Определение активности классического пути системы комплемента в тесте коагуляции фибриногена
DETERMINING THE ACTIVITY OF THE CLASSICAL PATHWAY OF THE COMPLEMENT SYSTEM IN A FIBRINOGEN COAGULATION TEST

Система комплемента представляет собой механизм раннего реагирования, служащий для инициации и усиления воспалительной реакции в ответ на микробную инфекцию и другие острые повреждения [Liszewski М.K. and.Atkinson J.P., 1993, Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E.Paul, Raven Press, Ltd., NewYork]. Несмотря на то, что активация комплемента обеспечивает весьма эффективную первичную защиту от потенциальных патогенов, активность комплемента, которая вызывает защитную воспалительную реакцию, может также представлять потенциальную угрозу для организма хозяина [Kalli K.R., Hsu P., Fearon D.T. Therapeutic uses of recombinant complement protein inhibitors // Springer Semin Immunopathol. - 1994. - V. 15, № 4. - P.417-31; Morgan B.P. Clinical complementology: recent progress and future trends // Eur J Clin Invest.- 1994. - V. 24, № 4. - P. 219-228]. Например, протеолитические продукты С3 и С5 мобилизуют и активируют полиморфноядерные нейтрофилы. Эти активированные клетки являются неспецифичными при выработке разрушающих ферментов и могут привести к поражению собственных органов. Кроме того, активация комплемента может привести к накоплению цитолитического комплекса, терминальных компонентов комплемента, как на микробных клетках-мишенях, так и на соседних клетках организма хозяина, что приводит к лизису клеток организма хозяина. Система комплемента принимает участие в патогенезе многочисленных острых и хронических заболеваний, включая: инфаркт миокарда, реваскуляризация вследствие нарушения мозгового кровообращения, респираторный дистресс-синдром у взрослых, поражение вследствие реперфузии, септический шок, капиллярное кровотечение вследствие термического ожога, воспаление вследствие кардио-легочного шунтирования, отторжение трансплантата, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, прогрессирующая миастения, и болезнь Альцгеймера. Почти во всех перечисленных случаях комплемент не является непосредственной причиной данных заболеваниях, но представляет собой один из серьезных факторов, вовлеченных в патогенез. Тем не менее, активация комплемента может быть главным патологическим механизмом и представлять собой эффективный показатель для клинического контроля при многих указанных выше заболеваниях. Растущее признание важности комплемент-опосредованных поражений тканей при множестве болезней подчеркивает необходимость создания эффективных медикаментов для ингибирования комплемента. В настоящее время не существует официально одобренных для использования человеком медикаментов, которые бы имели специфическую нацеленность и ингибировали бы активацию комплемента.
Известно, что система комплемента может быть активирована тремя различными путями: классическим, лектиновым и альтернативным. Классический путь активации системы комплемента инициируется при связывании антитела с инородной частицей (т.е., антигеном) и, таким образом, требует предварительного воздействия данного антигена для генерации специфического антитела. Поскольку активация классического пути связана с развитием иммунной реакции, классический путь активации является частью приобретенной иммунной системы. В отличие от этого, лектиновый и альтернативный пути не зависят от клонального иммунитета и являются частью врожденной иммунной системы.
Первым шагом в активации классического пути является прикрепление специфической молекулы распознавания, C1q, к антигенно-нагруженным элементам IgG и IgM. Результатом активации системы комплемента является последовательная активация зимогенов сериновой протеазы. C1q связан с проферментами сериновой протеазы C1r и C1s в комплексе, известном как компонент C1, при связывании C1q с иммунным комплексом, аутопротеолитическое расщепление участка Arg-Ile субкомпонента C1r сопровождается активацией C1s, которая необходима для расщепления компонентов С4 и С2. Расщепление С4 на два фрагмента, обозначенных соответственно С4а и C4b, позволяет фрагментам C4b сформировать ковалентные связи с примыкающим гидроксильными или амино-группами на поверхности патогена посредством нековалентного взаимодействия с фрагментом C4b компонента С2, расщепления под действием С1s и последующей генерацией конвертазы С3 (C4b2a).
С3-конвертаза (C4b2a) активирует компонент С3, который вызывает генерацию С5-конвертазы (C4b2a3b) и формирование мембрано-атакующего комплекса (C5b-9), что может спровоцировать микробный лизис. Активированные формы С3 и С4 (C3b и C4b) ковалентно связываются на чужеродных поверхностях и опсонизируют их для распознования рецепторами комплемента-1 (CR-1) на фагоцитах.
Первым шагом в активации системы комплемента по лектиновому пути также является прикрепление специфической молекулы распознавания, за которым следует активация ассоциированных сериновых протеаз. Однако более верным, чем прикрепление к иммунным комплексам при помощи C1q, является то, что молекулы распознавания в лектиновом пути активации представляют собой белки, связывающие углеводы (маннан-связывающий лектин (МСЛ), Н-фиколин, М-фиколин, и L- фиколин) [Lu J., Teh C., Kishore U., Reid K.B. Collectins and ficolins: sugar pattern recognition molecules of the mammalian innate immune system // Biochim Biophys Acta. - 2002 .- V. 1572, №(2-3).- P. 387-400: Holmskov U., Thiel S., Jensenius J.C. Collections and ficolins: humoral lectins of the innate immune defense // Annu Rev Immunol. - 2003.- V. 21.- P. 547-78; The C., Le Y., Lee S.H., Lu J.. M-ficolin is expressed on monocytes and is a lectin binding to N-acetyl-D-glucosamine and mediates monocyte adhesion and phagocytosis of Escherichia coli // Immunology. - 2000. - V. 101, №2. - P. 225-232].
