Повышение адаптационных резервов поврежденного миокарда к нагрузочным тестам после трансплантации стромальных клеток костного мозга различного фенотипа

Оригинальные исследования

Повышение адаптационных резервов поврежденного миокарда к нагрузочным тестам после трансплантации стромальных клеток костного мозга различного фенотипа

И.В. Потапов, И А. Кириллов, НА. Онищенко Лаборатория биотехнологии стволовых клеток

ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва

Increase of adaptive reserves of the damaged myocardium to load tests after intramyocardial transplantation of various phenotypes of bone marrow stromal cells

I.V. Potapov, LA. Kirillov, N.A. Onlschenko

Laboratory of stem cell biotechnology Institute of transplantology and artificial organs, Moscow

Известно, что трансплантация стромальных клеток костного мозга [СККМ) улучшает функцию сердца. Однако остается невыясненным, как влияет предифференцировка СККМ на функцию поврежденного миокарда, особенно в условиях повышенной нагрузки на левый желудочек [ЛЖ]. В настоящем исследовании через 1 неделю после криодеструкции миокарда крыс в принекротическую зону ЛЖ был трансплантирован один из трех видов аутологичных СККМ: недифференцированные, кардиомиоцитоподобные и эндотелиоцитоподоб-ные. Через 3 недели после трансплантации была изучена функция Л Ж с применением метода дозированных пред- и постнагрузок на изолированные сердца. Было показано, что после трансплантации всех типов СККМ сердца проявляли лучшую устойчивость к нагрузочным тестам по сравнению с контрольной группой. Однако повышение адаптационных резервов миокарда ЛЖ после трансплантации было реализовано различными способами в каждой группе.

Ключевые слова: стромальные клетки костного мозга, аутологичная трансплантация, метод Neely, нагрузочные тесты, адаптационные резервы.

In many works It was shown that bone marrow stromal cells [BMSC} transplantation Improves heart function. However remains unclear whether the predifferentiation could Influence on the damaged myocardial function repare, especially In the Increased load settings on the left ventricle [LV}. In our study one of three types of autologous BMSC has been transplanted In 1 week after cryodestructlon of rat myocardium In perl-lnfarct areas of LV: undifferentiated, cardlomyocyte-llke and endothellal-llke predifferentiated BMSC. In 3 weeks after transplantation L V function has been studied using method of dosed pre- and afterloads on the Isolated hearts [as provided by Neely preparation). It has been shown, that after all 3 types BMSC transplantation heart showed the best stability to load tests In comparison with control group. However we consider that Increase of adaptive reserves of LV myocardium after transplantation all different types of BMSC was realized by various pathways in each group.

Key words: bone marrow stromal cells, autologous transplantation, Neely preparation, load tests, adaptive reserves.

Стромальные клетки костного мозга (СККМ) вследствие высокого пролиферативного потенциала, способности к дифференцировке в миогенном и эндотелиальном направ лениях являются перспективным материалом для восста новления сократительной функции поврежденного миокарда [1, 2]. В ряде экспериментальных работ были исследованы эффекты интрамиокардиальной трансплантации кардиомио цитоподобных, эндотелиоцитоподобных и недифференциро ванных стромальных клеток костного мозга в поврежденный миокард [3 10]. Было показано, что пересаженные клетки пе реживают после трансплантации, улучшают сократительную функцию миокарда, стимулируют ангиогенез. Однако в этих работах не оценивались адаптационные резервы сократи тельной функции миокарда после трансплантации клеток. Кроме того, вследствие различий в моделях повреждения миокарда, методах культивирования, количестве трансплан тированных клеток, способах трансплантации провести сравнительный анализ степени терапевтической эффектив ности используемых клеточных препаратов в подавляющем большинстве работ не представлялось возможным. Поэто му большое значение приобретают исследования, где в сходных условиях эксперимента сравниваются терапевта ческие эффекты различных типов клеток, так как только такие работы позволяют ответить на вопрос о целесообразности предифференцировки клеток для восстановления тканеспе цифических структур миокарда [4, 5, 10]. Настоящее иссле дование было предпринято с целью сравнительного изуче ния влияния аутогенных СККМ различного фенотипа на

насосную функцию и адаптационные резервы левого же лудочка (ЛЖ) после его криодеструкции (КД) в условиях повышенных пред и постнагрузок, а также для получения ответа на вопрос о целесообразности предифференциров ки клеток для восстановления тканеспецифических струк тур миокарда.

