Применение консорциума аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов для ремедиации черноземной и серой лесной почв Республики Татарстан

УДК 574.24

И. А. Дегтярева, А. Я. Давлетшина

ПРИМЕНЕНИЕ КОНСОРЦИУМА АБОРИГЕННЫХ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ РЕМЕДИАЦИИ ЧЕРНОЗЕМНОЙ И СЕРОЙ ЛЕСНОЙ ПОЧВ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН

Ключевые слова: углеводороды, ремедиация, почва, загрязнение, консорциум, углеводородокисляющие микроорганизмы.

Из черноземной почвы Республики Татарстан выделен эффективный консорциум микроорганизмов-деструкторов, способный утилизировать углеводороды в концентрациях до 12 %. Консорциум состоит из трех штаммов (Achromobacter insolitus, Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas stutzeri), каждый из которых способен утилизировать дизельное топливо в концентрации до 10 %. В вегетационных опытах консорциум аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов проявил высокую эффективность деструкции углеводородов на различных типах почв, загрязненных дизельным топливом, - до 62% на черноземе и до 70% на серой лесной.

Keywords: hydrocarbons, remediation, soil, contamination, consortium, hydrocarbon oxidizing microorganisms.

Of chernozem soil Republic Tatarstan highlighted effective consortium microorganisms destructors capable of utilizing hydrocarbons at concentrations up to 12.0%. Consortium consisting of three strains (Pseudomonas stutzeri, Achromobacter insolitus, Achromobacter xylosoxidans), each of which is capable of utilizing the diesel fuel at a concentration of 10.0%. In pot experiments consortium of indigenous hydrocarbon-oxidizing microorganisms showed high efficiency of degradation of hydrocarbons in various types of soils contaminated with diesel fuel - up to 62% on chernozem and to 70% for gray forest.

Введение

Значительные трудности возникают при восстановлении почвенных экосистем,

загрязненных нефтью и продуктами ее переработки [1, 2]. Почва, обладая высокой адсорбирующей способностью, аккумулирует в себе большую часть углеводородов. При этом изменяются ее физические, агрохимические и микробиологические характеристики.

В структуре земельного фонда Республики Татарстан (РТ) основная доля приходится на земли сельскохозяйственного назначения. Наибольшее значение имеют черноземные, серые лесные и дерново-подзолистые почвы, площадь которых равна 43.7, 43.1 и 7.7% соответственно от общей площади сельскохозяйственных угодий [3].

Большая часть плодородных черноземов сосредоточена в Юго-Восточной части и Восточном Закамье РТ [4]. Этот тип почвы характеризуется зернистой или комковой структурой, высоким содержанием гумуса (3-15%) и кальция (до 70%), прекрасными водно-воздушными качествами и др. В них много полезных гуминовых кислот, которые являются самой ценной фракцией гумуса, легко усваивающейся корнями растений [3].

В связи с расширением зоны нефтедобычи на Предкамскую и Заволжскую зоны РТ, где преобладают серые лесные почвы, которые по своим свойствам занимают переходное положение от дерново-подзолистых к черноземам, возникает необходимость изучения воздействия нефти и на этот тип почв. У серых лесных почв реакция слабокислая или близкая к нейтральной, они содержат до 8,0% гумуса, достаточно хорошо обеспечены подвижным фосфором, средне -доступным калием и бедны азотом.

Поэтому актуальной экологической проблемой является разработка высокоэффективных приемов для ремедиации загрязненных земель (черноземных и серых лесных) в зонах высокой техногенной нагрузки.

В настоящее время наиболее эффективными считаются биологические способы мобилизации природных резервов почвенных экосистем, направленные на восстановление функций нарушенных экосистем. Применение эффективных микроорганизмов, найденных в естественных условиях загрязнении, является перспективным путем ускоренного возврата нарушенных земель в сельскохозяйственный оборот. Интродуцируемые микроорганизмы-деструкторы должны обладать не только высокой метаболической активностью и скоростью потребления углеводородов нефти, но и конкурентной способностью к длительному выживанию в изменяющихся условиях окружающей среды [5-7].

Интенсификации процессов

жизнедеятельности растений и почвенных микроорганизмов способствует фиторемедиация, которая является завершающей стадией рекультивации загрязненных почв. Перспективными для фиторемедиации считаются злаки и бобовые [8].

Цель работы - оценка восстановления нарушенных почв биологическими методами.

Экспериментальная часть

В процессе многолетних комплексных исследований было выделено, отобрано и изучено эффективное сообщество углеводородокисляющих микроорганизмов [5, 6], видовую идентификацию которых проводили методом ПЦР.

