ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХРОМОСОМНЫХ АНОМАЛИЙ В КЛЕТКАХ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЖИДКОСТИ
DETECTION OF CHROMOSOME ANOMALIES IN CELLS OBTAINED FROM FOLLICULAR FLUID

Перекрестные ссылки на
родственную заявку
В настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной индийской заявке на патент № 642/MUM/2004, зарегистрированной 11 июня 2004 г.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способу определения у индивидуума в клетках, полученных из фолликулярной жидкости хромосомных аномалий, включая гонадный мозаицизм.
Описание смежной области
Представленные в ядре эукариотических клеток хромосомы несут генетическую информацию клетки. Как правило, в каждой диплоидной клетке человека присутствует 23 пары хромосом с общим количеством 46 хромосом. Аномалии в структуре или количестве хромосом могут приводить к физиологическим и связанным с развитием аномалиям. Структурные аномалии хромосом могут представлять собой транслокации (реципрокные и робертсоновские), делеции, инверсии (парацентрические и перицентрические), кольцевые хромосомы и изохромосомы. Структурные хромосомные аномалии также включают в себя реаранжировку хромосом, возникающую в результате разрыва хромосомы и последующей сборки с различной сбалансированной или несбалансированной конфигурацией (Mueller RF and Young ID; Emery's Elements of Medical Genetics Ninth Edition, 1995, p. 37).
Количественные хромосомные аномалии представляют собой потерю или увеличение на одну или несколько хромосом (анеуплоидия), потерю полного набора хромосом (моноплоидия) или увеличение на один или несколько полных наборов хромосом (полиплоидия). Анеуплоидия может встречаться в форме нуллисомии (потери пары гомологичных хромосом, 2n-2), моносомии (потери одной хромосомы, 2n-1), трисомии (увеличении на одну хромосому, 2n+1) или тетрасомии (увеличении на пару гомологов, 2n+2). Анеуплоидия может быть результатом отсутствия расхождения, когда парные хромосомы не разделяются друг с другом во время деления клетки. Если нерасхождение происходит во время гаметогенеза, половина (нерасхождение при мейозе II) или все (нерасхождение при мейозе I) образующиеся гаметы будут являться анеуплоидными. Нерасхождение также может происходить при митозе, образуя две клеточные линии с различным количеством хромосом.
Следовательно, отдельный индивидуум может иметь две или несколько клеточных популяций с различными кариотипами или генетическим составом, который можно назвать мозаицизмом, хромосомным мозаицизмом или гонадным мозаицизмом. Здесь мозаичным является организм, состоящий из клеток с двумя или несколькими различными генотипами. Различные части тела индивидуума могут иметь клетки с различным общим количеством хромосом или содержанием хромосом, если явление нерасхождения происходит на этапе раннего развитии индивидуума. Мозаицизм также может являться следствием событий генных мутаций. Аналогичным образом, если мутация происходит на этапе раннего эмбрионального развития, некоторые, но не все, клетки индивидуума могут иметь мутацию.
о
Хромосомный мозаицизм может возникать в любом количестве тканей, в зависимости от временнго интервала явления нерасхождения и типа клеток, в которых оно происходит. Следовательно, трудно предсказать тип или тяжесть симптомов у индивидуума с хромосомным мозаицизмом. Если мозаицизм ограничен гонадами, он известен как гонадный мозаицизм (Goldstein et al., J. Pediatrics, 1977, 90:604). Гонадный мозаицизм может возникать в результате происходящей в гонадах развивающегося эмбриона мутации.
Также известно, что хромосомные аномалии влияют на развитие и функционирование яичников в зависимости от доли аномальных клеток в яичниках (Cunniff et al., Hum Genet., 1991, 86: 553-556). Например, показано, что женщины с потерей копии X-хромосомы (45,X) или обладающие дополнительной копией X-хромосомы (46,XX) имеют повышенный риск преждевременного угасания функции яичников (Cunniff et al., Hum. Genet., 1991, 86: 553-556; Zinn et al., Trends Genet. 1993, 9: 90-93). Исследования показали, что до 99% оплодотворений с моносомией 45,X приводят к преждевременному прерыванию беременности (Hook and Warburton, Hum. Genet., 1983, 64: 24-27; Hassold et al., Am. J. Hum. Genet., 1988, 42: 534-541). Мозаичная X-хромосомная моносомия (45,X/46,XX) ассоциирована с атрезией фолликулов, гонадной дисгенезией, а также отчасти является причиной прерывания беременности на ранних сроках (Zinn et al., Trends Genet., 1993, 9: 90-93; Shreck et al., Emery and Rimoni's Principles of Practice of Medical Genetics, Vol. 1, Churchill Livingstone, 2002, 982-97).
Женщины с гонадным мозаицизмом могут иметь ооциты с хромосомными аномалиями, которые могут являться причиной бесплодия или хромосомных аномалий у развивающегося эмбриона. Данные возможные эффекты служат основанием для консультации или лечебных действий, как, например, донорство ооцитов/эмбрионов, предимплантационная генетическая диагностика или пренатальная диагностика. Следовательно, усовершенствование определения или диагностики гонадного мозаицизма улучшат обслуживание больных.
Существующие способы идентификации и диагностики хромосомных аномалий ограничены гонадным мозаицизмом, а при обнаружении слабо выраженного мозаицизма доступные способы являются инвазивными или неэффективными. Например, подозрение на хромосомную аномалию у индивидуума можно подтвердить или исключить посредством анализа образца крови. Однако данное исследование необязательно определяет мозаицизм, ограниченный одним органом или тканью или даже ограниченной части клеток в данной ткани. Например, анализ образца крови может не определить гонадный мозаицизм. Кроме того, люди с гонадным мозаицизмом могут оставаться в значительной степени бессимптомными в течение жизни, что дополнительно снижает возможности диагностики.
Для диагностики ограниченного одной тканью мозаицизма должны быть проанализированы клетки данной конкретной ткани. Обнаружение мозаицизма в данной ткани зависит от количества пораженных клеток и количества проанализированных клеток. Кариотипирование представляет собой часто применяемый генетический тест для хромосомного анализа, при котором исследуют полный хромосомный состав клетки индивидуума посредством визуализации хромосом и подсчета хромосом. Подверженные кариотипированию клетки предпочтительно культивируют и останавливают митоз на стадии метафазы клеточного деления, так как хромосомы лучше всего визуализируются на стадии метафазы клеточного деления. Это делает кариотипирование длительной и трудоемкой процедурой и не позволяет анализировать очень большое количество клеток. Следовательно, при помощи кариотипирования можно не определить слабо выраженный мозаицизм, при котором поражена лишь небольшая часть клеток в органе или ткани.
В настоящее время для определения гонадного мозаицизма гонадную ткань выделяют посредством биопсии гонад. Биопсия гонад не является обычной процедурой, ее выполняют посредством тонкоигольной пункционно-аспирационной биопсии или клинообразной биопсии с применением лапаротомии или лапароскопии. После этого полученный образец ткани кариотипируют, что может не выявить слабо выраженный гонадный мозаицизм. Следовательно, существующие исследования для определения хромосомных аномалий имеют ограниченные возможности в определении гонадного мозаицизма, конкретно слабовыраженного гонадного мозаицизма.
Следовательно, желательно предоставить миниинвазивный способ для определения хромосомных аномалий, включая гонадный мозаицизм, предпочтительно определяющий даже слабовыраженный гонадный мозаицизм.
КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам определения по меньшей мере одной хромосомной аномалии в клетках, полученных из фолликулярной жидкости, включающим в себя
a) получение клеток из фолликулярной жидкости;
b) генетический анализ клеток;
in vitro
где часть клеток имеет по меньшей мере одну хромосомную аномалию. В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам идентификации аномалий репродуктивной системы, где идентификация по меньшей мере одной хромосомной аномалии в части полученных из фолликулярной жидкости клеток является характерной аномалией репродуктивной системы. Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам идентификации гонадного мозаицизма посредством идентификации по меньшей мере одной хромосомной аномалии в клетках, полученных из фолликулярной жидкости с применением тех же способов. В конкретных вариантах осуществления гонадный мозаицизм представляет собой слабовыраженный гонадный мозаицизм, где предпочтительно менее 10% клеток, более предпочтительно, менее чем 5%-10% клеток в ткани или органе имеют хромосомную аномалию. В предпочтительных вариантах осуществления фолликулярную жидкость получают от животного, более предпочтительно, от человека. Полученные из фолликулярной жидкости клетки могут происходить из репродуктивных тканей и в конкретных вариантах осуществления представляют собой соматические клетки. В предпочтительных вариантах осуществления, фолликулярную жидкость получают во время процедуры оплодотворения или процедуры внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида . В других вариантах осуществления, фолликулярную жидкость не получают в связи с любой из данных процедур. Предпочтительно фолликулярную жидкость получают из одного или обоих яичников субъекта.
