СПОСОБЫ КОМПЛЕКСНОЙ ОЦЕНКИ ГЛУБИНЫ ДЕПРИМИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
METHODS FOR FULL ASSESSMENT OF EXTENT OF DEPRIVATION ACTION OF CHEMICAL SUBSTANCES

Изобретение относится к области медицины, в частности фармакологии, физиологии и токсикологии. Предназначено для унификации подходов к оценке депримирующих эффектов, вызванных химическими соединениями, и оптимизации поиска средств патогенетической терапии отравлений в эксперименте.
Имеются различные способы использования химических веществ для моделирования патологических состояний, сопровождающихся угнетением функций центральной нервной системы. В работах отечественных и зарубежных авторов по экспериментальному моделированию коматозных состояний отсутствуют адекватные критерии оценки тяжести состояний у животных (Ryan C.J. Multisorbent plasma perfusion in fulminant hepatic failure: effects of duration and frequency of treatment in rats with grade III hepatic coma / C.J.Ryan // Artif. Organs. - 2001. - Vol.25, №2. - P.109-118., Siglin J.C. Laboratory animal management / J.C.Siglin, W.H.Baker /Handbook of toxicology/ cd. M.G.Derelanko, M.A.Holinger. - 2nd. ed. - USA: CRC Press LLS, 2002. - P.12-79, Шелыгин К.В. Использование лабораторных животных в токсикологическом эксперименте. Методические рекомендации [Электронный ресурс] / К.В.Шелыгип, И.А.Кирпич, В.Я.Леонтьев. - Архангельск, 2002. - Режим доступа: "http://www.psychoshell.narod.ru", свободный, Рейнюк В.Л. Кинетика эндогенного аммиака при отравлениях веществами седативно-гипнотического действия; роль ее нарушений в формировании летального исхода: автореф. дис. … д-ра мед. наук / В.Л.Рейнюк. - СПб, 2008. - 41 с.).
Недостатками этих способов являются низкая информативность, прогностическая неточность и высокая субъективность диагностики тяжести состояний. Кроме того, отсутствие стандартной процедуры оценки показателей приводит к низкой межлабораторной повторяемости экспериментальных данных, что приводит к ошибочной интерпретации выраженности нарушений неврологических и витальных функций и эффектов фармакологических препаратов при проведении доклинических исследований.
Нами впервые предложен способ универсальной, комплексной оценки глубины депримирующего действия химических веществ у экспериментальных животных. Отличием предлагаемого способа от других является простота воспроизводства, высокая надежность (надежность данного способа оценки составляет более 80%) и объективное экспертного заключения о степени тяжести состояния и прогнозе исхода интоксикации.
Цель изобретения - разработать способы комплексной оценки глубины депримирующего действия веществ у лабораторных животных.
Цель достигается тем, что, используя объективные критерии оценки неврологического статуса и показатели витальных функций, рассчитывается индекс глубины комы (ИГК), который позволяет достаточно точно оценить тяжесть состояния и прогноз исхода интоксикации депримирующими агентами.
Алгоритм создания способов комплексной оценки депримирующего действия веществ выглядит следующим образом.
На первом этапе производится определение среднелетальных доз модельных веществ. Затем животным вводят химические вещества в диапазоне доз, вызывающих депримирующие эффекты с оценкой неврологических и вегетативных показателей, выраженных в баллах:
1. Поведение животных (ПЖ): активная деятельность (груминг, принятие пищи и др.), сон, при взятии на руки активные целенаправленные реакции - 4 балла; лежит, при взятии на руки движения замедленные, но сохраняется их целенаправленность к избеганию, поворот головы - 3 балла; лежит на животе или в боковом положении, при взятии на руки движения нецеленаправленные - 2 балла; лежит на животе или боковом положении, при взятии на руки движения отсутствуют - 1 балл.
2. Реакция на обонятельный (пищевой) раздражитель (шоколад) (РО): активная с движением, точная ориентация к стимулу - 3 балла; ослабленная реакция, поворотом головы с движением по направлению к стимулу - 2 балла; отсутствует - 1 балл.
3. Аудиомоторная реакция (АР): выражена (проявляется реакцией избегания, вытягиванием задних конечностей, сгибанием передних конечностей, выгибанием спины) - 3 балла; ослаблена (в том числе сокращением круговой мышцы глаза) - 2 балла; отсутствует - 1 балл.