Характер взаимоотношений между отдельными штаммами, то есть возможность их совместного использования изучен методом

перпендикулярных штрихов и блоков [9], суть которого в следующем: на поверхность среды в чашки Петри высевали суточную культуру одного из изучаемых микроорганизмов. Посев делали широкой полосой по центру чашки и помещали в термостат на 48 ч. Когда бактерии хорошо развивались и образуемые ими вещества проникали в толщу агара, перпендикулярно первичному посеву подсевали параллельными штрихами другие микроорганизмы. Результаты учитывали через сутки по степени развития культуры и по расстоянию от начала роста вторичного посева до первичного. Изучаемые микроорганизмы заранее высевали сплошным газоном на чашки Петри. Стерильно переносили агаровые блоки из первых чашек с выросшими микроорганизмами и переносили их на поверхность только что засеянной среды. Результаты учитывали через 48 ч по степени развития культур вокруг блоков.

На двух типах почв (черноземная из Азнакаевского района и серая лесная из Альметьевского района РТ) были заложены вегетационные опыты с вариантами: незагрязненная почва - контроль; почва, загрязненная дизельным топливом (5%); почва, загрязненная дизельным топливом, с внесением в нее эффективного консорциума углеводородокисляющих

микроорганизмов (УОМ); почва, загрязненная дизельным топливом, на которой выращивали фитомелиоранты (яровая пшеница на черноземе и горох на серой лесной); почва, загрязненная дизельным топливом, в которую вносили консорциум и выращивали растения.

Дизельное топливо представляет собой фракцию, образующуюся при перегонке нефти, поэтому оно было выбрано в качестве источника загрязнения.

Титр вносимого консорциума - не менее 3*1012 КОЕ/см3.

Пробы почв в течение эксперимента отбирали семь раз - в день закладки опыта, а затем на 10, 20, 30, 45, 60 и 90 сут.

В почвенных образцах изучали изменение концентрации углеводородов [10], численности микроорганизмов-деструкторов [11], респираторной активности [12].

Для подтверждения достоверности результатов в работе использован пакет компьютерных программ MS Excel: описательная статистика.

Результаты и их обсуждение

В результате многолетних комплексных исследований из разных типов почв Татарстана были выделены сообщества, у которых изучали углеводородокисляющую активность, способность к деструкции различных алифатических и ароматических углеводородов, солеустойчивость и др. По комплексу положительных свойств был отобран консорциум из черноземной почвы Азнакаевского района РТ, культивирование которого изменяло цвет среды, приводило к образованию сгустков и интенсивному

формированию пленки. Содержание углеводородов за 120 ч снижалось на 85%. Микроорганизмы консорциума проявили активность при утилизации вакуумной газойли, гексана, мазута, толуола, фенола.

Микроорганизмы консорциума были идентифицированы методом установления нуклеотидной последовательности 16S рРНК и депонированы в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии: Achromobacter insolitus А-102 (RCAM02108); Achromobacter xylosoxidans А-10 (RCAM02109) и Pseudomonas stutzeri Р-1026 (RCAM02107). Каждый из них способен утилизировать углеводороды (до 10%), а также активно развиваться в среде с добавлением NaCl (до 6%).

Методом перпендикулярных штрихов и блоков установлено, что эти штаммы совместно хорошо развиваются, для них характерен нейтрализм.

В последующем действие консорциума и растений-фитомелиорантов на загрязнение было изучено в вегетационных опытах. На черноземной почве следует выделить два варианта, в которых наблюдали максимальное снижение углеводородов к 90 сут. Внесение консорциума микроорганизмов-деструкторов способствовало снижению концентрации дизельного топлива до 60%, а в варианте с консорциумом и пшеницей - до 62%. В вариантах же с растениями снижение содержания углеводородов составило 44%, в загрязненной почве - только 28%.

Для оценки состояния почвенного микробиоценоза использовали показатель присутствия углеводородокисляющих

микроорганизмов. Так, в ненарушенной почве в течение эксперимента количество УОМ изменялось от 1,0-106 до 10,0-106 КОЕ/г.

Высокая эффективность деструкции изучаемого углеводорода отмечалась в конце опыта (на 90 сут), максимальная же численность микроорганизмов-деструкторов - на 60 сут. По эффективности воздействия опытные варианты располагались спустя два месяца после загрязнения следующим образом: 72^106 КОЕ/г (внесение консор6циума и выращивание яровой пшеницы)6, 110106 КОЕ/г (вариант с растениями) и 150^10 (применение консорциума).

