СПОСОБ ОЧИСТКИ ЛИПОПЕПТИДА (ВАРИАНТЫ), АНТИБИОТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ ОЧИЩЕННОГО ЛИПОПЕПТИДА (ВАРИАНТЫ)
METHOD OF PURIFYING LIPOPEPTIDE (OPTIONS) AMD ANTIBIOTIC COMPOSITION BASED ON PURIFIED LIPOPEPTIDE (OPTIONS)

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к высокоочищенной форме липопептидов, в том числе к даптомицину, липопептидному антибиотику с сильной бактерицидной активностью против грамположительных бактерий, включающих штаммы, которые обладают резистентностью к традиционным антибиотикам. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения высокоочищенной формы данного липопептида. Далее, настоящее изобретение относится к мицеллам липопептидов. Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям липопептидных мицелл и к способам использования этих композиций. Еще настоящее изобретение относится к способам создания липопептидных мицелл из неассоциированных мономеров липопептидов и к превращению липопептидных мицелл в неассоциированные мономеры. И, наконец, настоящее изобретение относится к способу получения липопептидов с использованием мицелл, которые легко масштабируются для целей коммерческого производства.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Быстрое повышение распространяемости грамположительных инфекций, - в том числе и тех, которые вызваны бактериями, резистентными к антибиотикам, - вновь возродило интерес к созданию новых классов антибиотиков. Один из таких классов представляет собой класс липопептидных антибиотиков, которые включают даптомицин. Даптомицин обладает сильной бактерицидной активностью in vitro против клинически выявляемых грамположительных бактерий, которые являются причиной серьезных и опасных для жизни заболеваний. Эти бактерии включают резистентные патогены, такие как энтерококки, резистентные к ванкомицину (VRE), Staphylococcus aureus, резистентные к метициллину (MRSA), Staphylococcus aureus, промежуточно чувствительные к гликопептиду (GISA), коагулаза-негативные стафилококки (CNS), и Streptococcus pneumoniae, резистентные к пенициллину (PRSP), для которых существует очень мало терапевтических альтернатив. См., например, Tailly и соавт., 1999, Exp. Opin. Invest. Drugs 8:1223-1238, в дальнейшем "Tally". Ингибирующее действие даптомицина является быстрым, концентрационно-зависимым бактерицидным эффектом in vitro и in vivo, и относительно пролонгированным концентрационно-зависимым постантибиотическим эффектом in vivo.
nd
0
Baltz описал даптомицин в Biotechnology of Antibiotics, 2 Ed., ed W.R.Strohl (New York: Marcel Dekker, Inc), 1997, pp.415-435, в дальнейшем "Baltz". Даптомицин, известный также в качестве LY 146032, представляет собой циклический липопептидный антибиотик, который можно получить при ферментации Streptomyces roseosporus. Даптомицин является представителем антибиотиков S.roseosporus, фактора А-21978С типа и включает деканоильную боковую цепь, присоединенную к N-концевому триптофану циклического 13-аминокислотного пептида (Фиг.1). Даптомицин обладает наилучшим профилем активности из-за своей высокой эффективности против большинства грамположительных бактерий; он высокобактерициден и обладает быстрым действием; он обладает низким уровнем резистентности и эффективен в отношении организмов, резистентных к антибиотикам. В настоящее время данное соединение входит в целый ряд композиций, которыми лечат опасные инфекционные заболевания, вызываемые бактериями, в том числе, но не ограничиваясь, бактерией Staphylococcus aureus, резистентной к метициллину (MRSA) и энтерококками, резистентными к ванкомицину (VRE).
В ряде Патентов Соединенных Штатов описываются антибиотики А-21978С и их производные, в том числе, даптомицин (LY 146032), а также способы получения и выделения антибиотиков А-21978С и их производных.
В патентах США Re.32333, Re.32455 и 4800157 описан способ синтеза даптомицина путем культивирования Streptomyces roseosporus NRL15998 в условиях глубинной аэробной ферментации. В Патенте США №4885243 описан усовершенствованный способ синтеза даптомицина в ферментируемой культуре, источником питания которой является декановая жирная кислота или сложный эфир, или ее соль.
В Патентах США Re.32310, Re.32311, 4537717, 4482487 и 4524135 описаны способы деацилирования антибиотика А-21978С и реацилирования пептидного ядра и производных антибиотика, созданных с помощью данного способа. Во всех этих патентах описан выделенный очисткой антибиотик А-21978С с деацилированным ядром или его производное, которое выделяли из культуральной среды путем фильтрации и последующего выделения очисткой с помощью хроматографии на Diaion HP-20 и хроматографии на силикагеле/С18.
В Патентах США Re.32333 и Re.32455 раскрыт способ очистки, в котором фильтрат всей культуральной жидкости выделяли очисткой с помощью ряда стадий осаждения и экстракции для получения неочищенного комплекса А-21978С. Затем этот неочищенный комплекс очищали с помощью ионообменной хроматографии на IRA-68 и двух стадий хроматографии на силикагеле. Отдельные факторы А-21978С разделяли с помощью обращенно-фазовой хроматографии на силикагеле или на силикагеле/С18. Далее, в Патентах США Re.32333 и Re.32455 показано также, что А-21978С может быть выделен очисткой с помощью ступенчатой хроматографии с использованием смолы Diaion HP-20 после хроматографии на колонке с силикагелем.
Патент США 4874843 описывает очистку даптомицина способом, в котором используемая культуральная жидкость фильтруется и пропускается через колонку, содержащую смолу HP-20. После элюирования не полностью очищенный даптомицин пропускают через колонку, содержащую HP-20ss, а затем вновь разделяют на смоле HP-20. В данном патенте 4874843 указывается, что окончательное разрешение и отделение даптомицина от структурно сходных соединений с помощью данного способа затруднено присутствием примесей, которые не идентифицируются в культуральной жидкости с помощью ультрафиолетового анализа. Кроме того, в патенте 4874843 указывается, что попытки удалить эти примеси с помощью обращенно-фазовой хроматографии на силикагеле, нормальной фазовой хроматографии на силикагеле или с помощью ионообменной хроматографии также оказались неудачными в отношении существенного повышения чистоты даптомицина. Далее, в патенте 4874843 раскрыт "обратный способ" очистки, включающий стадии контактирования водного раствора продукта ферментации с нефункциональной смолой в водной фазе, физического удаления воды из ионообменной смолы, повторного увлажнения ионообменной смолы полярным органическим растворителем, промывкой смолы с помощью органического растворителя, элюирования продукта ферментации из данной смолы в результате увеличения полярности данного растворителя и извлечения данного продукта ферментации. В патенте 4874843 указывается, что данный способ улучшает окончательную чистоту от около 80% до около 93% и повышает выход от около 5% до около 35%; вместе с тем, в патенте 4874843 не раскрыт характер примесей, присутствующих в полученном препарате даптомицина.
В Патенте США 5912226 описана идентификация и выделение двух примесей, полученных во время производства даптомицина. Даптомицин, α-аспартилпептид, транспептидируется с образованием стабильного промежуточного соединения, в котором аспартильная группа становится ангидро-сукцинимидной группой (Фиг.3). В патенте 5912226 указывается, что присутствие этого промежуточного соединения, обозначаемого ангидро-даптомицин, наиболее ясно выражено при рН 4-6. Регидратация ангидро-сукцинимидной формы дает второй продукт деградации, который содержит β-аспартильную группу и представляет собой β-изомерную форму даптомицина (Фиг.2).
В патенте 5912226 указывается, что трет-ВОС-производное ангидро-даптомицина можно выделить с помощью обращенно-фазовой хроматографии на колонке с силикагелем/С-18, преципитировать, и очистить с помощью обращенно-фазовой хроматографии на силикагеле/С-18. В патенте 5912226 указывается также, что β-изомерная форма даптомицина может быть очищена с помощью хроматографии на смоле Diaion HP-20ss, обессолена с помощью хроматографии через смолу Diaion HP-20, и далее очищена с использованием обращенно-фазовой колонки С-18 с последующим режимом обращения на колонке со смолой HP-20.
Kirsch и соавт.(Pharmaceutical Research, 6:387-393, 1989, в дальнейшем "Kirsch") указывают, что ангидро-даптомицин и β-изомер были получены при очистке даптомицина. Kirsch описывает способы минимизации содержания ангидро-даптомицина и β-изомера путем регуляции рН и температурных условий. Однако Kirsch не смог стабилизировать даптомицин и предотвратить превращение даптомицина в ангидро-даптомицин и его последующую изомеризацию в β-изомер. Kirsch не смог предотвратить деградацию даптомицина в другие продукты деградации, не связанные с ангидро-даптомицином и β-изомером. В патенте 5912226 установлено, что даптомицин можно получить с использованием этих операций так, что полученный даптомицин содержит не более, чем 2,5 масс.% объединенных ангидро-даптомицина и β-изомера, но уровней этих примесей не приведено. В способе, представленном в Патенте США 4874843 и в способе крупномасштабного получения даптомицина для клинических испытаний, наивысшие уровни чистоты даптомицина наблюдались, около 90%-93%. Существует потребность в коммерчески осуществимом способе получения более высокоочищенного даптомицина и, если возможно, повышения его выхода после очистки. Более того, было бы желательно получить очищенный даптомицин, который содержит мало или вовсе не содержит ангидро-даптомицина и β-изомерной формы даптомицина. Было бы также желательно снизить в даптомицине содержание ряда других примесей. Однако в данной области техники не существует способа, который мог бы способствовать дальнейшему снижению уровней ангидро-даптомицина, β-изомерной формы и иных примесей при производстве даптомицина.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении данные проблемы решаются созданием коммерчески осуществимых способов получения липопептидов с высоким уровнем очистки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения искомый липопептид представляет собой даптомицин или родственный даптомицину липопептид. В одном варианте осуществления настоящего изобретения раскрыты коммерчески осуществимые способы получения даптомицина со степенью чистоты в 95-97%. Во втором варианте осуществления настоящего изобретения раскрыт коммерчески осуществимый способ, который почти полностью исключает наличие основных примесей в виде ангидро-даптомицина и β-изомера, а также других примесей в препаратах даптомицина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения раскрыты коммерчески осуществимые способы по очистке липопептидов, в том числе, даптомицина или родственного даптомицину липопептида, включая отделение липопептидных мицелл от низкомолекулярных контаминантов и отделение неассоциированных липопептидов от высокомолекулярных контаминантов. Кроме того, в настоящем изобретении используются методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), анализирующие чистоту даптомицина, а также детектирующие и характеризующие другие примеси в даптомицине, некоторые из них ранее не известные.
В настоящем изобретении представлен также очищенный даптомицин, который обладает, по меньшей мере, 98%-й чистотой, и он в значительной степени или практически свободен от ангидро-даптомицина и β-изомера. В настоящем изобретении представлен очищенный даптомицин, который свободен или практически свободен от ангидро-даптомицина и содержит гораздо меньший уровень β-изомера и иных контаминантов по сравнению с прежней возможностью его получения в данной области техники. В настоящем изобретении представлены также липопептидные мицеллы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные мицеллы включают даптомицин или родственный даптомицину липопептид. Кроме того, в настоящем изобретении представлены фармацевтические композиции, включающие высокоочищенный даптомицин или родственные даптомицину липопептидные мицеллы, а также способы применения этих композиций.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг.1 показана структура даптомицина. На Фиг.2 показана структура примеси 8, СВ-131010 (ранее идентифицированной как β-изомера, LY213846).
На Фиг.3 показана структура примеси 13, СВ-130952 (ранее идентифицированной как ангидро-даптомицина, LY178480).
На Фиг.4 показана предполагаемая структура примеси 1, СВ-131012 (ранее идентифицированной как LY212218).
На Фиг.5 показана предполагаемая структура примеси 2, СВ-131011.
На Фиг.6 показана предполагаемая структура примеси 3, СВ-131008 (ранее идентифицированной как LY213928).
На Фиг.7 показана предполагаемая структура примеси 4, СВ-131006.
На Фиг.8 показана предполагаемая структура примеси 6, СВ-130989 (ранее идентифицированной как LY213827).
На Фиг.9 показана предполагаемая структура примеси 7, СВ-131005.
На Фиг.10 показана предполагаемая структура примеси 12, СВ-131009.
На Фиг.11 показана предполагаемая структура примеси 14, СВ-131078 (ранее идентифицированной как LY109208).
На Фиг.12 представлена HPLC хроматограмма основной массы препарата даптомицина, включая примеси 1-14.
На Фиг.13 представлена HPLC хроматограмма препарата даптомицина после выделения очисткой на смоле Poros P150.
На Фиг. 14А-14С представлены мицеллярные структуры. На Фиг.14А показана сферическая мицелла, в которой гидрофобные хвосты амфипатических молекул ориентированы в направлении к центру данной сферы, а гидрофильные головки амфипатических молекул ориентированы за пределы сферы, в контакте с водным окружением. На Фиг.14А показан пример отрицательно заряженных гидрофильных головок. На Фиг.14В показана бислойная липидная структура, в которой два слоя амфипатических молекул объединены так, что гидрофобные хвосты каждого слоя ориентированы друг к другу, а гидрофильные головки, ориентированные на любую сторону из данного бислоя, находятся в контакте с водным окружением. Липидные бислои могут быть сферическими или планарными. На Фиг.14С показана липосома, в которой липидный бислой, показанный на Фиг.14В, образует сферическую структуру, окружающую водную часть. Гидрофильные головки липосомы обращены к внутренней водной части и к наружному водному окружению.
На Фиг.15 представлены результаты эксперимента по определению критической мицеллярной концентрации (cmc) даптомицина при рН 4,0.
На Фиг.16 показано распределение по размеру даптомициновых мицелл при светорассеянии. Мицеллы даптомицина обладают средним размером 5,4 нм (54Å).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Цели настоящего изобретения
Первая цель настоящего изобретения заключается в разработке способа очистки липопептидов, которые легко масштабировать для коммерческого производства, включающего уникальное сочетание анионообменной хроматографии и гидрофобной хроматографии. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ используется для производства очищенного даптомицина, который имеет более чем 95%-й уровень чистоты и проявляет низкое содержание примесей по сравнению с даптомицином, полученным прежними способами в данной области техники. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ применяется для производства даптомицина с использованием сниженного количества растворителей по сравнению с теми, которые использовались в прежних способах в данной области техники. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ применяется для производства очищенных родственных даптомицину липопептидов, которые превышают 95%-й уровень чистоты.
Другая цель настоящего изобретения состоит в разработке способа, повышающего уровень продуцирования липопептида микроорганизмом при питании ферментируемой культуры сниженным количеством жирной кислоты. Применение сниженных уровней декановой кислоты по сравнению с уровнем для ферментации даптомицина, предлагаемым Патентом США 4885243, повышает экономичность процесса и, кроме того, дает высокоочищенную форму даптомицина или родственного даптомицину липопептида. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ используется для повышения концентрации и количества даптомицина, продуцируемого Streptomyces roseosporus, тогда как образование родственных контаминантов минимизируется. Снижение уровня контаминантов в культуральной среде позволяет с большей эффективностью извлекать и очищать даптомицин, что делает производственный процесс высокопродуктивным.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в создании способа очистки даптомицина или родственных даптомицину липопептидов, включающего использование модифицированного буфера, усиливающего эффективность анионообменной хроматографии. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ применяется для получения даптомицина, чистота которого составляет, по меньшей мере, 98% или который, в значительной степени, или по существу свободен от ангидро-даптомицина или β-изомера. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ используется для очистки родственных даптомицину липопептидов, до, по меньшей мере, 98%-й чистоты.
