ТРАНСДЕРМАЛЬНАЯ СИСТЕМА МОНИТОРИНГА АНАЛИТА И СПОСОБЫ ДЕТЕКЦИИ АНАЛИТА
TRANSDERMAL SYSTEM OF ANALITE MONITORING AND METHODS OF ANALITE DETECTION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области систем и способов улучшения неинвазивного пробоотбора биологических жидкостей и более подробно к системам и способам улучшения трансдермального обнаружения и количественного определения аналита.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
Данная заявка устанавливает приоритет в отношении заявки США, серийный номер 60/893563, поданной в Бюро по патентам и торговым знакам США 7 марта 2007 г.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Влияние, оказываемое сахарным диабетом на здоровье американцев, является ужасающим. Согласно данным Американской ассоциации по диабету в 2006 г. сахарный диабет был диагностирован приблизительно у 20,8 миллионов американцев. Расходы на диабет в 2002 оценивались в 132 биллиона долларов США. Число смертей от осложнений, вызванных сахарным диабетом, в 2006 г. оценивалось, как 613 американцев ежедневно.
Высоко востребованными являются новые и улучшенные системы и способы для лечения и обнаружения диабета. Аналитические биосенсоры обеспечивают один тип систем, которые можно использовать для лечения диабета. Аналитические биосенсоры применяли в течение последнего десятилетия в качестве средств, объединяющих преимущества электрохимического преобразования сигнала со специфичностью, присущей биологическим взаимодействиям. Например, использование непрерывного мониторинга глюкозы (continuous glucose monitoring (CGM)) для лечения диабета становится все более популярным.
Несмотря на улучшения аналитических биосенсорных систем, доступные системы страдают от недостатков. Например, системы, использующие сенсор на основе гидрогеля, обычно обладают короткими сроками эксплуатации и могут вытекать на кожу пользователя. Альтернативно, рост бактерий или рост других микроорганизмов может загрязнять или засорять биосенсор, делая измерения аналита недостоверными. В некоторых примерах белки, углеводы клетки или фрагменты клеток пользователя могут связываться с сенсором и мешать измерениям. Такое связывание также может загрязнять биосенсор.

Для того чтобы препятствовать прохождению загрязняющих веществ к лицевой поверхности электрода, на поверхности сенсорных электродов применяли мембраны, пленки или другие физические барьеры. Обычные пленки, которые использовали, включали ацетат целлюлозы, поли(o-фенилендиамин), полифенол, полипиррол, поликарбонат и NAFION, то есть сополимер тетрафторэтилен-перфтор-3,6-диокса-4-метил-7-октенсульфоновой кислоты (E.I. du Pont de Nemours & Co., Wilmington, Del.). Однако эти мембраны могут быть трудны в получении и могут недостаточно эффективно присоединяться к реакционноспособной поверхности электрода.
Некоторые CGM системы перед подсоединением требуют предварительной обработки кожи гидратирующей рецептурой. Например, для существующих биосенсорных систем на намеченном участке кожи обычно применяют 10-40-минутную процедуру увлажнения кожи для увеличения пористости кожи и перед приложением сенсора. Процедура гидратации приводит к лучшей работе сенсора, по сравнению с той, которая достигается без предварительной обработки (сигнал сенсора хорошо отражает референсные показания глюкозы в крови). Хотя это дает возможность улучшить работу сенсора, процедура гидратации кожи требует нежелательных трудозатрат, материалов и времени, которые могут дополнительно осложнять процедуру и увеличивать стоимость системы. Желательны системы, которые не требуют сложных или длительных по времени процедур предварительной обработки кожи.
2
2
В еще других CGM системах для калибровки глюкозного сенсора используют стандартный референсный глюкозный способ и затем регистрирует последующие показания глюкозы на основе калиброванного электрического сигнала. В принципе концентрация глюкозы в крови испытуемого должна быть пропорциональна измеренному электрическому сигналу. Для сенсоров, основанных на ферментативном превращении глюкозы, например, там, где фермент глюкозооксидаза (GOx) использует воду и кислород для превращения глюкозы в пероксид водорода (HO) и глюконолактон, ферментативное превращение лимитируется количеством доступного кислорода. Когда снабжение кислородом ограничено, как в тканевой жидкости, концентрация глюкозы превышает концентрацию кислорода, ферментативное превращение глюкозы будет зависеть от снабжения кислородом, приводя к ненадежным показаниям сенсором глюкозы и, таким образом, влияя на работу сенсора.
Сообщали о различных способах уменьшения проблемы ограничения по кислороду. Tierney et al. описывает применение обратного ионофореза для ограничения экстракции глюкозы, поддерживающего требуемый баланс между кислородом и глюкозой (M. Tierney с соавт., Annals of Medicine, 32(9):632-641 (2000)). Патент США № 7110803 Shults с соавт. раскрывает применение мембранного слоя, ограничивающего доступ глюкозы, который обладает высокой степенью проницаемости кислорода по отношению к глюкозе. Патент США № 7108778 Simpson с соавт. раскрывает применение вспомогательного электрода для генерации кислорода для сенсорной химии. Однако каждый из этих способов требует добавления дополнительных элементов к CGM системе, увеличивая, тем самым, стоимость и сложность системы. Требуется простой способ увеличения количества доступного для сенсора кислорода без увеличения стоимости и сложности системы.
Таким образом, целью изобретения является именно обеспечение улучшенной трансдермальной системы мониторинга аналита.
Другой целью является обеспечение способа понижения биозагрязнения и/или засорения в трансдермальной системе мониторинга аналита.
Другой целью является повышение точности обнаружения и/или количественного определения аналита при помощи трансдермальной системы мониторинга аналита.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Здесь описаны трансдермальные системы мониторинга аналита (TAMS) с улучшенным сроком службы и обнаружением аналита. Вообще трансдермальная система обнаружения аналита («TADS») включает в себя сенсорное устройство, которое включают (1) гидрофильный полимерный субстрат, такой как гидрогель, созданный для сбора аналита с кожи, и (2) основную часть сенсора, содержащую множество электродов, и дисплей и/или компьютер. В предпочтительном варианте осуществления TAMS включает полупроницаемую мембрану на конце сенсора, которая присоединена к гидрофильному полимерному субстрату. Эта мембрана связана с внешней поверхностью испытуемого и действует как барьер между кожей пациента и гидрофильным полимерным субстратом. Полупроницаемая мембрана снижает количество биологического загрязнения гидрофильного полимерного субстрата по сравнению с тем же самым прибором в отсутствие полупроницаемой мембраны путем образования защитного барьера над подвергаемой воздействию поверхностью гидрофильного полимерного субстрата. Дополнительно полупроницаемая мембрана оберегает гидрофильный полимерный субстрат от утечки из прибора. Гидрофильный полимерный субстрат обычно содержит фермент и необязательно содержит одно или несколько гигроскопических веществ.
В предпочтительном варианте осуществления, TAMS включает один или несколько каналов или полостей в сенсорном устройстве, которые увеличивают количество кислорода, доступного для реагирования аналита с ферментом и генерирования детектируемого сигнала.
В другом варианте осуществления обеспечивается способ улучшения обнаружения аналита и/или количественного определения при помощи трансдермальной системы мониторинга аналита. Способ включает обработку области кожи организма для увеличения пористости, потом протирку обработанной области кожи субстратом. Субстрат может быть любым подходящим адсорбирующим материалом, таким как тампон, тканый или нетканый материал, войлок или марля. Вообще, субстрат содержит протирающий реагент, такой как растворитель (например, воду, этанол или изопропанол), фосфатный буферный раствор, молочную кислоту, мыло поверхностно-активное вещество или их комбинацию. Стадия протирания предотвращает необходимость стадии гидратирования кожи. После того, как кожа протерта, присоединяют трансдермальную систему мониторинга аналита. В другом варианте осуществления обеспечивается набор, содержащий трансдермальную систему детекции аналита и субстрат. Субстрат может быть пропитан протирающим реагентом. Альтернативно, протирающие реагенты можно включить в набор отдельно.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 показывает типовую проводную трансдермальную систему мониторинга аналита (TAMS) для проведения непрерывного мониторинга аналита с сенсором, показанным в виде отдельных частей. Альтернативно передачи информации между сенсором и монитором можно достичь посредством беспроводной связи (не показано на Фиг.1).
Фиг.2 показывает основную часть сенсора, представленного на Фиг.1.
ex vivo
Фиг.3 представляет собой гистограмму остаточного сигнала типового биосенсора, содержащего и не содержащего барьерные мембраны после 24-часового  наложения, где «n» представляет собой число тестов.
Фиг.4 показывает гистограмму дрейфа сигнала (%) и 24-часовой усредненный модуль относительной разности (MARD) между сенсором (nA) и уровнями глюкозы в крови (BG) для прибора с различными мембранами, калибруемыми каждые 4 часа. Метки «PES-10K» (поли(эфирсульфон)) и "RC-3k" относятся к ультрафильтрационным мембранам, «UB» относится к ковалентно активированному PES, «0,2PES» относится к непокрытому сенсору с порами 0,2 мкм, «.NAF» относится к покрытому Nafion, и знак (*) отмечает, что для этого сенсора MARD воспроизводится по калибровке каждые 8 часов.
ex vivo
Фиг.5 показывает гистограмму смещения сигнала (%) и 24-часовой (MARD), когда в гидрогелевую матрицу включены различные гигроскопические вещества. Тестирование представляло собой 24-часовое  наложение, и везде использовали 0,2PES.Naf мембрану.
