Разработка методики количественного определения биологически активных веществ в сухом экстракте «Фитопрост» методом ВЭЖХ

6. Корсун В.Ф., Захаров П.А., Корсун А.А. 1001 вопрос о фитотерапии.. — М., 1955. — С. 144—147.

7. Кучина Н.Л. Лекарственные растения средней полосы европейской части России. — М.: Планета, 1992. — С. 111-112.

8. Лаврепов В.К, Лавреповй Г.В. Полная энциклопедия ле-

карственных растений. — СПб.: Издательский Дом «Нева»; - М.: ОЛМА - ПРЕСС, 1999. - Т. 1. - С. 136-137.

9. Ладынина Е.А., Морозова Р.С. Лекарственные растения

в медицине и в бьпу. — Ставрополь: Книжное изд-во, 1992. - С. 243-244.

10. Ловкова М.Я., Рабинович А.М. и др. Почему растения лечат. - М.: Наука, 1989. - С. 67-68.

11. Минаева В. Г. Лекарственные растения Сибири. — Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1991. — С. 199-200.

12. Муравьёва Д.А., Самылипа И.А. Яковлев Г.П. Фармакогнозия: учебник. — 4-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 2002. - С. 610-612.

13. Соколов С.Я. Фитотерапия и фитофармакология. — М.: Медицинское информац. агенство, 2000. — С. 175.

14. Телятьев В. В. Целебные клады Восточной Сибири. — Иркутск: Воет-Сиб кн. Изд-во, 1991. — С. 20—21.

15. Турова АД. Лекарственные растения СССР и их применение. — М.: Медицина. 1974. — С. 312—314.

16. Универсальная энциклопедия лекарственных растений / Сост. И. Пустырский, В. Прохоров. — Мн.: Книжный Дом. - М.: Махаон, 2000. - С. 77-82.

17. Чага и её лечебное применение при раке IV стадии / Под ред. П.К. Булатова, М.П. Березиной, П.А. Якимова. — Л.: Медгиз, 1959. - 334 с.

18. Шамрук С.Г. Лекарственные растения: сбор, заготовка, применение: (Справ, пособие). - Мн.: Ураджай, 1988.-С. 178-179.

19. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. Характеристика комплекса сложных органических соединений чаги. В кн. «Чага и её лечебное применение». — Л.,АНСССР, 1959. - С. 72-74.

20. Шмерко Е.П., Мазан И.Ф. Практическая фитотерапия.— Минск: Лечприрода, 1996. — С. 211—213.

21. Чиков П. С. Лекарственные растения — путь к здоровью. — М.: Науч. Издат. Центр «Инженер», 1997. — С. 414—416.

© ГАРМАЕВА Е.А., НИКОЛАЕВА Г.Г., МАНТАТОВ В.В., ДАРГАЕВА Т.Д., МАРКАРЯН А.А.

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В СУХОМ ЭКСТРАКТЕ «ФИТОПРОСТ» МЕТОДОМ ВЭЖХ

Е.А. Гармаева, Г. Г. Николаева, В. В. Мантатов, Т.Д. Даргаева, А.А. Маркарян

Резюме. Разработаны методики количественного определения действующих веществ методом ВЭЖХ. Определено количественное содержание фенологликозидов в пересчете на арбутин, апигенина и глицирризиновой кислоты, что позволяет получить объективные данные по их количественной оценке для стандартизации сухого экстракта.

Ключевые слова. «Фитопрост», сухой экстракт, действующие вещества, количественное определение.

Хронический простатит — наиболее частое воспалительное заболевание половой сферы мужчин. Согласно статистическим данным простатитом болеют 25—40 % мужчин (по некоторым данным до 80 %) в наиболее трудоспособном возрасте (25—40 лет) [6,14].

В последние годы отмечается увеличение заболеваемости хроническим простатитом. Многообразие и тяжесть клинических проявлений болезни, нерешенность многих вопросов его распознавания и неудовлетворительные результаты лечения, негативно влияющие на такие показатели как рождаемость, частота разводов, инвалидизация и смертность в молодом возрасте и др., придают хроническому простатиту все возрастающую социальную значимость и требуют дальнейшего изучения и решения этой актуальной проблемы современной медицины [13].

Одной из наиболее актуальных, но пока, к сожалению, нерешенных проблем лекарственной терапии больных является выбор препарата той или иной группы, который будет наиболее эффективным и безопасным для больного. В настоящее время очень много препаратов синтетического происхождения с выраженным фармакологическим действием. Однако все большее значение для лечения хронического простатита приобретает фитотерапия — лечение лекарственными травами [4,9,12]. Преимущество отдается расти-

тельным препаратам, которые отличаются низкои токсичностью, широтой терапевтического действия, малой стоимостью, возможностью длительного применения без развития существенных побочных действий. Лекарственные растения хорошо сочетаются друг с другом, могут оказывать влияние на различные органы и системы, что позволяет лечить одновременно сопутствующие заболевания внутренних органов. Поэтому актуальной задачей является поиск и изучение новых эффективных средств, полученных из растительного сырья, предназначенных для профилактики и лечения хронического простатита.

