СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ С ЦИЛИНДРИЧЕСКОЙ ИОННОЙ ЛОВУШКОЙ
METHOD OF IDENTIFYING ORGANOPHOSPHORUS COMPOUNDS BY CHROMATOGRAPHIC-MASS SPECTROMETRY WITH CYLINDRICAL ION TRAP

Изобретение относится к анализу паров веществ путем измерения их физических свойств с использованием метода масс-спектрометрии в сочетании с методом хроматографии.
Изобретение может быть использовано для идентификации фосфорорганических соединений в пробах неизвестного состава методом хромато-масс-спектрометрии на основе цилиндрической ионной ловушки (ЦИЛ).
Для идентификации органических соединений хромато-масс-спектрометрическим методом анализа применяется несколько способов.
Известен способ идентификации химических веществ с использованием хроматографического индекса удерживания / Патент №2619395; от 05.05.17 г.; МПК G01N 30/86 [Текст] / Садовски Ч., Андерссон Г., Джадж К., заявитель и патентообладатель Смите Детекшен инк. - №2014104609; заявл. 03.08.12 г.; опубл. 15.05.17 г./. Недостаток данного метода заключается в невозможности идентификации веществ, отсутствующих в базе данных.
Известен способ идентификации примеси исследуемого вещества, родственной его основному компоненту / Патент №2669266; от 09.10.18 г.; Российская Федерация, МПК G01N 30/08 [Текст] / Медведевских М.Ю., Крашенинина М.П., Шохина О.С., Медведевских С.В.; Способ идентификации примеси исследуемого вещества; заявитель и патентообладатель Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии - №2017123461; заявл. 03.07.17 г.; опубл. 09.10.18 г./, который заключается в том, что первоначально идентифицируют основной компонент исследуемого вещества, затем с помощью хромато-масс-спектрометра определяют экспериментальные значения времен удерживания или индексов удерживания основного и примесных компонентов в исследуемом веществе, а также их масс-спектры, дополнительно среди примесных компонентов выявляют идентифицируемую примесь, с различными вариантами идентификации, которые включают вещество, родственное основному компоненту, далее осуществляют дериватизацию основного компонента исследуемого вещества методом, позволяющим получить из него один из вариантов идентифицируемой примеси, затем определяют значения времени или индекса удерживания и масс-спектр полученного производного основного компонента, и путем их сравнения делают вывод о совпадении/несовпадении полученного производного основного компонента исследуемого вещества и идентифицируемой примеси. Недостатком данного способа является проведение дополнительной идентификации примесных соединений, а также необходимость проведения дополнительных манипуляций с пробой, что приводит к увеличению времени проведения анализа.
2
Известен способ масс-спектрометрической идентификации соединений ряда V-газов / Патент №2616595 от 10.12.2016 г., Российская Федерация, МПК G01N 30/72 [Текст], Терентьев А.Г., Иванова М.В., Морозик Ю.И., Рыбальченко И.В., Дудкин А.В.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное казенное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военная академия радиационной, химической и биологической защиты имени Маршала Советского Союза С.К. Тимошенко» Министерства обороны Российской Федерации - №2015118563; заявл. 18.05.15 г.; опубл. 10.12.16 г./, в котором установление структуры соединения происходит в четыре этапа: масс-спектрометрией электронной ионизации (ЭИ) определяется характеристическая составляющая масс-спектра нейтральной молекулы; по масс-спектру с регистрацией отрицательно заряженных ионов при энергии ионизации 4 эВ определяется молекулярная масса соединения; устанавливается масса и строение О-алкильного радикала; определяется масса алкильного радикала путем вычитания из характерного иона массы О-алкильного радикала и фосфонотиолятной группы (POS). Недостатком данного способа является то, что идентификация проводится только для соединений одного гомологического ряда.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ идентификации органических соединений методом хромато-масс-спектрометрии / Патент №2599900 от 27.08.2016 г., Российская Федерация, МПК G01N 30/72 [Текст], Терентьев А.Г., Иванова М.В., Хатымов Р.В., Рыбальченко И.В., Дудкин А.В., Дьячков А.В.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное казенное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военная академия радиационной, химической и биологической защиты имени Маршала Советского Союза С.К. Тимошенко» Министерства обороны Российской Федерации - №2015104248/28; заявл. 09.02.15 г.; опубл. 27.08.16 г./, основанный на использовании совместно трех методов: газовой хроматографии, масс-спектрометрии ЭИ и масс-спектрометрии отрицательных ионов резонансного захвата электронов.
