Способ таргетной доставки терапевтических препаратов к опухолевым клеткам
METHOD FOR TARGETED DELIVERY OF THERAPEUTIC DRUGS TO TUMOR CELLS

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения мягкотканых опухолей, клетки которых экспрессируют HER2, путем доставки терапевтических средств к клеткам опухолевого узла.
Актуальность
В настоящее время известно о применении различных методов и средств иммунотерапии как для терапии опухолей, так и для профилактики рецидива онкологического заболевания у пациентов после условно-радикальных операций. В качестве средств иммунотерапии используют биомедицинские клеточные продукты, рекомбинантные цитокины, а также антитела к мембранно-связанным опухоль-специфическим молекулам или рецепторам, вовлеченным в реализацию противоопухолевого иммунного ответа.
Для снижения вводимой дозы препарата было предложено доставлять препараты in situ - локально в область опухолевого узла или высокого риска рецидива опухоли после резекции злокачественного новообразования, что призвано уменьшить риск развития побочных эффектов и снизить стоимость лечения.
Современные методы таргетной терапии показали свою достаточно высокую специфичность и эффективность по сравнению с химиотерапией. Вместе с тем они могут воздействовать на нормальные ткани, органы и нервную систему и вызывать серию иммуноопосредованных нежелательных явлений. Кроме того, при системном введении таргетных препаратов на основе больших молекул (моноклональных антител) биодоступность этих соединений обычно невысокая [Avramović N., Mandić В., Savić-Radojević A., Simić Т. Polymeric nanocarriers of drag delivery systems in cancer therapy. Pharmaceutics. 2020;12:298. doi: 10.3390/pharmaceutics12040298]. Учитывая вышеупомянутые проблемы и ограничения в использовании, в последние годы предпринимаются попытки снизить побочные эффекты и максимизировать эффективность лечения этими препаратами за счет их внутриопухолевого введения.
Уровень техники
Для целенаправленной доставки лекарственных препаратов в опухоль ранее предлагалось использовать наночастицы, нагруженные веществами с противоопухолевой активностью, однако, они могут накапливаться и в здоровых тканях или органах, вызывая побочные токсические эффекты. Кроме того, после введения наночастиц in vivo они могут временно или постоянно оставаться в нормальных тканях и органах и поэтому мало подходят для таргетной терапии [https://ec.europa.eu/health/ph_risk/committees/04_scenihr/docs/scenihr_o_003b.pd
В результате недавних исследований были разработаны технологии иммобилизации в гидрогелях лекарств для локальной внутриопухолевой доставки, чтобы свести к минимуму их системную токсичность для нормальных тканей и органов. После имплантации гидрогели, за счет формирования трехмерной сетчатой структуры, могут играть роль депо лекарственных средств, диффундирующих в опухолевый узел в контактной области гель/ткань против вектора градиента концентрации. Этот факт, наряду с хорошей биосовместимостью и низкой токсичностью, способствовал расширению области применения гидрогелей в различных биомедицинских областях [Sood N., Bhardwaj A., Mehta S., Mehta A. Stimuli-responsive hydrogels in drug delivery and tissue engineering. Drug Deliv. 2016;23:758-780. doi: 10.3109/10717544.2014.940091]. Таким образом, доставка препаратов с противоопухолевым действием в составе гидрогелей может рассматриваться как средство локальной терапии онкологических больных.
Для внутриопухолевых инъекций обычно используют инъекционные гидрогелевые составы, содержащие противоопухолевые препараты, которые вводят непосредственно в определенные участки опухоли или рядом с капсулой опухолевого узла, что оптимизирует биодоступность лекарственных средств относительно опухолевых клеток и, при этом сводит к минимуму накопление препарата в других органах, уменьшая его системную токсичность [Fakhari A., Subramony JA. Engineered in-situ depot-forming hydrogels for intratumoral drug delivery. J. Controlled Release. 2015;220:465-475. doi: 10.1016/j. jconrel. 2015.11.014]. Технология внутриопухолевых инъекций в последнее время претерпела огромный прогресс, включая разработку формирующихся in situ гидрогелей, оптимизированных для эффективной доставки и медленного поступления противоопухолевых препаратов в ткань опухолевого узла. Основной целью является проведение пациентам циторедуктивной терапии для уменьшения опухолевой массы, торможения, контроля, сдерживания или замедления роста и метастазирования опухоли, с последующими хирургическим удалением оставшейся опухолевой массы, что призвано обеспечить увеличение продолжительности жизни онкологического больного.
