СИСТЕМА ЭНХАНСЕРОВ ТРАНСДЕРМАЛЬНОГО ПЕРЕНОСА И КОСМЕТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ НА ЕЕ ОСНОВЕ
SYSTEM OF TRANSDERMAL TRANSFER ENHANCERS AND COSMETIC COMPOSITIONS BASED THEREON

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[001] Настоящие изобретение относится к области косметологии, а именно к разработке системы энхансеров трансдермального переноса биологически активных веществ (БАВ). Заявленная система энхансеров может быть использована для создания косметических композиций, содержащих БАВ, или в качестве самостоятельного средства, увеличивающего эффективность косметических средств, применяемых непосредственно после использования системы энхансеров.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[002] Все больше людей прибегает к малоинвазивным и неинвазивным косметологическим процедурам. К малоинвазивным процедурам относятся инъекции с кожными наполнителями или БАВ, что позволяет улучшить внешний вид кожи без хирургического вмешательства. Поскольку анестезии, как правило, не требуется, большинство инъекционных процедур представляют значительно меньший риск для пациента, чем при пластической хирургии. Кроме того, инъекции косметических средств не требуют длительного реабилитационного периода. Однако после косметических инъекций были зарегистрированы такие осложнения, как припухлость, гематомы, боль, зуд, болезненность, линии под кожей, а также аллергические реакции. При инъекциях также возможно повреждение кровеносных сосудов, приводящее к эмболии, некрозу или другим значительным повреждениям кожи.
[003] Неинвазивные косметологические процедуры предполагают трансдермальную (чрескожную) доставку БАВ. Трансдермальный путь доставки косметических активных веществ дает возможность осуществить медленное, введение БАВ и приостановить его, если в процессе косметической процедуры возникают нежелательные побочные эффекты, например аллергические реакции. Однако кожа обладает превосходными барьерными свойствами, что значительно ограничивает типы молекул, которые могут быть через нее введены.
[004] Структурно кожа состоит из двух основных слоев — сравнительно тонкого внешнего слоя (эпидермиса) и толстого внутреннего слоя (дермы). Эпидермис состоит из многослойного эпителия, который характеризуется тем, что в наружных его слоях постоянно происходит ороговение клеток. Самый поверхностный роговой слой эпидермиса состоит из корнеоцитов — безъядерных, плоских, упорядоченно уложенных ороговевших клеток, заполненных филаментным кератином. Корнеоциты превращаются в чешуйки, которые на поверхности эпидермиса постепенно слущиваются, заменяясь новыми клетками, происходящими из лежащих глубже слоев эпидермиса. Роговой слой эпидермиса в толстой коже состоит из 15-20 слоев роговых чешуек, а в тонкой коже — из 3-4 слоев роговых чешуек [1]. Роговой слой эпидермиса имеет уникальное строение, которое называют «briсk and mortar» («кирпич и цемент»), где роль «кирпичей» играют корнеоциты, а «цемента» — межклеточный липидный матрикс [2]. Межклеточные липиды представлены церамидами (англ. ceramides), холестеролом, жирными кислотами, фосфолипидами, гликосилцерамидами, а также свободными сфингоидными основаниями и сульфатом холестерола. Межклеточные липиды обусловливают водонепроницаемость рогового слоя эпидермиса. Дерма состоит из волокнистой соединительной ткани. В дерме располагаются кровеносные и лимфатические сосуды, нервы, гладкие мышечные клетки, волосяные фолликулы, сальные и потовые. Сальные железы располагаются по всему телу, кроме кожи ладоней и подошв. Секрет сальных желез (кожное сало), который вырабатывают специальные клетки — себоциты, выделяется на поверхность эпидермиса или в волосяную воронку. Кожное сало обладает бактерицидными и фунгицидными свойствами. Кожное сало на 60% состоит из триглицеридов, которые под воздействием микробных гидролаз превращаются в свободные жирные кислоты, моноглицериды, линоглицериды и глицерин. Оставшуюся часть кожного сала в основном составляют восковые эфиры, сквален и холестерин. Сквален является промежуточным соединением в биологическом синтезе холестерина. В кожном сале человека до приблизительно до 25 лет сквален составляет примерно 13% [3]. Кожное сало предотвращает испарение эндогенной воды, а в холодную погоду — способствует сохранению тепла [1].
[005] Согласно современным представлениям, существуют следующие пути проникновения экзогенных веществ через кожу: трансдермальный (через роговой слой эпидермиса), трансфолликулярный (через волосяные фолликулы) и трансгландулярный (через протоки сальных и потовых желез). При этом через волосяные фолликулы, протоки сальных и потовых желез проникает от 0,01% до 0,1% экзогенных веществ, проникающих через роговой слой [4] Таким образом барьерные свойства кожи в основном определяются барьерными свойствами рогового слоя эпидермиса, который защищает нижележащие ткани от инфекций, дегидратации, от агрессивного химического и физического воздействия [5] Проницаемость рогового слоя обусловлена в основном проницаемостью липидного матрикса, заполняющего промежутки между корнеоцитами, однако возможно прохождение экзогенных веществ и непосредственно через корнеоциты.
[006] Эффективное проникновение экзогенных веществ в глубокие слои кожи по градиенту концентрации возможно только для молекул, обладающих сродством и к гидрофобному роговому слою, и к нижележащим гидрофильным слоям эпидермиса и дермы. То есть молекулы должны быть нейтральными. Положительный или отрицательный заряд молекулы может затормозить ее продвижение через гидрофобную среду. Например, эффективность проникновения заряженных веществ через роговой слой кожи на два порядка ниже, чем незаряженных [6]. Кроме того, проникающая способность экзогенного вещества зависит от молекулярной массы молекул.
[007] Также на проницаемость влияют локализация участка кожи, степень его гидратации, толщина рогового слоя, наличие или отсутствие липидной смазки и ее качественный состав. Без специальных систем переноса, в здоровую, неповрежденную кожу способны проникать только маленькие малополярные молекулы — спирты, кетоны и т.д. Для преодоления барьерных свойств рогового слоя в основном применяются физические и химические подходы.
[008] При физическом подходе к трансдермальной доставке БАВ, с целью создания обратимых физических изменений в пределах рогового слоя, используются внешние силы: электрический ток (ионофорез), высоковольтные электрические импульсы (электрофорез/электропорация) и ультразвук (сонофорез). Такая модификация рогового слоя позволяет трансдермально доставлять большие заряженные молекулы, которые не могут пройти через роговой слой в результате пассивной диффузии. Основными достоинствами этого подхода являются: быстрое проникновение БАВ и, соответственно, короткое время, необходимое БАВ для достижения мишени, а также возможность контроля доставки путем варьирования силы и продолжительности воздействия. Недостатки физического подхода – необходимость использования специфического оборудования, возможные неприятные ощущения от используемого физического воздействия и противопоказания к применению некоторых видов воздействия при ряде заболеваний.
[009] Один из химических подходов заключается в доставке БАВ в инкапсулированном виде, например, внутри липосом, способных проходить сквозь роговой слой кожи с последующим освобождением БАВ. Однако применение липосом в косметических и фармацевтических средствах ограничено из-за их низкой термодинамической стабильности и невысокой емкости [7].
[0010] Основным недостатком композиций, содержащих липосомы и микроэмульсионные растворы в качестве носителей БАВ является их расслаивание при введении водного или неполярного раствора БАВ, что вызывает технологические проблемы при производстве косметических и фармацевтических средств на их основе.
[0011] Другой популярный химический подход к трансдермальной доставке БАВ заключается в использовании в составе косметического или лекарственного средства дополнительных химических веществ – энхансеров трансдермального переноса, которые воздействуют на мембраны корнеоцитов или модифицируют межклеточный липидный матрикс рогового слоя, тем самым увеличивая проницаемость кожного барьера.
N-метил-2-пирролидон
[0012] В последние два десятилетия изучено большое количество соединений с точки зрения их эффективности для увеличения скорости и интенсивности проникновения БАВ через кожу. В качестве энхансеров используется широкий спектр веществ, включающий многоатомные спирты, жирные кислоты и их эфиры, поверхностно-активные вещества, терпены. Классическими примерами энхансеров являются протоноакцепторные растворители, в частности диметилсульфоксид (ДМСО) и диметилацетамид (ДМАА). Кроме того, в качестве эффективных энхансеров описаны 2-пирролидон, N,N-диэтил-м-толуамид (ДЭТА), 1-додецилазациклогептан-2-он, N,N-диметилформамид,  и тиогликолят кальция.
[0013] В патентах US4980378 (опубликован 25.12.1990) и US5082866 (опубликован 21.01.1992) приводится группа биоразлагаемых, которые представляют собой N,N-дизамещенные аминоацетаты. Указанные биоразлагаемые энхансеры трансдермального переноса не вызывают реакцию и/или раздражение на коже в месте их применения. К недостаткам применения N,N-дизамещенных аминоацетатов можно отнести ограниченность ряда БАВ, с которыми их можно использовать.
[0014] Некоторые переносчики представляют собой неионогенные поверхностно-активные вещества, состоящие из полярной группы и высокомолекулярной неполярной части. К таким соединениям относится N-додецилкапролактам-2, изопропилмиристат, олеиновая кислота, аналоги N-додецилкапролактама-2. Все эти вещества взаимодействуют с липидной структурой эпидермиса, разрушая ее упорядоченность. В результате сопротивление кожи потоку БАВ снижается.
