СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ ЧАСТИЦ, СОДЕРЖАЩЕЙ БЕЗВОДНУЮ КРИСТАЛЛИЧЕСКУЮ 2-О-АЛЬФА-D-ГЛЮКОЗИЛ-L-АСКОРБИНОВУЮ КИСЛОТУ
METHOD FOR PRODUCING 2-O-ALPHA-D-GLUCOSYL-L-ASCORBIC ACID ANHYDROUS CRYSTAL-CONTAINING POWDER

Область техники
Настоящее изобретение относится к способу получения композиции в форме частиц, содержащей безводную кристаллическую 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту, более конкретно, к способу получения композиции в форме частиц, содержащей безводную кристаллическую 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту, которая крайне незначительно слеживается, по сравнению с обычными композициями.
Уровень техники
Вследствие преимущественной физиологической активности и антиоксидантного действия, L-аскорбиновую кислоту используют для различных целей, включая применение для пищевых продуктов и косметики. Однако L-аскорбиновая кислота имеет серьезный недостаток, состоящий в том, что она является нестабильной вследствие ее способности к восстановлению и чувствительной к окислительной деградации, и легко утрачивает свою физиологическую активность. Для преодоления этого недостатка автор настоящего изобретения, который также является одним из авторов патентного документа 1, описал 2-O-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту, которая состоит из одной молекулы D-глюкозы, связанной с гидроксильной группой в положении C-2 L-аскорбиновой кислоты (далее сокращенно называемая “2-глюкозид аскорбиновой кислоты” по всему описанию). В качестве характерных особенностей, 2-глюкозид аскорбиновой кислоты не проявляет способности к восстановлению, имеет удовлетворительную стабильность и проявляет физиологическую активность, присущую L-аскорбиновой кислоте, после гидролиза в живых организмах до L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы in vivo ферментом, естественным образом существующим в живых организмах. В соответствии со способом, описанным в патентном документе 1, 2-глюкозид аскорбиновой кислоты получают путем обеспечения воздействия переносящего сахарид фермента, такого как цикломальтодекстринглюканотрансфераза (далее сокращенно называемая “CGT-азой”) или α-глюкозидаза, на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и соединение α-глюкозилсахарида.
В патентном документе 2, того же заявителя, что и заявитель настоящего изобретения, был успешно кристаллизован 2-глюкозид аскорбиновой кислоты из перенасыщенного раствора 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и описан кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты и содержащая его композиция в форме частиц. В непатентном документе 1, того же заявителя, что и заявитель настоящего изобретения, описан способ крупномасштабного получения продукта с высоким содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. До настоящего времени было известно, что кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты существует только в безводной кристаллической форме. В качестве справочной информации, в непатентных документах 2 и 3 описаны результаты рентгеноструктурного анализа кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
В патентных документах 3 и 4 того же заявителя, что и заявитель настоящего изобретения, описан способ получения продукта с высоким содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, который включает стадии проведения колоночной хроматографии раствора с 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты, полученного посредством ферментативных реакций, с сильной кислотной катионообменной смолой, и сбора фракции, обогащенной 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты. В патентном документе 5, того же заявителя, что и заявитель настоящего изобретения, описан способ получения продукта с высоким содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, включающий проведение электродиализа раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученного посредством ферментативных реакций, с анионообменной мембраной для удаления примесей, таких как L-аскорбиновая кислота и сахариды, из раствора; и в патентном документе 6, того же заявителя, что и заявитель настоящего изобретения, описан способ получения продукта с высоким содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, включающий стадии воздействия на раствор с 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты анионообменной смолы, и селективной десорбции ингредиентов, адсорбированных на смолу, с получением фракции, богатой 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты.
Кроме того, в патентных документах 7-11 описана CGT-аза, полученная из микроорганизма вида Bacillus stearothermophilus, который в настоящее время классифицируют как микроорганизм вида Geobacillus stearothermophilus; нуклеотидная последовательность гена, кодирующего такой белок CGT-азы; аминокислотная последовательность, определенная из нуклеотидной последовательности; мутантная CGT-аза, полученная искусственным внесением мутации в аминокислотную последовательность; и способ получения сахаридов с их использованием. В непатентных документах 4 и 5 описано получение 2-глюкозида аскорбиновой кислоты путем обеспечения воздействия CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Bacillus stearothermophilus, на раствор, содержащий крахмальное вещество и L-аскорбиновую кислоту, и затем обеспечения воздействия глюкоамилазы на полученный раствор с образованием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
В патентном документе 12, того же заявителя, что и заявитель настоящего изобретения, описан способ получения 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, включающий обеспечение воздействия либо фермента, образующего α-изомальтозилглюкосахарид, либо фермента, образующего α-изомальтозилглюкосахарид, и CGT-азы на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и соединение α-глюкозилсахарида с образованием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. В патентных документах 13 и 14 того же заявителя, что и заявитель настоящего изобретения соответственно, описано, что фермент, образующий α-изомальтозилглюкосахарид, и фермент, осуществляющий перенос α-изомальтозила, образуют 2-глюкозид аскорбиновой кислоты путем катализа переноса сахаридов на L-аскорбиновую кислоту.
Что касается использования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, было сделано множество предположений, как показано в патентных документах 15-34. Вследствие его преимущественных свойств, 2-глюкозид аскорбиновой кислоты широко используют в качестве пищевого материала, материала пищевых добавок, косметического материала, лечебно-профилактической косметики или фармацевтического материала для применения, как и у обычной L-аскорбиновой кислоты, и для других применений, где L-аскорбиновую кислоту нельзя использовать вследствие ее нестабильности.
Как описано выше, в настоящее время известно, что 2-глюкозид аскорбиновой кислоты получают с использованием различных ферментов, осуществляющих перенос сахаридов из L-аскорбиновой кислоты и крахмального вещества в качестве исходных материалов. Среди них, в пределах знаний на дату подачи настоящей заявки, способ, включающий обеспечение воздействия CGT-азы в качестве фермента, осуществляющего перенос сахаридов, на раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту, является промышленно преимущественным способом, поскольку выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты является наиболее высоким. На основе открытия, автором настоящего изобретения была получена композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, способом, включающим обеспечение воздействия CGT-азы на раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту, и запущена в производство в качестве материала для косметики/лечебно-профилактической косметики и для пищевых продуктов и пищевых добавок с соответствующими названиями продуктов “AA2G” (производимый Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония) и “ASCOFRESH” (производимый Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Япония), где все из указанных общепринятых композиций в форме частиц, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которые были произведены в качестве материала для косметики/лечебно-профилактической косметики и для пищевых продуктов и пищевых добавок, далее сокращенно обозначаются как “порошки категории лечебно-профилактической косметики”.
Хотя порошки категории лечебно-профилактической косметики имеют относительно высокую чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющую 98,0% по массе или еще более высокие характеристики продукта, и имеют удовлетворительную сыпучесть в виде порошков непосредственно после их получения, они имеют недостаток, состоящий в том, что они индуцируют слеживание вследствие их собственной массы и поглощения влаги, когда им дают возможность находиться в условиях относительно высокой температуры и влажности. Ввиду такого недостатка, порошки категории лечебно-профилактической косметики были запущены в производство в форме продукта, заключенного в стальную емкость с крышкой после упаковки в полиэтиленовый мешок по 10 кг в каждом вместе с осушителем, однако последующее открытие авторов настоящего изобретения показало, что порошки категории лечебно-профилактической косметики даже в такой форме продукта имеют недостаток, состоящий в том, что они могут часто подвергаться слеживание и утрачивать полезные свойства в виде порошков при хранении в течение относительно длительного периода времени. Когда композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты для использования в качестве косметического материала или материала лечебно-профилактической косметики или в качестве пищевого материала или материала пищевых добавок, слеживается, это может вызывать некоторые проблемы на стадиях транспортировки, просеивания, смешения ингредиентов и т.д., если промышленная установка сконструирована с исходным условием, что ингредиенты представляют собой порошки, сохраняющие сыпучесть.
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты (название продукта “ASCORBIC ACID 2-GLUCOSIDE 999”, код №: AG124, производимый Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan) (далее сокращаемый как “порошок категории реагентов”) (см., например, непатентный документ 6), которая производится в качестве аналитического стандартного реагента тем же заявителем, что и заявитель настоящего изобретения, не слеживается даже в условиях, которые способствуют слеживанию порошка категории лечебно-профилактической косметики, и все еще сохраняет ее свойства в виде порошка. Аналогично, как в порошке категории лечебно-профилактической косметики, такой порошок категории реагентов представляет собой порошок, полученный путем обеспечения воздействия CGT-азы на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество, очистки и концентрирования полученного раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, для осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и сбора выпавших в осадок кристаллов. Такой порошок категории реагентов отличается от порошка категории лечебно-профилактической косметики тем, что, в дополнение к общепринятым стадиям, для первого из них требуются дополнительные стадии, такие как стадия перекристаллизации, состоящая в растворении полученных кристаллов и последующей перекристаллизации кристаллов, и стадия промывания, состоящая в многократном промывании кристаллов, полученных на стадии перекристаллизации, очищенной водой и т.д., для повышения чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до определенно высокой чистоты, составляющей 99,9% по массе или более. Таким образом, даже в случае порошка категории лечебно-профилактической косметики, можно рассматривать преобразование его в композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который значительно труднее слеживается, путем увеличения чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до уровня по меньшей мере 99,9% по массе.
Однако, как описано выше, для увеличения чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до уровня по меньшей мере 99,9% по массе, необходимо добавлять стадию перекристаллизации и многократного промывания очищенной водой и т.д., в дополнение к обычной стадии получения, что приводит к недостатком, состоящим не только в увеличении времени и рабочей силы, требуемой для получения, но и к потере 2-глюкозида аскорбиновой кислоты на стадиях перекристаллизации и промывания, а также к снижению выхода продуцирования и значительному увеличению стоимости производства. Вследствие этого, является нереалистичной возможность просто увеличения чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до уровня по меньшей мере 99,9% по массе с целью получения композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая значительно труднее слеживается, по сравнению с порошком категории лечебно-профилактической косметики. Кроме того, насколько известно авторам настоящего изобретения, порошок категории реагентов имеет недостаток, состоящий в том, что его растворимость является более низкой при смешивании с гидрофильным растворителем, таким как водный раствор 1,3-бутиленгликоля, который часто используют в косметике и лечебно-профилактической косметике.
В этих обстоятельствах автор настоящего изобретения предпринял усилия методом проб и ошибок, и обнаружил, что в способе получения, состоящем в обеспечении воздействия CGT-азы на раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту, и последующем обеспечении воздействия глюкоамилазы на полученный раствор, в случае увеличения выхода продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в растворе, полученном ферментативными реакциями, до уровня по меньшей мере 35% по массе, можно получать порошок, который значительно труднее слеживается, по сравнению с общепринятым порошком категории лечебно-профилактической косметики посредством по существу таких же стадий, как в способе получения такого общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики без растворения и перекристаллизации полученного безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты; и описал указанное выше открытие в патентном документе 35. Однако в описанном выше способе существует недостаток, состоящий в том, что ограниченную специфическую CGT-азу следует использовать отдельно или в комбинации с ферментом, осуществляющим расщепление разветвленной структуры крахмала, таким как изоамилаза, для увеличения выхода продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до уровня по меньшей мере 35% по массе в реакционной смеси, полученной посредством ферментативных реакций, и такой способ лишен общей универсальности в качестве способа получения.
Документы уровня техники
Патентные документы
[Патентный документ 1] патент Японии Kokai № 139288/91
[Патентный документ 2] патент Японии Kokai № 135992/91
[Патентный документ 3] патент Японии Kokai № 183492/91
[Патентный документ 4] патент Японии Kokai № 117290/93
[Патентный документ 5] патент Японии Kokai № 208991/93
[Патентный документ 6] патент Японии Kokai № 2002-088095
[Патентный документ 7] патент Японии Kokai № 63189/75
[Патентный документ 8] патент Японии Kokai № 39597/88
[Патентный документ 9] патент Японии Kokai № 244945/93
[Патентный документ 10] международная публикация патента WO 96033267
[Патентный документ 11] международная публикация патента WO 99015633
[Патентный документ 12] патент Японии Kokai № 2004-065098
[Патентный документ 13] международная публикация патента WO 02010361
[Патентный документ 14] международная публикация патента WO 01090338
[Патентный документ 15] международная публикация патента WO 05087182
[Патентный документ 16] патент Японии Kokai № 046112/92
[Патентный документ 17] патент Японии Kokai № 182412/92
[Патентный документ 18] патент Японии Kokai № 182413/92
[Патентный документ 19] патент Японии Kokai № 182419/92
[Патентный документ 20] патент Японии Kokai № 182415/92
[Патентный документ 21] патент Японии Kokai № 182414/92
[Патентный документ 22] патент Японии Kokai № 333260/96
[Патентный документ 23] патент Японии Kokai № 2005-239653
[Патентный документ 24] международная публикация патента WO 06033412
[Патентный документ 25] патент Японии Kokai № 2002-326924
[Патентный документ 26] патент Японии Kokai № 2003-171290
[Патентный документ 27] патент Японии Kokai № 2004-217597
[Патентный документ 28] международная публикация патента WO 05034938
[Патентный документ 29] патент Японии Kokai № 2006-225327
[Патентный документ 30] международная публикация патента WO 06137129
[Патентный документ 31] международная публикация патента WO 06022174
[Патентный документ 32] патент Японии Kokai № 2007-063177
[Патентный документ 33] международная публикация патента WO 06132310
[Патентный документ 34] международная публикация патента WO 07086327
[Патентный документ 35] международная публикация патента WO 2011/027790
Непатентные документы
[Непатентный документ 1] Sanyo-Gijyutsu-Zasshi, Vol. 45, No. 1, pp. 63-69, 1997
[Непатентный документ 2] Carbohydrate Research, Takahiko MANDAI et al., Vol. 232, pp. 197-205, 1992
[Непатентный документ 3] International Journal of Pharmaceutics, Yutaka INOUE et al., Vol. 331, pp. 38-45, 2007
[Непатентный документ 4] Applied Biochemistry and Microbiology, Vol. 143, No. 1, pp. 36-40, 2007
[Непатентный документ 5] Agricultural Biological Chemistry, Vol. 7, pp. 1751-1756, 1991
[Непатентный документ 6] Wako Analytical Circle, No. 29, pp. 6, 2003
Описание изобретения
Задача изобретения
Задачей настоящего изобретения, которое было осуществлено для устранения описанного выше недостатка, является предоставление способа получения композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который обеспечивает получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая значительно труднее слеживается, по сравнению с порошком категории лечебно-профилактической косметики, даже когда выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в реакционном растворе, полученном путем ферментативных реакций, составляет менее 35% по массе.
Средства для решения задачи
Для решения описанной выше задачи авторы настоящего изобретения далее продолжили исследование и повторно предприняли усилия методом проб и ошибок в отношении способа получения композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, и обнаружили, что с использованием описанного ниже способа контролируемого охлаждения или способа псевдоконтролируемого охлаждения при осаждении безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты из раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, можно получать безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который значительно труднее слеживается, по сравнению с общепринятым порошком категории лечебно-профилактической косметики, посредством по существу таких же стадий, как стадии обычного способа получения такого порошка категории лечебно-профилактической косметики, даже когда выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в реакционном растворе, полученном путем ферментативных реакций, составляет менее 35% по массе.
Иными словами, настоящее изобретение решает описанную выше задачу путем предоставления способа получения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, который включает следующие стадии (a)-(e):
(a) стадию обеспечения воздействия CGT-азы на раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту в качестве исходных материалов, и последующего обеспечения воздействия глюкоамилазы на полученный раствор с получением раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с получением выхода продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющим по меньшей мере 27% по массе;
(b) стадию очистки полученного раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с получением содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты более 86% по массе в расчете на массу сухого вещества (далее может сокращенно обозначаться как “м.с.в.”);
(c) стадию осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты из очищенного раствора с содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты более 86% по массе, м.с.в., способом контролируемого охлаждения или способом псевдоконтролируемого охлаждения;
(d) стадию сбора выпавшего в осадок безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты; и
(e) стадию выдерживания, сушки и необязательно измельчения собранного безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты без его растворения и перекристаллизации, с получением композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая содержит 2-глюкозид аскорбиновой кислоты на уровне в расчете на массу сухого твердого веществ более 98,0% по массе, но менее 99,9% по массе, и имеет степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющую по меньшей мере 90%, при вычислении на основе профиля порошковой рентгеновской дифракции композиции в форме частиц.
Согласно способу настоящего изобретения, композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая имеет содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, в расчете на массу сухого твердого вещества, более 98,0% по массе, но менее 99,9% по массе, и имеет степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющую по меньшей мере 90% при вычислении на основе профиля порошковой рентгеновской дифракции композиции в форме частиц, можно получать путем осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты из раствора 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, который получен ферментативными реакциями, и соответствующей очистки полученного реакционного раствора описанным ниже способом контролируемого охлаждения или способом псевдоконтролируемого охлаждения, при условии, что выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты составляет по меньшей мере 27% по массе в реакционном растворе, даже, когда уровень выхода продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты не достигает 35% по массе.
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный описанным выше способом, имеет чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты более 98,0% по массе, но менее 99,9% по массе, где уровень чистоты практически равен или ниже уровня чистоты общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики; имеет степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты (далее по всему описанию сокращаемый просто как “степень кристалличности”) вплоть до по меньшей мере 90%; представляет собой порошок, который значительно труднее слеживается, по сравнению с порошком категории лечебно-профилактической косметики; и имеет преимущественную растворимость в гидрофильных растворителях, широко используемых в косметике и лечебно-профилактической косметике, по сравнению с порошком категории реагентов, вследствие его чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты менее 99,9% по массе. Такую композицию в форме частиц легко обрабатывать, и она пригодна для применения в качестве пищевого материала, материала пищевых добавок, косметического материала, материала лечебно-профилактической косметики и фармацевтического материала.
В способе согласно настоящему изобретению выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в реакционном растворе, полученном посредством ферментативных реакций, предпочтительно должен составлять по меньшей мере 27% по массе, и, в некоторых случаях, он может составлять по меньшей мере 35% по массе. Способ является особенно преимущественным в том, что он обеспечивает композицию в форме частиц, которая представляет собой порошок, который значительно труднее слеживается, по сравнению с порошком категории лечебно-профилактической косметики, посредством практически такой же стадии, как и для общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики, за исключением применения способа контролируемого охлаждения или способа псевдоконтролируемого охлаждения, даже когда уровень указанного выше выхода продуцирования составляет менее 35% по массе, т.е. по меньшей мере 27% по массе, но менее 35% по массе. Когда описанный выше выход продуцирования составляет по меньшей мере 35% по массе, способ согласно настоящему изобретению имеет преимущество в том, что с его помощью можно получать композицию в форме частиц, которая представляет собой порошок, который значительно труднее слеживается, по сравнению с порошком категории лечебно-профилактической косметики, с использованием практически такой же стадии, как в обычно используемом способе получения порошка категории лечебно-профилактической косметики, за исключением применения способа контролируемого охлаждения или способа псевдоконтролируемого охлаждения. В способе согласно настоящему изобретению, на стадии (a), состоящей в получении раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с выходом продуцирования по меньшей мере 27% по массе, можно использовать фермент, расщепляющий разветвленную структуру крахмала, такой как изоамилаза и пуллуланаза, в комбинации с CGT-азой для большего увеличения выхода продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в реакционном растворе.
Более того, в способе согласно настоящему изобретению, на стадии (b), состоящей в очистке полученного раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с получением содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты более 86% по массе, м.с.в., также можно использовать колоночную хроматографию с использованием анионообменной смолы в качестве материала наполнителя колонки и колоночную хроматографию с псевдодвижущимся слоем с использованием сильной кислотной катионообменной смолы в качестве материала наполнителя колонки. На стадии (b), когда колоночную хроматографию с использованием описанной выше анионообменной смолы в качестве материала наполнителя колонки и колоночную хроматографию с псевдодвижущимся слоем с использованием описанной выше сильной кислотной катионообменной смолы в качестве материала наполнителя колонки используют в комбинации, в качестве преимущества можно более эффективно получать раствор, содержащий 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты более 86% по массе, м.с.в.
Кроме того, продолжение исследования авторами настоящего изобретения выявило, что CGT-азы, способные продуцировать по меньшей мере 27% по массе 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в реакционных растворах, полученных посредством ферментативных реакций на стадии (a), имеют общий характерный признак на уровне аминокислот.
Более конкретно, настоящее изобретение также решает описанную выше задачу путем предоставления способа получения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с использованием, в качестве описанных выше CGT-аз, любых CGT-аз, имеющих следующие частичные аминокислотные последовательности (a)-(d):
1
(a) Asn-Glu-Val-Asp-X-Asn-Asn;
2
(b) Met-Ile-Gln-X-Thr-Ala;
(c) Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile и
3
(d) Val-X-Ser-Asn-Gly-Ser-Val,
1
2
3
(где X означает Pro или Ala, X означает Ser или Asp, и X означает Ser или Gly, соответственно).
Примеры CGT-аз, имеющих описанные выше аминокислотные последовательности (a)-(d), включают природные и рекомбинантные ферменты, полученные из микроорганизмов вида Geobacillus stearothermophilus или Thermoanaerobacter thermosulfirigenes, более конкретно, CGT-азы, имеющие любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1, 3, 4 и 5, которые предпочтительно можно использовать в настоящем изобретении.
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученная способом по настоящему изобретению, предпочтительно содержит 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с содержанием, в расчете на массу сухого твердого вещества, более 98,0% по массе, но менее 99,9% по массе; имеет степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющую по меньшей мере 90%, при вычислении на основе профиля порошковой рентгеновской дифракции композиции в форме частиц; содержит L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу, полученные из данных материалов; содержит L-аскорбиновую кислоту с содержанием не более 0,1% по массе, м.с.в.; и имеет способность к восстановлению композиции в форме частиц в целом, составляющую менее одного процента по массе.
Эффект изобретения
Поскольку способ по настоящему изобретению обеспечивает получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая значительно труднее слеживается, по сравнению с порошком категории лечебно-профилактической косметики, даже в случае, когда выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в реакционном растворе, полученном посредством ферментативных реакций, составляет менее 35% по массе, он обеспечивает значительное преимущество в том, что диапазон выбираемых ферментов, в частности, CGT-аз, используемых для ферментативных реакций, значительно расширяется. Способ по настоящему изобретению предоставляет информацию о частичных аминокислотных последовательностях, распространенных в CGT-азах, которые реализуют выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты на уровне по меньшей мере 27% по массе в ферментативных реакциях, и, таким образом, обеспечивает преимущество в том, что скрининг CGT-аз, пригодных для способа по настоящему изобретению, становится возможным на основе частичных аминокислотных последовательностей. Кроме того, согласно способу настоящего изобретения, композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который значительно труднее слеживается, по сравнению с общепринятым порошком категории лечебно-профилактической косметики, можно получать способом, который, с точки зрения стадий, не отличается от способа получения общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики, в котором используется либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновая кислота, в качестве исходных материалов, за исключением применения способа контролируемого охлаждения или способа псевдоконтролируемого охлаждения на стадии кристаллизации для осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты из реакционного раствора, полученного посредством ферментативных реакций; и, таким образом, композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который значительно труднее слеживается, по сравнению с порошком категории лечебно-профилактической косметики, можно в качестве преимущества получать за период времени, с рабочей силой, производственной установкой и стоимостью, которые достаточно сходны с периодом времени, рабочей силой, производственной установкой и стоимостью, обычно требуемыми для получения такого порошка категории лечебно-профилактической косметики.
В качестве справочной информации, при использовании в качестве порошкового пищевого материала, материала пищевых добавок, косметического материала, материала лечебно-профилактической косметики и фармацевтического материала, композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный способом по настоящему изобретению, обладает преимуществом, состоящим в том, что ее можно легко сохранять, хранить и обрабатывать, а также в том, что она по существу не вызывает проблем в таких процессах, как транспортировка, просеивание и смешение материалов, даже при использовании в производственной установке, сконструированной с исходными условиями, что материалы, используемые в ней, должны быть сыпучими, поскольку композиция в форме частиц, в качестве компонента порошковых материалов, значительно труднее слеживается.