Икеда и соавторы первыми продемонстрировали, что подобно молекуле C1q, МСЛ может активировать систему комплемента С4-зависимым путем, прикрепляясь к эритроцитам, покрытыми маннанами дрожжей [Ikeda K., Sannoh T., Kawasaki N., Kawasaki T., Yamashina I. Serum lectin with known structure activates complement through the classical pathway // J Biol Chem. - 1987. - V. 262, №16. - P. 7451-4]. МСЛ, член семейства коллектиновых белков, представляет собой кальций-зависимый лектин, который связывает углеводы с гидроксильными группами в 3 и 4 положении, ориентированными в экваториальной плоскости пиранозного кольца. Главными лигандами для МСЛ являются, таким образом, D-манноза и N-ацетил-D-глюкозамин, в то время как для углеводов, не соответствующих подобному стерическому требованию, афинность по отношению к МСЛ не выявлена [Weis W.I., Drickamer K., Hendrickson W.A. Structure of a C-type mannose-binding protein complexed with an oligosaccharide // Nature. - 1992. - V. 360, №6400. - P. 127-134]. Взаимодействие между МСЛ и моновалентными сахарами является чрезвычайно слабым, с типичными константами диссоциации порядка 2 ммоль. МСЛ достигает стойкого специфичного связывания с полисахаридными лигандами в процессе одновременного взаимодействия с множественными остатками моносахаридов [Lee R.T., IchikawaY., Kawasaki T., Drickamer K., Lee Y.C. Multivalent ligand binding by serum mannose-binding protein // Arch Biochem Biophys. - 1992. - V. 299, № 1. - V. 129-136]. МСЛ распознает углеводные структуры, которые обычно покрывают микроорганизмы, такие как бактерии, дрожжи, паразиты и некоторые вирусы. Однако МСЛ не распознает D-галактозу и сиаловую кислоту, которые обычно покрывают «зрелый» гликоконъюгатный комплекс гликопротеинов, присутствующих в плазме млекопитающих и находящихся на поверхности их клеток. Данная специфичность связывания может помочь в защите от самопроизвольной активации. Однако МСЛ не образует высокоаффинных связей со скоплениями высокоразветвленныхманнозных предшественников гликанов на N-связанных гликопротеинах и гликолипидах, находящихся в эндоплазмическомретикулуме и звездчатых невроцитах (Гольджи) клеток млекопитающих [Maynard Y., Baenziger J.U. Characterization of a mannose and N-acetylglucosamine-specific lectin present in rat hepatocytes // J Biol Chem. - 1982. - V. 257, № 7. - P. 3788-94]. Следовательно, поврежденные клетки являются потенциальными мишенями для лектинового пути активации посредством МСЛ-связывания.
2+
Фиколины обладают отличным от МСЛ типом лектинового домена, известным как фибриноген-подобный домен. Фиколины связывают остатки сахара Са-независимым образом. У людей идентифицировано три типа фиколинов: L-фиколин, М-фиколин и Н-фиколин. Два сывороточных фиколина, L-фиколин и Н-фиколин имеют общность в специфичности к N-ацетил-D-глюкозамину; однако Н-фиколин также связывается с N-ацетил-D-галактозамином. Специфичность по отношению к различным сахарам у L-фиколина, Н-фиколина и МСЛ означает, что различные лектины могут быть комплементарны различным, хотя и частично перекрывающимся гликоконъюгатам. Данная концепция поддерживается недавним сообщением о том, что среди известных лектинов, принимающих участие в лектиновом пути активации, только L-фиколин специфическим образом связывается с липотейхоевой кислотой, гликоконъюгатом клеточной стенки, обнаруженным во всех Грамм-положительных бактериях [Lynch N.J., Roscher S., Hartung T., Morath S., Matsushita M., Maennel D.N., Kuraya M., Fujita T., Schwaeble W.J. L-ficolin specifically binds to lipoteichoic acid, a cell wall constituent of Gram-positive bacteria, and activates the lectin pathway of complement // J Immunol. - 2004. - V.172, №2. - P. 1198-11202]. Коллектины, то есть, МСЛ и фиколины, не имеют значительного сходства в аминокислотной последовательности. Однако эти две группы белков имеют схожие организации доменов и, подобно Clq, собираются в олигомерные структуры, которые максимально увеличивают возможность многосайтового связывания. У здоровых людей концентрация МСЛ в сыворотке сильно варьирует в популяциях, и он генетически контролируется полиморфизмом или мутациями как в промоторе, так и в кодирующей области гена МСЛ.
Так как белок МСЛ является белком острой фазы, то его дальнейшая экспрессия регулируется во время воспалительного процесса. L-фиколин присутствует в сыворотке в такой же концентрации, как и МСЛ. Поэтому, роль L-фиколина в лектиновом пути активации по значимости потенциально сравнима с ролью МСЛ. МСЛ и фиколины могут также выступать в роли опсонинов, которые требуют взаимодействия между данными белками и рецепторами фагоцитов [Kuhlman M., Joiner K., Ezekowitz R.A. The human mannose-binding protein functions as an opsonin // J Exp Med. - 1989. - V. 169, № 5. - P. 1733-45; Matsushita M., Endo Y., Taira S., Sato Y., Fujita T., Ichikawa N., Nakata M., Mizuochi T. A novel human serum lectin with collagen- and fibrinogen-like domains that functions as an opsonin // J Biol Chem. - 1996. - V. 271, №5 - P. 2448-54]. Однако идентичность рецептора на клетках-фагоцитах не была установлена. МСЛ человека при помощи своего коллагено-подобного домена осуществляет высокоаффинное специфичное взаимодействие с уникальными Clr/Cls-подобными сериновыми протеазами, названными МСЛ-ассоциированными сериновыми протеазами (МАСП). К настоящему времени описано три типа МАСП. Сначала одиночный фермент «МАСП» был идентифицирован и охарактеризован как фермент, отвечающий за инициацию классического пути активации комплемента (т.