Влияние заболеваний щитовидной железы на процесс клеточного старения

КАДЫРОВА Д.А., АБДУГАФУРОВА Д.Г., ЯКУБОВА Р.А., МАМАТКУЛОВ Д.А. Институт биохимии АНРУз, г. Ташкент, Узбекистан

ВЛИЯНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА ПРОЦЕСС КЛЕТОЧНОГО СТАРЕНИЯ

Резюме. С возрастом секреторная функция щитовидной железы снижается. Снижение гормонообразо-вания с возрастом, возможно, связано с нарушением регуляции экспрессии гена тиреоглобулина (ТГ) у людей пожилого возраста. По-видимому, нарушение регуляции экспрессии гена ТГ связано со структурно-функциональными изменениями хроматина. Проведено изучение структурно-функциональных изменений хроматина и роли различных модификаций в ДНК при старении (функциональная активность различных фракций ДНК, ДНКаза I-гиперчувствительность хроматина ядер). Установлено наличие прямой корреляции между степенью экспрессивности гена ТГ в тиреоидных клетках в процессе клеточного старения и ДНКаза I-гиперчувствительностью. Показано, что в процессе клеточного старения у людей старшей возрастной группы при узловом эутиреоидном зобе содержание ТГ-последовательностей во фракции ДНК I снижается в 2 раза. Клеточное старение сопровождается разнообразными хромосомными изменениями: нарушение числа хромосом, внутригрупповые вариации количества хромосом, структурные изменения хромосом. Хромосомная нестабильность при старении приводит к появлению большого числа клеток с различными количественными и структурными нарушениями, которые возникают при хромосомных аберрациях. Цитогенетическим анализом установлено, что при узловом эутиреоидном зобе у пациента в возрасте 75 лет наблюдаются хромосомные аберрации.

Ключевые слова: старение, ген тиреоглобулина, хромосомные аберрации, тиреоидная патология, ДНКаза I-гиперчувствительность.

Клиническая тиреоидология

/Clinical Thyroidology/

Введение

Старение — много причинный процесс, вызываемый многими факторами, действие которых повторяется и накапливается в течение всей жизни. Старение приводит к функциональной неполноценности клеток различного типа. Более того, глубокие возрастные изменения метаболизма, функции и структуры заканчиваются не только функциональной дефектностью клеток, но и в конечном итоге приводят к их гибели. Однако даже функционально однородные клетки стареют в неодинаковом темпе. Среди одного и того же класса клеток — нервных, мышечных, печеночных, эндокринных и др. — можно выделить клетки с грубыми нарушениями структуры и функции, с выраженными признаками гиперфункции, комплексом адаптационных реакций [1]. Так, во многих клетках отмечается уменьшение ядерно-цитоплазматического контраста; числа митохондрий, их набухание, нарушение репарации и репликации ДНК, уменьшение числа рибосом. Первичные механизмы старения связаны с нарушением генной регуляции. Ее изменения ведут к сдвигу соотношения разных белков, снижению потенциальных возможностей белок-синтезирующих систем. С возрастом в соматических клетках накапливаются не только мутации, но и хромосомные перестройки. Полагают, что изменения хроматина могут играть главную роль в связанных с возрастом изменениях регуляции генов [2]. В процессе старения центральное

место занимает именно накопление генетических повреждений в клетке, в то время как иммунологические, гормональные и метаболические повреждения рассматриваются в качестве вспомогательных. Одной из причин накопления повреждений ДНК с возрастом может быть снижение эффективности систем репарации ДНК. Клеточное старение сопровождается разнообразными хромосомными изменениями: нарушение числа хромосом, внутригрупповые вариации количества хромосом, структурные изменения хромосом, появление маркерных хромосом-аберраций. Старение клеток, возможно, связано с появлением спонтанных хромосомных аберраций. Хромосомная нестабильность при старении приводит к появлению большого числа клеток с различными количественными и структурными нарушениями, которые возникают при хромосомных аберрациях [3]. Полагают, что изменения хроматина могут играть главную роль в связанных с возрастом изменениях регуляции экспрессии генов. При старении происходит нарушение процессов транскрипции и трансляции. Молекулярные события, определяющие транскрипцию, имеют решающее значение при изучении механизмов старения, поскольку регуляция экспрессии генов коренным образом влияет на старение и старческие изменения.