Материал и методы

Опыты выполнены на 40 взрослых крысах самцах поро ды Вистар массой 300 400 г. Животные были разделены на 4 группы: 1 я группа - контрольная, крысы с криодест рукцией (КД) миокарда и введением в принекротическую зону физраствора (10 животных, «контроль»); 2 я группа -крысы с КД и введением в принекротическую зону аутогенных недифференцированных стромальных клеток костного мозга (нСККМ) (10 животных); 3 я группа - крысы с КД и введе нием в принекротическую зону аутогенных предифферен цированных в кардиомиоцитоподобном направлении СККМ (кСККМ) (10 животных); 4 я группа - крысы с КД и введе нием в принекротическую зону аутогенных предифферен цированных в эндотелиоцитоподобном направлении СККМ (эСККМ) (10 животных).

Операции проводили в условиях комбинированного нар коза (ксилазолин 10 мг/кг в/м и эфир ингаляционно) и ин тубационной искусственной вентиляции легких.

КД выполняли с помощью металлического стержня ци линдрической формы диаметром 6 мм, охлажденного в жид ком азоте, путем прикладывания его к передне боковой

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 2, 2007

I I I I I I

I I I

Оригинальные исследования

поверхности левого желудочка (ЛЖ) на 0,5 мин. После отта ивания стенки ЛЖ процедуру КД повторяли 10 раз.

Костный мозг получали путем пункции большеберцовых костей. Аспират обрабатывали гипотоническим раствором для лизиса эритроцитов. Полученные клетки культивирова ли в среде DMEM (Sigma), содержащей 10% FBS (HiClone) в термостате при 37°С в атмосфере с 5% С02 и 95% влажности. Среду меняли каждые 3 сут., элиминируя неприк репившиеся ко дну культуральной посуды клетки. Через 6 7 сут. культуру рассевали в соотношении 1:2, используя

0,25% раствор трипсина. Далее клетки культивировали тремя способами. Для получения культуры нСККМ клетки культивировали до получения 90% монослоя. Для полу чения культуры кСККМ в культуру на 2 суток добавляли

5 азацитидин (Sigma) в концентрации 6 мкмоль/л и культивировали до получения 90% монослоя. Для получения культуры эСККМ клетки культивировали до получения 90% мо нослоя, после чего среду меняли на DMEM low glucose (Sigma), содержащую 2% FBS и 50 нг/мл VEGF (rat) (Sigma) и культи вировали в течение 7 суток (1). Для трансплантации клетки снимали с пластика, используя 0,25% раствор трипсина.

Принадлежность трансплантируемых СККМ к опреде ленному фенотипу подтверждали иммуноцитохимической окраской культур клеток на виментин, тропонин I, фактор фон Виллебрандта (11 13].

Трансплантацию клеточного материала проводили в ко личестве 5±1,2x106 клеток, ресуспендированных в 100 мкл физраствора, инъекционно в 5 точек принекротической зоны через 7 сут. после КД.

Исследование насосной функции сердец проводили через 3 недели после трансплантации. Оценку насосной функции Л Ж проводили в стендовых условиях по модифицированной ме тодике Neely [14], которая позволяет количественно оцени вать аортальный, коронарный, минутный объемы (АО, КО и МО соответственно) перфузионного раствора (ПР), ЧСС, сис толическое, диастолическое давления (СД, ДД) в устье аорты, а также рассчитать ударный объем ПР (УО), долю АО в МО, развиваемое давление (РД=СД ДД), время систолы, ско рость нарастания давления во время систолы (dP/dt). При этом имеется возможность менять пред и постнагрузку на ЛЖ (рис. 1).