2
Фиг.6 показывает гистограмму, сравнивающую биосенсорную систему с ковалентно иммобилизованной GOx с биосенсорной системой без ковалентной иммобилизации, используя корреляцию между нA и BG (R) и MARD, после 4-часового ex vivo наложения.
Фиг.7A представляет собой линейный график концентраций глюкозы в крови (в мг/дл) от времени (в минутах), полученный от непрерывного трансдермального глюкозного сенсора с процедурой подготовки кожи протиранием, выполненной перед наложением сенсора. Референсные уровни глюкозы в крови («Фактический уровень BG», показания глюкометра по крови из прокола на пальце, сплошная линия с кружками) сравнивали с предсказанными уровнями глюкозы в крови («Предсказанный уровень BG», показания глюкозного сенсора, сплошная линия). Данные показывают наличие строгой корреляции (r=0,950) между предсказанным уровнем BG и фактическим уровнем BG.
Фиг.7B представляет собой линейный график концентраций глюкозы в крови (в мг/дл) от времени (в минутах), полученный от непрерывного трансдермального глюкозного сенсора без проведения какой-либо процедуры подготовки кожи перед наложением сенсора. Референсные уровни глюкозы в крови («Фактический уровень BG», показания глюкометра по крови из прокола на пальце, сплошная линия с кружками) сравнивали с предсказанными уровнями глюкозы в крови («Предсказанный уровень BG», показания глюкозного сенсора, сплошная линия). Данные показывают плохую корреляцию (r=0,309) между предсказанным уровнем BG и фактическим уровнем BG.
Фиг.7C представляет собой линейный график концентраций глюкозы в крови (в мг/дл) от времени (в минутах), полученный от непрерывного трансдермального глюкозного сенсора с 40-минутной процедурой гидратации кожи протиранием, выполненной перед наложением сенсора. Референсные уровни глюкозы в крови («Фактический уровень BG», показания глюкометра по крови из прокола на пальце, сплошная линия с кружками) сравнивали с предсказанными уровнями глюкозы в крови («Предсказанный уровень BG», показания глюкозного сенсора, сплошная линия). Данные показывают строгую корреляцию (r=0,947) между предсказанным уровнем BG и фактическим уровнем BG.
Фиг.8A показывает схему нижней части типовой пластинки-мишени с четырьмя воздушными каналами.
Фиг.8B показывает схему вида спереди типовой пластинки-мишени глюкозного сенсора с тремя выемками для внутренних воздушных полостей, окружающих центральное отверстие для химии гидрогеля.
Фиг.8C показывает схему типового сенсора, помещенного поверх пластинки-мишени для получения закрытого глюкозного сенсора.
Фиг.9 представляет собой схематическое представление того, как используется типовая беспроводная трансдермальная система мониторинга аналита (TAMS) для проведения непрерывного мониторинга аналита. Эту систему можно было бы использовать с глюкозным сенсором, показанным на Фиг.8A, 8B и 8C.
Фиг.10 представляет собой сетку ошибок Кларка по данным, полученным в исследовании IA с 222 откликами сенсора по глюкозе в крови, собранными от 10 пациентов.
Фиг.11 представляет собой сетку ошибок Кларка по данным, полученным в исследовании IB с 225 откликами сенсора по глюкозе в крови, собранными от 10 пациентов.
Фиг.12 представляет собой сетку ошибок Кларка по данным, полученным в исследовании 2С с 147 откликами сенсора по глюкозе в крови, собранными от 10 пациентов (9 из которых закончили исследование).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. Трансдермальная система мониторинга аналита
Здесь описаны системы и способы улучшения трансдермальной детекции аналита. Вообще, трансдермальная система мониторинга аналита («TAMS») включает сенсорное устройство, которое включает (1) гидрофильный полимерный субстрат, такой как гидрогель, предназначенный для получения аналита с кожи, и (2) основную часть сенсора, содержащую множество электродов, и дисплей и/или компьютер. В предпочтительном варианте осуществления TAMS на конце сенсора содержит полупроницаемую мембрану, которая присоединена к гидрофильному полимерному субстрату. Эта мембрана действует как полупроницаемый барьер между кожей пациента и гидрофильным полимерным субстратом.
TAMS накладывают на область кожи животного; обычно животное является млекопитающим и в предпочтительном варианте осуществления млекопитающее является человеком.
Когда систему используют, то гидрогель содержит фермент, который непрерывно реагирует с аналитом, производя, тем самым, электрический сигнал. Затем электрический сигнал направляется на сенсорное устройство. Электрический сигнал коррелирует с содержанием аналита.
Контролируемый аналит может быть любым представляющим интерес аналитом, включая, но не ограничиваясь, глюкозу, лактат, кровяные газы (например, диоксид углерода или кислород), pH крови, электролиты, аммиак, белки или любые другие биологические виды молекул, которые присутствуют в биологической жидкости, такой как кровь, плазма, сыворотка или тканевая жидкость.
Типовая TAMS описана в патентной публикации США № 2006 0094946 Kellogg с соавт. и она проиллюстрирована в данном описании на Фиг.1. TAMS, показанную на Фиг.1, можно использовать для проведения непрерывного мониторинга аналита, такого как глюкоза. Как показано на Фиг.1, TAMS (100) содержит сенсорное устройство (112), которое включает основную часть сенсора (101), гидрогелевый диск (106) и крепежную пластинку (102), а также другие компоненты, как описано в данном описании, которые можно подсоединить к дисплею или компьютеру. В ходе работы сенсорное устройство (112) можно расположить рядом с проницаемой областью (107) кожи пользователя, как показано пунктирной линией на Фиг.1. Сенсорное устройство (112) можно подсоединить любым подходящим способом к дисплею или компьютеру. Подходящие способы включают беспроводное соединение или любой другой способ электрического подсоединения, такой как гибкий соединительный кабель (109). В варианте осуществления сенсорное устройство (112) подсоединяют к записывающему потенциостату (108), который может включать печатную плату (111). Соединительный кабель (109) предпочтительно подсоединяют к записывающему потенциостату (108), используя соединитель (110), который обеспечивает удаление и подсоединение сенсорного устройства (112). Подходящие способы подсоединения включают гибкий соединительный кабель (109) и беспроводное соединение.
TAMS с беспроводным соединением представлена на Фиг.9. Сенсорное устройство (112) включает пластинку-мишень (120), гидрогель (106) и сенсор, и основную часть сенсора (125). Сенсор соединяют с миниатюрным анализатором, который по беспроводной связи посылает данные на монитор для обработки и показа.
A. Сенсорное устройство
Сенсорное устройство (112), представленное на Фиг.1 и 2, можно ввести в один или несколько датчиков. Например, это сенсорное устройство можно ввести в приемник для обеспечения дискретного и/или непрерывного мониторинга глюкозы.
Сенсорное устройство (112) содержит основную часть сенсора (101). Основная часть сенсора может содержать электроды, как показано на Фиг.2, на своей поверхности для электрохимической детекции аналитов или продуктов реакции, которые указывают на аналиты.
Термический преобразователь (103), который можно разместить внутри сенсорного устройства (112) с формой, которая соответствует форме основной части сенсора (101), размещен между основной частью сенсора (101) и крепежной пластинкой (102). Электрохимические сенсоры на основе ферментов, такие как глюкозные сенсоры, могут быть чувствительны к колебаниям температуры. Термический преобразователь (103) можно использовать для нормировки и записи только тех изменений, которые приписываются изменениям аналита или индикатора аналита.
Сенсорное устройство (112) также может включать адгезивный диск (104), который можно присоединить со стороны основной части сенсора (101), которая обращена лицом к термическому преобразователю (103).
Сенсорное устройство (112) может также содержать адгезивное кольцо (105), которое можно присоединить на сторону основной части сенсора (101), противоположной адгезивному диску (104). Вырезанная центральная часть адгезивного кольца (105) предпочтительно оставляет незакрытой некоторую часть или все из компонентов сенсора на основной части сенсора (101). Адгезивное кольцо (105) и адгезивный диск (104) могут иметь форму, которая соответствует форме основной части сенсора, как показано на Фиг.1.
