ЯЧЕЙКА И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ КЛЕТОК И/ИЛИ ЧАСТИЦ В ЖИДКОСТИ И СПОСОБ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
COMPARTMENT AND DEVICE FOR PREPARING PREPARATIONS OF CELLS AND/OR PARTICLES IN LIQUID AND METHOD OF MICROSCOPIC ANALYSIS

Настоящее изобретение относится к приготовлению препаратов прикрепляющихся или неприкрепляющихся клеток и/или частиц, содержащихся в жидкости.
Ячейки для приготовления препаратов хорошо известны в области фармацевтической промышленности, относящейся к исследованию биологических клеток, которые содержатся в жидкости. Например, такие ячейки приготовления препаратов доступны под наименованием "Shandon EZ Single Cytofunnel" от компании Thermo Fisher Scientific Inc., 81 Wyman Street, Уолтэм, США. Такая ячейка содержит накопительную камеру, фильтрующую пластину и оптическое предметное стекло.
Соответствующая фильтрующая пластина изготовлена из высокопоглощающего материала и имеет отверстие в центре. Обычно фильтрующая пластина располагается смежно с предметным стеклом таким образом, что отверстие фильтрующей пластины образует область осаждения на предметном стекле. Таким образом, область осаждения окружена высокопоглощающим материалом фильтрующей пластины.
Исходно жидкость, содержащая клетки, содержится в накопительной камере, отделенной от предметного стекла. После размещения ячейки для приготовления препарата в специализированной центрифуге, например "Shandon Cytospin 4 Cytocentrifuge", и при вращении ячейки для приготовления препарата с определенной скоростью вращение наклоняет ячейку для приготовления препарата, таким образом выпуская жидкость, содержащую клетки, из накопительной камеры через отверстие в фильтрующей пластине в область осаждения на предметном стекле. Когда жидкость, содержащая клетки, достигает области осаждения, жидкость удаляется высокопоглощающим материалом фильтрующей пластины, оставляя клетки в области осаждения на предметном стекле. Затем стеклянная пластина может быть отделена от ячейки для приготовления препарата и передана для исследования клеток с помощью микроскопа.
Хотя вышеописанная центрифуга может одновременно обрабатывать 12 ячеек для приготовления препаратов, существует потребность в более эффективной ячейке для приготовления препарата и/или устройстве для приготовления препаратов.
Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в создании ячейки для приготовления препарата, устройства для приготовления препаратов и способа высокоэффективного, надежного и высококачественного приготовления препаратов клеток и/или частиц, содержащихся в жидкости.
Согласно изобретению данная задача решается ячейкой для приготовления препарата, устройством для приготовления препаратов и способом согласно соответствующим независимым пунктам формулы изобретения. Дополнительные варианты выполнения ячейки для приготовления препарата и устройства для приготовления препаратов согласно изобретению определены в зависимых пунктах.
В частности, согласно изобретению предложена ячейка для приготовления препаратов клеток и/или частиц, содержащихся в жидкости, содержащая накопительную камеру, выполненную с возможностью хранения жидкости, содержащей упомянутые клетки и/или частицы, и выпуска сохраняемой жидкости, содержащей упомянутые клетки и/или частицы, через выпускное отверстие при приложении заданной внешней силы, в частности центробежной силы. Смежно с выпускным отверстием накопительной камеры расположен канал, причем выпускное отверстие накопительной камеры ведет в упомянутый канал. Канал имеет сечение, большее, чем сечение выпускного отверстия. При переходе от выпускного отверстия в канал стенка образует край. Ячейка дополнительно содержит предметный участок для приема выпущенной жидкости, содержащей упомянутые клетки и/или частицы, и поглощающее средство, расположенное смежно с предметным участком между каналом и предметным участком. Поглощающее средство имеет отверстие, позволяющее жидкости, содержащей упомянутые клетки и/или частицы, проходить через отверстие на предметный участок. Кроме того, поглощающее средство удаляет жидкость из жидкости, содержащей упомянутые клетки и/или частицы, на предметном участке, таким образом, чтобы оставить упомянутые клетки и/или частицы на предметном участке для исследования. Ячейка для приготовления препарата согласно изобретению представляет собой небольшую и простую ячейку для эффективного по себестоимости, надежного и высококачественного приготовления препаратов клеток, в частности для неприкрепляющихся клеток или для других частиц, изначально содержащихся в жидкости.
Жидкость хранится в накопительной камере в подвешенном состоянии против силы тяжести, действующей на жидкость, без необходимости приложения какой-либо дополнительной внешней силы. Это достигается за счет сил сцепления и/или поверхностного натяжения, на которые может полезным образом повлиять надлежащая форма накопительной камеры или ее выпускного отверстия. Таким образом, жидкость может надежно удерживаться в накопительной камере таким образом, чтобы исключить неконтролируемый контакт жидкости с поглощающим средством до выпуска жидкости из накопительной камеры.
Кроме того, обеспечивается осторожная обработка клеток и/или частиц. Уменьшаются или полностью исключаются повреждения при приготовлении препарата, что приводит к меньшему уровню гибели клеток или деформации частиц. Кроме того, исключается контаминация клеток, что обеспечивает высокую воспроизводимость результатов при большом количестве препаратов. Это особенно полезно, если множество ячеек для приготовления препаратов обеспечено на планшете с множеством лунок, причем параллельно выполняется обработка различных жидкостей, содержащих клетки или частицы.
Кроме того, благодаря применению ячейки для приготовления препарата согласно изобретению клетки и частицы могут осаждаться в жидкости, удерживаемой в накопительной камере, в равномерных условиях. Такое осаждение остается практически неизменным при выпуске жидкости с клетками и частицами. Поэтому результирующее распределение клеток в области осаждения является в высокой степени равномерным. Равномерное распределение полезно, поскольку оно обеспечивает хорошие условия исследования, в частности для автоматического анализа изображения.
