Способ комплексной оценки количества окислительно модифицированных белков в биологических жидкостях
METHOD FOR COMPLEX ESTIMATION OF THE AMOUNT OF OXIDATIVELY MODIFIED PROTEINS IN BIOLOGICAL FLUIDS

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, и предназначено для комплексной оценки количества окислительно модифицированных белков (ОМБ) при проведении спектрофотометрических исследований в биологических жидкостях (сыворотка и плазма крови, эритроциты, слюна, моча и др.). В подготовленных образцах исследуемой жидкости измеряют оптическую плотность раствора, далее строят график зависимости оптической плотности от длины волны. Количественную оценку содержания окислительно модифицированных белков в исследуемых жидкостях проводят по величине площади графика.
Данный способ позволяет оценивать количественное соотношение составляющих фракций окислительно модифицированных белков, в частности  альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ) и кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ) основного и нейтрального характера с целью выяснения степени выраженности и стадии окислительного стресса. Определение количества белков каждой фракции проводят в определенных диапазонах длин волн, так для альдегид-динитрофенилгидразонов нейтрального характера измерение оптической плотности проводят в диапазоне длин волн 230-558 нм, основного характера - в диапазоне 258-264 и 428-520 нм. Для кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера оптическую плотность измеряют в диапазоне 363-367 нм, основного характера - 430-434 и 524-535 нм.
Известен метод оценки окислительной модификации белков (авторы Безручко И.В., Рубцов К.К. Методология и метод оценки окислительной модификации белков в комплексе с молекулами средней массы, перспективы их применения // Вестник ТГПУ 2014. № 8(149). С. 185-188), который заключается в том, что при проведении спектрофотометрического анализа ОМБ их регистрируют при четырех длинах волн, в частности 356 нм -  альдегид-динитрофенилгидразоны нейтрального характера; 370 нм кетондинитрофенилгидразоны нейтрального характера и при 430 и 530 нм - альдегид-динитрофенилгидразоны и кетон-динитрофенилгидразоны основного характера.
Недостатком этого метода оценки является то, что определение оптической плотности проводится в отдельных точках, в то время как установлены диапазоны длин волн, в которых происходит поглощение света окислительно модифицированными белками. Указанный недостаток значительно снижает информативность и точность оценки результатов исследований.
Наиболее близким к заявляемому, является способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков (патент № 2524667 C1, МПК G01N 33/52, «Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях», авторы Фомина М.А., Абаленихина Ю.В., Фомина Н.В, Терентьев А.А.). Сущность изобретения заключается в том, что при проведении спектрофотометрического анализа определение количества окислительно модифицированных белков оценивают по величине площади графика спектра оптического поглощения окислительно модифицированными белками. Поскольку зависимость между оптической плотностью в диапазонах соответствующих длин волн не прямолинейна, поэтому площади графика зависимости спектра поглощения ОМБ и длинами волн разделяют на отдельные сегменты - прямоугольные трапеции (метод трапеций). Высота трапеций равна разнице экстинции между крайними значения диапазона длин волн, а основания равны разнице между длинами волн диапазона, впоследствии все площади суммируются.
Недостатком данного способа  является то, что используемая методика расчета достаточно приблизительно описывают криволинейную зависимость оптической плотности ОМБ и длин волн диапазонов измерения, что значительно снижает точность проведения исследования, занижая или завышая показатели исследований.
Технический результат – увеличение точности комплексной оценки содержания окислительно модифицированных белков в биологических жидкостях при проведении спектрофотометрического анализа за счет применения способа расчета, позволяющего более подробно рассчитать полученные результаты исследования.
Технический результат достигается тем, что график разбивают на сегменты по диапазонам длин волн поглощения фракциями, и в каждом сегменте, при расчете количества окислительно модифицированных белков используют метод численного интегрирования - формулу Симпсона
0
1
3
n-1
2
4
n-2
n
S= h/3[(y+4(y+y+…+y) + 2(y+y+…+y)+y)],
где:  А – количество окислительно модифицированных  белков,
0
1
2
3
y, y, y, y – показатели оптической плотности,
h – шаг интервала оптической плотности.
Изобретение поясняется фигурой, на фигуре изображен график зависимости оптической плотности исследуемого образца в зависимости от длины волны.
