1
7
КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ МОНОГЛИЦЕРИДЫ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ С-С И ГЛИЦЕРИН, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ И ПРОТИВОПЛЕСНЕВЫХ СРЕДСТВ
1
7
COMPOSITIONS CONTAINING MONOGLYCERIDES OF C-C ORGANIC ACIDS AND GLYCERINE, PRODUCTION AND USE THEREOF AS ANTIBACTERIAL AND ANTIMOULD AGENTS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение имеет отношение к составам кормов для животных.
Уровень техники
Самой распространенной и известной проблемой, затрагивающей сельскохозяйственных и домашних животных, является поражение, которое вызывают бактериальные инфекции и вырабатываемые плесневыми грибами микотоксины, потребляемые животными вместе с кормом. Бактериальные инфекции, в частности кишечные инфекции, часто проявляются в виде тяжелой диареи, которая может нарушать в значительной степени здоровье животных и в результате снижать прибыль сельского хозяйства в целом.
Токсическое действие микотоксинов, вырабатываемых плесневыми грибами, на конкретные органы и физиологические функции животных, и их способность вызывать болезни, например токсикоз, известны в течение ряда лет. Известно также, что канцерогенные микотоксины, такие как афлатоксины, вырабатываемые плесневыми грибами штамма Aspergillus, могут передаваться человеку через коровье и козье молоко, поскольку они стабильны и не устраняются при обычной термической обработке. Если в корме присутствует ократоксин А, вырабатываемый видами Aspergillus и Penicillium, он может вызывать серьезные болезни почек у свиней и птиц.
Токсин Т-2, вырабатываемый видами Fusarium, может вызывать некроз пищеварительного тракта у животных.
1
2
2
2
4
2
3
5
2
3
6
2
4
4
4
4
8
2
6
8
7
7
6
2
Обычно стремятся преодолеть эти недостатки путем использования органических кислот с короткой цепью в отдельности или в смеси, таких как муравьиная кислота (CHO), уксусная кислота (CHO), пропионовая кислота (CHO), молочная кислота (CHO), фумаровая кислота (CHO), масляная кислота (CHO), лимонная кислота (CHO) и бензойная кислота (CHO).
К числу ограничений при использовании указанных органических кислот относится их сильное коррозионное действие, которое может повредить любое оборудование, с которым контактируют кислоты. Соли кислот, образованные с аммонием, кальцием, натрием или калием, также оказывают коррозионное действие, которое является более умеренным, но все равно присутствует.
+
Существуют также определенные физиологические ограничения, связанные с действием органических кислот как таковых или в форме солей при использовании в качестве антибактериальных средств в пищевых рационах для животных; в этом отношении известно, что органическим кислотам необходимо кислое значение pH для осуществления реального антибактериального действия, так как при таких условиях они присутствуют в недиссоциированной RCOOH форме. Эта недиссоциированная RCOOH форма проходит через клеточные стенки микроорганизмов и, как только попадает внутрь, диссоциирует в соответствии с внутриклеточным значением pH. Для поддержания внутриклеточного значения pH микроорганизм выбрасывает Н; таким образом, уровень диссоциированной органической кислоты повышается, и поскольку кислота не выходит из микроорганизма, она убивает его.
Однако в кишечнике pH является слабоосновным (около 7), так что наличие органической кислоты в недиссоциированной форме очень ограничено, и, следовательно, антибактериальное действие также является очень ограниченным.
Поэтому в свете вышесказанного существует очевидная потребность в разработке новых композиций, способных препятствовать действию плесневых грибов и бактерий, присутствующих в кормах для животных, но не проявляющих вышеизложенные недостатки.
Метод микроинкапсулирования органических кислот с липидными веществами был разработан как способ доставки органической кислоты в кишечник и понижения в нем значения pH, но полученные результаты являются скорее неудовлетворительными по причине буферного действия бикарбоната натрия, вырабатываемого поджелудочной железой в качестве регулятора pH в кишечнике. В дополнение к тому что эта технология является не очень эффективной, при этом она очень дорогая.
