СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ОКСИДАТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ РТА У БОЛЬНЫХ КРАСНЫМ ПЛОСКИМ ЛИШАЕМ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ РТА НА ФОНЕ НАРУШЕНИЙ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА
METHOD FOR ASSESSING DEGREE OF SEVERITY OF ORAL MUCOSAL OXIDATIVE CHANGES IN PATIENTS WITH ORAL LICHEN ACUMINATIS WITH UNDERLYING LIPID STORAGE DISEASE

Изобретение относится к области медицины, а именно стоматологии, и может использоваться для определения степени тяжести оксидативных изменений непосредственно в слизистой оболочке рта у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта (КПЛ СОР) на фоне нарушений липидного обмена для выбора тактики лечения данной категории больных.
Красный плоский лишай относится к распространенным и трудно излечимым заболеваниям кожи и слизистых оболочек и, особенно часто, слизистой оболочки рта (Заболевания слизистой оболочки рта и губ / Под ред. проф. Е.В. Боровского, проф. А.Л. Машкиллейсона - М.: МЕДпресс, 2001. - 320 с. - С.156-166). Этиология и патогенез красного плоского лишая изучены недостаточно. Следовательно, этиотропного лечения не существует, а патогенетическая терапия не всегда эффективна. По нашим данным красный плоский лишай относится к патоморфологическим состояниям слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена с дистрофическими изменениями в эпителии: гранулезом, гиперкератозом, акантозом.
Известен способ определения степени оксидативных изменений в организме по показателям в сыворотке крови у больных красным плоским лишаем с помощью определения содержания малонового диальдегида. Способ заключается в том, что содержание малонового диальдегида определяют по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Методы определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // В кн.: Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С.66-68). К 0,2 мл сыворотки крови добавляют 3 мл 1% раствора ортофосфорной кислоты, 1 мл 0,6% водного раствора тиобарбитуровой кислоты и 0,1 мл водного раствора сернокислого железа. Пробы ставят на 1 час в кипящую водяную баню. Затем пробы охлаждают и добавляют в каждую 4 мл бутанола и тщательно премешивают, центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин. Верхний бутаноловый слой, содержащий окрашенный продукт реакции, спектрофотометрируют при длине волны 532 нм на спектрофотометре СФ-46. Выявлено, что уровень малонового диальдегида повышен при всех формах красного плоского лишая (показатели у больных от 9,35 до 12, 24 мкмоль/л, у лиц без красного плоского лишая - 8,3 мкмоль/л).
Недостатком способа является то, что способ не позволяет определять степень тяжести оксидативных изменений непосредственно в слизистой оболочке рта у больных КПЛ СОР.
В качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности нами выбран способ определения оксидативных изменений в тканях слизистой оболочки рта с помощью аскорбинового теста, позволяющего оценить насыщение слизистой оболочки рта аскорбиновой кислотой (Giza Т., Weclawowicz J.,1960 The perligual metod for evaluating the vitamin С content off the body. A rapid diagnostic test fur vitamin С under nutrition // Intern. Zeitschrift fur Vitamin Forschung. - 1960. - Vol.30, N.3. - P.327-332). Аскорбиновая кислота является витамином - антиоксидантом, участвующим в окислительно-восстановительных реакциях организма. При дистрофических процессах на фоне оксидативных изменений насыщенность аскорбиновой кислотой снижается. Аскорбиновый тест, который позволяет оценить насыщение слизистой оболочки рта аскорбиновой кислотой, проводят с помощью 0,06% раствора натриевой соли 2,6-дихлорфенолинофенола (краска Тильманса). Техника проведения: на предварительно очищенную ватным тампоном переднюю треть спинки языка инъекционной иглой диаметром 0,2 мм наносят 1 каплю краски Тильманса и секундомером засекают время обесцвечивания индикатора. Результаты теста оценивают следующим образом: если время обесцвечивания индикатора составляет менее 15 секунд, то насыщение тканей организма аскорбиновой кислотой находится в пределах нормы; в случае обесцвечивания индикатора более 16 секунд - насыщение тканей организма аскорбиновой кислотой снижено, что опосредованно можно расценивать как проявление оксидативных изменений в эпителии слизистой оболочки рта.