[0015] Наиболее часто в качестве химического энхансера используют ДМСО – представитель класса биполярных апротонных веществ. ДМСО менее токсичен, чем другие представители этой группы, такие как диметилформамид, диметилацетамид, N-метил-2-пирролидон и др. ДМСО демонстрирует низкую токсичность для животных, растений или водных организмов, не является канцерогеном [8] и не проявляет мутагенных свойств в стандартных тестах [9]. Не было зарегистрировано никакой генотоксичности после применения ДМСО в качестве лекарственного средства, также подобных эффектов не было зарегистрировано у рабочих в течение 40 лет промышленного производства [10].
[0016] Стоит отметить, что ДМСО обладает противовоспалительным, противоотечным и местным обезболивающим действием [11].
in vivo
in vitro
[0017] ДМСО способен проникать через биологические мембраны, способствуя лучшему и более глубокому проникновению в кожу применяемых одновременно с ним БАВ. В работе Rama et al. описывается создание и изучение  и  трансдермальных фармацевтических композиций метотрексата на основе ТВИН-80, Span-80, ДМСО и изопропилмиристата. Отмечается высокая пенетрирующая способность ДМСО по сравнению с остальными агентами [12].
[0018] Известны многочисленные косметические составы с использованием ДМСО, например, заявка WO2017205659 (опубликована: 25.05.2017), патент EA019760B1 (опубликована: 31.10.2008), заявка WO2011000210 (опубликована: 24.06.2010). Во всех указанных составах ДМСО используется в качестве энхансера трансдермального переноса.
[0019] Однако при всех своих достоинствах ДМСО имеет ряд побочных эффектов. Например, при концентрации 25-100% ДМСО разрушает мембраны клеток. При топическом нанесении ДМСО в концентрации от 45.5% до 90% наблюдаются покраснение, зуд или жжение в месте применения, а также появление неприятного чесночного запаха изо рта, который возникает из-за того, что в организме человека диметилсульфоксид метаболизируется до диметилсульфона и диметилсульфида, который выводится через легкие [13–21].
[0020] Еще одним известным энхансером трансдермального переноса липофильных БАВ является этанол. Известна композиция RU2107515 включающая водно-этанольный растворитель, содержащий 15-75% этанола по объему. В пределах всего указанного диапазона концентрации этанол обеспечивает заметное улучшение трансдермального проникновения. Однако этиловый спирт вызывает значительную дегидратацию кожи.
[0021] Дегидратация ослабляет защитную функцию кожи, способствует развитию иммунных нарушений и формированию аллергического воспаления [22]. В поддержании водного баланса кожи участвуют многочисленные структуры, регулирующие скорость трансэпидермальной потери воды (transepidermal water loss – TEWL) и осуществляющие поступление воды из дермы в эпидермис. В эпидермисе контроль водного баланса осуществляется компонентами рогового слоя — натуральным увлажняющим фактором, липидами кожи, кожным салом и кератином [23, 24].
[0022] Натуральный увлажняющий фактор (natural moisturizing factor, NMF) – это комплекс органических молекул на поверхности корнеоцитов, обладающий способностью связывать воду. В состав NMF входят свободные аминокислоты, NaPCA, мочевина, аммиак, креатинин, магний, калий, кальций, натрий, молочная и лимонная кислоты, ионы хлорида и фосфата. NMF связывает приблизительно треть молекул воды, содержащейся в роговом слое эпидермиса. Кроме того, NMF поддерживает процесс отшелушивания отмерших клеток на нормальном уровне благодаря участию в работе гидролитических ферментов. Нарушение баланса компонентов NMF снижает способность эпидермиса удерживать влагу [25–27].
[0023] 2-Пирролидон-5-карбоновая кислота (PCA) является компонентом NMF и наряду с лактатом натрия составляют наиболее гигроскопичную фракцию рогового слоя эпидермиса [27, 28]. Подавляющее количество PCA в роговом слое при рН около 5 существует в виде солей, в том числе, в виде натриевой соли. Таким образом, натриевая соль 2-пирролидон-5-карбоновой кислоты, или пирролидон карбоксилат натрия (NaPCA), является естественной составляющей эпидермиса человека и часто используется в косметических средствах в качестве увлажняющей добавки. Например, в заявках и патентах CN110051614 (опубликована: 27.05.2019), CN107837205 (опубликована: 28.11.2017), CN108578277 (опубликована: 13.02.2016), CN104546654 (опубликована: 11.10.2013), RU2444980 (опубликована: 20.03.2012) описаны косметические средства, содержащие NaPCA как гигроскопическое вещество, которое при малых молекулярных размерах способно связывать большое количество воды. На 2019 год NaPCA используется в составе 1289 косметических средств [29].
[0024] В качестве БАВ в косметических композициях используют широкий спектр разнообразных веществ, в том числе пептиды, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, гиалуроновую кислоты, сахариды, церамиды, витамины, минералы и много других. Однако большая часть БАВ самостоятельно не проникает через роговой слой эпидермиса в более глубокие слои кожи, где и должна оказывать свое действие. В связи с развитием неинвазивной косметологии существует необходимость разработки системы энхансеров трансдермального переноса, которые позволят БАВ успешно преодолевать кожный барьер.
ТЕРМИНЫ И СОКРАЩЕНИЯ
EGF
[0025]  – epidermal growth factor
MgPCA
[0026]  — 2-пирролидон карбоксилат магния
MMP
[0027]  – матриксная металлопротеиназа
NaPCA
[0028]  — 2-пирролидон карбоксилат натрия
NMF
[0029]  (natural moisturizing factor) — натуральный увлажняющий фактор
PCA
[0030]  — 2-пирролидон-5-карбоновая кислота
TGF-β
[0031]  – transforming growth factor β
VEGF
[0032]  – vascular endothelial growth factor
АФК
[0033]  - активные формы кислорода
БАВ
[0034]  — биологически активные вещества
ДМСО
[0035]  — диметилсульфооксид
кДа
[0036]  — килоДальтон
УФ
[0037]  – ультрафиолет
Васкулоэндотелиальный фактор роста
[0038]  (VEGF, Васкулярно-эндотелиальный пептид, Фактор роста эндотелия сосудов) – ряд сигнальных пептидов, которые возникают в результате альтернативного сплайсинга матричной РНК (мРНК) одного гена, содержащего 8 экзонов. VEGF экспрессируется различными типами клеток в условиях нехватки кислорода.   VEGF служит частью системы, отвечающей за восстановление подачи кислорода к тканям.
Витамин А
[0039]  – ряд ретиноидов, включающий ретинол, третиноин, адапален, тазаротен ретинальдегид и сложные эфиры ретинила.
Витамины группы В
[0040]  – группа водорастворимых витаминов, включающая витамин В1 (тиамин, аневрин), витамин В2 (рибофлавин, лактофлавин), витамин В3 (никотиновая кислота, ниацин), витамин В5 (пантотеновая кислота), витамин В6 (пиридоксин, пиридоксаль, пиридоксамин, пиривитол), витамин В7 (биотин, витамин Н), витамин В9 (фолиевая кислота), витамин В12 (кобаламин, цианокобаламин).
Витамин С
[0041]  (L-аскорбиновая кислота) – биологически активный изомер аскорбиновой кислоты, необходимый для нормального функционирования соединительной и костной ткани.
Витамин Е
[0042]  (токоферол) – группа природных жирорастворимых соединений производных токола. Наиболее активной формой витамина Е является α-токоферол.
Витамин F
[0043]  — представляет собой комплекс полиненасыщенных жирных кислот, относящихся к классам омега-3-ненасыщенных жирных кислот и омега-6-ненасыщенных жирных кислот. Комплекс включает линолевую кислоту, линоленовую кислоту, арахидоновую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и докозагексаеновую кислоту. Название «витамин F» является условным, так как с биохимической и фармакологической точки зрения указанный комплекс полиненасыщенных жирных кислот витамином не является, и его выделяют в особую группу биологически активных веществ — незаменимые жирные кислоты.
Витамин K
[0044]  — групповое название для ряда жирорастворимых, гидрофобных витаминов, являющихся производными 2-метил-1,4-нафтохинона. В природе найдены выделенный из люцерны витамин K1 и выделенный из гниющей рыбной муки K2. Кроме природных витаминов К, в настоящее время известен ряд производных нафтохинона, полученных синтетическим путём: витамин К3 (2-метил-1,4-нафтохинон), витамин К4 (2-метил-1,4-нафтогидрохинон), витамин К5 (2-метил-4-амино-1-нафтогидрохинон), витамин К6 (2-метил-1,4-диаминонафтохинон), витамин К7 (3-метил-4-амино-1-нафтогидрохинон).
Трипептид-10 цитруллин
ТМ
[0045]  (Lys-a-Asp-Ile-Citrulline, Декоринил, Decorinyl) – синтетический тетрапептид, аналог белка декорина, вырабатываемого кожей человека.
Карнозин
[0046]  (L-carnosine, пептид β-Ala-His) – низкомолекулярный водорастворимый дипептид, состоящий из остатков аминокислот β-аланина и гистидина. Обнаружен в высоких концентрациях в мышцах и тканях мозга млекопитающих, в том числе человека.
Пальмитоил пентапептид-3

16
[0047]  (pal-KTTKS, матриксил, Matrixyl) – липопептид C-KTTKS, полученный путем протеолитического гидролиза коллагена I типа и стабилизированный за счет пальмитирования.
