КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕК НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ CRISPR/CAS9, ИММОБИЛИЗОВАННОГО НА ТВЕРДОЙ ПОДЛОЖКЕ

1. Способ получения иммобилизованной библиотеки фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, включающий:
(а) предоставление твердой подложки с иммобилизованными на нем ферментами CRISPR/Cas9; и
(б) нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку в условиях, при которых целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота фрагментирована случайным образом ферментами CRISPR/Cas9, а CRISPR/Cas9 связывается по меньшей мере с одной цепью двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты; посредством чего получают иммобилизованную библиотеку фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п. 1, в котором целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит двухцепочечную ДНК (дцДНК), двухцепочечную РНК (дцРНК) или гибрид двухцепочечной РНК/ДНК.
3. Способ по п. 1, в котором целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота представляет собой дцДНК.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором ферменты CRISPR/Cas9 связаны с первым полинуклеотидом, который направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.
5. Способ по п. 4, в котором первый полинуклеотид иммобилизован на твердой подложке.
6. Способ по п. 4 или 5, в котором первый полинуклеотид содержит 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.
n
n
7. Способ по п. 6, в котором огРНК содержит (GC) или (AT), при этом n составляет 5-20.
8. Способ по п. 7, в котором n составляет 10.
9. Способ по п. 6, в котором огРНК содержит от 10 до 40 нуклеотидов.
10. Способ по п. 9, в котором огРНК содержит от 17 до 20 нуклеотидов.
11. Способ по любому из пп. 4-10, в котором первый полинуклеотид биотинилирован, а твердая подложка содержит один или более биотинсвязывающих белков.
12. Способ по п. 11, в котором биотинсвязывающие белки содержат авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент.
13. Способ по п. 12, в котором биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или синтетазу биотин-голокарбоксилазы.
14. Способ по любому из пп. 1-13, включающий промывку твердой подложки с иммобилизованными на ней двухцепочечными фрагментами нуклеиновой кислоты для удаления любых несвязанных нуклеиновых кислот.
15. Способ по любому из пп. 4-14, включающий амплификацию двухцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот, иммобилизованных на твердой поверхности.
16. Способ по п. 15, в котором амплификация включает предоставление полимеразы и праймера для амплификации, соответствующего части первого полинуклеотида.
17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку включает обработку ферментов CRISPR/Cas9 одним или более реагентами, снижающими специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой.
18. Способ по п. 18, в котором один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.
3
4
5
6
2
19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором ферменты CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 10, 10, 10 или 10 ферментов на мм.
20. Способ по любому из пп. 1-19, в котором длины двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты в иммобилизованной библиотеке пропорциональны плотности ферментов CRISPR/Cas9 на твердой подложке.
21. Способ по любому из пп. 1-20, в котором твердая подложка содержит микрочастицы, структурированную поверхность или лунки.
22. Способ по п. 21, в котором микрочастицы представляют собой гранулы.
23. Способ по любому из пп. 1-22, включающий: (в) нанесение интеркалирующего красителя по меньшей мере на часть иммобилизованной библиотеки двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты для получения набора окрашенных иммобилизованных фрагментов; и получение изображения окрашенных иммобилизованных фрагментов.
24. Способ по любому из пп. 1-23, в котором нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает добавление биологического образца на твердую подложку.
25. Способ по п. 24, в котором биологический образец содержит клеточный лизат.
26. Способ по п. 24, в котором биологический образец содержит цельные клетки.
27. Способ по п. 24, в котором биологический образец выбирают из группы, состоящей из крови, плазмы, сыворотки крови, лимфы, слизи, мокроты, мочи, спермы, спинномозговой жидкости, бронхиального аспирата, фекалий и мацерированной ткани.
28. Способ по любому из пп. 1-27, включающий мечение двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.
29. Способ по п. 28, в котором двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты помечены первой меткой, содержащей домен первой метки.
30. Способ по п. 29, в котором домен первой метки содержит область для кластерной амплификации.
31. Способ по п. 29 или п. 30, в котором домен первой метки содержит область для праймирования реакции секвенирования.
32. Способ по любому из пп. 1-31, включающий высвобождение с твердой подложки иммобилизованных двухцепочечных фрагментов.
33. Способ по п. 32, в котором высвобождение включает отщепление ферментов CRISPR/Cas9 от твердой подложки.
34. Способ по п. 32, в котором высвобождение включает выполнение полимеразной цепной реакции (ПЦР), амплификации с замещением цепей (SDA), опосредованной транскрипцией амплификации (ТМА) и амплификации на основе нуклеотидной последовательности (NASBA) или другого процесса амплификации.
35. Способ по п. 34, в котором ПЦР содержит ПЦР супрессии.
36. Способ по п. 32, в котором высвобождение содержит применение света или тепла.
37. Способ получения иммобилизованной библиотеки фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, включающий:
(а) предоставление твердой подложки с иммобилизованными на ней комплексами CRISPR/Cas9, причем комплексы CRISPR/Cas9 содержат фермент CRISPR/Cas9, связанный с биотинилированным первым полинуклеотидом, содержащим 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом, и при этом биотинилированный первый полинуклеотид связан с биотинсвязывающим белком на твердой подложке; и
(б) нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку в условиях, при которых целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота фрагментирована случайным образом комплексами CRISPR/Cas9, а комплексы CRISPR/Cas9 связываются по меньшей мере с одной цепью двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты; посредством чего получают иммобилизованную библиотеку фрагментированных случайным образом двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.
