Энтеротоксигенная активность разных видов стафилококков, выделенных при атопическом дерматите у детей (часть 1)

Энтеротоксигенная активность разных видов стафилококков, выделенных при атопическом дерматите у детей

Ф.С. Флуер, А.Ю. Максимушкин ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения России,

А.В. Кудрявцева, О.А. Морозова ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова»

Enterotoxigenic activity of different types of staphylococci, isolated from children with atopic dermatitis

F.S. Fluer, A.V. Kudryavtzeva, A.Yu. Maximushkin, O.A. Morozova.

We investigated the presence of staphylococcal enterotoxins SEA, SEB, and TSST-1 by ELISA in 69 strains of staphylococci isolated from 32 children with AD, swabs were taken several times during the exacerbation and remission. We studied 26 strains of S. aureus, 15 strains S.epidermidis, 14 strains of S. haemolyticus, 8 strains of S. warneri, four strains of S. hominis, two strains of S. caprae. It was shown that 57% of S. aureus strains produced SEA, 53% - SEB, 46% - TSST-1 and 42% of S. aureus strains simultaneously produced three toxins - SEA, SEB and TSST-1. For S. epidermidis 53% of strains produced SEA, SEB - 53%, and TSST-1 - 20%, respectively. Staphylococcal enterotoxins were detected for S. warneri and S. haemolyticus strains, isolated from children with atopic dermatitis. SEA, SEB and TSST-1 were not detected for S. caprae and S. hominis strains, isolated from children with atopic dermatitis. The percentage of enterotoxigenic strains in children under 5 years was significantly higher than in children older than 5 years. It should be noted that severe atopic dermatitis was observed in children with isolates, that produced three types of enterotoxins - SEA, SEB and TSST-1. The expediency of research of enterotoxin production in coagulase-negative staphylococci strains isolated from damaged skin of children with AD was shown.

Атопический дерматит (АтД) является мульти-факторным социально значимым хроническим заболеванием кожи. Патогенетической основой заболевания является дефект кожного барьера. АтД может быть вызван разными факторами, как внешними, способными приводить к обострению АтД,

так и внутренними - генетическая предрасположенность, грибковые инфекции, пыльца, вирусы, различные микроорганизмы [1]. Важными причинами нарушений барьерной функции кожи, играющими роль в патогенезе АтД и запускающими процесс сенсибилизации, являются сухость кожных покровов, трансэпидермальная потеря воды, нарушение потоотделения, мутация гена, кодирующего филаггрин, участвующий в дифференцировке клеток эпидермиса. Немаловажную роль в развитии АтД и возникновении аллергического воспаления, особенно в раннем возрасте, играют иммунокомпе-тентные клетки - дендритные клетки, Т-лимфоци-ты, кератиноциты, тучные клетки и эозинофилы. Выделяя различные цитокины, хемокины клетки взаимодействуют между собой, запуская каскад иммунологических реакций, приводящих к развитию аллергического воспаления.

Значительное внимание уделяется факторам риска возникновения АтД, обусловленным различными микроорганизмами. Среди бактерий основную роль отводят Staphylococcus aureus (S. aureus), который не только вызывает пиодермию, но и приводит к развитию бактериальной сенсибилизации. Механизмы, ведущие к повышению колонизации кожи стафилококками у больных АтД, обусловлены несколькими причинами: снижением барьерной функции кожи, связанным с нарушением сальной и потовой секреции [2], а также нарушением местного иммунитета (снижением уровня секреторного IgA на поверхности кожи) и влиянием провоспалительных цитокинов, которые действуют как адгезины для стафилококков [3]. Установлена важная роль ИЛ-4 в повышении связывания стафилококков с кожей [4], большое значение для колонизации кожи стафилококками имеет изменение рН кожи в сторону защелачива-ния [3]. Не менее важная роль в развитии и под-