Следующая цель настоящего изобретения заключается в создании технологии хроматографического метода очистки липопептида, включающей новое сочетание анионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии и модифицированного буфера, усиливающего эффективность анионообменной хроматографии. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используется данная технология хроматографического метода очистки даптомицина или родственного даптомицину липопептида. Неожиданно оказалось, что модифицированный буфер позволяет отделять ангидро-даптомицин от даптомицина хроматографическими методами, ранее не применяемыми.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в разработке способа очистки липопептидов, который легко масштабировать для коммерческого производства, используя липопептидные мицеллы. В первом варианте осуществления настоящего изобретения данный способ включает превращение липопептидного раствора, во время операций по очистке, из мономерного, немицеллярного состояния, в мицеллярное состояние и обратно. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ включает обработку данных липопептидов в условиях, в которых образуются мицеллы, отделение полученных липопептидных мицелл от низкомолекулярных контаминантов с помощью, например, методики разделения по размеру. В другом варианте осуществления настоящего изобретения данный способ включает обработку липопептидов в условиях, в которых эти липопептиды находятся в мономерной форме, и отделение молекул мономерного липопептида от высокомолекулярных молекул или агрегатов с помощью, например, методики разделения по размеру. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ включает обе стадии: обработку липопептидов в условиях, в которых образуются мицеллы, и отделение полученных липопептидных мицелл от низкомолекулярных контаминантов, и последующую обработку данных липопептидных мицелл в условиях, в которых эти липопептиды находятся в мономерной форме, и отделение полученных липопептидных мономеров от высокомолекулярных молекул или агрегатов. Данные две стадии можно осуществлять в любом порядке. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения методика разделения по размеру представляет собой ультрафильтрацию или эксклюзионную хроматографию.
Следующая цель настоящего изобретения состоит в разработке улучшенных способов измерения чистоты липопептидов, в том числе и даптомицина, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
Другая цель настоящего изобретения состоит в представлении очищенных липопептидов, таких как даптомицин или родственный даптомицину липопептид, и в получении фармацевтически приемлемых его солей или его композиций. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения получили даптомицин или родственный даптомицину липопептид, выделенный очисткой, одним из представленных в настоящем описании способов. В настоящем изобретении представляются также фармацевтические композиции из очищенного липопептида или его солей и способы введения этих композиций. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция включает очищенный даптомицин.
Другая цель настоящего изобретения заключается в представлении липопептидных мицелл и их фармацевтически приемлемых композиций. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения представляются даптомициновые мицеллы или родственная даптомицину липопептидная мицелла и их фармацевтически приемлемые композиции. В другом варианте осуществления настоящего изобретения представляются также способы введения липопептидных мицелл или их фармацевтических композиций пациентам, нуждающимся в этом. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липопептидные мицеллы вводят внутривенно, парентерально, внутримышечно или местно.
Определения
Если не оговорено иначе, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют смысл, обычно подразумеваемый рядовыми специалистами в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. В практике настоящего изобретения используются, если не оговорено иначе, традиционные методики химии, биохимии и микробиологии и употребляют используемую в них основную терминологию.
Термин "выделенный" относится к соединению или продукту, который относится к соединению, которое представляет, по меньшей мере, 10%, предпочтительно, по меньшей мере, 20% или 30%, более предпочтительно, по меньшей мере, 50%, 60% или 70%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 80% или 90% соединения, присутствующего в данной смеси.
Термин "липопептид" относится к молекуле, которая включает липидоподобную составляющую, ковалентно присоединенную к пептидной составляющей, а также к ее солям, сложным эфирам, амидам и простым эфирам. Термин "липопептид" охватывает также защищенные формы липопептидов, в которых одна или несколько амино-, карбоксилатсодержащих или гидроксильных групп защищены. Примеры защитных групп приведены в, например, "Protective Groups in Organic Synthesis" под авторством Theodora W.Greene, John Wiley and Sons, New York, 1981. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой антибиотик. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой LY303366, эхинокандины, пневмокандины, акулеацины, сурфактин, плипастатин В1, амфомицин или липопептидное производное, раскрытое в Патенте США 5629288. Эти липопептиды известны в данной области техники. См., например. Патент США 5202309 и Международную Заявку РСТ WO 00/08197. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липопептид представляет собой молекулу, родственную даптомицину, в том числе, в частности, и А54145, родственный даптомицину липопептид, раскрытый в Патентах США 4537717, 4482487, Re.32311, Re.32310, 5912226, переизданный в настоящее время в качестве Патента США №09/547357, в Международных Заявках РСТ WO 01/44272, WO 01/44274 и WO 01/44271, которые в данном случае все включены здесь путем ссылки, или антибиотик А-21978, в котором боковая цепь н-декановой жирной кислоты даптомицина замещается боковой цепью н-октановой, н-нонановой, н-ундекановой, н-додекановой или н-тетрадекановой жирной кислоты. Родственные даптомицину липопептиды, раскрытые в WO 01/44272, WO 01/44274 и WO 01/44271 связаны с синтетическими и полусинтетическими липопептидами, в которых орнитиновые или кинуриновые остатки или жирнокислотная боковая цепь даптомицина модифицированы. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой даптомицин. Термин “родственный даптомицину липопептид” относится к вышеописанным соединениям и их солям.
Термин "даптомицин" относится к н-декановому производному антибиотического фактора класса А-21978Со или его фармацевтически приемлемой соли. "Даптомицин" является синонимом LY146032. См. Фиг.1.
Термин "ангидро-даптомицин" относится к производному даптомицина, в котором α-аспартильная группа даптомицина транспептидирована в ангидро-сукцинимидную группу. См. Фиг.3.
Термин "β-изомер" или "β-изомер даптомицина" относится к производному даптомицина, который содержит β-аспартильную группу вместо α-аспартильной группы. См. Фиг.2.
Даптомицин или родственный даптомицину липопептид является "в значительной степени чистым", если, по меньшей мере, 95% образца составляет даптомицин или родственный даптомицину липопептид. Предпочтительно даптомицин или родственный даптомицину липопептид является "в значительной степени чистым", если, по меньшей мере, 97% образца составляет даптомицин или родственный даптомицину липопептид.
Даптомицин или родственный даптомицину липопептид является "существенно чистым", если, по меньшей мере, 98% образца составляет даптомицин или родственный даптомицину липопептид. Предпочтительно, даптомицин или родственный даптомицину липопептид является "существенно чистым", если, по меньшей мере, 99% образца составляет даптомицин или родственный даптомицину липопептид.
Даптомицин или родственный даптомицину липопептид является "в значительной степени свободным" от другого соединения, если это другое соединение присутствует в количестве, которое не превышает 1% количества даптомицина или родственного даптомицину липопептидного препарата.
Даптомицин или родственный даптомицину липопептид "существенно свободен" от другого соединения, если это другое соединение присутствует в количестве, которое не превышает 0,5% количества даптомицина или родственного даптомицину липопептидного препарата.
Даптомицин или родственный даптомицину липопептид "свободен" от другого соединения, если это другое соединение присутствует в количестве, которое не превышает 0,1% количества препарата даптомицина или родственного даптомицину липопептидного препарата. В качестве альтернативы, даптомицин или родственный даптомицину липопептид "свободен" от другого соединения, если данное соединение невозможно обнаружить с помощью HPLC в условиях максимальной чувствительности, в которых предел детектирования составляет, приблизительно, 0,05% или меньше от количества даптомицина или родственного даптомицину липопептидного -препарата. Типичные методы ВЭЖХ описаны здесь (Таблица 1 и 2).
"Очищенный" даптомицин или родственный даптомицину липопептид относится к чистым в значительной степени даптомицину или родственному даптомицину липопептиду, к существенно чистому даптомицину или к родственному даптомицину липопептиду, или его соли, или к даптомицину, родственному даптомицину липопептиду, или его соли, которая в значительной степени свободна, существенно свободна, или свободна от другого соединения.
"Частично очищенный" даптомицин или родственный даптомицину липопептид относится к даптомицину, родственному даптомицину липопептиду, или к его соли, которая характеризуется степенью чистоты менее 90%.
Чистый даптомицин, чистый родственный даптомицину липопептид или иной чистый липопептид относится к липопептиду до его включения в фармацевтическую композицию. Эту чистоту можно измерить разными способами, в том числе ядерным магнитным резонансом (ЯМР), газовой хроматографией/масс-спектроскопией (GC/MS), жидкостной хроматографией/масс-спектроскопией (LC/MS) или микробиологическим анализом. Предпочтительным способом измерения чистоты даптомицина является аналитическая высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC).
Термин "мицелла" относится к агрегатам амфипатических молекул. В водной среде липофильные домены молекул ориентированы внутрь мицеллы, а гидрофильные домены находятся в контакте, с данной средой. Структура мицелл включает, но не ограничивается, сферическую, пластинчатую, цилиндрическую, эллипсоидальную, везикулярную (липосомную), ламеллярную и жидкокристаллическую. См. Фиг.14.
Термин "смешанная мицелла" относится к конкретному типу мицеллы, в которой мицелла содержит более одного типа амфипатической молекулы. В контексте настоящего изобретения смешанные мицеллы содержат липопептид и, по меньшей мере, одну иную амфипатическую молекулу, которая может представлять собой другой липопептид. Смешанные мицеллы содержат, по меньшей мере, 10 масс.% данного липопептида. В других вариантах осуществления настоящего изобретения смешанная мицелла содержит, по меньшей мере, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% данного липопептида.
Термин "мицеллярный раствор" относится к раствору, в котором более 50% молекул данного липопептида в данном растворе присутствуют в мицеллах, по массе. Предпочтительно, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% данных молекул присутствуют в мицеллах. Мицеллярный раствор удерживается на ультрафильтрующей мембране, которая имеет порог номинальной молекулярной массы (NMW) 10000 дальтон.
Термин "критическая концентрация мицелл" (cmc) относится к определенной концентрации молекул, которая зависит от температуры, концентрации соли, а также от природы и типа амфипатической молекулы. При вышеуказанной cmc неассоциированные мономеры и мицеллы находятся в равновесии.
Термин "мономер" относится к амфипатической молекуле, которая не является частью агрегата, но которая существует в виде одиночной молекулы. В контексте настоящего изобретения термин мономер относится к неассоциированному липопептиду.
Термин "мономерный раствор" относится к раствору, в котором более 50% липопептидных молекул присутствуют в виде мономеров, что измеряется по массе. Предпочтительно, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% присутствуют в виде мономеров. Мономерный раствор не удерживается на ультрафильтрующей мембране, которая обладает порогом NMW 10000 дальтон, и значительная часть которого проходит через эту мембрану.
Термин "буфер с низкой ионной силой" относится к раствору, который обладает концентрацией соли менее 50 мМ; термин "буфер со средней ионной силой" относится к раствору, который обладает концентрацией соли между 50-250 мМ; термин "буфер с высокой ионной силой" относится к раствору, который обладает концентрацией соли, превышающей 250 мМ.
Способы производственной очистки липопептидов
Один вариант осуществления настоящего изобретения близок к технологии хроматографического способа, с помощью которого получают очищенный липопептид коммерчески осуществимым способом. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой даптомицин или родственный даптомицину липопептид. Технология хроматографического способа включает последовательное применение анионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии (HIC) и анионообменной хроматографии для очистки препарата, содержащего липопептид, такой как даптомицин или родственный даптомицину липопептид.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ очистки включает, кроме того, изменение условий ферментации, в которой неочищенный продукт, содержащий А21978С, продуцируется Streptomyces roseosporus в целях увеличения образования даптомицина и снижения примесей и родственных контаминантов, продуцируемых ферментируемой культурой S. roseosporus.
Предпочтительный вариант осуществления способа хроматографией описывается ниже:
Streptomyces roseosporus ферментируют в питательной среде с подачей н-декановой кислоты, как описано в Патенте США 4885243, с модификацией, в которой питание этой декановой кислотой поддерживают на самом низком уровне без снижения суммарной производительности ферментации. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения во время аэробной ферментации остаточная декановая кислота поддерживается на уровне менее 50 частей на миллион (ppm). В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, остаточная декановая кислота поддерживается во время аэробной ферментации на уровне между одной и 20 ppm. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения остаточная декановая кислота поддерживается на уровне, приблизительно десяти ppm во время аэробной ферментации. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация остаточной декановой кислоты измеряется на протяжении всей ферментации и уровень подачи декановой кислоты непрерывно корректируют для сохранения остаточного уровня декановой кислоты в рамках предпочтительных параметров. В уровне техники не описаны специфичность in situ и низкие постоянные концентрации остаточной декановой кислоты, необходимые для получения оптимального количества даптомицина, содержащего довольно низкие уровни примесей.
После ферментации неклеточный раствор осветляют путем удаления мицелия из культуральной жидкости. Удаление мицелия из ферментационной смеси осуществляют с помощью любой общепринятой методики отделения, такой как центрифугирование или микрофильтрация. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения культуральную среду осветляют путем микрофильтрации, например, путем использования мембранной системы Pall Sep™. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения культуральную среду осветляют с использованием промышленной центрифуги, такой как центрифуга Westfalia™, с последующим завершением с помощью глубинного фильтра. Для удаления мицелия из культуральной среды могут использоваться и другие механизмы, такие как пресс для фильтрации, роторный барабанный фильтр или глубинный фильтр одноразового действия, которые осветляют питательную среду и делают ее пригодной для крупномасштабной колоночной хроматографии.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин можно экстрагировать непосредственно из мицелиальной ферментационной среды путем использования органического растворителя, такого как бутанол, добавленного перед осветлением на центрифуге для отделения растворителя или на фильтре. Для экстрагирования в соответствии с данным вариантом осуществления настоящего изобретения можно применять любой спирт, с четырьмя и более углеродами. Предпочтительным растворителем является н-бутанол. Использование органического растворителя повышает эффективность начального выделения очисткой даптомицина по сравнению с одним лишь водным отделением даптомицина. Например, даптомицин распределяется в н-бутанол, при использовании н-бутанола в концентрации, превышающей 10%, и при осуществлении данного процесса в условиях, в которых н-бутанол образует отдельную фазу, например, при значении рН 4-5, которое находится вблизи изоэлектрической точки даптомицина (см. Пример 4).
В следующем варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин образуется в иммобилизационном ферментере, в котором используется преактивированный мицелий для неферментативного образования даптомицина с использованием в качестве источника энергии, предпочтительно сахара, основных компонентов, таких как аминокислоты и аммоний, а также декановой кислоты. Затем, полученный в иммобилизационом ферментном реакторе даптомицин обрабатывается описанными здесь способами.
После осветления культуральной среды уровень даптомицина в осветленной среде обогащается (т.е. концентрируется) анионообменной хроматографией. Вначале осветленный раствор контактирует с анионообменной смолой в условиях, в которых большая часть или весь даптомицин связывается с анионообменной смолой. После связывания эту смолу промывают водным буфером соответствующей ионной силы для удаления несвязавшегося материала и некоторых даптомициновых примесей. Наконец, очищенный даптомицин, связавшийся со смолой, элюируют в условиях, при которых даптомицин диссоциирует со смолы.
Стадии связывания, промывки и элюции могут осуществляться в соответствии с настоящим изобретением с использованием буферов и способов, известных в данной области техники. Например, элюцию можно осуществлять с использованием буфера, содержащего повышенную концентрацию соли по сравнению с промывочным буфером, буфером, который обладает сниженным рН в сравнении с данным промывочным буфером, или буфером, который обладает и повышенной концентрацией соли и сниженным рН, в сравнении с промывочным буфером. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин связывается с анионообменной смолой, которая уравновешена буфером, не содержащим повышенной или сниженной концентрации соли при рН, который колеблется от нейтрального до щелочного. Нагруженную смолу промывают тремя чистыми колоночными объемами воды, а затем шестью чистыми объемами промежуточного солевого буфера, содержащего 30-60 мМ NaCl. Даптомицин элюируют из колонки одним-тремя колоночными объемами буфера с повышенной солевой концентрацией и/или сниженным рН, содержащего 300-500 мМ NaCl. Повышенные концентрации хлорида натрия и альтернативной соли, такой как хлорид калия, будут также элюировать даптомицин из данной смолы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используется анионообменная смола с высокой скоростью потока. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используется смола FP-DA 13 (Mitsubishi).
Анионообменная хроматография может осуществляться путем колоночной хроматографии или может осуществляться в режиме ступенчатой хроматографии. Для коммерческого производства предпочтительной является ступенчатая хроматография. Анионообменную смолу можно промыть и элюировать ступенчатыми градиентами концентрации соли или непрерывным градиентом концентрации соли. Любой подходящий ступенчатый или непрерывный градиент концентрации соли, позволяет отделять даптомицин от примесей. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения непрерывный градиент концентрации соли представляет собой градиент, который изменяется от 0 до 1000 мМ NaCl. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения непрерывный градиент концентрации соли представляет собой градиент, который изменяется от 100 до 500 мМ NaCl или от 0 до 400 мМ NaCl. Можно также использовать радиальную проточную хроматографию, которая описана в Патентах США 5756680, 4865729, 4840730 или 4708782.
