СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ
METHOD FOR PRODUCTION OF REMEDY WITH ANTINEOPLASTIC ACTIVITY AND REMEDY WITH ANTINEOPLASTIC ACTIVITY

Группа изобретений относится к области биотехнологии и может быть использована для получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, путем культивирования базидиомицетов в погруженной культуре.
Известно, что метаболиты многих видов базидиомицетов обладают лечебными свойствами, в частности противоопухолевым действием, включающим прямое ингибирующее действие на пролиферацию и рост клеток опухоли, повышение противоопухолевого иммунитета, антиканцерогенное действие, а также антиоксидантным, противовирусным, гепатопротекторным и иммуномоделирующим действием. В последние годы в России, США, Китае, Японии, Корее ведутся работы по получению лекарственных средств на основе базидиомицетов. Создание новых лекарственных препаратов сдерживается сложной дорогостоящей технологией выращивания базидиомицетов и выделения из них веществ, обладающих стабильными биологическими свойствами, в частности противоопухолевыми.
Образование базидиомицетами ценных для фармакологии веществ зависит как от используемых видов базидиомицетов, так и от технологии их культивирования (приготовление посевного материала, условия культивирования), а также процессов выделения метаболитов.
Для лечения онкологических заболеваний используют химические вещества, такие как цитостатики, проявляющие высокую токсичность, что ограничивает их применение.
Токсичность противоопухолевых средств, полученных из съедобных или несъедобных (неядовитых) базидиомицетов, по литературным данным или отсутствует, или очень низкая (Chang & But, 1986, Su et al., 1987).
В настоящее время большое внимание уделяется разработке технологии культивирования базидиомицетов с целью получения максимального количества мицелия при культивировании в возможно короткий срок и методам выделения противоопухолевых средств.
Известен способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, из мицелия гриба Ganoderma lucidum. Мицелий получают путем культивирования Ganoderma lucidum в погруженной культуре на питательной среде, содержащей 50 г глюкозы, 20 г пептона, 0,87 г дигидрофосфата калия, 0,5 г сульфата магния, 10 г хлорида железа (II), 7 г хлорида марганца, 10 г сульфата цинка, 4 мг хлорида цинка на 1 л воды, рН среды 5,5.
Предварительно готовят посевной мицелий. Для этого указанный гриб культивируют при 180 об/мин, 25°С в течение 10 суток. Полученную культуру пересевают в свежую питательную среду в количестве 5% и вновь культивируют в течение 10 суток. Мицелий отделяют от культуральной жидкости и из него выделяют протеогликан G009 - средство, обладающее противоопухолевой активностью, очищают его и определяют противоопухолевую активность в отношении саркомы 180, привитой самцам мышей (RU 2082755 С1, 19.08.1997).
Недостатком описанного способа является длительный процесс приготовления посевного мицелия (до 20 суток), продолжительный процесс культивирования гриба (7 суток) и сложный процесс выделения средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Известен способ получения препарата, влияющего на тканевый обмен, в том числе обладающего противоопухолевой активностью, предусматривающий глубинное культивирование гриба Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ-F 819) в колбах на среде, содержащей пивное сусло 0,65° Б, при 26-28°С на роторной качалке с 200 об/мин, длительность процесса до 24 суток, с последующим отделением мицелия от нативного раствора центрифугированием и выделением биологически активных веществ из мицелия экстракцией этанолом при нейтральном или кислом значениях рН. Экстракты упаривают в вакууме до сухого остатка. Сухой остаток растворяют в водном растворе этанола. Полученные фракции используют для биологических испытаний. Противоопухолевую активность полученного средства исследуют на мышах с трансплантированным асцитным раком молочной железы при однократном введении химических противоопухолевых средств - цитостатиков. Препарат, полученный вышеописанным способом, вводят в дозе 100 мг/кг через 2 часа после трансплантации опухоли, а затем в той же дозе в течение 9 суток ежедневно. Средняя продолжительность жизни животных составила 30,8±0,8 суток, а в контроле - 18,0±0,8 суток, т.е. на 71% больше, чем в контроле (RU 2192873 С1, 20.11.2002).
