Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации РНК коронавируса человека SARS-CoV-2 методом изотермической ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
SET OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND FLUORESCENTLY LABELED PROBES FOR THE IDENTIFICATION OF HUMAN CORONAVIRUS SARS-COV-2 RNA BY ISOTHERMAL PCR WITH REAL-TIME HYBRIDIZATION-FLUORESCENCE DETECTION

Изобретение относится к набору олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации РНК коронавируса человека SARS-CoV-2 методом изотермической ПНР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени и может быть использовано в медицине, биотехнологии и генетической инженерии для выявления генетического материала (РНК) коронавируса человека SARS-CoV-2 в клинических образцах, секционных пробах, образцах окружающей среды, культуральных вируссодержащих жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач по мониторингу и изучению свойств коронавируса.
Новый вид вируса коронавируса был зафиксирован в декабре прошлого года в Китае в городе Ухань. Новый коронавирус передается между людьми и вызывает быстрое развитие пневмонии. Для него характерны симптомы ОРВИ, в значительном количестве случаев переходящие в тяжелую пневмонию.
Коронавирусов известно в общей сложности 38. Большинство из них поражает животных и есть всего несколько коронавирусных инфекций, характерных для людей и они вызывают сравнительно легкие респираторные заболевания типа ОРВИ. Известны, однако, два коронавируса, которые в прошлом вызвали достаточно серьезные заболевания. Одно из них - атипичная пневмония (SARS). Ее вспышка началась также в Китае в 2002 году. В 2012 году был выявлен коронавирус, который регулярно передается человеку от одногорбых верблюдов (дромадеров) и вызывает ближневосточный респираторный синдром (MERS).
Отличительная черта коронавируса SARS-CoV-2, заключается в том, что он может передаваться от человека к человеку уже в инкубационном периоде, до вступления заболевания в активную фазу. Инкубационный период, то есть время, прошедшее от момента заражения до появления первых признаков болезни, составляет от 1 до 14 дней. Больной человек на этом этапе выглядит здоровым, и контакт с ним не представляется опасным, что повышает риск распространения инфекции.
С целью контроля и предупреждения завоза и распространения новой коронавирусной инфекции чрезвычайно важным является разработка быстрых и эффективных средств диагностики этого опасного заболевания. Данная заявка на изобретение посвящена разработке набора реагентов для выявления РНК (кДНК) коронавируса SARS-CoV-2 методом изотермической ПНР с гибридизационно флуоресцентной детекцией. Амплифицируемый участок, являясь маркерным, позволяет выявить с помощью специфичных праймеров вирусную кДНК в исследуемом образце.
Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. Праймеры должны быть комплементарны нуклеотидным последовательностям кДНК, ограничивая амлифицируемый участок справа и слева таким образом, чтобы синтез ДНК ДНК-полимеразой проходил строго в выбранном регионе. Правильный выбор праймеров позволяет осуществить экспоненциальное увеличение количества копий целевого участка кДНК. В целом от правильности выбора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров зависит специфичность проводимой ПНР, а значит и точность диагностики вирусного заболевания.
Известен "АмплиСенс COVID-19-FL" - набор реагентов для выявления и количественного определения РНК SARS-CoV-2 в биологическом материале и в объектах окружающей среды методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией (ЦНИИ Эпидемиологии, г. Москва), включающий праймеры, для амплификации кДНК коронавируса человека, из клинического материала.
Кроме того, была разработана тест-система "АмплиТест SARS-CoV-2 LAMP" для детекции вируса SARS-CoV-2 методом изотермической амплификации. Однако, указанные наборы реагентов были разработаны в начальный период вспышки заболеваемости, вызванным коронавирусом.
За прошедшие два года, в ходе эпидемиологических исследований, учеными были выделены новые штаммы этого вируса. Для этих новых геновариантов выше названные наборы праймеров не будет обладать достаточной специфичностью, чтобы обеспечить надежный синтез целевых фрагментов ДНК и таким образом, праймеры, используемые в выше приведенных аналогах, имеют недостаточную гомологию к новым последовательностям генома SARS-CoV-, циркулирующих в настоящее время в дикой природе.
Известен набор праймеров RT-LAMP для обнаружения нового коронавируса SARS-CoV-2 (патент Нидерландов №2027315, МПК C12N 15/11, опубл. 28.10.2021) и набор для выявления нового коронавируса SARS-CoV-2 методом RT-LAMP по району orfR геномной РНК, с химической детекцией продуктов ПЦР по пирофосфатам, созданный в китайском университете Qilu University of Technology.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является набор праймеров для диагностики коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 методом RT-LAMP по районам orflab и N геномной РНК с гибридизационно-флюоресцентной детекцией (международная заявка WO 2021/201601, МПК C12Q 1/6818, опубл. 07.10.2021), разработанный корейской компанией SEASUN BIOMATERIALS.
