Роль микроРНК в сперматогенезе

Роль микроРНК в сперматогенезе

С. А. Руднева, А. А. Хаченкова

ФГБНУ«Медико-генетический научный центр»; Россия, Москва, 115478, ул. Москворечье, 1 Контакты: Светлана Айвенговна Руднева sveta_a_r@mail.ru

Мужские половые клетки имеют сложный транскриптом. Помимо кодирующих белки матричных РНК в нем присутствует много некодирующих РНК, включая микроРНК. Известно, что микроРНК — важные регуляторы экспрессии генов. Они функционируют в основном посттранскрипционно, контролируя трансляцию их целевых мессенджеров — матричных РНК — и участвуя в каждом этапе дифференцировки мужских половых клеток. В данном обзоре продемонстрировано значение путей микроРНК для нормального сперматогенеза. Определена функциональная роль ряда микроРНК на различных этапах дифференцировки половых клеток. Рассмотрены микроРНК в сперматозоидах и семенной плазме человека в качестве потенциальных биомаркеров мужского бесплодия.

Ключевые слова: микроРНК, сперматогенез, сперматозоид, эпигенетика сперматогенеза, некодирующие РНК, биомаркер, мужская фертильность

DOI: 10.17650/2070-9781-2016-17-3-23-37

Role of microRNAs in spermatogenesis

S.A. Rudneva, A.A. Khachenkova

Research Centre for Medical Genetics; 1 Moskvorech'e St., Moscow, 115478, Russia

Male germ cells have a complex transcriptome. In addition to proteincoding messenger RNAs, many noncoding RNAs, including microRNAs (miRNAs), are produced. The miRNAs are important regulators of gene expression. They function mainly post-transcriptionally to control the stability or translation of their target messenger RNAs. The miRNAs are expressed in a cell-specific manner during spermatogenesis to participate in the control of each stage of male germ cell differentiation. Clinical studies have exploited the well-defined expression profiles of miRNAs, and human spermatozoal or seminal plasma miRNAs have been explored as potential biomarkers for malefactor infertility.

Key words: microRNAs, spermatogenesis, male germ cells, epigenetics of spermatogenesis, Dicer, noncoding RNAs, biomarker, male infertility

Этапы сперматогенеза

Сперматогенез — процесс, в результате которого происходит дифференцировка первичных половых клеток (ППК) в зрелые сперматозоиды. В сперматогенезе можно выделить 3 основные фазы: пролиферацию и диф-ференцировку сперматогониев, мейоз и спермиогенез. У мужчин сперматогенез начинается в период полового созревания и продолжается до конца жизни.

Сперматогенез отличается от женского оогенеза наличием гаплоидной стадии дифференцировки. Кроме этого, у женщин весь резерв ППК закладывается в период эмбрионального развития, и затем происходит непрерывное снижение числа ооцитов вплоть до полного их истощения, что проявляется как менопауза. Сперматогенез, напротив, представляет собой непрерывный процесс, в ходе которого каждый день, вплоть до преклонного возраста, образуются миллионы сперматозоидов.

Комплекс клеточных трансформаций, приводящих к дифференцировке ППК в сперматозоиды, осуществляется в сперматогенном эпителии, выстилающем изви-

тые семенные канальцы (рис. 1) [1—4]. Сперматогонии, расположенные между клеток Сертоли вдоль базальной мембраны, служат источником недифференцированных клеток для сперматогенеза и по мере дифферен-цировки продвигаются в адлюминальном направлении. Герминативный эпителий извитых семенных канальцев организован таким образом, что каждое сечение канальца содержит последовательные группы различных типов половых клеток на разных стадиях развития (см. рис. 1). У мышей существует 12 (1—Х11) определенных клеточных стадий, у человека — 6, которые расположены упорядоченно, согласно прогрессу развития [5].

Согласованное регулирование процессов в половых клетках на разных стадиях дифференцировки осуществляется благодаря клеткам Сертоли, формирующим для них микроокружение, и благодаря синхронизированному действию гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси [6]. Гормональная функция яичек при наличии обратных связей находится под контролем гипоталамуса и гипофиза, а в самих яичках эта функция обеспечивается деятельностью 2 типов клеток — клеток

Е га Е

и

Эпидидимис

Клетки Сертоли

Сперматогонии

т

I

циты "р

ы а

Сперматиды Сперматиды

А (Я

Сперматоци го порядка

Сперматоциты 2-го порядка

1-е мейотическое деление

2-е

мейотическое деление

Рис. 1. Схема сперматогенеза

Е га Е

и

Лейдига, вырабатывающих тестостерон, и клеток Сертоли, вырабатывающих ингибин, антимюллеров гормон, эстрадиол. Клетки Сертоли многофункциональны. Они не только обеспечивают микроокружение для дифференцирующихся клеток, но также принимают участие в фагоцитозе дегенерирующих половых клеток, в паракринной регуляции сперматогенеза, выполняют опорные и трофические функции. Формирующиеся между клетками Сертоли плотные контакты (один из компонентов, структур гемато-тестикулярного барьера) разделяют семенные канальцы на 2 отдела: базальный и адлюминальный. Базальный отдел — зона активного размножения сперматогониев, в адлюминальном отделе происходит их дальнейшая дифференцировка через мейоз и спермиогенез [7, 8].

Светлые сперматогонии типа А вступают в процесс сперматогенеза, темные являются резервными, включающимися в сперматогенез по мере необходимости. По мере дифференцировки половых клеток сперматогонии типа А 4 раза делятся митотически, дифференцируясь в сперматогонии типа В, которые и вступают в мейоз, преобразуясь в сперматоциты 1-го порядка [4, 9].

Благодаря неполному разделению клеток первичные сперматоциты оказываются соединенными между собой межклеточными мостиками. Последующие поколения клеток также остаются связанными между собой, в результате чего образуется синцитий, клетки которого делятся синхронно.

Во время профазы I мейоза в сперматоците 1-го порядка на стадии зиготены происходит конъюгация

между гомологичными родительскими хромосомами. На стадии пахитены между сконъюгированными гомологами происходит обмен участками хромосом (крос-синговер) — гомологичная рекомбинация, важнейший генетический процесс. После коротких стадий дипло-тены и диакинеза сперматоциты 1-го порядка вступают в стадию метафазы I мейоза, во время которой хромосомы выстраиваются по экватору, закрепляясь на микротрубочках веретена деления с помощью центромер (кинетохоров), и на стадии анафазы I мейоза гомологичные хромосомы расходятся к противоположным полюсам веретена деления [4, 9].

В соответствии с этими изменениями профаза I мейоза делится на 5 последовательных стадий: лепто-тену (начало конденсации хромосом), зиготену (начало конъюгации гомологичных хромосом и формирование синаптонемного комплекса, который скрепляет гомологичные хромосомы по всей длине и удерживает их вместе), пахитену (осуществление кроссинговера), диплотену (начало расхождения гомологичных хромосом), диакинез (разделение гомологичных хромосом). После диакинеза в метафазе I бивалентные хромосомы выстраиваются вдоль экватора клетки, а в анафазе I гомологичные хромосомы расходятся к полюсам.

Важно отметить, что к полюсам расходятся целые хромосомы, состоящие из 2 хроматид. В каждую дочернюю клетку попадает по 1 гомологичной хромосоме, материнские и отцовские гомологи случайным образом распределяются между дочерними клетками. В телофазе I хромосомы деспирализуются, появляется

ядерная оболочка. Анафаза и телофаза 1-го деления мейоза протекают быстро.

Во время 2-го деления мейоза из каждого сперма-тоцита 2-го порядка образуются 2 гаплоидные спер-матиды. Ранние (округлые) сперматиды претерпевают дальнейшую дифференцировку (спермиогенез). При этом формируются жгутик и акросома, происходит изменение формы ядра, компактизация хроматина с помощью протаминов, заменяющих большинство гистонов [1—4].

Процесс спермиогенеза можно условно разделить на несколько фаз: фазу округлой сперматиды (образование акросомы, содержащей литические ферменты), фазу удлиненной сперматиды (образование жгутика из центриолей) и фазу созревания (конденсация хроматина, замена гистонов на протамины, сбрасывание цито-плазматической капли с шейки сперматозоида) (рис. 2).

Сперматозоиды, которые высвобождаются в просвет канальцев, продолжают свой путь к придатку яичка — эпидидимису — для окончательного (биохимического) созревания. Там они теряют цитоплазматические капли, изменяется заряд их мембран, сперматозоиды приобретают подвижность и способность связываться с мембраной ооцитов [5].

Транскриптом мужской половой клетки и транскрипционные волны

Ход сперматогенеза сопровождается высокоорганизованными транскрипционными волнами, которые генерируют специфичные профили транскриптомов, характерные для каждой стадии дифференцировки ППК, что было подтверждено в ряде работ [10—12]. Показано, что в митотических сперматогониях, мейо-тических сперматоцитах и гаплоидных сперматидах экспрессируются совершенно разные группы генов (рис. 3).

