Гематологический статус мышей, получавших пре-, про -, сим - и антибиотики

И.Е. Андрианова, В.Н. Мальцев, А. М. Уланова, Н.М. Ставракова, А.А. Иванов

ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС МЫШЕЙ, ПОЛУЧАВШИХ ПРЕ-, ПРО-, СИМ- И

АНТИБИОТИКИ

ФГБУ «Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, г. Москва

I. E. Andrianova, V.N. Maltsev, A.M. Ulanova, N.M. Stavrakova, A.A. Ivanov.

HEMATOLOGICAL STATUS OF MICE AFTER ADMINISTRATION ON PRE-, PRO, SYM- AND ANTIBIOTICS

Federal State Budgetary Enterprise Burnasyan Federal Medical Biophysical Center of the

FMBA Russia, Moscow.

Ключевые слова: бактериальные препараты, антибиотики, периферическая кровь, костный мозг, масса селезенки.

Keywords: bacterial drugs, antibiotics, peripheral blood, bone marrow, spleen mass.

Цель: Оценить влияние бактериальных препаратов и их сочетания с антибиотиками на кроветворение — критическую систему при лучевой болезни.

Материалы и методы: Анализ действия препаратов проведен на основании результатов исследований у мышей показателей периферической крови, общего количества ядросодержащих клеток в костном мозге бедренной кости и массы селезенки.

Для изучения использованы витафлор, витафлор форте, актофлор, которые вводили ин- трагастрально, гентамицин и нистатин, которые поступали с питьевой водой. Результаты: В ходе исследований после 2-кратного введения бактериальных препаратов выявлено увеличение уровня лейкоцитов в периферической крови и миелокариоцитов в костном мозге (актофлор), эритроцитов и содержания гемоглобина (витафлор), существенное снижение массы селезенки во всех группах. Применение витафлора или витафлора форте после 7-ми дней приема антибиотиков нивелировало побочное действие последних по показателю численности миелокариоцитов в костном мозге.

Выводы: Впервые показано, что бактериальные препараты, предназначенные для нормализации нарушений микрофлоры кишечника, оказывают модифицирующее действие на гематологический статус при кратковременном приеме внутрь.

Purpose: Estimation the efficiency of bacterial drugs on hematopoiesis of normal mice — critical system for radiation disease.

Material and methods: It was studied the effect of probiotic Vita/lor, prebiotic Actoflor, symbiotic Vitaflorforte and their combination with antibiotics (gentamycin, nystatin) on peripheral blood, bone marrow cells and spleen mass.

Results: Administration on bacterial drugs intragastrally once a day for 2 days increased the leucocytes count (Actoflor), erythrocytes and hemoglobin concentration (Vitaflor) in peripheral blood, significantly decreased spleen mass in all groups of mice versus control. When bacterial means were used after application antibiotics for 7 days they diminished negative influence of antibiotics on bone marrow cells number.

Conclusion: The results demonstrate that new bacterial drugs for treatment disbacteriosis have the modulating effect on the hematological states.

Введение

Известно, что в развитии многих заболеваний человека, в первую очередь иммунодефицитов, важную роль играют микробиологические нарушения, лежащие в основе дисбактериозов. Причины их возникновения разные. Формирование дисбактериозов часто происходит при длительном применении антибиотиков. Крайне тяжелым течением отличаются постлучевые дисбактериозы, которые протекают на фоне не только микробного дисбаланса, но и вследствие подавления иммунологической реактивности, серьезных изменений кроветворения. В этих условиях у пострадавших от радиационного воздействия основными средствами борьбы с инфекционными осложнениями являются антибиотики, которые в то же время вносят дополнительный вклад в нарушение указанных систем.

Разрабатывая в течение многих лет в эксперименте средства профилактики и лечения острых лучевых поражений, удалось показать, что применение различных соединений бактериальной природы (эндотоксины, полисахариды, вакцины и др.) может смягчить последствия, вызванные облучением. Эти соединения при изолированном введении или в сочетании с антибиотиками снижали смертность и ускоряли восстановление гематологических и иммунологических показателей по сравнению с антибиотиками [2, 7, 8, 10—12,14,15]. Появление в медицинской практике бактериальных препаратов нового поколения, направленных на восстановление нарушений микробного баланса, послужили основанием для использования их в комплексном лечении лучевой болезни в целях борьбы с проявлениями дисбактериоза.

