Способ лечения болезней легких ингаляционным введением мезенхимальных стромальных клеток и гексапептида
METHOD FOR TREATMENT OF LUNG DISEASES BY INHALATION ADMINISTRATION OF MESENCHYMAL STROMAL CELLS AND HEXAPEPTIDE

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области здравоохранения. Более конкретно, изобретение относится к способу лечения болезни легких, связанных с повышенными уровнями интерлейкина-6, ингаляционным внутрилегочным введением мезенхимальных стромальных клеток и гексапептида.
Сведения о предшествующем уровне техники
Tanaka T et al. Interleukin (IL-6) Immunotherapy. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2018, 10(8):a028456
Rincon M, Irvin CG. Role of IL-6 in asthma and other inflammatory pulmonary diseases. Int J Biol Sci. 2012;8(9):1281-90
Celli BR et al. Inflammatory biomarkers improve clinical prediction of mortality in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012, 185(10):1065-72
McGonagle D et al. Autoimmun Rev. 2020, 19(6):102537
Papiris SA et al. Cytokine. 2018, 102:168-172
Andrijevic I et al. Ann Thorac Med. 2014, 9(3):162-7
Henry BM et al., Hematologic, biochemical and immune biomarker abnormalities associated with severe illness and mortality in coronavirus disease 2019 (COVID-19): a meta-analysis. Clin. Chem. Lab. Med. 2020;58(7):1021–1028
Udomsinprasert W et al., Circulating levels of interleukin-6 and interleukin-10, but not tumor necrosis factor-alpha, as potential biomarkers of severity and mortality for COVID-19: systematic review with meta-analysis. J. Clin. Immunology. 2021;41(1):11–22
Болезни легких часто сопровождаются чрезмерной продукцией интерлейкина-6 (ИЛ-6), которая вызывает синдром системной воспалительной реакции, состояние гиперкоагуляции при острых и хронических иммуноопосредованных заболеваниях легких. . ИЛ-6 продуцируется первичными эпителиальными клетками легких при астме и других болезнях легких, причем уровень ИЛ-6 определяет тяжесть нарушений функций легких. . Уровень ИЛ-6 является прогностическим фактором увеличения смертности при хронической обструктивной болезни легких. . Устойчивое повышение уровней ИЛ-6 наблюдается при остром респираторном дистресс-синдроме взрослых (ОРДС), возникающем вследствие вирусных и бактериальных инфекций, в том числе при COVID-19. . Повышение уровней ИЛ-6 является патологическим фактором при фиброзе легких. . Повышение уровней ИЛ-6 у пациентов с пневмонией коррелирует с тяжестью заболевания и является биомаркером смертности от пневмонии. . Повышенные уровни ИЛ-6 связаны с тяжелым течением и смертностью при COVID-19. . . Таким образом, существует необходимость в снижении патологически высоких уровней ИЛ-6 для снижения тяжести болезней легких и снижения риска смертности от этих заболеваний.
