Способ лечения остаточных длительно существующих ожоговых ран
METHOD FOR THE TREATMENT OF RESIDUAL LONG-EXISTING BURN WOUNDS

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к комбустиологии и может быть использовано для лечения бактериальных раневых инфекций любой локализации у ожоговых пациентов.
В настоящее время возрастающая антибиотикорезистентность и отсутствие в ближайшей перспективе новых антибактериальных средств становится важной проблемой обеспечения качества медицинской помощи и наносит современному здравоохранению значительный ущерб. В связи с этим постепенно уменьшается спектр антимикробных средств лечения и профилактики инфекционных заболеваний, что возрождает интерес к фаготерапии и фагопрофилактике. Одним из перспективных направлений преодоления феномена антибиотикорезистентности является исследование возможности использования бактериофагов [1, 2]. Бактериофаги - это вирусы, способные при встрече с бактериальной клеткой разрушать ее. Препараты бактериофагов обладают рядом очевидных преимуществ, в числе которых полная совместимость с любыми лекарственными средствами, отсутствие побочных, токсических и тератогенных эффектов, а также высокая избирательность, быстрое действие и глубокое проникновение в очаг инфекции. Поэтому сегодня бактериофаги нашли применение в разных сферах человеческой деятельности, включая био- и нанотехнологии, генетическую инженерию и медицину (для идентификации возбудителей, лечения и профилактики инфекционных заболеваний) [3, 4, 5].
Большое место в лечении ожоговых пациентов отводится борьбе с возникновением раневой инфекции, в том числе связанной с оказанием медицинской помощи. Внутрибольничные раневые инфекции, возникая, с одной стороны, утяжеляют состояние пациента, с другой - снижают эффективность уже разработанных схем лечения, увеличивают длительность заболевания и вероятность возникновения осложнений [5].
4
5
Факторами, влияющими на течение заболевания и частоту развития благоприятных клинических исходов, являются этиология инфекционного раневого процесса и величина бактериальной нагрузки - 10-10 КОЕ/г [6, 7]. С учетом формирования в каждом медицинском учреждении характерного спектра эпидемиологически значимых микроорганизмов необходимо разрабатывать персонализированный подход к подбору бактериофага, который планируется ввести в состав раневого покрытия. Это позволит оперативно реагировать на изменения микрофлоры и эффективно противодействовать опасности внутрибольничного инфицирования. Колонизация ожоговой области антибиотикорезистентными микроорганизмами и результат их жизнедеятельности приводит к дополнительному нарушению окислительно-восстановительных процессов, снижению антиоксидантной защиты, усилению локальной гипоксии и приводит к медленному закрытию ожогового дефекта [8]. Особенностью длительно существующей ожоговой раны является воздействие микрофлоры, всегда колонизирующей ожоговые раны с одной стороны, а с другой - сниженный уровень ангиогенеза в результате ожоговой болезни. Ангиогенез является базовым биологическим механизмом, обеспечивающим заживление ожоговой раны, доставку кислорода и питательных веществ. В связи с этим вопрос местного применения антигипоксантов, в частности янтарной кислоты, в лечении ожоговых пациентов становится актуальным [8, 9].
В хирургической практике недостаточно разработаны и внедрены научно-обоснованные технологии лечения и профилактики раневых инфекций у ожоговых пациентов с применением локальных специфических антимикробных препаратов. Поэтому данный вопрос поиска новых возможностей применения бактериофагов в раневых покрытиях для ожоговых ран является актуальным. Несколько исследовательских групп во всем мире работают над созданием локального искусственного депо бактериофагов с длительным сохранением их достаточной концентрации в зоне инфекционного процесса. Однако до настоящего времени не проводилось исследований по созданию композиции бактериофага и раневого гидрогелевого покрытия, способного доставлять активные фаговые частицы к инфицированной ожоговой ране на коже в максимальной концентрации с сохранением литической активности с целью длительного специфического и неспецифического терапевтического эффекта.
