Малые интерферирующие РНК паразитов: современный статус и перспективы использования

Обзоры

Вестник ДВО РАН. 2011. № 4

УДК 577.218:576.8 Г.Н.ЧЕЛОМИНА

Малые интерферирующие РНК паразитов: современный статус и перспективы использования

В сфере биологических наук открытие класса малых эндогенных некодирующих РНК (названныx интерфе-рерирующими РНК), способных подавлять генную экспрессию, является одним из главных научных прорывов последних лет. Интерферирующие РНК имеют крошечный размер, длинную эволюционную историю и широкое распространение среди представителей различных классов животных, растений и человека. Участие интерферирующих РНК во многих важных клеточных процессах определяет их огромные потенциальные возможности для использования в разных областях медицины и биотехнологии. В настоящей работе дан краткий обзор результатов изучения этих молекул у паразитических видов: современный статус, потенциальные функции, перспективы дальнейших исследований и практического применения.

Ключевые слова: интерференция РНК, микроРНК, паразиты.

Short interfering RNA of parasites: current status and application potential. G.N.CHELOMINA (Institute of Biology and Soil Science, FEB RAS, Vladivostok).

In the field of life sciences, the discovery of class of small endogenous noncoding RNA (named as interfering RNA) that can repress gene expression is one of the major scientific breakthroughs of recent years. Interfering RNA has tiny size, long evolutionary history and is widely distributed among various classes of animals, plants and humans. Participation of interfering RNA in many important cellular processes determines their enormous potential for use in various fields of medicine and biotechnology. In this paper, we give a brief overview of the results of the study of these molecules in parasitic species: present status, potential function, the prospects for further research and practical applications.

Key words: RNA interference, microRNA, parasites.

В 1998 г. Крейг Меллоу и Эндрю Файер с соавторами опубликовали статью в журнале «Nature» [7] с данными о том, что молекулы двухцепочечных РНК способны подавлять экспрессию генов у почвенной нематоды Caenorhabditis elegans1. Позднее выяснилось, что инициируют процесс одноцепочечные молекулы. За это открытие в 2006 г. им была присуждена Нобелевская премия в области физиологии и медицины. Первое описание аналогичного явления у растений дано группой Дэвида Болкомба в статье журнала «Science» [11]. Подавление экспрессии может происходить на разных этапах реализации генетической информации. Во всех случаях необходимы сходный набор специфических белков и короткие РНК, которые направляют разрезание РНК-мишеней. Такой механизм подавления экспрессии генов (сайленсинг) у животных был назван РНК-интерференцией, у грибов это явление получило название «подавление» (quelling) транскрипции, а у растений - «посттрансляционный сайленсинг генов». По определению Л.И.Корочкина [1], РНК-интерференция - это механизм формирования и наследственной передачи специфического функционального состояния генома. РНК-интерференция

ЧЕЛОМИНА Галина Николаевна - доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник (Биолого-почвенный институт ДВО РАН, Владивосток). E-mail: chelomina@ibss.dvo.ru

'C. elegans - свободноживущая почвенная нематода длиной около 1 мм. Широко используется как модельный организм в исследованиях по генетике, биологии развития, нейрофизиологии. C. elegans - первый многоклеточный организм, чей геном был полностью просеквенирован (первичные данные опубликованы в 1998 г., дополнены в 2002 г.).

обеспечивает возможность появления множественных фенотипов, поскольку связана с изменением экспрессии ядерной ДНК. Полагают, что первоначально этот механизм мог сформироваться как защита клеток хозяина против внедрения чужеродных генетических последовательностей вирусной природы и транспозонов - мобильных элементов эукари-отического генома. К настоящему времени данный способ регуляции экспрессии генов обнаружен во всех крупных таксонах, включая вирусы, грибы, растения, позвоночных и беспозвоночных и даже один одноклеточный организм - зеленую водоросль Chlamydomo-nas reinhardtii [18, 24].

История открытия малых интерферирующих РНК (микроРНК). Первая мик-роРНК, lin-4, была впервые описана у почвенной нематоды Caenorhabditis elegans Виктором Амбросом более двух десятков лет назад [3]. Эти крошечные молекулы длиной всего 22 нуклеотида были идентифицированы при генетическом скрининге мутаций, вовлеченных в координацию развития (developmental timing) C. elegans. К удивлению исследователей, lin-4 хотя и не кодировала белок, но играла в данном процессе важную роль. Через несколько лет обнаружили вторую 22-нуклеотидную РНК, let-7, также вовлеченную в процесс координации развития C. elegans. Позднее такие типы молекул малых РНК (рис. 1, см. вклейку) были выявлены во многих других организмах; стало понятно, что микроРНК и РНК-интерференция взаимосвязаны [21].