Для исследования животное наркотизировали эфиром, в условиях ИВЛ извлекали сердце, помещали в холодный (+4°С) ПР, в течение 2 мин. канюлировали аорту и начинали перфузию по Langendorff оксигенированным ПР при +37°С, затем канюлировали левое предсердие. После 5 мин. рет роградной перфузии через аорту начинали подавать ПР в левое предсердие. Наше исследование насосной функции изолированных сердец заключалось в последовательной смене 5 режимов нагрузки на ЛЖ (табл. 1), осуществляв мых за 30 35 мин. Исследование насосной функции сер дец начинали с преднагрузки на ЛЖ 10 см вод. ст., после чего увеличивали преднагрузку (режим 2) путем подъема уровня предсердной камеры с 10 на 20 см (нагрузка объе мом). Затем повышали постнагрузку на ЛЖ, увеличивая высоту столба в аортальной трубке с 70 до 100 см (режим 3). В режиме 4 увеличивали постнагрузку на ЛЖ, повышая со противление аортальному выбросу сердца за счет присое динения к аортальной трубке наконечника с узким (0,3 мм) просветом. В режиме 5, повторяющем режим 3, оценивали способность ЛЖ к восстановлению показателей насосной функции после режима 4.

Таблица. 1. Режимы нагрузочных тестов, использованных для оценки насосной функции изолированных сердец в стендовых условиях

Режим Преднагрузка, см вод. ст. Постнагрузка, см вод. ст. Диаметр аортальной трубки, мм

1 IO 7O з

P PO 7O З

з PO 1OO з

4 PO 1OO O,3

S PO 1OO з

Пocтнaгpyзкa

Обработку результатов сравнительного исследования показателей насосной функции сердца осуществляли с помощью С критерия Стьюдента и с учетом поправки Бон феррони для множественных сравнений при вероятности ошибки I рода р = 0,05.

Пpeдcepднaя raMepa

Пpeднaгpyзкa

Kap6o^ Poликoвый

нacoc

Peзepвyap

пepфyзиoннoгo

pacTBopa

Kopoнapный Aopтaльный Зaпиcь кpивoй oбъeм oбъeм дaвлeния

Рис. 1. Схема установки для изучения сократительной функции ЛЖ изолированного сердца

Результаты

Наши исследования показали, что сразу после КД на на ружной стенке ЛЖ в зоне криовоздействия возникал округ лый очаг повреждения темно вишневого цвета диаметром

6 7 мм, а через 30 дней после КД наблюдалось формиро вание рубцовой ткани светлого серого цвета в миокарде пе реднебоковой стенки ЛЖ округлой формы диаметром 6 7 мм со стороны эпикарда и 3 мм со стороны эндокарда; толщи на стенки ЛЖ в центре рубца не превышала 1 мм (толщина стенки ЛЖ у взрослых интактных крыс составляет 4 5 мм) Нами не было отмечено различий в размерах и форме рубца миокарда у животных различных групп.

При изучении насосной функции ЛЖ (объемы, давление и др.) в большинстве опытов нам не удалось получить четкой картины, описывающей закономерности функционирования сердец различных групп. Такую ситуацию мы связали с ин дивидуальными различиями функционирования ЛЖ в каж дом опыте. Чтобы нивелировать эти различия показателей, для анализа результатов были использованы относитель ные величины, отражающие увеличение/уменьшение по казателей при смене режимов. В рамках данной статьи не

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 2, 2007

Оригинальные исследования

возможно отразить все полученные числовые данные, по этому мы ограничиваемся описанием наиболее важных и показательных результатов, отражающих характер функци онирования сердец каждой группы.

Во всех исследованных группах сердца адекватно реа гировали на преднагрузку и, следовательно, их функцио нирование подчинялось закону Франка Старлинга: при увеличении преднагрузки увеличивались МО, КО, АО и УО. Однако увеличение этих объемов имело разную степень выраженности в экспериментальных группах. Например, увеличение АО было наиболее выражено в группах нСККМ и эСККМ (рис. 2).

