Генотипические особенности и фенотипические проявления муковисцидоза у больных Ленинградской области

КЛИНИЧЕСКАЯ ГЕНЕТИКА В ПЕДИАТРИИ

© Коллектив авторов, 2015

Е.В. Бойцова1, Т.Е. Гембицкая1, Т.Э. Иващенко2, А.Г. Черменский1, Д.М. Москвина1, Ю.А. Насыхова2

ГЕНОТИПИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ МУКОВИСЦИДОЗА У БОЛЬНЫХ ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ

1НИИ пульмонологии ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова», 2Институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАН, Санкт-Петербург, РФ

Boytsova E.V.1, Gembitskaya T.E.1, Ivashchenko T.E.2, ChermenskiyA.G.1, Moskvina D.M.1, Nasykhova IU.A.2

GENOTYPIC FEATURES AND PHENOTYPIC MANIFESTATIONS OF CYSTIC FIBROSIS IN PATIENTS FROM LENINGRAD REGION OF RUSSIA

Research Institute of Pulmonology, Pavlov First Saint-Petersburg State Medical University, 2FSBSI «The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott»,

Saint-Petersburg, Russia

В статье проанализированы и сделаны выводы о гено- и фенотипических особенностях 20 детей и 5 взрослых больных муковисцидозом (МВ) Ленинградской области (ЛО). Ставилась задача обязательной верификации двух мутантных аллелей гена МВТР, для чего использовали специальный алгоритм поиска, включая метод полноэкзонного секвенирования. Установлено, что наиболее частой мутацией у больных МВ является del508F (69%). Внедрение активного динамического наблюдения позволило улучшить качество жизни пациентов. Установлено, что больные МВ, проживающие в ЛО, имеют клинико-генетические и микробиологические особенности. Самым частым осложнением МВ у детей был синдром псевдо-Барттера. Ключевые слова: муковисцидоз, генотип и фенотип, Центр муковисцидоза, дети и взрослые больные.

Genotypic features and phenotypic manifestations of 20 children and 5 adult patients with cystic fibrosis (mucoviscidosis, or MV) from Leningrad region of Russia were analyzed in the article with the appropriate conclusions drawn further. The purpose was to verify obligatory the two mutant alleles of the gene CFTR with the use of a special search algorithm, which included the whole genome sequencing method. It was revealed that the most frequent mutation in MV patients is del508F (69%). The implementation of active dynamic observation allowed improving the quality of life of patients. It was found that MV patients living in Leningrad region of Russia are having their own clinical, genetic, and microbiological features. The most frequent MV complication in pediatric patients was Pseudo-Bartter's syndrome.

Keywords: cystic fibrosis, mucoviscidosis, genotype and phenotype, children and adult patients.

58

Контактная информация: Бойцова Евгения Викторовна - д.м.н.,

заведующая лабораторией детской пульмонологии НИИ пульмонологии ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Адрес: Россия, 197089, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8

Тел.: (812) 234-13-83, E-mail: evboitsova@mail.ru Статья поступила 8.05.15, принята к печати 24.05.15.

Contact Information:

Boytsova Eugeniya Viktorovna - Ph.D., Head of the Laboratory of Pediatric Pulmonology of the Research Institute of Pulmonology, Pavlov First Saint-Petersburg State Medical University Address: Russia, 197089, Saint-Petersburg, Lev Tolstoy street, 6/8

Теl.: (812) 234-13-83, E-mail: evboitsova@mail.ru The article received 8.05.15, accepted for publication 24.05.15.

Муковисцидоз (МВ) — кистофиброз поджелудочной железы — моногенное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования, обусловленное мутацией гена муковисцидозно-го трансмембранного регулятора проводимости (МВТР). Заболевание характеризуется поражением экзокринных желез жизненно важных органов и систем; до недавнего времени подчеркивалось, что болезнь имеет тяжелое течение и низкую выживаемость. Совершенствование лечебно-реабилитационных режимов способствует постоянному увеличению средней продолжительности и значительному улучшению качества жизни больных. По данным С.А. Красовского и соавт., за последние годы выживаемость данной категории больных в Москве и Московской области значительно увеличилась, и медиана выживаемости составляет 37 лет [1]. Ген МВ локализуется на длинном плече хромосомы 7 в области q31-q32, состоит из 250 тыс пар нуклеотидных оснований. Значительная протяженность гена определяет большое количество мутаций, описанное число которых к настоящему времени составляет 1996. Частота и спектр мутаций гена МВТР (С¥ТЕ) в Российской Федерации отличается от таковых в Западной Европе и Северной Америке. Это касается как частоты основной причины МВ во всем мире — мутации delF508, так и структуры других мутаций. Данные Регистра больных МВ в России убедительно свидетельствуют об этом [2]. Изучение характера и распределение мутаций гена МВТР, влияние генотипа на особенности клинического течения и прогноза болезни являются актуальными для клиницистов, молекулярных генетиков, организаторов здравоохранения. В настоящем сообщении мы остановимся на характеристике больных Ленинградской области (ЛО).

