ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЖИДКОЙ МИНЕРАЛЬНОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ АДАПТИВНОЙ РЕАКЦИИ РАСТЕНИЙ НА ИЗМЕНЕНИЕ УСЛОВИЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
APPLICATION OF LIQUID MINERAL COMPOSITION FOR IMPROVEMENT OF ADAPTIVE RESPONSE OF PLANTS TO CHANGE OF ENVIRONMENTAL CONDITIONS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области композиций удобряющих веществ, позволяющих сохранять или улучшать санитарное состояние растений, используемых в сельском хозяйстве, садоводстве, лесоводстве или в области луговых пастбищ. В частности, оно относится к области композиций, способствующих улучшению систем защиты растений от внешних биотических или абиотических агрессивных воздействий.
Уровень техники
Показатели растений с точки зрения роста, развития, накопления и выхода биомассы зависят, в частности, от их способности адаптироваться к изменениям условий окружающей их среды, которые включают в себя физические, химические и биологические агрессивные явления.
Например, наблюдения показали, что агрессивные явления, такие как водный, осмотический или термический стрессы представляют собой факторы, ограничивающие рост растений и, следовательно, уровень производительности в областях сельского хозяйства, садоводства, лесоводства или луговых пастбищ. Растения, подвергающиеся воздействию жары или засушливых условий, обычно показывают низкий выход биомассы, семян, фруктов или других продуктов, предназначенных для питания людей или животных, в том числе скота. Снижения урожайности, в том числе потери в выходе потребляемого растительного материала, например в производстве риса, кукурузы или пшеницы, вызванные стрессовыми событиями, приводят к нехватке продуктов питания в некоторых развивающихся странах.
Агрессивные явления активируют в растениях физиологические защитные механизмы, которые мобилизуют ресурсы для обеспечения выживания растения и сохранения его санитарного состояния в ущерб ресурсам, используемым для сохранения первоначального уровня выхода необходимого растительного материала.
В целом из предшествующего уровня техники известны самые разные решения биологического или химического характера, предназначенные, по меньшей мере, для частичной защиты растений от последствий внешних агрессивных явлений.
В частности, можно упомянуть технологии генетической модификации растений, предназначенные для обеспечения производства трансгенных растений, обладающих передаваемой способностью сопротивления стрессам, что описано, например, в международных заявках WO 2007/125531, WO 2007/060514, WO 2008/050350 и WO 2008/145675. Однако в данном случае речь идет о специфических, длительных и дорогостоящих решениях, которые необходимо возобновлять для каждой генетически трансформируемой растительной разновидности. Кроме того, в настоящее время во многих странах существуют общие или почти общие регламентные запреты, идущие вразрез со стремительным развитием производства генетически модифицированных растений.
Другими путями решения проблемы устойчивости растений к стрессовым событиям являются сегодня выпускаемые на рынок органические или органоминеральные удобряющие композиции, в частности жидкие композиции, которые обладают общими или специфическими свойствами, позволяющими преодолеть дефицит питательных элементов. Известны также композиции, предназначенные для стимулирования у растений естественных защитных реакций против агрессивных воздействий со стороны патогенных биологических организмов, например композиции, содержащие такие вещества, как экстрагированные из растений молекулы, агрополимерные гидролизаты, экстракты микроорганизмов, натуральные или модифицированные полисахариды, фитогормоны, пептиды или белки, а также агонистические или антагонистические субстанции растительных белков, известные своим участием в защитном механизме растений.
Вышеупомянутые композиции могут давать удовлетворительные результаты, в частности, для борьбы с дефицитом питательных элементов или для стимулирования защитных механизмов растений против патогенных биологических организмов, таких как вирусы, микроорганизмы или насекомые.
Однако, насколько известно заявителю, в настоящее время не существует чисто минеральной композиции, способной защищать или стимулировать растения против агрессивных явлений типа абиотических, таких как условия водного, осмотического или термического стресса, или одновременно способствовать реакции растения по отношению к агрессивным видам с высоким содержанием хитина, таким как грибки.
Во всех случаях, учитывая экономическое значение и роль в обеспечении питания человека или животных, важно иметь растения с хорошим санитарным состоянием, в частности растения, характеризующиеся хорошей производительностью в областях сельского хозяйства, садоводства, лесоводства или луговых пастбищ, поэтому существует потребность в широком доступе к недорогим альтернативным композициям или композициям, усовершенствованным по сравнению с известными композициями.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение касается использования жидкой минеральной композиции формулы (I), детально представленной в дальнейшем тексте настоящего описания, для улучшения адаптивной реакции растений по отношению к изменению условий окружающей среды.
Жидкая минеральная композиция формулы (I) представляет собой концентрированную композицию, которую при применении для опрыскивания листьев используют в разбавленном виде в воде или водосодержащей жидкости.
В частности, изобретение касается использования жидкой минеральной композиции описанной ниже формулы (I) для улучшения адаптивной реакции растения на биотическое или абиотическое стрессовое событие.
Абиотические стрессовые события включают в себя, в частности, водный стресс, осмотический стресс, термический стресс или дефицит питательных веществ.
Биотические стрессовые события включают в себя, в частности, контакт или заражение биологическими организмами, в том числе патогенными микроорганизмами, содержащими хитин, а также веществами, производимыми этими различными биологическими организмами или являющимися их производными, включая в том числе хитин.
Описание фигур
2+
Фиг.1А и 1В - кривые кальциевой реакции у всходов Arabidopsis thaliana десятидневного возраста, появившейся в результате обработки возрастающим количеством композиции формулы (I). На оси абсцисс: время, выраженное в секундах. На оси ординат: концентрация ионов Са в цитозоле, выраженная в микромолях (мкмоль).
2+
Фиг.2А и 2В - кривые кальциевой реакции у всходов Arabidopsis thaliana десятидневного возраста, появившейся в результате холодного термического шока через 24 часа после предварительной обработки растений в присутствии или в отсутствие композиции формулы (I). На фиг.2А и 2В показаны результаты двух серий идентичных испытаний. На оси абсцисс: время, выраженное в секундах. На оси ординат: концентрация ионов Са в цитозоле, выраженная в микромолях (мкмоль).
