Стволовые клетки и клеточные технологии: настоящее и будущее

б главная тема: клетки в законе: регулирование биотехнологий

PEMEDIIUM 2006 август

М.А.ПАЛЬЦЕВ, академик РАН и РАМН, д.м.н., проф.

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ: НАСТОЯЩЕЕ И БУДУЩЕЕ

В 1908 г. русский гистолог А.А.Максимов сформулировал концепцию существования стволовых клеток в кроветворной ткани (стволовых кроветворных клеток). В середине 70-х годов А.Я.Фриденштейн с соавторами описали стволовую мезенхимальную клетку в строме костного мозга. Успешные исследования стволовых клеток, проводимые до начала 90-х годов в ряде институтов РАН и РАМН, позволяли сохранять определенные приоритеты отечественной науки до середины 90-х годов ХХ в. Однако дальнейшие исследования стволовых клеток в нашей стране практически прекратились, за исключением работы отдельных научных групп.

ПЕРСПЕКТИВЫ РЕГЕНЕРАТОРНОЙ ЕРАПИИ I

В 1998 г. исследователям Университета штата Висконсин удалось получить культуру эмбриональных стволовых клеток человека, которые дифференцировались в нервные, мышечные и костные клетки, а также клетки островков поджелудочной железы. Открытие возможности культивирования эмбриональных стволовых клеток по своей значимости стоит в одном ряду с открытием ДНК и расшифровкой генома человека.

Потенциальные возможности стволовых клеток стимулировали поиск подходов для их использования в медицине и породили большие надежды, связанные с принципиально новыми, так называемыми клеточными технологиями. Клеточные технологии — совокупность методов, направленных на выделение отдельных типов клеток из какой-либо ткани, их культивирование (выращивание) с целью увеличения количества определенного типа клеток и последующего использования продуктов жиз-

недеятельности этих клеток или самих клеток в научных или научно-практических целях. Это новая многообещающая отрасль современной биомедицины, и от того, по какому пути она пойдет, зависит будущее медицины в ближайшие десятилетия.

Уже к июню 2002 г. было создано более 30 биотехнологических старт-ап компаний в 11 странах с ежегодным бюджетом около 200 млн. долл., основной коммерческой деятельностью которых стали технологии, основанные на применении стволовых клеток и терапевтическом клонировании. Рынок клеточных технологий в 2005 г. оценивался в 26,6 млрд. долл., в 2010 г. — в 56,2 млрд. долл., в 2015 — в 96,3 млрд. долл. На сегодняшний день более 300 компаний занимаются разработкой подходов к клеточной терапии, из них 85 — с использованием стволовых клеток. Трансплантация стволовых клеток прочно вошла в арсенал современных подходов к лечению целого ряда наследственных и приобретенных заболеваний. Аутологичные кроветворные стволовые клетки уже на протяжении

Cell techlogies is a new and promising area of biomedicine nowadays and the way it’s going to develop will define the future of medical science for the few next decades. The article considers the current problems of application the cell technologies to medical practice and the state regulations of the issue in Russia and EU countries. M.A.PALCEV, Doctor of Medicine, professor, academician of the Russian Academy of Sciences and Russian Academy of Medical Sciences. Stem cells and cell technologies: the present and the future.

двух десятилетий используются для восстановления кроветворения у пациентов с онкологическими и гематологическими заболеваниями. Аутологичные мезенхимальные клетки применяются при лечении инфаркта миокарда и хронической сердечной недостаточности. Активно разрабатываются подходы к применению трансплантации стволовых клеток при лечении заболеваний, которые до последнего времени считались неизлечимыми с помощью традиционных подходов: инсульта, нейродегенеративных заболеваний, травм головного и спинного мозга.