е., расщепление С2 и С4) [Ji Y.Н., Fujita T., Hatsuse H., Takahashi A., Matsushita M., Kawakami M. Activation of the C4 and C2 components of complement by a proteinase in serum bactericidal factor, Ra reactive factor. J. Immunol. 150:571-578, 1993]. Позже выяснилось, что МАСП на самом деле представляет собой комбинацию двух протеаз: МАСП-1 и МАСП-2 [Thiel S., Vorup-Jensen T., Stover C.M., Schwaeble W., Laursen S.B., Poulsen K., Willis A.C., Eggleton P., Hansen S., Holmskov U., Reid K.B., Jensenius J.C. A second serine protease associated with mannan-binding lectin that activates complement Nature. 1997 Apr 3; 386(6624):506-10]. Однако было продемонстрировано, что комплекс МСЛ-МАСП-2 сам по себе является достаточным для активации комплемента [Vorup-Jensen T., Petersen S.V., Hansen A.G., Poulsen K., Schwaeble W., Sim R.B, Reid K.B., Davis S.J., Thiel S., Jensenius J.C. Distinct pathways of mannan-binding lectin (MBL)- and C1-complex autoactivation revealed by reconstitution of MBL with recombinant MBL-associated serine protease-2. J Immunol. 2000 Aug 15; 165(4):2093-20100]. Кроме того, только МАСП-2 расщеплял С2 и С4 с высокой эффективностью [Ambrus G., Gál P., Kojima M.,  K., Balczer J., Antal J.,  Laich A., Moffatt B.E., Schwaeble W., Sim R.B.,  Natural substrates and inhibitors of mannan-binding lectin-associated serine protease-1 and -2: a study on recombinant catalytic fragments. J Immunol. 2003 Feb 1; 170(3):1374-82]. Поэтому, MASP-2 представляет собой протеазу, ответственную за активацию С4 и С2 для генерации С3-конвертазы, C4b2a. В этом заключается его значительное отличие от комплекса С1, где скоординированная активность двух специфичных сериновых протеаз (C1r и C1s) приводит к активации системы комплемента. Недавно была выделена третья новая протеаза, МАСП-3 [Dahl MR., Thiel S., Matsushita M., Fujita T., Willis A.C., Christensen T., Vorup-Jensen T., Jensenius J.C. MASP-3 and its association with distinct complexes of the mannan-binding lectin complement activation pathway. Immunity. 2001; 15(1): 127-135].
МАСП-1 и МАСП-3 представляют собой продукты одного и того же гена, полученные в результате альтернативного сплайсинга. Их биологические функции до сих пор остаются невыясненными. МАСПы имеют одинаковую доменную организацию с белками C1r и C1s, ферментными субкомпонентами комплекса С1, классического пути активации системы комплемента [Sim R.B., Laich A. Serine proteases of the complement system. Biochem Soc Trans. 2000; 28(5): 545-50]. Как в протеазах С1, активация МАСП-2 протекает при расщеплении связи Arg-Ile, примыкающей к домену сериновой протеазы, это приводит к расщеплению фермента на связанные дисульфидными связями цепочки А и В, последняя из которых состоит из домена сериновой протеазы. Генетически обусловленная неполноценность МАСП-2 была описана в недавних исследованиях [Stengaard-Pedersen K., Thiel S., Gadjeva M., Møller-Kristensen M., Sørensen R., Jensen L.T., Sjøholm A.G., Fugger L., Jensenius J.C. Inherited deficiency of mannan-binding lectin-associated serine protease 2. N Engl J Med. 2003; 349(6): 554-560].
Мутация одного нуклеотида приводит к замене Asp в домене CUB1, что в свою очередь лишает МАСП-2 способности связываться с МСЛ. МСЛ также связывается с неферментным белком, обозначаемым как МСЛ-связанный белок 19 кДА (МСБ19) [21] или малым МСЛ-связанным белком (мМСБ) [Takahashi M., Endo Y., Fujita T., Matsushita M. A truncated form of mannose-binding lectin-associated serine protease (MASP)-2 expressed by alternative polyadenylation is a component of the lectin complement pathway. Int Immunol. 1999; 11(5): 859-863]. МСБ19 формируется при альтернативном сплайсинге продукта гена МАСП-2 и содержит два первых домена МАСП-2, за которыми следует дополнительная последовательность четырех уникальных аминокислот. Гены МАСП-1 и МАСП-2 расположены на хромосомах 3 и 1, соответственно [Schwaeble W., Dahl M.R., Thiel S., Stover C., Jensenius J.C. The mannan-binding lectin-associated serine proteases (MASPs) and MAp19: four components of the lectin pathway activation complex encoded by two genes. Immunobiology. 2002; 205(4-5): 455-466].
Ряд данных указывают на то, что существуют различные комплексы МСЛ-МАСП, a также на то, что значительная часть находящихся в сыворотке МАСП не связана с МСЛ [Thiel S., Petersen S.V., Vorup-Jensen T., Matsushita M., Fujita T., Stover C.M., Schwaeble W.J., Jensenius J.C. Interaction of C1q and mannan-binding lectin (MBL) with C1r, C1s, MBL-associated serine proteases 1 and 2, and the MBL-associated protein MAp19. J Immunol. 2000; 165(2): 878-887]. Н- и L-фиколин также связываются с МАСП и активируют лектиновый путь также, как МСЛ [Dahl M.R., Thiel S., Matsushita M., Fujita T., Willis A.C., Christensen T., Vorup-Jensen T., Jensenius J.C. MASP-3 and its association with distinct complexes of the mannan-binding lectin complement activation pathway. Immunity. 2001; 15(1):127-135].