Например, ячейки согласно изобретению могут быть использованы для приготовления препаратов клеток и/или частиц в фармацевтической промышленности.
Удержание жидкости в накопительной камере с помощью сил сцепления и/или поверхностного натяжения усиливается за счет края, расположенного у выпускного отверстия накопительной камеры. Вследствие этого жидкость может надежно удерживаться в накопительной камере при любой ориентации накопительной камеры без применения дополнительных внешних сил.
Процесс центрифугирования особенно полезен для закрепления неприкрепляющихся клеток на предметном участке, поскольку можно обойтись без применения адгезивных химикатов. Адгезивные химикаты несут в себе риск, заключающийся в возможности изменения ими индукционного состояния клеток, например за счет взаимодействия с белками внеклеточной матрицы.
В первом варианте выполнения ячейки согласно изобретению стенка края при переходе между выпускным отверстием и каналом имеет угол, составляющий 90 градусов. Такой переход прост в производстве. Однако возможны также другие формы переходов, например зигзагообразной формы или в виде края, имеющего угол, отличный от 90 градусов.
Угол может иметь такие размеры, чтобы обеспечить хорошее соответствие свойств жидкости и свойств материала стенки, образующей угол. Например, для жидкости, обладающей высокой ползучестью, край может иметь форму пика, т.е. он может иметь угол, составляющий менее 90 градусов.
В другом варианте выполнения ячейки для приготовления препарата согласно изобретению накопительная камера содержит участок куполообразной или воронкообразной формы и участок цилиндрической формы, примыкающий к упомянутому участку куполообразной или воронкообразной формы. В другом варианте выполнения ячейки для приготовления препарата согласно изобретению накопительная камера выполнена с возможностью содержания заданного объема жидкости, содержащей упомянутые клетки и/или частицы, причем упомянутый заданный объем составляет от 1 мкл до 1000 мкл, в частности от 10 мкл до 100 мкл, и в особенности составляет 50 мкл. Это величина, которая обычно используется в фармацевтической промышленности, где необходимо обрабатывать малые объемы жидких препаратов.
В другом варианте выполнения ячейки для приготовления препарата согласно изобретению накопительная камера содержит вентиляционное отверстие, расположенное на том конце накопительной камеры, который противоположен выпускному отверстию. Это позволяет осторожно и равномерно выпускать сохраняемую жидкость из накопительной камеры при центрифугировании. Пространство, покидаемое выпускаемой жидкостью, наполняется газом, например воздухом, через вентиляционное отверстие. Таким образом можно предотвратить любые побочные воздействия на клетки или частицы, содержащиеся в жидкости, вследствие неравномерного или неосторожного выпуска жидкости.
Далее, для заполнения накопительной камеры жидкость, содержащая клетки и/или частицы, может быть с достижением преимущества распределена в накопительную камеру через упомянутое вентиляционное отверстие. В частности, это может быть сделано путем введения открытого конца пипетки, содержащей жидкость с клетками и/или частицами, в стенку, окружающую вентиляционное отверстие, и путем последующего приложения давления к жидкости, содержащейся в пипетке, таким образом, чтобы вызвать перемещение жидкости через вентиляционное отверстие по направлению к накопительной камере. Поскольку стенки накопительной камеры смачиваются жидкостью, жидкость, содержащая упомянутые клетки и/или частицы, засасывается в накопительную камеру. Ячейка для приготовления препарата может быть предварительно собрана, а именно путем сборки накопительной камеры с поглощающим средством и/или предметным участком, и затем накопительная камера может быть заполнена жидкостью с помощью дозирующего робота. Однако следует отметить, что хотя предпочтительным является заполнение накопительной камеры через вентиляционное отверстие, возможно заполнение накопительной камеры и с противоположного конца.
В другом варианте выполнения ячейки для приготовления препарата согласно изобретению предметный участок представляет собой предметное стекло для оптических исследований. В частности, предметное стекло для оптических исследований представляет собой прозрачное стекло, например предметное стекло, такое как предметное стекло для микроскопии, и может иметь покрытие или не иметь его.
В другом варианте выполнения ячейки для приготовления препарата согласно изобретению поглощающее средство содержит фильтрующую бумагу. Фильтрующая бумага обеспечивает высокую поглощающую способность и является сравнительно дешевой. Разумеется, могут быть использованы и другие поглощающие средства, кроме фильтрующей бумаги.
В другом варианте выполнения ячейки для приготовления препарата согласно изобретению участок поглощающего средства (40), окружающий отверстие (42), имеет такую заданную толщину, чтобы достигнуть заданной скорости поглощения для жидкости. Скорость поглощения является параметром, которым следует управлять, чтобы позволить клеткам и/или частицам осесть на предметном участке, а не быть унесенными жидкостью, которая перемещается к поглощающему средству и в него.
Поглощающее средство может иметь ступенчатую форму, так что оно содержит внутреннюю область, непосредственно граничащую с отверстием, где поглощающее средство сжато таким образом, чтобы управлять скоростью поглощения, и внешнюю область вокруг этой внутренней области, где поглощающее средство не сжато и имеет высокую поглощающую способность. Это обеспечивает возможность как управления скоростью поглощения, так и удаления большого объема жидкости и, кроме того, предотвращает перекрестную контаминацию в случае смежно размещенных ячеек.
Предпочтительно поверхность поглощающего средства вблизи отверстия является плоской, пологой, ровной или гладкой и исключает проникновение каких-либо волокон в отверстие или в область на предметном участке, где осаждаются клетки. Это обеспечивает высокую воспроизводимость процесса приготовления препарата.
