Биохимические характеристики микроорганизмов щелочных гидротерм Прибайкалья

2. Намсараев Б.Б., Намсараев З.Б. Микробные процессы круговорота углерода и условия среды обитания в щелочных озерах Забайкалья и Монголии // Труды Ин-та микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. - М.: Наука, 2007. - Вып. 14. - С. 299-322.

3. Содовые озера Забайкалья: экология и продуктивность / отв. ред. А.Ф. Алимов. - Новосибирск: Наука, 1991. - 215 с.

4. Козеренко В.Н. Геологическое строение юго-восточного Забайкалья. - Львов.: Изд-во Львовского гос-университета, 1956. - 162 с.

5. Заварзин Г.А. Эпиконтинентальные содовые водоемы как предполагаемые реликтовые биотопы формирования наземной биоты // Микробиология. - 1993. - Т.62. - С. 789-800.

6 Алекин О.А., Семенов А.Д., Скопинцев Б.А. Руководство по химическому анализу вод суши. - Л.: Гид-рометеоиздат, 1973. - 280 с.

7 Есиков А. Д. Масс-спектрометрический анализ природных вод. - М. : Наука, 1980. - 204 с.

8. Hardie L.A., Eugster H.P. The evolution of closed-basin brines // Mineral. Soc. of America, 1970. - P. 253-273.

9. Соломин Г.А., Крайнов С.Р. Щелочные составляющие природных и сточных щелочных вод, геохимические процессы их нейтрализации кислыми и около нейтральными подземными водами // Геохимия. - 1998. -№2. - С.183-201.

УДК 577.151.01

БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ ЩЕЛОЧНЫХ ГИДРОТЕРМ ПРИБАЙКАЛЬЯ

Е.В. Лаврентьева*’**, А.А. Раднагуруева*, Б.Б. Намсараев*’**, Я.Е. Дунаевский***

Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ. E-mail: lena_l@mail.ru Бурятский государственный университет, Улан-Удэ НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва

Изучены биохимические характеристики культур Ur-6, Br-2-2, Ga-9-2, Al-9-1 и Se-1. Показано, что культуры обладают высокой субтилизиноподобной, аминопептидазной активностями. Протеазы стабильны в широком диапазоне температур от 23 до 60°С и рН от 10,9 до 12.

Ключевые слова: щелочные гидротермы. бактерии, термостабильные протеазы.

BIOCHEMICAL PARAMETERS OF THE MICROORGANISMS OF ALKALINE HYDROTHERMES OF PRIBAIKALIE E.V. Lavrentieva, A.A. Radnagurueva, B.B. Namsaraev, Ya.E. Dunaevskiy Institute of General and Experimental Biology SB RAS, Ulan-Ude Buryat State University, Ulan-Ude SRI Physical-Chemical Biology named by A.N. Belozerskiy MSU named by M.V. Lomonosov, Moscow

Biochemical characteristics of strains Ur-6, Br-2-2, Ga-9-2, Al-9-1 and Se-1 are studied. It is shown, that cultures possess high subtilizin-like and aminopeptidase activities. Proteases are stable in a wide range of temperatures from 23 up to 60°С and рН from up 10.9 to 12.

Key words: alkaline hydrotherms, bacteria, termostable proteases.

В гидротермах Бурятии широко распространены микроорганизмы - потенциальные продуценты ферментативных систем, устойчивые к высоким значениям температуры и рН. Исследования по выделению, идентификации и классификации ферментов протеолитической активности в последние годы проводятся особенно интенсивно, что объясняется востребованностью и многообразием проте-олитических ферментов. Они играют ключевую роль в использовании микроорганизмами органических субстратов [1].

Целью представленной работы было изучение внеклеточной протеазной активности у гетеротрофных алкалотермофильных бактерий, выделенных из гидротерм Бурятии.