Основным отличием бактериофагов является селективное, направленное и локальное воздействие в ожоговой ране. Применяемые на сегодняшний момент технологии лечения инфицированных ожоговых ран имеют ряд недостатков: обычные повязки на ожоговые раны высыхают через 3-4 часа, что требует частой смены повязок (увеличение материальных ресурсов на 35%); накладываемые на раны мази с антисептиком имеют недостаточный антимикробный эффект в силу высокой частоты распространения резистентной микрофлоры. Так 85% инфекций ожоговых ран вызваны мультирезистентными бактериями [2-5,10], что значимо снижает терапевтический потенциал применяемых в лечебно-диагностическом процессе местных антимикробных средств.
Особый интерес представляет возможность насыщать полимерную пленку, являющуюся заготовкой для гидрогелевого раневого покрытия, раствором, содержащим бактериофаги, которые воздействуют на актуальную в конкретной медицинской организации микрофлору. Это дает возможность своевременно реагировать на появление в области ожоговой раны антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов.
Однако в состав современных раневых покрытий, содержащих бактериофаги, полученных при промышленном производстве, невозможно заранее подобрать тип бактериофага к актуальному именно в данной медицинской организации патогену. Кроме того, необходимо решить технически сложную задачу сохранения жизнеспособности бактериофагов в период создания, транспортировки и хранения повязки, а предлагаемые авторами технологии, обеспечивающие длительный срок годности раневых покрытий, достаточно трудоемки и дорогостоящи [11, 12].
Способ местного применения бактериофага подробно описан в [11] и заключается в обильном орошении раневой поверхности раствором, содержащим бактериофаги и затем наложении на рану марлевой повязки. Способ имеет недостаток - поскольку бактериофаги функционируют только во влажной среде с определенными химико-физическими параметрами, при высыхании марлевой повязки их активность резко падает. Это требует повторного периодического обильного смачивания повязки раствором бактериофага и частых перевязок. С целью упрощения технологии применения и удлинения срока активности бактериофагов на раневой поверхности предлагается осуществлять их иммобилизацию в структуре полимерных носителей.
В работе [12] осуществлена ковалентная иммобилизация бактериофага на наноструктурированном носителе в виде нетканого нановолокнистого материала из поликапролактона. При этом иммобилизованные бактериофаги ориентированы таким образом, что их расположение позволяет им воздействовать на бактерии: капсид прочно связан с носителем, а хвост остается свободным. В другой работе с целью промышленного получения раневых покрытий с бактериофагами исследовано влияние типа полимерной матрицы на активность бактериофагов, иммобилизованных в структуре покрытий путем введения в раствор полимера и последующего высушивания разными способами [10]. Однако при этом не дана характеристика используемых полимеров (молекулярная масса, степень замещения карбоксиметилцеллюлозы, содержание ацетильных групп в поливиниловом спирте и т.д.), что может существенно влиять на активность иммобилизованных бактериофагов. Кроме того, не указывается рН композиций, что является важным для стабильности бактериофагов. Наилучшие результаты получены авторами [10] при иммобилизации стафилококкового и синегнойного фагов в структуре полимерной биодеградируемой повязки из полиэфирамида с использованием лиофильной сушки. Описанный способ [10] имеет недостатки: невозможно выполнить подбор бактериофага к актуальному именно в данной медицинской организации патогену, поскольку иммобилизация бактериофагов широкого спектра действия выполняется заранее, в промышленных условиях, без учета чувствительности конкретного штамма микроорганизма; сохранение жизнеспособности бактериофагов в период создания, транспортировки и хранения повязки с помощью лиофилизации является трудоемкой и дорогостоящей технологией; не конкретизирован способ обеспечения стерильности повязки.
Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату, выбранным в качестве прототипа, является способ профилактики инфекционных процессов в области аутодермотрансплантата в послеоперационном периоде [13]. Способ заключается в создании вокруг реципиентной раны среды из гелевой пластины и раствора бактериофагов, обладающих по данным ретроспективного анализа чувствительностью к основным возбудителям раневых инфекций в стационаре.
Известный способ предназначен для профилактики инфекционных процессов, не предусматривает персонализированный подбор бактериофага к микрофлоре раны конкретного пациента согласно чувствительности микроорганизмов, в том числе в условиях ex tempore, и не оказывает неспецифического воздействия на процесс ангиогенеза в ране.
