FAD-2-МУТАНТЫ И РАСТЕНИЯ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ОЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ
FAD-2-MUTANTS AND HIGH OLEIC ACID PLANTS

Область техники
Настоящее изобретение относится к растениям, семенам и продуктам, их производным, в частности к растениям рода Brassica, продуктам семян, полученным из них, которые имеют мутантные последовательности, придающие маслу из семян высокий профиль олеиновой кислоты.
Более конкретно, изобретение относится к мутантным последовательностям дельта-12-десатуразы жирных кислот, также обозначенным в настоящей заявке как мутантные FAD2-последовательности в таких растениях, которые придают маслу из семян высокий профиль олеиновой кислоты.
Предшествующий уровень техники
Дельта-12-десатураза жирных кислот (также известная как олеиндесатураза или десатураза олеиновой кислоты) участвует в ферментативном превращении олеиновой кислоты в линоленовую кислоту.
Сорта с высоким содержанием олеиновой кислоты (возможно в комбинации с низким уровнем линоленовой кислоты) используются для многих различных приложений (для применения в пищевой промышленности, применения в здравоохранении, применения в качестве биодизельного топлива и пр.).
Ранее в литературе сообщалось, что мутантные семена, из которых получают масло, с высоким содержанием олеиновой кислоты (содержание олеиновой кислоты выше 70% веса из расчета на общий вес присутствующих в масле жирных кислот) имеют недостаточную агрономическую ценность, и/или плохие характеристики корневой системы, и/или очень низкую продуктивную способность.
Все еще существует потребность в материале, имеющем стабильно высокое содержание олеиновой кислоты (возможно в сочетании со стабильно низким содержанием линоленовой кислоты) на всей территории его выращивания и на протяжении ряда лет, а также с хорошими агрономическими характеристиками и с нормальной морфологией семян масличной культуры. В частности, растения не должны иметь фасциации и должны иметь нормальное развитие корневой системы.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к растению, или части растения, или семени, содержащему первый ген FAD2 и, возможно, второй ген FAD2, причем указанный первый или указанный второй ген FAD2 имеют делецию в положении 1421 и в соответствующем ему положении (также обозначаемый как DEL.1421) в сравнении с геном FAD2 дикого типа, таким как ген FAD2 дикого типа с последовательностью SEQ ID NO 9.
Другим объектом настоящего изобретения является растение, или часть растения, или семя, содержащее первый ген FAD-2, имеющий делецию в положении 1421 или в соответствующем ему положении в сравнении с геном FAD2 дикого типа, таким как ген FAD2 дикого типа с последовательностью SEQ ID NO 9, и второй ген FAD2, кодирующий FAD-2-белок, имеющий замену аминокислоты в положении 118 или в соответствующем ему положении в сравнении с белком FAD-2 дикого типа, таким как белок FAD-2 дикого типа с последовательностью SEQ ID NO 2 или 6.
Растение, или часть растения, или семя согласно изобретению предпочтительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую SEQ ID NO 1 или 5, в которой нуклеотид (C) в положении 215 удален, или содержащую (вариантную) последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO 1 или 5, в которой нуклеотид, соответствующий положению 215, удален.
Растение, или часть растения, или семя согласно изобретению может содержать (вариантную) последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO 9, в которой нуклеотид, соответствующий положению 1421, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1421). Предпочтительно, растение, или часть растения, или семя согласно изобретению содержит последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую SEQ ID NO 9, в которой нуклеотид в положении 1421 удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1421).
Растение, или часть растения, или семя согласно изобретению может содержать (различную) последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO 10, в которой нуклеотид, соответствующий положению 1453, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1453). Предпочтительно, чтобы растение, или часть растения, или семя согласно изобретению содержало последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую SEQ ID NO 10, в которой нуклеотид в положении 1453 удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1453).
Предпочтительное растение, или часть растения, или семя согласно изобретению дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок FAD-2, имеющий замену аминокислоты в положении 118 или в соответствующем ему положении в сравнении с белком FAD-2 дикого типа, таким как белок FAD2 дикого типа с последовательностью SEQ ID NO 2 или 6. Предпочтительно, указанной замещенной аминокислотой в положении 118 или соответствующем положении является фенилаланин.
Растение, или часть растения, или семя согласно изобретению может быть получено посредством обработки мутагеном, в частности обработки этилметансульфонатом (EMS).
Другим объектом настоящего изобретения является изолированная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая (или состоящая из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 1 или 5, в которой нуклеотид в положении 215 удален (т.е. SEQ ID NO 1 или 5 с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 215).
Объектом изобретения также является (вариантная) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок FAD2 (или фрагмент указанного белка), по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичная SEQ ID NO 1 или 5, в которой нуклеотид, соответствующий положению 215, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 215).
Изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) (вариантную) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок FAD2 (или фрагмент), по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO 9, в которой нуклеотид, соответствующий положению 1421, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1421). Предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержала (или состояла из) последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 9, в которой нуклеотид в положении 1421 удален (т.е. SEQ ID NO 9 с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1421).
Изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) (вариантную) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок FAD2 (или фрагмент), по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO 10, в которой нуклеотид, соответствующий положению 1453, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1453). Предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержала (или состояла из) последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 10, в которой нуклеотид в положении 1453 удален (т.е. SEQ ID NO 10 с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1453).
Предпочтительная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит (состоит из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 3, комплементарную ей форму или форму ее РНК.
Также объектом изобретения является фрагмент по меньшей мере из 10 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере из 15, 20, 25, 30 или 40 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере из 50 или 100 нуклеотидов изолированной молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, причем указанный фрагмент содержит мутантный кодон, полученный в результате указанной делеции.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения линий растений с высоким содержанием олеиновой кислоты, включающий в себя
a) индукцию мутагенеза предпочтительно посредством обработки EMS по меньшей мере в некоторых клетках растения, в частности, растения рода Brassica, и предпочтительно, сорта Brassica napus, у которого содержание олеиновой кислоты менее 70%;
b) регенерацию растения по меньшей мере из одной указанной мутантной клетки;
c) селекцию регенерировавших растений, которые имеют последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению; и
d) получение следующих поколений растений из указанных регенерировавших растений.
