ПОЛИМЕРНЫЙ АДЪЮВАНТ - АНТИГЕН-НОСИТЕЛЬ ДЛЯ ВАКЦИН
POLYMER ADJUVANT - ANTIGEN CARRIER FOR VACCINES

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к адъювантам, предназначенным для повышения эффективности вакцин и увеличения интервалов между вакцинациями.
Известен адъювант Фрейнда. Полный адъювант Фрейнда содержит BCG или липополисахариды, полученные из микобактерий туберкулеза, сложные жирные кислоты (дериваты ланолина), масла и эмульгаторы (Арлацел А или Твпн-80) (Kathy D. Antibodies. Methods: [book 1] [Text] / Kathy D. - M.: Mir, 1991. - 287 с. ). Адъювант Фрейнда, лишенный фракции микобактерий туберкулеза, называют неполным. Адъювант имеет вид эмульсий вода-в-масле (Е/Н), т.е. эмульсий, в которых непрерывная фаза представляет собой масло или смесь масел, а дисперсная фаза представляет собой водную фазу, которая может включать солюбилизирующие вспомогательные вещества, такие как, например, глицерин или диметилсульфоксид. Действующее начало обычно локализуется в водной фазе, которая часто является солевым забуференным раствором. Эта фаза находится в форме капель, отделенных между собой масляной пленкой. Этот состав позволяет получить более сильные и продолжительные во времени биологические ответы.
Недостатками является то, что он обладает токсичностью и аллергизирующим действием, использование адъюванта Фрейнда способствует индукции гиперчувствительности замедленного типа и развитию аутоиммунных процессов, вызывает и характеризуется комплексом воспалительных изменений с преобладанием пролиферативного компонента, локализующегося главным образом в суставах и периартикулярной ткани. Также эмульсии этого типа Е/Н обычно являются высоковязкими эмульсиями, и следовательно, создают трудности при введении их путем инъекции.
3
3
Известен адъювант гидрат окиси алюминия - Al(OH). Гидрат окиси алюминия представляет собой минеральный гель, содержащий 6-22 мг Al(OH) в 1 мл, с хорошими сорбционными свойствами и представляет собой наиболее часто используемый адъювант (Статья Rajesh K. Gupta и соавт. "Adjuvants, balance between toxicity and adjuvanticity", Vaccine, vol. 11, Issue 3, 1993, pages 993-306").
Недостатком является низкая эффективность, токсичность и риск образования гранулем в зонах введения. Кроме того, известно, что гидрат окиси алюминия эффективно индуцирует только гуморальный, но не клеточный иммунитет и относительно кратковременно образует антитела, титры которых понижаются через 3-4 недели после введения антигена.
Наиболее близкий к предлагаемому изобретению адъювант - антиген-носитель сополимеров 2-метил-5-винилпиридин и N-винилпирролидона (Патент РФ, №2446824). Это водорастворимый полимер с средневязкостной молекулярной массой М=30000÷55000 дальтон, нетоксичный, обладающий иммуностимулирующим действием. Его совместное введение с белком увеличивает выход антителообразующих клеток в 5-15 раз, предположительно активируя В-лимфоциты и Т-хелперы. Добавление к белковому антигену сополимера приводит к увеличению образования специфических антителообразующих клеток.
Недостатком вакцин с применением данного адъюванта - антиген-носителя является то, что они вводятся только перорально, имеют низкую гемосовместимость, возможно применение лишь в вакцинах против гриппа.
Технической задачей и результатом является создание адъюванта - антиген-носителя для вакцин, обладающего биологической совместимостью и гемосовместимостью, оптимальными физико-механическими свойствами, а также способностью быстро биорезорбироваться in vivo без образования токсичных продуктов и негативных реакций в процессе использования.
Технический результат достигается тем, что в качестве адъюванта - антиген-носителя - выбран полиазолидинаммоний, модифицированный гидрат-ионами галогенов, нанесенный на поверхность микрочастиц карбоната кальция с размером частицы от 1 до 5 мкм, модификация которого происходит под действием жесткого ультрафиолетового излучения с длиной волны 240-260 нм в кислой среде с pH не выше 3, разведенный в дистиллированной воде в следующем соотношении компонентов, мас. %:
Полиазолидинаммоний модифицированный
гидрат-ионами галогенов
0,001-0,15
Микрочастицы карбоната кальция с размером 1-5 мкм
3-5
Вода
остальное
Адъювант - антиген-носитель вносится в состав вакцины в концентрациях 2 мкг - 25 мг/мл и обеспечивает значительное улучшение гемосовместимости, иммунного ответа, может использоваться в вакцинах против рожи свиней, антирабических и других, также дает возможность перорального, внутримышечного и подкожного введения.
Пример 1. Определение острой токсичности адъюванта - антиген-носителя.
Для определения острой токсичности применяют максимальные дозы исследуемого препарата. Определение токсичности адъюванта - антиген-носителя проводились путем перорального введения исследуемого образца лабораторным мышам в следующем (максимальном) соотношении компонентов, мас. %:
Полиазолидинаммоний модифицированный
гидрат-ионами галогенов
0,15
Микрочастицы карбоната кальция с размером 1-5 мкм
5
Вода
остальное
Ежедневно фиксировалось общее состояние мышей. Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток, в первый день мыши находились под непрерывным наблюдением. Результаты определения острой токсичности адъюванта - антиген-носителя приведены в таблице 1.
Основные параметры острой токсичности вычислены методом Литчфилда и Уилкоксона.
Исходя из полученных данных адъювант - антиген-носитель - имеет следующие параметры:
LD50 = не выявлено.
LD0 = 25 мг/кг м.т. (максимальное содержание д.в. адъюванта - антиген-носителя)
Пример 2. Исследование гематологических показателей крови при пероральном, внутримышечном и подкожном способах введения адъюванта антиген-носителя.
Эксперимент проводился на крысах 6 месячного возраста, подобранных по принципу аналогов и содержащихся в клетках по 5 голов, получающих одинаковый рацион. Животным вводили адъювант - антиген-носитель - в максимально допустимой дозе - 25 мг/кг м.т., как в примере исследования острой токсичности. Кровь получали путем декапитации в пробирку со стабилизатором ЭДТА на следующий день после введения адъюванта - антиген-носителя. Определение гематологических показателей проводилось на автоматическом ветеринарном гематологическом анализаторе ВС - 2800 VET фирмы МИНДРЕИ. Общее состояние животных определяли путем осмотра. В таблице 2 представлены результаты эксперимента.
Полученный цифровой материал исследований подвергнут биометрической обработке по методике Е.К. Меркурьевой (1970).
Полученные показатели периферической крови свидетельствуют о том, что независимо от способа введения адъюванта - антиген-носителя, гематологические показатели соответствовали физиологической норме для данного вида животного. Данные согласуются с показателями крови крыс, полученные учеными И.Н. Кравченко, Хохловой О.Н., (2008), которые определяли гематологические показатели свободных от патогенной флоры крыс CD (spraguedawley) и мышей CD 1 в норме. Кроме того, на месте введения не развивается воспалительный или аллергический процесс.
В литературных источниках указано, что адъювант - антиген-носитель не мутагенен по результатам тестов AMES, не тератогенен (не вызывает пороков и уродств), NOEL=25 мг/кг.
Таким образом, полученные результаты по определению острой токсичности адъюванта - антиген-носителя - и гематологические показатели свидетельствуют о безопасности применения для организма животных, что позволяет его использовать в качестве адъюванта - антиген-носителя для вакцин с различными антигенными субстанциями.