Анализ стабильности генотипа Vibrio cholerae в условиях низкой температуры и дефицита питательных веществ

Пробл. особо опасных инф. 2016; 3:52-56. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-3-52-56

УДК 616.932:579.61

л.В.миронова, Ж.Ю.хунхеева, Е.А.Басов, А.с.Пономарева, с.к.миткеева, с.В.Балахонов

анализ стабильности генотипа vibrio cholerae в условиях низкой температуры и дефицита питательных веществ

ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт, Иркутск, Российская Федерация

цель работы. Экспериментальное исследование влияния низкой температуры и дефицита питательных веществ на стабильность комплекса генетических локусов Vibrio cholerae Eltor. материалы и методы. В экспериментальных микрокосмах исследовалась стабильность комплекса генетических локусов (основные гены патогенности; участки генома, содержащие вариабельные тандемные повторы и сайты узнавания редкощепящих рестриктаз, определяющие VNTR- и PFGE-профиль изолятов соответственно; гены жизнеобеспечения холерного вибриона) четырех штаммов Vibrio cholerae Eltor на разных этапах инкубации. результаты и выводы. Установлено, что при культивировании исследуемых штаммов в условиях дефицита питательных веществ и низкой температуры произошло формирование клонов с измененным VNTR- и PFGE-профилями, частота обнаружения которых составила 4-8 10-2. Изменений в структуре генов «домашнего хозяйства» и утраты генов патогенности в составе мобильных генетических элементов не выявлено. Результаты исследования доказывают вероятность изменения анализируемых локусов генома V. cholerae в период пребывания микроорганизма в неблагоприятных условиях среды, что следует принимать во внимание при интерпретации результатов молекулярного типирования.

Ключевые слова: Vibrio cholerae, стабильность генотипа, адаптация, VNTR, PFGE, гены «домашнего хозяйства», гены патогенности.

Корреспондирующий автор: Миронова Лилия Валерьевна, e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru.

L.V.Mironova, Zh.Yu.Khunkheeva, E.A.Basov, A.S.Ponomareva, S.K.Mitkeeva, S.V.Balakhonov Analysis of Vibrio cholerae Genotype Stability at Low Temperature and Nutrients Deficiency

Irkutsk Research Anti-Plague Institute of the Rospotrebnadzor, Irkutsk, Russian Federation

Objective is an experimental study of the low temperature and nutrient deficiency effects on the stability of Vibrio cholerae El Tor genetic loci complex. Materials and methods. The stability of the genetic loci (i.e. the basic pathogenicity genes; genome fragments containing variable tandem repeats and sites of rare cutting restrictase recognition defining VNTR- and PFGE-profiles of the isolates, accordingly; V. cholerae «housekeeping» genes) of the four Vibrio choleme El Tor strains was investigated on the experimental microcosm at different stages of incubation. Results and conclusions. The study demonstrated that clones with altered VNTR- and PFGE-profiles (the detection frequency was 4-8 10-2) were being formed when strains were cultivated under nutrient deficiency and low temperature conditions. Neither changes in the structure of «housekeeping» genes nor loss of pathogenicity genes of the mobile genetic elements were revealed. The findings affirm the probability of analyzed V. cholerae loci alteration occurrence under unfavorable environment conditions. Obtained results should be taken into consideration for interpretation of molecular typing data.

Key words: Vibrio cholerae, genotype stability, adaptation, VNTR, PFGE, «housekeeping» genes, pathogenicity genes.

Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.

Corresponding author: Liliya V. Mironova, e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru.