Механизм действия этих препаратов достаточно сложен и далек от окончательного понимания. Помимо способности

восстанавливать количественные составы микробиоценозов они проявляют соб

ственные иммуномодулирующие свойства. Бактериальная природа новых препаратов и некоторые, связанные с упомянутыми выше соединениями, биологические эффекты позволяли предполагать наличие у них гемопоэз

— модифицирующего действия. Однако мы не встретили сведений об их влиянии на гемопоэз

— ключевое звено в патогенезе костномозговой формы острой лучевой болезни, подвергающееся также негативному воздействию антибиотиков при лечении различных патологических состояний.

Цель исследования - оценить участие системы кроветворения — критической при лучевой болезни в реакции организма на бактериальные препараты и их сочетания с антибиотиками.

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на 90 мышах самцах гибридах F,(CBA * С57В1) с исходной массой 18—22 г. Животные находились в условиях вивария в клетках по 10 голов, получали стандартный гранулированный корм и потребляли кипяченую водопроводную воду в свободном доступе. Температура в помещении поддерживалась на уровне 2 Г— 23°С.

Для исследования были выбраны следующие средства, разработанные в «Гос- НИИ ОЧБ» ФМБА России:

• пребиотик актофлор — содержит продукты обмена веществ представителей нормальной микрофлоры человека;

• пробиотик витафлор — иммунобиологический бактериальный препарат на основе жизнеспособных клеток лактобацилл Lactobacillus acidophilus',

• симбиотик витафлор форте — содержит

живые лактобациллы и актофлор; а также:

• гентамицин - широко используемый в экспериментах на животных малоаб-сорбируемый антибиотик с широким спектром деконтаминирующего дей

ствия на большинство представителей микрофлоры кишечника; • нистатин — противогрибковый антибиотик.

Бактериальные препараты растворяли в водопроводной воде и вводили дважды внутрижелудочно через канюли один раз в сутки в объеме 0,2 мл. В указанном объеме витафлора и витафлора форте содержалось 20 млн. лактобацилл, актоф- лора — 0,04 мл исходного безмикробного продукта.

.Антибиотики мыши лшгучали в течение 7 дней с питьевой водой. Содержание тентами цина в 1 мл составляло 1,6 мг, нистатина — 7500 ед. С учетом выпиваемой в сутки каждой мышью воды (2-3 мл) доза гентамицина соответствовала 3,2—4,8 мг, нистатина — 15000—22500 ед. Бактериальные препараты назначали двукратно на 1-е и 2-е сут после отмены антибиотиков. Схема введения препаратов и их дозировка были отработаны ранее на модели экспериментального постлучевого дисбактериоза.

Контрольные животные вместо лечебных средств получали кипяченую водопроводную воду.

Оценку влияния препаратов на кро -ветворение производили по показателям периферической крови (эритроциты,

гемоглобин, показатель гематокрита, средний объем эритроцитов, тромбоциты, лейкоциты), количеству ядросодержащих клеток костного мозга в бедренной кости и массе селезенки. Для этих целей животных умерщвляли путем де-капитации по 5 мышей из группы на следующий день после отмены антибиотиков и на 1-е, 2-е сутки после приема препаратов (актофлор, витафлор и витафлор форте). В качестве контроля использовали показатели интактных мышей, забитых в те же сроки.

Показатели периферической крови определяли на гематологическом анализаторе А1соп 7 (ФРГ), содержание миело-

кариоцитов в бедренной кости — по общепринятой методике, массу селезенки — путем взвешивания на электронных весах Adventurer (Ohaus).

Все эксперименты проведены с учетом требований биоэтики по отношению к животным данного вида.

Для статистической обработки использовались критерий Стъюдента и компьютерная программа Биостат.

Результаты исследований

Проведенные исследования показали, что при изолированном двукратном введении внутрь бактериальные препараты вызывали изменения некоторых показателей гемопоэза.