В связи с заменой гистонов протаминами на поздних стадиях сперматогенеза происходит значительно более плотная конденсация хроматина, и, как следст-

РАННЯЯ СРЕДНЯЯ ФАЗА АКРОСОМНАЯ ФАЗА ФАЗА

ГОЛЬДЖИ ФАЗА СОЗРЕВАНИЯ СОЗРЕВАНИЯ

Сперматида

Ядро

Жгутик

Митохондри

Акросомная Ядро везикула Акросома

/

Акросомная шапочка

Ядро

Рис. 2. Схема спермиогенеза

вие, транскрипция в этих клетках снижается. В связи с этим матричные РНК (мРНК) для многих сперма-тидных белков синтезируются на более ранних стадиях и сохраняются до надобности в виде рибонуклеопро-теиновых комплексов [13, 14]. Последние исследования показали, что в клетках человека транскрибируется большая часть генома, но лишь малая часть из транскрибируемой РНК кодирует белки [14]. Таким образом, большинство РНК-транскриптов является некодиру-ющими, но при этом выполняет важные клеточные функции. В частности, некодирующие РНК играют определяющую роль в регуляции экспрессии генов как на транскрипционном уровне (в качестве компонентов комплексов транскрипционных факторов), так и пост-транскрипционно [14, 15].

Гены некодирующих РНК, как и гены белков, дифференцированно экспрессируются во время сперматогенеза [14]. Поскольку некодирующие РНК участвуют в регуляции трансляции мРНК, у каждого типа дифференцирующихся клеток образуются свои паттерны экспрессии обоих типов РНК, что приводит к возможности формирования сложных регуляторных сетей. Мужские половые клетки, особенно сперматоциты и округлые сперматиды, транскрипционно активны. Было показано, что клетки семенников имеют наиболее сложные по составу транскриптомы по сравнению с клетками других тканей и органов. В этих клетках экспрессиру-ются гены не только белков, но и большое количество генов различных некодирующих РНК [11, 16—19]. Очевидно, что точная, пространственная и временная регуляция экспрессии генов имеет фундаментальное значение для нормального протекания сперматогенеза.

Разница в судьбах РНК контролируется в основном их ассоциацией с РНК-связывающими белками. Существует широкий спектр различных РНК-связываю-щих белков, в том числе специфичных для мейотиче-ских и постмейотических клеток семенников [20, 21].

Рибонуклеопротеиновые комплексы, специфичные для дифференцирующихся половых клеток, считающиеся их особенностью, и, по всей видимости, участвуют в посттранскрипционном контроле РНК. Например, постмейотические гаплоидные округлые сперматиды содержат необыкновенно большую цитоплазматиче-скую рибонуклеопротеиновую гранулу, которая аккумулирует РНК и различные белки, вовлеченные в процессы регуляции РНК, и, как предполагают, является центральной структурой в управлении сложнейшим транскриптомом гаплоидных клеток [22—24]. Не удивительно, что из-за высоких требований к регуляции экспрессии генов микроРНК обеспечили важный дополнительный уровень в регуляции спермиогенеза.

МикроРНК и их экспрессия во время сперматогенеза

МикроРНК — небольшие одноцепочечные РНК длиной около 22 нуклеотидов [25—28], которые ком-

Е га Е

и

3

ГЕНЫ

КЛЕТКИ

Acvr2a Cldn11 Cdi1 Lhcgr Serpina5

Adralb Cyp17a1 Cdnf Man2a2 Sfc12a2

Ar Cyp19a1 Gja1 Mtap7 Sox8 С аптлпм

B4galnt1 Dhh Hmgal Nrobl 1 или,

Bcf2l2 Dmrt1 Hmgb2 Rbp4 Лейдига

Cdkn2c Dnajal Inha Sf1

Cdkn2e Efv5 Kitl Sbf1

Adamts2 Cyp19a1 Gja1 Pi3K Sycp2

Apafl Daz1 Kit Rbp4 Utp14b

Bax Ddx4 Limk2 Rhox5 Zbt16 Сперматогонии

Bmp8b Dnmt3l Nanos2 Slc19a2

Csf1 Etv5 Pin1 Sohfh2

Cdkn2d Gdnf P2rx1 Stra8

Adrafb Cdk2 Erocl Ihpk1 Piwil2

Atm Conal Exo1 Limk2 Piwil4

Bat3 Cks2 Fanca Lmna Pms2

Bcl2 Cnblipl Fkbp6 Mei1 Psmc3ip

Bcl6 Cnot7 Fus Mth1 Rad51c Сперматоциты

Bcl2l2 Cpebl Gal3st1 Mth3 Rara

Bcl2l2 Cstf2t Gnpat Morcl Rarb

Bmp8a Csda H2afx Msh4 Rec8

Brca2 Dazapl H3f3a Msh5 Slc25a4

Btrc Dmc1 Hsf1 Mybll Sgol2 Бтс1Ь

Bsg Dmrt1 Hsf2 Ovoll Siahla БоММ

Bub1b Egr4 Hspa2 Pafah1b2 Slc25a4 БГх2

ФУНКЦИИ РОСТОВЫЕ ФАКТОРЫ, ГОНАДОТРОПИН, РЕЦЕПТОРЫ КЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ, РЕЦЕПТОРЫ СИГНАЛЬНОЙ ТРАНСДУКЦИИ

РЕГУЛЯЦИЯ МИТОЗА И АПОПТОЗА

РЕГУЛЯЦИЯ МЕЙОЗА

Adamts2 Ddx25 Pank2 Ppplcc Tdrd1

Bcl2l2 Fndc3a Pacrg Pygo2 Tbpl1

Cadml Hlfnt Pafahlbl Rpb4 Theg

Camk4 Hip1 Parp2 Rnf17 Tlp

Cib1 Ihpk1 Piwill Six5 Tnp1

Crem Krt9 Prm1 Slc12a2 Tnp2

Csnk2a Lmtk2 Prm2 Slc4a2 Ube2b

Cugbpl Mtap7 Prnd Styx Ybx2

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА КЛЕТОК,

РЕМОДЕЛИРОВАНИЕ ХРОМАТИНА

Ace Acr Adad1 Adsm2

Adsm3

Apob Bub1 Clgn Csnk2a2

Dnahcl

Egr4

Inpp5b

Jund

Klhl10

Pebpl

Prm1

Prm2

Pbmxl2

Rxrb

Ros1

Spnr

Tekt2 Tekt3 Tekt4 Tnp1

Tnp2

Pcsk4 Vdac3

Количество

Adamts2

Arl4

Ahr

Apob

Cenpb

Gamt

Gdi1

Hspa4l

Pacrg

P2nd

Rxfpl

Sh2b1

Slc12a2

Spag16 Spag9 Tsn Vipr2

Олиготерато-зооспермия

Fhl5 Gmcl1 Nphp1 Prkarla

Олигоастеноте-ратозооспермия

Apob

Brdt

Cadni7

Cnot7

Cstf2t

Gmcfl

Jam3

Polg

Prnd

Rhox5

Spg6

Taf7l Pcsk4

Морфология Pla2g4c

Aff4 Agtpbpl

Atp2b4

Bbs1 Bbs4 CatSperl CatSper2

CatSper3

CatSper4 Cd59b Cga Fllr

Gapddhs

Gm101

Inpp5b

Ldhc

Lrp8

Mthfr

Nsun7

Pgs1 Pltp

Pold4

Prkaca Prkarla Ros1 Sirtl

Slc9a10

Smcp

Spag6

Sultlel

Taldol

Tcf21

Tekt2

Tekt3

Tekt4

Tekt18

Tgfbl

Theg

Vdac3 Pvrl2

Фертильность Rasipl

Acr Ace

Adam2

Adam3 B4gaft1 Cadml Cib1

Cplxl

Crem

Crisp

Fndc3a

HexbB

Mfge8

Mmell

Pgapl

Piwill

Plcbl

Plcd4

Pmd

Rbmxl2 Spaml

Tyst2

Wipf3 Zpbp

СОЗРЕВАНИЕ

В ПОЛОВЫХ ПУТЯХ,

КАПАЦИТАЦИЯ,

ОПЛОДОТВОРЕНИЕ,

ГИПЕРАКТИВАЦИЯ

СПЕРМАТОЗОИДОВ

Рис. 3. Группы генов, экспрессирующихся в дифференцирующихся половых клетках, клетках Сертоли и клетках Лейдига

плементарно (или частично комплементарно) связываются с мРНК, приводя к ее деградации или блокированию трансляции с нее. Оба эти процесса приводят к уменьшению белкового продукта гена, т. е. к подавлению его экспрессии, и поэтому названы посттранскрипционным сайленсингом генов.

Гены, кодирующие идентичные микроРНК (как и сами зрелые микроРНК), называются одинаково и различаются только номером, например, miR-6-1 и miR-6-2. Различающиеся на 1 или 2 нуклеотида зрелые микроРНК и их кодирующие гены обозначают также одинаково, но после номера добавляется латинская буква, например let-7a, let-7b [28].