Объекты и методы исследования

В качестве источников секретируемых протеолитических ферментов использовали культуральную жидкость 5 алкало-термофильных культур Ur-6, Br-2-2, Ga-9-2, Al-9-1 и Se-1, выделенных из микробных матов и донных осадков горячих источников Байкальской рифтовой зоны. Температура воды в точках отбора проб на выходе и по изливу термальных вод в изученных источниках варьировала от 45 (источник Сея) до 72,50С (источник Гарга). Значения pH изменялись от слабощелочных 8,2 в воде источников Гарга до сильнощелочных 9,9 в гидротерме Алла. Выделенные штаммы Ur-6 и Br-

2-2 относятся к представителям рода Bacillus. Наибольшее сходство у культуры Ur-6 выявлено с Bacillus hemicellulosolyticum C-11 (99%). Штаммы Br-2-2 на 97% близки к B. licheniformis BBDC6. У штамма Ga-9-2 обнаружено 95% сходства с A. flavithermus DSM 2641 (Z26932). Штаммы Al-9-1 и Se-1 образуют отдельный кластер на филогенетическом дереве, и ближайшим гомологом является Anoxybacillus pushchinoensis AT-2 (AB234214). Сходство составляет 96 и 95% соответственно.

Определение внеклеточной протеазной активности в культуральной жидкости у изученных культур проводили по методу Эрлангера [2], используя 5 мМ пара-нитроанилидные субстраты протеаз -трипсиноподобных, химотрипсиноподобных, субтилизиноподобных, цистеиновых и аминопептидаз (BAPA, GlpFpNA, GlpAALpNA, GlpFApNA и TpNA, ApNA, LpNA соответственно) и на белковом субстрате азоказеине, используемом для определения общей активности. Для выяснения природы функциональных групп активного центра штаммов к раствору фермента добавляли раствор соответствующего ингибитора, инкубировали 40 мин при температуре 370С, затем добавляли раствор субстрата и определяли активность, как указано выше. В работе использовались ингибиторы металло-протеаз-этилендиаминтетраацетат Na (ЭДТА), цистеиновых протеаз-иодацетамид (HAA) и серино-вых протеаз-фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ). Для определения оптимума рН активности исследуемых протеиназ по отношению к синтетическим субстратам были использованы цитрат-фосфатные, фосфатные, гидрокарбонатные буферы [3] в диапазоне рН 5-12. Температурный оптимум ферментов определяли, измеряя их активность после 5 мин инкубации при температурах от 23-800С.

Результаты и обсуждение

1. Определение субстратной специфичности

Определение субстратной специфичности показало, что изученные штаммы не гидролизуют субстраты, специфичные для химотрипсинподобных и цистеиновых протеиназ, независимо от времени культивирования (до 60 ч) и источников органического азота (триптон, казеин и желатин). Все изученные культуры наиболее активны в отношении субстратов, специфичных для субтилизинов и ами-нопептидаз (рис. 1). Результаты исследования зависимости активности протеиназ от температуры культивирования показали, что наиболее высокая активность на субстрате для субтилизиноподобных протеиназ обнаружена при 500С. При этой температуре максимальная удельная активность у культуры Ur-6 обнаружена на 12 ч культивирования и составила 3,24 ед/мг. Показано, что температура 600С является наиболее благоприятной для развития аминопептидазной активности. В целом отмечено, что культуры Ur-6, Br-2-2, Ga-9-2, выделенные из микробных матов горячих источников, кроме суб-тилизиноподобной обладают высокой аминопептидазной активностью. Характерно, что наибольшая активность по субстрату для субтилизиноподобных протеиназ обнаружена на среде с триптоном. Добавление в среду желатина или казеина приводило к слабой индукции субтилизиноподобных протеиназ.