Как видно из таблицы 1, в группе с актофлором наблюдалось более выраженное по сравнению с другими препаратами повышение уровня лейкоцитов в периферической крови (4,2±0,4х109/л) и количества ядросодержащих клеток в костном мозге (35,4±2,2хЮ6 и 32,4±4,2ХЮ6 на 1—2-е сут). В контроле аналогичные показатели составляли 2,6+0,4х КГ/л и 23,9+1,6x106. Введение витафлора сопровождалось незначительным, но статистически значимым увеличением числа эритроцитов и содержания гемоглобина. На 1 -е—2-е сут значения этих показателей находились соответственно на уровне 7,9+0,22 и 7,7±0,24хЮ|2/л (в контроле 6,9±0,24хЮ|2/л); 18,6+0,9 и 17,9+0,1 г % (в контроле 16,2+0,2 г %).

Существенные различия отмечены при учете массы селезенки, которая во всех группах в той или иной мере была ниже, чем у контрольных. Наиболее низкая масса органа зафиксирована у мышей, получавших витафлор, причем на оба срока исследования (41+9,2 и 42+3,4 мг) различия достоверны по сравнению с контролем (79+9,9 мг) (рис. 1). Та же направленность изменений наблюдалась при анализе весовых индексов органа у мышей различных групп.

Таблица 1

Гематологические показатели (М+т) мышей, получавших бактериальные препараты

"и м § & £ " о в в о

,в а то ор т

Сроки исследования (су Группа Эритроциты, х10|2/л Гемоглобин, г% Средний объем эритроците Показатель гематокрит Тромбоциты, хЮ'/л Количество миелокариоци костном мозге, х 106/бед Масса селезенки, мг

Витафлор 7,9+0,22* 18,6+0,9* 49+0,43 39+1,3 825,8+83,9 3,48+1,05 27,7+3,7 41+9,2*

1 Витафлор форте 7,3+1,72 17±0,71 48,5+0,22 36+0,86 890,8+17,6 3,04+0,6 26,5+2,1 57,6+5,2

Актофлор 7,5±0,3 17,2±0,73 49+0,43 38+1,72 814,4+7,3 4,2+0,4* 35,4+2,2* 62,4+6,45

Витафлор 7,7±0,24* 17,9±0,1 * 49,6+2,37 39,6+3,87 683+74 4,2+0,9 24,3+2,8 42+3,4*

2 Витафлор форте 7,1+0,26 16,5+0,54 47,6+0,43 34+1,72 759+45 2,7+0,37 29,9+7,35 71,8+3,2

Актофлор 7,6±0,3 17,9±0,49* 48+0,43 36,6+1,72 838+19,4 3,3+0,5 32,4+4,2* 69+6,0

Контроль 6,9±0,24 16,2+0,19 48+0,22 33,4+0,86 863,8+27,3 2,6+0,4 23,9+1,6 79+9,9

Примечание * - различия с контрольной группой статистически достоверны, р<0,05

Быстрота развития и кратковременность обнаруженных изменений объясняется, по-видимому, перераспределительной реакцией, так как уже на следующие сутки у большинства мышей масса селезенки возвращалась к исходным значениям. После введения витафлора, как уже было отмечено выше, уменьшение массы селезенки сопровождалось увеличением численности эритроцитов и содержания гемоглобина, тогда как реакция на актоф- лор характеризовалась повышением количества лейкоцитов и миелокариоцитов в костном мозге.

Результаты изучения гематологических показателей у мышей, которым бактериальные препараты назначались двукратно после окончания 7-дневного курса антибиотиков, представлены в таблице 2.

Проведенные исследования показали, что использованная схема применения препаратов не оказала какого-либо влияния на количество эритроцитов, на

сыщенность их гемоглобином и содержание тромбоцитов. Средние уровни лейкоцитов во всех группах, которым вводили лекарственные средства, колебались незначительно.

Достоверное снижение (до 3,34+ 0,34х 109/л) по отношению к контролю (4,96+0,45х109/л) зарегистрировано на 1-е сутки только у мышей, получавших антибиотики с витафлором форте.

Общее количество миелокариоцитов в костном мозге через 1—2 сут после отмены антибиотиков, достоверно снижалось по сравнению с контролем. Витаф- лор и витафлор форте смягчали этот эффект (на 1—2-е сут), тогда как актофлор не оказал подобного действия. На 2-е сутки у мышей, получавших актофлор, имело место заметное снижение ядросодержащих клеток (до 20,0+1,6хЮ6, в контроле 26,7+0,26х106; /КО, 05).

