ФЕРМЕНТНАЯ РЕАКЦИОННАЯ СРЕДА, СОДЕРЖАЩАЯ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНОЕ ВЕЩЕСТВО
ENZYMATIC REACTION MEDIUM CONTAINING SURFACTANT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение направлено на улучшение реакционной среды для реакций ферментативного синтеза. Реакционная среда содержит определенное поверхностно-активное вещество (ПАВ), которое усиливает растворение реагентов и продуктов химической реакции и повышает активность фермента по сравнению с общепринятыми ПАВ. Применение определенного ПАВ приводит к повышению выхода и более устойчивой ферментативной реакции. Для этой цели в изобретении предложена реакционная смесь, содержащая фермент и ПАВ, и способ проведения ферментативной реакции с использованием указанной реакционной смеси.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Новые методы каталитического синтеза в органической химии, удовлетворяющие все более строгим экологическим требованиям, пользуются большим спросом в фармацевтической и химической промышленностях. Кроме того, необходимы новые каталитические процедуры для получения новых классов органических соединений, которые становятся объектами молекулярных и биомедицинских исследований. Катализируемые ферментами химические превращения теперь широко признаются качестве практических альтернатив традиционному (небиологическому) органическому синтезу и в качестве удобных решений некоторых трудноразрешимых проблем синтеза.
Ферментативные реакции, как правило, выполняют в водной среде. Однако, многие представляющие интерес с точки зрения химической индустрии субстраты и продукты только частично растворимы в воде. Для улучшения растворимости в реакционную смесь часто добавляют органические растворители. С другой стороны, эти органические растворители отрицательно влияют на стабильность и эффективность многих ферментов. Кроме того, некоторые органические растворители вредны для окружающей среды.
Поэтому, в этой области техники существует потребность в реакционной среде для реакций ферментативного синтеза, которая позволила бы растворять гидрофобные субстраты и продукты, но не влияла бы на стабильность и выход ферментативной реакции.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение основано на открытии того, что эффективность реакций химического синтеза с использованием ферментов в качестве катализаторов может быть повышена с помощью введения определенных ПАВ в реакционную смесь. ПАВ можно применять в реакциях ферментативного синтеза для повышения растворимости реагентов и продуктов реакции. Однако, эти ПАВ отрицательно влияют на активность и стабильность ферментов. Данными изобретателями было обнаружено, что применение ПАВ, полученных из витамина Е, таких как TPGS-750-M, значительно повышает эффективность ферментативной реакции по сравнению с общепринятыми ПАВ или сорастворителями. Выход реакции увеличивается также при более низких температурах, и реакция по-прежнему протекает даже при неблагоприятных условиях, таких как низкие значения рН.
В первом аспекте настоящего изобретения предложена водная реакционная смесь, содержащая фермент, субстрат фермента и ПАВ, где ПАВ выбирают из группы, состоящей из
(i) ПАВ, имеющих следующую формулу I:
(I)
(ii) ПАВ, имеющих следующую формулу II:
(II)
и
(iii) ПАВ, имеющих следующую формулу III:
(III)
где
1-4
R1 содержит группу поли(C-алкиленгликоля);
1-4
R2, R3, R4 и R5 независимо представляют собой C-алкил; и
5-80
5-80
R6 представляет собой C-алкил или C-алкенил.
Во втором аспекте в настоящем изобретении предложен способ проведения ферментативной реакции, включающий следующие стадии
(a) предоставление реакционной смеси согласно первому аспекту изобретения, и
(b) обеспечение самостоятельного протекания реакции.
В третьем аспекте в настоящем изобретении предложено применение ПАВ для повышения выхода и/или стабильности ферментативной реакции, включающее введение ПАВ в водную смесь, содержащую фермент и субстрат фермента, где ПАВ выбирают из группы, состоящей из
(i) ПАВ, имеющих следующую формулу I:
(I)
(ii) ПАВ, имеющих следующую формулу II:
(II)
и
(iii) ПАВ, имеющих следующую формулу III:
(III)
где
1-4
R1 содержит группу поли(C-алкиленгликоля);
1-4
R2, R3, R4 и R5 независимо представляют собой C-алкил; и
5-80
5-80
R6 представляет собой C-алкил или C-алкенил.
Вышеуказанные аспекты можно объединять. Другие объекты, признаки, преимущества и аспекты настоящего изобретения будут понятны специалисту в данной области из следующего описания и приложенной формулы изобретения. Однако следует понимать, что нижеследующее описание, прилагаемая формула изобретения и конкретные примеры, которые указывают на предпочтительные варианты осуществления заявки, приведены только в качестве иллюстрации. Различные изменения и модификации в пределах сущности и объема раскрытого изобретения легко станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения нижеследующего.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении, в его первом аспекте предложена водная реакционная смесь, содержащая фермент, субстрат фермента и ПАВ, где ПАВ выбирают из группы, состоящей из
(i) ПАВ, имеющих следующую формулу I:
(I)
(ii) ПАВ, имеющих следующую формулу II:
(II)
и
(iii) ПАВ, имеющих следующую формулу III:
(III)
где
1-4
R1 содержит группу поли(C-алкиленгликоля);
1-4
R2, R3, R4 и R5 независимо представляют собой C-алкил; и
5-80
5-80
R6 представляет собой C-алкил или C-алкенил.
