Коррекция патогенетических нарушений при сахарном диабете второго типа методами клеточной трансплантации

Illll

БИОМЕДИЦИНА • № 1 2005, с. 35-51

Коррекция патогенетических нарушений при сахарном диабете второго типа методами клеточной трансплантации

О.И. Степанова, Н.Н. Каркищенко, Н.А. Онищенко, Е.А. Степанова

Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава, Москва

Цель данного обзора — предоставить информацию о причинах возникновения одного из самых распространенных заболеваний в мире — сахарного диабета II типа, а также оценить перспективы современных методов лечения. Анализ опыта отечественных и зарубежных ученых показал, что клеточная терапия является наиболее перспективным направлением лечения и коррекции клинических проявлений сахарного диабета и его осложнений. Терапевтический эффект при сахарном диабете был экспериментально доказан в модельных опытах на лабораторных животных, который, как полагают, обусловлен регенерацией островковых клеток поджелудочной железы, а также восстановлением адекватной реакции клеток организма, в том числе р-клеток и клеток иммунной системы на нарушения метаболизма углеводов и липидов.

Ключевые слова: сахарный диабет, стволовые клетки головного мозга, регенерация поджелудочной железы, дуктальные стволовые клетки, трансплантация.

Сахарный диабет (СД) чрезвычайно распространен в современном мире. В настоящее время в мире насчитывается около 150 миллионов больных СД, причем численность больных постоянно увеличивается и, по прогнозам ВОЗ, к 2020 году достигнет 300 миллионов. Таким образом, СД

— это еще одна «эпидемия» ХХ (а теперь уже и XXI) века наряду с атеросклерозом и онкологическими заболеваниями. С ростом заболеваемости во всем мире увеличиваются и государственные затраты в этих странах на обследование, лечение и реабилитацию больных СД. Особенно велики государственные затраты на регулярное обеспечение больных сахароснижающими препаратами, шприцами, диагностическими средствами. Однако СД причиняет не только материальный и моральный, но и значительный социальный ущерб обществу, так как необходимость постоянного самоконтроля, соблюдения строгих диетических и режимных ограничений, трудность социальной адаптации больного в обществе (начиная от выбора профессии

и кончая проблемами создания семьи и рождения детей) — все это ложится тяжелым бременем на семью и органы соцзащиты. Поэтому не будет преувеличением считать, что число лиц, прямо или косвенно страдающих от СД, неизмеримо больше, чем это отражено в статистических сводках. Существует несколько типов СД, механизм развития каждого из которых имеет свою специфику:

I. Инсулинзависимый сахарный диабет (I тип) развивается из-за недостаточности функции и гибели островковых клеток поджелудочной железы.

II. Инсулиннезависимый сахарный диабет (II тип) развивается у лиц с ожирением и нормальной массой тела в результате резистентности органов (клеток-мишеней) к инсулину. Продукция инсулина Р-клетками исходно не нарушена.

III. Симптоматический сахарный диабет развивается:

— на фоне заболеваний поджелудочной железы (рак, панкреатит);

— на фоне других эндокринных заболеваний (болезнь Иценко—Кушинга, диффузно-токсический зоб);

— на фоне применения некоторых гормональных препаратов глюкокор-тикоидов (стероидный диабет);

— на фоне хронической интоксикации

IV Диабет беременных [8].

Ниже мы рассмотрим этиологию, патогенез и лечение инсулиннезависимого сахарного диабета (ИНСД) как наиболее распространенной формы СД среди людей старше 40 лет.

1. Современные представления

о патогенезе ИНСД и его осложнениях

ИНСД представляет собой заболевание, обусловленное резистентностью тканей к инсулину и развитием относительного дефицита инсулина. Инсулин представляет собой полипептидный гормон, обеспечивающий снижение содержания глюкозы в крови путем усиления ее трансмембранного транспорта в клетки в качестве энергетического субстрата. Стимуляция инсулином трансмембранного транспорта приводит к увеличению скорости поступления глюкозы внутрь клетки в 20-40 раз. Все метаболические эффекты инсулина первично реализуются на уровне цитоплазматической мембраны путем связывания инсулина со специфическими рецепторами [11].

Проникновение глюкозы через мембрану осуществляется с помощью белков-переносчиков. Инсулин стимулирует перемещение белков—переносчиков глюкозы из эндоплазматического ретикулума к цитоплазматической мембране. Инсулин снижает гипергликемию не только за счет транспорта глюкозы в ткани, но и торможения глюкоонгенеза в печени. Инсулин ускоряет гликолиз в клетках, способствует образованию АТФ и синтезу гликогена

36

в печени и мышцах, а также тормозит в них гликогенолиз.

При ИНСД инсулин исходно синтезируется островковыми клетками поджелудочной железы, однако клетки органов и тканей являются резистентными к циркулирующему инсулину в крови, в результате чего развивается гипергликимия — ведущий симптом заболевания. Гипергликемия стимулирует продукцию инсулина (гиперинсулинемия) и является показателем относительного дефицита этого гормона [4, 24].

Как правило, ИНСД поражает людей старше 40 лет, и поскольку функция бета-клеток частично или полностью сохранена, большинство больных первоночально не нуждается в инсулинотерапии [19].

Различают два типа ИНСД: с поражением отдельных генов (10—15%) и с поражением множества генов (85—90%), ответственных в клетках за связывание инсулина рецепторами клеток, за интернализацию гормоно-рецепторного комплекса, ответственного за аутофосфорилирование Р-рецепторов или фосфорилирование других белковых компонентов мембран. Примером множественного повреждения может служить инсулинорезистентность клеток, обусловленная множественными мутациями гена рецептора инсулина. Обнаружено до 30 типов мутаций гена [3, 19].

То, что клинические проявления ИНСД возникают у больных во второй половине жизни (как правило после 40 лет), позволяет считать, что существующие генетические дефекты клеток-мишеней длительно компенсируется в организме с помощью вспомогательных систем регуляции углеводного обмена. Факторами, которые приводят к декомпенсации этих механизмов, являются так называемые внешние причины, которые, циркулируя в крови, ослабляют действие инсулина. К ним относится избыток контринсулярных гормонов, аутоантитела и блокирующие рецепторы инсулина. Особенно большое значение прида-

ется избыточному поступлению с пищей в организм и кровь сахаров, липидов, несбалансированных липидов (дислипидемия), в результате чего рецепторы инсулина на клеточных мембранах блокируются [4, 9].

