Композиция на основе R(-)-празиквантела для лечения и профилактики гельминтозов у теплокровных
COMPOSITION BASED ON R(-)-PRAZIQUANTEL FOR TREATING AND PREVENTING HELMINTHIASIS IN WARM-BLOODED ANIMALS

Изобретение относится к области фармацевтики и может быть использовано для лечения и профилактики гельминтозов у теплокровных, включая сельскохозяйственных и домашних животных, в частности кошек и собак. Предлагается композиция, содержащая комбинацию активного энантиомера празиквантела (R-празиквантела, R-PZQ) с пирантелом (пирантела памоатом) в качестве активного начала, циклодекстрин, воду и растительное масло, нейтральные наполнители, вкусовые и другие вспомогательные добавки, в частности добавки с гепатопротекторным и восстанавливающим микрофлору ЖКТ действием. Заявляемый антигельминтный препарат предназначается для перорального применения в виде водно-масляной суспензии, вносимой с помощью дозатора.
Гельминтозы - заболевания, возникающие вследствие паразитирования в животном организме гельминтов и сопровождающиеся тяжелыми клиническими симптомами. Жизнедеятельность гельминтов в организме хозяина имеет следствием различные патологии желудочно-кишечного тракта, являющиеся результатом как механических повреждений кишечника, так и различных нарушений обменных процессов, возникающих вследствие выделения гельминтами в процессе их жизнедеятельности токсичных для организма хозяина продуктов обмена. Присутствие в организме животного гельминтов, которые являются чужеродными для него объектами, может приводить к развитию выраженных аллергических реакций, а также повышает вероятность возникновения инфекционных заболеваний как в результате прямого внесения гельминтами патогенной микрофлоры, так и в силу снижения иммунитета хозяина, зараженного гельминтами.
Развитие техники, сопровождающееся открытием новых природных антигельминтиков и расширением возможностей органического синтеза новых химических соединений с антигельминтными свойствами, а также веществ, выполняющих роль целевых добавок, с одной стороны открывает новые возможности для совершенствования медикаментозной базы в области борьбы с гельминтозами, а с другой - является основанием для предъявления повышенных требований к их качеству. Современный антигельминтик должен обладать широким спектром действия, высокой эффективностью, пролонгированным действием, максимальной токсичностью для паразита при минимально возможном уровне токсичности для организма хозяина, иметь форму, обеспечивающую поступление в организм животного необходимой терапевтической дозы активного агента и удобство применения, а в случае оральных препаратов - приемлемый для потребления вкус.
В связи с этим, представляется очевидной актуальность задачи, связанной с продолжением разработки и внедрением новых препаратов для лечения и профилактики гельминтозов у теплокровных животных, которые отвечали бы указанной совокупности современных требований к их качеству.
Уровень техники
Сегодня фармацевтическая промышленность предлагает множество лекарственных средств для лечения животных, зараженных гельминтами, которые в качестве активного начала используют различные по своей природе и механизму действия химические соединения, в частности такие, как празиквантел, фенбендазол (профенбендазол), оксантел, бензимидазолы и их производные, пирантел и его соли, нитросканат, макролиды (макроциклические лактоны), соли пиперазина и другие.
Одним из наиболее часто используемых активных компонентов антигельминтных составов является празиквантел (2-(циклогексилкарбонил)-1,2,3,6,7,11b-гексагидро-4Н-пиразино[2,1-а] изохинолин-4-он). Празиквантел (ПР) известен как высоко эффективное антигельминтное средство, механизм действия которого состоит в повышении проницаемости мембран клеток гельминтов для ионов кальция, вызывающем генерализованное сокращение мускулатуры паразита, переходящее в стойкий паралич с последующей гибелью гельминта. После приема внутрь соединение быстро и полно всасывается из ЖКТ, в крови связывается с белками плазмы на 80%, далее подвергается биотрансформации в печени с образованием неактивных моно- и полигидроксилированных метаболитов. Время полужизни в организме составляет 0,8-1,5 ч (для празиквантела) и 4-6 ч (для метаболитов); выведение (80% - в виде метаболитов) осуществляется преимущественно почками и в небольшом количестве - с фекалиями. Празиквантел эффективен при лечении трематодозов (клонорхоза, метагонимоза, описторхоза, парагонимоза, фасциолеза, фасциолопсидоза, шистосомоза), цестодозов (гименолепидоза, дифиллоботриоза, тениаринхоза, тениоза), цистицеркоза и нейроцистицеркоза. По результатам многочисленных исследований празиквантел признается сравнительно малотоксичным препаратом (терапевтический индекс равен 40), не обладающим эмбриотропным и мутагенным свойствами и не влияющим на постнатальное развитие.