Однако, праймеры, используемые в выше приведенных аналогах также имеют недостаток, свойственный наборам, разработанным ранее, в которых не учитываются мутации в геномных последовательностях коронавирусов появившиеся в природных изолятах в последнее время и к настоящему времени уже широко распространившиеся и циркулирующих в дикой природе. За прошедшие два года, в ходе эпидемиологических исследований, учеными были выделены новые штаммы вируса SARS-CoV-2. Для этих новых геновариантов выше названные наборы праймеров не будет обладать достаточной специфичностью, чтобы обеспечить надежный синтез целевых фрагментов ДНК. Таким образом, праймеры, используемые в приведенных аналогах и прототипе, имеют недостаточную гомологию к новым последовательностям генома SARS-CoV-2, циркулирующим в настоящее время в дикой природе. Кроме того, в большинстве аналогов используется один таргетный (диагностический) район, что так же снижает диагностическую чувствительность тест-системы и делает ее более чувствительной к случайным мутациям. Но даже использование диагностического района гена lab является различным во всех приведенных аналогах.
Техническим результатом заявленного изобретения является создание набора праймеров для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 тяжелого острого респираторного синдрома (COVID-2019) методом изотермической амплификации, который обеспечивал бы при высокой чувствительности более высокую специфичность и детекцию только коронавируса человека SARS-CoV-2 в клинических образцах.
Указанный технический результат достигается созданием набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации коронавируса человека SARS CoV-2 методом LAMP ПНР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, содержащих диагностические пары праймеров к двум генам lab и S вируса SARS-CoV-2 и DARC-зонды, а также пару праймеров к ферменту Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase - GAPDH, EC 1.2.1.12 и имеющие следующую первичную последовательность:
SARS-CoV 2019 LAMP (I)
RT-изотермическая полимеразная цепная реакция (RT-ПЦР) проводится одновременно на два таргетных района (lab и S) с детекцией продуктов LAMP-ПЦР и использованием двух флуоресцентно-меченых зондов (DARC-зонды).
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.
На фиг. 1. представлена схема прохождения реакции LAMP (New England Biolabs).
На фиг. 2 и фиг. 3 представлены праймеры для LAMP на две мишени (районы S1 и lab). На фиг 2. приведено строение праймеров для LAMP SARS-CoV 2019 на таргетный район S1 (21158-21367 bp). На фиг 3. строение праймеров для LAMP SARS-CoV 2 на таргетный район lab (19477-19606 bp).
На фиг. 4 представлены ключевые мутации основных геновариантов SARS-CoV 2 в lab и S генах.
На фиг. 5 представлена флюоресценция продуктов ПЦР в режиме реального времени для оценки чувствительности с 10-кратными разведениями плазмидной ДНК.
На фиг. 6 приведена флюоресценция продуктов ПЦР в режиме реального времени. Анализ клинических образцов (мазки из зева и носа) инфицированных коронавирусом SARS CoV-2 пациентов (образец 39 Ct 33).
На фиг. 7 представлены данные флюоресценции продуктов ПЦР в режиме реального времени. Анализ клинических образцов (мазки из зева и носа) инфицированных коронавирусом SARS CoV-2 пациентов (образец 39, Ct 34) с использованием праймеров рекомендованных ВОЗ для ПЦР диагностики коронавирусом SARS CoV-2.
На фиг. 8 изображен график, где представлен результат ПЦР (СТ-25,72), который свидетельствует об успешной экстракции РНК и построении к ДНК на ее основе.
На фиг. 9 изображен график, где представлены результаты проверки аналитической специфичности набора праймеров и реагентов.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это широко известный подход к амплификации специфических ДНК последовательностей. ПЦР включает в себя повторяющуюся циклическое изменение температуры реакционного коктейля.
LAMP&RT-LAMP (петлевая изотермическая амплификация & петлевая изотермическая амплификация, совмещенная с обратной транскрипцией) является альтернативным подходом к амплификации специфического образца ДНК, не требующим изменения температуры реакционной смеси.
Проведение изотермической амплификации требует намного меньше времени и не требует амплификатора, что делает методику особенно удобной для применения в поле и во время приема пациента.
Преимущества методики:
• Быстрый протокол;
• Минимальное количество требуемого оборудования;
• Надежное проведения реакции в присутствии ингибиторов полимеризации;
• Простая оптическая детекция прохождения реакции.
На Фиг. 1 представлена схема проведения эксперимента при реализации петлевой изотермической амплификации. LAMP была создана для детекции таргентых нуклеиновых кислот без использования сложного оборудования. В протоколе используется 4-6 праймеров, которые направлены на распознание 4-6 определенных регионов таргетной ДНК. ДНК-полимераза, которая обладает способностью к расплетанию цепей, инициирует синтез, и два праймера формируют петлеобразную структуру мультиплицирующуюся на последующих раундах амплификации.