Транскрипция микроРНК обычно начинается с образования ветвей шпильки, входящей в состав предшественника микроРНК, длиной в несколько сотен нуклеотидов (рис. 4), и называемой первичной микроРНК (рп-микроРНК). Большинство известных микроРНК транскрибируется с помощью РНК-полимеразы II [29]. Далее с помощью «микропроцессора» (ядерного комплекса, включающего ферменты БгозИа и двуцепочеч-ный РНК-связывающий белок DGCR8) происходит созревание pri-микроРНК. DGCR8 распознает субстрат РНК, в то время как фермент Drosha, имеющий эндонуклеазную активность (каталитический домен РНК-полимеразы), гидролизует pri-микроРНК на расстоянии 11 нуклеотидов от основания шпильки [29, 30].

После транспортировки в цитоплазму с помощью белка Exportin 5 предшественники микроРНК гидро-лизуются эндонуклеазой Dicer (также имеющей каталитический домен РНК-полимеразы) на маленькие двуцепочечные РНК (см. рис. 4). Двуцепочечная РНК впоследствии разделяется, и 1 из цепей связывается с белками Argonaute и другими вспомогательными белками, образуя РНК-индуцированный комплекс (RNA-induced silencing complex, RISC), осуществляющий регуляцию активности гена [31]. С помощью этого комплекса микроРНК узнают их мРНК-мишени, и в дальнейшем происходит либо деградация (при полной комплемен-тарности микроРНК и мРНК), либо трансляционная инактивация мРНК (при неполной комплементарно-сти микроРНК и мРНК). Каждая микроРНК может иметь сотни мРНК-мишеней, а каждая мРНК-мишень содержит несколько сайтов связывания для тождественных и разных микроРНК. Кроме этого, было показано, что если в активно делящейся клетке микроРНК, связавшись с комплементарной последовательностью в З'-участке мРНК, ингибирует синтез (трансляцию) белка, то в состоянии покоя это событие может приводить к прямо противоположному эффекту — усилению синтеза целевого белка [26].

Таким образом, микроРНК образуют мощные регулирующие схемы управления широким диапазоном различных физиологических процессов. Было показано, что подобно генам, кодирующим белок, у генов

микроРНК также выражена тканеспецифическая активность экспрессии. В связи с этим можно сделать предположение о вкладе мутаций в генах микроРНК в развитие различных патологических состояний [32—35].

В мужских половых клетках транскрибируется несколько классов микроРНК: Dicer-зависимые микроРНК, эндогенные интерферирующие РНК (эндо^РНК), а также Dicer-независимые piРНК [36]. piРНК — класс малых, некодирующих РНК (26—32 нуклеотидов), обнаруженных в комплексах с белками семейства Piwi. Белки Piwi относятся к большой группе белков Argonaute, необходимых для поддержания сперматогониальных стволовых клеток (ССК), сперматогенеза и репрессии мобильных элементов. Уровень экспрессии генов piРНК меняется в ходе сперматогенеза. Они начинают детектироваться в пахитене профазы I деления мейоза [34], однако при образовании гаплоидных сперматид содержание piРНК в них резко падает, и в зрелых сперматозоидах они отсутствуют [28]. Комплексы Piwi с piРНК не только задействованы в сайленсинге ретротранспо-зонов и других генетических элементов на посттрансляционном уровне, но имеют и некоторые другие, еще неописанные, эффекты, например эпигенетические [35].

В работах [37—40] дифференциально выраженный паттерн микроРНК в эмбриональных половых клетках и ССК оценивали путем сравнения профилей ми-кроРНК у незрелых и половозрезрелых мышей и в семенниках приматов, а также в различных тестикулярных популяциях клеток (рис. 5). К ним относят популяции гоноцитов и сперматогониев у мышей [41], Тку1(+)-кле-точные популяции, состоящие в основном из соматических клеток семенников, и Тйу1(-)-клеточные популяции [42], сперматогониев GFRa(+) (рецептора, располагающегося исключительно на поверхности не-дифференцирующихся сперматогониев) и спермато-гониев GFRa(-) [43].

Было выявлено отличие в экспрессии генов микро-РНК в клетках семенников мышей во время первой волны сперматогенеза, а также в различных обогащенных (отобранных по определенным маркерам) популяциях клеток: премейотической, мейотической и постмейо-тической [44-48].

Помимо исследования половых клеток профили микроРНК были оценены в соматических клетках семенников — клетках Сертоли [49-51]. Продемонстрировано, что экспрессия генов нескольких микроРНК в клетках Сертоли регулируется с помощью мужского гормона - тестостерона. Многие из этих микроРНК избирательно транскрибируются в семенниках и регулируют экспрессию генов в клетках Сертоли. Поэтому можно предположить, что андрогены в ряде случаев контролируют фазы сперматогенеза посредством микроРНК-зависимых механизмов [52, 53].

В ткани семенников экспериментально доказано избирательное профилирование микроРНК, выявлен

Е га Е

и

I

РНК-полимераза

pri-микроРНК

5'сар

(А) n

Ядро Цитоплазма

рге-микроРНК <^пт|Г Тпннщг j Exportin5

C^EBDCtf-ZTl 1.1 I.I. I IJ^J IJ

I Dicer

микроРНК-дуплекс ГТГ?'~">ТТПТПДТ1~

I

Двуцепочечные

РНК ДДШШШШДЕ

II i;iimri НИИ"

эндо-siРНК

1

RISC-комплекс

RISC-комплекс

ir

Таргетное связывание

1

Трансляционная инактивация либо деградация мРНК

Деградация мРНК

Рис. 4. Биогенез микроРНК

Е га Е

U

ряд специфических микроРНК для данного типа клеток (см. рис. 5) [44].

Также в клетках семенников были проанализированы эндо^РНК, образующиеся из длинных дву-цепочечных РНК, в биогенезе которых участвует Dicer, но не участвует «микропроцессор» (Drosha—DGCR8) [54—60]. В общей сложности были определены 73 эндо-siРНК, полученные из различных хромосом [60]. Био-информатический анализ показал, что эндо-микро-РНК в семенниках в основном нацелены на мРНК (92 %), на мРНК псевдогенов (3 %), ретротранспозо-нов (1 %), а также на некодирующие РНК (4 %) [60].

МикроРНК в качестве регуляторов дифференцировки

сперматогониальных стволовых клеток

Во время преобразования ППК в гоноциты на 12,5 дпс (дней после спаривания у мышей) начинается диффе-ренцировка предшественников клеток Сертоли. Этот процесс запускается действием гена Y-хромосомы Sry.

В дальнейшем клетки Сертоли синтезируют множество факторов, запускающих процесс превращения половых тяжей в эмбриональные семенные канальцы [61-64].

Недавние исследования показали, что микроРНК играют важную роль в регуляции этого процесса [62, 63]. Сигнальная система клеток Сертоли (они продуцируют факторы роста, нейротропные факторы (ОВКБ), цитокины, которые связываются с различными рецепторами ССК, такими как ОБЯа1, и тирозинкиназами) существенно влияет на дифференцировку ССК [62, 63, 65]. Так, при гипоэкспрессии гена Ойп/ полностью нарушается сперматогенез, и мыши приобретают синдром только клеток Сертоли. При гиперэкспрессии гена Ойп/возникает блок дифференцировки ССК, что также приводит к нарушениям сперматогенеза. Статус ССК является строго регламентированным, и микроРНК вносят свой вклад в регулирование этого процесса. Показано, что гены микроРНК-21, наряду с микро-

Типы клеток

Сперматогонии

А

X

п

Ts

го Ранниесперматоциты

Поздние сперматиды

Гоноциты

3 дпс

Thy1(+) клетки

6 дпс

СРКэ1(+)-клетки Thy1(+)-клетки

СРКа1(+)ТИу1(+) 7-9 дпс

Сперматогонии

Б1га8

Сперматогонии

Буср3

Сперматоциты

Поздние

сперматоциты

Округлые

сперматиды

18-20дпс М1, М11

Округлые сперматиды 28 дпс

Оплодотворение

Зигота

микроРНК

тШ-291а-5р, -293, -294, -290-5р

miR-21 (устойчивость к апопозу, подавление

дифференцировки сперматогониев)

тШ-34с, -182, -183, -146а-465а-3р, -465Ь-3р, -465с-3р, -465с-5р

miR-20, -106a

miR-221/222

miR-17-92

miR-146

тЮ-136, 743а, -463

miR-34c (индукция апоптоза) miR-449 (регуляция мейоза) miR-18 регуляция (деградация) мРНК транскрипционного фактора Нsf2 miR-469 регуляция (деградация) мРНК транзиторных белков TP2 и протаминов Prm2 miR-122 регуляция (деградация) мРНК транзиторных белков ТP2

В сперматозоидах:

