СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ
METHOD FOR DETECTING CARBOHYDRATE METABOLITES IN BIOLOGICAL TISSUES

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для изучения количественного определения метаболитов углеводного обмена (гликогена, глюкозы, лактата) в биологических тканях (печени, скелетной и сердечной мышцах) трупов человека и животных для изучения метаболизма углеводов в организме и дальнейшей диагностики патологических состояний и причины смерти.
Известен способ определения метаболитов углеводного обмена (гликогена, глюкозы, молочной кислоты) в биологических тканях (печени, миокарде, скелетной мышце): "Судебно-медицинская оценка некоторых показателей углеводного обмена при смерти от острого отравления этиловым алкоголем и ишемической болезни сердца: Метод. рекоменд. / №583/01-02 бюро главн. суд.-мед. эксперт. М., 1994. 28 с.", заключающийся в том, что исследуют свежие биологические ткани, определение суммарного содержания глюкозы и гликогена проводят по методу Kemp, Kits van Heijningen, определение лактата (молочной кислоты) колориметрическим методом с параоксифенилом по Н.И.Мешковой и С.Е.Северину.
Недостатки известного способа.
Способ рассчитан на проведение анализа в первые сутки после взятия объектов исследования (в течение нескольких часов). Для практических целей необходим больший срок. В постмортальном периоде даже при хранении образцов в холодильнике происходит изменение показателей углеводного обмена, поэтому рекомендуется замораживать объекты исследования до момента исследования. Транспортировка объектов исследования в данных условиях представляет определенные трудности. Способ позволяет определять отдельно суммарное содержание глюкозы и гликогена в тканях и отдельно содержание лактата, то есть используются две пробы биологического материла. Способ не позволяет определять раздельное содержание глюкозы и гликогена. Используются неспецифические химические методы определения метаболитов углеводного обмена, результаты которых недостоверны.
Технический результат: определение ряда метаболитов углеводного обмена в одной пробе биологического материала, возможность исследования объектов в течение длительного периода после забора материала - количественный результат не зависит от длительности периода между забором объекта и проведением лабораторного исследования.
Указанные задачи достигаются путем предварительного фиксирования биологического материала в ацетоне с последующей пробоподготовкой и определением метаболитов углеводного обмена в фиксаторе (в ацетоне), при этом исследуют содержание метаболитов в межтканевой жидкости и самой ткани высокоспецифичными ферментными методами.
Способ осуществляют следующим образом: биологические ткани, например части печени, скелетной мышцы, миокарда и др. массой около 0,5-2,0 г, помещают в отдельные стеклянные или пластиковые флаконы с плотно закрывающимися пробками, заливают ацетоном для фиксирования объектов в объемном соотношении не менее 1:5. Исследования проводят через трое и более суток (для более полной фиксации).
Из флаконов аккуратно извлекают кусочки тканей, помещают на фильтровальную бумагу. Проводят измерение количества фиксатора (в мл). В предварительно маркированные фарфоровые тигли вносят фиксатор (по 0,5-1,0 мл) и проводят испарение в вытяжном шкафу. Для ускорения процесса используют электрический фен. Далее в тигли вносят соответствующий объем дистиллированной воды (0,5-1,0 мл) и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. В полученном растворе определяют метаболиты углеводного обмена ферментными методами.
Кусочки тканей освобождают на фильтровальной бумаге от остатка фиксатора в вытяжном шкафу, помещают в термостат (37°C) на 10-15 мин, проводят взвешивание. Навески тканей растирают с небольшим количеством кварцевого песка в фарфоровых ступках с добавлением 8% раствора трихлоруксусной кислоты. Гомогенизат сливают в мерные центрифужные пробирки. Отмечают уровень жидкости. Пробирки, прикрытые резиновыми пробками, ставят в термоблок или на кипящую водяную баню на 30 минут (при этом весь гликоген подвергают гидролизу до глюкозы). После охлаждения центрифугируют 10 минут при 1600 g. Нейтрализуют до рН 7-8 10% NaOH и доводят уровень жидкости до метки дистиллированной водой. Вновь центрифугируют 15 минут при вышеуказанных условиях. В надосадочной жидкости определяют содержание метаболитов углеводного обмена ферментными методами.
Количественное определение глюкозы проводят стандартным унифицированным глюкозооксидазным методом [Балаховский И.С.в кн. «Лабораторные исследования в клинике» под ред. Меньшикова В.В., 1987 г., с.230-234] (набор реагентов «Фотоглюкоза» фирмы «Импакт» - Москва). Количественное определение молочной кислоты (лактата) проводят энзиматическим колоримертическим методом (набор реагентов "Lactic Acid" фирмы "Vital Diagnostics SPb" - Санкт-Петербург).
Расчет проводят по формуле:
С - концентрация метаболита в образце (мкмоль/г);
ОП
D - оптическая плотность образца при исследуемой длине волны;
CT
D - оптическая плотность стандартного раствора исследуемого вещества;
CT
C - концентрация стандартного раствора (ммоль/л);
М - масса фиксированного объекта или навески (г);
V - объем раствора (мл), в котором гомогенизировали ткань или объем фиксатора (мл);
Р - коэффициент дополнительного разведения.
Пример
Определение метаболитов углеводного обмена в фиксаторе позволяет выявлять их количественное содержание в межтканевой жидкости, а в фиксированной ткани - в самой ткани.
ст
ст
Определение количественного содержания глюкозы в фиксаторе (ацетоне): С=1,25 ммоль/л; D=0,408
Объект исследования
М (г)
V (мл)
Р
D
С (мкмоль/г)
Печень
0,86
7,2
3
0,562
43,3
Скелетная мышца
0,55
7,1
-
0,087
3,4
Миокард
0,61
7,9
-
0,309
12,3
ст
ст
Определение количественного содержания лактата в фиксаторе (ацетоне): С=3,33 ммоль/л; D=0,369
Объект исследования
М (г)
V (мл)
Р
D
С (мкмоль/г)
Печень
0,86
7,2
-
0,244
18,4
Скелетная мышца
0,66
7,1
-
0,134
15,6
Миокард
0,61
7,9
3
0,180
63,1
ст
ст
Определение количественного содержания гликогена в тканях (в пересчете на глюкозу): С=1,25 ммоль/л; D=74
Объект исследования
М г)
V (мл)
Р
D
С (мкмоль/г)
Печень
0,25
6,0
3
0,380
91,4
Скелетная мышца
0,50
6,0
-
0,281
11,3
Миокард
0,50
6,0
-
0,385
15,4
ст
ст
Определение количественного содержания лактата в тканях: С=3,33 ммоль/л; D=0,280
Объект исследования
М (г)
V(мл)
Р
D
С (мкмоль/г)
Печень
0,25
6,0
-
0,077
22,0
Скелетная мышца
0,50
6,0
-
0,244
34,8
Миокард
0,50
6,0
3
0,196
83,9
Аналогично проводят исследования и других тканей, а также измерения других интересующих метаболитов, например пировиноградной кислоты.
Положительный эффект.
Способ определения метаболитов углеводного обмена в тканях позволяет проводить измерения ряда параметров в одном объекте исследования, результат не зависит от длительности периода между забором объекта и проведением лабораторного исследования.