Cef (Cho cell elongating factor) холерных вибрионов: биоин-формационный анализ и экспериментальные данные

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 579.843.1:579.22].083.1:681.518

Е. В. Монахова, Р. В. Писанов, А. Б. Мазрухо, О. В. Маркина, Л. П. Алексеева СВОЙСТВА CEF (CHo CELL ELoNGATING FACTOR) хОЛЕРНЫх ВИБРИОНОВ:

биоинформационный анализ и экспериментальные данные

ФГУЗ Научно-исследовательский противочумный институт, Ростов-на-Дону

Проведен биоинформационный анализ первичной и вторичной структуры белка Cef (CHO cell elongating factor) Vibrio cholerae, выявлено его сходство с триацилглицероллипазами и цитотони-ческими токсинами других видов бактерий. Прогностические данные о том, что Cef представляет собой термотолерантную сериновую липазу с доменом Куница и лейциновой "молнией", подтверждены экспериментально. Из рекомбинантных штаммов Escherichia coli получены препараты Cef холерных вибрионов обоих биоваров серогруппы O1, O139 и не01/не0139 серогрупп, охарактеризованы их физико-химические свойства, биохимическая и биологическая активность in vitro и in vivo. Установлено, что биологическая активность Cef по отношению к культурам клеток не связана с его эстеразной активностью. Очевидно, Cef является белком с двойной функцией, вносящим определенный вклад как в проявление возбудителем патогенных свойств, так и в его конкурентоспособность в различных экологических нишах.

Ключевые слова: холерный вибрион, CHO cell elongating factor, биоинформационный анализ, биохимическая активность, биологическая активность

Как известно, эпидемические штаммы возбудителя холеры способны к продукции основного фактора патогенности - холерного токсина (CT). Вместе с тем описаны спорадические случаи и локальные вспышки заболеваний, вызванных нетоксигенными штаммами, в том числе в России и странах СНГ [4, 10]. На сегодняшний день идентифицирован целый ряд дополнительных токсинов, которые могут обусловливать этиологическую опасность таких штаммов, однако роль каждого из них в патологии точно не установлена [1, 12]. Некоторые, по-видимому, обладают двойной функцией, являясь одновременно факторами патогенности и персистенции во внешней среде. К числу предполагаемых факторов патогенности холерных вибрионов относят, в частности, малоизученный цитотонический фактор Cef (CHO cell elongating factor) [8, 9, 11].

Ранее мы сообщали о клонировании генов cef Vibrio cholerae разных биоваров и серогрупп и констру-ированиио штаммов Escherichia coli - продуцентов рекомбинантных белков Cef. Осветленные ультразвуковые дезинтеграты клеток E. coli сохраняли все свойства, описанные в литературе для препаратов, выделенных из V cholerae - эстеразную активность, способность вызывать удлинение клеток CHO и L-929 и накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков [2]. Однако очищенные препараты не были получены.

Механизм действия Cef не изучен. Известно лишь то, что он отличен от такового CT, поскольку не вызывает повышения уровня цАМФ и простагландина E2 в эукариотических клетках [8, 9]. Связь между его эстеразной и биологической активностью также не установлена. Поэтому необходимы дальнейшие исследования его структурно-функциональных особен-

ностей с использованием биоинформационных и экспериментальных методов.

Цель настоящей работы состояла в прогнозировании свойств Cef холерных вибрионов с помощью компьютерных программ и экспериментальной проверке полученных данных с использованием его препаратов - рекомбинантных белков.

Материалы и методы

Методы биоинформационного анализа. Анализ проводили с помощью пакета компьютерных программ Vector NTI Suite 9 (www.informax.com), а также on-line с использованием программ SMART domains (www.dove.embl-heilderberg.de), SCOP (www. scop.mrc-lmb.cam.ac.uk), Blast2 (Bork Group's WU-Blast2 Server at TMBL), ALB (www.phys.protres.ru) и PSIPRED (http://bioinf3.cs.ucl.ac.uk). Полные последовательности белков Cef и других липаз V. cholerae и других микроорганизмов были найдены на сайтах www.ncbi.nlm.nih.gov (NCBI) и www.genome.ad.jp.