Недостатки прототипа:
- Исследования проводят только на горизонтальной поверхности спинки языка для того, чтобы не стекал раствор, и в связи с этим способ отражает оксидативные процессы преимущественно в эпителии, а не в собственно слизистой оболочке рта и таким образом, не отражает более глубинные оксидативные изменения.
- Поверхность языка может быть покрыта ороговевающим эпителием (норма), а при таких патологических состояниях как красный плоский лишай иногда покрыта десквамированным эпителием, поэтому воздействие краски Тильманса будет разной и результаты теста могут быть недостоверны.
- Кроме того, у больных на фоне выработки различных цитокинов в крови может быть разная проницаемость капилляров слизистой оболочки, что также влияет на результат исследования.
- Способ не может считаться фундаментальным, так как ориентирован на зрение исследователя и поэтому является субъективным.
Техническим результатом изобретения является повышение объективности и точности способа за счет количественной оценки определения степени выраженности оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных с красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена, что позволит выработать тактику адекватной терапии у данной категории больных.
Технический результат изобретения достигается тем, что в биоптате собственно слизистой оболочки рта больных КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена определяют макрофаги, содержащие аполипопротеины В. При их количественном значении 0,8-3,0 клеток в одном поле зрения определяют легкую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных КПЛ СОР на фоне нарушения липидного обмена, при 3,1-6,0 клеток в одном поле зрения - среднюю степень, при 6,1-9,0 и более клеток в одном поле зрения - тяжелую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных КПЛ СОР на фоне нарушения липидного обмена.
Способ осуществляется следующим образом:
1) Проводят клинико-морфологическое обследование больного, у которого в результате обследования диагностируют красный плоский лишай слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.
2) За 1,5 часа до взятия биоптата раствор сахарозы (транспортная среда для забора и хранения клинического материала: фосфатный буфер с сахарозой (сахароза 48,46 г, К2НР04 (б/в) - 2,088 г, КН2Р04 (б/в) - 1,088 г) и официнальный фиксатор помещают в холод (+4 -+6°С).
3) Проводят взятие биоптата со слизистой оболочки щек в области появления голубовато-перламутровых папул вне зоны расположения эрозий под инфильтрационной анестезией (2 мл 2,0% раствора лидокаина гидрохлорида). Средние размеры биоптата: 10 мм в длину, 5 мм в ширину и 3 мм в глубину.
4) Биоптат разрезают на мелкие доли размером 5×5 мм и помещают в 5-10 мл раствора официнального фиксатора.
5) Проводят инкубацию препарата в течение 40 минут при температуре +4°С.
6) Помещают биоптат в 5 мл буферного раствора и инкубируют при температуре +4°С 3 раза по 10 минут с заменой буфера.
7) Перекладывают препарат в 5-10 мл раствора сахарозы, в котором производят транспортировку при температуре +4°С в тот же день в лабораторию.
8) В лабораторных условиях после фиксации и изготовления криостатных срезов проводят исследование экспрессии маркеров методом непрямой иммуногистохимии с применением системы экстравидин-биотин-щелочная фосфатаза.
9) Для определения макрофагов, содержащих аполипопротеины В, используют моноклональные антитела и красители фирмы Sigma (США).
10) Подсчет клеток проводят на трех срезах в трех полях зрения под световым микроскопом «Leica DMLB». Результаты исследования оценивают по цифровым показателям обнаружения в 9-ти полях зрения и среднего количества макрофагов, содержащих аполипопротеины В.
11) При количественном значении аполипопротеинов В 0,8-3,0 клеток в одном поле зрения определяют легкую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена, при 3,1-6,0 клеток в одном поле зрения -среднюю степень, а при 6,1-9,0 и более клеток в одном поле зрения - тяжелую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена.
Отличительные существенные признаки изобретения и причинно-следственная связь между ними и достигаемыми результатом:
- в биоптате собственно слизистой оболочки рта больных КПЛ СОР определяют макрофаги, содержащие аполипопротеины В;
- при количественном значении аполипопротеинов В 0,8-3,0 клеток в одном поле зрения определяют легкую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена. При 3.1-6,0 клеток в одном поле зрения - среднюю степень. При 6,1-9,0 и более клеток в одном поле зрения - тяжелую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.
Изобретение основано на нашем предположении о том, что выявление в слизистой оболочке рта макрофагов, содержащих аполипопротеины В, и их количественная оценка могут свидетельствовать о степени тяжести оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.
