СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ ХРОНИЧЕСКОЙ ИСТИННОЙ ЭКЗЕМЫ
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF DEVELOPING COMPLICATIONS OF CHRONIC TRUE ECZEMA

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития осложнений хронической истинной экземы.
Истинная экзема  - хронический зудящий дерматоз, проявляющийся возникновением на покрасневшем и отечном участке кожи мелких пузырьков (везикул) и серозных папул, которые быстро вскрываются, превращаясь в точечные эрозии. Серозное отделяемое последних обуславливает характерное для экземы мокнутие пораженного участка кожи, которое может осложниться присоединением бактериальной или грибковой инфекции.
Истинная экзема считается многопричинным заболеванием. В ее возникновении играют роль инфекционно-аллергические, эндокринно-метаболические, нейрогенные и наследственные факторы.
У больных экземой отмечаются изменения функции центральной нервной системы, преобладают безусловные рефлексы над условными, нарушается равновесие между деятельностью отделов вегетативной нервной системы, изменяется функциональное состояние рецепторов кожи в виде нарушения кожной чувствительности [Изучение уровня свободного и общего холестерина эпидермиса у больных экземой и атопическими дерматитами /Ю.С. Бутов, К.В. Попов А.С. Парфенов [и др.] //Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2000. - №4. - С. 31-35].
Таким образом, подавление иммунного ответа у больных экземой развивается в результате сложных нейроэндокринно-гуморальных нарушений, меняющих трофику тканей.
Гуморальная недостаточность гипофизарно-надпочечниковой системы и преобладание парасимпатических медиаторов в коже ведут к усилению чувствительности гладкомышечных волокон и резкому повышению проницаемости стенок сосудов, а также к действию эндогенных и экзогенных факторов, в том числе микробных антигенов [Махнева, Н. В. Болезни кожи и антигены главного комплекса гистосовместимости класса I: иммуногистохимические исслед. /Н.В. Махнева, Л.В. Белецкая //Вестник дерматологии и венерологии. - 2004. - №2. - С. 12-16]. При наличии инфекционных антигенных раздражителей слабость иммунитета проявляется в виде персистенции микробных и бактериальных антигенов, формировании хронического воспаления в эпидермисе и дерме. Возникающие патологические иммунные комплексы, повреждают собственные микроструктуры и создают аутоантигены, которые образуют аутоагрессивные антитела [Бережная Н.М. Неспецифическая иммунотерапия аллергических заболеваний / Н.М. Бережная //Аллергология и иммунология. - 2005. - Т. 6, №2. - С. 127-128].
У больных экземой происходят изменения неспецифических факторов защиты, которые проявляются в способности к спонтанному и комплементарному розеткообразованию нейтрофильных лейкоцитов, снижении функциональной активности нейтрофилов, уменьшении числа цитоплазматических гранул (цитоплазматические гранулы нейтрофилов являются морфологическим показателем их переваривающей способности, отражающей четвертую стадию фагоцитоза) [Елькин В.Д. Влияние активного двигательного режима на вегетативные функции кожи у больных хроническими дерматозами /В.Д. Елькин // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2003. - №33. - С.334-38].
Этими нарушениями, по-видимому, можно объяснить частые осложнения экземы - вторичная бактериальная и грибковая инфекции, отягощающие течение заболевания и приводящая к дополнительной сенсибилизации организма [Кожные и венерические болезни: учеб. для студентов мед. вузов / под ред. О.Л. Иванова. - Москва: Шико, 2006. - 477 С.].
На современном этапе развития учения об экземе основное внимание уделяют изменениям состояния циклических нуклеотидов, простагландинов и роли различных иммунных сдвигов [Дерматовенерология /Рос. об-во дерматовенерологов; гл. ред. А.А. Кубанова. - Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 299 С. - (Клинические рекомендации)].
При исследовании иммунного статуса больных экземой установлены значительные нарушения неспецифических факторов защиты и клеточного звена иммунитета, которые проявляются в виде выраженной лимфоцитопении, снижении количества T-хелперов, уменьшении содержания T-лимфоцитов и угнетении функциональной активности T-супрессоров. Данные нарушения напрямую зависели от выраженности клинических проявлений, продолжительности заболевания и изменялись с возрастом [Елькин В.Д. Влияние активного двигательного режима на вегетативные функции кожи у больных хроническими дерматозами /В. Д. Елькин // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2003. - №33. - С.334-38]. Т-лимфоциты, которые несут на своей поверхности специфические рецепторы к антигену и выделяют ряд провоспалительных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО-α [Павлова О.В., 2010].
