ПРИМЕНЕНИЕ И ПОЛУЧЕНИЕ НЕЙТРАЛЬНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗ НА ФОНЕ, СВОБОДНОМ ОТ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕАЗ

1. Способ получения нейтральной металлопротеазы, включающий:
i) предоставление клетки-хозяина Bacillus, лишенной эндогенного фермента сериновой щелочной протеазы (AprE), эндогенного фермента внеклеточной нейтральной металлопротеазы (NprE) и эндогенного фермента минорной внеклеточной сериновой протеазы (Vpr);
ii) трансформацию указанной клетки-хозяина Bacillus нуклеиновой кислотой, кодирующей гетерологичный фермент NprE в оперативной связи с промотором, для получения трансформированной клетки-хозяина и
iii) культивирование указанной трансформированной клетки-хозяина в условиях, подходящих для продукции гетерологичного фермента NprE, так что продуцируется гетерологичный фермент NprE.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий выделение указанного продуцируемого гетерологичного фермента NprE.
3. Способ по п.1, где указанная клетка-хозяин Bacillus представляет собой B.subtilis.
4. Способ по п.1, где указанная клетка-хозяин Bacillus дополнительно лишена эндогенного фермента минорной внеклеточной сериновой протеазы (Epr).
5. Способ по п.1, где указанная клетка-хозяин Bacillus дополнительно лишена эндогенного фермента главной внутриклеточной сериновой протеазы (IspA) и/или эндогенного фермента бациллопептидазы F (Bpr).
6. Способ по п.1, где указанная клетка-хозяин Bacillus лишена эндогенного фермента протеазы, связанной с клеточной стенкой (WprA), и/или эндогенного фермента внеклеточной металлопротеазы (Mpr).
7. Способ по п.1, где указанный гетерологичный фермент NprE представляет собой фермент NprE Bacillus amyloliquefaciens или его вариант.
8. Способ по п.7, где указанный вариант NprE Bacillus amyloliquefaciens обладает аминокислотной последовательностью, включающей замену, по меньшей мере, в одном положении, выбранном из положений, эквивалентных положениям 1, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 16, 21, 23, 24, 25, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 5, 51, 54, 55, 58, 59, 6, 61, 62, 63, 65, 66, 69, 7, 76, 85, 86, 87, 88, 9, 91, 92, 96, 97, 98, 99, 1, 12, 19, 11, 111, 112, 113, 115, 117, 119, 127, 128, 129, 13, 132, 135, 136, 137, 138, 139, 14, 146, 148, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 169, 173, 178, 179, 18, 181, 183, 184, 186, 19, 191, 192, 196, 198, 199, 2, 22, 23, 24, 25, 21, 211, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 22, 221, 222, 223, 224, 228, 229, 237, 239, 24, 243, 244, 245, 248, 252, 253, 26, 261, 263, 264, 265, 267, 269, 27, 273, 277, 28, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 289, 29, 292, 293, 296, 297 и 299 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 3.
