СПОСОБ ОЦЕНКИ СООТНОШЕНИЯ ГОРМОНАЛЬНОГО И ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ГЛЮКОЗЫ
METHOD OF GLUCOSE ANALYSIS FOR HORMONAL TO GENOTOXIC EFFECT RATIO

Изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии и онкологии.
В последнее время отмечается отчетливая тенденция к увеличению заболеваемости сахарным диабетом (СД). По данным ВОЗ (WHO, 2002) предполагается, что к 2025 г. число больных СД может удвоиться. В России СД болеют более 4% населения. При этом частота СД 2 типа составляет не менее 80% от всех заболевших. В то же время число больных с нарушенной толерантностью к глюкозе еще выше. Роли подобных нарушений в развитии основных неинфекционных заболеваний человека (включая злокачественные новообразования) нередко придается даже большее значение, чем в случае явного СД (Saydah S.H. et al., 2003; Silvera S.A. et al., 2005). He исключено, что это ассоциировано с развитием инсулинорезистентности, или метаболического синдрома (Дедов И.И. и др., 2003; Facchini F.S. et al., 2001).
Другими факторами, способствующими развитию гипергликемии, являются: избыточное потребление углеводистой и жирной пищи, а также прибавка веса тела и низкая физическая активность. Иными словами, в настоящее время наряду с гиподинамией можно говорить о постоянном углеводном пищевом "давлении", оказывающем влияние на все большую часть населения.
Как известно, глюкоза является базовым компонентом внутренней среды организма и обладает важной эндокринной функцией, проявляющейся, в частности, в способности стимулировать секрецию инсулина в β-клетках поджелудочной железы. В результате воздействия многих из вышеперечисленных факторов функция β-клеток постепенно нарушается, чем обусловлена необходимость следить за динамикой чувствительности упомянутых клеток к глюкозе и особенностями секреции инсулина (Ferrannini E. et al., 2005).
С другой стороны, накапливается все больше данных о том, что реактивная (в том числе, постпрандиальная) гипергликемия способна индуцировать образование реактивных форм кислорода (РФК) и создавать условия для усиления повреждения ДНК (Ceriello A. et al., 1998; Dandona Р., et al., 1996, 2001; Hiramatsu К. and Arimori S., 1988; Mohanty P. et al., 2000). Тем самым глюкозе может быть приписано участие в генотоксическом или прогенотоксическом воздействии на организм. Однако надежных подходов к одновременному изучению и сопоставлению эндокринного и генотоксического действия глюкозы, а также к оценке возможного изменения соотношения этих эффектов у отдельных лиц, что предлагается рассматривать как проявление джокерной (двойственной) функции глюкозы (ДФГ) (Берштейн Л.М., 2004, 2005; Берштейн Л.М. и соавт., 2005, 2006), до настоящего времени не имеется.
В качестве маркеров генотоксического или прогенотоксического повреждения могут быть избраны РФК или reactive oxygen species (ROS), образование которых, с одной стороны, постоянно происходит в норме при любых окислительных процессах, связанных с обменом углеводов, липидов, белков и нуклеиновых кислот. В то же время их образование лейкоцитами/мононуклеарами является, как полагают, ответом на увеличение окислительного повреждения (Dandona P. et al., 2001). В действительности, РФК образуются в больших количествах в поврежденных тканях и сами способны оказывать ДНК-повреждающее действие, в том числе при их индукции под избыточным воздействием углеводов (Ceriello А. et al., 1998; Dandona P., et al., 2001; Hiramatsu К. and Arimori S., 1988; Mohanty P. et al., 2000).
Принимая во внимание сведения о том, что глюкоза обладает двойственным эффектом (см. выше), мы пришли к выводу о целесообразности разработки способа индивидуальной оценки соотношения гормонального и генотоксического эффекта глюкозы у обследуемых лиц. Предлагаемый подход имеет своей целью выявить, в каком случае глюкоза преимущественно стимулирует выброс инсулина у одних людей, а в каком индуцирует избыточный прогенотоксический эффект - у других. Обнаружение на основе такого подхода эндокринного или генотоксического «преобладания» в эффекте глюкозы будет дополнительным основанием для назначения мер по профилактике выявленных нарушений, а, с другой стороны, базисом для понимания особенностей патогенеза ряда основных неинфекционных заболеваний, ассоциированных с нарушением углеводного обмена.
