СПОСОБ АКТИВАЦИИ ПРОЛИФЕРАТИВНОГО ОТВЕТА ФИБРОБЛАСТОПОДОБНЫХ КЛЕТОК СТРОМАЛЬНО-ВАСКУЛЯРНОЙ ФРАКЦИИ ЖИРОВОЙ ТКАНИ
METHOD FOR ACTIVATION OF PROLIFERATIVE RESPONSE OF FIBROBLAST-LIKE CELLS OF STROMAL-VASCULAR FRACTION OF ADIPOSE TISSUE

Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано для повышения эффективности противоожоговой терапии, а также при лечении диабетических язв.
Несмотря на то, что с момента открытия стромально-васкулярной фракции (СВФ) клеток прошло уже много времени, чаще всего СВФ рассматривается как источник мезенхимальных стволовых клеток (МСК) жировой ткани [1]. Известно, что МСК обладают способностью дифференцироваться в клетки фибробластного ряда, но для этого процесса необходимо длительное (25-40 дней) культивирование в условиях стерильного бокса. Данная манипуляция несет в себе риски, связанные с нежелательной дифференцировкой МСК в нецелевые популяции, возможность контаминации и гибели культуры в ходе культивирования, необходимость постоянного контроля за стимуляцией МСК для получения пула целевых клеток. В то же время применение собственно СВФ лишено этих недостатков и позволяет оказать лечебную услугу практически сразу после госпитализации (через 4-5 часов). При некоторых заболеваниях сокращение времени с момента забора образца и до внесения клеточного препарата очень важно [2]. В связи с этим появляется необходимость разработки способа, позволяющего повысить эффективность пролиферативного ответа фибробластоподобных клеток СВФ, при использовании в терапии непосредственно СВФ.
2
Известен способ активации пролиферативного ответа фибробластов, культивированных на проводящих подложках из нанотрубок под действием локального электрического поля [4]. Клетки культивируются на покровных стеклах с нанесенным на них слоя нанотрубок в среде Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в CO-инкубаторе при 37°С в течение 72 ч. Для электрической стимуляции используется система локального подведения электрического потенциала к клеткам через наноразмерные электроды. Электрическая стимуляция продолжается еще 48 ч. Указанный метол способен стимулировать пролиферацию фибробластов, однако в связи с необходимостью постоянного продолжительного воздействия на клетки его применение на поврежденных тканях и в короткие сроки оказывается невозможным. Сам метод весьма трудоемкий и имеет высокую себестоимость за счет необходимости постоянного нанесения слоя нанотрубок для каждого образца.
Известен способ активации пролиферативного ответа фибробластов под воздействием цитокинов, продуцируемых мононуклеарными фагоцитами [5, 6]. К ним относятся гепарин-связанный эпидермальный ростовой фактор (HB-ECF), вырабатываемый макрофагами и стимулирующий пролиферацию фибробластов, фактор роста фибробластов (FGF) и его аналоги [7, 8], а также основной фактор роста фибробластов (bFGF), являющийся частью молекулы природного фактора роста фибробластов [9]. Указанные средства способны стимулировать пролиферацию фибробластов. Однако их применение при краткосрочном культивировании весьма затруднено в связи со сложностью и дороговизной промышленного синтеза, а также возможностью последующего развития аллергических реакций у пациента, обусловленных высокой молекулярной массой препарата.
Известен способ активации пролиферативного ответа фибробластов с применением пародонтальных пептидов [10]. Пародонтальные пептиды дозозависимо и избирательно стимулируют пролиферацию фибробластов. Этот эффект проявляется в увеличении количества клеток и индекса пролиферации. Пародонтальные пептиды активны в диапазоне концентраций от 0,5 до 50 мкг/мл. Причем прослеживается доза-эффект - при увеличении концентрации пародонтальных пептидов в культуральной среде возрастает их специфическая активность. Однако пародонтальные пептиды обладают низкой биологической активностью. Так, максимальная активность вещества в культуре фибробластов проявляется в концентрации 50 мкг/мл. Это требует применения больших доз препарата и влечет возможное появление аллергических и других нежелательных побочных эффектов.