Оба - лектиновый и классический, - пути активации комплемента формируют общую С3-конвертазу (C4b2a) и оба пути активации сходятся в этом пункте. Считается, что лектиновому пути активации комплемента принадлежит ведущая роль в иммунной защите организма против инфекции. Доказательства вовлеченности МСЛ в иммунную реакцию были получены в результате наблюдений за субъектами, имеющими пониженный уровень функционального МСЛ в сыворотке [Matsushita M., Kuraya M., Hamasaki N., Tsujimura M., Shiraki H., Fujita T. Activation of the lectin complement pathway by H-ficolin (Hakata antigen). J Immunol. 2002; 168(7): 3502-3506]. Такие субъекты демонстрируют восприимчивость к рецидивирующим бактериальным и грибковым инфекциям. Данные симптомы обычно проявляются в раннем возрасте, во время определенного промежутка времени, когда титр производных от материнских антител снижается, а собственные антитела еще не вырабатываются в полном объеме. Данный синдром часто является следствием мутаций некоторых сайтов в коллагеновой части МСЛ, которая препятствует непосредственному образованию олигомеров МСЛ. Однако, так как МСЛ способен функционировать в качестве независимого от комплемента опсонина, остается невыясненным, до какого предела повышенная восприимчивость к инфекции обусловлена нарушениями в активации комплемента. Несмотря на исчерпывающие доказательства участия всех путей активации классического и альтернативных - в патогенезе неинфекционных человеческих заболеваний, роль лектинового пути активации только начинают оценивать. Недавние исследования показали, что активация лектинового пути может провоцировать активацию комплемента и воспаление, связанное с реперфузионным повреждением после ишемии. Коллард и др. (2000) показали, что культивируемые эндотелиальные клетки, подвергнутые окислительному стрессу, связываются с МСЛ и демонстрируют отложение C3b в присутствии человеческой сыворотки [Collard C.D.,  Morrissey M.A., Agah A., Rollins S.A., Reenstra W.R., et al. Complement activation after oxidative stress: role of the lectin complement pathway. Am J Pathol. 2000; 156(5): 1549-56].
Кроме того, обработка человеческой сыворотки блокирующими анти-МСЛ моноклональными антителами ингибирует связывание МСЛ и активацию комплемента. Данные открытия были проверены опытным путем на лабораторных крысах с ишемией-реперфузией миокарда, в процессе чего у крыс, подвергшихся лечению с использованием блокирующих крысиных моноклональных антителк МСЛ, наблюдали значительно меньше случаев поражения миокарда вследствие закупорки коронарной артерии, чем у крыс, подвергнутых лечению контрольными антителами [Jordan J.E., Montalto M.C., Stahl G.L. Inhibition of mannose-binding lectin reduces postischemic myocardial reperfusion injury. Circulation. 2001; 104(12): 1413-1418].
Все три пути активации (классический, лектиновый и альтернативный) сходятся на компоненте С5, который расщепляется на С5а и C5b. С5а является самым сильным анафилатоксином, индуцирующим изменения как в гладкой мускулатуре и сосудистом тонусе, так и в проницаемости сосудов. Он также представляет собой эффективный хемотаксин и активатор как нейтрофилов, так и моноцитов. С5а-опосредованная клеточная активация может значительным образом усиливать воспалительные реакции путем индуцирования секреции дополнительных воспалительных медиаторов, включая цитокины, гидролитические ферменты, метаболиты арахидоновой кислоты и активные формы кислорода. Расщепленный C5b приводит к формированию C5b-9, также известного как мембрано-атакующий комплекс (МАК). В настоящее время имеются веские доказательства того, что сублитическое отложение МАК может играть важную роль в воспалительном процессе в дополнение к роли литического, поро-формирующего комплекса.
В дополнение к клеточным и сосудистым эффектам вышеописанного активированного компонента комплемента, который может объяснить связь между травмой и дессеминированным внутрисосудистым свертыванием (ДВС), появляющиеся новые данные подтверждают прямые молекулярные связи между системами комплемента и коагуляции. Экспериментальные данные были получены при исследованиях на мышах с дефицитом компонента С3. Поскольку С3 является общим компонентом для каждого из трех путей активации комплемента, у мышей с дефицитом компонента С3 нарушена функция комплемента. Однако мыши с С3-дефицитом могут превосходно активировать терминальные компоненты комплемента [Huber-Lang., Sarma J.V., Zetoune F.S., Rittirsch D., Neff T.A., McGuire S.R., et al. Generation of C5a in the absence of C3: a new complement activation pathway. Nat Med. 2006; 12(6): 682-687]. Детальные исследования выявили, что С3-независимая активация терминальных компонентов комплемента опосредована тромбином, ключевым ферментом коагуляционного каскада [30]. Молекулярные компоненты, опосредующие активацию тромбина после начальной активации комплемента, остались пока невыясненными. Авторы показали молекулярную основу связи между комплементом и коагуляционными каскадами и идентифицировали МАСП-2 в качестве центральной молекулы, связывающей две системы. Биохимические исследования о субстратной специфичности МАСП-2 идентифицировали протромбин в качестве возможного субстрата в дополнение к широко известным белкам комплемента С2 и С4. МАСП-2 специфически расщепляет протромбин на функционально релевантных участках, генерируя тромбин, ключевой фермент, регулирующий скорость коагуляционного каскада [Hess K., Ajjan R., Phoenix F.,  Schroeder V. Effects of MASP-1 of the complement system on activation of coagulation factors and plasma clot formation. PLoS One. 2012; 7(4): e35690. doi: 10.1371/journal.pone.0035690].
Тромбин, генерированный МАСП-2, способен стимулировать отложение фибрина в определенной восстановленной системе in vitro, демонстрируя функциональную релевантность расщепления МАСП-2 [Krarup, A., WallisR., PresanisJ.S., GalP., SimR.B. Simultaneous Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated Serine Protease 2. // PLoS. ONE. (2007) 2(7): e623. Doi:10.1371/journal.pone.0000623]. Авторы подтвердили физиологическую значимость данного открытия посредством определения активации тромбина в нормальной сыворотке грызунов после активации лектинового пути, а также продемонстрировали, что данный процесс блокируется нейтрализующими МАСП-2 моноклональными антителами. МАСП-2 может представлять центральную точку разветвления в лектиновом пути, способную стимулировать активацию систем комплемента и коагуляции. Поскольку активация лектинового пути представляет собой физиологическую реакцию на многие виды травматических повреждений, авторы полагают, что сопутствующее системное воспаление (опосредованное компонентами комплемента) и диссеминированную внутрисосудистую коагуляцию (ДВС) (опосредованную через коагуляционный путь) можно объяснить способностью MASP-2 активировать оба пути. Данные открытия четко указывают на роль МАСП-2 в генерации ДВС и терапевтическую полезность ингибирования МАСП-2 при лечении или предупреждении ДВС. МАСП-2 может обеспечить молекулярную связь между комплементом и коагуляционной системой, и активация лектинового пути, возникающая при разных травмах, может непосредственно инициировать активацию коагуляционной системы через ось «(МАСП-2)-тромбин», обеспечивая механизм связи между травмой и ДВС.