9. Способ по п.8, где указанный вариант NprE Bacillus amyloliquefaciens обладает аминокислотной последовательностью, включающей, по меньшей мере, одну замену, выбранную из T4C, T4E, T4H, T4I, T4K, T4L, T4M, T4N, T4P, T4R, T4S, T4V, T4W, T4Y, G12D, G12E, G121, G12K, G12L, G12M, G12Q, G12R, G12T, G12V, G12W, K13A, K13C, K13D, K13E, K13F, K13G, K13H, K13I, K13L, K13M, K13N, K13Q, K13S, K13T, K13V, K13Y, T14F, T14G, T14H, Tl4I, T14K/T14L, T14M, T14P, T14Q, T14R, T14S, T14V, T14W, T14Y, S23A, S23D, S23F, S23G, S23I, S23K, S23L, S23M, S23N, S23P, S23Q, S23R, S23S, S23T, S23V, S23W, S23Y, G24A, G24D, G24F, G24G, G24H, G24I, G24K, G24L, G24M, G24N, G24P, G24R, G24S, G24T, G24V, G24W, G24Y, K33H, Q45C, Q45D, Q45E, Q45F, Q45H, Q45I, Q45K, Q45L, Q45M, Q45N, Q45P, Q45R, Q45T, Q45W, N46A, N46C, N46E, N46F, N46G, N46H, N46I, N46K, N46L, N46M, N46P, N46Q, N46R, N46S, N46T, N46V, N46W, N46Y, R47E, R47K, R47L, R47M, R47Q, R47S, R47T, Y49A, Y49C, Y49D, Y49E, Y49F, Y49H, Y49I, Y49K, Y49L, Y49N, Y49R, Y49S, Y49T, Y49V, Y49W, N50D, N50F, N50G, N50H, N50I, N50K, N50L, N50M, N50P, N50Q, N50R, N50W, N50Y, T54C, T54D, T54E, T54F, T54G, T54H, T54I, T54K, T54L, T54M, T54N, T54P, T54Q, T54R, T54S, T54V, T54W, T54Y, S58D, S58H, S58I, S58L, S58N, S58P, S58Q, T59A, T59C, T59E, T59G, T59H, T59I, T59K, T59L T59M, T59N, T59P, T59Q, T59R, T59S, T59V, T59W, T60D, T60F, T60I, T60K, T60L, T60N, T60Q, T60R, T60V, T60W, T60Y, T65C, T65E,T65F, T65H, T65I, T65K, T65L, T65M, T65P, T65Q, T65R, T65V, T65Y, S66C, S66D, S66E, S66F, S66H, S66I, S66K, S66L,S66N, S66P, S66Q, S66R, S66T, S66V, S66W, S66Y, Q87A, Q87D, Q87E, Q87H, Q87I, Q87K, Q87L, Q87M, Q87N, Q87R, Q87S, Q87T, Q87V, Q87W, N90C, N90D, N90E, N90F, N90G, N90H, N90K, N90L, N90R, N90T, N96G, N96H, N96K, N96R, K97H, K97Q, K97W, K100A, K100D, K100E, K100F, K100H, K100N, K100P, K100Q, K100R, K100S, K100V, K100Y, R110A, R110C, R110E, R110H, R110K, R110L, R110M, R110N, R110Q, R110S, R110Y, D119E, D119H, D119I, D119L, D119Q, D119R, D119S, D119T, D119V, D119W, G128C, G128F, G128H, G128K, G128L, G128M, G128N, G128Q, G128R, G128W, G128Y, S129A, S129C, S129D, S129F, S129G, S129H, S 1291, S129K, S129L, S129M, S129Q, S129R, S129T, S129V, S129W, S129Y, F130I, F130K, F130L, F130M, F130Q, F130R, F130T, F130V, F130Y, S135P, G136I, G136L, G136P, G136V, G136W, G136Y, S137A, M138I, M138K, M138L, M138Q, M138V, D139A, D139C, D139E, D139G, D139H, D139I, D139K, D139L, D139M, D139P, D139R, D139S, D139V, D139W, D139Y, V140C, Q151I, E152A, E152C, E152D, E152F, E152G, E152H, E152L, E152M, E152N, E152R, E152S, E152W, N155D, N155K, N155Q, N155R, D178A, D178C, D178G, D178H, D178K, D178L, D178M, D178N, D178P, D178Q, D178R, D178S, D178T, D178V, D178W, D178Y, T179A, T179F, T179H, T179I, T179K, T179L, T179M, T179N, T179P, T179Q, T179R, T179S, T179V, T179W, T179Y, E186A, E186C, E186D, E186G, E186H, E186K, E186L, E186M, E186N, E186P, E186Q, E186R, E186S, E186T, E186V, E186W, E186Y, V190H, V190I, V190K, V190L, V190Q, V190R, S191F, S191G, S191H, S191I, S191K, S191L, S191N, S191Q, S 191R, S191W, L198M, L198V, S199C, S199D, S199E, S199F, S199I, S199K, S199L, S199N, S199Q, S199R, S199V, Y204H, Y204T, G205F, G205H, G205L, G205M, G205N, G205R, G205S, G205Y, K211A, K211C, K211D, K211G, K211M, K211N, K211Q, K211R, K211S, K211T, K211V, K214A, K214C, K214E, K214I, K214L, K214M, K214N, K214Q, K214R, K214S, K214V, L216A, L216C, L216F, L216H, L216Q, L216R, L216S, L216Y, N218K, N218P, T219D, D220A, D220E, D220H, D220K, D220N, D220P, A221D, A221E, A221F, A221I, A221K, A221L, A221M, A221N, A221S, A221V, A221Y, G222C, G222H, G222N, G222R, Y224F, Y224H, Y224N, Y224R, T243C, T243G, T243H, T243I, T243K, T243L, T243Q, T243R, T243W, T243Y, K244A, K244C, K244D, K244E, K244F, K244G, K244L, K244M, K244N, K244Q, K244S, K244T, K244V, K244W, K244Y, V260A, V260D, V260E, V260G, V260H, V260I, V260K, V260L,V260M, V260P, V260Q, V260R