О важном значении перечисленных факторов свидетельствуют наблюдения по восстановлению чувствительности клеток к инсулину в условиях диетотерапии (ограничения поступления в организм сахаров и липидов) и применения препаратов суль-фанилмочевины, которые подавляют продукцию глюкозы и расщепление инсулина в печени.

На ранних стадиях болезни инсулино-резистентность не сопровождается выраженной гипергликемией, поскольку Р-клет-ки секретируют достаточно инсулина, однако, уже в это время может выявляться нарушение (снижение) толерантности клеток к глюкозе. Инсулинорезистентность постепенно приводит к усилению секреции инсулина Р-клетками. Однако гиперинсу-линемия уменьшает число рецепторов на клетках-мишенях, и поэтому инсулиноре-зистентность усиливается.

В этих условиях Р-клетки поджелудочной железы постепенно теряют способность реагировать на повышение уровня глюкозы. Истощается восстановительная регенерация Р-клеток (потеря Р-клеток преобладает над их образованием), и в результате возникает относительный дефицит инсулина в организме [11].

Из-за дефицита инсулина еще больше снижается утилизация глюкозы в тканях, особенно в мышечной, и усиливаются гли-когенолиз и глюконеогенез в печени. В результате появляется выраженная гипергликемия и нарастает энергетический дефицит в тканях. На этой стадии проявляются классические симптомы сахарного диабета (полиурия, полифагия, полидипсия) и возникает необходимость применения экзогенного инсулина [9, 18, 19].

Для больных ИНСД как с ожирением, так и без него, наряду с инсулинорезис-

тентностью, характерна дислипопротеиде-мия, особенно гипертриглицеридемия, поскольку избыток инсулина стимулирует липогенез и секрецию липопротеидов низкой и очень низкой плотности (ЛПНП, ЛПОНП) в печени. С другой стороны, дислипидемия и атеросклероз индуцируют симптомы ИНСД, так как липидный и углеводный обмен метаболически взаимодействуют. Гиперинсулинемия и дислипи-демия служат непосредственной причиной развития макроангиопатических (преимущественно при атеросклерозе и ИБС) и микроангиопатических (преимущественно при ИНСД: ретинопатия, нефропатия, нейропатия) осложнений [3].

У 30% больных ИНСД без ожирения через 5—10 лет после проявления заболевания возникает абсолютный дефицит инсулина. У части больных выявляются аутоантитела к антигенам Р-клеток, и это дает основание полагать, что абсолютный дефицит инсулина вызван аутоиммунным разрушением Р-клеток [9, 19].

По современным представлениям, атеросклероз является аутоиммунным заболеванием, при котором аутоантитела могут не выявляться в крови, но обнаруживаются в регионарных лимфоузлах рядом с атероматозной бляшкой [17]. Поскольку атеросклероз является спутником ИНСД, усугубляет и индуцирует его клинические проявления, то можно полагать, что при ИНСД также имеет место аутоиммунный процесс с преимущественной локализацией антител сначала в регионарных лимфоузлах, прилегающих к поджелудочной железе, а позднее уже в крови.

Из схемы, приведенной на рис. 1, видно, что для поддержания нормального уровня глюкозы в крови в условиях инсу-линорезистентности клеток требуется усиленная секреция инсулина. Когда секреторная активность Р-клеток становится недостаточной для преодоления инсули-норезистентности, возникают нарушения обмена глюкозы. Вначале они проявляют-

Рис. 1. Обобщенная схема патогенеза инсулинонезависимого сахарного диабета и синдрома инсулинорезистентности

ся как нарушение толерантности к глюкозе, а впоследствии — клиническими признаками ИНСД: гипергликемией, артериальной гипертонией, повышением уровня триглицеридов, ЛПНП, ЛПОНП, снижением уровня ЛПВП, а также усилением липолиза и ускорением атерогенеза в результате компенсаторно развившейся гиперинсулинемии.

Инсулинорезистентность клеток печени приводит к повышению продукции гепатоцитами глюкозы (в основном за счет усиления глюконеогенеза). В результате еще более повышается уровень глюкозы в крови.

Из-за инсулинорезистентности скелетных мышц и подавления транспорта глюкозы резко повышается уровень глюкозы в крови после приема пищи, так как утилизация глюкозы в мышцах является главным механизмом удаления её из крови. Из-за инсулинорезистентности скелетных мышц

38

происходит снижение тирозинкиназной активности рецепторов инсулина в мышцах и снижение активности гликогенсинтета-зы и пируватдегидрогеназы. Следствием этого становится снижение кровотока в скелетных мышцах, повышение уровня амелина и кальцитониноподобного пептида в сыворотке, а также нарушение процессов транспорта и окисления липидов [8,

9, 18, 19].

Таким образом, инсулинорезистент-ность клеток-мишеней в организме является пусковым механизмом развития клинических проявлений ИНСД. С общепатологической точки зрения, избыточно накапливающиеся в организме белковые продукты нарушенного межуточного обмена углеводов и липидов (гликозилированные белки и липопротеиды) становятся факторами запуска системной воспалительной реакции организма на измененные белки и индукции нарушений со стороны иммун-

ной системы, которые по современным представлениям, по-видимому, лежат в основе развития тяжелых осложнений, сопутствующих ИНСД [2, 7, 12, 17, 23].

Между тем механизмы развития осложнений ИНСД до конца не выяснены. Установлено, что гипергликемия приводит к микроангиопатическим, а сопутствующее неферментативное гликозилирование белков — к макроангиопатическим осложнениям [25].

Неферментативное гликозилирование белков, развивающееся как компенсаторная реакция для связывания сахаров и удаления их из крови, приводит к образованию гликозилированного гемоглобина, альбумина, коллагена, белков хрусталика, липопротеидов. В результате нарушаются функции этих белков и распознавание их соответствующими рецепторами: гликози-лированные ЛПНП не распознаются ЛПНП-рецепторами в печени, поэтому концентрация ЛПНП в плазме возрастает. Напротив, гликозилированные ЛПВП метаболизируются в печени гораздо быстрее, чем нормальные ЛПВП. Такие нарушения метаболизма липопротеидов могут играть важную роль в патогенезе макро-ангиопатических осложнений, типичных для дислипидемий и атеросклероза.

