СПОСОБ ПОДБОРА ВЫСОКОАКТИВНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ПАТОГЕННЫМИ БУРКХОЛЬДЕРИЯМИ
METHOD OF SELECTION OF HIGHLY ACTIVE ANTIBACTERIAL MEDICATION FOR TREATMENT OF DISEASES CAUSED BY PATHOGENIC BURKHOLDERIA

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается подбора высокоактивных антибактериальных средств для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями.
Известно, что использование антибактериальных препаратов, достаточно активных in vitro в отношении патогенных микроорганизмов, в том числе и буркхольдерий (В. mallei, В. pseudomallei), в ряде случаев оказывается неэффективным при лечении вызываемых ими заболеваний. Этот феномен связывают с различными факторами, проявляющимися в процессе взаимодействия микроорганизма с антибиотиками в условиях in vivo: постантибиотическим эффектом, повышением антибиотикоустойчивости бактерий при формировании биопленки, наконец, прямым воздействием физико-химических факторов внутренней среды макроорганизма, существенно влияющих на характер взаимодействия антибиотиков с патогенным микроорганизмом.
2
В род Burkholderia в настоящее время входят более 30 видов грамотрицательных глюкозу неферментирующих бактерий, подавляющее большинство которых является свободноживущими почвенными и водными микроорганизмами. Для медицинской практики имеют значение 2 вида патогенных буркхольдерий: В. mallei и В. pseudomallei. Они являются возбудителями особо опасных инфекционных заболеваний - сапа и мелиоидоза. Заболевания, вызванные патогенными буркхольдериями, требуют длительной интенсивной химиотерапии, так как эти микробы устойчивы к широкому спектру химиопрепаратов, а в процессе многодневного введения антибиотиков часто селекционируются устойчивые культуры возбудителей, чем и объясняются проблемы подбора препаратов для эффективной химиотерапии. В работе Corkill J.E., Deveney J., Pratt J. Effect of pH and СО on in vitro susceptibility of Pseudomonas cepacia to beta-lactams // Pediatr. Res. - 1994. - Vol.35. - N.3. - P.299-302 изучалось влияние рН среды и углекислого газа на чувствительность буркхольдерий к химиопрепаратам.
Наиболее близким аналогом подбору высокоактивного антибактериального средства для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями, является работа по изучению влияния физико-химических факторов (температуры, рН среды) на чувствительность буркхольдерий к химиопрепаратам (Илюхин В.И., Батманов В.П. Влияние температуры и рН среды на чувствительность патогенных псевдомонад к химиопрепаратам. - Антибиотики. - 1997. - №4 - С.21-23). Однако в вышеуказанных работах изучалось только влияние физико-химических факторов на чувствительность микроорганизмов к различным химиопрепаратам, вне какой-либо связи с эффективностью антибактериальных препаратов in vivo. Наша модификация постановки опытов по оценке антибактериальной чувствительности позволяет по уровню снижения чувствительности буркхольдерий к антибактериальным препаратам высказать предположение об эффективности тех или иных химиопрепаратов при лечении заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями.
4
2
Целью изобретения является подбор эффективного антибактериального средства для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями. Поставленная цель достигается за счет установления влияния на МПК условий постановки опытов, моделирующих характер взаимодействия препаратов с микробами in vivo. Для этого исследуемую культуру В. pseudomallei или В. mallei в дозе 10м.к. засевают на среду Muller Hinton, добавляют диски с антибактериальными средствами, обычно применяемые для лечения острых форм сапа и мелиоидоза (цефтазидим, меропенем, ципрофлоксацин, доксициклин, рифампицин, хлорамфеникол, ко-тримоксазол) и культивируют при 37°С в течении 24 ч в обычных условиях и параллельно эти же концентрации исследуемых культур засевают на среду Muller Hinton с добавлением 10% свежей гепаринизированной крови лабораторных животных (высокочувствительных к сапу и мелиоидозу золотистых хомячков), наносят стандартные бумажные диски, пропитанные вышеуказанными антибактериальными средствами, и культивируют при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО, в течение 24 ч, после чего проводят учет чувствительности исследуемой культуры микроорганизма к антибактериальному средству согласно прилагаемой инструкции путем измерения зон задержки роста микроба вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Отсутствие зоны задержки роста микроба вокруг диска говорит о том, что испытуемый штамм не чувствителен к данному антибактериальному средству. Если диаметр зоны задержки роста бактерий превышает величину, указанную в проспектах к фирменным дискам, то штамм оценивается как чувствительный к данному антибактериальному средству. При этом показателем падения активности (неэффективности) антибактериального средства является существенное, достоверное уменьшение зоны задержки роста на среде Muller Hinton, содержащей 10% крови лабораторных животных и культивируемой в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, по сравнению с опытом, проводимом в обычных условиях, и одновременно определяют сравнительную эффективность препаратов в опытах по лечению экспериментальных животных.
Примеры конкретного выполнения.