Указанные регенерировавшие растения содержат последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO 9, в которой нуклеотид, соответствующий положению 1421, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1421), или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO 10, в которой нуклеотид, соответствующий положению 1453, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1453).
Предпочтительно, чтобы указанные регенерировавшие растения содержали последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 9, в которой нуклеотид 1421 удален (т.е. SEQ ID NO 9 с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1421), или последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 10, в которой нуклеотид 1453 удален (т.е. SEQ ID NO 10 с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1453), или последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 3.
Более предпочтительно, чтобы указанные регенерировавшие растения дополнительно содержали последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок FAD-2, имеющий замену аминокислоты в положении 118 или в соответствующем ему положении в сравнении с белком FAD2 дикого типа, таким как белок FAD2 дикого типа SEQ ID NO 2 или 6. Предпочтительно, чтобы указанной замещенной аминокислотой в положении 118 или в соответствующем ему положении являлся фенилаланин.
Стадия c) может включать в себя любой способ, известный в области техники, с тем, чтобы идентифицировать указанную(ые) мутацию(ии) (DEL.1421, DEL.1453, DEL.215 и , возможно, SNP1590), в частности стадия c) может включать в себя применение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP), определение полиморфизмов путем случайной амплификации (RAPD) или методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения линий растений с высоким содержанием олеиновой кислоты, включающий в себя
i. скрещивание первого растения согласно изобретению со вторым растением,
ii. получение семян после скрещивания на стадии (a),
iii. выращивание фертильных растений из таких семян,
iv. получение семян от потомства растений на стадии (c) и
v. идентификацию среди потомства тех семян, которые обладают высоким содержанием олеиновой кислоты.
Стадия (v) по идентификации указанных семян может включать в себя использование молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
Более конкретно, стадия (v) может включать в себя любой способ, известный в данной области, с тем, чтобы идентифицировать указанную(ые) мутацию(и) согласно изобретению, и, более конкретно, стадия (v) может включать в себя использование полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP), обнаружение полиморфизмов путем случайной амплификации (RAPD) или метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Другой объект настоящего изобретения относится к растительному маслу, полученному из семян согласно изобретению, причем указанное масло содержит более чем (приблизительно) 72%, 75%, 80% или 85% олеиновой кислоты из расчета на общий вес присутствующих в указанном масле жирных кислот.
Предпочтительно, чтобы растительное масло согласно изобретению дополнительно содержало менее чем (приблизительно) 4%, 3,5%, 3%, 2%, 1% или 0,5% линоленовой кислоты.
Краткое описание фигур
Фиг.1 соответствует списку последовательностей согласно изобретению.
Фиг.2 соответствует документам о депонировании сортов MSP05, 28DHS.086 и MSP12.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к растениям, в частности к растениям рода Brassica, предпочтительно, к сортам Brassica napus, из которых получают масло, обладающее содержанием олеиновой кислоты выше чем 70% по весу из расчета на общий вес присутствующих в масле жирных кислот.
Более конкретно, растение согласно изобретению содержит по меньшей мере один мутантный ген FAD2 согласно изобретению.
Предпочтительно, чтобы указанный мутантный ген FAD2 наделял семена указанных растений и масло, экстрагированное из указанных семян, высоким содержанием олеиновой кислоты (то есть когда содержание олеиновой кислоты выше чем 70% по весу из расчета на общий вес присутствующих в масле жирных кислот).
Настоящее изобретение относится также к любой части или любому продукту указанного растения, имеющему по меньшей мере один мутантный ген FAD2.
В контексте настоящего изобретения под частью или продуктом растения подразумевают лист, семядолю, стебель, черешок, стебель, семя или любую другую ткань или фрагмент ткани указанного растения.
Настоящее изобретение относится также к любому потомству указанного растения, имеющему по меньшей мере один мутантный ген FAD2 согласно изобретению.
В контексте настоящего изобретения термин "потомство" относится к прямым и косвенным потомкам, потомству и производным растения или растений согласно изобретению и включает в себя первое, второе, третье и/или последующие поколения, которые могут быть получены посредством самоопыления, скрещивания с растениями такого же или отличного генотипа и могут быть модифицированы многими подходящими методами генной инженерии.
Настоящее изобретение относится также к указанным мутантным генам FAD2, которые, если присутствуют в растении, наделяют семена высоким содержанием олеиновой кислоты.
В частности, изобретение относится к новым изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, которые соответствуют новым вариантным формам генов FAD2 с делецией нуклеотида в положении 1421 или в соответствующем ему положении в сравнении с геном FAD2 дикого типа, например геном FAD2 дикого типа, представленным последовательностью SEQ ID NO 9.
Указанная делеция изменяет функции продукта гена FAD2, посредством чего в растении, в котором экспрессируется мутантная последовательность(и), уровень олеиновой кислоты повышается по сравнению с соответствующим уровнем в растении, в котором экспрессируется последовательность(и) дикого типа.
В частности, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична любой из SEQ ID NO 9 или ее комплементарной форме или форме ее РНК, в которой нуклеотид в положении 1421 или в соответствующем ему положении удален (то есть дополнительно удален нуклеотид, соответствующий положению 1421).
Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которая содержит указанную делецию в положении 1421 или в соответствующем ему положении (также обозначаемая как DEL.1421), может быть получена из сортов Brassica napus, например из сортов CONTACT, CABRIOLET, 28DHS.086 и/или MSP12.
