СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВРЕМЕНИ САМОСБОРКИ ФИБРИН-МОНОМЕРА
METHOD FOR DETERMINATION OF FIBRIN MONOMER SELF-ASSEMBLY TIME

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для исследования крови при нарушениях в системе гемостаза.
Система свертывания крови характеризуется как каскад ферментативных реакций с превращением на конечном этапе коагуляции фибриногена под влиянием тромбина в фибрин. Конечный этап свертывания включает ряд ферментативных и неферментативных реакций. Вначале от α- и β-цепей фибриногена тромбин отщепляет два пептида А и два пептида В. Молекулярная масса каждого из этих пептидов составляет около 4 кДа. Оставшаяся основная молекула с мол. массой около 300 кДа (фибрин-мономер) при взаимодействии с аналогичными фибрин-мономерами образует димер фибрина, затем тетрамер, октамер и т.д., в результате чего образуется крупномолекулярный комплекс, обозначаемый как «растворимый фибрин» или «растворимые фибрин-мономерные комплексы». Достигнув определенной критической массы (около 12000-15000 кДа), они коагулируют, превращаясь в волокна и сгустки фибрина. Этот фибрин нестоек и легко растворяется в 5М мочевине или 1%-ной уксусной кислоте, но он немедленно дополнительно фиксируется фибринстабилизирующим фактором (фактором ХIIIа), который формирует дисульфидные связи между γ-цепями фибрин-мономеров.
Удлинение времени на конечном этапе свертывания, связанные с дефектами отделения фибринопептидов А и/или В от фибриногена и взаимодействием фибрин-мономеров между собой (самосборка фибрин-мономера), характерны для врожденных или приобретенных дисфибриногенемий, при которых часто наблюдается геморрагический синдром. С другой стороны, ускорение времени самосборки фибрин-мономера может быть одной из причин гиперкоагуляционного синдрома, ведущего к внутрисосудистому свертыванию крови.
Известен способ определения активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ), основанный на измерении времени свертывания плазмы крови человека при ее рекальцификации в условиях стандартизированной контактной и фосфолипидной активации свертывания (Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. Издание 2-е дополненное. - М.: «Ньюдиамед», 2001. - С.79-81).
Недостатком известного способа является влияние на АПТВ дефицита факторов коагуляции (XII, XI, X, IX, VIII, V, II), наличия их ингибиторов и присутствия в плазме крови антикоагулянтов прямого действия (гепарина и др.).
Кроме того, известный способ мало чувствителен к нарушениям самосборки фибрин-мономера и редко является показательным в этом отношении.
Известен способ определения продолжительности самосборки фибрина в плазме, включающий обработку фибриногена тромбином непосредственно в плазме в присутствии мочевины, добавление буфера с низкой ионной силой и последующее определение времени самосборки фибрина (авторское свидетельство SU 1210094, опубл. 07.02.1986 г., реферат и описание изобретения).
Определяют долю продолжительности самосборки фибрина в общей продолжительности фибринообразования.
Реактивы.
1. Мочевина, 40% на 0,02М ацетатном буфере с рН 5,2
2. Раствор тромбина 0,1%, 1% в 0,14М хлориде натрия
3. Боратный буфер 0.0075М, рН - 7,6
Материал для исследования. Цитратная плазма крови.
Ход определения. К 0,2 мл исследуемой плазмы добавляют 0,2 мл 40% раствора мочевины и 0,2 мл 0,1% раствора тромбина. Смешивают и оставляют на водяной бане при +37°С на 10 мин.
0,1 мл смеси после экспозиции переносят в пробирку, куда предварительно наливают 0,3 мл боратного буфера. В момент внесения включают секундомер, выключая его при появлении сгустка, регистрируя продолжительность самосборки фибрина. Показания секундомера, например 16,3 с.
В пробирку на водяной бане при +37°С вносят 0,3 мл боратного буфера, добавляют 0,033 мл 40% раствора мочевины и 0,033 мл исследуемой плазмы, все смешивают. К смеси добавляют 0,033 мл 1% раствора тромбина, немедленно включают секундомер и отмечают момент образования сгустка, регистрируя общую продолжительность фибринообразования. Показания секундомера, например 58,7 с.
Чтение результатов. Расчет доли самосборки в общей продолжительности фибринообразования в исследуемой плазме: (16,3:58,7)×100=27,7%.
К недостаткам способа определения продолжительности самосборки фибрина в плазме следует отнести:
1. Невозможность использования тромбина, стандартного по активности.
2. Невозможность проведения коагулометрического исследования.
3. Трудоемкость и длительность теста.
4. Низкая точность способа.
