АНТИТЕЛА ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА CCR7 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
ANTIBODIES AGAINST CCR7 RECEPTOR FOR CANCER TREATMENT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
В целом настоящее изобретение относится к лечению рака. Более конкретно, данное изобретение затрагивает лечение злокачественных опухолей, опухолевые клетки которых представляют собой клетки, экспрессирующие рецептор CCR7, посредством применения антител к рецептору CCR7, которые способны селективно уничтожать, уменьшать миграцию и/или блокировать диссеминацию указанных опухолевых клеток.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Рак представляет собой группу заболеваний, характеризующихся неконтролируемым клеточным делением (или возрастанием выживаемости или устойчивости к апоптозу) и способностью указанных клеток поражать другие соседние ткани (инвазия) и распространяться на другие области тела, где в норме данные клетки не обнаруживаются (метастазирование), через лимфатические и кровеносные сосуды, циркулировать в кровотоке и затем поражать здоровые ткани где-либо еще в организме. В зависимости от того, могут ли (или нет) они распространяться посредством инвазии и метастазирования, опухоли классифицируются как доброкачественные или злокачественные: доброкачественные опухоли - это опухоли, которые не могут распространяться посредством инвазии или метастазирования, то есть они растут только в определенном месте; тогда как злокачественные опухоли - это опухоли, которые способны распространяться посредством инвазии и метастазирования.
Существует несколько типов злокачественных опухолей, которые можно классифицировать по типу клетки, в которой они возникают, и по локализации данной клетки, то есть карциномы, которые происходят из клеток, которые выстилают внешнюю и внутреннюю поверхность организма, например кожу, желудочно-кишечный тракт или гланды; лейкемия, которая берет начало в кроветворной ткани, такой как костный мозг, и служит причиной большого количества аномальных клеток крови, которые продуцируются и проникают в кровоток; лимфома, которая представляет собой злокачественную опухоль, образующуюся в лимфатических узлах и тканях иммунной системы организма; меланома, которая возникает в меланоцитах; саркома, которая берет начало в соединительной ткани кости или мышцы; и тератома, которая берет начало в зародышевых клетках.
Рак может лечиться посредством хирургического вмешательства, химиотерапии, радиационной терапии, иммунотерапии или другими способами. Выбор лечения зависит от расположения и степени злокачественности опухоли и от стадии заболевания.
Существенную проблему, требующую рассмотрения, в схемах лечения опухоли составляет желание «полного уничтожения клеток». Это означает, что схемы более эффективного лечения близки к полному уничтожению всех так называемых «клоногенных» злокачественных клеток, то есть клеток, которые имеют способность расти бесконтрольно и приводить к образованию опухолевой массы, которая могла бы быть удалена посредством лечения.
Другой стратегией лечения опухоли является применение «иммунотоксина», в котором антитело против опухолевой клетки используется для доставки токсина к опухолевым клеткам. Однако, наряду с химиотерапевтическими подходами, описанными выше, терапия иммунотоксином также страдает значительными недостатками. Например, антиген-негативные или лишенные антигена клетки могут выжить и восстановить популяцию опухоли или привести к последующим метастазам. Даже если первичный рак удален полностью, злокачественная опухоль очень часто бывает метастатической. Образование метастазов злокачественных опухолей, происходящих из первичной опухоли в более или менее удаленных местах организма, представляет собой одно из наиболее серьезных последствий рака и является тем последствием, для которого в настоящее время не существует удовлетворительного протокола лечения. Доступные в настоящее время способы лечения рака либо имеют ограниченный успех в предотвращении метастазов, либо вызывают серьезные и нежелательные побочные эффекты.
Хотя специальная доставка терапевтических средств, таких как антиклеточные агенты, токсины и коагулирующие факторы для опухолевой массы, отражает значительный успех в протоколах лечения рака, до сих пор существует место для дополнительных или даже альтернативных способов лечения. Определение дополнительных мишеней, с целью сделать возможным специфическое разрушение опухоли in vivo, естественно, принесло бы пользу в увеличении количества возможностей нацеливания (таргетинга).
В настоящее время новые терапевтические стратегии лечения рака движутся по направлению к применению специфических способов лечения, включая моноклональные антитела (mAb) против различных антигенов, экспрессируемых опухолевыми клетками, которые, как надеются, могут излечить заболевание.
При выборе антигена для иммунотерапии должны учитываться или опухолевая специфичность антигена, антигенная плотность на поверхности опухолевых клеток и антигенное модулирование, или интернализация комплекса антиген-антитело, что может уменьшать способность вызывать гибель клеток. Считается, что в большинстве случаев комплементзависимый клеточный лизис (CDC) и антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) отвечают за клиническую ценность неконъюгированных mAb, хотя индукция апоптоза или блокирование клеточного цикла также могли бы играть немаловажную роль в прочих случаях.
Раковые клетки могут экспрессировать некоторые молекулярные рецепторы. Различные исследования демонстрируют, что хемокиновый рецептор CCR7 (CC chemokine receptor 7, CCR7) экспрессируется в различных опухолевых клетках, например B-клеточной хронической лимфоцитарной лейкемии, неходжкинской лимфомы, в клетках рака молочной железы, злокачественных опухолей молочной железы и т.д. Более того, ясно, что рецептор CCR7 играет роль в метастазировании лимфатического узла различными злокачественными опухолями, например клетками карциномы желудка, меланомы, немелкоклеточного рака легкого, T-клеточной лейкемии и т.д. Таким образом, указанный хемокиновый рецептор (CCR7) может быть выбран в качестве возможной мишени для mAb-терапии рака.
CCR7 представляет собой рецептор из семи трансмембранных доменов, связанный с G-белком (GPCR). Семейство рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR), охватывает рецепторы к гормонам, нейромедиаторам, факторам роста и вирусам [Yoshie O, Imai T, Nomiyama H. Novel lymphocyte-specific CC chemokines and their receptors. J Leukoc Biol. 1997; 62:634-644; Kim CH, Pelus LM, White JR, Applebaum E, Johanson K, Broxmeyer HE. CK beta-11/macrophage inflammatory protein-3 beta/EBIl-ligand chemokine is an efficacious chemoattractant for T and B cells. J Immunol. 1998; 160:2418-2424; Dieu MC, Vanbervliet B, Vicari A, et al., Selective recruitment of immature and mature dendritic cells by distinct chemokines expressed in different anatomic sites. J Exp Med. 1998; 188:373-386; Willimann K, Legler DF, Loetscher M, et al., The chemokine SLC is expressed in T cell areas of lymph nodes and mucosal lymphoid tissues and attracts activated T cells via CCR7. Eur J Immunol. 1998; 28:2025-2034; Yoshida R, Nagira M, Imai T, et al., EBIl-ligand chemokine (ELC) attracts a broad spectrum of lymphocytes: activated T cells strongly up-regulate CCR7 and efficiently migrate toward ELC. Int Immunol. 1998; 10:901-910; Sallusto F, Schaerli P, Loetscher P, et al., Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation. Eur J Immunol. 1998; 28:2760-2769].
+
3
Частным случаем лейкемии, опухолевые клетки которой экспрессируют рецептор CCR7, является хроническая лимфоцитарная лейкемия (CLL), наиболее общий тип лейкемии у взрослых людей. Указанная лейкемия представляет собой B-клеточную лейкемию, характеризующуюся накоплением единственного клона CD5 B-клеток с высокой устойчивостью к апоптозу вследствие нарушения регуляции внеклеточных или внутриклеточных сигнальных событий, вовлеченных в программируемую гибель клетки. Несмотря на ее очень низкий индекс пролиферации, при подсчете лимфоцитов периферической крови достигаются значения более чем 5×10/мкл, и клетки лейкемии демонстрируют заметную тенденцию к проникновению в лимфатические узлы, селезенку и костный мозг.
Лечение CLL основано на применении аналогов пурина, в частности флударабина, одного или совместно, в качестве схемы лечения первой линии. К настоящему времени единственной терапевтической комбинацией, приводящей к более высокой степени полной ремиссии, чем та, что получена с флударабином, было применение ритуксимаба, моноклонального антитела против CD20, совместно либо с флударабином, либо с флударабином и циклофосфамидом. Более того, были достигнуты молекулярные ремиссии в пунктатах костного мозга у пациентов с CLL при вышеописанных комбинациях, повышая возможность того, что CLL потенциально может быть излечена без пересадки стволовых клеток. Достижение наилучшего первичного ответа совместно с уничтожением клеток CLL в инокуляте пациентов, подвергающихся аутологичной трансплантации, составляет некоторые из основных терапевтических перспектив для CLL.
Лимфома клеток мантийной зоны (MCL) является агрессивным подтипом B-клеточной неходжкинской лимфомы. Данные клетки характеризуются как CD20+ CD5+ CD23- со сверхэкспрессией t(11;14) и циклина D1. Обычно пациентов лечат либо по схеме ритуксимаб-CHOP (циклофосфамид, гидроксилдаунорубицин, онковин и преднизон) с последующей трансплантацией стволовых клеток, либо по схеме ритуксимаб-HyperCVAD (циклофосфамид, винкристин, адриамицин и дексаметазон). Однако в большинстве случаев MCL остается неизлечимой, указывая на четкую потребность в новых подходах к лечению.
В последнее время было показано, что пациенты с CLL, обнаруживающие клиническую лимфаденопатию, имеют более высокий миграционный ответ CLL-клеток к лигандам CCR7, гомеостатическим хемокинам CCL19 (MIP3-β) и CCL21 (6Ckine) in vitro. Поэтому блокирование вторжения CLL-клеток во вторичную лимфоидную ткань с помощью mAb против CCR7 могло бы быть еще одним преимуществом. Также в этом смысле нелимфоидные опухоли, экспрессирующие эктопический CCR7, обладают способностью метастазировать во вторичные лимфоидные органы, тогда как опухоли без этой молекулы или других хемокиновых рецепторов, вовлеченных в хоминг к вторичным лимфоидным органам, обнаруживают минимальную узловую диссеминацию.
Следовательно, существует необходимость в дополнительных способах лечения рака, в частности раковых и опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7. Указанная терапия должна допускать преимущественно специфическое разрушение опухоли in vivo посредством, например, уничтожения опухолевых клеток, уменьшения миграции и/или блокирования диссеминации опухолевых клеток.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение основано на обнаружении того, что рецептор CCR7 сильно экспрессируется в некоторых опухолевых клетках, он играет основную роль в проникновении лимфоидных клеток во вторичные лимфоидные органы, включая лимфатические узлы (LN), и его экспрессия ограничена наивными T- и B-лимфоцитами и зрелыми дендритными клетками (DC), таким образом, делая указанный рецептор CCR7 любопытной мишенью для mAb-терапии при раке, особенно при злокачественных опухолях, опухолевые клетки которых экспрессируют рецептор CCR7. Авторы изобретения неожиданно заметили, что mAb к CCR7, то есть антитела, которые распознают эпитоп в рецепторе CCR7 и которые способны связывать указанный рецептор CCR7, способны к уничтожению клеток CLL и MCL in vitro, то есть опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, несмотря на то, что они неспособны к значительному уничтожению неопухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, таких как T-клеточные лимфоциты.
Следовательно, в основном изобретение относится к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с рецептором CCR7, для уничтожения или для индукции апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, в производстве фармацевтической композиции для лечения рака; в конкретном варианте осуществления рак, который подлежит лечению, характеризуется опухолевыми клетками, экспрессирующими рецептор CCR7.
Таким образом, в одном аспекте данное изобретение относится к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с рецептором CCR7, в производстве фармацевтической композиции для уничтожения или индукции апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7.
В другом аспекте изобретение относится к способу уничтожения или индукции апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, который включает контактирование указанных клеток с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые связываются с указанным рецептором CCR7.
В другом аспекте изобретение относится к способу уничтожения или индукции апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, у субъекта, нуждающегося в указанном лечении, который включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с указанным рецептором CCR7.
В другом аспекте изобретение относится к способу уменьшения миграции опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, к вторичной лимфоидной ткани и/или блокирования диссеминации опухолевых клеток во вторичной лимфоидной ткани, который включает контактирование указанных опухолевых клеток с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые связываются с рецептором CCR7.
В другом аспекте изобретение относится к способу уменьшения миграции опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, к вторичной лимфоидной ткани и/или блокирования диссеминации опухолевых клеток во вторичной лимфоидной ткани у субъекта, нуждающегося в указанном лечении, который включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с рецептором CCR7.