Антибактериальное действие некоторых моноглицеридов жирных кислот было изучено в целом ряде исследований, например:
1. J.Kabara, Dennis M. Swieczkowski, Anthony J, Conley, Joseph P. Truant 1972 FATTY ACIDS AND DERIVATES AS ANTIMICROBIAL AGENTS.
2. G.Bergsson, J.Amfinnsson S.Karlsson, O.Steingrimsson, Н.Thormar 1998. IN VITRO INACTIVATION OF CHLAMYDIA TRACHOMATIS BY FATTY ACIDS AND MONOGLYCERIDES.
3. G.Bergsson, J.Amfinnsson, O.Steingrimsson, Н.Thormar 2001. IN VITRO KILLING OF CANDIDA ALBICANS BY FATTY ACIDS AND MONOGLYCERIDES.
4. Н.Thormar, Н.Hilmarsson, G. Bergsson 2005. STABLE CONCENTRATED EMULSIONS OF THE 1-MONOGLYCERIDE OF CAPRIC ACID (MONOCAPRIN) WITH MICROBICIDAL ACTIVITIES AGAINST THE FOOD-BORNE BACTERIA CAMPYLOBACTER JEJUNI, SALMONELLA SPP AND ESHERICHIA COLI;
PCTnS2005/000026 "STABLE CONCENTRATED ANTI-BACTERIAL EMULSIONS OF MONOCAPRIN IN WATER".
5. Hilmarsson, H.Thormar, J.H.Thrainsson, E.Gunnarsson 2006 EFFECT OF ГЛИЦЕРИН MONOCAPRATE (MONOCAPRIN) ON BROILER CHICKENS: AN ATTEMPT AT REDUCING INTESTINAL CAMPYLOBACTER INFECTION.
Эти работы представляют многообещающее, но не исчерпывающее направление исследований; насколько известно, не существует исследований, которые подтверждают специфичное антибактериальное и противоплесневое действие композиций моноглицеридов жирных кислот с короткой цепью в сочетании с глицерином.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 - это водная суспензия композиции изобретения, показанная под электронным микроскопом.
Фигура 2 показывает необработанный корм, зараженный Fusarium. Фигура 3 показывает корм, зараженный Fusarium и обработанный 0,7% монопропионином 43.
Сущность изобретения
1
7
Настоящее изобретение имеет отношение к композициям, содержащим моноглицериды жирных кислот C-С в процентном отношении от 10% до 90% и глицерин в процентном отношении от 10 до 90% по массе (вычисленному к общей массе композиции), которые добавляют к зерновым культурам, фуражу и к обычным кормам и питьевой воде, предназначенным для кормления животных, в качестве антибактериальных средств и средств против плесени.
Раскрытие изобретения
1
7
Неожиданно было обнаружено, что композиции, содержащие эфиры моноглицеридов и органических кислот C-C в сочетании с глицерином, обладают сильным антибактериальным действием и при кислом значении pH (4,5), и при нейтральном значении pH, которое имеется в кишечнике животных (т.е. pH 7).
Как установлено выше, в композициях изобретения эфиры моноглицеридов и органических кислот присутствуют в количествах от 10% до 90 масс.%, а глицерин от 10 до 90% масс.% (к общей массе композиции); предпочтительно указанные количества составляют между 40%-90% и 10%-60% соответственно.
1
7
Термин "органические кислоты C-C" согласно изобретению предпочтительно относится к следующим кислотам: муравьиной, уксусной, пропионовой, молочной, масляной, лимонной, фумаровой и бензойной кислотам.
Масляная и пропионовая кислота являются особенно предпочтительными.
