Анализ хромосомных нарушений при доброкачественных пролиферативных процессах и злокачественных новообразованиях молочных желез с помощью сравнительной геномной гибридизации

лабораторные и экспериментальные исследования

УДК: 575.224.23:616-006.6

анализ хромосомных нарушений при доброкачественных пролиферативных процессах и злокачественных новообразованиях молочных желез с помощью сравнительной геномной гибридизации

н.А. Скрябин1, и.н. лебедев1, А.д. черемных1, И.И.Суханова1,

Е.М. Слонимская23, н.В. чердынцева2

НИИ медицинской генетики СО РАМН, г. Томск1 НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск2 гОУ ВпО «Сибирский государственный медицинский университет» Росздрава, г. Томск3 634050, г. Томск, Набережная р. Ушайки, 10, e-mail: skryabinn@mail.ru1

Хромосомные нарушения характеризуют практически все злокачественные новообразования, включая и рак молочной железы. У 23 женщин были исследованы спектр и частота хромосомных аберраций в тканях молочной железы с проявлениями фиброзно-кистозной болезни (n=4) и злокачественными новообразованиями (n=23) с использованием метода сравнительной геномной гибридизации высокого разрешения. В обеих группах выявлены множественные хромосомные аномалии, в том числе специфичные для рака молочной железы. Показано наличие общих хромосомных аномалий в тканях одних и тех же пациенток с доброкачественными пролиферативными процессами и злокачественными новообразованиями, которые могут служить цитогенетическими маркерами в оценке риска малигнизации. Полученные результаты указывают на возможность использования молекулярно-цитогенетического анализа в диагностике хромосомных нарушений при доброкачественных изменениях для оценки риска развития рака молочной железы.

Ключевые слова: рак молочной железы, фиброзно-кистозная болезнь, сравнительная геномная гибридизация, хромосомные аберрации.

ANALYSIS OF CHROMOSOMAL ABNORMALITIES IN BENIGN AND MALIGNANT BREAST TUMORS USING COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION N.A. Skryabin1, I.N. Lebedev1, A.D. Cheremnykh1, N.N. Sukhanova1,

E.M. Slonimskaya2,3, N.V Cherdyntseva2 Research Institute of Medical Genetics, Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk1 Research Institute of Oncology, Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk2 Siberian State Medical University, Tomsk3 10, Naberezhnaya Ushaiki Street, 634050-Tomsk, e-mail: skryabinn@mail.ru1

Chromosomal abnormalities are typical for almost all tumors, including breast cancer. The spectrum and frequency of chromosomal aberrations in breast aissues with benign (n=4) and malignant neoplasms (n=23) were investigated in 23 women using high-resolution comparative genomic hybridization. Multiple chromosomal abnormalities, including those specific to the breast cancer, were revealed in both groups. The presence of common chromosomal aberrations was found in tissues of patients with benign and malignant tumors providing evidence for a new cytogenetic marker of malignancy risk estimation. Our results indicate the possibility of application of the molecular-cytogenetic analysis in the diagnosing of chromosomal aberrations in benign tumors to predict the risk of the breast cancer.

Key words: breast cancer, fibrocystic disease, comparative genomic hybridization, chromosomal aberrations.

Подавляющее большинство, а возможно и железы (РМЖ), характеризуются наличием

все солидные опухоли, включая рак молочной генетических нарушений на хромосомном

уровне. Предполагается, что нарушения числа и структуры хромосом могут вносить заметный вклад в индукцию и прогрессию опухолей через изменение дозы сразу большого числа генов [4]. Более того, анализ хромосомных аберраций при доброкачественных новообразованиях приобретает особую актуальность в свете исследований, в которых показано увеличение относительного риска РМЖ у женщин с доброкачественными опухолями. Так, у женщин с фиброаденомой риск развития рака выше в 1,9-2,17 раза, чем у здоровых, а при наличии двух или более типов доброкачественных новообразований риск увеличивается до 2,6 раза [3, 5].

Исследование хромосомных нарушений при злокачественных новообразованиях с использованием методов классической цитогенетики затруднено вследствие наличия определенных сложностей в получении стабильно пролиферирующих клеточных культур in vitro. Применение методов молекулярной цитогенетики, в частности сравнительной геномной гибридизации (Comparative Genomic Hybridization, CGH), позволяет избежать данной проблемы, поскольку не требует культивирования опухолевых клеток. CGH регистрирует в рамках одной реакции гибридизации все числовые и несбалансированные хромосомные перестройки путем сравнительного анализа числа копий ДНК в клетках тестируемой ткани и контрольного образца [7]. Целью настоящего исследования явился анализ хромосомных аберраций при доброкачественных и злокачественных новообразованиях молочных желез.