Dominici M et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 8(4):315-7, 2006
Galipeau J et al., International Society for Cellular Therapy perspective on immune functional assays for mesenchymal stromal cells as potency release criterion for advanced phase clinical trials. Cytotherapy 18, 151–159, 2016
Ji HL et al., Stem cell therapy for COVID-19 and other respiratory diseases: Global trends of clinical trials. World J Stem Cells. 2020 Jun 26;12(6):471-480
Zanirati G et al., Stem cell-based therapy for COVID-19 and ARDS: a systematic review. NPJ Regen Med. 2021 Nov 8;6(1):73
Fröhlich E. Therapeutic Potential of Mesenchymal Stem Cells and Their Products in Lung Diseases-Intravenous Administration versus Inhalation. Pharmaceutics. 2021 Feb 7;13(2):232
6
6
К мезенхимальным стромальным клеткам (МСК), известным также как мезенхимальные стволовые клетки, относят клеточные линии, удовлетворяющие критериям, установленным Международным обществом клеточной терапии (ISCT). . . МСК могут быть выделены из различных тканей млекопитающих, включая костный мозг, жировую ткань, пуповину, кровь, студень Вартона, бронхеоальвеолярный лаваж и т.д. После выделения МСК культивируют вне организма и используют для лечения болезней легких. Эффективность МСК в лечении респираторных заболеваний, включая коронавирусную болезнь 2019 (COVID-19), бронхолегочную дисплазию, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), эмфизему, острое повреждение легких, острый респираторный дистресс-синдром, легочный фиброз, легочную артериальную гипертензию, была изучена более, чем в 80 клинических исследованиях. МСК вводились пациенту в дозах от долей миллиона до миллиарда клеток на кг массы тела в виде внутривенных инфузий, подкожных инъекций, инъекцией в легочную артерию, интраназально, и интратрахеально. . Эффективность МСК в лечении COVID-19 изучалась в более, чем в двадцати клинических исследованиях. МСК выделенные из костного мозга человека, жировой ткани человека, менструальной крови, пуповины человека, перинатальной ткани вводились пациенту в дозах от 1,0x10 до 10,0x10 клеток/кг массы тела. В половине исследований клеточная терапия снижала уровни ИЛ-6 и улучшала насыщение (сатурацию) кислородом крови. . Ингаляционное введение МСК в виде аэрозолей также известно из уровня техники. Этот тип введения не снижает жизнеспособность клеток и может быть использован в качестве альтернативы внутривенным инфузиям. .
Гексапептид H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH представляет собой аналог эндогенного пептида динорфина 1-6, полученный заменой Gly на D-Ala в положении 2 аминокислотной последовательности. Использование гексапептида для лечения респираторных заболеваний при внутрилегочном (ингаляционном) введении в дозах от 0,001 до 1,000 мг/кг массы тела млекопитающего раскрыто в патентах RU 2728821, 2728938, 2728939, 2733269, 2737790, 2739573. Уксуснокислая соль гексапептида в форме ингаляций является коммерчески доступным лекарственным средством в Российской Федерации для лечения COVID-19.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что ингаляционное введение гексапептида H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH и мезенхимальных стромальных клеток обеспечивает синергический эффект в лечении болезней легких, в том числе связанных с чрезмерной продукцией интерлейкина-6 (ИЛ-6).
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу лечения болезни легких, связанной с повышенными уровнями интерлейкина-6, включающий ингаляционное введение терапевтически эффективных количеств мезенхимальных стромальных клеток млекопитающих и терапевтически эффективных количеств гексапептида формулы H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH (I) или его фармацевтически приемлемой соли в млекопитающего, нуждающегося в этом, где указанные клетки и гексапептид (I) вводят по отдельности последовательно в течение одних суток или смешивают непосредственно перед введением и вводят одновременно.
Технический результат настоящего изобретения состоит в том, что ингаляционное введение МСК и гексапаптида (I) обеспечивает синергический эффект в лечении болезни легких, связанной с чрезмерной продукцией интерлейкина-6 (ИЛ-6), т.е. эффект совместного введения МСК и гексапаптида (I) больше, чем сумма эффектов МСК и гексапаптида (I), вводимых в тех же дозах и при одних и тех же условиях, но по отдельности.
Dominici M et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 8(4):315-7, 2006
Galipeau J et al., International Society for Cellular Therapy perspective on immune functional assays for mesenchymal stromal cells as potency release criterion for advanced phase clinical trials. Cytotherapy 18, 151–159, 2016
Термин «мезенхимальные стромальные клетки», эквивалентный термин «мезенхимальные стволовые клетки», сокращенно МСК, относится к любой клеточной линии, удовлетворяющей критериям, выработанным Международным обществом клеточной терапии (ISCT) как описано в  и/или в .
При осуществлении настоящего изобретения, МСК могут быть выделены из любой ткани млекопитающего, которая содержит эти клетки. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, МСК выделяют из ткани млекопитающего, выбранной из группы, состоящей из костного мозга, жировой ткани, пуповины, и плаценты. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, МСК выделяют из костного мозга или жировой ткани человека.
