Совершенствование иммунологических технологий в клинической лабораторной диагностике

общую интоксикацию организма и способствовали мембра-нолитическим процессам. Коэффициент ХС/ФЛ в 2 раза превышал нормальные значения. К выявленным особенностям фосфолипидограммы эритроцитов относятся уменьшение процентного содержания сфингомиелина, фосфатидилэта-ноламина, повышение фосфатидилхолина, цитотоксической фракции лизофосфатидилхолина и кардиолипина. Таким образом, у обследованных нами больных МВ в связи с панкреатической недостаточностью происходит нарушение всасывания липидов, которое ведет к возникновению дислипидемии и изменению спектра липидов биологических мембран.

Представленные нами материалы показывают перспективность дальнейшего изучения метаболических нарушений при МВ у детей для понимания сущности этого заболевания и разработки обоснованной гиполипидемической и мембра-ностабилизирующей терапии.

Э.А. Юрьева, В.С. Сухоруков, Е.С. Воздвиженская, Н.Н. Новикова, М.Н. Харабадзе, М.И. Яблонская. Алгоритм диагностики гипоксии у детей с кардиопатиями. Обособленное структурное подразделение Научно-исследовательский клинический институт педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва

Цель - определить основные признаки гипоксического синдрома (гипоксии) у детей с различными типами наследственных и врожденных кардиопатий для оптимизации лечения и профилактики осложнений.

Обследовано 170 детей с кардиопатиями, в том числе с гипертрофической кардиомиопатией (ГКМП), 10 детей с ди-латационными кардиомиопатиями, 5 детей с синдромом слабости синусового узла, 70 детей с синдромом Элерса-Данло в сочетании с пролапсом митрального клапана и врожденными пороками сердца, в том числе с синдромом ССУ, блокадой правой ножки пучка Гисса. В группе сравнения обследовано 30 практически здоровых детей. Возраст обследованных детей составлял от 7 до 17 лет (13 ± 2 года).

Для определения диагностически информативных признаков гипоксии проводилось биохимическое исследование трех

биосред: крови, слюны и мочи. Кроме того, исследовался би-опсийный материал скелетных мышц. Использовались стандартные наборы Хьюман и биохимический комбайн КониЛаб, культура лимфоцитов в присутствии 6-тиогуанина (6-ТГ), цветные реакции на лактат (гидрохинон) и пируват (дифенил-гидразин), АОА (дифенил-пикрилгидразин), МДА (тиобарби-туровая кислота), активность ксантиноксидазы (КО) определялась по цветной реакции с нитротетразолиевым синим в присутствии гипоксантина в качестве субстрата. Активность гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ) и S-фазы митоза определяли с помощью культуры лимфоцитов в присутствии 6-ТГ. Микроэлементы в биоматериале определяли с помощью рентгенофлюоресцентного метода на аппарате PICOFOX. Газы крови определялись на газовом анализаторе АКЬ-500 (Radiometr). Морфологию скелетных мышц проводили на световом и электронном микроскопе.

Установлено, что у детей с кардиопатиями имеет место нарушение биоэнергетики с накоплением в крови продуктов анаэробного гликолиза - лактата, пирувата и снижение р02, а также в 1,5-2 раза снижается содержание АТФ в крови. Характерным оказалось значительное снижение активности ГГФРТ в лимфоцитах, повышение активности КО и повышение содержания мочевой кислоты в крови и/или моче. В полости рта повышается содержание лактата и пирувата и снижается содержание противовоспалительных факторов. Снижение рН слюны и скорости слюноотделения сочетается с высокой частотой системной гипоплазии эмали, множественного кариеса зубов и рецидивирующего гингивита. В моче детей с кардиопатиями в 50-90% случаев определяется снижение антиоксидантной защиты, повышение продуктов перекисных процессов, средних молекул и микропротеинов нагруженных микроэлементами, что характерно для эндогенной интоксикации продуктами перекисного окисления. Морфологически выявляются признаки нарушения структуры и функции митохондрий. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости включения антигипоксантов в комплекс лечебно-профилактических мероприятий.

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

А.А. Новиков, Е.Н. Александрова, А.Н. Герасимов, М.В. Черкасова, Д.Е. Каратеев, Е.Л. Лучихина, Е.Л. Насонов. Оценка активности ревматоидного артрита с использованием многопараметрического анализа лабораторных биомаркеров. НИИ ревматологии им. В.А. Насоновой РАМН

Регулярный контроль активности заболевания является ключевым компонентом ведения больных ревматоидным артритом (РА). Количественная оценка статуса пациента дает возможность разрабатывать стандартизованные показания для применения противоревматической терапии. Цель - выявление лабораторных биомаркеров, способных отражать активность РА.

