УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕОТИДОВ
DEVICE FOR IDENTIFICATION OF NUCLEOTIDE SEQUENCES

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии и может быть использовано для идентификации последовательностей нуклеотидов биологических и синтетических объектов, например, для идентификации генов, бактерий, вирусов и т.д.
Известно устройство для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящее из источника света, излучение от которого направлено на отражающую подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами, и системы детекции отраженного от подложки света (Eliza Hutter, Marie-Paule Pileni, Detection of DNA Hybridization by Gold Nanoparticle Enhanced Transmission Surface Plasmon Resonance Spectroscopy // The Journal of Physical Chemistry B, V.107, №27, 2003, p.6497-6499).
Известно устройство для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящее из просвечивающего электронного микроскопа, излучение от источника света которого направлено на прозрачную подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами (Eliza Hutter, Marie-Paule Pileni, Detection of DNA Hybridization by Gold Nanoparticle Enhanced Transmission Surface Plasmon Resonance Spectroscopy // The Journal of Physical Chemistry B, V.107, №27, 2003, p.6497-6499).
Наиболее близким к заявляемому является известное устройство для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящее из источника света, излучение от которого направлено на прозрачную подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами и расположенной под ней системой детекции интенсивности света, прошедшего через подложку (патент РСТ WO 01/18242 А1, кл. C12Q 1/68) - прототип. В данном техническом решении использована комбинированная горизонтальная подложка, способная как пропускать, так и частично отражать падающий на нее свет, состоящая из основания и верхней части подложки. На верхней внешней части подложки иммобилизованы олигонуклеотиды, специфические к различным последовательностям нуклеотидов исследуемых объектов. В данном техническом решении использованы источники света с высокостабилизированным по интенсивности потоком светового излучения, что обусловлено конструктивными особенностями известного устройства.
Недостатками известного технического решения является его относительная сложность, связанная с его конструктивными особенностями, а также то, что данное устройство не позволяет осуществлять анализ с последовательностей нуклеотидов с высокой точностью.
Задачами изобретения являются упрощение известного устройства для идентификации последовательностей нуклеотидов, разработка устройства, позволяющего осуществлять идентификацию последовательностей нуклеотидов с более высокой точностью, а также расширение арсенала технических средств, дающих возможность идентифицировать последовательность нуклеотидов.
Техническая задача изобретения заключается в упрощении устройства для идентификации последовательностей нуклеотидов и повышении точности идентификации последовательностей нуклеотидов.
Указанный технический результат достигается тем, что в известном устройстве для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящем из источника света, излучение от которого направлено на прозрачную подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами и расположенной под ней системой детекции интенсивности света, прошедшего через подложку, подложка содержит не менее двух зон, на поверхности одной из которых иммобилизован слой олигонуклеотидов, неспецифических к исследуемой последовательности нуклеотидов, на поверхности другой зоны иммобилизован слой олигонуклеотидов, специфических к исследуемой последовательности нуклеотидов, а система детекции содержит не менее двух независимых фоточувствительных секций, каждая из которых освещена излучением, прошедшим только через одну зону.
Указанный технический результат может быть достигнут, если в качестве подложки устройство содержит внешнюю поверхность светочувствительной матрицы.
Указанный технический результат также может быть достигнут, если в качестве подложки устройство содержит не менее двух торцевых поверхностей от разных оптоволокон, причем каждая из поверхностей содержит не более одной зоны.
Предлагаемое техническое решение является новым и не описано в научно-технической литературе.
Предлагаемое изобретение может быть использовано для идентификации последовательностей нуклеотидов биологических и синтетических объектов, например, таких как гены, бактерии, вирусы и т.д. При этом исследуемые последовательности нуклеотидов могут отличаться как по химическому составу (строению), так и по количеству содержащихся в них звеньев.
В изобретении могут быть использованы различные источники света, например, такие как лазерный модуль, ртутная лампа, светодиод и т.д. При этом в отличие от прототипа в устройстве не обязательно использовать источники света с высокостабилизированным по интенсивности потоком светового излучения, что упрощает предлагаемое устройство.