Наиболее близким аналогом заявляемому изобретению является способ активации пролиферативного ответа фибробластов под действием пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu [11]. Фибробласты выделяются по стандартной методике и вносятся в среду 199, содержащую гидролизат лактальбумина и 20% фетальной сыворотки теленка в соотношении 1:1. В культуру фибробластов вносится пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu в концентрациях от 0,005 до 0,5 мкг/мл. Клетки культивируются в течение 72 часов при 37°С. При микроскопической оценке под влиянием пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu возрастает число фибробластов, имеет место доза-эффект. Пептид Lys-GIu-Glu-Leu-Asn-Glu стимулирует пролиферацию фибробластов в диапазоне концентраций от 0,01 до 0,5 мкг/мл. Указанный метод способен стимулировать пролиферацию фибробластов, однако, в связи с необходимостью продолжительного инкубирования in vitro, его применение непосредственно в день забора материала не представляется возможным. Также метод не учитывает исходного состояния метаболизма СВФ-клеток.
Задачей изобретения является создание способа персонифицированного подхода к активации пролиферативного ответа фибробластоподобных клеток, полученных из СВФ жировой ткани.
4
4
4
Поставленную задачу осуществляют за счет того, что у больных забирают жировую ткань, из которой выделяют СВФ-клетки, после чего выделенные клетки подсчитывают. Затем, биолюминесцентным методом определяют активность ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и малатдегидрогеназы (МДГ). Если в фибробластоподобных клетках СВФ снижена активность одного, двух или трех ферментов, то для повышения эффективности пролиферативного ответа в культуру фибробластоподобных клеток СВФ добавляют необходимое количество соответствующих субстратов для тех ферментов, активности которых снижены: глюкозо-6-фосфат в количестве 2,12 мг/мл при активности Г6ФДГ ниже 84,3 мкЕ/10. глицеральдегид-3-фосфат в количестве 0,45 мг/мл при активности ЛДГ ниже 250,42 мкЕ/10, глутаминовую кислоту в количестве 1,6 мг/мл при активности МДГ ниже 212,34 мкЕ/10.
4
4
4
Значения 84,3 мкЕ/10 для Г6ФДГ, 250,42 мкЕ/10 для ЛДГ и 212,34 мкЕ/10 для МДГ получены опытным путем, на основании проведенного биолюминесцентного анализа активности данных ферментов в пролиферирующих фибробластоподобных клетках СВФ. При данных значениях активности ферментов пролиферативная активность фибробластоподобных клеток СВФ составляла 65% и выше.
Уровни концентраций глюкозо-6-фосфата, глицеральдегид-3-фосфата и глутаминовой кислоты также подобраны опытным путем на основании того, что при достижении указанных концентраций данных метаболитов в культуре пролиферирующих фибробластоподобных клеток СВФ (в случае низкой активности ферментов) пролиферативная активность фибробластоподобных клеток СВФ достигала 65% и выше. При увеличении уровней концентраций данных метаболитов в культуре пролиферирующих фибробластоподобных клеток СВФ (в случае низкой активности ферментов) пролиферативная активность фибробластоподобных клеток СВФ не возрастала.
В вопросе терапии повреждений кожных покровов наиболее перспективными кандидатами являются мультипотентные МСК, выделенные из СВФ жировой ткани, которые обладают выраженным противовоспалительным и регенераторным потенциалом и способны к трансформации в клетки фибробластного дифферона. [13]. Количество МСК. которые можно выделить из жировой ткани, в 100-1000 раз превышает их количество, содержащееся в эквивалентном объеме костного мозга [14]. Кроме того, выделенные из жировой ткани МСК генетически более стабильны в течение длительного срока культивирования, отличаются более низким коэффициентом старения и высокой пролиферативной активностью. Клетки СВФ оказывают противовоспалительный и иммуномодулирующий эффекты. Функциональная активность, пролиферация и дифференцировка клеток СВФ в значительной степени определяются уровнем активности их метаболических процессов. Так, Г6ФДГ является инициализирующим и ключевым ферментом пентозофосфатного пути, поставляющего рибозу и дезоксирибозу для реакций макромолекулярного синтеза, в том числе и для синтеза ДНК и РНК [15]. Глюкозо-6-фосфат является ключевым метаболитом для стимуляции ЛДГ и заключительным этапом в анаэробном гликолизе. Ключевым метаболитом для стимуляции окислительно-восстановительной стадии анаэробного гликолиза является глицеральдегид-3-фосфат [16]. Малатдегидрогеназа принимает участие в катализе на заключительной стадии цикла трикарбоновых кислот, который, в свою очередь, является ключевым для процессов аэробного дыхания. Глутаминовая кислота, осуществляя взаимосвязь между циклом трикарбоновых кислот и реакциями аминокислотного обмена, позволяет стимулировать оба метаболических процесса с активацией клеточной пролиферации и дифференцировки.
Способ выполняется следующим образом.