Заявляемый способ лишен этих недостатков: тест легко выполняется на коагулометрах различной конструкции с использованием стандартного по активности тромбина, имеет более высокую точность при оценке как замедления, так и укорочения времени самосборки в плазме больных с различными видами нарушений гемостаза.
Авторами разработан высокоэффективный и высокоточный способ определения времени самосборки фибрин-мономера, позволяющий определять как удлинение, так и укорочение времени самосборки фибрин-мономера.
Техническим результатом заявляемого способа является повышение точности определения времени самосборки фибрин-мономера.
Технический результат достигается тем, что в реагирующую смесь вводят мочевину в концентрации 150-250 г/л и используют тромбин активностью 40-60 NIH/мл или 4-6 с.
Способ осуществляют следующим образом.
Реактивы и оборудование:
1. Цитрат натрия, трехзамещенный, 3,8% раствор, получают растворением 3,8 г цитрата натрия в 100 мл дистиллированной воды.
2. Тромбин человека (лиофильно высушенный), 500 NIH, фирма «Технология-Стандарт», Россия.
3. Буфер трис-НСl концентрированный (20:1), 1,0 М, 5 мл, рН 7,3-7,4, фирма «Технология-Стандарт», Россия.
4. Мочевина, осч, фирма «Merck», Германия.
5. Физиологический (0,9%) раствор хлорида натрия.
6. Дистиллированная вода.
7. Центрифуга ОПН-8.
8. Коагулометр Минилаб-701 фирмы Юнимед, Россия.
9. Пробирки стеклянные объемом 20 мл.
10. Цилиндр стеклянный, мерный, на 100 мл.
Приготовление реактивов.
1. Разведение тромбина: во флакон с лиофильно высушенным тромбином добавляют 10,0 мл физиологического раствора хлорида натрия и при легком покачивании растворяют реагент в течение 5 мин.
2. Приготовление рабочего буферного раствора, содержащего мочевину: концентрированный буфер в объеме 2,0 мл и навеску мочевины (18 г) вносят в мерный цилиндр и общий объем доводят дистиллированной водой до 100 мл. В результате получают рабочий буферный раствор следующего состава - трис-HCl 0,01 М, рН 7,3-7,4, содержащий мочевину в концентрации 180 г/л.
Подготовка исследуемой плазмы больного и пула контрольной нормальной плазмы крови (взятой у здоровых людей).
Кровь получают из локтевой вены самотеком через иглу в пластиковую пробирку, содержащую 0.1М раствор цитрата натрия (соотношение крови и цитрата 9:1). Кровь центрифугируют 5 мин при скорости вращения 1000 об./мин (200g). Полученную богатую тромбоцитами плазму повторно центрифугируют в течение 20 минут при 4000 об./мин (1200g). Полученную бедную тромбоцитами плазму используют для проведения исследования.
Для приготовления пула контрольной нормальной плазмы в равной пропорции смешивают образцы бедной тромбоцитами плазмы от 8-10 здоровых людей.
Ход определения
В кювету коагулометра вносят 0,1 мл исследуемой плазмы и выдерживают в термостатируемой ячейке 1 мин при +37°С. Затем добавляют 0,05 мл рабочего буферного раствора, содержащего мочевину в концентрации 180 г/л, и инкубируют там же при +37°С в течение 1 мин. Переносят кювету в измерительный канал, затем добавляют 0,05 мл раствора тромбина, тотчас запускают измерительный канал и регистрируют время свертывания в конечном этапе.
Оценка полученных результатов. По результатам обследования здоровых людей (42 наблюдения) время свертывания в конечном этапе составляет 24,5-37,8 с (Х=30,7; σ=3,01; m=0,46).
Удлинение времени самосборки фибрин-мономера свыше указанного верхнего предела свидетельствует о врожденной или приобретенной дисфибриногенемии, либо тормозящем влиянии ингибиторов самосборки фибрин-мономера (продукты деградации фибрина - D-димер, парапротеины). Укорочение времени самосборки фибрин-мономера показывает на наличие тромбогенного сдвига на конечном этапе свертывания.
Апробация предлагаемого способа.
Апробация заявляемого способа проведена на 25 больных с удлинением времени свертывания на конечном этапе (I группа), в том числе с геморрагическими мезенхимальными дисплазиями (14), с болезнью Виллебранда (7), циррозами печени (4), а также на 27 больных (II группа) с укорочением времени самосборки фибрин-мономера при гиперкоагуляционных состояниях, а именно с гематогенными тромбофилиями (11), тяжелыми гестозами последнего триместра беременности (9), септическими состояниями (7). Результаты обследования больных с нарушениями конечного этапа свертывания по предлагаемому способу представлены в таблице 1. Из таблицы следует, что предлагаемый способ позволяет оценить как замедление, так и ускорение самосборки фибрин-мономера в соответствующих типовых клинических ситуациях.