График оптической плотности образца не прямолинеен, поэтому использование формулы Симпсона позволяет наиболее точно рассчитать площадь прямоугольников, ограниченных с одной стороны кривой линией.
Способ выполняют следующим образом.
Предварительно приготовленный материал переносят в кювету спектрофотометра. На спектрофотометре устанавливают диапазон длин волн (230-550 нм.) и сканируют оптическую плотность образца. В качестве контроля используют образцы этого же исходного материала. Строят график зависимости оптической плотности образца от длины волны, далее график разбивают на сегменты по диапазонам длин волн поглощения фракциями, и в каждом сегменте, при расчете количества окислительно модифицированных белков используют метод численного интегрирования - формулу Симпсона
0
1
3
n-1
2
4
n-2
n
S= h/3[(y+4(y+y+…+y) + 2(y+y+…+y)+y)],
где:  S – площадь оптической плотности образца,
0
1
2
3
y, y, y, y – показатели оптической плотности,
h – шаг интервала оптической плотности.
Площади оптического поглощения образцов рассчитывают в следующих диапазонах длин волн: SАДНФГн в диапазоне 230-367 нм; SАДНФГо - 258-264 и 428-520 нм; SКДНФГн - 363-367 нм; SКДНФГо = 430-434 и 524-535 нм. Общее количество окислительно модифицированных белков рассчитывают суммированием площадей составляющих фракций.
Пример 1. В сыворотке крови, пациентки с диагнозом панкреатит, определяют окислительно модифицированные белки. По результатам спектрофотометрического анализа получены значения оптической плотности в диапазонах длин волн. По полученным значениям строят график  и рассчитывают площади методом численного интегрирования при помощи формулы Симпсона.
АДНФГн
АДНФГо
КДНФГн
КДНФГо
ОМБ
S= 67,79; S = 24,51; S = 46.16; S = 14,60; S = 153,06.
АДНФГн
АДНФГо
КДНФГн
КДНФГо
Полученные значения количества ОМБ рассчитаны в 50 мкл сыворотки крови, соответственно в 1 мл сыворотки крови сумма ОМБ составила 3061,56  о.п./мл, из них  S= 1355,93; S = 490,21; S = 923,25; S = 292,17.
Содержание первичных маркеров окислительного стресса в сыворотке крови пациентки с диагнозом острый панкреатит составило 60,3%, а на долю вторичных маркеров 39,7%. Полученные результаты исследований свидетельствуют о преобладании первичных маркеров окислительного стресса, что свидетельствует о том, что преобладает процесс фрагментации белковых молекул.
Пример 2. В сыворотке крови, пациентки с диагнозом ишемическая болезнь сердца, определяли окислительно модифицированные белки по методике Levin R., в модификации Дубининой Е.Е. По результатам спектрофотометрического анализа получены значения оптической плотности в диапазонах длин волн. По полученным значениям построили график  и рассчитали площади методом численного интегрирования при помощи формулы Симпсона.
АДНФГн
АДНФГо
КДНФГн
КДНФГо
ОМБ
S= 81,06; S = 53,29; S = 55,82; S = 8,01; S = 198,186.
АДНФГн
АДНФГо
КДНФГн
КДНФГо
Полученные значения площадей поглощения рассчитаны на 50 мкл сыворотки крови, соответственно в 1 мл сыворотки крови сумма ОМБ составила 3963,60  о.п./мл, из них  S= 1621,20; S = 1065,80; S = 1116,40; S = 160,20.
Содержание первичных маркеров окислительного стресса в сыворотке крови пациентки с диагнозом острый панкреатит составило 67,7%, а на долю вторичных маркеров 32,4%. Полученные результаты исследований свидетельствуют о преобладании первичных маркеров окислительного стресса, что свидетельствует о том, что преобладает процесс фрагментации белковых молекул.
Таким образом, предполагаемая совокупность признаков при проведении спектрофотометрического анализа оценку количества окислительно модифицированных белков в биологических жидкостях рассчитывать по площади графика соответствующего диапазона оптического поглощения по методу численного интегрирования - формула Симпсона позволяет:
- повысить точность проведения спектрофотометрического анализа;
- сократить время расчета.