2
2
Фиг.3 - кривые образования пероксида водорода (HO) у всходов Arabidopsis thaliana десятидневного возраста в результате осмотического шока через 24 часа после предварительной обработки растений в присутствии или в отсутствие композиции формулы (I). На оси абсцисс: время, выраженное в секундах. На оси ординат: произвольные единицы люминесценции (RLU).
2
2
Фиг.4 - кривые образования пероксида водорода (НО) у всходов Arabidopsis thaliana десятидневного возраста в результате элиситорного шока от химического вещества хитина через 24 часа после предварительной обработки растений в присутствии или в отсутствие композиции формулы (I). На оси абсцисс: время, выраженное в секундах. На оси ординат: произвольные единицы люминесценции (RLU).
Фиг.5 - долговременные эффекты композиции формулы (I) на развитие всходов Arabidopsis thaliana, предварительно подвергнутых воздействию различных стрессовых влияний. На оси ординат: измерение роста всходов, выраженное в сантиметрах корневого роста, в течение двух недель пребывания в стрессовых условиях. Гистограммы на оси абсцисс: (а) контрольные всходы, не обработанные и не подвергнутые условию стресса; (b) необработанные контрольные всходы, подвергнутые водному стрессу от NaCl; (с) необработанные контрольные всходы, подвергнутые осмотическому стрессу от маннитола; (d) всходы, обработанные композицией формулы (I) и не подвергнутые условию стресса; (е) всходы, обработанные композицией формулы (I) и подвергнутые водному стрессу от NaCl; (f) всходы, обработанные композицией формулы (I) и подвергнутые осмотическому стрессу от маннитола.
Подробное описание изобретения
После долгих исследований заявитель разработал жидкую минеральную композицию и доказал, что она обладает свойством улучшения адаптивной реакции растений на изменение условий окружающей среды.
В частности, он показал, что жидкая минеральная композиция формулы (I), представленной ниже в настоящем описании, обладает при использовании после соответствующего разбавления свойством улучшать адаптивную реакцию растений в ответ на изменение различных условий окружающей среды, включая водный шок, осмотический шок, и реакцию на контакт с некоторыми веществами, принадлежащими к биологическим организмам, таким как грибки.
Настоящее изобретение касается также использования жидкой минеральной композиции для опрыскивания листьев формулы (I) следующего состава:
общий аммиачный азот N (%)
0,08-2%
калий, выраженный в K<sub>2</sub>O (%)
3-6%
магний, выраженный в MgO (%)
0,4-0,8%
натрий, выраженный в Na<sub>2</sub>O (%)
1-2%
кальций, выраженный в CaO (%)
0-0,5%
общие сульфаты, выраженные в SO<sub>3</sub> (%)
3-6%
общий фосфор, выраженный в P<sub>2</sub>O<sub>5</sub> (%)
0%
хлориды Cl (%)
1-2%
бикарбонаты (в % HCO<sub>3</sub>)
1,2-3,0%
бор (%)
0,1-0,2%
медь (%)
0,018-0,03%
марганец (%)
0,00005-0,006%
йод (%)
0,02-0,04%
цинк (%)
0,00005-0,006%
железо
0,0002-0,003%
вода
остальное, достаточное для 100%
при этом процентное содержание выражено в массовых процентах относительно общей массы композиции,
для улучшения адаптивной реакции растений на изменение условий окружающей среды.
Минеральная композиция формулы (I) представляет собой минеральную композицию в концентрированном виде. Для ее использования посредством опрыскивания листьев минеральную композицию формулы (I) разбавляют соответствующим образом в воде или в водосодержащей жидкости.
Чтобы проверить, что композиция имеет качественные и количественные характеристики по минеральным элементам композиции вышеуказанной формулы (I), специалист может обратиться к хорошо известным методам количественного анализа для композиций этого типа.
Например, специалист может применять следующие методы анализа композиции:
(i) для количественного анализа аммиачного азота используют метод, описанный Conway (Директива Европейского Союза №71/393, измененная европейскими директивами №73/47 и №81/681),
2
(ii) для количественного анализа калия используют метод количественного анализа KО согласно французскому стандарту № NF U 44-140 и метод атомно-эмиссионной спектроскопии,
(iii) для количественного анализа магния используют метод количественного анализа, описанный во французском стандарте № NF U 44-140 и № NF U 44-146, и метод атомно-абсорбционной спектроскопии,
2
(iv) для количественного анализа натрия NaO используют метод количественного анализа, описанный во французском стандарте №NF U 44-140, и метод фотометрии,
(v) для количественного анализа кальция используют метод атомно-абсорбционной спектроскопии, определенный во французском стандарте №NF U 44-140,
(vi) для количественного анализа общих сульфатов используют метод, определенный европейским стандартом №СЕЕ 8.1 и метод гравиметрии,
2
5
(vii) для количественного анализа общего фосфора, выраженного в процентах (масса/масса) PO, применяют метод, определенный стандартами NF U 42-241 (СЕЕ 3.1) и NF U 42-246 (спектрометрия),
(viii) для количественного анализа хлоридов применяют метод, определенный французским стандартом №NF U 42-371,
(ix) для количественного анализа бикарбонатов используют метод количественного анализа ионов гидрогенокарбоната согласно технологии, описанной в стандарте №NF EN ISO 9963-1 (Т 90-036),
(х) для количественного анализа бора применяют метод количественного анализа, определенный в европейском стандарте №СЕЕ 9-1 и №СЕЕ 9-5, если конечная концентрация меньше 10% (масса/масса), или в европейском стандарте №СЕЕ 10-1 и №СЕЕ 10-5, если конечная концентрация больше 10% (масса/масса),
(xi) для количественного анализа меди применяют метод, определенный европейским стандартом №СЕЕ 9-1 и №СЕЕ 9-7, и метод атомно-абсорбционной спектроскопии,
(xii) для количественного анализа марганца используют метод количественного анализа, определенный стандартом №ICP NF EN ISO 11885,
(xiii) для количественного анализа йода применяют следующий метод: пробу измельчают в порошок согласно подготовительному методу Гроте-Крекелера (в небольшие фарфоровые ванночки погружают кварцевую трубку - стандарт DIN 53474). Газообразный йод абсорбируется в каустической соде, затем производят фотометрию согласно методу Санделла-Колтхоффа (с каталитическим воздействием окислительно-восстановительной пары Ce(IV)/As(III) на 436 нм).
