Методические подходы к созданию отечественных диагностических тест-систем для выявления спектра антител к вирусу гепатита с

Заключение

Методика проведения предложенного способа контурной пластики отработана в экспериментальных условиях с изучением морфологических особенностей процесса приживления аллогенного коллаген - фасци-ального трансплантата в тканях реципиента. Учитывая достаточно успешное применение способа контурной пластики, в клинике челюстно-лицевой хирургии, его можно считать методом выбора при исправлении контура лица и устранении деформаций челюстно-лицевой области различной этиологии с преимущественной утратой мягких тканей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Титова А.Т., Ярчук Н.И., Румянцева В.В. Применение аллогенной фасции для устранения нарушений формы лица // Стоматология. — 1979. — № 5. — С. 26-31.

2. Чудаков О.П., Горбачев Ф.А. Контурная пластика челюстно-лицевой области аллогенным кол-лаген-фасциальным трансплантатом в эксперименте // Христианство и медицина; Актуальные проблемы медицины: Матер. II Белорусско - Американской науч.-практ. конф. врачей и 14-й научной сессии Гомельского государственного медицинского университета, посвященных 18-летию Чернобыльской катастрофы, г. Гомель 13-15 апреля 2004 г. / Сост. С.В. Жаворонок, А.Н. Лызиков, В.В. Аничкин, А.Л. Калинин. — Учреждение образования

Гомельский государственный медицинский институт, 2004. — Т. 4. — С. 87-89.

3. Boyce R.G., Toriumi D.M. Considerations in the use of biologic grafts and alloplastic implants in facial plastic and reconstructive surgery // J Long Term Eff Med Implants. — 1992. — Vol. 2. — № 4. — P. 199-220.

4. Franz F.P., Blocksma R., Brundage S.R., Ringler S.L. Massive injection of liquid silicone for hemifacial atrophy // Ann Plast Surg. — 1988. — Vol. 20. — № 2. — P. 140-145.

5. Guerrerosantos J. Long-term outcome of autologous fat transplantation in aesthetic facial recontouring: sixteen years of experience with 1936 cases // Clin Plast Surg. — 2000. — Vol. 27. — № 4. — P. 515-543.

6. Leaf N., Zarem HA. Correction of contour defects of the face with dermal and dermal-fat grafts // Arch Surg. — 1972. — Vol. 105. — № 5. — P. 715-719.

7. Sclafani A.P., Romo T., Jacono A.A., McCormick S., Cocker R., Parker A. Evaluation of acellular dermal graft in sheet (AlloDerm) and injectable (micronized Al-loDerm) forms for soft tissue augmentation. Clinical observations and histological analysis // Arch Facial Plast Surg. — 2000. — Vol. 2. — № 2. — P. 130-136.

8. Titova A.T., Yarchuk N.I., Rumyantseva V.V., Limberg A. A. Contour plasty of the face using alloge-nous fascia // Acta Chir Plast. — 1988. — Vol. 30. — № 2. — P. 94-104.

9. Wellisz T. Clinical experience with the Medpor porous polyethylene implant // Aesthetic Plast Surg. — 1993. — Vol. 17. — № 4. — P. 339-344.

Поступила 22.11.2004

УДК 616.36-002:616-097

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕКТРА АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА С

С.В. Жаворонок, Е.В. Воропаев, Аль Шаби Аль Ханса, В.М. Мицура, А.В. Воропаева Гомельский государственный медицинский университет

В соответствии с ГОСТом проведена разработка средств диагностики и контроля качества вирусного гепатита С, в основе которого лежит технология иммуноферментного анализа. Подготовлены технические условия на производство, программа и методика испытаний, проведены предварительные испытания иммуноферментных тест-систем для выявления антител к отдельным полипептидам вирусного гепатита С, а также стандартной национальной панели сывороток с различным содержанием антител к вирусному гепатиту С.

Ключевые слова: иммуноферментый анализ, вирусный гепатит, анти-HCV, синтетические полипептиды.

