Сравнительная оценка эффективности использования некоторых антигипоксантов для восстановления активности нервных клеток после гипоксии

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НЕКОТОРЫХ АНТИГИПОКСАНТОВ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ НЕРВНЫХ КЛЕТОК

ПОСЛЕ ГИПОКСИИ

И.Г. ВЛАСОВА, В.И. ТОРШИН

Кафедра нормальной физиологии РУДН, 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая д.8,

Медицинский факультет

На нейрональной модели - переживающих срезах мозжечка крыс проводилось сравнительное исследование прямого влияния ГОМК (104. 5хЮЛ 10'3 М), пирацетама (10‘4-10'6 М), тиролиберина (10 " - Ю'20 М) на нервные клетки в условиях нормоксии и гипоксии нарастающей тяжести, а также в период реоксигенации. Для всех исследуемых препаратов отмечена полифазность ответной реакции в условиях нормоксии. По силе анти-гипоксического эффекта исследуемые вещества располагались следующим образом: пирацетам > тиролиберин > ГОМК. Дается рекомендация о предпочтительном использовании пирацетама и тиролиберина для профилактики и лечения ишемических и постишемических состояний мозга.

Ключевые слова: срез мозжечка, нервная клетки, импульсная активность, гипоксия, антигипоксант, реокси-генация

Гипоксия - это универсальный экстремальный фактор, сопровождающий как некоторые физиологические, так и многие патологические состояния организма. Особенно чувствительны к недостатку кислорода клетки центральной нервной системы. Являясь строгим аэробом, они могут функционировать без кислорода всего несколько минут, после чего начинаются необратимые структурные изменения, приводящие к их гибели. Последние могут иметь место не только при остром дефиците 02, но возникать и в период реоксигенации. В основе этих изменений лежит токсический эффект кислорода, содержание которого в крови, притёкающей к мозгу после его длительной ишемии или гипоксии становится избыточным. На фоне повреждения систем утилизации кислорода и дефицита антиоксидантов происходит усиление процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), что приводит к еще более серьезным нарушениям в деятельности мозга. Поэтому проблема восстановления функций нервных клеток после ишемического повреждения остается актуальной для современной экспериментальной и клинической нейрофизиологии. Задача реаниматологов, невропатологов и патофизиологов состоит в ускорении процесса восстановления деятельности мозга и его биоэлектрической активности.

Надо полагать, что из всех имеющихся способов коррекции последствий кислородного голодания организма и его центральной нервной системы предпочтительным остается фармакологический, с помощью целого ряда хорошо известных антигипоксантов. Для профилактики гипоксических состояний и ускорения восстановительного периода, необходимо выбрать из них наиболее эффективные, действующие как при нарастающем дефиците 02, так и в период реоксигенации.

С этой целью нами проведена сравнительная оценка эффективности ранее изученных нами препаратов- антигипоксантов, имеющих различную природу. Исследовались такие антигипоксанты, как пирацетам, гамма-оксимасляная кислота (ГОМК) или натрия окси-бутират и тиролиберин (ТРЛ). ГОМК является структурным аналогом гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), но, в отличие от последней, хорошо проходит через гематоэнцефалический барьер. Он обладает элементами ноотропной активности. В клинике ГОМК получил признание как гипноседативное и антигипоксическое средство. Он повышает устойчивость мозга, сердца, сетчатки глаза к дефициту кислорода, снижает утилизацию мозговой тканью пирувата, увеличивает потребление мозгом глюкозы [7], нормализует мнестические функции мозга, сон, физическое развитие и адаптивные возможности у крысят, подвергшихся воздействию гипоксии в процессе внутриутробного развития [6] . Принято считать, что ГОМК оказывает более выраженный антигипоксиче-ский эффект, нежели ГАМК. Для уменьшения последствий гипоксии нервной ткани ее вводят в относительно больших дозах (50-100 мг/кг). В условиях нормоксии это вещест-

во приводит к фазным изменениям ИА нейронов с появлением судорожного компонента [2].