Как и в первой серии опытов, наиболее отчетливые изменения отмечены по массе селезенки (рис. 2).

Примечание * - различия с контрольной группой статистически достоверны, /><0,05

Таблица 2

Гематологические показатели (М+т) мышей, получавших бактериальные препараты

Сутки после введения бактериальных препаратов Группа Эритроциты, х10|2/л Гемоглобин, г% Средний объем эритроцитов, мк3 Показатель гематокрита 1 Тромбоциты, хЮ'/л Лейкоциты, хЮ'/л Количество миелокариоцитов в костном мозге, х 10''/бедро

4 0 Антибиотики 7,6±0,5 16,5+0,4 49+0,43 38± 1,3 788,6±28,4 4,3±0,62 26,0± 1,46

Антибиотики 7,7±0,1 1 8,6±0,19 45,2± 1,29 37±0,86 . 826+64,3 3,96±0,75 22,8± 1,72*

1 Антибиотики + витафлор 7,5+0,19 17,1+0,34 48+0,43 36± 1.08 785,4±52,6 3,56+0,6 24,4±3,9

Антибиотики + витафлор форте 7,2±0,2б 16,8+0,6 47,4±0,22 34,2+1,29 783±79 3,34±0,34* 25,0+0,99

Антибиотики + актофлор 7,4±0,28 17,0±0,43 47,2±0,22 36,4±1,5 764,4±90,5 3,8±1,44 27,8+2,75

Антибиотики 7,46±0,1 18,0+0,26 47,6+0,43 36,0+0,65 729+124,5 4,2±0,45 22,9± 1,0

Антибиотики + витафлор 7,4±0,1 16,7+0,15 47+0,43 35+0,86 763+45,2 4,2+1,14 27,2+2,37

2 Антибиотики + витафлор форте 7,3+0,37 17,7+0,62 47,4+0,86 34,6±2,37 811±42 3,9±0.37 30,8+1.3

Антибиотики + актофлор 7,4+0,17 17,1 ±0,43 47 ±0,43 35± 1,08 814±64 4,1+0,73 20,0±1,6*

Контроль 7,5+0,17 16,5+0,15 48,6±0,43 36,6+0,86 778±21,7 4,96±0,45 26,7+0,26

Этот показатель под действием при -менявшихся средств был снижен во всех группах. Достоверные различия (при /КО,05) проявились между контрольными животными (87,6=5=6,0 мг) и группами, в которых применялись антибиотики изолированно (65,8±4,5 мг, 2-е сут) или сочетались с витафлором (65,8±4,1 мг, 1 -е сут), с витафлором форте (63,0±7,3 мг, 2-е сут) или актофлором (68,4±5,2 мг, 2-е сут).

Полученные результаты показывают, что при выбранном режиме назначения антибиотики, про-, пре- и симби- отики не вызывали стабильных изменений показателей эритропоэза в перифе

рической крови и общего числа тромбоцитов. Снижение массы селезенки, отчетливая тенденция той же направленности, прослеживаемая по численности

миелокариоцитов в костном мозге, и эпизодическое уменьшение количества лейкоцитов в отдельных группах указывают, вероятно, на перераспределительный характер этих изменений. Не исключено и побочное действие антибиотиков, которое, судя по содержанию ка- риоцитов в костном мозге, в определенной мере нивелировалось благодаря применению бактерийных препаратов.

Время после начала поения бактериальными препаратами, суг

Рис. 1. Изменение массы селезенки после приема бактериальных препаратов Обозначения: А — контроль, Б — Витафлор, В — Витафлор форте, Г - Актофлор,

* - статистически значимая разница по сравнению с контролем, р<0,05.

Ромбиками обозначены границы доверительных интервалов средней арифметической.

