СПОСОБЫ ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ АГРЕГАТОВ А-БЕТА
METHODS FOR SELECTIVE QUANTITATIVE ASSESSMENT OF A-BETA AGGREGATES

Настоящее изобретение относится к способам избирательной количественной оценки агрегатов А-бета, заключающимся в том, что иммобилизуют захватывающие А-бета молекулы на субстрате, вносят предназначенный для тестирования образец на субстрат, добавляют зонды, меченные с целью осуществления детекции, которые посредством специфического связывания с агрегатами А-бета осуществляют их мечение, и осуществляют детекцию меченых агрегатов.
Агрегаты А-бета присутствуют при болезни Альцгеймера (AD, деменция Альцгеймера, латинское название: Morbus Alzheimer). Наряду с таким заболеванием, как, например, болезнь Паркинсона, она относится к гетерогенной группе клинических состояний, общим признаком которых во многих (но не во всех) случаях является присутствие внеклеточных системных или локальных отложений белка, специфического для каждого случая, как правило, имеющих упорядоченную конформацию в виде бета-складчатой структуры. В современном обществе возрастная деменция становится все более важной проблемой, поскольку вследствие увеличивающегося ожидаемого времени жизни она поражает все большее количество людей, и тем самым болезнь оказывает влияние на системы социального страхования и их финансовые возможности.
При многих нейродегенеративных заболеваниях присутствуют патологические агрегаты, образованные эндогенными белками, такие, например, как олигомеры или фибриллы. Например, в головном мозге при деменции Альцгеймера обнаружены отложения пептида амилоида-бета (отложения пептида А-бета), а при болезни Паркинсона - отложения синуклеина. Однако отложения пептида амилоида-бета (или пептидные фибриллы) характерны только для конечной стадии процесса, который начинается с отщепления мономерных пептидов амилоида-бета от АРР (белок-предшественник амилоида), после чего формируются нейротоксичные олигомеры пептида амилоида-бета, и, в конце концов, или в альтернативном варианте в сочетании с фибриллами пептида амилоида-бета откладываются в виде бляшек. Основными патологическими признаками AD являются образование старческих или амилоидных бляшек, состоящих из пептида А-бета, и, кроме того, нейрофибриллярные отложения тау-белка. Белок-предшественник пептида А-бета, АРР, локализован в клеточной оболочке нейронов. В результате протеолитического расщепления и последующей модификации из него образуются фрагменты А-бета различной длины и природы, такие, например, как А-бета 1-40, А-бета 1-42 или pGluA-бета 3-42. В течение жизни в здоровом организме образуются также мономерные пептиды А-бета.
Согласно гипотезе амилоидного каскада, выдвинутой в 1990-е годы, отложения А-бета в форме бляшек являются триггерами симптомов заболевания. Однако различные исследования, выполненные в последние годы, свидетельствуют о том, что среди всех видов А-бета наибольшей токсичностью обладают, прежде всего, небольшие свободно диффундирующие олигомеры А-бета, и они являются ответственными за возникновение и развитие AD. Таким образом, агрегаты пептидов А-бета непосредственно ассоциированы с патогенезом AD.
В настоящее время надежный диагноз AD можно установить только после проявления выраженных клинических симптомов, и в этом случае можно предполагать, что достоверность может достигать максимум 90%. В настоящее время единственная возможность гарантированного установления правильного диагноза существует только после смерти пациента, она заключается в выявлении гистологическим путем различных изменений в головном мозге.
Таким образом, существует необходимость в разработке способов идентификации и количественной оценки агрегатов А-бета, прежде всего небольших свободно диффундирующих олигомеров или агрегатов А-бета.
В настоящее время описано лишь несколько методов, позволяющих осуществлять характеризацию и количественную оценку патогенных агрегатов или олигомеров в тканях и общей воде организма.
Соединения, обладающие способностью связываться с А-бета и ингибировать агрегацию, описаны, например, у Chafekar и др., ChemBioChem, 8, 2007, cc. 1857-1864. Указанные субстанции состоят из фрагментов пептида А-бета (последовательность KLVFF), и их применяют для терапевтических целей, но их не используют для характеризации и количественной оценки патогенных агрегатов или олигомеров в тканях и общей воде организма.
В настоящее время отсутствуют общепринятые критерии и/или средства идентификации, так называемые биомаркеры, для AD. Ранее один из подходов с применением таких биомаркеров заключался в использовании радиоактивных трейсеров для позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ-радиотрейсеров), применяемых в методах визуализации, он был основан на предположении о том, что радиоактивно меченые субстанции связываются с амилоидными бляшками и, таким образом, после детекции могут служить в качестве меры отложения бляшек. Несмотря на наличие очевидной связи между ПЭТ-сигналом и заболеванием, ранее не удавалось продемонстрировать возможность установления на этой основе надежного диагноза, поскольку для многих индивидуумов, у которых деменция отсутствует, также характерен высокий уровень удержания трейсеров. Недостатками этого метода являются также его высокая стоимость и необходимость наличия технических средств, которые не во всех случаях бывают доступными.
В качестве другого подхода в настоящее время изучают количества различных субстанций в крови и спинномозговой жидкости (СМЖ) пациентов и анализируют возможность их применения в качестве биомаркеров. Одной из таких субстанций является пептид А-бета. Так, в настоящее время наиболее надежным представляется определение содержания мономерного А-бета в спинномозговой жидкости пациентов, возможно в сочетании с определением концентрации белка tau. Однако имеет место настолько большая вариация значений, что с помощью таких биомаркеров нельзя установить надежный диагноз для индивидуума. Применение такого метода описано в DE 69533623 Т2. Несмотря на наличие указанных различных подходов до настоящего времени не удалось выявить ни одного надежного биомаркера.
Другая трудность заключается в том, что в настоящее время для специфической количественной оценки агрегатов А-бета в отличие от оценки мономеров А-бета и/или общего содержания А-бета доступно лишь небольшое количество систем обнаружения. В настоящее время в качестве возможной системы обнаружения применяют методы ELISA, в которых детекцию олигомеров А-бета осуществляют с использованием антител. Антитела, применяемые для этой цели, распознают либо только очень специфические типы олигомеров А-бета, либо неспецифически распознают другие олигомеры, которые состоят не из пептидов А-бета, а из совершенно других белков, что оказывает неблагоприятное влияние на оценку.
Применение методов на основе ELISA с использованием специфических в отношении конформеров антител описано в WO 2005/018424 А2.
В качестве еще одного метода обнаружения применяют измерения с помощью сэндвич-ELISA. В этом методе применяют специфические в отношении А-бета антитела для иммобилизации молекул А-бета. Затем те же самые антитела используют для детекции. В этом методе мономеры не приводят к возникновению сигнала, поскольку сайт связывания антитела уже оккупирован захватывающими молекулами. Таким образом, специфические сигналы создаются только димерами или более крупными олигомерами. Однако при оценке таким методом можно количественно определять только сумму всех агрегатов, присутствующих в образце, а не характеризовать индивидуальные агрегаты. Кроме того, метод на основе ELISA не обладает необходимой чувствительностью для надежного обнаружения и количественной оценки индивидуальных агрегатов А-бета. Применение метода на основе сэндвич-ELISA описано в WO 2008/070229 А2.
В основу настоящего изобретения была положена задача разработать биомаркер для заболеваний, связанных с агрегацией белка, прежде всего AD, а также ультрачувствительный способ количественной оценки и характеризации агрегатов А-бета. На основе характеризации с помощью биомаркера, т.е. определения числа, количества и/или размера указанной субстанции (биомаркер) в эндогенной жидкости или ткани, может быть установлен точный диагноз и/или получена информация о протекании заболевания и состоянии пациента.
Следующая задача настоящего изобретения заключалась в том, чтобы разработать способ избирательной количественной оценки патогенных агрегатов, которые вызывают и/или характеризуют заболевание, связанное с агрегацией белка, прежде всего агрегатов А-бета любого размера или состава, олигомеров А-бета, и в то же время также небольших свободно диффундирующих олигомеров А-бета.