Термином "в положении 1421" обозначают нуклеотид в положении 1421 в гене  FAD2 дикого типа, представленном последовательностью SEQ ID NO 9, а также нуклеотид, соответствующий указанному положению в гене дикого типа или вариантном гене, который будет иметь отличную последовательность нуклеиновой кислоты из-за делеций или добавочных нуклеотидов в последовательности.
Термин "соответствующий положению" в настоящем описании означает, что положение определено не только числом предшествующих нуклеотидов. Положение данного нуклеотида в соответствии с настоящим изобретением может измениться из-за делеций или добавочных нуклеотидов в последовательности нуклеиновой кислоты. Таким образом, под "соответствующим положением" в соответствии с настоящим изобретением следует подразумевать, что нуклеотид, на который ссылаются, может отличаться по указанному номеру, но все еще имеет сходные соседние нуклеотиды в линейной последовательности. Например, таким положением являются положение 1453 в SEQ ID NO 10 или положение 215 в SEQ ID NO 1 или 5.
Точно также термин "в положении 118" следует понимать как обозначение положения аминокислоты 118 в белке FAD2 дикого типа, представленном последовательностью SEQ ID NO 2 или 6, а также как ссылку на аминокислоту, соответствующую указанному положению в белке дикого типа или вариантом белке FAD2, который будет иметь отличную аминокислотную последовательность из-за делеций или добавочных аминокислот в полипептиде.
Термин "соответствующий положению" в настоящем описании означает, что положение не только определено числом предшествующих аминокислот. Положение данной аминокислоты в соответствии с настоящим изобретением может измениться из-за делеций или добавочных аминокислот в полипептиде. Таким образом, под "соответствующим положением" согласно изобретению следует подразумевать, что аминокислота(ы), на которую(ые) ссылаются, может(гут) отличаться по указанному номеру, но все еще имеет(имеют) сходные соседние аминокислоты в линейной последовательности.
В другом аспекте молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодирует белок FAD2, в котором аминокислота в положении 118 или в соответствующем ему положении заменена в сравнении с белком FAD2 дикого типа, например белком FAD2 дикого типа, представленным последовательностью SEQ ID NO 2 или 6.
Изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит по меньшей мере одну мутацию, причем указанная мутация приводит к указанной замене в положении 118 или в соответствующем ему положении, предпочтительно, замене лейцина на триптофан, более предпочтительно, замене на фенилаланин, в сравнении с белком FAD2 дикого типа, таким как белок FAD2 дикого типа, представленный последовательностью SEQ ID NO 2 или 6.
Указанная мутация (мутации) изменяет функциональные свойства полученного продукта гена FAD2, посредством чего в растении, в котором экспрессируется(ются) мутантная(ые) последовательность(и), изменяется уровень олеиновой кислоты, предпочтительно, увеличивается по сравнению с соответствующим уровнем в растении, в котором экспрессируется(ются) последовательность(и) дикого типа.
В частности, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодирует белок FAD2, имеющий замену лейцина в положении 118 на фенилаланин, в сравнении с белком FAD2 дикого типа, представленным аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6.
Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 1, 5, 9 или 10, в которой кодон, кодирующий аминокислоту в положении 118, имеет по меньшей мере одну мутацию, в результате чего кодирует отличную от лейцина аминокислоту и предпочтительно кодирует фенилаланин в положении 118 согласно белку FAD2 согласно изобретению.
Другими словами, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 1, 5, 9 или 10, которая дополнительно содержит по меньшей мере одну мутацию в кодоне, кодирующем аминокислоту в положении 118, в результате кодирующем отличную от лейцина аминокислоту и предпочтительно кодирующем фенилаланин в положении 118.
Предпочтительная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит (или состоит из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 7.
В другом аспекте молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может кодировать белок FAD2, имеющий делецию в положении 118 относительно белка  FAD2 дикого типа, например белка FAD2 дикого типа, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2 или 6.
Более конкретно, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может кодировать белок FAD2, в котором в сравнении с белком FAD2, представленным аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2 или 6, лейцин в положении 118 удален.
Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 1, 5, 7, 9 или 10, в которой кодон, кодирующий аминокислоту в положении 118, удален (то есть SEQ ID NO 1, 5, 7, 9 или 10 с дополнительно удаленным кодоном, кодирующим аминокислоту в положении 118).
Как будет очевидно для специалистов, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 1, 5, 7, 9 и 10 не являются единственными последовательностями, которые могут быть использованы для получения белка FAD2 согласно изобретению. Также предполагаются любые молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие различные последовательности, но которые в силу вырожденности генетического кода кодируют белок FAD2, содержащий замену аминокислоты в положении 118 (или в соответствующем ему положении) в сравнении с аминокислотной последовательностью дикого типа, такой как последовательность белка FAD2 дикого типа SEQ ID NO 2 или 6.
В частности, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична любой из SEQ ID NO 1, 5, 7, 9 и 10, или их комплементарной форме, или форме их РНК, кодирующим белок FAD2, имеющий замену аминокислоты в положении 118 в сравнении с белком FAD2 дикого типа.
Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, имеющая указанную мутацию(и), приводящую к указанной замене аминокислоты в положении 118, может быть получена из сортов Brassica napus, таких как сорт 28DHS.086 и/или сорт MSP12.
В частности, в молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению есть мутация в положении 1590 (также обозначаемая как SNP1590) последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 10, которая вызывает изменение в генетическом кодоне с CTT на TTT, приводящее к замене аминокислоты в положении 118 относительно аминокислотной последовательности дикого типа, такой как белок FAD2 дикого типа, представленный последовательностью SEQ ID NO 6.
Изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, содержащая указанную мутацию SNP1590, приводящую к замене лейцина в положении 118 на фенилаланин, изменяет функциональные свойства полученного продукта гена FAD2, посредством чего уровень олеиновой кислоты в растении, в котором экспрессируется мутантная последовательность, увеличен по сравнению с соответствующим уровнем в растении, в котором экспрессируется последовательность дикого типа.