Сенсорное устройство (112) содержит гидрогельный диск (106), который может быть расположен внутри вырезанной центральной части адгезивного кольца (105), граничащей с основной частью сенсора (101).
a. Основная часть сенсора
Основная часть сенсора (101) подробно изображена на Фиг.2. Основная часть сенсора (101) включает слой основы (207), на которую нанесены провода (204, 205 и 206). Провода можно сформировать, например, путем покрывания металлом слоя основы (207) в требуемых местах. Рабочий электрод (201) обычно располагают в центре основной части сенсора (101). Рабочий электрод (201) может содержать каталитический и/или проводящий материал, такой как чистая платина, платинированный углерод, стеклоуглерод, углеродные нанотрубки, мезопористая платина, платиновая чернь, палладий, золото или платина-индий. Рабочий электрод (201) можно нанести на провод (206), так чтобы он был в электрическом контакте с проводом (206). Электрод сравнения (202) может содержать стабильный проводящий материал и предпочтительно содержит углерод, который можно расположить по периферии части рабочего электрода (201), как показано на Фиг.2. Электрод сравнения (202) можно разместить над проводом (205), так чтобы он находился в электрическом контакте с проводом (205). Референсный электрод (203), содержащий двухкомпонентные окислительно-восстановительные вещества, которые обеспечивают постоянный окислительно-восстановительный потенциал, предпочтительно содержащий Ag/AgCl, можно расположить по периферии другой части рабочего электрода (201), как показано на Фиг.2. Электроды (201, 202 и 203) можно сформировать примерно по направлению расположения электрических проводов (206, 205, 204), соответственно, которые нанесены в чувствительной части устройства. Электроды (201, 202 и 203) можно нанести методом трафаретной печати или методом напыления на электрические провода (206, 205, 204), соответственно. Провода можно нанести на основную часть сенсора (101), используя метод трафаретной печати или другие методы, известные в данной области, таким образом, который сделает возможным электрическое соединение с внешними приборами или компонентами. Например, провода могут образовать 3-контактный вывод проводов, включающий провода (204, 205 и 206) на конце вытянутой области основной части сенсора, как показано на Фиг.2. Затем можно использовать стандартный разъем для подсоединения сенсорных электродов к внешнему прибору или компонентам.
b. Гидрофильный полимерный субстрат
Сенсорное устройство содержит гидрофильный полимерный субстрат. Субстрат предназначен для обеспечения структуры, образующей водный резервуар в сенсорном устройстве. Гидрофильный полимерный субстрат может быть любой подходящей формы, которая соответствует сенсорному устройству. Обычно гидрофильный полимерный субстрат имеет форму основной части сенсора. Стандартной формой является диск. Форму выбирают, чтобы она согласовывалась с формой сенсора. Необязательно, в гидрофильные полимерные субстраты вводят ионные фрагменты для придания дополнительной функциональности, такой как биоадгезивность. В предпочтительном варианте осуществления субстрат представляет собой гидрогель.
Гидрогели представляют собой класс биоматериалов, используемых для медицинских и биотехнологических применений, таких как контактные линзы, биосенсоры, покрытия для искусственных имплантов и средств для доставки лекарственных препаратов. Трансдермальная система мониторинга аналита может использовать один или несколько из гидрогелевых материалов, описанных ниже. Классы гидрогелевых материалов, которые можно использовать в сенсорном устройстве, включают гидрогели на основе агарозы, гидрогели на основе полиэтиленгликоль диакрилата (PEG-D A) и гидрогели на основе винилацетата, включая полиэтиленгликоль диакрилат/полиэтиленимин (PEGDA-PEI) и полиэтиленгликоль диакрилат -N-винил пирролидон (PEGDA-NVP).
Подходящие полимеры, которые могут образовывать гидрогель, включают, но не ограничиваются, синтетические или природные полимеры. Примеры синтетических полимеров включают полимеры полиакриловой кислоты и полиметакриловой кислоты, производные целлюлозы, такие как гидроксипропил целлюлоза, полимеры полиэтиленгликоля, сополимеры и блок-сополимеры и другие набухающие в воде биосовместимые полимеры. Примеры природных полимеров включают коллаген, гиалуроновую кислоту, желатин, альбумин, полисахарид и их производные. Природные полимеры также могут представлять собой образцы, выделенные из различных растительных материалов, таких как подорожник. Структурно-полимерные гидрогели представляют собой трехмерные макромолекулярные конфигурации. Их можно получить несколькими способами: a) синтезом из мономеров (полимеризация с образованием поперечных связей); b) синтезом из полимеров и полимеризуемых вспомогательных ингредиентов (привитая полимеризация и полимеризация с образованием поперечных связей); c) синтезом из полимеров и неполимеризуемых вспомогательных ингредиентов (сшитые полимеры); d) синтезом из полимеров с источниками энергии (сшитые полимеры без вспомогательных ингредиентов) и e) синтезом из полимеров (сшивание путем перекрестного взаимодействия реакционноспособных полимеров).
Гидрогели могут варьироваться по толщине. Обычно гидрогель составляет от приблизительно 10 до приблизительно 1000 мкм, более предпочтительно от приблизительно 50 до приблизительно 700 мкм и даже более предпочтительно от приблизительно 200 до приблизительно 500 мкм.
Как показано на Фиг.1, диск гидрогеля (106) можно расположить таким образом, что он своей лицевой частью будет обращен к пользователю после наложения на крепежную пластинку (102). Основную часть сенсора (101) можно соединить с крепежной пластинкой (102), используя стандартные соединители с защелкой, которая совмещается с соответствующей рабочей поверхностью контактов соединения, которые находятся на опорной пластинке (102).
i. Гидрогели на основе агарозы
Гидрогели на основе агарозы могут представлять преимущества при непрерывном трансдермальном мониторинге аналита. Например, гидрогели на основе агарозы представляют одно или несколько из следующих свойств: хороший отклик на глюкозу и пероксид водорода благодаря высокому содержанию в них воды, высокое заполнение ферментом, хорошая биосовместимость и отличная проницаемость и диффузионные свойства. Гидрогели на основе агарозы вообще совместимы с водорастворимыми аналитами. В дополнение к этому, агарозные гидрогели прозрачны, недороги и/или легки в приготовлении.

Агарозный гель можно сформировать, например, из 1-20% агарозы в буферном растворе, содержащем 0-1 M натрий или калий фосфата, 0-1 M натрий хлорида, 0-1 M калий хлорида, 0-2 M молочной кислоты, поверхностно-активное вещество, такое как 0-1 M TRITON X-100 (Union Carbide Chemicals & Plastics Technology Corp.), TWEEN 80 (ICI Americas Inc.), или натрий лаурилсульфат, и любых других биосовместимых компонентов. Заполнение агарозного гидрогеля глюкозооксидазой может составлять до 0-20% (по массе), например, путем набухания твердого гидрогеля в концентрированном растворе глюкозооксидазы или альтернативно путем смешения концентрированного порошка или раствора глюкозооксидазы с раствором агарозы в ходе стадии его плавления (15-65°C) с последующим охлаждением и гелеобразованием при более низкой температуре (40°C или ниже).
ii. Гидрогели на основе ПЭГ
Гидрогели на основе ПЭГ могут представлять несколько преимуществ для непрерывного трансдермального мониторинга аналита. По своей структуре ПЭГ являются высокогидрофильными и в водных растворителях присутствуют в высокой степени гидратации. Предпочтительная сольватация молекул ПЭГ может эффективно исключать белки из объема цепей ПЭГ, тем самым, защищая поверхность от биозагрязнения белками. Преимущество, которое можно обеспечить химически сшитыми гидрогелями на основе ПЭГ, заключается в том, что его физические и химические свойства можно регулировать путем изменения молекулярной массы цепей ПЭГ и изменения концентрации инициатора. Например, увеличение молекулярной массы полиэтиленоксидного хребта увеличивает размер ячейки в сетке. Выделение биоактивных молекул, таких как ферменты, можно контролировать путем контроля плотности сетки. Таким образом, гидрогель, содержащий ПЭГ со средневесовой молекулярной массой 8 кДа, обладал бы более высокой скоростью выделения включенного в него лекарственного препарата, чем гидрогель, содержащий ПЭГ со средневесовой молекулярной массой 3,3 кДа.
Необязательно в гидрогели можно ввести добавки для придания им дополнительной функциональности, такой как биоадгезивность. Например, для создания биоадгезивных гидрогелей к ПЭГ макромеру перед сшивкой можно добавить гиалуроновую кислоту или полиакриловую кислоту. В другом примере, сшитым гидрогелям можно придать ионный характер для обеспечения молекулярного взаимодействия (например, ионных связей) с введенными лекарственными препаратами для замедления скоростей выделения лекарственного препарата из матрицы.
Гидрогели на основе ПЭГ, используемые в биосенсорах, могут обеспечить одно или несколько из следующих свойств: (a) биосовместимую, не подверженную биозагрязнению поверхность, предназначенную для длительного воздействия биологических жидкостей без нарушения нормального функционирования сенсора, (b) резервуар для глюкозооксидазы, (c) матрицу, в которую можно ввести ионные фрагменты для увеличения удержания глюкозооксидазы, (d) матрицу, которую можно регулировать в отношении ее физических и химических свойств (плотность сетки, набухание) путем варьирования молекулярной массы хребта, (e) матрицу, которую можно было сделать биоадгезивной путем добавления ионных наполнителей, таких как хитозан глюконат, полиакриловая кислота, поли(амидоамин), поли(этиленимин) и гиалуроновая кислота.