Citation: Mironova L.V., Khunkheeva Zh.Yu., Basov E.A., Ponomareva A.S., Mitkeeva S.K., Balakhonov S.V. Analysis of Vibrio cholerae Genotype Stability at Low Temperature and Nutrients Deficiency. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; 3:52-56. (In Russ.). DOI: 10.21055/0370-1069-2016-3-52-56

Изменчивость микроорганизмов рассматривается как лежащее в основе их эволюции свойство приобретать или утрачивать исходные признаки в определенных условиях существования [1, 3]. Известно, что фенотипические модификации свойств бактерий нестабильны, тогда как генетическая изменчивость, обусловленная мутационными процессами в геноме или различного рода рекомбинациями генетического материала [3, 8], характеризуется относительной стабильностью и при условии закрепления изменений в популяции является основой диверсифицирующего отбора.

Для генотипирования микроорганизмов, изучения генетического разнообразия микробных популя-

ций используется анализ структуры определенных локусов и, соответственно, вопрос сохранения стабильности исходного генотипа в различных условиях существования микроорганизмов оказывается важным при проведении эпидемиологических расследований, а также в эволюционном анализе. Поскольку известно, что для холерного вибриона характерна высокая пластичность генома, изучение вопросов стабильности применяемых для генотипи-рования локусов данного патогена приобретает особую актуальность. Ранее, при макрорестрикционном анализе хромосомной ДНК, нами выявлена вариабельность пульс-электротипов изолированных при эпидемических осложнениях штаммов Vibrio chole-

rae Eltor [7]. Кроме того, в эксперименте показана возможность реорганизации генома токсигенного холерного вибриона посредством утраты генов CTX профага в условиях недостатка питательных веществ [4], обнаружена способность V. cholerae к спонтанной элиминации детерминант патогенности в составе мобильных генетических элементов при пассаже на питательных средах [6], а также утрате генов вирулентности генетически измененными вариантами вибриона эльтор [5]. Вместе с тем отсутствуют данные об экспериментальном влиянии стрессовых факторов окружающей среды на стабильность таких используемых для генотипирования холерного вибриона локусов как вариабельные тандемные повторы, участки генома, содержащие сайты узнавания редкощепящих рестриктаз и определяющие профиль рестрикции ДНК изолятов при PFGE-типировании, гены жизнеобеспечения холерного вибриона и др.

С учетом изложенного цель работы - экспериментальное исследование влияния низкой температуры и дефицита питательных веществ на стабильность комплекса генетических локусов Vibrio chol-erae Eltor.

Материалы и методы

В эксперимент включено четыре штамма V. chol-erae Eltor, выделенные на территории сибири и Дальнего Востока при разных эпидемиологических ситуациях из клинического материала (V cholerae Eltor 01 № И-441 (генотип ctxÁB+(ctxB3)tcpA+toxR+) и № И-1300 (генотип ctxÁB+(ctxB1)tcpA+toxR+)) и из объектов окружающей среды (V cholerae Eltor 01 № И-1310 (генотип ctxÁB+(ctxB1)tcpA+toxR+) и № И-1462 (генотип ctx.АB- tcpA- toxR+)).

Экспериментальные микрокосмы формировали во флаконах с забуференным физиологическим раствором, в которые вносили микробную взвесь исследуемых штаммов в конечной концентрации 107 м.к./ мл. Инкубацию проводили при температуре 6 °С с контрольными высевами (на 12, 26, 54 и 82-е сутки) на плотные питательные среды до прекращения высеваемости. Также исследованию подвергали последние обнаруживаемые на питательных средах вегетативные клетки штаммов.

На каждом этапе контрольных исследований оценивали морфологию колоний, отбирали по три колонии каждого штамма (субкультуры) для анализа комплекса молекулярно-генетических свойств (наличие основных генов вирулентности - ctxAB, tcpA и регу-ляторного гена toxR; определение пульс-электротипа, VNTR-профиля и сиквенс-типа). Кроме того, проводили MALDI-ToF масс-спектрометрическую оценку видовой принадлежности субкультур. После прекращения роста штаммов в высевах из микрокосмов осуществляли центрифугирование их содержимого при 6 тыс. об/мин, 30 мин, осадок подвергался комплексному молекулярно-генетическому исследованию и иммуно-флуоресцентному анализу.