Целью данной работы является изучение особенностей клинического течения и генетических характеристик больных МВ (детей и взрослых) ЛО для дальнейшего улучшения диагностики и лечения данной категории больных.

Материалы и методы исследования

В регистре больных МВ Ленинградской области за 2013-2014 гг. состоят 20 детей и 5 взрослых старше 18 лет. Диагноз был верифицирован согласно международным и российским стандартам диагностики МВ.

Проведена оценка результатов клинических, лабораторных, функциональных, рентгенологических исследований, бактериологического исследования мокроты и/или бронхиальных смывов, уровня фекальной эластазы 1, копрологического исследования, антропометрических данных.

При изучении генотипа ставилась задача обязательной верификации обоих мутантных аллелей (исследование выполняли в лаборатории пренаталь-ной диагностики НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАН). Работа выполнена на образцах ДНК, выделенных из лейкоцитов периферической крови

пациентов с МВ. Выделение ДНК проводили в соответствии с методикой Сэмбрука с некоторыми модификациями [4].

На первом этапе образцы ДНК проанализированы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) на наличие диагностически значимых мутаций (частота >2%) для пациентов с МВ в РФ (delF508, 394delTT, G542X, 2143delT, 2184insA, W1282X, N1303K, 3732delA, CFTRdele2,3(21kb)) [3]. Последовательности олигонуклеотидных прай-меров и условия идентификации мутаций описаны в монографии Т.Э. Иващенко и В.С. Баранова [4]. Последовательности олигонуклеотидных праймеров, использованных для секвенирования экзона гена МВТР, опубликованы в работе J. Boyne и соавт. [5].

Анализ результатов секвенирования проводили с помощью программного обеспечения Sequencing Analysis 5.2 (Applied Biosystems, США), BioEdit, базы данных Cystic Fibrosis Mutation Database и CFTR2.

Результаты

Частота встречаемости МВ среди лиц, проживающих в ЛО, согласно регистру больных МВ в Российской Федерации составляет 1,384 на 100 тыс населения, что несколько ниже, чем в Центральном, Приволжском регионах, в ряде регионов Сибири и Дальнего Востока [2] и соответствует распространенности в Томской и Тульской областях, Красноярском и Краснодарском краях, республиках Хакасия, Мордовия, Башкортостан. В настоящее время в ЛО наблюдаются 20 детей и 5 взрослых пациентов с подтвержденным диагнозом МВ, установленным на основании данных неонатального скрининга, клинической картины, положительной потовой пробы (Macroduct) и генетического исследования. Больные наблюдаются в пульмонологическом отделении ЛОГУЗ «Детская областная клиническая больница», взрослые больные — в НИИ пульмонологии ГБОУ ВПО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова, а также в городской клинической больнице № 2. Средний возраст всех больных 9,8±7,29 лет. Средний возраст больных детского возраста — 7,18±4,5 лет (5 мес-16 лет). Средний возраст взрослых больных МВ составляет 23,8±2,9 лет (от 18 до 25 лет). Среди больных преобладают пациенты мужского пола (54%). Доля взрослых больных (старше 18 лет) — 20%. Всем взрослым больным диагноз был установлен в детстве, они наблюдались в детском пульмонологическом отделении ЛОГУЗ «ДКБ», являющимся клинической базой лаборатории детской пульмонологии НИИ пульмонологии ГБОУ ВПО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова. Средний возраст установления диагноза у больных ЛО был 1,75±3,11 лет, что ниже средних значений по стране [2]. Диагностика МВ в ЛО значительно улучшилась после введения неона-тального скрининга. В последние годы в 86% случаев диагноз устанавливался в возрасте до 1 года жизни (рис. 1). Среднее содержание хлори-