Заявляемая технология подходит для всех химических реакций, в которых используется фермент, чтобы катализировать реакцию. Она, в частности, может применяться для синтеза органических соединений с использованием ферментативных реакций. Устойчивые ферменты для применения в настоящей реакционной смеси включают, например, оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы (синтазы), изомеразы и лигазы (синтетазы). Оксидоредуктазы могут катализировать реакцию связей C=O и C=C, восстановительное аминирование C=O групп, и окисление связей C-H, C=C, C-N и C-O. Трансферазы способны переносить функциональные группы, такие как аминогруппа, ацил, фосфорил, метил, гликозил, нитрогруппа и серосодержащие группы из одного соединения в другое. Гидролазы могут катализировать гидролиз сложных эфиров, амидов, лактонов, лактамов, эпоксидов, нитрилов и других групп, а также соответствующие обратные реакции с формированием таких функциональных групп. Лиазы, также называемые синтазами, могут катализировать присоединение малых молекул по двойным связям, таким как C=C, C=N и C=O. Изомеразы могут катализировать преобразование изомеров (изомеризацию), включая рацемизации, эпимеризации и реакции перегруппировки. Лигазы, также называемые синтетазами, могут образовывать комплексные соединения (по аналогии с лиазами) с использованием АТФ в качестве источника энергии. В конкретных вариантах осуществления фермент выбирают из группы, состоящей из кеторедуктаз, ен-редуктаз, трансаминаз, дегидрогеназ, таких как алкогольдегидрогеназы и аминокислотные дегидрогеназы, липаз, эстераз и фенилананин-аммоний-лиаз. Конкретные примеры ферментов включают кеторедуктазу, ен-редуктазу и аланинтрансаминазу.
Фермент присутствует в реакционной смеси в концентрации, подходящей для выполнения реакции, например, его содержание составляет от примерно 0,01% до примерно 100% относительно содержания субстрата. В частности, содержание фермента может составлять от примерно 0,1% до примерно 75%, от примерно 0,5% до примерно 50%, от примерно 1% до примерно 40%, от примерно 2% до примерно 30%, от примерно 4% до примерно 25% или от примерно 5% до примерно 20% относительно содержания субстрата. "Содержание" в этом отношении означает либо массовое содержание соединений, либо мольное содержание соединений.
+
+
В определенных вариантах осуществления водная реакционная смесь дополнительно содержит кофактор и/или кофермент. Наличие кофактора/кофермента зависит от ферментативной реакции, которую требуется провести. Примеры кофакторов включают никотинамидадениндинуклеотид (NAD), никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP), флавинадениндинуклеотид (FAD) и пиродоксалмонофосфат. Эти кофакторы можно использовать для предоставления протонов, электронов и/или аминогрупп в ферментативной реакции. NAD, NADP и FAD могут присутствовать в водной реакционной смеси в ионной (например, NAD, NADP) или протонированной (например, NADH, NADPH) форме.
Кофактор может присутствовать в водной реакционной смеси в стехиометрических количествах. В частности, мольное содержание кофактора может быть по крайней мере не меньше мольного содержания субстрата. В других вариантах осуществления содержание кофактора может быть ниже содержания субстрата, в частности, оно может составлять от примерно 0,01% до примерно 20%, от примерно 0,05% до примерно 15%, от примерно 0,1% до примерно 10%, от примерно 0,25% до примерно 7,5% или от примерно 0,5% до примерно 5% относительно содержания субстрата. "Содержание" в этом отношении означает либо массовое содержание соединений, либо мольное содержание соединений. В этих вариантах осуществления предпочтительно, чтобы кофактор возобновлялся в ходе реакции, если это необходимо. Например, реакционная смесь может содержать дополнительный фермент, необязательно с соответствующим ему субстратом, который возобновляет кофактор. Например, если NAD, NADP или FAD используют в качестве кофактора, водная реакционная смесь может дополнительно содержать дегидрогеназу, такую как алкогольдегидрогеназу или глюкозодегидрогеназу, и соответствующий субстрат, такой как спирт или глюкоза.
В других вариантах осуществления кофактор может возобновляться ферментом, который также катализирует интересующую реакцию. В этих вариантах осуществления второй субстрат этого фермента может присутствовать в водной реакционной среде, в частности, в значительно большем количестве, чем субстрат, представляющий интерес, например, не менее чем в 2 раза большем, предпочтительно - не менее чем в 4 раза, не менее чем в 10 раз или не менее чем в 50 раз большем избытке по сравнению с субстратом, представляющим интерес. Например, для реакции трансаминазы водная реакционная смесь может содержать аминное соединение, такое как изопропиламин, для возобновления кофактора, такого как пиридоксальмонофосфат.
В конкретном варианте осуществления фермент представляет собой кеторедуктазу, субстрат представляет собой кетон, а кофактором является NADP. В другом варианте осуществления фермент представляет собой ен-редуктазу, субстрат представляет собой соединение, содержащее двойную связь углерод-углерод, а кофактором является NAD. В другом варианте осуществления фермент представляет собой трансаминазу, субстрат представляет собой кетон, а кофактором является пиридоксальмонофосфат.
ПАВ в водной реакционной смеси выбирают из группы, состоящей из
(i) ПАВ, имеющих следующую формулу I:
(I)
(ii) ПАВ, имеющих следующую формулу II:
(II)
и
(iii) ПАВ, имеющих следующую формулу III:
(III)
где
1-4
R1 содержит группу поли(C-алкиленгликоля);
1-4
R2, R3, R4 и R5 независимо представляют собой C-алкил; и
5-80
5-80
R6 представляет собой C-алкил или C-алкенил.
ПАВ в водной реакционной смеси может быть любым поверхностно-активным веществом согласно формуле (I), формуле (II) или формуле (III). В некоторых вариантах осуществления ПАВ характеризуется молекулярной массой, равной 10000 г/моль или меньше, в частности, 7500 г/моль или меньше, 5000 г/моль или меньше, 3000 г/моль или меньше, 2500 г/моль или меньше или даже 2000 г/моль или меньше.