В другом аспекте данное изобретение относится к способу идентификации соединения для уничтожения или индукции апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, который включает
a) контактирование клетки, экспрессирующей рецептор CCR7, с соединением-кандидатом, соединенным с антителом против CCR7 или его фрагментом, и
b) определение, уничтожает ли соединение-кандидат указанные клетки, экспрессирующие рецептор CCR7,
в котором соединение, которое уничтожает указанную клетку, экспрессирующую рецептор CCR7, представляет собой соединение, потенциально пригодное для уничтожения или для индукции апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1(A) демонстрирует, что поверхностная экспрессия CCR7 больше в опухолевых клетках CLL, чем в нормальных B- и T-лимфоцитах. Образцы периферической крови от 11 пациентов с CLL и 6 здоровых доноров анализировали посредством проточной цитометрии (FCM), чтобы различить разные лимфоидные популяции и соответствующую им плотность CCR7 на поверхности, измеренную как средняя интенсивность флуоресценции (MFI). Полосы представляют среднее ± SD; и (B) демонстрирует, что mAb против CCR7 не вызывают эндоцитоза рецептора. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) пациентов с CLL инкубировали в течение различных периодов времени между 30 секундами и 60 минутами с используемыми mAb против CCR7 (2 мкг/мл), mAb класса IgM (клон 2H4) и IgG2a mAb (клон 150503), или с CCL19 (1 мкг/мл), одним из физиологических лигандов CCR7 в качестве положительного контроля. Затем определяли MFI рецептора CCR7 посредством FCM в CD19+CD5+ клетках CLL, дающих электронный сигнал выше порогового значения. Линии представляют экспрессию CCR7, относительно спонтанной MFI рецептора CCR7. Показан иллюстративный случай.
Фиг.2 демонстрирует, что оба mAb против CCR7 опосредуют сильный и специфический комплементзависимый клеточный лизис (CDC) клеток CLL. PBMC пациентов с CLL инкубировали с mAb против CCR7 или с их соответствующими изотипическими контролями (IC) и затем подвергали воздействию кроличьего комплемента в течение часа. Клеточный лизис определяли посредством включения 7-AAD и FCM-исследования на дающих электронный сигнал выше порогового значения клетках CLL и нормальных T-клетках. Полосы отражают среднее значение 11 случаев ±SD. (A) mAb против CCR7 класса IgM (2 мкг/мл), (B) mAb против CCR7 класса IgG (2 мкг/мл).
Фиг.3A демонстрирует поверхностную экспрессию CCR7 (черная линия) в опухолевых клетках типичного пациента с лимфомой клеток мантийной зоны (MCL), измеренную посредством проточной цитометрии, включая соответствующие IC (серая линия), а фиг.3B демонстрирует CDC клеток MCL в присутствии mAb против CCR7 или их соответствующие IC. Для четырех случаев показано среднее значение ±SD.
Фиг.4 описывает кривые дозовой зависимости для CDC. Исследования CDC с PBMC от пациентов с CLL (n=5) и здоровых доноров (n=2) проводили с концентрациями mAb против CCR7 от 0,5 до 16 мкг/мл. Процентное отношение клеточного лизиса вследствие CDC определяли посредством включения 7-AAD и FCM-анализа на дающих электронный сигнал выше порогового значения клетках CLL, T-лимфоцитах пациентов с CLL и нормальных B- и T-клетках здоровых доноров. Линии представляют среднее значение клеточного лизиса. (A) mAb против CCR7 класса IgM, (B) mAb против CCR7 класса IgG.
Фиг.5 демонстрирует, что сила CDC коррелирует с уровнями экспрессии CCR7. Поверхностная плотность CCR7 клеток CLL коррелировала (r=0,602, P=0,025, n=11) с процентом лизиса вследствие CDC, опосредованного 2 мкг/мл mAb против CCR7 класса IgM после часа инкубации с кроличьим комплементом.
Фиг.6 демонстрирует, что мышиное mAb против CCR7 класса IgG не опосредует ADCC клеток CLL. Клетки CLL, предварительно проинкубированные либо с mAb против CCR7 класса IgG (2 мкг/мл), IC или ритуксимабом (в качестве положительного контроля), обрабатывали человеческими естественными клетками-киллерами (NK) в течение 4 часов. Затем определяли мертвые клетки посредством включения 7-AAD и FCM-анализа на дающих электронный сигнал выше порогового значения клетках CLL. Полосы показывают среднее значение ±SD из 6 экспериментов.
3
Фиг.7 демонстрирует, что mAb против CCR7 не вызывают пролиферации лимфоцитов. PBMC от здоровых доноров культивировали в течение 72 часов с mAb против CCR7, изотипическими контролями (IC), mAb против CD3 с IL2 или с одной средой. Синтез ДНК в завершающие 16 часов культивирования определяли по включению [H]-тимидина. Полосы представляют среднее значение ±SD для 6 случаев, выполненных в трех повторах.
Фиг.8 демонстрирует, что mAb против CCR7 блокируют миграцию клеток CLL и MCL в ответ на CCL19 или CCL21. Исследования хемотаксиса осуществляли, как описано в "Методах", после предварительной инкубации клеток в течение 30 минут с 2 мкг/мл IgG против CCR7 (черные полосы), mAb класса IgM (серые полосы) или без mAb (белые полосы). (A) Миграцию клеток CLL в ответ на CCL19 (1 мкг/мл) сравнивали со спонтанной миграцией и миграцией в присутствии CXCL12 (100 нг/мл), лиганда хемокинового рецептора CXCR4, который не обрабатывался mAb против CCR7. Показан характерный случай. (B) Миграцию клеток MCL в ответ на оба лиганда CCR7, CCL19 (1 мкг/мл) и CCL21 (1 мкг/мл) сравнивали со спонтанной миграцией. Показан иллюстративный случай.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение в целом относится к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с рецептором CCR7, при производстве фармацевтической композиции для лечения рака, в частности рака, опухолевые клетки которого экспрессируют рецептор CCR7, посредством уничтожения или индукции апоптоза указанных опухолевых клеток.
Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с рецептором CCR7, при производстве фармацевтической композиции для уничтожения или для индукции апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7.
Опухолевые клетки, подлежащие лечению, представляют собой опухолевые клетки, экспрессирующие рецептор CCR7. Иллюстративные неограничивающие примеры указанного типа рака, опухолевые клетки которого экспрессируют рецептор CCR7, охватывают хроническую лимфоцитарную лейкемию (CLL), лимфому клеток мантийной зоны (MCL), фолликулярную лимфому, крупноклеточную B-клеточную лимфому, СПИД-ассоциированную лимфому, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому Беркитта, острую В-клеточную лимфобластную лейкемию, болезнь Ходжкина, T-клеточную лейкемию/лимфому взрослых, фунгоидный микоз, бластный кризис при хронических миелопролиферативных синдромах, бластный кризис при миелодиспластических синдромах, злокачественные опухоли, такие как рак молочной железы, немелкоклеточный рак молочной железы, меланому, рак желудка или плоскоклеточную карциному головы и шеи и карциному толстой кишки.
Опухолевые клетки, экспрессирующие рецептор CCR7, могут быть идентифицированы посредством стандартных способов; например, поверхностная экспрессия рецептора CCR7 может быть исследована посредством проточной цитометрии в соответствии с методом, раскрытым Lόpez-Giral S. et al. (Journal of Leukocyte Biology, Vol. 76, Aug. 2004, 462-471).
В настоящем изобретении «лечение рака» означает подавление или контроль пролиферации опухолевых клеток, где указанные опухолевые клетки являются опухолевыми клетками, экспрессирующими рецептор CCR7. Термин включает, среди прочего, уничтожение указанных опухолевых клеток, индукцию апоптоза указанных опухолевых клеток, снижение миграции указанных опухолевых клеток к вторичной лимфоидной ткани и/или блокирование диссеминации указанных опухолевых клеток во вторичной лимфоидной ткани.
В соответствии с данным изобретением антитело или его антигенсвязывающий фрагмент к рецептору CCR7 (или специфичные для него), то есть которые связываются с рецептором CCR7, иногда называемые здесь как антитело согласно изобретению, могут применяться для уничтожения или индукции апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7. Следовательно, антитело согласно изобретению может применяться при производстве фармацевтической композиции для уничтожения или индукции апоптоза указанных опухолевых клеток. Поэтому данное изобретение предоставляет альтернативный подход к лечению рака, особенно рака, опухолевые клетки которого экспрессируют рецептор CCR7.
Используемый здесь термин «уничтожение опухолевых клеток» касается механизма уничтожения опухолевых клеток, таких как опухолевые клетки, экспрессирующие рецептор CCR7, посредством специфического лизиса указанных клеток. Указанный лизис или цитотоксичность обычно опосредуются пополнением либо белков комплемента (CDC), либо клеток-эффекторов, таких как NK-клетки (ADCC), указанные белки и NK-клетки способны специфически нацеливать и вызывать лизис соответственно указанных опухолевых клеток после воздействия антител против CCR7.
Используемый здесь термин «индукция апоптоза опухолевых клеток» относится к механизму, посредством которого опухолевые клетки, экспрессирующие рецептор CCR7, претерпевают апоптоз, то есть запрограммированную гибель клетки, после обработки антителами против CCR7.
2
Используемый здесь термин «антитело согласно изобретению» относится к гамма-глобулину или его фрагменту, который проявляет специфическую связывающую активность к молекуле-мишени, а именно к рецептору CCR7 (антиген). Поэтому антитело согласно изобретению способно связывать эпитоп CCR7; обычно по меньшей мере 6, 8, 10 или 12 непрерывных аминокислот необходимо для образования эпитопа, однако эпитопы, которые включают в себя незаменимые аминокислоты, могут требовать больше, например по меньшей мере 15, 25 или 50, аминокислот. Термин «антитело согласно изобретению» охватывает, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, сконструированные или модифицированные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, приматизированные антитела, человеческие антитела, фрагменты антитела, такие как Fab, F(ab'), Fab', одноцепочечные фрагменты Fv (scFv), димерные антитела, биспецифичные антитела и гетероконъюгатные антитела. Кроме того, антитело согласно изобретению также может быть конъюгировано с дополнительным соединением, таким как терапевтический агент, токсин и тому подобное. Такие антитела могут быть получены различными способами, включая культуры гибридом, рекомбинантную экспрессию в бактериях или культурах клеток млекопитающих и рекомбинантную экспрессию в трансгенных животных. Также антитела могут быть получены посредством отбора последовательности из библиотеки последовательностей, экспрессированных в дисплейных системах, таких как система нитевидного фага, бактериальная, дрожжевая или рибосомальная. В литературе существует множество инструкций по выбору конкретной методики получения, например Chadd and Chamow, Curr. Opin. Biotechnol., 12: 188-194 (2001). Выбор производственной методологии зависит от нескольких факторов, включая желаемую структуру антитела, значение углеводных частей антитела, простоту культивирования и очистки и стоимость. При использовании общепринятой экспрессионной технологии может быть создано множество различных структур антитела, включая полноразмерные антитела, фрагменты антитела, такие как фрагменты Fab и Fv, а также химерные антитела, содержащие компоненты от различных видов. Фрагменты антитела небольшого размера, такие как фрагменты Fab и Fv, не имеющие эффекторных функций и ограниченной фармакокинетической активности, могут быть получены в бактериальной экспрессионной системе. Одноцепочечные Fv-фрагменты проявляют низкую иммуногенность, и они быстро очищаются из крови.
Антитело согласно изобретению, которое специфически связывается с эпитопом рецептора CCR7, может применяться в терапевтических целях, а также в иммунохимических исследованиях, таких как иммунофлуоресцентные исследования, проточная цитометрия, вестерн-блоты, ELISA, радиоиммунологические исследования, иммуногистохимические исследования, иммунопреципитации или другие иммунохимические исследования, известные в данной области. Для идентификации антител, имеющих желаемую специфичность, могут применяться различные иммунологические исследования. В данной области хорошо известны многочисленные протоколы по конкурентному связыванию или иммунорадиометрическим исследованиям. Такие иммунологические исследования обычно затрагивают измерение комплексообразования между иммуногеном и антителом, которое специфически связывается с иммуногеном рецептора CCR7.