Задача настоящего изобретения - повышение эффективности лечения остаточных длительно существующих ожоговых ран за счет стимуляции ангиогенеза.
Техническим результатом способа является расширение арсенала технических средств, направленных на повышение эффективности лечения остаточных длительно существующих ожоговых ран, обеспечение синергетического эффекта стимуляции ангиогенеза в области длительно существующей ожоговой раны, в том числе за счет антибактериального действия, предотвращающего торможение ангиогенеза при бактериальном инфекционном процессе.
-5
2
2
Указанный технический результат достигается тем, что методом микробиологического анализа выявляют микрофлору, колонизирующую ожоговую рану, подбирают бактериофаг с литической активностью не менее «++++» к выделенному бактериальному патогену, готовят две гидрогелевые пластины соответствующие размеру раны, первую - на основе пленки из поливинилового спирта с содержанием ацетильных групп не более 2% толщиной 60 мкм, содержащую в составе фосфатный буфер в концентрации 3×10 моль/г с рН 6,6-7,8, путем насыщения бактериофагом из расчета 0,1 мл/см, вторую - на основе пленки из поливинилового спирта с содержанием ацетильных групп не более 2% толщиной 60 мкм путем насыщения стерильным раствором янтарной кислоты в концентрации 0,26 мг/г из расчета 0,1 мл/см, укладывают на рану первую гидрогелевую пластину, наносят жидкую аэрозольную повязку, содержащую силоксановый полимер, хлороформ, пропеллент R-406, затем вторую гидрогелевую пластину, рану оставляют укрытой до трех суток.
Способ осуществляют следующим образом.
Выполняют этиологическую расшифровку раневой инфекции согласно действующим нормативно-методическим документам. Проводят изучение чувствительности микроорганизма к коммерческому лечебно-диагностическому бактериофагу с использованием spot-метода согласно «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике: федеральные клинические (методические) рекомендации» (2014). Подбирают специфический бактериофаг (моно- или поливалентный) с литической активностью не менее «++++».
Для подготовки первой пластины берут пленку из поливинилового спирта (ПВС) со следующими свойствами:
- содержание в составе не более 2% ацетильных групп;
- толщина 60 мкм;
-5
- содержание в составе фосфатного буфера в концентрации 3×10 моль/г (сухой остаток) с кислотно-щелочной средой рН 6,6-7,8.
2
Из пленки стерильными ножницами вырезают фрагмент, соответствующий раневому дефекту. Фрагмент помещают в чашку Петри и заливают раствором подобранного литического бактериофага из расчета 0,1 мл/см.
Для подготовки второй пластины берут пленку из поливинилового спирта (ПВС) со следующими свойствами:
- содержание в составе не более 2% ацетильных групп;
- толщина 60 мкм.
2
Из пленки стерильными ножницами вырезают фрагмент, соответствующий раневому дефекту. Фрагмент помещают в чашку Петри и насыщают стерильным раствором антигипоксанта (янтарной кислоты) в концентрации 0,26 мг/г из расчета 0,1 мл/см.
Время впитывания растворов и набухания пленок составляет 1 мин. После пропитывания фрагментов пленок растворами они преобразуются в гидрогелевые пластины.
На раневой дефект накладывают первую пластину (с бактериофагом), затем покрывают эту пластину слоем жидкой аэрозольной повязки, содержащей силоксановый полимер, хлороформ, пропеллент R-406 (Пентазоль), после высыхания аэрозольной повязки накладывают сверху вторую пластину (с янтарной кислотой). Рану оставляют укрытой до трех суток.
Для доказательства возможности реализации заявленного способа и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.
В эксперименте на 16 животных (крысы) моделировали ожог по методу A. Orenstein (1997). В этой модели для создания ожога III степени используют предварительно нагретую до 150°C металлическую пластину размером 7×4×1 см. После наркотизации животного пластину прижимали в течение 10 секунд к выбритой коже крысы в межлопаточной области. Через трое суток в области ожога отмечали наличие струпа, в котором у каждого животного при помощи ножниц формировали отверстие диаметром 22 мм, моделируя таким образом обширную ожоговую рану. Для профилактики ретракции кожи к краям ран подшивали металлическое кольцо.
