СИНЕРГИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ РАКА
SYNERGETIC CANCER TREATMENT

Перекрестные ссылки на родственные заявки
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 62/617095 поданной 12 января 2018, предварительной заявки на патент США 62/674483, поданной 21 мая 2018, предварительной заявки на патент США 62/711421, поданной 27 июля 2018, предварительной заявки на патент США 62/716788, поданной 9 августа 2018, предварительной заявки на патент США 62/716796, поданной 9 августа 2018, предварительной заявки на патент США 62/700147, поданной 18 июля 2018, и предварительной заявки на патент США 62/711423, поданной 27 июля 2018, содержание которых во всей полноте включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Область техники
[0002] Настоящее изобретение относится к применению ингибиторов топоизомеразы I, связанных с макромолекулой через связь, которая подвергается бета-элиминированию, для лечения рака. Более конкретно, оно касается лечения ингибитором топоизомеразы I субъектов, имеющих рак, когда фармакокинетика контролируется надлежащим образом, причем указанные субъекты имеют генетический дефект в ответ на повреждение ДНК (DDR), и/или указанное лечение включает введение ингибитора топоизомеразы I в комбинации с ингибитором DDR или в комбинации с ингибитором контрольной точки клеточного цикла. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает применение синтетических летальных взаимодействий в раковых клетках, где дефект в гене, необходимом для DDR, заставляет второй ген становиться существенным для выживания клетки.
Предпосылки создания изобретения
[0003] Ингибиторы топоизомеразы I хорошо известны для лечения различных видов рака, так как они являются ингибиторами основной стадии лигирования, катализируемой топоизомеразой I, для устранения повреждения одноцепочечной ДНК, которое происходит вследствие ослабления напряжения, вызванного сверхспирализацией при репликации ДНК. (Для репликации ДНК требуется топоизомераза I.) Ингибиторы топоизомеразы I включают камптотецин и его аналоги. Многие из этих соединений одобрены и используются в химиотерапии при лечении самых разных видов рака.
Oncol. Gene
Targ Oncol
Cancer
Cancer Biol. and Ther
Cancer Res
Breast Cancer Res Treat
Biol Pharm Bull
J. Exp. Clin. Cancer Res.
[0004] Было обнаружено, что в раковых клетках с определенными генетическими дефектами введение ингибитора топоизомеразы I имеет повышенную эффективность по сравнению с раковыми клетками без таких дефектов. Например, один ингибитор топоизомеразы, SN-38, вводили в виде конъюгата с полиэтиленгликолем BRCA1-дефицитным мышам с опухолями молочной железы, и не только эффективной является комбинация BRCA1-дефицита с ингибированием топоизомеразы посредствам SN-38, но он также преодолевает ABCG2-опосредованную резистентность. См., например, Zander, S.A.L. et al., PLOS One (2012) 7:e45248. Кроме того, различные ингибиторы топоизомеразы вводили в комбинации с дополнительными противораковыми средствами, которые являются ингибиторами DDR и/или ингибиторами контрольной точки клеточного цикла. См., например, Abal, M. et al.,  (2004) 23:1737-1744, Wainberg, Z.A. et al., . (2017) 12:775-785; Verschraegen, C.F. et al.,  (2013) 5:418-429; и Gray, J. et al., . (2012) 13:614-622; Josse, R e.al,  (2014) 74:6968-6978; Ma, C.X., et al,  (2013) 137:483-492. Исследования in vitro также показали, что ингибируя экспрессию белка, важного для репликации и репарации ДНК, геликаза синдрома Вернера (WRN) усиливает действие иринотекана на раковые клетки. См. Futami, K., et al., (2007) 30:1958-1961. Комбинация ингибиторов клеточных контрольных точек с различными повреждающими ДНК лекарственными средствами также была испытана в клинических исследованиях (См., Visconti, R. et al.,  (2016) 35:153).
Cell Reports
[0005] Кроме того, имеется обширная информация, касающаяся дефицитов ответа на повреждение ДНК для различных генов и геномных локализаций (см. Knijnenburg, T.A. et al.,  (2018) 23:239-254.