Гликозилированный коллаген менее растворим и более устойчив к коллагена-зе, чем нормальный коллаген. Предполагают, что утолщение базальной мембраны эндотелия при макроангиопатии и изменения структуры кожи при диабетической нейропатии обусловлены отложением в этих тканях гликозилированного коллагена [10].

Несколько гликозилированных белков могут соединяться друг с другом через остатки 3-дезоксиглюкозы, при этом образуются перекрестно сшитые гликозилирован-ные белки. Появление таких патологически измененных белков связывание их рецепторами макрофагов и эндотелиальных клеткок стимулирует в организме систем-

ную воспалительную реакцию, синтез и секрецию провоспалительных цитокинов, эндотелина-1 и тканевого фактора: активатор тканевого плазминогена и одновременно ингибитор 1-го типа активатора плазминогена (ИАП-1), которые повреждают эндотелий, нарушают сосудистый тонус, способствуют развитию ангиопатий и нарушению свертывания крови [3].

Гемодинамические нарушения при сахарном диабете обусловлены как поражением эндотелия, так и нарушением нервной регуляции сосудистого тонуса.

В итоге, конечные продукты гликиро-вания белков связываются со специфичными рецепторами на поверхности эндотелиальных клеток и клеток воспаления (макрофаги, моноциты), стимулируют секрецию факторов роста провоспалитель-ных цитокинов. В зонах повреждения эндотелия клетки воспаления (макрофаги) прикрепляются и проникают в стенку сосуда, начинают захватывать липиды из кровотока, превращаясь в пенистые клетки и запуская процесс атерогенеза [3, 6, 10]. Однако сосудистые нарушения обусловлены не только дисфункцией эндотелия, но и развитием окислительного стресса клеток, накоплением в эндотелии и сосудистом русле активных форм кислорода, усиливающих процессы перекислого окисления липидов, в том числе фосфолипидов клеточных мембран [7, 10].

Схема патогенеза сосудистых осложнений при ИНСД представлена на рис. 2.

Как видим, центральную роль в патогенезе сосудистых осложнений при СД — в развитии макро- и микроангиопатий — играет системная воспалительная реакция, которая, как и при других хронических системных заболеваниях, проявляется повышением экспрессии специфических маркеров воспаления (фибриногена, С-реактивного белка и белка-амилоид-1), а также повышением уровня цитокинов (интерлейкины, а-фактор некроза опухолей и т.д.) [3].

Рис. 2. Патогенез развития сосудистых осложнений при сахарном диабете II типа

Самое грозное осложнение СД и самая частая причина слепоты — это диабетическая ретинопатия, которая развивается у 60—80% больных СД.

От 20 до 85% больных СД поражает диабетическая нейропатия, которая проявляется сенсорными, двигательными и вегетативными нарушениями. Различают несколько клинических типов нейропатии: периферическую полинейропатию, вегетативную нейропатию, мононейропатию и радикулит. Диабетическая стопа — синдром, обусловленный периферической нейропатией и макроангиопатией, включает поражения костей и сосудов стопы и язвенные поражения стопы.

У 10—20% больных СД развивается диабетическая нефропатия. Больные инсулинозависимым СД (I типа) особенно подвержены этому осложнению: у 30—40% больных через 15—20 лет после клинического проявления болезни развивается терминальная почечная недостаточность.

Особенно подвержены диабетической нефропатии люди, страдающие артериальной гипертонией, инфекцией мочевых путей, и те, кто применяет нефротоксичные лекарственные средства.

40

Атеросклероз — типичное макроангио-патическое осложнение ИНСД, повышающее риск инфаркта миокарда и инсульта: распространенность инфаркта миокарда среди больных сахарным диабетом в два раза выше, чем среди общей массы населения [10, 17, 18, 25]. Атеросклеротические поражения артерий ног способствуют развитию диабетической стопы.

Несмотря на то, что в патогенезе ангиопатий при сахарном диабете I и II типа имеются общие черты, различная частота и специфичность поражения отдельных сосудов свидетельствуют о наличии не только общих, но и специфических механизмов развития сосудистых осложнений. Таблица дает представление об особенностях клинических проявлений ангиопатий при сахарном диабете I и II типа.

Из таблицы видно, что СД I и II типа характеризуется различной частотой, распространенностью и локализацией патологического процесса в разных частях сосудистой системы.

Сосудистые нарушения при СД (I и II типов) являются следствием адаптационных изменений в тканях организма при гипергликемии и нарушении межклеточ-

і і і і і і 4. п

Коррекция патогенетических нарушений при сахарном диабете ...

Особенности сосудистых осложнений при СД I и II типа

Сосудистые осложнения Сахарный диабет I типа Сахарный диабет II типа

Причины снижения остроты зрения и развития слепоты Микроангиопатия - пролиферативная ретинопатия Макулопатия, ретинопатия значительно реже

Нарушение функции почек (нефропатия) Микроангиопатия вплоть до развития ХПН Поражение крупных сосудов почек, пиелонефрит и другая патология почек

Макроангиопатия (ИБС и инфаркт миокарда, инсульт, гангрена нижних конечностей) Встречается редко Встречается в несколько раз чаще по сравнению с диабетом I типа

Частота гипертензии Встречается при наличии клини- У 40-50% больных имеется

чески выраженной нефропатии уже при манифестации диабета

ного обмена, которые приводят к мобилизации защитных систем организма и развитию системной воспалительной реакции. Важным звеном этой реакции является поражение сосудистой выстилки эндотелия и гиперактивизация макрофа-гальной системы. Поскольку нарушения углеводного обмена взаимно влияют на нарушения липидного обмена, то изменения сосудистого русла при СД II типа близки к ангиопатиям при атеросклерозе, которые патологически характеризуются как макроангиопатия. Для диабета I типа, который относят к аутоиммунным заболеваниям, характерны микроангиопатии; диабет II типа в поздней стадии развития, как и СД I типа, связан с гибелью островко-вой ткани и его также относят к аутоиммунным заболеваниям.