В рамках настоящего изобретения термин "SNP1590" относится к однонуклеотидному полиморфизму, соответствующему указанной мутации в положении 1590 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 10, и может также относиться к соответствующей мутации в любой молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей белок FAD2 согласно изобретению с заменой аминокислоты в положении 118 (или в соответствующем 118 положении) в сравнении с белком FAD2 дикого типа, таким как белок FAD2 дикого типа, представленным последовательностью SEQ ID NO 2 или 6.
Рассматривается любой фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению по меньшей мере из 10, 15, 20, 25, 50, 100 или более нуклеотидов, содержащий по меньшей мере одну мутацию, приводящую к белку FAD2 согласно изобретению.
В частности, рассматривается фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению по меньшей мере из 10, 15, 20, 25, 50, 100 или более нуклеотидов, содержащий указанную делецию DEL1421, DEL1453 или DEL215 или указанный SNP1590.
Также рассматривается фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению по меньшей мере из 20, 25, 50, 100 или более нуклеотидов, включающий указанную DEL1421 и указанный SNP1590.
Такие фрагменты могут быть использованы в качестве праймеров, в качестве зондов и/или в качестве маркеров.
Фрагменты нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть использованы в качестве маркеров при генетическом картировании в растениях.
В частности, фрагменты нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть использованы в качестве маркеров в программах по селекции растений.
Такие маркеры могут включать в себя полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP), обнаружение полиморфизма путем случайной амплификации (RAPD), полимеразную цепную реакцию (ПЦР) или, например, самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (3SR).
Методики маркер-опосредованной селекции могут быть использованы для идентификации и селекции растений согласно изобретению или его потомства, также являющегося объектом изобретения, в процессе селекции.
Методики маркер-опосредованной селекции могут быть использованы в дополнение или в качестве альтернативы другим видам методов идентификации.
Примером маркер-опосредованной селекции является использование ПЦР-праймеров, которые специфически амплифицируют молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
Настоящее изобретение, таким образом, связано со способами анализа сегрегации и селекции генетических гибридов, включающих в себя растения, имеющие последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
Объектом настоящего изобретения также является молекула нуклеиновой кислоты по меньшей мере из 10 или 15 нуклеотидов, предпочтительно, из 20, 25, 50, 100 или более нуклеотидов, которая в жестких условиях гибридизуется с любой последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 1, 3, 5, 7 и с 9 по 12, которая содержит (или дополнительно содержит) мутацию согласно изобретению.
Примером жестких условий гибридизации является гибридизация приблизительно при 50°C, или при приблизительно 60°C или выше, и 0.1xSSC (буфер 0,15 M NaCl, 0,015 M тринатрия цитрат).
Способ согласно изобретению может, например, включать в себя определение наличия в геноме конкретных аллелей FAD2, содержащих по меньшей мере указанную делецию в (или соответствующем) положении 1421 в сравнении с геном FAD2 дикого типа, таким как ген FAD2 дикого типа, представленный последовательностью SEQ ID 9, и/или указанную замену, SNP1590, (приводящую к замене лейцина на фенилаланин) в (или соответствующем) положении 118 в сравнении с белком FAD2 дикого типа, таким как белок FAD2 дикого типа SEQ ID NO 2 или 6.
Такое определение можно, например, осуществить рядом методов, таких как ПЦР-амплификация, ДНК-«фингерпринт», РНК-«фингерпринт», гель-блоттинг и RFLP-анализ, методы защиты от нуклеазы, секвенирование соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты, получение антител (моноклональных или поликлональных) или альтернативные методы, предназначенные для различения белков, полученных с использованием соответствующих аллелей от других вариантных форм такого белка или от формы дикого типа.
В частности, такие фрагменты могут быть использованы в способе маркер-опосредованной селекции характеристик растений с высоким содержанием олеиновой кислоты, предпочтительно для видов рода Brassica, более конкретно для сортов Brassica napus.
Другой аспект настоящего изобретение относится к рекомбинантной нуклеотидной последовательности, содержащей одну или несколько смежных регуляторных последовательностей, функционально связанных с нуклеотидной последовательностью согласно изобретению. Указанная смежная регуляторная последовательность предпочтительно происходит из соответствующих организмов.
Однако указанные смежные регуляторные последовательности могут также происходить из несоответствующих организмов.
Указанные смежные регуляторные последовательности являются определенными последовательностями, такими как промоторы, энхансеры, последовательности сигнала секреции и/или терминаторы.
Другой аспект изобретения относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, возможно, функционально связанную с одной или несколькими смежными регуляторными последовательностями, происходящими из соответствующего или из несоответствующего организмов.
В контексте настоящего изобретения "вектор" определен как любой биохимический конструкт, который может быть использован для введения нуклеотидной последовательности (посредством трансдукции, трансфекции, трансформации, инфекции, конъюгации и т.д.) в клетку.
Преимущественно вектор согласно изобретению выбран из группы, состоящей из плазмид (включая реплицирующиеся и интегрирующиеся плазмиды), вирусов, фагмид, хромосом, транспозонов, липосом, катионных пузырьков или их смеси. Указанный вектор может уже содержать одну или более смежных регуляторных последовательностей, обеспечивающих экспрессию указанной молекулы нуклеиновой кислоты и ее транскрипцию в полипептид согласно изобретению.
Настоящее изобретение охватывает также любой пептид, который все еще обладает дельта-12-олеиндесатуразной активностью, полученный в результате экспрессии нуклеиновой кислоты согласно изобретению, содержащей указанную делецию (DEL1421, DEL1453 или DEL215), как, например, пептид SEQ ID NO 4.
Молекулы нуклеиновой кислоты, рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты и/или векторы согласно изобретению являются подходящими для трансформации растений-мишеней и, таким образом, наделяют растение, в котором экспрессируется мутантный FAD2 согласно изобретению, измененным продуктом гена FAD2, в результате чего уровень олеиновой кислоты изменяется, предпочтительно, возрастает, по сравнению с соответствующим уровнем в растении, в котором экспрессируется последовательность дикого типа.