Далее были сформированы 4 экспериментальные группы по 4 животных. В первой группе - (контрольная), никакого дополнительного воздействия на раны не оказывалось. Раны животных второй, третьей, четвертой групп колонизировали антибиотикорезистентным штаммом Pseudomonas aeruginosa, чувствительным к препарату «Пиобактериофаг», уровень литической активности составлял «++++» по spot-методу в бактериологических исследованиях.
После инфицирования раны всех животных (в том числе и первой группы) укрывали гидрогелевым раневым покрытием, выполненным из двух гидрогелевых пластин на основе ПВС (фиг. 1).
Приготовление гидрогелевого раневого покрытия, состоящего из двух гидрогелевых пластин, проводилось следующим способом.
Для подготовки первой пластины брали пленку из ПВС со следующими свойствами:
- содержание в составе не более 2% ацетильных групп;
- толщина 60 мкм;
-5
- содержание в составе фосфатного буфера в концентрации 3×10 моль/г (сухой остаток) с кислотно-щелочной средой рН 6,6-7,8.
Для подготовки второй пластины брали пленку из ПВС со следующими свойствами:
- содержание в составе не более 2% ацетильных групп;
- толщина 60 мкм.
Из пленок стерильными ножницами вырезали фрагменты круглой формы диаметром 22 мм.
Для первой и второй группы фрагменты и первой, и второй пленки пропитывали физиологическим раствором в объеме 3,8 мл на каждый;
Для третьей группы фрагменты и первой, и второй пленки пропитывали раствором готового лечебно-профилактического бактериофага «Пиобактериофаг» в объеме 3,8 мл на каждый.
Для четвертой группы фрагмент первой пленки пропитывали 3,8 мл раствора готового лечебно-профилактического бактериофага «Пиобактериофаг», фрагмент второй пленки пропитывали 3,8 мл стерильного раствора янтарной кислоты в концентрации 0,26 мг/г.
Время впитывания растворов и набухания пленок с образованием пластин составляло 1 мин.
У животных первой группы и второй группы раны укрывали последовательно двумя гидрогелевыми пластинами, полученными путем насыщения пленок ПВС физиологическим раствором. В третьей группе рану каждого животного укрывали последовательно двумя гидрогелевыми пластинами, полученными путем насыщения пленок ПВС лечебно-профилактическим бактериофагом «Пиобактериофаг». В четвертой группе раны укрывали гидрогелевой пластиной, полученной путем насыщения пленки ПВС бактериофагом, затем - жидкую аэрозольную повязку Пентазоль путем распыления на рану в течение 3 секунд с расстояния.. 10 см, дожидались высыхания в течение 1 минуты, затем укладывали гидрогелевую пластину, насыщенную янтарной кислотой. Повязку оставляли на 3 суток.
Через трое суток после формирования и колонизации ран признаков активного инфекционного процесса не отмечалось.
Для моделирования длительно существующих ожоговых ран и активных хирургических действий как этапа лечебного процесса всем животным была выполнена свободная аутодермопластика. Трансплантат толщиной 0,2 мм забирали с кожи поясничной области и перемещали на ожоговые раны. Металлические пластины при этом оставались до конца эксперимента. После выполнения кожной пластики аутодермотрансплантаты животных всех 4-х групп укрывали гидрогелевым раневым покрытием, выполненным аналогичным способом и по той же схеме эксперимента как и до аутодермопластики.
На 10-е сутки животные были выведены из эксперимента, проведены микробиологические исследования отделяемого ран и ткани из области ран с аутодермотрансплантатами забраны для гистологического исследования. Биологический материал забирали таким образом, чтобы захватывалась область раны и неизмененных тканей. Полученный материал фиксировался в 10% нейтральном формалине с последующим обезвоживанием и заливкой в парафин. Из парафиновых блоков приготавливали срезы толщиной 7 мкм, которые наклеивались на обезжиренные предметные стекла. Гистологические срезы были ориентированы строго вертикально и проходили через все слои стенок и дна раны.