Пальмитоил трипептид-38
[0048]  (пептид pal-Lys-Met-Lys) – сигнальный пептид, состоящий из двух остатков лизина и одного метионина, стабилизированный за счет пальмитирования.
Пептид Ala-Glu-Asp-Gly
[0049]  (пептид AGAG, эпиталон) — тетрапептид, синтезированный на основе анализа аминокислотного состава комплекесного пептидного препарата эпиталамина, выделенного из эпифиза мозга животных.
Пептид Arg-Lys-Asp-Val-Tyr
[0050]  (пептид RKDVY) – пентапептид, соответствующий участку аминокислотной последовательности белка тимопоэтина, вырабатываемого тимусом. При этом последовательность аминокислотных остатков Arg-Lys-Asp-Val-Tyr (RKDVY) соответствует позициям 32-36 в пептидной цепи тимопоэтина.
Пептид Сu-GHK
[0051]  (Copper tripeptide, пептид GHK-Cu, пептид Cu-Gly-L-His-L-Lys) – природный комплекс одновалентной меди и трипептида, состоящего из глицина, гистидина и лизина.
Пептид Glu-Trp
[0052]  (пептид EW)– синтетический дипептид, идентичный природному соединению, выделенному хроматографическим методом из экстракта тимуса.
Пептид Lys-Glu
[0053]  (пептид KE) – синтетический дипептид, состоящий из остатков лизина и глутаминовой кислоты, один из представителей пептидных тимомиметиков, который был обнаружен в составе полипептидного комплекса тимуса животных.
Пептид Lys-Asp-Glu
[0054]  (пептид KDE) – вазоактивный трипептид, состоящий из остатков лизина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.
Свободная аминокислота
[0055]  — аминокислота, не входящая в состав пептида.
Сквалан
[0056]  — углеводород тритерпенового ряда, принадлежащий к группе каротиноидов. Сквалан представляет собой стабилизированную форму сквалена, полученную в процессе гидрирования. Сквалан по сравнению со скваленом более устойчив к окислению и воздействию высоких температур. Принадлежит к группе каротиноидов.
Эпидермальный фактор роста
[0057]  (EGF) – глобулярный белок размером около 6 кДа, состоящий из 53 аминокислотных остатков. Также под термином «EGF» в тексте данной заявки подразумеваются синтетические пептиды, аминокислотные последовательности которых соответствуют части аминокислотной последовательности EGF.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0058] Задачей настоящего изобретения является неинвазивная доставка БАВ в составе косметических композиций в глубокие слои кожи, включая дерму.
[0059] Данная задача решается заявляемым изобретением за счет достижения такого технического результата, как обеспечение проникновения БАВ через роговой слой эпидермиса в дерму без травмирования кожных покровов, быстрое восстановление кожного барьера после применения заявленного изобретения, сохранение увлажненности кожи.
[0060] Заявленный технический результат достигается за счет состава системы энхансеров трансдермального переноса, которая содержит перечисленные ниже компоненты в следующем соотношении мас. %:
Диметилсульфооксид (ДМСО) — 0,01-0,05,
Пирролидон карбоксилат натрия (NaPCA) — 1-2,5,
Вода — 97,45-98,99
[0061] Заявленная система энхансеров может быть использована самостоятельно, непосредственно перед нанесением косметического средства. В этом случае заявленная система энхансеров повышает эффективность этого косметического средства, увеличивая проницаемость кожи для БАВ, содержащихся в косметическом средстве.
[0062] ДМСО и NaPCА в составе заявленной системы энхансеров служат для обеспечения проникновения БАВ через роговой слой эпидермиса. При этом NaPCa дополнительно способствует сохранению увлажненности кожи.  Кроме того, NaPCa выполняет функцию консерванта за счет своих антимикробных свойств.
[0063] В одном из вариантов реализации заявленная система энхансеров содержит сквалан, который служит для предотвращения дегидратации кожи, а также способствует проникновению некоторых БАВ через роговой слой эпидермиса. Сквалан дополнительно оказывает противовоспалительное действие и помогает предотвратить УФ повреждения кожи. Содержание сквалана в заявленной системе энхансеров составляет – 2-5%. При этом количество воды в заявленной системе энхансеров уменьшается на то количество мас. %, которое соответствует содержанию сквалана.
[0064] Заявленная система энхансеров может входить в состав косметической композиции, содержащей БАВ. В этом случае косметическая композиция имеет следующий состав в мас. %:
Диметилсульфооксид (ДМСО) — 0,01-0,05,
Пирролидон карбоксилат натрия (NaPCA) — 1-2,5,
БАВ — 4-10,
Вода — 87,45-94,99.
[0065] При этом БАВ в составе заявленной косметическоой композиции включают по меньшей мере один пептид, а также могут включать широкий спектр веществ, в том числе свободные аминокислоты и их производные, витамины, полиненасыщенные жирные кислоты, магний и кремний.
[0066] Пептид в составе заявленной косметической композиции может быть выбран из ряда: пептид Ala-Glu-Asp-Gly, пептид Lys-Asp-Glu, пептид Lys-Glu, пептид Arg-Lys-Asp-Val-Tyr, пептид Glu-Trp, трипептид-10 цитруллин, карнозин, пальмитоил пентапептид-3, пептид Cu-GHK, пальмитоил трипептид-38, васкулярно-эндотелиальный пептид (VEGF), эпидермальный фактор роста (EGF). Причем косметическая композиция может включать как один пептид, так и комбинацию пептидов, при этом суммарное содержание пептидов в заявленной косметической композиции не превышает 0,01-1% мас.
[0067] Пептиды в составе заявленной косметической композиции замедляют возрастные изменения в коже, способствуют разглаживанию морщин, уменьшению пигментных пятен, повышают увлажненность, упругость и гладкость кожи. Пептиды защищают клетки кожи от негативного воздействия УФ, радиационных и токсикохимических факторов, оказывают антимутагенный и антиканцерогенный эффекты. Кроме того, пептиды оказывают противовоспалительное, ранозаживляющее, антисептическое действие, благодаря чему улучшают состояние кожи при дерматите, эритеме, инфекционно-воспалительных заболеваниях.
[0068] Свободные аминокислоты и их производные в составе заявленной косметической композиции участвуют в поддержании увлажненности, упругости и эластичности кожи. Свободные аминокислоты и их производные могут быть представлены одним или более вариантом, выбранным из ряда: глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, тирозин, серин, оксипролин, пролин, треонин, цистеин, аспарагиновая кислота, аспарагин, глутаминовая кислота, глутамин, гистидин, лизин, аргинин, фенилаланин, триптофан, эктоин. При этом суммарное содержание свободных аминокислот и их производных в заявленной косметической композиции не превышает 5 % мас.
[0069] Витамины в составе заявленной косметической композиции уменьшают морщины повышают упругость кожи, способствуют поддержанию увлажненности кожи, защищают кожу от солнечных ожогов. Витамины регулируют работу сальных желез, оказывают противовоспалительное действие и способствуют заживлению ран при мелких повреждениях, за счет чего улучшают состояние кожи при таких заболеваниях, как акне, дерматит, псориаз, экзема. Витамины могут быть представлены одним или более вариантом, выбранным из ряда: витамин А, витамин В1, витамин В2, витамин В3, витамин В5, витамин В6, витамин В7, витамин В9, витамин В12, витамин Е, витамин С и витамин К. При этом суммарное содержание витаминов в заявленной косметической композиции не превышает 2-5 % мас.
[0070] Комплекс полиненасыщенных жирных кислот в составе заявленной косметической композиции включает линолевую и линоленовую кислоты, а также может включать арахидоновую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и докозагексаеновую кислоту. Указанный комплекс полиненасыщенных жирных кислот оказывает противовоспалительное и ранозаживляющее действие, снижает проявление аллергических реакций, защищает кожу от воздействия УФ, а также способствует сохранению увлажненности кожи, тем самым повышая ее упругость, эластичность и уменьшая морщины. Содержание указанного комплекса полиненасыщенных жирных кислот в составе заявленной косметической композиции не превышает 2-5% мас.
[0071] Магний способствует сохранению увлажненности кожи. Магний нетоксичен, неканцерогенен и некомедогенен. В одном варианте осуществления магний представляет собой глюконат магния. В другом варианте осуществления магний представляет собой магниевую соль 2-пирролидон-5-карбоновой кислоты (MgPCA). Еще в одном варианте осуществления магний представлен комбинацией глюконата магния и MgPCA. Суммарное содержание глюконата магния и MgPCA в заявленной косметической композиции составляет 0,5-2% мас.
[0072] Кремний повышает упругость кожи, влияя на прочность волокон эластина и коллагена. Кремний входит в состав заявленной косметической композиции в виде диоксида кремния. Содержание диоксида кремния в заявленной косметической композиции составляет 0,5-2% мас.
[0073] В одном из вариантов реализации заявленная косметическая композиция дополнительно содержит сквалан в составе системы энхансеров. При этом содержание сквалана в заявленной косметической композиции составляет от 2 % мас. до 5 % мас., а количество воды уменьшается на то количество % мас., которое соответствует содержанию сквалана.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0074] На Фиг. 1 схематично показан механизм работы ДМСО как энхансера трансдермального переноса.
[0075] На Фиг. 2 схематично показан механизм работы NaPCa как энхансера трансдермального переноса.