В частности, ПАВ не должен взаимодействовать в химической реакции. В некоторых вариантах осуществления ПАВ является неионогенным ПАВ. ПАВ обычно является амфифильным соединением и включает гидрофильную часть и гидрофобную часть. Гидрофильная часть в основном образована остатком R1, а гидрофобная часть в основном образована остатком R6. В определенных вариантах осуществления ПАВ способен формировать мицеллы в смеси ПАВ-вода.
1-4
1-4
1-4
1-4
2-3
1-4
ПАВ содержит группу поли(C-алкиленгликоля) в остатке R1. Эти группа поли(C-алкиленгликоля) в особенности представляет собой группу поли(пропиленгликоля), в частности, группу поли(этиленгликоля). Группа поли(C-алкиленгликоля) также может состоять из смеси разных групп поли(C-алкиленгликоля), такой как смесь поли(этиленгликоля) и поли(пропиленгликоля). R1, в частности, содержит группу поли(C-алкиленгликоля). Группа поли(C-алкиленгликоля), особенно группа поли(этиленгликоля), может характеризоваться средней молекулярной массой в пределах от примерно 100 до 10000 г/моль, особенно в пределах от примерно 200 до примерно 5000 г/моль, в частности, в пределах от примерно 250 до 2500 г/моль, от примерно 400 до примерно 2000 г/моль или от примерно 500 до 1500 г/моль, например, примерно 550, примерно 750 или примерно 1000 г/моль.
1-4
1-4
1-4
Группа поли(C-алкиленгликоля) остатка R1 может быть присоединена к атому кислорода в основной цепи ковалентной связью или связывающей группой. Связывающая группа может быть любым химическим линкером, пригодным для присоединения группы поли(C-алкиленгликоля) к атому кислорода. В частности, связывающая группа может представлять собой дикарбоновую кислоту, которая образует сложноэфирные связи с основной цепью и группой поли(C-алкиленгликоля). Иллюстративные связывающие группы включают дикарбоновую кислоту, имеющую от 2 до 20 атомов углерода, такую как янтарная кислота, себациновая кислота, малоновая кислота, глутаровая кислота, адипиновая кислота, малеиновая кислота и фумаровая кислота.
1-4
1-4
1-16
1-8
1-4
1-4
В некоторых вариантах осуществления R1 дополнительно содержит концевую группу, присоединенную к концу группы поли(C-алкиленгликоля). Эта концевая группа, в частности, присоединена к группе поли(C-алкиленгликоля) посредством простой эфирной, сложноэфирной или амидной связью. Концевая группа особенно представляет собой группу C алкила или алкенила, в частности, группу C алкила, такую как группа C алкила. В некоторых вариантах осуществления концевая группа представляет собой группу метила, присоединенную к группе поли(C-алкиленгликоля) посредством простой эфирной связи.
1-4
В определенных вариантах осуществления R1 состоит из группы поли(C-алкиленгликоля), связывающей группы и концевой группы, как описано в данном документе.
1-4
R2, R3, R4 и R5 независимо представляют собой водород или C-алкил, в частности, водород, метил или этил, особенно водород или метил. В определенных вариантах осуществления R5 представляет собой метил. В определенных вариантах осуществления R4 представляет собой метил. В определенных вариантах осуществления R4 и R5 представляют собой метил. В дополнительных вариантах осуществления R2 и R3 независимо представляют собой водород или метил. В конкретных вариантах осуществления R4 и R5 представляют собой метил, а R2 и R3 независимо представляют собой водород или метил. В некоторых вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (I), все R2, R3, R4 и R5 представляют собой метил. В некоторых вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (II), R4 и R5 представляют собой метил. В некоторых вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (III), R2 представляет собой водород, R3, R4 и R5 представляют собой метил.
5-80
5-80
R6 представляет собой C-алкил или C-алкенил. R6 может быть линейным или разветвленным и может содержать циклические группы, включая ароматические группы. В некоторых вариантах осуществления R6 не содержит циклические группы или ароматические группы. В частности, R6 является разветвленным.
5-30
5-30
8-25
8-25
10-20
10-20
14-18
14-18
16
R
В вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (I), R6 может быть C-алкилом или C-алкенилом, особенно C-алкилом или C-алкенилом, в частности, C-алкилом или C-алкенилом, предпочтительно - C-алкилом или C-алкенилом. Алкенильная группа может содержать одну или несколько двойных связей углерод-углерод, в частности, одну, две, три, четыре или пять двойных связей, например, две или три, особенно три. В конкретных вариантах осуществления R6 представляет собой C-алкенил, в частности, 4,8,12-триметилтридецил или 4,8,12-триметил-3,7,11-тридекатриенил. В некоторых вариантах осуществления атом углерода, несущий на себе R5 и R6, имеет  конформацию.
5-20
5-20
6-18
6-18
7-15
7-15
8-12
8-12
10
В вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (II), R6 может быть C-алкилом или C-алкенилом, особенно C-алкилом или C-алкенилом, в частности, C-алкилом или C-алкенилом, предпочтительно - C-алкилом или C-алкенилом. В конкретных вариантах осуществления R6 представляет собой C-алкил, в частности, 5-этил-6-метилгептан-2-ил.
30-80
30-80
35-70
35-70
40-60
40-60
45-55
45-55
50
В вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (III), R6 может быть C-алкилом или C-алкенилом, особенно C-алкилом или C-алкенилом, в частности, C-алкилом или C-алкенилом, предпочтительно - C-алкилом или C-алкенилом. Алкенильная группа может содержать одну или несколько двойных связей углерод-углерод, в частности, пять, восемь или десять двойных связей, особенно десять. В конкретных вариантах осуществления R6 представляет собой C-алкенил, в частности, 3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-декаметилтетраконта-2,6,10,14,18,22,26,30,34,38-декаенил.
В вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (I), ПАВ специально получают из витамина Е, в частности, из токоферола, особенно из α-токоферола. Некоторые примеры ПАВ включают токоферола полиэтиленгликоля сукцинаты (TPGS), в частности, DL-α-токоферола полиэтиленгликоля сукцинаты, такие как TPGS-750-M, TPGS-1000, TPGS-1500, TPGS-400, TPGS-1100-M, TPGS-2000, TPGS-860-олеат, TPGS-PEG-PPG-PEG-1100 и TPGS-PPG-PEG-70-бутил, и DL-α-токоферола полиэтиленгликоля сукцинаты, такие как TPPG-1000 и TPPG-1000-бутил; и диэфир полиэтиленгликоля α-токоферола и себациновой кислоты (PTS), такой как PTS-600. В определенных вариантах осуществления ПАВ выбран из группы, состоящей из TPGS-750-M, TPGS-1000 и PTS, в частности, TPGS-750-M.
В вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (II), ПАВ специально получают из убихинола. Некоторые примеры ПАВ включают полиэтиленгликоля убихинола сукцинат (PQS), в частности, PQS, содержащий mPEG, такой как mPEG2000.
В вариантах осуществления, где ПАВ представлен формулой (III), ПАВ специально получают из ситостерин, в частности, β-ситостерин. Некоторые примеры ПАВ включают β-ситостерина метоксиэтиленгликоля сукцинат (Nok), в частности, Nok, содержащий mPEG, такой как mPEG550.
Концентрация ПАВ в водной реакционной смеси, в частности, составляет не менее 0,01% (вес/вес), в частности, не менее 0,02% (вес/вес), особенно, не менее 0,5% (вес/вес) или не менее 1% (вес/вес). В определенных вариантах осуществления концентрация ПАВ в водной реакционной смеси находится в пределах от 0,01 до 20% (вес/вес), в частности, в пределах от 0,02 до 15% (вес/вес), в пределах от 0,1 до 10% (вес/вес), от 0,2 до 7.5% (вес/вес) или от 0,5 до 5% (вес/вес), особенно в пределах от 0,75 до 3% (вес/вес), например, примерно 1% (вес/вес), примерно 1,5% (вес/вес) или примерно 2% (вес/вес). В определенных вариантах к осуществления концентрация ПАВ в водной реакционной смеси выше его критической концентрации мицеллообразования.
В некоторых вариантах осуществления водная реакционная смесь дополнительно содержит буфер. Буфер, в частности, должен быть пригоден для поддержания рН реакционной смеси при нейтральном рН или при примерно нейтральном рН. В частности, буфер выбирают из группы, состоящей из TRIS, фосфата, цитрата, ацетата и аммиака. Водная реакционная смесь предпочтительно имеет рН, при котором фермент активен и стабилен, и/или который пригоден для ферментативной реакции. В некоторых вариантах осуществления значение pH находится в пределах от 4,0 до 10,0, в частности, от 6,0 до 8,0, особенно от 6,5 до 7,5, например, равно примерно 7,0.
Субстратом в реакционной смеси может быть любой субстрат, подходящий для проведения ферментативной реакции. Субстрат, в частности, зависит от типа ферментативной реакции, которую требуется провести в реакционной смеси. Реакционная смесь может также содержать более одного субстрата, как например, два субстрата или три субстрата. В определенных вариантах осуществления субстрат и/или продукт ферментативной реакции не смешиваются с водой или только частично водорастворимы. Частично водорастворимое соединение, в частности, только смешивается с водой при концентрации 20 г/л или меньше, особенно 10 г/л или меньше или 5 г/л или меньше при комнатной температуре. Субстрат можно использовать в любой концентрации, которая годится для проведения химической реакции. В частности, субстрат используют при высоких концентрациях. Например, концентрация субстрата в реакционной смеси составляет не менее 0,1 M, в частности, не менее 0,5 M, не менее 1,0 M, не менее 1,1 M, не менее 1,2 M, не менее 1,3 M, не менее 1,5 M, не менее 1,7 M или не менее 2,0 M. Специалист в данной области способен выбрать подходящие субстраты и их концентрации.
В некоторых вариантах осуществления водная реакционная смесь дополнительно содержит сорастворитель. Сорастворитель может быть, в частности, органическим растворителем или дополнительным ПАВ или их смесью.
1-10
Органический растворитель может быть любым органическим растворителем. Предпочтительно, чтобы он не нарушал или ингибировал ферментативную реакцию. В некоторых вариантах осуществления органический растворитель смешивается с водой или частично смешивается с водой. Органический растворитель особенно представляет собой апротонный органический растворитель. Подходящие примеры органических растворителей включают ацетон, тетрагидрофуран (THF, ТГФ) и их производные, такие как метилтетрагидрофуран, пиридин, полиэтиленгликоль (PEG, ПЭГ), полипропиленгликоль (PPG, ППГ), в частности, ПЭГ со средней молекулярной массой от примерно 100 г/моль до примерно 2000 г/моль, такие как ПЭГ200, ПЭГ600, ПЭГ1000 и ПЭГ2000, их производные, такие как моно- или диалкил ПЭГ, в частности, моно- или диметил ПЭГ, моно- или диэтил ПЭГ и моно- или дипропил ПЭГ. Дополнительные примеры включают ацетонитрил, диметилформамид (ДМФА), дихлорметан (ДХМ), толуол и спирты, такие как C алифатический спирт, в частности, 2-бутиловый спирт. В некоторых вариантах осуществления содержание органического растворителя в реакционной смеси находится в пределах от 0,1% до 50% (об./об.), в частности, от 1% до 40% (об./об.), от 2% до 30% (об./об.), от 4% до 25% (об./об.) или от 5% до 20% (об./об.).
