Ферментативная активность ксилотрофных базидиомицетов при твердофазном культивировании

УДК 582.84

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ ПРИ ТВЕРДОФАЗНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

Д. Ю. Ильин, канд. биол. наук, доцент; Г. В. Ильина, канд. биол. наук, доцент; Ю. С. Лыков*, канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник; М. И. Морозова, аспирант

ФГБОУ ВПО «Пензенская ГСХА»; *РЦГЭКиМ по Пензенской области ФБУ «ГосНИИЭНП», е-таП: д-1!ута@уа^ех. ги

Приводятся результаты исследования ферментативной активности культур кси-лотрофных базидиомицетов на лигноцеллюлозных субстратах различной структуры. Установлены зависимости уровней ферментативной активности от экологических особенностей видов. Показаны возможности интенсификации некоторых сторон ферментативной активности грибов путем обработки субстрата с целью повышения содержания метоксильных групп лигнина.

Ключевые слова: ксилотрофные базидиомицеты, экологические стратегии, ферменты, биоконверсия.

Разносторонние исследования, посвященные изучению особенностей развития и оптимизации процесса выращивания дереворазрушающих грибов в культуре, имеют особое как теоретическое, так и практическое значение. Наиболее значительную долю культивируемых в мире съедобных и лекарственных базидиомицетов составляют именно виды - представители группы ксилотрофов. Ежегодно в культуру вводятся новые виды, перспективные в качестве продуцентов грибного белка для пищевых целей, а также виды, для которых установлены те или иные ценные свойства. При этом в качестве таких свойств рассматривают как способность грибов продуцировать биологически активные вещества различной природы, так и ферментативную активность, позволяющую использовать дереворазрушаю-щие грибы в качестве деструкторов стойких органических токсикантов, в биоконверсии органических остатков. В природе биодеструкция целлюлозных и лигнинсо-держащих субстратов базидиальными грибами представляет собой подобный конвейеру многоступенчатый полиэнзимати-

ческий процесс, где ведущими факторами являются внеклеточные целлюлазы, кси-ланазы, протеиназы, пектиназы и целый комплекс окислительных ферментов [1].

Различия в типах разложения растительных субстратов грибами заключаются в доле участия ферментов, катализирующих гидролиз или окисление основных компонентов - целлюлозы и лигнина. Разница в типах гниения древесины позволила выделить две группы грибов: возбудители бурой и белой гнили [2]. Грибы бурой гнили разлагают, преимущественно, полисахариды, а разложение лигнина ограничено деметилированием, лишь незначительная часть лигнина может разлагаться до СО2. Наиболее важной группой грибов, способных разлагать лигнин, являются грибы белой гнили древесины. Эти грибы вырабатывают ферменты, деструктирующие лигнин, а также ферменты, разрушающие пектины, по-лиозы и, в том числе, целлюлозу.

Исследования особенностей ферментативной активности коллекционных культур ксилотрофных базидиомицетов проводились на базе межфакультетской лабора-

тории ФГБОУ ВПО «Пензенская ГСХА». Было изучено по три штамма следующих видов: Inonotus obliquus (Pers.: Fr.) Pilát (трутовик скошенный), Phellinus tremulae (Bondartsev) Bondartsev & P. N. Borisov (ложнотрутовик осиновый), Fomitopsis pinícola (Sw.) P. Karst. (трутовик окаймленный), Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill (трутовик серно-желтый), Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. (трутовик плоский), Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. (трутовик лакированный), Fomes fomentarius (L.) J. J. Kickx (трутовик настоящий), Heterobasidion anno-sum (Fr.) Bref. (корневая губка) Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P. Karst. (трутовик ки-новарно-красный), Fistulina hepatica (Scha-eff.) Sibth (трутовик печёночный). Среди названных видов присутствуют представители различных экологических стратегий (об-лигатные и факультативные паразиты, факультативные сапротрофы, эври- и стено-трофные виды по отношению к субстрату), а также представители грибов бурой и белой гнили древесины. В рамках твердофазного культивирования на различных субстратах (нативном, представляющем собой экстрагированные дубовые опилки, и метанолизном - дериватизированных путем метанолиза дубовых опилках, обладающих более рыхлой структурой и повышенной концентрацией метоксильных групп лигнина) определялись общая окси-дазная, общая пероксидазная и целлюлаз-ная активность мицелия. Оксидазную и пе-роксидазную активности ферментов определяли в вытяжках из субстратов, на которых происходило культивирование изучаемых штаммов грибов, соответствующим буфером. Общую оксидазную активность определяли спектрофотометрически, при 410 нм с использованием в качестве субстрата 1 %-ного пирокатехина в 0,1 М цит-

