Устройство для анализа параметров живых клеток

Полезная модель относится к области медицины и может быть использована для диагностики заболеваний, а также в ветеринарии, микробиологии и научных исследованиях.
В медицинской практике всестороннее исследование клеток является актуальным для диагностики многих заболеваний человека.
Живые клетки при физиологическом значении рН несут на своей поверхности избыточный отрицательный заряд, который образуется вследствие диссоциации ионогенных групп клеточной мембраны. Клетку можно рассматривать как конгломерат биологических молекул, в основном представленных в виде диполей. Клетки отличаются по массам, по форме, по наведенным и постоянным дипольным моментам.
Коэффициент поляризации зависит от формы тела [Kock W.E. Mettalic delay lenses // Bell system Techn. Journ. - 1948. - V. 27. - p. 58-82; Микаэлян А.Л. Методы расчета диэлектрической и магнитной проницаемости искусственных сред: // Радиотехника. - 1955. - Т.10. - №1. - с.23-36; Jaggard P.L., Mackelson A.R., Papas C.H. // Appl. Phys. - V. 18. - p. 211-216; Завьялов А.С., Фалиц А.В., Чернявский С.В. Поляризуемости линейного вибратора и кирального элемента типа «вибратор-виток» - Известия вузов физика, 2006, №5, - 52-58 с.] и неявно зависит от массы.
Для клеток характерны особые свойства, например, двойной электрический слой, который окружает клетку и легко смещается во внешнем электрическом поле. Клетки, которые находятся в электролите, благодаря наличию на своей поверхности электрического заряда притягивают противоионы из окружающей среды, которые стремятся приблизиться к ионизированным группам клеточной мембраны, за счет межмолекулярного взаимодействия [Казанкин Д.С.Электрокинетические методы прижизненного исследования клеток // МИС-РТ - 2000, сборник №17-3 (www.ikar.udm.ru/sb/sb17-3.htm)]. Таким образом, клетка находится в окружении ионной атмосферы с избыточным диффузным зарядом.
Если поместить клетку в электрическое поле, то на каждый диполь будет действовать электрофоретическая сила. Суммарная сила, приводящая к движению клетку, складывается из отдельных электрокинетических сил. В однородном электрическом поле с постоянными знаками электродов происходит деформация двойного электрического слоя. Однако, однонаправленные быстрые перемещения клеток малоинформативны, так как изменение скорости перемещения затруднено. В неоднородном электрическом поле перемещение клеток зависит от их поляризуемости. Если поляризуемость клетки больше чем окружающей среды, то она перемещается в сторону большей напряженности электрического поля и наоборот.Таким образом, возможно разделение живых и мертвых клеток.
Известно устройство для микрофореза эритроцитов [см. Харамоненко С.С., Ракитянская А.А. «Электрофорез клеток крови в норме и паталогии», Минск, 1974, с. 33-38], содержащее измерительную камеру с электродами, источник постоянного электрического напряжения, соединенного с электродами, термостата и устройства регистрации в виде биологического микроскопа.
Клетки помещают в жидкую забуференную инкубационную среду с концентрацией клеточной взвеси в пределах 0.05%, а затем помещают в измерительную камеру. Под воздействием постоянного электрического поля клетки перемещаются к аноду. Скорость их перемещения зависит от мембранного потенциала клеток, их формы и функционального состояния.
Недостатком данного устройства являются низкая точность определения скорости перемещения клеток из-за торможения их неподвижными клетками при контакте.
Известна комбинированная камера для анализа живых клеток в переменных неоднородных электрических полях (Е. Cen, С. Dalton, Y. Li, S. Adamia, L. Pilarski, K. Kaler, Journal of Microbiological Methods 58 (2004), p.387-401). Камера выполнена в виде плоского капилляра, одной из формирующих плоскостей которого является стеклянная пластина, а другой - кремниевая подложка с системой микроэлектродов.