Аутоиммунный компонент является непременным участником развития сосудистых осложнений [17].

Развитие системной воспалительной реакции и аутоиммунного поражения ос-тровковой ткани поджелудочной железы, в особенности на поздних сроках развития ИНСД, позволяет прийти к заключению, что прогрессирование ИНСД и развитие опасных для жизни осложнений являются результатом глубокой дисфункции иммунной системы, которая, как известно, в норме регулирует не только им-

муногенез (поддержание постоянства антигенного состава организма), но и морфогенез, то есть ответственна за процессы восстановительной регенерации клеток разных органов и тканей [1, 2].

2. Современные методы лечения СД

Лечение несложных форм ИНСД часто может быть эффективным при соблюдении диеты с ограничением углеводов и жиров и режима физической нагрузки. Если не удаётся этими мерами поддерживать нормальные значения глюкозы в крови, назначают лекарственные препараты — пероральные сахаропонижающие средства (обычно производные сульфанилмочеви-ны и/или инъекции инсулина). Инсулин

— основное средство терапии СД I типа.

2.1. Медикаментозная терапия

Основной механизм действия всех производных сульфанилмочевины (глибенкла-мид, гликлазид, глипизид, гликвидон и др.) одинаков: они связываются с АТФ-зависимыми калиевыми каналами в мембранах Р-клеток, блокируют эти каналы и тем самым стимулируют секрецию инсулина. Кроме того, производные сульфа-нилмочевины подавляют продукцию глюкозы и расщепление глюкогена в печени,

а также повышают чувствительность тканей к инсулину. Все производные сульфа-нилмочевины метаболизируются в печени и выводятся почками [19, 25].

Производные сульфанилмочевины лучше всего подходят для больных с ожирением, не предрасположенных к кетонемии и диабетическому кетоацидозу, старше 50 лет, с нормальной осмоляльностью плазмы, без тяжелой гипергликемии. У таких больных эти препараты обычно снижают уровень глюкозы в крови натощак до 3,9— 4,4 ммоль/л. Препараты назначают только после того, как все попытки нормализовать уровень глюкозы в крови с помощью диеты и физических нагрузок оказались безуспешными. Производные суль-фанилмочевины менее эффективны у больных без ожирения и при тяжелых метаболических нарушениях. Для таких больных показан инсулин.

Примерно у 5% больных ИНСД лечение производными сульфанилмочевины с самого начала оказывается безуспешным.

У 15—30% больных потеря чувствительности к производным сульфанилмочевины наблюдается через 5—10 лет после начала лечения. Среди возможных причин указывают на десенсибилизацию калиевых каналов, скрытое аутоиммунное разрушение Р-клеток, несоблюдение режима лечения и диеты. В таких случаях производные сульфанилмочевины отменяют и переходят к инсулинотерапии [25].

Самыми частыми осложнениями при медикаментозном лечении являются гипогликемии в результате передозировки препарата, пропуска приема пищи, тяжелой физической нагрузки и употребления алкоголя.

Некоторые лекарственные средства взаимодействуют с производными суль-фанилмочевины, усиливая их гипоглике-мизирующее действие. К таким средствам относятся салицилаты, варфарин, фенил-бутазон, фенитоин, сульфаниламиды. Одновременный прием таких лекарств мо-

42

жет вызвать тяжелую гипогликемию.Воз-можны побочные эффекты от применения сульфанилмочевины: аллергические реакции (зуд, крапивница, отек Квинке), лейкопения, тромбоцитопения, гипо-хромная анемия, желудочно-кишечные нарушения (тошнота, рвота, холестати-ческая желтуха).

Существует ряд противопоказаний для лечения препаратами сульфанилмочевины, среди которых инсулинозависимый сахарный диабет, диабетический кетоаци-доз, прекома, кома, тяжелая диабетическая нефропатия, печеночная недостаточность, лейкопения, тромбоцитопения, беременность, лактация и аллергия к данному препарату и другим производным сульфанилмочевины, сульфаниламидам. При указанных состояниях и осложнениях обычно переходят к инсулинотерапии.

Инсулинотерапия является эффективным средством борьбы с СД I и II типа, тем не менее при длительной терапии инсулином возникает ряд осложнений, среди которых наиболее серьезными является ослабление терапевтического эффекта инсулина за счет развития антител к используемому инсулину. Кроме того, важно точно дозировать инсулин, так как неадекватная доза препарата может вести к развитию как гипо-, так и гипергликеми-ческих состояний. Важно подчеркнуть, что инсулин малоэффективен при лечении ан-гиопатических осложнений. Терапия этим препаратом требует постоянных, ежедневных введений и регулярного контроля адекватности используемой дозы.

Ограничения, связанные с медикаментозной терапией СД, в последние годы способствовали разработке новых методов терапии, которые основаны на применении клеточных технологий. Основным достоинством этих технологий является возможность биологической саморегуляции уровня глюкозы в организме (система с обратной связью).

2.2 Клеточная терапия сахарного диабета

Успехи клеточной биологии последних десятилетий создали научные и практические предпосылки для развития новой области трансплантологии — клеточной трансплантации.

Благодаря клеточной трансплантации появилась возможность возмещения отсутствующих клонов специализированных клеток, а также активизации в сохранив -шихся клетках органа собственного резерва регенерации и пролиферации [21, 36].

2.2.1. Терапия дифференцированными фетальными и неонатальными островковыми клетками поджелудочной железы

Терапия СД донорскими островковыми клетками (ОК) поджелудочной железы (ПЖ) разрабатывается уже более 30 лет. Для терапии используются донорские ОК, аллогенные или ксеногенные, причем в качестве донора используется фетальные, неонатальные ткани ПЖ. Терапия донорскими ОК, возмещающая дефицит клонов Р-клеток у реципиента, оказалась весьма эффективной для лечения СД I типа. Первоначально для коррекции СД I типа в клинике использовали аллогенные остро-вковые клетки плодов человека, однако из-за дефицита донорского материала, пришлось перейти на использование ксе-ногенных донорских клеток. Эти работы проводятся исследовательскими группами в ряде стран мира (США, Канада, Индия, Япония и др.), в том числе и в России. Особенно большой опыт по применению гормонально-активных культур аллоген-ных и ксеногенных ОК ПЖ имеется в ФГУ НИИТ и ИО Росздрава [24]. К настоящему времени в этом институте выполнено более 1500 трансплантаций, а в качестве донорского материала стали наиболее широко использоваться ОК ПЖ новорожденных кроликов. Путем трансплантации донорских ОК у больных СД I типа удавалось в течение 8—12 месяцев снизить ги-

пергликемию, стабилизировать течение лабильных форм СД и получить выраженный клинический эффект в лечении осложнений СД [20, 21, 22, 24].

