СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ СБРАЖИВАНИЯ ГЛЮКОЗЫ ИЗ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ И ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ ОТХОДОВ ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИЕЙ
METHOD FOR PRODUCING GLUCOSE FERMENTATION PRODUCTS FROM CELLULOSE-CONTAINING RAW MATERIALS AND CELLULOSE-CONTAINING WASTE BY THERMOPHILIC BACTERIUM

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии. Более подробно изобретение относится к технологиям использования микроорганизмов для переработки сырья и отходов, содержащих целлюлозу, и получения соединений с добавленной стоимостью и конкретно к применению термофильных микроорганизмов рода Dictyoglomus для переработки целлюлозосодержащего сырья и отходов с образованием перспективных для последующего применения в качестве кормовых добавок веществ, таких как жирные кислоты, в том числе летучие жирные кислоты (ЛЖК).
Уровень техники
Органические кислоты входят в наиболее обширный и разнообразный класс кормовых добавок - подкислители кормов. В состав подкислителей входят органические кислоты и (или) их соли. Применяемые в сельском хозяйстве подкислители различают по своим свойствам: снижающие рН или воздействующие на микробов, вводимые в жидком или сухом виде, обладающие летучестью, коррозионной активностью, запахом, вкусом, уровнем безопасности для животных и людей, и т.п. Яркий пример подкислителя - молочная кислота (лактат). Это органическая кислота, которая, по сравнению с муравьиной или уксусной кислотами, не обладает летучестью и имеет крайне малую коррозионную активность. Помимо снижения рН перспективность применения молочной кислоты обусловлена еще и ее антибактериальным действием, а также стимулированием потребления животными корма. Как подкислитель молочная кислота особенно востребована в качестве добавки в кормах для поросят.
По агрегатному состоянию подкислители бывают жидкими и порошкообразными. Жидкие подкислители, как правило, вносят в воду или жидкие корма, реже - в сухой корм. Если в состав подкислителей введены органические кислоты, находящиеся в жидком состоянии, то, как правило, их изготавливают методом иммобилизации жидких кислот на инертном носителе (чаще всего, на окиси кремния).
При этом содержание наполнителя в продукте колеблется от 30 до 60%. Этот наполнитель с точки зрения кормовой ценности является балластом. Существуют также подкислители без балласта, представляющие собой смесь сухих кислот и солей органических кислот.  Они отличаются высокой кормовой ценностью при сохранении присущих им свойств.
В зависимости от состава препарата, подкислители могут выполнять следующие функции:
- консервируют корм, то есть препятствуют развитию в нем патогенной микрофлоры, дрожжей, плесеней;
- снижают буферность корма, повышая его кислотность;
- способствуют снижению pH в желудке при попадании туда корма;
- препятствуют развитию патогенных микроорганизмов в желудке и кишечнике;
- стимулируют развитие нормофлоры;
- способствуют увеличению уровня выработки ферментов;
- улучшают усвоение корма.
Однако применение ряда органических кислот, таких, как муравьиная, пропионовая, уксусная, масляная в виде собственно кислот имеет ряд недостатков. Они провоцируют возникновение коррозии металлических частей оборудования, могут вызывать раздражения кожи и органов дыхания, а также ожоги у людей при работе с ними. Вышеуказанные кислоты могут вступать в реакции с витаминами и микроэлементами, входящими в состав кормов, снижая их биологическую активность. Т.к. эти кислоты легко испаряются, то существует высокий риск их потери при хранении и очень высокий - при влаготермической обработке кормов (гранулировании, экспандировании, экструдировании).
Вышеописанных недостатков лишены соли органических кислот. Они менее агрессивны и более безопасны в работе, имеют низкую летучесть, имеют преимущества при прохождении ЖКТ и могут эффективно «работать» в нижних отделах пищеварительного тракта животных. Подобные продукты востребованы, но пока почти не представлены на российском рынке.
