СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ УРОВНЯ ВНУТРИГЛАЗНОГО ДАВЛЕНИЯ У БОЛЬНЫХ С ПОУГ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДАННЫХ
METHOD FOR PREDICTION OF INTRAOCULAR PRESSURE LEVEL IN PATIENTS WITH PRIMARY OPEN-ANGLE GLAUCOMA DEPENDING ON GENETIC DATA

0
Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования повышенного уровня внутриглазного давления (далее, ВГД) и истинного внутриглазного давления р у больных с первичной открытоугольной глаукомой (далее ПОУГ).
Повышенное внутриглазное давление является основным фактором риска развития глаукомной оптической нейропатии путем апоптоза ганглиозных клеток сетчатки, приводящей в конечном счете к снижению зрительных функций и инвалидности. Поэтому снижение повышенного офтальмотонуса является важным звеном в патогенетическом лечении глаукомы.
В настоящее время одно из центральных звеньев в апоптозе занимают факторы некроза опухолей и их рецепторы [Glaucomatous neurodegeneration: An eye on tumor necrosis factor-alpha /R. Agarwal, P. Agarwal //Indian. J. Ophthalmol. - 2012. - Vol.60. - P. 255]. Обладая множеством медико-биологических эффектов, эти цитокины могут влиять на развитие и прогрессирование ПОУГ [TNF-alpha signaling in glaucomatous neurodegeneration /G. Tezel //Prog Brain Res. - 2008. - Vol.173. - P. 409-421].
TNFα - многофункциональный цитокин, обеспечивающий широкий спектр биологических сигналов [Цитокины иммунной системы: основные свойства и иммунобиологическая активность /К.П. Кашкин //Клин. лабораторная диагностика. - 1998. - №11. - С. 21]. Запуская различные интрацеллюлярные процессы, TNFα контролирует жизнедеятельность различных клеток путем инициации апоптоза. Ген, кодирующий белок TNFα, включает 4 экзона и 3 интрона, имеет размер 2762 п.н. и картируется в геноме человека на коротком плече шестой хромосомы (6p21.3), располагаясь рядом с генами главного комплекса гистосовместимости [Tumor Necrosis Factor and Lymphotoxin Alfa Genetic Polymorphisms and Outcome in Pediatric Patients With Non-Hodgkin's Lymphoma: Results From Berlin-Frankfurt-Münster Trial NHL-BFM 95 /K. Seidemann [et al.] //Journal of Clinical Oncology. - 2005. - Vol.23. - №33. - P. 8414-8421]. Самым распространенным видом мутаций гена TNFα являются однонуклеотидные замены в промоторном регионе. Известно более 30 полиморфных вариантов этого гена, но только около половины из них влияют на экспрессию TNFα in vivo. Для большинства из них установлено влияние на уровень транскрипционной активности промотора гена TNFα, а следовательно, и на продукцию самого цитокина [Cytokine gene polymorphism in human disease /M.V. Hollegaard, J.L. Bidwell //Genes Immun. - 2006. - Vol.7. - Suppl. 3. - P. 269-276].
TNFβ (лимфотоксин-α, Ltα) представляет собой гликопротеид, содержащий 171 аминокислотных остатков и имеющий молекулярную массу около 33 кДа. Ген Ltα расположен на шестой хромосоме (6р21.3), находясь в 1100 полинуклеотидных оснований от гена TNFα. Ген лимфотоксина имеет сходную с геном фактора некроза опухолей экзон-интронную структуру. Степень аминокислотной гомологии TNFβ и TNFα составляет около 30% [Tandem arrangement of the genes coding for tumor necrosis factor (TNF-alpha) and lymphotoxin (TNF-beta) in the human genome /S.A. Nedospasov, A.N. Shakhov, R.L. Turetskaya et al. //Cold Sping Harbor Symp. Quant. Biol. - 1986. - Vol.51. - P. 611-625]. Таким образом, Ltα обладает рядом подобных TNFα биологических активностей [Cytokine gene polymorphism in human disease /M.V. Hollegaard, J.L. Bidwell //Genes Immun. - 2006. - Vol.7. - Suppl. 3. - P. 269-276], связываясь с теми же рецепторами, что и TNFα.
В настоящее время идентифицированы два типа рецепторов TNFα: TNFR1 и TNFR2.
