Изучение фенольного состава коры мушмулы методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и УФ-спектрофотометрии

В. А. Сысоев, Д. А. Халитова

ИЗУЧЕНИЕ ФЕНОЛЬНОГО СОСТАВА КОРЫ МУШМУЛЫ МЕТОДАМИ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ

Ключевые слова: экстракт мушмулы, фенольный состав, хроматография, спектрофотометрия.

Проведено изучение фенольного состава коры мушмулы методами УФ-спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлено, что доминирующей группой биологически активных веществ (БАВ) являются дубильные вещества и мономерные катехины.

Keywords: medlar bark, chromatography, UV-spectrophotometry.

The research of phenolic profile of medlar’s bark using UV-spectrophotometry and high-performance liquid chromatography (HPLC) was done. It was established that dominating group of the biologically active agents (BAA) are tannins and monomeric catechins.

Создание высокоэкологичных технологий в производстве кожи и меха, является существенной составляющей процесса инновационного развития отрасли. Указанные технологии могут быть основаны, как на применении химических добавок и модификаторов, позволяющих повысить степень использования компонентов рабочих растворов, так и на частичной или полной замене их аналогами растительного происхождения [1,2].

При изучении химического состава растительного сырья, в частности для количественного определения дубильных веществ традиционно используют известный

перманганатометрический метод — метод Левенталя. Это фармакопейный титриметрический метод, основан на легкой окисляемости полифенолов перманганатом калия в кислой среде в присутствии индикатора и катализатора индигосульфокислоты, которая в точке

эквивалентности раствора меняет его цвет от синего до золотисто-желтого. Однако перманганат калия является сильным окислителем в кислой среде, при титровании в реакцию вступают не только дубильные вещества, но и другие группы БАВ (витамины, фенолы, дигидрофлавоноиды и др.), что приводит к завышенным результатам.

Данная работа посвящена изучению состава фенольных соединений, экстрагированных из коры мушмулы и разработке селективной методики их количественного определения с использованием современных физико-химических методов исследования.

Экспериментальная часть

Для разработки метода количественного анализа по доминирующим группам БАВ необходимо детальное изучение химического состава коры мушмулы. Ранее сообщалось [3], что методами тонкослойной (ТСХ) и

высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) хроматографии удалось обнаружить в листьях мушмулы - кустарникового растения, широко распространенного на Северном Кавказе и в Дагестане, флавоноиды, дубильные вещества, органические кислоты, эфирные масла,

каротиноиды, тритерпеновые сапонины. Кора мушмулы также может содержать широкий спектр дубящих и красящих соединений, которые могут быть использованы для создания «чистых» технологий выделки и крашения кожевнно-мехового полуфабриката [2].

Для анализа фенольного состава коры мушмулы использовали метод ВЭЖХ,

отличающийся высокой чувствительностью и точностью, позволяющий достоверно судить о качественном составе изучаемой группы БАВ. Исследование проводили на приборе «Gilson» с последующей компьютерной обработкой результатов (программа «Мультихром» для «Windows»). В работе применяли обращеннофазный вариант метода, в качестве неподвижной фазы использовали металлическую колонку «Alltima С-18» (4,61 250 мм); подвижная фаза: метанол—вода—концентрированная

фосфорная кислота в соотношении 40:60:0,5. Анализ проводили при комнатной температуре (20оС) в изократическом режиме элюирования. Скорость подачи элюента 0,7 мл/мин. Для детектирования использовали УФ-детектор (X = 254 нм). Продолжительность анализа составляла 42 мин.

Методика проведения анализа

10 г коры мушмулы измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм (ГОСТ 214-83).

Навеску измельченного сырья помещают в круглодонную колбу вместимостью 200 мл, прибавляют 70 мл 70%-го спирта и нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 ч с момента закипания водной-спиртовой смеси; экстракцию повторяют дважды. Извлечения охлаждают, объединяют и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят объем тем же растворителем до метки (раствор А). Параллельно готовят 0,05%-е растворы сравнения в метаноле: рутина, кверцетина,

кемпферола, гесперидина, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, галловой, цикоревой, феруловой,

эллаговой, хлорогеновой, салициловой и

коричной кислот, танина, пирогаллола, эпикатехина. По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводят в хроматограф и анализируют в условиях, описанных выше. Полученные результаты приведены на рис. 1 и в таблице 1.

мВ

Рис. 1 - Хроматограмма 70% спиртового

извлечения из коры мушмулы

Таблица 1 - Идентифицированные БАВ

Номер пика Название Время удерживания, мин

1 Хлорогеновой кислоты 4,67

2 Галловой кислоты 4,83

3 Цирконевая кислота 10,83

4 Гесперидин 12,25

5 Пирогаллол 12,75

6 Лютеолин-7- глюкозид 14,17

7 Эллаговая кислота 16,42

8 Лютеолин 18,33

9 Салициловая кислота 20,58

10 Коричная кислота 28,67

Таким образом, извлечения, полученные из коры мушмулы, содержат следующие вещества фенольной природы, идентифицированные по времени удерживания стандартных растворов: гесперидин, лютеолин, лютеолин-7-гликозид, галловая, цикориевая, эллаговая, хлорогеновая, салициловая и коричная кислоты, а также танин, пирогаллол.

С помощью ВЭЖХ-анализа удалось подтвердить качественный фенольный состав веществ, идентифицированных ранее с помощью тонкослойной хроматографии, а также получить представление о том, какие фенольные соединения доминируют в изучаемом растительном сырье, что крайне необходимо для последующей разработки методики их количественного определения.