Настоящее изобретение относится также к трансформированной клетке-хозяину или рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей (или в которую включена) одну или несколько нуклеотидных последовательностей и/или векторов согласно изобретению, имеющих делецию 1421.
В контексте настоящего изобретения "трансформированная клетка-хозяин" или "рекомбинантная клетка", также называемая "трансформантом", является клеткой, содержащей одну или несколько нуклеотидных последовательностей и/или векторов согласно изобретению. Трансформированная клетка-хозяин может быть клеткой, в которой указанный вектор(ы) и/или указанная нуклеотидная последовательность(и) введены посредством генетического трансформации, предпочтительно посредством гомологической рекомбинации или посредством любых других известных способов, применяемых при получении рекомбинантного организма.
Любой способ, посредством которого новая последовательность может быть включена в геном хозяина, рассматривается в настоящем изобретении.
В частности, любой способ, посредством которого новая последовательность может быть включена в геном хозяина и стабильно унаследована его потомством, рассматривается в настоящем изобретении.
В настоящее время существует широкий диапазон методов для достижения прямой или косвенной трансформации высших растений экзогенной ДНК.
Трансформация растительных клеток может быть произведена с использованием векторов. В общепринятой методике достижения трансформации используют Agrobacterium tumefaciens для введения чужеродного гена в растительную клетку-мишень.
Вирусы растений также являются возможным средством для переноса экзогенной ДНК.
Может быть использован также прямой захват растительной клеткой. Как правило, протопласты растения-мишени помещают в культуру в присутствии молекул нуклеиновой кислоты, которые будут перенесены, и вещества, которое обеспечивает поглощение протопластом указанных молекул нуклеиновой кислоты. Полезными веществами в этом отношении являются полиэтиленгликоль или фосфат кальция.
В качестве альтернативы поглощение молекул нуклеиновой кислоты может стимулироваться путем электропорации. В этом способе для временного открытия пор в мембране протопласта клетки используется электрический импульс, и указанные молекулы нуклеиновой кислоты из окружающего раствора поступают в клетку через поры. Точно также для доставки указанных молекул нуклеиновой кислоты непосредственно в клетку и, предпочтительно, непосредственно в ядро клетки, можно использовать микроинъецирование.
В этих методах трансформация происходит в растительной клетке в культуре. После этапа трансформации растительные клетки могут быть регенерированы в целые растения.
Известны методы для регенерации зрелых растений из каллюса или культуры протопласта.
Также доступны дополнительные способы, которые не обязательно требуют использования изолированных клеток и, соответственно, способов регенерации растений для достижения трансформации. Такие способы обычно обозначаются как "баллистические", или способы “ускорения частиц”, в которых частицы металла, покрытые молекулами нуклеиновой кислоты, доставляются в растительные клетки посредством или заряда пороха, или электрического разряда. Таким же образом растительные клетки в культуре или репродуктивная система растения, или клетки, например пыльца, могут быть устойчиво трансформированы представляющими интерес молекулами нуклеиновой кислоты.
Настоящее изобретение может быть использовано для трансформации фактически любого типа растений, однодольных растений или двудольных растений.
Подходящие растения, которые предстоит трансформировать, являются предпочтительно масличными культурами, такими как подсолнечник, соя, хлопок, зерновые и т.д., предпочтительно, рода Brassica, более предпочтительно, сорта Brassica napus.
Настоящее изобретение относится к растению, или части растения, или семени, содержащему первый ген FAD2 и, возможно, второй ген FAD2, причем указанный первый или указанный второй ген FAD2 имеют указанную делецию (DEL.1421, DEL.1453 или DEL.215).
В частности, растение, или часть растения, или семя согласно изобретению содержит первый ген FAD2 и, возможно, второй ген FAD2, причем указанный первый или указанный второй ген FAD2 имеет делецию в положении 1421 или в соответствующем ему положении (обозначаемый также DEL.1421) в сравнении с геном FAD2 дикого типа, таким как ген FAD2 дикого типа с последовательностью SEQ ID NO 9.
Предпочтительно, растение, или часть растения, или семя согласно изобретению содержит первый ген FAD-2, имеющий делецию в положении 1421 или в соответствующем ему положении в сравнении с геном FAD2 дикого типа, таким как ген FAD2 дикого типа с SEQ ID NO 9, и второй ген FAD2, кодирующий белок FAD-2, имеющий замену аминокислоты в положении 118 или соответствующем положении в сравнении с белком FAD-2 дикого типа, таким как белок FAD-2 дикого типа с SEQ ID NO 2 или 6.
В частности, растение, или часть растения, или семя согласно изобретению предпочтительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую SEQ NO 1 или 5, в которой нуклеотид (C) в положении 215 удален (то есть соответствующая SEQ ID NO 1 или 5 с дополнительно удаленным нуклеотидом в положении 215), или содержит (вариантную) последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO 1 или 5, в которой нуклеотид, соответствующий положению 215, удален (то есть с SEQ ID NO 1 или 5 с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 215).
Примерами таких растений являются сорта CONTACT и CABRIOLET, которые являются зарегистрированными сортами.
Предпочтительное растение, или часть растения, или семя согласно изобретению дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую FAD-2 белок, имеющий замену аминокислоты в положении 118 или в соответствующем ему положении в сравнении с белком FAD-2 дикого типа, таким как белок FAD2 дикого типа с SEQ ID NO 2 или 6. Предпочтительно, чтобы указанной замещенной аминокислотой в положении 118 или в соответствующем ему положении являлся фенилаланин.
Примерами таких растений являются сорта 28DHS.086 и MSP12.