Mosna F et al. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide.Stem Cells Dev. 2010 Oct;19(10):1449-70
Приготовление МСК может быть выполнено согласно процедурам, известным из технического уровня, например, как описано в . Например, приготовление МСК млекопитающего может включать следующие этапы: выделение клеток из ткани млекопитающего, в частности костного мозга или жировой ткани, культивацию клеток в подходящей среде для увеличения количества клеток, контроль качества, включающий проверку клеток на жизнеспособность и соответствие критериям ISCT для МСК.
При осуществлении изобретения, МСК может входить в состав биомедицинского клеточного продукта как активный ингредиент.
Термин «биомедицинский клеточный продукт», сокращенно БМКП, относится к комплексу, состоящему из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ либо из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ в сочетании с прошедшими государственную регистрацию лекарственными препаратами для медицинского применения (далее - лекарственные препараты) и (или) медицинскими изделиями.
При осуществлении изобретения, БМКП может быть приготовлен в виде водной суспензии клеток путем смешивания МСК и вспомогательных веществ в фармацевтической воде в асептических условиях.
Используемый здесь термин «фармацевтическая вода» относится к воде, которая соответствует требованиям нормативных документов Российской Федерации и/или других стран, например, требования ФС.2.2.0020.15 «Очищенная вода» и требования ФС.2.2.0019.15 «Вода для инъекций» фармакопеи Российской Федерации; и/или CPMP/QWP/158/01 «Note for Guidance on Quality of Water for Pharmaceutical Use», EMEA, 2002. Предпочтительно, фармацевтическая вода выбирается из группы, состоящей из очищенной воды и воды для инъекций.
При осуществлении изобретения БМКП может содержать вспомогательные вещества. Неисключительные примеры вспомогательных веществ включают метаболиты, регуляторы тоничности раствора, буферные системы, криопротекторы, витамины, и белки (например, сывороточный альбумин).
Неисключительные примеры метаболитов для поддержания метаболической активности МСК в водной суспензии включают глюкозу, бета-гидроксибутират; субстраты цикла трикарбоновых кислот такие как цитрат, 2-кетоглутарат, сукцинат, фумарат, малат; аминокислоты такие как аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, гистидин, глицин, глутамин, глютаминовая кислота, пролин, серин, тирозин, валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, и фениалалнин.
Неисключительные примеры регуляторов тоничности включают подходящий осмотически активный неорганический агент, такой как хлориды, сульфаты или фосфаты натрия, кальция или магния; подходящий осмотически активный органический агент, такой как сахара и сахарные спирты, в частности трегалоза, маннитол и сорбитол. Предпочтительным регулятором тоничности является хлорид натрия в количестве от 0,1 до 0,9% от указанной композиции.
Используемый здесь термин «буферная система» описывает комбинацию кислоты и основания в количествах, достаточных для поддержания желаемого уровня pH. Неисключительные примеры фармацевтически приемлемых буферных систем для поддержания рН в диапазоне от 3,0 до 8,5 описаны в Фармакопее Российской Федерации (OFS.1.3.0003.15 «Буферные растворы») и включают ацетатный буфер, цитратный буфер, сукцинатный буфер, фосфатный буфер, и бикарбонатный буфер.
Неисключительные примеры криопротекторов включают диметилсульфоксид и пропиленгликоль.
Неисключительные примеры витаминов включают аскорбиновую кислоту и никотинамид.
При осуществлении настоящего изобретения, БМКП может приготавливаться как аутологичный биомедицинский клеточный продукт, аллогенный клеточный продукт, и комбинированный биомедицинский клеточный продукт.
Термин «аутологичный», используемый в настоящем изобретении относится к биомедицинскому клеточному продукту, содержащему в своем составе клеточную линию (клеточные линии), полученную из биологического материала определенного млекопитающего (например, человека), и предназначенный для применения этому же млекопитающему (человеку).
Термин «аллогенный», используемый в настоящем изобретении относится к биомедицинскому клеточному продукту, содержащему в своем составе клеточную линию (клеточные линии), полученную из биологического материала определенного млекопитающего (например, человека), и предназначенный для применения другому млекопитающему (человеку).
Термин «комбинированный», используемый в настоящем изобретении относится к биомедицинскому клеточному продукту, содержащему в своем составе клеточные линии, полученные из биологического материала нескольких млекопитающих (людей), и предназначенный для применения одному из них.