тШ-34с

41

42

43

67

68

66 41

46

let-7f, -7a, -7b, -c7, -7g, -7i miR-99a, -34a, -322, -201, -547, -204

let-7a, -7b, -7c, -7d, -7e, -7g 69

miR-15b, -34b-5p, -34b-3p, -34c, -449a, -425, -375, -3470a, 46 -18a, -296-5p, 466i-5p, -3085-5p

miR-464, -t13, -t12, -t20, -t8, -t14, -t17, -469, -t3 45

80

85 81 83

84

Потенциальные биомаркеры мужского бесплодия

микроРНК в сперме

олигозооспермия:

тШ-141, -200а повышенный уровень

тШ-34Ь, -15Ь, 34с-5р, -34Ь, -449а, -1973, -122, -16, -19а 113

пониженный уровень

астенозооспермия:

тШ-200а, -141 повышенный уровень

тШ-1973, -34Ь, -122 пониженный уровень

МикроРНК в семенной плазме

тШ-34с-5р, -122, -146Ь-5р, -181а, -374Ь, -509-5р, 112

-513а-5р пониженный уровень при необструктивной азооспермии повышенный уровень при астенозооспермии

тШ-141, -429, -7-1-3р

пониженный уровень при необструктивной 111

азооспермии

102

Е га Е

U

Рис. 5. МикроРНК, которые преимущественно транскрибируются в семенниках и в специфических типах клеток семенников. ш1Я — микроРНК

Е га Е

и

РНК-34с, -182, -183 и -146а, преимущественно экс-прессируются в ССК [44] (см. рис. 5). Ингибирование микроРНК-21 в популяции ССК привело к существенному увеличению числа клеток, перешедших в апоптоз [42]. Гены и микроРНК-20 и -106а также преимущественно транскрибируются в ССК и участвуют в диффе-ренцировке сперматогониальных клеток на посттранскрипционном уровне, поскольку имеют таргетные области связывания с мРНК Stat3 и CyclinD1 [43]. Ген микроРНК-146 также выражено экспрессируется в недифференцированных сперматогониях, так как в дифференцированных сперматогониях уровень его экспрессии снижается почти в 180 раз [66]. Уменьшение уровня экспрессии гена микроРНК-146 приводит к индукции дифференцировки сперматогониев [66].

Другие микроРНК, участвующие в поддержании недифференцированного статуса сперматогониев, являются микроРНК Х-хромосомного кластера микро-РНК-221 и -222, гены которых имеют высокий уровень экспрессии в недифференцированных клетках и также участвуют в индукции дифференцировки сперматого-ниев, поскольку при понижении уровня экспрессии этих генов запускается механизм дифференцировки сперматогониев [67]. Нарушения функций микроРНК-221 и -222 также индуцируют дифференцировку и потерю свойств стволовых клеток у мышей [67]. Нокаутирование кластера генов микроРНК-17-92 у мышей, который избирательно экспрессируется в недифференцированных сперматогониях, приводит к синдрому микрояичек и существенному снижению количества сперматозоидов в эпидидимисе [68]. Интересно отметить, что удаление кластера генов микроРНК-17-92 приводит к увеличению экспрессии другого кластера генов микроРНК-106b-25, также избирательно экспрессирующегося в недифференцированных сперматогониях, что, по всей видимости, указывает на их функциональное сотрудничество [68]. Показано, что при дифференцировке сперматогониев снижается регуляция семейством микроРНК let-7 таргетных целей мРНК Mycn, Ccnd1 и Colla2 [69-75].

МикроРНК в мейотических и постмейотических клетках

Транскриптом семенников млекопитающих гораздо более сложно организован, чем описанные транс-криптомы других тканей. Это объясняется повышением транскрипционной активности в сперматоцитах в пахитене профазы I мейоза и в сперматидах на ранних стадиях спермиогенеза [18, 76, 77]. Этот вывод позволяет предположить, что эффективный посттранскрипционный контроль, в том числе микроРНК-регуляция, играет одну из ключевых ролей в мейотических и пост-мейотических клетках. Данное утверждение подтверждает и тот факт, что модельные мыши с нокаутированным геном Dicer1 имеют выраженное нарушение мейоза.

Существует много подтверждений функциональной важности конкретных микроРНК в сперматоген-ных клетках. Так, микроРНК-34с была выявлена уже в ППК, но во время сперматогенеза ее уровень варьирует. Ее роль изначально связывали с поддержанием определенного клеточного статуса. Однако в дальней -шем было показано, что на более поздних этапах сперматогенеза в сперматоцитах и сперматидах уровень микроРНК-34с в клетке возрастает [78-80]. Снижение уровня экспрессии гена микроРНК-34С в первичных сперматоцитах считается необходимым для блокировки индуцированного апоптоза. Напротив, повышение экспрессии гена микроРНК-34С в культивируемых половых клетках является триггером апоптоза — процесса, который частично опосредован связыванием микроРНК-34С с 3'-нетранслируемой областью гена ATF1 (циклического АМФ-зависимого транскрипционного фактора ЛТП).

Считается, что кластер микроРНК-449 также участвует в регуляции мейоза, поскольку экспрессия его генов сильно возрастает в этот период сперматогенеза, и, кроме того, он участвует в регуляции таких транскрипционных факторов, как СЯЕМ1аи и 8ох5 [81]. Однако, несмотря на высокий уровень экспрессии генов кластера микроРНК-449 в мужских половых клетках, у мышей мужского пола с делецией данного гена наблюдали нормальный сперматогенез [81].

Важной составляющей сперматогенеза считается компактизация хроматина, в ходе которой происходит замена гистонов на протамины. Регуляция этого процесса осуществляется в том числе с помощью посттранскрипционного микроРНК-контроля. Было показано, что мишенью для микроРНК-469 являются мРНК транзиторного белка ТР2 и мРНК протамина Prm2, в результате чего подавляется экспрессия белка TP2 и Prm2 в пахитенных сперматоцитах и ранних спер-матидах. Другая микроРНК, контролирующая экспрессию гена Tр2, — микроРНК-122а, эта микроРНК активирует деградацию мРНК Тр2 [82—84]. МикроРНК-18, принадлежащая онкогенному микроРНК-кластеру — Опсошк-1 — регулирует трансляцию транскрипционного фактора ЖР2 во время сперматогенеза [85, 86]. Экспрессия гена транскрипционного фактора И8Р2 в семенниках регистрируется между 14-м и 21-м днем постнатального развития. Самый высокий уровень экспрессии ЖР2 в семенниках мужчин наблюдается в сперматоцитах и ранних сперматидах. Иммуноцито-химическое окрашивание показывает, что белок ЖР2 локализуется в ядрах сперматоцитов и ядрах округлых сперматид, и этот транскрипционный фактор находится в семенниках в конститутивно активном ДНК-свя-зывающем состоянии. Кроме этого, было выявлено, что транскрипционный фактор ЖР2 способен взаимодействовать с промоторной последовательностью гена ЖР70.2 — члена семейства генов ЖР70, которые,

в свою очередь, необходимы для нормального функционирования андрогенового рецептора [86]. И8Р2 и микроРНК-18 демонстрируют обратную корреляцию во время сперматогенеза. Так, уменьшение экспрессии гена микроРНК-18 приводит к повышению уровня белка ЖР2 и наоборот [85].

Модельные системы для изучения путей микроРНК при сперматогенезе

Значение регуляторных путей микроРНК в сперматогенезе стало понятно после создания особых типов моделей нокаутированных мышей (рис. 6). Для изучения влияния мутаций, приводящих к генетическим заболеваниям, часто используют модели животных. При этом в геном модельного животного вносят мутации либо как у больных людей, либо нарушающие экспрессию тех генов, регуляция которых у больных нарушена [87]. Однако генетический нокаут не всегда позволяет понять функции гена и последствия его мутаций. Для многих генов нарушение их работы на уровне всего организма несовместимо с нормальным развитием и приводит к гибели эмбрионов. Эту проблему возможно решить с помощью выборочного редактирования генома в определенном типе клеток. В этих целях в настоящее время часто используют рекомби-назу Сге, которая узнает специальные последовательности длиной 34 пар нуклеотидов, называющиеся ЬохР [88]. Эта рекомбиназа, впервые обнаруженная в бактериофаге Р1, может проводить специфическую реком-

бинацию 2 сайтов узнавания ЬохР (т. е. удалять участок ДНК между фрагментами ЬохР) независимо от того, в каком геноме они находятся. Последовательность ЬохР состоит из 2 инвертированных повторов и специфического спейсера между ними. Последовательность спейсера может изменяться, однако Сге-реком-биназа осуществляет рекомбинацию только между ЬохР-сайтами с одинаковыми спейсерами. Таким образом, можно создавать сложные конструкции с большим числом ЬохР-сайтов [89]. Мыши, несущие ген Сге-ре-комбиназы, называют Сге-делитерами. В настоящее время описано несколько сотен различных линий Сге-делитеров, обеспечивающих широкое разнообразие выбора клеток-мишеней [90]. Их используют для получения гибридных мышей, у которых рекомбиназа будет синтезироваться и удалять ген-мишень только в клетках определенного типа.