0,9

0,8

0,7

(Ü

ж 0,6

о

О 0,5

Ж

К 0,4

с

в о 0,3

(Г

0,2

0,1

0

ратно-фосфатном буфере (рН 4,5) [3]. Общую пероксидазную активность определяя-ли также спектрофотометрически, при 440 нм с использованием в качестве субстрата 1 %-ного раствора гваякола в 0,06 М фосфатном буфере (рН 6,7), с добавлением 0,3 %-ного раствора перекиси водорода [4]. О целлюлазной активности судили косвенно по осахариванию экстрагированных на-тивных и метанолизных опилок, определяя концентрацию глюкозы глюкозооксидазным методом [5]. Для определения использовали набор реагентов для определения глюкозы «Фотоглюкоза» фирмы ООО «Им-пакт». Измерения оптической плотности проводились на спектрофотометре КФК-3 при длине волны 500 нм. Этим методом так же оценивали утилизацию глюкозы в процессе глубинного культивирования [6]. Также о целлюлазной активности судили по убыли холоцеллюлозы (сумма целлюлозы и гемицеллюлозы) в субстратах в конце периода культивирования [7]. Для этого определили содержание холоцеллюлозы в нативных и метанолизных опилках перед посевом изучаемых культур. Количество холоцеллюлозы определяли как разницу между массой экстрагированных опилок (нативных и метанолизных) и содержанием в них лигнина (определённого сернокислотным методом в модификации Комарова). Изучение активности ферментов кси-лотрофных базидиомицетов проводилось при твердофазном культивировании на двух субстратах. В качестве субстратов выступали экстрагированные нативные и метанолизные дубовые опилки, пропитанные солевым раствором Чапека. Определение ферментативной активности проводилось на 13-16 сутки роста мицелия, в момент наступления идиофазы, о котором судили по косвенным визуальным призна-

{

12

S

0,11 0,09

Й

0J9

0,11 0,09

0 П

I

0ГВ1 0«2

Í

J,1 j

H M

HM HM H M HM H M HM HM HM

Ph. tremulae F. pinícola L. sulphureus G. G.lucidum F.fomentarius Pyc. H. annosum

applanatum cinnabarinus

%

Рис. 1. Общая оксидазная активность изученных видов грибов на различных субстратах. Субстраты: Н - нативный, М - метанолизный. Показатели средние по виду

0,45

Нива Поволжья № 2 (23) май 2012 27

кам (появление капель экссудата, пигментирование).

Изученные виды грибов обнаружили различные уровни оксидазной активности в ходе развития на нативном и метанолиз-ном субстратах (рис. 1).

Как видно на рис. 1, при культивировании на метанолизных опилках, по сравнению с нативными, достоверно снижается общая оксидазная активность у таких видов, как Ph. tremulae, L. sulphureus, H. an-nosum и F. hepatica. Выявленное снижение общей оксидазной активности у названных видов грибов, вероятно, определяется воздействием фенольных компонентов субстрата. Такое явление можно объяснить тем, что Ph. tremulae и H. annosum являются облигатными паразитами, а L. sulphureus и F. hepatica, как факультативные паразиты, способны колонизировать живые деревья и нормально существовать в таком состоянии длительное время. Кроме того, эти виды достаточно узко специализированы к породам деревьев [8]. Вероятно, повышенное содержание более доступных фенольных компонентов лигнина в метанолизных опилках, подобно содержанию их в фаутной древесине, ингибирует у них выработку оксидазных ферментов. Это, возможно, и является одной из причин приуроченности этой группы грибов к живым деревьям, древесина которых на начальных этапах колонизации имеет небольшое, по сравнению с фаутной, содержание мономерных фенольных структур [9].