Другой препарат - пирацетам является циклическим аналогом ГАМК, относится к группе ноотропов, хорошо проходит через гематоэнцефалический барьер и оказался эффективным антигипоксантом. Пирацетам улучшает кровообращение мозга, стимулирует окислительно-восстановительные процессы, способствует утилизации глюкозы, а в ишемизированном участке мозга улучшает регионарный кровоток. Он эффективен при лечении начальных форм нарушения мозгового кровообращения [8]. Пирацетам обладает цитопротекторной активностью и предупреждает апоптоз астроцитов в условиях in vitro при гипоксии и реоксигенации [9]. Кроме того, было показано, что пирацетам, введенный предварительно, модифицирует эффект гипоксии и развитие пентилентетразоловых судорог [10]. Пирацетам применяется как в таблетках, так и внутривенно или внутримышечно и также, как и ГОМК в больших дозах (до 4-6 г в сутки).

Третье вещество - тиролиберин относится к группе нейропептидов, изучение которых открывает новые перспективы регуляции процессов адаптации к действию ряда экстремальных факторов и, в частности, таких как гипоксия. Среди многочисленных хорошо изученных нейропептидов, тиролиберин отличается наличием антигипоксических свойств, которые выражаются в его активирующем влиянии на регуляцию дыхания и кислородного гомеостаза . Восстанавливающий эффект больших доз ТРЛ был показан на модели фокальной церебральной ишемии. Он уменьшал гемиплегию и постишемиче-ские постуральные нарушения. Аналог ТРЛ (PR-546) стимулировал частоту дыхания у ваготомированных кошек. Кроме того, ТРЛ нормализовал церебральную циркуляцию и р02 у новорожденных детей [1]. В отличие от других антигипоксантов, защитный эффект ГРЛ отмечен при его применении в ультрамалых дозах. Ранее нами было показано [3], что ТРЛ обладает пролонгированным антигипоксическим эффектом в дозе 200 мкг/кг в течение 3 недель, который проявился особенно четко на низкоустойчивых к гипоксии животных (крысы), увеличив время жизни при подъеме в барокамере на “высоту” 11000 м в 6,2 раза по сравнению с контрольными животными. Для изучения характера прямого влияния препарата на функциональную активность нервных клеток и для изучения их антигипоксических свойств нами использовалась нейрональная модель - переживающие срезы мозжечка крыс. Данная модель имеет преимущества перед моделями in vivo, т к. будучи лишенной всех внешних афферентных влияний и воздействия со стороны других отделов мозга, но имея сохраненные внутренние связи, нейроны в условиях среза продолжают функционировать вне организма и генерировать спайковую активность, по своим частотным и амплитудным характеристикам аналогичную той, которая регистрируется в условиях in situ. Срезы мозга используются для исследования непосредственного влияния на нервные клетки различных факторов как физической, так и химической природы. Срезы мозга раскрывают неограниченные возможности для предварительного скринингового отбора биологически активных веществ и антигипоксантов, т.к. позволяют получить информацию о прямом, минуя гематоэнцефалический барьер, влиянии исследуемых веществ на нервную ткань.

Цель настоящего исследования - дать сравнительную оценку эффективности использования в качестве антигипоксантов ГОМК, пирацетама и тиролиберина при остром дефиците кислорода, а также в постгипоксический период для быстрейшего восстановления функций клеток мозга, используя в качестве объекта переживающие срезы мозжечка крыс. Срезы мозга мышей и крыс, как модельная система, были неоднократно апробированы нами в качестве тест-системы для изучения механизмов действия антигипоксических препаратов.

Материал и методы.

В экспериментах использовались переживающие срезы мозжечка крыс (п=70), толщиной 300-500 мкм, включающие в себя кору мозжечка с клетками Пуркинье, подкорковые

и вестибулярные ядра. Срезы помещались в термостатированный ( 1-34-35° С) и оксигенированный карбогеном (95% 02 и 5% С02) раствор Эрла (pH - 7,34) в перфузионную камеру с прозрачным дном для визуального наблюдения под микроскопом. После 60 минут адаптации в перфузате регистрировалась спонтанная импульсная активность (ИА) нейронов мозжечка (клетки Пуркинье) с использованием микроэлектродной техники, предусилителя, осциллографа с фотонасадкой, частотного анализатора и самописца. Гипоксию создавали пропусканием через перфузат, омывающий срез чистого азота, замещающего карбоген в течение 20 минут. Исходное содержание 02 в растворе, равное 670 мм рт.ст., принимали за 100%. Измерение содержания кислорода при его нарастающем дефиците от 100% до относительного нуля и реоксигенации определяли полярографическим методом, а также на микроанализаторе типа “Корнинг”

Вещества вводили в перфузат в дозах : ГОМК - 10'4, 5Х10-4, 10° М ( эквивалентно 13, 65 и 130 мг/кг), пирацетам - Ш '6, 10'5, 10'4 М ( эквивалентно 0,2, 2 и 20 мг/кг массы тела), тиролиберин 10'" - 10'2ОМ.