У больных с ожоговыми травмами, диабетическими язвами и другими повреждениями кожных покровов производят забор жировой ткани в объеме не менее 50 мл. Разбавляют образец равным объемом забуференного физиологического раствора и центрифугируют при 430g в течение 10 минут. Затем отбирают клетки-мишени. К отмытому материалу добавляют равный объем раствора коллагеназы II-типа (с активностью не менее 125 ед/мг) и инкубируют смесь при температуре 37°С в течение 30-60 минут на предварительно нагретом орбитальном шейкере со скоростью вращения 250 оборотов в минуту. По завершению инкубации добавляют равное количество забуференного физиологического раствора и разливают образец в 50 мл пробирки с коническим дном, после чего центрифугируют 10 минут при 600g и температуре 4°С [12]. Полученную клеточную суспензию процеживают через фильтр с диаметром отверстий менее 100 мкм и подсчитывают количество клеток. В результате получают готовую стерильную суспензию клеток СВФ в физиологическом растворе. 1 млн выделенных клеток СВФ используют для определения активности Г6ФДГ, ЛДГ и МДГ одним из известных способов, например, биолюминесцентным [3]. Для этого суспензию выделенных клеток СВФ (1,0 млн/мл) разрушают путем осмотического лизиса с добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0-2,0 мМ дитиотреитола. Затем непосредственно определяют активность Г6ФДГ, ЛДГ и МДГ. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных клеток. Конкретные значения концентраций субстратов и коферментов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в таблице 1.
-5
+
+
После инкубации исследуемых проб при 37°С (в течение 30 минут для Г6ФДГ и МДГ; 5 минут для ЛДГ) к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДН:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1 М К, Na-фосфатном буфере с рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биохемилюминометра, например, марки «БЛМ-3607», измеряют свечение.
-9
-4
Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные «субстратный фон ферментов». Определяют в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биохемилюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности строят графики зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАД(Ф)Н (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАД(Ф)Н в диапазоне 10-10 М вносят в кюветы биохемилюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы из светящихся бактерий, калибровочные графики строят для каждого рН буфера. Активность ферментов рассчитывают по формуле:
А=Δ[С]×V/T
где:
4
А-активность фермента, Е на 1×10нейтрофилов (1E=1 мкмоль/мин [16]);
Δ [С] - разница концентраций НАДН или НАДФН в пробах «фермент» и «фон фермента», мкмоль;
V - объем пробы, мл;
Т - время инкубации, мин.
4
4
4
Затем определяют субстрат, который необходимо добавить с инкубационную среду для активации и поддержания пролиферативного ответа фибробластоподобных клеток СВФ. В культуру пролиферирующих фибробластоподобных клеток СВФ добавляют глюкозо-6-фосфат в количестве 2,12 мг/мл при активности Г6ФДГ ниже 84,3 мкЕ/10, глицеральдегид-3-фосфат в количестве 0,45 мг/мл при активности ЛДГ ниже 250,42 мкЕ/10, глутаминовую кислоту в количестве 1,6 мг/мл при активности МДГ ниже 212,34 мкЕ/10.
При снижении активности двух или трех ферментов в фибробластоподобных клетках СВФ пациента в культуру пролиферирующих клеток для повышения эффективности пролиферативного ответа добавляют при необходимости сразу несколько субстратов.
Контроль пролиферативной активности фибробластоподобных клеток СВФ осуществляют следующим образом.
7
2
Выделенные фибробластоподобные клетки СВФ окрашивают флуоресцентным красителем карбоксифлуоресцеин-диацетат-сукцинимидил эфир (CFSE) в концентрации 3 мкл/10клеток и ставят в термостат на 20 минут при 37°С, после чего трехкратно отмывают раствором полной питательной среды (среда RPMI 1640, 10% (от общего объема) аутологичной сыворотки, антибиотиком (например, гентамицин в концентрации 4-6 мкл/мл)) и разделяют клетки на две пробы. Опытную пробу клеток помещают в инкубационный матрас, добавляют 5 мл полной питательной среды, а также глюкозо-6-фосфат, глицеральдегид-3-фосфат, глутаминовую кислоту в соответствии с вышеописанным методом и помещают в СО инкубатор при температуре 37°С на 120 часов.
2
Контрольную пробу клеток помещают в инкубационный матрас, добавляют 5 мл полной питательной среды и помещают в СО инкубатор при температуре 37°С на 120 часов. Спустя 120 часов инкубации собирают обе пробы клеток и двукратно отмывают от питательной среды раствором Хенкса. В кювету отбирают 100 мкл суспензии пролиферирующих фибробластоподобных клеток СВФ. Затем добавляют готовые моноклональные антитела CD34, CD45, CD73, CD90, несущие флуоресцентную метку FITC (fluoresceinisothiocyanate), РЕ (phycoerythrin), РС5 (phycoerythrin-cyanin 5) РС7 (phycoerythrin-cyanin 7), в количестве, соответствующем рекомендациям производителя.
