СОПОЛИМЕРЫ 2-МЕТИЛ-5-ВИНИЛПИРИДИНА И N-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА, ОБЛАДАЮЩИЕ СВОЙСТВАМИ АКТИВАТОРОВ ФАГОЦИТОЗА
COPOLYMERS OF 2-METHYL-5-VINYL-PYRIDINE AND N-VINYL PYRROLIDONE, HAVING PHAGOCYTOSIS ACTIVATOR PROPERTIES

Область техники
Изобретение относится к области химии биологически активных полимеров. Более конкретно, изобретение относится к сополимеру на основе N-винилпирролидона, представленному общей формулой (I):
где мономерное звено М представляет фрагмент 2-метил-5-винилтетразола (МВТ) или 2-метил-5-винилпиридина (МВП):
µ
µ
µ
и содержание мономерных звеньев n составляет 25-50 мол.%, а средневязкостная молекулярная масса М сополимера зависит от природы М: если М представляет МВТ, то М=30-50 кДа; если М представляет МВП, то М=15-28 кДа, а также к смесям таких сополимеров. Сополимер в соответствии с настоящим изобретением, а также смесь таких сополимеров, являются активаторами фагоцитоза.
Уровень техники
В авторском свидетельстве СССР 1578143 (C08F 226/10, А61К 31/785, опубл. 15.07.1990) описан сополимер N-винилпирролидона и 5-изопропенил-тетразола с молекулярной массой, определенной методом светорассеяния, равной 85 кДа, в котором содержание 5-изо-пропенилтетразольных звеньев составляет 0,40-0,74 мол. доли, обладающий свойствами иммуноадъюванта поверхностного антигена вирусного гепатита В.
В патенте РФ 2000004 (C08F 226/10, А61К 31/79, опубл. 15.02.1993) раскрыт способ получения и свойства сополимеров N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина со средневязкостной молекулярной массой в диапазоне 30-45 кДа, содержащих 25-40 мол.% 2-метил-5-винилпиридиновых звеньев. У этих сополимеров выявлена иммуностимулирующая активность, а также показано их лечебно-профилактическое и пролонгирующее действие при классической чуме свиней и сибирской язве в комплексе с антибиотиками фторхинолонового ряда и химиопрепаратами.
В патенте РФ 2015993 (C08F 226/10, A61K 31/79, опубл. 15.07.1994) описаны сополимеры N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина, содержащие 35 мол.% 2-метил-5-винилпиридиновых звеньев, со средневязкостной молекулярной массой приблизительно 40 кДа. Для этих сополимеров описано противоопухолевое действие на животных моделях (крысы, мыши) в отношении различных сарком (саркома Иенсена, саркома М-1, саркома-45) и аденокарциномы толстого кишечника. Весьма высокая противоопухолевая активность наблюдалась только в случае саркомы Иенсена (торможение роста опухоли 76%), в остальных случаях этот показатель составлял 30-54%.
Указанные сополимеры получают радикальной сополимеризацией N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина в присутствии динитрила азобис-изомасляной кислоты в качестве инициатора сополимеризации, пероксида водорода и циклогексана в качестве регулятора молекулярной массы, а целевой продукт выделяют осаждением в диэтиловый эфир.
В международной заявке WO 2009/136805 (A61K 36/66, A61K 36/8969, A61K 38/56, опубл. 12.11.2009) раскрыто иммуностимулирующее средство, содержащее растительные полипептиды с молекулярными массами от 15 до 63 кДа, получаемые из смеси листьев чистотела большого (Chelidonium majus) и корневищ купины горной (Polygonatum varticillatum). Указанное средство стимулирует фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов при внутрибрюшинном введении (белые мыши): в дозе 2 мкг/кг - на 64% и в дозе 20 мкг/кг - на 97%. Также это средство повышает гуморальный иммунитет, о чем свидетельствует увеличение титра гемагглютинов (агглютенация эритроцитов барана) в 2,14 раза при введении 2 мкг/кг и в 1,31 раза при введении 2 мкг/кг белым мышам. Недостатком данного средства является недостаточная устойчивость полипептидных структур активных ингредиентов при хранении в обычных условиях, а также необходимость проведения гель-хроматографии для очистки растительного экстракта, что снижает производительность технологической схемы.
