СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ АНТИТЕЛ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ
METHOD FOR STABILISING ANTIBODIES IN AQUEOUS SOLUTIONS

Изобретение относится к области биотехнологии, в том числе к способам сохранения свойств биологических материалов, используемых в исследовательских или аналитических целях.
В частности, изобретение предназначено для повышения стабильности антител в условиях их длительного хранения в водных растворах с целью последующего применения при проведении диагностических иммунологических исследований.
Задача стабилизации функциональной активности антител определяется тем, что в силу своих уникальных свойств (специфическое связывание с соответствующими антигенами) они широко используются в медицине и ветеринарии в диагностических и лечебно-профилактических целях. В то же время наиболее удобные для использования водные растворы антител при хранении являются достаточно нестабильными. Причина этого заключается в спонтанно протекающем гидролизе с разрушением дисульфидных или пептидных связей, сопровождающимся образованием димеров и олигомеров молекул. Соответственно, конечным результатом подобных процессов является изменение физико-химического состояния антител с утратой их значимых функциональных свойств. В наибольшей степени сказанное относится к получаемым гибридомным методом моноклональным антителам, каковые обладают очень высокой специфичностью и не дают перекрестных реакций с другими антигенами, но при этом наиболее неустойчивы к тепловым воздействиям и спонтанному гидролизу.
Таким образом, заявляемый способ предназначен для использования на биотехнологических производствах, производящих препараты на основе антител для иммунологических диагностических исследований.
Известные из уровня техники способы стабилизации функциональных белковых молекул могут быть объединены в три основные группы: 1) направленное изменение первичной структуры белковой молекулы с использованием приемов сайт-направленного мутагенеза; 2) ковалентная химическая модификация белковой молекулы; 3) использование модифицирующих добавок, изменяющих конформацию или гидратную оболочку белковой молекулы при ее нахождении в водном растворе.
По совокупности существенных признаков способы, использующие последний принцип, могут быть охарактеризованы как аналоги заявляемого изобретения. При этом их общим преимуществом является то, что добавление веществ, модифицирующих конформацию или гидратную оболочку белка, является наиболее простым, дешевым и во многих случаях наиболее эффективным подходом, позволяющим существенно увеличивать сроки хранения готовых препаратов. Другим достоинством большинства подобных способов является безопасность применяемых добавок в случае использования растворов антител не только в диагностических, но и в лечебно-профилактических целях.
По своей химической природе круг веществ, используемых для стабилизации антител, достаточно широк и разнообразен, начиная от небольших по молекулярной массе соединений, заканчивая биомакромолекулами.
Так известен способ стабилизации антител в растворе, основанный на добавлении к ним глициновой и лимонной кислот [US 0020255, Method of stabilizing antibody and stabilized solution-type antibody preparation, 2007]. При этом положительным эффектом от использования способа является подавление образования растворимых ассоциаций антител, сохранение их химической структуры и стабилизация функциональной активности.
Более крупномолекулярным стабилизатором антител является декстран, представляющий собой группу растворимых в воде полисахаридов с молекулярной массой 20000-150000 Да. Реализованный с его использованием способ направлен на сохранение активности специфичных к гонадотропным гормонам моноклональных антител в диапазоне концентраций 0,1-2,5 мг/мл, дезактивация которых может быть предотвращена в диапазоне температур от 4 до 40°С [US 5237054, Stabilized aqueous composition containing antibodies, 1993].
Антитела становятся более устойчивыми в процессе хранения, если в их растворе содержится смесь по крайней мере одного полиоксипропиленового-полиоксиэтиленового блоксополимера, представленного под торговыми марками «Pluronic», «Synperonic», «Superonic» или «Emkalyx», и одного фосфолипида, например лецитина [US 4902500, Stabilization of antibodies, 1990].