59

Таблица

Мутации гена С¥ТЯ, выявленные в анализируемой группе больных МВ

Генотип (новое название мутаций) Генотип (старое название мутаций) Частота, %

p.Phe508del/p.Phe508del delF508/delF508 50

p.Leu1335Pгo/p.Asn1303Lys L1335P/N1303K 4,2

p.Phe508del/c.2052_2053insA delF508/2184insA 4,2

p.Phe508del/p.Glu92Lys delF508/E92K 4,2

p.Phe508del/c.54-5940-_273+10250del21kb delF508/CFTRdele2,3 4,2

p.Phe508del/c.2012delT delF508/2143delT 4,2

p.Phe508del/489+1G>T delF508/621+1G->T 4,2

p.Phe508del/c.4296_4297insGA delF508/4428insGA 4,2

p.Phe508del/p.Aгg75X delF508/R75X 4,2

p.Phe508del/c.262_263delTT delF508/394delTT 4,2

c.1545_1546delTA/? 1677delTA/? 4,2

p.Leu1335Pгo/? L1335P/? 4,2

p.Phe508del/? delF508/? 4,2

до 1 1-3 4-6 7-10 10-16 Возраст, годы

Рис. 1. Возрастная структура установления диагноза МВ до и после введения неонатального скрининга.

1-й столбик - до скрининга, 2-й столбик - после скрининга.

был, т.е. частота неизвестных мутаций составила 17%.

Далее для наиболее полного выявления мутаций в генах больных нами проанализирована нуклеотидная последовательность 27 экзонов, а также промоторной области гена МВТР в 7 образцах ДНК, выделенных из лейкоцитов периферической крови пациентов с МВ. Это позволило определить дефект гена обоих хромосом у 4 из 7 пациентов. Таким образом, в результате применения метода полноэкзомного секвенирова-ния выявляемость мутаций повысилась до 94%, а частота неизвестных мутаций снизилась до 6%. Разнообразие генотипов при МВ у пациентов ЛО представлено в таблице и на рис. 2.

дов пота при проведении потового теста во время диагностики болезни — 87,2±17,4 ммоль/л (Масго^с^.

При исследовании генотипа больных на первом этапе частота delF508 в обследуемой группе составила 69%, что значительно выше, чем у больных Санкт-Петербурга (53%) и в среднем по России (52,85%) [2, 4, 6]. Данная мутация встречалась в группе пациентов в гомозиготном состоянии в 50% случаев, тогда как частота гетерозигот составила 37%. В единичных случаях выявлены мутации 394delTT, 1677delTA, 2143delT, 2184твА, Ш303К, CFTRdele2,3. Таким образом, в исследуемой группе больных генетический дефект двух МВ хромосом определен в 71%, тогда как лишь одна мутация идентифицирована у 6 (25%) пациентов, а у одного (4%) пациента генетический дефект выявлен не

9- 2,1% 11 - 2,1%

12 - 2,1%

,13 - 6,3%

1 - 68,8%

Рис. 2. Частота мутаций в гене СЖТЯ у больных МВ Ленинградской области.

1 - p.Phe508del ^№508), 2 - Leu1335Pгo (Ь1335Р), 3 - c.54-5940_273+10250del21kb (CFTRdele2,3), 4 -c.1545_1546delTA (1677delTA), 5 - С.2052_20531ПЙА (2184ЬяА), 6 - c.2012delT (2143delT), 7 - 489+Ю>Г (621 + Ю-^), 8 - с. 4 2 96_4 2 9 71ПЙО А (44281ПЙОА), 9 - p.Glu92Lys (Е92К), 10 - р.Агё75Х ^75Х), 11 -p.Asn1303Lys (Ш303К), 12 - c.262_263delTT (394delTT), 13 - неизвестные мутации.

60

Как следует из представленных данных, преобладающей по частоте мутацией является мутация delF508. Мутация L1335P в экзоне 25 выявлена на двух МВ хромосомах и ее частота составила 4%. Необходимо отметить, что данная мутация не входит в стандартные тест-системы, используемые в Российской Федерации. Остальные мутации в гене МВТР выявлены в единичных случаях.

Все больные, кроме одного ребенка, имевшего генотип delF508/4428insGA и нормальный уровень эластазы-1, страдали смешанной формой МВ. Объективная оценка недостаточности поджелудочной железы основывается на исследовании уровня эластазы-1 в кале. У всех наблюдаемых больных, детей и взрослых, отмечался низкий уровень этого показателя, только в одном случае значение эластазы-1 было выше 200 нг/г. Нутритивный статус больных МВ во многом определяет прогноз заболевания. В то же время панкреатическая недостаточность может быть нормализована адекватно подобранной заместительной терапией и низкий нутритивный статус у этих пациентов определяется тяжелым течением бронхолегочного процесса. Характеристика нутритивного статуса у детей проводилась на основании оценки массо-ростового индекса (МРИ). Средние значения МРИ у детей составили 96,8±11,5%, значения этого показателя ниже 90% обнаружены у 4 больных детей. У взрослых больных о состоянии питания судили на основании индекса массы тела по Quetelet, показатели которого были низкими у всех больных (15-17,8). Таким образом, более выраженные нарушения нутритивного статуса отмечались у взрослых пациентов, что связано с более тяжелым течением бронхолегочного процесса у взрослых и пренебрежением режимными мероприятиями, типичными для больных в молодом возрасте.