METHODICAL APPROACHES TO CREATION DOMESTIC DIAGNOSTIC THE TEST-SYSTEMS FOR REVEALING ANTIBODIES TO INDIVIDUAL POLYPEPTIDES HCV

S.V. Zavoronok, E.V. Voropaev, Munasar Hani, V.M. Mitsura, A.V. Voropayev

Gomel State Medical University

In conformity with national standard, design of diagnostics and monitoring methods to qualifying control of virus hepatites С according to the basis of ELISA technology. Creation оf test

manual documentation, techniques of tests are prepared, preliminary researches in ELISA testsystems for revealing antibodies to individual polypeptides HCV, and also standard national panels with various contents antibodies HCV.

Key words: ELISA, virus hepatites Q anti-HCV, synthetically polypeptides.

Вирусы связывались с воспалением печени, или гепатитом, начиная с 40-50-х годов прошлого века. Тогда идентифицировали и начали изучать два типа вирусов гепатитов: А и В. Но уже в то время было высказано предположение о третьем, неопознанном типе вируса, который обозначили как ни-А ни-B гепатит [9]. Идентифицирован же он был только в 1989 году и получил название вируса гепатита С (HCV). После этого и началось активное изучение HCV-инфекции, являющейся одной из причин развития хронических диффузных заболеваний печени и гепатоцел-люлярной карциномы. Частота хронизации HCV-инфекции достигает 70-80%.

Для скрининговой диагностики HCV-инфекции наиболее широко практикуется определение анти-HCV антител методом иммуноферментного анализа (ИФА), который в последнее время не только используется достаточно широко, но и находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой — углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых ферментов, используемых в качестве маркеров [2, 1]. В то же время принципиальное значение имеет генодиагностика, основанная на детекции РНК HCV. Недавно появилась возможность обнаружения циркулирующих HCV- антигенов, в частности, Core Ag HCV [6, 5].

Проблема скрининговой диагностики вирусного гепатита С на ранних стадиях заболевания усугубляется тем, что в настоящее время определения только тотальных антител к HCV недостаточно. Известно, что в организации генома HCV выделяют две зоны, кодирующие структурные и неструктурные (функциональные) белки. К структурным белкам относят белки, кодированные Соге, Е1 и Е2 зонами РНК HCV. В неструктурной зоне РНК HCV выделяют участки, обозначенные как: NS2, NS3, NS4A, NS4B,

№5А и N853. Большинство из белков, кодированных неструктурными зонами РНК ИСУ, необходимы для репликации вируса.

Однако ряд индивидуумов не вырабатывают антитела на те или иные белки, против которых в норме наблюдается интенсивный гуморальный ответ, и потому продолжает увеличиваться количество больных, перенесших вирусные гепатиты бессимптомно. Это делает типичной ситуацию, когда поражение печени регистрируется в уже далеко зашедшей стадии — цирроза или даже первичного рака, при которых терапия этио-тропными препаратами (интерферонами) практически бесполезна.

Учитывая, что ИСУ персистирует в крови больных острым и хроническим гепатитом С одновременно с анти-ИСУ, внимание разработчиков диагностических препаратов концентрируется на создании тест-систем для детекции антител, обеспечивающих максимально полное выявление носителей вируса и максимально ранние сроки диагностики острой инфекции. Многообразие антигенов и антигенных детерминант, кодированных структурной и неструктурной зоной РНК ИСУ, определило направление в конструировании диагностических препаратов выбором и аранжировкой олигопептидов, применяемых для их создания. После масштабных испытаний диагностических средств с использованием ИФА на территории Российской Федерации приказом МЗ РФ № 322 от 21.10.2002. с 1 октября 2003 года регламентировано, какими именно диагностическими средствами необходимо проводить подтверждение ИСУ-инфекции: «запретить с 1 января 2004 года к применению диагностические тест-системы для подтверждения анти-ИСУ, содержащие неполный спектр структурных и неструктурных белков ИСУ».

Материалы и методы

Разработка комплекта НТД велась в соответствии с СТБ 1019-96 ГОСТ РБ «Разработка и постановка на производство медицинских изделий».