Данная задача решается с помощью способа избирательной количественной оценки и/или характеризации агрегатов А-бета, заключающегося в том, что осуществляют следующие стадии:
а) наносят предназначенный для тестирования образец на субстрат,
б) добавляют меченые для целей детекции зонды, которые в результате специфического связывания с агрегатами А-бета маркируют указанные агрегаты, и
в) осуществляют детекцию маркированных агрегатов, при этом стадию б) можно осуществлять до осуществления стадии а).
Характеризация агрегатов А-бета или олигомеров А-бета означает определение формы, размера и/или состава.
В контексте настоящего изобретения понятие мономер А-бета обозначает пептидную молекулу, представляющую собой часть белка-предшественника амилоида АРР, которая известна под названием А-бета. В зависимости от вида-источника (человек и/или животное) и процессинга длина и природа точной аминокислотной последовательности мономера А-бета может варьироваться.
В контексте настоящего изобретения понятие олигомеры А-бета обозначает агрегаты А-бета, а также олигомеры А-бета, и также небольшие свободно диффундирующие олигомеры А-бета. В контексте изобретения олигомер представляет собой полимер, образованный из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мономеров или кратного их количества. При этом все мономеры А-бета в олигомере А-бета могут быть идентичными друг другу, но это не является обязательным.
Таким образом, следует иметь в виду, что понятие «агрегаты А-бета» относится как к олигомерам А-бета, так и к небольшим свободно диффундирующим олигомерам А-бета. Это понятие включает также агрегаты, например фрагменты фибрилл, обозначенные как «протофибриллы», «ADDLS (выведенные из амилоида диффундирующие лиганды)» и р56*. В контексте настоящего изобретения важным является то, что с точки зрения размера агрегаты А-бета представляют собой такие агрегаты или полимеры, которые могут перемещаться в организме, а не являются иммобилизованными вследствие своего размера в форме отложений бляшек пептида амилоида-бета.
Согласно изобретению в качестве субстрата выбирают материал, который обладает максимально низкой способностью к неспецифическому связыванию, прежде всего в отношении олигомеров А-бета.
В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве субстрата выбирают стекло.
На субстрат можно наносить покрытие из гидрофильных материалов, предпочтительно из поли-D-лизина, полиэтиленгликоля (ПЭГ) или декстрана.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стеклянную поверхность гидроксилируют и затем активируют с помощью аминогрупп.
Для подготовки субстрата к нанесению покрытия осуществляют одну или несколько из следующих стадий:
промывают стеклянный субстрат или стеклянную подложку в ультразвуковой ванне или плазменном очистителе, в альтернативном варианте инкубируют по меньшей мере в течение 3 ч в 5М NaOH,
отмывают водой и затем сушат в атмосфере азота,
погружают в раствор, содержащий концентрированную серную кислоту и перекись водорода в соотношении 3:1, для активации гидроксильных групп,
отмывают водой до достижения нейтрального значения рН, затем этанолом и сушат в атмосфере азота,
погружают в раствор 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES) (1-7%) в безводном толуоле или в раствор этаноламина,
отмывают ацетоном или ДМСО и водой и сушат в атмосфере азота.
Для нанесения покрытия из декстрана, предпочтительно из карбоксиметилдекстрана (КМД), субстрат инкубируют в водном растворе, содержащем КМД (в концентрации 10 или 20 мг/мл) и необязательно N-этил-N-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДК) (200 мМ) и N-гидроксисукцинимид (NHS) (50 мМ), и затем отмывают.
В одном из вариантов осуществления изобретения карбоксиметилдекстран ковалентно связывают со стеклянной поверхностью, которая перед этим была гидроксилирована и затем активирована с помощью аминогрупп согласно описанной выше процедуре.
В качестве субстрата можно использовать также титрационные микропланшеты, предпочтительно со стеклянным дном. Поскольку нельзя использовать полистироловые рамки вследствие применения концентрированной серной кислоты, то активацию стеклянной поверхности в одном из вариантов осуществления изобретения проводят согласно методу, описанному у Janissen и др., Colloids Surf В Biointerfaces, 71(2), 2009, cc. 200-207.
В одном из альтернативных вариантов осуществления настоящего изобретения на субстрате иммобилизуют захватывающие молекулы для того, чтобы захватывать и иммобилизовать агрегаты А-бета.
Предпочтительно в качестве захватывающих молекул применяют антитела к А-бета.
В одном из вариантов осуществления изобретения захватывающие молекулы ковалентно связаны с субстратом.
В другом варианте осуществления изобретения захватывающие молекулы ковалентно связаны с покрытием, предпочтительно с декстрановым слоем.
Антитела к А-бета специфически связываются с одним эпитопом агрегатов А-бета. В одном из вариантов осуществления изобретения эпитоп имеет аминокислотную последовательность аминоконцевой части пептида А-бета, выбранную из подобластей А-бета 1-8 (SEQ ID NO: 2), А-бета 1-11 (SEQ ID NO: 3), А-бета 1-16 (SEQ ID NO: 4), А-бета 3-11 (SEQ ID NO: 5) и pyroGluA-бета 3-11 (SEQ ID NO: 6), А-бета 11-16 (SEQ ID NO: 7) и pyroGluA-бета 11-16 (SEQ ID NO: 8), например, человеческого N-концевого эпитопа (имеющего следующую последовательность: DAEFRHDSGYE (1-11, SEQ ID NO: 3).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения захватывающие молекулы (антитела) иммобилизуют на субстрате при необходимости после активации покрытой КМД подложки смесью ЭДК/NHS (200 и 50 мМ соответственно).
Оставшиеся карбоксилатные концевые группы, с которыми не связаны захватывающие молекулы, можно деактивировать.
Для деактивации указанных карбоксилатных концевых групп на КМД-спейсере применяют этаноламин в ДМСО. Перед внесением образцов субстраты или подложки отмывают с помощью ЗФР.
Предназначенный для анализа образец инкубируют на подготовленном таким путем субстрате.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения внесение образца осуществляют непосредственно на субстрат (субстрат без нанесенного покрытия) при необходимости путем ковалентного связывания с активированной при необходимости поверхностью субстрата.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предварительную обработку образца проводят с помощью одной или нескольких из следующих процедур:
- нагревание (до температуры вплоть до температуры кипения образца);
- осуществление одного или нескольких циклов замораживания-оттаивания,
- разведение водой или буфером,
- обработка ферментами, например протеазами, нуклеазой, липазами,
- центрифугирование,
- осаждение,
- конкурентное взаимодействие с использованием зондов для вытеснения любых присутствующих антител к А-бета.
На следующей стадии агрегаты А-бета маркируют с помощью зондов, несущих метку для целей последующей детекции.
В одном из вариантов осуществления изобретения в качестве зондов применяют антитела к А-бета. Захватывающие молекулы и зонды могут быть идентичными.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения захватывающие молекулы и зонды являются отличными друг от друга. Так, например, в качестве захватывающих молекул и зондов можно применять различные антитела к А-бета. В другом варианте осуществления настоящего изобретения применяют захватывающие молекулы и зонды, которые являются идентичными за исключением возможной маркировки красителем. В другом варианте осуществления настоящего изобретения применяют различные зонды, которые являются идентичными за исключением возможной маркировки красителем. В других вариантах осуществления настоящего изобретения применяют по меньшей мере 2 или большее количество различных захватывающих молекулы и/или зонда, которые выведены из различных антител к А-бета и при необходимости маркированы различными красителями.
Однако в качестве захватывающих молекул можно применять также различные молекулы, такие, например, как различные антитела к А-бета. Захватывающие молекулы могут иметь аминокислотные последовательности, специфические в отношении пептида А-бета, например А-бета 1-40/42, pyroGlu 3-40/42 или pyroGlu 11-40/42.
Равным образом, в качестве зондов можно применять несколько различных молекул, таких, например, как различные антитела к А-бета.
Для последующего контроля качества поверхности, например однородности покрытия захватывающими молекулами, можно применять захватывающие молекулы, меченные флуоресцентными красителями. Для этой цели предпочтительно применяют краситель, который не оказывает влияния на детекцию. Благодаря этому становится возможным последующая проверка структуры и стандартизация результатов анализа.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве зондов применяют антитела к А-бета, которые специфически связываются с N-концевыми эпитопами пептида А-бета.
Для детекции зонды метят таким образом, чтобы они испускали обнаруживаемый оптическими методами сигнал, выбранный из группы, включающей испускание и поглощение флуоресценции, биолюминесценции и хемилюминесценции.
В альтернативном варианте осуществления изобретения зонды метят с помощью красителей. Предпочтительно они представляют собой флуоресцентные красители.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения применяют по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или большее количество различных зондов. Зонды могут отличаться друг от друга как в отношении их специфического связывания с агрегатами А-бета, так и с позиций их различного мечения, например флуоресцентными красителями.
Зонды, пригодные для применения в методе детекции на основе FRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии (Fluorescence Resonance Energy Transfer)), можно использовать также в комбинации друг с другом.
Применение нескольких различных зондов, меченных различными флуоресцентными красителями, повышает специфичность получаемого при измерениях корреляционного сигнала. Кроме того, при этом можно отфильтровывать сигнал от мономеров А-бета. Детекцию мономеров А-бета следует исключать прежде всего в том случае, когда зонд и захватывающая молекула являются идентичными или когда они оба распознают перекрывающий эпитоп.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения применяют зонды, обладающие специфичностью в отношении определенных видов агрегатов А-бета, таких, например, как А-бета (х-40,), А-бета (х-42) или пироглутамат А-бета (3-х), пироглутамат А-бета (11-х). X обозначает целое число от 1 до 40 или 42, при этом специалисты в данной области на основе своих знаний о последовательности пептида А-бета могут определять длину применяемой последовательности. В другом альтернативном варианте можно применять зонды, обладающие специфичностью в отношении определенных форм агрегатов А-бета, такие, например, как поступающие в продажу антитела «А-11» или «1-11».
Таким образом, использование или применение специфических в отношении агрегатов А-бета или специфических в отношении олигомеров А-бета зондов также является объектом настоящего изобретения. Они специфически связываются с определенным агрегатом А-бета или олигомером А-бета, предпочтительно относящимся к указанным выше видам. Благодаря специфическому связыванию с определенным агрегатом А-бета или олигомером А-бета можно определять природу и/или размер и структуру агрегата А-бета или олигомера А-бета.
Таким образом, специфические в отношении агрегатов А-бета или специфические в отношении олигомеров А-бета зонды также являются объектом настоящего изобретения.
В другом альтернативном варианте в качестве зондов можно применять меченые флуоресцентными красителями пептиды А-бета.
В качестве образцов, предназначенных для тестирования, можно использовать эндогенные жидкости или ткани. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения образец выбирают из спинномозговой жидкости (СМЖ), крови, плазмы и мочи. Образцы можно подвергать различным стадиям предварительной обработки, известным специалистам в данной области.
Преимуществом настоящего изобретения является возможность определения агрегатов А-бета в необработанных образцах, предпочтительно в СМЖ.
Таким образом, способ определения состава, размера и/или формы агрегатов А-бета также представляет собой объект настоящего изобретения. Для этого применяют указанные и описанные выше стадии способа.
Детекцию маркированных агрегатов осуществляют путем сканирования или с помощью других типов визуализации поверхности. Детекцию предпочтительно осуществляют с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии или флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS), прежде всего в сочетании с кросс-корреляционным и лазерным сканирующим иммуносольвентным анализом отдельных частиц и/или с применением лазерного сканирующего микроскопа (ЛСМ).
В одном из альтернативных вариантов осуществления настоящего изобретения детекцию осуществляют с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения для этой цели применяют метод лазерного фокусирования, такой, например, который используют в лазерной сканирующей микроскопии, или FCS (система флуоресцентной корреляционной спектроскопии), и соответствующие обеспечивающие очень высокое разрешение модификации, такие, например, как STED или SIM. В альтернативном варианте детекцию можно осуществлять с помощью TIRF-микроскопа (микроскоп на основе эффекта полного внутреннего отражения флуоресценции) и его соответствующих обеспечивающих очень высокое разрешение модификаций, таких, например, как STORM или dSTORM.
Таким образом, в вариантах осуществления изобретения не применяют методы, не обеспечивающие пространственное разрешение сигнала, такие как ELISA или сэндвич-ELISA.
При осуществлении детекции важное значение имеет обеспечение высокого пространственного разрешения. В одном из вариантов способа, предлагаемого в изобретении, осуществляют сбор настолько большого количества «точек», что оказывается возможным осуществлять детекцию одного агрегата на фоне шума, обусловленного, например, зависящим от конкретного прибора шумом, от других неспецифических сигналов или сигналов, вызываемых неспецифически связанными зондами. Таким путем регистрируют такое количество величин (считываемых значений), какое имеется для поддающихся пространственному разрешению событий, таких, например, как пиксели. Посредством пространственного разрешения каждое событие определяют относительно соответствующего фона, и это представляет собой преимущество по сравнению с методами ELISA, которые не основаны на пространственном разрешении сигнала.
В одном из альтернативных вариантов осуществления изобретения в способе, предлагаемом в изобретении, применяют несколько различных зондов. Благодаря этому происходит умножение объема информации, т.е. считываемых значений, поскольку для каждой точки, для каждого агрегата или для каждого обнаруживаемого события получают отдельную порцию информации от конкретного зонда, генерирующего сигнал. Тем самым возрастает специфичность сигнала для каждого события. Таким образом, для каждого обнаруженного агрегата можно определять также его состав, т.е. вид агрегатов, также состав А-бета-видов, таких, например, как А-бета (1-40), А-бета (1-42), пироглутамат-А-бета (3-40/42, 11-40/42), или их смесей.
Количество различных зондов в данном случае ограничено только интерференцией предназначенных для применения флуоресцентных красителей. Так, можно использовать 1, 2, 3, 4 или большее количество различных комбинаций зонд-краситель.
Пространственно разрешенная информация имеет важное значение для осуществления оценки согласно представленному в настоящем описании способу. Она может представлять собой, например, вид и/или интенсивность флуоресценции. Путем оценки этих данных для всех применяемых и детектируемых зондов определяют согласно изобретению количество агрегатов, их форму, размер и/или их состав. При этом информацию о размере олигомеров можно получать прямым или косвенным путем в зависимости от того, является ли размер частиц меньше или больше пространственного разрешения, обеспечиваемого применяемым методом визуализации, в одном варианте осуществления изобретения можно применять алгоритмы минимизации фона и/или использовать пороговые величины интенсивности.
В качестве флуоресцентного красителя можно применять красители, известные в данной области. В альтернативном варианте можно использовать GFP (зеленый флуоресцентный белок), его конъюгаты и/или слитые с ним белки, и квантовые точки.
Путем использования внутренних и внешних стандартов результаты тестов можно объективно сравнивать друг с другом и поэтому они являются информативными.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения внутренний или внешний стандарт применяют для количественной оценки агрегатов А-бета.
Поскольку он основан на анализе распределения интенсивности флуоресценции (FIDA-Анализ распределения интенсивности флуоресценции (Fluorescence Intensity Distribution Analysis)), то способ, предлагаемый в изобретении, представляет собой так называемый поверхностный FIDA (sFIDA).
Путем выбора захватывающих молекул и молекул-зондов можно оценивать, какой размер должны иметь олигомеры для того, чтобы они были пригодны для детекции (могли давать сигнал, достаточный для обнаружения).
Кроме того, с помощью способа, предлагаемого в изобретении, можно осуществлять также точный анализ небольших свободно диффундирующих агрегатов А-бета. Вследствие их размера, находящегося ниже предела разрешения методами оптической микроскопии, указанные небольшие олигомеры А-бета трудно отличать от фоновой флуоресценции (обусловленной, например, несвязанными антителами).
Помимо очень высокой чувствительности способ, предлагаемый в изобретении, характеризуется также линейностью в широком диапазоне количеств агрегатов А-бета.