Последствия удаления Dicer1 в эмбриональных и дифференцирующихся половых клетках изучали, используя различные мышиные модели, в которых Dicer1 был нокаутирован в конкретной ткани и в конкретный момент дифференцировки половых клеток с помощью специфических промоторов, управляющих экспрессией рекомбиназы Сге.

Исследования генетически модифицированных линий мышей показали, что Dicer1 имеет решающее значение для мужской фертильности, а также для развития тестикулярных клеток и клеток Сертоли. При удалении Dicer1 в клетках Сертоли с помощью SF1 промотор-

U/

UfM

- A

I

со

i

B

U>

A «Ф C B

Линия с LoxP-фланкированным геном-мишенью

Линия с рекомбиназой Cre под контролем тканеспецифического промотера

В поколении Р2 ген-мишень удаляется в нужной ткани

5'-ATAACTTCGTATA 3' -TATTGAAGCATAT

ATGTATGC -

TACATACG

TATACGAAGTTAT-3' ATATGCTTCAATA-5'

Е га Е

и

Последовательность нуклеотидов LoxP

Рис. 6. Принцип редактирования гена с использованием тканеспецифической Сгв-^рекомбиназы

управляемой Cre-рекомбиназы не выявлено отклонений в течение внутриутробной жизни плода, хотя согласно этой методике удаление Dicer1 было осуществлено уже в ППК. Однако это привело к полной дегенерации семенника вскоре после рождения [88]. На 5-й день после рождения значительно уменьшилось количество про-лиферирующих клеток Сертоли и клеток Лейдига [91]. Решающая роль Dicer1 в функционировании клеток Сертоли была также продемонстрирована с использованием AMF промоторуправляемой Сге-рекомбиназы. С ее помощью было проведено модельное нокаутирование Dicer1 исключительно в клетках Сертоли мышей. Это привело к нарушению сперматогенеза и прогрессирующей тестикулярной дегенерации [50, 51, 92].

Удаление Dicer1 в примордиальных половых клетках после 10-го дня эмбрионального развития с использованием управляющего промотора тканенеспецифи-ческой щелочной фосфатазы (tissue non-specific alkaline phosphatase, TNAP) для Cre-рекомбиназы привело к проявлению дефектов пролиферации в примордиальных половых клетках. Последствием этого процесса стало выраженное нарушение сперматогенеза [93, 94]. Однако низкая пенетрантность трансгена TNAP-Cre (трансгенные мыши экспрессировали Cre-рекомбина-зу только в 50 % половых клеток) препятствовала точному анализу дефектов в данной модели мыши.

Удаление Dicer1 в линии мышиных мужских половых клеток непосредственно перед рождением с помощью Ddx4 промотеруправляемой Cre-рекомбиназы привело к возникновению серьезных дефектов в мейо-

тических и постмейотических половых клетках [78, 95]. Произошла задержка в прохождении профазы I мейо-за во время сперматогенеза, значительно увеличилось количество апоптотических сперматоцитов, что, в свою очередь, привело к уменьшению числа сперматид. Га -плоидная дифференцировка оставшихся сперматид привела к образованию нескольких морфологически атипичных нефункциональных сперматозоидов [78]. Удаление Dicer1 в сперматогониях с помощью моделей Ngn3-Cre и Stra8-Cre обусловило появление менее тяжелых фенотипов [92—94].

Ngn3 — член семейства транскрипционных факторов. Этот белок синтезируется преимущественно в недифференцированных сперматогониях половозрелых мышей. Селективное удаление Dicer1 в сперматогониях типа А с помощью Ngn3 промотеруправляемой Cre-ре-комбиназы не повлияло на прогрессирование мейоза, и первые явные дефекты проявились лишь в гаплоидных мышиных мужских половых клетках (рис. 7) [96]. Возникли серьезные проблемы с компактизацией хроматина и формированием правильной формы головки сперматозоида [96]. Подобные дефекты возникли и у модельных мышей с нокаутом Ddx4-Cre-Dicer1: морфология сперматозоидов в эпидидимисе была атипичной — с маленькими деформированными головками и атипичной структурой жгутиков, кроме того, значительно снизилось количество продуцируемых сперматозоидов. Удаление Dicer1 в ранних сперматогониях с помощью модели Stra8-Cre привело к серьезным нарушениям в гаплоидной дифференцировке [97, 98],

Е га Е

и

Атипия сперматозоидов

Prm1 -Cre

Stra8-Cre

Нарушение мейоза

Ngn3-Cre

Дефекты мейоза Активация апоптоза

Ddx4-Cre

Нарушение пролиферации

TNAP-Cre

Первичные Недифференциро- Сперматогонии половые ванные

клетки сперматогонии

t

Нокаут LIN28 Нарушение митоза

Нокаут AGO4 Преждевременная инициация мейоза, нарушение MSCI

Нарушение гаплоидной дифференцировки

Нарушение гаплоидной дифференцировки

Нарушение гаплоидной дифференцировки

<тЛг

Сперматозоиды

Сперматиды

Рис. 7. Обобщенный анализ моделей мыши с использованием тканеспецифической Ск-рекомбиназы. Показаны выявленные основные дефекты сперматогенеза в каждой модельной системе

а также к замедлению мейотического деления. Позднее делетирование Dicerl в гаплоидных клетках с использованием модельных мышей линии Protamine 1 (Prml)-Cre привело к менее серьезным нарушениям сперматогенеза, чем в предыдущих модельных системах Ngn3-Cre и Stra8-Cre [95, 96]. Они имели атипичную форму головки сперматозоидов и неправильную компактиза-цию хроматина [99]. Это исследование показало, что инактивация Dicerl в округлых сперматидах замедляет трансляционную активность в половых клетках.

Было продемонстрировано, что микроРНК существенно влияют на экспрессию генов. Выявлены значительные различия в уровне экспрессии многих генов при отсутствии Dicer [97, 98]. Однако экспрессия транс-позонов не пострадала в семенниках мышей, нокаутированных по Ngn3-Cre-Dicer1.

Суммарный анализ фенотипов этих специфических для мышиных мужских половых клеток нокаутов по Dicerl указывает на зависимость дифференцировки мужских половых клеток от деятельности Dicer. Причем его модельные делеции на более ранних стадиях дифференцировки приводят к накоплению дефектов [44]. Кроме этого, активность Dicer является важным звеном для нормального прохождения мейоза, как было показано на модельных мышах Ddx4-Cre.

Чтобы выявить роль путей микроРНК в сперматогенезе, были также созданы мыши, нокаутированные по Drosha c помощью модели Stra8-Cre, фенотип которых был сравнен с мышами, нокаутированными по Dicer. Отмечено, что Drosha имеет несколько независимых функций, а именно участвует в гидролизе мРНК и биогенезе рибосомной РНК. Drosha участвует только в процессинге микроРНК, в то время как Dicer участвует также в процессинге эндо-микроРНК. Сравнение 2 линий модельных мышей, у которых нокаутирование Dicer и Drosha было произведено в яичках с помощью Cre-рекомбиназы, позволило выявить, что оба гена необходимы для нормального прохождения сперматогенеза. Анализ транскриптома показал изменение профилей мРНК в обоих Drosha- и Dicer-нулевых пахитенных сперматоцитах и округлых сперматидах. Некоторые мРНК показали схожие изменения в обоих мышиных линиях. Однако большинство изменений в уровнях экспрессии мРНК уникальны для каждого из 2 мутант-ных генотипов. Таким образом, микроРНК и другие Dicer-зависимые пути (например, эндо-микроРНК) играют расходящиеся и независимые друг от друга роли в процессе сперматогенеза [97, 98].

Пути микроРНК и половые хромосомы

Плотность локализации генов микроРНК выше на Х-хромосоме млекопитающих, чем на аутосомах. Это является следствием кластерной организации Х-хромосомных генов микроРНК, которые представ-

ляют собой копии, образованные в результате дупликации генов микроРНК [100].

Сравнение уровней экспрессии генов микроРНК в сперматоцитах и сперматидах с уровнем их экспрессии в соматических клетках показало, что многочисленное семейство генов микроРНК на Х-хромосоме имеет более высокие уровни экспрессии в мужских половых клетках, чем все другие категории генов ми-кроРНК [100]. Известно, что гены половых хромосом подвергаются эпигенетическому сайленсингу в сперматоцитах на стадии пахитены во время профазы I мей-оза путем мейотической инактивации половых хромосом (meiotic sex chromosome inactivation, MSCI) с образованием полового тельца. При этом происходят модификации хроматина, сопровождающие процесс репрессии генов. Транскрипционно неактивное состояние половых хромосом сохраняется и после первого деления мейоза, и даже на этапе спермиогенеза. Тем не менее оказалось, что микроРНК, в частности семейства микроРНК Х-хромосомы, не подвергаются сайленсингу по типу MSCI [101]. Это говорит о том, что дупли-цирование генов микроРНК на Х-хромосоме является эволюционно значимым процессом, важным для того, чтобы гены микроРНК имели возможность экспрес-сироваться в сперматоцитах и сперматидах, несмотря на инактивацию половой хромосомы [100, 101].