После анионообменной хроматографии полученный препарат даптомицина далее очищают с помощью гидрофобной хроматографии (HIC). Один из вариантов осуществления данной стадии описан в Патенте США 4874843, включенном здесь путем ссылки. Элюируемый водный препарат даптомицина контактирует с HIC-смолой в условиях, при которых большая часть или весь даптомицин связывается с данной смолой. Содержание воды в смоле, нагруженной даптомицином, уменьшается при контактировании этой смолы при повышенной концентрации неполярного растворителя. Данную смолу промывают соответствующим полярным органическим растворителем в условиях, при которых примеси отделяются от смолы, а даптомицин остается связанным. В заключение препарат даптомицина элюируется в условиях, при которых даптомицин диссоциирует со смолы. Обычно даптомицин элюируется с использованием буфера, содержащего растворитель со сниженной полярностью (повышенный уровень полярного растворителя), и/или повышенным рН по сравнению с промывочным буфером.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нефункциональная смола для HIC представляет собой небольшие частицы HP-20ss (Mitsubishi). Связанный даптомицин специфически удаляют из смолы HP-20ss фазой органического растворителя, например, фазой, которая содержит изопропиловый спирт, ацетонитрил, бутанол или иной подходящий растворитель. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин связан со смолой HP-20ss, которая уравновешена ацетатным буфером, содержащим 10% ацетонитрила или эквивалентного полярного растворителя, такого как изопропиловый спирт. Нагруженную даптомицином смолу промывают, по меньшей мере, тремя чистыми колоночными объемами уравновешивающего буфера. Далее нагруженную даптомицином смолу освобождают от дополнительных примесей путем промывки тремя-шестью чистыми объемами ацетатного промывочного буфера, содержащего неэлюирующую концентрацию полярного растворителя. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нагруженную даптомицином смолу промывают 30% ацетонитрилом или 45% изопропиловым спиртом. Даптомицин из нагруженной смолы элюируют одним-тремя чистыми объемами ацетатного буфера, содержащего 35% или больше ацетонитрила или более 50% изопропилого спирта. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин элюируется 35% ацетонитрилом при рН 4,0-5,0 или 55-60% изопропиловым спиртом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин из нагруженной смолы элюируют одним-тремя чистыми объемами буфера при повышенном рН. В данном варианте осуществления настоящего изобретения рН буфера градиентно повышается для элюции различных соединений из данной колонки с различными скоростями, что связано с различиями в заряде. При повышенном рН, например, при рН 6,0-7,0, элюирующая концентрация ацетонитрила снижается до 10-20%. Подобным же образом, при повышенном рН, например, при рН 6,0-7,0 элюирующая концентрация изопропилового спирта снижается до 20-25%. Регулируемая температура, при которой осуществляется хроматография, также влияет на концентрацию растворителя. Элюция при сниженных температурах, т.е. в условиях охлаждения, требует повышенных уровней растворителя при всех значениях рН.
После HIC содержание органического растворителя в полученном препарате даптомицина уменьшают с помощью анионообменной хроматографии. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используется FP-DA 13, как указано выше.
После второй анионообменной хроматографии выделенный очисткой даптомицин депирогенируется, фильтруется и концентрируется в условиях охлаждения. Фильтрование даптомицина можно осуществлять любым способом, известным в данной области техники. В одном варианте осуществления настоящего изобретения фильтрацию и депирогенирование можно осуществить с помощью:
i) получения раствора даптомицина в условиях, при которых даптомицин находится в мономерном и немицеллярном состоянии;
ii) фильтрации раствора даптомицина в условиях, при которых даптомицин необходимо пропустить через определенный фильтр, кроме пирогенов, которые не должны проходить через данный фильтр, например, имея раствор даптомицина с рН 6,0-8,0, и фильтрацию данного раствора проводят с помощью ультрафильтра, который характеризуется значениями для NMW между 3000 и 30000;
iii) изменения раствора даптомицина, который пропускают через данный фильтр так, чтобы даптомицин агрегировался, например, путем изменения рН раствора даптомицина до 2,5-4,5 так, чтобы даптомицин образовывал мицеллы;
iv) фильтрации раствора даптомицина в условиях, при которых даптомицин удерживается на фильтре, например, концентрирования даптомицина на ультрафильтре с NMW 30000 или меньше, таком как например, мембрана с обратным осмосом; и
v) сбора депирогенного даптомицина.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин со стадии (ii) фильтруют под давлением через ультрафильтр с отсечением молекулярной массы (MWCO) в 10000 дальтон при рН, приблизительно, 7-8. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин присутствует в начальной концентрации менее 40 мг/мл, более предпочтительно, в концентрации, приблизительно, 31,25 мг/мл. При этих условиях даптомицин проходит через данный фильтр, а пирогены, такие как липополисахариды (LPS), не проходят. После начальной ультрафильтрации рН получаемого фильтрата снижается до рН 2,5-4,5 и этот фильтрат концентрируют на ультрафильтре 10000 MWCO до, приблизительно, 120 мг/мл. При этих условиях даптомицин удерживается на данном фильтре. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рН получаемого фильтрата равен рН 3,5. После концентрирования концентрацию даптомицина доводят до 105 мг/мл, проверяют на эндотоксичность и используют для наполнения флаконов в асептических условиях.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения нанофильтрацию с обратным осмосом осуществляют при рН 1,5-3,0. Низкий рН и охлаждение используются для задержки деградации выделенного очисткой даптомицина. Кроме того, даптомицин можно фильтровать через фильтр с размером пор 0,2 мкм, чтобы снизить биологическую загрязненность, а затем лиофилизировать целиком или во флаконах.
В качестве альтернативы вышеприведенной стадии ультрафильтрации и концентрирования, элюируемые фракции, содержащие даптомицин, смешивают с бутанолом (н-, изо- или трет-бутанолом) с рН, приблизительно, 4,5 в соотношении, превышающем соотношение одной части бутанола к девяти частям раствора даптомицина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения одну часть бутанола смешивают с четырьмя частями раствора даптомицина с получением 20%-го раствора бутанола. Полученному бутанол-даптомициновому раствору позволяют разделиться на органическую и водную фазы. Даптомицин, распределенный в органическую фазу, собирают. Обезвоживание даптомицина в органической фазе может стабилизировать даптомицин и предотвратить деградацию выделенного очисткой даптомицина до ангидро-даптомицина и последующего образования β-изомера. В конце концов даптомицин может быть возвращен в водную фазу добавлением буфера с рН 6,5-7,5 в данную органическую фазу. После концентрирования или сбора даптомицина даптомицин лиофилизируют.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения хроматография используется для выделения очисткой липопептидов, иных нежели даптомицин, таких как А54145, LY303366, эхинокандины, пневмокандины, акулеацин, сурфактин, плипастатин В1, амфомицин или липопептидного производного, раскрытого в Патенте США 5629288. Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения хроматография используется для очистки родственных даптомицину липопептидов, в том числе, А54145, или липопептида, раскрытого в Патентах США 4537717, 4482487, Re.32311, Re.32310, 5912226, переизданных в настоящее время в виде Патента США №09/547357, Международных Заявок РСТ WO 01/44272, WO 01/44274 и WO 01/44271 или антибиотика А-21978, в котором боковая цепь н-декановой жирной кислоты даптомицина замещается боковой цепью на н-октановой, н-нонановой, н-ундекановой, н-додекановой, н-тридекановой или н-тетрадекановой жирной кислоты.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения для очистки даптомицина или других липопептидов используется "Salt Cloud Method" [Genetic Engineering News, Vol.19, No.20, pages 1, 34 and 43, (November 15, 1999)]. Указанный "Salt Cloud" способ базируется на системе, включающей мембрану, которая объединяет избирательность разделения и высокообъемную пропускную способность. Указанный Salt Cloud Method может использоваться совместно со стадиями раскрытого здесь способа или отдельно для очистки даптомицина или других липопептидов.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения близок хроматографическому методу, который дает высокоочищенный липопептид, получить который невозможно с помощью прежних в данной области техники хроматографических методов. Данный хроматографический метод включает применение модифицированного буфера, усиливающего анионообмен при хроматографии при очистке препарата, содержащего липопептид. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ используется для получения высокоочищенного даптомицина или родственного даптомицину липопептида. Данный способ при его применении к частично очищенному даптомицину, дает даптомицин, который обладает, по меньшей мере, 98% чистоты. Данным способом получают также даптомицин, который свободен или существенно свободен от ангидродаптомицина. Данный способ включает следующие стадии:
Частично очищенный даптомицин получают с помощью любого способа, известного в данной области техники или так как он описан здесь. Полученный препарат даптомицина далее очищают с помощью модифицированного буфера, усиливающего эффективность анионообменной хроматографии. Даптомицин связывается с анионообменной смолой в присутствии соответствующего буфера с измененной ионной силой в условиях, при которых даптомицин связывается с данной смолой в мономерном и немицеллярном состоянии. Модифицированный буфер включает забуферивающий агент, такой как, не ограничивая, ацетат, фосфат, цитрат и Трис-HCl, или любой другой буферящий агент, который забуферивает раствор до нейтрального рН. Кроме того, модифицированный буфер включает один или несколько хаотропных агентов, в том числе, не ограничивая, гуанидин, аммоний, мочевину, сильный восстанавливающий агент, бензоат, аскорбат или другой ионный усилитель, способный модифицировать данный буфер так, что даптомицин легко отделяется от примесей. Нагруженную даптомицином смолу промывают соответствующим ионно-модифицированным буфером для элюции примесей, в том числе и ангидро-даптомицина. Затем даптомицин элюируют в условиях, которые позволяют отделить даптомицин от примесей, в том числе, и β-изомер, которые остаются связанными со смолой.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения модифицированный буфер обладает нейтральным рН (рН 6-8) и содержит 2-6 М мочевины. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения анионообменная смола представляет собой Porous Resin P150 или Porous D50 (РЕ Biosystems). В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения анионообменная смола представляет собой Porous P150. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин, связанный с данной смолой в буфере с низкой ионной силой, промывают буфером с низкой-средней ионной силой и элюируют буфером с высокой ионной силой. В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин связан со смолой Porous P150 в Трис-буфере рН 7,0, содержащим 6 М мочевину. Нагруженную даптомицином смолу Porous P150 промывают тремя чистыми объемами Трис-буфера или иным подходящим буфером, содержащим уровень соли, которая удаляет контаминанты и ангидро-даптомицин, не элюируя даптомицин. Даптомицин элюируется из смолы Porous P150 Трис-буфером или другим подходящим буфером при повышенных солевых условиях, которые оставляют дополнительные примеси, в том числе, существенную часть β-изомера, связанного с данной колонкой. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используется Porous P150, а даптомицин связывается со смолой в ацетатном буфере рН 6,0, содержащем 2 М мочевины. Нагруженную даптомицином смолу Porous P150 промывают и элюируют аналогичным вышеуказанным способом, за тем исключением, что используется ацетатный буфер рН 6,0, содержащий 2 М мочевины. Продукт фракционирования можно измерить с помощью HPLC или с помощью УФ-мониторинга.
Анионообменную хроматографию, усиленную модифицированным буфером, можно осуществить с помощью колоночной хроматографии или с помощью ступенчатой хроматографии. Можно также использовать радиальную проточную хроматографию, которая описана в Патентах США 5756680, 4865729, 4840730 или 4708782. Анионообменную смолу, усиленную модифицированным буфером, можно промыть и элюировать ступенчатым градиентом концентрации соли или непрерывным градиентом концентрации соли. Подходящим ступенчатым или непрерывным градиентом концентрации соли является любой градиент, который позволяет отделить даптомицин от примесей, в том числе, но не ограничиваясь, от ангидро-даптомицина и β-изомера. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения непрерывный градиент концентрации соли составляет 0-1000 мМ NaCl. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения градиент концентрации соли составляет 100-500 мМ NaCl или 0-400 мМ NaCl.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения используется модифицированный буфер, усиливающий анионообменную хроматографию, для очистки липопептидных соединений иных, чем даптомицин. Эти липопептидные соединения включают, но не ограничиваются, А54145, LY303366, эхинокандины, пневмокандины, акулеацин, сурфактин и плипастатин B1 (Tsuge и соавт., 1996, Arch. Microbiol. 165:243-51) и липопептидные производные, как показано в Патенте США 5629288. В другом варианте осуществления настоящего изобретения модифицированный буфер, усиливающий анионообменную хроматографию, используется для очистки родственного даптомицину липопептида, такого как А54145, или липопептида, раскрытого в Патентах США 4537717, 4482487, Re.32311, Re.32310, 5912226, в настоящее время переизданных в США под №09/547357, в Международных Заявках РСТ WO 01/44272, WO 01/44274 и WO 01/44271, или антибиотика А-21978, в котором боковая цепь н-декановой жирной кислоты даптомицина замещается боковой цепью н-октановой, н-нонановой, н-ундекановой, н-додекановой, н-тридекановой или н-тетрадекановой жирной кислоты.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения для очистки даптомицина или родственного даптомицину липопептида используется новое сочетание стадий хроматографической технологии. Данный способ включает анионообменную хроматографию, обращенно-фазовую хроматографию на небольших частицах (обращенно-фазовую распределительную хроматографию) и модифицированный буфер, усиливающий анионообменную хроматографию. Данный способ выделения очисткой может, кроме того, включать изменение условий ферментации, в которой неочищенный продукт, содержащий А21978С, образуется с помощью Streptomyces roseosporus. Этими способами получают даптомицин или родственный даптомицину липопептид, который обладает, по меньшей мере, 98%-й чистотой. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данными способами получают даптомицин или родственный даптомицину липопептид, который обладает, по меньшей мере, 99%-й чистотой.
Предпочтительный вариант осуществления хроматографического способа описан ниже:
Streptomyces roseosporus ферментирует в питательной среде с подачей н-декановой кислоты, как описано в Патенте США 4885243, с модификацией, при которой подпитка декановой кислотой поддерживается на самом низком уровне без уменьшения общего выхода продуктов ферментации, как указано выше. В альтернативном варианте осуществления можно регулировать приток питательного вещества при условии, что в конечном итоге он создает н-декановую группу, для введения в ядро даптомицина. Примеры этих питательных веществ представляют собой, без ограничения, декановый амид, декановые сложные эфиры, включающие бутиловые сложные эфиры, неочищенные кокосовое или пальмовое масла, декановую кислоту животного происхождения, различные соли декановой кислоты и нефтехимическую декановую кислоту. После ферментации полученный надклеточный раствор осветляют, как описано выше. В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин можно экстрагировать из мицелия с использованием органического растворителя, такого как н-бутанол, до осветления раствора на центрифуге, отделяющей растворитель или на фильтре, как описано выше. После осветления культуральной среды, содержание даптомицина обогащается в данном осветленном растворе вначале с помощью анионообменной хроматографии, а затем с помощью HIC, как описано выше.
По завершении HIC, содержание органического растворителя в препарате даптомицина уменьшают с помощью любого способа, известного в данной области техники. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения содержание органического растворителя уменьшают с помощью анионообменной хроматографии, как описано выше. Даптомицин следует элюировать из колонки в буфере, совместимым с буфером, необходимым для хроматографии с усиливающим модифицированным буфером. Альтернативно, элюирующий буфер можно заменить на этот модифицированный буфер путем обратного осмоса или фильтрацией на 10000 MWCO-фильтре. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данное содержание органического растворителя уменьшают выпариванием или разбавлением в буфере. В третьем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растворитель обращенно-фазовой хроматографии и остаточная соль удаляются с использованием обратного осмоса при рН 1,5-4,0 или ультрафильтрацией при рН 2,5-4,5. Полученный продукт можно заморозить для бестарного хранения или лиофилизировать, а затем регидратировать в воде или в буфере, используемом для приготовления модифицированного буфера, усиливающего эффективность анионообменной хроматографии.
Кроме того, даптомицин очищают с помощью модифицированного буфера, усиливающего эффективность анионообменной хроматографии, как описано выше.
После анионообменной хроматографии с модифицированным буфером для усиления эффективности, очищенный даптомицин фильтруют и концентрируют в условиях охлаждения. Фильтрацию даптомицина можно осуществить с помощью любого способа, известного в данной области техники. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин депирогенируют и концентрируют, как описано выше. Альтерантивно, даптомицин можно сконцентрировать обратным осмосом в условиях охлаждения при рН 1,5-4. Низкий рН и режим охлаждения применяются для предупреждения деградации выделенного очисткой даптомицина.
