КЛЕТКА

1. Клетка, которая коэкспрессирует первый химерный рецептор антигена (CAR) и второй CAR на клеточной поверхности, при этом каждый CAR включает антигенсвязывающий домен, причем антигенсвязывающий домен первого CAR связывается с CD19, а антигенсвязывающий домен второго CAR связывается с CD22.
2. Клетка по п.1, в которой каждый CAR включает:
(i) антигенсвязывающий домен;
(ii) спейсер и
(iii) трансмембранный домен;
причем спейсер первого CAR отличается от спейсера второго CAR.
3. Клетка по п.2, в которой антигенсвязывающий домен второго CAR связывается с эпитопом в Ig-домене 1, 2, 3 или 4 CD22.
4. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая как первый, так и второй химерные рецепторы антигенов (CAR), которые определены в любом из пп. 1-3.
5. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.4, которая имеет следующую структуру:
AgB1-spacer1-TM1-coexpr-AbB2-spacer2-ТМ2,
где
AgB1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антигенсвязывающий домен первого CAR;
spacer1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую спейсер первого CAR;
ТМ1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансмембранный домен первого CAR;
coexpr представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая делает возможной коэкспрессию обоих CAR;
AgB2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антигенсвязывающий домен второго CAR;
spacer2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую спейсер второго CAR;
ТМ2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансмембранный домен второго CAR;
при этом указанная последовательность нуклеиновой кислоты, при экспрессии в Т-клетке, кодирует полипептид, который расщепляется в сайте расщепления таким образом, что первый и второй CAR совместно представлены на поверхности Т-клетки.
6. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.5, в которой coexpr кодирует саморасщепляющийся пептид.
7. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.5 или 6, в которой альтернативные кодоны используются в районах последовательности, кодирующих одинаковые или схожие аминокислотные последовательности, во избежание гомологичной рекомбинации.
8. Набор, который включает
(i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый химерный рецептор антигена (CAR), определенный в любом из пп. 1-3, при этом указанная последовательность нуклеиновой кислоты имеет следующую структуру:
AgB1-spacer1-TM1
где
AgB1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антигенсвязывающий домен первого CAR;
spacer1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую спейсер первого CAR;
ТМ1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансмембранный домен первого CAR; и
(ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй химерный рецептор антигена, определенный в любом из пп. 1-3, при этом указанная последовательность нуклеиновой кислоты имеет следующую структуру:
AgB2-spacer2-ТМ2
AgB2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антигенсвязывающий домен второго CAR;
spacer2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую спейсер второго CAR; и
ТМ2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансмембранный домен второго CAR.
9. Набор, включающий: первый вектор, который включает первую последовательность нуклеиновой кислоты, определенную в п.8, и второй вектор, который включает вторую последовательность нуклеиновой кислоты, определенную в п.8.
10. Набор по п.9, в котором векторы представляют собой интегрирующиеся вирусные векторы или транспозоны.
11. Вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп. 4-7.
12. Ретровирусный вектор или лентивирусный вектор, или транспозон по п.11.
13. Способ получения клетки по любому из пп. 1-3, который включает стадию введения в клетку: последовательности нуклеиновой кислоты по любому из пп. 4-7, первой последовательности нуклеиновой кислоты и второй последовательности нуклеиновой кислоты, которые определены в п.8, и/или первого вектора и второго вектора, которые определены в п.9, или вектора по п.11 или 12.
14. Способ по п.13, в котором клетка происходит из образца, выделенного из пациента.
15. Фармацевтическая композиция, включающая множество клеток по любому из пп. 1-3.
16. Способ лечения и/или профилактики заболевания, который включает стадию введения пациенту фармацевтической композиции по п.15.
17. Способ по п.16, который включает следующие стадии:
(i) выделение содержащего клетки образца из пациента;
(ii) трансдукцию или трансфекцию клеток: последовательностью нуклеиновой кислоты по любому из п.п. 4-7, первой последовательностью нуклеиновой кислоты и второй последовательностью нуклеиновой кислоты, которые определены в п.8, первым вектором и вторым вектором, которые определены в п.9 или 10, или вектором по п.11 или 12; и
(iii) введение пациенту клеток из (ii).
