Способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования
METHOD FOR IDENTIFICATION AND QUANTITATIVE ASSESSMENT OF PATHOGENIC AND OPPORTUNISTIC BACTERIA IN FOOD SUBSTRATES USING HIGH-PERFORMANCE SEQUENCING

Настоящее изобретение относится к микробиологии и касается способов измерения, использующих микроорганизмы, а именно, нуклеиновые кислоты. Данное изобретение может быть использовано в пищевой промышленности и лабораториях по контролю качества продукции при количественной оценки бактерий, как во входящем сырье пищевого предприятия, так и на разных этапах производства, включая конечную продукцию, а также при контроле продукции надзорными ведомствами и лабораториями.
В настоящее время производители продуктов питания сталкиваются с проблемой обсеменения продукции микроорганизмами. Некоторые из них являются патогенными и условно-патогенными. К поражению этими микроорганизмами склонны пожилые люди, младенцы и люди с ослабленным иммунитетом [The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2013, EFSA Journal, 2015, vol. 13, no. 1, pp. 1-165]. Наиболее часто встречающимися пищевыми патогенами, вызывающими заболевания являются Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Campylobacter spp., Yersinia spp., Listeria monocytogenes, Vibrio cholera, Enterococcus faecalis, а также энтерогеморрагический штамм O157:H7 Escherichia coli [Newell D.G. Koopmans M, Verhoef L, Duizer E, Aidara-Kane A, Sprong H, Opsteegh M, Langelaar M, Threfall J, Scheutz F, van der Giessen J, Kruse H. Food-borne diseases - The challenges of 20years ago still persist while new ones continue to emerge. International Journal of Food Microbiology, 2010, vol. 139, no. 1, pp. 3-15].
На данный момент идентификацию микроорганизмов, в том числе их количественную оценку, в продуктах питания и входящем сырье пищевых предприятий в большинстве случаев проводят классическими методами с использованием посева на питательные среды, их микроскопическом наблюдении и биохимическом анализе [Мао Z., Zheng Н., Wang X., Lin S., Sun Y., Jiang B. DNA microarray for direct identification of bacterial pathogens in human stool samples, Digestion, 2008, vol. 78, no. 2-3, pp.131-138], что является сложной задачей, которую способен решить только высококвалифицированный микробиолог. Кроме того, такой анализ для ряда патогенных бактерий длится от 5 до 7 дней. Другой альтернативой является проведение реакции ПЦР с праймерами и зондами, специфичным к конкретным патогенным микроорганизмам [Rodriguez-Lazaro D. Real-Time PCR in Food Science: Current Technology and Applications, 2013, Caister Academic Press]. Главным недостатком ПЦР является невозможность количественной оценки идентифицируемых бактерий в субстрате. Кроме того, полимеразная цепная реакция позволяет выявить только какой-либо один микроорганизм, либо небольшую группу микроорганизмов.
Анализ всего микробного сообщества пищевых субстратов возможен с помощью методов секвенирования нового поколения. Для этого чаще всего применяют метод, основанный на анализе нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, который предварительно амплифицируется в ДНК, выделенной из сообществ бактерий [Мауо В., Rachid С.Т.,  A., Leite A.M., Peixoto R.S., Delgado S. Impact of Next Generation Sequencing Techniques in Food Microbiology, Curr. Genomics., 2014, vol. 15, no. 4, pp. 293-309]. При количественной оценке микроорганизмов методами с использованием высокопроизводительного секвенирования оценивается параметр «relative species abundances», который рассчитывается исходя из количества полученных «ридов» - количество «ридов» прямо пропорционально присутствию микроорганизма в субстрате. Главным недостатком такого подхода является возможность оценивать только относительные количественные соотношения микробов (процентное соотношение различных видов бактерий в исследуемом субстрате). Кром того, по данным высокопроизводительного секвенирования известных количественных соотношений микроорганизмов, полученных в Воронежском государственном университете, количество «ридов» не прямо пропорционально присутствию микроорганизма в субстрате, чаще всего наблюдается картина, при которой подавляющее большинство ридов «оттягивает» ДНК наиболее представительного в смеси вида бактерий. Еще одной проблемой анализа таких данных является полное «доверие» международным биоинформатическим базам данных, которые зачастую содержат ошибочно задепонированные нуклеотидные последовательности. Наличие «контрольных» штаммов значимых для пищевой индустрии микроорганизмов значительно упростит процедуру их идентификации в исследуемых субстратах.
Известен способ профилирования микробиоты желудочно-кишечного тракта (патент RU 2605913, опубл. 27.12.2016), взятый за прототип, включающий амплификацию ДНК микробных сообществ с помощью праймеров, специфичных к последовательности 16S рРНК для наиболее значимых таксонов микроорганизмов, а также гибридизацию зондов к амплифицированным нуклеотидным последовательностям. Метод позволяет в том числе оценивать количественные соотношения идентифицируемых бактерий. Недостатком данного способа является то, что спектр анализируемых таксонов бактерий ограничивается набором олигонуклеотидных зондов, что не делает данную систему универсальной для широкого круга таксонов бактерий. Кроме того, для большей достоверности необходимо проведение секвенирования амплифицированных последовательностей, что не предусмотрено в этом способе.
