ПОЛИМЕРЫ, СОДЕРЖАЩИЕ КОВАЛЕНТНО СВЯЗАННЫЕ АНТИБИОТИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА
POLYMERS, WHICH CONTAIN COVALENTLY CONNECTED ANTIBIOTIC PREPARATIONS

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение в целом относится к противомикробной композиции, содержащей полимеры, ковалентно связанные с антибиотическими средствами, и их применению для изготовления устройств медицинского назначения. Точнее, данное изобретение относится к противомикробной композиции, содержащей полисахариды, ковалентно связанные с антибиотическими средствами. Кроме того, данное изобретение относится к противомикробной композиции, содержащей окисленную регенерированную целлюлозу (ORC), ковалентно связанную с гентамицином, которая может применяться отдельно или в комбинации с устройствами медицинского назначения. Данное изобретение также относится к устройствам медицинского назначения, использующим полимеры, ковалентно связанные с антибиотическими средствами.
Уровень изобретения
Всякий раз, когда устройство медицинского назначения применяют в хирургической практике, создается риск инфекции. Риск инфекции драматически повышается для инвазивных или имплантируемых устройств медицинского назначения, таких как внутривенные катетеры, артериальные трансплантаты, интратекальные или интрацеребральные шунты и протезные устройства, которые создают входные ворота для патогенов во время близкого контакта с тканями и жидкостями организма. Происхождение инфекций на хирургическом участке часто связано с бактериями, которые поселяются на медицинском инструменте. Например, в течение хирургической операции бактерии из окружающей атмосферы могут поступать на участок хирургического воздействия и прикрепляться к медицинскому инструменту. Бактерии могут использовать имплантированное медицинское устройство в качестве пути поступления к окружающей ткани. Такие бактериальные колонии на устройстве медицинского назначения могут привести к инфекции и угрозе заболеваемости и смерти пациента.
S. aureus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Был разработан ряд методов снижения риска инфекции, связанной с инвазивными или имплантируемыми устройствами медицинского назначения на основе включения противомикробных средств в медицинские устройства. Такие устройства обеспечивают присутствие эффективных количеств противомикробного средства в период использования медицинского устройства. Например, устройства медицинского назначения могут содержать антибиотики, такие как β-лактамные антибиотики, полипептиды и хинолоны. Однако устройства медицинского назначения, содержащие антибиотик, могут терять эффективность в результате постепенного высвобождения антибиотика и затем образования сублетальной концентрации такого антибиотика. Данная сублетальная концентрация способствует росту бактерий, устойчивых к антибиотику. Например, хотя β-лактамные антибиотики, как известно, эффективны против , бактериальных видов, которые, как полагают, являются самой обычной причиной хирургических инфекций, данные антибиотики не эффективны против устойчивых к антибиотикам бактерий, таких как MRSA (, устойчивые к метициллину) и MRSE (, устойчивые к метициллину).
Одно потенциальное решение данной проблемы состоит в том, чтобы применять комбинацию антибиотиков и полимерного субстрата для иммобилизации антибиотиков. В частности, полезно, если полимерный субстрат связан ковалентно с антибиотическим средством.
Публикация US20050192547A 1 раскрыла подход к приготовлению противоинфекционных полимерсодержащих медицинских изделий обработкой медицинских изделий раствором смеси антибиотиков и антисептиков. Противомикробная активность была продемонстрирована с помощью экспериментов по зональному ингибированию (ZOI). С помощью комбинации различных антибиотиков и антисептиков может быть достигнуто ингибирование ряда бактерий. Однако раскрытый подход основан исключительно на физической абсорбции или осаждении агентов на медицинских изделиях. Очевидно, что предоставляемая активность является кратковременной из-за отсутствия ковалентной связи между устройством и антибиотиками. Также данный подход может представлять потенциальный риск отбора устойчивых к антибиотикам бактерий.
WO2005016972 A1 описывает противомикробные полимерные продукты, содержащие полимер, связанный с положительно заряженной группировкой через карбоксильную группу, и способы получения таких противомикробных соединений и их применения. Здесь высвобождение антибиотиков также не фиксируется из-за отсутствия ковалентного связывания.