Существует несколько мнений относительно того, почему микроРНК не были открыты раньше. Но абсолютно понятно, что это произошло не потому, что они редки - микроРНК и связанные с ними белки оказались одним из наиболее обильных рибонуклеопротеидных комплексов клетки. Тем не менее микроРНК, чья экспрессия ограничена немногочисленными клеточными типами или специфическими условиями окружающей среды, выявить трудно. Поэтому, чтобы дополнить экспериментальные методы идентификации генов микроРНК, были разработаны подходы in silico [15]. Они основываются на разных принципах: 1) поиск гомологии с известными генами микроРНК, 2) исследование окружения известных генов микроРНК, 3) идентификации консервативных генных сегментов, которые выпадают из предсказанных белок-кодирующих регионов и способны формировать структуры типа стебель-петля. Потенциальные мишени для микроРНК, информационные РНК (мРНК), могут быть идентифицированы с помощью методов биоинформатики (таких как MiRanda и PicTar) и экспериментальной биологии, включающих иммунопреципита-цию мРНК в комплексах сайленсинга и секвенирование [5].

Со времени первого описания микроРНК обнаружены у широкого круга многоклеточных организмов, от губки до млекопитающих; более 10 тыс. микроРНК (для более 100 видов) зарегистрировано в базе данных miRBase (ftp://mirbase.org/pub/mirbase/). Показано, что микроРНК регулируют работу, по крайней мере, 10% генов C. elegans. В геноме человека обнаружено около 1000 генов микроРНК (большинство из которых являются факторами развития и транскрипции), контролирующих работу не менее трети генов, в том числе ответственных за злокачественную трансформацию клеток [19]. Аномальная экспрессия генов микроРНК может быть причиной болезней человека, сильных феноти-пических изменений и даже летального исхода [6, 17]. Открыты стресс-индуцированные микроРНК, появляющиеся в ответ на специфические условия [3, 8]. Показано, что малые интерферирующие РНК вовлечены в ключевые биологические процессы, такие как развитие, дифференциация, апоптоз и пролиферация [4, 12]. Они играют важную роль в контроле генной экспрессии, эпигенетической модификации и регуляции активности ге-терохроматина, а также в паразитохозяинных взаимодействиях [25].

Биогенез и эволюция микроРНК. Хотя зрелые микроРНК состоят всего из 22 нук-леотидов, их биогенез является достаточно сложным (рис. 2). Первичные транскрипты представляют собой относительно крупные молекулы, содержащие характерные структуры типа стебель-петля, которые процессируются в ядре ферментом Drosha и белком Pasha, специфически связывающимся с двухцепочечной РНК. Продукт Drosha представляет

Процессинг с участием Drosha

Процес

Ядро

Первичный транскрипт микро РНК

Транскрипция

Предшественник микроРНК

Цитоплазма

1

Экспортин 5

Дуплекс микроРНК: микроРНК

Зрелая микроРНК

сГо

RISC

Процессинг с участием Dicer

dCb

.....ТТТ......

1

Регуляция трансляции

Рис. 2. Биогенез микроРНК [22]

собой примерно 65-нуклеотидную спираль, называемую пре-микроРНК. Пре-микроРНК экспортируются в цитоплазму с помощью особого белкового комплекса Exportin, где разрезаются ферментом Dicer. В результате образуются зрелые микроРНК, которые являются РНК-дуплексами длиной около 22 нуклеотидов. Показано, что они могут служить прай-мерами для синтеза новых, вторичных, молекул, что приводит к амплификации сигнала. Одна нить дуплекса микроРНК, называемая направляющей miR нитью, селективно наносится на белок-аргонавт (AGO). В итоге формируется РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC), который может связаться и репрессировать мРНК-мишени, содержащие сайты, комплементарные микроРНК. Другая нить, получившая название спутника, или пассажира, деградирует во время активизации RISC. У животных микроРНК обычно имеют неполное спаривание с мРНК-мишенью, поэтому они могут ингибировать транскрипцию многих генов, в мРНК которых имеются гомологичные последовательности.

