СПОСОБ ОЦЕНКИ ДИНАМИКИ МЕТАБОЛИЗМА КРОВИ У БОЛЬНЫХ С ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМОЙ
METHOD OF BLOOD METABOLISM DYNAMICS ASSESSMENT FOR PATIENTS WITH HEAT INJURY

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к лабораторному исследованию биологических жидкостей.
В качестве прототипа выбран способ оценки динамики метаболизма системы крови, заключающийся в заборе крови и спектрометрическом исследовании в полученных пробах гемолизата амплитуд пиков полос поглощения (см. патент РФ №2315306, G01N 33/49, 2008 г.).
Однако известный способ является узкоспецифичным и не дает возможности ранней оценки нарушения окислительно-энергетических реакций у больного с термической травмой.
Задача предлагаемого изобретения - раннее выявление нарушения баланса энергетических реакций у больных с термической травмой.
Поставленная задача решается за счет того, что в способе, включающем забор крови, в гемолизате эритроцитов ожоговых больных определяют активность лактатдегидрогеназы, вычисляют коэффициент баланса энергетических реакций (КБЭР), и если показатель КБЭР у больных с ожогом выше показателя КБЭР здоровых людей, делают вывод о снижении скорости протекания окислительно-энергетических реакций.
Способ оценки динамики метаболизма крови у больных с термической травмой осуществляют следующим образом: в течение первых шести часов после травмы у больного забирают кровь из вены, стабилизируют ее цитратом натрия (3,8%) в соотношении 9:1, центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин, отделяют плазму от эритроцитов. Эритроцитарную массу промывают в 5 мл физиологического раствора. После осаждения (10 минут при 3000 об/мин) удаляют физиологический раствор с 10-15% поверхностно расположенных эритроцитов. Отмытые эритроциты гемолизируют в дистиллированной воде в соотношении 1:40. Затем в спектрофотометрическую кювету помещают 2,8 мл 0,05М глицин-щелочного буфера (pH 10), 0,05 мл 0,45 М раствора молочнокислого натрия, 0,1 мл 0,8 мМ окисленного никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и добавляют в смесь 0,05 мл гемолизата эритроцитов. Содержимое кюветы (3 мл) быстро перемешивают, измеряют величину его оптической плотности при 340 нм с интервалом 15 сек в течение 1 минуты и определяют активность фермента - лактатдегидрогеназы в прямой реакции (ЛДГпр, нмоль НАДН/мин) по формуле
,
340
340
1
2
2
где ΔЕ - величина оптической плотности, измеренной при 340 нм и рассчитанной следующим образом: ΔЕ=|(ΔE-ΔE/2)|+|ΔЕ|
1
30
0
2
60
0
ΔE=|Е-Е|; ΔЕ=|Е-E|;
3 - объем пробы в кювете в мл;
9
10 - коэффициент пересчета моль в нмоль;
6
6,22×10 - коэффициент молярной экстинкции для восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН);
t - время, в течение которого измеряют активность лактатдегидрогеназы в мин.
Затем в спектрофотометрическую кювету помещают 2,8 мл 0,05М фосфатного буфера (pH 7,4), 0,05 мл 0,15 М раствора пировинограднокислого натрия, 0,1 мл 10 мМ восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) и добавляют в смесь 0,05 мл гемолизата эритроцитов. Содержимое кюветы (3 мл) быстро перемешивают, измеряют величину его оптической плотности при 340 нм с интервалом 15 сек в течение 1 минуты и определяют активность фермента - лактатдегидрогеназы в обратной реакции (ЛДГобр, нмоль НАДН/мин) по формуле
,
340
340
1
2
2
где ΔE - величина оптической плотности, измеренной при 340 нм и рассчитанной следующим образом: ΔЕ=|(ΔE-ΔЕ/2)|+|ΔЕ|
1
30
0
2
60
0
ΔE=|Е-Е|; ΔЕ=|Е-Е|;
3 - объем пробы в кювете в мл;
9
10 - коэффициент пересчета моль в нмоль;
6
6,22×10 - коэффициент молярной экстинкции для восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН);
t - время, в течение которого измеряют активность лактатдегидрогеназы в мин.
Затем вычисляют коэффициент баланса энергетических реакций (КБЭР) по формуле
КБЭР=(ЛДГпр/ЛДГобр)/(ЛДГобр/ЛДГпр)×100, где
ЛДГпр - активность прямой лактатдегидрогеназы (нмоль НАДН/мин);
ЛДГобр - активность обратной лактатдегидрогеназы (нмоль НАДН/мин);
100 - поправочный коэффициент.
Норма представлена кровью здоровых людей. У здоровых людей активность ЛДГпр составляет 56,23±0,35 нмоль НАДН/мин, активность ЛДГобр составляет 315,41±0,75 нмоль НАДН/мин, КБЭР равен 3,10±0,07. Затем сравнивают КБЭР ожоговых больных с КБЭР здоровых людей, и если показатель КБЭР у больного с ожогом выше показателя КБЭР здоровых людей, делают вывод о снижении метаболизма у пациентов.
Результаты исследования активности лактатдегидрогеназы в прямой и обратной реакциях (нмоль НАДН/мин) и величины коэффициента баланса энергетических реакций (КБЭР) в гемолизате эритроцитов 20 ожоговых больных представлены в таблице.