4. Поисковая реакция (ПР): активная деятельность (обнюхивание, двигательная активность) - 3 балла; сидит, поисковая реакция не выражена - 2 балла; поисковая реакция отсутствует, лежит на животе или боковое положение - 1 балл.
5. Рефлекс хватания за решетку: выражен (при поднятии крысы сила держания возрастает) - 3 балла; снижен - 2 балла; отсутствует - 1 балл.
6. Рефлекс переворачивания (РП): сохранен - 4 балла; замедлен - 3 балла; отсутствие переворачивания при сохраненных попытках - 2 балла; отсутствует - 1.
7. Тонус мышц (ТМ): нормальный тонус (упругий тонус брюшной стенки тонус конечностей умеренный) - 3 балла; дистонус (снижен или повышен) - 2 балла; атония - 1 балл.
8. Тестирование равновесия на наклонной поверхности: животное быстро поворачивается мордочкой к верхней части платформы или обследует платформу - 4 балла; замедленно переворачивается, сидит или лежит, отдельные целенаправленные движения - 3 балла; отсутствует переворачивание, могут быть некоординированные движения - 2 балла; отсутствуют движения, боковое положение - 1 балл.
9. Тестирование равновесия на горизонтальном стержне (без вращения) (ТГС): животное сидит более 30 с - 3 балла; животное неуклюже выполняет данный тест и быстро падает (менее 30 с) - 2 балла; не выполняет тест (падает), не удается посадить на стержень - 1 балл.
10. Нарушение координации (атаксия): отсутствует - 3 балла; отмечается атаксия - 2 балла; невозможно проверить (отсутствие движений, боковое положение) - 1 балл.
11. Проба на нашатырный спирт (ПНС): выраженная реакция на раздражитель избеганием - 3 балла; ослабленная реакция, сохранен чихательный рефлекс - 2 балла; отсутствует - 1 балл.
12. Тактильно-болевая чувствительность (БР): реагирует на одиночное воздействие, агрессией или избеганием - 4 балла; слабая реакция отползанием или поворотом - 3 балла; нелокализованный ответ, в том числе сокращением брюшной стенки - 2 балла; отсутствует - 1 балл.
13. Рефлекс сгибания задних конечностей: быстрое сгибание ступни, которое ненадолго сохраняется - 4 балла; замедленное сгибание ступни, которое длительно сохраняется - 3 балла; отсутствие сгибания ступни после одиночного стимула, нелокализованный ответ сокращением брюшной стенки - 2 балла; отсутствует, даже после многократного стимула - 1 балл.
14. Состояние зрачков (СЗ): норма- 2 балла; миоз или мидриаз - 1 балл.
15. Зрачковый рефлекс (реакция зрачков на свет) (ЗР): выраженный - 3 балла; ослаблен - 2 балла; отсутствует - 1 балл.
16. Мидриаз и отсутствие зрачкового рефлекса (МОР): сочетание мидриаза и отсутствие реакции зрачка не выявляется - 2 балла; зрачок расширен и на свет не реагирует - 1 балл.
17. Корнеальный рефлекс (КР): выражен - 3 балла; ослаблен - 2 балла; отсутствует - 1 балл.
18. Глоточный рефлекс (ГР): выражен - 3 балла; ослаблен - 2 балла; отсутствует - 1 балл.
19. Судорожная активность (СА): судороги отсутствуют - 4 балла; локальные судороги или миоклонии - 3 балла; генерализованные судороги - 2 балла; опистотонус - 1 балл.
Помимо неврологических показателей у животных оцениваются витальные функции: частота дыханий, частота сердечных сокращений и ректальная температура. Дополнительной оценке подвергаются характер и ритм дыхания, с выражением в баллах: ритмичное, 100-150 дыхательных движений в минуту - 4 балла; брадипноэ (тахипноэ) - 3 балла; брадипноэ с участием вспомогательных мышц, ЧД до 40 в мин - 2 балла; патологическое дыхание, длительные промежутки апноэ, ЧД менее 20-1 балл.
Полученные первичные данные подвергаются статистической обработке, по результатам которой создается математическая модель, где рассчитывается индекс глубины комы, позволяющий оценить тяжесть состояния отравленного животного.