Если гидрогель образуется из полиэтиленгликоль диакрилатного (PEGDA) макромера, полимеризация, такая как УФ-полимеризация, может происходить в форме, которая содержит предварительно натянутый лист холста, который обеспечивает поддерживающую матрицу и основу для гидрогеля. PEGDA макромер полимеризуется только вокруг круглой передней части листа в форме диска на палочке, оставляя хвостовую часть листа свободной от гидрогеля и используемую как ручку (см. Фиг.2 и Фиг.9).
Необязательно PEDGA гидрогель содержит акрилат-PEG-NHS (A-PEG-N) реагент (например, продаваемый фирмой Nektar), который может действовать в качестве сшивающей молекулы для ковалентной пришивки фермента, такого как фермент глюкозооксидаза, к PEGDA сетке гидрогеля.
iii. Гидрогели на основе винилацетата
Гидрогели на основе винилацетата, такого как сополимер N-винилпириролидона/винилацетата, могут обладать характеристиками, такими как прозрачность, липкость, нетоксичность, гибкость и/или гидрофобность. Гидрогели на основе винилацетата обычно обладают хорошей способностью к удерживанию влаги и включению ферментов, таких как глюкозооксидаза, являются биосовместимыми и хорошо прилипающими к коже для улучшения сцепления кожи с сенсором. Как сообщает Chuang с соавт., проточный глюкозный сенсор, в котором в качестве гидрогеля использовали сополимер N-винилпириролидона/винилацетата, демонстрировал хорошую работу при слежении за уровнями глюкозы в плазме пациентов с диабетом в ходе исследования по ограничению глюкозы. Chuang с соавт. «Ultrasonic Pretreatment Enables Continuous Transdermal Glucose Monitoring», представленной на 4-ом Ежегодном митинге по технологиям для диабета, проходившем в 28-30 октября, 2004 (Филадельфия, Пенсильвания).
iv. Модифицированные гидрогели
1. Ковалентно иммобилизованные ферменты
Необязательно гидрогели можно модифицировать для того, чтобы включить ферменты и/или гигроскопические вещества. Ферменты и/или гигроскопические вещества можно ввести любыми подходящими средствами, включая ковалентное связывание и нековалентную иммобилизацию. Примеры нековалентной иммобилизации включают, но не ограничиваются, ионные взаимодействия и физическое включение. Предпочтительно ферменты ковалентно связывают с гидрогелем, как, например, с использованием связывающего агента. В одном варианте осуществления, особенно подходящем для применения в CGM системе, глюкозооксидазу ковалентно иммобилизуют на диск гидрогеля. Например, ковалентная иммобилизация GOx в сетку PEGDA улучшает эффективную работу прибора путем устранения диффузии GOx (сохраняя биодоступность) и/или путем стабилизации фермента (сохраняя биоактивность). Сетка PEGDA обеспечивает структуру, содержащую ~80% воды внутри своей матрицы. Она действует как резервуар для удержания жизненно важных компонентов в растворе (например, буферных солей и осмотических агентов), а также обеспечивает транспортную среду для диффузии аналита.
При концентрации PEGDA в 15% (в/в) большинство GOx может удерживаться в гидрогеле путем физического включения в сетку. Однако при более низких концентрациях PEGDA, таких как те, которые находятся вблизи 10% (в/в), более открытая сетка не будет удерживать GOx, и необходима ковалентная иммобилизация.
Ковалентная пришивка фермента к гидрогелю с использованием сшивающего агента
Пришивку фермента к гидрогелю можно также выполнить с использованием сшивающего агента. Молекула сшивающего агента вообще содержит две или несколько функциональных групп, которые способны реагировать с функциональными группами фермента и функциональными группами гидрогеля. Например, молекула сшивающего агента может содержать электрофильные группы, которые реагируют с нуклеофильными группами, встречающимися в ферменте и гидрогеле, такими как гидрокси, тиольные и/или аминогруппы. Эти сшивающие агенты содействуют соединению фермента с поверхностью гидрогеля путем образования связи, содержащей различное число атомов. Молекулы сшивающего агента могут быть гомофункциональными (то есть функциональные группы одинаковые) или гетерофункциональным (то есть функциональные группы разные).
Подходящие молекулы сшивающего агента включают, но не ограничиваются, N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP, 3- и 7-атомный спейсер), длинноцепочечный-SPDP (12-атомный спейсер), сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-2-(2-пиридилдитио)толуол (SMPT, 8-атомный спейсер), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC, 11-атомный спейсер) и сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC, 11-атомный спейсер), сложный эфир m-малеимидобензоил-N гидроксисукцинимида (MBS, 9-атомный спейсер), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сукцинимида (GMBS, 8-атомный спейсер), сложный эфир N-(γ-малеимидобутирилокси)сульфосукцинимида (сульфо-GMBS, 8-атомный спейсер), сукцинимидил 6-((йодацетил)амино)гексаноат (SIAX, 9-атомный спейсер), сукцинимидил 6-(6-(((4-йодацетил)амино)гексаноил)амино)гексаноат (SIAXX, 16-атомный спейсер), 1,4-ди-[3'-2'-пиридилдитио)пропион-амидо]бутан (DPDPB, 16-атомный спейсер), бисмалеимидогексан (BMH, 14-атомный спейсер) и п-нитрофенил йодацетат (NPIA, 2-атомный спейсер). Специалист с обычным образованием в данной области также будет отдавать себе отчет в том, что можно использовать ряд других сшивающих агентов с другим числом атомов.
Помимо этого, для увеличения дистанции между реакционноспособными функциональными группами на концах в сшивающий агент можно ввести спейсерные молекулы, такие как акрилат-полиэтиленгликоль-N-гидроксисукцинимид (акрилат-PEG-NHS или A-PEG-N). Ряд многофункциональных ПЭГ коммерчески доступен на фирме Shearwater Polymers (Хантсвил, Алабама) и в Texaco Chemical Co. (Хьюстон, Техас). ПЭГ с множеством аминогрупп доступен под названием «Jeffamine» и включает диамино ПЭГ и триамино ПЭГ. В предпочтительном варианте осуществления фермент ковалентно иммобилизован в гидрогель с использованием акрилат-PEG-NHS (A-PEG-N).
Ковалентное связывание фермента с гидрогелем с использованием модификатора
Фермент можно также непосредственно связать с гидрогелем путем использования реагента или реакции, которая активирует группы на поверхности гидрогеля или фермента, делая их реакционноспособными по отношению к функциональным группам фермента или полимера, соответственно, без введения сшивающего агента.
Например, карбодиимиды способствуют образованию амидных связей между карбоксилатом и амином или фосфорамидатных связей между фосфатом и амином. Примерами карбодиимидов являются 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (EDC), 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимид (CMC), дициклогексил карбодиимид (DCC), диизопропил карбодиимид (DIC) и N,N'-карбонилдиимидазол (CDI). N-этил-3-фенилизоксазолиум-3'-сульфонат (Реагент Вудворда) способствует образованию амидных связей посредством конденсации карбоксилатов и аминов. CDI можно также использовать для соединения аминогрупп и гидроксильных групп.
2. Гигроскопическое вещество
В другом варианте осуществления, гидрогель модифицируют с тем, чтобы он содержал одно или несколько гигроскопических веществ. Гигроскопическим является гигроскопичное вещество с высоким сродством к образованию водородных связей с молекулами воды. Гигроскопическое вещество обычно имеет несколько гидрофильных групп, таких как гидроксильная группа, амино или карбоксильные группы. Гидрогель может содержать любое подходящее количество гигроскопического вещества, гарантирующее, что гидрогель сохранит необходимый уровень воды. Подходящие количества гигроскопического вещества в гидрогеле лежат в пределах от 0,1 до 40% (в/в), предпочтительно количество лежит в пределах от 5 до 15% (в/в).
Предпочтительно гигроскопическое вещество содержит суммарный отрицательный заряд. Подходящие анионные гигроскопическое вещества включают, но не ограничиваются, глицерил триацетат и отрицательно заряженные полиолы. Предпочтительные гигроскопическое вещества, которые были опробованы, включают натрий PCA (то есть натриевая соль 2-пирролидон-5-карбоновой кислоты) и натрий лактат.
Некоторые небольшие молекулы гигроскопических веществ, то есть молекулы с молекулярной массой меньше чем 1000 Да, могут оказаться полезными. Примеры полезных гигроскопических веществ с малым размером молекул включают, но не ограничиваются, мочевину, пропиленгликоль, натрий лактат и натрий пирролидон карбоновую кислоту (PCA).
Могут оказаться полезными некоторые полисахаридные гигроскопические вещества. Примеры полезных полисахаридных гигроскопических веществ включают, но не ограничиваются, гиалуроновую кислоту (натриевую соль), каррагенан и агарозу.
Гигроскопические вещества удерживают молекулы воды, которые, в противном случае, испарились бы из открытой системы в ходе применения. Потеря гелем воды вызвала бы множество вредных эффектов, среди которых сопротивление повышенному транспорту, пониженная биодоступность катализатора, который обеспечивает электрический сигнал (например, фермента GOx), утрата площади поверхностного контакта при сморщивании. Любой из вышеупомянутых эффектов может мешать работе прибора.
Гигроскопическое вещество улучшает стабильность работы прибора путем подавления потери воды. Пониженная потеря воды также улучшает срок службы прибора. Как описано в примере 2, определенные гигроскопические вещества, как было показано, продлевают работу прибора (на что указывает снижение дрейфа сигнала) по сравнению с контролем (без гигроскопического вещества), в то время как другие, такие как глицерин и гидроксиэтил мочевина, не продлевают работу прибора (на что указывает увеличение дрейфа сигнала) по сравнению с контролем (без гигроскопического вещества) и, таким образом, не являются полезными. Предпочтительные гигроскопические вещества увеличивают долговечность работы прибора, не увеличивая одновременно с этим значительным образом ошибку считываний (такую как та, которая анализируется MARD) (см. Фиг.5).
c. Крепежная пластинка или пластинка-мишень
Крепежная пластинка (102) может обладать любой подходящей геометрией. Крепежную пластинку соединяют с основной частью сенсора (101), используя стандартные коннекторы, такие как SLIM/RCPT коннекторы с защелкой, которая соединена с соответствующим контактом соединения коннектора, который закреплен на крепежной пластинке (102). В беспроводной системе, такой как показана на Фиг.8A, 8B и 8C, вместо крепежной пластинки используют пластинку-мишень (120). Предпочтительно крепежную пластинку или пластинку-мишень формируют из жестких непроводящих материалов с высокими диэлектрическими константами, таких как пластики, которые обеспечивают плотное прилегание к основной части сенсора (101) и надежное размещение гидрогеля. Подходящие материалы для крепежной пластинки включают материалы, обычно используемые в печатных платах, которые обеспечивают не только плотное прилегание к основной части сенсора (101), но также печатную электрическую схему для сенсорной системы.
i. Воздушные полости или каналы
В одном варианте осуществления, сенсорное устройство, используемое в TAMS, содержит каналы или полости, для того чтобы дать возможность снабжать воздухом и/или кислородом гидрогель или другие элементы в сенсорном устройстве, которые требуют кислород для функционирования. Один или несколько воздушных каналов или полостей можно расположить вокруг гидрогеля. Воздушные каналы (122) и/или полости (124) вообще имеют форму щелей или отверстий в крепежной пластинке (102) проводной системы (Фиг.1) или в пластинке-мишени (120) беспроводной системы (см. Фиг.8A и 8B). Каналы и полости не только увеличивают снабжение кислородом (повышенная оксигенация), но также сохраняют влажность гидрогеля (воду). Воздушные каналы или полости можно создать формованием, фрезеровкой, перфорацией, травлением или любыми другими механическими или химическими способами.
Фиг.8A-C показывают примеры воздушных каналов или полостей в пластинке-мишени (120) в беспроводной TAMS. Проводную систему (показана на Фиг.1 и 2) можно модифицировать аналогичным образом для того, чтобы включить в нее воздушные каналы и полости. Фиг.8A показывает изображение вида сзади пластинки-мишени примерного глюкозного сенсора с четырьмя воздушными каналами (122 A, B, C и D). Фиг.8B показывает изображение вида спереди пластинки-мишени примерного глюкозного сенсора с тремя выемками (124 A, B и C) внутренних воздушных полостей, окружающих центральное отверстие (125) для химии гидрогеля. Фиг.8C показывает изображение корпуса примерного беспроводного сенсора (126) на верхней части пластинки-мишени (120) для обеспечения закрытого глюкозного сенсорного устройства (112).
2
2
2
2
В одном предпочтительном варианте осуществления TAMS включает сенсоры для трансдермальной детекции аналита, в которых глюкозооксидаза (GOx, фермент), используя воду и кислород, превращает глюкозу в пероксид водорода (HO) и глюконолактон. Электрохимический глюкозный сенсор можно сконструировать, используя платиновый электрод, для того, чтобы разрушать HO и в то же время генерировать непрерывный электрический ток с непрерывным обеспечением трансдермального потока глюкозы. Если в сенсорное устройство включены каналы или полости для воздуха или кислорода, то количество кислорода, доставляемого к гидрогелю, возрастает, по сравнению с тем же самым гидрогелем в отсутствии таких каналов и полостей, и уровень влажности сохраняется. Это является существенным для GOx, превращающей глюкозу в пероксид водорода, который впоследствии электрохимически окисляется и измеряется для определения количества глюкозы в крови.
B. Полупроницаемая мембрана
В одном предпочтительном варианте осуществления TAMS включает защитную полупроницаемую мембрану между поверхностью гидрогеля и кожей пользователя. Защитная полупроницаемая мембрана может иметь другой размер пор, состав, заряд, реакционную способность и толщину. У NAFION с неопределенной структурой поры могут варьироваться в пределах от макропор (5 мкм) до ультрафильтрационных (3k). "Неопределенный", как использовано здесь, относится к мембранам, для которых в настоящее время не существует стандартного способа характеристики их структуры пор, таких как NAFION. NAFION содержит ионные каналы с размерами, варьирующимися в пределах от приблизительно 1 нм до приблизительно 50 нм, в зависимости от уровня гидратации.
В трансдермальных системах мониторинга аналитов, таких как CGMs, присоединение защитной полупроницаемой мембраны на внешнюю поверхность гидрогеля улучшает работу прибора путем продления его срока службы и снижения загрязнения гидрогеля микроорганизмами, белками, клеточным материалом и др. В качестве границы между гидрогелем и кожей с порами мембрана может сокращать биологические загрязнители, такие как белки, липиды, продукты распада клеток, микроорганизмы или их комбинацию.
Защитную полупроницаемую мембрану можно сформировать из множества полимеров, сополимеров или их смесей. Подходящие полимеры включают гидрофобные полимеры, такие как политетрафторэтилен (PTFE); гидрофильные полимеры, такие как нейлон, полиэфирсульфоны (PES), активированные PES, (3-меркаптопропил)триметилсилан, ацетат целлюлозы, электрополимеризуемые пленки, такие как 1,8-диаминонафталин и фенилендиамин и NAFION-покрытый PES. NAFION (сополимер тетрафторэтилен-перфтор-3,6-диокса-4-метил-7-октенсульфоновой кислоты) является биосовместимым анионным фторполимером, которым можно покрыть гидрогель как защитным слоем против физиологических загрязнителей и биоотложений. NAFION действует как защитный слой на основании своей гидрофобности, отбора зарядов и/или исключения по размерам.
Полупроницаемой мембраной, такой как в виде полимерной пленки, можно покрыть внешнюю поверхность слоя гидрогеля (106). Вообще, в ходе работы между гидрогелем и кожей пользователя можно создать один или несколько защитных барьерных слоев. Поверхность гидрогеля можно покрыть полимерной пленкой, используя подходящий способ, такой как при помощи микропипетки или путем погружения сенсора в водный или органический раствор полимера с последующей сушкой в течение нескольких часов перед применением.
В другом варианте осуществления защитную полупроницаемую мембрану присоединяют только с одной стороны гидрогеля. Присоединение к поверхности раздела образуется путем полимеризации гидрогеля в присутствии мембраны и образования взаимопроникающей полимерной сетки (IPN) в межфазной зоне. IPN формируется когда первый полимер (такой как PEGDA гидрогель) сшивают в присутствии другой полимерной сетки (такой как полимерная мембрана).
В одном варианте осуществления полупроницаемая мембрана является отрицательно заряженной (например, NAFION-покрытая PES) на границе раздела гидрогель/кожа, для того чтобы предотвратить утечку отрицательно заряженных компонентов из гидрогеля в кожу. Отрицательно заряженные гигроскопические вещества (например, NaPCA) и осмотические агенты (например, молочную кислоту) часто включаются в гидрогель и увеличивают стабильность системы.
Известно, что защитная мембрана связывает белки или другие биологические агенты посредством ковалентных, электростатических, гидрофобных и/или механических взаимодействий. Как показано нашими собственными экспериментами (неопубликованные данные), когда мембрану наносят между кожей и гидрогелем (в ходе 12-часовых ex vivo нанесений), наблюдается снижение белковых отложений на гидрогеле. Используя экстракцию и анализ белка с бицинхониновой кислотой (BCA), наблюдали среднее отложение белка в 32 мкг в расчете на диск геля без мембраны и среднее отложение белка в 14 мкг в расчете на диск геля, если использовалась защитная мембрана.
IV. Способы улучшения детекции аналита
A. Подготовка кожи
В одном предпочтительном способе использования TAMS, перед наложением TAMS на кожу наносят протирку для подготовки кожи. Протирку для подготовки кожи используют вместо стандартной процедуры гидратации кожи, обычно используемой в методах данной области. Эту протирку для подготовки кожи наносят для протирания или очистки поверхности. Ее обычно наносят массированием, протиранием, пропиткой, втиранием или любыми другими способами для очистки целевого участка кожи после предобработки кожи для увеличения пористости. Эта стадия обычно занимает короткий период времени (по сравнению с более длительными стандартными процедурами гидратации, применяемыми в предыдущем уровне техники), например приблизительно от 1 до 30 секунд.
Протирку можно сделать из бумаги, ваты или ткани, пропитанных агентами, содержащими воду, фосфатный буферный раствор, молочную кислоту, мыло, поверхностно-активное вещество и другие химические вещества, растворители или их смеси, которые можно использовать для очистки целевого участка кожи после любой, такой как с использованием SonoPrep Ultrasonic Skin Permeation System (Sontra Medical). Предпочтительно агенты являются неорганическими или органическими растворителями, такими как вода, этанол, изопропанол или их комбинация. Примерная рецептура агента содержит 30-95% изопропанола в воде и протирочный материал представляет собой марлю.
a. Наборы
В одном варианте осуществления набор содержит систему трансдермальной детекции аналита и протирку для подготовки кожи, необязательно включающую протирочные реагенты, такие как фосфатный буферный раствор, молочную кислоту, мыло, поверхностно-активное вещество или растворитель. В одном варианте осуществления субстрат предварительно пропитывают протирочным реагентом. В другом варианте осуществления протирочный реагент поставляется как отдельный компонент набора.
B. Улучшенное насыщение биосенсоров кислородом
В одном предпочтительном варианте осуществления, сконструировано сенсорное устройство, для того чтобы увеличить снабжение кислородом гидрогеля и/или других элементов сенсорного устройства, которым для функционирования необходим кислород. Вокруг гидрогеля можно расположить воздушные каналы или полости. Воздушные каналы или полости обычно имеют форму щелей или отверстий на крепежной пластинке (102) или пластинке-мишени (Фиг.8). Каналы или полости не только увеличивают насыщение кислородом (повышенную оксигенацию), но также сохраняют влажность гидрогеля (воду). Предпочтительно крепежную пластинку или пластинку-мишень формируют из жестких непроводящих материалов с высокой диэлектрической константой, таких как пластики, которые обеспечивают плотное примыкание основной части сенсора и надежное размещение гидрогеля. Воздушные каналы или полости можно создать формованием, фрезеровкой, перфорацией, травлением или любыми другими механическими или химическими способами.
IV. Способы применения
Описанную здесь TAMS можно использовать для мониторинга биологических аналитов, например, для концентрации глюкозы в крови пользователя и/или, при необходимости, для доставки терапевтических соединений. TAMS накладывают на участок кожи животного; обычно животное является млекопитающим, в предпочтительном варианте осуществления млекопитающее является человеком.
Например, человек с пред-диабетом или диабетом может использовать прибор для мониторинга своих уровней концентрации глюкозы в крови и, при необходимости, для доставки инсулина, в зависимости от этих уровней концентрации. Инсулин может доставляться пользователем или прибором. Можно также измерять другие аналиты.
Непрерывный мониторинг глюкозы может измерять концентрацию глюкозы в крови, не учитывая накопление биологических жидкостей в сенсорном приборе. При непрерывном мониторинге глюкозы, например, предпочтительно минимизировать накопление как глюкозы, так и пероксида водорода в гидрогеле, так чтобы текущее измерение электрохимическим сенсором в реальном времени отражало поток глюкозы через проницаемую область кожи. Это преимущественно обеспечивает трансдермальный мониторинг глюкозы в реальном времени.
Для использования описанной здесь трансдермальной системы мониторинга аналита сперва участок кожи пользователя делают более проницаемым, используя любой подходящий метод. Обычные методы увеличения проницаемости кожи включают соскоб кожи при помощи липкой ленты, шлифовка, обработка наждачной бумагой, шлифовка абразивом, лазерная абляция, абляция СВЧ, химический пилинг, сонофорез, ионофорез, электропорация, нанесение агентов, повышающих проницаемость. Например, процедурой обработки кожи может быть наложение ультразвука с низкой энергией (например, SonoPrep Ultrasonic Skin Permeation System) или контролируемая обработка абразивными материалами.
При использовании беспроводной TAMS обычно пластинку-мишень (120) размещают на коже в месте с повышенной проницаемостью. Затем применяют процедуру предварительной обработки кожи. Этот способ особенно пригоден для применения с SonoPrep в качестве системы предварительной обработки кожи.
В предпочтительном варианте осуществления, после стадии предварительной обработки кожи обработанную кожу очищают способом, таким, например, как вытирание или протирание обработанного участка кожи салфеткой для подготовки кожи в течение короткого периода времени, такого как приблизительно от 1 до 30 секунд.
Затем сенсорное устройство, такое как представленное на Фиг.1 (проводная система) или на Фиг.9 (беспроводная система), присоединяют к проницаемому участку (107) кожи так, чтобы полупроницаемая мембрана (не показана на Фиг.1) находилась в контакте с проницаемой кожей. Если используют беспроводную TAMS, то обычно гидрогель и сенсор размещают на пластинке-мишени и совмещают с центральным отверстием (125). Затем присоединяют футляр сенсора (126) и соединяют его с пластинкой-мишенью (120) для формирования укомплектованного сенсорного устройства (112).
Аналит может экстрагироваться через обработанный проницаемый участок (107) кожи пользователя и проходить через полупроницаемую мембрану, так чтобы он контактировал с диском гидрогеля (106) сенсорного устройства (101).
Например, аналит, такой как глюкоза, может перемещаться при помощи диффузии через полупроницаемую мембрану в диск гидрогеля (106), где он контактирует с глюкозооксидазой. Глюкоза затем реагирует с глюкозооксидазой, присутствующей в диске гидрогеля (106), до образования глюконолактона и пероксида водорода. Затем пероксид водорода перемещается к поверхности электрода основной части сенсора (101), где он электрохимически окисляется. Ток, производимый при этом окислении, показывает скорость выработки пероксида водорода в гидрогеле, которая связана с объемом потока глюкозы через кожу (скорость потока глюкозы через заданную площадь кожи). Поток глюкозы через кожу пропорционален концентрации глюкозы в крови пользователя.
Сигнал от сенсорного устройства можно, таким образом, использовать для непрерывного мониторинга концентрации глюкозы в крови пользователя путем отображения на экране концентрации глюкозы в крови записывающим устройством потенциостата (108) непрерывным способом в режиме реального времени.
В принципе, любой сенсор, который использует рабочий электрод (201), электрод сравнения (202) и референсный электрод (203) для измерения пероксида водорода, можно встроить тем же способом. Примерами являются биосенсоры на глюкозу, лактат или любые другие, использующие оксидазный фермент, введенный в гидрогель (106). В ходе непрерывного мониторинга глюкозы электрохимический сенсор предпочтительно работает в потенциостатическом режиме. В потенциостатическом режиме электрический потенциал между рабочим и референсным электродами трехэлектродной ячейки поддерживают при заданном значении. Измеряют ток между рабочим электродом и электродом сравнения. Сенсор поддерживают в этом режиме до тех пор, пока необходимые напряжение в ячейке и ток не превышают пределы по току и напряжению потенциостата. В потенциостатическом режиме работы потенциал между рабочим и референсным электродом можно выбрать так, чтобы достичь селективного электрохимического измерения отдельного аналита или индикатора аналита.
Другие режимы работы можно использовать для исследования кинетики и механизма электродной реакции, происходящей на поверхности рабочего электрода или для электрохимических применений. Например, в соответствии с режимом работы электрохимической ячейки ток может протекать между рабочим электродом и электродом сравнения, в то время как потенциал рабочего электрода измеряют относительно референсного электрода. Специалистами в данной области будет оценено то, что режим работы электрохимического сенсора можно выбирать в зависимости от применения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: Применение защитной полупроницаемой мембраны для формирования композита гидрогель/мембрана и улучшения работы TAMS.
Тестировали следующие мембраны: [a] непокрытый полиэфирсульфон (PES): симметричную с размерами пор 0,2, 1,2 и 5,0 мкм; асимметричную с размерами пор 0,3, 1,0 и 2,0 мкм, [b] Nafion-покрытый PES: каждый из 6 различных PES с размерами пор, перечисленными выше, также тестировали с покрытием Nafion, [c] активированный PES с альдегидными функциональными группами (с порами 0,45 мкм), [4] амфотерный и катионный нейлон 66 (с порами 0,2 мкм), [d] ультрафильтрационные мембраны: регенерированную целлюлозу (RC) с 3,5k отсечкой по молекулярной массе; PES с 10k MW отсечкой по молекулярной массе, [e] пластины нафиона 1135 с ~35 nm ионными каналами.
Формирование композита гидрогель/мембрана: мембрану нарезали на диски, вымачивали в буфере и помещали на дно пресс-формы для полимеризации; поверх мембраны помещали лист холста; раствор полимера впрыскивали в полость пресс-формы; пресс-форму облучали УФ-светом для формирования полимера.
Для мембран, образованных из Nafion-покрытого PES, PES мембрану предварительно покрывали раствором Nafion, используя автоматическую машину для нанесения покрытий. Параметры покрытия включали скорость машины, размер арматуры при покрытии, растворитель Nafion и число покрытий и варьировались в зависимости от размера пор PES. Параметры покрытия влияют на толщину покрытия, как глубоко оно впитывается в мембрану, на его консистенцию и на его долговечность. Например, легкое покрытие поверхности получается в результате, если 0,2 мкм PES однократно покрывают 5% раствором Nafion (в 45% спирте) при 8 дюймах/в секунду, используя арматуру №20; более глубокое покрытие получается в результате множества циклов покрытий 5,0 мкм PES 20% раствором Nafion (в 80% спирте), используя арматуру №20. Глубину покрытия Nafion определяли путем сушки покрытой мембраны с катионным метиленовым голубым.
