3α-ЭТИНИЛ,3β-ГИДРОКСИ,5α-ПРЕГНАН-20-ОКСИМ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РАССТРОЙСТВ ЦНС
3α-ETHYNYL, 3β-HYDROXY, 5α-PREGNAN-20-OXIME FOR USE IN TREATING CNS DISORDERS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Данное изобретение относится к новому стероидному соединению и его применению в терапии, например, при лечении печеночной энцефалопатии, синдрома Дауна, болезни Альцгеймера и когнитивного нарушения в целом, а также к фармацевтическим композициям, содержащим это соединение. Изобретение также относится к применению известного стероидного соединения для лечения печеночной энцефалопатии, синдрома Дауна и болезни Альцгеймера.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Несомненно, перечисление или обсуждение ранее опубликованного документа в этом описании не обязательно должны рассматриваться как подтверждение того, что документ является частью современного уровня техники или относится к известному уровню техники.
Метаболиты эндогенных стероидных гормонов, таких как прегнанолоны (в том числе, прегненолон, прогестерон, деоксикортикостерон, кортизон и кортизол), тестостерон, андростендион и дегидроэпиандростерон, были предметом различных исследований.
A
A
A
Известно, что многие примеры 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероидов действуют на рецепторный комплекс хлор-ионофор-гамма-аминомасляная кислота (ГАМК-R) и поэтому называются ГАМК-рецепторными модулирующими стероидами (GAMS). Механизмы взаимодействия на сайте рецептора еще не были полностью выяснены из-за структурной сложности комплекса ГАМК-R. Однако семейство рецепторов ГАМК содержит несколько субъединичных компонентов, некоторые из которых, как известно, связаны со специфическими функциями и нарушениями ЦНС.
3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероиды получают в больших количествах в течение нескольких дней/недель и могут непосредственно вызывать ингибирование функций ЦНС. Примеры расстройств и симптомов, вызванных прямым действием 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероидов, включают предменструальное дисфорическое расстройство, предменструальный синдром, деменцию, болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, седативный эффект, повышенную утомляемость, синдром хронической усталости, нарушение памяти, нарушение слуха, нарушение двигательной функции, переломы, неуклюжесть, повышенный аппетит и тягу к пище, ожирение, рецидив злоупотребления алкоголем или психоактивными веществами, отрицательное настроение в виде напряжения, раздражительность, депрессию, снижение слуха и зрения, усугубление детской абсансной эпилепсии и синдром выгорания.
A
Непрерывное и/или долгосрочное воздействие 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероидов вызывает толерантность к развитию в системе ГАМК-рецептора. Эта толерантность является первым шагом в процессе, который может, в конечном итоге, привести к чувствительности к стрессу, трудностям с концентрацией и потере контроля импульсивности и депрессии. Кроме того, было установлено, что действие 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероидов является фактором, который усиливает зависимость от лекарственных средств.
corpus luteum
С другой стороны, непрерывное, но более короткое воздействие приводит к эффекту отмены, когда воздействие прекращается. Этот симптом проявляется, например, во время менструации, когда получение 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероидов в  яичника прерывается. Этот симптом отмены также проявляется после родов, когда их получение плацентой прерывается или в конце периода стресса (надпочечники получают 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероиды во время стресса).
Примерами состояний, которые подвержены влиянию подобной отмены и/или воздержания, являются частичная эпилепсия, “катамениальная пневмония”, мигрень, изменения настроения и головная боль в “уикенд”.
A
A
A
ГАМК-рецептор является хлоридным каналом и оказывает свое действие, изменяя приток хлорида через канал. В данной области техники известно, что активность нейронов в головном мозге снижается при открытии ГАМК-рецептора и больших количествах ионов хлорида, проникающих в клетку. Также известно, что существует связь между количеством хлоридов и клиническим эффектом активного лекарственного средства, воздействующего на ГАМК-рецептор.
посредством
Бензодиазепины, барбитураты и, в какой-то мере, спирт, оказывают свое действие  этого механизма. Это, однако, также объясняет неблагоприятные эффекты этих лекарственных средств.
A
Проблема с ГАМК-рецептором заключается в том, что он действует в большинстве частей мозга. Ввиду этого полные блокаторы ГАМК опасны и могут вызывать психотические симптомы и судороги. При этом, когда действие 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-прегнан-стероидов должно быть антагонистическим, было бы желательным применение соединений, которые специфически антагонизируют эффектам 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-прегнан-стероида, но не антагонизируют собственному эффекту ГАМК.
Соответственно, настоящее изобретение направлено на решение проблемы обеспечения конкретных средств, которые способны блокировать ГАМК-рецепторы, поэтому эти соединения могут быть полезны при лечении аномалий при возбуждении рецепторов ГАМК или других нейротрансмиттеров, связанных с рецепторами ГАМК.
A
Международная патентная заявка WO 2008/063128 описывает 3-альфа-гидрокси стероиды и 3-бета-гидрокси стероиды. Международная патентная заявка WO 99/45931 описывает антагонистические эффекты стероида 3-бета-OH-5альфа-прегнан-20-она. Международная патентная заявка WO 03/059357 описывает 3-бета-гидрокси стероиды и его антагонистические эффекты по отношению к рецептору ГАМК.
A
Патенты США US 5232917, US 5925630, US 5939545, US 6143736 и US 6277838 описывают 3-альфа-гидрокси стероиды и 3-бета-гидрокси стероиды в качестве агонистических модуляторов ГАМК-рецептора с особым вниманием на 3-альфа-гидрокси стероиды и их подобный бензодиазепинам эффект. В заявке на патент США US 2004/0242549, описывают ряд стероидов.
et al
Acta Physiol. Scand
J. Neurosci.
169
22
Антагонистический эффект 3-бета-ОН-5-альфа-прегнан-20-она и других 3-бета-ОН-5-альфа/бета-прегнан-стероидов обсуждают в Wang  (., , 334 (2000) и , , 3366 (2002)).
A
Известные в данной области техники соединения, в том числе упомянутые выше, не являются специфическими по отношению к определенным подтипам ГАМК-R. Соответственно, существует потребность в соединениях, которые являются более селективными по отношению к подтипам рецептора.
