Абзимная активность у больных с хирургической инфекцией

АБЗИМНАЯ АКТИВНОСТЬ У БОЛЬНЫХ С ХИРУРГИЧЕСКОЙ

ИНФЕКЦИЕЙ

СЕНЬКОВИЧ С.А.

Витебская городская центральная клиническая больница

Резюме. Наша работа посвящена исследованию собственной ферментной активности иммуноглобулинов у лиц с хирургической инфекцией. а также изучению зависимости активности от вида микроорганизма. вызвавшего патологический процесс. Очистка иммуноглобулинов проводилась риванол-сульфатным методом с использованием афинной хроматографии на стафиллакокковом протеине А. Были исследованы БАПНА-амидазная и ДНК-азная активность иммуноглобулинов. В результате исследования было выявлено достоверное повышение уровня собственной ферментной активности иммуноглобулинов у хирургических больных с гнойными процессами в сравнении с контрольной группой. Не было выявлено зависимости уровня абзимной активности от вида микроорганизма - возбудителя хирургической инфекции. Таким образом. в результате нашего исследования получены данные. которые могут вносить новое понимание в патогенез гнойной хирургической инфекции.

Ключевые слова: абзимная активность. хирургическая инфекция.

Abstract. Our research is devoted to the investigation of inner enzyme activity of immunoglobulins in patients with surgical infection and dependence of this activity on the type of microorganism that causes the pathological process. The purification of immunoglobulins was made by rivanol sulphate including affinity chromatography on staphylococcal protein А. In our research we also examined BAPNA-amidase and DNA-se activities of immunoglobulins. As the result of the investigations we revealed the increase of the level of immunoglobulin abzyme activity in surgical patients with suppurative processes in comparison with control group. We didn’t reveal any dependence of inner enzyme activity on the type of microorganism - causative agent of surgical infection. Thus it can be concluded that the result of our investigations may invest new understanding into pathogenesis of suppurative surgical infection.

Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь. г. Витебск. ул. Берестеня 40. кв.8 Тел. 24-71-84. 8-0295-19-30-78

Изучение механизмов реакции макроорганизма на инвазию инфекционного агента не утрачивает актуальности. т.к. знание этих механизмов необходимо для понимания патогенеза различных заболеваний и разработки эффективных схем их лечения. Иммунная система воспринимает микроорганизм как набор антигенов и отвечает выработкой соответствующих иммуноглобулинов и иммунных Т-клеток. На ферменты. продуцируемые микроорганизмами. вырабатываются антитела. активный центр которых является как бы зеркальным отражением активного центра фермента. Далее за счет реализации идиотип-антиидиотипического механизма (согласно теории иммунной сети Ерне) [1. 2] образуются антитела второго порядка. активный центр которых подобен активному центру фермента. Такие антитела могут обладать свойством катализировать химические реакции. Помимо описанного варианта. образование антител с собственной ферментной активностью (абзимов) может происходить при иммунизации организма стабильными аналогами переходных состояний химических реакций. при ковалентном присоединении единичных молекул ферментов к шарнирным участкам молекул иммуноглобулинов. а также за счет модификации активного центра иммуноглобулина при взаимодействии с катионами различных металлов (магния. кальция. цинка. меди). являющихся ко-ферментами различных реакций [3. 4. 5].

Впервые антитела с собственными ферментными свойствами были описаны в начале 80-х годов XX века [4. 6]. На сегодняшний день доказано возникновение высокооктивных абзимов у лиц с системными заболеваниями соединительной ткани (системная красная волчанка. склеродермия. ревматоидный артрит и т.п.). геликобактерных гастродуоденитах [4. 6. 7. 8]. Доказано

участие абзимов в патогенезе системных заболеваний соединительной ткани [4]. В то же время. существует мнение. что каталитическая инактивация антигенов представляется гораздо более эффективной. чем обычное образование иммунного комплекса. в результате чего абзимы могут оказывать положительное или отрицательное влияние на развитие инфекционного процесса [9].