Настоящее описание изобретения также относится к способам анализа повышенного риска бесплодия у животных, включающим в себя
a) получение клеток из фолликулярной жидкости животного; и
b) генетический анализ клеток,
in vitro
in vitro
где определение по меньшей мере одной хромосомной аномалии в части клеток является характерным указанием на повышенный риск бесплодия. В предпочтительных вариантах осуществления животным является человек. Полученные из фолликулярной жидкости клетки могут происходить из репродуктивных тканей и в конкретных вариантах осуществления представляют собой соматические клетки. В предпочтительных вариантах осуществления фолликулярную жидкость получают во время процедуры оплодотворения или процедуры внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида . В других вариантах осуществления фолликулярную жидкость получают способом, не связанным с любой из указанных процедур. Предпочтительно фолликулярную жидкость получают из одного или обоих яичников животного. В предпочтительных вариантах осуществления, когда идентифицируют, что животное имеет повышенный риск бесплодия, и подвергают животное процедуре оплодотворения , эмбрион, полученный из выделенных у животного ооцитов, можно подвергать предимплантационному генетическому анализу. В более предпочтительных вариантах осуществления, когда генетический анализ показывает, что эмбрион не имеет хромосомной аномалии, эмбрион предпочтительно пересаживают в матку животного.
in situ
Любой из описанных здесь способов можно применять в качестве хорошо известных специалисту в данной области способов генетического анализа для определения хромосомных аномалий в клетках, полученных из фолликулярной жидкости. В предпочтительных вариантах осуществления, генетический анализ представляет собой флуоресцентную гибридизацию , кариотипирование или секвенирование ДНК. В других предпочтительных вариантах осуществления генетический анализ представляет собой сравнительную геномную гибридизацию (CGH) (например, выполненную с метафазными хромосомами или CGH-матрицей), многоцветный бэндинг (MCB), количественную FISH (Q-FISH), полимеразную цепную реакцию (PCR), технологию GBA (минитипирование), мультиплексное секвенирование, SNaPshot, MassEXTEND, MassArray, лигирование на миниматрицах, минисеквенирование на микроматрицах, маркерные миниматрицы, удлинение праймеров на матрицах (APEX), удлинение праймеров на микроматрицах, GOOD-анализ, кодированные микросферы, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP), аллель-специфический анализ олигонуклеотидов (ASO), специфичную к метилированию ПЦР (MSPCR), способ пиросеквенирования, анализ acycloprime, обратный дот-блот, микроматрицы GeneChip, динамическую аллель-специфическую гибридизацию (DASH), пептидные зонды нуклеиновых кислот (PNA) и запирающие зонды нуклеиновых кислот (LNA), TaqMan, Molecular Beacons, интеркалирующее окрашивание, праймеры FRET, AlphaScreen, SNPstream, Invader assay, управляемое матрицей включение (TDI), флуоресцентную поляризацию, анализ олигонуклеотидного лигирования и выделение кодированных последовательностей, лигазную цепную реакцию, запирающие зонды, амплификацию по типу катящегося кольца или колориметрический анализ олигонуклеотидного лигирования (OLA).
В выделенных из фолликулярной жидкости клетках можно идентифицировать любое количество хромосомных аномалий, которые могут являться характерными для гонадного мозаицизма или слабо выраженного гонадного мозаицизма. В конкретных вариантах осуществления, хромосомная аномалия, идентифицированная во всех клетках или в части клеток из фолликулярной жидкости, представляет собой анеуплоидию, транслокацию, делецию, микроделецию, инверсию или удвоение. Идентифицированная анеуплоидия может представлять собой полную или частичную трисомию, например, трисомию 13, трисомию 16, трисомию 18, трисомию 21, трисомию 22, XXY, XYY или XXX; полную или частичную моносомию, например, моносомию X, моносомию 13, моносомию 16, моносомию 18, моносомию 21 или моносомию 22; или полную или частичную нуллисомию, например, для хромосом 13, 16, 18, 21, 22, X или Y.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Сопровождающие фигуры являются частью настоящего изобретения и включены для дополнительной демонстрации конкретных аспектов настоящего изобретения. Описание изобретения можно лучше понять со ссылкой на одну или несколько данных фигур в сочетании с подробным описанием представленных здесь конкретных вариантов осуществления.
Фигура 1. Микрофотография анализа FISH нормальной диплоидной человеческой женской клетки, полученной из фолликулярной жидкости. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два голубых сигнала для хромосомы 18 и два зеленых сигнала для хромосомы X, обозначающие нормальную диплоидную женскую клетку.
Фигура 2. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с моносомией 18. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны один голубой сигнал для хромосомы 18 и два зеленых сигнала для хромосомы X, обозначая в женской клетке моносомию 18.
Фигура 3. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с моносомией X. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два голубых сигнала для хромосомы 18 и один зеленый сигнал для хромосомы X, обозначая в женской клетке моносомию X.
Фигура 4. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией 18. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны три голубых сигнала для хромосомы 18 и два зеленых сигнала для хромосомы X, обозначая в женской клетке трисомию 18.
Фигура 5. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией X. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два голубых сигнала для хромосомы 18 и три зеленых сигнала для хромосомы X, обозначая в женской клетке трисомию X.
Фигура 6. Микрофотография анализа FISH нормальной полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки. Применяют специфичные для хромосом 13 (зеленый) и 21 (оранжевый) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два зеленых сигнала для хромосомы 13 и два оранжевых сигнала для хромосомы 21, обозначая диплоидную клетку с нормальным набором хромосом 13 и 21.
Фигура 7. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией 13. Применяют специфичные для хромосом 13 (зеленый) и 21 (оранжевый) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны три зеленых сигнала для хромосомы 13 и два оранжевых сигнала для хромосомы 21, обозначая трисомию 13 женской клетки.
Фигура 8. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией 21. Применяют специфичные для хромосом 13 (зеленый) и 21 (оранжевый) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два зеленых сигнала для хромосомы 13 и три оранжевых сигнала для хромосомы 21, обозначая трисомию 21 женской клетки.
Фигура 9. Кариотипический анализ полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с моносомией X. В данном кариотипе видна одна хромосома X, обозначая моносомию X данной клетки. При анализе дополнительных клеток из того же образца фолликулярной жидкости, 3 из 20 проанализированных клеток продемонстрировали аналогичный профиль, означающий гонадный мозаицизм при моносомии X.
Фигура 10. Кариотипический анализ полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией 21. В данном кариотипе показаны три 21 хромосомы, обозначая трисомию 21 данной клетки.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем описании изобретения описаны способы идентификации хромосомных аномалий у субъекта посредством получения клеток из фолликулярной жидкости и анализа данных клеток, например, генетического анализа хромосомных аномалий. Предпочтительно посредством описанного способа выявляют субъектов с гонадным мозаицизмом или слабовыраженным гонадным мозаицизмом. Слабовыраженным гонадный мозаицизм является, если мозаичность субъекта составляет предпочтительно менее 10% клеток, а более предпочтительно, менее чем от 5% до 1% клеток в ткани или органе. В одном варианте осуществления проанализированные посредством описанных здесь способов клетки происходят из репродуктивной ткани субъекта, от которого выделяют образец фолликулярной жидкости. В еще одном варианте осуществления клетки, проанализированные посредством описанных здесь способов, являются соматическими клетками субъекта, от которого выделяют образец фолликулярной жидкости, и исключают любые присутствующие в фолликулярной жидкости половые клетки, как, например, ооциты. Хромосомные аномалии можно идентифицировать с применением любого одного из ряда известных специалисту в данной области способов генетического анализа. Здесь выражение "генетический анализ" относится к любому анализу на основании хромосом, ДНК или РНК, с помощью которого можно определить в клетках индивидуума, или предпочтительно в полученных из фолликулярной жидкости клетках аномалии хромосом, ДНК или экспрессии генов.
Полученные из фолликулярной жидкости клетки также можно подвергать анализу ДНК для идентификации повреждений отдельных генов вместо аномалий хромосомного уровня. Идентификация повреждений отдельных генов, нарушений импринтинга или предрасположенности к злокачественной опухоли можно выполнять с применением любого способа, приемлемого для определения по меньшей мере одной замены нуклеиновой кислоты, например, однонуклеотидного полиморфизма (SNP). Тогда как перечисленные выше способы генетического анализа являются предпочтительными, другие способы, способные использовать клетки из фолликулярной жидкости для идентификации хромосомных аномалий, включающих в себя гонадный мозаицизм или слабовыраженный мозаицизм, находятся в рамках объема настоящего изобретения и известны специалисту в данной области.
