СПОСОБ ЗАКРЕПЛЕНИЯ ГЕТЕРОЗИСА ГИБРИДОВ
METHOD FOR SECURING HYBRID VIGOUR

Рост населения планеты, сокращение запасов продовольствия. Глобальное изменение климата может привести к невозможности гарантированного получения гибридных семян как на основе ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), так и при использовании ТЧГМС (термочувствительной генной мужской стерильности. Традиционная селекция многих культур сейчас испытывает своего рода кризис, так как потенциала продуктивности в последние годы не растет или темпы его роста значительно снизились. Причина в том, что собрать комплекс «лучших» генов повышающих продуктивность в одном образце при отборе в поздних поколениях явление маловероятное. Преодолеть этот барьер возможно используя успехи гетерозисной селекции. Каждый гетерозисный гибрид уже несет комплекс генов, позволяющий ему показывать урожайность на 20-50% выше, чем у сортов традиционной селекции, причем у каждого гибрида отобранный селекционером комплекс уникален.
Однако эти комплексы генов мы можем использовать только у гибридов первого поколения, поскольку каждый гибрид кроме благоприятных генов несет еще и комплекс неблагоприятных или малоэффективно действующих генов полученных от обоих родителей и который большей частью не проявляется у гетерозисного гибрида, но передается его потомкам. Закрепление гетерозисного эффекта позволит создавать на основе лучших гибридов сорта с аналогичной урожайностью. Мы предлагаем подойти к решению этой проблемы с другой стороны. Если чрезвычайно трудно, собрать в одном генотипе лучшие аллели по десяткам тысяч генов, то значительно проще из уже созданного комплекса (генотипа гетерозисного гибрида) удалить неэффективно действующие или снижающие жизнеспособность гены (в дальнейшем полулетальные гены).
Ранее предложено множество способов закрепления гетерозисного эффекта:
1. Известен способ закрепления гетерозисного эффекта при получении вегетативно размножающихся многолетних растений риса (см., например, F.Hu, P.Xu, J.Li, J.Zhou, E. Sacks, Z.Li, D.Tao Rice heterosis fixing by means of vegetative propagation from Oryza longistaminata. // Abstracts 4th International Symposium on Hybrid rice, 2002, p. 95), заключающийся в переносе генов, ответственных за формирование корневища у диких родственников риса (например, от вида Orisa longistominata, у которого эти гены расположены в третьей и четвертой хромосомах и ассоциированы с локусами OSR 16, RM 119 соответственно).
2. Известен способ закрепления гетерозисного эффекта (см., например, Bennett J.. Xuezhi Bi, Kathiresan, Chaudhury A., Ivahova A., Payne Т., Dennis L., and Khush G. Molecular tools for achieving synthetic apomixes for hybrid rice. // Abstracts 4 International Symposium on Hybrid rice, 2002, p. 12), заключающийся в переводе гибридов на апомиктичное размножение, методом переноса генов, ответственных за апомиктичное размножение из других видов, включая и родственные рису: кукуруза, сорго, пшеница.
3. Известен способ закрепления гетерозисного эффекта (см., например, V.Krishnasamy, 2002), заключающийся в получении синтетических семян гибридов. Под синтетическими семенами в данном случае подразумевается использование соматических эмбрионов, в качестве эндосперма которых служит смесь регуляторов роста, элементов питания и антибиотиков.
Недостатком указанных выше способов является то, что для закрепления гетерозисного эффекта они предлагают полное сохранение комплекса генов исходного гибрида, включая летальные и полулетальные гены, приводящие к расщеплению в последующих поколениях при половом размножении. Их основная задача заключается в переводе гибридов на вегетативное или апомиктичное размножение, кроме того, ни один из приведенных способов не реализован.
4. Известен способ закрепления гетерозиса гибридов в последующих поколениях, принятый нами в качестве одного из прототипов, описанный в патенте №2153253, М.Кл. А01К 67/00, А01К 67/04, опубликованный 27.07.2000, Бюл. №21 (ч.2), включающий получение гомозиготных особей, осуществление возвратных скрещиваний с абсолютно гомозиготными особями (для растений дигаплоидами, полученными через культуру пыльников) для удаления летальных и полулетальных генов из генотипа гетерозисного гибрида и восстановления комплекса генов исходного гибрида.
