ОПТИМИЗАТОР ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Настоящая полезная модель относится к биотехнологии и предназначена для поиска (оптимизации) наилучших составов питательных сред для процессов микробного роста и биосинтеза в аэробных условиях.
До настоящего времени специальные устройства для оптимизации питательных сред не разрабатывались.
Оптимизация традиционно осуществляется либо с использованием качалок (термостатируемых шейкеров), либо миниреакторов, либо непосредственно в рабочем реакторе. С точки зрения достижения соответствия среды условиям аэрации и перемешивания наилучшие результаты будут получены при использовании рабочего биореактора. Однако при этом трудозатраты и затраты ресурсов будут неприемлемыми. Использование миниреакторов позволяет сократить временные затраты за счет параллельного проведения нескольких процессов. Но в этом случае возрастает стоимость оборудования и сложность подготовительных работ, связанная с необходимостью подготовки нескольких отдельных биореакторов с автономными технологическими обвязками. В качалочных же колбах нет возможности обеспечить соответстствие режимных параметров условиям в биореакторе.
Задачей полезной моделей является упрощение технологии поиска наилучших составов питательных сред для процессов микробного роста и биосинтеза в аэробных условиях.
Данная задача решается за счет оптимизатора питательных сред, включающий жидкостный термостат, имеющий магнитную мешалку, комплект рабочих ячеек для питательных сред, установленных внутри термостата на едином штативе и оснащенных штуцерами для аэрации и отбора проб, увлажнитель воздуха, погруженный в термостат и оснащенный штуцерами ввода воздуха и дополнительного газа, стерилизующие фильтры и ротаметры для подачи в увлажнитель воздуха и дополнительного газа с контролируемым расходом.
Количество рабочих ячеек составляет от 6 до 18.
Увлажнитель газов содержит два барботера для регулируемого ввода компонентов газового питания.
Увлажнитель газового потока установлен на том же штативе, что и рабочие ячейки;
Термостат и ячейки выполнены из термостойкого стекла.
Техническим результатом, является то, что разработанная полезная модель приближает гидродинамические условия и массообмен к режиму культивирования в биореакторе (в отличие от условий в качалочных колбах).
Основным узлом оптимизатора питательных сред является реакторный блок, представляющий собой термостатируемый стеклянный сосуд объемом 20 л (термостат) с погружным штативом, на котором по окружности размещены 12 рабочих барботажных ячеек объемами по 250 мл (рисунки 1 и 2). Количество ячеек обусловлено числом опытов в полном факторном эксперименте, равном 23 при трех факторах с учетом еще 4 опытов в центре плана и дробной репликой для 5 факторов (25-3) с числом экспериментов (5+1)⋅(5-3)=12.
Ячейки выполнены из стандартных стеклянных мерных цилиндров с целью визуального контроля объема жидкости, режима перемешивания и пенообразования. С учетом возможного пенообразования и с целью увеличения времени контакта жидкой и газовой фаз соотношение диаметра ячеек и их высоты должно находиться в пределах 1:5 - 1:7. Этим требованиям полностью отвечают стандартные мерные цилиндры. Наконец, применение стандартных мерных цилиндров гарантирует идентичность ячеек.
Рабочие ячейки закрыты пробками и герметизированы силиконовыми манжетами. В пробках сверлятся отверстия для ввода нержавеющих штуцеров подачи газа на аэрацию, отвода отработанной газовой смеси, отбора проб культуральной жидкости, залива среды и инокулирования.
Штатив для установки рабочих ячеек представляет собой две квадратные пластиковые пластины с отверстиями, скрепленные четырьмя стойками (шпильки M12). Верхняя пластина размером имеет 12 отверстий диаметром 41 мм для установки рабочих ячеек и 1 отверстие диаметром 50 мм для установки увлажнителя газового потока. Отверстия для установки ячеек расположены на равном удалении по окружности. В этой же пластине имеются отверстия для ввода датчика температуры, ТЭНа и установки U-образной трубки водяного охлаждения.
Нижняя пластина штатива размером обеспечивает вертикальное положение рабочих ячеек, которые входят в 12 отверстий, идентичных отверстиям на верхней пластине. Углы нижней пластины срезаны для обеспечения лучшей циркуляции воды в термостате.
Пластины изготавливаются из капролона или фторопласта Ф4.
Штатив при установке в термостат опирается на стенки термостата через резиновые профилированные прокладки.
Общий вид штатива с установленными ячейками и сменной технологической обвязкой представлен на Фиг. 1.
Монтаж штатива осуществляется следующим образом: а) на шпильки наворачиваются гайки до уровня, соответствующего длине цилиндрических ячеек; б) шпильки вставляются в отверстия нижней панели; в) нижняя панель закрепляется четырьмя гайками и цилиндрическими опорами, имеющими отверстия с резьбой; г) на верхние части шпилек наворачиваются гайки, на которые ложится верхняя панель; д) верхняя панель закрепляется фигурными гайками колпачкового типа.