Предлагаемое техническое решение позволяет проводить как качественный, так и количественный анализ последовательностей нуклеотидов в исследуемых объектах. При проведении количественного анализа целесообразнее использовать источники света с равномерным распределением интенсивности светового излучения. В данном техническом решении источник света должен располагаться так, чтобы его излучение было направлено на каждую из зон прозрачной подложки.
В предлагаемом устройстве подложка содержит не менее двух зон, на поверхности одной из которых иммобилизован слой олигонуклеотидов, неспецифических к исследуемой последовательности нуклеотидов, а на поверхности другой зоны иммобилизован слой олигонуклеотидов, специфических к исследуемой последовательности нуклеотидов. При этом зоны могут как соприкасаться, но не пересекаться друг с другом, так и быть отделены друг от друга пространством, перегородкой и т.д. Наличие в предлагаемом техническом решении в отличие от прототипа не менее двух зон в сочетании с нижеописанной системой детекции дает возможность повысить точность идентификации последовательностей нуклеотидов. При этом на одной из зон обязательно должны быть иммобилизованы неспецифические олигонуклеотиды для того, чтобы исключить влияние актов неспецифического связывания, а также исключить нежелательное влияние флуктуации интенсивности света по ходу эксперимента. Каждая другая зона содержит иммобилизованные на поверхности подложки олигонуклеотиды, специфические только к одному исследуемому объекту. Площадь каждой из зон может быть как одинаковой, так и отличаться друг от друга. Во втором случае вводят поправочные коэффициенты, учитывающие площадь каждой из зон.
В данном техническом решении подложка и система детекции фактически совмещены, поэтому количество зон всегда совпадает с количеством фоточувствительных секций. Для изготовления подложки могут быть использованы внешняя поверхность светочувствительной матрицы или не менее двух торцевых поверхностей от разных оптоволокон. При этом геометрические размеры подложки в зависимости от решаемой задачи могут варьироваться в широких пределах. В предлагаемом изобретении система детекции содержит не менее двух фоточувствительных независимых секций, каждая из которых освещена излучением, прошедшим только через одну зону, в качестве которых могут быть использованы, например, двухсекционный фотодиод, КМОП матрица (светочувствительная матрица, выполненная на основе комплементарной металлооксидной полупроводниковой технологии), прибор с зарядовой связью (ПЗС матрица) и т.д. Устройство может содержать в качестве подложки внешнюю поверхность светочувствительной матрицы, т.е. олигонуклеотиды иммобилизованы непосредственно на поверхности светочувствительных секций. При использовании в качестве подложки не менее двух торцевых поверхностей от разных оптоволокон нуклеотиды иммобилизуются непосредственно на торцевых поверхностях оптоволокон. При этом излучение, прошедшее через модифицированный торец оптоволокна, попадает на одну из фоточувствительных секций, а фоточувствительная секция может располагаться как со стороны модифицированного, так и немодифицированного торца оптоволокна. Стоит отметить, что в предлагаемом техническом решении каждая из торцевых поверхностей оптоволокон содержит не более одной зоны. Каждая из фоточувствительных секций может состоять, например, как из одной, так и нескольких фотодиодных секций, может представлять собой как всю матрицу, так и часть КМОП матрицы, ПЗС матрицы или других фоточувствительных элементов. Рассеянное излучение, обусловленное методикой эксперимента, может попадать только на одну фоточувствительную секцию, что позволяет повысить точность экспериментальных измерений.
Иммобилизацию специфических и неспецифических олигонуклеотидов на поверхности подложки любого вышеописанного типа можно осуществлять различными известными методами. При этом возможна как химическая иммобилизация олигонуклеотидов с использованием различных химических соединений, содержащих якорные группы, так и физическая иммобилизация, основанная, например, на электростатическом взаимодействии. Плотность иммобилизованных на поверхности подложки специфических и неспецифических олигонуклеотидов может варьироваться в широких пределах в зависимости от решаемой конкретной технической задачи.
