СПОСОБ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ
METHOD FOR GENETIC PREDICTION OF RESPIRATORY TUBERCULOSIS

Изобретение относится к медицине, а именно фтизиатрии, и может быть использовано для прогноза развития заболевания туберкулезом органов дыхания.
Туберкулез легких остается одной из главных медицинских проблем. Учитывая высокую контагиозность заболевания, сложность лечения многих форм специфической инфекции, ВОЗ рассматривает туберкулез как одну из основных социально значимых инфекционных болезней, которая является предметом интенсивных научных исследований.
Туберкулез легких различается не только по клинической картине, но и по эпидемиологической значимости, а развитие заболевания связано не только с биологическими свойствами микроорганизма, но и зависит от степени напряженности клеточного иммунитета больного и во многом определяется генетическими факторами.
К настоящему времени известно более 4000 моногенных (менделевских) болезней, являющихся следствием мутаций единичного гена, и более 600 хромосомных болезней, обусловленных изменением числа или структуры хромосом, однако доля их неизмеримо мала среди всей патологии у человека в сравнении с мультифакториальными заболеваниями, по которым пожизненный риск (lifetime risk) достаточно высок. Именно к этой группе заболеваний можно отнести туберкулез (2, 6, 10).
Система HLA генов II класса является наиболее значимым звеном в восприимчивости к инфекционным заболеваниям вообще и к туберкулезу, в частности, т.к. в ней расположены гены иммунного ответа, ответственные за распознавание инфекта, кооперацию клеток и дальнейшее развитие иммунного ответа (9, 11).
Молекулярное типирование аллелей HLA II класса, пришедшее на смену серологическому выявлению антигена, позволило проанализировать аллельный уровень с более высокой разрешающей способностью.
Многочисленные исследования показали наличие положительной ассоциации системы HLA с развитием туберкулезной инфекции в различных популяциях. Верификация групп риска в возникновении и неблагоприятном течении туберкулеза органов дыхания очень важна и связана с идентификацией генов, от которых зависит восприимчивость или резистентностность организма человека к туберкулезной инфекции, в частности HLA генов II класса главного комплекса гистосовместимости локуса DQB1*.
Прототипом предлагаемого изобретения явилась работа, задачей которой было изучение возможности прогнозирования течения туберкулеза легких (8). Она посвящена изучению частоты встречаемости антигенов локусов HLA-A, HLA-B и HLA-Cw у больных остропрогрессирующим и ограниченным инфильтративным туберкулезом легких в сравнении с группой доноров. С помощью стандартного микролимфоцитотоксического теста решалась задача генетического прогноза заболевания и течения туберкулеза органов дыхания. Точность прогноза данного метода более низкая, т.к. определяет антигены, а не сам ген человека, что является недостатком.
Достижения последних десятилетий в области фундаментальной иммуногенетики позволили перейти к изучению на молекулярно-генетическом уровне HLA генов, который привел к новому «прорыву» в получении знаний. Новые методы изучения не только позволили конкретизировать представление о комплексе HLA, но и значительно расширили представление о его полиморфизме, при этом были открыты многие новые аллели I, II и III классов (3, 7, 4, 5).
Задачей способа является повышение эффективности генетического прогнозирования туберкулеза органов дыхания у взрослых.
Задача реализуется за счет того, что проводят молекулярное типирование гена HLA - DQB1* при помощи полимеразной цепной реакции и при выявлении в генотипе аллеля HLA - DQB1*05 прогнозируют риск развития туберкулеза органов дыхания и неблагоприятное его течение.
Принципиальным отличием данного подхода явился переход от использования в качестве объекта исследования белковых молекул HLA, экспрессированных на мембранах клеток, т.е. антигенов, к непосредственно генетическому материалу - участков ДНК, определяющих аллельный полиморфизм системы HLA.
Проведено молекулярное генотипирование аллелей локусов HLA -DQB1* у 100 больных с различным течением деструктивного туберкулеза органов дыхания с бактериовыделением.
