ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ВАКЦИНА ОТ ТУБЕРКУЛЕЗА
PREVENTIVE ANTI-TUBERCULOSIS VACCINE

Область техники
Mycobacterium tuberculosis,
Настоящее изобретение относится к применению иммунотерапевтического средства, основанного на фрагментах клеточной стенки вирулентного штамма комплекса  для получения лекарственного средства для профилактического лечения туберкулеза.
Предшествующий уровень техники
Mycobacterium tuberculosis
M. tuberculosis, M. bovis, M. microti
M. africanum.
Туберкулез представляет собой хроническое инфекционное заболевание, вызываемое бациллами комплекса  (МТВ-С), который в настоящее время включает виды и
В соответствии с данными Всемирной организации здравоохранения во всем мире каждый год регистрируется 8000000 новых случаев развития заболевания, и около 3000000 людей умирают. Предполагают, что во всем мире инфицировано более чем 2000000000 людей и что каждый год появляется около 90-100 миллионов новых заболевших.
M. bovis
Существующая в настоящее время вакцина, которую используют в профилактическом лечении туберкулеза, основана на бактериях штамма, называемого БЦЖ (BCG) (Bacillus Calmette-Guerin), ослабленного варианта .
Mycobacterium
В области техники описаны различные вакцины против туберкулеза, основанные на фрагментах клеточной стенки вирулентных или авирулентных штаммов . Также описано, что добавка, используемая в композиции вакцины, существенно влияет на ее эффективность.
В E. Ribi et al., Nature, 1963, 198, с. 1214-1215, описаны исследования иммунизации, проводимой с помощью композиции, включающей фрагменты клеточной стенки авирулентного штамма БЦЖ и минеральное масло. Указанные фрагменты получают гомогенизацией культуры упомянутого штамма в минеральном масле. Композиция является более эффективной, чем обычная вакцина (БЦЖ). Однако в той же самой статье описано, что фрагменты клеточной стенки не вызывают какого-либо иммунологического ответа при их получении гомогенизацией в воде и в отсутствие минерального масла.
37
В D.P. Pal et al., Indian J. Med. Res. 1977, 65, с. 340-345, описана вакцина, полученная из фрагментов клеточной стенки вирулентного штамма HRv и минерального масла. В таком случае фрагменты клеточной стенки получают посредством гомогенизации мертвых клеток в водной фазе и впоследствии к композиции добавляют минеральное масло. Также описано, что фрагменты клеточной стенки, гомогенизированные в водной фазе, не являются иммуногенными, и, чтобы вакцина была эффективной, необходимо присутствие минерального масла.
37
M. tuberculosis
В G.K. Khuller et al., Folia Microbiol., 1992, 37, с. 407-412, описана защитная эффективность различных фракций клеточной стенки авирулентного штамма HRv , рецептированных с неполным адъювантом Фрейнда, который также включает минеральное масло.
37
M. tuberculosis
В E.M. Agger et al., Scand.J.Immunol., 2002, 56, с. 443-447, описаны вакцины, включающие фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма HRv, которые являются эффективными, когда содержат в качестве адъюванта катионное поверхностно-активное вещество бромид диметилдиоктадециламмония. Также описано, что исследования, проводимые с гомогенизированными бактериями , которые не содержали упомянутого адъюванта, не создавали устойчивости против туберкулеза в модели на мышах.
В I.M. Orme Vaccine, 2006, 24, с. 2-19, которая является последней обзорной статьей о новых вакцинах против туберкулеза, описано, что обычная вакцина БЦЖ является по существу неэффективной в защите взрослых людей от туберкулеза. В той же статье указано, что проанализированы и ожидают дальнейших разработок несколько кандидатов различных типов вакцин (субъединичные вакцины с белками, вакцины с ДНК, вакцины, комбинированные с вирусом, вакцины с рекомбинантными штаммами).
M. tuberculosis
Следовательно, необходимо иметь профилактическую вакцину для предотвращения инфекций, вызванных , которая более эффективна, чем существующие в настоящее время вакцины на основании ослабленного штамма БЦЖ.
Цель изобретения
M. tuberculosis.
Целью настоящего изобретения является применение иммунотерапевтического средства, включающего фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма МТВ-С, для получения лекарственного средства для профилактического лечения инфекций, вызванных
Подробное описание изобретения
Mycobacterium tuberculosis
В патентной заявке ES2231037-A1 описан метод получения иммунотерапевтического средства, включающего фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма комплекса  (МТВ-С). В ней также описаны композиции, содержащие его, и их терапевтическое применение для комбинированного лечения туберкулеза в сочетании с другими лекарственными средствами.