Цель работы: изучение структурно-функциональных нарушений хромосом и хромосомных аберраций, возникающих в клетках щитовидной железы (ЩЖ) при старении.

Материалы и методы исследований

Полирибосомы и ДНК выделяли из клеток ЩЖ и крови людей с различными формами тиреоидной патологии. Нами были созданы три возрастные группы людей без патологии ЩЖ и при некоторых формах тиреоидной патологии:

— 1-я группа — 10 человек в возрасте 45—55 лет;

— 2-я группа — 12 человек в возрасте 55—65 лет;

— 3-я группа — 8 человек в возрасте 65—75 лет.

Контрольная группа — 12 человек в возрасте 25 лет.

Для выделения суммарных полирибосом из клеток ЩЖ

мы применили магниевый метод выделения полирибосом [4], с помощью которого удалось добиться их оптимального выхода. В основе метода лежит открытое Таканами [5] свойство полирибосом преципитировать из раствора под действием высоких концентраций магния. Суммарную РНК выделяли SDS-фенол-хлороформным методом. Выделение высокомолекулярной ДНК из лейкоцитов крови человека осуществляли методом фенольной экстракции [6]. Культивирование лимфоцитов проводили в среде для культивирования, состоящей (в расчете на 1 флакон) из: 6 мл среды RPMI 1640 с глутамином («ПАНЭКО», Россия), 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки (пр-во Франция — Германия), 40 мкг/мл гентамицина и 20 мкг/мл митогена — фитогемаг-глютинина (ФГА DifcоP), добавляли 0,8 мл цельной крови. Препараты окрашивали 4% раствором Романовского — Гим-за. Анализ проводили в стадии метафазы. Ядра из клеток ЩЖ выделяли осаждением в 0,25 М сахарозе, содержащей 5 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтола (ДТТ), 10 мМ трис-HCI pH 7,5, и проводили очистку ядер путем наслоения на раствор 2 М сахарозы в буфере Б (24 000 об/мин 1 час, ротор SW 27). Для определения ДНКаза-чувствительности обрабатывали ядра ДНКазой 1 (2000 Ед/мг Serva), инкубировали при 4 °С в течение 5 мин с различными концентрациями ДНКазы I (от 0,1 до 100 Ед/мл) или с фиксированной концентрацией фермента (20 Ед/мл) при 37 °С в течение 15 мин. Выделение фракций ДНК из клеток крови проводили модифицированным фенольным методом, позволяющим выделить три фракции ДНК благодаря применению различных условий депротеинизации. Комплементарную ДНК для гена ТГ синтезировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на 0,5 мкг суммарной РНК в присутствии обратной транс-криптазы с применением праймеров, специфичных для гена ТГ 51-AGGCTAGGAAAATGGCCCTGGTCC-31 и 51-TTGG ATCCTTATGTGGGGGAATCTGCC-31. ПЦР проводили в инкубационной среде: 50 мкл содержали 60 мМ трис-НС1 (рН 8,6), 6 мМ ЭДТА, 10 мМ р-меркаптоэтанола, 10 мкг/мл ВСА, 1 мМ каждого из 4 нуклеотидов, 2 ед. обратной транс-криптазы. ПЦР имела всего 55 циклов. Синтез проводили при 72 °С в течение 4 мин. Последующие циклы включали денатурацию (1 мин, 49 °С), отжиг праймеров (1 мин, 55 °С), синтез кДНК (2 мин, 72 °С). После 55 циклов амплификации пробы выдерживали 10 мин при 72 °С и затем охлаждали, отбирали аликвоты, ставили электрофорез кДНК для гена ТГ в 1%-ном агарозе с бромистым этидием.

Результаты исследований и их обсуждение

С возрастом секреторная функция ЩЖ снижается. Снижение активности ЩЖ в онтогенезе выражается в уменьшении органификации йода и гормонообразова-ния. Чувствительность гипоталамо-гипофизарного комплекса к ингибирующему воздействию трийодтиронина уменьшается, что способствует повышению уровня тире-отропного гормона (ТТГ) у здоровых людей в пожилом возрасте. Снижение гормонообразования с возрастом, возможно, связано с нарушением регуляции экспрессии гена ТГ у людей пожилого возраста. По-видимому, нарушение регуляции экспрессии гена ТГ связано со структурно-функциональными изменениями хроматина. Было проведено изучение структурно-функциональных изменений хроматина и роли различных модификаций в ДНК при старении (функциональная активность различных фракций ДНК, ДНКаза 1-гиперчувствительность хроматина ядер). ДНКаза 1-гиперчувствительные сайты локализованы во фланкирующих (51- или 31-) областях активных генов. Они отображают структурные вариации в хроматине, характер которых все еще не выяснен. Появление гиперчувствительных сайтов предшествует началу транскрипции и связано с транскрипционной активностью. Исходя из вышесказанного, представляло интерес изучить влияние различий в степени экспрессии гена ТГ при клеточном старении на структуру хроматина.

