Свойства и возможная биологическая роль альфа-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas spp. Кмм 701

Вестник ДВО РАН. 2017. № 2

УДК 577.2

Л.В. СЛЕПЧЕНКО, Л.А. БАЛАБАНОВА, И.Ю. БАКУНИНА, В В. ИСАКОВ, А.Б. ПОДВОЛОЦКАЯ, М.Г. ЕЛИСЕЙКИНА, Ю.А. НОСКОВА, В.А. РАССКАЗОВ

Свойства и возможная биологическая роль альфа-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas spp. КММ 701

В присутствии рекомбинантной альфа-галактозидазы a-PsGal из морской бактерии Pseudoalteromonas spp. КММ 701 могут происходить процессы как гидролиза, так и трансгликозилирования полисахаридных структур, существенно меняющие морфологию внеклеточного матрикса бактерий. При ферментативной обработке биопленок штаммов Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa и Salmonella enteritidis выявлено присутствие галактозосодержащих субстратов для a-PsGal. Методы ТСХ, ЯМР- и MALDI-TOF-масс-спектрометрии подтвердили наличие a-(1-6)-, a-(1-3)-, а-(1-2)-связанных продуктов реакции трансгликозили-рования a-PsGal.

Ключевые слова: биопленка, внеклеточный полисахаридный матрикс, гидролиз, трансгликозилирование.

Properties and possible biological role of alpha-galactosidase from marine bacterium Pseudoalteromonas spp. КММ 701. L.V. SLEPCHENKO1, L.A. BALABANOVA1,2, I.Yu. BAKUNINA1, V.V. ISAKOV1, A.B. PODVOLOTSKAYA2, M.G. ELISEIKINA3, Yu.A. NOSKOVA1, V.A. RASSKAZOV1 (1G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, 2Far East Federal University, 3National Scientific Center of Marine Biology, FEB RAS, Vladivostok).

In the presence of the recombinant alpha-galactosidase a-PsGal from marine bacterium Pseudoalteromonas spp. KMM 701, the processes of hydrolysis and transglycosylation of polysaccharide structures may occur significantly altering the morphology of the bacterial extracellular matrix. The enzymatic treatment of biofilms from Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa and Salmonella enteritidis isolates revealed the presence of galactose substrates for a-PsGal. TLC, NMR- and MALDI-TOF-mass-spectrometry confirmed the presence of a-(1-6)-, a-(1-3)-, a-(1-2)-linked products of the reaction of transglycosylation for a-PsGal.

Key words: biofilm, extracellular polysaccharide matrix, hydrolysis, transglycosylation.

*СЛЕПЧЕНКО Любовь Васильевна - аспирант, БАКУНИНА Ирина Юрьевна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, ИСАКОВ Владимир Владимирович - кандидат химических наук, НОСКОВА Юлия Александровна - кандидат биологических наук, научный сотрудник, РАССКАЗОВ Валерий Александрович -кандидат биологических наук, заведующий лабораторией (Тихоокеанский институт биоорганической химии им Г.Б. Елякова, Владивосток), БАЛАБАНОВА Лариса Анатольевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (Тихоокеанский институт биоорганической химии им Г.Б. Елякова, Владивосток; Дальневосточный федеральный университет, Владивосток), ПОДВОЛОЦКАЯ Анна Борисовна - кандидат медицинских наук, доцент (Дальневосточный федеральный университет, Владивосток), ЕЛИСЕЙКИНА Марина Геннадьевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (Национальный научный центр морской биологии ДВО РАН, Владивосток). *Е-таП: slepchenko.lubov@gmail.com

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 15-04-08654, 16-34-00431), научного фонда ДВФУ (проект № 14-08-01-11_ и).