Отсутствуют сообщения о применении комбинации полисахарида, ковалентно связанного с антибиотиками. Поэтому существует потребность в полисахаридах, содержащих ковалентно связанные антибиотики, которые проявляют постоянную и продолжительную противомикробную активность.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к противомикробной композиции, содержащей комплекс полисахарида, ковалентно связанного с, по меньшей мере, одним антибиотическим средством.
Точнее, данное здесь описание представляет собой противомикробную композицию, содержащую комплекс полисахарида, ковалентно связанного с, по меньшей мере, одним антибиотическим средством, в которой полисахарид является окисленной регенерированной целлюлозой и в которой антибиотическое средство является гентамицином.
Краткое описание фигур
Фигура 1. Структура гентамицина.
Фигура 2. Ковалентное присоединение гентамицина к ORC.
Фигура 3. Сравнение FT-IR необработанной ORC и ORC, обработанной гентамицином.
Фигура 4. Ковалентное присоединение ONAMER M к ORC.
Фигура 5. Сравнение FT-IR необработанной ORC и ORC, обработанной с помощью ONAMER M.
Подробное описание
Данное изобретение относится к противомикробной композиции, содержащей комплекс полисахарида, ковалентно связанного с, по меньшей мере, одним антибиотическим средством. В одном варианте осуществления противомикробная композиция содержит комплекс полисахарида, ковалентно связанного с, по меньшей мере, одним антибиотическим средством, в котором полисахарид представляет собой окисленную регенерированную целлюлозу (ORC). Комплекс обычно содержит от примерно 0,1% мас. до примерно 20% мас. антибиотического средства.
Изобретение относится к эффективному способу иммобилизации антибиотиков с целью предотвращения образования колоний микроорганизмов на медицинских устройствах. В случае ORC с ковалентно иммобилизованным гентамицином может быть приготовлен продукт с высокой бактерицидной активностью.
Термин “комплекс”, как он используется в настоящем описании, относится к тщательно перемешанной смеси на молекулярном уровне предпочтительно с ионным или ковалентным связыванием между антибиотическим средством и полисахаридом. Полисахарид предпочтительно представляет собой полисахарид, содержащий карбоксильные группы. Предпочтительные полисахариды выбраны из группы, состоящей из целлюлоз, содержащих карбоксильные группы, модифицированных крахмалов, окисленной регенерированной целлюлозы, хитозанов, гуаровых камедей, гликанов, галактанов, глюканов, ксантановых смол, альгиновых кислот, полиманнуроновых кислот, гиалуроновых кислот, полигликозуроновых и полигулуроновых кислот, маннанов, декстринов, циклодекстринов и их смесей, а также других синтетически карбоксилированных полисахаридов или карбоксилированных полисахаридов природного происхождения, которые могут быть линейными или разветвленными. Полисахариды могут представлять собой фуранозан или пиранозан, связанный с белками, липидами или другими молекулами, и могут включать полисахариды из водорослей, растительные, бактериальные и мукополисахариды, гликоген, пектин, гликопротеины и гликолипиды. Гиалуроновая кислота, геллан, ксантан, сукциногликан, пектин, окисленная регенерированная целлюлоза, хондроитинсульфат, гепарансульфат, дерматан представляют собой предпочтительные примеры карбоксилированных полисахаридов. Наиболее предпочительна окисленная регенерированная целлюлоза.
Окисленную целлюлозу получают окислением целлюлозы, например, тетраоксидом диазота. Данный процесс превращает первичные спиртовые группы на остатках сахарида в карбоксильные кислотные группы с образованием остатков уроновой кислоты внутри целлюлозной цепи. Предпочтительно, окисленную целлюлозу, окисленную регенерированную целлюлозу (ORC) получают окислением регенерированной целлюлозы, такой как rayon. В течение некоторого времени было известно, что ORC проявляет гемостатические свойства. ORC была доступна в качестве гемостатического продукта, называемого как SURGICEL (товарная марка фирмы Johnson and Johnson Medical, Inc.) с 1950. Данный продукт получают окислением материала из трикотажного rayon.