Известно, что нарушения липидного обмена в организме приводят к нарушениям антиоксидантной защиты человека и, соответственно, к увеличению уровня аполипопротеинов В, которые являются маркерами оксидативных изменений в тканях организма (Денисенко А.Д., Виноградов А.Г., Нагорнев В.А. и др. Взаимодействие макрофагов с аутоиммунным комплексом липопротеид - антитело//Иммунология. - 1989. - №2 - С.32-35.; Денисенко Т.В. Гликолизированные липопротеиды как атерогенный фактор при диабете // Вопр. мед. химии. - 1990. - №2 - С.5-10.).
Поэтому количественное значение наличия макрофагов, насыщенных аполипопротеинами В, может являться объективным показателем степени оксидативных изменений в собственно слизистой оболочке рта больных красным плоским лишаем слизистой оболочке рта на фоне нарушений липидного обмена.
Нами проведен анализ историй болезни 400 больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта, в результате которого был выделен общий признак - у 96,0% больных - наличие гиперхолестеринемии. Между тем исследования последних лет значительную роль в патогенезе красного плоского лишая отводят активизации процессов свободнорадикального окисления липидов (Ярвиц А.А. Метаболические изменения и их коррекция у больных красным плоским лишаем: Автореф. дис.… канд. мед. наук. - Москва, 1994. - 24 с.; Евсеева И.К. Особенности клинического течения и лечения некоторых кератозов слизистой оболочки рта у лиц пожилого возраста: Автореф. дис.… канд. мед. наук. - Санкт - Петербург, 1997. - 18 с.; Шумский А.В., Трунина Л.П. Красный плоский лишай: монография. - Самара, РЕАВИЗ, 2004. - 161 с. - С.4-16). Так в периферической крови больных красным плоским лишаем было обнаружено существенное повышение уровня первичных (диеновых конъюгатов) и конечных (малонового диальдегида) продуктов перекисного окисления липидов. О снижении антиоксидантной защиты организма свидетельствовало также уменьшение содержания в крови компонентов антиоксидантной системы - глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы (Скляр В.Е., Кондратьев Н.И., Шафран Л.М. Состояние перекисного окисления липидов и содержание микроэлементов в крови у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта. // Стоматология. - 1991. - С.29-31.), супероксиддисмутазы и общей пероксидазы (Епишова А.А. Клиника, диагностика, лечение больных красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта: Автореф. дис.… канд. мед. наук. - Екатеринбург, 1993. - 16 с.), каталазы, витаминов А и Е (Баранник Н.Г, Колесник Н.В., Бердюк Л. В., Синицын Р.Г. Этиология и патогенез красного плоского лишая слизистой оболочки рта: Метод. пособие. - Запорожье, 1994. - 17 с.).
Однако известно, что основными мишенями воздействия оксидантов являются липиды и белки и их комплексы, среди которых на первом месте стоят липопротеиды низкой плотности, способные под воздействием оксидантов деградировать и модифицироваться, образуя аполипопротеины В и в дальнейшем участвовать в воспалительных реакциях. В первую очередь это происходит у лиц с гиперхолестеринемией и атеросклерозом. Поэтому мы предположили, что повышение уровня липопротеидов низкой плотности у больных КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена на фоне нарушения антиоксидантной защиты приводит к повышению уровня аполипопротеинов В в слизистой оболочке рта.
По данным литературы известно, что рецепторы к аполипопротеинам В имеются во многих исследованных тканях организма человека, но работ по выявлению в слизистой оболочке рта, как рецепторов, так и аполипопротеинов В, до настоящего времени проведено не было.
На этом основании мы провели иммуногистохимическое исследование слизистой оболочки рта у 9 больных КПЛ СОР и у 3 лиц контрольной группы с нарушением липидного обмена, но без диагноза - КПЛ СОР для выявления макрофагов, содержащих аполипопротеины В. Результаты исследования представлены в таблице. Нами были обозначены количественные границы по определению степени тяжести оксидативных изменений слизистой оболочки рта по содержанию выявленных макрофагов, содержащих аполипопротеины В, соответственно числу и сложности клинической картины и формы КПЛ СОР.
Как видно из представленной таблицы, аполипопротеины В-содержащие макрофаги, были выявлены во всех препаратах в собственно слизистой оболочке рта.