При оценке микробиологического профиля респираторного тракта установлено, что преобладающим патогеном был S. aureus в монокультуре (72%). Хроническая инфекция Ps. aeruginosa в монокультуре или в сочетании с S. aureus была диагностирована у 24% больных, что ниже средних значений по России [2]. У одного ребенка не было обнаружено патогенной флоры при повторных посевах (4% ). Хроническая инфекция Ps. aeruginosa диагностирована у 4 взрослых больных, причем в 2 случаях в сочетании с хронической инфекцией S. aureus. У одного 18-летнего больного, диагноз МВ которому был установлен в возрасте 16 лет, имела место хроническая стафилококковая инфекция. У детей хроническое инфицирование Ps. aeruginosa в сочетании с S. aureus отмечено только в 2 случаях, причем у одного ребенка эти патогены сочетались также с выделением Achroromobacter spp. и Stenotrophomonas maltophilia (10% в группе больных до 18 лет). Однократное выделение Ps. aeruginosa с эрадикацией патогена после

лечения наблюдалось у 2 (10%) детей в возрасте 5 и 8 лет. Эти данные соответствуют результатам, полученным в других регионах России и в западных странах, которые свидетельствуют о повышении с возрастом частоты инфицирования Ps. aeruginosa и снижении частоты колонизации S. аureus [2]. Среди наблюдаемых больных не было случаев инфекции, обусловленной B. cepacia, представляющей большую проблему для стран Запада и некоторых регионов России, в связи с резким ухудшением течения болезни на фоне этой инфекции.

Для диагностики легочных поражений всем больным детского возраста, достигшим 5 лет, была проведена компьютерная томография (КТ) легких. Распространенные или локализованные бронхоэктазы были обнаружены у 5 из 14 обследованных детей (30%), облитерирующий брон-хиолит, диагностированный на основании выявления симптома «воздушной ловушки», сочетающейся с участками дистелектазов и субсегментарных ателектазов, был зарегистрирован у 8 (53%), в остальных случаях отмечались минимальные изменения в виде утолщения стенок бронхов (17%). У всех взрослых больных диагностированы распространенные двусторонние бронхоэктазы. Осложнения болезни встречались в обеих возрастных группах. Мекониальный илеус в анамнезе был диагностирован у 2 детей. Сахарный диабет был выявлен у одной больной в возрасте 18 лет и у одной пациентки 11 лет. Гепатомегалия, повышение уровня щелочной фосфатазы, трансаминаз отмечались у большинства больных независимо от возраста (80%). Цирроз печени с портальной гипертензией обнаружен у одного больного старше 18 лет.

В период 2008-2014 гг. мы наблюдали 6 детей в возрасте от 3 до 9 месяцев (средний возраст 5,5 мес) с синдромом псевдо-Барттера. Синдром псевдо-Барттера является потенциально жиз-неугрожающим состоянием, связан с потерей электролитов с потом и характеризуется выраженными нарушениями электролитного состава сыворотки крови: снижением уровня калия, натрия, хлора и смещением кислотно-щелочного равновесия в сторону метаболического алкалоза. У больных с синдромом псевдо-Барттера уровень калия колебался от 2,6 до 3,2 ммоль/л, уровень натрия - от 126 до 131 ммоль/л. Основными симптомами болезни были рвота, отказ от еды, беспокойство и потеря веса. В 2 случаях симптомы появились на фоне вирусной инфекции. Во всех случаях состояние было купировано назначением препаратов калия, верошпирона.

Полипоз верхних дыхательных путей чаще наблюдался у взрослых больных (40%), чем у детей (20%). Пневмоторакс, потребовавший дренирования, осложнил течение МВ у взрослого пациента.