6-20
Дополнительное ПАВ может быть любым поверхностно-активным веществом. Предпочтительно, чтобы оно не нарушало или ингибировало ферментативную реакцию. В некоторых вариантах осуществления гидрофильная часть ПАВ содержит полиалкиленгликолевый фрагмент, особенно полиэтиленгликолевый фрагмент или полипропиленгликолевый фрагмент. Полиалкиленовый фрагмент, особенно полиэтиленгликолевый фрагмент, может характеризоваться средней молекулярной массой в пределах от примерно 100 до 10000 г/моль, особенно в пределах от примерно 300 до примерно 3000 г/моль, в частности, в пределах от примерно 400 до 2000 г/моль. Определенные примеры дополнительных ПАВ, содержащих полиалкиленгликолевый фрагмент, включают Triton X-100; простые алкиловые эфиры полиэтиленгликоля, такие как Brij ПАВ, в частности, Brij 30, Brij 35, Brij 52, Brij 56, Brij 58, Brij 72, Brij 76, Brij 78, Brij 92, Brij 96, Brij 98, Cremophor A6, Cremophor A25 и Thesit; сложные эфиры полиэтиленгликоля, такие как полиэтиленгликоля (15)-гидроксистеарат (Solutol HS 15); эфиры полиэтиленгликоля и сорбита с жирной кислотой, также известные как полисорбаты или Tween, такие как полисорбат 20, полисорбат 21, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 61, полисорбат 65, полисорбат 80, полисорбат 81, полисорбат 85 и полисорбат 120; холестерила ПЭГ сукцинаты, такие как холестерила ПЭГ1000 сукцинат; эфир ПЭГ и (дезокси) холевой кислоты, такой как холевый эфир PEG1000 и дезоксихолевый эфир PEG1000; хроманолполиэтиленгликольсукцинаты, такие как Chrom-400 и Chrom-1000; и другие производные ПЭГ, такие как C4-азо-ПЭГ; цетилтриметиламмония бромид (CTAB, ЦТАБ); межфазные ПАВ, такие как дезоксихолат натрия; и октановую кислоту и другие кислоты с длинной алкильной цепью, в частности, кислоты с цепью C алкила. Концентрация дополнительного ПАВ в водной реакционной смеси, в частности, находится в пределах от 0,1 до 10% (вес/вес). В некоторых вариантах осуществления концентрация дополнительного ПАВ в водной реакционной смеси находится в пределах от 0,5 до 5% (вес/вес), особенно в пределах от 0,8 до 4% (вес/вес), от 1 до 3% (вес/вес) или от 1,5 до 2,5% (вес/вес), например, примерно 2% (вес/вес).
Настоящая технология особенно полезна для применений, где желательны высокие концентрации субстрата в реакционной смеси, например, в очень крупномасштабных или в очень мелкомасштабных процессах. В одном варианте осуществления реакционная смесь имеет промышленный масштаб. Она может иметь объем, например, не менее 1 л, в частности, не менее 10 л, не менее 100 л, или не менее 1000 л. В другом варианте осуществления реакционная смесь имеет микромасштаб. Она может иметь объем, например, равный 10 мл или меньше, в частности, 1 мл или меньше, 100 мкл или меньше, 10 мкл или меньше или 1 мкл или меньше.
Реакционная смесь представляет собой смесь загрузки или партии для проведения химической реакции. В некоторых вариантах осуществления реакционная смесь не содержит каких-либо продуктов ферментативной реакции или содержит только остаточные количества каких-либо продуктов ферментативной реакции. В других вариантах осуществления она может содержать значительные количества продукта ферментативной реакции.
Во втором аспекте в настоящем изобретении предложен способ проведения ферментативной реакции, включающий следующие стадии
(a) предоставление водной реакционной смеси, как описано в данном документе, и
(b) обеспечение самостоятельного протекания реакции.
Реакционная смесь в особенности содержит фермент, субстрат фермента и ПАВ, где ПАВ выбирают из группы, состоящей из
(i) ПАВ, имеющих следующую формулу I:
(I)
(ii) ПАВ, имеющих следующую формулу II:
(II)
и
(iii) ПАВ, имеющих следующую формулу III:
(III)
где
1-4
R1 содержит группу поли(C-алкиленгликоля);
1-4
R2, R3, R4 и R5 независимо представляют собой C-алкил; и
5-80
5-80
R6 представляет собой C-алкил или C-алкенил.
В частности, водная реакционная смесь может характеризоваться любыми из признаков, вариантов осуществления и примеров, описанных здесь, включая их комбинации.
Ферментативная реакция может представлять собой любые химические реакции, в которых используется фермент, чтобы катализировать реакцию. В частности, реакции органического химического синтеза можно проводить, например, с по меньшей мере частично гидрофобными соединениями. Типичные химические реакции включают восстановительные реакции, окислительные реакции, реакции аминирования, реакции нитрирования, реакции гидролиза, реакции этерификации и реакции амидирования, такие как ацилирование. Фермент и субстрат в водной реакционной смеси подходят для конкретной химической реакции. В частности, фермент и субстрат специально выбирают так, чтобы ферментативная реакция протекала требуемым образом. Подходящие ферменты и субстраты описаны в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления ферментативной реакции на стадии (b) позволяют протекать в условиях реакции, подходящих для осуществления ферментативной реакции. В частности, условия реакции включают температуру, равную 80°C или ниже, особенно 60°C или ниже, 45°C или ниже, или 40°C или ниже. В частности, ферментативную реакцию проводят при температуре в интервале от 10°C до 50°C, в частности, от 20°C до 45°C или от 25°C до 40°C. Например, ферментативной реакции позволяют протекать при примерно 37°C, при примерно 30°C или при примерно комнатной температуре. В определенных вариантах осуществления реакционную смесь взбалтывают, в частности, перемешивают в продолжении ферментативной реакции.
