ПОДСОЛНЕЧНОЕ МАСЛО С ВЫСОКОЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬЮ
SUNFLOWER OIL WITH HIGH THERMAL STABILITY

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к пищевой, сельскохозяйственной и промышленной отраслям. Целевое подсолнечное масло по настоящему изобретению обладает высокой термостабильностью, гораздо большей, чем у существующих в настоящее время подсолнечных масел. Высокая термостабильность масла делает его подходящим для бытовых и промышленных процессов, нуждающихся в высоких температурах или вызывающих их, как в пищевой (жареная пища), так и в промышленной отраслях (биосмазочные вещества, биотопливо).
Уровень техники
При использовании растительных масел в процессах, нуждающихся в высоких температурах или вызывающих их, требуется, чтобы масла обладали высокой термостабильностью или термической стабильностью. Для процессов приготовления пищи (жарка, выпечка) или для процессов трения (смазка двигателей и механизмов) характерна подверженность масла высоким температурам, что вызывает в нем ряд процессов деградации, таких как окисление, полимеризация, гидролиз, циклизация и изомеризация, приводящих к образованию продуктов с неприятными запахами и вкусами, и с отрицательными свойствами с точки зрения питательной ценности (Bastida and Sanchez Muniz, Thermal oxidation of olive oil, sunflower oil and a mix of both oils during forty discontinuous domestic fryings of different foods. Food Science and Technology International, 7:15-21, 2001). Чем лучше термостабильность масла, тем реже идут процессы деградации, и, следовательно, тем дольше становится срок полезного использования масла.
Термостабильность растительных масел определяется, главным образом, по степени их ненасыщенности и по присутствию в них веществ с антиокислительными свойствами, которые защищают масло в процессе нагревания и задерживают проявление процессов деградации. Степень ненасыщенности масла определяется по профилю жирных кислот. Жирные кислоты тем более подвержены окислению, чем больше степень ненасыщенности или число двойных связей в их углеводородных цепях. Среди наиболее распространенных жирных кислот в растительных маслах, наиболее чувствительной к окислению является линоленовая кислота (полиненасыщенная, три двойные связи), следом идут линолевая кислота (полиненасыщенная, две двойные связи), олеиновая кислота (мононенасыщенная, одна двойная связь) и стеариновая и пальмитиновая кислоты (насыщенные, без двойных связей) (F.B.Padley et al., 1994; Occurrence and characteristics of oils and fats. The Lipid Handbook, ed. F.D.Gunstone, J.L.Harwood and F.B.Padley, London: Chapman & Hall, pp.47-223).
В семенах масличных культур продуцируются вещества с антиокислительными свойствами, среди которых отдельно стоят токоферолы. Токоферолы являются молекулами, состоящими из хроманольной группы и фитильной боковой цепи. Существует четыре различных естественных формы токоферолов, называемые альфа-, бета-, гамма- и дельта-токоферол, отличающихся одна от другой по числу и количеству метальных групп в хроманольном кольце (фиг.1).
Фигура 1. Химическая структура токоферолов
R1=Me; R2=Me: альфа-токоферол
R1=Me; R2=H: бета-токоферол
R1=H; R2=Me: гамма-токоферол
R1=H; R2=He: дельта-токоферол
Поскольку токоферолы являются жирорастворимыми веществами, присутствующие в семенах масличных культур, токоферолы проникают в масло в процессе экстракции. Они имеют двойное антиокислительное действие. С одной стороны, они обладают in vitro действием, т.е. они защищают масло и продукты, содержащие его (приготовленная пища) или полученные из него (биотопливо, биосмазочные материалы) от окисления в ходе хранения и использования. С другой стороны, токоферолы являются биоактивными соединениями с важным антиокислительным эффектом in vivo, т.е. в живой клетке. Эта антиокислительная активность in vivo известна как активность витамина Е (G.Pongracz et al., Tocopherole, Antioxidantien der Natur. Fat Science and Technology 97:90-104, 1995). Четыре типа токоферолов сильно различаются по их антиокислительной активности in vivo и in vitro. В силу вышесказанного, альфа-токоферол характеризуется, как обладающий максимальной эффективностью антиоксиданта in vivo или в качестве витамина Е, но его активность in vitro низка по сравнению с другими токоферолами. Взяв, в качестве эталона, за 100% антиокислительную активность альфа-токоферола, Pongracz et al. (1995, работа упомянута выше) определили относительную эффективность токоферолов в качестве антиоксидантов in vivo, которая составила: для бета-токоферола - 50%, для гамма-токоферола - 25%, для дельта-токоферола - 1%. В другом случае, относительная эффективность в качестве антиоксидантов in vitro составила: для бета-токоферола - 182%, для дельта-токоферола - 194%, для гамма-токоферола - 285%.