Одним из таких препаратов на основе лекарственных растений является сухой комплексных экстракт «Фитопрост».

Сухой комплексный экстракт «Фитопрост» разработан на основе тибетской рецептуры и содержит сумму биологически активных веществ из растительного сырья: ортосифона тычиночного (Orthosiphon stamincus Benth.), листьев толокнянки обыкновенной (Aretostaphylos uva-ursi L.), травы гореца птичьего (Poligonum avieulare L.), цветков календулы лекарственной (Calendula officinalis), корней солодки голой (Glyeyrrhiza glabra L.).

При предварительном фитохимическом изучении было установлено, что в субстанции содержатся био-

логически активные вещества (БАВ) класса феноло-гликозилов, тритерпены, флавононды, органические кислоты, дубильные вещества, полисахариды.

" Эм fftaKT обладает противовоспалительным, спазмолитическим, диуретическим, мембраностабилизирующим, антиоксидантным и антимикробным эффектом, который в основном обусловлен содержанием веществ полифенольной группы и предназначен для профилактики простатита (101.

В связи с этим целью настоящих исследований является количественное определение БАВ и разработка методики контроля качества с целью стандартизации.

Материалы и методы

Материалом для изучения служил сухой экстракт.

Количественное определение проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе фирмы «G1LSTON» (Франция), с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром» для «Windows». В качестве неподвижной фазы используют металлическую колонку PLATINUM EPS €-18 100 А размером 4,6x250 мм.

В качестве подвижной фазы использовали раствор метанол-вода-фосфорная кислота концентрированная в соотношении 40:60:0,5. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента была 1,0 мл/мин. при продолжительности анализа 36,97 минуты. Детектирование проводили с помощью УФ - детектора при длине волны 254 нм.

Точная навеска 0,25 г сухого экстракта помещали в колбу объёмом 200 мл, прибавляли по 70 мл 70 % этилового спирта, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течении 1 часа с момента закипания спирто — водной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали в мерную колбу вместимостью 50 мл через бумажный фильтр, объём довели растворителем до метки (исследуемый раствор).

Таблица 1

Результаты количественного определения БАВ методом ВЭЖХ

Масса «Фитопроста», в г Найдено апигенина, в% Найдено арбутина, в% Глицирризиновой кислоты, в %

0,2545 0,64 2,89 2,80

0,2584 0,66 2,95 2,90

0,2607 0,65 2,85 2,85

0,2478 0,64 2,90 2,93

0,2885 0,67 2,85 2,85

X 0,65 2,89 2,87

Параллельно готовили 0,05 % растворы апигенина, арбутина и глицирризиновой кислоты в этаноле: 0,05 г (точная навеска) веществ помещали в мерные колбы вместимостью 100 мл и прибавляли по 50 мл этанола, перемешивали до растворения и доводили растворителем до метки (растворы РСО).

По 20 мкл исследуемого раствора и раствора РСО вводили в хроматограф.

Приведенная методика позволила нам в одной навеске провести определение фенологликозидов в пересчете на арбутин, флавоноидов-апигенина и глицирризиновой кислоты, что дало возможность получить объективные данные по их количественной оценке.

«I «V : : : : : : : : : : 7 : ; : •

t

№ Время, мин Высота, га V Пло- щадь МУ*сек ФО Конц. пмоль Конц. % Назва- ние

1 218 56.20 994.68 1.161 57.74 17.21 Арбу- ТИН

8 562 13.23 1338.13 0.192 12.88 3.84 Ап и ге-

нии

10 1114 17.84 1184.34 4.473 264.9 78.95 Глицир- ризин. к-та

3 2218 82.27 3517.15 0.095 335.5 100.0

Рис. 1. Хроматограмма ВЭЖХ экстракта «Фитопрост»

Результаты и обсуждение Расчет количественного содержания арбутина, апигенина и глицирризиновой кислоты производили методом абсолютной калибровки с помощью компьютерной программы «мультихром» для «\Vindows» и с помощью формулы:

У_внс/х- X Сс-анДаРха Г/МЛ X 1 00

''стандарта X 3 X (100-\У) где: в ига. — площадь пика апигенина, арбутина в исследуемом растворе;

в сонара — площадь пика стандартного раствора РСО апигенина или арбутина;

С, % — концентрация апигенина или арбутина

в %;

С стандарта, г/мл — концентрация РСО апигенина или арбутина в г/мл;

а — навеска пробы, вводимая в хроматограф в г;

\\ — влага «Фитопроста» в %.

Для подтверждения объективной оценки содержания глицирризиновой кислоты мы определили чистоту её пика с помощью диодно-матричного детектора.

Условия диодно-матричного детектирования для определения чистоты пика: шкала поглощения

0,0—0,01; длина волны 254 нм; фиксирующий мини-

мум площади пика от 0,0001 интенсивности поглощения в минуту. Согласно полученным данным (рис. 1, табл. 2) время удерживания пика глицирризиновой кислоты 15,64 минуты. Начало выхода чистого пика — 15,57 минуты, конец выхода - 15,69 минуты. Пик содержит примеси. При наложении пика гли определили, что при длине волны 254 нм в исследуемом растворе доля чистого пика составляет 21,75 %, что в последующем учтено при расчете количественного содержания кислоты.

