, функционально связанный на своем 3’-конце с 23-мерной RSS, или любую их комбинацию и
H
H
(ii) один или множество человеческих генных сегментов D, где каждый из одного или множества человеческих генных сегментов D фланкирован на своих 5’- и 3’-концах 12-мерной RSS; и
H
(c) один или более неперегруппированных человеческих генных сегментов J.
H
H
H
H
H
H
H
19. Нуклеотидная молекула по п. 17 или 18, где один или более неперегруппированных человеческих генных сегментов V содержат от 5’-конца к 3’-концу неперегруппированный человеческий генный сегмент V1-2 и неперегруппированный человеческий генный сегмент V6-1, где нуклеотид дополнительно содержит один или более функциональных генов Adam6 грызуна между неперегруппированным человеческим генным сегментом V1-2 и неперегруппированным человеческим генным сегментом V6-1, и где неперегруппированный человеческий генный сегмент V1-2, один или более генов Adam6 грызуна и неперегруппированный человеческий генный сегмент V6-1 являются смежными.
H
H
H
H
20. Нуклеотидная молекула по любому из пп. 17-19, где один или более неперегруппированных человеческих генных сегментов V содержат полный репертуар функциональных неперегруппированных человеческих генных сегментов V, охватывающих и содержащих неперегруппированные человеческие генные сегменты V3-74 и V1-6, необязательно в конфигурации зародышевой линии.
H
H
21. Нуклеотидная молекула по любому из пп. 17-20, где один или более неперегруппированных человеческих генных сегментов J содержат неперегруппированный человеческий генный сегмент J6.
H
H
H
H
22. Нуклеотидная молекула по п. 21, где один или более неперегруппированных человеческих генных сегментов J содержат неперегруппированный человеческий генный сегмент J4, неперегруппированный человеческий генный сегмент J5 и неперегруппированный человеческий генный сегмент J6.
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
23. Нуклеотидная молекула по п. 22, где один или более неперегруппированных человеческих генных сегментов Jсодержат неперегруппированный человеческий генный сегмент J1, неперегруппированный человеческий генный сегмент J2, неперегруппированный человеческий генный сегмент J3, неперегруппированный человеческий генный сегмент J4, неперегруппированный человеческий генный сегмент J5 и неперегруппированный человеческий генный сегмент J6, где необязательно неперегруппированные человеческие генные сегменты J1, J2, J3, J4, J5 и J6 находятся в конфигурации зародышевой линии.
H
24. Нуклеотидная молекула по любому из пп. 1-23, которая дополнительно содержит на своем 3’-конце константную область (C) тяжелой цепи иммуноглобулина или ее часть.
H
H
25. Нуклеотидная молекула по п. 24, где C представляет собой C-область грызуна или ее часть.
H
26. Нуклеотидная молекула по п. 25, где C-область грызуна или ее часть содержат область интронного энхансера грызуна и ген IgM грызуна.
27. Нуклеотидная молекула по любому из пп. 1-26, дополнительно содержащая кассету для отбора по устойчивости к лекарственному средству,
H
где кассета для отбора по устойчивости к лекарственному средству расположена выше генного сегмента D, функционально связанного с 23-мерной RSS, и
где кассета для отбора по устойчивости к лекарственному средству необязательно фланкирована одним или более сайтами сайт-специфической рекомбинации.
28. Нацеливающийся вектор, содержащий нуклеотидную молекулу по любому из пп. 1-27, содержащий 5’- и 3’-плечи гомологии, расположенные в конфигурации для создания условий для гомологичной рекомбинации с последовательностью тяжелой цепи иммуноглобулина, где необязательно последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина расположена в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна и содержит вариабельную область тяжелой цепи человеческого или гуманизированного иммуноглобулина или их комбинацию.
H
H
29. Способ модифицирования вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина для конструирования рекомбинации D-D, при этом способ включает:
H
H
H
получение вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей D-область, содержащую один или более неперегруппированных генных сегментов D, где каждый из неперегруппированных генных сегментов D фланкирован с одной стороны 12-мерной RSS и с другой стороны другой 12-мерной RSS, и
H
H
модифицирование D-области таким образом, чтобы она дополнительно содержала по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS.
H
H
30. Способ по п. 29, где один или более неперегруппированных генных сегментов D содержат один или более неперегруппированных человеческих генных сегментов D.
H
H
H
H
31. Способ по п. 30, где один или более неперегруппированных генных сегментов D содержат все функциональные человеческие генные сегменты D зародышевой линии, охватывающие и содержащие человеческие генные сегменты D1-1 и D7-27 зародышевой линии, необязательно в конфигурации зародышевой линии.