Камера заполняется препаратом живых клеток в буферном растворе, при включении напряжения в камере создаются быстропеременные неоднородные электрические поля, под действием которых клетки поляризуются и перемещаются с различной скоростью вдоль направлений градиентов этих полей (диэлектрофорез). Известно, что величина дипольного момента и поляризуемость биообъектов коррелируют с их иммуногенностью. При патологических состояниях величина отрицательного заряда мембраны эритроцитов изменяется. По деталям поведения клеток и известным показателям полей и среды рассчитываются диэлектрические и биологические параметры клеток (электроемкость и диэлектрическая проницаемость клеточной мембраны, равновесная частота диэлектрофореза, степень злокачественности клеток и т.п.).
Известно устройство для микроэлектрофореза [патент РФ №2168176], содержащее измерительную камеру, выполненную в виде плоского капилляра, образованного покровным стеклом и стеклянной платформой с расположенными на ней электродами, расположенными по окружности, соединенные с источником переменного симметричного напряжения и термодатчиком, связанным с термостабилизирующим устройством.
Камера заполняется препаратом анализируемых клеток в буферном растворе, при включении напряжения в ней между электродами создается переменное симметрично, многовекторное однородное электрическое поле, под действием которого заряженные живые клетки выполняют возвратно-поступательное движение с различными амплитудами, пропорциональными их интегральным зарядам (осуществляется процесс микроэлектрофореза). По определяемым характеристикам поведения клеток и известным показателям полей и среды рассчитываются электрические и биологические параметры клеток (их средний интегральный заряд и потенциал мембраны, гистограмма клеток по зарядам и доля подвижных клеток относительно их общего числа).
Известно устройство комплексного анализа параметров живых клеток [Патент РФ №2357251], содержащее измерительную камеру с электродами соединенными с источником переменного электрического напряжения, термодатчик и измерительный блок.
Общим недостатком рассмотренных устройств является низкая точность определения скорости перемещения живых клеток в зависимости от их параметров (поляризуемости и дипольных моментов).
4
6
Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является устройство для измерения вязкоупругих и электрических характеристик клеток биологических объектов [Патент на полезную модель №71439], состоящее из прозрачной измерительной ячейки, в которой расположены электроды, установленные с зазором, достаточным для формирования в нем средней напряженности электрического поля в пределах от 10 до 10 В/м и соединенные с источником электропитания, представляющий собой генератор переменного электрического напряжения, и измерительный блок, содержащий микроскоп, оптически связанный с измерительной кюветой.
Однако вышеприведенные устройства обладают низкой точностью определения скорости перемещения живых клеток в зависимости от их параметров (поляризуемости и дипольных моментов).
Техническим результатом заявляемой полезной модели является обеспечение возможности повышения точности определения перемещения живых клеток в зависимости от их параметров (поляризуемости и дипольных моментов).
Технический результат достигается тем, что устройство для анализа параметров живых клеток, содержит термостат с помещенной в него оптически прозрачной измерительной кюветой, с электродами, установленными параллельно с зазором относительно друг друга, соединенными с источником электрического напряжения, а так же измерительный блок с микроскопом, оптически связанный с измерительной кюветой и систему анализа изображений, согласно полезной модели дополнительно введено устройство создания микропотока жидкости носителя клеток с вектором скорости, перпендикулярного электрическому полю создаваемого между электродами, а источник электрического напряжения выполнен в виде двух источников напряжения, соединенных параллельно и представляющих собой генератор переменного асимметричного по полярности периодического напряжения и генератор линейно изменяющегося напряжения, являющегося источником постоянного компенсируемого напряжения. Кроме того, измерительная кювета содержит устройство регистрации субволновых частиц.
На фиг. 1. приведена схема устройства для анализа параметров живых клеток.
Устройство включает оптически прозрачную измерительную кювету 1 с электродами 2, 3, соединенные с источником электрического напряжения в виде генератора переменного асимметричного по полярности периодического напряжения 4 и генератора линейно изменяющегося напряжения 5, включенных параллельно, измерительного блока 6 и устройство создания микропотока жидкости носителя клеток 7.
Работа устройства для анализа параметров живых клеток основан на том эффекте, что скорость перемещения клеток в потоке жидкости носителя под действием приложенного электрического поля в направлении силовых линий различна. Скорость дрейфа клеток V связана с величиной электрического поля Е действующего на клетку соотношением:
0
2
V=k(E) E, k=k+kE+…,
где k(Е) - подвижность клетки. Величина К определяется массами клетки, их формой, поляризуемостью, массами молекул дрейфовой жидкости, потенциалом их взаимодействия и напряженностью электрического поля.