Таблица 2

Метрологическая характеристика результатов определения глицирризиновой кислоты

Для глицирризиновой кислоты использовали следующую расчетную формулу:

с %= .Чтсх х (™1мар1м г ; >1 .1 х у * | ()() х 1 00 X 2 1 ,75

встнаарт X а X ( !00-\\') X 100

где: в их—площадь пика глицирризиновой кислоты в исследуемом растворе; в сгацра — площадь пика стандартного раствора

РСО глицирризиновой кислоты;

С, % — концентрация глицирризиновой кислоты в %;

С стщцпа г/мл — концентрация РСО ЦЦЩ’фГ" эицсшай кип"'1’1 1 ** '/'—г

а — навеска пробы вводимая в хроматограф в г;

\¥— влага «Фитопроста» в %;

V— объём разведения;

21,75 — коэффициент перерасчета обшей площади на площадь пика глицирризиновой кислоты.

По результатам проведенного количественного анализа сухого экстракта «Фитопрост» методом ВЭЖХ установлено, что в сухом экстракте содержание суммы флавоноидов в пересчете на апигенин составляет — 0,65 %, суммы фенологликозидов в пересчете на арбутин — 2,89 %.

Методом ВЭЖХ в сухом экстракте "Фитопрост" определено количественное содержание глицирризиновой кислоты составляющей 2,87 %, при относительной ошибке единичного определения с 95 % вероятностью ± 0,90 %.

Таким образом, для количественного определения биологически активных веществ в сухом экстракте «Фитопрост» предложен метод ВЭЖХ.

F X S Р,% t(P.f> Ах Е, %

4 2,87 0,05 95 2,78 0,062 ±0,90

QUANTITATIVE DETERMINATION OF ACTIVE SUBSTANCE IN DRIED EXTRACT «PHITOPROST» WITH THE METHOD OF HIGH-EFFECTIVE LIQUID CHROMATHOGRAPHY

E.A. Garmaeva, G.G. Nikolaeva, V.V. Mantatov, T.D. Dargaeva, A.A. Markaryan

There has been worked up the method of quantitative analysis of active substance with the method of High-effective liquid chromatography. There has been defined quantitative content offenologlycozids in recount on the arbutin, apigenin and glycyrrhyzin acid, that make it possible to receive objective facts on quantitative evaluation for standardization the dried extract.

ЛИТЕРАТУРА

1. Безменов А.Я., Грахов В.П., Четверня Е.А. Анализ свободных фенол-карбоновых кислот лекарственных растений методом ВЭЖХ // Тез. докладов: 2 рееп. конф. по медицинской ботанике. — Киев, 1988. — С. 67.

2. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. (Под ред. А. Хейшена, К.Л. Хунса, Ф. Лот-шнайха).— М.: Мир.— 1988.

3. Головкин Б.Н., Руденская Р.Н., Трофимова И.А., Шретер А.И. Биологически активные вещества растительного происхождения. В трех томах. — М., 2001. — Т. I. — 350 е.; Т. II - 764 е.; 2002. - Т. III. - 216 с.

4. КанД.В., СегалА.С., КозьменкоА.П. Диагностика влечение хронического простатита: Методические рекомендации. — М.,1980. — 30 с.

5. Космам В.М., Зенкевич И.Г. Информационное обеспечение для идентификации фенольных соединений растительного происхождения в обрашенно-фазовой ВЭЖХ. Флавоны, флавонолы, флавононы и их глико-зиды. // Растит, ресурсы. — 1997. — Т. 73, вып. 2. — С. 14-26.

6. Кругляк Л.Г. Простатит: как определить,.как предупредить, как вылечить. — 2002. — 64 с.

7. Лекарственные растения Бурятии. — Улан-Удэ, 1974. — 207с.

8. Лекарственные растения Государственной фармакопеи: Фармакогнозия./!!.А. Самылина, В.А Северцев, А.А. Сорокина, В.А. Ермакова и др. — М.: АНМИ, 2003. - 534 с.

9. Мамчур Ф.И., Кушнирук Ю.И. Фитотерапия в комплексном лечении половых расстройств у мужчин. — Киев, 1992. - 144 с.

10. Мантатов В.В. Влияние комплексного средства «Фитопрост» на течение экспериментального хронического простатита.: Автореф. ...канд. биол. наук / В.В. Мантатов. — Улан-Удэ, 1999. — 20 с.

11. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия: Учебник.-4-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 2002. — 656 с.

12. Суворов А.П., Тюренков И.Н., Богословская СИ. и др. Фитотерапия воспалительных заболеваний мочеполовой сист емы. — Саратов, 1994. — 39 с.

13. Ткачу к В. Н., Горбачев А.Г., Агулянский Л.И. Хронический простатит. —Л.: Медицина, 1989. — 208 с.

14. Щетинин В.В., Колнинский Г.И., Зотоев Е.А. Лечение хронического простатита. — 2002. - 240 с.