Сорт MSP05 зарегистрирован согласно Будапештскому Договору о Международном Признании Депонирования Микроорганизмов для Патентной Процедуры под инвентарным номером NCIMB 41233, присвоенным 9 июля 2004 года.
Сорт 28DHS.086 зарегистрирован согласно Будапештскому Договору о Международном Признании Депонирования Микроорганизмов для Патентной Процедуры под инвентарным номером NCIMB 41365, присвоенным 22 декабря 2005 года.
Сорт MSP12 зарегистрирован согласно Будапештскому Договору о Международном Признании Депонирования Микроорганизмов для Патентной Процедуры под инвентарным номером NCIMB 41374, присвоенным 10 февраля 2006 года.
Мутантное растение, или часть растения, или семя согласно изобретению проявляет неожиданное преимущество в развитии хорошей корневой системы. Более конкретно, относясь к мутантному сорту Brassica napus согласно изобретению, основной корень и вторичная корневая система имеют длину, сопоставимую (сходную) с длиной основного корня и вторичной корневой системы сортов дикого типа. Для сравнения, мутантный Brassica napus, полученный способом, описанным в WO98/56239, имеет основной корень намного меньший, чем у особи дикого типа, и его вторичная корневая система существенно ослаблена.
Растение, или часть растения, или семя согласно изобретению может быть получено путем обработки мутагеном, более предпочтительно путем обработки этилметансульфонатом (EMS).
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения линий растений с высоким содержанием олеиновой кислоты, включающий в себя (a) скрещивание первого растения со вторым растением, имеющим по меньшей мере один ген FAD2, содержащий указанную делецию согласно изобретению, (b) получение семян от гибридов на стадии (a), (c) выращивание фертильных растений из таких семян, (d) получение семян потомства от растений со стадии (c), (e) идентификацию таких семян среди потомства, которые обладают высоким содержанием олеиновой кислоты.
В указанном способе получения линий растений с высоким содержанием олеиновой кислоты указанное второе растение предпочтительно имеет второй мутантный ген FAD2, содержащий мутацию SNP1590.
В другом аспекте изобретение связано со способом увеличения содержания олеиновой кислоты в растениях, более конкретно в растениях рода Brassica и, предпочтительно в растениях Brassica napus, включающим в себя следующие стадии:
(a) индукцию мутагенеза по меньшей мере в нескольких клетках растения, более конкретно, растения рода Brassica и, предпочтительно, растения Brassica napus, у которого содержание олеиновой кислоты составляет менее 70%;
(b) регенерацию растения по меньшей мере из одной указанной мутантной клетки;
(c) селекцию регенерировавших растений, которые имеют последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению и/или которые экспрессируют белок FAD2  согласно изобретению; и
(d) получение следующих поколений растений из указанных регенерировавших растений.
Предпочтительно, из семян указанных растений получают масло, имеющее содержание олеиновой кислоты более чем 70 вес.%, более предпочтительно, более чем 75 вес.% из расчета на общий вес присутствующих в масле жирных кислот.
Другим объектом настоящего изобретения является растительное масло, полученное по меньшей мере из одного растения согласно изобретению, причем это растительное масло содержит более чем (приблизительно) 70%, 72%, 75%, 80% или 85% олеиновой кислоты.
Более конкретно, растительное масло согласно изобретению, предпочтительно, полученное по меньшей мере из одного сорта рода Brassica согласно изобретению, более предпочтительно, по меньшей мере из одного сорта Brassica napus согласно изобретению, содержит более чем (приблизительно) 70%, 72%, 75%, 80% или 85% олеиновой кислоты. Указанное масло дополнительно содержит менее чем (приблизительно) 4%, 3,5%, 3%, 2%, 1% или 0,5% линоленовой кислоты относительно общего веса присутствующих в масле жирных кислот.
Предпочтительно, чтобы указанное масло содержало более чем (приблизительно) 70%, 72%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90%, предпочтительно, от (приблизительно) 70% до (приблизительно) 90%, более предпочтительно, от (приблизительно) 72% до (приблизительно) 89% олеиновой кислоты. Указанное масло дополнительно содержит менее чем (приблизительно) 4%, 3,5%, 3%, 2%, 1% или 0,5%, предпочтительно, от (приблизительно) 4% до (приблизительно) 0,4% линоленовой кислоты относительно общей массы жирных кислот, присутствующих в масле.
Согласно предпочтительному варианту осуществления два двойных низких озимых сорта рапса (ENVOL и LIBERATOR) были обработаны этилметансульфонатом (EMS) в 1992 году. Обработку EMS в концентрации 2,5% и 5% проводили в течение 4 часов или 8 часов.
Поколение М1 выращивали в оранжерее после 8 недель яровизации в камере роста и затем собирали в июле 1993 г.
Семена М1 были высеяны в поле в сентябре 1993 г., накрыты мешочками в начале цветения, и семена M2 были собраны в июле 1994 г.
Семена M2 были высеяны в сентябре 1994 г., накрыты мешочками в начале цветения, и семена M3 были собраны в июле 1995 г.
Далее потомства анализировали на предмет определения состава жирных кислот, используя аналитический метод на основе газовой хроматографии, который является общеизвестным в данной области.
Все потомства с содержанием олеиновой кислоты выше 68% были сохранены.
Отобранное потомство повторно высевали в поле в сентябре 1995 г., накрывали мешочками в апреле, затем собирали в июле 1996 г.
На этой стадии потомство подвергали скринингу на предмет определения хороших агрономических и морфологических характеристик, таких как хорошая всхожесть семян, хорошая осенняя ростовая способность, хорошая зимостойкость, хорошая корневая система, хорошая резистентность к фомозу и пятнистости листьев на свету, а также превосходная устойчивость к полеганию.
Материал, который был слишком высок и слишком поздно всходил, был устранен, также как и материал, который образовывал сильную фасциацию.
Анализ оставшегося потомства методом газовой хроматографии был снова проведен для селекции особей с уровнями олеиновой кислоты выше 68%. Все такие особи были высажены в поле в сентябре 1996-1997 г.