Обследовано 58 пациентов с РА: 46 женщин и 12 мужчин; возраст: 49 (47-58) лет, длительность 48 (28-120) мес., disease activity score (DAS28) 4,8 (3,85-5,8), а также 30 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными. Концентрации 30 биомаркеров в сыворотке крови измеряли с использованием иммунонефелометрического метода, иммуноферментного анализа и технологии xMAP.

Проведение многофакторного анализа позволило выделить факторы, наиболее «связанные» с высокой/умеренной активностью РА по DAS28: фактор роста фибробластов (FGF), моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (МСР)-1, интерлейкины: IL-ip, -6-15, фактор некроза опухоли а (TNF-а) и создать прогностическую модель оценки активности РА. По данным характеристического анализа, данная мо-

дель обладает «отличной» диагностической эффективностью при дифференциации высокой/средней и низкой активности РА (площадь под ЯОС-кривой 0,94; 95% доверительный интервал 0,88-1,0).

Создание независимого от субъективной оценки иммунологического многопараметрического индекса, обладающего более высокой диагностической точностью по сравнению с рутинно используемыми в клинической практике лабораторными показателями, может являться качественно новым этапом в оценке и контроле активности РА.

А.И. Сперанский, В.А. Кузьмин, И.Н. Вейко. Экстрацеллю-лярная ДНК и ее роль в развитии процессов аутоиммуни-тета и воспаления. НИИ ревматологии РАМН, Институт биохимической физики РАН, Генетический центр РАН, Москва

При аутоиммунных воспалительных заболеваниях внеклеточная ДНК (вкДНК) в плазме крови больных присутствует в виде комплексов с белками, в частности при анки-лозирующем спондилите (болезнь Бехтерева) воспаление ассоциируется с увеличением уровня вкДНК, образующей комплексы с монометиновым протеином и гиперметилированием вкДНК. Кроме того, показано, что в составе вкДНК при РА и других аутоиммунных воспалительных заболеваниях накапливаются ГЦ-обогащенные последовательности, в частности транскрибируемая область рибосомного повтора.

Целью проводимого исследования был поиск сигнальных путей, приводящих к прогрессии аутоиммунного вос-

палительного заболевания, индуцированной фрагментами вкДНК.

При действии ГЦ-обогащенных фрагментов вкДНК больных РА на лимфоциты, выделенные из крови здоровых доноров, активируются TLR9- и NF-kB-сигнальные пути, направленные на выживание клеток, что сопровождается повышенной транскрипционной активностью генов этих сигнальных путей. Исследовали уровень экспрессии генов TLR9- и NF-kB-сигнальных путей с помощью метода ПЦР в реальном времени,

Фрагменты вкДНК больных РА инициируют повышение уровня экспрессии гена TLR9 и гена адаптера TLR9-сигнального пути - MyD88 в лимфоцитах, полученных от 21 здорового донора в 3-3,5 и 4-4,5 раза (p < 0,05) соответственно. Стимуляция TLR9 активирует TLR9- и NF-kB-сигнальные пути, что приводит к синтезу клетками большого количества провоспалительных цитокинов и ведет к прогрессии заболевания.

Исследовали изменение уровня экспрессии генов NF-kB-сигнального пути: NFKB1, M4KJZ4, RELA и генов-мишеней NF-kB - IL6 и TNF через 3 и 24 ч инкубации лимфоцитов здоровых доноров в присутствии фрагментов вкДНК больных РА и модельных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК.

При действии фрагментов вкДНК больных РА и модельных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК в концентрации 50 нг/мл на лимфоциты здоровых доноров уровень экспрессии генов MAP4K4, RELA, NFKB1 повышается в 3-3,5 раза через 3 ч и остается повышенным через 24 ч инкубации (p < 0,05). Уровень экспрессии генов IL6 и TNF повышается в среднем в 2 раза через 3 ч, через 24 ч уровень экспрессии гена IL6 остается повышенным (в 3-4 раза), а уровень экспрессии гена TNF снижается, превышая контрольные значения только в 1,2-1,5 раза. Повышение уровня экспрессии генов IL6 и TNF сопровождается повышением уровня синтеза цитокинов.