Авторы настоящего изобретения нашли применение указанного иммунотерапевтического средства для получения лекарственного средства для профилактического лечения туберкулеза.
Mycobacterium tuberculosis
Следовательно, целью настоящего изобретения является применение иммунотерапевтического средства, содержащего фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма комплекса  (МТВ-С), для получения лекарственного средства для профилактического лечения туберкулеза, где указанное средство получают методом, включающим следующие стадии:
культивирование вирулентного штамма МТВ-С в течение периода, равного или большего чем три недели, и затем
гомогенизирование культуры клеток в присутствии неионного поверхностно-активного вещества.
37
Вирулентным штаммом может быть любой вирулентный штамм МТВ-С. Одним из штаммов, наиболее используемым исследователями в этой области, является HRv, который, например, может быть легко получен из Национальной коллекции типов культур (NCTC), Лондон, Великобритания (номер хранения NC007416).
Вирулентный штамм может быть культивирован путем инокуляции в культуральной среде, хорошо известной специалисту в области техники, например, агар Middlebrook 7H10 или 7Н11, среда Sauton или среда Proskauer-Beck.
Культивирование вирулентного штамма проводили в течение периода, равного или большего чем три недели, предпочтительно составляющего от 3 до 4 недель. Температуру культивирования предпочтительно поддерживали между 34°С и 38°С.
При завершении культивирования клетки выделяли с использованием методик, таких как описанные, например, в патентной заявке ES2231037-A1.
Гомогенизацию живых клеток проводили в присутствии неионного поверхностно-активного вещества предпочтительно в забуференной среде при нейтральном уровне рН, например, при рН, составляющем от 6 до 8, например, представленной буфером PBS (фосфатный буферный раствор).
Гомогенизацию можно проводить посредством обработки ультразвуком или с использованием небольших шариков приблизительно 1 мм в диаметре, например, шариков диоксида кремния или циркония/диоксида кремния, вместе с механическим гомогенизатором. Механическим гомогенизатором, который может быть использован, например, является модель BioSpec BeadBeater.
Клетки МТВ-С разрушают посредством такого процесса гомогенизации и получают мелкие обломки клеточной стенки.
Тип неионного поверхностно-активного вещества, используемого в процессе гомогенизации, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из этоксилатов алкилфенола, этоксилатов сложных эфиров сорбита и их смесей.
Более предпочтительно, неионное поверхностно-активное вещество выбирают из группы, состоящей из этоксилатов октилфенола. Более предпочтительно, используют этоксилаты октилфенола с содержанием этиленоксида, составляющим от 7 до 8 моль, такие поверхностно-активные вещества могут быть обнаружены на рынке под наименованием Triton X-114.
Содержание неионного поверхностно-активного вещества на стадии гомогенизации составляет предпочтительно между 1 и 10% по массе в отношении общей массы гомогената, более предпочтительно, между 3% и 6 масс.%.
Гомогенизированную массу, содержащую фрагменты клеточной стенки, подвергают обычной обработке для отделения и удаления нефрагментированных клеток и растворенных компонентов. Например, могут быть использованы центрифугирование при различной скорости и промывка буферным раствором, как описано в патентной заявке ES2231037-A1. Осадок, содержащий фрагменты клеточной стенки, получают после проведения упомянутого процесса очистки. Указанный осадок диспергируют в буфере PBS и подвергают обычной обработке для обеспечения полной инактивации клеток МТВ-С, которые могут оставаться жизнеспособными после процесса фрагментации и очистки. Упомянутой обработкой может быть химический процесс, например, обработка формальдегидом, или физический процесс, например, автоклавирование или обработка пастеризацией.
Дисперсия фрагментов клеток в PBS буфере, полученная после инактивационной обработки, для облегчения хранения может быть лиофилизирована. Для этого дисперсия может быть помещена во флаконы и лиофилизирована при температуре между -15°С и -25°С и в вакууме, составляющем от 0,1 до 0,4 мбар.
Флаконы, полученные после процесса лиофилизации, содержат иммунотерапевтическое средство, включающее фрагменты клеточной стенки MTB-C, и их обычно хранят при очень низких температурах, например, при -70°С.