Следующим объектом предварительной заявки на изобретение является применение небольших свободно диффундирующих агрегатов А-бета в качестве биомаркеров для обнаружения и идентификации заболеваний, связанных с агрегацией белков, прежде всего AD. Изобретение относится также к способу идентификации и/или обнаружения заболеваний, связанных с агрегацией белков, прежде всего AD, отличающемуся тем, что анализируют образец общей воды из организма пациента, предпочтительно СМЖ, с помощью описанного выше способа, предлагаемого в изобретении.
В одном из вариантов настоящего изобретения применяют внутренние или внешние стандарты.
Такие стандарты, применяемые для количественной оценки олигомеров или патогенных агрегатов, которые характерны для заболевания, связанного с агрегацией белков, или амилоидной дегенерации, или заболевания, связанного с неправильной укладкой белков, отличаются тем, что конструируют полимер из полипептидных последовательностей, которые с точки зрения их последовательностей имеют соответствующую подобласть, идентичную эндогенным белкам, или гомологичны по меньшей мере на 50% по длине соответствующей подобласти эндогенным белкам, которые характерны для заболевания, связанного с агрегацией белков, или амилоидной дегенерации, или заболевания, связанного с неправильной укладкой белков, при этом полимеры не образуют агрегаты.
В контексте настоящего изобретения стандарт обозначает общеобязательную и общепринятую фиксированную эталонную величину, которую используют для сравнения и определения свойств и/или количества, прежде всего для определения размера и количества патогенных агрегатов эндогенных белков. Согласно настоящему изобретению стандарт можно применять для калибровки приборов и/или измерений.
В контексте настоящего изобретения амилоидная дегенерация и заболевания, связанные с неправильной укладкой белков, могут быть также объединены под понятием «заболевание, связанное с агрегацией белков». Примерами таких заболеваний и эндогенными белками, ассоциированными с ними, являются: А-бета и белок tau для AD, альфа-синуклеин для болезни Паркинсона или белок прион для прионных заболеваний, таких, например, как болезнь Крейтцфельда-Якобса (CJD), болезнь скрепи овец и бычья спонгиоформная энцефалопатия (BSE).
В контексте настоящего изобретения понятие «гомологичные последовательности» означает, что аминокислотная последовательность идентична аминокислотной последовательности из эндогенного патогенного агрегата или олигомеров, вызывающих заболевание, связанное с агрегацией белков, по меньшей мере на 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%. В настоящем описании вместо понятия «идентичность» употребляют в качестве синонимов понятия «гомологичный» или «гомология». Идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями рассчитывают путем их сравнения с помощью программы BESTFIT на основе алгоритма Smith T.F. и Waterman M.S (Adv. Appl. Math. 2, 1981, cc. 482-489), задавая для аминокислот следующие параметры: штраф за создание бреши: 8 и штраф за удлинение бреши: 2; и для нуклеиновых кислот следующие параметры: штраф за создание бреши: 50 и штраф за удлинение бреши: 3. Предпочтительно идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями определяют как идентичность нуклеотидной последовательности/полипептидной последовательности по всей длине конкретной последовательности, которую рассчитывают путем сравнения с помощью программы GAP на основе алгоритма Needleman S.B. и Wunsch CD. (J. Mol. Biol. 48, cc. 443-453), задавая для аминокислот следующие параметры: штраф за создание бреши: 8 и штраф за удлинение бреши: 2; и для нуклеиновых кислот следующие параметры: штраф за создание бреши: 50 и штраф за удлинение бреши: 3.
В контексте настоящего изобретения две аминокислотные последовательности являются идентичными, если они имеют одну и ту же аминокислотную последовательность.
Следует понимать, что понятие «соответствующая подобласть» эндогенных белков означает пептидную последовательность, которая в соответствии с определениями, используемыми в изобретении, идентична или гомологична на указанный процент пептидной последовательности мономера, на основе которого конструируют стандарты, предлагаемые в изобретении.
Важным свойством стандартов, предлагаемых в изобретении, является то, что стандарты не образуют агрегаты, предпочтительно благодаря применению мономерных последовательностей, которые не образуют агрегаты, поскольку «соответствующая подобласть» эндогенных белков не опосредует агрегацию, или благодаря тому, что группы, опосредующие агрегацию, не образуют агрегаты вследствие их блокирования.
В контексте настоящего изобретения агрегаты представляют собой:
- частицы, которые состоят из нескольких предпочтительно идентичных конструктивных элементов, не связанных друг с другом ковалентной связью, и/или
- нековалентные агломераты нескольких мономеров.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стандарты имеют строго определенное количество эпитопов, которые ковалентно сцеплены друг с другом (непосредственно или через аминокислоты, спейсеры и/или функциональные группы), предназначенные для связывания с соответствующими зондами.
Согласно изобретению зонды выбирают из группы, состоящей из: антител, нанободи и аффибоди. Кроме того, зондами могут служить все молекулы, которые обладают достаточной аффинностью связывания с агрегатами, подлежащими детекции, например красители (тиофлавин Т, Конго красный и т.д.).
Количество эпитопов определяют с использованием полипептидной последовательности, последовательность которой идентична подобласти эндогенных белков, которая образует эпитоп, или гомологична по меньшей мере на 50% указанной подобласти, и которая обладает также биологической активностью эпитопа. Выбранную таким образом полипептидную последовательность встраивают в желаемом количестве в процессе конструирования стандарта, предлагаемого в изобретении, и/или сцепляют друг с другом согласно изобретению.
Стандарты, предлагаемые в изобретении, представляют собой полимеры, которые создают из полипептидных последовательностей, предпочтительно описанных выше эпитопов, и которые при необходимости содержат другие компоненты.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения вышеописанные полипептидные последовательности, предпочтительно эпитопы, и/или их гомологи, обладающие биологической активностью, присущей соответствующему эпитопу, имеют такое же или большее количество мономеров в каждом случае относительно количества одного из остальных видов мономеров стандарта и/или относительно количества всех других мономеров.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения эпитопы представляют собой эпитопы пептида А-бета, выбранные из подобластей А-бета 1-8 (SEQ ID NO: 2), А-бета 1-11 (SEQ ID NO: 3), А-бета 1-16 (SEQ ID NO: 4), A-бета 3-11 (SEQ ID NO: 5) и pyroGluA-бета 3-11 (SEQ ID NO: 6), А-бета 11-16 (SEQ ID NO: 7) и pyroGluA-бета 11-16 (SEQ ID NO: 8), например, человеческий N-концевой эпитоп (имеющий следующую последовательность: DAEFRHDSGYE (1-11; соответствует SEQ ID NO: 3).
PyroGlu является сокращением пироглутамата, который находится в положении 3 и/или 11 пептида А-бета и предпочтительно образован путем циклизации N-концевого глутамата.
Молекула стандарта, предлагаемая в изобретении, представляет собой полимер, имеющий указанные выше полипептидные последовательности. В контексте изобретения олигомер представляет собой полимер, состоящий из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мономеров (следует иметь в виду, что понятие «мономер» обозначает указанную выше полипептидную последовательность) или из их кратного количества, предпочтительно из 2-16, 4-16, 8-16, прежде всего предпочтительно из 8 или 16, или из их кратного количества.
Таким образом, стандарты, предлагаемые в изобретении, представляют собой олигомеры или полимеры, предлагаемые в изобретении.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стандарты, предлагаемые в изобретении, являются водорастворимыми.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стандарты, предлагаемые в изобретении, созданы из идентичных полипептидных последовательностей.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стандарты, предлагаемые в изобретении, созданы из различных полипептидных последовательностей.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такие вышеуказанные полипептидные последовательности сцеплены друг с другом в виде линейной конформации.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такие вышеуказанные полипептидные последовательности сцеплены друг с другом в виде разветвленного олигомера, предлагаемого в изобретении.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такие вышеуказанные полипептидные последовательности сцеплены друг с другом в виде поперечно-сшитого олигомера, предлагаемого в изобретении.
Разветвленные или поперечно-сшитые олигомеры, предлагаемые в изобретении, можно получать путем сцепления индивидуальных конструктивных элементов с помощью лизина или методами клик-химии.