Необходимо отметить, что заявленный способ имеет существенные отличия от известного SU 1210094, а именно использование стандартизированного по коагуляционной активности тромбина, значительное сокращение времени проведения анализа, возможность коагулометрического проведения исследования, повышение точности результатов.
В частности:
1. Повышение точности заявленного способа достигается использованием тромбина стандартной активности 4-6 с (или 40-60 NIH/мл).
Описываемая в способе-прототипе активность применяемого тромбина (0,1% или 0,1 г/100 мл) не может быть стандартизирована, поскольку тромбин представляет собой фермент, активность которого трудно сопоставить с его весом в разных партиях данного реагента различных производителей.
Для пояснения выбора диапазона активности используемого тромбина приводим таблицу 2, в которой показано влияние активности тромбина на результат в заявляемом способе. В ней приведены средние данные по результатам 10-кратного повтора оценки времени самосборки фибрин-мономера. Как видно из таблицы 2, оптимальной активностью тромбина в заявляемом способе является диапазон от 40 до 60 NIH/мл. Более низкая активность тромбина (менее 40 NIH/мл) дает неустойчивые результаты и удлиняет время исследования. Применение активности тромбина свыше 60 NIH/мл экономически нецелесообразно.
2. Кроме того, в заявляемом способе время, необходимое для выполнения анализа, составляет 2,5-3 мин, в то время как способ-прототип требует для своего выполнения 15-17 мин, т.е. в среднем в 5,8 раз меньше.
3. Принято проводить оценку свертывания крови или полученной из нее плазмы с использованием коагулометров. Оценка результатов в заявляемом способе может проводиться на коагулометре любой конструкции. В то же время определение времени свертывания в способе-прототипе выполняется лишь мануально и не улавливается коагулометрически из-за низкой концентрации фибриногена в оцениваемой смеси («крошковидное» свертывание). Последнее обусловлено высоким, в 12 раз, разведением плазмы в ходе выполнения анализа по способу-прототипу. В заявляемом способе плазма в ходе выполнения анализа разводится в 2 раза. Кратно приведенным разведениям снижается количество необходимого субстрата свертывания для тромбина - фибриногена.
4. При выполнении заявляемого способа определения времени самосборки фибрин-мономера повышается точность определений по сравнению со способом-прототипом. В таблице 3 показано, что коэффициент вариации результатов в заявляемом способе более, чем в 3 раза ниже аналогичного показателя в способе-прототипе, и составляет 4,4%. Расчет коэффициента вариации получаемых результатов представлен в предлагаемом способе коагулометрически и способе-прототипе мануально.
Обоснование необходимого диапазона концентрации мочевины для оценки конечного этапа свертывания в предложенном способе.
Для выбора необходимой концентрации мочевины при определении времени самосборки фибрин-мономера использовали образцы буферного раствора мочевины с концентрацией от 50 до 350 г/л (таблица 4). Установлено, что оптимальные ее концентрации лежат в диапазоне от 150,0 до 250,0 г/л. Снижение концентрации мочевины ниже 150,0 г/л приводит к тому, что время образования сгустка укорачивается до 17,1-19,0 с и менее и достоверно не отличается у больных разных групп. С другой стороны, использование концентрации мочевины свыше 250,0 г/л приводит к значительному удлинению времени свертывания и снижению воспроизводимости метода. Для определения оптимального диапазона концентрации мочевины в тест-системе при определении времени самосборки фибрин-мономера применили соотношение С=К/Б,
где С - соотношение;
К - время самосборки фибрин-мономера в контрольной нормальной пулированной плазме;
Б - время самосборки фибрин-мономера в плазме больного.
Из исследований, приведенных в таблице 3, можно наблюдать, что необходимый диапазон концентраций мочевины в тест-системе составляет 150-250 г/л, так как именно в этом диапазоне концентраций мочевины соотношения остаются неизменными и имеют диагностическое значение.
Для оценки воспроизводимости заявляемого способа использовали коэффициент вариации CV(%). Коэффициент вариации способа при исследовании в разные дни проведения исследований не превышает 8,5%.
Таким образом, заявляемый способ определения времени самосборки фибрин-мономера обладает высокой точностью и позволяет диагностировать врожденные или приобретенные дисфибриногенемии, при которых часто наблюдается геморрагический синдром, а также выявлять гиперкоагуляционный синдром, ведущий к внутрисосудистому свертыванию крови.
Способ определения времени самосборки фибрин-мономераТаблица 1
I группа
II группа
Больной (ая)
Время самосборки ФМ (разница от нормального показателя, %)
Больной (ая)
Время самосборки ФМ (разница от нормального показателя, %)
1. Н.М.
38,4(+25,1%)
1. У.М.
22,4(-27,0%)
2. З.В.
