СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШПИЛЕЧНОЙ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОЙ МОЛЕКУЛЫ РНК

1. Способ получения шпилечной одноцепочечной молекулы РНК, способной ингибировать экспрессию гена-мишени, включающий:
стадию гибридизации для гибридизации первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК; и
стадию лигирования для лигирования 3'-конца первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК и 5'-конца второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК посредством лигазы семейства Rnl2,
где первая одноцепочечная молекула олиго-РНК содержит первую область РНК и вторую область РНК, соединенные посредством первого линкера, и одна из первой области РНК и второй области РНК является способной к комплементарному связыванию с другой,
вторая одноцепочечная молекула олиго-РНК содержит третью область РНК и четвертую область РНК, соединенные посредством второго линкера, и одна из третьей области РНК и четвертой области РНК является способной к комплементарному связыванию с другой,
первая одноцепочечная молекула олиго-РНК и вторая одноцепочечная молекула олиго-РНК являются способными формировать межмолекулярную двойную цепь между комплементарными последовательностями на их 5'-конце или 3'-конце,
когда двойная цепь формируется между первой одноцепочечной молекулой олиго-РНК и второй одноцепочечной молекулой олиго-РНК во время стадии гибридизации, возникает ник между 3'-концевым рибонуклеотидным остатком первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК и 5'-концевым рибонуклеотидным остатком второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, и пропуск по меньшей мере одного рибонуклеотидного остатка присутствует между 5'-концевым рибонуклеотидным остатком первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК и 3'-концевым рибонуклеотидным остатком второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, и
последовательность, полученная посредством лигирования первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, содержит ингибирующую экспрессию гена последовательность для гена-мишени.
2. Способ по п. 1, где первая одноцепочечная молекула олиго-РНК представлена следующей формулой (I), и вторая одноцепочечная молекула олиго-РНК представлена следующей формулой (II):
1
5'-Xs-Lx-Xa-3' - формула (I)
1
2
3
2
5'-Ya-Ya-Ya-Lx-Ys-3' - формула (II),
1
2
3
где каждый из Xs, Xa, Ya, Ya, Ya и Ys представляет один или несколько рибонуклеотидных остатков,
1
2
Lx и Lx представляют первый линкер и второй линкер соответственно,
3
Ya является комплементарным Ys,
1
Xa-Ya, полученный посредством стадии лигирования, является комплементарным Xs, и
1
2
3
Xa-Ya-Ya-Ya, полученный посредством стадии лигирования, содержит ингибирующую экспрессию гена последовательность для гена-мишени.
3. Способ по п. 1 или 2, где первая одноцепочечная молекула олиго-РНК имеет урацил (U) или аденин (A) на 3'-конце, и вторая одноцепочечная молекула олиго-РНК имеет урацил (U) или аденин (A) на 5'-конце.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где каждый из первого линкера и второго линкера независимо представляет собой (i) ненуклеотидный линкер, содержащий по меньшей мере один, выбранный из пирролидинового остова и пиперидинового остова, или (ii) нуклеотидный линкер.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где лигаза семейства Rnl2 представляет собой РНК-лигазу 2 T4.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где лигирование проводят в реакционном растворе при pH 7,4-8,6.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где лигирование проводят в реакционном растворе, содержащем 2-10 мМ двухвалентный ион металла.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где каждый из первого линкера и второго линкера независимо представляет собой ненуклеотидный линкер, представленный следующей формулой (VI):
Формула (VI).
9. Способ по любому из пп. 1-8, где ген-мишень представляет собой ген TGF-β1, ген GAPDH, ген LAMA1 или ген LMNA.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где шпилечная одноцепочечная молекула РНК состоит из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1, где рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством первого линкера, и рибонуклеотидные остатки в положениях 50 и 51 соединены посредством второго линкера.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где первая одноцепочечная молекула олиго-РНК и вторая одноцепочечная молекула олиго-РНК представляют собой любые из следующих (1)-(6):
(1) комбинация первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством первого линкера, и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 10 и 11 соединены посредством второго линкера;
(2) комбинация первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 19, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством первого линкера, и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 18, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 16 и 17 соединены посредством второго линкера;
(3) комбинация первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 27, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством первого линкера, и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 26, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 20 и 21 соединены посредством второго линкера;
(4) комбинация первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 29, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством первого линкера, и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 28, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 21 и 22 соединены посредством второго линкера;
(5) комбинация первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 31, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством первого линкера и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 30, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 22 и 23 соединены посредством второго линкера;
(6) комбинация первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 33, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством первого линкера, и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 32, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 23 и 24 соединены посредством второго линкера.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где указанная стадия лигирования включает, после первой реакции лигирования, осуществление один раз или повторение более одного раза дополнительной стадии реакции дополнительного добавления первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК для проведения дополнительной реакции лигирования.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где указанную лигазу семейства Rn12 используют в количестве 10 единиц или меньше на нмоль первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК и/или второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК.
14. Способ по п. 2, в котором Ха имеет длину от 2 до 20 нуклеотидов.
15. Одноцепочечная молекула олиго-РНК, представляющая собой любую из следующих (a)-(l):
(a) одноцепочечная молекула олиго-РНК, состоящая из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством линкера;
(b) одноцепочечная молекула олиго-РНК, состоящая из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 10 и 11 соединены посредством линкера;
(c) одноцепочечная молекула олиго-РНК, состоящая из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 19, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством линкера;
(d) одноцепочечная молекула олиго-РНК, состоящая из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 18, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 16 и 17 соединены посредством линкера;
(e) одноцепочечная молекула олиго-РНК, состоящая из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 27, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством линкера;
(f) одноцепочечная молекула олиго-РНК, состоящая из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 26, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 20 и 21 соединены посредством линкера;
(g) одноцепочечная молекула олиго-РНК, состоящая из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 29, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством линкера;
(h) одноцепочечная молекула олиго-РНК, состоящая из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 28, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 21 и 22 соединены посредством линкера;
(i) одноцепочечная молекула олиго-РНК, состоящая из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 31, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством линкера;
(j) одноцепочечная молекула олиго-РНК, состоящая из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 30, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 22 и 23 соединены посредством линкера;
(k) одноцепочечная молекула олиго-РНК, состоящая из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 33, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством линкера; и
(l) одноцепочечная молекула олиго-РНК, состоящая из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 32, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 23 и 24 соединены посредством линкера.
16. Набор для получения шпилечной одноцепочечной молекулы РНК для ингибирования экспрессии гена TGF-β1, содержащий комбинацию одноцепочечных молекул олиго-РНК по любому из следующих (1)-(6):
(1) комбинация первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством первого линкера, и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 10 и 11 соединены посредством второго линкера;
(2) комбинация первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 19, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством первого линкера, и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 18, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 16 и 17 соединены посредством второго линкера;
(3) комбинация первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 27, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством первого линкера, и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 26, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 20 и 21 соединены посредством второго линкера;
(4) комбинация первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 29, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством первого линкера, и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 28, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 21 и 22 соединены посредством второго линкера;
(5) комбинация первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 31, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством первого линкера, и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 30, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 22 и 23 соединены посредством второго линкера; и
(6) комбинация первой одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 33, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 24 и 25 соединены посредством первого линкера, и второй одноцепочечной молекулы олиго-РНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 32, в которой рибонуклеотидные остатки в положениях 23 и 24 соединены посредством второго линкера.