В качестве альтернативы или в дополнение к вышеуказанной стадии фильтрации и концентрирования, элюируемые фракции, содержащие даптомицин в модифицированном буфере, усиливающем эффективность анионообменной хроматографии, можно смешать с бутанолом (н-, изо- или трет-бутанолом) при рН, приблизительно, 4,5 в соотношении, превышающем соотношение одной части бутанола к девяти частям раствора даптомицина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения одну часть бутанола смешивают с четырьмя частями раствора даптомицина с получением 20%-го бутанольного раствора. Раствор даптомицина в бутаноле позволяет разделить органическую и водную фазы. Даптомицин распределяется в органическую фазу, которую собирают. Дегидратация даптомицина в данном органическом растворителе может стабилизировать даптомицин и предотвратить деградацию выделенного очисткой даптомицина до ангидро-даптомицина и последующего образования β-изомера.
После концентрирования или сбора даптомицина, даптомицин лиофилизируют.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения хроматографическая технология используется для очистки других липопептидов, отличных от даптомицина, таких, которые описаны выше.
Образование липопептидных мицелл и способы их использования
В другом варианте настоящего изобретения создали липопептидные мицеллы, способы получения липопептидных мицелл и способы использования липопептидных мицелл для выделения очисткой липопептида и фармацевтических композиций. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой родственную даптомицину молекулу, включая, в частности, даптомицин, А54145, родственный даптомицину липопептид, раскрытый в Патентах США 4537717, 4482487, Re.32311, Re.32310, 5912226, переизданных в настоящее время в виде Патента США №09/547357, Международных Заявок РСТ WO 01/44272, WO 01/44274 и WO 01/44271, или антибиотик А-21978, в котором н-декановая боковая цепь даптомицина замещена на н-октановую, н-нонановую, н-ундекановую, н-додекановую, н-тридекановую или н-тетрадекановую боковую цепь. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный липопептид представляет собой даптомицин.
Мицеллы представляют собой агрегаты амфипатических молекул. В водной среде липофильные части этих молекул ориентированы внутрь мицеллы, а гидрофильные части молекул контактируют с водной средой. Мицеллы образуются спонтанно в растворе, содержащем амфипатические молекулы, если концентрация данных молекул достаточно высока.
Образование мицелл вызывает изменения некоторых общих физических свойств раствора, включая изменения осмотического давления, мутности, электрической проводимости, поверхностного натяжения, коионной и противоионной активностей (в случае ионных амфипатических молекул), коэффициента преломления, УФ и ЯМР спектров, парциального молярного объема, вязкости, коэффициента диффузии и солюбилизации красителя. Соответствующую cmc можно определить путем измерения одного или нескольких этих мицеллозависимых физических свойств в виде функции концентрации амфипатической молекулы. Размер и форму мицелл можно определить с помощью динамического рассеяния света лазера, ультрацентрифугирования, вязкости и/или в экспериментах по малоугловому рентгеновскому рассеянию. Мицеллы могут также существовать в жидкокристалических фазах.
2
Липопептиды могут агрегировать в мицеллы при создании концентрации липопептида, которая превышает cmc данного липопептида. Cmc зависит от природы липопептида и определенной температуры, концентрации соли и рН водного раствора, включающего данный липопептид. Что касается природы данного липопептида, то cmc липопептида понижается при добавлении СН-групп к липофильным углеродным цепям. Поэтому, если известна cmc даптомицина в конкретной солевой концентрации, температуре и рН, тогда антибиотик типа А-21978, в котором боковая цепь н-декановой жирной кислоты замещена н-октановой, или н-нонановой боковой цепью жирной кислоты, будет обладать более высокой cmc, а антибиотик А-21978, в котором боковая цепь н-декановой жирной кислоты даптомицина замещена боковой цепью н-ундекановой, н-додекановой, н-тридекановой или н-тетрадекановой жирной кислоты, будет обладать пониженной cmc по сравнению с даптомицином.
2
В одном варианте осуществления настоящего изобретения cmc липопептида можно регулировать путем добавления или удаления СН-групп в данный липопептид. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липопептид представляет собой А-21978, в котором боковая цепь н-декановой жирной кислоты даптомицина замещена боковой цепью н-октановой, н-нонановой, н-ундекановой, н-додекановой, н-тридекановой или н-тетрадекановой жирной кислоты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения cmc липопептида можно приблизительно вычислить, следуя отличительным особенностям данного описания. Зная cmc для такого липопептида как даптомицин, можно приблизительно вычислить cmc для родственного липопептида, в котором боковая цепь н-декановой жирной кислоты замещена боковой цепью н-октановой, н-нонановой, н-ундекановой, н-додекановой, н-тридекановой или н-тетрадекановой жирной кислоты. Вышеуказанное можно осуществить способами, известными специалисту в данной области техники.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, зная cmc для некоего липопептида, можно вычислить примерную cmc для липопептида, который содержит родственную пептидную составляющую. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, зная cmc для даптомицина и отличительные особенности известного уровня техники, можно легко определить cmc для родственного липопептида, такого как А54145, родственного даптомицину липопептида, раскрытого в Патентах США 4537717, 4482487, Re.32311, Re.32310, 5912226, переизданного ныне в виде Патента США №09/547357, Международных Заявок РСТ WO 01/44272, WO 01/44274 и WO 01/44271.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения cmc липопептида регулируется путем изменения температуры раствора, содержащего данный липопептид. Обычно cmc для липопептида увеличивается с повышением температуры данного раствора. Поэтому образование мицелл ускоряется при понижении температуры и замедляется при повышении температуры. Например, раствор, включающий липопептид может образовать мицеллы при 4°С, потому что при этой температуре cmc понижена, а концентрация липопептида выше данной cmc; однако, тот же липопептидный раствор может быть мономерным при 20°С, потому что cmc увеличилась при данной температуре, а концентрация липопептида оказалась ниже cmc. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления концентрация липопептида выше, чем cmc при первой температуре и ниже, чем cmc при другой, повышенной температуре. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липопептид представляет собой даптомицин или родственную даптомицину молекулу, такие как молекулы, описанные выше. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липопептид представляет собой даптомицин.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения возможность управлять образованием липопептидных мицелл путем использования разных температур, которые изменяют cmc, применяли для выделения очисткой данного липопептида. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липопептид представляет собой даптомицин или родственную молекулу, такую как вышеописанные молекулы. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липопептид представляет собой даптомицин. В другом варианте осуществления настоящего изобретения возможность управлять образованием липопептидной мицеллы путем изменения температуры используется для создания фармацевтических композиций, которые являются мицеллярными в определенных температурных условиях и мономерными в других температурных условиях. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данные фармацевтические композиции включают даптомицин или родственный даптомицину липопептид, который описан выше. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данные фармацевтические композиции включают даптомицин.
В следующем варианте осуществления настоящего изобретения добавление электролита используется для уменьшения cmc ионного липопептида. В предпочтительном варианте осуществления к раствору, включающему липопептид, добавляют соль, такую как NaCl для уменьшения отталкивания между заряженными группами в липопептидной мицелле. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой даптомицин или родственную даптомицину молекулу, которая описана выше. Например, пептидная составляющая даптомицина содержит три остатка аспарагиновой кислоты и остатки L-трео-3-метилглутаминовой кислоты (3-MG), которые все будут заряжаться при нейтральном рН. Таким образом, добавление электролита, такого как NaCl или эквивалентной соли, будет уменьшать cmc даптомицина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация данной соли составляет, по меньшей мере, 100 мМ. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения солевая концентрация равна 150-300 мМ соли. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данная соль представляет собой NaCl.
Уменьшение cmc наблюдается также при добавлении электролита к другим липопептидам, к таким молекулам, которые родственны даптомицину, и которые содержат остатки аспарагиновой кислоты, остатки 3-MG или иные заряженные остатки. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения к раствору добавляется соль для уменьшения cmc родственного даптомицину липопептида, такого как А54145, родственного даптомицину липопептида, раскрытого в Патенте США 4537717, 4482487, Re.32311, Re.32310, 5912226, переизданного в настоящее время в виде Патента США №09/547357, международных Заявок РСТ WO 01/44272, WO 01/44274 и WO 01/44271, или антибиотика А-21978 у которого боковая цепь н-декановой жирной кислоты даптомицина замещена боковой цепью н-октановой, н-нонановой, н-ундекановой, н-додекановой, н-тридекановой или н-тетрадекановой жирной кислоты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения концентрацию соли снижают для того, чтобы увеличить cmc ионного липопептида. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный ионный липопептид представляет собой даптомицин или родственный даптомицину липопептид, который описан выше.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения возможность управлять образованием мицелл липопептида путем изменения концентрации электролита, которая влияет на cmc, используется для очистки данного липопептида. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой даптомициновую или родственную даптомицину молекулу, такую например, которая описана выше. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой даптомицин. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения возможность управлять образованием липопептидной мицеллы с помощью концентрации электролита используется для создания фармацевтических композиций, которые являются мицеллярными при одних концентрациях электролита и мономерными при других концентрациях электролита. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данные фармацевтические композиции включают даптомицин или родственный даптомицину липопептид, который описан выше. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данная фармацевтическая композиция включает даптомицин.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения рН раствора, включающего липопептид, регулируют для оказания влияния на cmc данного липопептида. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой даптомицин или родственную даптомицину молекулу, которая описана выше. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой даптомицин. В одном варианте осуществления настоящего изобретения рН регулируется таким образом, чтобы концентрация липопептида превышала cmc при одном рН и была ниже cmc при другом рН. Например, для даптомицина, cmc при рН 4,0 в воде и температуре 20-25°С гораздо меньше, чем при рН 6,0 или 7,5. При рН 4,0 cmc в этих условиях составляет, приблизительно, 400 мкг/мл. См. Фиг.15. Кроме того, даптомицин "является мономерным даже при 150 мг/мл даптомицина при рН 6,5 (причем концентрация соли равна 150 мМ-300 мМ NaCl, а температура равна 4°С). Таким образом, для даптомицина, cmc при рН 4,0 меньше, чем в растворах с любым более высоким рН или более низким рН. Изменение в cmc при разных уровнях рН можно использовать также и для других заряженных липопептидов, в том числе, липопептидов, которые родственны даптомицину, как описано выше.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения возможность управлять образованием мицелл липопептида путем изменения рН, который влияет на cmc, используют для выделения очисткой данного липопептида. В более предпочтительном варианте осуществления, данный липопептид представляет собой даптомицин или родственную даптомицину молекулу, которая описана выше. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой даптомицин. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения возможность управлять образованием мицеллы с помощью рН используется для создания фармацевтических композиций, которые являются мицеллярными при одном рН и мономерными при другом рН. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данные фармацевтические композиции включают даптомицин или родственный даптомицину липопептид, как описано выше. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данные фармацевтические композиции включают даптомицин.
В другом аспекте настоящего изобретения липопептид может быть частью смешанной мицеллы. Смешанная мицелла представляет собой мицеллу, в которой липопептид образует мицеллу с одним или несколькими другими видами амфипатических молекул. Примеры таких амфипатических молекул включают, без ограничений, средне- и длинноцепочечные жирные кислоты, фосфоглицериды (фосфолипиды), сфингомиелин, гликолипиды и холестерин. В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения спирты со средней длиной цепи могут быть включены в данную мицеллу, где они уменьшают электростатическое отталкивание и стерическое препятствие, уменьшая тем самым cmc данного липопептида. В другом варианте осуществления настоящего изобретения добавление одного или нескольких видов амфипатических молекул может использоваться для изменения структуры данной мицеллы из сферической мицеллы (См. Фиг.14, часть а) в планарную липиднобислойную структуру (См. Фиг.14, часть b) или в липосомную структуру (См. Фиг.14, часть с). Вообще, смешанные мицеллы, включающие фосфолипиды и/или гликолипиды, будут побуждать сферические мицеллы превращаться в бислойную липидную структуру, которая служит в качестве проницаемых барьеров для ионов и большинства полярных молекул.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения смешанная мицелла может быть образована из двух или более разных липопептидов. Например, смешанная мицелла может быть образована из даптомицина и другого липопептида, такого как, например, А54145 или родственного даптомицину липопептида, что описано выше. В другом варианте осуществления настоящего изобретения смешанная мицелла  может включать липопептид вместе с одной или несколькими терапевтически полезными амфипатическими молекулами, такими как антибиотик, противовоспалительный или противогрибковый агент, которые известны рядовым специалистам в данной области техники. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липопептид представляет собой даптомицин или родственный даптомицину липопептид, такой как А54145, родственные даптомицину липопептиды, раскрытые выше, или антибиотик А-21978, в котором боковая цепь н-декановой жирной кислоты даптомицина замещена боковой цепью н-октановой, н-нонановой, н-ундекановой, н-додекановой, н-тридекановой или н-тетрадекановой жирной кислоты. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой даптомицин.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения мицелла, смешанная или включающая единственный тип липопептидной молекулы, включает липопептид, который является терапевтически полезным. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой антибиотик. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой даптомицин. Даптомицин образует мицеллы в воде, приблизительно, 5,4 нм (54Å), при концентрации 1 мг/мл и рН приблизительно 4,0. См. Фиг.16.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения мицеллы включают один или несколько различных видов терапевтических веществ. В одном варианте осуществления настоящего изобретения терапевтическое вещество может быть смешано с данным липопептидом в растворе таким образом, что мицелла, образуемая из данного липопептида и данного терапевтического вещества, захватывается гидрофобной частью. В другом варианте осуществления настоящего изобретения терапевтическое вещество смешивается с липопептидом и с одной или с несколькими другими амфипатическими молекулами так, чтобы смешанная мицелла образовалась из данного липопептида и других амфипатических молекул, а данное терапевтическое вещество обнаружилось в гидрофобной части. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данное терапевтическое вещество представляет собой антибиотик, противовоспалительный или противогрибковый агент. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данное терапевтическое вещество представляет собой антибиотик или противогрибковый агент, раскрытый выше. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данное терапевтическое вещество растворяется в гидрофобном окружении и не растворяется в водном растворе.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные липопептиды могут образоваться в липосомы, которые представляют собой везикулы, в которых сферический липидный бислой окружает водную часть. См. Фиг.14, часть с. Липосомы обладают преимуществом для терапевтического использования, потому что они легко сливаются с плазматической мембраной, и могут также использоваться для захвата веществ их внутренним водным компартментом. Данное вещество может представлять собой вещество, которое растворяется лишь в водных растворах. В одном варианте осуществления настоящего изобретения раствор, включающий липопептид и другую амфипатическую молекулу, можно подвергнуть ультразвуковой обработке для получения липосом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения для получения липосом можно подвергнуть ультразвуковой обработке один лишь данный липопептид. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липосома включает даптомицин или родственный даптомицину липопептид, такой как А54145, липопептид, раскрытый в Патентах США 4537717, 4482487, Re.32311, Re.32310, 5912226, переизданный в настоящее время в виде Патента США 09/547357, в Международных Заявках РСТ WO 01/44272, WO 01/44274, WO 01/44271, или антибиотик А-21978, в котором боковая цепь н-декановой жирной кислоты даптомицина замещается боковой цепью н-октановой, н-нонановой, н-ундекановой, н-додекановой, н-тридекановой или н-тетрадекановой жирной кислоты. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой даптомицин.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липосомы включают одно или несколько терапевтических веществ в их внутренние водные компартменты. В предпочтительном варианте осуществления данное терапевтическое вещество представляет собой антибиотик, противовоспалительный или противогрибковый агент. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данное терапевтическое вещество представляет собой антибиотик или противогрибковый агент, раскрытый выше. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данное терапевтическое вещество растворяется в водном растворе. В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция включает данную липосому.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция включает липопептидные конструкции мицеллярного типа, содержащие терапевтическое вещество. Липопептидные конструкции мицеллярного типа могут представлять собой сферические мицеллы, смешанные мицеллы или липосомы. Фармацевтические композиции, включающие липопептидные мицеллы, могут минимизировать локальное раздражение после инъекции или при внутривенном введении. В одном варианте осуществления настоящего изобретения данная фармацевтическая композиция включает соль, буфер для поддержания определенного рН и мицеллы. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения данная фармацевтическая композиция включает один или несколько агентов, которые стабилизируют мицеллы и/или которые стабилизируют липопептид или иное терапевтическое вещество. В одном варианте осуществления настоящего изобретения данная фармацевтическая композиция включает также одно или несколько терапевтических веществ. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данное терапевтическое вещество представляет собой антибиотик, противовоспалительный или противогрибковый агент. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данное терапевтическое вещество представляет собой антибиотик или противогрибковый агент, раскрытый выше. Данное терапевтическое вещество может быть добавлено к терапевтическому веществу, которое уже ввели в данную мицеллу, или может представлять собой терапевтический агент, который уже ввели в данную мицеллу.