Кроме того, известные в данной области техникии полученные из натуральных источников стероиды подвержены метаболизму, часто не подходят для перорального введения и, как правило, имеют низкую всасываемость. Это затрудняет введение таких соединений. Соответственно, также существует потребность в соединениях, которые менее легко метаболизируют/деградируют в организме и/или имеют улучшенную всасываемость/биодоступность.
ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
A
A
Было обнаружено, что соединение 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксим может действовать как антагонист по отношению к ГАМК-рецептору, и что это может осуществляться путем модулирования стероидного усиления ГАМК-R комплекса, например, путем модулирования сигнального эффекта GAMS как антагониста субъединицы альфа 5 ГАМК-рецептора.
В соответствии с изобретением предложено соединение 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксим или его фармацевтически приемлемая соль, которые далее упоминаются вместе как “соединения по изобретению”.
Фармацевтически приемлемые соли содержат соли присоединения кислоты и соли присоединения основания.
in vacuo
Такие соли присоединения кислоты и соли присоединения основания могут быть получены обычными способами, например, путем реакции соединения формулы I в форме свободной кислоты или свободного основания с одним или несколькими эквивалентами подходящей кислоты или основания, необязательно, в растворителе или в среде, в которой соль нерастворима, с последующим удалением указанного растворителя или указанной среды с применением стандартных технологий (например, , путем сушки вымораживанием или путем фильтрации). Соли также могут быть получены путем замены противоиона соединения по изобретению в форме соли другим противоионом, например, с применением подходящей ионообменной смолы.
o
Примеры солей присоединения кислот, которые могут быть упомянуты, включают карбоксилатные соли (например, формиатные, ацетатные, трифторацетатные, пропионатные, изобутиратные, гептаноатные, деканоатные, капратные, каприлатные, стеаратные, акрилатные, капроатные, пропиолатные, аскорбатные, цитратные, глюкуронатные, глутаматные, гликолатные, α-гидроксибутиратные, лактатные, тартратные, фенилацетатные, манделатные, фенилпропионатные, фенилбутиратные, бензоатные, хлорбензоатные, метилбензоатные, гидроксибензоатные, метоксибензоатные, динитробензоатные, -ацетоксибензоатные, салицилатные, никотинатные, изоникотинатные, циннаматные, оксалатные, малонатные, сукцинатные, субератные, себакатные, фумаратные, малатные, малеатные, гидроксималеатные, гиппуратные, фталатные или терефталатные соли), соли галогенидов (например, хлоридные, бромидные или иодидные соли), соли гидроалогенидов (например, гидрохлоридные, гидробромидные или гидроиодидные соли), сульфонатные соли (например, бензолсульфонатные, метил-, бром - или хлорбензолсульфонатные, ксилолсульфонатные, метансульфонатные, этансульфонатные, пропансульфонатные, гидроксиэтансульфонатные, 1- или 2- нафталинсульфонатные или 1,5-нафталиндисульфонатные соли) или сульфатные, пиросульфатные, бисульфатные, сульфитные, бисульфитные, фосфатные, моногидрофосфатные, дигидрофосфатные, метафосфатные, пирофосфатные или нитратные соли и тому подобные.
Примеры солей присоединения основания, которые могут быть упомянуты, включают соли, образованные с кислотами, такими как HCl, щелочными металлами (такими как соли Na и K), щелочноземельными металлами (такими как соли Mg и Ca), органическими основаниями (такими как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, трометамин и лизин) и неорганическими основаниями (такими как аммиак и гидроксид алюминия). Более конкретно, соли присоединения оснований, которые могут быть упомянуты, содержат соли Mg, Ca и, более предпочтительно, K и, наиболее предпочтительно, Na.
В соответствии с одним аспектом изобретения предлагают гидрохлоридную соль 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксима. В соответствии с еще одним аспектом изобретения предлагают натриевую соль 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксима.
Соединения по изобретению могут быть получены, например, таким образом, как описано ниже.
МЕДИЦИНСКОЕ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
Соединения по изобретению обозначены как фармацевтические препараты. Следовательно, согласно еще одному аспекту изобретения предлагают соединение, как определено выше, для применения в качестве фармацевтического средства и/или для применения в терапии, например, в медицине.
A
A
Как описано ниже, неожиданно было показано, что соединения по изобретению могут усиливать эффект ГАМК в ГАМК-рецепторах, содержащих композицию субъединиц α1,β2,γ2, в то же время не влияя непосредственно на поток хлорида при применении самой по себе на ГАМК-рецепторе, содержащем α1,β2,γ2.
А
В частности, было обнаружено, что соединения по изобретению могут усиливать эффект ГАМК на α1,β2,γ2-рецепторы, в то же время являясь антагонистом α5,β3,γ2-рецепторов. Как ни удивительно, одновременное лечение 3-альфа-гидрокси-прегнан-стероидами и соединениями по изобретению ингибирует поток хлорида через ГАМК-рецептор типа альфа 5 человека, когда рекомбинантно экспрессируются в клетках HEK (почки эмбриона человека, HEK), индуцированные 3-альфа-гидрокси-прегнан-стероидом, но мало влияют на хлоридный поток, индуцированный с помощью ГАМК самой по себе.
Кроме того, было обнаружено, что это действие может быть достигнуто в фармакологически и физиологически приемлемых концентрациях.
A
Соответственно, поскольку соединения по изобретению могут блокировать действие 3-альфа-гидрокси-прегнан-стероидов на ГАМК-рецептор человека, они являются потенциально полезными при лечении связанных со стероидами расстройств ЦНС, как правило, у людей.
“Связанные с стероидами расстройства ЦНС” содержат эпилепсию, эпилепсию, зависящую от менструального цикла, депрессию, депрессию, связанную со стрессом, мигрень, повышенную утомляемость и, в частности, обусловленную стрессом повышенную утомляемость, предменструальный синдром, предменструальное дисфорическое расстройство, связанные с менструальным циклом изменения настроения, когнитивное нарушение (в том числе, минимальное когнитивное нарушение), изменения памяти, связанные с менструальным циклом, изменения памяти, связанные со стрессом, затруднения в приобретении знаний, связанные со стрессом, печеночную энцефалопатию, синдром Дауна, болезнь Альцгеймера, связанные с менструальным циклом трудности с концентрацией, связанные с нарушением менструального цикла нарушения сна и повышенная утомляемость. Имеются также явные признаки того, что также ожирение и повышенный аппетит, так же как рецидивы в злоупотреблении алкоголем и/или психоактивными веществами, некоторые формы нарушений/расстройств психического равновесия, моментальных расстройств и трудности с координацией являются связанными со стероидами или индуцированными стероидами, а также “связанные со стероидами расстройства ЦНС”, таким образом, также включают в себя повышенный аппетит, переедание и ожирение, рецидив злоупотребления алкоголем и психоактивными веществами. Таким образом, настоящее изобретение предлагает соединения и способы лечения, смягчения или предотвращения этих состояний.