Используемый для проведения анализа с помощью LAMP набор состоит из 2 внешних (F3 и В3) и 2 внутренних (FIP и BIP) праймеров, которые распознают 6 отдельных областей последовательности ДНК-мишени (F3c, В3с, F2c, В2с, F1 и В1). Прямой внутренний праймер (FIP - Forward Internal Primer) в направлении 5'→3' состоит из области F1c, комплементарной последовательности мишени F1, и области F2, которая комплементарна участку F2c. Аналогично обратный внутренний праймер (BIP - Backward Internal Primer) состоит из областей В1с и В2, комплементарных последовательностям В1 и В2с в ДНК-мишени. Внешние праймеры F3 и В3 имеют последовательности, комплементарные участкам F3c и В3с соответственно. Применяемые для процедуры LAMP праймеры оптимизированы в целях удовлетворения ряду критериев, таких как температура плавления, GC-состав, длина и расстояния между участками в ДНК-мишени, стабильность 5'- и 3'-концов и т.д.
Амплификационный процесс начинается с формирования комплекса FIP с целевой ДНК в области F2 с образованием двухцепочечной ДНК при температуре около 55-65°С. Затем Bst-ДНК-полимераза с вытесняющей (хеликазной) активностью садится на эту двухцепочечную ДНК с FIP и начинает достраивать вторую цепь одновременно вытесняя ее. После этой стадии праймер F3 связывается с комплементарной областью F3c и Bst-ДНК-полимераза начинает замещать недостающую FIP-комплементарную цепь. Благодаря наличию последовательности F1c в FIP последняя способна самоотжигаться и образовывать петлевую структуру на одном конце ДНК. Эта цепь затем служит мишенью для инициированного с BIP синтеза ДНК и последующего замещения цепи начавшегося с В3. Подобное явление позволяет другому концу одноцепочечной ДНК также образовывать форму петли, в результате чего получается напоминающая гантель структура, служащая шаблоном для последующей амплификации.
9
После образования гантелеподобной структуры происходит экспоненциальная амплификация аналогичных образований, при этом ДНК-полимераза запускает синтез ДНК из области F1. FIP также гибридизуется с однопетлевой структурой из участка F2, и синтез ДНК этого праймера вызывает смещение праймированной с области F1 цепи и самосвязывание ее в петлевую структуру. Наконец, с другой стороны фрагмента ДНК, из области В1 в новой петле повторно начинается синтез самопраймированной ДНК с амплификацией текущей матрицы и созданием новой из замещения FIP-комплементарной цепи. Благодаря этому повторяющемуся процессу возможно получение больших количеств нуклеиновых кислот - ДНК может быть амплифицирована до 10 копий в течение 1 ч.
LAMP реакции могут быть проведены при помощи термостата или водной бани, а детекция результатов, из-за большого количества копий, может быть проведена визуально по хромогенной реакции, без инструментального измерениями и тем самым с высокопропускной способностью.
Материалы и реактивы.
В работе были использованы следующие материалы и реактивы: трис-(оксиметил)-аминометан, диметилсульфоксид (ДМСО), маркеры молекулярных масс белков, 3,3-диаминобензидин тетрагидрохлорид, ФИТЦ (F7250), ФИТЦ меченый стрептоавидин (S2313), N-гудроксисукцинимидный эфир биотина (Н1759), EDAC (Е7750), натриевая соль MES (М3058), ("Sigma", США); ПЭГ-20000 ("Merck", США); полиэтиленгликоль м.в. 6000 (ПЭГ-6000), этилендиаминтетрауксусная кислота, глицерин, трипановый синий, сахароза, глицин, твин-20, натрия азид ("Serva", США); набор для определения концентрации белка "Bio-Rad Protein Assay Kit" ("BioRad", США); акриламид, бисакриламид, натрия додецилсульфат, тетраметилэтилендиамин (ТЕМЭД), 2-меркаптоэтанол, бромфеноловый синий, кумасси G-250, амидочерный 10В ("Bio-Rad" США); казеин, бычий сывороточный альбумин (БСА), яичный альбумин, пластиковая культуральная посуда ("Costar", США).
Вирусные штаммы. В работе были использованы вирусы и вируссодержащий материал из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Культуры клеток и среды. Клетки 293 получены из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». В работе использовали питательные среды: среда Игла MEM с двойным набором аминокислот и витаминов производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Культивирование вирусов. Культивирование вируса проводили в стационарном режиме на монослое клеток 293 в культуральных флаконах объемом 1 л. Множественность заражения монослоя составляла 0,1 ЛД50 или 0,01 ЛД50 на клетку в зависимости от задачи исследования. Адсорбцию вируса проводили в течение 40 мин при температуре 37°С. После этого монослой заливали питательной средой Игла MEM с двойным набором ингредиентов, в которую добавляли 0,06% глутамина и 0,05%, 0,4% или 2% человеческого сывороточного альбумина (в зависимости от условий эксперимента для получения вакцинного препарата) или 2% эмбриональную сыворотку КРС (для выделения анализа белков вируса) и антибиотиков (бензилпенициллина - 100 ед/мл, стрептомицина - 100 мкг/мл). Объем питательной среды составлял 10-15% емкости культурального сосуда. Затем клетки инкубировали при температуре 37°С до появления ЦПД. КВЖ использовали для выделения РНК вируса.