В то же время нерешенность этических и юридических проблем использования человеческого фетального материала, с одной стороны, и опасность переноса инфекций от животного человеку ксено-генного донорского материала — с другой, не позволяют в настоящее время рекомендовать метод трансплантации алло- и ксе-ноостровковых клеток ПЖ для широкого применения в практике лечения СД. Кроме того, при использовании чужих ОК возникает проблема несовместимости пары донор-реципиент, которая сокращает сроки терапевтического эффекта. Для лечения СД II типа этот метод не применялся, и это, очевидно, связанно с тем, что трансплантация ОК производится для возмещения дефицита островковой ткани у реципиента, которая у больных ИНСД не наблюдается. Мы полагаем, что трансплантация островковой ткани могла бы быть терапевтически полезной благодаря продукции ОК в процессе жизнедеятельности комплекса регуляторных тканеспецифических пептидов, которые могли бы осуществить восстановление нарушенной регуляции метаболизма углеводов и липидов [5, 6, 14, 42]. С разработкой учения о стволовых клетках появилась надежда и возможность регуляции липидного и углеводного обмена в организме с помощью аутологичных стволовых клеток костного мозга [13, 14].

2.2.2. Коррекция стволовыми клетками

Стволовыми клетками (СК) в настоящее время называют клетки, способные пролиферировать без дифференцировки и превращаться, по крайней мере, в два типа клеток. Полагают, что именно из СК происходят все специализированные клетки различных органов и тканей эмбриона, плода и взрослого человека. По происхож-

дению различают две группы СК: эмбриональные и взрослые (или регионарные СК), потенции генома которых существенно различаются между собой. Эмбриональные СК, полученные из эмбриона на стадии морулы или бластоцисты (несколько дней гестации), обладают потенциями к пролиферации и дифференцируются во все известные типы клеток. Благодаря то-типотентности эти клетки привлекают наибольшее внимание исследователей, но при этом остается не решенным ряд правовых и этических проблем применения эмбриональных стволовых клеток. Отсутствие законодательства по их использованию и опасность образования во взрослом организме тератокарциномных опухолей заставили исследователей обратиться к изучению терапевтических возможностей взрослых СК.

Хотя взрослые СК имеют ограниченную способность к самообновлению (репопуляции) и дифференцируются преимущественно в тот тип клеток, который предопределен эмбриональным лепестком их происхождения, взрослые СК имеют то достоинство, что могут быть получены и применены аутогенно, и таким образом снимается проблема поиска адекватного донора. Кроме того, взрослые СК обладают свойством хоминга, в результате чего они могут засевать при введении в кровоток идентичные органы взрослого человека. Мембраны взрослых СК обладают свойством, позволяющим этим клеткам сливаться с мембранами соматических дифференцированных клеток и образовывать гибридные (полиплоидные) клетки, обладающие более высокими адаптивными и компенсаторными возможностями.

Источником получения взрослых СК является костный мозг, периферическая и пуповинная кровь, а также биопсийный материал из органов [16].

Для лечения СД стволовыми клетками в эксперименте используют регионарные (взрослые) стволовые клетки [27, 31, 33, 38,

40]. Такие клетки были выделены из эпителия протоков и из самой ткани ПЖ. Возможность их дифференцировки в Р-клетки продемонстрирована Катдаре (Ка1ёаге) и др. [33]. На рис. 3 показана возможность дифференцировки дуктальных эпителиальных клеток ПЖ в инсулинпродуцирующие клетки, выявление которых осуществлялось путем окраски дитизоном.

Стволовые клетки протоков ПЖ, дифференцированные в инсулинпродуцирую-щие клетки, были использованы у мышей-самцов (линия БЛЬБ/е) с СД I типа, вызванного стрептозотоцином (8Т7). Клетки вводили в хвостовую вену в количестве 500 островков на 1 животное.

Рис. 3. (Этапы дифференцировки эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы мышей в инсулинпродуцирующие клетки (по КаМаге et а1., 2004):

А - культура фрагментов клеток из протоков ПЖ; В - окраска дуктальных эпителиальных клеток антителами апАСК-19 (маркер эпителиальных клеток); С - дуктальные клетки после 2-недельной инкубации и окраска дитизоном фТИ) Монослой пока не продуцирует инсулин; D -дуктальные клетки после 4-недельной инкубации, окраска DTZ. Появление инсулинпродуци-рующих клеток отмечено белыми стрелочками

Контроль уровня глюкозы у мышей-реципиентов инсулинпродуцирующих клеток осуществляли в динамике на 3, 5 и 20-й день после трансплантации. Динами-

44

Коррекция патогенетических нарушений при сахарном диабете ...

Дни после трансплантации

Рис. 4. Динамика изменения содержания глюкозы крови у мышей с диабетом

ка изменений уровня глюкозы у этих мышей представлена на рис. 4.

Из рис. 4 видно, что инсулинпродуци-рующие клетки, полученые из аллогенной ПЖ, позволяют корригировать уровень глюкозы в крови. Хотя стволовые клетки из протоков ПЖ могут оказаться эффективными для коррекции не только СД I типа, но и для ИНСД, использование их для лечения СД, по-видимому, не будет иметь практического применения. Описанные наблюдения лишь подтверждают положение о том, что взрослые стволовые клетки могут дифференцироваться в этот тип клеток, который предопределен эмбриональным лепестком происхождения.