Примерами композиций в соответствии с изобретением являются композиции, состоящие из:
(a)
эфира моноглицерида и масляной кислоты
42-47%
эфира диглицерида и масляной кислоты
5-8%
эфира триглицерида и масляной кислоты
0,5-2%
глицерина
45-50%,
(b)
эфира моноглицерида и пропионовой кислоты
45-50%
эфира диглицерида и пропионовой кислоты
8-12%
эфира триглицерида и пропионовой кислоты
1-3%
глицерина
36-40%,
Конкретными примерами композиций в соответствии с изобретением являются композиции, состоящие из:
(c)
эфира моноглицерида и масляной кислоты
45%
эфира диглицерида и масляной кислоты
6%
эфира триглицерида и масляной кислоты
1%
глицерина
48%,
(d)
моноглицерида масляной кислоты
43%
диглицерида масляной кислоты
6%
триглицерида масляной кислоты
1%
глицерина
50%,
(e)
эфира моноглицерида и пропионовой кислоты
49%
эфира диглицерида и пропионовой кислоты
10%
эфира триглицерида и пропионовой кислоты
2%
глицерина
39%,
(f)
моноглицерида пропионовой кислоты
43%
диглицерида пропионовой кислоты
6%
триглицерида пропионовой кислоты
1%
глицерина
50%.
Оценка антибактериальной активности органических кислот в отдельности по сравнению с композициями изобретения представлена в Таблице 1 ниже.
Таблица 1
Продукт
Использованные концентрации
pH
E.coli (кое/мл)
Salmonella typhimurium (кое/мл)
Campylobacter jejuni (кое/мл)
Положит. контроль
7
108×105
120×105
431×105
Положит. контроль
4.5
84×105
96×105
201×105
Пропионовая кислота
1:909
7
54×104
11×104
33×103
Пропионовая кислота
1:909
4.5
13×104
42×103
14×101
Масляная кислота
1:1000
7
106×104
65×104
18×103
Масляная кислота
1:1000
4.5
78×104
25×103
2×101
Монопропионин 43
1:109
7
110×104
12×103
79×105
Монобутирин 43
1:100
7
75×104
35×103
48×104
Монобутирин 43
1:100
4.5
47×104
8×102
87×103
Примечание: монопропионин 43 состоит из:
43% моноглицерида пропионовой кислоты
6% диглицерида пропионовой кислоты
1% триглицерида пропионовой кислоты
50% глицерина
Примечание: монобутирин 43 состоит из:
43% моноглицерида масляной кислоты
6% диглицерида масляной кислоты
1% триглицерида масляной кислоты
50% глицерина
Таблица 2 сравнивает антибактериальное действие in vitro чистой масляной кислоты, моноглицерида масляной кислоты без свободного глицерина и смеси моноглицерида масляной кислоты со свободным глицерином против Clostridium perfringens. В то время как смесь моноглицерида масляной кислоты и глицерина уже проявила ингибирующую активность (т.е. отсутствие роста) во всех трех повторах при концентрации 1000 ppm, моноглицерид масляной кислоты не показал какой-либо ингибирующей активности против бактерий, а масляная кислота продемонстрировала ингибирующую активность, только начиная с концентрации от 3000 ppm.
Таблица 2
Бактерии: Clostridium perfringens CP27
Концентрация инокуляции: 10<sup>5</sup>
Среда: сердечно-мозговая вытяжка
Время инкубации и появление роста; + в течение 24 час, ++ в течение 37 час и +++ в течение 96 час - 3 повтора для каждой концентрации
Отрицат. контроль
Полож. контроль +
ppm 500
Масляная кислота +
Монобутирин 43 +
Моноглицерид масляной кислоты +
+
+
+
+
++
+
+
+
среднее
1000
+
нет роста
+
+
нет роста
+
+
нет роста
+
среднее
1500
+
нет роста
+
+
нет роста
+
+
нет роста
+
среднее
2000
++
нет роста
+
++
нет роста
+
++
нет роста
+
среднее
2500
++
нет роста
+
++
нет роста
+
++
нет роста
+
среднее
3000
нет роста
нет роста
+
нет роста
нет роста
+
нет роста
нет роста
+
среднее
4000
нет роста
нет роста
+
нет роста
нет роста
+
нет роста
нет роста
+
среднее
Таблица 3 сравнивает антибактериальное действие in vitro чистой уксусной кислоты, моноглицерида уксусной кислоты без свободного глицерина и смеси моноглицерида уксусной кислоты со свободным глицерином против Salmonella typhimurium свиней. В то время как смесь моноглицерида уксусной кислоты и глицерина (моноацетин 42) проявляет ингибирующую активность (т.е. отсутствие роста) во всех трех повторах при концентрации 10000 ppm, моноглицерид уксусной кислоты проявляет ингибирующую активность против бактерий, начиная от концентрации 25000 ppm, a уксусная кислота проявляет ингибирующую активность, начиная от концентрации 20000 ppm.
