ПРОТОЧНЫЕ ЯЧЕЙКИ
FLOW CELLS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
В данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США с серийным номером 62/692511, поданной 29 июня 2018 г., и предварительной заявки на патент США с серийным номером 62/743373, поданной 9 октября 2018 г., содержание каждой из которых включается в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Перечень последовательностей, представленный на рассмотрение наряду с этим документом посредством EFS-Web, является тем самым включенным посредством ссылки во всей его полноте. Название данного файла - ILI172APCT_IP-1806-PCT_Sequence_Listing_ST25.txt, размер файла - 551 байт и дата создания файла - 20 мая 2019 г.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В некоторых доступных платформах для секвенирования нуклеиновых кислот используется подход секвенирования посредством синтеза. С использованием данного подхода синтезируются растущая нить, и добавление каждого мономера (например, нуклеотида) к растущей нити выявляется оптически и/или электронно. Поскольку нить матрицы управляет синтезом растущей нити, можно вывести последовательность ДНК-матрицы из ряда нуклеотидных мономеров, которые были добавлены к растущей нити во время синтеза. В некоторых примерах можно использовать парно-концевое секвенирование, когда прямые нити секвенируются и удаляются, и затем обратные нити строятся и секвенируются.
ВВЕДЕНИЕ
Первым аспектом, раскрытым в данном документе, является проточная ячейка, содержащая: субстрат; первый набор праймеров, присоединенных к первой области на субстрате, причем данный первый набор праймеров включает нерасщепляемый первый праймер и расщепляемый второй праймер; и второй набор праймеров, присоединенных ко второй области на субстрате, причем данный второй набор праймеров включает расщепляемый первый праймер и нерасщепляемый второй праймер.
В одном примере первого аспекта первая область включает вещество, имеющее первую функциональную группу; и вторая область включает вещество, имеющее вторую функциональную группу, которая отличается от первой функциональной группы.
В одном примере первого аспекта данная проточная ячейка дополнительно содержит просвет, отделяющий первый набор праймеров от второго набора праймеров.
В одном примере первого аспекта данный субстрат включает впадины, разделенные промежуточными областями; и каждая из впадин включает: первую область, расположенную в первом положении; и вторую область, расположенную во втором положению. В одной версии данного примера проточная ячейка может дополнительно содержать просвет, отделяющий первую область от второй области. В другой версии данного примера первая область и вторая область частично перекрываются. В еще одной другой версии данного примера первая и вторая части имеют разную глубину. В другой версии данного примера первая и вторая области представляют собой разные блоки блок-сополимера.
В одном примере первого аспекта данный субстрат включает впадины, разделенные промежуточными областями; причем каждая из впадин включает первую область; и вторая область располагается на по меньшей мере некоторых из промежуточных областей.
В одном примере первого аспекта первая область включает первый полимер, и первый набор праймеров прививается к данному первому полимеру; и вторая область включает второй полимер, и второй набор праймеров прививается к данному второму полимеру. В одной версии данного примера проточная ячейка дополнительно содержит защитное покрытие на первом наборе праймеров и на первом полимере. В другой версии данного примера первый полимер представляет собой первый слой на субстрате; второй полимер представляет собой второй слой на первом слое; проточная ячейка дополнительно содержит: пассивирующую смолу на втором слое; и элементы, определенные в данной пассивирующей смоле: второй полимер и первый полимер; и каждый из первого и второго набора праймеров экспонирован на каждом из данных элементов.
В одном примере первого аспекта субстрат включает впадины, разделенные промежуточными областями; каждая из впадин включает: первую часть, где располагается первая область; и вторую часть; и данная проточная ячейка дополнительно содержит шарик, расположенный во второй части, где вторая область находится на поверхности данного шарика.
В одном примере первого аспекта расщепляемый первый праймер включает первый сайт расщепления, расщепляемый второй праймер включает второй сайт расщепления, и первый и второй сайты расщепления имеют идентичный тип. В одной версии данного примера каждый из нерасщепляемого первого праймера, расщепляемого второго праймера, расщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера включает соответствующий линкер; первый сайт расщепления первого расщепляемого праймера располагается вдоль его линкера, и второй сайт расщепления второго расщепляемого праймера располагается вдоль его линкера.
В одном примере первого аспекта расщепляемый первый праймер включает первый сайт расщепления, расщепляемый второй праймер включает второй сайт расщепления, и первый и второй сайты расщепления относятся к разному типу. В одной версии данного примера каждый из нерасщепляемого первого праймера, расщепляемого второго праймера, расщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера включает соответствующий линкер; первый сайт расщепления первого расщепляемого праймера располагается вдоль его линкера; и второй сайт расщепления второго расщепляемого праймера располагается вдоль его линкера.
В одном примере первого аспекта первый набор праймеров присоединен к первой опорной структуре; первая область представляет собой первый сайт захвата, который присоединен к первой опорной структуре; второй набор праймеров присоединен ко второй опорной структуре, которая отличается от первой опорной структуры; и вторая область представляет собой второй сайт захвата, который присоединен ко второй опорной структуре.
Следует понимать то, что любые характеристики первого аспекта, раскрытые в данном документе, могут быть объединены друг с другом в любых желательных способе и/или конфигурации.
Вторым аспектом, раскрытым в данном документе, является проточная ячейка, содержащая первый субстрат; первый набор праймеров, присоединенных к первому субстрату, причем первый набор праймеров включает нерасщепляемый первый праймер и расщепляемый второй праймер; второй субстрат напротив первого субстрата; и второй набор праймеров, присоединенных ко второму субстрату, причем второй набор праймеров включает расщепляемый первый праймер и нерасщепляемый второй праймер.
Следует понимать то, что любые характеристики второго аспекта могут быть объединены друг с другом любым желательным способом. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик первого аспекта и/или второго аспекта может использоваться совместно и/или может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Третий аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой набор, содержащий проточную ячейку, включающую: субстрат, включающий впадины, разделенные промежуточными областями; первый полимерный слой в каждой из впадин, где некоторые функциональные группы первого полимерного слоя являются кэппированными; первый набор праймеров, присоединенных к другим функциональным группам первого полимерного слоя в каждой из впадин; и второй полимерный слой на промежуточных областях; примирующую жидкость, включающую: жидкий носитель; и второй набор праймеров, который отличается от первого набора праймеров.
В одном примере третьего аспекта первый набор праймеров включает нерасщепляемый первый праймер и расщепляемый второй праймер; и второй набор праймеров включает расщепляемый первый праймер и нерасщепляемый второй праймер.
Следует понимать то, что любые характеристики третьего аспекта могут быть объединены друг с другом любым желательным способом. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик третьего аспекта и/или второго аспекта, и/или первого аспекта может использоваться совместно, и/или может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Четвертым аспектом, раскрытым в данном документе, является способ, включающий введение матричной жидкости в проточную ячейку, включающую субстрат, включающий впадины, разделенные промежуточными областями; первый полимерный слой в каждой из впадин, где экспонированные функциональные группы первого полимерного слоя являются кэппированными; первый набор праймеров, присоединенных к первому полимерному слою в каждой из впадин, причем первый набор праймеров включает расщепляемый первый праймер и нерасщепляемый второй праймер; и второй полимерный слой на промежуточных областях; при этом матрица из матричной жидкости амплифицируется с образованием кластера в по меньшей мере некоторых из впадин; введение примирующей жидкости, включающей нерасщепляемый первый праймер и расщепляемый второй праймер, в проточную ячейку, при этом нерасщепляемый первый праймер и расщепляемый второй праймер прививаются ко второму полимерному слою; и инициирование мостиковой амплификации от данного кластера к нерасщепляемому первому праймеру и расщепляемому второму праймеру, образуя, посредством этого второй кластер на по меньшей мере некоторых из промежуточных областей.
Следует понимать то, что любые характеристики четвертого аспекта можно объединять друг с другом любым желательным способом. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик четвертого аспекта и/или третьего аспекта, и/или второго аспекта, и/или первого аспекта может использоваться совместно, и/или может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Пятым аспектом, раскрытым в данном документе, является способ, включающий: введение матричной жидкости в проточную ячейку, включающую субстрат, включающий впадины, разделенные промежуточными областями; первый полимерный слой в каждой из впадин; первый набор праймеров, присоединенных к первому полимерному слою, причем первый набор праймеров включает расщепляемый первый праймер и нерасщепляемый второй праймер; факультативно защитный покровный слой на первом полимерном слое и на первом наборе праймеров; второй полимерный слой на промежуточных областях; и второй набор праймеров, присоединенных ко второму полимерному слою, причем второй набор праймеров включает нерасщепляемый первый праймер и расщепляемый второй праймер; при этом матрица из матричной жидкости амплифицируется с образованием кластера в по меньшей мере некоторых из впадин и на по меньшей мере некоторых промежуточных областях; и расщепление расщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера.
Следует понимать то, что любые характеристики пятого аспекта можно объединять друг с другом любым желательным способом. Кроме того, следует понимать то, что любую комбинацию характеристик пятого аспекта и/или третьего аспекта, и/или второго аспекта, и/или первого аспекта можно использовать совместно, и/или можно объединять с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Шестым аспектом, раскрытым в данном документе, является проточная ячейка, содержащая подложку; структурированная смола на данной подложке, включающая первые впадины и вторые впадины, разделенные промежуточными областями, причем первые впадины имеют меньшие размеры отверстия, чем вторые впадины; первый набор праймеров, присоединенный к по меньшей мере некоторым из первых впадин; и функционализированный шарик, расположенный, соответственно, в по меньшей мере некоторых из вторых впадин, включающий второй набор праймеров, присоединенных к поверхности сердцевинной структуры, где второй набор праймеров отличается от первого набора праймеров.
В одном примере шестого аспекта сердцевинная структура функционализированного шарика выбрана из группы, состоящей из диоксида кремния, суперпарамагнитного материала, полистирола и акрилата.
В одном примере шестого аспекта структурированная смола выбрана из группы, состоящей из смолы на основе полиэдрической олигомерной силсесквиоксановой смолы (POSS), эпоксисмолы, поли(этиленгликолевой) смолы, полиэфирной смолы, акриловой смолы, акрилатной смолы, метакрилатной смолы и их комбинаций.
В одном примере шестого аспекта проточная ячейка дополнительно содержит полимер в первых впадинах и во вторых впадинах, и где первый набор праймеров присоединен к полимеру в по меньшей мере некоторых из первых впадин. В одной версии данного примера функционализированный шарик располагается на полимере в по меньшей мере некоторых из вторых впадин. В другой версии данного примера первый набор праймеров также присоединен к полимеру в по меньшей мере некоторых из вторых впадин; и функционализированный шарик располагается на первом наборе праймеров в по меньшей мере некоторых из вторых впадин.
В одном примере шестого аспекта первый набор праймеров включает первый праймер и второй праймер, модифицированный урацилом; и второй набор праймеров включает модифицированный урацилом первый праймер и второй праймер.
Следует понимать то, что любые характеристики шестого аспекта, раскрытые в данном документе, можно объединять друг с другом в любом желательном способе и/или конфигурации.
Седьмым аспектом, раскрытым в данном документе, является проточная ячейка, содержащая подложку; структурированная смола на данной подложке, включающая впадины, разделенные промежуточными областями; первый набор праймеров, присоединенных к по меньшей мере некоторым из впадин; и функционализированный шарик, расположенный в по меньшей мере некоторых из впадин таким образом, что по меньшей мере некоторые праймеры из первого набора праймеров являются экспонированными, причем данный функционализированный шарик включает второй набор праймеров, присоединенных к поверхности сердцевинной структуры, где второй набор праймеров отличается от первого набора праймеров.
В одном примере седьмого аспекта каждая из впадин включает первую часть с размером первого отверстия, который больше чем или равен диаметру функционализированного шарика, и вторую часть с размером второго отверстия, который меньше, чем диаметр функционализированного шарика; и данный функционализированный шарик расположен в первой части каждой из по меньшей мере некоторых впадин.
В одном примере седьмого аспекта сердцевинная структура функционализированного шарика выбрана из группы, состоящей из диоксида кремния, суперпарамагнитного материала, полистирола и акрилата.
В одном примере седьмого аспекта структурированная смола выбрана из группы, состоящей из смолы на основе полиэдрической олигомерной силсесквиоксановой смолы (POSS), эпоксисмолы, поли(этиленгликолевой) смолы, полиэфирной смолы, акриловой смолы, акрилатной смолы, метакрилатной смолы и их комбинаций.
В одном примере седьмого аспекта проточная ячейка дополнительно содержит во впадинах полимер. В одной версии данного аспекта первый набор праймеров присоединен к части полимера, не занятой функционализированным шариком. В одном примере данной версии первый набор праймеров присоединен к полимеру во впадинах; и функционализированный шарик располагается на некоторых других праймерах первого набора праймеров.
Следует понимать то, что любые характеристики седьмого аспекта, раскрытого в данном документе, могут быть объединены друг с другом в любых желательных способе и/или конфигурации.
Восьмым аспектом, раскрытым в данном документе, является способ, включающий селективное нанесения полимера во впадины структурированной смолы на подложке; прививку первого набора праймеров к полимеру в по меньшей мере некоторых впадинах; и до или после прививки первого набора праймеров отложение функционализированных шариков i) в части каждой из по меньшей мере некоторых впадин или ii) во вторых впадинах, имеющих большие размеры отверстия, чем по меньшей мере некоторые из впадин, причем данные функционализированные шарики включают второй набор праймеров, присоединенных к поверхности сердцевинной структуры, где первый и второй наборы праймеров являются отличными.
В одном примере восьмого аспекта перед отложением функционализированных шариков данный способ дополнительно включает образование функционализированных шариков посредством присоединения второго набора праймеров к сердцевинной структуре.
В одном примере восьмого аспекта часть каждой из по меньшей мере некоторых впадин имеет размер отверстия, который больше чем или равен диаметру каждого функционализированного шарика; по меньшей мере некоторые из впадин включают вторую часть, взаимосвязанную с данной частью, где вторая часть имеет размер второго отверстия, который меньше, чем диаметр каждого функционализированного шарика; и данные функционализированные шарики подвергаются самоорганизации в части каждой из по меньшей мере некоторых впадин посредством исключения размера.
В одном примере восьмого аспекта до селективного нанесения полимера данный способ дополнительно включает образование структурированной смолы на подложке посредством: отложения смолы на данной подложке и структурирования данной смолы с использованием наноимпринтной литографии.
Следует понимать то, что любые характеристики восьмого аспекта могут быть объединены друг с другом любым желательным способом. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик восьмого аспекта и/или седьмого аспекта, и/или шестого аспекта, и/или первого аспекта может использоваться совместно и/или может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Девятым аспектом, раскрытым в данном документе, является проточная ячейка, включающая подложку; структурированная смола на данной подложке, включающая впадины, разделенные промежуточными областями; блок-сополимер на структурированной смоле во впадинах, причем каждый блок данного блок-сополимера имеет специфичную для блока функциональную группу, которая отличается от специфичной для блока функциональной группы каждого другого блока данного блок-сополимера; и праймер, присоединенный к специфичной для блока функциональной группе по меньшей мере одного из блоков.
В одном примере девятого аспекта структурированная смола выбрана из группы, состоящей из смолы на основе полиэдрической олигомерной силсесквиоксановой смолы (POSS), эпоксисмолы, поли(этиленгликолевой) смолы, полиэфирной смолы, акриловой смолы, акрилатной смолы, метакрилатной смолы и их комбинаций. В одной версии данного примера структурированная смола представляет собой смолу на основе POSS, и где смола на основе POSS представляет собой сшитую эпокси POSS смолу. В другой версии данного примера блок-сополимер включает: первый блок, включающий акриламидный мономер, имеющий аминогруппу в качестве ее специфичной для блока функциональной группы; и второй блок, включающий азидоацетамидопентилакриламидный мономер, имеющий азидо группу в качестве ее специфичной для блока функциональной группы. В одном примере этой другой версии данный блок-сополимер представляет собой:
где R представляет собой атом водорода или концевую группу полимер-инициирующего соединения, n варьирует от 1 до 10000, и m варьирует от 1 до 10000. В еще одной другой версии данного примера блок-сополимер представляет собой:
где n варьирует от 1 до 10000, и m варьирует от 1 до 10000.
В одном примере девятого аспекта структурированная смола представляет собой аморфный фторполимер. В одной версии данного примера данный блок-сополимер включает: первый блок, включающий мономер, имеющий трифторметильную группу в качестве ее специфичной для блока функциональной группы; и второй блок, включающий мономер, имеющий функциональную группу прививки праймера в качестве ее специфичной для блока функциональной группы.
В одном примере девятого аспекта данный блок-сополимер включает: первый блок, включающий мономер, имеющий функциональную группу прививки праймера в качестве ее специфичной для блока функциональной группы; и второй блок, включающий мономер для корректировки параметра взаимодействия для управления разделением фаз первого и второго блоков. В одной версии данного примера функциональная группу прививки праймера представляет собой азидогруппу; и специфичная для блока функциональная группа мономера второго блока выбрана из группы, состоящей из аминогруппы, спиртовой группы, арильной группы и заряженной группы.
В одном примере девятого аспекта данный блок-сополимер представляет собой терполимер, включающий первый блок, второй блок и третий блок; специфичная для блока функциональная группа первого блока присоединена к структурированной смоле; специфичная для блока функциональная группа второго блока присоединена к праймеру; и специфичная для блока функциональная группа третьего блока присоединена к другому праймеру, который является отличным от первого праймера, или к ферменту.
В одном примере девятого аспекта данный блок-сополимер представляет собой терполимер, включающий первый блок, второй блок и третий блок; специфичная для блока функциональная группа первого блока присоединена к структурированной смоле; специфичная для блока функциональная группа второго блока присоединена к праймеру; и специфичная для блока функциональная группа третьего блока влияет на свободную энергию поверхности данного блок-сополимера или влияет на стабильность данного блок-сополимера.
В одном примере девятого аспекта впадины выбраны из группы, состоящей из лунок и бороздок.
В одном примере девятого аспекта каждый из структурированной смолы и блок-сополимера имеет свободную энергию поверхности в пределах интервала от примерно 25 мН/м до примерно 50 мН/м.
Следует понимать то, что любые характеристики девятого аспекта, раскрытого в данном документе, могут быть объединены друг с другом в любых желательных способе и/или конфигурации. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик девятого аспекта и/или первого аспекта может быть использована совместно и/или может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Десятым аспектом, раскрытым в данном документе, является проточная ячейка, содержащая подложку; структурированная смола на основе полиэдрической олигомерной силсесквиоксановой смолы (POSS) на подложке, причем данная структурированная смола на основе POSS включает впадины, разделенные промежуточными областями; сегрегированный блок-сополимер на структурированной смоле на основе POSS во впадинах, где один блок данного разделенного блок-сополимера имеет функциональную группу, присоединенную к структурированной смоле на основе POSS, а другой блок данного разделенного блок-сополимера имеет другую функциональную группу; и праймер, присоединенный к другой функциональной группе.
В одном примере десятого аспекта сегрегированный блок-сополимер выбран из группы, состоящей из:
i)
где n варьирует от 1 до 10000, и m варьирует от 1 до 10000; и
ii)
где R представляет собой атом водорода или концевую группу полимер-инициирующего соединения, n варьирует от 1 до 10000, и m варьирует от 1 до 10000.
Следует понимать то, что любые характеристики десятого аспекта, раскрытого в данном документе, могут быть объединены друг с другом в любых желательных способе и/или конфигурации. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик десятого аспекта и/или девятого аспекта, и/или первого аспекта может быть использована совместно, и/или может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Одиннадцатым аспектом, раскрытым в данном документе, является способ, включающий структурирование смолы с образованием структурированной смолы, включающей впадины, разделенные промежуточными областями; введение раствора, включающего блок-сополимер, на структурированную смолу, причем каждый блок данного блок-сополимера имеет специфичную для блока функциональную группу, которая отличается от специфичной для блока функциональной группы каждого другого блока блок-сополимера; подвергание данного раствора воздействию отжига парами растворителя, при этом фаза блок-сополимера отделяется и подвергается самоорганизации во впадинах; и прививку праймера на специфичную для блока функциональную группу по меньшей мере одного из блоков.
В одном примере одиннадцатого аспекта структурирование смолы включает наноимпринтную литографию.
В одном примере одиннадцатого аспекта раствор, включающий блок-сополимер, имеет параметр взаимодействия Флори-Хаггинса, варьирующий от примерно 0,04 до примерно 0,30.
В одном примере одиннадцатого аспекта перед прививкой данный способ дополнительно включает воздействие на структурированную смолу, включающую подвергнувшийся разделению фаз и самоорганизации блок-сополимер во впадинах, процесса отверждения.
Следует понимать то, что любые характеристики одиннадцатого аспекта, раскрытого в данном документе, могут быть объединены друг с другом в любых желательных способе и/или конфигурации. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик одиннадцатого аспекта и/или десятого аспекта, и/или девятого аспекта, и/или первого аспекта может быть использована совместно и/или может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Двенадцатым аспектом, раскрытым в данном документе, является способ, включающий нанесение первого функционализированного слоя на субстрат; структурирование данного первого функционализированного слоя, образуя, посредством этого, первую функционализированную область, покрытую фоторезистом; нанесение второго функционализированного слоя на фоторезист и части субстрата; отрыв фоторезиста и любого второго функционализированного слоя на нем; удаление части второго функционализированного слоя, посредством этого образуя вторую функционализированную область, смежную с первой функционализированной областью; и присоединение первого набора праймеров к первому функционализированному слою или к первой функционализированной области и второго набора праймеров ко второму функционализированному слою или ко второй функционализированной области, где первый набор праймеров отличается от второго набора праймеров.
В одном примере двенадцатого аспекта присоединение первого набора праймеров включает предварительную прививку нерасщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера к первому функционализированному слою перед нанесением первого функционализированного слоя; и присоединение второго набора праймеров включает предварительную прививку расщепляемого первого праймера и нерасщепляемого второго праймера ко второму функционализированному слою перед нанесением второго функционализированного слоя.
В одном примере двенадцатого аспекта присоединение первого набора праймеров включает прививку нерасщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера к первому функционализированному слою после его нанесения; и присоединение второго набора праймеров включает прививку расщепляемого первого праймера и нерасщепляемого второго праймера ко второму функционализированному слою после его нанесения.
В одном примере двенадцатого аспекта данный способ дополнительно включает: отложение, соответственно, первого самоорганизующегося монослоя на первой функционализированной области и второго самоорганизующегося монослоя на второй функционализированной области; где присоединение первого набора праймеров включает прививку нерасщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера к первому самоорганизующемуся монослою; и где присоединение второго набора праймеров включает прививку расщепляемого первого праймера и нерасщепляемого второго праймера ко второму самоорганизующемуся монослою.
В одном примере двенадцатого аспекта удаление включает: нанесение второго фоторезиста на первую функционализированную область и вторую часть второго функционализированного слоя, который должен стать второй функционализированной областью; и травление части второго функционализированного слоя.
В одном примере двенадцатого аспекта субстрат включает смолу на подложке; данная смола включает впадины, разделенные промежуточными областями; первая функционализированная область находится на первой части каждой впадины; второй функционализированный слой находится на второй части каждой впадины и на промежуточных областях; и удаление включает отшлифовывание второго функционализированного слоя от промежуточных областей.
В одном примере двенадцатого аспекта субстрат включает смолу на подложке; данная смола включает многоуровневые впадины, разделенные промежуточными областями; первая функционализированная область находится на первом уровне каждой многоуровневой впадины; и до нанесения второго функционализированного слоя данный способ дополнительно включает: нанесение жертвенного слоя на фоторезист и части смолы; удаление жертвенного слоя с частей данной смолы; и удаление области данной смолы из многослойной впадины с созданием области, которая является смежной с первой функционализированной областью; и второй функционализированный слой наносится на жертвенный слой на фоторезисте, на данную область и на промежуточные области.
Следует понимать то, что любые характеристики двенадцатого аспекта, раскрытого в данном документе, могут быть объединены друг с другом любым желательным способом и/или в любой желательной конфигурации. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик двенадцатого аспекта и/или первого аспекта, и/или второго аспекта может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Тринадцатым аспектом, раскрытым в данном документе, является способ, включающий нанесение первого фоторезиста на субстрат таким образом, что экспонируется первая часть субстрата; нанесение первого функционализированного слоя на фоторезист и данную первую часть субстрата; отрыв фоторезиста и любого первого функционализированного слоя на нем, образуя, посредством этого, первую функционализированную область на первой части субстрата; нанесение второго фоторезиста на первую функционализированную область и на субстрат таким образом, что экспонируется вторая часть субстрата, смежная с первой функционализированной областью; нанесение второго функционализированного слоя на второй фоторезист и вторую часть субстрата; отрыв второго фоторезиста и любого второго функционализированного слоя на нем, образуя, посредством этого, вторую функционализированную область, смежную с первой функционализированной областью; и присоединение первого набора праймеров к первому функционализированному слою или первой функционализированной области и второго набора праймеров ко второму функционализированному слою или второй функционализированной области, где первый набор праймеров отличается от второго набора праймеров.
В одном примере тринадцатого аспекта присоединение первого набора праймеров включает предварительную прививку нерасщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера к первому функционализированному слою перед нанесением первого функционализированного слоя; и присоединение второго набора праймеров включает предварительную прививку расщепляемого первого праймера и нерасщепляемого второго праймера ко второму функционализированному слою перед нанесением второго функционализированного слоя.
В одном примере тринадцатого аспекта присоединение первого набора праймеров включает прививку нерасщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера к первому функционализированному слою после его нанесения; и присоединение второго набора праймеров включает прививку расщепляемого первого праймера и нерасщепляемого второго праймера ко второму функционализированному слою после его нанесения.
В одном примере тринадцатого аспекта данный способ дополнительно включает: отложение, соответственно, первого самоорганизующегося монослоя на первой функционализированной области и второго самоорганизующегося монослоя на второй функционализированной области; где присоединение первого набора праймеров включает прививку нерасщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера к первому самоорганизующемуся монослою; и где присоединение второго набора праймеров включает прививку расщепляемого первого праймера и нерасщепляемого второго праймера ко второму самоорганизующемуся монослою.
Следует понимать то, что любые характеристики тринадцатого аспекта, раскрытого в данном документе, могут быть объединены друг с другом в любых желательных способе и/или конфигурации. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик тринадцатого аспекта и/или первого аспекта, и/или второго аспекта может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Четырнадцатым аспектом, раскрытым в данном документе, является способ, включающий нанесение первого функционализированного слоя на субстрат, включающий бороздки, разделенные промежуточными областями, и жертвенную область материала в первой части каждой из бороздок; структурирование первого функционализированного слоя, образуя, посредством этого, первую функционализированную область, покрытую фоторезистом, во второй части каждой из бороздок; удаление области жертвенного материала для экспонирования первой части на каждой из бороздок; нанесение второго функционализированного слоя на промежуточные области, на первую часть и на фоторезист; отрыв фоторезиста и любого второго функционализированного слоя на нем; удаление любого второго функционализированного слоя с промежуточных областей, при этом вторая функционализированная область остается в первой части каждой из бороздок; нанесение второго фоторезиста в виде структуры пространственно разделенных полосок, которые являются по меньшей мере существенно перпендикулярными бороздкам; удаление частей первых функционализированных областей и вторых функционализированных областей, которые экспонированы между пространственно разделенными полосками; удаление второго фоторезиста; и присоединение первого набора праймеров к первому функционализированному слою или первым функционализированным областям, и второго набора праймеров ко второму функционализированному слою или вторым функционализированным областям, где первый набор праймеров отличается от второго набора праймеров.
В одном примере четырнадцатого аспекта присоединение первого набора праймеров включает предварительную прививку нерасщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера к первому функционализированному слою перед нанесением первого функционализированного слоя; и присоединение второго набора праймеров включает предварительную прививку расщепляемого первого праймера и нерасщепляемого второго праймера ко второму функционализированному слою перед нанесением второго функционализированного слоя.
В одном примере четырнадцатого аспекта присоединение первого набора праймеров включает прививку нерасщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера к первому функционализированному слою после его нанесения; и присоединение второго набора праймеров включает прививку расщепляемого первого праймера и нерасщепляемого второго праймера ко второму функционализированному слою после его нанесения.
В одном примере четырнадцатого аспекта субстрат включает вторую область жертвенного материала во второй части каждой из бороздок; причем субстрат, область жертвенного материала и вторая область жертвенного материала имеют разные скорости травления; и перед нанесением первого функционализированного слоя данный способ дополнительно включает удаление второй области жертвенного материала от второй части каждой из бороздок. В одной версии данного примера перед удалением второй области жертвенного материала данный способ дополнительно включает образование области жертвенного материала и второй области жертвенного материала посредством: нанесения жертвенного материала на субстрат, включающий бороздки, разделенные промежуточными областями; удаление части жертвенного материала, таким образом, что область жертвенного материала остается непосредственно смежной с каждой боковой стенкой каждой бороздки; нанесение второго жертвенного материала на субстрат и на области жертвенного материала; удаление части второго жертвенного материала, таким образом, что область второго жертвенного материала остается непосредственно смежной с каждой областью жертвенного материала; и нанесение материала для заполнения любых пространств между вторыми областями жертвенного материала. В одном примере данной версии субстрат представляет собой многослойный субстрат; бороздки определяются в самом наружном слое многослойного субстрата; и данный материал и самый наружный слой являются одинаковыми.
Следует понимать то, что любые характеристики четырнадцатого аспекта, раскрытого в данном документе, могут быть объединены друг с другом в любых желательных способе и/или конфигурации. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик четырнадцатого аспекта и/или первого аспекта, и/или второго аспекта может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Четырнадцатым аспектом, раскрытым в данном документе, является способ, включающий нанесение жертвенного материала на субстрат, включающий впадины, разделенные первыми промежуточными областями, где каждая впадина включает глубокую часть и мелкую часть, ограниченные частью в виде ступеньки, и где жертвенный слой частично заполняет данную глубокую часть; последовательное удаление части жертвенного слоя и части субстрата с образованием вторых промежуточных областей, которые по меньшей мере частично выровнены с остающейся частью жертвенного слоя, и удаление части в виде ступеньки с образованием области, находящейся рядом с остающейся частью жертвенного слоя; нанесение первого функционализированного слоя на вторые промежуточные области, остающуюся часть жертвенного слоя и площадь; нанесение фоторезиста на первый функционализированный слой; удаление части фоторезиста и нижележащей части первого функционализированного слоя таким образом, что остающаяся часть жертвенного слоя и вторых промежуточных областей экспонируются, и часть первого функционализированного слоя, имеющего на нем вторую часть фоторезиста, остается в данной области; удаление остающейся части жертвенного слоя с образованием второй области рядом с частью первой функционализированной области; нанесение второго функционализированного слоя на данную область, образуя, посредством этого, вторую функционализированную область; отрыв второй части фоторезиста, образуя, посредством этого, первую функционализированную область; и присоединение первого набора праймеров к первому функционализированному слою или первой функционализированной области и второго набора праймеров ко второму функционализированному слою или второй функционализированной области, где первый набор праймеров отличается от второго набора праймеров.
В одном примере четырнадцатого аспекта второй функционализированный слой также наносится на вторую часть фоторезиста и вторые промежуточные области; первая часть второго функционализированного слоя удаляется со второй частью фоторезиста; и данный способ дополнительно включает отшлифовку второго функционализированного слоя от вторых промежуточных областей.
В одном примере четырнадцатого аспекта присоединение первого набора праймеров включает предварительную прививку нерасщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера к первому функционализированному слою перед нанесением первого функционализированного слоя; и присоединение второго набора праймеров включает предварительную прививку расщепляемого первого праймера и нерасщепляемого второго праймера ко второму функционализированному слою перед нанесением второго функционализированного слоя.
В одном примере четырнадцатого аспекта присоединение первого набора праймеров включает прививку нерасщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера к первому функционализированному слою после его нанесения; и присоединение второго набора праймеров включает прививку расщепляемого первого праймера и нерасщепляемого второго праймера ко второму функционализированному слою после его нанесения.
Следует понимать то, что любые характеристики четырнадцатого аспекта, раскрытого в данном документе, могут быть объединены друг с другом в любых желательных способе и/или конфигурации. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик четырнадцатого аспекта и/или первого аспекта, и/или второго аспекта может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Шестнадцатым аспектом, раскрытым в данном документе, является способ, включающий импринтинг многослойного субстрата, включающего: подложку; первый функционализированный слой на подложке; второй функционализированный слой на первом функционализированном слое; и пассивирующий слой на втором функционализированном слое; образуя, посредством этого, элементы, разделенные промежуточными областями пассивирующего слоя, где область каждого первого и второго функционализированных слоев экспонируется в каждом элементе; присоединение первого набора праймеров к первому функционализированному слою или к первой функционализированной области и второго набора праймеров ко второму функционализированному слою или второй функционализированной области, где первый набор праймеров отличается от второго набора праймеров.
В одном примере шестнадцатого аспекта присоединение первого набора праймеров включает предварительную прививку нерасщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера к первому функционализированному слою перед включением первого функционализированного слоя в многослойный субстрат; и присоединение второго набора праймеров включает предварительную прививку расщепляемого первого праймера и нерасщепляемого второго праймера ко второму функционализированному слою перед включением второго функционализированного слоя в многослойный субстрат.
В одном примере шестнадцатого аспекта присоединение первого набора праймеров включает прививку нерасщепляемого первого праймера и расщепляемого второго праймера к первой функционализированной области в каждой впадине; и присоединение второго набора праймеров включает прививку расщепляемого первого праймера и нерасщепляемого второго праймера ко второй функционализированной области в каждой впадине.
Следует понимать то, что любые характеристики шестнадцатого аспекта, раскрытого в данном документе, могут быть объединены друг с другом в любых желательных способе и/или конфигурации. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик шестнадцатого аспекта и/или первого аспекта, и/или второго аспекта может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Семнадцатым аспектом, раскрытым в данном документе, является способ, включающий импринтинг первой смолы с образованием впадины, включающей глубокую часть и мелкую часть, определенные частью в виде ступеньки, где первая смола располагается на жертвенном слое, который располагается на второй смоле; травление первой части первой смолы и части жертвенного слоя, лежащего под глубокой частью, посредством этого экспонируя часть второй смолы; травление части в виде ступеньки, посредством этого экспонируя вторую часть жертвенного слоя; нанесение первого функционализированного слоя на часть второй смолы с образованием первой функционализированной области; удаление второй части жертвенного слоя, посредством этого экспонируя вторую часть второй смолы; нанесение второго функционализированного слоя на вторую часть второй смолы с образованием второй функционализированной области; и присоединение первого набора праймеров к первому функционализированному слою или первой функционализированной области и второго набора праймеров ко второму функционализированному слою или второй функционализированной области, где первый набор праймеров отличается от второго набора праймеров.
В одном примере семнадцатого аспекта во время нанесения второго функционализированного слоя второй функционализированный слой отлагается на промежуточные области, окружающие впадины, и не отлагается на первую функционализированную область; и данный способ дополнительно включает отшлифовку второго функционализированного слоя от промежуточных областей.
Следует понимать то, что любые характеристики семнадцатого аспекта, раскрытого в данном документе, могут быть объединены друг в любых желательных способе и/или конфигурации. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик семнадцатого аспекта и/или первого аспекта, и/или второго аспекта может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Восемнадцатым аспектом, раскрытым в данном документе, является способ, включающий присоединение первого набора праймеров к первой опорной структуре; присоединение второго набора праймеров ко второй опорной структуре, где второй набор праймеров и вторая опорная структура отличаются от первого набора праймеров и первой опорной структуры; и загрузку первой и второй опорных структур на поверхности субстрата, имеющего множество первых сайтов захвата для селективного присоединения к первым опорным структурам и множество вторых сайтов захвата для селективного присоединения ко вторым опорным структурам.
Следует понимать то, что любые характеристики восемнадцатого аспекта, раскрытого в данном документе, могут быть объединены друг с другом в любых желательных способе и/или конфигурации. Кроме того, следует понимать то, что любая комбинация характеристик восемнадцатого аспекта и/или первого аспекта, и/или второго аспекта может быть объединена с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Характеристики примеров по настоящему раскрытию станут очевидными посредством ссылки на следующее подробное описание и графические материалы, в которых подобные ссылочные числительные соответствуют аналогичным, хотя, факультативно, и не идентичным компонентам. Ради краткости ссылочные числительные или характеристики, имеющие ранее описанную функцию, могут быть описаны или могут не быть описаны в связи с другими графическими материалами, в которых они появляются.