Хромосомные аномалии являются общей причиной бесплодия и врожденных пороков развития и включают в себя структурные и количественные аномалии. Организм может иметь мозаицизм при хромосомных аномалиях, обнаруженных только в конкретных клеточных популяциях или линиях в организме, тогда как другие клетки являются нормальными. Наряду с тем, что целостный организм может являться мозаичным, также мозаицизм может быть ограничен конкретными органами или тканями, как, например, гонадный мозаицизм. Гонадный мозаицизм может оставаться необнаруженным из-за преимущественного отсутствия симптомов у пораженных индивидуумов. Однако, если гонадный мозаицизм представляет собой предполагаемую причину бесплодия, существующие способы для идентификации или определения гонадного мозаицизма требуют хирургического вмешательства для забора образца ткани для анализа. Таким образом, существующие аналитические способы являются продолжительными и ограничивают количество клеток, которые можно проанализировать, ограничивая тем самым определение слабо выраженного гонадного мозаицизма.
in vitro
В настоящем описании изобретения анализируют полученные из фолликулярной жидкости клетки посредством генетического анализа для определения хромосомных аномалий и для диагностики гонадного мозаицизма, например, слабо выраженного гонадного мозаицизма. Например, фолликулярную жидкость выделяют у подверженного сбору ооцитов для оплодотворения  пациента. При данной процедуре содержащую ооциты фолликулярную жидкость отсасывают из яичников пациента с применением, например, трансвагинального ультразвука. В фолликулярной жидкости идентифицируют и удаляют ооциты с окружающими скоплениями клеток, а жидкость затем, как правило, сбрасывают. Следовательно, для уже подверженных извлечению ооцитов пациенток, настоящее описание изобретения не требует дополнительных хирургических вмешательств для обеспечения возможности детекции гонадного мозаицизма.
in vitro
in vitro
В предпочтительном варианте осуществления, фолликулярную жидкость собирают при заборе ооцитов для оплодотворения . Способы фолликулярной аспирации хорошо известны специалисту в области гинекологии и акушерства. Как правило, ооциты извлекают посредством фолликулярной аспирации через 36 часов после индукции овуляции, после чего ооциты с окружающими их клетками удаляют из оставшейся фолликулярной жидкости. Предпочтительным способом получения клеток из оставшейся фолликулярной жидкости является центрифугирование, но можно применять любой известный способ клеточного выделения. Предпочтительно, фолликулярную жидкость центрифугируют в течение любого интервала времени приблизительно от 1 минуты приблизительно до 30 минут, приблизительно от 1000 об/мин до 3000 об/мин и при любой температуре приблизительно от 20°C приблизительно до 40°C. В альтернативном варианте осуществления, фолликулярную жидкость не собирают при извлечении ооцитов для оплодотворения , например, посредством фолликулярной аспирации или лапароскопии.
2
2
После того, как клетки выделены из фолликулярной жидкости, их можно подвергнуть генетическому анализу для детекции хромосомных аномалий. По предпочтительному варианту осуществления, клетки подвергают анализу FISH. Например, клетки подвергают обработке гипотоническим раствором в течение приблизительно от 5 до 45 минут при температуре приблизительно от 20°C приблизительно до 40°C, а затем фиксируют на приемлемой поверхности приемлемым фиксатором, как, например, фиксатор Карнуа, приблизительно от 1°C приблизительно до 25°C. Можно проводить гибридизацию соответствующих зондов с однократно фиксированными клетками образца с применением известных специалисту в данной области способов. Предпочтительно, меченые зонды ДНК для анализируемых хромосом предварительно смешивают с блокирующей ДНК и гибридизационным буфером, а затем вносят к фиксированным клеткам из образца фолликулярной жидкости. Затем зонд и образец подвергают денатурации в течение 5 минут приблизительно при 73°C и инкубируют в темной гибридизационной камере приблизительно при 37°C в течение приблизительно от 16 до 18 часов для обеспечения гибридизации. После гибридизации стекла промывают приблизительно в течение 2 минут приблизительно при 73°C в растворе из 1 мл 20×SSC, 49 мл RO HO и 150 мкл Igepal или другого аналогичного сурфактанта, а затем в течение приблизительно 1 минуты приблизительно при комнатной температуре в растворе из 5 мл 20×SSC, 45 мл RO HO и 50 мкл Igepal или другого аналогичного сурфактанта. После отмывки стеклам позволяют высохнуть и докрашивают с применением, предпочтительно, DAPI. После этого клетки можно анализировать с применением флуоресцентного микроскопа. Приблизительно от 20 до 1000 клеток из данного образца фолликулярной жидкости можно анализировать с применением данных предпочтительных способов. Можно выявлять поражающий лишь небольшую часть клеток в яичниках слабо выраженный гонадный мозаицизм, так как подход FISH позволяет анализировать большое количество клеток из отдельного образца фолликулярной жидкости.
В предпочтительных вариантах осуществления клетки, выделенные из фолликулярной жидкости, анализируют на хромосомные аномалии, например, анеуплоидию, как, например, моносомию или трисомию, любой хромосомы можно определять с применением хорошо известных специалисту в данной области способов генетического анализа. В предпочтительных вариантах осуществления клетки, выделенные из фолликулярной жидкости, анализируют для определения анеуплоидии для хромосом 13, 15, 16, 18, 21, 22, X или Y. Хромосомные аномалии можно определять с применением анализа FISH со специфичными для данных хромосом зондами. Сходным образом, обнаружение клеток с моносомией для хромосом 13, 15, 16, 18, 21, 22, X или Y можно выполнять с применением специфичных для данных хромосом зондов. Известно, что моносомия хромосом 15, 16, 21 и 22 вовлечена в прерывание беременности (Munne, S. et al., 2004, Reprod. Biomed. Online, 8: 91-90).
По другим предпочтительным вариантам осуществления, кариотипирование можно применять для анализа хромосомных аномалий в клетках. В предпочтительном способе кариотипирования клетки, полученные из фолликулярной жидкости, сначала культивируют с применением приемлемой культуральной среды. Примеры коммерчески доступных культуральных сред включают в себя Amniomax, среду F10 или Rose Park Memorial Institute medium. Клетки предпочтительно культивируют с применением известных специалисту в данной области стандартных способов при подходящей температуре (например, 37°C) до получения сплошного роста. Затем культивированные клетки предпочтительно собирают с применением обычных способов и фиксируют на соответствующей поверхности приемлемым фиксатором, как, например, фиксатор Карнуа при температуре приблизительно от 1°C приблизительно до 25°C. Бэндинг микропрепаратов выполняют с применением известных обычному специалисту в данной области способов и микропрепараты анализируют на метафазные хромосомы под контролем соответствующего микроскопа. Можно проанализировать приблизительно от 1 до 40 клеток из данного образца фолликулярной жидкости, применяя данные предпочтительные способы.
В других предпочтительных вариантах осуществления применяют сравнительную геномную гибридизацию (CGH) для идентификации хромосомных аномалий, включающих в себя едва различимые хромосомные аномалии. CGH основан на количественной двухцветной FISH, с применением синтезированных из контрольного образца зондов, например, выделенных из фолликулярной жидкости клеток и клеток нормального контрольного референсного образца. Предпочтительно, одновременно проводят гибридизацию зондов с метафазными хромосомами из нормального референсного образца. Сравнение интенсивности сигнала от гибридизованных зондов может показать области патологии в клетках фолликулярной жидкости.
В других вариантах осуществления, сконструированные выше зонды можно наносить на матрицу ДНК в называемом CGH-матрица способе. Показали, что CGH-матрица подтверждает аномалии, как, например, мозаицизм трисомии 20 (Schaeffer et al., Am. J. Hum. Genet., 2004; 74: 1168-1174), несбалансированную транслокацию (Klein et al., Clin. Genet., 2004; 65: 477-82), несбалансированные субтеломерные реаранжировки (Ness et al., Am. J. Med. Genet, 2002, 113: 125-136) и несбалансированные инверсии или хромосомные реаранжировки (Daniely et al., Cytogenet. Cell. Genet., 1999, 86: 51-5). Способы CGH-матриц и получения специфичных для хромосом библиотек ДНК описаны и известны в данной области (Hu, et al., Mol. Hum. Reprod., 2004, 10: 283-289; Bolzer et al., Cytogenet. Cell. Genet., 1999, 84: 233-240). Применение основанного на матрицах CGH для определения генетического мозаицизма в клеточной популяции также показано Mansoor Mohammed в опубликованной заявке на патент США № 20030124584, которая включена сюда в качестве ссылки в полном объеме.
Специалисту в данной области хорошо известны другие способы для анализа хромосомных и генетических аномалий, в качестве не ограничивающих примеров включающие в себя многоцветный бэндинг (MCB), количественную FISH (Q-FISH), полимеразную цепную реакцию (PCR), технологию GBA (минитипирование), мультиплексное секвенирование, SNaPshot, MassEXTEND, MassArray, лигирование на мини-матрицах, мини-секвенирование на микроматрицах, маркерные миниматрицы, удлинение праймеров на матрицах (APEX), удлинение праймеров на микроматрицах, GOOD-анализ, кодированные микросферы, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP), аллель-специфический анализ олигонуклеотидов (ASO), специфичную к метилированию ПЦР (MSPCR), способ пиросеквенирования, анализ acycloprime, обратный дот-блот, микроматрицы GeneChip, динамическую аллель-специфическую гибридизацию (DASH), пептидные зонды нуклеиновых кислот (PNA) и запирающие зонды нуклеиновых кислот (LNA), TaqMan, Molecular Beacons, интеркалирующее окрашивание, праймеры FRET, AlphaScreen, SNPstream, Invader assay, управляемое матрицей включение (TDI), флуоресцентную поляризацию, анализ олигонуклеотидного лигирования и выделение кодированных последовательностей, лигазную цепную реакцию, запирающие зонды, амплификацию по типу катящегося кольца и колориметрический анализ олигонуклеотидного лигирования (OLA).
in vitro
В программах оплодотворения  предимплантационная генетическая диагностика ооцитов и эмбрионов является способом выбора для отделения аномального эмбриона перед пересадкой эмбриона. Таким образом, в альтернативных вариантах осуществления, у субъектов с идентифицированным гонадным мозаицизмом предимплантационную генетическую диагностику и диагностику хромосомных аномалий в ооцитах и эмбрионах можно выполнять для повышения вероятности отбора и имплантации выживающего в продолжение беременности эмбриона.