Как указано ранее, целью изобретения является применение иммунотерапевтического средства, включающего фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма МТВ-С, для получения лекарственного средства для профилактического лечения туберкулеза, т.е. для получения профилактической вакцины от туберкулеза.
Лекарственное средство для профилактического лечения туберкулеза включает иммунотерапевтическое средство, основанное на фрагментах клеточной стенки и, необязательно, фармацевтически приемлемые разбавители, адъюванты и/или вспомогательные вещества. Лекарственное средство может быть в форме фосфатного буферного раствора, водного раствора, эмульсии или в форме липосом.
Лекарственное средство предпочтительно находится в форме липосом.
Липосомы могут быть получены с использованием обычных вспомогательных липидов и методик, хорошо известных специалисту в области техники, таких как описанные в патентной заявке ES2231037-A1.
Липосомы обычно включают фосфолипиды с нейтральным и/или отрицательным суммарным зарядом и стерины.
Используемыми фосфолипидами могут быть, например, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин и фосфатидилинозитол.
Основным компонентом липосом обычно является фосфатидилхолин, который может быть синтезирован или выделен из естественных источников. Часто используемым коммерческим продуктом является соевый лецитин, который представляет собой комплексную смесь фосфолипидов, включающую фосфатидилхолин.
Стеринами, которые используют в получении липосом, могут быть, среди других, холестерин и соли желчных кислот.
Липосомы предпочтительно получают с использованием смеси соевого лецитина и холата натрия.
Липосомы могут, необязательно, содержать добавки, улучшающие их стабильность, например, витамин Е, который действует как липидный антиоксидант.
Полученные липосомы обычно имеют распределение по размерам, в котором 99,9% меньше, чем 1 микрон.
Липосомы могут быть подвергнуты лиофилизации для получения таким образом иммунотерапевтического средства в форме лиофилизированных липосом.
Лекарственное средство может быть введено в форме разовой дозы или нескольких доз, посредством повторения с определенными временными интервалами. Предпочтительно вводят две дозы, разделенные периодом, составляющим от 2 до 5 недель, предпочтительно от 3 до 4 недель.
Лекарственное средство может вводиться через слизистые, например, слизистую глаз, носа, полости рта, желудка, кишечника, влагалища или мочевого тракта, или парентерально, например, подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутривенно или интраперитонеально. Парентеральное введение является предпочтительным.
Подходящая доза зависит от нескольких параметров, включая среди них способ введения и пациента, получающего лечение, но предпочтительно доза составляет от 1 мкг до 1000 мкг, более предпочтительно от 25 до 700 и еще более предпочтительно от 50 мкг до 200 мкг.
Лекарственное средство, включающее фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма MTB-C, может вводиться в комбинации с другими профилактическими вакцинами от туберкулеза, такими как упомянутые в S.H.E. Kaufmann, Nature Rev. Immunol. 2006, 6, 699-704, как например, вакцина БЦЖ, субъединичные вакцины или рекомбинантные вакцины БЦЖ.
Комбинация вакцин может быть одновременной, или это может быть сделано в два введения, разделенных по времени. Период между вакцинациями может быть продолжительностью даже несколько лет.
В случае если вакцинации разделены во времени, предпочтительно сначала вводят профилактическую вакцину от туберкулеза, а затем вводят лекарственное средство, включающее фрагменты клеточной стенки вирулентного штамма МТВ-С, которое действует как рестимулирующее (дополнительное) средство первоначально введенной вакцины.
M. tuberculosis
Неожиданно было обнаружено, что введение лекарственного средства, включающего иммунотерапевтическое средство на основании фрагментов клеточной стенки вирулентного штамма МТВ-С, способно индуцировать ответ типа Th1 с выделением интерферона-γ против антигенов, специфических для . Указанные антигены включают Ag85B и Ag85A, которые являются частью комплекса Ag85, состоящего из семейства низкомолекулярных белков, играющих решающую роль в биосинтезе клеточной стенки и продуцируемых в значительных количествах, когда культивирование бактерий находится в лог-фазе.
Было обнаружено, что обычная вакцина БЦЖ не создает иммунозащитного ответа против антигенов комплекса Ag85, что может представлять собой более низкую защитную способность.
37
Также было обнаружено, что количество живых бацилл, присутствующих в легких мышей, вакцинированных указанным иммунотерапевтическим средством и впоследствии инфицированных вирулентным штаммом HRv, было меньше, чем количество живых бацилл, присутствующих в контрольной группе мышей, и указанное количество было сравнимым с таковым для мышей, вакцинированных обычной вакциной БЦЖ.