32. Способ по любому из пп. 29-31, где модифицирование включает замену
H
H
(a) по меньшей мере одного из одного или более неперегруппированных генных сегментов D на генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS,
H
(b) по меньшей мере одной из двух 12-мерных RSS, фланкирующих неперегруппированный генный сегмент D, на 23-мерную RSS или
(c) комбинацию (a) и (b).
H
H
33. Способ по п. 32, где вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина дополнительно содержит J-область, содержащую по меньшей мере один неперегруппированный генный сегмент J,
H
H
где J-область функционально связана с D-областью, и
H
H
H
H
где замена по меньшей мере одного из одного или более неперегруппированных генных сегментов D на генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS, включает делецию по меньшей мере одного неперегруппированного генного сегмента J, содержащегося в J-области.
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
34. Способ по п. 33, где J-область содержит полный репертуар человеческих генных сегментов J зародышевой линии, содержащий человеческий генный сегмент J1 зародышевой линии, человеческий генный сегмент J2 зародышевой линии, человеческий генный сегмент J3 зародышевой линии, человеческий генный сегмент J4 зародышевой линии, человеческий генный сегмент J5 зародышевой линии и человеческий генный сегмент J6 зародышевой линии, где необязательно человеческие генные сегменты J1, J2, J3, J4, J5 и J6 зародышевой линии находятся в конфигурации зародышевой линии, и
H
H
H
H
H
H
H
где делеция по меньшей мере одного генного сегмента J зародышевой линии, содержащегося в J-области, включает делецию неперегруппированных человеческих генных сегментов J1, J2 и J3 и необязательно дополнительную делецию генных сегментов J4 и J5.
H
35. Способ любому из пп. 29-34, где по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS, содержит
H
H
(a) человеческий генный сегмент D3-3, функционально связанный с 23-мерной RSS, где необязательно 23-мерная RSS является смежной с 5’-концом генного сегмента D3-3,
H
H
(b) человеческий генный сегмент D2-2, функционально связанный с 23-мерной RSS, где необязательно 23-мерная RSS является смежной с 3’-концом генного сегмента D2-2,
H
H
(c) человеческий генный сегмент D2-8, функционально связанный с 23-мерной RSS, где необязательно 23-мерная RSS является смежной с 3’-концом генного сегмента D2-8,
DH2
H
(d) человеческий генный сегмент -15, функционально связанный с 23-мерной RSS, где необязательно 23-мерная RSS является смежной с 3’-концом генного сегмента D2-15, или
(e) любую комбинацию (a)-(d).
H
H
H
36. Способ по любому из пп. 32-35, где по меньшей мере один неперегруппированный генный сегмент D, который подвергается замене, содержит ближайший к 3’-концу неперегруппированный генный сегмент D D-области.
H
H
H
37. Способ по любому из пп. 32-36, где по меньшей мере один неперегруппированный генный сегмент D, который подвергается замене, содержит генный сегмент D, который соответствует по меньшей мере одному генному сегменту D, функционально связанному с 23-мерной RSS.
38. Локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий нуклеотидную молекулу по любому из пп. 1-27, нацеливающийся вектор по п. 28 или вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, модифицированную в соответствии со способом по любому из пп. 29-37.
39. Геном грызуна, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-27, нацеливающийся вектор по п. 28, вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, модифицированную в соответствии со способом по любому из пп. 29-37, или локус тяжелой цепи иммуноглобулина по п. 38, где геном грызуна необязательно представляет собой геном зародышевой линии грызуна.
40. Геном зародышевой линии грызуна, содержащий вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит:
H
(i) неперегруппированные вариабельные (V) генные сегменты тяжелой цепи,
H
H
H
H
(ii) сконструированную определяющую вариабельность область (D) вариабельной области тяжелой цепи, где сконструированная D-область содержит один или более генных сегментов D зародышевой линии и один или более генных сегментов D, функционально связанных с 23-мерной последовательностью сигнала рекомбинации (RSS), и
H
(iii) неперегруппированные соединяющие генные сегменты (J) тяжелой цепи,
H
H
H
H
где (i)-(iii) находятся в функциональной связи таким образом, чтобы после рекомбинации вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержала перегруппированную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, где необязательно указанная перегруппированная последовательность вариабельной области тяжелой цепи образуется после события рекомбинации V(D-D)J.