Введение

Как известно, около 99 % всех бактерий существует на Земле в форме биопленок, состоящих из клеточного компонента - монокультур или ассоциации культур микроорганизмов, и внеклеточного матрикса, представляющего собой сложную биохимическую смесь полисахаридов, гликопептидов, нуклеиновых кислот и липидов [2, 3]. В морской среде, где процесс адгезии микроорганизма к субстрату может быть затруднен сильным течением, низкими температурами, высоким давлением и жесткой конкуренцией за дефицитные источники питания со стороны других организмов, обитателям приходится вырабатывать особые приспособления для выживания, включая уникальные ферментные системы. Сложные структуры внеклеточного матрикса морских микроорганизмов также являются одним из механизмов, позволяющим им сосуществовать в многовидовом сообществе других участников биологической ниши. Так, основным компонентом внеклеточного матрикса Vibrio cholerae являются полисахариды, имеющие в своем составе глюкозу, галактозу, N-ацетилгалактозамин и маннозу, которые не только помогают бактерии выживать в морской среде, но и являются факторами вирулентности, способствуя проникновению в организм человека в период сезонной эпидемии [6]. Бактерии рода Pseudoalteromonas, часто встречающиеся в моллюсках, рыбах, губках и водорослях, особенно предрасположены к образованию биопленок и могут как выполнять роль симбионтов этих эукариотических организмов, так и быть для них патогенами [13]. И в том и в другом случае внешняя мембрана этих бактерий насыщена полисахаридами, которые играют важнейшую роль в инициации адгезии бактериальной клетки к поверхности субстрата, после которой следует фаза колонизации, запускающая программу конкурентной борьбы против других колонизирующих данную поверхность бактерий, включая синтез специфических ферментов и антибиотиков [11]. Недавно было показано, что и третья стадия формирования биопленок - стадия дисперсии, или распространения на другие территории, также является важнейшим этапом в процессе размножения и колонизации бактериями новых поверхностей при ухудшении условий окружающей среды. Важность этого процесса подтверждается активизацией систем клеточной сигнальной трансдукции, экспрессии эндогенных и экзогенных ферментов, сенсорных систем [9].

Таким образом, одной из стратегий борьбы с биопленками является ферментативная деградация внеклеточного матрикса. В литературе имеются сведения о том, что бактериальные биопленки могут разрушаться при обработке их ДНКазами [12,14], протеазами [7], полисахарид-деградирующими ферментами [10]. Одним из наиболее распространенных полисахаридов матрикса является полимер р-1,6-Ы-ацетил-Э-глюкозамин (PNAG), обнаруженный в разных видах бактерий, в том числе Escherichia coli, Streptococcus epider-midis, Staphylococcus aureus, Yersinia pestis, Actinobacillus spp., Aggregatibacter actinomy-cetemcomitans, Bordetella spp. [9]. Дисперсин B (Р-гесозаминидаза) гидролизует гликозид-ные связи PNAG матрикса биопленок ряда бактерий. В его присутствии может полностью ингибироваться образование биопленок штаммов E. coli, а также S. epidermidis, S. aureus, Psedomonas fluorescens и Y. pestis [8].

Кроме проблем в медицине способность бактерий формировать биопленки вызывает серьезные трудности и в пищевой промышленности, повышая риск заражения пищи патогенными микроорганизмами и создавая условия для формирования антибиотикорези-стентных, устойчивых к дезинфектантам и УФ-облучению штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, что значительно увеличивает риски для здоровья людей и создает предпосылки для циркуляции генетического материала в окружающей среде.

Так как основную часть внеклеточного матрикса бактерий составляют полисахариды, целью данной работы было изучение механизма ферментативного действия рекомбинант-ной а-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas spp. КММ 701 с использованием коммерческих гликозидов и ее биологической активности в отношении биопленок

условно-патогенных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa и Salmonella enteritidis, выделенных из продуктов питания.