Проведено изучение ДНКаза 1-гиперчувствительности хроматина клеток ЩЖ у пожилых людей при различной тиреоидной патологии. В качестве контроля были использованы пожилые люди без нарушений ЩЖ. В этом случае ядра выделяли из эпителиальных клеток слюны пациентов. Было исследовано 70 людей пожилого возраста. На рис. 1 приведены данные по ДНКаза 1-гиперчувствительности хроматина ядер пожилых людей без патологии ЩЖ и при узловом эутиреоидном зобе (УЭЗ). Из приведенных данных видно, что существует прямая корреляция между степенью экспрессированности гена ТГ и ДНКаза 1-гиперчувствительностью хроматина ядер ЩЖ пожилых при узловом эутиреоидном зобе, т.е. экспрессированные гены являются более чувствительными к ДНКазе, чем неактивные гены. Для понимания экспрессии гена ТГ важное значение имеет выяснение структурной организации функциональных свойств транскрипционно активных участков генома. Выяснение факторов, определяющих потенциально активное состояние гена ТГ, чрезвычайно важно для понимания молекулярных механизмов регуляции экспрессии данного гена в процессе клеточного старения [7].

Из лейкоцитов крови людей без патологии ЩЖ и при узловом эутиреоидном зобе методом дифференциальной бездетергентной фенольно-солевой депротеинизации выделены три фракции ДНК: ДНК I, ДНК II, ДНК III. Фракция ДНК I охарактеризована как транскрипцион-но активная ДНК, фракция ДНК II представляет собой

80 Tl 70 60 50 40 30 20 10

75 7

32

25 Ё

20

25

40 45 55 65 Возраст, лет

70

75

Без патологии  с патологией УЭЗ

Рисунок 1. ДНКаза I-гиперчувствительность хроматина ядер

30 25 20 15

30 30

30

28

28 28 28

ГШ

26

25

20

23

18

1

15

25

40 45 55 65 Возраст, лет

70

75

Без патологии  с патологией УЭЗ

Рисунок 2. Содержание последовательностей гена ТГ во фракциях ДНК

ДНК стабильно репрессированных участков генома, ДНК III — потенциально активные участки генома.

Прямые доказательства функциональных различий ДНК

I, ДНК II и ДНК III были получены при изучении содержания последовательностей гена ТГ во фракциях методом молекулярной гибридизации этих фракций с избытком 3Н ТГ кДНК. Методом ПЦР была синтезирована ТГ кДНК. Для синтеза кДНК для гена ТГ использовали как ДНК-полимеразу I, так и РНК-зависимую ДНК-полимеразу (ревертазу). Синтезированный препарат ТГ кДНК был использован нами в качестве зонда в экспериментах по гибридизации.

На рис. 2 приведены данные по гибридизации фракций с 3Н ТГ кДНК. В случае фракции ДНК I процент гибридизации в контроле (25 лет) составил 30 %, в то время как у людей в возрасте 55 лет при узловом эутиреоидном зобе этот показатель равен 26 %. Процент гибридизации фракции ДНК I с 3Н ТГ кДНК у людей в возрасте 65 и 75 лет составил 20 и 15 % соответственно. Таким образом, содержание последовательностей гена ТГ во фракции ДНК I при клеточном старении уменьшается в 2 раза по сравнению с контролем.

При гибридизации фракции ДНК III с 3Н ТГ кДНК ги-бридизуемость в контроле составила 23 %. У людей в возрасте 55, 65 и 70 лет процент гибридизации составил 18, 11 и 6 % соответственно. Содержание последовательностей гена ТГ во фракции ДНК III при клеточном старении уменьшается в 3,8 раза. При изучении содержания последовательностей гена ТГ во фракциях ДНК I, ДНК II и ДНК III у людей старшей возрастной группы без патологии ЩЖ различия в содержании последовательностей гена ТГ в этих фракциях было незначительно. На рис. 2 приведены данные по содержанию последовательностей гена ТГ во фракциях ДНК I и ДНК III.