(xiv) для количественного анализа цинка применяют метод количественного анализа, определенный стандартом ICP NF EN ISO 11885, и
(xv) для количественного анализа железа применяют метод количественного анализа, определенный стандартом ICP NF EN ISO 11885.
В предпочтительных вариантах выполнения композиция формулы (I) представляет собой композицию, содержащую исключительно минеральные элементы или соединения. В этих вариантах выполнения композиция формулы (I) представляет собой чисто или исключительно минеральную композицию и, следовательно, не содержит никакого органического элемента или соединения, то есть никакого углеводородного соединения. Например, композиция формулы (I) не содержит витаминов, аминокислот, сахаров, органических кислот или оснований и т.д.
Согласно другим отличительным признакам, композиция формулы (I) представляет собой композицию в концентрированном виде, которую, как правило, разбавляют перед применением на растениях.
Для получения композиции вышеуказанной формулы (I) специалист предпочтительно может обратиться к техническому содержанию настоящего описания, включая примеры.
Под «растением» в рамках настоящего изобретения следует понимать однодольные растения и двудольные растения.
Растения в рамках настоящего изобретения включают в себя растения, используемые в областях сельского хозяйства, садоводства, лесоводства или луговых пастбищ.
Сюда входят, в частности, злаковые культуры, плодовые деревья и цветы. Растения включают в себя, в частности, пшеницу, ячмень, рапс, кукурузу и рис и садовые виды, такие как яблони, груши, сливы, персики, абрикосы и т.д.
Двудольные растения включают в себя следующие виды и семейства:
Nymphaeaceae, Ceratophyllaceae, Ranunculaceae, Paraveraceae, Fumariaceae, Ulmaceae, Cannabinaceae, Urticaceae, Myricaceae, Fagaceae, Betulaceae, Aizoaceae, Chenopodiaceae, Portulacaceae, Caryophyllaceae, Polygonaceae, Plumbaginaceae, Elatinaceae, Guttiferae/Hypericaceae/Clusiaceae, Malvaceae, Malvaceae, Droseraceae, Violaceae, Cucurbitaceae, Salicaceae, Cruciferae/ Brassicaceae, Resedaceae, Empetraceae, Ericaceae, Pyrolaceae, Monotopaceae, Primulaceae, Grossulariaceae, Crassulaceae, Saxifragaceae, Rosaceae, Lehuminosae/Fabaceae, Eleagnaceae, Halogaraceae, Lythraceae, Onasraceae, Viscaceae, Celastraceae, Aguitofoliaceae, Euphorbiaceae, Rhamnaceae, Linaceae, Polygalaceae, Aceraceae, Oxalidaceae, Geraniaceae, Balsaminaceae, Araliaceae, Umbelliferae/Apiaceae, Gentianaceae, Apocynaceae, Solanaceae, Convolvulaceae, Cuscutaceae, Menyanthaceae, Boraginaceae, Lamiaceae, Hippuridaceae, Callitrichaceae, Plantaginaceae, Buddlejaceae, Oleaceae, Scrophulariaceae, Orobanchaceae, Lentibulariaceae, Campanulaceae, Rubiaceae, Caprifoliaceae, Adoxaceae, Valerianaceae, Dipsacaceae и Compositae/Asteraceae.
Под «адаптивной реакцией» растения следует понимать любое обнаруживаемое физиологическое изменение растения вследствие воздействия на указанное растение быстрого изменения условий окружающей его среды. Обнаруживаемые физиологические изменения охватывают любое изменение количества или концентрации одного или нескольких тканевых, в том числе внутриклеточных метаболитов или любое обнаруживаемое качественное или количественное изменение ферментативного(ых) действия(ий) указанного растения, или любое обнаруживаемое изменение морфологии указанного растения. Адаптивные реакции растений приводят, в частности, к производству клетками растений метаболитов, называемых «вторичными сигнализаторами». Вторичные сигнализаторы включают в себя ионы кальция и реактивные кислородные агенты (ROS).
«Условия окружающей среды» охватывают водные условия, соленость, осмотические условия, окислительные условия и термические условия. Быстрое изменение условий окружающей среды растения в рамках настоящего изобретения будет называться также «шоком» или «стрессом». Условия окружающей среды включают в себя (i) «биотические» условия, которые создаются биологическим окружением растения, и (ii) «абиотические» условия, возникающие в результате изменения физико-химического окружения растения.
Изменения условий окружающей среды, представляющие собой абиотический стресс или шок, охватывают стрессы или шоки солености, осмотические, окислительные, термические шоки и шоки, вызываемые при контакте растения с токсичными веществами, такими как некоторые металлы или некоторые органические синтетические токсичные химические вещества или некоторые натуральные или синтетические минеральные химические вещества. Они включают в себя также воздействие ионизирующего или не ионизирующего излучения и недостаточность или избыточность питательных веществ.
Стресс или шок солености может возникнуть, когда растение растет на почве с высоким содержанием хлорида натрия, например на полях или лугах, расположенных вблизи морского берега. Стресс солености приводит, в частности, к нарушению регулирования гомеостаза или ионного распределения в растительных тканях, следствием чего является ухудшение прорастания семян и роста растения.
Осмотический стресс или шок может быть вызван искусственно культурой или субстратом с высоким содержанием маннитола. Осмотический стресс вызывает, в частности, нарушение регулирования гомеостаза или ионного распределения в растительных тканях, следствием чего является ухудшение прорастания семян и роста растения.
Окислительный стресс или шок может быть вызван искусственно культурой на метил-виологене. В частности, окислительный стресс приводит к образованию реактивных кислородных агентов (ROS), к денатурации белков и к разложению хлорофилла, что вызывает обесцвечивание растения и может привести к его гибели.
