НОВЫЙ СПОСОБ КЛОНИРОВАНИЯ, ЭКСПРЕССИИ И ОЧИСТКИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РАНИБИЗУМАБА
NEW METHOD OF CLONING, EXPRESSION AND PURIFICATION FOR PREPARATION OF RANIBIZUMAB

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка является родственной по отношению к предварительной заявке на выдачу патента Индии № 1570/MUM/2013, поданной 30 апреля 2013 г. и включенной в настоящий документ в полном ее объеме.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к клонированию, экспрессии и получению ранибизумаба с применением нового подхода для улучшенного выхода продукта и получения биологически активного белка.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Белки очень важны, поскольку их применяют для лечения ряда заболеваний, включая нарушения ангиогенеза (VEGF), диабет (например, инсулин), различные формы рака (например, интерферон, моноклональные антитела), инфаркты, инсульты, кистозный фиброз (например, ферменты, факторы крови), воспалительные заболевания (например, факторы некроза опухоли), анемию (например, эритропоэтин), гемофилию (например, факторы свертывания крови) и т.д. Одной из сложных проблем является разработка эффективного и подходящего способа клонирования, экспрессии и масштабной очистки таких белков. Доступны многочисленные способы клонировании, экспрессии и масштабной очистки требуемого белка из надосадочных жидкостей клеточной культуры, но до сих пор возникают сложности в клонировании, экспрессии и выделении требуемого белка из смеси.
Фактор А роста эндотелия сосудов (VEGF-A) представляет собой биологический компонент, который может запустить ангиогенез, являющийся ростом новых кровеносных сосудов. Различные заболевания, среди прочих ишемия, анемия, заболевания периферических сосудов и атеросклеротические поражения, можно лечить путем увеличения ангиогенеза. Этого достигают путем стимуляции положительной регуляции экспрессии VEGF-A, ведущей в результате к повышению кровообращения, и, следовательно, увеличению поступления кислорода в больную ткань. В глазе, однако, избыточная васкуляризация может привести к утечке крови и жидкости в глаз. Эти «протекающие» кровеносные сосуды могут способствовать отеку макулы и неоваскуваляризации сосудистой оболочки глаза, приводя к влажной форме возрастной макулодистрофии (AMD). Результатом AMD может быть потеря остроты зрения или даже слепота. Следовательно, контроль избыточной васкуляризации макулы важен в лечении макулодистрофии. По сути, целью медиков является создание средства лечения для контроля или излечения AMD без ингибирования полезных эффектов нормальной активности VEGF-A в других частях организма. Было обнаружено, что ранибизумаб является эффективным средством лечения AMD.
Ранибизумаб представляет собой моноклональное антитело, рекомбинантный гуманизированный IgG1 изотипа каппа, ингибирующий активность VEGF, конкурентно связываясь с сайтом связывания на рецепторе активных форм VEGF-A, включая биологически активную расщепленную форму этой молекулы, VEGF1 10. Поэтому, ранибизумаб предотвращает связывание VEGF-A со своими главными рецепторами VEGFR1 и VEGFR2, которые находятся на поверхности эндотелиальных клеток. Это приводит к уменьшению размножения эндотелиальных клеток, утечки из сосудов и образованию новых кровеносных сосудов.
LUCENTIS представляет собой лекарственный состав с ранибизумабом и разработан для внутриглазной инъекции непосредственно в жидкость стекловидного тела глаза, где активный ингредиент ранибизумаба проникает во внутреннюю ограничивающую мембрану, достигая субретинального пространства. Эти инъекции обычно производят пациентам 5-7 раз в год и во многих случаях производят ежемесячно. Поскольку стоимость лечения очень высока, и немногие пациенты могут ее себе позволить, все еще существует необходимость в улучшении способа клонирования и очистки белка с целью возможности увеличения эффективности получения и возможности удешевления получения лекарственного препарата.
В US 6998383 раскрыт ингибитор RANK, состоящий из TRAF-6-связующего домена, прикрепленного к лидерной последовательности.
В US 7569384 раскрыта молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая альбуминовый слитый белок. Также раскрыты векторы, содержащие эти нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, трансформированные этими векторами на основе этих нуклеиновых кислот, и способы получения альбуминового слитого белка с применением таких нуклеиновых кислот, векторов и/или клеток-хозяев.