Таблица 3
Бактерии: Salmonella typhimurium свиней
Концентрация инокуляции: 10<sup>5</sup>
Среда: сердечно-мозговая вытяжка
Время инкубации и появление роста: + в течение 24 час, ++ в течение 37 час и +++ в течение 96 час - 3 повтора для каждой концентрации
pH 6
Отрицат.контроль
Положит.контроль (PC)
ppm
Уксусная кислота
Моноацетин 42
Моноглицерид уксусной кислоты
+
5000
+
+
+
+
+
+
+
++
+
+
+
среднее
10000
+
нет роста
+
+
нет роста
+
+
нет роста
+
среднее
15000
+
нет роста
+
+
нет роста
+
+
нет роста
+
среднее
20000
нет роста
нет роста
+
нет роста
нет роста
+
нет роста
нет роста
+
среднее
25000
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
среднее
30000
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
среднее
40000
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
среднее
Примечание: моноацетин 42 состоит из:
42% моноглицерида пропионовой кислоты
7% диглицерида уксусной кислоты
1% триглицерида уксусной кислоты
50% глицерина
Таблица 4 сравнивает антибактериальное действие in vitro чистой муравьиной кислоты, моноглицерида муравьиной кислоты без свободного глицерина и смеси моноглицерида муравьиной кислоты со свободным глицерином против Salmonella typhimurium свиней. В то время как смесь моноглицерида муравьиной кислоты и глицерина (моноформин 42) проявляет ингибирующую активность (т.е. отсутствие роста) во всех трех повторах при концентрации 5000 ppm, моноглицерид муравьиной кислоты проявляет ингибирующую активность против бактерии, начиная от концентрации 25000 ppm, а муравьиная кислота проявляет ингибирующую активность от 15000 ppm.
Таблица 4
Бактерии: Salmonella typhimurium свиней
Концентрация инокуляции: 10<sup>5</sup>
Среда: сердечно-мозговая вытяжка
Время инкубации и появление роста: + в течение 24 час, ++ в течение 37 час и +++ в течение 96 час - 3 повтора для каждой концентрации
pH 6
Отрицат.контроль
Полож. контроль
ppm
Муравьиная кислота
Моноформин 42
Моноглицерид муравьиной кислоты
+
5000
+
нет роста
+
+
+
нет роста
+
++
+
нет роста
+
среднее
10000
+
нет роста
+
+
нет роста
+
+
нет роста
+
среднее
15000
нет роста
нет роста
+
нет роста
нет роста
+
нет роста
нет роста
+
среднее
20000
нет роста
нет роста
+
нет роста
нет роста
+
нет роста
нет роста
+
среднее
25000
нет роста
нет роста
нет роста
Отрицат.контроль
Полож. контроль
ppm
Муравьиная кислота
Моноформин 42
Моноглицерид муравьиной кислоты
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
среднее
30000
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
среднее
40000
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
среднее
Примечание: моноформин 42 состоит из:
42% моноглицерида муравьиной кислоты
7% диглицерида муравьиной кислоты
1% триглицерида муравьиной кислоты
50% глицерина
Таблица 5 сравнивает антибактериальное действие in vitro чистой фумаровой кислоты, моноглицерида фумаровой кислоты без свободного глицерина и смеси моноглицерида фумаровой кислоты со свободным глицерином (монофумарин 41) против Е. coli. Тогда как смесь моноглицерида фумаровой кислоты и глицерина проявляет ингибирующую активность (т.е. отсутствие роста) во всех трех повторах при концентрации 20000 ppm, моноглицерид фумаровой кислоты проявляет ингибирующую активность в отношении бактерий, начиная от концентрации 60000 ppm, а фумаровая кислота проявляет ингибирующее действие от 90000 ppm.