Экстракция белков для масс-спектрометри-ческого анализа проводили посредством обработки микробной взвеси этиловым спиртом и 70 % муравьиной кислотой с последующим добавлением ацетонитрила. Выделение ДНК осуществляли с использованием стандартного набора для экстракции нуклеиновых кислот.

Фрагменты генов ctxAB, tcpA и toxR детектировали в мультиплексной ПЦР. Анализ структуры вариабельных тандемных повторов V. cholerae проводили по пяти локусам - VcA, VcB, VcC, VcD, VcG [2] с определением размера ампликонов капиллярным электрофорезом. Для уточнения структуры ло-кусов с измененным размером ампликона проводили их секвенирование. Макрорестрикционный анализ хромосомной Днк выполняли с использованием эн-донуклеаз NotI и SfiI в соответствии с предложенным PulseNet протоколом. Стабильность структуры генов жизнеобеспечения изучали на основании секвениро-вания пяти локусов - dnaE, lap, recA, pgm, cat.

Результаты и обсуждение

пребывание исследуемых культур V. cholerae в микрокосмах в условиях низкой температуры и дефицита питательных веществ привело к постепенному снижению концентрации микробных клеток: вегетативные клетки в высевах токсигенных штаммов обнаруживались до 68 сут эксперимента, нетоксиген-ного - до 82 сут (рис. 1, А). Полученный после прекращения высеваемости осадок содержимого микрокосмов не содержал вегетативных клеток, что подтверждено отсутствием роста при высеве его на жидкие и плотные питательные среды. Люминесцентная микроскопия полученных из осадка препаратов обнаружила присутствие в них полиморфных клеток с преобладанием округлых форм с интенсивной флуоресценцией оболочек при окрашивании специфическими холерными иммуноглобулинами. подобные изменения морфологии клеток являются одним из свидетельств перехода микроорганизма в некульти-вируемое состояние (рис. 1, Б).

В ходе эксперимента существенных изменений морфологии колоний V. cholerae в контрольных высевах не выявлено. Однако при анализе последних высевов из микрокосмов в популяции штамма V. cholerae Eltor И-1300 обнаружены единичные мелкие сухие морщинистые непрозрачные желтоватые колонии. микроскопически колонии неоднородной структуры с валиком по периферии и вдавленным центром, с признаками диссоциации и формированием дочерних, типичных для холерного вибриона, колоний (рис. 2, А). последующие пересевы привели к постепенному увеличению в популяции доли морфологически типичных форм. наряду с изменением морфологии колоний, произошло существенное снижение агглютанабельности холерными сыворотками о- и огава, утрата способности ферментировать сахарозу (рис. 2, А), замедление ферментации глюкозы,

Рис. 1. Динамика высеваемости исследуемых культур V. cholerae Eltor из микрокосмов

Б

снижение подвижности микробных клеток. Масс-спектрометрически субкультура идентифицирована как V. cholerae (score value 2,48-2,62). Установленные изменения биологических свойств штамма могут рассматриваться как формирование «персистирую-щего» фенотипа («persister») - одного из вариантов адаптивной изменчивости холерного вибриона [12]. Исследование фенотипических свойств субкультуры последнего высева V. cholerae Eltor И-1310 выявило отсутствие у нее продукции декарбоксилазы орнити-на и незначительную гемолитическую активность. У остальных штаммов изменений фенотипа в экспериментальных микрокосмах не выявлено.

MALDI-ToF масс-спектрометрический анализ субкультур на контрольных этапах эксперимента показал сохранение исходного профиля референсных белков холерного вибриона (все образцы идентифи-

цированы как V. cholerae, score value 2,44-2,70).

При ПЦР-детекции установлено сохранение исходного набора детерминант патогенности во всех исследуемых образцах. Стабильной оказалась и ну-клеотидная последовательность генов «домашнего хозяйства», определенная в полученных на последнем этапе эксперимента субкультурах.