Напротив, такие виды грибов, как F. pinícola, G. applanatum и F. fomentarius демонстрируют более выраженную общую оксидазную активность на метанолизном субстрате, чем на нативном. Эти виды характеризуются более широкой трофической специализацией. Названные виды являются эвритрофными по отношению к по-

родам деревьев [10]. Увеличение оксидазной активности у этих видов грибов на субстрате с более доступными фенольными компонентами лигнина может свидетельствовать о выработке у них индуцибельных форм оксидазных ферментов. Кроме того, вероятно, метанолизный субстрат может содержать фенольные компоненты, являющиеся индукторами биосинтеза ферментов, в частности лакказ [11,12]. Стено-трофные виды, приуроченные к ограниченному числу пород деревьев, показали недостоверные отличия оксидазной активности при росте на нативном и метанолизном субстратах. В отношении перок-сидазной активности отмечено, что при развитии на нативном субстрате она в разной степени выражена у изученных видов (рис. 2). Наибольшие значения характерны для возбудителей белой гнили (Ph. tremulae, G. applanatum) и активной смешанной гнили (F. fomentarius). Возбудители белой гнили I. obliquus и P. cin-nabarinus при развитии на нативных опилках проявили относительно слабые уровни пероксидазной активности, которые оказались близки к значениям, полученным для представителей бурой гнили (F. pinicola, L. sulphureus). При развитии на метанолизном субстрате такие виды, как I. obliquus, G. applanatum и F. fomentarius, продемонстрировали рост пероксидазной активности соответственно в 11,0; 2,3 и 1,6 раза, что, как и в случае с оксидазной активностью, может говорить о наличии индуцибельных форм пероксидазных ферментов, вырабатываемых рассматриваемой группой. Все возбудители бурой гнили, а также некоторые представители белой (G. lucidum, P. cinnabarinus) при культивировании на метанолизных опилках показали полное снижение активности пе-роксидазных ферментов.

ш

H | M I. obliquus

0,47

H M Г=П _ H M H M H M H M H M 1_1 _ H M 1_1 _ H M

Ph. tremulae F. pinicola L. sulphureus G. G.lucidum F.fomentarius Pyc. H. annosum

applanatum cinnabarinus

0

F. hepatica

Рис. 2. Общая пероксидазная активность изучаемых грибов на различных субстратах. Субстраты: Н - нативный, М - метанолизный. Показатели средние по виду

8

5

9

0,45

ста

0

0

0

0

15

10

1,7

Л

ñ

916

14,6

10,3

I. obliquus IO- Ph. tremulae 3 Pht-3

H

M

H

M

H

M

F. pinicola L. sulphureus G. Fpi-3 Ah-02 applanatum

G-3

G.lucidum Gl- F.fomentarius 6 Lp-05

H

M

H

M

Pyc. H. annosum cinnabarinus Han-3 PyC-4

F. hepatica Fh-5

виды

25

20

3

6

20

3

2

6

5

16

5

9

7

3,6

5

0

Рис. 3. Утилизация из субстрата холоцеллюлозы штаммами изучаемых видов базидиомицетов. Субстраты: Н - нативный, М - метанолизный. Показатели средние по виду

Наряду с исследованием активности лигнолитических ферментных систем была определена также активность целлюлаз-ных ферментных систем изученных видов. О целлюлазной активности тех или иных видов грибов судили по утилизации целлюлозы в материале опилок и, косвенно, по концентрации глюкозы в вытяжке из субстрата, на котором проходило культивирование [13]. Данные приемы целесообразны, поскольку опилки перед культивированием были подвергнуты водной экстракции до полного вымывания глюкозы и других водорастворимых сахаров. Таким образом, появление глюкозы в вытяжке из субстрата после культивирования свидетельствует о работе целлюлазных ферментов и утилизации полисахаридного комплекса древесины. Данный метод отражает активность комплекса целлюлазных ферментов в совокупности.

