Способ оценки характера экзогенных воздействий на сперматогенез у экспериментальных животных
METHOD FOR ASSESSING THE NATURE OF EXOGENOUS EFFECTS ON SPERMATOGENESIS IN EXPERIMENTAL ANIMALS

Изобретение относится к области медицины, а именно к области андрологии, физиологии и биохимии, а также имеет отношение к молекулярной биологии и патофизиологии.
Известны способы цитологической оценки сперматогенеза на основе подсчета количества сперматогенных клеток в гомогенате или биоптате семенников, либо в эякуляте (Мамина В.П., Семенов Д.И. Метод определения количества сперматогенных клеток семенника в клеточной суспензии // Цитология. - 1976. - Т. 18, №7. - С. 913-914; Курило Л.Ф. Способ цитологической диагностики нарушения сперматогенеза: Пат. 2328736 Рос. Федерация, МПК G01N 33/48; патентообладатель Л.Ф. Курило. - №2007103879/15; заявл. 01.02.2007; опубл. 10.07.2008. Бюл. №19).
Способы имеют следующие недостатки:
- подготовка препаратов из тестикулярной ткани - технически трудоемкий процесс;
- для приблизительной оценки тестикулярного сперматогенеза требуется гонадоэктомия (у животных), либо биопсия ткани яичка (у мужчин);
- при оценке характера сперматогенеза на уровне эпидидимиса имеются ограничения, связанные с наличием прочих клеток в эякуляте;
- показатели сперматогенеза в эякуляте не позволяют достоверно характеризовать тестикулярный сперматогенез.
Известны способы оценки сперматогенеза по уровню свободных радикалов в тестикулярной ткани, эякуляте или спермоплазме, заключающиеся в измерении уровней ТБК-активных продуктов, образующихся в результате взаимодействия тиобарбитуровой кислоты (ТБК) с продуктом липоперокси-дации - малоновым диальдегидом (МДА), а также в измерении интенсивности люминесценции (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии / под ред. акад. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68; Короткова И.В., Николаева М.А., Божедомов В.А. и др. Уровень генерации свободных радикалов в образцах эякулята бесплодных пациентов // Бюл. экспер. биол. - 2001. - Т. 131, №6. - С. 658-660; Неймарк А.И., Алиев Р.Т., Ноздрачев Н.А. и др. Нарушения сперматогенеза у больных с хроническим абактериальным простатитом / Урология. - 2008. - №1. - С. 40-45). Однако известные способы имеют следующие недостатки:
- требуют значительных количеств реактивов и оборудования;
- конечный результат во многом зависит от качества подготовки гомогенатов тканей (при измерении уровней ТБК-активных продуктов в тестикулярной ткани);
- тиобарбитуровая кислота (ТБК) - сравнительно дорогой реактив.
Известны также способы оценки уровня токсичности экзогенного фактора, заключающиеся в измерении в УФ-диапазоне содержания так называемых «средних молекул» (ТХУ-растворимых метаболитов; ТХУ - трихлоруксусная кислота) в плазме крови (Волчегорский И.Я., Дятлов Д.А., Куликов Л.М. и др. «Средние молекулы» и продукты перекисного окисления липидов как система неспецифических регуляторов гемодинамики у спортсменов-лыжников // Физиология человека. - 1996. - Т. 22, №6. - С. 106-110; Бобров В.М., Шишкин С.А. Молекулы средней массы - показатель интоксикации при гнойно-воспалительных заболеваниях ЛОР-органов // Вестник оториноларингологии. - 1999. - №1. - С. 33-34; Шевченко С.С, Грекова А.И. Оценка уровня молекул средней и низкой массы и пептидов у детей раннего возраста при пневмонии и ОРВИ // Детские болезни. - 2015. - №1. - С. 9-12).
Известные способы имеют недостатки:
- приводимые способы использовались для оценки уровней средних молекул в плазме крови;
- приводимые показатели не позволяют интегрировано оценить содержание средних молекул как пептидной, так и непептидной природы (прочие «среднемолекулярные» метаболиты).