В частности, известна имплантируемая и герметизируемая система для однонаправленной доставки терапевтических препаратов в ткани (RU 2311892). Данная система предназначена для установки на поверхности ткани или органа (преимущественно, глаза) и не предполагает интратуморальной имплантации. Кроме того, корпус устройства выполнен из пластика, имеющего низкую рентгеноконтрастность, что затрудняет контроль локализации устройства после имплантации рентгенологическими методами, а также не обеспечивает жесткость скаффолда (система доставки веществ с регулируемыми свойствами), достаточную для его внедрения в ткань опухоли.
Известен имплантат для хирургического лечения воспалительных и опухолевых заболеваний позвоночника (RU 2611883). Однако каркас данного устройства содержит в своем составе такие опасные элементы как вольфрам, относящийся к тяжелым металлам, и молибден, способный оказать токсическое воздействие на организм пациента в целом, и на репродуктивную функцию и развитие плода, в частности [Vyskocil A, Viau Сюб 1999, doi: 10.1002/(sici)1099-1263(199905/06)19:3<185::aid-jat555>3.0.co;2-z.].
Известны способы, устройства и композиции для лечения пациентов с опухолями в различных органах путем внутрипросветной доставки онколитических агентов через кровеносный сосуд или проток, ведущий к опухолевой ткани. (TRANSLUMINAL DELIVERY OF ONCOLTYIC VIRUSES FOR CANCER THERAPY US 2010331815). Однако, в данном случае доставка лекарственного средства возможна только в хорошо васкуляризируемый или сообщающийся с протоком опухолевый узел. Кроме того, такой способ локорегионарной терапии не позволяет достичь длительного поддержания эффективной концентрации препарата в области опухоли. Также данное изобретение подразумевает использование вирусов, что, может приводить к системным воспалительным реакциям у пациентов.
Известны также составы для противораковых агентов, чья эффективность зависит от клеточного цикла (FORMULATIONS FOR CELL-SCHEDULE DEPENDENT ANTICANCER AGENTS WO 2004081196). Известное изобретение подразумевает использование пластиковой основы, имеющей низкую ренгеноконтрастность, что затрудняет контроль локализации устройства после имплантации рентгенологическими методами, а также не обеспечивает жесткость скаффолда, достаточную для его внедрения в ткань опухоли. Кроме того, биодоступность и механизм действия лекарственного средства зависит от стадии клеточного цикла, что вследствие гетерогенности клеток опухолевой массы, не позволит достичь существенной эффективности терапии.
Известен медицинский имплантат с пролонгированным высвобождением лекарственного средства, пригодный для многократного введения, который в основном состоит из тканевой оболочки с микропорами для высвобождения лекарственного средства и отверстиями для инъекции или постоянного введения лекарственного средства. Структурная форма, механические и биологические свойства, необходимые для реконструкции тканей, обеспечиваются тканевой оболочкой и микрокапсулами с противоопухолевыми свойствами (Medical implant with drag sustained-release effect, which can be repeatedly administrated CN 212140659). Однако, при данном способе введения противоопухолевое средство контактирует с окружающими тканями только в области микропор тканевой оболочки, значительно ограничивая контактную площадь, что может негативно повлиять на его биодоступность. Кроме того, из-за отсутствия жесткого каркаса, маловероятно, что данное устройство самостоятельно сможет обеспечить внутритуморальную доставку лекарственного препарата, что обусловило основное его применение на поверхности органов и тканей. Данное изделие не обладает рентгенконтрастностью, что делает невозможным ренгенологический контроль за его размещением внутри опухолевого узла.
Известен стент для переноса радиоактивных частиц и факторов подавления опухоли, содержащий опорный корпус, который представляет собой цилиндрическую сетчатую каркасную структуру, образованную переплетением никель-титанового сплава. Внутренняя и внешняя поверхности корпуса стента снабжены слоями пленочного покрытия, на слои пленочного покрытия напылены слои биоактивного средства с медленным высвобождением, множество из аксиально расположенных канавок равномерно покрывают наружную поверхность стента, контактируя с резервуарами для радиоактивных частиц (Stent for carrying radioactive particles and tumor suppression factors CN 209236465). Однако опасность для здоровья пациента, опосредованная внесением радиоактивных частиц в организм больного, значительно ограничивает область применения данного способа из-за риска развития целого спектра побочных негативных эффектов. Кроме того, данное устройство может быть использовано только для локальной терапии радиочувствительных опухолей и не позволяет применять таргетные препараты [Howell RW. Patient exposures and consequent risks from nuclear medicine procedures. Health Phys. 2011; 100(3):313-317. doi: 10.1097/HP. 0b013e31820ef10a].