5
6
7
2
3
Во всех группах животных при визуальной оценке явных признаков активного инфекционного процесса не наблюдали. В течение 10-дневного периода наблюдения после кожной пластики площадь раны во всех группах прогрессивно уменьшалась за счет эпителизации со стороны краев раны и трансплантата, однако во второй и третьей группах этот процесс был замедленным - по данным планиметрических исследований скорость сокращения площади раны составляла в первой группе - 4% в сутки, во второй и третьей - 2,4%, в четвертой - 6%. Эта тенденция сохранялась на протяжении всего периода наблюдения. При микробиологическом исследовании из всех ран первой группы высевался сапрофит S. chromogenes 1×10. Из всех ран второй и третьей групп высевалась P. aeruginosa в количестве 10-10 КОЕ/мл. Из ран четвертой группы P. aeruginosa высевался только в 1 случае из 4, при этом в значительно меньшем количестве - 10-10 КОЕ/мл.
При гистологическом исследовании на 10-е сутки от начала эксперимента в ранах первой группы (контроль) визуализировались участки полноценного восполнения раневого дефекта аутодермотрансплантатом с восстановлением структуры эпидермиса и соединительнотканной основы дермы, при этом степень инфильтрации и отека была умеренной. Во второй группе определялась выраженная инфильтрация, представленная нейтрофильными лейкоцитами, отек. В пределах дермы имелись полнокровные капилляры и стаз форменных элементов в них. В реакцию вовлекались тучные клетки, индекс дегрануляции составил 29,4±3,7%.
В третьей группе животных при гистологическом исследовании тканей отмечалась картина, схожая с картиной в первой группе. Однако по сравнению с первой группой несколько более выраженной была степень отека тканей и лейкоцитарной инфильтрации.
В четвертой группе, как и в первых трех группах, грануляционная ткань имела в целом типичное строение и содержала множество кровеносных микрососудов, а в периваскулярных зонах располагались клеточные элементы фибробластического ряда. Индекс дегрануляции тучных клеток составил 48,2±3,1%, величина этого показателя в четвертой группе статистически значимо (р<0,05) отличалась от значений в первой, второй и третьей группах. Повышение индекса дегрануляции, сопровождалось увеличением скорости заживления раневого дефекта, за счет модулирующего воздействия продуктов дегрануляции на клетки воспалительного ряда, а также их активирующего влияния на фибробласты, и, как следствие, на стимуляцию коллагеногенеза. Это согласуется с данными литературы [14], свидетельствующими, что при заживлении ран происходит активация клеток фибробластического дифферона и они активно участвуют в пластических процессах. В то же время, в четвертой группе наблюдались многочисленные формирующиеся и растущие сосудистые почки, что указывало на интенсивный ангиогенез. В центре и дне раны в отличие от ран первой, второй и третьей групп отмечалась значительная дилятация сосудов микроциркуляторного русла, что может рассматриваться как реакция на стимуляцию ангиогенеза.
При иммуногистохимическом исследовании на 10-е сутки выявлено статистически значимое (для сравнения групп использовали критерий Манна-Уитни) увеличение концентрации CD-31-положительных клеток в четвертой группе (54,9±4,6) (фиг. 2) по сравнению с первой (28,0±4,4; p=0,004) (фиг. 3), второй (15,0±3,7; p=0,002,) (фиг. 4) и третьей группами (31,3±4,9; p=0,004) (фиг. 5). На фотоизображениях гистологических препаратов (фиг. 2-5), увеличение 200. В то же время статистически значимых различий (р>0,05) по этому признаку между первой, второй и третьей группами не выявлено.
Таким образом, представленный способ позволяет обеспечить персонализированный подбор фагов к микрофлоре раны конкретного пациента согласно чувствительности микроорганизмов, позволяет сформировать раневое покрытие, содержащее как бактериофаг, так и антигипоксант (янтарная кислоту), стимулирующий ангиогенез, что является принципиальным при лечении длительно существующих ожоговых ран, которое оказывает действие в течение 3 суток, при этом в 1-2 сутки под раневым покрытием обеспечивается слабощелочная среда, благоприятная для бактериофагов, обеспечивающих гибель бактерий, действие которых способствует торможению ангиогенеза, на 2-3 сутки в рану поступает янтарная кислота, обеспечивая активацию ангиогенеза.