Поскольку композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный способом по настоящему изобретению, можно легко контролировать в отношении распределения размера частиц, которое требуется для пищевых материалов и т.д., т.е. ее можно контролировать так, чтобы содержание частиц с размером частиц менее 150 мкм составляло по меньшей мере 70% по массе всей композиции в форме частиц и содержание частиц с размером частиц по меньшей мере 53 мкм, но менее 150 мкм составляло от 40 до 60% по массе всей композиции в форме частиц, данная композиция в форме частиц имеет преимущество в том, что ее можно использовать, как и ранее, без изменения предшествующих стадий получения и стандартов материалов, даже при использовании в качестве пищевого материала, материала пищевых добавок, косметического материала, материала лечебно-профилактической косметики или фармацевтического материала. Поскольку композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный способом согласно настоящему изобретению, содержит L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу и имеет способность к восстановлению более 0% по массе, но менее 1% по массе всего порошка и, несмотря на то, что она представляет собой композицию в форме частиц, полученную либо из разжиженного крахмала, либо из декстрина и L-аскорбиновой кислоты в качестве исходных материалов, она имеет преимущество в том, что отсутствует угроза возникновения ухудшения качества, такого как изменение цвета, даже при смешении с другими веществами, имеющими внутримолекулярные аминогруппы, такими как аминокислоты и белки. Кроме того, хотя композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный способом по настоящему изобретению, содержит L-аскорбиновую кислоту с содержанием более 0% по массе, но менее 0,1% по массе, отсутствует угроза, что в ней самой изменится цвет на светло-коричневый, даже при хранении отдельно в течение относительно длительного периода времени, и ее можно использовать в качестве пищевого материала, материала пищевых добавок, косметического материала, материала лечебно-профилактической косметики и фармацевтического материала в виде по существу бесцветного белого порошка.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлен пример диаграммы порошковой рентгеновской дифракции с характеристическим рентгеновским излучением для композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая по существу состоит из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
На фиг.2 представлен пример диаграммы порошковой рентгеновской дифракции с характеристическим рентгеновским излучением для композиции в форме частиц, содержащей 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая по существу состоит из аморфного 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
На фиг.3 представлен пример диаграммы порошковой рентгеновской дифракции с синхротронным излучением для композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая по существу состоит из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
На фиг.4 представлен пример диаграммы порошковой рентгеновской дифракции с синхротронным излучением для композиции в форме частиц, содержащей 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая по существу состоит из аморфного 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
На фиг.5 представлено изображение структуры и участков распознавания ферментов рестрикции рекомбинантной ДНК “pRSET-iBTC12”, которая содержит ген CGT-азы, полученный из линии Tc-91 Geobacillus stearothermophilus, используемой в настоящем изобретении.
На фиг.5 представлено изображение диаграмм охлаждения.
Наилучшие способы осуществления изобретения
1. Определение терминов
По всему описанию следующие термины означают следующее:
<Степень кристалличности>
Термин “степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты”, используемый в описании, означает величину, определяемую по следующей формуле [1]:
Формула [1]:
Степень кристалличности (%)
=
Hs-H<sub>0</sub>
×100
[Уравнение 1]
H<sub>100</sub>-H<sub>0</sub>
100
H: Аналитическое значение степени кристалличности, определенное на основе профиля порошковой рентгеновской дифракции для порошкового стандартного образца, содержащего безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, где порошковый стандартный образец по существу состоит из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
0
H: Аналитическая величина для степени кристалличности, определенная на основе профиля порошковой рентгеновской дифракции для порошкового стандартного образца, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, где порошковый стандартный образец по существу состоит из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
Hs: Аналитическая величина для степени кристалличности, определенная на основе профиля порошковой рентгеновской дифракции для порошка, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, в качестве тестируемого образца.
100
0
В формуле [1], диаграммы рентгеновской дифракции порошка в качестве основы для определения аналитических величин H, H и Hs обычно можно определять с использованием порошкового рентгеновского дифрактометра, оборудованного отражающей или передающей оптической системой. Диаграммы порошковой рентгеновской дифракции содержат данные об углах дифракции и интенсивности дифракции безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, содержащегося в тестируемом или стандартном образце. Примеры способа определения аналитических данных для углов кристалличности таких образцов на основе их диаграмм порошковой рентгеновской дифракции включают, например, способ Германса, способ Вонка и т.д. Среди них способ Германса является предпочтительным вследствие его простоты и точности. Поскольку любые из указанных аналитических способов в настоящее время предоставлены в виде компьютерного программного обеспечения, можно подходящим образом использовать любые порошковые рентгеновские дифрактометры, оборудованные аналитическим устройством, на которое установлено любое из описанных выше компьютерных программных обеспечений.
100
100
В качестве “порошкового стандартного образца, содержащего безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, где порошковый стандартный образец по существу состоит из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты”, для определения аналитической величины H, безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты необходимо использовать в форме порошка или монокристалла, который имеет чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 99,9% по массе (по всему описанию “% по массе” сокращенно обозначают как “%”, если не указано иное, однако “%”, относящийся к степени кристалличности не должен ограничиваться этим), проявляет характеристические дифракционные пики, присущие безводному кристаллическому 2-глюкозиду аскорбиновой кислоты, и состоит по существу из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Их примеры в форме порошка или монокристалла включают указанный выше порошок категории реагентов, композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный путем перекристаллизации порошка категории реагентов, и безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в форме монокристалла. В качестве справочной информации, при анализе с помощью компьютерного программного обеспечения для способа Германса, диаграмма порошковой рентгеновской дифракции для указанного выше порошкового стандартного образца композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая состоит по существу из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, дает аналитическую величину H, обычно находящуюся в диапазоне приблизительно от 70,2% до приблизительно 70,5%.
0
100
0
В качестве “порошкового стандартного образца, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, где порошковый стандартный образец по существу состоит из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты” для определения аналитической величины H, необходимо использовать 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в форме порошка, который имеет чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 99,1%, имеет диаграмму порошковой рентгеновской дифракции, состоящую только из гало, присущего его аморфной форме, и по существу не проявляет какого-либо характеристического пика дифракции, присущего безводному кристаллическому 2-глюкозиду аскорбиновой кислоты. Примеры такого порошка включают порошки, полученные растворением указанного выше порошкового стандартного образца для определения указанной выше аналитической величины H в соответствующем количестве очищенной воды, концентрированием раствора, сушкой вымораживанием концентрата и сушкой в вакууме полученного вещества, достигая содержания влаги 2,0% или менее, определяемого способом Карла Фишера. Из опыта известно, что путем таких обработок получают порошок, по существу состоящий из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. В качестве справочной информации, при анализе с помощью компьютерного программного обеспечения для способа Германса, диаграмма порошковой рентгеновской дифракции для указанного выше порошкового стандартного образца, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который по существу состоит из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, дает аналитическую величину H, обычно находящуюся в диапазоне приблизительно от 7,3% до приблизительно 7,6%.
0
0
100
100
Совершенно очевидно, что в качестве стандартного образца для определения аналитической величины H предпочтительным является 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с более высокой чистотой, однако чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты стандартного образца, используемого для определения аналитической величины H, полученного из стандартного образца, используемого для определения аналитической величины H, как указано выше, ограничена до 99,1%, даже несмотря на то, что чистота стандартного образца, используемого для определения аналитической величины H, определенно достигает 99,9% или выше, как показано в описанном ниже эксперименте 1-1. Таким образом, чистота “порошкового стандартного образца, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, где порошковый стандартный образец по существу состоит из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты”, установлена на 99,1% или более, как указано выше.
<Средний диаметр кристаллита>
Как правило, признано, что частица порошка в содержащем кристаллы порошке образована монокристаллами, т.е. кристаллитами. Размер кристаллитов (диаметр кристаллитов) в кристаллическом порошке, как полагают, отражается на его свойствах. Термин “средний диаметр кристаллитов безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты”, как указано в настоящем описании, означает среднее значение диаметров кристаллитов, вычисленное соответственно путем проведения анализа с использованием порошковой рентгеновской дифракции композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид; выбора пяти пиков дифракции из пиков дифракции, выявленных на полученных диаграммах порошковой рентгеновской дифракции, т.е. пиков дифракции (см. обозначения “a”-”e” на фиг.1) с дифракционными углами (2θ) 10,4° (индекс Миллера(hkl):120), 13,2° (индекс Миллера (hkl):130), 18,3° (индекс Миллера (hkl):230), 21,9° (индекс Миллера (hkl):060) и 22,6° (индекс Миллера (hkl):131), которые расположены в области относительно малых углов, где в наименьшей степени нарушается ширина пика дифракции вследствие гетерогенного напряжения кристаллита, и которые были четко отделены от других пиков дифракции; калибровки соответствующей полуширины (полная ширина на уровне половины максимального значения) и дифракционных углов, исходя из измеренных величин, определенных, когда кремний (“Si640C”, предоставляемый NIST: National Institute of Standards and Technology, в качестве стандартного образца для рентгеновской дифракции) используют в качестве стандартного образца; и вычисления соответствующих средних значений диаметров кристаллитов по уравнению Шеррера, представленному в следующей формуле [2]:
Формула [2]:
D
=
Kλ
[Уравнение 2]
βcosθ
D: Размер кристаллита (Å)
λ: Длина волны рентгеновского луча (Å)
β: Ширина линии дифракции (рад)
θ: Дифракционный угол (°)
K: Константа (0,9 когда для β используют полуширину (полная ширина на уровне половины максимального значения))
Поскольку на обычно используемом рентгеновском дифрактометре установлено компьютерное программное обеспечение для вычисления таких диаметров кристаллитов, средний диаметр кристаллитов безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты относительно легко определять, при условии, что композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, является доступной. Перед измерением диаграммы порошковой рентгеновской дифракции каждый тестируемый образец растирают в ступке и просеивают через сито с размером ячеек 53 мкм, с получением порошка, пропущенного через сито, для применения.
<Способность к восстановлению>
Термин “способность к восстановлению всей композиции в форме частиц”, как указано в описании, означает процент (%) содержания восстанавливающего сахарида к общему содержанию сахара в тестируемом образце, вычисленный по следующей формуле [3] на основе содержания восстанавливающего сахара и общего содержания сахара в расчете на D-глюкозу, определенного способом Somogyi-Nelson и способом антрон-серной кислоты, широко используемого в данной области, когда D-глюкозу используют в качестве стандартного вещества.
Формула [3]:
Способность к восстановлению (%)
=
Содержание восстанавливающего сахара
×100
Общее содержание сахара
[Уравнение 3]
<Распределение размера частиц>
В описании распределение размера частиц композиции в форме частиц определяют следующим образом: металлические сита с размером ячеек 425, 300, 212, 150, 106, 75 и 53 мкм, изготовленные Kabushiki Gaisha Iida Seisaku-sho, Tokyo, Японии, которые удовлетворяют Японским промышленным стандартам (JIS Z 8801-1), точно взвешивают, укладывают стопкой в указанном выше порядке и помещают в механический встряхиватель для лабораторных сит с названием продукта “R-1”, производимый Kabushiki Gaisha Tanaka Kagaku Kikai Seisaku-sho, Osaka, Япония. Назначенное количество взвешенного образца помещают на верхнее сито (имеющее размер ячеек 425 мкм) в стопке сит, и затем сита встряхивают в течение 15 мин, поддерживая уложенное стопкой состояние. Затем каждое из уложенных стопкой сит вновь точно взвешивают и массу образца, собранную на каждом из сит, определяют путем вычитания массы каждого из сит до нагрузки образца из массы соответствующего сита после встряхивания. Затем распределение размеров частиц выражают путем вычисления массового процента (%) для каждой из масс композиций в форме частиц с соответствующими размерами частиц, собранными на каждом из сит, относительно массы образца, нагруженного на верхнее сито.
<Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты>
Термин “выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты”, используемый в настоящем описании, означает содержание (%) 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., в растворе ферментативной реакции, полученном путем обеспечения воздействия фермента, такого как CGT-аза, на раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту.
<Содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в.>
Термин “содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в.” означает процент (%) по массе 2-глюкозида аскорбиновой кислоты относительно всей массы содержащего его образца, при вычислении, исключая содержание влаги. Например, значение содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., в растворе представляет собой процент по массе 2-глюкозида аскорбиновой кислоты от общего содержания оставшихся твердых веществ, исключая воду, содержащуюся в растворе. Между тем, значение содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., в композиции в форме частиц представляет собой процент по массе массы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты относительно общей массы композиции в форме частиц при вычислении, рассматривая остаток композиции в форме частиц, за исключением содержащейся в ней влаги, в качестве общей массы композиции в форме частиц.
<Активность CGT-азы>
Термин “активность CGT-азы”, используемый в настоящем описании, определяют следующим образом: к пяти миллилитрам водного раствора субстрата, содержащего 0,3% (масс./об.) растворимого крахмала, 20 мМ ацетатный буфер (pH 5,5) и 1 мМ хлорид кальция, добавляют 0,2 мл соответствующим образом разведенного раствора фермента, и полученный раствор субстрата поддерживают при 40°C, и проводят взятие образцов через 0 мин и 10 мин после начала ферментативной реакции в соответствующих количествах 0,5 мл, и затем в каждый образец сразу добавляют 15 мл 0,02н. раствора серной кислоты для остановки ферментативной реакции. Каждый из полученных растворов серной кислоты смешивают с 0,2 мл 0,1н. раствора йода для проявления цвета, и через 10 мин в окрашенных растворах соответственно измеряют поглощение при длине волны 660 нм с помощью устройства для измерения поглощения, с последующим вычислением активности CGT-азы с использованием следующей формулы [4], как активность гидролиза крахмала. Одну единицу активности CGT-азы определяют как количество фермента, которое полностью устраняет окрашивание йодом 15 мг крахмала в растворе.
Формула [4]:
Активность (единицы/мл)
=
Aa-Ab
×
1
×
(коэффициент разведения)
Aa
0,2
[Уравнение 4]
Примечание: "Aa" обозначает поглощение при длине волны 660 нм реакционного раствора через 0 мин после начала ферментативной реакции.
"Ab" обозначает поглощение при длине волны 660 нм реакционного раствора через 10 мин после начала ферментативной реакции.
<Активность изоамилазы>
Термин “активность изоамилазы”, используемый в настоящем описании, определяют следующим образом: к трем миллилитрам водного раствора субстрата, содержащего 0,83% (масс./об.) растворимого восковидного кукурузного крахмала Литнера и 0,1M ацетатный буфер (pH 3,5) добавляют 0,5 мл соответствующим образом разведенного раствора фермента, и полученный раствор субстрата поддерживают при 40°C и проводят взятие образцов через 0,5 мин и 30,5 мин после начала ферментативной реакции в соответствующих количествах 0,5 мл, и затем в каждый образец сразу добавляют 15 мл 0,02н. раствора серной кислоты для остановки ферментативной реакции. Каждый из полученных растворов серной кислоты смешивают с 0,5 мл 0,01н. раствора йода для проявления цвета при 25°C в течение 15 мин, и затем в окрашенных растворах соответственно измеряют поглощение при длине волны 610 нм с помощью устройства для измерения поглощения, с последующим вычислением активности изоамилазы с использованием следующей формулы [5], как активность гидролиза крахмала. Одну единицу активности изоамилазы определяют как количество фермента, которое увеличивает поглощение на 0,004 при длине волны 610 нм в описанных выше условиях измерения.
Формула [5]:
Активность (единицы/мл)
=
Aa-Ab
×
(коэффициент разведения)
0,004
[Уравнение 5]
Примечание: "Aa" обозначает поглощение реакционного раствора при длине волны 610 нм.
"Ab" обозначает поглощение контрольного раствора при длине волны 610.
<Активность пуллуланазы>
Термин “активность пуллуланазы”, используемый в настоящем описании, определяют следующим образом: 1,25% (масс./об.) водный раствор пуллулана (реагент для определения активности пуллуланазы, производимый Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония) предоставляют в виде водного раствора субстрата. Четыре миллилитра водного раствора субстрата и 0,5 мл 0,05M лимонной кислоты в забуференном фосфатом солевом растворе (pH 5,8) помещают в тестовую пробирку и предварительно нагревают до 30°C. В тестовую пробирку добавляют 0,5 мл раствора фермента, который надлежащим образом разведен 0,01M ацетатным буфером (pH 6,0), и полученный раствор субстрата инкубируют при 30°C, производят взятие образцов в соответствующих количествах 0,5 мл через 0,5 мин (контрольный раствор) и 30,5 мин (реакционный раствор), и затем быстро добавляют каждый из растворов образцов к двум миллилитрам раствора меди Somogyi для остановки реакции, подвергая каждый из полученных растворов способу Somogyi-Nelson, с определением поглощения каждого раствора при длине волны 520 нм с использованием устройства для измерения поглощения для измерения появившейся способности к восстановлению, и вычислением величины активности разложения пуллулана по следующей формуле [6]. Одну единицу активности пуллуланазы определяют как количество фермента, которое высвобождает способность к восстановлению, соответствующую одному микромолю мальтотриозы в минуту.
Формула [6]:
Активность (единицы/мл)
=
Aa-Ab
×
100
×
5
×
1
×
1
×
(коэффициент разведения)
Ac
0,5
180
30
[Уравнение 6]
Примечание: "Aa" обозначает поглощение реакционного раствора при длине волны 520 нм.
"Ab" обозначает поглощение контрольного раствора при длине волны 520 нм.
"Ac" обозначает поглощение стандартного раствора при длине волны 520 нм.
В качестве стандартного раствора используют D-глюкозу (100 мкг/мл).
<Способ контролируемого охлаждения>
0
f
Термин “способ контролируемого охлаждения”, используемый в описании, означает способ осаждения кристаллов посредством “контролируемого охлаждения” и означает способ охлаждения, где температура жидкости “T” в момент времени “t”, в основном, выражается по следующей формуле [7], где “τ” представляет собой операционное время, установленное для стадии кристаллизации, “T” представляет собой температуру жидкости в начале кристаллизации, и “T” представляет собой целевую температуру жидкости после завершения кристаллизации.
Формула [7]:
0
0
f
3
T=T-(T-T)(t/τ) [Уравнение 7]
m
m
0
f
f
0
f
Способ контролируемого охлаждения выражен более конкретно (схематично) с помощью графика посредством “a” на фиг.6, где ось абсцисс соответствует операционному времени, соответствующему стадии кристаллизации, и продольная ось соответствует температуре жидкости при кристаллизации. Как показано под обозначением “a” на фиг.6, в соответствии со способом контролируемого охлаждения, температура жидкости постепенно снижается на ранней стадии кристаллизации, на которой температура является относительно высокой, но быстро снижается на последующей фазе, на которой температура жидкости снижается до некоторой степени. Таким образом, температура жидкости “T” в момент времени t=τ/2, т.е. в средней точке стадии кристаллизации, поддерживается по меньшей мере с взаимосвязью T>[(T-T)/2+T] (или изменение температуры в средней точке стадии кристаллизации составляет менее чем 50% от общего изменения температуры). На диаграмме изменения температуры жидкости от времени, способ контролируемого охлаждения четко отличается как от линейного способа охлаждения (обозначение “b” на фиг.6), где температура жидкости линейно снижается со временем “τ” от температуры жидкости T до T, так и от способа обычного естественного охлаждения (обозначение “c” на фиг.6), где температура жидкости снижается экспоненциально и быстро на ранней фазе стадии кристаллизации, на которой температура жидкости является относительно высокой, но постепенно снижается на последующей фазе стадии кристаллизации, на которой температура жидкости является сниженной. Для изменения температуры жидкости “T” в качестве функции времени “t”, указанной в формуле [7] выше, можно использовать, например, коммерческий программный непрерывный циркулятор общего назначения для системы кристаллизации и т.д.
Когда такой способ контролируемого охлаждения используют для стадии кристаллизации, после добавления затравочных кристаллов 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, проводят постепенное снижение температуры жидкости на ранней фазе кристаллизации, и, таким образом, путем охлаждения ингибируются как быстрое увеличение степени перенасыщения 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, так образование вторичного центра кристаллизации, и можно преимущественно осуществлять рост кристаллов из добавленных затравочных кристаллов в качестве кристаллических ядер. Между тем, на последней из указанных стадий кристаллизации, при которой кристаллы полностью образуются из добавленных затравочных кристаллов в качестве кристаллических ядер, всем гомогенно сформированным кристаллам дают возможность расти путем быстрого снижения температуры жидкости и, таким образом, обеспечивает преимущество в том, что способ контролируемого охлаждения обеспечивает утфель, содержащий кристаллы с единообразным размером частиц и меньшим количеством микрокристаллов. В качестве справочной информации, “способ контролируемого охлаждения” подробно описан в “Wakariyasui-Batch-Shoseki” (Доступная массовая кристаллизация), pp. 32-47, под редакцией Noriaki KUBOTA, опубликованной The Society of Separation Process Engineers, Япония, 30 апреля 2010 года.
<Способ псевдоконтролируемого охлаждения>
0
m
0
f
0
m
0
f
Термин “способ псевдоконтролируемого охлаждения”, используемый в настоящем описании, означает дословно способ охлаждения, искусственным образом напоминающий описанный выше способ контролируемого охлаждения, где температура жидкости “T” не строго изменяется относительно времени “t” в соответствии с формулой [7] выше, и более конкретно он означает способ охлаждения, где температуре жидкости “T” дают линейно или постепенно снижаться относительно времени “t” для поддержания варьирования (T-T) температуры жидкости “T” в момент времени “t=τ/2” так, чтобы оно составляло по меньшей мере 5%, но менее 50%, от общего изменения температуры (T-T), предпочтительно, по меньшей мере 10%, но менее 30%, поскольку при варьировании, зависящем от содержания затравочных кристаллов, чистоты, концентрации и степени перенасыщения (T-T), температуры жидкости “T” в момент времени “t=τ/2” так, чтобы она составляла по меньшей мере 5%, но менее 50% от общего изменения температуры (T-T), температура жидкости “T” обеспечивает постепенное снижение количества 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в растворе, содержащем 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, используемый в кристаллизации, является предпочтительным, чтобы кристаллические ядра были практически полностью сформированы за операционное время “t=τ/2” (средняя точка стадии кристаллизации). В этом случае, температуре жидкости “T” дают линейно или постепенно снижаться относительно времени “t” так, чтобы скорректировать варьирование (исследование времени “t” на ранней фазе кристаллизации, при которой температура жидкости является относительно высокой, в то время как температура жидкости “T” быстро снижается против времени “t” на последующей фазе стадии кристаллизации, при которой температура жидкости является сниженной до некоторой степени). В результате, он может быть в некоторой степени хуже, чем приведенный выше способ контролируемого охлаждения, однако способ псевдоконтролируемого охлаждения обеспечивает по существу те же преимущества, что и способ контролируемого охлаждения, где способ псевдоконтролируемого охлаждения обеспечивает предоставление утфеля, содержащего кристаллы с меньшим количеством микрокристаллов и единообразным размером частиц.
0
m
0
f
0
m
0
f
Конкретно, например, температуре жидкости “T” дают линейно или постепенно снижаться относительно времени “t” путем деления операционного времени “τ” по меньшей мере на две и, предпочтительно, по меньшей мере на три зоны, и затем в зоне ранней фазы стадии кристаллизации давая возможность градиенту температуры при охлаждении постепенно снизиться (для замедления скорости охлаждения); и поскольку это изменяет раннюю фазу или среднюю фазу на последующую фазу, давая возможность градиенту температуры увеличиться (для ускорения скорости охлаждения), чтобы обеспечить варьирование (T-T) температуры жидкости “T” в момент времени “t=τ/2”, составляющее по меньшей мере 5%, но менее 50% от общего изменения температуры (T-T), предпочтительно, по меньшей мере 10%, но менее 30%. В случае, когда варьирование (T-T) температуры жидкости “T” в момент времени “t=τ/2” составляет по меньшей мере 50% от общего изменения температуры (T-T), скорость охлаждения в ранней фазе стадии кристаллизации является настолько высокой, что может произойти быстрое увеличение степени перенасыщения путем охлаждения, с образованием вторичных кристаллических ядер; в то время как в случае варьирования менее 5%, скорость охлаждения в ранней фазе стадии кристаллизации является слишком медленной, чтобы перейти на последующую фазу стадии кристаллизации, где быстрое охлаждение начинается до завершения достаточного образования кристаллов из добавленных затравочных кристаллов в качестве кристаллических ядер. В любом случае, становится невозможно получить утфель, содержащий кристаллы с меньшим количеством микрокристаллов и единообразным размером частиц.
0
m
0
f
Для проведения способа контролируемого охлаждения, как описано выше, температура жидкости “T” должна изменяться как функция времени “t”, согласно формуле [7], и являются необходимыми устройство или кристаллизатор, которые контролируют температуру жидкости по заданной программе; однако в соответствии со способом псевдоконтролируемого охлаждения, температура жидкости “T” может линейно или постепенно снижаться относительно времени “t”, так чтобы скорректировать варьирование (T-T) температуры жидкости “T” в момент времени “t=τ/2” до уровня по меньшей мере 5%, но менее 50%, от общего изменения температуры (T-T), предпочтительно, по меньшей мере 10%, но менее 30%, так что такой способ псевдоконтролируемого охлаждения имеет преимущество в том, что его можно легко осуществить в случае, когда отсутствует оборудование, которое точно контролирует температуру жидкости.
2. Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный способом по настоящему изобретению
Ниже поясняется композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный способом по настоящему изобретению.
<Содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и других примесей>
Как описано выше, композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный способом по настоящему изобретению, представляет собой композицию, которая содержит 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в количестве, в расчете на массу сухого твердого вещества, более 98,0%, но менее 99,9%. В предпочтительном варианте осуществления описанная выше композиция в форме частиц содержит L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу, полученную из исходных материалов, и имеет способность к восстановлению более 0% но менее 1%. Как хорошо известно, поскольку L-аскорбиновая кислота и D-глюкоза имеют способность к восстановлению и они индуцируют окрашивание коричневым цветом при нагревании в присутствии соединения с внутримолекулярной аминогруппой, такого как аминокислоты и белки, эти вещества предпочтительно не включаются в безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в качестве продукта. Однако, например, в случае получения композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты путем стадии обеспечения воздействия фермента, такого как CGT-аза, на раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту, в большем или меньшем количестве, как неизмененная L-аскорбиновая кислота, так и D-глюкоза, полученная из материала разжиженного крахмала или декстрина, неизбежно включаются в виде примесей реакции в композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в качестве продукта. Например, поскольку в общепринятом порошке категории лечебно-профилактической косметики общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы, содержащейся в ней, может достичь даже приблизительно одного процента, м.с.в., то, когда порошок используют в качестве пищевого материала, может индуцироваться неожиданное окрашивание коричневым цветом.
В способах согласно настоящему изобретению неизбежно неминуемое включение L-аскорбиновой кислоты и/или D-глюкозы является приемлемым, и в композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, способность к восстановлению всей композиции в форме частиц контролируется на уровне ниже 1%, и, в частности, выше 0%, но ниже 1%. Как показано в описанном ниже эксперименте, в случае получения композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты способом согласно настоящему изобретению, способность к восстановлению всей композиции в форме частиц можно легко корректировать до более 0% но менее 1%. Даже несмотря на то, что композиция в форме частиц содержит L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу, она по существу не индуцирует окрашивание в коричневый цвет, даже при нагревании в присутствии соединения с внутримолекулярной аминогруппой, такого как аминокислоты и белки, когда способность к восстановлению всей композиции в форме частиц выше 0%, но ниже 1%. Таким образом, композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая содержит L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу и имеет способность к восстановлению всей композиции в форме частиц выше 0%, но ниже 1%, имеет преимущество в том, что ее можно смешивать с пищевыми продуктами, косметикой, лечебно-профилактической косметикой и фармацевтическими препаратами, как правило, без угрозы возникновения окрашивания или изменения цвета. Кроме того, в случае, когда способность к восстановлению всей композиции в форме частиц составляет менее 1%, содержание L-аскорбиновой кислоты, содержащейся в ней, не превышает 0,1%, м.с.в.
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный способом по настоящему изобретению, содержит L-аскорбиновую кислоту в количестве не более 0,1%, м.с.в., в частности, выше 0%, но не выше 0,1%. Поскольку L-аскорбиновую кислоту используют в пищевых продуктах и т.д. в качестве антиоксиданта или раскислителя, она является высокочувствительной к воздействию кислорода. Таким образом, считается, что при нагревании в присутствии соединения с внутримолекулярной аминогруппой(ами) L-аскорбиновая кислота не только индуцирует окрашивание в коричневый цвет, но прочно взаимосвязана с окрашиванием композиции в форме частиц, содержащей саму L-аскорбиновую кислоту. В действительности, как показано в описанном ниже эксперименте, порошок категории лечебно-профилактической косметики содержит приблизительно 0,2% L-аскорбиновой кислоты, и, исходя из данных авторов настоящего изобретения, такой порошок категории лечебно-профилактической косметики часто вызывает явление самопроизвольного окрашивания в светло-коричневый цвет при хранении в течение относительно длительного периода времени в указанной выше форме продукта. Напротив, в случае содержания L-аскорбиновой кислоты в композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, составляющего выше 0%, но ниже 0,1%, отсутствует угроза, что композиция в форме частиц сама по себе окрасится в светло-коричневый цвет, даже при хранении в течение относительно длительного периода времени в форме продукта, сходной с формой продукта для порошка категории лечебно-профилактической косметики. Согласно способу настоящего изобретения, можно относительно легко довести содержание L-аскорбиновой кислоты в композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, до уровня выше 0%, но не выше 0,1%, без увеличения стоимости изготовления, путем последовательного использования колоночной хроматографии с использованием анионообменной смолы для удаления сахаридов, таких как D-глюкоза, и колоночной хроматографии с использованием катионообменной смолы или пористой обменной смолы на стадии очистки, в частности, в случае использования колоночной хроматографии с псевдодвижущимся слоем с использованием катионообменной смолы.
<Степень кристалличности и средний диаметр кристаллитов>
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный способом по настоящему изобретению, имеет степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 90%, при вычислении на основе профиля порошковой рентгеновской дифракции композиции в форме частиц, и имеет средний диаметр кристаллитов по меньшей мере 1400 Å, но менее 1710 Å. Как показано в представленных ниже экспериментах, композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты по настоящему изобретению, которая имеет описанные выше уровни степени кристалличности и средний диаметр кристаллитов, имеет по существу тот же уровень чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, т.е. содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., или не достигает чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, как в порошке категории реагентов, однако, она имеет такие характеристики, что она значительно труднее слеживается, по сравнению с порошком категории лечебно-профилактической косметики, и по сравнению с порошком категории реагентов, она имеет более высокую растворимость в гидрофильных растворителях, широко используемых в косметике и лечебно-профилактической косметики.
<Распределение размера частиц>
В предпочтительном варианте осуществления композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный способом по настоящему изобретению, она имеет содержание частиц с размером частиц менее 150 мкм, составляющее 70% или более от всей композиции в форме частиц, и имеет содержание частиц с размером частиц 53 мкм или более, но менее 150 мкм, составляющее от 40 до 60% от всей композиции в форме частиц. Поскольку композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты по настоящему изобретению, можно, например, легко контролировать в пределах указанного выше распределения размера частиц, требуемого для материалов для пищевых продуктов, и т.д., она имеет преимущество в том, что ее можно использовать в качестве материала для пищевых продуктов, пищевых добавок, косметики, лечебно-профилактической косметики или фармацевтических препаратов, аналогично общепринятым композициям, без изменения каких-либо общепринятых стадий получения или требований к материалам.
3. Способ получения композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты по настоящему изобретению
Ниже объясняется способ получения композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты по настоящему изобретению.
Способ получения композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты по настоящему изобретению, в основном, включает следующие стадии (a)-(e):
(a) стадию обеспечения воздействия CGT-азы на раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту, и затем обеспечения воздействия глюкоамилазы на полученную смесь с образованием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с получением раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в качестве реакционной смеси после обработки глюкоамилазой с выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 27%,
(b) стадию очистки раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с получением содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты более 86% по массе, м.с.в.;
(c) стадию осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты из очищенного раствора с содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты более 86% по массе, м.с.в., способом контролируемого охлаждения или способом псевдоконтролируемого охлаждения;
(d) стадию сбора осажденного безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты; и
(e) стадию выдерживания, сушки и необязательно измельчения собранного безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты без растворения и перекристаллизации с получением композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая имеет содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, в расчете на массу сухого твердого вещества, более 98,0% по массе, но менее 99,9% по массе, и имеет степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 90%, при вычислении в расчете на профиль анализа порошковой рентгеновской дифракции композиции в форме частиц.
Ниже поясняется каждая стадия:
<Стадия (a)>
Стадия (a) предназначена для увеличения выхода продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в реакционном растворе до уровня по меньшей мере 27%, путем обеспечения воздействия CGT-азы на раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту, и затем обеспечения воздействия глюкоамилазы на полученную смесь. Сначала поясняются используемые материалы и ферменты, и затем поясняются используемые ферментативные реакции.
A. Используемые материалы и ферменты
(L-Аскорбиновая кислота)
Примеры L-аскорбиновой кислоты, используемой в настоящем изобретении, включают любую форму гидроксикислоты и ее соли с металлом, такую как соли щелочных металлов и их соли щелочноземельных металлов, и даже можно без труда использовать их смеси.
(Разжиженный крахмал или декстрин)
Примеры разжиженного крахмала или декстрина, используемого в настоящем изобретении, включают разжиженный крахмал или декстрин, которые получают путем разжижения картофельного крахмала, крахмала сладкого картофеля, крахмала тапиоки, кукурузного крахмала, пшеничного крахмала и т.д., термостабильной α-амилазой. При проведении такой ферментативной реакции CGT-азу можно использовать в комбинации, например, с ферментом, расщепляющим разветвленную структуру(ы) крахмала, такого как изоамилаза (EC 3.2.1.68) и пуллуланаза (EC 3.3.1.41) для расщепления разветвленной структуры по участкам ветвления крахмала. Такой разжиженный крахмал и декстрин являются пригодными материалами для массовой продукции в промышленном масштабе по сравнению с циклодекстринами и амилозами.
(CGT-аза)
Примеры CGT-азы (EC 2.4.1.19), используемой в настоящем изобретении, включают любую из CGT-аз природного происхождения, CGT-азы, которые получают рекомбинантной технологией, и мутантные ферменты, получаемые внесением модификации, состоящей в замене, вставке или делеции аминокислоты(аминокислот) в природные или рекомбинантные ферменты, без конкретного ограничения их происхождения и источников, при условии, что они образуют 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с выходом продуцирования по меньшей мере 27%, когда им обеспечивают возможность воздействовать отдельно или в комбинации с ферментом, расщепляющим разветвленную структуру крахмала, на раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту, и затем глюкоамилазе обеспечивают возможность воздействовать на полученную смесь.
Согласно изобретению авторов настоящего изобретения, CGT-азы, которые образуют 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с выходом продуцирования по меньшей мере 27%, когда им обеспечивают возможность воздействовать отдельно или в комбинации с ферментом, расщепляющим разветвленную структуру крахмала, на раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту, и затем глюкоамилазе обеспечивают возможность воздействовать на полученную смесь, обычно имеют следующие общие неполные аминокислотные последовательности, соответствующие (a)-(d):
1
(a) Asn-Glu-Val-Asp-X-Asn-Asn;
2
(b) Met-Ile-Gln-X-Thr-Ala;
(c) Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile и
3
(d) Val-X-Ser-Asn-Gly-Ser-Val,
1
2
3
(где X означает Pro или Ala, X означает Ser или Asp, и X означает Ser или Gly, соответственно)
Примеры таких CGT-аз включают, например, CGT-азы, которые представляют собой природные или рекомбинантные ферменты, полученные из микроорганизмов вида Geobacillus stearothermophilus и Thermoanaerobacter thermosulfirigenes, и конкретные их примеры включают CGT-азу, полученную из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91, т.е. CGT-азу, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, мутанты CGT-азы, полученные путем внесения модификации посредством замены, вставки или делеции аминокислоты(аминокислот) с помощью рекомбинантной технологии в аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, т.е. мутант CGT-азы, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или 5, CGT-азу, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, полученную из микроорганизма вида Thermoanaerobacter thermosulfirigenes, и мутанты этих CGT-аз.
Описанный выше штамм Tc-91 Geobacillus stearothermophilus представляет собой микроорганизм, описанный в патенте Японии Kokai № 63189/75 (публикация патента Японии № 27791/78), на имя того же заявителя, что и заявитель настоящего изобретения, и он был депонирован местно 30 июля 1973 года под номером доступа FERM-P 2225, и в настоящее время он депонирован в International Patent Organism Depositary в National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japan, под номером доступа FERM BP-11273. Например, известно, что CGT-аза, полученная из штамма Tc-91 Geobacillus stearothermophilus, имеет молекулярную массу приблизительно 68000 дальтон и имеет более сильное действие переноса сахарида, чем CGT-азы, полученные из других микроорганизмов. Ген указанной выше CGT-азы клонирован, и аминокислотная последовательность зрелой CGT-азы (аминокислотная последовательность SEQ ID NO:1) была определена, исходя из нуклеотидной последовательности (нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:2) гена, и известно, что существует четыре консервативных области, признанных в качестве обычно существующих в ферментах, классифицируемых как семейство α-амилаз, на аминокислотной последовательности CGT-азы. Трехмерная конформация CGT-азы уже была установлена с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллов. Было выявлено три каталитических остатка CGT-азы, т.е. аспарагиновая кислота в положении 225 (D225), глутаминовая кислота в положении 253 (E253) и аспарагиновая кислота в положении 324 (D324) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 (см., например, “Kogyo-yo-Toshitsu-Koso-Handbook” (Справочник промышленных ферментов для сахаридов), под редакцией Kodansha Scientific Ltd., Tokyo, Japan, опубликованная Kodansha Ltd., Tokyo, Japan, pp. 56-63, 1999).
Конкретные примеры CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Thermoanaerobacter thermosulfirigenes, включают “TORUZYME 3.0L”, название продукта для фермента, изготавливаемого в качестве рекомбинантного фермента CGT-азы, полученного из описанного выше микроорганизма, производимого Novozymes Japan Ltd., Tokyo, Япония. Также выявлены физико-химические свойства и аминокислотная последовательность CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Thermoanaerobacter thermosulfirigenes.
(Фермент, расщепляющий разветвленную структуру крахмала)
Когда CGT-азе обеспечивают возможность воздействовать на раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту, можно в комбинации с ней использовать фермент, расщепляющий разветвленную структуру крахмала, для увеличения выхода продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. В качестве предпочтительного фермента, расщепляющего разветвленную структуру крахмала, особенно предпочтительной является изоамилаза, поскольку ею легко манипулировать с точки зрения ее ферментативной активности, субстратной специфичности и т.д. Примеры такой изоамилазы включают, например, изоамилазы, которые получены из микроорганизмов вида Pseudomonas amyloderamosa, Bacillus sp., Flavobacterium sp., и мутантные изоамилазы, полученные путем генетической модификации генов указанных выше микроорганизмов. Можно использовать “GODO-FIA”, название продукта препарата изоамилазы, изготавляемого Godo Shusei Co., Ltd., Tokyo, Япония, в качестве изоамилазы, полученной из микроорганизма вида Flavobacterium odoratum.
Примеры пуллуланазы включают пуллуланазы, которые получены из микроорганизмов вида Bacillus sp., Bacillus acidopullulyticas, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes, Flavobacterium pennivorans и Enterobacter aerogenes.
<Глюкоамилаза>
Можно использовать любые глюкоамилазы (EC 3.2.1.3) без ограничения, независимо от их происхождения и источников, и они включают глюкоамилазы в форме природного фермента и глюкоамилазы, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК, при условии, что образуется 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, когда CGT-азе обеспечивают возможность воздействовать на раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту, и затем глюкоамилазе обеспечивают возможность воздействовать на полученную смесь.
Поскольку глюкоамилазу обычно добавляют в раствор ферментативной реакции после нагревания раствора для остановки реакции переноса сахарида CGT-азой, желательны такие глюкоамилазы, которые могут проявлять ферментативную активность, достаточную для фактического применения относительно высокой температуры, например, приблизительно от 40°C до приблизительно 60°C, чтобы сохранить энергию и время, требуемые для охлаждения раствора ферментативной реакции после нагревания. Когда глюкоамилаза, подлежащая применению, содержит α-глюкозидазу, образовавшийся 2-глюкозид аскорбиновой кислоты будет гидролизоваться, и, таким образом, желательно использовать глюкоамилазы, по существу свободные от α-глюкозидазы. Можно использовать любые глюкоамилазы, независимо от их источников и чистоты, при условии, что они удовлетворяют описанным выше требованиям, например, коммерческий препарат глюкоамилазы, полученный из микроорганизма рода Rhizopus ("GLUCOZYME #20000", название продукта фермента, от фирмы Nagase ChemteX Corp., Osaka, Япония); и предпочтительно можно использовать препарат фермента, полученный из микроорганизма рода Aspergillus ("GLUCZYME AF6", название продукта фермента, выпускаемого Amano Enzyme Inc., Aichi, Япония).
B. Ферментативные реакции
Ниже объясняется реакция переноса сахарида на L-аскорбиновую кислоту. CGT-азе обеспечивают возможность воздействовать на раствор, обычно водный раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту. Когда CGT-азе обеспечивают возможность воздействовать на водный раствор, содержащий либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту, один или более остатков D-глюкозы переносятся на гидроксильную группу в положении C-2 L-аскорбиновой кислоты, что приводит к образованию 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, где один остаток D-глюкозы связан с гидроксильной группой в описанном выше положении C-2, и других α-гликозил-L-аскорбиновых кислот, таких как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота и 2-O-α-мальтотетраозил-L-аскорбиновая кислота, которая имеет по меньшей мере два остатка D-глюкозы, связанных с гидроксильной группой, в указанном выше положении C-2.
CGT-азу обычно добавляют в водный раствор, который обычно получают путем растворения либо разжиженного крахмала, либо декстрина и L-аскорбиновой кислоты в воде с получением концентрации субстрата от 1 до 40%, с содержанием от 1 до 500 единиц/г субстрата, и затем проводят ферментативную реакцию при pH приблизительно от 3 до приблизительно 10 и температуре от 30 до 70°C в течение по меньшей мере шести часов, предпочтительно, приблизительно от 12 до приблизительно 96 часов. Поскольку L-аскорбиновая кислота является чувствительной к окислению, раствор предпочтительно следует держать в анаэробных или восстанавливающих условиях в ходе ферментативной реакции, при защите от света и необязательно совместном присутствии, например, восстановителя, такого как тиомочевина или сероводород в реакционном растворе.
Соотношение по массе, м.с.в., либо разжиженного крахмала, либо декстрина и L-аскорбиновой кислоты в растворе предпочтительно должно составлять от 8:2 до 3:7. Когда соотношение L-аскорбиновой кислоты и разжиженного крахмала или декстрина превышает описанный выше диапазон, эффективно протекает перенос сахарида на L-аскорбиновую кислоту; однако выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты ограничен исходной концентрацией L-аскорбиновой кислоты, чтобы она оставалась на относительно низком уровне. Хотя, когда доля L-аскорбиновой кислоты превышает указанный выше диапазон, неизмененная L-аскорбиновая кислота будет оставаться в значительном количестве, и это не является предпочтительным для продуцирования в промышленном масштабе. Таким образом, наилучшим считается указанный выше диапазон соотношений.
В дополнение к CGT-азе, в случае применения изоамилазы в качестве фермента, расщепляющего разветвленную структуру крахмала, такой изоамилазе предпочтительно следует обеспечивать возможность воздействовать либо на разжиженный крахмал, либо на декстрин, в совместном присутствии с CGT-азой в растворе, содержащем либо разжиженный крахмал, либо декстрин и L-аскорбиновую кислоту, где количество изоамилазы, подлежащее добавлению, обычно составляет от 200 до 2500 единиц/г субстрата, и его подвергают ферментативной реакции при температуре 55°C или ниже, варьируя, в зависимости от типа, оптимальной температуры и оптимального pH используемой изоамилазы. Когда пуллуланазу используют в качестве фермента, расщепляющего разветвленную структуру крахмала, его обычно можно использовать в количестве от 1 до 500 единиц/г субстрата в соответствии со случаем изоамилазы.
После полного завершения ферментативной реакции с CGT-азой отдельно или вместе с ферментом, расщепляющим разветвленную структуру крахмала, полученный ферментативный реакционный раствор сразу нагревают для инактивации CGT-азы отдельно или вместе с ферментом, расщепляющим разветвленную структуру крахмала, для остановки ферментативной реакции(й), и затем обеспечивают возможность воздействовать глюкоамилазы на полученный ферментативный реакционный раствор. Под действием глюкоамилазы, цепь из двух или более остатков D-глюкозы, связанных с гидроксильной группой в положении C-2 L-аскорбиновой кислоты, расщепляют для преобразования α-гликозил-L-аскорбиновых кислот, таких как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота и 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота, в 2-глюкозид аскорбиновой кислоты.
<Стадия (b)>
Стадия (b) предназначена для очистки раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный на описанной выше стадии (a), для увеличения содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до более чем 86%, м.с.в.; раствор, содержащий 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный на стадии (a), обесцвечивают активированным углем, и т.д., фильтруют, и затем обессоливают полученный фильтрат с помощью катионообменной смолы и подвергают обессоленный раствор колоночной хроматографии для очистки раствора с получением содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, в расчете на массу сухого твердого вещества, более 86%, предпочтительно, 88% или более. В качестве колоночной хроматографии, используемой для такой очистки, можно использовать по существу любой тип колоночной хроматографии, при условии, что она увеличивает содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в растворе до более чем 86%, м.с.в., однако ее предпочтительными примерами являются колоночная хроматография с использованием катионообменной смолы или пористой смолы, которая следует после колоночной хроматографии с использованием анионообменной смолы для удаления сахаридов, таких как D-глюкоза. Примеры желаемых анионообменных смол для удаления сахаридов, таких как D-глюкоза, включают смолы, такие как “AMBERLITE IRA411S” и “AMBERLITE IRA478RF” (обе из которых производятся Rohm & Hass Company, Philadelphia, США); и “DIAION WA30” (производимая Mitsubishi Chemical Corp., Tokyo, Япония). Примеры желаемых катионообменных смол для отделения 2-глюкозида аскорбиновой кислоты от L-аскорбиновой кислоты включают “DOWEX 50WX8” (производимая Dow Chemical Co., Midland, США); “AMBERLITE CG120” (производимая Rohm & Hass Company, Philadelphia, США); “XT-1022E” (производимая Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Япония); и “DIAION SK104” и “DIAION UBK 550” (оба из которых производятся Mitsubishi Chemical Corp., Tokyo, Япония). Примеры желаемых пористых смол включают смолы, такие как “TOYOPEARL HW-40” (производимая Tosoh Corp., Tokyo, Япония); и “CELLFINE GH-25” (производимая Chisso Corp., Tokyo, Япония). В случае проведения колоночной хроматографии с использованием катионообменной смолы или пористой смолы, предпочтительными условиями являются следующие: концентрация твердого вещества в растворе материала, подлежащем добавлению в колонку, составляет приблизительно от 10 до приблизительно 50%, м.с.в., объем нагрузки смолы составляет приблизительно от 1/1000 до приблизительно 1/20 от объема влажной смолы, и очищенную воду в количестве, приблизительно равном объему влажной смолы, подают в колонку с линейной скоростью от 0,5 до 5 м/час. Среди них, в случае использования хроматографии с псевдодвижущимся слоем, такой как колоночная хроматография с использованием катионообменной смолы, такая колоночная хроматография является предпочтительной, поскольку она увеличивает чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в полученном очищенном продукте и снижает количество примесей, таких как L-аскорбиновая кислота и D-глюкоза, в частности, она уменьшает содержание L-аскорбиновой кислоты и обеспечивает композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с содержанием L-аскорбиновой кислоты только 0,1% или ниже, м.с.в. В качестве справочной информации, при варьировании в зависимости от операционной температуры и заданной скорости потока, предпочтительными условиями элюирования для хроматографии с псевдодвижущимся слоем, где катионообменную смолу используют в качестве упаковочного материала, являются следующие: концентрация раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, подаваемого в указанную выше колоночную хроматографию, составляет 60% или ниже; объем загрузки раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, составляет 1/20 объема или менее от объема влажной смолы; и объем очищенной воды, используемой в качестве элюента, вплоть до 30 раз по объему, обычно приблизительно от 3 до приблизительно 20 раз по объему, превышает указанный выше объем загрузки.
Когда содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., в растворе составляет 86% или ниже, трудно получить композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, имеющий степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 90%, даже после прохождения через последующие стадии (c)-(e). Полагают, что причина состоит и том, что, когда содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., в растворе составляет 86% или ниже, чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в полученной композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный посредством последующих стадий, является относительно низким и это препятствует его плавной кристаллизации.
Раствор, очищенный до получения содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, в расчете на массу сухого твердого вещества, более 86%, предпочтительно, 88% или более, концентрируют вплоть до получения предусмотренной концентрации, обычно концентрации приблизительно от 65 до приблизительно 85% 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, перед стадией кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозид аскорбиновой кислоты. Температура концентрата обычно контролируется приблизительно от 30 до приблизительно 45°C. Концентрат с такой концентрацией и температурой соответствует раствору 2-глюкозида аскорбиновой кислоты со степенью перенасыщенности от 1,05 до 1,50.
<Стадия (c)>
0
m
0
f
Стадия (c) предназначена для осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты из раствора, содержащего более 86%, предпочтительно, 88% или более, м.с.в., 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, способом контролируемого охлаждения или способом псевдоконтролируемого охлаждения; раствор, содержащий 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который был ранее очищен и концентрирован до заданной чистоты и концентрации, и температуру которого контролировали на заданном уровне на стадии (b), переносят в кристаллизатор, смешивают с 0,1-5% (масс./об.), предпочтительно, от 0,5 до 2% (масс./об.) затравочных кристаллов безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и осторожно перемешивают, с последующим постепенным снижением температуры жидкости на ранней фазе стадии кристаллизации и быстрым снижением температуры жидкости на последующей стадии кристаллизации способом контролируемого охлаждения или способом псевдоконтролируемого охлаждения для достижения кристаллизации. Хотя время, требуемое для кристаллизации, варьирует в зависимости от содержания затравочных кристаллов 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, подлежащих добавлению, например, в случае способа псевдоконтролируемого охлаждения, общее время, требуемое для кристаллизации, можно подразделить по меньшей мере на две зоны, предпочтительно, по меньшей мере на три зоны, где в каждой зоне температуре жидкости дают возможность снизиться приблизительно линейным образом относительно времени, температура жидкости “T” предпочтительно должна снижаться линейно или постепенно относительно времени “t” так, чтобы дать возможность варьирования (T-T) температуры жидкости “T” в момент операционного времени “t=τ/2” (в средней точке стадии кристаллизации), так чтобы оно составляло по меньшей мере 5%, но менее 50%, предпочтительно, по меньшей мере 10%, но менее 30%, от общего изменения температуры (T-T). Например, когда кристаллы осаждают путем охлаждения раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, от 40°C до 15°C в течение 48 часов, время охлаждения можно подразделить на две зоны: 36 и 12 часов, где раствор предпочтительно охлаждают от 40°C до 30°C в течение 36 часов, и затем охлаждают от 30°C до 15°C в течение 12 часов, или раствор также предпочтительно охлаждают от 40°C до 35°C в течение 30 часов, и затем охлаждают от 35°C до 15°C в течение 18 часов. Более предпочтительно, время охлаждения можно подразделить на три зоны: 24, 12 и 12 часов, где раствор предпочтительно последовательно охлаждают от 40°C до 35°C на протяжении 24 часов в первой зоне, охлаждают от 35°C до 27,5°C на протяжении 12 часов в следующей зоне, и затем охлаждают от 27,5°C до 15°C на протяжении 12 часов в последней зоне.
