Ферментативная переработка жиросодержащих отходов с применением грибных липаз

ВЕСТНИК ПНИПУ

2018 Химическая технология и биотехнология № 4

Б01: 10.15593/2224-9400/2018.4.06 УДК 577.15

Е.А. Першин, И.А. Пермякова

Пермский национальный исследовательский политехнический университет, Пермь, Россия

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ПЕРЕРАБОТКА ЖИРОСОДЕРЖАЩИХ ОТХОДОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ГРИБНЫХ ЛИПАЗ

Жиросодержащие отходы являются ценным ресурсом для производства целого ряда востребованных продуктов. Сложность переработки жиросодержащих отходов в основном связана с наличием в таком сырье свободных жирных кислот. Существующие методы переработки растительных масел основаны на использовании щелочных катализаторов, которые оказываются неприменимы для переработки отходов с повышенным содержанием свободных жирных кислот. Использование ферментных препаратов, способных катализировать как реакцию этерификации жирных кислот, так и реакцию переэтерификации триглицеридов, позволяет решить задачу переработки отходов. Однако литературные данные по использованию ферментов оказались весьма противоречивы. Проведены исследования двух ферментных препаратов. Препараты выделены из грибных почвенных культур на специфических средах с жирами в качестве субстрата. По результатам определения липазной активности выделенные ферменты сопоставимы по активности с промышленным ферментным препаратом животного происхождения. В отношении реакции этерификации препараты проявляют активность, несколько меньшую по сравнению с промышленным препаратом, но достаточную для переработки отходов. После определенного периода времени кислотное число реакции, характеризующее убыль свободных жирных кислот, начинает возрастать, что говорит о проявлении обратной реакции гидролиза и о возможных побочных реакциях. В отношении реакции переэтерификации препараты не показали высокой активности, что может быть связано с отсутствием специфичности к данной реакции, а также с возможной инактивацией ферментов спиртом, являющимся одним из основных реагентов. Полученные ферментные препараты могут быть использованы в составе комплексного ферментного катализатора в качестве катализатора реакции эте-рификации.

Ключевые слова: липазы, липолитические ферменты, триглицериды, пере-этерификация, этерификация, эфиры жирных кислот.

E.A. Pershin, I.A. Permyakova

Perm National Research Polytechnic University, Perm, Russian Federation

THE ENZYMATIC FAT-CONTAINING WASTES RECYCLING USING FUNGAL LIPASE

Fat-containing waste is a valuable resource for the production some popular products. Recycling of fat-containing wastes is difficult due to the presence of free fatty acids in such raw materials. Widespread technologies of the vegetable oils processing are based on the use of alkaline catalysts, which are not applicable for the recycling of waste with a high content of free fatty acids. Enzymes are capable of catalyzing both the reaction of esterifi-cation of fatty acids and the reaction of transesterification of triglycerides. These type of catalysts are allow to solve the problem of waste recycling. However, the literature data of enzymes using are very controversial. Two type of enzyme preparations were studied in this work. Enzymes were produced from fungal cultures using specific culturing media with fats as a substrate. According to the results of determining the lipase activity the selected enzymes are comparable by activity with the industrial enzyme preparation of animal source. As to the esterification reaction, the produced enzymes have less activity than the industrial ensyme, but this activity is sufficient for waste processing. After a period of time, the acid number of the reaction, which characterizes the decrease of free fatty acids, begins to increase, indicating the enhancement of the reverse reaction of hydrolysis and secondary reactions. As to the reaction of transesterification, the enzyme did not show high activity. The reasons of this effect are the lack of unavailability to this reaction, the possible inactivation of enzymes with alcohol, which is one of the main reagents. The resulting enzyme preparations can be used as part of a complex enzyme catalyst as a catalyst for the esterification reaction.

Keywords: lipases, lipolytic enzymes, triglycerides, transesterification, esterifica-tion, fatty acid esters.

В настоящее время проблеме утилизации отходов уделяется все большее внимание. В последнее время активно рассматриваются проблемы переработки жиросодержащих отходов [1-3]. Например, жиро-содержащие отходы, образуемые в пищевой промышленности, могут служить источником для получения жирных кислот и их эфиров, которые в свою очередь могут использоваться в различных областях. Существуют методы переработки таких отходов на базе технологии производства биодизеля с использованием щелочных катализаторов (чаще KOH, NaOH). Однако переработка на такой базе может затрудняться наличием свободных жирных кислот в отходах, которые в присутствии щелочного катализатора омыляются и препятствуют полному протеканию реакций и качественному разделению продуктов.