В качестве прототипа заявляемого изобретения может быть рассмотрена система доставки rhuMAb-HER2 (Герцептина) - антитела, нацеленного на рецептор HER2, с использованием инъекционных и термочувствительных гидрогелей в качестве носителя для пролонгированного высвобождения терапевтического средства [Xiaobin Chen, Maoli Wang, Xiaowei Yang, Yaoben Wang, Lin Yu, Jian Sun, Jiandong Ding. Injectable hydrogels for the sustained delivery of a HER2-targeted antibody for preventing local relapse of HER2+ breast cancer after breast-conserving surgery. Theranostics. 2019 Aug 14;9(21):6080-6098. doi: 10.7150/thno.36514]. В описанной системе использована композиция на основе смеси гидрогелей и герцептина, которую инъекционно еженедельно вводили мышам на расстоянии 5 мм от опухолевого узла. Причинами, по которым использование способа-прототипа не позволяет достичь технического результата заявляемого способа являются:
• повышенный риск преждевременной полимеризации геля в просвете иглы из-за ее нагревания вследствие контакта с тканями тела;
• отсутствие возможности контролировать процесс биодеградации имплантата вследствие его низкой рентгеноконтрастности.
• использование гидрогелей на основе смеси полилактида, полиэтиленгликоля и полигликолида, находящихся на ранней стадии разработки и не разрешенных пока для медицинского применения.
Раскрытие сущности изобретения
1
Одним из широко известных средств для таргетной терапии HER2+ опухолей является препарат герцептин (трастузумаб), который представляет собой рекомбинантные гуманизированные моноклональные антитела, избирательно взаимодействующие с внеклеточным доменом рецепторов эпидермального фактора роста человека 2 типа (HER2). Эти антитела представляют собой IgG, состоящие из человеческих регионов (константные участки тяжелых цепей) и определяющие комплементарность мышиных участков антитела pi 85 HER2 к HER2.
Человеческие рецепторы эпидермального фактора роста составляют семейство поверхностных рецепторов клеток, вовлеченных в передачу сигналов, управляющих нормальным ростом и дифференцированием клеток. HER2 - высокоспецифичная мишень для лечения рака молочной железы и ряда других солидных опухолей. Рекомбинантное моноклональное антитело к HER2 (rhuMAb-HER2) обеспечивает быстрое удаление HER2 с поверхности клеток и, таким образом, уменьшает доступность этого белка и его онкогенность. В частности, известно, что повышенная экспрессия HER2, характерная для 20-25% больных раком молочной железы, также была отмечена у больных саркомой, немелкоклеточным раком легких, раком желудка, глиобластомой. Было показано, что сверхэкспрессия клетками HER2 связана с резистентностью к терапии, низкодифференцированными опухолями и повышенной частотой метастазирования в головной мозг. В рутинной клинической практике основным способом введения rhuMAb-HER2 является еженедельное внутривенное введение, но при этом возможно развитие кардиотоксичности и плохая ретенция опухоли.
Задачей заявляемого изобретения является способ таргетной доставки рекомбинантных моноклональных антител к HER2 (rhuMAb-HER2) в толщу мягкотканной опухоли, клетки которой экспрессируют на своей поверхности молекулы HER2.
Особенность заявляемого способа заключается в том, что осуществляют таргетную доставку к опухолевым клеткам терапевтического препарата, размещенного внутри скаффолда, выполненного в форме трубки из титанового сплава ВТ6, снабженного продольным отверстием на боковой стороне, путем имплантации внутрь опухолевого узла. Терапевтический препарат представляет собой композицию из гетерогенного имплантируемого геля СФЕРОгель для хирургии, разрешенного для клинического применения в медицине (производитель - АО «Биомир сервис», Россия) и рекомбинантных моноклональных антител к HER2 «Трастузумаб» (производитель - Биокад, Россия) в соотношении 1:1.
Техническими результатами заявляемого способа являются:
• минимизация механической травматизации окружающих тканей при имплантации пациенту за счет использования скаффолда, конфигурированного в форме трубки с отшлифованной внешней поверхностью, изготовленной из биосовместимого титанового сплава ВТ6, широко используемого в качестве основы медицинских имплантатов [Гуртовая Г.В., 2003, https://wvvw.dissercat.com/content/termovodorodnaya-obrabotka-fasonnykh-otlivok-iz-titanovogo-splava-vt201-dlya-meditsinskikh-i];
• гидрогель, заполняющий внутреннюю полость скаффолда, выполняет роль депо для иммунопрепарата;
• пролонгированное высвобождение иммунопрепарата - рекомбинантных моноклональных антител к HER2 в окружающие ткани после имплантации в ткань опухолевого узла происходит за счет его диффузии из гидрогеля на границе гель - ткань из области торцов и продольного отверстия на боковой стороне трубки;
• имплантат, выполненный в форме жесткого скаффолда, из титанового сплава, имеющий форму трубки с гладкой наружной поверхностью, обеспечивает функцию защиты внутреннего содержимого от контакта с окружающими тканями, а также обеспечивает проникновение имплантата вглубь опухолевой массы под давлением, создаваемым либо рукой хирурга, либо троакаром, доставляя терапевтический препарат в толщу опухоли;
• скаффолд из рентгеноконтрастного титанового сплава позволяет рентгенологически контролировать локализацию имплантата после введения пациенту, маркируя зону опухолевого узла для последующей резекции опухолевой массы, что позволяет уменьшить длину разреза и оптимизировать процесс хирургического вмешательства.