В US 8597907 раскрыт способ эффективного получения пригодного с промышленной точки зрения белка в дифтериеподобных бактериях. Настоящее изобретение предлагает способ эффективного получения гетерологичных белков, предусматривающий культивирование дифтериеподобных бактерий, содержащих генетическую конструкцию, которая содержит промоторную последовательность, функционирующую в дифтериеподобных бактериях, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальную пептидную область, зависящую от Tat-системы, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гетерологичный белок в направлении от 5'-конца к 3'-концу, и секреторное получение гетерологичного белка с применением дифтериеподобных бактерий.
В US 5641870 раскрыт способ очистки антитела. В этом способе смесь, содержащую антитело и загрязнитель, подвергают хроматографии гидрофобных взаимодействий при низком рН (LPHIC) необязательно при низкой концентрации солей. Антитело элюируется из колонки во фракцию, которая не связывается с ней. Этому способу могут предшествовать и за ним могут следовать другие стадии очистки.
В US 7847071 раскрыт способ очистки антитела, предусматривающий следующие стадии: во-первых, очистки антитела посредством аффинной хроматографии с белком А, где белок А представляет собой нативный белок А или его функциональное производное, во-вторых, загрузки очищенного антитела, содержащего загрязнитель-белок А, где указанный загрязнитель-белок А получают при элюировании связанного антитела с помощью указанной аффинной хроматографии с белком А, на первый ионообменник в условиях, которые обеспечивают возможность связывания белка А или его производного, в-третьих, сбора антитела, загруженного на первый ионообменник, в элюате первого ионообменника, в то время как загрязнитель-белок А связан с первым ионообменником, где первый ионообменник является анионообменником, дополнительной очистки антитела посредством его загрузки на второй ионообменник, связывания с ним и элюирования из него, и удаления концевой фракции элюата второго ионообменника так, чтобы мономерная фракция антител обогащалась в виде пула очищенных антител.
В WO 2011089212 раскрыт способ уменьшения количества примесей, в частности, белков и ДНК клеток-хозяев (НСР) из надосадочных жидкостей клеточных культур посредством хроматографии с белком А с применением нового промывочного буфера.
Liu et al. обсуждали в mAbs 2, 2010, 480-499, основные операции, такие как сбор, аффинную хроматографию с белком А и дополнительные стадии очистки совместно с альтернативными способами, такими как образование хлопьев, осаждение и мембранная хроматография, а также осветили основные принципиальные подходы к разработке способов очистки, применение способов скрининга с высокой пропускной способностью и предложили собственное виденье будущих разработок в методологии очистки применительно к моноклональным антителам.
Рефолдинг белков телец включения в биологически активные формы затруднителен, требует многих производственных стадий и в большинстве случаев приводит к очень низкому выделению свернутого белка. В случаях, где высокопроизводительный способ выделения был разработан для рефолдинга агрегированного белка, образование телец включения дает прямую стратегию для очистки рекомбинантного белка. Чем выше количество этого частично свернутого белка, который превращается в биологически активную форму, тем больше белка с терапевтическими свойствами может быть получено с улучшенным выходом и низкой стоимостью из телец включения Е.coli.
Необходим способ клонирования, экспрессии и очистки антител и предпочтительно без как дорогостоящей стадии хроматографии, так и дополнительных стадий. Предполагают, что антитело, полученное способом клонирования, экспрессии и очистки согласно настоящему изобретению, отвечает критериям чистоты и выхода продукта, которые установлены контролирующими организациями.
ОБЪЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Главным объектом настоящего изобретения является применение новых способов клонирования с последующей экспрессией нового белка и процедурами его очистки для быстрого и эффективного выделения рекомбинантного ранибизумаба.
Объектом настоящего изобретения является создание нового способа клонирования ранибизумаба, который предусматривает трансформацию клетки-хозяина с помощью:
i) вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1, кодирующую легкую цепь ранибизумаба, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID No. 2, где N-конец указанной SEQ ID No. 1 функционально связан с уникальной сигнальной последовательностью, стартовым ко доном и индуцируемой промоторной системой;
ii) трансформацию другой клетки-хозяина с помощью другого плазмидного вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 3, кодирующую тяжелую цепь ранибизумаба, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID No. 4, где N-конец указанной SEQ ID No. 3 функционально связан с уникальной сигнальной последовательностью, стартовым кодоном и индуцируемой промоторной системой.