Материал и методы

Материал для анализа был получен от 23 женщин, страдающих РМЖ: 23 образца опухолевой ткани и 4 образца были представлены тканью молочной железы с проявлениями фиброзно-кистозной болезни (ФКБ). Из них 4 опухолевых образца и 4 образца эпителия с ФКБ были взяты от одних и тех же пациенток. Проведение исследования было одобрено Комитетами по биомедицинской этике НИИ медицинской генетики СО РАМН и НИИ онкологии СО РАМН. Клинические данные о больных были получены при анализе первичных документов - историй болезни и амбулаторных карт. Все пациентки,

включенные в исследование, имели морфологически верифицированный операбельный РМЖ T1-4N0-3M0 и получали лечение в НИИ онкологии СО РАМН в 1996-2006 гг. Средний возраст больных составил 51,2 года (32-71 год). Больные получали комбинированное лечение, 12 пациенткам проводилось 2-4 курса неоадъю-вантной химиотерапии (НАХТ) по схемам FAC, CAF, CMF. Всем больным выполнялось хирургическое вмешательство в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции. В послеоперационном периоде при наличии показаний проводилась адъювантная химиотерапия по вышеуказанным схемам, гормонотерапия, облучение.

Образцы ДНК были выделены из операционного материала опухолей с использованием стандартного фенол-хлороформного метода [1]. Мечение тестируемой и референсной ДНК осуществляли методом ник-трансляции [11]. Гибридизация полученных ДНК-библиотек на метафазных препаратах, полученных из лимфоцитов периферической крови здорового индивида мужского пола, проводилась с супрессией 100-кратным избытком C0t-1 ДНК. Препараты метафазных хромосом окрашивали раствором DAPI и проводили детекцию гибридизацион-ных сигналов на люминесцентном микроскопе «Axioskop 50» (^arl Zeiss», Германия) с набором соответствующих светофильтров. Для компьютерной обработки полученных данных применялся программный продукт «CGHView» («Applied Spectral Imaging», США), который позволяет использовать CGH-анализ высокого разрешения (High Resolution CGH, HR-CGH). Принцип HR-CGH заключается в применении доверительного интервала, построенного в настоящем исследовании на основе сравнительной гибридизации 4 контрольных образцов ДНК с нормальным кариотипом на 50 метафазных пластинках здорового индивида мужского пола.

При обработке результатов использовался 95 % доверительный интервал, который соответствует тому, что в него попадает профиль 95 % обследованных гомологичных хромосом, использовавшихся для построения этого доверительного интервала. Нахождение гибридизаци-онного профиля и его стандартного отклонения вдоль каждой хромосомы в пределах довери-

тельного интервала расценивалось как нормальное событие. В случае же, если медиальная граница стандартного отклонения выходила за пределы доверительного интервала, то делалось заключение о наличии делеций или амплификаций соответствующих последовательностей ДНК (рис. 1). Таким образом, применение HR-CGH позволяет увеличить разрешающие возможности классического варианта метода и исключить ложнопозитивные и ложнонегативные результаты. При исследовании опухолевых образцов и тканей с фиброзно-кистозными изменениями в анализ включалось не менее 10 метафазных пластинок.

Результаты и обсуждение

Во всех образцах с РМЖ обнаружены множественные хромосомные аберрации: число ам-

Рис. 1. Интерпретация результатов сравнительной геномной гибридизации высокого разрешения: 1 - гибридизационный профиль исследуемого образца; 2 - стандартное отклонение гибридизационного профиля; 3 - доверительный интервал ги-бридизационного профиля контрольных образцов ДНК (95 %);

4 - идиограмма хромосомы 1, слева от идиограммы вертикальными линиями обозначены районы делеций (1р12-р22, 1р36.3-р36.2), справа - районы амплификаций (Ц22^ег). Цифры в скобках указывают число проанализированных гомологичных хромосом