Материалы и методы

Выделение и идентификация штаммов проводились общепринятыми методами в условиях аккредитованной лаборатории (ISO/IEC 17025) с использованием микробиологического анализатора БакТрак 4300 SY-LAB Gerate GmbH (Австрия) в 1 г продукта, с последующим выделением и идентификацией чистой культуры доминирующего вида с помощью автоматизированной системы МикроТакс, SY-LAB Gerate, GmbH на планшете МикроТакс-Е. Дополнительные идентификационные тесты ставились по общепринятым методикам. Бактерии рода Salmonella выделялись из 50 г продукции классическими методами, с предварительным скринингом со среды предобогащения методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе Rotor Gen 6000 с использованием промышленной тест-системы.

Изучение адгезивной и пленкообразующей активности изучаемых штаммов проводили в стандартных 96-луночных полистироловых планшетах. Бактерии выращивали в мя-сопептонном бульоне в течение 18-24 ч при температуре 18 °С. Затем микроорганизмы в дозе 107 мк/мл в количестве 200 мкл вносили в лунки планшета. Для каждого опыта использовали 3-4 повтора. Инкубировали планшет в течение суток при температуре 18 °С. Среду с клетками удаляли из лунок, промывали 2-4 раза стерильным 0,85%-ным раствором NaCl для удаления неприкрепившихся клеток и компонентов среды. В каждую лунку вносили по 200 мкл 0,5%-ного водного раствора кристаллического фиолетового и инкубировали планшет при комнатной температуре 15 мин. После удаления несвязанного красителя лунки промывали 3-4 раза дистиллированной водой до исчезновения окраски. Для количественного определения биопленки в каждую лунку планшета добавляли 200 мкл 96%-ного этанола, содержащего 2%-ную уксусную кислоту (объем/объем), инкубировали планшет при комнатной температуре 15 мин. Наличие и количество биопленки оценивали в планшет-ридере БиоРад (X = 600 нм). Результаты пересчитывали, определяя коэффициент пленкообразования Кбп = ODопыта/ODконтроля. Контрольные лунки учитывали на каждом планшете. Окончательный результат оценивали, используя критерий достоверности Стьюдента.

Для выявления действия фермента на биопленки различные его концентрации добавляли в лунки после формирования биопленки при 20-22 °С. Затем систему инкубировали в течение 1-24 ч при той же температуре. Дальнейшую обработку лунок планшета и окраску биопленки проводили, как описано выше.

Для визуализации эффекта действия фермента на биопленки использовали электронную сканирующую микроскопию. Для этого бактерии выращивали на мясопептонном агаре до созревания биопленок в течение 10 дней при комнатной температуре (24 °С). Затем кусочки агара вместе с покрывающими его бактериями фиксировали в 2,5%-ном глутаровом альдегиде, приготовленном на 0,1 М какодиллатном буфере (рН 7,2) в течение 24 ч. Затем промывали в том же буфере 24 ч, дополнительно фиксировали в 0,5%-ном OsO4 (тетроксид осмия), приготовленном на дистиллированной воде, 20 мин, промывали 5 раз в дистиллированной воде в течение 5 ч. Затем образцы обезвоживали в серии разведения этанола и помещали в ацетон. Образцы высушивали в критической точке 2 ч, закрепляли на столиках для СЭМ, используя двустороннюю ленту, и напыляли хромом толщиной 10-15 нм (Q150 TES, Quorum Technologies). Образцы анализировали с использованием Evo 40 (Carl Zeiss). Разгонное напряжение составляло 29 кВ.

Рекомбинантную альфа-галактозидазу a-PsGal из морской бактерии Pseudoalteromo-nas spp. KMM 701 для исследования ее действия на бактериальные пленки получали на основе плазмиды pET40 b(+), как описано ранее [4].

Исследование механизма действия и свойств фермента проводили методами ТСХ, ЯМР- и MALDI-TOF-масс-спектрометрии по идентификации продуктов каталитических реакций с использованием мелибиозы и п-нитрофенил-а-галактопиранозида в качестве субстратов.