Выделение препаратов Cef. В качестве продуцентов Cef V. cholerae O1 эльтор и классического биоваров, неО1/неО139 (О13) и О139 были использованы сконструированные нами рекомбинантные штаммы E. coli Jm103, содержащие плазмиды pCef61B, pCef69B, pCef49B и pCef31B соответственно. Наращивание биомассы с индукцией арабинозой проводили, как описано ранее [2]. Каждый препарат выделяли из 2 г сырой бактериальной массы, разрушенной ультразвуком в 50 мл лизис-буфера (8 М мочевина, 10 мМ ЭДТА, pH 8,0). Объем полученного лизата доводили до 200 мл дистиллированной водой, осветляли центрифугированием, насыщали сульфатом аммония (СА), pH 8,0, до 50% и инкубировали в течение 12 ч при 4°C. Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в буфере для гель-фильтрации (200 мМ СА, 10 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, 1% изопропанол, pH 8,0) и наносили на колонку для гель-фильтрации HW-55F (Farmacia). Ферментативную активность фракций определяли в лунках агара, содержащего твин 20 или трибутирин [2]. Активные фракции объединяли, уравновешивали буфером (50 мМ СА, 10 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, 1% изопропанола, pH 8,0) и наносили на колонку для хроматографии в обращенной фазе с Butyl-Toyopearl 650M (Toysoda). Элюцию вели снижающимся градиентом СА от 50 мМ до 0. Активные фракции объединяли, концентрировали, диализовали против 10 мМ трис-HCl, pH 8,0, и прогревали при 57°C в течение 60 мин, после чего осаждали центрифугированием денатурированные балластные белки и

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №2, 2012

собирали прозрачный супернатант. Степень очистки препаратов контролировали электрофоретически в полиакриламидном геле. Содержание белка определяли методом Лоури.

Изучение физико-химических свойств и биохимической активности. Эстеразную активность препаратов определяли в лунках агара, содержащего 0,5-1% твинов 20, 40, 60, 80, 85 и трибутирина, как описано ранее [2], лецитиназную (фосфолипазную) - на агаре с яичным желтком и соевым лецитином, а также по образованию кристаллов холина с помощью метода, описанного в работе [5].

Для определения степени термостабильности Cef препараты (100 мкг/мл) прогревали в течение 60 мин при 40, 50, 60, 70 и 90°C. Активность серийных разведений (в 10 мМ трис-HC, pH 8,0) проверяли на чашках с твином-20. Взаимодействие с протеазами изучали следующим образом. К растворам Cef (100 мкг/мл) добавляли трипсин (Sigma) и препарат рекомбинант-ной гемагглютинин/протеазы (HA/P) V. cholerae [3] до конечной концентрации 10 мкг/мл, смеси инкубировали при 37°С в течение 1 ч, затем готовили серийные разведения и проверяли эстеразную и протеолитиче-скую активность в лунках агара с твином-20 и молоком соответственно. Контролями служили растворы Cef (100 мкг/мл) и обеих протеаз (10 мкг/мл) в 10 мМ трис-HCl, pH 8,0.

Ингибирование активного центра Cef осуществляли прогреванием препарата при 40°C в течение 60 мин в присутствии PMSF (конечная концентрация 5 мМ) с последующим диализом и концентрированием. Инактивированные и контрольные препараты проверяли на эстеразную активность и способность вызывать удлинение культивируемых клеток.

Изучение биологической активности. Для оценки биологической активности Cef in vitro использовали культуру клеток подкожной соединительной ткани мыши L-929 (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург), поскольку наши предшествующие исследования показали, что в этой культуре удлинение клеток под действием Cef выражено более четко по сравнению с CHO [2]. Количественное определение активности проводили в 96-луночных пластиковых планшетах, как описано ранее [2]. Для изучения биологической активности in vivo мышам-сосункам 4-5-дневного возраста вводили ректально по 10 мкг каждого препарата в 100 мкл 10 мМ трис-HCl (pH 8,0), контрольным - по 100 мкл того же буфера без Cef. Опытные группы включали по 10 животных, контрольная - 12. Через 5 ч определяли FA ± SD (соотношение массы желудочно-кишечного тракта и тела ± стандартное отклонение; см. табл.).

Накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков под действием препаратов Cef

Препарат (10 мкг/животное) Число животных FA ± SD Р

Cef-eltor 10 0,082 ± 0,006 0,000

Cef-classical 10 0,078 ± 0,005 0,000

Cef-O13 10 0,080 ± 0,008 0,000

Cef-O139 10 0,079 ± 0,005 0,000

10 мМ трис-HCl 12 0,059 ± 0,005 -

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Primer of Biostatistics v.4.03.

Результаты и обсуждение

Биоинформационный анализ Cef. Ранее группой авторов, впервые описавших Cef V Cholerae и идентифицировавших его ген [8, 9], было показано, что аминокислотная последовательность этого белка (AAF96761) имеет сходство с цитотоническим токсином и фосфолипазами возбудителя гастроэнтеритов Aeromonas hydrophila. В составе молекулы Cef был выявлен активный центр липаз, содержащий консервативный пентапептид GXSXG, в центре которого се-рин играет ключевую роль в связывании с субстратом [6]. В ходе проведенного нами более подробного анализа первичной структуры было установлено, что Cef - кислый белок с изоэлектрической точкой 4,88 и мол. массой (ММ) 83,5 кД, содержит в составе молекулы следующие функциональные аминокислотные (АК) домены (рис. 1):

- домен Куница (179-196 аа), свойственный ингибиторам протеаз;

- лейциновую "молнию" (352-373 аа) - домен, за счет электрических взаимодействий образующий а-спираль, в которой остатки лейцина расположены вдоль одной ее стороны. Он может обеспечивать формирование димерной структуры белков, а также взаимодействие с ДНК;

- домен сериновых триацилглицероллипаз GXSXG (549- 553 аа) в молекуле Cef имел последовательность GHSLG;

- a/bH (424-563 аа) - домен белков суперсемейства а-Р-гидролаз, включающий множество эукарио-тических и бактериальных липаз/эстераз. В состав a/bH входит и вышеупомянутый субстратсвязываю-щий домен GXSXG;

- LIP (444-723 аа) - домен, характерный для большинства триацилглицероллипаз, перекрывающийся с доменом a/bH.

Поскольку в обеих хромосомах V. cholerae eltor N16961 присутствуют 20 генов известных и предполагаемых липаз и эстераз, мы также провели сравнительный анализ их продуктов с помощью программы AlignX. Несмотря на то что 7 из 20 белков содержали пентапептид GXSXG, они не обладали сколько-нибудь значительным сходством с Cef. В то же время, согласно данным программы BlastSearch, выявленный в составе Cef домен GHSLG был полностью идентичен таковым многих сериновых триацилглице-роллипаз и цитотонических токсинов вибрионов других видов - V. alginolyticus (ZP_01261058), V. vulnificus (NP_936808), V. Shilonii (ZP_01867894), V. camp-bellii (ZP_02194541), V slendidus (YP_002395357), V. parahemolyticus (NP_800369, ZP_01993895), V. angustum (ZP_01234972), а также Aeromonas hy-dropila (AAB52231, AAC64133, AAA75598, P40600, AAA96668, ABC54618), A. jandaei (ACF1012), A. sal-monicida (YP_001143960), Pseudomonas fluorescens (P41773) и Thermomyces lanuginosus (CAB58509). Большинство триацилглицероллипаз известны как относительно термостабильные при 40-50°C, это позволило нам предположить, что и Cef обладает термостабильностью в указанной области температур.