Заключение

В результате проведенных экспериментов обнаружены новые факты, свидетельствующие о том, что изученные препараты, предназначенные для нормализации микрофлоры кишечника и стимуляции иммунитета, способны оказывать модифицирующее влияние на кроветворение при изолированном применении и смягчать негативные эффекты антибиотиков. Как уже было отмечено, эти препараты созданы на основе представителей нормальной микрофлоры кишечника и продуктов их жизнедеятельности, которые, по многочисленным данным литературы, обладают выраженными стимулирующими кроветворение свойствами, способствуя выработке различных эндогенных регуляторов гемопоэза и иммунитета [2,5,14]. Можно предположить, что изученные бактериальные пре-, про- и сим- биотики при введении внутрь также действуют сходным образом — путем индук

12 1 X 1 2 12

Время посче начала поения бактериальными препаратами , сут

Рис. 2 Изменение массы селезенки после приёма антибиотиков вместе с бактериальными препаратами.

Обозначения: А — контроль,

Б — антибиотики + Витафлор, В — антибиотики + Витафлор форте, Г— антибиотики + Актофлор, Д— антибиотики;

* — статистически значимая разница по сравнению с контролем, р<0,05.

Ромбиками обозначены границы доверительных интервалов средней арифметической.

ции разного рода цитокинов. Показано, что интрагастральное введение животным пробиотиков вызывает экспрессию генов провоспалительных цитокинов, таких как интерферон-а, интерлейкин-12, интерлейкин-6, фактор некроза опухолей-а [4]. Отмечается, что один из важных элементов механизма протективного и иммуномодулирующего действия пробиотиков при приеме внутрь заключается в их способности влиять через дендритные клетки на выработку цитокинов индукторной области местной иммунной системы [3]. Влияние на кроветворение может быть обусловлено пептидогликаном клеточных стенок микробов (мурамилдипепти- дом и нуклеинсодержащими компонентами).

Фрагменты переваривания пептидо- гликана всасываются в кишечнике, достигают пейеровых бляшек, лимфоузлов, воздействуют на рецепторную систему клеток иммунной системы, индуцируют образование цитокинов, интерферонов, стиму

лируют активность иммунокомпетентных клеток, макрофагов, усиливают фагоцитоз и синтез антител [9]. Установлено также, что мурамилдипептид и его производные активизируют гемопоэз у здоровых животных, благодаря выработке интерлейкина- 1, способствуют ускорению восстановления при лучевой и цитостатической цитопении [1,6,13].

С позиции сходства механизма действия изученных препаратов и других веществ бактериальной природы (эндотоксины, полисахариды), для которых харак- гернп pssBffTWC г&шщннзяарреских расстройств в ответ на их введение, могут объясняться и изменения массы селезенки, наблюдавшиеся в наших экспериментах.

Полученные данные расширяют существующие представления о биологических свойствах бактериальных препаратов нового поколения для борьбы с дисбактериозом, указывают на их способность при приеме внутрь активировать гемопоэз и в некоторой степени смягчать отдельные негативные проявления побочных эффектов антибиотиков. Наряду с имеющимся клиническим опытом, приведенные результаты могут служить дополнительным обоснованием

целесообразности использования подобных сочетаний в практике лечения инфекционных осложнений различного генеза, в том числе и при острой лучевой болезни.

Литература

1. Андрианова И.Е., Филимонова Г.И.,

- Андронова Т.М. Влияние иммуномо-дулятора глюкозаминилмурамилди- пептида на кроветворение мышей с

экспериментальной цитопенией //Радиобиология. 1992. — Т. 32, вып. 4, - С. 566570.

2. Андрущенко В.Н., Мальцев В.Н., Иванов A.A. Противолучевое действие веществ микробного происхождения // Радиационная биология. Радиоэкология. 1996. - Т. 36, вып. 2. - С. 195-207.

3. Бактериальные пробиотики: биотехнология, клиника, алгоритм выбора / Л.Н. Петров, Н.Б. Вербицкая, В.П. До- брица и др. C-Пб: ООО «ИИЦ ВМА», ООО «Бастион». 2008.

— 136 с.

4. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Наров-линский А.Н. Влияние бактерий рода Lactobacillus на продукцию цитокинов клетками пейеровых бляшек экспериментальных животных //Иммунология. 2004.

- № 5. - С. 288-290.