2
2
2
4
Пример 1. Чувствительность культур к химиопрепаратам определяли на среде Muller Hinton («Himedia») - диско-диффузионным методом со стандартными бумажными дисками диаметром 6 мм («Himedia»). Постановка опытов и учет результатов соответствовали общепринятым стандартам. Параллельно чувствительность буркхольдерий к химиопрепаратам определяли на среде Muller Hinton с добавлением свежей гепаринизированной (гепарин «Richter», 5 МЕ/мл) крови (10%) золотистых хомячков в атмосфере, содержащей 5% CO (CO инкубатор Forma scientific). В таблице 1 показано, что практически во всех случаях резистентность буркхольдерий к препаратам в модифицированных условиях повышалась, особенно заметное снижение чувствительности буркхольдерий в этих условиях отмечается в постановке опытов с рифампицином. Зона задержки роста упала до 8 мм, превысив уровень показателя резистентности штаммов (<14 мм). В то же время размер зоны задержки роста штаммов ко-тримоксазолом и при модификации постановки опыта существенно превышал стандарт показателя чувствительности к данному препарату, составляя величину в пределах 28-33 мм при показателе чувствительности >16 мм. Объяснение этому явлению двоякое - с одной стороны в условиях повышенного содержания СО падает рН среды и снижается эффективность действия некоторых групп антибактериальных препаратов, с другой - добавление крови (10%) лабораторных животных к среде Muller Hinton повышает ее ростовые свойства. В опытах показано, что при высеве на модифицированную среду взвеси 10м.к. буркхольдерий в среднем на 20% повысилось количество колоний и их размер при учете на 2-3 сут после высева.
3
50
2
Пример 2. Для заражения лабораторных животных была избрана равноэффективная доза, соответствующая 10 ЛД. Лечение химиопрепаратами начинали через 24 ч после инфицирования. Лечебные дозы, учитывая более интенсивный уровень метаболизма и высокий коэффициент соотношения площади поверхности к массе тела у лабораторных животных по сравнению с человеком, были несколько выше рекомендуемых для лечения людей. Из отобранных препаратов для лечения высокочувствительных к сапу и мелиоидозу золотистых хомячков наиболее эффективным оказался ко-тримоксазол, достоверно снизивший уровень летальности при заражении В. mallei 10230 и существенно увеличивший продолжительность жизни павших животных при обеих инфекциях (таблица 2). Наименее эффективным оказался рифампицин. Эффективность препаратов коррелирует с уровнем снижения их чувствительности в опытах по определению МПК с добавлением к среде Muller Hinton 10% крови золотистых хомячков в атмосфере 5% СО (таблица 1). Вполне перспективными препаратами при лечении сапа оказались ципрофлоксацин и доксициклин, которые, однако, при мелиоидозной инфекции не предотвращали летальность животных, но достоверно увеличивали их продолжительность жизни.
2
На основании полученных данных видно, что оценка чувствительности патогенных культур к набору антибиотиков в стандартных условиях не может служить единственным определяющим фактором при назначении набора препаратов для лечения инфекций, вызванных патогенными буркхольдериями. Во многом на эффективность терапии влияет характер инфекционного процесса у конкретного макроорганизма, скорость и форма сформировавшегося патологического процесса. Таким образом, благодаря предлагаемому способу путем создания условий, максимально приближенных к процессу, происходящему в конкретном макроорганизме, можно более точно определить, какое антибактериальное средство эффективно для лечения заболеваний, вызываемых патогенными буркхольдериями. В условиях in vitro для оценки эффективности химиопрепаратов против буркхольдерий желательно воспроизвести условия, моделирующие характер взаимоотношений in vivo, a именно добавив к среде Muller Hinton 10% крови золотистых хомячков в атмосфере, содержащей 5% CO.
Таблица 1
Изменения чувствительности буркхольдерий на среде Muller Hinton после добавления 10% крови золотистых хомячков в атмосфере 5% СО<sub>2</sub>
Антибиотики
С
<R->S
Штаммы
В. mallei 10230
B. pseudomallei C 141
K
з.х
K
з.х.
Цефтазидим
30
14-18
27
20*
25
20*
Меропенем
10
13-16
33
22*
30
20*
Ципрофлоксацин
5
16-24
30
22*
30
25*
Доксициклин
10
12-16
30
25
25
20*
Рифампицин
30
14-19
20
8*
12
8*
Хлорамфеникол
30
12-18
30
30
28
25
Ко-тримоксазол
25
10-16
35
33
30
28
Примечания: С - содержание препарата в диске (мкг); <R->S - зона оценки резистентности (R), чувствительности (S) буркхольдерий к данному препарату; цифровой материал зон задержки роста выражен в мм; K - контроль - зона задержки роста на среде Muller Hinton; з.х. - зоны задержки роста на среде Muller Hinton с добавлением 10% крови золотистых хомячков в атмосфере 5% СО<sub>2</sub>; цифры - медиана 5 опытов; * - достоверность различия показателя с контролем превышает 95% (р<0,05).
Таблица 2
Эффективность химиотерапии экспериментального сапа и мелиоидоза у золотистых хомячков
Препараты
Доза, мг/кг/сут
Штамм заражения
Л
Т
Штамм заражения
Л
Т
Цефтазидим
120
B. mallei 10230 10<sup>4</sup> м.к
10/10
7,5
B. pseudomallei C 141 10<sup>4</sup> м.к.
10/10
7,0
Меропенем
50
10/10
6,5
10/10
6,2
Ципрофлоксацин
50
4/10*
14,2*
8/10
15,5*
Доксициклин
50
5/10*
16,5*
10/10
18*
Рифампицин
50
10/10
15,5*
10/10
5
Хлорамфеникол
80
10/10
6,2
10/10
5
Ко-тримоксазол
100
2/10*
8,5
7/10
30*
Контроль
-
10/10
5,2
10/10
4,0
Примечания: Л - летальность среди зараженных животных, где числитель - количество павших, знаменатель - общее число зараженных; Т - средняя продолжительность жизни павших животных в сутках; * - достоверность различия показателя с контролем превышают 95% (р<0,05).