Легионеллы в градирнях промышленных предприятий: особенности колонизации и серологическое разнообразие

38

ЗНиСО ОШШ №10

ЛЕГИОНЕЛЛЫ В ГРАДИРНЯХ ПРОМЫШЛЕННЫХ ПРЕДПРИЯТИИ: ОСОБЕННОСТИ КОЛОНИЗАЦИИ И СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ

И.В. Новокшонова1, И.С. Тартаковский2

LEGIONELLA IN COOLING TOWERS INDUSTRY: CHARACTERISTICS OF COLONIZATION AND SEROLOGICAL DIVERSITY

I.V. Novokshonova, I.S. Tartakovskiy

'ФБУЗ Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва, 2НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва

Проведено обследование водных систем охлаждения промышленных предприятий в Москве и Московской области с целью количественного выявления Legionella pneumophila. Изучено серологическое разнообразие штаммов легионелл, циркулирующих в воде градирен, и морфологические особенности формирования биопленок, ассоциированных с легионеллами на поверхности градирен. Показана высокая эффективность количественного обследования воды и биопленок градирен на наличие легионелл с помощью ПЦР в реальном времени и бактериологического метода. Впервые биопленки легионелл в градирнях комплексно изучены с помощью электронно-микроскопических методов исследования (сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии).

Ключевые слова: легионеллы, методы определения, серологическое разнообразие, характеристика биопленок.

The examination of water cooling systems of industrial enterprises in Moscow and the Moscow region was made in order to identify quantitative Legionella pneumophila. The authors studied a variety of strains of Legionella circulating in water cooling towers and morphological features of the formation of biofilms associated with Legionella on the surface of cooling towers. The high efficiency of the quantitative survey of water and cooling towers biofilms for the presence of Legionella was made using real-time PCR and bacteriological method. First Legionella biofilms in cooling towers are comprehensively studied by electron microscopic methods (scanning and transmission electron microscopy).

Keywords: Legionella, methods of determining, serological diversity, characterization of biofilms.

Наиболее часто эпидемические вспышки легионеллеза за рубежом связаны с контаминацией градирен (водных систем охлаждения). Данные объекты являются предметом регулярного профилактического мониторинга. Европейская рабочая группа по легионеллезу (EWGLI) за период c 2002 по 2007 гг. зарегистрировала в странах Европы 44 эпидемические вспышки, связанные с контаминацией градирен. Крупная эпидемическая вспышка болезни легионеров в Эдинбурге (Шотландия) в мае 2012 г. (более 90 заболевших, 3 летальных случая) связана с эксплуатацией градирен промышленных предприятий. За последние годы в Российской Федерации была разработана современная методическая база для выявления легионелл в окружающей среде и внедрены эффективные методы эпиднадзора за легионел-лезной инфекцией [4; 5].

Проведено обследование водных систем охлаждения промышленных предприятий в Москве и Московской области с целью количественного выявления Legionella pneumophila. В процессе исследования изучено серологическое разнообразие штаммов легионелл, циркулирующих в воде градирен и морфологические особенности формирования биопленок, ассоциированных с легионеллами, на поверхности градирен. Образцы воды и биопленок были отобраны из 20 градирен предприятий Москвы и Московской области, обследованных в 2008—2011 гг. на предмет контаминации Legionella pneumophila.

Количественный анализ проводился бактериологическим методом с помощью набора для латекс-агглютинации SLIDEX и ПЦР в реальном времени [1]. Для оценки серологического разнообразия штаммов легионелл, циркулирующих в градирнях, использовалась Дрезденская панель

ц

моноклональных антител [5]. Для изучения биопленок, образованных с участием легионелл, с помощью методов сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии брались соскобы из градирен промышленных предприятий Московской области. Образцы фиксировались по методу Ito — Karnovski для проведения исследований в трансмиссионном электронном микроскопе и 10 %-м водном растворе формалина - для исследования в сканирующем режиме. Для анализа ультратонких срезов биопленки препараты были подготовлены по общепринятой методике заливки в метакрилатную смолу LR White. Ультратонкие срезы получали с помощью ультрамикротома LKB — 3, окрашивались по методу Reynolds и изучались в электронном микроскопе JEOL 100 B (Japan) [6]. Образцы природных биопленок изучались с помощью сканирующего микроскопа нового поколения Quanta 200 3D (FEI Company USA). В работе также был проведен рентгеновский микроструктурный анализ образцов с помощью приставки EDAX (EDAX Inc. USA) к сканирующему электронному микроскопу Quanta 200 3D.