Результаты и обсуждение

Поскольку известно, что основную часть внеклеточного матрикса бактерий составляют полисахариды, мы изучили способность одной из О-гликозидгидролаз морских бактерий принимать участие в трансформации углеводов и углеводсодержащих биополимеров и влиять на формирование биопленки модельных микроорганизмов Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa и Salmonella enteritidis, выделенных из мясных замороженных полуфабрикатов. В экспериментах была использована рекомби-нантная а-галактозидаза морской бактерии Pseudoalteromonas spp. КММ 701 (а-PsGal) [4].

Известно, что a-D-галактозидаза катализирует гидролиз а-галактозидной связи в таких олигосахаридах, как раффиноза, мелибиоза, стахиоза, галактоманнаны, а также в глико-конъюгатах, включая гликопротеины и гликолипиды [1].

Среди бактериальных экзополисахаридов встречаются сложные разветвленные полимеры, имеющие в своем составе глюкозу, галактозу, маннозу, рамнозу, маннуроновую и гулуроновую кислоты [5]. Полисахариды не только помогают бактериям выживать в морской среде, но являются факторами, способствующими проникновению их в организм человека в период сезонных эпидемий. Данные о полном составе полисахаридов внеклеточного матрикса биопленок многих бактерий пока отсутствуют. Однако ранее было установлено, что а-PsGal из морской бактерии Pseudoalteromonas spp. KMM 701 обладает свойством разрушать пленки патогенных микроорганизмов Corynebacterium diphtheriae, образующиеся на слизистых поверхностях человека. Обработка эпителиальных клеток гортани человека препаратом такого фермента значительно снижала адгезию возбудителя дифтерии С. diphtheriae [6].

Методами спектрофотометрии было обнаружено, что в первые часы (1-12) действия фермента на культуры исследуемых бактерий масса биопленки уменьшалась на 7-8 % у S. aureus и B. subtilis и на 60 и 50 % у P. aeruginosa и S. enteritidis. При нанесении 15 мкл а-PsGal в концентрации 0,08 мг/мл на уже сформированную зрелую пленку P aeruginosa и выдерживании ее в течение 12 ч происходили явные изменения в структуре матрикса в виде образования рытвин, каналов и глубоких ям между скоплениями клеток (рис. 1). У всех исследуемых штаммов структура биопленки становилась более рыхлой, что приводило к увеличению ее проницаемости для других веществ.

Однако результаты электронной микроскопии наряду с эффектом деградации биопленки обнаружили наличие значительного изменения морфологии внеклеточного матрикса спустя 24 ч после инкубации с ферментом (рис. 2). Биопленки меняли свою структуру с равномерно рыхлой за счет возникших пустот и каналов между скоплениями клеток на непрозрачную монолитную субстанцию, покрывающую значительную часть клеток (рис. 2). Количество клеток при этом уменьшалось. Очевидно, что в биопленках всех исследуемых штаммов присутствует то или иное количество галактозосодержащих субстратов для осуществления реакции гидролиза в присутствии фермента а-PsGal. Однако появление большого количества свободной галактозы в результате действия фермента могло запустить синтез новых олиго- и полисахаридных структур во внеклеточном матриксе.

Мы предположили, что а-галактозидаза в природном холодостойком штамме Pseudoalteromonas spp. КММ 701 может выполнять и синтетическую функцию при формировании биопленки, поскольку эти бактерии часто оказываются в экстремальных условиях выживания. Выяснению механизма действия фермента на формирование структуры биопленки способствовало дальнейшее исследование свойств фермента, а именно

1 Mm EHT = 29.00 kV Mag = 10.66 К X Signal A = SE1 Date :13 Jul 2015

I Probe = 4pA WD = 8.0 mm Photo No. = 7760 Time :14:37:25 РЩ j

Рис. 1. Структура 10-дневной биопленки P. aeruginosa, обработанной рекомбинант-ной альфа-галактозидазой Pseudoalteromonas spp. КММ 701, через 12 ч инкубирования при комнатной температуре

способности к трансгликозилированию - переносу галактозной группы на другие субстраты (олиго- и полисахариды).