Расстройства, которые могут быть конкретно упомянуты, включают, синдром Дауна и болезнь Альцгеймера и, особенно, печеночную энцефалопатию.
Расстройства, связанные с печеночной энцефалопатией, могут проявляться и/или характеризоваться симптомами, в том числе, нарушением функций одного или нескольких циклов сна, познания, памяти, обучения, моторной координации и/или сознания, а также сниженными уровнями энергии, изменением личности, когнитивным нарушением, дезориентацией и/или комой и содержат печеночную энцефалопатию типа A, печеночную энцефалопатию типа B, печеночную энцефалопатию типа C, минимальную печеночную энцефалопатию и клинически выраженную печеночную энцефалопатию.
“Печеночная энцефалопатия типа А” обычно относится к печеночной энцефалопатии, связанной с острой печеночной недостаточностью, обычно связанной с отеком головного мозга.
“Печеночная энцефалопатия типа B” обычно относится к печеночной энцефалопатии (обходной), вызванной портосистемным анастомозом без сопутствующей собственной болезни печени.
“Печеночная энцефалопатия типа C” обычно относится к печеночной энцефалопатии, возникающей у пациентов с циррозом. Этот тип часто подразделяют на “эпизодическую”, “персистирующую” и “минимальную” печеночную энцефалопатию.
“Минимальная печеночная энцефалопатия” обычно относится к печеночной энцефалопатии, которая не приводит к клинически выраженной когнитивной дисфункции, но может быть продемонстрирована с помощью нейропсихологических исследований.
“Клинически выраженная печеночная энцефалопатия” обычно относится к клинически очевидной печеночной энцефалопатии, проявляющейся как нейропсихиатрический синдром с большим спектром психических и двигательных расстройств. Клинически выраженная печеночная энцефалопатия может возникать эпизодически, в течение нескольких часов или дней у пациентов, которые ранее были стабильными, или у пациентов могут возникать постоянные нейропсихиатрические аномалии.
В дополнение к вышесказанному, хотя в большинстве операций по пересадке печени применяют печень от здоровых умерших доноров, печень может также поступать от живого донора (часть печени здорового человека). Пациенты с, например, циррозом, обычно испытывают печеночную энцефалопатию и предоперационную печеночную энцефалопатию, что является значительным прогностическим фактором посттрансплантационных неврологических осложнений. Лечение печеночной энцефалопатии у пациентов, перенесших трансплантацию печени, включено в объем изобретения.
Термин “гипераммонемия” обычно относится к метаболическому нарушению, характеризуемому доступом аммиака в крови.
Термин “острая или хроническая печеночная недостаточность” обычно относится к острой декомпенсации цирроза, по меньшей мере одной органной недостаточности или относится к подгруппе с высокой кратковременной смертностью.
Термин “декомпенсированный цирроз” обычно включает запущенный цирроз печени с рядом клинических проявлений, таких как желтуха, асцит, отек, печеночная энцефалопатия, кровоизлияние в желудочно-кишечный тракт, портальная гипертензия, бактериальные инфекции или любая их комбинация. Его следует противопоставлять “компенсированному циррозу”, который обычно относится к циррозу печени без каких-либо клинических проявлений, но может включать асимптотический варикоз пищевода или желудка и такие ранние симптомы, как усталость и потеря энергии, потеря аппетита и потеря веса, тошнота или абдоминальная боль.
Термин “портальная гипертензия” обычно относится к градиенту венозного давления в печени после цирроза печени с или без связанного трансъюгулярного внутрипеченочного портотехнического шунта (ТВПШ).
Соединения по изобретению указаны и в терапевтическом, и/или в профилактическом лечении всех вышеупомянутых состояний.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения связанного со стероидами расстройства ЦНС, как указано выше, причем этот способ включает введение фармацевтически эффективного количества соединения по изобретению пациенту, нуждающемуся в таком лечении.
Кроме того, предлагается способ лечения и/или профилактики связанных со стероидами или индуцированных стероидами расстройств памяти и обучения, когнитивного нарушения, деменции и/или расстройств настроения, таких как описаны выше, путем введения нуждающемуся в этом пациенту соединения по изобретению.
A
A
Соединения по изобретению могут иметь то преимущество, что они могут предотвращать развитие толерантности и/или понижающую регуляцию ГАМК-рецептора. Соединения по изобретению могут иметь то преимущество, что они могут препятствовать эффектам отмены, после того, как стероид отменяют. Таким образом, соединения по изобретению могут иметь то преимущество, что они могут сохранять чувствительность ГАМК-системы и ингибировать развитие менее чувствительного состояния во время лютеиновой фазы, например, менструального цикла, таким образом предотвращая такие симптомы, как мигрень и/или эпилептические припадки.
Другим вариантом реализации настоящего изобретения является, соответственно, способ лечения или профилактики состояний или симптомов развития толерантности к стероидам и/или состояний или симптомов отмены стероида путем введения соединения по изобретению нуждающемуся в этом пациенту.
Примерами таких симптомов и/или состояний, которые могут быть упомянуты, являются седативный эффект, повышенная утомляемость, нарушение памяти, нарушение обучения, нарушение двигательной функции, неуклюжесть, например, симптомы при печеночной энцефалопатии, повышенный аппетит и пристрастие к пище, рецидив при злоупотреблении алкоголем и/или психоактивными веществами, отрицательное настроение в виде напряжения, раздражительность и депрессия, которые являются основными симптомами предменструального синдрома и усугубление детской абсансной эпилепсии.