Антитела согласно изобретению могут быть поликлональными антителами. Такие поликлональные антитела могут быть получены в млекопитающих, таких как млекопитающие, не являющиеся человеком, например, после одной или нескольких инъекций иммунизирующего вещества и предпочтительно адъюванта. Обычно иммунизирующее вещество и/или адъювант будут вводить млекопитающему посредством серий подкожных или внутрибрюшинных инъекций. Иммунизирующий агент может включать рецептор CCR7, или его фрагмент, или его слитый белок, или клетку, экспрессирующую рецептор CCR7. В ином случае для получения антител может использоваться препарат неочищенного белка, который был обогащен рецептором CCR7 или его фрагментом. Такие белки, фрагменты или препараты вводят млекопитающему, не являющемуся человеком, в присутствии соответствующего адъюванта. Другой способ введения иммуногена представляет собой, например, трансмембранный белок на поверхности клетки (методы описаны, например, у Spiller et al., J. Immunol. Methods, 224: 51-60 (1999)). Эти клетки могут быть любыми клетками, которые от природы экспрессируют антиген в их клеточной мембране или в которых эта экспрессия может быть получена после трансфекции клетки ДНК-конструкцией, которая содержит среди прочих ДНК-последовательностей те, что кодируют данный антиген, те, что необходимы для его достаточной экспрессии в клетке. Этот подход возможен, не только когда клеточная мембрана представляет собой природный сайт, в котором экспрессируется данный антиген, даже антиген, синтезированный однократно в клетке, направляется в это место при помощи сигнального пептида, который добавляется к последовательности, кодирующей антиген. Если сыворотка содержит поликлональные антитела к нежелательным эпитопам, поликлональные антитела могут быть очищены посредством иммуноаффинной хроматографии.
Альтернативно, указанные антитела могут быть моноклональными антителами. Моноклональные антитела могут быть получены при помощи гибридом, в которых мышь, хомяк или другое подходящее животное-хозяин, иммунизируется иммунизирующим агентом, чтобы получить лимфоциты, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с иммунизирующим веществом, например, как описано у Kohler и Milstein, Nature 256:495 (1975). Иммунизирующий агент обычно будет включать рецептор CCR7, или его фрагмент, или его слитый белок, и при желании носитель или препарат неочищенного белка, который был обогащен рецептором CCR7 или его фрагментом, или клетку, экспрессирующую рецептор CCR7. Такие белки, фрагменты или препараты вводят млекопитающему, не являющемуся человеком, в присутствии соответствующего адъюванта. Другая форма введения иммуногена представляет собой трансмембранный белок на поверхности клетки (методы описаны, например, у Spiller et al., J. Immunol. Methods, 224: 51-60 (1999)). Эти клетки могут быть любыми клетками, которые от природы экспрессируют антиген в их клеточной мембране или в которых может быть получена эта экспрессия после трансфекции клетки ДНК-конструкцией, которая содержит среди прочих ДНК-последовательностей те, что кодируют данный антиген, те, что необходимы для его достаточной экспрессии в клетке. Этот подход возможен, не только когда клеточная мембрана представляет собой природный сайт, в котором экспрессируется данный антиген, даже антиген, синтезированный однократно в клетке, направляется в это место при помощи сигнального пептида, который добавляется к последовательности, кодирующей антиген. В ином случае лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Как правило, если желательным источником является млекопитающее, не являющееся человеком, используют клетки селезенки или клетки лимфатического узла либо, если желательными являются клетки человеческого происхождения, используются лимфоциты периферической крови («PBL»). Чтобы получить гибридомную клетку, лимфоциты сливают с иммортализованной клеточной линией, используя подходящий агент слияния, такой как полиэтиленгликоль. В большинстве случаев иммортализованные клеточные линии являются клетками миеломы крысы, мыши, коровы или имеют человеческое происхождение. Гибридомные клетки культивируют в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживаемость неслитых иммортализованных клеток. Клоны выделяют, применяя метод серийных разведений, а культуральную среду (супернатант), в которой культивируют гибридомные клетки, можно исследовать на присутствие моноклональных антител, направленных против рецептора CCR7, с помощью обычных технологических приемов, таких как проточная цитометрия или иммунопреципитация, или с помощью другого метода связывания in vitro, такого как RIA или ELISA. Также клоны можно культивировать in vivo, как и асцитные опухоли у животных.
Предпочтительно, чтобы связывающая специфичность моноклональных антител, продуцируемых клоном гибридомных клеток, определялась с помощью иммунопреципитации или посредством исследования связывания in vitro, такого как радиоиммунологическое исследование (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), или посредством иммунофлуоресцентных технологических приемов, таких как флуоресцентная микроскопия или проточная цитометрия.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, отделяют надлежащим образом от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки при помощи обычных процедур очистки иммуноглобулина, таких как, например, белок A-Сефароза, хроматография с гидроксилапатитом, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.
Также моноклональные антитела могут быть получены с помощью методов рекомбинантной ДНК, таких как те, что описаны в патенте США 4816567. ДНК, кодирующая моноклональные антитела согласно изобретению, может быть отделена от гибридомных клеток, характеризующихся рецептором CCR7, и секвенирована посредством общепринятых методов, например при применении олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи мышиных антител. Гибридомные клетки служат предпочтительным источником такой ДНК. Чтобы добиться синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах, выделенная однократно ДНК может быть встроена в экспрессионный вектор, который затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как COS-клетки обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, которые без него не продуцируют иммуноглобулиновый белок.
Еще один способ получения специфических антител или фрагментов антитела, реактивных против молекулы-мишени, - это скринирование экспрессионных библиотек, кодирующих иммуноглобулиновые гены или их части, экспрессирующиеся в дисплейных системах бактерий, дрожжей, нитевидных фагов, рибосом или рибосомных субъединиц и в других. Обычно эти способы используют большие библиотеки последовательностей антител или последовательностей фрагментов антител, полученных из различных источников, таких как здоровые доноры, пациенты или здоровые или больные животные. Эти последовательности клонируют и экспрессируют в соответствующей системе и отбирают по их связывающей аффинности к антигену. Были описаны различные подходы для отбора антител или фрагментов с желаемыми свойствами, например нейтрализация, агонист и т.д. (Fernandez, Curr. Op. Biotech., 15: 364-373 (2004); Schmidt, Eur. J. Biochem., 268: 1730-1738 (2001)). В одном варианте осуществления антитела и фрагменты антитела, характерные для гибридом согласно изобретению, также могут быть получены с помощью рекомбинантных способов посредством выделения информационной РНК, построения библиотеки cDNA и отбора клонов, которые кодируют части молекулы антител.
Сконструированные или модифицированные антитела
Чтобы создавать различные модификации молекулы иммуноглобулина с целью улучшения его свойств для клинического или иного применения, используются многочисленные подходы молекулярной биологии и генетические приемы, такие как хорошее знание генетики и структуры иммуноглобулинов. Некоторые из них направлены на уменьшение иммуногенности молекулы у видов, в которых их следует использовать, и образующаяся молекула имеет последовательность, более гомологичную этим видам. Для получения mAb человеческого происхождения применяли различные способы, избегая этически недопустимых действий на здоровых людях. При других подходах уменьшают молекулярную массу и размер, например, чтобы улучшить распределение молекулы в солидных опухолях. Другие возможности представляют собой соединение в молекуле связывающих доменов более чем одной молекулы-мишени (биспецифичное антитело или также триспецифичное и т.д.) или соединение антитела или фрагмента с еще одной молекулой с желаемой функцией, например с токсическим агентом, гормоном, фактором роста, иммуномодулирующим агентом (иммуносупрессором или иммуностимулятором), ингибитором клеточного роста и т.д. В большинстве случаев все получающиеся молекулы сохраняют по меньшей мере один вариабельный домен антитела, который дает высокую специфичность и характеристику аффинности связывания антиген-антитело. Некоторыми примерами этих конструкций являются следующие.
Химерные антитела
Это относится к антителам, сконструированным на основе вариабельных областей из антитела некоторых видов (обычно - млекопитающего, в котором вырабатывали mAb) и константных областей других видов (тот самый вид, в котором применяется химерное антитело). Цель такой конструкции - получение антитела на основе исходного mAb, но менее иммуногенного и лучше переносимого субъектом, который подлежит лечению, с улучшенным временем полужизни в сыворотке и которое может быть распознано эффекторными иммунологическими механизмами, то есть комплементом, Fc-рецептором цитотоксических клеток или другими специфическими рецепторами к иммуноглобулинам, что свидетельствует о видовой специфичности.
Гуманизированные антитела
Под «гуманизированным антителом» подразумевается антитело, полученное из антитела, не являющегося человеческим, обычно из мышиного антитела, которое сохраняет антигенсвязывающие свойства исходного антитела, но которое является менее иммуногенным у людей. Это может быть достигнуто при помощи различных способов, включая (a) прививание целых вариабельных доменов, не являющихся человеческими, на человеческие константные области для создания химерных антител, (b) прививание только определяющих комплементарность областей (CDR), не являющихся человеческими, в человеческую каркасную и константную области с сохранением критических каркасных остатков или без них, и (c) пересаживание целых вариабельных доменов, не являющихся человеческими, но «маскирование» их фрагментом, обладающим чертами человеческого, посредством замещения поверхностных остатков.
В данной области описаны способы гуманизации антител, не являющихся человеческими. Предпочтительно, чтобы гуманизированное антитело имело один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него от источника, который не является человеческим. Эти не являющиеся человеческими аминокислотные остатки часто именуются «импортированными» остатками, которые обычно берутся из «импортирующего» вариабельного домена.
По сути гуманизация может быть осуществлена, следуя способу Winter и коллег (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986), Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)) посредством замещения последовательностей гипервариабельной области на соответствующие последовательности человеческого антитела. На практике гуманизированные антитела обычно являются человеческими антителами, в которых некоторые остатки гипервариабельной области и, возможно, некоторые остатки каркасной области (FR) замещают остатками аналогичных сайтов антител грызуна. Выбор человеческих вариабельных доменов, и легкого, и тяжелого, используемых для создания гуманизированных антител, является очень важным для снижения иммуногенности, при сохранении специфичности и аффинности антигена. Согласно так называемому «best-fit» (наиболее соответствующему) способу последовательность вариабельного домена антитела грызуна скринируется против всей библиотеки известных последовательностей вариабельного домена человека. Затем человеческая последовательность, которая наиболее близка последовательности грызуна, принимается за человеческую каркасную область (FR) гуманизированного антитела (Suns et al., J. Immonol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). В еще одном способе используется специфическая каркасная область, полученная из консенсусной последовательности всех человеческих антител отдельной подгруппы легкой или тяжелой цепей. Та же каркасная область может применяться для нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
Кроме того, важно, что антитела гуманизируют с сохранением высокой аффинности к антигену и других полезных биологических свойств. Для достижения этой цели в соответствии с предпочтительным способом гуманизированные антитела готовят посредством анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов, применяя трехмерные модели исходной и гуманизированной последовательности.
Приматизированные антитела
Дальнейшим шагом в этом подходе в создании антитела, более сходного с человеческим, является приготовление так называемых приматизированных антител, то есть рекомбинантного антитела, которое сконструировали таким образом, что оно содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепи антитела обезьяны (или другого примата), в частности антитела макаки-крабоеда, и которое включает последовательности человеческого константного домена, предпочтительно константного домена человеческого иммуноглобулина гамма 1 или гамма 4 (или PE-вариант). Препарат таких антител описан у Newman et al., Biotechnology, 10: 1458-1460 (1992); в патенте США 5658570 и в патенте США 6113898. Было описано, что эти антитела проявляют высокую степень гомологии к человеческим антителам, то есть 85-98%, обнаруживают человеческие эффекторные функции, имеют пониженную иммуногенность и могут проявлять высокую аффинность к человеческим антигенам. Другие высокоэффективные способы создания рекомбинантных антител раскрыты у Newman, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992).
Человеческие антитела
Под «человеческим антителом» подразумевается антитело, содержащее полностью человеческую легкую и тяжелую цепи, а также константные области, полученные любым из известных стандартных способов.