Термический стресс или шок включает в себя стресс, вызванный жарой, и стресс, вызванный холодом. Стресс культуры от высокой температуры приводит, в частности, к денатурации белков, что вызывает ухудшение вегетативного роста. Стресс культуры от холода приводит к образованию реактивных кислородных агентов, к разрушению клеточных мембран и, как следствие, к ухудшению вегетативного роста.
Водный стресс культуры может произойти в сухих условиях. В частности, водный стресс подавляет клеточный рост и фотосинтез, что приводит к ухудшению вегетативного роста.
Изменения условий окружающей среды, являющиеся биотическим стрессом или шоком, включают в себя стрессы или шоки в результате контакта растения с одноклеточными или многоклеточными организмами, например бактериями, вирусами, грибками, фитофагами, насекомыми или патогенными организмами, или стрессы или шоки в результате контакта растения с веществами, выделяемыми одноклеточными или многоклеточными организмами. Биотический стресс может быть вызван бактериями, вирусами или грибками или их частями или веществами бактериального, вирусного или грибкового происхождения.
+2
Композиция формулы (I) в соответствии с настоящим изобретением обладает свойством прямого создания физиологического канала, участвующего в адаптивной реакции растений на изменение условий окружающей среды, в данном случае создание канала кальциевой сигнализации, что показано в примерах в виде влияния повышения концентрации ионов Са. Так, композиция формулы (I) приводит в цитозоле клеток к кальциевым изменениям, уровень которых зависит от количества композиции формулы (I), вводимой в контакт с растением.
При этом показано также, что композиция формулы (I) приводит к изменениям реакции растений на абиотический стресс, такой как термический шок от холода.
2
2
Результаты, представленные в примерах, показывают также, что композиция формулы (I) в соответствии с настоящим изобретением может стимулировать ускорение образования пероксида водорода (НО) при реакции на осмотический стресс.
Таким образом, согласно некоторым из аспектов, улучшение адаптивной реакции растений, вызванное композицией формулы (I), в рамках настоящего описания включает в себя:
+2
(i) свойство обнаруживаемого усиления кальциевой реакции растения на абиотический или биотический стресс, при этом усиление кальциевой реакции обнаруживают посредством измерения концентрации ионов кальция Са в растительных тканях и, в частности, в цитозоле растительных клеток; и
(ii) свойство обнаруживаемого ускорения образования пероксида водорода в растительных тканях в ответ на абиотический или биотический стресс.
+2
+2
+2
+2
Тот факт, что композиция формулы (I) в соответствии с настоящим изобретением обладает свойством усиления кальциевой реакции растения в ответ на биотический или абиотический стресс, является очень важным то, как ионы кальция, образующиеся в момент кальциевой реакции, известны как соединения, называемые «вторичными сигнализаторами» в каналах сигнализации, метаболически и хронологически возникающих намного раньше каскадного процесса, которые приводят к наведению адаптивных реакций у растения, подвергнутого влиянию биотического или абиотического стресса. Известно, что повышение концентрации ионов кальция приводит к активации белков, обладающих сродством к ионам, таких как кальциевые белки. Затем активированные кальциевые белки активируют, в свою очередь, другие белки, обладающие ферментативной активностью, такие как киназы, или активируют другие белки, не являющиеся ферментами, такие как белки типа «насоса» (Sanders, D., Brownlee, С., and Harper, J.F. (1999). Communicating with calcium. Plant Cell 11, 691-706. Shapiro, A.D. (2005). Nitric oxide signaling in plants. Plant Hormones VOL 72, 339-398; Brownlee, С.(2003). Plant signaling: Calcium first and second. Current Biology 13, R923-R924., Heitherington, A.M., and Brwonlee, C. (2004). The generation of Ca signals in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 55, 401-427.; Harper, J.F., Breton, G., and Harmon, A. (2004). Decoding Ca() signals through plant protein kinases. Annu Rev Plant Biol 55, 263-288.; Mori, I.C., Murata, Y., Yang, Y.Z., Munemasa, S., Wang, Y.F., Andreoli, S., Tiriac, H., Alonso, J.M., Harper, J.F., Ecker, J.R., Kwak, J.M., and Schroeder, J.I. (2006). CDPKs CPK6 and CPK3 finction in ABA regulation of guard cell S-type anion- and Ca- permeable channels and stomatal closure - art. no e327. Plos Biology 4, 1749-1762.; George, L., Romanowsky, S.M., Harper, J.F., and Sharrock, R.A. (2007). The ACA10 Ca ATPase Regulates Adult Vegetative Development and Inflorescence Architecture in Arabidopsis. Plant Physiol.). Эти каскадные процессы способствуют установлению специфических адаптивных реакций растения в ответ на первоначальный стресс. В качестве адаптивной реакции растений можно указать, например, закрывание устьиц, которое обеспечивает ограничение потери воды во время периодов водного стресса, образование осмотических защитных элементов в ответ на термический или осмотический стресс и образование эндогенных токсичных соединений, в результате чего происходит ограничение наступления патогенных организмов.
Очень важным является то, что композиция формулы (I) в соответствии с настоящим изобретением обладает свойством усиливать окислительную реакцию, в частности, образование реактивных кислородных агентов в ответ на событие биотического или абиотического стресса. В частности, очень важно, что композиция формулы (I) в соответствии с настоящим изобретением способствует, в частности, образованию пероксида водорода, который является наиболее устойчивым реактивным кислородным агентом и, следовательно, может в качестве соединения «вторичного сигнализатора» индуцировать на расстоянии клеточные реакции, необходимые для реализации адаптивной реакции растения. Следует напомнить, что образование реактивных кислородных агентов способствует запуску большинства адаптивных реакций растений в ответ на абиотический стресс. Следует также уточнить, что адаптивные реакции растений на событие биотического или абиотического стресса, приводящие к образованию реактивных кислородных агентов, включают в себя: тепловое рассеяние избыточной энергии, фотохимическое рассеяние энергии с использованием кислорода в качестве акцептора электронной схемы переноса, использование целого ряда ферментов и молекул-антиоксидантов для детоксикации производимых ROS, вовлечение ферментов-антиоксидантов (супероксид дисмутаза, каталаза, глутатион пероксидаза, аскорбат пероксидаза, пара тиоредоксин/тиоредоксин редуктаза, белки теплового шока), вовлечение белков-переносчиков железа и меди (трансферрин, ферритин), вовлечение малоразмерных молекул-антиоксидантов: глутатиона, каротиноидов, витаминов А, С (аскорбиновая кислота), Е (токоферол), убихинона, флавоноидов, билирубина, и вовлечение олигоэлементов (медь, цинк, селений), необходимых в качестве кофакторов для деятельности ферментов-антиоксидантов.