Согласно данному изобретению, антибиотик иммобилизуют ковалентным химическим связыванием на устройстве, чтобы обеспечить противомикробную активность определенным образом, как показано на фигуре 2.
Ковалентное присоединение антибиотиков осуществляют таким образом, что противомикробная активность данных средств сохраняется несмотря на наличие химической связи. Эффективность такого подхода продемонстрирована на примере ковалентного присоединения гентамицина к окисленной регенерированной целлюлозе (ORC). Была подтверждена противомикробная активность такой модифицированной ORC. Ковалентная иммобилизация антибиотиков предоставляет путь для снижения до минимума устойчивости бактерий против антибиотиков и более долгую остаточную активность по сравнению с их свободными формами.
ORC с ковалентно присоединенными антибиотиками, такими как гентамицин, проявила значительное повышение противомикробной активности против широкого спектра бактерий. Гентамицин ковалентно присоединяли к карбоновой кислоте в ORC посредством карбодиимидной реакции конденсации. Наблюдали, что противомикробное действие обработанной таким образом ORC является более эффективным и длительно сохраняется по сравнению с ORC, обработанной только раствором гентамицина без химической реакции.
Гентамицин был ковалентно присоединен к ORC посредством карбодиимидной реакции конденсации. Продукт был интенсивно промыт перед проведением тестов на противомикробную активность. Нагрузка гентамицина на ORC оценивалась как ~12%. Для обработанной ORC установили исчезновение функциональных групп карбоновой кислоты и наличие вновь образованных амидных функциональных групп с помощью FT-IR анализа.
in vitro
Вновь образованная, ковалентно иммобилизованная связанная структура ORC-гентамицин (ORC-GM-CVB) показывает значительную противомикробную эффективность . Как описано в примерах ниже, логарифмический анализ показал от 2 до 5 порядков снижения количества бактерий. Необработанная ORC не показала никакого снижения количества бактерий в тех же условиях.
В другом аспекте данное изобретение включает изделие, которое представляет собой медицинское устройство, содержащее противомикробные композиции, описанные в настоящем описании. В одном варианте осуществления противомикробная композиция может быть использована в форме изделия или части изделия, например, посредством выдавливания, прессования, литья или экструзии.
Противомикробная композиция может быть использована для изготовления устройства/приспособления медицинского назначения, включающего, но без ограничения только ими, волокно, петлю, порошок, микросферы, хлопья, тампон, пену, ткань, нетканый материал, тканую циновку, пленку, фиксирующее устройство для наложения швов, шовный материал, скобу, хирургические гвозди, зажимы, пластину и винт, устройство для доставки лекарственного средства, экран для предотвращения адгезии и тканевый клей.
Медицинское приспособление может быть составлено из одной или нескольких противомикробных композиций данного изобретения, по отдельности или в комбинации с другими полимерными компонентами.
Хотя нижеследующие примеры показывают некоторые варианты осуществления изобретения, они не должны восприниматься как ограничение области изобретения, а скорее как помощь, чтобы закончить описание изобретения.
Пример 1 (по изобретению). Получение соединения ORC-гентамицин (ORC-GM-CVB)
Материалы
Все материалы приобретены от Sigma-Aldrich и использовались как были получены, за исключением окисленного регенерированного целлюлозного (ORC) материала, который доступен от Ethicon, Inc., под торговой маркой Interceed. Гентамицин был закуплен в форме сульфата в Sigma-Aldrich как смеси аналогов, показанных на фигуре 1.
Процедура
Синтез представлен на фигуре 2.
2
ORC материал разрезали на 1'' узкие полоски массой 0,25 г. Вырезанную ORC узкую полоску сушили в вакууме при комнатной температуре в течение ночи. Высушенную ORC узкую полоску помещали в раствор гентамицина (5 мл) в 20 мл сосуде. Добавляли 0,080 г 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и реакционный сосуд герметизировали в атмосфере N. Реакционный сосуд оставляли на шейкере при комнатной температуре в течение ночи.
