Влияние гидрофобной компоненты меланина чаги на его структуру и антиоксидантную активность

М. А Сысоева, Г. А. Иванова, Л. Я. Захарова ВЛИЯНИЕ ГИДРОФОБНОЙ КОМПОНЕНТЫ МЕЛАНИНА ЧАГИ

НА ЕГО СТРУКТУРУ И АНТИОКСИДАНТНУЮ АКТИВНОСТЬ

Ключевые слова: меланин, гиперразветвленный полимер, антиоксидантная активность.

Проанализированы меланины водного извлечения из чаги и меланины водных извлечений чаги после их обработки растворами гиперразветвленных полимеров (ГРП). Определено, что количество гидрофобной компоненты, отделяемой из меланинов чаги петролейным эфиром, влияет на изменение анти-оксидантной активности меланина. После удаления гидрофобной компоненты из меланинов водного извлечения чаги, их антиоксидантная активность возрастает, а у меланинов водного извлечения, обработанного ГРП, она существенно снижается.

Keywords: melanin, hyperbranched polymer, antioxidant activity, structure.

Melanins of chaga water extract and melanins isolated from chaga water extracts after their treating with hyperbranched polymers (HBP) are obtained and analized. With photon-correlation spectroscopy and atomic force microscopy determined sizes and forms of melanin’s particles. Exhausting extraction of hydrophobic component of chaga water extract melanins and melanins isolated from chaga water extracts after their treating with HBP are conducted by petroleum ether. Compositions of petroleum extracts are studied. Determind that melanin’s hydrophobic component separable with petroleum ether change the melanin’s structure and antioxidant activity.

Водные извлечения из чаги представляют собой полидисперсные коллоидные системы. Дисперсную фазу этих систем составляет меланин.

Меланины, выделенные из различных природных объектов, - это частицы, представляющие собой пигменты, связанные с белками и полисахаридами. Размер частиц меланина чаги составляет 100-400 нм, то есть их размер близок к наноразмерному диапазону [1]. Меланин синтезируется грибом в процессе его жизнедеятельности, количество, состав и структура которого могут существенно отличаться в зависимости от места и условий произрастания чаги. По соединениям предшественникам пигментов меланины разделяют на эумеланины, феомеланины, нейромеланины и алломеланины. Меланин чаги отнесен к алломеланинам.[2] Кроме гидрофильных компонентов в составе меланина чаги обнаружены такие вещества гидрофобной природы, как триацилглицериды, высшие жирные кислоты, в том числе, полиненасыщенные, витамин Е, коэнзим Q, сквален, некоторые из них могут вносить вклад в проявление меланином антиоксидантной активности [1]. Липидные включения в нейромеланине прикреплены к частицам меланина [3]. Согласно электронной микроскопии, меланины чаги не содержат таких включений гидрофобной фазы. Высказано предположение, что липидная компонента равномерно распределена в частице меланина и не просматривается при микроскопии образца [4].

Объектами исследования выбраны меланины чаги, полученные по традиционной технологии [5] и меланины, выделенные из извлечений чаги, обработанных растворами ГРП Вокот Н30 и Н40. [6] Антиоксидантная активность меланинов, полученных из разного сырья по традиционной технологии, находится в диапазоне 20-40 кКл/100 г. Обработка водных извлечений растворами ГРП приводит к повышению антиоксидантной активности меланинов в 2-4 раза, в зависимости от применяемого полимера [7]. Ранее было показано, что антиоксидантная активность меланинов увеличивается после удаления из водных извлечений чаги липидной компоненты петролейным эфиром [8]. И в том, и в другом случаях, повышение антиоксидантной активности сопровождается изменением размера частиц меланина. Можно ожидать, что последовательная обработка водных извлечений ГРП, а затем петролейным эфиром, приведет к большему увеличению антиоксидантной активности полученных коллоидных систем и меланинов.

Целью данного исследования является определение влияния гидрофобной компоненты частиц меланинов чаги на их структуру и антиоксидантную активность.

Результаты и их обсуждение

Поскольку водное извлечение чаги это полидисперсная коллоидная система, не содержащая эмульсионной фазы [9], то при обработке водных извлечений из чаги петролейным эфиром гидрофобная компонента экстрагируется из дисперсной фазы - меланина. После удаления гидрофобной компоненты из меланина наблюдается снижение размера его частиц (табл. 1). Причем удаление как 21%, так и 1% этих компонентов приводит к формированию частиц одинаковых размеров (1 и 3 партии сырья). Но при потере гидрофобной фазы в количестве 21% антиоксидантная активность меланинов увеличивается в 2 раза, а при 1%-ной потере такого повышения антиоксидантной активности не наблюдается. Следовательно, лишь удаление значительного количества гидрофобной компоненты приводит к увеличению антиоксидантной активности меланина. Данные по изменению размеров и, соответственно, по антиоксидантной активности меланинов второй партии сырья хорошо согласуются с этим заключением, поскольку имеют промежуточные значения, по сравнению с результатами, полученные для других партий сырья.