В качестве альтернативы гуманизации могут быть получены человеческие антитела. Например, сейчас можно создавать трансгенных животных (например, мышей), которые способны, после иммунизации, продуцировать полный набор человеческих антител при отсутствии продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например, было описано, что гомозиготная делеция соединительного сегмента PH-гена тяжелой цепи антитела у химерных и исходных мутантных мышей приводит к полному подавлению продукции эндогенных антител. Перенесение генной матрицы исходного человеческого иммуноглобулина таким мутантным мышам исходной линии приведет к продукции человеческих антител после иммунизации. См., например, Jakobovits et al., Proc. Mad. Acad. Sci. USA, 90:255 1 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993).
В ином случае для получения человеческих антител и фрагментов антитела in vitro, из набора генов вариабельного (V) домена иммуноглобулина от доноров, может применяться технология фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)). В соответствии с этой технологией гены V-домена антитела клонируют в рамку гена либо мажорного, либо минорного белка оболочки нитевидного бактериофага, такого как M13 или fd, и они отображаются как функциональные фрагменты антитела на поверхности фаговой частицы. Поскольку нитевидная частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, отбор, основанный на функциональных свойствах антитела, также приводит к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющего такие свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые особенности B-клетки. Фаговый дисплей может быть осуществлен разнообразными способами; для ознакомления с ними см., например, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-57 1 (1993).
Человеческие антитела также могут быть созданы с помощью активированных B-клеток in vitro или с помощью SCID-мышей и их иммунной системы, воспроизведенной с человеческими клетками.
Как только получено человеческое антитело, последовательности кодирующей ДНК могут быть выделены, клонированы и введены в соответствующую экспрессионную систему, то есть в клеточную линию, предпочтительно от млекопитающего, которая в дальнейшем экспрессирует и высвобождает его в культуральную среду, из которой можно выделить антитело.
Фрагменты антитела
2
Фрагмент антитела - это фрагмент антитела, такой как, например, Fab, F(ab'), Fab' и scFv. Для получения фрагментов антитела были разработаны различные технические приемы. Традиционно эти фрагменты получали путем протеолитического гидролиза интактных антител, но совсем недавно эти фрагменты смогли производить непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. В других вариантах осуществления выбранное антитело представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv), который, кроме того, может быть моноспецифичным или биспецифичным.
2
Расщепление антител папаином дает два одинаковых антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагментами, каждый с единственным антигенсвязывающим сайтом, и остаточный «Fc»-фрагмент, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает F(ab')-фрагмент, который имеет два антигенсвязывающих сайта и еще способен к перекрестному сшиванию антигена.
«Fv» представляет собой наименьший фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий сайт. Эта область состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в плотном нековалентном комплексе. Она находится в такой конформации, что три гипервариабельные области каждого вариабельного домена взаимодействуют, чтобы обозначить антигенсвязывающий сайт на поверхности димера VH-VL. В совокупности шесть гипервариабельных областей дают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже единственный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три гипервариабельные области, специфичные к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с меньшей аффинностью, чем целый связывающий сайт.
Fab-фрагмент также содержит константную область легкой цепи и первую константную область (CHI) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце CHI-области тяжелой цепи, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела. Fab'-SH в настоящем изобретении является обозначением Fab', в котором цистеиновый остаток (остатки) константных областей несет (несут) по меньшей мере одну свободную тиольную группу. Фрагменты антитела F(ab')Z первоначально получали как пары Fab'-фрагментов, которые между ними содержат шарнирные цистеиновые остатки. Также известны другие способы химического соединения фрагментов антитела.
«Одноцепочечный Fv» или «scFv» фрагменты антитела содержат домены антитела VH и VL, где эти домены присутствуют в одноцепочечной полипептидной цепи. Предпочтительно, чтобы, кроме того, Fv-полипептид содержал между доменами VH и VL полипептидный линкер, который дает возможность scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. Для ознакомления с scFv см. Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, N. Y., pp. 269-315 (1994).
Термин «димерные антитела» относится к небольшим фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими сайтами, эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH-VL). При использовании линкера, который слишком короток, чтобы обеспечить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, домены вынуждены образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Димерные антитела описаны более полно, например, в Европейском патенте 404097; WO 93/11161 и у Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
Функциональные фрагменты антител, которые связываются с рецептором CCR7, включенные в настоящее изобретение, сохраняют по меньшей мере одну связывающую функцию и/или функцию модулирования полноразмерного антитела, из которого они происходят. Предпочтительные функциональные фрагменты сохраняют антигенсвязывающую функцию соответствующего полноразмерного антитела (например, способность связывать рецептор млекопитающих CCR7). Особенно предпочтительные функциональные фрагменты сохраняют способность подавлять одну или несколько функциональных характеристик рецептора млекопитающих CCR7, таких как связывающая активность, сигнальная активность и/или стимуляция клеточного ответа. Например, в одном варианте осуществления функциональный фрагмент может ингибировать взаимодействие CCR7 с одним или несколькими из его лигандов и/или может подавлять одну или несколько функций, опосредованных рецептором.
Биспецифичные антитела
2
Биспецифичные антитела представляют собой антитела, которые обладают связывающей специфичностью по меньшей мере к двум различным эпитопам. Типичные биспецифичные антитела могут связываться с двумя различными эпитопами поверхностного маркера B-клетки. Другие подобные антитела могут связывать первый B-клеточный маркер и затем связывать второй поверхностный маркер B-клетки. В ином случае связывающий спейсер анти-B-клеточного маркера может быть связан со спейсером, который связывается с триггерной молекулой на лейкоците, такой как молекула T-клеточного рецептора (например, CD2 или CD3), или с Fc-рецепторами к IgG (FcyR), такими как FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD 16), для того, чтобы сосредоточить клеточные защитные механизмы на B-клетке. Также биспецифичные антитела могут быть использованы, чтобы определить местонахождение цитотоксических агентов на B-клетке. Эти антитела захватывают связывающий спейсер B-клеточного маркера и спейсер, который связывает цитотоксический агент (например, сапорин, анти-интерферон-α, алкалоид барвинка, A-цепь рицина, метотрексат или радиоактивный изотоп гаптена). Биспецифичные антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антитела (например, биспецифичные антитела F(ab)).
В данной области известны способы получения биспецифичных антител. Традиционная продукция полноразмерных биспецифичных антител основана на совместной экспрессии двух пар тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, где две цепи обладают различной специфичностью (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Вследствие случайного выбора тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, эти гибридомы (квадромы) дают потенциальную смесь 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет подходящую биспецифичную структуру. Очистка подходящей молекулы, которая обычно проводится посредством этапов аффинной хроматографии, является довольно трудоемкой, а выход продукта - низким. Аналогичные методики раскрыты в WO 93/08829 и у Traunecker et al., EMBO J, 10:3655-3659 (1991).
Согласно другому подходу вариабельные домены антитела с желаемой связывающей специфичностью (антигенсвязывающие активные центры антител) сливают с последовательностями константной области иммуноглобулина. Слияние происходит предпочтительно с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей по меньшей мере часть шарнирной области, области CH2 и CH3. Предпочтительно получить первую константную область тяжелой цепи (CHI), содержащую сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующий по меньшей мере в одной из слитых молекул. DNA, кодирующие слитые тяжелые цепи иммуноглобулинов и, если желательно, легкую цепь иммуноглобулина, вводят в отдельные экспрессионные векторы и совместно трансфицируют в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в подборе взаимных пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах осуществления, когда в конструкции используются неравные соотношения трех полипептидных цепей, чтобы обеспечить оптимальный выход. Однако можно ввести кодирующие последовательности двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессионный вектор, если экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равном соотношении приводит к высокому выходу или если соотношение не имеет особого значения.
Биспецифичные антитела охватывают перекрестносшитые или «гетероконъюгатные» антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, другое - с биотином. Предположили, что такие антитела, например, направляют клетки иммунной системы к нежелательным клеткам. Гетероконъюгатные антитела можно получить, используя любой подходящий для перекрестного сшивания способ. Пригодные сшивающие вещества общеизвестны в данной области и раскрыты в патенте США 4676980 наряду с несколькими способами перекрестного сшивания.
Технические приемы для создания биспецифичных антител из фрагментов антитела также описаны в литературе. Например, биспецифичные антитела можно получить, используя химическое сшивание.
Конъюгирование антител
Применение цитотоксической химиотерапии или радиотерапии рака ограничено вследствие серьезных, иногда угрожающих жизни, побочных эффектов, которые возникают из-за токсичности по отношению к чувствительным нормальным клеткам, поскольку терапия не является селективной для злокачественных клеток. Одной из стратегий по предотвращению этих проблем является соединение терапевтического агента с антителами или другими лигандами, которые распознают антигены, ассоциированные с опухолью. Это увеличивает воздействие на злокачественные клетки и уменьшает воздействие на нормальные клетки лиганд-нацеленных терапевтических средств. См. Allen, Nature, 2: 750-763 (2002).
Терапевтическое вещество может быть иммуносупрессирующим веществом, то есть веществом, которое принимает участие в супрессии или маскировании иммунной системы млекопитающего, подвергающегося лечению. Оно охватывает вещества, которые супрессируют продукцию цитокинов, подавляют или супрессируют экспрессию собственных антигенов или маскируют антигены MHC.
Также терапевтическое вещество может быть цитотоксическим агентом, то есть веществом, которое ингибирует или ограничивает работу клеток и/или вызывает деструкцию клеток. Термин охватывает радиоактивные изотопы, химиотерапевтические вещества, то есть химические соединения, пригодные для лечения рака, и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины, происходящие от бактерий, грибов, растений или животных, или их фрагменты.
Терапевтическое вещество также может быть цитокином, гормоном, фактором роста, фактором некроза, то есть белком или пептидом, высвобождаемым некой клеточной популяцией, которая влияет на другую клетку или даже на ту же самую клеточную популяцию как межклеточные медиаторы. В настоящем изобретении термин цитокин охватывает белки и пептиды из природных источников или культуры рекомбинантных клеток и биологически активные аналоги природной последовательности цитокинов.
Терапевтическое вещество также может быть пролекарством, которое имеет отношение к предшественнику или производной форме фармацевтически активного вещества, которая является менее цитотоксичной для опухолевых клеток, в сравнении с основным лекарственным препаратом, и способна ферментативно активироваться или превращаться в более активную основную форму.
Конъюгаты антитела и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов
Pseudomonas
aeruginosa
Aleurites
fordii
Phytolaca
americana
momordica
charantia
sapaonaria
officinalis
В одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения антагонист конъюгируют с одной или несколькими молекулами токсина. Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, охватывают A-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из ), A-цепь рицина, A-цепь абрина, A-цепь модецина, альфа-сарцин, белки , белки диантина, белки  (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор , курцин, кротин, ингибитор , гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены.
Кроме того, настоящее изобретение рассматривает антитело, конъюгированное с соединением с нуклеолитической активностью (например, с рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза, ДНКаза) или с другим соединением, способным разрушать клеточную структуру или органеллу и, следовательно, уничтожать или снижать жизнеспособность клетки.
Также антитела согласно настоящему изобретению могут быть конъюгированы с активирующим пролекарство агентом, который превращает пролекарство в активный противораковый препарат. Компонент агента таких конъюгатов включает любое вещество, способное воздействовать на пролекарство таким образом, что превращает его в его более активную, цитотоксическую форму.
В ином случае слитые белки, включающие по меньшей мере антигенсвязывающую область антагониста согласно изобретению, связанные по меньшей мере с функционально активной частью фермента согласно изобретению, могут быть сконструированы при применении методов рекомбинантной ДНК, хорошо известных в данной области (см., например, Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984)).
Конъюгаты антитела и цитотоксического агента могут быть созданы при использовании ряда бифункциональных белковых сшивающих агентов или линкеров. Линкер может быть «расщепляемым линкером», способствующим высвобождению цитотоксического препарата в клетке. Например, может быть использован кислотолабильный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, диметиловый линкер или содержащий дисульфид линкер.
В ином случае слитый белок, включающий антитело и цитотоксический агент, может быть создан, например, при помощи рекомбинантных способов или пептидного синтеза.
Другие потенциально пригодные модификации
Предполагается модификация (модификации) аминокислотной последовательности белка или пептида антагонистов, описанных в настоящем изобретении. Например, может быть желательным улучшение связывающей аффинности и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела создаются посредством введения соответствующих нуклеотидных изменений в нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, или посредством пептидного синтеза. Такие модификации охватывают, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в пределах аминокислотных последовательностей антагониста. Любое сочетание делеции, инсерции и замены делается, чтобы получить конечную конструкцию, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками. Также аминокислотные изменения могут изменять посттрансляционные процессы у антагониста, такие как изменение числа или местоположения сайтов гликозилирования.
