ЛИНИИ СКОНСТРУИРОВАННЫХ КЛЕТОК-ПРОДУЦЕНТОВ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

1. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащая клетки, в которых экспрессия ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.
2. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 1, содержащая клетки, в которых экспрессия KCNN2, LINC00319, RGMA и SPANXN3 снижена по сравнению с контрольными родительскими клетками.
3. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 1 или 2, в которой экспрессию снижают с использованием нуклеазы, двухцепочечной РНК (dsRNA), малой интерферирующей РНК (siRNA), малой шпилечной РНК (shRNA), микроРНК (miRNA) или антисмыслового РНК-олигонуклеотида (ASO).
4. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по любому из пп. 1-3, в которой экспрессию снижают с помощью siRNA, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 1-11.
5. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 4, в которой экспрессия ATP5EP2 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 32 в антисмысловой нити.
6. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 4, в которой экспрессия LINC00319 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 33 в антисмысловой нити.
7. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 4, в которой экспрессия CYP3A7 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 34 в антисмысловой нити.
8. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 4, в которой экспрессия NOG снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 35 в антисмысловой нити.
9. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 4, в которой экспрессия SPANXN3 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 36 в антисмысловой нити.
10. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 4, в которой экспрессия MYRIP снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 37 в антисмысловой нити.
11. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 4, в которой экспрессия KCNN2 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 38 в антисмысловой нити.
12. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 4, в которой экспрессия NALCN-AS1 снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 39 в антисмысловой нити.
13. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 4, в которой экспрессия RGMA снижена, а siRNA содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9 в смысловой нити и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 40 в антисмысловой нити.
14. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 4, в которой экспрессия PGA5 снижена, а siRNA содержит последовательность SEQ ID NO: 10 в смысловой нити и последовательность SEQ ID NO: 41 в антисмысловой нити.
15. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 4, в которой экспрессия ABCA10 снижена, а siRNA содержит последовательность SEQ ID NO: 11 в смысловой нити и последовательность SEQ ID NO: 42 в антисмысловой нити.
16. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 3, в которой нуклеазу выбирают из группы, состоящей из нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), мегануклеазы, нуклеазы на основе эффектора, подобного активатору транскрипции (TALEN), или белка, ассоциированного с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR).
17. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по пп. 1-16, в которой экспрессию снижают с использованием редактирования генома CRISPR.
18. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 17, в которой экспрессию снижают с использованием пары направляющих РНК, причем каждая направляющая РНК:
(a) содержит последовательность, выбранную из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 12-15, и/или
(b) нацелена на последовательность ДНК-мишени, выбранную из любой из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 16-31.
19. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 18, в которой пару gRNA используют для нацеливания на KCNN2, и она содержит первую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12, и вторую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13.
20. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 18, в которой пару gRNA используют для нацеливания на KCNN2, и она содержит первую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14, и вторую молекулу gRNA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15.
21. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 19 или 20, в которой каждая молекула gRNA представляет собой аналог 2’ O-метила, содержащий 3’ фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в трех концевых нуклеотидах на одном или обоих его 5’ и 3’ концах.
22. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по любому из пп. 1-21, в которой экспрессия гена устранена по сравнению с контрольными родительскими клетками.
23. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по любому из пп. 1-22, в которой линией клеток является линия клеток человека.
24. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков по п. 23, в которой линией клеток человека является линия клеток HeLa или линия клеток 293 первичной почки (HEK) человека.
25. Линия клеток по любому из пп. 1-24, в которой линией клеток является линия клеток-упаковщиков rAAV.
26. Линия клеток по любому из пп. 1-24, в которой линией клеток является линия клеток-продуцентов rAAV.
27. Линия клеток по п. 26, в которой титр rAAV увеличен примерно в 1,5 - примерно в 7 раз по сравнению с титром rAAV, полученным из линий клеток, содержащей контрольные родительские клетки.
28. Лизат линии клеток по любому из пп. 1-27.
29. Супернатант клеточной культуры из линий клеток по любому из пп. 1-27.