Таким образом, согласно одному из этих аспектов, использование композиции формулы (I) отличается тем, что улучшает адаптивную реакцию растений на биотический или абиотический стресс.
В некоторых вариантах реализации использование композиции формулы (I) отличается тем, что абиотический стресс выбирают из группы, в которую входят водный стресс, осмотический стресс, термический стресс и дефицит питательных веществ. Дефицит питательных веществ включает в себя дефицит минеральных веществ, в том числе дефицит олигоэлементов.
Согласно некоторым вариантам реализации, использование композиции формулы (I) отличается тем, что биотический стресс включает в себя, в частности, контакт или заражение биологическими организмами, в том числе патогенными микроорганизмами, содержащими хитин, а также веществами, производимыми или производными от этих биологических организмов, включая хитин.
Кроме того, согласно изобретению, композиция формулы (I) обладает, в частности, при опрыскивании листьев, свойством стимулировать корневой рост растений, причем как растений в нормальных условиях выращивания, так и растений, подвергнувшихся, по меньшей мере, одному условию абиотического или биотического стресса.
Так, согласно другим аспектам, использование в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что композиция формулы (I) способствует также улучшению корневого развития растений. Улучшение корневого развития можно наблюдать визуально при увеличении скорости роста корней путем измерения их средней длины.
Таким образом, композиция формулы (I) комбинирует (1) эффект усиления адаптивной реакции растений на изменение условий окружающей среды и (ii) физиостимулирующий эффект, визуально выражающийся в ускорении корневого развития.
Таким образом, доказано, что композиция формулы (I) в соответствии с настоящим изобретением при ее нанесении на растения предпочтительно путем опрыскивания листьев обеспечивает следующие технические результаты:
- усиление кальциевой реакции растений на водный, осмотический и термический стрессы,
- усиление реакции на элиситацию защитных механизмов с вовлечением хитинового элиситора,
2
2
- улучшение окислительного состояния растительных клеток посредством стимуляции образования реактивных кислородных агентов, включая пероксид водорода (HO),
- увеличение скорости роста корней молодых растений, и
- повышение сопротивляемости молодых растений по отношению к засухе.
В частности, в примерах показаны следующие эффекты композиции формулы (I):
+2
2
2
А. На уровне вторичных сигнализаторов реакции растений на биотические/ абиотические агрессивные проявления (Со и HO), вовлеченных в каналы сигнализации:
a) Композиция формулы (I) воспринимается растением как экзогенный стимул и наводит каналы сигнализации, приводя к цитозольным кальциевым изменениям в клетках всходов Arabidopsis thaliana. Обработка композицией формулы (I) приводит к изменениям в способности растения реагировать на стрессы.
2
3
b) Образование реактивных кислородных агентов, таких как (НО), в ответ на хитиновый элиситор у всходов, предварительно обработанных композицией формулы (I), превышает степень образования, измеренную у всходов, опрыскиваемых водой. Этот результат указывает на усиление защитных реакций растений, предварительно обработанных композицией формулы (I), в ответ на элиситоры, производимые патогенными агентами.
B. На уровне роста и развития всходов:
a) Композиция формулы (I) существенно ускоряет корневой рост всходов Arabidopsis thaliana в нормальных условиях или в условиях стресса (осмотического или солевого).
b) Возобновление развития всходов, повергнувшихся сильному водному стрессу, происходит быстрее при предварительной обработке композицией формулы (I).
Результаты примеров показывают, что композиция формулы (I) оказывает благотворное влияние на рост и развитие всходов как в нормальных условиях выращивания, так и в условиях стресса.
В некоторых предпочтительных вариантах выполнения композиция в соответствии с настоящим изобретением имеет следующую формулу (II), которая находится в интервале формулы (I):
общий аммиачный азот N (%)
0,08-1%
калий, выраженный в K<sub>2</sub>O (%)
3,5-4,5%
магний, выраженный в MgO (%)
0,4-0,5%
натрий, выраженный в Na<sub>2</sub>O (%)
1,2-1,6%
кальций, выраженный в CaO (%)
0-0,1%
общие сульфаты, выраженные в SO<sub>3</sub> (%)
3-5%
общий фосфор, выраженный в P<sub>2</sub>O<sub>5</sub> (%)
0%
хлориды Cl (%)
1-2%
бикарбонаты (в % HCO<sub>3</sub>)
1,5-1,9%
бор (%)
0,1-0,15%
медь (%)
0,020-0,026%
марганец (%)
0,00005-0,0002%
йод (%)
0,025-0,031%
цинк (%)
0,00005-0,0002%
железо
0,0002-0,001%
вода
количество, достаточное для 100%
при этом процентное содержание выражено в массовых процентах относительно общей массы композиции.
В других предпочтительных вариантах выполнения композиция в соответствии с настоящим изобретением имеет следующую формулу (III), которая находится в интервалах формул (I) и (II):
общий аммиачный азот N (%)
0,09%
калий, выраженный в K<sub>2</sub>O (%)
4%
магний, выраженный в MgO (%)
0,45%
натрий, выраженный в Na<sub>2</sub>O (%)
1,40%
кальций, выраженный в CaO (%)
0,05%
общие сульфаты, выраженные в SO<sub>3</sub> (%)
3,85%
общий фосфор, выраженный в P<sub>2</sub>O<sub>5</sub> (%)
0%
хлориды Cl (%)
1,40%
бикарбонаты (в % HCO<sub>3</sub>)
1,7%
бор (%)
0,12%
медь (%)
0,023%
марганец (%)
0,00005%
йод (%)
0,028%
цинк (%)
0,00005%
железо
0,0003%
вода
количество, достаточное для 100%
при этом процентное содержание выражено в массовых процентах относительно общей массы композиции.