Широкое распространение компонентов РНК-интерференции среди эукариотических организмов различной степени филогенетического родства предполагает наличие функциональной системы РНК-интерференции у общего предка всех эукариот, т.е. эта система, вероятно, сформировалась сотни миллионов лет назад [25]. Широкомасштабное сравнительное исследование [13], включающее филогенетический анализ всех известных семейств микроРНК животных, позволило надежно идентифицировать кластеры мик-роРНК, которые произошли от общего транскрипта. Идентифицировали три эпизода инноваций микроРНК, которые соответствуют основным инновациям развития животных организмов. Первую волну инноваций представляет класс из примерно 20 микроРНК, который является общим для первично- и вторичноротых и может быть связан с появлением билатеральности. Вторая волна связана с позвоночными, а третья - с плацентарными млекопитающими. Кроме того, обнаружена ожидаемая экспансия микроРНК, обусловленная геномными дупликациями у ранних позвоночных и предков костистых рыб. Нелокальные дупликации у предка позвоночных предшествовали локальным (тандемным), ведущим к образованию множества предковых кластеров микроРНК. Инновации микроРНК, тандемные и нелокальные дупликации генов микроРНК распределены в филогении Meta-zoa неравномерно (рис. 3, см. вклейку).

Малые интерферирующие РНК паразитических видов. Паразитарные заболевания широко распространены (рис. 4). Они являются причиной болезней человека и животных, большого экономического ущерба. По данным Всемирной организации здравоохранения, ими заражено более 4,5 млрд чел., а средняя заболеваемость населения Земли составляет 100 млн чел. в год. В странах Европы треть, а в США половина населения заражена паразитами; в России практически каждый гражданин в течение жизни переносит паразитарное заболевание.

Паразитизм возник на самых ранних этапах развития жизни, вскоре после начала ее дифференциации. Являясь с биологической точки зрения прогрессивным явлением как наиболее выгодный в энергетическом и физиологическом аспектах способ существования живых организмов, он получил широкое распространение в природе. Паразитический образ жизни оказался столь успешным в эволюции, что паразиты стали не менее многочисленными и разнообразными, чем свободноживущие организмы, а среди Metazoa практически нет ни одного крупного таксона, в котором не было бы паразитов. Скачок от свободноживущего к паразитическому образу жизни совершили представители тех ветвей эволюции, в которых сохранились циклы развития и пластичность обмена древних эукариот, а также генетически унаследованная способность развития в нескольких средах

Рис. 4. Географические карты распространения некоторых видов паразитов, особо патогенных для человека [16]

и произошла молекулярно-генетическая преадаптация к эндопаразитизму [2]. Сложный жизненный цикл паразитических видов требует наличия надежных механизмов, обеспечивающих нормальное развитие при постоянном изменении окружающей среды. Функцию посредника между поступающими сигналами и адекватным ответом организма могут выполнять молекулы малых интерферирующих РНК.

В системах паразит-хозяин и хозяин-патоген РНК-интерференция представляет особый интерес для исследования коэволюционных взаимодействий [25]. Гены иммунной системы и молекулы паразитов взаимодействуют и часто быстро эволюционируют - это процессы адаптации и контрадаптации между паразитом и хозяином. РНК сайленсинг (подавление экспрессии генов) при этом играет важную роль. Для хозяина РНК-интерференция является защитой как против внешних, так и против «геномных паразитов», таких как транспозоны, и может обеспечить тонкий контроль над компонентами врожденного иммунитета через модуляцию генной экспрессии. У паразита РНК-интерференция может быть использована для «подрыва» клеточных функций хозяина манипулированием генной экспрессией хозяина и блокированием механизмов его резистентности. К сожалению, исследования микроРНК и РНК-интерференции у паразитических видов только начинают развиваться; в литературе имеются немногочисленные примеры по нескольким видам простейших, червей и артропод (рис. 5).

МикроРНК паразитических простейших. Среди паразитических простейших наиболее изучены микроРНК четырех видов: трипаносомы Trypanosoma brucei, амебы Entamoeba histolytica, джиардии Giardia lamblia и трихомонады Trichomonas vaginalis [20]. G. lamblia является одноклеточным двуядерным организмом (геном расшифрован в 2007 г.), ответственным за джиардиаз (лямблиоз) у человека. T. vaginalis, принадлежащая к наиболее дивер-гировшей линии эукариот, является причиной трихомоноза. У этого вида самое большое среди геномов простейших число генов (предполагают, их примерно столько же, сколько в геноме человека) и строгий контроль генной экспрессии в условиях изменяющейся среды, что делает его очень интересной моделью для изучения внутриклеточных процессов. Трипаносома T. brucei (имеет два генома, ядерный и кинетопластный) вызывает развитие хронической инфекции у млекопитающих в результате антигенной изменчивости.