Как указано выше, стандарты, предлагаемые в изобретении, которые представляют собой олигомеры или полимеры, предлагаемые в изобретении, помимо полипептидных последовательностей, предпочтительно эпитопов, присутствующих в строго определенном количестве, могут содержать также дополнительные аминокислоты, спейсеры и/или функциональные группы, посредством которых полипептидные последовательности, предпочтительно эпитопы, ковалентно сцеплены друг с другом.
В одном из альтернативных вариантов осуществления изобретения исключают непосредственное сцепление полипептидных последовательностей, предпочтительно эпитопов, с помощью цистеина, прежде всего посредством формирования дисульфидных мостиков с помощью цистеинов (для того, чтобы избежать применения восстанавливающих агентов для удаления мостиков). Аналогично этому, в другом варианте осуществления изобретения исключают непосредственное сцепление спейсеров с полипептидной последовательностью, с одной стороны, и с цистеином, с другой стороны.
Один из вариантов осуществления изобретения относится к молекуле стандарта, которая состоит или сконструирована из копий аминоконцевого участка пептида А-бета, выбранного из подобластей А-бета 1-8 (SEQ ID NO: 2), А-бета 1-11 (SEQ ID NO: 3), А-бета 1-16 (SEQ ID NO: 4), А-бета 3-11 (SEQ ID NO: 5) и pyroGluA-бета 3-11 (SEQ ID NO: 6), А-бета 11-16 (SEQ ID NO: 7) и pyroGluA-бета 11-16 (SEQ ID NO: 8), например, человеческого N-концевого эпитопа (имеющего следующую последовательность: DAEFRHDSGYE (1-11).
Увеличение количества эпитопов с помощью функциональных групп можно осуществлять до или после синтеза индивидуальных конструктивных элементов. Ковалентное сцепление полипептидных последовательностей представляет собой характерную особенность стандартов, предлагаемых в изобретении.
Полипептидные последовательности, предназначенные для применения согласно изобретению, могут быть идентичны последовательности полноразмерного пептида А-бета или могут быть гомологичны на 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% последовательности полноразмерного пептида А-бета.
В альтернативном варианте осуществления изобретения для конструирования молекул стандарта, предлагаемого в изобретении, можно использовать также полипептидные последовательности, которые идентичны подобласти полноразмерного пептида А-бета или гомологичны на 50, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% подобласти полноразмерного пептида А-бета.
Для последовательностей, предлагаемых в изобретении, важным является их свойство не образовывать агрегаты (или образовывать их только контролируемым образом в зависимости от условий) и/или их активность в качестве эпитопа.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения стандарты конструируют в виде дендримеров. Дендримеры, предлагаемые в изобретении, конструируют из указанных выше полипептидных последовательностей, предназначенных для применения согласно изобретению, и они могут содержать центральную каркасную молекулу. Предпочтительно каркасная молекула представляет собой стрептавидиновый мономер, наиболее предпочтительно полимер, прежде всего тетрамер.
В одном из вариантов осуществления изобретения дендримеры, предлагаемые в изобретении, содержат полипептидные последовательности, которые идентичны подобласти пептида А-бета или которые обладают по меньшей мере 50%-ной гомологией с соответствующей подобластью.
В контексте изобретения под понятием «по меньшей мере 50%-ная гомология» следует понимать более высокую степень гомологии, а именно выбранную из группы, включающей 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%.
В одном из вариантов осуществления изобретения стандарты, преимущественно обладающие более высокой растворимостью в водных средах, чем патогенные агрегаты или олигомеры эндогенных белков, конструируют из полипептидных последовательностей, которые идентичны N-концевой области пептида А-бета или которые обладают по меньшей мере 50%-ной гомологией с указанной областью. Следует иметь в виду, что согласно изобретению N-концевая область полипептида А-бета представляет собой аминокислотную последовательность А-бета 1-8 (SEQ ID NO: 2), А-бета 1-11 (SEQ ID NO: 3), A-бета 1-16 (SEQ ID NO: 4), А-бета 3-11 (SEQ ID NO: 5) и pyroGluA-бета 3-11 (SEQ ID NO: 6), А-бета 11-16 (SEQ ID NO: 7) и pyroGluA-бета 11-16 (SEQ ID NO: 8).
Молекула стандарта, предлагаемого в изобретении, может содержать эпитопы по меньшей мере для 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или большего количества различных зондов.
Эпитопы, соответствующие различным зондам, можно встраивать в стандарты, предлагаемые в изобретении, с использованием пептидных последовательностей, которые идентичны различным областям пептида А-бета или которые характеризуются по меньшей мере 50%-ной гомологией с указанными областями, но обладают активностью, присущей соответствующему эпитопу.
В одном из вариантов осуществления изобретения для этой цели применяют полипептидные последовательности, которые идентичны или гомологичны на 50% N-концевой области полипептида А-бета, и полипептидные последовательности, которые идентичны или гомологичны по меньшей мере на 50% С-концевой области полипептида А-бета.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулы стандарта содержат так называемые спейсеры.
Под спейсером следует понимать молекулу, которую встраивают в молекулу стандарта с помощью ковалентных связей и которая обладает определенными физическими и/или химическими свойствами, благодаря которым модифицируются свойства молекул стандартов. В одном из вариантов стандартов, предлагаемых в изобретении, применяют гидрофильные или гидрофобные, предпочтительно гидрофильные спейсеры. Гидрофильные спейсеры выбирают из группы молекул, включающей полиэтиленгликоль, сахара, глицерин, поли-L-лизин или бета-аланин.
В одном из альтернативных вариантов осуществления настоящего изобретения стандарты, предлагаемые в изобретении, содержат (дополнительные) функциональные группы.
Под функциональными группами следует понимать молекулы, которые ковалентно связаны с молекулами стандарта. В одном из вариантов осуществления изобретения функциональные группы содержат биотиновые группы. Благодаря этому можно осуществлять сильное ковалентное связывание со стрептавидином. Таким образом, можно связывать молекулы стандарта, содержащие биотиновые группы, с молекулами, содержащими стрептавидиновые группы. Если молекулы стандарта, предлагаемые в изобретении, содержат биотиновые и/или стрептавидиновые группы, то благодаря этому можно осуществлять сборку более крупных стандартов или можно связывать с одним каркасом несколько при необходимости различных молекул стандарта.
В другом альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения молекулы стандарта содержат красители для определения спектрофотометрическим методом и/или ароматические аминокислоты. Ароматические аминокислоты представляют собой, например, триптофан, тирозин, фенилаланин или гистидин, или их выбирают из указанной группы. Благодаря встраиванию триптофана можно определять спектрофотометрическим методом концентрацию стандартов в растворе.
Следующим объектом настоящего изобретения являются дендримеры, содержащие полипептиды, последовательности которых идентичны соответствующей подобласти эндогенных белков или гомологичны по меньшей мере на 50% соответствующей подобласти эндогенных белков, характерных для заболевания, связанного с агрегацией белков.
Дендримеры, предлагаемые в изобретении, могут обладать любой из указанных выше характерных особенностей стандартов или любой их требуемой комбинацией.
В одном из альтернативных вариантов осуществления настоящего изобретения они представляют собой:
дендримеры, содержащие строго определенное количество эпитопов для ковалентного связывания с зондами,
дендример, содержащий эпитопы пептида А-бета,
дендример, отличающийся тем, что он обладает более высокой растворимостью в водных средах, чем патогенные агрегаты эндогенных белков, характерных для заболевания, связанного с агрегацией белков,
дендример, содержащий функциональные группы,
дендример, содержащий по меньшей мере одну спейсерную молекулу, и/или
дендример, содержащий красители для спектрофотометрического определения и/или ароматические аминокислоты.
Согласно изобретению дендримеры обладают радиальной симметрией.
В одном из вариантов осуществления изобретения разветвление первого поколения дендримеров осуществляют с помощью лизина, прежде всего трех аминокислот, представляющих собой лизин.