Ниже показаны примеры для обеспечения специалиста в области техники подробным объяснением специфических вариантов осуществления изобретения.
.tuberculosis.
Пример 1. Эффективность иммунотерапевтического средства в качестве профилактической вакцины от инфекции, вызванной M
Иммунотерапевтическое средство, используемое в этом примере, получали в соответствии с методом, описанным в Примере 2 патентной заявки ES2231037-A1.
Эффективность иммунотерапевтического средства, основанного на фрагментах клеточной стенки вирулентного штамма МТВ-С, исследовали у самок мышей типа C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель и не имеющих специфических патогенов.
Мышей делили на три группы по 12 животных в каждой и подвергали следующему протоколу вакцинации:
1) без вакцинации (контрольная группа)
2) подкожно вводили две дозы по 285 мкг иммунотерапевтического средства, полученного в Примере 2 патентной заявки ES2231037-A1, на 3-й и 6-й неделях эксперимента.
6
3) подкожно вводили дозу 2×10колониеобразующих единиц Датского штамма БЦЖ (Statens Serum Institute, Denmark) на 0-й неделе эксперимента.
Mycobacterium tuberculosis
37
Для инфицирования использовали вирулентный штамм  (HRv Pasteur), который культивировали в среде Proskauer-Beck до средней лог-фазы и хранили в аликвотах по 1 мл при температуре -70°С до использования.
Мышей инфицировали указанным вирулентным штаммом посредством аэрозоля на девятой неделе эксперимента путем помещения их в прибор для аэрозольного инфицирования Middlebrook, который обеспечивал введение в легкие мышей приблизительно 10-50 живых бацилл.
Количество живых бацилл в легких определяли через 3 недели после аэрозольного инфицирования животных (12-я неделя эксперимента), инкубируя серийные разведения гомогената легких в агаре Middlebrook 7H11 в течение 4 недель при 37°С. Легкие гомогенизировали в присутствии 1 мл дважды дистиллированной воды.
Результаты таблицы 1 выражают логарифм колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл, которые обнаруживали в легких.
Таблица I
Группа мышей
Вакцина
Log<sub>10</sub>KOE/мл
1
Нет (контрольная группа)
6,42±0,24
2
Инкапсулированное в липосомах иммунотерапевтическое средство
5,72±0,30
3
БЦЖ
5,71±0,58
Различия между результатами группы мышей, которые не были вакцинированы, и результатами вакцинированных групп были статистически значимыми.
Обнаружено, что в легких группы мышей, вакцинированных инкапсулированным в липосомы иммунотерапевтическим средством, определялось меньшее количество живых бацилл, чем в легких невакцинированных мышей, и по существу такое же количество, как у мышей, вакцинированных обычной вакциной БЦЖ.
M. tuberculosis
Следовательно, вакцинация иммунотерапевтическим средством, основанным на фрагментах клеточной стенки вирулентного штамма МТВ-С, дает защиту против инфекций, вызванных .
M. tuberculosis
Пример 2. Эффективность иммунотерапевтического средства в качестве генератора Th1 ответа, специфичного против инфекции, вызванной
Иммунотерапевтическое средство, используемое в настоящем примере, получали в соответствии со способом, описанным в Примере 2 патентной заявки ES2231037-A1.
Эффективность иммунотерапевтического средства, основанного на фрагментах клеточной стенки вирулентного штамма МТВ-С, оценивали в эксперименте ex vivo у самок мышей C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель и не имеющих специфических патогенов.
Мышей делили на группы по 4 животных в каждой и подвергали следующей схеме вакцинации:
1) подкожное введение физиологического раствора на 3-й и 6-й неделях эксперимента (контрольная группа);
2) подкожное введение двух доз по 285 мкг иммунотерапевтического средства, полученного в Примере 2 патентной заявки ES2231037-A1, на 3-й и 6-й неделях эксперимента;
6
3) подкожное введение дозы 2×10 колониеобразующих единиц Датского штамма БЦЖ (Statens Serum Institute, Denmark) на 0-й неделе эксперимента и физиологического раствора на 3-й и 6-й неделях эксперимента;
6
Mycobacterium tuberculosis
37
4) подкожное введение 2×10 колониеобразующих единиц вирулентного штамма  (HRv Pasteur) на 3-й неделе эксперимента и физиологического раствора на 6-й неделе эксперимента.