МАСП-1 похож с тромбином в том, что она расщепляет фактор XIII, фибриноген и тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза (ТАИФ), в то время как МАСП-2 расщепляет только протромбин [Krarup A., Gulla K.C., Gál P., Hajela K., Sim R.B. The action of MBL-associated serine protease 1 (MASP1) on factor XIII and fibrinogen. Biochim Biophys Acta. 2008; 1784(9): 1294-300. doi: 10.1016/j.bbapap.2008.03.020]. Гулла и соавт. (2010) показали, что МСЛ-МАСП и L-фиколин-МАСП комплексы активируют коагуляционную систему при связывании к их соответствующими лигандами с образованием фибринового сгустка. Образовавшийся фибриновый сгусток связывает микробы и предотвращает их распространение [Gulla K.C., Gupta K., Krarup A., Gal P., Schwaeble W.J., Sim R.B., O'Connor C.D., Hajela K. Activation of mannan-binding lectin-associated serine proteases leads to generation of a fibrin clot. Immunology. 2010; 129(4):482-95. doi: 10.1111/j.1365-2567.2009.03200.x.].
Также как тромбин, МАСП-1 способна активировать протеазо-активируемый рецептор 4, который является медиатором тромбоцитарной активации и воспаления [Megyeri M., Makó V., Beinrohr L., Doleschall Z., Prohászka Z., Cervenak L.,  Complement protease MASP-1 activates human endothelial cells: PAR4 activation is a link between complement and endothelial function. J Immunol. 2009; 183(5): 3409-16. doi: 10.4049/jimmunol.0900879]. МАСП-3 расщепляет инсулино-подобный ростовой фактор-связывающий белок 5 (ИПРФСБ-5), который связывается к инсулино-подобному фактору роста (ИПФР) и модулирует его действие на клеточную пролиферацию, дифференциацию, выживание [Cortesio C.L., Jiang W. Mannan-binding lectin-associated serine protease 3 cleaves synthetic peptides and insulin-like growth factor-binding protein 5. Arch Biochem Biophys. 2006; 449 (1-2): 164-10] . ИПРФСБ-5 также регулирует эти клеточные события через ИПФР-независимые механизмы. Недавно было показано, что случаи с МАСП-3 дефицитом у человека обусловлены мутацией гена МАСП-1 и связаны с нарушениями эмбрионального развития, одним из синдромов которого является лицевая расщелина - «волчья пасть» [Rooryck C., Diaz-Font A., Osborn DP., Chabchoub E., Hernandez-Hernandez V., Shamseldin H., et al. Mutations in lectin complement pathway genes COLEC11 and MASP1 cause 3MC syndrome. Nat Genet. 2011;43(3):197-203. doi: 10.1038/ng.757]. Это предполагает, что МАСП-3 выполняет критическую роль в эмбриональном развитии плода.
В донорской плазме in vitro после рекальцификации, даже при отсутствии активаторов, процесс свертывания начинается через 10-20 мин спонтанно в отдельных центрах. Далее спонтанные сгустки увеличиваются в размере, постепенно заполняют весь объем плазмы. Показано также, что количество спонтанных центров с уменьшением числа тромбоцитов в плазме снижается. После ультрацентрифугирования плазмы для удаления всех тромбоцитов и крупных фосфолипидных везикул спонтанные центры практически не образуются. Ингибитор контактной фазы, полученный из зерен кукурузы, значительно снижает число спонтанных сгустков, но не подавляет их образование полностью [Каротина Н.Г., Ованесов М.В., Плющ О.П., Копылов К.Г., Лопатина Е.Г., Саенко Е.Л., Бутылин А.А., Атауллаханов Ф.И. Исследование спонтанных сгустков в нормально плазме и плазме больных гемофилией // Гематол. и трансфузиол. - 2002. - Т. 47. - С. 26-30].
Известны лабораторные способы исследования свертывания крови в условиях низкоконтактной активации, основанные на принципе рекальцификации цитратной крови [Исследование системы гемостаза в клинике. Под ред. Баркагана З.С., Барнаул, 1975, с. 21, 72-73; Иванов Е.П. Диагностика нарушений гемостаза. Минск, 1983, с. 120-124; Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Под ред. Балуды В.П. и соавт. Томск, 1980, с. 55-56]. Указанные способы считаются одними из основных в гемостазиологии. Однако накопившийся опыт и расширение знаний в области механизмов свертывания крови показали, что эти способы по своей чувствительности перестали удовлетворять все возрастающим требованиям к выявлению гиперкоагуляции [Rohrer M.J. et al. Annls of Surgery. - 1988. - V. 208, N 5. - P. 554-557].
Из уровня техники известен способ оценки гемостаза методом тромбодинамики. Тромбодинамика как метод исследования плазменного гемостаза был предложен в 1994 г. группой исследователей под руководством Атауллаханова Ф.И. [Атауллаханов Ф.И., Гурия Г.Т., Сафрошкина А.Ю. Пространственные аспекты динамики свертывания крови. II. Феноменологическая модель // Биофизика. - 1994. - Т. 39, №1. - С. 97-106]. В основу метода положена модель распространения сгустка начиная от повреждения сосудистой стенки вглубь сосуда. Имитация поврежденной сосудистой стенки достигается путем нанесения тонкого слоя тканевого фактора на поверхности вставки-активатора, которая и запускает процесс образования сгустка в плазме. В ходе исследования оцениваются параметры пространственного роста сгустка (лаг-период, Tlag), начальную скорость сгустка (Vo), стационарную скорость сгустка (Vst), размер сгустка (CS), оптическую плотность сгустка (CD). Таким образом, врач получает возможность характеризовать процессы активации свертывания с участием тканевого фактора. Также этот метод позволяет регистрировать феномен спонтанного образования сгустка.