Исследование содержания холоцеллю-лозы в субстратах до и после ферментации (на 25 день) обнаружило, что все штаммы изучаемых видов грибов более или менее активно утилизировали этот материал (рис. 3).

Культивирование грибов - представителей деструктивной гнили (H. annosum, L. sulphureus, F. pinicola, F. hepatica) на нативных опилках привело к потере холоцеллюлозы соответственно на 10,3, 13,7, 14,1 и 15,9 %. Представители коррозионной гнили (Ph. tremulae, P. cinnabarinus, F. fomentarius, I. obliquus, G. lucidum, G. ap-planatum) при росте на нативных опилках утилизировали соответственно 1,7, 6,9, 5,9, 8,3, 8,1 и 7,8 % целлюлозы. Представители бурой деструктивной гнили активнее разрушают целлюлозу, чем представители бе-

лой коррозионной при росте на нативных опилках.

Рост на метанолизных опилках сопровождался более интенсивным потреблением целлюлозы у таких видов, как Ph. tremulae, P. cinnabarinus, F. fomentarius, I. obliquus, G. lucidum, G. applanatum и H. annosum. Не установлено достоверных отличий в утилизации целлюлозы у L. sulphureus, F. pinicola, F. hepatica. Максимально за 25 суток культивирования деградировали целлюлозу при росте на метанолизном субстрате F. pinicola и G. lucidum (20,3 и 19,6 % соответственно).

Данные, полученные при изучении процесса утилизации целлюлозы, согласуются с результатами определения концентрации глюкозы в вытяжках из субстратов, что позволяет более объективно судить о целлюлазной активности изучаемых ксилотроф-ных базидиомицетов.

Установлено, что более или менее выраженной целлюлазной активностью при развитии на обоих типах субстратов обладали все изученные виды (рис. 4).

Максимальные концентрации глюкозы, обнаруженные в вытяжках из нативного субстрата, отмечены у видов грибов, вызывающих бурую деструктивную гниль (H. annosum, L. sulphureus, F. pinicola, F. heap-tica), причем значения варьируют соответственно от 0,86 до 1,23 мМоль/л. Показатели содержания глюкозы в вытяжке из нативного субстрата при культивировании видов - представителей белой гнили (Ph. tremulae, P. cinnabarinus, F. fomentarius, I. obliquus, G. lucidum, G. applanatum) варьируют в пределах от 0,12 до 0,44 мМоль/л соответственно.

Нива Поволжья № 2 (23) май 2012 29

SE 1,5

042

Ш

0,12

n

0,92

51

0,44

043

rfl

06

fL

ж

H M H M H M H M H M H M H M H M H M

I. Obliquus Ph. Tremulae F. Pinicola L. Sulphureus G. Applanatum G.Lucidum F.Fomentarius Pyc. Cinnabarinus H. Annosum

17

Рис. 4. Содержание глюкозы в вытяжке из различных типов субстрата: Н - нативный, М - метанолизный. Показатели средние по виду

В целом, все виды изученных грибов, кроме hepatica, при культивировании на метанолизном субстрате отличаются более высокой целлюлазной активностью по сравнению с таковой при развитии на на-тивных опилках. Согласно литературным данным, отдельные фенольные компоненты лигнина индуцируют выработку целю-лазных ферментов некоторых грибов [14, 15], что подтверждается полученными нами результатами.