Определяли латентный период (ЛП) возникновения первой ответной реакции на вещество, действие которого наблюдали в течение 10 минут, выявляя тем самым наиболее активную дозу препарата, после чего вещество отмывалось и исследовалось действие гипоксии на фоне препарата, которое вводилось в перфузат одновременно с азотом. Материал обработан статистически, достоверность различия средних значений определяли по критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение.

Изучалась биологическая активность всех исследуемых препаратов при действии их на импульсную активность нейронов мозжечка в срезе в условиях нормоксии.

ГОМК в концентрации 10'4, 5х10‘4 М с ЛП 121,6±1,48 н- 193,0±3,01с увеличивала частоту спайков на 47,6±1,39% с последующим появлением судорожной активности и ее колебаниями в пределах от 23,6± 1,52% до 110,0±1,97% от исходного уровня (рис.1).

Более высокая концентрация вещества (10-3М) оказывала двухфазное действие на ИА клеток Пуркинье с ЛП 117,6± 1,39 с. Происходило первоначальное увеличение активности на 120±1,98% с последующим снижением частоты спайков на 35,0±2,95%. Если для всех предыдущих концентраций вещества отмывка от него приводила к восстановлению исходного уровня активности, то после концентрации ГОМК-Ю'3 М ИА не восстанавливалась. Для пирацета-ма отмечен иной характер действия на нейрональную активность в условиях нормоксии. Дозы 10~4 и 10'5М с ЛП57,2±1,40 и 405,0± 2,79 с соответственно вызывали первоначальное торможение ИА на 22,5± 1,87% с последующей активацией на 120,2±1,59% (рис.2) и восстановлением исходного уровня после отмывки раствором Эрла. Фазный характер действия пирацетама отмечен в экспериментах на собаках [5].

___________0,5 с

Рис.1 Импульсная активность нейронов в срезе мозжечка крысы под влиянием ГОМК в дозе Ю'4 М:

1 - исходная ИА; 2, 3 - ИА под влиянием ГОМК; 4 - восстановление ИА после отмывки

0,5мВ

0,5 с

Рис.2, Импульсная активность нейронов в срезе мозжечка крысы под влиянием пирацетама в дозе 10'4 М:

А - исходная ИА;

Б, В - ИА под влиянием пирацетама в дозе 10'4 М;

Г - восстановление ИА после отмывки

Для тиролиберина показана его высокая биологическая активность при действии на нейроны мозжечка в очень низких концентрациях (КГ11 - 10‘20 М). Для доз Ю'11 - 10 -|4 М характерен двухфазный ответ. Через 20 с от начала действия вещества возникало первоначальное значительное на 84,4±2,64% уменьшение частоты спайков, сменившееся ее активацией на 23,6±1,52% по сравнению с 100%-м исходным уровнем. Полифазность ответной реакции нейронов отмечена для более низких доз ТЛ (1015 - 10"17 М). Она выражалась в чередовании фазы активации с элементами судорожной активности и фаз торможения ИА.

Воздействие еще более низких доз ТРЛ (1018 -Ю'20 М) приводило к возникновению преимущественно фазы активации ИА на 77,6±1,39% с вовлечением в возбудительный процесс новых нейронов (рис.З).

Последующее торможение ИА не наступало, а отмечалось спонтанное восстановление исходного уровня активности еще до отмывки раствором Эрла без вещества. На фазный характер ответной реакции ТРЛ указывали и другие авторы [4], что согласуется с нашими данными.

Таким образом, все изученные нами вещества в условиях нормоксии проявили себя как нейрональноактивные. Короткий ЛП возникновения ответной реакции нервной клетки на действие каждого из препаратов свидетельствует, прежде всего, об их синаптической активности, которая' и была показана на нейрональной модели.