Таким образом, иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител впервые показало наличие в слизистой оболочке рта аполипопротеинов В как у лиц контрольной группы (без красного плоского лишая, но с нарушениями липидного обмена), так и у больных с проявлением КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена. Выявление макрофагов, нагруженных аполипопротеинами В и увеличение их количества указывает на активизацию оксидативных процессов, а также развитие более тяжелой степени оксидативных изменений слизистой оболочки рта больных и появлению более сложной клинической картины КПЛ СОР. Так, легкая степень тяжести оксидативных изменений соответствует нахождению в одном поле зрения в среднем 0,8-3,0 позитивных клеток, что характерно для слизистой оболочки рта лиц без красного плоского лишая, (но с умеренно повышенным холестерином), а также больных КПЛ СОР с сетчатой формой, локализованной на фоне нарушений липидного обмена. Средняя степень тяжести оксидативных изменений в слизистой оболочке рта соответствует выявлению 3,1-6,0 макрофагов с апопротеинами В, что определяется у больных с сетчатой формой, распространенной (без гиперемии и отека) и экссудативно-гиперемической формой, локализованной КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена. Тяжелая степень тяжести оксидативных изменений в слизистой оболочке больных соответствует выявлению в среднем, в одном поле зрения 6,1-9,0 и более макрофагов, нагруженных аполипопротеинами В, что характерно для эрозивно-язвенной формы, распространенной; пузырной формы, локализованной; экссудативно-гиперемической формы, распространенной КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена.
Выявление и нарастание оксидативных изменений в собственно слизистой оболочке больных КПЛ СОР с нарушением липидного обмена в виде определения макрофагов с аполипопротеинами В указывает на то, что они играют большую роль в патогенезе осложненных форм данного заболевания. Чем степень тяжести оксидативных изменений выраженное, тем красный плоский лишай приобретает более разлитую и тяжелую по течению форму заболевания.
Указание на степень тяжести оксидативных изменений в слизистой оболочке рта больных красным плоским лишаем на фоне нарушений липидного обмена диктует определенную тактику лечения -коррекцию липидного обмена, оксидативных изменений и их осложнений, в том числе в слизистой оболочке рта.
Приводим примеры из амбулаторной практики:
Пример 1. Набл. №2. А/к №495. Больная А. 55 лет. Обратилась с жалобами на чувство стянутости в области слизистой оболочки левой щеки. Уровень общего холестерина 5,8 мкМоль/л. Объективно: цвет слизистой оболочки щек розовый без признаков гипермии и отека. На слизистой оболочке левой щеки в области моляров определяется измененный участок (размером 1,0×2.5 см в диаметре) с появлением сеточки, образованной от слияния мелких голубовато-перламутровых папул. Диагноз: красный плоский лишай слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена, сетчатая форма, локализованная. Проведена биопсия слизистой оболочки левой щеки в зоне патологических элементов. Размер биоптата в среднем длиной 10 мм, шириной 5 мм, в глубину 3 мм. Методом иммуногистохимического исследования были выявлены макрофаги, содержащие аполипопротеины В. Среднее количество позитивных клеток в одном поле зрения - 1,1, что указывает на легкую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больной красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.
Пример 2. Набл. №4. А/к №497. Больная И. 48 лет. Обратилась с жалобами на появление беловатых высыпаний на слизистой оболочке щек. Уровень общего холестерина 6,5 мкМоль/л. Объективно: слизистая оболочки без признаков отека и гиперемии. На слизистой оболочке обеих щек определяется сеточка из мелких голубовато-перламутровых папул. Диагноз: красный плоский лишай слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена, сетчатая форма, распространенная. Проведена биопсия слизистой оболочки правой щеки в зоне патологических высыпаний. Размер биоптата в среднем длиной 10 мм, шириной 5 мм, в глубину 3 мм. Методом иммуногистохимического исследования были выявлены макрофаги, содержащие аполипопротеины В. Среднее количество позитивных клеток в одном поле зрения - 4,3, что указывает на среднюю степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больной красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.