Bioconjugate Chem
Cancer Res
J. Med. Chem
[0006] О связывании ингибиторов топоизомеразы I, включая SN-38, с макромолекулами сообщалось в Zhao, H. et al., . (2008) 19:849-859 и Koizumi, F. et al., . (2006) 66:10048-10056. Конкретный набор конъюгатов, полезных в изобретении, раскрыт в Santi, D.V. et al., . (2014) 57:2303-2314. Также известен дополнительный конъюгат, обычно обозначаемый как NKTR-102, который представляет собой пегилированный иринотекан.
[0007] Настоящее изобретение обеспечивает улучшенные способы лечения ингибиторами топоизомеразы I у субъектов с опухолями, причем в этих способах эффективно используют либо врожденный дефект DDR у субъекта, связанный с генеративной мутацией или другой дисфункцией, в раковых клетках субъекта, либо комбинированное лечение дополнительными средствами, которое приводит к синтетической летальности.
Раскрытие настоящего изобретения
[0008] Как видно из приведенной выше литературы, известно, что топоизомераза I необходима для репликации ДНК, что важно для роста клеток и для репликации. Ингибиторы топоизомеразы I, такие как иринотекан и его активный метаболит SN-38, используются для лечения рака путем ингибирования успешной репликации ДНК.
[0009] Также есть сообщения о попытках комбинирования ингибиторов топоизомеразы I либо с ингибитором контрольной точки клеточного цикла (который нейтрализует механизм, посредством которого клетки определяют, что репликация успешно выполнена или нет), либо с дополнительным ингибитором ответа на повреждение ДНК (DDR). Известно также введение ингибиторов топоизомеразы I при раке, который уже характеризуется как дефицитный по DDR.
[0010] Некоторые такие попытки включали ингибиторы топоизомеразы I, связанные с солюбилизирующим агентом, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Однако фармакокинетика ингибиторов, предлагаемых до настоящего времени, не подходит для получения успешного результата, и также является проблематичной токсичность этих ингибиторов.
[0011] Протоколы по настоящему изобретению наиболее важно осуществлять на людях, хотя изобретение также применимо к другим субъектам-млекопитающим, включая лабораторные модели для исследования лечения заболеваний. Протоколы также полезны для домашнего скота и домашних животных.
[0012] В настоящее время было обнаружено, что обеспечивая ингибитор топоизомеразы I со связью с макромолекулой, которая расщепляется посредством бета-элиминирования, фармакокинетику можно регулировать для обеспечения более эффективных и переносимых лечений для субъекта, имеющего дефект в DDR, или в комбинации с ингибиторами пути контрольной точки клеточного цикла и/или с ингибитором DDR. Конъюгаты по настоящему изобретению также можно вводить в дозах, которые снижают синергетическую токсичность ингибиторов топоизомеразы I с такими дополнительными средствами.
[0013] Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение направлено на способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в таком лечении, при этом указанный субъект идентифицирован как имеющий один или несколько дефектов в ответе на повреждение ДНК (DDR). Способ включает введение субъекту эффективного количества ингибитора топоизомеразы I, связанного с макромолекулой через линкер, который обеспечивает отщепление через механизм бета-элиминирования.
[0014] Во втором аспекте настоящее изобретение направлено на способ лечения рака у субъекта, который включает введение субъекту эффективного количества ингибитора топоизомеразы I, связанного с макромолекулой через линкер, который обеспечивает отщепление через механизм бета-элиминирования, в комбинации с эффективным количеством дополнительного ингибитора DDR.
[0015] В третьем аспекте настоящее изобретение направлено на способ лечения рака у субъекта, который включает введение эффективного количества ингибитора топоизомеразы I, связанного с макромолекулой через линкер, который обеспечивает отщепление через механизм бета-элиминирования, в комбинации с эффективным количеством ингибитора пути контрольной точки клеточного цикла.
[0016] В первом аспекте настоящего изобретения способ также может включать процедуру диагностики субъекта на наличие дефекта; и в вариантах осуществления, где вводят более одного средства (включая конъюгаты по изобретению), совместное введение более чем одного средства может быть одновременным или последовательным в любом порядке введения средств. Разница во времени введения совместно вводимых средств может составлять несколько дней. Средства также необязательно можно вводить в одной и той же композиции.