Состояния и симптомы, вызванные развитием толерантности после более длительных временных интервалов (например, несколько дней) воздействия 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероидов, представляют собой, например, чувствительность к стрессу, трудности с концентрацией, трудность с концентрацией при стрессе или менструальном цикле, нарушения сна, повышенную утомляемость, потерю контроля импульсивности и депрессию, нарушение памяти и обучения. 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероиды также усиливают зависимость от лекарственных средств. В соответствии с настоящим изобретением, эти состояния или симптомы могут быть предотвращены, смягчены или вылечены путем введения нуждающемуся в этом пациенту соединения по изобретению.
post partum
post partum
Непрерывное, но более короткое воздействие 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероидов дает эффект отмены, когда воздействие прекращается. Этот симптом проявляется во время менструации, когда прерывается получение 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероидов в corpus luteum яичника. Этот симптом отмены также проявляется после родов (), когда выработка 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероидов в плаценте приостанавливается. Такой же симптом отмечают тогда, когда оканчивается период стресса и 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероиды, получаемые надпочечником во время стресса, прерываются. Примерами состояний, на которые влияет этот симптом отмены/воздержания, являются частичная эпилепсия, когда пациент имеет эпилептический очаг в коре головного мозга, где усугубление проявляется в период отмены во время менструации. Симптом называют “менструальной эпилепсией”. Другими примерами являются мигрень, связанная с менструацией, мигрень, связанная со стрессом, и изменения настроения . Симптом отмены является признаком ранее развитой толерантности.
Один из вариантов реализации изобретения, рассматривающий проблему, от которой страдают множество женщин, представляет собой способ лечения и/или профилактики побочных эффектов противовоспалительного стероида и постменопаузальной терапии у пациентов-людей. В соответствии с изобретением, эти состояния или симптомы могут быть предотвращены, смягчены или вылечены путем введения нуждающемуся в этом пациенту соединения по изобретению.
Другим вариантом реализации изобретения является лечение и/или профилактика побочных эффектов оральных контрацептивов у пациентов-людей. В соответствии с изобретением, эти состояния или симптомы могут быть предотвращены, смягчены или вылечены путем введения нуждающемуся в этом пациенту соединения по изобретению. В этом контексте соединения по изобретению могут вводить вместе с оральным контрацептивом, который может уже приниматься пациентом. Назальные и чрескожные введения также являются подходящими способами введения.
Другими словами, соединения по изобретению могут действовать для лечения состояний, связанных со стрессом и/или индуцированных стрессом, вызванных одним или несколькими из трех возможных механизмов, посредством которых стероиды действуют на центральную нервную систему, а именно:
(a) прямое действие,
(b) индукция толерантности и/или
(c) эффект отмены.
Кроме того, в рамках вышеуказанного варианта реализации, дозы соединений по изобретению во время стресса или менструального цикла могут быть доведены до уровней эндогенных стероидов.
“Пациенты” включают пациентов-млекопитающих (и, особенно, людей).
Термин “эффективное количество” относится к количеству соединения, которое оказывает терапевтический эффект на больного. Эффект может быть объективным (т. е. поддающимся измерению некоторым исследованием или маркером) или субъективным (т. е. субъект дает указание или чувствует эффект).
посредством
Cоединения по изобретению обычно вводят перорально, внутривенно, подкожно, буккально, ректально, дермально (например, подкожно), назально, трахеально, бронхиально, подъязычно, любым другим парентеральным путем или  ингаляции в фармацевтически приемлемой лекарственной форме.
Соединения по изобретению могут вводить в виде таблеток, капсул или эликсиров для перорального введения, суппозиториев для ректального введения, стерильных растворов или суспензий для парентерального введения, в том числе внутривенного или внутримышечного введения и тому подобного.
Состав композиций, содержащих соединения по изобретению, может быть адаптирован или доведен в соответствии с нормальными фармакологическими процедурами, в химической форме, подходящей для выбранного пути, вместе с подходящими адъювантами, носителями, разбавителями и наполнители, традиционно применяемые и хорошо известные специалисту в данной области техники. Таким образом, такие составы могут быть получены в соответствии со стандартной и/или принятой фармацевтической практикой.
В соответствии с еще одним аспектом изобретения предлагают, таким образом, фармацевтическую композицию, содержащую соединение по изобретению, как определено выше, в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.
В зависимости от, например, эффективности и физических характеристик соединения по изобретению (т.е., активного ингредиента), фармацевтические композиции, которые могут быть упомянуты, содержат те, в которых активный ингредиент присутствует по меньшей мере на 1% (или по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 30% или по меньшей мере на 50%). То есть отношение активного ингредиента к другим компонентам (т.е., добавлению адъюванта, разбавителя и носителя) фармацевтической композиции составляет по меньшей мере 1:99 (или по меньшей мере 10:90, по меньшей мере 30:70 или по меньшей мере 50:50) по массе.
Изобретение также дополнительно предлагает способ получения фармацевтического состава, таким образом, как определено выше, который включает приведение в ассоциацию соединения по изобретению, как определено выше, с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.
Соединения по изобретению также могут быть объединены с другими терапевтическими средствами, которые являются полезными при одном или более из:
(a) лечения связанного со стероидами расстройства ЦНС;
(b) лечения состояния или симптомов, вызванных развитием толерантности после воздействия 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероидов;
(c) лечения состояния, на которое влияет отмена/воздержание от воздействия 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероидов;
(d) лечения одного или нескольких побочных эффектов противовоспалительного стероида;
(e) лечения одного или нескольких побочных эффектов постменопаузальной терапии; и/или
(f) лечения одного или нескольких побочных эффектов орального контрацептива,
per se
или с оральным контрацептивом . Такие терапевтические средства или оральные контрацептивы далее упоминаются вместе как другое(ие) или другое(ие) “терапевтическое(ие) средство(а), как указано выше”.
Например, соединения по изобретению могут содержаться в составе или в режиме лечения вместе с оральным контрацептивом для облегчения и/или удаления:
(i) побочных эффектов оральных контрацептивов; и/или
(ii) любого нежелательного эффекта периодических изменений эндогенных стероидов.
Другие аспекты изобретения предлагают фармацевтические композиции и наборы частей, содержащих терапевтически приемлемые дозы других терапевтических средств, как определено выше, в комбинации с терапевтически приемлемой дозой соединения по изобретению.
Согласно еще одному аспекту изобретения предлагается комбинированный продукт, содержащий:
(A) соединение по изобретению, как определено выше; и
(B) по меньшей мере одно другое терапевтическое средство, как определено выше,
Причем каждый из компонентов (А) и (В) составляют в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.