Стерилизация штатива с ячейками производится в собранном виде в автоклаве вертикального типа. Режим стерилизации определяется способом загрузки питательных сред. При стерилизации вместе с залитыми в рабочие ячейки питательными средами температура стерилизации составляет 120°С, длительность от 25 до 30 минут. При этом, если в состав сред входят витамины, их необходимо стерилизовать кипячением отдельно, а затем вводить в ячейки с соблюдением требований асептики. Поэтому целесообразнее стерилизовать штатив с ячейками и питательные среды раздельно. При этом штатив, как любые устройства для работы с микроорганизмами, стерилизуется при 123°С в течение 1 часа.
Термостатирование ячеек осуществляется в погружном термостате с помощью нагревательного элемента (ТЭН патронного типа), полностью погруженного в теплоноситель (дистиллированная вода), и U-образного холодильника, через который осуществляется отвод избыточного тепла водопроводной водой. В качестве регулятора температуры используется стандартный прибор ТРМ500 фирмы ОВЕН. Мощность нагревательного элемента составляет 250 вт.Непрерывный постоянный расход охлаждающей воды от 0,1 до 0,3 л/мин.
Теплоноситель в термостате перемешивается с помощью магнитной мешалки при скорости вращения 120-150 об/мин (12-14 гц по уставке ПЧВ).
Регулировка скорости вращения магнитной мешалки осуществляется с помощью преобразователя частоты (ПЧВ) при использовании асинхронного двигателя. Но может применяться и двигатели иного типа (постоянного тока, шаговый двигатель) с соответствующими блоками управления.
Схема оптимизатора представлена на Фиг. 2.
1 - Барабанный газовый счетчик;
2 - Коллектор отработанного воздуха;
3 - Рабочие ячейки;
4 - увлажнительный сосуд;
5 - термостат
6 - стерилизующие фильтры;
7 - магнитная мешалка;
8 - ТЭН;
9 - кислород;
10 - воздух;
11 - вода охлаждающая;
12 - преобразователь частоты.
13 - регулятор температуры.
Для контроля общего расхода воздуха может использоваться барабанный газовый счетчик (ГСБ-400 или РГ-7000).
С целью предотвращения изменения объема жидкой фазы в ячейке за счет уноса паров воды отработанной газовой смесью, осуществляется увлажнение входного газового потока в ячейке 4 объемом 500 мл, установленной в центре термостата 5. При температуре 30°С воздух может содержать до 30,4 г/м3 паров воды [Матвеев, К.В. Испарение и конденсация воды. Несколько практических советов [Электронный ресурс] / К.В. Матвеев // URL: http://life.mosmetod.ru/index.php/item/isparenie-i-kondensaciya-vody-neskolko-prakticheskih-sovetov (Дата обращения 15.07.2017)]. Таким образом, при расходе воздуха 1 объем на объем жидкости в минуту, длительности процесса 24 часа и влажности входного воздуха 60% получаем:
[30,4⋅(100-60)/100]⋅24⋅60/1000=17,5 г
Отсутствие учета уноса паров воды может привести к ошибкам в расчете концентраций компонентов культуральной жидкости 100⋅17,5/120=14,6% при рабочем объеме ячейки 120 мл. Для технологических расчетов допустима погрешность 5%. Поэтому, исходя из требований метрологии, необходимо увлажнение воздуха на входе в ячейку для поддержания и корректного расчета объема жидкой фазы.
Увлажнительный сосуд имеет 2 барботера, через которые подается соответственно стерильный воздух и кислород или азот (стерилизующие фильтры 6).
Коллектор сбора отработанного воздуха располагается вокруг увлажнительного сосуда на верхней панели штатива. Специального крепления не имеет и держится непосредственно на присоединяемых силиконовых шлангах, соединяющих его с ячейками. Выходной штуцер коллектора соединяется шлангом с фильтром отработанного газа.
Регулировка расхода воздуха и кислорода осуществляется вручную вентилями, имеющимися в составе ротаметров на линиях подвода воздуха и кислорода. Давление газов на входе ротаметров задается и поддерживается редукторами (например, РДФ6 и кислородным баллонным редуктором). В отдельных экспериментах, когда необходимо при достаточно интенсивном перемешивании обеспечить низкую концентрацию кислорода, вместо кислорода воздух может смешиваться с азотом. При этом необходимо внести поправку в показания ротаметра, поскольку плотности азота и кислорода различны.
Одной из особенностей установки является наличие жидкостного стеклянного термостата с принудительным перемешиванием теплоносителя с помощью магнитной мешалки.
Применение стеклянного сосуда с прозрачными стенками и стандартных стеклянных мерных цилиндров в качестве рабочих ячеек обеспечивает визуальный контроль за аэрацией, ростом биомассы (увеличение мутности культуральной жидкости) и пенообразованием.
Перемешивание теплоносителя осуществляется магнитной мешалкой. Для уменьшения потерь на трение ведомого диска о днище термостата несущий диск мешалки изготовлен из фторопласта Ф4. В пазах несущего диска установлены ниобиевые магниты, имеющие усилие на отрыв 10 кг. Магниты цилиндрической формы диаметром 25 мм и высотой 5 мм расположены в пазах фторопластового несущего диска на одинаковом расстоянии друг от друга.