Задачей настоящего изобретения является разработка универсального метода идентификации и количественной оценки бактерий в пищевой продукции с применением высокопроизводительного секвенирования.
Технический результат заключается в разработке универсального высокочувствительного способа идентификации и количественной оценки значимых для пищевой индустрии бактерий в пищевых субстратах и сокращении времени анализа присутствия микроорганизмов в исследуемой среде с 5-7 суток (при стандартном микробиологическом посеве) до 1-2 суток (в зависимости от проведения или не проведения предварительного обогащения бактерий в питательной среде).
Технический результат достигается тем, что в способе идентификация и количественная оценка бактерий в пищевых продуктах осуществляется с помощью проведения ПЦР с универсальными праймерами к 16S рРНК, с последующим высокопроизводительным секвенированием амплифицированных последовательностей и их сопоставлением с международной базой данной и полученными в ходе секвенирования контрольными нуклеотидными последовательностями. В анализе используются известные количественные смеси бактерий, которые наиболее значимы для пищевой индустрии, секвенированные последовательности которых выступают в качестве контрольных последовательностей, что позволяет резко повысить точность используемого метода, как в идентификации таксонов бактерий, так и оценки их количественных соотношений.
Способ идентификации патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах в представленном способе реализуется следующим образом:
1. Производится асептический сбор биологического материала (молоко, мясо, входящее сырье предприятия и др.). Для анализа используется 1-25 мл (г) биологического материала.
2. При необходимости проводится предварительное обогащение микроорганизмов в универсальной жидкой питательной среде (например, пептонная вода в соотношении 1:10 в течение 24 часов).
3. Проводится отбор необходимого для выделения ДНК количества биологического материала, либо обогащенной среды полученной в ходе выполнения пункта 2.
4. Производится выделение ДНК из отобранного биологического материала, выделение ДНК можно осуществлять как с помощью коммерческих наборов, так и методами органической экстракции.
5. Проводят ПЦР с универсальными к бактериям праймерами: 785F (GGATTAGATACCCTGGTA)/ 1100R (GGGTTGCGCTCGTTG). Могут быть использованы другие универсальные для бактерий праймеры (например, 515F/ 806R, 341F/ 806R, 515F/ 907R и др.). Используют следующие температурные циклы: 94°С 4 мин, 37 циклов (94°С 30 сек, 50-54°С 30 сек, 72°С 30-40 сек).
6. Отличительной особенностью данного способа является то, что параллельно с анализом исследуемых проб проводится ПНР с праймерами из пункта 5, но при этом используются известные количественные смеси бактерий, которые наиболее значимы для пищевой индустрии: Bacillus cereus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Cronobacter sakazii, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Salmonella enteric, Shigella sp., Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Vibrio parahaemoliticus.
7. Продукты реакции ПЦР далее используются для приготовления библиотек ДНК для высокопроизводительного секвенирования, включающее очистку ампликона от коротких неспецифических нуклеотидных последовательностей и праймеров, лигирование адаптеров к концам амплифицированных последовательностей и оценку качества приготовленных библиотек. При этом для анализа известных количественных смесей микроорганизмов используются отдельные адаптеры с «баркодами» которые позволяют отфильтровать эти данные при биоинформатическом анализе.
8. Проводится другие этапы необходимые для конкретного способа секвенирования нового поколения и выбранной платформы секвенирования (например, эмульсионная ПЦР при использовании платформы для полупроводникового секвенировакния Ion torrent).
9. Осуществляется секвенирование приготовленных в процессе выполнения п. 1-п. 8. нуклеотидных последовательностей.
10. Проводиться биоинформатический анализ секвенированных нуклеотидных последовательностей с использованием пользовательской базы данных и программного обеспечения, либо с использованием международных баз данных. При этом учитываются данные секвенирования известных смесей бактерий, верифицированные «риды» которых используются как контрольные нуклеотидные последовательности. Относительное изобилие (relative abundance) бактерий также рассчитывается исходя из полученных данных секвенирования известных микробиологических смесей.
11. При совпадении (идентичность свыше 99,5%) секвенированных нуклеотидных последовательностей с последовательностями, полученными в ходе секвенирования известных смесей бактерий говорят наличие того или иного патогенного либо условно-патогенного микроорганизма. По соотношению полученных «ридов» контрольных смесей бактерий и «ридов» полученных в ходе секвенирования анализируемых образцов пищевой продукции судят о количестве идентифицированных бактерий в субстрате.
Примечание: для высокопроизводительного секвенирования используются платформы и наборы химических реактивов, способные секвенировать последовательности длинной до 400 п.н.
Предлагаемый способ является высокочувствительным, универсальным и быстрым по отношению к другим методам определения патогенных микроорганизмов в пищевых субстратах. Кроме того, представленный метод позволяет оценить количественное соотношение микроорганизмов в анализируемом субстрате.