Контроль качества проводили с использованием тест-системы сравнения, в

качестве которой выступала ИФА тест-система фирмы Вектор-Бест, позволяющая проводить отдельное выявление антител к различным полипептидам HCV.

Для создания тест-системы для раздельного выявления антител к различным полипептидам вируса гепатита С нами были использованы рекомбинантные полипептиды, полученные в фирме «Капель» (г. Москва). Для сорбции использовались стрипованные полистироловые модифицированные планшеты фирмы «Биомедикал» (г. Москва). Модификацию, т.е. ультрафиолетовое облучение проводили бактерицидным облучателем в течение 30 минут.

Для сорбции использовались следующие синтетические полипептиды: область CORE — HCV 21 (0,5 мкг/мл) и 34 (1 мкг/мл), NS4 — HCV 6 (1 мкг/мл) и 645 (0,5 мкг/мл), NS5 — HCV 540 (1 мкг/мл); для области NS3 использовался рекомбинантный полипептид (0,1-0,2 мкг/мл) и синтетический HCV-93 (0,5мкг/мл). Собранная таким образом диагностическая тест-система выявляла 1 b генотип HCV.

Сорбция полипептидов проводилась на физиологическом растворе, при комнатной температуре, на ночь, сушка на воздухе. Коньюгат: антитела против IgG человека, меченные пероксидазой хрена — фирм «Сорбент-сервис» и «Капель» (г. Москва).

На созданных тест-системах в общей сложности нами обследовано 70 больных ХГС, находившихся на стационарном лечении. Сыворотки крови этих больных исследовались методом ИФА на определение спектра антител к четырем белкам HCV (Core, NS3, NS4, NS5).

Проводилась качественная оценка результатов иммуноферментного анализа в соответствии с инструкциями по применению данных тест-систем. Оптическая плотность измерялась при длине волны 450 нм на автоматическом иммуноферментном анализаторе АИФ М/340 производства Витебского телевизионного завода.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием программы STATISTICA v.5.0, были применены метод вариационной статистики Фишера-Стьюдента, критерий х2, непараметрический критерий Манна-Уитни.

Для модификации планшет в качестве источников ультрафиолетового излучения

применяли широко используемый облучатель бактерицидный потолочный ОБП-300 (ТУ 64-1-1445-78). В облучателе использовали две открытые газозарядные лампы низкого давления, излучающие УФ лучи (длинна волны 253,7 нм).

Результаты и обсуждение

Вирусом гепатита С инфицировано 1% населения Республики Беларусь, что составляет около 100 000 человек, из которых около 10% имеют манифестные формы инфекции. В Российской Федерации частота обнаружения антител к антигенам ИСУ в сыворотках крови доноров составляет в среднем 2-4% [4]. На долю ИСУ приходится около 40% всех случаев хронического гепатита. В основном инфицированные — это молодые люди в возрасте 15-29 лет [8, 3, 7].

У большинства людей, перенесших вирусный гепатит С, иммунная система оказывается неспособной элиминировать вирус, что позволяет ему длительно реплицироваться в гепатоцитах и ряде других клеток. При этом пациенты имеют выраженный гуморальный и клеточный иммунный ответ как на структурные, так и на неструктурные белки вируса.

Важнейшей задачей создания качественных наборов является стандартизация технологических операций процесса изготовления изделия и, в первую очередь, стандартизация нанесения на поверхность лунок полимерных стрипов комбинаций синтетических полипептидов — аналогов антигенных детерминант вируса гепатита.

Иммобилизация чувствительного материала (синтетических полипептидов) в зависимости от природы носителя может быть выполнена либо посредством физической адсорбции, либо путем образования химической связи с поверхностью носителя.

Современные методы диагностики позволяют с высокой точностью выявлять ИСУ-инфекцию и следить за ее развитием, что дает возможность прогнозировать заболевание и своевременно назначать антивирусную терапию.