Однако при всех неоспоримых достоинствах празиквантела, он имеет ряд недостатков, к которым относят: а) отсутствие необходимой активности в отношении класса круглых червей (нематод), б) низкую растворимость в воде и, соответственно, не оптимальную биодоступность для организма в составе жидких композиций; и в) резко выраженный горький вкус, являющийся существенным препятствием при создании препаратов для орального приема, и особенно жидких форм, предназначенных для кошек и собак.
Вопрос расширения спектра действия антигельминтных композиций с празиквантелом достаточно успешно решается путем комбинирования его с различными агентами, обладающими высокой активностью в отношении нематод.
Для решения проблемы повышения водорастворимости и биодоступности празиквантела в последние годы успешно используются циклодекстрины, которые представляют собой циклические олигосахариды, содержащие 6 (α-циклодекстрин), 7 (β-циклодекстрин) или 8 (γ-циклодекстрин) глюкопиранозных единиц. Структурная организация молекулы циклодекстрина такова, что в ней различаются гидрофильная внешняя часть, которая повышает водорастворимость и способность соединения проникать в клетки организма, и гидрофобная внутренняя часть, которая образует полость. В водной среде гидрофобные участки многих молекул способны занимать гидрофобную полость циклодекстрина, образуя т.н. «соединения включения» (клатратные комплексы). Сегодня экпериментально подтверждено, что использование циклодекстринов и их производных во многих случаях существенно повышает водорастворимость и биодоступность многих лекарственных препаратов. При этом установлено, что указанный феномен достигается не только в результате образования «клатратов», но и за счет других типов взаимодействия между циклодекстринами и некоторыми слабо растворимыми в воде субстанциями, входящими в состав композиций и при этом не образующих с ЦД истинных комплексов (см., например, WO 2010008995, 21.01.2010).
Празиквантел известен специалистам как типичное соединение, формирующее с ЦД классические клатратные комплексы (Becket G. et al., Int J Pharm. 1999 Mar 1; 179(1):65-71; de Jesus MB. et al., J Pharm Biomed Anal. 2006 Jun 16; 41(4):1428-32: Maragos S. et al., AAPS PharmSciTech. 2009; 10(4):1444-51). Это свойство ПР сегодня используется для повышения его растворимости и биодоступности в составе водных антигельминтных композиций (de Jesus et al., J Drug Target. 2010 Jan; 18(1):21-26; CN 1557318 (A), 29.12.2004), оно также лежит в основе снижения концентрации празиквантела в лекарственных препаратах без изменения терапевтической активности последних, что в целом позволяет говорить о повышении эффективности лекарственного средства. Кроме того, сообщается, что комплексообразование между ЦД и ПР имеет результатом, по меньшей мере, частичное улучшение (подавление горького) вкуса.
Однако на сегодняшний день известны лишь единичные примеры разработок, которые связаны с составами, включающими комбинации празиквантела с противонематодными агентами, и при этом представленными в форме водных суспензий благодаря введению в систему с циклодекстрином (CN 1232253 (С), 21.12.2005; WO 2009062939 (А1), 22.05.2009).
В частности, в международной заявке WO 2009062939 (22.05.2009), поданной фирмой Novartis AG, описано противогельминтное средство в виде водной суспензии, антипаразитарный эффект которого определяется использованием в качестве активного начала комбинации празиквантела с макроциклическим лактоном, в частности оксимом мибельмицина, ивермектином и др., где растворимость ПР в воде определяется наличием в данном составе циклодекстрина β-циклодекстрина). Дополнительно предлагаемый состав может содержать до 10% наполнителей (предпочтительно поливинилпирролидон и/или микрокристаллическую целлюлозу и/или ксантановую камедь), включаемых в значительных количествах для получения пастообразного состояния продукта (с плотностью до 1,15), и при необходимости - другие используемые в ветеринарии ингредиенты, в частности хумектанты, стабилизаторы, диспергирующие агенты и вкусовые добавки. Предложенный состав позиционируется авторами как эффективное антигельминтное средство с широким спектром действия. В качестве основных преимуществ данного состава авторы отмечают удобство применения (в основном как результат стабильной пастообразной консистенции) и приемлемый для животных вкус (благодаря отсутствию «растекаемости» препарата в ротовой полости и частичной маскировке горечи связыванием с ЦД), которые обеспечивают возможность доставки в организм необходимой терапевтической дозы основных компонентов, что особенно важно при лечении в домашних условиях таких животных, как кошки и собаки.
Однако следует отметить, что раскрытая в WO 2009062939 композиция, которая может рассматриваться как ближайший аналог настоящего изобретения, имеет ряд существенных недостатков.