Мышей умерщвляли на 7-й неделе, и их селезенки экстрагировали и погружали в пробирки, содержащие 5 мл L-глютамин-RPMI (Gibco). Пробирки хранили на льду до конца эксперимента. Селезенки механически разрушали и суспензию фильтровали через нейлоновое сито с диаметром 70 мкм. Затем их центрифугировали в течение 10 минут при 300g. Осадки восстанавливали 15 мл раствора, состоящего из Tris и хлорида аммония в дважды дистиллированной воде, для проведения лизиса клеток. После 8 минут их промывали 20 мл L-глютамин-RPMI и центрифугировали в течение 10 минут при 300g.
Полученные осадки ресуспендировали 5 мл L-глютамин-RPMI и суспензию фильтровали через нейлоновое сито с диаметром 70 мкм. Клетки считали в камере Ньюбауера.
5
M.tuberculosis
Клетки селезенок мышей сеяли на чашки в соотношении 1×10 клетка/ячейка и культивировали с 200 мкл полной культуральной среды (ССМ), состоящей из L-глютамин-RPMI, дополненного инактивированной фетальной сывороткой телят, пенициллином, стрептомицином, пируватом натрия и 2-меркаптоэтанолом, или 200 мкл полной культуральной среды (ССМ), дополненной антигенами : 10 мкг/мл антигена PPD (Statens Serum Institut, Denmark) и 5 мкг/мл ESAT-6, Ag85A и Ag85B (Lionex Diagnostics and Therapeutics GmbH, Federal Republic of Germany).
2
Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% СО. Через 96 часов чашки центрифугировали в течение 10 минут при 300g и из каждой из них собирали надосадочную жидкость.
Надосадочные жидкости замораживали и после оставления в указанном состоянии в течение по меньшей мере 24 часов анализировали содержание интерферона-γ, применяя методику двойного сэндвич ELISA и с использованием моноклонального антитела, специфичного к мышиному интерферону-γ (Diaclone).
10
M. tuberculosis
В таблице II показаны средние концентрации интерферона-γ, выраженные как Log пг/мл, которые были индуцированы в каждой из групп мышей против антигенов :
Таблица II
Группа
Вакцина
Антигены
Конт-роль
PPD
ESAT-6
Ag85B
Ag85A
1
Контроль
0
0
0
0
0
2
Иммунотерапевтическое средство, инкапсулированное в липосомах
0
2,57
0
2,69<sup>(1)</sup>
2,53<sup>(1)</sup>
3
БЦЖ
0
2,01<sup>(3)</sup>
0
0
0
4
H<sub>37</sub>Rv
0
3,06<sup>(3)</sup>
2,86<sup>(2)(3)</sup>
2,76<sup>(3)</sup>
2,50<sup>(3)</sup>
(1) Статистически значимые различия между группой 2 и группой 3(2) Статистически значимые различия между группой 2 и группой 4(3) Статистически значимые различия между группой 3 и группой 4
M.tuberculosis,
M. tuberculosis
Результаты Таблицы II показывают, что две вакцинации, проведенные иммунотерапевтическим средством на основании фрагментов клеточной стенки вирулентного штамма  инкапсулированным в липосомах, способны индуцировать продукцию интерферона-γ против . Это означает, что они могут индуцировать защитный ответ типа Th1.
37
M. tuberculosis
В частности, ответ, индуцированный в группе мышей, вакцинированных иммунотерапевтическим средством, инкапсулированным в липосомах, против антигенов PPD, Ag85B и Ag85A, не показывает статистически значимых различий при сравнении с ответом в группе мышей, которым вводили вирулентный штамм HRv . Указанный ответ был лучше, чем ответ в группе мышей, вакцинированных штаммом БЦЖ, который является обычной вакциной, так как она тоже индуцирует ответ против PPD и не против Ag85B и Ag85A.
Только группа мышей, вакцинированная вирулентным штаммом, была способна индуцировать ответ против антигена ESAT-6.
M. Tuberculosis,
M. tuberculosis
M. tuberculosis
Следовательно, иммунотерапевтическое средство на основе фрагментов клеточной стенки вирулентного штамма  способно индуцировать защитный ответ типа Th1 против антигенов, специфических для , что является показателем того, что оно может быть эффективно использовано для профилактики инфекций, вызванных .