Преимуществом способа является повышение точности генетического прогноза туберкулеза органов дыхания.
Предлагаемый способ поясняется чертежом, где отражена частота встречаемости аллелей локуса HLA-DQB1 у больных двух обследуемых групп и здоровых лиц.
Способ осуществляется следующим образом.
Молекулярное типирование HLA-генов DQB1* локуса проводилось методом полимеразной цепной реакции (PCR-SSP) с использованием панели отечественных праймеров фирмы «ДНК-технология» (Москва, Институт Иммунологии) и состояло из нескольких этапов.
1. Выделение ДНК
Геномная ДНК выделялась из мононуклеарных клеток периферической крови (свежей или замороженной при -20°С), стабилизированной ЭДТА или цитратом натрия (конечная концентрация антикоагулянта 0,5%), с помощью набора реагентов для выделения ДНК "НПФ ДНК-технология" (Москва). Периферическую кровь центрифугировали в пластиковой пробирке типа "Eppendorf" при 13000 g в течение 1 минуты. Затем надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в 0,5 мл лизирующего буфера и центрифугировали при 13000 g в течение 1 минуты. Процедура лизиса повторялась до тех пор, пока надосадочная жидкость не становилась прозрачной.
После окончательного удаления надосадочной жидкости к осадку мононуклеаров добавляли 60 мкл буфера для протеиназы К, 1 мкл протеиназы К (концентрация 10 мг/мл) и ресуспендировали. Инкубация с ферментом проводилась не менее чем в течение 60 минут при +55°С. Инактивация протеиназы К после инкубации проводилась путем нагревания пробирки на водяной бане при 95°С в течение 10 минут. После охлаждения пробирку центрифугировали при 13000 g в течение 10-15 секунд. Раствор ДНК хранился при +4°С до использования.
2. HLA-DQB1*-типирование
Молекулярное типирование гена HLA-DQB1* проводилось с использованием панели праймеров, позволяющей выявлять 5 групп аллелей DQB1* (DQB1*02, 03, 04, 05, 06, базовое разрешение).
Амплификация проводилась в 3 этапа: I этап - амплификация II экзона DQB1*-гена проводилась по следующему температурному режиму:
1. 94°С - 1 мин
2. 94°С - 0 мин 20 сек
}7 циклов
67°С - 0 мин 5 сек
3. 93°С - 0 мин 1 сек
} 28 циклов
65°С - 0 мин 2 сек
II этап - серия амплификации со специфическими парами праймеров, разделяющих DQB1* аллели на 3 подгруппы.
III этап - серия амплификации со специфическими парами праймеров, определяющих конкретные аллели DQB1* гена.
Температурный режим II и III этапов:
93°С - 0 мин 1 сек
} 12 циклов
67°С - 0 мин 2 сек
Продукты амплификации оценивались методом гель-электрофореза в 3,2% агарозном геле. Аллельная идентификация проводилась с помощью интерпретационной таблицы, прилагаемой к каждому набору реагентов.
Материалы касаются 100 больных туберкулезом органов дыхания старше 18 лет (I гр.: 58 - впервые выявленные больные инфильтративным туберкулезом легких; II гр.: 42 - пациенты с прогрессирующим инфильтративным туберкулезом легких с тенденцией к формированию фиброзно-кавернозной формы).
9
Среди пациентов I группы незначительные симптомы интоксикации регистрировали у 2/3 больных. Кашель беспокоил 31,0% больных, одышку отмечали у единичных больных. При аускультативном исследовании у 50,0% пациентов выслушивали ослабленное или жесткое дыхание и катаральные явления. В клиническом анализе крови лейкоцитоз более 10×10,0 /л фиксировали у 15,5%, СОЭ более 31 мм/час - у 20,7%).