Во-первых, предлагаемая разработка не использует особенностей химических свойств празиквантела и преимуществ ЦД-системы, позволяющих существенно уменьшить терапевтически эффективную дозу действующего вещества (ДВ). Фактически прототип раскрывает результаты применения предлагаемого состава, исходя из традиционно используемой в большинстве препаратов дозы празиквантела - 5 мг/кг веса животного.
Во-вторых, в составе композиции предлагается использовать в качестве второго (кроме празиквантела) антигельминтика макроциклический лактон, в частности ивермектин или оксим мильбемицина (в дозе порядка 1-2 мг/кг), сведения о токсичности которых носят весьма противоречивый характер. Большинство исследователей, по меньшей мере, сходится во мнении, что токсичность этих соединений существенно зависит от вида обрабатываемого животного и от вида заболевания. Так, хорошо известно, что ивермектин ограниченно применим для собак, т.к. у некоторых пород (колли, шелти, австралийская и старая английская овчарки, а также их помеси) он вызывает тяжелые побочные эффекты, являясь нейротоксичным для них даже при однократном применением в дозе 0,1-0,5 мг/кг. Кроме того, сравнительно недавно в литературе появились также сообщения, что и у некоторых других видов животных применение ивермектина может иметь неблагоприятные отдаленные последствия (Семеряк Е.В. Патоморфологические признаки токсичности и отдаленные эффекты действия ивермектина на организм животных, канд. Диссертация, Омск, 2009). Что касается мильбемицина, то хотя он признан остро токсичным только для рыб и других гидробионтов, а для большинства теплокровных - малотоксичным соединением, тем не менее, дегельминтизации препаратами с этим лактоном согласно прилагаемым инструкциям не подлежат собаки породы колли, мелкие породы собак (до 5 кг) и щенки до 2-3-недельного возраста. По мнению некоторых специалистов, из-за достаточно высокой и при этом трудно просчитываемой опасности побочных явлений лечение кошек и особенно собак ивермектином и/или мибельмицином желательно начинать в условиях стационара или назначать эти препараты совместно с гамавитом, понижающим их токсичность.
В-третьих, из представленных в прототипе результатов по исследованию индивидуального ответа животных на дозу предлагаемой пасты следует, что легко потребляли ее лишь немногим более ¼ животных (28%), тогда как почти треть кошек, использованных в эксперименте, потребляли средство либо крайне неохотно (24%), либо вовсе оказывались (5%) от него (см. табл. 5 на стр. 16 прототипа). Это означает, что задача улучшения потребляемости животными, если и была решена, то лишь частично, причиной чего может быть сохранение присущего празиквантелу горького вкуса.
В-четвертых, данный препарат мало пригоден для лечения котят и щенков, а также старых или ослабленных животных, не только в силу возможных побочных эффектов (см. выше), но и по причине отсутствия в нем необходимых в этих случаях вспомогательных добавок с гепатопротекторным эффектом и способностью восстанавливать утраченную после обработки антигельминтиками полезную микрофлору.
При создании настоящего изобретения ставилась задача получения эффективной антигельминтной композиции широкого спектра действия в отношении уничтожаемых паразитов, включающей комплекс празиквантела с циклодекстрином и второй основной (противонематодный) агент, которая была бы лишена недостатков ближайшего аналога и характеризовалась большей, чем в прототипе, эффективностью, безопасностью, отсутствием горького вкуса и расширением круга хозяев за счет включения в него котят и щенков, мелких животных, а также возрастных и/или ослабленных особей.
Раскрытие изобретения.
Достижение поставленной при создании настоящего изобретения цели предполагало решение следующих конкретных задач:
а) использование особенностей химической структуры празиквантела и возможностей циклодекстриновой системы для снижения эффективной дозы ДВ;
б) поиск возможностей для полного устранения горького вкуса антигельминтика и улучшения его потребления животными;
в) подбор и включение в состав композиции полностью безопасного для всех видов теплокровных соединения, которое не уступало бы макроциклическим лактонам в плане эффективности противо-нематодного действия;
б) поиск возможностей для полного устранения горького вкуса антигельминтика и улучшения его потребления животными;
г) при необходимости - введение вспомогательных добавок, обеспечивающих дополнительную возможность расширения круга хозяев, который включал бы возрастных и/или ослабленных животных.