Немодифицированное подсолнечное масло обладает профилем жирных кислот, состоящим из пальмитиновой кислоты (4-8% от всех жирных кислот), стеариновой кислоты (2-6% от всех жирных кислот), олеиновой кислоты (20-45% от всех жирных кислот) и линолевой кислоты (45-70% от всех жирных кислот). Относительная пропорция олеиновой и линолевой жирных кислот непостоянна и сильно зависит от температуры в ходе развития семени (Fernandez-Martinez et al., Performance of near-isogenic high and low oleic acid hybrids of sunflower. Crop Science 33: 1158-1163, 1993). Широкий диапазон линий подсолнечника с модифицированными профилями жирных кислот был выведен с помощью генетического улучшения. Основные выведенные линии и их профили жирных кислот представлены в Таблице 1.
Таблица 1
Усредненная композиция жирных кислот (%) масла семян естественных или индуцированных мутантов подсолнечника по сравнению со стандартным маслом (взято из Fernandez-Martinez et al., Mejora de la calidad del girasol. Mejora Genetica de la Calidad en Plantas. Editors: G.Llacer, M.J.Diez, J.M.Carrillo, and M.L. Badenes. Universidad Politecnica de Valencia, pp.449-471, 2006)
Мутант или линия
Композиция жирных кислот (%)<sup>1</sup>
16:0
16:1
18:0
18:1
18:2
Стандарт<sup>2</sup>
5,7
---
5,8
20,7
64,5
6,5
---
3,0
40,9
49,6
Низкое содержание насыщенных жирных кислот
LS-1
5,6
0,0
4,1
20,2
67,4
LS-2
8,6
0,0
2,0
10,8
75,0
LP-1
4,7
0,0
5,4
23,8
63,7
RSI
3,9
0,0
2,6
40,1
51.8
RS2
4.4
0,0
3,2
42,9
47,7
Высокое содержание пальмитиновой кислоты
275НР
25,1
6,9
1.7
10,5
55,8
CAS-5
25,2
3,7
3,5
11.4
55.1
CAS-12
30,7
7,6
2,1
56,0
3.1
HP line
23,9
3.4
2,0
20.4
50,7
CAS-37<sup>3</sup>
29,5
12,3
1.4
5.4
38,7
Высокое содержание стеариновой кислоты
CAS-3
5,1
0,0
26,0
13,8
55,1
CAS-4
5,4
0,0
11.3
34,6
48,0
CAS-8
5,8
0,0
9,9
20,4
63,8
CAS-14
8.4
0,0
37.3
12,4
38,0
CAS-19
6,8
0,0
15.3
21.5
56.4
CAS-20
5,7
0,0
7,7
35,9
50,5
Высокое содержание олеиновой кислоты
Pervenets
---<sup>3</sup>
---
---
79,3
14,8
М-4229
3.4
4.1
86,1
3,9
М-3067
3,9
5.2
54,6
33,9
Высокое содержание линолевой кислоты
F6 sel.
---
---
---
77.3
2698-1
---
---
---
78,0
<sup>1</sup>16:1=пальмитиновая кислота; 18:0=стеариновая кислота; 16:1=пальмитолеиновая кислота 18:1=олеиновая кислота; 18:2=линолевая кислота.
<sup>2</sup>Данные стандартных урожаев, полученных в холодных и теплых условиях окружающей среды соответственно.
<sup>3</sup>Данные не представлены авторами
Для немодифицированного подсолнечного масла характерен профиль токоферолов, который состоит, главным образом, из альфа-токоферола, представляющего более чем 90% от всех токоферолов, и бета-, гамма- и дельта-токоферолов, доли которых составляют меньше чем 5% от всех токоферолов (Demurin et al., Genetic variability of tocopherol composition in sunflower seeds as a basis of breeding for improved oil quality. Plant Breeding 115:33-36, 1996). С помощью генетического улучшения были выведены линии подсолнечника с высоким содержанием бета-токоферола (более чем 50% от всех токоферолов), с высоким содержанием гамма-токоферола (более чем 90% от всех токоферолов) и с высоким содержанием дельта-токоферола (более чем 65% от всех токоферолов) (Fernandez-Martinez et al., 2006, работа упомянута выше).