39,5(+28,7%)
2. З.А.
24,6(-19,9%)
3. Н.Г.
45,2(+47,2%)
3. К.Р.
20,6(-32,9%)
4. А.И.
39,6(+29,0%)
4. А.И.
17,1(-44,3%)
5. Т.И.
46,7(+52,1%)
5. В.О.
14,7(-52,1%)
6. И.Г.
41,4(+34,9%)
6. Л.Г.
25,3(-17,6%)
7. И.А.
44,6(+45,3%)
7. И.Д.
24,9(-18,9%)
8. Т.С.
39,8(+29,6%)
8. Х.С.
22,4(-27,0%)
9. Н.В.
38,9(+26,7%)
9. Р.Д.
20,3(-33,9%)
10. О.А.
43,0(+40,1%)
10. Р.А.
21,6(-29,6%)
11. Э.С.
47,0(+53,1%)
11. А.С.
22,3(-27,4%)
12. О.О.
56,7(+84,7%)
12. Л.Л.
21,8(-29,0%)
13. А.П.
49,4(+60,9%)
13. А.Т.
24,6(-19,0%)
14. Е.Р.
39,4(+28,3%)
14. И.Р.
17,7(-42,4%)
15. В.И.
44,5(+45,0%)
15. В.И.
19,6(-36,2%)
16. А.Н.
46,3(+50,8%)
16. О.Л.
15,9(-48,2%)
17. Г.К.
48,2(+57,0%)
17. Д.А.
24,6(-19,9%)
18. Е.А.
41,3(+34,5%)
18. Э.А.
22,6(-26,4%)
19. Т.А.
40,3(+31,3%)
19. С.А.
23,0(-25,1%)
20. В.В.
48,2(+57,0%)
20. В.Р.
19,1(-37,8%)
21. Ю.Н.
42,7(+39,1%)
21. Д.Н.
20,3(-33,9%)
22. А.К.
38,3(+24,8%)
22. Д.К.
20,3(-33,9%)
23. Т.Г.
39,4(+28,3%)
23. Б.Г.
21,4(-30,3%)
24. С.С.
42,4(+38,1%)
24. Б.С.
23,5(-23,5%)
25. А.Д.
49,4(+60,9%)
25. Р.Л.
16,5(-46,3%)
26. С.П.
18,7(-39,1%)
27. А.А.
24,3(-20,3%)
I группа
II группа
Средний результат по I группе больных (X±m)
43,6±0,9
Средний результат по II группе больных (X±m)
21,1±0,6
Нормативные показатели по результатам обследования 42 здоровых доноров
Средний контрольный результат (Х±m)
30,7±0,5
Средний контрольный результат (Х±m)
30,7±0,5
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВРЕМЕНИ САМОСБОРКИ ФИБРИН-МОНОМЕРАТаблица 2
Концентрация тромбина, NIH/мл
20
30
40
50
60
70
80
Время в с в заявляемом способе
77,2±9,6
46,5±5,9
32,7±0,9
31,3±0,6
29,1±0,7
28,2±0,7
28,8±0,6
влияние активности тромбина на результат в заявляемом способе
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВРЕМЕНИ САМОСБОРКИ ФИБРИН-МОНОМЕРАТаблица 3
Коэффициент вариации оценки времени самосборки фибрин-мономера
По заявляемому способу, с
по способу-прототипу, %
32,0
22
33,0
27
30,5
23
32,8
31
31,9
23
35,7
22
33,5
27
32,6
29
31,8
30
34,2
33
Коэффициент вариации - 4,39%
Коэффициент вариации - 15,09%
коэффициент вариации результатов в заявляемом способе и в способе-прототипе
Способ определения времени самосборки фибрин-мономераТаблица 4
Концентрации мочевины в тест-системе, г/л
50
100
150
200
250
300
350
Контрольная нормальная пулированная плазма (К)
Время самосборки фибрин-мономера, с
5,9
18,5
26,4
46,4
60,3
Более 120
Более 120
Плазма больного Н., с удлинением времени самосборки фибрин-мономера (Б<sub>1</sub>)
Время самосборки фибрин-мономера, с
6,3
19,0
34,5
59,2
79,5
Более 120
Более 120
Соотношение времени самосборки фибрин-мономера (K/Б<sub>1</sub>), с
0,94
0,97
0,76
0,79
0,76
Не определяется
Не определяется
Плазма больного Б. с укорочением времени самосборки фибрин-мономера (Б<sub>2</sub>)
Время самосборки фибрин-мономера, с
5,8
17,1
20,0
35,4
46,0
Более 120
Более 120
Соотношение времени самосборки фибрин-мономера (К/Б<sub>2</sub>), с
1,02
1,08
1,32
1,31
1,31
Не определяется
Не определяется