Другим объектом настоящего изобретения является создание нового способа экспрессии белка для получения ранибизумаба, который предусматривает стадии:
i) экспрессии легкой и тяжелой цепи отдельно в двух различных экспрессирующих клетках-хозяевах;
ii) экспорт белка в периплазматическое пространство клеток с помощью уникальной сигнальной последовательности;
iii) рефолдинг частично очищенных белков легкой и тяжелой цепи друг с другом in vitro.
Еще одним объектом настоящего изобретения является создание нового способа очистки белка ранибизумаба, имеющего аминокислотную последовательность SEQ. ID. No. 2 и 4, который предусматривает:
i) культивирование клеток-хозяев при высокой плотности клеток в среде для роста посредством поддержания специфичных условий культивирования;
ii) экспрессию белка в форме периплазматических телец включения;
iii) рефолдинг белка обеих цепей друг с другом in vitro;
iv) очистку правильно свернутого белка.
Еще одним объектом настоящего изобретения является создание способа очистки ранибизумаба, который предусматривает:
i) рефолдинг белка in vitro;
ii) выполнение анионообменной хроматографии для отделения близкородственных неправильно свернутых молекул белка;
iii) выполнение катионообменной хроматографии, за которой следует
iv) ультрафильтрация/диафильтрация.
Дополнительным объектом настоящего изобретения является создание способа улучшенной очистки ранибизумаба, с помощью которого можно отделить даже близкородственные неправильно свернутые молекулы белка (степень очистки белка >95%).
Еще одним объектом настоящего изобретения является создание последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1, кодирующей легкую цепь ранибизумаба, где N-конец указанной SEQ ID No. 1 функционально связан с уникальной сигнальной последовательностью (SEQ ID No. 5).
Еще одним объектом настоящего изобретения является создание последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 3, кодирующей тяжелую цепь ранибизумаба, где N-конец указанной SEQ ID No. 3 функционально связан с уникальной сигнальной последовательностью (SEQ ID No. 6).
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение применения уникальной сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 5, для получения антитела к VEGF.
Еще одним объектом изобретения является обеспечение применения уникальной сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 6, для получения антитела к VEGF.
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение применения уникальной сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 5, для получения легкой цепи ранибизумаба.
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение применения уникальной сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 6, для получения тяжелой цепи ранибизумаба.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Главным аспектом настоящего изобретения является применение новых способов клонирования, с последующими новыми процедурами экспрессии белка и его очистки для быстрого и эффективного выделения рекомбинантного ранибизумаба.
Аспектом настоящего изобретения является создание нового способа клонирования ранибизумаба, который предусматривает трансформацию клетки-хозяина с помощью:
i) вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1, кодирующую легкую цепь ранибизумаба, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID No. 2, где N-конец указанной SEQ ID No. 1 функционально связан с уникальной сигнальной последовательностью, стартовым ко доном и индуцируемой промоторной системой;
ii) трансформацию другой клетки-хозяина с помощью другого плазмидного вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 3, кодирующую тяжелую цепь ранибизумаба, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID No. 4, где N-конец указанной SEQ ID No. 3 функционально связан с уникальной сигнальной последовательностью, стартовым кодоном и индуцируемой промоторной системой.
Другим аспектом настоящего изобретения является создание нового способа экспрессии белка для получения ранибизумаба, которые предусматривает следующие стадии:
i) экспрессии легкой и тяжелой цепей отдельно в двух различных экспрессирующих клетках-хозяевах;
ii) экспорта белка в периплазматическое пространство клеток с помощью уникальной сигнальной последовательности;
iii) рефолдинга частично очищенных белков легкой и тяжелой цепей друг с другом in vitro.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является создание нового способа очистки белка для получения ранибизумаба, имеющего аминокислотную последовательность SEQ. ID. No. 2 и 4, который предусматривает:
i) культивирование клеток-хозяев при высокой плотности клеток в среде для роста посредством поддержания специфичных условий культивирования;
ii) экспрессию белка в форме периплазматических телец включения;
iii) рефолдинг белков обоих цепей друг с другом in vitro;
iv) очистку правильно свернутого белка.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является создание улучшенного способа очистки ранибизумаба, который предусматривает:
i) рефолдинг белка in vitro;
ii) осуществление анионообменной хроматографии для отделения близкородственных неправильно свернутых молекул белка;
iii) осуществление катионобменной хроматографии с последующей
iv) ультрафильтрацией/диафильтрацией.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является создание улучшенного способа очистки ранибизумаба, с помощью которого можно отделить даже близкородственные неправильно свернутые молекулы белка (степень очистки белка >95%).