Работа по оптимизации сред начинается с выбора факторов - ключевых веществ, концентрации которых подлежат уточнению. Готовятся питательные среды в количестве до 12, объемами по 110-130 мл. Среды забуфериваются добавлением натриевых солей фосфорной кислоты. Кислотность среды доводится до оптимума соляной кислотой или едким натром. При этом надо учитывать, что из числа факторов, подлежащих оптимизации, исключается фосфат-ион.
Во все среды вносится химический пеногаситель, например, пропинол Б400 или иной, согласно заданию на эксперимент.
Среды стерилизуются в автоклаве в колбах с отводами при 120°С в течение 25-30 минут. Если среды включают витамины, то последние стерилизуются кипячением отдельно в течение 20 минут и вливаются затем в простерилизованную среду.
В центральную ячейку объемом 500 мл перед стерилизацией штатива с ячейками заливается 200 мл дистиллированной воды.
Параллельно со средами стерилизуется штатив с ячейками в автоклаве при 123°С в течение 1 часа.
Свободные концы шлангов, присоединенные к отводам колб, увлажнителю и гребенке отвода отработанной газовой смеси перед стерилизацией затыкаются ватными тампонами и оборачиваются калькой.
После стерилизации штатив и колбы со средами вносятся в бокс для стерильных работ. После чего бокс обрабатывается ультрафиолетовым излучением в течение 30 минут.
Готовые стерильные среды разливаются по ячейкам через штуцеры, предназначенные для вноса инокулята. Соединение шлангов производится в пламени спиртового факела.
По завершении остывания ячеек до 25-30°С осуществляется ввод инокулята во все ячейки стерильным шприцем.
Штатив выносится из бокса и устанавливается в термостат.
В пламени спиртового факела осуществляется соединение шлангов от стерилизующих фильтров к увлажнителю газового потока и от гребенки отвода отработанного газа к выходному фильтру.
Открывается вентиль на линии аэрации. Вентилем редуктора РДФ6 регулируется давление воздуха, подаваемого на аэрацию. Вентилем ротаметра воздуха регулируется расход. При этом осуществляется визуальный контроль за процессом аэрации ячеек.
Включается электропитание. Выставляется уставка по температуре ниже, чем заданная в эксперименте, на 2-3°С.
Включается двигатель мешалки. Частота на шкале ПЧВ должна быть установлена в диапазоне 3-12 гц.
После прогрева термостата до температуры первоначальной уставки, устанавливается регламентная температура путем смены уставки.
В ходе процесса визуально контролируется работа мешалки и регулятора температуры - по табло регуляторов.
Отбор проб из каждой ячейки осуществляется с заданной периодичностью в объеме 5 мл в пипетку, присоединяемую к шлангу пробоотборника. Предварительно необходимо слить 5 мл культуральной жидкости в пипетку аналогичного объема. Всего допустим отбор 4-5 проб за эксперимент. После каждого пробоотбора необходимо подстраивать расход газовой смеси, сохраняя заданную величину удельной аэрации.
Для исключения образования и выброса пены в выходную газовую магистраль предварительно до стерилизации вносят пеногаситель в питательную среду. Если в ходе процесса пена все же образуется, то можно подавать стерильный пеногаситель шприцем через засевочные штуцеры. При этом поверхность пробок, закрывающих засевочные штуцеры необходимо обрабатывать дезинфицирующим раствором.
Возможно проведение исследований и без применения фосфатного буфера. Например, с применением мела. При этом измерение оптической плотности в ходе процесса не будет соответствовать динамике концентрации биомассы микроорганизмов. Надо будет использовать другой метод, например, определение аминного азота, что более трудоемко. Также возможно проведение экспериментов вообще без использования буфера. При этом анализируется рН культуральной жидкости (периодически в отбираемых пробах), и через засевочные штуцеры с соблюдением правил асептики в ячейки вводится титрующий агент. Но при этом существенно возрастают трудозатраты.
По завершении эксперимента штатив с ячейками извлекается из термостата. Ячейки отсоединяются от всех технологических линий. Из них культуральные жидкости сливаются в утилизационную емкость, передаваемую на стерилизацию. Не простерилизованные остатки биологических препаратов сливать в канализацию категорически запрещено!
После слива остатков культуральной жидкости, ячейки и присоединительные шланги тщательно моются содовым раствором и ополаскиваются трижды дистиллированной водой. Затем осуществляется установка ячеек в штатив с присоединением всех технологических линий. Штатив снова готов к стерилизации.
Изделие может использоваться для оснащения заводских лабораторий малых и средних предприятий, а также в образовательном процессе при обучении студентов соответствующих специализаций и повышении квалификации работников биотехнологических производств.
Изделие обеспечивает простоту подготовки эксперимента, как при использовании качалочных колб. Мойка, стерилизация, подключение линий аэрации упрощены за счет совмещения крепления всех устройств на едином штативе.