Известен способ-прототип оценки эффектов воздействия внешних факторов на сперматогенез, заключающийся в измерении уровней протеогликанов (ПГ) в семенниках и эпидидимисах крыс с помощью электрофореза на ацетат-целлюлозных пластинах (Николаев А.А., Ветошкин Р.В., Логинов П.В. Изменения протеогликанов семенников крыс в условиях экспериментальной хронической интоксикации серосодержащим газом // Астраханский медицинский журнал. - 2012. - Т. 7, №2. - С. 75-79).
Прототип имеет следующие недостатки:
- сложная техника выполнения исследования и получения конечных результатов;
- заметные и достоверные изменения ПГ происходят в условиях сильных экстремальных воздействий;
- некоторые фракции ПГ трудно идентифицировать.
Предлагаемое изобретение направлено на оценку характера экзогенного воздействия (положительного, отрицательного, нейтрального) на сперматогенез у экспериментальных животных путем определения содержания (в у.е.) ТХУ-растворимых метаболитов («средние молекулы») в гомогенатах семенников и эпидидимисов крыс. Предлагаемым способом также определяется суммарное содержание метаболитов пептидной и непептидной природы.
Указанный технический результат достигается тем, что к 0,2 г пробы гомогенизированной ткани семенника с придатком добавляют 2 мл физиологического раствора, перемешивают, и приливают 1 мл 40%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, затем центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, отбирают центрифугат и измеряют оптические плотности при 220, 254 и 280 нм в кювете 1 см, затем вычисляют индекс характера воздействия ИХВ по формуле:
где: ИХВ - индекс характера воздействия; ΣЕ(пробы) - сумма экстинкций пробы Е220, Е254, Е280; ΣЕ(конт.) - сумма экстинкций контроля Е220, Е254, Е280 при длинах волн 220, 254 и 280 нм соответственно каждому набору (в у.е.), и при значении ИХВ больше 1 судят об отрицательном характере воздействия, при ИХВ меньше 1 судят о положительном характере воздействия, при ИХВ равном 1 - о нейтральном характере воздействия.
Средние молекулы (СМ) - эндогенные компоненты, молекулярная масса которых составляет 500-5000 Да. Название «средние молекулы» основано на общности группового признака - величине молекулярной массы. Они занимают промежуточное положение по своей молекулярной массе между простыми веществами (мочевина, креатинин, билирубин и т.д.) и белками. Химический состав группы СМ весьма неоднороден. Она включает пептиды, гликопептиды, аминосахара, полиамины, многоатомные спирты и др. Группа СМ состоит по меньшей мере из 30 пептидов с установленной биологической активностью. Среди них вазопрессин, окситоцин, нейротензин, ангиотензин, АКТГ, глюкагон, кальцитонин, эндорфины, энкефалины и др. Значительная часть СМ образуется в процессе катаболизма белков в организме. Существенная особенность СМ заключается в их высокой биологической активности. При эндогенной интоксикации наблюдается прямая связь между увеличением уровня СМ и ухудшением состояния больного (Шевченко С.С., Грекова А.И. Оценка уровня молекул средней и низкой массы и пептидов у детей раннего возраста при пневмонии и ОРВИ // Детские болезни. - 2015. - №1. - С. 9-12).
Для идентификации средних молекул обычно прибегают к УФ-спектроскопии. Однако далеко не все авторы задумываются о применении тех или иных длин волн для осуществления анализа. Диапазон волн, при которых проводятся измерения, лежит в пределах 220-280 нм. Вместе с тем при 280 нм весьма успешно можно идентифицировать карбонильные соединения (олигосахариды, аминосахара с открытой цепью последнего мономерного звена и др.), при 254 нм помимо всего прочего хорошо идентифицируются полиеновые низкомолекулярные соединения (промежуточные продукты липопероксидации), а при 220-230 нм отчетливо можно определять олигопептиды (Тюкавкина Н.А., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия: Учебник для вузов. - 7-е изд-е. - М: Дрофа, 2008. - 542 с). В этой связи нами был предложен интегрированный показатель для оценки уровня СМ, позволяющий учитывать содержание соединений как пептидной, так и непептидной природы. Для этого содержание средних молекул вычисляли по формуле, в которой учитывались экстинкций, получаемые при пропускании пучка УФ-излучения при трех длинах волн, а именно при 220, 254 и 280 нм:
где Е220, Е254, Е280 - экстинкций (оптические плотности) при пропускании пучка УФ-излучения через анализируемые растворы (в у.е.).
