Способ оценки функционального состояния лимфоцитов периферической крови
METHOD FOR ASSESSING THE FUNCTIONAL STATE OF PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к иммунологии, которое может быть использовано в клинической практике для оценки жизнеспособности лимфоцитов периферической крови организма, в частности к способу определения оценки функционального состояния лимфоцитов периферической крови и использовании иммунологических методов диагностики для выявления различных иммунологических заболеваний и действия лекарственных препаратов на организм.
Уровень техники
При изучении патентной и научно-технической информации выявлено несколько способов оценки функционального состояния лимфоцитов периферической крови.
Известен способ оценки влияния глюкокортикостероидов на моноциты периферической крови по изменению их морфометрических показателей методом компьютерной фазово-интерференционной микроскопии (Терпигорев С.А., Ильченко В.А., Василенко И.А. и др. «Соотношение результатов лечения глюкокортикостероидами с их влиянием на моноциты in vitro при бронхиальной астме» Бюл. Эксп. биол. и мед., 2003, Т. 135-6, стр. 683-687). Этот способ основан на определении изменений морфометрических показателей моноцитов (диаметра, периметра, высоты, площади, объема) после их инкубации с преднизолоном в концентрации 10-7 и 10-4 ммоль/л в течение 60 минут при комнатной температуре. При снижении показателей (диаметра, периметра и площади) клеток на 10% и более по сравнению с контролем (с необработанными клетками) прогнозируется эффективность глюкокортикостероидной терапии.
Недостатком этого способа является ограниченная достоверность анализа, связанная с использованием в качестве критерия эффективности терапии фиксированного уровня (10% и более) снижения значимых параметров, большое время измерений и тестирования одного типа препаратов.
2
2
Известен способ, описанный в (См. Патент РФ №2382364, М.Кл. G01N33/49 2010 г.) способ прогнозирования эффективности лечения глюкокортикостероидами, включающими исследование in vitro методом фазово-интерференционной микроскопии моноцитов периферической крови, определение морфометрических параметров клеток и анализ полученных результатов. Отличительной чертой способа является активация моноцитов больного в течение 15 минут излучением гелий-неонового лазера. В качестве критерия эффективности лечения используется оптическая толщина ядер. Этот способ прогнозирования методом фазово-интерференционной микроскопии эффективности лечения глюкокортикостероидами включает в себя исследование in vitro моноцитов периферической крови, обработанных преднизолоном, определение морфометрических параметров моноцитов, анализ полученных результатов, при этом перед обработкой преднизолоном моноциты активируют в течение 10-20 мин гелий-неоновым лазером при мощности (0,5-1,0)103 Вт/см, регистрируют оптическую толщину ядер моноцитов, затем обрабатывают преднизолоном и повторно регистрируют оптическую толщину ядер моноцитов, и при увеличении этого показателя на 30% и более прогнозируют эффективность лечения глюкокортикостероидами.
Основным недостатком этого способа, который ограничивает возможность его более широкого применения, является использование в качестве активирующего фактора излучения гелий-неонового лазера без указания дозировки. В качестве значимого параметра используется фазовая толщина, в которую дают вклад, кроме ядра, также другие органеллы.
2
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному результату, принятый авторами за прототип является способ оценки функционального состояния лимфоцита человека (См. Патент РФ №2543340, М.КЛ. G01N 33/49, G01N 21/45 2015 г.). включающий исследование отдельных лимфоцитов периферической крови методом интерференционной микроскопии, отличающийся тем, что из суспензии клеток крови донора выделяют первую пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе для получения изображения мононуклеара в виде зон оптической плотности в проекциях отдельных органелл и измеряют последовательно следующие параметры: цитоплазматический индекс, значения фазовой толщины, площади, эквивалентных диаметров, фазового объема, рефрактерности у следующих органелл лимфоцита: внешняя граница периферийной части цитоплазмы, плотная часть цитоплазмы, хондриом, ядро и ядрышко, затем у этого же донора из суспензии лимфоцитов выделяют вторую пробу и после действия на суспензию лимфоцитов внешнего фактора их повторно микроскопируют в интерференционном микроскопе, измеряют вышеуказанные параметры указанных органелл лимфоцита, после чего образуют второй набор значений фазовой толщины, затем сравнивают параметры первого и второго наборов значений фазовой толщины, при этом оценку функционального состояния лимфоцита человека производят по коэффициентам корреляции с указанием процентов вероятности. Отличающийся тем, что в качестве интерференционного микроскопа для получения фазовых изображений используют когерентный фазовый микроскоп.