V260S, V260T, V260W, V260Y, Y261C, Y261F, Y261I, Y261L, T263E, T263F, T263H, T263I, T263L, T263M, T263Q, T263V, T263W, T263Y, S265A, S265C, S265D, S265E, S265K, S265N, S265P, S265Q, S265R,S265T, S265V, S265W, K269E, K269F, K269G, K269H, K269I, K269L, K269M, K269N, K269P, K269Q, K269S, K269T, K269V, K269W, K269Y, A273C, A273D, A273H, A273I, A273K, A273L, A273N, A273Q, A273R, A273Y, R280A, R280C, R280D, R280E, R280F, R280G, R280H, R280K, R280L, R280M, R280S, R280T, R280V, R280W, R280Y, L282F, L282G, L282H, L282I, L282K, L282M, L282N, L282Q, L282R, L282V, L282Y, S285A, S285C, S285D, S285E, S285K, S285P, S285Q, S285R, S285W, Q286A, Q286D, Q286E, Q286K, Q286P, Q286R, A289C, A289D, A289E, A289K, A289L, A289R, A293C, A293R, N296C, N296D, N296E, N296K, N296R, N296V, A297C, A297K, A297N, A297Q, A297R и G299N аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:3.
10. Способ по п.8, где указанный вариант NprE Bacillus amyloliquefaciens обладает аминокислотной последовательностью, включающей множественные замены, выбранные из S129I/F130L/D220P, M138L/V190I/D220P и S120I/F130L/M138L/V190I/D220P.
11. Способ по п.1, где указанная нейтральная металлопротеаза обладает, по меньшей мере, приблизительно 45%-ной идентичностью аминокислот нейтральной металлопротеазе, включающей аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 3.
12. Гетерологичный фермент NprE, получаемый с помощью способа, представленного в п.1.
13. Выделенный фермент NprE, обладающий, по меньшей мере, приблизительно 45% идентичностью аминокислот нейтральной металлопротеазе, включающей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, или его варианты.
14. Композиция, включающая фермент NprE или его вариант, представленные в п.13, где указанная композиция, по существу, лишена загрязнения ферментом сериновой протеазой (AprE) Bacillus.
15. Композиция по п.14, где указанное загрязнение AprE включает менее приблизительно 1% по массе по отношению к NprE или его варианту указанной композиции.
16. Композиция по п.15, где указанное загрязнение AprE включает менее приблизительно 0,50 Е/мл активности сериновой протеазы.
17. Композиция по п.16, где указанное загрязнение AprE включает менее приблизительно 0,05 Е/мл активности сериновой протеазы.
18. Композиция по п.17, где указанное загрязнение AprE включает менее приблизительно 0,005 Е/мл активности сериновой протеазы.
19. Композиция по п.14, где указанная композиция представляет собой чистящую композицию.
20. Композиция по п.19, где указанная чистящая композиция представляет собой детергент.
21. Композиция по п.14, дополнительно включающая, по меньшей мере, один дополнительный фермент или производное фермента, выбранные из амилаз, липаз, маннаназ, пектиназ, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и целлюлаз.
22. Композиция по п.14, где указанная композиция включает, по меньшей мере, приблизительно 0,0001 процент по массе указанного фермента NprE или его варианта.
23. Композиция по п.22, где указанная композиция включает от приблизительно 0,001 до приблизительно 0,5 процента по массе указанного фермента NprE или его варианта.