Методы ТСХ, ЯМР- и MALDI-TOF-масс-спектрометрии подтвердили наличие продуктов реакции трансгликозилирования, катализируемой ферментом a-PsGal. На рис. 3 представлены продукты гидролиза и трансгликозилирования мелибиозы

Рис. 2. Действие галактозидазы a-PsGal на культуру Pseudomonas aeruginosa. А - граница между обработанным

Мелибиоза

342,2 кДа 0,39 Rf

+ г-Рвва!*

Глюкоза

Галактоза

но „-он 1Н 5,28 м.д.

1Н 5,23 м.д. 1Н 5,26 м.д.

но

1Н 4,58 м.д. 180,14 кДа

0,55

он

1Н 4,64 м.д. 180,14 кДа 0,52 ИГ

но\ \ он , *

н° гОН

но\ О

1Н 4,59 м.д. ° 342,205 кДа

0,39 КГ

он

1Н 5,22 м.д. 342,205 кДа 0,39 IV

р-МР11-альфа-0-галактопиранозид

301,165 кДа НО <-0Н 0,82 Ю

о + г-Рэ6а1А

ОН о-// \— М;

\ -

\=/ о

но ^он

1Н 5,26 м.д.

1Н 5,91 м.д.

он1Н4,58 м.д.

но

но _

он~ 180,14 кДа 0,52 ГС

1Н 4,98 м.д. но ^ОН

но.

1Н 5,22 м.д.

но но

он

\ о + о

(1,2%) 1Н 5,87 м.д.

но

но \

342,205 кДа 0,39 ЯГ

з , —

ОН

о

342,205 кДа 0,39 И

463.185 кДа

Рис. 3. Продукты гидролиза-трансгликозилирования мелибиозы и п-нитрофенил-а-галактопиронозида под действием альфа-галактозидазы

и п-нитрофенил-а-галктопиранозида под действием a-PsGal. В 1Н ЯМР-спектрах продуктов гидролиза мелибиозы, полученных при действии альфа-галактозидазы, помимо сигналов аномерных атомов таких продуктов, как глюкоза (45,6 %) и галактоза (27,3 %), были отмечены сигналы аномерных атомов, характерных для дигалактозидов Gala1-6Gal (5,5 %) и Gala1-4Gal (0,6 %) (рис. 3). При действии альфа-галактозидазы на коммерческий хромогенный субстрат п-нитрофенил-а-галактопиранозид основными продуктами трансгликозилирования являлись замещенные паранитрофенилом а-(1-6) (8 %) и а-(1-3) (1,2 %) связанные дисахариды галактозы, а также а-(1-6) (3,1 %) и а-(1-4) (1 %) связанные дисахариды галактозы.

Таким образом, установлено, что помимо гидролитического действия на галактозосо-держащие субстраты в биопленке бактерий, приводящего к их разрыхлению, рекомби-нантная альфа-галактозидаза морской бактерии Pseudoalteromonas spp. КММ 701 может одновременно принимать участие и в синтезе новых полисахаридов, образуя более плотную структуру (рис. 2). Так как a-PsGal оказывала подобное действие на все исследуемые штаммы микроорганизмов, можно сделать вывод о содержании значительного количества галактозы в структурных компонентах их биопленок. Механизм биологического действия альфа-галактозидазы на биопленки и штаммоспецифический углеводный состав биопленок каждого микроорганизма требуют дополнительного изучения.