Инсерции в аминокислотной последовательности охватывают амино- и/или С-терминальные слияния, колеблющиеся по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также инсерции одного или множества аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры терминальных инсерций включают антагонист с N-терминальным метиониновым остатком или антагонист, слитый с цитотоксическим полипептидом. Другие инсерционные варианты молекулы антагониста охватывают слияние с N- или C-концом антагониста фермента или полипептид, который увеличивает время полужизни антагониста в сыворотке.
Другой тип модификации представляет собой модификацию с аминокислотной заменой. Эти модификации содержат по меньшей мере один аминокислотный остаток в молекуле антагониста, замещенный другим остатком. Сайты, представляющие наибольший интерес для заместительного мутагенеза антагонистов антитела, охватывают гипервариабельные области, но также рассматриваются и изменения в FR.
Другой тип аминокислотной модификации антитела изменяет исходный участок гликозилирования антагониста. Под изменением подразумевается удаление одной или нескольких углеводных частей, обнаруживаемых в антагонисте, и/или добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые не представлены в антагонисте. Гликозилирование полипептидов обычно либо N-сопряженное, либо O-сопряженное. N-сопряжение относится к присоединению углеводной части к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X - это любая аминокислота кроме пролина, представляют собой распознаваемые последовательности для ферментативного присоединения углеводной части к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие в полипептиде любой из этих трипептидных последовательностей создает потенциальный сайт гликозилирования. O-сопряженное гликозилирование относится к присоединению одного моносахарида или производных моносахарида N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего к серину или треонину, хотя также может использоваться 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Введение сайтов гликозилирования в антитело удобно совершать при изменении аминокислотной последовательности таким образом, что она содержит одну или несколько из ранее описанных трипептидных последовательностей (для N-сопряженных сайтов гликозилирования). Также изменение может быть осуществлено посредством введения или замены одного или нескольких остатков серина или треонина в последовательности исходного антитела (для O-сопряженных сайтов гликозилирования). Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей модификации аминокислотной последовательности антитела, готовят при помощи различных способов, известных в данной области. Эти способы охватывают, но не ограничиваются этим, выделение из природного источника (в случае природных модификаций аминокислотной последовательности) или препарата с помощью опосредованного олигонуклеотидами (или сайтнаправленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза ранее полученной модифицированной модификации или немодифицированного варианта антагониста.
Может быть желательным изменить антитела, используемые в данном изобретении, для улучшения эффекторной функции, например чтобы увеличить ADCC и/или CDC антитела. Это может быть достигнуто посредством введения одной или нескольких аминокислотных замен в Fc-область антитела.
Гликозильные группы, добавленные к аминокислотному остову гликопротеинов, например антител, образованы несколькими моносахаридами или производными моносахаридов, что дает в результате композицию, которая может различаться одним антителом, продуцирующимся в клетке от различных млекопитающих или тканей. Кроме того, было показано, что различная компоновка гликозильных групп может влиять на силу опосредования антигензависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC) данного антитела. Поэтому можно улучшить эти свойства посредством изучения области гликозилирования антител из различных источников. Примером такого подхода является Niwa et al., Cancer Res. 2004 Mar 15; 64(6):2127-33.
В ином случае или дополнительно остаток(-ки) цистеина может быть введен в Fc-область, таким образом, делая возможным образование в этой области межцепочечной дисульфидной связи. Гомодимерное антитело полученное таким образом может обладать повышенной возможностью интернализации и/или увеличенным комплементзависимым уничтожением и антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). См. Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) и Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Также гомодимерные антитела с усиленной противоопухолевой активностью могут быть получены при использовании гетеробифункциональных кросслинкеров, как описано у Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). В ином случае может быть сконструировано антитело, которое имеет двойные Fc-области и, таким образом, может обладать усиленными возможностями комплементзависимого лизиса и ADCC. См. Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:2 19-230 (1989).
Чтобы увеличить время полужизни антитела в сыворотке, специалист может включить спасательный рецепторсвязывающий эпитоп в антитело (особенно во фрагмент антитела), как описано, например, в патенте США 5739277. Используемый в настоящем изобретении термин «спасательный рецепторсвязывающий эпитоп» относится к эпитопу Fc-области молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), который отвечает за увеличение времени полужизни в сыворотке молекулы IgG in vivo.
Предпочтительно, чтобы антитела согласно изобретению, например моноклональные антитела, Fv-фрагменты, Fab-фрагменты или прочие связывающие соединения, произошедшие от моноклональных антител согласно изобретению, имели высокую аффинность к рецептору CCR7. Аффинность моноклональных антител и родственных молекул к рецептору CCR7 может быть измерена с помощью обычных способов.
Аффинность антитела к антигену может быть определена как эффективность связывания антителом такого антигена. Связывание антигена с антителом - это обратимое связывание, и поэтому, если обе молекулы растворены в одном растворе, после достаточного времени этот раствор достигает равновесия, в котором постоянны концентрации комплекса антиген-антитело (AgAb), свободного антигена (Ag) и свободного антитела (Ab). Следовательно, отношение [AgAb]/[Ag]·[Ab] также является константой, определенной как константа ассоциации, названная Ka, которая может использоваться для сравнения аффинности некоторых антител к их соответствующему эпитопу.
Общим способом измерения аффинности является экспериментальное определение связывающей кривой. Он включает в себя измерение количества комплекса антитело-антиген как зависимости от концентрации свободного антигена. Существует два общих способа осуществления этого измерения: (i) классический равновесный диализ при помощи исследования Скэтчарда и (ii) метод поверхностного плазмонного резонанса, в котором либо антитело, либо антиген связаны с электропроводящей поверхностью, а связывание антигена или антитела соответственно влияет на электрические свойства этой поверхности.
Часто необходимо определить только относительные аффинности двух или более mAb, которые соединяются с одним и тем же эпитопом. В этом случае может быть осуществлено конкурентное исследование, в котором серийное разведение одного из mAb инкубируют с постоянным количеством лиганда и затем добавляют второе mAb, меченное любой подходящей меткой. После связывания этого mAb и отмывки несвязанных антител измеряют концентрацию второго mAb и строят графики зависимости от концентрации первого mAb и анализируют методом Скэтчарда. Примером является Tamura et al., J. Immunol. 163: 1432-1441 (2000).
Кроме того, антитела согласно настоящему изобретению могут применяться для обнаружения рецептора CCR7. Такие способы обнаружения успешно применяются в диагностике и/или прогнозе рака, опухолевые клетки которого представляют собой клетки, экспрессирующие рецептор CCR7.
Кроме того, антитела согласно изобретению могут применяться для выявления клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, с помощью стандартных способов, таких как иммунофлуоресценция, проточная цитометрия, аффинная хроматография или иммунопреципитация. Например, антитело согласно изобретению может способствовать выявлению опухолевой клетки, экспрессирующей рецептор CCR7. Более того, антитела согласно изобретению могут использоваться для выявления опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, чтобы оценить его уровень в конкретной ткани. Таким образом, антитела согласно изобретению могут применяться диагностически, чтобы отслеживать уровни клеток, экспрессирующих рецептор CCR7 в ткани, как часть клинических исследований, например чтобы определить эффективность назначенного режима лечения. Определение может быть упрощено при соединении (то есть физическом сшивании) антитела с меткой.
Как описано ниже, в конкретном варианте осуществления антитело согласно изобретению может применяться совместно с дополнительным терапевтически активным соединением, таким как цитокин, болеутоляющее вещество, иммуносупрессирующий агент и/или химиотерапевтический агент. Комбинированное введение включает в себя совместное введение при использовании отдельных композиций или одной фармацевтической композиции и последовательное введение в любом порядке, при котором предпочтительно существует временной период, когда оба (или все) активные агенты одновременно проявляют их биологическую активность.
В другом аспекте данное изобретение относится к фармацевтической композиции, иногда называемой здесь фармацевтической композицией согласно изобретению, включающей в себя антитело согласно изобретению, то есть антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с рецептором CCR7, или фармацевтическую производную или ее пролекарство вместе с фармацевтически приемлемым носителем, адъювантом или средством доставки для введения субъекту. Указанная фармацевтическая композиция может применяться для уничтожения или для индукции апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, после введения субъекту, болеющему раком. Используемый в настоящем изобретении термин «субъект» относится ко всем животным, отнесенным к млекопитающим, и охватывает, но не ограничивается этим, домашних и сельскохозяйственных животных, приматов и людей. Субъект предпочтительно является человеком мужского или женского пола любого возраста или расы.
Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый носитель» предназначен для охвата любого и всех растворителей, дисперсионных сред, оболочек, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических и замедляющих абсорбцию агентов и тому подобного, совместимых с введением лекарственного средства. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных субстанций хорошо известно в данной области. Исключая случаи, когда какие-либо стандартные среды или агент являются несовместимыми с активным соединением, предполагается применение их в композициях. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиента в применяемых дозах и концентрациях и содержат буферы, такие как фосфатный, цитратный и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензила аммония; хлорид гексония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем около 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Антитела согласно изобретению могут находиться в той же композиции или могут вводиться в различных композициях. Введение может быть одновременным или последовательным и может быть эффективным и в том, и в другом случае.
Также в фармацевтическую композицию согласно изобретению могут вводиться дополнительные активные соединения. Таким образом, в определенном варианте осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению также может содержать более чем одно активное соединение, что необходимо для конкретного подлежащего лечению симптома, предпочтительно, чтобы соединения с комплементарной активностью не оказывали неблагоприятного влияния друг на друга. Например, может быть желательным дополнительно предоставить химиотерапевтический агент, цитокин, анальгезирующий агент или иммуносупрессирующий агент. Эффективное количество таких дополнительных активных агентов зависит, кроме того, от количества антитела согласно изобретению, присутствующего в фармацевтической композиции, от типа заболевания, или нарушения, или лечения и т.д.
В одном воплощении антитело согласно изобретению готовят с носителями, которые защитят указанное соединение от быстрого выведения из организма, как например композиция с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и системы микроинкапсулированной доставки. Могут применяться биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолиевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы приготовления таких композиций будут ясны специалистам в данной области. Также материалы могут быть получены коммерчески из Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. В качестве фармацевтически приемлемых носителей также могут использоваться липосомные суспензии (включая нацеленные на инфицированные клетки липосомы с моноклональными антителами к вирусным антигенам). Они могут быть приготовлены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области, например как описано в патенте США 4522811.
Способ введения антитела (или его фрагмента) согласно изобретению может быть пероральным, парентеральным, осуществляться посредством ингаляции или быть местным.
Используемый в настоящем изобретении термин «парентеральный» охватывает внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное введение. Как правило, предпочтительны подкожный и внутримышечный способы парентерального введения.
Под «ингаляцией» подразумевается интраназальное и пероральное ингаляционное введение. Соответствующие лекарственные формы для подобного введения, как например аэрозольная композиция или дозирующий ингалятор, могут быть подготовлены с помощью обычных способов.
Кроме того, под «местным» введением подразумевается несистемное введение и включает нанесение антитела согласно изобретению снаружи на эпидермис, на ротовую полость и закапывание такого антитела в ухо, глаз и нос, где оно незначительно проникает в кровь. Под «системным введением» подразумевается пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное и внутримышечное введение. Количество антитела, требующееся для терапевтического или профилактического эффекта, конечно, будет варьировать в зависимости от выбранного антитела, природы и тяжести состояния, подвергающегося лечению, и от пациента.
Кроме того, антитело может быть введено соответствующим образом с помощью импульсной инфузии, например, со снижающимися дозами антитела. Предпочтительно, чтобы дозирование проводили с помощью инъекций, наиболее предпочтительно - внутривенных или подкожных инъекций, частично зависящих от того, является ли введение кратким или постоянным.