[0076] Фиг. 3 иллюстрирует изменение проницаемости кожи человека под воздействием заявленной системы энхансеров.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0077] В приведенном ниже подробном описании реализации изобретения приведены многочисленные детали реализации, призванные обеспечить отчетливое понимание настоящего изобретения. Однако, квалифицированному в предметной области специалисту, очевидно, каким образом можно использовать настоящее изобретение, как с данными деталями реализации, так и без них. В других случаях хорошо известные методы, процедуры и компоненты не описаны подробно, чтобы не затруднять излишне понимание особенностей настоящего изобретения.
[0078] Кроме того, из приведенного изложения ясно, что изобретение не ограничивается приведенной реализацией. Многочисленные возможные модификации, изменения, вариации и замены, сохраняющие суть и форму настоящего изобретения, очевидны для квалифицированных в предметной области специалистов.
[0079] Заявленная система энхансеров трансдермального переноса является альтернативой инвазивному введению косметических препаратов и позволяет доставлять в дерму БАВ, нанесенные на кожу совместно с заявленной системой энхансеров или непосредственно после нанесения на кожу заявленной системы энхансеров. Заявленная система энхансеров трансдермального переноса содержит ДМСО, NaPCA и воду в следующем соотношении в мас. %:
Диметилсульфооксид (ДМСО) — 0,01-0,05,
Пирролидон карбоксилат натрия (NaPCа) — 1-2,5,
Вода — 97,45-98,99.
[0080] На Фиг. 1 схематично показан механизм действия ДМСО в качестве энхансера трансдермального переноса. ДМСО усиливает проникновение как гидрофильных 1 БАВ, так и липофильных 2 БАВ сквозь мембраны корнеоцитов 3 рогового слоя эпидермиса 4. ДМСО является хорошим растворителем и смешивается с водой и органическими растворителями, что позволяет совмещать заявленную систему энхансеров с большим количеством разнообразных БАВ в составе различных косметических средств. Кроме того, ДМСО оказывает противовоспалительное, антисептическое, анальгезирующее и фибринолитическое действие.
[0081] Как правило, содержание ДМСО в составе косметических средств составляет 10% и выше. Однако при этом возникает целый ряд побочных эффектов, о которых написано выше. При этом самым распространенным побочным эффектом и является сухость кожи, которая обнаруживается обнаруживается у приблизительно 11% испытуемых [15]. Одной из причин сухости кожи при использовании ДМСО является взаимодействие ДМСО с кератином корнеоцитов, что приводит к нарушению филаментной структуры кератина и снижению его способности удерживать воду. Как отмечалось выше, сухость кожи ослабляет ее защитную функцию и может приводить к ряду воспалительных заболеваний. Казалось бы очевидным решением данной проблемы является уменьшение концентрации ДМСО в составе косметического средства. Однако при низком содержании ДМСО не будет эффективно выполнять свою энхансерную функцию.
[0082] В заявленной системе энхансеров снижение концентрации ДМСО, исключающее практически все описанные побочные эффекты, дополнено введением NaPCA в качестве второго энхансера трансдермального переноса. В заявленной системе энхансеров NaPCA является энхансером межклеточного пути проникновения БАВ. На Фиг. 2 схематично показан механизм действия NaPCA. За счет модификации межклеточного липидного матрикса 5 рогового слоя эпидермиса 4 NaPCA усиливает проникновение гидрофильных 1 БАВ. Сочетание ДМСО с NaPCA позволяет расширить круг БАВ, проникающий через эпидермальный барьер, и в целом усилить проводниковые функции заявленной системы энхансеров.
[0083] Помимо усиления трансдермального переноса NaPCA способствует повышению уровня гидратации кожи. NaPCA является гигроскопичным веществом, его водоудерживающая способность превышает таковую у глицерина более чем в два раза. Увеличение содержания NaPCA отчасти компенсирует потерю воды в условиях нарушения гигроскопичности кератиновых филаментов. Кроме того, NaPCA, являясь компонентом NMF, обеспечивает увлажненность рогового слоя эпидермиса за счет нормализации работы увлажняющего фактора.
[0084] NaPCA в составе заявленной системы энхансеров трансдермального переноса также выполняет функцию консерванта, которая обусловлена его антимикробной активностью.
[0085] В концентрации, не превышающей 2,5%, NaPCA не обладает раздражающим действием, не фототоксичен, не вызывает сенсибилизации, не является камедогеном и не является мутогеном [29].
[0086] В одном из вариантов реализации заявленная система энхансеров дополнительно содержит 2-5% мас. сквалана. При этом количество воды в заявленной системе энхансеров уменьшается на то количество мас. %, которое соответствует содержанию сквалана. Сквалан выполняет двойную функцию: увлажняющего компонента и энхансера трансдермального переноса. Так как сквалан является формой сквалена — естественного компонента кожного сала — молекулы сквалана имеют высокое сродство к коже, легко смешиваются с кожным салом и препятствуют испарению влаги с поверхности кожи. Сквалан способен проникать дальше поверхности кожи и встраиваться в межклеточный липидный матрикс рогового слоя эпидермиса. Благодаря этому сквалан восстанавливает поврежденный роговой слой эпидермиса и уменьшает шелушение кожи при паталогических состояниях. Молекулы сквалана гигроскопичны, за счет чего они способны удерживать в коже молекулы воды [30].
[0087] Сквалан также обладает свойствами энхансера трансдермального переноса и обеспечивая межклеточный путь проникновения. Подобно NaPCA, он способен менять проницаемость липидного матрикса проводя с собой некоторые БАВ, такие, например, как витамины, микро- и макроэлементы [3].
[0088] Кроме того, сквалан обладает антиоксидантными свойствами, стимулирует клеточный рост и регенерацию кожи, оказывает антибактериальное и противогрибковое действие [3,30]. Благодаря своим свойствам сквалан повышает эластичность кожи, ускоряет заживление мелких ран и трещин, способствует разглаживанию мелких морщин, стимулирует антиоксидантные процессы, препятствуя старению кожи. При этом сквалан некамедогенен, практически не имеет запаха и цвета и может храниться больше двух лет, не теряя своей функциональности.
[0089] Заявленная система энхансеров может входить в состав косметической композиции, содержащей БАВ. В этом случае косметическая композиция имеет следующий состав в мас. %:
Диметилсульфооксид (ДМСО) — 0,01-0,05,
Пирролидон карбоксилат натрия (NaPCа) — 1-2,5,
БАВ — 4-10,
Вода — 87,45-94,99.
[0090] При этом БАВ в составе заявленной косметическоой композиции включают по меньшей мере один пептид, а также могут включать широкий спектр веществ, например, свободные аминокислоты и их производные, витамины, полиненасыщенные жирные кислоты, магний и кремний.
[0091] Заявленная косметическая композиция может включать как один пептид, так и комбинацию пептидов, включающих, но не ограничивающихся этим, пептид Ala-Glu-Asp-Gly, пептид Lys-Asp-Glu, пептид Lys-Glu, пептид Arg-Lys-Asp-Val-Tyr, пептид Glu-Trp, трипептид-10 цитруллин, карнозин, пальмитоил пентапептид-3, пептид Cu-GHK, пальмитоил трипептид-38, васкулярно-эндотелиальный пептид (VEGF), эпидермальный фактор роста (EGF). При этом суммарное содержание пептидов в заявленной косметической композиции не превышает 0,01-1% мас.
[0092] Пептиды в составе заявленной косметической композиции обладают широким спектром биологических активностей. Пептиды стимулируют пролиферацию, дифференцировку и активность фибробластов дермы, повышают уровень экспрессии и качество фибрилл коллагена и эластина. При этом пептиды препятствуют модификации и разрушению белков кожи, вызванным возрастными изменениями. Кроме того, пептиды повышают уровень увлажненности кожи, способствуют восстановлению микроциркулярного русла, предотвращают образование паталогических рубцов. Благодаря этому пептиды функционируют как геропротекторы — способствуют разглаживанию морщин, уменьшению пигментных пятен, повышают упругость и гладкость кожи. Кроме того, пептиды оказывают противовоспалительное, ранозаживляющее, антисептическое действие, благодаря чему улучшают состояние кожи при дерметите, эритеме, инфекционно-воспалительных заболеваниях. Пептиды защищают клетки кожи от негативного воздействия УФ, тяжелых металлов, оксидативного стресса, от действия радиационных и токсикохимических факторов, защищают клетки от хромосомных нарушений и предотвращают образование опухолей.
[0093] Пептид Ala-Glu-Asp-Gly обладает широким спектром биологических активностей.  На культуре фибробластов дермы человека было показано, что пептид Ala-Glu-Asp-Gly повышает активность теломеразы, увеличивая пролиферационный потенциал клеток. Это позволяет продлить период активного функционирования фибробластов, иными словами, продлить «клеточную молодость». Фибробласты дермы являются основными коллагенобразующими клетками, ответственными за состояние коллагенового каркаса, и соответственно, за упругость и подтянутость кожи. Также пептид Ala-Glu-Asp-Gly улучшает реологические свойства крови, снижает межсосудистое тромбообразование. Кроме того, пептид Ala-Glu-Asp-Gly способен подавлять экспрессию онкогенов, тем самым предотвращая спонтанное появление опухолей.
[0094] Пептид Lys-Asp-Glu обладает ярко выраженными вазопротекторными свойствами. Кроме того, пептид Lys-Asp-Glu подавляет синтез матриксных металлопротеиназ в фибробластах кожи. Благодаря указанным свойствам пептид Lys-Asp-Glu замедляет процессы старения кожи и восстанавливает капиллярную систему, что способствует питанию и увлажнению кожи.