Таблица 1 - Характеристика водных извлечений из чаги

Партия сырья Количество сухих веществ, удаляемых петролейным эфиром, %** Размер частиц (р меланинов водных извлечений чаги, нм АОА меланинов,кКл/100 гр меланина

до обработки петролейным эфиром после обработки петролей-ным эфиром до обработки петролейным эфиром после обработки петролейным эфиром

1 1,14 190 65 31,00±1,00 32,00±1,70

2 3,34 108 2 37,00±1,00 46,00±1,50

3* 21,30 160 67 27,50±0,7 63,00±4,00

Примечание: *- литературные данные, **- от массы сухого вещества водного извлечения чаги.

В таблице 2 представлены результаты обработки водных извлечений чаги ГРП, а затем удаление из этих коллоидных систем гидрофобной компоненты петролейным эфиром. Примененные для обработки водных извлечений ГРП Вокот Н30 и Н40 отличаются по молекулярной массе, количеству концевых гидроксильных групп и по воздействию на дисперсную фазу водного извлечения чаги [7,10].

Таблица 2 - Характеристика водных извлечений из чаги, обработанных ГРП

Вводи- мый ГРП Партия сырья Количество сухих веществ, удаляемых петролейным эфиром, %** Размер частиц (р меланинов чаги в извлечениях, обработанных ГРП, нм АОА меланинов, кКл/100 гр меланина

до обработки петролейным эфиром после обработки петролей-ным эфиром до обработки пет-ролейным эфиром после обработки пет-ролейным эфиром

Вокот 1 1, 02 74 81 64±3,5 36±1,4

Н30 2 2, 73 121 1,1 67±1,7 40±2,1

Вокот 1 0, 97 96 84 72±2 41±2,2

Н40 1* 0, 57 80 146 121±4 44±2,2

2 2, 81 156 7 116±1,2 56±1,4

2** 2, 48 196 3,7 93±1 65±1,4

Примечание: *, ** - отличаются концентрацией вводимого ГРП.

Обработка водных извлечений чаги ГРП влияет на дисперсные фазы формируемых коллоидных систем таким образом, что частицы меланина изменяются по размеру, но доступность гидрофобной компоненты к ее извлечению петролейным эфиром остается прежней, как и у меланина исходного водного извлечения. То есть из этих меланинов петролей-ным эфиром извлекается такое же количество липидной компоненты, как из меланинов водных извлечений чаги (табл. 1, 2). Это хорошо согласуется с литературными данными, согласно которым частица меланина состоит из более мелких частиц-агрегатов и субагрегатов [11]. Следовательно, после обработки водных извлечения чаги Вокот Н30 и Н40 происходит изменение размеров и формы частиц меланинов за счет агрегационных и де-загрегационных процессов, происходящих в этих коллоидных системах, но они не затрагивают те участки, в которых находится гидрофобная компонента меланина. Можно предположить, что она локализована в более мелких частицах - агрегатах и субагрегатах, тогда их перекомпоновка не приводит к большей или меньшей доступности гидрофобной компоненты меланина в целом. Это также хорошо согласуется с тем, что меланины, полученные из коллоидных систем после удаления гидрофобной компоненты из извлечений, обработанных ГРП, во всех случаях имеют антиоксидантную активность более низкую, чем до удаления. Поскольку, в отличие от меланинов самих водных извлечений, в этих меланинах перекомпоновка частицы, вероятно, приводит к снижению активности парамагнитных центров этих частиц.

Для подтверждения иной компоновки частиц меланинов чаги, выделенных до (рис.1 а) и после (рис. 1 б) удаления гидрофобной компоненты из водного извлечения чаги, обработанного ГРП, применена атомно-силовая микроскопия меланинов. Изменение и формы, и размера частиц меланина может указывать на существенное изменение компоновки частицы меланина и влиять на расположение и активность парамагнитных центров, а, следовательно, и проявление меланинами антиоксидантной активности.

В целом, результаты, полученные с помощью фотон-корреляционной спектроскопии (ФКС) хорошо согласуются с данными атомно-силовой микроскопии (АСМ) (табл. 3). Некоторые отклонения в размерах частиц меланина, полученных разными методами, можно объяснить отличиями агрегатных состояний образцов.

Рис. 1 - Меланины, полученные после обработки водного извлечения из чаги раствором ГРП БоКогп Н40 до

С помощью тонкослойной хроматографии проведен анализ экстрактивных веществ петролейных экстрактов водных извлечений чаги и водных извлечений чаги, обработанных ГРП. Установлено, что отличия в составе извлекаемых липидов не обнаружено. Их спектр ограничивается наиболее распространенными липидными веществами-триацилглицеридами, диглицеридами, моноглицеридами, жирными кислотами, высшими алифатическими спиртами, стеринами.

Установлено, что количество гидрофобной компоненты, удаляемой петролейным эфиром из частиц меланина водного извлечения чаги, влияет на формирование их структуры и проявление ими антиоксидантной активности. Последовательная обработка водных извлечений из чаги ГРП, а затем петролейным эфиром приводит к снижению антиокси-

дантной активности меланинов. Антиоксидантная активность меланинов зависит от компоновки частицы меланина.