Использование клеток, выделенных из различных органов и тканей человека, для лечения заболеваний получило название «регенераторная медицина». В регенераторной медицине условно можно выделить два направления — клеточная и тканевая инженерия. Клеточная инженерия основывается на выделении определенных типов клеток, придании им in vitro с помощью генетических конструкций или «сигнальных» молекул специфических свойств

и введения их в организм больного. Наиболее ярким примером клеточной инженерии является использование дендритных клеток для модуляции иммунного статуса и стволовых клеток как инструментов для генной терапии. Тканевая инженерия является самостоятельным междисциплинарным направлением. Эта форма терапии отличается от стандартной терапии тем, что сформированная инженерным путем ткань интегрируется в организм пациента, осуществляя постоянное и специфическое лечение болезни.

При создании новой ткани используют один из трех общих подходов:

1. Дизайн и выращивание ткани человека in vitro с последующей ее имплантацией для восстановления или замещения поврежденных тканей. Наиболее ярким примером подобной терапии является пересадка компонентов кожи при лечении ожогов, использующаяся в клинике более 10 лет.

2. Имплантация клеток, содержащих средства, индуцирующие репарацию или регенерацию функции поврежденных тканей. Этот подход основан на выделении клеток, добавлении к ним определенных «сигнальных» молекул, подобных факторам роста, и переносе этих клеток в биоматериалы, обеспечивающие регенерацию тканей. Наиболее часто в качестве биоматериалов ис-

пользуются новые полимеры, образующие трехмерные конфигурации, удобные для прикрепления и роста клеток, реконструирующих поврежденные ткани. Примером такого биоматериала является биоматрикс, стимулирующий рост костной ткани при заболеваниях периодонта.

3. Использование внутренних потенциалов тканей для восстановления функции поврежденных органов и тканей. Этот подход использует технику выделения стволовых клеток (СК), которые либо имплантируются пациенту непосредственно в суспензии или в структурном матриксе, либо после коммити-рования in vitro.

|СВОЙ ИЛИ ЧУЖОЙ

В тех случаях, когда необходим зрелый имплантат и ожидается минимальный тканевой ремоделинг, предпочтительным клеточным источником является аутогенный материал. Аллогенные же клетки, как было показано на примере дермального эквивалента, приобретают особую практическую ценность, когда речь идет о конструировании временной провизиональной ткани. Аллогенный материал, иммуноген-ность которого может варьировать, в ходе репарации подвергается постепенному лизису или даже отторгается,

стимулируя в то же самое время репа-ративный процесс за счет собственных сил организма.

Применение того или иного подхода зависит от конечной цели и имеет свои «за» и «против». Понятно, что неоспоримым преимуществом аутогенного источника является отсутствие иммунной реакции, хотя риск инфицирования при этом не сводится к нулю, т.к. клетки проходят ряд этапов вне организма, прежде чем быть заново ретрансплантированными в составе реконструированой ткани или части органа. Проблемы, однако, в основном связаны с получением нужного количества клеток in vitro за желаемый промежуток времени. На фоне успехов, достигнутых в технологиях культивирования, когда стало возможным первичное культивирование практически любых типов клеток из весьма ограниченного фрагмента ткани, использование собственных клеток пациента кажется наиболее простым выбором. Однако здесь существуют определенные ограничения. Возможность получения адекватного биопсийного материала зависит от требуемого типа ткани и состояния пациента, подразумевающего, что лимитирующими факторами могут стать те или иные заболевания и/или возраст. Особенности некоторых типов тканей не располага-

ют к получению такого количества аутологичных клеток, которого было бы достаточно для первичного размножения в культуре. Например, для изоляции минимально необходимого количества клеток из суставного хряща взрослого пациента требуется недопустимо большой фрагмент хрящевой ткани из-за относительно низкой плотности хондроцитов и слишком низкого пролиферативного потенциала. А для получения 20 млн. остеобластов из надкостницы 36-летнего пациента (для реконструкции дистальной фаланги большого пальца) потребовалось 9 недель. Подобные ситуации иногда предопределяют неизбежность обращения к аллогенным источникам, в качестве которых могут служить операционный и абортивный материал, а для низковаскуляризированных тканей также и свежий трупный материал. Несомненным преимуществом использования аллогенных источников является, в основном, их сиюминутная доступность, например посредством создания банков аллогенных донорских тканей и клеток. Получение и поддержание аллогенных культур и

криоконсервация тканей и суспензий культивированных аллогенных клеток дает возможность получать клетки требуемого типа в нужных количествах за предельно короткий промежуток времени.