Недостатком описанного способа является длительность процесса культивирования гриба, а также проведение исследования противоопухолевой активности на фоне цитостатиков - токсичных веществ, в связи с чем невозможно судить о самостоятельной противоопухолевой эффективности полученных средств.
Известен способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, из мицелия базидиомицетов, выбранных из группы Ganoderma lucidum, Hypsizygus ulmarius, Kuhneromyces mutabilis, Omphalotus olearis, Panus conchatus, Piptoporus betulinus, Pleurotus eryngii, Trametes zonata.
Базидиомицеты вначале выращивают на агаровой среде при 27°С, а затем пересевают на жидкую среду и культивируют в погруженной культуре при 27°С, 180 об/мин в течение 2-3 недель. Среда содержит 2% глюкозы, 0,1% пептона, 0,1% дрожжевого экстракта, 0,1% дигидрофосфата калия, 0,1% сульфата магния и микроэлементы (сульфат железа (II), сульфат марганца, сульфат цинка, сульфат меди). Из погруженной культуры выделяют мицелий, высушивают и из сухого мицелия экстрагируют средство, обладающее противоопухолевой активностью. В качестве экстрагента используют метанол, этанол, ацетонитрил, этилацетат, хлороформ, дихлорметан или их смеси (US 20060057157, 16.03.2006).
Недостатком описанного способа получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, является длительное культивирование базидиомицетов (2-3 недели), использование для получения противоопухолевого средства только отделенного от культуральной жидкости и высушенного мицелия и низкая эффективность полученного средства в системе in vitro. В системе in vivo полученное средство испытано не было.
Задачей, на решение которой направлена группа изобретений, является сокращение длительности процесса культивирования базидиомицетов, повышение выхода мицелия и получение более эффективного противоопухолевого средства.
-5
Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, включающем приготовление посевного мицелия базидиомицета, приготовление стерильной производственной питательной среды, засев производственной питательной среды, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, приготовленным посевным мицелием, культивирование базидиомицета с последующим получением погруженной культуры, согласно изобретению, приготовление посевного мицелия осуществляют на стерильной жидкой питательной среде, содержащей (г/л воды): глюкозу - 18,0-22,0, соевую муку - 8,0-12,0, дигидрофосфат калия - 2,0-3,0, сульфат магния - 0,2-0,4 и арахидоновую кислоту - 1,0-5,0×10, выращивание посевного материала проводят при температуре 22-29° С в течение 2-6 суток при аэрации, при этом готовый посевной мицелий гомогенизируют.
Соевая мука может быть использована как генетически модифицированных, так и не модифицированных сортов сои.
Гомогенизацию готового посевного материала можно осуществлять как перед засевом производственной питательной среды в гомогенизаторе в течение 2-5 минут, так и в процессе засева непосредственно в биореакторе при включенной мешалке на 300-500 об/мин в течение 0,5-6 минут.
Для культивирования следует использовать базидиомицет, выбранный из группы Armillaria mellea (Fr.) Karst., Flammulina velutipes (Curt.:Fr.) Singer, Hericium erinaceus (Bull.:Fr.) Pers., Hypsizygus marmareus (Peck) H.E.Bigelow, Hypsizygus tessulatus (Bulliard:Fr.) Singer, Lentinus edodes (Berk.) Singer, Lyophyllum shimeji (Kawam.) Hongo, Pleurotus djamor (Rumphius ex Fries) Boedjin, Pleurotus ostreatus (Jacg.:Fr.) Kumm.
При культивировании базидиомицета Armillaria mellea в производственную питательную среду следует вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 15,0-18,0, соевую муку - 18,0-20,0, дигидрофосфат калия - 0.5-2,5, сульфат магния - 0,05-0,26, культивирование осуществлять при температуре 24-28° С в течение 4,5-5,5 суток.
При культивировании базидиомицета Flammulina velutipes в производственную питательную среду следует вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 19.0-27,0, соевую муку в количестве 19,0-27,0, дигидрофосфат калия - 1,4-3,0, сульфат магния - 0,14-0,30, культивирование осуществлять при температуре 20-28° С в течение 5,5-6,5 суток.