Таблица 5
Бактерии: Е. coli
Концентрация инокуляции: 10<sup>5</sup>
Среда: сердечно-мозговая вытяжка
Время инкубации и появление роста: + в течение 24 час, ++ в течение 37 час и +++ в течение 96 час - 3 повтора для каждой концентрации
pH 5
Отрицат.контроль
Полож. контроль (PC)
ppm
Фумаровая кислота
Монофумарин 41
Моноглицерид фумаровой кислоты
+
10000
+
+
+
+
+
+
+
++
+
+
+
среднее
20000
+
нет роста
+
+
нет роста
+
+
нет роста
+
среднее
40000
+
нет роста
+
+
нет роста
+
+
нет роста
+
среднее
60000
++
нет роста
нет роста
++
нет роста
нет роста
++
нет роста
нет роста
среднее
80000
++
нет роста
нет роста
++
нет роста
нет роста
++
нет роста
нет роста
среднее
90000
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
среднее
100000
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
нет роста
среднее
Примечание: монофумарин 41 состоит из:
41% моноглицерида фумаровой кислоты
8% диглицерида фумаровой кислоты
1% триглицерида фумаровой кислоты
50% глицерина
По желанию композиции изобретения также могут содержать действующие компоненты эфирных масел (коричный альдегид, тимол, карвакрол) в процентных отношениях от 1 до 20 масс.% (относительно массы смеси других компонентов), как обычно предусматривается в отношении продуктов, предназначенных для кормления животных, когда эти действующие компоненты являются растворимыми в липидах, но нерастворимыми в глицерине.
Следует отметить, что когда композиции изобретения диспергируются в воде, глицерин окружает моноглицерид с образованием капель, которые включают указанный моноглицерид, при этом капли остаются суспендированными в воде (другие необязательно добавленные действующие компоненты растворяются в моноглицериде и также становятся включенными в капли глицерина) (см. Фиг.1).
Композиции изобретения можно получить в соответствии с обычными способами этерификации жирных кислот, достаточно описанными в литературе, но используя большой избыток глицерина (ни в коем случае не меньше чем 200% по весу относительно веса использованных жирных кислот) для того, чтобы получить большое количество моноглицеридов вместе с большим количеством свободного глицерина.
Композиции изобретения можно добавить к кормам для животных и/или питьевой воде в количествах от 0,1 до 1,5%, предпочтительно от 0,3 до 0,6 масс.% относительно массы корма или питья.
В частности, композиции изобретения предназначаются для рациона свиней, кур, рыбы, крупного рогатого скота, овец и домашних животных.
Пример 1
Реакцию этерификации проводили в отдельных порциях по 10000 кг.
3000 кг масляной кислоты и 7000 кг глицерина поместили в реактор при комнатной температуре.
Температуру увеличивают до 140°С, так что масляная кислота выпаривается, возвращаясь в реактор с помощью обратного холодильника.
Дальнейшее повышение температуры от 140 до 170°С должно происходить очень медленно (примерно в течение 4 часов), а температура обратного холодильника должна поддерживаться на уровне 120°С для выпаривания воды, полученной при реакции этерификации, в то время как масляная кислота продолжает повторять цикл (рециркулировать) в реакторе.