Однако недостатком данного способа является повышенная трудоемкость, что особенно сложно для тяжелобольных и в педиатрической практике. Из-за высокой вариабельности индикаторных показателей невозможно проведение анализа после длительного хранения проб и исключается проведение скрининговых исследований. Способ недостаточно информативен, т.к. позволяет определить предрасположенность к небольшому количеству заболеваний, характеризуется низкой пропускной способностью из-за длительности процесса. Также для его исполнения требуется уникальное лабораторное оборудование - когерентный фазовый микроскоп.
Наш способ будет выявлять уже доступные изменения с первых часов жизни в живом организме. Основным методом иммуногенетического исследования лимфоцитов периферической крови является комплементзависимая цитотоксичность живых клеток.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является разработка оценки функционального состояния лимфоцитов периферической крови, направленного на более релевантное определение комплемент зависимой цитотоксичности в двухэтапном воздействии вначале иммунной (аутологической) сыворотки, содержащей антитела известной специфичности, а затем комплемента, позволяющего в относительно короткие сроки определить уровень цитологической устойчивости исследуемых лимфоцитов.
Цель изобретения - повышение точности и упрощения процедуры определения функциональной активности лимфоцитов периферической крови.
Техническим результатом изобретения является повышение, достоверности лабораторного исследования за счет выявления состояния комплемент зависимой цитотоксичности в двухэтапном воздействии вначале иммунной (аутологической) сыворотки, содержащей антитела известной специфичности, а затем комплемента. При этом лимфоциты с низкой функциональной активностью подвергаются реакция клеточного лизиса, установленного по проникновению в клетку прижизненного красителя, а по интенсивности реакции устанавливают процент их лизиса.
Технический результат достигается при помощи способа оценки функционального состояния лимфоцитов периферической крови, включающего взятие крови, разделение ее на плазму, при чем, кровь берут у животных сразу после родов из яремной вены, при этом используют аутологические сыворотки с содержащимися цитотоксическими антителами, которые вызывают в лимфоцитах с низкой функциональной активностью интенсивное окрашивание и деформацию клеточных контуров вследствие начавшегося лизиса, после чего по интенсивности клеточного лизиса вычисляют процент их гибели.
Краткое описание чертежей и иных материалов
На фиг. 1 приведена жизнеспособность лимфоцитов, консервированных замораживанием.
На фиг. 2 приведена шкала оценки интенсивности цитотоксической реакции и определения функционального состояния лимфоцитов.
Осуществление изобретения
Примеры конкретного выполнения способа оценки функционального состояния лимфоцитов периферической крови. Пример 1.
6
5
Проводят отбор сыворотки крови у животных. Выделение лимфоцитов осуществляют в градиенте плотности верографинфиколла. Через 18 часов осадок ресуспендируют в криоконсервирующей среде 199, доводя концентрацию клеток до 2,5×10-2,5×10 клеток в 1 мкл. Для приготовления криоконсервирующей среды смешивают 7 частей среды-199, 1 часть раствора диметилсульфоксида (ДМСО - биполярный апротонный растворитель) и 2 части сыворотки крови, взятой от нескольких индивидов и проверенной на отсутствие цитотоксических антител.
