Способ окрашивания антигенов при помощи флуоресцентных антител на свежезамороженных срезах опухоли и метастазов
METHOD OF STAINING ANTIGENS BY MEANS OF FLUORESCENT ANTIBODIES ON FRESH-FROZEN SECTIONS OF TUMOUR AND METASTASES

Иммуногистохимический анализ опухолевых образцов с использованием антител против интегринов может использоваться в клинической практике для оценки прогноза метастазирования.
Из уровня техники известен метод иммуногистохимического анализа (ИГХ) американского врача Эльберта Кунса с применением моноклональных антител к рецепторам эстрогенов, прогестерона, с-erB-2 онкобелку и Ki-67 (MIB-1) который позволяет лишь оценить фенотип опухоли и определиться с тактикой лечения пациенток.
Также известен способ оценки вероятности гематогенного метастазирования инфильтрирующего протокового рака молочной железы путем исследования операционного материала пациента, отличающийся тем, что проводят исследование макроскопически выявляющихся опухолевых узлов и всех аксиллярных лимфатических узлов, учитывают тубулярные и трабекулярные структуры инфильтративного компонента (патент RU 2 324 180 C1). Однако данный способ является более трудозатратным и менее точным в оценке прогнозирования  метастазирования рака молочной железы.
Техническим результатом заявленного способа является возможность оценки  точного прогноза, метастазирования рака молочной железы позволяющего тем самым улучшить тактику наблюдения за пациентами и сократить время проведения анализа.
Для достижения технического результат нами использовался следующий способ:
При проведении иммуногистохимического анализа на свежезамороженных срезах, отрабатывался протокол проведения иммуногистохимического окрашивания, решались важные проблемы: отработка техники выполнения работы, приготовление образцов ткани, надлежащий контроль. Стандартным методом приготовления образца во многих руководствах остается фиксация формалином и заливка в парафин. Мы использовали свежезамороженные срезы, так как окрашивание свежезамороженных срезов происходит быстрее, что важно при быстрой постановке диагноза, при этом не затрачивается время на фиксацию, проводку и депарафинирование. Свежезамороженные срезы также удобно использовать при иммунофлюоресценции.
Послеоперационный материал доставлялся в лабораторию в жидком азоте. Изготовление срезов может проходить, например, в микротоме Thermofisher Microm HM560 с криостатом при температуре среды -40°С - -25°С, температуре ножа -25°С - -18°С, с толщиной срезов 7мкм. Полученные срезы переносились на стекла с адгезивным покрытием, после чего инкубировались в 2% растворе формалина, в течение часа сушились на воздухе при температуре  20-26°С.
Изготавливались положительный и отрицательный контроли. Положительным контролем были клетки рака молочной железы MCF7, на поверхности которых экспрессируются интегриновые рецепторы. Отрицательным контролем были срезы, окрашенные по протоколу, но без использования первичных антител. Протокол иммуногистохимического окрашивания представлен ниже.
Протокол иммуногистохимического анализа:
1) Регидратация.  Стекла с фиксированными срезами помещали в ёмкость с солевым фосфатным буфером (PBS) на 15 минут. После чего производилась отмывка в PBS 2 раза по 5 минут.
2) Демаскировка. Инкубировали препараты поочередно в 1% SDS и в PBS в течение 15 минут. Далее промывали в PBS 3 раза по 5 минут.
3) Блокировка. На мокрые срезы наносили 1% раствор бычьего сывороточного альбумина. Проводили блокировку в течение 30 минут. Отмывали один раз 5 минут в PBST.
4) Инкубация с первичными антителами. Инкубацию проводили во влажной камере при  температуре 20-26°С в течение 1 часа. Далее промывали срезы в фосфатном буфере 3 раза по 5 минут.
5) Инкубация с вторичными антителами. Инкубировали во влажной камере в течение 1 часа, после проводили отмывку 3 раза по 5 минут.
6) Окрашивание ядер. На готовое стекло наносили реагент Prolong DAPI , закрывали покровным стеклом, закрепляли прозрачным лаком.
На качество окраски влияют многие факторы, в первую очередь это титр антител, а также время и температура  инкубации.