Наконец, определение хромосомной аномалии, включающей в себя гонадный мозаицизм, применимо у других животных, предпочтительно млекопитающих, и конкретно трансгенных животных. Генетический мозаицизм часто возникает у полученных посредством микроинъекции в пронуклеустрансгенных животных. Успешный способ скрининга родительских животных на гонадный мозаицизм до спаривания может сократить стоимость размножения трансгенных линий и посредством скрининга родительских животных на гонадный мозаицизм до спаривания повысить эффективность получения трансгенных животных для получения трансгенных млекопитающих.
В свете настоящего описания изобретения, описанные и заявленные здесь способы можно разрабатывать и осуществлять без проведения лишней экспериментальной работы. Хотя способы настоящего описания изобретения описаны в границах предпочтительных вариантов осуществления, специалисту в данной области очевидно, что в способы и в стадии или в последовательность стадий описанных здесь способов можно вносить вариации без отклонения от концепции, объема и сущности изобретения. Более конкретно, очевидно, что вместо описанных здесь средств можно использовать определенные химически или физиологически близкие средства, если достигают аналогичных или сходных результатов. Считают, что все очевидные специалисту в данной области подобные аналогичные замены и модификации находятся в пределах сущности, объема и концепции изобретения, как обозначено в прилагаемой формуле изобретения.
Следующие далее примеры включены сюда для иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалисту в данной области следует понимать, что в примерах описаны способы, сопровождающие представленные способы, открытые авторами изобретения для правильной работы при применении изобретения, и, таким образом, могут рассматриваться для составления предпочтительных способов его применения. Однако в свете настоящего изобретения специалист в данной области должен понимать, что в определенных вариантах осуществления можно сделать много описанных изменений, и, тем не менее, получить подобный или аналогичный результат без отклонения от объема и сущности изобретения.
Пример 1
1) Забор и обработка клеток из образцов фолликулярной жидкости
in vitro
Образцы оставшейся фолликулярной жидкости подверженных оплодотворению  пациенток собирают в центрифужные пробирки в аликвотах приблизительно от 5 до 10 мл. Затем образцы центрифугируют приблизительно при 1000 об/мин в течение 10 минут. После этого большую часть супернатанта удаляют, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл жидкости. К осадку добавляют приблизительно 8 мл предварительно нагретого до 37°C 75 мМ KCl, перемешивают, а затем инкубируют при 37°C в течение 20 минут. После инкубации пробирки центрифугируют приблизительно при 1000 об/мин в течение 10 минут. После этого супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл жидкости. При постоянном перемешивании добавляют приблизительно 8 мл холодного фиксатора Карнуа. Пробирки инкубируют при 2-8°C в течение по меньшей мере 30 минут, а затем центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл жидкости. Стадию отмывки с фиксатором повторяют 2 раза.
2) Подготовка микропрепарата и анализ FISH
2
2
2
На задней стороне чистых стекол алмазным маркером отмечают один или два небольших квадрата. В каждый квадрат добавляют 10 мкл фиксированных клеток и оставляют стекла сохнуть на воздухе. Стекла последовательно обезвоживают в спирте: 70% одну минуту; 85% одну минуту; 100% две минуты. После этого покровные стекла обрезают до размера области образца и наносят на покровное стекло 1-2 мкл зонда. Стекло переворачивают на покровное стекло и заклеивают каучуковым клеем. Затем стекло подвергают денатурации, помещая его на подогревательный столик при 73°C в течение пяти минут. После этого стекла немедленно помещают в гибридизационную камеру и инкубируют при 37°C в течение времени от 16 до 18 часов. После инкубации покровные стекла снимают в 5 мл 20×SSC и 45 мл RO HO. Затем стекло отмывают в 1 мл 20×SSC и 49 мл RO HO и 150 мкл Igepal (Sigma) в течение двух минут, с последующей еще одной отмывкой в растворе 5 мл 20×SSC, 45 мл HO и 50 мкл Igepal в течение одной минуты. Стекло сушат на воздухе и заключают в 10 мкл заключающей среды (200 нг/мл DAPI в Vectashield, Vector Lab) и накладывают покровное стекло. Стекло заклеивают каучуковым клеем и изучают под контролем флуоресцентного микроскопа.
3) Зонды для анализа FISH
Для определения гонадного мозаицизма для хромосом 18, X и Y применяют смесь зондов, содержащую CEP 18 Spectrum Aqua/X Spectrum Green/Y Spectrum Orange (AneuVysion EC DNA probe kit, Vysis). Также можно раздельно применять отдельные зонды для 18, X и Y хромосом, несмотря на то, что авторы применяли в виде смеси.
Таблица 1
<b>Серийн.№</b>
<b>№ образца</b>
<b>Один яичник </b>
<b>Состояние оплодотворе-ния</b>
<b>№ проанализиро-ванных клеток</b>
<b>Норма для X&18 (%)</b>
<b>Х хр. аном. %</b>
<b>хр. 18 аном. %</b>
1
FF-001
100
100
0
0
-
2
FF-002
100
96
2
2
-
3
FF-003
200
90
10
0
-
4
FF-004
100
100
0
0
-
5
FF-005
100
100
0
0
-
6
FF-006
100
100
0
0
+
7
FF-007
100
100
0
0
+
8
FF-008
100
100
0
0
-
9
FF-009
100
95
2
3
-
10
FF-010
100
95
5
0
-
11
FF-011
100
92
3
5
-
12
FF-012
100
100
0
0
-
13
FF-013
100
100
0
0
+/потеря (прерывание беременности)
14
FF-014
100
96
2
2
+
15
FF-015
100
100
0
0
-
16
FF-016
100
90
4
6
-
17
FF-017
100
100
0
0
-
18
FF-018
100
100
0
0
-
19
FF-019
100
97
1
2
-
20
FF-020
100
100
0
0
+
21
FF-021
100
100
0
0
-
22
FF-022
100
98
1
1
-
23
FF-023
100
100
0
0
-
24
FF-024
100
100
0
0
-
25
FF-025
100
100
0
0
+/потеря (прерывание беременности)
26
FF-026
200
96
3
0
-
27
FF-027
200
99
1
0
+
28
FF-028
200
94
5
1
+
29
FF-029
200
97
0
3
-
30
FF-030
200
95
3
2
-
31
FF-031
200
97
1
2
-
32
FF-032
100
96
3
1
-
33
FF-033
100
96
1
3
-
34
FF-034
100
100
0
0
+
35
FF-035
100
98
2
0
-
36
FF-036
100
100
0
0
-
37
FF-037
30
28
2
0
-
38
FF-038
100
100
0
0
+
39
FF-039
100
98
1
1
-
40
FF-040
100
100
0
0
-
41
FF-041
100
96
2
2
-
42
FF-042
100
100
0
0
+
43
FF-043
100
100
0
0
-
44
FF-044
100
100
0
0
+/потеря (прерывание беременности)
45
FF-045
100
98
2
0
+
46
FF-046
100
100
0
0
+
47
FF-047
200
92
6
2
-
48
FF-048
100
97
1
2
+
49
FF-049
200
96
3
1
-
50
FF-050
200
95
3
2
-
51
FF-051
200
99
1
0
-
52
FF-052
100
96
1
3
+
53
FF-053
200
97
2
1
-
54
FF-054
100
100
0
0
-
55
FF-055
100
100
0
0
56
FF-056
200
96
3
1
+
57
FF-057
200
99
1
0
-
58
FF-058
200
94
5
1
-
59
FF-059
200
97
0
3
+
60
FF-060
200
95
3
2
+
61
FF-061
200
97
1
2
-
62
FF-062
200
96
3
1
+
63
FF-063
200
99
1
0
+
64
FF-064
200
94
1
5
-
65
FF-065
200
97
0
3
-
66
FF-066
100
89
10
1
-
67
FF-067
200
95
3
2
-
68
FF-068
200
97
1
2
-
69
FF-069
100
100
0
0
+/потеря (прерывание беременности)
70
FF-070
100
95
3
2
-
71
FF-071
100
100
0
0
-
72
FF-072
100
99
1
0
-
73
FF-073
100
92
5
2
-
74
FF-074
200
93
5
2
-
75
FF-075
200
95
5
0
-
76
FF-076
200