H
H
41. Геном зародышевой линии грызуна по п. 40, где один или более генных сегментов D, функционально связанных с 23-мерной последовательностью сигнала рекомбинации (RSS), содержат сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS 3’-конца.
H
H
42. Геном зародышевой линии грызуна по п. 40 или 41, где один или более генных сегментов D, функционально связанных с 23-мерной последовательностью сигнала рекомбинации (RSS), содержат генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS 5’-конца.
H
H
H
43. Геном зародышевой линии грызуна по любому из пп. 40-42, где вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой вариабельную область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, содержащую только человеческие генные сегменты V, D и J.
44. Геном зародышевой линии грызуна по п. 43, где вариабельная область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина.
45. Геном зародышевой линии грызуна по п. 44, где константная область тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой эндогенную константную область тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна, необязательно в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна.
H
H
H
H
46. Геном зародышевой линии грызуна по любому из пп. 40-45, где неперегруппированные генные сегменты V содержат полный репертуар функциональных человеческих генных сегментов V зародышевой линии, охватывающих и содержащих сегменты от V3-74 до V6-1, необязательно в конфигурации зародышевой линии.
H
H
47. Геном зародышевой линии грызуна по любому из пп. 40-46, где неперегруппированные генные сегменты J тяжелой цепи содержат человеческий генный сегмент J6.
48. Геном зародышевой линии грызуна по любому из пп. 40-47, где в геноме зародышевой линии грызуна отсутствует эндогенный ген Adam6.
49. Геном зародышевой линии грызуна по любому из пп. 40-47, дополнительно содержащий один или более генов Adam6 грызуна, где необязательно один или более эндогенных генов Adam6 грызуна содержат эндогенный ген Adam6 грызуна.
H
50. Геном зародышевой линии грызуна по п. 49, где один или более генов Adam6 грызуна вставлены между двумя человеческими генными сегментами V.
H
H
51. Геном зародышевой линии грызуна по п. 50, где один или более генов Adam6 грызуна вставлены между человеческим генным сегментом V1-2 и человеческим генным сегментом V6-1.
52. Геном зародышевой линии грызуна по п. 49, где один или более один или более генов Adam6 грызуна вставлены вместо человеческого псевдогена Adam6.
H
H
53. Геном зародышевой линии грызуна по п. 49, где один или более один или более генов Adam6 грызуна вставлены между человеческим генным сегментом V и человеческим генным сегментом D.
54. Геном зародышевой линии грызуна по любому из пп. 39-53, дополнительно содержащий ген терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы.
H
55. Геном зародышевой линии грызуна по любому из пп. 39-54, характеризующийся тем, что он является гомозиготным по сконструированной D-области.
H
56. Геном зародышевой линии грызуна по любому из пп. 39-54, характеризующийся тем, что он является гетерозиготным по сконструированной D-области.
57. Геном зародышевой линии грызуна по любому из пп. 39-56, где грызун представляет собой крысу или мышь.
58. Грызун или клетка грызуна, содержащая геном зародышевой линии грызуна по любому из пп. 39-57.
59. Грызун или клетка грызуна по п. 58, где грызун или клетка грызуна представляют собой крысу, мышь, клетку крысы или клетку мыши.
60. Грызун или клетка грызуна по п. 58 или 59, где клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку грызуна.
61. Грызун или эмбрион грызуна, полученные из эмбриональной стволовой клетки грызуна по п. 60.
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
62. Грызун, эмбрион грызуна или клетка грызуна по любому из пп. 58-61, дополнительно содержащие соматический геном, который содержит перегруппированную кодирующую последовательность V(DA-DB)J тяжелой цепи, где необязательно перегруппированный генный сегмент V(DA-DB)J тяжелой цепи функционально связан с последовательностью гена константной области IgM, и/или где DA или DB получены из генного сегмента D, функционально связанного с 23-мерной RSS, или его части, и по меньшей мере 9 пар оснований из DA или DB являются идентичными по меньшей мере 9 парам оснований из генного сегмента D, функционально связанного с 23-мерной RSS, или его части.
63. Грызун по любому из пп. 58-62, где по меньшей мере 95% от всех перегруппированных кодирующих последовательностей тяжелой цепи VDJ у грызуна имеют длину CDR3, составляющую по меньшей мере 10 аминокислот, где необязательно по меньшей мере 70% от всех перегруппированных генных последовательностей тяжелой цепи VDJ у грызуна имеют длину CDR3, составляющую по меньшей мере 11 аминокислот, необязательно по меньшей мере 15% от всех перегруппированных генных последовательностей тяжелой цепи VDJ у грызуна имеют длину CDR3, составляющую по меньшей мере 14 аминокислот.