Фармацевтическая композиция может быть высушена или лиофилизирована и в этом случае мицеллы образуются в любом водном растворе, таком как вода или буфер, добавляемый к данной фармацевтической композиции. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данная фармацевтическая композиция лиофилизована и содержит физиологическую концентрацию соли при воссоздании влагосодержания, и буфер, который поддерживает рН, при котором мицеллы спонтанно образуются при комнатной температуре после добавления стерильной воды или другого буфера. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данная фармацевтическая композиция включает даптомицин или родственный липопептид, такой как А54145, родственные даптомицину липопептиды, раскрытые выше, или антибиотик А-21978, в котором боковая цепь н-декановой жирной кислоты даптомицина замещается боковой цепью н-октановой, н-нонановой, н-ундекановой, н-додекановой, н-тридекановой или н-тетрадекановой жирной кислоты. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липопептид представляет собой даптомицин. В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция является водной. Это предпочтительно при использовании липосом. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция включает стабилизирующий агент для липосом.
В другом аспекте настоящего изобретения выделяют и/или очищают раствор мицелл. В одном варианте осуществления настоящего изобретения мицеллы выделяют с помощью ультрафильтрации с наименьшими заместителями. Выбор ультрафильтрационной мембраны определяется размером выделяемой мицеллы. Как правило, мембрана для NMW с 10000 или 30000 будет достаточной для удержания мицелл и, кроме того, позволит наименьшим заместителям, таким как контаминанты, проходить через нее. В другом варианте осуществления настоящего изобретения мицеллы могут быть выделены и/или очищены с помощью диализа, центрифугированием в градиенте плотности или эксклюзионной хроматографией. Данные методы хорошо известны в данной области техники. В одном варианте осуществления настоящего изобретения мицеллы характеризуются более чем 30% чистоты, где чистоту измеряют в виде массы мицелл, сравнимой с массой мономерных форм данного липопептида или других молекул. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полученные мицеллы характеризуются более чем 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% чистоты.
В другом аспекте настоящего изобретения возможность образовать липопептидные мицеллы, а затем диссоциировать их путем изменения температуры, рН, концентрации электролита и/или концентрации липопептида, обеспечивает создание способа очистки липопептидов. В одном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ включает очистку липопептидов от низкомолекулярных контаминантов путем обработки липопептидов в условиях, в которых данные липопептиды образуют мицеллы, и последующего отделения полученных мицелл от данных контаминантов с помощью методики разделения по размеру, такой как ультрафильтрация или эксклюзионная хроматография. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ включает концентрирование липопептидов путем обработки липопептидов в условиях, в которых данные липопептиды образуют мицеллы, и последующего их концентрирования с помощью методики разделения по размеру. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ включает и очистку, и концентрирование в виде одной стадии.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения данный способ включает очистку липопептида от высокомолекулярных контаминантов, в том числе  пирогенов (например, липополисахаридов), в результате обработки данного липопептида в условиях, при которых указанный липопептид является мономерным, и последующего отделения полученного раствора мономерного липопептида от высокомолекулярных контаминантов с помощью методики разделения по размеру. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения методика разделения по размеру представляет собой ультрафильтрацию, как указано выше. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный липопептид представляет собой даптомицин или родственный даптомицину липопептид, такой как А54145, родственные даптомицину липопептиды, раскрытые выше, или антибиотик А-21978, в котором боковая цепь н-декановой жирной кислоты даптомицина замещена боковой цепью н-октановой, н-нонановой, н-ундекановой, н-додекановой, н-тридекановой или н-тетрадекановой жирной кислоты. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный липопептид представляет собой даптомицин.
Предпочтительный вариант осуществления хроматографического способа с использованием мицелл для выделения очисткой даптомицина, описан ниже:
Streptomyces roseosporus ферментируют в питательной среде с н-декановой кислотой, как описано выше. После ферментирования полученный надклеточный раствор осветляют, как описано выше.
Затем этот осветленный препарат наносят на анионообменную смолу, такую как FP-DA 13, как описано выше. Даптомицин элюируют из данной колонки напором одного-трех объемов солевого буфера, содержащего 300-500 мМ NaCl.
Элюированный препарат даптомицина доводят до рН 2,5-5,0 с использованием кислоты. В предпочтительном варианте осуществления данная кислота представляет собой разбавленную фосфорную кислоту. При рН 2,5-4,7, 300-500 мМ NaCl и температуре 2-15°С этот даптомицин образует мицеллу.
Полученный препарат даптомицина фильтруют на ультрафильтрационной мембране для NMW с 10000-30000. Во время ультрафильтрации препарат даптомицина промывают буфером, содержащим 30 MM ацетата натрия рН 3,5, и при температурах выше 15°С. Начальная концентрация соли, равная 300 мМ NaCl, обусловлена условиями элюции, однако эта концентрация соли уменьшается при непрерывной промывке. Так как даптомицин находится в мицеллярной форме, он удерживается на фильтре, тогда как примеси менее чем 10000-30000 (в зависимости от используемого фильтра), проходят через этот фильтр. Данный препарат даптомицина получают с чистотой, приблизительно, 85-90%.
В качестве необязательной стадии препарат даптомицина можно разбавить и его рН возрастет до 6,5 с тем, чтобы перевести даптомицин в мономерное состояние. Затем препарат даптомицина пропускают через ультрафильтрационную мембрану для NMW с 10000. Данная необязательная стадия существенно уменьшает пирогенное содержание.
Способы анализа чистоты даптомицина
Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения представляются аналитические способы измерения чистоты даптомицина.
Раньше в данной области техники многие контаминанты, которые выделяли очисткой вместе с даптомицином, были не определены или не идентифицировались из-за ограниченной возможности аналитических способов и доступного оборудования визуализировать и измерять примеси. См., например. Патент США 4874843 и Kirsch и соавт. С появлением более чувствительных аналитических систем и методик HPLC открылась возможность обнаружения ряда контаминантов, которые присутствуют в партиях даптомицина, получаемых с помощью прежних в данной области техники способов. Методы HPLC с более высоким разрешением показывают, что даптомицин, который выделяли очисткой прежними в данной области техники способами, контаминирован уже идентифицированными примесями, такими как ангидро-даптомицин и β-изомер, а также другими, прежде неизвестными контаминантами, которые выделяются очисткой вместе с даптомицином (и коэлюируются в уже созданных детекционных условиях HPLC) прежними способами в данной области техники. Идентификация этих контаминантов позволяет теперь создавать способы, предназначенные для элиминации этих контаминантов.
Как указано выше, ангидро-даптомицин и β-изомер уже описаны в качестве примесей, которые неизменно и постоянно встречаются во время получения даптомицина. Применяя описанные здесь HPLC-анализы, удалось охарактеризовать, приблизительно, двенадцать примесей, образующихся при получении даптомицина, причем некоторые из них не были раньше идентифицированы. Эти примеси не удаляются после очистки способом, раскрытым в Патенте США 4874843. Идентифицировали, по меньшей мере, десять из этих примесей (см., например. Фиг.2-11). Более того, по меньшей мере, шесть из этих соединений не являются прямым следствием реакции, в которой из даптомицина образуются ангидро-даптомицин и β-изомер, а скорее представляют собой соединения, полученные в иных, неродственных процессах, которые проистекают во время ферментации или очистки даптомицина. Способ настоящего изобретения, описанный ниже, также существенно снижает уровни ряда этих примесей (см. Примеры).
Для измерения количества других соединений при получении даптомицина может использоваться любой способ, известный в данной области техники. Способы идентификации контаминантов даптомицина включают, без ограничения, масс-спектроскопию, инфракрасную спектроскопию, капиллярный электрофорез и ядерную магнитную резонансную спектроскопию. Предпочтительным способом количественного измерения других соединений при получении даптомицина является HPLC.
В настоящем изобретении использовали два способа по измерению даптомициновых примесей. Первый способ обладает несколько меньшим разрешением, чем второй способ. В обоих способах используется система Shimadzu или HP HPLC с РЕ Nelson's Turbochrom Software Version 4.1. Разрешение "первого" способа суммировано в Таблице 1, а разрешение "второго" способа суммировано в Таблице 2:
Таблица 1
1. Система подачи растворителя:
Режим: изократическое прокачивание
Скорость потока: 1,5 мл/мин.
Рабочее время: 30 минут
2. Растворитель А: 34% ацетонитрила в 0,5% NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> при рН 4,5
Растворитель В: 20% ацетонитрила в 0,5% NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> при рН 4,5
Базовое условие заключается в удержании даптомицина около 15,0±0,5 минут. Растворитель В может использоваться вместе с растворителем А для корректировки условий подвижной фазы HPLC, чтобы достигнуть нужного времени удерживания.
3. Охлаждаемая автоматическая пипетка: 5(4-6)°С
4. Вводимый объем: 5 мкл 75 мкл (обычно 20 мкл)
5. Колонка: IB-SIL (Phenomenex), С-8, 5µ, 4,6 мм × 250 мм (или эквивалентная)
6. Предколонка: IB-SIL (Phenomenex), С-8, 5µ, 4,6 мм × 30 мм (или эквивалентная)
7. Длина волны детектирования: 214 нм
8. Температура колонки: температура окружающего воздуха
9. Интеграция: компьютерная система или интегратор, способный измерять площадь пика.
Таблица 2
1. Система подачи растворителя:
Режим: изократическое прокачивание
Скорость потока: 1,5 мл/мин.
Рабочее время: 75 минут
2. Растворитель А: 20% ацетонитрила в 0,45% NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> при рН 3,25
Растворитель В: 50% ацетонитрила в 0,45% NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> при рН 3,25
Базовым условием для удержания даптомицина в течение около 36,0±1,5 минут является использование, приблизительно, 35% ацетонитрила в 0,45% NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> при рН 3,25 (50% растворителя В); вместе с тем, данное соотношение растворителя используется для корректировки состава подвижной фазы HPLC, чтобы получить требуемое время удерживания
3. Охлаждаемая автоматическая пипетка: 5(4-6)°С
4. Вводимый объем: 5 мкл 75 мкл (обычно 20 мкл)
5. Колонка: IB-SIL (Phenomenex), С-8, 5µ, 4,6 мм × 250 мм (или эквивалентная)
6. Предколонка: IB-SIL (Phenomenex), С-8, 5µ, 4,6 мм × 30 мм (или эквивалентная)
7. Длина волны детектирования: 214 нм
8. Температура колонки: 25(22-28)°С
9. Интеграция: компьютерная система или интегратор, способный измерять площадь пика.
Очищенные липопептиды, фармацевтические композиции и способы их использования
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в представлении очищенных липопептидов, их солей, сложных эфиров и защищенных форм, а также фармацевтических композиций, включающих очищенные липопептиды или их соли. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения такой липопептид представляет собой даптомицин или родственный даптомицину липопептид, что описано выше. Дополнительная цель настоящего изобретения состоит в представлении фармацевтических композиций, включающих липопептидные конструкции мицеллярного типа. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные липопептидные мицеллы представляют собой мицеллы, включающие даптомицин либо один или несколько родственных даптомицину липопептидов. Все ссылки на приведенные здесь липопептиды относятся не только ко всем липопептидным конструкциям мицеллярного типа, но и, в частности, предполагают даптомицин или родственный липопептид, такой как А54145, родственные даптомицину липопептиды, раскрытые выше, или антибиотик А-21978, в котором боковая цепь н-декановой жирной кислоты даптомицина замещена боковой цепью н-октановой, н-ундекановой, н-додекановой, н-тридекановой или н-тетрадекановой жирной кислоты. Кроме того, все приведенные здесь ссылки на липопептидные конструкции мицеллярного типа подразумевают, в частности, сферические или смешанные мицеллы, а также липосомы, которые рассмотрены выше.
Очищенные липопептиды, их фармацевтически приемлемые соли или липопептидные мицеллы могут быть созданы для перорального, внутривенного, внутримышечного, подкожного, аэрозольного, местного или парентерального введения для терапевтического или профилактического лечения заболеваний, в частности, бактериальных инфекций. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения очищенный липопептид представляет собой очищенный даптомицин или родственный даптомицину липопептид. Приводимая здесь ссылка на "очищенный даптомицин", "очищенный родственный даптомицину липопептид" или "очищенный липопептид" включает их фармацевтически приемлемые соли. Даптомицин, родственный даптомицину липопептид или другие липопептидные мицеллы можно смешивать с любым фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем, который совместим с даптомицином или с представляющим интерес липопептидом. См., например, Handbook of Pharmaceutical Additives: An International Guide to More than 6000 Products by Trade Name, Chemical, Function, and Manufacturer, Ashgate Publishing Co., eds., M. Ash and I. Ash, 1996; The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, ed. S. Budavari, annual; Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA; Martindale: The Complete Drug Reference, ed. K.Parfitt, 1999; и Goodman and Gilman's, The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, NY, ed. L.S.Goodman et al.; содержание которых включено здесь путем ссылки, для общего описания способов введения различных противомикробных агентов при лечении человека. Очищенный даптомицин, родственный даптомицину липопептид или другие липопептидные мицеллы настоящего изобретения могут быть смешаны с традиционными фармацевтическими носителями и наполнителями и использоваться в виде таблеток, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток, кремов и т.п. Даптомицин, родственный даптомицину липопептид или иные липопептидные мицеллы могут быть смешаны с другими терапевтическими агентами и антибиотиками, которые рассматриваются здесь. Композиция, включающая соединение настоящего изобретения, должна содержать от около 0,1 до около 90 масс.% активного соединения, но, в общем, от около 10 до около 30%.
Композиции настоящего изобретения могут быть доставлены с использованием контролируемых систем доставки (например, капсул) или систем доставки с длительным высвобождением (например, биораспадающиеся связующие материалы). Типичные системы доставки с длительным высвобождением для доставки лекарства, которые пригодны для введения композиций настоящего изобретения, описаны в Патентах США 4452775 (Kent), 5239660 (Leonard), 3854480 (Zaffaroni).
Указанные композиции могут содержать обычные носители и наполнители, такие как кукурузный крахмал или желатин, лактозу, сахарозу, микрокристаллическую целлюлозу, каолин, маннит, дикальцийфосфат, хлорид натрия и альгиновую кислоту. Эти композиции могут содержать кроскармеллозу натрия, микрокристалиическую целлюлозу, кукурузный крахмал, гликолят натрия крахмала и альгиновую кислоту.
Связывающие вещества для приготовления таблеток могут включать аравийскую камедь, метилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон (Povidone), гидроксипропилметилцеллюлозу, сахарозу, крахмал и этилцеллюлозу.
Смазывающие вещества, которые могут использоваться, включают стеарат магния или стеараты других металлов, стеариновую кислоту, силиконовую жидкость, тальк, воски, масла и коллоидную двуокись кремния.
Могут также использоваться ароматизирующие агенты, такие как перечная мята, винтегриновое масло, вишневый ароматизатор или что-либо подобное. По желанию можно также добавить красящий агент для придания дозированной форме более эстетичного внешнего вида или помогающего идентифицировать данное изделие.
