СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ ИЗМЕНЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО ЗАРЯДА ЭРИТРОЦИТОВ
METHOD OF REGISTRATION OF CHANGE OF THE SURFACE CHARGE OF ERYTHROCYTES

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследований.
Известен способ определения поверхностного отрицательного заряда эритроцитов путем измерения их электрофоретической подвижности.
К недостаткам известного способа следует отнести сравнительную трудоемкость определения изменения поверхностного заряда эритроцитов, труднодоступность специальных приборов.
Известен также способ определения изменения поверхностного заряда эритроцитов (Шереметьев Ю.А., Макин Г.И., Суслов Ф.Ю. Способ регистрации изменения поверхностного заряда эритроцитов №2027188, 1995) путем их выделения из крови и регистрации агрегации, индуцированной лантаном.
В качестве прототипа выбран способ определения изменения поверхностного заряда эритроцитов, включающий забор крови, выделение эритроцитов из крови, и их инкубирование с катионным красителем - альциановым голубым, при этом краситель инкубируют с эритроцитами при 37°С в течение 30 минут, определяют оптическую плотность раствора до и после инкубации с эритроцитами, а изменение поверхностного заряда рассчитывают по количеству связанного красителя эритроцитами больных по сравнению с эритроцитами здоровых доноров (Klinger М., Kramarz S., Wendycz D., Kopec W. Different erythrocyte and platelet surface electric charge in various types of glomerulonephritis. Nephrol. Dial.Transplant. 1997.12.707-712).
Принцип метода основан на том, что положительно заряженный краситель связывается с отрицательно заряженной поверхностью эритроцитов. Чем меньше связалось красителя с эритроцитами, тем ниже их отрицательный заряд.
Однако альциановый голубой является дорогим и дефицитным препаратом.
Известно, что другой положительно заряженный краситель акридиновый оранжевый используется для определения нуклеиновых кислот в различных клетках. При этом окрашивание акридиновым оранжевым клеток нельзя наблюдать в световом микроскопе. Для этого требуются специальные приборы (люминисцентный микроскоп).
Задача предлагаемого изобретения - использование нового, катионного красителя, обеспечивающего определение поверхностного заряда эритроцитов.
Технический результат - определение изменения поверхностного заряда эритроцитов у больных по сравнению с эритроцитами, взятыми у здоровых доноров.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем забор крови у здоровых доноров и больных, выделение эритроцитов из крови и их инкубируют с акридиновым оранжевым при 37°С в течение 30 минут, определяют оптическую плотность раствора при 412 нм до и после инкубации с эритроцитами, поверхностный заряд рассчитывают по количеству связанного красителя, определяют изменение поверхностного заряда эритроцитов у больных по сравнению с эритроцитами, взятыми у здоровых доноров.
Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты после забора крови трижды отмывают от плазмы и белых клеток центрифугированием в 10-кратном объеме физиологического раствора. К 2 мл 0.005% раствора акридинового оранжевого, приготовленного на забуференном физиологическом растворе (10 мМ трис - HCI, 150 мМ NaCl, рН 7.4), добавляют 0.05 мл отмытых эритроцитов и инкубируют при 37°С в течение 30 минут. После этого центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 минут и определяют при 412 нм оптическую плотность раствора до и после инкубации с эритроцитами. Рассчитывают количество связанного красителя с анионными участками поверхности эритроцитов по формуле:
А(%)=100-(С⋅100)/В, где А - количество связанного эритроцитами красителя (%);
В - оптическая плотность исходного раствора (в ед. экстинкции); С - оптическая плотность раствора красителя после инкубации с эритроцитами (в ед. экстинкции). По разнице между количеством связанного красителя эритроцитами здорового донора и клетками больных судят об изменении поверхностного заряда эритроцитов.
Пример 1. К 2 мл 0.005% раствора акридинового оранжевого, приготовленного на забуференном физиологическом растворе (10 мМ трис - HCl, 150 мМ NaCl, рН 7.4), добавляют 0.05 мл отмытых эритроцитов здорового донора и инкубируют при 37°С в течение 30 мин. После этого центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 минут и определяют при 412 нм оптическую плотность раствора до и после инкубации с эритроцитами. Количество связанного с эритроцитами акридинового оранжевого составило 61.5%.
Пример 2. К 2 мл 0.005% раствора акридинового оранжевого, приготовленного на забуференном физиологическом растворе (10 мМ трис - HCl, 150 мМ NaCl, рН 7.4), добавляют 0.05 мл отмытых эритроцитов больного болезнью Крона и инкубируют при 37°С в течение 30 мин. После этого центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 минут и определяют при 412 нм оптическую плотность раствора до и после инкубации с эритроцитами. Количество связанного с эритроцитами акридинового оранжевого составило 46.2%. Поверхностный заряд эритроцитов больного с болезнью Крона снижен на 15.3%.
Пример 3. К 2 мл 0.005% раствора акридинового оранжевого, приготовленного на забуференном физиологическом растворе (10 мМ трис - HCl, 150 мМ NaCl, рН 7.4), добавляют 0.05 мл отмытых эритроцитов больного неспецифическим язвенным колитом и инкубируют при 37°С в течение 30 минут. После этого центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 минут и определяют при 412 нм оптическую плотность раствора до и после инкубации с эритроцитами. Количество связанного с эритроцитами акридинового оранжевого составило 51.7%. Поверхностный заряд эритроцитов больного неспецифическим язвенным колитом снижен на 9.8%.