Мы полагаем, что перспективным для лечения инсулинзависимого СД, как и ИНСД, является применение стволовых клеток аутологичного костного мозга. Костный мозг — важнейший орган иммунной системы и его клеткам присуща

не только высокая миграционная, но и пролиферативная активность. Из костного мозга могут быть получены гемопоэти-ческие стволовые клетки, являющиеся источником клеток крови и стромальных (мезенхимальных) стволовых клеток, из которых можно получить клетки, дифференцирующие в клетки опорно-двигательного аппарата: остеобласты, хондроблас-ты, фибробласты, миобласты, кардиоми-областы и др. Полагаем, что стромальные клетки являются источником получения эндотелиоцитов, которые участвуют в процессах неоангенеза. Поскольку стромаль-ные клетки создают остов различных органов и, интегрируясь с паренхиматозными клетками, обеспечивают их функционирование, то становится понятным, почему стволовые клетки костного мозга стали широко использовать в терапевтических целях при различных патологиях. Для лечения СД представляется наиболее пер-

спективным использование не стромаль-ной фракции стволовых клеток, а (моно-нуклеарной) фракции гемопоэтических стволовых клеток [16].

Это связанно с тем, что мононуклеар-ная фракция клеток костного мозга содержит значительное количество прогинитор-ных клеток, состоящих из клеток лимфоидного ряда различной степени зрелости. Эти клетки способны не только мигрировать и пролиферировать, но и индуцировать регенерацию паренхиматозных органов и клеток, выделяя в процессе жизнедеятельности регуляторные пептиды и факторы, способствующие репаративной и физиологической регенерации [2].

Регуляторные пептиды органов, в особенности иммунной системы, осуществляют передачу информационных сигналов с надклеточного уровня внутрь клетки и от клетки к клетке, выполняя роль мессенджеров межклеточных взаимодействий [1, 5, 12, 14].

В условиях хронической патологии организма, связанной с повреждением того или иного органа, ослабевает взаимодействие между надклеточным и внутриклеточным уровнем регуляции, в результате чего нарушается информационный и структурный гемостаз органов, нарушаются процессы их репаративной регенерации, что усугубляет дисфункцию поврежденного органа [23].

Выше мы указали, что СД является хронической патологией с глубокой дисрегу-ляцией моноцитарно-макрофогальной и иммунной системы: резко активирована системная воспалительная реакция на фоне прогрессирующего аутоиммунного процесса.

Все вышеизложенное позволяет предположить, что стволовые клетки костного мозга могут оказаться эффективными для лечения СД путем коррекции нарушений, обусловленных развившейся системной воспалительной реакцией и иммунным дисбалансом [29, 34].

46

Действительно, было показано [34], что нефракционированный костный мозг, полученный из бедренной кости здоровых мышей, способен корригировать уровень сахара в крови у мышей-реципиентов (швейцарские мыши-альбиносы) с СД

I типа, вызванным 8Т/.

Этим животным вводили в хвостовую вену по 1 млн. клеток однократно или многократно с интервалом в 6 дней. Оказалось, что как при однократном, так при многократном введении клеток костного мозга достигалась нормализация уровня глюкозы в крови. Такой уровень глюкозы держался не более 30 дней у животных с однократным введением, а при многократном введении сохранялся до конца эксперимента (4 месяца).

Исследование толерантности этих животных к глюкозе (рис. 5) показало, что при трансплантации клеток костного мозга возникла адекватная реакция (как у здоровых животных) на введение глюкозы, и хотя она была менее выраженной, однако, достоверно отличалась от реакции у животных с СД без клеточной терапии.

Время

Рис. 5. Динамика содержания глюкозы крови у мышей с СД без и после в/в введения клеток костного мозга

Гистологическое исследование ПЖ показало, что у животных с СД и введением клеток костного мозга был отчетливо выражен эффект её регенерации. На рис. 6

Рис. 6. Гистологический срез ткани ПЖ здоровых мышей

показано образование новых островков (белые стрелки) ПЖ у экспериментальных животных с СД после введения клеток костного мозга.

Результаты этих исследований продемонстрировали, таким образом, не только снижение уровня гликемии, но и улучшение морфологии ПЖ.

В исследовании, выполненном Д. Хессом и др. [29], была показана возможность коррекции сахарного диабета с помощью стволовых клеток костного мозга. Для доказательства этого в качестве доноров были использованы здоровые мыши GFP с геном зеленого белка. Клетки этих мышей использовались для выявления при-живляемости клеток костного мозга у реципиентов, которыми были мыши линии С57В1/6 со стрептозотоциновым (8Т7) сахарным диабетом [29].

Через 7 дней после введения стволовых клеток наблюдалось снижение уровня глюкозы в крови до нормальных значений, а также была обнаружена внутриклеточная регенерация ОК ПЖ, причем донорские клетки обнаруживались как в дуктальной, так и в островковой частях ПЖ мышей-реципиентов (рис. 7). Из рис. 7 видно, что стволовые клетки кост-

ного мозга от доноров GFP мигрируют при внутривенном введении в дуктальную и островковую часть ПЖ, и это доказывает их участие в процессе регенерации поврежденной ПЖ.

В 2002 году Н.Энде и др. [30] применили ксенотрансплантацию мононуклеар-ных клеток из пуповинной крови человека для снижения уровня гликемии и нормализации функции почек у трансгенных мышей (В6^^ер-оЪе8е), являющихся моделью сахарного диабета II типа. Этим животным вводили по 200 млн. клеток в ретроорбитальное венозное сплетение, контролировали уровень гликемии, вес животных и изучали морфологию почек до и в течение 9 месяцев после трансплантации клеток, без применения иммуносупрессии.

Было установлено, что однократная трансплантация клеток стабильно снижала уровень глюкозы в крови у экспериментальных животных на протяжении всего срока наблюдения. К концу эксперимента уровень глюкозы в крови у контрольных животных (без трансплантации) составлял 344 мг/дл., а у экспериментальных — 262 мг/дл (близко к норме). Выживаемость животных в экспериментальной группе

О.И. Степанова, Н.Н. Каркищенко, Н.А. Онищенко, Е.А. Степанова

Рис. 7. Люминесцентная микроскопия срезов протока и островковых клеток ПЖ у мышей с СД после введения донорских стволовых клеток мышей GFP - носителей гена зеленого белка [29]

также была выше, чем в контрольной (анализ выживаемости по методу Каплана-Мейера). До конца эксперимента (392 дня) в контрольной группе «выжили» только два животных, а в экспериментальной — пять. При изучении морфологии почек было выявлено, что клеточная трансплантация способствовала снижению выраженности гипертрофии клубочков и дилата-ции канальцев. Кроме того, контрольные животные значительно быстрее набирали лишний вес, чем экспериментальные.