Фиг. 1A-1D представляют собой схематичные виды разных примеров первого и второго наборов праймеров, присоединенных к первой и второй области на субстрате;
Фиг. 2 представляет собой схематичный вид поперечного среза примера первой и второй областей на поверхности субстрата;
Фиг. 3А и 3В представляют собой, соответственно, схематичный вид поперечного среза и вид сверху примера первой и второй областей во впадине;
Фиг. 4А-4С представляют собой схематичные виды поперечного среза разных примеров первой и второй областей во впадине;
Фиг. 5 представляет собой схематичный вид поперечного среза примера первой области во впадине и второй области на поверхности субстрата;
Фиг. 6А и 6В представляют собой, соответственно, схематичный вид поперечного среза и вид сверху примера первой области во впадине и второй области на поверхности субстрата;
Фиг. 7A-7G представляют собой схематичный вид поперечного среза, который совместно иллюстрирует пример способа получения типичной проточной ячейки, включающей пример первой области во впадине и второй области на поверхности субстрата;
Фиг. 8A-8F представляют собой схематичный вид поперечного среза, который совместно иллюстрирует другой пример способа получения другой типичной проточной ячейки, включающей пример первой области во впадине и второй области на поверхности субстрата;
Фиг. 9 представляет собой схематичный вид поперечного среза примера первой области во впадине и второй области как части шарика, который располагается во впадине;
Фиг. 10 представляет собой схематичный вид поперечного среза примера первого и второго набора праймеров, присоединенных к отдельным субстратам;
Фиг. 11А-11С представляют собой схематичные перспективные виды, которые совместно иллюстрируют образование одного примера структурированной смолы на подложке;
Фиг. 11А, 11В и 11D представляют собой схематичные перспективные виды, которые совместно иллюстрируют образование другого примера структурированной смолы на подложке;
Фиг. 12 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую пример способа, раскрытого в данном документе;
Фиг. 13A-13D представляют собой схематичные перспективные виды, которые совместно иллюстрируют пример способа, раскрытого в данном документе, с использованием структурированного субстрата Фиг. 11С;
Фиг. 14 представляет собой вид поперечного среза, полученного вдоль линии 4-4 Фиг. 13D;
Фиг. 15A-15D представляют собой схематичные перспективные виды, которые совместно иллюстрируют другой пример способа, раскрытого в данном документе, с использованием структурированного субстрата Фиг. 11С;
Фиг. 16 представляет собой вид поперечного среза, полученного вдоль линии 6-6 Фиг. 15D;
Фиг. 17A-17D представляют собой схематичные перспективные виды, которые совместно иллюстрируют пример способа, раскрытого в данном документе, с использованием структурированного субстрата Фиг. 11D;
Фиг. 18 представляет собой вид поперечного среза, полученного вдоль линии 8-8 Фиг. 17D;
Фиг. 19A-19D представляют собой схематичные перспективные виды, которые совместно иллюстрируют другой пример способа, раскрытого в данном документе, с использованием структурированного субстрата Фиг. 11D;
Фиг. 20 представляет собой вид поперечного среза, полученного вдоль линии 10-10 Фиг. 19D;
Фиг. 21 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую другой пример способа, раскрытого в данном документе;
Фиг. 22А-22Е представляют собой схематичные перспективные виды, которые совместно иллюстрируют пример другого способа, раскрытого в данном документе;
Фиг. 22F представляет собой увеличенный вид впадины примера проточной ячейки, показанной на Фиг. 22Е, где данная впадина включает блок-сополимер и праймер, привитый к одному блоку;
Фиг. 23А и 23В представляют собой схематичные виды сверху примеров впадин и окружающих промежуточных областей, где разные примеры блок-сополимеров подвергаются самосборке и разделению фаз во впадинах, где на каждой Фиг. показана отличная структура блоков;
На Фиг. 24 показан схематичный перспективный вид примера проточной ячейки, раскрытой в данном документе;
Фиг. 25А и 25В представляют собой схематичные виды поперечного среза, иллюстрирующие разные примеры проточных ячеек, раскрытых в данном документе, которые включают триблок-сополимеры;
Фиг. 26А-26Н представляют собой схематичные виды, которые совместно иллюстрируют типичный способ образования типичных областей, показанных на Фиг. 2;
Фиг. 27A-27F представляют собой схематичные виды, которые совместно иллюстрируют другой типичный способ образования типичных областей, показанных на Фиг. 2;
Фиг. 28A-28G представляют собой схематичные виды, которые совместно иллюстрируют типичный способ образования типичных областей, показанных на Фиг. 3А и 3В;
Фиг. 29А-29Н представляют собой схематичные виды, которые совместно иллюстрируют другой типичный способ образования типичных областей, показанных на Фиг. 3А и 3В;
Фиг. 30A-30F представляют собой схематичные виды, которые совместно иллюстрируют еще один типичный способ образования типичных областей, показанных на Фиг. 3А и 3В;
Фиг. 31A-31I представляют собой схематичные виды, которые совместно иллюстрируют типичный способ образования типичных областей, показанных на Фиг. 3А и 3В;
Фиг. 32A-32F представляют собой схематичные виды, которые совместно иллюстрируют типичный способ образования типичных областей, показанных на Фиг. 4С;
Фиг. 33А представляет собой схематичный вид типичного способа образования другого примера областей, раскрытых в данном документе;
Фиг. 33В представляет собой вид сверху одной из впадин Фиг. 33А, иллюстрирующий области;
Фиг. 34A-34S представляют собой схематичные виды, которые совместно иллюстрируют типичный способ образования типичных областей в бороздках; и
На Фиг. 35 схематично проиллюстрирован пример функционализированных опорных структур;
Фиг. 36А и 36В представляют собой схематичные виды, которые совместно иллюстрируют типичный способ образования типичных областей с использованием функционализированных опорных структур Фиг. 35;
Фиг. 37А и 37В представляют собой схематичные виды, которые совместно иллюстрируют типичный способ образования типичных областей с использованием функционализированных опорных структур Фиг. 35;
Фиг. 38А и 38В представляют собой схематичные виды, которые совместно иллюстрируют типичный способ, включающий другой пример блок-сополимера;
Фиг. 39А представляет собой изображение сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) субстрата проточной ячейки, имеющего впадины диаметром 50 мкм, разделенные промежуточными областями, со слоем предварительно привитого полимера, нанесенным на них;
Фиг. 39В представляет собой изображение СЭМ субстрата проточной ячейки Фиг. 39А с защитным слоем, отложенным на предварительно привитый полимерный слой;
Фиг. 39С представляет собой изображение СЭМ субстрата проточной ячейки Фиг. 39В после травления для удаления защитного слоя от промежуточных областей;
На Фиг. 40А и 40В проиллюстрирован анализ данных для одновременного парно-концевого считывания (Фиг. 40А) и последовательного парно-концевого считывания (Фиг. 40В);
Фиг. 41A-41G представляют собой схематичные виды, которые совместно иллюстрируют другой типичный способ образования типичных областей, показанных на Фиг. 2; и
Фиг. 42А-42Н представляют собой схематичные виды, которые совместно иллюстрируют еще один другой типичный способ образования типичных областей, показанных на Фиг. 2.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Примеры проточных ячеек, раскрытых в данном документе, могут использоваться для секвенирования нуклеиновых кислот.
Некоторые из данных проточных ячеек включают разные наборы праймеров, присоединенных к разным областям субстрата проточной ячейки. В этих примерах данные наборы праймеров могут контролироваться таким образом, что химия расщепления (линеаризации) является ортогональной в разных областях. Ортогональная химия расщепления может осуществляться посредством идентичных сайтов расщепления, которые присоединяются к разным праймерам в разных наборах, или посредством разных сайтов расщепления, которые присоединяются к разным праймерам в разных наборах. Это обеспечивает генерацию кластера прямых нитей в одной области субстрата и генерацию кластера обратных нитей в другой области субстрата. В одном примере данные области являются непосредственно смежными друг с другом. В другом примере любое пространство между областями является достаточно маленьким для того, чтобы кластеризация могла охватывать две данные области. С некоторыми конфигурациями проточных ячеек, раскрытыми в данном документе, прямые и обратные нити являются разделенными в пространстве, что отделяет флуоресцентные сигналы от обоих считываемых фрагментов при обеспечении одновременного распознавания оснований каждого считываемого фрагмента. В силу этого некоторые примеры проточных ячеек, раскрытых в данном документе, обеспечивают получение одновременного парно-концевого считывания.
Для получения одновременного парно-концевого считывания можно использовать другие примеры проточных ячеек; или их можно использовать для получения последовательного парно-концевого считывания, где прямые нити секвенируются и удаляются, и затем обратные нити секвенируются и удаляются. В этих других примерах структурированная смола на подложке проточной ячейки покрывается блок-сополимером, который подвергается направленной самоорганизации во впадинах структурированной смолы. Данная структурированная смола служит в качестве направляющей для организации блок-сополимера. При контролируемых условиях блок-сополимер подвергается самоорганизации в специфические домены. В некоторых примерах, раскрытых в данном документе, функциональность доменов контролируется так, чтобы быть ортогональной таким образом, что один или более чем один домен может взаимодействовать со структурированной смолой, и один или более чем один другой домен может прививать праймер(ы). В некоторых примерах функциональность домена может контролироваться для изменения характеристики данного домена. Данные типичные проточные ячейки могут подходить для применения с использованием оптических или неоптических способов выявления.
Определения
Следует понимать то, что термины, используемые в данном документе, будут принимать их обычное значение в релевантной области, если не определено иначе. Несколько терминов, используемых в данном документе, и их значения излагаются ниже.
Формы единственного числа включают объекты ссылки во множественном числе, если контекст явно не диктует иное.
Термины содержащий, включающий, вмещающий и разные формы данных терминов являются синонимичными друг другу и подразумеваются как одинаково широкие.
Термины верхняя часть, дно, нижний, верхний, на и т.д. используются в данном документе для описания проточной ячейки и/или разных компонентов данной проточной ячейки. Следует понимать то, что не означает то, что данные термины направления подразумевают специфическую ориентацию, но используются для обозначения относительной ориентации между компонентами. Применение терминов направления не должно интерпретироваться как ограничивающее раскрытые в данном документе примеры какой(кими)-либо конкретной(ными) ориентацией(ями).
«Акриламидный мономер» представляет собой мономер со структурой  или мономер, включающий акриламидную группу с данной структурой. Примеры мономера, включающего акриламидную группу, включают азидоацетамидопентилакриламид:
и N-изопропилакриламид:
Можно использовать другие акриламидные мономеры.
Альдегид в том виде, в котором он используется в данном документе, представляет собой органическое соединение, содержащее функциональную группу со структурой -СНО, которое включает карбонильный центр (т.е. углерод, связанный двойной связью с кислородом) с атомом углерода, также связанным с водородом и группой R, такой как алкил или другая боковая цепь. Общей структурой альдегида является:
1-4
Термин «алкил» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к прямой или разветвленной углеводородной цепи, которая является полностью насыщенной (т.е. не содержит двойных или тройных связей). Алкильная группа может иметь от 1 до 20 атомов углерода. Типичные алкильные группы включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, третичный бутил, пертил, гексил и тому подобные. В качестве примера, обозначение «Салкил» указывает то, что в алкильной цепи имеется от одного до четырех атомов углерода, т.е. алкильная цепь выбрана из группы, состоящей из метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила.
Термин «алкенил» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к прямой или разветвленной углеводородной цепи, содержащей одну или более чем одну двойную связь. Алкенильная группа может иметь от 2 до 20 атомов углерода. Типичные алкенильные группы включают этенил, пропенил, бутенил, пентенил, гексенил и тому подобные.
Термин «алкин» или «алкинил» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к прямой или разветвленной углеводородной цепи, содержащей одну или более чем одну тройную связь. Алкинильная группа может иметь от 2 до 20 атомов углерода.
Термин «арил» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к ароматическому кольцу или кольцевой системе (т.е. два или более чем два конденсированных кольца, которые имеют два общих смежных атома углерода), содержащим только углерод в остове кольца. Когда арил представляет собой кольцевую систему, каждое кольцо в данной системе является ароматическим. Арильная группа может иметь от 6 до 18 атомов углерода. Типичные арильные группы включают фенил, нафтил, азуленил и антраценил.
a
b
a
b
Функциональная «амино» группа относится к группе -NRR, где R и R каждый независимо выбран из атома водорода (например, , С1-6алкила, С2-6алкенила, С2-6алкинила, С3-7карбоциклила, С6-10арила, 5-10-членного гетероарила и 5-10-членного гетеро цикл ила, как определено в данном документе.
Термин «присоединенный» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к состоянию двух объектов, являющихся соединенными, пристегнутыми, приклеенными, присоединенными или связанными друг с другом, либо непосредственно, либо опосредованно. Например, шарик, который присоединен к впадине, может быть физически захваченным в данной впадине. В качестве другого примера нуклеиновая кислота может быть присоединена к функционализированному полимеру ковалентной или нековалентной связью. Ковалентная связь характеризуется наличием общих пар электронов между атомами. Нековалентная связь представляет собой физическую связь, которая не включает наличие общих пар электронов и может включать, например, водородные связи, ионные связи, вандерваальсовы силы, гидрофильные взаимодействия и гидрофобные взаимодействия. В качестве еще одного другого примера, праймер может быть присоединен к области на субстрате посредством опорной структуры.
3
Функциональная группа «азид» или «азидо» относится к -N.
Термины «шарик» или «сердцевинная структура» функционализированного шарика относятся к маленькому телу, сделанному из твердого или полутвердого материала. Данное тело может иметь форму, характеризуемую, например, как шар, овал, микросфера или другая признанная форма частицы, независимо от того, имеет ли она правильные или неправильные измерения. Типичные материалы, которые являются полезными для шариков/ сердцевинных структур включают, без ограничения, стекло; пластмассу, такую как акрил, полистирол или сополимер стирола и другого материала, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретан или политетрафторэтилен (TEFLON от Chemours); полисахариды или поперечносвязанные полисахариды, такие как агароза или сефароза; нейлон; нитроцеллюлоза; смола; кремний или материалы на основе кремния, включающие диоксид кремния и модифицированный диоксид кремния; углеродное волокно; металл; неограническое стекло; пучок оптоволокон или множество других полимеров. Типичные шарики/ сердцевинные структуры включают шарики из стекла с контролируемым размером пор, парамагнитные шарики, соль тория, сефарозные шарики, нанокристаллы и другие, известные в данной области, как описано, например, в Microsphere Detection Guide от Bangs Laboratories, Fishers Ind. Шарики также могут быть покрыты полимером, который имеет функциональную группу, которая может присоединять праймер.
«Блок-сополимер» представляет собой сополимер, образованный при кластеризации друг с другом двух или более чем двух мономеров и образовании блоков повторяющихся звеньев. Каждый блок должен иметь по меньшей мере одну характеристику и/или по меньшей мере одну блокспецифичную функциональную группу, которая(рые) не присутствует(ют) в смежных блоках. В примерах, раскрытых в данном документе, блок-сополимеры способны, при воздействии на них конкретных условий отжига, к самоорганизации в упорядоченные домены с нанометровыми размерами посредством микрофазового разделения составляющих полимерных блоков. Конкретные примеры блок-сополимеров будут дополнительно описаны ниже.
Термин «блок-специфичная функциональная группа» относится к группировке атомов и/или связей в пределах конкретного блока блокполимера, который имеет конкретный функционал, такой как взаимодействие со структурированной смолой, присоединение праймера, корректировка параметра взаимодействия для управления микрофазового разделения, изменение характеристики блок-сополимера и т.д. В некоторых примерах, раскрытых в данном документе, каждый блок включает отличную блокспецифичную функциональную группу. Конкретные примеры каждой блокспецифичной функциональной группы будут дополнительно описаны ниже.
Термин «область связывания» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к области на подложке, которая подлежит связыванию с другим материалом, который может представлять собой, в качестве примеров, спейсерный слой, крышку, другой субстрат и т.д. или их комбинации (например, спейсерный слой и крышка). Связь, которая образуется на области связывания, может представлять собой химическую связь (как описано выше) или механическую связь (например, с использованием застежки и т.д.).
Термин «сайт захвата» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к части поверхности проточной ячейки, которая была физически модифицирована и/или модифицирована химическим свойством, которое обеспечивает локализацию функционализированной опорной структуры. В одном примере сайт захвата может включать химический захватывающий агент.
Термин «карбоциклил» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает неароматическое циклическое кольцо или кольцевую систему, содержащую только атомы углерода в остове кольцевой системы. Когда карбоциклил представляет собой кольцевую систему, два или более чем два кольца могут быть связаны друг с другом конденсированным, мостиковым способом или способом спиросоединения. Карбоциклилы могут иметь любую степень насыщения, при условии, что по меньшей мере одно кольцо в кольцевой системе не является ароматическим. Таким образом, карбоциклилы включают циклоалкилы, циклоалкенилы и циклоалкинилы. Карбо цикл ильная группа может иметь от 3 до 20 атомов углерода. Примеры карбоциклильных колец включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, 2,3-дигидроинден, бицикло[2.2.2.]октанил, адамантил и спиро[4.4]нонанил.
Термин «карбоновая кислота» или «карбоксил» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к-СООН.
«Химический захватывающий агент» представляет собой вещество, молекулу или группировку, которая способна присоединять, удерживать или связывать молекулу-мишень (например, функционализированная опорная структура). Один пример химического захватывающего агента включает захватывающую нуклеиновую кислоту (например, захватывающий олигонуклеотид), который является комплементарным по меньшей мере части нуклеиновой кислоты-мишени или присоединенным к молекуле-мишени. Еще один другой типичный химический захватывающий агент включает члена пары связывания рецептор-лиганд (например, авидин, стрептавидин, биотин, лектин, углевод, белок, связывающий нуклеиновую кислоту, эпитоп, антитело и т.д.), который способен связываться с молекулой-мишенью (или со связывающей группировкой, присоединенной к молекуле-мишени). Еще одним другим примером химического захватывающего агента является химический реактив, способный образовать электростатическое взаимодействие, водородную связь или ковалентную связь (например, тиол-дисульфидный обмен, клик-химия, реакция Дильса-Альдера и т.д.) с молекулой-мишенью.
Термин «циклоалкилен» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает полностью насыщенное карбоциклическое кольцо или кольцевую систему, которая присоединена к остальной молекуле через две точки присоединения.
Термин «циклоалкенил» или «циклоалкен» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает карбоциклильное кольцо или кольцевую систему, имеющую по меньшей мере одну двойную связь, где ни одно кольцо в данной кольцевой системе не является ароматическим. Примеры включают циклогексенил или циклогексен и норборненил или норборнен. Также термин «гетероциклоалкенил» или «гетероциклоалкен» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает карбоциклическое кольцо или кольцевую систему с по меньшей мере одним гетероатомом в остове кольца, имеющего по меньшей мере одну двойную связь, где ни одно кольцо в данной кольцевой системе не является ароматическим.
Термин «циклоалкинил» или «циклоалкин» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает карбоциклильное кольцо или кольцевую систему, имеющую по меньшей мере одну тройную связь, где ни одно кольцо в данной кольцевой системе не является ароматическим. Примером является циклооктин. Другим примером является бициклононин. Также термин «гетероциклоалкинил» или «гетероциклоалкин» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает карбоциклическое кольцо или кольцевую систему с по меньшей мере одним гетероатомом в остове кольца, имеющего по меньшей мере одну тройную связь, где ни одно кольцо в данной кольцевой системе не является ароматическим.
Термин «отложение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к любой подходящей методике нанесения, которая может осуществляться вручную или автоматизировано и, в некоторых случаях, приводит к модификации поверхностных свойств. Обычно отложение может осуществляться с использованием методики осаждения из паровой фазы, методик покрытия, методик прививки или тому подобных. Некоторые конкретные примеры включают химическое осаждение из паровой фазы (CVD), покрытие распылением (например, ультразвуковое покрытие распылением), покрытие методом центрифугирования, покрытие окунанием или погружением, покрытие, наносимое ножевым устройством, нанесение в ванночке, проточное покрытие, аэрозольную печать, трафаретную печать, м и кро контактную печать, струйную печать или тому подобные.
Термин «впадина» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к дискретному вогнутому элементу в субстрате или структурированной смоле, имеющему отверстие на поверхности, которое по меньшей мере частично окружается промежуточной(ными) областью(тями) субстрата или структурированной смолы. Впадины могут иметь любую из целого ряда форм в их отверстии в поверхности, включая, в качестве примеров, круглую, эллиптическую, квадратную, полигональную, звездчатую (с любым числом вершин) и т.д. Поперечный срез впадины, взятый ортогонально относительно поверхности, может быть искривленным, квадратным, полигональным, гиперболическим, коническим, угловым и т.д. В качестве примера, впадина может представлять собой лунку или две взаимосвязанные лунки. Впадина также может иметь более сложную архитектуру, такую как ребра, ступенчатые элементы и т.д.
Подразумевается то, что термин «каждый», при использовании в связи с набором элементов, идентифицирует индивидуальный элемент в наборе, но не обязательно относится к каждому элементу в наборе. Исключения могут встречаться, если прямое раскрытие или контекст явно диктуют иное.
Термин «эпокси» (также именуемый глицидильная или оксирановая группа) в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к  или
Подразумевается то, что термин «проточная ячейка» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает сосуд, имеющий камеру (т.е. проточный канал), где может проводиться реакция, входное отверстие для доставки реактива(вов) в камеру и выходное отверстие для удаления реактива(вов) из камеры. В некоторых примерах данная камера обеспечивает выявление реакции, которая происходит в камере. Например, данная камера/проточный канал может включать одну или более чем одну прозрачную поверхность, обеспечивающую оптическое выявление чипов, оптически меченых молекул или тому подобного во впадине.
Термин «проточный канал» в том виде, в котором он используется в данном документе, может представлять собой область, определенную между двумя связанными компонентами, которая может селективно получать жидкий образец. В некоторых примерах проточный канал может быть определен между структурированной смолой и крышкой, и, таким образом, может находиться в жидкостной связи с одной или более чем одной впадиной, определенной в структурированной смоле.
Термин «функционализированная опорная структура» относится к маленькому телу, сделанному из жесткого или полужесткого материала, которое имеет один из наборов праймеров, раскрытых в данном документе, присоединенный к его поверхности. Данное тело может иметь форму, характеризуемую, например, как шар, овал, микросфера или другая признанная форма частицы, независимо от того, имеет ли она правильные или неправильные измерения. Типичные материалы, которые являются полезными для данного тела включают, без ограничения, стекло; пластмассу, такую как акрил, полистирол или сополимер стирола и другого вещества, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретан или политетрафторэтилен (TEFLON от Chemours); полисахариды или поперечносвязанные полисахариды, такие как агароза или сефароза; нейлон; нитроцеллюлоза; смола; кремний или материалы на основе кремния, включающие диоксид кремния и модифицированный диоксид кремния; углеродное волокно; металл; неограническое стекло; пучок оптоволокон или множество других полимеров.
Термин «гетероарил» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к ароматическому кольцу или кольцевой системе (т.е. два или более чем два кольца, которые имеют два общих соседних атома), которая(рые) содержит(жат) один или более чем один гетероатом, то есть элемент, отличный от углерода, включающий азот, кислород и серу в остове кольца, но не ограничивающийся ими. Когда гетероарил представляет собой кольцевую систему, каждое кольцо в данной системе является ароматическим. Данная гетероарильная группа может иметь 5-18 членов кольца.
Термин «гетероциклил» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает неароматическое циклическое кольцо или кольцевую систему, содержащую по меньшей мере один гетероатом в остове кольца. Гетероциклилы могут соединяться друг с другом конденсированным, мостиковым способом или способом спиросоединения. Гетероциклилы могут иметь любую степень насыщенности, при условии, что по меньшей мере одно кольцо в кольцевой системе не является ароматическим. В данной кольцевой системе гетероатом(мы) может(гут) присутствовать либо в неароматическом, либо в ароматическом кольце. Гетероциклильная группа может иметь от 3 до 20 элементов кольца (т.е. число атомов, составляющих остов кольца, включающих атомы углерода и гетероатомы). В некоторых примерах гетероатом(мы) представляет(ют) собой О, N или S.
2
Термин «гидразин» или «гидразинил» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к -NHNH.
a
b
Термин «гидразон» или «гидразонил» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к группе  в которой каждый R и Rнезависимо выбран из атома водорода, С1-6алкила, С2-6алкенила, С3-7карбоциклила, С6-10арила, 5-10-членного гетероарила и 5-10-членного гетероциклила, как определено в данном документе.
Термин «гидрокси» или «гидроксил» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к группе -ОН.
Термин «промежуточная область» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к области, например, к субстрату, структурированной смоле или другой подложке, которая разделяет впадины. Например, промежуточная область может отделять одну впадину чипа от другой впадины чипа. Две впадины, которые отделяются друг от друга, могут быть дискретными, т.е. не имеющими физического контакта друг с другом. Во многих примерах промежуточная область является непрерывной, тогда как впадины являются дискретными, например, как в случае множества впадин, определенных в иных отношениях непрерывной поверхности. В других примерах промежуточные области и данные элементы являются дискретными, например, как в случае множества бороздок, разделенных соответствующими промежуточными областями. Разделение, предоставляемое промежуточной областью, может быть частичным или полным разделением. Промежуточные области могут иметь поверхностный материал, который отличается от поверхностного материала впадин, определенных в поверхности. Например, впадины могут иметь полимер и первый набор праймеров в них, а промежуточные области могут иметь полимер и второй набор праймеров на них. В качестве другого примера, впадины чипа могут иметь в них шарики, тогда как промежуточные области не имеют на них шариков.
a
Термин «нитрилоксид» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает группу  в которой R является таким, как определено в данном документе. Примеры получения нитрилоксида включают генерацию in situ из альдоксимов посредством обработки хлорамидом Т или посредством действия основания на имидоилхлориды [RC(Cl)=NOH], или от реакции между гидроксиламином и альдегидом.
1
2
3
a
b
Термин «нитрон» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает группу  в которой R, R и R могут представлять собой любую из групп R и R, определенных в данном документе.
Термин «нуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, включает азотсодержащее гетероциклическое основание, сахар и одну или более чем одну фосфатную группу. Нуклеотиды представляют собой мономерные звенья последовательности нуклеиновой кислоты. В РНК сахар представляет собой рибозу, а в ДНК сахар представляет собой дезоксирибозу, т.е. сахар, не имеющий гидроксильной группы, которая присутствует в 2'-положении в рибозе. Азотсодержащее гетероциклическое основание (т.е. нуклеиновое основание) может представлять собой пуриновое основание или пиримидиновое основание. Пуриновые основания включают аденин (А) и гуанин (G), и их модифицированные производные или аналоги. Пиримидиновые основания включают цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U), и их модифицированные производные или аналоги. С-1 атом дезоксирибозы связывается с N-1 пиримидина или N-9 пурина. Аналог нуклеиновой кислоты может иметь измененным любой из фосфатного остова, сахара или нуклеинового основания. Примеры аналогов нуклеиновых кислот включают, например, универсальные основания или аналоги фосфатно-сахарного остова, как, например, пептидная нуклеиновая кислота (ПНК).
Термин «структурированная смола» относится к любому полимеру, который может иметь определенные в нем впадины. Конкретные примеры смол и методик структурирования данных смол будут описаны далее ниже. В некоторых примерах, раскрытых в данном документе, структурированная смола может служить как направляющая матрица для того, чтобы блок-сополимер подвергался самоорганизации на ней. Конкретные примеры характеристик, которые делают полимер «направляющей матрицей» будут дополнительно описаны ниже.
Термин «праймер» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется как последовательность одноцепочечной нуклеиновой кислоты (например, одноцепочечной ДНК или одноцепочечной РНК). Некоторые праймеры, именуемые в данном документе амплификационными праймерами, служат в качестве исходной точки для амплификации матрицы и генерации кластера. Другие праймеры, именуемые в данном документе праймерами для секвенирования, служат в качестве исходной точки для синтеза ДНК или РНК. 5'-Конец праймера может быть модифицирован для обеспечения реакции связывания с функциональной группой полимера или с поверхностью шарика. Длиной данного праймера может быть любое число оснований, и он может включать целый ряд неприродных нуклеотидов. В одном примере праймер для секвенирования представляет собой короткую нить, варьирующую от 10 до 60 оснований или от 20 до 40 оснований.
Термин «спейсерный слой» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к веществу, которое связывает два компонента друг с другом. В некоторых примерах спейсерный слой может представлять собой вещество, поглощающее излучение, которое помогает связыванию, или может быть приведено в контакт с веществом, поглощающим излучение, которое помогает связыванию.
«Отжиг растворителем» или «отжиг парами растворителя» включает воздействие на полимер (например, в виде пленки или слоя) избытка растворителя в герметичной емкости с получением насыщенного пара (т.е. атмосферы растворителя) над полимером. Полимерную пленку или слой можно выдерживать при комнатной температуре (например, от примерно 18°С до примерно 25°С) или при повышенной температуре, что вызывает набухание полимера и увеличивает подвижность его цепи.
Термин «субстрат» относится к структуре, на которую можно добавлять разные компоненты проточной ячейки (например, полимер, праймер(ры) и т.д.). Данный субстрат может представлять собой кристаллическую пластину, панель, прямоугольный лист, кристалл или иметь любую другую подходящую конфигурацию. Данный субстрат обычно является твердым и нерастворимым в водной жидкости. Данный субстрат может быть инертным в отношении химии, которая используется для модификации впадин, или которая присутствует во впадинах. Например, субстрат может быть инертным в отношении химии, используемой для образования полимера, для присоединения праймера(ров) и т.д. Субстрат может представлять собой однослойную структуру или многослойную структуру (например, включающую подложку и структурированную смолу на подложке). Примеры подходящих субстратов будут дополнительно описаны ниже.
Термин «тиольная» функциональная группа относится к-SH.
Термины «тетразин» и «тетразинил» в том виде, в котором они используются в данном документе, относятся к шестичленной гетероарильной группе, содержащей четыре атома азота. Тетразин факультативно может быть замещенным.
Термин «тетразол» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к пятичленной гетероциклической группе, включающей четыре атома азота. Тетразол может быть факультативно замещенным.
Проточные ячейки для одновременного парно-концевого секвенирования
Пример проточной ячейки, раскрытой в данном документе, включает субстрат; первый набор праймеров, присоединенных к первой области на субстрате, причем данный первый набор праймеров включает нерасщепляемый первый праймер и расщепляемый второй праймер; и второй набор праймеров, присоединенных ко второй области на субстрате, причем данный второй набор праймеров включает расщепляемый первый праймер и нерасщепляемый второй праймер.
3
4
2
5
6
2
Примеры подходящих субстратов включают э по кси сил океан, стекло и модифицированное или функционализированное стекло, пластмассы (включающие акрилы, полистирол и сополимеры стирола и других веществ, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, политетрафторэтилен (такой как TEFLON от Chemours), циклические олефины/цикло-олефиновые полимеры (СОР) (такие как ZEONOR от Zeon), полиимиды и т.д.), нейлон, керамику/оксидную керамику, диоксид кремния, аморфный кварц или вещества на основе диоксида кремния, силикат алюминия, кремний и модифицированный кремний (например, р+ кремний с присадкой бора), нитрид кремния (SiN), оксид кремния (SiO), пентоксид тантала (TaO) или другой(гие) оксид(ды) тантала (ТаО), оксид гафния (HaO), углерод, металлы, виды неорганического стекла или тому подобные. Данный субстрат также может представлять собой многослойную структуру. Некоторые примеры многослойной структуры включают стекло или кремний, со слоем покрытия из оксида тантала или другой оксидной керамики на поверхности. Другие примеры многослойной структуры включают нижележащую подложку (например, стекло или кремний), имеющую на ней структурированную смолу. Другие примеры многослойного субстрата могут включать субстрат со структурой «кремний на диэлектрике» (SOI).
В одном примере данный субстрат может иметь диаметр, варьирующий от примерно 2 мм до примерно 300 мм, или представлять собой прямоугольный лист или панель, имеющую ее наибольшее измерение вплоть до примерно 3 метров. В одном примере данный субстрат представляет собой кристаллическую пластину, имеющую диаметр, варьирующий от примерно 200 мм до примерно 300 мм. В другом примере данный субстрат представляет собой кристалл, имеющий ширину, варьирующую от примерно 0,1 мм до примерно 10 мм. В то время как были приведены типичные размеры, следует понимать то, что можно использовать субстрат с любыми подходящими размерами. В качестве другого примера можно использовать панель, которая представляет собой прямоугольную подложку, которая имеет большую площадь поверхности, чем 300 мм круглая кристаллическая пластина.
В некоторых примерах проточной ячейки первый набор праймеров присоединен к первой области на субстрате, и второй набор праймеров присоединен ко второй области на субстрате. На Фиг. 1А - Фиг. 1D показаны разные конфигурации наборов праймеров 12А, 12А', 12В, 12В', 12С, 12С' и 12D, 12D', присоединенных к разным областям 14, 16.
Каждый из первых наборов праймеров 12А, 12В, 12С и 12D включает нерасщепляемый первый праймер 18 или 18' и расщепляемый второй праймер 20 или 20'; и каждый из вторых наборов праймеров 12А', 12В', 12С' и 12D' включает расщепляемый первый праймер 19 и нерасщепляемый второй праймер 21.
Нерасщепляемый первый праймер 18 или 18' и расщепляемый второй праймер 20 или 20' представляют собой представляют собой олиго пары, например, где нерасщепляемый первый праймер 18 или 18' представляет собой прямой амплификационный праймер, и расщепляемый второй праймер 20 или 20' представляет собой обратный амплификационный праймер, или где расщепляемый второй праймер 20 или 20' представляет собой прямой амплификационный праймер, и нерасщепляемый первый праймер 18 или 18' представляет собой обратный амплификационный праймер. В каждом примере первого набора праймеров 12А, 12В, 12С и 12D расщепляемый второй праймер 20 или 20' включает сайт расщепления 22, тогда как нерасщепляемый первый праймер 18 или 18' не включает сайт расщепления 22.
Расщепляемый первый праймер 19 или 19' и нерасщепляемый второй праймер 21 или 21' также представляют собой олиго пары, например, где расщепляемый первый праймер 19 или 19' представляет собой прямой амплификационный праймер, и нерасщепляемый второй праймер 21 или 21' представляет собой обратный амплификационный праймер, или где нерасщепляемый второй праймер 21 или 21' представляет собой прямой амплификационный праймер, и расщепляемый первый праймер 19 или 19' представляет собой обратный амплификационный праймер. В каждом примере второго набора праймеров 12А', 12В', 12С' и 12D' расщепляемый первый праймер 19 или 19' включает сайт расщепления 22' или 23, тогда как нерасщепляемый второй праймер 21 или 21' не включает сайт расщепления 22' или 23.
Следует понимать то, что нерасщепляемый первый праймер 18 или 18' первого набора праймеров 12А, 12В, 12С и 12D и расщепляемый первый праймер 19 или 19' второго набора праймеров 12А', 12В', 12С' и 12D' имеют одинаковую нуклеотидную последовательность (например, оба представляют собой прямые амплификационные праймеры), за исключением того, что расщепляемый первый праймер 19 или 19' включает сайт расщепления 22' или 23', интегрированный в нуклеотидную последовательность или в линкер 24', присоединенный к данной нуклеотидной последовательности. Аналогично расщепляемый второй праймер 20 или 20' первого набора праймеров 12А, 12В, 12С и 12D и нерасщепляемый второй праймер 21 или 21' второго набора праймеров 12А', 12В', 12С' и 12D' имеют одинаковую нуклеотидную последовательность (например, оба представляют собой обратные амплификационные праймеры), за исключением того, что расщепляемый второй праймер 20 или 20' включает сайт расщепления 22, интегрированный в нуклеотидную последовательность или в линкер 24, присоединенный к данной нуклеотидной последовательности.
Следует понимать то, что когда первые праймеры 18 и 19 или 18' и 19' представляют собой прямые амплификационные праймеры, вторые праймеры 20 и 21 или 20' и 21' представляют собой обратные праймеры и наоборот.
Примеры нерасщепляемых праймеров 18, 21 или 18', 21' включают праймеры Р5 и Р7, примеры которых используются на поверхности имеющихся в продаже проточных ячеек, продаваемых Illumina Inc. для секвенирования, например, на HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NEXTSEQ™, NEXTSEQDX™, NOVASEQ™, ISEQ™, GENOME ANALYZER™ и других инструментальных платформах. Праймеры Р5 и Р7 имеют универсальную последовательность для целей захвата и/или амплификации. В одном примере праймеры Р5 и Р7 включают следующее:
Праймеры Р5 и Р7 представляют собой нерасщепляемые праймеры 18, 21 или 18', 21', так как они не включают сайт расщепления 22, 22', 23. Следует понимать то, что в качестве нерасщепляемых праймеров 18, 21 или 18', 21' можно использовать любую подходящую универсальную последовательность.
Примеры расщепляемых праймеров 19, 20 или 19', 20' включают праймеры Р5 и Р7 (или другую универсальную последовательность) с соответствующими сайтами расщепления 22, 22', 23, включенными в соответствующие последовательности нуклеиновых кислот (например, Фиг. 1А и Фиг. 1С) или в линкер 24', 24, который присоединяет расщепляемые праймеры 19, 20 или 19', 20' к соответствующим областям 16, 14 (Фиг. 1В и Фиг. 1D). Примеры подходящих сайтов расщепления 22, 22', 23 включают ферментативно расщепляемые нуклеиновые основания или химически расщепляемые нуклеиновые основания, модифицированные нуклеиновые основания или линкеры (например, между нуклеиновыми основаниями). Ферментативно расщепляемое нуклеиновое основание может быть чувствительным к расщеплению посредством реакции с гликозилазой и эндонуклеазой, или с экзонуклеазой. Одним конкретным примером расщепляемого нуклеинового основания является дезоксиурацил (dU), который может служить мишенью фермента USER. В одном примере основание урацил может быть включено в положение 7-го основания от З'-конца праймера Р5 (P5U) или праймера Р7 (P7U). Также могут быть использованы другие сайты без оснований. Примеры химически расщепляемых нуклеиновых оснований, модифицированных нуклеиновых оснований или линкеров включают соседний диол, дисульфид, силан, азобензол, фоторасщепляемую группу, аллил Т (аналог нуклеотида тимина, имеющий аллильную функциональную группу), аллиловые эфиры или простой эфир с функциональной азидо группой.