Моделируемая гипоксия позволила выявить наиболее выраженные антигипоксические свойства изучаемых препаратов как в период нарастающей гипоксии, так и в постгипок-сический период. Ранее нами на нейрональных моделях (культивируемой нервной ткани и переживающих срезах мозга) был показан фазный характер изменений импульсной активности нейронов различных структур мозга при нарастающей гипоксий и в период ре-оксигенации, выразившийся в чередовании торможения и активации ИА. Исследуемое вещество вводилось в перфузат, омывающий срез одновременно с гипоксическим воздействием. Наибольший защитный эффект для ГОМК при снижении концентрации 02 от 100% до относительного нуля, проявился при концентрации вещества 5x10'4 М и выразился в отсутствии 1-й тормозной фазы (рис.4), которая характерна для нейронов при воздействии гипоксии без вещества, быстром наступлении фазы активации (при 80 -60% 02), неполном угнетении ИА при 0% 02, а также 50%-м восстановлении ИА при 60% 02, в то время как без ГОМК ИА достигала 50% от исходного уровня при 75-80% 02. В отличие от ГОМК, у пирацетама в дозе Ю^М антигипок-

-0,5 с

Рис.З. Импульсная активность нейронов в срезе мозжечка крысы под влиянием тиролиберина в дозе 1018 М:

А - исходная ИА;

Б.В.Г. - ИА под влиянием тиролиберина;

Д - восстановление И А после отмывки

сические свойства оказались более выраженными, чем у ГОМК (рис.4),

ИМП. АКТ.%

Рис. 4. Динамика изменений И А нейронов в срезе мозжечка крысы под влиянием гипоксии и реоксигенации:

I - с пирацетамом (10° М); 2 - без вещества; 3 - с ГОМК (10"* М).

как в период нарастающей гипоксии, так и преимущественно при реоксигенации. Следует отметить отсутствие 1-й тормозной фазы, а фаза активации возникала с увеличением частоты спайков на 120,6±0,9% и была отчетливо выражена в диапазоне от 70 до 20% 02. При относительном 0% 02 ИА снизилась лишь на 60%. Реоксигенация привела к очень быстрому восстановлению ИА, а 70%-е восстановление ИА наблюдалось уже при 20% 02

Таким образом, пирацетам оказался наиболее эффективным по сравнению с ГОМК не только при низких значениях 02, но особенно в период реоксигенации.

На антигипоксическую активность исследовались три дозы ТРЛ (10‘14, 10~17 и 1019 М). Из них доза 10'17 М оказалась наиболее эффективной как при низких значениях 02, так и в восстановительный период (рис.5).

ИМП.АКТ.% 140

100 90 во 70 во 50 40 30 20 10

10 20 30 40 50 вО 70 80 90 ЮО

Рис. 5. Динамика изменений ИА нейронов в срезе мозжечка крысы под влиянием гипоксии, реок-

сигенации и тиролиберина в дозе 10'17 М:

1 - гипоксия с тиролиберином; 2 - гипоксия без тиролиберина.

Показано, что при относительном отсутствии 02 ИА сохранялась на 30%, 50%-й уровень И А восстанавливался при 50% кислорода, а 100%-й - при 70% 02, т.е. гораздо раньше чем без вещества.

Было показано, что защитные свойства ТРЛ в период реоксигенации оказались менее выраженными, чем у пирацетама, но более чем у ГОМК. Из рис. 4 и 5 следует, что по силе антигипоксического эффекта исследуемые вещества располагались следующим образом; пирацетам> тиролиберйн> ГОМК.

Рекомендуя данные препараты для применения в клинике в качестве антигипоксантов, следует учесть, что пирацетам обладает не только защитными свойствами при низких значениях кислорода, но и высоко эффективен в восстановительный период после гипок-сического воздействия. Поэтому его назначение при отсутствии противопоказаний предпочтительно перед другими изученными препаратами. Преимущество тиролиберина -это возможность его использования в качестве антигипоксанта в ультрамалых дозах, что позволит снизить нежелательные побочные эффекты и расширить область его применения.