Рис. 2. Прирост аортального объема после увеличения преднагрузки

В группе нСККМ увеличение МО было реализовано в основном за счет увеличения ЧСС при одновременном уменьшении времени систолы ЛЖ и сравнительно большого прироста значений КО (рис. 3). В противовес этому, в группе эСККМ наблюдалось небольшое уменьшение ЧСС при од новременном увеличении времени систолы ЛЖ. На фоне сравнительно низких значений прироста КО увеличение МО в группе эСККМ было реализовано преимущественно за счет более значительного увеличения ударного объема. Можно предположить, что у миокарда сердец группы нСККМ, в отличие от миокарда группы эСККМ, имеет место более значительное потребление кислорода, который и оказыва ет положительное инотропное воздействие. Таким образом, после трансплантации всех типов СККМ сердца были более адаптированы к воздействию преднагрузок, что можно рас ценить как свидетельство улучшения эластических свойств миокарда ЛЖ.

При увеличении постнагрузки при практически неизмен ном МО во всех группах происходило перераспределение АО и КО в пользу КО, однако в группе эСККМ тенденция к малому приросту КО сохранялась. Во всех группах также происхо дило повышение СД примерно на 20% и ДД примерно на 50%. Также во всех группах, кроме кСККМ, происходило снижение показателей с1Р/ А (показатель, характеризую щий сократимость) и увеличение времени систолы на 10%. В целом, в режиме 3 максимально адаптировались сердца группы кСККМ.

Следующим этапом тестирования сердец было примене ние сверхвысокой постнагрузки при одновременном ис пользовании высокой преднагрузки, что способствовало выявлению максимальных адаптационных резервов миокар да. При этом мы наблюдали снижение АО более чем в 2 раза, которое было менее выражено в группах кСККМ и эСККМ. Также усиливалась перфузия ПР через коронарные сосуды, однако в группе эСККМ приросты КО были меньшими, чем в контроле (р<0,05), а у кСККМ, наоборот, более выражен ными. При этом в группе эСККМ значимо снижалась ЧСС, но УО изменялся менее значительно (по сравнению с кон тролем), и поэтому МО уменьшился примерно так же, как и в остальных группах. Показатели давления еще дополни тельно выросли во всех группах примерно на те же величи ны, что и после применения первого режима преднагрузки. На рис. 4 видно, что сила сокращения была наиболее выра жена в группе кСККМ, сердца в которой наиболее полно адаптировались к сверхвысоким преднагрузкам.

Рис. 3. Прирост коронарного объема после увеличения преднагрузки

Рис. 4. Прирост систолического давления во время сверхвысокой постнагрузки

Далее мы проводили сравнение показателей одинаковых режимов 5 и 3, отражающих уровень функциональных ре зервов сердец. АО практически не изменялся во всех экс периментальных группах и выгодно отличался этим от АО контрольной группы, где он падал почти на 20%. Более от четливо значения АО выразились в показателе доли АО в МО. Он наиболее значительно снизился в контрольной группе (-10%) и достоверно отличался от остальных групп. Кроме того, при сравнении значений доли АО в МО выявились раз личия в группах с трансплантацией. В группе кСККМ показа тель АО/МО остался практически тем же, нов группах нСККМ и эСККМ он вырос примерно на 9%, достоверно отличаясь от группы кСККМ (рис. 5). При этом КО в группах нСККМ и эСККМ уменьшался, тогда как в остальных группах - не ме нялся (р<0,05). Разница между группами нСККМ и эСККМ заключалась в разном соотношении прироста УО и убыли ЧСС. В группе эСККМ прирост УО составил 24%, убыль ЧСС - 15%, в группе нСККМ - 12% и 3% соответственно. Можно заклю чить, что трансплантация всех типов клеток повышает пере носимость миокардом сверхвысоких постнагрузок: после

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 2, 2007

I I I I I I

I I I

Оригинальные исследования

сверхвысокой постнагрузки мы наблюдали практически полное восстановление систолической функции ЛЖ в этих группах. В группе эСККМ это происходило за счет более эффективной («экономной») перфузии миокарда, в группе кСККМ - только за счет возросшей перфузии миокарда. Несмотря на сохранение уровня перфузии миокарда в кон трольной группе, восстановления функции ЛЖ у этих сер дец не наступало.