+
+
Недостаток данного способа состоит в том, что анализ необходимо проводить минимум два раза, что в условиях проведения экспресс-анализа требует дополнительных временных затрат и ресурсов. Вторым значимым недостатком является необходимость проведения дополнительных исследований по установлению молекулярного иона, который может регистрироваться как М, так и как псевдомолекулярный ион [М-1].
Задача настоящего изобретения заключается в разработке способа идентификации фосфорорганических соединений по масс-спектрам ЭИ, регистрируемых в условиях ЦИЛ.
Поставленная задача была решена путем выделения в условиях одного анализа масс-спектров электронной ионизации в сканах на спаде, вершине и подъеме одного хроматографического пика, отличающиеся набором пиков-ионов, как по массовым значениям, так и по их интенсивности; проведении групповой идентификация путем сравнения с масс-спектрами разных баз данных (NIST, e-OCAD); определении вероятной молекулярной массы; вычислении количества углеродных атомов в О-алкильных радикалах, при этом разница между значением псевдомолекулярного иона и иона, образующегося вследствие элиминирования алкенового фрагмента, должна быть кратна 14; по совокупности полученных данных производится идентификация фосфорорганического соединения.
Техническим результатом изобретения является повышение достоверности и надежности идентификации фосфорорганических соединений в пробах неизвестного состава, а также расширение функциональных возможностей масс-спектрометрического метода на основе цилиндрической ионной ловушки. На базе полученных результатов возможно появление программного продукта для автоматической идентификации фосфорорганических соединений.
Поставленную задачу идентификации фосфорорганических соединений решают с применением метода хромато-масс-спектрометрии с цилиндрической ионной ловушкой.
-1
На первом этапе производится ввод раствора исследуемой пробы с концентрацией более 0,1 мг⋅мл в испаритель хромато-масс-спектрометра. Далее происходит хроматографическое разделение компонентов пробы на капиллярной колонке в условиях метода с программируемым подъемом температуры печи хроматографа. После разделения компоненты пробы поступают в масс-детектор, в качестве которого используется ЦИЛ.
-5
-4
+
n
При малом объеме камеры ионизации и вакууме от 10 до 10 мм рт.ст. высокая плотная среда парогазовой фракции анализируемого вещества в квазизамкнутом объеме анализатора приводит к возможности многократного соударения ионов с нейтральными молекулами, что характерно для большинства органических молекул / Карачевцев Г.В., Виноградов П.С. Трехчастичные ионно-молекулярные процессы [Текст] // Успехи химии. 1999. №68. С. 605-618 /. Это связано с геометрией движения ионов и временем пребывания нейтральной и ионизированной форм молекулы во внутреннем объеме ЦИЛ. Накопление заряженных частиц происходит в результате постепенного увеличения амплитуды высокочастотного напряжения. В результате чего наблюдается эмиссия ионных кластеров H(M), где n>0, что приводит к искажению масс-спектра.