Приводим примеры практической реализации способа универсальной оценки депримирующего действия при интоксикациях.
Пример 1. Способ оценки тяжести состояния животных при отравлении производными барбитуровой кислоты.
Первый этап определение среднесмертельной дозы для тиопентала натрия, которая в течение суток составила 85±1,6 мг/кг.
50
На следующем этапе эксперимента белым беспородным крысам-самцам внутрибрюшинно вводили тиопентал натрия в диапазоне доз от 0,7 до 1,5 ЛД. Количество животных и дозы представлены в таблице.
Доза, мг/кг
Количество животных, голов
63
9
75
18
90
26
95
14
135
6
Неврологические показатели и витальные функции у животных, отравленных тиопенталом натрия, оценивались в баллах через 30 мин, 1, 3, 6 и 8 ч после инъекции токсиканта. Полученные результаты подвергались статистической обработке, в результате которой с учетом наиболее значимых изменений оцениваемых показателей было разработано уравнение, позволяющее судить о тяжести состояния животного;
ИГК=5*ПЖ+3*ТГС+2*БР+3*РС+3*МОР+2*КР+ГР+2*ХРД+0,01 ЧСС
где ИГК - индекс глубины комы, балл; ПЖ - поведение животных, балл; ТГС - тестирование равновесия на горизонтальном стержне (без вращения); БР - тактильно-болевая чувствительность, балл; PC - рефлекс сгибания задних конечностей, балл; MOP - мидриаз и отсутствие зрачкового рефлекса, балл; КР - корнеальный рефлекс, балл; ГР - глоточный рефлекс, балл; ХРД - характер и ритм дыхания, ЧСС - частота сердечных сокращений (сокращений в мин); цифры 5, 4, 3, 2, 1, 0,01 - коэффициенты значимости признака (коэффициенты регрессии).
При интерпретации значений, рассчитанных по формуле глубины тяжести комы, были статистически обоснованы следующие критерии: более 68 баллов - состояние функционирования нервной системы в пределах физиологической нормы; от 68 до 59 баллов - оглушение; от 58 до 48 баллов - сопор; от 47 до 38 баллов - кома умеренная; от 37 до 32 баллов - кома глубокая и менее 32 баллов - запредельная кома.
Надежность данного метода составила 85,7%.
Пример 2. Способ оценки тяжести состояния животных при отравлении производными гамма-оксимаслянной кислоты.
На первом этапе определили среднесмертельную дозу оксибутирата натрия, которая в течение 1 суток составила 2,75±0,1 г/кг.
50
Затем белым беспородным крысам-самцам вводили внутрибрюшинно оксибутират натрия в виде 20% раствора в диапазоне доз от 0,7 до 1,2 ЛД. Количество животных и дозы токсиканта в таблице.
Доза, г/кг
Количество животных, голов
2,0
8
2,5
8
3,0
8
4,0
8
У отравленных животных оценивали неврологические показатели и витальные функции, выраженные в баллах. С помощью пошаговой регрессии в было разработано решающее правило для расчета индекса глубины комы (ИГК):
ИГК=8*МОР+4*ПЖ+4*ГР+3*АР+2*БР+2*ПНС+КР+PC
ИГК более 67 баллов - состояние в пределах физиологической нормы; от 58 до 67 баллов - оглушение; от 50 до 57 баллов - сопор; от 41 до 49 баллов - кома умеренная; от 34 до 40 баллов - кома глубокая и 33 и менее - терминальная кома.
Пример 3. Способ оценки тяжести состояния животных при отравлении 1,4-бутандиолом.
50
Среднесмертельная доза для 1,4-бутандиола в течение 1 суток составила 1,2±0,04 г/кг. Двухатомный спирт вводили белым беспородным крысам внутрибрюшинно в диапазоне доз от 0,5 до 1,2 ЛД. Количество животных и дозы вещества представлены в таблице.
Доза, г/кг
Количество животных, голов
0,6
6
1,0
3
1,1
30
1,2
21
1,4
18
1,8
8
Для диагностики степени тяжести состояния экспериментальных животных при острой интоксикации 1,4-бутандиолом были использованы элементы алгоритма последовательного принятия решений или построения решающих правил с ветвлением. Для их применения требовалось учитывать данные о сроках оценки состояния - в обобщенном виде: срок оценки (0.5 и 1 час) или срок оценки (3, 6 или 8 часов).