держании АтД принадлежит очагам хронических инфекций - заболеваниям ЛОР-органов, нарушениям биоценоза кишечника и дисбактериозу кишечника [3]. Известно, что у 90% больных преобладающим микроорганизмом на пораженных участках поверхности кожи является именно S. aureus, который обнаруживается до 107 КОЕ на 1 см2 [5]. S. aureus продуцирует 23 иммунологиче-ски различных типов стафилококковых энтероток-синов (SE), обозначенных буквами алфавита в порядке их открытия [6]. Способностью вырабатывать SE обладают более 50% штаммов S. aureus. В последнее время были обнаружены продуценты SE и у коагулазноотрицательных штаммов стафилококков (КОС) [7]. Как коагулазоположительные (КПС), так и КОС обладают способностью продуцировать одновременно два или более типов SE, а также токсин синдрома токсического шока (TSST-1). SE продуцируются антибиотико-устойчивыми штаммами и могут вызывать энтероколиты у пациентов, проходящих лечение широким спектром антибиотиков. Показана способность бактериальных суперантигенов вызывать обострение АтД и поддерживать аллергическое воспаление. SE способны индуцировать выработку специфических к ним IgE-антител. Известно, что у 57 % больных АД детей и подростков имеются IgE к энтеротоксинам A (SEA), B (SEB) и TSST-1, что косвенно указывает на этиологическую роль SE в возникновении АтД. Были найдены специфические IgE антитела к SE, обладающим свойствами суперантигенов и способным стимулировать пролиферацию Т-кле-ток и макрофагов, которые по своей природе являются протеинами с молекулярным весом 24-30 Kd, достаточным, чтобы выступать в качестве аллергенов и переводить активацию Т-лимфо-цитов из Th1 в Th2 [ 8]. Нарушение деятельности иммунной системы приводит к увеличению количества ТЬ2-цитокинов и понижению количества других цитокинов (например, альфа-фактора некроза опухолей) и снижение количества антистафилококковых пептидов в иммунной системе новорожденных, например, бета-дефенсина-3 и кателе-цидинов. [9]

Показана важная роль SE в патогенезе АтД, связанная с их воздействием на интерферонобразую-щую функцию лимфоцитов. SE приводят к угнетению продукции ИФН-гамма, играющего существенную роль в подавлении синтеза IgE, и таким

образом способствуют гиперпродукции IgE, а также напрямую стимулируют выброс гистамина тучными клетками [10]. Установлено, что штаммы стафилококков, выделенные с пораженной кожи детей с тяжелым течением АтД, чаще всего образуют SEA, SEB и TSST-1 [11]. Особую роль в сенсибилизации и поддержании АтД имеют токсины SEB и TSST-1.

До последнего времени роль других коагулазо-отрицательных видов стафилококков, кроме S. epidermidis, в развитии АтД не была известна.

Целью работы было изучить особенности продукции SEA, SEB и TSST-1 у КПС и КОС, выделенных с кожи от больных детей и подростков с АтД.

Материалы и методы. Всем больным проводили посев с кожи на кровяной агар, полученные изоляты идентифицировали до вида по общепринятым микробиологическим тестам. У некоторых детей мазок был взят несколько раз в период обострения и в период ремиссии. Идентификация изо-лятов стафилококков была выполнена при помощи системы API (Франция).

Степень обсемененности кожи стафилококками оценивали полуколичественным методом (количество колонеобразующих единиц на чашку Петри (КОЕ/чашка).

Полученные данные обрабатывали с применением программы статистического анализа Biostat в среде Windows XP и стандартного приложения Excel для Microsoft Office 2005. Использовали метод Пирсона с поправкой Иетса, корреляционный анализ (оценивали коэффициент Пирсона); уровень значимости разницы считали достоверным при р<0,05.

Было обследовано 32 больных с АтД, который диагностировали по критериям, предложенным J. Hanifin и G. Rajka [12]. Для оценки степени тяжести АтД использовали следующие критерии: длительность обострения и ремиссии, распространенность поражения. У всех пациентов учитывали распространенность, локализацию патологического процесса, наличие экссудации и зуда, реакцию регионарных лимфатических узлов. Выраженность кожных проявлений оценивали по полуколичественной шкале SCORAD (Scoring of Atopie Dermatitis). Индекс SCORAD составлял от 0 до 30 для легкой формы, от 30 до 60 для умеренной формы и больше 60 для тяжелых больных с АтД.

Средний возраст больных составил 5,2±0,7 лет (от 3 месяцев до 15 лет). Средняя продолжительность АтД приблизительно совпадала со средним возрастом больных в связи с ранним дебютом болезни и составила 4,8±0,5 лет. Распределение больных в зависимости от тяжести течения заболевания было следующим: 10 (31,2%) больных с легким течением, 11 (34,4%) со среднетяжелым и 11 (34,4%) - с тяжелым течением заболевания. При изучении характера распределения больных в зависимости от формы заболевания отмечено, что у 11 больных (34,4%) диагностирована эритема-тосквамозная форма с лихенизацией, у 16 больных (50%) - эритематосквамозная форма, у 4 (12,5%) -лихеноидная и у одного (3,1%) - экссудативная. Средний показатель индекса SCORAD в период обострения АтД был равен 65,4±6,5, в период ремиссии - 25,4±2,5. КОС обнаруживались у больных в 60 % случаев.