Таким образом, согласно способу контролируемого охлаждения или способу псевдоконтролируемого охлаждения, можно получать утфель, который легко образует микрокристаллы безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и содержит кристаллы по существу с однородным диаметром кристаллов, по сравнению со способом кристаллизации, где раствор охлаждается естественным путем без контролирования температуры. Как описано далее, полученная композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, имеет характерные признаки наличия как более высокой чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, так и более высокой степени кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, что является важным показателем слеживания по сравнению с порошком, полученным способом естественного охлаждения. В случае способа контролируемого охлаждения или способа псевдоконтролируемого охлаждения, они имеют преимущество в получении композиции в форме частиц с однородным распределением размера частиц, относительно порошка, полученного способом кристаллизации с естественным охлаждением.
<Стадия (d)>
Данная стадия предназначена для сбора кристаллизованного безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты из утфеля, полученного на стадии кристаллизации (c) в соответствии с общепринятым разделением твердое вещество-жидкость. Собранный безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты промывают распылением на него (орошения) небольшого количества воды для удаления аморфного сиропа, адсорбированного на поверхности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Предпочтительное количество очищенной воды, используемой для такого распыления, обычно составляет по меньшей мере 3%, но вплоть до 10%, массы утфеля до центрифугирования. Более конкретно, когда количество очищенной воды, используемой для промывания, составляет менее 3%, достаточное промывание можно не проводить и все еще остается аморфный сироп, что приводит к угрозе получения 2-глюкозида аскорбиновой кислоты требуемой чистоты. Напротив, когда количество очищенной воды, используемой для промывания, превышает 10%, количество безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, подлежащего растворению и удалению путем промывания, увеличивается, и это приводит к угрозе снижения выхода кристаллов.
<Стадия (e)>
Стадия (e) предназначена для выдерживания, сушки и необязательно измельчения собранного безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты без его растворения и перекристаллизации; безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, собранный центрифугированием, промывают небольшим количеством очищенной воды, такой как деионизированная вода и дистиллированная вода, для смывания примесей, адсорбированных на поверхности кристаллов. Содержание воды, используемой для промывания, не должно быть конкретно ограничено, однако чрезмерное содержание воды непосредственно растворяет кристаллы, а также примеси, что приводит к снижению выхода и увеличению стоимости воды для промывания. Таким образом, поверхность кристаллов обычно предпочтительно промывают водой в количестве вплоть до 30%, предпочтительно, от 15 до 25% по массе кристаллов. Кристаллы, промытые таким образом, выдерживают и сушат выдерживанием их в атмосфере с заданной температурой и влажностью в течение заданного периода времени для преобразования в композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты. Хотя температура продукта композиции в форме частиц, содержащей кристаллы, относительная влажность атмосферы и время стадий выдерживания и сушки не должны быть конкретно ограничены, при условии, что получают композицию в форме частиц с желаемой степенью кристалличности, температуру продукта и относительную влажность атмосферы предпочтительно следует поддерживать при температуре от 20 до 55°C и относительной влажности от 60 до 90%, соответственно, на стадиях выдерживания и сушки. Общее время стадий выдерживания и сушки предпочтительно составляет приблизительно от 5 до приблизительно 24 часов. Композицию в форме частиц, содержащую кристаллы, полученные с помощью стадий выдерживания и сушки, естественным образом охлаждают до температуры окружающей среды, или ее также можно преимущественно охлаждать принудительно, продувая чистым воздухом, имеющим температуру, приблизительно равную температуре окружающей среды, до достижения температуры продукта, приблизительно равной температуре окружающей среды. Кристаллический порошок, полученный таким образом, преобразовывают в конечный продукт с необязательным измельчением или без него.
Описанные выше стадии (a)-(e), за исключением стадии кристаллизации способом контролируемого охлаждения или способом псевдоконтролируемого охлаждения в описанной выше стадии (d), в основном являются такими же, как и стадии получения порошков категории лечебно-профилактической косметики, и они не имеют каких-либо стадий перекристаллизации и многократного промывания кристаллов, обе из которых необходимы для стадий получения порошков категории реагентов.
Порошок, полученный таким образом, представляет собой композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который содержит 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в количестве, в расчете на массу сухого твердого вещества, более 98,0%, но менее 99,9%, имеет степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 90%, при вычислении на основе профиля порошковой рентгеновской дифракции композиции в форме частиц, более предпочтительно, содержит 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в количестве, в расчете на массу сухого твердого вещества, более 98,0%, но менее 99,9%, имеет степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 90% при вычислении на основе профиля порошковой рентгеновской дифракции композиции в форме частиц, содержит L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу, полученную из материалов, содержит L-аскорбиновую кислоту в количестве 0,1% или ниже, м.с.в., и имеет способность к восстановлению всей композиции в форме частиц менее одного процента. Поскольку композиция в форме частиц труднее слеживается даже в условиях, где общепринятые порошки категории лечебно-профилактической косметики слеживаются, то композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты значительно труднее слеживается, по сравнению с общепринятыми порошками категории лечебно-профилактической косметики. Кроме того, по сравнению с порошками категории реагентов, композиция в форме частиц имеет преимущество в том, что имеет преимущественную растворимость в гидрофильных растворителях, широко используемых в косметике и лечебно-профилактической косметики.
Поскольку композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный способом по настоящему изобретению, значительно труднее слеживается, по сравнению с общепринятыми порошками лечебно-профилактической косметики, она имеет преимущество в том, что ее можно безопасно включать в один или более других порошковых материалов для продуктов питания, пищевых добавок, косметики, лечебно-профилактической косметики и фармацевтических препаратов в области производства пищевых продуктов, включая напитки, а также косметики, лечебно-профилактической косметики и фармацевтических препаратов, которые получают на производственных предприятиях, которые построены с условиями, что будут использоваться порошковые материалы.
Следующие эксперименты конкретно объясняют настоящее изобретение:
<Эксперимент 1: Эффект степени кристалличности на слеживание композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Композиции в форме частиц, которые содержат безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с различными степенями кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в диапазоне от 0 до 100%, получали и исследовали в отношении слеживания для исследования взаимосвязи между степенью кристалличности и слеживанием. Деталями является следующее:
<Эксперимент 1-1: Получение тестируемых образцов>
<Тестируемый образец 1>
В качестве исследуемого образца 1 использовали “ASCORBIC ACID 2-GLUCOSIDE 999” (код №: AG124, чистота: по меньшей мере 99,9%), название продукта для композиции в форме частиц категории реагентов, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, по существу состоящей из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, в качестве стандартного образца.
<Тестируемый образец 2>
Композицию в форме частиц, по существу состоящую из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, полученную путем растворения тестируемого образца 1 в достаточном количестве очищенной воды, сублимационной сушки полученного раствора в течение трех суток, и сушки полученного вещества в вакууме при температуре 40°C или ниже в течение ночи, использовали в качестве стандартного образца, по существу состоящего из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, для применения в качестве “тестируемого образца 2”. Тестируемый образец 2 имел содержание влаги 2,0% при измерении способом Карла Фишера.
<Тестируемые образцы 3 и 4>
В качестве тестируемых образцов 3 и 4 получали образцы, которые имели степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, находящуюся между степенями кристалличности тестируемых образцов 1 и 2, по следующей методике: композицию в форме частиц, состоящую из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, которая получена аналогично тестируемому образцу 2, распределяли на металлические лотки и частично кристаллизовали путем помещения их в камеру с постоянной температурой и влажностью, контролируемую при температуре 25°C, и относительной влажности 90% на 24 или 72 часа для ускорения кристаллизации. Металлические лотки последовательно извлекали из камеры и сушили в вакууме при 38°C в течение ночи с получением двух типов композиций в форме частиц, где одну из них со временем содержания 24 часов в камере с постоянной температурой и влажностью, назвали “тестируемым образцом 3”, а другую - с временем содержания 72 часа, называли “тестируемым образцом 4”. Кроме того, тестируемые образцы 3 и 4 соответственно помещали во флаконы, закрывали крышками и хранили вместе с осушителем в сушильном шкафу в герметичных условиях до момента времени непосредственно перед их аналитическим тестированием.
Эксперимент 1-2: Чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и степень кристалличности тестируемых образцов 1-4
<Чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты>
Чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в тестируемых образцах 1-4 определяли следующим образом: с использованием очищенной воды каждый из тестируемых образцов 1-4 приготавливали в виде 2% раствора, который затем фильтровали с использованием 0,45-мкм мембранного фильтра. Каждый из фильтратов подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в представленных ниже условиях, с последующим вычислением чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., для каждого из тестируемых образцов, основываясь на площади пика, наблюдаемого на хроматограмме с помощью дифференциального рефрактометра. Результаты представлены в таблице 1.
Условия анализа
Система ВЭЖХ: “LC-10AD”, производимая Shimadzu Corp., Kyoto, Япония;
дегазатор: “DGU-12AM”, производимый Shimadzu Corp., Kyoto, Япония;
+
колонка: “WAKOPAK WAKOBEADS T-330”, H-форма, производимая Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Япония;
объем инъекции образца: 10 мкл;
элюент: 0,01% (об./об.) водный раствор азотной кислоты;
скорость потока: 0,5 мл/мин;
температура: 25°C;
дифференциальный рефрактометр: “RID-10A”, производимый Shimadzu Corp., Kyoto, Япония;
устройство для обработки данных: “CHROMATOPAK C-R7A”, производимый Shimadzu Corp., Kyoto, Япония;
<Степень кристалличности>
Степень кристалличности тестируемых образцов 1-4 определяли следующим образом: аналитические величины для степеней кристалличности соответствующих тестируемых образцов 1-4 согласно способу Германса определяли с использованием “X' Pert PRO MPD”, название продукта коммерчески доступного порошкового рентгеновского дифрактометра с исследованием по отраженному свету, производимого Spectris Co., Ltd., Tokyo, Япония, и с использованием аналитического компьютерного программного обеспечения, установленного исключительно на дифрактометр, на основе профиля порошковой рентгеновской дифракции по CuKα-лучу (рентгеновский электрический ток: 40 мА, напряжение на рентгеновской трубке: 45 кВ, длина волны: 1,5405 Å), в качестве характеристического рентгеновского излучения, излучаемого мишенью на основе Cu. Перед описанным выше анализом степени кристалличности способом Германса, зернистость и коэффициент преломления, предварительно заданные в программном обеспечении, корректировали соответственно до соответствующих уровней для получения исходного уровня, сочтенного наиболее предпочтительным, при рассмотрении взаимноперекрывающихся пиков, интенсивности дифракции и интенсивности рассеяния в соответствующих диаграммах порошковой рентгеновской дифракции. Способ Германса подробно описан как P. H. Hermans, так и A. Weidinger, “Journal of Applied Physics, Vol. 19, pp. 491-506 (1948), и P. H. Hermans and A. Weidinger, “Journal of Polymer Science”, Vol. 4, pp. 135-144, 1949.
100
0
100
0
Степень кристалличности каждого тестируемого образца вычисляли путем подстановки следующих данных в указанную выше формулу [1]: Hs в качестве величины степени кристалличности каждого тестируемого образца; H, ее аналитическая величина в тестируемом образце 1; и H, ее аналитическая величина в тестируемом образце 2. При анализе способом Германса, аналитическая величина степени кристалличности тестируемого образца 1 (аналитическая величина H) и аналитическая величина степени кристалличности тестируемого образца 2 (аналитическая величина H) составляли, соответственно, 70,23% и 7,57%. Результаты представлены в таблице 1 параллельно. Диаграммы порошковой рентгеновской дифракции тестируемых образцов 1 и 2, в качестве стандартных образцов, соответственно, представлены на фиг.1 и 2.
Как показано на фиг.1, четкие и острые пики дифракции, специфичные для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, были найдены в диапазоне углов дифракции (2θ) от 4 до 65° на диаграмме порошковой рентгеновской дифракции тестируемого образца 1, но не было выявлено какого-либо гало, специфичного для аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Между тем, как показано на фиг.2, в отличие от диаграммы порошковой рентгеновской дифракции, представленной на фиг.1, гало, специфический для аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, был отчетливо выявлен в качестве группы исходного уровня на диаграмме порошковой рентгеновской дифракции тестируемого образца 2, но не было выявлено пика дифракции, специфического для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
<Эксперимент 1-3: порошковая рентгеновская дифракция тестируемых образцов 1 и 2 с использованием синхротронного излучения>
100
0
Данный эксперимент проводили для дальнейшего подтверждения того, что тестируемые образцы 1 и 2, соответственно являются надлежащими стандартными образцами для определения аналитических величин H и H: указанные образцы подвергали порошковой рентгеновской дифракции в проходящем свете, которая выявляет слабый сигнал дифракции и рассеяния с использованием синхротронного излучения (далее называемого “излучением”), в качестве источника рентгеновских лучей. Условия измерения были следующими:
<Условия измерения>
Порошковый рентгеновский дифрактометр: модель “PDS-16”, высокоскоростной порошковый рентгеновский дифрактометр (режим Debye Scherrer, длина камеры: 497,2 мм), производимый Kohzu Precision Co., Ltd., Kanagawa, Япония;
источник рентгеновских лучей: “Beam line of Hyogo Prefecture (BL08B2)”, излучаемый свет из изгибающего электромагнита;
длина волны: 0,7717 Å (16,066 кэВ);
9
сила: 10 фотон/с;
угол измерения: 2-40°;
время воздействия: 600 с;
регистрация изображения: “IMAGING PLATE BAS-2040”, рентгенографическая пластина, производимая Fujifilm Corp., Tokyo, Япония; и
анализатор изображения: “BIO-IMAGE ANALYZER BAS-2500”, производимый Fujifilm Corp., Tokyo, Япония.
Измерение проводили с использованием “Beam line of Hyogo Prefecture (BL08B2)” помешенного в “SPring-8”, большую установку синхротронного излучения, 1-1-1, Kouto, Sayo-cho, Sayo-gun, Hyogo, Япония.
Перед измерением порошковой рентгеновской дифракции тестируемые образцы 1 и 2 соответственно растирали в ступке и просеивали через сито с размером ячеек 53 мкм. Затем каждую из полученных композиций в форме частиц, пропущенную через сито, равномерно инжектировали в “MARKTUBE No. 14”, название продукта капилляров для порошковой рентгеновской дифракции (диаметр: 0,6 мм, стекло Линдемана), производимых Toho KK, Tokyo, Япония, с получением длины инжектируемого образца приблизительно 30 мм. Затем капилляры разрезали на конце инжектированного образца, и открытый конец закрывали адгезивом. Затем капилляр фиксировали на образце с подложкой из глины, и подложку образца помещали в порошковый рентгеновский дифрактометр с получением продольного направления капилляров, перпендикулярно оптической оси дифрактометра.
Для устранения неблагоприятного эффекта ориентации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты на диаграмме порошковой рентгеновской дифракции измерение порошковой рентгеновской дифракции проводили, давая возможность подложке с образцом двигаться возвратно-поступательно с единой скоростью в продольном направлении капилляра шириной ±1,5 мм и с временным циклом один раз/60 с, и одновременно давая возможность подложке с образцом вращаться с единой скоростью вокруг оси вращения в продольном направлении капилляра с циклом два раза/с.
В способах анализа диаграмм порошковой рентгеновской дифракции и получения диаграмм порошковой рентгеновской дифракции тестируемых образцов 1 и 2, из каждой диаграммы порошковой рентгеновской дифракции для повышения точности измерения устраняли общепринятым способом фоновые сигналы, присущие порошковому рентгеновскому дифрактометру. Полученные диаграммы порошковой рентгеновской дифракции тестируемых образцов 1 и 2 соответственно представлены на фиг.3 и 4.
Как показано на фиг.3, пики порошковой рентгеновской дифракции, специфические для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, появлялись четкими и острыми при диапазоне углов дифракции (2θ) от 2 до 40° для диаграммы порошковой рентгеновской дифракции тестируемого образца 1, измеренного с использованием синхротронного излучения. При сравнении фиг.3 с фиг.1, поскольку длина волны синхротронного излучения (0,7717 Å) отличалась от длины волны характеристического рентгеновского излучения (1,5405 Å), каждый пик дифракции на фиг.3 появлялся приблизительно при половинном угле дифракции (2θ) каждого из соответствующих пиков на фиг.1. Однако диаграммы порошковой рентгеновской дифракции на фиг.1 и 3, чрезвычайно хорошо совпадают друг с другом. Между тем, ширина пика при половине высоты каждого пика дифракции на фиг.3 очевидно была уже, чем на фиг.1, и каждый пик дифракции на фиг.3 показал большее разрешение, чем на фиг.1, несмотря на то, что каждый пик дифракции на фиг.3 был выше, чем на фиг.1, практически в 100 раз. Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции на фиг.3 не проявила гало, специфического для аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, как показано на следующей фиг.4. Результат указывает на то, что степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты тестируемого образца 1 является крайне высокой, и тестируемый образец 1 состоит по существу из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
Как показано на фиг.4, диаграмма порошковой рентгеновской дифракции тестируемого образца 2, полученная с помощью порошковой рентгеновской дифракции с использованием синхротронного излучения, показал заметный гало, специфический для аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, в качестве группы исходного уровня, но не было выявлено пика дифракции, специфического для безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Этот результат указывает на то, что тестируемый образец 2 по существу состоит из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
100
0
Описанные выше результаты, полученные с использованием синхротронного излучения в качестве источника рентгеновского излучения, подтверждают, что тестируемые образцы 1 и 2 являются надлежащими стандартными образцами для определения аналитических величин H и H, соответственно, для применения в формуле 1.
<Эксперимент 1-4: тест на слеживание>
Представленный ниже эксперимент проводили, чтобы исследовать слеживание соответствующих тестируемых образцов 1-4: аликвотами массой один грамм каждого из тестируемых образцов 1-4, полученных согласно эксперименту 1-1, по отдельности заполняли “FALCON TUBE 2059”, название продукта 14-мл полипропиленовой цилиндрической пробирки (диаметром 1,7 см, высотой 10 см), имеющей полусферическую форму дна и крышку, производимой Becton, Dickinson и Company, New Jersey, США. Пробирки помещали в вертикальном положении в штатив для пробирок и давали им стоять в течение 24 часов, затем штатив с пробирками помещали в “IC-410”, название продукта инкубатора, производимого Advantec Toyo Kaisha, Ltd., Tokyo, Япония, контролируемый при 50°C. После инкубации пробирки извлекали из инкубатора, и затем снимали каждую крышку, извлекая каждый тестируемый образец из каждой пробирки для помещения его на черную пластмассовую плоскую пластину путем медленного переворачивания пробирок вниз, и макроскопического исследования состояния полученных тестируемых образцов.
Степень слеживания в каждом тестируемом образце оценивали, исходя из следующих критериев: “слежавшийся”, (+): образец отчетливо сохраняет полусферическую форму дна пробирки даже при помещении на пластину; “слабо слежавшийся”, (±): образец немного, но отличимо проявляет полусферическую форму дна пробирки; “не слежавшийся” (-): образец не сохраняет полусферическую форму дна пробирки. Результаты представлены в столбце “образование комков” в таблице 1.
Таблица 1
Тестируемый образец
1
2
3
4
Чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты (%)
99,9
99,1
99,1
99,1
Степень кристалличности (%)
100,0
0,0
88,3
93,1
Слеживание
-
+
+
-
100
0
Как показано в таблице 1, тестируемый образец 1, в качестве стандартного образца для определения аналитической величины H (степень кристалличности: 100,0%) был оценен как “не слежавшийся” (-), поскольку он обвалился и не сохранил полусферической формы дна пробирки, когда его извлекли из пробирки и поместили на плоскую пластину. Напротив, тестируемый образец 2, в качестве другого стандартного образца для определения аналитической величины H (степень кристалличности: 0,0%) был отчетливо оценен как “слежавшийся” (+), поскольку он еще явно сохранял полусферическую форму дна пробирки, даже после извлечения из пробирки и помещения на пластину. Полусферическая форма тестируемого образца 2 не обвалилась, даже когда пластине придали небольшую вибрацию.
Тестируемый образец 3 со степенью кристалличности 88,3% все еще явно сохранял полусферическую форму дна в пробирке, сходную с тестируемым образцом 2, даже после извлечения из пробирки и помещения на плоскую пластину, и он явно был оценен как “слежавшийся” (+). Тестируемый образец 4 со степенью кристалличности 93,1% мгновенно обвалился аналогично тестируемому образцу 1 после извлечения из пробирки и помещения на пластину, и он был оценен как “не слежавшийся” (-).
Как описано выше, хотя тестируемые образцы 2-4 получали из тестируемого образца 1 с чистотой 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 99,9%, приведенный выше анализ ВЭЖХ показал, что чистота в них 2-глюкозида аскорбиновой кислоты составляла вплоть до 99,1%. Причина этого точно неизвестна, однако можно предположить что небольшое количество 2-глюкозида аскорбиновой кислоты могло утратиться вследствие разложения и т.п. в ходе приготовления по какой-то причине.
Описанные выше результаты указывают на то, что, в случае композиций в форме частиц, содержащих по меньшей мере 99,1%, м.с.в., безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, композиции в форме частиц с более высокой степенью кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты имеют тенденцию к свойству более низкого слеживания; и факты, что тестируемый образец 3 со степенью кристалличности 88,3% был оценен как “слежавшийся” (+) и тестируемый образец 4 со степенью кристалличности 93,1% был оценен как “не слежавшийся” (-) указывают на то, что порог изменения от оценки “слежавшийся” (+) до оценки “не слежавшийся” (-) в указанном выше тестировании на слеживание находится между степенями кристалличности 88,3% и 93,1%.
<Эксперимент 2: Взаимосвязь между слеживанием и степенью кристалличности композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
В данном эксперименте, на основе результатов эксперимента 1, семь типов композиций в форме частиц, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, имеющих степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в диапазоне от 0 до 100% и чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в диапазоне от 99,1 до 99,9%, использовали и исследовали в отношении слеживания аналогично тому, как в эксперименте 1, для более детального исследования взаимосвязи между слеживанием и степенью кристалличности.
<Эксперимент 2-1: получение тестируемого образца>
Композиции в форме частиц тестируемых образцов 5-9 в таблице 2 получали путем взвешивания тестируемых образцов 1 и 2, полученных согласно эксперименту 1-1, в соответствующих количествах, соответственно, и смешения их до однородного состояния. В таблице 2 показана чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты тестируемых образцов 5-9, определенные способом, описанным в эксперименте 1-2. Результаты для тестируемых образцов 1 и 2 в таблице 2 взяты из таблицы 1.
<Эксперимент 2-2: тестирование на слеживание>
Тестируемые образцы 5-9 подвергали тесту на слеживание в эксперименте 1-4. Результаты представлены в столбце “слеживание” в таблице 2. Результаты “слеживания” тестируемых образцов 1 и 2 в таблице 2 взяты из результатов, описанных в таблице 1.
Таблица 2
Тестируемый образец
1
2
5
6
7
8
9
Чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты (%)
99,9
99,1
99,8
99,7
99,6
99,5
99,4
Степень кристалличности (%)
100,0
0,0
99,8
92,6
91,5
89,2
29,9
Слеживание
-
+
-
-
-
±
+
Как показано в результатах таблицы 2, тестируемый образец 9 со степенью кристалличности 29,9% был оценен как “слежавшийся” (+) и тестируемый образец 8 со степенью кристалличности 89,2% был оценен как “слабо слежавшийся” (±). Напротив, все из тестируемых образцов 7, 6 и 5 с соответствующими степенями кристалличности 91,5%, 92,6% и 99,8% были оценены как “не слежавшиеся” (-), аналогично тестируемому образцу 1. Эти результаты указывают на то, что среди композиций в форме частиц, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в количестве по меньшей мере 99,1% но менее 99,9%, м.с.в., композиции со степенью кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 90% не слеживаются в условиях данного эксперимента.