Каждый набор праймеров 12А и 12А' или 12В и 12В', или 12С и 12С', или 12D и 12D' присоединен к соответствующей области 14 или 16 на субстрате. В некоторых примерах области 14, 16 имеют одинаковую поверхностную химию, и любая из методик, изложенных в данном документе, может использоваться для прививки одного набора праймеров 18, 20 или 18', 20' на область 14 и другого набора праймеров 19, 21 или 19', 21' - на область 16. В других примерах области 14 или 16 включают разные поверхностные химии (например, функциональные группы), которые могут селективно взаимодействовать с соответствующими праймерами 18, 20 или 18', 20', или 19, 21 или 19', 21'. В этих других примерах первая область 14 имеет первую функциональную группу, и вторая область 16 имеет вторую функциональную группу, которая отличается от первой функциональной группы.
Как упомянуто, на Фиг. 1A-1D показаны разные конфигурации наборов праймеров 12А, 12А', 12В, 12В', 12С, 12С' и 12D, 12D', присоединенных к разным областям 14, 16. Более конкретно, на Фиг. 1А - Фиг. 1D показаны разные конфигурации праймеров 18, 20 и 19, 21 или 18', 20' и 19', 21', которые можно использовать.
В примере, показанном на Фиг. 1А, праймеры 18, 20 и 19, 21 наборов праймеров 12А и 12А являются непосредственно присоединенными, например, к областям 14 и 16 без линкера 24, 24'. Область 14 может иметь поверхностные функциональные группы, которые могут иммобилизовать концевые группы на 5'-конце праймеров 18, 20. Аналогично область 16 может иметь поверхностные функциональные группы, которые могут иммобилизовать концевые группы на 5'-конце праймеров 19, 21. В одном примере химия иммобилизации между областью 14 и праймерами 18, 20 и химия иммобилизации между областью 16 и праймерами 19, 21 может отличаться таким образом, что праймеры 18, 20 или 19, 21 селективно присоединяются к желательной области 14 или 16. В другом примере химия иммобилизации может быть одинаковой для областей 14, 16 и соответствующих праймеров 18, 20 или 19, 21, и методика структурирования может использоваться для прививки одного набора праймеров 12А, 12А' за один раз. В еще одном другом примере вещества, наносимые для образования областей 14, 16, могут иметь соответствующие праймеры 18, 20 или 19, 21, предварительно привитые к ним, и, таким образом, химии иммобилизации могут быть одинаковыми или разными.
В данном примере иммобилизация может осуществляться посредством одноточечного ковалентного присоединения к соответствующей области 14 или 16 на 5'-конце соответствующих праймеров 18 и 20 или 19 и 21. В областях 14, 16 можно использовать любые подходящие способы ковалентного присоединения, известные в данной области. Примеры терминированных праймеров, которые можно использовать, включают праймер, терминированный алкином, праймер, терминированный тетразином, праймер, терминированный азидо, праймер, терминированный амино, праймер, терминированный эпокси или глицидилом, праймер, терминированный тиофосфатом, праймер, терминированный тиолом, праймер, терминированный альдегидом, праймер, терминированный гидразином, праймер, терминированный фосфорамидитом, и праймер, терминированный триазолиндионом. В некоторых конкретных примерах праймер, терминированный сложным сукцинимидиловым эфиром (NHS), может взаимодействовать с амином на поверхности области 14 и/или 16, праймер, терминированный альдегидом, может взаимодействовать с гидразином на поверхности области 14 и/или 16, или праймер, терминированный алкином, может взаимодействовать с азидом на поверхности области 14 и/или 16, или праймер, терминированный азидом, может взаимодействовать с алкином или DBCO (дибензоциклооктин) на поверхности области 14 и/или 16, или праймер, терминированный амино, может взаимодействовать с активированной карбоксилатной группой или сложным NHS эфиром на поверхности области 14 и/или 16, или праймер, терминированный тиолом, может взаимодействовать с алкилирующим реактивом (например, йодацетамин или малеимид) на поверхности области 14 и/или 16, праймер, терминированный фосфорамидитом, может взаимодействовать с тиоэфиром на поверхности области 14 и/или 16, или праймер, модифицированный биотином, может взаимодействовать со стрептавидином на поверхности области 14 и/или 16.
Также в примере, показанном на Фиг. 1А, сайт расщепления 22, 22' каждого из расщепляемых праймеров 20, 19 включается в последовательность праймера 20, 19. В данном примере используется одинаковый тип сайта расщепления 22, 22' в расщепляемых праймерах 20, 19 соответствующих наборов праймеров 12А, 12А'. В качестве примера, сайтами расщепления 22, 22' являются основания урацил, и расщепляемыми праймерами 20, 19 являются P5U и P7U. В данном примере нерасщепляемый праймер 18 олиго пары 18, 20 может представлять собой Р7, и нерасщепляемый праймер 21 олиго пары 19, 21 может представлять собой Р5. Таким образом, в данном примере первый набор праймеров 12А включает Р7, P5U, и второй набор праймеров 12А' включает Р5, P7U. Наборы праймеров 12А, 12А' имеют противоположные химии линеаризации, что, после амплификации, генерации кластеров и линеаризации, обеспечивает образование прямых матричных нитей на одной области 14 или 16 и образование обратных нитей на другой области 16 или 14.
В примере, показанном на Фиг. 1В, праймеры 18', 20' и 19', 21' наборов праймеров 12В и 12В' присоединяются к областям 14 и 16, например, через линкеры 24, 24'. Область 14 может иметь поверхностные функциональные группы, которые могут иммобилизовать линкер 24 на 5'-конце праймеров 18', 20'. Аналогичным образом, область 16 может иметь поверхностные функциональные группы, которые могут иммобилизовать линкер 24' на 5'-конце праймеров 19', 21'. В одном примере химия иммобилизации области 14 и линкеров 24, и химия иммобилизации области 16 и линкеров 24' может быть разной, таким образом, что праймеры 18', 20' или 19', 21' селективно прививаются к желательной области 14 или 16. В другом примере химия иммобилизации может быть одинаковой для областей 14, 16 и линкеров 24, 24', и для прививки одного набора праймеров 12В, 12В' за один раз может использоваться любая подходящая методика, раскрытая в данном документе. В еще одном другом примере вещества, наносимые для образования областей 14, 16, могут иметь соответствующие праймеры 18', 20' и 19', 21', предварительно привитые к ним, и, таким образом, химии иммобилизации могут быть одинаковыми или разными. Примеры подходящих линкеров 24, 24' могут включать линкеры на основе нуклеиновых кислот (например, 10 нуклеотидов или меньше) или линкеры не на основе нуклеиновых кислот, как, например, цепь полиэтиленгликоля, алкильная группа или углеродная цепь, алифатический линкер с соседними диолами, пептидный линкер и т.д. Примером линкера на основе нуклеиновой кислоты является полиТ спейсер, хотя также можно использовать и другие нуклеотиды. В одном примере спейсер представляет собой спейсер 6Т-10Т. Следующее представляет собой некоторые примеры нуклеотидов, включающих линкеры не на основе нуклеиновой кислоты (где В представляет собой нуклеиновое основание, и «олиго» представляет собой праймер):
В примере, показанном на Фиг. 1В, праймеры 18', 19' имеют одинаковую последовательность и одинаковый или отличный линкер 24, 24'. Праймер 18' является нерасщепляемый, тогда как праймер 19' включает сайт расщепления 22', включенный в линкер 24'. Также в данном примере праймеры 20', 21' имеют одинаковую последовательность (например, Р7) и одинаковый или отличный линкер 24, 24'. Праймер 21' является нерасщепляемый, и праймер 20' включает сайт расщепления 22, включенный в линкер 24. Одинаковый тип сайта расщепления 22, 22' используется в линкере 24, 24' каждого из расщепляемых праймеров 20', 19'. В качестве примера расщепляемыми сайтами 22, 22' могут быть урациловые основания, которые включаются в линкеры на основе нуклеиновой кислоты 24, 24'. Наборы праймеров 12В, 12В' имеют противоположные химии линеаризации, которые, после амплификации, генерации кластеров и линеаризации, обеспечивают образование прямых матричных нитей на области 14 или 16 и образование обратных нитей на другой области 16 или 14.
Пример, показанный на Фиг. 1С, является аналогичным примеру, показанному на Фиг. 1А, за исключением того, что используются разные типы сайтов связывания 22, 23 в расщепляемых праймерах 20, 19 соответствующего набора праймеров 12С, 12С'. В качестве примеров можно использовать два разных сайта ферментативного расщепления, два разных сайта химического расщепления, или можно использовать один сайт ферментативного расщепления и один сайт химического расщепления. Примеры разных сайтов расщепления 22, 23, которые можно использовать в соответствующих расщепляемых праймерах 20, 19, включают любую комбинацию соседнего диола, урацила, аллилового эфира, дисульфида, сайта рестрикционного фермента и 8-оксогуанина.
Пример, показанный на Фиг. 1D, является аналогичным примеру, показанному на Фиг. 1 В, за исключением того, что используются разные типы сайтов расщепления 22, 23 в линкерах 24, 24', присоединенных к расщепляемым праймерам 20', 19' соответствующих наборов праймеров 12D, 12D'. Примеры разных сайтов расщепления 22, 23, которые можно использовать в соответствующих линкерах 24, 24', присоединенных к расщепляемым праймерам 20, 19, включают любую комбинацию соседнего диола, урацила, аллилового эфира, дисульфида, сайта рестрикционного фермента и 8-оксогуанина.
В любом из примеров, показанных на Фиг. 1А - Фиг. 1D, присоединение праймеров 18, 20 и 19, 21 или 18', 20' и 19', 21' к областям 14, 16 оставляет специфичную в отношении матрицы часть праймеров 18, 20 и 19, 21 или 18', 20' и 19', 21' свободной для отжига с ее когнатной матрицей и свободную 3'-гидроксильную группу для достройки праймера.
Области 14, 16 представляют собой разные области на субстрате, которые имеют присоединенными к ним разные наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D'. Области 14, 16 могут включать вещества с разными функциональными группами. В некоторых примерах разными функциональными группами являются поверхностные функциональные группы субстрата или функциональные группы, которые были введены на поверхность субстрата, или могут быть функциональные группы другого компонента (например, полимерного слоя, шарика и т.д.), который откладывается на субстрат.
В некоторых примерах области 14, 16 являются химически одинаковыми, и любую методику, раскрытую в данном документе, можно использовать для последовательного присоединения праймеров 18, 20 и 19, 21 или 18', 20' и 19', 21' соответствующих наборов 12А и 12А' или 12В и 12В', или 12С и 12С', или 12D и 12D' к соответствующим областям 14, 16.
В одном примере, где области 14, 16 являются химически одинаковыми, обе области 14, 16 включают одинаковый полимерный слой. Данный полимерный слой может представлять собой полужесткий полимерный материал, проницаемый для жидкостей и газов. Пример данного полимерного слоя включает акриламидный сополимер, такой как поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид-соариламид, PAZAM. PAZAM и некоторые другие виды акриламидного сополимера представлены следующей структурой (I):
в которой:
RA выбран из группы, состоящей из азидо, факультативно замещенного амино, факультативно замещенного алкенила, факультативно замещенного гидразона, факультативно замещенного гидразина, карбоксила, гидрокси, факультативно замещенного тетразола, факультативно замещенного тетразина, нитрилоксида,нитрона и тиола;
B
R представляет собой Н или факультативно замещенный алкил;
C
D
E
каждый R, R и R независимо выбран из группы, состоящей из Н и факультативно замещенного ал кила;
2
Р
каждый из -(СН)- факультативно может быть замещенным;
р представляет собой целое число в интервале от 1 до 50;
n представляет собой целое число в интервале от 1 до 50000; и
m представляет собой целое число в интервале от 1 до 100000.
Обычному специалисту в данной области будет понятно то, что организация повторяющихся элементов «n» и «m» в структуре (I) является репрезентативной, и мономерные субъединицы могут присутствовать в структуре полимера в любом порядке (например, случайном, в виде блоков, структурировано или в их комбинации).
Молекулярная масса PAZAM может варьировать от примерно 10 кДа до примерно 1500 кДа или в конкретном примере может составлять примерно 312 кДа.
В некоторых примерах PAZAM представляет собой линейный полимер. В некоторых других примерах PAZAM представляет собой слегка сшитый полимер.
D
E
F
G
H
D
E
F
G
H
В других примерах полимер 26 может быть вариацией структуры (I). В одном примере акриламидное звено может быть заменено N,N-диметилакриламидом . В данном примере акриламидное звено в структуре (I) может быть заменено  где каждый R, R и R представляет собой Н, и каждый R и R представляет собой метильную группу (вместо Н, как в случае с акриламидом). В данном примере q может представлять собой целое число в интервале от 1 до 100000. В другом примере помимо акриламидного звена может использоваться N,N-диметилакриламид. В данном примере структура (I) может включать  помимо повторяющихся элементов «n» и «m», где каждый R, R и R представляет собой Н, и каждый R и R представляет собой метильную группу. В данном примере q может представлять собой целое число в интервале от 1 до 100000.
В качестве другого типичного полимера, повторяющийся элемент «n» в структуре (I) может быть заменен мономером, включающим гетероциклическую азидо группу, имеющую структуру (II):
1
2
в которой R представляет собой Н или С1-С4алкил; R представляет собой Н или С1-С4алкил; L представляет собой линкер, включающий линкерную цепь с 2-20 атомами, выбранными из группы, состоящей из углерода, кислорода и азота, и 10 факультативных заместителей на углероде, и любое число атомов азота в данной цепи; Е представляет собой линейную цепь, включающую от 1 до 4 атомов, выбранных из группы, состоящей из углерода, кислорода и азота, и факультативные заместители на углероде и любых атомах азота в данной цепи; А представляет собой амид, замещенный N, с Н или С1-С4алкилом, присоединенным к N; и Z представляет собой гетероцикл, содержащий азот.
Примеры Z включают 5-10-членные элементы, присутствующие в виде одной циклической структуры или конденсированной структуры.
В качестве еще одного другого примера данный полимер может включать повторяющееся звено каждой структуры (III) и (IV):
1a
2a
1b
2b
3a
3b
в которой каждый из R, R, R и R независимо выбран из атома водорода, факультативно замещенного алкила или факультативно замещенного фенила; каждый R и R независимо выбран из атома водорода, факультативно замещенного алкила, факультативно замещенного фенила или факультативно замещенного С7-С14аралкила; и каждый L1 и L2 независимо выбран из факультативно замещенного алкиленового линкера или факультативно замещенного гетероалкиленового линкера.
Следует понимать то, что для образования полимерного слоя могут использоваться другие молекулы, при условии, что они являются функционализированными для взаимодействия с первым и вторым наборами праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D'. Другие примеры подходящих полимерных слоев включают слои, имеющие коллоидную структуру, такие как агароза; или структуру полимерной сети, такие как желатин; или структуру сшитого полимера, такие как полиакриламидные полимеры и сополимеры, акриламид, не содержащий силан (SFA), или азидолизированную версию SFA. Примеры подходящих полиакриламидных полимеров могут быть синтезированы из акриламида и акриловой кислоты или акриловой кислоты, содержащей винильную группу, или из мономеров, которые образуют реакции [2+2] фотоциклоприсоединения. Другие примеры подходящих полимерных слоев включают смешанные сополимеры акриламидов и акрилатов. Также можно использовать разветвленные полимеры, такие как звездообразные полимеры, полимеры в форме звезды или звездообразные блокполимеры, дендримеры и тому подобное.
В других примерах области 14, 16 являются химически отличными. Например, область 14 может иметь поверхностные функциональные группы, которые могут иммобилизовать праймеры 18, 20 или 18', 20' первых наборов праймеров 12А, 12В, 12С, 12D, и область 16 может иметь другие поверхностные функциональные группы, которые могут иммобилизовать праймеры 19, 21 или 19', 21' вторых наборов праймеров 12А', 12В', 12С', 12D'.
В одном примере, где области 14, 16 являются химически отличными, используется блок-сополимер. В этом примере данный блок-сополимер включает два разных блока: один с функциональными группами, прививающими праймеры, которые могут присоединяться к праймерам 18, 20 или 18', 20' первых наборов праймеров 12А, 12В, 12С, 12D, и другой с функциональными группами, прививающими праймеры, которые могут присоединяться к праймерам 19, 21 или 19', 21' вторых наборов праймеров 12А', 12В', 12С', 12D'. Примеры функциональной группы, прививающей праймеры, выбраны из группы, состоящей из азида/азидо, факультативно замещенного амино, факультативно замещенного алкенила, альдегида, факультативно замещенного гидразона, факультативно замещенного гидразина, карбоксила, гидрокси, факультативно замещенного тетразола, факультативно замещенного тетразина, нитрилоксида, нитрона, тиола и их комбинаций.
2
2
5
2
5
2
Другие примеры химически отличных областей 14, 16 включают золото и PAZAM, золото и алюминий, силаны, имеющие две разные поверхностные функциональные группы (например, азиды и амины), тиольный подвергающийся самоорганизации монослой на золоте и фосфонатный подвергающийся самоорганизации монослой на алюминие или оксиде гафния, SiO и TaO, эпокси и TaO, первый полимер, включающий азидные группы, и второй полимер, включающий аминогруппы, SiO и медь или эпокси и медь. В то время как было приведено несколько примеров, следует понимать то, что можно использовать другие комбинации химически отличных областей 14, 16.
Области 14, 16 также могут иметь разные физические конфигурации. На Фиг. 2 - Фиг. 6 В проиллюстрированы разные примеры данных конфигураций. В данных примерах субстрат 26 показан в виде одного слоя/материала, такого как стекло, кремний и т.д. Однако следует понимать то, что многослойный субстрат можно использовать с любой из данных типичных конфигураций. Например, любой из данных примеров может включать подложку и структурированную смолу, образованную на данной подложке.
На Фиг. 2 проиллюстрирован пример, где области 14, 16 располагаются на разных областях поверхности S субстрата 26.
Один типичный способ получения данного примера, показанного на Фиг. 2, показан на Фиг. 26А - Фиг. 26Н. В то время как наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' упоминаются во всем данном описании, они не показаны для ясности.
Как показано на Фиг. 26А, первый функционализированный слой 60 наносится на субстрат 26. Первый функционализированный слой 60 может представлять собой полимер (PAZAM), силан, металл (золото, алюминий и т.д.) или любое другое вещество, которое имеет функциональную группу, которая может присоединяться к первому набору праймеров 12А, 12В, 12С, 12D. Первый функционализированный слой 60 может быть отложен с использованием любых методик, описанных в данном документе.
В зависимости от первого функционализированного слоя 60, который используется, субстрат 26 может быть активирован с использованием силанизации или плазменного травления с получением поверхностных групп, которые могут взаимодействовать с первым функционализированным слоем 60. Примеры силанизации и плазменного травления более подробно описываются в связи с Фиг. 13А. Первый функционализированный слой 60 затем можно откладывать с использованием любых методик, описанных в данном документе. В зависимости от использованного материала, первый функционализированный слой 60 также может отверждаться.
На Фиг. 26В и Фиг. 26С первый функционализированный слой 60 затем структурируется с образованием первой функционализированной области (области 14), покрытой фоторезистом 62. В одном примере фоторезист 62 представляет собой обратный фоторезист (экспонированная область становится нерастворимой). Пример подходящего обратного фоторезиста включает фоторезист SU-8 на основе эпокси (доступен у MicroChemicals). Фоторезист 62 наносится на первый функционализированный слой 60, подвергается селективному воздействию определенных длин волн света с образованием нерастворимой области (показанной в 62) и подвергается воздействию раствора проявителя с удалением растворимых частей. В другом примере фоторезист 62 представляет собой прямой фоторезист (экспонированная область становится растворимой). Примеры подходящих прямых фоторезистов включают серию MICROPOSIT S1800 или серию AZ 1500, которые обе доступны у MicroChemicals. Фоторезист 62 наносится на субстрат 26, подвергается селективному воздействию определенных длин волн света с образованием растворимой области и подвергается воздействию раствора проявителя с удалением растворимых частей, оставляя нерастворимую область (показанную в 62). В других примерах фоторезист 62 может быть заменен смолой для наноимпринтной литографии, которая структурируется с образованием данной области (например, 62).
Как показано на Фиг. 26С, экспонированные части первого функционализированного слоя 60 (например, части, не покрытые фоторезистом 62) затем могут быть удалены, например, посредством травления или другой подходящей методики.
Как показано на Фиг. 26D, затем на фоторезист 62 и на части (например, экспонированную поверхность S) субстрата 26 наносится второй функционализированный слой 64 с использованием любой подходящей методики отложения. В зависимости от использованного материала, второй функционализированный слой 64 также может отверждаться.
Как показано на Фиг. 26Е, фоторезист 62 затем может быть оторван, что также удаляет любой второй функционализированный слой 64 на нем.
На Фиг. 26F и Фиг. 26G удаляется часть второго функционализированного слоя 64. Для удаления части(тей) наносится второй фоторезист 62', экспонируется и проявляется таким образом, что нерастворимая область (показанная в 62') покрывает первую функционализированную область 14 и желательную часть второго функционализированного слоя 64, которая является i) смежной с первой функционализированной областью 14 и ii) становится второй функционализированной областью 16. Как только образуется фоторезист 62', экспонированные части второго функционализированного слоя 64 (например, части, не покрытые фоторезистом 62') могут затем удаляться, например, посредством травления или другой подходящей методики.
Как показано на Фиг. 26Н, фоторезист 62' может затем быть оторван, что экспонирует первую и вторую функционализированные области 14, 16.
В некоторых примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' (не показанные на Фиг. 26А - Фиг. 26Н) могут быть предварительно привиты к первому функционализированному слою 60 и, таким образом, присоединяются к первой функционализированной области 14. Аналогичным образом праймеры 19, 21 или 19', 21' (не показанные на Фиг. 26А-Фиг. 26Н) могут быть предварительно привиты ко второму функционализированному слою 64 и, таким образом, присоединяются ко второй функционализированной области 16. В данных примерах не проводится дополнительная прививка праймеров.
В других примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' не подвергаются предварительной прививке к первому функционализированному слою 60. В данных примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты после нанесения первого функционализированного слоя 60 (например, на Фиг. 26А). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 26Н), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 16.
Аналогично праймеры 19, 21 или 19', 21' могут не подвергаться предварительной прививке ко второму функционализированному слою 64. В данных примерах праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты после нанесения второго функционализированного слоя 64 (например, на Фиг. 26D). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 26Н), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 14.
При осуществлении прививки во время данного способа, прививка может осуществляться посредством проточного отложения (например, с использованием временно связанной крышки), покрытия окунанием, покрытия распылением, распределения в ванночке или другим подходящим способом, который будет присоединять праймер(ры) 18, 20 или 18', 20' к области 14, или который будет присоединять праймер(ры) 19, 21 или 19', 21' к области 16. В каждой из данных типичных методик может использоваться раствор или смесь праймеров, которая может включать праймер(ры) 18, 20 или 18', 20', 19, 21 или 19', 21', воду, буфер и катализатор. С использованием любого из способов прививки праймеры 18, 20 или 18', 20' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 14, или праймеры 19, 21 или 19', 21' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 16 и не имеют аффинности в отношении субстрата 26.
В то время как это не показано на Фиг. 26А - Фиг. 26Н, данный типичный способ может дополнительно включать отложение первого самоорганизующегося монослоя (SAM) на первую функционализированную область 14 и отложение второго самоорганизующегося монослоя (SAM) на вторую функционализированную область 16. В данном примере областью 14 является золото, и первый SAM включает тиольные группы, которые могут присоединяться к золоту и азидным группам, которые могут присоединяться к праймерам 18, 20 или 18', 20'. В другом примере область 16 представляет собой оксид гафния или оксид алюминия, и второй SAM включает фосфонатные группы, которые могут присоединяться к оксиду гафния или оксиду алюминия, и аминогруппы, которые могут присоединяться к праймерам 19, 21 или 19', 21'. В одном примере с использованием монослоев, подвергнувшихся самоорганизации, наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' прививаются после образования SAM.
Другой типичный способ получения примера, показанного на Фиг. 2, показан на Фиг. 27А-Фиг. 27F. В то время как наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' упоминаются во всем данном описании, они не показаны для ясности.
Как показано на Фиг. 27А, первый фоторезист 62 наносится на субстрат 26 таким образом, что часть первого субстрата 66 остается экспонированной. В данном примере фоторезист 62 может быть прямым фоторезистом (экспонированная область становится растворимой) или обратным фоторезистом (экспонированная область становится нерастворимой). Фоторезист 62 также может быть заменен смолой для наноимпринтной литографии, которая структурируется с образованием области (например, 62).
Как показано на Фиг. 27В, первый функционализированный слой 60 может быть отложен на фоторезист 62 и на первую часть субстрата 66 с использованием любой из методик, описанных в данном документе. В некоторых примерах первый функционализированный слой 60 также может быть отвержден.
Как показано на Фиг. 27С, фоторезист 62 может быть затем оторван, что также удаляет любой первый функционализированный слой 60 на нем. Это оставляет область 14, образованную на поверхности субстрата S.
Второй фоторезист 62' наносится, экспонируется и проявляется таким образом, что нерастворимая область (показанная в 62') покрывает первую функционализированную область 14 и субстрат 26, за исключением части второго субстрата 68, которая является смежной с первой функционализированной областью 14.
Как показано на Фиг. 27Е, затем наносится второй функционализированный слой 64 с использованием любого подходящего способа отложения и, в некоторых случаях, отверждения на фоторезист 62' и на вторую часть субстрата 68.
Как показано на Фиг. 27F, фоторезист 62' может быть затем оторван, что также удаляет любой второй функционализированный слой 64 на нем. Это экспонирует первую и вторую функционализированную области 14, 16.
В некоторых примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' (не показанные на Фиг. 27А - 27F) могут быть предварительно привиты на первый функционализированный слой 60 и, таким образом, присоединяются к первой функционализированной области 14. Аналогичным образом праймеры 19, 21 или 19', 21' (не показанные на Фиг. 27А - 27F) могут быть предварительно привиты на второй функционализированный слой 64 и, таким образом, присоединяются ко второй функционализированной области 16. В данных примерах не проводится дополнительная прививка праймеров.
В других примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' предварительно не прививаются на первый функционализированный слой 60. В данных примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты после нанесения первого функционализированного слоя 60 (например, на Фиг. 27 В - Фиг. 27С). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 27F), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 16.
Аналогичным образом праймеры 19, 21 или 19', 21' могут предварительно не прививаться на второй функционализированный слой 64. В данных примерах праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты после нанесения второго функционализированного слоя 64 (например, на Фиг. 27Е). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 27F), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 14.
При проведении прививки во время данного способа прививка может осуществляться с использованием любой методики прививки, раскрытой в данном документе. С использованием любого из данных способов прививки праймеры 18, 20 или 18', 20' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 14, или праймеры 19, 21 или 19', 21' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 16 и не имеют аффинности в отношении субстрата 26.
В то время как это не показано на Фиг. 27А - Фиг. 27F, данный типичный способ может дополнительно включать отложение первого самоорганизующегося монослоя (SAM) на первую функционализированную область 14 и отложение второго самоорганизующегося монослоя (SAM) на вторую функционализированную область 16. В данном примере с использованием самоорганизующихся монослоев наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' прививаются после образования SAM.
Еще один типичный способ получения примера, показанного на Фиг. 2, показан на Фиг. 41А - Фиг. 41G. В то время как наборы праймеров 12А, 12А' или 12 В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' упоминаются во всем данном описании, они не показаны для ясности.
Субстрат 26 может быть любым примером субстрата, раскрытого в данном документе. В то время как это не показано, следует понимать то, что данный субстрат также может быть многослойным субстратом, включающим неструктурированную смолу на подложке (например, смола для наноимпринтной литографии на стеклянной подложке или любой другой пример смолы 54 и подложки 52, описанных в данном документе, см. раздел «Проточная ячейка на основе шариков»).
Как показано на Фиг. 41А в данном примере, жертвенный слой металла 98 наносится на субстрат 26. В данном примере смола для наноимпринтной литографии/резист многослойного субстрата могут подвергаться воздействию кислородной плазмы, и затем может откладываться жертвенный слой металла 98 с использованием любой подходящей методики отложения металла. В одном примере жертвенный слой металла 98 отлагается с использованием распыления. Примеры жертвенного слоя металла 98 включают алюминий или медь, и слой 98 может иметь толщину, варьирующую от примерно 10 нм до примерно 100 нм.
Как показано на Фиг. 41В, на жертвенный слой металла 98 наносится резист и структурируется для определения в нем впадины со многими уровнями или со многими глубинами. Данная структурированная смола показана в ссылочном числовом значении 54'. В данном примере смола может представлять собой любую смолу для наноимпринтной литографии. В данном примере смола наносится посредством центрифугирования и подвергается первой сушке и затем штампуется и отверждается (например, с использованием ультрафиолетового отверждения) для определения впадины со многими уровнями или со многими глубинами, которая включает глубокую часть 70 и мелкую часть 72, которая частично ограничена частью с виде ступеньки 74 структурированной смолы 54'.
3
2
3
Затем можно использовать влажное или сухое травление для экспонирования части 100 субстрата 26 (например, части неструктурированной смолы или стекла многослойного субстрата), лежащей под глубокой частью 70, и части 102 жертвенного металлического слоя 98, лежащего под мелкой частью 72. Данные экспонированные части показаны на Фиг. 41С. В примере влажного травления можно использовать FeCl для удаления медного жертвенного металлического слоя 98. В другом примере влажного травления можно использовать KOH для удаления алюминиевого жертвенного металлического слоя 98. В одном примере сухого травления сначала можно использовать кислородную плазму для удаления остатка структурированной смолы 54', и затем можно использовать комбинацию плазм Cl и BCl для травления алюминиевого жертвенного металлического слоя 98. Кислородную плазму можно вновь использовать для очистки экспонированных частей 100 и 102. В данном примере глубины D1 (например, мелкая часть 72), D2 (например, от дна глубокой части 70 до верха части в виде ступеньки 74) и глубины D3 жертвенного металлического слоя 98 могут быть одинаковыми или аналогичными (например, в пределах одного нм друг от друга) таким образом, что во время травления удаляется желательная толщина каждого из материалов 54' и 98 для того, чтобы экспонировать части 100 и 102.
Как показано на Фиг. 41D, первый функционализированный слой 60 может откладываться на остающейся структурированной смоле 54', на экспонированной части 100 субстрата 26 и на экспонированной части 102 жертвенного металлического слоя 98. Первый функционализированный слой 60 может представлять собой любой из примеров и может быть отложен с использованием любой из методик, описанных в данном документе. В некоторых случаях первый функционализированный слой 60 также отверждается.
На Фиг. 41Е влажное травление используется для селективного удаления части первого функционализированного слоя 60 и другой части жертвенного металлического слоя 98 для того, чтобы экспонировать другую часть 104 субстрата 26. Влажное травление может осуществляться, как описано в данном документе. Используемый травящий агент может вытравливать жертвенный металлический слой 98, таким образом, отрывая первый функциональный слой 60.
Как показано на Фиг. 41F, затем на экспонированную часть 104 и на первый функционализированный слой 60 наносится второй функционализированный слой 64. Для второго функционализированного слоя 64 может использоваться любая подходящая методика отложения. В любом из типичных способов, раскрытых в данном документе, при проведении отложения при высокой ионной силе (например, в присутствии 10× PBS, NaCl, KCl и т.д.), второй функционализированный слой 64 не откладывается на или не прилипает к первому функционализированному слою 60. В силу этого второй функционализированный слой 64 не загрязняет первый функционализированный слой 60, оставляя область 16.
Как показано на Фиг. 41G, остающаяся структурированная смола 54 может затем быть оторвана, что удаляет любой из первого функционализированного слоя 60 на ней. Этот процесс отрыва можно осуществлять в диметилсульфоксиде (ДМСО) с использованием ультразвука или в ацетоне, или использованием реактива для удаления фоторезиста на основе NMP (N-метил-2-пирролидон). Остающийся жертвенный металлический слой 98 затем экспонируется, и он может быть удален с использованием влажного травления, как описано в данном документе. Области 14, 16 остаются интактными на поверхности субстрата после влажного травления, отчасти из-за того, что жертвенный металлический слой 98 не присутствует под областями 14, 16.
В некоторых примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' (не показанные на Фиг. 41А - Фиг. 41G) могут быть предварительно привиты на первый функционализированный слой 60 и, таким образом, присоединяются к первой функционализированной области 14. Аналогичным образом, праймеры 19, 21 или 19', 21' (не показанные на Фиг. 41А - Фиг. 41G) могут быть предварительно привиты на второй функционализированный слой 64 и, таким образом, присоединяются ко второй функционализированной области 16. В данных примерах не осуществляется дополнительная прививка праймеров.
В других примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' не подвергаются предварительной прививке на первый функционализированный слой 60. В данных примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты после нанесения первого функционализированного слоя 60 (например, на Фиг. 41D). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 41G), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 16.
Аналогичным образом, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут не подвергаться предварительной прививке на второй функционализированный слой 64. В данных примерах праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты после нанесения второго функционализированного слоя 64 (например, на Фиг. 41F). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 41G), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 14.
При осуществлении прививки во время данного способа, прививка может осуществляться посредством проточного нанесения (например, с использованием временно связанной крышки), покрытия окунанием, покрытия распылением, распределения в ванночке или другим подходящим способом, который будет присоединять праймер(ры) 18, 20 или 18', 20' к области 14, или который будет присоединять праймер(ры) 19, 21 или 19', 21' к области 16. В каждой из данных типичных методик может использоваться раствор или смесь праймеров, которая может включать праймер(ры) 18, 20 или 18', 20', 19, 21 или 19', 21', воду, буфер и катализатор. С использованием любого из способов прививки праймеры 18, 20 или 18', 20' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 14, или праймеры 19, 21 или 19', 21' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 16 и не имеют аффинности в отношении субстрата 26.
Еще один другой типичный способ получения примера, показанного на Фиг. 2, показан на Фиг. 42А - Фиг. 42Н. Опять-таки, в то время как наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' упоминаются во всем данном описании, они не показаны для ясности.
Субстрат 26 может быть любым примером субстрата, раскрытого в данном документе. Аналогично примеру, описанному на Фиг. 41А - Фиг. 41G, субстрат также может представлять собой многослойный субстрат, включающий неструктурированную смолу на подложке.
Как показано на Фиг. 42А, в данном примере жертвенный металлический слой 98 наносится на субстрат 26. Жертвенный металлический слой 98 может быть из любого типичного материала и может быть отложен посредством любого из примеров, описанных со ссылкой на Фиг. 41А.
Как показано на Фиг. 42В, на жертвенный металлический слой 98 наносится резист и структурируется для определения в нем впадины со многими уровнями или со многими глубинами. Данная структурированная смола показана в ссылочном числовом значении 54'. В данном примере смола может представлять собой любую смолу для наноимпринтной литографии. В данном примере смола наносится посредством центрифугирования, подвергается первой сушке и затем штампуется и отверждается (например, с использованием ультрафиолетового отверждения) для определения впадины со многими уровнями или со многими глубинами, которая включает глубокую часть 70 и мелкую часть 72, которая частично ограничена частью с виде ступеньки 74 структурированной смолы 54'.
Затем можно использовать влажное или сухое травление для экспонирования части 100 субстрата 26 (например, части неструктурированной смолы многослойного субстрата), лежащей под глубокой частью 70, и части 102 жертвенного металлического слоя 98, лежащего под мелкой частью 72. Данные экспонированные части 100 и 102 показаны на Фиг. 42С. Влажное или сухое травление можно осуществлять, как описывается со ссылкой на Фиг. 41С.
Как показано на Фиг. 42D, первый функционализированный слой 60 может откладываться на остающейся структурированной смоле 54', на экспонированной части 100 субстрата 26 и на экспонированной части 102 жертвенного металлического слоя 98. Первый функционализированный слой 60 может представлять собой любой из примеров и может быть отложен с использованием любой из методик, описанных в данном документе. В некоторых случаях первый функционализированный слой 60 также может отверждаться.
На Фиг. 42Е и Фиг. 42F первый функционализированный слой 60 затем структурируется с образованием первой функционализированной области (область 14), покрытой фоторезистом 62. В данном примере фоторезист 62 представляет собой обратный фоторезист. Фоторезист 62 может быть нанесен на первый функционализированный слой 60, селективно подвергнут воздействию определенных длин волн света с образованием нерастворимой области и подвергнут воздействию раствора проявителя для удаления растворимых частей. Остающийся фоторезист 62 располагается на части первого функционализированного слоя 60, которая находится на части 100 в глубокой части 70.
Как показано на Фиг. 42F, экспонированные части первого функционализированного слоя 60 (например, части, не покрытые фоторезистом 62), могут быть затем удалены, например, посредством травления или другой подходящей методики. Данный способ травления (например, кислородная плазма) также удаляет некоторую часть структурированной смолы 54' и некоторую часть фоторезиста 62. В отдельном способе травления удаляется жертвенный металлический слой 98, который лежал под мелкой частью 72 (см. Фиг. 42В). В данном примере можно использовать влажное или сухое травление, как описано со ссылкой на Фиг. 41С. Данный способ экспонирует другую часть 104 субстрата 26.
Как показано на Фиг. 42G, затем наносится второй функционализированный слой 64 на экспонированные части смолы 54', фоторезист 62 и экспонированную часть 104 субстрата 26 с использованием любой подходящей методики отложения. В одном примере второй функционализированный слой 64 может быть нанесен на фоторезист 62, но может быть удален с фоторезистом 62 при его отрыве.