При культивировании базидиомицета Hericium erinaceus в производственную питательную среду рекомендуется вводить (г/л воды): растительное масло и соевую муку в количествах, соответственно равных 10.0-27,0 и 20,0-25,0, дигидрофосфат калия вводить в количестве 2.0-3,3, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 24-32° С в течение 5,5-6,5 суток. В указанную производственную среду для культивирования Hericium erinaceus можно дополнительно вводить мелассу в количестве 1-40 г/л среды.
При культивировании базидиомицета Hypsizygus marmareus в производственную питательную среду целесообразно вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 20,0-24,0, соевую муку в количестве 16,0-22,0, дигидрофосфат калия - 1,5-3,0, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 24-31°С в течение 5,5-6,5 суток.
При культивировании базидиомицета Hypsizygus tessulatus в производственную среду следует вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 18.0-25,0, соевую муку - 20,0-28,0, дигидрофосфат калия - 1,6-2,6, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 24-33° С в течение 6,5-7,5 суток.
При культивировании базидиомицета Lentinus edodes в производственную питательную среду целесообразно вводить (г/л воды): растительное масло и соевую муку в количествах, соответственно равных 12,0-16,0 и 18,0-24,0, дополнительно вводить источник углерода в виде глюкозы в количестве 8-12, вводить дигидрофосфат калия в количестве 1,3-2,6, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 24-30°С в течение 5,5-6,5 суток.
При культивировании базидиомицета Lyophyllum shimeji в производственную питательную среду следует вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 16,0-22,0, соевую муку - 18,0-25,0, дигидрофосфат калия - 2,0-3,0, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 24-34°С в течение 3,5-4,5 суток.
При культивировании базидиомицета Pleurotus djamor в производственную среду следует вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 15,0-20,0, соевую муку - 15,0-21,0, дигидрофосфат калия - 2.0-3,3, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 26-35°С в течение 2,5-3,5 суток.
При культивировании базидиомицета Pleurotus ostreatus в производственную питательную среду целесообразно вводить (г/л воды): растительное масло в количестве 14,0-20,0, соевую муку - 11,0-19,0, дигидрофосфат калия - 2.0-3,0, сульфат магния - 0,2-0,3, культивирование осуществлять при температуре 24-28°С в течение 2,5-3,5 суток.
В качестве растительного масла в производственных питательных средах для культивирования Armillaria mellea, Flammulina velutipes, Hericium erinaceus, Hypsizygus marmareus, Hypsizygus tessulatus, Lentinus edodes, Lyophyllum shimeji, Pleurotus djamor, Pleurotus ostreatus могут быть использованы подсолнечное, оливковое, соевое, льняное, арахисовое масла или их смеси.
Введение в состав производственных питательных сред растительного масла в заявленном количестве способствует не только сокращению длительности процесса культивирования и повышению выхода мицелия, но и снижает процесс пенообразования в процессе культивирования.
После культивирования базидиомицета полученную погруженную культуру следует подвергать сублимационной сушке, затем сухой мицелий измельчать и использовать в качестве противоопухолевого средства.
После культивирования базидиомицета полученную погруженную культуру можно автоклавировать при 1,2-1,5 атм в течение 1,5-3 часов, отделять жидкую фазу фильтрованием и использовать в качестве противоопухолевого средства.
Для получения противоопухолевого средства после культивирования базидиомицета можно отделять мицелий из погруженной культуры фильтрованием, экстрагировать его дистиллированной водой в соотношении 90-360 г/л воды в процессе автоклавирования при 1,2-1,5 атм в течение 1,5-2,5 часов, отделенный водный экстракт использовать в качестве целевого средства.
После культивирования из погруженной культуры целесообразно отделять мицелий базидиомицета и проводить экстракцию этанолом в соотношении 90-360 г/100 мл экстрагента в течение 0,5-1,5 часов при перемешивании, полученный этанольный экстракт отделять от остатков мицелия, упаривать до сухого остатка на испарителе, а остаток мицелия заливать дистиллированной водой в соотношении 90-360 г/л, автоклавировать при 1, 2-1,5 атм в течение 1,5-2,5 часов, полученный водный экстракт отделять и объединять с сухим остатком этанольного экстракта и полученную смесь использовать в качестве противоопухолевого средства.