Известно, что гены семейства AGO (AGO1—AGO4) экспрессируются во всех типах тканей организма, однако экспрессия AGO4 наиболее выражена в семенниках. При этом ген AGO4 локализуется в эпигенетически молчащем во время профазы I мейоза половом тельце

[102]. Модельный Cre-нокаут AGO4 в сперматогониях привел к преждевременному инициированию мейоза и началу неправильной сборки полового тельца, что обусловило нарушение MSCI (см. рис. 7). Интересно, что делеция AGO4 сопровождалась также уменьшением экспрессии Х-хромосомных генов микроРНК, которые способны избегать воздействия на себя MSCI [101, 102].

Эти результаты позволили выявить роль AGO4 в ядрах пахитенных сперматоцитов в качестве регулятора MSCI, что предполагает участие сетей малых РНК в этом процессе. Кроме этого, было показано, что ряд микроРНК был локализован в ядрах пахитенных спер-матоцитов, что дополнительно подтверждает предположение об участии микроРНК в MSCI [47].

Однако удаление Dicer или Drosha в сперматогониях у мышей не оказало значимого эффекта на формирование половых телец в пахитенных сперматоцитах

[103]. Неясно, объясняется ли избыточная экспрессия генов, которые должны быть молчащими при MSCI, прямыми дефектами процесса MSCI в анализируемых пробах нокаутированных семенников или нет [101]. В целом все больше доказательств свидетельствует о причастности Dicer и микроРНК к регуляции половых хромосом. Очевидно, что точная связь между Dicer,

Е га Е

и

E

W

E

u

микроРНК, AGO-белками и сайленсингом генов половых хромосом требует дальнейшего изучения.

Потенциал внеклеточных микроРНК в качестве биомаркеров бесплодия

Помимо присутствия микроРНК на клеточном уровне в ряде исследований было показано наличие микро-РНК во внеклеточных жидкостях, таких как плазма крови [104—106], слюна [107, 108], выделения из влагалища, семенная жидкость [108]. В отечественных источниках такую микроРНК называют циркулирующей. Повышение уровня внеклеточной микроРНК связано с различными физиологическими расстройствами [109]. Было отмечено изменение уровня экспрессии генов различных микроРНК, а также мРНК, специфичной для семенников при мужском бесплодии [106—109]. В связи с этим высказано предположение о возможности использования микроРНК в качестве биомаркеров мужского бесплодия.

Первый доклад об изменении уровня экспрессии генов микроРНК в яичках пациентов с необструктив-ной азооспермией был сделан J. Lian и соавт. [110]. Следует отметить, что необструктивная азооспермия имеет широкий спектр проявления дефектов — от крипто-зооспермии и блока созревания сперматозоидов до синдрома «только клеток Сертоли». Таким образом, оценка дифференциальной экспрессии генов микроРНК у пациентов с данным диагнозом важна для более точного понимания патологического процесса и расшифровки патогенеза заболевания.

С. Wang и соавт. анализировали уровень экспрессии генов микроРНК в сперме мужчин с бесплодием и сравнили результаты с аналогичными данными, полученными от фертильных мужчин (группа контроля). Они обнаружили изменения в концентрационных профилях микроРНК (более чем в 50 раз) при азооспермии и астенозооспермии для 7 микроРНК: микроРНК-34с-5р, -122, -146b-5P, -181а, -374b, -509-5p и -513A-5P. Концентрация этих 7 микроРНК была значимо (более чем в 50 раз) ниже в случае азооспермии и выше при асте-нозооспермии по сравнению с группой контроля (см. рис. 5). Авторы сделали вывод, что эти 7 микроРНК имеют достаточный потенциал, чтобы стать молекулярными маркерами диагностики мужского бесплодия [111].

W. Wu и соавт. оценили паттерн экспрессии генов miR-I9b и let-7a у мужчин с идиопатическим бесплодием с необструктивной азооспермией или олигозоо-спермией с помощью количественной полимеразной цепной реакции. Они показали выраженное увеличение концентрации этих микроРНК при бесплодии по сравнению с образцами фертильных мужчин. Авторы заключили, что микроРНК-19В и let-7a являются

хорошими диагностическими молекулярными биомаркерами при идиопатическом бесплодии с необструк-тивной азооспермией или олигозооспермией [112].

Однонуклеотидные полиморфизмы

С учетом важности влияния микроРНК на процесс сперматогенеза можно предположить, что мутации в генах, вовлеченных в сперматогенез в зоне микроРНК-свя-зывающего сайта, могут привести к бесплодию. H. Zhang и соавт. впервые сообщили о связи между однонуклео-тидным полиморфизмом (ОНП) в зоне микроРНК-свя-зывающего сайта с идиопатическим мужским бесплодием [113]. Они исследовали все ОНП в З'-нетранслируемой области 140 генов млекопитающих, вовлеченных в сперматогенез, и заметили, что некоторые ОНП в пределах сайтов связывания микроРНК могут быть сопряжены с идиопатическим мужским бесплодием. Среди 140 исследованных генов выявлены 6 полиморфизмов (2 в CYP19, Serpina5 и 4 в CGA, CPEB1, CPEB2), участвующих в снижении уровня экспрессии генов при сперматогенезе и мейозе. С помощью программ биоинформатики, таких как Pictar, Miranda, TargetScan, было высказано предположение, что данные ОНП могут влиять на связывание (сродство) с микроРНК [110—116].

Выводы

Мужские половые клетки имеют сложный транскрип-том. Помимо кодирующих белков мРНК в нем присутствует много некодирующих РНК, включая микроРНК.

Известно, что микроРНК являются важными регуляторами экспрессии генов. Они функционируют в основном посттранскрипционно, контролируя трансляцию их целевых мессенджеров — мРНК — и участвуя в каждом этапе дифференцировки мужских половых клеток. В данном обзоре продемонстрировано значение путей микроРНК для нормального сперматогенеза. Определена функциональная роль ряда микроРНК на различных этапах дифференцировки половых клеток. Рассмотрены микроРНК в сперматозоидах и семенной плазме человека в качестве потенциальных биомаркеров мужского бесплодия.

Показано, что дисфункции при процессинге ми-кроРНК могут привести к азооспермии и бесплодию. Другие аномалии, такие как наличие ОНП в генах, вовлеченных в сперматогенез в зоне микроРНК-связы-вающего сайта, либо нарушение регуляции экспрессии данных генов, также могут обусловливать бесплодие. В связи с этим исследователи предполагают, что оценка роли микроРНК может иметь диагностическое значение и в будущем расширить понимание молекулярных механизмов мужского бесплодия, а также углубить представление о патогенезе форм бесплодия.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Jan S.Z., Hamer G., Repping S. et al. Molecular control of rodent spermatogenesis. Biochim Biophys Acta 2012;1822(12): 1838-50.

2. Kanatsu-Shinohara M., Shinohara T. Spermatogonial stem cell self-renewal and development. Annu Rev Cell Dev Biol 2013;29:163-87.

3. Miller M.P., Amon A., Unal E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Curr Opin Cell Biol 2013;25(6): 687-96.

4. Rathke C., Baarends W.M., Awe S., Renkawitz-Pohl R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochim Biophys Acta 2014;1839:155-68.

5. Kotaja N., Kimmins S., Brancorsini S. et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods 2004;1:249-54.

6. Ruwanpura S.M., McLachlan R.I., Meachem S.J. Hormonal regulation of male germ cell development. J Endocrinol 2010;205(2):117-31.

7. Guyonnet B., Dacheux F., Dacheux J.L., Gatti J.L. The epididymal transcriptome and proteome provide some insights into new epididymal regulations. J Androl 2011;32(6):651-64.

8. Rato L., Alves M.G., Socorro S. et al. Metabolic regulation is important for spermatogenesis. Nat Rev 2012;9(6):330-8.

9. Tilly J.L., Sinclair D.A. Germline energetics, aging, and female infertility. Cell Metab 2013;17(6):838-50.

10. Chalmel F., Rolland A.D., NiederhauserWiederkehr C. et al. The conserved transcriptome in human and rodent male gametogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 2007;104(20):8346-51.

11. Laiho A., Kotaja N., Gyenesei A., Sironen A. Transcriptome profiling

of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS One 2013;8(4):e61558.

12. Matzuk M.M., Lamb D.J. The biology of infertility: research advances and clinical challenges. Nature Med 2008;14(11): 1197-213.

13. Kimmins S., Kotaja N., Davidson I., Sassone-Corsi P. Testis-specific transcription mechanisms promoting male germ-cell differentiation. Reproduction 2004;128(1):5-12.

14. Kimmins S., Sassone-Corsi P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature 2005;434(7033):583-9.

15. Rinn J.L., Chang H.Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem 2012;81:145-66.

16. Bao J., Wu J., Schuster A.S. et al. Expression profiling reveals developmentally

regulated lncRNA repertoire in the mouse male germline. Biol Reprod 2013; 89(5):107.