[0095] Пептид Lys-Glu регулирует скорость пролиферации и дифференцировки, фибробластов, стимулирует их функциональную активность, в том числе синтез коллагена и эластина. Пептид Lys-Glu стимулирует процесс регенерации кожи, благодаря чему ускоряет заживление ран. Также пептид Lys-Glu обладает иммуномодулирующим и онкостатическим действием. Кроме того, пептид Lys-Glu проявляет выраженные геропротекторные свойства [31–33].
[0096] Пептид Arg-Lys-Asp-Val-Tyr улучшает регенерацию эпидермальных структур, стимулирует пролиферацию клеток эпидермиса, фибробластов, пролиферацию и миграцию клеток эндотелия (в том числе капиллярного), стимулирует образование новых капиллярных каналов, что улучшает микроциркуляцию крови, питание и увлажнение кожи. Пептид Arg-Lys-Asp-Val-Tyr улучшает кожный иммунитет, благодаря чему ускоряет выздоровление при таких кожных заболеваниях, как атопический дерматит [34, 35].
[0097] Пептид Glu-Trp обладает антиоксидантными свойствами, стимулируя синтез и повышение активности ферментов антиоксидантной защиты. Также пептид Glu-Trp стимулирует пролиферацию и дифференцировку Т-лимфоцитов, регулирует продукцию IgA, IgG, IgM и IgE, экспрессию генов защитных систем клеток и митохондрий, повышает активность системы неспецифической защиты. Пептид Glu-Trp обладает антимутагенным действием, снижая уровень хромосомных аберраций при воздействии радиационных и токсикохимических факторов. Кроме того, пептид Glu-Trp нормализует содержание провоспалительных (TNF-α, IL-1β, IL-8) и противовоспалительных (TGFβ1, IL-10) цитокинов, а также ингибирует продукцию гистамина и серотонина при воспалениях. Благодаря этому пептид Glu-Trp снимает воспаления и оказывает иммуномодулирующий эффект, что способствует улучшению состояния при инфекционно-воспалительных заболеваниях кожи [36, 37].
[0098] Трипептид-10 цитруллин является синтетическим аналогом белка кожи декорина, функцией которого является контроль формирования качественного коллагена кожи. Трипептид-10 цитруллин используется для специфической целенаправленной организации коллагенового волокна. В слепом плацебо-контролируемом параллельном групповом исследовании с 43 здоровыми добровольцами трипептид-10 цитруллин продемонстрировал способствовал увеличению однородности диаметра фибрилл коллагена и увеличивал эластичность кожи благодаря лучшему сцеплению коллагеновых фибрилл [38]. Кроме того, трипептид-10 цитруллин способен предотвращать образование рубцовой ткани. Образование паталогических рубцов и фиброзных спаек происходит, в основном, под воздействием фактора роста TGF-β [39]. Трипептид-10 цитруллин подавляет активность TGF-β, предотвращая тем самым образование избыточной рубцовой ткани.
2+
2+
[0099] Карнозин – пептид с выраженными антиоксидантными свойствами [40, 41]. Карнозин способен хелаторовать ионы Cu и Fe, которые в свободном виде катализируют превращение перекиси водорода в радикал *ОН [42]. Также карнозин участвует в расщеплении активных форм кислорода (АФК) и защищает организм от α-β-ненасыщенных альдегидов, образующихся из суперокисленных жирных кислот клеточных мембран. Благодаря своим антиоксидантным свойствам карнозин препятствует перекисной модификации белков кожи и предотвращает гликирование белков кожи, вызванное возрастными изменениями [43, 44]. Кроме того, карнозин демонстрирует ранозаживляющие свойства, способствует разглаживанию мимических морщин и предотвращает развитие некоторых дерматологических нарушений, например, эритемы [45, 46].
[00100] Пальмитоил пентапептид-3 усиливает экспрессию коллагена I типа и синтазы-1 гиалуроновой кислоты, а также увеличивает секрецию проколлагена и коллагена I типа фибробластами человека [47]. Благодаря этим свойствам пальмитоил пентапептид-3 способствует разглаживанию морщин. В двойном слепом плацебо-контролируемом рандомизированном исследовании было показано, что пальмитоил пентапептид-3 способствует уменьшению морщин, улучшению структуры кожи, уменьшению возрастных пигментных пятен и темных кругов под глазами [48].
[00101] Пептид Cu-GHK стимулирует синтез коллагена эластина, протеогликана и обеспечивает противовоспалительное и антиоксидантные ответы. Благодаря этим свойствам пептид Cu-GHK ускоряет заживление ран, в том числе осложненных ран, например, ожогов, ран с нарушенным кровоснабжением и ран, на которые трудно наложить повязки. Кроме того, пептид Cu-GHK стимулирует синтез гликозаминогликанов – влагоудерживающих молекул дермы, способствуя увлажненности кожи [44, 49, 50].
[00102] Пальмитоил трипептид-38 является сигнальным пептидом, запускающим в коже синтез таких важнейших компонентов внеклеточного матрикса, как коллаген I, III и IV типов, фибронектин, гиалуроновая кислота, ламинин-5 и белок теплового шока 47. Благодаря своей сигнальной активности пальмитоил трипептид-38 способствует разглаживанию морщин, заживлению ран, защите от воздействия   тяжелых металлов и оксидативного стресса, увеличивает увлажненность, плотность и эластичность кожи [44, 51].
[00103] Васкулоэндотелиальный фактор роста (VEGF) индуцирует пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов, усиливает формирование новых кровеносных сосудов микрокапиллярного русла. Благодаря этому улучшается питание и увлажненность кожи. Кроме того, VEGF влияет на синтез коллагена и способствует заживлению ран [50, 52, 53].
[00104] Эпидермальный фактор роста (EGF) контролирует и стимулирует пролиферацию эпидермальных клеток, включая фибробласты. Благодаря этому EGF способствует заживлению ран и язв при местном применении. Кроме того, EGF способствует уменьшению морщин, возрастных пигментных пятен, покраснений кожи, и повышает гладкость и упругость кожи [50, 54].
[00105] Заявленная косметическая композиция в качестве БАВ может содержать свободные аминокислоты и их производные. При этом аминокислоты и их производные могут быть представлены одним или более вариантом, выбранным из ряда: глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, тирозин, серин, оксипролин, пролин, треонин, цистеин, аспарагиновая кислота, аспарагин, глутаминовая кислота, глутамин, гистидин, лизин, аргинин, фенилаланин, триптофан, эктоин. При этом суммарное содержание аминокислот и их производных в заявленной косметической композиции не превышает 5% мас.
[00106] Одной из основных функций свободных аминокислот в составе заявленной косметической композиции является увлажнение. Эту функцию аминокислоты во многом выполняют благодаря тому, что входят в состав NMF. Кроме того, свободные аминокислоты стимулируют синтез церамидов, а также являются строительным материалом для коллагена и эластина. Благодаря своим свойствам аминокислоты участвуют в поддержании увлажненности, упругости и эластичности кожи.
[00107] Витамины в составе заявленной косметической композиции предотвращают старение кожи, уменьшая возрастное расщепление коллагена и способствуя синтезу коллагена и эластина. Кроме того, витамины способствуют поддержанию увлажненности кожи и активизируют ферментативную антиоксидантную защиту, благодаря чему защищают кожу от солнечных ожогов. Витамины регулируют работы сальных желез, оказывают противовоспалительное действие, способствуют заживлению ран при мелких повреждениях, за счет чего улучшают состояние кожи при таких заболеваниях, как акне, дерматит, псориаз, экзема.
[00108] Витамины могут быть представлены одним или более вариантом, выбранным из ряда: витамин А, витамин В1, витамин В2, витамин В3, витамин В5, витамин В6, витамин В7, витамин В9, витамин В12, витамин Е, витамин С и витамин К. При этом суммарное содержание витаминов в заявленной косметической композиции составляет 2-5% мас.
[00109] Витамин А индуцирует выработку проколлагена I и II типа и уменьшает возрастное расщепление коллагена благодаря ингибированию матриксных металлопротеиназ. В результате происходит утолщение дермы и уменьшение морщин. Кроме того, витамин А обладает противовоспалительными свойствами, способствует восстановлению кожи после повреждений, уменьшению пигментных пятен [55–57].
[00110] Витамины группы В включают в себя витамин В1, витамин В2, витамин В3, витамин В5, витамин В6, витамин В7, витамин В9, витамин В12. Витамины группы В участвуют в работе нервной системы и регулируют чувствительность кожи. Кроме того, витамины группы В регулируют работы сальных желез и способствуют поддержанию увлажненности кожи и упругости. Являясь кофакторами многих ферментов, витамины группы В способствуют синтезу коллагена и эластина, а также проявляют антиоксидантные свойства. Витамины группы В укрепляют местный иммунитет, оказывая противовоспалительное действие и способствуя обновлению клеток кожи. Благодаря своим свойствам витамины группы В уменьшают морщины, покраснения, пигментные пятна, способствуют заживлению ран при мелких повреждениях. Кроме того, витамины группы В оказывают положительный эффект при лечении таких заболеваний кожи, как акне, дерматит, псориаз, экзема [55, 56, 58].