Основу травянистых кормов, в частности, соломы, сена, составляет целлюлоза. Молекулы целлюлозы представляют собой неразветвленную цепь, состоящую из молекул D-глюкозы, соединенных между собой 1,4-β-гликозидными связями. Степень полимеризации варьируется от 8 до 14 тысяч молекул мономеров. Несмотря на то, что молекулы целлюлозы неразветвленные, между параллельными целлюлозными тяжами образуются водородные связи, которые обуславливают высокую прочность волокон полимера. В растениях молекулы целлюлозы обычно окружены сетью, состоящей из гемицеллюлоз и лигнина, что дополнительно усложняет гидролиз растительных остатков. Частичное разложение целлюлозы с образованием ЛЖК и других органических соединений может, во-первых, существенно повысить усвояемость кормов, а во-вторых, улучшить сохранность данного субстрата при длительном хранении благодаря образованию органических кислот и соответственному подкислению среды. Наличие микроорганизма, способного разлагать целлюлозу с образованием органических кислот, в том числе ЛЖК, и спиртов, способствует достижению обеих целей.
Учитывая высокую потребность в подкислителях как добавок для кормов сельскохозяйственных животных, а также необходимость эффективной и безопасной интеграции таких добавок в корм, разработка новых способов получения соединений, которые могут быть использованы в качестве подкислителей и консервантов кормов, представляет актуальную задачу современной биотехнологии. Экстремально термофильные (температурный оптимум роста 75°С и выше) микроорганизмы являются продуцентами термозимов - термостабильных и термоактивных ферментов с оптимумами активности при высоких температурах (Zeikus и др., 1998). Термозимы обладают сходными с их мезофильными аналогами механизмами катализа, но имеют ряд преимуществ: высокая термостабильность, устойчивость к высоким концентрациям денатурирующих агентов (таких, как детергенты, растворители, денатурирующие агенты и др.), высокой солености, а также к экстремальным значениям рН (Friedrich и Antranikian, 1996; Egorova и Antranikian, 2005). Помимо собственно свойств термозимов, протекание биотехнологических процессов при повышенных температурах имеет ряд дополнительных преимуществ: повышение температуры оказывает значительное влияние на растворимость веществ (например, крахмала, что облегчает процесс его гидролиза амилазами); возрастают коэффициенты диффузии, а значит, снижается вязкость растворов (Bruins и др., 2001; Eichler, 2001); и главное - существенно снижается риск контаминации, и, следовательно, побочных процессов, (Egorova и Antranikian, 2005). Также при повышенных температурах возможно существенное увеличение доступности трудноразлагаемых нерастворимых веществ, благодаря чему происходит их более эффективная утилизация (Niehaus и др., 1999). Среди термофильных микроорганизмов известно значительное число представителей, обладающих способностью к гидролизу природных биополимеров (полисахаридов, белков и пр.) благодаря действию внеклеточных термозимов с соответствующими активностями. Использование термофильных гидролитиков для повышения питательной ценности травянистых кормов сельскохозяйственных животных привлекательно с точки зрения отсутствия контаминации субстрата посторонней микрофлорой, в том числе, патогенными микроорганизмами, что позволяет стабилизировать процессы и снизить затраты на производство. Все перечисленное делает термофильные микроорганизмы и их ферменты (термозимы) привлекательными для использования в биотехнологических целях, в том числе для получения ЛЖК.