+
+
+
+
В области высоких масс регистрируются пики, соответствующие протонированному молекулярному иону [М+1] и его димеру [2М+1] / Smith Р.А., Lepage C.J., Lukacs М, Mattin N., Shufutinsky A., Savage P.B. Field-portable gas chromatography with transmission quadrupole and cylindrical ion trap mass spectrometric detection [Текст] / Chromatographic retention index and ion/molecule integrations for chemical warfare agent identification // International Journal of Mass Spectrometry. 2010. Vol. 295. P. 113-118/. В условиях ЦИЛ происходит химическая самоионизация (ХСИ) / Ghaderi S., Kulkarni P.S., Ledford Е.В., Wilkins C.L., Gross M.L. Chemical ionization in Fourier transform mass spectrometry [Текст] // Anal. Chem. 1981. Vol. 53. P. 428-437./, когда регистрируемые ионы [M+1] и [2М+1] образуются в условиях отсутствия в ионизационной камере вещества-реагента, сродство к протону которого меньше, чем для анализируемых веществ. На начальном этапе происходит образование дистонических ионов, которые образуются в результате изомеризации, подобной кето-енольной, основанной на последовательности миграции протона (фиг. 1) /  N., Plomley J., March R.E., Blasco Т., Tabet J.C. Formation of protonated phosphonates in the ion-trap mass spectrometer under electron impact conditions [Текст] // Rapid communications in mass spectrometry. 1995. Vol. 9. P. 5-8. / Holtzclaw J.R., Wyatt J.R., Campana J.E. Structure and Fragmentation of Dimethyl Methylphosphonate and Trimethyl Phosphite [Текст] // Organ. Mass Spectrom. 1985. Vol. 20, P. 90-97/.
+
При этом механизм ион-молекулярной реакции в ионной ловушке предполагает формирование комплексного димера с нечетным числом электронов, который разрушается с образованием свободного радикала и иона MH (фиг. 2).
+
Далее в результате ион-молекулярной реакции образуется электрофил, который склонен к нуклеофильному присоединению нейтральной молекулы. При плотном газовом потоке в источнике ионов [М+1] и нейтральные молекулы вступают в реакцию электрофильного присоединения с образованием ковалентно связанного аддукта с несколькими формами резонансной стабилизации положительного заряда.
+
+
+
+
На втором этапе определяются псевдомолекулярные ионы [М+1] и [2М+1]. Образование протонированного молекулярного иона и его димера зависит от количества анализируемого аналита и времени его ионизации / McLuckey S.A., Glish G.L., Asano K.G., Van Berkel G.J. Self chimical ionization in an ion trap mass spectrometer [Текст] // Anal. Chem. 1988. Vol. 61. P 2312-2314/. Поскольку хроматографический пик регистрирует отклик детектора, отображая постепенное нарастание концентрации вещества и последующее ее уменьшение, то, следовательно, на вершине хроматографического пика будут регистрироваться псевдомолекулярные ионы, а на склонах хроматографического пика, где должна быть минимальная концентрация исследуемого вещества, они будут отсутствовать, или их интенсивность будет слабая. Однако, в условиях ЦИЛ псевдомолекулярный ион [М+1] может образовываться по двум механизмам. Первый механизм - ион-молекулярные реакции, в результате которых образуется псевдомолекулярный ион, второй - распад протонированного димера. При этом можно предполагать, что время распада димерного иона [2М+1] зависит от термодинамической устойчивости, определяющейся строением исследуемого соединения, что может привести к незначительным смещениям пиков образующихся ионов относительно вершины.
Таким образом, хроматографический пик исследуемого соединения условно разбивается на три сегмента («а», «б», «в» фиг. 3). Проводится регистрация масс-спектра в каждом сегменте. Выделение масс-спектров из полученного хроматографического пика происходит справа налево. Масс-спектр, регистрируемый в сегменте «а» (от полувысоты правого склона до конца хроматографического пика), наиболее схож с масс-спектрами ЭИ, представленными в электронных библиотеках [NIST, e-OCAD], по которому проводится предварительная групповая идентификация ФОС.
+
+
+
В сегментах «б» и «в» в масс-спектрах будет регистрироваться псевдомолекулярный ион [М+1] (также возможна совместная регистрация [М+1] и [2М+1]), интенсивность которого будет изменяться при перемещении от скана к скану. Для ФОС образование псевдомолекулярного иона происходит и при наличии  в спектрах ЭИ.
+
+
Масс-спектр ФОС характеризуется образованием димера певдомолекулярного иона [2М+1] с молекулярной массой до 212 Да. В случае, если молекулярная масс ФОС более 212 Да, его димер не регистрируется (ограничение регистрации масс в конкретном приборе). При этом происходит уменьшение интенсивности иона [М+1] и увеличение некоторых фрагментарных ионов, в целом, масс-спектр будет схож с масс-спектром, регистрируемом в сегменте «а».