Использованные нами разведения представлены в таблице № 1. Мы установили подходящее время инкубации: 1 час во влажной камере при комнатной температуре – инкубация с первичным и вторичным  антителом.
Принцип непрямой иммунофлюоресценции основан на том, что первичное антитело не имеет метки, а вторичное антитело несет флюоресцентную метку. У непрямой иммунофлюоресценции более высокая чувствительность, чем у прямой, вторичные антитела доступнее и дешевле.
Трудности использования иммунофлюоресцентного анализа это фотообесцвечивание и аутофлюоресценция. Поэтому анализировать срезы тканей необходимо в первые часы после окрашивания, а аутофлюоресценция заключалась в тщательном промывании стекол в растворе солевого фосфатного буфера и тщательном подборе титра антител.
Оценка экспрессии белков может проводиться, например, на платформе IN Cell Analyzer - приборе, позволяющим получать высококачественные флуоресцентные изображения в автоматическом режиме с последующим высокоинтеллектуальным анализом изображений с использованием программы In Cell Investigator. Другое название данной технологии - скрининг высокого содержания (high-content screening), в результате которого мы получаем информацию как на уровне одной клетки, так и всей популяции. Съёмка может проводиться в светлом поле, в 6 флуоресцентных каналах, в любых планшетах (от 6 до 384-луночных) и на покровных стеклах. Прибор позволяет проводить длительные эксперименты и съёмку в режиме реального времени с поддержанием СО2 и температуры.
Для определения рецепторного статуса использовались данные иммуногистохимического анализа 28 больных раком молочной железы.
Для определения уровня экспрессии белков методом иммуногистохимии использовали опухолевую ткань молочной железы и метастазы рака в лимфоузлы,  удаленные в ходе хирургического вмешательства. В качестве контроля служила прилегающая к опухоли нетрансформированная ткань молочной железы.
Использовались образцы опухолевой ткани 28 пациенток с диагнозом рак молочной железы стадии T2-4NхMх в возрасте от 45 до 70 лет (средний возраст 60,6 лет).
Проводимые исследования соответствовали рекомендациям стандартов этического комитета, принятым в Российской Федерации, разработанным в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека»,  поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.
Значения экспрессии белков, полученные в ходе иммунофлюоресцентного окрашивания оценивали при помощи факторного дисперсионного анализа.
При помощи факторного дисперсионного анализа была проведена оценка влияния рецепторного статуса на метастазирование в различные органы. С вероятностью Р > 0,999 можно утверждать, что 15% различий следует отнести к факториальным и 85% составляют различия случайные. Достоверным оказалось влияние положительного рецепторного статуса на метастазы в печень и кости. Полученные срезы переносились на стекла с адгезивным покрытием, после чего инкубировались в двух процентном растворе формалина, в течение 1-го часа сушились на воздухе при температуре  20-26°С.
Данные представлены в таблице 3.
Окрашенные при помощи иммунофлюоресцентного метода ткани подвергались количественной оценке In Cell Investigator.
Достоверно показано влияние экспрессии интегринов на различие в тканях разных фенотипов РМЖ, а именно, ITG α6 (Р>0,99) и  β3 (P>0,999) в гормон-негативных опухолях, HER2- раке; ITG αV (P>0,999) – в гормонозависимых образованиях, а ITG α2 (P>0,99) и α3 (P>0,999) – в остальных фенотипах. Данные представлены в таблице 5.
При попарном сравнении значений экспрессии интегриновых рецепторов в тканях опухоль – метастаз – норма достоверно показана максимальная экспрессия в метастазах рака относительно нормы для интегриновых рецепторов α3, α6, αV, β3 и достоверное снижение экспрессии α2 в опухоли по сравнению с нормальной тканью.
1) Способ непрямой флюоресценции отработан на свежезамороженных срезах, этот способ окрашивания тканей позволяет значительно сократить время проведения исследования по сравнению с иммуногистохимическим анализом на парафиновых срезах;
2) Экспрессия интегриновых рецепторов различается в зависимости от фенотипа рака молочной железы: ITG α6 (Р>0,99) и  β3 (P>0,999) экспрессируются преимущественно в ER-, HER2-отрицательных, а ITG αV (P>0,999) – в гормонозависимых опухолях;
3) Максимальная экспрессия интегриновых рецепторов наблюдается в метастазах лимфатических узлов (p<0,05), что делает данные белки перспективными мишенями для прогноза и лечения рака молочной железы.