Недостатком метода тромбодинамики является низкая производительность (2 анализа в течение 45 мин), необходимость дополнительной подготовки пробы (плазмы) путем высокоскоростного центрифугирования, необходимость специального прибора для регистрации тромбодинамики (или нескольких - для увеличения производительности анализа), набора реагентов и расходных материалов и, соответственно, высокая стоимость одного анализа для рутинных исследований. Также недостатком метода тромбодинамики является использование ингибитора контактного пути активации коагуляции, ингибитора трипсина из кукурузы, который снижает информативность теста и оценивает только активацию свертывания через тканевой фактор.
Из уровня техники известен также метод выделения и количественного определения множественно-модифицированных липопротеинов низкой плотности. Суть метода заключается в том, что выделение ммЛНП из сыворотки крови человека и определение количества ммЛНП по содержанию холестерина проводят путем обработки ее буфером, содержащим поливинилпирролидон с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000), инкубации пробы в течение 10 мин при комнатной температуре, осаждения агрегированных ммЛНП центрифугированием, преципитаты ммЛНП отделяют декантацией и ммЛНП растворяют в буфере без ПВП-35000. При уровне содержания холестерина в ммЛНП более 6,6 мг/дл констатируют наличие субклинического атеросклероза у обследуемого индивидуума [Шойбонов Б.Б., Баронец В.Ю., Толпыго С.М., Замолодчикова Т.С., Котов А.В., Кравченко М.А., Костырева М.В., Шабалина А.А. Метод выделения и количественного определения множественно-модифицированных липопротеинов низкой плотности // Патент РФ № 2592238, опубл. 20.07.2016. Бюл. №20]
Также известен способ выделения и исследования иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛНП), из сыворотки крови человека. Множественно модифицированные ЛНП из сыворотки крови человека предварительно агрегируют в условиях 9,1% ПВП-35000 как описано выше. Супернатант, полученный на стадии приготовления ммЛНП, дополнительно инкубируют при 4°С в течение 30 мин. Образовавшиеся агрегаты ИК-ммЛНП осаждают центрифугированием при 4°С в течение 10 мин при 3100g, декантируют, растворяют преципитат ИК-ммЛНП в буфере без ПВП-35000 и определяют содержание холестерина. Комплемент-связывающую способность ИК- ммЛНП исследуют с помощью гемолитического теста с использованием комплемента морской свинки. Способ может применяться как для ранней диагностики субклинического атеросклероза, так и для оценки характера аутоиммунной реакции организма на ммЛНП [Драпкина О.М., Шойбонов Б.Б., Елиашевич С.О. Способ выделения иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины. // Патент РФ № 2632118. Бюлл. № 28 от 02.10.2017 г].
Таким образом, в настоящее время не существует доступных тест-систем определения активности комплемента по классическому пути в тесте коагуляции фибриногена для рутинных исследований.
Задачей настоящего изобретения является создание скриниг-теста для определения активности системы комплемента по классическому пути в тесте коагуляции фибриногена для диагностики гиперкоагуляции и угрозы тромбоза, обусловленной высокой функциональной активностью системы комплемента.
Техническим результатом предлагаемого способа является расширение арсенала лабораторных скрининг-тестов для диагностики гиперкоагуляции, обусловленной высокой функциональной активностью классического пути системы комплемента в тесте коагуляции фибриногена.
Указанный результат достигается тем, что определение функциональной активности системы комплемента в тесте коагуляции фибриногена проводят с использованием сыворотки крови в качестве источника комплемента и специально обработанной цитратной плазмы крови в качестве источника протромбинового комплекса с фактором XII и фибриногеном, а в качестве активатора системы комплемента используют иммунные комплексы, содержащие множественно-модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛПНП). Активацию контактного пути коагуляции вызывают рекальцификацией, а степень коагуляции фибриногена определяют как разность изменения мутности пробы при 450 нм после 20 минутной инкубации при 37°С. Пробы с декомплементезированной сывороткой служат контролем для подтверждения участия системы комплемента в коагуляции фибриногена. Расчет степени коагуляции проводят относительно пробы, содержащей человеческий тромбин вместо исследуемой сыворотки человека. Максимальную абсорбцию фибринового сгустка, полученного с тромбином, при 450 нм принимают за 100% коагуляцию фибриногена. Коагуляция на уровне до 20% считают низкой активностью комплемента в тесте коагуляции фибриногена, от 21% до 48% - средняя активность и выше 49% - как высокую активность комплемента в тесте коагуляции фибриногена.
2
Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови, приготовление сыворотки, проведение теста коагуляции фибриногена с использованием специально обработанной цитратной плазмы, содержащей множественно-модифицированные липопротеины в качестве активатора классического пути активации комплемента, и CaClдля рекальцификации плазмы. Время проведения теста составляет 20 мин, одномоментно возможно исследование 90 проб сыворотки и тест может быть адаптирован для автоматических анализаторов.
.
Приготовление протромбинового комплекса с фактором XII и иммунными комплексами, содержащими множественно-модифицированные липопротеины низкой плотности К 10 мл цитратной плазмы прибавляют 8,4 мл 20% поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35) и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Образовавшиеся агрегаты ммЛПНП (П-1) отделяют центрифугированием при 23°С при 8000 об/мин в течение 10 мин. Тщательно декантируют и преципитат растворяют в 5 мл 0,01М трис-HCl-буфера, содержащего 0,15 М NaCl, рН 7,4. Супернатант далее инкубируют в течение 30 мин при 4°С. Образовавшиеся агрегаты протромбинового комплекса с фактором XII и иммунными комплексами, содержащими множественно-модифицированные липопротеины низкой плотности (П-2), осаждают центрифугированием при 4°С при 8000 об/мин в течение 10 мин. Преципитат тщательно декантируют и растворяют в 5 мл (концентрирование в 2 раза исходного образца цитратной плазмы). После растворения преципитатов (П-1 и П-2) определяют определяют коагуляцию при рекальцификации полученных препаратов.