Подсолнечное масло с низкой степенью ненасыщенности, состоящее, главным образом, из насыщенных жирных кислот (стеариновой и пальмитиновой кислоты) и мононенасыщенных жирных кислот (олеиновой кислоты), обладает термостабильностью большей, чем стандартное подсолнечное масло с высокой степенью ненасыщенности (R.Garces et al., High stable vegetable oils. WO 99/64546). Точно также, подсолнечные масла, в которых альфа-токоферол был частично замещен другими токоферолами с высокой антиоксидантной силой in vitro, главным образом гамма- и дельта-токоферолами, имеют большую термостабильность по сравнению со стандартным подсолнечным маслом, с высоким содержанием альфа-токоферола (L.Velasco and J.M.Fernandez-Martinez, Sunflower Seeds with High Delta-tocopherol Content. WO 2004/089068). До сих пор не был выведен растительный материал подсолнечника, семена которого продуцировали бы масло с низкой степенью ненасыщенности, определенной высоким содержанием насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот, и низким содержанием альфа-токоферола в профиле токоферола.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к экстрагируемому из семян маслу подсолнечника, обладающему рядом свойств профилей жирных кислот и токоферолов, которые придают ему большую термостабильность по сравнению с любым другим разработанным до сих пор подсолнечным маслом. Для целевого подсолнечного масла данного изобретения характерно содержание насыщенных жирных кислот (пальмитиновой и стеариновой кислотой) от 15% до 45% от всех присутствующих в масле жирных кислот, и содержание олеиновой кислоты от 45% до 75% от всех жирных кислот. В этом масле также содержание пальмитолеиновой кислоты больше чем 5% от всех жирных кислот, главным образом, когда преобладающей насыщенной жирной кислотой является пальмитиновая кислота. Содержание линолевой кислоты составляет меньше чем 10%, предпочтительно меньше чем 5%, от всех присутствующих в масле жирных кислот. Точно также, сумма гамма- и дельта-токоферолов превышает 85% от всех присутствующих в масле токоферолов, содержание альфа-токоферола составляет менее чем 15% от всех токоферолов, а содержание общего токоферола в масле составляет от 500 мг на кг масла и до более чем 1250 мг на кг масла.
Данное масло обладает высокой термостабильностью, его индекс стабильности масла (измеренный прибором «Rancimat model 743 apparatus» (Metrohm AG, Херизау, Швейцария) после 10-часового периода индукции при температуре 110°С на нерафинированном масле) составил от 35 до более чем 120 часов.
Настоящее изобретение также относится к семенам подсолнечника, содержащим масло с упомянутыми выше характеристиками, и к растениям подсолнечника, которые, будучи самоопыленными, продуцируют семена с упомянутыми характеристиками. На данный момент не существует семян подсолнечника, продуцирующих масло с комбинацией характеристик профилей жирных кислот и токоферолов, такой же, как у масла, получаемого из целевых семян настоящего изобретения.
Другой задачей настоящего изобретения является использование масла для приготовления пищи человека и животных, и для производства биосмазывающих материалов и биогорючего.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к подсолнечному маслу, экстрагированному из семян разновидностей растений Helianthus annuus L., в которых продуцируется особый тип масла с характерными профилями жирных кислот и токоферолов, придающими маслу исключительную термостабильность.
Упомянутое масло характеризуется высоким содержанием насыщенных жирных кислот, пальмитиновой и стеариновой кислот (15-45% от всех жирных кислот в масле); высоким содержанием олеиновой кислоты (45-75% от всех жирных кислот в масле) и высоким содержанием суммы гамма- и дельта-токоферолов (больше чем 85% от всех присутствующих в масле токоферолов). Комбинация этих трех свойств придает маслу высокую термостабильность.
Это масло также может содержать пальмитолеиновую кислоту, больше чем 5% от всех жирных кислот, главным образом, когда преобладающей насыщенной жирной кислотой является пальмитиновая кислота, с содержанием линолевой кислоты меньше чем 10%, предпочтительно меньше чем 5% от всех присутствующих в масле жирных кислот.
В конкретном воплощении изобретения, содержание пальмитолеиновой кислоты больше чем 10% от всех жирных кислот в масле.
Максимальный вклад в стабильность масла вносят насыщенные жирные кислоты. Однако очень большое содержание этих жирных кислот в масле определяет низкое значение температуры образования копоти при жарке продуктов и низкую питательную ценность масла. Олеиновая кислота придает маслу более низкую, чем насыщенные жирные кислоты, стабильность масла, но более высокое значение температуры образования копоти и более высокую пищевую ценность. Гамма- и дельта-токоферолы придают маслу стабильность большую, чем бета- и альфа-токоферолы.
Содержание альфа-токоферола в масле по изобретению составляет менее чем 15% от всех присутствующих в масле токоферолов. Общее содержание токоферолов может составлять от 500 мг на кг масла до более чем 1250 мг на кг масла.