18. Способ по п.16 или 17, в котором заболеванием является рак.
19. Способ по п.18, в котором рак представляет собой В-клеточную злокачественная опухоль.
20. Фармацевтическая композиция по п.15 для применения в лечении и/или профилактике заболевания.
21. Применение клетки по любому из пп. 1-3 в получении лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболевания.
22. Химерный рецептор антигена (CAR), включающий CD19-связывающий домен, который включает
a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющие комплементарность (гипервариабельные) участки (CDR) со следующими последовательностями:
CDR1 - SYWMN (SEQ ID NO:15);
CDR2 - QIWPGDGDTNYNGKFK (SEQ ID NO:16);
CDR3 - RETTTVGRYYYAMDY (SEQ ID NO:17); и
b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR со следующими последовательностями:
CDR1 - KASQSVDYDGDSYLN (SEQ ID NO:18);
CDR2 - DASNLVS (SEQ ID NO:19);
CDR3 - QQSTEDPWT (SEQ ID NO:20).
23. CAR по п.22, причем CD19-связывающий домен включает VH-домен, имеющий последовательность, представленную как SEQ ID NO:23 или SEQ ID NO:24; или VL-домен, имеющий последовательность, представленную как SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:40, или его вариант, идентичный по последовательности на по меньшей мере 90%, который сохраняет способность связываться с CD19.
24. CAR по п.22, причем CD19-связывающий домен включает последовательность, представленную как SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 или SEQ ID NO:39, или ее вариант, идентичный по последовательности на по меньшей мере 90%, который сохраняет способность связываться с CD19.
25. Химерный рецептор антигена (CAR), включающий CD22-связывающий домен, который включает
a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющие комплементарность участки (CDR) со следующими последовательностями:
CDR1 - NYWIN (SEQ ID NO:27);
CDR2 - NIYPSDSFTNYNQKFKD (SEQ ID NO:28);
CDR3 - DTQERSWYFDV (SEQ ID NO:29); и
b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR со следующими последовательностями:
CDR1 - RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO:30);
CDR2 - KVSNRFS (SEQ ID NO:31);
CDR3 - SQSTHVPWT (SEQ ID NO:32).
26. CAR по п.25, причем CD22-связывающий домен включает VH-домен, имеющий последовательность, представленную как SEQ ID NO:35 или SEQ ID NO:36; или VL-домен, имеющий последовательность, представленную как SEQ ID NO:37 или SEQ ID NO:38, или его вариант, идентичный по последовательности на по меньшей мере 90%, который сохраняет способность связываться с CD22.
27. CAR по п.25, причем CD22-связывающий домен включает последовательность, представленную как SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:34, или ее вариант, идентичный по последовательности на по меньшей мере 90%, который сохраняет способность связываться с CD22.
28. Клетка по любому из пп. 1-3, в которой первым CAR является CAR, определенный в любом из пп. 22-24, а вторым CAR является CAR, определенный в любом из пп. 25-27.
29. Последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп. 4-7, кодирующая первый CAR, определенный в любом из пп. 22-24, и второй CAR, определенный в любом из пп. 25-27.
30. Набор по любому из пп. 8-10, в котором первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует первый CAR, определенный в любом из пп. 22-24, а вторая последовательностью нуклеиновой кислоты кодирует второй CAR, определенный в любом из пп. 25-27.
31. Вектор по п.11 или 12, который включает последовательность нуклеиновой кислоты по п.29.
32. Клетка, которая коэкспрессирует первый химерный рецептор антигена (CAR) и второй CAR на клеточной поверхности, при этом каждый CAR включает внутриклеточный, передающий сигналы домен, причем внутриклеточный, передающий сигналы домен первого CAR включает костимулирующий домен; а внутриклеточный, передающий сигналы домен второго CAR включает эндодомен семейства рецепторов TNF.
33. Клетка по п.32, причем костимулирующим доменом является костимулирующий домен CD28.