При проведении сравнительного анализа мы обра-

Сигнальный пептид

=

Домен Куница

—й=

Лейциновая молния

GHSLG

а/ЬН

Cef V.cholerae

796 аа

Рис. 1. Схема локализации доменов в белке Cef V. cholerae.

тили внимание на тот факт, что белки, обозначенные в базе данных как цитотонические токсины, представляют собой намного более короткие полипептиды, чем обозначенные как предполагаемые липазы, но при этом первые почти идентичны C-концам последних у одного вида микроорганизмов. Так, АК-последовательность Cef V. parahaemolyticus (ZP_01993895) длиной 266 аа, кроме первых 42 аа, полностью идентична C-концевой последовательности (355-578 аа) предполагаемой липазы этого вида (NP_800369) длиной 802 аа. Такая же картина наблюдается у аэромонад - цитотонические токсины нескольких штаммов очень похожи на C-концы их липаз. Эти короткие цитотонические токсины, как и более высокомолекулярные липазы, содержат мотивы, идентичные таковым, расположенным в молекуле Cef V. cholerae в области домена a/bH. Интересно, что последний имеет 77,1% сходства и 66,4% идентичности с C-концом одного из двух самых коротких (266 аа) ци-тотонических факторов - Cef V. parahaemolyticus. Второй, цитотонический энтеротоксин A. jandaei (257 аа), напротив, содержит сходную последовательность (55% сходства и 43% идентичности) ближе к N-концу. Поскольку согласно данным, представленным в аннотациях к этим белкам, они являются цитотонически-ми факторами, из проведенного анализа следует, что и способность Cef холерных вибрионов вызывать удлинение клеток, по всей вероятности, связана именно с областью домена a/bH. Однако вопрос о том, обусловлена ли эта способность эстеразной активностью, оставался открытым.

Для бактериальных липаз/эстераз характерно наличие а-спиральной структуры, которая прикрывает «погруженный в глубь» молекулы каталитический центр и при соприкосновении с субстратом «сдвигается», обеспечивая возможность контакта [7]. Результаты моделирования вторичной структуры Cef с помощью программ ALB и PSIPRED были одинаковыми и показали, что, как и у других липаз, остаток серина (551 аа) находится в консервативной позиции ß-s-Ser-a (549-553 аа). В лейциновой «молнии» (352-373 аа) остатки лейцина локализованы в двух спиральных участках, соединенных короткой «петлей» (DSK), а домен Куница (179-196 аа) в основном представлен "петлей", заканчивающейся коротким спиральным участком.

Описанные результаты были идентичны представленным в GenBank АК-последовательностей Cef V. cholerae О1 эльтор (AAF96761, AAV40602) и классического биовара (AAV40603), которые различаются всего одним АК-остатком [9], и близки таковым Cef V. cholerae non01/non0139 (AAV40604.1), несмотря на то что в его молекуле мы обнаружили 26 АК-замен, которые, однако, не затрагивали активного центра, доменов Куница и сериновых триацилглицероллипаз (GHSLG).

Таким образом, результаты биоинформационного анализа позволили прогнозировать, что Cef представляет собой термотолерантную сериновую триа-цилглицероллипазу с доменом Куница, вероятно, защищающим ее от протеаз, и лейциновой "молнией", позволяющей формировать димерные структуры. Для подтверждения этих предположений были проведены экспериментальные исследования, описанные ниже.

Выделение препаратов Cef и изучение их свойств. Препараты Cef получали из клеток штаммов-продуцентов, как описано в разделе "Материалы и методы". На этапе гель-фильтрации было установлено, что Cef выходит с колонки двумя фракциями: тяжелой (близкой к свободному объему колонки) и легкой (соответствующей его ММ). Этот факт свидетельствует о том, что Cef способен формировать димерные структуры (даже после денатурации в 8 М мочевине), вероятнее всего, за счет лейциновой "молнии".