[00111] Витамин Е проявляет антиоксидантные свойства. Он является универсальным протектором клеточных мембран от окислительного повреждения, препятствуя контакту кислорода с ненасыщенными липидами мембран. Также витамин E способствует включению селена в состав активного центра глутатионпероксидазы, тем самым он активизирует ферментативную антиоксидантную защиту. Витамин Е стабилизирует митохондриальную мембрану, что защищает митохондрии от повреждений. Кроме того, витамин Е способствует выработке коллагена фибробластами. Благодаря своим свойствам витамин Е защищает кожу от солнечных ожогов, снижает гиперпигментацию кожи, отек и эритему, вызванные УФ облучением. Также использование витамина Е уменьшает морщины и улучшает снабжение кислородом клеток кожи [55, 59, 60].
[00112] Витамин С обладает антиоксидантными свойствами, стимулирует синтез коллагена, способствует регенерации поврежденной кожи, усиливает защитные возможности эпидермиса относительно вредного влияния УФ-лучей. Благодаря своим свойствам витамин С повышает упругость кожи, уменьшает количество и глубину морщин, пигментацию кожи.
[00113] Витамин К оказывает положительное влияние на физиологию кожи, подавляет пигментацию кожи, уменьшает покраснения и способствует устранению синяков [61, 62].
[00114] Комплекс полиненасыщенных жирных кислот в составе заявленной косметической композиции включает линолевую и линоленовую кислоты, а также может включать арахидоновую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и докозагексаеновую кислоту. Указанный комплекс полиненасыщенных жирных кислот уловно называется витамином F. В составе заявленной косметической композиции содержание витамина F составляет 2-5%.
[00115] Полиненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав витамина F, являются энергетическим субстратом в процессе внутриклеточного дыхания и входят в состав фосфолипидов мембран животных клеток. При их недостатке в коже происходит нарушение функционирования клеточных мембран и жирового обмена, что приводит к развитию таких патологических процессов, как дерматит, экзема, себорея, угри, трещины. Линолевая, линоленовая и арахидоновая кислоты оказывают противовоспалительное действие, защищают кожу от воздействия УФ, способствуют заживлению ран и язв.
[00116] Наружное применение витамина F способствует насыщению кожи жирными кислотами, нормализует клеточный обмен, способствует заживлению ран, снижает воспаление и проявление аллергических реакций. Кроме того, витамин F способствует сохранению увлажненности кожи, тем самым повышая ее упругость, эластичность и уменьшая морщины.
[00117] Витамин F чувствителен к воздействию высоких температур, света и контакту с воздухом, что порождает образование токсичных окисей и свободных радикалов, поэтому важно использовать его одновременно с антиоксидантами, например, с витамином Е или селеном.
[00118] Магний в составе заявленной косметической композиции способствует увлажнению кожи. Магний является важным компонентом NMF, а также влияет на количество и качество жирных кислот в роговом слое и на поверхности эпидермиса. Кроме того, магний способствует синтезу коллагена фибробластами кожи [5, 63]. Однако повысить содержание магния в коже достаточно сложно. При пероральном приеме препаратов магния он в значительной степени выводится с мочой, а оставшийся в организме магний накапливается в основном в костях [5, 64]. В одном варианте реализации косметической композиции согласно настоящему изобретению магний представляет собой глюконат магния. В другом варианте реализации косметической композиции магний представляет собой магниевую соль 2-пирролидон-5-карбоновой кислоты (MgPCA). Еще в одном варианте реализации косметической композиции магний представляет собой комбинацией глюконата магния и MgPCA. В любом указанном варианте реализации суммарное содержание глюконата магния и MgPCA в косметической композиции составляет 0,5-2% мас.
[00119] Кремний влияет на протеогликаны – сложные белки с высокой степенью гликозилирования. Протеогликаны переплетаются с волокнами коллаген и эластинаодин из основных белков соединительной ткани — протеогликан. В результате волокна эластина и коллагена надежно скрепляются, придавая коже упругость. В заявленную косметическую композицию кремний входит в виде диоксида кремния в количестве 0,5-2% мас.
[00120] Значительная часть указанных БАВ имеет очень небольшое сродство к коже. Эффективность трансдермальной доставки большинства указанных БАВ без дополнительных энхансеров трансдермального переноса остается вопросом научных дискуссий.
ПРИМЕРЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример 1. Исследование способности заявленной косметической композиции, содержащей заявленную систему энхансеров, изменять проницаемость кожи
in vitro
2
[00121] В описанном ниже эксперименте исследовали косметическую композицию, включающую систему энхансеров, содержащую 0,01 % мас. ДМСО и 2 % мас. NaPCA. В качестве объекта испытаний использовали трехмерную модель человеческой кожи, состоящую из реконструированного эпидермиса с функциональным роговым слоем «VitroSkin» (разработан ООО НПО «ВитроЛаб», соответствует п. 4.2 ГОСТ 32634-2014). Постановка эксперимента с исследованием динамики проникновения контрольного вещества через эпидермис человека в тесте  позволяют дать интегральную оценку изменению проницаемости кожи под влиянием тестируемого продукта [65]. В качестве контрольного вещества использовали флуоресцеин (CAS Number: 2321-07-5) – низкомолекулярное органическое соединение, способное к диффузии через кожный барьер, а в качестве физического принципа детекции использовали флуоресцентный метод. В качестве отрицательного контрольного вещества использовали 0,9% NaCl. Исследуемое вещество (косметическая композиция или отрицательное контрольное вещество) наносили местно на модель кожи «VitroSkin». Способности тестируемого вещества изменять проницаемость кожи определяли по количеству проникшего флуоресцеина из апикального отдела трансвелла в базолатеральный отдел. Количество проникшего флуоресцеина определяли по интенсивности флуоресценции раствора в базолатеральном отделе, определяемой с помощью планшетного флуориметра VarioSkan (ThermoFisher). Сначала исследовали динамику проникновения флуоресцеина через толщу модели кожи. Для этого 100 мкл флуоресцеина наносили на образец модели кожи (в апикальную часть трансвелла). Сразу после нанесения (0 минут), через 30 и 60 минут из базолатерального отдела отбирали по 50 мкл. Отобранный объем восполняли соответствующим количеством 0,9% NaCl. Для каждого времени экспозиции использовали не менее двух образцов модели кожи. Затем исследовали динамику проникновения флуоресцеина через толщу модели кожи после воздействия на ее поверхность тестируемой косметической композиции или отрицательного контрольного вещества. Тестируемое вещество наносили на 3 минуты равномерно на поверхность образца модели кожи с полным покрытием не менее 25 мкл/см. По окончании периода воздействия исследуемое вещество тщательно смывали с поверхности модели кожи 0,9% раствором NaCl.  Затем 100 мкл флуресцеина наносили на образец модели кожи (в апикальную часть трансвелла). Сразу после нанесения (0 минут), через 30 и 60 минут из базолатерального отдела отбирали по 50 мкл раствора. Отобранный объем восполняли соответствующим количеством 0,9% NaCl. Для каждого времени экспозиции использовали не менее двух образцов модели кожи.
[00122] Результаты измерений представлены в Таблице 1, а также проиллюстрированы Фиг. 3.
Таблица 1.
Динамика проникновения флуоресцеина через толщу образца модели кожи без воздействия и после воздействия на ее поверхность косметической композиции, содержащей заявленную систему энхансеров, или отрицательного контрольного вещества
<b>№</b>
<b>Вариант обработки</b>
<b>Время экспозиции, мин</b>
<b>Интенсивность флуоресценции, RFU</b>
1
Без обработки
0
0
2
Без обработки
0
0
3
Без обработки
0
0
4
Без обработки
30
4,22
5
Без обработки
30
9,69
6
Без обработки
30
6,85
7
Без обработки
60
21,99
8
Без обработки
60
23,45
9
Без обработки
60
20,35
10
Косметическая композиция
0
0
11
Косметическая композиция
0
0
12
Косметическая композиция
0
0
13
Косметическая композиция
30
12,76
14
Косметическая композиция
30
14,34
15
Косметическая композиция
30
11,01
16
Косметическая композиция
60
16,55
17
Косметическая композиция
60
19,86
18
Косметическая композиция
60
15,52
19
Отрицательный контрольный образец
0
0
20
Отрицательный контрольный образец
0
0
21
Отрицательный контрольный образец
0
0
22
Отрицательный контрольный образец
30
3,57
23
Отрицательный контрольный образец
30
4,22
24
Отрицательный контрольный образец
30
3,05
25
Отрицательный контрольный образец
60
9,98
26
Отрицательный контрольный образец
60
7,23
27
Отрицательный контрольный образец
60
6,86
р
р
р
[00123] На Фиг. 3 представлены графики, отражающие кинетику проникновения флуресцеина через толщу модели кожи без какого-либо воздействия на образец модели кожи и после воздействия на образец модели кожи тестируемого и контрольного веществ. График 6 отражает динамику проникновение флуоресцеина через толщу необработанного образца модели кожи. График 7 получен при обработке образца модели кожи тестируемой косметической композиции, график 8 — при обработке  отрицательным контрольным веществом. Точки на графиках показывают среднеарифметическое значение для каждого времени экспозиции. Видно, что через 30 мин после воздействия проникновение флуоресцеина через толщу модели кожи заметно сильнее после воздействия тестируемой косметической композиции, по сравнению с воздействием отрицательного контрольного вещества или без какого-либо воздействия. Как показал статистический анализ с использованием критерия Стьюдента, различия, наблюдаемые между воздействием тестируемой косметической композиции и отрицательного контрольного вещества были достоверны как для времени экспозиции 30 мин ( < 0,01), так и для времени экспозиции 60 мин ( < 0,01). Также через 30 минут после воздействия проникновение флуоресцеина через толщу образца модели кожи, обработанного тестируемой косметической композицией, достоверно отличалось от проникновения через ничем необработанный образец ( < 0,05). При этом через 60 минут после воздействия проникновение флуоресцеина через толщу модели кожи не отличалось для образца, обработанного косметической композицией, и необработанного образца. Исходя из результатов эксперимента, был сделан вывод, что косметическая композиция, содержащая заявленную систему энхансеров, достоверно повышает проницаемость кожи через 30 минут  после своего воздействия. При этом уже через 60 минут проницаемость кожи возвращается в норму, что критически важно для поддержания здорового состояния кожи.