17. Sun J., Lin Y., Wu J. Long non-coding RNA expression profiling of mouse testis during postnatal development. PLoS One 2013;8(10):e75750.

18. Soumillon M., Necsulea A., Weier M.

et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Rep 2013;3(6):2179-90.

19. Ascano M., Gerstberger S., Tuschl T. Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks. Curr Opin Genet Dev 2013;23(1):20-8.

20. Paronetto M.P., Sette C. Role of RNA-binding proteins in mammalian spermato-genesis. Int J Androl 2010;33(1):2-12.

21. Idler R.K., Yan W. Control of messenger RNA fate by RNA-binding proteins:

an emphasis on mammalian spermatogenesis. J Androl 2012;33(3):309-37.

22. Meikar O., Da Ros M., Korhonen H., Kotaja N. Chromatoid body and small RNAs in male germ cells. Reproduction 2011;142(2):195-209.

23. Kotaja N., Bhattacharyya S.N., Jaskiewicz L. et al. The chromatoid body

of male germ cells: similarity with processing bodies and presence of Dicer and microRNA pathway components. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103(8):2647-52.

24. Kotaja N., Sassone-Corsi P.

The chromatoid body: a germ-cell-specific RNAprocessing centre. Nat Rev Mol Cell Biol 2007;8(1):85-90.

25. Ghildiyal M., Zamore P.D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet 2009;10(2):94-108.

26. Vasudevan S., Tong Y.,

Steitz J.A. Switching from repression to activation: MicroRNAs can up-regulate translation. Science 2007;318(5858):1931-4.

27. Zheng H., Fu R., Wang J.T. et al. Advances in the techniques for the prediction of microRNA targets. Int J Mol Sci 2013;14(4):8179-87.

28. Макарова Ю.А., Крамеров Д.А. Некодирующие РНК. Биохимия 2007;72(11):1427-48. [Маkarovа Yu.А., Kramerov D.А. Noncoding RNA. Biokhimiya = Biochemistry 2007;72(11):1427-48. (In Russ.)].

29. Lee Y., Kim M., Han J. et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J 2004;23(20):4051-60.

30. Chen K., Rajewsky N. The evolution of gene regulation by transcription factors and microRNAs. Nat Rev Genet 2007;8(2):93-103.

31. Pratt A.J., MacRae I.J. The RNA-induced silencing complex: a versatile

genesilencing machine. J Biol Chem 2009;284(27):17897-901.

32. Sood P., Krek A., Zavolan M. et al. Cell-type-specific signatures of microRNAs on target mRNA expression. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103(8):2746-51.

33. Wang Z., Yao H., Lin S. et al. Transcriptional and epigenetic regulation of human microRNAs. Cancer Lett 2013;331(1):1-10.

34. Ishizu H., Siomi H., Siomi M.C. Biology of PIWI-interacting RNAs: new insights into biogenesis and function inside and outside of germlines. Genes Dev 2012;26(21):2361-73.

35. Siomi M.C., Sato K., Pezic D., Aravin A.A. PIWI-interacting small RNAs: the vanguard of genome defence. Nat Rev Mol Cell biol 2011;12(4):246-58.

36. Yadav R.P., Kotaja N. Small RNAs in spermatogenesis. Mol Cell Endocrinol 2014;382(1):498-508.

37. Papaioannou M.D., Nef S. McroRNAs in the testis: building up male fertility.

J Androl 2010;31(1):26-33.

38. Mclver S.C., Roman S.D., Nixon B., McLaughlin E. A. miRNA and mammalian male germ cells. Hum Reprod Update 2012;18(1):44-59.

39. Yan N., Lu Y., Sun H. et al. A microarray for microRNA profiling in mouse testis tissues. Reproduction 2007;134(1):73-9.

40. Yan N., Lu Y., Sun H. et al. Microarray profiling of microRNAs expressed in testis tissues of developing primates. J Assist Reprod Genet 2009;26(4):179-86.

41. Mclver S.C., Stanger S.J.,

Santarelli D.M. et al. A unique combination of male germ cell miRNAs coordinates gonocyte differentiation. PLoS One 2012;7(4):e35553.

42. Niu Z., Goodyear S.M., Rao S. et al. MicroRNA-21 regulates the self-renewal of mouse spermatogonial stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108(31):12740-5.

43. He Z., Jiang J., Kokkinaki M. et al. MiRNA-20 and miRNA-106a regulate spermatogonial stem cell renewal

at the posttranscriptional level via targeting STAT3 and Ccnd1. Stem Cells 2013;31(10):2205-17.

44. Kotaja N. MicroRNAs and spermatogenesis. Fertil Steril 2014;101(6): 1552-62.

45. Ro S., Park C., Sanders K.M. et al. Cloning and expression profiling of testis-expressed microRNAs. Dev Biol 2007;311(2):592-602.

46. Smorag L., Zheng Y., Nolte J. et al. MicroRNA signature in various cell types of mouse spermatogenesis: evidence

for stage-specifically expressed miRNA-221, -203 and -34b-5p mediated

E

W

E

и

Е га Е

и

spermatogenesis regulation. Biol Cell 2012;104(11):677-92.

47. Marcon E., Babak T., Chua G. et al. miRNA and piRNA localization in the male mammalian meiotic nucleus. Chromosome Res 2008;16(2):243-60.

48. Ro S., Park C., Young D. et al. Tissue-dependent paired expression of miRNAs. Nucleic Acids Res 2007;35(17):5944—53.

49. Ortogero N., Hennig G.W., Langille C. et al. Computerassisted annotation of murine Sertoli cell small RNA transcriptome. Biol Reprod 2013;88(1):3.

50. Papaioannou M.D., Pitetti J.L., Ro S. et al. Sertoli cell Dicer is essential for spermatogenesis in mice. Dev Biol 2009;326(1):250-9.

51. Papaioannou M.D., Lagarrigue M., Vejnar C.E. et al. Loss of Dicer in Sertoli cells has a major impact on the testicular proteome of mice. Mol Cell Proteomics 2011;10(4):M900587MCP200.

52. Panneerdoss S., Chang Y.F., Buddavarapu K.C. et al. Androgen-responsive microRNAs in mouse Sertoli cells. PLoS One 2012;7(7):e41146.

53. Nicholls P.K., Harrison C.A., Walton K.L. et al. Hormonal regulation of sertoli cell micro-RNAs at spermiation. Endocrinology 2011;152(4):1670-83.

54. Schwarz D.S., Zamore P.D. Why do miRNAs live in the miRNP? Genes Dev 2002;16(9):1025-31.

55. Stark A., Brennecke J., Bushati N. et al. Animal MicroRNAs confer robustness

to gene expression and have a significant impact on 3'UTR evolution. Cell 2005;123(6):1133-46.

56. Lewis B.P., Shih I.H., Jones-Rhoades M. et al. Prediction of Mammalian MicroRNA Targets. Cell 2003;115(7):787-98.

57. Chen C., Ridzon D.A., Broomer A.J.

et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res 2005;33(20):e179.

58. Shingara J., Keiger K., Shelton J. et al. An optimized isolation and labeling platform for accurate microRNA expression profiling. RNA 2005;11(9):1461-70.

59. Nozawa M., Miura S., Nei M. Origins and evolution of microRNA genes

in Drosophila species. Genome Biol Evol 2010;2:180-9.

60. Song R., Hennig G.W., Wu Q. et al. Male germ cells express abundant endogenous siRNAs. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108(32):13159-64.

61. Ewen K.A., Koopman P. Mouse germ cell development: from specification to sex determination. Mol Cell Endocrinol 2010;323(1):76-93.

62. Wainwright E.N., Jorgensen J.S., Kim Y. et al. SOX9 regulates microRNA miR-202-5p/3p expression during mouse testis differentiation. Biol Reprod 2013;89(2):34.

63. Rakoczy J., Fernandez-Valverde S.L., Glazov E.A. et al. MicroRNAs-140-5p/140-3p modulate Leydig cell numbers

in the developing mouse testis. Biol Reprod 2013;88(6):143.

64. Matsui Y. The molecular mechanisms regulating germ cell development and potential. J Androl 2010;31(1):61-5.

65. De Rooij D.G., Russell L.D. All you wanted to know about spermatogonia but were afraid to ask. J Androl 2000;21(6): 776-98.

66. Huszar J.M., Payne C.J. MicroRNA 146(Mir146) modulates spermatogonial differentiation by retinoic acid in mice. Biol Reprod 2013;88(1):15.

67. Yang Q.E., Racicot K.E., Kaucher A.V. et al. MicroRNAs-221 and -222 regulate

the undifferentiated state in mammalian male germ cells. Development 2013;140(2):280-90.

68. Tong M.H., Mitchell D.A., McGowan S.D. et al. Two miRNA clusters, Mir-17-92 (Mirc1) and Mir-106b-25 (Mirc3), are involved in the regulation

of spermatogonial differentiation in mice. Biol Reprod 2012;86(3):72.