Для орального использования особенно полезны твердые рецептурные смеси, такие как таблетки и капсулы. Могут быть также разработаны препараты с замедленным высвобождением или с энтеральным покрытием. Для педиатрического и гериатрического применения особенно подходят суспензии, сиропы и жевательные таблетки. Для орального введения указанные фармацевтические композиции получают, например, в форме таблетки, капсулы, суспензии или жидкости. Данную фармацевтическую композицию предпочтительно создают в виде дозированной единицы, содержащей терапевтически эффективное количество активного ингредиента. Примерами таких дозированных единиц являются таблетки и капсулы. Для терапевтических целей применяют таблетки и капсулы, которые могут содержать, помимо активного ингредиента, традиционные носители, такие как связывающие агенты, например, аравийскую камедь, желатин, поливинилпирролидон, сорбит, или трагакант; наполнители, например, кальцийфосфат, глицин, лактозу, кукурузный крахмал, сорбит, или сахарозу; смазывающие вещества, например, стеарат магния, полиэтиленгликоль, двуокись кремния, или тальк; дезинтегранты, например, картофельный крахмал, ароматизаторы или красители, или же приемлемые увлажнители. Жидкие оральные препараты, как правило, находящиеся в виде водного или масляного растворов, суспензий, эмульсий, сиропов или эликсиров, могут содержать традиционные добавки, такие как суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, неводные агенты, консерванты, красящие агенты и ароматизирующие агенты. Жидкие оральные препараты могут включать липопептидные мицеллы или мономерные формы данного липопептида. Примеры добавок для жидких препаратов включают аравийскую камедь, миндальное масло, этиловый спирт, ректифицированное кокосовое масло, желатин, глюкозный сироп, глицерин, гидрогенизированные пищевые масла, лецитин, метилцеллюлозу, метил- или пропил-пара-гидроксибензоат, пропиленгликоль, сорбит или сорбиновую кислоту.
В случае внутривенного (IV) использования водорастворимую форму даптомицина, родственный даптомицину липопептид или иной липопептид можно растворять в любой жидкости, обычно используемой для внутривенного введения или для введения путем инфузии. В случае липопептидных мицелл липопептид растворяют для внутривенного применения в условиях, в которых данный липопептид присутствует в концентрации выше его cmc. Рядовой специалист в данной области техники может варьировать рН, температуру или концентрацию соли с учетом указаний настоящего изобретения по получению внутривенного раствора, включающего липопептидные мицеллы. Кроме того, он может подвергнуть данный раствор липопептида ультразвуковой обработке с целью получения липопептидных липосом. Внутривенные композиции могут включать носители, наполнители или стабилизаторы, в том числе, без ограничения, кальций, сывороточный альбумин человека, цитрат, ацетат, хлорид кальция, карбонат и другие соли. Жидкости для внутривенного введения включают, без ограничения, физиологический раствор или раствор Рингера. Даптомицин или родственный даптомицину липопептид могут быть помещены в шприцы, канюли, катетеры и капельницы.
Композиции для парентерального введения могут находиться в виде водных или неводных изотонических стерильных инъекционных растворов или суспензий. Эти растворы или суспензии могут быть получены из стерильных порошков или гранул, содержащих один или несколько носителей, показанных для использования в рецептурах для орального введения. Липопептидные мицеллы подходят, в частности, для парентерального введения. Данные соединения можно растворить в полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле, кукурузном масле, бензиловом спирте, хлориде натрия, и/или в различных буферах. Что касается внутримышечных препаратов, стерильную композицию липопептидного соединения или подходящую растворимую соль данного соединения, например, хлористоводородную соль, можно растворить и ввести в фармацевтический разбавитель, такой как вода для инъекций (WFI), физиологический раствор или 5%-я глюкоза.
Липопетидные мицеллы особенно подходят для парентерального введения потому, что они не вызывают местного раздражения в месте инъекции. Не вдаваясь в какое-либо теоретическое рассуждение, можно предположить, что липопептидные мицеллы будут в меньшей степени вызывать местное раздражение, чем мономерные липопептиды, потому что липидные хвосты, которые могут вызывать раздражение после инъекции, изолированы внутри мицеллы, тогда как пептидное ядро, которое, по-видимому, в меньшей степени вызывает локальное раздражение, чем липидный хвост, будет обращено в данную ткань. Липопептидные мицеллы могут быть получены для внутримышечного и парентерального препаратов, следуя указаниям настоящего изобретения по получению препарата, включающего липопептидные мицеллы. Кроме того, данный липопептидный раствор можно подвергнуть ультразвуковой обработке с целью получения липопептидных липосом. Можно также изготовить подходящую нерастворимую форму данного соединения и ввести его в виде суспензии на водной основе или на фармацевтически приемлемой масляной основе, например, сложноэфирной или длинноцепочечной жирной кислоте, такой как этилолеат.
Инъецируемые формы-депо можно создать путем образования микроинкапсулированных матриц данного соединения в биодеградируемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарственного средства и полимера, а также природы конкретного используемого полимера, можно контролировать скорость высвобождения лекарственного средства. Примеры других биодеградируемых полимеров включают сложные полиортоэфиры и полиангидриды. Инъецируемые композиции-депо получают также в результате включения данного лекарственного средства в микроэмульсии, которые совместимы с тканями организма.
Для местного применения соединения и мицеллы настоящего изобретения могут быть также получены в подходящих формах для нанесения на кожу, или на слизистые мембраны носа и горла, но могут быть получены и в форме кремов, мазей, жидких спреев или ингаляционных препаратов, лепешек или в вязких формах, наносимых на горло. Кроме того, такие местные композиции могут включать химические соединения, такие как диметилсульфоксид (DMSO), которые облегчают поверхностное проникновение данного активного ингредиента. Для местных препаратов стерильная композиция даптомицина, родственного даптомицину липопептида, их соответствующие солевые формы, или липопептидная мицелла может быть введена в крем, мазь, спрей или аппликатор для местного наложения. Местные препараты могут также находиться в форме повязок, которые были импрегнированы очищенным даптомицином, родственным даптомицину липопептидом или липопептидной мицельной композицией.
Для применения в глаза или в уши соединения настоящего изобретения могут быть представлены в жидкой или полужидкой форме, изготовленных на гидрофобной или гидрофильной основе в виде мазей, кремов, лосьонов, вязких форм или порошков.
Для ректального введения соединения настоящего изобретения можно вводить в форме суппозиториев, смешанных с традиционными носителями, такими как кокосовое масло, воск или другой глицерид.
Для аэрозольных препаратов стерильную композицию очищенного даптомицина или родственного даптомицину липопептида или данного соединения в форме соли можно использовать в ингаляторах, таких как дозируемые ингаляторы и распылители. Стерильная композиция липопептидной мицеллы может также использоваться в аэрозольном препарате. Аэрозольные формы могут быть особенно полезны для лечения респираторных инфекций, таких как пневмония и синусные инфекции.
Альтернативно, соединения настоящего изобретения могут находиться в порошкообразной форме для последующего восстановления в соответствующем фармацевтически приемлемом носителе в момент доставки. Если порошковая форма восстанавливается в виде липопептидных мицелл, такой порошок может включать буфер и/или соль, так что воссоздание с помощью определенного количества стерильной воды или физиологического раствора будет заставлять липопептид образовывать мицеллы. Альтернативно, к порошковой форме могут прилагаться инструкции относительно количества и вида фармацевтически приемлемого носителя, используемого для восстановления данного липопептида с целью получения мицелл. В другом варианте осуществления настоящего изобретения соединение в единичной дозированной форме может представлять собой раствор данного соединения, его соли, или липопептидной мицеллы в соответствующем разбавителе в стерильных, герметично запаянных ампулах. Концентрация соединения в дозированной единице может варьировать, например, от около 1 процента до около 50 процентов, в зависимости от используемого соединения и его растворимости, а также требуемой лечебной дозы. Если композиции содержат дозированные единицы, то каждая дозированная единица предпочтительно включает от 50 до 500 мг данного активного вещества. Для лечения взрослого человека используемая доза предпочтительно колеблется от 100 мг до 3 г в день, в зависимости от способа и частоты введения.
В дополнительном аспекте в настоящем изобретении представляется способ лечения инфекций у человека и других животных, в частности тех из них, которые вызываются грамположительными бактериями. Используемый термин "лечение" означает и предупреждение инфицирования, и контроль за установленной инфекцией после того, как животное-хозяин стало инфицированным. Установленная инфекция может представлять собой инфекцию в острой или хронической форме. Данный способ включает введение человеку или иному животному эффективной дозы соединения настоящего изобретения. В большинстве случаев эффективная доза находится между около 0,1 и около 25 мг/кг очищенного даптомицина, родственного даптомицину липопептида или его фармацевтически приемлемой соли. Даптомицин или родственный даптомицину липопептид может быть мономерным или может быть частью липопептидной мицеллы. Предпочтительная доза составляет от около 1 до около 25 мг/кг очищенного даптомицина или родственного даптомицину липопептида или его фармацевтически приемлемой соли. Более предпочтительная доза составляет от около 1 до 12 мг/кг очищенного даптомицина или его фармацевтически приемлемой соли.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения представляется способ лечения инфекции, в частности, той, которая вызывается у пациента грамположительными бактериями, терапевтически эффективным количеством даптомицина или другого антибактериального липопептида. Даптомицин или антибактериальный липопептид может быть мономерным или может быть липопептидной мицеллой. Типичные способы доставки антибактериального агента описаны в Патенте США 5041567, (Rogers) и в патентной заявке РСТ ЕР94/02552 (публикация WO 95/05384), содержания которых включено в настоящее описание полностью путем ссылки. Используемая здесь фраза "терапевтически эффективное количество" означает количество даптомицина или антибактериального липопептида в соответствии с настоящим изобретением, которое предотвращает начало, частично снимает симптомы, или останавливает развитие бактериальной инфекции. Термин "лечение" подразумевает введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения настоящего изобретения для предупреждения возникновения инфекции и для контроля или ликвидации инфекции. Термин “субъект” или ""пациент", используемый здесь, подразумевает млекопитающее, растительную или клеточную культуру. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения субъект (пациент) представляет собой человека или другое животное, нуждающегося в лечении липопептидным соединением.
Липопептидное антибиотическое соединение можно назначать в виде одной ежедневной дозы или нескольких доз в течение дня. Режим лечения может требовать введения в течение продолжительного периода времени, например, в течение нескольких дней или в течение двух-четырех недель. Количество вводимой дозы или суммарное вводимое количество зависит от таких факторов, как природа и тяжесть данной инфекции, возраст и общее состояние данного пациента, толерантность пациента к данному антибиотику и от микроорганизма или микроорганизмов, вовлеченных в данную инфекцию. Способ введения раскрыт в Международной Заявке РСТ WO 00/18419.
Способы настоящего изобретения включают введение очищенного даптомицина или другого липопептидного антибиотика, или его фармацевтических композиций пациенту, нуждающемуся в нем, в количестве, которое является эффективным для уменьшения или ликвидации грамположительной бактериальной инфекции. Даптомицин или липопептидный антибиотик может быть либо мономерным либо может быть липопептидной мицеллой. Данный антибиотик может быть введен орально, парентерально, путем ингаляции, местно, ректально, назально, трансбуккально, вагинально, или с помощью имплантируемого резервуара, внешнего насоса или катетера. Данный антибиотик можно изготовить для офтальмологического или аэрозольного использования. Очищенный даптомицин, липопептидный антибиотик, или их фармацевтические композиции можно непосредственно инъецировать или ввести в абсцесс, полость или в сустав. Парентеральное введение включает подкожную, внутривенную, внутримышечную, интраартикулярную, внутрисуставную, цистернальную, подоболочечную, внутрипеченочную, внутрираневую и интракраниальную инъекцию или инфузию.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин или другой липопептид вводят внутривенно, подкожно или орально.
Способ настоящего изобретения может использоваться для лечения пациента с бактериальной инфекцией, у которого данная инфекция вызвана или обострена любым видом грамположительных бактерий. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения очищенный даптомицин, родственный даптомицину липопептид, другой липопептид или их фармацевтические композиции вводят пациенту в соответствии со способами настоящего изобретения. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данная бактериальная инфекция может быть вызвана или обострена бактериями, включающими, но не ограничивающимися, метициллин-чувствительные и метициллин-резистентные стафилококки (в том числе Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus saprophyticus, и коагулаза-негативные стафилококки), промежуточно-чувствительные к гликопептиду Staphylococcus aureus (GISA), пенициллин-чувствительные и пенициллин-резистентные стрептококки (в том числе, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus lactis, Streptococcus sangius, и Streptococcus группы С, Стрептококки группы G и стрептококки viridans), энтерококки (в том числе ванкомицин-чуствительные и ванкомицин-резистентные штаммы, такие как Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium), Clostridium difficile, Clostridium clostridiiforme, Clostridium innocuum, Clostridium perfringens, Clostridium ramosum, Haemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Corynebacterium jeikeium, Bifidobacterium spp., Eubacterium aerofaciens, Eubacterium lentum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactococcus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus asaccarolyticus, Peptostreptococcus magnus, Peptostreptococcus micros, Peptostreptococcus prevotii, Peptostreptococcus productus, Propionibacterium acnes, и Actinomyces spp.
Антибактериальная активность даптомицина против классически "резистентных" штаммов сравнима с антибактериальной активностью против классически "чувствительных" штаммов в экспериментах in vitro. Кроме того, значение минимальной ингибирующей концентрации (MIC) для даптомицина против чувствительных штаммов обычно в 4 раза ниже, чем для ванкомицина. Поэтому, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения очищенный даптомицин, родственный даптомицину липопептидный антибиотик, или их фармацевтические композиции, вводили, в соответствии со способами настоящего изобретения, пациенту, который обнаруживает бактериальную инфекцию, резистентную к другим антибиотикам, в том числе и ванкомицину. Кроме того, в отличие от гликопептидных антибиотиков, даптомицин проявляет быструю, зависимую от концентрации бактерицидную активность против грамположительных организмов. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения очищенный даптомицин, липопептидный антибиотик, или их фармацевтические композиции вводят, в соответствии со способами настоящего изобретения, пациенту, нуждающемуся в быстродействующем действии антибиотического лечения.
Способ настоящего изобретения может использоваться в отношении грамположительной бактериальной инфекции любого органа или ткани данного организма. Эти органы или ткань включают, не ограничиваясь, скелетную мышцу, кожу, кровоток, почки, сердце, легкие и скелет. Способ настоящего изобретения может использоваться для лечения, не ограничиваясь, инфекций кожи и мягкой ткани, бактериемии и инфекций мочевого пути. Способ настоящего изобретения может использоваться для лечения группы населения, среди которой распространены инфекции дыхательных путей, в том числе, не ограничиваясь, воспаление среднего уха, синусит, хронический бронхит и пневмония, в том числе и пневмония, вызванная резистентными к лекарствам Streptococcus pneumoniae или Haemophilus influenzae. Способ настоящего изобретения может также использоваться для лечения смешанных инфекций, которые включают различные типы грамположительных бактерий, или которые включают и грамположительные, и грамотрицательные бактерии, в том числе, аэробные, капрофильные или анаэробные бактерии. Эти виды инфекций включают внутрибрюшные инфекции и акушерские/гинекологические инфекции. Способы настоящего изобретения могут использоваться в терапии для снижения уровня внутрибольничных инфекций, в том числе, не ограничиваясь, пневмонии, внутрибрюшного сепсиса, инфекций кожи и мягкой ткани, а также инфекций скелета и суставов. Способ настоящего изобретения может также использоваться для лечения инфекции, включающей, не ограничиваясь, эндокардит, нефрит, септический артрит и остеомиелит. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения любое из вышеуказанных заболеваний можно лечить с использованием очищенного даптомицина, липопептидного антибиотика, или их фармацевтических композиций. Кроме того, данные заболевания можно лечить с использованием даптомицина или липопептидного антибиотика в любой форме, мономерной или мицеллярной.
Даптомицин, родственный даптомицину липопептид или иной липопептид можно также вводить в пищу или в корм пациента или животного. При введении в виде части суммарного потребления с пищей, количество даптомицина или другого липопептида может составлять меньше 1 масс.% пищи и предпочтительно не более 0,5 масс.%. Диета для животных может быть обычным кормом, в который можно добавлять даптомицин или липопептид или он может быть добавлен в виде премикса.
Способ настоящего изобретения можно также использовать и тогда, когда одновременно вводят один или несколько противогрибковых агентов и/или один или несколько антибиотиков, отличающихся от даптомицина или другого липопептидного антибиотика. Совместное введение противогрибкового агента и антибиотика, отличающегося от даптомицина и другого липопептидного антибиотика, может быть полезным при смешанных инфекциях, которые вызваны разными видами грамположительных бактерий, которые вызваны грамположительными и грамотрицательными бактериями, или которые вызваны и бактериями и грибами. Более того, даптомицин или иной липопептидный антибиотик может улучшить характеристику токсичности одного или нескольких совместно вводимых антибиотиков. Было показано, что введение даптомицина и аминогликозида может уменьшать интенсивность токсического действия аминогликозида на почки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антибиотик и/или противогрибковый агент может быть введен одновременно с выделенным очисткой даптомицином, другим липопептидным антибиотиком или в фармацевтических композициях, включающих очищенный даптомицин или другой липопептидный антибиотик.