[0017] Комбинации вышеуказанных подходов также включены в настоящее изобретение; таким образом, субъекту, имеющему врожденный дефект в DDR, может быть предоставлен конъюгированный ингибитор топоизомеразы I, связанный с макромолекулой через линкер, который обеспечивает отщепление через механизм бета-элиминирования, в комбинации либо с дополнительным ингибитором DDR, либо ингибитором пути контрольной точки или обоими. Независимо от того, имеет ли субъект обнаруженный врожденный дефект в DDR, комбинация конъюгата ингибитора топоизомеразы I по изобретению с одним или обоими дополнительным ингибитором DDR и ингибитором контрольной точки клеточного цикла включена в объем изобретения. Кроме того, использование более одного ингибитора DDR и/или более одного ингибитора контрольной точки клеточного цикла в комбинации с конъюгатом ингибитора топоизомеразы I входит в объем настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей
[0018] Фиг. 1 схематично представляет подход по настоящему изобретению, где лечение только ингибитором топоизомеразы I может быть сведено на нет различными контрольными точками репарации или клеточного цикла, как на панели A. Когда субъект имеет врожденный дефект DDR, например, мутацию в гене BRCA, как на панели B, эффект ингибирования топоизомеразы I усиливается, и он дополнительно усиливается ингибитором репарации повреждений ДНК, таким как ингибитор PARP, как на панеле C (PARP представляет собой поли-АДФ рибоза-полимеразу).
[0019] Фиг. 2 показывает существующий уровень техники, что касается чувствительности к ингибиторам топоизомеразы I различных дефектов DDR, как в отношении DDR, связанного с различными генами как в зародышевой, так и не-зародышевой линии.
[0020] Фиг. 3A-3C показывают синергический эффект конъюгата SN-38 по настоящему изобретению с ингибитором PARP на рост опухоли и на бессобытийную выживаемость.
[0021] Фиг. 4A-4C показывают влияние дефицита BRCA 1 или BRCA 2 на эффективность конъюгата SN-38 при лечении опухолей у мышей.
Способы осуществления настоящего изобретения
[0022] Настоящее изобретение использует преимущества синергетических атак на ответ на повреждение ДНК, который может быть установлен в раковых клетках, чтобы повлиять на их успешную репликацию. Конъюгаты ингибитора топоизомеразы I, которые вызывают повреждение ДНК, можно комбинировать с ингибиторами DDR или другими ингибиторами, которые препятствуют репарации повреждений ДНК или репликации. DDR является чрезвычайно сложным процессом, включающим различные механизмы фиксации ДНК для исправления ошибок, которые происходят либо в результате мутации, либо в результате ошибок в самом процессе репликации. Частью этого ответа также является механизм контроля, включающий контрольные точки клеточного цикла, который гарантирует, что ДНК должным образом восстанавливается или реплицируется до того, как клетка делится, или, в качестве альтернативы, вызывает апоптоз, так что ошибочная ДНК не передается дочерним клеткам. В настоящем изобретении используется комбинация конкретного ингибитора DDR, ингибитора топоизомеразы I, с другими помехами для успешной репликации, включая другие ингибиторы DDR и ингибиторы путей контрольных точек клеточного цикла, включая случаи, когда сами раковые клетки дефектны по их способности отвечать на повреждение ДНК.
[0023] Настоящее изобретение использует конъюгат ингибитора топоизомеразы I, связанный с макромолекулой через линкер, который обеспечивает отщепление через механизм бета-элиминирования. Подходящими ингибиторами топоизомеразы I обычно являются камптотецин и аналоги, включая иринотекан, также известный как CPT-11, и его активный метаболит SN-38, а также топотекан, 9-аминокамптотецин и водорастворимые аналоги, такие как GI 147211 и GI 149893.
[0024] В некоторых вариантах осуществления макромолекула представляет собой линейный или разветвленный или многолучевой полиэтиленгликоль.
Особенно предпочтительным является конъюгат формулы (I)
(I)
где
ПЭГ представляет собой линейный или разветвленный и, когда q имеет значение 2-8, многолучевой, полиэтиленгликоль;
2
m
X представляет собой (CH), где m=1-6;
2
2
p
2
r
L представляет собой (CHCHO)(CH), где r=1-10 и p=0-10;
1
2
2
2
2
2
R представляет собой CN или SONR, где каждый R независимо представляет собой алкил, арил, гетероарил, алкилалкенил, алкиларил или алкилгетероарил, или два R, взятые вместе, могут образовывать кольцо;
3
3
3
4
4
4
2
2
Y представляет собой COR или SOR, где R=OH, алкокси или NR, где каждый R независимо представляет собой алкил, замещенный алкил, или два R, взятые вместе, могут образовывать кольцо; и
q имеет значение 1-8.
