К механизму токсического действия доксорубицина на почки

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Экспериментальные исследования

© Ю.В.Саенко, А.М.Шутов, Р.Х.Мусина, 2006 УДК 616.61-02:615.099:615.33.577]-092.4

Ю.В. Саенко, A.M. Шутов, Р.Х. Мусина

К МЕХАНИЗМУ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ДОКСОРУБИЦИНА НА ПОЧКИ

Yu.V. Saenko, A.M. Shutov, R.Kh. Musina

ON THE MECHANISM OF TOXIC EFFECT OF DOXORUBICIN ON THE KIDNEYS

Кафедра фармакологии с курсом клинической фармакологии, кафедра терапии и профессиональных болезней и кафедра лучевой диагностики, лучевой терапии и онкологии медицинского факультета Ульяновского государственного университета, Россия

РЕФЕРАТ

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Механизмы токсического действия доксорубицина (ДОК) на почки остаются неясными, что послужило основанием для уточнения влияния ДОК на клетки с использованием в качестве клеточной эукариотической модели Saccharomyces cerevisiae. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. В исследовании использовался штамм S. cerevisiae YPH499. Инкубацию клеток с различными концентрациями доксорубицина проводили в течение 24 часов. Степень повреждения ДНК оценивали по активности гена рибонуклеотидредуктазы-3 (RNR3). Определяли концентрацию восстановленного глутатиона (TSH), окисленного глутатиона (TSSr), содержание малонового диальдегида (МДА). РЕЗУЛЬТАТЫ. ДОК вызывал снижение клеточной пролиферации, приводил к росту концентрации TSH, при этом отмечался достоверный рост концентрации rSSr, но выраженный в меньшей степени. В контрольных экспериментах отношение TSH/rSST было 7,33±0,28, тогда как в экспериментах с 10, 20, 30, 40, 50 мкМ ДОК отношение rSH/rSSr составляло 7,52±1,08 (p>0,05); 5,51±0,46 (p< 0,01); 6,38±2,39 (p>0,05); 5,19±0,63 (p<0,01) и 5,05±0,70 (р<0,01), соответственно. ДОК вызывал увеличение экспрессии гена RNR3. Содержание малонового диальдегида существенно не изменялось. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. При инкубации S. cerevisiae в среде, содержащей ДОК и глюкозу, увеличение TSH, обусловленное экспрессией гена RNR3, компенсирует избыточное образование свободных радикалов и не ведет к свободно-радикальному повреждению биомолекул. В почках животных при введении ДОК не обеспечивается достаточной концентрации TSH, и в этих условиях свободные радикалы индуцируют оксидативный стресс за счет редокс циклических реакций ДОК.

Ключевые слова: глутатион, доксорубицин, оксидативный стресс, рибонуклеотидредуктаза, Saccharomyces cerevisiae. ABSTRACT

THE AIM of the investigation was to specify effects of doxorubicin (DOX) on renal cells using eukaryotic model Saccharomyces cerevisiae since the mechanisms of toxic effects of DOX on the kidneys still remain obscure. MATREIALS AND METHODS. The investigation was performed with strain S.cerevisiae YPH499. Incubation of the cells with different concentrations of DOX lasted 24 hours. The degree of injury of DNA was evaluated by activity of the ribonucleotide reductase -3 (RNR3). The concentration of reduced glutathione (G-SH), oxidized glutation (G-SSG), contents of malonic dialdehyde (MDA) were determined. RESULTS. DOX caused a decrease of cell proliferation, resulted in growing concentration of G-SH and so a reliable growth of the concentration of G-SSG was noted, but in less degree. In control experiments the ratio G-SH/G-SSG was 7.33±0.28 while in experiments with 10, 20, 30, 40, 50 mkM DOX the ratio G-SH/G-SSG was 7.52± 1.08 (p>0.05); 5.51±0.46 (p<0.01); 6.38±2.39 (p>0.05); 5.19±0.63 (p<0.01) and 5.05±0.70 (p<0.01) respectively. DOX induced expression of gene RNR3. The content of malonic dialdehyde did not substantially change. CONCLUSION. During the incubation of S.cerevisiae in the medium containing DOX and glucose an increase of G-SH due to expression of gene RNR3 compensates the redundant formation of free radicals and does not lead to free-radical damage of biomolecules. In the kidneys of animals administration of DOX fails to provide a sufficient concentration of G-SH and under these conditions free radicals induce oxidative stress at the expense of redox of cyclic reactions of DOX.