Таблица 1.Панель использованных в исследовании антител
Специфичность
Фирма
Разведение
Интегрин α2, α3
abcam
1:50
Интегрин αV
abcam
1:200
Интегрин α6
abcam
1:100
Интегрин α9
abcam
1:50
Интегрин β3, β1
abcam
1:50
AF 568 Goat anti- mouseAF 488 Goat anti- mouse
abcamabcam
1:10001:2000
Таблица 2. Отношение рецепторного статуса и метастазов в органы
Таблица 3. Значения факторного дисперсионного анализа
Примечание: df1/df2 – значения степеней свободы; mS – средний квадрат; F – критерий Фишера; Р – вероятность.
df1/df2
mSгруп.
mSслуч.
F
Р
Печень
6/625
1,24
0,15
8,26
>0,999
Кость
6/625
1,8
0,2
9
>0,999
Легкие
6/625
0,1
0,17
0,6
<0,95
Головной мозг
6/625
0,05
0,04
1,23
<0,95
Таблица 4. Среднее значение флюоресценции по полям для образцов гормон-зависимого рака, нм
Таблица 5. Факторный дисперсионный анализ признака
df1/df2
mSгруп.
mSслуч.
F
Р
αV
2/22
62 227
4 696
13,25
Р>0,999
2/22
43 481
17 261
2,8
P<0,95
2/12
44 027
11 539
3,8
P<0,95
α6
2/12
58 786
5 978
9,8
Р>0,99
2/12
37 417
18 708
2
P<0,95
2/12
55 458
19 116
2,9
P<0,95
β3
2/12
54 118
7 832
6, 9
P=0,99
β1
2/12
30 695
15 817
1,9
P<0,95
α3
2/22
60 712
4 112
14,7
P>0,999
α2
2/22
43 438
3 913
11,1
P>0,99
Примечание: df1/df2 – значения степеней свободы; mS – средний квадрат; F – критерий Фишера; Р – вероятность.
Перечень терминологии
• Блокировка – этап иммуногистохимического анализа для уменьшения неспецифического связывания антитело-антиген;
• Демаскировка – процесс восстановления структуры антигенов;
• Иммуногистохимический анализ – это метод локализации специфических антигенов в тканях, основанный на распознавании антигена соответствующим антителом и выявления результатов этого связывания;
• Инкубация – процесс связывания антитела с антигеном;
• Интегрины – гетеродимерные рецепторы, встроенные в мембрану клеток и обеспечивающие межклеточные взаимодействия, эпителиально-мезенхимальный переход, прикрепление, инвазию и миграцию опухолевых клеток;
• Регидратация – восстановление влагосодержания фиксированных срезов;
• Эпителиально-мезенхимальный переход – механизм, в процессе которого опухолевая клетка, отделившись от эпителия, приобретает подвижность, что способствует инвазии и метастазированию;
Список сокращений
dNTP – дезоксинуклеозид трифосфат
ER - эстрогеновые рецепторы
HER2 - рецепторы человеческого эпидермального фактора роста типа 2
ICTP - С - телопептид коллагена
NTx - N - телопептид коллагена
PBS – солевой фосфатный буфер
PBST – солевой фосфатный буфер с добавлением детергента
PR - прогестероновые рецепторы
SDS – додецилсульфат натрия
TBE – трис-боратный электродный буфер
TGF - трансформирующий ростовой фактор
TNF – фактор некроза опухоли
VGEF – фактор роста эндотелия сосудов
МРТ – магнитно-резонансная томография
ОНМК - острое нарушение мозгового кровообращения
РМЖ – рак молочной железы
ТНРМЖ/TNBC - тройной негативный рак молочной железы
ТЭПА – трансартериальная эмболизация печеночной артерии
ЦНС - центральная нервная система
ЭМП – эпителиальное-мезенхимальный переход.