95
5
0
-
77
FF-077
200
90
8
2
-
78
FF-078
200
93
5
2
-
79
FF-079
200
93
6
1
-
80
FF-080
100
89
11
0
-
81
FF-081
100
97
3
0
+
82
FF-082
100
98
2
0
+
83
FF-083
100
95
5
0
-
84
FF-084
100
100
0
0
-
85
FF-085
100
93
5
2
+/потеря (прерывание беременности)
86
FF-086
100
100
0
0
-
87
FF-087
100
100
0
0
+
88
FF-088
100
99
1
0
-
89
FF-089
100
98
2
0
-
90
FF-090
100
100
0
0
-
91
FF-091
100
100
0
0
-
92
FF-092
100
97
3
0
-
93
FF-093
100
98
1
1
+
94
FF-094
100
100
0
0
+
95
FF-095
100
92
6
2
+/потеря (прерывание беременности)
96
FF-096
100
100
0
0
+
97
FF-097
100
93
5
2
+/потеря (прерывание беременности)
98
FF-098
100
99
1
0
-
99
FF-099
100
100
0
0
-
100
FF-100
Отсутствие клетки
-
101
FF-101
100
99
1
0
+
102
FF-102
Отсутствие клетки
-
103
FF-103
100
97
3
0
+
104
FF-104
100
100
0
0
-
105
FF-105
Отсутствие клетки
-
106
FF-106
100
100
0
0
+
107
FF-107
100
100
0
0
-
108
FF-108
100
100
0
0
+
109
FF-109
100
92
6
2
-
110
FF-110
100
100
0
0
+
111
FF-111
100
90
9
1
-
112
FF-112
100
100
0
0
-
113
FF-113
100
100
0
0
-
114
FF-114
Отсутствие клетки
+
115
FF-115
300
100
0
0
+
116
FF-116
Отсутствие клеток
-
117
FF-117
200
94
1
5
-
118
FF-118
200
97
1
2
-
119
FF-119
Отсутствие клеток
-
120
FF-120
100
96
2
2
+
121
FF-121
200
98
1
1
-
122
FF-122
100
100
0
0
-
123
FF-123
100
95
3
2
-
124
FF-124
200
93
3
4
-
125
FF-125
200
96
1
3
-
126
FF-126
100
92
3
5
-
127
FF-127
100
100
0
0
-
128
FF-128
200
87
12
1
-
129
FF-129
200
97
3
0
-
130
FF-130
100
100
0
0
-
131
FF-131
200
98
0
2
-
132
FF-132
200
92
1
7
-
133
FF-133
200
95
2
3
-
134
FF-134
200
96
1
3
+
135
FF-135
200
94
2
4
+
136
FF-136
200
98
2
0
-
137
FF-137
200
98
2
0
-
138
FF-138
200
99
1
0
-
139
FF-139
200
98
2
0
-
140
FF-140
200
100
0
0
+
141
FF-141
100
93
4
3
+/потеря (прерывание беременности)
142
FF-142
100
96
4
0
-
143
FF-143
100
98
2
0
+
144
FF-144
200
97
2
1
-
145
FF-145
100
100
0
0
+
146
FF-146
100
92
4
4
-
147
FF-147
200
96
1
3
-
148
FF-148
200
94
2
4
+
149
FF-149
200
98
2
0
+
150
FF-150
200
98
2
0
-
151
FF-151
200
99
1
0
-
152
FF-152
200
98
2
0
-
153
FF-153
100
93
4
3
+
154
FF-154
100
100
0
0
-
155
FF-155
Отсутствие клетки
+
156
FF-156
200
92
6
2
+/потеря (прерывание беременности)
157
FF-157
100
97
1
2
-
158
FF-158
200
96
3
1
-
159
FF-159
200
95
3
2
-
160
FF-160
200
99
1
0
-
161
FF-161
100
96
1
3
+
162
FF-162
200
97
2
1
+
163
FF-163
Отсутствие клетки
-
164
FF-164
200
96
3
1
+
165
FF-165
200
95
1
4
+
166
FF-166
200
97
3
0
-
167
FF-167
200
98
2
0
-
168
FF-168
200
94
5
1
-
169
FF-169
200
95
2
3
-
170
FF-170
200
96
3
0
-
171
FF-171
200
99
1
0
-
172
FF-172
200
94
5
1
+/потеря (прерывание беременности)
173
FF-173
200
97
0
3
174
FF-174
200
95
3
2
-
175
FF-175
200
97
1
2
-
176
FF-176
Отсутствие клетки
-
177
FF-177
200
98
1
1
+/потеря (прерывание беременности)
178
FF-178
100
97
3
0
-
179
FF-179
200
94
2
4
-
180
FF-180
200
98
2
0
+
181
FF-181
200
98
2
0
-
182
FF-182
200
99
1
0
-
183
FF-183
100
96
2
2
-
184
FF-184
200
97
3
0
+/потеря (прерывание беременности)
185
FF-185
Отсутствие клетки
+
186
FF-186
200
92
6
2
-
187
FF-187
200
92
1
7
+
188
FF-188
200
95
2
3
+
189
FF-189
200
96
1
3
+/потеря (прерывание беременности)
190
FF-190
200
94
2
4
-
191
FF-191
200
98
2
0
+/потеря (прерывание беременности)
192
FF-192
200
98
2
0
-
193
FF-193
200
99
1
0
-
194
FF-194
200
98
2
0
+
195
FF-195
Отсутствие клетки
-
196
FF-196
200
97
3
0
-
197
FF-197
200
95
1
4
-
198
FF-198
100
97
0
3
+
199
FF-199
200
96
1
3
+
200
FF-200
200
99
1
0
+
201
FF-201
200
94
1
5
+
202
FF-202
200
98
1
1
-
203
FF-203
200
100
0
0
-
204
FF-204
200
98
2
0
-
205
FF-205
100
97
1
2
+/потеря (прерывание беременности)
206
FF-206
200
94
2
4
-
207
FF-207
100
95
5
0
-
208
FF-208
200
98
2
0
+
209
FF-209
200
98
2
0
-
210
FF-210
200
99
1
0
-
211
FF-211
100
95
3
2
-
212
FF-212
100
97
3
0
-
213
FF-213
100
98
2
0
-
214
FF-214
100
99
1
0
-
215
FF-215
200
92
6
2
-
216
FF-216
100
100
0
0
+
217
FF-217
100
98
1
1
-
218
FF-218
100
97
2
1
+
219
FF-219
100
97
2
1
+
220
FF-220
100
97
2
1
-
221
FF-221
100
100
0
0
+
222
FF-222
100
97
2
1
+
223
FF-223
100
97
3
0
+
224
FF-224
200
98
2
0
-
225
FF-225
100
94
5
1
-
226
FF-226
100
91
5
4
-
227
FF-227
Отсутствие клеток
-
228
FF-228
100
93
6
1
-
229
FF-229
100
98
2
0
-
230
FF-230
100
89
9
2
+
231
FF-231
Отсутствие клетки
-
232
FF-232
100
96
1
3
+
233
FF-233
100
98
2
0
-
234
FF-234
100
98
2
0
+
235
FF-235
100
97
3
0
-
236
FF-236
100
98
2
0
-
237
FF-237
100
98
2
0
+
238
FF-238
100
100
0
0
-
239
FF-239
100
98
1
1
-
240
FF-240
100
96
3
1
-
241
FF-241
100
98
2
0
+
242
FF-242
100
99
1
0
-
243
FF-243
100
96
3
1
+
244
FF-244
200
97
3
0
-
245
FF-245
100
98
2
0
-
246
FF-246
100
94
6
0
+/потеря (прерывание беременности)
247
FF-247
200
95
3
2
+
248
FF-248
100
100
0
0
+
249
FF-249
100
96
3
1
-
250
FF-250
200
97
3
0
-
251
FF-251
100
98
2
0
+
252
FF-252
200
95
3
2
+
253
FF-253
100
98
2
0
-
254
FF-254
200
97
2
1
-
255
FF-255
100
95
5
0
-
256
FF-256
100
100
0
0
-
257
FF-257
100
96
3
1
-
258
FF-258
200
97
3
0
+/потеря (прерывание беременности)
259
FF-259
100
98
2
0
+
260
FF-260
200
95
3
2
-
261
FF-261
Отсутствие клетки
-
262
FF-262
100
100
0
0
+
263
FF-263
100
100
0
0
+
264
FF-264
100
100
0
0
-
265
FF-265
100
100
0
0
-
266
FF-266
100
98
2
0
-
267
FF-267
100
98
1
1
+/потеря (прерывание беременности)
268
FF-268
100
100
0
0
-
269
FF-269
100
100
0
0
-
270
FF-270
100
98
2
0
-
271
FF-271
200
92
6
2
-
272
FF-272
100
97
2
1
-
273
FF-273
100
100
0
0
+
274
FF-274
100
97
2
1
-
275
FF-275
100
90
8
2
-
276
FF-276
100
97
1
2
-
277
FF-277
100
96
4
0
-
278
FF-278
100
96
2
2
-
279
FF-279
100
97
3
0
-
280
FF-280
100
100
0
0
+
281
FF-281
100
99
0
1
+/потеря (прерывание беременности)
282
FF-282
100
99
0
1
-
283
FF-283
100
97
2
1
-
284
FF-284
100
95
3
2
+
285
FF-285
100
95
2
3
-
286
FF-286
100
98
2
0
-
287
FF-287
100
98
2
0
-
288
FF-288
100
95
2
3
-
289
FF-289
100
98
2
0
-
290
FF-290
100
97
3
0
-
291
FF-291
100
100
0
0
-
292
FF-292
100
99
0
1
-
293
FF-293
100
97
2
1
+
294
FF-294
100
100
0
0
+
295
FF-295
100
97
2
1
+
296
FF-296
100
97
3
0
+
297
FF-297
100
93
4
3
-
298
FF-298
100
96
4
0
+
299
FF-299
100
96
3
1
-
300
FF-300
100
92
4
4
-
301
FF-301
200
98
2
0
-
302
FF-302
100
100
0
0
+
303
FF-303
100
100
0
0
-
304
FF-304
100
100
0
0
+
305
FF-305
100
98
2
0
+
306
FF-306
100
92
6
2
-
307
FF-307
100
98
1
1
+
308
FF-308
100
98
1
1
-
309
FF-309
100
95
4
1
-
310
FF-310
100
98
1
1
-
311
FF-311
100
95
4
1
-
312
FF-312
100
100
0
0
+
313
FF-313
100
98
2
0
-
314
FF-314
100
95
3
2
-
315
FF-315
200
95
3
2
+
316
FF-316
100
100
0
0
-
317
FF-317
100
100
0
0
-
318
FF-318
100
93
5
2
-
319
FF-319
100
99
1
0
+
320
FF-320
100
98
1
1
-
321
FF-321
100
95
4
1
+
322
FF-322
100
100
0
0
+
323
FF-323
100
96
3
1
-
324
FF-324
Отсутствие клетки
-
325
FF-325
100
98
1
1
-
326
FF-326
100
95
4
1
+
327
FF-327
100
100
0
0
+/потеря (прерывание беременности)
328
FF-328
100
100
0
0
+
329
FF-329
100
95
2
3
+
330
FF-330
100
97
1
2
-
331
FF-331
100
100
0
0
+
332
FF-332
100
100
0
0
+/потеря (прерывание беременности)
