Способ определения чувствительности неферментирующих бактерий к дезинфицирующим средствам с применением масс-спектрометрии
METHOD OF DETERMINING SENSITIVITY OF NON-FERMENTING BACTERIA TO DISINFECTANTS USING MASS SPECTROMETRY

Изобретение относится к области микробиологии и касается способа определения чувствительности неферментирующих бактерий (НФБ) к дезинфицирующим средствам (дезинфектантам).
В настоящее время инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП), являются актуальной медицинской проблемой, при этом в микробном пейзаже в отделениях лечебно-профилактических учреждений различного профиля доминируют НФБ. Частота выделения НФБ из клинического материала достигает 15% от всех аэробных и факультативно-анаэробных грамотрицательных бактерий, из них около 70% приходится на долю P. aeruginosa, Acinetobacter spp. и Stenotrophomonas maltophilia. Указанные бактерии могут существовать в любой из экологических ниш - почве, воде, воздухе, тканях и органах растений и животных, а также обладают способностью распространяться горизонтально через предметы или руки больных и медперсонала, т.е. быть возбудителями госпитальных инфекций. Эти возможности НФБ обеспечиваются наличием высокой частоты резистентности к различным классам антимикробных препаратов, межклеточной сигнальной системой «quorum sensing», а также способностью формировать биопленку, структура и физиологические свойства которой обеспечивают повышение устойчивости к антибиотикам и дезинфектантам.
Изучение устойчивости бактерий к дезинфектантам тормозится, прежде всего, отсутствием унифицированных методов определения и несовершенством показателей оценки чувствительности - устойчивости бактерий к этой группе препаратов.
Известен способ определения чувствительности микроорганизмов к дезинфектанту (RU 2378363), в основе которого лежит оценка жизнеспособности микроорганизмов по росту микроорганизмов на питательной среде после обработки взвеси микробов дезинфектантом в течение времени, необходимого для проявления дезинфицирующего эффекта и последующего дозированного посева на плотную питательную среду. О чувствительности микроорганизмов к дезинфектанту судят по росту микроорганизмов на питательной среде, при этом, при росте до 100 КОЕ/мл судят о неполном бактерицидном действии, при росте 100-300 КОЕ/мл - о суббактерицидном действии, при росте более 300 КОЕ/мл - об устойчивости микроорганизмов к дезинфектанту.
Подсчет колоний жизнеспособных бактерий в данном способе проводят в ручном режиме, что носит субъективный характер. Данный способ не дает возможности одновременного определения чувствительности культур НФБ к разным дезинфекционным средствам, трудоемок в исполнении и требует дорогостоящих расходных материалов.
Целью предлагаемого изобретения явилась разработка способа, позволяющего исследовать чувствительность культур неферментирующих бактерий одновременно к разным дезинфекционным средствам, обеспечивающего объективность и стандартность процедуры, сокращение времени проведения исследований и расходные материалы.
Поставленная цель достигается использованием времяпролетной масс-спектрометрии с матрично- активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS), основанной на ионизации атомов и молекул, входящих в состав исследуемого образца, и регистрации спектра масс образовавшихся ионов, получил широкое распространение в идентификации микроорганизмов. Получаемые масс-спектр профили микроорганизмов (белковые профили) являются уникальной родо-, видоспецифичной характеристикой, и, соответственно, позволяют идентифицировать микроорганизм до рода, вида.
По окончании процесса автоматической идентификации на основании сравнения полученного исходного спектра с референсными спектрами базы данных программа отображает результат идентификации, приводя наиболее релевантную исходному спектру таксономическую единицу базы данных с указанием значения коэффициента соответствия (показатель уровня идентификации бактерий) - «Score». Чем выше данный коэффициент, тем вероятнее классификация вида. После завершения процесса идентификации результат выводится в таблицу классификации, показывающую наилучшие результаты идентификации полученных масс-спектров, достоверность которых подтверждается коэффициентом соответствия.
В предлагаемом способе для определения чувствительности НФБ к дезинфектантам используют времяпролетную масс-спектрометрию с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS), при которой чувствительность НФБ к дезинфицирующим средствам определяют по оценке степени денатурации белков бактерий, фиксируемой при сопоставлении масс-спектрометрических профилей культур НФБ, полученных до- и после воздействия дезинфектантами.
Способ осуществляют следующим образом.