После культивирования можно отделять из погруженной культуры мицелий базидиомицета, высушивать его при температуре 35-80°С, измельчать и использовать в качестве противоопухолевого средства.
Сухой измельченный мицелий базидиомицета следует подвергать экстрагированию кипящей дистиллированной водой в соотношении 18-72 г/л при 1,2-1,5 атм в течение 1,5-2,5 часов, затем водный экстракт отделять от остатков мицелия и использовать в качестве противоопухолевого средства.
Для увеличения срока хранения без снижения биологической активности водный экстракт мицелия базидиомицета может быть заморожен при температуре -18-70° С. Перед использованием в качестве противоопухолевого средства водный экстракт следует разморозить.
С той же целью водный экстракт мицелия базидиомицета может быть высушен на распылительной сушилке. Возможно использование как непосредственно сухого экстракта, так и его раствора в дистиллированной воде.
В водный экстракт мицелия базидиомицета можно добавлять 2-6 объемов этанола, выпавший осадок отделять, высушивать и использовать в качестве противоопухолевого средства.
Как следует из вышесказанного, противоопухолевое средство может быть использовано как в сухом порошкообразном виде, так и в жидком. К полученному противоопухолевому средству могут быть добавлены различные фармацевтические добавки, такие как витамины, микроэлементы, антиоксиданты, совместимые противоопухолевые средства.
Противоопухолевое средство может быть изготовлено в виде таблеток, капсул, напитка и может быть использовано как перорально, так и в виде микроклизм.
Дозировка противоопухолевого средства зависит от заболевания, возраста пациента, его веса, состава средства. В пересчете на содержание полисахаридов предпочтительная дозировка для лабораторных животных может быть 1-3 мг полисахаридов на кг массы, для человека - 0,08-0,25 мг/кг.
Технический результат заявленной группы изобретений заключается в увеличении выхода мицелия за счет разработки состава производственной среды, условий культивирования, подбора состава среды для получения посевного материала, в сокращении длительности процесса культивирования базидиомицета с 2-3 недель до 7,5 суток. Включение в состав производственной среды растительного масла не только повышает выход биомассы базидиомицета, но и препятствует пенообразованию среды в процессе культивирования базидиомицета. В совокупности разработанные способ культивирования базидиомицета и способ выделения противоопухолевого средства позволили получить эффективное средство, тормозящее рост опухоли в опытах in vivo до 94%.
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, которые не охватывают весь объем притязаний, но и не ограничивают его.
Пример 1. Приготовление посевного мицелия базидиомицетов.
Готовили стерильные жидкие питательные среды, состав которых представлен в таблице 1, и засевали мицелием базидиомицетов, выращенных на агаровой питательной среде.
Выращивание посевного мицелия осуществляли на ротационной качалке при температуре 22-29°С, скорости вращения качалки 180-220 об/мин в течение 2-6 суток. Условия культивирования базидиомицетов приведены в таблице 2.
Приготовленный посевной мицелий Hericium erinaceus штамм He-4, Lentinus edodes штамм Le-14, Pleurotus ostreatus штамм 447 гомогенизировали в процессе засева производственной среды в биореакторе при включенной мешалке на 500 об/мин в течение 0,5 минут.
Таблица 1.
Составы сред для получения посевного мицелия базидиомицетов.
Вид базидиомицета
Источники питания, г/л воды
Глюкоза
Соевая мука
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
MgSO<sub>4</sub>
Арахидоновая кислота
A.mellea
18
12
2,4
0,20
1,0×10<sup>-5</sup>
F.velutipes
22
8
2,5
0,24
3,0×10<sup>-5</sup>
Н.erinaceus
19
10
3,0
0,4
5,0×10<sup>-5</sup>
Н.marmareus
21
9
2,4
0,25
2,0×10<sup>-5</sup>
Н.tessulatus
22
8,5
2,0
0,4
4,5×10<sup>-5</sup>
L.edodes
20
9
3,0
0,3
4,0×10<sup>-5</sup>
L.shimeji
21
9,5
2,5
0,24
3,5×10<sup>-5</sup>
P.djamor
19
10
2,0
0,3
2,0×10<sup>-5</sup>
P.ostreatus
22
9
2,5
0,4
1,0×10<sup>-5</sup>
Таблица 2.