Целью данного изобретения является расширение арсенала биологически активных соединений на основе сополимеров N-винилпирролидона, которые могут найти применение в медицине, в частности, в качестве активаторов фагоцитоза.
Описание изобретения
В соответствии с первым воплощением данного изобретения получают сополимер формулы (I), в котором мономерное звено М представляет МВТ. Для этого проводят радикальную сополимеризацию N-винилпирролидона (N-ВП) и 2-метил-5-винилтетразола (2-М-5-ВТ) в присутствии динитрила азобис-изомасляной кислоты (ДАК) в качестве инициатора сополимеризации в индифферентном растворителе, таком как диметилформамид (ДМФА) с последующим выделением продукта диэтиловым эфиром (ДЭ) или смесью бутилацетата (БА) и циклогексана (ЦГ).
Ввиду большого различия в константах сополимеризации N-ВП и 2-М-5-ВТ, последний быстро расходуется в процессе сополимеризации, поэтому синтез сополимера заданного состава обеспечивается поддержанием постоянного соотношения N-ВП и 2-М-5-ВТ путем компенсации расхода мономеров подпиточной смесью.
Исходная смесь содержит 40-55 мас.% N-ВП, 2-15 мас.% 2-М-5-ВТ, 0,6-1% ДАК и 29-57 мас.% ДМФА. Подпиточная смесь содержит 12-15 мас.% N-ВП, 8-25 мас.% 2-М-5-ВТ и 60-80 мас.% ДМФА. Объем подпиточной смеси вычисляют каждые 15-20 минут по результатам анализа соотношения концентраций мономеров в реакционной смеси. Экспрессность анализа достигается за счет применения автоматизированного анализатора (АА), в качестве которого может быть использован, например, высокоэффективный жидкостной хроматограф.
В одном варианте изобретения подпиточную смесь готовит и добавляет оператор (аппаратчик), основываясь на данных анализа и регламента синтеза. В другом варианте добавление подпиточной смеси осуществляется автоматически с помощью системы контроля и управления синтезом. Такая система объединяет АА, управляющее устройство и исполнительные устройства. В качестве управляющего устройства может быть использована ЭВМ, реализующая алгоритм управления синтезом, построенный на основе математической модели процесса. В качестве исполнительных устройств могут быть использованы управляемые запорные устройства, например клапаны с пневматическим или электромеханическим приводом.
Реакцию сополимеризации проводят при температуре 60-70°С. По достижении степени конверсии по мономерам около 20% реакционную массу охлаждают до 20°С и осаждают в диэтиловый эфир.
В соответствии со вторым воплощением данного изобретения сополимер формулы (I) на стадии выделения подвергают фракционированию осаждением диэтиловым эфиром из реакционной массы, дополнительно разбавленной ДМФА после окончания полимеразации. Для этого в реакционную массу последовательно добавляют объемы ДЭ таким образом, что каждый последующий объем в 2…3,5 раза превосходит предыдущий. Последнюю фракцию выделяют выпариванием раствора, оставшегося после осаждения всех предшествующих фракций. Таким образом, можно получить от 2 до 5 фракций сополимера, имеющих более узкое распределение средневязкостных молекулярных масс.
1
13
15
Строение полученного продукта характеризуется, в частности, числом мономерных звеньев МВТ (n). В одном варианте изобретения его вычисляют по данным элементного анализа с учетом стехиометрии сополимера. Получение необходимых для этого расчетных формул доступно среднему специалисту в данной области. В другом варианте изобретения строение полученного продукта определяют по данным ЯМР-спектрометрии, например Н-, С- или N-ЯМР, по соотношениям интегральных интенсивностей сигналов определенных ядер. Решение данной задачи также доступно среднему специалисту в данной области.
Полученный сополимер характеризуется средневязкостной молекулярной массой, которую вычисляют по характеристической вязкости сополимеров. Выбор методики и подбор условий измерения вязкости является рутинной процедурой, доступной среднему специалисту в данной области. В одном варианте изобретения характеристическую вязкость определяют в растворителе, состоящем из 85 об.% ДМФА и 15 об.% 0,1М водного раствора LiBr.