Главным результатом этого исследования явилось долговременное снижение (9 месяцев) уровня глюкозы до субнормальных цифр даже после однократного введения стволовых клеток. В отличие от трансплантации клеток костного мозга при трансплантации дифференцированных инсулинпродуцирующих клеток, полученных от здоровых фетальных плодов, мышам со стрептозотоциновой моделью СД наблюдалось лишь кратковременное снижение уровня гликемии до нормы; у 40% мышей через 12 недель цифры гликемии возвращались на прежний повышенный уровень [30, 39].

Сравнительный анализ результатов использования фетальных инсулинпродуци-рующих клеток и стволовых клеток костного мозга у животных с моделями СД I и

II типа позволил установить, что одновременное введение клеток костного мозга и однократная трансплантация фетальных клеток животным с СД I типа приводила к краткосрочной нормализации углеводного обмена, а многократное введение клеток костного мозга пролонгировало позитивный клинический эффект у животных с СД I типа. Особенно выраженный эффект наблюдался у мышей с СД II типа при введении стволовых клеток костного мозга, количество которых превосходило количество клеток в других опытах во много раз. Эти наблюдения позволяют прийти к заключению, что для восстановления функции пораженного органа с помощью клеточной терапии необходимо, чтобы масса биологической активности донорского материала была достаточной для индуцирования собственного резерва регенерации поврежденного органа. В тоже время масса ткани органов-мишеней также должна быть достаточной для восприятия

48

Bio-Medicine-1-2005.pmd Аоёуаоё Оиоёетоаеётйё херТйё

Illll

пролиферативных и регуляторных сигналов от используемого биоматериала. В этой связи нам представляется, что СД II типа, при котором отсутствует дефицит ткани ПЖ, а нарушены лишь механизмы адаптации и компенсации органов-мишеней, участвующих в регуляции углеводного и липидного обмена, окажется более благоприятной формой СД для терапевтического применения клеточных технологий.

Среди клеток, используемых для клеточной терапии, более выраженный эффект при СД II типа следует ожидать от стволовых клеток костного мозга, которые способны участвовать в регенеративных процессах, и не только потому, что они наделены свойствами стволовых клеток, но и потому, что они обладают свойствами клеток иммунной системы, которые всегда участвуют в регуляции процессов регенерации и на всех этапах онтогенетического развития организма. За счет регуляции иммунитета и торможения признаков системной воспалительной реакции должен наступить регресс клинических проявлений СД, в том числе тяжелых диабетических осложнений.

С помощью клеточной технологии, в особенности с применением клеток аутологичного костного мозга, может быть достигнута не только медицинская и социальная реабилитация больных, но могут быть отодвинуты сроки или предотвращено наступление инвалидности, а также увеличена продолжительность жизни больных с СД.

Литература

1. Бабаева А. Г. Регенерация и система иммуногенеза. М.: Медицина 1985, с. 285-286.

2. Бабаева А.Г. Единство и противоположность цитогенетической активности лимфоцитов и их антителообразующей функции при восстановительных процессах в органах. Бюлл. экспер. биол. мед. № 11, 1999, с. 484-490.

3. Балаболкин М.И. Молекулярные основы патогенеза сосудистых осложнений сахарного диабета. Медицинская кафедра, №1(9), 2004, с. 48-57.

4. Балаболкин М.И. Сахарный диабет. М.: Медицина, 1994, с. 384-387.

5. Берснев А.В., Крашениников М.Е., Кобозева Л.П., Аврамов П.В. Клеточная и пептидная терапия ранних стадий атерогенеза. Вестн. трансплантол и искусств. органов, № 3-4, 2002, с. 89-90.

6. Берснев А.В., Крашениников М.Е., Онищенко Н.А. Клеточная терапия дислипидемий и атеросклероза. Вестн. трансплантол и искусств. органов, № 2, 2002, с. 46-53.

7. Джеральд М. Фаллер, Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. Молекулярное строение и функциональные компоненты клеточных мембран. М.: Бином-Пресс, 2004, с. 27-55.

8. Жданова О., Стефанович И. Сахарный диабет без иллюзий и осложнений. СПб.: БВХ-Петербург, 2005, с. 45-101.

9. Зайчик А.Ш,. Гурилов Л.П. Инсулинонезависимый сахарный диабет (ИНСД). Основы патохимии. СПб.: ЭЛБИ-СПБ, 2001.

10. Зайчик А.Ш,. Гурилов Л.П. Атереосклероз. Основы патохимии. СПб.: ЭЛБИ-СПБ,

2001, с. 162-173.

11. Кендыш И.Н. Регуляция углеводного обмена. М.: Медицина, 1985, с. 270-271.

12. Новикова В.С. Программированная клеточная гибель. СПб.: Наука, 1996.

13. Онищенко Н.А. Инфузия регуляторных пептидов селезенки, трансплантация стволовых клеток костного мозга как два подхода к восстановительному лечению поврежденных органов. Вестн. трансплантол и искусств. органов, № 3, 2002, с. 91-92.

14. Онищенко Н.А. Пептидная биоциркуляция восстановительных процессов в поврежденных органах. Вестн. трансплантол. и искусств. органов, № 3-4, 2001, с. 87-93.

15. Онищенко Н.А. Клеточные технологии и современная медицина. Вестн. трансплантол. и искусств. органов, № 3, 2004, с. 2-10.

16. Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. Современные представления о биологии стволовых клеток косного мозга и крови в аспекте их клинического применения. Вест. трансплантол. и искусств. органов, № 4,

2004, с. 50-55.

17. Пигаревский П.В, Мальцева С.В., Селивест-рова В.Г. Иммунная система, атеросклероз и персистирующая инфекция. Вестник РАМН, 2005, № 2, с. 17-22.