Канал, в который выходит выпускное отверстие накопительной камеры, может иметь форму, образующую дополнительный край, который при сборке ячейки прижимает поглощающее средство к предметному участку для исключения зазоров между поглощающим средством и предметным участком. Это исключает выход клеток и/или частиц за пределы области осаждения на предметном участке и также предотвращает перекрестную контаминацию между смежно расположенными ячейками.
В другом варианте выполнения ячейки для приготовления препарата согласно изобретению участок стенки поглощающего средства, окружающий отверстие, является предварительно наклоненным в сторону предметного участка, так что при сборке ячейки этот предварительно наклоненный участок плотно прикрепляется к предметному участку. При такой конфигурации исключаются зазоры между предметным участком и поглощающим средством.
Далее, согласно изобретению предложено устройство для приготовления препаратов, содержащее множество отдельных ячеек для приготовления препаратов, описанных выше, причем отдельные ячейки изолированы друг от друга во избежание перекрестной контаминации. В таком устройстве может параллельно выполняться приготовление множества препаратов, что обеспечивает возможность автоматического приготовления препаратов, исследования и/или анализа клеток и/или частиц с высокой пропускной способностью.
Один вариант выполнения устройства для приготовления препаратов согласно изобретению содержит планшет с 96 лунками или 384 лунками, причем накопительные камеры множества отдельных ячеек образованы лунками планшета с 96 лунками или 384 лунками соответственно. Это обеспечивает преимущество, состоящее в том, что накопительные камеры отдельных ячеек объединены в компактном стандартном луночном планшете, имеющем стандартизированные расстояния между лунками и имеющем стандартизированную форму посадочных мест, так что они могут очень эффективно обрабатываться стандартным оборудованием для таких планшетов с множеством лунок. Например, возможно одновременное заполнение всех накопительных камер отдельных лунок такого планшета.
В другом варианте выполнения устройство для приготовления препаратов согласно изобретению содержит предметную пластину, образующую предметные участки отдельных ячеек. Таким образом, предметные участки отдельных ячеек могут обрабатываться совместно для обеспечения эффективного исследования посредством автоматического анализа изображения.
В другом варианте выполнения устройство для приготовления препаратов согласно изобретению содержит первую и вторую поглощающие пластины, образующие поглощающие средства отдельных ячеек, причем первая поглощающая пластина расположена непосредственно смежно с предметной пластиной и соприкасается с ней, и при этом вторая поглощающая пластина расположена смежно с первой поглощающей пластиной и соприкасается с ней на стороне, удаленной от предметной пластины. Вторая поглощающая пластина обладает поглощающей способностью, дополняющей поглощающую способность первой поглощающей пластины (например, поглощающая способность второй поглощающей пластины может быть выше, чем поглощающая способность первой поглощающей пластины). Это обеспечивает преимущество, состоящее в том, что может быть увеличен общий объем жидкости, подлежащей поглощению, и что улучшается изоляция друг от друга отдельных ячеек для приготовления препаратов, что снижает риск перекрестной контаминации.
В другом варианте выполнения устройство для приготовления препаратов согласно изобретению содержит пружинную пластину для приложения отдельных сжимающих усилий к отдельным ячейкам таким образом, чтобы обеспечить плотное прикрепление соответствующего поглощающего средства к соответствующему предметному участку. Сжимающее усилие плотно прижимает поглощающее средство к предметному участку для исключения зазоров (см. выше). Также сжатие компенсирует индивидуальные отличия в толщине первой поглощающей пластины.
В другом варианте выполнения устройства для приготовления препаратов согласно изобретению пружинная пластина содержит множество пружин спиралевидной формы, соответствующее числу отдельных ячеек. Каждая пружина спиралевидной формы действует на отдельную ячейку. Это приводит к тому, что к каждой отдельной ячейке для приготовления препарата прилагается отдельное сжимающее усилие, которое прижимает отдельную часть к отдельной накопительной камере, между которыми расположено соответствующее поглощающее средство. Пружины спиралевидной формы могут иметь, например, коническую форму.
Кроме того, изобретение включает в себя способ приготовления препарата клеток (в частности, но не исключительно неприкрепляющихся клеток), содержащихся в жидкости, содержащий этапы, на которых: распределяют жидкость, содержащую клетки, в накопительную камеру; удерживают жидкость, содержащую упомянутые клетки, в накопительной камере против действующей на нее силы тяжести только за счет сил сцепления и/или поверхностного натяжения; прилагают дополнительную заданную внешнюю силу, в частности центробежную силу, к жидкости, содержащей упомянутые клетки, чтобы выпустить жидкость из накопительной камеры на предметный участок; удаляют жидкость с предметного участка, оставляя упомянутые клетки на предметном участке для исследования.
За счет приложения заданной дополнительной внешней силы, в частности центробежной силы, клетки закрепляются на поверхности предметного участка. Кроме того, за счет упомянутой силы клетки расплющиваются, так что внутриклеточные структуры гораздо чаще оказываются лежащими, примыкая боками друг к другу, чем друг на друге. Это повышает качество микроскопического анализа клеточной структуры, поскольку микроскопическое изображение представляет собой по существу двумерную проекцию трехмерных клеточных структур. Это может быть особенно верно в случае определения генотоксических эффектов, которые может оказывать вещество, воздействию которого подверглись клетки, на структуры или компоненты клетки, такие как эндосомы, митохондрии, ядра или микроядра.
При том, что после осаждения клеток на предметном участке клетки могут быть высушены и затем подвергнуты микроскопическому анализу, один вариант способа приготовления препарата согласно изобретению дополнительно содержит этап, на котором наносят на предметный участок, на котором осажены упомянутые клетки, покрытие, содержащее гидрогель. Гидрогель содержит по меньшей мере один окрашивающий агент, который способен связываться с определенным компонентом клеток. Окрашивающий агент, связанный с определенным компонентом клеток, является флуоресцентным при возбуждении светом с заданной длиной волны, и при этом не является флуоресцентным, пока он не связан с таким определенным компонентом клеток.