Key words: glutation, doxorubicin, oxidative stress, ribonucleotide reductase, Saccharomyces cerevisiae.

ВВЕДЕНИЕ

Механизмы действия антрациклиновых антибиотиков на почки остаются неясными [1]. Ранее нами было показано, что в ответ на введение крысам доксорубицина (адриамицин) происходит снижение концентрации восстановленного глутатиона (ГБИ) в почках крыс [2]. Это может свидетельствовать, что токсическое действие доксорубицина (ДОК) на почки обусловлено индукцией окси-дативного стресса. Однако снижение концентра-

ции ГБИ может быть также следствием внутриклеточных метаболических нарушений [3]. Более того, в литературе имеются данные, свидетельствующие, что ДОК может вызывать увеличение внутриклеточного содержания ГБИ [4].

Среди возможных механизмов токсического действия ДОК на клетки обсуждается ДНК-по-вреждающее действие [5]. В результате повреждения ДНК запускается каскад событий, связанный с активацией внутриклеточных сигнальных и

метаболических путей, в том числе активируется ген рибонуклеотидредуктазы-3 (К^ЯЗ), активность которого коррелирует с концентрацией Г8И, что также косвенно свидетельствует о возможности влияния ДОК на внутриклеточную концентрацию Г8И [6,7].

Удобной моделью для изучения внутриклеточных сигнальных механизмов являются одноклеточные эукариотическое организмы - Басскатотусез сетеу1з1ае [8]. Это связано с тем, что многие внутриклеточные метаболические, генетические и сигнальные механизмы в общих чертах схожи у большинства эукариотических клеток различных видов.

сетеугзгае уже успешно использовались с целью изучения токсических эффектов лекарственных средств, в том числе и антрациклиновых антибиотиков [9].

Целью исследования явилось уточнение влияния ДОК на клетки с использованием в качестве клеточной эукариотической модели Басскатотусез сетеугзгае.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследовании использовался штамм УРИ499 (МАТа, ита3-52, 1уз2-801, ас(е2-101, гтр1-сСе1га63, Ыз3-сСеиа200, 1еи2-с(еиаЦ. Плазмиду pZZ2 (УСр иЯА3, КЫЯЗ-ЬасТ) мы получили от д-ра С. Элед-жа (Центр геномики и протеомики, Гарвардская школа медицины, Бостон, США) [6].

Инкубацию клеток с различными концентрациями доксорубицина проводили в течение 24 часов при температуре 250 С в минимальной синтетической среде без урацила. Проводилось 5 опытов с одной и той же концентрацией ДОК. Инкубация осуществлялась в круглодонных колбах объёмом 250 мл, объем среды - 30 мл, на качалке (250 об/мин). Для определения степени клеточной пролиферации определялась оптическая плотность клеток при 600 нм (ОБ600) [10].

Начальная концентрация клеток во всех опытах была одинаковой и составляла ОБ600= 0,3. Трансформацию клеток осуществляли с использованием ацетата лития по методу Р. Гейтца [11].

Для оценки степени повреждения ДНК использовали показатель экспрессии гена рибонуклеотид-редуктазы-3 (К^ЯЗ), который кодирует большую субъединицу фермента рибонуклеотидредуктазы [6]. Степень генотоксического эффекта доксору-бицина мы оценивали с помощью генетической конструкции ККЯ3-Ьас2, которая была включена в низкокопийную плазмиду pZ22. В генетической конструкции ККЯ3-Ьас2 промотор гена рибонук-леотидредуктазы 3 сцеплен с ферментом бета-галактозидазы. Это дает возможность по величи-

не активности в-галактозидазы судить о степени экспрессии гена рибонуклуотидредуктазы 3 [12].

Определение активности в-галактозидазы проводилось с использованием о-нитрофенилгалакто-пиранозида в качестве субстрата и выражалась в единицах Миллера [13].