Сохранение функциональных свойств моноклональных антител к теофиллину после их нахождения в водном растворе при температуре 45°С в течение семи дней может достигаться путем добавления 0,25-5% гидролизированного овальбумина [US 4650772, Monoclonal antibody stabilization, 1987].
Еще один способ, использующий существующие в естественных условиях механизмы стабилизации функциональных белковых молекул путем их связывания со специальными молекулами - шаперонами и шаиеронинами, реализован в рамках патента [US 6262238, Process for modifying the stability of antibodies, 2001], регламентирующего применение в качестве стабилизирующих добавок белков семейств DNAJ и HSP90.
В то же время из уровня техники неизвестны способы стабилизации антител, использующие другой природный, существующий у прокариотических микроорганизмов механизм стабилизации биополимеров, достигаемый путем их взаимодействия с низкомолекулярными ауторегуляторными факторами - индукторами анабиоза, по своей химической природе относящимся к алкилоксибензолам (алкилрезорцинам). При этом накопленные данные позволяют рассматривать алкилоксибензолы как своеобразные «химические шапероны», неспецифически взаимодействующие с широким кругом биополимеров, следствием чего является модификация их функциональной активности и изменение чувствительности к денатурирующим воздействиям [Мартиросова Е.И., Карпекина Т.А., Эль-Регистан Г.И. Модификация ферментов естественными химическими шаперонами микроорганизмов // Микробиология. 2004. Т.73. №5. С.708-715].
В наших предыдущих исследованиях [Дерябин Д.Г., Романенко Н.А., Эль-Регистан Г.И. Влияние алкилоксибензолов на антигенсвязывающую способность антител // Микробиология. 2009. Т.78. №5. С.569-574; Дерябин Д.Г., Романенко Н.А., Эль-Регистан Г.И. Влияние алкилоксибензолов на функциональную и операционную стабильность антител // Микробиология. 2010. Т.79. №3. С.314-320] модифицирующая активность алкилоксибензолов продемонстрирована и в отношении антител, что свидетельствует о потенциальной применимости подобного подхода для достижения заявленной цели. Другие предварительные экспериментальные данные получены в отношении одного из гидрофобных алкилоксибензолов (1,4-дигидроксибензил-(изопентан-1-ол)-3), стабилизирующего активность моноклональных антител против HBs-антигена при температурном воздействии [Липова В.В., Шушпанова О.Н., Казацкая Ж.А., Эль-Регистан Г.И., Новиков В.В. Стабилизирующее действие алкилоксибензолов па антитела против HBs-антигена// Иммунология. 2007. Т.28. №1. С.22-24].
В то же время в доступной литературе отсутствуют данные о влиянии алкилоксибензолов на функциональную стабильность антител при их длительном нахождении в водном растворе, неизвестны зависимости формирующихся эффектов от химической структуры алкилоксибензолов, времени и температуры совместной инкубации.
Таким образом, подводя итог данному разделу описания изобретения, следует указать, что заявляемый способ не известен из уровня техники, т.е. является новым.
Основной задачей, на решение которой направлен заявляемый способ, является сохранение функциональной активности антител (способности к специфическому взаимодействию с соответствующим антигеном) при их длительном нахождении в водных растворах.
1
Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее: взаимодействие химического аналога низкомолекулярных бактериальных индукторов анабиоза C-алкилоксибензола (метилрезорцина) с молекулами антител модифицирует их гидратную оболочку таким образом, что это ведет к увеличению сроков сохранения функциональной активности антител при длительном нахождении в водном растворе.