Из уровня техники известен документ CN 110699389 A «Способ получения летучих жирных кислот с использованием микроорганизмов рубца», в котором описано изобретение, относящееся к области ресурсов и окружающей среды и раскрывающее способ получения летучих жирных кислот с использованием микроорганизмов рубца. Заявленный способ включает следующие этапы: внесение твердожидкой смеси из рубца жвачного животного в предварительно нагретый анаэробный резервуар, добавление измельченной целлюлозной биомассы, работу биореактора таким образом, что вода, сбрасываемая из анаэробного резервуара, проходит через циклонную сепарацию, отстойник обеспечивает стекание твердой части обратно в анаэробный резервуар и позволяет жидкости попадать в коагулирующий отстойник для отделения продукта - летучих жирных кислот. Авторы указывают, что данное изобретение реализует производство летучих жирных кислот из отходов биомассы целлюлозы, повышает эффективность реакции и снижает стоимость продукта. При этом не раскрываются способ получения твердожидкой смеси из рубца жвачного животного и микробный состав твердожидкой смеси, полученной из рубца жвачного животного, а также не уточняется вид жвачного животного, из рубца, которого берется твердожидкая смесь, содержащая комплекс микроорганизмов, обеспечивающих осуществление изобретения. В качестве примеров целлюлозной биомассы, применимых в данном изобретении, указаны муниципальные садовые отходы, кухонные отходы и кукуруза, рис, пшеница, виноградные лозы и кресс-салат. В публикации US 2014353163 A1 «Биологическое / электролитическое преобразование биомассы в углеводороды» раскрыт способ получения углеводородного и водородного топлива, а также других продуктов, при котором используется комбинация ферментации и электрохимических реакций. По данному способу биомасса, содержащаяся в культуральной среде, ферментируется с инокулятом, содержащим смешанную культуру микроорганизмов, выделенных из содержимого рубца жвачного животного. Эту инокулированную среду инкубируют в анаэробных условиях в течение времени, достаточного для образования летучих жирных кислот. Отмечается, что данным способом может быть переработан широкий спектр целлюлозосодержащих соединений для получения различных летучих жирных кислот. Микробный состав смешанной культуры в описании изобретения не охарактеризован должным образом, хотя в примере 6 предлагается использовать культуру Clostridium kluyveri - подобных бактерий для сбраживания целлюлозосодержащего сырья. Недостатками данных изобретений является использование не охарактеризованной микробной композиции, поскольку изменение микробного состава композиции для сбраживания отходов напрямую влияет и на эффективность процесса получения целевого продукта, и на состав самого продукта. Более того, охарактеризовать микробную композицию самостоятельно, исходя из текстов данных публикаций, не представляется возможным.
Раскрытие изобретения
В заявляемом изобретении предложено использование термофильных микроорганизмов рода Dictyoglomus для получения органических соединений, пригодных для использования в качестве кормовых добавок, в частности молочной и уксусной кислот, а также янтарной, пропионовой, масляной, муравьиной и изовалериановой кислот и этанола из целлюлозосодержащего сырья и отходов. Вещества, полученные при переработке целлюлозосодержащего сырья термофильной бактерией рода Dictyoglomus, могут использоваться в качестве кормовой добавки, обеспечивая подкисление кормов.
Предлагается новый способ переработки целлюлозосодержащего сырья и отходов для получения кормовых добавок. Выращивание термофильных бактерий рода Dictyoglomus на питательных средах из целлюлозосодержащего сырья и отходов, обеспечивает их переработку с получением полезных для сельскохозяйственной промышленности продуктов, в частости, янтарной кислоты, молочной, уксусной, пропионовой, масляной, муравьиной и изовалериановой кислот и этанола, которые могут применяться в качестве кормовых добавок, улучшая пищевую ценность корма и способствуя подкислению кормов. В экспериментальных исследованиях показана эффективность использования термофильных бактерий рода Dictyoglomus для получения данных органических соединений из целлюлозосодержащих субстратов и отходов.
Задачей изобретения является разработка способа переработки целлюлозосодержащего сырья и отходов термофильной бактерией для получения органических соединений, которые могут быть использованы в качестве кормовых добавок.
Техническим результатом, достигаемым заявленным изобретением, является обеспечение возможности переработки целлюлозосодержащего сырья и отходов термофильной бактерией рода Dictyoglomus с получением следующих органических соединений: молочная, уксусная, янтарная, пропионовая, масляная, муравьиная и изовалериановая кислоты и этанол. Бактерии рода Dictyoglomus, выращиваемые на субстратах из целлюлозосодержащего сырья и отходов при оптимальных температурных условиях, обеспечивают получение указанных органических соединений в легко доступной форме за счет ферментативного расщепления целлюлозы до моносахаров и последующего сбраживания последних.