Для переменного периодического электрического поля, несимметричного по полярности, усредненная скорость дрейфа пропорциональна коэффициенту при квадратичном члене разложения k.
Вследствие того, что коэффициент k в зависимости от параметров клетки изменяется существенно сильнее чем подвижность, то и качество разделения живых клеток столь же существенно повышается. Скорость дрейфа повышается с увеличением напряженности электрического поля.
Устройство для анализа параметров живых клеток работает следующим образом. Живые клетки помещают в инкубационную среду и далее в измерительную кювету 1. От источника электрического напряжения 4 подается на электроды 2, 3 переменное асимметричное по полярности периодическое напряжение и одновременно компенсирующее линейно изменяющееся напряжение от источника 5. При этом создается периодическое асимметричное по полярности электрическое поле между электродами 2, 3 и перпендикулярное вектору скорости потока жидкости носителя, создаваемое устройством создания микропотока жидкости носителя клеток 7. Живая клетка начинает совершать осцилляции, причем смещение ее за время действия электрического поля более высокой напряженности больше и противоположно по направлению смещению клетки за время действия электрического поля более низкой напряженности.
Возникающий в связи с этим средний дрейф клетки в таком поле можно скомпенсировать противоположным дрейфом в слабом постоянном электрическим полем, создаваемым источником напряжения 5 и электродами 2, 3.
Таким образом, живые клетки движутся вместе с потоком жидкости совершая осцилляции возле первоначального положения в потоке. Клетки с иными параметрами (массой, поляризуемостью, дипольным моментом), имеющие другую зависимость подвижности от напряженности электрического поля, отклоняются от первоначального положения и осаждаются на поверхности электродов 2, 3. Изменяя слабое постоянное электрическое поле можно последовательно выполнять условие отбора клеток с различными параметрами.
После этого, с помощью измерительного блока, например, оптического микроскопа проводят микроскопирование прошедших живых клеток с фиксацией результатов движения и количества живых клеток.
Устройство регистрации субволновых частиц в потоке жидкости может быть выполнена, например, на основе эффекта «фотонных струй», в соответствии с рекомендациями [US Patent N 20140016175; Hui Yang et al. Photonic nanojet array for fast detection of single nanoparticles in a flow // Nano Letters, vol. 15, n 3, 11 march 2015, p. 1730-1735] или нефелометра.
Для создания микропотока жидкости могут быть использованы известные устройства, например, электрокинетический микронасос [Патент РФ №2300024 Электрокинетический микронасос; A. Manz, C.S. Effenhauser, N. Burggraf, D.J. Harrison, K. Seiler, K. Fluri, Electroosmotic pumping and electrophoretic separations for miniaturized chemical analysis systems, J. Micromech. Microeng., 1994, v. 4, pp. 257-265; Chuan-Hua Chen, Juan Santiago, A Planar Electroosmotic Micropump, J.Electromechanical Systems, 2002, v. 11. No. 6, pp. 672-683; Патент США №6770183; Oliver Geschke, Henning Klank, Pieter Telleman, Microsystem Engineering of Lab-on-a-chip Devices, Willey-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA, Weinheim, 2004, pp. 46-50.], пьезоэлектрических микронасосов [Yasumichi Nakamura. Murata Catches up as Demand for Fuel Cell Systems Grows. AEI December 2009. pp. 29-30.], микронасосы перистальтического типа [Yoseph Bar-Cohen and Zensheu Chang. Piezoelectrically Actuated Miniature Peristaltic Pump. / SPIE's 7th Annual International Symposium on Smart Structures and Materials, CA. Paper No. 3992-103. - 2000. - 8 с.] и т.п.
Зафиксированные характеристики движения живых клеток затем используют для расчета электрических, диэлектрических и биологических параметров этих клеток.
Таким образом, предлагаемое устройство для анализа параметров живых клеток обеспечивает повышение точности определения скорости перемещения живых клеток в зависимости от их параметров (поляризуемости и дипольных моментов).