Как показано на Фиг. 42Н, остающаяся структурированная смола 54' и фоторезист 62 могут быть затем оторваны, что удаляет любой второй функционализированный слой 64 на них. Этот процесс отрыва можно осуществлять в диметилсульфоксиде (ДМСО) с использованием обработки ультразвуком или в ацетоне, или с использованием реактива для удаления фоторезиста на основе NMP (N-метил-2-пирролидон). Остающийся жертвенный металлический слой 98 затем экспонируется, и он может быть удален с использованием влажного травления, как описано в данном документе. Области 14, 16 остаются интактными на поверхности субстрата после влажного травления, отчасти из-за того, что жертвенный металлический слой 98 не присутствует под областями 14, 16.
В некоторых примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' (не показанные на Фиг. 42А - Фиг. 42Н) могут быть предварительно привиты на первый функционализированный слой 60 и, таким образом, присоединяются к первой функционализированной области 14. Аналогичным образом, праймеры 19, 21 или 19', 21' (не показанные на Фиг. 42А - Фиг. 42Н) могут быть предварительно привиты на второй функционализированный слой 64 и, таким образом, присоединяются ко второй функционализированной области 16. В данных примерах не осуществляется дополнительная прививка праймеров.
В других примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' не подвергаются предварительной прививке на первый функционализированный слой 60. В данных примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты после нанесения первого функционализированного слоя 60 (например, на Фиг. 42D). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 42Н), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 16.
Аналогичным образом, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут не подвергаться предварительной прививке на второй функционализированный слой 64. В данных примерах праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты после нанесения второго функционализированного слоя 64 (например, на Фиг. 42G). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 42Н), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 14.
При осуществлении прививки во время данного способа, прививка может осуществляться посредством проточного отложения (например, с использованием временно связанной крышки), покрытия окунанием, покрытия распылением, распределения в ванночке или другим подходящим способом, который будет присоединять праймер(ры) 18, 20 или 18', 20' к области 14, или который будет присоединять праймер(ры) 19, 21 или 19', 21' к области 16. В каждой из данных типичных методик может использоваться раствор или смесь праймеров, которая может включать праймер(ры) 18, 20 или 18', 20', 19, 21 или 19', 21', воду, буфер и катализатор. С использованием любого из способов прививки праймеры 18, 20 или 18', 20' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 14, или праймеры 19, 21 или 19', 21' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 16 и не имеют аффинности в отношении субстрата 26.
Типичные области 14, 16, показанные на Фиг. 2, также могут быть образованы с использованием методик микроконтактной печати или прямой печати, такой как струйная печать. Данные способы могут быть особенно подходящими, когда желательно получать области в масштабе микрометров, как, например, от 1 мкм до примерно 50 мкм.
В примере, показанном на Фиг. 2, следует понимать то, что в чипе на поверхности субстрата S можно получать многочисленные наборы изолированных областей 14, 16. Для данного чипа можно использовать много разных расположений, при условии, что области 14, 16 в пределах изолированного набора являются смежными друг другу.
На Фиг. 3А - Фиг. 6В проиллюстрированы разные примеры, где по меньшей мере одна из областей 14, 16 располагается во впадине 28, определенной в субстрате 26. Впадины 28 могут быть образованы в однослойном субстрате (например, субстрат 26) или могут быть образованы в самом наружном слое многослойного субстрата.
Впадины 28 могут быть образованы с использованием любой подходящей методики, такой как фотолитография, наноимпринтная литография (NIL), методики штамповки, методики выдавливания, методики отливки, методики микротравления и т.д.
В то время как на каждой из Фиг. 3А - Фиг. 6В показана одна впадина 28, следует понимать то, что проточная ячейка может включать множество впадин 28, которые разделяются промежуточными областями 30, где каждая из впадин 28 включает первую область 14, расположенную в первой части, и вторую область 16, расположенную во второй части. Кроме того, некоторые из примеров, раскрытых в данном документе, включают впадины 28А и 28В с разными размерами (см., например, Фиг. 11С) или впадины 28В, которые включают две части 34, 34', которые являются взаимосвязанными, но которые имеют разные размеры (см., например, Фиг. 11D). Следует понимать то, что следующее обсуждение, относящееся к впадинам 28, может быть применимо для любого примера впадин 28, 28А, 28В, 28С, раскрытых в данном документе.
Можно рассматривать много разных размещений впадин 28, включая регулярные, повторяющиеся и нерегулярные структуры. В одном примере впадины 28 располагаются в гексагональной сетке для плотной упаковки и улучшенной плотности. Другие размещения могут включать, например, прямолинейные (т.е. прямоугольные) размещения (см. Фиг. 24), треугольные размещения и так далее. В некоторых примерах размещение или структура могут представлять собой х-у формат впадин 28, которые располагаются в рядах и столбцах. В некоторых других примерах размещением или структурой может быть повторяющаяся организация впадин 28 и/или промежуточных областей 30. В других примерах размещением или структурой может быть случайная организация впадин 28 и/или промежуточных областей 30. Данная структура может включать полоски, завитки, линии, треугольники, прямоугольники, круги, дуги, клетки, шотландские клетки, диагонали, стрелки, квадраты и/или перекрестные штрихи.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Размещение или картина может характеризоваться в отношении плотности впадин 28 (т.е. числа впадин 28) на определенной площади. Например, впадины 28 могут присутствовать в плотности приблизительно 2 миллиона на мм. Данная плотность может быть настроена до разных плотностей, включающих, например, плотность по меньшей мере примерно 100 на мм, по меньшей мере примерно 1000 на мм, по меньшей мере примерно 0,1 миллиона на мм, по меньшей мере примерно 1 миллион на мм, по меньшей мере примерно 2 миллиона на мм, по меньшей мере примерно 5 миллионов на мм, по меньшей мере примерно 10 миллионов на мм, по меньшей мере примерно 50 миллионов на мм или более. Альтернативно или дополнительно, данная плотность может быть настроена до не больше, чем примерно 50 миллионов на мм, не больше, чем примерно 10 миллионов на мм, не больше, чем примерно 5 миллионов на мм, не больше, чем примерно 2 миллиона на мм, не больше, чем примерно 1 миллион на мм, не больше, чем примерно 0,1 миллиона на мм, не больше, чем примерно 1000 на мм, не больше, чем примерно 100 на мм или меньше. Следует дополнительно понимать то, что плотность впадин 28 может находиться между одним из меньших значений и одним из больших значений, выбранных из приведенных выше интервалов. В качестве примеров, высокоплотный чип может отличаться наличием впадин 28, разделенных меньше, чем примерно 100 нм, чип средней плотности может отличаться наличием впадин 28, разделенных примерно 400 нм - примерно 1 мкм (1000 нм), и чип низкой плотности может отличаться наличием впадин 28, разделенных больше, чем примерно 1 мкм. В то время как были приведены типичные плотности, следует понимать то, что можно использовать субстраты с любыми подходящими плотностями.
Размещение или структура впадин 28 также или альтернативно может характеризоваться в показателях среднего шага, т.е. расстояния от центра впадины 28 до центра смежной впадины 28 (расстояние от центра до центра) или от края одной впадины 28 до края смежной впадины 28 (расстояние от края до края). Данная структура может быть регулярной таким образом, что коэффициент вариации вокруг среднего шага является маленьким, или данная структура может быть нерегулярной, причем в данном случае коэффициент вариации будет относительно большим. В любом случае средний шаг может составлять, например, по меньшей мере примерно 10 нм, примерно 0,1 мкм, примерно 0,5 мкм, примерно 1 мкм, примерно 5 мкм, примерно 10 мкм, примерно 100 мкм или более. Альтернативно или дополнительно, средний шаг может составлять, например, самое большее примерно 100 мкм, примерно 10 мкм, примерно 5 мкм, примерно 1 мкм, примерно 0,5 мкм, примерно 0,1 мкм или менее. Средний шаг для конкретной структуры впадин 28 может находиться между одним из меньших значений и одним из больших значений, выбранных из приведенных выше интервалов. В одном примере впадины 28 имеют шаг (расстояние от центра до центра) примерно 1,5 мкм. В то время как были приведены типичные средние значения шага, следует понимать то, что можно использовать другие средние значения шага.
В примере, показанном на Фиг. 3А - Фиг. 6В, впадины 28 представляют собой лунки. Данные лунки могут представлять собой микролунки или нанолунки. Размер каждой лунки может характеризоваться ее объемом, площадью отверстия лунки, глубиной и/или диаметром.
-3
3
-2
3
3
3
3
3
4
3
3
3
3
3
3
3
Каждая лунка может иметь любой объем, который способен заключать жидкость. Минимальный или максимальный объем может быть выбран, например, для приспособления к производительности (например, мультиплексность), разрешению, составу аналита или реакционной способности аналита, ожидаемых для последующих применений данной проточной ячейки. Например, объем может составлять по меньшей мере примерно 1×10 мкм, по меньшей мере примерно 1×10 мкм, по меньшей мере примерно 0,1 мкм, по меньшей мере примерно 1 мкм, по меньшей мере примерно 10 мкм, по меньшей мере примерно 100 мкм или более. Альтернативно или дополнительно, данный объем может составлять самое большее примерно 1×10 мкм, самое большее примерно 1×10 мкм, самое большее примерно 100 мкм, самое большее примерно 10 мкм, самое большее примерно 1 мкм, самое большее примерно 0,1 мкм или меньше. Следует понимать то, что область(ти) 14, 16 могут заполнять весь или часть объема лунки. Объем, например, полимерного слоя в индивидуальной лунке может быть больше, чем, меньше, чем или между значениями, определенными выше.
-3
2
-2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
-2
2
Площадь, занимаемая каждым отверстием лунки на поверхности, может быть выбрана на основе аналогичных критериев, таких как критерии, изложенные выше для объема лунки. Например, площадь для каждого отверстия лунки на поверхности может составлять по меньшей мере примерно 1×10 мкм, по меньшей мере примерно 1×10 мкм, по меньшей мере примерно 0,1 мкм, по меньшей мере примерно 1 мкм, по меньшей мере примерно 10 мкм, по меньшей мере примерно 100 мкм или более. Альтернативно или дополнительно, данная площадь может составлять самое большее примерно 1×10 мкм, самое большее примерно 100 мкм, самое большее примерно 10 мкм, самое большее примерно 1 мкм, самое большее примерно 0,1 мкм, примерно 1×10 мкм или меньше. Площадь, занимаемая каждым отверстием лунки, может быть больше, чем, меньше, чем или между значениями, определенными выше.
3
Глубина каждой лунки (или любого другого типа впадины 28) может составлять по меньшей мере примерно 0,1 мкм, по меньшей мере примерно 1 мкм, по меньшей мере примерно 10 мкм, по меньшей мере примерно 100 мкм или больше. Альтернативно или дополнительно, глубина может составлять самое большее примерно 1×10 мкм, самое большее примерно 100 мкм, самое большее примерно 10 мкм, самое большее примерно 1 мкм, самое большее примерно 0,1 мкм или меньше. Глубина каждой лунки (или другой впадины 28) может быть больше, чем, меньше, чем или между значениями, определенными выше.
3
В некоторых примерах диаметр каждой лунки (или другой впадины 28) может составлять по меньшей мере примерно 50 нм, по меньшей мере примерно 0,1 мкм, по меньшей мере примерно 0,5 мкм, по меньшей мере примерно 1 мкм, по меньшей мере примерно 10 мкм, по меньшей мере примерно 100 мкм или больше. Альтернативно или дополнительно, диаметр может составлять самое большее примерно 1×10 мкм, самое большее примерно 100 мкм, самое большее примерно 10 мкм, самое большее примерно 1 мкм, самое большее примерно 0,5 мкм, самое большее примерно 0,1 мкм или меньше (например, примерно 50 нм). Диаметр каждой лунки (или другой впадины 28) может быть больше, чем, меньше, чем или между значениями, определенными выше.
3
Когда впадина 28 представляет собой бороздку (см., например, Фиг. 34Н), и бороздки, и промежуточные области могут иметь прямолинейную конфигурацию. Глубина каждой бороздки может составлять по меньшей мере примерно 0,02 мкм (20 нм), по меньшей мере примерно 0,1 мкм (100 нм), по меньшей мере примерно 1 мкм, по меньшей мере примерно 10 мкм, по меньшей мере примерно 100 мкм или больше. Альтернативно или дополнительно, данная глубина может составлять самое большее примерно 1×10 мкм, самое большее примерно 100 мкм, самое большее примерно 10 мкм, самое большее примерно 1 мкм, самое большее примерно 0,1 мкм или меньше. Глубина каждой бороздки может быть больше, чем, меньше, чем или между значениями, определенными выше.
3
В некоторых случаях ширина каждой бороздки может составлять по меньшей мере примерно 0,02 мкм, по меньшей мере примерно 0,1 мкм, по меньшей мере примерно 0,5 мкм, по меньшей мере примерно 1 мкм, по меньшей мере примерно 10 мкм, по меньшей мере примерно 100 мкм или больше. Альтернативно или дополнительно, данная ширина может составлять самое большее примерно 1×10 мкм, самое большее примерно 100 мкм, самое большее примерно 10 мкм, самое большее примерно 1 мкм, самое большее примерно 0,5 мкм, самое большее примерно 0,1 мкм или меньше (например, примерно 50 нм). Ширина каждой бороздки может быть больше, чем, меньше, чем или между значениями, определенными выше.
На Фиг. 3А и Фиг. 3В показаны, соответственно, вид поперечного среза и вид сверху примера, где области 14, 16 располагаются в разных областях впадины 28. В данном примере области 14, 16 являются непосредственно смежными друг с другом в пределах впадины 28.
Один типичный способ получения примера, показанного на Фиг. 3А и Фиг. 3В, показан на Фиг. 28А - Фиг. 28G. В то время как наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' упоминаются во всем данном описании, они не показаны для ясности. Кроме того, на Фиг. 3А и Фиг. 3В показана впадина 28, определенная в однослойном субстрате 26, тогда как в типичном способе показана впадина 28, определенная в структурированной смоле 54' на подложке 52 многослойного субстрата. Следует понимать то, что в данном способе можно использовать однослойный субстрат.
В данном примере многослойный субстрат включает (структурированную) смолу 54' на подложке 52. Можно использовать любой пример смолы 54 (например, см. раздел «Проточная ячейка на основе шариков»), подложки 52 и способов структурирования смолы 54, описанных в данном документе.
Как показано на Фиг. 28А, впадина 28, заданная в структурированной смоле 54', является смежной с промежуточными областями 30, которые отделяют смежные впадины 28 друг от друга. Как показано на Фиг. 28В, первый функционализированный слой 60 наносится (например, отлагается или отлагается и отверждается) на структурированную смолу 54' с использованием любой из методик, описанных в данном документе.
На Фиг. 28С и Фиг. 28D первый функционализированный слой 60 затем структурируется с образованием первой функционализированной области (области 14), покрытой фоторезистом 62. В данном примере фоторезист 62 может представлять собой обратный фоторезист (экспонированная область становится нерастворимой) или прямой фоторезист (экспонированная область становится растворимой). Фоторезист 62 наносится на первый функционализированный слой 60, подвергается селективному воздействию определенных длин волн света с образованием нерастворимой и растворимой области, и подвергается воздействию раствора проявителя для удаления растворимых частей. В других примерах фоторезист 62 может быть заменен смолой для наноимпринтной литографии. Как показано на Фиг. 28С, в данном примере фоторезист 62 покрывает часть первого функционализированного слоя 60, которая находится на первой части 76 впадины 28 (например, часть слоя 60, которая должна стать областью 14) и не покрывает вторую часть первого функционализированного слоя 60, которая находится на второй части 78 впадины 28.
Как показано на Фиг. 28D, экспонированные части первого функционализированного слоя 60 (например, части, не покрытые фоторезистом 62) могут быть затем удалены, например, посредством травления или другой подходящей методики. Это экспонирует вторую часть 78 впадины 28 и промежуточные области 30.
Как показано на Фиг. 28Е, затем наносится второй функционализированный слой 64 с использованием любой подходящей методики отложения (с или без отверждения, в зависимости от материала) на фоторезист 62 и на части (например, на экспонированную поверхность S) субстрата 26, включая вторую часть 78 впадины 28, и на промежуточные области 30.
Как показано на Фиг. 28F, затем можно оторвать фоторезист 62, что также удаляет любой второй функционализированный слой 64 на нем.
На Фиг. 28G удаляется часть второго функционализированного слоя 64. В частности, второй функционализированный слой 64 удаляется от промежуточных областей 30. В данном примере удаление включает отшлифовку второго функционализированного слоя 64 (и любого первого функционализированного слоя 60, который может присутствовать) с промежуточных областей 30.
Способ шлифования может осуществляться с использованием щадящей химической суспензии (включающей, например, абразив, буфер, хелатор, поверхностно-активное вещество и/или диспергент), которая может удалять второй функционализированный слой 64 (и любой первый функционализированный слой 60, который может присутствовать) с промежуточных областей 30 без вредного влияния на нижележащий субстрат 26 или структурированную смолу 54' на данных областях. В качестве альтернативы, шлифовка может осуществляться с использованием раствора, который не включает абразивные частицы.
Для шлифовки поверхности промежуточных областей 30 можно использовать химическую суспензию в химической механической шлифовальной системе. Шлифовальная(ные) головка(ки)/шкурка(ки) или другое(гие) средство(ва) шлифования способно(ны) отшлифовывать второй функционализированный слой 64 (и любой первый функционализированный слой 60, который может присутствовать) с промежуточных областей 30, оставляя области 14, 16 во впадине(нах) 28 по меньшей мере по существу интактными. В качестве примера, шлифовальная головка может представлять собой шлифовальную головку Strasbaugh ViPRR II.
После шлифования можно осуществлять способы очистки и сушки. В способе очистки может использоваться водная баня и обработка ультразвуком. Водная баня может поддерживаться при относительно низкой температуре, варьирующей от примерно 22°С до примерно 30°С. Способ сушки может включать сушку центрифугированием или сушку посредством другой подходящей методики.
В некоторых примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' (не показанные на Фиг. 28А - Фиг. 28G) могут быть предварительно привиты на первый функционализированный слой 60 и, таким образом, присоединяются к первой функционализированной области 14. Аналогично праймеры 19, 21 или 19', 21' (не показанные на Фиг. 28А - Фиг. 28G) могут быть предварительно привиты на второй функционализированный слой 64 и, таким образом, присоединяются ко второй функционализированной области 16. В данных примерах не осуществляется дополнительная прививка праймеров.
В других примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' не подвергаются предварительной прививке на первый функционализированный слой 60. В данных примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты после нанесения первого функционализированного слоя 60 (например, на Фиг. 28В). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 28G), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 16.
Аналогичным образом, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут не подвергаться предварительной прививке на второй функционализированный слой 64. В данных примерах праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты после нанесения второго функционализированного слоя 64 (например, на Фиг. 28Е). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 28G), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 14.
При осуществлении прививки во время данного способа, прививка может осуществляться с использованием любой методики прививки, раскрытой в данном документе. С использованием любого из способов прививки праймеры 18, 20 или 18', 20' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 14, или праймеры 19, 21 или 19', 21' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 16 и не имеют аффинности в отношении структурированной смолы 54'.
В то время как это не показано на Фиг. 28А - Фиг. 28G, данный типичный способ может дополнительно включать отложение первого самоорганизующегося монослоя (SAM) на первую функционализированную область 14 и отложение второго самоорганизующегося монослоя (SAM) на вторую функционализированную область 16. В данном примере с использованием самоорганизующихся монослоев наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' прививаются после образования SAM.
Еще один типичный способ получения примера, показанного на Фиг. 3А и 3В, показан на Фиг. 29А - Фиг. 293. В то время как наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' упоминаются во всем данном описании, они не показаны для ясности. Кроме того, на Фиг. 3А и 3В показана впадина 28, заданная в однослойном субстрате 26, тогда как в данном типичном способе показана впадина 28', заданная в структурированной смоле 54' на подложке 52 многослойного субстрата. Следует понимать то, что данный способ можно использовать с однослойным субстратом.
В данном примере многослойный субстрат включает (структурированную) смолу 54' на подложке 52. Как показано на Фиг. 29А, впадина 28', определенная в структурированной смоле 54', является смежной с промежуточными областями 30, которые отделяют смежные впадины 28' друг от друга. Впадина 28' представляет собой впадину с многими уровнями или многими глубинами, которая включает глубокую часть 70 и мелкую часть 72, которая частично ограничена частью в виде ступеньки 74 структурированной смолы 54'.
В данном примере на структурированную смолу 54' наносится жертвенный слой таким образом, что данный жертвенный слой по меньшей мере частично заполняет глубокую часть 70 во впадине 28'. Типичный жертвенный слой 76 представляет собой любой материал, который имеет скорость травления, которая отличается от скорости травления смолы 54' и фоторезиста 62, используемых в данном способе. Примеры подходящих материалов жертвенного слоя 76 включают кремний, алюминий, обратный или прямой фоторезисты, медь и т.д. Данные материалы могут быть отложены с использованием любой подходящей методики, раскрытой в данном документе. В то время как это не показано, следует понимать то, что помимо отложения в по меньшей мере части глубокой части 70, искусственный слой также может откладываться на промежуточные области 30 и на часть в виде ступеньки 74 или полностью заполнять впадину 28'.
Часть жертвенного слоя и часть смолы 54' затем последовательно удаляют. Сначала может вытравливаться жертвенный слой таким образом, что он удаляется с промежуточных областей 30 и с части в виде ступеньки 74 и таким образом, что остающаяся часть жертвенного слоя (показанная в ссылочном числовом значении 80 на Фиг. 29В) в глубокой части 70 по существу выравнивается с частью в виде ступеньки 74. Как показано на Фиг. 29В, удаляются несколько частей смолы 54'. Например, части смолы 54' удаляются с образованием новых (именуемых вторыми) промежуточных областей 30', которые по существу выравниваются с остающейся частью жертвенного слоя 80, и смола 54' удаляется для того, чтобы избавиться от части в виде ступеньки 74. Удаление части в виде ступеньки 74 образует область/часть 76 впадины 28' рядом с остающейся частью жертвенного слоя 80.
Как показано на Фиг. 29С, первая функционализированная область 60 наносится на остающуюся часть жертвенного слоя 80, область/часть 76 и (вторые) промежуточные области 30'. Как показано на Фиг. 29D, на первый функционализированный слой 60 затем наносится фоторезист 62.
Части фоторезиста 62 и нижележащего первого функционализированного слоя 60 могут затем удаляться для экспонирования остающейся части жертвенного слоя 80 и промежуточных областей 30'. Это показано на Фиг. 29D. Данный способ удаления можно осуществлять посредством травления реактивом для травления, который селективно удаляет часть фоторезиста 62 и нижележащего первого функционализированного слоя 60, но не удаляет остающуюся часть жертвенного слоя 80. В данном примере можно осуществлять влажное травление с использованием раствора проявителя с основным рН, такого как NaOH, KOH или ТМАН (тетраметиламмония гидроксид), или можно осуществлять сухое травление с использованием кислородной плазмы. В данном примере травление прекращается при экспонировании остающейся части жертвенного слоя 80. Это оставляет вторую часть (например, область 14) первого функционализированного слоя 60, имеющую на ней вторую часть 62'' фоторезиста, на площади/части 76.
Как показано на Фиг. 29F, затем удаляется остающаяся часть жертвенного слоя 80 с экспонированием второй площади/части 78 рядом со второй частью (например, областью 14) первого функционализированного слоя 60. Этот способ удаления может осуществляться посредством травления реактивом для травления, который селективно удаляет остающийся жертвенный слой 76, но не удаляет вторую часть (например, область 14) первого функционализированного слоя 60, имеющую вторую часть 62'' фоторезиста на ней. В качестве примеров алюминиевый жертвенный слой 80 можно удалять в кислотных или основных условиях, медный жертвенный слой 80 можно удалять с использованием FeCI3, жертвенный слой фоторезиста 80 можно удалять с использованием органических растворителей, таких как ацетон, или в основных (рН) условиях; и кремниевый жертвенный слой 80 можно удалять в основных (рН) условиях.
Как показано на Фиг. 29G, на площадь/часть 78 затем наносится второй функционализированный слой 64 с использованием любой подходящей методики отложения (и, если применимо, отверждения). Это образует вторую функционализированную область 16. Как показано на Фиг. 29G, второй функционализированный слой 64 также можно наносить на вторую часть 62'' фоторезиста и на промежуточные области 30.
Как показано на Фиг. 29G, вторая часть 62'' фоторезиста может быть затем оторвана, что также удаляет любой второй функционализированный слой 64 на ней. Это образует первую функционализированную область 14. Для удаления второго функционализированного слоя 64 от промежуточных областей 30' также можно проводить шлифовку.
В то время как пример, показанный на Фиг. 29А - Фиг. 29Н включает фоторезист 62, следует понимать, что если второй функционализированный слой 64 не прилипает к первому функционализированному слою 60, тогда фоторезист 62 можно опускать. Кроме того, если жертвенный слой 80 представляет собой прозрачный материал, к которому не прилипает первый функционализированный слой 60, тогда жертвенный слой 80 может не удаляться, и область 16 может образоваться на жертвенном слое 80.
В некоторых примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' (не показанные на Фиг. 29А - Фиг. 29Н) могут быть предварительно привиты на первый функционализированный слой 60 и, таким образом, присоединяются к первой функционализированной области 14. Аналогично праймеры 19, 21 или 19', 21' (не показанные на Фиг. 29А - Фиг. 29Н) могут быть предварительно привиты на второй функционализированный слой 64 и, таким образом, присоединяются ко второй функционализированной области 16. В данных примерах не осуществляется дополнительная прививка праймеров.
В других примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' не подвергаются предварительной прививке на первый функционализированный слой 60. В данных примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты после нанесения первого функционализированного слоя 60 (например, на Фиг. 29С). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 293), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 16.
Аналогичным образом, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут не подвергаться предварительной прививке на второй функционализированный слой 64. В данных примерах праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты после нанесения второго функционализированного слоя 64 (например, на Фиг. 29G). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 29Н), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 14.
При осуществлении прививки во время данного способа, прививка может осуществляться с использованием любой методики прививки, раскрытой в данном документе. С использованием любого из способов прививки праймеры 18, 20 или 18', 20' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 14, или праймеры 19, 21 или 19', 21' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 16 и не имеют аффинности в отношении структурированной смолы 54'.
В то время как это не показано на Фиг. 29А - Фиг. 29Н, данный типичный способ может дополнительно включать отложение первого самоорганизующегося монослоя (SAM) на первую функционализированную область 14 и отложение второго самоорганизующегося монослоя (SAM) на вторую функционализированную область 16. В данном примере с использованием самоорганизующегося монослоев наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' прививаются после образования SAM.
Еще один другой типичный способ получения примера, показанного на Фиг. 3А и Фиг. 3В, показан на Фиг. 30А - Фиг. 30F. В то время как наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' упоминаются во всем данном описании, они не показаны для ясности. Кроме того, на Фиг. 3А и 3В показана впадина 28', заданная в однослойном субстрате 26, тогда как в данном типичном способе показана впадина 28', заданная в структурированной смоле 54' на подложке 52 многослойного субстрата. Следует понимать то, что данный способ можно использовать с однослойным субстратом.
Как показано на Фиг. 30А, в данном примере многослойный субстрат включает неструктурированную смолу 54 на подложке 52 и жертвенный слой 80 на смоле 54. Можно использовать любые примеры смолы 54, подложки 52 и жертвенного слоя 80.
Как показано на Фиг. 30В, на жертвенный слой 80 наносится дополнительная смола и структурируется с определением в ней впадины 28'. Дополнительная смола может быть такой же или отличной от смолы 54. Впадина 28' представляет собой впадину с многими уровнями или многими глубинами, которая включает глубокую часть 70 и мелкую часть 72, которая частично ограничена частью в виде ступеньки 74 структурированной смолы 54'.
3
2
Как показано на Фиг. 30С, первая часть структурированной смолы 54' (смежная с глубокой частью 70) и часть жертвенного слоя 80, лежащего под глубокой частью 70, вытравливаются. Это экспонирует часть 82 смолы 54. В одном примере структурированная смола 54' может вытравливаться с использованием анизотропной кислородной плазмы с экспонированием нижележащей части жертвенного слоя 80, и затем часть жертвенного слоя 80 может быть удалена, например, с использованием плазмы на основе BCl и Cl.
Как показано на Фиг. 30D, часть в виде ступеньки 74 структурированной смолы 54' вытравливается, например, с использованием кислородной плазмы. Это экспонирует жертвенный слой 80, который лежит под частью в виде ступеньки 74. Используемый агент для травления может вытравливать смолу 54', но не жертвенный слой 80. Жертвенный слой 80, как таковой, действует в качестве тормоза травления, и, таким образом, экспонируется часть 102' жертвенного слоя 80.
Следует понимать, что при вытравливании смолы 54' исходные промежуточные области 30 могут укорачиваться. В силу этого образуются прмежуточные области 30'.
Также, как показано на Фиг. 30D, может быть отложен первый функционализированный слой 60 (и в некоторых случаях отвержден). Данный первый функционализированный слой 60 может не прилипать к экспонированной части 102' жертвенного слоя 80, но будет прилипать к части 82 смолы 54 и к промежуточным областям 30', окружающим впадину 28'.
3
Экспонированная часть 102' жертвенного слоя 80 может быть затем вытравлена (например, с использованием основного раствора FeCl, в зависимости от материала), и может быть отложен второй функционализированный слой 64 (и отвержден, в зависимости от материала). Как показано на Фиг. 30Е, второй функционализированный слой 64 наносится на вновь экспонированную часть смолы 54 (где была удалена часть 102'). В одном примере первый функционализированный слой 60 не имеет аффинности ко второму функционализированному слою 64, и, таким образом, второй функционализированный слой 64 не откладывается на первом функционализированном слое 60. В этом примере данного способа, как показано на Фиг. 30F, может осуществляться шлифовка для удаления первого функционализированного слоя 60 от промежуточных областей 30'.
В некоторых примерах способа(бов) Фиг. 30А - Фиг. 30F праймеры 18, 20 или 18', 20' (не показанные на Фиг. 30А - Фиг. 30F) могут быть предварительно привиты на первый функционализированный слой 60 и, таким образом, присоединяются к первой функционализированной области 14. Аналогично праймеры 19, 21 или 19', 21' (не показанные на Фиг. 30А - Фиг. 30) могут быть предварительно привиты на второй функционализированный слой 64 и, таким образом, присоединяются ко второй функционализированной области 16. В данных примерах не осуществляется дополнительная прививка праймеров.
В других примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' не подвергаются предварительной прививке на первый функционализированный слой 60. В данных примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты после нанесения первого функционализированного слоя 60 (например, на Фиг. 30А или 30D). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 30F), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 16.
Аналогичным образом, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут не подвергаться предварительной прививке на второй функционализированный слой 64. В данных примерах праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты после нанесения второго функционализированного слоя 64 (например, на Фиг. 30Е). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 30F), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 14.
При осуществлении прививки во время данного способа, прививка может осуществляться с использованием любой методики прививки, раскрытой в данном документе. С использованием любого из способов прививки праймеры 18, 20 или 18', 20' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 14, или праймеры 19, 21 или 19', 21' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 16 и не имеют аффинности в отношении структурированной смолы 54'.
В то время как это не показано на Фиг. 30А - Фиг. 30F, данный типичный способ может дополнительно включать отложение первого самоорганизующегося монослоя (SAM) на первую функционализированную область 14 и отложение второго подвергающегося самоорганизующегося (SAM) на вторую функционализированную область 16. В данном примере с использованием самоорганизующихся монослоев наборы праймеров 12А, 12А или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' прививаются после образования SAM.
Еще один другой типичный способ получения примера, показанного на Фиг. 3А и Фиг. 3В, показан на Фиг. 31А - Фиг. 31I. В то время как наборы праймеров 12А, 12А или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' упоминаются во всем данном описании, они не показаны для ясности. Кроме того, на Фиг. 3А и 3Б показана впадина 28', заданная в однослойном субстрате 26, тогда как в данном типичном способе показана впадина 28', заданная в структурированной смоле 54' на подложке 52 многослойного субстрата. Следует понимать то, что данный способ можно использовать с однослойным субстратом.
Как показано на Фиг. 31А, данный многослойный субстрат включает (структурированную) смолу 54' на подложке 52. Впадины 28', заданные в структурированной смоле 54', являются смежными с промежуточными областями 30, которые отделяют смежные впадины 28' друг от друга. Впадина 28' представляет собой впадину со многими уровнями или многими глубинами, которая включает глубокую часть 70 и мелкую часть 72, которая частично ограничена частью в виде ступеньки 74 структурированной смолы 54'.
Как показано на Фиг. 31В, первый функционализированный слой 60 наносится на структурированную смолу 54'. Первый функционализированный слой 60 может быть любым из примеров, раскрытых в данном документе, и может быть отложен с использованием любой из методик, описанных в данном документе.
На Фиг. 31В и Фиг. 31D первый функционализированный слой 60 затем структурируется с образованием первой функционализированной области (область 14), покрытой фоторезистом 62. В данном примере фоторезист 62 представляет собой обратный фоторезист (экспонированная область становится нерастворимой). Как показано на Фиг. 31С, фоторезист 62 наносится на первый функционализированный слой 60, селективно подвергается воздействию определенных длин волн света с образованием нерастворимой области (показанной в 62 на Фиг. 31D) и подвергается воздействию раствора проявителя для удаления растворимых частей. Как показано на Фиг. 31D, экспонированные части первого функционализированного слоя 60 (например, части, не покрытые фоторезистом 62) затем могут удаляться, например, посредством травления или другой подходящей методики. Остающаяся часть первого функционализированного слоя 60 (например, область 14) находится на первом уровне каждой многоуровневой впадины. В данном примере первый уровень находится в глубокой части 70 на подложке 52.
В данном примере жертвенный слой 84 наносится на фоторезист 62 и части смолы 54' (например, промежуточные области 30, повехность части в виде ступеньки 74). Жертвенный слой 84 показан на Фиг. 31Е. В качестве жертвенного слоя 84 можно использовать любой материал, которое имеет разницу в эффективности травления по отношению к смоле 54'. В одном примере в качестве жертвенного слоя 84 можно использовать алюминий.
Как показано на Фиг. 31F, жертвенный слой 84 удаляется с частей смолы 54'. Жертвенный слой 84 может быть сначала вытравлен таким образом, что он удаляется с промежуточных областей 30 и с части в виде ступеньки 74, и, таким образом, остающаяся часть жертвенного слоя (показанная в ссылочном числовом значении 84' на Фиг. 31F) остается на фоторезисте 62 в глубокой части 70.
Область смолы 54' (в частности, область в виде ступеньки 74) затем удаляется из многоуровневой впадины 28' с созданием площади/части 78, которая является смежной с первой функционализированной областью 14 (например, часть первого функционализированного слоя 60, которая лежит под фоторезистом 62, и остающаяся часть жертвенного слоя 84'). В данном способе также могут удаляться части промежуточных областей 30, приводя к новым промежуточным областям 30'. Данный способ удаления может осуществляться посредством травления с использованием агента для травления, такого как кислородная плазма, который селективно удаляет смолу 54', но не удаляет остающуюся часть жертвенного слоя 84'.
Как показано на Фиг. 31Н, затем на остающуюся часть жертвенного слоя 84, на площадь/часть 78 и на промежуточные области 30' наносится второй функционализированный слой 64 с использованием любой подходящей методики отложения.
Как показано на Фиг. 31I, фоторезист 62 может быть затем оторван, что также удаляет остающуюся часть жертвенного слоя 84' и любой второй функционализированный слой 64 на нем. Любой второй функционализированный слой 64 на промежуточных областях 30' также можно удалять посредством шлифования.
В некоторых примерах способа(бов) Фиг. 31А - Фиг. 31I праймеры 18, 20 или 18', 20' (не показанные на Фиг. 31А - Фиг. 31I) могут быть предварительно привиты на первый функционализированный слой 60 и, таким образом, присоединяются к первой функционализированной области 14. Аналогично праймеры 19, 21 или 19', 21' (не показанные на Фиг. 31А - Фиг. 31I) могут быть предварительно привиты на второй функционализированный слой 64 и, таким образом, присоединяются ко второй функционализированной области 16. В данных примерах не осуществляется дополнительная прививка праймеров.
В других примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' не подвергаются предварительной прививке на первый функционализированный слой 60. В данных примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты после нанесения первого функционализированного слоя 60 (например, на Фиг. 31В). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 31I), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 16.
Аналогичным образом, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут не подвергаться предварительной прививке на второй функционализированный слой 64. В данных примерах праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты после нанесения второго функционализированного слоя 64 (например, на Фиг. 31Н). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 31I), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 14.
При осуществлении прививки во время данного способа, прививка может осуществляться с использованием любой методики прививки, раскрытой в данном документе. С использованием любого из способов прививки праймеры 18, 20 или 18', 20' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 14, или праймеры 19, 21 или 19', 21' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 16 и не имеют аффинности в отношении структурированной смолы 54'.
В то время как это не показано на Фиг. 31А - Фиг. 31I, данный типичный способ может дополнительно включать отложение первого самоорганизующегося монослоя (SAM) на первую функционализированную область 14 и отложение второго самоорганизующегося монослоя (SAM) на вторую функционализированную область 16. В данном примере с использованием самоорганизующихся монослоев наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' прививаются после образования SAM.
На протяжении переработки в примерах, показанных на Фиг. 31А - Фиг. 31I, многоуровневая впадина 28' становится одноуровневой впадиной 28, как показано на Фиг. 3А.
На Фиг. 4А - 4С проиллюстрированы разные примеры областей 14, 16, которые располагаются в разных частях впадины 28.
На Фиг. 4А имеется промежуток 36 между областями 14, 16. В силу этого, данный пример проточной ячейки включает промежуток 36, разделяющий первый набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D (в области 14, не показанной на Фиг. 4А) и второй набор праймеров 12А, 12В', 12С', 12D' (в области 16, не показанной на Фиг. 4В). В одном примере промежуток 36 представляет собой пространство между соответствующими отрезками полимера, где образуются области 14, 16. Любой из способов, показанных на Фиг. 31А - Фиг. 31I, может быть модифицирован для образования промежутка 36. Промежуток 36 может иметь любую измеряемую длину, большую, чем ноль. В одном примере промежуток 36 составляет более 1 нм. В одном примере данный промежуток варьирует от примерно 1 нм до примерно 10 нм.
На Фиг. 4В области 14, 16 частично перекрываются. Перекрывающаяся область 38 представляет собой область, где прививаются оба праймера 18, 20 или 18', 20' и праймеры 19, 21 или 19', 21'. В одном примере данная перекрывающаяся область 38 может образоваться во время способа структурирования и прививки посредством наличия в экспонированном виде той же самой части полимера 32 при прививке праймеров 18, 20 или 18', 20' и при прививке праймеров 19, 21 или 19', 21'. В другом примере эта перекрывающаяся область 38 может образоваться, когда отдельно привитые праймеры 18, 20 или 18', 20' и праймеры 19, 21 или 19', 21' физически перекрываются или взаимно диффундируют во время или после данного способа.
На Фиг. 4С первая и вторая части впадины 28', где образуются соответствующие части 14, 16, имеют разную глубину. Можно использовать любую из глубин впадины, описанных в данном документе, при условии, что одна часть впадины 28' глубже, чем другая часть впадины 28'. При образовании впадины 28' могут быть генерированы разные глубины, например, посредством наноимпринтинга, травления и т.д.
Один типичный способ получения примера, показанного на Фиг. 4С, показан на Фиг. 32А - Фиг. 32F. В то время как наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' упоминаются во всем данном описании изобретения, они не показаны для ясности. Кроме того, на Фиг. 4С показана впадина 28', заданная в однослойном субстрате 26, тогда как в типичном способе показана впадина 28', заданная в структурированной смоле 54' на подложке 52 многослойного субстрата. Следует понимать то, что данный способ можно использовать с однослойным субстратом.
Как показано на Фиг. 32А многослойный субстрат включает (структурированную) смолу 54' на подложке 52. Впадина 28', определенная в структурированной смоле 54', является смежной с промежуточными областями 30, которые отделяют смежные впадины 28' друг от друга. Впадина 28' представляет собой впадину со многими уровнями или многими глубинами, которая включает глубокую часть 70 и мелкую часть 72, которая частично ограничена частью в виде ступеньки 74 структурированной смолы 54'.
Как показано на Фиг. 32В, первый функционализированный слой 60 наносится на структурированную смолу 54'. Первый функционализированный слой 60 может принадлежать к любому из примеров, раскрытых в данном документе, и может быть отложен с использованием любой из методик, описанных в данном документе, и если подходит, также может быть отвержден.
На Фиг. 32С и Фиг. 32D первый функционализированный слой 60 затем структурируется с образованием первой функционализированной области (область 14), покрытой фоторезистом 62. В данном примере фоторезист 62 представляет собой обратный фоторезист или прямой фоторезист. Как показано на Фиг. 32С, фоторезист 62 наносится на первый функционализированный слой 60, селективно подвергается воздействию определенных длин волн света с образованием нерастворимой области или растворимой области (в зависимости от использованного резиста) и подвергается воздействию раствора проявителя для удаления растворимых частей. Как показано на Фиг. 32D, экспонированные части первого функционализированного слоя 60 (например, части, не покрытые фоторезистом 62) затем могут удаляться, например, посредством травления или другой подходящей методики. В данном примере первый функционализированный слой 60 и смола 54' могут иметь дифференциальную способность к травлению. Остающаяся часть первого функционализированного слоя 60 (например, область 14) находится на первом уровне каждой многолуночной впадины. В данном примере первый уровень находится в глубокой части 70 на смоле 54'.
Как показано на Фиг. 32Е, затем на экспонированные части смолы 54' (например, на промежуточные области 30 и на область в виде ступеньки 74) наносится второй функционализированный слой 64 с использованием любой подходящей методики отложения. В зависимости от вещества, второй функционализированный слой 64 также может быть отвержден. В одном примере фоторезист 62 не имеет аффинности в отношении второго функционализированного слоя 64, и, таким образом, второй функционализированный слой 64 не откладывается на фоторезист 62. В другом примере второй функционализированный слой 64 может быть отложен на фоторезист 62, но может быть удален с отрывом фоторезиста 62.
Как показано на Фиг. 32F, фоторезист 62 может быть затем оторван, что, в некоторых случаях также удаляет любой второй функционализированный слой 64 на нем. Любой второй функционализированный слой 64 на промежуточных областях 30 также может быть удален посредством шлифования.
В некоторых примерах способа(бов) Фиг. 32А - Фиг. 32F праймеры 18, 20 или 18', 20' (не показанные на Фиг. 32А - Фиг. 32F) могут быть предварительно привиты на первый функционализированный слой 60 и, таким образом, присоединяются к первой функционализированной области 14. Аналогично праймеры 19, 21 или 19', 21' (не показанные на Фиг. 32А - Фиг. 32F) могут быть предварительно привиты на второй функционализированный слой 64 и, таким образом, присоединяются ко второй функционализированной области 16. В данных примерах не осуществляется дополнительная прививка праймеров.
В других примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' не подвергаются предварительной прививке на первый функционализированный слой 60. В данных примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты после нанесения первого функционализированного слоя 60 (например, на Фиг. 32В). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 32F), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 16.
Аналогичным образом, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут не подвергаться предварительной прививке на второй функционализированный слой 64. В данных примерах праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты после нанесения второго функционализированного слоя 64 (например, на Фиг. 32Е). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 32F), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам области 14.
При осуществлении прививки во время данного способа, прививка может осуществляться с использованием любой методики прививки, раскрытой в данном документе. С использованием любого из способов прививки праймеры 18, 20 или 18', 20' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 14, или праймеры 19, 21 или 19', 21' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 16 и не имеют аффинности в отношении структурированной смолы 54'.
В то время как это не показано на Фиг. 32А - Фиг. 32F, данный типичный способ может дополнительно включать отложение первого самоорганизующегося монослоя (SAM) на первую функционализированную область 14 и отложение второго подвергающегося самоорганизующегося (SAM) на вторую функционализированную область 16. В данном примере с использованием самоорганизующихся наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' прививаются после образования SAM.
На Фиг. 5, 6А и 6В проиллюстрированы разные примеры, где субстрат 26 включает впадины 28, разделенные промежуточными областями 30; каждая из впадин включает первую область 14; и вторая область 16 располагается на по меньшей мере некоторых их промежуточных областей 30. В силу этого в данных примерах одна из областей 14 располагается во впадине 28, а другая из областей 16 располагается на поверхности субстрата S, смежной со впадиной 28. В примере, показанном на Фиг. 5, область 16 на поверхности субстрата S находится рядом со впадиной 28. В примере, показанном на Фиг. 6А и 6В, область 16 на поверхности субстрата S окружает впадину 28. Типичные способы получения одной из областей 14, 16 во впадине 28 и других областей 14, 16 на по меньшей мере части поверхности субстрата S теперь будут описаны со ссылкой на Фиг. 7А - Фиг. 7G и Фиг. 8А - Фиг. 8F.
Один типичный способ получения примера, показанного на Фиг. 6А и 6В, показан на Фиг. 7А - Фиг. 7G. Как показано на Фиг. 7А, в данном способе используется субстрат 26, имеющий целый ряд впадин 28, разделенных промежуточными областями 30. В данном типичном способе полимерный слой 32 откладывается на субстрате 26 и отшлифовывается от промежуточных областей 30, как описано со ссылкой на Фиг. 3А и 3В. Это оставляет полимерный слой 32 во впадине 28 и не на промежуточных областях 30. Если желательно, чтобы области 14 находились во впадинах 28, тогда праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты с использованием любого из примеров, раскрытых в данном документе. Если желательно, чтобы области 16 находились во впадинах 28, тогда праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты с использованием любого из примеров, раскрытых в данном документе. В примере, показанном на Фиг. 7В, праймеры 18, 20 или 18', 20' прививаются на полимерный слой 32. Следует понимать то, что праймеры 18, 20 или 18', 20' будут прививаться к полимерному слою 32 во впадине 28 и не будут прививаться к промежуточным областям 30, как показано на Фиг. 7В.
В некоторых примерах данного способа субстрат 26 (который имеет область 14 или 16, образованную во впадине 28) подвергается воздействию кэппирующего агента. Кэппирующий агент включает химическое соединение, которое может реагировать с любыми непрореагировавшими функциональными группами полимерного слоя 32 (например, с любыми функциональными группами, которые не прореагировали с праймером 18, 20 или 18', 20'') для того, чтобы делать данные функциональные группы нефункциональными на протяжении последующей обработки. Данный процесс может уменьшать способность отложенного затем полимерного слоя 32' прилипать к области 14. Другими словами, взаимодействие между полимерным слоем 32 и отложенным затем полимерным слоем 32' уменьшается таким образом, что к полимерному слою 32 прилипает малая часть или не прилипает полимерный слой 32'. Это, в свою очередь, уменьшает способность отложенных затем праймеров (например, 19, 21 или 19', 21') прививаться к площади, лежащей над областью 14.
В примере, где полимерный слой 32 включает азидные функциональные группы, химическим соединением в кэппирующем агенте может быть восстановитель, такой как фосфин. Типичным фосфином является трис(гидроксипропил)фосфин. Непрореагировавшие азиды полимерного слоя 32 будут восстанавливаться фосфином, что делает их нефункциональными в отношении прививки дополнительного праймера.
Как показано на Фиг. 7С, данный способ тогда включает отложение второго полимерного слоя 32'. Полимерный слой 32' может представлять собой такой же полимер, который используется в полимерном слое 32, или может представлять собой другой тип полимера, который используется в полимерном слое 32. В одном примере каждый из первого полимера 32 и второго полимера 32' представляет собой акриламидный сополимер, такой как PAZAM. Полимерный слой 32' может покрывать одни промежуточные области 30 или может покрывать по меньшей мере некоторые из областей 14, помимо промежуточных областей 30. То, покрывает ли полимерный слой 32' по меньшей мере частично области 14, будет зависеть от кэппирующего агента, используемого на полимерном слое 32.
В данном примере нити матричного полинуклеотида, включающие нить нерасщепляемой первой матрицы 40 и нить расщепляемой второй матрицы 42, могут быть образованы в области 14 с использованием, соответственно, праймеров 18 или 18' и 20, 20'. На начальном этапе образования нити матричного полинуклеотида можно получать матрицы библиотеки из любого образца нуклеиновой кислоты (например, образца ДНК или образца РНК). Образец нуклеиновой кислоты может быть фрагментирован на одноцепочечные фрагменты ДНК или РНК одинакового размера (например, меньше 1000 п. о.). Во время получения на концы данных фрагментов можно добавлять адапторы. Посредством амплификации с малым числом циклов в адапторы можно вводить разные мотивы таким образом, чтобы секвенировать сайты связывания, индексы и области, которые являются комплементарными праймерам 18 или 18' и 20, 20' в областях 14. Конечные матрицы библиотеки включают фрагмент ДНК или РНК и адапторы на обоих концах. В некоторых примерах фрагменты из одного образца нуклеиновой кислоты имеют добавленные к ним одинаковые адапторы.
На субстрат 26 можно вводить целый ряд матриц библиотеки. Это может включать введение в проточную ячейку матричной жидкости. Данная матричная жидкость может включать жидкий носитель и целый ряд матриц библиотеки. Поскольку субстрат 26 включает группу областей 14 во впадинах 28, многие матрицы библиотеки гибридизуются, например, с одним или двумя типами праймеров 18, 18' или 20, 20', иммобилизованных в них.
Затем можно осуществлять получение кластера. Во время получения кластера матрица из матричной жидкости амплифицируется с образованием кластера в по меньшей мере некоторых впадинах 28. В одном примере получения кластера матрицы библиотеки копируются от гибридизованных праймеров 18, 18' или 20, 20' посредством 3' достройки с использованием высокоточной ДНК-полимеразы. Исходные матрицы библиотеки денатурируют, оставляя копии, иммобилизованные в областях 14. Для амплификации иммобилизованных копий можно использовать изотермическую мостиковую амплификацию. Например, копированные матрицы проходятся с гибридизацией со смежным комплементарным праймером 20, 20' или 18, 18', и полимераза копирует данные копированные матрицы с образованием двухцепочечных мостиков, которые денатурируют с одназование двух одноцепочечных нитей. Эти две нити проходятся и гибридизуются со смежными комплементарными праймерами 20, 20' или 18, 18', и вновь достраиваются с образованием двух новых двухцепочечных петель. Данный процесс повторяется на каждой копии матрицы посредством циклов изотермической денатурации и амплификации с созданием плотных клональных кластеров. Каждый кластер двухцепочечных мостиков денатурирует, приводя к нерасщепляемым нитям первой матрицы 40, присоединенным к нерасщепляемым первым праймерам 18, 18', и расщепляемым нитям второй матрицы 42, присоединенным к расщепляемым вторым праймерам 20, 20', как показано на Фиг. 7D. Следует понимать то, что расщепляем ость праймеров управляет расщепляемостью нитей матрицы, присоединенных к ним. Поскольку нити второй матрицы 42, присоединенные к расщепляемым вторым праймерам 20, 20', включают сайт расщепления 22, нити расщепляемой второй матрицы 42 являются расщепляемыми. Этот пример кластеризации представляет собой мостиковую амплификацию и является одним примером амплификации, которую можно проводить. Следует понимать то, что можно использовать другие методики амплификации, такие какие как поток операций амплификации исключения (Ехатр) (lllumina Inc.).
Следует понимать то, что поскольку второй полимерный слой 32' не имеет привитых к нему праймеров 18, 18' или 20, 20', процесс амплификации не идет за пределы индивидуальных впадин 28.
На субстрат 26 затем может вводиться примирующая жидкость. Данная примирующая жидкость включает жидкий носитель и второй набор праймеров 12А', 12В', 12С', 12D', который отличается от первого набора праймеров 12А, 12В, 12С, 12D, которые были введены во впадины 28. Жидким носителем в примирующей жидкости может быть любая жидкость, которая может поддерживать клик-химию, такая как фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), физиологический раствор-цитрат натрия (SSC), буфер на основе карбоната и т.д. В данном примере набор праймеров в примирующей жидкости включает праймеры 19 или 19' и 21 или 21'. Следует понимать то, что если набор праймеров 12А', 12В', 12С', 12D' (включающий праймеры 19 или 19' и 21 или 21') сначала прививается с образованием области 16 во впадинах 28, тогда примирующая жидкость может включать набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D (включающий праймеры 18 или 18' и 20 или 20').
Праймеры 19 или 19' и 21 или 21' в примирующей жидкости могут прививаться ко второму полимерному слою 32', который лежит над промежуточными областями 30. Поскольку второй полимерный слой 32' может не прилипать к полимерному слою 32, так как амплификация была проведена в области 14, и поскольку функциональные группы нижележащего полимерного слоя 32 были сделаны нефункциональными, праймеры 19 или 19' и 21 или 21' могут не прививаться к экспонированному полимерному слою 32.
Как показано на Фиг. 7Е, привитые праймеры 19 или 19' и 21 или 21' присоединяются ко второму полимерному слою 32', который лежит над промежуточными областями 30, которые образуют область 16.
Затем можно проводить дополнительную амплификацию. Например, можно инициировать мостиковую амплификацию от кластера привитых праймеров 19 или 19' и 21 или 21' для того, чтобы образовать второй кластер на по меньшей мере некоторых промежуточных областях. Во время данного раунда амплфикации нерасщепляемые первые нити матрицы 40 проходятся и гибридизуются со смежными комлементарными праймерами 21, 21', тогда как расщепляемые вторые нити матрицы 42 проходятся и гибридизуются со смежными комлементарными праймерами 19, 19'. Соответствующие нити 40, 42 достраиваются с образованием двух новых двухцепочечных петель. Данный способ повторяется на каждой копии матрицы посредством циклов изотермической денатурации и амплификации с созданием плотных клональных кластеров, которые вырастают из впадин 28 в промежуточные области 30. Каждый дополнительный кластер двухцепочечных мостиков денатурирует, приводя к нерасщепляемым вторым нитям матрицы 44, присоединенным к нерасщепляемым вторым праймерам 21, 21', и расщепляемым первым нитям матрицы 46, присоединенным к расщепляемым первым праймерам 19, 19', как показано на Фиг. 7F. Поскольку расщепляемые первые нити матрицы 46, присоединенные к расщепляемым первым праймерам 19, 19', включают сайт расщепления 22' или 23, данные расщепляемые первые нити матрицы 46 являются расщепляемыми.
Следует понимать то, что когда нерасщепляемые первые нити матрицы 40 представляют собой прямые нити, нерасщепляемые вторые нити матрицы 44 представляют собой обратные нити, и когда нерасщепляемые первые нити матрицы 40 представляют собой обратные нити, нерасщепляемые вторые нити матрицы 44 представляют собой прямые нити. Аналогичным образом, когда расщепляемые первые нити матрицы 46 представляют собой прямые нити, расщепляемые вторые нити матрицы 42 представляют собой обратные нити, и когда расщепляемые первые нити матрицы 46 представляют собой обратные нити, расщепляемые вторые нити матрицы 42 представляют собой прямые нити.
Расщепляемые первые и вторые нити матрицы 46, 42 могут быть затем удалены введением химического агента или ферментативного расщепляющего агента, в зависимости от сайтов расщепления 22, 22' или 22, 23. Как показано на Фиг. 7G, после расщепления нерасщепляемые первые нити матрицы 40 остаются в области 14 во впадине 28, и нерасщепляемые вторые нити матрицы 44 остаются в области 16 на промежуточных областях 30. В одном примере после осуществления расщепления область 14 включает прямые нити, и область 16 включает обратные нити.
Другой типичный способ получения примеров, показанных на Фиг. 5, 6А и 6Б, показан на Фиг. 8A-8G. Как показано на Фиг. 8А, в данном способе используется субстрат 26, имеющий целый ряд впадин 28, разделенных промежуточными областями 30. В данном типичном способе полимерный слой 32 откладывается на субстрате 26 таким образом, что он присутствует во впадинах 28 и на промежуточных областях 30. Если для областей 14 желательно находиться во впадинах 28, тогда праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты с использованием любых примеров, раскрытых в данном документе. Если для областей 16 желательно находиться во впадинах 28, тогда праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты с использованием любых примеров, раскрытых в данном документе. В примере, показанном на Фиг. 8В, праймеры 18, 20 или 18', 20' прививаются к полимерному слою 32. Следует понимать то, что праймеры 18, 20 или 18', 20' будут прививаться к полимерному слою 32 по всему субстрату 26, как показано на Фиг. 8В.
В данном типичном способе, как показано на Фиг. 8С, затем откладывается защитное покрытие 48 на полимерный слой 32, имеющий набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D, присоединенных к нему. Защитное покрытие 48 может представлять собой отрывной резист. Этот тип защитного покрытия 48 может быть нанесен центрифугированием, отвержден и затем удален в желательное время в данном способе. Защитное покрытие 48 также может представлять собой водорастворимое покрытие.
Затем может осуществляться травление для экспонирования тех промежуточных областей 30, где желательно получать область 16, включающую набор праймеров 12А', 12В', 12С', 12D'. Например, изолированный отрезок поверхности субстрата S рядом с каждой впадиной 28 может быть экспонирован посредством травления с образованием примера, показанного на Фиг. 5. В качестве другого примера, отрезок поверхности субстрата S, который окружает всю впадину 28, может быть экспонирован посредством травления с образованием примера, показанного на Фиг. 6А и 6В. На Фиг. 8D проиллюстрирован один пример субстрата 26 после осуществления травления для экспонирования промежуточных областей 30. В данном примере может осуществляться плазменное травление с использованием воздуха или газообразного кислорода.
Данный типичный способ может затем включать силанизацию экспонированных частей поверхности субстрата S. Силанизация вводит на поверхность субстрата S усилитель адгезии для того, чтобы помогать второму полимерному слою 32' прилипать к ней.
Затем откладывается второй полимерный слой 32'. Как показано на Фиг. 8Е, второй полимерный слой 32' может быть отложен на экспонированные части поверхности субстрата S (например, на промежуточные области 30) и на защитное покрытие 48. В данном типичном способе полимерный слой 32' может представлять собой такой же полимер, который используется в полимерном слое 32, или может представлять собой другой тип полимера, чем полимер, используемый в полимерном слое 32.
Как показано на Фиг. 8F, праймеры 19, 19' и 21, 21' второго набора праймеров 12А', 12В', 12С', 12D' могут быть затем привиты к полимерному слою 32' с получением областей 16. Прививка может осуществляться с использованием любого из способов, описанных в данном документе. В другом примере полимерный слой 32' может быть предварительно привит с использованием праймеров 19, 19' и 21, 21'.
В то время как это не показано, следует понимать то, что данный типичный способ может затем включать удаление защитного покрытия 48. В качестве примера, для удаления защитного покрытия 48 и любого полимерного слоя 32' и праймеров 19, 19' и 21, 21' на нем можно использовать способ отрыва. Если защитное покрытие 48 является водорастворимым, удаление может включать растворение данного покрытия 48 в воде, что также будет удалять любой лежащий над ним полимерный слой 32' и праймеры 19, 19' и 21, 21'. Удаление защитного покрытия экспонирует все праймеры 18, 18' и 20, 20' в областях 14 и все праймеры 19, 19' и 21, 21' в областях 16.
В то время как это не показано на Фиг. 8А - Фиг. 8F, следует понимать то, что на субстрат 26 затем можно вводить целый ряд матриц библиотеки. Поскольку субстрат 26 включает группу областей 14 во впадинах 28, много матриц библиотеки гибридизуются, например, с одним из двух типов праймеров 18, 18' или 20, 20', иммобилизованных в них. В данном примере, поскольку субстрат 26 также включает группу областей 16 по меньшей мере на некоторых из промежуточных областей 30, много матриц библиотеки гибридизуются, например, с одним из двух типов праймеров 19, 19' или 21, 21', иммобилизованных в них. Затем может осуществляться получение кластера, как описано в данном документе. Расщепление расщепляемых матриц также может осуществляться посредством расщепления расщепляемого первого праймера 19, 19' и расщепляемого второго праймера 20, 20'.
На Фиг. 9 проиллюстрирован еще один другой пример областей 14, 16, которые расположены в разных частях впадины 28. В данном примере одна из областей 14, 16 является частью шарика 50, который располагается во впадине 28. Шарик 50 включает сердцевинную структуру 49 и область 16 на поверхности сердцевинной структуры 49. В данном примере область 16 может включать функциональную(ные) группу(пы), по своей природе присутствующую(щие) на поверхности сердцевинной структуры 49, или функциональную(ные) группу(пы), включенную(ные) на поверхность сердцевинной структуры 49 посредством любой подходящей методики функционализации (например, химическая реакция, покрывающая сердцевинную структуру 49 полимером, содержащим реакционноспособную группу, и т.д.).
В то время как на Фиг. 9 показана одна впадина 28, следует понимать то, что в некоторых примерах субстрат 26 включает множество впадин 28, разделенных промежуточными областями 30; и каждая из впадин включает первую часть, где располагается первая область 14, и вторую часть; и данная проточная ячейка дополнительно содержит шарик 50, расположенный во второй части, где вторая область 16 находится на поверхности шарика. В данном документе дополнительно описываются несколько вариаций данного примера со ссылкой на Фиг. 11А-20 в разделе «Проточная ячейка на основе шарика».
На Фиг. 10 показана еще одна другая типичная конфигурация для областей 14, 16. В данном примере области 14, 16 располагаются на отдельных субстратах 26, 26'. В силу этого данный пример проточной ячейки включает первый субстрат 26, первый набор праймеров 12А, присоединенных к первому субстрату 26, причем данный первый набор праймеров включает не расщепляемый первый праймер 18, 18' и расщепляемый второй праймер 20, 20', второй субстрат 26' напротив первого субстрата 26, и второй набор праймеров 12А', присоединенных ко второму субстрату 26', причем второй набор праймеров 12А' включает расщепляемый первый праймер 19, 19' и нерасщепляемый второй праймер 21, 21'. В качестве одного примера способа получения данной проточной ячейки каждый из субстратов 26, 26' может быть покрыт полимерным слоем (например, 32, не показанным на Фиг. 10), первый набор праймеров 12А (или 12В, 12С или 12D) может быть привит на один из субстратов 26, и второй набор праймеров 12А' (или 12В', 12С' или 12D') может быть привит на другой из субстратов 26'.
В то время как они показаны на соответствующих поверхностях S субстрата, следует понимать то, что области 14, 16 могут быть, в качестве альтернативы, расположены во впадинах 28 соответствующих субстратов 26, 26'. В данном примере полимерный слой может быть отложен во впадинах 28 и на промежуточных областях 30 и затем может быть удален с промежуточных областей 30 посредством шлифовки. Первый набор праймеров 12А (или 12В, 12С или 12D) может быть привит к впадинам 28 одного субстрата 26, и второй набор праймеров 12А (или 12В', 12С' или 12D') может быть привит к впадинам другого субстрата 26'.
В данном примере для субстратов 26, 26' может быть желательным нахождение в тесной близости таким образом, что могут успешно проводиться посев матриц и кластеризация. В одном примере «тесная близость» означает то, что расстояние между двумя субстратами 26, 26' составляет примерно 100 мкм или менее. В другом примере расстояние между двумя субстратами 26, 26' варьирует от примерно 10 мкм до примерно 90 мкм.
Вместо расположения на отдельных субстратах 26, 26' первая и вторая области 14, 16 и наборы праймеров 12А, 12А или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' могут быть макроразделеными на поверхности субстрата S или могут присутствовать в отдельных впадинах 28, которые являются макроразделеными друг от друга. Под макроразделенным подразумевается то, что области 14, 16 отделяются друг от друга по меньшей мере 5 мкм. В одном примере области 14, 16 отделяются друг от друга расстоянием, варьирующим от примерно 5 мкм до примерно 100 мкм.
На Фиг. 33А показана еще одна другая типичная конфигурация областей 14, 16. В данном примере первый и второй функционализированные слои 60, 64 интегрируются в часть многослойного субстрата в виде смолы. Как показано на Фиг. 33А, этот пример многослойного субстрата включает подложку 52; первый функционализированный слой 60 на подложке 52; второй функционализированный слой 64 на первом функционализированном слое 60; и пассивирующий слой 86 на втором функционализированном слое 64.
В данном примере первый и второй функционализированные слои 60, 64 могут представлять собой любую полученную наноимпринтной литографией смолу, имеющую или способную иметь введенные в нее поверхностные функциональные группы, которые могут присоединять соответствующие наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D'. В одном примере слой 60 может быть функционализирован эпоксигруппами, и слой 64 может быть функционализирован аминогруппами.
Смолы слоев 60, 64 могут быть одинаковыми, если соответствующие наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' являются предварительно привитыми в слои 60, 64 перед образованием многослойного субстрата, показанного на Фиг. 33А. В этих примерах данного способа первый набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D (например, нерасщепляемый первый праймер 18, 18' и расщепляемый второй праймер 20, 20') может быть предварительно привит на первый функционализированный слой 60 перед тем, как первый функционализированный слой 60 включается в многослойный субстрат; и второй набор праймеров 12А', 12В', 12С', 12D' (например, расщепляемый первый праймер 19, 19' и нерасщепляемый второй праймер 21, 21') может быть предварительно привит на второй функционализированный слой 66 перед тем, как второй функционализированный слой 64 включается в многослойный субстрат.
Данные слои (независимо от того, являются ли они предварительно привитыми или нет) могут отлагаться на подложке 52 с использованием любого из примеров, раскрытых в данном документе.
При прививке праймеров после отпечатывания следует понимать то, что слои 60, 64 по меньшей мере имеют разные поверхностные функциональные группы, которые могут присоединять соответствующие наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D'. Можно использовать любую из смол, раскрытых в данном документе.
n
3
Пассивирующий слой 86 может представлять собой любой гидрофобный слой, который может быть отпечатан. В качестве примеров, пассивирующий слой 86 выбран из группы, состоящей из фторированного полимера, перфорированного полимера, кремниевого полимера и их смеси. В качестве примеров, пассивирующий слой 86 может включать аморфный фторполимер (имеющиеся в продаже примеры которого включают фторполимеры в серии CYTOP от AGC Chemicals, которые имеют одну из следующих концевых функциональных групп: типа А: -СООН, типа М: -CONH-Si(OR) или типа S: -CF), политетрафторэтилен (имеющимся в продаже примером которого является TEFLON от Chemours), парилен, фторированный углеводород, фторакриловый сополимер (имеющийся в продаже пример которого включает FLUOROPEL от Cytonix). Пассивирующий слой 86 может быть отложен на подложку 52 с использованием любого из примеров, раскрытых в данном документе.
Как показано на Фиг. 33А, этот пример данного способа включает отпечатывание многослойного субстрата, образуя, посредством этого, элементы (например, впадины 28), разделенные промежуточными областями 30 пассивирующего слоя 86, где область 14, 16, соответственно, каждого первого и второго функционализированных слоев экспонируется на каждом элементе/впадине 28. Экспонированные области 14, 16 одного элемента/впадины 28 и окружающие промежуточные области 30 пассивирующего слоя 86 показаны сверху на Фиг. 33В. Для каждой области 14, 16 элемент/впадина 28 имеет наклонное дно или область ступеньки, или некоторую другую вариацию в геометрии, которая экспонирует и часть слоя 60, и часть слоя 64 сверху элемента/впадины 28.
Для отпечатывания многослойного субстрата форма наноимпринтной литографии или рабочий штамп 56 вдавливается в слой смолы 54 с созданием отпечатка элементов в слоях 60, 64, 68. Другими словами, каждый из слоев 60, 64, 68 вдавливается или перфорируется выступами рабочего штампа 56. Слои 60, 64, 68 затем могут быть отверждены при нахождении рабочего штампа 56 в рабочем положении. Отверждение осуществляется воздействием актиничного излучения, такого как излучение видимого света или ультрафиолетовое (УФ) излучение, или излучения с длиной волны, варьирующей от примерно 240 нм до 380 нм при использовании фоторезиста; или воздействием тепла при использовании термоотверждаемого резиста. Отверждение может стимулировать полимеризацию и/или поперечное связывание. В качестве примера отверждение может включать много стадий, включая термообработку при низкой температуре (например, для удаления растворителя(лей)) и термообработку при высокой температуре. Термообработка при низкой температуре может происходить при более низкой температуре, варьирующей от примерно 50°С до примерно 150°С. Продолжительность термообработки при высокой температуре может составлять от примерно 5 секунд до примерно 10 минут при температуре, варьирующей от примерно 100°С до примерно 300°С. Примеры устройств, которые можно использовать для термообработки при низкой температуре и/или термообработки при высокой температуре, включают плитку, печь и т.д.
После отверждения рабочий штамп 56 высвобождается. Это создает топографические элементы, т.е. впадины 28, в слоях 60, 64, 68.
Как упомянуто, праймеры 18, 20 или 18', 20' (не показанные на Фиг. 33А или Фиг. 33В) могут быть предварительно привиты на первый функционализированный слой 60 и, таким образом, присоединяются к первой функционализированной области 14; и праймеры 19, 21 или 19', 21' (не показанные на Фиг. 33А или Фиг. 33В) могут быть предварительно привиты на второй функционализированный слой 64 и, таким образом, присоединяются ко второй функционализированной области 16. В данных примерах дополнительная прививка праймеров не осуществляется.
В других примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' и/или праймеры 19, 21 или 19', 21' не подвергаются предварительной прививке, соответственно к первому функционализированному слою 60 и ко второму функционализированному слою 64. В данных примерах области 14, 16 имеют разные функциональные группы, и праймеры 18, 20 или 18', 20' и праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты после отпечатывания.
При проведении прививки после отпечатывания прививка может осуществляться с использованием любой методики прививки, раскрытой в данном документе. С использованием любого из способов прививки праймеры 18, 20 или 18', 20' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 14, или праймеры 19, 21 или 19', 21' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 16 и не имеют аффинности в отношении пассивирующего слоя 86.
Как упомянуто, некоторые примеры впадины 28 могут находиться в виде бороздок. На Фиг. 34S показана (сверху) еще одна другая типичная конфигурация областей 14, 16, где они образуются в бороздках 28''.
2
Как показано на Фиг. 34А, многослойный субстрат включает (структурированную) смолу 54' на подложке 52. Бороздки 28'', определенные в структурированной смоле 54' (например, смоле на основе NIL, SiO и т.д.), являются смежными с промежуточными областями 30, которые отделяют соседние бороздки 28'' друг от друга (см., например, Фиг. 34Н, на которой проиллюстрирован вид сверху многих бороздок 28'').
Как показано на Фиг. 34В, на смолу 54' (например, на промежуточные области 30 и в бороздку 28'') наносится жертвенный слой 84. В качестве жертвенного слоя 84 можно использовать любое вещество, которое имеет разницу в эффективности травления по отношению к смоле 54' и по отношению ко второму жертвенному слою 88. В одном примере жертвенный слой 84 представляет собой кремний, алюминий или хром.
Как показано на Фиг. 34С, жертвенный слой 84 удаляется от частей смолы 54'. В данном примере жертвенный слой 84 может быть вытравлен таким образом, что область жертвенного материала 84'' остается непосредственно смежной с каждой боковой стенкой 90 каждой из бороздок 28''. После травления экспонируются промежуточные области 30 и донная часть каждой бороздки 28''.
Как показано на Фиг. 34D, второй жертвенный слой 88 наносится на области жертвенного материала 84'' и на любые экспонированные области смолы 54' (например, на промежуточные области 30 и в донную часть бороздки 28''). В качестве второго жертвенного слоя 88 можно использовать любое вещество, которое имеет разницу в эффективности травления по отношению к смоле 54' и по отношению ко второму жертвенному слою 84. Например, если слой 84 представляет собой кремний, тогда слой 88 может представлять собой алюминий или хром.
Жертвенные слои 84, 88 можно наносить с использованием любых методик отложения, описанных в данном документе.
Как показано на Фиг. 34Е, второй жертвенный слой 88 удаляется с областей жертвенного материала 84'' и с частей смолы 54'. В данном примере второй жертвенный слой 88 может вытравливаться таким образом, что область второго жертвенного материала 88'' остается непосредственно смежной с каждой областью жертвенного материала 84''. В данном примере после травления экспонируются промежуточные области 30 и другая (меньшая) донная часть каждой бороздки 28''.
Как показано на Фиг. 34F (иллюстрирующей вид сверху) вещество 92 откладывается для заполнения любых пространств между областями второго жертвенного материала 84''. Другими словами, дополнительный материал 92 покрывает донную часть каждой бороздки 28'' и полностью разделяет области второго жертвенного материала 88'. Дополнительный материал 92 может быть таким же материалом, что и смола 54'. Например, если в качестве смолы 54' используется диоксид кремния; тогда дополнительный материал 92 может представлять собой диоксид кремния. Дополнительный материал 92 помогает определять новые бороздки 28'' (в которых будут определены области 14, 16), которые меньше, чем бороздки 28''.
В данном примере способа, как показано на Фиг. 34G, может проводиться шлифовка для удаления дополнительного материала 92 с промежуточных областей 30'.
На Фиг. 34Н показан вид сверху бороздок 28''' двумя жертвенными материалами/слоями 84'', 88'. Как показано, каждый из жертвенных материалов/слоев 84'', 88' увеличивает длину каждой бороздки 28'''.
На Фиг. 34I показан вид поперечного среза одной из бороздок 28''', заполненной двумя жертвенными материалами/слоями 84'', 88'.
Как показано на Фиг. 34J, область жертвенного материала 84'' удаляется с части каждой из бороздок 28'''. Это экспонирует площадь/часть 76, где следует образовать первую функционализированную область 14. Область жертвенного материала 84'' может быть вытравлена, и данный способ травления не влияет на смолу 54' или область второго жертвенного материала 88' из-за разных скоростей травления.
На Фиг. 34К первый функционализированный слой 60 наносится на промежуточные области 30, площадь 76 и область второго жертвенного материала 88'. Первый функционализированный слой 60 может представлять собой любой из примеров, раскрытых в данном документе, и может быть отложен с использованием любой из методик, раскрытых в данном документе.
На Фиг. 34К, L и Фиг. 34М первый функционализированный слой 60 затем структурируется с образованием первой функционализированной области (области 14), покрытой фоторезистом 62 на площади/части 76. Фоторезист 62 и нижележащий первый функционализированный слой 60 может быть отшлифован или вытравлен с использованием промежуточных областей 30 и второй области жертвенного материала 88' в качестве каждой остановки травления. Это образует первую функционализированную область 14, покрытую фоторезистом 62 на площади/части 76 бороздки 28'''.
Как показано на Фиг. 34N, вторую область жертвенного материала 88' удаляют с части каждой из бороздок 28'''. Это экспонирует площадь/часть 78, где следует образовать вторую функционализированную область 16. Вторая область жертвенного материала 88' может быть вытравлена, и данный способ травления не влияет на смолу 54' или фоторезист 62 из-за разных скоростей травления. Данная экспонированная часть первого функционализированного слоя 60 может быть удалена во время данного процесса травления.
На Фиг. 340 второй функционализированный слой 64 наносится на промежуточные области 30, площадь 78, фоторизист 62 и любую экспонированную часть области 14. Второй функционализированный слой 64 может представлять собой любой из примеров, раскрытых в данном документе, и может быть отложен с использованием любой из методик, раскрытых в данном документе.
На Фиг. 34Р фоторизист 62 может быть затем оторван, что удаляет любой второй функционализированный слой 64 на нем. В любом из примеров, раскрытых в данном документе, может проводиться обработка ультразвуком для улучшения эффективности процесса снятия или отрыва фоторезиста.
На Фиг. 34Q промежуточные области 30 могут быть отшлифованы для удаления любого второго функционализированного слоя на них. Как показано на Фиг. 34Q, области 14, 16 образуются в соответствующих областях бороздки 28'''. Следует понимать то, что области 14, 16 увеличивают длину бороздок 28''' (как показано на Фиг. 34R). Эту конфигурацию областей 14, 16 можно использовать для одновременного секвенирования с парно-концевыми считываемыми фрагментами с использованием наборов праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D', раскрытых в данном документе.
На Фиг. 34R наносится второй фоторезист 62' (и экспонируется, и проявляется) с образованием структуры пространственно разделенных полосок, которые являются по меньшей мере существенно перпендикулярными бороздкам 28'''. Данная структура оставляет части первых функционализированных областей 14 и вторых функционализированных областей 16, которые экспонируются между пространственно разделенными полосками, как показано на Фиг. 34R. Части первых функционализированных областей 14 и вторых функционализированных областей 16, которые экспонируются между пространственно разделенными полосками, удаляются (например, посредством травления), и затем удаляются (например, посредством травления) пространственно разделенные полоски (второй фоторезист 62'). Области 14, 16, лежащие под пространственно разделенными полосками (второй фоторезист 62'), остаются интактными после удаления пространственно разделенных полосок (второй фоторезист 62'), как показано на Фиг. 34S. В данном примере соответствующие области 14, 16 представляют собой выделенные пары вдоль бороздок 28'''.
В некоторых примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' (не показанные на Фиг. 34А - Фиг. 34S) могут быть предварительно привиты на первый функционализированный слой 60 и, таким образом, присоединяются к первой функционализированной области 14. Аналогично, праймеры 19, 21 или 19', 21' (не показанные на Фиг. 34А - Фиг. 34S) могут быть предварительно привиты на второй функционализированный слой 64 и, таким образом, присоединяются ко второй функционализированной области 16. В данных примерах дополнительная прививка праймеров не осуществляется.
В других примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' не подвергаются предварительной прививке к первому функционализированному слою 60. В данных примерах праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты после нанесения первого функционализированного слоя 60 (например, на Фиг. 34К). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 34S), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам областей 16.
Аналогичным образом, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут не быть привиты ко второму функционализированному слою 64. В данных примерах праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты после нанесения второго функционализированного слоя 64 (например, на Фиг. 340). Если области 14, 16 имеют разные функциональные группы, праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты в конце данного способа (например, на Фиг. 34S), так как они не будут прививаться к поверхностным функциональным группам областей 14.
При проведении прививки во время данного способа прививка может проводиться с использованием любого примера, раскрытого в данном документе. С использованием любого из способов прививки праймеры 18, 20 или 18', 20' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 14 или праймеры 19, 21 или 19', 21' взаимодействуют с реакционноспособными группами области 16 и не имеют аффинности в отношении смолы 54'.
В еще одном другом примере проточной ячейки области 14, 16 могут быть образованы на соответствующих функционализированных опорных структурах 93, 94, как показано на Фиг. 35. Функционализированные опорные структуры 93, 94 имеют поверхностные функциональные группы, которыми они могут присоединять соответствующие наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D', раскрытые в данном документе. Для функционализированных опорных структур 93, 94 можно использовать любой пример сердцевинной структуры 49, раскрытой в данном документе. Также можно использовать любую из поверхностных функциональных групп, раскрытых в данном документе, которая способна присоединять разные наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D'. Функционализированную опорную структуру 93, 94 можно образовать, например, с использованием способа(бов), раскрытого(тых) в данном документе, для образования функционализированного шарика 50 (см. раздел «Проточная ячейка на основе шарика»).
В некоторых примерах функционализированные опорные структуры 93, 94 также могут иметь разные формы. В некоторых примерах соответствующие формы соответствуют, соответственно, формам захватывающих сайтов 95, 96 (показанных на Фиг. 36А, Фиг. 36В, Фиг. 37А и Фиг. 37В) на или определенных в поверхности S субстрата (который может представлять собой однослойный или многослойный субстрат, как описано в данном документе). Например, функционализированные опорные структуры 93, 94 могут, соответственно, иметь такую же форму, а также захватывающие сайты 95, 96 (описанные ниже). Разные формы будут помогать функционализированной опорной структур 93 становиться физически захваченной в луночном сайте захвата 95 соответствующей формы, и функционализированная опорная структура 94 становиться физически захваченной в луночном сайте захвата 96 соответствующей формы.
В некоторых примерах структуры функционализированные опорные структуры 93, 94 также могут иметь разную химию захвата. Данная химия захвата представляет собой химию, которая обеспечивает присоединение структур 93, 94 к желательному месту на поверхности субстрата S. В некоторых примерах химия захвата функционализированных опорных структур 93, 94, соответственно, соответствует химии захвата сайтов захвата 95, 96, которые должна получить соответствующая функционализированная опорная структура 93, 94. Например, каждый из функционализированной опорной структуры 93 и сайта захвата 95 может включать члена одного типа пары связывания рецептор-лиганд, тогда как каждый из функционализированной опорной структуры 94 и сайта захвата 96 может включать члена другого типа пары связывания рецептор-лиганд. Разные химии могут помогать переносить то, что данные функционализированные опорные структуры 93, 94 (и соответствующие области 14, 16) представляют собой ловушки в желательных областях поверхности субстрата S.
Сайты захвата 95, 96 физически и/или химически способны иммобилизировать соответствующую функционализированную опорную структуру 93, 94 на субстрате 26 (или смоле 54' многослойного субстрата). Сайты захвата 95, 96 могут располагаться в любом подходящем месте, где желательно иметь смежные области 14, 16. Расположение сайтов захвата 95, 96 по субстрату 26 может быть однородным (см. Фиг. 36А и 36В) или может быть неоднородным. Сайты захвата 95, 96 могут иметь любую подходящую форму, геометрию и размеры, которые могут зависеть, по меньшей мере частично, от конфигурации сайтов захвата 95, 96 (например, участок, лунка, выступ и т.д.) и типа функционализированной опорной структуры 93, 94, которую следует захватывать сайтами захвата 95, 96.
В некоторых примерах сайты захвата 95, 96 представляют собой разные химические захватывающие агенты, которые наносятся на часть поверхности субстрата S. Можно использовать любые примеры химического захватывающего агента, раскрытого в данном документе. В одном примере соответствующие химические захватывающие агенты могут быть отложены в желательных местах с использованием микроконтактной печати или другой подходящей методики.
В других примерах сайты захвата 95, 96 включают соответствующие лунки, которые определяются в поверхности S субстрата 26 (или смолы 54'). Данные лунки могут быть образованы с использованием травления или отпечатывания, в зависимости от субстрата (например, одно- или многослойный), который используется. Данные лунки могут иметь любую подходящую форму и геометрию, такие как форма и геометрия, изложенные в данном документе для впадин 28.
В некоторых примерах данные лунки не имеют дополнительного химического захватывающего агента, добавленного в них. В данных примерах размеры отверстия обеспечивают самоорганизацию соответствующей функционализированной опорной структуры 93, 94 в соответствующих лунках (например, на основе формы). В других примерах данные лунки не имеют соответствующих химических захватывающих агентов, добавленных в них.
Другие примеры захватывающих сайтов 95, 96 включают лунку и захватывающий шарик, имеющий химический захватывающий агент на его поверхности. Данный захватывающий шарик может быть доведен до такого размера, чтобы соответствовать лункам. В некоторых примерах захватывающие шарики могут лежать в одной плоскости или простираться немного выше смежных промежуточных областей 30, 30' таким образом, что функционализированная опорная структура 93, 94, которая, в конечном счете, присоединяется к ним, не ограничивается в пределах лунки. В одном примере захватывающий шарик выбран из группы, состоящей из диоксида кремния, суперпарамагнитного материала, полистирола и акрилата. На поверхности захватывающего шарика можно использовать любые примеры химического захватывающего агента, раскрытого в данном документе, и им можно покрывать данный захватывающий шарик перед его введением в лунку. Конфигурация лунок и шариков данных захватывающих сайтов 95, 96 может быть таковой, что функционализированная опорная структура 93, 94 (когда она присоединена) образует области 14, 16, которые являются смежными друг с другом.
Глубина лунки захватывающих сайтов 95, 96 может варьировать, в зависимости от того следует ли вводить в нее химический захватывающий агент, и следует ли вводить в нее захватывающий шарик. Глубина может быть выбрана по меньшей мере так, чтобы быть приспособленной к этим материалам (т.е. материалу, содержащемуся в пределах лунок). В одном примере глубина лунки варьирует от примерно 1 нм до примерно 5 мкм.
В качестве другого примера, захватывающие сайты 95, 96 включают выступы, которые определяются в субстрате 26 (или в смоле 54'). Данные выступы представляют собой трехмерные структуры, которые простираются наружу (вверх) от смежной поверхности. Данные выступы могут быть получены посредством травления, фотолитографии, отпечатывания и т.д.
В то время как для захватывающих сайтов 95, 96 в виде выступов можно использовать любую подходящую трехмерную геометрию, может быть желательной геометрия с по меньшей мере по существу плоской верхней поверхностью. Типичные геометрии выступов включают сферу, цилиндр, куб, полигональные призмы (например, прямоугольные призмы, гексагональные призмы и т.д.) или тому подобные.
На верхнюю поверхность соответствующих захватывающих сайтов 95, 96 в виде выступов могут наноситься разные химические захватывающие агенты. Можно использовать любые примеры химического захватывающего агента, раскрытого в данном документе, и для нанесения химического захватывающего агента на верхнюю поверхность выступов можно использовать любую методику отложения.
Следует понимать то, что, в то время как захватывающие сайты 95, 96 были описаны и как захватывающие агенты, и лунки, и т.д., на проточной ячейке можно совместно использовать любую комбинацию типов захватывающих сайтов 95, 96 (например, захватывающий агент и лунку).
На Фиг. 36А захватывающие сайты 95, 96 на поверхности S имеют разные формы. При загрузке в проточную ячейку функционализированной опорной структуры 93, 94, имеющей, соответственно, соответствующие формы (Фиг. 36В), функционализированная опорная структура 93, 94 подвергается самоорганизации или посредством физического исключения и/или посредством химии захвата таким образом, что функционализированная опорная структура 93 присоединена к захватывающим сайтам 95, и функционализированная опорная структура 94 присоединена к захватывающим сайтам 96.
На Фиг. 37А захватывающие сайты 95, 96 на поверхности S также имеют разные формы, но организуются иным образом, чем пример, показанный на Фиг. 36А. При загрузке в проточную ячейку функционализированной опорной структуры 93, 94, имеющей, соответственно, соответствующие формы (Фиг. 37В), функционализированная опорная структура 93, 94 подвергается самоорганизации или посредством физического исключения и/или посредством химии захвата таким образом, что функционализированные опорные структуры 93 присоединяются к захватывающим сайтам 95, и функционализированная опорная структура 94 присоединена к захватывающим сайтам 96.
Обе конфигурации, показанные на Фиг. 36В и Фиг. 37В приводят к группе областей 14, 16 в изолированных положениях по поверхности субстрата S.
На Фиг. 2 - Фиг. 10, Фиг. 33А, Фиг. 34S, Фиг. 36В и Фиг. 37В проиллюстрированы разные конфигурации для областей 14, 16 проточной ячейки без крышки, связанной с субстратом 26 (или смолой 54'). В то время как это не показано, следует понимать то, что проточные ячейки могут иметь крышку, связанную с по меньшей мере частью промежуточной области 30, 30'. В некоторых примерах данная крышка может быть связана до или после прививки наборов праймеров 12А, 12А', или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D'. При связывании крышки до прививки праймеров следует понимать то, что для прививки можно использовать процесс протекания. В данном процессе протекания раствор или смесь праймеров может вводиться в проточный(ные) канал(лы) (определенный между крышкой и промежуточной областью 30, 30') через соответствующий(щие) впускной(ные) порт(ты) (не показано), может сохраняться в проточном(ных) канале(лах) в течение достаточного времени (т.е. инкубационного периода) для того, чтобы праймер(ры) 18, 18', 20, 20', 19, 19', 21, 21' присоединились к соответствующим областям 14, 16, и затем может быть удален из соответствующего(щих) выпускного(ных) порта(тов) (не показано). После присоединения праймера 18, 18', 20, 20', 19, 19', 21, 21' дополнительная(ные) жидкость(ти) может(гут) быть направлена(ны) через проточный(ные) канал(лы) для промывки теперь функционализированных впадин и проточного(ных) канала(лов).
Крышка может быть расположена на промежуточной области 30 таким образом, что она определяет один проточный канал или много жидкостно разделенных проточных каналов.
Крышка может быть из любого материала, который является прозрачным для возбуждающего света, который направляется к субстрату 26. В качестве примеров, крышка может быть стеклянной (например, борсиликатной, из плавленого кварца и т.д.), пластмассовой или тому подобными. Имеющимся в продаже примером подходящего борсиликатного стекла является D 263, доступное у Schott North America, Inc. Имеющиеся в продаже примеры подходящих пластмассовых материалов, а именно циклоолефиновых полимеров, представляют собой продукты ZEONOR, доступные у Zeon Chemicals LP.
В некоторых примерах крышка может быть интегрально образованной с боковой(выми) стенкой(ками), которая(рые) соответствуют по форме части промежуточной области 30, с которой она(они) будет(дут) связаны. Например, в прозрачном блоке может быть вытравлен прорез с образованием по существу плоской (например, верхней) части и боковой(вых) стенки(нок), простирающейся(щихся) от по существу плоской части. При установке вытравленного блока на промежуточную область 30 данный прорез может становиться проточным каналом. В других примерах боковая(вые) стенка(ки) и крышка могут быть отдельными компонентами, которые связываются друг с другом. Например, крышка может представлять собой по существу прямоугольный блок, имеющий по меньшей мере существенно плоскую внешнюю поверхность и по меньшей мере существенно плоскую внутреннюю поверхность, которая определяет часть (например, верхнюю часть) проточного канала (при связывании с частью промежуточной области 30). Данный блок может быть установлен на (например, связан с) боковую(вые) стенку(ки), которая(рые) связана(ны) с частью промежуточной области 30 и образует(ют) боковую(вые) стенку(ки) данного проточного канала. В данном примере боковая(вые) стенка(ки) может(гут) включать любой из материалов, изложенных в данном документе, для спейсерного слоя (описанного ниже).
Крышка может быть связана с использованием любой подходящей методики, такой как лазерная сварка, диффузная сварка, анодная сварка, пайка эвтектическим сплавом, сварка, активированная плазмой, пайка стеклокерамическим припоем или другие способы, известные в данной области. В одном примере для связывания крышки с частью промежуточной области 30 может использоваться спейсерный слой. Данный спейсерный слой может представлять собой любое вещество, которое будет склеивать друг с другом по меньшей мере некоторые из промежуточных областей 30 и крышку.
В одном примере спейсерный слой может представлять собой вещество, поглощающее излучение, которое поглощает излучение при длине волны, которая пропускается крышкой и/или субстратом 26 (или, например, структурированной смолой на субстрате 26). Поглощенная энергия, в свою очередь, образует связь между спейсерным слоем и крышкой и между спейсерным слоем и субстратом 26. Примером данного вещества, поглощающего излучение, является черный KAPTON (полиимид, содержащий сажу) от DuPont (США), который поглощает при примерно 1064 нм. Следует понимать то, что полиимид мог бы использоваться без добавления сажи, за исключением того, что длина волны должна была бы быть изменена до длины волны, которая значительно поглощается естественным полимидным веществом (например, 480 нм). В качестве другого примера может связываться полиимид CEN JP при облучении светом при 532 нм. Когда спейсерный слой представляет собой вещество, поглощающее излучение, данный спейсерный слой может быть расположен на поверхности контакта между крышкой и частью промежуточной области 30 таким образом, что спейсерный слой контактирует с желательной областью связывания. Может прилагаться давление (например, давление приблизительно 689 кПа), в то время как к поверхности контакта прилагается энергия лазера при подходящей длине волны (т.е. вещество, поглощающее излучение, облучается). Энергия лазера может прилагаться к поверхности контакта сверху и снизу для того, чтобы достигать подходящего связывания.
В другом примере спейсерный слой может включать вещество, поглощающее излучение, в контакте с ним. Данное вещество, поглощающее излучение, может наноситься на поверхность контакта между спейсерным слоем и крышкой, а также на поверхность контакта между спейсерным слоем и частью промежуточной области 30. В качестве примера спейсерный слой может представлять собой полиимид, и отдельное вещество, поглощающее излучение, может представлять собой сажу. В данном примере отдельное вещество, поглощающее излучение, поглощает энергию лазера, которая образует связи между спейсерным слоем и крышкой и между спейсерным слоем и частью промежуточной области 30. В данном примере давление может прилагаться на соответствующих поверхностях контакта при одновременном приложении к данным поверхностям контакта энергии лазера при подходящей длине волны (т.е. вещество, поглощающее излучение, облучается).
Способ одновременного парно-концевого секвенирования
В одновременном парно-концевом секвенировании, где одновременно считываются прямые и обратные нити (например, нити 40 и 44), можно использовать любые примеры проточной ячейки, включающей наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D'.
Как только генерируются кластеры нерасщепляемых нитей первой матрицы 40 в областях 40 и генерируются кластеры нерасщепляемых нитей второй матрицы 44 в области 16 (описанные со ссылкой на Фиг. 7С - Фиг. 7G), свободные концы могут блокироваться для предотвращения нежелательного примирования. Следует понимать то, что свободные концы любых праймеров, которые остаются, также могут блокироваться.
В данных способах может быть добавлена смесь для включения, которая включает праймеры для секвенирования, которые способны, соответственно, гибридизоваться с нерасщепляемыми нитями первой матрицы 40 и нерасщепляемыми нитями второй матрицы 44. Достройка праймеров для секвенирования вдоль соответствующих нитей матрицы 40, 44 отслеживается для определения последовательности нуклеотидов в нитях матрицы 40, 44. Лежащим в основе химическим процессом может быть полимеризация (например, катализируемая ферментом полимеразой) или лигирование (например, катализируемое ферментом лигазой). В конкретном способе на основе полимеразы флуоресцентно меченые нуклеотиды добавляются к соответствующим праймерам для секвенирования способом, зависимым от матрицы, таким образом, что выявление порядка и типа нуклеотидов, добавленных к соответствующим праймерам для секвенирования, можно использовать для определения последовательности матрицы. Например, для инициации первого цикла секвенирования посредством синтеза в/через проточную ячейку можно доставлять один или более чем один меченый нуклеотид, ДНК-полимеразу и т.д., где достройка праймера для секвенирования вызывает включение меченого нуклеотида в растущую нить, которая комплементарна соответствующей матрице 40, 44. Данные события включения могут выявляться совместно посредством события визуализации без существенного физического перекрывания флуоресцентных сигналов, генерированных на соответствующих матрицах 40, 44. Это обеспечивает одновременное распознавание оснований в соответствующих матрицах 40, 44. Во время события визуализации система освещения (не показана) может предоставлять в проточную ячейку возбуждающий свет, и могут быть сфотографированы и проанализированы изображения. В качестве примеров освещение может осуществляться лазером, светодиодом, плоским волноводом или тому подобным.
В некоторых примерах флуоресцентно меченые нуклеотиды могут дополнительно включать свойство обратимой терминации, которое терминирует дальнейшую достройку праймера, как только к соответствующим матрицам 40, 44 был добавлен нуклеотид. Например, к матрицам 40, 44 может быть добавлен аналог нуклеотида, имеющий обратимую терминирующую группировку, таким образом, что последующая достройка не может происходить, пока не доставляется деблокирующий агент для удаления данной группировки. Таким образом, для примеров, в которых используется обратимая терминация, в проточную ячейку может доставляться деблокирующий реактив и т.д. (после осуществления выявления).
Между разными стадиями доставки жидкости может(гут) происходить промывка(ки). Цикл секвенирования можно затем повторять п раз для достройки матрицы на п нуклеотидов, выявляя, посредством этого, последовательность длины п.
Парно-концевое секвенирование позволяет пользователям секвенировать оба конца фрагмента и получать высококачественные выравниваемые данные по последовательности. Парно-концевое секвенирование облегчает выявление геномных перестроек и повторяющихся элементов последовательности, а также слияний генов и новых транскриптов. В то время как был подробно описан один типичный способ парно-концевого секвенирования, следует понимать то, что проточные ячейки, описанные в данном документе, могут быть использованы с другим протоколом секвенирования, для генотипирования или в других химических и/или биологических приложениях. В еще одном другом примере проточные ячейки, раскрытые в данном документе, могут использоваться для получения библиотеки на клетке.
Наборы
Любой пример проточных ячеек, описанных в данном документе, может быть частью набора.
Некоторые примеры данного набора включают проточную ячейку, матричную смесь/жидкость и смесь для включения. Данные примеры проточной ячейки имеют оба набора праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D', присоединенных к ней. Матричная смесь/жидкость включает матрицу, подлежащую секвенированию, а смесь для включения включает праймеры для секвенирования, которые способны, соответственно, гибридизоваться с нитями нерасщепляемой первой матрицы 40 и нитями нерасщепляемой второй матрицы 44 (образующимися с использованием матрицы).
Другие примеры данного набора включают проточную ячейку и примирующую жидкость, описанную в данном документе. Данные примеры проточной ячейки имеют один набор праймеров 12А, 12В, 12С или 12D, присоединенных к ней, а примирующую жидкость можно использовать для введения другого набора праймеров 12А', 12В', 12С' или 12D'. В одном примере данного набора проточная ячейка включает субстрат 26, включающий впадины 28, разделенные промежуточными областями 30, первый полимерный слой 32 в каждой из впадин, где некоторые функциональные группы первого полимерного слоя являются кэппированными, первый набор праймеров 12А, 12В, 12С или 12D, присоединенных к другим функциональным группам первого полимерного слоя 32 в каждой из впадин 28, и второй полимерный слой 32' на промежуточных областях 30; и примирующая жидкость включает жидкий носитель и второй набор праймеров 12А', 12В', 12С' или 12D', который отличается от первого набора праймеров 12А, 12В, 12С или 12D. Данный типичный набор также может включать смесь матриц и смесь для включения.
Проточная ячейка на основе шариков
На Фиг. 9 показана одна конфигурация проточной ячейки, где одна из областей 14 или 16 представляет собой часть шарика 50. На данном срезе описаны разные примеры и способы для данной конфигурации проточной ячейки.
Примеры данной проточной ячейки 10А (Фиг. 13D и 14), 10В (Фиг. 15D и 16), 10С (Фиг. 17D и 18), 10D (Фиг. 19D и 20), раскрытые в данном документе, включают подложку 52 и структурированную смолу 54', 54'' на подложке 52, причем данная структурированная смола включает впадины 28А, 28В или 28С, разделенные промежуточными областями 30. На Фиг. 11A-11D совместно проиллюстрирован пример способа структурирования смолы 54 с образованием впадин 28А, 28В или 28С. Более конкретно, на 11A-11D показано образование впадин 28А, 28В, и на Фиг. 11А, 11В и 11D показано образование впадин 28С.
На Фиг. 11А проиллюстрирована подложка 52, и на Фиг. 11В проиллюстрирована смола 54, отложенная на подложку 52. Для подложки 52 можно использовать любой пример субстрата 12, описанный в данном документе.
Некоторые примеры подходящих смол 54 выбраны из группы, состоящей из смолы на основе полиэдрической олигомерной силсесквиоксановой смолы (POSS), эпоксисмолы, поли(этиленгликолевой) смолы, полиэфирной смолы, акриловой смолы, акрилатной смолы, метакрилатной смолы и их комбинаций. В то время как было предложено несколько примеров, считается, что можно использовать любую смолу, которая может отверждаться.
1.5
2
2
3/2
n
8
Термины «полиэдрический олигомерный силсесквиоксан» (POSS) и «смола на основе POSS» в том виде, в котором они используются в данном документе, относятся к химической композиции, которая представляет собой гибридный интермедиат (RSiO) между диоксидом кремния (SiO) и силиконом (RSiO). Примером POSS может быть соединение, описанное Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778, которая включается посредством ссылки во всей ее полноте. Данная композиция представляет собой кремнийорганическое соединение с химической формулой [RSiO], где R группы могут быть одинаковыми или разными. Данная композиция может содержать одну или более отличных каркасных или сердцевинных структур в качестве мономерных звеньев. В некоторых случаях данная структура включает следующую структуру полиоктаэдрического каркаса или ядра. В некоторых случаях данная полиэдрическая структура может представлять собой структуру Т, такую как:
1
8
и представленную  Данное мономерное звено типично имеет восемь ручек функциональных групп R-R.
10
Данное мономерное звено может иметь структуру каркаса с 10 атомами кремния и 10 R группами, которая называется Т, такую как:
12
или может иметь структуру каркаса с 12 атомами кремния и 12 R группами, которая называется Т, такую как:
Вещество на основе POSS может включать структуры каркаса Т6, Т14 или Т16. Среднее содержание каркаса может корректироваться во время синтеза и/или контролироваться способами очистки, и распределение размеров каркаса мономерного(ных) звена(звеньев) может использоваться в примерах, раскрытых в данном документе. В качестве примеров, любая из структур каркаса может присутствовать в количестве, варьирующем от примерно 30% до примерно 100% всех использованных мономерных звеньев POSS. Вещество на основе POSS может представлять собой смесь структур каркаса, наряду с открытыми и частично открытыми структурами каркаса. Таким образом, предшественник или смола на основе POSS может включать эпокси POSS вещества, которые могут представлять собой смесь силсесквиоксановых конфигураций. Например, любое POSS вещество, описанное в данном документе, может представлять собой смесь дискретных каркасов POSS и недискретных силсесквиоксановых структур и/или неполностью конденсированных дискретных структур, таких как полимеры, соединения с сопряженной циклической структурой и тому подобное. Частично конденсированные вещества, следовательно, включали бы эпокси R группы, как описано в данном документе, на некоторых кремниевых вершинах, но некоторые атомы кремния не были бы замещенными группами R и могли бы быть вместо этого замещенными группами ОН. В некоторых примерах POSS вещества содержат смесь разных форм, таких как:
Конденсированные каркасы
(а)
Неполностью конденсированные каркасы
(б)
Содержание некаркаса
Большая и плохо
определенная структура
и/или (в)
1
8
10
12
1
8
10
12
1
8
10
12
1
8
10
12
1
8
10
12
1
8
10
12
В некоторых примерах, раскрытых в данном документе, по меньшей мере один из R-R или R, или R содержит эпокси и, таким образом, POSS называется эпокси POSS. В некоторых примерах большинство ручек, как, например, восемь, десять или двенадцать ручек, или R групп содержат эпоксигруппы. В других примерах R-R или R, или R являются одинаковыми и, таким образом, каждый из R-R или R, или R содержит эпоксигруппу. В других примерах R-R или R или R являются неодинаковыми, и, таким образом, по меньшей мере один из R-R или R, или R содержит эпокси, и по меньшей мере один другой из R-R или R, или R представляет собой функциональную группу, не являющуюся эпокси. Функциональная группа, не являющаяся эпокси, может представлять собой (а) реакционноспособную группу, которая ортогонально реагирует с эпоксигруппой (т.е. реагирует при других условиях, чем эпоксигруппа), которая служит в качестве ручки для связывания смолы с амплификационным праймером, полимером или агентом полимеризации; или (б) группу, которая корректирует механические или функциональные свойства смолы, например, корректирует поверхностную энергию. В некоторых примерах функциональная группа, не являющаяся эпокси, выбрана из группы, состоящей из азида/азидо, тиола, поли(этиленгликоля), норборнена, тетразина, амино, гидроксила, алкинила, кетона, альдегида, сложноэфирной группы, алкила, арила, алкокси и галогеналкила. В некоторых аспектах функциональная группа, не являющаяся эпокси, выбрана для увеличения поверхностной энергии смолы. В этих других примерах отношение эпоксигрупп к группам, не являющимся эпокси, варьирует от 7:1 до 1:7 или от 9:1 до 1:9, или от 11:1 до 1:11. В любом из данных примеров двухзамещенная(ные) или монозамещенная(ные) (концевая(вые)) эпоксигруппа(пы) обеспечивает(ют) полимеризацию мономерного звена в поперечносвязанный матрикс при инициации с использованием ультрафиолетового света (УФ) и кислоты. В некоторых аспектах эпокси POSS содержит концевые эпоксигруппы. Одним примером данного типа POSS является глицидил-POSS, имеющий следующую структуру:
1
8
10
12
Эпокси POSS также может представлять собой модифицированным эпокси POSS, который включает агент контролируемой радикальной полимеризации (CRP) и/или другую интересующую функциональную группу, включенную в смолу или в сердцевинную или каркасную структуру в качестве одной или более чем одной функциональной группы R-R или R, или R.
1
8
10
12
В других примерах смолы на основе POSS, раскрытой в данном документе, каждая из R-R или R, или R содержит любую группу, не являющуюся эпокси, такую как акрилат, метакрилат, этиленгликоль или короткая цепь полиэтиленгликоля (вплоть до 50 повторяющихся звеньев). Можно использовать любой мономер неэпокси POSS, который может полимеризоваться радикально. Одним примером является смесь метакрил POSS каркаса, имеющая следующую структуру:
Другим примером является смесь PEG(полиэтиленгликоль)-POSS каркаса, имеющая следующую структуру:
3
В одном примере PEG-POSS концевая метильная группа (СН) R группы может быть заменена на X, где X представляет собой акриловую группу, метакриловую группу или другую подходящую концевую группу.
Также можно использовать другие смолы 54. Примеры включают (не-POSS) эпоксисмолы, поли(этиленгликолевые) смолы, полиэфирные смолы (которые могут представлять собой эпокси с открытым кольцом), акриловые смолы, акрилатные смолы, метакрилатные смолы и их комбинации. В качестве примеров, можно использовать смолу, включающую эпокси и акрилатные мономеры, или смолу, включающую эпокси и этиленовые мономеры.
Другим примером подходящей смолы 54 является аморфный фторполимер. Примером имеющегося в продаже аморфного (некристаллического) фторполимера является CYTOP от Bellex.
Как показано на Фиг. 11В, смола 54 откладывается на подложку 52. В одном примере откладывание смолы 54 включает химическое осаждение из паровой фазы, покрытие погружением, покрытие окунанием, покрытие методом центрифугирования, покрытие распылением, распределение в ванночке, ультразвуковое покрытие распылением, покрытие, наносимое ножевым устройством, аэрозольную печать, трафаретную печать, микроконтактную печать или струйную печать.
Отложенная смола 54 затем структурируется с использованием любой из методик структурирования, упомянутых в данном документе. В примере, показанном на Фиг. 11В, для структурирования смолы 54 используется наноимпринтная литография. После отложения смолы 54 она может подвергаться термообработке при низкой температуре для удаления избытка растворителя. Форма или рабочий штамп наноимпринтной литографии вдавливается в слой смолы 54 с созданием отпечатка на смоле 54. Другими словами, продавливается или перворируется выступами рабочего штампа 56. Смола 54 может затем отверждаться с рабочим штампом 56 в рабочем положении. Отверждение может осуществляется воздействием актиничного излучения, такого как излучение видимого света или ультрафиолетовое излучение (УФ), или излучения с длиной волны, варьирующей от примерно 240 нм до 380 нм при использовании фоторезиста; или воздействием тепла при использовании термоотверждаемого резиста. Отверждение может стимулировать полимеризацию и/или поперечное связывание. В качестве примера отверждение может включать много стадий, включая термообработку при низкой температуре (например, для удаления растворителя(лей)) и термообработку при высокой температуре. Термообработка при низкой температуре может происходить при более низкой температуре, варьирующей от примерно 50°С до примерно 150°С. Продолжительность термообработки при высокой температуре может продолжаться от примерно 5 секунд до примерно 10 минут при температуре, варьирующей от примерно 100°С до примерно 300°С. Примеры устройств, которые можно использовать для термообработки при низкой температуре и/или термообработки при высокой температуре, включают плитку, печь и т.д.
После отверждения рабочий штамп 56 высвобождается. Это создает топографические элементы, т.е. впадины 28А и 28В или 28С в смоле 54. Как показано на Фиг. 11С, смола 54, имеющая определенные в ней впадины 28А и 28В, именуется структурированная смола 54'. Как показано на Фиг. 11D, смола 54, имеющая определенные в ней впадины 28С, именуется структурированной смолой 54''. Структурированная смола 54', 54'' может подвергаться дальнейшей термообработке при высокой температуре для завершения отверждения и фиксации в отпечатанной топографии. В некоторых примерах термообработка при высокой температуре может проводиться при температуре, варьирующей от примерно 60°С до примерно 300°С.
Впадины 28А и 28Б, показанные на Фиг. 11С, имеют разные размеры. В данном примере фраза «разные размеры» означает то, что некоторые из впадин 28В имеют меньшие размеры отверстия, чем некоторые другие из впадин 28А. В данном примере «размер отверстия» относится к площади, занимаемой каждым отверстием впадины на структурированной смоле 54', и/или к диаметру каждого отверстия впадины на структурированной смоле 54'. В примере, показанном на Фиг. 11С, площадь и диаметр отверстия каждой из впадин 28В меньше, чем площадь и диаметр отверстия каждой из впадин 28А. Площадь и диаметр отверстия больших впадин 28А зависит от размера частиц (например, диаметра) шариков 50, подлежащих введению в них. Площадь и диаметр отверстия меньших впадин 28 В меньше, чем размер частиц шариков 50. Эти размеры отверстий обеспечивают самоорганизацию шариков 50 во впадинах 28А, а не во впадинах 28В посредством исключения по размеру.
Впадины 28С, показанные на Фиг. 11D, включают две части 34, 34', которые являются взаимосвязанными, но которые имеют разные размеры. В данном примере фраза «разные размеры» означает то, что часть 34' каждой из впадин 28С имеет меньшие размеры отверстия, чем часть 34. Также в данном примере «размер отверстия» относится к площади, занимаемой отверстием каждой части на структурированной смоле 54'', и/или к диаметру отверстия каждой части на структурированной смоле 54''. В примере, показанном на Фиг. 11D, площадь и диаметр отверстия каждой из частей 34' меньше, чем площадь и диаметр отверстия каждой из частей 34. Площадь и диаметр отверстия больших частей 34 зависит от размера частиц (например, диаметра) шариков 50, подлежащих введению в них. Площадь и диаметр отверстия меньших частей 34' меньше, чем размер частиц шариков 50. Эти размеры отверстий обеспечивают самоорганизацию шариков 50 в частях 34, а не в частях 34' посредством исключения по размеру.
-3
2
-2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
-2
2
3
Примеры площади отверстия каждой впадины или отверстия части на поверхности могут составлять по меньшей мере примерно 1×10 мкм, по меньшей мере примерно 1×10 мкм, по меньшей мере примерно 0,1 мкм, по меньшей мере примерно 1 мкм, по меньшей мере примерно 10 мкм, по меньшей мере примерно 100 мкм или более. Альтернативно или дополнительно, данная площадь может составлять самое большее примерно 1×10 мкм, самое большее примерно 100 мкм2, самое большее примерно 10 мкм, самое большее примерно 1 мкм, самое большее примерно 0,1 мкм, примерно 1×10 мкм или меньше. В некоторых случаях диаметр каждой впадины 28А, 28В или части 34, 34' может составлять по меньшей мере примерно 50 нм, по меньшей мере примерно 0,1 мкм, по меньшей мере примерно 0,5 мкм, по меньшей мере примерно 1 мкм, по меньшей мере примерно 10 мкм, по меньшей мере примерно 100 мкм или больше. Альтернативно или дополнительно, диаметр может составлять самое большее примерно 1×10 мкм, самое большее примерно 100 мкм, самое большее примерно 10 мкм, самое большее примерно 1 мкм, самое большее примерно 0,5 мкм, самое большее примерно 0,1 мкм или меньше (например, примерно 50 нм). Площадь и диаметр отверстия каждой впадины или отверстия части может быть больше чем, меньше чем или находиться между значениями, определенными выше. Можно использовать любые желательные площади и диаметры, при условии, что площадь и диаметр отверстий впадин 28А больше, чем площадь и диаметр отверстий впадин 28В, или при условии, что площадь и диаметр отверстий частей 34 впадин 28С больше, чем площадь и диаметр отверстий частей 34' впадин 28С.
Можно рассматривать много разных размещений впадин 28А и 28В или 28С, включая регулярные, повторяющиеся и нерегулярные структуры. В одном примере впадины 28А и 28В или 28С располагаются в гексагональной сетке для плотной упаковки и улучшенной плотности. Другие размещения могут включать, например, прямолинейные (т.е. прямоугольные) размещения, треугольные размещения и так далее, при условии, что впадина 28А или часть 34 может принимать функционализированный шарик 50 (например, сердцевинную структуру 49 с образовавшейся на ней областью 16, как показано, например, на Фиг. 13С, 14 и т.д.). В некоторых примерах размещение или структура может иметь х-у формат впадин 28А и 28В или 28С, которые находятся в рядах и столбцах. В некоторых других примерах размещение или структура может представлять собой повторяющуюся огранизацию впадин 28А и 28В или 28С и/или промежуточных областей 30. В других примерах размещение или структура может представлять собой случайную организацию впадин 28А и 28В или 28С и/или промежуточных областей 30. Данная структура может включать полоски, завитки, линии, треугольники, прямоугольники, круги, дуги, клетки, шотландские клетки, диагонали, стрелки, квадраты и/или перекрестные штрихи.