Условия выращивания посевного мицелия базидиомицетов.
Вид базидиомицета
Параметры культивирования
Скорость вращения мешалки, об/мин
Температура, °С
Длительность процесса, сут
A.mellea
220
25
4
F.velutipes
180
22
6
H.erinaceus
200
28
6
Н.marmareus
220
25
3
Н.tessulatus
220
25
3
L.edodes
220
25
6
L.shimeji
200
28
3
P.djamor
200
29
2
P.ostreatus
220
25
2
Пример 2. Погруженное культивирование базидиомицетов.
Для погруженного культивирования базидиомицетов готовили производственные среды, состав которых представлен в таблице 3. Производственные среды стерилизовали при 1,2 атм в течение 30 мин, охлаждали и засевали посевным мицелием базидиомицетов, полученным по примеру 1.
Приготовленный посевной мицелий Armillaria mellea штамм Am-4, Flammulina velutipes штамм Fv-7, Hypsizygus marmareus штамм Hm-1, Hypsizygus tessulatus штамм Ht-1, Lyophyllum shimeji штамм Ls-2, Pleurotus djamor штамм Pd-3 гомогенизировали в гомогенизаторе в течение 4 минут перед засевом производственной среды, посевной мицелий Hericium erinaceus, Lentinus edodes, Pleurotus ostreatus гомогенизировали в процессе засева производственной среды в биореакторе при включенной мешалке на 500 об/мин в течение 0,5 минут.
Таблица 3.
Составы сред для погруженного культивирования базидиомицетов.
Вид
Источники питания, г/л воды
Источники углерода
Источники азота
Минеральные соли
масло раст.
глюкоза
меласса
соевая мука
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
MgSO<sub>4</sub>
A.mellea
17
-
-
20
0,5
0,05
F.velutipes
27
-
-
27
2,4
0,24
H.erinaceus
10
-
30
22
2,8
0,28
H.erinaceus
27
-
-
25
3,3
0,30
H.marmareus
22
-
-
19
2,0
0,2
H.tessulatus
24
-
-
28
1,6
0,24
L.edodes
15
8
-
21
1,5
0,24
L.edodes
12
11
-
24
2,6
0,3
L.shimeji
20
-
-
23
2,6
0,26
P.djamor
18
-
-
18
2,6
0,26
P.ostreatus
15
-
-
11
2,4
0,24
Культивирование базидиомицетов Armillaria mellea, Flammulina velutipes, Hypsizygus marmareus, Hypsizygus tessulatus, Lyophyllum shimeji, Pleurotus djamor осуществляли в колбах на ротационной качалке при 200 об/мин. Базидиомицеты Hericium erinaceus, Lentinus edodes, Pleurotus ostreatus выращивали в биореакторах с постоянно работающей мешалкой (200 об/мин) и подачей воздуха 1,5 об./об. в минуту.
Температурный режим и длительность процессов погруженного культивирования, а также выход воздушно-сухой биомассы (влажность 5-6%) представлены в таблице 4. Контроль чистоты культур осуществляли с помощью световой микроскопии. Фиксировали наличие на мицелии грибов пряжек, являющихся специфической морфологической структурой базидиомицетов, и отсутствие посторонней мико- и микробиоты.
Таблица 4.
Температурный режим, длительность процессов погруженного культивирования и выход воздушно-сухой биомассы базидиомицетов.
Вид
Температура культивирования, <sup>0</sup> С
Длительность процесса культивирования, сутки
Выход воздушно-сухой биомассы, г/л
A.mellea
24-26
4,5
20-22
F.velutipes
20-22
6,0
36-40
H.erinaceus
25-27
6,5
24-25
Н.marmareus
24-26
5,5
27-29
Н.tessulatus
24-26
7,5
18-21
L.edodes
24-26
6,0
20-21
L.shimeji
28-30
4,0
26-28
P.djamor
29-31
3,0
23-24
P.ostreatus
25-27
3,0
26-27
Пример 3. Получение средства, обладающего противоопухолевыми свойствами.