Концентрация Г8И и Г88Г определялась по методу Баккера [14]. Количество Г8И и Г88Г выражали в (мМ х мл)/(107 клеток). Для этого перед лизисом клеток определялась их оптическая плотность при 600 нм. При оптической плотности ОБ600 = 1,0 (Ь = 1,0) количество клеток принималось равным 1 х 107 [10].

Результаты обработаны статистически с использованием критерия Стьюдента для парных переменных. Показатели представлены как М±8Б. Различия между сериями экспериментов считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

На рис. 1 представлена выраженность клеточной пролиферации при разных концентрациях док-сорубицина. Как видно из графика, доксорубицин вызывал замедление клеточной пролиферации 5. сетеу1з1ае при концентрациях от 10 до 50 мкмоль.

Содержание Г8И и Г88Г при различных концентрациях доксорубицина представлено на рис. 2. Док-сорубицин вызывал увеличение концентрации Г8И, при этом одновременно с ростом концентрации Г8И отмечался достоверный рост концентрации Г88Г, но выраженный в меньшей степени. Отношение Г8Б/ Г88Г с ростом концентрации доксорубицина снижалось. Так, в контрольных экспериментах этот показатель составлял 7,33 ± 0,28, тогда как в экспериментах с 10, 20, 30, 40, 50 мкМ ДОК отношение

Рис. 1. Пролиферация клеток Б. Сегеу^ае, инкубированных в среде с разной концентрацией доксорубицина. Примечание: * - р < 0,05; ** - р < 0,01.

Рис. 2. Содержание rSH и TSST в клетках S. Cerevisiae, инкубированных в среде с разной концентрацией доксорубицина. Примечание: * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001.

Рис. 3. Активность b-галактозидазы в клетках S. Cerevisiae, инкубированных в среде с разной концентрацией доксорубицина. Примечание: * - p < 0,05; ** - p < 0,01.

Рис. 4. Концентрация малонового диальдегида в клетках S. Cerevisiae, инкубированных в среде с разной концентрацией доксорубицина. Примечание: НД - различие недостоверно.

rSH/rSSr составляло 7,52±1,08 (p>0,05); 5,51±0,46 (p< 0,01); 6,38±2,39 (p>0,05); 5,19±0,63 (p<0,01) и 5,05±0,70 (р<0,01), соответственно.

Наибольшая активность ß-галактозидазы и, соответственно, наибольшая экспрессия гена ри-бонуклеотидредуктазы-3 наблюдалась при концентрации доксорубицина в ростовой среде равной 20 мкМ, а минимальная активность при концентрации доксорубицина 40 мкМ (рис. 3).

Содержание малонового диальдегида при инкубации клеток в среде, содержащей ДОК, не отличалось от контроля (рис. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

Представленные данные свидетельствуют, что ДОК вызывает увеличение внутриклеточного содержания TSH у S. cerevisiae. Сам по себе факт роста концентрации TSH в ответ на добавление в ростовую среду доксорубицина не является необычным и уже отмечался в экспериментах на культурах эукариотических клеток [4]. Однако наши данные не согласуются с многочисленными фактами, свидетельствующими о снижении концентрации TSH в ответ на введение доксорубицина, в частности, в предыдущих работах мы отмечали, что в ответ на введение крысам доксорубицина происходит снижение концентрации TSH в почках [2].

Расхождение данных, полученных на эукари-отической модели S. cerevisiae с экспериментальными данными, полученными на животных, по нашему мнению, можно объяснить различной доступностью глюкозы. Окисление глюкозы в пентозо-фосфатных путях является основным источником НАДФН2 для клетки, и следовательно, восстановленных эквивалентов в виде TSH. S. cerevisiae культивировались в среде с высоким содержанием глюкозы. В то же время клетки почек экспериментальных животных могли испытывать дефицит в глюкозе.

Глутатион восстановленный - низкомолекулярный содержащий серу трипептид, который может легко окисляться и быстро восстанавливаться, в этой связи он участвует во многих биохимических и фармакологических реакциях, регулирует экспрессию генов и апоптоз [15]. Показано, что отсутствие адаптивного адекватного увеличения TSH способствует большему повреждающему действию свободных радикалов [16]. Свободные радикалы могут вести к апоптозу, в частности, это показано при гентамициновой нефротоксичности [17]. При остром пуромициновом нефрозе оксида-тивный стресс ведет к развитию апоптоза, что коррелирует с уровнем протеинурии у Sprague-Dawley крыс [18].