Пример 2. Исследование способности заявленной косметической композиции, содержащей заявленную систему энхансеров, вызывать раздражение кожи
2
[00124] В описанном ниже эксперименте исследовали косметическую композицию, включающую систему энхансеров, содержащую 0,01 % мас. ДМСО и 2 % мас. NaPCA. В качестве объекта испытаний использовали трехмерную модель человеческой кожи, состоящую из реконструированного эпидермиса с функциональным роговым слоем «VitroSkin» («ВитроЛаб»). Протокол исследований сформирован в соответствии с ГОСТ 32634-2014. Исследование по данному протоколу позволяет надежно идентифицировать наличие или отсутствие у тестируемых веществ способности вызывать раздражение/повреждение кожи [66–68]. Исследуемое вещество наносили на поверхность модели кожи. Коррозионные свойства вещества определяли по способности вызывать снижение жизнеспособности ниже порогового уровня за определенные периоды воздействия. Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-теста [69]. Принцип исследования на модели кожи основан на положении, что коррозионные химические вещества могут проникать в роговой слой кожи путем диффузии или эрозии и оказывают цитотоксическое действие на нижележащие слои клеток. Для подтверждения надлежащего действия экспериментальных моделей в качестве отрицательного контрольного вещества использовали водный раствор 0,9% мас. NaCl, в качестве положительного контрольного вещества использовали водный раствор 8н КОН. На поверхность образца модели кожи наносили тестируемое вещество так, что оно покрывало не менее 25 мкл/см поверхности образца модели кожи. Время экспозиции составляло 3 минут и 60 минут. По окончании периода воздействия тестируемое вещество тщательно смывали с поверхности образца модели кожи раствором 0,9% мас. NaCl. Для оценки жизнеспособности клеток использовался подтвержденный количественный метод, совместимый с использованием трехмерной модели кожи и позволяющий получать точные и воспроизводимые результаты (Fentem et al., 1998). Этот метод основан на способности митохондриальных ферментов восстанавливать краситель МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид] до нерастворимого формазана. Образец модели кожи помещали в раствор МТТ концентрации 1 мг/мл и выдерживали при температуре 37ºС в течение 3 часов.  Затем осажденный формазан экстрагировали с помощью изопропанола и определяли концентрацию формазана путем измерения оптической плотности при длине волны от 595 нм. Результаты измерения оптической плотности для всех образцов представлены в Таблице 2.
Таблица 2.
[00125]  Оптическая плотность экстракта формазона
№
Тип образца
Значение оптической плотности
1
Отрицательный контроль
0,675
2
Отрицательный контроль
0,620
3
Отрицательный контроль
0,719
4
Положительный контроль
0,090
5
Положительный контроль
0,067
6
Положительный контроль
0,105
7
Косметическая композиция, воздействие 3 мин
0,611
8
Косметическая композиция, воздействие 3 мин
0,779
9
Косметическая композиция, воздействие 3 мин
0,5
10
Косметическая композиция, воздействие 60 мин
0,489
11
Косметическая композиция, воздействие 60 мин
0,470
12
Косметическая композиция, воздействие 60 мин
0,568
Значения оптической плотности для каждого вещества и времени воздействия усредняли, и усредненные значения оптической плотности, использовали для расчета процента жизнеспособности по сравнению с отрицательным контрольным значением, которое произвольно устанавливали на уровне 100%. Данные по жизнеспособности клеток после воздействия тестируемых веществ представлены в Таблице 3.
Таблица 3
[00126] . Жизнеспособность клеток после воздействия заявленной косметической композиции, содержащей заявленную систему энхансеров
№
Тип образца
Средняя жизнеспособность, %
Ошибка средней, %
1
Отрицательный контроль
100
5,16
2
Положительный контроль
13,01
1,64
3
Косметическая композиция,воздействие 3 мин
93,84
12,08
4
Косметическая композиция,воздействие 60 мин
75,82
4,47
[00127] В используемой методике пороговое значение жизнеспособности после 3 минут воздействия составляет 50%, пороговое значение жизнеспособности после 60 минут воздействия составляет 15%. Из Таблицы 4 видно, что жизнеспособность клеток после 3 минут воздействия тестируемой косметической композиции составила 93,84%, а после 60 минут воздействия – 75,82%, что значительно выше пороговых значений. На основе полученных экспериментальных данных был сделан вывод о том, что заявленная система энхансеров не вызывает раздражение/повреждение кожи человека.
[00128] В настоящих материалах заявки представлено предпочтительное раскрытие осуществления заявленного технического решения, которое не должно использоваться как ограничивающее иные, частные воплощения его реализации, которые не выходят за рамки испрашиваемого объема правовой охраны и являются очевидными для специалистов в соответствующей области техники.
Литература
1. Гелашвили ПА, Супильников АА, Плохова ВА. Кожа человека (анатомия, гистология, гистопатология). НОУ ВПО МИ «РЕАВИЗ» // 2013.
2. Мурашкин НН, Амбарчян ЭТ, Епишев РВ, Материкин АИ. Барьерные свойства кожи в норме и патологии. Педиатрия. Журнал им ГН Сперанского // 2015; 6:165–9.
3. Kim SK, Karadeniz F. Biological importance and applications of squalene and squalane. 1st ed. Adv. Food Nutr. Res. Elsevier Inc. // 2012; 65:223-233.
4. Мизина ПГ, Быков ВА, Настина ЮИ, Фоменко ЕА. Введение лекарственных веществ через кожу - достижения и перспективы (обзор). Вестник ВГУ // 2004; 1:176–83.
5. Gröber U, Werner T, Vormann J, Kisters K. Myth or reality-transdermal magnesium? Nutrients // 2017; 9:1–8.
6. Swarbrick J, Lee G, Brom J, Gensmantel NP. Drug permeation through human skin II: Permeability of ionizable compounds. J Pharm Sci. // 1984; 73:1352–1355.
7. Заборова ОВ. Комплексы катионных полимерных микросфер с отрицательно заряженными липосомами: формирование, строение и свойства. Диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук // 2014.
8. McKim AS, Strub R. Advances in the regulated pharmaceutical use of dimethyl sulfoxide USP, Ph.Eur. Pharm Technol. // 2016; 2016: 30–5.
9. Ивкин ДЮ, Оковитый СВ, Ивкина АС, Анисимова НА. Диметилсульфоксид — вещество с плейотропными эффектами, актуальными при заболеваниях опорно-двигательного аппарата. Лечащий врач // 2019; 4:19–22.
10. Brayton CF. Dimethyl sulfoxide (DMSO): a review. Cornell Vet. // 1986; 76:61–90.
11. Машковский МД. Лекарственные средства. Пособие для врачей. М. Новая волна // 2012.
12. Rama B, Shantha A. Chemical penetration enhancers for enhance transdermal delivery of methotrexate: Formulation, in vitro, ex vivo and in vivo characterization. Int J Pharma Bio Sci. // 2012; 3(4):36-47.
13. Gurtovenko AA, Anwar J. Modulating the structure and properties of cell membranes: The molecular mechanism of action of dimethyl sulfoxide. J Phys Chem B. // 2007; 111:10453–60.
14. Gurtovenko AA, Anwar J, Vattulainen I. Defect-mediated trafficking across cell membranes: Insights from in silico modeling. Chem Rev. // 2010; 110:6077–103.
15. Simon LS, Grierson LM, Naseer Z, Bookman AAM, Zev Shainhouse J. Efficacy and safety of topical diclofenac containing dimethyl sulfoxide (DMSO) compared with those of topical placebo, DMSO vehicle and oral diclofenac for knee osteoarthritis. Pain. // 2009; 143:238–45.
16. Notman R, Noro M, O’Malley B, Anwar J. Molecular basis for dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes. J Am Chem Soc. // 2006; 128:13982–3.
17. Baer PA, Thomas LM, Shainhouse Z. Treatment of osteoarthritis of the knee with a topical diclofenac solution: A randomised controlled, 6-week trial. BMC Musculoskelet Disord. // 2005; 6:1–9.
18. Bookman AAM, Williams KSA, Shainhouse JZ. Effects of a tropical diclofenac solution for relieving symtoms of primary osteoarthritis of the knee: A randomized controlled trial. CMAJ. // 2004; 171:333–8.
19. Bertelli G, Gozza A, Forno GB, Vidili MG, Silvestro S, Venturini M, et al. Topical dimethylsulfoxide for the prevention of soft tissue injury after extravasation of vesicant cytotoxic drugs: A prospective clinical study. J Clin Oncol. // 1995; 13:2851–5.