Получали погруженную культуру Hericium erinaceus штамм He-4 по примеру 2 в биореакторе объемом 15 л (объем культуральной среды - 8 л). По окончании процесса культивирования погруженную культуру базидиомицета подвергали сублимационной сушке при профильном изменении температуры, включая многократное снижение температуры до минус 30°С, измельчали и использовали полученный сухой порошок в качестве противоопухолевого средства. Результаты оценки противоопухолевого действия средства представлены в таблице 5.
Пример 4. Получение средства, обладающего противоопухолевыми свойствами.
Получали погруженную культуру Hypsizygus marmareus штамм Hm-1 по примеру 2. По окончании процесса погруженную культуру базидиомицета подвергали автоклавированию при 1,2-1,5 атм в течение 2 часов, отделяли жидкую фазу и использовали ее в качестве противоопухолевого средства. Результаты оценки противоопухолевого действия средства представлены в таблице 5.
Пример 5. Получение средства, обладающего противоопухолевыми свойствами.
Получали погруженную культуру Lentinus edodes штамм Le-14 no примеру 2, выращивая базидиомицет в биореакторе объемом 15 л с загрузкой 8 л производственной среды. По окончании погруженного культивирования мицелий отделяли фильтрованием. Сырой мицелий заливали дистиллированной водой в соотношении 100 г/л, автоклавировали при 1,5 атм в течение 2 часов. Полученный водный экстракт отделяли фильтрованием и использовали в качестве противоопухолевого средства. Результаты оценки противоопухолевого действия средства представлены в таблице 6.
Пример 6. Получение средств, обладающих противоопухолевыми свойствами.
Получали погруженные культуры Hericium erinaceus штамм He-4 и Lentinus edodes штамм Le-14 по примеру 2, выращивая базидиомицеты в биореакторах объемом 15 л, содержащих по 9 л производственной среды. По окончании процессов выращивания мицелий отделяли фильтрованием. Навески сырой биомассы Hericium erinaceus и Lentinus edodes в количестве 150 и 300 г, соответственно, заливали 100 мл этанола, экстракцию проводили в течение 1 часа при перемешивании. Этанольные экстракты отделяли фильтрованием и упаривали до сухого остатка на вакуумном испарителе. Оставшиеся после экстракции этанолом порции мицелия Hericium erinaceus и Lentinus edodes заливали по 1 л дистиллированной воды и автоклавировали при 1,2 атм в течение 2,5 часов. Водные экстракты отделяли от мицелия фильтрованием, водный экстракт мицелия Hericium erinaceus объединяли с сухим остатком этанольного экстракта мицелия Hericium erinaceus. Водный экстракт мицелия Lentinus edodes - с этанольным экстрактом мицелия Lentinus edodes. Таким образом было получено 2 противоопухолевых средства. Результаты оценки противоопухолевого действия средств представлены в таблице 6.
Пример 7. Получение средств, обладающих противоопухолевыми свойствами.
Получали погруженные культуры Flammulina velutipes штамм Fv-7 и Pleurotus ostreatus штамм 447 по примеру 2, выращивая первый базидиомицет в колбах на качалке, а второй - в биореакторе общим объемом 15 л с 9 л производственной среды. По окончании процессов погруженного культивирования мицелий базидиомицетов отделяли фильтрованием, сушили при 60°С, измельчали и использовали в качестве противоопухолевых средств. Результаты оценки противоопухолевого действия средств представлены в таблице 5.
Пример 8. Получение средств, обладающих противоопухолевыми свойствами.