Из приведенных данных видно, что фракция ДНК I более обогащена последовательностями гена ТГ в клетках ЩЖ в контроле, т.е. доказано, что фракция ДНК I является транскрипционно активной.

Для подтверждения полученных данных нами был проведен цитогенетический анализ хромосомных аберраций на стадии метафазы митоза лимфоцитов периферической крови у молодых людей (18 лет и 24 года) и людей в возрасте 54, 69 и 75 лет. В табл. 1 приведены данные по изучению хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови людей разного возраста.

Необходимо отметить, что люди старшей возрастной группы были с патологией ЩЖ: 54 и 69 лет — с диффузным токсическим зобом и 75 лет — с узловым эутиреоидным зобом.

В данных культурах мы изучали уровень спонтанных хромосомных аберраций в клетках лимфоцитов периферической крови. Из табл. 1 видно, что на каждую культуру анализировали не менее 100 метафаз с хорошим разбросом хромосом. У пациентов в возрасте 50 лет общее число изученных метафаз составило 123 клетки, среди которых одна клетка с одним микрофрагментом (0,8 %); у пациентов в возрасте 69 лет общее число изученных метафаз состав-

Таблица 1. Частота аберраций хромосом в лимфоцитах периферической крови людей различного возраста

Возраст пациентов, лет Количество исследованных метафаз Количество аберрантных метафаз Количество аберраций

18 100 Нет Нет

24 100 Нет Нет

50 123 1 0,81 ± 0,80

54 100 Нет Нет

69 111 Нет 0,9 ± 0,9

75 156 3 1,92 ± 1,10

ляло 111 клеток, и одна клетка — с парным фрагментом (0,9 %). У пациента в возрасте 75 лет с узловым эутиреоид-ным зобом общее число изученных метафаз составило 156 клеток, из них 3 (1,92 %) — аберрантные клетки с парными фрагментами. Аберрантные клетки у данного пациента превышают количество аберрантных клеток в контроле (18 лет и 24 года).

Нами был проведен цитогенетический анализ хромосом клеток лимфоцитов периферической крови людей возрастной группы без патологии ЩЖ (59—75 лет). Цито-генетический анализ хромосом клеток лимфоцитов периферической крови в возрасте 75 лет без патологии ЩЖ выявил единичные асимметричные транслокации хромосом.

Известно, что структурные аберрации хромосом относятся к тому типу генетических нарушений, которые вносят свой вклад в многофакторный процесс старения. Нестабильные хромосомные аберрации — дицентрики, кольца, фрагменты — приводят к гибели клеток, стабильные — транслокации, инсерции — могут влиять на процесс клеточного старения. На основании полученных данных можно заключить, что независимо от патологии ЩЖ при старении наблюдаются различные хромосомные аберрации.

Выводы

1. Установлено наличие прямой корреляции между степенью экспрессированности гена ТГ в тиреоид-ных клетках в процессе клеточного старения и ДНКаза Ьгиперчувствительностью.

Кадирова Д.А., Абдугафурова Д.Г., Якубова Р.А., Маматкулов Д.А.

Нститут б'ююмн АНРУз, м. Ташкент, Узбекистан

ВПЛИВ ЗАХВОРЮВАНЬ ЩИТОПОДiБНОÍ ЗАЛОЗИ НА ПРОЦЕС КЛПИННОГО СТАРШНЯ

Резюме. З вжом секреторна функцш щитоподабно! залози знижуеться. Зниження гормоноутворення з вжом, можливо, пов'язане