30. Способ получения линии клеток-продуцентов, причем способ включает доставку рекомбинантного аденоассоциированного вирусного (rAAV) вектора в клетки линии клеток-упаковщикова по п. 25.
31. Способ получения rAAV, причем способ включает заражение клеток линии клеток-продуцентов, полученной способом по п. 30, вирусом-помощником.
32. Способ получения rAAV, причем способ включает заражение клеток линии клеток-продуцентов по п. 26 вирусом-помощником.
33. Способ по п. 31 или 32, в котором rAAV собирают из линий клеток-продуцентов.
34. Способ по любому из пп. 31-33, в котором выработка rAAV повышена по сравнению с контрольной родительской линией клеток.
35. Способ идентификации одного или нескольких генов, имеющих отношение к выработке rAAV, причем способ включает:
i. добавление одной или нескольких добавок, которые повышают титр rAAV в линии клеток;
ii. Измерение глобальной экспрессии гена в транскриптоме в линиях клеток с добавками и без добавок;
iii. Получение списка генов, которые дифференциально экспрессируются между линиями клеток с добавками и без добавок; и
iv. Идентификацию одного или нескольких генов, которые имеют отношение к выработке rAAV.
36. Способ по п. 35, в котором одна или несколько добавок, добавленных в линию клеток, включают дексаметазон, гидрокортизон, преднизолон, метилпреднизолон, бетаметазон, кортизон, преднизон, будезонид или триамцинолон.
37. Способ получения линии клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV для стимулирования повышенной выработки rAAV, причем способ включает модуляцию экспрессии одного или нескольких генов, идентифицированных с использованием способа по п. 35.
38. Способ по любому из пп. 35-37, в котором линией клеток является линия клеток-упаковщиков rAAV.
39. Способ по любому из пп. 35-37, в котором линией клеток является линия клеток-продуцентов rAAV.
40. Способ по п. 39, в котором линия клеток-продуцентов rAAV увеличивает титр rAAV по меньшей мере в 1,5 раза больше титра rAAV, вырабатываемого линией клеток-продуцентов rAAV без модуляции экспрессии соответствующих одного или нескольких генов.
41. Способ по любому из пп. 37-40, в котором модуляция экспрессии включает в себя снижение экспрессии одного или нескольких генов.
42. Способ по любому из пп. 37-40, в котором модуляция экспрессии включает в себя устранение экспрессии одного или нескольких генов.
43. Способ по любому из пп. 30-42, в котором линией клеток является линия клеток человека.
44. Способ по п. 43, в котором линией клеток человека является линия клеток HeLa или линия клеток 293 первичной почки (HEK) человека.
45. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащая клетки, которые были сконструированы для снижения экспрессии и/или активности продукта гена, экспрессированного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1, по сравнению с соответствующими немодифицированными родительскими клетками.
46. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV по п. 45, в которой экспрессия и/или активность продукта гена, экспрессированного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1, снижена на неопределенный срок или навсегда.
47. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV по п. 46, причем линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать разрыв гена или частичную или полную делецию гена по меньшей мере в одном из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1.
48. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV по п. 47, причем линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать разрыв гена по меньшей мере в одном из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1.
49. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV по п. 47, причем линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать разрыв гена по меньшей мере в двух генах, выбранных из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и NALCN-AS1.
50. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV по п. 47, причем линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать частичную или полную делецию гена по меньшей мере в одном из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и/или NALCN-AS1.
51. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков rAAV по п. 47, причем линия клеток была сконструирована так, чтобы содержать частичную или полную делецию гена по меньшей мере в двух генах, выбранных из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и NALCN-AS1.
52. Линия клеток-продуцентов и/или упаковщиков рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), причем указанная линия клеток демонстрирует снижение экспрессии и/или активности полипептида или полирибонуклеотида, экспрессированного по меньшей мере из одного из ATP5EP2, LINC00319, CYP3A7, ABCA10, NOG, RGMA, SPANXN3, PGA5, MYRIP, KCNN2 и NALCN-AS1, по сравнению с соответствующей родительской линией клеток.