Главной проблемой использования ал-логенных клеток, однако, все же является реакция отторжения. Но и здесь необходимо учитывать, что сила иммунного ответа колеблется, опять-та-ки, в зависимости от клеточного типа. Эндотелиальные клетки, как правило, индуцируют сильный ответ, в то время как фибробласты, кератиноциты и гладкомышечные клетки сами по себе менее иммуногенны. Реакция также зависит от возраста донора. Так, фетальные и неонатальные клетки проявляют низкую иммуногенность, вплоть до полного ее отсуствия. Помимо выявления инфекций, аллогенный материал необходимо подвергать скринингу на предмет других потенциальных рисков, ассоциированных, например, с ненормальным кариотипом и приобретением туморогенности.

БИОБАНКИ — СОКРОВИЩНИЦЫ КЛЕТОК

В настоящее время для получения и хранения аллогенных клеток используются биобанки. В частности, в нашей стране и за рубежом активно создаются банки стволовых клеток, хранящие в основном плацентарную/пуповинную кровь. Создание коллекции образцов стволовых клеток пуповинной крови представляет реальную альтернативу регистрам костного мозга, и все необходимые условия для этого существуют. Ежегодно в мире происходят десятки миллионов родов, т.е. существует неиссякаемый источник стволовых клеток. Их получение не несет опасности для здоровья донора. В отличие от крови взрослых доноров, пуповинная кровь крайне редко бывает инфицирована вирусами и другими агентами, представляющими потенциальную опасность для здоровья реципиента. Программы по созданию банков стволовых клеток пуповинной крови активно развиваются практически во всех странах мира. Первое из подобных учреждений — Нью-Йоркский Центр Крови — появилось в 1993 г.; в том же году были созданы банки стволовых клеток в Милане и Дюссельдорфе. Сегодня в мире насчитывается около 50 активных банков-регистров, в которых

хранится, в общей сложности, около 200 000 готовых для трансплантации единиц пуповинной крови.

«Именные» или «семейные» банки СК пуповинной крови представляют собой альтернативу банкам-регистрам. Эти банки осуществляют целевое хранение клеток, предполагающее их перспективное применение в случае возникновения заболевания у самого ребенка или его ближайших родственников. В отличие от банков-регистров, нормальное функционирование которых (т.е. высокая вероятность подбора совместимого донора) возможно лишь при определенном объеме хранилища (обычно, десятки тысяч образцов), именные банки не имеют подобных ограничений. Во всем мире «именное» хранение стволовых клеток пуповинной крови развивается не менее активно, а количество образцов, хранящихся в частных банках, не уступает запасам банков-регистров: отдельные коллекции уже давно превысили десятки тысяч образцов.

Россия только вступает на путь создания банков стволовых клеток. Поскольку в стране нет (и не было) регистра доноров костного мозга, сегодня предпочтение следует отдавать наиболее перспективному направлению — созданию регистра пуповинной крови. Финансирование подобного проекта должно осуществляться государством и контролироваться Минздравсоцразвития РФ.

РЕМШІШМ

На первых порах работа в этом направлении может осуществляться с привлечением уже существующих и заново создаваемых коммерческих банков СК, которые в России, как и во всем мире, развиваются успешнее. Использование унифицированных и сертифицированных технологий выделения клеток позволило бы в короткие сроки восполнить существующий дефицит в материале для трансплантации, который до сих пор приходится приобретать за рубежом.

ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

Успехи исследований и технологические решения в области клеточных технологий могут оказаться столь значимыми, что их можно отнести к разряду «критических». Отставание в этой области может привести к потерям в социальном и экономическом развитии, в обеспечении безопасного и устойчивого развития страны. Понимая перспективы данных технологий, ряд стран уже сегодня концентрирует усилия на этих направлениях. Так, Германия и Великобритания оспаривают звание ведущей биотехнологической страны Европы. В этих странах выделяются значительные целевые средства на данные исследования. В Англии, кроме того, принято

чрезвычайно либеральное законодательство, позволяющее проводить научные исследования фактически без каких-либо ограничений. Как следствие, ряд ведущих ученых из США переехали работать в Англию. Речь идет об отсутствии ограничений на научные исследования. Любые клинические работы находятся под строжайшим контролем. К настоящему времени известно несколько форм стволовых клеток: эмбриональная стволовая клетка (из бластоцисты, ЭСК), стволовая клетка эмбриональных тканей (фетальные СК, ФСК) и стволовая клетка дифференцированных тканей (соматические СК, СКК) организма (кровь, костный мозг, кожа, мышечная и жировая ткани). Эмбриональные стволовые клетки — потенциальный источник для получения любых специализированных клеток, тканей и органов, биологическая основа терапевтического клонирования. Полученные линии эмбриональных стволовых клеток человека могут быть дифференцированы в любую необходимую ткань — нервную, костную, мышечную или эндокринную.

Однако имеется ряд серьезных аргументов против использования эмбриональных стволовых клеток в лечении заболеваний и повреждений тканей. Прежде всего, это иммунологическая несовместимость клеток, пересаживае-

мых реципиенту. Несмотря на тщательный подбор донора и реципиента по антигенам главного комплекса гистосовместимости, а также успехи имму-носупрессивной терапии, вероятность иммунологического отторжения крайне велика.

В настоящее время ученые предлагают большой набор генно-инженерных манипуляций, способных изменить иммунные характеристики эмбриональных стволовых клеток и снизить риск развития реакции «трансплантат против хозяина». Однако подобные манипуляции не являются рутинными и не могут обеспечить полную безопасность каждого пациента. Риск появления генетических мутаций при генно-инженерных манипуляциях вполне реален. Не исключено, что эти мутации будет сложно определить до трансплантации. В качестве альтернативы этому подходу предлагается использовать «терапевтическое клонирование». В этом случае генетическая информация стволовой клетки могла бы быть заменена генети-

ческой информацией от пациента, в результате чего продуцирующиеся эмбриональные копии создают «клон» пациента. Подобный клон может быть источником стволовых клеток для трансплантации. Именно эти технологии призваны революционизировать наше будущее, именно они привлекают всеобщее внимание. Хотя в данной области масса нерешенных научных, технологических и медицинских проблем, с гуманистических позиций все этические проблемы сводятся к вопросам добровольного донорства.

Однако результаты опытов по клонированию на животных, полученные в ведущих лабораториях, показывают, что в таких «терапевтических» клонах возникает высокая степень ненормальностей, делающих невозможным их использование для лечения. Постнатальные тканеспецифические стволовые клетки, находящиеся в каждой ткани или органе взрослого организма, — еще одно направление создания новых технологических решений и методов лечения. Спектр стволовых

таблица i| Коммерческая привлекательность клеточных технологий

Клиника Источник стволовых клеток/ способ введения Заболевание Стоимость, долл.

Кардиологический госпиталь Бангкока Аутологичные стволовые клетки из периферической крови вводятся в сердце Кардиомиопатия 25 000

Детский госпиталь Пекина Фетальные клетки оболочек глаза Нейродегенеративные заболевания, повреждения спинного мозга 20 000

«ЭмСелл», Киев Суспензия фетальных клеток из 4—12-недельных фетусов, внутривенные инъекции Омолаживание, СПИД, рак, диабет, рассеянный склероз 10 000 — 15 000 за цикл

Госпиталь Эгаса Моница, Лиссабон Аутологичные клетки оболочки глаза, трансплантация в спинной мозг Повреждения спинного мозга 50 000