Такие комбинированные продукты предлагают для введения соединения по изобретению в сочетании с другим терапевтическим средством и могут, таким образом, быть представлены либо в виде отдельных составов, где по меньшей мере один из этих составов содержит соединение по изобретению и по меньшей мере один содержит другое терапевтическое средство, либо могут быть представлены (т.е., составлены) в виде комбинированного препарата (т.е. представлены в качестве единого препарата, содержащего соединение по изобретению и другое терапевтическое средство).
Таким образом, дополнительно предлагают:
(1)
фармацевтический состав, содержащий соединение по изобретению, как определено выше, по меньшей мере одно другое терапевтическое средство, как определено выше, и фармацевтически приемлемый адъювант, разбавитель или носитель; и
(2) набор частей, содержащих компоненты:
(a) фармацевтический состав, содержащий соединение по изобретению, как определено выше, в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем; и
(b)
фармацевтический состав, содержащий по меньшей мере одно другое терапевтическое средство, как определено выше, в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем,
чьи компоненты (а) и (b) представлены в форме, пригодной для введения в сочетании с другим.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает способ получения комбинированного продукта, как определено выше, который включает приведение в ассоциацию соединения по изобретению, как определено выше, с по меньшей мере одним другим терапевтическим средством, как определено выше, и по крайней мере одним фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.
Под “приведением в ассоциацию” подразумевают, что эти два компонента оказываются пригодными для введения в сочетании друг с другом. Соединения по изобретению могут быть применены как часть ”дополнения к терапии” при лечении, содержащем по меньшей мере одно другое терапевтическое средство, как определено выше.
Таким образом, что касается способа подготовки набора частей, как определено выше, путем приведения двух компонентов “в ассоциацию” друг к другу, предусматривают, что два компонента набора частей могут быть:
(i) предложены в качестве разделенных составов (т.е. независимо друг от друга), которые впоследствии объединяют для применения в сочетании друг с другом в комбинированной терапии; или
(ii) упакованы и представлены вместе как разделенные компоненты “комбинированной упаковки” для применения в сочетании друг с другом в комбинированной терапии.
Соединения по изобретению могут быть введены в различных дозах. В случае, например, парентеральных (например, внутривенных) доз, подходящий интервал составляет от около 0,2 до около 200 мг на кг массы тела, такой как от около 20 до около 100 мг на кг массы тела. Дозы могут назначаться ежедневно непрерывно или в разделенных дозах один раз, два, три или четыре раза или более.
В любом случае врач или квалифицированный специалист смогут определить фактическую дозировку, которая будет наиболее подходящей для отдельного пациента, которая, вероятно, будет изменяться в зависимости от пути введения, типа и тяжести состояния, подлежащего лечению, а также вида, возраста, массы, пола, почечной функции, печеночной функции и ответа конкретного пациента, подлежащего лечению. Вышеуказанные дозы являются приведенными в качестве примера для среднего случая; конечно, могут быть индивидуальные случаи, когда заслуживают внимания более высокие или более низкие диапазоны дозировки, и таковые входят в объем настоящего изобретения.
A
Cоединения по изобретению имеют то преимущество, что они способны блокировать действие 3-альфа-гидрокси-прегнан-стероидов на ГАМК-рецептор человека.
Термин “блокирование” применяют в этом контексте для определения эффекта, при котором предотвращают воздействие 3-альфа-гидрокси-5-альфа/бета-стероидов на ГАМК-R-рецептор с помощью соединения по изобретению. “Блокирование” является, таким образом, отличным термином от того, что обычно означают “модуляцией” или “репрессией” или подобными терминами, которые предполагают, что фармакологическое действие все еще имеет место, но в меньшей степени или с меньшей скоростью. Таким образом, “антагонист” означает вещество, которое препятствует другому веществу, например, агонисту, индуцируя его эффект. В этой заявке термины “антагонист” и “блокатор” могут быть применены взаимозаменяемо.
A
Как обсуждалось выше, соединения по изобретению также имеют то преимущество, что они избирательно блокируют действие 3-альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидов на ГАМК-рецептор путем одновременного введения с только ограниченными эффектами на (в большинстве случаев частичные антагонисты по отношению к) эффект ГАМК.
В дополнение к преимуществам, упомянутым выше, соединения по изобретению могут дополнительно иметь преимущество, заключающееся в том, что они могут быть более эффективными, быть менее токсичными, иметь более продолжительное действие, быть более мощными, давать меньше побочных эффектов, быть более легко абсорбируемыми и/или иметь лучший фармакокинетический профиль (например, более высокую биодоступность, что получают, например, исходя из улучшенной растворимости в водных растворителях, и/или более низкий клиренс) и/или иметь другие полезные фармакологические, физические или химические свойства, нежели известные из уровня техники вещества, независимо от того, применяют ли их при указанных выше показаниях или иным образом.
Всякий раз, когда в данном документе применяют термин “около”, например, в контексте количеств (например, доз активных ингредиентов) или периодов времени, будет понятно, что такие переменные являются приблизительными и, как таковые, могут варьироваться на ± 10%, например, ± 5% и предпочтительно, ± 2% (например, ± 1%) от указанных в данном документе чисел.
Изобретение проиллюстрировано, но никоим образом не ограничено следующими примерами.
Пример 1
Синтез 3
-этинил,3
-гидрокси,5
-прегнан-20-оксима
αβα
Было обнаружено, что реакция этинил-реагента Гриньяра с 3, 20/17 дикетоновыми стероидами в большинстве случаев является селективной по отношению к положению 3, и нет необходимости в защите/снятии защиты в случае другой функциональной группы кетона. Образуются как альфа-, так и бета-изомеры, которые могут быть разделены с помощью хроматографических способов и перекристаллизованы.
Исходные материалы для синтеза 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксима являются соответствующими стероидами с заместителем 3-гидроксил и кетогруппой в положениях 20. Они могут быть преобразованы в соответствующие дионы путем окисления с помощью реагента IBX. Реакция протекает гладко и с полным превращением. В качестве исходного материала, когда это необходимо, могут быть применены другие подходящие стероиды. Реакции осуществляли в подходящих растворителях, таких как метанол, этанол, вода, ТГФ, диэтиловый эфир, дихлорметан или других растворителях, которые специалист в данной области может признать подходящим. Участвующие в реакции вещества выбирали для того, чтобы избежать, когда это возможно, применения таких участвующих в реакции веществ, как тяжелые металлы, которые являются токсичными даже в виде следов или их трудно полностью удалить в процессе обработки.