Следует отметить значение полиморфизма генов, ответственных за реакцию организма на окси-дативный стресс [15]. Кроме того, разные ткани одного и того же организма по-разному отвечают на введение ДОК [19,20]. Большую подверженность сердца токсическому действию ДОК объясняют низкой активностью антиоксидантных ферментов, в отличие от тканей печени и почек [21].

Доксорубицин способен принимать электрон и восстанавливаться до семихинона [22]. Доксо-рубицин в форме семихинона является свободным радикалом и способен восстанавливать кислород до супероксид анион-радикала. В ходе реакции с кислородом, кроме супероксид анион-радикала, генерируется исходная форма доксорубицина (т.е. хинон). Такие свойства доксорубицина делают возможным повреждение ДНК либо непосредственно свободными радикалами, либо их продуктами.

Полученные нами данные свидетельствуют, что экспрессия ККЯ3 достигала максимума при 20 мкмолях, при дальнейшем росте концентрации доксорубицина степень экспрессии несколько снижалась.

Интересно, что легкая острая гентамициновая нефротоксичность предохраняет почки от хронических структурных изменений у крыс с односторонней нефрэктомией и адриамициновым нефрозом [17]. Механизм протективного действия низких доз гентамицина не ясен, однако аминогликозиды в низких дозах при кратковременном применении могут увеличивать клеточную пролиферацию [23].

Увеличение экспрессии КЫЯ3 происходило на фоне повышения концентрации ГБИ. Фермент ри-бонуклеотид редуктаза восстанавливает рибозу до дезоксирибозы, используя при этом в качестве доноров водорода глутаредоксин и тиоредоксин. Глутаредоксин, окисляясь в реакции восстановления рибонуклеотидов, сам восстанавливается за счет окисления глутатиона [24].

В процессе репарации ДНК также необходимы дополнительные количества рибозы, которая синтезируется в ходе реакций пентозо-фосфатных путей. Кроме образования рибозы, в ходе реакций пентозо-фосфатных путей происходит восстановление двух молекул НАДФ+ до НАДФН2, что также может вызвать увеличении концентрации ГБИ [25]. Таким образом, увеличение экспрессии гена рибонуклеотид редуктазы сопровождается синтезом дополнительного количества ГБИ.

Несмотря на рост содержания ГБИ в ответ на увеличение концентрации доксорубицина, отношение Г8И/Г88Г уменьшалось, что свидетельствует о снижении окислительно-восстановительного

потенциала [26]. Такой эффект является следствием редокс-циклической активности ДОК.

Таким образом, доксорубицин вызывает рост внутриклеточной концентрации TSH в клетках S. Cerevisiae, что опосредуется через экспрессию гена RNR3. Одновременно с этим наблюдается рост концентрации rSSr, как результат редокс-циклической активности ДОК. Отмеченное в предыдущих наших работах снижение TSH в почках крыс в ответ на введение ДОК может быть связано с недостаточной обеспеченностью клеток почек глюкозой, в результате чего инициируемое ДОК повышение концентрации TSH через активацию экспрессии гена RNR3 не может реализоваться, тогда как редокс-цикличес-кая активность доксрубицина не снижается.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При инкубации S. cerevisiae в среде, содержащей ДОК и глюкозу, увеличение TSH компенсирует избыточное образование свободных радикалов и не ведет к свободно-радикальному повреждению биомолекул. В почках животных при введении ДОК не обеспечивается достаточной концентрации TSH и в этих условиях наблюдается избыток свободных радикалов за счет редокс циклических реакций ДОК. Одной из возможных причин дефицита TSH в клетках почек животных при введении ДОК является дефицит или недостаточное поступление глюкозы в клетки. Представленные данные открывают перспективу новых подходов к профилактике токсического действия ДОК на почки.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Gewirts DA. A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin. Biochem Pharmacol 1999;57:727-741

2. Саенко ЮВ, Шутов АМ, Напалкова СМ, Селиванова ОС. Эритропоэтин снижает проявления оксидативного стресса, индуцированного доксорубицином, в почках крыс. Нефрология 2005;9(2):96-100