Кроме того, условия реакции, в частности, включают значение pH в пределах от 4,0 до 10,0, в частности, от 5,0 до 9,5, от 5,5 до 9,0, от 6,0 до 8,5 или от 6,5 до 8,0. В некоторых вариантах осуществления pH поддерживают постоянным в продолжение ферментативной реакции, в частности, в пределах +/- 1,0 единицы рН, особенно в пределах +/- 0,5 единицы pH от требуемой величины pH. В других вариантах осуществления, однако, значение рН может варьироваться на величину больше, чем 1,0 единицы рН, в частности, больше чем 1,5 единицы рН, или даже больше чем 2,0 единицы рН. Описанная здесь водная реакционная смесь способна стабилизировать фермент так, что изменение рН не оказывает значительного влияния на ферментативную реакцию.
Способы проведения ферментативной реакции могут включать дополнительную стадию выделения продукта ферментативной реакции. В частности, эту стадию выполняют после завершения ферментативной реакции. Продукт, в частности, отделяют от одного или нескольких, в частности, по сути всех других компонентов водной реакционной смеси. Например, продукт отделяют от оставшегося субстрата, побочных продуктов, фермента, ПАВ, коферментов, кофакторов и/или органических растворителей. Выделения продукта можно достичь с помощью технологий, известных в области техники, включая, например, выпаривание растворителей, агрегации или кристаллизации или фильтрации, разделения фаз, хроматографического разделения и др.
Настоящее изобретение улучшает растворимость субстратов и продуктов в водной реакционной смеси и повышает стабильность фермента. Таким образом, повышается выход ферментативной реакции, а количество нежелательных побочных продуктов, образующихся в ходе ферментативной реакции, уменьшается. С учетом этого, в дополнительном аспекте в настоящем изобретении предложено применение ПАВ для повышения выхода ферментативной реакции, включающее введение ПАВ в водную смесь, содержащую фермент и субстрат фермента, где ПАВ выбирают из группы, состоящей из
(i) ПАВ, имеющих следующую формулу I:
(I)
(ii) ПАВ, имеющих следующую формулу II:
(II)
и
(iii) ПАВ, имеющих следующую формулу III:
(III)
где
1-4
R1 содержит группу поли(C-алкиленгликоля);
1-4
R2, R3, R4 и R5 независимо представляют собой C-алкил; и
5-80
5-80
R6 представляет собой C-алкил или C-алкенил.
В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предложено применение ПАВ для повышения стабильности ферментативной реакции, включающее введение ПАВ в водную смесь, содержащую фермент и субстрат фермента, где ПАВ выбирают из группы, состоящей из
(i) ПАВ, имеющих следующую формулу I:
(I)
(ii) ПАВ, имеющих следующую формулу II:
(II)
и
(iii) ПАВ, имеющих следующую формулу III:
(III)
где
1-4
R1 содержит группу поли(C-алкиленгликоля);
1-4
R2, R3, R4 и R5 независимо представляют собой C-алкил; и
5-80
5-80
R6 представляет собой C-алкил или C-алкенил.
Повышенная стабильность ферментативной реакции, в частности, включает в себя повышенную стабильность фермента в реакционной смеси.
В вариантах осуществления, описанные в данном документе признаки и примеры, включая их комбинации, для способов выполнения ферментативной реакции и водных реакционных растворов одинаково относятся к применению ПАВ для увеличения выхода и/или стабильности ферментативной реакции.
Выражение "включает" или "содержит" в данном контексте, помимо своего непосредственного значения, также включает и особенно относится к выражениям "состоит в основном из" и "состоит из". Таким образом, выражение "содержит" относится к вариантам осуществления, в которых предмет, который "содержит" конкретно перечисленные элементы, может и/или действительно включает в себя дополнительные элементы, а также к вариантам осуществления, в которых предмет, который "содержит" конкретно перечисленные элементы, не содержит другие элементы. Выражение "имеет" или "характеризуется" в данном контексте, помимо своего непосредственного значения, также включает и особенно относится к выражениям "состоит в основном из" и "состоит из".
Числовые интервалы, описанные здесь, включают числа, определяющие границы интервала. Заголовки, представленные здесь, не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления этого изобретения, которые могут быть прочитаны со ссылкой на описание в целом. Согласно одному варианту осуществления объект, описанный в данном документе как включающий определенные стадии в случае способов или как содержащий определенные ингредиенты в случае композиций, относится к объекту, состоящему из соответствующих стадий или ингредиентов. Предпочтительно выбирать и комбинировать конкретные аспекты и варианты осуществления, описанные в данном документе, а конкретный объект, возникающий из соответствующей комбинации конкретных вариантов осуществления, также охвачен настоящим раскрытием.
Перечень фигур
Фигуре 1
2
На  показано сравнение кинетики реакции в различных реакционных средах. Условия реакции: В каждую ампулу вносили 20 мг кетона 1, 5 мг KRED-EW124, 5 мг GDH, 2 мг NADP, 25 мг глюкозы, 2 мM MgCl в системах сорастворителей согласно описанию. pH=7, температура=30°C. Анализ ВЭЖХ реакционной смеси выполняли в заданный момент времени.
ПРИМЕРЫ
Пример 1.