69. Tong M.H., Mitchell D., Evanoff R., Griswold M.D. Expression of Mirlet7 family microRNAs in response to retinoic acid-induced spermatogonial differentiation

in mice. Biol Reprod 2011;85(1):189-97.

70. Mayr F., Heinemann U. Mechanisms of Lin28-mediated miRNA and mRNA regulation - a structural and functional perspective. Int J Mol Sci 2013;14(8): 16532-53.

71. Zheng K., Wu X., Kaestner K.H., Wang P.J. The pluripotency factor LIN28 marks undifferentiated spermatogonia

in mouse. BMC Dev Biol 2009;9:38.

72. Gillis A.J., Stoop H., Biermann K. et al. Expression and interdependencies

of pluripotency factors LIN28, OCT3/4, NANOG and SOX2 in human testicular germ cells and tumours of the testis. Int J Androl 2011;34(4 Pt 2):e160-74.

73. Gaytan F., Sangiao-Alvarellos S., Manfredi-Lozano M. et al. Distinct expression patterns predict differential roles of the miRNA-binding proteins, LIN28 and LIN28b, in the mouse testis: studies during postnatal development and in a model

of hypogonadotropic hypogonadism. Endocrinology 2013;154(3):1321-36.

74. Aeckerle N., Eildermann K., Drummer C. et al. The pluripotency factor LIN28

in monkey and human testes: a marker for spermatogonial stem cells? Mol Hum Reprod 2012;18(10):477-88.

75. Chakraborty P., Buaas F.W., Sharma M. et al. LIN28A marks the spermatogonial progenitor population and regulates its cyclic expansion. Stem Cells 2014;32(4):860-73.

76. Murchison E.P., Stein P., Xuan Z. et al. Critical roles for Dicer in the female germline. Genes Dev 2007;21(6):682-93.

77. Platts A.E., Dix D.J., Chemes H.E. et al. Success and failure in human spermatogenesis as revealed by teratozoospermic RNAs. Hum Mol Genet 2007;16(7):763-73.

78. Romero Y., Meikar O., Papaioannou M.D. et al. Dicer1 depletion in male germ cells leads to infertility due to cumulative meiotic and spermiogenic defects. PLoS One 2011;6(10):e25241.

79. Bouhallier F., Allioli N., Lavial F. et al. Role of miR-34c microRNA in the late steps of spermatogenesis. RNA 2010;16(4):720-31.

80. Liang X., Zhou D., Wei C. et al. MicroRNA-34c enhances murine male germ cell apoptosis through targeting ATF1. PLoS One 2012;7(3):e33861.

81. Bao J., Li D., Wang L. et al. MicroRNA-449 and microRNA-34b/c function redundantly in murine testes by targeting E2F transcription factor-retinoblastoma protein(E2F-pRb) pathway. J Biol Chem 2012;287(26):21686-98.

82. Meikar O., Da Ros M., Kotaja N. Epigenetic regulation of male germ cell differentiation. Subcell Biochem 2012;61:119-38.

83. Dai L., Tsai-Morris C.H., Sato H. et al. Testis-specific miRNA-469 up-regulated in gonadotropin-regulated testicular RNA helicase (GRTH/DDX25) - null mice silences transition protein 2 and protamine 2 messages at sites within coding region: implications of its role in germ cell development. J Biol Chem 2011;286(52):44306-18.

84. Yu Z., Raabe T., Hecht N.B. MicroRNA Mirn122a reduces expression

of the posttranscriptionally regulated germ cell transition protein 2 (Tnp2) messenger RNA (mRNA) by mRNA cleavage. Biol Reprod 2005;73(3):427-33.

85. Bjork J.K. Sandqvist A., Elsing A.N. miR-18, a member of Oncomir-1, targets heat shock transcription factor 2

in spermatogenesis. Development 2010;137(19):3177-84.

86. Akerfelt M., Morimoto R.I., Sistonen L. Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan. Nat Rev Mol Cell Biol 2010;11(8):545-55.

89. Missirlis P.I., Smailus D.E., Holt R.A. A high-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics of the loxP spacer region in Cre-mediated recombination. BMC Genomics 2006;7:73.

90. Landel C.P., Chen S.Z., Evans G.A. Reverse genetics using transgenic mice. Annu Rev Physiol 1990;52:841-51.

91. Hoess R.H., Ziese M., Sternberg N. P1 site-specific recombination: nucleotide sequence of the recombining sites. Proc Natl Acad Sci USA 1982;79(11):3398-402.

92. Kuhn R., Wurst W. Gene Knockout Protocols. 2nd Edition. New-York: Humana Press, 2009. 517 p.

93. Hayashi K., Chuva de Sousa Lopes S.M., Kaneda M. et al. MicroRNA biogenesis

is required for mouse primordial germ cell development and spermatogenesis. PLoS One 2008;3(3):e1738.

94. Maatouk D.M., Loveland K.L., McManus M.T. et al. Dicerl is required for differentiation of the mouse male germline. Biol Reprod 2008;79(4):696-703.

95. Liu D., Li L., Fu H. et al. Inactivation of Dicerl has a severe cumulative impact on the formation of mature germ cells

in mouse testes. Biochem Biophys Res Commun 2012;422(1):114-20.

96. Korhonen H.M., Meikar O., Yadav R.P. et al. Dicer is required for haploid male germ cell differentiation in mice. PLoS One 2011;6(9):e24821.

97. Wu Q., Song R., Ortogero N. et al. The RNase III enzyme Drosha is essential for microRNA production and spermatogenesis. J Biol Chem 2012;287(30):25173-90.

98. Greenlee A.R., Shiao M.S., Snyder E. et al. Deregulated sex chromosome gene expression with male germ cell-specific loss of Dicer1. PLoS One 2012;7(10):e46359.

99. Chang Y.F., Lee-Chang J.S., Imam J.S. et al. Interaction between microRNAs and actinassociated protein Arpc5 regulates translational suppression during male germ cell differentiation. Proc Natl Acad Sci USA 2012;109(15):5750-5.

100. Meunier J., Lemoine F., Soumillon M. et al. Birth and expression evolution

of mammalian microRNA genes. Genome Res 2013;23(1):34-45.

101. Song R., Ro S., Michaels J.D. et al. Many X-linked microRNAs escape meiotic sex chromosome inactivation. Nat Genet 2009;41(4):488-93.

102. Modzelewski A.J., Holmes R.J., Hilz S. et al. AGO4 regulates entry into meiosis and influences silencing of sex chromosomes

in the male mouse germline. Dev Cell 2012;23(2):251-64.

103. Johanson T.M., Lew A.M.,

Chong M.M. MicroRNA-independent roles of the RNase III enzymes Drosha and Dicer. Open Biol 2013;3(10):130144.

104. Luteijn M.J., Ketting R.F. PIWI-interacting RNAs: from generation

to transgenerational epigenetics. Nat Rev Genet 2013;14(8):523-34.

105. Liu W.M., Pang R.T., Chiu P.C. et al. Sperm-borne microRNA-34c is required for the first cleavage division in mouse. Proc Natl Acad Sci USA 2012;109(2):490-4.

106. Ostermeier G.C., Dix D.J., Miller D. et al. Spermatozoal RNA profiles of normal fertile men. Lancet 2002;360(9335):772-7.

107. Jodar M., Selvaraju S., Sendler E. et al. The presence, role and clinical use

of spermatozoal RNAs. Hum Reprod Update 2013;19(6):604-24.

108. Sendler E., Johnson G.D., Mao S. et al. Stability, delivery and functions of human sperm RNAs at fertilization. Nucleic Acids Res 2013;41(7):4104-17.

109. Krawetz S.A., Kruger A., Lalancette C. et al. A survey of small RNAs in human sperm. Hum Reprod 2011;26(12):3401-12.

110. Lian J., Zhang X., Tian H. et al. Altered microRNA expression in patients with non-obstructive azoospermia. Reprod Biol Endocrinol 2009;7:13.

111. Wang C., Yang C., Chen X. et al. Altered profile of seminal plasma microRNAs

in the molecular diagnosis of male infertility. Clin Chem 2011;57(12):1722-31.

112. Wu W., Hu Z., Qin Y. et al. Seminal plasma microRNAs: potential biomarkers for spermatogenesis status. Mol Hum Reprod 2012;18(10):489-97.

113. Zhang H., Liu Y., Su D. et al. A single nucleotide polymorphism in a miR-1302 binding site in CGA increases the risk

of idiopathic male infertility. Fertil Steril 2011;96(1):34-9.

114. Abu-Halima M., Hammadeh M., Schmitt J. et al. Altered microRNA expression profiles of human spermatozoa in patients with different spermatogenic impairments. Fertil Steril 2013;99(5): 1249-55.

115. Montjean D., De La Grange P., Gentien D. et al. Sperm transcriptome profiling in oligozoospermia. J Assist Reprod Genet 2012;29(1):3-10.

116. Jodar M., Kalko S., Castillo J. et al. Differential RNAs in the sperm cells

of asthenozoospermic patients. Hum Reprod 2012;27(5):1431-8.

E

W

E

u