Контаминация Legionella pneumophila выявлена на 5 из 8 промышленных предприятий, в 14 из 20 обследованных градирен (70 %). Концентрация возбудителя в контаминированных системах колебалась в диапазоне от 1,2х102 до 9,6х104 КОЕ (геномных копий) на литр воды. Среди выделенных изолятов 52 % принадлежали к 1 серогруп-пе L. pneumophila, 48 % — к другим серогруппам возбудителя. В 14 % положительных образцов были выделены изоляты нескольких серогрупп L. pneumophila, в т. ч. и в первой. По уровню контаминации все обследованные объекты можно разделить на 3 группы:

ОШШ №10 (235) ЗНиСО

39

I группа: на объекте отсутствуют легионеллы, '— при визуальном осмотре не обнаружены биопленки (3 объекта, 4 градирни);

II группа: на объекте выявлены легионеллы в -чт низкой концентрации (менее 103КОЕ на литр), ^ биопленки не обнаружены (2 объекта, 4 градирни);

III группа: на объекте выявлены легионеллы в концентрации, превышающей уровень 103КОЕ на литр, обнаружены биопленки, содержащие Legionella pneumophila, на орошаемой поверхности чаши градирен (3 объекта, 12 градирен).

В ряде случаев в образцах выявлены ассоциации L. pneumophila и Ps. aeruginosa.

Из 44 положительных проб воды и биопленок результаты бактериологического исследования и ПЦР в реальном времени коррелировали в 82 % случаев. При этом количество геномных копий превышало число КОЕ на 1—2 порядка. В 5 случаях положительные результаты ПЦР не подтверждены бактериологически. В 3 случаях при положительных результатах бактериологического анализа имела место ингибиция ПЦР. В 4-х пробах, где концентрация легионелл превышала 104КОЕ на литр, результаты бактериологического метода и ПЦР совпадали.

В данных системах циркулировало аксо-номическое разнообразие штаммов Legionella pneumophila. Выделенные штаммы принадлежали ко всем 14 серогруппам L. pneumophila и к 7 из 9 подгрупп 1-й серогруппы L. pneumophila. К первой серогруппе принадлежали 22,6 % выделенных штаммов L. pneumophila. Обратило внимание преобладание штаммов первой серогруппы возбудителя в градирнях промышленных предприятий. Вместе с тем, в градирнях выделено 6 штаммов L.pneumophila первой серогруппы, типируемых моноклоном MAb 3/1 (ассоциированный с ЛПС эпитоп и выявляемый только у наиболее вирулентных штаммов легионелл). Среди штаммов первой серогруппы преобладают представители подгрупп Oxford и Heysham. Среди серогрупп L.pneumophila, наряду со штаммами серогруппы 1, наиболее широко представлена серогруппа 6 (26 %). Также в воде градирен промышленных предприятий часто выделялись штаммы серо-групп 3 и 2 (14 и 13 % соответственно). Для воды градирен характерен значительно более высокий уровень серологического разнообразия выделенных штаммов легионелл (в 56 % проб выделены штаммы двух и более серотипов возбудителя).

Анализ ультратонких срезов образцов биопленок из градирен показал, что в их состав входили микроорганизмы различных систематических групп (бактерии, грибы, сине-зеленые водоросли, диатомовые водоросли). Эти микроорганизмы сформировали сложноорганизованную биопленку, в состав которой вошли грамположительные и грамотрицательные бактерии, грибы и сине-зеленые водоросли, объединенные общим экзо-клеточным матриксом.

Грамотрицательные бактерии, идентичные по ультраструктурной организации легионел-лам, объединялись между собой посредством наружной мембраны клеточной стенки, вокруг

них визуализировался экзоклеточный матрикс, с помощью которого осуществлялся тесный контакт с клеточными стенками грибов и сине-зелеными водорослями. В препаратах также были обнаружены особые структурные образования, плотный матрикс которых формировал округлые структуры в виде «пчелиных сот», внутри которых находились бактерии с электронно-плотным матриксом и дефектными поверхностными структурными компонентами — клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной. Подобного рода субмикроскопическая организация характерна для некультивируемых форм бактерий [6]. Обнаруженная сложноорганизованная структура соответствовала строению зрелой биопленки. В экзоклеточном матриксе выявлялись включения высокой (металлической) электронной плотности в виде округлых с четкими контурами и мелкозернистых образований, объединенных в хлопьевидные структуры.