9
У всех пациентов II группы на момент обследования отмечали симптомы интоксикации различной степени, в т.ч. выраженные, более чем у половины больных. Понижение аппетита, слабость, потливость в течение дня и ночные поты определяли у 66,6% больных. Респираторные нарушения в виде кашля наблюдали у 54,8%, в т.ч. с выделением мокроты слизисто-гнойного характера до 30-50 мл в сутки; одышку регистрировали у трети пациентов. Локальные признаки болезни с изменением характера дыхания и различных катаральных явлений были выявлены также у всех больных этой группы. Лейкоцитоз более 10×10,0/л отмечен у 21,4%, ускорение СОЭ определяли у половины пациентов.
У больных II группы преобладали двусторонние изменения, поражение 3-х сегментов у 76,2%, против 55,2% у больных впервые выявленным инфильтративным туберкулезом легких. У 84,5% пациентов I группы регистрировали бактериовыделение, в т.ч. у 97,9% подтверждено культуральным методом, лекарственную устойчивость определяли у 64,5%. Все больные II группы являлись бактериовыделителями, методом посева МБТ выделены у 97,6% пациентов, лекарственную устойчивость регистрировали у 92,7%.
2
Сопоставление проведено с группой здоровых лиц - жителей Северо-Запада России (88 человек) - методом непараметрической статистики с вычислением χ с поправкой Йетса. Показатель относительного риска (RR) определяли методом Вульфа (Шабалин В.Н., 1994). В результате установлено, что в группе больных туберкулезом легких значительно чаще встречается аллель DQB1*05 (42,0%, р<0,05) по сравнению со здоровыми лицами (29,5%) (чертеж). Относительный риск (RR) заболеть туберкулезом у здоровых лиц - носителей 05 аллеля равен 2,63.
Данную наследственную компоненту (05 аллель) идентифицировали чаще у больных с более тяжелым течением туберкулеза легких в 52,4% против 34,9% в I группе и 29,5% (р<0,001) у здоровых людей (чертеж), при относительном риске (RR) развития неблагоприятного течения у заболевших носителей 05 аллеля, равном 2,62.
Распределение аллелей локуса HLA-DQB1 у больных и здоровых лиц (%)
Аллель локуса HLA-DQB1*
Здоровые
Больные туберкулезом
02
31,8
25,0
03
61,4
50,0
04
3,4
5,0
05
29,5
42,0*
06
46,6
42,0
*p<0,05 по сравнению со здоровыми лицам
Риск развития туберкулеза органов дыхания и неблагоприятное его течение в популяции связан с наличием HLA генотипа DQB1*05.
Клинические примеры:
Больная В.Л.В., 09.01.1957 г.p. Поступила в стационар 21.04.2005 г. Пациентка из семейного контакта: в 1980 г - с сыном, в 2001 г. - с дочерью. Из анамнеза известно, что изменения в легких были выявлены при обращении к врачу по поводу повышения температуры тела и ухудшения самочувствия. После дообследования и проведения противопневмонической терапии больной установлен диагноз: инфильтративный туберкулез верхней доли левого легкого в фазе распада и обсеменения МБТ (+). После поступления в СПбНИИ фтизиопульмонологии, наряду с комплексным рентгено-лаборатоным обследованием, проведено молекулярное генотипирование гена HLA - DQB1* методом полимеразной цепной реакции (PCR - SSP), в результате установлено присутствие у больной HLA генотипа DQB1*05.
Было решено проводить противотуберкулезную терапию, после стабилизации специфических изменений и сохранения деструкции в легких больной рекомендовать хирургическое лечение. Терапия осуществлялась изониазидом, стрептомицином, рифампицином, пиразинамидом три месяца, далее в соответствии с лекарственной чувствительностью МБТ до 10 месяцев изониазидом, пиразинамидом, амикацином, циклосерном, ПАСКом, была достигнута стабилизация процесса с формированием фиброзно-кавернозного туберкулеза верхней доли левого легкого МБТ (±), методом бактериоскопии достигнута конверсия бактериовыделения. Больной 06.02.06 была проведена левосторонняя верхняя лобэктомия, френикотрипсия и далее продолжена химиотерапия.