Смесь тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут в месте, защищенном от проникновения прямых солнечных лучей. Оценку пролиферативного ответа фибробластоподобных клеток СВФ осуществляют на основании снижения флуоресценции CFSE на проточном цитофлуориметре (например, Navios (BeckmanCoulter, USA)).Для повышения степени точности анализа необходимо проанализировать не менее 50000 фибробластоподобных клеток СВФ.
Данный способ апробирован на 25 больных с ожоговыми травмами различными степени тяжести таблица 2.
По результатам обследования ожоговых больных по заявленному способу установлено, что на фоне снижения активности Г6ФДГ. МДГ и ЛДГ, при добавлении в культуру клеток СВФ глюкозо-6-фосфата, глицеральдегид-3-фосфата, глутаминовой кислоты, повышается количество (в процентах) активированных фибробластоподобных клеток СВФ, вовлеченных в пролиферативный ответ относительно контрольных значений, у всех 25 больных. По результатам дальнейшего клинического наблюдения установлено совпадение описанной зависимости в 100% случаев.
Клинический пример 1.
Больной Д. 43 лет госпитализирован в ожоговое отделение Красноярской краевой больницы №1 22.05.2019 г. Травму получил при контакте с горячим битумом во время ремонтных работ крыши гаража. После хирургической обработки ожоговой поверхности диагностирован контактный ожог горячим битумом левой стопы IIIB степени площадью до 2%.
7
4
7
Проведено исследование заявленным способом. Забран материал в объеме 50 мл жировой ткани. Произведено выделение клеток СВФ методом последовательной ферментации, в количестве 8×10 кл/мл. Проведено биолюминесцентное исследование активности ферментов. Установлено снижение активности ЛДГ (ниже 250,42 мкЕ/10). В культуру добавлен субстрат глицеральдегид-3-фосфат в количестве 0,45 мг/мл. В результате получено 12×10 кл/мл. По результатам фенотипирования, установлено повышение пролиферативного ответа фибробластоподобных клеток СВФ на 35%.
Клинический пример 2.
Больной В. 35 лет госпитализирован в ожоговое отделение Красноярской краевой больницы №1 08.04.2019 г. Получил травму в результате опрокидывания кастрюли с горячей водой. Произведена хирургическая обработки ожоговой поверхности под обезболиванием, диагностирован термический ожог горячей жидкостью обоих бедер и голеней I-II-IIIA степени общей площадью 12%.
7
4
4
7
Проведено исследование заявленным способом. Забран материал в объеме 50 мл жировой ткани. Произведено выделение клеток СВФ методом последовательной ферментации в количестве 4,7×10 кл/мл. Проведено биолюминесцентное исследование активности ферментов и установлено снижение активности ферментов: Г6ФДГ (ниже 84,3 мкЕ/10) и МДГ (ниже 212,34 мкЕ/10). В культуру фибробластоподобных клеток СВФ добавлены субстраты глюкозо-6-фосфат в количестве 2,12 мг/мл и глутаминовая кислота в количестве 1,6 мг/мл. В результате получено 7,6×10 кл/мл. По результатам фенотипирования установлено повышение пролиферативного ответа фибробластоподобных клеток СВФ на 38%.
Клинический пример 3.
Больной С. 28 лет госпитализирован в ожоговое отделение Красноярской краевой больницы №1 12.03.2019 г. Травма получена при падении в костер и возгорании одежды. Произведена хирургическая обработки ожоговой поверхности под обезболиванием, диагностирован термический ожог пламенем поясничной области, передней брюшной стенки IIIA-IIIB степени общей площадью 15%.
7
4
4
4
7
Проведено исследование заявленным способом. Забран материал в объеме 49 мл жировой ткани. Произведено выделение клеток СВФ методом последовательной ферментации в количестве 5,3×10 кл/мл. Проведено биолюминесцентное исследование активности ферментов и установлено снижение активности ферментов: Г6ФДГ (ниже 84,3 мкЕ/10), МДГ (ниже 212,34 мкЕ/10) и ЛДГ (ниже 250.42 мкЕ/10). В культуру фибробластоподобных клеток СВФ добавлены соответствующие субстраты: глюкозо-6-фосфат в количестве 2,12 мг/мл, глицеральдегид-3-фосфат в количестве 0,45 мг/мл и глутаминовая кислота в количестве 1,6 мг/мл. В результате получено 9,2×10 кл/мл. По результатам фенотипирования установлено повышение пролиферативного ответа фибробластоподобных клеток СВФ на 41%.