В этой точке температура может быть поднята до 180°С (однако температура обратного холодильника остается 120°С), при этом ожидается, что как только эта температура достигнута, кислотность смеси достигает значения меньше чем 1%.
Затем применяется вакуум, чтобы отогнать непрореагировавшую масляную кислоту, пока не достигается окончательная кислотность меньше чем 0,2%.
Смесь выпускают через холодильник, чтобы довести ее до комнатной температуры.
Полученная таким образом смесь содержит 43% эфира моноглицерида, 6% эфира диглицерида, 1% эфира триглицерида и 50% глицерина.
Как только реакция этерификации заканчивается, глицерин, при желании, может быть отделен дистилляцией от полученных таким образом эфиров моно- ди- и триглицеридов, чтобы достигнуть 90% концентрации моноглицеридов.
Пример 2
7
Шестьдесят поросят DanBred 5-недельного возраста разделили на две группы по тридцать поросят в каждой: А) контроль и В) лечебная группа, которые подразделили на 6 загонов по десять животных в каждом. После первых 10 дней адаптации в огороженных местах всем животным перорально ввели (инокулировали) Salmonella typhimurium, выделенный в институте Форли Istituto Zooprofilattico (Италия) из фекальных образцов инфицированных свиней, в дозе 7×10 кое.
На следующий день у некоторых субъектов из каждого загона наблюдалась диарея. В течение следующих трех дней после заражения симптомы ухудшились и затронули всех субъектов.
На третий день после инфекции собирали образцы фекалий; при определении количества бактерий было обнаружено, что оно равно 165000 КОЕ в контрольной группе A) и 160000 КОЕ в лечебной группе В). Начиная с третьего дня после заражения, группу B) лечили смесью, состоящей из:
- моноглицерида масляной кислоты =45%
- диглицерида масляной кислоты =6%
- триглицерида масляной кислоты =1%
- глицерина =48%
смесь вводили в питьевой воде в дозировке 0,5% в течение трех дней. На третий день после начала лечения вновь собирали образцы фекалий для определения количества бактерий. В контрольной группе А) среднее число КОЕ составило 160000, тогда как в лечебной группе В) число кое было 900. Применение смеси "эфиров масляной кислоты и глицерина" в установленных процентных соотношениях снижало КОЕ сальмонеллы до 3 log 10 за 3 дня введения. Этот факт подтверждает бактерицидную эффективность смеси.
Пример 3
Настоящие испытания «в полевых условиях» проводили на итальянской ферме, где наблюдались такие проблемы с гигиеной, как явно выраженный илеит, обусловленный инфекцией Lawsonia intracellularis, энтерит, связанный с Brachyspira Spp, и некротический энтерит, связанный с инфекцией Treponema hyoaysenteriae. 1027 свиней DanBred весом около 25 кг (в возрасте 71 день) разделили на две группы: контрольную группу А) и лечебную группу В), состоявшие из 511 и 516 животных соответственно.
Обе группы кормили одинаковым кормом за исключением следующих компонентов: в корм контрольной группы добавляли линкомицин (200 ppm) и доксициклин (250 ppm) в течение первых 14 дней испытаний, и только линкомицин в течение остального времени. Лечебная группа В не получала антибиотиков с пищей, при этом в корм добавляли смесь "эфиров масляной кислоты и глицерина", составленную, как указано ниже:
- моноглицерид масляной кислоты =45%
- диглицерид масляной кислоты =6%
- триглицерид масляной кислоты =1%
- глицерин =48%
смесь вводили с кормом в количестве 0,5%, заменив 0,5% масла сои. Испытания длились 63 дня. Результаты, показывающие рост и эффективность кормления, суммированы в таблице ниже.