TNFR2 - гликопротеин, имеющий молекулярную массу 75 кДа и включающий 440 аминокислот. Со структурной точки зрения данный рецептор содержит экстраклеточный (240 аминокислот), трансмебранный (27 аминокислот) и цитоплазматический (173 аминокислоты) домены. Ген TNFR2 локализован в хромосоме 1p36.2 и состоит из 10 экзонов.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2014 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования уровня ВГД и истинного ВГД у больных с ПОУГ в зависимости от полиморфных маркеров генов факторов некроза опухолей и их рецепторов. Источник информации: сайт Федерального института промышленной собственности http://fips.ru/.
Выявлен способ диагностики повышенного внутриглазного давления по патенту РФ №2284757, опубликован 10.10.2006. Способ состоит в том, что путем хронобиологических исследований в утренние, дневные и вечерние часы для исследования внутриглазного давления используют 9-11 измерений с интервалом 1-2,5 часа, причем измерения производят в течение 4-5 суток таким образом, чтобы на каждые сутки приходилось 2-3 соседних измерения, не дублирующих друг друга. Предлагаемый способ особенно эффективен при диагностике ВГД при нестабилизированной первичной открытоугольной глаукоме и глаукоме псевдонормального давления.
Однако он достаточно трудоемок и не учитывает генетические полиморфизмы.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования повышенного уровня ВГД и истинного ВГД у больных с ПОУГ на основе данных о генетических полиморфизмах.
Задача - создание способа прогнозирования повышенного уровня ВГД у больных с ПОУГ на основе данных о генетических полиморфизмах.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития повышенного уровня ВГД и истинного ВГД у индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья России, с ПОУГ в зависимости от выявленных генетических вариантов локусов -308G/A TNFα,+250A/G Ltα,+1663A/G TNFR2.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования высокого уровня ВГД и истинного ВГД у индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья России, больных ПОУГ, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов генов -308G/A TNFα,+250A/G Ltα,+1663A/G TNFR2;
- прогнозирование повышенного уровня ВГД у больных с ПОУГ в случае выявления генотипа -308GG TNFα;
- прогнозирование повышенного уровня истинного внутриглазного давления при наличии генотипов +250АА Ltα, либо +250AG Ltα, либо +1663AG TNFR2, либо +1663GG TNFR2.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития повышенного уровня ВГД и истинного ВГД у индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья России, больных ПОУГ по данным о генетических вариантах локусов -308G/A TNFα, +250A/G Ltα, +1663A/G TNFR2.
Изобретение охарактеризовано на следующих фигурах:
На фиг. 1 представлена дискриминация аллелей по локусу -308G/A TNFα, где  - -308АА TNFα,  - -308GG TNFα,  - -308GA TNFα,  - отрицательный контроль;
На фиг. 2 представлена дискриминация аллелей по локусу +250A/G Ltα, где  - +250GG Ltα,  - +250AA Ltα,  - +250AG Ltα,  - отрицательный контроль;
На фиг. 3 представлена дискриминация аллелей по локусу +1663A/G TNFR2, где  - +1663GG TNFR2,  - +1663AA TNFR2,  - +1663AG TNFR2,  - отрицательный контроль;
На фиг.4 представлена ассоциация генетического полиморфизма -308G/A TNFα с уровнем ВГД у больных ПОУГ;
На фиг.5 представлена ассоциация генетического полиморфизма+250А/G Ltα с уровнем истинного внутриглазного давления у больных ПОУГ;
На фиг.6 представлена ассоциация генетического полиморфизма+1663А/G TNFR2 с уровнем истинного внутриглазного давления у больных ПОУГ.
На фигурах 1-3 две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием УОФ для одного флуорофора на оси x относительно УОФ для другого флуорофора на оси y на диаграмме дискриминации аллелей. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю A, зонд с красителем FAM - аллелю G.
• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).
• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю A (УОФ аллеля A отложены по оси y).
• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю G (УОФ аллеля G отложены по оси x).
• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно: в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль.
Способ осуществляют следующим образом.
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови индивидуумов в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМNaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ локусов -308G/A TNFα, +250G/A Ltα, +1663A/G TNFR2 осуществляют методами полимеразной цепной реакции (далее, ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводят на аппарате IQ5 (Bio-Rad) в режиме real time с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М» и олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» с последующим анализом полиморфизмов методом дискриминации аллелей. Для дискриминации аллелей использована программа Bio-Rad «IQ5-Standart Edition».
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития повышенного уровня ВГД и истинного ВГД у больных с ПОУГ по данным о генетических вариантах локусов -308G/A TNFα, +250A/G Ltα, +1663A/G TNFR2 подтверждает анализ результатов наблюдений 162 индивидуумов (227 глаз) с ПОУГ.