Рис. 5. Паразитические виды с наиболее изученными микроРНК. Верхний ряд: Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis, Giardia lamblia, нижний ряд: Schistosoma haematobium, Clonorchis sinensis, Bursaphelenchus xylophilus и Anopheles stephensi

E. histolytica является анаэробным паразитом, вызывающим дизентерию и абсцессы печени, приводящие к гибели около 2,5 млн чел. ежегодно, главным образом в тропических странах. C помощью методов биоинформатики и компьютерного программирования в геноме E. histolytica идентифицировано 17 потенциальных микроРНК, G. lamblia - 50, а T. brucei - более тысячи.

Первые данные по клонированию и экспериментальному доказательству наличия микроРНК у паразитических простейших, обеспечивающие новые пути для идентификации и функционального анализа микроРНК в других паразитах, получены на джиардии. Опубликованные результаты допускают возможность того, что опосредованная через мик-роРНК трансляционная репрессия может быть единственным механизмом генной регуляции этого организма [26]. Существование функционирующих микроРНК у трихомонад также нашло экспериментальное подтверждение. Однако ни точная длина этих молекул у T. vaginalis, ни их взаимодействие с РНК-мишенью еще не выяснены. Экспериментального подтверждения РНК-интерференции у E. histolytica пока нет [19, 20].

Микро-РНК паразитических червей. Данные получены всего на нескольких представителях трематод и на одном виде нематоды. Паразиты класса трематод являются важными эукариотическими патогенами человека, со сложным жизненным циклом и уникальной системой экспрессии на разных его стадиях. Одним из наиболее широко распространенных и тяжелых заболеваний человека является шистосоматоз2. Около 200 млн чел., главным образом в тропических и субтропических регионах Азии, Африки и Латинской Америки, поражены этим заболеванием, и почти 500 млн подвержены его риску. Шистосоматоз вызывают в основном три вида из рода шистосом (кровяных сосальщиков): Sсhistosoma mansoni, S. japonicum и S. haematobium. Данные по геномике, транскриптомике и биоинформатике предполагают наличие системы сайленсинга через микроРНК, по крайней мере, у двух первых видов. Причем характер экспрессии генов, участвующих в интерференции РНК, существенно различается на разных стадиях развития паразита [9, 30].

Клонорхоз - эндемичное заболевание во многих странах Восточной Азии, а также Дальнего Востока России. Более 35 млн чел. во всем мире, включая 15 млн китайцев, инфицированы Clonorchis sinensis3. По эпидемиологическим данным, влияние клонорхоза на здоровье человека возрастает, что связано с увеличением импорта сырой, мороженой или сушеной пресноводной рыбы из эндемичных районов. В Корее клонорхоз является одной из преобладающих инфекций. Во Вьетнаме в некоторых районах заболеваемость достигает 79%. Первое, и пока единственное, исследование РНК-интерференции у С. sinensis позволило идентифицировать и клонировать 6 новых и 62 512 консервативных микроРНК, принадлежащих к 284 семействам [29]. Резонно полагать, что в определенных ситуациях благодаря такому разнообразию микроРНК С. sinensis может легко расширить круг своих хозяев. В то же время обилие консервативных микроРНК может указывать на то, что они все еще находятся в процессе эволюции, а «birth-and-death» различных семейств мик-роРНК является их общим свойством [28, 29].

Паразитические нематоды вызывают различные заболевания у людей (ими заражены 3 млрд чел. во всем мире), а также у домашнего скота. Экономические потери от

2 Шистосоматоз является одним из древнейших известных человеку гельминтозов; шистосомы найдены в пластах земли, датируемых 1-1,5 млн лет. В Древнем Египте болезнь называлась «египетская гематурия»; из Египта она распространилась в другие районы Африки, а затем в Малую Азию, Америку и Китай. Историки описывали ее как болезнь, при которой мужчины «менструируют, как женщины». Многочисленные научные труды показывают, что в местностях, где широко распространен шистосоматоз, население чаще болеет раком мочеполовых органов. Кроме того, недавно американскими учеными были получены результаты, свидетельствующие о том, что заражение шистосомами значительно увеличивает риск ВИЧ-инфекции, и борьба с этой болезнью может замедлить темпы распространения эпидемии ВИЧ в развивающихся странах.