Следует понимать то, размещение или структура впадин 28А и 28В или 28В может отличаться в отношении плотности и/или среднего шага, как описано в данном документе.
Кроме того впадины 28А и 28В или 28С могут иметь любую подходящую глубину.
Пример способа 100 получения примера проточной ячейки с использованием структурированной смолы 54', показанной на Фиг. 11С, или структурированной смолы 54", показанной на Фиг. 11D, показан на Фиг. 12. Как показано на Фиг. 12, способ 100 включает селективное нанесение полимера 32 во впадинах 28А, 28В или 28С структурированной смолы 54' или 54'' на подложке 52 (ссылочное числовое значение 102); прививку первого набора праймеров 12А, 12В, 12С, 12D к полимеру 32 в по меньшей мере некоторых из впадин 28А, 28В или 28С (ссылочное числовое значение 104); и, до или после прививки первого набора праймеров 12А, 12В, 12С, 12D, отложение функционализированных шариков 50 i) в часть каждой из по меньшей мере некоторых впадин 28С, или ii) во вторые впадины 28А, имеющие большие размеры отверстия, чем по меньшей мере некоторые из впадин 28В, причем данные функционализированные шарики 50 включают второй набор праймеров 12А', 12В', 12С', 12D', присоединенных к поверхности сердцевинной структуры 49, где первый и второй наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' являются разными. Разные примеры данного способа 100, включающего впадины 28А, 28В, будут дополнительно описаны со ссылкой на Фиг. 13A-13D и 14, и Фиг. 15A-15D и 16. Разные примеры данного способа 100, включающего впадины 28С, будут описаны далее со ссылкой на Фиг. 17A-17D и 18, и Фиг. 19A-19D и 20.
На Фиг. 13А показана структурированная смола 54', включающая большие впадины 28А и меньшие впадины 28В. Глубина данных впадин 16А и 16В опущена для ясности.
На Фиг. 13В показано селективное нанесение полимера 32 в каждую из впадин 28А и 28В. Селективное нанесение полимера 32 может включать многие процессы, включающие активацию промежуточных областей 30 и экспонированных поверхностей во впадинах 28А, 28В, отложение полимера 32 на активированные промежуточные области 30 и во впадины 28А, 28В и удаление полимера 32 из промежуточных областей 30.
В некоторых примерах активация включает силанизацию поверхности, включая промежуточные области 30 структурированной смолы 54' и области подложки 52, которые экспонируются во впадинах 28А, 28В. Силанизация может осуществляться с использованием любого силана или производного силана. Выбор силана или производного силана может зависеть, отчасти, от полимера 32, который следует образовать, так как может быть желательным образование ковалентной связи между силаном или производным силана и полимером 32. Способ, используемый для присоединения силана или производного силана, может варьировать, в зависимости от силана или производного силана, которое используется. В данном документе изложено несколько примеров.
Примеры подходящих способов силанизации включают осаждение из паровой фазы (например, способ YES), покрытие центрифугированием или другие способы отложения.
В одном примере с использованием CVD печи YES подложку 52, имеющую на ней структурированную смолу 54', помещают в CVD печь. Камера может вентилироваться, и затем начинается цикл силанизации. Во время циклирования сосуд с силаном или производным силана может поддерживаться при подходящей температуре (например, примерно 120°С для норборненового силана), линии с парами силана или производного силана будут поддерживаться при подходящей температуре (например, примерно 125°С для норборненового силана), и вакуумные линии будут поддерживаться при подходящей температуре (например, примерно 145°С).
В другом примере силан или производное силана (например, жидкий норборненовый силан) может отлагаться внутри стеклянного сосуда и размещаться внутри стеклянного вакуумного десикатора с подложкой 52, имеющей на ней структурированную смолу 54'. Затем из десикатора может откачиваться воздух до давления, варьирующего от примерно 2000 Па до примерно 4000 Па, и он может размещаться внутри печи при температуре, варьирующей от примерно 60°С до примерно 125°С. Обеспечивается ход силанизации, и затем десикатор удаляют из печи, охлаждают и вентилируют на воздухе.
Осаждение из паровой фазы, способ YES и/или вакуумный десикатор можно использовать со множеством силанов или производных силана, таких как те силаны или производные силана, которые включают ненасыщенную циклоалкеновую группировку, такую как норборнен, производное норборнена (например, (гетеро)норборнен, включающий кислород или азот вместо одного из атомов углерода), трансциклооктен, производные трансциклооктена, трансциклопентен, трансциклогептен, транс-циклоноен, бицикло[3.3.1]нон-1-ен, бицикло[4.3.1]дец-1(9)-ен, бицикло[4.3.1]нон-1(8)-ен и бицикло[4.2.1]нон-1-ен. Любой из данных циклоалкенов может быть замещен, например, R группой, такой как атом водорода, алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкинил, арил, гетероарил, гетероали циклил, аралкил или (гетероалициклил)алкил. Пример норборненового производного включает [(5-бицикло[2.2.1]гепт-2-енил)этил]триметоксисилан. В качестве других примеров данные способы можно использовать, когда силан или производное силана включает ненасыщенную циклоалкиновую группировку, такую как циклооктин, производное циклооктина или бициклононины (например, бицикло[6.1.0]нон-4-ин или его производные, бицикло[6.1.0]нон-2-ин или бицикло[6.1.0]нон-3-ин). Данные циклоалкины могут быть замещены любой из R групп, описанных в данном документе.
Присоединение силана или производного силана образует активированную поверхность как на промежуточных областях 30, так и во впадинах 28А, 28В.
Затем можно наносить полимерный слой 32, как описано в данном документе. В качестве примеров, полимер (например, PAZAM) может быть отложен с использованием покрытия центрифугированием или погружения, или покрытия погружением, или током функционализированной молекулы при положительном или отрицательном давлении, или другой подходящей методикой. Полимер, отложенный с образованием полимерного слоя 32, может присутствовать в смеси. В одном примере данная смесь включает PAZAM в воде или в этанольной и водной смеси.
После покрытия смесь, включающую полимер, также может подвергаться процессу отверждения с образованием полимерного слоя 32 по всем активированным промежуточным областям 30 структурированной смолы 54' и во впадинах 28А, 28В. В одном примере отверждение может происходить при температуре, варьирующей от комнатной температуры (например, примерно 25°С) до примерно 95°С в течение периода времени, варьирующего от примерно 1 миллисекунды до примерно нескольких суток. В другом примере данное время может варьировать от 10 секунд до по меньшей мере 24 часов. В еще одном другом примере данное время может варьировать от примерно 5 минут до примерно 2 часов.
Присоединение полимерного слоя 32 к активированным (в данном примере силанизированным) поверхностям может осуществляться посредством ковалентного связывания. Ковалентное связывание является полезным для сохранения по меньшей мере первого набора праймеров 12А, 12В, 12С, 12D во впадинах 28 В на протяжении всего срока службы образующейся в конечном счете проточной ячейки на протяжении целого ряда применений. Следующее представляет собой некоторые примеры реакций, которые могут происходить между активированными (например, силанизированными) поверхностями и полимерным слоем 32.
Когда силан или производное силана включает норборнен или производное норборнена в качестве ненасыщенной группировки, данный норборнен или производное норборнена может: i) подвергаться реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения с азид/азидной группой PAZAM; ii) подвергаться реакции связывания с тетразиновой группой, присоединенной к PAZAM; подвергаться реакции циклоприсоединения с гидразоновой группой, присоединенной к PAZAM; подвергаться фотоклик-реакции с тетразольной группой, присоединенной к PAZAM; или подвергаться циклоприсоединению с группой нитрилоксида, присоединенного к PAZAM.
Когда силан или производное силана включает циклооктин или производное циклооктина в качестве ненасыщенной группировки, данный циклооктин или производное циклооктина может: i) подвергаться стимулируемой деформацией реакции азид-алкинового 1,3-цикпоприсоединения (SPAAC) с азид/азидо PAZAM, или ii) подвергаться стимулируемой деформацией реакции циклоприсоединения алкин-нитрилоксид с группой нитрилоксида, присоединенного к PAZAM.
Когда силан или производное силана включает бициклононин в качестве ненасыщенной группировки, данный бициклононин может подвергаться аналогичному SPAAC алкиновому циклоприсоединению с азидами или нитрилоксидами, присоединенными к PAZAM, из-за деформации в бициклической кольцевой системе.
В других примерах для активации промежуточных областей 30 и экспонированных поверхностей подложки 52 во впадинах 28А, 28В можно использовать плазменное травление, а не силанизацию. После плазменного травления смесь, содержащую полимер, можно непосредственно наносить центрифугированием (или откладывать другим способом) на поверхности, подвергнутые плазменному травлению, и затем отверждать с образованием полимерного слоя 32. В данном примере плазменное травление может генерировать агент(ты), активирующие поверхность (например, гидроксильные (С-ОН или Si-OH) и/или карбоксильные группы), которые могут приклеивать полимер к промежуточным областям 30 и к экспонированным поверхностям подложки 52 во впадинах 28А, 28В. В данных примерах полимер 26 выбирают таким образом, что он реагирует с поверхностными группами, генерированными плазменным травлением.
Независимо оттого, происходит ли активация посредством силанизации или плазменного травления, затем может осуществляться шлифовка для того, чтобы удалять полимерный слой 32 от активированных промежуточных областей 30. Шлифовка может осуществляться, как описано в данном документе. В некоторых примерах шлифовка также может удалять или может не удалять силан или производное силана, смежное с промежуточными областями 30. Следует понимать, что при полном удалении данных силанизированных частей экспонируется нижележащая структурированная смола 54'.
Как показано на Фиг. 13С, в данном примере способа 100 функционализированные шарики 50 откладываются во впадины 28А. Каждый функционализированный шарик 50 включает сердцевинную структуру 49 и второй набор праймеров 12А, 12В', 12С', 12D', присоединенных на поверхности сердцевинной структуры 49. Данный второй набор праймеров 12А', 12В', 12С', 12D' является другим, чем первый набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D, как описано в данном документе. Можно использовать любые примеры наборов праймеров 12А, 12А или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D'.
Сердцевинная структура 49 может представлять собой любой из примеров, упомянутых в данном документе для шарика/ сердцевинной структуры. В одном примере сердцевинная структура 49 функционализированного шарика 50 выбрана из группы, состоящей из диоксида кремния, суперпарамагнитного материала, полистирола и акрилата. Сердцевинная структура 49 может иметь не его поверхности реакционноспособные группы для ковалентного связывания со вторым набором праймеров 12А', 12В', 12С', 12D'. Примеры таких реакционноспособных групп включают карбоновую кислоту, первичный алифатический амин, ароматический амин, ароматический хлорметил (например, винилбензилхлорид), амид, гидразид, альдегид, гидроксил, тиол и эпокси. Данная(ные) реакционноспособная(ные) группа(пы) может(гут) по своей природе присутствовать на поверхности сердцевинной структуры 49 или может(гут) быть включена(ны) на поверхность сердцевинной структуры 49 посредством любой подходящей методики функционализации (например, химическая реакция, покрытие сердцевинной структуры 49 полимером, содержащим реакционноспособную группу, и т.д.). Сердцевинная структура 49 с присущей(щими) ей реакционноспособной(ными) группой(пами) или добавленной(ными) на нее реакционноспособной(ными) группой(пами), или покрытие определяют область 16.
В примерах, раскрытых в данном документе, в которых используется шарик 50, один набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D или 12А', 12В', 12С', 12D' мог быть функционализирован фосфатной блокирующей группой на 3'-конце, что ингибировало бы любую достройку после посева. Как только происходит первая достройка (с другим набором праймеров 12А', 12В', 12С', 12D' или 12А, 12В, 12С, 12D), фосфатная группа тогда удалялась бы, наряду с любыми нитями, посеянными на набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D или 12А', 12В', 12С', 12D', блокированный фосфатом, и тогда могла бы идти амплификация между двумя группами праймеров 12А, 12В, 12С, 12D и 12А', 12В', 12С', 12D'. Данный способ помог бы уменьшать показатели поликлональности, так как только один набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D или 12А, 12В', 12С', 12D' был бы исходно достраиваемым.
В то время как это не показано на Фиг. 13A-13D, перед отложением функционализированных шариков 50, способ 100 может включать образование функционализированных шариков 50 посредством присоединения второго набора праймеров 12А', 12 В', 12С', 12D' к сердцевинной структуре 49. Функционализация может происходить с использованием любой подходящей методики, включающей взаимодействие праймера, заканчивающегося азидо (например, сложный сукцинимидиловый (NHS) эфир), с гидразином на поверхности сердцевинной структуры 49 или взаимодействие праймера, заканчивающегося алкином, с азидом на поверхности сердцевинной структуры, или взаимодействие праймера, заканчивающегося амино, с активированной карбоксилатной группой или сложным NHS эфиром на поверхности сердцевинной структуры 49, или праймера, заканчивающегося тиолом, с алкилирующим реактивом (например, йодацетамид или малеимид), праймера, заканчивающегося фосфорамидитом, стиоэфиром, или праймера, модифицированного биотином, со стрептавидином на поверхности сердцевинной структуры 49. Некоторые праймеры на основе нуклеиновой кислоты 19, 19', 21, 21' могут быть захвачены на шариках из диоксида кремния в присутствии хаотропного агента (KI, Nl или NaSCN). В качестве одного конкретного примера праймер, заканчивающийся дибензоциклооктином (DBCO, который включает алкин), можно использовать для клик-прививки без участия меди.
Функционализированные шарики 50 могут быть отложены на структурированную смолу 54' с использованием любой подходящей методики. В качестве одного примера, функционализированные шарики 50 могут быть смешаны в жидком носителе (например, воде), который может быть загружен на поверхность структурированной смолы 54'. В другом примере функционализированные шарики 50 могут быть с применением силы вставлены во впадины 28А посредством встряхивания шариков 50 с 50 мкм - 150 мкм стальными шариками в шейкере, который также включает подложку 52, имеющую на ней структурированную смолу 54'. Из-за размера функционализированных шариков 50 и размера впадин 28А и 28В исключение по размеру будет предотвращать попадание функционализированных шариков 50 в меньшие впадины 28В и обеспечит самоорганизацию одного функционализированного шарика 50 в одной впадине 28А. Функционализированные шарики 50 могут быть физически захвачены в соответствующих впадинах 28А. Функционализированные шарики 50, в качестве альтернативы, могут быть химически присоединены к соответствующим впадинам 28А, например, посредством стрептавидиновых/биотиновых линкеров.
Как показано на Фиг. 13D, впадины 28 В могут быть затем функционализированы с использованием первого набора праймеров 12А, 12В, 12С, 12D. Праймеры 18, 18' и 20, 20' могут представлять собой любые из примеров, раскрытых в данном документе, и включают функциональную группу, которая может присоединяться к реакционноспособной группе на полимерном слое 32. Поскольку полимерный слой 32 во впадинах 28А покрывается функционализированными шариками 50, полимерный слой 32 во впадинах 28А не экспонируется, и, таким образом, его реакционноспособные группы не доступны для реакции с первым набором праймеров 12А, 12В, 12С, 12D.
Праймеры 18, 18' и 20, 20' могут представлять собой любые из примеров, изложенных в данном документе, и они отличаются друг от друга и отличаются от праймеров 19, 19' и 21, 21'. Например, если праймеры 21, 19 включают праймеры Р5 и P7U, тогда праймеры 20, 18 могут включать праймеры P5U и Р7. В данном примере первый набор праймеров 12А включает нерасщепляемый первый праймер 18 (например, Р7) и расщепляемый (например, модифицированный урацилом) второй праймер (например, P5U); и второй набор праймеров 12А включает расщепляемый (например, модифицированный урацилом) первый праймер 19 (например, P7U) и нерасщепляемый второй праймер 21 (например, Р5). Как обсуждалось в данном документе, химия наборов праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' является ортогональной, что обеспечивает амплификацию среди обеих популяций праймеров (наборы 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D') и расщепление некоторых генерированных нитей матрицы (например, 42, 46), оставляя одинаковые (прямые или обратные) нити матрицы 40 или 44 в конкретной области 14 или 16. Это обеспечивает одновременное получение различимых сигналов считываемого фрагмента 1 и считываемого фрагмента 2.
Способ прививки можно осуществлять для прививки праймеров 18, 18' и 20, 20' к полимерному слою 32 во впадинах 28 В. В одном примере прививку можно осуществлять посредством проточного отложения (например, с использованием временно связанной крышки), покрытия окунанием, покрытия распылением, распределения в ванночке или другим подходящим спосом, который будет присоединять праймер(ры) 18, 18' и 20, 20' к полимерному слою 32 во впадинах 28В. В каждой из данных типичных методик может использоваться раствор или смесь праймеров, которая может включать праймер(ры), воду, буфер и катализатор.
Покрытие окунанием можно использовать так как функционализированные шарики 50 в данном примере функционализируются до введения во впадины 28А и, таким образом, не реагируют с реактивами, используемыми при окунании. Покрытие окунанием может включать погружение подложки 52, как показано на Фиг. 13С (со структурированной смолой 54' на ней и функционализированными шариками 50 во впадинах 28А), в ряду ванн с контролируемой температурой. В данных ваннах также может контролироваться поток и/или они могут быть покрыты азотным одеялом. Данные ванны могут включать раствор или смесь праймеров. Во всех разных ванных праймер(ры) 18, 18' и 20, 20' присоединяются к реакционноспособной(ным) группе(пам) полимерного слоя 32. В одном примере подложка 52 будет введена в первую ванну, включающую раствор или смесь праймеров, где происходит происходит реакция с присоединением праймера(ров) 18, 18' и 20, 20', и затем она будет перенесена в дополнительные ванны для промывки. Перенос из ванны в ванну может включать применение робота-манипулятора или может осуществляться вручную. При покрытии окунанием также может использоваться система сушки.
Покрытие распылением может осуществляться посредством распыления раствора или смеси праймеров непосредственно на подложку 52, как показано на Фиг. 13С (со структурированной смолой 54' на ней и функционализированными шариками 50 во впадинах 28А). Покрытая распылением кристаллическая пластина может инкубироваться в течение времени, варьирующего от примерно 4 минут до примерно 60 минут при температуре, варьирующей от примерно 0°С до примерно 70°С. После инкубации раствор или смесь праймеров можно разбавлять и удалять с использованием, например, центрифуги для нанесения покрытия.
Распределение в ванночке можно осуществлять согласно способу опускания ванну и отделения центрифугированием и, таким образом, может осуществляться в центрифуге для нанесения покрытия. Раствор или смесь праймеров можно наносить (вручную или посредством автоматизированного способа) на подложку 52, как показано на Фиг. 13С (со структурированной смолой 54' на ней и функционализированными шариками 50 во впадинах 28А). Наносимый раствор или смесь праймеров может наноситься или распределяться по всей поверхности, включая функционализированные шарики 50 и промежуточные области 30. Субстрат, покрытый праймерами, может инкубироваться в течение времени, варьирующего от примерно 2 минут до примерно 60 минут при температуре, варьирующей от примерно 0°С до примерно 80°С. После инкубации раствор или смесь праймеров можно разводить и удалять с использованием, например, центрифуги для нанесения покрытия.
При любом из способов прививки праймеры 18, 18' и 20, 20' взаимодействуют с реакционноспособными группами экспонированного полимерного слоя 32 во впадинах 28 В и не имеют аффинности в отношении функционализированных шариков 50 или промежуточных областей 30 структурированной смолы 54'. В силу этого праймеры 18, 18' и 20, 20' селективно прививаются к полимерному слою 32 во впадинах 28В.
Фиг. 14 представляет собой вид поперечного среза части проточной ячейки 10А, показанной на Фиг. 13D. Проточная ячейка 10А включает подложку 52; структурированную смолу 54' на подложке 52, структурированную смолу 54', включающую первые впадины 28В и вторые впадины 28А, разделенные промежуточными областями 30, причем первые впадины 28В имеют меньшие размеры отверстия, чем вторые впадины 28А; первый набор праймеров 12А, 12В, 12С или 12D (включающий праймеры 18, 18' и 20, 20'), присоединенные в по меньшей мере некоторых из первых впадин 28В; и функционализированный шарик 50, соответственно, расположенный в по меньшей мере некоторых из вторых впадин 28А, причем данный функционализированный шарик 50 включает второй набор праймеров 12А', 12В', 12С или 12D' (включающий праймеры 19, 19' и 21, 21'), присоединенных на поверхности сердцевинной структуры 49, где второй набор праймеров 12А', 12В', 12С или 12D' является другим, чем первый набор праймеров 12А, 12В, 12С или 12D. В примере, показанном на Фиг. 13D и 14, полимерный слой 32 присутствует в первых впадинах 28 В и во вторых впадинах 28А, и первый набор праймеров 12А, 12В, 12С или 12D присоединен к полимерному слою 32 в по меньшей мере некоторых из первых впадин 28 В. Кроме того, в примере, показанном на Фиг. 13D и 14, функционализированные шарики 50 располагаются на полимерном слое 32 в по меньшей мере некоторых из вторых впадин 28А.
Теперь ссылаясь на Фиг. 15A-15D, показан другой пример способа 100, включающего впадины 28А, 28В. На Фиг. 15А показана структурированная смола 54', включающая большие впадины 28А и меньшие впадины 28 В. Глубина впадин 28А и 28В опущена для ясности.
На Фиг. 15В показан полимерный слой 32 в каждой из впадин 28А и 28В. Полимерный слой 32 может быть селективно нанесен, как описано в данном документе, что может включать активирование промежуточных областей 30 и экспонированных поверхностей во впадинах 28А, 28В, отложение полимерного слоя 32 на активированных промежуточных областях 30 и во впадинах 28А, 28В и удаление полимерного слоя 32 из промежуточных областей 30.
В данном примере, как показано на Фиг. 15С, набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D (включающий праймеры 18, 18' и 20, 20') затем прививается к полимерному слою 32 в каждой из впадин 28А, 28В. Поскольку функционализированные шарики 50 не были введены, экспонируется полимерный слой 32 в каждой из впадин 28А, 28В, и, таким образом, его реакционноспособные группы доступны для реакции с первым набором праймеров 12А, 12В, 12С, 12D. Прививка может осуществляться с использованием любой из методик, описанных со ссылкой на Фиг. 13D. Поскольку полимерный слой 32 экспонируется в каждой из впадин 28А, 28В, праймеры 18, 18' и 20, 20' могут быть привиты в каждой из впадин 28А, 28В.
Как показано на Фиг. 15D, функционализированные шарики 50 могут быть затем введены во впадины 28А (имеющие полимерный слой 32 и набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D в нем). Функционализированные шарики 50 могут быть отложены на структурированную смолу 54' с использованием любой подходящей методики. Из-за размера функционализированных шариков 50 и размера впадин 28А и 28В, исключение по размеру будет предотвращать попадание функционализированных шариков 50 в меньшие впадины 28В и будет обеспечивать то, что один функционализированный шарик 50 подвергается самоорганизации в одной впадине 28А. В данном примере функционализированные шарики 50 могут быть физически захваченными в соответствующих впадинах 28А. В качестве альтернативы, в данном примере функционализированные шарики 50 могут быть химически присоединенными к соответствующим впадинам 28А, например, посредством стрептавидин/биотиновых линкеров.
Фиг. 16 представляет собой вид поперечного среза части проточной ячейки 10В, показанной на Фиг. 15D. Проточная ячейка 10В включает подложку 52; структурированную смолу 54' на подложке 52, причем данная структурированная смола 54' включает первые впадины 28В и вторые впадины 28А, разделенные промежуточными областями 30, причем первые впадины 28В имеют меньшие размеры отверстия, чем вторые впадины 28А; первый набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D (включающий праймеры 18, 18' и 20, 20'), присоединенных в по меньшей мере некоторых из первых впадин 28В; и функционализированный шарик 50, соответственно, расположенный в по меньшей мере некоторых из вторых впадин 28А, причем данный функционализированный шарик 50 включает второй набор праймеров 12А', 12В', 12С' или 12D' (включающий праймеры 19, 19' и 21, 21'), присоединеных на поверхности структуры ядра 49, где второй набор праймеров 12А', 12В', 12С' или 12D' является другим, чем первый набор праймеров 12А, 12В, 12С или 12D. В примере, показанном на Фиг. 15D и 16, полимерный слой 32 присутствует в первых впадинах 28В и во вторых впадинах 28А, и первый набор праймеров 12А, 12В, 12С или 12D присоединен к полимерному слою 32 в первых впадинах 28В и во вторых впадинах 28А. В данном примере тогда функционализированный шарик 50 располагается на первом наборе праймеров 12А, 12В, 12С, 12D (включающем праймеры 18, 18' и 20, 20') в по меньшей мере некоторых из вторых впадин 28А.
Теперь ссылаясь на Фиг. 17A-17D показан пример способа 100, включающего впадины 28С.
На Фиг. 17А показана структурированная смола 54'', включающая впадины 28С. Каждая из впадин 28С включает большую часть 34 и меньшую часть 34'. Глубина впадин 28С (как показано на Фиг. 11D) опущена для ясности.
На Фиг. 17В показан полимерный слой 32 в каждой из впадин 28С. Как показано на Фиг. 17 В, и большая часть 34, и меньшая часть 34' каждой впадины 28С имеет полимерный слой 32, нанесенный на нее. Полимерный слой 32 может быть селективно нанесен, как описано в данном документе, что, в одном примере, может включать активирование промежуточных областей 30 и экспонированных поверхностей во впадинах 28С, отложение полимерного слоя 32 на активированных промежуточных областях 30 и во впадинах 28С и удаление полимерного слоя 32 с промежуточных областей 30.
Как показано на Фиг. 17С, в данном примере способа 100 функционализированные шарики 50 откладываются с большие части 34 впадин 28С. В данном примере можно использовать любой из функционализированных шариков 50, описанных в данном документе.
Функционализированные шарики 50 (включающие праймеры 19, 19' и 21, 21') можно откладывать на структурированную смолу 54'' с использованием любой подходящей методики, такой как методики, описанные в данном документе. Из-за размера функционализированных шариков 50 и размера частей 34 и 34', исключение по размеру будет предотвращать попадание функционализированных шариков 50 в меньшие части 34' и будет обеспечивать то, что один функционализированный шарик 50 подвергается самоорганизации в одной большей части 34 каждой впадины 28С. В данном примере функционализированные шарики 50 могут быть физически захваченными в соответствующих больших частях 34 или могут быть химически присоединенными к соответствующим большим частям 34, например, посредством стрептавидин/биотиновых линкеров.
Как показано на Фиг. 17D, меньшие части 34' впадин 28С могут быть затем функционализированы первым набором праймеров 12А, 12В, 12С, 12D. Можно использовать любые примеры праймеров 18, 18' и 20, 20', описанных в данном документе, при условии, что они выбраны так, чтобы быть отличными и ортогональными по отношению к праймерам 19, 19' и 21, 21' функционализированных шариков 50. В данном примере полимерный слой 32 в больших частях 34 впадин 28С покрывается функционализированными шариками 50, и, таким образом, полимерный слой 32 в больших частях 34 впадин 28С не экспонируется. В силу этого, реакционноспособные группы данного полимера не доступны для реакции с первым набором праймеров 12А, 12В, 12С, 12D. Реакционноспособные группы полимера в меньших частях 34' остаются экспонированными, и, таким образом, доступными для реакции с первым набором праймеров 12А, 12В, 12С, 12D. Прививка праймеров 18, 18' и 20, 20' к полимерному слою 32 в меньших частях 34' может осуществляться с использованием любой из методик, описанных со ссылкой на Фиг. 13D.
Фиг. 18 представляет собой вид поперечного среза части проточной ячейки ЮС, показанной на Фиг. 17D. Проточная ячейка 10С включает подложку 52; структурированную смолу 54" на подложке 52, причем структурированная смола 54'' включает впадины 28С, разделенные промежуточными областями 30; первый набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D (включающий праймеры 18, 18' и 20, 20'), присоединенных к по меньшей мере некоторым из впадин 28С; и функционализированные шарики 50, расположенные в по меньшей мере некоторых из впадин 28С, таким образом, что экспонируются по меньшей мере некоторые праймеры 18, 18' и 20, 20' первого набора праймеров 12А, 12В, 12С, 12D, причем функционализированные шарики 50 включают второй набор праймеров 12А', 12В', 12С', 12D', присоединенных к поверхности сердцевинной структуры 49, где второй набор праймеров 12А', 12В', 12С', 12D' является другим, чем первый набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D. В примере, показанном на Фиг. 17D и 18, каждая из впадин 28С включает первую часть 34 с первым размером отверстия, который больше чем или равен диаметру функционализированного шарика 50, и вторую часть 34' со вторым размером отверстия, который меньше, чем диаметр функционализированного шарика 50; и функционализированный шарик 50 располагается в первой части 34 каждой из по меньшей мере некоторых впадин 28С. Также в примере, показанном на Фиг. 17D и 18, полимерный слой 32 присутствует во впадинах 28С, и первый набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D присоединен к части полимерного слоя 32, не занятой функционализированным шариком 50 (т.е. к части полимерного слоя 32 в меньшей части 34' впадины 28С).
Теперь со ссылкой на Фиг. 19A-19D показан другой пример способа 100, включающего впадины 28С. Каждая из впадин 28С включает большую часть 34 и меньшую часть 34'. Глубина впадин 28С (как показано на Фиг. 11D) опущена для ясности.
На Фиг. 19В показан полимерный слой 32 в каждой из впадин 28С. Как показано на Фиг. 19 В, и большая часть 34, и меньшая часть 34' каждой впадины 28С имеет полимерный слой 32, нанесенный на нее. Полимерный слой 32 может быть селективно нанесен, как описано в данном документе, что, в данном примере может включать активирование промежуточных областей 30 и экспонированных поверхностей во впадинах 28С, отложение полимерного слоя 32 на активированные промежуточные области 30 и впадины 28С и удаление полимерного слоя 32 с промежуточных областей 30.
В данном примере, как показано на Фиг. 19С, набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D (включающий праймеры 18, 18' и 20, 20') затем прививается на полимерный слой 32 в каждой из впадин 28С. Поскольку функционализированные шарики 50 не были введены, полимерный слой 32 в каждой части 34, 34' впадин 28С экспонируется, и, таким образом, его реакционноспособные группы доступны для реакции с первым набором праймеров 12А, 12В, 12С, 12D. Прививка может осуществляться с использованием любой из методик, описанных со ссылкой на Фиг. 13D. Поскольку полимерный слой 32 экспонируется в каждой части 34, 34' впадин 28С, праймеры 18, 18' и 20, 20' могут быть привиты в каждую часть 34, 34'.
Как показано на Фиг. 19D, функционализированные шарики 50 могут быть затем введены в большие части 34 впадин 28С (имеющих в них полимерный слой 32 и набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D). Функционализированные шарики 50 могут быть отложены на структурированную смолу 54" с использованием любой подходящей методики. Из-за размера функционализированных шариков 50 и размера частей 34 и 34', исключение по размеру будет предотвращать попадание функционализированных шариков 50 в меньшие части 34' и будет обеспечивать то, что один функционализированный шарик 50 подвергается самоорганизации в одной большей части 34. В данном примере функционализированные шарики 50 могут быть физически захваченными в соответствующих больших частях 34 или могут быть химически присоединенными к соответствующим большим частям 34, например, посредством стрептавидин/биотиновых линкеров.
Фиг. 20 представляет собой вид поперечного среза части проточной ячейки 10D, показанной на Фиг. 19D. Проточная ячейка 10D включает подложку 52; структурированную смолу 54" на подложке 52, причем структурированная смола 54'' включает впадины 28С, разделенные промежуточными областями 30; первый набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D (включающий праймеры 18, 18' и 20, 20'), присоединенных к по меньшей мере некоторым из впадин 28С; и функционализированный шарик 50, расположенный в по меньшей мере некоторых из впадин 28С, таким образом, что экспонируются по меньшей мере некоторые праймеры 18, 18' и 20, 20' первого набора праймеров 12А, 12В, 12С, 12D, причем функционализированный шарик 50 включает второй набор праймеров 12А', 12В', 12С' или 12D', присоединенных к поверхности сердцевинной структуры 49, где второй набор праймеров 12А', 12В', 12С' или 12D' является другим, чем первый набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D. В примере, показанном на Фиг. 19D и 20, каждая из впадин 28С включает первую часть 34 с первым размером отверстия, который больше чем или равен диаметру функционализированного шарика 50, и вторую часть 34' со вторым размером отверстия, который меньше, чем диаметр функционализированного шарика 50; и функционализированный шарик 50 располагается в первой части 34 каждой из по меньшей мере некоторых впадин 28С. Также в примере, показанном на Фиг. 19D и 20, полимерный слой 32 присутствует во впадинах 28С, первый набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D присоединен к полимерному слою 32 во впадинах 28С, и функционализированный шарик 50 располагается на некоторых из праймеров 18, 18' и 20, 20' первого набора праймеров 12А, 12 В, 12С, 12D (т.е. на праймерах 18, 18' и 20, 20', присоединенных к полимерному слою 32 в большей части 34 впадины 28С).
Типичные проточные ячейки 10А, 10В, 10С, 10D показаны без связанной с ними крышки. В то время как это не показано, проточные ячейки 10А, 10В, 10С, 10D могут иметь крышку, связанную с по меньшей мере частью промежуточной области 30, как описано. В некоторых примерах данная крышка может быть связана после образования проточной ячейки 10А, 10В, 10С, 10D.
Проточные ячейки 10А, 10В, 10С, 10D можно использовать в целом ряде подходов или технологий секвенирования, включающих методики, часто именуемые секвенированием посредством синтеза (SBS), секвенированием с циклическим чипом, секвенированием посредством лигирования, пиросеквенированием и так далее. Водном конкретном примере проточные ячейки 10А, 10В, 10С, 10D могут быть подвергнуты воздействию матричной жидкости/смеси, и может осуществляться амплификация, как описано в данном документе, с получением нити нерасщепляемой первой матрицы 40, нити расщепляемой первой матрицы 46, нити нерасщепляемой второй матрицы 44, нити расщепляемой второй матрицы 42. Может проводиться расщепление, и затем может осуществляться раскрытый в данном документе способ одновременного парно-концевого секвенирования.
С использованием любой из методике проточными ячейками 10А, 10В, 10С, 10D амплификация и секвенирование будут ограничиваться во впадинах 28А и 28В или 28С, так как наборы праймеров 12А, 12А или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D' присутствуют во впадинах 28А или 28В, или на частях 34 или 34' впадины 28С, а не на промежуточных областях 30.
Проточная ячейка на основе блок-сополимера
Некоторые примеры проточной ячейки, раскрытой в данном документе, включают блок-сополимер, который используется с многослойным субстратом, включающим структурированную смолу. Данные примеры описываются со ссылкой на Фиг. 21 - Фиг. 25В.
В данных примерах структурированная смола (например, 54') может быть изготовлена с использованием подхода «сверху вниз», такого как наноимпринтная литография. Подходы сверху вниз могут генерировать группу впадин 28 с высокой плотностью, малым шагом и малыми наноэлементами. При объединении с направленной самоорганизацией блок-сополимера, которая представляет собой подход «снизу вверх», во впадинах 28 могут образоваться даже меньшие элементы (имеющие домены сублитографического размера). Маленькие элементы могут быть желательными, так как может быть получена более высокая плотность кластеров. Более высокая плотность кластеров означает то, что больше оснований может считываться с данной единицы площади, что увеличивает генетический выход от структурированной проточной ячейки. Кроме того, непривитые области (например, промежуточные области 30) окружают маленькие элементы, что обеспечивает большую доступность праймеров, привитых на блок-сополимер. В силу этого может увеличиваться использование праймеров.
В данных примерах блок-сополимер подвергается самоорганизации во впадинах 28 структурированной смолы, а не на промежуточных областях 30 между впадинами 28. В силу этого не участвует дополнительная обработка для удаления вещества из промежуточных областей 30.
Данные примеры проточной ячейки включают подложку 52; структурированную смолу на подложке 52, включающую впадины 28, разделенные промежуточными областями 30; блок-сополимер на структурированной смоле во впадинах 28, причем каждый блок данного блок-сополимера имеет блокспецифичную функциональную группу, которая отличается от блокспецифичной функциональной группы каждого другого блока данного блок-сополимера; и праймер, присоединенный к блокспецифичной функциональной группе по меньшей мере одного из блоков. В некоторых примерах праймеры включают нерасщепляемые праймеры 18, 18' и 21, 21', присоединенные к одному блоку данного блок-сополимера, и данная проточная ячейка может использоваться в методиках парно-концевого секвенирования, которые включают последовательное секвенирование прямых нитей матрицы и затем обратных нитей матрицы, которые присоединяются к одному блоку. В других примерах соответствующие наборы праймеров 12А, 12А' или 12В, 12В', или 12С, 12С', или 12D, 12D', раскрытые в данном документе, присоединяются к разным блокам блок-сополимера. В данном примере один блок включает праймеры 18, 18' и 20, 20', и другой блок включает праймеры 19, 19' и 21, 21'. Данный пример проточной ячейки может использоваться в методиках одновременного парно-концевого секвенирования, раскрытых в данном документе.