Данное масло получено путем рекомбинации следующих, ранее выведенных в подсолнечнике, индивидуальных признаков:
a) высокое содержание насыщенных жирных кислот. Существует несколько линий подсолнечника, у которых в масле семян от 15% до 45% жирных кислот находится в форме насыщенных жирных кислот: как в форме пальмитиновой кислоты (16:0), так и в форме стеариновой кислоты (18:0). Были использованы оба типа линий: 1) высокостеариновые, содержание стеариновой кислоты в которых составляет от 15% до 45% от всех жирных кислот в масле семян, и 2) высокопальмитиновые, содержание пальмитиновой кислоты в которых составляет от 15% до 45% от всех жирных кислот в масле семян, а содержание пальмитолеиновой кислоты (16:1) - от 5% до 15% от всех жирных кислот в масле семян;
b) с высоким содержанием олеиновой кислоты. Использованные линии подсолнечника, именуемые «высокоолеиновыми», содержат в форме олеиновой кислоты от 85% до 95% жирных кислот в масле семян. Содержание линолевой кислоты (18:2) составляет от 2% до 10% от всех жирных кислот в масле семян.
c) С высоким содержанием суммы гамма- и дельта-токоферолов. Этот признак присутствует в нескольких линиях подсолнечника, в которых сумма обоих токоферолов составляет более чем 85% от всех присутствующих в семенах токоферолов. Были использованы два типа линий: 1) с высоким гамма-токоферолом, в которых содержание гамма-токоферола составляет более чем 85% от всех токоферолов в семенах, будучи в состоянии достичь значения вплоть до 99% от всех токоферолов в семенах, и 2) с высоким дельта-токоферолом, в котором содержание дельта-токоферола составляет более чем 65% от всех токоферолов в семенах, содержание гамма-токоферола составляет более чем 20% от всех токоферолов в семенах, а сумма дельта- и гамма-токоферолов составляет более чем 85% от всех токоферолов в семенах, будучи в состоянии достичь значения вплоть до 99% от всех токоферолов в семенах. Семена обоих типов линий дают в результате масло с вышеупомянутыми профилями токоферолов и с общим содержанием токоферола от 500 до 1500 мг на кг масла.
Поскольку эти признаки являются признаками с высокой генетической сложностью, рекомбинация была проведена в два этапа, описанных ниже:
1) Рекомбинация признаков «высокое содержание насыщенных кислот» и «высокое содержание олеиновой кислоты».
1
2
2
Проводили контролируемое скрещивание линий с высоким содержанием насыщенных жирных кислот (пальмитиновой и стеариновой кислот) с линией с высоким содержанием олеиновой кислоты, в результате были получены гибридные семена F. Эти семена проращивали, а соответствующим растениям давали самоопыляться для получения семян F, которые демонстрировали расщепление по обоим признакам. Поскольку каждый индивидуальный признак контролируется 1-3 генами, большинство из которых рецессивны, для получения семян, обладающих комбинацией искомых признаков, т.е. высоким содержанием насыщенных жирных кислот и высоким содержанием олеиновой кислоты, было необходимо проанализировать в среднем по 100 семян каждого из гибридов F. Для получения необходимого числа семян с комбинацией двух признаков, из-за низкой частоты встречаемости таких семян, было необходимо проанализировать в среднем 2000 семян каждого из гибридов.
2
3
2
4
3
Для того чтобы комбинация модифицированных признаков профиля жирных кислот была коммерчески полезной, признаки должны быть наследуемыми и они должны быть выраженными независимо от условий окружающей среды, в которых культивируются растения. По этой причине процесс отбора проводили таким образом, чтобы зафиксировать признаки и верифицировать их стабильность в различных условиях окружающей среды. Для этого, сеяли отобранные семена F и подтверждали генетическую стабильность комбинированных признаков путем анализа семян F, образованных самоопылением каждого из растений F, а семена F, образованные из большого числа растений F, культивировали в нескольких типах окружающей среды.
В результате этого первого этапа были получены растения, семена которых имели: высокое содержание насыщенных жирных кислот, от 15% до 45% от всех жирных кислот в масле; высокое содержание олеиновой кислоты, от 45% до 75% от всех жирных кислот; и низкое содержание линолевой кислоты, менее чем 10% от всех жирных кислот.
2) Рекомбинация нового признака «высокое содержание насыщенных жирных кислот и высокое содержание олеиновой кислоты» с признаком «высокое содержание суммы гамма- и дельта-токоферолов».
На этом втором этапе были использованы растения, полученные на предыдущем этапе 1), в которых были рекомбинированы высокое содержание насыщенных жирных кислот (15-45% от всех присутствующих в масле жирных кислот) и высокое содержание олеиновой кислоты (45-75% от всех присутствующих в масле жирных кислот), а также растения с высоким содержанием суммы гамма- и дельта-токоферолов (более чем 85% от всех присутствующих в семенах токоферолов).