В соответствии с третьим воплощением данного изобретения получают сополимер формулы (I), в котором мономерное звено М представляет МВП. Для этого проводят радикальную сополимеризацию N-винилпирролидона (N-ВП) и 2-метил-5-винилпиридина (2-M-5-BТ) в присутствии динитрила азобис-изомасляной кислоты (ДАК) в качестве инициатора сополимеризации сополимеризации, пероксида водорода и циклогексана в качестве регулятора молекулярной массы. Продукт выделяют осаждением в диэтиловый эфир (ДЭ).
Постоянство соотношения N-ВП и 2-М-5-ВП обеспечивают, компенсируя расход мономеров подпиточной смесью. Исходная смесь содержит 76,5-89,5 мас.% N-ВП, 1,5-10 мас.% 2-М-5-ВП, 0,1-0,5 мас.% пероксида водорода, 8-10 мас.% циклогексана и 1-3 мас.% ДАК. Подпиточная смесь содержит 68-79 мас.% N-ВП и 19-28 мас.% 2-М-5-ВП, 0,1-0,3 мас.% пероксида водорода и 2-4 мас.% ДАК. Объем подпиточной смеси вычисляют каждые 15-20 минут по результатам анализа соотношения концентраций мономеров в реакционной смеси. Реакцию сополимеризации проводят при температуре 65-70°С. По достижении степени конверсии по мономерам около 20% реакционную массу охлаждают до 20°С и осаждают в диэтиловый эфир. Для проведения реакции и исследований, необходимых для контроля ее протекания, а также для определения физико-химических характеристик продукта, применяют средства и методы, описанные выше для первого воплощения изобретения.
Сополимер в соответствии с любым из воплощений настоящего изобретения является нетоксичным. В качестве признаков токсического воздействия сополимера на подопытных животных могут рассматриваться, например, гибель, снижение массы тела, изменения походки и поведения, цвета мочи, консистенции экскрементов, состояния глаз и ушей, выпадение зубов и шерсти, а также раздражение и шелушение кожи.
В соответствии со следующим воплощением настоящего изобретения предлагается применение сополимеров в качестве активаторов фагоцитоза. Повышение фагоцитарной активности при введении сополимеров в соответствии с настоящим изобретением можно экспериментально подтвердить на общеизвестной модели макрофагов перитонеального экссудата. Исследования в рамках данной модели можно проводить на различных животных, например на белых мышах или беспородных белых крысах. Образование интактных макрофагов может быть индуцировано внутрибрюшинным введением стерильного 2,5% раствора крахмала в изотоническом растворе NaCl, стерильного парафинового масла или стерильного раствора красителя Нейтрофильного красного или коллоидной туши. Активированные макрофаги образуются в результате индуцирования очагового септического воспаления брюшины, например, при введении взвеси убитых или живых микроорганизмов.
Предложенные соединения, вводимые внутримышечно в дозах 5 или 50 мг/кг, статистически достоверно увеличивали фагоцитарную активность на 15…45% по сравнению с контролем в исследованиях с красителем Нейтрофильным красным, а также повышали долю фагоцитирующих клеток на 8…23%, а индекс завершенности фагоцитоза - на 85…138% в исследованиях с частицами коллоидной туши. В последнем случае отмечалось, что введение сополимеров, практически не изменяя числа фагоцитирующих клеток, в 1,5…2 раза увеличивает переваривающую способность макрофагов.
Далее приведены иллюстративные примеры осуществления изобретения, способствующие более точному и полному пониманию его сути. Специалисту в данной области очевидны возможные модификации и замены, например, относящиеся к протоколам исследований, которые не выходят за рамки объема изобретения, определяемые его формулой.
Пример 1. Получение сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилтетразола с выделением продукта диэтиловым эфиром.