плификаций варьировало от 1 до 29, в среднем на один случай приходилось 14 различных хромосомных нарушений. Число амплификаций в некоторых образцах достигало 24, а число делеций -14. Среднее число амплификаций составило 9, а делеций - 5 на образец. Среднее число хромосомных регионов, затронутых хромосомными перестройками, составило 54 на образец ткани. Наиболее частыми являлись амплификации в регионах Ц32 (80 %), Ц31 (76 %), Ц23^25 (47 %), Ц41^44 (47 %), 10д22 (42 %), 8д23 (38 %), 8д22 (33 %) и делеции в регионах 16д12.2-д13 (66 %), 16д12.1 (57 %), 9д21 (47 %), 16д21 (47 %). В целом спектр хромосомных аберраций при РМЖ, выявленный в настоящем исследовании, соответствует уже описанным в литературе и является характерным для опухолей данной локализации [2, 8]. Так, наиболее частая амплификация, выявленная в данной работе (Ц32), является и наиболее частой в Базе данных «Progenetix», в которой обобщены результаты CGH-анализа различных злокачественных новообразований, в том числе исследований 1908 образцов РМЖ [10].

В тканях с фиброзно-кистозной болезнью количество хромосомных аберраций варьировало от 5 до 18 на образец ткани, в среднем на один случай приходилось 10 различных хромосомных нарушений. Число амплификаций в некоторых образцах достигало 6, а число делеций - 12. Среднее число амплификаций составило 3, а делеций - 7 на образец. Среднее число хромосомных регионов, затронутых хромосомными нарушениями, составило 24 на образец ткани. В образцах с доброкачественными пролиферативными изменениями наиболее частая амплификация была выявлена в регионе 14q21 (50 %), а наиболее частые делеции в регионах 16р11.2-р12 (75 %), ^12.2^22 (75 %), 17р11.2 (75 %) и 22q11.2-q13 (75 %). Средняя частота хромосомных аберраций в образцах с ФКБ оказалась меньше, чем в группе образцов с РМЖ, однако все же имела достаточно высокий уровень. Вероятнее всего, это объясняется особенностью обследованного материала - во всех 4 случаях ткани с фиброзно-кистозными изменениями были получены от женщин с диагностированным раком молочной железы.

Спектр хромосомных перестроек в обеих группах оказался разнородным, за исключением

Таблица

Спектр хромосомных нарушений у пациенток с фиброзно-кистозной болезнью и раком

молочной железы

Пациентка 1 Пациентка 2 Пациентка 3 Пациентка 4

епЬ dim епЬ dim епЬ dim епЬ dim

Мутации, выявленные только в тканях с фибрознокистозными изменениями 2q31-q32, 4q13-q31.3, 5q15, 6q16, 6q22, ^21^31 1р35-р36.3, 8р21-р22, 9^ Щ25-q26, 1Ц13, 16р11.2-р13.1, ^12.1-q22, 17, 19, 20q, 22 10q22, Щ22 5111.2, 9121, 17р11.2 1р33-р36.1, 11р11.2- р14, 11112-113, 16р11.2-р12, 16112.2122, 19, 201, 221 6р24-р25, 8р23, 14121, 20р13 9р13, 16р11.2-р12,16121-122, 221

Мутации, выявленные только в опухолевых образцах ^21^41, 5q23, Щ21, ^13.3- q13.4 1р31, 1131-Я41, 2р13, 2р15,2р22-р25, 2114.3-2q24, 7р15, 7q21-q22, 8р21-р23, 8121.1-q24.1, Щ24^25, 11q23, 12р12-р13, 17і11.2-і21 1р22-р31, 1122-142, 2р22, 2і22, 2і32-і36, 3р14-р22, 3і22-і26.3, 5і31, 6і21-123, 7р13-р15, 7131, 8р22-р23, 8113-123, 11р14-р15, 9121, 10р14-р15, 17111.2121, 21122 1р22-р31, 5113, 5134, 8123-124.3, 9123, 10122, 1р12-р13, 9121, 20р11.2

Мутации, выявленные в тканях с фибрознокистозными изменениями и в опухолях 5q21-q22 12^121 17р, 22111.2 16112.1- 113

региона 16q21. Делеции региона 16q21 являлись наиболее частыми не только для образцов с фиброзно-кистозными изменениями (75 %), но и для образцов с РМЖ (47 %), что соответствует данным литературы [6, 9, 12, 13]. Некоторые авторы указывают на делецию 16q как на одну из основных хромосомных аберраций, которые ответственны за малигнизацию доброкачественных дисгормональных пролиферативных процессов, и в совокупности с другими аномалиями кариотипа, такими как амплификация Ц, приводят к развитию того или иного типа рака [12, 13].