3
1
2
2
После осуществления контролируемого скрещивания между линиями с высоким содержанием суммы гамма- и дельта-токоферолов с растениями F с высоким содержанием насыщенных жирных кислот и олеиновой кислоты, были получены семена гибридов F. Эти семена проращивали, и соответствующие растения самоопылялись для получения семени F, которое демонстрировало расщепление по трем целевьм признакам рекомбинации, т.е. по высокому содержанию насыщенных жирных кислот, высокому содержанию олеиновой кислоты и высокому содержанию суммы гамма- и дельта-токоферолов. Поскольку искомый профиль жирных кислот контролируется 4-6 генами, а искомый профиль токоферолов контролируется 1-3 генами, главным образом рецессивными, для получения семени, обладающего комбинацией искомых признаков, т.е. высокого содержания жирных кислот, высокого содержания олеиновой кислоты, и высокого содержания суммы гамма- и дельта-токоферолов было необходимо проанализировать в среднем по 400 семян каждого из гибридов F. Низкая частота встречаемости семян с комбинацией двух признаков сделала необходимым анализ в среднем 5000 семян каждого из гибридов для получения необходимого числа семян с комбинацией двух признаков.
2
3
2
4
3
Для того чтобы комбинация модифицированных признаков профиля жирных кислот была коммерчески полезной, признаки должны быть наследуемыми и они должны быть выраженными независимо от условий окружающей среды, в которых культивируются растения. По этой причине, процесс отбора проводили таким образом, чтобы зафиксировать признаки и верифицировать их стабильность в различных условиях окружающей среды. Для этого сеяли отобранные семена F и подтверждали генетическую стабильность комбинированных признаков путем анализа семян F каждого из растений F, а семена F, образованные из большого числа растений F, культивировали в нескольких типах окружающей среды. Эти растения культивировали в различных типах окружающей среды, которые служили для подтверждения того, что одновременная экспрессия высокого содержания насыщенных жирных кислот, высокого содержания олеиновой кислоты и высокого содержания суммы гамма- и дельта-токоферолов является результатом закрепленной и стабильной генетической наследственности, выраженной независимо от условий культивации растений.
В результате этого второго этапа были получены растения, семена которых имели: высокое содержание насыщенных жирных кислот, от 15% до 45% от всех жирных кислот в масле; высокое содержание олеиновой кислоты, от 45% до 75% от всех жирных кислот; и содержание суммы гамма- и дельта-токоферолов больше чем 85% от всех присутствующих в масле токоферолов. Если источником насыщенных жирных кислот была линия с высоким содержанием пальмитиновой кислоты (15-45% от всех жирных кислот в масле), то также наблюдалось присутствие пальмитолеиновой кислоты в количестве большем чем 5% от общего содержания жирных кислот в масле.
Принимая во внимание диапазон содержания жирных кислот (пальмитиновой, стеариновой и олеиновой кислот) и токоферола в использованных линиях подсолнечника на различных этапах рекомбинации, конкретные воплощения по полученному изобретению включают масло с содержанием стеариновой кислоты больше чем 15%, больше чем 25% и больше чем 35% от всех присутствующих в масле жирных кислот. Другие конкретные воплощения по изобретению содержание пальмитиновой кислоты составляет больше чем 15%, больше чем 25% и больше чем 35% от всех присутствующих в масле жирных кислот.
В двух других конкретных воплощениях по изобретению, содержание гамма-токоферола в масле по изобретению больше чем 85% и больше чем 95% от всех токоферолов в масле.
В других конкретных воплощениях по изобретению, содержание дельта-токоферола в масле больше чем 25%, больше чем 55% и больше чем 75% от всех токоферолов в масле.
Из-за профиля жирных кислот с низким уровнем ненасыщенности, который является основной причиной окисления и низкой термостабильности растительных масел, и из-за присутствия большой доли токоферолов с сильным защитным действием против окисления и влияния высокой температуры, масло, экстрагируемое из семян, полученных из описанных выше растений, обладает исключительной термостабильностью, гораздо большей, чем у любого обычного подсолнечного масла, а также большей, чем у любого другого подсолнечного масла, у которого модифицированным является либо только профиль жирных кислот, либо только профиль токоферолов.
Индекс стабильности масла (oil stability index (OSI)) у целевого масла по настоящему изобретению, измеренный с помощью прибора «Rancimat model 743 apparatus» (Metrohm AG, Херизау, Швейцария) после 10-часового периода индукции при температуре 110°С на нерафинированном масле, составил от 35 до более чем 120 часов.
Термоокислительная деградация масла оценивается путем изучения деградации присутствующих в упомянутом масле токоферолов и изучения появления в процессе нагревания полярных соединений и полимеров. Термоокислительная деградация целевого масла по настоящему изобретению гораздо слабее, чем у масла, полученного из семян, использованных в качестве родительских, и имеет низкий процент (половину) образования полимеров и полярных соединений.
С учетом технических характеристик масла по изобретению, высокой стабильности масла и высокого сопротивления термоокислительной деградации, данное масло может быть пригодно для продуктов питания человека и животных. Масло по изобретению также может быть использовано для производства биосмазочных веществ и биогорючего.
В конкретном воплощении по изобретению, масло по изобретению получается экстракцией семян подсолнечника семенной линии IAS-1265, депонированной 20 марта 2007 года в NCIMB (National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria) Ltd., Абердин, Шотландия, под номером NCIMB-41477.