3 С. sinensis и Opisthorchis felineus вызывают такие заболевания человека, как холецистит, цирроз печени, панкреатит, и классифицируются в настоящее время как канцерогены. Например, в России наибольшая частота холангиокарциномы отмечается в интенсивных очагах описторхоза в Обь-Иртышском регионе.

нематодозов только в овцеводстве Шотландии ежегодно достигают 84 млн фунтов. Хотя о микроРНК C. е^аш известно многое, изучение микроРНК и их функций у паразитических нематод только начинает развиваться. Первые данные получены недавно на Bursa-phelenchus xylophilus [14]. Нематода сосновой древесины B. xylophilus - хорошо известный паразитический вид, она приводит к гибели сосновых деревьев в Азии. Полагают, что эта нематода является нативной для Северной Америки, где обычно повреждает экзотические сосновые деревья. В этом регионе она существует в двух формах, слабопатогенной «R» и высокопатогенной «М», которая и встречается в Азии. Жизненный цикл этой нематоды сложный, с чередованием циклов размножения и дисперсии. Интересно, что вид толерантен к температурным стрессам. Оказалось, что мишенями для микроРНК нематоды являются 949 генов, 7 из которых - гены белков теплового шока. Основываясь на отрицательной корреляции между профилями экспрессии микроРНК и мРНК-мишеней при стрессе и в норме, авторы пришли к заключению, что микроРНК может принимать участие в экологической адаптации и регуляции поведения нематоды.

МикроРНК артропод. Москиты Anopheles gambiae4 и A. stephensi являются основными переносчиками малярии в станах Африки и Азии. Знания о функциях их микроРНК необходимы для лучшего понимания биологии москитов (включая продолжительность жизни, репродуктивность и т.п.), а также взаимодействий москит-патоген, которые играют важную роль в распространении болезни. Поиск микроРНК, гомологичных таковым генома дрозофилы, позволил обнаружить у A. gambiae 91 кандидатную микроРНК, 50 из которых были новыми, а у A. stephensi - 4 новых микроРНК. Примечательно, что экспрессия одной из микроРНК происходит преимущественно в яичниках взрослых самок. Вероятно, эти типы молекул вовлечены в репродукцию самок и их функция у москитов может быть консервативной [23]. Экспрессия микроРНК, которая является гомологом регулятора продолжительности жизни и апоптоза у дрозофилы, зависит от возраста, пола и статуса питания кровью; т.е. она может быть важной для всех жизненных стадий москитов [23]. Интересно, что у самих малярийных плазмодиев не было обнаружено каких-либо мик-роРНК. Однако показано, что они проявляют способность к интерференции с популяцией микроРНК клеток хозяина [10].

Перспективы исследования и практического применения микроРНК паразитов. Открытие микроРНК является одним из главных научных прорывов последних лет. Эти крошечные регуляторы генной экспрессии имеют уникальный характер тканеспецифич-ности, специфичности к стадиям развития и к болезням. Хотя функции большинства открытых микроРНК не определены, исходя из имеющихся сведений можно полагать, что они регулируют некоторые виды физиологических и патологических процессов у паразитов. Паразитические микроРНК могут регулировать экспрессию не только собственных генов, но, вероятно, и генов хозяина. И паразиты, и хозяева кодируют микроРНК, которыми первые могли бы воспользоваться, чтобы клеточное окружение стало высокочувствительным к их размножению и выживанию, а вторые - чтобы это окружение было нечувствительным к выживаемости паразитов. К настоящему времени у паразитирующих видов идентифицированы тысячи потенциальных микроРНК, и их число продолжает увеличиваться. Прежде всего были обнаружены микроРНК, находящиеся в изобилии и широко экспрес-сируемые. Цель дальнейших исследований заключается в идентификации РНК-мишеней этих новых микроРНК, чтобы интерпретировать их функции. Из-за сложного жизненного цикла многих паразитов с несколькими стадиями развития (характеризующимися уникальным набором экспрессируемых генов) у позвоночных и беспозвоночных хозяев

4 Планируется в ближайшее время определить полную нуклеотидную последовательность генома Anopheles gambiae, чтобы выявить различия в геномах комаров, связанные со способностью к передаче заболевания. Полученную информацию можно будет использовать для «конструирования» таких особей, у которых эта способность снижена. Полагают, что внедрение трансгенных комаров в природную экосистему приведет к снижению заболеваемости малярией.

