СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ ТИОРЕДОКСИНА
METHOD OF DETERMINATION OF THIOREDOXIN OXIDATIVE MODIFICATION

Изобретение относится к области медицины, к клинической лабораторной диагностике, а именно к молекулярным методам определения модифицированных белков, и предназначается для селективного количественного определения степени окисления тиоредоксина в клетках по содержанию карбонилированного тиоредоксина.
В настоящее время имеются многочисленные данные о важной роли процесса перекисного окисления липидов, являющегося неотъемлемой частью окислительного стресса, в этиологии и патогенезе многих заболеваний, в частности сердечно-сосудистых, нейро-дегенеративных, воспалительных, онкологических. Однако активные формы кислорода, наряду с продуктами окислительной модификации липидов, вызывают и окислительную модификацию белков, приводящую к патологическим изменениям их структуры, свойств и функций [Stadtman E.R., Levine R.L. Protein oxidation. // Annals of N.Y. Academy of Sciences, 2000, 899: 191-208]. Окислительная модификация белков в клетках рассматривается как одна из возможных причин нарушения функций ферментов и изменения структуры некоторых важных белковых молекул при окислительном стрессе. При окислительной модификации белков в них образуются карбонильные группы - альдегидные и кетоновые группы аминокислотных остатков, повышенный уровень которых, наряду с гидроперекисями липидов, является показателем-маркером окислительного стресса [Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс: биохимический и патофизиологический аспекты. // М: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001, 343 с.; Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты. // Спб.: Медицинская пресса, 2006, 400 с.].
Согласно современным представлениям окислительной модификации могут подвергаться все остатки аминокислот в белках, но наиболее чувствительными являются остатки триптофана, тирозина, гистидина и цистеина [Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты. // Спб.: Медицинская пресса, 2006, 400 с.]. Поскольку тиоредоксин содержит несколько аминокислотных остатков цистеина, он способен подвергаться окислительной модификации с образованием карбонилированных форм белка.
Процессы окислительной модификации белков имеют место при различных свободнорадикальных патологиях, в частности злокачественных новообразованиях. Поскольку тиоредоксин является одним из внутриклеточных антиоксидантов, защищающих клетки от повреждения активными формами кислорода, в то же время выступает коферментом для работы рибонуклеотидредуктазы, необходимой для синтеза ДНК, а следовательно, деления клеток, принимает участие в восстановлении других антиоксидантных молекул, то большой интерес на сегодняшний день представляет определение окислительной модификации тиоредоксина в клетках. Поскольку концентрация тиоредоксина является диагностически значимым маркером состояния антиоксидантной системы клеток при условиях окислительного стресса при различных патологиях, сопровождающихся свободнорадикальным окислением [Калинина Е.В., Чернов Н.Н., Саприн А.Н. Участие тио-, перокси- и глутаредоксинов в клеточных редокс-зависимых процессах // Успехи биологической химии, 2008, 48, 319-358.; Shan W., Zhong W., Zhao R., Oberley T.D. Thioredoxin 1 as a subcellular biomarker of redox imbalance in human prostate cancer progression // Free Radic. Biol. Med., 2010, 49(12), 2078-2087.; Lu J., Holmgren A. The thioredoxin antioxidant system // Free Radic. Biol. Med., 2014, (66), 75-87], то его окислительная модификация еще в большей степени может способствовать развитию и усугублению окислительного стресса, нарушению внутриклеточных процессов.
На сегодняшний день исследования и разработки в области рассматриваемой научной проблемы носят приоритетный характер и входят в перечень приоритетных направлений развития науки, технологий и техники Российской Федерации - науки о жизни, относятся к критической технологии Российской Федерации - биомедицинские и ветеринарные технологии и поддержаны грантом президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых «Карбонилирование редокс-белков как способ управления пролиферацией при персонифицированном подходе к диагностике и терапии опухолей молочной железы» (Договор №14.W 01.17.1742-MK от 22.02.17). В рамках указанного научного исследования и на основании имеющегося научного задела проведена разработка заявляемого изобретения.
Известны способы определения окислительной модификации белков тканей и биологических жидкостей (патенты RU 2298189 С2 от 27.04.2007 «Способ определения окислительной модификации фибриногена плазмы крови», RU 2595806 С2 от 27.08.2016 «Способ определения окислительной модификации фибриногена плазмы крови по содержанию карбонильных групп в фибриновом сгустке»).
Недостатком данных способов оценки окислительной модификации белков является невозможность их использования для оценки модификации отдельного от других внутриклеточного белка, играющего важную роль в патогенезе различных патологий, сопровождающихся развитием окислительного стресса.