Если исследователю доступна информация о сроках оценки состояния животного в обобщенном виде, то алгоритм принятия решения для расчета ИГК соответствует представленному ниже.
При малых сроках оценки (0,5 и 1 ч): если значение определяющего показателя «Тактильно-болевая чувствительность» равно 1, используется решение №1:
ИГК=6*ЗР+4*КР-3*ПНС,
где ИГК - индекс глубины комы, балл; ЗР - зрачковый рефлекс, балл; КР - корнеальный рефлекс, балл; ПНС - проба на нашатырный спирт, балл; цифры 6, 4, 3 - коэффициенты значимости признака (коэффициенты регрессии).
При интерпретации значений, рассчитанных по формуле степени тяжести состояния нервной системы, используются следующие критерии: ИГК 22 балла и более - сопор; 21 и менее - умеренная кома.
Результат применения данного решающего правила - 96,7% правильной классификации.
Если значение показателя «Тактильно-болевая чувствительность» равно 2 баллам, то используется решение №2:
ИГК=30+3,7*ЗР+4,7*ТМ-0,07*ЧСС,
где ИГК - индекс глубины комы, балл; ЗР - зрачковый рефлекс, балл; ТМ - тонус мышц, балл; ЧСС - частота сердечных сокращений, сокращений в мин; цифры 3.7, 4.7, 0.07 - коэффициенты значимости признака (коэффициенты регрессии). Полученное решение округляют до целого числа.
При интерпретации значений, рассчитанных по формуле степени тяжести состояния нервной системы, используются следующие критерии: ИГК 26 баллов и более баллов - оглушение; 18-25 баллов - сопор, 17 баллов и менее - умеренная кома.
Результат применения данного решающего правила для части выборки, соответствующей срокам оценки 0,5 и 1 час и значению показателя «тактильно-болевая чувствительность», равному 2 баллам, позволяет точно спрогнозировать состояние в 72,3%.
Если значение показателя «тактильно-болевая чувствительность» равно 3 или 4 баллам, используется решение №3:
ИГК=5*ПР+6,5*БР+1,5*ПНС+1,5*ТМ-4*РС,
где ИГК - индекс глубины комы, балл; ПР - поисковая реакция, балл; БР - тактильно-болевая чувствительность, балл; ПНС - проба на нашатырный спирт, балл; ТМ - тонус мышц, балл; PC - рефлекс сгибания задних конечностей, балл; цифры 6.5, 5,4, 1.5 - коэффициенты значимости признака (коэффициенты регрессии). Полученное решение округляют до целого числа.
При интерпретации значений, рассчитанных по формуле степени тяжести состояния нервной системы, используются следующие критерии: ИГК 26 баллов и более баллов - состояние функционирования нервной системы в пределах физиологической нормы; 18-25 баллов - оглушение, 17 баллов и менее - сопор. Результат применения данного решающего правила - 90,4% правильной классификации состояния.
Если сроки исследования составляют 3, 6 или 8 ч, то для оценки тяжести состояния используют решающее правило №4:
ИГК=5*ГР+3,5*РП+3*БР+3*ПНС+2,5*ЗР+1,5*АР+0,01*ЧСС,
где ИГК - индекс глубины комы, балл; ГР - глоточный рефлекс, балл; РП - рефлекс переворачивания, балл; БР - тактильно-болевая чувствительность, балл; ПНС - проба на нашатырный спирт, балл; ЗР - зрачковый рефлекс, балл; АР - аудиомоторный рефлекс, балл; ЧСС - частота сердечных сокращений, сокращений в мин; цифры 5, 3.5, 3, 2.5, 1.5, 0.01 - коэффициенты значимости признака (коэффициенты регрессии). При выполнении расчета ИГК округляется до целого числа.
При интерпретации значений, рассчитанных по формуле степени тяжести состояния нервной системы, используются следующие критерии: ИГК более 62 баллов - состояние функционирования нервной системы в пределах физиологической нормы; от 53 до 62 баллов - оглушение; от 44 до 52 баллов - сопор; от 33 до 43 баллов - кома умеренная; от 24 до 32 баллов - кома глубокая; 23 и менее - запредельная кома.
Результат применения данного решающего правила, соответствующий срокам оценки 3, 6 и 8 часов, составляет 85,4% правильной классификации.