Институт регенеративной медицины, Барбадос Фетальные клетки, внутривенные инъекции Перечислено свыше 20 заболеваний 20 000 за цикл

«Медра», Малибу, Калифорния (клиника в Доминиканской Республике) Фетальные клетки, подкожные и внутривенные инъекции Перечислено свыше 20 заболеваний 25 000 за цикл

«Нейровита», Москва Аутологичные нейральные и гемопоэтические клетки, часто трансплантируются интратекально Неврологические заболевания, травмы спинного мозга 9000 — 50 000

Источник: http://www.cord-blood-stem-cell-herapies.com/Stem_Cell_Therapy_Clinics_Hot_Spots

тканеспецифических клеток в организме широк. Фактически для каждого органа или каждой ткани существует свой регенераторный компартмент, в котором и присутствуют стволовые тканеспецифические клетки. Сегодня известны клетки-предшественники для печени и поджелудочной железы, кожи, кости, хряща, нейронов, сетчатки глаза и т.д. Другое дело, что далеко не всегда имеется возможность выделения и трансплантации этих клеток с целью восстановления структур или функций органа или тканей. Однако работы в данной области, укладывающиеся в понятие «регенераторная медицина», могут привести к значительным результатам. Эти подходы лишены моральноэтических проблем, поскольку речь идет о клетках взрослого организма. Методы биотехнологии и тканевой инженерии уже сегодня позволяют восстанавливать кожу и уретру, мочевой пузырь, роговицу, кость, гортань и т.д. Очевидны научные, этические и политические преимущества использования соматических стволовых клеток вместо эмбриональных стволовых клеток. Соматические стволовые клетки получают из ткани самого пациента, поэтому

проблемы иммунологического отторжения не возникает. Стволовые клетки из дифференцированных тканей не вызывают образования тератом. Терапевтическое использование соматических стволовых клеток самого пациента не ставит серьезных этических вопросов и не вызывает, в отличие от применения эмбриональных стволовых клеток, горячих политических дебатов. Однако существует проблема, затрудняющая использование соматических стволовых клеток. Они, в отличие от эмбриональных стволовых клеток, плохо растут в культуре, стремясь дифференцироваться в зрелые клетки той ткани, из которой они первоначально выделены, и ограничены к дифференци-ровке в любые другие клеточные типы. Несмотря на многочисленные публикации, пока не существует достаточных знаний о том, как длительно поддерживать и коммитировать соматические стволовые клетки из дифференцированных тканей в зрелые клетки любых других тканей. В связи с этим эмбриональные стволовые клетки кажутся более привлекательными, поскольку доказана их способность (в эмбриональном микроокружении) генерировать все

клеточные типы. Одним из видимых вариантов решения этой проблемы является получение стволовых клеток из пуповинной крови новорожденных и их хранение в банках стволовых клеток. Число кроветворных стволовых клеток в пуповинной крови гораздо выше, чем в крови взрослого человека, и эти клетки обладают более высоким пролиферативным и дифференцировочным потенциалом.

Кроме того, если дифференцировоч-ный потенциал соматических стволовых клеток низок, то «терапевтический потенциал» этих клеток не ограничен. Пациенту не требуется одновременного замещения всех тканей. Если у пациента с заболеванием сердца для реконструкции сердечной мышцы используют стволовые клетки сердечной мышцы, не способные к дифференцировке в клетки печени или почек, то этот факт не представляет серьезной проблемы для пациента.

В настоящее время опубликованы экспериментальные медицинские протоколы по успешному применению соматических стволовых клеток у больных с рассеянным склерозом, болезнью Паркинсона, инфаркту миокарда. FDA раз-

решила проведение I стадии клинических испытаний в ряде клиник США.