Анализ препаратов соскобов из градирен в сканирующем электронном микроскопе позволил детализировать строение сложного микробного сообщества, формирующегося в градирнях. При исследовании в сканирующем электронном микроскопе в препаратах выявлялись длинные переплетающиеся волокнистые структуры (по всей видимости, гифы грибов), которые образовывали своеобразный сетчатый каркас. На них были видны аморфные массы и геометрически правильные объемные структуры. При большем увеличении оказалось, что аморфные массы есть не что иное, как биопленки, на поверхности которых можно было видеть контуры бактериальных клеток. Геометрически правильные образования представляли собой диатомовые водоросли. Следует обратить особое внимание на присутствие диатомовых водорослей в препаратах соскоба из градирен. Диатомовые водоросли можно рассматривать как прочный элемент сложной конструкции, которую формируют микроорганизмы в условиях существования в градирне. Прочный скелет диатомов, состоящий в, основном, из кальция и кремния, обеспечивает механическую прочность этой конструкции, к которой прикрепляются гифы грибов. Кроме этого, на поверхности диатомовых водорослей можно было наблюдать адгезию бактерий и формирующиеся биопленки.

Проведенный рентгеновский микроэлементный анализ диатомовых водорослей показал, что в их составе, помимо основных структурных элементов (кальция, фосфора и кремния), выявляются железо, натрий, калий, алюминий и марганец.

Микроэлементный анализ биопленок показал наличие в их составе углерода, кислорода, азота, серы, а также включений разных металлов (титана, железа, натрия, магния и др.).

Обнаружение высокой электронной (металлической) плотности частичек при ультраструктурном анализе срезов биопленки, а также данные рентгеновского микроструктурного анализа в сканирующем режиме могут свидетельствовать о вовлечении в метаболические процессы, протекающие в биопленке, металлов, из которых состоит

40

ЗНиСО ОКТЯбРЬ №10

поверхность оборудования, т. е. указывать на биокоррозионные процессы.

Таким образом, природные биопленки представляют собой совокупность микроорганизмов, относящихся к представителям разных систематических групп. Совместное сосуществование разных микроорганизмов в одной экологической нише обеспечивается трофическими цепями — продукты метаболизма одних сочленов сообщества служат питательным субстратом для других. Эффективная защита от неблагоприятных факторов внешней среды в таком организованном сообществе достигается интегральным синтезом экзополисахаридного матрикса. Помимо обнаруживаемых бактериологическими методами патогенных для человека бактерий в составе природных биопленок, грибы и сине-зеленые водоросли следует также рассматривать как возможных возбудителей. Диатомовые водоросли, которые входят в состав сложноорганизованного сообщества, формирующегося в градирнях, следует воспринимать как неблагоприятный фактор, способствующий бактериальному загрязнению систем водоснабжения, и концентратор различных микроэлементов.

В странах ЕЭС, США и Японии, а с 2010 г. — и в Российской Федерации, введены допустимые концентрации Legionella pneumophila для различного типа водных систем или объектов [4]. Так, для градирен допускается эксплуатация при концентрации возбудителя, не превышающей 104КОЕ/л. Проведенные исследования позволили впервые охарактеризовать частоту и уровень контаминации Legionella pneumophila, потенциально опасных водных систем в Российской Федерации. Частота контаминации водных систем охлаждения промышленных предприятий (70 %) соответствовала частоте контаминации аналогичных объектов за рубежом — 50—75 %. Превышение допустимого уровня контаминации Legionella pneumophila выявлено на одном из восьми промышленных предприятий (12,5 %). Полученные результаты подтверждают значение реализуемой в нашей стране концепции профилактики легионелле-за, основанной на регулярном количественном мониторинге возбудителя в потенциально опасных водных объектах и проведении профилактических мероприятий в случае превышения допустимого уровня контаминации.

Полученные данные о серологическом разнообразии штаммов легионелл представляют интерес как с точки зрения характеристики штаммов возбудителя, циркулирующих в России, так и для сравнения с результатами аналогичных зарубежных национальных и международных программ исследований. Мультицентровое европейское исследование, проведенное в 15 странах, 1134 тыс. клинических штаммов Legionella pneumоphila показало, что 72,7 % внебольничных случаев и 85,8 % случаев легионеллеза, связанных с поездками, вызваны штаммами L.pneumophila серогруппы 1, типируемых моноклоном MAb 3/1 [7]. Процент аналогичных штаммов, выделенных в России, не велик и составляет 2,9 %. Вместе с тем, высокий процент случаев легионеллеза в