В качестве примера, гидрогель может представлять собой агарозный гидрогель, который удерживает клетки осажденными на предметном участке во влажном состоянии. Гидрогель может быть полезен в отношении сохранения морфологии клеток, осажденных на предметном участке (например, на предметном стекле для микроскопии) или на вышеупомянутой предметной пластине. Гидрогель, такой как вышеупомянутый агарозный гидрогель, при комнатной температуре находится в состоянии, подобном желатину, то есть он является по существу твердым. Он защищает клетки от высыхания, а также от загрязнения. Однако малые молекулы, такие как молекулы окрашивающего агента, способны по существу свободно перемещаться в гидрогеле и распространяться через гидрогель и в клетки, где они связываются с определенными компонентами клеток, такими как, например, ядра, микроядра, другие определенные компоненты клетки, или с оболочкой клетки.
Данный вариант выполнения является полезным, поскольку, в отличие от нанесения окрашивающего агента на клетки, осажденные на предметном участке, смыва избытка окрашивающего агента, который не распространился в клетки, с предметного участка перед помещением предметного участка с окрашенными клетками под микроскоп для микроскопического анализа, можно полностью исключить этап смыва, поскольку окрашивающий агент уже содержится в гидрогеле и распространяется в клетки без необходимости смыва какого-либо избытка окрашивающего агента.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к способу микроскопического анализа клеток, содержащему этапы, на которых
- готовят препарат клеток с применением вышеупомянутого способа согласно изобретению,
- облучают клетки светом с заданной длиной волны,
- помещают препарированные клетки под микроскоп и
- анализируют микроскопическое изображение.
Только окрашивающие агенты, которые распространились в клетку и которые связались с определенными компонентами клетки, проявляют флуоресцирующее свойство после того, как их осветили светом с заданной длиной волны. Например, окрашивающий агент может быть выполнен с возможностью связывания с ядрами и потенциальными микроядрами клеток. Таким образом может быть выявлено формирование микроядер, которое может указывать на то, что определенное вещество, воздействию которого клетки подверглись перед микроскопическим анализом, может быть генотоксичным.
В случае, если был обеспечен дополнительный окрашивающий агент и он распространился в клетки и связался с оболочками клеток, и после того, как клетки были облучены светом с еще одной заданной длиной волны, он также проявляет флуоресцирующее свойство, так что ясно видны как оболочки клеток, так и какие-либо определенные внутриклеточные структуры, таким образом дополнительно улучшается контрастность микроскопического изображения.
Далее изобретение будет описано более подробно с помощью примерных вариантов выполнения и со ссылкой на сопровождающие чертежи. На чертежах показано:
Фиг.1 - вид в разрезе варианта выполнения отдельной ячейки для приготовления препарата согласно изобретению;
Фиг.2 - вид в перспективе в разобранном виде варианта выполнения устройства для приготовления препаратов согласно изобретению;
Фиг.3 - вид сбоку устройства для приготовления препаратов по Фиг.2;
Фиг. 4 - вид в разрезе по линии IV-IV по Фиг.3;
Фиг.5 - увеличенный вид узла V по Фиг.4;
Фиг.6 - увеличенный вид узла VI по Фиг.4;
Фиг.7 - увеличенный вид узла VII по Фиг.2;
Фиг.8 - вид сбоку устройства для приготовления препаратов по Фиг.2 в собранном виде;
Фиг.9 - вид в разрезе по линии IX-IX по Фиг.8;
Фиг.10 - увеличенный вид узла X по Фиг.9;
Фиг.11 - вид в перспективе устройства для приготовления препаратов по Фиг.2 в собранном состоянии,
Фиг.12 - часть предметной пластины устройства по Фиг.2 с осажденными на ней клетками, покрытыми гидрогелем, содержащим окрашивающие агенты,
Фиг.13 - примеры изображений неприкрепляющихся клеток, препарированных с помощью устройства и способа согласно изобретению, и
Фиг.14 - примеры результатов анализа микроядерного теста, выполненного с применением устройства и способа согласно изобретению.
На Фиг.1 показан вид в разрезе варианта выполнения отдельной ячейки 10 для приготовления препарата, предназначенной для приготовления препарата клеток и/или частиц, содержащихся в жидкости, согласно изобретению.
Ячейка 10 для приготовления препарата содержит накопительную камеру 2 0 для хранения суспензии клеток. Накопительная камера 20 содержит участок 25 куполообразной или воронкообразной формы и участок 26 цилиндрической формы, примыкающий к участку 25 куполообразной формы. Накопительная камера 20 может быть выполнена с возможностью содержания заданного объема суспензии клеток, который составляет в общем от 1 мкл до 1000 мкл, в частности от 10 мкл до 100 мкл, и в особенности составляет 50 мкл. На конце, удаленном от участка 25 куполообразной формы, накопительная камера 20 содержит выпускное отверстие 22. Накопительная камера 20 дополнительно содержит вентиляционное отверстие 24, которое выходит в участок 25 куполообразной формы.
Имеющий цилиндрическую форму канал 30 расположен смежно с выпускным отверстием 22 накопительной камеры 20. Канал 30 имеет сечение, большее, чем сечение выпускного отверстия 22. В честности, канал 30 соосно совмещен с выпускным отверстием 22 накопительной камеры 20. При переходе из выпускного отверстия 22 в канал 30 стенка образует край 32. В данном варианте выполнения край 32 имеет угол α в 90 градусов.
Поглощающее средство 40, выполненное в виде фильтрующей бумаги 40, расположено смежно с каналом 30, на стороне, удаленной от выпускного отверстия 22 накопительной камеры 20. Фильтрующая бумага 40 может представлять собой чертежную бумагу или бумагу для хроматографии, в частности бумагу Grade 17 Chr, реализуемую компанией Whatman Ltd, Брентфорд, Лондон, Великобритания. Фильтрующая бумага 40 имеет отверстие 42. Отверстие 42 соосно совмещено с каналом 30, имеющим цилиндрическую форму.