Реакции с применением реагентов или продуктов, чувствительных к воздуху или влаге, осуществляли в инертной атмосфере, такой как газ азот или аргон, в присутствии сухих растворителей. Диэтиловый эфир и тетрагидрофуран высушивали над Na в присутствии бензофенона. Для переноса реагентов и сухих растворителей применяли шприцы, продутые инертным газом. Оптимизированное время и температуру реакций определяли путем контроля образования продуктов и потери исходного материала с применением подходящей хроматографической технологии, такой как ТСХ или ГХ/МС.
Очистку осуществляли с применением таких хроматографических технологий, как флэш-хроматография на силикагеле или препаративная высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с применением аппарата ВЭЖХ. Специалисты в данной области могут признать, что могут быть применены альтернативные способы очистки, а лабораторные хроматографические технологии могут быть адаптированы к промышленному масштабу с применением хроматографических колонок для масштабированных препаратов. Идентификацию продуктов осуществляют с применением таких подходящих аналитических технологий, как 1H-ЯМР, 13C-ЯМР, масс-спектрометрия, ИК-спектроскопия, рентгеновская спектроскопия и любой другой анализ, который специалист в данной области может признать подходящим для структурной идентификации и определения чистоты 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксима. Специалисту в данной области будет понятно, что аналогичные реагенты, растворители, условия и параметры могут быть применены в реакциях в зависимости от субстрата. Данные ЯМР записывали с применением спектрометра Bruker 400 МГц.
3
-этинил,3
-гидрокси,5
-прегнан-20-он
αβα
3,20-5α-прегнандион (1,580 г, 5,0 ммоль) растворяли в 50 мл сухого ТГФ при комнатной температуре (к.т.) в атмосфере азота. Этинилмагнийбромид (1,1 экв.) добавляли по каплям при комнатной температуре при перемешивании и раствор оставляли перемешиваться в течение ночи при комнатной температуре в токе азота.
4
(водн.)
4
Затем желтоватый раствор гасили насыщенным NHCl и экстрагировали водную фазу с помощью дихлорметана (3 x 30 мл). Собранные органические фазы выпаривали при пониженном давлении, полученное желтое масло растворяли в дихлорметане, промывали раствором соли и высушивали над MgSO. Раствор уменьшали в вакууме и очищали остаток с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (1:4 диэтиловый эфир:дихлорметан). Обычные выходы составляли 72%. Возможные следы побочных продуктов могут быть устранены путем дальнейшей перекристаллизации из диэтилового эфира.
1
3
6
d
H ЯМР (400 МГц, CDCl-): δ 2,51 (т, 1H); 2,47 (с, 3H); 2,14 (м, 1H); 2,11 (с, 3H); 0,81 (с, 1H); 0,60 (с, 3H).
3
-этинил,3
-гидрокси,5
-прегнан-20-он
αβα
Это соединение получали в виде побочного продукта из описанной выше реакции и выделяли с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле. Обычный выход составлял 13%.
1
3
6
d
H ЯМР (400 МГц, CDCl-): δ 2,52 (т, 1H); 2,43 (с, 1H); 2,11 (с, 3H); 0,80 (с, 3H), 0,60 (с, 3H).
3
-этинил,3
-гидрокси,5
-прегнан-20-оксим
αβα
2
2
2
4
3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-он (10 ммоль) растворяли в дихлорметане 5 мл и этаноле 50 мл при комнатной температуре и в воздушной атмосфере в круглодонной колбе емкостью 250 мл. 4 экв. хлоргидрата NHOH и 4 экв. ацетата натрия растворяли в 5 мл HO, а затем добавляли к раствору стероида. Добавляли 20 мл этанола, а смесь помещали в колбу с обратным холодильником и кипятили в течение ночи. Затем смесь охлаждали и растворитель удаляли при пониженном давлении. Затем белый остаток обрабатывали с помощью 50 мл HO и 50 мл дихлорметана, водную фазу экстрагировали с помощью 3 х 30 мл дихлорметана. Собранные органические фазы затем высушивали над МgSO, отфильтровывали и удаляли растворитель при пониженном давлении. Конечный остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле с дихлорметан:диэтиловый эфир 4:1, обычные выходы 95-100%.
1
3
6
d
H ЯМР (400 МГц, CDCl-): δ 2,47 (с, 1H); 2,22 (т, 1H); 2,05 (м, 1H); 1,88 (с, 3H); 1,86 (м, 1H); 0,81 (с, 3H), 0,62 (с, 3H).
Пример 2
Эффекты 3
-этинил,3
-гидрокси,5
-прегнан-20-оксима на ГАМК
рецептор подтипа альфа 5 и альфа 1
A
αβα-
A
A
A
A
A
A
A
A
Применяли НEK-293 клетки, постоянно трансфицированные с помощью α1β2γ2 ГАМК человека, и α5β3γ2 ГАМК-рецептор, экспрессирующий функционал α1β2γ2L и α5β3γ2L ГАМК-рецепторов. На следующих этапах получали клеточные линии, постоянно экспрессирующие функционал ГАМК-рецептора человека. Субъединицы α1 (308-1727 NM_000806), β2 (214-1679 NM_000813) и γ2L (290-1785 NM_198904) ГАМК-рецептора, в том числе последовательности Козак, введенные непосредственно перед началом субклонирования кодонов в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие устойчивость к генетицину, гигромицину B и зеоцину, соответственно. Клеточную линию HEK-293, стабильно экспрессирующую три субъединицы ГАМК-рецептора, получали путем трансфекции субъединиц по одной за раз. Трансфекцию сопровождали селекцией с соответствующими антибиотиками, отделением клеток с применением специфических к субъединицам (β2 и γ2) антител и получением моноклональных колоний. Полученные клеточные линии анализировали с помощью иммуноцитохимии для трех субъединиц ГАМК-рецептора, с последующим выбором подходящей клеточной линии, показывающую в случае ГАМК-рецептора нормальной и хорошей реактивности в анализе фиксации потенциала (смотри ниже) в направлении ГАМК и тетрагидродеоксикортикостерона GAMS (THDOC).