Первое. Основным достижением при создании нового препарата следует считать решение задачи снижения терапевтически эффективной дозы ДВ путем применения в нем активного энантиомера празиквантела (R(-)-празиквантела, Ievo-празиквантела, R-PZQ) вместо традиционно применяемой в антигельминтных препаратах коммерческой субстанции, представляющей рацемическую смесь его оптических изомеров ((rac)-празиквантел). Несмотря на то, что факт существования празиквантела в виде рацемической смеси установлен достаточно давно, только в последние годы он привлек пристальное внимание фармацевтов и медиков, особенно педиатров. Это связано с тем, что в целом ряде недавних разработок были определены особые свойства одного из двух оптических изомеров празиквантела - R-энантиомера, который, как выяснилось, определяет основную часть противопаразитарной активности рацемической смеси, тогда как второй компонент (S(+)-празиквантел), являясь по существу «балластом» в плане активности, в основном ответственен за горький вкус рацемата (Meyer Т. et al., PLoS Negl. Trop. Dis., 2009, 3, №1, e357; Olliaro P. et al., J. Antimicrob. Chemother., 2014, 69(4), 863-870). Открытие этого факта позволило многим авторам рассматривать R-празиквантел как один из наилучших кандидатов для лечения гельминтозов, и особенно шистозоматоза, который широко распространен в некоторых африканских странах, причем у детей раннего возраста, лекарства для которых заведомо предполагают использование малых доз активного компонента с приемлемым вкусом. Несмотря на повышенный интерес исследователей к R-празиквантелу, на сегодняшний день нами не найдено публикаций, касающихся реальных предложений с конкретными составами противогельминтных средств, для которых показана возможность применения для лечения животных. Отчасти это может объясняться тем, что коммерческий препарат R-празиквантела пока недостаточно широко представлен на рынке и является весьма дорогостоящим.
R-празиквантел, используемый в настоящем изобретении, был получен нами самостоятельно по методу, описанному Woelfle М. et al. в PLoS, 2011, v. 5, №9, е1260 с некоторыми модификациями.
Полученный энантиомер празиквантела при смешивании с бета-циклодекстрином и водой образовывал комплекс, аналогичный тому, который наблюдается для рацемата.
Существенно, что применение в качестве активного компонента R(-)-празиквантела, благодаря показанной нами возможности уменьшить в среднем в 2-5 раз (до 1,0-2,5 мг/кг) терапевтическую дозу ДВ за счет удаления малоактивного S-дистомера, позволило решить не только задачу повышения эффективности антигельминтика, но и существенно повысить показатель потребления лекарственного средства животными (см. пример 6) в результате значительного снижения горького вкуса, за который ответственен, главным образом, неактивный изомер.
Второе. По результатам проведенного анализа литературы и собственных экспериментальных исследований было установлено, что наилучшим кандидатом на роль второго основного компонента композиции, сочетающим в себе все необходимые качества, в этом случае является пирантел (пирантела памоат).
Пирантел - нетоксичное для организма хозяина соединение, эффективно действующее на нематод в ранней фазе их развития и на зрелые формы паразитов, он обладает широким спектром действия в рамках класса нематод: активен в отношении Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Trichostrongylos orientalis, Trichostrongylos colubriformis; практически не абсорбируется в желудочно-кишечном тракте и характеризуется пролонгированным действием в организме хозяина. Благодаря низкой токсичности, высокой переносимости и отсутствию неприятного вкуса допускает многократное (повторное) применение обработки, которое проходит без неблагоприятных последствий для организма. (Справочник Машковского on-line, Д.А. Авданина и др., Российский ветеринарный журнал, №1, 2006 г., с. 46-47; http://www.micro-plus.ru/publ53.htm, Санин А.В., Выбор антгельминтных средств и основы дегельминтизации).
Пирантел в комбинации с празиквантелом достаточно активно используется в ветеринарной практике. Известные препараты на основе такой комбинации («Празител» (СКиФФ, Россия), «Празицид» (Апи-Сан, Россия), «Дронтал» (Bayer, Германия), «Прател» (Lek Pharmaceuticals, Словения), и др.) демонстрируют широкий спектр действия, низкую токсичность для хозяина и при этом высокую эффективность в отношении паразитов. Более того, существует мнение, что два названных ингредиента демонстрируют синергетический эффект, который позволяет использовать их в более низких концентрациях, чем при раздельном применении.
Следует, однако, отметить, что использование пирантела, обычно выпускаемого и используемого в форме памоата (реже эмбоната), в жидких антигельминтных композициях обычно сопровождается введением в их состав токсичных органических растворителей таких, как диметилсульфоксид или диметилформамид, поскольку пирантел памоат практически не растворим в воде, а также в большинстве спиртов. Из соображений обеспечения безопасности препарата для животных нами было сознательно исключено применение любых токсичных растворителей. Что касается исследования «взаимоотношений» пирантела с ЦД и возможности повышения его растворимости в воде путем введения в систему с циклодекстрином, то в уровне техники такая информация отсутствует.