Предметный участок 50, выполненный в виде предметного стекла 50, расположен смежно с фильтрующей бумагой 40 таким образом, что фильтрующая бумага 40 размещена между каналом 30 и предметным стеклом 50. Кроме того, канал ячеек 10 для приготовления препарата имеет такую форму, что образует дополнительный край 34, который расположен смежно с фильтрующей бумагой 40. Край 34 прижимает фильтрующую бумагу 40 к предметному стеклу 50 для исключения зазоров между фильтрующей бумагой 40 и предметным стеклом 50.
Участки 25 и 26 образуют внутреннее пустое пространство накопительной камеры 20 для хранения суспензии клеток, которая содержит жидкость и клетки, содержащиеся в жидкости, пока не прилагаются какие-либо внешние силы, кроме силы тяжести. В этом отношении край 32 в сочетании с силами сцепления и/или поверхностного натяжения помогает удерживать суспензию клеток в накопительной камере 20 против силы тяжести. Однако при применении заданной центробежной силы суспензия клеток выпускается из накопительной камеры через выпускное отверстие 22. Затем в накопительную камеру 20 через вентиляционное отверстие 24 может поступать воздух, таким образом заполняя пустое пространство, которое остается после выпущенной суспензии клеток. Вентиляционное отверстие 24 также может быть использовано для заполнения накопительной камеры 20 суспензией клеток путем прижатия концов пипетки к стенке вокруг вентиляционного отверстия 24, приложения заданного давления к суспензии клеток в пипетке (например, путем сжатия пипетки), так что клеточная суспензия выводится через вентиляционное отверстие 24 в расширяющийся имеющий куполообразную форму участок и затем в цилиндрический участок 26 накопительной камеры 20.
Канал 30 и отверстие 42 позволяют суспензии клеток, которая выпущена из накопительной камеры 20, перемещаться из накопительной камеры 20 на предметное стекло 50. Предметное стекло 50 служит для приема выпущенной суспензии клеток через отверстие 42. Отверстие 42 в фильтрующей бумаге 40 выполнено с возможностью контакта с принимаемой суспензией клеток, чтобы удалить жидкость из суспензии клеток и оставить клетки осажденными на предметном стекле 50. Скоростью поглощения жидкости можно управлять посредством высоты участка фильтрующей бумаги 40, который окружает отверстие 42. Как только жидкость поглощена и клетки осаждены на предметном стекле 50, предметное стекло 50 может быть перенесено в устройство формирования изображения, например в микроскоп или планшет-ридер.
На Фиг.2 показан вид в перспективе в разобранном виде варианта выполнения устройства для приготовления препаратов согласно изобретению. Это устройство для приготовления препаратов содержит стопку различных пластин и листов, а именно в следующем порядке снизу вверх: опорную плиту 7 00, пружинную пластину 600, промежуточную пластину 602, предметную пластину 500 (например, стеклянную пластину), первую поглощающую пластину 400 (например, первую фильтрующую пластину), вторую поглощающую пластину 402 (например, вторую фильтрующую пластину), луночный планшет 200 (например, планшет с воронками) и покровную пластину 702.
Устройство для приготовления препаратов содержит 96 отдельных ячеек 10 (см. Фиг.1). Луночный планшет 200 содержит накопительные камеры 20 и каналы 30, первая поглощающая пластина 400 содержит поглощающее средство 40, и предметная пластина 500 содержит предметные участки 50.
Промежуточная пластина 602 служит для компенсации различных давящих сил, прилагаемых отдельными пружинами пружинной пластины 600 отдельных ячеек 10 для приготовления препарата. Кроме того, промежуточная пластина 602 исключает возникновение царапин на предметной пластине 500 от пружин 604 пружинной пластины 600 (см. также узел VII на Фиг.7).
Опорная плита 700 содержит множество стержней 706, которые помогают правильно совместить пластины при сборке. Эти стержни 706 взаимодействуют с соответствующими отверстиями в пружинной пластине 600 и в луночном планшете 200. Кроме того, показан зажим 704, который приспособлен для удержания собранной и сжатой стопки вместе в виде компактного устройства для приготовления препаратов. Для этих целей зажим 704 имеет U-образную форму, причем два изогнутых края выполнены с возможностью взаимодействия с пазами, которые имеются на боковых стенках опорной плиты 700 и покровной пластины 702.
На Фиг.3 показан вид сбоку устройства для приготовления препаратов по Фигуре 2, а на Фиг.4 показан вид в разрезе по линии IV-IV по Фиг.3 со ссылкой на те же ссылочные позиции. Узел V, показывающий часть луночного планшета 200, показан в увеличенном виде на Фиг.5, а узел VI, показывающий часть первой поглощающей пластины 400, показан в увеличенном виде на Фиг.6. Эти части более подробно описаны ниже.
На Фиг.5 показан увеличенный вид узла V луночного планшета 200 по Фиг.3. Узел V показывает участок, содержащий два из 96 отдельных ячеек для приготовления препарата луночного планшета 200. Каждый участок с отдельными ячейками содержит накопительную камеру 20 и канал 30 для отдельного хранения и выпуска отдельных суспензий клеток.
На Фиг.6 показан увеличенный вид узла VI первой поглощающей пластины 400 по Фиг.3. Этот узел показывает одну целую ячейку из 96 отдельных ячеек поглощающей пластины 4 00, содержащий отверстие 42, окруженное поглощающей пластиной 400. Поглощающая пластина 400 имеет ступенчатую форму в сечении в области, окружающей отверстие 42 с внутренней областью 44, окружающей отверстие 42 и имеющей меньшую толщину, и с внешней областью 45, окружающей внутреннюю область 44 и имеющей большую толщину, чем толщина внутренней области 44. Меньшая толщина внутренней области 44 может быть получена путем сжатия поглощающей пластины 400. Путем такого сжатия может регулироваться скорость поглощения жидкости до желаемого значения скорости. Внешняя область 45 остается несжатой для обеспечения высокой поглощающей способности для удаляемой жидкости.