Выделение вирусной РНК. Для выделения РНК/ДНК было использовано решение от Nimagen (Голандия), с использованием полимерных материалов, а так же набор «Рибо-ПРЕП» (ЦНИИ Эпидемиологии, Россия), согласно инструкции по применению.
Оптимизацию ПЦР проводили с использованием амплификаторов Rotor Gene 6000 («Corbett Research», Австралия), CFX96 («BioRad», США) и GENIE II (GB). Электрофоретическую детекцию продуктов амплификации в агарозном геле проводили с использованием электрофоретических камер SE-20 (Хеликон, Россия), источников питания PowerPac Basic (Bio-Rad), системы видео документирования Molecular Imager Gel Doc XR System («BioRad», США) с прилагаемым ПО.
Оценка специфичности продуктов ПЦР. После проведения ПЦР с помощью праймеров F3 и В3 полученные фрагменты ДНК очищали с использованием набора QIAEX II Gel Extraction Kit («Qiagen», США) и определяли нуклеотидные последовательности на автоматическом секвенаторе ABI Genetic Analyzer 3500xl (ABI, США). Нуклеотидные последовательности анализировались с использованием базы данных NCBI MegaBLAST.
Нуклеотидные последовательности. Нуклеотидные последовательности были взяты из базы данных GenBank [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/].
Статистическая обработка полученного материала проводилась с использованием STATISTICA 6.0 for Windows (Stat Soft, USA). При статистической обработке данных для ненормально распределенных признаков использовали непараметрический критерий Манна-Уитни и коэффициент корреляции Спирмена. Сравнение частот встречаемости проводили по критерию χ 2. Для показателей, чьи вариационные ряды приближались к нормальному, применяли дисперсионный анализ. При множественном сравнении средних использовали LSD-тест, а при сравнении 2-х средних - t-критерий Стьюдента.
Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили при помощи приложения AlignX программного пакета Vector NTI 10 (Informax, США).
Филогенетический анализ штаммов и изолятов вируса гриппа проводили при помощи программы MEGA 4 [17]. Филогенетические деревья строили по методу объединения ближайших соседей на основе матриц генетических расстояний, рассчитанных по модели Юкса-Кантора. Индексы поддержки ветвей определяли перестановочным тестом (bootstrep) для 1000 повторов.
В работе было использовано лицензионное программное обеспечение Microsoft Office 2010, Vector NTI 11.5, Lasergene 7 и MEGA 7.
Результаты
Формат реакции был выбран как OneStep RT-LAMP-ПЦР и включает следующие этапы:
1. Экстракцию РНК из образцов биологического материала в присутствии внутреннего контрольного образца, который позволяет оценить качество анализа каждой биопробы. Для выделения РНК/ДНК было использовано передовое решение от Nimagen, с использованием полимерных материалов, что позволило в два раза ускорить процесс пробоподготовки, с 40 мин, до 20 мин.
Реагент GenePurgeDirect (Nimagen) состоит из полимерных материалов, которые обеспечивают быстрое извлечение нуклеиновых кислот из клеток в форме, которую можно использовать для ПЦР. Ингибиторы ПЦР, высвобождающие во время лизиса и другие вещества, которые могут принять участие в реакции ПЦР, сегрегируются с полимерным материалом, и супернатант, содержащий нуклеиновые кислоты, может быть использован напрямую для ПЦР. Протокол выделения РНК занимает до 20 минут.
Для проведения лабораторных испытаний при выделении РНК/ДНК, были использованы зарегистрированные на территории Российской Федерации наборы реагентов.
2. При разработке представленных в заявляемом наборе диагностических праймеров было синтезировано 4 комплекта праймеров с различной первичной структурой для LAMP, с использованием NEB LAMP Primer Design Tool (version 1.0.2), с каждой из которых были проведены соответствующие исследования. Эмпирическим путем была определена наиболее подходящая пара праймеров, обладающая наибольшей аналитической чувствительностью и 100%-ной специфичностью на панели заявленных образцов. В результате работы были подобраны оригинальные праймеры для постановки LAMP.
В работе, помимо дизайна структуры праймеров и олигонуклеотидного зонда, были получены положительные контрольные образцы, представляющие из себя рекомбинантную плазмиду, несущую вставки ДНК комплементарные участкам гена lab и S коронавируса SARS CoV-2.