Вопрос о поведении пирантела в циклодекстриновой системе был исследован нами опытным путем. При этом было установлено, что при использовании пирантела в форме памоата растворимость его в воде меняется в присутствии ЦД незначительно. Однако нами впервые было показано, что в случае перевода этой обычно используемой коммерческой субстанции собственно в основание пирантела (например, в результате проведения реакции с бикарбонатом натрия) может быть достигнуто практически полное растворение пирантела в водно-циклодекстриновой системе. Это позволяет при необходимости дополнительно снижать концентрации данного соединения в препарате, хотя следует иметь в виду, что предварительное получение пирантела из памоата в виде отдельной стадии усложняет и удорожает процесс получения лекарственного препарата, а высокие концентрации бикарбоната, введенного непосредственно в состав препарата, ухудшают его органолептические свойства.
Вместе с тем, при определении нами эффективной терапевтической дозы для предлагаемой композиции в опытах на кошках и собаках было показано (см. пример 4), что биодоступность пирантела памоата в предлагаемом составе, не содержащем никаких органических растворителей, тем не менее, является достаточной для использования его в зоне самых низких из известных эффективных доз (10-15 мг/1 кг веса животного). Тот факт, что при изучении стабильности суспензии ни в одном случае не обнаруживалось отделения фракции, содержащей преимущественно пирантела памоат (см. пример 2) позволяет предположить, что с высокой степенью вероятности имеет место, по меньшей мере, частичная адсорбция его на комплексе празиквантел-ЦД.
Третье. Вопрос об улучшении потребления животными лекарства решался не только за счет устранения горького вкуса в результате применения R-энантиомера празиквантела, но и в направлении поддержания вязкости суспензии, необходимой для того, чтобы предотвратить растекание лекарства в ротовой полости и сократить площадь его контакта со вкусовыми рецепторами. Для этого в нашем случае, в отличие от ближайшего аналога, где применялись высокие концентрации (до 10%) наполнителей, было использовано растительное масло (предпочтительно тыквенное или соевое), которое, помимо проявления им свойств мягкого слабительного, часто обладает прямым антигельминтным действием (тыквенное масло используется для избавления от круглых и ленточных гельминтов, соевое в комбинации с силимарином - для лечения описторхозов). Приемлемое содержание масла варьировало от 22 до 4% в зависимости от общего содержания базовых компонентов (см. составы в примере 2).
Четвертое. Известно, что проводимая обработка хозяина антигельминтиком, как правило, сопровождается нарушением нормального баланса микрофлоры в ЖКТ, а повторные процедуры могут неблагоприятным образом отразиться на состоянии печени, что особенно важно при проведении лечения пациентов детского и пожилого возраста. С целью исключения или максимально быстрого восстановления указанных последствий обработки антигельминтиком в конкретных вариантах предлагаемой суспензии дополнительно использовали добавки с гепатопротекторным и восстанавливающим микрофлору ЖКТ действием, предпочтительно инулин и/или экстракт расторопши (с 80% силимарина).
Предлагаемая композиция для лечения и профилактики гельминтозов теплокровных животных характеризуется следующим составом компонентов в мас.%:
R - празиквантел
0.1-0,5
пирантела памоат
1, 0-3,0
бета-циклодекстрин
1,5-5,0
наполнители и вспомо-
1,2-5,3
гательные добавки
растительное масло
4,0-22,0
вода
остальное
В качестве наполнителей могут быть использованы поливинилпирролидон, аэросил, МКЦ и др., в число вспомогательных добавок могут входить стабилизаторы, диспергирующие агенты, вкусовые добавки, традиционно применяемые в данной области.
Таким образом, сущность настоящего изобретения состоит в создании новой антигельминтной композиции в форме суспензии, содержащей комбинацию активного энантиомера празиквантела (R(-)- празиквантела) с пирантела памоатом в качестве активного начала, бета-циклодекстрин, водно-масляную смесь, нейтральные наполнители и другие используемые в ветеринарии вспомогательные ингредиенты, при определенном соотношении компонентов. Предлагаемая антигельминтная водно-масляная суспензия характеризуется широким спектром антигельминтного действия, стабильностью при хранении, удобством в применении, приемлемыми для животных консистенцией и вкусом и отличается от ближайшего аналога более высокой эффективностью, практически полным отсутствием горького вкуса и улучшением показателей потребления животными (основные технические результаты), расширением круга хозяев за счет включения в него любых (без ограничения) пород собак, котят и щенков, а также возрастных и/или ослабленных животных (дополнительный технический результат).
Принимая во внимание, что все вышеперечисленные преимущества заявляемой композиции, а также то, что все соединения, входящие в предлагаемые составы, используются не только в ветеринарии, но и в фармацевтике, и являются безопасными для человека, есть все основания полагать, что данный лекарственный препарат после необходимых дополнительных испытаний и соответствующей доработки лекарственной формы может быть использован также и в медицинской практике.
Осуществление изобретения.
Осуществление изобретения с достижением технического результата подтверждается нижеследующими конкретными примерами, которые не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.