Активность лактатдегидрогеназы (нмоль НАДН/мин) и коэффициент баланса энергетических реакций в гемолизате эритроцитов в норме и при ожоге
№
Здоровые, n=20
Больные с ожогом, n=20
ЛДГпр
ЛДГобр
КБЭР
ЛДГпр
ЛДГобр
КБЭР
1
55,66
313,94
3
50,21
160,21
10
2
56,78
315,67
3
47,48
165,48
8
3
58,13
317,22
3
47,94
167,10
8
4
52,94
317,56
3
51,21
161,45
10
5
54,16
318,97
3
49,23
159,17
10
6
56,21
316,42
3
48,16
158,34
9
7
58,01
309,21
4
49,54
159,21
10
8
56,34
310,43
3
50,21
161,97
10
9
56,13
312,54
3
49,45
162,54
9
10
55,42
319,72
3
48,02
161,18
9
11
57,21
317,66
3
49,72
160,35
10
12
55,94
316,51
3
50,61
161,15
10
13
56,33
316,21
3
47,54
162,58
8
14
52,99
315,25
3
47,68
163,24
8
15
59,07
317,48
4
49,51
164,95
9
16
57,88
319,94
3
49,17
162,87
9
17
55,97
311,26
3
48,61
164,58
9
18
56,20
310,21
3
45,21
162,64
8
19
57,05
312,48
3
49,31
165,45
9
20
56,20
319,46
3
51,16
162,78
10
M±m
56,23
315,41
3,10
49,01
162,36
9,15
±0,35
±0,75
±0,07
±0,32
±0,52
±0,18
Примечания: ЛДГпр - активность лактатдегидрогеназы в прямой реакции, ЛДГобр - активность лактатдегидрогеназы в обратной реакции,КБЭР - коэффициент баланса энергетических реакций, n - количество людей.
Клинический пример
340
Будилов М.П., 25 лет, история болезни №200473, получил ожог пламенем на площади 45% поверхности тела. Спустя несколько часов после травмы взяли кровь из вены, стабилизировали ее 3,8% раствором цитрата натрия, приготовили гемолизат отмытых эритроцитов, 0,05 мл которого поместили в спектрофотометрическую кювету, содержащую 2,8 мл 0,05М глицин-щелочного буфера, 0,05 мл 0,45 М раствора молочнокислого натрия, 0,1 мл 0,8 мМ окисленного никотинамидадениндинуклеотида (НАД), и измерили величину оптической плотности при длине волны 340 нм (Е) в течение 1 минуты с интервалом 15 секунд:
Время
0
15 сек
30 сек
45 сек
1 мин
Е<sub>340</sub>
0,100
0,134
0,152
0,185
0,200
340
1
2
2
1
2
340
Рассчитали величину оптической плотности при 340 нм за 1 минуту по формуле ΔЕ=|(ΔE-ΔЕ/2)|+|ΔЕ|, где ΔE - величина оптической плотности, измеренная за 30 сек, ΔЕ - величина оптической плотности, измеренная за 1 мин. Таким образом, ΔЕ=(0,052-0,050)+0,100=0,102.
После этого рассчитали активность фермента - лактатдегидрогеназы в прямой реакции - по формуле
,
340
где ΔЕ - величина оптической плотности, измеренной при 340 нм за мин;
3 - объем пробы в кювете;
9
10 - коэффициент пересчета моль в нмоль;
6
6,22×10 - коэффициент молярной экстинкции для восстановленного никотинамидадениндинуклеотида;
t - время, в течение которого измеряют активность лактатдегидрогеназы в мин.
Таким образом,
340
Затем 0,05 мл гемолизата эритроцитов поместили в спектрофотометрическую кювету, содержащую 2,8 мл 0,05 М фосфатного буфера, 0,05 мл 0,15 М раствора пировинограднокислого натрия, 0,1 мл 10 мМ восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН), и измерили величину оптической плотности при длине волны 340 нм (Е) в течение 1 минуты с интервалом 15 секунд:
Время
0
15 сек
30 сек
45 сек
1 мин
Е<sub>340</sub>
0,800
0,740
0,620
0,580
0,500
340
1
2
2
1
2
340
Рассчитали величину оптической плотности при 340 нм за минуту по формуле ΔЕ=|(ΔE-ΔЕ/2)|+|ΔЕ|, где ΔE - величина оптической плотности, измеренная за 30 сек, ΔЕ - величина оптической плотности, измеренная за 1 мин. Таким образом, ΔЕ=(0,180-0,150)+0,300=0,330.
После этого рассчитали активность фермента - лактатдегидрогеназы в обратной реакции - по формуле
,
340
где ΔЕ - величина оптической плотности, измеренной при 340 нм за мин;
3 - объем пробы в кювете;
9
10 - коэффициент пересчета моль в нмоль;
6
6,22×10 - коэффициент молярной экстинкции для восстановленного никотинамидадениндинуклеотида;
t - время, в течение которого измеряют активность лактатдегидрогеназы в мин.
Таким образом,
Затем рассчитали коэффициент баланса энергетических реакций по формуле
КБЭР=(ЛДГпр/ЛДГобр)/(ЛДГобр/ЛДГпр)×100, где
ЛДГпр - активность прямой лактатдегидрогеназы (нмоль НАДН/мин);
ЛДГобр - активность обратной лактатдегидрогеназы (нмоль НАДН/мин);
100 - поправочный коэффициент.
Таким образом, КБЭР=(49,23/159,17)/(159,17/49,23)×100=10
Коэффициент баланса энергетических реакций у Будилова М.П. равен 10 и повышен по сравнению с КБЭР здоровых людей (равен 3), что свидетельствует о снижении у него интенсивности энергетического метаболизма.
Способ оценки динамики метаболизма крови у больных с термической травмой простой и быстрый в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и большого количества биологического материала. Способ позволяет в ранние сроки определить нарушения энергетического метаболизма и возможные осложнения у больных с термической травмой.