<Эксперимент 3: Эффект чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты на степень кристалличности композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
В предшествующих экспериментах было выявлено, что в композициях в форме частиц, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с чистотой 2-глюкозида аскорбиновой кислоты вплоть до 99,1% или более, существуют композиции с различными степенями кристалличности, так что в данном эксперименте далее исследовали взаимосвязь между степенью кристалличности композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, и чистотой 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Кроме того, исследовали взаимосвязь между чистотой и слеживанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
<Эксперимент 3-1: Получение тестируемых образцов>
Тестируемые образцы 10-15, имеющие отличающиеся свойства 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, как показано в таблице 3, получали из водного раствора, содержащего L-аскорбиновую кислоту и декстрин.
Четыре части по массе “PINEDEX #100”, название продукта декстрина, производимого Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Япония, растворяли в 15 частях по массе воды при нагревании. Затем с раствором смешивали три части по массе L-аскорбиновой кислоты. Затем раствор смешивали с 100 единиц/г декстрина, м.с.в., CGT-азой, полученной из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-62 и 250 единиц/г декстрина, м.с.в., образца изоамилазы, производимого Hayashibara Biochemicals Laboratories, Inc., Okayama, Япония, и подвергали ферментативной реакции при поддержании раствора при pH 5,5 и температуре 55°C в течение 50 часов с образованием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Кроме того, можно предположить, что в реакционном растворе естественным образом образовывались α-гликозил-L-аскорбиновые кислоты, такие как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотетраозил-L-аскорбиновая кислота и т.д.
После инактивации остальных ферментов нагреванием, реакционный раствор доводили до pH 4,5, смешивали с 50 единиц/г декстрина, м.с.в., “GLUCZYME AF6”, название продукта препарата глюкоамилазы, производимого Amano Enzymes Inc., Aichi, Япония, и подвергали ферментативной реакции в течение 24 часов для гидролиза описанных выше α-гликозил-L-аскорбиновых кислот вплоть до 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и гидролиза остальных загрязняющих олигосахаридов вплоть до D-глюкозы. На данной стадии реакционный раствор содержал 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с выходом продуцирования 39%.
+
-
2+
Реакционный раствор нагревали для инактивации глюкоамилазы, обесцвечивали активированным углем, фильтровали, пропускали через колонку с катионообменной смолой (H-форма) для обессоливания, и затем пропускали через анионообменную смолу (OH-форма) для поглощения L-аскорбиновой кислоты и 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и затем смолу промывали водой для удаления D-глюкозы, и подавали 0,5н. раствор хлористоводородной кислоты для обеспечения элюирования. Элюат концентрировали до достижения содержания твердого вещества приблизительно 50%, и затем подвергали колоночной хроматографии с использованием “DOWEX 50WX4” (Ca-форма), название продукта сильной кислотной катионообменной смолы, производимой Dow Chemical Company. Концентрат наносили на колонку в объеме приблизительно 1/50 от объема влажной смолы, и затем в колонку подавали очищенную воду в объеме, в 50 раз превышающем объем нагрузки концентрата с линейной скоростью 1 м/час и фракционированием полученного элюата на аликвоты объемом, составляющим 0,05 от объема колонки. Затем композицию каждой фракции измеряли на ВЭЖХ, как описано в примере 1-2, и шесть фракций с содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 80%, м.с.в., концентрировали в вакууме с получением соответствующих концентраций твердых веществ приблизительно 76%. Полученные концентраты помещали соответственно в кристаллизатор, смешивали с тестируемым образцом 1 согласно эксперименту 1-1, в качестве затравочного кристалла, в количестве двух процентов от содержания каждого твердого вещества, м.с.в., и затем естественным образом охлаждали каждый концентрат от 40°C до 15°C в течение приблизительно двух суток при осторожном перемешивании для осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
После этого, в соответствии с общепринятым способом, тестируемые образцы 10-15, представленные в таблице 3, получали путем сбора кристаллов из каждого утфеля с помощью центрифуги корзинного типа, промывания кристалла небольшим количеством дистиллированной воды, выдерживания и сушки промытых кристаллов, продувания воздухом при температуре 25°C в течение 30 мин выдержанных и высушенных кристаллов для охлаждения и измельчения полученного материала. “AA2G”, название продукта композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, в качестве общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики, производимый Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, использовали в качестве тестируемого образца 16.
Таблица 3
Тестируемый образец
1
2
10
11
12
13
14
15
16
Чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты (%)
99,9
99,1
97,4
98,0
98,6
99,1
99,5
99,7
98,9
Степень кристалличности (%)
100,0
0,0
88,7
89,0
91,6
94,8
99,4
99,5
88,9
Слеживание
-
+
+
±
-
-
-
-
±
Стабильность при хранении
-
+
+
-
-
-
-
+
Как показано в таблице 3, тестируемые образцы 1 и 2 были сходны с тестируемыми образцами эксперимента 1-1, и их чистота и степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты были взяты из предшествующих экспериментальных результатов. Тестируемые образцы 10-16 исследовали в отношении слеживания способом, аналогично эксперименту 1-4. Результаты представлены в таблице 3. Результаты теста на слеживание для тестируемых образцов 1 и 2, как показано в таблице 3, были взяты из таблицы 1 без какого-либо изменения.
<Эксперимент 3-2: тест на стабильность при хранении>
Для подтверждения того, что тест на слеживание, проведенный в эксперименте 1-4, и т.д., является адекватным испытанием для оценки слеживания композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты при хранении в реальных условиях, тестируемый образец 1, полученный в эксперименте 1-1, тестируемые образцы 10-15, полученные в эксперименте 3-1, и тестируемый образец 16 подвергали тестированию на стабильность при хранении, которое было разработано с учетом условий, окружающей обстановки, и периода времени фактического хранения композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты.
Аликвоты массой десять килограмм любого из тестируемых образцов 1 и 10-16 соответственно взвешивали и помещали в полиэтиленовые двойные мешки (800 мм на 600 мм) для каждого тестируемого образца. Затем каждый мешок помещали в 18-литровую стальную емкость так, чтобы дать возможность открывающейся части каждого мешка быть открытой и стоять в вертикальном положении без закрытия открывающейся части, дать возможность мешкам стоять без закрытия стальных емкостей, и хранить в течение 45 суток в комнате в отсутствие относительно высокой температуры и влажности. После хранения в течение 45 суток каждый полиэтиленовый двойной мешок, содержащий любой из тестируемых образцов, извлекали из емкостей, и образцы извлекали из мешков и помещали на черную пластмассовую плоскую пластину для микроскопического исследования их сыпучести и состояния слеживания.
Тестируемые образцы оценивали в отношении их слеживания по следующим критериям: “слежавшийся” (+), комок(и) выявляется в тестируемом образце и сыпучесть тестируемого образца снижена по сравнению с сыпучестью в начале испытания; и “не слежавшийся” (-), в тестируемом образце не выявляется комков и сыпучесть тестируемого образца не изменяется по сравнению с сыпучестью в начале испытания. Форма хранения каждого тестируемого образца в испытании на стабильность при хранении является такой же, как и форма хранения порошка категории лечебно-профилактической косметики, который коммерчески распространяют и хранят, за исключением того, что не закрывают открывающуюся часть мешка резиновой лентой, не добавляют какого-либо осушителя и хранят в стальной емкости, не закрывая ее крышкой. Описанные выше три отличия представляли собой отличия, которые были заданы в качестве условий хранения тестируемого образца, которые были немного более жесткими, чем истинные условия хранения, чтобы ускорить получение результатов испытания. Результаты представлены в таблице 3 параллельно.
Как показано в таблице 3, за исключением тестируемого образца 2, по существу состоящего из аморфной формы 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и тестируемого образца 16 в качестве порошка категории лечебно-профилактической косметики, оставшиеся тестируемые образцы 1 и 10-15 имеют тенденцию к увеличению их степеней кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по мере увеличения чистоты в них 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. В испытании на слеживание тестируемые образцы 10 и 11 с соответствующей чистотой 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 97,4% и 98,0% были оценены как “слежавшиеся” (+) или “немного слежавшиеся” (±). Напротив, тестируемые образцы 12-15 с чистотой 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 98,6-99,7% оценивали как “не слежавшиеся” (-). Эти результаты указывают на то, что пороговая величина чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, которая влияет на слеживание, находится на уровне приблизительно 98,0%, и было сделано заключение, что для получения композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, оцениваемой как “не слежавшаяся” (-), была необходима чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты более 98,0%.
Не наблюдали слеживания в тестируемых образцах 12-15, аналогично тестируемому образцу 1, хотя чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты тестируемых образцов 12-15 составляла от 98,6% до 99,7%, что представляло собой практически такие же уровни, как у тестируемого образца 16, порошка категории лечебно-профилактической косметики с чистотой 98,9%, и они были значительно ниже, чем в тестируемом образце 1, порошке категории реагентов, по существу состоящем из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Степени кристалличности тестируемых образцов 12-15 составляли от 91,6% до 99,5%, что составляет вплоть до 90% или более, и тестируемый образец 16, порошок категории лечебно-профилактической косметики, имел степень кристалличности 88,9%, что составляет ниже 90%. Из этих результатов, можно сделать заключение, что степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты должна составлять 90% или более для получения желаемой композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая значительно труднее слеживается, по сравнению с тестируемым образцом 16 в качестве порошка категории лечебно-профилактической косметики.
Как показано в нижнем столбце таблице 3, тестируемые образцы 10 и 11 с соответствующей чистотой 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 97,4% и 98,0% были оценены как “слежавшиеся” (+) даже в тесте на стабильность при хранении, где их хранили в течение 45 суток в мешках с соответствующим содержанием 10 кг/мешок в соответствии с их формой истинного коммерческого продукта. Напротив, тестируемые образцы 12-15 с чистотой 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 98,6%-99,7% были оценены как “не слежавшиеся” (-), аналогично результатам в их испытаниях на слеживание. Эти факты указывают на то, что тест на слеживание, как в эксперименте 1-4 и т.д., является подходящим испытанием для оценки слеживания композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в фактических условиях хранения.
<Эксперимент 4: Взаимосвязь между способностью к восстановлению и появлением коричневой окраски композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Все тестируемые образцы, используемые в предшествующих экспериментах, представляли собой композиции в форме частиц, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный из растворов, содержащих 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный посредством стадии обеспечения воздействия CGT-азы на раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и крахмальное вещество. При использовании такого способа продуцирования полученные композиции в форме частиц будут содержать L-аскорбиновую кислоту и D-глюкозу в качестве примесей, специфических для способа продуцирования, независимо от содержания таких примесей. Хотя как L-аскорбиновая кислота, так и D-глюкоза обладают восстанавливающей способностью, композиции в форме частиц, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, варьирующие, в зависимости от содержания L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы, возможно, могут вызывать неблагоприятное изменение окрашивания конечных продуктов при использовании в продуктах, содержащих соединения с аминогруппой, таких как белки и аминокислоты. Среди них, поскольку L-аскорбиновая кислота обладает относительно высокой реакционной активностью в отношении кислорода, предполагают, что L-аскорбиновая кислота должна быть причиной индукции не только неблагоприятного изменения цвета в продуктах, в которых ее используют, но и нежелательного окрашивания в коричневый цвет самого общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики, которое иногда наблюдали при хранении в течение относительно длинного периода времени.
Таким образом, в данном эксперименте тестируемые образцы 1 и 12-16, которые использовали в предшествующих экспериментах, исследовали в отношении взаимосвязи между окрашиванием и общим содержанием L-аскорбиновой кислоты вместе с D-глюкозой, содержанием L-аскорбиновой кислоты или способностью к восстановлению всей композиции в форме частиц путем проведения ускоренного тестирования на обработку нагреванием по следующей методике:
Сто пятьдесят миллиграмм каждого из тестируемых образцов взвешивали и помещали в 10-мл тестовую пробирку с завинчивающейся крышкой, и тестовые пробирки в закрытом состоянии их открытых частей навинчивающимися крышками помещали в “DRYING-OVEN SA310”, название продукта печи, производимой Masuda Corp., Osaka, Япония, и нагревали при 80°C в течение трех суток. Затем после снятия навинчивающихся крышек с тестовых пробирок в каждую из пробирок добавляли три миллилитра деионизированной воды для растворения каждого образца. В полученных растворах измеряли поглощение при длине волны 400 нм с использованием “UV-2400PC”, название продукта спектрофотометра, производимого Shimadzu Corp., Kyoto, Япония. Степень окрашивания, вызванного нагреванием, оценивали, исходя из следующих двух критериев: когда поглощение при длине волны 400 нм меньше, чем 0,50, его оценивали как “отсутствие окрашивания в коричневый цвет или по существу отсутствие окрашивания в коричневый цвет” (-); и когда поглощение при длине волны 400 нм составляет 0,50 или более, его оценивали как “окрашивание в коричневый цвет” (+). Результаты приведены в таблице 4.
Общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы в каждом тестируемом образце определяли с использованием ВЭЖХ, как описано в эксперименте 1-1. Способность к восстановлению всей композиции в форме частиц каждого тестируемого образца определяли путем измерения содержания восстанавливающего сахара и общего содержания сахаров способом Somogyi-Nelson и способом антрон-серной кислоты, обычно используемым в данной области, соответственно, с использованием D-глюкозы в качестве стандартного вещества, и вычисления способности к восстановлению путем подстановки данных в указанную выше формулу [3]. Общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы, содержание L-аскорбиновой кислоты и способность к восстановлению всей композиции в форме частиц для каждого образца были такими, как показано в таблице 4.
Таблица 4
Тестируемый образец
1
12
13
14
15
16
2-глюкозид аскорбиновой кислоты
99,9
98,6
99,1
99,5
99,7
98,9
Общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы (L-аскорбиновая кислота)
0,0(0,0)
0,2(0,1)
0,1(<0,1)
0,1(<0,1)
0,1(0,0)
0,3(0,2)
Прочие
0,1
1,2
0,8
0,4
0,3
0,8
Способность к восстановлению композиции в форме частиц в целом (%)
0,05
0,98
0,86
0,2
0,12
1,12
Свойство окрашивания в коричневый цвет
-
-
-
-
-
+
Как показано в таблице 4, в композициях в форме частиц, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, содержание как L-аскорбиновой кислоты, так и D-глюкозы в тестируемом образце 1, который представляет собой порошок категории реагентов, по существу состоящий из безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, было ниже их предела выявления. Напротив, L-аскорбиновая кислота и/или D-глюкоза были выявлены в любом из тестируемых образцов 12-15 в виде композиций в форме частиц, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты по настоящему изобретению, и тестируемом образце 16 в виде общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики. В этих порошках, как очевидно из тестируемых образцов 12-15, когда общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы не превышало 0,2%, м.с.в., их оценивали как “не окрашивающиеся в коричневый цвет или по существу не окрашивающиеся в коричневый цвет” (-); хотя, как очевидно из тестируемого образца 16, когда общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы достигало 0,3%, м.с.в., их оценивали как “окрашенные в коричневый цвет” (+). Что касается L-аскорбиновой кислоты, которую считали наиболее глубоко связанной с окрашиванием порошков, порошки, подобные тестируемым образцам 12-15, которые содержат L-аскорбиновую кислоту в количестве 0,1% или менее, м.с.в., оценивали как “не окрашивающиеся в коричневый цвет или по существу не окрашивающиеся в коричневый цвет” (-); в то время как один порошок, такой как тестируемый образец 16, который имеет содержание L-аскорбиновой кислоты, достигающее 0,2%, м.с.в., оценивали как “окрашенный в коричневый цвет” (+). Как указано выше, поскольку L-аскорбиновая кислота имеет относительно высокую реакционную способность в отношении кислорода и связана с окрашиванием в коричневый цвет композиций, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, для композиций с содержанием L-аскорбиновой кислоты более 0%, но не более 0,1%, м.с.в., отсутствует угроза возникновения существенного окрашивания в коричневый цвет даже при хранении в течение относительно длительного периода времени в форме продукта общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики.
С точки зрения способности к восстановлению, как очевидно из тестируемых образцов 12-15, образцы со способностью к восстановлению всей композиции в форме частиц более 0%, но менее 1%, были оценены как “не окрашивающиеся в коричневый цвет или по существу не окрашивающиеся в коричневый цвет” (-). Напротив, как очевидно из тестируемого образца 16, тестируемые образцы со способностью к восстановлению всей композиция в форме частиц более 1% оценили как “окрашенные в коричневый цвет” (+). Эти результаты хорошо согласовывались с описанными выше результатами, полученными путем оценки с помощью индекса общего содержания L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы.
Описанные выше результаты указывают на то, что можно получать композиции в форме частиц, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты без угрозы окрашивания в коричневый цвет, путем контроля способности к восстановлению композиций в форме частиц в целом до уровня более 0%, но менее 1%, даже несмотря на то, что они неизменно содержат L-аскорбиновую кислоту и/или D-глюкозу на поддающемся выявлению уровне благодаря их способу получения. Учитывая оба аспекта окрашивания в коричневый цвет не только конечных продуктов, изготовленных с композициями в форме частиц, но и самих композиций в форме частиц, указанные выше результаты показывают, что содержание L-аскорбиновой кислоты в композициях в форме частиц предпочтительно должны составлять более 0%, но не более 0,1%, м.с.в.
<Эксперимент 5: Эффект способа охлаждения при кристаллизации на степень кристалличности композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Для изучения эффекта способа охлаждения во время кристаллизации на степень кристалличности композиций в форме частиц, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, композиции в форме частиц, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, представленные в таблице 5 (тестируемые образцы 17-22), получали представленным ниже способом. Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в каждом ферментативном реакционном растворе определяли способом в эксперименте 1-2.
(1) Тестируемый образец 17
Аналогично тому, как описано ниже в справочном примере 1, получали тестируемый образец 17 в виде композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, за исключением того, что в способе описанного ниже справочного примера 1 длительность действия CGT-азы и изоамилазы останавливали через 25 часов, что составляло половину времени справочного примера 1, с последующей очисткой ферментативного реакционного раствора с получением содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 86%, и затем концентрированием в вакууме раствора, содержащего 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, до концентрации приблизительно 76%, переносом полученного концентрата в кристаллизатор с емкостью рубашки вокруг кристаллизатора, осаждением кристаллов способом псевдоконтролируемого охлаждения, состоящим в постепенном охлаждении концентрата от 40°C до 30°C в течение 1,5 суток, и затем быстрого охлаждения его от 30°C до 15°C в течение 0,5 суток путем контроля температуры воды в емкости рубашки. Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативном реакционном растворе составлял 25,3%.
(2) Тестируемый образец 18
Аналогично примеру 1, получали тестируемый образец 18 в виде композиции в форме частиц, содержащий безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, за исключением того, что в способе описанного ниже примера 1, разжиженный картофельный крахмал, используемый в качестве материала, был заменен на “PINEDEX #100”, название продукта декстрина, производимого Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Япония; и кристаллы получали путем очистки раствора после ферментативных реакций, концентрирования очищенного раствора при пониженном давлении и охлаждения естественным образом концентрата от 40°C до 15°C в течение приблизительно двух суток. Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативном реакционном растворе составил 27,0%.
(3) Тестируемый образец 19
Тестируемый образец 19 в виде композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, получали аналогично тестируемому образцу 18, за исключением того, что раствор после ферментативных реакций переносили в кристаллизатор с емкостью рубашки вокруг кристаллизатора и кристаллизовали способом псевдоконтролируемого охлаждения, состоящим в постепенном охлаждении раствора от 40°C до 30°C в течение 1,5 суток, и затем быстром охлаждении от 30°C до 15°C в течение 0,5 суток путем контроля температуры воды в емкости рубашки. Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативном реакционном растворе составил 27,0%.
(4) Тестируемый образец 20
Аналогично примеру 4, получали тестируемый образец 20 в виде композиции в форме частиц, содержащий безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, за исключением того, что в способе описанного ниже примера 4, раствор, содержащий 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, концентрировали до концентрации приблизительно 76% при пониженном давлении, и полученный раствор с температурой 40°C переносили в кристаллизатор и естественным образом охлаждали так, чтобы происходило охлаждение раствора от 40°C до 15°C в течение приблизительно двух суток для осаждения кристаллов. Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативном реакционном растворе составил 32,5%.
(5) Тестируемый образец 21
Тестируемый образец 21 в виде композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, получали аналогично тестируемому образцу 20, за исключением того, что раствор после ферментативных реакций переносили в кристаллизатор с емкостью рубашки вокруг кристаллизатора, с последующим осаждением кристаллов способом псевдоконтролируемого охлаждения, состоящим в постепенном охлаждении раствора от 40°C до 30°C в течение 1,5 суток, и затем быстром охлаждении от 30°C до 15°C в течение 0,5 суток путем контроля температуры воды в емкости рубашки. Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативном реакционном растворе составил 32,5%.
(6) Тестируемый образец 22
Аналогично эксперименту 3-1, получали тестируемый образец 22 в виде композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, за исключением того, что в способе получения тестируемых образцов согласно эксперименту 3-1, ферментативные реакции CGT-азы и изоамилазы останавливали через 30 часов после начала ферментативных реакций, и раствор, который был очищен до содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 86,2%, концентрировали до концентрации приблизительно 76% при пониженном давлении, и затем полученный раствор с температурой 40°C переносили в кристаллизатор и охлаждали раствор способом естественного охлаждения от 40°C до 15°C в течение приблизительно двух суток для осаждения кристаллов. Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативном реакционном растворе составил 35,3%.
<Измерение чистоты и степени кристалличности 2-глюкозида аскорбиновой кислоты>
Согласно способу, аналогичному способу эксперимента 1-2, определяли чистоту и степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты тестируемых образцов 17-22.
<Средний диаметр кристаллитов>
Средние диаметры кристаллитов тестируемых образцов 17-22 измеряли следующим способом. Для вычисления по описанной выше формуле [2], в дифрактограммах, которые были получены на основе диаграмм порошковой рентгеновской дифракции, которые использовали для определения степени кристалличности каждого тестируемого образца, половинную ширину и углы дифракции (2θ) пяти дифракционных пиков, выявленных при дифракционных углах (2θ) 10,4° (индекс Миллера (hkl):120), 13,2° (индекс Миллера (hkl):130), 18,3° (индекс Миллера (hkl):230), 21,9° (индекс Миллера (hkl):060) и 22,6° (индекс Миллера (hkl):131), которые соответствуют обозначениям “a”-“e” на фиг.1, соответственно, подвергали обработке с помощью “X' pert Highscore Plus”, аналитического программного обеспечения для компьютерной обработки, предоставляемого с “X' Pert PRO MPD”, название продукта коммерчески доступного порошкового рентгеновского дифрактометра, и подвергали вычислению среднего диаметра кристаллитов безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в каждом тестируемом образце с помощью программы “Scherrer Formula” в описанном выше компьютерном программном обеспечении.
Описанные выше результаты приведены в таблице 5.
Таблица 5
Тестируемый образец
17
18
19
20
21
22
Выход продуцирования (%)2-глюкозида аскорбиновой кислоты
25,3
27,0
27,0
32,5
32,5
35,3
Чистота (%) 2-глюкозида аскорбиновой кислоты
98,6
98,5
99,2
98,3
99,3
99,6
Степень кристалличности (%)
86,0
88,5
90,7
87,3
92,1
98,9
Средний диаметр кристаллитов (Å)
1410
1220
1450
1250
1650
1705
Как показано в таблице 5, тестируемые образцы 19 и 21, которые получены путем очистки и концентрирования ферментативного реакционного раствора с выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 27,0% или 32,5%, и кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты способом псевдоконтролируемого охлаждения, имели степень кристалличности более 90% и соответствующие средние диаметры кристаллитов 1450 Å и 1650 Å. Между тем, тестируемый образец 17, полученный путем очистки и концентрирования ферментативного реакционного раствора с выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 25,3% и осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты из полученного раствора, содержащего L-2-глюкозид аскорбиновой кислоты также способом псевдоконтролируемого охлаждения, аналогично тому, как указано выше, имел относительно высокий средний диаметр кристаллитов, составляющий 1410 Å, но имел степень кристалличности менее 90%. Тестируемые образцы 18 и 20, которые получены путем очистки и концентрирования ферментативного реакционного раствора с выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 27,0% или 32,5%, аналогично тому, как в тестируемых образцах 19 и 21, и осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты из раствора, содержащего L-2-глюкозид аскорбиновой кислоты, способом псевдоконтролируемого охлаждения, имел степень кристалличности менее 90% и соответствующие средние диаметры кристаллитов только 1220 Å и 1250 Å. Тестируемый образец 22, полученный путем очистки и концентрирования ферментативного реакционного раствора с выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 35,3% и осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты из раствора, содержащего L-2-глюкозид аскорбиновой кислоты, способом естественного охлаждения, имел степень кристалличности вплоть до 98,9% и средний диаметр кристаллитов вплоть до 1705 Å.