Заявляемый способ характеризуется простотой, низкой стоимостью, контролируемостью ввиду использования единственного штамма микроорганизмов, отсутствием необходимости дополнительных расходных материалов и специальных навыков, что позволит быстро и широко внедрить его в промышленность.
Поставленная задача решается тем, что способ получения органических соединений, пригодных для использования в качестве кормовых добавок, из целлюлозосодержащего сырья и отходов термофильной бактерией, включает следующие шаги:
1. Культивирование на субстратах из целлюлозосодержащего сырья и отходов микроорганизмов рода Dictyoglomus;
2. Отделение продуктов гидролиза целлюлозы и сбраживания глюкозы, представляющих органические соединения, включающие молочную, уксусную, янтарную, пропионовую, масляную, муравьиную и изовалериановую кислоты и этанол, от биомассы посредством отгонки и/или жидкостной хроматографии, электродиализа и упаривания.
Микроорганизмы рода Dictyoglomus являются экстремально термофильными анаэробными органотрофными бактериями, характеризующимися формой нитей длиной 10-30 мкм и шириной 0.5-0.7 мкм, клеточной стенкой грамотрицательного типа, отсутствием спор и жгутиков, использующими моно-, ди- и полисахариды в качестве субстратов роста, обладающие целлюлазной активностью за счет внеклеточных целлюлаз, при температурах 50-80°С, значениях рН 6.0-8.0 и солености 0-2%. Термофильные микроорганизмы рода Dictyoglomus, которые могут быть использованы для осуществления данного способа, включают, но не ограничиваются следующими штаммами: Dictyoglomus sp. 2307, 1923, 1445d, 1521-1, 1944, а также могут быть скомбинированы в 2-5 компонентные микробные композиции.
В качестве целлюлозосодержащего сырья и отходов для осуществления данного способа могут быть использованы следующие материалы или их комбинации: ячменная и пшеничная солома, листья кукурузы, сено.
Основные продукты разложения целлюлозы и сбраживания образовавшейся глюкозы, получаемые при осуществлении данного способа, включают молочную, уксусную, янтарную, пропионовую, масляную, муравьиную и изовалериановую кислоты и этанол.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами.
На фиг. 1 представлена микрофотография Dictyoglomus sp. Фазово-контрастная световая микрофотография.
На фиг. 2 представлена микрофотография Dictyoglomus sp., окрашенных акридином оранжевым, полученная при помощи флуоресцентного микроскопа.
2
На фиг. 3 представлена Зимограмма. Субстрат, КМЦ; инкубация 2 часа при 70°C в 40 мМ МОПС, рН 7,43, 100 мМ NaСl, 5 мМ CaCl.
1. Клетки штамма Dictyoglomus sp., сконцентрированные в 10 раз под фазово-контрастным световым микроскопом Zeiss AxioLab;
2. Клетки штамма Dictyoglomus sp., окрашенные акридиновым оранжевым (сконцентрированы в 10 раз).