VNTR-анализ показал изменение структуры содержащих вариабельные тандемные повторы ло-кусов в двух отобранных при первом контрольном исследовании субкультурах: в субкультуре штамма V. cholerae Eltor 01 И-1462 (локус VcA) и штамма V. cholerae Eltor 01 И-441 (локус VcB). В обоих случаях произошла дупликация, что привело к увеличению размера локуса на один повтор (VcA 12—>13, VcB 25—26). Выявленное изменение структуры локусов подтверждено секвенированием. Частота из-

Рис. 2. Фенотипические (А) и молекулярно-генетические (Б) свойства субкультуры штамма V. cholerae Eltor И-1300:

А - полиморфные колонии V. cholerae Eltor И-1300 на щелочном агаре и ферментация сахарозы на полужидкой питательной среде; Б - PFGE-паттерны исходного штамма V. cholerae Eltor И-1300 и экспериментальной морфологически измененной субкультуры: 1—4 - ДНК Salmonella ser. Braenderup H98124, рестрицированнаяXbaI (размерный стандарт - 668,9; 452,7; 398,4; 336,5; 310,1; 244,4; 216,9; 173,4; 167,4; 138,9; 104,5; 78,2; 76,8; 54,7; 33,3; 28,8; 20,5 kb); 2—3 - NotI- и S^I-генерируемые паттерны рестрикции ДНК исходного штамма V. cholerae Eltor И-1300; 5—6- NotI- и S^I-генерируемые паттерны рестрикции днк измененной субкультуры V. cholerae Eltor И-1300

менчивости VNTR-профиля составила 410-2 и касалась только локусов VcA и VcB.

При макрорестрикционном анализе хромосомной ДНК установлено изменение структуры N0(1- и «^-генерируемых профилей двух субкультур штамма V. сЫ1егае ЕЬог 01 И-1300, полученных через 7 сут пребывания в микрокосмах. В структуре N0(1-генерируемого паттерна произошло формирование дополнительного фрагмента и смещение в сторону уменьшения размера фрагмента в диапазоне 104,5-138,9 кЬ. Изменение профиля рестрикции SfiI заключалось в утрате бэнда в размерном диапазоне 76,8-78,2 кЬ. Кроме того, на 54-е сутки эксперимента (третье контрольное исследование) выявлено изменение полученного при гидролизе экзонуклеа-зой PFGE-профиля штамма V. сЫ1егае ЕЬюг 01 И-1310: профиль одной из субкультур демонстрирует сдвиг фрагмента в сторону увеличения размера в области 216,9-244,4 кЬ, другой - уменьшения в области 78,2-104,5 кЬ (рис. 3). Частота изменчивости PFGE-профиля составила 8 10-2, с неравномерными распределением показателя между двумя рестрикта-зами - 6102, N0(1 - 2-10-2). Следует отметить, что модификации профиля рестрикции ДНК выявлены только у атипичных генетически измененных штаммов вибриона эльтор.

Анализ структурной организации исследуемых участков генома фенотипически измененной субкультуры V. сЫ1егае ЕЬог 01 И-1300 выявил трансформацию паттернов рестрикции ДНК эндонуклеа-зами N0(1 (утрата одного фрагмента в диапазоне 104,5-138,9 кЬ) и (увеличение размера фрагмента в области 216,9-244,4 кЬ) (рис. 2, Б), при сохранении исходных VNTR- и амплификационного профилей.