Потомство под названием MUT 152-96 выглядело особенно интересным в силу агрономических и морфологических характеристик, а также по содержанию в нем олеиновой кислоты. Это потомство выращивали в изоляции в течение вегетационного периода в сентябре 1996-1997 г. Наиболее интересные из потомков [MUT 152-96] по агрономическим и морфологическим характеристикам были отобраны для дальнейшей расфасовки и скрещивания. Скрещивание производили с озимыми масличными сортами рапса, имеющими обычно в два раза более низкий профиль жирных кислот (то есть содержание олеиновой кислоты ниже 70%) или с низким содержанием линоленовой кислоты (то есть менее чем приблизительно 3,5%), для выведения линий с высоким содержанием олеиновой кислоты в сочетании с низким содержанием линоленовой кислоты (HOLL).
Материал подвергали внутриродовому скрещиванию, самоопылению по меньшей мере до поколения F7.
Ко всем поколениям применяли сильное давление отбора против фасциаций и в сторону нормального развития растения и нормальной корневой системы.
Состав жирных кислот проверяли в каждом поколении и оставляли только материал с содержанием олеиновой кислоты выше 75% и содержанием линоленовой кислоты ниже 3,5%.
Таким способом были получены различные сорта HOLL, такие, например, как MSP05.
И посредством скрещивания сорта MSP05 и сорта CABRIOLET был получен сорт 28DHS.086.
MSP12 был получен посредством такого же способа размножения, что и MSP05, но в качестве исходного родителя, вместо родителей, имеющих обычный профиль жирных кислот, был использован CONTACT.
Использованными в этой работе сортами, у которых обычные профили жирных кислот вдвое ниже были BRISTOL, CAPITOL, CAPVERT, VIVOL и CAIMAN, и эти сорта размножали или поддерживали, используя такую же схему поддержания, как описано в настоящем описании выше для линий HOLL (в соответствии с техническими правилами, изданными "GNIS" и отредактированными SEDIS, например, смотрите выпуск 2003, издание 1, pp.135-147, которые относятся к злаковым растениям).
2
2
Для определения содержания жирных кислот в испытаниях - небольших исследовательских испытаниях (6-12 м) или испытаниях на этапе разработки (500 м) и для работы по секвенированию - использовали элитные семена.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Семена перемалывали в первом растворе, состоящем из метанола (800 мл), триметилпентана (200 мл) и 5 г NaOH. Приблизительно на 10 г семян использовали приблизительно 3 мл раствора (другими словами, приблизительно 10-50 семян на 1 мл раствора).
Экстракцию проводили в течение 20 минут и после этого добавляли второй раствор, состоящий из триметиламина (900 мл) и пропанола-2 (100 мл), в таком же объеме, как и первый раствор.
Полученный раствор перемешивали на вортексе и оставляли отстаиваться до образования верхней фазы.
Верхнюю фазу отбирали и переносили в пробирки.
Один микролитр полученного раствора вносили в газовый хроматограф (Fisons от thermo-electron с колонкой DB3-30 метров с диаметром 0,25 мм и толщиной 25 микрометров). Продолжительность измерения составляла приблизительно 4 минуты.
Результаты по содержанию олеиновой кислоты вкратце изложены в таблице 1.
<b>Таблица 1</b>
Сорта
Содержание олеиновой кислоты (вес.%)
Оценка
CONTACT
71,8-75,2
Высокое
CABRIOLET
73,2-76,8
Высокое
28DHS086
80,3-83,1
Очень высокое
MSP12
80,3-83,5
Очень высокое
MSP05
78,1-81,9
Очень высокое
BRISTOL
61,4-65,7
Нормальное
VIVOL
60,8-63,2
Нормальное
CAPVERT
58,9-65,9
Нормальное
CAIMAN
61,9-64,0
Нормальное
CAPITOL
59,7-64,6
Нормальное
Содержание олеиновой кислоты из расчета на общую массу жирных кислот, присутствующих в экстрагированном масле.
Пример 2
Материалы растений, использованные для секвенирования:
- мутантные линии с более высоким содержанием олеиновой жирной кислоты: CONTACT, CABRIOLET и 28DHS.086; и
- сорта дикого типа с нормальным содержанием олеиновой кислоты: Bristol, Capitol, Vivol, Capvert и Caiman.
Все эти линии выращивали в камере роста, и у 7-дневных растений собирали семядоли и стебли.
Растительные ткани лиофилизировали и использовали для экстракции ДНК.
ДНК выделяли с помощью наборов Qiagen Plant DNA (Qiagen INC.-USA, Valencia CA).
ПЦР выполняли по протоколу TaqGold (AB Biosystem, Inc.).
2
Реакционная смесь содержала 2,5 мкл 10× буфера, 0,2 мкл TaqGold, 0,2 мкл dNTP (25 мМ), 2 мкл праймеров (5 мкМ) и 10 мкл ДНК матрицы (2 нг/мкл) и 10,1 мкл HO.
Циклы ПЦР были следующие: 94°C 5 минут; 8 циклов 94°C 40 секунд, 62°C 40 секунд, 72°C 1 минута, 94°C 40 секунд, 60°C 40 секунд, 72°C 1 минута, 94°C 40 секунд, 58°C 40 секунд, 72°C 1 минута, 94°C 40 секунд, 56°C 40 секунд, 72°C 1 минута; 3 цикла 94°C 40 секунд, 55°C 40 секунд, 72°C 1 минута; задержка на 72°C в течение 7 минут.
Продукты ПЦР анализировали на 1% агарозном геле.
Для секвенирования 5 мкл продуктов ПЦР и 1 мкл экзонуклеазы I (разведение 1:50) и 1 мкл щелочной фосфатазы креветок (разведение 1:5) переносили в новую пробирку.