1
2
2
2
2
[0025] В частности, этот конъюгат может иметь ПЭГ со средней молекулярной массой 30000-50000 Да, и/или где q=4, и/или где R=CN или SONR, где каждый R представляет собой алкил.
[0026] Конъюгат может иметь формулу:
где m=1-6 и n имеет значение 200-250.
[0027] В частности, конъюгат может представлять собой PLX038, который имеет вышеуказанную формулу, где m имеет значение 1 и n примерно равен 225.
[0028] Конъюгаты, полезные в настоящем изобретении, обычно представлены в стандартных фармацевтических композициях в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, в некоторых случаях, когда уровень рН составляет от 4,0 до 6,0. Стандартные композиции можно найти, например, в Remington Pharmaceutical Sciences, Latest Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
[0029] Настоящее изобретение основано на благоприятных свойствах конъюгата, который имеет подходящую фармакокинетику для комбинации либо с эндогенными дефектами DDR, либо с совместно вводимыми соединениями, которые являются ингибиторами контрольной точки клеточного цикла или ингибиторами DDR.
[0030] В некоторых вариантах осуществления конъюгаты при введении субъектам обеспечивают непрерывное воздействие низкой дозы ингибитора топоизомеразы I, где концентрацию свободного ингибитора можно поддерживать между 15 и 5 нМ между однократным или двукратным еженедельным введением или на протяжении протокола введения, например, раз в две недели. В любом случае конъюгаты обеспечивают постоянное воздействие низких доз активного лекарственного средства.
[0031] Что касается идентичности совместно вводимых ингибиторов DDR и/или ингибиторов контрольной точки клеточного цикла, многие из них известны в данной области, как изложено, например, в обсуждении предшествующего уровня техники выше.
[0032] Контрольные точки клеточного цикла включают G1-S, S и G2/M. Любая из этих точек может быть таргетирована в комбинации с конъюгатом ингибитора топоизомеразы I и/или в комбинации с дополнительными средствами, которые таргетируют компоненты, необходимые для успешного перехода контрольной точки. Это также может происходить на фоне эндогенного дефекта в контроле контрольной точки клеточного цикла.
[0033] Подходящие мишени контрольных точек клеточного цикла включают киназу 1 или 2 контрольной точки (CHK1 или CHK2), мутантную при атаксии-телеангиэктазии киназу (ATM), атаксия-телеангиэктазия и Rad3-родственную киназу (ATR), киназу Wee1 и p53. Обширный перечень ингибиторов этих мишеней можно найти в WO2012/074754.
[0034] Подходящие ингибиторы DDR включают те, которые нацелены на гомологичную рекомбинацию (HR), например ингибиторы поли(АДФ-рибоза)полимеразы (PARP) и/или другие пути DDR, включая HEJ, HR, alt-NHEJ/MMEJ, SSA, ICL, SSB, BER, TLS, NER и MMR. В разработке находится большое количество средств для направленного действия на эти мишени, и в настоящее время в клинике используют ряд средств, о которых известно, что они работают таким образом.
[0035] Все цитируемые документы включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей их полноте.
[0036] Следующий пример предназначен для иллюстрации, но не для ограничения изобретения.
Пример 1
Синергический эффект PLX038A и ингибитора PARP Талазопариба (обозначен как BMN673 или TLZ)
Получение мышиных ксенотрансплантатов MX-1:
2
[0037] Клеточную линию MX-1 получали от Charles River Labs (Frederick, Maryland). Клетки культивировали в RPMI-1640, 10% FBS и 1% 2 мМ L-глютамина при 37°C в атмосфере 95% воздуха/5% CO.