Кислотный катализ позволяет избежать омыления свободных жирных кислот [4]. При этом кислоты могут катализировать как реакцию переэтерификации триглицеридов, так и реакцию этерификации свободных жирных кислот, которые содержатся в отходах. В то же время кислотный катализ является медленным, протекает в разы медленнее, чем щелочной [5]. Существуют технологии, последовательно использующие два катализатора: на первой стадии - кислотный катализатор для осуществления реакции этерификации свободных жирных кислот, далее - щелочной катализатор для переэтерификации триглицеридов [6, 7]. Данный метод осложняется тем, что при кислотном катализе этерификации жирных кислот образуется вода, которая может способствовать омылению триглицеридов при переходе на щелочной катализатор [8], в связи с чем усложняется аппаратурное оборудование и увеличиваются энергозатраты на дополнительную очистку реакционной смеси от примесей воды.

Перспективным направлением может быть использование в качестве катализаторов реакций при переработке жиросодержащих отходов липолитических ферментов. Ферменты обладают рядом преимуществ: они могут эффективно действовать в более мягких условиях, чем неорганические катализаторы, могут катализировать как реакцию этерифи-кации жирных кислот, так и переэтерификацию триглицеридов, при использовании иммобилизованных катализаторов возможно их многократное использование [9-11].

Перспективными катализаторами реакции переэтерификации являются липазы. Недостатком ферментативной переэтерификации является часто большая стоимость ферментных препаратов [12, 13], а также сложность подбора фермента, способного катализировать как этери-фикацию свободных жирных кислот, так и переэтерификацию триглицеридов. Часто отдельные ферменты эффективно катализируют лишь одну из реакций (этерификацию или переэтерификацию) и оказываются малоприменимы ко второй реакции, что на текущий момент не позволяет широко использовать ферменты для переработки отходов [14, 15]. Поэтому целью данной работы является поиск и исследование активности липолитических ферментов, проявляющих активность в отношении реакций этерификации и переэтерифкации.

Экспериментальная часть. Выделение культуры микроорганизмов проводится методом глубинного культивирования. В данной

работе используются две питательные среды, отличающиеся по источнику углерода.

Состав питательной среды, г/л: KH2PO4 - 0,7; K2HPO4 - 0,3; MgSO4-7H2Ü - 0,5; NaNO3 - 2,0; KCl - 0,5; FeSO4'7H2O - 0,01.

В качестве источника углерода использовались: среда 1 - оливковое масло - 30,0 мл/л; Твин-80 - 0,25 мл/л; среда 2 - Твин-80 -30,0 мл/л.

Липазы являются внеклеточными ферментами, поэтому после культивирования биомассу отделяли от культуральной жидкости центрифугированием. После отделения биомассы фугат отправляли на высаливание фермента сульфатом аммония, полученный осадок осушали на воздухе. Сухой препарат измельчали и использовали в качестве катализатора реакций.

Активность липазы определяется следующим образом: к 5 мл 40%-ного раствора Твин-80 добавляли 4 мл воды и 1 мл исследуемого раствора фермента, далее ферментативную реакцию проводили на качалке при температуре 30 °С и скорости вращения 150 об/мин, каждые 24 ч отбирали пробу на анализ кислотного числа.

При определении кислотного числа брали навеску около 1 г известной массы, к навеске приливали 50 мл нейтрализованной по фенолфталеину смеси этанол - диэтиловый эфир в соотношении 1:1 (об.), а также фенолфталеин в качестве индикатора. Полученный раствор тщательно перемешивали и титровали 0,1 н NaOH до розовой окраски, не исчезающей в течение 30 с. Кислотное число (КЧ) рассчитывали по формуле

КЧ = (5,61- V)/a,

где 5,61 - пересчет на КОН; V- объем титранта, мл; а - навеска жира.

Зная начальную массу Твин-80 и значение КЧ, рассчитывали степень конверсии Твин-80.

Для проведения реакции этерификации готовили смесь олеиновой кислоты и этилового спирта в мольном соотношении 1:5. Далее к смеси добавляли 0,9 % воды, фермент в концентрации 20 мг/мл. Реакцию проводили на качалке при температуре 30 °С и скорости вращения 150 об/мин. В течение реакции через определенные интервалы времени проводили анализ на кислотное число.