24. Композиция по п.14, дополнительно включающая, по меньшей мере, один добавочный ингредиент.
25. Композиция по п.14, дополнительно включающая достаточное количество модификатора рН для придания композиции итогового рН от приблизительно 3 до приблизительно 5, причем композиция является по существу свободной от веществ, которые гидролизуют при рН от приблизительно рН 3 до приблизительно рН 5.
26. Композиция по п.25, где указанные вещества, которые гидролизуют при рН от приблизительно рН 3 до приблизительно рН 5, включают, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество.
27. Композиция по п.26, где указанное поверхностно-активное вещество представляет собой поверхностно-активное вещество алкилсульфат натрия, включающий этиленоксидную часть.
28. Композиция по п.14, где указанная композиция представляет собой жидкость.
29. Способ очистки, включающий приведение поверхности и/или изделия, включающего ткань, в контакт с чистящей композицией по п.19.
30. Способ по п.29, дополнительно включающий стадию промывания поверхности и/или материала после приведения указанной поверхности или материала в контакт с указанной чистящей композицией.
31. Композиция по п.14, где указанная композиция представляет собой корм для животных.
32. Композиция по п.14, где указанная композиция представляет собой композицию для обработки текстиля и/или кожи.
33. Клетка-хозяин Bacillus, лишенная эндогенного фермента сериновой щелочной протеазы (AprE), эндогенного фермента внеклеточной нейтральной металлопротеазы (NprE) и эндогенного фермента минорной внеклеточной сериновой протеазы (Vpr), где указанная клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей гетерологичный фермент NprE в оперативной связи с промотором.
34. Клетка-хозяин Bacillus по п.33, где указанная клетка-хозяин Bacillus представляет собой B.subtilis.
35. Клетка-хозяин Bacillus по п.33, дополнительно лишенная эндогенного фермента минорной внеклеточной сериновой протеазы (Epr).
36. Клетка-хозяин Bacillus по п.35, дополнительно лишенная эндогенного фермента главной внутриклеточной сериновой протеазы (IspA) и/или эндогенного фермента бациллопептидазы F (Bpr).
37. Клетка-хозяин Bacillus по п.36, где указанная клетка-хозяин Bacillus представляет собой B.subtilis.
38. Клетка-хозяин Bacillus по п.36, дополнительно лишенная эндогенного фермента протеазы, связанной с клеточной стенкой (WprA), и/или эндогенного фермента внеклеточной металлопротеазы (Mpr).
39. Клетка-хозяин Bacillus по п.38, где указанная клетка-хозяин Bacillus представляет собой B.subtilis.
40. Клетка-хозяин Bacillus по п.33, где указанный гетерологичный фермент NprE представляет собой фермент NprE Bacillus amyloliquefaciens или его вариант.
41. Выделенная клетка-хозяин Bacillus, лишенная эндогенного фермента сериновой щелочной протеазы (AprE), эндогенного фермента внеклеточной нейтральной металлопротеазы (NprE), эндогенного фермента минорной внеклеточной сериновой протеазы (Vpr), эндогенного фермента минорной внеклеточной сериновой протеазы (Epr), эндогенного фермента главной внутриклеточной сериновой протеазы (IspA) и эндогенного фермента бациллопептидазы F (Bpr).
42. Клетка-хозяин Bacillus по п.41, где указанная клетка-хозяин представляет собой B.subtilis.
43. Выделенная клетка-хозяин Bacillus, лишенная эндогенного фермента сериновой щелочной протеазы (AprE), эндогенного фермента внеклеточной нейтральной металлопротеазы (NprE), эндогенного фермента минорной внеклеточной сериновой протеазы (Vpr), эндогенного фермента минорной внеклеточной сериновой протеазы (Epr), эндогенного фермента главной внутриклеточной сериновой протеазы (IspA), эндогенного фермента бациллопептидазы F (Bpr), эндогенного фермента протеазы, связанной с клеточной стенкой (WprA), и эндогенного фермента внеклеточной металлопротеазы (Mpr).
44. Клетка-хозяин Bacillus по п.43, где указанная клетка-хозяин представляет собой B.subtilis.