Провоспалительные цитокины вызывают индукцию экспрессии молекул адгезии на эндотелиальных клетках и лейкоцитах, вследствие чего путем трансэндотелиальной миграции усиливается приток в очаг воспаления лейкоцитов из сосудистого русла [Intеrlеukin-16 stimulatеs thе еxprеssiоn and prоductiоn оf prо-inflammatоry cytоkinеs by human mоnоcytеs /N.L. Mathy, W. Schеuеr, M. Lanzеndörfеr [еt al.] //Immunоlоgy. - 2000. - Vоl. 100, №1. - P. 63-69]. Дальнейшее накопление и продвижение иммунокомпетентных клеток в очаге воспаления контролируют хемокины, которые продуцируются эндотелиальными клетками и макрофагами. Клеточный инфильтрат в очаге воспаления, состоящий из макрофагов, нейтрофилов и эозинофилов, способствует развитию аллергического воспаления. Полиморфный инфильтрат в коже при экземе - результат действия образовавшихся провоспалительных цитокинов, в том числе ФНО-α.
Таким образом, в аллергических реакциях замедленного типа, лежащих в основе формирования истинной экземы, участвуют Th1- лимфоциты, макрофаги, эндотелиальные клетки и секретируемые ими цитокины.
Цитокины - это биологически активные вещества белковой природы, которые регулируют широкий спектр процессов, протекающих в организме [Inhibitоry еffеcts оf tumоr nеcrоsis factоr оn hеmatоpоiеsis sееn in vitrо arе translatеd tо incrеasеd numbеrs оf bоth cоmmittеd and multipоtеnt prоgеnitоrs in TNF-dеficiеnt micе /M. S. Drutskaya, M. Оrtiz, D. J. Liеpinsh [еt al.] //Еxp. Hеmatоl. - 2005. - Vоl. 33, №11. - Р. 1348-1356].
Среди множества биологических эффектов и реакций, опосредуемых цитокинами, главными являются иммунные реакции, воспалительный ответ, регуляция гемопоэза, ангиогенез, репаративные процессы в тканях. Их действие является антиген-неспецифическим, они способны воздействовать на любые клетки, содержащие соответствующие рецепторы и находящиеся в адекватной физиологической активности. К цитокинам относят и факторы некроза опухолей (TNF).
С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования риска развития осложнений хронической истинной экземы на основании полиморфных вариантов генов факторов некроза опухолей и их рецепторов и других возможных факторов риска с целью выявления больных ХИЭ, предрасположенных к развитию осложнений.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития осложнений хронической истинной экземы, таких как вторичная грибковая и бактериальная инфекции, на основе данных о генетическом полиморфизме+250A/G Ltα в сочетании с такими предикторами как наличие очагов хронической инфекции и уровень лейкоцитов.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2012 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования повышенного риска развития осложнений хронической истинной экземы. Аналогичных патентов нет.
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития осложнений хронической истинной экземы, таких как вторичная грибковая и бактериальная инфекции, у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья Российской Федерации.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития осложнений хронической истинной экземы, таких как вторичная грибковая и бактериальная инфекции, у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья Российской Федерации, на основе данных о генетическом полиморфизме+250A/G Ltα в сочетании с такими предикторами, как наличие очагов хронической инфекции и уровень лейкоцитов.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития осложнений хронической истинной экземы, таких как вторичная грибковая и бактериальная инфекции, у лиц русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья Российской Федерации, включающий:
- забор венозной крови,
- выделение геномной ДНК из периферической крови методом полимеразной цепной реакции  синтеза ДНК.