Таким образом, в определенном варианте осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению может находиться в форме для введения, подходящей для перорального введения, либо в твердой, либо в жидкой. Подходящие лекарственные формы для перорального введения могут представлять собой таблетки, капсулы, сиропы или растворы и могут содержать стандартные вспомогательные вещества, известные в данной области, такие как связывающие агенты, например сироп, камедь, желатин, сорбит или поливинилпирролидон; заполнители, например лактозу, сахар, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит или глицин; смазывающие вещества для таблеток, например стеарат магния; агенты, вызывающие дезинтеграцию, например крахмал, поливинилпирролидон, натрийкрахмалгликолят или микрокристаллическую целлюлозу; или фармацевтически приемлемые смачивающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия. Твердые пероральные композиции могут быть приготовлены посредством стандартных способов измельчения, наполнения или таблетирования. Повторяющиеся измельчающие действия могут применяться для распределения активного агента во всех этих композициях, содержащих большие количества заполнителей. Такие операции являются стандартными в данной области. Таблетки могут быть приготовлены, например, при помощи влажного или сухого гранулирования и при желании покрыты в соответствии со способами, хорошо известными в обычной фармацевтической практике, в частности энтеросолюбильным покрытием.
В еще одном варианте осуществления фармацевтические композиции согласно данному изобретению могут быть адаптированы для парентерального введения, как например стерильные растворы, суспензии или лиофилизированные продукты в соответствующей стандартной лекарственной форме. Фармацевтические композиции, пригодные для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (в тех случаях, когда они водорастворимы) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсий для немедленного введения. Для внутривенного введения подходящие носители охватывают физиологический раствор, бактериостатическую воду, CremophorEM (BASF, Parsippany, N.J.) или фосфатно-солевой буфер (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной, и ей следует быть текучей до такой степени, что возможно легкой шприцевание. Она должна быть стабильна при условиях производства и хранения и должна предохраняться от загрязняющего воздействия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, фармацевтически приемлемый многоатомный спирт, как глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и их подходящие смеси. Характерная текучесть может поддерживаться, например, при применении оболочки, такой как лецитин, с помощью поддержания требуемого размера частицы в случае дисперсии и при использовании поверхностно-активных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов может быть достигнуто при помощи различных антибактериальных и противогрибковых веществ, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и тому подобного. Во многих случаях будет предпочтительно включить в композицию изотонические агенты, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может достигаться при включении в композицию агента, который замедляет абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.
Стерильные инъецируемые растворы могут быть приготовлены посредством объединения активного соединения (например, полипептида или антитела) в требуемом количестве в соответствующем растворителе с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии готовят посредством объединения активного соединения в стерильном средстве доставки, которое содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофильная сушка, которые дают активный ингредиент в виде порошка плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его ранее простерилизованного фильтрованием раствора.
В определенном варианте осуществления указанную фармацевтическую композицию вводят внутривенно (IV) или подкожно (SC). Могут использоваться отвечающие требованиям вспомогательные вещества, такие как наполнители, буферные вещества или поверхностно-активные вещества. Указанные композиции будут готовиться при применении стандартных способов, таких как те, что описаны или о которых идет речь в Испанской Фармакопее и Фармакопее Соединенных Штатов Америки и аналогичных исходных текстах.
Особенно полезно составлять фармацевтические композиции, а именно пероральные или парентеральные композиции, в стандартной лекарственной форме для легкого введения и единообразия дозировки. В настоящем изобретении стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, соответствующим одинарным дозировкам для субъекта, проходящего лечение; каждая единица, содержащая предопределенное количество активного соединения (антитела согласно изобретению) рассчитана таким образом, чтобы давать желаемый терапевтический эффект совместно с предусмотренным фармацевтическим носителем. Спецификации для стандартных лекарственных форм согласно изобретению обуславливаются и напрямую зависят от уникальных особенностей активного соединения и конкретного достигаемого терапевтического эффекта и от ограничений, свойственных области составления рецепта смеси такого активного соединения для лечения индивидуумов.
Как правило, вводимое эффективное количество антитела согласно изобретению будет зависеть от относительной эффективности выбранного соединения, тяжести нарушения, подлежащего лечению, и веса пациента. Однако обычно активные соединения будут вводиться один раз в день или более, например 1, 2, 3 или 4 раза ежедневно, со стандартными суммарными ежедневными дозами в диапазоне от 0,001 до 1000 мг/кг веса тела/день, предпочтительно от около 0,01 до около 100 мг/кг веса тела/день, наиболее предпочтительно приблизительно от 0,05 до 10 мг/кг веса тела/день.
Помимо введения антител пациенту, настоящая заявка рассматривает введение антител при посредстве генной терапии. WO 96/07321 затрагивает применение генной терапии для создания внутриклеточных антител.
Фармацевтическая композиция может быть заключена в контейнер, пакет или дозирующее устройство вместе с инструкциями по введению.
Антитела и фармацевтические композиции согласно этому изобретению могут применяться с другими лекарственными препаратами для обеспечения комбинированной терапии. Другие лекарственные препараты могут составлять часть той же композиции или могут предоставляться как отдельные композиции для введения в одно и то же время или в разное время.
Антитела и фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению будут пригодны в лечении медицинских состояний, таких как нарушения или заболевания, связанные со злокачественными опухолями, особенно для лечения злокачественных опухолей; указанные злокачественные опухоли характеризуются опухолевыми клетками, экспрессирующими рецептор CCR7, более конкретно для уничтожения или индукции апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7. Иллюстративные неограничивающие злокачественные опухоли, опухолевые клетки которых экспрессируют рецептор CCR7, чувствительные к лечению в соответствии с данным изобретением, охватывают хроническую лимфоцитарную лейкемию (CLL), лимфому клеток мантийной зоны (MCL), фолликулярную лимфому, крупноклеточную B-клеточную лимфому, СПИД-ассоциированную лимфому, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому Беркитта, острую В-клеточную лимфобластную лейкемию, болезнь Ходжкина, T-клеточную лейкемию/лимфому взрослых, фунгоидный микоз, бластный кризис при хронических миелопролиферативных синдромах, бластный кризис при миелодиспластических синдромах, рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого, меланому, рак желудка или плоскоклеточную карциному головы и шеи и карциному толстой кишки. В предпочтительном варианте осуществления злокачественные опухоли, чувствительные к лечению в соответствии с данным изобретением, охватывают рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого, меланому, рак желудка или плоскоклеточную карциному головы и шеи и карциному толстой кишки. В наиболее предпочтительном воплощении злокачественные опухоли, чувствительные к лечению в соответствии с данным изобретением, охватывают фолликулярную лимфому, T-клеточную лейкемию/лимфому взрослых, лимфому Беркитта, бластный кризис при хронических миелопролиферативных синдромах и бластный кризис при миелодиспластических синдромах. В еще одном наиболее предпочтительном исполнении злокачественные опухоли, подвергающиеся лечению в соответствии с данным изобретением, включают CLL и MCL.
В определенном варианте осуществления антитело согласно изобретению может быть объединено с другим лечением для медицинских состояний, описанных в настоящем изобретении, например с химиотерапией, радиационной терапией, иммунотерапией или с хирургическим методом, включая алкилирующие агенты, антиметаболиты, антигормоны, лекарственные средства для различных симптомов, например болеутоляющие средства, диуретики, антидиуретики, антивирусные препараты, антибиотики, цитокины, биологически активные добавки, лечение анемии, лекарственные препараты, способствующие свертыванию крови, лечение заболевания кости, психиатрическое и психологическое лечение и тому подобное.
Костный мозг или стволовые клетки периферической крови могут быть собраны у указанного пациента после лечения антителом против CCR7 с тем, чтобы осуществить трансплантацию аутологичного костного мозга или стволовых клеток.
Также может быть полезно лечить пациентов цитокинами, чтобы позитивно регулировать экспрессию CCR7 или другого белка-мишени на поверхности раковых B-клеток перед введением антитела согласно изобретению. Также цитокины могут вводиться одновременно, или до, или после введения истощающего антитела или антитела с радиоактивной меткой, чтобы стимулировать иммунные эффекторные функции.
В одном варианте осуществления химиотерапевтические схемы могут применяться, чтобы дополнить варианты терапии, раскрытой в настоящем изобретении, и могут назначаться одновременно или последовательно в любом порядке с введением указанного антитела с радиоактивной меткой. Химиотерапевтическая схема может быть отобрана из группы, состоящей из CHOP (циклофосфамида, доксорубицина (также называемого гидроксилдаунорубицином), винкристина (также называемого онковином) и преднизона), ICE (идарубицина, цитарабина и этопозида), Митозантрона, Цитарабина, DVP (даунорубицина, винкристина и преднизона), ATRA (полностью транс-ретиноевой кислоты), Идарубицина, химиотерапевтического режима Hoelzer, La-химиотерапевтического режима, ABVD (блеомицина, дакарбазина, доксорубицина и винкристина), CEOP (циклофосфамида, эпирубицина, винкристина и преднизолона), 2-CdA (2-хлордеоксиаденозина), FLAG & IDA (флударабина, цитарабина, филграстрима и идарубицина) (с последующим лечением G-CSF (гранулоцитарным колониестимулирующим фактором) или без него), VAD (винкристина, доксорубицина и дексаметазона), M & P (мелфалана и преднизона), C (циклофосфамида) - раз в неделю, ABCM (адриамицина, блеомицина, циклофосфамида и митомицина-С), MOPP (мехлоретамина, винкристина, преднизона и прокарбазина) и DHAP (дексаметазона, цитарабина и цисплатина). Предпочтительной химиотерапевтической схемой является CHOP.
Таким образом, в другом аспекте данное изобретение затрагивает способ лечения рака, особенно рака, опухолевые клетки которого экспрессируют рецептор CCR7, который включает в себя введение субъекту, нуждающемуся в указанном лечении, терапевтически эффективного количества антитела согласно изобретению, то есть антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который связывается с рецептором CCR7, или фармацевтической композиции согласно изобретению. В определенном варианте осуществления указанный рак представляет собой рак, характеризующийся опухолевыми клетками, экспрессирующими рецептор CCR7. Иллюстративные неограничивающие злокачественные опухоли, подлежащие лечению в соответствии с данным изобретением, охватывают CLL, MCL, фолликулярную лимфому, крупноклеточную B-клеточную лимфому, СПИД-ассоциированную лимфому, лимфоплазмоцитарную лимфому, лимфому Беркитта, острую В-клеточную лимфобластную лейкемию, болезнь Ходжкина, T-клеточную лейкемию/лимфому взрослых, фунгоидный микоз, бластный кризис при хронических миелопролиферативных синдромах, бластный кризис при миелодиспластических синдромах, рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого, меланому, рак желудка или плоскоклеточную карциному головы и шеи и карциному толстой кишки. В предпочтительном варианте осуществления злокачественные опухоли, подлежащие лечению в соответствии с данным изобретением, охватывают рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого, меланому, рак желудка или плоскоклеточную карциному головы и шеи и карциному толстой кишки. В наиболее предпочтительном воплощении злокачественные опухоли, подлежащие лечению согласно изобретению, включают фолликулярную лимфому, T-клеточную лейкемию/лимфому взрослых, лимфому Беркитта, бластный кризис при хронических миелопролиферативных синдромах и бластный кризис при миелодиспластических синдромах. В еще одном наиболее предпочтительном воплощении злокачественные опухоли, подлежащие лечению согласно данному изобретению, включают CLL и MCL.
В ином аспекте изобретение затрагивает способ уничтожения или индукции апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, который включает в себя контакт указанных клеток с антителом согласно изобретению, то есть с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые связываются с рецептором CCR7. В определенном варианте осуществления указанные опухолевые клетки представляют собой опухолевые клетки, экспрессирующие рецептор CCR7, такие как клетки CLL и MCL.
В другом аспекте данное изобретение затрагивает способ уничтожения или индукции апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, у субъекта, нуждающегося в указанном лечении, который включает в себя введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела согласно изобретению, то есть антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который связывается с указанным рецептором CCR7.
В ином аспекте данное изобретение затрагивает способ уменьшения миграции опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, к вторичной лимфоидной ткани и/или блокирования диссеминации опухолевых клеток во вторичную лимфоидную ткань, который включает в себя контактирование указанных опухолевых клеток с антителом согласно изобретению, то есть с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые связываются с рецептором CCR7.
В ином аспекте данное изобретение затрагивает способ уменьшения миграции опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, к вторичной лимфоидной ткани и/или блокирования диссеминации опухолевых клеток во вторичную лимфоидную ткань у субъекта, нуждающегося в указанном лечении, который включает в себя введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с рецептором CCR7.