Объектом настоящего изобретения является также любая из композиций, раскрытых в настоящем описании, в том числе в примерах, и, в частности, композиции формул (I), (II) и (III).
В некоторых вариантах выполнения композицию формулы (I) можно получить в соответствии с протоколом, детализированным в приведенной ниже таблице.
водопроводная вода
количество, достаточное для 100%
йодид калия
0,030-0,050%
хлорид натрия
0,8-1,2%
борная кислота
0,6-1,0%
карбонат натрия
2,0-4,0%
сульфат калия
7,0-1,10%
пятиводный сульфат меди
0,05-0,15%
сульфат аммония
1,5-3,5%
Вышеуказанные значения содержания даны в массовых процентах для каждого ингредиента относительно общей массы жидкой композиции.
Различные вышеуказанные ингредиенты добавляют в водопроводную воду при окружающей температуре, затем раствор тщательно перемешивают до получения стабильной жидкой композиции. После этого жидкую композицию фильтруют для удаления нерастворившихся твердых веществ, чтобы получить готовую к использованию прозрачную композицию формулы (I).
Предпочтительно композиция формулы (I), включая ее конкретный пример формулы (II), представляет собой жидкий состав в концентрированном виде, который разбавляют в определенном объеме воды для получения готовой к использованию разбавленной композиции.
Таким образом, изобретение касается также использования жидкой минеральной композиции для опрыскивания листьев, представляющей собой концентрированную композицию формулы (I), включая композицию формулы (II), которую разбавляют в объеме воды, 50-10000-кратном ее объему, предпочтительно 100-5000-кратном ее объему, например, 100-1000-кратном или 400-600-кратному ее объему, для усиления адаптивной реакции растений на изменение условий окружающей среды.
Изобретение касается также использования концентрированной минеральной композиции формулы (I), отличающегося тем, что перед опрыскиванием листьев композицию формулы (I) разбавляют в воде или в водосодержащей жидкости в пропорции композиция (1):вода или водосодержащая жидкость в пределах от 0,1:500 (об./об.) до 10:500 (об./об.), предпочтительно от 0,5:500 (об./об.) до 2:500 (об./об.).
На практике вышеуказанную разбавленную композицию наносят на растения посредством рассеивания на верхних частях, предпочтительно посредством опрыскивания листьев.
В некоторых вариантах выполнения вышеуказанную разбавленную композицию наносят на растения посредством рассеивания на верхних частях в количествах от 0,5 л до 20 л на гектар обрабатываемой площади посевов, предпочтительно от 0,5 л до 20 л на гектар обрабатываемой площади посевов периодичностью один раз в год в один или несколько приемов.
Следующие примеры, которые не носят ограничительного характера, иллюстрируют настоящее изобретение.
Примеры
А. Материалы и методология примеров
A.1. Растительный материал
10-дневные всходы Arabidopsis thaliana экотипа Col 0 (дикорастущие) или экотипа No0 (трансгенные, выражающие индикатор кальция экворин).
Всходы выращивают либо in vitro в чашках Петри на удобренной агаром питательной среде (среда MS, выпускаемая компанией Murashige et Skoog), либо на перегное в горшке или в GiFi.
При выращивании всходов in vitro предварительно стерилизованные семена Arabidopsis thaliana высаживают рядками примерно по 100 семян.
А.2. Измерение кальциевой реакции всходов Arabidopsis thaliana
2
Накануне измерений 50 ростков примерно 10-дневного возраста отобрали от культуры in vitro и распределили в чашках Петри партиями по три в 500 мкл воды, содержащей 2 мкл коэлентеразина, затем оставили на инкубацию в темноте при окружающей температуре на ночь, на следующий день произвели измерения при помощи люминометра, переместив партию из трех ростков в чашку Петри, содержащую 1 мл раствора композиции формулы (III) выбранной концентрации, и записали сигнал, излучаемый экворином после введения растений в контакт (путем погружения) с продуктом. После записи сигнала в течение 15 мин экворин разряжают путем впрыскивания раствора для лизиса, содержащего 100 миллимоль CaCl, для калибровки сигнала.
2
2
А.3. Измерение образования HO во всходах Arabidopsis thaliana
2
2
2
2
Произвели количественный анализ образования НО в 10-дневных всходах Arabidopsis thaliana посредством измерения люминесценции, появляющейся при окислении люминола. Партии по три ростка поместили в чашках Петри в люминометр, затем измеряли люминесценцию в течение 10 минут после введения реакционной среды (люминол 20 микромоль, пероксидаза 4 единицы, Tris-HCl 5 миллимоль при рН 7.8) с добавлением либо маннитола 350 миллимоль, либо хитина 10 мкг/мл, используемого в данном случае в качестве средства положительного контроля, способствующего образованию HO.
А.4. Измерение корневого роста всходов, выращенных in vitro и предварительно обработанных композицией формулы (I)
Для каждого опыта рядок 10-дневных всходов обработали посредством опрыскивания 2%-ной композицией формулы (III), затем переместили либо на нормальную среду, либо на стрессовую среду (NaCl 100 миллимоль или маннитол 350 миллимоль). После этого ежедневно отслеживали рост корней.
А. 5. Наблюдение развития всходов Arabidopsis thaliana в условиях стресса после предварительной обработки композицией формулы (I)
Семена Arabidopsis thaliana высадили в горшке на перегное, затем выращивали в условиях наблюдения при помощи фитотрона (t°=22/20°C, фотопериод 9/15, влажность 70%) в течение 10 дней (A. thaliana).
Затем молодые всходы обработали путем опрыскивания листьев водой (контрольные образцы) или композицией формулы (III) с концентрацией 2% в воде, после чего поместили в условия стресса: осмотического стресса (ежедневный полив маннитолом 350 миллимоль), солевого стресса (полив NaCl 100 миллимоль), водного стресса (без полива).
