СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА БЕЛКОВ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА ПОДЛОЖКЕ СКАНИРУЮЩЕГО ЗОНДОВОГО МИКРОСКОПА
METHOD FOR ENZYMATIC HYDROLYSIS OF PROTEINS IMMOBILISED ON SUBSTRATE OF SCANNING PROBE MICROSCOPE

Изобретение относится к биофизике и медицинской протеомике, в частности способу сайт-специфичного гидролиза белковых молекул при помощи энзима, иммобилизованных на поверхности сканирующего зондового микроскопа. Описываемый способ может быть использован для применения методов зондовой микроскопии и масс-спектрометрии при визуализации и идентификации белковых молекул в протеомных исследованиях. Масс-спектрометрическое исследование при этом обеспечивает верификацию результатов идентификации белков (белковых комплексов), полученных методом сканирующей зондовой микроскопии. Изобретение может быть использовано в медицинской диагностике инфекционных и онкологических заболеваний при проведении идентификации специфических белков и белковых комплексов в исследуемых биологических жидкостях организма.
Известен способ гидролиза [патент WO 2004049818], где белок (белковый комплекс, белоксодержащий исходный материал) подвергают воздействию, по крайней мере, одного энзима. Однако данный способ предполагает использование произвольного энзима, что не обеспечивает сайт-специфичность процесса гидролиза. В результате при последующем масс-спектроскопическом исследовании продуктов такого гидролиза невозможно идентифицировать исходный белок, так как существующие геномные базы данных предполагают использование сайт-специфичных энзимов, разрушающих пептидную связь при наличии в пептидной последовательности строго определенных аминокислот.
Известен способ [Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М.: Мир, 1976 г., 368 с.], где предлагается реакция Сэнгера и Туппи, - неспецифический частичный кислотный гидролиз. Его недостатком является невозможность последующего анализа масс-спектрометрическими методами.
Известен патент [РФ 2351932], заключающийся в том, что используется гидролиз сайт-специфичным энзимом - трипсином - для специфического отделения частей (а именно, пептидов) белков (белковых комплексов) от поверхности. Тот факт, что гидролизуемые белки (белковые комплексы) иммобилизованы на поверхности, не позволяет добиться высокой степени гидролиза: реакция взаимодействия энзима и белка (белкового комплекса) протекает малоэффективно из-за того, что белки (белковые комплексы) расположены на поверхности, а энзим находится в объеме, что приводит к слабой кинетике реакции, которая определяется диффузией к поверхности.
Наиболее близким по своей технической сущности, принятым за прототип, является способ ферментативного гидролиза, заключающийся в использовании сайт-специфичного энзима трипсина совместно с ультразвуковым воздействием на стадии проведения реакции гидролиза, описанный в патенте [US 20090246813]. Недостатком данного способа, как и в предыдущем способе, является неэффективность его применения для гидролиза белков, иммобилизованных на поверхности, из-за сложности проведения реакции между белком (белковым комплексом), расположенным исключительно у поверхности, и энзимом трипсином, находящимся в объеме.
11
2
Задачей настоящего изобретения является снижение порога обнаружения белковых молекул (белков, белковых комплексов), иммобилизованных на поверхности подложки сканирующего зондового микроскопа при помощи масс-спектрометра до 10 шт./см. Для этого требуется обеспечить высокую эффективность гидролиза при достаточно низкой концентрации белка, обусловленной плотностью его усадки на поверхности, которая определяется возможностью их визуализации (регистрации) с помощью сканирующего зондового микроскопа.
Достигаемый технический результат состоит в повышении эффективности десорбирования белковых молекул, ковалентно связанных с подложкой, и их последующего гидролиза, что приводит к снижению порога обнаружения методами масс-спектрометрического анализа. Технический результат достигается путем предварительного ультразвукового воздействия, в ходе которого белки отсоединяются от поверхности и переходят в жидкую фазу, что повышает эффективность последующего гидролиза. Это отличает предлагаемый способ от прототипа, где ультразвуковое воздействие используется для повышения скорости гидролиза.
Для решения поставленной задачи предлагается способ, заключающийся в том, что белки подвергают воздействию ультразвука и сайт-специфичного фермента в буферном растворе с величиной pH и при температуре, которые обеспечивают активность фермента, а длительность воздействия выбирают таким образом, чтобы обеспечить гидролиз основной доли белков, но избежать неспецифичного гидролиза.