Одним из наиболее интересных моментов нашего исследования явился сравнительный

анализ хромосомных аберраций в образцах тканей молочных желез с ФКБ и РМЖ, взятых у одних и тех же пациенток (таблица). Аномалии, выявленные в тканях пациенток с этими патологическими процессами, вероятнее всего, возникли на ранних этапах трансформации и могли способствовать развитию как доброкачественного, так и злокачественного фенотипа. По всей видимости, именно такие общие хромосомные нарушения могут выступать в качестве маркеров ранней злокачественной трансформации клеток и в дальнейшем быть использованы при оценке риска малигнизации. Появление на фоне этих перестроек дополнительных аберраций хромосом, характерных для рака молочной

железы, является, по всей видимости, закономерным звеном дальнейшего патогенеза уже злокачественной трансформации клеток. Также заслуживает внимания факт наличия в образцах с ФКБ хромосомных аберраций, которых нет в опухоли, что, вероятно, может свидетельствовать о гетерогенной эволюции генетического аппарата клеток в процессе канцерогенеза.

Таким образом, результаты проведенного исследования демонстрируют высокий уровень хромосомных аберраций как в опухолевых тканях молочных желез, так и при доброкачественных пролиферативных процессах. Диагностика хромосомных аномалий в тканях с ФКБ может оказаться информативным инструментом в оценке риска возможной малигнизации.

Настоящее исследование выполнено в рамках Интеграционного проекта СО РАМН «Молекулярногенетические механизмы формирования и прогрессии рака молочной железы: разработка критериев риска, прогноза клинического течения и чувствительности к химиотерапии на основании информативных маркеров опухоли и организма» и Государственного контракта № П525 от 05.08.09 Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.».

ЛИТЕРАТУРА

1. Маниатис Т., фрэнч Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. С. 265-266.

2. Baudis M. Genomic imbalances in 5918 malignant epithelial tumors: an explorative meta-analysis of chromosomal CGH data // BMC Cancer. 2007. Vol. 7. P. 226.

3. Dorjgochoo T., Deming S.L., Gao Y.T. et al. History of benign breast disease and risk of breast cancer among women in China: a case-control study // Cancer Causes Control. 2008. Vol. 19 (8). P. 819-828.

4. Duesberg P. Are centrosomes or aneuploidy the key to cancer? // Science. 1999. Vol. 284 (5423). P. 2091-2092.

5. Dupont W.D., Page D.L., Parl FF. et al. Long-term risk of breast cancer in women with fibroadenoma // N. Engl. J. Med. 1994. Vol. 331 (1). P. 10-15.

6. Green A.R., Krivinskas S., Young P. et al. Loss of expression of chromosome 16q genes DPEP1 and CTCF in lobular carcinoma in situ of the breast // Breast Cancer Res. Treat. 2009. Vol. 113. P. 59-66.

7. Kallioniemi A., Kallioniemi O.-P., Sudar D. et al. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors // Science. 1992. Vol. 258. P. 818-821.

8. Larramendy M.L., Lushnikova T., Bjorkqvist A.-M. et al. Comparative Genomic Hybridization Reveals Complex Genetic Changes in Primary Breast Cancer Tumors and Their Cell Lines // Cancer Genet. Cytogenet. 2000. Vol. 119. P. 132-138.

9. Natrajan R., Lambros M.B., Geyer FC. et al. Loss of 16q in high grade breast cancer is associated with estrogen receptor status: Evidence for progression in tumors with a luminal phenotype? // Genes Chromosomes Cancer. 2009. Vol. 48. P. 351-365.

10. Progenetix // www.progenetix.net

11. Rooney D.E., Czepulkowski B.H. Human cytogenetics. A practical approach // New York.: Oxford University Press, 1992. Vol. 1. P. 274.

12. Roylance R., Gorman P., Papior T. et al. A comprehensive study of chromosome 16q in invasive ductal and lobular breast carcinoma using array CGH // Oncogene. 2006. Vol. 25. P. 6544-6655.

13. Xu S., Wei B., ZhangH. et al. Evidence of chromosomal alterations in pure usual ductal hyperplasia as a breast carcinoma precursor // Oncology Reports. 2008. Vol. 19. P. 1469-1475.

Поступила 16.06.10