Полученные нами данные согласуются с исследованиями других авторов [13], которые отмечают, что внесение в почву различных биопрепаратов способствовало росту

углеводородокисляющей микрофлоры.

Уровень респираторной активности характеризует способность микробного сообщества минерализовать органическое вещество в почве и часто используется для характеристики деградации органического вещества при биоремедиации [14]. На черноземной почве базальное дыхание во всех опытных вариантах возрастало до 4 раз по сравнению с контролем. Следует отметить, что только в варианте с применением консорциума этот

показатель на 10 сут увеличился в двое. Яровая пшеница в качестве фитомелиоранта существенного влияния на «дыхательную» активность не оказала.

Наши результаты согласуются с данными других исследователей [15, 16], в работах которых активность почвенной респирации возрастала в первые 30 сут после загрязнения.

На другом типе почв - серой лесной -максимальное снижение содержания углеводородов на 90 сут, также как и на черноземной почве, наблюдали в двух вариантах: с внесением консорциума, в котором этот показатель уменьшился до 70%, и при использовании сообщества микроорганизмов-деструкторов и растений гороха, где снижение составило 62%. При выращивании гороха содержание дизельного топлива составило 45%, а в загрязненной почве -32%.

Особенностью серой лесной почвы являлся более быстрый рост углеводородокисляющих микроорганизмов. Уже на 30 сут в варианте с внесением консорциума наблюдали их максимальную численность (190-10° КОЕ/г). В других вариантах, в частности, при использовании консорциума и растений гороха, а также при выращивании растений пик роста этой группы микроорганизмов отмечен на 45 сут - 210^10° и 135-10° КОЕ/г соответственно, в то время как на черноземной почве в этих же вариантах - на 60 сут.

По-видимому, ризосфера бобовых растений создает более комфортные условия для развития углеводородокисляющих микроорганизмов, в результате происходит ускорение процессов деструкции загрязнителя.

Численность УОМ в незагрязненной серой лесной почве на протяжении всего эксперимента сохранялась на уровне 5-10-10-10° КОЕ/г, что сопоставимо с таковыми данными на черноземе.

При внесении в загрязненную серую лесную почву консорциума микроорганизмов-деструкторов, а также в варианте с горохом увеличение интенсивности базального дыхания продолжалось до 30 сут и достигало в этот период максимальной величины - 50 и 56 мг СО2/100гсут соответственно.

При использовании консорциума УОМ и растений гороха наблюдали стабильно высокий показатель респираторной активности - 59 мг СО2/100г-сут. Это один вариант, в котором почвенное дыхание было максимальным в течение всего периода наблюдений.

Изменение этого показателя на обоих типах почв в начале эксперимента носило подобный характер и соотносилось с численностью углеводородокисляющей микрофлоры.

Последующее же снижение интенсивности респираторной активности может быть связано с уменьшением концентрации углеводородов, которые являются энергетическим субстратом для почвенной микрофлоры.

Полученные результаты свидетельствует о значительном ускорении процесса биодеградации дизельного топлива в почве при внесении исследуемого консорциума микроорганизмов-

деструкторов. По-видимому, и снижение концентрации углеводородов, и увеличение численности углеводородокисляющей микрофлоры в опытных вариантах связано с быстрой адаптацией и последующим активным ростом вносимого сообщества.

Сравнительный анализ течения процесса восстановления почв после загрязнения дизельным топливом показал, что консорциум микроорганизмов-деструкторов, выделенный из черноземной почвы, проявил высокую эффективность и на «родной» почве, и на серой лесной. Обладая полифукциональными

положительными свойствами, штаммы консорциума активно встраивались в биоценоз, приживались и начинали эффективно разлагать углеводороды, используя их в качестве питания и энергии.

Заключение

Учитывая то, что различные штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов сильно различаются по способности усваивать нефтепродукты, в результате многолетних исследований нами выделена «специализированная» группа (консорциум) аборигенных

углеводородокисляющих микроорганизмов,

использующая различные углеводороды в качестве субстрата для своего роста. Применение консорциума из эффективных микроорганизмов, таких как Achromobacter insolitus, Achromobacter xylosoxidans и Pseudomonas stutzeri, способных активно разлагать углеводороды, позволяет обеспечить скорость деструкции нефтяных загрязнений на максимально высоком уровне за счет утилизирующей способности консорциума по отношению к углеводородам в широком диапазоне содержания последних в субстрате.