Разработке оптимальной методики количественного анализа предшествовала работа по изучению поглощений в УФ-области спектра водно-спиртовых извлечений, приготовленных по нижеприведенной методике.

Методика приготовления водно-

спиртовых извлечений

Около 10 г навески коры мушмулы помещают в колбу объемом 200 мл, добавляют 70 мл 70%-го спирта, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч с момента закипания водноспиртовой смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный фильтр, и доводят объем этим же растворителем до метки (раствор А).

В мерную колбу вместимостью 250 мл помещают 1,5 мл раствора А, доводят соответствующим растворителем до метки и перемешивают.

Оптическую плотность полученного раствора измеряли на саморегистрирующем спектрофотометре "СеИоБ" (США) в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм при длине волны 280 нм. В качестве раствора сравнения использовали 70%-й спирт.

Параллельно в тех же условиях измеряли оптическую плотность РСО хлорогеновой кислоты в 70%-м спирте. Для этого 0,055 г (точная навеска) хлорогеновой кислоты помещали в мерную колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 100 мл 70%-го спирта, перемешивали до растворения и доводили 70%-м спиртом до метки (раствор Б). В мерную колбу вместимостью 100 мл помещали 5 мл раствора Б и доводили до метки 70%-м спиртом. Расчет количественного содержания фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту и абсолютно сухую массу в сырье проводили по формуле: потеря в массе при высушивании сырья, %.

Оптическую плотность растворов стандартных образцов: рутина, кверцетина,

кемпферола, гесперидина, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, галловой, цикориевой, феруловой, эллаговой, хлорогеновой, салициловой и коричной кислот, танина, пирогаллола, эпикатехина измеряли в 10%-м спирте. Результаты проведенных исследований приведены в табл.2.

Таблица 2 - Результаты

спектрофотометрического определения 70%-го спиртового извлечения из коры мушмулы и растворов стандартных образцов

УФ-спектр поглощения Максимум поглощения

Исследуемого 280

извлечения

Арбутина 221, 285

Хлорогеновой кислоты 235, 244, 324

Галовой кислоты 267

Эпикатехин 279

Кверцетин 256, 291,371

Рутин 257,358

Обсуждение результатов

Полученные данные свидетельствуют о том, что спектры поглощения водно-спиртовых

извлечений из сырья имеют максимум поглощения при длине волны 280 нм. Поскольку наличие полос поглощения при 250—290 и 320—380 нм характерно для соединений фенольного ряда, можно сделать вывод о содержании в извлечениях флавоноидов, дубильных веществ и фенолкарбоновых кислот, что согласуется с результатами, полученными методом ВЭЖХ.

Фенольные соединения являются доминирующими в изучаемом сырье. Поскольку эти вещества поглощают в УФ-области спектра, при разработке методики количественного анализа за основу предложен метод УФ-спектрофотометрии.

При разработке методики количественного определения компонентов растительного сырья необходимо учитывать основные

гидродинамические факторы экстракционного процесса.

Оптимальным экстрагентом оказался 70%-й этиловый спирт.

Экстрагирование биологически активных соединений из коры мушмулы целесообразно проводить однократно, так как при удлинении времени экстракции содержание фенольных веществ в сырье не увеличивается. Опытным путем установлено оптимальное соотношение сырье: экстрагент (1:10), время экстракции (1 час) и средний размер сырья — 2мм.

При выборе аналитической длины волны опирались на данные, полученные в результате УФ-спектрофотометрического исследования водноспиртового извлечения из сырья и рабочего стандартного образца (РСО) хлорогеновой кислоты. Максимумы спектров поглощения изучаемых объектов совпадают при 280-290 нм (рис. 2). Выбор хлорогеновой кислоты в качестве РСО обусловлен ее доминированием в количественном отношении и наличием плеча (280-300 нм) в УФ-области спектра.

О, ед.

Результаты исследований и

метрологические характеристики методики количественного определения фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту следующие: содержание фенольных соединений составляет 1,85% при относительной погрешности ±4,35% (для доверительной вероятности 95%). Отсутствие систематической ошибки методики доказано опытами с добавками РСО хлорогеновой кислоты в навеску сырья. При этом относительная ошибка эксперимента не превышает 0,5% и находится в пределах случайной погрешности предложенной методики, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки при определении содержания фенольных соединений в коре мушмулы в пересчете на РСО хлорогеновой кислоты.

Таким образом, используя

высокоэффективную жидкостную хроматографию и УФ-спектрометрию, экспериментально установлены параметры для разработки методики количественного анализа фенольного состава растительных экстрактов, обладающих дубящими и красящими свойствами. При этом установлено, что доминирующей группой биологически активных веществ являются дубильные вещества и мономерные катехины.

Литература

1. В.А.Сысоев, А.Р.Гарифуллина, Вестник Казан. технол. ун-та, 11, 541-546 (2010).

2. В.А.Сысоев, И.Ш.Абдуллин, А.И.Салимова, Е.А.Панкова, КОП, 1, 48-50 (2004).

3. В.А. Сысоев, Д.А. Халитова, Вестник Казан. гос. технол. ун-та, 10, 140 - 144 (2012).

Рис. 2 - УФ-спектры поглощения 70%-го водноспиртового извлечения из коры мушмулы

© В. А. Сысоев - д-р техн. наук, проф. каф. плазмохимических и нанотехнологий высокомолекулярных материалов КНИТУ, sisoev@kstu.ru; Д. А. Халитова - асп. той же кафедры.