Термин «эффективное количество» относится к такому количеству действующего ингредиента, которое достаточно для того чтобы обеспечить желаемый терапевтический эффект.
6
9
Ji HL et al., Stem cell therapy for COVID-19 and other respiratory diseases: Global trends of clinical trials. World J Stem Cells. 2020 Jun 26;12(6):471-480
Терапевтически эффективные количества МСК при введении млекопитающему известны из уровня техники и составляют от 0,1x10 до 1,0x10 клеток/кг массы тела млекопитающего (человека), как описано в . Выбор предпочтительных эффективных количеств МСК может быть осуществлен обычным квалифицированным специалистом в данной области (например, при помощи клинических испытаний) на основе рассмотрения таких факторов, как заболевание требующее лечения, масса тела пациента, иммунный статус пациента, а также любых других факторов известных квалифицированным специалистам.
6
9
6
6
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, терапевтически эффективные количества МСК при введении млекопитающему составляют от 0,1x10 до 1,0x10 клеток/кг массы тела млекопитающего (человека), более предпочтительно от 0,3x10 до 1,0x10 клеток/кг массы тела млекопитающего (человека).
При осуществлении изобретения, БМКП могут быть введены пациенту разными путями, включая без ограничения инъекционный (инфузионный) путь введения, наружный путь введенияо, ректальный путь введения, а также путь внутрилегочных ингаляций.
Термин «ингаляция», используемый в настоящем изобретении относится к вдыханию паров или дисперсии твердых или жидких частиц содержащих лекарственное средство и/или БМКП.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, эффективные количества МСК в составе БМКП вводят в легкие ингаляционно при помощи небулайзера в виде аэрозоля с размером частиц от 0,1 до 10,0 микрон, более предпочтительно от 1 до 5 микрон однократно или многократно, в течение одних суток или нескольких суток.
Averyanov A et al., Eur Respir J. 2013; 42:226
Термин «небулайзер» обозначает устройство для ингаляций, обеспечивающее преобразование жидкого лекарственного средства для распыления в дисперсию в газовой среде для доставки действующего вещества в легкие. Примеры небулайзеров включают компрессорные, ультразвуковые, либо меш небулайзеры. В компрессорных небулайзерах раствор подается в капиллярную трубку, где под действием сжатого газа формируется аэрозоль. В ультразвуковых небулайзерах вибрирующий с выокой частотой пьезоэлектрический кристалл генерирует аэрозоль. В меш небулайзерах для генерации аэрозоля раствор под давлением продавливается через микроскопические отверстия в вибрирующей пластине (мембрану) с множеством микроскопических отверстий. Все три типа небулайзеров могут быть использованы для ингаляционного введения МСК, как описано в .
McCarthy SD et al., J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 2020, 33(3):140-152
Неэксклюзивные примеры меш-небулайзеров для ингаляционного введения МСК включают Aerogen Solo вибрирующий меш небулайзер (Aerogen Ltd., Galway, Ireland) как описано, например, в .
Неэксклюзивные примеры компрессионных небулайзеров для ингаляционного введения МСК включают Delphinus F1000 (FLAEM NUOVA, Италия); Omron CompAir NE C-28 (Япония).
Неэксклюзивные примеры ультразвуковых небулайзеров для ингаляционного введения МСК включают Little Doctor LD 250U (Китай).
35
51
9
8
Гексапептид формулы (I) имеет брутто-формулу CHNO, молекулярную массу 725,84 дальтон и регистрационный номер CAS 81733-79-1 в качестве идентификатора.
Настоящее изобретение относится ко всем фармацевтически приемлемым солям и сольватам гексапептида формулы (I). Неисключительные примеры таких фармацевтически приемлемых солей включают хлорид, бромид, сульфат, ацетат, пируват, малат, фумарат и цитрат. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, фармацевтически приемлемой солью гексапептида формулы (I) является диацетат, химическое название тирозил-D-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат.