Выращивали погруженные культуры Armillaria mellea штамм Am-4, Flammulina velutipes штамм Fv-7, Hypsizygus tessulatus штамм Ht-1, Lyophyllum shimeji штамм Ls-2, Pleurotus djamor штамм Pd-3 и Pleurotus ostreatus штамм 447 согласно примеру 2, культивирование проводили в колбах на качалке. После окончания процессов погруженного культивирования мицелий базидиомицетов отделяли фильтрованием, сушили при 65°С и измельчали. Делали навески сухого измельченного мицелия базидиомицетов: Armillaria mellea - 6 г, Flammulina velutipes - 6 г, Hypsizygus tessulatus - 5 г, Lyophyllum shimeji - 10 г, Pleurotus djamor - 1,8 г, Pleurotus ostreatus - 3,6 г. Навески заливали 100 мл дистиллированной воды и экстрагировали в автоклаве при 1,2 атм в течение 2 часов. Водные экстракты отделяли фильтрованием и использовали в качестве противоопухолевых средств. Результаты оценки противоопухолевого действия полученных средств представлены в таблице 5.
Пример 9. Получение средств, обладающих противоопухолевыми свойствами.
Водный экстракт сухого измельченного мицелия Armillaria mellea штамм Am-4, полученный по примеру 8, замораживали при температуре -18°С, водный экстракт сухого измельченного мицелия Pleurotus djamor штамм Pd-3, полученный по примеру 8, замораживали при температуре -70°С. Экстракты хранили при температуре заморозки в течение 4 месяцев, после чего размораживали при комнатной температуре и использовали в качестве противоопухолевых средств. Результаты изучения противоопухолевой активности средств представлены в таблице 5.
Пример 10. Получение средств, обладающих противоопухолевыми свойствами.
Экстракт погруженного мицелия Hericium erinaceus штамм He-4, полученный по примеру 6, и водный экстракт сухого измельченного погруженного мицелия Hypsizygus tessulatus Ht-1, полученный по примеру 8, сушили с помощью распылительной сушилки. Полученные средства растворяли в дистиллированной воде таким образом, чтобы концентрации полученных растворов соответствовали концентрации растворов, подвергнутых сушке, и использовали для оценки их противоопухолевых свойств. Полученные результаты приведены в таблице 5.
Пример 11. Получение средств, обладающих противоопухолевыми свойствами.
В работе использовали водный экстракт сырого мицелия Lentinus edodes штамм Le-14, полученный по примеру 5, и водные экстракты сухого измельченного мицелия Flammulina velutipes штамм Fv-7 и Pleurotus ostreatus штамм 447, полученные по примеру 8. В экстракты добавляли 96% этанол. Соотношение объемов этанола и экстракта мицелия Lentinus edodes было 4:1, соотношение объемов этанола и экстракта Flammulina velutipes было 2:1, соотношение объемов этанола и экстракта Pleurotus ostreatus было 6:1. Выпавшие осадки, представляющие собой суммарные фракции водорастворимых полисахаридов мицелия, отделяли цетрифугированием и подвергали лиофильной сушке. Сухие осадки использовали в качестве противоопухолевых средств. Результаты изучения их активности представлены в таблице 5.
Пример 12. Оценка противоопухолевого действия полученных противоопухолевых средств.