С использованием положительных контрольных образцов эмпирическим путем были подобрана оптимальная температура отжига диагностических праймеров, которая отличается от теоретической, рассчитанной с использованием компьютерных программ. Также, была установлена аналитическая чувствительность праймеров/зонд для идентификации коронавируса человека SARS CoV-2. Заявленные диагностические праймеры обладают 100%-ной специфичностью на панели отрицательных контрольных образцов. Экспериментальным путем было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд не имеют гомологии с человеческой ДНК и не взаимодействуют с геномной ДНК человека, летучих мышей и других животных. На панели положительных контрольных образцов, состоящей из образцов, содержащих генетический материал коронавирусов, произведена оценка чувствительности данной пары диагностических праймеров. С использованием положительного контроля определена аналитическая чувствительность заявляемой пары диагностических праймеров, которая составила не менее 50 геном-эквивалентов на реакцию.
Из приведенных выше доводов следует, что заявленный набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации генетического материала SARS CoV-2 методом LAMP ПЦР в реальном времени соответствует критерию «изобретательский уровень».
Реакцию обратной транскрипции и получение кДНК на матрице РНК и амплификацию целевых фрагментов кДНК при помощи специфичных к этим участкам пар праймеров проводили при помощи фермента Bst (Инова Плюс, Россия) в сочетании с обратной транскриптазой M-MuLV (Инова Плюс, Россия) в одной реакции.
3. Детекция результатов ПНР.
Для детекции результатов возможно использовать несколько методов:
- регистрация результатов непосредственно в ходе изотермической ПЦР с использованием автоматических регистрирующих приборов: iQ5, Genie II и CFX96.
- По внешнему виду смеси, за счет специфической окраски образующейся в присутствии реагентов выявляющих пирофосфаты, в сравнении с калибровочными образцами (полевой вариант).
В нашем варианте были использованы DARC-зонды, когда праймер меченый флюорофором (Fam) и праймер с гасителем (Quenched) расположены в комплементарных цепях, а в процессе амплификации праймер меченый флюорофором включатся в синтезируемую цепь вытесняет Quenched и тем самым флюоресценция увеличивается.
4. Получение стандартных положительных контрольных образцов (СОП), внутреннего контрольного образца (ВКО) и панели положительных контрольных образцов SARS-CoV2. Для получения стандартных положительных контрольных образцов и внутреннего контрольного образца использованы методы молекулярного клонирования специфических фрагментов кДНК в плазмиды (E. Coli). Полученные стандартные образцы оценивались количественно.
Для формирования панели положительных и отрицательных контрольных образцов была использована коллекция природных изолятов SARS-CoV2 и гетерологичных вирусных штаммов ФБУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора.
Для ВКО использовали праймеры и зонд на ген домашнего хозяйства (human).
Для выбора генотип-специфичных праймеров и ДНК-зондов предварительно был проведен анализ всех известных к настоящему моменту последовательностей геномов выбранных вирусов и представленных в базе данных GISAD и GenBank. С использованием известных последовательностей были построены элайменты, соответствующие как полногеномным последовательностям, так и отдельным участкам генома вируса. На основе полученных данных для каждого из выбранных вирусов были найдены уникальные замены и отобраны пары праймеров, в максимальной степени отвечающие необходимым требованиям.
Для успешного проведения LAMP очень важен правильный дизайн праймеров. Подбор и анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и зондов проводился с использованием программного обеспечения Vector NTI 8 (InforMax) и NEB LAMP Primer Design Tool (version 1.0.2), с помощью которого можно провести конструирование праймеров на основе известной последовательности нуклеотидов
Подбор праймеров осуществлялся на область lab и S геномной РНК коронавируса SARS CoV-2. При этом праймеры подбирались с на консервативный район коронавируса SARS CoV-2, с учетом известных генотипов взятых с GISAD и наименьшей гомологией к другим коронавирусам человека и животных, а также к геному человека (Blast, GenBank).
Наиболее сложной задачей при расчете праймеров являлся максимальный учет мутаций в геномной РНК SARS-CoV 2. На фиг. 4 представлены ключевые мутации основных геновариантов SARS-CoV 2 в lab и S генах.
На фиг. 4 представлены ключевые мутации основных геновариантов SARS-CoV 2 в lab и S генах.
Из представленных NEB LAMP Primer Design Tool вариантов были отобраны те, что были комплиментарны районам геномной РНК с минимальным числом нуклеотидных замещений при сравнении последовательностей SARS-CoV 2 с множественным выравниванием. Из выбранных вариантов были выбраны те, что показали максимальную чувствительность и специфичность во время лабораторных испытаний.
Положительные контрольные образцы были получены методом молекулярной трансформации компетентных бактериальных клеток Escherichia coli бактериальными плазмидами pCR 2.1 (Invitrogen, США), включающими вставки ДНК, комплементарные участкам гена lab и S коронавируса SARS CoV-2, с последующим выделением плазмидной ДНК из бактериальных клеток.