Способы исследования эффектов 3
-этинил,3
-гидрокси,5
-прегнан-20-оксима на ГАМК
-рецептор
A
αβα
A
Эксперименты проводили для исследования влияния 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксима на функцию ГАМК-рецептора в отсутствии и в присутствии тетрагидродеоксикортикостерона GAMS (THDOC) с помощью системы Dynaflow™ на HEK-293 клетках. В этих исследованиях протокол был оптимизирован таким образом, что он был аналогичен физиологическим условиям синаптической щели.
A
A
2
4
2
Клеточная культура: HEK-293 клетки, постоянно трансфицированные с помощью подтипов α1β2γ2 ГАМК и α5β3γ2 ГАМК-рецептора человека, высевали при плотности 3 x 10/25 см в колбе для культивирования клеток. Трансфицированные клетки применяли для экспериментов с фиксацией потенциала через 3 дня после посева. При применении клеток для экспериментов с фиксацией потенциала клетки дважды промывали O-барботированным ВК раствором (смотри ниже). Затем добавляли около 5 мл ВК и выдерживали клетки в инкубаторе в течение около 15 минут. Через 15 минут клетки выходили из нижней части колбы и их отделяли путем осторожного отсасывания с помощью пипетки Пастера.
Система Dynaflow™: Систему Dynaflow™ с чипами для анализа применяли в случае всех экспериментов с фиксацией потенциала. Чипы для анализа выполнены из нелипких материалов. Ширина канала составляла 150 мкм, а высота 50 мкм. Объем лунки составлял 280 мкл. Время работы при скорости потока 26 мкл/мин. составляло 180 мин. Настройки насоса были следующими: Применяли 2 мл шприц Omnifix с внутренним диаметром 9,65 мм. Скорость потока шприцевого насоса чипа составляла 26 мкл/мин.
Стероиды и ГАМК: ГАМК растворяли в ВК растворе с помощью ультразвука в течение примерно 40 минут до концентрации 10 мМ при комнатной температуре. Все стероиды растворяли до концентрации 6 мМ в этаноле. Концентрация этанола составляла 0,1% во всех конечных растворах, в том числе промывочном растворе (ВК) и растворе только с ГАМК. Конечные растворы представляли собой растворы, которые добавляли в лунки чипа.
2
2
2
Электрофизиология: Пэтч-электроды тащили от 1,5 мм внешн.диам., 0,86 мм внутр.диам. из боросиликатного капиллярного стекла без нити. Типичные электроды при заполнении внутриклеточными растворами имели сопротивление 2–5 M. Внутриклеточный раствор состоял из (в мМ): 140 Cs-глюконата, 3,0 NaCl, 1,2 MgCl, 1,0 EGTA, 10 HEPES. pH доводили до 7,2 с помощью CsOH. Внеклеточный раствор (ВК), применяемый во время протоколирования, содержал (в мМ): 137 NaCl, 5,0 KCl, 1,0 CaCl, 1,2 MgCl, 10 HEPES, 10 глюкозы. pH доводили до 7,4 с помощью NaOH. После компенсации потенциал на границе раздела жидкостей во всех экспериментах применяли устойчивый исходный потенциал -17 мВ. В физиологических условиях HEK-293 имеет потенциал покоя при -40 мВ и низкую концентрацию ионов хлорида внутри клетки. Применяя исходный потенциал -17 мВ и внутриклеточный раствор с низкой концентрацией ионов хлора, ионы хлора поступают в клетку при активации рецепторов. Все эксперименты осуществляли при комнатной температуре (от 21 до 23°C). Для всех экспериментов применяли стандартный протокол.
Протокол
Применения ГАМК:
Применяя оборудование Dynaflow, возможно изучать трансфицированные HEK-293 при практически физиологических условиях. Система Dynaflow позволяет применять растворы в течение от 40 мс до нескольких минут. Физиологически, в синаптической щели, ГАМК высвобождается в диапазоне мМ около 2 мс, это справедливо для рецепторов альфа1. На дополнительных синаптических сайтах уровни ГАМК ниже, но остаются в течение более длительного времени, это справедливо для рецепторов альфа5. В экспериментах с α1β2γ2L применяли ГАМК ± стероид в течение 40 мс; в экспериментах с α5β3γ2L, ГАМК ± стероид применяли в течение 6 с. Было обнаружено, что почти во всех клетках первое применение ГАМК давало меньший ответ, чем второе применение ГАМК. В ответе между вторым и третьим применением ГАМК разницы не было. Поэтому первое применение ГАМК всегда повторяли дважды, а второй ответ применяли для анализа.
Вымывание:
ГАМК полностью растворима в воде и легко вымывается из рецептора. Время вымывания устанавливали равным 1 минуте после применения ГАМК самой по себе. Стероиды, с другой стороны, трудно растворяются в воде и также трудно вымываются из рецептора. В наших экспериментах применяли THDOC в качестве агониста ГАМК. При времени вымывания 2 минуты, 200 нМ THDOC полностью вымылись, что показало ни накопительный, ни десенсибилизирующий эффект.
Инкубация:
et al
Чтобы увидеть эффект стероидов и добиться стабильных результатов, было выяснено, что перед применением ГАМК стероиды необходимо инкубировать на рецепторе. Этот вывод подтверждался предположением о том, что сайт связывания THDOC расположен на рецепторе внутриклеточно (Hosie 2006). Исследовали различные времена инкубации, чтобы достичь оптимального времени для достижения стабильных результатов и свести к минимуму время вымывания. Время инкубации в 20 секунд показало, оптимальное время вымывания составляет 2 минуты.
Выводы, полученные из оптимизации:
Оптимизированный протокол выглядит следующим образом: 20 секунд инкубации стероидов, 40 мс или 6 с. ГАМК ± стероиды, 2 минуты вымывания. Первое применение ГАМК повторяли дважды с временем вымывания 1 мин. между первым и вторым применениями.