ORC материал вынимали из реакционной смеси, промывали обильной проточной деионизированной (DI) водой, погружали в 50 мл DI воды в течение 30 мин и 50 мл метанола в течение 30 мин на шейкере. Обработанный ORC материал сушили в вакууме в течение 2 ч. Получали 0,28 г обработанного ORC материала светло-желтого цвета. FT-IR использовали для сравнения обработанных и необработанных ORC образцов.
-1
-1
-1
-1
-1
На фигуре 3, FT-IR сигналы при 3383 см (протон карбоновой кислоты) и 1728 см (карбонил карбоновой кислоты) для необработанной ORC указывали на присутствие функциональных групп свободной карбоновой кислоты. После химической реакции ORC с гентамицином сигналы при 3383 см и 1728 см исчезали, тогда как новые сигналы появлялись при 1595 см, что является указанием на вновь образованную амидную связь между функциональной группой карбоновой кислоты в ORC и аминофункциональной группой гентамицина. Вышепредставленное наблюдение подтверждало успешное присоединение гентамицина к ORC.
Пример 2 (по изобретению)
Нижеследующее изучение проводили, чтобы показать, что ковалентно связанный гентамицин сохранял бактерицидную эффективность (таблица 1).
Для данного изучения использовали два образца следующим образом:
1) необработанный ORC материал;
2) ORC-GM-CVB: ORC материал c ковалентно связанным гентамицином, полученный согласно примеру 1.
in vitro
Для результата в таблице 1 тестируемые образцы оценивали по их эффективности  анализом по log снижения. Чтобы показать эффективность ковалентно связанного GM, тестируемые образцы экстрагировали физиологическим раствором для удаления свободного гентамицина перед применением. Тестируемые образцы представляли собой квадратики из примерно 4,0 мг/кусок и были проэкстрагированы в 40 мл/образец стерильного физиологического раствора при 37°С со встряхиванием (100 об/мин) в течение 1 часа два раза последовательно. Эффективность тестируемых образцов после экстракций оценивали анализом log снижения. В анализе по log снижения тестируемые образцы заражали с помощью 1-2 × 10е4 КОЕ(CFU) бактерий на поверхности тестируемых образцов в течение одного часа. Чтобы облегчить оценку эффективности на поверхности тестируемых образцов с ковалентно связанным гентамицином, инокулят доставляли в объеме 10 мкл/образец, малые объемы по отношению к тестируемым образцам допускали полную абсорбцию инокулята тестируемыми образцами, такую, что инокулят локализовался на поверхностях тестируемых образцов. Инокулят готовили в 20× буфере фосфата калия, который поддерживал рН тестируемых образцов близко к нейтральному. Противомикробная эффективность ORC при нейтральном рН будет минимальной, такой что log снижения должен указывать антибактериальную активность гентамицина, а не ORC. После заражения тестируемый образец погружали в физиологический раствор со встряхиванием, чтобы удалить выжившие бактерии, и выживших бактерий определяли подсчетом на чашках Петри. Подсчет на чашках Петри проводили в триптиказо-соевом агаре и инкубировали при 37°С в течение 24 часов.
in vitro,
Данные в таблице 1 показали, что ORC с ковалентно связанным гентамицином (ORC-GM-CVB) проявила хорошую эффективность  равную 2,8 log снижения после двух последовательных экстракций, тогда как необработанный ORC материал не показал log снижения в тех же самых условиях тестирования. Данный результат показал, что гентамицин был ковалентно присоединен к ORC материалу и сохранял его бактерицидную эффективность.