В другом альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения в стандартах, прежде всего в дендримерах, полипептидные последовательности, предпочтительно эпитопы, сцепляют, прежде всего ковалентно связывают друг с другом или с другими компонентами стандарта, такими как аминокислоты, спейсеры и/или функциональные группы, и/или другими описанными выше компонентами не через связь с атомом серы, не через тиоэфирную связь и/или не через цистеин (необязательно через цистеин посредством образования дисульфидного мостика). Аналогично этому, в другом варианте осуществления изобретения полипептидные последовательности, предпочтительно эпитопы, и связанный с ними спейсер сцепляют, прежде всего ковалентно связывают друг с другом или с другими компонентами стандарта, такими как аминокислоты, спейсеры и/или функциональные группы, и/или с другими описанными выше компонентами не через связь с атомом серы, не через тиоэфирную связь и/или не через цистеин.
Настоящее изобретение относится также к описанному выше способу получения стандарта.
В одном из вариантов осуществления изобретения стандарт, предлагаемый в изобретении, получают путем пептидного синтеза или методами рекомбинации, известными специалистам в данной области.
Следующим объектом настоящего изобретения является применение описанного выше стандарта или описанного выше дендримера для количественной оценки патогенных агрегатов или олигомеров эндогенных белков, характерных для заболевания, связанного с агрегацией белков.
В одном из вариантов осуществления изобретения стандарт применяют для количественной оценки олигомеров А-бета.
Согласно изобретению олигомеры или полимеры, предлагаемые в изобретении, применяют в качестве стандарта в способе количественной оценки патогенных агрегатов или олигомеров эндогенных белков, характерных для заболевания, связанного с агрегацией белков, или амилоидной дегенерации, или заболевания, связанного с неправильной укладкой белков.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стандарты, предлагаемые в изобретении, применяют для калибровки метода поверхностного FIDA, ELISA (сэндвич-ELISA) или FACS.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к набору, который содержит стандарт, предлагаемый в изобретении. Соединения и/или компоненты набора, предлагаемого в изобретении, могут быть упакованы в контейнеры, необязательно вместе с буферами и/или раствором, или в буферах и/или растворе. В альтернативном варианте в одном и том же контейнере могут быть упакованы несколько компонентов. Дополнительно к указанному или альтернативно указанному один или несколько компонентов могут быть адсорбированы на твердой подложке, такой, например, как стеклянная пластина, чип или найлоновая мембрана, или в лунке титрационного микропланшета. Кроме того, набор может содержать инструкции по применению набора для любого из вариантов осуществления изобретения.
В одном из альтернативных вариантов осуществления настоящего изобретения стандарты для количественной оценки патогенных агрегатов или олигомеров эндогенных белков применяют следующим образом:
на первой стадии маркируют зондами стандарты или дендримеры и определяют количество зондов, связанных со стандартами или дендримерами,
на второй стадии маркируют зондами патогенные агрегаты или олигомеры эндогенных белков, характерных для заболевания, связанного с агрегацией белков, определяют количество зондов, связанных в каждом случае с патогенным агрегатом или олигомером,
на третьей стадии сравнивают количество зондов, которые связаны со стандартом или дендримером соответственно, определенное на стадии 1, с количеством, определенным на стадии 2, и
на четвертой стадии определяют на основе полученных данных количество и размер олигомеров, присутствующих в общей воде организма.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стандарты, предлагаемые в изобретении, предпочтительно дендримеры, применяют для калибровки метода поверхностного FIDA. На первой стадии осуществляют иммобилизацию эндогенных патогенных агрегатов, присутствующих в общей воде организма, например агрегатов А-бета, на стеклянной поверхности с помощью зонда. В случае агрегатов А-бета для этой цели можно применять N-концевой захватывающий зонд. После иммобилизации агрегаты маркируют с помощью двух различных зондов. В случае агрегатов А-бета применяют, например, антитела к А-бета, которые оба связаны через N-концевой связывающий эпитоп. Предназначенные для детекции зонды маркируют предпочтительно различными флуоресцентными красителями. Благодаря этому они становятся видимыми под микроскопом, например лазерным сканирующим микроскопом.
Согласно изобретению исключают детекцию мономеров эндогенных полипептидов, поскольку в системе анализа применяют три различных зонда или три различным образом маркированные зонда, которые связываются со сходным или идентичным эпитопом. В альтернативном варианте или дополнительно можно исключать детекцию мономеров путем исключения оценки сигналов низкой интенсивности с помощью предельного значения интенсивности. Поскольку более крупные агрегаты имеют несколько сайтов связывания для двух зондов, маркированных различными красителями, то детекцию мономеров можно в альтернативном варианте или дополнительно исключать, используя кросс-корреляцию указанных сигналов.
Стандарты, предлагаемые в изобретении, можно применять в анализе в качестве внутренних или внешних стандартов.
Объектом изобретения является также набор для избирательной количественной оценки агрегатов А-бета с помощью описанного выше способа. Указанный набор может содержать один или несколько из следующих компонентов:
стеклянный субстрат, на который нанесено покрытие из гидрофобной субстанции, предпочтительно декстрана, предпочтительно карбоксиметилдекстрана;
стандарт;
захватывающую молекулу;
зонд;
субстрат с захватывающей молекулой.
Соединения и/или компоненты набора, предлагаемого в настоящем изобретении, могут быть упакованы в контейнеры необязательно вместе с буферами и/или раствором, или в буферах и/или растворе. В альтернативном варианте в одном и том же контейнере могут быть упакованы несколько компонентов. Дополнительно к указанному или альтернативно указанному один или несколько компонентов могут быть адсорбированы на твердой подложке, такой, например, как стеклянная пластина, чип или найлоновая мембрана, или в лунке титрационного микропланшета. Кроме того, набор может содержать инструкции по применению набора для любого из вариантов осуществления изобретения.
В другом варианте набора описанные выше захватывающие молекулы иммобилизованы на субстрате. Кроме того, набор может содержать растворы и/или буфер. Для защиты поверхности с покрытием из декстрана и/или иммобилизованных на нем захватывающих молекул их можно покрывать раствором или буфером.
Следующим объектом настоящего изобретения является применение предлагаемого в изобретении способа для установления диагноза, раннего диагноза и/или прогноза AD.
Следующим объектом настоящего изобретения является применение предлагаемого в изобретении способа для мониторинга терапии AD и для мониторинга и/или проверки эффективности действующих веществ и/или терапии. Это можно осуществлять при проведении клинических тестов, исследований, а также при мониторинге терапии. Для этой цели анализируют образцы согласно способу, предлагаемому в изобретении, и сравнивают результаты.
Следующим объектом настоящего изобретения является применение предлагаемого в изобретении способа и биомаркеров для решения вопроса о том, можно ли включать индивидуума в клиническое исследование. Для этой цели анализируют образцы согласно способу, предлагаемому в изобретении, и принимают решение с учетом соответствующей пороговой величины.
Следующим объектом настоящего изобретения является способ определения эффективности действующих веществ и/или терапий с помощью способа, предлагаемого в изобретении, в котором сравнивают результаты, полученные на образцах, друг с другом. Образцы представляют собой образцы общей воды организма, взятые до или после, или в различные моменты времени после введения действующих веществ или применения терапии. На основе полученных результатов отбирают действующие вещества и/или терапии, после применения которых наблюдалось снижение количества агрегатов А-бета.
Согласно изобретению полученные результаты сравнивают с результатами, полученными для контроля, который не обрабатывали действующим веществом и/или не подвергали терапии.
Примеры:
I. Определение олигомеров А-бета (агрегатов А-бета) в СМЖ
1. Подготовка субстрата
Стеклянные подложки очищали в течение 15 мин в ультразвуковой ванне. Поверхность отмывали трижды водой и сушили в потоке газообразного азота. Очищенные подложки погружали в смесь 3:1 (об./об.) концентрированной серной кислоты и пероксида водорода по меньшей мере на 30 мин для активации гидроксильных групп. Затем их отмывали водой до достижения нейтрального значения рН в смывной воде. На второй стадии отмывки применяли 99%-ный этанол и затем сушили подложку в потоке газообразного азота. Стеклянные подложки погружали в раствор, содержащий 1-7% 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES) в безводном толуоле, на период от 1 до 4 ч. Удовлетворительные результаты получали при использовании 5%-ного раствора APTES и инкубации в течение 2 ч. После этого предметные стекла отмывали ацетоном и водой и сушили в потоке газообразного азота.