Технический результат предлагаемого способа:
- Возможность за 30-40 минут с момента забора биологического материала оценить состояние метаболизма фибробластоподобных клеток;
- Индивидуальная метаболическая активация пролиферативного ответа фибробластоподобных клеток, ускоряющая их деление и дифференцировку на 35% и более;
- Возможность длительного поддержания пролиферативного ответа за счет периодического внесения субстратов и постоянного мониторинга состояния клеток;
- Получение активных фибробластоподобных клеток, способных оказать выраженный терапевтический эффект.
Таким образом, способ эффективен, отвечает современным требованиям к методам регенеративной медицины, позволяет в короткие сроки получать активированные фибробластоподобные клетки.
Источники информации
1. Алексеева Н.Т., Глухов А.А., Остроушко А.П. Роль клеток фибробластического дифферона в процессе заживления ран // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2012. - Т.5. - №3. - С. 601-608.
2. Масгутов Р.Ф., Салихов Р.З., Ризванов А.А. и др. Применение клеток стромальной васкулярной фракции жировой ткани при лечении полнослойного дефекта гиалинового хряща медиального мыщелка бедренной кости коленного сустава: клинический случай. // Гены & клетки. - 2014. - Т. 9. - №3. - С. 303-306.
3. Савченко А.А. Определение активности NAD(P)-зависимых дегидрогеназ в нейтрофильных гранулоцитах биолюминесцентным методом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. - Т. 159, №5. - С. 656-660.
4. Подчерняева Р.Я., Суетина И.А., Михайлова Г.Р., Лопатина О.А., Бобринецкий И.И., Морозов Р.А., Селезнев А.С. Культивирование перевиваемых клеточных линий на подложках из углеродных нанотрубок и влияние электростимуляции на пролиферацию клеток // Медицина. - 2012. - С. 46-48.
5. Жибурт Е.Б., Серебряная Н.Б., Каткова И.В. и др. Цитокины в кроветворении, иммуногенезе и воспалении // Терра Медика Нова. - 1996. - 3(4). - С. 15-20.
6. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета // Иммунология. - 1995. - 3. - С. 30-44
7. Пат. 97105853 РФ. Аналоги кислого фактора роста фибробластов // Аракава Цутому и др.; заявл. 07.04.1997; опубл. 20.07.1999.
8. Пат. 99109987 РФ. Гомологи факторов роста фибробластов // Дейшер Тереза А.; заявл. 16.10.1997; опубл. 20.05.2001.
9. Пат. 2093519 РФ. Способ энзиматического получения основного фактора роста фибробластов BFGF (10-155) и фармацевтическая композиция на его основе / Пьер Монсан и др.; Патентообладатель армиталиа Карло ЭрбаС.р.л.; заявл. 30.07.1991; опубл. 20.10.1997.
10. Степанов А.В., Цепелев В.Л. Влияние синтетических пептидов сумки фабрициуса на функциональную активность макрофагов // Забайкальский медицинский вестник. -2014. - №2. - С. 44-47.
11. Пат. 2211046 РФ. Средство, стимулирующее пролиферацию фибробластов // Цепелев В.Л. и др.; Патентообладатель ГОУ «Читинская государственная медицинская академия»; заявл. 08.01.2002; опубл. 27.08.2003.
12. Повещенко О.В., Колесников А.П., Ким И.И. и др. Способы выделения и условия культивирования стромальных клеток жировой ткани человека, полученной из различных источников // Бюллетень СО РАМН. - 2008. - №5 (133). - С. 90-95.
13. D'souza N., Rossignoli F., Golinelli G., Grisendi G., Spano C., Candini O., Dominici M. Mesenchymalstem / stromal cells as a delivery platform in cell and gene therapies // BMC Medicine, 2015, Vol. 13, №1, p. 186.
14. El-Badawy A., Amer M., Abdelbaset R., Sherif S.N., Abo-Elela M., Ghallab Y.H., Abdelhamid H., Ismail Y., El-Badri N. Adipose stem cells display higher regenerative capacities and more adaptable electro-kinetic properties compared to bone marrow-derived mesenchymal stromal cells // Sci. Rep., 2016, Vol.6, p. 37801
15. Савченко A.A., Борисов А.Г. Основы клинической иммунометаболомики // Новосибирск: Наука, - 2012. - 263 с.
16. Das M.R., Bag А.K. Molecular association of glucose-6-phosphate isomerase and pyruvate kinase M2 with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in cancer cells. // BMC Cancer. - 2016. - Vol. 16, - p.152.