Постановка RT-LAMP-PCR
4
2
Реакцию RT-LAMP-PCR проводили в конечном объеме 15 мкл. Реагент 1 (5,5 мкл): 1,5 мкл PCR-mix х10, 1.0 мкл 10 мМ dNTP, 0,7 мкл MgSO 100 mM, 1 мкл F3/B3 (10 мкМ), 1 мкл FIP/BIP (40 мкМ), в которую добавляют Реагент 2 (1,0 мкл): 0,5 мкл Ultra Fast Bst DNA полимераза (Инова Плюс), 4 единицы на реакцию и 0,5 мкл InovaScript обратная транскриптаза, 20 ед. на реакцию. В пробирку с 6,5 мкл реакционной смеси вносят от 1 до 8,5 мкл очищенной РНК и НО до конечного объема 15 мкл.
В качестве положительного контрольного образца используют раствор (5 мкл) рекомбинантной плазмиды, содержащей фрагмент кДНК SARS-COV2 (К+).
В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь вместо положительного контрольного образца добавляли 5 мкл ТЕ-буфера (К-).
Для ВКО использовали раствор с праймерами и зондом на ген домашнего хозяйства (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase - GAPDH (EC 1.2.1.12) 37kDa).
В качестве гетерологичных контрольных образцов используют РНК вируса гриппа (H1N1, H3N2, H5N2), аденовируса 5 серотипа, SARS, MERS, коронавируса NL63 и отрицательный контрольный образец - вода. Образцы контрольной и тестовой РНК инкубируют при 52°С в течение 40 мин.
Визуализацию продуктов LAMP проводили путем измерения интенсивности флюоресценции продуктов реакции с использованием флюоресцентно-меченых зондов или органолептически, в присутствии HNB (Sigma), по изменению цвета реакционной смеси, для бес приборного формата. Полученные продукты LAMP-ПЦР также визуализировались путем электрофореза в 2% агарозном геле, окрашенном этидиумбромидом (Sigma).
7
Для определения аналитической чувствительности «праймеры зонд» для детекции вируса из концентрированных растворов положительных контрольных образцов были приготовлены последовательные 10-кратные разведения. Определение концентрации ДНК в разведениях при исследовании чувствительности праймеров осуществляли при помощи коммерческого набора «Quant-iT dsDNA, HS» («Invitrogen», США) и флуориметра QUBIT («Invitrogen», США). Для контроля повторяемости использовали образец СОП ПКО SARS CoV-2 разведенный до концентрации 1,0×10 копий/мл (5 образцов). Процедура проводится одним оператором на одном наборе. Коэффициент вариации для повторяемости рассчитывается по формуле: CVp,%=Ct (станд отклон) / Ct (ср.знач.) × 100% для 5 проб СОП ПКО SARS CoV-2 и не должен превышать 3%.
7
Для контроля воспроизводимости используют образец СОП ПКО SARS CoV-2 разведенный до концентрации 1,0×10 копий/мл (10 образцов). Процедура проводится двумя разными операторами с двумя разными наборами одной серии в разные дни.
Коэффициент вариации для воспроизводимости рассчитывается по формуле: CVp,%=Ct (станд отклон) / Ct (ср.знач.) × 100% для 10 проб СОП ПКО SARS CoV-2 и не должен превышать 6%.
Минимальное количество ДНК-матриц, детектируемое с применением наших праймеров и зондов после оптимизации условий проведения реакции, выраженное в ГЭ (геномных эквивалентах) в 24 мкл реакционной смеси, составило 50 ГЭ (Ct 39,5).
На фиг. 5 представлена флюоресценция продуктов LAMP ПЦР в режиме реального времени. Оценка чувствительности с 10-кратными разведениями плазмидной ДНК.
Прослеживается зависимость накопления флуоресцентного сигнала от концентрации матричной ДНК (кДНК коронавируса SARS CoV-2) (Кривые 1-7).
Специфичность отжига праймеров и зондов проверяли постановкой ПНР в режиме реального времени с использованием в качестве детектируемых образцов синтетической последовательности фрагмента гена SARS CoV-2 и кДНК вируса соответственно, полученные из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Контроль специфичности осуществляли проведением ПЦР с флуоресцентной детекцией, где в качестве исследуемых образцов использовали пробы, содержащие генетический материал коронавируса SARS CoV-2 и пробы, содержащие генетический материал гетерологичных вирусов (вирус гриппа типа А, Коронавирус SARS, аденовирус 5 типа, вирус денге, RSV). Не специфических перекрестных реакций отмечено не было.
На фиг. 6 приведена флюоресценция продуктов LAMP ПЦР в режиме реального времени. Анализ клинических образцов (мазки из зева -34 и носа -33) инфицированных коронавирусом SARS CoV-2 пациента (образец 33, Time 35 и 40).
На фиг. 7 представлены данные по флюоресценции продуктов ПЦР в режиме реального времени клинического образца (мазки из зева и носа) инфицированного коронавирусом SARS CoV-2 пациента (К+, Ct 20 и образец 39, Ct 23) с использованием праймеров рекомендованных ВОЗ для ПЦР диагностики заболевания вызванного коронавирусом SARS CoV-2. Полученные данные свидетельствуют о специфичности выбранных нами праймеров для набора реагентов «Вектор RT-LAMP SARS CoV-2».