Гексапептид формулы (I) может быть получен любым способом, известным в данной области, в частности твердофазным синтезом. Гексапептид формулы (I) и его соли и сольваты коммерчески доступны, например, в каталоге Bachem № 4030569.0100. Гексапептид (I) диацетат представляет собой коммерчески доступный активный фармацевтический ингредиент, который выпускается несколькими производителями в Российской Федерации.
Терапевтически эффективные количества гексапептида (I) при ингаляционном (внутрилегочном) введении млекопитающему известны из уровня техники (RU 2737799) и составляют от 1 до 1000 мкг/кг веса тела млекопитающего. Оптимальное количество гексапептида (I), обычно используемое в клинике при введении человеку, составляет 10 мг в сутки, как указано, например, в инструкции по применению препарата лейтрагин.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, терапевтически эффективные количества гексапептида (I) при введении млекопитающему составляют от 1 до 1000 мкг/кг массы тела млекопитающего (человека).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гексапептид (I) в виде водного раствора вводят в легкие ингаляционно в форме аэрозоля с размером частиц от 0,1 до 10,0 микрон, более предпочтительно от 1 до 5 микрон.
В конкретных примерах вдыхание может происходить через распылитель или другое устройство для доставки аэрозоля в легкие.
Из уровня техники хорошо известны многочисленные способы и устройства, которые можно применять для генерирования указанных аэрозолей в терапевтически полезных диапазонах размеров и концентраций. В частности, это небулайзеры, дозированные ингаляторы (MDI) и ингаляторы для сухого порошка (DPI). Pilcer G. et al. Int J Pharm. 2010, 392(1-2):1-19. Распылители, такие как струйные распылители или ультразвуковые распылители, используются для доставки водных фармацевтических препаратов. Дозированный ингалятор MDI суспендирует или растворяет порошки лекарственного средства в жидких пропеллентах, и, когда отмеренное количество пропеллента высвобождается из накопительного контейнера, пропеллент испаряется и быстро расширяется для диспергирования порошкообразного лекарственного средства или жидкого лекарственного средства с каплями. Такие пропелленты включают, но не ограничиваются, хлорфторуглеродами, гидрохлорфторуглеродами или углеводородами. Ингалятор для сухого порошка DPI доставляет точно отмеренную дозу лекарства в легкие в виде сухого порошка. Он предназначен для создания аэрозоля лекарственного порошка в потоке воздуха для вдоха. При осуществлении изобретения любые способы и устройства, включая небулайзеры, MDI и DPI, могут использоваться для легочной доставки гексапептида формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли нуждающемуся в этом пациенту.
Термин «болезнь легких» означает болезнь органов дыхания, для которой нежелательное повышение уровней интерлейкина-6, как фактора, влияющего на тяжесть заболевания известно из уровня техники. К таким болезням легких относятся болезни классифицированные под кодами J00-J99 согласно Международной Классификации Болезней 10-го пересмотра (МКБ-10). Предпочтительно, к таким болезням легких относятся астма (код J45), острая тяжелая астма (J46), хронический астматический (обструктивный) бронхит (J44.-), хроническая обструктивная астма (J44.-), эозинофильная астма (J82), болезни легкого, вызванные внешними агентами (J60-J70) астматический статус (J46), бронхит (J40), простой и слизисто-гнойный хронический бронхит (J41), хронический бронхит (J42), эмфизема (J43), хроническая обструктивная легочная болезнь (коды J44.0; J44.1; J44.8; J44.9), грипп и пневмония (J10-J18); пневмокониоз, вызванный внешним агентом (J60-J65); болезнь дыхательных путей, вызванная специфической органической пылью (J66); гиперсенситивный пневмонит, вызванный органической пылью (J67); респираторные состояния, вызванные вдыханием химических веществ, газов, дымов и паров (J68); пневмонит, вызванный твердыми веществами и жидкостями (J69); респираторные состояния, вызванные другими внешними агентами (J70); синдром респираторного расстройства [дистресса] у взрослого (J80); легочный отек (J81); альвеолярные и парието-альвеолярные нарушения (J84.0); другие интерстициальные легочные болезни с упоминанием о фиброзе (J84.1); другие уточненные интерстициальные легочные болезни (J84.8); интерстициальная легочная болезнь, неуточненная (J84.9); абсцесс легкого и средостения (J85).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, болезнь легких выбирается из группы, состоящей из острого воспалительного поражения легких, острого респираторного дистресс-синдрома, пневмонии, хронической обструктивной болезни легких, эмфиземы, астмы, COVID-19.