Предлагаемое изобретение работает следующим образом. На поверхности разных зон подложки известными приемами иммобилизуют специфические и неспецифические олигонуклеотиды к исследуемому объекту. После этого проводят измерения разности интенсивности света, прошедшего через разные зоны подложки. Таким образом, получают сигнал, соответствующий нулевой концентрации исследуемых соединений. Известными биохимическими методами нарабатывают исследуемые последовательности нуклеотидов. Дальнейший анализ может проводиться, например, двумя известными способами. Первый из них заключается в предварительной иммобилизации исследуемых последовательностей нуклеотидов на поверхности носителя (наночастиц) с последующей обработкой вышеназванных зон подложки суспензией модифицированных наночастиц. При этом происходит адсорбция наночастиц на поверхности соответствующих зон подложки за счет комплементарного связывания специфических олигонуклеотидов с идентифицируемой последовательностью нуклеотидов. В зонах, содержащих неспецифические олигонуклеотиды к идентифицируемой последовательности нуклеотидов, вышеуказанного комплементарного связывания не происходит, в результате сорбция наночастиц на поверхности этих зон практически отсутствует.
Другой известный способ заключается в предварительном введении биотина в исследуемую последовательность нуклеотидов. Затем поверхность подложки, содержащую иммобилизованные олигонуклеотиды, обрабатывают раствором исследуемых последовательностей нуклеотидов, модифицированных биотином, в результате чего происходит комплементарное связывание специфических олигонуклеотидов с идентифицируемой последовательностью нуклеотидов на поверхности зон подложки. После этого модифицированную таким образом подложку обрабатывают суспензией наночастиц, содержащих химически связанный с ними стрептавидин. При этом наночастицы сорбируются только в тех зонах, где произошло комплементарное связывание биотина со стрептавидином.
В обоих способах перед измерениями подложку промывают для удаления не вступивших в реакцию реагентов. Затем измеряют разность интенсивности света, прошедшего через специфические и неспецифическую зоны подложки. Изменение разности интенсивности пропорционально количеству сорбированных наночастиц, которая соответствует определенной концентрации исследуемых последовательностей нуклеотидов в растворе. Это позволяет проводить как качественный, так и количественный анализ исследуемых последовательностей нуклеотидов.
Преимущества предлагаемого изобретения иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1 (качественный анализ)
В опыте используют устройство (систему) для идентификации последовательностей нуклеотидов, имеющее источник света, в качестве которого оно содержит светодиод белого света, излучение от которого направлено на поверхность светочувствительной матрицы с двумя отделенными друг от друга зонами. Одна из зон содержит на рабочей поверхности химически иммобилизованные олигонуклеотиды, специфические к последовательности нуклеотидов бактерии Е.coli, а другая зона содержит на рабочей поверхности химически иммобилизованные олигонуклеотиды, неспецифические к последовательностям нуклеотидов Е.coli. В качестве светочувствительной матрицы устройство содержит ПЗС матрицу марки Hamamatsu (Япония). При таких конструктивных особенностях устройства на каждую независимую фоточувствительную секцию устройства попадает излучение, прошедшее только через одну зону.
Качественную идентификацию (анализ) последовательностей нуклеотидов Е.coli с помощью данного устройства проводят следующим образом. Предварительно проводят измерения разности интенсивности света, прошедшего через разные зоны подложки. После этого биотин химически прививают к исследуемой последовательности нуклеотидов Е.coli, а белок стрептавидин к поверхности наночастиц кремния с диаметром частиц 100 нанометр (нм). Затем поверхность подложки, содержащую иммобилизованные олигонуклеотиды, обрабатывают исследуемым раствором последовательностей нуклеотидов, модифицированных биотином, в результате чего происходит комплементарное связывание специфических олигонукелотидов с идентифицируемой последовательностью нуклеотидов на поверхности зоны подложки. После этого модифицированную таким образом подложку обрабатывают суспензией наночастиц, содержащих химически связанный с ними стрептавидин. При этом наночастицы сорбируются только в зоне, где произошло связывание биотина со стрептавидином. После этого промывают подложку в буферном растворе и бидистиллированной воде для удаления не вступивших в реакцию реагентов и высушивают до постоянной массы. Затем измеряют разность интенсивности света, прошедшего через специфические и неспецифическую зоны подложки. Отклонение разности интенсивности от базового уровня говорит о присутствии последовательностей нуклеотидов Е.coli в исследуемом растворе. Таким образом, данное устройство позволяет проводить качественный анализ последовательностей нуклеотидов с точностью 92%.