На Фиг.7 показан увеличенный подробный вид пружинной пластины 600 по Фиг.2 с двумя пружинами 604 спиралевидной формы. Пружины 604 спиралевидной формы расположены между пружинной пластиной 600 и промежуточной пластиной 602. Каждая пружина 604 спиралевидной формы воздействует на отдельную ячейку 10 (см. Фиг.1). Таким образом, каждая пружина 604 прилагает отдельную давящую силу к соответствующей области на промежуточной пластине 602, которая, в свою очередь, прилагает давящую силу в соответствующей области предметной пластины 500, которая прижимается к луночному планшету 2 00, содержащему отдельные накопительные камеры 20.
Пружины 604 спиралевидной формы могут иметь коническую форму, причем виток пружины, имеющий больший диаметр, расположен смежно с пружинной пластиной 600 и диаметры витков уменьшаются в направлении промежуточной пластины 602.
На Фиг.8 показан вид сбоку устройства для приготовления препаратов по Фиг.2 в собранном виде, и на Фиг.9 показан вид в разрезе по линии IX-IX по Фиг.8. Два зажима 704 (показан только один) удерживают собранную и сжатую стопку пластин и листов вместе в виде компактного устройства для приготовления препаратов. Это обеспечивается с помощью двух изогнутых краев каждого зажима 704, которые взаимодействуют с пазами на боковых стенках опорной пластины 700 и покровной пластины 702. Узел X устройства для приготовления препаратов показан на Фиг.10 и дополнительно более подробно описан ниже.
На Фиг.10 показан увеличенный вид узла X устройства для приготовления препаратов по Фиг.9, и в частности на этом узле показаны две полностью собранных ячейки 10 для приготовления препарата. Вторая поглощающая пластина 402 расположена смежно с первой поглощающей пластиной 400 и соприкасается с ней со стороны, удаленной от предметной пластины 500. Вторая поглощающая пластина 402 имеет более высокую поглощающую способность, чем поглощающая способность первой поглощающей пластины 400. Это увеличивает общий объем жидкости, который может быть поглощен поглощающими пластинами, и помогает улучшить изоляцию друг от друга отдельных ячеек для приготовления препарата, таким образом снижая риск перекрестной контаминации.
На Фиг.11 показан вид в перспективе устройства для приготовления препаратов по Фиг.2 в собранном виде, причем стопка включает в себя опорную пластину 700 и покровную пластину 702, сжатые вместе двумя зажимами 704 (причем показан только один зажим). В собранном виде устройство для приготовления препаратов является очень компактным и надежным и может быть с легкостью помещено в центрифугу. В данном варианте выполнения устройство для приготовления препаратов имеет стандартную форму посадочных мест. Таким образом, его без каких-либо изменений можно поместить в обычную центрифугу, например "Shandon Cytospin 4 Cytocentrifuge".
Устройство для приготовления препаратов по Фигурам 2-11 содержит множество отдельных ячеек 10, изолированных друг от друга во избежание перекрестной контаминации, и таким образом подходит для параллельного приготовления множества препаратов. Луночный планшет 200 обеспечивает накопительные камеры 20 и каналы 30 отдельных ячеек 10 компактным образом и на стандартизированных расстояниях между лунками и с обеспечением стандартной формы посадочных мест. Предметная пластина 500 обеспечивает предметные участки 50 отдельных ячеек 10 таким образом, что предметные участки 50 могут обрабатываться вместе для обеспечения эффективного исследования посредством автоматизированного анализа изображения. Первая поглощающая пластина 400 служит в качестве первого средства удаления жидкости с предметной пластины 500, однако с управляемой скоростью поглощения, чтобы исключить возможность того, что клетки могут быть унесены вместе с жидкостью при поглощении. Вторая поглощающая пластина 402 служит для того, чтобы помочь первой поглощающей пластине 400 в удалении жидкости, и для улучшения изоляции друг от друга отдельных ячеек для приготовления препаратов.
Промежуточная пластина 602 служит для равномерного распределения отдельных сжимающих сил, прилагаемых пружинами 604 пружинной пластины 600, и предотвращает возникновение царапин на предметной пластине 500 от пружин 604. Пружинная пластина 600 служит для приложения сжимающей силы к стопке пластин и листов, которая компактным и надежным образом удерживается вместе с помощью опорной пластины 700, покровной пластины 702 и зажимов 704. Стержни 706 служат для правильного совмещения стопки пластин во время сборки. В случае, если необходимо увеличить сжимающую силу, может быть вставлена дополнительная разделительная пластина, при этом остальная стока останется неизменной (таким образом увеличивается сжатие пружин пружинной пластины 600). Все устройство для приготовления препаратов в сборе может быть помещено в стандартную центрифугу, так что может одновременно выполняться приготовление множества препаратов клеток.
Как упоминалось выше, может быть полезным применение гидрогеля, содержащего один или более окрашивающих агентов, к клеткам, осажденным на предметном участке или на предметной пластине соответственно. Гидрогель может содержать по меньшей мере один окрашивающий агент, который способен связываться с определенным компонентом клеток. Например, гидрогель представляет собой агарозный гидрогель и содержит два окрашивающих агента, один из которых выполнен с возможностью связывания с определенными компонентами или структурами клетки, например с ядрами или микроядрами, а другой окрашивающий агент выполнен с возможностью связывания с оболочками клеток. При связывании с определенными компонентами или структурами либо с оболочками клеток, соответственно, соответствующий окрашивающий агент проявляет флуоресцирующие свойства при возбуждении светом с соответствующей заданной длиной волны, и при этом он не проявляет флуоресцирующие свойства, пока он не связан с таким соответствующим компонентом клетки, структурой или оболочкой.