2. Определение температурной стабильности фермента

Внеклеточная протеиназа штамма Ur-6 имела оптимум активности при 600С и сохраняла до 31% активности при 700С. Температурная стабильность фермента находилась в интервале температур 23600С. Культура Ga-9-2 показала оптимум активности при 500С, тогда как культура Br-2-2 при 400С. Стабильность ферментов изученных штаммов сохраняется до 600С (рис. 2).

3. Определение рН-оптимума и стабильности фермента

Исследования рН оптимума и стабильности проведены в диапазоне рН 5,8-12,0 для трех культур: Ur-6, Ga-9-2 и Br-2-2 (рис. 3). Как следует из полученных данных, изученные ферменты штаммов Ga-9-2 и Br-2-2 активны в относительно узком интервале рН: активность, превышающая 50%, была выявлена на участке рН 10-12 с максимумом при рН 11,7 и 11,3 соответственно. Исследуемые ферменты были стабильны при рН 10,9- 12,0. Напротив, протеиназа культуры Ur-6 активна в широком диапазоне рН, значения активности более 50% были выявлены на отрезке рН 7,3-12, с максимумом при рН

10. Фермент сохранял стабильность в интервале рН 7,8-12.

0,5

0,45

0,4

0,35

0,3

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05

0

п

ТІ

ттГ

Пгт пГ а ГНТ

Бг-2-2

Оа-9-2

Эе-1

АІ-9-1

иг-6

12 24 36 48 12 24 36 48

время культивирования, ч

Активность Бг-2-2 на различных субстратах

3.5 3

2.5 2

1.5 1

0,5

0

т

Дщлн, ні

БАПА

субтилизин

аргинин

тирозин

лейцин

12 24 36 48 12 24 36 48

время культивирования, ч.

Активность Оа-9-2 на различных субстратах

БАПА

субтилизин

аргинин

тирозин

лейцин

время культивирования, ч.

Активность Ур-6 на различных субстратах

1,6

1,4

1,2

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

II

11

БАПА

субтилизин

аргинин

тирозин

лейцин

12 24 36 48 12 24 36 48

время культивирования,ч

Рис. 1. Внеклеточная протеазная активность на различных субстратах

Рис. 2. Температурный оптимум и стабильность культур Ga-9-2, Br-2-2, Ur-6

Рис. 3. рН оптимум и стабильность культур Ga-9-2, Br-2-2, Ur-6

ЛИТЕРАТУРА

1. Ward O.P. Proteolytic enzymes. Comprehensive Biotechnol / ed. M. Moo-Young. - 1985. - V.3. - P. 789-818.

2. Erlanger B.F., Kokowsky N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophis. - 1961. - V.95. - P. 271-278.

3. Досон Р., Эллиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. - М.: Мир, 1991. - 544 с.

4. Кевбрин В.В. Термофильные алкалофильные микроорганизмы / Труды Ин-та микробиологии им. С.Н. Виноградского. Алкалофильные микробные сообщества. - М.: Наука, 2007. - Вып.14. - C. 374-396.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 07-04-90816-моб_ст, №08-05-98038р _Сибирь_а, НОЦ-Байкал, гранта МО РФ РНП 2.1.1/2165, Молодежного гранта МО РБ, Программ Президиума СО РАН 38 и 95.

УДК 54.027

ИЗОТОПНЫЙ СОСТАВ УГЛЕРОДА ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА ДОННЫХ ОСАДКОВ ОЗЕРА БАЙКАЛ

В.П. Гаранкина*, В.Б. Дамбаев*, С.П. Бурюхаев*’**

Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ. E-mail: G_val_82@mail.ru Бурятский государственный университет, Улан-Удэ

Показано, что изотопный состав углерода органического вещества исследуемых донных осадков озера Байкал варьирует от — 31,84 до -26,13%о. Минимальное содержание органического вещества отмечено в соре Провал — 1,30%, максимальное количество органического вещества — 39,21% наблюдалось в донных осадках мыса Толстый.

Ключевые слова: органическое вещество, донные осадки, озеро Байкал.