Еще одним аспектом изобретения является создание последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1, кодирующей легкую цепь ранибизумаба, где N-конец указанной SEQ ID No. 1 функционально связан с уникальной сигнальной последовательностью (SEQ ID No. 5).
Еще одним аспектом изобретения является создание последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 3, кодирующей тяжелую цепь ранибизумаба, где N-конец указанной SEQ ID No. 3 функционально связан с уникальной сигнальной последовательностью (SEQ ID No. 6).
Еще одним аспектом настоящего изобретения является обеспечение применения уникальной сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 5, для получения антитела к VEGF.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является обеспечение применения уникальной сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 6, для получения антитела к VEGF.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является обеспечение применения уникальной сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 5, для получения легкой цепи ранибизумаба.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является обеспечение применения уникальной сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 6, для получения тяжелой цепи ранибизумаба.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг. 1 представлена плазмида экспрессии, несущая генную конструкцию легкой цепи ранибизумаба.
На фиг. 2 представлена плазмида экспрессии, несущая генную конструкцию тяжелой цепи ранибизумаба.
На фиг. 3 представлена характеристика рекомбинантного белка, экспрессируемого с применением вышеизложенного способа.
На фиг. 4а представлен спектр CD правильно свернутого ранибизумаба в сравнении с Lucentis.
На фиг. 4b представлен спектр флуоресценции правильно свернутого ранибизумаба в сравнении с Lucentis.
На фиг. 5 представлен клеточный анализ, демонстрирующий сравнительную активность рекомбинантного ранибизумаба в сравнении с Lucentis.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ранибизумаб представляет собой Fab-фрагмент с созревшей аффинностью, полученный из бевацизумаба. Ранибизумаб имеет более высокую аффинность к VEGF и также имеет меньший размер, что позволяет ему лучше проникать в сетчатку глаза и, таким образом, лечить глазную неоваскуляризацию, связанную с AMD (Lien and Lowman, In: Chemajovsky, 2008, Therapeutic Antibodies. Handbook of Experimental Pharmacology 181, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 131-150). Ранибизумаб был разработан и выведен на рынок компанией Genentech под торговой маркой Lucentis.
LUCENTIS представляет собой стерильный раствор, цвет которого меняется от бесцветного до бледно-желтого, в одноразовой стеклянной пробирке. Ранибизумаб, у которого не хватает Fc-области, имеет молекулярный вес приблизительно 48 килодальтон и вырабатывается экспрессирующей системой Е.coli в питательной среде, содержащей антибиотик тетрациклин. Тетрациклин не обнаруживается в конечном продукте.
Если не указано иное, термин «VEGF-связывающая молекула» включает антитела к VEGF, фрагменты антител к VEGF, «молекулы, подобные антителам к VEGF» и соответствует любому из них. Антитела включают, но не ограничиваются ими, моноклональные или химерные моноклональные антитела. Термин «антитело» охватывает полные иммуноглобулины, такие как моноклональные антитела, производимые путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах, а также VEGF-связующие фрагменты антител или «молекулы, подобные антителам», в том числе одноцепочечные антитела и линейные антитела, так называемые «SMIP» («иммунофармацевтические средства на основе модульного белка малого размера»), как, например, описано в WO 02/056910. Молекулы, подобные антителам, к VEGF включают одиночные вариабельные домены иммуноглобулина, как определено в данном документе. Другими примерами молекул, подобных антителам, являются антитела суперсемейства иммуноглобулинов (IgSF) или молекулы с пересаженной CDR.
«VEGF-связывающая молекула» относится как к моновалентным VEGF-связывающим молекулам (т.е. молекулам, которые связываются с одним эпитопом VEGF), так и к би- или мультивалентным связывающим молекулам (т.е. связывающим молекулам, которые связываются с более чем одним эпитопом, например, «бипаратопные» молекулы, как определено в данном документе ниже).
«Сигнальная последовательность» относится к последовательности, присутствующей на N-концевой стороне предшественника секреторного белка, но отсутствующей в зрелом белке, встречающемся в природе, а «сигнальный пептид» относится к пептиду, отщепленного от этого предшественника белка. В общем, сигнальная последовательность расщепляется протеазой (под которой, как правило, предусматривается сигнальная пептидаза) при внеклеточной секреции. Хотя подобным сигнальным пептидам из разных биологических видов присущи постоянные общие черты в их последовательностях, сигнальный пептид, проявляющий секреторную функцию в одних биологических видах, необязательно проявляет ее в других биологических видах.