Осуществление изобретения
4
2
4
2
2
2
2
Штаммы Dictyoglomus spp., (2307, 1923, 1445d, 1521-1, 1944), выделенные из горячих источников Камчатки, культивируют в 18 мл пробирках Хангейта на минеральной среде Пфеннига (г/л): NHCl - 0.33, KCl - 0.33, KHPO - 0.33, CaCl*2HO - 0.33, MgCl*6HO - 0.33, дрожжевой экстракт - 0.1, раствор микроэлементов [Кевбрин В.В., Заварзин Г.А. // Микробиология. 1992. Т. 61, В. 5. C. 812-817] - 1 мл/л, витамины [Wolin E.A., Wolin M.J., Wolf R.S. // J. Biol. Chem. 1963. V. 238, P. 2882-2888] - 1 мл/л, содержащую целлобиозу в качестве субстрата. рН доводят до 7.0 с использованием 1Н растворов соляной кислоты или гидроксида натрия. Анаэробно приготовленную среду (рН 7.0) разливают под током очищенного от кислорода молекулярного азота порциями по 10 мл и автоклавируют при избыточном давлении (1.0 атм). Таким образом, нарабатывают чистые культуры клеток, которые затем инкубируют в анаэробных условиях на целлюлозосодержащих субстратах в течение не менее 4 суток при оптимальных условиях (76°С, рН=7.0). Динамику роста культуры контролируют стандартными методами. В ходе культивирования на целлюлозосодержащих субстратах микроорганизмы Dictyoglomus spp. гидролизуют целлюлозу и ее производные до глюкозы, которая служит штаммам Dictyoglomus spp. источником энергии и углерода и разлагается ими до конечных продуктов (молочная, уксусная, янтарная, пропионовая, масляная, муравьиная и изовалериановая кислоты и этанол) посредством субстратного фосфорилирования (брожения). Отбор газообразных продуктов брожения осуществляется стандартным образом.
Таким образом, в ходе роста экстремально термофильных бактерий Dictyoglomus spp. на целлюлозосодержащих субстратах при сбраживании глюкозы выделяются молочная, уксусная, янтарная, пропионовая, масляная, муравьиная и изовалериановая кислоты и этанол. Ниже приведены примеры конкретного выполнения. Специалисту в данной области техники понятно, что данные примеры не являются ограничивающими изобретение, а лишь показывают возможность его реализации.
Пример 1
Выделение чистых культур и изучение их морфологии и физиологии.
4
2
4
2
2
2
2
Штаммы Dictyoglomus spp. выделяют из горячего источника в Долине Гейзеров на Камчатке, характеризующегося температурой 65°С и значением рН 7.0. Выделение и культивирование данного микроорганизма проводят в 18 мл пробирках Хангейта на минеральной среде Пфеннига (г/л): NHCl - 0.33, KCl - 0.33, KHPO - 0.33, CaCl*2HO - 0.33, MgCl*6HO - 0.33, дрожжевой экстракт - 0.1, раствор микроэлементов [Кевбрин В.В., Заварзин Г.А. // Микробиология. 1992. Т. 61, В. 5. C. 812-817] - 1 мл/л, витамины [Wolin E.A., Wolin M.J., Wolf R.S. // J. Biol. Chem. 1963. V. 238, P. 2882-2888] - 1 мл/л. рН доводят до 7.0 с использованием 1Н растворов соляной кислоты или гидроксида натрия. Анаэробно приготовленную среду (рН 7.0) разливают под током очищенного от кислорода молекулярного азота порциями по 10 мл и автоклавируют при избыточном давлении (1.0 атм). Процедуру очистки осуществляют посредством пересева микроорганизмов, населяющих накопительную культуру, последовательными 10-кратными разведениями на среду, содержащую целлобиозу в качестве субстрата, и последующем высевом каждого разведения на ту же среду, с добавлением 2% агарозы. После инкубации выросшие на максимальном разведении отдельные колонии отбирают и пересевают на свежую жидкую среду того же состава. Таким образом, получают чистую культуру клеток, численность которых в исходной накопительной культуре была максимальной.
Штаммы Dictyoglomus spp. имеют форму нитей длиной 10-30 мкм и шириной 0.5-0.7 мкм (Фиг. 1) с клеточной стенкой грамотрицательного типа, спор и жгутиков обнаружено не было. Штаммы являются экстремально термофильными и гипертермофильными анаэробными органотрофными микроорганизмами, использующими моно-, ди- (глюкозу, сахарозу, целлобиозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, лактозу, арабинозу, ксилозу) и полисахариды (ксилан, пектин, целлюлоза, карбоксиметил целлюлоза, крахмал, декстран) в качестве субстратов роста. Способны расти при температурах 50-80°С, значениях рН 6.0-8.0 солености 0-2%. Оптимальными условиями для роста являются 70-75°С, рН 7.0-7.5 и соленость 0-0.5%.