Таким образом, был разработан набор реагентов «Вектор RT-LAMP SARS CoV-2» предназначенный для выявления РНК коронавируса SARS CoV-2 методом, основанным на амплификации кДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизационно флуорецентной детекции продуктов амплификации в режиме реального времени.
Для определения возможности использования указанных комплектов реагентов для выделения РНК и получения кДНК коронавируса использовали клинический материал - мазки из ротоглотки, контаминированные коронавирусом SARS (штамм Frankfurt 1) из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
На фиг. 8 представлен положительный результат LAMP ПЦР (Time -10,2), который свидетельствует об успешной экстракции РНК и построении к ДНК на ее основе.
Проверка аналитической специфичности набора реагентов «Вектор RT-LAMP SARS CoV-2» с заявляемым набором праймеров и зонда при тестировании на вирусе гриппа В, вирусах парагриппа 1-4, риновирусах, человеческих метапневмовирусах Контроль аналитической специфичности набора реагентов «Вектор RT-LAMP SARS CoV-2» осуществляли проведением ПЦР с флуоресцентной детекцией, где в качестве исследуемых образцов использовали инактивированные образцы культуральной жидкости, содержащие следующие штаммы из Государственной коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»: коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ) штамм hCoV-EMC/2012); коронавирус SARS (штамм Frankfurt 1), вирус гриппа B/Chita/01/2010, вирус гриппа B/Chita/02/2010, вирус гриппа B/Chita/03/2010, вирус гриппа B/Chita/04/2010, РСВ штамм Long, аденовирус типа 5 штамм AD-GP (АВ_AD-GP), а также охарактеризованные изоляты риновируса человека С (изолят RhV-NSC-14/2012), риновируса человека А (изолят RhV-NSC-08/2011, изолят RhV-NSC-11/2012) и клинический материал, содержащий вирус парагриппа 1-4 и метапневмовирус человека.
Из представленных данных на фиг. 9 следует, что набор реагентов «Вектор RT-LAMP SARS CoV-2» не дает положительных результатов с образцами, содержащими гетерологичные вирусы: коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ); коронавирус SARS, вирус гриппа В, РСВ, метапневмовирус человека, аденовирус типа 5, риновируса человека, вирус парагриппа 1-4 и ДНК человека (К+ Time 34,8).
Медицинское изделие для in vitro диагностики «Набор реагентов «Вектор RT-LAMP SARS CoV-2» предназначено для выявления РНК коронавируса SARS CoV-2 методом, основанным на изотермической амплификации кДНК с гибридизационно-флуорецентной детекции продуктов амплификации в режиме реального времени. Диагностическая роль набора реагентов «Вектор RT-LAMP SARS CoV-2» заключается в возможности его использования для ранней диагностики коронавируса SARS CoV-2, индикации патогенных биологических агентов (ПБА); как ускоренного предварительного теста при выполнении культурального и биологического методов исследования и идентификации подозрительных культур для эпидемиологического мониторинга.
В состав набора на 50 определений входят следующие компоненты:
1. PCR-mix x10 - прозрачная бесцветная жидкость 0,10 мл 1 пробирка;
2. Реагент 2 - прозрачная светло-желтая жидкость 0,26 мл 1 пробирка;
3. ПКО - Положительный контрольный образец, прозрачная бесцветная жидкость 0,10 мл 1 пробирка;
4. ОКО - Отрицательный контрольный образец прозрачная бесцветная жидкость 0,10 мл 1 пробирка;
5. ВКО - Внутренний контрольный образец прозрачная бесцветная жидкость 0,10 мл 1 пробирка.
Референтный метод
Для выявления РНК коронавируса SARS CoV-2 методом LAMP ПЦР, в качестве референтного метода использовали тест-систему "АмплиТест SARS-CoV-2 LAMP" для детекции вируса SARS-CoV-2 методом изотермической амплификации (ЦНИИ Эпидемиологии, Москва), (https://lab-medica.ru/covid-19/vyyavleniya-rnk-koronavirusa-sars-cov-/amplitest-sars-cov-2-lamp).
Подлинность используемых штаммов вирусов из Государственной коллекции микроорганизмов 1-4 групп патогенности ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» была подтверждена секвенированием.
Обеззараживание проб
Обеззараживание проб проводили в соответствии с требованиями СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и МУ 1.3.2569 -09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
Пробы, содержащие гетерологичные вирусы в объеме 1 мл переносили в микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 мл, добавляли натрия мертиолят до концентрации 1:10000 (0,01%) и прогревали при (56±1)°С в течение 30 минут. Затем в отдельные микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 мл переносили по 100 мкл обработанных мертиолятом натрия вирусосодержащих проб. Во все пробирки, добавляли лизирующий буфер на основе 6М гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения РНК, и инкубировали 15 минут при температуре (65±1)°С. После выполнения данного этапа материал считался обеззараженным.