Результаты исследования 3
-этинил,3
-гидрокси,5
-прегнан-20-оксима на
1
2
2L и
5
3
2 ГАМК
-рецепторе
A
αβααβγαβγ
A
A
Результаты исследования фиксации потенциала 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксима на двух различных подтипах α1β2γ2L и α5β3γ2L ГАМК-рецептора давали неожиданный и удивительный результат.Как показано в Таблице 2, 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксим не имел в α1β2γ2Lрецепторе, никакого антагонистического эффекта по отношению к усиливающему эффекту THDOC, в эксперименте применяли GAMS. 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксимсам по себе не оказывал усиливающего или антагонистического эффекта на поток хлорида. 3α-этинил,3β-гидрокси,5α--прегнан-20-оксим имел небольшой агонистический эффект на просвет ГАМК α1β2γ2L ГАМК-рецептора. Этот агонистический эффект настолько мал, что он не имел значения и находился в диапазоне наполнителя.
Как ни странно, нарецепторе подтипа α5β3γ2L 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксимявляется антагонистом во всех исследуемых ситуациях с GAMS и ГАМК (Таблица 2). 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксим, таким образом, проявляют специфичность в зависимости от подтипа рецептора. Поэтому 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксимпроявляет избирательность в своем действии и поэтому подходит в качестве лекарства. Поскольку 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксим специфичен и неактивен на рецепторе α1β2γ2L, 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксим будет иметь меньше побочных эффектов из-за более общей природы рецептора альфа1. Ингибирование эффекта в качестве антагониста оказывает большее влияние, чем аналогичное положительное изменение в качестве агониста.
Таблица 2.
A
A
Исследования по текущему ответу, опосредованному потоком ионов хлорида через ГАМК-рецепторы, экспрессирующие субъединицу α1 и α5. В этом исследовании применяли технику фиксации потенциала в сочетании с прикладной системой Dynaflow™, которая обеспечивает быстрое применение и удаление веществ. “Соединение” соответствует 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксиму. “GAMS” соответствует “ГАМК-рецепторным модулирующими стероидам” в случае тетрагидродезоксикортикостерона (THDOC).
<b>Подтип рецептора ГАМК</b><sub><b>A</b></sub>
<b>Соединение</b><b>+ GAMS</b><b>+ ГАМК</b>
<b>Соединение само по себе</b>
<b>Соединение + GAMS</b>
<b>Соединение + ГАМК</b>
α1β2γ2L
Нет эффекта
Нет эффекта
н.д.
+11 ± 4
α5β3γ2
-15,2±2,8
Нет эффекта
-29,7 ± 6,5
-18,8 ± 2,2
1
2
2-ГАМК
-рецепторы
A
αβγ
A
A
A
A
1 мкМ 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксимаувеличивали опосредованный ГАМК текущий ответ на α1β2γ2L- ГАМК-рецепторах приблизительно на 10% (Таблица 2). 1 мкМ 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксимане активировали непосредственно ГАМК-рецептор, в отсутствие ГАМК. Результаты этого исследования показали, что 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксим не модулирует вызванные ГАМК токи отрицательно на α1β2γ2- ГАМК-рецепторах. Кроме того, наблюдаемое увеличение на 10% вызванных ГАМК токов на α1-субъединице должно рассматриваться как незначительный эффект. Таким образом, 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксим не оказывает никакого существенного влияния на вызванные ГАМК токи на α1β2γ2L- ГАМК-рецепторах.
5
3
2-ГАМК
-рецепторы
A
αβγ
A
Четкую зависимость антагонизирующего эффекта от концентрации обнаружили в случае 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксимапо отношению к вызванным 200 нM GAMS (THDOC) и 0,3 мкМ ГАМК токам (Таблица 3). 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксимтакже имел антагонизирующий эффект на вызванный 200 нM THDOC ток, т.е., прямую активацию ГАМК-рецептора с помощью GAMS. Этот антагонизм имел ту же величину, что и вызванный 200 нМ THDOC и 0,3 мкМ ГАМК ток.
Таблица 3.
0,1-3 мкМ 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксима (“Соединения”) в присутствии 200 нМ THDOC + 0,3 мкМ ГАМК. Относительный эффект для контроля 200 нМ THDOC + 0,3 мкМ ГАМК, установили на 0.
Соединение в доземкΜ
Средний относительный эффект (%)
Медиана
СПС
n
Мин.
Макс.
P-величина
0,1
- 3,0
- 1,6
2,0
10
- 19,6
2,8
0,093
0,3
- 6,6
- 6,9
3,2
10
- 22,8
6,0
0,114
1
- 15,2
- 11,0
2,8
11
- 30,0
- 2,5
0,003
3
- 20,7
- 23,6
2,3
9
- 30,0
- 10,4
0,008
Пример 3
Сравнительные эффекты 3
-этинил,3
-гидрокси,5
-прегнан-20-оксима и его эпимера на ГАМК
рецептор субтипа альфа 5
A
αβα-
A
Применяя процедуры, описанные в Примере 2 выше, 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксим и его эпимер, 3β-этинил,3α-гидрокси,5α-прегнан-20-оксим, исследовали на эффекты на ГАМК-рецептор подтипа альфа 5.
Единственной методологической разницей в применяемых процедурах по сравнению с Примером 2 было то, что стероиды растворяли в этаноле до концентрации 2 мМ в исходном растворе, с конечной концентрацией этанола 0,1% во всех растворах. Результаты сведены в таблицу в Таблице 4 ниже.
Таблица 4.
A
Эффекты исследуемых UC-стероидов 3α-этинил,3β-гидрокси,5α-прегнан-20-оксима (“Соединение”) и 3β-этенил,3α-гидрокси,5α-прегнан-20-оксима (“Препарат сравнения”) в концентрациях 1 мкM исследовали по сравнению с ГАМК-стероидом. THDOC измеряли как изменение потока хлорида через α5β3γ2L ГАМК-рецептор.
Стероид
Средний % (СПС)Соединение+ THDOC+ ГАМК
Средний % (СПС) Соединение+ THDOC
Средний % (СПС)Соединение + ГАМК
Средний % (СПС)Соединение само по себе
Соединение
- 15 (3)антагонист
- 30 (6)антагонист
- 19 (2)антагонист
нет эффекта
Препарат сравнения
+ 80 (8)агонист
+ 128 (22)агонист
+ 210 (23)агонист
+ 50 (12)агонист
Результаты показали, что соединение по изобретению действует как антагонист субъединицы альфа 5 ГАМК рецептора, тогда как эпимер действует как агонист.