Способ повышает эффективность лечения, позволяет остаточные длительно существующие ожоговые раны к выполнению кожно-пластических операций.
Литература:
1. Jault P., Leclerc T., Jennes S., Pirnay J.P., Que Y.A., Resch G., Rousseau A.F., Ravat F., Carsin H., Le Floch R., Schaal J.V., Soler C., Fevre C., Arnaud I., Bretaudeau L., Gabard J. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, doubleblind phase 1/2 trial. Lancet Infect Dis 2019; 19(1): 35-45, https://doi.org/10.1016/S1473-3099(18)30482-1.
2. Ávila-Salas F., Marican A., Pinochet S., Carreño G., Valdés O., Venegas B., Donoso W., Cabrera-Barjas G., Vijayakumar S., Durán-Lara E.F. Film dressings based on hydrogels: simultaneous and sustained-release of bioactive compounds with wound healing properties. Pharmaceutics 2019; 11(9): 447, https://doi.org/10.3390/pharmaceutics11090447
3. Бактериофаги. Общая фармакопейная статья. ОФС.1.7.1.0002.15. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II.
4. Бактериофаги. Биология и практическое применение [Текст] / ред. Э. Каттер, А. Сулаквелидзе : пер. с англ. - Москва : Научный мир, 2012. - 640 с.
5. Ковалишена, О.В. Использование бактериофагов в борьбе с инфекциями / О.В. Ковалишена, Р.Ф. Чанышева // Заместитель главного врача. - 2016. - №7. - С. 90-95.
6. Lipsky B.A., Dryden M., Gottrup F., Nathwani D., Seaton R.A., Stryja J. Antimicrobial stewardship in wound care: A Position Paper from the British Society for Antimicrobial Chemotherapy and European Wound Management Association. J. Antimicrob. Chemother. 2016;71:3026-3035. https://doi.org/10.1093/jac/dkw287
7. Caldwell M.D. Bacteria and Antibiotics in Wound Healing. Surg. Clin. N. Am. 2020;100:757-776. https://doi.org/10.1016/j.suc.2020.05.007
8. Bodnár E, Bakondi E, Kovács K, et al. Redox Profiling Reveals Clear Differences between Molecular Patterns of Wound Fluids from Acute and Chronic Wounds. Oxid Med Cell Longev. 2018;2018:5286785. Published 2018 Nov 18.
https://doi.org/10.1155/2018/5286785
9. Ghezzi P, Jaquet V, Marcucci F, Schmidt HHHW. The oxidative stress theory of disease: levels of evidence and epistemological aspects. Br J Pharmacol. 2017;174(12):1784-1796. https://doi.org/10.1111/bph.13544
10. Ковязина, Н.А. Подходы к конструированию полимерных раневых покрытий с бактериофагами / Н.А. Ковязина, П.С. Лукин, Е.В. Функнер и др. // Медицинский альманах. - 2013. - №2 (26). - С. 72-74.
11. Покровская, М.П. Лечение ран бактериофагами / М.П. Покровская, Л.С. Каганова, М.А. Морозенко, А.Г. Булгакова, Е.Е. Скаценко - Москва: Наркомздрав СССР Государственное издательство медицинской литературы «МЕДГИЗ», 1941. - 51 с.
12. Nogueira, F. Immobilization of bacteriophage in wound-dressing nanostructure / F. Nogueira, N. Karumidze, I. Kusradze, M. Goderdzishvili, P. Teixeira, I.C. Gouveia // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2017. - V. 13, №8. - P. 2475-2484.https://doi.org/10.1016/j.nano.2017.08.008
13. Патент № 2687108 C1 Российская Федерация, МПК A61L 15/36, A61K 35/76. Способ профилактики инфекционных процессов при свободной кожной пластике : № 2018139554 : заявл. 09.11.2018 : опубл. 07.05.2019 / В.В. Бесчастнов, Т.Н. Юданова, М.Г. Рябков [и др.]; заявитель Общество с ограниченной ответственностью "Новые Перевязочные Материалы".