Для оценки характера экзогенного воздействия полученные результаты сравнивали с контрольными показателями путем вычисления индекса характера воздействия ИХВ по формуле:
Подставляя в формулу (2) формулу (1) для расчета содержания уровней средних молекул, получаем выражение:
где ΣЕ - сумма экстинкций пробы и контроля Е220, Е254, Е280 при длинах волн 220, 254 и 280 нм соответственно.
Таким образом, при повышении уровня СМ в анализируемом образце (пробе), по сравнению с контрольным показателем, индекс ИХВ будет больше 1; при пониженных уровнях СМ в образцах индекс ИХВ будет ниже 1; в случае нейтрального характера воздействия уровень СМ не будет достоверно изменяться, и в таком случае индекс ИХВ будет равен 1.
С другой стороны, для более глубокого анализа различных фракций среди СМ дополнительно вычисляли соотношение пептидных и непептидных СМ в анализируемых пробах по формуле:
Здесь в знаменателе сумма двух экстинкций показывает суммарное содержание (в у.е.) молекул средней и низкой массы (МСИНМ) преимущественно непептидной природы. Вычисляемое соотношение позволяет более детально проанализировать возможные сдвиги в составе СМ.
Повышение уровня СМ можно ожидать при развитии состояния напряжения в организме, что может быть обусловлено различными токсическими эффектами. В пользу указанного обстоятельства свидетельствуют повышенные уровни продуктов перекисного окисления (ПОЛ) липидов при одновременном измерении уровня ПОЛ и содержания СМ (Волчегорский И.Я., Дятлов Д.А., Куликов Л.М. и др. «Средние молекулы» и продукты перекисного окисления липидов как система неспецифических регуляторов гемодинамики у спортсменов-лыжников // Физиология человека. - 1996. - Т. 22, №6. - С. 106-110).
3
2
Создание способа оценки характера экзогенных воздействий на сперматогенез осуществлялось на 50 половозрелых самцах крыс линии Wistar массой 210±10 г на базе кафедры химии ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России. Животные были разделены на 5 групп, из которых одна была контрольная (10 шт. ), а четыре другие - опытные по 10 животных в каждой. В первой экспериментальной группе животные подвергались воздействию микроволнового излучения (МВИ) миллиметрового диапазона (λ=7,1 мм, частота f=42 ГГц) в течение 30 дней по 30 минут ежедневно. Для создания электромагнитного поля использовали генератор монохроматических электромагнитных волн Явь-1-7,1 (Россия). Во вторую группу вошли животные, подвергавшиеся воздействию сероводородсодержащим природным газом в концентрации 10 мг/м (по HS) в течение 30 дней по 4 часа ежедневно. В третью экспериментальную группу входили животные, получавшие перорально имбирь в дозе 100 мг/кг массы тела животного в сутки в течение 14 дней. В четвертую группу вошли животные, получавшие имбирь в указанной дозе в течение 14 дней, после чего подвергались воздействию МВИ (λ=7,1 мм, частота f=42 ГГц) в течение 30 дней по 30 минут ежедневно.