Недостатком способа является его трудоемкость, выражающаяся в проведении 5-6 возвратных скрещиваний между дигаплоидом и исходной особью, то есть растением гетерозисного гибрида, пыльцу которого использовали для получения популяции дигаплоидных растений. Для проведения возвратного скрещивания необходимо поддерживать жизнеспособность гибрида в течение нескольких его обычных жизненных циклов, например для риса период его вегетации 3-5 месяцев, после чего растения погибают. Для удаления летальных и полулетальных генов, а также сохранения комплекса генов, определяющего гетерозисный эффект, необходимо получить гибрид между дигаплоидом и исходным растением гетерозисного гибрида, от которого получали пыльцу для создания дигаплоидов. Получение дигаплоидов требует продолжительного времени от 7 месяцев, цикл вегетации исходного растения к этому времени уже закончен и оно очень ослаблено. Гибридизация дигаплоидов на ослабленные материнские растения приводит к очень низкой завязываемости и жизнеспособности гибридных семян, эта процедура повторяется 5-6 раз.
5. Известен способ закрепления гетерозиса гибридов в последующих поколениях, принятый нами в качестве второго прототипа, он предложен нами ранее и описан в патенте №2465771, МПК А01К 67/00 (2006.01), опубликованном 10.11.2012. Бюл. №31, включающий получение гомозиготных особей через культуру пыльников с последующим восстановлением комплекса генов исходного гибрида, путем гибридизации генотипически контрастных дигаплоидных линий. При этом в гибридизацию включают только наиболее продуктивные дигаплоидные линии, а контрастность дигаплоидных линий оценивают по комплексу признаков морфологических, физиологических, биохимических, молекулярных маркеров (SSR, SNP, и.т.д.), по вкладам генетических систем в продуктивность образца, и по совокупности всех предложенных методов.
Недостатком предложенного нами ранее способа является то, что как и в методе Струнникова для удаления летальных и полулетальных генов из генотипа гетерозисного гибрида используется получение гомозиготных особей, для растений дигаплоидных линий полученных через культуру пыльников. Проблема в том, что до сих пор процесс получения дигаплоидных линий слабо изучен и во многом не предсказуем. Так в одних гибридных комбинациях получают тысячи дигаплоидных линий, в других единицы, в третьих их не удается получить совсем. Причины слабой отзывчивости различных генотипов на культивирование пыльников слабо изучены. Для большинства культур методики получения дигаплоидных линий до сих пор не найдены. То есть предложенные ранее методы можно использовать не для всех гибридов у которых планируется закрепить гетерозисный эффект. Вторая проблема - получение дигаплоидных линий в культуре пыльников это очень трудоемкий и дорогостоящий процесс.
Для расширения возможностей методики закрепления гетерозисного эффекта и снижение затратности метода для удаления полулетальных генов из генотипа гетерозисного гибрида мы предлагаем использовать неспецифический стресс, которым по результатам наших исследований может быть воздействие высоких температур (35-40°С в зависимости от генотипа). Так как при их воздействии изменяется экспрессия большей части генома, что говорит о вовлеченности в процесс огромного числа генов. В пыльцевом зерне работают до 30% генов растений, следовательно речь идет о отборе по 10-15 тысячам генов, а точнее по их комплексам. Многие гены определяют устойчивость к ряду стрессовых факторов, Высокая температура выше 31°С, снижает эффективность фотосинтеза, индекс стабильности хлорофилла, стабильность мембран клеток. В формирование устойчивости к абиотическим стрессам вовлечены многие физиологические процессы. Многие механизмы формирования устойчивости сходны для различных стрессов. Так в формирование устойчивости к высоким температурам вовлечены факторы, определяющие устойчивость к таким стрессовым условиям как засуха, засоление, эффективность использования элементов минерального питания. Среди них: скорость роста клеток, характеристики устиц и устичная проводимость, эффективность фотосинтеза и скорость аттрагирования пластических веществ из вегетативных в генеративные органы, а также их микрораспределение между элементами соцветия и зерном [11]. Из 12 генов используемых для повышения устойчивости к засолению при создании трансгенных растений четыре гена также повышают устойчивость к холоду и засухе, 2 ко всем абиотическим стрессам, 6 повышают также устойчивость к засухе или холоду [12]. Из изученных 13 999 генов гетерозисных гибридов кукурузы сверхэкспрессия была характерна для 15,3%, 8,7% генов показали уровень экспрессии, более чем в 2 раза превышающий таковой у родительских форм. По данным анализа функций генов с повышенной экспрессией, в основном они вовлечены в регуляцию транскрипции, инициацию репликации, синтез белка и РНК, C:N - метаболизм, гормональную регуляцию, митохондриальную активность, устойчивость к стрессам, скорость деления клеток [6]. Большинство локусов составляющих комплекс генов определяющих гетерозис, отвечают также за повышение устойчивости к стрессам и общей адаптивности организма. Из всего вышеперечисленного можно сделать вывод о возможности отбора форм с комплексной устойчивостью при отборе на фоне одного из стрессов с наименьшей специфичностью. Воздействие высоких температур в период цветения, можно считать одним из вариантов гаметной селекции, который можно использовать как неспецифический стресс.