Таблица
Группа А) - Контроль
Группа В) - Эфиры масляной кислоты и глицерина
Дельта
Количество животных
511
516
Возраст в начале испытаний (дни)
71
71
Возраст в конце испытаний (дни)
134
134
Средний вес в начале испытаний (кг)
25
25
Средний вес в конце испытаний (кг)
62.13
63.61
Кол-во умерших животных
5
2
-3
Кол-во исключенных животных
3
2
-1
Среднее увеличение веса в день (кг)
0.59
0.61
+0.02
Общее кол-во потребленной пищи (кг)
53.570
53.250
-320
Выработка мяса в кг
19.340
20.200
+860
Индекс трансформации корма
2.76
2.64
-0.12
Анализ фекалий контрольной группы А) показал присутствие Lawsonia, тогда как в лечебной группе В) бактерия не была обнаружена. Также в лечебной группе В) наблюдалось значительное уменьшение случаев диареи. Параметры роста, индекс трансформации корма лечебной группы В) были сравнимы, а в тенденции лучше, чем показатели контрольной группы А), в рационе которой содержались вышеперечисленные антибиотики. Применение смеси "эфиров масляной кислоты и глицерина" дало возможность контролировать вышеуказанные болезни без использования антибиотиков. В испытании было продемонстрировано антибактериальное действие смеси "эфиров масляной кислоты и глицерина" с последующим улучшением состояния кишечника.
Пример 4
Исследование эффективности по отношению к Salmonella typhimurium на цыплятах
Штамм Salmonella
Для исследования использовали штамм Salmonella typhimurium, выделенный и установленный отделением IZSLER института Форли.
Животные
Использовали цыплят SPF (свободных от специфической патогенной флоры), 30 птиц на тест. Цыплята были выведены в отделении IZSLER института Форли. Цыплят незамедлительно помещали в изолированные клетки.
Диета
Животные получали водопроводную воду и неограниченное кормление при помощи коммерческого устройства. В корм дополнительно добавляли монобутирин 43.
Протокол эксперимента
Подготовили 4 группы по 30 птиц. Диеты различались разным количеством монобутирина 43, который добавляли к корму с первого дня жизни, и представляли собой следующее: нелеченная контрольная группа - 0%, группа 1 - 1% монобутирина в корме, группа 2 - 0,3% монобутирина в корме. Группа 3 получала тот же самый корм, как и контрольная группа до 14-го дня жизни, т.е. до 7 дня после заражения, и только после этого дня получала корм с добавлением 1,4% монобутирина 43.
7
В 7-дневном возрасте всех цыплят заражали через пищевод Salmonella typhimurium, 10 КОЕ. Через 24 часа после заражения у каждой птицы были взяты клоакальные мазки для подтверждения заражения Salmonella typhimurium. На 14, 24 и 35 дни жизни забивали 10 птиц в каждой группе. От каждого животного собирали цекальные массы и определяли «нагрузку» Salmonella typhimurium (выраженную в КОЕ/г).
Лабораторные испытания
Отсутствие антител против S. typhimurium было подтверждено с помощью анализа ELISA. Клоакальные мазки непосредственно высевали на гектоеновый энтеро-агар и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Один грамм содержимого кишечника разводили в 9 мл лактата Рингера и высевали на гектоеновый энтеро-агар (объем инокулума 0,1 мл). Колонии подсчитывали после инкубации в течение 24 часов при 37°С. Вычисляли среднее геометрическое бактериальной «нагрузки» 10 забитых субъектов для каждой серии образцов.
Было обнаружено, что после дня жизни все субъекты были серонегативными по отношению к Salmonella typhimurium. Через 24 часа после заражения было обнаружено, что все клоакальные мазки были положительными по S. typhimurium. Результаты по определению цекальной бактериальной «нагрузки» показаны в следующей таблице.