Высокая эффективность применения данного консорциума обусловлена тем, что штаммы найдены в почвенно-климатических условиях конкретного региона и обеспечивают прогнозируемость результатов; экологически безопасны; не генномодифицированы; стоимость аборигенных углеводородокисляющих

микроорганизмов ниже стоимости промышленных биопрепаратов.

Перспективность дальнейшего изучения и применения эффективного сообщества

углеводородокисляющих микроорганизмов

заключается в создании на его основе биоудобрения для ремедиации нарушенных почв.

Технология по применению

представленного консорциума микроорганизмов-деструкторов внедрена на загрязненных нефтью участках сельскохозяйственных угодий площадью 3,8 га. Задача рекультивации состояла в снижении содержания углеводородов и находящихся с ними других токсичных веществ до безопасного уровня и восстановлении продуктивности почвы, утерянной в результате загрязнения. В процессе ремедиации с использованием эффективного консорциума микроорганизмов-деструкторов содержание

углеводородов снизилось до уровня предельно-допустимой концентрации.

Таким образом, использование данного консорциума комплексе с биологическим мониторингом является экологически безопасным способом и позволяет в короткие сроки вернуть нарушенные нефтезагрязнением почвы в активное землепользование.

Литература

1. А.М. Петров, Э.Р. Зайнулгабидинов, Л.М. Сунгатуллина, Р.Р. Шагидуллин, Д.В. Иванов, О.Ю. Тарасов, Б.Р. Григорьян, Вестник Казанского технологического университета, 14, 23, 129-135 (2011).

2. А.А. Вершинин, А.М. Петров, Л.К. Каримуллин, Ю.А. Игнатьев, Вестник Казанского технологического университета, 15, 8. 207-210 (2012).

3. Е.И. Ломако, Ш.А. Алиев Рекомендации по расчету баланса гумуса в земледелии и потребности в органических удобрениях. - Казань: РИВЦ МСХ и П РТ, 2002. - 55 с.

4. Д.И. Тазетдинова, Р.И. Тухбатова, А.И. Ахметова, В сб. Актуальные аспекты современной микробиологии. Москва, 2007. С. 106-107.

5. И.А. Дегтярева, А.Я. Хидиятуллина, Ученые записки Казанского ун-та, 153, 3, 137-143 (2011).

6. И.А. Дегтярева, А.Я. Хидиятуллина, Вестник Казанского технологического университета, 15, 5, 134136 (2012).

7. И.А. Дегтярева, А.Я. Хидиятуллина, Вестник Казанского технологического университета, 17, 13, 242-245 (2014).

8. S. Susarla, V.F. Medina, S.C. McCutcheon, Ecological Engineering, 18, 647-658 (2002).

9. Г.И. Ежов Руководство для практических занятий по сельскохозяйственной микробиологии. - М.: Высшая школа, 1981. - 271 с.

10. Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в почвах и донных отложения методом ИК-спектрометрии. ПНД Ф 16.1:2.2.22-98. - Москва, 1998. 35 с.

11. О.И. Колешко, Экология микроорганизмов почвы. Лабораторный практикум. Высшая школа, Минск,1981. 175 с.

12. M.P. Maila, Т.Е. Cloete, Int. Biodeterior. Biodegrad., 55, 1-8 (2005).

13. В.Г. Алехин, А.И. Фахрутдинов, Л.А. Малышкина и др. Биологические ресурсы и природопользование. Сборник научных трудов. Нижневартовск, 3, 96-106 (1999).

14. J. Dloem, D.W. Hopkins, A. Benedetti, CABI Publishing, 2006. 307 p.

15. S.-H. Lee, B.-I. Oh, J.-g. Kim. Bioresour. Technol. 7, 99, 2578-2587 (2008).

16. G. Castorena-Cortés, T. Roldán-Carrillo, I. Zapata-Peñasco et al. Bioresour. Technol., 100, 5671-5677 (2009).

© И. А. Дегтярева - д-р биол. наук, зав. отделом агроэкологии и микробиологии, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения», peace-1963@mail.ru; А. Я. Давлетнина - канд. сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник отдела агроэкологии и микробиологии, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения», kindness2006@mail.ru.

© I. A. Degtyareva - dortor of biology Science, head of a department agroecology and microbiology Tatar Scientific Research Institute of agricultural chemistry and soil sciences, peace-1963@mail.ru; A. Ya. Davletshina - Ph. D. of agricultural science, researcher of a department agroecology and microbiology Tatar Scientific Research Institute of agricultural chemistry and soil sciences, kindness2006@mail.ru.