Тельцами включения являются плотные преломляющие поток электронов частицы агрегированного белка, обнаруживаемые как в цитоплазматическом, так и периплазматическом пространствах Е.coli во время высокоинтенсивной экспрессии гетерогенного белка. В целом, принимают, что накоплению телец включения в Е.coli способствует высокоинтенсивная экспрессия ненативного белка (более высокая, чем 2% от клеточного белка) и высоко гидрофобного белка. Для белков, имеющих дисульфидные связи, более характерно образование белковых агрегатов в виде телец включения, поскольку восстанавливающая среда бактериального цитозоля ингибирует образование дисульфидных связей.
-1
Тельца включения имеют более высокую плотность (~1,3 мг мл), чем многие клеточные компоненты, и, таким образом, они могут быть легко отделены с помощью высокоскоростного центрифугирования после разрушения клеток. Одним из наиболее эффективных путей получения клонированных белков является экспрессия рекомбинантных белков в виде телец включения у бактерий, поскольку белок тельца включения может быть успешно подвержен рефолдингу. Агрегация является одной из основных причин уменьшенного выхода при рефолдинге.
Рефолдинг белка относится к процессу, при котором белковая структура принимает свою функциональную форму или конформацию. Это физический процесс, при котором полипептид свертывается в свою характерную и функциональную трехмерную структуру из случайной спирали. Каждый белок существует в виде несвернутого полипептида или случайной спирали при трансляции из последовательности м-РНК в линейную цепь аминокислот. У этого полипептида отсутствует любая стабильная (долго сохраняющаяся) трехмерная структура. Аминокислоты взаимодействуют друг с другом для создания хорошо определенной трехмерной структуры, свернутого белка, известного как нативный. Его конечная трехмерная структура определяется аминокислотной последовательностью. Нерастворимые неактивные тельца включения часто образуются при получении рекомбинантного белка в трансформированных микроорганизмах. Эти тельца включения, содержащие рекомбинантный белок в высокой концентрации, можно изолировать при помощи разделения твердой/жидкой фаз. После растворения нативные белки можно создавать из неактивного материала при применении методик свертывания in vitro.
Настоящее изобретение создает новую процедуру рефолдинга ранибизумаба, предусматривающую эффективное восстановление in vitro структуры сложных гидрофобных, мультидоменных, олигомерных белков или белков с высоким содержанием дисульфидных связей. Эти протоколы принимают во внимание такие параметры процесса, как концентрация белка, катализ образования дисульфидных связей, температуру, рН и ионную силу, а также специфичные ингредиенты раствора, уменьшающие непродуктивные побочные реакции.
Клон относится к последовательности ДНК, такой как ген, который перенесен из одного организма в другой и реплицирован с помощью технологий генной инженерии. Настоящее изобретение включает гены тяжелой и легкой цепей ранибизумаба с требуемыми для клонирования модификациями на обоих концах. Генные последовательности оптимизированы для лучшей экспрессии белка в Е.coli. Синтетические конструкции построены так, чтобы получить бактериальную лидирующую сигнальную последовательность на N-конце, за которой следуют последовательности гена, представляющего интерес, и два концевых ко дона, останавливающих трансляцию. Эти сигнальные последовательности выбирают на основе их способности транспортировать максимальное количество белка в периплазму клетки. Выбранную сигнальную последовательность взяли из природного гена бактерий.
Основным вариантом осуществления настоящего изобретения является применение новых способов клонирования с последующей новой экспрессией белка и стадиями его очистки для быстрого и эффективного извлечения рекомбинантного ранибизумаба.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является создание нового способа клонирования ранибизумаба, который предусматривает трансформацию клетки-хозяина с помощью:
i) вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1, кодирующую легкую цепь ранибизумаба, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID No. 2, где N-конец указанной SEQ ID No. 1 функционально связан с уникальной сигнальной последовательностью, стартовым кодоном и индуцируемой промоторной системой;
ii) трансформацию другой клетки-хозяина с помощью другого плазмидного вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 3, кодирующую тяжелую цепь ранибизумаба, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID No. 4, где N-конец указанной SEQ ID No. 3 функционально связан с уникальной сигнальной последовательностью, стартовым кодоном и индуцируемой промоторной системой.