1
1
к
о
к
к
о
5
6
Изучение противоопухолевого действия препаратов из погруженной культуры изучаемых видов грибов проводили in vivo на двух перевиваемых штаммах опухолей: Т-лимфоме EL-4 и Т-клеточном лимфолейкозе Р388. Опухоли прививали гибридным мышам (С57В1/6×DBA/2)F (далее B6D2F), Т-лимфому EL-4 прививали самцам, Т-клеточный лимфолейкоз Р388 - самкам. Мышей получали из питомника РАМН «Крюково». После поступления мышей выдерживали в карантине 21 день. Штаммы опухолей хранили в азотном банке при температуре -196°С. После размораживания штаммы опухолей поддерживали в сингенных условиях в асцитной форме серийными внутрибрюшинными пассажами на мышах линии DBA/2. В опыте в день 0 Т-лимфому EL-4 прививали под кожу правого бока по 10 клеток. Т-клеточный лимфолейкоз Р388 - по 10 клеток. Лечение начинали через 10 суток после прививки Т-лимфомы EL-4 и через 2 суток после прививки Т-клеточного лимфолейкоза Р388. Действие изучаемых препаратов оценивали при пероральном введении. Препараты вводили с помощью зонда внутригастрально ежедневно 1 раз в сутки в течение 10 суток. Сухую измельченную биомассу грибов и сублимированные погруженные культуры грибов испытывали в дозе 50 мг/кг/сут, препараты готовили, добавляя измельченный грибной материал в крахмальный клейстер таким образом, чтобы суточная доза для каждого животного содержалась в 0,3 мл клейстера. Полисахаридные фракции применяли в дозе 2 мг/кг/сут в виде водных растворов, суточная доза раствора составляла 0,3 мл/мышь. Доза водных экстрактов мицелия базидиомицетов составляла 0,25-0,3 мл/кг/сут, содержание сухих веществ в водных экстрактах варьировало в диапазоне 13-19 мг/мл. Высушенные с помощью распылительной сушки водные экстракты мицелия грибов испытывали в дозе 4,8 мг/кг/сут, навески сухих экстрактов растворяли в воде, объем вводимого раствора составлял 0,3 мл/мышь. Количество мышей в контрольных и экспериментальных группах составляло 8-10 животных. В течение опытов следили за общим состоянием мышей, изменением массы тела, прививаемостью опухоли, динамикой роста опухоли. Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле: ТРО(%)=(М-М)/(М)×100, где М и M - средняя расчетная масса опухоли в контроле и опыте, соответственно. Массу опухоли рассчитывали по формуле М (мг)=(а×b×с)/2, где М - расчетная масса опухоли, а, b, с - 3 наибольших взаимоперпедикулярных диаметра опухолевого узла в мм. Достоверность различий средних значений массы опухоли определяли по t-критерию Стьюдента. За достоверные принимали различия при Р≤0,05. Противоопухолевая эффективность полученных средств представлена в таблицах 5 и 6.
Таблица 5.
Противоопухолевое действие полученных средств.
Модель: Т-клеточный лимфолейкоз Р388, учет на 14 сутки опыта.
№ примера
Препарат
ТРО, %
1
2
3
3
Hericium erinaceus, сублимированная погруженная культура
75
4
Hypsizygus marmareus, жидкий экстракт, полученный из погруженной культуры
56
7
Flammulina velutipes, сухой измельченный погруженный мицелий
52
Pleurotus ostreatus, сухой измельченный погруженный мицелий
56
8
Armillaria mellea, водный экстракт сухого погруженного мицелия
69
Flammulina velutipes, водный экстракт сухого погруженного мицелия
87
Hypsizygus tessulatus, водный экстракт сухого погруженного мицелия
59
Lyophyllum shimeji, водный экстракт сухого погруженного мицелия
72
Pleurotus djamor, водный экстракт сухого погруженного мицелия
44
Pleurotus ostreatus, водный экстракт сухого погруженного мицелия
75
9
Armillaria mellea, водный экстракт сухого погруженного мицелия, хранившийся при -18°С
66
Pleurotus djamor, водный экстракт сухого погруженного мицелия, хранившийся при -70°С
45
1
2
3
10
Hericium erinaceus, сухой экстракт сухого погруженного мицелия (после распылительной сушки)
65
Hypsizygus tessulatus, сухой экстракт сухого погруженного мицелия (после распылительной сушки)
63
11
Lentinus edodes, полисахаридная фракция погруженного мицелия
81
Flammulina velutipes, полисахаридная фракция погруженного мицелия
94
Pleurotus ostreatus, полисахаридная фракция погруженного мицелия
74
Таблица 6.
Противоопухолевое действие полученных средств.
Модель: Т-лимфома EL-4 учет на 18 сутки опыта.
№
Препарат
ТРО,
примера
%
5
Lentinus edodes, водный экстракт сырого погруженного
62
мицелия
6
Hericium erinaceus, объединенный водный и
58
этанольный экстракт сырого погруженного мицелия
Lentinus edodes, объединенный водный и этанольный
59
экстракт сырого погруженного мицелия
Таким образом, поставленная задача решена. Длительность процесса культивирования сокращена до 2-6 дней при сохранении эффективности полученных средств, обладающих противоопухолевой активностью.