Способ прототип определения окислительной модификации белков гомогената клеток [Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма // Методические рекомендации, СПб.: ИКФ «Фолиат», 2000, 104 с.] осуществляется следующим образом: к 0,25 мл лизированного биологического материала добавляют 0,5 мл 10 мМ раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М растворе НСl, связывающегося с карбонильными группами белков, инкубируют пробу при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляют 0,5 мл 20% ТХУ и центрифугируют при 11000 g 10 минут, осадок промывают 3 раза 1 мл раствора этанол:этилацетат (1:1) для экстракции избытка 2,4-динитрофенилгидразина, не прореагировавшего с карбонильными группами окисленных белков, осадок высушивают и далее растворяют в 0,6 мл 6 М раствора гуанидина. В контрольную пробу добавляют вместо 2,4-динитрофенилгидразина 0,5 мл 2 М раствора НСl. Степень окислительной модификации белков определяют измерением оптической плотности образовавшихся динитрофенилгидразонов спектрофотометрическим методом при длине волны 360-390 нм. Результаты выражают в условных единицах/мг белка.
Недостатком данного способа является отсутствие информации об окислительной модификации отдельных белков, поскольку оценивается степень окисления общей (суммарной) фракции всех белков клеточного гомогената. В связи с этим невозможно объективно и точно оценить подверженность белков, относящихся к разным классам и звеньям метаболизма, к окислению при различных заболеваниях, сопряженных с окислительным стрессом.
Новый технический результат - повышение точности определения уровня карбонилированного тироредоксина за счет возможности его избирательного выделения.
Для достижения нового технического результата в способе определения окислительной модификации тиоредоксина, включающем инкубацию 0,25 мл лизированных 1% раствором тритона Х-100 клеток с 0,5 мл 10 мМ раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М НСl, связывающегося с карбонильными группами белков, инкубируют пробу при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляют 0,5 мл 20% ТХУ и центрифугируют при 11000 g 10 минут, осадок промывают 3 раза 1 мл раствора этанол:этилацетат (1:1) для экстракции избытка 2,4-динитрофенилгидразина, не прореагировавшего с карбонильными группами окисленных белков, осадок высушивают и ресуспендируют, клеточный лизат 0,25 мл, содержащий карбонилированные белки, связанные с 2,4-динитрофенилгидразином, инкубируют с 0,5 мл магнитных частиц, нагруженных антителами к 2,4-динитрофенолу, в течение 3 ч при 25°С и непрерывном перемешивании, далее магнитные частицы со связавшимся комплексом антиген-антитело собирают с помощью магнитного штатива и трижды отмывают 0,5 мл 0,01 М натрий-фосфатным буфером, после этого инкубируют в термостате в течение 10 мин при 95°С, после чего перемешивали, далее, освободившиеся от карбонилированных белков магнитные частицы собирают в магнитном штативе, а из надосадка, содержащего карбонилированные белки, с помощью вестерн-блоттинга с антителами к тиоредоксину, обеспечивающими выделение из суммарного количества модифицированных белков только карбонилированного тиоредоксина и количественную оценку его содержания.
Способ осуществляют следующим образом. На первом этапе проводят инкубацию 0,25 мл лизированных 1% раствором тритона Х-100 клеток с 0,5 мл 10 мМ раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М НСl, связывающегося с карбонильными группами белков, инкубируют пробу при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляют 0,5 мл 20% ТХУ и центрифугируют при 11000 g 10 минут, осадок промывают 3 раза 1 мл раствора этанол:этилацетат (1:1) для экстракции избытка 2,4-динитрофенилгидразина, не прореагировавшего с карбонильными группами окисленных белков, осадок высушивают и ресуспендируют. Затем клеточный лизат 0,25 мл, содержащий карбонилированные белки, связанные с 2,4-динитрофенилгидразином, инкубируют с 0,5 мл магнитных частиц («Силекс», Россия), нагруженных антителами к 2,4-динитрофенолу («Sigma-Aldrich», США), в течение 3 ч при 25°С и непрерывном перемешивании. Используемое количество магнитных частиц, длительность инкубации и температура нами были определены после серии экспериментов как оптимальные для возможности использования полученных белков для последующей количественной оценки модифицированного белка методом вестерн-блоттинга. Связывание антител с молекулами 2,4-динитрофенилгидразина, соединенного с карбонильными группами белков, является специфичным и обеспечивает присутствие в растворе окисленных модифицированных суммарных белков. Магнитные частицы со связавшимся комплексом антиген-антитело собирают с помощью магнитного штатива и трижды отмывают 0,5 мл 0,01 М натрий-фосфатным буфером, инкубируют в термостате 10 мин при 95°С, после чего перемешивали. Эта процедура необходима для отделения карбонилированных белков от магнитных частиц. На втором этапе освободившиеся от карбонилированных белков магнитные частицы собирают в магнитном штативе, а белковый надосадок используют для проведения вестерн-блоттинга [Protocol Western Blotting Transfer and Detection Procedure MitoSciences http://www.mitosciences.com/PDF/western.pdf] с антителами к тиоредоксину («Thermo Scientific», США), обеспечивающими выделение из суммарного количества модифицированных белков только карбонилированного тиоредоксина и количественную его оценку. Содержание модифицированного тиоредоксина выражали в условных единицах.