Эффективность метода предложенного нами выше, так как при использовании высоких температур отбор идет сразу в двух направлениях: отбор наиболее жизнеспособных мужских и женских гамет (в культуре пыльников отбираются только мужские гаметы). То есть спектр генов подвергающийся отбору шире, и выше возможность получения сочетения генов близкого к исходному гетерозисному гибриду. Так как в реакции генотипа на неспецифический стресс задействована большая часть генома, отбор должен быть не менее эффективным, чем в культуре пыльников (которую предложено использовать для элиминации полулетальных аллелей в методах закрепления гетерозиса предложенных ранее), а провести его значительно легче.
Эффективность отбора при воздействии высоких температур и фиксация его результатов в последующих поколениях показали наши исследования внутрисортовой специфики по устойчивости к стрессу у пяти сортов отечественной селекции (анализировали 100 семей каждого сорта). Изучение внутрисортовой вариабельности позволило выделить несколько растений в популяциях сортов риса, различающихся по устойчивости к высоким температурам. В фазу цветения устойчивые и неустойчивые линии помещались в камеру на 10 дней, дозревание линий происходило на вегетационной площадке (температура составляла 35°С в дневное время, ночные 22-25°С). Биометрический анализ данных устойчивых и неустойчивых линий сортов показал их достоверные различия по реакции на воздействие стрессового фактора. Для выделенных по устойчивости к фактору линий показано сохранение признака в последующих поколениях (табл. 1). Средняя пустозерность линий, выделенных в сорте Лиман, составила у устойчивых 61,9±7,2, у неустойчивых - 86,4±3,1; у линий, выделенных в сорте Изумруд, составила у устойчивых 53,8±6,5, у неустойчивых 80,8±5,9; Гибридизация более устойчивых линий сорта приводит к получению более устойчивого гибрида (табл. 2 и 3). Так, при скрещивании устойчивых родительских форм в комбинации Хазар/Изумруд средняя пустозерность гибридов F1 составила 47,4±5,9, у неустойчивых - 86,3±4,7.
При гибридизации более устойчивого сорта Лиман (в качестве материнской формы) при опылении его менее устойчивым сортом Хазар полученные гибриды более устойчивы к стрессовому фактору: средняя пустозерность гибридов составила 39,9±8,1; в обратной комбинации при гибридизации менее устойчивого сорта Хазар (в качестве материнской формы) при опылении его более устойчивым сортом получены гибриды, средняя пустозерность которых составила 74,5±10,1.
Исследования внутрисортовой специфики по устойчивости к стрессу у изучаемых сортов показали наличие в них линий с различной реакцией на фактор. Изучение внутрисортовой структуры по признаку «устойчивость к высоким температурам» позволило выделить семьи устойчивые и неустойчивые к стрессовому фактору. По признаку «пустозерность» семьи сортов были разделены на четыре группы: до 20%, до 30%, более 70% и более 90%.
240
120
120
120
60
60
Проведено изучение стабильности продуктивности контрастных по устойчивости линий пяти наиболее распространенных сортов риса: Лиман, Рапан, Регул, Лидер, Хазар. Исследования проводили в лизиметрических опытах в условиях: засоления, повышенного (NPK) и низкого фона минерального питания (NPK), в условиях загущенного посева.
Во всех вариантах опыта устойчивые линии имели более высокие значения признаков характеризующих продуктивность и более низкую пустозерность (табл. 4).
В гибридных популяциях второго поколения линий со стабильной продуктивностью в условиях неспецифического стресса (высокие температуры) количество растений с озерненностью метелки более 50% варьировало от полного их отсутствия как в комбинации Baldo х Аметист до 26% в комбинации Volano х Arborio. Высокая пустозерность в условиях стресса говорит о наличии в комбинации летальных и полулетальных генов и общей несбалансированности генома полученного в данных комбинациях (Roma х Флагаман, 97010-TR 1830-4-1-2 х Аметист, MV-73 х Боярин, Baldo х Аметист) таблица 5 (фиг. 1).
Аналогичные исследования проведены с использованием молекулярных маркеров. Анализировали элиминацию аллелей в популяциях дигаплоидных линий гибридов Лиман /Хазар и Хазар /Лиман, а также в популяциях рекомбинантных инбредных линий этих же комбинаций (Лиман/Хазар и Хазар/Лиман), полученных после воздействия высоких температур (35-40°С) в фазу цветения.
Ранее мы показали селективную элиминацию аллелей в культуре пыльников, маркеры расположенные в районе изучаемых локусов приведены в таблице 6.