38. Способ по п. 37, в котором биотинсвязывающий белок содержит авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент.
39. Способ по п. 38, в котором биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или биотин-голокарбоксилазу синтетазу.
40. Способ по п. 38 или 39, в котором нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на твердую подложку включает обработку ферментов CRISPR/Cas9 одним или более реагентами, снижающими специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой.
41. Способ по п. 40, в котором один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.
42. Способ по любому одному из пп. 37-41, содержащий мечение двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты.
43. Способ по п. 42, в котором двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты помечены первой меткой, содержащей домен первой метки.
44. Способ по п. 43, в котором домен первой метки содержит область для кластерной амплификации.
45. Способ по п. 43 или 44, в котором домен первой метки содержит область для праймирования реакции секвенирования.
46. Способ по любому из пп. 37-45, дополнительно содержащий высвобождение с твердой подложки иммобилизованных двухцепочечных фрагментов.
47. Способ по п. 46, в котором высвобождение включает отщепление ферментов CRISPR/Cas9 от твердой подложки.
48. Способ по п. 47, в котором высвобождение включает выполнение ПЦР или другого процесса амплификации.
49. Способ по п. 48, в котором ПЦР включает ПЦР супрессии.
50. Способ по п. 48, в котором высвобождение включает применение света или тепла.
51. Твердая подложка, имеющая библиотеку иммобилизованных на ней двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, полученная в соответствии со способом по любому из пп. 1-45.
52. Твердая подложка с иммобилизованными на ней комплексами CRISPR/Cas9, причем комплексы CRISPR/Cas9 содержат ферменты CRISPR/Cas9, которые случайным образом фрагментируют целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту.
53. Твердая подложка по п. 52, в которой целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит двухцепочечную ДНК (дцДНК), двухцепочечную РНК (дцРНК) или гибрид двухцепочечной РНК/ДНК.
54. Твердая подложка по п. 53, в которой целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота представляет собой дцДНК.
55. Твердая подложка по любому из пп. 51-54, в которой ферменты CRISPR/Cas9 связаны с первым полинуклеотидом, который направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.
56. Твердая подложка по п. 55, в которой первый полинуклеотид иммобилизован на твердой подложке.
57. Твердая подложка по п. 55 или 56, в которой первый полинуклеотид содержит 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом.
n
n
58. Твердая подложка по п. 57, в которой огРНК содержит (GC) или (AT), при этом n составляет 5-20.
59. Способ по п. 58, в котором n составляет 10.
60. Способ по п. 57, в котором огРНК содержит от 10 до 40 нуклеотидов.
61. Способ по п. 60, в котором огРНК содержит от 17 до 20 нуклеотидов.
62. Твердая подложка по любому из пп. 55-51, в которой первый полинуклеотид биотинилирован, а твердая подложка содержит биотинсвязывающие белки.
63. Твердая подложка по п. 62, в которой биотинсвязывающие белки содержат авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент.
64. Твердая подложка по п. 63, в которой биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или биотин-голокарбоксилазу синтетазу.
3
4
5
6
2
65. Твердая подложка по любому из пп. 52-64, в которой ферменты CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 10, 10, 10 или 10 ферментов на мм.
66. Твердая подложка по любому из пп. 52-65, которая содержит микрочастицы, структурированную поверхность или лунки.
67. Твердая подложка по п. 66, в которой микрочастицы представляют собой гранулы.
68. Композиция, содержащая твердую подложку по любому из пп. 52-67 и один или более реагентов, уменьшающих специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой.
69. Композиция по п. 68, в которой один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.
70. Твердая подложка с иммобилизованными на ней комплексами CRISPR/Cas9, причем комплексы CRISPR/Cas9 содержат фермент CRISPR/Cas9, связанный с биотинилированным первым полинуклеотидом, содержащим 3'-участок, содержащий концевую последовательность CRISPR/Cas9, и 5'-участок, содержащий одноцепочечную гидовую РНК (огРНК), которая направляет ферменты CRISPR/Cas9 для связывания с целевой двухцепочечной нуклеиновой кислотой неспецифичным к последовательности образом, и при этом биотинилированный первый полинуклеотид связан с биотинсвязывающим белком на твердой подложке.
71. Твердая подложка по п. 70, в которой биотинсвязывающий белок содержит авидин, стрептавидин, нейтравидин, антитело к биотину, рецептор биотина и/или биотинсвязывающий фермент.
72. Твердая подложка по п. 71, в которой биотинсвязывающий фермент содержит биотинидазу или биотин-голокарбоксилазу синтетазу.
3
4
5
6
2
73. Твердая подложка по любому из пп. 70-72, в которой комплексы CRISPR/Cas9 присутствуют на твердой подложке с плотностью по меньшей мере 10, 10, 10, 10 комплексов на мм.
74. Твердая подложка по любому из пп. 70-73, которая содержит микрочастицы, структурированную поверхность или лунки.
75. Твердая подложка по п. 74, в которой микрочастицы представляют собой гранулы.
76. Композиция, содержащая твердую подложку по любому из пп. 70-75 и один или более реагентов, снижающих специфичность связывания ферментов CRISPR/Cas9 с нуклеиновой кислотой.
77. Композиция по п. 76, в которой один или более реагентов содержат бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), этанол, этиленгликоль, диметилацетамид, диметилформамид и/или сульфалан.