Для оценки содержания уровней СМ использовали УФ спектрофотометр ПЭ-5400УФ. Способ осуществляют следующим образом: 1) тщательно измельчают замороженную ткань семенника с придатком; 2) 0,2 г пробы полученного таким образом гомогената смешивают с 2 мл физиологического раствора (в соотношении 1:10), тщательно перемешивают; 3) добавляют 1 мл 40%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ); 4) центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин; 5) отбирают центрифугат (приблизительно 3 мл) и наливают в кювету толщиной 1 см; 6) измеряют величины оптических плотностей при длинах волн 220, 254 и 280 нм против раствора, полученного смешением 2 мл физиологического раствора и 1 мл раствора ТХУ; 7) вычисляют индекс характера воздействия ИХВ относительно установленных контрольных показателей по формуле (3). В гомогенатах тканей семенников и эпидидимисов крыс определяли также уровень МДА (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии / под ред. акад. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68). Срезы семенников толщиной 7 мкм изготавливали на микротоме "Microm НМ - 400" (Германия) и окрашивали гематоксилин-эозином. Полученные препараты изучались на универсальном микроскопе "Nu" (Германия), соединенным с цветной телевизионной камерой "Pixera" (США). Исследование препаратов проводили при увеличении 200× (объектив 10, окуляр 20).
В предлагаемом способе достигнуты следующие результаты. Содержание молекул средней и низкой массы (МСИНМ) и пептидов в гомогенатах семенников и эпидидимисов крыс в условиях различных воздействий отражено в таблице 1. В таблице также приводится интегральный показатель СМ, вычисляемый по формуле (1), а также уровень МДА в гомогенатах тканей семенников и эпидидимисов животных. Как следует из таблицы 1, под влиянием МВИ и СВСГ АГКМ достоверно возрастает содержание МСИНМ и пептидов, по сравнению с контролем (P<0,001). Содержание СМ также закономерно возрастает. Вместе с тем имбирь вызвал некоторые изменения в профиле СМ, а именно: содержание МСИНИ уменьшилось, в то время как содержание пептидов имело тенденцию к возрастанию. Так, если в контроле отношение пептидных к непептидным СМ (в соответствии с формулой 4) составляло 0,97, то в присутствии имбиря это соотношение было 1,4. Это означает, что имбирь закономерно вызывает снижение карбонильных соединений в тестикулярной ткани, но вместе с тем стимулирует белковый синтез. Причиной тому может быть активация стероидогенеза, который в условиях снижения липопероксидации возрастает. Это, в свою очередь, ведет к усилению синтеза различных белковых факторов, которые в том числе участвуют в сперматогенезе. В то же самое время содержание СМ в целом снижается, что свидетельствует о положительном влиянии имбиря на функциональное состояние семенников и эпидидимисов животных.
В присутствии имбиря МВИ не оказывает существенного влияния на уровень пептидов и удельное содержание СМ в целом. Содержание пептидов имеет даже тенденцию к снижению. Это можно объяснить следующим образом. Процессы биосинтеза активируются незначительно в условиях разнонаправленного действия двух факторов (имбирь, МВИ). В то же самое время необходимость в синтезе антиперекисных ферментов (супероксиддисмутаза СОД, глутатионпероксидаза ГПО, каталаза) практически отпадает в присутствии такого полифенольного соединения, как имбирь. Таким образом, умеренное содержание антиперекисных ферментов (пептиды) на фоне также умеренного уровня биосинтеза прочих регуляторных пептидов сказывается на почти неотличимом от контроля уровне пептидов в гомогенатах тестикулярной ткани. В целом же эффект сочетанного воздействия имбиря и МВИ оказывается нейтральным.
Выявленные закономерности в уровнях средних молекул соотносятся с уровнем радикалообразования в тестикулярной ткани с придатком. Так, содержание МДА в гомогенатах тканей семенников и эпидидимисов коррелировало с содержанием СМ в соответствии с высоким коэффициентом положительной корреляции r=+0,93 (Р<0,05). Таким образом, в условиях повышенной динамики свободнорадикального окисления возрастают уровни СМ.