Пример 3. Набл. №6. А/к №512. Больная К., 67 лет. Обратилась с жалобами на боли и чувство стянутости в области слизистой оболочки обеих щек. Уровень общего холестерина 6,8 мкМоль/л. Объективно: слизистая оболочка щек в задней трети гиперемирована, отечна. На этом фоне определяются эрозии размером 0,3×0,2 см в диаметре. По краям эрозий наблюдаются следы голубовато-перламутровых мелких папул.
Диагноз: красный плоский лишай слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена, эрозивно-язвенная форма, умеренно распространенная. Проведена биопсия слизистой оболочки правой щеки в области папул вне эрозий. Размер биоптата в среднем длиной 10 мм, шириной 5 мм, в глубину 3 мм. Методом иммуногистохимического исследования были выявлены макрофаги, содержащие апрлипопротеины В. Среднее количество позитивных клеток в одном поле зрения - 6,1, что указывает на тяжелую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больной красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.
Пример 4. Набл. №9. А/к №515. Больная Д., 62 года. Обратилась с жалобами на сильные боли и чувство стянутости в области слизистой оболочки обеих щек. В анамнезе: уровень общего холестерина 7,8 мкМоль/л. Объективно: слизистая оболочка щек резко гиперемирована и отечна на большом протяжении. В районе зоны воспаления определяются следы голубовато-перламутровой сеточки.
Диагноз: красный плоский лишай слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена, экссудативно-гиперемическая форма, распространенная. Проведена биопсия слизистой оболочки правой щеки в области папул вне эрозий. Размер биоптата в среднем длиной 10 мм, шириной 5 мм, в глубину 3 мм. Методом иммуногистохимического исследования были выявлены макрофаги, содержащие аполипопротеины В. Среднее количество позитивных клеток в одном поле зрения - 8,8, что указывает на тяжелую степень оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больной красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена.
Пример 5. Набл. №12. Контрольное исследование. А/к №480. Мужчина Г., 25 лет. Жалоб нет. Уровень общего холестерина 5,6 мкМоль/л. Объективно: слизистая оболочка рта без патологических изменений. Проведена биопсия слизистой оболочки левой щеки. Размер биоптата в среднем длиной 10 мм, шириной 5 мм, в глубину 3 мм. Методом иммуногистохимического исследования в собственно слизистой оболочке были выявлены макрофаги, содержащие аполипопротеины В. Среднее количество позитивных клеток в одном поле зрения - 1,3, что указывает на легкую степень оксидативных изменений в слизистой оболочке рта.
Способ апробирован у 9 больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта на фоне нарушений липидного обмена: у 3 больных определена легкая степень, у 2 больных - средняя степень, и у 4 больных - тяжелая степень оксидативных изменений на фоне нарушений липидного обмена.
Таким образом, нами впервые предложена количественная оценка определения степени выраженности оксидативных изменений слизистой оболочки рта у больных с КПЛ СОР на фоне нарушений липидного обмена, что, по сравнению с прототипом, повышает объективность и точность способа. Заявляемый способ позволит выработать тактику адекватной терапии у данной категории больных.
Распределение степеней тяжести оксидативных изменений в слизистой оболочке рта у 9 больных КПЛ СОР и 3 исследуемых относительно форм КПЛ СОР и количественного значения макрофагов, содержащих аполипопротеины В в одном поле зрения
№ наблюдения
Возраст больного
Форма КПЛ СОР по клинической картине
Макрофаги с аполипо-протеинами В
Степень тяжести оксидативных изменений
1
51
КПЛ СОР, сетчатая форма, локализованная
0,8
легкая
2
55
КПЛ СОР, сетчатая форма, локализованная
1,1
легкая
3
50
КПЛ СОР, сетчатая форма, локализованная
1,2
легкая
4
48
КПЛ СОР, сетчатая форма, распространенная
4,3
средняя
5
62
КПЛ СОР, экссудативно-гиперемическая форма, локализованная
4,3
средняя
6
67
КПЛ СОР, эрозивно-язвенная форма, распространенная
6,1
тяжелая
7
55
КПЛ СОР, пузырная форма, локализованная
6,7
тяжелая
8
60
КПЛ СОР, экссудативно-гиперемическая форма, распространенная
7,3
тяжелая
9
61
КПЛ СОР, экссудативно-гиперемическая форма, распространенная
8,8
тяжелая
Контрольные исследования
10
69
норма
2,5
легкая
11
67
норма
1,2
легкая
12
25
норма
1,3
легкая