На третьем этапе проводится подтверждение молекулярной массы.
+
+
+
В случае регистрации  в масс-спектре ЭИ должен регистрироваться [М+1], интенсивность которого от скана к скану будет изменяться. Значение иона [2М+1] должно являться суммой  и [М+1]. Соблюдение данного равенства подтвердит гипотезу о наличии
В случае отсутствия молекулярного иона в спектре ЭИ определяется ион (m/z (X)), который образуется вследствие элиминирования алкоксильного радикала с обратной миграцией двух атомов водорода к фосфорсодержащему фрагменту, с последующим протонированием Р=O и Р-O связей, например:
2
+
- для О-алкилалкилгалогенфосфонатов - ион [R-P(OH)Hal];
3
+
- для O,O-диалкилалкилфосфонатов - ион [R-P(OH)];
4
+
- для O,O,O-триалкилфосфатов - ион [Р(ОН)];
2
2
+
- для O,O-диалкилдиалкилпирофосфонатов [(R-Р(ОН))О] и др.
Далее по уравнению (1) проводится расчет числа углеродных атомов в отщепляемых при ЭИ алкильных радикалах. Значение разницы масс [М+1] и m/z (X) для ФОС должно быть кратно 14.
где: N - количество углеродных атомов в алкильных радикалах (целое число);
[М+1] - массовое значение предполагаемого псевдомолеклярного иона;
m/z (X) - массовое значение группового иона, образующегося в результате отщепления алкильных радикалов.
Значение N, вычисленное по уравнению (1), может быть нецелочисленным при неправильном выборе псевдомолекулярного или группового иона, что свидетельствует о ложной групповой идентификации на первом этапе.
В таблице 1 представлены результаты выполнения критерия уравнения (1) для органических соединений с молекулярной массой до 424 Да, содержащихся в базе данных NIST. В столбце 4 указано количество органических соединений, имеющих в масс-спектре характеристичный ион, схожий по своему значению с ФОС. Столбец 5 содержит данные по количеству соединений из столбца 4, для которых результат расчета по уравнению (1) является целым числом. В столбцах 6-8 представлено количество соединений, для которых с определенной вероятностью может возникнуть ошибка идентификации.
Данные таблицы 1 показывают, что для соединений рассмотренных классов вероятность ошибок идентификации, которые могут быть как I, так и II рода по уравнению (1) для соединений, не содержащих фосфорорганический фрагмент, составляет менее 1%.
Следующим действием является проверка правильности выбора всех ионов по уравнению (2):
Выполнение данного равенства позволит определить молекулярную массу исследуемого соединения и количество углеродных атомов в О-алкильном радикале.
На четвертом этапе определяется разветвление О-алкильного радикала. По данным масс-спектра, регистрируемого в сегменте «а», определяются структурные особенности строения О-алкильного радикала, с учетом правил масс-фрагментации, характерных для данного ряда ФОС. Для каждой гипотетической структуры проводится сопоставление экспериментального значения индекса удерживания со справочным (рассчитанным) значением для данного ФОС / Морозик Ю.И., Смирнов А.О. Прогнозирование масс-спектров О-метил, О-алкилметилфосфонатов // Масс-спектрометрия. 2008. Т. 5, №3. С. 211-218. / Лебедев А.Т., Морозик Ю.И., Рыбальченко И.В., Мясоедов Б.Ф., Фоменко П.В. Установление строения О-алкилфторфосфонатов методом масс-спектрометрии и компьютерное прогнозирование их масс-спектров // Масс-спектрометрия. 2007. Т. 4, №4. С. 255-266/.
По результатам выполнения всех этапов делается вывод о структуре анализируемого ФОС.
В качестве примера рассмотрим проведение идентификации пробы триэтилфосфата предложенным способом.
На первом этапе 1 мкл раствора триэтилфосфата в гексане с концентрацией 0,5 мг/мл анализировали на хромато-масс-спектрометре с ЦИЛ.