- анализ полиморфизмов лимфотоксина α (+250A/G Ltα);
1
2
- определение значений уи упо уравнениям линейной дискриминантной функции следующего вида:
1
1
2
3
у=-114,015+108,475x+1,267x+2,743x
2
1
2
3
у=-114,720+103,793x+2,370x+3,399x,
1
2
3
3
3
3
12
где x - наличие очагов хронической инфекции (да - 1; нет - 2), x- уровень лейкоцитов (10/л), x- генетический вариант по локусу+250 A/G Ltα: AA - x=1; AG - x=2; GG - x=3;
2
1
- прогнозирование риска развития осложнений, таких как вторичная грибковая и бактериальная инфекции ХИЭ в случае, если значениеубольше значения у;
1
2
- прогнозирование отсутствия риска развития осложнений, таких как вторичная грибковая и бактериальная инфекции ХИЭ в случае, если значениеубольше значения у.
Новизна и изобретательский уровень предложенного изобретения заключается в том, что впервые генетический полиморфизм лимфотоксина α (+250 A/G Lt α) в сочетании с предикторами - наличие очагов хронической инфекции и уровень лейкоцитов - может быть использован в качестве прогностически значимого признака развития таких осложнений ХИЭ, как вторичная грибковая и бактериальная инфекции, у лиц русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья Российской Федерации.
Способ осуществляют следующим образом:
2
Выделение геномной ДНК осуществляют стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. 1-й этап: к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, который содержит 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ МgСl и 10 мМ трис-НCl (pH=7,6) [Мathew С.С., 1984]. Полученную смесь при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут перемешивают и центрифугируют. После центрифугирования сливают надосадочную жидкость, к полученному осадку добавляют 4 мл раствора, с 25 мM ЭДTA (рН=7,8) и 75 мМ NаСl, затем ресуспензируют. После этого прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы K (10 мг/мл) и в течение 16 часов при 37ºС инкубируют образец.
На 2-м этапе в течение 10 минут при 4000 об/мин из полученного лизата последовательно экстрактируют ДНК равными частями фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием. Производят отбор водной фазы после каждого центрифугирования. Из раствора 2-я объемами охлажденного 96% этанола осаждают ДНК. Полученную ДНК растворяют в деионизованной, бидистиллированной воде и хранят при t=-20°С. Выделенную ДНК используют для полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК.
Анализ+250G/A Ltα осуществляют методами ПЦР синтеза ДНК на CFX 96 с системой ПЦР в режиме real time. Используют ДНК-полимеразу Thermus aquaticus (производитель фирма «Силекс-М») и олигонуклеотидные праймеры и зонды (синтезированные фирмой «Синтол»).
2
2
Реакционная смесь (объем 25 мкл) включает: 67 мМ трис-НCl (pН=8,8), 2,5 мМ МgCl, 0,1 мкг геномной ДHK, по 10 пM каждого праймера, по 5 пkмoль каждого зонда, по 200 мkM dАТР, dGТР, dСТР, dТТР и 1 единицу активной Тaq-полимеразы. Для каждой пары праймеров рассчитывали оптимальный температурный и временной режим отжига и подбирали соответствующую концентрацию MgCl.
Генотипирование производят по методу Tag Man зондов на основании данных значений УФО (уровень относительной флуоресценции) для каждого зонда (при проведении ПЦP в амплификаторе IQ5).
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития осложнений хронической истинной экземы подтверждает анализ результатов обследования 552 индивидуумов: среди 230 больных ХИЭ различные осложнения заболевания были зарегистрированы у 488 пациентов (20,87%), больных без осложнений было 182 человек (79,13%) и 322 человек контрольной группы. Среди осложнений наблюдались: вторичная грибковая (9,13%) и вторичная бактериальная инфекции (11,74%).
В исследуемые группы включались лица русской национальности, которые являлись уроженцами Центрального Черноземья Российской Федерации и не имели родства между собой. Клиническое и клинико-лабораторное обследование больных проводили на базе поликлинического отделения ОГБУЗ «Кожно-венерологический диспансер». Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета. Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0».
Средний возраст больных хронической истинной экземой составил 45,91±2,68 (варьировал от 18 лет до 86 лет), контрольной выборки - 43,62±3,46 (варьировал от 20 до 76 лет) (р>0,05). Следовательно, группа больных не отличалась от группы контроля по возрасту, месту рождения и национальности.