Для нанесения покрытия из декстрана стеклянную поверхность гидроксилировали и затем активировали аминогруппами.
Карбоксиметилдекстран (КМД) растворяли в воде до концентрации 10 мг/мл и смешивали с N-этил-N-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом (ЭДК) (200 мМ) и N-гидроксисукцинимидом (NHS), (50 мМ). После предварительной инкубации в течение 10 мин раствор инкубировали еще в течение 2 ч при комнатной температуре. После этого стеклянные подложки промывали водой.
2. Иммобилизация антител, применяемых в качестве захватывающих молекул, на субстрате с нанесенным покрытием
Вторую активацию поверхности осуществляли с помощью раствора ЭДК/NHS (200 или 50 мМ) в течение 5 мин. К нему добавляли раствор антитела и инкубировали в течение 2 ч при 4°С. В результате этого происходило ковалентное связывание антител со стеклянной поверхностью с нанесенным КМД-покрытием. Для того чтобы после этого деактивировать оставшиеся активные карбоксильные концевые группы на КМД-спейсере, осуществляли инкубацию с 1М этаноламином в ДМСО в течение 15 мин. Затем субстрат промывали трижды ЗФР.
3. Иммобилизация агрегатов А-бета на предварительно обработанном субстрате
Предназначенный для анализа образец инкубировали в течение 1 ч на субстрате и затем его промывали дважды с помощью TBST (0,1 мас.%), Твин-20 в TBS-буфере (TBS: 50 нМ Трис-HCl, 0,15М NaCl, рН 7,4).
4. Сцепление образцов с флуоресцентным красителем с целью их мечения
Применяли антитела, Nab 228, антимышиное, меченное Alexa 633 и 6 Е10, меченное Alexa 488. Антитела Nab 228 метили с использованием KIT (набор для флуоресцентного мечения с помощью Alexa-647, фирма Molecular Probes, Карлсруэ, Германия) согласно инструкциям производителя. Меченые антитела хранили в ЗФР, содержащем 2 мМ азид натрия, при 4°С в темноте.
5. Маркировка агрегатов зондами
Количество применяемых антител зависело от степени мечения. Добавляли зонды и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего промывали пять раз с помощью TBST и дважды с помощью TBS.
6. Детекция агрегатов и анализ образцов
Измерения осуществляли с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 710 (фирма Carl Zeiss, Йена, Германия). Микроскоп был снабжен аргоновым ионным лазером и тремя гелий-неоновыми лазерами. Лазерные пучки фокусировали на ограниченном дифракцией пятне объемом 0,25 фемтолитров. Интенсивность флуоресценции определяли на площади 1000×1000 пикселей. Поскольку применяли различные зонды, то осуществляли анализ колокализации. Для получения репрезентативных величин указанную площадь оценивали в нескольких местах на подложке.
Измерения осуществляли с использованием программного обеспечения ZEN 2008 фирмы Carl Zeiss, Йена, Германия.
7. Анализ образцов СМЖ
С помощью способа, предлагаемого в изобретении, анализировали 26 образцов СМЖ, полученных от различных пациентов. Образцы брали соответственно у 14 страдавших AD и 12 контрольных пациентов (у пациентов различного возраста, не страдавших заболеваниями, связанными с агрегацией белков). Результаты обобщены на фиг. 1. Результаты свидетельствуют о том, что можно четко выявлять различие между группами. Средний уровень олигомеров А-бета в AD-группе был значимо выше, чем в контрольной группе.
8. Корреляция с MMSE
Результаты анализа, осуществленного согласно изобретению, сравнивали с результатами MMSE (минитест оценки психического статуса), проведенного на донорах. Эти результаты обобщены на фиг. 2. Они свидетельствуют о наличии четкой корреляции между оценками с помощью MMSE-теста и оценкой с помощью анализа, предлагаемого в изобретении.
II. Детекция стандартов агрегатов
1. Приготовление стандартов агрегатов
В одном из примеров осуществления изобретения на практике конструировали стандарт олигомера А-бета, который имел 16 эпитопов для антител, связывающихся с N-концом А-бета (эпитоп, соответствующий А-бета-(1-11), последовательность: DAEFRHDSGYE).
Прежде всего синтезировали множественный антигенный пептид (MAP), который имел четыре N-концевых эпитопа А-бета, А-бета-1-11. Они были соединены, как проиллюстрировано на фиг. 3А, с содержащим три лизина ядром, которое для целей точного определения концентрации MAP с помощью УФ/VIS-спектроскопии содержало два триптофана. Кроме того, к N-концу присоединяли биотиновую метку. Ее использовали для сочетания соответственно четырех единиц 4-МАР со стрептовидиновым тетрамером, изображенным на фиг. 3Б. После инкубации 4-МАР со стрептавидином происходило образование 16-МАР, как показано на фиг. 3В. 16-МАР отделяли от других компонентов смеси для инкубации с помощью гель-фильтрации.
После этого MAP-16 серийно разводили в ЗФР и применяли в sFIDA-тесте для определения олигомеров А-бета.
2. Подготовка стеклянных планшетов
Стеклянные титрационные микропланшеты очищали в течение 15 мин в ультразвуковой ванне и затем обрабатывали плазменным очистителем в течение 10 мин. Для активации стеклянной поверхности лунки инкубировали в 5М NaOH в течение по меньшей мере 3 ч, отмывали водой и затем сушили в потоке газообразного азота. Для нанесения покрытия из декстрана стеклянную поверхность гидроксилировали и затем активировали с помощью аминогрупп. Для этой цели стеклянные планшеты инкубировали в течение ночи в растворе 5М этаноламина в ДМСО. После этого стеклянные планшеты отмывали водой и сушили в потоке газообразного азота. Карбоксиметилдекстран (КМД) растворяли в воде до концентрации 20 мг/мл и смешивали с N-этил-N-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом (ЭДК) (200 мМ) и N-гидроксисукцинимидом (NHS), (50 мМ). После предварительной инкубации в течение 10 мин раствор инкубировали еще в течение 2 ч при комнатной температуре. После этого стеклянные планшеты промывали водой.
3. Иммобилизация антител, используемых в качестве захватывающих молекул, на стекле с нанесенным покрытием
Вторую активацию осуществляли с помощью раствора ЭДК/NHS (200 или 50 мМ) в течение 5 мин. К нему добавляли раствор антитела и инкубировали в течение 2 ч при 4°С. В результате этого происходило ковалентное связывание антител со стеклянной поверхностью, активированной КМД. Для того чтобы после этого деактивировать оставшиеся активные карбоксильные концевые группы на КМД-спейсере, осуществляли инкубацию с 1М этаноламином в ДМСО в течение 15 мин. Затем субстрат промывали трижды ЗФР.
4. Иммобилизация MAP-16 на предварительно обработанном стекле
Предназначенный для анализа образец, содержащий MAP-16, инкубировали в течение 1 ч на стекле, после чего промывали трижды с помощью TBST (0,1 мас.%), Твин-20 в TBS-буфере (TBS: 50 нМ Трис-HCl, 0,15 М NaCl, рН 7,4).
5. Мечение зондов флуоресцентным красителем
Применяли антитела 6Е10 Alexa-488 и антитела IC-16. Антитела IC16 маркировали с использованием набора (набор для флуоресцентного мечения KIT Alexa-647, фирма Molecular Probes, Карлсруэ, Германия) согласно инструкциям производителя. Меченые антитела хранили в ЗФР, содержащем 2 мМ азид натрия, при 4°С в темноте.
6. Маркировка агрегатов зондами
Добавляли зонды и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, затем промывали пять раз с помощью TBST и дважды водой.
7. Детекция стандарта агрегатов
Измерения осуществляли с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 710 (фирма Carl Zeiss, Йена, Германия). Микроскоп был снабжен аргоновым ионным лазером и тремя гелий-неоновыми лазерами. Измерения проводили в режиме «черепичного» сканирования, при котором измерения выполняют на смежных участках поверхности в лунке и затем осуществляют сборку изображения. Каждый «черепичный» скан содержал 3×2 индивидуальных изображения и каждое изображение имело площадь 213×213 мкм.