R(-) - празиквантел был получен по методу, описанному Woelfle М. et al. в PLoS, 2011, v. 5, №9, е1260 с некоторыми модификациями. Очищенная субстанция представляла собой белый кристаллический порошок с Тплав.=109-111°С, характеризующийся высокой гигроскопичностью, растворимостью в большинстве органических растворителей и низкой растворимостью в воде.
Пример 1. Способ приготовления суспензии.
В сосуд заливают воду, нагревают ее до температуры 55°С и прибавляют сухую смесь, состоящую из расчетных количеств R-празиквантела и бета-циклодекстрина, перемешивают компоненты при поддержании указанной температуры до полного их растворения. После охлаждения смеси до комнатной температуры образуется осадок комплекса R-празиквантела с циклодекстрином. К суспензии комплекса в воде при постоянном перемешивании последовательно добавляют водорастворимые компоненты (такие, как лимонная кислота, аспасвит, при необходимости - экстракт расторопши и инулин) и продолжают перемешивание еще 5 минут после их растворения. Затем вводят масло, пирантел и наполнители (например, твин, аэросил и др.). Полученный полный состав перемешивают в течение 30-40 минут.
Пример 2. Способ определения стабильности препарата при его хранении.
Оценку стабильности препарата проводили по двум направлениям: визуально - на седиментационную устойчивость суспензии и методами количественного анализа - на сохранение концентрации ДВ в составе композиции.
Для определения седиментационной устойчивости суспензии полученный состав помещали в стеклянный флакон и хранили при комнатной температуре, через определенные промежутки времени (примерно 12 часов) визуально оценивая степень расслоения суспензии в обоих случаях. При этом было установлено, что первые признаки расслоения препарата отмечаются не ранее, чем через 10-14 дней от начала хранения.
Количественный анализ проводился в отношении концентрации празиквантела и пирантела до и после хранения препарата при 5°С и 30°С в течение 6 месяцев. Содержание ДВ в препаратах определяли методом ВЭЖХ. В результате проведенных исследований было установлено, что в пределах указанного периода времени сколько-нибудь существенных изменений в содержании ДВ не наблюдалось вне зависимости от температуры хранения.
Пример 3. Составы с различным содержанием ДВ.
Способом, описанным в примере 1, были получены водно-масляные антигельминтные суспензии следующих составов:
Состав №1
R-празиквантел
0,25
пирантела памоат
1,0
бета-циклодекстрин
2,0
лимонная кислота
0,35
аспасвит
0,5
аэросил
1,0
твин
0,5
шаромикс
0,05
инулин
2,5
экстракт расторопши
(80% силимарина)
0,4
соевое масло
22,0
вода
остальное
Состав №2
R-празиквантел
0,5
пирантела памоат
3,0
бета-циклодекстрин
5,0
лимонная кислота
0,40
аспасвит
0,45
аэросил
0,80
твин
0,5
шаромикс
0,05
тыквенное масло
20,0
вода
остальное
Состав №3
R-празиквантел
0,1
пирантела памоат
1,5
бета-циклодекстрин
1,5
лимонная кислота
0,30
аспасвит
0,45
аэросил
0,80
твин
0,5
шаромикс
0,05
соевое масло
22,0
вода
остальное
Составы №1-№3 ориентированы на использование их в объеме (дозировке) 1 мл/1 кг или 1 мл/2 кг.
С целью удобства использования и обеспечения разумного объема вводимого животному препарата композиция может готовиться так, чтобы содержать в 1 мл большее количество эффективных доз ДВ. Такие концентрированные составы содержат значительные количества циклодекстрина и пирантела и нуждаются в увеличении содержания воды, что может быть без ущерба для свойств препарата, в частности для сохранения активности и достаточной вязкости, достигнуто путем снижения содержания масла до 4-5%, а также наполнителей и добавок до минимального значения, соответствующего примерно 1,2%. Ниже приведены 3 состава, рассчитанные на применение в дозировке 1 мл/5 кг массы животного, которые особенно удобно использовать при лечении собак средних и крупных пород.
Состав №4
R-празиквантел
0,25
пирантела памоат
1,0
бета-циклодекстрин
2,0
лимонная кислота
0,25
аспасвит
0,30
аэросил
0,40
твин
0,20
шаромикс
0,05
инулин
2,5
экстракт расторопши
(80% силимарина)
0,4
соевое масло
4,0
вода
остальное
Состав №5
R - празиквантел
0,5
пирантела памоат
3,0
бета-циклодекстрин
5,0
лимонная кислота
0,25
аспасвит
0,25
аэросил
0,50
твин
0,25
шаромикс
0,03
тыквенное масло
5,0
вода
остальное
Состав №6
R - празиквантел
0,1
пирантела памоат
1,5
бета-циклодекстрин
1,5
лимонная кислота
0,25
аспасвит
0,25
аэросил
0,40
твин
0,25
шаромикс
0,05
соевое масло
4,50
вода
остальное
Пример 4. Мониторинг терапевтически эффективных доз ДВ
Оценка эффективности действия исследуемых составов с различными дозами ДВ проводилась на кошках и собаках, содержащихся в приюте для бездомных животных.