з порушенням регуляцп експресп гена тиреоглобулшу (ТГ) у людей лптнього вжу. Мабуть, порушення регуляцп експресп гена ТГ пов'язане з1 струкгурно-функцюнальними змнами хроматину. Проведено вивчення струкгурно-функцюнальних змш хроматину й рол1 р1зних модифжацш у ДНК при старiннi (функцюнальна активн1сть р1зних фракцiй ДНК, ДНКаза ¡-г1перчутлив1сть хроматину ядер). Встановлена наявтсть прямо! кореляцii мiж ступенем експресивносп гена ТГ в тиреощних кттинах у процес1 кл1тинного старiння та ДНКаза ¡-гтерчутлишстю. Показано, що в процеа кл1тинного старiння в людей старшо! вiково'i групи при вузловому еутирео!дному зоб1 вм1ст ТГ-послщовностей у фракцп ДНК I знижуеться в 2 рази. Клшнне старiння супроводжуеться р1зноман1тними хромосомними змiнами: порушення числа хромосом, внутршньогружт варiацii ылькосп хромосом, структурш змiни хромосом. Хромосомна нестабтьшсть при старiннi приводить до появи великого числа китин 1з р1зними ыльюсними й структурними порушеннями, що виникають за хромосомно'! аберацii. Цитогенетичним анал1зом установлено, що при вузловому еутиреощному зоб1 в пац1ента вжом 75 роив спостертаеться хромосомна аберацш.

Ключовi слова: стар1ння, ген тиреоглобулшу, хромосомна аберацш, тиреощна патолог1я, ДНКаза Т-гшерчутливгсть.

2. Показано, что в процессе клеточного старения у людей старшей возрастной группы при узловом эути-реоидном зобе содержание ТГ-последовательностей во фракции ДНК I снижается в 2 раза.

3. Установлено, что при узловом эутиреоидном зобе у пациента в возрасте 75 лет наблюдаются небольшие хромосомные аберрации.

4. Показано, что у пациентов в возрасте 75 лет без патологии щитовидной железы наблюдаются единичные асимметричные транслокации хромосом.

Список литературы

1. Recves D. Molecular mechanisms of aging // Experim. Cell. Researh. - 1998. - Vol. 185. - P. 277-283.

2. Recves D. Trancriptionally active chromatin // Biochem. Biophys. Acta. - 1999. - Vol. 782. - P. 343-393.

3. Sanchez-Cespedes M, Monzo M, Rosell R. et al. Detection of chromosome 3p alterations in serum DNA of non-small-cell lung cancer patients //Ann Oncol. - 1998. - № 9. - P. 113-116.

4. Лейтин В.Л., Лерман М.И. Изучение полирибосом из клеток печени крыс. Препаративный метод получения полирибосом //Биохимия. - 1969. - Т. 34. - С. 839-841.

5. Takanami M. Stable ribonucleoprotein for amino acid incorporation // Biochim. Biophys. Acta. — 1960. — Vol. 39. — P. 318-322.

6. Дашкевич В. С., Аршинова Т.В. Выделение фракций реплицирующейся ДНК печени крыс бездетергентным фенольным методом // Биология. - 1963. - Вып. 43, т. 15. - С. 133-136.

Получено 10.02.11

Kadyrova D.A., Abdugafurova D.G., Yakubova R.A., Mamktulov D.A.

Institute of Biochemistry of AS of Republic of Uzbekistan, Tashkent, Uzbekistan

INFLUENCE OF THYROID GLAND DISEASES ON PROCESS OF CELLULAR AGEING

Summary. With the increase ofyears the secretory function ofthyroid gland is reduced. Decrease of hormonopoiesis with the increase of years is probably connected with disorder of regulation of thyreoglobulin (TG) gene expression in elderly. Apparently, disorder of regulation of TG gene expression is related to structural and functional changes of the chromatin. There was carried out the study of structural and functional changes of the chromatin and of the role of different modifications in DNA while ageing (functional activity of various DNA fractions, DNAase I-hypersensitivity of nucleus of chromatin). There was defined the presence of direct correlation between TG gene expressivity degree in thyroid cells in the process of cellular ageing and DNAase I-hypersensitivity. It is shown, that during cellular ageing in senior age group at nodular euthyroid goiter the content of TG-sequences in DNA fractions reduced in 2 times. Cellular ageing is associated with various chromosomal changes: disturbance of chromosome number, intragroup variations of quantity of chromosomes, structural changes of chromosomes. Chromosomal instability at ageing results in occurrence of the big number of cells with different quantitative and structural disorders nascent at chromosomal aberrations. By cytogenetic analysis it is established that at nodular euthyroid goiter in the 75-year-ols patient the chromosomal aberrations are observed.

Key words: ageing, thyroglobulin gene, chromosomal aberrations, thyroid pathology, DNAase I-hypersensitivity.