Информация, касающаяся опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, восприимчивых к лечению способами согласно изобретению, антител, режимов введения и дозировок, упоминалась ранее. В определенном варианте осуществления опухолевые клетки, экспрессирующие рецептор CCR7, восприимчивые к лечению ранее указанными способами, являются клетками CLL или MCL.
Во всех случаях экспрессия «терапевтически эффективного количества» означает количество, эффективное при лечении рака, как описано выше; указанное количество может быть количеством, достаточным для достижения желаемого ответа или для улучшения симптома или признака, например метастазирования или прогрессии первичной опухоли, размера или роста. Терапевтически эффективное количество для конкретного субъекта может изменяться в зависимости от факторов, таких как состояние, подлежащее лечению, общее самочувствие субъекта, способ, путь введения и доза и тяжесть побочных эффектов. Лучше, если воздействие будет приводить к изменению при измерении по меньшей мере приблизительно на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, 30%, 50%, 70% или даже на 90% или более. В случае сочетания терапевтически эффективное количество пропорционально сочетанию компонентов и эффект не ограничен компонентами в отдельности.
Терапевтически эффективное количество будет изменять симптомы типично по меньшей мере примерно на 10%; обычно по меньшей мере примерно на 20%; предпочтительно по меньшей мере примерно на 30%; или более предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%. В ином случае изменение миграции будет означать, что затрагивается миграция или направленная миграция разных клеточных типов. Это приведет, например, к статистически значимым и поддающимся количественному определению изменениям в количестве затронутых клеток. Это может быть уменьшением количества привлеченных клеток-мишеней в отрезок времени или площади мишени. Также могут быть отслежены степень прогрессии первичной опухоли, размер, диссеминация или рост.
Любой из указанных терапевтических способов может применяться для любого субъекта, нуждающегося в таком лечении, включая, например, млекопитающих, таких как собаки, кошки, коровы, лошади, кролики, обезьяны и наиболее предпочтительно люди.
В ином аспекте данное изобретение затрагивает способ выявления соединения для уничтожения или индукции апоптоза опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, который включает
a) контактирование клетки, экспрессирующей рецептор CCR7, с соединением-кандидатом, соединенным с антителом против CCR7 или с его фрагментом, и
b) определение, уничтожает ли указанное соединение-кандидат клетки, экспрессирующие рецептор CCR7,
где соединение, которое уничтожает указанную клетку, экспрессирующую рецептор CCR7, представляет собой соединение, потенциально пригодное для уничтожения или индукции апоптоза опухолевых клеток.
В сущности, любая клетка, экспрессирующая рецептор CCR7, либо опухолевая, либо неопухолевая клетка, может использоваться для воздействия указанным способом. В определенном варианте осуществления указанная клетка, экспрессирующая рецептор CCR7, представляет собой клетку CLL или MCL.
Гибель клеток, экспрессирующих рецептор CCR7, может быть определена любым стандартным способом, например согласно способу, раскрытому в примере, сопровождающем это описание.
Нижеследующий пример служит иллюстрацией к данному изобретению.
ПРИМЕР
Антитела к CCR7 как средство в лечении CLL
I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы, реагенты и проточная цитометрия (FCM)
Образцы периферической крови пациентов с CLL (хроническая лимфоцитарная лейкемия) и MCL (лимфома клеток мантийной зоны) и здоровых доноров получали после информированного согласия. Начальную иммунофенотипическую характеристику клеток цельной крови осуществляли с помощью стандартной четырехцветной FCM с моноклональными антителами (mAb), направленными против следующих человеческих поверхностных антигенов: CD45, CD19, легкой цепи каппа, легкой цепи лямбда, CD20, CD23, CD5 и CD3 (все приобретены в BD Biosciences, San Jose, CA). Образцы менее чем с 60% клеток CLL или MCL в мононуклеарной субпопуляции отбраковывали. Затем осуществляли анализ экспрессии CCR7 на дающих электронный сигнал выше порогового значения опухолевых B-клетках или нормальных T- и B-лимфоцитах. Мышиный античеловеческий CCR7, конъюгированный с фикоэритрином (PE), приобретали в R&D Systems (McKinley Place, MN). Во все случаи включены соответствующие изотипические контроли. Иммунофлуоресцентное окрашивание оценивали на проточном цитометре FACScalibur, используя программное обеспечение CellQuest (BD Biosciences).
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяли с помощью градиентного центрифугирования с фиколом (Histopaque-1077, Sigma-Aldrich, Madrid, Spain).
Очищенные мышиные mAb против человеческого CCR7 (в дальнейшем называемые «mAb против CCR7») получали из BD Biosciences (150503 клон, изотип IgG2a) и R&D Systems (2H4 клон, изотип IgM). ДНК-краситель 7-аминоактиномицин D (7-AAD), использовавшийся при исследовании клеточного цикла и жизнеспособности клетки, был из BD Biosciences. Рекомбинантные человеческие хемокины CCL19 и CXCL12 приобретали в R&D Systems.
Исследование эндоцитоза рецепторов
5
2
Чтобы исследовать, вызывает ли связывание mAb против CCR7 интернализацию хемокинового рецептора (CCR7), 5×10 клеток CLL инкубировали с 2 мкг/мл mAb против CCR7 в течение различных периодов времени (изменяющихся от 30 секунд до 1 часа) при 37°C в атмосфере 5% CO. CCL19, один из физиологических лигандов CCR7, который вызывает его эндоцитоз, использовали в качестве положительного контроля. После удаления либо связанного mAb, либо CCL19 при кислой отмывке (0,1M глицин, 0,15M NaCl, pH=2,5), определяли экспрессию CCR7 на клетках CLL с помощью FCM-анализа, как указано выше.
Комплементзависимая цитотоксичность (CDC)
5
50 мкл суспензии PBMC, содержащей 10 клеток, наносили на 96-луночный круглодонный планшет совместно с желаемой концентрацией, от 0,5 до 16 мг/мл, очищенных mAb против CCR7 или изотипическим контролем (IC). После 30 минут инкубации при 37°C клетки центрифугировали и отмывали. Затем добавляли комплемент крольчонка (Serotec, Oxford, UK), разведенный до 25% в среде RPMI 1640. После 1-2 часов при 37°C клетки окрашивали mAb против CD19, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), mAb против CD5, конъюгированным с аллофикоцианином (APC) и 7-AAD. Оба поверхностных маркера позволяют различать с помощью FCM популяции клеток CLL, клеток MCL и T-клеточные популяции, и 7-AAD использовали как краситель, исключающий жизнеспособность. Процент нежизнеспособных клеток измеряли отдельно в каждой популяции, а процент лизиса с термоинактивированным комплементом использовали, чтобы подсчитать специфический лизис в соответствии с формулой (1).
где A: % погибших клетки с комплементом,
B: % погибших клетки с инактивированным комплементом.
Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC)
Естественные клетки-киллеры (NK) выделяли из PBMC, полученных из лейкоцитарной пленки. Положительную селекцию NK-клеток осуществляли с помощью окрашивания mAb против CD56, конъюгированного с PE, с последующим магнитным сортингом клеток с микробусинами, соединенными с анти-PE (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany). Чистота NK-клеток, измеренная с помощью FCM, варьировала от 95% до 98%. Анти-CCR7-зависимую клеточную цитотоксичность измеряли посредством FCM после 4 часов инкубации клеток CLL (клетки-мишени) с NK-клетками (в качестве эффектора клеточного лизиса) при различных соотношениях эффектор-мишень (E/T) от 5 до 40 в присутствии или в отсутствие mAb против CCR7 или его изотипического контроля. Затем клетки окрашивали mAb против CD19, конъюгированным с FITC, mAb против CD56, конъюгированным с PE, и 7-AAD, чтобы различить клетки CLL и эффекторные NK-клетки и чтобы проанализировать жизнеспособность клеток CLL. Клетки CLL, инкубированные без NK-клеток, использовали в качестве контроля спонтанной гибели, а специфический лизис вычисляли, как в исследовании CDC.
Исследование хемотаксиса
5
2
Хемотаксис клеток CLL и MCL, предварительно инкубированных в течение 30 минут с 2 мкг/мл mAb против CCR7, в ответ на CCL19, CCL21 и CXCL12, лиганд CXCR4, исследовали в культуральных камерах Transwell (6,5 мм в диаметре, 10 мкм толщиной, 5 мкм диаметр пор, Costar, Cambridge, MA). Для исследования хемотаксиса 5×10 опухолевых клеток, суспендированных в 100 мкл RPMI 1640 с 0,5% BSA, добавляли в верхнюю часть камеры и в нижнюю лунку добавляли хемокины в 600 мкл той же среды при оптимальной концентрации (100 нг/мл для CXCL12 и 1 мкг/мл для CCL19 и CCL21). Миграция развивалась в течение 4 ч при 37°C в атмосфере 5% CO. Мигрировавшие клетки извлекали из нижней камеры, окрашивали mAb против CD19, конъюгированным с FITC, и подсчитывали посредством FCM в течение 60 секунд после калибровки скорости потока с пробирками Trucount (BD Biosciences). Результаты анализировали внутри популяции B-клеток, дающей электронный сигнал выше порогового значения, и сравнивали с количеством клеток, подсчитанных в исходной суспензии клеток, чтобы вычислить процент поступления (100×количество мигрировавших клеток/количество подсчитанных клеток в исходной суспензии). Каждый образец измеряли дважды.
Апоптоз и исследование клеточного цикла
5
5
l
В некоторых экспериментах mAb против CCR7 разводили до 2 мкг/мл в 50 мкл культуральной суспензии с 10 клеток CLL. В других - mAb против CCR7 фиксировали на 96-луночных плоскодонных планшетах посредством ночной инкубации в RPMI 1640. Затем планшет отмывали и добавляли 10 клеток CLL. В обоих случаях клетки инкубировали при 37°C в течение максимум 48 часов. Клетки отмывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS), окрашивали mAb против CD19, конъюгированным с FITC, ресуспендировали в 0,5 мл PBS и разводили в 5 мл 70% охлажденного на льду этанола для ночной фиксации при -20°C. На следующий день фиксированные клетки центрифугировали, отмывали и окрашивали с 20 мкг/мл 7-AAD для исследования содержания ДНК. Получали информацию минимум о 10000 суммарных событий и анализировали, применяя программное обеспечение Cell-Quest Pro (BD Bioscences). Кратко: селектировали CD19-положительные случаи и отбраковывали повторы при использовании флуоресценции 7-AAD, основанной на площади импульса и ширине импульса. Анализировали процентные соотношения пика суб-G относительно апоптических клеток в гистограмме флуоресценции 7-AAD.
Исследование пролиферации
3
PBMC выделяли у здоровых доноров и культивировали в течение 72 часов в 96-луночных планшетах, предварительно покрытых и mAb против CCR7, и их соответствующими изотипическими контролями. Также включали положительные контроли, такие как анти-CD3 с IL2. Все измерения проводили в трех повторах. Клетки метили 1 мкКи [H]-тимидина (Amersham Biosciences GmbH, Freiburg, Germany) на лунку примерно последние 16 часов культивирования. Затем клетки собирали и подвергали измерению активности сцинтилляционным методом.
Статистический анализ
3
Все статистические проверки осуществляли с помощью SPSS version 8.0. Уилкоксона и непараметрических тестов W Кендалла и использовали для сравнения результатов различного лечения в большинстве исследований. При исследовании пролиферации с [H]-тимидином проводили ANOVA для сравнения между группами. Подсчитывали коэффициент корреляции Пирсена, чтобы изучить ассоциацию между средней интенсивностью флуоресценции (MFI) CCR7 и процентом лизиса в CDC.
II. РЕЗУЛЬТАТЫ
mAb против CCR7 не вызывают интернализацию мишени
Использование терапевтических mAb в их неконъюгированной форме требует не только высокой плотности антигена мишени, но также присутствия комплексов антиген-антитело на поверхности клеток, чтобы активировать комплемент или связать Fc-рецепторы цитотоксических клеток, то есть важно, чтобы связывание mAb с антигеном не вызывало его интернализации, поскольку это может снизить терапевтический эффект mAb. В этом отношении предположено, что связывание антитела с некоторыми хемокиновыми рецепторами может приводить к эндоцитозу рецептора с его последующим протеолизом или повторной экспрессией после деградации антитела. Исследователи проанализировали, вызывает ли связывание mAb с CCR7 его интернализацию в клетках CLL. Экспрессия CCR7 на поверхности клеток CLL была от двух до четырех раз выше в клетках CLL, чем в нормальных B- или T-клетках (фиг.1A), и не уменьшалась после их инкубации с mAb против CCR7 в течение различного времени вплоть до 60 минут (фиг.1B). И наоборот, она снижалась примерно на 60% в первые 5 минут инкубации с 1 микрограмм/мл CCL19, который использовался в качестве положительного контроля.