Определение оптимальной концентрации хлорида кальция для запуска коагуляции препаратов П-1 и П-2 по контактному пути.С этой целью предварительно в 96-ти луночных плоскодонных планшетах 25 мкл 10% раствора хлорида кальция был прогрессивно раститрован начиная с первой лунки по седьмую лунку (8 лунка представляет бланк П-1 или П-2 без кальция). После добавляют по 50 мкл трис-имидазолового буфера, рН 7,4 и препараты П-1 или П-2. Тщательно перемешивают и измеряют степень коагуляции по изменению мутности при 450 нм на фотометре для иммуноферментного анализа (0 мин), далее ставят на 30-минутную инкубацию при 37°С. Далее измерение поглощения проб для контроля коагуляции проводят через 20, 30, 60 мин инкубации. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Влияние концентрации 10% раствора хлорида кальция на коагуляцию П-1
10% CaCl<sub>2</sub>,мкл в 100 мкл 25% П-1
12,5
6,25
3,125
1,56
0,75
0,37
0,185
0
А<sub>450</sub>
0 мин
0,108
0,086
0,082
0,064
0,064
0,056
0,069
0,062
20 мин
0,077
0,057
0,063
0,05
0,054
0,054
0,066
0,059
30 мин
0,073
0,056
0,062
0,061
0,058
0,063
0,067
0,059
60 мин
0,07
0,054
0,061
0,071
0,052
0,061
0,074
0,056
Как видно из данных, представленных в таблице 1, препарат П-1, приготовленный из цитратной плазмы, не обладает способностью к коагуляции при рекальцификации. Далее в аналогичных условиях был тестирован препарат П-2, приготовленный из супернатанта после отделения множественно-модифицированных липопротеинов низкой плотности из цитратной плазмы в условиях 9,1% ПВП-35. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние концентрации 10% раствора хлорида кальция на коагуляцию П-2
10% CaCl<sub>2</sub>,мкл в 100 мкл 25% П-2
12,5
6,25
3,125
1,56
0,75
0,37
0,185
0
А<sub>450</sub>
0 мин
0,096
0,085
0,08
0,06
0,062
0,056
0,069
0,059
20 мин
0,066
0,06
0,056
0,047
0,056
0,055
0,065
0,057
30 мин
0,068
0,067
0,065
0,056
0429
0,406
0,289
0,059
60 мин
0,059
0,054
0,053
0,519
0,504
0,481
0,467
0,057
2+
2+
Как видно из данных, представленных в таблице 2, в препарате П-2, приготовленном из супернатанта после отделения на первом этапе ммЛПНП из цитратной плазмы, содержится полный набор факторов протромбинового комплекса с фактором XII, который запускает коагуляцию при оптимальной концентрации ионов Са. Максимальная коагуляция наблюдается при инкубации в течение 60 мин при 37°С при концентрации Са от 0,185% до 1,56%. При инкубации 20 мин в системе не наблюдается какая-либо коагацияция П-2. Для дальнейших исследований влияния активации комплемента на коагуляцию П-2 нами выбрана 20 минутная инкубация.
Определение фибриногена в препаратах П-1 и П2.В препаратах П-1 и П-2 определяли содержание фибриногена по Миллар. Суть метода заключается в термоагрегации фибриногена при 56°С в течение 3 мин. Количество термоаггрегированного фибриногена определяли турбидиметрически в иммунологических планшетах с плоским дном с использованием фотометра для иммуноферментного анализа. К 25 мкл П-1, П-2 и исходной цитратной плазмы после термоаггрегации добавляют 75 мкл 0,15 М раствора NaCl. В пробе контроли бланка использовали растворы препаратов П-1, П-2 и исходной цитратной плазмы. Пробы тщательно перемешивали и измеряли мутность при 450 нм. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Содержание фибриногена в препаратах П-1, П-2 и в пулированной цитратной плазме
Препараты
Опыт А<sub>450</sub>
Бланк А<sub>450</sub>
∆А<sub>450</sub>
% фибриногена от исходной плазмы
П-1
0,076
0,077
0
0
П-2
0,365
0,074
0,291
111%
Пулированная цитратная плазма
0,377
0,166
0,261
100%
Как видно из данных, представленных в таблице 3, фибриноген не определялся в препарате П-1, в препарате П-2 содержание фибриногена составило 111% по сравнению с содержанием в исходной пулированной цитратной плазме. Учитавая то, что на стадии выделения П-2 проводилась концентрирование в 2 раза, выход по фириногену составил приблизительно 56%. Далее проводили эксперименты с определением фибриногена с тромбином. Для этого к 25 мкл препаратов П-1, П-2 или исходной пулированной цитратной плазме добавляли 65 мкл трис-имидазолового буфера с рН 7,4 и 10 мкл тромбина с активностью10 NIH.
2
Пример 1. Определение коагуляции фибриногена при активации комплемента множественно-модифицированными липопротеинами низкой плотности в препарате П-2. В лунки 96-луночной планшеты вносили последовательно 10 мкл сыворотки крови человека, 40 мкл трис-имидазолового буфера, 75 мкл препарата П-2 и 25 мкл 10 мМоль/л CaCl, тщательно перемешивали и измеряли оптическую плотность проб при 450 нм (0 мин инкубации - бланк). Затем пробы инкубировали 10 и 20 мин. В качестве контроля на полную коагуляцию препарата П-2 использовали тромбин с активностью 10 NIH и бланк представлял контроль П-2 без сыворотки. Полученные результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4
Коагуляция фибриногена в препарате П-2 при активации комплемента ммЛНП в сыворотке крови человека
№ сыв.
А<sub>450</sub>0 мин
А<sub>450</sub>10 мин
А<sub>450</sub>20 мин
∆А<sub>450 </sub>20 мин
%Коагуляции
1
0,093
0,216
0,561
0,468
72
2
0,091
0,147
0,503
0,412
63
3
0,096
0,089
0,442
0,346
53
4
0,097
0,09
0,256
0,159
24
5
0,097
0,176
0,521
0,424
65
6
0,093
0,087
0,305
0,212
32
7
0,11
0,111
0,581
0,471
72
8
0,098
0,175
0,52
0,422
65
К (полнаякоагуляция)
0,075
0,72
0,72
0,654
100
К(П-2) Бланк
0,06
0,06
0,06
0
Как видно из данных, представленных в таблице 4, инкубация препарата П-2 с сыворотками при рекальцификации приводила к разной степени коагуляции фибриногена в зависимости от времени инкубации.