Тяжесть течения болезни в одном случае была обусловлена ателектазом правого легкого. Пациент наблюдался и лечился по поводу

61

МВ с возраста 1 года 7 месяцев, диагноз был подтвержден высокими значениями потового теста и выявлением мутаций delF508/2143delT. С 10-летнего возраста к хронической инфекции S. aureus присоединились Ps. aeruginosa, затем Achroromobacter spp. и Stenotrophomonas maltophilia. При рентгенологическом исследовании выявлялись фиброателектаз средней доли правого легкого, бронхоэктазы S1, 2, 3, 6, 8, 9 справа, S2 слева. Мальчик госпитализировался 3-4 раза в год для внутривенной антибактериальной терапии. При плановой госпитализации в возрасте 14 лет обнаружен ателектаз правого легкого, подтвержденный при рентгенологическом исследовании. Во время перерыва между госпитализациями больной получал обычную терапию, в т.ч. и ингаляционную антибактериальную терапию, за несколько недель до госпитализации ингаляции раствора тобрамицина через небулайзер были заменены на тобрамицин подхалер. Больному выполнена фибробронхо-скопия, выявлен диффузный гнойный эндоброн-хит, нарушения проходимости бронхов не было обнаружено. Во время проведения повторных санационных бронхоскопий ребенку местно вводились дорназа-альфа, флуимуцил-антибиотик, проводились антибактериальная терапия, ингаляции с дорназой альфа и с гипертоническим раствором, кинезитерапия. Несмотря на проводимую активную терапию, ателектаз правого легкого сохраняется.

Все дети и взрослые больные МВ в ЛО обеспечены микросферическими ферментами, дорназой-альфа, препаратами урсодезоксихоле-

вои кислоты и по показаниям — ингаляционными антибиотиками. Необходимость в постоянной оксигенотерапии имеется у одного ребенка со значениями сатурации кислорода менее 89% и ателектазом правого легкого.

Заключение

Важной генетической особенностью больных ЛО является высокая частота delF508 в генотипе больных и высокая частота гомозигот по этой мутации (значительно выше, чем среди больных МВ Санкт-Петрбурга), что, несомненно, предрасполагает к тяжелому течению заболевания с генетически обусловленной недостаточностью функции поджелудочной железы. Ранняя диагностика МВ у больных ЛО, улучшение организации и преемственности в помощи этим больным, получение необходимой терапии уже сейчас положительно сказались на повышении качества жизни этих больных [7]. Больные МВ взрослые и дети, проживающие в ЛО, имеют клинико-генетические и микробиологические особенности по сравнению с пациентами других регионов Российской Федерации. Взрослые больные в отличие от пациентов детского возраста имеют более тяжелые структурные изменения в легких, значительные нарушения питания, более агрессивную микрофлору в дыхательных путях, увеличение частоты тяжелых осложнений. В раннем детском возрасте преобладающими осложнениями болезни у наблюдаемых пациентов были электролитные нарушения, связанные с синдромом псевдо-Барттера.

Литература

1. Красовский СА., Амелина Е.Л., Черняк А.В. Динамика выживаемости больных муковисцидозом в Москве и Московской области за периоды 1992-2001 и 2002-2011 гг. Пульмонология. 2012; 3: 79-86.

2. Красовский СА., Каширская Н.Ю., Амелина Е.Л.. и др. Регистр больных муковисцидозом в Российской Федерации. 2012 год. Пульмонология. 2015; (Приложение): 1-58.

3. Иващенко Т.Э., Насыхова ЮА., Гембицкая Т.Е., Орлов А.В., Черменский А.Г., Баранов В.С. Анализ мутаций у больных муковисцидозом методом полноэкзомного секвенирова-ния гена CFTR. Медицинская генетика. 2014; 13 (3): 28-31.

4. Иващенко Т.Э., Баранов В.С. Биохимические и молекулярно-генетические аспекты патогенеза муковисици-доза. СПб.: Интермедика, 2002: 252 с.

5. Boyne J, Evans S, Pollitt R, Taylor C, Dalton A. Many delF508 heterozygote neonates with transient hyper-trypsinaemia have a second, mild CFTR mutation. J. Med. Genet. 2000; 37: 543-547.

6. Гембицкая Т.Е., Иващенко Т.Э., Черменский А.Г., Насыхова Ю.Л^ Фенотипические особенности и генетическая неоднородность больных при поздней манифестации и неклассическом течении муковисцидоза. Пульмонология. 2014; 1: 66-70.

7. Гембицкая Т.Е., Бойцова Е.В., Черменский А.Г. Преемственность в работе детского и взрослого центров помощи больным муковисцидозом. Педиатрия. 2014; 93 (4): 160-164.

62