Затем развитие всходов отслеживали ежедневно посредством фотографирования.
Пример 1. Получение композиции формулы (I).
Приготовили композицию формулы (I), имеющую следующую формулу (III):
общий аммиачный азот N (%)
0,09%
калий, выраженный в K<sub>2</sub>O (%)
4%
магний, выраженный в MgO (%)
0,45%
натрий, выраженный в Na<sub>2</sub>O (%)
1,40%
кальций, выраженный в CaO (%)
0,05%
общие сульфаты, выраженные в SO<sub>3</sub> (%)
3,85%
общий фосфор, выраженный в P<sub>2</sub>O<sub>5</sub> (%)
0%
хлориды Cl (%)
1,40%
бикарбонаты (в % HCO<sub>3</sub>)
1,7%
бор (%)
0,12%
медь (%)
0,023%
марганец (%)
0,00005%
йод (%)
0,028%
цинк (%)
0,00005%
железо
0,0003%
вода
количество, достаточное для 100%
при этом процентное содержание выражено в массовых процентах относительно общей массы композиции.
Композицию формулы (III) готовили согласно протоколу, представленному в нижеследующей таблице.
Ингредиенты
Количество соли (г)
Конечная концентрация добавленной соли (г/л)
водопроводная вода
2500,00
KI
1,00
0,40
NaCl
24,00
9,60
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
20,00
8,00
NaHCO<sub>3</sub>
72,50
29,00
MgCl<sub>2</sub>
65,00
26,00
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
247,50
99,00
CuSO<sub>4</sub>, 5H<sub>2</sub>O
2,50
1,00
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
62,50
25,00
ВСЕГО
495,00
198,00
Различные ингредиенты добавили в водопроводную воду, затем раствор тщательно перемешали, чтобы получить жидкость стабильной растворимой композиции.
Затем жидкость профильтровали для получения готовой к применению прозрачной и стабильной растворимой композиции формулы (III). Для фильтрации можно использовать ячеистый бумажный беззольный фильтр PRAT DUMAS с размером ячейки от 7 до 10 микрометров.
В нижеследующих примерах композицию формулы (III) использовали с разными степенями разбавления от 0,01 до 8,00% (об./об.) в водопроводной воде и полученную разбавленную композиции использовали для опрыскивания листьев.
Пример 2. Измерение кальциевой реакции всходов Arabidopsis thaliana при опрыскивании листьев композицией формулы (I).
Было установлено, что применение композиции формулы (III) способствует кальциевым изменениям в клетках, что доказывает, что растения воспринимают композицию формулы (III) как средство стимулирования адаптивных реакций у растения.
Результаты показаны на фиг.1А и 1В в виде кальциевых изменений в 10-дневных всходах Arabidopsis thaliana в результате применения композиции формулы (III) разной концентрации (стрелка=момент введения к контакт всходов с продуктом).
Для этого использовали всходы Arabidopsis thaliana, выражающие ген экворина в цитозоле. Были произведены опыты с композицией формулы (III), разбавленной от 0,01 до 8% (об./об.) в воде, и контрольный опыт с водой. В момент введения растений в контакт с раствором наблюдается быстрое изменение сигнала, связанное непосредственно с манипуляцией (механические сотрясения) и не зависящее от концентрации продукта (это же наблюдают и при контроле с водой).
Результаты показали, что композиция формулы (III) активирует дозозависимую бимодальную реакцию, максимум которой находится между 30 секундами и одной минутой после введения растений в контакт с продуктом, после которого следует фаза постепенного возврата к базовому уровню при разбавлении менее 2% (об./об.) или продолжительный горизонтальный участок при разбавлении выше 2% (об./об.). Следует отметить, что при концентрации композиции формулы (III) выше 2% (об./об.) кальциевая реакция является быстрой, интенсивной и сильно зашумленной.
Таким образом, на основании этих опытов можно сделать следующий вывод:
1) Композиция формулы (III) даже при сильном разбавлении 0,01% (об./об.) оказывает действие стимулирования кальциевой реакции у растений. Продукт вызывает в цитозоле клеток кальциевые изменения, которые меняются в зависимости от концентрации и, следовательно, от количества композиции формулы (III), которую наносят на листья.
2+
2) При концентрации выше 2% (об./об.) эта кальциевая реакция имеет характеристики, отличающиеся от реакции, полученной при концентрации менее 2%. В частности, при концентрации выше 2% (об./об.) кальциевая реакция характеризуется устойчивой фазой горизонтального участка (дельта [Са]>0/5%), что может привести к другим конечным биологическим реакциям в ответ на эти кальциевые сигналы «вторичной сигнализации».
Пример 3. Исследование долговременного влияния опрыскивания листьев композицией формулы (I) на кальциевую реакцию всходов Arabidopsis thaliana при термическом шоке от холода.
Для определения эффекта предварительной обработки всходов Arabidopsis thaliana композицией формулы (III) на кальциевую реакцию, индуцируемую термическим шоком от холода, 10-дневные всходы опрыскали накануне измерений 2%-ным раствором композиции формулы (III) или воды (контрольный тест). Примерно три часа спустя после обработки отобрали образцы этих всходов и поместили для инкубации в коэлентеразин на ночь, как было описано в разделе «Материалы и методы». На следующий день зарегистрировали кальциевые реакции в этих всходах при термической обработке (холодный шок).
Как известно, холодный шок при погружении всходов в воду при 4°С приводит к быстрой, интенсивной и краткосрочной кальциевой реакции.
На фиг.2А и 2В показаны средние результаты, полученные в ходе двух независимых троекратных серий опытов спустя 24 часа и 48 часов после предварительной обработки композицией формулы (III).
После 24 часов наблюдают существенное различие в интенсивности реакции, индуцируемой стрессом, в зависимости от предварительной обработки (композицией формулы (III) или водой).
Было установлено, что обработка композицией формулы (III) значительно усиливает реакцию на холод.