Преимуществом данного способа является определение уровня окислительной модификации отдельного белка - тиоредоксина и его количественная оценка. Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышения точности и эффективности способа: взаимодействие 0,25 мл лизата с 0,5 мл магнитных частиц, нагруженных антителами к 2,4-динитрофенолу, инкубируемых в течение 3 ч при 25°С и непрерывном перемешивании; сбор магнитных частиц со связавшимся комплексом антиген-антитело с помощью магнитного штатива и трехкратная отмывка 0,5 мл 0,01 М натрий-фосфатным буфером, инкубация в термостате 10 мин при 95°С, с последующим перемешиванием; удаление освободившихся магнитных частиц и использование белкового надосадка для проведения вестерн-блоттинга с антителами к тиоредоксину.
Кроме того, предлагаемый способ является высокоинформативным и диагностически значимым в отношении окислительной модификации тиоредоксина, которая усугубляет снижение резерва антиоксидантной защиты, компонентом которой является тиоредоксин, и сопровождается утратой этим белком способности участвовать в пролиферации клеток, что является важным аспектом патогенеза опухолевого роста и других свободнорадикальных патологий. Выявление повышенной окислительной модификации тиоредоксина позволит комплексно, в дополнение к оценке интенсивности процессов перекисного окисления липидов и продукции активных форм кислорода, оценить степень выраженности окислительного стресса в организме.
1
3
Проведено сравнительное исследование между показателями известного способа прототипа [Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма // Методические рекомендации, СПб.: ИКФ «Фолиат», 2000, 104 с] определения окислительной модификации белков гомогената клеточных культур линий MCF-7 и HBL-100 и предлагаемого способа определения окислительной модификации тиоредоксина в лизатах клеток линий MCF-7 и HBL-100. Сравнительные исследования проводили 10 раз для предлагаемого и известного способов. Результаты исследования подвергали статистической обработке с использованием пакета программ SPSS v11.0 с определением медианы (Me), первого и третьего квартилей (Q-Q). Достоверность различий независимых выборок оценивали с помощью непараметрических критериев для малых групп Манна-Уитни.
При проведении исследования по способу прототипу уровень окислительной модификации белков в гомогенате опухолевых клеток линии MCF-7 составил 5,48 (5,01-6,28) условных единиц/мг белка, в гомогенате клеток эпителия молочной железы линии HBL-100 - 1,85 (1,48-1,97) условных единиц/мг белка. При оценке окислительной модификации тиоредоксина по предлагаемому способу содержание карбонилированного тиоредоксина в лизатах клеток линии MCF-7 составило 0,27 (0,19-0,29) условных единиц, в лизированных клетках эпителия молочной железы линии HBL-100 - 0,18 (0,09-0,14) условных единиц.
Подтверждение наличия в растворе модифицированных суммарных белков обеспечивалось специфической реакцией взаимодействия окисленных аминокислотных остатков (карбонильных групп) белков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона. Присутствие в растворе только модифицированных суммарных белков (отделенных от белков, не содержащих карбонильных групп) достигалось путем высоко аффинного связывания антител к 2,4-динитрофенолу с белковыми производными 2,4-динитрофенилгидразона. Наличие в растворе среди модифицированных белков карбонилированного тиоредоксина достигалось путем высокоселективного связывания антител к тиоредоксину с этим белком.
При использовании способа-прототипа в опухолевых клетках отмечалось увеличение в 3,0 раза (р<0,01) уровня окислительной модификации белков по сравнению с этим показателем в клетках эпителия молочной железы. При оценке окислительной модификации тиоредоксина по предлагаемому способу содержание карбонилированного тиоредоксина в лизатах опухолевых клеток в 1,5 раза (р<0,01) было выше значений показателя в клетках эпителия молочной железы. Полученные данные свидетельствуют о том, что 50% от всех внутриклеточных белков подвергающихся окислению в опухолевых клетках линии MCF-7 приходится на тиоредоксин. Кроме того, все внутриклеточные белки могли содержать карбонильные группы, характерные для их структуры, образовавшиеся без участия окислительных процессов. В отличие от результатов известного способа прототипа полученные результаты заявляемого способа объективно отражают повышенную окислительную модификацию тиоредоксина при опухолевых новообразованиях по сравнению с клетками эпителия молочной железы, потенцирующую дальнейшее развитие патологического процесса и прогрессирование повреждения внутриклеточных структур при окислительном стрессе.
Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области, и не являются очевидными для специалиста.
Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научно-медицинской литературы.
Данное изобретение может быть использовано в медицинской практике для оценки степени окисления внутриклеточных белков, ключевых компонентов антиоксидантной системы и пролиферации при патологиях, сопровождающихся развитием окислительного стресса. Следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».
Таким образом, заявляемый способ является высокоинформативным и диагностически значимым, так как позволяет количественно оценить степень окислительной модификации отдельного белка тиоредоксина - одного из ключевых белков антиоксидантной системы клеток и пролиферативной активности в условиях окислительного стресса при различных патологиях, сопровождающихся свободнорадикальным окислением.
Предлагаемое изобретение в техническом исполнении достаточно простое и работа осуществляется одним врачом-лаборантом, для его выполнения требуется ограниченный набор недорогостоящего оборудования: камера для вестерн-блоттинга с источником питания, шейкер, термостат и необходимые реактивы. В связи с этим заявляемое изобретение может использоваться в условиях клинических биохимических лабораторий для оценки степени окисления тиоредоксина.