Результаты, представленные в таблице 5, указывают на то, что даже композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученная из реакционного раствора с тем же выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, степенью кристалличности и средним диаметром кристаллитов безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, кристаллизованного способом псевдоконтролируемого охлаждения, лучше, чем композиции, полученные кристаллизацией способом естественного охлаждения. В случае осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида способом естественного охлаждения, композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты со степенью кристалличности более 90% не могла быть получена, если выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты не составлял более 35%, в то время как в случае применения способа псевдоконтролируемого охлаждения при кристаллизации даже ферментативного реакционного раствора с выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 32,5% (тестируемый образец 21) или 27,0% (тестируемый образец 19), что составляет менее 35%, получали композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты со степенью кристалличности более 90%. Эти результаты указывают на то, что способ псевдоконтролируемого охлаждения эффективно увеличивает степень кристалличности и средний диаметр кристаллитов, и может быть получена композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты со степенью кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты более 90% с применением либо способа псевдоконтролируемого охлаждения, либо способа контролируемого охлаждения после очистки и концентрирования, при условии, что выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативном реакционном растворе превышает 27,0%. Поскольку тестируемые образцы 19 и 21 имеют чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в диапазоне более 98,0%, но менее 99,9%, и степень кристалличности более 90%, они представляют собой композиции в форме частиц, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которые значительно труднее слеживаются, по сравнению с общепринятым порошком категории лечебно-профилактической косметики.
<Эксперимент 6: Влияние среднего диаметра кристаллитов на растворимость в гидрофильном растворителе>
В качестве тестируемых образцов использовали тестируемые образцы 17-22, использованные в описанном выше эксперименте, композиции в форме частиц, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученные способами, согласно описанным ниже примерам 1-4, тестируемый образец 1, полученный согласно эксперименту 1-1, и тестируемый образец 16 (порошок категории лечебно-профилактической косметики), использованный в эксперименте 3-1, для исследования растворимости в гидрофильных растворителях, широко используемых в косметике и лечебно-профилактической косметике.
Отвешивали 0,25 г любого из описанных выше тестируемых образцов и композиций в форме частиц согласно примерам 1-4 и помещали их в “FALCON TUBE 2059”, название продукта для 14-мл полипропиленовой цилиндрической пробирки, имеющей полусферическую форму дна и крышку, производимой Becton, Dickinson and Company, New Jersey, США. В каждую пробирку с каждым образцом добавляли пять миллилитров раствора, полученного разбавлением 1,3-бутиленгликоля (реагент специальной категории, производимый Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Япония) деионизированной водой до концентрации 30%, и полученную смесь нагревали в течение 30 мин на водяной бане с постоянной температурой 50°C, и затем пробирку опрокидывали дважды, выдерживая ее при 50°C в течение 15 мин, и микроскопически оценивали внешний вид следующим образом: “достаточная растворимость” (-), когда порошок считали полностью растворившимся; “недостаточная растворимость” (+), когда наблюдали нерастворимое вещество(а). Когда наблюдали такое нерастворимое вещество(а), образец далее выдерживали при 50°C в течение 15 мин и оценивали как “немного недостаточная растворимость” (±), когда порошок оценивали как полностью растворившийся. Результаты представлены в таблице 6.
С использованием описанных выше тестируемых образцов или композиций в форме частиц примеров 1-4, их подвергали тесту на слеживание и стабильность при хранении способами, описанными в экспериментах 1-4 и 3-2. Результаты приведены в таблице 6 параллельно. Тестируемые образцы 1 и 16 измеряли в отношении среднего диаметра кристаллитов способом, описанным в эксперименте 5, и результаты представлены в таблице 6 параллельно. Результаты в отношении чистоты 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, степени кристалличности, слеживания и стабильности при хранении для тестируемых образцов 1 и 16 перенесены из результатов таблицы 3 для тестируемых образцов 1 и 16.
Таблица 6
Тестируемый образец
1
16
17
18
19
20
21
22
Пример 1
Пример 2
Пример 3
Пример 4
Выход продуцирования (%) 2-глюкозида аскорбиновой кислоты
25,3
27,0
27,0
32,5
32,5
35,3
28,0
29,5
31,0
32,5
Чистота (%) 2-глюкозида аскорбиновой кислоты
99,9
98,9
98,6
98,5
99,2
98,3
99,3
99,6
99,3
99,5
99,2
99,7
Степень кристалличности (%)
100
88,9
86,0
88,5
90,7
87,3
92,1
98,9
90,3
91,0
91,5
92,4
Средний диаметр кристаллитов (Å)
1770
1380
1410
1220
1450
1250
1650
1705
1460
1540
1610
1670
Растворимость
+
-
-
-
-
-
-
±
-
-
-
-
Слеживание
-
+
+
+
-
+
-
-
-
-
-
-
Стабильность при хранении
-
+
+
+
-
+
-
-
-
-
-
-
Как показано в таблице 6, тестируемые образцы 16-21 и описанные ниже композиции в форме частиц согласно примерам 1-4 со средним диаметром кристаллитов 1670 Å или менее были оценены как “достаточно растворимые” (-). Напротив, тестируемый образец 22 со средним диаметром кристаллитов 1705 Å был оценен как “немного недостаточно растворимый” (±). Тестируемый образец 1 (порошок категории реагентов) со средним диаметром кристаллитов 1770 Å был оценен как “недостаточно растворимый” (+). Порошки тестируемых образцов 1, 19, 21 и 22 и композиции в форме частиц согласно примерам 1-4 были оценены как “не слежавшиеся” (-) в тесте на слеживание и стабильность при хранении, в то время как тестируемые образцы 16-18 и 20 были оценены как “слежавшиеся” (+). Исходя из этих результатов, было предположено, что порог среднего диаметра кристаллитов, который влияет на растворимость в гидрофильных растворителях, составляет менее 1705 Å, и композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты со средним диаметром кристаллитов менее 1700 Å, более конкретно, 1670 Å или менее, была оценена как превосходящая порошок категории реагентов в отношении растворимости в гидрофильных растворителях. Среди тестируемых образцов 19 и 21 и композиций в форме частиц согласно примерам 1-4, которые были оценены как удовлетворительные в каких-либо показателях растворимости, слеживания и стабильности при хранении, наиболее низкий средний диаметр кристаллитов составляет 1450 Å (тестируемый образец 19), так что предпочтительный средний диаметр кристаллитов был оценен как находящийся в диапазоне от 1400 Å или более, но менее 1700 Å, более предпочтительно, 1450 Å или более, но не более 1670 Å.
<Эксперимент 7: Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты посредством CGT-аз, полученных из различных микроорганизмов>
В ферментативной реакционной системе, где CGT-азе обеспечивают воздействие на раствор, содержащий разжиженный крахмал и L-аскорбиновую кислоту, и затем глюкоамилазе обеспечивают воздействие на полученный раствор с образованием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, проводили следующий эксперимент для исследования того, как отличие в источнике CGT-азы влияет на выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативном реакционном растворе, полученном посредством описанных выше ферментативных реакций.
<Коммерческая CGT-аза>
Среди CGT-аз, полученных из различных микроорганизмов, следующие CGT-азы используют в качестве коммерческих CGT-аз: “CONTIZYME”, название продукта коммерческого препарата CGT-азы, продаваемый Amano фермент Inc., Tokyo, Япония, использовали в качестве CGT-азы, производной микроорганизма вида Bacillus macerans; CGT-азу, полученную из Geobacillus stearothermophilus штамма TC-91, производимую Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, использовали в качестве CGT-азы, производной микроорганизма вида Geobacillus stearothermophilus; и “TORUZYME 3.0L”, название продукта коммерческой рекомбинантной CGT-азы, продаваемый Novozymes Japan Ltd., Tokyo, Япония, использовали в качестве CGT-азы, производной микроорганизма вида Thermoanaerobacter thermosulfirigenes.
<Эксперимент 7-1: Получение CGT-аз, полученных из различных микроорганизмов>
<Эксперимент 7-1-1: получение CGT-азы, производной Paenibacillus illinoisensis штамма NBRC15379>
Paenibacillus illinoisensis штамма NBRC15379 культивировали в жидкой культуральной среде, содержащей 2% декстрин, 0,5% хлорид аммония, 0,05% гидрофосфат калия, 0,025% сульфат магния и 0,5% карбонат кальция при 27°C в течение трех суток. Полученную культуру центрифугировали, и полученный супернатант высаливали сульфатом аммония обычным путем и подвергали диализу с получением раствора фермента CGT-азы. Неочищенный раствор фермента, полученный таким образом, подавали в DEAE-TPYOPEAL 650S, производимый Tosoh Corp., Tokyo, Япония, катионообменную колоночную хроматографию, и гидрофобную колоночную хроматографию с использованием геля BUTYL-TOYOPEARL 650 M, производимого Tosoh Corp., Tokyo, Япония, с получением частично очищенной CGT-азы.
<Эксперимент 7-1-2: Получение мутантной CGT-азы, производной Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91>
Как описано выше, ген CGT-азы, полученный из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91, клонировали и определяли аминокислотную последовательность зрелой CGT-азы (аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:1) на основе нуклеотидной последовательности (нуклеотидная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:2) гена. Путем внесения мутации в генетическую ДНК CGT-азы по следующей методике получали мутантную CGT-азу с более высокой продуктивностью 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, чем у CGT-азы дикого типа.
С использованием гена CGT-азы, полученного из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91 (депонированного в International Patent Organism Depositary in National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japan, под номером доступа FERM BP-11273), который принадлежит авторам настоящего изобретения, ген подвергали мутации для внесения или устранения участка(ов) расщепления ферментом рестрикции без изменения аминокислотной последовательности, кодируемой геном CGT-азы, и встраивали в плазмидный вектор с получением рекомбинантной ДНК, содержащей ген, кодирующий CGT-азу дикого типа. На фиг.5 показана структура рекомбинантной ДНК “pRSET-iBTC12”. Затем фрагмент гена (фрагмент Nde I-EcoT221), кодирующий область, содержащую активный остаток CGT-азы дикого типа в рекомбинантной ДНК, полученной, как описано выше, расщепляли и подвергали случайному мутагенезу в исследуемой пробирке с использованием набора “GeneMorph PCR Mutagenesis”, название продукта набора для внесения мутаций способом ПЦР, производимого Stratagene Company, CA, США, и полученные фрагменты возвращали в исходную ДНК с получением смеси генов, кодирующих мутанты CGT-азы с различными аминокислотными заменами. Путем внесения мутантных генов в экспрессирующие плазмидные векторы получали рекомбинантные ДНК. Библиотеку мутантных генов CGT-азы получали путем трансформации E. coli рекомбинантными ДНК.
Более 1300 штаммов трансформантов было выделено из полученной библиотеки генов и, соответственно, их культивировали и затем получали клеточный лизат в виде неочищенного раствора ферментов, содержащего мутант CGT-азы из клеток, полученных с использованием каждой культуры. Полученному неочищенному раствору ферментов обеспечивали воздействие на водный раствор, содержащий L-аскорбиновую кислоту и частичный гидролизат крахмала, и затем обрабатывали образовавшиеся α-гликозил-L-аскорбиновые кислоты глюкоамилазой с образованием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и проводили скрининг трансформантов, способных продуцировать мутанты CGT-азы с относительно высокой продуктивностью 2-глюкозида аскорбиновой кислоты путем сравнения продуктивности с продуктивностью CGT-азы дикого типа. В ходе скрининга получали два штамма трансформантов, обладающих целевыми мутантными генами CGT-азы, т.е. штаммы #129 и #268. Нуклеотидные последовательности мутантных генов CGT-азы, которыми обладают трансформанты, были расшифрованы и было выявлено, что мутант CGT-азы, продуцируемый штаммом-трансформантом #129, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, где заменены два аминокислотных остатка: 176 остаток глицина (G) заменен остатком аргинина (R), и 452 остаток тирозина (Y) заменен остатком гистидина (H), т.е. он имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. Между тем, мутант CGT-азы, продуцированный штаммом-трансформантом #268, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, где один аминокислотный остаток заменен: 228 остаток лизина (K) заменен остатком изолейцина (I), т.е. он имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5. Эти мутанты CGT-азы соответственно были названы G176R/Y452H и K228I, исходя из замененных участков аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и аминокислотных замен.
Описанные выше два трансформанта, которые обладают генетическими ДНК, кодирующими описанные выше мутанты CGT-азы, соответственно, культивировали в аэробных условиях при 37°C в течение 24 часов с использованием культуральной среды T (содержащей на литр 12 г бактотриптона, 24 г бакто-дрожжевого экстракта, 5 мл глицерина, 17 мМ фосфата калия и 72 мМ дикалийфосфата), содержавшей 100 мкл/мл натрий ампициллина. Клетки, полученные центрифугированием каждой культуры, соответственно подвергали разрушающей обработке посредством “Ultra Sonic Homogenizer UH-600”, название продукта устройства для ультразвукового разрушения, производимого MST Corporation, Aichi, Япония, и супернатант разрушенных клеток нагревали при 60°C в течение 30 мин для денатурации и инактивации нетермостабильных белков, полученных из хозяина. Растворы с тепловой обработкой соответственно далее центрифугировали с получением частично очищенных образцов мутантов CGT-азы.
Ферментативную активность для каждой из описанных выше CGT-аз определяли описанным выше способом и вычисляли с использованием формулы [4].
<Эксперимент 7-2: реакция получения 2-глюкозида аскорбиновой кислоты>
Пять частей по массе “PINEDEX #1”, название продукта декстрина, производимого Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Япония, добавляли к 20 частям по массе воды, растворяли путем нагревания, смешивали с тремя частями по массе L-аскорбиновой кислоты и доводили до pH 5,5 для использования в качестве раствора субстрата. К раствору субстрата добавляли любую из описанных выше коммерческих CGT-аз, и CGT-азы, полученные в эксперименте 7-1, в количестве 100 единиц/г декстрина, м.с.в., и давали им ферментативно взаимодействовать при 55°C в течение 40 часов, и затем нагревали ферментативные реакционные растворы для инактивации оставшегося фермента с получением 2-глюкозида аскорбиновой кислоты вместе с α-гликозил-L-аскорбиновыми кислотами, такими как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота и 2-O-α-мальтотетраозил-L-аскорбиновая кислота. Полученные таким образом реакционные растворы нагревали для инактивации оставшегося фермента, доводили до pH 4,5, смешивали с “GLUCZYME AF6”, название продукта препарата глюкоамилазы (6000 единиц/г), производимым Amano Фермент, Inc., Aichi, Япония, в количестве 50 единиц/г декстрина, м.с.в., подвергали взаимодействию при 55°C в течение 24 часов для гидролиза α-гликозил-L-аскорбиновых кислот вплоть до 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и для гидролиза сопутствующих сахаридов вплоть до D-глюкозы, и нагревали для инактивации оставшейся глюкоамилазы для получения ферментативных реакционных растворов 1-6.
<Эксперимент 7-3: измерение выхода продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты>
Выходы продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативных реакционных растворах 1-6, полученных в эксперименте 7-2, определяли следующим образом: ферментативные реакционные растворы 1-6 соответственно приготавливали в виде 2% раствора с очищенной водой, фильтровали через 0,45-мкм мембранный фильтр и подвергали анализу ВЭЖХ, описанному в эксперименте 1-2, и затем вычисляли содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты каждого из полученных ферментативных реакционных растворов, исходя из каждой площади пика, присутствовавшего на хроматограмме, полученной с помощью дифференциального рефрактометра для каждого раствора, и преобразованием вычисленных данных в данные, выраженные в расчете на массу сухого твердого вещества. Результаты представлены в таблице 7. Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в каждом ферментативном реакционном растворе в таблице 7 представляет собой выход, который можно воспроизводимым образом получать в пределах значительной дисперсии, даже когда реакцию получения 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и обработку глюкоамилазой повторяют пять раз в тех же условиях для каждой CGT-азы.
Таблица 7
Реакционный раствор
Тип CGT-азы
Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативном реакционном растворе (% по массе)*
1
CGT-аза из Bacillus macerans
16
2
CGT-аза из Paenibacillus illinoisensis NBRC15379
18
3
CGT-аза из Geobacillus stearothermophilus Tc-91
28
4
CGT-аза из Thermoanaerobacter thermosulfirigenes
30
5
G176R/Y452H, мутант CGT-азы из Geobacillus stearothermophilus Tc-91
32
6
K228I, мутант CGT-азы, полученный из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91
31
Примечание *: после обработки глюкоамилазой
Как показано в таблице 7, в случае использования CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Bacillus macerans (реакционный раствор 1), выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты после обработки глюкоамилазой составлял вплоть до 16%, и в случае использования CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Paenibacillus illinoisensis (реакционный раствор 2), выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты составлял только 18%. Напротив, в случае использования CGT-азы, полученной из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91 (реакционный раствор 3), выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты достигал 28%, и в случае использования CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Thermoanaerobacter thermosulfirigenes (реакционный раствор 4), выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты достигал 30%. Кроме того, в случае использования G176R/Y452H и K228I, мутантов CGT-азы, полученных из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91, выходы продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты достигали 32% и 31%, соответственно.
Результаты четко указывают на то, что CGT-азы, полученные из микроорганизмов вида Bacillus macerans и Paenibacillus illinoisensis, не могли продуцировать 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с эффективным выходом, и они не пригодны для продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
<Эксперимент 8: влияние способа кристаллизации на чистоту и свойства 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
С использованием общепринятого способа естественного охлаждения и способа псевдоконтролируемого охлаждения в качестве способов кристаллизации для осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, композиции в форме частиц, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, получали из ферментативных реакционных растворов 3-6 с различными выходами продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, полученного согласно эксперименту 7, с последующим изучением влияния таких способов кристаллизации на чистоту и свойства порошкового 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Ферментативные реакционные растворы 1 и 2 с отчетливо низким выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты на стадиях ферментативных реакционных растворов, т.е. ферментативные реакционные растворы, полученные путем обеспечения воздействия CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Bacillus macerans или Paenibacillus illinoisensis, на каждый из ее субстратов, не использовали для получения порошков, поскольку было решено, что они неспособны эффективно продуцировать какую-либо композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты.
<Эксперимент 8-1: получение тестируемых образцов>
<Тестируемые образцы 23-26>
+
-
+
Ферментативные реакционные растворы 3-6 с различным выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, полученные в эксперименте 7, соответственно обесцвечивали активированным углем, фильтровали, обессоливали с использованием катионообменной смолы (H-форма), и пропускали через анионообменную смолу (OH-форма) для адсорбции на нее L-аскорбиновой кислоты и 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и затем смолу промывали водой для удаления сахаридов, содержащих D-глюкозу, и подавали 0,5н. водный раствор хлористоводородной кислоты для обеспечения элюирования. Каждый из элюатов концентрировали до концентрации твердого вещества приблизительно 50%, м.с.в., и подвергали колоночной хроматографии с использованием колонки, упакованной “DIAION UBK 550” (Na-форма), название продукта сильной кислотной катионообменной смолы, производимой Mitsubishi Chemical Corp., Tokyo, Япония, с получением фракций с высоким содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 86% или более. Собранные фракции объединяли и концентрировали до содержания твердого вещества приблизительно 75%, м.с.в., с получением растворов, содержащих 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, 3-6 (содержащих 86,3-87,1%, м.с.в. 2-глюкозида аскорбиновой кислоты), которые соответствовали ферментативным реакционным растворам 3-6, соответственно.
Каждый из описанных выше растворов 3-6, содержавших 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, помещали в кристаллизатор, смешивали с безводным кристаллическим 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты в качестве затравочного кристалла с содержанием приблизительно два процента (масс./об.) по объему раствора каждого сахарида, и кристаллизовали посредством естественного охлаждения каждого раствора от 40°C до 15°C в течение приблизительно 48 часов в условиях перемешивания с получением утфеля с выпавшим в осадок безводным кристаллическим 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты. Безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты собирали из утфеля с использованием общепринятой центрифуги корзинного типа, промывали деионизированной водой в количестве восьми процентов по массе каждого утфеля, выдерживали и сушили при 40°C в течение трех часов, принудительно охлаждали путем продувания его чистым воздухом при 25°C в течение 30 мин, и измельчали в композиции в форме частиц, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты. Композиции в форме частиц, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный из 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, содержащего растворы 3-6, способом естественного охлаждения, были названы, соответственно, тестируемыми образцами 23-26.
<Тестируемые образцы 23c-26c>
Аналогично тому, как указано выше, получали утфель с осажденным безводным кристаллическим 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты, за исключением того, что каждый из растворов 3-6, содержащих 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с различным содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., полученных, как указано выше, концентрировали в вакууме до концентрации твердого вещества приблизительно 75%, м.с.в., помещали в кристаллизатор, смешивали с безводным кристаллическим 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты в качестве затравочного кристалла с содержанием приблизительно два процента (масс./об.) от объема концентрата и подвергали кристаллизации способом псевдоконтролируемого охлаждения, состоящего в охлаждении от 40°C до 15°C в течение приблизительно 48 часов в условиях перемешивания. В способе псевдоконтролируемого охлаждения, время кристаллизации 48 часов в целом разделили на три зоны: 24 часа, 12 часов и 12 часов, где в первой зоне температуру жидкости снижали от 40°C до 35°C в течение 24 часов; в средней зоне температуру жидкости снижали от 35°C до 27,5°C в течение 12 часов; и в последней зоне температуру жидкости охлаждали от 27,5°C до 15°C в течение 12 часов. Из каждого полученного утфеля собирали безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты с использованием общепринятой центрифуги корзинного типа, промывали деионизированной водой в количестве восьми процентов по массе утфеля, выдерживали и сушили при 40°C в течение трех часов, принудительно охлаждали путем продувания чистым воздухом при 25°C в течение 30 мин, и измельчали в композиции в форме частиц, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты. Композиции в форме частиц, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученные из растворов 3-6, содержащих 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, способом псевдоконтролируемого охлаждения, были соответственно названы тестируемыми образцами 23c-26c.
<Эксперимент 8-2: чистота и свойства 2-глюкозида аскорбиновой кислоты тестируемых образцов 23-26 и тестируемых образцов 23c-26c>
Тестируемые образцы 23-26 и тестируемые образцы 23c-26c, полученные, как описано выше, исследовали аналогично эксперименту 6, в отношении их чистоты, степени кристалличности, среднего диаметра кристаллитов, слеживания и растворимости в 1,3-бутиленгликоле в качестве гидрофильного растворителя. Результаты приведены в таблице 8. Результаты для тестируемого образца 16 в качестве порошка категории лечебно-профилактической косметики взяты из таблицы 6 и представлены в таблице 8 параллельно.
Таблица 8
Тестируемый образец
Чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты (% по массе)
Степень кристалличности (%)
Средний диаметр кристаллитов (Å)
Слеживание
Растворимость
23
98,5
87,2
1220
+
-
24
98,4
87,8
1240
+
-
25
98,5
88,5
1280
+
-
26
98,5
87,6
1280
+
-
23c
99,5
90,6
1480
-
-
24c
99,5
92,2
1520
-
-
25c
99,6
93,4
1540
-
-
26c
99,5
92,8
1500
-
-
16
98,9
88,9
1380
+
-
Как показано в таблице 8, содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., или чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в композициях в форме частиц, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты тестируемых образцов 23-26 и тестируемых образцов 23c-26c во всех случаях составляла более 98%, и эти тестируемые образцы представляли собой композиции в форме частиц, содержащие относительно высокочистый безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, аналогично тестируемому образцу 16, который представляет собой композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты в качестве общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики.
Что касается степеней кристалличности, тестируемые образцы 23-26, полученные с использованием общепринятого способа естественного охлаждения на стадии кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, сохраняли степень кристалличности менее 90% аналогично тестируемому образцу 16 в качестве общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики; в то время как все тестируемые образцы 23c-26c, полученные с использованием способа псевдоконтролируемого охлаждения на стадии кристаллизации, продемонстрировали степень кристалличности 90% или более, вновь подтверждая, что такой способ псевдоконтролируемого охлаждения имеет эффект увеличения степени кристалличности полученной композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты. Аналогично степеням кристалличности порошков, средние диаметры кристаллитов тестируемых образцов 23-26 оставались в диапазоне от 1220 до 1280 Å, в то время как тестируемые образцы 23c-26c имели средние диаметры кристаллитов вплоть до 1480-1540 Å.
Также, что касается слеживания порошков, тестируемые образцы 23-26, которые имели степени кристалличности менее 90% и средние диаметры кристаллитов менее 1400 Å, были оценены как “слежавшиеся” (+), в то время как тестируемые образцы 23c-26c, которые имели степени кристалличности по меньшей мере 90% и средние диаметры кристаллитов 1400 Å или более, были оценены как “не слежавшиеся” (-). Что касается растворимости в 1,3-бутиленгликоле, каждый тестируемый образец оценили как “достаточно растворимый” (-).
Результаты в экспериментах 7 и 8 указывают на то, что композицию в форме частиц, которая имеет степень кристалличности по меньшей мере 90% и значительно труднее слеживается, получают путем получения ферментативного реакционного раствора с выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 27% или более с использованием в способе получения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты любой из CGT-аз, полученных из микроорганизма вида Geobacillus stearothermophilus, ее мутантных ферментов, и CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Thermoanaerobacter thermosulfirigenes; очистки ферментативного реакционного раствора до содержания 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 86% или более; и применения способа псевдоконтролируемого охлаждения или способа контролируемого охлаждения на стадии кристаллизации.