3. Lu SC. Regulation of hepatic glutathione synthesis: current concepts and controversies. FASEB J 1999;13:1169-1183

4. Pinkus R, Weiner LM, Daniel V. Role of quinine-mediated generation of hydroxyl radicals in the induction of glutathione S-transferase gene expression. Biochemistry 1995;34: 81-88

5. Doroshow JH, Synold TW, Somlo G et al. Oxidative DNA base modifications in peripheral blood mononuclear cells of patients treated with high-dose infusion doxorubicin. Blood 2001; 97:2839-2845

6. Elledge SJ, Davis RW. Two genes differentially regulated in the cell cycle and by DNA-damaging agents encode alternative regulatory subunits of ribonucleotide reductase. Genes Dev 1990; 4:740-751

7. Miranda-Vizuete A, Rodri'guez-Ariza A, Toribio F, et al. The levels of ribonucleotide reductase, thioredoxin, glutaredoxin 1, and GSH are balanced in Escherichia coli K12. J Biol Chem 1996;271(32):19099-19103

8. Goffeau A, Barrell BG, Bussey B et al. Life with 6000 genes. Science 1996;274: 546-567

9. Buschini A, Poli P, Rossi C. Saccharomyces cerevisiae

as an eukaryotic cell model to assess cytotoxicity and genotoxicity of three anticancer anthraquinones. Mutagenesis 2003;18:26-36

10. Berlin V, Brill JA, Trueheart J et al. Genetic screens and selections for cell and nuclear fusion mutants. Methods in Enzymology 1991;194:774-792

11. Gietz RD, Woods RA. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology 2002;350: 87-96

12. Jia X, Xiao W. Compromised DNA repair enhances sensitivity of the yeast RNR3-LacZ genotoxicity testing system. Toxicological Science 2003;75:82-88

13. Guarente L. Yeast promoters and lacZ fusions designed to study expression of cloned genes in yeast. Methods Enzymol 1983;101:181-191

14. Baker MA, Cerniglia GJ, Zaman A. Microtiter plate assay for the measurement of glutathione and glutathione disulfide in large numbers of biological samples. Anal Biochem 1990;190:360-365

15. Jefferies H, Coster J, Khalil A et al. Glutathione ANZ. J Surg 2003;73:517-522

16. Kannan K, Jain SK. Oxidative stress and apoptosis. Pathophysiology 2000;7:153-163

17. Martinez-Salvado C, Eleno N, Morales AI et al. Gentamicin treatment induced simultaneous mesangial proliferation and apoptosis in rats. Kidney Int 2004:65:21612171

18. Rincon J, Romero M, Viera N et al. Increased oxidative

stress and apoptosis in acute puromycin aminonucleoside nephrosis. Int J Exp Path 2004;85:25-33

19. Liu QY, Tan BK. Relationship between anti-oxidant activities and doxorubicin-induced lipid peroxidation in P388 tumour cells and heart and liver and mice. Clinical and experimental pharmacology and Physiology 2003;30:185-188

20. Liu QY, Tan BK. Dietary fish oil and vitamin E enhance doxorubicin effects in P388 tumor-bearing mice. Lipids 2002;37:549-556

21. Doroshow JH, Locker GY, Myers CE. Enzymatic defenses of the mouse heart against reactive oxygen metabolites: Alterations produced by doxorubicin. J Clin Invest 1980; 65:128-135

22. Powis G. Free radical formation by antitumor quinones. Free Rad Biol Med 1989;6:63-101

23. Toubeau G, Laurent G, Carlier MB et al.Tissue repair in rat kidney cortex after short treatment with aminoglycosides at low doses. Lab invest 1986;54:385-393

24. Arner ESJ, Holmgren A. Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase. Eur J Biochem 2000; 267:6102-6109

25. Schafer QF, Buettiner GR. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/ glutathione couple. Free Rad Biol Med 2001;30: 1191-1212

26. Klatt P, Lamas S. Regulation of protein function by S-glutathiolation in response to oxidative stress. Eur J Biochem 2000;267:4928-4944

Поступила в редакцию 14.06.2006 г.