5. Лебедев В.Г., Мороз Б.Б., Воротникова Т.В., Дешевой Ю.Б. Исследование клеточных и гуморальных механизмов радиозащитного действия проди- гиозана и индометофена на длительных культурах костного мозга мышей //Патофизиология и эксперим. терапия. 2000. - №3, - С. 10-14.

6. Никитин А. В. Иммуномодуляторы природного происхождения и их синтетические аналоги //ВИНИТИ. Серия «Иммунология». 1986. — Т. 17. — С. 62-86.

7. Пинегин Б.В., Коршунов В.М., Иванова Н.П., Мальцев В.Н. Влияние сочетанного применения антибиотикоустойчивых бифидумбактерий и соответствующих антибиотиков на выживаемость облученных мышей //Журнал микробиолог., эпидемилог. и иммунолог. 1982. - № 5 — С. 50 —53.

8. Разоренова В.А., Андрианова И.Е., Вернигорова Л.А., Мальцев В.Н. Микробные гексозаны как неспецифические стимуляторы резистентности организма //В сб. «Клиническое применение зимозана и изучение механизма его действия». Рига, РМИ. 1982. — С. 157-161. л

9. Спивак Н.Я., Лазаренко Л.Н., Тиио=- шок Н.А. и др. Пробиотики как модификаторы иммунного ответа //Аллергология и иммунология. 2008. — Т. 9. №

3. - С. 355-358.

10. Чертков К.С., Андрианова И.Е., Ата-манова О.М. и др. Течение восстано -вительных процессов в отдаленный период после лучевого поражения у собак, получивших различные терапевтические средства //Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях. Тезисы докл. X научн. конф. С -1Т6.1992. - С. 206-208.

11. Ainsworth E.J. From endotoxins to newer immunomodulators: survival-promoting effects of microbiol polysaccharide complexes in radiated animals //Pharmac. Ther. 1988. - V. 39. - P. 223-241.

12. Behling U. //Beneficial effects of endotoxins N.Y.; Pergamon Press. 1983. - P. 127-148.

13. Nakajima R., Ishida J., Jamaguci F. et al. Beneficial effects of Muroctasin // Azzneim. Forschung /Drug. Res. BRd. 1988. - V. 38. - № 7a. - P. 986-992.

14. Pospisil M. Pharmacological radiation protection //In: Fundamental for the assessment of riskus from environmental radiation. Netherlands. 1999. — P. 411— 420.

15. Jamaguchi F., Akasaki M., Tsukada W. Induction of Colonystimulating factor and stimulation of stem cell proliferation by injection of muroctasin // Azzneim. Forschung. /Drug. Res. 1988. - V. 38 (II) - № 7a - P. 980983.

информация --------------------------------------------------------------------------------------

Российский медцентр в Лондоне: при обращениях спортсменов доминируют хронические травмы и микротравмы

Медицинский центр в Олимпийской деревне работал с восьми утра до двенадцати ночи, медицинскую помощь спортсменам оказывали 6 медицинских работников ФМБА России. Врачи по спортивной медицине, невролог, физиотерапевт, массажист. Работой центра руководит профессор Сергей Архипов.

Чаще всего спортсмены обращались за медицинской помощью с хроническими травмами и свежими микротравмами. В основном это проблемы с суставами (плечевыми, коленными, голеностопными). Ежедневно в медцентре Олимпийской деревни фиксировалось более 30 обращений.

Руководитель медицинской службы олимпийских команд России Юлия Мирошникова подчеркивает, что во всех трех медицинских центрах есть современная физиотерапевтическая аппаратура (включающая ударноволновую терапию) и эффективные разрешенные фармакологические препараты. При необходимости специалисты медцентра направляли спортсменов на дополнительные обследования в Интернациональную поликлинику в Олимпийской деревне, а также оформляли разрешение на лечение с применением препаратов, не входящих в список допустимых.

Эффективная работа медиков позволила тяжелоатлетке Светлане Царукаевой завоевать серебро в своей весовой категории - по признанию спортсменки, за несколько дней до выступления она испытывала серьезные проблемы со здоровьем, и только действия врачей позволили ей принять участие в соревнованиях.

Профессор Сергей Архипов указывает на важность и своевременность удаления межпозвоночной грыжи у тяжелоатлета Хаджимурата Акаева: «Мы спасли его не только как человека, но и как спортсмена».