Содержащие масло по изобретению смеси масел также являются целью настоящего изобретения, также как и жмых, полученный как остаток процесса экстракции масла из семян подсолнечника.
Другая цель настоящего изобретения заключается в семенах подсолнечника, содержащих масло, обладающее характеристиками масла по изобретению. Они являются семенами, дающими растения которые, после прорастания, будучи самоопыленными, содержат в своих семенах масло с характеристиками масла по изобретению, независимо от условий культивации растений. В конкретном воплощении семена по изобретению происходят из линии подсолнечника IAS-1265, депонированной 20 марта 2007 года в семенном фонде NCIMB Ltd., Абердин, Шотландия, под номером NCIMB-41477. Целевые семена по настоящему изобретению могут быть использованы для получения масла по изобретению.
Также другой задачей настоящего изобретения являются растения подсолнечника (Helianthus annuus L), которые, будучи самоопыленными, дают семена, содержащие масло по изобретению.
Осуществление изобретения
Получение семян
5.1. Рекомбинация признаков «высокое содержание насыщенных кислот» и «высокое содержание олеиновой кислоты».
Отобрали случайно по сорок восемь семян полученной с помощью химического мутагенеза линии подсолнечника NP-40, с высоким содержанием пальмитиновой кислоты в масле (больше чем 15% от всех жирных кислот), и линии BSD-2-423, с высоким содержанием в масле олеиновой кислоты (больше чем 85% от общего содержания жирных кислот) и проанализировали кислотную композицию или профиль в масле каждого индивидуального семени. Поскольку анализ семян не мог быть деструктивным, т.к. после него семена не должны потерять всхожесть, анализ проводили на половине семени. Упомянутый способ заключается в отрезании небольшой части семени дистально относительно эмбриона так, чтобы разрез не влиял на всхожесть семени. Затем анализировали профиль жирных кислот в отрезанной части посредством газовой хроматографии метиловых эфиров жирных кислот (R.Garces and M.Mancha, One-step lipid extraction and fatty acid methyl esters preparation from fresh plant tissues. Analytical Biochemistry, 211:139-143, 1993), а остаток семени, содержащий эмбрион, хранили в оптимальных условиях для того, чтобы прорастить его в зависимости от результатов анализа.
После подтверждения профиля жирных кислот в каждом семени проращивали упомянутые семена, культивировали в теплице соответствующие растения и осуществляли контролируемое скрещивание между растениями линий NP-40 и BSD-2-423. Скрещивание заключается в удалении тычинок или мужских органов цветков на заре, перед тем как откроются пыльники для высвобождения пыльцы, в растениях, которые будут использоваться в качестве материнских особей, с последующим искусственным опылением пыльцой растений, используемых в качестве отцовских особей. В этом примере растения BSD-2-423 использовали в качестве материнских особей, а растения NP-40 использовали в качестве отцовских особей, хотя подобный результат можно получить и реципроктно.
1
1
1
В гибридных семенах, полученных в результате скрещивания, именуемых семенами F, анализировали профиль жирных кислот описанным выше способом, в половине семени. Среднее содержание пальмитиновой кислоты в семенах F составляло 7,3% от всех жирных кислот в масле, по сравнению с 30,0% в семенах растений NP-40 и с 3,5% в семенах растений BSD-2-423. Среднее содержание олеиновой кислоты в семенах F составляло 69,8% от всех жирных кислот в масле, по сравнению с 8,0% в семенах NP-40 и с 89.6% в семенах BSD-2-423.
1
2
2
2
2
Проращивали 150 семян F, давали самоопылиться соответствующим растениям для получения семян F, в которых анализировали профиль жирных кислот. Проанализировали 2348 семян F, в которых наблюдалось расщепление по содержанию пальмитиновой и олеиновой кислот. Содержание пальмитиновой кислоты в семенах F находилось в диапазоне от 3,1% до 37,8% от всех жирных кислот в масле. Содержание олеиновой кислоты в семенах F варьировало в диапазоне от 6,9% до 92,2% от всех жирных кислот в масле. Среди 2348 проанализированных семян, 104 продемонстрировали комбинацию высокого содержания пальмитиновой кислоты (больше чем 15% от всех жирных кислот) и высокое содержание олеиновой кислоты (больше чем 45% от всех жирных кислот в масле). Среди этих 104 семян, в семени с наибольшим содержанием пальмитиновой кислоты содержание пальмитиновой кислоты составило 34%, а олеиновой кислоты 55% от всех жирных кислот, в то время как в семени с наивысшим содержанием олеиновой кислоты содержание пальмитиновой кислоты составило 18%, а олеиновой кислоты 73% от всех жирных кислот.