В качестве прототипа данного предложения следует рассматривать работу Р.Dandona et al. (J.Clin. Endocrinol. Metabol., 2001, Vol.86, P.355-362), в которой активность РФК измеряли люминолзависимым хемилюминесцентным методом. Было показано, что образование РФК в мононуклеарах было минимальным натощак, несколько более высоким на 60 мин и достигало максимума к 120 мин перорального теста на толерантность к глюкозе (ПТТГ). О разделении обследуемых на две группы в зависимости от выраженности хемилюминесцентного ответа (генерации РФК) и о сопоставлении последнего с секрецией инсулина в этой работе не говорится. Принимая этот факт во внимание, мы пришли к выводу о том, что, во-первых, обследуемые могут быть подразделены на две группы в зависимости от того, достигает ли у них образование РФК под влиянием глюкозы к 120 мин теста 2-кратной и более величины (глюкозиндуцированная токсичность, ГИГТ +) или нет (ГИГТ -) и, во-вторых, что выраженность глюкозстимулируемого образования РФК может быть непосредственно (т.е. у того же обследуемого) сопоставлена с реактивной секрецией инсулина применительно к тому же самому временному интервалу.
Техническим результатом заявляемого изобретения является оптимизация оценки преобладания генотоксического и/или гормонального эффектов глюкозы. Это достигается путем расчета коэффициентов, полученных в ходе пероральной глюкозной нагрузки на основании соотношения хемилюминесценции РФК (120 мин/0 мин) к коэффициенту секреции инсулина (120 мин/0 мин).
2
Материал для исследования брали у обследованных в лаборатории онкоэндокринологии ГУН НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова Росздрава 54 здоровых женщин и 23 онкологических больных в возрасте от 19 до 77 лет. При проведения пробы на толерантность к глюкозе (из расчета 40 г/мповерхности тела) обследуемые в течение 3 минут выпивали ее раствор, содержащийся в 250 мл воды. Кровь для исследования брали из локтевой вены в пробирки, содержащие ЭДТА, в точках 0 и 120 мин. Кровь, предназначенную для выделения мононуклеаров и гормонально-биохимических исследований, собирали в разные пробирки. Кровь центрифугировали для отделения плазмы при 2000 об/мин в течение 10 мин. Образцы плазмы, в которых определяли содержание глюкозы, сохраняли при +4°С не более 24 ч, а для оценки инсулина плазму замораживали и сохраняли вплоть до определения при -20°С.
Выделение мононуклеаров. Венозную кровь выдерживали 40-60 мин при 37°С, затем наслаивали 2 мл на фиколл-верографин (с плотностью 1,077 г/мл) и подвергали при комнатной температуре в течение 30 мин центрифугированию при 1400 об/мин. Отбирали слой, содержащий мононуклеары, и дважды отмывали клетки физиологическим раствором, забуференным фосфатом (ФФР, рН 7,4) путем перемешивания (через пипетирование) и центрифугирования в течение 10 мин при 1200 об/мин после каждого промывания. Мононуклеары сохраняли при +4°С и использовали для дальнейшего анализа в тот же день.
5
-5
9
Оценка образования реактивных форм кислорода (РФК) в мононуклеарах крови. Измерения проводились на люминометре-VV (Санкт-Петербургский Гос. Университет) при комнатной температуре и в затемненном помещении. Мононуклеары (2×10 клеток в 1 мл ФФР) вносили в кювету, содержащую люминол (50 мкл, конечная концентрация 2,5×10 М). Образование РФК индуцировали частицами латекса «Sigma» (20 мкл, конечная концентрация 7×10 частиц/мл). Хемилюминесценцию (ХЛ) регистрировали непосредственно после добавления реагентов (точка 1) и на 15 минуте в соответствии с рекомендациями Р.Dandona et al. (1998) и R.S.Jayshree et al. (1993). Соответственно, рассчитывали коэффициенты ХЛ 15/1 для каждой точки, а также коэффициент Р (отношение ХЛ 15/1 в пробах, отобранных на 120 и 0 минуте теста на толерантность к глюкозе). Более чем 2-кратное повышение генерации РФК к 120 мин теста (т.е. коэффициента Р) считали, как отмечалось выше, проявлением глюкозиндуцированной генотоксичности.