Процедура измерения и оценки результатов анализа. ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе CFX 96 (BioRad, США) по каналу Fam.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла "Ct" в соответствующей графе в таблице результатов).
Результат подлежит учету в случае:
а) появления пересечения кривых флуоресценции с пороговой линией на канале FAM (канал измерения указан во вкладыше к набору) в пробах с положительными контрольными образцами (ПКО);
б) отсутствия положительного сигнала на канале FAM (канал измерения указан во вкладыше к набору) в пробе с отрицательными контрольными образцами (ОКО).
Результат считать положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию. При этом значение Ct для данного образца должно быть менее 35. Амплитуда сигнала при этом не имеет значения. Результат считать отрицательным, если значение Ct на канале Fam (канал измерения указан во вкладыше к набору) отсутствует. Если значение Ct больше 35, то анализ необходимо повторить и считать положительным в случае повторения результата или при значении Ct меньше 35.
4
Чувствительность медицинского изделия (МИ) «Набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS CoV-2 методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Вектор RT-LAMP SARS CoV-2» с использованием заявляемых праймеров и зонда по ТУ 21.20.23-088-05664012-2020», при исследовании наборами двух серий 50 проб, содержащих генетический материал коронавируса SARS CoV-2 в концентрации не менее 1×10 копий/мл, составляет 100%.
Внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость для всех положительных образцов - 100%.
4
Специфичность МИ «Набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS CoV-2 методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Вектор RT-LAMP SARS CoV-2» с использованием заявляемых праймеров и зонда по ТУ 21.20.23-088-05664012-2020» при исследовании проб, содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV в концентрации не менее 1×10 копий/мл, составляет 100%.
Специфичность МИ «Набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS CoV-2 методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Вектор RT-LAMP SARS CoV-2» с использованием заявляемых праймеров и зонда по ТУ 21.20.23-088-05664012-2020» - при исследовании наборами двух серий 200 отрицательных образцов, содержащих НК гетерологичных микроорганизмов (вирус денге, аденовирус 5 типа, вирус гриппа типа А, вирус гриппа типа В, вирус парагриппа 1 типа, респираторно-синцитиальный вирус), 8 отрицательных образцов, содержащих ДНК человека, 20 образцов мокроты и 20 образцов смывов из полости носоглотки, 20 образцов мокроты, 4 клинических образца мазков из ротоглотки, для которых клинически подтвержден вирус парагриппа 1 типа, 4 клинических образца мазков из ротоглотки, для которых клинически подтвержден вирус гриппа типа А, 2 клинических образца мазков из ротоглотки, для которых клинически подтвержден вирус гриппа типа В, 2 клинических образца мазков из ротоглотки, для которых клинически подтвержден респираторно-синцитиальный вирус отрицательный результат в ПЦР получен для 200 образцов. Диагностическая специфичность - не менее 98% с доверительной вероятностью 90%.
Статистическая обработка результатов проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по порядку проведения экспертизы качества, эффективности и безопасности медицинских изделий», утв. ФГБУ «ЦМиКЭЭ» и ФГБУ «ВНИИМТ» 14.11.2013 г. Статистическую достоверность полученных результатов испытаний оценивали в зависимости от числа параллельных опытов при доверительной вероятности 90%, используя формулу биноминального распределения Бернулли.
4
При испытаниях МИ «Вектор RT-LAMP SARS CoV-2» на 50 положительных пробах (2 по 25 проб), содержащих генетическийматериал коронавируса SARS CoV-2 в концентрации не менее 1×10 копий/мл был получен положительный результат в 100% случаев (50 проб из 50 заведомо положительных).
4
При испытаниях МИ «Вектор RT-LAMP SARS CoV-2» на 20 пробах, не содержащих генетический материал коронавируса SARS CoV-2 в концентрации не менее 1×10 копий/мл (152 пробы, содержащих гетерологичные вирусы, по 20 проб смывов из полости носоглотки и мокроты и 8 содержащих ДНК человека), отрицательный ответ получен в 20 пробах (100% случаев). В ходе испытаний с использованием 25 положительных проб, содержащих генетический материал коронавируса SARS CoV-2 (каждая на 2 сериях набора), и на отрицательных пробах, содержащих ДНК человека (4 проб), смывы из полости носоглотки (10 проб), мокроту (10 проб), мозговую суспензию мышей (10 проб) и НК гетерологичных вирусов (аденовирус 5 типа (10 проб), вирус денге (10 проб), вирус гриппа А (52 пробы), вирус гриппа В (1 проба), вирус парагриппа 1 типа (2 пробы), респираторно-синцитиальный вирус (1 проба)) - суммарно на 100 пробах (каждая на 2 сериях набора), доказана диагностическая эффективность медицинского изделия «Вектор RT-LAMP SARS CoV-2» с использованием заявляемого набора праймеров и зонда.