Лимфоциты, ресуспендированные в криоконсервирующей среде-199, разливают с помощью автоматической пипетки в конические полиэтиленовые пробирки для микробиологических исследований по 0,015 мл. Пробирки помещают в стоячем положении в пенопластиковые пеналы с толщиной стенок 1 см и хранят при -70°С.
Клетки, консервированные подобным образом, могут быть использованы в реакциях лимфоцитотоксичности для определения коэффициента серопозитивности, в прямой реакции клеточно-опосредованного лимфолизиса. Затем проводят проверку жизнеспособности лимфоцитов, консервированных подобным образом в реакции комплементзависимости лимфоцитотоксичности.
6
5
Определение жизнеспособности клеток, замороженных в различные сроки, производят в обычном тесте с трипаном голубым; результаты представлены в фиг. 1. Наблюдают увеличение числа погибших клеток: с увеличением срока консервации и уменьшение гибели с уменьшением концентрации клеток. «Рабочими» концентрациями для лимфоцитотоксической реакции являются 2,5×10 и 2,5×10.
Пример 2.
Клетки, изъятые из интерфазы, ресуспендируют в фосфатном буфере и отмывают дважды, в течение 15 мин. После отмывания клетки ресуспендируют в аутологичной сыворотке. Два объема диметилсульфоксида смешивают с тремя объемами раствора Хенкса и охлаждают в течение 5 мин. Один объем смеси добавляют, помешивая, к трем объемам суспензии клеток в аутологичной сыворотке и суспензию немедленно разливают в пластиковые пробирки (1 мл) или флакончики из силиконизированного стекла того же объема. Пробирки или флакончики помещают в цилиндр, на который вставляют в горловину резервуара с жидким азотом (объем резервуара 35 л) и оставляют на 12 часов. Замороженные пробирки пересыпают в сосуды с жидким азотом для хранения.
При размораживании пробирки погружают в водяную баню (37°С), непрерывно встряхивая, избегая нагревания содержимого. В пробирку добавляют примерно 1 мл Хенкса по каплям, непрерывно помешивая в течение 15 мин, суспензию осторожно центрифугируют. Данное исполнение необходимо для сохранения функциональной активности лимфоцитов периферической крови.
Пример 3.
Для оценки функциональной активности лимфоцитов периферической крови аутологические сыворотки раскапывают в лунки планшетов под вазелиновое масло и замораживают (-20°С) до момента использования. Перед использованием размораживают при комнатной температуре. Лимфоцитарную взвесь раскапывают микрошприцем в планшеты по 1 мкл на лунку и инкубируют при +22°С в течении 30 мин вместе с аутологической сывороткой. В каждую лунку добавляют 5 мкл свежезамороженного фактора комплемента и инкубируют при комнатной температуре 1 ч. Резко стряхивают планшеты для удаления вазелинового масла и закапывают в каждую лунку 1 мкл трипана голубого. Через 10 мин избыток краски удаляют стряхиванием и учитывают реакцию. Клетки «убитые», цитотоксическими антителами, окрашены в голубой цвет и стертые контуры вследствие начавшегося лизиса.
При использовании окраски гематоксилин-эозином планшеты после инкубации с комплементом не стряхивают. В каждую лунку закапывают 3 мкл эозина. Через 2 3 мин закапывают 5 мкл формальдегида (40%), планшет накрывают покровным стеклом и через 15 мин, когда клетки осядут на дно, проводят сверку реакции под инвертированным микроскопом интенсивность цитотоксической реакции оценивают по шкале, представленной на фиг. 2.
Из проведенного исследования можно сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение обладает в отношении известных разработок следующими преимуществами:
1. Предлагаемый способ предназначен для релевантной оценки функциональной активности лимфоцитов периферической крови.
2. Обладает меньшей трудоемкостью в применении, делая его простым и доступным по техническому выполнению на любом сельскохозяйственном предприятии.