Используемый здесь термин «лечение» означает предотвращение, уменьшение или ингибирование развития заболевания, к которому применяется этот термин, или одного или нескольких симптомов этого заболевания. Термин «лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим мерам. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, у кого уже есть расстройство, тех, кто склонен иметь расстройство, теху у кого диагностировано расстройство, или тех, у кого расстройство должно быть предотвращено.
Используемый здесь термин «млекопитающее» относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, например, мыши, крысе, и человеку. Предпочтительно, млекопитающее это человек.
При осуществлении изобретения, эффективное количество МСК и гексапептида (I) или его фармацевтически приемлемой соли вводят в легкие млекопитающего путем непрерывной ингаляции в течение периода от 1 минуты до 2 часов, предпочтительно, от 30 до 60 минут, один раз в день или больше, в течение одного дня или нескольких дней.
При осуществлении изобретения терапевтически эффективное количество МСК и гексапептида (I) или его фармацевтически приемлемой соли можно вводить в легкие млекопитающего последовательно или одновременно. При одновременном введении указанные клетки и гексапептид (I) смешивают непосредственно перед введением и вводят в составе единой комбинации. При последовательном введении, МСК и гексапептид (I) вводятся в легкие млекопитающего по отдельности, в течение одних суток, с перерывом между введениями от минут до нескольких часов.
6
9
При осуществлении изобретения терапевтически эффективные количества МСК (от 0,1x10 до 1,0x10 клеток/кг массы тела млекопитающего) и гексапептида (I) или его фармацевтически приемлемой соли (1 до 1000 мкг/кг веса тела млекопитающего) смешивают непосредственно перед введением в физиологическом растворе, и полученную суспензию вводят в легкие млекопитающего с помощью небулайзера, например, Delphinus F1000 (FLAEM NUOVA, Италия).
6
6
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, терапевтически эффективные количества МСК (от 0,3x10 до 1,5x10 клеток/кг массы тела человека) в 10 мл физиологического раствора смешивают с 10 мг гексапептида (I) или его фармацевтически приемлемой соли непосредственно перед введением, и полученную суспензию непрерывно вводят в легкие человека, с помощью небулайзера, например, Delphinus F1000 со скоростью введения 0,2-0,3 мл/мин в течение 30-50 мин, однократно.
Следующие примеры демонстрируют изобретение. Примеры иллюстрируют изобретение и не предназначены для ограничения объема изобретения тем или иным образом.
Пример 1
Пример иллюстрирует способ лечения настоящего изобретения.
Получение МСК
Gnecchi M, Melo LG. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, characterization, viral transduction, and production of conditioned medium. Methods Mol Biol. 2009;482:281-94.
Boregowda SV et al. Isolation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Methods Mol Biol. 2016;1416:205-23
Dominici M et al. Cytotherapy 8(4):315-7, 2006
2
2
2
: мезенхимальные стромальные клетки мыши были получены согласно процедуре, детально описанной в  Кратко, клетки костного мозга выделяли из бедренных и большеберцовых костей мышей C57Bl/6, возраст 6-9 недель, путем промывания костей с помощью коммерчески доступной среды DMEM (состав с низким содержанием глюкозы) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% витаминов, 1% глютамина, 1% заменимых аминокислот. Далее клетки центрифугировали, ресуспендировали в свежей питательной среде и подсчитывали. Изолированные таким образом клетки высевали во флаконы с площадью поверхности 75 мм и выращивали в инкубаторе при 37°C / 5% CO / 5% O в течение 48 часов. Флаконы с клетками были промыты раствором PBS (phosphate buffered saline) для удаления всех неприлипающих клеток. Прикрепленные клетки культивировали со сменой среды в первый раз через 48 часов после посева и затем каждые 72 часа. При достижении слияния колоний клеток на 80%, клетки собирали, ресуспендировали и повторно засевали. Процедуру повторяли несколько раз при достижении слияния колоний на 90%. Подтверждение фенотипа МСК проводили как описано в  и согласно критериям описанным в . Полученные таким образом МСК использовали в в виде водной суспензии для лечения болезни легкого.