Таблица 1Эффективность ORC с ковалентно связанным гентамицином(ORC-GM-CVB)
Образец
S. aureus
E. coli
log CFU
log снижения∗
log CFU
log снижения
Инокулят
4,1
непригодный(n/a)
4,2
Непригодный (n/a)
ORC контроль
4,1
0
4,2
0
ORC-GM-CVB
1,8
2,3
1,4
2,7
∗ log снижения = log CFU инокулята - log CFU обработанного образца
Пример 3 (сравнительный). Ковалентное присоединение ONAMER M к ORC
Материалы
Все материалы, если не указано особо, приобретены от Sigma-Aldrich и использовались как были получены. ONAMER M (поликватерниум 1/polyquaternium 1) закуплены от Stephen Company, Maywood, NJ (lot#5572-c) в виде 32% водного раствора и использовались как были получены. Окисленный регенерированный целлюлозный (ORC) материал получен от Ethicon, Inc., под торговой маркой Interceed.
Процедура
Синтез представлен на фигуре 4.
2
Из ORC материала вырезали 1'' узкие полоски массой 0,25 г. Вырезанную ORC узкую полоску сушили в вакууме при комнатной температуре в продолжение ночи. Высушенную ORC узкую полоску помещали в раствор ONAMER M (40 мл) в 100 мл RBF. 0,32 г 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида (EDC) смешивали с 5 мл воды и добавляли по каплям стеклянной пипеткой к реакционной смеси. Реакционную смесь покрывали с помощью N и оставляли на шейкере при комнатной температуре в течение ночи.
ORC материал вынимали из реакционной смеси, промывали обильной проточной DI водой, замачивали в 150 мл воды в химическом стакане в течение 30 мин и в 100 мл метанола в течение 30 мин с перемешиванием. Обработанный ORC материал сушили в вакууме в течение 2 ч. После сушки получали 1,07 г обработанного ORC материала светло-желтого цвета. Количество ONAMER M (ONM), ковалентно присоединенного к ORC, равно примерно 7%. FT-IR использовали для сравнения обработанных и необработанных ORC образцов.
-1
На фигуре 5 FT-IR данные подтверждали образование ковалентной связи между ORC и ONM, как указано сигналом при 1603 см.
Пример 4 (сравнительный)
in vitro
Нижеследующее изучение показывает, что ONAMER M (ONM), ковалентно присоединенный к ORC, теряет антибактериальную эффективность (таблица 2). Образец ONM, ковалентно присоединенный к ORC (ORC-ONM-CV) из примера 3, оценивали по его эффективности  анализом по log снижения. В анализе по log снижения тестируемые образцы (квадраты из примерно 4,0 мг/кусок) заражали примерно 1-2 × 10е4 КОЕ бактериями на поверхности тестируемых образцов в течение одного часа. Чтобы облегчить оценку эффективности на поверхности тестируемых образцов с ковалентно связанным OMN, инокулят доставляли в объеме 10 мкл/образец, малые объемы по отношению к тестируемым образцам допускали полную абсорбцию инокулята тестируемыми образцами, так что инокулят локализовался на поверхностях тестируемых образцов. Инокулят готовили в 20× буфере фосфата калия, который поддерживал рН тестируемых образцов близко к нейтральному. Противомикробная эффективность ORC при нейтральном рН будет минимальной, такой, что log снижения указывал бы антибактериальную эффективность ONM, а не ORC. После заражения тестируемый образец погружали в физиологический раствор со встряхиванием, чтобы удалить выжившие бактерии, и выживших бактерий определяли посевом на чашках Петри. Посев на чашках Петри проводили в триптиказо-соевом агаре и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Положительный ONM контроль включали в данную оценку, чтобы показать, что ONM в свободной форме действительно обладает эффективностью против бактериального заражения.
Таблица 2Эффективность ORC с ковалентно связанным ONAMER M (ONM)
Образец
<i>S. aureus</i> ATCC 6538
log CFU
log снижения∗
Инокулят
4,5
непригодный (n/a)
ORC
4,5
0
ORC-ONM-CV(560 мкг ONM, присоединенный к ORC)
4,5
0
ONM контроль(100 мкг ONM в свободной форме на бумажном диске)
0,3
4,2
∗ log снижения = log CFU инокулята - log CFU обработанного (три образца ниже инокулята)