H
H
H
H
64. Грызун по любому из пп. 58-63, характеризующийся тем, что грызун проявляет по меньшей мере 3-кратное повышение частоты рекомбинации D-D по сравнению с частотой рекомбинации D-D у эталонного грызуна.
H
65. Способ получения грызуна, геном которого содержит сконструированную D-область, при этом способ включает получение грызуна из эмбриональной стволовой клетки по п. 60.
H
66. Способ получения грызуна, геном которого содержит сконструированную D-область, при этом способ включает
H
(a) модифицирование генома эмбриональной стволовой клетки грызуна таким образом, чтобы он содержал фрагмент ДНК, содержащий один или более генных сегментов D, каждый из которых функционально связан с 23-мерной RSS, где необязательно фрагмент ДНК содержит нуклеотидную молекулу по любому из пп. 1-27, нацеливающийся вектор по п. 28, вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, модифицированную в соответствии со способом по любому из пп. 30-37, или тяжелую цепь иммуноглобулина по п. 38, и
(b) получение грызуна с применением модифицированной эмбриональной стволовой клетки грызуна из стадии (a).
H
H
H
H
H
67. Способ получения грызуна, геном которого содержит сконструированную D-область, при этом способ включает модифицирование неперегруппированной D-области вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина таким образом, чтобы она содержала по меньшей мере один сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS, где неперегруппированная D-область дополнительно содержит один или более генных сегментов D зародышевой линии, с получением таким образом указанного грызуна.
H
H
H
68. Способ по п. 67, где модифицирование включает замену одного или более неперегруппированных человеческих генных сегментов D и необязательно замену одного или более генных сегментов J на по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS.
H
H
H
H
H
H
H
H
69. Способ по п. 67 или 68, где вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой вариабельную область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, где необязательно вариабельная область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина содержит неперегруппированный кластер генов V тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, содержащий по меньшей мере один генный сегмент V, неперегруппированную D-область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, содержащую один или более неперегруппированных человеческих генных сегментов D, и неперегруппированный кластер генов J тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, содержащий один неперегруппированный человеческий генный сегмент J, где неперегруппированную D-область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина модифицируют таким образом, чтобы она содержала по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS.
70. Способ по п. 69, где стадия модифицирования приводит к получению вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей
H
H
H
H
H
(i) полный репертуар функциональных человеческих генных сегментов V, необязательно все функциональные человеческие генные сегменты V, охватывающие и содержащие сегменты от V3-74 до V6-1, где необязательно все функциональные генные сегменты V расположены в конфигурации зародышевой линии,
H
H
H
(ii) полный репертуар неперегруппированных человеческих генных сегментов D, за исключением D7-27, который заменяют на по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS, и
H
H
H
H
(iii) по меньшей мере неперегруппированный человеческий генный сегмент J6 и необязательно по меньшей мере неперегруппированный человеческий генный сегмент J4, неперегруппированный человеческий генный сегмент J5 и неперегруппированный человеческий генный сегмент J6.
H
H
71. Способ по п. 70, где по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS, содержит генный сегмент D3-3, функционально связанный с 23-мерной RSS 5’-конца.
72. Способ по п. 69, где стадия модифицирования приводит к получению вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей
H
H
H
H
H
(i) полный репертуар функциональных человеческих генных сегментов V, необязательно все функциональные генные сегменты V, охватывающие и содержащие сегменты от V3-74 до V6-1, где необязательно все функциональные генные сегменты V расположены в конфигурации зародышевой линии
H
H
H
H
H
(ii) полный репертуар неперегруппированных человеческих генных сегментов D, за исключением неперегруппированных генных сегментов D2-2, D2-8 и D2-15, каждый из которых заменяют на по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS, и
H
H
H
H
H
H
H
(iii) полный репертуар неперегруппированных человеческих генных сегментов J, необязательно неперегруппированный человеческий генный сегмент J1, неперегруппированный человеческий генный сегмент J2, неперегруппированный человеческий генный сегмент J3, неперегруппированный человеческий генный сегмент J4, неперегруппированный человеческий генный сегмент J5 и неперегруппированный человеческий генный сегмент J6.