Современные представления о биопленках диктуют необходимость изменения подходов к профилактике, диагностике и лечению инфекций в самых различных областях медицины и ветеринарии. Рекомбинантная альфа-галактозидаза может оказаться весьма полезной как инструмент в исследовании полисахаридного состава бактериальных пленок для установления видо- и штаммоспецифических механизмов их образования и соответственно выявления различных способов предотвращения пленкообразования. Психрофиль-ность а-галактозидазы Pseudoalteromonas spp. КММ 701 с оптимумом действия 20-22 °С является преимуществом в использовании фермента как для разрыхления биопленок бактерий на ранних стадиях гидролиза олигосахаридов в целях увеличения проницаемости антибактериальных веществ, так и для синтеза новых полисахаридных структур с целью увеличения жизнеспособности некоторых полезных бактерий кишечной микрофлоры или микрофлоры очистных сооружений.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бакунина И.Ю., Сова В.В., Недашковская О.И., Кульман P.A., Лихошерстов JI.M., Мартынова М.А., Михайлов В.В., Елякова Л.А. а-Галактозидаза из морской бактерии Pseudoalteromonas spp. КММ 701 // Биохимия. 1998. Т. 63. С. 1420-1427.

2. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. 2004. Т. 11. С. 1-12.

3. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина // Журн. микробиол. 2011. Т. 33. С. 99-109.

4. Bakunina I.Y., Balabanova L.A., Golotin V.A., Slepchenko L.V., Isakov V.V., Rasskazov V.A. Stereochemical course of hydrolytic reaction catalyzed by alpha-galactosidase from cold adaptable marine bacterium of genus Pseudo-alteromonas // Frontiers in Chemistry. 2014. Vol. 2. P. 1-6.

5. Balabanova L.A., Bakunina I.Y., Nedashkovskaya O.I., Makarenkova I.D., Zaporozhets T.S., Besednova N.N., Zvyagintseva T.N., Rasskazov V.A. Molecular Characterization and Therapeutic Potential of a Marine Bacterium Pseudoalteromonas spp. KMM 701 a-Galactosidase // Mar Biotechnol. 2010. Vol. 12. P. 111-120.

6. Fong J.C.N., Syed K.A., Klose K.E., Yildiz F.H. Role of Vibrio polysaccharide (vps) genes in VPS production, biofilm formation and Vibrio cholerae pathogenesis // Microbiology. 2010. Vol. 156. P. 2757-2769.

7. Gilan I., Sivan A. Effect of proteases on biofilm formation of the plastic-degrading actinomycete Rhodococcus ruber C208 // FEMS Microbiol Lett. 2013. Vol. 342. P. 18-23.

8. Itoh Y., Wang X., Hinnebusch B.J., Preston III J.F., Romeo T. Depolymerization of beta-1,6-N-acetyl-D-glucos-amine disrupts the integrity of diverse bacterial biofilms // Bacteriol. 2005. Vol. 187. P. 382-387.

9. Karatan E., Watnick P. Signals, regulatory networks, and materials that build and break bacterial biofilms // Microbiol. Mol. Biol. Rew. 2009. Vol. 73. P. 310-347.

10. Landini P., Antoniani D., Burgess J., Nijland R. Molecular mechanisms of compounds affecting bacterial biofilm formation and dispersal // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. Vol. 86. P. 813-823.

11. Mai-Prochnow A., Webb J.S, Ferrari B.C., Kjelleberg S. Ecological advantages of autolysis during the development and dispersal of Pseudoalteromonas tunicata biofilms // Appl. Environ. Microbiol. 2006. Vol. 72. P. 5414-5420.

12. Nijland R., Hall M.J., Burgess J.G. Dispersal of biofilms by secreted, matrix degrading, bacterial DNAse // PLoS One. 2010. Vol. 5, N 12. P. 1-8.

13. Rao D.T., Skovhus N., Tujula C., Holmstrom I., Webb D.J.S., Rjelleberg S. Ability of Pseudoalteromonas tunicata to colonize natural biofilms and its effect on microbial community structure // FEMS Microbiology Ecology. 2010. Vol. 73. P. 450-457.

14. Tetz G.V, Artemenko N.K., Tetz V.V. Effect of DNase and Antibiotics on Biofilm Characteristics // Antimicrob. Agents Chemother. 2009. Vol. 53. P. 1204-1209.