333
FF-333
100
96
1
3
+
334
FF-334
100
94
3
3
-
335
FF-335
100
100
0
0
-
336
FF-336
100
99
1
0
-
337
FF-337
100
96
2
2
-
338
FF-338
100
96
3
1
+/потеря (прерывание беременности)
339
FF-339
100
100
0
0
-
340
FF-340
100
100
0
0
-
341
FF-341
100
100
0
0
+
342
FF-342
100
100
0
0
-
343
FF-343
100
95
3
2
-
344
FF-344
100
100
0
0
+
345
FF-345
100
100
0
0
+
346
FF-346
100
98
1
1
-
347
FF-347
100
95
4
1
-
348
FF-348
100
95
3
2
-
349
FF-349
100
96
2
2
+
350
FF-350
100
96
3
1
+
351
FF-351
100
100
0
0
-
352
FF-352
100
100
0
0
+
353
FF-353
100
100
0
0
+
354
FF-354
100
100
0
0
+
355
FF-355
100
100
0
0
-
356
FF-356
100
94
5
1
-
357
FF-357
100
99
1
0
+
358
FF-358
100
98
1
1
-
359
FF-359
100
99
0
1
-
360
FF-360
100
99
0
1
-
361
FF-361
100
97
2
1
-
362
FF-362
100
95
3
2
-
363
FF-363
100
95
2
3
-
364
FF-364
100
98
2
0
-
365
FF-365
100
98
2
0
-
366
FF-366
Отсутствие клетки
-
367
FF-367
100
98
2
0
-
368
FF-368
Отсутствие клетки
-
369
FF-369
100
100
0
0
-
370
FF-370
100
99
1
0
-
371
FF-371
100
98
2
0
-
372
FF-372
100
96
4
0
~
373
FF-373
200
88
0
12
-
374
FF-374
100
98
2
0
+
375
FF-375
100
99
1
0
-
376
FF-376
100
93
7
0
+
377
FF-377
100
91
5
4
-
378
FF-378
100
100
0
0
+
379
FF-379
100
95
3
2
-
380
FF-380
100
100
0
0
-
381
FF-381
100
99
1
0
-
382
FF-382
100
97
3
0
-
383
FF-383
100
98
2
0
+
384
FF-384
100
97
1
2
-
385
FF-385
100
95
3
2
-
386
FF-386
100
96
3
1
-
387
FF-387
100
96
1
3
+
388
FF-388
100
100
0
0
+/потеря (прерывание беременности)
389
FF-389
100
98
2
0
-
390
FF-390
100
95
2
3
+
391
FF-391
30
28
2
0
+
392
FF-392
100
100
0
0
-
393
FF-393
100
100
0
0
-
394
FF-394
100
100
0
0
-
395
FF-395
100
100
0
0
-
396
FF-396
100
98
2
0
-
397
FF-397
100
98
2
0
-
398
FF-398
100
98
1
1
-
399
FF-399
100
94
4
2
-
400
FF-400
Отсутствие клетки
-
401
FF-401
100
100
0
0
-
402
FF-402
100
97
1
2
+
403
FF-403
100
100
0
0
-
404
FF-404
100
100
0
0
-
405
FF-405
Отсутствие клеток
-
406
FF-406
100
96
0
4
+
407
FF-407
100
100
0
0
-
408
FF-408
100
100
0
0
-
409
FF-409
100
100
0
0
-
410
FF-410
100
98
2
0
+/потеря (прерывание беременности)
411
FF-411
100
100
0
0
+/потеря (прерывание беременности)
412
FF-412
100
98
0
2
-
413
FF-413
100
98
2
0
+
414
FF-414
100
94
6
0
+/потеря (прерывание беременности)
415
FF-415
100
97
3
0
-
416
FF-416
100
94
2
4
-
417
FF-417
100
95
3
2
-
418
FF-418
100
100
0
0
-
419
FF-419
100
100
0
0
-
420
FF-420
100
98
2
0
-
421
FF-421
100
100
0
0
+
422
FF-422
100
100
0
0
-
423
FF-423
100
98
2
0
-
424
FF-424
100
98
0
2
+
425
FF-425
100
98
2
0
-
426
FF-426
100
100
0
0
-
427
FF-427
100
95
3
2
+/потеря (прерывание беременности)
428
FF-428
200
94
5
1
-
429
FF-429
200
97
0
3
-
430
FF-430
200
95
3
2
-
431
FF-431
200
97
1
2
-
432
FF-432
100
96
3
1
+
433
FF-433
100
96
1
3
-
434
FF-434
100
100
0
0
-
435
FF-435
100
100
0
0
+
436
FF-436
100
100
0
0
-
437
FF-437
100
100
0
0
-
438
FF-438
100
94
3
3
-
439
FF-439
100
95
3
2
-
440
FF-440
100
94
2
4
+
441
FF-441
100
100
0
0
-
442
FF-442
100
98
0
2
-
443
FF-443
100
98
2
0
-
444
FF-444
100
100
0
0
-
445
FF-445
100
95
3
2
-
446
FF-446
200
94
5
1
-
447
FF-447
200
95
3
2
+
448
FF-448
200
95
3
2
+
449
FF-449
200
97
1
2
+
450
FF-450
100
96
3
1
-
451
FF-451
100
96
1
3
+
452
FF-452
100
94
2
4
-
453
FF-453
100
100
0
0
-
454
FF-454
200
97
0
3
+
455
FF-455
200
95
3
2
+
456
FF-456
100
93
4
3
+
457
FF-457
100
100
0
0
+
458
FF-458
100
98
2
0
-
459
FF-459
100
100
0
0
-
460
FF-460
100
95
3
2
-
461
FF-461
200
94
5
1
+
462
FF-462
200
97
0
3
-
463
FF-463
200
95
3
2
-
464
FF-464
200
97
0
3
-
465
FF-465
200
95
3
2
+/потеря (прерывание беременности)
466
FF-466
100
100
0
0
-
467
FF-467
100
100
0
0
+
468
FF-468
100
98
0
2
-
469
FF-469
100
98
2
0
+
470
FF-470
100
100
0
0
+
471
FF-471
100
95
3
2
-
472
FF-472
100
96
1
3
-
473
FF-473
100
95
3
2
-
474
FF-474
100
98
1
1
-
475
FF-475
100
94
0
6
-
476
FF-476
100
95
3
2
+
477
FF-477
100
95
3
2
-
478
FF-478
100
98
1
1
+
На фигурах 1-5 показаны клетки, выбранные из указанных выше образцов, проанализированные посредством FISH. На фигуре 1 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с нормальным состоянием хромосом 18 и X, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-205. На фигуре 2 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с моносомией 18, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-070. На фигуре 3 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с моносомией X, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-097. На фигуре 4 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с трисомией 18, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-200. На фигуре 5 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с трисомией X, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-318.
Представленные в таблице 1 данные обобщены в таблице 2:
Таблица 2
№ случаев
Количество проанализированных для каждого яичника образцов
478
Непригодные клетки для анализа
19
Общее количество проанализированных образцов
459
Общее количество нормальных пациенток по диплоидной хромосоме X после анализа FISH
415
Анеуплоидию для хромосомы X обнаружили в ≥5% клеток из выделенной фолликулярной жидкости
44 (9,58%)
Далее в таблице 3 показан ретроспективный анализ в состоянии беременности или выкидыша у пациенток с нормальными хромосомами X или аномальной X-хромосомной анеуплоидией, определяемыми посредством FISH:
Таблица 3
Пациентки с X-хромосомной анеуплоидией в фолликулярной жидкости (44)
Пациентки с нормальным состоянием X-хромосом в фолликулярной жидкости (415)
№ пациенток с беременностью
11/44 (25%)
148/415 (35,66%)
№ пациенток с прерыванием беременности
7/11 (63,63%)
21/148 (14,19%)
Из проанализированных для каждого яичника 478 образцов фолликулярной жидкости в 19 случаях не получили клетки, необходимые для анализа. Результаты FISH на клетках фолликулярной жидкости в остальных 459 случаях показаны в таблице 1. В лаборатории авторов изобретения полагают, что 1-4% анеуплоидных клеток представляют собой нормальную величину. Это также обнаружили в других лабораториях (Vysis AneuVysion Multicolor DNA Probe Kit (Part Number 32-161075 & 33-161075 & 35-161075) листок-вкладыш, таблица 4, прикрепленная сюда как приложение A и включенная сюда в качестве ссылки). Из проанализированных посредством FISH образцов, у 415 пациенток показан нормальный профиль хромосомы X, в то же время у 44 пациенток показан мозаичный профиль фолликулярной жидкости (≥5% анеуплоидии хромосомы X). У индивидуумов с обнаруженной мозаичной анеуплоидией хромосомы X также выполняли кариотипирование и анализ FISH на образцах крови. У восемнадцати из этих 44 (40,9%) пациенток в крови так же выявили слабо выраженный мозаицизм (≥5% анеуплоидии) хромосомы X, подтверждая результаты фолликулярной жидкости. Остальные 26 пациенток при анализе крови являлись нормальными по анеуплоидии хромосомы X, давая возможность предположить, что мозаицизм у этих 26 пациенток может быть ограничен гонадами (гонадный мозаицизм).