Получение водной суспензии МСК №1
: водная суспензия МСК была получена ресуспендированием клеток в физилогическом растворе в пропорциях, указанных в таблице 1.
Таблица 1. Состав водной суспензии МСК №1.
Ингредиент
Содержание
МСК
1,2x10<sup>5</sup> клеток
Физ.раствор
1,0 мл
Модель воспалительного повреждения легких
D'Alessio FR. Mouse Models of Acute Lung Injury and ARDS. Methods Mol Biol. 2018, 1809:341-350
Aoyagi T et al. Int Immunol. 2011, 23(2):97-108
. Эффективность способа настоящего изобретения была протестирована на модели острого воспалительного поражения легких, вызванного внутритрахеальным введением липополисахарида E.coli (ЛПС, Sigma-Aldrich) самцам мышей C57Bl/6 как описано в  с предварительной сенсибилизацией 1 мкг/мышь α-галактозилцерамидом (α-GalCer, KRN7000, Sigma-Aldrich) как описано в . Через 24 часа после сенсибилизации α-галактозилцерамидом, мышам вводили интратрахеально ЛПС (E.coli; 300 мкг/мышь) с добавлением 10 мкл/мышь полного адъюванта Фрейнда. Эта модель характеризуется острым перепроизводством ИЛ-6 в легких, причем это перепроизводство связано с острым повреждением легких, отеком легких, острым респираторным дистресс-синдромом, и пневмонией. Другими симптомами смоделированного респираторного заболевания, связанного с ИЛ-6, были угнетение двигательной активности, нарушение координации, недостаточное широкое раскрытие век и опущение, низкий мышечный тонус, снижение аппетита, потребления воды и мочеиспускания; а также нарушение дыхания.
Введение препаратов
6
6
. Через 30 мин после индукции воспаления интратрахеальным введением ЛПС, мышам вводили ингаляционно однократно 50 мкл физ. раствора (контроль, n=5); 50 мкл суспензии МСК в физ.растворе (доза 0,3x10 клеток/кг; n=5), 50 мкл раствор гексапептида (I) в физ.растворе (доза 10 мкг/кг; n=5); или 50 мкл суспензии (n=5), полученной смешиванием суспензии МСК в физ. растворе (доза 0,3x10 клеток/кг) и гексапептида (I) (доза 10 мкг/кг) непосредственно перед введением с использованием компрессионного ингалятора Omron CompAir NE C-28, снабженного специально сконструированной насадкой для введения аэрозоля животным.
Измерение ИЛ-6
. Уровни ИЛ-6 определяли в водном экстракте гомогенатов легких, полученных от животных через 2 часа после введения препаратов с использованием Bio-Plex MAGPIX™ Multiplex Reader, коммерчески доступной панели (Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine Th17 Panel A 6-Plex # M6000007NY, и программы анализа данных Bio-Plex Data Pro (версия 1.0.0.06) компании Bio-Rad.
Результаты
фр
пр
фр
пр
. Результаты представлены в таблице 2 как среднее ± ошибка среднего (SEM) концентраций ИЛ-6 в легких. Для сравнения, средний уровень ИЛ-6 в легких у интактных мышей составлял 0,12 нг/мл. Статистический анализ проводился с помощью one-way ANOVA, пос-тест Тьюки для множественного сравнения между группами. Эффект (Δ) воздействия препарата на уровни ИЛ-6 оценивался по формуле Δ= [ИЛ-6] – [ИЛ-6], где [ИЛ-6] – это средняя концентрация ИЛ-6 в легких мышей получивших физ. раствор и [ИЛ-6] – это средняя концентрация ИЛ-6 в легких мышей получивших препарат.
Таблица 2. Уровни ИЛ-6 (среднее ± SEM) в легких мышей с воспалительным поражением легких после введения указанных препаратов.