2
В реактор загружают исходную реакционную смесь, содержащую 13,24 г N-ВП (51,2%), 0,625 г 2-М-5-ВТ (2,4%), 12,5 мл (11,8 г) ДМФА (45,6%) и 0,2 г ДАК(0,8%). Реакционную массу нагревают до 65-70°С и ведут синтез при данной температуре, периодически отбирая пробы для хроматографического анализа (ВЭЖХ, Сферисорб С-18, 5 мкм, 4,6×250 мм, EtOH/HO 6:94, 2,5 мл/мин (50°С), 254 нм) и подавая подпиточную смесь, содержащую 1,2 мл N-ВП (12%), 0,8 мл 2-М-5-ВТ (8%), 8,0 мл ДМФА (80%). По достижении степени конверсии по мономерам 20%, реакционную массу охлаждают до 20°С и осаждают в 300 мл диэтилового эфира. Целевой продукт выделяют фильтрацией и сушат: сначала при атмосферном давлении при 40-60°С, а затем - в вакуумном сушильном шкафу при 80-90°С. Получают 1,26 г аморфного порошка белого цвета, растворимого в воде, с содержанием звеньев МВТ 48 мол.%.
Пример 2. Получение сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилтетразола с последующим фракционированием осаждением.
2
В реактор загружают исходную реакционную смесь, содержащую 13,24 г N-ВП (51,2%), 0,625 г 2-М-5-ВТ (2,4%), 12,5 мл (11,8 г) ДМФА (45,6%) и 0,2 г ДАК (0,8%). Реакционную массу нагревают до 65-70°С и ведут синтез при данной температуре, периодически отбирая пробы для хроматографического анализа (ВЭЖХ, Сферисорб С-18, 5 мкм, 4,6×250 мм, EtOH/HO 6:94, 2,5 мл/мин (50°С), 254 нм) и подавая подпиточную смесь, содержащую 1,2 мл N-ВП (12%), 0,8 мл 2-М-5-ВТ (8%), 8,0 мл ДМФА (80%). По достижении степени конверсии по мономерам 20% реакционную массу охлаждают до 20°С и добавляют 1450 мл (1370 г) ДМФА. В полученный раствор добавляют 15 мл диэтилового эфира в качестве осадителя, оставляют на 4 часа в закрытой емкости для формирования осадка. Осадок отделяют декантацией, промывают на фильтре минимальным объемом диэтилового эфира и сушат: сначала при атмосферном давлении при 40-60°С, а затем - в вакуумном сушильном шкафу при 80-90°С. В оставшийся раствор продукта синтеза в ДМФА добавляют следующую порцию (35 мл) диэтилового эфира и повторяют операции фильтрования и сушки. Цикл осаждения повторяют еще раз, добавляя 100 мл диэтилового эфира, с последующими фильтрованием и сушкой. Последнюю фракцию получают испарением жидкости. Получают четыре порции аморфного порошка белого цвета, растворимого в воде, с содержанием звеньев МВТ в диапазоне 40-50 мол.%. Средневязкостная масса приблизительно составляет: для первой фракции продукта - от 47 до 52 кДа, для второй фракции - от 42 до 48 кДа, для третьей фракции - от 37 до 46 кДа, для четвертой фракции - от 29 до 39 кДа.
Пример 3. Получение сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина с выделением продукта диэтиловым эфиром.
2
В реактор загружают исходную реакционную смесь, содержащую 3,00 кг (2,88 л) N-ВП (85,94%), 50,4 г (52,8 мл) 2-М-5-ВП (1,44%), 4,70 г (5,04 мл) 30% водного раствора пероксида водорода (0,13%), 327,6 г (420 мл) циклогексана (9,39%) и 108 г ДАК (3,10%). Реакционную массу нагревают до 65-70°С и ведут синтез при данной температуре, периодически отбирая пробы для хроматографического анализа (ВЭЖХ, Сферисорб С-18, 5 мкм, 4,6×250 мм, EtOH/HO 6:94, 2,5 мл/мин (50°С), 254 нм) и подавая подпиточную смесь, содержащую 450 г (433 мл) N-ВП (69,7%), 172 г (164 мл) 2-М-5-ВП (26,6%), 1,54 г (1,4 мл) 30% водного раствора пероксида водорода (0,2%) и 22,5 г ДАК (3,5%). По достижении степени конверсии по мономерам 20% реакционную массу охлаждают до 20°С и осаждают в 65 л диэтилового эфира. Целевой продукт промывают на фильтре 2 л ДЭ, выделяют фильтрацией и сушат: сначала при атмосферном давлении при 40-60°С, а затем - в вакуумном сушильном шкафу при 80-90°С. Получают 490 г аморфного порошка белого цвета, растворимого в воде, с содержанием звеньев МВП 25 мол.%. Средневязкостная масса приблизительно составляет: для первой фракции продукта - от 15 до 19 кДа, для второй фракции - от 20 до 24 кДа, для третьей фракции - от 25 до 28 кДа.