Затем производят аналогичный эксперимент, но только используют раствор с последовательностями нуклеотидов, не принадлежащих Е.coli. Нулевое отклонение разности интенсивности от базового уровня говорит об отсутствии последовательностей нуклеотидов Е.coli в исследуемом растворе
Пример 2 (количественный анализ)
В опыте используют устройство, аналогичное описанному в примере 1, однако используют набор растворов, содержащих известные концентрации последовательностей нуклеотидов Е.Coli от 0 до 5 нанограмм/миллилитр (нг/мл). Для каждого раствора определяют отклонение разности интенсивности света, прошедшего через разные зоны, от базового уровня. На основе этих данных строят градуировочный график зависимости отклонения разности интенсивности света от концентрации последовательностей нуклеотидов в исследуемом растворе.
Затем проводят аналогичный эксперимент с использованием раствора последовательностей нуклеотидов Е.coli, взятых в концентрации 11 нг/мл. Измеряют отклонение разности интенсивности света, прошедшего через разные зоны, от базового уровня и по градуировочному графику определяют, что в исследуемом растворе присутствует последовательность нуклеотидов Е.Coli в концентрации 12 нг/мл.
Эксперимент был проведен 5 раз, в результате было установлено, что точность определения концентрации последовательностей нуклеотидов составляет 91%.
Пример 3
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют устройство, имеющее в виде подложки 3 торцевые поверхности (зоны) от трех различных оптоволокон. Одна из зон содержит на рабочей поверхности химически иммобилизованные олигонуклеотиды, специфические к последовательности нуклеотидов бактерии Е coli, а другая зона содержит на рабочей поверхности иммобилизованные олигонуклеотиды, соответствующие специфическим участкам кодирующих генов бактериальных ферментов бета-лактамаз СТХ-М типа, а третья зона содержит олигонуклеотиды, неспецифические к последовательностям нуклеотидов Е coli и бета-лактамаз СТХ-М.
В опыте используют устройство, содержащее в качестве источника света твердотельный лазерный модуль LDM-5 Laserex Ltd. (Австралия), а в качестве системы детекции устройство содержит трехсекционный фотодиод.
Эксперимент показывает, что данное устройство позволяет одновременно проводить качественный анализ различных последовательностей нуклеотидов с точностью 90%.
Пример 4
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют устройство, содержащее в качестве источника света ртутную лампу и имеющее подложку, представляющую собой КМОП матрицу, разделенную на две секции. При этом одна из зон содержит на рабочей поверхности физически иммобилизованные олигонуклеотиды, соответствующие специфическим участкам кодирующих генов бактериальных ферментов бета-лактамаз ТЕМ типа, а другая зона содержит на рабочей поверхности физически иммобилизованные олигонуклеотиды, неспецифические к последовательностям нуклеотидов бета-лактамаз ТЕМ типа.
Эксперимент показывает, что данное устройство позволяет проводить качественный анализ последовательности нуклеотидов бета-лактамаз ТЕМ типа с точностью 92%.
Пример 5 (контрольный, по прототипу)
В опыте используют устройство для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящее из источника света, в качестве которого оно содержит гелий-неоновый лазер марки Coherent Inc с высокостабилизированным по интенсивности потоком светового излучения. Излучение от лазера направлено на прозрачную стеклянную подложку, содержащую только одну зону, на поверхности которой химически иммобилизованы олигонуклеотиды, специфические к последовательности нуклеотидов бактерии Е.Coli. В качестве системы детекции устройство содержит фотодиод марки Hamamatsu (Япония).
Качественную идентификацию (анализ) последовательностей нуклеотидов Е.coli с помощью данного устройства проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что определяют не разность интенсивностей от различных фоточувствительных секций, а проводят определение изменения интенсивности света на одной секции.
Эксперимент показывает, что данное устройство позволяет проводить качественный анализ последовательности нуклеотидов бактерии Е.coli с точностью 75%.
Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенное устройство действительно позволяет проводить качественный и количественный анализ последовательностей нуклеотидов, упрощает известное устройство для идентификации последовательности нуклеотидов за счет устранения необходимости использования  источника света с высокостабилизированным по интенсивности потоком светового излучения, повышает точность идентификации последовательностей нуклеотидов с 75% (прототип) до 92% и расширяет арсенал технических средств, которые могут быть использованы для идентификации последовательностей нуклеотидов.