Пример 2
Молекулярная идентификация штаммов Dictyoglomus spp. Геномную ДНК выделяют стандартными методами [Park, D. // Methods in Molecular Biology, v. 353: Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Second Edition. (Ed.) E. Hilario and J. Mackay. Humana Press Inc., Totowa, NJ. 2007. 3-13], последовательность гена 16S рРНК определяют, как описано в работе [Sokolova T.G., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Tourova T.P., Kolganova T.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. // Int. J. Syst. Evolut. Microbiol. 2002. V. 59. N 6. P. 1961-1967].
Первичный сравнительный анализ полученной de novo последовательности гена 16S рРНК с последовательностями базы данных GenBank проводят с помощью утилиты Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Последовательности генов 16S рРНК штаммов Dictyoglomus spp. и родственных микроорганизмов (выявленных при помощи BLAST) выравнивают между собой с использованием MAFFT v. 7 [Katoh, K., Rozewicki, J., Yamada, K.D. MAFFT online service: multiple sequence alignment, interactive sequence choice and visualization. Brief. Bioinform. 2017. V.20, №4, P.1160-1166. Построение филогенетического дерева исследуемых микроорганизмов и их родственников осуществляют с использованием MEGA 7 (Метод максимального правдоподобия, модель General Time Reversible (GTR), [Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. (2016) MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Mol. Biol. Evol. 33(7), 1870-4]). Филогенетическое расстояние определяют в количестве замен на 1 нуклеотид, в соответствии с выбранной моделью. Достоверность порядка ветвления (Bootstrap value) рассчитывают при 1000 повторах.
Пример 3
Измерение целлюлазной активности штаммов Dictyoglomus spp. Целлюлазную активность штаммов Dictyoglomus spp.1445d и 1521-1 измеряют динитросалициловым методом (ДНС, DNS) определения восстановленных сахаров и методом зимографии.
2
2
Для определения целлюлазной активности методом ДНС исследуемые образцы центрифугируют при 13400 об/мин в течение 10 мин и определяют активность внеклетоных целлюлаз в полученном супернатанте культуральной жидкости, а связанных с клеточными оболочками ферментов - во фракциях клеток, ресуспендированных в 50 мМ МЭС (2-(N-морфолин)этансульфоновая кислота) буфере, рН 6,5, 20°С, содержащем 5 мМ CaCl. Для измерения активности по 0.1 мл образцов супернатантов или ресуспендированных клеток добавляют к 0.2 мл 0.5% раствора аморфной целлюлозы в 50 мМ МЭС буфере, рН 6,5, 20°С, содержащем 5 мМ CaCl и инкубируют 16 часов при 70°C или 80°C. По окончании инкубации к 0.3 мл реакционной смеси добавляют 1.2 мл ДНС-реагента (0.05% динитросалициловая кислота, 1.6% NaOH, 30% K-Na субстрат), полученную смесь кипятят 10-15 минут, охлаждают и измеряют оптическую плотность при 510 нм. В качестве отрицательного контроля используют реакционную смесь, содержащую дистиллированную воду вместо образца целлюлазы и неинкубированные образцы ферментов без субстрата. Для калибровки готовят по 0.1 мл растворов глюкозы различной концентрации и проводят с ними те же операции, что и с опытными образцами. Значения, полученные при измерении контролей, вычитают из значений опытных образцов. В результате в супернатанте культуральной жидкости была детектирована целлюлазная активность, составляющая 150 мкм глюкозы на 1 мл культуральной жидкости в минуту. В клетках активности обнаружено не было.
Таблица 1. Измерение восстановленных сахаров методом ДНС при росте штаммов 1445d и 1521-1 на различных видах целлюлозы.