Полученные препараты были проверены на термостабильность. После прогревания при 40-50°C Cef сохранял 100% своей активности, при 60°C - 50%, при 70-90°C инактивировался. Таким образом, была подтверждена его относительная термостабильность, предсказанная в ходе биоинформационного анализа. Это позволило ввести дополнительный этап очистки искомого белка - прогревание препаратов при 56°C в течение 60 мин, которое приводило к денатурации большинства примесей термолабильных белков, с последующим отделением последних центрифугированием. При изучении полученных препаратов с помощью SDS-электрофореза в гелях выявлялась мажорная полоса с ММ около 85 кД, что соответствовало ММ Cef (рис. 2).

Рис. 2. SDS-электрофорез осветленных ультразвуковых де-зинтегратов клеток рекомбинантных штаммов E. coli (четные дорожки) и полученных из них препаратов Cef (нечетные).

1, 2 - Cef-O1 classical; 4 - Cef-O1 eltor; 5, 6 - Cef-O13; 7, 8 - Cef-O139.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №2, 2012

При тестировании препаратов на различных субстратах были получены такие же результаты, как с осветленными ультразвуковыми дезинтегратами клеток штаммов-продуцентов [2]: наличие способности гидролизовать твины и для Cef вибрионов серогрупп О1 и неО1/неО139 - трибутирин, однако активность препаратов была выше и проявлялась в концентрации белка 5-6 нг/мл (против 1-4 мкг/мл дезинтеграта [2]). Причины полного отсутствия активности Cef вибрионов серогруппы О139 по отношению к трибутирину при сохранении способности к гидролизу твинов, возможно, удастся определить на основании биоинформационного анализа АК-последовательности продукта трансляции его гена, секвенирование которого является предметом нашего отдельного исследования, так как на сегодняшний день в базах данных последовательности Cef представители этой серогруппы отсутствуют. Ни один из препаратов не обладал лецитиназной (фосфолипазной) активностью.

Несмотря на присутствие в молекуле Cef домена Куница (ингибитора протеаз), препараты не инги-бировали протеолитическую активность трипсина и HA/P. В свою очередь оба фермента не ингибировали эстеразную активность Cef. Очевидно, домен Куница служит для защиты самой молекулы белка Cef от деградации под действием протеаз кишечника и/или других микроорганизмов.

Все препараты вызывали удлинение не менее 50% клеток L-929 в концентрации 2,5 мкг/мл и выше, а также статистически достоверное накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков в дозе 10 мкг на одно животное (см. таблицу).

Для подтверждения принадлежности Cef к сери-новым липазам и выяснения роли домена GHSLG в способности вызывать удлинение клеток мы провели эксперимент по его инактивации PMSF, ингибитором сериновых ферментов. Инактивированный препарат Cef в отличие от контрольного полностью утрачивал эстеразную активность, но сохранял способность вызывать удлинение клеток L-929. Следовательно, цитотоническая активность Cef не определяется его субстратсвязывающим доменом. Однако, несмотря на то что приведенные выше результаты сравнительного анализа АК-последовательностей указывают на причастность к этой активности а/ЬН-домена, на основе имеющихся в распоряжении собственных и литературных данных нам не удалось даже предположительно определить, какой(ие) из консервативных мотивов ответственен за ее проявление. Расширенный on-line бласт-поиск с помощью программы Advanced BLAST2 Search в базах данных Swissprot и sp nrdb не выявил значительного сходства а/ЬН-домена Cef с доменами каких-либо других белков, кроме приведенных выше липаз и цитотонических токсинов, механизм действия которых на эукариотические клетки не описан ни в литературе, ни в аннотациях к сиквен-сам. Вместе с тем полученная нами информация значительно сужает "круг поиска" и приближает к ответу на этот вопрос с помощью создания серии изогенных мутантов, содержащих делеции отдельных участков конкретной области.

Таким образом, Cef холерных вибрионов, очевидно, является белком с двойной функцией, вно-

сящим определенный вклад как в проявление возбудителем патогенных свойств, так и в конкурентоспособность холерных вибрионов в различных экологических нишах.