На фиг. 4 представлен хроматографический пик триэтилфосфата, полученный в условиях ЦИЛ.
На втором этапе производилось условное разделение хроматографического пика на три сегмента с последующей фиксацией уникальных масс-спектров в каждом сегменте.
На фиг. 5 представлены масс-спектры, зафиксированные в сегментах «а», «б» и «в» хроматографического пика, полученного в условиях ЦИЛ. Масс-спектр сегмента «а» сравнивается с масс-спектром, представленным в библиотеке NIST. Фактор совпадения (Match) при поиске по специализированной библиотеке ФОС составляет 78,4%. Таким образом можно предположить что данное соединение относится к ряду O,O,O-триалкилфосфатов.
+
+
Как видно масс-спектр «б» фиг. 5 существенно отличается от масспектра «а 2». Наблюдаются характеристичные ионы с m/z 183 и 365 Да, при этом интенсивность иона с m/z 183 Да в масс-спектре «а 1» снижается до 10%. В масс-спектре «в» ион с m/z 365 Да не наблюдается, однако, ион с m/z 99 Да остается характеристичным, а интенсивность иона с m/z 183 Да составляет 20%. Исходя из этого можно предположить, что ион с m/z 183 Да является псевдомолекулярным [М+1]. Поскольку 183 масса меньше 212 Да, то должен регистрироваться димер [2М+1], m/z которого составляет 365 Да.
4
+
На третьем этапе проводим подтверждение молекулярной массы. Для данного ряда определяем, что ион с m/z 99 Да является ионом m/z (X) - [Р(ОН)]. По уравнению (1) рассчитываем количество углеродов в отщепляемых алкильных радикалах:
По уравнению 2 проверяем правильность отнесения всех ионов к [М+1] и [2М+1]:
365-183=6⋅14+99-1,
182=182
n
Таким образом получаем молекулярную массу исследуемого соединения М=182 и число углеродных атомов в отщепляемых алкильных радикалах C=6.
На четвертом этапе по известным направлениям фрагментации соединений ряда O,O,O-триалкилфосфатов определяем распределение углеродных атомов по алкильным радикалам. В данном случае алкильные радикалы содержат по 2 углеродных атома.
Данные, представленные на фиг. 5, подтверждают теоретические положения предлагаемого способа.
th
Актуальность изобретения обусловлена тем, что молекулярный ион в масс-спектрах, представленных в базах данных NIST'08, Willey 8 для 39% органических соединений мало интенсивен (менее 5%) или вообще отсутствует. При этом число масс-спектров ЭИ фосфорорганических соединений, подлежащих контролю, согласно требованиям Конвенции о запрещении химического оружия, у которых регистрируется молекулярный ион еще меньше относительно их общего количества. Так, по данным базы данных e-OCAD v.20-2018, для соединений ряда O,O-диалкилалкилфосфонатов, молекулярный ион отсутствует (или менее 5%) в 97,8% спектров, для соединений ряда О-алкилалкилфторфосфонатов - в 97,9% спектров, для соединений ряда веществ типа VX - более 99% спектров. Однако молекулярный ион является важной структурной информацией, которая позволяет резко уменьшить число гипотез о природе определяемых веществ / Мильман Б.Л. Развитие новых подходов к масс-спектрометрической и хромато-масс-спектрометрической идентификации органических соединений // дис. докт. хим. наук: 02.00.02: защ. 23.11.06 г.,/ Мильман Борис Львович. С.-П., 2006. 236 с./, а его отсутствие в масс-спектрах ЭИ снижает достоверность идентификации неизвестных соединений, основанной на библиотечном поиске / Самохин А.С., Ревельский И.А. Интенсивность пика молекулярного иона в масс-спектрах электронной ионизации // Масс-спектрометрия. 2012. №9. С 58-60/. В связи с этим, разработка способов идентификации фосфорорганических соединений, направленных на выявление молекулярного иона и его фрагментации в условиях ЭИ, является актуальной задачей и имеет важное практическое значение.