Агарозный гидрогель удерживает клетки осажденными на предметном участке во влажном состоянии, что может быть полезно в отношении сохранения морфологии клеток, осажденных на предметном участке или на предметной пластине. Гидрогель, такой как вышеупомянутый агарозный гидрогель, при комнатной температуре находится в состоянии, подобном желатину, то есть является по существу твердым. Он защищает клетки от засыхания и от загрязнения. Однако малые молекулы, такие как молекулы окрашивающего агента, могут по существу свободно передвигаться в гидрогеле и рассеиваться через гидрогель и в клетки, где они связываются с соответствующими компонентами клеток, такими как, например, ядра, микроядра, другие соответствующие компоненты клеток, или с оболочкой клеток.
Детальный вид предметной пластины 500 с осажденными на ней клетками 501, покрытой гидрогелем 502, содержащим окрашивающие агенты, схематично показан на Фиг.12. Подготовленная таким образом предметная пластина 500 может храниться заданное время, чтобы позволить окрашивающим агентам рассеяться в клетки 501 и связаться с ядрами и потенциальными микроядрами и с оболочками клеток соответственно. Затем клетки могут быть подвергнуты микроскопическому анализу, дающему высококонтрастное микроскопическое изображение клеток и клеточных структур.
Более подробный пример способа будет описан следующим образом:
Клеточная структура
+/-
Клетки лимфомы мыши типа «L5178Ytk» выращивали в суспензии во флаконах Т-175 в среде RPMI 1640, содержащей 10% инактивированной лошадиной сыворотки, 2 мМ L-глутамина и 1% антибиотиков пенициллин-стрептомицинового ряда до 75% конфлюентности и 95% жизнеспособности (все среды реализуются компанией Life Technologies Corporation, Карлсбад, Калифорния, США).
Инкубация смеси
2
Инкубацию смеси выполняли в 96-луночных планшетах типа "Falcon 353077", реализуемых компанией Beckton Dickinson, Нью-Джерси, США, в течение 24 часов при 37°С, в 5% CO и при 8000 клеток в 60 мкл субстрата. Смеси растворяли в диметилсульфоксиде DMSO (иногда в воде) при окончательной концентрации DMSO 1%. В качестве позитивного контроля использовали 15 мкг/мл метилметансульфоната (MMS).
Центрифугирование и фиксация клеток
Из всей суспензии клеток 50 мкл переносили из инкубационного планшета в камеры планшета с ячейками в форме перевернутых воронок (см. камеры 20 луночного планшета 200, показанного на Фиг.4 и Фиг.5) с использованием 96-элементной головки автоматического устройства дозирования типа "CyBi-well", реализуемого компанией CyBio AG, Йена, Германия, после пятикратного смешивания с использованием наконечников пипеток на 250 мкл.
Устройство для приготовления препарата клеток собирали по существу, как показано на Фиг.2. Пружинную пластину 600, содержащую 96 спиральных пружин равной силы, помещали на опорную пластину 700 каркаса и покрывали тонкой и гибкой металлической промежуточной пластиной 602 для защиты. Далее в сборке в форме стопки специализированная стеклянная пластина 500 служит в качестве предметной пластины, на которую должны быть нанесены клетки. Эта пластина может быть стеклянной пластиной "Nexterion", реализуемой компанией Schott Technical Glass Solutions GmbH, Йена, Германия. Использовали два перфорированных бумажных листа 400 и 402 фильтрующей бумаги, каждый из которых имеет 96 отверстий с интервалами согласно стандарту SBS (SBS - Общество биомолекулярных наук). Первая фильтрующая пластина 400, соприкасающаяся со стеклянной пластиной 500, предназначена для формирования границ каждого из 96 пятен пробы и для удаления среды из суспензии во время центрифугирования (отверстия диаметром 3,5 мм). Для обеспечения однородного и изотропного удаления жидкости с заданной скоростью фильтрующий материал был обжат в форме кольца вокруг каждой лунки до толщины 0,5 мм.
Вторая фильтрующая пластина 402, которая лежит поверх первой фильтрующей пластины 400 и слегка соприкасается с ней, предназначена для повышения удерживающей способности первой фильтрующей пластины 400 и содержит более крупные отверстия (диаметром 7,0 мм) для лучшего примыкания к краям 32 планшета 200 с лунками в форме перевернутых воронок.
Луночный планшет 200, наполненный суспензией клеток, осторожно помещали поверх первой фильтрующей пластины 400 и совмещали с отверстиями второй фильтрующей пластины 402. Сборку завершали установкой покровной пластины устройства для приготовления препаратов. Будучи предварительно сжатым ручным рычажным прессом, устройство для приготовления препаратов фиксировалось сбоку с помощью двух металлических скобок 704, которые по существу не занимают места, так что все устройство помещается в ротор-бакет микротитра доступной на рынке центрифуги, например типа "Multifuge 1S", реализуемой компанией Heraeus, Германия. Эта конкретная центрифуга немедленно ускоряется до установленной скорости центрифугирования в 1000 об/мин, которая поддерживается в течение 5 минут. После разборки устройства для приготовления препаратов пластины сушили в атмосферном воздухе 1 минуту, затем на ночь погружали в 70% водный раствор этилового спирта для фиксации и помещали на хранение сроком до недели.
Окрашивание и установка
2
После фиксации стеклянные пластины высушивали в течение 1 минуты, стряхивая избыточную жидкость, и погружали в натрий-фосфатный буфер (PBS) на 5 минут в качестве предварительной обработки. Нижнюю поверхность пластин, противоположную поверхности, на которой осаждались клетки, быстро ополаскивали дважды дистиллированной водой (ddHO) и после этого пластины были готовы к установке.