Рис. 6. Механизм РНК-интерференции: терапевтический эффект [25]

особенно важно выяснить роль микроРНК в росте и развитии паразитов, а также в способности регулировать заражение млекопитающих хозяев. Выяснение генной регуляции, основанной на микроРНК, станет вкладом в дальнейшее развитие представлений о биологических основах антигенной изменчивости и иммунного отклонения для паразитов [21].

Накопление данных по РНК-интерференции должны инициировать усилия по использованию микроРНК как потенциально нового класса лекарств (рис. 6) [31]. Не вызывает сомнений, что в ближайшие годы предстоит открытие большого количества микроРНК, специфичных к определенным клеточным типам или стадиям развития, с высоко специализированными функциями, связанными с клеточными процессами у паразитов. Они смогут обеспечить создание новых лекарств, направленных на лечение паразитарных заболеваний. Для этого необходимо разрешить две основные проблемы. Одна из них заключается в том, что эффект РНК-интерференции, запускаемой эндогенным или экзогенными малыми интерферирующими РНК, является кратковременным и дозозависимым. Различными работами показано, что пик деградации РНК-мишени приходится на 36-48 ч после интродукции малых интерферирующих РНК. Эффект можно продлить повторной доставкой. Количество доставляемых молекул может быть ключевым, так как использование слишком малых или слишком больших доз минимизирует эффект интерференции [27]. Кроме того, синтетические РНК для использования в терапии определенным образом модифицируются, чтобы придать стабильность, эффективность и специфичность, а также чтобы уменьшить иммуностимулирующие эффекты. Другая проблема терапии заключается в необходимости развития эффективных систем прямой доставки малых интерферирующих РНК в ткани мишени [27]. Следовательно, клиническое использование такой терапии будет зависеть, по крайней мере частично, от наличия безопасных и эффективных систем доставки, которые представляют первостепенную важность для успеха будущей терапии болезней человека. Эффективная доставка включает широкий диапазон стратегий, от инъекций чистых («naked») молекул малых интерферирующих РНК до недавно разработанных систем доставки этих молекул в нано-частицах, комплексированных с поликатионами. Так как все эти технологии новейшие, их продолжают совершенствовать. Однако большое будущее малых интерферирующих РНК в биологии и медицине уже предопределено.

ЛИТЕРАТУРА

1. Корочкин Л.И. Клонирование. Фрязино: Век 2, 2006. 64 с.

2. Сопрунов Ф.Ф. Молекулярные основы паразитизма. М.: Наука, 1987. 224 с.

3. Ambros V. A hierarchy of regulatory genes controls a larva-to-adult developmental switch in C. elegans // Cell. 1989. Vol. 57. P. 49-57.

4. Bartel D.P. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function // Cell. 2004. Vol. 116. P. 281-297.

5. Devaney E., Winter A.D., Britton C. MicroRNA: a role in drug resistance in parasitic nematodes? // Trends Para-sitol. 2010. Vol. 26. P. 428-433.

6. Esau C.C., Monia B.P. Therapeutic potential for microRNAs // Adv. Drug Deliv. Rev. 2007. Vol. 59. P. 101-114.

7. Fire A., Xu S.Q., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. 1998. Vol. 391. P. 806-811.

8. Flynt A.S., Lai E.C. Biological principles of microRNA-mediated regulation: shared themes amid diversity // Nat. Rev. Genet. 2008. Vol. 9. P. 831-842.

9. Gomes M.S., Cabral F.J., Jannotti-Passos L.K., Carvalho O., Rodrigues V., Baba E.H., Sa R.G. Preliminary analysis of miRNA pathway in Schistosoma mansoni // Parasitol. Int. 2009. Vol. 58. P. 61-68.

10. Hakimi M.A., Menard R. Do apicomplexan parasites hijack the host cell microRNA pathway for their intracellular development? // Biol. Reports. 2010. Vol. 2. P. 42-45.

11. Hamilton A.J., Baulcombe D.C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants // Science. 1999. Vol. 286. P. 950-952.