2
3
2
3
Отобранные семена F проращивали и подтверждали генетическую стабильность объединенных признаков с помощью анализа семян F из каждого растения F. Композиция жирных кислот в масле по результатам анализа всех 3744 семян F была следующей: среднее содержание пальмитиновой кислоты 27,7%±3,4% (среднее ± стандартное отклонение), пальмитолеиновой кислоты (7,2%±1,7%), стеариновой кислоты (1,4%±0,3%), олеиновой кислоты (59,8%±4,9%) и линолевой кислоты (3,9%±1,0%).
5.2. Рекомбинация признака «высокое содержание насыщенных жирных кислот и высокое содержание олеиновой кислоты» с признаком «высокое содержание суммы гамма- и дельта-токоферолов».
3
Взяли сорок восемь полученных на предыдущем этапе семян F, в которых сочетается высокое содержание пальмитиновой кислоты (больше 15%) и высокое содержание олеиновой кислоты (больше чем 45%), и 48 семян линии Т2100, с высоким содержанием гамма-токоферола (более 85%), затем в масле каждого семени проанализировали композицию или профиль кислот и токоферолов. Такой анализ провели посредством описанного выше способа на половине семени. Отрезанную часть семени делили на две половины: в одной половине с помощью газовой хроматографии метиловых эфиров жирных кислот (R.Garces and M.Mancha, 1993, работа упомянута выше) анализировали профиль жирных кислот; в другой половине с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии - ВЭЖХ анализировали профиль токоферолов (F.Goffman et al., Quantitative determination of tocopherols in single seeds of rapeseed, Brassica napus L., Fett/Lipid 101:142-145, 1999).
3
1
1
1
1
После подтверждения профиля жирных кислот и токоферолов в каждом семени упомянутые семена проращивали, культивировали в теплице соответствующие им растения, после чего проводили контролируемое скрещивание между растениями, происходящими из семян F и из Т2100, согласно описанию в разделе 5.1. В семенах F анализировали профили жирных кислот и токоферолов. Среднее содержание пальмитиновой кислоты в семенах F составило 6,8% от всех жирных кислот в масле, по сравнению с 28,9% в семенах растений NP-40 и с 3,2% в семенах растений Т2100. Среднее содержание олеиновой кислоты в семенах F составило 72.6.8% от общего содержания жирных кислот в масле, по сравнению с 90,3% в семенах BSD-2-423 и с 12,1% в семенах Т2100. Содержание гамма-токоферола в семенах F составило 1,2% от всех токоферолов, по сравнению с 0.0% в использованных в качестве контроля семенах NP-40 и BSD-2-423, и с 99.2% в Т2100.
1
2
2
2
2
100 семян F проращивали и с помощью самоопыления в соответствующих растениях получали семена F, в которых анализировали профиль жирных кислот. Проанализировали 8952 семян F, в которых наблюдалось расщепление по содержанию пальмитиновой кислоты, олеиновой кислоты и гамма-токоферола. Содержание пальмитиновой кислоты в семенах F находилось в диапазоне от 2,2% до 37,6% от всех жирных кислот в масле. Содержание олеиновой кислоты в семенах F варьировало в диапазоне от 5,8% и 94,2% от всех жирных кислот в масле. Содержание гамма-токоферола варьировало в диапазоне от 0,0% до 99,6% от всех токоферолов в семенах. Среди 8952 проанализированных семян, 51 семя продемонстрировало комбинацию высокого содержания пальмитиновой кислоты (больше чем 15% от всех жирных кислот), высокого содержания олеиновой кислоты (больше чем 45% от всех жирных кислот в масле) и высокое содержание гамма-токоферола (больше чем 85% от всех токоферолов в семенах).
2
3
2
Отобранные семена F проращивали и подтверждали генетическую стабильность объединенных признаков с помощью анализа семян F из каждого растения F.
3
Композиция жирных кислот в масле по результатам анализа всех 3744 семян F была следующей: среднее содержание пальмитиновой кислоты 28,9%±3,3% (среднее ± стандартное отклонение), пальмитолеиновой кислоты - 7,3%±1,1%, стеариновой кислоты - 1,6%±0,5%, олеиновой кислоты - 52,5%±3,9% и линолевой кислоты - 4,2%±0,7%, а композиция токоферольной фракции была следующей: среднее содержание альфа-токоферола - 2,8%±1,3%, гамма-токоферола - 96,6%±1,8%, и дельта-токоферола - 0,6%±0,2%.
Экстракция масла
Для экстракции масла с помощью петролейного эфира (температура кипения 40-60°С) использовали 150-граммовую порцию семян и систему экстракции Сокслета, в соответствии со способом Испанской ассоциации стандартизации (Asociacion Espanola de Normalizacion) (Catalogo de normas UNE. Madrid, 1991). В масле анализировали композицию жирных кислот и токоферолов, по результатам анализа композиция жирных кислот была следующей: 29,9% пальмитиновой кислоты, 7,5% пальмитолеиновой кислоты, 1,7% стеариновой кислоты, 52,4% олеиновой кислоты, и 4,2% линолевой кислоты; а композиция фракции токоферолов была следующей: 2,4% альфа-токоферола, 96,4% гамма-токоферола и 1,2% дельта-токоферола.