Предлагаемые составы задавали животным однократно из полимерного шприца в ротовую полость до утреннего кормления. Специальной диеты при дегельминтизации не назначали. Животных в опыт подбирали после предварительных копроскопических исследований, в ходе которых пробы фекалий исследовали методом флотации с использованием в качестве флотационной жидкости раствора сульфата цинка и проводили подсчет количества яиц гельминтов в грамме фекалий животных с помощью счетной камеры ВИГИС до и через 10 дней после дегельминтизации. Все полученные данные подвергались статистической обработке.
Для дегельминтизации кошкам задавали составы №1-№3 в дозе 1 мл/2 кг массы тела животного; собакам - составы №4-№6 в дозе 1 мл/5 кг веса.
Кошки.
а) Для титрации терапевтической дозы R-празиквантела при лечении дипилидиоза в опыт отобрали 15 кошек разных пород, спонтанно инвазированных Dipylidium caninum, и разделили их на 3 группы, где 1-я группа кошек получала состав №1, 2-я группа - состав №2, 3-я группа - состав №3, приготовленных согласно примеру 3.
Результаты исследований представлены в таблице 1. Из приведенных данных следует, что все животные, получавшие титруемые составы, полностью освободились от дипилидиумов. Исходя из полученных результатов, можно заключить, что все испытанные дозы R-празиквантела, в том числе и минимальная из них (1,0 мг/кг, состав №3), обеспечивают 100%-ную интенсэффективность при дипилидиозе. Титруемые составы не вызывали у животных признаков токсикоза или других побочных действий после обработки.
б) Для установления эффективной терапевтической дозы пирантела памоата при лечении токсокароза в опыт было отобрано 15 кошек разных пород, спонтанно инвазированных Toxocara cati, которые были разделены на 3 группы для испытания каждого из составов №1-№3.
Полученные результаты (таблица 2) показывают, что все животные, получавшие титруемые составы, полностью освободились от токсокар. Из этого следует, что при токсокарозе кошек пирантел памоат в дозе от 10 до 30 мг/кг демонстрирует одинаковую 100%-ную интенсэффективность. Признаков токсикоза или других побочных действий после обработки ни у одного животного не наблюдалось.
в) При оценке эффективности терапевтической дозы пирантела памоата в лечении токсаскариоза использовали 12 кошек разных пород, спонтанно инвазированных Toxascaris leonina (3 группы по 4 животных).
Из данных, приведенных в таблице 3, следует, что все животные во всех трех опытных группах полностью освободились от токсаскарисов. Исходя из полученных результатов, дозировка пирантела памоата в интервале 10-30 мг/кг показывает одинаковую (100%-ную) интенсэффективность при токсаскариозе кошек. Титруемые составы не вызывали у животных признаков токсикоза или других побочных эффектов после обработки.
Собаки
а) Для установления эффективной терапевтической дозы R-празиквантела при лечении эхинококкоза в опыт было отобрано 15 собак различных пород, спонтанно инвазированных Echinococcus spp., которые были разделены на 3 группы для испытания составов №4-№6.
В таблице 4 представлены полученные результаты, из которых следует, что все животные, получавшие титруемые составы, полностью освободились от эхинококков. Как и в испытаниях, проведенных на кошках, минимальная дозировка R-празиквантела (1,0 мг/кг, состав №6) показала 100%-ную эффективность в уничтожении цестод. Признаков токсикоза или других побочных эффектов после обработки тестируемыми препаратами ни у одного животного не наблюдали.
б) Для оценки терапевтической эффективности дозы пирантела памоата при лечении токсокароза в опыт отобрали 18 собак разных пород, спонтанно инвазированных Тохосага canis (3 группы по 6 животных).
Полученные результаты представлены в таблице 5. Очевидно, что все животные, получавшие титруемые составы, полностью освободились от токсокар. Исходя из полученных результатов, можно заключить, что пирантела памоат в дозе 10-30 мг/кг демонстрирует 100%-ную интенсэффективность при токсокарозе собак. Титруемые составы не вызывали у животных признаков токсикоза или других неблагоприятных эффектов.
в) Для установления терапевтически эффективной дозы пирантела памоата при лечении токсаскариоза использовали 15 собак разных пород, спонтанно инвазированных Toxascaris leonina (3 группы по 5 животных).