Масс-спектрометрическим методом (идентификация молекул путем измерения отношения их массы к заряду (m/z) в ионизированном состоянии) с использованием настольного масс-спектрометра Microflex с базой данных MALDI Biotyper (Bruker Daltonics Germany) проводят исследования суточной бульонной чистой культуры НФБ до- и после воздействия дезинфектанта.
Изолированную колонию испытуемой культуры с чашки Петри вносят в пробирку с питательным микробиологическим бульоном и выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение суток. Каплю испытуемой суточной чистой культуры НФБ наносят на мишень в двух повторностях, сушат при комнатной температуре в течение 5-15 мин. На каждый образец наносят 1 μl матрицы СНСА (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid), просушивают. Образцы помещают в масс-спектрометр и подвергают воздействию лазерных импульсов (ионизация).
Исходный (до воздействия дезинфектантами) масс-спектрометрический профиль рассматривают, как показатель уровня идентификации НФБ и оценивают в соответствии с полученным коэффициентом соответствия:
- при коэффициенте соответствия 2,300-3,000 - высокая вероятность идентификации вида;
- 2,000-2,299 - надежная идентификация рода, вероятная идентификация вида;
- 1,700-1,999 - вероятная идентификация рода;
- 0,00-1,699 - ненадежная идентификация.
Определяют масс-спектрометрический профиль суточной бульонной чистой культуры НФБ после воздействия дезинфицирующих средств.
Суточные бульонные чистые культуры НФБ подвергают воздействию разных дезинфектантов: 6% перекись водорода, 70° этанол; препарат «Ультрадон» (Россия); препарат «Сульфохлорантин Д» (Россия), используя концентрации рабочих растворов дезинфектантов, и, в качестве сублетальной дозы, 10-кратное разведение их рабочих растворов. Тестируемые культуры выдерживают в растворах препаратов при экспозиции, рекомендованной соответствующими инструкциями. Действие дезинфектантов останавливают 0,5% раствором тиосульфата натрия (10 мкл 0,5% раствора тиосульфата натрия + 90 мкл взвеси культуры в дез.средстве) в течение 15 мин при 20°С. Затем подращивают 3 час при 37°С в питательном бульоне (НПО «Микроген») в соотношении 1 мл взвеси микроорганизма с дезинфектантом + 1 мл питательного бульона, и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Осадок микроорганизмов наносят на мишень (10 мкл) и анализируют масс-спектрометрическим методом (Bruker Daltonik MALDI Biotyper) по описанной выше схеме.
Параллельно из растворов культур с дезинфектантами проводят дозированные посевы на микробиологический агар (НПО «Микроген») для подсчета жизнеспособных бактериальных клеток.
Проводят оценку варьирования распределения пиков различной длины пролета в полученных профилях. Пики различной длины пролета условно разделяют на группы, в зависимости от отношения массы иона к заряду (m/z):
- высоко-пролетные - (m/z≥5000), мажорные;
- средне-пролетные - (m/z от 5000 до 2500), промежуточные;
- низко-пролетные (m/z≤2500), минорные.
Масс-спектрометрический профиль различных штаммов Р. aeruginosa до воздействия дезинфектантов представлен на рисунке 1.
Описание способа
1. Используемые штаммы:
1) P. aeruginosa - 35,
2) Acinetobacter iwoffii -1,
3) Acinetobacter baumannii - 2,
4) Stenotrophomonas maltofilia - 2.
2. Используемые дезинфекционные средства
1) 6% перекись водорода
2) 70° этанол;
3) «Ультрадон» (Россия);
4) препарат «Сульфохлорантин Д» (Россия).
Этап 1. Подготовка культур.
Приготовление рабочей взвеси. Суточные бульонные чистые культуры неферментирующих бактерий используют для приготовления основной рабочей взвеси с использованием стандарта оптической плотности, соответствующего 1 млрд мт/мл в изотоническом растворе хлорида натрия.
Этап 2 Подготовка дезинфекционных средств.
Подготовка рабочих стандартных растворов дезинфектантов. Рабочие растворы дезинфектантов приготавливают из концентрированных растворов в соответствии с инструкциями.
Подготовка сублетальных концентраций растворов дезинфектантов. Из рабочих растворов дезинфектантов приготавливают раствор 1:10 последовательным разведением в изотоническом растворе хлорида натрия. При этом 1 мл рабочего раствора дезинфектанта соединяют и перемешивают с 9 мл изотонического раствора хлорида натрия.