При возникновении гнойного процесса происходит массивный выброс различных ферментов в кровеносное русло. что в соответствии с теорией иммунной сети может привести к возникновению антител с собственной ферментативной активностью.

Таким образом. целью нашего исследования явилось изучение абзимной активность у лиц с хирургической инфекцией и ее связь с видом микроорганизма. вызвавшего гнойный процесс.

Методы

Выделение (иммуноглобулинов) проводилось в несколько этапов. Пер-

вый этап - осаждение сыворотки крови 0.75% раствором риванола с последующей обработкой надосадка активированным углем [10]. Далее проводилась аффинная хроматография полученного материала на агарозе. конъюгированной с протеином А золотистого стафилококка. Этот белок селективно сорбирует на себе иммуноглобулины О подклассов 1. 2. 4. Хроматографическую колонку последовательно отмывали 0.01 М фосфатным буферным раствором рН 7.4. содержащим 1% раствор твин 20 и 0.01 М фосфатным буферным раствором с рН

7.4 без детергента до исчезновения белка в элюенте. что контролировали методом Бредфорда. Элюцию связавшихся c коньюгированным протеином А IgG вели 0.1 М глицин-НО буфером. рН 2.8. Элюция контролировалась по выходу белка с использованием метода Бредфорда [11]. Полученные Ig концентрировали и дополнительно очищали переосаждением в 40% растворе сульфата аммония. растворяли в 2 мл дистиллированной воды и проводили диализ против 2.5 л 0.9% NaCl четыре раза.

Проверку чистоты Ig проводили с помощью электрофореза в 10% и градиентном от 4 до 20% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. а гель окрашивали Кумасси R250 или нитратом серебра. Контроль стерильности материала осуществлялась посевом проб иммуноглобулинов на кровяной агар.

Определение бензоиларгинин-р-нитроанилид (БАПНА) - амидазной активности иммуноглобулинов проводили по методу Эрлангера в нашей модификации [12]. В качестве субстрата протеолиза использовали бензоиларгинин-р-нитроанилид. Распад этого субстрата происходит только в результате расщепления амидной (аналога пептидной) связи по аминокислотам аргинин-лизин. Реакционная смесь содержала Ig G в концентрации 0.75 мг/мл и БАПНА в концентрации 0.4 мг/мл. Концентрацию иммуноглобулинов определяли спектрофотометрически по степени поглощения при длине волны 280 мкм. Учет результатов реакции осуществлялся после 20-ти часовой инкубации при температуре 37.6°С на иммуноферментном анализаторе при длине волны 410 нм. В качестве отрицательного контроля вместо Ig использовался стерильный физиологический раствор.

Для пересчета полученного результата в пикокаталы использовалась формула У=0.028+11хБоп. где Y - искомый результат. Еоп - оптическая плотность пробы минус оптическая плотность контроля. Формула была выведена на основе определения зависимости оптической плотности от молярной концентрации р-нитроанилида в растворе (при распаде 1 молекулы БАПНА образуется 1 молекула р-нитроанилида). Т. о. был получен калибровочный график представляющий собой линейную зависимость с коэффициентом корреляции 0.998.

Для определения ДНК-азной активности IgG сыворотки крови в качестве субстрата использовали дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК. Sigma). Активность иммуноглобулинов определяли в условных единицах по уменьшению образования сгустка ДНК [13]. Опыт проводили следующим образом: после суточной инкубации при температуре 37.6°С реакционной смеси. содержащей ДНК в концентрации 0.166 мг/мл. IgG в концентрации 0.25 мг/мл. 0.001 М Mg(Cl)2 на трис-HCI буфере. рН 7.4. 0.02 М в пробирки добавляли по 0.02 мл

0.75% раствора риванола и встряхивали их. Образовавшийся сгусток отмывали дистиллированной водой и растворяли в 0.5 мл 1 N HCl (подогревая на спиртовке до полного растворения). Объем пробы доводили до 2 мл дистиллированной водой и измеряли ее оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 410 нм. В качестве отрицательного контроля вместо раствора иммуноглобулинов использовался стерильный физиологический раствор.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