Кроме того, рассчитывали коэффициент И (соотношение «инсулина 120 мин/инсулин 0 мин»), отражающий гормональный эффект глюкозы. Медиана коэффициента И во всей группе обследованных равнялась 2,9. Если показатель превышал данный уровень, то это считали проявлением инсулинорезистентности или глюкозиндуцированного эндокринного (гормонального) эффекта.
Как следствие и в соответствии с основной задачей был введен коэффициент K (Р/И), отражающий соотношение генотоксического и гормонального эффекта у обследуемого. Медиана этого коэффициента равнялась, по нашим данным, 0,5. Соответственно, при коэффициенте выше 0,5 следует говорить о преобладании генотоксического эффекта глюкозы. В качестве иллюстрации приводим примеры конкретных наблюдений за индивидуальными значениями полученных показателей.
Пример 1. Б-ва З.А., 56 лет, практически здорова, имела нормальный тип кривой при проведении глюкозотолерантного теста. Образование РФК к 120 мин по отношению к нулевой точке (коэффициент Р) равнялось 0,86. Уровень инсулина натощак и на 120 мин равнялся 9,78 мкЕД/мл и 71,93 мкЕД/мл (коэффициент И=7,35). Соотношение показателей Р и И (коэффициент К) было равно соответственно 0,12.
2
0
0
Пример 2. Больная П-ва З.А., 51 год, страдающая первичным раком толстой кишки TNM, с нормальным типом глюкозной кривой имела нормальный уровень секреции инсулина как натощак, так и на 120 мин теста (11,63 мкЕД/мл и 21,06 мкЕД/мл, коэффициент И=1,81), а образование РФК под воздействием глюкозы не только не стимулировалось, но даже ослабевало, Р=0,39. Как результат, величина коэффициента К, демонстрирующего соотношение Р и И, была равна 0,22.
Пример 3. В-ва А.С., 34 лет, практически здорова, у которой, несмотря на нормальный тип глюкозной кривой, обнаружено повышенное образование РФК к 120 минуте (Р=5,29) при отсутствии стимуляции секреции инсулина (инсулин 0 мин = 11,07 мкЕД/мл, а инсулин 120 мин = 8,0 мкЕД/мл, коэффициент И=0,72). Как следствие, величина коэффициента K=7,32.
la
0
0
Пример 4. Пациентка М-на Т.Ю., 52 года, страдающая первичным раком тела матки TNM, с нормальным типом глюкозной кривой имела повышенный уровень секреции инсулина (инсулин 0 мин = 16,58 мкЕД/мл, а инсулин 120 мин = 83,49 мкЕД/мл, коэффициент И=5,04) и повышенное образование РФК под воздействием глюкозы, Р=2,67. Как результат, величина коэффициента K, демонстрирующего соотношение Р и И, была равна 0,53.
Таким образом, у обследуемых 1 и 2 на фоне нормального типа кривой пробы на толерантность к глюкозе не выявлялась гиперстимуляция образования РФК на 120 мин теста, а стимуляция инсулина была в пределах нормы или несколько повышена, что может свидетельствовать о преобладании гормонального эффекта глюкозы. С другой стороны, у обследуемых 3 и 4, несмотря на нормальный тип кривой в ходе глюкозного перорального теста, выявлялась гиперстимуляция образования РФК. При этом у обследуемой 4 дополнительно выявлялась и повышенная стимуляция секреции инсулина, однако при сопоставлении данных выявлено преобладание генотоксического эффекта глюкозы над гормональным. Добавим, что лица, вошедшие в группу с преобладанием глюкозоиндуцированной генотоксичности, характеризовались тенденцией к более низким индексу массы тела и холестеринемии и более высокой концентрацией фактора некроза опухоли в крови, что свидетельствует о вероятных фенотипических различиях, существующих между людьми с преобладанием глюкозоиндуцированных реакций того или иного типа.
В итоге, определение соотношения индукции РФК и секреции инсулина при проведении пробы на толерантность к глюкозе следует расценивать как метод оценки глюкозиндуцированных эффектов (гормонального и/или генотоксического) путем простых расчетов коэффициентов Р и И, а вычисление коэффициента К позволяет установить соотношение данных эффектов. При использовании предлагаемого способа создаются условия для выявления преобладания одного из двух изучаемых эффектов глюкозы и возможности его коррекции применительно к каждому отдельному обследуемому.