Примеры частей проточных ячеек показаны на Фиг. 22Е и 23 и будут описаны в данном документе далее.
Один пример способа 200 получения примера проточной ячейки показан на Фиг. 21. Как показано на Фиг. 21, способ 100 включает структурирование смолы с образованием структурированной смолы, включающей впадины 28, разделенные промежуточными областями 30 (ссылочное числовое значение 202); введение раствора, включающего блок-сополимер, на данную структурированную смолу, причем каждый блок данного блок-сополимера имеет блокспецифичную функциональную группу, которая отличается от блокспецифичной функциональной группы каждого другого блока данного блок-сополимера (ссылочное числовое значение 204); воздействие на данный раствор отжига парами растворителя, посредством чего происходит разделение фаз и самоорганизация блок-сополимера во впадинах 28 (ссылочное числовое значение 206); и прививку праймера к блокспецифичной функциональной группе по меньшей мере одного из блоков (ссылочное числовое значение 208). Данный способ 200 будет дополнительно описан со ссылкой на Фиг. 22А- 22Е.
На Фиг. 22А показана подложка 52, и на Фиг. 22В показана смола 54А, отложенная на подложку 52. Можно использовать любые примеры подложки 52, описанной в данном документе. С блок-сополимером смола 54А способная иметь впадины 28 (Фиг. 22С), определенные в ней, и также способна действовать как направляющая матрица для последовательно отложенного блок-сополимера 58 («ВСР» от Фиг. 22С до 22D). В силу этого, можно использовать любую смолу 54А, которая может быть структурирована с использованием фотолитографии, наноимпринтной литографии, методик штамповки, методик выдавливания, методик отливки, методик микротравления, методик печати и т.д. Кроме того, смола 54А, после структурирования (т.е. структурированная смола 54А'), должна иметь поверхностную энергию, которая находится в пределах того же самого интервала, что и у блок-сополимера 58, который следует нанести на нее. В одном примере каждый из смолы 54А/структурированной смолы 54А' и блок-сополимера 58 имеет поверхностную энергию в пределах интервала от примерно 25 мН/м до примерно 50 мН/м.
Некоторые примеры смол 54А, которые могут быть структурированы и действуют как направляющие матрицы, выбирают из группы, состоящей из смолы на основе полиэдрической олигомерной силсесквиоксановой смолы (POSS), эпоксисмолы, поли(этиленгликолевой) смолы, полиэфирной смолы, акриловой смолы, акрилатной смолы, метакрилатной смолы и их комбинаций. В то время как было предложено несколько примеров, считается, что можно использовать любую смолу, которая может быть подвергнута радикальному отверждению. Для смолы 54А можно использовать любую из смол 54, раскрытых в данном документе.
Как показано от Фиг. 22А до Фиг. 22В, смола 54А откладывается на подложку 52. В одном примере способа 200 отложение смолы 44 включает химическое осаждение из паровой фазы, покрытие погружением, покрытие окунанием, покрытие методом центрифугирования, покрытие распылением, распределение в ванночке, ультразвуковое покрытие распылением, покрытие, наносимое ножевым устройством, аэрозольную печать, трафаретную печать, микроконтактную печать или струйную печать.
Отложенная смола 54 затем структурируется с использованием любой из методик структурирования, упомянутых в данном документе. В примере, показанном на Фиг. 22А - Фиг. 22В, для структурирования смолы 54 используется наноимпринтная литография. После отложения смолы 54 она может подвергаться термообработке при низкой температуре для удаления избытка растворителя. Форма наноимпринтной литографии или рабочий штамп 56 прижимается к слою смолы 54 с созданием отпечатка на смоле 54. Другими словами, смола 54 вдавливается или перфорируется выступами рабочего штампа 56. Смола 54 может быть затем отверждена при нахождении рабочего штампа 56 в рабочем положении. Отверждение может осуществляться воздействием актиничного излучения, такого как излучение видимого света или ультрафиолетовое (УФ) излучение, или излучение с длиной волны, варьирующей от примерно 240 нм до 380 нм при использовании фоторезиста; или воздействием тепла при использовании термоотверждаемого резиста. Отверждение может стимулировать полимеризацию и/или поперечное связывание. В качестве примера, отверждение может включать много стадий, включая термообработку при низкой температуре (например, для удаления растворителя(лей)) и термообработку при высокой температуре. Термообработка при низкой температуре может происходить при более низкой температуре, варьирующей от примерно 50°С до примерно 150°С. Продолжительность термообработки при высокой температуре может составлять от примерно 5 секунд до примерно 10 минут при температуре, варьирующей от примерно 100°С до примерно 300°С. Примеры устройств, которые можно использовать для термообработки при низкой температуре и/или термообработки при высокой температуре, включают плитку, печь и т.д.
После отверждения рабочий штамп 56 высвобождается. Это создает топографические элементы, т.е. впадины 16 в смоле 54. Как показано на Фиг. 22С, смола 54, имеющая впадины 28, определенные в ней, называется структурированной смолой 54'. Структурированная смола 54' может подвергаться дальнейшей термообработке при высокой температуре для завершения отверждения и для фиксации отпечетанной топографии. В некоторых примерах термообработку при высокой температуре можно проводить при температуре, варьирующей от примерно 60°С до примерно 300°С.
Как показано на Фиг. 22С, структурированная смола 54' включает впадины 28, определенные в ней, и промежуточные области 30, разделяющие смежные впадины 28. В примерах, раскрытых в данном документе, впадины 28 становятся функционализированными блок-сополимером (ВСР) 58 и праймерами 18, 21 (Фиг. 22F), тогда как части промежуточных областей 20 могут использоваться для связывания, но не будут иметь блок-сополимера 58 и праймера(ров) 18, 21.
Как показано на Фиг. 22С, структурированная смола 54' может затем подвергаться воздействию процессов для образования во впадинах 28 блок-сополимера 58 с разделенными фазами (включающими блоки 58А и 58В). Как показано на Фиг. 22С - Фиг. 22D, раствор блок-сополимера 58 наносится на структурированную смолу 54', где каждый блок 58А, 58В блок-сополимера 58 имеет блокспецифичную функциональную группу, которая отличается от блокспецифичной функциональной группы каждого другого блока 58В, 58А блок-сополимера 58. Теперь будут описаны разные примеры блок-сополимера 58.
Блок-сополимер 58 представляет собой гетерополимер, составленный из по меньшей мере двух разных мономеров. В одном примере блок-сополимер 58 включает первый блок 58А, включающий мономер, имеющий функциональную группу прививки праймера в качестве его блокспецифичной функциональной группы, и второй блок 58В, включающий мономер, который служит для корректировки параметра взаимодействия для управления разделением фаз первого и второго блоков. В данном примере мономер второго блока 58В также может включать блокспецифичную функциональную группу, которая может взаимодействовать со (и, таким образом, присоединяться к) структурированной смолой 54'. Данная блокспецифичная функциональная группа, которая может взаимодействовать со (и, таким образом, присоединяться к) структурированной смоле 54', именуется в данном документе функциональной группой для присоединения к смоле. Следует понимать то, что обозначения первый и второй не указывают какого-либо конкретного порядка в блок-сополимере, и что любой блок может включать функциональную группу прививки праймера или функциональную группу для корректировки параметра взаимодействия. Например, первый блок 58А может включать мономер, имеющий блокспецифичную функциональную группу, которая способна прививать праймер (например, 18, 21), и которая способна корректировать параметр взаимодействия для управления разделением фаз первого и второго блоков, и второй блок 58В может включать мономер, имеющий функциональную группу для присоединения к смоле. В качестве другого примера, первый блок 58А может включать мономер, имеющий блокспецифичную функциональную группу, которая способна прививать праймер (например, 18, 21) и присоединяться к смоле 54', и что второй блок 58 В может включать мономер, который способен корректировать параметр взаимодействия для управления разделением фаз первого и второго блоков.
В любых примерах блок-сополимера 58, раскрытых в данном документе, функциональная группа прививки праймера выбрана из группы, состоящей из азида/азидо, факультативно замещенного амино, факультативно замещенного алкенила, альдегида, факультативно замещенного гидразона, факультативно замещенного гидразина, карбоксила, гидрокси, факультативно замещенного тетразола, факультативно замещенного тетразина, нитрилоксида, нитрона, тиола и их комбинаций. При включении в один блок многих функциональных групп прививки праймера к одному блоку можно присоединять разные праймеры. При включении в разные блоки разных функциональных групп прививки праймера к разным блокам можно присоединять разные праймеры.
Функциональная группа прививки праймера может быть способна взаимодействовать с функциональной группой, присоединенной к 5'-концу праймера. Например, праймер, заканчивающийся бицикло[6.1.0]нон-4-ином (BCN), может быть захвачен азидной функциональной группой прививки праймера блоксоолимера 58 посредством стимулируемой деформацией клик-химии без участия катализатора. В качестве другого примера, праймер, заканчивающийся алкином, может быть захвачен азидной функциональной группой прививки праймера блок-сополимера 58 посредством катализируемой медью клик-химии. В качестве еще одного другого примера, праймер, заканчивающийся норборненом, может подвергаться стимулируемой деформацией кольца клик-реакции без участия катализатора с тетразиновой функциональной группой прививки праймера блок-сополимера 58.
В одном примере функциональная группа прививки праймера представляет собой азидогруппу, присоединенную к акриламидному мономеру. Примером данного мономера является азидоацетамидопентилакриламид. В другом примере функциональная группа прививки праймера представляет собой азидогруппу, присоединенную к мономеру, содержащему бензол. Два примера данного мономера включают бензилазид и стирол, функционализированный азидом (например,
3
3
2
В любых примерах блок-сополимера 58, раскрытого в данном документе, функциональная группа для присоединения к смоле выбрана из группы, состоящей из аминогруппы, спиртовой группы, арильной группы и заряженной группы. Подходящие анионные заряженные группы включают сульфаты или карбоновые кислоты. Подходящие катионные заряженные группы включают аммоний, гуанидиний или имидазолий. В других примерах функциональная группа для присоединения к смоле может представлять собой трифторметильную группу (-CF). В еще одном другом примере блок-сополимера 18, раскрытого в данном документе, мономер, включающий функциональную группу для присоединения к смоле, может представлять собой силоксановый мономер, такой как SiO(CH).
В одном примере функциональная группа присоединения к смоле представляет собой аминогруппу, присоединенную к акриламидному мономеру. Примером данного мономера является . В данном примере этильный мостик (между азотами) может быть заменен пропильным мостиком или любым другим мостиком, длина которого не мешает желательной функции данного мономера. В одном примере длина мостика может составлять вплоть до 16 атомов углерода. В другом примере функциональная группа для присоединения к смоле представляет собой арильную группу стирольного мономера. Другие группы для присоединения к смоле (для ковалентного присоединения) зависят от того, как функционализирована смола 14. Например, если данная смола включает эпоксигруппы, подходящей функциональной группой для присоединения к смоле может быть амино- или спиртовая группа.
Некоторые примеры блок-сополимера 58 включают функциональную группу прививки праймера и функциональную группу для присоединения к смоле. Данные группы могут зависеть, соответственно и частично, от праймера (например, 18, 21 или 18, 20, или 18', 20', или 19, 21, или 19', 21'), подлежащего прививке, и от структурированной смолы 54', которую следует присоединить к блок-сополимеру 58. Следующее представляет собой некоторые примеры блок-сополимеров 58, которые включают и функциональную группу прививки праймера, и функциональную группу для присоединения к смоле.
В одном примере, где структурированная смола 54' представляет собой эпокси POSS, блок-сополимер 58 включает первый блок 58А, включающий акриламидный мономер, имеющий аминогруппу в качестве его блокспецифичной функциональной группы, и второй блок 58 В, включающий азидоацетамидопентилакриламидный мономер, имеющий азидогруппу в качестве его блокспецифичной функциональной группы. В данном примере первый блок 58А включает функциональную группу для присоединения к смоле, и второй блок 58В включает функциональную группу прививки праймера, хотя данный второй блок 58В также может функционировать в качестве функциональной группы для присоединения к смоле. Конкретным примером данного блок-сополимера 18 является:
где R представляет собой атом водорода или концевую группу поли меринициирующего соединения, n варьирует от 1 до 10000, и m варьирует от 1 до 10000. Примеры концевой группы полимер-инициирующего соединения, включают концевую группу обратимого присоединения-переноса с фрагментацией цепи (RAFT), концевую группу радикальной полимеризации с переносом атома (ATRP), концевую группу радикальной полимеризации, опосредованной нитроксидом (NMP), тетраметилэтилендиаминовую (TEMED) концевую группу или концевую группу свободнорадикальной полимеризации (FRP). В другом примере n и m независимо варьируют от примерно 1 до примерно 1000.
В другом примере, где структурированная смола 54' представляет собой эпокси POSS, блок-сополимер 58 включает первый блок 58А, включающий стирольный мономер, имеющий арильную группу в качестве его блокспецифичной функциональной группы, и второй блок 58 В, включающий стирол, функционализированный азидом, имеющий азидо в качестве его блокспецифичной функциональной группы. В данном примере первый блок 58А включает функциональную группу для присоединения к смоле, и второй блок 58В включает функциональную группу прививки праймера, хотя данный второй блок 58В также может функционировать в качестве функциональной группы для присоединения к смоле. Конкретным примером данного блок-сополимера 18 является:
где n варьирует от 1 до 10000, и m варьирует от 1 до 10000. В другом примере n и m независимо варьируют от примерно 1 до примерно 1000.
В еще одном другом примере, где структурированная смола 54' представляет собой эпокси POSS, блок-сополимер 58 включает первый блок 58А, включающий стирол, функционализированный азидом, в качестве его блокспецифичной функциональной группы, и второй блок 58В, включающий силоксановый мономер, имеющий силоксан в качестве его блокспецифичной функциональной группы. В данном примере первый блок 58А включает функциональную группу прививки праймера, хотя данный первый блок 58А также может функционировать в качестве функциональной группы для присоединения к смоле, и второй блок 58В включает функциональную группу для присоединения к смоле. Конкретным примером данного блок-сополимера 58 является:
где n варьирует от 1 до 10000, и m варьирует от 1 до 10000. В другом примере n и m независимо варьируют от примерно 1 до примерно 1000.
В одном примере, где структурированная смола 54' представляет собой аморфный фторполимер (такой как CYTOP), блок-сополимер 58 включает первый блок 58А, включающий мономер, имеющий трифторметильную группу в качестве его блокспецифичной функциональной группы, и второй блок 58В, включающий мономер, имеющий функциональную группу прививки праймера и присоединения к смоле в качестве его блокспецифичной функциональной группы. В одном примере данного блок-сополимера 58 второй блок 58В включает азидоацетамидопентилакриламидный мономер, и первый блок 58А (который в данном примере может представлять собой функциональную группу, изменяющую поверхностную энергию) может представлять собой фторированный акрилат или фторированный акриламид. Конкретные примеры данного блок-сополимера 18 имеют структуру:
где n варьирует от 1 до 10000, и m варьирует от 1 до 10000. В другом примере n и m независимо варьируют от примерно 1 до примерно 1000. В другом примере данного блок-сополимера 58 (который подходит для применения с аморфным фторполимером) второй блок 58В включает стирол, функционализированный азидом, и первый блок 58А (в данном примере функциональная группа, изменяющая поверхностную энергию) может представлять собой трифторэтилакрилат. Конкретный пример данного блок-сополимера 58 имеет следующую структуру:
где n варьирует от 1 до 10000, и m варьирует от 1 до 10000. В другом примере n и m независимо варьируют от примерно 1 до примерно 1000.
Кроме того, следует понимать то, что блок-сополимер 58, раскрытый в данном документе, также может включать один или более чем один другой мономер, который не препятствует соответствующим функциям блоков 58А и/или 58В (например, прививка праймера, присоединение к смоле, разделение фаз и т.д.). Дополнительный(ные) мономер(ры) (и, в частности, блокспецифичная функциональная группа дополнительного(ных) мономе ра(ров)) дополнительного(ных) блока(ков) может(гут) быть выбрана(ны) для влияния на/изменения свободной энергии поверхности блок-сополимера 58, для влияния на стабильность блок-сополимера 58, для присоединения другого праймера и/или для присоединения фермента. Примеры мономеров, которые могут влиять на/изменять свободную энергию поверхности, включают трифторметильную группу акрилатного мономера (например, трифторэтилакрилат или трифторэтилметакрилат) или трифторэтилакриламид. Примеры мономеров, которые могут присоединять фермент, могут включать следующие блокспечифичные функциональные группы: тиолы, амины или спирты, которые могут реагировать с ферментами, функционализированными N-гидроксисукцинимидом (NHS). Следует понимать то, что для присоединения ферментов или других биомолекул можно использовать другие функциональные группы. В силу этого, некоторые примеры блок-сополимера 58 представляют собой терполимеры, которые будут обсуждаться с большими подробностями со ссылкой на Фиг. 24А и Фиг. 24С.
Как упомянуто выше в способе 200, раствор блок-сополимера 58 вводится на структурированную смолу 54' (как показано на Фиг. 22C-22D). Данный раствор может представлять собой разбавленный раствор (например, с содержанием, варьирующим от примерно 0,01% масс, до примерно 10% масс.) блок-сополимера 58 в подходящем растворителе, таком как толуол. Раствор блок-сополимера 58 может быть нанесен с использованием любой подходящей методики, такой как покрытие центрифугированием и т.д.
Для того чтобы блок-сополимер 58 подвергался самоорганизации и подвергался разделению микрофаз на топологически структурированной подложке (например, структурированной смоле 54'), раствор, включающий данный блок-сополимер, должен иметь высокий параметр взаимодействия Хаггинса с нижележащей структурированной смолой 54'. В одном примере раствор блок-сополимера 58 имеет параметр взаимодействия Флори-Хаггинса, варьирующий от примерно 0,04 до примерно 0,30. В другом примере раствор блок-сополимера 58 имеет параметр взаимодействия Флори-Хаггинса примерно 0,26.
Блок-сополимер 58 в том виде, в котором он отложен на структурированную смолу 54', затем подвергается отжигу растворителем. Пары растворителя, температура и время, используемые в отжиге растворителем, могут зависеть от используемого блок-сополимера 58 и, в частности, от условий, при которых блок-сополимер 58 подвергается самоорганизации во впадинах 28 и разделяются микрофазы в соответствующие блоки 58А и 58В. В одном примере паром растворителя является толуол, температурой является комнатная температура (например, от примерно 14°С до примерно 25°С), и время составляет примерно 3 часа. Следует понимать то, что выбор растворителя, времени отжига и температуры отжига зависят от блок-сополимера. Некоторыми подходящими растворителями могут быть толуол, гептан, высшие алканы и их смеси. Время и температура могут влиять на морфологию во впадинах 28, и, таким образом, могут контролироваться. В качестве примера, время отжига может варьировать от 1 минуты до 180 минут или даже дольше, например, от примерно 3 часов до примерно 48 часов; и температура отжига может варьировать от 18°С до примерно 250°С.
В результате отжига растворителем блок-сополимер 58 подвергается самоорганизации во впадинах 16 (и, таким образом, не присутствует на промежуточных областях 30) и также подвергается разделению фаз на сегрегированные (разделенные) домены или блоки 58А, 58В. На Фиг. 2D разделенные блоки 58А, 58В имеют кольцевую или спиральную структуру, хотя данная структура может зависеть от использованного блок-сополимера 58. Другие примеры структуры блок-сополимера 58 показаны, например, на Фиг. 23А и 23В. Фиг. 23А представляет собой вид сверху впадины 28 и некоторой части окружающей промежуточной области 30, где у блок-сополимера 58 во впадине 28 происходит разделение фаз на блоки 58А и 58В, которые демонстрируют структуру отпечатков пальцев. На Фиг. 23В показан вид сверху впадины 28 и некоторой части окружающей промежуточной области 30, где у блок-сополимера 58 во впадине 28 происходит разделение фаз на блоки 58А и 58В, которые демонстрируют линейную структуру. Блоки 58А, 58В имеют домены сублитографического размера.
Во время отжига растворителем блок 58А или 58В, включающий функциональную группу для присоединения к смоле, может взаимодействовать со структурированной смолой 54' и, таким образом, может присоединяться к структурированной смоле 54'.
В то время как это не показано, в некоторых примерах способа 200 структурированная смола 54', включающая блок-сополимер 58А, 58В с разделенными фазами и подвергнувшийся самоорганизации во впадинах 28, подвергается дополнительному процессу отверждения. Отверждение может проводиться, как описано ранее.
Как показано на Фиг. 22D-22E, процесс прививки проводится для того, чтобы прививать праймеры (18, 21 или 18', 21' для последовательного парно-концевого секвенирования) или (18, 20 или 18', 20' и 19, 21 или 19', 21' для одновременного парно-концевого секвенирования) к любым функциональным группам прививки праймера блока(ков) 58А и/или 58 В во впадине(нах) 28.
В одном примере прививка может осуществляться посредством проточного отложения (например, с использованием временно связанной крышки), покрытия окунанием, покрытия распылением, распределения в ванночке или другим подходящим способом, который будет присоединять праймер(ры) (18, 21 или 18', 21' для последовательного парно-концевого секвенирования) или (18, 20 или 18', 20' и 19, 21 или 19', 21' для одновременного парно-концевого секвенирования) к функциональным группам прививки праймера блока(ков) 58А и/или 58В. В примере одновременного парно-концевого секвенирования праймеры 18, 20 или 18', 20' могут быть привиты к одному блоку 58А, и праймеры 19, 21 или 19', 21' могут быть привиты к другому блоку 58 В. Каждую из данных типичных методик можно проводить, как описано в данном документе, и можно использовать раствор или смесь праймеров, которая может включать праймер(ры), воду, буфер и катализатор.
Следует понимать то, что праймер(ры) (нерасщепляемые праймеры 18, 21 или 18', 21' для последовательного парно-концевого секвенирования) или (пары нерасщепляемых/расщепляемых праймеров 18, 20 или 18', 20' и 19, 21 или 19', 21' для одновременного парно-концевого секвенирования) будут присоединяться к блоку(кам) 58А и/или 58В, которые включают функциональные группы прививки праймера. В примере, показанном на Фиг. 22Е и 22F, праймер(ы) 18, 21 присоединяется(ются) к блоку 58В, а не к блоку 58А. В данном примере блок 58А факультативно содействовал параметру взаимодействия для управления разделением фаз первого и второго блоков 58А, 58В и также мог быть присоединен к структурированной смоле 54' через функциональную группу для присоединения к смоле.
Теперь, ссылаясь на Фиг. 24, показан другой пример блок-сополимера 58 с разделением фаз на блоки 58А и 58В. В данном примере к соответствующим блокам 58А, 58В присоединяются два разных набора праймеров: один, включающий праймеры 18, 18' и 20, 20', и другой, включающий праймеры 19, 19' и 21, 21'. Данный пример обеспечивает получение одновременных парно-концевых считываемых фрагментов во время секвенирования, как описано в данном документе. В данном примере каждый из соответствующих блоков 58А, 58В включает функциональные группы прививки праймера, которые могут присоединять соответствующие наборы праймеров.
Как упомянуто выше, некоторые из блок-сополимеров 58 представляют собой терполимеры, где каждый блок включает отличную блокспецифичную функциональную группу. В одном примере блок-сополимер 58 представляет собой терполимер, включающий первый блок, второй блок и третий блок; где блокспецифичная функциональная группа первого блока присоединена к структурированной смоле (т.е. представляет собой функциональную группу для присоединения к смоле); блокспецифичная функциональная группа второго блока присоединена к праймеру(рам) (т.е. представляет собой функциональную группу прививки праймера); и блокспецифичная функциональная группа третьего блока присоединена к i) другому(гим) праймеру(рам), который(рые) является(ются) другим(гими), чем праймер(ры), присоединенный(ные) к блокспецифичной функциональной группе второго блока или ii) к ферменту (например, транспосомы NEXTERA™). Пример терполимера с разделенными фазами показан на Фиг. 25А. В данном примере сегрегированный терполимер включает блоки 58А, 58В, 58С, где 58А включает функциональную группу прививки праймера, 58В включает функциональную группу для присоединения к смоле и/или влияет на свободную энергию поверхности блок-сополимера, и/или влияет на стабильность блок-сополимера, и 58С включает другую функциональную группу прививки праймера или функциональную группу для присоединения фермента. Как показано, блок 58А присоединяет первый набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D, включающий праймеры 18, 18' и 20, 20', и блок 58С присоединяет второй набор праймеров 12А, 12В', 12С', 12D', включающий праймеры 19, 19' и 21, 21'. В данном примере блок 58А служит в качестве области 14, и блок 58С служит в качестве области 16. В другом примере области 14, 16 могут представлять собой блоки (например, 58А и 58В, или 58В и 58С), которые являются непосредственно смежными друг с другом.
В другом примере блок-сополимер 58 представляет собой терполимер, включающий первый блок, второй блок и третий блок; где блокспецифичная функциональная группа первого блока присоединена к структурированной смоле 54' (т.е. представляет собой функциональную группу для присоединения к смоле); блокспецифичная функциональная группа второго блока присоединена к праймеру(рам) (т.е. представляет собой функциональную группу прививки праймера); и блокспецифичная функциональная группа третьего блока влияет на свободную энергию поверхности данного блок-сополимера или влияет на стабильность данного блок-сополимера. Один пример терполимера с разделенной фазой показан на Фиг. 25В. В данном примере сегрегированный терполимер включает блоки 58А, 58В, 58С, где 58А включает функциональную группу для присоединения к смоле, 58 В влияет на свободную энергию поверхности блок-сополимера или влияет на стабильность данного блок-сополимера, и 58С включает функциональную группу прививки праймера. В данном примере присоединяются нерасщепляемые праймеры 18, 21, и, таким образом, данный пример может быть особенно подходящим для последовательного парно-концевого секвенирования.
На Фиг. 38А и Фиг. 38В совместно показан другой пример способа, включающего блок-сополимер 58'. В данном примере блок-сополимер 58' представляет собой слоистый блок-сополимер. Слоистый блок-сополимер будет подвергаться самоорганизации таким образом, что разные блоки 58А' и 58В' наслаиваются один на поверхность другого таким образом, что они являются параллельными нижележащим материалам 54В, 54С и подложке 52. Примеры слоистых блок-сополимеров включают сополимеры, включающие гетероциклические азидные звенья. Материалы 54В, 54С могут быть разными примерами смолы 54А, описанными в данном документе, силанами или силанизированными смолами и могут быть выбраны для управления самоорганизацией блок-сополимера 58'. При контролируемых условиях блок-сополимер 58' подвергается самоорганизации в специфические домены/блоки 58А и 58В', которые наслаиваются на нижележащие материалы 54В, 54С. В примере, показанном на Фиг. 38А и 38В, в результате отжига домены/блоки 58А и 58В' подвергаются самоорганизации таким образом, что блок 58В' экспонируется на поверхности одной площади (лежащий сверху материала 54В) и таким образом, что блок 58А экспонируется на поверхности другой площади (лежащий сверху материала 54С). Блок 58В' может включать функциональные группы присоединения праймера, которые могут присоединять первый набор праймеров 12А, 12В, 12С, 12D, включающий праймеры 18, 18' и 20, 20'; и блок 58А' может включать другие функциональные группы присоединения праймера, которые могут присоединять второй набор праймеров 12А', 12В', 12С', 12D', включающий праймеры 19, 19' и 21, 21'. В данном примере блок 58В' служит в качестве области 14, и блок 58А служит в качестве области 16.
Проточные ячейки, включающие блок-сополимер 58, 58', можно использовать во множестве подходов или технологий секвенирования, включая методики, часто именуемые секвенированием посредством синтеза (SBS), секвенированием с циклическим чипом, секвенированием посредством лигирования, пиросеквенированием и так далее. В некоторых из данных примеров, поскольку блоки разделенных фаз 58А, 58В, 58С и присоединенный(ные) праймер(ры) (нерасщепляемые праймеры 18, 21 или 18', 21' для последовательного парно-концевого секвенирования) или (пары нерасщепляемых/расщепляемых праймеров 18, 20 или 18', 20' и 19, 21 или 19', 21' для одновременного парно-концевого секвенирования) присутствуют во впадинах 28 и не на промежуточных областях 30, амплификация будет ограничиваться впадинами 28.
В качестве одного примера реакцию секвенирования посредством синтеза (SBS) можно проводить на такой системе, как HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NOVASEQ™, NEXTSEQDX™, NEXTSEQ™ или любые другие системы секвенаторов от Illumina (Сан-Диего, СА). При SBS отслеживается достройка праймера для секвенирования вдоль нуклеиновой кислоты-матрицы (например, матрицы для секвенирования) для определения последовательности нуклеотидов в матрице. Лежащим в основе химическим процессом может быть полимеризация (например, катализируемая ферментом полимеразой) или лигирование (например, катализируемое ферментом лигазой). В конкретном способе SBS на основе полимеразы флуоресцентно меченые нуклеотиды добавляются к праймеру для секвенирования (посредством этого достраивая данный праймер) способом, зависимым от матрицы, таким образом, что выявление порядка и типа нуклеотидов, добавленных к праймеру для секвенирования, можно использовать для определения последовательности матрицы.
Например, для инициации первого цикла SBS один или более чем один меченый нуклеотид, ДНК-полимеразу и т.д. можно доставлять в/через проточный канал, который содержит группу прямых или обратных нитей, присоединенных к нерасщепляемым праймерам 18, 21 или 18', 21' (для последовательного парно-концевого секвенирования) или и прямых, и обратных нитей, присоединенных к парам нерасщепляемых/расщепляемых праймеров 18, 20 или 18', 20' (для одновременного парно-концевого секвенирования), где достройка праймера для секвенирования вызывает включение меченого нуклеотида, которое может быть выявлено посредством события визуализации. Во время события визуализации система освещения (не показана) может давать возбуждающий свет в функционализированные впадины.
В данных примерах нуклеотиды могут дополнительно включать свойство обратимой терминации, которое терминирует дальнейшую достройку праймера, как только был добавлен нуклеотид, и для продолжения секвенирования может использоваться деблокирующий агент. Между разными стадиями доставки жидкости может(гут) происходить промывка(ки). Цикл SBS можно затем повторять n раз для достройки праймера для секвенирования на n нуклеотидов, выявляя, посредством этого, последовательность длины n.
В то время как было подробно описано SBS, следует понимать то, проточные ячейки, описанные в данном документе, можно использовать с другим протоколом секвенирования, для генотипирования или в других химических и/или биологических приложениях.
Для дополнительной иллюстрации настоящего раскрытия в данном документе приводятся примеры. Следует понимать то, что данные примеры приводятся для иллюстративных целей, и их не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего раскрытия.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
PAZAM с предварительно привитыми праймерами Р7 и P5U откладывали на субстрате проточной ячейки, имеющем колоновидные элементы, которые были примерно 400 нм в высоту и примерно 350 нм в диаметре. На Фиг. 39А показано изображение полученной сканирующей электронной микроскопией (SEM) микрофотографии части отложенного предварительно привитого слоя PAZAM. На этот первый привитый слой PAZAM откладывали отрывной резист с образованием примера защитного слоя, описанного в данном документе. На Фиг. 39В показано изображение SEM части отложенного защитного слоя. Затем проводили травление для удаления защитного слоя и первого привитого слоя PAZAM с верхних частей колоновидных элементов. На Фиг. 39С показано изображение SEM части субстрата после травления. PAZAM откладывали на верхние части колоновидных элементов и на остающийся защитный слой с образованием второго слоя PAZAM. На данный второй слой PAZAM прививали праймеры Р5 и P7U.
Способ отрыва использовали для удаления защитного слоя и любого второго привитого слоя PAZAM от первого привитого слоя PAZAM.
В данную проточную ячейку вводили фрагменты библиотеки из того же самого генома (из человеческого генома). Данные фрагменты библиотеки включали часть, которая была комплементарна последовательностям праймеров Р5 или Р7, наряду с индексными последовательностями и последовательностями считываемого фрагмента 1 и считываемого фрагмента 2. Фрагменты библиотеки высевали и осуществляли кластеризацию с использованием мостиковой амплификации. Затем проводили одновременное парно-концевое секвенирование.
В пограничной области между колоновидными элементами и соседними областями обнаружили, что примерно 34% всех считываемых фрагментов были парными.
Данные считываемые фрагменты выделяли из одного места и выравнивали с геномом. На Фиг. 40А проиллюстрировано два считываемых фрагмента R1 (R1 и R1'), которые относятся к одновременным парно-концевым считываемым фрагментам.
Проточную ячейку также обрабатывали посредством последовательного парно-концевого синтеза (прямые нити секвенировались и удалялись, с последующим секвенированием обратных нитей). На Фиг. 40В проиллюстрированы результаты из Фиг. 40А со вторым считываемым фрагментом (R2) из последовательного парно-концевого синтеза, перевернутые для того, чтобы показать, что они, в самом деле, соответствуют паре одновременных парно-концевых считываемых фрагментов. Вырезанная часть в R2 может быть обусловлена падением качества, тогда как считываемый фрагмент R1 представляет собой считываемый фрагмент более высокого качества без вырезания. Эти результаты демонстрируют то, что способы, раскрытые в данном документе, могут давать эквивалентную информацию по отношению к стандартному парно-концевому секвенированию (Фиг. 40В) с использованием одновременно полученных пар (Фиг. 40А).
Кроме того, распределения размера вставок фрагментов библиотеки были грубо эквивалентными для данных на основе одновременного парно-концевого секвенирования и стандартного (последовательного) парно-концевого секвенирования. Данные результаты дополнительно демонстрируют то, что способы, раскрытые в данном документе, с использованием одновременно полученных пар могут давать эквивалентную информацию по отношению к стандартному парно-концевому секвенированию.
Пример 2
PAZAM откладывали на плоский субстрат проточной ячейки, и прививали к нему праймеры Р7 и P5U. На верх этого первого привитого слоя PAZAM откладывали защитный слой (фоторезист Shipley 1813). УФ свет использовали через фотомаску для экспонирования определенных частей защитного слоя, которые затем проявляли в растворителе, оставляя сзади 50 мкм круглые блоки защитного слоя. Для вытравливания экспонированных частей первого привитого слоя PAZAM в промежуточных областях использовали воздушную плазму, тогда как части под защитными блоками оставались интактными. Затем на промежуточные области и на остающийся защитный слой наносили второй слой PAZAM. На данный второй отложенный PAZAM затем прививали праймеры Р5 и P7U.
Для удаления защитного слоя и любого второго привитого слоя PAZAM от первого привитого слоя PAZAM использовали способ отрыва.
В проточную ячейку вводили фрагменты библиотеки из того же самого генома (из человеческого генома). Данные фрагменты библиотеки включали часть, которая была комплементарна последовательностям праймеров Р5 и P7U, наряду с индексными последовательностями и последовательностями считываемого фрагмента 1 и считываемого фрагмента 2. Фрагменты библиотеки высевали, и осуществляли кластеризацию с использованием мостиковой амплификации. Затем проводили одновременное парно-концевое секвенирование.
В пограничной области между первым привитым и вторым привитым PAZAM обнаружили то, что примерно 2,2% из всех считываемых фрагментов были парными. Это означало то, что два считываемых фрагмента находились в пределах 2 мкм друг от друга и находились в пределах 2 т.п.о. друг от друга в геноме.
Дополнительные примечания
Следует понимать то, что все комбинации вышеизложенных идей и дополнительных идей, обсуждаемых в больших подробностях ниже (при условии, что такие идеи не являются взаимоисключающими), рассматриваются как часть объекта изобретения, раскрытого в данном документе. В частности, все комбинации заявленных объектов, появляющиеся в конце данного раскрытия, рассматриваются как часть объекта изобретения, раскрытого в данном документе. Также следует понимать то, что терминология, прямо используемая в данном документе, которая также может появляться в любом раскрытии, включенном посредством ссылки, должна соответствовать значению, наиболее согласующемуся с конкретными идеями, раскрытыми в данном документе.
Ссылка во всем данном описании изобретения на «один пример», «другой пример», «пример» и так далее означает то, что конкретный элемент (например, элемент, структура и/или характеристика), описанный в связи сданным примером, включается в по меньшей мере один пример, описанный в данном документе, и может присутствовать или может не присутствовать в других примерах. Кроме того, следует понимать то, что описанные элементы для любого примера могут объединятся любым подходящим способом в разных примерах, если контекст явно не диктует иное.
Следует понимать то, что интервалы, приведенные в данном документе, включают заявленный интервал и любое значение или подинтервал в пределах заявленного интервала, как если бы такие значения или подинтервалы были прямо перечислены. Например, следует интерпретировать то, что интервал от примерно 400 нм до примерно 1 мкм (1000 нм) включает не только прямо перечисленные границы от примерно 400 нм до примерно 1 мкм, но также включает индивидуальные значения, такие как примерно 708 нм, примерно 945,5 нм и т.д., и подинтервалы, такие как от примерно 425 нм до примерно 825 нм, от примерно 550 нм до примерно 940 нм и т.д. Кроме того, при использовании терминов «примерно» и/или «по существу» для описания значения подразумевается то, что они охватывают небольшие вариации (вплоть до плюс/минус 10%) от заявленного значения.
В то время как несколько примеров были подробно описаны, следует понимать то, что раскрытые примеры могут быть модифицированы. Следовательно, вышеизложенное описание следует рассматривать как неограничивающее.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Illumina, Inc.
Illumina Cambridge Limited
<120> ПРОТОЧНЫЕ ЯЧЕЙКИ
<130> IP-1806-PCT
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga                                           20
<210> 2
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 2
caagcagaag acggcatacg a                                         21
<---