В альтернативном варианте измерения осуществляли с помощью TIRF-микроскопа (TIRF - сокращение: total internal reflection (полное внутреннее отражение)), состоящего из инвертированного микроскопа DMI 6000, лазерной системы и камеры Hamamatsu EM-CCD С9100. В режиме «черепичного» сканирования получали 3×3 индивидуальных изображения размером 109,9×109,9 мкм каждое.
Обработку проводили с помощью программы «Image J» ((http://rsbweb.nih.gov/ij/). Благодаря применению различных зондов оказалось возможным осуществлять колокализационный анализ. Для этого сначала из величин интенсивности индивидуальных пикселей вычитали отсекающее значение, соответствующее отрицательному контролю без MAP-16. Затем добавляли количество колокализованных пикселей, интенсивность которых была выше нуля.
На фиг. 4 представлены результаты измерений. Можно четко видеть, что sFIDA-сигнал, т.е. количество колокализованных пикселей, коррелирует с концентрацией молекул MAP-16.
III. Сравнение агрегатов А-бета (олигомеров А-бета) с мономерами А-бета
1. Определение с помощью sFIDA
Для того чтобы было можно исключать возможность того, что с помощью sFIDA будут обнаруживаться также и мономеры А-бета и тем самым будет происходить зашумление сигнала от олигомеров А-бета, приготавливали мономеры и олигомеры А-бета, состоящие из синтетических А-бета, согласно протоколу, описанному у Johannson и др., FEBS J., 273, 2006, сс. 2618-2630, и тестировали с помощью указанной системы. Кроме того, осуществляли серийное разведение олигомеров А-бета в ЗФР и с использованием серий концентраций проверяли линейность метода анализа. Измерения проводили согласно уже описанной выше процедуре, для детекции применяли микроскоп Zeiss LSM 710 и регистрировали 2×25 изображений, каждое размером 213×213 мкм и 1024×1024 пикселей. Результаты представлены на фиг. 5. Олигомеры А-бета давали четкий sFIDA-сигнал, что не имело места в случае мономеров А-бета. На основе данных, представленных на фиг. 5Б, можно сделать вывод о том, что sFIDA-сигнал коррелировал с концентрацией олигомеров А-бета и, кроме того, для получения положительного сигнала была достаточна очень низкая концентрация олигомеров А-бета.
2. Измерения FRET
Для решения вопроса о том, может ли генерироваться также другой sFIDA-сигнал, отличный от предварительно выбранного количества перекрестно коррелированных пикселей, осуществляли измерения FRET. FRET является сокращением названия Forster resonance energy transfer (Ферстеровский резонансный перенос энергии). При FRET энергия возбужденного флуорохрома передается второму флуорохрому. FRET-интенсивность зависит среди прочего от расстояния между донором и акцептором, и ее можно обнаруживать в диапазоне длин волн вплоть до 10 нм. Таким образом, можно использовать FRET в sFIDA-методе для того, чтобы отличать мономеры А-бета от олигомеров А-бета. Если антитело к А-бета (например, 6Е10-Alexa488), сцепленное с донорским красителем, и антитело к А-бета (например, IC-16-Alexa647), сцепленное с пригодным для рассматриваемой цели красителем, связываются с олигомером А-бета в непосредственной близости друг к другу, то благодаря пространственной близости становится возможным FRET. Статистически очень маловероятно, что 6Е10-Alexa-488 и IC-16-Alexa647 свяжутся с двумя мономерами А-бета, которые случайно оказались иммобилизованными на расстоянии менее 10 нм друг от друга. Эту вероятность можно свести к нулю, если для детекции применять антитела, которые имеют эпитоп, перекрывающийся с захватывающим антителом. Для целей эксперимента выделяли мономеры А-бета и олигомеры А-бета с помощью гель-фильтрации и иммобилизовали для sFIDA-измерений, как описано выше. При проведении последующих измерений с помощью флуоресцентного микроскопа фирмы Leica флуорохромы возбуждали при длине волны 488 нм и осуществляли детекцию FRET-эмиссии при длине волны 705 нм. В качестве контролей анализировали также два образца, в каждый из которых добавляли только одно сцепленное с флуоресцентным красителем антитело.
Как продемонстрировано на фиг. 6, при измерениях получали FRET-сигнал только от олигомеров А-бета, но не от мономеров А-бета или контролей.
IV. Определение агрегатов А-бета в спинномозговой жидкости мышей, на которых моделировали болезнь Альцгеймера
В следующих экспериментах исследовали, пригоден ли sFIDA также и для обнаружения агрегатов А-бета в спинномозговой жидкости мышей, на которых моделировали болезнь Альцгеймера, и если это имеет место, то при каких разведениях. При осуществлении процедуры эксперимента спинномозговую жидкость, взятую у мышей линии APP/Psl и у нетрансгенных контрольных животных, разводили в соотношениях 1:10, 1:50 и 1:250 ЗФР-буфером и анализировали с помощью sFIDA.
Процедура эксперимента соответствовала описанной выше процедуре, но измерения осуществляли с помощью LSM фирмы Leica. Было установлено, что в одном из двух образцов, взятых у трансгенных мышей, даже при 250-кратном разведении оказалось возможным обнаружить существенно больший sFIDA-сигнал, чем в образцах, взятых у нетрансгенных контрольных животных. Для каждой лунки анализировали по 25 областей (каждая по 246 мкм) с разрешением 1024×4024 пикселей, т.е. анализировали 16% площади лунки.
Результаты представлены на фиг. 7. Они демонстрируют, что sFIDA пригоден не только для установления раннего диагноза у человека, но пригоден также для мониторинга эффективности терапии в доклинических исследованиях.
Описание чертежей:
На чертежах показано:
на фиг. 1 - результаты определения агрегатов А-бета в СМЖ, взятой у пациентов;
на фиг. 2 - корреляция результатов, представленных на фиг. 1, с результатами MMSE;
на фиг. 3 - конструкция стандарта олигомеров Аβ, содержащего 16 эпитопов для N-концевого связывания антител к Аβ, которые соответствуют первым 11 аминокислотам Аβ (последовательность: DAEFRHDSGYE). А) синтезировали 4-МАР, содержащий 4 N-концевых эпитопа Аβ 1-11, сцепленных с содержащим три лизина ядром, которое содержит два триптофана для определения концентрации с помощью УФ/VIS-спектроскопии. Б и В) Для получения 16-МАР в каждом случае сцепляли четыре 4-МАР через стрептавидиновый тетрамер. MAP-16 отделяли от других компонентов смеси для инкубации с помощью гель-фильтрации;
на фиг. 4 - результаты sFIDA-измерений MAP-16, взятых в различных концентрациях, полученных путем разведений в ЗФР-буфере. ЗФР-буфер, не содержащий MAP-16, применяли в качестве отрицательного контроля. А) Измерения проводили с использованием лазерного сканирующего микроскопа (Zeiss LSM 710). Б). Измерения проводили с использованием TIRF-микроскопа (фирма Leica);
на фиг. 5 - демонстрация того, что A) sFIDA не обладает чувствительностью в отношении мономеров Аβ, но Б) позволяет определять олигомеры Аβ в зависимости от концентрации, линейно и с высокой чувствительностью. Мономеры и олигомеры Аβ получали, выделяли из синтетического Аβ с помощью гель-фильтрации и разводили в ЗФР-буфере;
на фиг. 6 - результаты sFIDA-измерений с FRET-сигналом от мономеров Аβ и олигомеров Аβ. ЗФР применяли в качестве отрицательного контроля. В качестве дополнительных контролей анализировали образцы, в каждый из которых добавляли только одно сцепленное с красителем антитело. Донорским красителем служил Alexa 488, сцепленный с антителом к Аβ 6Е10, а акцепторным красителем служил Alexa 647, сцепленный с антителом к Аβ IC-16;
на фиг. 7 - результаты детекции с помощью sFIDA олигомеров Аβ в спинномозговой жидкости трансгенных (Tg) мышей, на которых моделировали болезнь Альцгеймера (APP/PS1), и нетрансгенных контрольных животных (K). В качестве отрицательного контроля применяли образец, содержащий чистый буфер.