Изменения динамики свободнорадикального окисления и уровней СМ соотносятся с морфологическими данными о характере сперматогенеза в извитых канальцах семенников. В контрольной группе животных (Фиг. 1) семенные канальцы имели округлую форму, тесно прилегали друг к другу. Половые клетки располагались упорядоченно в соответствии со стадиями сперматогенного цикла. В условиях воздействия СВСГ АГКМ (Фиг. 2) семенные канальцы располагались на значительном расстоянии друг от друга; внутри них наблюдалось скопление отечной жидкости. Кроме того, имело место отслоение базальной мембраны и дезорганизация сперматогенного эпителия (либо абсолютное запустевание семенных канальцев). В условиях воздействия МВИ (Фиг. 3) наблюдалось хаотичное расположение клеток сперматогенного эпителия, либо неравномерная его высота. Воздействие МВИ на фоне потребляемого имбиря (Фиг. 4) не вызывало заметных деструктивных изменений в структуре извитых семенных канальцев. Высота сперматогенного эпителия была визуально соизмерима с аналогичным контрольным показателем (табл. 2).
Для создания указанного способа полученные результаты успешно прошли апробацию.
Пример 1. Контрольная группа. Экстинкций (средние значения) при длинах волн 220, 254 и 280 нм соответственно: Е220 = 0,37; Е254 = 0,18; Е280 = 0,20. Сумма экстинкций контрольной группы ΣЕ (конт.) = 0,75. В соответствии с формулой (1), содержание средних молекул СМ составляет 0,25. Полученный показатель суммы экстинкций ΣЕ (конт.) будет использоваться в дальнейших расчетах при вычислении индекса ИХВ.
Пример 2. Воздействие микроволнового излучения (МВИ). Экстинкций при длинах волн 220, 254 и 280 нм соответственно: Е220 = 0,59; Е254 = 0,23; Е280 = 0,27. Сумма экстинкций в средней пробе данной группы ΣЕ (пробы) = 1,09. В соответствии с формулой (3),
Полученное значение ИХВ больше 1, что говорит об отрицательном характере данного экзогенного воздействия.
Пример 3. Воздействие сероводородсодержащего газа АГКМ. Экстинкций при длинах волн 220, 254 и 280 нм соответственно: Е220 = 0,89; Е254 = 0,45; Е280 = 0,43. Сумма экстинкций в средней пробе данной группы ΣЕ (пробы) = 1,77. В соответствии с формулой (3),
Полученное значение ИХВ значительно больше 1, что говорит об отрицательном характере данного экзогенного воздействия.
Пример 4. Влияние имбиря. Экстинкций при длинах волн 220, 254 и 280 нм соответственно: Е220 = 0,42; Е254 = 0,12; Е280 = 0,18. Сумма экстинкций в средней пробе данной группы ΣЕ (пробы) = 0,72. В соответствии с формулой (3),
Полученное значение ИХВ меньше 1, что говорит о положительном характере данного экзогенного воздействия.
Пример 5. Воздействие МВИ в сочетании с имбирем. Экстинкций при длинах волн 220, 254 и 280 нм соответственно: Е220 = 0,36; Е254 = 0,16; Е280 = 0,23. Сумма экстинкций в средней пробе данной группы ΣЕ (пробы) = 0,75. В соответствии с формулой (3),
Полученное значение ИХВ равное 1 говорит о нейтральном характере данного комбинированного воздействия. Все приведенные выше примеры представлены в обобщенном виде в таблице 2.
Результаты апробации подтверждаются морфологическими данными тестикулярной ткани, полученными от животных, подвергавшихся указанным воздействиям. Из таблицы 2 следует, что при значениях ИХВ больше 1 высота сперматогенного эпителия была достоверно ниже контрольного показателя (Р<0,001), а при значении ИХВ меньше 1 высота сперматогенного эпителия была достоверно выше контрольного показателя (Р<0,01). При нейтральном характере воздействия (пример 5) высота сперматогенного эпителия не отличалась достоверно от контрольного значения. Кроме того, полученные результаты апробации соотносятся с обнаруженными тенденциями по уровням МДА для каждой из описанных групп (таблица 1).
Таким образом, предлагаемый способ позволяет с высокой точностью качественно оценивать характер экзогенных воздействий на сперматогенез у экспериментальных животных, что можно использовать при анализе аналогичных воздействий на человека. Способ также позволяет комплексно оценивать изменения в содержании уровней средних молекул разного профиля вне зависимости от характера воздействия.