2
Перед воздействием фермента подложку сканирующего зондового микроскопа с иммобилизованным на ней белком извлекают из транспортировочного буферного раствора, помещают в 1-5% раствор уксусной кислоты и подвергают воздействию ультразвука высокой частоты с мощностью не менее 1 Вт/см, что обеспечивает разрыв связей белок-поверхность. После чего раствор, содержащий десорбированные белки, замораживают и подвергают лиофилизации.
11
13
2
2
Способ заключается в следующем: первоначально сливают транспортировочный буферный раствор из пробирки, в котором находится образец (подложка, предназначенная к исследованию в сканирующем зондовом микроскопе, с иммобилизованными на ней белковыми молекулами с концентрацией в диапазоне 10-10 шт./см). Далее образец заливают уксусной кислотой в диапазоне концентраций 1-5% так, чтобы образец был полностью погружен в раствор. Пробирку с образцом помещают в ультразвуковую ванну с частотой ультразвука 1-3 МГц и мощностью не менее 1 Вт/см на время, обеспечивающее отделение максимального количества белков (белковых комплексов) от поверхности, но без разрушения самих белков, при температуре, диапазон которой обусловлен коэффициентом диффузии и сохранением структуры белка (белкового комплекса). Затем удаляют подложку из пробирки. После этого пробирку с раствором, содержащим десорбированные белки, замораживают и подвергают лиофилизации. Затем производят размораживание до комнатной температуры. Добавляют раствор энзима, а также буферный раствор, позволяющий поддерживать рН на уровне, необходимом для эффективной работы энзима. Выдерживают полученный раствор при температуре 37°C. Длительность воздействия выбирают таким образом, чтобы наибольшее количество целевого белка было гидролизовано и при этом было минимизировано количество продуктов самогидролиза энзима. После осуществления гидролиза производят остановку процесса путем изменения рН на слабокислую среду. Контроль продуктов самогидролиза энзима выполняют путем сравнения масс-спектров продуктов реакции исследуемого вещества, полученных при различной длительности выдерживания, и масс-спектра тестовой пробы, содержащей исключительно используемый энзим. Для целей контроля энзима с его помощью также проводят гидролиз известного белка при тех же условиях, что и гидролиз исследуемого вещества. Затем оба раствора продуктов гидролиза переносят в хроматограф, соединенный с масс-спектрометром, или на пластину МАЛДИ-спектрометра, предварительно добавив матрицу в раствор.
Пример №1
2
4
3
Первоначально сливают транспортировочный буферный раствор из пробирки, в которой находился образец размером 10×20×0.5 мм (подложка сканирующего зондового микроскопа). Затем заливают образец 2% уксусной кислотой так, чтобы образец был полностью погружен в раствор. Далее на 10 минут помещают пробирку с образцом в термостатирующую ультразвуковую ванну мощностью 5 Вт/см при температуре 37°C. После этого вынимают подложку и замораживают раствор, содержащий десорбированные белки, при -70°C. Затем раствор подвергают лиофилизации в течение 4 ч, после чего размораживают до комнатной температуры. Добавляют в пробирку 400 мкл буферного раствора NHHCO с концентрацией 3,95 мкг/мкл и 2 мкл трипсина с концентрацией 0.2 мкг/мкл. Далее пробирку помещают в термостат (с постоянным перемешиванием) при температуре 37°C на 12 часов. Затем добавляют МАЛДИ-матрицу и наносят на мишень для получения масс-спектра.
Пример №2
2
4
3
Первоначально сливают транспортировочный буферный раствор из пробирки, в которой находился образец размером 10×20×0.5 мм (подложка сканирующего зондового микроскопа). Затем заливают образец 2% уксусной кислотой так, чтобы образец был полностью погружен в раствор. Далее на 10 минут помещают пробирку с образцом в термостатирующую ультразвуковую ванну мощностью 5 Вт/см при температуре 37°C. После этого вынимают подложку и замораживают раствор, содержащий десорбированные белки, при -70°C. Затем раствор подвергают лиофилизации в течение 4 ч, после чего размораживают до комнатной температуры. Добавляют в пробирку 400 мкл буферного раствора NHHCO с концентрацией 3,95 мкг/мкл и 1/30 часть (по отношению к количеству белка) кристаллического пепсина. Далее пробирку помещают в термостат (с постоянным перемешиванием) при температуре 25°C на 17 часов. После чего пробу анализируют при помощи хромато-масс-спектрометра.
11
2
Использование способа обеспечивает снижение порога обнаружения белковых молекул (белков, белковых комплексов), иммобилизованных на поверхности подложки сканирующего зондового микроскопа, при помощи масс-спектрометра до концентрации 10 шт./см.