Таким образом, инкубация холерного вибриона

Рис. 3. PFGE-паттерны экспериментальных субкультур V chol-erae Eltor:

1—3 - ^^-генерируемые паттерны рестрикции ДНК V. cholerae Eltor И-1300

в экспериментальных условиях привела к формированию клонов с геномными перестройками отдельных анализируемых локусов. Изменения VNTR-профиля выявлены только на начальном этапе эксперимента и заключались в дупликации повторов VcA и VcB. Известно, что одним из широко распространенных вариантов адаптации бактериальных геномов к стрессовым условиям являются дупликации-амплификации генов (gene duplication-amplification), которые могут служить основой для дальнейших генетических модификаций при условии получения селективных преимуществ измененными клонами [10]. Соответственно, обнаруженные в эксперименте изменения VNTR-профиля можно расценивать как первичную реакцию генома на стресс, а отсутствие в последующем измененных клонов в популяции свидетельствует о нестабильности вариантов с данными модификациями. Вариабельность и изменчивость VNTR-генотипа V. cholerae показана ранее при исследовании в динамике материала от больных холерой и контактировавших с ними лиц в Бангладеш и in vitro при пассаже штаммов на питательных средах [13]. Данные о возможности изменения структуры VNTR-локусов в эксперименте in vivo получены при исследовании Salmonella enterica Typhimurium [11], метициллин-резистентного S. aureus [14].

Менее стабильным в эксперименте оказался макрорестрикционный профиль штаммов: измененные по данному признаку клоны выявлялись на всем протяжении опыта с большей частотой в сравнении с VNTR-профилем. Характер изменений PFGE-профиля также может свидетельствовать в пользу дупликаций участков генома как в области сайтов рестрикции (генерирование дополнительных бэндов), так и за их пределами (увеличение размера фрагментов) [10]. Наряду с этим, изменение паттернов рестрикции может быть обусловлено и другими генетическими модификациями, в т.ч. не затрагивающими сайты рестрикции делециями, что рассматривается как один из признаков процесса компактиза-ции генома микроорганизма [8, 9]. Следует сказать, что изменчивость PFGE-профилей выявлена при проспективном исследовании генотипов V. cholerae в ходе эпидемии холеры на о. Гаити [15], а также у метициллин-резистентного S. aureus in vivo [14].

Проведенные исследования доказывают вероятность изменения отдельных локусов генома в период пребывания V. cholerae в неблагоприятных условиях среды, что следует принимать во внимание при интерпретации результатов молекулярного типиро-вания. Учитывая особенности экологии холерного вибриона (наличие сапрофитической и паразитической форм существования), необходимо проведение дальнейших экспериментальных исследований по изучению стабильности генотипа изолятов in vitro и in vivo для комплексной оценки эффективности и информативности применения того или иного подхода к типированию в рамках эпидемиологического надзора за холерой и изучения филогении возбудителя.

конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вельский В.А., Калуцкий П.В., Киселева В.В., Шаталова Е.В., Закарян Л.М. Гетерогенность микробных популяций. М.: Медицинское информационное агентство; 2008. 160 с.

2. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Мишанькин М.В., Сучков И.Ю., Мишанькин В.Н. Вариабельные тандемные повторы, выявленные при компьютерном анализе генома Vibrio cholerae. Биотехнология. 2001; 6:85—8.

3. Красильников А.П., Романовская Т.Р. Микробиологический словарь-справочник. Минск: Асар; 1999. 397 с.

4. Кульшань Т.В., Топорков А.В., Смирнова Н.И. генетические изменения вирулентных штаммов холерных вибрионов биовара Эльтор при их обитании в водной среде. Пробл. особо опасных ин ф. 2006; 1(91):41-4.

5. КульшаньТ.В., Заднова С.П., Челдышова Н.В., Смирнова Н.И. Оценка функциональных особенностей и стрессоустойчи-вости изогенных токсигенных и нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор. Журн. микробиол., эпидемиол. и имму-нобиол. 2015; 3:11-7.

6. Миронова Л.В., балахонов С.В., Урбанович Л.Я., Кожевникова А.С., Половинкина В.С., Куликалова Е.С., Афанасьев М.В. Молекулярно-генетический анализ заносных эпидемически опасных штаммов Vibrio cholerae eltor, изолированных в Сибирском и Дальневосточном регионах России. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2012; 2:13-20.