Синтез (R)-4-гидрокси-2-(4-(метоксикарбонил)фенил)пиперидин-1-карбоксилата бензила с использовавнием кеторедуктазы
Применение ПАВ в биокатализе для модификации активностей фермента дает благоприятные результаты, такие как повышение растворимости реагентов и повышение избирательности реакции. Хотя число ПАВ, включая ионогенные жидкости, SDS и Triton X, к настоящему времени широко использовались при биопреобразованиях, применение TPGS-750-M, разработанного в лаборатории Lipshutz, в качестве альтернативного ПАВ не было исследовано. В ходе исследования опосредованной кеторедуктазой (KRED) реакции, показанной на схеме 1, значительные усилия были направлены на поиск подходящей реакционной среды, что было обусловлено низкой растворимостью обоих исходного кетона 1 и продукта-спирта 2 в этой гетерогенной реакции.
Схема 1
Сначала использовали несколько систем сорастворителей, включая TPGS, PEG400 и DMSO, в водных растворах, параллельно проводя скрининг условий указанной выше реакции. Как показано на Фиг. 1, в ходе первой фазы реакции, продолжавшейся 2,5 ч, показатели TPGS были лучше, чем у PEG400 и DMSO, при этом разница в уровнях конверсии составляла 10%. По мере дальнейшего протекания реакции, реакция шла значительно быстрее в TPGS, а наблюдаемая разница в уровнях конверсии составляла примерно 40% по сравнению с реакцией в PEG400 и DMSO за период 6 ч. Через 22 ч конверсия в реакции в TPGS была практически полной (100%), в то время как реакция в PEG400 и DMSO остановилась при конверсиях 82% и 86%, соответственно. Этот факт является следствием более низкой стабильности кеторедуктазы в присутствии добавок органических растворителей в системе обоих PEG400 и DMSO.
o
Имея в своем распоряжении результаты скрининга, мы смогли далее оптимизировать реакцию в масштабе граммов. Особенно мы сравнивали показатели систем TPGS и DMSO. Так, реакции проводили в 2% TPGS и 15% DMSO водном растворе, соответственно, при 40C, используя 5 вес.% загрузку фермента. Реакция достигла 93% конверсии через 18 ч в системе TPGS, в то время как более низкая 80% конверсия через 20 ч наблюдалась в системе DMSO. Более важно то, что реакция продолжалась и достигла 98,8% конверсии в TPGS после дополнительных 25 ч. А в случае DMSO для достижения 98,6% конверсии потребовалось дополнительно внести 2 вес.% фермента (запись 1, таблица 1). Это наблюдение наглядно демонстрирует более высокий уровень активности и стабильный характер фермента в TPGS по сравнению с DMSO. Другим интересным наблюдением было то, что после незапланированного воздействия на фермент в течение 24 ч среды с pH 4,7 в реакционной системе TPGS и после этого доведения pH до 7, фермент был по-прежнему достаточно активным, чтобы и далее катализировать реакцию с тем же уровнем активности (запись 2, таблица 1). Превосходной стабильности можно получить за счет молекулярных взаимодействий между TPGS и белком и защиты каталитически активного сайта фермента от водной реакционной среды.
Таблица 1: Сравнение кеторедуктазы в TPGS и DMSO
<b>Условия</b>
<b>2% TPGS-750M</b>
<b>DMSO/вода</b>
Конверсия при 40°C (с 5% фермента)
93% за 18 ч; вплоть до 98,8% за дополнительных 25 ч без дополнительного внесения ферментов
80% за 20 ч; вплоть до 98,6% за дополнительных 32 ч требуется дополнительное внесение ферментов
Активность фермента
По-прежнему активен в течение 6 д, даже при падении pH до 4,7 за 24 ч при к.т.
pH должен быть постоянным при 6,9-7,1 для активного катализа
2
4
2
2
4
2
o
Наконец, реакция в TPGS более пригодна для масштабирования, и соединение 1 можно добавлять в твердой форме без предварительного получения раствора или размола с целью уменьшения размера частиц. Типичная экспериментальная процедура представляет собой следующее: к дегазированному 2% по массе раствору TPGS-750-M в забуференной воде (34 мл, 10 об.; стандартный раствор готовят из 74 мл 2% по массе водного раствора TPGS-750-M, 1,6 г NaHPO.12HO и 0,5 г NaHPO.2HO) добавляли глюкозу (3,2 г, 18 ммоль, 2,0 экв.) в реактор с механическим перемешиванием, оборудованный системой регулирования pH/ОВП при к.т. Суспензию перемешивали при к.т. в течение 20 минут и к полученной смеси последовательно добавляли NADP (59 мг, чистота 68%), GDH (33 мг) и кеторедуктазу (0,16 г, 5 (вес.)% субстрата 1). Затем добавляли субстрат 1 (3,3 г, 9 ммоль, 1,0 экв.) и pH реакционную смесь доводили до 6,8-7,2 добавлением 1M водн. NaOH при к.т. Полученную смесь нагревали до 40°C и перемешивали при 40°C в течение 43 часов до завершения реакции, которое определяли с помощью ВЭЖХ. По мере протекания реакции продукт 2 выпадал в осадок из реакционной смеси и образовывал суспензию. Полученную суспензию отфильтровывали при 40C, а полученный на фильтре осадок промывали и сушили с получением продукта 2 в виде грязно-белого твердого вещества (2,8 г, чистота 97%, выход 85%).
Схема 2
Вывод: был показан благоприятный эффект от TPGS в качестве добавки при биопреобразовании, опосредованном кеторедуктазой, включая отличную кинетику реакции и устойчивость процесса. Получаемая в TPGS стабильность фермента будет сходным образом благоприятна при применении в широком перечне биокаталитических преобразований.