Технические характеристики полученного масла
а) Исследование индекса стабильности масла (OSI) в различных типах подсолнечного масла
После нагревания до 110°С в течение 10 часов индекс стабильности масла (OSI) измеряли согласно стандартному протоколу Американского Общества Нефтехимиков (Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemists' Society, 4th edition, AOCS, Champaign, IL, U.S.A., 1994), у следующих типов подсолнечного масла:
Масло 1: Стандартное подсолнечное масло (стандартные профили жирных кислот и токоферолов);
Масло 2: Масло с высоким содержанием олеиновой кислоты и со стандартным профилем токоферолов;
Масло 3: Масло с высоким содержанием пальмитиновой кислоты, с высоким содержанием олеиновой кислоты и со стандартным профилем токоферолов;
Масло 4: Целевое масло настоящего изобретения, с высоким содержанием пальмитиновой кислоты, высоким содержанием олеиновой кислоты и модифицированным профилем токоферолов (с высоким содержанием гамма-токоферола).
Композиция жирных кислот и токоферолов четырех типов подсолнечного масла, а также значения OSI после нагревания при 110°С в течение 10 часов, показаны в Таблице 2.
Таблица 2
Композиции жирных кислот и токоферолов четырех типов подсолнечного масла и их значения OSI после нагревания при 110°С в течение 10 часов
Жирные кислоты (%)<sup>a</sup>
Токоферолы (%)<sup>b</sup>
Масло
16:0
16:1
18:0
18:1
18:2
А-Т
В-Т
G-T
D-T
OSI(h)
1
6,9
0,0
5,8
34.1
53.2
99,9
0.1
0,0
0,0
1.2
2
4,3
0,0
3,1
90.4
2,2
99,9
0,1
0,0
0,0
1,5
3
28,2
7,8
1,7
56,9
2,1
99,9
0,1
0,0
0,0
17,1
4
29,2
7,5
1,7
52.4
4,2
2,4
0,0
96,4
1,2
49,5
<sup>a</sup>16:0 = пальмитиновая кислота; 18:0 = стеариновая кислота; 18:1 = олеиновая кислота; 18:2 = линолевая кислота; 16:1 пальмитолеиновая кислота
<sup>b</sup>A-T = альфа-токоферол; В-Т=бета-токоферол; G-Т=тамма-токоферол; D-T=дельта-токоферол
b) Исследование деградации токоферолов и возникновения полярных соединений и полимеров при нагревании
Для исследования синергетического эффекта модификации профиля токоферола масла, с ранее модифицированным профилем жирных кислот, масла 3 и 4, описанные в разделе а), подвергали действию высокой температуры (180°С) в течение продолжительного периода времени (25 часов), после чего измеряли параметры, непосредственно связанные с термоокислительной деградацией масла:
- общее содержание токоферолов, упомянутые токоферолы, выраженные, как мг токоферола на кг масла, измеряли в соответствии со стандартным способом Международного Союза Теоретической и Прикладной Химии (International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), Standard methods for the analysis of oils, fats and derivatives. 1st supplement to 7th edition. Pergamon Press, Oxford, United Kingdom, 1992).
- Образование полярных соединений, выраженное как % от общей массы масла, измеряли в соответствии со способом, описанным М.С.Dobarganes et al. (High-performance size exclusion chromatography of polar compounds in heated and non-heated fats. Fat Science and Technology 90:308-311, 1988).
- Образование полимеров, выраженное как % от общей массы масла, измеряли в соответствии со стандартным способом Международного Союза Теоретической и Прикладной Химии (IUPAC, 1992, упомянутая выше работа).
Результаты представлены в Таблице 3.
Таблица 3
Содержание общего токоферола (мг*кг<sup>-1</sup>), полярных соединений (%) и полимеров (%) в двух типах масла после нагревания при 180°С в течение 25 часов.
Токоферолы (%)<sup>a</sup>
Токоферолы, (мг*кг<sup>-1</sup>)
Полярные соединения, (%)
Полимеры, (%)
Масло
А-Т
В-Т
G-T
D-T
0<sup>b</sup>
25<sup>b</sup>
0
25
0
25
3
99,9
0,1
0,0
0,0
826
0
3,0
21,0
0,0
8,7
4
2,4
0,0
96,4
1,2
808
135
3,2
10,7
0,0
4,0
<sup>a</sup>A-T = альфа-токоферол; В-Т=бета-токоферол; G-Т=гамма-токоферол; D-T=дельта-токоферол
<sup>b</sup>(0) - это исходный уровень, а (25) - это уровень, полученный после 25 часов нагревания в указанных выше условиях.