7. Миронова Л.В., Афанасьев М.В., Васов Е.А., Урбанович Л.Я., балахонов С.В. Ретроспективный макрорестрикционный анализ штаммов Vibrio cholerae eltor, изолированных при эпидемических осложнениях на Дальнем Востоке России. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2014; 2:29-36.

8. Равин Н.В., Шестаков С.В. Геном прокариот. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013; 17(4/2):972-84.

9. Смирнов Г.В. Механизмы приобретения и потери генетической информации бактериальными геномами. Усп. современной биол. 2008; 128(1^:52-76.

10. Andersson D.I., Hughes D. Gene Amplification and Adaptive Evolution in Bacteria. Annu. Rev. Genet. 2009; 43:167-95. DOI: 10.1146/annurev-genet-102108-134805.

11. Barua H., Lindblom I.L., Bisgaard M., Сhristensen J.P., Olsen R.H., Christensen H. In vitro and in vivo investigation on genomic stability of Salmonella enterica Typhimurium DT41 obtained from broiler breeders in Denmark. Vet. Microbiol. 2013; 166:607-16. DOI: 10.1016/j.vetmic.2013.06.035.

12. Jubair M., Morris J.G. Jr., Ali A. Survival of Vibrio cholerae in nutrient-poor environments is associated with a novel «persister» phenotype. PLoS One. 2012;7(9). DOI: 10.1371/journal. pone.0045187.

13. Kendall E.A., Chowdhrny F., Begum Y., Khan A.I., Li S., Thierer J.H., Bailey J., Kreisel K., Tacket C.O., LaRocque R.C., Harris J.B., Ryan E.T. Qadri F., Calderwood S.B., Stine O.C. Relatedness of Vibrio cholerae O1/O139 isolates from patients and their household contacts, determined by multilocus variable-number tandem-repeat analysis. J. Bacteriol. 2010; 192(17):4367-76. DOI: 10.1128/JB.00698-10.

14. O'Sullivan M.V.N., Sintchenko V., Gilbert G.L. Quantitative Estimation of the Stability of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strain-Typing Systems by Use of Kaplan-Meier Survival Analysis. J. Clin. Microbiol. 2013; 51(1):112-16. DOI: 10.1128/ JCM01406-12.

15. Talkington D., Bopp C., Tarr C., Parsons M.B., Dahourou G., Freeman M., Joyce K., Turnsek M., Garrett N., Humphrys M., Gomez G., Stroika S., Boncy J., Ochieng B., Oundo J., Klena J., Smith A., Keddy K., Gerner-Smidt P. Characterization of toxigenic

Vibrio cholerae from Haiti, 2010-2011. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17(11):2122-9. DOI: 10.3201/eid1711.110805.

References

1. Bel'sky V.A., Kalutsky P.V., Kiseleva VV, Shatalova E.V., Zakaryan L.M. [Heterogeneity of Bacterial Populations]. M.: Medical News-Agency; 2008. 160 p.

2. Vodop'yanov A.S., Vodop'yanov S.O., Mishan'kin M.B., Suchkov I.Yu., Mishan'kin B.N. [Variable tandem repeats, identified via computerized analysis of Vibrio cholerae genome]. Biotekhnologiya. 2001; 6:85-8.

3. Krasil'nikov A.P., Romanovskaya T.R. [Microbiological Glossary]. Minsk: Asar; 1999. 397 p.

4. Kul'shan' T.V., Toporkov A.V., Smirnova N.I. [Genetic Changes of Virulent Vibrio cholerae El Tor Biovar Strains Living in Water Environment]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2006;1:41-4.

5. Kul'shan' T.V., Zadnova S.P., Cheldyshova N.B., Smirnova N.I. [Evaluation of functional peculiarities and stress-resistance in isogenic toxigenic and non-toxigenic strains of Vibrio cholerae, biovar El Tor]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2015; 3:11-7.