in vitro
При дополнительном анализе авторы обнаружили, что 11 из 44 пациенток (25%) с определенной посредством FISH анеуплоидией являлись беременными. В то же время являлись беременными 148 из 415 пациенток (35,66%) с нормальной фолликулярной жидкостью по результатам FISH. Таким образом, соотношение беременных среди пациенток с определенной в клетках фолликулярной жидкости анеуплоидией является меньшим, чем соотношение для пациенток с нормальной фолликулярной жидкостью по результатам FISH. Это подтверждает, что гонадный мозаицизм коррелирует со сниженными коэффициентами фертильности среди использующих оплодотворение  с целью забеременеть женщин. Кроме того, из 11 забеременевших пациенток с анеуплоидией хромосомы X, у 7 пациенток произошло прерывание беременности (63,63%). С другой стороны, из 148 забеременевших пациенток с нормальной фолликулярной жидкостью по результатам FISH, только у 21 пациентки произошло прерывание беременности (14,19%), что коррелирует с нормальным соотношением прерывания беременностей в общей популяции. Это подтверждает, что гонадный мозаицизм для анеуплоидии хромосомы X коррелирует с повышенным риском прерывания беременности.
Пример 2
Идентификация гонадного мозаицизма в отношении аномалий хромосом 13 и 21 посредством FISH с применением клеток из фолликулярной жидкости из каждого яичника.
Клетки и стекла обрабатывают, как указано в примере 1. Однако образцы фолликулярной жидкости получали от пациенток с анамнезом пораженных трисомией 13 или 21 детей. Самим пациенткам посредством анализа крови также ставили диагноз наличия мозаичного профиля анеуплоидии для 13 или 21 хромосом. Применяют специфичные для хромосомы 13 (LSI 13 Spectrum Green) и 21 (LSI 21 Spectrum Orange) зонды (AneuVysion EC DNA probe kit, Vysis). Результаты данных исследований показаны далее в таблице 4:
Таблица 4
<b>сер. №</b>
<b>№ образца</b>
<b>Идентификация аномалий хромосом 13 и 21 на клетках, полученных из фолликулярной жидкости из каждого яичника </b>
<b>состояние оплодотворения</b>
<b>№ проанализир. клеток</b>
<b>Норма для 13 & 21 (%)</b>
<b>аном. хр. 13 %</b>
<b>аном. хр. 21 %</b>
1
FF-A01
200
92
8
0
+
2
FF-A02
200
94
6
0
-
3
FF-A03
200
99
0
1
-
4
FF-A04
200
91
1
8
+
5
FF-A05
200
88
2
10
-
6
FF-A06
200
96
2
2
-
7
FF-A07
200
97
1
2
-
8
FF-A08
200
92
3
5
-
9
FF-A09
200
99
1
0
-
10
FF-A10
200
93
3
4
+
На фигурах 6-8 показаны клетки, выбранные из указанных выше образцов, проанализированные посредством FISH. На фигуре 6 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с нормальным состоянием хромосом 13 и 21, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-A01. На фигуре 7 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с трисомией 13, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-A03. На фигуре 8 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с трисомией 21, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-A053.
Пример 3
Идентификация гонадного мозаицизма в отношении аномалий хромосом 18, X и Y посредством FISH, с применением клеток из полученной из обоих яичников индивидуума фолликулярной жидкости.
Данный эксперимент проводили в тех же условиях, что и для примера 1, за исключением того, что клеточный образец фолликулярной жидкости получали из обоих яичников, а не из каждого из яичников, как в примере 1. Результаты данных исследований показаны далее в таблице 5:
Таблица 5
<b>сер. №</b>
<b>№ образца</b>
<b>Левый</b>
<b>Правый</b>
<b>Состояние оплодотво-рения</b>
<b>№ проанали-зирован-ных клеток</b>
<b>Норма для X&18 (%)</b>
<b>Х хр. аном. %</b>
<b>аном. хр. 18 (%)</b>
<b>№ проанализированных клеток</b>
<b>Норма для X&18 (%)</b>
<b>Х хр. аном. (%)</b>
<b>аном. хр. 18 (%)</b>
1
FF-479
100
92
6
2
100
86
8
2
-
2
FF-480
100
92
6
2
100
91
5
4
-
3
FF-481
100
100
0
0
100
100
0
0
-
4
FF-482
100
97
3
0
100
100
0
0
-
5
FF-483
100
100
0
0
100
100
0
0
-
6
FF-484
100
100
0
0
100
98
2
0
+
7
FF-485
100
98
2
0
100
100
0
0
-
8
FF-486
100
95
4
0
100
98
0
2
-
9
FF-487
100
94
3
3
100
98
2
0
-
10
FF-488
100
94
5
1
100
93
4
3
-
11
FF-489
100
94
0
6
100
97
0
3
+
12
FF-490
100
99
0
1
100
94
6
0
+
13
FF-491
50
96
2
2
100
97
3
0
-
14
FF-492
100
82
14
4
100
92
6
2
<b>+/потеря (прерывание беременности)</b>
15
FF-493
100
97
0
3
100
95
3
2
-
16
FF-494
100
100
0
0
100
98
2
0
-
17
FF-495
100
100
0
0
100
91
5
4
-
18
FF-496
100
95
5
0
100
95
5
0
-
19
FF-497
100
96
1
4
100
96
2
2
+
20
FF-498
100
96
4
0
100
98
1
1
-
21
FF-499
100
100
0
0
100
94
4
2
-
22
FF-500
100
94
3
3
100
93
2
5
+
23
FF-501
100
95
3
2
100
97
0
3
-
24
FF-502
100
97
0
3
100
97
0
3
-
25
FF-503
100
100
0
0
100
97
3
1
+
26
FF-504
100
95
2
3
100
93
3
4
-
27
FF-505
100
96
4
0
100
97
0
3
+
28
FF-506
100
92
2
6
100
95
1
4
-
29
FF-507
100
95
3
2
100
94
2
4
-
30
FF-508
100
100
0
0
100
94
4
2
-
31
FF-509
100
97
0
3
100
94
4
2
+
32
FF-510
100
96
2
3
100
95
1
4
-
33
FF-511
100
96
2
2
100
98
2
0
+
34
FF-512
100
99
1
0
100
100
0
0
-
35
FF-513
100
94
5
2
100
95
5
0
-
36
FF-514
100
96
0
4
100
93
3
4
<b>+/потеря (прерывание беременности)</b>
37
FF-515
100
97
3
0
100
98
0
2
+
38
FF-516
100
97
1
2
100
96
2
2
-
39
FF-517
100
97
1
2
100
98
2
0
-
40
FF-518
100
98
0
2
100
97
3
0
-
41
FF-519
100
97
2
1
100
96
4
2
-
42
FF-520
100
93
2
5
100
99
0
1
-
43
FF-521
100
90
5
5
100
94
5
2
+
44
FF-522
100
98
1
1
100
97
2
1
-
45
FF-523
100
95
3
2
100
95
2
3
-
46
FF-524
100
91
3
6
100
93
5
2
<b>+/потеря (прерывание беременности)</b>
47
FF-525
100
95
3
2
100
93
2
5
-
48
FF-526
100
100
0
0
100
94
2
4
-
49
FF-527
100
97
2
1
100
98
1
1
<b>+/потеря (прерывание беременности)</b>
50
FF-528
100
95
2
3
100
86
7
7
-
51
FF-529
100
100
0
0
100
100
0
0
-
52
FF-530
100
93
2
3
100
100
0
0
-
53
FF-531
100
96
3
1
100
94
2
5
<b>+/потеря (прерывание беременности)</b>
54
FF-532
100
97
2
1
100
94
2
4
+
55
FF-533
100
100
0
0
100
100
0
0
-
56
FF-534
100
95
3
2
100
93
3
4
-
57
FF-535
100
100
0
0
100
100
0
0
-
58
FF-536
100
93
5
2
100
95
5
0
-
59
FF-537
100
93
1
5
100
90
3
7
-
60
FF-538
100
97
1
2
100
92
2
6
+
61
FF-539
100
98
0
2
100
94
0
6
-
62
FF-540
100
98
0
2
100
94
4
2
-
63
FF-541
100
96
2
2
100
95
1
4
-
64
FF-542
100
96
2
2
100
96
2
2
-
65
FF-543
100
87
6
7
100
92
3
5
-
66
FF-544
100
93
3
4
100
94
2
4
+
67
FF-545
100
95
3
2
100
91
5
4
<b>+/ прерывание беременности)</b>
68
FF-546
100
94
2
4
100
93
3
4
+
69
FF-547
100
97
0
3
100
96
2
2
-
70
FF-548
100
97
1
2
100
100
0
0
+
71
FF-549
100
93
4
3
100
96
2
2
-
72
FF-550
100
92
3
5
100
91
4
5
-
73
FF-551
100
95
1
4
100
97
2
3
-
74
FF-552
100
89
2
9
100
93
2
5
-
75
FF-553
100
96
2
2
100
94
2
5
-
76
FF-554
100
96
1
3
100
98
1
1
-
77
FF-555
100
96
0
4
100
95
1
4
-
78
FF-556
100
91
4
5
100
94
0
6
+
79
FF-557
100
93
3
4
100
95
2
3
-
80
FF-558
100
94
2
4
100
94
2
4
-
81
FF-559
100
86
6
8
100
83
8
9
-
Данные из таблицы 5 обобщили и проанализировали, а результаты показаны далее в таблице 6:
Таблица 6
№ случаев
Количество проанализированных для обоих яичников образцов
81
Непригодные для анализа клетки
0
Общее количество проанализированных образцов
81
Общее количество пациенток, нормальных в отношении X-хромосомной аномалии, согласно анализу FISH
67
Анеуплоидия по хромосоме X ≥5% в фолликулярной жидкости в каждом яичнике
06
Анеуплоидия по хромосоме X ≥5% в фолликулярной жидкости в обоих яичниках
08
Далее в таблице 7 показан ретроспективный анализ в состоянии беременности или выкидыша у нормальных пациенток по сравнению с пациентками с определяемой посредством FISH X-хромосомной анеуплоидией:
Таблица 7
Пациентки с X-хромосомной анеуплоидией в фолликулярной жидкости в обоих яичниках
Пациентки с X-хромосомной анеуплоидией в фолликулярной жидкости в любом яичнике
Пациентки с нормальным состоянием X-хромосом в фолликулярной жидкости
№ пациенток с беременностью
2/8 (25%)
2/6 (33,33%)
16/67 (23,88%)
№ пациенток с прерыванием беременности
2/2 (100%)
1/2 (50%)
3/16 (18,75%)
Из 81 проанализированного образца фолликулярной жидкости, 67 образцов не показали X-хромосомной аномалии (≤ 5% анеуплоидных клеток; таблица 6). В образцах из одного яичника анеуплоидию обнаружили только для 6 из оставшихся 14 случаев, тогда как в образцах фолликулярной жидкости из обоих яичников анеуплоидию обнаружили в других 8 случаях (таблица 6).