РЕГУЛИРОВАНИЕ НЕИЗБЕЖНО

Быстрая коммерциализация фундаментальных исследований стволовых клеток создала ажиотажный спрос на клеточные технологии в медицине и косметологии. Это привело к бесконтрольному использованию доморощенных технологий и клеток неизвестного происхождения учреждениями и «специалистами», плохо представляющими, что такое трансплантология. Отсутствие законодательной базы позволяет фактически проводить «эксперименты» на людях. Фундаментальные исследования, создающие базу для цивилизованного использования клеточных технологий, проводятся лишь небольшими научными группами в ряде вузов, институтов РАН и РАМН без серьезной государственной поддержки.

В нашей стране, на фоне незначительного объема научных исследований, используются многочисленные неконтролируемые и нелицензированные клеточные технологии для лечения любых заболеваний за деньги пациентов. При этом обращает на себя внимание коммерческая привлекательность применения клеточных технологий (табл. 1). Такие клиники нередко применяют эмбриональные или фетальные клетки, выделяемые из абортивного материала, из тканей мертворожденных плодов. Выделение, культивирование и трансплантация фетальных клеток не требует больших затрат, сложных научных и технологических решений или высококвалифицированного персонала. Поэтому сегодня в условиях, когда в стране данный вид материала легко доступен, эти клетки широко применяются без всяких разрешений и предварительных испытаний на коммерческой основе в огромном числе клиник, фирм и даже институтов.

Во всем мире данный тип клеток достаточно изучен и проверен. Поэтому можно уверенно утверждать, что использование этого типа клеток, кроме морально-этических проблем и издержек, не дает никаких иных результатов. Сегодня нет болезней, которые могли бы быть

устранены с помощью этих клеток. Это самый главный вывод, который позволяет критически оценивать этот подход, способный только дискредитировать остальные более перспективные и позитивные направления. Кроме того, применение термина «стволовые клетки» по отношению к клеткам из абортивного материала или тканей и органов плодов дезориентирует медиков и специалистов, не достаточно искушенных в этой специальной области. К сожалению, данный тип клеток наиболее распространен в России и странах ближнего зарубежья.

В заключение хотелось бы подчеркнуть, что в настоящее время не существует разработанных методов использования стволовых клеток в терапевтических целях. Все проводимые исследования с применением стволовых клеток

носят предварительный экспериментальный характер и их результаты не разрешены для клинического применения. По данным FDA широкое использование стволовых клеток в клинической практике можно ожидать не ранее чем через 5 лет.

Поскольку клеточные технологии будут медицинскими, то и отвечать они должны критериям, предъявляемым к медицинской технологии: безопасность и эффективность. Конечно, следует учитывать массу нюансов, присущих использованию клеток, но общие принципы, применяемые к медицинским технологиям, должны быть сохранены. Проблемой является стандартизация и обеспечение биобезопасности трансплантата, а это тесно связано с правовой базой развития и применения клеточных технологий. Специфика клеточных транс-

плантатов значительна, но и эти вопросы могут быть решены в рамках действующих принципов. Тем более что определенные наработки в этом направлении уже имеются.

Разработка и применение клеточных технологий в странах ЕС является одним из новых направлений нормативного регулирования. В ЕС действует директива 2004/23/ЕС, в которой установлены стандарты качества забора, обработки и контроля человеческих тканей и клеток. В зависимости от целей (исследовательская или терапевтическая), предусмотрены различные требования к информированному согласию пациентов. Подчеркнута обязательность этической экспертизы.

В ноябре 2005 г. в Совете ЕС был представлен проект директивы о лекарственных средствах для новых медицинских

технологий, включающих продукты тканевой инженерии, генные терапевтические методы и средства, соматические клеточные терапевтические средства. Утверждение этой Директивы ожидается в середине 2007 г., через 4 мес. она вступит в силу. Для клеточных технологий, разрешенных к применению, устанавливается срок их перерегистрации в соответствии с новыми правилами — 2 года. Следующим своим шагом Совет ЕС планирует детальную разработку технических требований для продуктов тканевой инженерии из аутологичных клеток. Очевидно, само время требует развития клеточных технологий на благо пациентов, и следовательно, необходимо обеспечить правовой статус как разработок в этой области, так и медицинской практической деятельности.

<$>