При исследовании БАПНА-амидазной и ДНК-азной активности иммуноглобулинов все обследованные были разделены на пять групп: больные хроническим остеомиелитом. больные с различными острыми хирургическими гнойно-воспалительными процессами (панариции. абсцессы. флегмоны различной локализации и т. п.). лица с инфекцией челюстно-лицевой области. больные с различными заболеваниями щитовидной железы (тиреоидит. токсический зоб) и контрольная группа - лица прооперированные по поводу хирургической патологии без гнойно-воспалительных процессов. В результате исследования выявлено. что у лиц с гнойно-воспалительными процессами уровень БАПНА-амидазной активности иммуноглобулинов был достоверно выше. чем в контрольной (табл.1). Выделение группы лиц с заболеваниями щитовидной железы связано с тем. что в литературе имеются данные о повышенном уровне БАП-НА-амидазной и ДНК-азной активности у таких больных [4].

Таблица 1

БАПНА-амидазная активность иммуноглобулинов

N Группа п Активность средняя

1 Хронический остеомиелит 39 0.316+0.063

2 Острые гнойные заболевания 52 0.379+0.075

3 Инфекция челюстно-лицевой области 28 0.278+0.036

4 Заболевания щитовидной железы 15 0.176+0.042

5 Контроль 32 0.199+0.029

Достоверность отличия

Р1-5<0.05

Р2-5<0.05

Р3-5<0.05

Р4-5>0.05

* Между остальными группами достоверных отличий не выявлено (р>0.05).

При исследовании зависимости БАПНА-амидазной активности от вида микроорганизма. вызвавшего гнойный процесс. достоверных отличий не получено (табл.2). Деление на группы было связано с уровнем БАПНА-амаидазной активности микроорганизмов: в первой группе активность высокая. во второй средняя. в третьей отсутствует [12].

Таблица 2

БАПНА-амидазная активность иммуноглобулинов в зависимости от этиологического фактора гнойно-воспалительного процесса

N Группа п Активность средняя Достоверность отличия

1 Синегнойная палочка 11 0.210+0.058 Р>0.05

2 Грамотрицательные палочки 11 0.210+0.104

3 Стафиллококки 11 0.227+0.046

При исследовании ДНК-азной активности иммуноглобулинов было установлено. что у лиц с остеомиелитом средний уровень ДНК-азной активности был достоверно выше. чем у лиц контрольной группы и лиц с инфекцией челюстно-лицевой области. Между остальными группами достоверных отличий не обнаружено (табл.3).

Таблица 3

ДНК-азная активность иммуноглобулинов

N Группа n Активность средняя

1 Хронический остеомиелит 30 33.76+6.23

2 Острые гнойные заболевания 25 22.28+4.33

3 Инфекция челюстно-лицевой области 27 13.29+2.54

4 Заболевания щитовидной железы 17 18.64+3.88

5 Контроль 19 12.36+3.31

Достоверность отличия

P1-5<0.01

P1-3<0.01

* Между остальными группами достоверных отличий не выявлено (p>0.05).

При анализе частоты встречаемости лиц с достоверно положительной ДНК-азной активностью. т. е. такой активностью. уровень которой достоверно превышает уровень спонтанного распада субстрата в контрольных пробах были получены следующие результаты. В группах больных с гнойными процессами (за исключением группы больных с инфекцией челюстно-лицевой области) и заболеваниями щитовидной железы она оказалась достоверно выше. чем в контрольной (табл. 4).

Таблица 4

Частота лиц с достоверно положительной ДНК-азной активностью

N Группа Достоверно положительная активность Достоверность отличия

1 Хронический остеомиелит 17 (56.666%) P1-5<0.001 P1-3<0.05 P2-5<0.05 P4-5<0.01

2 Острые гнойные заболевания 9

3 Инфекция челюстно-лицевой области 7

4 Заболевания щитовидной железы 9

5 Контроль 2

* Между остальными группами достоверных отличий не выявлено (p>0.05).