При ретроспективном анализе 2 из 8 пациенток с X-хромосомной анеуплоидией в обоих яичниках являлись беременными, но у обеих произошло прерывание беременности. Две из 6 пациенток с X-хромосомной анеуплоидией в каждом из двух проанализированных яичников являлись беременными, у одной из них произошло прерывание беременности. При сравнении, из 67 нормальных по X-хромосоме пациенток 16 являлись беременными (23,88%), из которых только у 3 произошло прерывание беременности (18,75%).
Пример 4
Определение гонадного мозаицизма при кариотипическом анализе с применением клеток из фолликулярной жидкости (Способ с покровным стеклом).
1) Забор клеток из фолликулярной жидкости.
in vitro,
Клетки из фолликулярной жидкости собирают от 4 пациенток, подверженных способу оплодотворения как описано в примере 1.
2) Клеточная культура
2
2
Для осаждения клеток образец фолликулярной жидкости от каждой пациентки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 4 мл жидкости, а затем ресуспендируют осадок в оставшейся жидкости. На помещенное в чашку Петри стерильное покровное стекло капают из пипетки приблизительно 0,5 мл. Образцу позволяют подсохнуть в течение нескольких минут перед добавлением 0,5 мл культуральной среды (Amniomax; Sigma) и инкубируют в течение ночи при температуре 37°C и 5% CO. На следующий день добавляют приблизительно 2 мл культуральной среды и инкубируют планшеты в течение дополнительных двух суток. Ежедневно под контролем микроскопа за культурами наблюдают в отношении образования фибробластов и вносят дополнительную культуральную среду, если необходимо. Супернатант удаляют и добавляют свежую среду, когда культуры являются конфлуентными. Через двое суток клетки собирают, добавлением в культуру 20 мкл Demicolcine (Sigma), инкубируя в CO-инкубаторе в течение 20 минут и добавляя 2 мл гипотонического раствора (0,75 М KCl и 0,6% цитрата натрия). После этого культуры инкубируют в течение 20 минут при 37°C.
3) Фиксация клеток и кариотипирование
К культурам при комнатной температуре медленно добавляют пять капель свежего фиксатора и инкубируют культуры при 37°C в течение 10 минут. Добавляют еще одну 1 мл аликвоту фиксатора, а через 10 минут добавляют еще 2 мл. Через 20 минут весь фиксатор удаляют при комнатной температуре и добавляют 2 мл свежего фиксатора, и снова инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре. Эту последнюю стадию фиксации повторяют дважды. Покровное стекло вынимают из чашки Петри и оставляют на влажной ткани для высушивания. Затем покровное стекло заключают на чистом, сухом стекле с применением заключающей среды DPX. После этого стекло окрашивают способом GTG-бэндинга (The AGT Cytogenetics Laboratory Manual, 3rd Edition, 1997, P 259-324) и сушат на воздухе. Затем стекло изучают под масляной иммерсией для проверки четкой исчерченности хромосом. При исследовании количественных и структурных аномалий анализируют как минимум от 20 до 30 метафаз.
4) Результаты
Моносомию обнаружили в 3 метафазах (фигура 9) из 20 проанализированных в образце от одного индивидуума метафаз. Данный результат также подтвердили в 1 из 20 проанализированных в образце крови метафаз.
Пример 5
Определение гонадного мозаицизма при кариотипическом анализе с применением клеток из фолликулярной жидкости (Способ с культуральным флаконом)
1) Забор клеток фолликулярной жидкости
in vitro
Образцы фолликулярной жидкости забирают от шести подвергнутых процедуре оплодотворения  индивидуумов, как описано в примере 1.
2) Клеточная культура и фиксация
Для осаждения клеток образец фолликулярной жидкости от каждого индивидуума центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 4 мл жидкости. Затем осадок ресуспендируют в оставшемся супернатанте. В два флакона для культур ткани вносят соответственно по 2 мл клеточной суспензии. Во флаконы добавляют культуральную среду (Amniomax, Sigma) и инкубируют флаконы при 37°C в течение 6-8 суток. В каждый флакон вносят дополнительные 2 мл культуральной среды и инкубируют флаконы еще двое суток. Ежедневно под контролем микроскопа за культурами наблюдают в отношении образования фибробластов и вносят культуральную среду по мере необходимости. При обнаружении колоний фибробластов клетки собирают, добавляя 50 мкл Demicolcine (Sigma) и инкубируя приблизительно при 37°C в течение от 2 до 3 часов. Затем клетки переносят в центрифужную пробирку. Во флакон добавляют раствор ЭДТА, встряхивают флакон и снова переносят содержимое в центрифужную пробирку. После этого флакон отмывают раствором трипсина в продолжение от двух до трех минут и снова переносят содержимое в центрифужную пробирку.
В содержащую культивированные клетки центрифужную пробирку добавляют приблизительно 2 мл гипотонического раствора (0,75 М KCl и 0,6% цитрата натрия) и оставляют пробирку приблизительно при 37°C в течение приблизительно 20 минут. К этому медленно добавляют от 10 до 12 капель свежего фиксатора комнатной температуры и оставляют пробирку приблизительно при 37°C в течение приблизительно 10 минут. После этого пробирку центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл раствора. Осадок ресуспендируют в оставшемся супернатанте. Сначала добавляют 1 мл свежего охлажденного фиксатора; к этому добавляют еще приблизительно 5 мл фиксатора и суспензию оставляют при 2-8°C в течение 16-20 часов. Фиксированные образцы центрифугируют и сбрасывают супернатант, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл раствора. Вносят приблизительно 6 мл свежего холодного (от 2 до 8°C) фиксатора Карнуа, содержимое центрифугируют и вносят дополнительный фиксатор. Эту стадию фиксации повторяют дважды.
3) Кариотипирование
Несколько капель клеточной суспензии помещают на охлажденное влажное стекло. После этого стекло в течение 2 секунд нагревают на настроенной на 60-68°C водяной бане и затем переносят на установленную на 45°C горячую плитку на одну минуту. Стекло исследуют на метафазы с длинными сильно спирализованными хромосомами под контролем фазово-контрастного микроскопа при 10× увеличении. Стекло окрашивают способом GTG-бэндинга, как описано выше, и сушат. Затем стекло изучают под масляной иммерсией для проверки хорошей и четкой исчерченности хромосом. При исследовании количественных и структурных аномалий анализируют как минимум от 20 до 30 метафаз.
4) Результаты
Трисомию 21 определили в 4 метафазах из 30 проанализированных в образце от каждой пациентки метафаз с анамнезом у плода синдрома Дауна (фигура 10). Напротив, все исследованные в образце крови метафазы являлись нормальными. Данные результаты подтверждают наличие гонадного мозаицизма у данного индивидуума.
Как показано в примерах 1-5, гонадный мозаицизм, включающий в себя слабо выраженный гонадный мозаицизм, можно выявлять в полученных из фолликулярной жидкости клетках. Это показывает, что полученные из фолликулярной жидкости клетки можно использовать в качестве эффективного средства для выявления хромосомных аномалий в популяции симптоматических и бессимптомных индивидуумов.