Реакция переэтерификации проводится аналогичным образом. В качестве исходных реагентов использовали подсолнечное масло

и этиловый спирт, смешанные в мольном соотношении 1:10. После окончания реакции переэтерификации смесь промывали водой и разделяли. Верхний слой выпаривали, растворяли в бутаноле и анализировали методом газовой хроматографии. Для определения количества образовавшихся эфиров использовали газовый хроматограф «Кристалл 5000.2» (ЗАО СКБ «Хроматек», Россия) с капиллярной колонкой НРЕБАР50 м х 0,32 мм х 0,5 мкм и пламенно-ионизационным детектором (ПИД), газ-носитель - гелий.

Результаты и обсуждение. Выделение микроорганизмов - продуцентов липаз проводилось методом глубинного культивирования. В качестве инокулята использовалась почвенная суспензия в разведении 1:10. Из полученной накопительной культуры выделяли чистую культуру грибов. Полученные чистые культуры микроскопировали. Во всех препаратах были обнаружены сходные микроорганизмы. Наличия посторонней микрофлоры не наблюдалось.

Из культуральной жидкости выделенных культур микроорганизмов проводили выделение ферментов методом высаливания. Для эффективного высаливания на 500 мл фугата культуральной жидкости потребовалось 20 г сульфата аммония. Ферментный препарат, полученный со среды 1, был назван липаза МТ; препарат, полученный со среды 2, - липаза Т. Для сравнения активности препаратов также изучался промышленный ферментный препарат (липаза П) животного происхождения (панкреатическая липаза). Липазная активность ферментных препаратов, полученных с разных сред, показана на рис. 1.

0 2 4 6 8 10

т, дни

Рис. 1. Конверсия Твин-80 в ходе реакции с ферментными препаратами: ф - конверсия субстрата, т - время

Кинетические кривые свидетельствуют о том, что препараты, выделенные на разных средах, проявляют разную липазную активность: у ферментного препарата Т она выше, чем у препарата МТ. Максимальные конверсии субстрата для исследуемых ферментных препаратов и промышленного препарата приведены в таблице.

Средние скорости ю и максимальные конверсии Твин-80 ф при использовании разных ферментных препаратов

Препарат Средняя скорость реакции, г/(л-сут) Максимальная степень конверсии субстрата, %

Липаза П 1 мас.% 16,8 25,3

Липаза П 3 мас.% 41,8 49,1

Липаза МТ 20,0 29,0

Липаза Т 33,0 33,0

Выделенные ферментные препараты проявляют активность выше, чем активность 1%-ного препарата Липаза П, при этом достигается конверсия субстрата до 33 % (липаза Т), что свидетельствует об активности полученных препаратов.

Для сравнения эффективности действия полученных препаратов ферментов в отношении реакции этерификации проводили этерифика-цию смеси жирных кислот с доминирующим содержанием олеиновой кислоты этанолом с использованием разных препаратов ферментов. Реакция этерификации проводилась в течение 5 дней. На рис. 2 показана зависимость кислотного числа от времени реакции.

Рис. 2. Зависимость кислотного числа от времени реакции при использовании разных ферментных катализаторов

В ходе действия промышленного препарата липазы сначала происходит убыль кислотного числа с 120 до 62 в течение 3 сут, что связано с образованием эфиров и понижением концентрации жирных кислот. При этом за 3 сут происходит конверсия 45 % жирных кислот. На 3-и сутки происходит перегиб кривой и далее величина КЧ растет. Это свидетельствует о том, что липаза начинает катализировать противоположную реакцию гидролиза сложного эфира либо начинают протекать побочные реакции. Кривая действия липазы МТ имеет схожую форму с кривой промышленной липазы. За 2 сут происходит конверсия 21 % жирных кислот, что говорит о ее активности в отношении реакции этерификации, но активность липазы МТ ниже, чем у промышленной липазы.

Кривая липазы Т не имеет области снижения кислотного числа, величина КЧ растет по мере протекания реакции, что можно объяснить наличием в неочищенном ферментном препарате дополнительных ферментов, катализирующих распад жирных кислот или их окисления. Поэтому можно сделать вывод о ее неприменимости в неочищенном виде для катализа реакции этерификации.

Для оценки возможности применения полученных ферментных препаратов в отношении реакции переэтерификации был проведен га-зохроматографический анализ продуктов реакции переэтерификации при использовании ферментных препаратов и подсолнечного масла в качестве субстрата. На рис. 3 представлена хроматограмма пробы, полученной в ходе реакции переэтерификации с использованием промышленной липазы в качестве катализатора.

Рис. 3. Хроматограмма пробы реакции переэтерификации подсолнечного масла промышленным препаратом Липаза П при 30 °С

Газохроматографический анализ подтвердил наличие эфиров жирных кислот - продуктов переэтерификации - в ходе ферментативной переработки триглицеридов подсолнечного масла этанолом.