Там, где размер пор мембраны был меньше, чем у 3,4k PEG макромера (как у 3k целлюлозы), меньший 0,75k PEG макромер использовали для соединения мембраны с 3,4k PEG сеткой. В этом случае, когда PEG макромер (3,4k дальтон) не мог проникать в поры мембраны (3k дальтон), использовали 0,75k PEG макромер для образования двух взаимопроникающих сеток, IPNs. 0,75 PEG макромер сначала полимеризовали с одной стороны 3k мембраны; затем 3,4k PEG макромер полимеризовали на новой поверхности мембраны, которая теперь представляла собой 0,75k PEG сетку.
Проводили 24-часовые ex vivo исследования для изучения влияния каждой мембраны на работу глюкозного сенсора. Сравнивали группы испытуемых, у которых либо не было мембраны, либо были различные типы мембран. Мембрану, которая увеличивала срок службы прибора без увеличения MARD ошибки, определяли как предпочтительную мембрану. Каждую мембрану прикладывали к внешней поверхности сенсорного устройства в CGM приборе (поставляемом Sontra Medical), который затем прикладывали к обработанной ультразвуком коже пациента. В ответ на это прибор вырабатывал электрический сигнал в наноамперах (nA), который затем калибровали по уровню глюкозы в крови (BG) испытуемого, используя измеритель глюкозы в крови путем прокола пальца. В ходе ex vivo изучения (продолжительностью в 24 часа) образцы BG из проколов пальцев были отобраны в часы бодрствования с часовыми интервалами или во время приема пищи с 15-минутными интервалами, и они коррелировали с сигналом прибора. Анализ этой корреляции обеспечил информацию относительно точности прибора, стабильности и эффективности срока работы.
Вообще добавление любой мембраны к гидрогелю продлевает продолжительность эксплуатации глюкозного сенсора. Как показано на Фиг.3, при ex vivo наложениях без мембран только 55% испытуемых имели 24-часовой отклик; с мембраной 83% испытуемых имели 24-часовой отклик (см. Фиг.3).
Среди мембран существует разница, и критерием, используемым для отбора лучшей мембраны, было наличие наиболее низкого дрейфа сигнала за 24 часа при обеспечении, тем не менее, хорошей корреляции сигнала (в nA по отношению к BG) (то есть отсутствие значительного увеличения MARD ошибки). PES мембрана, покрытая Naflon с 5,0 мкм порами, была определена как лучший кандидат, поскольку она показывала наиболее низкий дрейф сигнала 54% за 24 часа и приемлемый уровень MARD (см. Фиг.4).
ПРИМЕР 2: Включение гигроскопического вещества в буфер гидрогеля для уменьшения потери воды и улучшения работы прибора.
Были проведены серии экспериментов по включению различных гигроскопических веществ в гидрогель. Тестировали две категории гигроскопических веществ. Первая категория включала гигроскопические вещества с малым размером молекул, обычно увлажняющие факторы природного происхождения (NMFs), и вторая категория включала полисахариды. Тестировали следующие гигроскопические вещества с малым размером молекул: глицерин, мочевину, гидроксиэтилмочевину, пропиленгликоль, натрий лактат (Na лактат) и натрий пирролидон карбоновую кислоту (Na PCA). Тестировали следующие полисахаридные гигроскопические вещества: гиалуроновую кислоту (натриевую соль), каррагенан и агарозу.
Для гигроскопических веществ с малым размером молекул каждое гигроскопическое вещество растворяли в растворе полимера перед полимеризацией. Индивидуальную концентрацию гигроскопического вещества в полимерном растворе также поддерживали в буфере гидрогеля. Это предотвращало градиент концентрации гигроскопического вещества, который мог бы способствовать диффузионным потерям гигроскопического вещества в ходе промывания и хранения.
Для полисахаридных гигроскопических веществ использовали тот же общий подход, что и для гигроскопических веществ с малым размером молекул. Однако некоторые кандидаты, такие как агароза и выделенные типы каррагенана, требовали нагревания для должной растворимости и охлаждения для образования геля. Концентрация PEGDA была понижена до 10% для увеличения растворимости полисахарида.
Сначала были проведены скрининговые эксперименты для того, чтобы выбрать наилучших кандидатов для ограниченных ex vivo экспериментов. Скрининговые эксперименты включали сравнения растворимости и скорости сушки.
Были проведены 24-часовые ex vivo эксперименты для изучения эффекта каждого гигроскопического вещества на работу глюкозного сенсора. Сравнивали группы испытуемых, у которых либо не было гигроскопического вещества, либо были различные типы гигроскопических веществ. Гигроскопическое вещество, которое увеличивало срок службы прибора без увеличения MARD ошибки, определяли как предпочтительное гигроскопическое вещество. Эксперименты ex vivo включали наложение прибора волонтерам на 24 часа и затем сравнение продолжительности работы при включении различных гигроскопических веществ.
Аналогично примеру 1, целью исследования включения гигроскопического вещества являлось продление срока работы прибора. Результаты тестов приведены на Фиг.5. Несмотря на то, что многие гигроскопические вещества демонстрировали некоторые перспективы, включая натрий лактат, каррагенан и агарозу, Na PCA определенно обеспечивал наиболее низкий дрейф сигнала (см. Фиг.5). Также, когда Na PCA образовывал пару с PES мембранами, покрытыми Nafion, в ходе 24-часовых ex vivo исследований, потеря воды не происходила. Данные, собранные от 27 испытуемых, показали фактический прирост воды в 2%. Однако обычно в 24-часовых исследованиях происходила потеря воды. В сравнительной группе в исследовании по 36 испытуемым без Na PCA наблюдали среднюю потерю воды в 19%.
Пример 3: Ковалентная иммобилизация глюкозооксидазы (GOx) внутри PEGDA гидрогеля
Проводили серии экспериментов для установления стратегии иммобилизации фермента. Акрилат-PEG-NHS (A-PEG-N) реагент (Nektar) выбирали в качестве сшивающего агента или реагента для иммобилизации. Интересуемые параметры включали отношение реагента для иммобилизации к ферменту, последовательность реакции и время инкубации.
Использовали стадию пре-полимеризации для инкубации акрилат-PEG-NHS (A-PEG-N) реагента для иммобилизации с ферментом. 3% GOx растворяли в буфере для полимеризации и добавляли молярный избыток A-PEG-N в соотношении 7:1. Молярное соотношение 7:1 выбирали, чтобы быть уверенными в конъюгации без интерференции с ферментативной активностью. Раствор оставляли инкубироваться в течение ночи при 4°C (время реакции в течение трех часов при комнатной температуре также оказалось эффективным). PEGDA добавляли обычно на следующий день для завершения подготовки полимерного раствора с последующим УФ-отверждением.
Доказательством того, что ковалентная иммобилизация была успешной, было получение 10% PEGDA полимеров, содержащих 3% GOx. Без ковалентной иммобилизации GOx вымывалась из дисков гидрогеля, если их помещали в промывочный буферный раствор, и превращала раствор в заметно желтый (поглощение в УФ-области при 460 нм=0,16). При ковалентной иммобилизации промывочный раствор не становился желтым (поглощение в УФ-области при 460 нм=0,02).
Доказательством того, что фермент все еще оставался активным после ковалентной иммобилизации, было обеспечение потенциостатического тестирования, которое показало отсутствие значительных отличий в откликах на глюкозу: -700 нА для контрольной системы и -650 нА для ковалентно иммобилизованной системы.
2
После того, как параметры ковалентной иммобилизации были установлены, проводили ex vivo эксперименты для определения того, увеличилась ли стабильность значений системы. Эксперименты ex vivo включали наложение прибора добровольцам на 4 часа и затем сравнение работы с прибором без ковалентной иммобилизации путем проведения статистического анализа и вычисления значений r и MARD.
2
2
В 4-часовом сравнительном исследовании ex vivo работы прибора для ковалентно иммобилизованной GOx относительно нековалентно иммобилизованной GOx система с ковалентно иммобилизованной GOx обеспечивала лучшую корреляцию (корреляцию нА с BG). Результаты этих исследований показаны на Фиг.6. Как показано на Фиг.6, после принятия ковалентно иммобилизованной GOx исследования ex vivo обеспечивали более устойчивую корреляцию с r 0,68 и MARD 12,27. В противоположность этому, для системы с нековалентно иммобилизованной GOx величина r составляла 0,41 и MARD составляла 20,44.
ПРИМЕР 4: Процедура подготовки кожи для трансдермальной детекции аналита
Пластинку-мишень сначала накладывали на кожу. Затем на участок кожи через пластинку-мишень прикладывали SonoPrep. SonoPrep затем включали на период в 1 секунду или больше и автоматически выключали при помощи встроенного контрольного алгоритма прибора. После проведения процедуры обработки кожи наложением SonoPrep (Sontra Medical) для увеличения пористости кожи обработанный участок кожи протирали протиркой для обработки кожи. Протирка для обработки кожи, используемая в этом исследовании, представляла собой марлевый тампон, пропитанный в 70%/30% смеси изопропанол/вода.