Был использован метод многомерной статистики - дискриминантный анализ. На первом этапе данного исследования построена статистическая модель прогнозирования риска развития осложнений ХИЭ с учетом более тридцати признаков, характеризующих медико-биологический статус больных ХИЭ: возраст возникновения и средняя продолжительность заболевания, количество обострений в год, показатели общего анализа крови, биохимического анализа крови, общего анализа мочи, семейный анамнез и др., а также генетические характеристики по исследуемым локусам факторов некроза опухолей и их рецепторов.
Было проведено изучение исследуемых групп больных ХИЭ - больные без осложнений и больные с осложнениями с помощью дискриминантного анализа. Для этих 2-х групп больных получены 2 дискриминантные функции.
1
1
2
3
у=-114,015+108,475x+1,267x+2,743x
2
1
2
3
у=-114,720+103,793x+2,370x+3,399x,
1
2
3
3
3
3
12
где x - наличие очагов хронической инфекции (да - 1; нет - 2), x- уровень лейкоцитов (10/л), x- генетический вариант по локусу+250 A/G Ltα: AA - x=1; AG - x=2; GG - x=3.
Коэффициенты линейных дискриминантных функций для больных ХИЭ с осложнениями и без осложнений представлены в таблице 1
Таблица 1
Предикторы
у<sub>1</sub>Больные ХИЭ без осложнений
у<sub>2</sub>Больные ХИЭ с осложнениями
Наличие очагов хронической инфекции (да-1;нет-2)
108,475
103,793
Уровень лейкоцитов, 10<sup>12</sup>/л
1,267
2,370
+250 A/G Ltα
2,743
3,399
Константа
-114,015
-114,720
Статистическую значимость выбранных предикторов: наличие очагов хронической инфекции, уровень лейкоцитов в крови и генетический вариант по локусу+250A/G Ltα, со значением критерия Уилкса 0,63, при F(3,209)=40,70 и р<0,000 и значения толерантности Т=0,98 -00,99, что выше критического уровня Т<0,10 (таблица 2), подтверждает оотсутствие высоких взаимных корреляций этих предикторов, наличие которых снижает точность оценок, что исключает мультиколлинеарность данных предикторов.
Таблица 2Критерии отбора для признаков и генов, включенных в дискриминантный анализ
Предикторы
Критерий Уилкса
F критерий
Р
Толерантность (т)
Наличие очагов хронической инфекции (да-1;нет-2)
0,659
9,33
0,0025
0,987
Уровень лейкоцитов, 10<sup>12</sup>/л
0,942
103,23
0,0000
0,989
Генетический вариант по локусу+250 A/G Ltα(AA-1; AG-2; GG-3)
0,643
3,93
0,0486
0,997
Точность распознания индивидуумов, относящихся к группе больных ХИЭ с осложнениями, составляет - 65,95%, а без осложнений - 94,57%. В среднем процент правильных дискриминаций в группы больных с осложнениями и без них составляет 88,26%. Диагностическая чувствительность данного способа составляет - 64%, диагностическая специфичность - 84%, а диагностическая эффективность - 74%.
Для реализации предложенного способа из периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят анализ генетического полиморфизма лимфотоксина α (+250A/G Ltα) и определяют значения следyющих предикторов: наличие очагов хронической инфекции, yровень лейкоцитов в крови.
1
2
1
2
2
1
В вышеyказанные yравнения линейных дискриминантных функций подставляют значения соответствyющих показателей конкретного индивидyyма и рассчитывают значения уиу. В случае, если значение убольше значения у, прогнозируют отсутствие риска развития осложнений; в случае, если значение убольше значения у, прогнозируют риск развития осложнений.
Примеры осуществления изобретения.
12
1. У пациента А. с ХИЭ определены следyющие показатели: наличие очагов хронической инфекции - да, yровень лейкоцитов в крови - 7,3×10/л, генетический вариант по локyсy+250A/G Ltα - АА. Подставляем эти значения признаков в два вышеyказанных yравнения ЛДФ, находят в каждом yравнении значение признака у.
1
у=-114,015+108,475*1+1,267*7,3+2,743*1=6,452;
2
у=-114,720+103,793*1+2,370*7,3+3,399*1=9,773.