Выход сложных эфиров в реакции переэтерификации подсолнечного масла ферментными препаратами при 30 °С за период 7 суток: промышленная липаза - 0,63 %; липаза МТ - 0,14 %; липаза Т - 0,17 %.

По данным результатам можно судить о том, что промышленная липаза обладает большей активностью в реакции переэтерификации, чем полученные препараты. Однако в целом активность липаз в отношении реакции переэтерификации низка. В то же время в представленных результатах ферментные препараты использовались в неочищенном виде напрямую в реакциях этерификации и переэтерификации. Грубая очистка препаратов может вызвать проявление побочных реакций за счет наличия в составе препарата ферментов, отличных от липаз, которые также прошли этап высаливания. Полученные ферментные препараты показали активность в отношении реакции этерифика-ции и низкую активность в отношении переэтерификации. При оптимизации условий проведения реакции этерификации в дальнейшем возможно увеличение степени конверсии жирных кислот для более полной переработки жиросодержащих отходов. В дальнейшем данные ферментные препараты можно использовать в составе комплексного ферментного препарата для переработки жиросодержащих отходов с высоким содержанием свободных жирных кислот.

Список литературы

1. Canakci M., Gerpen J.V. Biodiesel production from oils and fats with high free fatty acids // Trans ASAE. - 2001. - Vol. 44, no. 6. - P. 1489-1436.

2. Efficient production of biodiesel from high free fatty acid-containing waste oils using various carbohydrate-derived solid acid catalysts / W.Y. Lou, M.N. Zong, Z.-Q. Duan // Technol. - 2008. - Vol. 99, no. 18. - P. 8752-8758.

3. Economic assessment of biodiesel production from wastewater sludge / J. Chen, R.D. Tyagi, Zhang X. Li. J., P. Drogui, F. Sun // Biores. Technol. -2018. - Vol. 253. - P. 41-48.

4. Zhang J., Jiang L. Acid-catalyzed esterification of Zanthoxylum bungeanum seed oil with high free fatty acids for biodiesel production // Biores. Technol. - 2008. - Vol. 99, no. 18. - P. 8995-8998.

5. Kinetics of free fatty acids esterification with methanol in the production of biodiesel fuel / E. Sendzikiene, V. Makarevicience, P. Janulis, S. Kiys // Eur. J. Lipid Sci. Technol. - 2004. - Vol. 106. - P. 831-836.

6. Production of biodiesel from acid waste lard / Dias J.M., Alvim-Ferraz M.C.M., Almeida M.F. // Bioresource Technology. - 2009. - Vol. 100, no. 24. -P.6355-6361.

7. Kulkarni M.G., Dalai A.K. Waste cooking oil - an economical source for biodiesel: a review // Industrial and Engineering Chemistry Resesearch. - 2006. -Vol. 45. - P. 2901-2913.

8. Production of biodiesel from acid waste lard / J.M. Dias, M.C.M. Alvim-Ferraz, M.F. Almeida // Biores. Technol. - 2009. - Vol. 100, no. 24. - P. 63556361.

9. Скрининг продуцентов липаз / М.А. Пушкарев, Т.Б. Лисицкая, В.А. Галынкин, А.В. Гарабаджиу, Г.В. Козлов // Известия СПбГТИ (ТУ). -2014. - № 27. - C. 43-46.

10. Основные аспекты использования липаз для получения биодизеля (обзор) / А.В. Гарабаджиу, В.А. Галынкин, М.М. Карасев, Г.В. Козлов, Т.Б. Лисицкая // Известия Санкт-Петербургского государственного технологического института. - 2010. - № 7. - C. 63-67.

11. Enzymatic biodiesel production from palm oil and palm kernel oil using free lipase / S.O. Kareem, E.I. Falokun, S.A. Balogun, O.A. Akinloye, SO. Omeike // Egyptian Journal of Petroleum. - 2017. - Vol. 26. - P. 635-642.

12. Kareem S.O. Enzymatic biosiesel production from Manilkara Zapota (L.) Seed oil // Waste biomass valor. - 2018. - Vol. 9. - P. 725-730.

13. Development of biodiesel from inedible feedstock through various production processes. Review / J. Qiul, X. Fan, H. Zou // Chemistry and technology of fuels and oils. - 2011. - Vol. 47. - P. 102-111.

14. Jeon D.J., Yeom S.H. Two-step bioprocess employing whole cell and enzyme for economical biodiesel production // Korean Journal of Chemical Engineering. - 2010. - Vol. 27, no. 5. - P. 1555-1559.