Во второй серии опытов обработка композицией формулы (I) привела к значительной потере чувствительности к холоду по сравнению с растениями, обработанными водой.
Таким образом, в зависимости от рассматриваемого испытания композиция формулы (III) оказывает либо усиливающее действие, либо блокирует реакцию, что не позволяет сделать окончательный вывод о ее эффекте. После 48 часов на двух сериях испытаний оказалось, что обработка PRP уже не отличается от обработки водой (контрольные испытания).
Таким образом, результаты примера 3 показывают, что предварительная обработка композицией формулы (III) с концентрацией 2% (об./об.) приводит к изменению поведения растений во время кальциевой реакции на холодный шок, если этот шок применяют в период максимум до 24 часов.
2
2
Пример 4. Исследование долговременного влияния композиции формулы (I) на образование НО у всходов Arabidopsis thaliana в ответ на осмотический шок или на элиситорную обработку веществом, производимым патогенным организмом.
2
2
2
2
2
2
В примере 4 была поставлена задача определения эффекта предварительной обработки всходов Arabidopsis thaliana композицией формулы (III) на реакцию НО, вызываемую осмотическим шоком или элиситорным веществом, производимым грибковым микроорганизмом, а именно хитином. В данном случае хитин используют как положительный контрольный индикатор, известный своей способностью индуцировать образование НО, для имитации агрессивного воздействия от патогенных агентов, способных вызывать защитные реакции, одним из показателей которых является образование HO.
2
2
Для этого десятидневные всходы накануне измерений опрыскали 2%-ным раствором композиции формулы (III) или водой (контроль). На следующий день на этих всходах произвели измерения образования НО в ответ на воздействие либо осмотическим шоком (фиг.3), либо хитином (фиг.4), как было описано в разделе «Материалы и методы».
2
2
Результаты показаны на фиг.3 и 4. Фиг.3 и 4 иллюстрируют образование НО в ответ на осмотический шок (фиг.3) или на хитин (фиг.4) у всходов Arabidopsis thaliana, предварительно за 24 часа обработанных водой или композицией формулы (III) с концентрацией 2% (об./об.).
2
2
2
В ответ на маннитол, который в данном случае имитирует водный стресс, интенсивность наблюдаемых реакций является самой разной. Измеренный уровень интенсивности у всходов, предварительно обработанных композицией формулы (III), ниже, чем у всходов, предварительно обработанных водой. С другой стороны, маннитол не вызывает образования НО, существенно отличающегося от образования, полученного при предварительной обработке всходов водой (контрольная НО) или опрыскивании композицией формулы (III) (PRP).
2
2
2
2
Что касается образования HO при воздействии хитином, можно отметить, что у всходов, предварительно обработанных композицией формулы (III), хитин вызывает образование НО в 4-5 раз больше, чем у всходов, предварительно обработанных композицией формулы (III), но выдержанных в условиях инкубации в присутствии воды (PRP).
2
2
2
2
В случае всходов, предварительно обработанных водой и стимулированных хитином, образование HO существенно не отличается от стимулирования этих же всходов водой (контрольная HO).
2
2
Таким образом, результаты примера 4 показывают стимулирующий эффект на образование НО в ответ на воздействие хитином при предварительной обработке всходов композицией формулы (III). Это доказывает, что всходы, предварительно обработанные композицией формулы (III), обладают способностью усиливать свои защитные реакции в ответ на возможное заражение патогенным агентом, содержащим или производящим хитин, таким как грибки.
Пример 5. Долговременное влияние композиции формулы (I) на корневой рост всходов Arabidopsis thaliana, выращиваемых in vitro.
В примере 5 всходы Arabidopsis thaliana, выращиваемые в чашках со средой, удобренной агаром, опрыскали либо композицией формулы (III) с концентрацией 2% (об./об.), либо водой.
На следующий день эти всходы переместили в новые чашки либо на нормальную среду, либо на стрессовую среду, содержащую 100 миллимоль NaCl или 350 миллимоль маннитола.
После этого ежедневно замеряли длину основного корня.
2
На фиг.5 показан результат измерений, произведенных через 24 часа после перемещения на 20-30 всходах одной партии. Несмотря на довольно значительный разброс длин, наблюдается очень существенный общий эффект продукта PRP-EPV на корневой рост (р<0.01): увеличение длины основного корня больше у всходов, предварительно обработанных композицией формулы (III), чем у всходов, обработанных НО, как в контрольных условиях (без стресса), так в условиях стресса (NaCl или маннитол). Из графика можно установить, что предварительно обработанные всходы лучше сопротивляются стрессу, чем контрольные всходы.
Таким образом, результаты примера 5 показывают, что композиция формулы (III) оказывает положительный эффект на рост первичного корня. Этот лучший рост, в том числе в ситуациях стресса, способствует лучшей стойкости к водному стрессу.
Пример 6. Долговременное влияние композиции формулы (III) на развитие всходов Arabidopsis thaliana, выращиваемых в горшке.
Для проверки влияния композиции формулы (III) на сопротивляемость всходов Arabidopsis thaliana по отношению к различным стрессам всходы, выращенные в горшках в течение 10 дней, обработали посредством опрыскивания композицией формулы (III) с концентрацией 2% (об./об.) или водой (контрольные всходы), затем в последующие дни поливали водой, содержащей либо 350 миллимоль маннитола (осмотический стресс, моделирующий водный стресс) либо 100 миллимоль NaCl (солевый стресс), либо оставили без полива (водный стресс).
После двух недель стрессовой обработки всходы полили, как обычно, чистой водой.
Отмечается, что обработка оказывает одинаковое влияние на развитие всходов, независимо от того были они предварительно обработаны или нет композицией формулы (III).
С другой стороны, как оказалось, после водного стресса при прекращении полива возобновление развития после повторного полива ускорилось у всходов, которые были предварительно обработаны композицией формулы (III). Это лучшее возобновление проявилось в более выраженной степени после 10 дней полива.
Вывод: результаты примера 5 показывают, что предварительная обработка композицией формулы (III) улучшает восстановление растений после сильного водного стресса (высыхание верхних частей).