Пример 2. Влияние инактивации комплемента на коагуляцию фибриногена в П-2. Сыворотки № 1-8 были предварительно декомплементизированы (инактивированы) инкубацией в течение 30 мин при 56°С. Условия эксперимента подробно описаны выше (см. пример 1), за исключением того, что в экспериментах использованы термоинактивированные сыворотки №1-8. Данные по влиянию инактивации комплемента при прогревании на коагуляцию П-2 представлены в таблице 5.
Таблица 5
Влияние декомплементизации сыворотки на коагуляцию П-2
№ сыв
А<sub>450</sub>0 мин
А<sub>450</sub>10 мин
А<sub>450</sub>20 мин
∆А<sub>450 </sub>(20 мин)
1
0,091
0,089
0,085
-0,06
2
0,09
0,088
0,09
0
3
0,093
0,092
0,116
0,023
4
0,077
0,077
0,079
0,002
5
0,087
0,083
0,085
-0,002
6
0,083
0,081
0,09
0,007
7
0,09
0,096
0,096
0,006
8
0,09
0,097
0,097
0,007
К (полная коагуляция)
0,075
0,72
0,72
0,654
К(П-2) Бланк
0,06
0,06
0,06
0
Как видно из данных, представленных в таблице 5, термоинактивация комплемента приводит к полной потере коагуляции П-2 при рекальцификации.
Таким образом, коагуляция препарата П-2 при рекальцификации обусловлена активацией системы комплемента.
Пример 3. Влияние маннана на коагуляцию фибриногена при активации комплемента ммЛНП в препарате П-2. Проведены исследования влияния прапарата дрожжевого маннана, активатора лектинового пути системы комплемента, на коагуляцию фибриногена при активации комплемента ммЛНП. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии активации лектинового пути системы комплемента множественно-модифицированными липопротеинами низкой плотности в препарате П-2 при рекальцификации. Также отсутствие ионов магния исключает активацию комплемента по альтернативному пути.
Таким образом в данных условиях (при рекальцификации) наблюдается активация систем комплемента по классическому пути до стадии образования С3-конвертазы. Для формирования С3-конвертазы классического пути активации системы комплемента, а также для активации альтернативного пути требуются ионы двухвалентного магния. Следовательно в данных условиях мы наблюдаем активацию компонента С1 на иммунных комплексах, содержащих ммЛНП в препарате П-2.
Пример 4. Влияние активации системы комплемента в сыворотках крови беременных женщин на коагуляцию фибриногена в препарате П-2. Проведено исследование влияния активации системы комплемента в сыворотках крови беременных женщин препаратом П-2 на коагуляцию фибриногена. Условия эксперимента подробно описаны выше. Полученные результаты представлены в таблице 6.
Таблица 6
Влияние активации системы комплемента в сыворотках крови беременных женщин на коагуляцию фибриногена в препарате П-2
№сыв.
А<sub>450</sub>
%коагуляции
№ сыв.
А<sub>450</sub>
% коагу-ляции
0 мин
20 мин
0 мин
20 мин
1
0,100
0,413
49
35
0,116
0,16
7
2
0,115
0,202
13
36
0,093
0,318
37
3
0,094
0,161
10
37
0,097
0,369
44
4
0,089
0,288
31
38
0,085
0,43
56
5
0,092
0,123
5
39
0,082
0,252
28
6
0,087
0,481
61
40
0,11
0,369
42
7
0,090
0,247
24
41
0,105
0,537
70
8
0,091
0,451
56
42
0,133
0,323
31
9
0,091
0,309
34
43
0,096
0,346
41
10
0,099
0,363
41
44
0,098
0,285
30
11
0,118
0,518
62
45
0,088
0,495
66
12
0,080
0,379
46
46
0,093
0,09
0
13
0,094
0,370
43
47
0,095
0,371
45
14
0,092
0,356
41
48
0,081
0,295
35
15
0,094
0,310
33
49
0,082
0,457
61
16
0,088
0,414
51
50
0,088
0,36
44
17
0,094
0,433
52
51
0,086
0,38
48
18
0,163
0,485
50
52
0,097
0,289
31
19
0,091
0,244
24
53
0,098
0,499
65
20
0,093
0,38
44
54
0,094
0,325
38
21
0,110
0,485
58
55
0,108
0,531
69
22
0,082
0,329
38
56
0,109
0,512
66
23
0,104
0,565
71
57
0,088
0,205
19
24
0,111
0,425
49
58
0,112
0,327
35
25
0,122
0,198
12
59
0,095
0,257
26
26
0,100
0,44
53
60
0,139
0,749
100
27
0,101
0,539
68
К<sub>тромбин</sub>
0,141
0,733
100
28
0,111
0,365
39
К<sub>тромбин</sub>
0,115
0,728
100
29
0,107
0,377
42
К<sub>тромбин</sub>
0,118
0,731
100
30
0,112
0,606
77
Бл<sub>плазмы</sub>
0,091
0,087
0
31
0,098
0,402
47
Бл<sub>плазмы</sub>
0,086
0,08
0
32
0,116
0,557
68
Бл<sub>плазмы</sub>
0,09
0,082
0
33
0,111
0,533
65
34
0,141
0,44
46
Как видно из данных, представленных в таблице 6, в 7 пробах (12%) из 60 тестированных проб сыворотки в тесте коагуляции фибриногена выявляется коагуляция до 20% (низкая активность комплемента) по сравнению с контролем полной коагуляции, которую определяли с использованием тромбина. В 32 пробах (53%) - коагуляция фибриногена колебалась от 20 до 49% (Средняя активность комплемента). В 21 пробе (35%) - выше 49% коагуляции (Высокая активность комплемента в тесте коагуляции фибриногена).
Таким образом, разработанный тест позволяет выявлять предтромботические состояния, обусловленные высокой функциональной активностью комплемента по классическому пути, для ранней профилактики инсультов и инфарктов.