В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России, с установленным диагнозом ПОУГ и имеющие некомпенсированное ВГД на фоне консервативного лечения. Исследование больных проводилось на базе отделения микрохирургии глаза Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.
Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета.
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Для описания данных количественных показателей применяли медиану (Ме) и интерквартильный размах (Q25-Q75) (уровень значимости для критерия Шапиро-Уилка p<0,05).
е
е
В целом уровень ВГД в исследуемой группе больных составил М=27 мм рт.ст. (интерквартильный размах 25-31 мм рт.ст.), а истинное внутриглазное давление составило М=23,95 мм рт.ст. (интерквартильный размах 21,3-26,9 мм рт.ст.).
Индивидуумы с генотипом -308GG TNFα имели более высокий уровень ВГД (медиана - 27 мм рт.ст., интерквартильный размах 25-31 мм рт.ст) по сравнению с аналогичным показателем у пациентов с генотипами -308GA TNFα (медиана - 26 мм рт.ст., интерквартильный размах 24-29 мм рт.ст., p=0,02) (фиг.4).
0
Индивидуумы с генотипами+250AA Ltα и +250AG Ltα имели более высокий уровень р (медиана -24,2 мм рт.ст., нижний квартиль - 21,5 мм рт.ст., верхний квартиль - 27,3 мм рт.ст.) по сравнению с пациентами с генотипом +250GG Ltα (медиана - 22,4 мм рт.ст., нижний квартиль - 20,6 мм рт.ст., верхний квартиль - 24,5 мм рт.ст.) (фиг.5). Данные различия являются статистически достоверными (p=0,02).
Также установлено, что значение истинного внутриглазного давления было выше у индивидуумов с генотипами +1663GG TNFR2 и +1663AG TNFR2 (медиана - 24,6 мм рт.ст, интерквартильный размах 22,1-27,3 мм рт.ст.) по сравнению с аналогичным показателем у пациентов с генотипом +1663AA TNFR2 (медиана - 22,75 мм рт.ст., интерквартильный размах 20,6-24,4 мм рт.ст., p=0,01) (фиг.6).
Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что генотип -308GG TNFα ассоциирован с более высоким уровнем ВГД, а генотипы +250АА Ltα, либо +250AG Ltα, либо +1663AG TNFR2, либо +1663GG TNFR2 связаны с более высоким уровнем истинного внутриглазного давления у больных ПОУГ.
Примеры
1. У пациента А. с ПОУГ, использующего закапывание гипотензивного средства из группы простагландинов, выявлен генотип -308GG TNFα. При дальнейшем детальном офтальмологическом обследовании подтвержден повышенный уровень внутриглазного давления (ВГД=29 мм рт.ст.), что требует назначения комбинированных лекарственных средств.
0
2. У пациента B. с ПОУГ, использующего закапывание гипотензивного средства из группы простагландинов, выявлен генотип +250АА Ltα. При дальнейшем детальном офтальмологическом обследовании подтвержден повышенный уровень истинного внутриглазного давления (р=24,9 мм рт.ст.), что требует назначения комбинированных лекарственных средств.
0
3. У пациента С. с ПОУГ, использующего закапывание гипотензивного средства из группы ингибиторов карбоангидразы, выявлен генотип +250АG Ltα. При дальнейшем детальном офтальмологическом обследовании подтвержден повышенный уровень истинного внутриглазного давления (р=27,6 мм рт.ст.), что требует назначения комбинированных лекарственных средств.
0
4. У пациента E. с ПОУГ, использующего закапывание гипотензивного средства из группы ингибиторов карбоангидразы, выявлен генотип +1663GG TNFR2. При дальнейшем детальном офтальмологическом обследовании подтвержден повышенный уровень истинного внутриглазного давления (р=26,8 мм рт.ст.), что требует назначения комбинированных лекарственных средств.
0
5. У пациента K. с ПОУГ, использующего закапывание гипотензивного средства из группы β-блокаторов, выявлен генотип +1663AG TNFR2. При дальнейшем детальном офтальмологическом обследовании подтвержден повышенный уровень истинного внутриглазного давления (р=24,9 мм рт.ст.), что требует назначение комбинированных лекарственных средств.
Использование данного способа позволяет прогнозировать повышенный уровень ВГД и истинного внутриглазного давления у больных с ПОУГ в зависимости от генетических вариантов -308G/A TNFα, +250A/G Ltα, +1663A/G TNFR2 и на этой основе выделять группы риска с целью корректировки тактики ведения больного с ПОУГ с назначением более мощного гипотензивного лечения: назначение комбинированных лекарственных средств, использование сочетания нескольких методов лечения.