Выращивание стафилококковых штаммов осуществляли в пробирках объемом 50 мл, в которые наливали по 5 мл жидкой среды Casman (1958) в нашей модификации - вместо кислотного гидро-лизата казеина нами был использован ферментативный гидролизат казеина с добавлением 1% сердечно-мозговой вытяжки (лаборатория DIFCO). Культивирование проводили на шуттель-аппарате при непрерывном встряхивании при 210 об/мин в течение 24 ч при 37 С0. Микробные клетки удаляли центрифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин. Выявление SEA, SEВ и TSST-1 в надосадочной жидкости проводили иммунофер-ментным методом (ИФА) согласно МУК 4.2.242908 с использованием иммуноферментных тест-систем [13, 14]. SEA, SEВ и токсин токсического шока (TSST-1) определяли у 26 штаммов S. aureus, 15 штаммов S.epidermidis, 14 штаммов S. haemolyti-cus, 8 штаммов S. warneri, 4 штаммов S. hominis, 2 штаммов S. caprae.

ЛИТЕРАТУРА

1. Балаболкин И.И., Гребенюк B.H. Атопический дерматит у детей. - М.: Медицина, 1999.

2. Anderson A.L., Sporici R., Lambris J. et al. Pathogenesis of B-Cell Superantigen-Induced Immune Complex-Mediated Inflammation Infect. // Immun. February 2006. 74:1196-1203.

3. Bautista L., Gaya P., Medina M. A quantitative study of enterotoxin production by sheep milk stap-

hylococci. // Appl. Environ. Microbiol. February 1988.54:566-569.

4. Cho S.H., Strickland I., Tomkinson A. et al. Preferential binding of Staphylococcus aureus to skin sites of Th-2 mediated inflammation in a murine model.. //J. Invest. Dermatol. 2001. 116, 658-663.

5. Noble W.C. Skin bacteriology and the role of Staphylococcus aureus infection. // Br. J. Dermatol. 1998.139:9-12.

6. Dinges M.M.,Orwin P.M, Schlievert P.M. Exotoxins of Staphylococcus aureus. // Clin. Microbiol Rev. 2000. 13(1):16-34.

7. Cuhna M.L. R., Calsolari RA. O., Jnior J.P. A. Detection of Enterotoxin and Toxic Shock Syndrome Toxin 1 Genes in Staphylococcus, with Emphasis on Coagulase-Negative Staphylococci. // Microbiology and Immunol. 2007.51 (4): 381-390.

8. Imayama S., Shimozono Y., Hoashi M. Reduced secretion of IgA to skin surface of patients with atopic dermatitis. //J. Allergy. Clin. Immunolog. 1994. 94: 195-200.

9. OngP. Y., Ohtake T. Brandt C. et al. Endogenous antimicrobial peptides and skin infections in atopic dermatitis. //N. Engl. J. Med. 2002.347:1151-1160.

10. Leung D.Y. M., Harbeck R., Bina P. et al. Presence of IgE antibodies to staphylococcal exotoxins on the skin of patients with atopic dermatitis. Evidence for a new group of allergens. //J. Clin. Invest., 1993, Vol. 92. P. 1374-1380.

11. Флуер Ф.С., Кудрявцева А.В., Прохоров ВЯ. и др. Влияние энтеротоксинов Staphylococcus aureus и Epidermidis на течение атопического дерматита у детей. //Педиатрия. - 2009. - 87 (2). - С. 43-48.

12. Hanifin J.M., Rajka G. Diagnostic features of atopic dermatitis. //Acta Dermatol. Venereol. 1980.92:44.

13. Тутельян В.А,. Шевелева СА,. Ефимочкина Н.Р. и др.. Методы определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах. Методические указания. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Методические указания МУК 4.2.2429-08.

14. Флуер Ф.С., Михеева Г.В., Пожар П. и др. Тест-система иммуноферментная для определения стафилококкового экзотоксина токсического шока. // Ж микробиол., эпидемиол. и иммуно-биол.. - 1990. - № 12. - С. 70-73.

Продолжение в следующем номере