Предлагаемый способ заключается в подготовке композиции, состоящей из гидрогеля и действующего терапевтического иммунопрепарата в форме рекомбинантных моноклональных антител к HER2 в соотношении 1:1, заполнении подготовленной композицией внутренней полости скаффолда, изготовленного из титанового сплава ВТ6 в форме трубки длиной 5-10 мм с внутренним диаметром 2-4 мм (толщина стенок - 1±0,02 мм) и последующего размещения имплантата в глубине опухолевой массы. Физико-химические свойства гидрогеля: высокая влагоудерживающая способность, возникающая за счет большого количества гидроксильных групп и образования поперечных связей между линейными молекулами полимера, и способность к биодеградации обеспечивают доставку терапевтического агента непосредственно в ткань опухолевого узла за счет диффузии моноклональных антител по границе гель - ткань.
Моноклональные антитела опосредуют ингибирование HER2 рецепторов на поверхности опухолевых клеток, что индуцирует их апоптоз, уменьшение объема опухоли и реализацию противоопухолевой активности.
Способ осуществляют следующим образом.
В качестве основы имплантата используют скаффолд в виде трубки длиной 5-10 мм с продольным отверстием на боковой стороне шириной 1±0,05 мм. Трубка изготовлена из титанового сплава ВТ6, полученного методом электро-эрозионной резки, с внутренним диаметром 2-4 мм, и толщиной стенок 1±0,02 мм. Внешнюю сторону и края трубки шлифуют. Таким образом, формируют скаффолд в виде незамкнутой трубки с шлифованными краями.
Моноклональные антитела смешивают с гидрогелем в соотношении 1:1 и заполняют полученной композицией внутреннюю полость предварительно простерилизованного и охлажденного титанового скаффолда, при поддержании температуры не выше 6°С и соблюдении требований асептики и антисептики. Затем образец помещают в термостат, поддерживающий температуру 37°С в течение 30 минут, для полимеризации геля, что позволяет фиксировать моноклональные антитела в полости скаффолда до имплантации в ткань опухолевого узла.
Краткое описание иллюстраций.
На Фиг. 1 представлена конструкция устройства готового имплантата для внутритуморальной доставки иммунопрепарата.
Обозначения:
1 - скаффолд;
2 - наружная поверхность скаффолда;
3 - края скаффолда;
4 - продольное отверстие на боковой стороне скаффолда;
5 - композиция из иммунопрепарата на основе моноклональных антител к HER2, смешанных с гидрогелем.
Пример. Исследование биоактивных свойств in vivo.
Изготавливали скаффолды из титанового сплава марки ВТ6 в виде незамкнутых трубок с внутренним диаметром 2,5 мм, длиной 6 мм методом электроэрозионной резки с последующей шлифовкой внешней поверхности и краев. Скаффолды промывали дистиллированной водой с использованием ультразвука, а затем стерилизовали и высушивали в стерильной атмосфере. Готовили композицию путем внесения в гидрогель раствора моноклональных антител (доза 0,125 мг/кг) в соотношении 1:1 при температуре +6°С. Заполняли полученной композицией внутреннюю полость скаффолдов и выдерживали в термостате при 37°С в течение 30 минут.
Эффективность противоопухолевой активности тестировали в эксперименте in vivo. Группа бестимусных мышей с привитой подкожно HER2+ опухолью молочной железы человека была разделена на две равные части. Первой имплантировали интратуморально подготовленные скаффолды под визуальным контролем, остальных использовали как контроль. Расположение и биодеструкцию изделия контролировали с использованием компьютерной томографии. Противоопухолевый эффект оценивали через 20 суток после введения имплантатов. Полученные результаты продемонстрировали, что введение заявляемых образцов имплантатов обеспечило 62% торможения роста опухоли в сравнении с контролем. Был сделан вывод о том, что под влиянием пролонгированного поступления иммунопрепарата из гидрогеля происходила блокировка HER2 на поверхности раковых клеток, что обеспечило антипролиферативный эффект и редукцию опухоли.