Рис. 5. Сохранность доли аортального объема и минут ного объема после сверхвысокой постнагрузки

Обсуждение результатов

В мире уже накоплен некоторый материал по эффектам трансплантации СККМ на миокард. Например, в работе [3] изогенные кСККМ трансплантировались в окклюзированную аорту крысам после перевязки левой коронарной артерии. По данным эхоКГ в этих опытах улучшался ряд функциональ ных показателей сердец по сравнению с контролем. В ис следовании (6) изучали эффект кСККМ, трансплантирован ных в геле на поверхность инфаркта после ишемического инфаркта миокарда у свиней. Были констатированы мигра ция клеток в миокард, улучшение систолической функции, а также ангиогенез.

В работе [7] в зону, связанную с коронарной артерией, обусловившей инфаркт вводили аллогенные нСККМ. В ре зультате происходило сокращение некротической зоны ми окарда, нормализация систолической и диастолической функции сердец, исследованной методом магнитно резо нансной томографии. Повышение фракции выброса было подтверждено и в работе [8], где функцию сердца изучали эхокардиографией после трансплантации аллогенных нСККМ, причем, достоверные отличия от контроля стали проявляться только на 3 мес. после трансплантации. В эксперименте на собаках (9) трансплантировали нСККМ. Спустя 30 и 60 дней после трансплантации было показано достоверное увеличение фракции изгнания ЛЖ, уменьшение рубцовой ткани и увеличение плотности сосудов в миокарде у экспериментальной группы.

Oswald et al. (2004) изолировали СККМ крыс, размно жили их in vitro и получили эндотелиоподобные клетки (1). Ангиогенный эффект этих клеток в настоящее время изу чен недостаточно полно, а сократительная функция мио карда после их трансплантации в миокард вообще не изу чалась; мы впервые описали эти эффекты в настоящем исследовании.

Констатируя довольно большое количество работ по при менению СККМ различного фенотипа, мы вместе с тем от метили дефицит исследований, в которых бы проводилось сравнение эффектов трансплантации различных видов СККМ на состояние поврежденного миокарда. Например, в

работе Tomlta et al. (1999) [4] на модели КД миокарда были использованы различные виды аутогенных клеток костного мозга: кСККМ, свежевыделенные клетки КМ, нСККМ. По ложительный эффект был достоверно подтвержден после трансплантации этих клеток по сравнению с контролем. Это выражалось в уменьшении инфарктной зоны (чего мы не отметили в настоящем исследовании) и в улучшении систо лической и диастолической функции, изученных по методике Langendorff. Но достоверных результатов о более эффектив ном применении какой либо фракции клеток приведено не было. В другой работе [5] по данным морфометрии постин фарктного ЛЖ показан отрицательный эффект от интрами окардиальной трансплантации мононуклеарной фракции КМ и положительный после трансплантации нСККМ. Однако в этих исследованиях не изучались резервы сократительной функции ЛЖ. Также невозможно сделать выводы о необ ходимости предифференцировки СККМ перед транс плантацией.

В настоящем исследовании, применив методику Neely для изучения сократительной функции миокарда после трансплантации в него различных фенотипов СККМ, мы по лучили возможность применения дозированных нагрузочных тестов для подробного изучения отличий адаптационных возможностей миокарда, работающего в условиях высоких нагрузок.

Полученные нами данные свидетельствуют о существу ющих различиях в действии разных фенотипов СККМ. Так, кСККМ потенциально могут применяться для лечения со стояний, сопровождающихся снижением фракции выброса ЛЖ, при сердечной недостаточности (ДКМП, постинфаркт ный кардиосклероз, приобретенные пороки сердца). эСККМ могут найти применение в лечении состояний, когда имеется преходящий дефицит кровоснабжения миокарда (стенокар дия напряжения). нСККМ по способу действия занимают промежуточное положение и могут применяться, например, при ишемической кардиомиопатии.

Выводы

1. Исследование насосной функции интактных и повреж денных сердец на стендовой установке в условиях примене ния дозированных пред и постнагрузок на ЛЖ позволяет выявить признаки скрытой левожелудочковой недостаточ ности в криоповрежденных сердцах и признаки ослабления ее при трансплантации в миокард СККМ.