<Эксперимент 9: Влияние комбинированного применения фермента, расщепляющего разветвленную структуру крахмала, на выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты при использовании CGT-аз, полученных из различных микроорганизмов>
Представленный ниже эксперимент проводили для исследования того, как комбинированное применение фермента, расщепляющего разветвленную структуру крахмала, влияет на выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативном реакционном растворе, полученном путем ферментативной реакции с использованием любых из CGT-аз, полученных из различных микроорганизмов в ферментативной реакционной системе, где любой из таких CGT-аз обеспечивают воздействие на раствор, содержащий разжиженный крахмал и L-аскорбиновую кислоту, и затем глюкоамилазе обеспечивают воздействие на полученный раствор с образованием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
<Эксперимент 9-1: Реакция получения 2-глюкозида аскорбиновой кислоты>
Реакцию получения 2-глюкозида аскорбиновой кислоты проводили аналогично тому, как в эксперименте 7, за исключением предоставления 1000 единиц/г декстрина, м.с.в., препарата фермента изоамилазы (полученной из микроорганизма вида Pseudomonas amyloderamosa, производимый Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Япония) в качестве фермента, расщепляющего разветвленную структуру крахмала, вместе с любой из CGT-аз, используемых в эксперименте 7. Полученный 2-глюкозид аскорбиновой кислоты обрабатывали глюкоамилазой с получением любого из ферментативных реакционных растворов 7-12, как показано в приведенной ниже таблице 9, и затем проводили измерение выхода продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в каждом из ферментативных реакционных растворов 7-12 способом согласно эксперименту 1-2. Результаты представлены в таблице 9.
Таблица 9
Реакционный раствор
Тип CGT-азы
Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативном реакционном растворе (% по массе)*
7
CGT-аза из Bacillus macerans
21
8
CGT-аза из Paenibacillus illinoisensis NBRC15379
25
9
CGT-аза из Geobacillus stearothermophilus Tc-91
37
10
CGT-аза из Thermoanaerobacter thermosulfirigenes
33
11
G176R/Y452H, мутант CGT-азы, полученный из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91
37
12
K228I, мутант CGT-азы из Geobacillus stearothermophilus Tc-91
36
Примечание *: После обработки глюкоамилазой
Как показано в таблице 9, при использовании в комбинации с ферментом, расщепляющим разветвленную структуру крахмала, CGT-аза, полученная из микроорганизма вида Bacillus macerans (реакционный раствор 7), и CGT-аза, полученная из микроорганизма вида Paenibacillus illinoisensis (реакционный раствор 8), проявляли выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющий 21% и 25%, соответственно, после обработки глюкоамилазой. Между тем, CGT-аза, полученная из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91 (реакционный раствор 9), проявляла выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющий 37%, и CGT-аза, полученная из микроорганизма вида Thermoanaerobacter thermosulfirigenes (реакционный раствор 10), проявляла выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющий 33%. В случае использования G176R/Y452H и K228I, мутанты CGT-азы, полученной из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91, проявляли 37% и 36%, соответственно.
Варьируясь в зависимости от происхождения CGT-аз, комбинированное использование фермента, расщепляющего разветвленную структуру крахмала (изоамилаза) с ферментативной реакцией CGT-азы, более существенно увеличивало выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты после обработки глюкоамилазой в любом из ферментативных реакционных растворов 7-12 на 3%-9%, по сравнению с реакционными растворами, полученными при использовании единичных соответствующих CGT-аз (см. реакционные растворы 1-6 в таблице 7). В случае CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Bacillus macerans (реакционный раствор 7), и CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Paenibacillus illinoisensis (реакционный раствор 8), даже когда фермент, расщепляющий разветвленную структуру крахмала, использовали в комбинации, выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты после обработки глюкоамилазой оставался равным 21% и 25%, соответственно, что было значительно ниже, чем выход, полученный при применении любой из единичных CGT-аз, отличных от указанных выше CGT-аз (см. реакционные растворы 3-6 в таблице 7).
Описанные выше результаты указывают на то, что, когда фермент, расщепляющий разветвленную структуру крахмала, используют в комбинации, CGT-аза, полученная из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91, CGT-аза, полученная из микроорганизма вида Thermoanaerobacter thermosulfirigenes, и G176R/Y452H и K228I в качестве мутантов CGT-азы, полученной из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91, более эффективно продуцируют 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, поскольку они достигают более высокого выхода продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты на приблизительно от 3% до приблизительно 9%, чем выход продуцирования, достигаемый при использовании любой из единичных CGT-аз без использования фермента, расщепляющего разветвленную структуру крахмала.
Описанные выше результаты вновь подтвердили, что CGT-азы, полученные из микроорганизмов видов Bacillus macerans и Paenibacillus illinoisensis, не пригодны для получения 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, поскольку они не могут эффективно продуцировать 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, даже при использовании в комбинации с ферментом, расщепляющим разветвленную структуру крахмала.
<Эксперимент 10: Влияние способа кристаллизации на получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, из реакционного раствора, полученного с использованием CGT-азы и фермента, расщепляющего разветвленную структуру крахмала, в комбинации>
В данном эксперименте исследовали влияние способа кристаллизации на чистоту и свойства порошкового 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, аналогично тому, как в эксперименте 8, при получении композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, из ферментативного реакционного раствора, полученного с использованием CGT-азы и фермента, расщепляющего разветвленную структуру крахмала, в комбинации. Для ферментативных реакционных растворов 7 и 8 с относительно низким выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, их любые порошки не были получены по той же причине, что и в случае эксперимента 8.
<Эксперимент 10-1: получение тестируемых образцов>
<Тестируемые образцы 27-30>
Ферментативные реакционные растворы 9-12, полученные согласно эксперименту 9, соответственно очищали, аналогично эксперименту 8, с получением растворов 9-12, содержащих 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с содержанием 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 86% или более, и затем путем осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты с применением способа естественного охлаждения, аналогично эксперименту 8-1, с получением композиций в форме частиц, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты для использования в качестве тестируемых образцов 27-30.
<Тестируемые образцы 27c-30c>
Аналогично тому, как в тестируемых образцах 27-30, за исключением применения способа псевдоконтролируемого охлаждения, как в эксперименте 8, на стадии кристаллизации 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, получали композиции в форме частиц, содержащие безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, из растворов 9-12, содержащих 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, с содержанием аскорбиновой кислоты 86% или более для использования в качестве тестируемых образцов 27c и 30c.
<Эксперимент 10-2: чистота и свойства 2-глюкозида аскорбиновой кислоты тестируемых образцов 27-30 и тестируемых образцов 27c-30c>
Аналогично эксперименту 8, тестируемые образцы 27-30 и тестируемые образцы 27c-30c соответственно исследовали в отношении чистоты в них 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, степени кристалличности, средних диаметров кристаллитов, слеживания и растворимости в 1,3-бутиленгликоле в качестве гидрофильного растворителя. Результаты представлены в таблице 10. Результаты для тестируемого образца 16 в качестве порошка категории лечебно-профилактической косметики, были взяты из таблицы 6 и показаны в таблице 10 параллельно.
Таблица 10
Тестируемый образец
Чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты (% по массе)
Степень кристалличности (%)
Средний диаметр кристаллитов (Å)
Слеживание
Растворимость
27
99,4
92,6
1440
-
-
28
99,2
88,0
1280
+
-
29
99,5
94,2
1480
-
-
30
99,6
93,8
1460
-
-
27c
99,7
97,6
1660
-
-
28c
99,6
97,2
1620
-
-
29c
99,8
98,0
1680
-
-
30c
99,6
97,1
1650
-
-
16
98,9
88,9
1380
+
-
Как очевидно из таблицы 10, любой из тестируемых образцов 27-30, исключая тестируемый образец 28 и тестируемые образцы 27c-30c, имел чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 99,2%, степень кристалличности по меньшей мере 92,6%, и средний диаметр кристаллитов 1440 Å или более, и они представляли собой порошки, которые не проявляли слеживания в исследованных условиях. Тестируемый образец 28, полученный из ферментативного реакционного раствора с выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты вплоть до 33% на стадии ферментной реакции, полученный с применением способа естественного охлаждения на стадии кристаллизации, имел чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 99,2%, степень кристалличности 88,0%, и средний диаметр кристаллитов 1280 Å, и он был оценен как “слежавшийся” (+) в тесте на слеживание. Напротив, как очевидно из результатов тестируемого образца 28c, даже когда выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты остается на уровне не более 33% на стадии ферментативной реакции, можно получать порошок, который не проявляет слеживания, с применением способа псевдоконтролируемого охлаждения на стадии кристаллизации, чтобы он имел степень кристалличности по меньшей мере 90% и средний диаметр кристаллитов 1400 Å или более.
Описанные выше результаты указывают на то, что композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который значительно труднее слеживается и имеет степень кристалличности по меньшей мере 90%, можно получать из ферментативного реакционного раствора с увеличенным выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты до 35% или более при использовании в комбинации с ферментом, расщепляющим разветвленную структуру крахмала, в реакции продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, независимо от способа охлаждения, используемого на стадии кристаллизации; и композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который значительно труднее слеживается и имеет степень кристалличности по меньшей мере 90%, можно получать даже из ферментативного реакционного раствора с увеличенным выходом продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты приблизительно до 33%, но ниже 35%, с применением способа псевдоконтролируемого охлаждения или способа контролируемого охлаждения на стадии кристаллизации.
<Эксперимент 11: Обычные неполные аминокислотные последовательности CGT-аз, пригодных для продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты>
Для характеризации CGT-аз, пригодных для получения 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, аминокислотные последовательности (SEQ ID NO:1, 4 и 5) CGT-азы, полученной из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91 и его мутантных ферментов, и аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:3) CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Thermoanaerobacter thermosulfirigenes, которые пригодны для продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, сравнивали с аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:6) CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Bacillus macerans, и одной (SEQ ID NO:7) из CGT-аз, полученных из микроорганизма вида Paenibacillus illinoisensis, которые не пригодны для продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. При сравнении этих аминокислотных последовательностей, использованные последовательности представляли собой последовательности CGT-аз, полученных из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91 и микроорганизма вида Bacillus macerans, которые были уникальным образом определены тем же автором, что и автор настоящего изобретения, и описаны, соответственно, в патенте Японии Kokai № 135581/86, выданном на имя того же заявителя, что и заявитель настоящего изобретения. Аминокислотную последовательность, зарегистрированную в “GenBank”, базе данных генов, под номером доступа 35484, использовали в качестве последовательности для CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Thermoanaerobacter thermosulfirigenes. Кроме того, ее использовали в качестве аминокислотной последовательности CGT-азы, полученной из микроорганизма вида Paenibacillus illinoisensis, кодируемой нуклеотидной последовательностью, уникальным образом определенной тем же автором, что и автор настоящего изобретения, после клонирования гена CGT-азы Paenibacillus illinoisensis штамма NBRC15379.
При сравнении описанных выше аминокислотных последовательностей, следующие неполные аминокислотные последовательности (a)-(d) были определены в качестве последовательностей, которые обычно существуют в CGT-азах, пригодных для продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, т.е. в CGT-азе, полученной из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91, ее мутантных ферментах, и CGT-азе, полученной из микроорганизма вида Thermoanaerobacter thermosulfirigenes, но не существуют в CGT-азах, не пригодных для продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, т.е. CGT-азах, полученных из микроорганизмов вида Bacillus macerans и Paenibacillus illinoisensis:
1
(a) Asn-Glu-Val-Asp-X-Asn-Asn;
2
(b) Met-Ile-Gln-X-Thr-Ala;
(c) Pro-Gly-Lys-Tyr-Asn-Ile и
3
(d) Val-X-Ser-Asn-Gly-Ser-Val,
1
2
3
(где X означает Pro или Ala, X означает Ser или Asp, и X означает Ser или Gly).
Исходя из представленных выше результатов, было обнаружено, что CGT-аза, пригодная для продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты способом согласно настоящему изобретению, т.е. CGT-азы, которые достигают выхода продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составляющего 27% или более, характеризуются указанными выше неполными аминокислотными последовательностями (a)-(d).
Следующие примеры, сравнительные примеры и справочные примеры поясняют настоящее изобретение более подробно, но настоящее изобретение никогда не следует ограничивать ими.
Пример 1
<Получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Четыре части по массе разжиженного картофельного крахмала добавляли к 20 частям по массе воды, растворяли в ней нагреванием и смешивали с тремя частями по массе L-аскорбиновой кислоты, и затем полученный раствор доводили до pH 5,5 для применения в качестве раствора субстрата. К раствору субстрата добавляли раствор неочищенного фермента (производимого Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония) CGT-азы, полученной из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91 (депонированного в International Patent Organism Depositary in National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japan, под номером доступа FERM BP-11273) в количестве 100 единиц/г твердого разжиженного картофельного крахмала, м.с.в. и подвергали ферментативной реакции при 55°C в течение 40 часов с получением 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и α-гликозил-L-аскорбиновых кислот, таких как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота и 2-O-α-мальтотетраозил-L-аскорбиновая кислота.
После нагревания ферментативного реакционного раствора для инактивации оставшегося фермента, полученный раствор доводили до pH 4,5, смешивали с “GLUCZYME AF6”, название продукта образца глюкоамилазы (6000 единиц/г), производимым Amano Enzyme, Inc., Aichi, Япония, в количестве 50 единиц/г твердого вещества, м.с.в., разжиженного картофельного крахмала и обрабатывали при 55°C в течение 24 часов для гидролиза α-гликозил-L-аскорбиновых кислот до 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и для гидролиза сопутствующих сахаридов до D-глюкозы. Выход продуцирования L-2-глюкозида аскорбиновой кислоты составлял приблизительно 28%.
+
-
+
После инактивации оставшегося фермента нагреванием, ферментативный реакционный раствор обесцвечивали активированным углем и фильтровали, и фильтрат обессоливали с использованием катионообменной смолы (H-форма). Затем L-аскорбиновой кислоте и 2-глюкозиду аскорбиновой кислоты в обессоленном растворе давали адсорбироваться на анионообменную смолу (OH-форма), и затем смолу промывали водой для удаления D-глюкозы перед элюированием 0,5н. водным раствором хлористоводородной кислоты. Концентрат концентрировали до концентрации твердого вещества приблизительно 50% и подвергали колоночной хроматографии с псевдодвижущимся слоем с использованием 10 колонок, упакованных “DIAION UBK 550” (Na-форма), название продукта сильной кислотной катионообменной смолы, производимой Mitsubishi Chemical Corp., Tokyo, Япония. Полученным элюатом загружали колонки на уровне приблизительно 1/40 объема влажной смолы, и затем в колонки подавали элюент на уровне приблизительно 5 объемов загрузки, и затем собирали фракции, богатые 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты, но бедные L-аскорбиновой кислотой. Фракции объединяли, установив, что они содержали 87,2%, м.с.в., 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
После концентрирования объединенных фракций при пониженном давлении до концентрата приблизительно 76%, которые затем помещали в кристаллизатор и смешивали с “ASCORBIC ACID 2-GLUCOSIDE 999” (код №: AG124, чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 99,9%), название продукта композиции в форме частиц, содержащего безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, производимый в качестве аналитического стандартного реагента Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, в качестве затравочного кристалла с содержанием твердых веществ два процента. Затем раствор смеси доводили до 40°C и подвергали способу псевдоконтролируемого охлаждения, состоящему в охлаждении раствора от 40°C до 30°C в течение 1,5 суток, и последующем охлаждении от 30°C до 15°C в течение 0,5 суток в условиях осторожного перемешивания для осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
100
0
Выпавшие в осадок кристаллы собирали с использованием центрифуги корзинного типа, промывали распылением на них небольшого количества холодной очищенной воды, выдерживали и сушили при 38°C в течение трех часов, охлаждали продуванием воздухом при 25°C в течение 45 мин, и измельчали с получением композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая имела чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 99,3%, общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы 0,1%, содержание L-аскорбиновой кислоты менее 0,1%, способность к восстановлению композиции в форме частиц в целом 0,27%, степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 90,3%, и средний диаметр кристаллитов 1460 Å. В частности, описанную выше степень кристалличности определяли способом Германса с использованием аналитических величин H и H, полученных в эксперименте 1-2. При измерении распределения размера частиц, композиция в форме частиц содержала 91,0% частиц с размером частиц менее 150 мкм и 50,7% частиц с размером частиц 53 мкм или более, но менее 150 мкм.
Композицией в форме частиц легко манипулировать, поскольку она значительно труднее слеживается и имеет более высокую растворимость в гидрофильных растворителях, широко используемых в косметике и лечебно-профилактической косметике, по сравнению с общепринятым порошком категории лечебно-профилактической косметики, производимым в качестве отбеливающего кожу ингредиента лечебно-профилактической косметики. Поскольку композиция в форме частиц не отличается от композиции общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики в том, что она представляет собой композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, аналогично описанному выше общепринятому порошку категории лечебно-профилактической косметики, ее можно использовать отдельно или в комбинации с другими ингредиентами в качестве порошкового материала для продуктов питания, пищевых добавок, косметики, лечебно-профилактической косметики, фармацевтических препаратов и т.д.
Пример 2
<Получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, получали аналогично примеру 1, за исключением обеспечения воздействия пуллуланазы (код продукта “EN201”, производимая Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония), полученной из микроорганизма вида Klebsiella pneumoniae (Aerobacter aerogenes), на раствор, содержащий разжиженный крахмал и L-аскорбиновую кислоту в количестве пяти единиц на твердый разжиженный крахмал, когда CGT-азе обеспечивают воздействие на раствор, содержащий разжиженный крахмал и L-аскорбиновую кислоту; и применения способа псевдоконтролируемого охлаждения, состоящего в охлаждении раствора от 40°C до 35°C в течение 1,5 суток, и последующем охлаждении его от 35°C до 15°C в течение 0,5 суток, при осаждении безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Более того, выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативном реакционном растворе после обработки глюкоамилазой составлял приблизительно 29,5%. Содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., в растворе, который подвергали кристаллизации 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составило 91,8%.
100
0
Продукт имел чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 99,5%, общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы 0,1%, содержание L-аскорбиновой кислоты менее 0,1%, способность к восстановлению композиции в форме частиц в целом 0,21%, степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 91,0%, и средний диаметр кристаллитов 1540 Å. В частности, описанную выше степень кристалличности определяли способом Германса с использованием аналитических величин H и H, полученных в эксперименте 1-2. При измерении распределения размера частиц, композиция в форме частиц содержала 93,0% частиц с размером частиц менее 150 мкм и 53,7% частиц с размером частиц 53 мкм или более, но менее 150 мкм.
Композицией в форме частиц легко манипулировать, поскольку она значительно труднее слеживается и имеет лучшую растворимость в гидрофильных растворителях, широко используемых в косметике и лечебно-профилактической косметике, по сравнению с общепринятым порошком категории лечебно-профилактической косметики, производимым в качестве отбеливающего кожу ингредиента лечебно-профилактической косметики. Поскольку композиция в форме частиц не отличается от такого общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики в том, что она представляет собой композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, аналогично описанному выше общепринятому порошку категории лечебно-профилактической косметики, ее можно использовать отдельно или в комбинации с другими ингредиентами в качестве порошкового материала для продуктов питания, пищевых добавок, косметики, лечебно-профилактической косметики, фармацевтических препаратов, и т.д.
Пример 3
<Получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Пять частей по массе кукурузного крахмала добавляли к 15 частям по массе воды, и затем растворяли в ней нагреванием после добавления коммерческого разжижающего фермента. Полученный раствор смешивали с тремя частями по массе L-аскорбиновой кислоты и доводили до pH 5,5 для использования в качестве раствора субстрата. К раствору субстрата добавляли “TORUZYME 3.0L” (см., например, патентные документы 30 и 31), название продукта коммерчески доступного образца CGT-азы, производимой Novozymes Japan Ltd., Tokyo, Япония, полученный с помощью рекомбинации гена CGT-азы, полученной из микроорганизма рода Thermoanaerobacter, и, давая полученной рекомбинантной CGT-азе экспрессироваться в микроорганизме рода Bacillus в количестве 100 единиц/г твердого кукурузного крахмала, м.с.в., и подвергали ферментативной реакции при 55°C в течение 50 часов с получением 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и других α-гликозил-L-аскорбиновых кислот.
После инактивации оставшихся ферментов нагреванием, ферментативный реакционный раствор доводили до pH 4,5, смешивали с “GLUCOZYME #20000”, название продукта препарата глюкоамилазы с активностью 20000 единиц/г, производимого Nagase ChemteX Corp., Osaka, Япония, в количестве 50 единиц/г твердого кукурузного крахмала, м.с.в., и подвергали ферментативной реакции при 55°C в течение 24 часов для гидролиза α-гликозил-L-аскорбиновых кислот, таких как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота и 2-O-α-мальтотетраозил-L-аскорбиновая кислота до 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и для гидролиза сопутствующих сахаридов до D-глюкозы. Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в полученном реакционном растворе составлял приблизительно 31%.
+
-
После инактивации оставшегося фермента нагреванием, реакционный раствор обесцвечивали активированным углем и фильтровали. Фильтрат обессоливали с использованием катионообменной смолы (H-форма) и подавали на анионообменную смолу (OH-форма) для адсорбирования на ней L-аскорбиновой кислоты и 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, с последующим промыванием анионообменной смолы водой для удаления D-глюкозы и подачей 0,5н. раствора хлористоводородной кислоты на смолу для элюирования. Элюат подвергали колоночной хроматографии с использованием “TOYOPEARL HW-40”, название продукта пористой смолы Tosoh Corp., Tokyo, Япония, для сбора фракций, богатых 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты, но бедных L-аскорбиновой кислотой. Собранные фракции объединяли, установив, что они содержали 88,6%, м.с.в., 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
Объединенные фракции концентрировали при пониженном давлении до концентрата 76%, который помещали в кристаллизатор и смешивали с композицией в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный согласно примеру 1, в качестве затравочного кристалла, с содержанием твердого вещества два процента. Затем концентрат нагревали до 40°C и подвергали способу псевдоконтролируемого охлаждения, состоящему в охлаждении концентрата в условиях осторожного перемешивания от 40°C до 33°C в течение 1,5 суток, и затем от 33°C до 15°C в течение 0,5 суток для осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
100
0
Кристаллы собирали с использованием центрифуги корзинного типа, промывали распылением на них небольшого количества дистиллированной воды, выдерживали и сушили полученный материал при 35°C в течение восьми часов, охлаждали полученный продукт продуванием его воздухом при 25°C в течение 15 мин, и измельчали полученный продукт с получением композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который имел чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 99,2%, общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы менее 0,1%, содержание L-аскорбиновой кислоты менее 0,1%, способность к восстановлению композиции в форме частиц в целом 0,17%, степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 91,5%, и средний диаметр кристаллитов 1610 Å. В частности, описанную выше степень кристалличности определяли способом Германса с использованием аналитических величин H и H, полученных в эксперименте 1-2. При измерении распределения размера частиц, композиция в форме частиц содержала 83,2% частиц с размером частиц менее 150 мкм и 57,1% частиц с размером частиц 53 мкм или более, но менее 150 мкм.
Композицией в форме частиц легко манипулировать, поскольку она значительно труднее слеживается и имеет лучшую растворимость в гидрофильных растворителях, широко используемых в косметике и лечебно-профилактической косметике, по сравнению с общепринятым порошком категории лечебно-профилактической косметики, производимым в качестве в качестве отбеливающего кожу ингредиента лечебно-профилактической косметики. Поскольку композиция в форме частиц не отличается от такого общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики в том, что она представляет собой композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, аналогично описанному выше общепринятому порошку категории лечебно-профилактической косметики, ее можно использовать отдельно или в комбинации с другими ингредиентами в качестве порошкового материала для продуктов питания, пищевых добавок, косметики, лечебно-профилактической косметики, фармацевтических препаратов и т.д.
Пример 4
<Получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, получали с применением способа, аналогично примеру 1, за исключением добавления шести частей по массе кукурузного крахмала к 15 частям по массе воды, растворения кукурузного крахмала путем нагревания после добавления коммерческого разжижающего фермента, добавления к полученному раствору трех частей по массе L-аскорбиновой кислоты, обеспечения воздействия “TORUZYME 3.0L”, название продукта коммерчески доступной CGT-азы, производимой Novozymes Japan Ltd., Tokyo, Япония, на раствор, на который обеспечивали воздействие препарата изоамилазы, полученной из микроорганизма вида Pseudomonas amyloderamosa (ATCC 21262), производимого Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, в количестве 500 единиц/г твердого кукурузного крахмала, м.с.в., и применения способа псевдоконтролируемого охлаждения, состоящего в охлаждении раствора от 40°C до 35°C в течение 24 часов, и последующем охлаждении его от 35°C до 15°C в течение 12 часов, при осаждении безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в реакционном растворе после обработки глюкоамилазой составил приблизительно 32,5%. Содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., в растворе, который подвергали осаждению безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составило 89,6%.
100
0
Продукт имел чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 99,7%, общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы менее 0,1%, содержание L-аскорбиновой кислоты менее 0,1%, способность к восстановлению композиции в форме частиц в целом 0,10%, степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 92,4%, и средний диаметр кристаллитов 1670 Å. В частности, описанную выше степень кристалличности определяли способом Германса с использованием аналитических величин H и H, полученных в эксперименте 1-2. При измерении распределения размера частиц, композиция в форме частиц содержала 94,5% частиц с размером частиц менее 150 мкм и 55,3% частиц с размером частиц 53 мкм или более, но менее 150 мкм.