18. Романова Е.А., Чапова О.И. Сахарный диабет. М.: Эксмо, 2004, с. 31-35.

19. Саланс С. Инсулинонезависимый сахарный диабет: диагностика и лечение. В кн.: Эндокринология. Под ред. М.Лавина. М.: Практика, 1999, с. 925-941.

20. Скалецкий Н.Н. Гончарова Т.Н., Засори-наЛ.В., Кирсанова Л.А., Скалецкая Г.Н., Новиков В.К. Ксенотрансплантация культур островковых клеток на пути достижения длительной инсулиннезависимости у больных сахарном диабетом 1 типа. Вестн. трансплантол. и искусств. органов, № 3,

2002, с. 85-86.

21. Скалецкий Н.Н. Онищенко Н. А. Клеточная трансплантация: достижения и перспективы. Вестн. трансплантол. и искусств. органов, № 3-4, 2001, с. 94-102.

22. Скалецкий Н.Н. Шумаков В.И. Лечение инсулинзависимого сахарного диабета методом трансплантации островковых клеткок поджелудочной железы плодов и новорожденных. Трансплант. фетальных тканей и клеток. 1996, с. 33-40.

23. Хавинсон В.Х., Кветковой И.М. Пептидные биорегуляторы ингибируют апоптоз. БЭБМ,

2000, т. 130, № 12, с. 657-659.

24. Шумаков В.И. Скалецкий Н.Н. Регуляция углеводного обмена и коррекция его нарушений при сахарном диабете. В кн.: Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и искусственных органов. Под ред. акад. В.И.Шумакова. Тула: Репраникс,

1998, с. 93-118.

25. Эйдельман С. Перспективы диагностики и лечения сахарного диабета. В кн.: Эндокринология. Под ред. М.Лавина. М.: Практика,

1999, с. 960-972.

26. Suzuki A., Nakauchi H., Taniguchi H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytomectric cell sorting. J. Diabetes, 2004, vol. 53, 2143-2152.

27. Bouwens Luc, Braet Filip, Heimberg Harry. Indetification of rat pancreatic duct cells by their histochemistry and cytochemistry. Endocrinology, 1995, vol. 43, 3, 245-253.

28. Choi J.B., Uchino H., Azuma K. et al. Little evidence of transdifferentiation of bone marrow-derived cells into pancreatic beta cells. Journal Diabetologia, 2003, vol. 46, 1366-1374.

29. Hess D., Li L., Martin M., Sakano S., et al. Bone marrow — derived stem cells initiate pancreatic regeneration. Nature Biotechnology,

2003, Vol. 21, 7, 763-769.

30. Ende N., Chen R., Mack R. NOD/LtJ type 1 diabetes in mice and the effect of stem cells derived from human umbilical cord blood. J. Med, 2002, No. 33, 181-187.

31. Gmyr V., Kerr-Conte J., Vandewalle B. et al. Human pancreatic ductal cells: large scale isolation and expansion. Cell Transplantation,

2001, No. 10, 109-121.

32. Hardikar A.A., Karandikar M.S., Bhonde R.R. Effect of partial pancreatectomy on diabetic status in BALA/C mice. Journal of Endocrinology, 1999, No. 162, 189-195.

33. Katdare M.R., Bhonde R.R., Parab P.B. Analysis of morphological and functional maturation of neoislets generated in vitro from pancreatic ductal cells and their suitability for islet banking and transplantation. Journal of Endocrinology, 2004, No. 182, 105-112.

34. Banerjeea M., Kumar A., Bhonde R. Reversal of experimental diabetes by multiple bone marrow transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications (BBRC),

2005, No. 328, 318-325.

35. Quesenberry, P. et al. Studies on the regulation of hemopoiesis. Exp. Hematol., 1985, 13, 43-48.

36. Raffii S., Lyden O. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. J. Nat. Med., 2003, No. 9, 702-712.

37. Ramiya V.K., Maraist M., Afors K.E. et al. Reversal of insulin dependent diabetes using islets generated in vitro from pancreatic stem cells. Nature Medicine, 2000, No. 6, 278-282.

38. Githens S. Pancreatic duct cell cultures. Annu. Rev. Physiol, 1994, No. 56, 419-443.

39. Soria M. et al. Znsulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. J. Diabetes, 2000, No. 49, 157-182.

40. Bonner-Weir S., Taneja M., Weir G. et al. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. PNAS, 2000, vol. 97, No. 14, 7999-8004.

50

41. Wang, Х. et al. Cell fusion is the principal 43. Zysset T., Sommer L. Diabetes alters drug me-

source ofbone-marrow-derived hepatocytes. J. Nature, 2003, No. 422, 897-901.

42. Yechoor Y., Chan L. Gene therapy progress and prospects. Gene therapy for diabetes mellitus. J. Gene Therapy, 2005, No. 12, 101-107.

tabolism — in vivo studies in a streptozotozin-diabetic rat model. J. Experientia, 1986, No. 42, 560-562.

NON-INSULIN-DEPENDENT DIABETES MELLITUS AND PERSPECTIVE METHODS OF TREATMENT

O.I. Stepanova, N.N. Karkischenko, N.A. Onischenko, E.A. Stepanova

Research Center for Biomedical Technology of RAMS, Moscow

One of the most widespread diseases in the modern world, diabetes mellitus, is reviewed. Here the purpose is to classify information on pathogenesis and origin of this disease and outline the prospects of up-to-date methods of therapy. To generalize the experience of the research groups, the experimental results of stem cells transplantation for the diabetes therapy have been analyzed. The researchers cultivate different types of stem cell. Using the pancreas of adult BALB/c mice, the ductal stem cells were cultivated/ extracted. With transgenic GFP mice as donors, the bone marrow stem cells were cultivated. In some cases the umbilical human blood was used to refine the mononuclear cells cultures. It was found that all types of stem cells can produce therapeutic effects (pancreatic regeneration, reducing glucose blood level and regeneration of p-cells functions). The cell transplantation is a new alternative in medical treatment of diabetes.

Key words: diabetes mellitus, bone marrow stem cells, transplantation.

pancreatic regeneration, ductal stem cells,