2. Пересаженные в перинекротическую зону аутологич ные СККМ при воздействии дозированных пред и постнаг рузок ослабляют признаки левожелудочковой недостаточно сти и повышают адаптационные резервы миокарда вне зависимости от своего фенотипа.

3. кСККМ повышают резистентность миокарда ЛЖ к нагрузочным тестам преимущественно за счет повышения сократимости и силы сокращения.

4. эСККМ повышают устойчивость миокарда к высоким постнагрузкам, главным образом, за счет повышения эф фективности перфузии миокарда.

5. нСККМ по эффективности адаптирующего воздей ствия на миокард занимают промежуточное положение между кСККМ и эСККМ по показателям сократимости и пер фузии миокарда.

6. Выбор направления предифференцировки СККМ клеток перед трансплантацией следует проводить с учетом характера патологических процессов в миокарде: для кор рекции сократительной функции предпочтительнее ис пользовать кСККМ, при относительном дефиците крово снабжения миокарда показано применение эСККМ, при сочетанном поражении целесообразнее трансплантировать нСККМ.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 2, 2007

Оригинальные исследования

ЛИТЕРАТУРА

1. Oswald J., Boxberger S., Jorgensen B. et al. Mesenchymal Stem Cells Can Be Differentiated Into Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells 2004; 22: 377 84.

2. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S. et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J. Clin. Invest. 1999; 103:697 705.

3. Neely J.R., Liebermeister H., Battersby E.J., Morgan H.E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am. J. Physiol. 1967; 312(4): 804 14.

4. Saito T., Kuang J.Q., Lin C.C., Chiu R.C. Transcoronary implantation of bone marrow stromal cells ameliorates cardiac function after myocardial infarction. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2003; 126: 114 23.

5. Tomita S., Li R.K., Weisel R.D. et al. Atologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circ. 1999; 100 Suppl II: II247 II256.

6. Матюков A.A., Цупкина H.В., Власов В.В. и др. Сравнение влияния интрамиокардиальной аутотрансплантации различных клеток костного мозга на репарацию миокарда кроликов после инфаркта. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007; 2(1): 48 52.

7. Liu J., Hu Q., Wang Z. et al. Autologous stem cell transplantation for myocardial repair. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2004; 287: H501 H511.

8. Amado L.C., Saliaris A.P., Schuleri K.H. et al. Cardiac repair with intramyocardial injection of allogeneic mesenchymal stem cells after myocardial infarction. PNAS 2005; 102(32): 11474 9.

9. Makkar R.R., Price M.J., Lili M. et al. Intramyocardial Injection of Allogenic Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells Without Immunosuppression Preserves Cardiac Function in a Porcine Model of Myocardial Infarction. J. Cardiovasc. Pharmacol. Ther. 2005; 10(4): 225 33.

10. Silva G.V., Litovsky S., Assad J.A.R. et al. Mesenchymal Stem Cells Differentiate into an Endothelial Phenotype, Enhance Vascular Density, and Improve Heart Function in a Canine Chronic Ischemia Model. Circ. 2005; 111: 1506.

11. Потапов И.В., Башкина Л.В., Онищенко Н.А. и др. Характеристика насосной функции сердца после трансплантации фетальных кардиомиоцитов и мезехимальных стволовых клеток костного мозга в криоповрежденный миокард. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2003; 3: 50 5.

12. Шумаков В.И., Онищенко НА, Расулов М.Ф. и др. Использование предифференцированных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения глубоких ожоговых ран. Вестник хирургии им И.И. Грекова 2003; 162(4): 38 41.

13. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. Дифференцировка стромальных стволовых клеток костного мозга в кардиомиоцито подобные клетки у различных видов млекопитающих. Бюл. эксперимент, биол. и мед. 2003; 4: 461 5.

14. Потапов И.В., Кириллов И А, Крашенинников М.Е. и др. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга как источник получения клеток для восстановительного морфогенеза миокарда. Тезисы Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении»; 2006 24 26 мая; Москва.

Поступила 07.05.2007

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 2, 2007

А