Субстрат
Образец
Прирост с учетом контроля
Время инкубации, ч
мкмоль глюкозы/мин^1 мл
КМЦ
1445d, клетки
0,168
19
75,5
КМЦ
1521-1, клетки
0,128
19
57,6
Аморфная целлюлоза
1445d, клетки
0,219
19
174,8
Аморфная целлюлоза
1521-1, клетки
0,05
22
34,5
Методом зимографии проводят электрофоретическое разделение находящихся в образце белков и визуализацию ферментов с искомой активностью благодаря гидролизу субстрата, находящегося в геле [Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assemblage of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685]. В качестве субстрата используют карбоксиметилцеллюлозу. Окрашивание и контрастирование гелей проводят с использованием красителя Congo red [Burianova, T., Kopecny, J., Sajdok, J., Kas, J. // Animal Feed Sci. Technol. 1991. V. 33 P. 41-48] с некоторыми модификациями. Методом зимографии были обнаружены связанные с клетками эндоглюканазы (Фиг. 3).
Таким образом, целлюлазная активность у штаммов Dictyoglomus определяется как внеклеточными целлюлазами, находящимися во внеклеточном пространстве, так и связанными с клетками микроорганизма-продуцента.
Пример 4
Культивирование чистых культур Dictyoglomus spp. на сельскохозяйственных растительных отходах. Коллекционные штаммы Dictyoglomus spp. 2307, 1923, 1445d, 1521-1, 1944 инкубируют 7 суток при оптимальных условиях (76°С, рН=7.0) и оценивают рост (Таблица 2), а также измеряют количество образовавшихся в ходе культивирования редуцирующих остатков сахаров с помощью колориметрического метода с использованием 3,5-динитросалициловой (ДНС) кислоты по следующей схеме: отбирают пробу культуральной жидкости объемом 1 мл, центрифугируют при 13400 об/мин, отбирают 500 мкл надосадочной жидкости и добавляют 500 мкл ДНС-реагента, инкубируют 15 минут при перемешивании и 98°С. Пробирки остужают и измеряют оптическую плотность проб при длине волны 575 нм против контроля (вода+ДНС-реагент). Концентрацию редуцирующих сахаров определяют с помощью калибровочных кривых, построенных по результатам измерения OD575 растворов глюкозы и ксилозы с концентрациями от 50 до 500 мкг/мл. В качестве положительного контроля используют микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ).
Таблица 2. Оценка роста коллекционных штаммов Dictyoglomus spр. на сельскохозяйственных отходах.
Культура/ субстрат
Рост
1923 МКЦ
+
1923 Кукуруза
+/-
1923 Солома
-
1944 МКЦ
+
1944 Кукуруза
+
1944 Солома
+
1445d МКЦ
+
1445d кукуруза
-
1445d Солома
+
1521-1 МКЦ
+
1521-1 Кукуруза
+
1521-1 Солома
-
2307 МКЦ
+
2307 Кукуруза
+
2307 Солома
+
Таблица 3. Образование редуцирующих сахаров в процессе культивирования термофильных бактерий рода Dictyoglomus spp. на растительных отходах.
Измерения
мкг редуцирующих сахаров/мл
Контроль МКЦ
77
1923 МКЦ
85
1944 МКЦ
77
1445d МКЦ
71
1521-1 МКЦ
87
2307 МКЦ
82
Контроль Кукуруза
83
1923 Кукуруза
81
1944 Кукуруза
73
1445d Кукуруза
80
1521-1 Кукуруза
87
2307 Кукуруза
86
Контроль Солома
86
1923 Солома
83
1944 Солома
77
1445d Солома
80
1521-1 Солома
0
2307 Солома
79
Пример 5
3
2
4
2
4
Определение продуктов брожения штамма Dictyoglomus spp. Штаммы Dictyoglomus spp. культивируют в оптимальных условиях в присутствии целлюлозы. Образующаяся в процессе гидролиза целлюлозы и ее производных глюкоза служит штаммам Dictyoglomus spp. источником энергии и углерода и разлагается ими до конечных продуктов посредством субстратного фосфорилирования (брожения). Продукты, образуемые в ходе роста экстремально термофильных и гипертермофильных бактерий Dictyoglomus spp. на глюкозе, измеряют хроматографически (методами газовой и жидкостной хроматографии). Анализ летучих органических соединений проводят на газовом хроматографе Кристалл-5000 (ЗАО Хроматэк, Россия) с пламенноионизационным детектором. Колонка - Superox-FA (10 м × 0.53 мм × 1.2 мкм) (Alltech, США) при программировании температур 60-160°С; газ носитель - гелий; скорость потока - 20 см/мин без деления, объем пробы - 1 мкл. Анализ органических кислот и спиртов проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Stayer (Аквилон, Россия). Перед измерением образцы суспензий центрифугируют, супернатант подкисляют 5М HSO до рН 2 и анализируют на колонке Aminex HPX-87H (BioRAD, США) в изократическом режиме с элюентом 25 мМ HSO со скоростью потока 0,6 мл/мин. Сигналы регистрировали при помощи двух детекторов - рефрактометрического Smartline (Knauer, Германия) и ультрафиолетового при 210 нм UVV 104 (Аквилон, Россия).