20. Jacob SW, Herschler R. Introductory Remarks: Dimethyl Sulfoxide After Twenty Years. Ann N Y Acad Sci. // 1983; 411:xiii–xvii.
21. Kligman AM. Topical Pharmacology and Toxicology of Dimethyl Sulfoxide — Part 1. JAMA J Am Med Assoc. // 1965; 193:796–804.
22. Lee HJ, Lee SH. Epidermal permeability barrier defects and barrier repair therapy in atopic dermatitis. Allergy, Asthma Immunol Res. // 2014; 6:276–87.
23. Boguniewicz M, Leung DYM. Atopic dermatitis: A disease of altered skin barrier and immune dysregulation. Immunol Rev. // 2011; 242:233–46.
24. Hoffjan S, Stemmler S. On the role of the epidermal differentiation complex in ichthyosis vulgaris, atopic dermatitis and psoriasis. Br J Dermatol. // 2007; 157:441–9.
25. Barco D, Giménez-Arnau A. Xerosis: a Dysfunction of the Epidermal Barrier. Actas Dermo-Sifiliográficas // 2008; 99:671–82.
26. Cork MJ, Robinson DA, Vasilopoulos Y, Ferguson A, Moustafa M, MacGowan A, et al. New perspectives on epidermal barrier dysfunction in atopic dermatitis: Gene-environment interactions. J Allergy Clin Immunol. // 2006; 118:3–21.
27. Harding C, Bartolone J, Rawlings A. Effects of Natural Moisturizing Factor and Lactic Acid Isomers on Skin Function. Dry Ski Moisturizers Chem Funct. // 2000; 214–29.
28. Andersen FA. Final safety assessment for PCA and sodium PCA. Int J Toxicol. // 1999; 18:25–34.
29. Fiume MM, Bergfeld WF, Belsito D V., Hill RA, Klaassen CD, Liebler DC, et al. Safety Assessment of PCA (2-Pyrrolidone-5-Carboxylic Acid) and Its Salts as Used in Cosmetics. Int J Toxicol. // 2019; 38:5S-11S.
30. Sethi A, Kaur T, Malhotra S, Gambhir M. Moisturizers: The Slippery Road. Indian J Dermatol. // 2016; 61:279–287.
31. Терехов АЮ, Кормилец ДЮ, Линькова НС, Кузник БИ, Марьянович АТ, Хавинсон ВХ. Пептид KE в протеоме человека. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. // 2019; 168:569–72.
32. Фридман НВ, Линькова НС, Полякова ВО, Дробинцева АО, Трофимова СВ, Кветной ИМ, et al. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Успехи геронтологии. // 2017; 30:698–702.
33. Линькова НС, Полякова ВО, Кветной ИМ. Единый механизм ремоделирования межклеточного матрикса в ткани тимуса и эпифиза при старении. Успехи геронтологии. // 2011; 24:420–2.
34. Liu Z, Zheng X, Wang J, Wang E. Molecular analysis of thymopentin binding to HLA-DR molecules. PLoS One. // 2007; 2:1–8.
35. Hsieh KH, Shaio MF, Liao TN. Thymopentin treatment in severe atopic dermatitis-clinical and immunological evaluations. Arch Dis Child. // 1992; 67:1095–1102.
36. Ясенявская АЛ, Самотруева МА, Башкина ОА, Андреева ЛА, Мясоедов НФ, Тюренков ИН, et al. Нейропептидная Регуляция Иммунитета. Иммунология. // 2018; 39:326–36.
37. Смирнов ВС. Клиническая фармакология тимогена. 2004.
38. Puig A, Antón JMG, Mangues M. A new decorin-like tetrapeptide for optimal organization of collagen fibres. Int J Cosmet Sci. // 2008; 30:97–104.
39. Younai S, Venters G, Vu S, Nichter L, Nimni M, Tuan T. Role of growth factors in scar contraction: an in vitro analysis. Ann Plast Surg. // 1996; 36:495–501.
40. Babizhayev MA, Seguin MC, Gueyne J, Evstigneeva RP, Ageyeva EA, Zheltukhina GA. L-carnosine (β-alanyl-L-histidine) and carcinine β-alanylhistamine) act as natural antioxidants with hydroxyl-radical-scavenging and lipid-peroxidase activities. Biochem J. // 1994; 304:509–16.
41. Aruoma OI, Laughton MJ, Halliwell B. Carnosine, homocarnosine and anserine: Could they act as antioxidants in vivo? Biochem J. // 1989; 264:863–9.
42. Choi SY, Kwon HY, Kwon O Bin, Kang JH. Hydrogen peroxide-mediated Cu,Zn-superoxide dismutase fragmentation: Protection by carnosine, homocarnosine and anserine. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. // 1999; 1472:651–657.
43. Narda M, Peno-Mazzarino L, Krutmann J, Trullas C, Granger C. Novel facial cream containing carnosine inhibits formation of advanced glycation end-products in human skin. Skin Pharmacol Physiol. // 2018; 31(6):324-331
44. Schagen SK. Topical peptide treatments with effective anti-aging results. Cosmetics. 2017;4.
45. Nino M, Iovine B, Santoianni P. Carnosine and N-Acetylcarnosine Induce Inhibition of UVB Erythema in Human Skin Massimiliano. J Cosmet Dermatological Sci Appl. // 2011; 1:177–9.
46. Lintner K, Peschard O. Biologically active peptides: From a laboratory bench curiosity to a functional skin care product. Int J Cosmet Sci. // 2000; 22:207–18.
47. Jones RR, Castelletto V, Connon CJ, Hamley IW. Collagen stimulating effect of peptide amphiphile C16-KTTKS on human fibroblasts. Mol Pharm. // 2013; 10:1063–9.
48. Robinson LR, Fitzgerald NC, Doughty DG, Dawes NC, Berge CA, Bissett DL. Topical palmitoyl pentapeptide provides improvement in photoaged human facial skin. Int J Cosmet Sci. // 2005; 27:155–60.
49. Pickart L, Margolina A. Regenerative and protective actions of the GHK-Cu peptide in the light of the new gene data. Int J Mol Sci. // 2018;19 (7).
50. Aldag C, Teixeira DN, Leventhal PS. Skin rejuvenation using cosmetic products containing growth factors, cytokines, and matrikines: A review of the literature. Clin Cosmet Investig Dermatol. // 2016; 9:411–9.
51. Sanz MT, Campos C, Milani M, Foyaca M, Lamy A, Kurdian K, et al. Biorevitalizing effect of a novel facial serum containing apple stem cell extract, pro-collagen lipopeptide, creatine, and urea on skin aging signs. J Cosmet Dermatol. // 2016; 24–30.
52. Fabi S, Sundaram H. The potential of topical and injectable growth factors and cytokines for skin rejuvenation. Facial Plast Surg. // 2014; 30:157–71.
53. Carmeliet P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. // 2005; 438:932–6.
54. Hardwicke J, Schmaljohann D, Boyce D, Thomas D. Epidermal growth factor therapy and wound healing - Past, present and future perspectives. Surgeon. // 2008; 6:172–177.
55. Katherine Martin  by I, Anna Glaser D. Cosmeceuticals: The New Medicine of Beauty. Mo Med. // 2011; 108(1):60–63.
56. Manela-Azulay M, Bagatin E. Cosmeceuticals vitamins. Clin Dermatol. // 2009; 27:469–74.
57. Stratigos AJ, Katsambas AD. The role of topical retinoids in the treatment of photoaging. Drugs. // 2005; 65:1061–1072.
58. Shapiro SS, Saliou C. Role of vitamins in skin care. Nutrition. // 2001; 17:839–44.
59. Pérez-Sánchez A, Barrajón-Catalán E, Herranz-López M, Micol V. Nutraceuticals for skin care: A comprehensive review of human clinical studies. Nutrients. // 2018; 10:1–22.
60. Dreher F, Gabard B, Schwindt DA, Maibach HI. Topical melatonin in combination with vitamins E and C protects skin from ultraviolet-induced erythema: A human study in vivo. Br J Dermatol. // 1998; 139:332–339.
61. Kozuki T. Skin problems and EGFR-tyrosine kinase inhibitor. Jpn J Clin Oncol. // 2016; 46:291–8.
62. Huang ZR, Lin YK, Fang JY. Biological and pharmacological activities of squalene and related compounds: Potential uses in cosmetic dermatology. Molecules. // 2009; 14:540–54.
63. Трисветова ЕЛ. Магний в клинической практике. Рациональная Фармакотерапия в Кардиологии. // 2012; 8:545–553.
64. Polefka TG, Bianchini RJ, Shapiro S. Interaction of mineral salts with the skin: A literature survey. Int J Cosmet Sci. // 2012; 34:416–423.
65. Patel R, Hossain MA, German N, Al-Ahmad AJ. Gliotoxin penetrates and impairs the integrity of the human blood-brain barrier in vitro. Mycotoxin Res. // 2018; 34:257–68.
66. Liebsch M, Traue D, Barrabas C, Spielmann H, Uphill P, Wilkins S, et al. The ECVAM prevalidation study on the use of epiderm for skin corrosivity testing. ATLA // 2000;28:371–401.
67. Barratt MD, Brantom PG, Fentem JH, Gerner I, Walker AP, Worth AP. The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxicol Vitr. // 1998; 12:471–82.
68. Botham PA, Chamberlain M, Barratt MD, Curren RD, Esdaile DJ, Gardner JR, et al. A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6. ATLA 1995;
69. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. // 1983; 65:55–63.