При изучении зависимости уровня ДНК-азной активности иммуноглобулинов от вида микроорганизма. вызвавшего патологический процесс. достоверных отличий выявлено не было (табл. 5).

Таблица 5

ДНК-азная активность иммуноглобулинов в зависимости от вида микро-

организмов

Группа n Активность средняя Достоверность отличия Достоверно положительные

S. aureus 17 38.71+7.61 P>0.05 10 (58.82%) P>0.05

Все остальные 11 27.27+7.34 5

Выбор групп для сравнения был обусловлен тем. что наиболее частым возбудителем хирургической инфекции остается золотистый стафилококк. который обладает наиболее высокой ДНК-азной активностью из распространенных этиологических факторов гнойно-воспалительных заболеваний.

Выводы

1. БАПНА-амидазная активность иммуноглобулинов у лиц с хирургической инфекцией (во всех исследованных группах) достоверно выше. чем в контрольной группе.

2. Средний уровень ДНК-азной активности иммуноглобулинов. а также частота встречаемости лиц с достоверно положительной ДНК-азной активностью в группе больных с хроническим остеомиелитом была достоверно выше. чем в контрольной группе и в группе лиц с инфекцией челюстно-лицевой области. В группах больных с острой хирургической инфекцией и заболеваниями щитовидной железы частота лиц с достоверно положительной ДНК-азной активностью оказалась достоверно выше. чем в контрольной группе.

3. В настоящее время не выявлено достоверных отличий абзимной активности от вида микроорганизма. вызвавшего патологический процесс.

Литература

1. Иммунология: в 3 т. / У. Пол [и др.]; под ред У. Пола. - Москва. -Мир. 1988. - Т. 2. - C. 456.

2. Monroe. J. G. Anti-idiotypic antibodyes and disease / J. G. Monroe.

M. I. Green // Green Immunol. Invest. - 1986. - Vol. 15. N 3. - P. 263-286.

3. Усиление абзимной активности поликлональных IgG при взаимодействии с катионами металлов / И. И. Генералов [и др.] // Иммунопатология. аллергология. инфектология. - 2000. - № 1. - С. 40-43.

4. Генералов. И. И. Абзимная активность иммуноглобулинов /

И. И. Генералов. - Витебск: издательство ВГМУ. 2000. - С.151.

5. Щуров. Д. В. Каталитические антитела / Д. В. Щуров // Молекулярная биология. - 1997. - № 1. - С. 5-15.

6. DNA hydrolyzing autoantibodies / A. M. Shuster [et al.] // Sciense. - 1992.

- Vol. 256. N 5057. - P. 665-667.

7. ДНК - и РНК-гидролизующие антитела из крови пациентов с различными формами вирусных гепатитов / А. Г. Барановский [и др.] // Биохимия. -1997. - Т.62. № 12. - С. 1358-1366.

8. Ферментативный спектр IgG антител к Helicobacter pylori / М. Р. Конорев [и др.] // Иммунопатология. аллергология. инфектология. - 1999.

- № 1. - С. 119-125.

9. Proteolytic activity of an antibody light chain / M. Sun [et al.] // J. Immunol. - 1994. - Vol.153. N 11. - P. 5121-5126.

10. Иммунологические методы: пер. с нем. / под ред. Г. Фримеля. - Москва. Мир. - 1987. - C. 472.

11. Шишкин. С. С. Использование связывания красителей для количественного определения содержания белка в растворах / С. С. Шишкин // Вопросы медхимии. - 1982. - № 5. - С. 134-141.

12. Определение БАПНА-амидазной активности микроорганизмов. сывороток крови и иммуноглобулинов класса G: инструкция на метод. Рег. № 60101 / В. К. Окулич [и др.]. - 2002.

13. Способ определен ДНК-азной активности: пат. 1066 Респ. Беларусь. МИ 02Q 1/34. C12N 9/22. / М. Р. Конорев. К. С. Азаренок. И. И. Генералов. А. Г. Голубева (РБ); заявитель Вит. гос. мед. ун-т. - № 243 А; заявл. 06.04.93; опубл. 14.08.96.