По сравнению с пирацетамом и тиролиберином ГОМК, вероятно, менее предпочтителен для использования в качестве антигипоксанта. Большие дозы препарата, появление судорожной активности при его непосредственном действии на нервную ткань наряду с тормозным эффектом (под влиянием седативных доз) может ограничить его применение для коррекции гипоксических состояний мозга.

Таким образом, нейрональная модель - переживающие срезы мозжечка крыс позволили показать характер прямого, минуя гематоэнцефалический барьер, влияния некоторых биологически активных веществ на нервные клетки и провести сравнительную оценку эффективности их использования для профилактики и лечения ишемических и постише-мических состояний мозга.

Литература

1. Ашмарин И.П., Гаврюшов В.В., Иониди В.И. и др Тиролиберин нормализует церебральную циркуляцию и рСЬ у новорожденных детей. ДАН СССР. - 1990. - Т.312, - N1. - С. 241-4.

2 Власова ИГ. Агаджанян НА., Лукьянова Л.Д. Влияние некоторых фармакологических препаратов на электрическую активность срезов мозжечка в условиях гипоксии.//Фармакология и токсикология 1989. - Т L1I -N.I.- С 12-16.

3 Власова И.Г., Чепурнова Н.Е., Ефимова Е В и др. Тиролиберин - антигипоксическое действие пролонгированного характера.//Физиология человека. 1994. - Т.20 - N. 6. - С. 118-123.

4. Кожечкин С.Н Влияние тиролиберина на нейроны сенсомоторной коры головного мозга// Бюлл эксп. биологии и медицины. 1982. - Т.84/ - N10. - С.46-48.

5 Мехедова А.Я. Сравнительная оценка эффектов пирацетама и аминалона при экспериментальных неврозах у собак//Ж.высш. нервн. деят. им. Павлова. 1983. - Т.ЗЗ. - вып. 5. -С.964-966.

6. Немова Е.П., Воронина ТА. Натрия оксибутират нормализует функции центральной нервной системы в потомстве крыс, подвергшихся гипербарической гипоксии во время беременности//Экспер. и клинич. Фармакология. 1993. - Т.56 - N.6. - С.8-11.

7. Плотников М.Б.. Плотникова Т.М., Якимова ТВ. Коррекция циркуляторной гипоксии мозга после внутри-мозгового кровоизлияния с помощью натрия оксибутирата.// Фармакологическая коррекция

кислородзависимых патологических состояний. Тез. докл Всесоюзн симпоз. - М. 1984. - С. 75-76.

8. Эминя Г.И., Тимофеева Т.И Пирацетам и показатели церебральной гемодинамики липидного обмена и реологических свойств крови при начальных формах нарушения мозгового кровообращения // Ж. Невропатологии и психиатрии 1990 - N. 11. - С. 20-23.

9. Gabryel В.. Adamek М.. Pude Ко.А et nl. Piracetam and Vinprocetane exert cytoprotective activity and prevent a apoptosis of astrocytes in vitro in hypoxia and reoxygenation.//Neurotoxicology. 2002. - V.23. -N.I. - P.19-31.

10.Rauca, C. Jantze. h., Krug, M. Does fucose or piracetam modify the effect of hypoxia preconditioning against pentylenetetrazol induced seizures?// Brain Res. 2000. - V. 880. -N 1-2. i'P. 187-90.

COMPARATIVE ASSESSMENT OF THE EFFICASY CERTAIN ANTIHYPOXANTES TO RESTORATION OF NERVE

CELLS ACTIVITY AFTER HYPOXIA

I.G.VLASOVA, V.I. TORSHIN

Department of normal physiology RPFU, 117198 Moscow, Miklucho-Maklaja st. 8, Medical faculty

Comparative studies of direct influence GOMK (10"\ 5х10Л 10'3M), pirazetam (1C4 - IMM), tyroliberin (10'" - 10 20 M) on the nerve cells were carried out on a neural model - survival slices rats cerebellum under normoxia and increasing hypoxia as well as reoxigenation. it was shown polyphase of the neuron’s reaction to all investigated drugs under normoxia. All investigated drugs were systematised at cording to antihypoxic effect in the following way: pirazetam > tyroliberin> GOMK. As a result pirazetam and tyroliberin are most suitable for prevention and treatment of ishemic and postishemic brain statement.