6. Mironova L.V., Balakhonov S.V., Urbanovich L.Ya., Kozhevnikova A.S., Polovinkina VS., Kulikalova E.S., Afanas'ev M.V. [Molecular-genetic analysis of imported epidemically hazardous Vibrio cholerae eltor strains, isolated in Siberian and Far East regions of Russia]. Mol. Genet. Microbiol. Virusol. 2012; 2:13-20.

7. Mironova L.V., Afanas'ev M.V., Basov E.A., Urbanovich L.Ya., Balakhonov S.V. [Retrospective macro-restriction analysis of Vibrio cholerae eltor strains, isolated in the period epidemic complications in the Far East region of Russia]. Mol. Genet. Microbiol. Virusol. 2014; 2:29-36.

8. Ravin N.V., Shestakov S.V. [Genome of prokaryotic microorganisms]. Vavilovsky Zh. Genet. Selektsii. 2013; 17(4/2):972-84.

9. Smirnov G.B. [Mechanisms of acquisition and loss of genetic information by bacterial genomes]. Uspekhi Sovrem. Biol. 2008; 128(1):52-76.

10. Andersson D.I., Hughes D. Gene Amplification and Adaptive Evolution in Bacteria. Annu. Rev. Genet. 2009; 43:167-95. DOI: 10.1146/ annurev-genet-102108-134805.

11. Barua H., Lindblom I.L., Bisgaard M., Christensen J.P., Olsen R.H., Christensen H. In vitro and in vivo investigation on genomic stability of Salmonella enterica Typhimurium DT41 obtained from broiler breeders in Denmark. Vet. Microbiol. 2013; 166:607-16. DOI: 10.1016/j. vetmic.2013.06.035.

12. Jubair M., Morris J.G. Jr., Ali A. Survival of Vibrio cholerae in nutrient-poor environments is associated with a novel «persister» phenotype. PLoS One. 2012;7(9). DOI: 10.1371/journal.pone.0045187.

13. Kendall E.A., Chowdhury F., Begum Y., Khan A.I., Li S., Thierer J.H., Bailey J., Kreisel K., Tacket C.O., LaRocque R.C., Harris J.B., Ryan E.T., Qadri F., Calderwood S.B., Stine O.C. Relatedness of Vibrio cholerae O1/O139 isolates from patients and their household contacts, determined by multilocus variable-number tandem-repeat analysis. J. Bacteriol. 2010; 192(17):4367-76. DOI: 10.1128/JB.00698-10.

14. O'Sullivan M.V.N., Sintchenko V., Gilbert G.L. Quantitative Estimation of the Stability of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strain-Typing Systems by Use of Kaplan-Meier Survival Analysis. J. Clin. Microbiol. 2013; 51(1):112-16. DOI: 10.1128/JCM.01406-12.

15. Talkington D., Bopp C., Tarr C., Parsons M.B., Dahourou G., Freeman M., Joyce K., Turnsek M., Garrett N., Humphrys M., Gomez G., Stroika S., Boncy J., Ochieng B., Oundo J., Klena J., Smith A., Keddy K., Gerner-Smidt P. Characterization of toxigenic Vibrio cholerae from Haiti, 2010-2011. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17(11):2122-9. DOI: 10.3201/ eid1711.110805.

Authors:

Mironova L.V., Khunkheeva Zh.Yu., Basov E.A., Ponomareva A.S., Mitkeeva S.K., Balakhonov S.V. Irkutsk Research Anti-Plague Institute of Siberia and Far East. 78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation. E-mail: adm@chumin.irkutsk.ru

об авторах:

Миронова Л.В., Хунхеева Ж.Ю., Басов Е.А., Пономарева А.С., Миткеева С.К., Балахонов С.В. Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока. Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78. E-mail: adm@chumin. irkutsk.ru

Поступила 13.01.16.