Препарат
ИЛ-6, нг/мл
Δ, нг/мл
Физ. раствор
1,86 ± 0,06
-
МСК (0.3x10<sup>6</sup> клеток/кг)
1,54 ± 0,02*
0,32
Гексапептид (I) (10 мкг/кг)
1,49 ± 0,12*
0,37
МСК (0.3x10<sup>6</sup> клеток/кг) + Гексапептид (I) (10 мкг/кг)
0,92 ± 0,08*
0,94
*Достоверно отличается от контроля (p<0,05).
Таблица 2 показывает, что эффект совместного введения МСК и гексапептида (I), больше, чем сумма эффектов МСК и гексапептида (I), введенных индивидуально в тех же дозах: 0,94 > 0,69 (0,32+0,37). Таким образом, способ лечения настоящего изобретения обеспечивает синергический эффект снижения уровней ИЛ-6, ключевого патогенетического фактора, определяющего тяжесть заболевания при болезни легких.
Пример 2
Пример иллюстрирует способ настоящего изобретения.
Приготовление суспензии МСК №№2-3
. Суспензии №№2-3 были приготовлены ресуспендированием МСК из костного мозга мыши, полученных как описано в примере 1, в физ.растворе в пропорциях, указанных в таблице 3.
Таблица 3. Составы водных суспензий МСК №№2-3.
Ингредиент
Суспензия МСК №2
Суспензия МСК №3
МСК
0,4x10<sup>5</sup> клеток
6,0x10<sup>5</sup> клеток
Физ.раствор
1,0 мл
1,0 мл
Введение препаратов
6
6
. Через 30 мин после индукции воспалительного повреждения легких как описано в примере 1, мышам в первой группе (n=5) вводили ингаляционно 50 мкл суспензии МСК №2 (доза 0,1x10 клеток/кг) и через 16 часов вводили ингаляционно 50 мкл раствор гексапептида (I) в физ.растворе (доза 10 мкг/кг); во второй группе (n=5) вводили 50 мкл суспензии МСК №3 (доза 1,5x10 клеток/кг), и через 16 часов вводили ингаляционно 50 мкл раствор гексапептида (I) в физ.растворе (доза 10 мкг/кг). В контроле (n=5), мышам дважды с перерывом 16 часов вводили 50 мкл физ. раствора. Для ингаляционного введения использовали компрессионный небулайзер Omron CompAir NE C-28, снабженный специально сконструированной насадкой для введения аэрозоля животным.
Измерение ИЛ-6
. Уровни ИЛ-6 определяли в водном экстракте гомогенатов легких, полученных от животных через 2 часа после последнего введения препаратов с использованием Bio-Plex MAGPIX™ Multiplex Reader, коммерчески доступной панели (Bio-Plex Pro™ Mouse Cytokine Th17 Panel A 6-Plex # M6000007NY, и программы анализа данных Bio-Plex Data Pro (версия 1.0.0.06) компании Bio-Rad.
Результаты
. Результаты представлены в таблице 4 как среднее ± ошибка среднего (SEM) концентраций ИЛ-6 в легких. Для сравнения, средний уровень ИЛ-6 в легких у интактных мышей составлял 0,12 нг/мл. Статистический анализ проводился с помощью one-way ANOVA, пос-тест Тьюки для множественного сравнения между группами.
Таблица 4. Уровни ИЛ-6 (среднее ± SEM) в легких мышей с воспалительным поражением легких после введения указанных препаратов.
Препараты
ИЛ-6, нг/мл
Суспензия МСК №2 + гексапептид (I)
1.17 ± 0,10*
Суспензия МСК №3 + гексапептид (I)
0.64 ± 0,06*
Физ. раствор + физ.раствор (контроль)
2,10 ± 0,19
*Достоверно отличается от контроля (p<0,05).
Таблица 2 показывает, что последовательное введение МСК и гексапептида (I) в терапевтически эффективных количествах в течение суток обеспечивает достоверное снижение уровней ИЛ-6 по сравнению с контролем.
Таким образом, способ лечения настоящего изобретения обеспечивает снижение уровней ИЛ-6, ключевого патогенетического фактора, определяющего тяжесть заболевания при болезни легких.