Таблица З - Размеры частиц меланина

Метод Меланин водного извлечения чаги Меланин после обработки водного извлечения чаги БоИогп Н40 Меланин после последовательной обработки водного извлечения чаги БоКогп Н40 и петролейным эфиром

ФКС АСМ 3S0 нм (Rf=190 нм) 400 нм 192 нм (Кг =96 нм) 120 нм, 500 нм 168 нм (Кг =84) 75-220 нм

Экспериментальная часть

В работе использовано две партии сырья чаги, приобретенные в аптечной сети, ГРП Bol-tom Н30 и Н40 производства компании Perstorp Speciality Chemicals AB, Швеция. Водные извлечения получали согласно [5]. Обработку водных извлечений растворами ГРП проводили по [6]. Антиоксидантную активность меланинов определяли согласно [12, 13]. Светорассеяние частиц изучали при помощи 72-канального коррелометра «ФотоКорр-М» и анализировали с использованием метода кумулянтов и программы DynaLS, позволяющей оценить распределение агрегатов по размерам. Атомно-силовую микроскопию меланинов проводили на сканирующем зондовом микроскопе MultiMode V фирмы Veeco. Осуществлялась исчерпывающая экстракция водных извлечений чаги и водных извлечений чаги, обработанных ГРП, петролейным эфиром [14.] Определение содержания экстрактивных веществ проводилось весовым методом. Качественный состав липидов анализировали методом тонкослойной хроматографии на пластинках Sorbfil согласно [15].

Литература

1. Сысоева, М. А. Высокоактивные антиоксиданты на основе гриба Inonotus obliquus: автореф. дис. ... д-ра хим. наук / М.А. Сысоева. - Казань, 2009. - 32 с.

2. Шашкина, М.Я. Чага, чаговит, чаголюкс как средство профилактики и лечения больных/ М.Я. Шашкина, П.Н Шашкин., А.В Сергеев. М.: Эдас, - 2008. - 80 с.

3. Bruno, J. R. <Neuromelanin and biological function> Accademia Pontaniana, Napoli, Bozza 5 (2004).

4. Харина, М.В. Сравнительный анализ меланинов чаги с помощью электронной микроскопии / М.В. Харина [и др.] //XI Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии», Казань, 2010. - С. 285

5. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами / М.А. Сысоева [и др.] // Вестник Казан. тех-нол. ун-та. - 2003. - №2. - С. 172-179.

6. Патент РФ № 2366439. Способ получения осажденного препарата из березового гриба чага / М. А. Сысоева, Г. А. Иванова, В. С. Гамаюрова, Г. А. Кутырев / 10. 09. 2009.

7. Сысоева, М.А. Повышение антиоксидантной активности водных извлечений и меланинов чаги.

I. Обработка водных извлечений чаги водными растворами гиперразветвленных полимеров / М.А. Сысоева [и др.] // Химия растительного сырья. 2010. №2. С. 105-108.

8. Хабибрахманова, В.Р. Состав и свойства дисперсной фазы золя водных извлечений чаги: автореф. дис. канд. хим. наук / В.Р. Хабибрахманова. - Казань, 2008. - 18 с.

9. Якимов, П.А. О причинах изменения устойчивости пигментного комплекса в водных экстрактах из чаги / П.А.Якимов, С.М.Андреева, Е.В. Алексеева // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений - М. Л.: Наука, 1961 г. - С. 113-119

10. Королев, Г.В. Гиперразветвленные полимеры - новый мощный стимул дальнейшего развития области трехмерной полимеризации и революция в полимерном материаловедении / Г.В.Королев, М.Л. Бубнова. - Черноголовка: ИПХФ РАН, 2006.

11. Bruno, J. R. Nicolaus <Health and molecular diseases-speculating on the global spreading of molecular diseases: How should mankind react? >, Accademia Pontaniana, Napoli, vol LII (2003), 285-293

12. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги. Исследование золя вводных извлечений чаги. IV. Антиоксидантная активность. Влияние способа извлечения и применение комплексонов, гидроокиси натрия / М.А. Сысоева [и др.] // Химия растительного сырья. - 2005. - №1. - С.41-47.

13. Абдуллин, И.Ф. Электрогенерированный бром - реагент для определения антиоксидантной способности соков и экстрактов / И.Ф. Абдуллин, Е.Н. Турова, Г.К. Будников // Заводская лаборатория. - 2002. - Т. 68. - №9. - С. 12-15.

14. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги. VIII. Размеры частиц дисперсных фаз, образующихся при экстракции водных извлечений чаги органическими растворителями / М.А. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова, В.С. Гамаюрова, Л.А. Кудрявцева // Химия растительного сырья. - 2008. - №4. - С.129-132.

15. Кейтс, М. Техника липидологии / М. Кейтс; пер. с англ. В.А. Вавера. - М.: Мир, 1975. - 322 с.

© М. А Сысоева - д-р хим. наук, зав. каф. пищевой биотехнологии КГТУ; Г. А. Иванова - асс. той же кафедры, guziva@rambler.ru; Л. Я. Захарова - д-р хим. наук, зав. лаб. ИОФХ им. А.Е. Арбузова КНЦ РАН, lucia@iopc.knc.ru.