Соответственно, при реализации заявляемого способа характеристика действий, порядок их выполнения и условия осуществления представляются следующим образом:
1) готовятся водные растворы антител необходимой специфичности, концентрация которых в 2 раза превышает необходимую для их последующего использования при постановке иммунологических реакций;
1
-4
2) готовится раствор C-алкилоксибензола (метилрезорцина) категории х.ч. в дистиллированной воде в оптимальной для последующей модификации антител концентрации 1×10М (0,0124 г/л);
1
1
-5
3) полученные растворы антител и C-алкилоксибензола (метилрезорцина) смешиваются в соотношении 1:1, так что конечная концентрация антител оказывается равной необходимой для их последующего использования при постановке иммунологических реакций, а конечная концентрация стабилизатора - C-алкилоксибензола (метилрезорцина) составляет 5×10М (0,0062 г/л);
4) полученные растворы переносятся в стеклянные емкости, герметично укупориваются и хранятся при температуре от +4°С до +37°С;
5) при необходимости растворы вскрываются и используются для постановки соответствующих иммунологических реакций без каких-либо дополнительных действий.
1
Основным отличием описанного выше алгоритма действий от известных способов является использование в качестве стабилизатора антител химического аналога низкомолекулярного бактериального индуктора анабиоза - C-алкилоксибензола (метилрезорцина), выполняющего у микроорганизмов роль «химического шаперона».
Возможность получения технического результата при выполнении перечисленных действий в указанных интервалах значений обусловлена следующим комплексом причинно-следственных связей:
1
1
6
12
1) использование для заявленных целей именно С-алкилоксибензола (С-АОБ), во-первых, определяется тем, что в отличие от прочих алкилоксибензолов с более длинным алкильным радикалом и определяемой этим гидрофобностью молекул он не вызывает выраженного блокирования связывания антител с соответствующими антигенами. Так отличные от него длинноцепочечные С- и С-АОБ вызывают выраженное снижение показателей связывания модифицированных ими антител с соответствующими антигенами до 15,4-40% от контрольных значений, что является нежелательным эффектом и существенно ограничивает возможности использования названных алкилоксибензолов в качестве стабилизирующих добавок;
1
1
1
1
-5
2) другим обоснованием использования C-алкилоксибензола для заявленных целей является выявленное в эксперименте стабилизирующее действие C-АОБ на функциональные характеристики антител при их длительном нахождении в водных растворах, наиболее выраженное в температурном режиме +37°С. Так при хранении интактных и модифицированных С-АОБ антител при температуре +4°С параметр TI20, характеризующий время утраты 20% их антигенсвязывающей способности, имел достаточно большую величину без достоверных различий в сравниваемых группах. С другой стороны, хранение интактных антител при +37°С вело к достаточно быстрой утрате их функциональной активности, сокращающей величину TI20 в 7-8 раз. В свою очередь, процедура модификации с использованием С-АОБ в конечной концентрации 5×10М (0,0062 г/л) не менее чем двукратно увеличивала значение TI20 но сравнению с интактными антителами (Р<0,05);
1
1
-5
3) экспериментальным обоснованием использования С-АОБ в оптимальной рабочей концентрации 5×10М является то, что его более низкие дозировки достоверно не увеличивали характеризуемые значениями TI20 сроки сохранения функциональной активности антител. Увеличение же присутствия С-АОБ выше указанной концентрации также являлось нецелесообразным, так как в этом случае в отдельных пробах антител индивидуальной специфичности отмечалось частичное блокирование их антигенсвязывающей способности, более характерное при модификации алкилоксибензолами с более длинным алкильным радикалом и определяемой этим гидрофобностью молекул (см. п.1 выше);
1
6
12
е
e
1
6
12
1
4) в качестве причины, лежащей в основе описанного выше влияния С-АОБ на функциональную стабильность антител, заявители называют особенности его взаимодействия с молекулами воды, имеющие выраженные количественные различия с таковыми у гомологов С- и С-АОБ. Основанием для подобного утверждения являются результаты компьютерного моделирования взаимодействия молекул воды с различными гомологами АОБ, позволившего методом функционала плотности DFT/ ROHF/ В3 LYP/ в базисе 6-31G провести расчет межмолекулярных потенциалов и определить возможность создания устойчивых по энергии комплексов. При этом в качестве характеристики минимальной энергии, необходимой для разрыва связи устойчивого комплекса «АОБ-вода», использована т.н. «глубина потенциальной ямы - D». Выполнение соответствующих расчетов позволило констатировать, что возникновение устойчивых комплексов с водой возможно только при ее взаимодействии с атомом кислорода каждой из двух гидроксильных групп в молекуле АОБ, но имеет неидентичные количественные характеристики у различных гомологов. Наибольшей (3 ккал/моль) величина D оказалась для С-АОБ по сравнению с С- и С-АОБ, для которых значения данного параметра составили 1 и 0,2 ккал/моль соответственно, что объясняет способность С-АОБ модифицировать гидратную оболочку антител с соответствующим увеличением сроков сохранения их функциональной активности при длительном нахождении в водном растворе.