Фиг.7A и 7B демонстрируют различия в работе сенсора при применении и без применения процедуры подготовки кожи протиранием, полученные на одном испытуемом. В противоположность процедуре подготовки кожи протиранием, Фиг.7C показывает результат по тому же испытуемому, для которого использовали 40-минутную процедуру гидратации кожи (то есть процедуру предыдущего уровня техники). Как показано на рисунках, протирание обработанной кожи протиркой для обработки кожи показывает производительность, эквивалентную 40-минутной процедуре гидратации, и оба эти способа работают намного лучше, чем без какой-либо процедуры подготовки кожи. Удаление и/или очистка от любых материалов, засоряющих поры, путем процедуры протирки кожи, как ожидается, улучшает трансдермальные пути как для экстракции, так и для доставки лекарств.
ПРИМЕР 5: Клиническое исследование непрерывного трансдермального глюкозного сенсора с тремя различными конфигурациями
Глюкозный биосенсор состоит из электрохимического сенсора и гидрогеля, который соединен с обработанной ультразвуком SonoPrep проницаемой кожей и непрерывно транспортирует глюкозу в сенсор. Глюкоза, которая течет через кожу, расходуется биосенсором, поскольку она реагирует с глюкозооксидазой в гидрогеле. Эта химическая реакция продуцирует постоянный электрохимический сигнал, который записывается глюкозным монитором. Благодаря повышенной проницаемости, созданной SonoPrep, и химии гидрогеля глюкозный поток, детектируемый сенсором, может обеспечить глюкозные отклики через беспроводную связь каждую минуту в течение времени до 24 часов. См. Фиг.9 для схематического представления беспроводной биосенсорной системы.
В каждом исследовании использовали следующую процедуру. Эта процедура схематически проиллюстрирована на Фиг 9. Сначала пластинку-мишень помещали на участок кожи пациента. Затем к участку кожи прикладывали SonoPrep на 5-15 секунд (шаг 1). Затем SonoPrep удаляли с пластинки-мишени. Затем обработанный участок кожи протирали протиркой для подготовки кожи, содержащей спирт. После этого в пластинку-мишень помещали гидрогель и сенсор (шаг 2). Для каждого пациента на обработанный SonoPrep участок кожи помещали глюкозный сенсор однократного применения (шаг 3). К сенсору подключали миниатюрный анализатор, который беспроводным способом передавал оцифрованные данные на монитор для обработки данных и их показа (шаг 3). Сигнал глюкозного сенсора привязывали к показаниям глюкометра для определения глюкозы в крови из прокола на пальце в исследовании IA и исследовании IB и глюкозу крови отбирали через IV линию для исследования 2C.
Таблица 1 описывает конфигурации сенсора, тип используемых мембран (если мембрана присутствовала) и тип гигроскопического вещества, включенного в гидрогель (если гигроскопическое вещество присутствовало) для каждого исследования. Сенсор, используемый в каждом из исследований, создавали для обеспечения повышенной оксигенации (так, как проиллюстрировано на Фиг.8A, 8B и 8C). Дополнительно гидрогели, используемые в каждом исследовании, содержали 3% GOx, ковалентно иммобилизованной в 15% PEGDA.
<b>Таблица 1</b>
<b>Конфигурации сенсоров, материалы и продолжительность каждого исследования</b>
№ исследования
Конфигурация сенсора
Продолжительность
Мембрана
Гигроскоп.вещество
1
А
12 часов
отсутств.
отсутств.
1
В
12 часов
Biodyne B
отсутств.
2
С
24 часа
5,0 PES/NAF
10% NaPCA
Исследование 1 с конфигурацией сенсора A
Используя способ, описанный выше, тестировали 10 пациентов с диабетом. Как отмечено в таблице 1, это исследование проводили в течение 12 часов. Сенсор, используемый в этом исследовании, не содержал мембраны (Biodyne B) поверх гидрогеля. Дополнительно гидрогель не содержал гигроскопическое вещество.
В этом исследовании были проанализированы 222 экспериментальных значения для того, чтобы подтвердить разработку алгоритма предсказания глюкозы в крови. Результаты суммированы в сетке ошибок Кларка на Фиг.10. Как показано на Фиг.10, результаты указывают на то, что сенсор может точно предсказывать значение глюкозы в крови каждую минуту в течение времени до 12 часов с одноточечной калибровкой после одночасового периода прогрева.
При сравнении сенсорных и референсных измерений глюкозы в крови статистический анализ показал, что MARD (усредненный модуль относительной разности) составил 12,4%. 98,7% данных попадают в область A+B в сетке ошибок Кларка с 89,6%, лежащими в области А. Отличная корреляция данных (средний r=0,87) была опять продемонстрирована в данном исследовании (см. Фиг.10). Эта статистика суммирована в таблице 2 наряду со статистикой для других исследований, описанных в этом примере.
Исследование 1 с конфигурацией сенсора B
Использовали тот же самый протокол и конфигурацию, что и при исследовании IA, за исключением того, что в гидрогель была введена фильтрующая мембрана (Biodyne B). Используя способ, описанный выше, тестировали 10 пациентов с диабетом. Как отмечено в таблице 1, это исследование проводили в течение 12 часов. Сенсор, используемый в этом исследовании, содержал мембрану (Biodyne B) поверх гидрогеля. Дополнительно гидрогель не содержал гигроскопическое вещество.
В этом исследовании были собраны 225 экспериментальных значений. Результаты суммированы в сетке ошибок Кларка на Фиг.11. Как показано на Фиг.11, результаты указывают на то, что сенсор может предсказывать концентрацию глюкозы в крови со средней точностью каждую минуту в течение времени до 12 часов с одноточечной калибровкой после одночасового периода прогрева.
При сравнении сенсорных и референсных измерений глюкозы в крови статистический анализ показал, что MARD (усредненный модуль относительной разности) составил 20,4%. 96,9% данных попадают в область A+B в сетке ошибок Кларка с 70,7%, лежащими в области А. Коэффициент корреляции между биосенсорными и референсными измерениями глюкозы в крови составил 0,64. Эта статистика суммирована в таблице 2 наряду со статистикой для других исследований, описанных в этом примере.
Исследование 2 с конфигурацией сенсора C
Проводили 24-часовое клиническое исследование на пациентах в ходе и после сердечно-сосудистой хирургии. Как отмечено в таблице 1, сенсор, используемый в этом исследовании, содержал мембрану (5,0 PES покрытого NAFION) поверх гидрогеля. Дополнительно гидрогель содержал гигроскопическое вещество (10% (в/в) Na PCA).
В ходе хирургической операции внутренняя температура пациента понижалась приблизительно до 20ºC и сердце пациента останавливали с целью подключения аппарата искусственного кровообращения для циркуляции крови. Вводили медицинские препараты, такие как инсулин и гепарин, и отбирали пробы глюкозы в крови через IV линию и анализировали анализатором глюкозы в крови.
В первой части исследования было установлено, что влага и бетадин (дезинфицирующее вещество, используемое для подготовки кожи к операции) неблагоприятно влияют на сенсор и приводят к повреждению прибора. Затем в отношении этих проблем были выполнены временные модификации конфигурации прибора и процедуры установки (например, избегание участков кожи с бетадином).
Во второй части исследования после модификации прибора 10 пациентов были набраны и 9 закончили исследование. 147 измеренных сенсором значений глюкозы в крови были собраны и проанализированы с использованием того же алгоритма предсказания глюкозы, который был разработан в исследовании IA.
Результаты суммированы в сетке ошибок Кларка на Фиг.12. Как показано на Фиг.12, результаты отражают, что сенсор точно предсказывает значения глюкозы в крови каждую минуту в течение 24 времени до часов в ходе и после операции.
При сравнении сенсорных и референсных измерений глюкозы в крови статистический анализ показал, что MARD составил 11,2%, и 100% данных попадают в область A+B в сетке ошибок Кларка с 86,4%, лежащими в области А. Это исследование иллюстрирует, что при соответствующей конфигурации и установке трансдермальный глюкозный монитор может также обеспечивать точное непрерывное считывание глюкозы в течение времени до 24 часов даже при хирургических ICU параметрах.
<b>Таблица 2</b>
<b>Суммарная таблица по статистическому анализу и клиническим исследованиям</b>
№ исслед.
Параметры
№ пациента
Конфигурац. прибора
№ калибровки
Статистика
(А+В)% в CEG
MARD
R2
1
Диабетики, 12 часов
9/10
А
1
98,7
12,4%
0,77
В
1
96,9
20,4%
0,64
2
Хирургические ICU, 24 часа
9/36
С
2-3
100
11,2%
0,83
Специалисты в данной области будут отдавать себе отчет или будут способны установить, используя не более чем обычные эксперименты, множество эквивалентов специфических вариантов осуществления описанного изобретения. Такие эквиваленты намерена охватить следующая формула изобретения.