Совместное введение другого терапевтического агента с даптомицином или с иным липопептидным антибиотиком можно осуществить с использованием даптомицина или липопептидного антибиотика в мономерной или в мицеллярной форме. Как указано выше, сферические липопептидные мицеллы могут быть использованы для того, чтобы помочь солюбилизировать агенты, которые проявляют низкую растворимость в воде. Кроме того, липопептидные липосомы могут использоваться для включения агентов, растворимых в водной среде, внутрь везикул липосом. Следуя указаниям данного описания, рядовой специалист в данной области техники способен создать липопептидные мицеллы, включающие терапевтические агенты, такие как противовоспалительные агенты, противогрибковые агенты и другие антибиотики.
Антибактериальные агенты и их виды, которые могут быть одновременно введены вместе с даптомицином или иными липопептидными антибиотиками, включают, но не ограничены, пенициллины и родственные лекарственные средства, карбапенемы, цефалоспорины и родственные лекарственные средства, аминогликозиды, бацитрацин, грамицидин, мупироцин, хлорамфеникол, тиамфеникол, фузидат натрия, линкомицин, клиндамицин, макролиды, новобиоцин, полимиксины, рифамицины, спектиномицин, тетрациклины, ванкомицин, тейкопланин, стрептограмины, антифолатные агенты, в том числе, сульфонамиды, триметоприм и его сочетания, а также пириметамин, синтетические антибактериальные средства, в том числе нитрофураны, метенаминманделат и метенамингиппурат, нитроимидазолы, хинолоны, фторхинолоны, изониазид, этамбутол, пиразинамид, пара-аминосалициловую кислоту (PAS), циклосерин, капреомицин, этионамид, протионамид, тиацетазон, биомицин, эвеминомицин, гликопептид, глицилцилклин, кеголиды, оксазолидинон; имипенен, амикацин, нетилмицин, фосфомицин, гентамицин, цефтриаксон, Зирацин, LY 333328, CL 331002, HMR 3647, Линезолид, Синерцид, Азтреонам, и Метронидазол, Эпироприм, ОСА-983, GV-143253, Санфетринем натрия, CS-834, Биапенем, А-99058.1, А-165600, А-179796, КА 159, Динемицин А, DX8739, DU 6681; Цефлупренам, ER 35786, Цефоселис, Санфетринем целексетил, HGP-31, Цефпиром, HMR-3647, RU-59863, Мерсацидин, КР 736, Рифалазил; Косан, AM 1732, MEN 10700, Ленапенем, ВО 2502А, NE-1530, PR 39, K130, OPC 20000, OPC 2045, Венеприм, PD 138312, PD 140248, СР 111905, Сулопенем, ритипенам акоксил, RO-65-5788, Циклотиалидин, Sch-40832, SEP-132613, микакоцидин A, SB-275833, SR-15402, SUN A0026, ТОС 39, карумонам, Цефозопран, Цефетамет пивоксил, и Т 3811.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антибактериальные агенты, которые, в соответствии с настоящим изобретением, могут быть введены совместно с даптомицином, включают, не ограничиваясь, имипенен, амикацин, нетилмицин, фосфомицин, гентамицин, цефтриаксон, тейкопланин, Зирацин, LY 333328, CL 331002, HMR 3647, Линезолид, Синерцид, Азтреонам, и Метронидазол.
Противогрибковые агенты, которые могут быть введены совместно с даптомицином или иным липопептидным антибиотиком, включают, не ограничиваясь, Каспофунген, Вориконазол, Сертаконазол, IB-367, FK-463, LY-303366, Sen-56592, Ситафлоксацин, DB-289; полиены, такие как Амфотерицин, Нистатин, Примарицин; азолы, такие как Флюконазол, Итраконазол, и Кетоконазол; аллиламины, такие как Нафтифин и Тербинафин; и антиметаболиты, такие как Флуцитозин. Другие противогрибковые агенты включают, не ограничиваясь, те из них, которые раскрыты в работе Fostel et al., Drug Discovery Today 5:25-32 (2000), включенной здесь в качестве ссылки. Fostel и соавт. описали противогрибковые соединения, в том числе, Коринекандин, Mer-WF3010, Фузакандины, Артрихитин/LL 15G256γ, Сордарины, Циспентацин, Азоксибациллин, Ауреобазидин и Хафрефунгин.
Даптомицин или другой липопептидный антибиотик, в том числе, родственные даптомицину липопептиды, можно вводить, в соответствии с настоящим изобретением, до тех пор, пока бактериальная инфекция не будет ликвидирована или уменьшена. В одном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин или другой липопептид вводят на протяжении от 3-х дней до 6 месяцев. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин или другой липопептид вводят в течение 7-56 дней. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин или другой липопептид вводят в течение 7-28 дней. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин или другой липопептид вводят в течение 7-14 дней. Даптомицин или другой липопептид, при необходимости, может вводиться в течение более длительного или более короткого периода времени.
Для более полного понимания настоящего изобретения ниже приводятся примеры. Данные примеры представлены только в иллюстративных целях и не рассматриваются в качестве какого-либо ограничения притязаний настоящего изобретения.
ПРИМЕР 1
Ферментативное культивирование S.roseosporus NRRL, штамм 15998, осуществляют в условиях контроля за декановой кислотой в качестве источника питания на уровне, который оптимизирует образование антибиотика при минимизации образования контаминантов. Остаточную декановую кислоту в качестве источника питания измеряют с помощью газовой хроматографии и заданный остаточный уровень декановой кислоты равен 10 ppm от начала ввода (приблизительно на 30-й час) вплоть до прекращения процесса культивирования. Центрифугирование данной культуры и последующий анализ осветленной культуральной жидкости используется для измерения образования даптомицина с помощью HPLC. Итоговый титр обычно находится между 2,1 и 2,6 грамма на литр ферментируемой культуральной жидкости.
Ферментативную среду собирают либо с помощью микрофильтрования с использованием Pall-Sep, либо с помощью крупномасштабного центрифугирования и глубинного фильтра. Полученную осветленную культуральную жидкость наносят на анионообменную смолу, Mitsubishi FP-DA 13, промывают 30 мМ NaCl с рН 6,5 и элюируют 300 мМ NaCl с рН 6,0-6,5. Альтернативно, колонку со смолой FP-DA 13 промывают 60 мМ NaCl с рН 6,5 и элюируют 500 мМ NaCl с рН 6,0-6,5. Полученный элюат наносят на HIC-смолу, HP-20ss, промывают 30%-ным ацетонитрилом и элюируют 35%-ным ацетонитрилом с рН 4,0-5,0. Или же, HIC-смолу промывают 45%-ным изопропиловым спиртом и элюируют 55-60%-ным изопропиловым спиртом. Полученный элюат наносят на смолу FP-DA 13, а затем промывают и элюируют как прежде. На заключительной анионнообменной стадии объем растворителя уменьшают на одну треть или больше. Диафильтрацию обратным осмосом и концентрированно при рН 1,5-2,5 осуществляют с использованием 0,2 мкм фильтра и полученный препарат даптомицина замораживают. Заключительную диафильтрацию с обратным осмосом осуществляют с помощью воды для инъекций (WFI), которая промывает даптомицин и корректирует его концентрацию перед стерильным наполнением. Затем даптомицин во флаконах или всю массу даптомицина лиофилизируют.
ПРИМЕР 2
Даптомицин, полученный при ферментативном культивировании S.roseosporus или частично очищенный даптомицин (9,9 кг) подвергают очистке с помощью микрофильтрации из 5500 литров культуральной жидкости способом, описанным в Патенте США 4885243. Частично очищенный даптомицин далее очищают способом, описанным в Патенте США 4874843 и основную массу препарата даптомицина получают с чистотой 91%. В соответствии с результатами HPLC этот препарат даптомицина содержит четырнадцать видов примесей (см. Пример 10). Данный препарат даптомицина наносят на анионообменную смолу Poros P150 (РЕ Biosystems) в Трис-буфере рН 7,0, содержащем 6 М мочевины, и позволяют ему связаться с данной смолой. Эту смолу промывают тремя колоночными объемами буфера перед началом градиентной обработки NaCl в том же буфере. Альтернативно, имеющиеся контаминанты могут эффективно удаляться из колонки фиксированным содержанием соли 30 мМ NaCl. Элюирование очищенного даптомицина из смолы осуществляется, приблизительно, 300 мМ NaCl при градиенте NaCl 0-1000 мМ. Чистота даптомицина, элюированного из данной колонки, превышает 99%, что измерено с помощью "первого" метода HPLC. Очищенный даптомицин содержит лишь один детектируемый контаминант. Ангидро-даптомицин и β-изомер не детектируются (они составляют менее 0,01% контаминации). Уровень неидентифицируемого контаминанта превышал 0,1% и был меньше 0,5%.
ПРИМЕР 3
Основную часть препарата даптомицина с чистотой 91% получают как описано в Примере 2. Данный продукт наносят на анионообменную смолу Poros D50 (РЕ Biosystems) в ацетатном буфере рН 7,0, содержащем 6 М мочевины. Смолу Poros D50 промывают и элюируют таким же образом как описано в Примере 2. Даптомицин, элюированный из данной колонки, обладает 96,92% чистотой, что измерено с помощью "второго" метода HPLC. Полученный продукт настоящего изобретения содержит только два от первоначальных четырнадцати видов примесей (менее 0,5% контаминации). В этом выделенном очисткой препарате даптомицина (менее 0,01% контаминации при точности количественной оценки не менее 0,05%) ангидро-даптомицин не детектируется.
ПРИМЕР 4
Культуральную жидкость, содержащую даптомицин, получают как описано в Примере 2. Полученную культуральную жидкость осветляют путем микрофильтрации. Осветленный продукт экстрагируют 20% н-бутанола или изо-бутанола при рН 4,5 (одна часть бутанола на четыре части осветленного раствора). Реэкстрагирование данного осветленного раствора осуществляют до получения частично очищенного даптомицина с выходом, превышающем 90% от общего даптомицина в осветленном растворе. Даптомицин извлекают из бутанольной фазы добавлением водного буфера рН 6,5 объемом, который составляет половину или больше от объема бутанола, которым экстрагируют даптомицин из бутанольной фазы в водную фазу. Стадия бутанольного экстрагирования дает частично очищенный препарат даптомицина с 5-кратной чистотой и 10-кратным концентрированием относительно данного осветленного раствора.
Затем водный препарат даптомицина подвергают очистке способом, раскрытым в Патенте США 4874843, с получением даптомицина, который обладает 91%-ной чистотой. Даптомицин содержит четырнадцать видов примесей. Этот продукт наносят на смолу Poros D50 в Трис-буфере рН 7,0, содержащем 6 М мочевины. Перед градиентной элюцией NaCl от 0 до 1000 мМ в этом же буфере смолу промывают тремя чистыми объемами Трис-буфера рН 7,0, содержащего 6 М мочевины. Элюирование из смолы выделяемого очищенного даптомицина происходит, приблизительно, при концентрации NaCl 300 мМ. Даптомицин характеризуется 98% чистоты, что измерено с помощью "второго" метода HPLC.
ПРИМЕР 5
Даптомицин ферментируют как описано в Примере 2. 5500 литров культуральной жидкости содержит 13 кг даптомицина. Полученную культуральную жидкость сразу экстрагируют 20% н-бутанолом рН 4,5, который распределяет даптомицин в бутанол. Повторное экстрагирование данной культуральной жидкости с бутанолом осуществляют по достижении выхода, превышающего 90% от общего даптомицина в культуральной жидкости. Полученную бутанольную фазу экстрагируют водным ацетатным буфером рН 6,5 с получением 5-кратно (35%) очищенного и 10-кратно сконцентрированного даптомицина относительно данной культуральной жидкости. Водный раствор даптомицина подвергают микрофильтрации способом, описанным в Патенте США 4885243, и затем подвергают очистке способом по Патенту США 4874843. Данный способ дает даптомицин с чистотой, приблизительно, 91%. В соответствии с методом HPLC, прежде применяемого в данной области техники, даптомицин содержит 14 видов примесей. Этот продукт наносят на колонку со смолой Poros D50 в ацетатном буфере рН 7,0, содержащем 6 М мочевины. Промывку и элюцию данной смолы осуществляют как указано в Примере 2. Продукт данной хроматографической стадии характеризуется, приблизительно, 98%-99% чистоты, что измерено с помощью второго метода HPLC.
ПРИМЕР 6
Даптомицин получают в ферментируемой культуре S.roseosporus за тем исключением, что используют сниженное остаточное питание декановой кислотой для того, чтобы улучшить качество ферментации до около 10% чистоты при осветлении микрофильтрацией или центрифугированием. Во время ферментации отслеживают содержание декановой кислоты и периодически его корректируют для поддержания остаточной декановой кислоты на уровне не менее 50 ppm и предпочтительно между 1 и 10 ppm. Культуральную жидкость подвергают микрофильтрации способом, описанным в Патенте США 4885243, с получением 12,1 кг частично очищенного даптомицина из 5500 литров культуральной жидкости. Осветленную культуральную жидкость связывают с анионообменником FP-DA 13 (Mitsubishi) в ацетатном буфере при нейтральном рН, промывают ацетатным буфером, содержащим 30 мМ NaCl, и затем элюируют ацетатным буфером с 300 мМ NaCl. В данной анионообменной стадии получают даптомицин с чистотой, превышающей 70%. Далее этот частично очищенный даптомицин подвергают очистке способом по Патенту США 4874843 с модификацией, в которой используется смола HP-20ss. А именно, частично очищенный даптомицин нагружают на HP-20ss в ацетатном буфере, содержащем 10% ацетонитрила, промывают ацетатным буфером, содержащим 30% ацетонитрила и элюируют 40% ацетонитрила в ацетатном буфере, получая даптомицин с чистотой от около 94 до 96%, что определено с помощью "второго" метода HPLC. Полученный продукт подвергают анионообменной хроматографии в усиливающем модифицированном буфере с использованием смолы Poros D50, как описано в Примере 5. Степень очистки даптомицина превышает 99% и он содержит лишь два из четырнадцати видов примесей, получаемых способами, описанными раньше в данной области техники.
ПРИМЕР 7
Препарат даптомицина с 93%-ной чистотой получают как описано в Примере 2. Этот продукт наносят на смолу Poros P150 (РЕ Biosystems) в ацетатном буфере рН 6,0, содержащем 2 М мочевины. Данную смолу Poroc P150 промывают тремя колоночными объемами указанного буфера. Даптомицин элюируют из смолы с использованием 0-400 мМ градиента NaCl в ацетатном буфере рН 6,0, содержащем 2 М мочевины. Даптомицин элюируется между 150 и 300 мМ NaCl. Элюируемый из колонки даптомицин характеризуется 99,0-99,5%-ной чистотой, что определено с помощью "первого" метода HPLC. Даптомицин содержит следовые количества четырех видов примесей, которые составляют менее 1% общего даптомицина. В выделенном очисткой препарате даптомицина (менее 0,02% контаминации) ангидро-даптомицин не детектируется.
ПРИМЕР 8
Препарат даптомицина с 93%-ной чистотой получают как описано в Примере 2. Этот продукт наносят на смолу Poros P150 (РЕ Biosystems) в ацетатном буфере, рН 6,0, содержащем 2 М мочевины. Данную колонку промывают шестью колоночными объемами 60 мМ NaCl в ацетатном буфере рН 6,0, содержащем 2 М мочевины ("промывочный буфер"). Содержание NaCl в промывочном буфере может варьировать от 50 до 75 мМ. Промывка удаляет практически весь ангидро-даптомицин. Даптомицин элюируют шестнадцатью колоночными объемами 250 мМ NaCl в ацетатном буфере рН 6,0, содержащем 2 М мочевины. Даптомицин характеризуется 98,5-99,5%-ной чистотой, что определено с помощью "первого" метода HPLC.