Для сохранения клеток во влажном состоянии и предотвращения нежелательных изменений морфологии клетки и появления артефактов окрашивания оказалось полезным покрытие клеток агарозным гидрогелем. Для этих целей «агарозу типа VII с низкой температурой плавления и низкой температурой застывания», реализуемую Sigma-Aldrich Corporation, Миссури, США, растворяли до конечного раствора с 2% веса на объем в PBS в микроволновой печи при 850 Вт. До полного растворения порошка потребовалось несколько минут и несколько циклов кипячения и размешивания.
2
Окрашивание ядер клеток окрашивающим агентом типа "Hoechst" (1 мкМ (HO)), реализуемым Sigma Aldrich Corporation, Миссури, США, и окрашивание цитоплазмы клеток окрашивающим агентом типа "cell mask red" (1 мкг/мл (PBS)), реализуемым Life Technologies Corporation, Карлсбад, Калифорния, США) может быть выполнено в агарозном геле без необходимости каких-либо дополнительных этапов промывания. Это вызвано тем, что окрашивающий агент Hoechst практически не проявляет флуоресцентных свойств в растворе и флуоресцирует лишь при связывании с ДНК, и тем, что получение изображения осуществляют путем конфокального возбуждения и детектирования, таким образом значительно уменьшая выраженность расфокусированного фона. Жидкий раствор агарозы, содержащий окрашивающие агенты, хранили при 50°С и лили на пластины, используя одноразовую 25-мл пипетку. Раствор оставался на пластине и не выливался через края благодаря поверхностному натяжению. Через 20-30 минут гель твердел и пластины можно было устанавливать в специализированные рамки с крышками для стекла "Nexterion", реализуемые той же компанией, что и само стекло.
Формирование изображений
Конфокальную флуоресцентную микроскопию с вращающимся диском на стеклянных пластинах, содержащих 96 проб, выполняли с помощью высокопроизводительной автоматической системы формирования изображений "Opera QEHS", реализуемой компанией PerkinElmer Cellular Technologies, Гамбург, Германия. Окрашивающий агент для ядер (Hoechst) и окрашивающий агент для цитоплазмы ("cell mask red") возбуждали с помощью твердотельных лазеров при длине волны 405 нм и 635 нм соответственно.
Интенсивность возбуждения и продолжительность воздействия источников излучения регулировали в каждом эксперименте для объяснения различий в эффективности нанесения меток, для оптимизации яркости и контрастности и для уменьшения обесцвечивания (как правило, при мощности лазера 50 мВт время интеграции 200-2000 мс).
Для каждой пробы обычно регистрировали 25 пар изображений сканирования с помощью воздушной линзы LCPLF 2Ox NA 0.4 (реализуемой компанией Olympus, Япония) и оптимизированных наборов фильтров посредством 2 отдельных 12-битных CCD-камер с высокой квантовой эффективностью (1,3-мегапиксельных, монохромных). Любую остаточную неоднородность освещения, сдвиг изображения или искажение корректировали, используя полученные по отдельности изображения из калибровочных проб.
Анализ изображений
Конфокальные микрографии анализировали с применением фирменной программной среды "Acapella 2.0" системы формирования изображений "Opera" от PerkinElmer, причем и первая, и вторая реализуются PerkinElmer Cellular Technologies, Гамбург, Германия. Сначала местоположение каждой клетки определяли путем сегментирования изображения с окрашенным ядром. После того как местоположение ядер было установлено и были измерены их контур и их площадь, определяли контур клетки путем сегментирования изображения с окрашенной цитоплазмой.
Кроме того, изображения проб, содержащих микроядра, анализировали с помощью программы для анализа изображений "eCognition", реализуемой компанией Definiens AG, Мюнхен, Германия.
На Фиг.13 приведены примеры изображений неприкрепляющихся клеток, подготовленных с помощью описанного устройства и способа. На изображениях в верхнем ряду клетки были окрашены окрашивающим агентом "Hoechst", упомянутым выше, в то время как в нижнем ряду клетки были окрашены также упомянутым выше окрашивающим агентом "cell mask red". В левом столбце клетки не обработаны, а в правом столбце клетки обработаны генотоксичным соединением. Можно увидеть, что клетки, подготовленные описанным устройством и способом, хорошо прикрепляются к необработанной поверхности стекла и плоско распределяются, так что клеточные структуры хорошо разделены.
На Фиг.14 показаны примеры результатов анализа микроядерной пробы, выполненного с применением описанного устройства и способа. Эксперименты выполняли на репликатах четыре разных дня, как указано в легенде над графиками. Соотношение клеток, содержащих микроядра, к общему числу клеток отложено на графике по отношению к концентрации вещества, как указано на графиках. Верхний ряд содержит вещества, для которых известно отсутствие генотоксичности, в то время как в нижнем ряду использованы вещества, которые известны своей генотоксичностью. На графиках можно увидеть, что все три вещества правильно классифицированы. Пластины №№13 и 14 были обработаны только DMSO (диметилсульфоксидом) без какого-либо токсичного вещества в качестве отрицательного контроля, и это можно в особенности увидеть на графиках, показанных в нижнем ряду. Клетки разводили на 12 растворов с указанными веществами. Диапазон концентраций определяли по максимальной концентрации (10 мкМ для нитрохинолиноксида и митомицина С, 100 мкМ для всех остальных веществ), коэффициенту разведения 1,5 и числу разведений. Клетки, не содержащие микроядер, и клетки, содержащие от одного до трех микроядер, подсчитывали с использованием специально разработанного алгоритма обработки изображений. На графике данные по нитрохинолиноксиду и митомицину С сместили вправо на коэффициент, равный десяти, исключительно для наглядности.