Состав газов в пробе измеряют на газожидкостном хроматографе Chrom-5 (Чехия) с использованием детектора теплопроводности (катарометра) со следующими параметрами: сорбент - активированный уголь АГ-3; газ-носитель - аргон; расход газа-носителя - 30 мл/мин; температура термостата - 25°С. Объем вводимой пробы был равен 0.5 мл газовой смеси. Основными продуктами, образующимися при сбраживании глюкозы, штаммами Dictyoglomus spp. оказались этанол, ацетат и лактат, углекислый газ и молекулярный водород. При росте на сельскохозяйственных отходах, экстремально термофильные и гипертермофильные штаммы бактерий рода Dictyoglomus spp образуют целый спектр органических соединений (Таблица 4): кислоты, такие как лактат, ацетат, формиат, пропионат, бутират и изо-валерат, а также спирт этанол. Помимо этого, с помощью ВЭЖХ детектируется глюкоза, образующаяся при разложении целлюлозосодержащих с/х отходов.
Таблица 4. Характеристика продуктов разложения целлюлозы и сбраживания глюкозы штаммами бактерий Dictyoglomus spp.
Штамм
Продукт брожения
Концентрация мМ/100 г субстрата
Солома
Кукуруза
Сено
Dictyoglomus sp.1521-1
Янтарная кислота
нд
13,86
548,5
Молочная кислота
нд
6,87
131,9
Муравьиная кислота
1,763
нд
142,8
Уксусная кислота
65,02
85,77
131,9
Пропионовая кислота
14,7
нд
нд
Этанол
51,38
78,64
142,8
масляная кислота
78,57
148,3
246,8
изовалериановая кислота
нд
20,29
Dictyoglomus sp.1445d
Янтарная кислота
нд
28,24
нд
Молочная кислота
нд
1,198
нд
Уксусная кислота
48,36
106,8
нд
Этанол
84,63
215,8
нд
изовалериановая кислота
1,571
нд
нд
Dictyoglomus sp.2307
Янтарная кислота
23,58
22,73
нд
Молочная кислота
3,945
9,447
нд
Муравьиная кислота
нд
6,5
нд
Уксусная кислота
60,18
91,75
нд
Этанол
146,6
93,28
нд
масляная кислота
85,02
163,6
нд
изовалериановая кислота
14,49
нд
Dictyoglomus sp.1923
Янтарная кислота
нд
4,567
нд
Уксусная кислота
45,65
55,65
нд
Этанол
35,26
60,16
нд
масляная кислота
87,68
133
нд
изовалериановая кислота
12,78
нд
нд
Dictyoglomus sp.1944
Янтарная кислота
нд
14,69
нд
Молочная кислота
4,636
9,04
нд
Муравьиная кислота
2,304
5,278
нд
Уксусная кислота
61,16
61,94
нд
Пропионовая кислота
нд
2,498
нд
Этанол
92,55
84,19
нд
масляная кислота
86,85
123,1
нд