Больная Н.Н.В. 13.09.1974 г.р. Поступила в стационар 19.11.2003 г. Больная из семейного контакта: в 1994 г. - с дядей, а также с братом, болевшим фиброзно-кавернозной формой и умершим от туберкулезной инфекции. Из анамнеза известно, что изменения в легких были выявлены в 1994 г., процесс в легких трактовался как инфильтративный МБТ (-), основной курс лечения противотуберкулезными препаратами 7,5 месяца, терапия осуществлялась изониазидом, стрептомицином, рифампицином, пиразинамидом, достигнута положительная клинико-рентгенологическая динамика. Рецидив туберкулеза легких отмечен в феврале 2001 г., лечение проводилось в соответствии с лекарственной чувствительностью МБТ (изониазидом, ПАСК, фторхинолонами, в т.ч. левофлоксацином, амикацином, пиразинамидом), но, несмотря на интенсивную противотуберкулезную терапию, лечение оказалось неэффективным, продолжалось бактериовыделение и сохранялись полости распада. После проведения молекулярного генотипирования гена HLA - DQB1* методом полимеразной цепной реакции (PCR - SSP) было определено, что у больной HLA генотип DQB1*05. В июне 2002 больной выполнена левосторонняя пульмонэктомия, продолжена химиотерапия. В ноябре 2003 года регистрируется очередное обострение специфического процесса в единственном оставшемся легком, далее туберкулезная инфекция стала носить прогрессирующий характер и к 2007 г. сформировался фиброзно-кавернозный туберкулез в единственном легком в фазе инфильтрации и обсеменения МВТ (+).
Литература
1. Апт А.С. Генетические аспекты выявления групп риска по туберкулезу // Проблемы туб. - 2001. - №7. - С.65-68.
2. Болдырева М.Н., Алексеев Л.П. HLA и естественный отбор. Гипотеза «преимущества функциональной гетерозиготности» // Иммунология. - 2006. - №3. - С.172-176.
3. Коненков В.И., Смольникова М.В. // Мед. иммунология. - 2003. - Т.5, №1-2. - С.11-38.
4. Кондакова М.Н. Клинико-генетические особенности патогенеза туберкулеза у подростков: Автореф…д-pa мед. наук. - СПб., 2006.
5. Кондакова М.Н., Павлова М.В., Скворцова Л.А. Аллельный полиморфизм гена HLA-DRB1* у подростков и его роль в выборе режима химиотерапии туберкулеза органов дыхания // Актуальные вопросы выявления, диагностики и лечения внелегочного туберкулеза: Науч. труды Всерос. науч.-практ. конф. - СПб., 2006. - С.274-277.
6. Математические методы в изучении генетики мультифакториальных заболеваний: Учеб. - метод. пособие / Под ред. Шабалина В.Н. - М., 1994.
7. Маянский Н.А., Маянская А.Н. Номенклатура и функции главного комплекса гистосовместимости человека // Иммунология. - 2006. - №1. - С.43-46.
8. Мишин В.Ю., Чуканова В.П., Поспелов Л.Е., Сайдулаева А.А., Маленко А.Ф., Нагорная Е.Д. Течение остропрогрессирующего туберкулеза легких у больных с различным фенотипом антигенов HLA // Актуальные вопросы выявления, диагностики и лечения внелегочного туберкулеза: Науч. труды Всерос. науч.-практ. конф. - СПб., 2005. - С.86-89.
9. Пичугин А.В., Лядова И.В., Еремеев В.В., Никоненко Б.В., Апт А.С. Течение туберкулезной инфекции и ответ Т-клеток на микобактериальные антигены у мышей конгенных по Н-2 линий // Иммунология. - 1999. - №5. - С.33-36.
10. Пузырев В.П. Генетика артериальной гипертензии // Клин. медицина. - 2003. - №1. - С.12-18.
11. Ярилин А.А. Симбиотические взаимоотношения клеток иммунной системы // Иммунология. - 2001. - №4. - С.16-20.