12. Harfe B.D. MicroRNAs in vertebrate development // Curr. Opin. Genet. Dev. 2005. Vol. 15. P. 410-415.

13. Hertel J., Lindemeyer M., Missal K., Fried C., Tanzer A., Flamm C., Hofacker I.L., Stadler P.F. The expansion of the Metazoan microRNA repertoire // BMC Genomics. 2006. Vol. 7. P. 25-40.

14. Huang Q.X., Cheng X.Y., Mao Z.C., Wang Y.S., Zhao L.L., Yan X., Ferris V. R., Xu R.M., Xie B.Y. MicroRNA discovery and analysis of Pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus by deep sequencing // PLoS. 2010. Vol. 5. e13271.

15. Huang Z., Mohebbi M., Malmberg R., Cai L. RNAv: Non-coding RNA secondary structure variation search via graph homomorphism // Proc. Computational Systems Bioinformatics Conference (CSB2010), Xiamen, China. 2010. Vol. 9. P. 56-69.

16. Jeong Y.J., Kim K.I., Seo I.J., Lee C.H., Lee K.N., Kim K.N., Kim J.S., Kwon W.J. Eosinophilic Lung Diseases: A Clinical, Radiologic, and Pathologic Overview // Radiographics. 2007.Vol. 27. P. 617-637.

17. Kloosterman W.P., Plasterk R.H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease // Dev. Cell. 2006. Vol. 11. P. 441-450.

18. Lema C., Cunningham M.J. MicroRNAs and their implications in toxicological research // Toxicol. Letters. 2010. Vol. 198. P. 100-105.

19. Lewis B.P., Shih I.H., Jones-Rhoades M.W., Bartel D.P., Burge C.B. Prediction of mammalian microRNA targets // Cell. 2003. Vol. 115. P. 787-798.

20. Lin W.C., Huang K.Y., Chen S.C., Huang T.Y., Chen S.J., Huang P. J., Tang P. Malate dehydrogenase is negatively regulated by miR-1 in Trichomonas vaginalis // Parasitol. Res. 2009. Vol. 105. P. 1683-1689.

21. Liu Q., Tuo W., Gao H., Zhu X.Q. MicroRNAs of parasites: current status and future perspectives // Parasitol. Res. 2010. Vol. 107. P. 501-507.

22. McDaneld T.G. MicroRNA: Mechanism of gene regulation and application to livwstock // J. Anim. Sci. 2009. Vol. 87 (E. Suppl.). E21-E28.

23. Mead E.A., Tu Z. Cloning, characterization and expression of microRNAs from the Asian malaria mosquito, Anopheles stephensi // BMC Genomics. 2008. Vol. 9. P. 244.

24. Molnar A., Schwach F., Studholme D.J., Thuenemann E.C., Baulcombe D.C. miRNAs control gene expression in the single-cell alga Chlamydomonas reinhardtii // Nature. 2007. Vol. 447. P. 1126-1129.

25. Obbard D.J., Gordon K.H., Buck A.H., Jiggins F.M. The evolution of RNAi as a defence against viruses and transposable elements // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Science. 2009. Vol. 364. P. 99-115.

26. Prucca C.G., Slavin I., Quiroga R., Elias E.V., Rivero F.D., Saura A. et al. Antigenic variation in Giardia lamblia is regulated by RNA interference // Nature. 2008. Vol. 456. P. 750-754.

27. Pushparaj P.N., Aarthi J.J., Manikandan J., Kumar S.D. siRNA, miRNA, and shRNA: in vivo application // J. Dent. Res. 2008. Vol. 87. P. 992-1003.

28. Wei L., Zhang D., Xiang F., Zhang Z. Differentially expressed miRNAs potentially involved in the regulation of defense mechanism to drought stress in maize seedlings // Int. J. Plant Sciences. 2009. Vol. 170. P. 979-989

29. Xu M.J., Liu Q., Nisbet A.J., Cai X.Q., Yan C., Lin R.Q., Yuan Z.G., Song H.Q., He X.H., Zhu X.Q. Identification and characterization of microRNAs in Clonorchis sinensis of human health significance // BMC Genomics. 2010. Vol. 11. P. 521-530.

30. Xue X., Sun J., Zhang Q., Wang Z., Huang Y., Pan W. Identification and characterization of novel microRNAs from Schistosoma japonicum // PLoS One. 2008. Vol. 3. e4034.

31. Zhang B.H., Farwell M.A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy // J. Cell. Mol. Medicine. 2008. Vol. 12. P. 3-21.