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является создание нового способа экспрессии белка для получения ранибизумаба, который предусматривает следующие стадии:
i) экспрессии легкой и тяжелой цепей отдельно в двух различных экспрессирующих клетках-хозяевах;
ii) экспорта белка в периплазматическое пространство клеток с помощью уникальной сигнальной последовательности;
iii) рефолдинг частично очищенных белков легкой и тяжелой цепей друг с другом in vitro.
Другим вариантом осуществления настоящего исследования является создание нового способа очистки белка ранибизумаба, имеющего аминокислотную последовательность SEQ. ID. No. 2 и 4, который предусматривает:
i) культивирование клеток-хозяев при высокой плотности клеток в среде для роста при поддержании специфичных условий культивирования;
ii) экспрессию белка в форме периплазматических телец включения;
iii) рефолдинг белка обеих цепей друг с другом in vitro;
iv) очистку правильно свернутого белка.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является создание улучшенного способа очистки ранибизумаба, который предусматривает:
i) рефолдинг белка in vitro;
ii) выполнение анионообменной хроматографии для отделения неправильно свернутых близкородственных молекул белка;
iii) выполнение катионообменной хроматографии, за которой следует
iv) ультрафильтрация/диафильтрация.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является создание улучшенного способа очистки ранибизумаба, при помощи которого можно отделить даже очень близкородственные неправильно свернутые молекулы белка (степень очистки белка >95%).
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является создание последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1, кодирующей легкую цепь ранибизумаба, где N-конец указанной SEQ ID No. 1 функционально связан с уникальной сигнальной последовательностью (SEQ ID No. 5).
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является создание последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 3, кодирующей тяжелую цепь ранибизумаба, где N-конец указанной SEQ ID No. 3 функционально связан с уникальной сигнальной последовательностью (SEQ ID No. 6).
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является обеспечение применения уникальной сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 5, для получения антитела к VEGF.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является обеспечение применения уникальной сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 6, для получения антитела к VEGF.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является обеспечение применения уникальной сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 5, для получения легкой цепи ранибизумаба.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является обеспечение применения уникальной сигнальной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 6, для получения тяжелой цепи ранибизумаба.
Аминокислотная последовательность уникальной сигнальной последовательности для легкой цепи ранибизумаба представляет собой
Аминокислотная последовательность уникальной сигнальной последовательности для тяжелой цепи ранибизумаба представляет собой
Настоящее изобретение будет дополнительно описано с помощью следующих примеров, которые являются скорее иллюстративными, чем ограничивающими.
Пример 1
Создание вектора pCDL18-LC для легкой цепи ранибизумаба
Создание бактериального экспрессирующего вектора для легкой цепи ранибизумаба осуществляли с помощью клонирования легкой цепи ранибизумаба вместе с сигнальной последовательностью (SEQ ID No. 1) на 5'-конце в сайт Ncol/HindIII во множественном сайте клонирования (MCS) вектора pCDL18-LC.
Ниже приведены ключевые компоненты синтетической генной кассеты и схематическое изображение.
Создание вектора pCDL18-HC для тяжелой цепи ранибизумаба
Создание бактериального экспрессирующего вектора для тяжелой цепи ранибизумаба осуществляли с помощью клонирования тяжелой цепи ранибизумаба вместе с сигнальной последовательностью (SEQ ID No. 3) на 5'-конце в сайт Ndel/Xhol в векторе pCDL18-НС.
Ниже приведены ключевые компоненты синтетической генной кассеты и схематическое изображение.
Пример 2
Трансформация гена легкой цепи в BL21 (DE3)
Вектор pSR04, несущий экспрессирующую конструкцию для гена легкой цепи (pCDL18-LC), трансформировали в BL21 (DE3), и отобрали рекомбинантные клоны.
Трансформанты помещали в чашки с агаровой средой LB, содержащие канамицин (30 мкг/мл) для отбора. Анализ экспрессии белка также выполняли после индуцирования клеток 1 мМ IPTG во встряхиваемой колбе в течение 4 часов. С целью отбора клонов анализировали цельный клеточный лизат и образцы внеклеточного белка.
Трансформация гена тяжелой цепи в BL21 (DE3)
Вектор pSR02, несущий экспрессирующую конструкцию для гена тяжелой цепи (pCDL18-НС), трансформировали в BL21 (DE3), и отобрали рекомбинантные клоны. Трансформанты помещали в чашки с агаровой средой LB, содержащие ампициллин для отбора. Анализ экспрессии белка также выполняли после индуцирования клеток 1 мМ IPTG во встряхиваемой колбе в течение 4 часов. С целью отбора клонов анализировали цельный клеточный лизат и образцы внеклеточного белка.