В таблице 6 представлены полученные результаты, которые показывают, что все животные, получавшие титруемые составы, полностью освободились от токсаскарисов. Из этого следует, что при токсаскариозе собак дозировка пирантела памоата в интервале 10-30 мг/кг демонстрирует 100%-ную интенсэффективность. Титруемые составы не вызывали у животных признаков токсикоза или других побочных действий после обработки.
На основании проведенных исследований было сделано заключение, что: а) минимальной терапевтически эффективной дозой R-празиквантела, обеспечивающей в составе предлагаемых композиций 100%-ное освобождение животных от инвазии цестодами, является доза 1,0 мг/кг массы животного; б) для пирантела памоата полная дегельминтизация в отношении нематод достигается, начиная с дозы 10 мг/кг.
Пример 5. Клинические исследования лечебного эффекта и их результаты.
Клинические испытания предлагаемых в настоящем изобретении антигельминтных композиций проводили на базе трех ветеринарных клиник г.Москвы.
При этом исследования и оценку результатов в целом осуществляли согласно схеме, описанной в примере 4, за исключением того, что а) в каждый опыт включали от 30 до 50 животных с установленным ветеринарными врачами диагнозом; б) оценку эффективности лечения проводили в сравнении с препаратом по прототипу (WO 2009062939, пример 1), который готовили с учетом применения в объеме 1 мл/2 кг веса (аналогично составам №№1-3) или 1 мл/5 кг веса (аналогично составам №№4-6), где доза празиквантела (рацемата) составляет 2,5 мг/1 кг веса животного (контроль 1, К-1); в) формировали дополнительную контрольную группу животных (контроль 2, К-2), которым вместо антигельминтика вводили соответствующий объем физраствора; г) дополнительно проводили исследования по индивидуальному потреблению («поедаемости») препаратов животными (кошками).
В таблице 7 представлены результаты исследования эффективности действия составов №№1-3 у кошек с диагнозами дипилидиоз, токсокароз и токсаскариоз.
В таблице 8 приводятся результаты лечения составами №№4-6 собак с эхинококкозом, токсокарозом и токсаскариозом.
Анализ результатов клинических исследований, как в случае лечения кошек, так и в случае лечения собак, убедительно свидетельствует о том, что снижение рекомендуемой авторами дозы препарата-прототипа (в расчете на празиквантел 5 мг/кг веса) в 2 раза (до 2,5 мг/кг) приводит к резкому падению цестоцидной активности, что практически делает нецелесообразным его применение при инвазировании животных плоскими гельминтами.
В случае предлагаемой нами композиции даже при 5-кратном уменьшении дозы ДВ по сравнению с используемой в прототипе (до 1,0 мг/кг празиквантела в составах №3 и №6) препарат обеспечивает 100%-ное избавление животных от инвазирования как круглыми, так и плоскими гельминтами.
Пример 6. Оценка (индивидуального) потребления препарата животными.
Для определения потребления животными предлагаемых антигельминтных композиций в ходе клинических испытаний (см. пример 5) дополнительно вели наблюдение за поведением кошек (30) во время и после введения им состава №1 (в дозе, содержавшей 2,5 мг празиквантела (R-энантиомера) на кг веса животного) с записью показателей, позволяющих оценить вкусовые качества препарата. Для этого, во-первых, использовали шкалу (в баллах), в соответствии с которой 1 балл означает невозможность применения, 2 балла - затрудненное применение, 3 балла - применение при умеренном сопротивлении, 4 балла - легкое (беспрепятственное) применение, а во-вторых, показатель наличия обильного слюноотделения после введения лекарственного средства.
В этом исследовании использовали в качестве контроля 30 клинически здоровых кошек, получавших контрольный препарат по прототипу, который был составлен согласно примеру 1 в WO 2009062939, исходя из введения его животному в объеме 1 мл/2 кг (аналогично составу №1) и рекомендуемой авторами дозы празиквантела 5 мг на кг веса, поскольку, как показали результаты наших исследований (см. пример 5), снижение дозировки для препарата-прототипа не представляется возможным из-за существенного уменьшения его цестодоцидной активности. Результаты испытания по определению потребления кошками антигельминтной композиции в сравнении с прототипом представлены в таблице 9.
На основании результатов наблюдения за потреблением кошками композиции по изобретению и композиции по прототипу можно заключить, что новый препарат демонстрирует существенно лучшие показатели, чем известный. Основной причиной доказанного экспериментальным путем улучшения вкусовых качеств предлагаемой композиции следует считать замену рацемата празиквантела R-энантиомером, которая позволила в два-пять раз по сравнению с прототипом снизить дозировку препарата (при сохраненном уровне цестодоцидной активности), а также исключить из состава наиболее горькую составляющую рацемической смеси - S(+)-празиквантел.