Foxn1
nu
6
3
[0038] Самок голых мышей NCr (N CrTac:NCr-; возраст 6-7 недель) от Taconic Bioscience (Cambridge City, Indiana) содержали в UCSF Preclinical Therapeutics Core виварии (San Francisco, California). Все исследования на животных проводились в соответствии с рекомендациями институционального комитета по содержанию и использованию лабораторных животных UCSF. Опухолевые ксенотрансплантаты устанавливали путем подкожной инъекции опухолевых клеток MX-1 (2×10 клеток в 100 мкл бессывороточной среды, смешанной 1:1 с матригелем) в правый бок самок голых мышей NCr. Когда опухолевые ксенотрансплантаты достигали объема 1000-1500 мм у мышей-доноров, их резецировали, разрезали на фрагменты одинакового размера (размером 2,5 × 2,5 × 2,5 мм), погружали в матригель и повторно имплантировали путем подкожной имплантации с использованием троакара мышам-реципиентам.
Дозирование и измерение объема опухоли:
[0039] Растворы PLX038A (1,02 мМ SN38; 0,26 мМ конъюгата PLX038A) получали в изотоническом ацетате с pH 5 и стерильно фильтровали (0,2 мкм) перед использованием. Растворы BMN673 (52 мкМ) получали в смеси 10% диметилацетамида/5% Solutol HS15/85% 1X PBS и стерильно фильтровали (0,2 мкм) перед использованием.
3
2
3
[0040] Введение доз осуществляли в группах (N=4-5/группа), когда средний размер в группе достигал 100-200 мм. Мыши получали носитель, разовую дозу PLX038A (14,7 мл/кг и/п(интраперитонеально), 15 мкмоль/кг), ежедневные дозы BMN673 (7,72 мл/кг п/о(перорально), 0,4 мкмоль/кг) или комбинацию PLX038A и BMN673 в тех же дозах. Для групп, получавших комбинацию, ежедневное введение BMN673 начиналось в тот же день (Фиг. 3А) или после 4-дневной задержки (Фиг. 3В) после введения PLX038A. Объемы опухолей (измерение штангенциркулем: 0,5x(длина × ширина)) и массу тела измеряли два раза в неделю. Когда опухоли в контрольной группе введения носителя достигали размера 3000 мм, мышей обрабатывали комбинацией однократной дозы PLX038A (15 мкмоль/кг) и ежедневной комбинацией BMN673 (0,4 мкмоль/кг) без отсрочки между введениями доз (Фиг. 3A).
[0041] Как показано на Фиг. 3A и 3B, введение PLX038A мышам с опухолями MX-1 при 15 мкмоль/кг в комбинации с ежедневными дозами Талазопариба при 0,4 мкмоль/кг обеспечивает синергетический эффект по сравнению с любым из этих лекарственных средств в отдельности. Это достигалось независимо от того, начиналось ли ежедневное введение TLZ одновременно с PLX038A или 4 дня спустя. Одна комбинация, вводимая для контроля, немедленно уменьшала объем опухоли (Фиг. 3A).
[0042] Как показано на Фиг. 3C, бессобытийная выживаемость синергически повышалась с использованием комбинации по сравнению с PLX038A и TLZ в отдельности.
Пример 2
Синергизм PLX038A и дефекта опухолевых клеток
[0043] Клетки MX-1 являются BRCA 1-дефицитными, а клетки CAPAN-1 поставляются либо как BRCA 2-дефицитные (-/-), либо на дефицитные (+/+). Следовали общему протоколу Примера 1 с использованием мышей с опухолями этих клеточных линий. Мышам с опухолями MX-1 вводили разовые инъекции 137 мкг/кг иринотекана или 4, 40 или 120 мкг/кг PLX038A. Мыши с ксенотрансплантатами CAPAN-1 получали разовые и/п инъекции 137 мкг/кг иринотекана или 15, 40 или 120 мкг/кг PLX038A. Фиг. 4A-4C показывают результаты введения этих доз на объемы опухолей, которые измеряли два раза в неделю.
3
[0044] Как показано на Фиг. 4A, все дозы PLX038A были более эффективными для уменьшения объема опухоли, чем иринотекан, при этом 40 или 120 мкг/кг практически останавливали рост опухоли. Также показан впечатляющий результат однократной дозы 120 мкг/кг PLX038A, вводимой, когда контрольные опухоли достигали размера 2000 мм.
[0045] Сравнение Фиг. 4B и 4C показывает эффект дефицита BRCA 2 на эффективность лечения иринотеканом или PLX038A - только самая высокая доза PLX038A была сравнительно эффективной как для дефицитных, так и для недефицитных клеток. Эффективность всех других уровней доз увеличивалась в BRCA 2-дефицитных клетках.