Характерным признаком гепатита С является отсроченная сероконверсия. Первые анти-ИСУ антитела удается обнаружить не ранее 5-12 недель после инфицирования, но сроки их появления могут удлиняться до 30-50 недель. Спектр антител достаточно сложен, отражая эпитопную

поливалентность HCV-антигенов. Динамика антител к различным антигенам (точнее их эпитопам) неодинакова, что имеет диагностическое значение.

Детекция антител к каждому из HCV-антигенов имеет самостоятельное диагностическое значение. Так, например, известно, что анти-Core, анти-Е и анти-Ы^3 выявляются на самых ранних этапах серо-конверсии, анти-Ы^4 и анти-NSS, как правило, появляются позднее. По мере развития инфекционного процесса титры выявляемых анти-HCV увеличиваются.

Таким образом, учитывая высокую чувствительность и специфичность метода ИФА, перспективность его применения для диагностики различных форм HCV-инфекции, индивидуальную вариабельность спектра антител к различным эпитопам вируса у больных HCV-инфекцией, отсутствие на рынке РБ широко доступных отечественных тест-систем, необходимость создания современной отечественной иммуноферментной тест-системы для определения спектра антител к основным эпи-топам вирус гепатита С очевидна.

Разработанные диагностические препараты были апробированы с использованием сывороток крови больных хроническими вирусными гепатитами В и С, находившихся на лечении в инфекционных стационарах Гомельской и Витебской областей.

Отобран банк анти-HCV позитивных сывороток крови. Их дополнительный отбор в больших объемах — более 800 сывороток крови проводится на Гомельской областной станции переливания крови.

На основе этих банков крови изготовлены пулы сывороток содержащих анти-HCV в различных концентрациях, пулы стандартизованы на тест-системах производства фирмы Вектор Бест (Новосибирская область, п. Кольцово) и НПО «ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ» (Нижний Новгород) с использованием наборов стандартных образцов (СО) анти-HCV, разработанных в соответствии с международным стандартом NIBSC code 80/549 (для HBsAg) Государственным учреждением НИИ Эпидемиологии и Микробиологии Министерства Здравоохранения Республики Беларусь (НИИЭМ) с нашим участием.

На основе пулов сывороток изготовлен опытный образец панели стандартных сывороток, содержащих анти-HCV в 8 различных

концентрациях плюс две негативных по ан-ти-HCV. При определении чувствительности тест-системы рекомендуется использовать все стандартные сыворотки, входящие в состав панели. Уровнем чувствительности тест-системы считается наименьшая концентрация панели, оцененная согласно инструкции по применению данной тест-системы как положительный образец в обеих лунках. Стандартизованные сыворотки были лио-филизированы, остаточная влажность составила не более 1,3%.

Заключение

В результате проведения предварительных внутрилабораторных испытаний было установлено, что по параметрам чувствительности и специфичности тест-система, созданная нами, практически полностью соответствует коммерческим имунофермент-ным тест-системам, зарегистрированным в Республике Беларусь. Уточнённые данные по этим параметрам будут представлены после официальных медицинских испытаний, которые будут проводиться в соответствии с назначением Центра экспертиз и испытаний в здравоохранении Республики Беларусь.

При анализе выявляемого спектра анти-НCV у 98,3% больных хроническим гепатитом С выявлены антитела к CORE-белку, у 97,2% — антитела к NS3, у 96,0% — антитела к NS4, у 63,1% — антитела к NS5. У большинства обследованных больных ХГС (92,0%) одновременно выявлялись антитела к CORE, NS3 и №4-белкам. Антитела анти-HCV IgM выявлены у 48,6% больных. При обнаружении анти-NSS и анти-HCV IgM чаще выявлялся повышенный уровень АЛТ (р = 0,047 и р = 0,011 соответственно).

Таким образом, для подтверждения HCV-инфекции методом иммуноферментного анализа необходимо использовать диагностические системы 3-го и 4-го поколения, которые построены из всего спектра реком-бинантных и/или синтетических фрагментов структурных и неструктурных HCV-белков (Сете, NS3, NS4 и NS5).