В целом, резюмируя приведенные выше материалы о сущности заявляемого способа, характеристике действий, порядке их выполнения и условиях осуществления, можно констатировать, что заявляемый способ не следует из уровня техники и по этому показателю должен быть оценен как соответствующий критерию «изобретательский уровень».
Возможность получения положительного результата при выполнении действий, их условий и режимов, предусмотренных заявляемым способом, иллюстрируется следующими примерами:
1
-4
1. Для хранения с последующим использованием для проведения диагностических исследований методом иммуноферментного анализа на основе коммерческих тест-систем для количественного выявления иммуноглобулинов класса G к Toxoplasma gondii производства ОАО «Вектор-Бест» (партия №116) были заложены опытная и контрольная серии антител. При этом в половине взятых в опыт тест-систем калибровочные образцы антител с концентрациями 10, 25, 50, 100, 200 МЕ/мл в соотношении 1:1 были модифицированы раствором C-алкилоксибензола (метилрезорцина) в концентрации 10М (0,0124 г/л), а во второй половине недостающий объем был восполнен дистиллированной водой.
2. Половина опытных (модифицированных) и половина контрольных (немодифицированных) образцов в течение 12 месяцев инкубировались в герметично упакованных стеклянных емкостях при температуре +4°С, а вторая половина в течение того же времени при +37°С.
3. В первые сутки хранения, а также в течение всего указанного срока с интервалом 10-30 суток растворы антител изымались и в необходимых количествах использовались для постановки иммуноферментного анализа.
4. На основе учета результатов иммуноферментного анализа проводился количественный учет показателей связывания модифицированных и немодифицированных антител к Toxoplasma gondii с соответствующими антигенами, сорбированными в лунках входящих в состав тест-систем полистироловых планшетов. Полученные данные были использованы для расчета величин TI20, характеризующих время, за которое утрачивается 20% функциональной (антигенсвязывающей) активности антител, и определяющих допустимые сроки их хранения.
1
5. Установлено, что хранение немодифицированных растворов антител к Toxoplasma gondii при температуре +4°С сопровождается относительно медленной утратой их антигенсвязывающей способности, характеризуемой величиной TI20=351,1±7,0 сут., что соответствует заявленным срокам хранения соответствующих тест-систем. В свою очередь, модификация антител С-алкилоксибензолом с последующим хранением в температурном режиме +4°С достоверно не изменяла сроков утраты их функциональной активности.
1
6. Хранение немодифицированных растворов антител к Toxoplasma gondii при температуре +37°С вело к значительно более быстрой утрате их функциональной активности, характеризуемой величиной TI20=44,0±3,3 сут. В свою очередь, процедура модификации антител с использованием С-алкилоксибензола почти двукратно увеличивала значение TI20 (до 86,6±7,4 сут.; Р<0,05), а к 228 суткам хранения при +37°С обуславливала превышение показателя антигенсвязывающей способности на 79,0±1,4% по сравнению с немодифицированными образцами антител (Р<0,001).
Таким образом, положительным результатом, достигаемым при использовании изобретения, является увеличение сроков годности коммерческих препаратов антител, в том числе при отклонении от температурных режимов их хранения.