Сведения об авторах:

Монахова Елена Владимировна - ст. науч. сотр., канд. биол. наук, e-mail: unicorn54@mail.ru

Писанов Руслан Вячеславович - ст. науч. сотр., канд. биол. наук, e-mail: qvetlorien@list.ru

Мазрухо Алексей Борисович - директор Ростовского НИПЧИ, канд. мед. наук, e-mail: plague@aanet.ru

Маркина Ольга Владимировна - науч. сотр., канд. биол. наук, e-mail: pochtamov@mail.ru

Алексеева Людмила Павловна - зав. группой, д-р биол. наук, проф., e-mail: lpalekseeva@yandex.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Монахова Е. В., Ломов Ю. М., Писанов Р. В. и др. // Биотехнология. - 2006. - № 5. - С. 12-18.

2. Монахова Е. В., Писанов Р. В. // Молекул. генетика. - 2005. -№ 1. - С. 7-18.

3. МонаховаЕ. В., Писанов Р. В., Гончарова Л. А. и др. // Биотехнология. - 2006. - № 6. - С. 8-15.

4. Покровский В. И., Онищенко Г. Г., Черкасский Б. Л. Эволюция инфекционных болезней в России в XX веке. - М., 2003.

5. Экспериментальная микробиология. - София: Медицина и физкультура, 1965. - С. 370-371.

6. Faustinella F., Smith L. S., Semenkovich C. F., Chan L. // J. Biol. Chem. - 1991. - Vol. 15. - P. 9481-9485.

7. Jaeger K. E., Ransac S., Dijkstra B. W. et al. // FEMS Microbiol. Rev. - 1994. - Vol. 15, N 1. - P. 29-63.

8. McCardell B. A., Kothary M. H., Hall R. N., Sathyamoorthy V. // Microb. Pathog. - 2000. - Vol. 29, N 1. - P. 1-8.

9. McCardell B. A., Sathyamoorthy V., Michalski J. et al. // Microb. Pathog. - 2002. - Vol. 32, N 4. - P. 165-172.

10. Monakhova E. V. // Epidemiological and molecular aspects on cholera / Eds T. Ramamurthy, S. K. Bhattacharya. - Springer Science + Business Media, 2010. - Ch. 4. - P. 51-78.

11. Sathyamoorthy V., Hall R. H., McCardell B. A. et al. // Infect. and Immun. - 2000. - Vol. 68, N 10. - P. 6062-6065.

12. Sears C. L., Kaper J. D. // Microbiol. Rev. - 1996. - Vol. 60, N 1. -P. 167-215.

Поступила 03.08.11

CHARACTERISTICS OF VIBRIO CHOLERAE CEF (CHO CELL ELONGATING FACTOR): BIOINFORMATICS ANALYSIS AND EXPERIMENTAL DATA

E. V. Monakhova, R. V. Pisanov, A. B. Mazrukho, O. V. Markina, and L. P. Alekseeva

Research Institute for Plague Control, Rostov-on-Don, Russia

Bioinformatics analysis of the primary and secondary structure of the Vibrio cholerae Cef (CHO cell elongating factor) protein was conducted. Similarity with triacylglycerol lipases and cytotonic toxins of other bacterial species was observed. Cef was predicted to be a heat-tolerant serine lipase with the Kunitz domain and leucine zipper. These data were confirmed experimentally. The Cefs of the two biotypes of V. cholerae O1, as well as O139 and nonO1/nonO139 serogroups, were purified from the recombinant Escherichia coli strains carrying corresponding cloned genes, and their physicochemical properties, biochemical and biological activities in vitro and in vivo were characterized. Biological activity against the cultured cells was not associated with estherase activity. Evidently, Cef is a bifunctional protein contributing both to pathogenicity of the cholera agent and to its competitive ability in different ecological niches.

Key words: Vibrio cholerae, CHO cell elongating factor, bioinformatics analysis, biochemical activity, biological activity