ЛИТЕРАТУРА

1. Виринская А.С., Гудков В.Г. Разработка и совершенствование диагностических препаратов в отношении ротавирусной инфекции и вирусного гепатита А. — С. 120-127.

2. Волосевич Н.Н., Владыко А.С. Использование лизатов рекомбинантного и нативного пептидов вируса ЛХМ в иммуноферментном анализе. //

Проблемы инфекционной патологии XXI века. Материалы юбилейной конференции, посвященной 80-летию НИИЭМ (г. Минск 27-28 октября 2004 г.) / Под ред. проф., чл.-корр. НАНБ Л.П. Титова. — Мн.: НИИЭМ, 2004. — С. 110-119.

3. Соринсон С.Н., Селиванов НА, Корочкина О.В. и др. Гепатит С: механизмы многолетней персистенции вируса и фазы течения инфекционного процесса // Клин. медицина. — 1997. — № 10 — С. 27-30.

4. Львов Д.К Вирусные гепатиты С и G (Hepacivirus, Flaviviridae): этиотропная терапия // Вопр. вирусол. — 1998. — № 2. — С. 54-58.

5. Маянский А.Н., ОбрядинаА.П., Уланова Т.И. и др. Диагностика гепатита С: информационные материалы. — Н. Новгород, 2003. — 47 с.

6. Система диагностики диффузных паренхиматозных поражений печени у различных групп населения с повышенным риском инфицирования вирусными гепатитами B, C, D, G: Методические рекомендации. / С.В. Жаворонок, А.Л. Калинин, А.А. Ключарева и др. — Мн., 1998. — 52 с.

7. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты. — СПб.: ТЕЗА, 1998. — 325 с.

8. Bukh J. The hepatitis C virus. American Association for the Study of Liver Diseases Post-graduate Course 2000, Update on Viral Hepatitis, October 2728. — Dallas, Texas, 2000. — P. 102-111.

9. Sherlock S. December 1996. Hepatitis C Virus: a Historical Perspective. Digestive Diseases and Science 3S-5S.

Поступила 28.03.2005

УДК 575.1

ХАРАКТЕРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ ДНК ИЗ ПАТОГЕННЫХ И САПРОФИТНЫХ ГРИБОВ КЛАССОВ ASCOMYCETES, BASIDIOMYCETES И DEUTEROMYCETES

М.Я. Острикова, О.Ю. Баранов

Гомельский государственный медицинский университет

Институт леса

Предложен быстрый микрометод выделения препаратов суммарной ДНК из грибов родов Candida, Aspergillius, Pleurotus и Lentinus. Установлено, что полученные микропрепараты ДНК грибов характеризуются высокой степенью чистоты и отсутствием деградации.

Ключевые слова: ДНК, Aspergillius, Candida, Pleurotus, Lentinus

CHARACTERISTIC FEATURES OF ISOLATION OF TOTAL DNA FROM PATHOGENIC AND SAPROPHYTE ASCOMYCETES BASIDIOMYCETES AND DEUTEROMYCETES FUNGES

M.Ya. Ostrikova, O.Yu. Baranov

Gomel State Medical University Institute of Forest

The micromethod of rapid preparation of DNA samples from fungi genus Candida, Aspergillius, Pleurotus u Lentinus have been developed. Showed, that prepared samples of DNA have high quality of clearness and no visual degradation.

Key words: DNA, Aspergillius, Candida, Pleurotus, Lentinus.

Введение

К настоящему времени методы анализа ДНК [2, 3, 4] нашли широкое практическое применение в различных областях медицины: изучение и определение врожденных заболеваний на различных стадиях онтогенеза; выявление и типировка инфекционных возбудителей in vitro и in vivo; исследование гено-

мов и классификация штаммов микроорганизмов [3, 5], используемых для получения лекарственных средств и др. Для большинства используемых технологий первоначальным этапом анализа является выделение де-зоксирибонуклеиновой кислоты из изучаемых объектов [1, 5]. Важным требованием, предъявляемым к стадии экстракции, являет-