15. Verma M., Barrow C.J. Recent advances in feedstocks and enzyme-immobilised techlogy for effective tranesterification of lipids into biodiesel // Microbial factories. - 2015. - P. 87-103.

References

1. Canakci M., Gerpen J.V. Biodiesel production from oils and fats with high free fatty acids. Trans ASAE, 2001, vol. 44, no. 6, pp. 1489-1436.

2. Lou W.Y., Zong M.N., Duan Z.-Q. Efficient production of biodiesel from high free fatty acid-containing waste oils using various carbohydrate-derived solid acid catalysts. Technol., 2008, vol. 99, no. 18, pp. 8752-8758.

3. Chen J., Tyagi R.D., Zhang X. Li. J., Drogui P., Sun F. Economic assessment of biodiesel production from wastewater sludge. Biores. Technol, 2018, vol. 253, pp. 41-48.

4. Zhang J., L. Jiang. Acid-catalyzed esterification of Zanthoxylum bungeanum seed oil with high free fatty acids for biodiesel production. Biores. Technol, 2008, vol. 99, no. 18, pp. 8995-8998.

5. Sendzikiene E., Makarevicience V., Janulis P., Kiys S. Kinetics of free fatty acids esterification with methanol in the production of biodiesel fuel. Eur. J. Lipid Sci. Technol, 2004, vol. 106, pp. 831-836.

6. Dias J.M., Alvim-Ferraz M.C.M., Almeida M.F. Production of biodiesel from acid waste lard. Bioresource Technology, 2009, vol. 100, no. 24, pp. 63556361.

7. Kulkarni M.G., Dalai A.K. Waste cooking oil - an economical source for biodiesel: a review. Industrial and Engineering Chemistry Resesearch, 2006, vol. 45, pp. 2901-2913.

8. Dias J.M., Alvim-Ferraz M.C.M., Almeida M.F. Production of biodiesel from acid waste lard. Biores. Technol., 2009, vol. 100, no. 24, pp. 6355-6361.

9. Pushkarev M.A., Lisitskaia T.B., Galynkin V.A., Garabadzhiu A.V., Kozlov G.V. Skrining produtsentov lipaz [Screening of lipase producers]. Izvestiia SPbGTI (TU), 2014, no. 27, pp. 43-46.

10. Garabadzhiu A.V., Galynkin V.A., Karasev M.M., Kozlov G.V., Lisitskaia T.B. Osnovnye aspekty ispol'zovaniia lipaz dlia polucheniia biodizelia (obzor) [The main aspects of the lipases for biodiesel using (review)]. Izvestiia Sankt-Peterburgskogo gosudarstvennogo tekhnologicheskogo institute, 2010, no. 7, pp. 63-67.

11. Kareem S.O., Falokun E.I., Balogun S.A., Akinloye O.A., Omeike S.O. Enzymatic biodiesel production from palm oil and palm kernel oil using free li-pase. Egyptian Journal of Petroleum, 2017, vol. 26, pp. 635-642.

12. Kareem S.O. Enzymatic biosiesel production from Manilkara Zapota (L.) Seed oil. Waste biomass valor., 2018, vol. 9, pp. 725-730.

13. Qiul J., Fan X., Zou H. Development of biodiesel from inedible feedstock through various production processes. Review. Chemistry and technology of fuels and oils, 2011, vol. 47, pp. 102-111.

14. Jeon D.J., Yeom S.H. Two-step bioprocess employing whole cell and enzyme for economical biodiesel production. Korean Journal of Chemical Engineering, 2010, vol. 27, no. 5, pp. 1555-1559.

15. Verma M.L., Barrow C.J. Recent advances in feedstocks and enzyme-immobilised techlogy for effective tranesterification of lipids into biodiesel. Microbial factories, 2015, pp. 87-103.

Получено 27.09.2018

Об авторах

Першин Егор Александрович (Пермь, Россия) - студент, кафедра химии и биотехнологии Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29; e-mail: egorpershin96@gmail.com).

Пермякова Ирина Александровна (Пермь, Россия) - ст. преподаватель кафедры химии и биотехнологии Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29; e-mail: zernina88@mail.ru).

About the authors

Egor A. Pershin (Perm, Russian Federation) - Student, Department of Chemistry and biotechnology, Perm National Research Polytechnic University (29, Komsomolsky av., Perm, 614990; e-mail: egorpershin96@gmail.com).

Irina A. Permyakova (Perm, Russian Federation) - Senior lecturer of the Department of Chemistry and biotechnology, Perm National Research Polytechnic University (29, Komsomolsky av., Perm, 614990; e-mail: zernina88@mail.ru).