Чтобы показать, что активация NF-kB-сигнального пути и последующий синтез цитокинов инициируется ГЦ-богатыми фрагментами вкДНК через инициацию TLR9-сигнального пути, применили ингибиторный олигонуклеотид 2088 (TCCTGGCGGGGAAGT) в концентрации 3 мкг/мл, избирательно блокирующий TLR9-сигнальный путь без изменения pH в эндосомах, и хлорохин (chloroquine) в концентрации 2 ммоль/л, который изменяет pH в эндосомах, где происходит связывание ГЦ-обогащенной ДНК с TLR9. Хлорохин и ин-гибирующий ОДН полностью блокировали активность генов TLR9- и NF-kB-сигнальных путей. Таким образом, активация NF-kB-сигнального пути, которая может вызывать прогрессию аутоиммунных заболеваний при действии накапливающейся в плазме крови ГЦ-богатой вкДНК, индуцируется в результате инициации TLR9-сигнального пути в лимфоцитах.

О.Я. Волкова. Необходимые условия успеха иммуноге-матологической диагностики в ЛПУ. ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России

Иммуногематология - часть клинической лабораторной диагностики, которая прежде всего используется для обеспечения безопасности гемокомпонентной терапии, что влечет за собой ее востребованность практически в любом лечебном учреждении. Соответственно неотъемлемыми составляющими этой диагностики являются иммуногематологические исследования крови доноров и реципиентов гемокомпонен-тов, традиционно выполняемые в ЛПУ в одной лаборатории. В соответствии с последними нормативными документами исследования крови доноров и реципиентов необходимо разделить и выполнять в разных лабораториях. При этом теряется основной смысл этих исследований - обеспечение совместимости при переливании, так как гемокомпоненты находятся в ведении подразделений службы крови, а индивидуальный подбор (выбор совместимых) гемокомпонентов призваны выполнять КДЛ ЛПУ, в распоряжении которых крови доноров быть не может. Таким образом, одной из важнейших составляющих успеха иммуногематологической диагностики в ЛПУ является ее централизация. Залогом успешности иммуногематологических исследований для обеспечения безопасности трансфузий гемокомпонентов является также их стандартизация, а в настоящее время для доноров и реципиентов эти стандарты различны. При этом выявление у реципиентов антигенов Cw и к приводит к возрастанию материальной и временной составляющих диагностики, но никак не отражается на безопасности трансфузий гемоком-понентов, так как эти антигены у доноров не определяются. Наряду с этим скрининг антител к антигенам эритроцитов у реципиентов регламентирован к проведению в непрямом антиглобулиновом тесте с качественной панелью эритроцитов, состоящей из трех разновидностей. При этом сенсибилизированным по данным такого исследования пациентам совместимые донорские эритроциты разрешается подбирать значительно более грубым методом - реакцией конглютина-ции с 10% желатиной. Таким образом, выбор качественных реагентов и их применение в чувствительных и специфичных методах исследования является еще одной из составляющих успеха иммуногематологической диагностики. Наряду с этим необходимо упомянуть также такие важные слагаемые успеха иммуногематологических исследований, как их автоматизация, контроль качества, квалификация персонала. Только все эти составляющие в комплексе могут привести к желаемой цели любого ЛПУ - иммуногематологической безопасности трансфузий гемокомпонентов.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ПРОБЛЕМЕ

А.С. Авдеева, Е.Н. Александрова, А.А. Новиков, М.В. Черкасова, А.П. Алексанкин, Е.Л. Насонов. Взаимосвязь уровня BAFF и APRIL с клинико-лабораторными показателями активности заболевания при ревматоидном артрите.

ФГБУ «НИИР им. В.А. Насоновой» РАМН, Москва

BAFF (B-cell activation factor) и APRIL (a proliferation inducing ligand) - представляют собой цитокины, относящиеся к семейству ФНО-а, являются важными факторами, контролирующими рост, дифференцировку, активацию и выживание аутореактивных B-клеток.

Цель - оценить взаимосвязь уровня BAFF и APRIL с активностью заболевания, уровнем аутоантител, иммуноглобулинов и CD19+ B-лимфоцитов при ревматоидном артрите (РА).

Обследован 21 больной РА (17 женщин, средний возраст - 50 лет; 37-62 года, длительность заболевания - 12; 5-21 год, DAS 28 - 5,3; 4,8-6,1); 72% больных получали терапию БПВП (73,3% - метотрексат, 20% лефлуномид, 6,7% другие БПВП) и ГК (76,2%) у 28% пациентов терапия БПВП на момент включения в исследование отсутствовала в связи с непереносимостью или нежелательными реакциями на препарат. 47,6% больных получали терапию ГИБП без эффекта.

Сывороточную концентрацию СРБ, IgM РФ, IgM, IgG и IgA измеряли иммунонефелометрическим методом, уровень АЦЦП, BAFF (в нг/мл) и APRIL (в нг/мл) - методом иммуно-ферментного анализа. При исследовании 26 сывороток здоровых доноров верхняя граница нормы BAFF и APRIL состави-