MAb против CCR7 опосредуют сильную и специфическую CDC клеток CLL и MCL in vitro
Цитотоксичность, опосредованная пополнением либо белка комплемента (CDC), либо клеток-эффекторов, таких как NK-клетки (ADCC), является основным механизмом воздействия, предложенным для уничтожения опухолевых клеток неконъюгированными терапевтическими mAb in vivo. Поэтому эффективность mAb против CCR7 в опосредовании CDC исследовали на образцах CLL и MCL от различных пациентов. Очень большая доля клеток CLL, предварительно проинкубированных с mAb против CCR7 класса IgM, была убита после часа обработки кроличьим комплементом (фиг.2A). Аналогично mAb против CCR7 с изотипом IgG также опосредовало значительную CDC (фиг.2B).
По аналогии с CLL, клетки MCL также экспрессируют значительные уровни CCR7 (фиг.3A), а эксперименты с CDC показали, что оба mAb против CCR7 эффективно убивают CCR7-позитивные клетки MCL (фиг.3B). Не наблюдалось значительной CDC при применении нехарактерных иммуноглобулинов того же изотипа (фиг.2A, 2B и 3B).
Несмотря на сравнительно более низкую эффективность mAb против CCR7 изотипа IgG в отношении CDC, кинетические исследования продемонстрировали, что его способность активировать комплемент может быть значительно увеличена посредством увеличения времени инкубации с источником комплемента (данные не показаны). Это может быть обусловлено более медленной активацией каскада комплемента посредством mAb с изотипом IgG2a.
CCR7 не относится исключительно к клеткам CLL или MCL, также экспрессируется некоторыми нормальными лимфоидными субпопуляциями, главным образом первичными B- и T-лимфоцитами, которые могли бы быть восприимчивы к цитотоксичности, опосредованной mAb против CCR7. Интересно, что CDC, опосредованная mAb против CCR7, была значительно выше (P=0,001 и P=0,016 для mAb класса IgM и IgG соответственно) в клетках CLL, чем в T-клетках тех же пациентов. Аналогично B- и T-лимфоциты здоровых доноров были устойчивы к активности комплемента при обработке в тех же экспериментальных условиях, что указаны выше, и даже с большими дозами обоих mAb против CCR7, как демонстрируют исследования дозовой зависимости (фиг.4A и 4B). Это было особенно верно в отношении T-клеток пациентов с CLL, которые практически не подвергались лизису (фиг.4A и 4B), вероятно, вследствие высокого и быстрого потребления комплемента клетками CLL, присутствующими в образце. С другой стороны, таких низких концентраций, как 1 мкг/мл, обоих mAb против CCR7 было достаточно, чтобы опосредовать CDC клеток CLL (фиг.4A и 4B).
Возможным объяснением является существование различной чувствительности к CDC-активности вследствие значительно более низкой экспрессии CCR7 в нормальных T- и B-лимфоцитах, чем в клетках CLL (фиг.1A). На самом деле уровни экспрессии CCR7 в клетках CLL значительно (r=0,602, P=0,025, n=11) коррелировали с чувствительностью к CDC в различных образцах (фиг.5), подтверждая важность плотности антигена при выборе мишени для иммунотерапии.
Более того, различия в CDC-активности не представлялись связанными с различной экспрессией регуляторных белков комплемента, таких как CD55 или CD59, поскольку их уровни экспрессии были очень схожи среди разных образцов CLL и среди клеток CLL и T-лимфоцитов различных пациентов (данные не показаны).
ADCC клеток CLL in vitro
Другим основным механизмом, опосредующим благоприятные эффекты терапевтических mAb, является опосредованная клетками цитотоксичность (ADCC). Поэтому авторы изобретения оценили способность NK-клеток вызывать лизис клеток CLL, предварительно обработанных mAb против CCR7 класса IgG. В 6 экспериментах, осуществленных с соотношениями E/T 5-40, не было обнаружено значительной ADCC в присутствии этого mAb против CCR7 (средний лизис = 13% ±1, n=6) при сравнении с нехарактерными иммуноглобулинами с тем же изотипом (средний лизис = 12% ±5, n=6) (фиг.6). Возможно, это связано с низкой аффинностью человеческих Fc-рецепторов к мышиным mAb. В противоположность этому, ритуксимаб, хорошо известное химерное mAb против CD20 изотипа IgG1, опосредовал ADCC в клетках CLL со средним лизисом = 34% ±2 (n=6) (фиг.6). ADCC в присутствии mAb против CCR7 класса IgM не оценивали, поскольку этот изотип неэффективен в опосредовании этого вида цитотоксичности.
Апоптоз и пролиферация при ответе на mAb против CCR7
1
Растущее количество доказательств указывает на то, что значительная часть благоприятных ответов на терапевтические mAb обусловлена влиянием на клеточный цикл или выживаемость клеток-мишеней. Влияние mAb против CCR7 на апоптоз клеток CLL исследовали посредством окрашивания клеточной ДНК 7-AAD и анализа пика суб-G. Степень апоптоза клеток CLL, обработанных в течение 24 часов растворимым mAb против CCR7 класса IgM, незначительно отличалась от апоптоза клеток CLL, обработанных IC (данные не показаны). Аналогично, сшивание CCR7 до 48 часов ввиду связывания с планшетом mAb против CCR7 не приводит к индукции апоптоза (данные не показаны).
3
3
Чтобы изучить пролиферацию клеток в ответ на mAb против CCR7, осуществляли классическое исследование поглощения [H]-тимидина PBMC от здоровых доноров, поскольку клетки CLL дают высокий спонтанный уровень апоптоза после 48-72 часов инкубации. Эти исследования выявили умеренное увеличение включения [H]-тимидина в клетки после инкубации с mAb против CCR7 с изотипом IgM, которое незначительно отличалось от такового, полученного с IC для IgM. В противоположность этому, ни mAb против CCR7 с изотипом IgG, ни его IC не вызывали пролиферацию (фиг.7). В качестве положительного контроля PBMC пролиферировали в ответ на инкубацию с mAb против CD3 плюс IL2.
Ингибирование миграции клеток CLL и MCL in vitro посредством mAb против CCR7
CCR7 играет важную роль не только в физиологического хоминге первичных лимфоцитов и зрелых дендритных клеток, но также и в метастатической миграции опухолевых (раковых) клеток, экспрессирующих его, и особенно клеток CLL и MCL. Нейтрализация функции этого хемокинового рецептора у пациентов с CLL и MCL могла бы представлять интерес, чтобы блокировать диссеминацию этих заболеваний в лимфоидную ткань. В этом отношении авторы изобретения оценили способность mAb против CCR7 нейтрализовать миграцию клеток CLL и MCL in vitro в ответ на CCL19 или CCL21. mAb против CCR7 с изотипом IgG было очень эффективно в блокировании миграции этих клеток к CCL19 или CCL21, тогда как mAb против CCR7 с изотипом IgM уменьшало ее незначительно (фиг.8A-B).
В этих исследованиях ни одно из двух участвовавших mAb не влияло на миграцию клеток CLL в ответ на CXCL12 (лиганд хемокинового рецептора CXCR4).
III. ОБСУЖДЕНИЕ
Данные, полученные авторами изобретения, показали, что уровни экспрессии хемокиновых рецепторов CCR7, CXCR4 и CXCR5 при B-клеточных лимфопролиферативных нарушениях очень гетерогенны в зависимости от гистологического субтипа и в значительной степени связаны с участием лимфатического узла (LN), поскольку эти молекулы опосредуют вхождение и местонахождение лимфоцитов во вторичной лимфоидной ткани. Экспрессия CCR7 особенно высока при CLL и лимфоме клеток мантийной зоны, объясняя высокую склонность этих заболеваний к захвату лимфатических узлов (LN). Аналогично, в недавних исследованиях сообщили об экспрессии CCR7 на злокачественных клетках при любом другом гематологическом злокачественном новообразовании, таком как болезнь Ходжкина, T-клеточная лейкемия/лимфома взрослых и фунгоидный микоз, или при негематологических солидных опухолях, таких как рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого, меланома, рак желудка, плоскоклеточная карцинома головы и шеи или карцинома толстой кишки. Интересно, что эта экспрессия коррелирует во всех случаях с характерной областью миграции и метастазирования в лимфоидную ткань.
Эти данные предполагают возможность применения CCR7 в качестве терапевтической мишени в иммунотерапии не только вследствие его высокой плотности в некоторых злокачественных клетках и их ограниченной экспрессии в нормальных тканях, но также и вследствие их ключевой роли в прогрессии заболевания и патогенности.
CDC принимают в качестве основного механизма действия неконъюгированного терапевтического mAb, если антиген-мишень экспрессируется в высокой степени, поскольку считается, что CDC требует до десяти раз больше плотности поверхностного антигена, чем ADCC. Поэтому исследователи проверили способность mAb против CCR7 фиксировать комплемент и опосредовать цитотоксичность против клеток CLL, клеток MCL и нормальных T-лимфоцитов пациентов с CLL. Их результаты показали значительный лизис клеток CLL и MCL вследствие фиксации комплемента с небольшим повреждением T-клеток даже при условиях насыщающих концентраций mAb против CCR7 и комплемента. Это могло являться следствием более низкой экспрессии CCR7 на нормальных T-клетках при сравнении с клетками CLL. При этом авторы обнаружили близкую корреляцию (p=0,025, r=0,602) между плотностью CCR7 на поверхности клеток CLL и процентом лизированных клеток при тех же экспериментальных условиях. Важно, что эти результаты предполагают, что лечение CLL или MCL при использовании mAb против CCR7, даже при низких концентрациях, может приводить к эффективному уничтожению опухолевых клеток без лизирования нормальных лимфоцитов, экспрессирующих данную молекулу (CCR7). Можно выдвинуть гипотезу о том, что вторичный иммунодефицит вследствие лечения mAb против CCR7 не был бы очень значительным, поскольку CCR7-негативные эффекторные лимфоциты оставались бы незатронутыми. Экстраполяция иммунологической недостаточности, которая характеризует CCR7-дефектных мышей, на пациентов с CLL или MCL, пролеченных mAb против CCR7, тем или иным образом затруднительна, поскольку у этих индивидуумов уже развилась иммунологическая память, что отсутствует у нокаута по CCR7.
В отличие от выводов в отношении CDC, изученное mAb против CCR7 с изотипом IgG не было активатором ADCC, вероятно, вследствие его происхождения от мыши. Тем не менее, общеизвестно, что молекулярные инженерные технологии делают возможным конструирование химерных или гуманизированных антител для улучшения клинических свойств, таких как способность mAb опосредовать клеточную цитотоксичность с помощью Fc-рецепторов моноцитов, нейтрофилов и NK-клеток. В любом случае значение ADCC в иммунотерапии CLL обсуждается в настоящее время по причине большого распространения злокачественных клеток и функциональных нарушений в T- и NK-клетках у таких пациентов. В этом отношении недавно было опубликовано несколько протоколов с тем, чтобы увеличить количество цитотоксических лимфоцитов и NK-клеток здоровых доноров или пациентов с CLL и активировать их, чтобы использовать этот механизм действия терапевтических mAb.
Блокирование функционирования антигена-мишени составляет еще один механизм действия терапевтических mAb. В этом изобретении блокирующие mAb против CCR7 могут иметь дополнительные преимущества ингибирования функции, вероятно, основной молекулы, вовлеченной в узловую диссеминацию лимфоидных опухолей и других экспрессирующих ее негематологических злокачественных новообразований. В этом отношении хорошо известно, что и ритуксимаб, и алемтузумаб очень неэффективны в сокращении лимфаденопатий у пациентов с CLL.
Эти результаты открывают новую терапевтическую возможность для тех патологий, в которых блокирующее mAb против CCR7 могло бы уменьшить миграцию к LN и, таким образом, блокировать диссеминацию опухоли в дополнение к уничтожению клеток в результате CDC или ADCC.