Пример 4. Исследование острой токсичности сополимеров in vivo.
Исследование проводят в группе из 5 здоровых беспородных белых мышей массой 18-20 г. Соединение, полученное в соответствии с каждым из примеров, растворяют в стерильном изотоническом растворе NaCl из расчета 10 мас.% и вводят каждому животному 0,4 мл этого раствора. Соединение считают выдержавшим испытание, если через 7 суток наблюдения в группе не погибло ни одно животное. В данном исследовании гибели животных не отмечено.
Пример 5. Исследование активности перитонеальных макрофагов в присутствии красителя Нейтрофильного красного.
Оценку фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов проводили по интенсивности поглощения ими красителя - Нейтрофильного красного (Таблица 1). Краситель вводили мышам внутрибрюшинно в виде 0,05% суспензии в объеме 2 мл. Сополимер применяли в дозах 5 и 50 мг/кг в объеме 250 мкл. Животным контрольной группы вводили равный объем воды для инъекций. Исследование проводили через 24 часа после завершения курса введения препарата или воды. Количество поглощенного красителя определяли по оптической плотности перитонеального лизата при длине волны 620 нм [(МВП) - сополимер 2-метил-5-винилпиридина; (МВТ) - сополимер 2-метил-5-винилтетразола].
Таблица 1
Влияние сополимера на фагоцитарную активность макрофагов
Препарат
Доза, мг/кг
Показатели фагоцитарной активности (ФА)
3 сутки
5 сутки
ФА, %
Изменение ФА, %
ФА, %
Изменение ФА, %
Сополимер
5
47
115
43
123
МВП
50
59
144
48
137
Сополимер
5
43
105
39
111
МВТ
50
56
136
42
120
Контроль
0
41
100
35
100
Пример 6. Исследование активности перитонеальных макрофагов в присутствии суспензии коллоидной туши.
Фагоцитарную активность макрофагов исследовали в тех же условиях, но вместо красителя мышам внутрибрюшинно вводили 2 мл 0,05% суспензии коллоидной туши. Исследование проводили через 24 часа после введения сополимера мышам. Через 10 минут после введения туши брюшную полость мышей промывали 5 мл изотонического раствора NaCl. Собранные клетки перитонеального экссудата трижды отмывали и суспендировали в 1 мл изотонического раствора NaCl. Процент фагоцитирующих клеток (% ФК) определяли по результатам микроскопического подсчета. После этого, клетки осаждали центрифугированием; удаляли супернатант и осадок клеток лизировали водой для инъекций. Лизаты помещали в фотометрические планшеты и определяли светопоглощение при длине волны 620 нм, пропорциональное количеству туши, поглощенной перитонеальными фагоцитами. Фагоцитарный индекс (ФИ), вычисляемый как отношение светопоглощения к числу фагоцитирующих клеток, отражает степень активации фагоцитоза. Индекс завершенности фагоцитоза, т.е. отношение среднего числа частиц (ФК), поглощенное одной фагоцитирующей клеткой за 1 ч, к ФК за 2,5 ч, отражает переваривающую способность фагоцитов (Таблица 2) [(МВП) - сополимер 2-метил-5-винилпиридина; (МВТ) - сополимер 2-метил-5-винилтетразола].
Таблица 2
Влияние сополимера на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей
Препарат
Доза, мг/кг
%, ФК
ФИ
ИЗФ
Сополимер
5
61,0±3,9
6,3±0,7
24,5±5,5
МВП
50
68,7±1,3
8,3±1,0
31,4±12,8
Сополимер
5
57,1±3,2
5,8±0,9
23,7±5,3
МВТ
50
66,4±1,1
7,9±1,1
30,0±11,7
Контроль
0
56,0±5,7
7,0±1,0
13,5±5,1
% ФК - процент фагоцитирующих клеток; ФИ - фагоцитарный индекс; ИЗФ - индекс завершенности фагоцитоза.