Таким образом, в ходе исследования особенностей ферментативной активности мицелия ксилотрофных базидиомицетов в чистой культуре была установлена ее зависимость от структуры лигноцеллюлозно-го субстрата. Так, метанолизный лигноцел-люлозный субстрат ингибирует оксидазную активность большинства видов с паразитной специализацией в природе и стимулирует таковую у большинства сапротрофных видов; он стимулирует пероксидазную активность у некоторых видов - представителей белой гнили; виды - представители бурой гнили на обычном лигноцеллюлоз-ном субстрате в культуре интенсивнее разрушают целлюлозу, чем представители белой; на метанолизном субстрате эта закономерность сохраняется. Метанолизный лигноцеллюлозный субстрат обеспечивает увеличение целлюлазной активности большинства изученных видов. Указанные факты говорят о целесообразности введения модифицированных посредством метано-лиза лигноцеллюлозных источников углерода в различные питательные среды. Это позволяет ускорить процессы адаптации культур за счет активации работы ряда индуцируемых субстратом ферментов. С прикладных позиций полученные результаты

могут иметь ценность в плане разработки способов подготовки лигноцеллюлозных субстратов для оптимизации процесса биоконверсии дереворазрушающими грибами.

Литература

1. Hatakka, A. Biodégradation of lignin / Hatakka, A. // Lignin, Humic Substances and Coal. Wiley-VCH, Germany. 2001. - P. 129-180.

2. Hartig, R. Die Zersetzungsercheiungen des Holzes der Nadelholbaume und der Eiche in forstlicher botanischer und chemischer Richtund / R. Hartig. - Berlin. 1978. - 211 p.

3. Никитина, О. В. Внеклеточные окси-доредуктазы лигнолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens (Shumach.) Pilat.: автореф. ... канд. биол. наук / О. В. Никитина. - Москва, 2006. - 26 с.

4. Gramss, G. Activity of oxidative enzymes in fungal mycelia from grassland and forest soils / G. Gramss // J. basic microbiol. -1997. - Vol. 37, № 6. - P. 407-423.

5. Синицын, А. П. Биоконверсия лигно-целлюлозных материалов: учебное пособие / А. П. Синицын, А. В. Гусаков, В. М. Чер-ноглазов. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 224 с.

6. Лабораторные методы исследований в клинике: справочник / Под ред. В. В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.

7. Методы экспериментальной микологии / Под ред. В. И. Билай. - Киев, 1982. -550 с.

8. Стороженко, В. Г. Научные основы устойчивости лесов к дереворазрушающим грибам / В. Г. Стороженко, М. А. Бондар-цева, В. А. Соловьёв. - М.: Наука, 1992. -221 с.

9. Крутов, В. И. Грибные болезни древесных пород / В. И. Крутов, И. И. Минке-вич. - Петрозаводск, 2002. - 196 с.

2,5

1

1

2

3

48

0J3Z

0,5

0,24

0

10. Стороженко, В. Г. Гнилевые фауты коренных лесов Русской равнины / В. Г. Стороженко. - М.: Изд-во ВНИИЛМ, 2002. -156 с.

11. Решетникова, И. А. Поиск грибов -продуцентов пероксидазы / И. А. Решетникова // Микология и фитопатология. - 1992. - Т. 26, вып. 5. - С. 383-387.

12. Решетникова, И. А. Деструкция лигнина ксилотрофными макромицетами. Накопление селена и фракционирование его изотопов микроорганизмами / И. А. Решетникова. - М., 1997. - 197 с.

13. Лыков, Ю. С. Влияние модификации лигноцеллюлозного субстрата на рост и

развитие ксилотрофных базидиомицетов: дис. ... канд. биол. наук / Ю. С. Лыков. - М., 2011. - 149 с.

14. Muller, H. W. Effect of phenolic compounds on cellulose degradation by same white-rot basidiomycetes / H. W. Muller, Trosch, K. D. Kulbe // FEMS Microbiol. Letters. -1988. -V. 49, № 1. - P. 87-93.

15. Kelley, R. L. Identification of glucose oxidase activity as a primary source of hydrogen peroxide production in lignolytic cultures of Phanerochaete Chrysosporium / R. L. Kelley, R. C. Andinarayana // Arch. Microbiol. -1986. - V. 144, № 3. - P. 248-253.

Нива Поволжья № 2 (23) май 2012 31