Пример 2:
Синтез (R)-5-фтор-3-(3-фторфенил)-2-(1-гидроксиэтил)-4H-хромен-4-она с использованием кеторедуктазы
Схема 3
Реакционная смесь:
20 мг субстрата 3
фермент кеторедуктаза KRED-EW-109 (количество: см. таблицу 2)
20 мг D-глюкозы
0,4 мг (2%(масс./масс.)) глюкозодегидрогеназы (GDH)
0,2 мг (1%(масс./масс.)) NADP
0,1M PBS (количество: см. таблицу 2)
2% TPGS-750-M (масс./масс.) в 0,1M PBS (количество: см. таблицу 2)
DMSO (количество: см. таблицу 2)
Условия реакции: pH 7,0, 30°C
Таблица 2
<b>№</b>
<b>фермент</b>
<b>0,1M PBS</b>
<b>2% TPGS в PBS</b>
<b>DMSO</b><b>(об./об.)</b>
<b>Конверсия </b>
<b>17,5 ч</b>
<b>24 ч</b>
1
1 мг5,0% (масс./масс.)
0,9мл
н.о.
0,1 мл10%(об./об.)
72,6%
67,5%
2
н.о.
1мл
н.о.
87,2%
87,2%
3
0,2 мг1,0% (масс./масс.)
0,9мл
н.о.
0,1 мл10%(об./об.)
3,9%
4,1%
4
н.о.
1мл
н.о.
11,7%
13,2%
5
0,1 мг0,5% (масс./масс.)
0,9мл
н.о.
0,1 мл10%(об./об.)
1,5%
1,5%
6
н.о.
1мл
н.о.
7,9%
9,3%
7
1 мг5,0% (масс./масс.)
0,9мл
н.о.
0,1 мл10%(об./об.)
63,2%
61,0%
8
0,5мл
0,5мл
н.о.
89,9%
90,4%
9
0,2 мг1,0% (масс./масс.)
0,9мл
н.о.
0,1 мл10%(об./об.)
2,1%
2,5%
10
0,5мл
0,5мл
н.о.
12,6%
14,4%
11
0,1 мг0,5% (масс./масс.)
0,9мл
н.о.
0,1 мл10%(об./об.)
1,2%
1,6%
12
0,5мл
0,5мл
н.о.
7,6%
8,4%
Пример 3:
Синтез 1-фенилэтанола с использованием кеторедуктазы
Схема 4
Реакционная смесь:
20 мкл ацетофенона
фермент кеторедуктаза KRED-EW-124 (количество: см. таблицу 3)
20 мг D-глюкозы
0,4 мг (2%(масс./масс.)) глюкозодегидрогеназы (GDH)
0,2 мг (1%(масс./масс.)) NADP
0,1M PBS (количество: см. таблицу 3)
2% TPGS-750-M (масс./масс.) в 0,1M PBS (количество: см. таблицу 3)
DMSO (количество: см. таблицу 3)
Условия реакции: pH 7,0, 30°C
Таблица 3
<b>№</b>
<b>фермент</b>
<b>0,1M PBS</b>
<b>2% TPGS в PBS</b>
<b>DMSO</b><b>(об./об.)</b>
<b>Конверсия</b>
<b>18 ч</b>
1
8 мг40% (масс./масс.)
0,9мл
н.о.
0,1 мл10%(об./об.)
53,5%
2
н.о.
1мл
н.о.
55,0%
3
4 мг20% (масс./масс.)
0,9мл
н.о.
0,1 мл10%(об./об.)
48,7%
4
н.о.
1мл
н.о.
52,4%
5
2 мг10% (масс./масс.)
0,9мл
н.о.
0,1 мл10%(об./об.)
45,2%
6
н.о.
1мл
н.о.
47,5%
7
8 мг40% (масс./масс.)
0,9мл
н.о.
0,1 мл10%(об./об.)
53,2%
8
0,5мл
0,5мл
н.о.
52,5%
9
4 мг20% (масс./масс.)
0,9мл
н.о.
0,1 мл10%(об./об.)
47,9%
10
0,5мл
0,5мл
н.о.
50,6%
11
2 мг10% (масс./масс.)
0,9мл
н.о.
0,1 мл10%(об./об.)
43,3%
12
0,5мл
0,5мл
н.о.
45,2%
Пример 4:
Синтез (S)-3-(3-бромпиридин-4-ил)-5-метилциклогексан-1-она с использованием ен-редуктазы
Схема 5
Реакционная смесь:
20 мкл субстрата 5
фермент ен-редуктаза ENE012 (количество: см. таблицу 4)
20 мг D-глюкозы
0,4 мг (2%(масс./масс.)) глюкозодегидрогеназы (GDH)
0,2 мг (1%(масс./масс.)) NAD
0,1M PBS (количество: см. таблицу 4)
2% TPGS-750-M (масс./масс.) в 0,1M PBS (количество: см. таблицу 4)
толуол (количество: см. таблицу 4)
Условия реакции: pH 7,0, 30°C
Таблица 4
<b>№</b>
<b>фермент</b>
<b>0,1M PBS</b>
<b>2% TPGS в PBS</b>
<b>Толуол</b><b>(об./об.)</b>
<b>Конверсия</b>
<b>19,5 ч</b>
<b>43,5 ч</b>
1
4 мг20% (масс./масс.)
0,8мл
н.о.
0,2 мл20%(об./об.)
45,8%
36,7%
2
н.о.
1мл
н.о.
82,7%
79,9%
3
2 мг10% (масс./масс.)
0,8мл
н.о.
0,2 мл20%(об./об.)
30,9%
33,8%
4
н.о.
1мл
н.о.
42,3%
69,3%
5
4 мг20% (масс./масс.)
0,8мл
н.о.
0,2 мл20%(об./об.)
47,8%
44,4%
6
0,5мл
0,5мл
н.о.
62,3%
59,0%
7
2 мг10% (масс./масс.)
0,8мл
н.о.
0,2 мл20%(об./об.)
28,1%
28,2%
8
0,5мл
0,5мл
н.о.
47,6%
75,2%