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
73. Способ по п. 72, где по меньшей мере один генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS, содержит человеческий генный сегмент D2-2, функционально связанный с 23-мерной RSS 3’-конца, человеческий генный сегмент D2-8, функционально связанный с 23-мерной RSS 3’-конца, или человеческий генный сегмент D2-15, функционально связанный с 23-мерной RSS 3’-конца, где необязательно неперегруппированные генные сегменты D2-2, D2-8 и D2-15 соответственно заменяют на человеческий генный сегмент D2-2, функционально связанный с 23-мерной RSS 3’-конца, человеческий генный сегмент D2-8, функционально связанный с 23-мерной RSS 3’-конца, и человеческий генный сегмент D2-15, функционально связанный с 23-мерной RSS 3’-конца.
74. Способ по любому из пп. 67-73, где вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина
H
H
H
(a) дополнительно содержит один или более генов Adam6 грызуна, где необязательно один или более генов Adam6 грызуна расположены между двумя неперегруппированными генными сегментами V, необязательно между неперегруппированным человеческим генным сегментом V1-2 и неперегруппированным человеческим генным сегментом V6-1, и/или
(b) функционально связана с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, где необязательно константная область тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой эндогенную константную область тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна, необязательно эндогенную константную область тяжелой цепи иммуноглобулина грызуна в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.
75. Способ по любому из пп. 65-74, где грызун представляет собой крысу или мышь.
76. Способ получения антитела или получения нуклеиновой кислоты, кодирующей его, при этом способ включает
H
H
иммунизацию грызуна с помощью антигена, где указанный грызун содержит геном зародышевой линии, содержащий сконструированную D-область, которая содержит один или более D-сегментов, каждый из которых функционально связан с 23-мерной RSS, где необязательно грызун представляет собой грызуна в соответствии с любым из пп. 58-64 и
обеспечение индукции у грызунаиммунного ответа на антиген, включая образование антитела, связывающего антиген, или нуклеиновой кислоты, кодирующей его.
77. Способ по п. 76, дополнительно включающий извлечение антитела или нуклеиновой кислоты, кодирующей его, из грызуна или клетки грызуна.
78. Способ по п. 76, где клетка грызуна представляет собой В-клетку или гибридому.
H
H
79. Способ по любому из пп. 76-78, где один или более сегментов D, каждый из которых функционально связан с 23-мерной RSS, содержит генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS 5’-конца.
H
H
80. Способ по любому из пп. 76-79, где один или более сегментов D, каждый из которых функционально связан с 23-мерной RSS, содержит генный сегмент D, функционально связанный с 23-мерной RSS 3’-конца.
81. Способ по любому из пп. 76-80, где грызун представляет собой крысу или мышь.
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
82. Геном грызуна, нуклеиновая кислота или локус иммуноглобулина, содержащие перегруппированную кодирующую последовательность V(DA-DB)J тяжелой цепи, функционально связанную с генной последовательностью константной области тяжелой цепи грызуна, где необязательно перегруппированная тяжелая цепь подвергнута соматической гипермутации и/или определяется как кодирующая последовательность V(DA-DB)J, с учетом того, что каждый из DA и DB соответственно демонстрирует 40% идентичность с первым и вторым генными сегментами D зародышевой линии, с максимально 1 нуклеотидом, подвергнутым мутации.
H
H
83. Геном грызуна, нуклеиновая кислота или локус иммуноглобулина по п. 82, где генный сегмент DB получен из человеческого генного сегмента D3-3 зародышевой линии.
H
H
H
H
84. Геном грызуна, нуклеиновая кислота или локус иммуноглобулина по п. 82, где генный сегмент DA получен из человеческого генного сегмента D2-2, D2-8 или D2-15 зародышевой линии.
H
H
H
H
85. Геном грызуна, нуклеиновая кислота или локус иммуноглобулина по любому из пп. 82-84, где перегруппированная кодирующая последовательность V(DA-DB)J тяжелой цепи кодирует CDR3, имеющий длину, составляющую более 20 аминокислот.
H
H
86. Геном грызуна, нуклеиновая кислота или локус иммуноглобулина по любому из пп. 82-85, где генный сегмент J получен из человеческого генного сегмента J6 зародышевой линии.
87. Грызун или клетка грызуна, содержащие геном, нуклеиновую кислоту или локус иммуноглобулина по любому из пп. 82-86.
88. Грызун или клетка грызуна по п. 87, где грызун представляет собой крысу или мышь, или клетка грызуна представляет собой клетку крысы или клетку мыши.
89. Грызун или клетка грызуна по п. 87 или 88, где клетка грызуна представляет собой B-клетку грызуна.
90. Гибридома, содержащая B-клетку грызуна по п. 89, слитую с клеткой миеломы.