Смесь инкубировали при 37°C в течение 20 минут и затем при 80°C в течение 15 минут для инактивации ферментов.
2
Добавляли 40 мкл HO и 6 мкл использовали в качестве матрицы с 1 мкл праймера для секвенирования.
Секвенирование выполняли на анализаторе ДНК 3730 DNA Analyzer (поставляемый компанией Biosystems).
Последовательности собирали и выравнивали, используя программу SeqMan II от LaserGene (DNASTAR, INC, Madison. WI).
Пример 3
Четыре последовательности гена дельта-12-олеиндесатуразы (FAD2) Brassica napus, 4684997, 46399190, 8705228 и 4092878, загружали из Genebank (NCBI). Эти последовательности использовали в качестве запросов для поиска в базе данных последовательностей Monsanto.
Используя программы "blastn" (NCBI), получали несколько результатов с высокой оценкой попадания. Все найденные последовательности были загружены и повторно обработаны программой SeqmanII (DNASTAR Inc, Madison, Wisconsin, США).
Два различных транскрипта было идентифицировано и обозначено Fad2-1 (SEQ ID NO 11) и Fad2-2 (SEQ ID NO 12). Fad2-1 и Fad2-2 имеют высокую гомологию последовательностей с 97% идентичностью последовательностей.
Для идентификации причинных мутаций, связанных с высоким содержанием олеиновой кислоты в мутантных линиях и их потомствах, были разработаны вложенные праймеры, полностью покрывающие последовательности.
3'-конец праймера всегда располагался у нуклеотида, которым Fad2-1 отличался от Fad2-2, кроме тех, которые располагались на 5'- и 3'-концах консенсусных последовательностей, в которых не было нуклеотида, отличного между этими двумя генами.
Праймеры были также разработаны таким способом, чтобы каждый ампликон накладывался на другой, с тем, чтобы гарантировать полное покрытие всей последовательности. Эти праймеры упорядочивали и использовали для получения локус-специфических ампликонов у мутантов и у дикого типа. Результаты секвенирования указывают, что все локус-специфические ПЦР-праймеры отжигались, как ожидалось.
Последовательности, принадлежащие одному и тому же гену, собирали вместе с помощью программы SeqManII.
Консенсусные геномные последовательности генов Fad2-1 и Fad2-2 дикого типа представлены в SEQ ID NO 9 и 10 соответственно.
В таблице 2 суммированы характеристики последовательностей обоих генов Fad2-1 и Fad2-2.
<b>Таблица 2</b>
Характеристики
Положение в FAD2-1
Положение в FAD2-2
Ген
1-2601
1-2666
5'UTR
1-1206
1-1238
Экзон
1-108
1-111
Интрон
109-1202
112-1234
Экзон
1207-2601
1235-2619
CDS
1207-2361
1239-2393
3'UTR
2362-2601
2394-2666
Характеристики основаны на консенсусных геномных последовательностях после нескольких прочтений с различных генотипов.
Оба гена Fad2-1 и Fad2-2 имеют каждый по одному интрону.
Размеры интрона немного различаются между двумя генами. Для Fad2-1 интрон охватывает 1105 п.н., начиная с положения 109 по 1213, в то время как для Fad2-2 интрон состоит из 1123 п.н., начиная с положения 112 по 1234 в консенсусных последовательностях.
Интрон расположен в 5'UTR-области.
Предполагаемые кодоны инициации трансляции имеют положения 1207 и 1239 для генов Fad2-1 и Fad2-2 соответственно.
Кодоны терминации трансляции имеют положения 2370-2372 и 2391-2393 соответственно для Fad2-1 и Fad2-2.
3'UTR-последовательности составляют 247 пар оснований для гена Fad2-1 и 273 пары оснований для гена Fad2-2.
Делеция в положении 1421 (обозначенная как DEL.1421) гена FAD2-1 вызывала сдвиг рамки считывания в генетических кодонах, приводящий к преждевременной терминации полипептидов.
Точечная мутация в положении 1590 (SNP1590) гена FAD2-2 (как представлено в SEQ ID NO 7) вызывала замену аминокислотного остатка с лейцина (CTT) на фенилаланин (TTT).
И лейцин, и фенилаланин являются по природе гидрофобными и имеют некоторые общие аминокислотные свойства, но фенилаланин содержит большую жесткую ароматическую группу в боковой цепи, которая вызывает некоторые изменения в функции фермента.
Кроме того, в сочетании с DEL.215 эта мутация более заметно отражается на фенотипе.
Комбинацией различных аллелей с этими мутациями создавали градиент содержания олеиновой кислоты, как это можно наблюдать в различных мутантных линиях (смотрите таблицу 1).
Две мутантные линии, 28DHS.086 и MSP12, несли двойные мутации по DEL1421 и SNP1590. Поскольку обе мутации были миссенс-мутациями, функции гена FAD2 были сильно изменены, что привело к самому высокому содержанию олеиновой кислоты в этой мутантной линии.
Нужно отметить, что сорта Brassica napus, несущие только мутацию SNP1590, демонстрируют нормальное содержание олеиновой кислоты (то есть содержание олеиновой кислоты эквивалентно содержанию олеиновой кислоты у диких типов).
Две мутантные линии, CONTACT и CABRIOLET, несли единственную точечную мутацию в DEL.1421, приводящую к несколько меньшему содержанию олеиновой кислоты по сравнению с двойными мутантами.
Вкратце, данные последовательностей убедительно свидетельствуют о том, что такие мутации в Fad2-1 и Fad2-2 ассоциированы с содержанием олеиновой кислоты в различных мутантных линиях.
Идентификация причинных вариаций в последовательностях крайне важна для создания диагностических анализов, специфичных для каждого мутантного аллеля.
Познание взаимосвязей между вариациями последовательностей и фенотипами может позволить создать методы анализа маркеров для точного предсказания содержания олеиновой кислоты в растениях без необходимости проведения химического анализа содержания жирных кислот.