В работе по маркированию, популяций рекомбинантных инбредных линий комбинаций Лиман/Хазар и Хазар/Лиман, полученных после воздействия высоких температур (35-40°С) в фазу цветения использовали те же маркеры, по которым ранее доказана селективная элиминация в популяции дигаплоидных линий (табл. 7).
В популяции рекомбинантных инбредных линий полученных после воздействия на гибридные комбинации высоких температур (35-38°С) в фазу цветения, на организменном и молекулярном уровне также показана селективная элиминация аллелей снижающими жизнеспособность пыльцевых зерен в культуре пыльников гибридов и, следовательно, возможность использования высокотемпературного стресса для «очищения» генотипов гетерозисных гибридов от аллелей снижающих жизнеспособность. С использованием данной технологии (фиг. 2) в 2019 году переданы на Государственное сортоиспытание 2 сорта риса Ассоль и Смуглянка.
Выводы:
1. Воздействие высоких температур в период цветения, можно считать одним из вариантов гаметной селекции (неспецифическим стрессом), так как оно вызывает значительное повышение пустозерности образцов, следовательно, и гибель гамет как женских, так и мужских.
2. Отбор с использованием температурного стресса в фазу цветения способствует повышению стабильности образцов, и элиминации из популяции особей с генами снижающими жизнеспособность.
3. Воздействие высоких температур в период цветения может быть использован как метод браковки низкопродуктивных семей и выявления семей генетически наиболее сбалансированных.
4. Воздействие высоких температур возможно использовать для элиминации генов снижающих продуктивность и адаптивность в расщепляющихся поколениях гетерозисных гибридов.
Анализ признаков на новизну
Анализ существенных признаков, создающих положительный эффект
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ
1. Струнников В.А. 1987. Генетические методы селекции и регуляции пола тутового шелкопряда. М. ВО «Агропромиздат», на стр. 35.
2. Струнников В.А. 1994. Природа гетерозиса и новые методы его повышения. - М. Наука, 108 с.
3. Струнникова Л.В., Струнников В.А. 1999. Способ закрепления гетерозиса гибридов в последующих поколениях.
4. Жученко А.А. Адаптивное растениеводство (эколого-генетические основы). - Кишинев, Штиинца, 1988.
5. Кравченко А.Н. Особенности элиминации гамет у растений - В сб. «Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке» - М.: ВНИИССОК. 2000. - С. 282-283
6. Лях ВА.. Сорока А.И., Мищенко Л.Ю., Калинова М.Г. Мирошниченко Е.Н. Методы отбора ценных генотипов на уровне пыльцы // Методические рекомендации. Ин-т масличных культур Укр. Академия аграрных наук., Запорожье, 2000 г.
7. Маковей М.Д. Применение метода пыльцевой оценки в селекции тепличного томата на устойчивость к стрессовым абиотическим факторам//Дисс. на соиск. степ. канд. с. -х. наук. - М., 1992 г.
8. Поддубная-Арнольди В.А. Цитоэмбриология покрытосеменных растений - М., 1976. - 507 с.
9. Кравченко А.Н., Лях В.А., Тодераш Л.Г., Салтанович Т.Н., Рожневская М.К., Духовный А.И Методы повышения жизнеспособности рекомбинантов. // Методы гаметной селекции растений. Ин-т экологической генетики и АН РМ, Кишинев. 1990 г.
10. Сенин И.В., Балашова Н.Н., Тимин Н. И. Изменчивость корреляционных связей между количественными признаками семенников и пыльцы моркови // С.-х. биология. - 1996. - №3.- С. 40-45.
11. Балашова Н.Н., Валееева З.Т., Игнатов А.Н., Суслова Л.В., Ущаповский И.В., Жученко А.А (мл.) Даус В.В. К вопросу о роли микрогаметофита в адаптации растений к эконише возделывания. // С.-х. биология. - 1994. - №3. - С. 59-64.
12. Фотев Ю.В. Исходный материал для селекции томата с устойчивостью к стрессовым температурам и болезням Автореф. дисс. на соиск. степ. канд. с. -х. наук. - М., 1992 г.
13. Валько О.В., Поликсенова В.Д., Анохина Н.С., Тимошенко М.К. Использование методов пыльцевого отбора в оценке селекционного материала на устойчивость к кладоспориозу - В сб. «Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке» - М.: ВНИИССОК. 2000. - С. 148-149.
14. А.М. Ismail, S. Heuer, М.J. Thomson, М. Wissuwa Genetic and genomic approaches to develop rice germplasm for problem soils// Plant. Mol. Biol - 2007. - P. 1007-1011.
15. Патент на изобретение №2465771, Способ закрепления гетерозиса гибридов в последующих поколениях / Гончарова Ю.К. Харитонов Е.М. Дата приоритета 13.07.2011, опубликовано 10.11.2012. Бюл. №31 - авт. - 70%.