Пример 3
Общая экспрессия легкой и тяжелой цепей отдельно в двух различных экспрессирующих клетках-хозяевах в Е.coli
Для увеличения требуемой экспрессии белка легкую и тяжелую цепи ранибизумаба клонировали в две отдельные векторные системы и трансформировали индивидуально в двух различных клетках Е.coli. Экспрессия белка происходила из промоторной системы Т7. Обе эти конструкции, способные к экспрессии белка строго регулируемым способом, вносили при помощи этих многократно копированных плазмид.
Избыточно экспрессированные рекомбинантные белки очищали и определяли. Подтвердили, что первые 10 остатков на N-конце были последовательностями DIQLTQSPSS для легкой и EVQLVESGGG для тяжелой цепи, которые являлись аутентичными начальными последовательностями обеих цепей. Ясный и однозначный сигнал получали для всех 10 остатков.
Пример 4
Создание целевого белка в форме периплазматических телец включения
Рекомбинантные клетки Е.coli культивировали во встряхиваемых колбах (посевных колбах) для приготовления и получения инокулята; потом инокулят, полученный из посевной колбы, переносили в ферментер и культивировали в течение 25 часов в культуре с подпиткой. В течение ферментации клетки обеспечивали воздухом и кислородом посредством опрыскивания. Рост клеток поддерживали с помощью контролируемого добавления подкормки (питательных добавок) при постоянном контроле режима рН, при этом рН поддерживали подачей глюкозы и азота в подкормку для снижения рН порции. При необходимости использовали основание (NaOH) для увеличения рН порции. Клетки индуцировали IPTG на 20-й час зрелости порции, затем ферментацию проводили еще 5 часов. Требуемый белок производили в форме периплазматических IB.
Для легкой цепи плотность клеточной культуры (OD600) на выходе была ~50, а получаемая биомасса из нее составляла приблизительно 100 г/л, что давало приблизительно 25 г IB/л.
Сходным образом для тяжелой цепи плотность клеточной культуры (OD600) на выходе была ~100, а получаемая биомасса составляла приблизительно 155 г/л, что давало приблизительно 33 г IB/л.
Пример 5
Рефолдинг легкой и короткой цепей друг с другом
Каждые 25 г LC и НС солюбилизировали отдельно в 500 мл солюбилизационного буфера, содержащего 6 M GuHCI, и объединяли в отношении 1:1. Объединенный SIB восстанавливали с 4 мМ DTT в течение 1 часа. Восстановленную смесь LC и НС подвергали окислению с цистином в количестве 10 мМ и инкубировали в течение 3 часов. Восстановленный и окисленный SIB медленно разбавляли 25 раз в рефолдинг-буфере (100 мМ Tris, 0,6 M аргинин, 5% сорбит, 2 мМ EDTA, рН 9,0). 0,6 мМ цистина и 0,75 мМ цистеина добавляли в смесь для рефолдинга, и реакцию инкубировали при (2-8)°С ~ 5 дней. Полученный продукт рефолдинга концентрировали с применением мембраны с порами 10 кДа и подвергали диафильтрации в 50 мМ Tris-буфере с рН 9,0.
Выход и чистота после рефолдинга: выход правильно свернутого ранибизумаба после рефолдинга составлял приблизительно 18% от общего белка.
Пример 6
Очистка правильно свернутого белка
Продукт рефолдинга концентрировали с применением мембраны 10 с порами кДа и диафильтровали в 50 мМ Tris-буфере при рН 9,0. Продукт, полученный диафильтрацией, загружали на FF-смолу Q-сефарозы связующим образом и белок элюировали, уменьшая pH до 6,7 по линейному градиенту в 10 CV от 0% В до 100% В. Продукт, полученный после пропускания через Q-сефарозу, загружали на НР-смолу SP-сефарозы при рН 5,0. Белок элюировали посредством увеличения концентрации соли следующим образом: за 20% стадией следовал 20%-50% градиент и, наконец, стадия 100%-ного градиента. Объединенные фракции концентрировали и диафильтровали в приготовленном буфере, используя мембрану с порами 10 кДа.
Выход конечного продукта после очистки: полное восстановление способа очистки белка составило приблизительно 9% со степенью чистоты >99%.