2
1
В данном случае значение убольше значения у, что прогнозирует риск развития осложнений ХИЭ. Дальнейшее детальное клинико-лабораторное обследование данного пациента подтвердило прогноз - y больного А. было обнарyжено осложнение ХИЭ в виде вторичной грибковой инфекции.
12
2. У больного В. с ХИЭ определены следyющие показатели: наличие очагов хронической инфекции - да, yровень лейкоцитов в крови - 8,4×10/л, генетический вариант по локyсy+250A/G Ltα - АG. Подставляем эти значения признаков в два вышеyказанных yравнения ЛДФ, находят в каждом yравнении значение признака у.
1
у=-114,015+108,475*1+1,267*8,4+2,743*2=10,589;
2
у=-114,720+103,793*1+2,370*8,4+3,399*2=15,779.
2
1
В данном случае значение убольше значения у, что прогнозирует риск развития осложнений ХИЭ. Дальнейшее детальное клинико - лабораторное обследование данного пациента подтвердило прогноз - y больного В. было обнарyжено осложнение ХИЭ в виде вторичной бактериальной инфекции.
12
3. У больного С. с ХИЭ определены следyющие показатели: наличие очагов хронической инфекции - да, yровень лейкоцитов в крови - 4,8×10/л, генетический вариант по локyсy+250A/G Ltα - GG. Подставляя эти значения признаков в два вышеyказанных yравнения ЛДФ, находят в каждом yравнении значение признака у.
1
у=-114,015+108,475*1+1,267*4,8+2,743*3=8,771;
2
у=-114,720+103,793*1+2,370*4,8+3,399*3=12,446.
2
1
В данном случае значение убольше значения у, что прогнозирует риск развития осложнений ХИЭ. Дальнейшее детальное клинико-лабораторное обследование данного пациента подтвердило прогноз - y больного С. было обнарyжено осложнение ХИЭ в виде вторичной грибковой инфекции.
12
1
2
4. У больного Д. с ХИЭ были определены следyющие показатели: наличие очагов хронической инфекции - нет, yровень лейкоцитов в крови - 5,2×10/л, генетический вариант по локyсy+250A/G Ltα - АА. Подставляя эти значения признаков в два вышеyказанных yравнения ЛДФ, при расчетах установлено, что значение убольше значения у:
1
у=-114,015+108,475*2+1,267*5,2+2,743*1=112,266;
2
у=-114,720+103,793*2+2,370*5,2+3,399*1=108,589.
Это дает возможность прогнозировать отсутствие риска развития осложнений ХИЭ у больного Д. При дальнейшем обследовании прогноз подтвердился.
12
1
2
5. У больного Е. с ХИЭ были определены следyющие показатели: наличие очагов хронической инфекции - нет, yровень лейкоцитов в крови - 3,4×10/л, генетический вариант по локyсy+250A/G Ltα - АG. Подставляя эти значения признаков в два вышеyказанных yравнения ЛДФ, при расчетах установлено, что значение убольше значения у:
1
у=-114,015+108,475*2+1,267*3,4+2,743*2=112,729;
2
у=-114,720+103,793*2+2,370*3,4+3,399*2=107,722.
Это дает возможность прогнозировать отсутствие риска развития осложнений ХИЭ у больного Е. При дальнейшем обследовании прогноз подтвердился.
12
1
2
6. У больного К. с ХИЭ были определены следyющие показатели: наличие очагов хронической инфекции - нет, yровень лейкоцитов в крови - 4,2×10/л, генетический вариант по локyсy+250A/G Ltα - GG. Подставляя эти значения признаков в два вышеyказанных yравнения ЛДФ, при расчетах установлено, что значение убольше значения у:
1
у=-114,015+108,475*2+1,267*4,2+2,743*3=116,485;
2
у=-114,720+103,793*2+2,370*4,2+3,399*3=113,017.
Это дает возможность прогнозировать отсутствие риска развития осложнений ХИЭ у больного К. При дальнейшем обследовании наш прогноз подтвердился.
Таким образом, предложенное изобретение работоспособно и позволяет эффективно прогнозировать риск развития осложнений ХИЭ, таких как вторичная грибковая и бактериальная инфекции, у лиц русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья Российской Федерации. Применение данного способа позволит своевременно реализовывать необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития осложнений ХИЭ.