Таблица
КОЕ в слепой кишке цыплят, зараженных Salmonella Typhimurium - 10<sup>7</sup>
Контроль
Группа 1 (1% в корме)
Группа 2 (0,3% в корме)
Группа 3 (1,4% в корме с 14<sup>го</sup> дня жизни)
День заражения (7<sup>ой</sup> день жизни)
0
0
0
0
7<sup>ой</sup> день после заражения
6,400,000
770,000
2,226,000
6,302,000 начало обработки
17<sup>ой</sup> день после заражения
25,120,000
213,220
1,242,000
171,120
28<sup>ой</sup> день после заражения
(высокая смертность)
>100
300
1,000
Пример 5
Тесты на чувствительность мицелиальиых грибов (плесеней) in vitro
Материалы и методы
Для исследования использовали штаммы Aspergillus spp, Penicillium spp и Fusarium spp, выделенные и установленные во время диагностирования в отделении IZSLER института Форли из сбалансированных кормов, используемых в птицеводстве. Для приготовления инокулума собирали мицелий чистых культур исследуемых штаммов с помощью мазков. Собранный таким образом материал растворяли в культуральном бульоне (BHI - сердечно-мозговая вытяжка). В пробирку помещали 5 мл суспензии грибов и равное количество испытываемого продукта. Пробирку инкубировали при 20±4°С в течение 24 часов.
После этого периода времени суспензию грибов высевали и подсчитывали. Контрольную суспензию получали, поместив в пробирку 5 мл суспензии грибов+5 мл разбавителя (лактат Рингера). Обработку тестов проводили после 5-дневного периода инкубации при 20±4°С.
Результаты, приведенные в следующей таблице, выражены в кое/мл.
Таблица
Продукт
ASPERGILLUS spp.
PENICILLIUM spp.
FUSARIUM spp:
Контроль
450000
97000
310000
Монопропионин 43
20000
1500
90000
Монобутирин 43
1000
700
3000
Пропионовая кислота
300
<100
300
Пропионат аммония
1000
100
500
Примечание: Монопропионин 43 состоит из:
43% моноглицерида пропионовой кислоты
12% диглицерида пропионовой кислоты
1% триглицерида пропионовой кислоты
28% свободного глицерина
16% H<sub>2</sub>O
Примечание: Монобутирин 43 состоит из:
43% моноглицерида масляной кислоты
6% диглицерида масляной кислоты
1% триглицерида масляной кислоты
50% глицерина
Пример 6
Проверка эффективности по отношению к Penicilium spp и Fusarium spp in vitro
Материалы и методы
Штаммы: для теста использовали штаммы плесневых грибов, выделенные и установленные отделением IZSLER института Форли. Штаммы восстанавливали в бульоне ВШ, затем подсчитывали в агаре OGYE (после инкубации при 20°С в течение 5 дней).
Субстрат: использовали сбалансированный куриный корм, стерилизованный в сушильном шкафу при 100°С в течение 4 часов.
Проверка эффективности: 10 г корма инокулировали 2 мл суспензии грибов (в дистиллированной воде), куда добавили 70 мкл исследуемого продукта. Полученную таким образом смесь держали при комнатной температуре. Также были приготовлены положительный контроль (инфицированный и необработанный) и отрицательный контроль (только корм + дистиллированная вода).
Через 7 и 14 дней после заражения были оценены концентрации грибов в обработанных и контрольных образцах.
Результаты представлены в таблице ниже.
Таблица
Продукт
Концентрация Fusarium spp. На день 0 (кое/г)
Концентрация Fusarium spp. 7 дней после заражения (кое/г)
Концентрация Fusarium spp. 14 дней после заражения (кое/г)
Концентрация Penicillium spp. На день 0 (кое/г)
Концентрация Penicillium spp. 7 дней после заражения (кое/г)
Концентрация Penicillium spp. 14 дней после заражения (кое/г)
Полож. контр.
5,700,000
72,000,000
300,000,000
100,000
30,000,000
200,000,000
Отриц. контр.
<100
<100
<100
<100
<100
<100
Монопропионин 43
5,700,000
410,000
250,000
100,000
<100
<100
Примечание: Монопропионин 43 состоит из:
43% моноглицерида пропионовой кислоты
12% диглицерида пропионовой кислоты
1% триглицерида пропионовой кислоты
28% свободного глицерина
16% H<sub>2</sub>O