Таким образом, для исследования устойчивости к препаратам используют 2 концентрации тестируемого дезсредства: рабочий стандартный раствор и 1:10.
Этап 3 Осуществление способа
1. Суточную бульонную чистую культуру бактерий подготавливают в соответствии с инструкцией по проведению биотипирования бактерий с использованием масс-спектрометра. Получают исходный (контрольный) масс-спектрометрический профиль штамма.
2. Культуры бактерий (микробная взвесь-1 млрд мт/мл) подвергают воздействию разных дезинфектантов (6% перекись водорода, 70° этанол; препарат «Ультрадон» (Россия); препарат «Сульфахлорантин Д» (Россия), в рабочей и сублетальной концентрациях препаратов.
3. Тестируемые культуры выдерживают в растворах препаратов при экспозиции, рекомендованной соответствующими инструкциями, при 20°С.
4. Действие дезинфектантов останавливают 0,5% раствором тиосульфата натрия. Затем подращивают 3 час при 37°С в питательном бульоне (НПО «Микроген»), добавляя к 1,0 мл взвеси 3,0 мл питательной среды. Затем центрифугируют при 13000 об/мин-10 мин.
5. Осадок микроорганизмов повторно анализируют методом масс-спектрометрии (Bruker Daltonik MALDI Biotyper).
Этап 4 Учет масс-спектрометрических профилей.
Сопоставляют полученные масс-спектрометрические профили с помощью программы MALDI-TOF Biotyper и затем проводят визуальный анализ произошедших изменений.
Пример 1. Изучение масс-спектрометрического профиля неферментирующих бактерий после воздействия этанолом.
Изменения, произошедшие под влиянием этанола для P. aeruginosa представлены на рисунке 2.
Для рабочего раствора этанола было выявлено практически полное исчезновение высоко-пролетных пиков, отсутствие средне-пролетных и превалирование низко-пролетных пиков. Для сублетальной концентрации - все пики были низко-пролетными. При этом отмечен переход величин первоначальных пиков к более низким значениям (отметка 1), либо их полным исчезновением (отметка 2).
В целом, наблюдается сглаживание масс-спектрометрического профиля с переходом в низко-пролетный интервал, что свидетельствует о денатурирующем действии препарата.
Пример 2. Изучение масс-спектрометрических профилей неферментирующих бактерий после воздействия перекиси водорода.
Масс-спектрометрический профиль P. aeruginosa после действия перекиси водорода приобретает вид, изображенный на рисунке 3.
Масс-спектрометрический профиль неферментирующих бактерий после воздействия рабочего раствора перекиси водорода не представлен, это определяется тем, что дезинфектант в большинстве случаев (97,3%) был летален для культур. Воздействие сублетальной концентрации привело у P. aeruginosa к снижению числа высоко- (отметка 1) и среднепролетных пиков (отметка 2); они трансформировались в пики с более низким значениями пролетности, что свидетельствует об эффективности действия препарата.
Пример 3. Изучение масс-спектрометрических профилей неферментирующих бактерий после действия «Сульфохлорантина Д».
Изменения масс-спектрометрического профиля на примере Р. aeruginosa после воздействия «Сульфохлорантина Д» представлены на рисунке 4.
Как видно из рисунка 4 масс-спектрометрический профиль Р. aeruginosa для рабочего раствора и сублетальной концентрации «Сульфохлорантина Д» приводит к сокращению числа высоко- (отметка 1), средне-пролетных пиков (отметка 2) и переходу их к низко- пролетным значениям.
Пример 4. Изучение масс-спектрических профилей неферментирующих бактерий после действия «Ультрадона».
Наблюдаемые перемены масс-спектрометрического профиля Р. aeruginosa показаны на рисунке 5.
При применении «Ультрадона», как видно на рисунке 5 происходило снижение числа высоко- и средне-пролетных пиков (отметка 1), а также исчезновение некоторых низко- пролетных (отметка 2).
Пример 5. Изучение масс-спектрометрических профилей у разных неферментирующих бактерий под действием разных концентраций дезинфектантов
В таблице 1 приведены данные изучения масс-спектрометрических профилей у разных неферментирующих бактерий по действием разных концентраций этанола, перекиси водорода, «Сульфохлорантина Д», «Ультрадона» по сравнению с методом серийных разведений с контрольным посевом
В целом, полученные результаты показали, что способы достоверно сходны.