ПРИМЕР 9
Препарат даптомицина, который описан в Примере 2, получают с использованием способа, который существенно снижает концентрацию растворителя, необходимого для осуществления НР-20ss-хроматографии. При проведении НР-20ss-хроматографии в нейтральном рН, а не в кислом рН, как описано в Патенте США 4874843, растворитель для элюции даптомицина, 40% ацетонитрил или 55-60% изопропиловый спирт, неожиданно был уменьшен, соответственно, до 12% и 25%. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения сдвиг рН можно использовать для повторного применения смолы HP-20ss без удаления растворителя.
После элюции из колонки FP-DA13 при рН 6,5-7,0 даптомицин загружают в уравновешенную НР-20ss-колонку, уравновешенную, например, 60 мМ ацетатом, рН 6,6. Такую колонку промывают пятью-восемью чистыми колоночными объемами промывочного буфера (CBV). Типичный промывочный буфер представляет собой 5% изопропиловый спирт/60 мМ ацетат, рН 6,6. Даптомицин элюируют из колонки буфером для элюции. Типичный буфер для элюции представляет собой два-три CBV 25% изопропилового спирта/60 мМ ацетат, рН 6,6. Колонку очищали десорбирующим буфером. В одном варианте осуществления настоящего изобретения колонку очищают с помощью одного CBV 40% изопропилового спирта/60 мМ ацетата рН 6,6-7,0. Раствор даптомицина доводят до рН 3,5-4,0 и вновь загружают в НР-20ss-колонку для того, чтобы еще больше повысить степень очистки. В одном варианте осуществления настоящего изобретения даптомицин, элюированный из НР-20ss-колонки при рН 6,5, доводят до рН 3,5 с использованием 0,25 М фосфорной кислоты. Этот раствор даптомицина вновь загружают в ранее очищенную НР-20ss-колонку, которая была уравновешена в 60 мМ ацетате, рН 3,5. Загруженную колонку промывают буфером для корректировки рН, рН которого равен 6,5. Типичный буфер для корректировки рН представляет собой пять-восемь CBV 5% изопропилового спирта/60 мМ ацетата, рН 6,6. Даптомицин, элюированный буфером для элюции, далее, при необходимости, очищают с помощью анионного обмена или иными способами очистки. НР-20ss-колонку очищают десорбирующим буфером и промывают перед повторным использованием. Типичная технология промывки включает промывку тремя CBV 0,5 М NaOH, промывку одним CBV воды, и затем промывку 0,25 М фосфорной кислоты перед уравновешиванием. Такую колонку можно хранить в 0,5 М NaOH.
ПРИМЕР 10
Основную массу даптомицина, полученную в Примере 2, характеризуют с помощью полупрепаративной HPLC и с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектроскопии (LC/MS) с использованием и положительного, и отрицательного ионного режимов. Характеристика примесей в основной массе даптомицина перед хроматографией на анионообменной смоле Poros Р150 представлена в Таблице 3, а хроматограмма основной массы полученного даптомицина представлена на Фиг.12.
Таблица 3
Примесь
Время удерживания
Наблюдаемая молекулярная масса
Lilly шифр примеси по номенклатуре
Cubist шифр примеси по номенклатуре
% Общей Площади HPLC
1
7,96
1638
LY212218
СВ-131012
>0,5%, <1,0%
2
9,11
1638
СВ-131011
<0,5%, >0,1%
3
11,54
745
LY213928
СВ-131008
>0,5%, <1,0%
4
12,28
1624
СВ-131006
<0,5%, >0,1%
5
13,10
1618
Неизвестный-1
<0,5%, >0,1%
6
14,43
587
LY213827
СВ-130989
>0,5%, <1,0%
7
14,43
1606
СВ-131005
>0,5%, <1,0%
8
15,10
1620
LY213846
СВ-131010
>1,0%, <4,0%
Даптомицин
16,68
1620
LY146032
СВ-109187
>90%
9
17,92
874
Неизвестный-2
<0,5%, >0,1%
10
19,57
1810
Неизвестный-3
<0,5%, >0,1%
11
19,57
1635
Неизвестный-4
<0,5%, >0,1%
12
20,93
859
СВ-131009
<0,5%, >0,1%
13
23,11
1602
LY178480
СВ-130952
>1,0, <4,0%
14
24,53
1634
LY109208
СВ-131078
<0,1
Примесь 1 (СВ-131012), которую элюируют, приблизительно, 7,96 минут, (MW: 1638) предположительно является продуктом гидролиза лактона даптомицина (Фиг.4). Данные результаты, по-видимому, соответствуют LY212218, ранее идентифицированного Lilly в виде дециловой циклической структуры открытого производного даптомицина.
Примесь 2 (СВ-131011), которую элюируют, приблизительно, 9,11 минут, (MW: 1638) также, предположительно, является продуктом гидролиза лактона β-изомера (Фиг.5).
Примесь 3 (СВ-131008), которую элюируют, приблизительно, 11,54 минут (MW: 745) предположительно является линейным липопептидом, состоящим из цепи из пяти аминокислот, содержащей триптофан, аспарагин, аспартат, треонин и глицин, и цепи декановой кислоты (Фиг.6). Полученный результат, по-видимому, соответствует LY213928, ранее идентифицированному Lilly.
Примесь 4 (СВ-131006), которую элюируют, примерно 12,28 минут, (MW: 1624) предположительно является окисленным аналогом даптомицина, в котором аминокислота триптофан окисляется до кинуриновой кислоты (Фиг.7).
Примесь 5, которую элюируют, приблизительно, 13,10 минут, (MW: 1618) еще не обладает определенной структурой.
Примесь 6 (СВ-130989) и Примесь 7 (СВ-131005) коэлюируют, приблизительно, 14,43 минуты. СВ-130989 (MW: 587), по-видимому, соответствует LY213827, состоящему из линейного липопептида, представленного цепью из трех аминокислот, включающей триптофан, аспарагин и аспартат, и цепью декановой кислоты (Фиг.8), который ранее идентифицирован Lilly. СВ-131005 (MW: 1606) соответствует даптомициновому аналогу, в декановой кислоте которого отсутствует одна метильная группа (Фиг.9).
Примесь 8 (СВ-131010), элюируют, приблизительно, 15,10 минут, (MW: 1620), соответствует LY213846 (β-изомер), который ранее идентифицирован Lilly (Фиг.2). Содержание β-изомера превышает 1%.
Примесь 9, которую элюируют, приблизительно 17,92 минуты (MW 874), еще не обладает определенной структурой.
Примесь 10 и 11, которую коэлюируют, приблизительно, 19,57 минут, еще не обладает определенной структурой.
Примесь 12 (СВ-131009), которую элюируют 20,93 минуты (MW: 859), предположительно представляет собой линейный липопептид, состоящий из цепи шести аминокислот триптофана, аспарагина, аспартата, треонина, глицина и орнитина, и цепи декановой кислоты (Фиг.10).
Примесь 13 (СВ-130952), которую элюируют, приблизительно, 23,11 минуты (MW: 1602), является, предположительно ангидро-даптомицином (Фиг.3), и имеет тот же вид, что и LY178480. Содержание ангидро-даптомицина превышает 1%.
Примесь 14 (СВ-131078), которую элюируют, приблизительно, 24,53 минуты (MW: 1634), имеет тот же вид, что и LY109208, ранее идентифицированный Lilly в качестве даптомицинового аналога, содержащий дополнительную метильную группу в цепи декановой кислоты (Фиг.11).
Основную массу даптомицина можно выделить очисткой на Poros P150, как описано выше в Примерах 2 или 7-8, или можно очистить на Poros D50, как описано выше в Примерах 3-5. После очистки на Poros P150, как описано в Примере 2, хроматограмма (Фиг.13) свидетельствует, что степень чистоты даптомицина превышает 99%, при том, что β-изомер и ангидро-даптомицин ниже уровня детекции (менее 0,05% от суммарного даптомицина). Существует одна неидентифицированная примесь, которая присутствует в количестве выше 0,1%, но меньше 0,5%.
ПРИМЕР 11
Ферментацию культуры S.roseosporus NRRL штамм 15998 осуществляют при контролируемом уровне питания декановой кислотой, который оптимизирует продуцирование антибиотика и минимизирует образование контаминантов. Питание остаточной декановой кислотой определяют с помощью газовой хроматографии, а заданное остаточное содержание декановой кислоты составляет 10 ppm с начала ввода (приблизительно на 30-й час) до момента сбора биомассы. Центрифугирование данной культуры и последующий анализ осветленной питательной среды используют для определения продукции даптомицина с помощью HPLC. Итоговый титр обычно находится между 1,0 и 3,0 граммами на литр культуральной жидкости.
Ферментационную среду собирают либо с помощью микрофильтрации с использованием Pall-Sep, либо с помощью промышленного центрифугирования и глубинного фильтра. Осветленную питательную среду наносят на анионообменную смолу, Mitsubishi FP-DA 13, промывают 30 мМ NaCl при рН 6,5 и элюируют 300 мМ NaCl при рН 6,0-6,5. Или же, смолу FP-DA 13 в колонке промывают 60 мМ NaCl при рН 6,5 и элюируют 500 мМ NaCl при рН 6,0-6,5. Полученный рН доводят до 3,0-4,8, а температуру доводят до 2-15°С. В этих условиях даптомицин образует мицеллу. Раствор мицеллярного даптомицина очищают путем промывки полученного мицеллярного препарата, пока он удерживается на ультрафильтре, используя фильтр любой конфигурации для NMW, равной 10000 (AG Technology Corp. UF hollow fiber or equivalent). Мицеллы даптомицина удерживаются на фильтре, а большая часть примесей удаляется потому, что они проходят через фильтр NMW равный 10000. Ультрафильтрация мицелл даптомицина повышает чистоту даптомицина от, приблизительно, 40% до 80% или выше.
Полученный элюат наносят на HIC-смолу, HP-20ss, промывают 30%-ным ацетонитрилом и элюируют 35%-ным ацетонитрилом при рН 4,0-5,0. Альтернативно, нагруженную HIC-смолу промывают 20-30%-ным изопропиловым спиртом и элюируют 30-40%-ным изопропиловым спиртом при рН 3,5-6,5. В этих условиях увеличенного растворителя и повышенного рН 6,0-7,5 даптомицин обращается в простое, немицеллярное состояние. Этот элюат загружают в колонку со смолой FP-DA 13, а затем промывают и элюируют как и раньше. На заключительной стадии анионного обмена содержание растворителя снижается на одну треть или более. Диафильтрацию с обратным осмосом и концентрирование при рН 1,5-2,5 осуществляют с использованием 0,2 мкм фильтра и препарат даптомицина замораживают. Заключительную диафильтрацию с обратным осмосом осуществляют с помощью воды для инъекций (WFI), которая промывает даптомицин и корректирует его концентрацию перед стерильным наполнением. Затем флаконы или всю массу даптомицина лиофилизируют.
ПРИМЕР 12
Лиофилизированный даптомицин, очищенный как описано в любом вышеприведенном примере, и так как описано в Примере 11, восстанавливают в физиологическом растворе (приблизительно 140 мМ NaCl) при рН 4,0-5,0. В этих условиях даптомицин присутствует в виде мицеллы и может использоваться для инъекции или внутривенного, парентерального, орального или местного введения.
ПРИМЕР 13
Даптомицин получают путем ферментации и осветляют питательную среду с помощью микрофильтрации, как описано в Примере 11. Осветленную питательную среду наносят на анионообменную смолу, Mitsubishi FP-DA 13, промывают 30 мМ NaCl при рН 6,5 и элюируют 300 мМ NaCl при рН 6,0-6,5, что дает даптомициновый препарат, который обладает, приблизительно, 40%-ной чистотой. Этот элюат доводят до рН 3,5 разбавленной фосфорной кислотой так, что практически весь даптомицин образует мицеллы. Данный мицеллярный препарат нагружают на ультрафильтрационную мембрану с NMW 10000. Полученный препарат даптомицина промывают 30 мМ ацетатом натрия с рН 3,5 и температурой до 15°С.Уменьшение объема и промывка снижают уровень контаминации, что дает препарат даптомицина 85% чистоты. Данный препарат даптомицина можно дальше очищать с использованием любых описанных здесь способов.
ПРИМЕР 14
Даптомицин получают путем ферментации, питательную среду осветляют микрофильтрацией, и фракционируют на носителе FP-DA 13, как описано в Примере 11. Полученный элюат доводят до рН 3,5 разбавленной фосфорной кислотой так, что практически весь даптомицин образует мицеллы. Мицеллярный препарат нагружают на ультрафильтрационную мембрану с NMW 10000. Этот препарат даптомицина промывают 30 мМ ацетатом натрия рН 3,5 при температуре до 15°С. Уменьшение объема и промывка снижают уровень контаминации, что дает препарату даптомицина 80-90% чистоты. Далее препарат даптомицина можно очищать с использованием любого описанного здесь способа.
ПРИМЕР 15
Даптомицин получают путем ферментации и осветления питательной среды с использованием микрофильтрации, как описано в Примере 11. Данный препарат очищают с использованием гидрофобной хроматографии, как описано в Патенте США 4874843, включенном здесь в качестве ссылки. В данном способе используют повторяемую колоночную хроматографию на смоле HP-20 и на смоле HP-20ss. Чистота даптомицина составляет 93% с видимыми на HPLC-хроматограммах примесями и измеримым пирогеном. Полученный продукт разбавляют водой, а его рН доводят до 6,5 с помощью NaOH или равноценным заменителем. Препарат даптомицина фильтруют через ультрафильтрационную мембрану с NMW 10000. В этих условиях даптомицин является мономерным и проходит через указанную ультрафильтрационную мембрану. Конечный продукт сохраняет 93% чистоты, а 0,1-0,2% присутствие некоторых примесей -удаляют с помощью ультрафильтрационной мембраны. Кроме того, содержание пирогена снижается до недетектируемого уровня.
ПРИМЕР 16
Препарат даптомицина, приблизительно с 93%-ной чистотой, получают как описано в Примере 15. Данный даптомициновый препарат переводят в мицеллярное состояние путем уменьшения рН до 4,7 с помощью HCl или равноценного заменителя и охлаждают этот даптомициновый препарат до 2-5°С. Этот продукт концентрируют с 400 литров до трех литров и до конечной концентрации, приблизительно, 100 мг/мл с помощью фильтрации на ультрафильтрационной мембране с NMW 10000. В этих условиях даптомицин удерживается на данной мембране. Это приводит к большому увеличению концентрации даптомицина. Чистота составляет, приблизительно, 93%.
ПРИМЕР 17
Препарат даптомицина получают как описано в Примере 16. Флаконы наполняют, приблизительно, 250 мг даптомицина и лиофилизируют.Для введения человеку или животному лиофилизированный даптомицин восстанавливают в 50 мл стерильного 150 мМ физиологического раствора при рН 4,0-5,0. Доза даптомицина, которую вводят, зависит от природы инфекции, возраста и веса пациента, а также вида животного. При рН 4,0-5,0 в 150 мМ физиологическом растворе такой даптомицин будет присутствовать в мицеллярном состоянии, которое является растворимым и пригодным для внутривенной, внутримышечной или парентеральной инъекции. Такая рецептура будет минимизировать любое локальное раздражение, обусловленное липопептидной природой даптомицина.
ПРИМЕР 18
Мицеллы даптомицина получают с использованием даптомицина в концентрации 1,0 мг/мл в воде при рН 4,0 и 25°С. Размер даптомициновой мицеллы измеряют с использованием Zetasizer™ (Malvern Instruments, Model 3000 HS). Скорость счета 36,3, ячейка представляет собой капилляр, угол детекции (град.) равен 90°, а длина волны (нм) составляет 633. Результаты свидетельствуют, что диаметр мицеллы равняется 54Å, который почти в два раза превышает диаметр одиночной мономерной молекулы даптомицина. См. Фиг.18.
Все публикации и патентные заявки, использованные в данном описании, включены здесь в качестве ссылки так, как если бы каждая индивидуальная публикация или патентная заявка были конкретно и индивидуально указаны для включения путем ссылки. Хотя вышеизложенное изобретение было описано довольно подробно с помощью иллюстраций и примеров в целях ясности понимания, рядовым специалистам в данной области техники в свете указаний настоящего изобретения очевидно, что в него могут быть внесены некоторые изменения и модификации, не выходящие за рамки существа настоящего изобретения и объема прилагаемой формулы изобретения.