Композицией в форме частиц легко манипулировать, поскольку она значительно труднее слеживается и имеет лучшую растворимость в гидрофильных растворителях, широко используемых в косметике и лечебно-профилактической косметике, по сравнению с общепринятым порошком категории лечебно-профилактической косметики, производимым в качестве в качестве отбеливающего кожу ингредиента лечебно-профилактической косметики. Поскольку композиция в форме частиц не отличается от такого общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики в том, что она представляет собой композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, аналогично описанному выше общепринятому порошку категории лечебно-профилактической косметики, ее можно использовать отдельно или в комбинации с другими ингредиентами в качестве порошкового материала для продуктов питания, пищевых добавок, косметики, лечебно-профилактической косметики, фармацевтических препаратов и т.д.
Пример 5
<Получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Пять частей по массе кукурузного крахмала добавляли к 15 частям по массе воды, и затем растворяли в ней нагреванием после добавления коммерческого разжижающего фермента. Полученный раствор смешивали с тремя частями по массе L-аскорбиновой кислоты и доводили до pH 5,5 для применения в качестве раствора субстрата. К раствору субстрата добавляли G176R/Y452H в качестве мутанта CGT-азы, полученной из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91, использованного в экспериментах 7 и 9, в количестве 100 единиц/г твердого кукурузного крахмала, м.с.в., и подвергали ферментативной реакции при 55°C в течение 50 часов с получением 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и других α-гликозил-L-аскорбиновых кислот.
После инактивации оставшихся ферментов нагреванием, реакционный раствор доводили до pH 4,5, смешивали с “GLUCOZYME #20000”, название продукта препарата глюкоамилазы (20000 единиц/г), производимым Nagase ChemteX Corp., Osaka, Япония, в количестве 50 единиц/г твердого кукурузного крахмала, м.с.в., и подвергали ферментативной реакции при 55°C в течение 24 часов для гидролиза α-гликозил-L-аскорбиновых кислот, таких как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота и 2-O-α-мальтотетраозил-L-аскорбиновая кислота до 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и для гидролиза сопутствующих сахаридов до D-глюкозы. Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в полученном реакционном растворе составлял приблизительно 31,5%.
+
-
После инактивации оставшегося фермента нагреванием реакционный раствор обесцвечивали активированным углем и фильтровали. Фильтрат обессоливали с использованием катионообменной смолы (H-форма) и подавали на анионообменную смолу (OH-форма) для адсорбирования на ней L-аскорбиновой кислоты и 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, с последующим промыванием анионообменной смолы водой для удаления D-глюкозы и подачи 0,5н. раствора хлористоводородной кислоты на смолу для элюирования. Элюат подвергали колоночной хроматографии с использованием “TOYOPEARL HW-40”, название продукта пористой смолы Tosoh Corp., Tokyo, Япония, для сбора фракций, богатых 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты, но бедных L-аскорбиновой кислотой. Собранные фракции объединяли, установив, что они содержали 88,6%, м.с.в., 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
Затем объединенные фракции помещали в кристаллизатор и смешивали с “ASCORBIC ACID 2-GLUCOSIDE 999” (код №: AG124, чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 99,9%), название продукта стандартной композиции в форме частиц категории реагентов, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, производимый Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, в качестве затравочного кристалла с содержанием твердых веществ два процента. Затем раствор смеси доводили до 40°C и подвергали способу псевдоконтролируемого охлаждения, состоящему в последовательном охлаждении раствора от 40°C до 35°C в течение 24 часов, от 35°C до 30°C в течение 12 часов, и от 30°C до 15°C в течение 12 часов в условиях осторожного перемешивания для осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Кристаллы собирали с использованием центрифуги корзинного типа, промывали распылением на них очищенной воды в количестве приблизительно пяти процентов от массы утфеля, выдерживали и сушили полученный материал при 35°C в течение восьми часов, охлаждали высушенный продукт продуванием его воздухом при 20°C в течение 10 мин, и измельчали охлажденный продукт с получением композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая имела чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 99,2%, общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы 0,4%, содержание L-аскорбиновой кислоты менее 0,1%, и способность к восстановлению композиции в форме частиц в целом 0,50%.
100
0
Композиция в форме частиц, содержащая продукт безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, полученный таким образом, имела степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 90,4% и средний диаметр кристаллитов 1480 Å. Описанную выше степень кристалличности определяли способом Германса с использованием аналитических величин H и H, полученных в эксперименте 1-2. Когда композицию в форме частиц измеряли в отношении распределения размера частиц, она содержала 85,2% частиц с размером частиц менее 150 мкм и 69,3% частиц с размером частиц 53 мкм или более, но менее 150 мкм. Когда композицию подвергали такому же тесту на слеживание, как в эксперименте 1-4, она была оценена как “не слежавшаяся” (-). Также продукт был оценен как “достаточно растворимый”, когда его подвергали такому же тесту на растворимость в 1,3-бутиленгликоле, как в эксперименте 6.
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный описанным выше способом, представляет собой порошок, который значительно труднее слеживается и легко храниться, им легко манипулировать, даже несмотря на то, что композиция в форме частиц не имеет существенных отличий по сравнению с “AA2G”, название продукта композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, в качестве коммерческого общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики, продаваемого Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Япония. Поскольку композиция в форме частиц сходна с таким общепринятым порошком категории лечебно-профилактической косметики в том, что она представляет собой композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, и поскольку ее легко хранить и ею легко манипулировать, ее можно пригодным образом использовать в качестве материала для продуктов питания, пищевых добавок, косметики, лечебно-профилактической косметики, фармацевтических препаратов и т.д.
Пример 6
<Получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Четыре части по массе разжиженного картофельного крахмала добавляли к 20 частям по массе воды и затем растворяли в ней нагреванием. Полученный раствор смешивали с тремя частями по массе L-аскорбиновой кислоты и доводили до pH 5,5 для применения в качестве раствора субстрата. К раствору субстрата добавляли CGT-азу, полученную из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91, в количестве 100 единиц/г твердого крахмала, м.с.в., и “GODO-FIA”, название продукта препарата изоамилазы, полученной из микроорганизма вида Flavobacterium odoratus, производимого Godo Shusei Co., Ltd., Tokyo, Япония, в количестве 500 единиц/г твердого крахмала, м.с.в., и подвергали ферментативной реакции при 55°C в течение 40 часов с получением 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и α-гликозил-L-аскорбиновых кислот, таких как 2-O-α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, 2-O-α-мальтотриозил-L-аскорбиновая кислота и мальтотетраозил-L-аскорбиновая кислота.
После нагревания для инактивации оставшихся ферментов, ферментативный реакционный раствор доводили до pH 4,5, смешивали с "GLUCZYME AF6", название продукта образца глюкоамилазы (6000 единиц/г), производимого Amano Enzyme Inc., Aichi, Япония, в количестве 50 единиц/г твердого крахмала, м.с.в., и обрабатывали нагреванием при 55°C в течение 24 часов для гидролиза α-гликозил-L-аскорбиновых кислот до 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и сопутствующих сахаридов до D-глюкозы. Выход продуцирования L-2-глюкозида аскорбиновой кислоты в реакционном растворе составил приблизительно 36%.
+
-
+
Реакционный раствор нагревали для инактивации оставшегося фермента, обесцвечивали активированным углем, фильтровали, обессоливали катионообменной смолой (H-форма), и подвергали воздействию анионообменной смолы (OH-форма) для адсорбции на нее L-аскорбиновой кислоты и 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и затем промывали анионообменную смолу водой для удаления сахаридов, содержащих D-глюкозу, и подавали 0,5н. водный раствор хлористоводородной кислоты для обеспечения элюирования. Элюат концентрировали до получения концентрации твердого вещества приблизительно 50%, м.с.в., и подвергали колоночной хроматографии с псевдодвижущимся слоем с использованием 10 колонок, упакованных “DIAION UBK 550” (Na-форма), название продукта сильной кислотной катионообменной смолы, производимой Mitsubishi Chemical Corp., Tokyo, Япония. Элюат, концентрированный до концентрации твердого вещества приблизительно 50%, загружали в колонки на уровне приблизительно 1/40 объема влажной смолы, и элюент подавали на уровне приблизительно 15 объемов загрузки для элюирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и затем собирали фракции, богатые 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты, но бедные L-аскорбиновой кислотой. Фракции объединяли, установив, что они содержат приблизительно 86,6%, м.с.в., 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
Объединенные фракции концентрировали в вакууме в приблизительно 76% концентрат, который затем помещали в кристаллизатор и смешивали с “ASCORBIC ACID 2-GLUCOSIDE 999” (код №: AG124, чистота 2-глюкозида аскорбиновой кислоты по меньшей мере 99,9%), название продукта композиции в форме частиц категории реагентов, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, производимый Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, в качестве затравочного кристалла, с содержанием твердого вещества на уровне двух процентов. Затем, раствор смеси доводили до 40°C и охлаждали в течение 48 часов путем последовательного охлаждения раствора от 40°C до 35°C в течение 20 часов, от 35°C до 30°C в течение 16 часов, и от 30°C до 15°C в течение 12 часов в условиях осторожного перемешивания способом псевдоконтролируемого охлаждения для кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Кристаллы собирали с использованием центрифуги корзинного типа, промывали распылением на нее очищенной воды в количестве приблизительно пяти процентов от массы утфеля, выдерживали и сушили полученный материал при 38°C в течение трех часов, охлаждали полученный продукт продуванием его воздухом при 20°C в течение 45 мин, и измельчали охлажденный продукт с получением композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который имел чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 99,5%, м.с.в., общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы 0,1%, содержание L-аскорбиновой кислоты менее 0,1%, и способность к восстановлению композиции в форме частиц в целом 0,21%.
100
0
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный описанным выше способом, имела степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 93,9%, и средний диаметр кристаллитов 1630 Å. В частности, описанную выше степень кристалличности определяли способом Германса с использованием аналитических величин H и H, полученных в эксперименте 1-2. Когда композицию в форме частиц измеряли в отношении распределения размера частиц, она содержала 91,2% частиц с размером частиц менее 150 мкм и 57,3% частиц с размером частиц 53 мкм или более, но менее 150 мкм. Когда композицию подвергали такому же тесту на слеживание, как в эксперименте 1-4, ее оценили как “не слежавшуюся” (-). Также, когда продукт подвергали такому же тесту на растворимость в 1,3-бутиленгликоле, как в эксперименте 6, она была оценена как “достаточно растворимая”.
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, представляет собой порошок, который значительно труднее слеживается, по сравнению с общепринятым порошком категории лечебно-профилактической косметики, и ее можно преимущественно использовать в качестве материала для продуктов питания, пищевых добавок, косметики, лечебно-профилактической косметики, фармацевтических препаратов, и т.д.
Пример 7
<Получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, получали аналогично примеру 6, за исключением использования в реакции продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, “TORUZYME 3.0L”, название продукта рекомбинантной CGT-азы, производимой Novozymes Japan Ltd., Tokyo, Япония, полученного из CGT-азы, полученной из микроорганизма рода Thermoanaerobacter, и “PROMOZYME”, название продукта препарата пуллуланазы, полученной из микроорганизма вида Bacillus acidopullulyticus, производимого Novozymes Japan Ltd., Tokyo, Япония, в качестве фермента, расщепляющего разветвленную структуру крахмала, подлежащего применению в комбинации с CGT-азой, в количестве 50 единиц/г твердого крахмала, м.с.в.; и использования на стадии кристаллизации способа псевдоконтролируемого охлаждения, состоящего в охлаждения ферментативного реакционного раствора от 40°C до 15°C в течение 48 часов за пять стадий, т.е. последовательного охлаждения раствора от 40°C до 38°C в течение 12 часов, от 38°C до 35°C в течение 12 часов, от 35°C до 30°C в течение восьми часов, от 30°C до 23°C в течение восьми часов, и затем от 23°C до 15°C в течение восьми часов. Композиция в форме частиц имела, в расчете на массу сухого твердого вещества, содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 99,3%, общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы 0,1%, содержание L-аскорбиновой кислоты менее 0,1%, и способность к восстановлению композиции в форме частиц в целом 0,28%. Данный способ обеспечил выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 32,9% в реакционном растворе после обработки глюкоамилазой. Содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., в растворе, который подвергали кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составило 86,4%.
100
0
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, имела степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 96,4%, и имела средний диаметр кристаллитов 1570 Å. В частности, описанную выше степень кристалличности определяли способом Германса с использованием аналитических величин H и H, полученных в эксперименте 1-2. Когда в композиции в форме частиц измеряли распределение размера частиц, она содержала 92,2% частиц с размером частиц менее 150 мкм и 54,8% частиц с размером частиц 53 мкм или более, но менее 150 мкм. Когда композицию подвергали такому же тесту на слеживание, как в эксперименте 1-4, ее оценили как “не слежавшуюся” (-). Также продукт был оценен как “достаточно растворимый”, когда его подвергали такому же тесту на растворимость в 1,3-бутиленгликоле, как в эксперименте 6.
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный описанным выше способом, представляет собой порошок, который значительно труднее слеживается и легко хранится, им легко манипулировать, даже несмотря на то, что композиция в форме частиц не имеет значительных отличий по сравнению с “AA2G”, название продукта композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, в качестве коммерческого общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики, продаваемого Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Япония.
Поскольку композиция в форме частиц сходна с композицией общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики в том, что она представляет собой композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, и поскольку она легко хранится, ею легко манипулировать, ее можно более пригодным образом использовать в качестве материала для продуктов питания, пищевых добавок, косметики, лечебно-профилактической косметики, фармацевтических препаратов, и т.д.
Пример 8
<Получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, получали аналогично примеру 3, за исключением использования запрограммированного калькулятора констант общего назначения для системы кристаллизации на стадии кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и применения способа контролируемого охлаждения, состоящего в охлаждении реакционного раствора от 40°C до 15°C в течение 48 часов с помощью диаграммы охлаждения из 20 стадий, практически идентичного формуле [7], путем подачи теплоносителя с контролируемой температурой в рубашку кристаллизатора. Композиция в форме частиц, полученная таким образом, имела, в расчете на массу сухого твердого вещества, содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 99,6%, общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы 0,1%, содержание L-аскорбиновой кислоты менее 0,1%, и способность к восстановлению композиции в форме частиц в целом 0,17%. Такое получение обеспечило выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты приблизительно 31% в реакционном растворе после обработки глюкоамилазой. Содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., в растворе, который подвергали кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составило 88,7%.
100
0
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, имела степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 93,0%, и имела средний диаметр кристаллитов 1650 Å. В частности, описанную выше степень кристалличности определяли способом Германса с использованием аналитических величин H и H, полученных в эксперименте 1-2. Когда в композиции в форме частиц измеряли распределение размера частиц, она содержала 90,4% частиц с размером частиц менее 150 мкм и 65,3% частиц с размером частиц 53 мкм или более, но менее 150 мкм. Когда композицию подвергали такому же тесту на слеживание, как в эксперименте 1-4, ее оценили как “не слежавшуюся” (-). Также продукт был оценен как “достаточно растворимый”, когда его подвергали такому же тесту на растворимость в 1,3-бутиленгликоле, как в эксперименте 6.
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный описанным выше способом, представляет собой порошок, который значительно труднее слеживается и легко хранится, им легко манипулировать, даже несмотря на то, что композиция в форме частиц не имеет значительных отличий по сравнению с “AA2G”, название продукта композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, в качестве коммерческого общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики, продаваемого Hayashibara Shoji, Co., Ltd., Okayama, Япония.
Поскольку композиция в форме частиц сходна с композицией общепринятого порошка категории лечебно-профилактической косметики в том, что она представляет собой композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, и поскольку она легко хранится и ею легко манипулировать, ее можно более пригодным образом использовать в качестве материала для продуктов питания, пищевых добавок, косметики, лечебно-профилактической косметики, фармацевтических препаратов, и т.д.
<Сравнительный пример 1: получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, получали аналогично примеру 1, за исключением применения общепринятого способа естественного охлаждения без применения способа псевдоконтролируемого охлаждения на стадии кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Композиция в форме частиц, полученная таким образом, имела, в расчете на массу сухого твердого вещества, содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 98,6%, общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы 0,5%, содержание L-аскорбиновой кислоты менее 0,3%, и способность к восстановлению композиции в форме частиц в целом 0,72%. Такое получение обеспечивало выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты приблизительно 28,4% в реакционном растворе после обработки глюкоамилазой, и содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., в растворе, подвергнутом осаждению безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составило 86,5%.
100
0
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, имела степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 87,5%, и имела средний диаметр кристаллитов 1290 Å. В частности, описанную выше степень кристалличности определяли способом Германса с использованием аналитических величин H и H, полученных в эксперименте 1-2. Когда в композиции в форме частиц измеряли распределение размера частиц, она содержала 74,8% частиц с размером частиц менее 150 мкм и 68,6% частиц с размером частиц 53 мкм или более, но менее 150 мкм. Когда композицию подвергали такому же тесту на слеживание, как в эксперименте 1-4, ее оценили как “слежавшуюся” (+). Также, когда продукт подвергали такому же тесту на растворимость в 1,3-бутиленгликоле, как в эксперименте 6, она была оценена как “достаточно растворимая”.
<Сравнительный пример 2: Получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, получали аналогично примеру 3, за исключением использования общепринятого способа естественного охлаждения без применения способа псевдоконтролируемого охлаждения на стадии кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Композиция в форме частиц, полученная таким образом, имела, в расчете на массу сухого твердого вещества, содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 98,3%, общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы 0,6%, содержание L-аскорбиновой кислоты менее 0,4%, и способность к восстановлению композиции в форме частиц в целом 0,85%. Это получение обеспечило выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты приблизительно 30,5% в реакционном растворе после обработки глюкоамилазой, и содержание 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, м.с.в., в растворе, подвергнутом кристаллизации безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, составило 87,8%.
100
0
Композиция в форме частиц, содержащая безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, имела степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 88,6%, и имела средний диаметр кристаллитов 1310 Å. В частности, описанную выше степень кристалличности определяли способом Германса с использованием аналитических величин H и H, полученных в эксперименте 1-2. Когда в композиции в форме частиц измеряли распределение размера частиц, она содержала 76,5% частиц с размером частиц менее 150 мкм и 68,4% частиц с размером частиц 53 мкм или более, но менее 150 мкм. Когда композицию подвергали такому же тесту на слеживание, как в эксперименте 1-4, ее оценили как “слежавшуюся” (+). Также, когда продукт подвергали такому же тесту на растворимость в 1,3-бутиленгликоле, как в эксперименте 6, ее оценили как “достаточно растворимая”.
<Справочный пример 1: получение композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты>
Пять частей по массе картофельного крахмала добавляли к 15 частям по массе воды, и затем растворяли в ней нагреванием после добавления коммерческого разжижающего фермента. Полученный раствор смешивали с тремя частями по массе L-аскорбиновой кислоты и доводили до pH 5,5 для применения в качестве раствора субстрата. К раствору субстрата добавляли CGT-азу, полученную из Geobacillus stearothermophilus штамма Tc-91 (депонированного в International Patent Organism Depositary in National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japan, под номером доступа FERM BP-11273), и изоамилазу, производимую Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Япония, в соответствующих количествах 100 единиц и 1000 единиц/г твердого картофельного крахмала, м.с.в., и подвергали реакции при 55°C в течение 50 часов с получением 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и других α-гликозил-L-аскорбиновых кислот. После инактивации оставшихся ферментов нагреванием, реакционный раствор доводили до pH 4,5, смешивали с “GLUCOZYME #20000”, название продукта препарата глюкоамилазы с активностью 20000 единиц/г, производимого Nagase ChemteX Corp., Osaka, Япония, в количестве 50 единиц/г твердого картофельного крахмала, м.с.в., и подвергали ферментативной реакции при 55°C в течение 24 часов для гидролиза α-гликозил-L-аскорбиновых кислот до 2-глюкозида аскорбиновой кислоты и для гидролиза сопутствующих сахаридов до D-глюкозы. Выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в полученном реакционном растворе составлял приблизительно 38%.
+
-
После нагревания для инактивации оставшегося фермента, реакционный раствор обесцвечивали активированным углем и фильтровали. Фильтрат обессоливали с помощью катионообменной смолы (H-форма) и подавали на анионообменную смолу (OH-форма) для адсорбции на ней L-аскорбиновой кислоты и 2-глюкозида аскорбиновой кислоты, и затем промывали анионообменную смолу водой для удаления D-глюкозы и подавали на смолу 0,5н. раствор хлористоводородной кислоты для обеспечения элюирования. Элюат подвергали колоночной хроматографии с использованием “TOYOPEARL HW-40”, название продукта пористой смолы Tosoh Corp., Tokyo, Япония, для сбора фракций, богатых 2-глюкозидом аскорбиновой кислоты, но бедных L-аскорбиновой кислотой. Собранные фракции объединяли, установив, что они содержали 87,6%, м.с.в., 2-глюкозида аскорбиновой кислоты.
100
0
Объединенные фракции концентрировали в вакууме в приблизительно 76% концентрат, который затем помещали в кристаллизатор и смешивали с композицией в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, полученный согласно примеру 1, в качестве затравочного кристалла с содержанием на уровне двух процентов от содержания твердых веществ. Затем полученную смесь нагревали до 40°C и подвергали способу естественного охлаждения, состоящему в охлаждении смеси до 15°C в течение двух суток в условиях осторожного перемешивания для осаждения безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты. Кристаллы собирали с использованием центрифуги корзинного типа, промывали распылением на них небольшого количества дистиллированной воды, выдерживали и сушили полученный материал при 35°C в течение восьми часов, охлаждали полученный продукт, продуванием его воздухом при 20°C в течение 10 мин, и измельчали охлажденный продукт с получением композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, который имел чистоту 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 98,5%, общее содержание L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы менее 0,1%, содержание L-аскорбиновой кислоты менее 0,1%, способность к восстановлению композиции в форме частиц в целом 0,15%, степень кристалличности безводного кристаллического 2-глюкозида аскорбиновой кислоты 91,8%, и средний диаметр кристаллитов 1320 Å. В частности, описанную выше степень кристалличности определяли способом Германса с использованием аналитических величин H и H, полученных в эксперименте 1-2. Когда в композиции в форме частиц измеряли распределение размера частиц, она содержала 83,0% частиц с размером частиц менее 150 и 57,7% частиц с размером частиц 53 мкм или более, но менее 150 мкм. Когда композицию подвергали такому же тесту на слеживание, тесту на стабильность при хранении и тесту на растворимость, как в соответствующих экспериментах 1-4, 3-2 и 6, она была оценена как “не слежавшаяся” (-) в тесте на слеживание и тесте на стабильность при хранении, но была оценена как “недостаточно растворимая” (-) в тесте на растворимость.
Промышленная применимость
Как описано выше, в соответствии со способом получения композиции в форме частиц, содержащей безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, можно получать композицию в форме частиц, содержащую безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, которая значительно труднее слеживается, по сравнению с общепринятыми порошками категории лечебно-профилактической косметики, с использованием либо крахмала, либо декстрина и L-аскорбиновой кислоты в качестве исходных материалов и с применением способа контролируемого охлаждения или способа псевдоконтролируемого охлаждения на стадии кристаллизации, даже когда выход продуцирования 2-глюкозида аскорбиновой кислоты в ферментативном реакционном растворе не достигает 35%. Как описано выше, способ согласно настоящему изобретению расширяет диапазон выбора используемых ферментов и обеспечивает более эффективное получение композиций в форме частиц, содержащих безводный кристаллический 2-глюкозид аскорбиновой кислоты, в промышленном масштабе с использованием, в качестве исходных материалов, либо крахмала, либо декстрина и L-аскорбиновой кислоты, которые являются истощимыми ресурсами; и таким образом, он имеет особую промышленную применимость.
Пояснение обозначений
На фиг.1, обозначения “a”-“e” означают следующее:
a: Дифракционный пик при угле дифракции (2θ) 10,4° (индекс Миллера (hkl):120) для применения для вычисления диаметра кристаллитов;
b: Дифракционный пик при угле дифракции (2θ) 13,2° (индекс Миллера (hkl):130) для применения для вычисления диаметра кристаллитов;
c: Дифракционный пик при угле дифракции (2θ) 18,3° (индекс Миллера (hkl):230) для применения для вычисления диаметра кристаллитов;
d: Дифракционный пик при угле дифракции (2θ) 21,9° (индекс Миллера (hkl):060) для применения для вычисления диаметра кристаллитов; и
e: Дифракционный пик при угле дифракции (2θ) 22,6° (индекс Миллера (hkl):131) для применения для вычисления диаметра кристаллитов.
На фиг.5, следующие обозначения означают следующее:
pUC ori: ориджин репликации плазмиды pUC;
T7: промотор T7;
Белая стрелка (Amp): ген устойчивости к ампициллину; и
Черная стрелка: ген CGT-азы.
На фиг.6, обозначения “a”-“c” означают следующее:
a: Кривая контролируемого охлаждения;
b: линейное охлаждение; и
c: кривая естественного охлаждения.