Европе, вызванных MAb 3/1 штаммами, получен за счет средиземноморского региона Европы. В '— Скандинавских странах почти 50 % случаев вне-больничного легионеллеза вызвано штаммами L.pneumophila, не реагирующими с моноклоном ^Е MAb 3/1: штаммами других подгрупп серогруп- ^ пы 1 или иных серогрупп L.pneumophila. Такие же штаммы преобладают среди выделенных из потенциально опасных водных объектов в г. Москва и Московской области. Проведенные исследования подтверждают важную роль международной панели моноклональных антител для характеристики и оценки эпидемической значимости штаммов, циркулирующих в потенциально опасных водных системах. Методы выделения легионелл в потенциально опасных водных системах активно внедряются в работу Центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, и их применение регламентируется соответствующими документами. Для характеристики этой группы штаммов легионелл типирование с помощью международной панели моноклональных антител наиболее информативно и методически доступно широкому кругу бактериологических лабораторий.

Важнейшим фактором распространения леги-онелл в различных водных объектах является их способность к существованию и размножению в составе биопленок [3]. Образование биопленок на поверхности оборудования систем водоснабжения и других инженерно-технических сооружениях, связанных с циркуляцией воды, является ключевым фактором накопления потенциально опасных концентраций легионелл. Биопленки широко представлены в искусственных водных системах и представляют собой особое структурное образование сообщества микроорганизмов, обеспечивающее их выживание и поддержание численности, т. к. формирующийся полисахарид-ный слой в совокупности с другими продуктами жизнедеятельности микроорганизмов образует матрикс биопленки, который обеспечивает бактериям защиту от неблагоприятных факторов окружающей среды. В составе биопленок бактерии хорошо защищены от неблагоприятных воздействий, химических и биологических факторов окружающей среды.

В данной работе впервые биопленки градирен изучены комплексно с помощью электронно-микроскопических методов исследования (сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии). Результаты подтверждают представления о природных биопленках как устойчивых сообществах легионелл, грибов и водорослей. Впервые показано с помощью микроэлементного анализа наличие в биопленках включений различных металлов, в т. ч. титана и железа, что указывает на тесную взаимосвязь формирования биопленок с процессами коррозии. В данном случае нарушение равновесия между биопленочными и планктонными формами легионелл может привести к выбросу мелкодисперсного аэрозоля легионелл в атмосферу. Наличие в градирнях промышленных предприятий большого количества циркулирующей теплой воды в сочетании с образованием водного аэрозоля, способного распространяться

ОКТЯбРЬ №10 (235) ЗНиСО

41

г-Ь

в радиусе до нескольких километров, позволяет отнести данные объекты к числу опасных в отношении возникновения эпидемических вспышек легионеллезной инфекции. Для предотвращения превышения предельно допустимой концентрации (104 КОЕ на литр) планктонных форм легио-нелл в воде градирни необходимо использовать эффективные дезинфектанты против планктонных форм легионелл и биопленок.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аляпкина Ю.С., Дронина Ю.Е., Карпова Т.И. и др. Применение ПЦР в реальном времени для выявления легионелл в объетках окружающей среды. Журн. микробиол. 2009. № 2. С. 75—80.

2. Онищенко Г.Г., Демина Ю.В., Тартаков-ский И.С. Современная концепция организации эпидемиологического надзора за легионеллезной инфекцией. Журн. микробиол. 2009. № 5. С. 85—91.

3. Тартаковский И.С. Мониторинг и контроль потенциально опасных водных объектов как основной путь профилактики легионеллеза. Вода: химия и экология. 2009. № 2. С. 28—35.

4. СанПиН 3.1.2.2626—10 «Профилактика легионеллеза».

5. Helbig J., Kurtz J., Castellanii Pastoris M. et. al. Antigenic lipopolysaccharide components of Legionella pneumophila recognized by monoclonal antibodies: possibilities and limitations for division of the species into serogroups. J.clin.microbiol. 1997. № 35 (11). С. 2841—2845.

6. Edward S. Reynolds The use of lead citrate at high ph as an electron-opaque stain in electron microscopy J. Cell Biol. 1963 April 1; 17 (1). P. 208—212.

7. Helbig J., Bernander S., Castellani Pastoris M. et. al., Pan-European study on culture-proven Legionnaires' Disease: Distribution of Legionella pneumophila serogroups and monoclonal subgroups. Eur.J.Clin. Microbol.Infect.Dis. 2002. № 21. P. 710—716.

Контактная информация:

Новокшонова Ирина Владимировна, тел.: 8 (495) 954-04-21

Contact Information: Novokshonova Irina, phone: 8 (495) 954-04-21

V-