Способ получения ингибитора трипсина из люцерны посевной
METHOD OF PRODUCING LUCERNE TRYPSIN INHIBITOR

Изобретение относится к способу получения ингибитора трипсина из люцерны посевной направленно на сокращение времени проведения процесса получения и увеличения степени очистки ингибитора трипсина из люцерны.
Известен способ получения ингибитора трипсина из люцерны А.С. СССР №1440924, заключающийся в связывании ингибитора трипсина из коричневого сока на аффинном сорбенте. Сорбент представляет собой поливиниловый спирт волокнистой структуры, предварительно активированный n-толуолсульфохлоридом и содержащим 47-60 мг трипсина на 1 г сухого сорбента, с последующей десорбцией целевого продукта.
Недостатком известного способа является длительность проведения процесса получения и недостаточная степень очистки ингибитора трипсина, которая составила 150-159 раз.
3
Наиболее близким к заявленному является способ получения ингибитора трипсина А.С. СССР №1162081 [Новиков Ю.Ф., Новиков Н.Н., Соколова Е.В., Шаповал И.В., Пройдак Н.И., Любецкая Х.А., Сухинин В.Н., Маслова Н.Ф., Потапов Н.В.]. В соответствии с этим способом сок коричневого цвета, полученный из люцерны посевной, использовали для биоспецифической колоночной хроматографии, в колонке объемом 265 см (150×15). Всего использовали 17 порций сока общим объемом 4,2 литра.
3
Недостатком известного способа является многоэтапность и длительность проведения очистки ингибитора при проведении биоспецифической хроматографии, поскольку она проводилась в колонке с объемом 265 см. Ограниченный объем колонки приводит к тому, что супернатант, полученный после центрифугирования, необходимо делить на 17 порций. Такое длительное и многоэтапное проведение операции очистки приводит к потерям продукта, снижению степени очистки и снижению активности ингибитора.
Технический результат изобретения - упрощение способа получения целевого продукта. Направленно на сокращение времени проведения процесса получения и увеличения степени очистки ингибитора трипсина из люцерны посевной.
Технический результат достигается тем, что очистку ингибитора трипсина из люцерны посевной проводят в один этап, в емкости с мешалкой с прибавлением сорбента. Сок коричневого цвета помещают в емкость с мешалкой и сюда же вносят сорбент трипсин-сефарозу, содержимое перемешивают в течение 10-15 минут, температуру в емкости поддерживают в диапазоне 36-38°С. Полноту связывания ингибитора трипсина определяют в отдельном опыте по величине активности трипсина. Пигменты и неспецифические связанные белки удаляют промыванием водой и ацетатным буфером с 0,3 М хлоридом натрия, рН раствора 7.
Десорбцию ингибитора осуществляют 0,15 М ацетатным буферным раствором с 0,3 М хлоридом натрия. Тонкую очистку ингибитора проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-75. Ингибитор осаждают сернокислым аммонием до насыщения 70% с последующим центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 15 минут и подвергают диализу через полупроницаемую мембрану против воды с 0,3 М хлоридом натрия. Полученный ингибитор трипсина замораживают и сушат в лиофильной сушилке.
Удельная активность полученного ингибитора трипсина составила 7,41±0,86 мг/мг белка, степень очистки 180-190 раз. Выход целевого продукта составил около 0,012-0,013 г из 1 килограмма исходного сырья.
Осуществление заявленного способа поясняется следующим примером технологического процесса.
3
Люцерну посевную в стадии бутонизации скашивают, измельчают при помощи измельчителя «Волгарь -5 А», отбирают 5 килограмм, далее из измельченной массы отжимают зеленый сок. В емкости, методом температурной коагуляции, нагревая сок до температуры 85°С, отделяют сопутствующие вещества, образовавшийся осадок осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 минут. Полученный раствор помещают в емкость объемом 8000 см для проведения сорбции, в нее вносят сорбент - трипсин-сефарозу, содержимое перемешивают в течение 10-15 минут, температуру раствора поддерживают в диапазоне 36-39°. Полноту связывания ингибитора трипсина определяют в отдельном опыте по активности трипсина. Пигменты и неспецифические связанные белки удаляют промыванием содержимого водой и ацетатным буфером с 0,3 М хлорида натрия, рН равна 7.
Десорбцию ингибитора осуществляют 0,15 М ацетатным буферным раствором с 0,3 М хлорида натрия. Ингибитор трипсина из полученного раствора осаждают сернокислым аммонием до насыщения 70% с последующим центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 15 минут. Тонкую очистку ингибитора проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-75. После очистки ингибитор подвергают диализу через полупроницаемую мембрану против воды с 0,3 М хлорида натрия. Полученный ингибитор трипсина замораживают и сушат в лиофильной сушилке.
Выход целевого продукта составляет около 0,012 г из 1 килограмма исходного сырья, степень очистки 180-190 раз. Удельная активность полученного ингибитора трипсина составила 7,41±0,86 мг/мг белка.
Предлагаемая совокупность отличительных признаков (проведение процесса очистки в один этап в емкости с мешалкой, тонкая очистка ингибитора методом гель-фильтрации на сефадексе G-75, осаждение продукта сернокислым аммонием до насыщения 70% и диализ его через полупроницаемую мембрану) взамен многоэтапного способа получения ингибитора трипсина в колонке с объемом 265 см, включающий биоспецифическую очистку ингибитора трипсина в один этап, тонкую очистку методом гель-фильтрации, осаждение сернокислым аммонием, диализ и лиофильное высушивание готового продукта позволяет:
- упростить способ получения целевого продукта - ингибитора трипсина;
- увеличить степень очистки целевого продукта (степень очистки 180-190 раз) за счет проведения процесса биоспецифической сорбции в один этап и тонкой очистки методом гель-фильтрации с последующим осаждением сернокислым аммонием и лиофильной сушкой.
- получить целевой продукт с более высокой удельной активностью (удельная активность полученного ингибитора трипсина составляла 7,41±0,86 мг/мг белка).