34. Клетка по п.32 или 33, причем эндодоменом семейства рецепторов TNF является эндодомен ОХ-40 или 4-1ВВ.
35. Клетка по любому из пп. 32-34, в которой внутриклеточный, передающий сигналы домен первого и второго CAR также включают ITAM-содержащий домен.
36. Клетка по п.35, в которой первый CAR имеет структуру:
AgB1-spacer1-TM1-costim-ITAM
,
где:
AgB1
представляет собой антигенсвязывающий домен первого CAR;
spacer1
представляет собой спейсер первого CAR;
TM1
представляет собой трансмембранный домен первого CAR;
costim
представляет собой костимулирующий домен; и
ITAM
представляет собой ITAM-содержащий эндодомен;
а второй CAR имеет структуру:
AgB2-spacer2-TM2-TNF-ITAM
,
где:
AgB2
представляет собой антигенсвязывающий домен второго CAR;
spacer2
представляет собой спейсер второго CAR;
TM2
представляет собой трансмембранный домен второго CAR;
TNF
представляет собой эндодомен рецептора TNF; и
ITAM
представляет собой ITAM-содержащий эндодомен.
37. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая как первый, так и второй химерные рецепторы антигенов (CAR), определенные в любом из пп. 32-36.
38. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.37, которая имеет следующую структуру:
AgB1-spacer1-TM1-costim-ITAM1-coexpr-AbB2-spacer2-TM2-TNF-ITAM2,
где
AgB1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антигенсвязывающий домен первого CAR;
spacer1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую спейсер первого CAR;
ТМ1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансмембранный домен первого CAR;
costim представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую костимулирующий домен;
ITAM1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ITAM-содержащий эндодомен первого CAR;
coexpr представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая делает возможной коэкспрессию обоих CAR;
AgB2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антигенсвязывающий домен второго CAR;
spacer2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую спейсер второго CAR;
ТМ2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансмембранный домен второго CAR;
TNF представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндодомен рецептора TNF;
ITAM2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ITAM-содержащий эндодомен второго CAR,
при этом указанная последовательность нуклеиновой кислоты, при экспрессии в клетке, кодирует полипептид, который расщепляется в сайте расщепления таким образом, что первый и второй CAR совместно представлены на клеточной поверхности.
39. Набор, который включает
(i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый химерный рецептор антигена (CAR), определенный в любом из пп. 32-36, при этом указанная последовательность нуклеиновой кислоты имеет следующую структуру:
AgB1-spacer1-TM1-costim-ITAM1,
где
AgB1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антигенсвязывающий домен первого CAR;
spacer1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую спейсер первого CAR;
ТМ1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансмембранный домен первого CAR;
costim представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую костимулирующий домен;
ITAM1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей ITAM-содержащий эндодомен первого CAR; и
(ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй химерный рецептор антигена (CAR), определенный в любом из пп. 32-36, при этом указанная последовательность нуклеиновой кислоты имеет следующую структуру:
AbB2-spacer2-ТМ2-TNF-ITAM2;
AgB2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антигенсвязывающий домен второго CAR;
spacer2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую спейсер второго CAR;
ТМ2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансмембранный домен второго CAR;
TNF представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эндодомен рецептора TNF; и
ITAM2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ITAM-содержащий эндодомен второго CAR.
40. Вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты по п.37 или 38.
41. Способ получения клетки по п.37 или 38, который включает стадию введения в клетку: последовательности нуклеиновой кислоты по п.37 или 38; первой последовательности нуклеиновой кислоты и второй последовательности нуклеиновой кислоты, которые определены в п.39; или вектора по п.40.
42. Фармацевтическая композиция, включающая множество клеток по любому из пп. 32-36.
43. Способ лечения и/или профилактики заболевания, который включает стадию введения пациенту фармацевтической композиции по п.42.
44. Фармацевтическая композиция по п.42 для применения в лечении и/или профилактике заболевания.
45. Применение клетки по любому из пп. 32-36 в получении лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболевания.