СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ИДИОПАТИЧЕСКОГО СКОЛИОЗА У ДЕТЕЙ
METHOD OF PREDICTING RISK OF IDIOPATHIC SCOLIOSIS DEVELOPMENT IN CHILDREN

Изобретение относится к области медицинской диагностики, в частности медицинской генетики и деткой ортопедии.
Идиопатический сколиоз (ИС) занимает первое место среди заболеваний позвоночника у детей и подростков, а его частота в общей популяции превышает 15%, причем грубые сколиозы с выраженными косметическими и функциональными нарушениями составляют около 1,5-2% [Цыкунов М.Б., Еремушкин М.А. Прогнозирование течения сколиотической деформации позвоночника. // Медицинская помощь. - 2001. - №1. - С.21-24]. При всей медико-социальной значимости данного заболевания эффективность его ранней (доклинической) диагностики, а также мероприятий по его лечению и профилактике по-прежнему остаются явно недостаточными.
Известно, что одним из наиболее эффективных и перспективных подходов к диагностике, лечению и профилактике распространенных заболеваний является внедрение во врачебную практику элементов геномной или персонифицированной медицины [Ginsburg GS, Willard HF. Genomic and personalized medicine: foundations and applications. Transi Res. 2009; 154(6):277-87. Генетический паспорт - основа индивидуальной предиктивной медицины. / Под ред. B.C.Баранова. - СПб.: Изд-во Н-Л, 2009. - 528 с.]. Данный подход основан на генетическом тестировании ДНК-полиморфизмов в геноме пациентов и подборе наиболее оптимальных (строго индивидуализированных) схем превентивного лечения в зависимости от генетической конституции индивида. В этой связи генетическое тестирование ДНК-полиморфизмов в семьях детей, отягощенных идиопатическим сколиозом и другими заболеваниями опорно-двигательного аппарата, позволит идентифицировать категорию пациентов, потенциально предрасположенных к заболеванию, и своевременно начать лечебно-превентивные мероприятия.
th
Исследованиями последних лет было убедительно показано, что первичные генетические нарушения в системе регулирования роста и развития организма могут лежать в основе различных деформаций позвоночника, в том числе идиопатического сколиоза [Sanders J.O., Finegold D.N. Maturity assessment and curve progression in girls with idiopathic scoliosis // J.Bone Joint Surg. Am. 2007. Vol.89. P.64-73. Viola S., Peter F., Nagy I.S., Gyorgy I. GH-IGF-I axis in young patients with adolescent idiopathic scoliosis (AIS) and Scheuermann's disease (SD) coupled with AIS. // 10 International Philip Zorab Symposium: Programme and abstracts / Oxford. 1998. Yeung H.Y., Tang N.L., Lee K.M., Nq B.K., Hung V.W., Kwok R., Guo X., Oin L., Cheng J.C. Genetic association study of insulin-like growth factor-I (IGF-I) gene with curve severity and osteopenia in adolescent idiopathic scoliosis. // Studies in health technology and informatics 2006. Vol.123. P.18-24]. Хотя регуляция структурно-функциональной организации костно-мышечной системы достаточно сложна и включает в себя большое количество звеньев, генетически детерминированными являются различные факторы роста, характеризующиеся выраженными межиндивидуальными различиями в активности и экспрессии, что связано с наличием в структуре их генов функционально неравнозначных полиморфных аллелей [Qiu G.-X., Guo S.-J., Liu Y., Qian W.-W., Wu Z.-H. The expression of collagen type I, II and TGF-βl in the articular processes of scoliosis patients. // National Medical Journal of China 2005 85(34) pp.2391-2403. Xu H., Qiu G.X., Wu Z.H., Wang Y., Zhang J., Liu Y., Yang X. Expression of transforming growth factor and basic fibroblast growth factor and core protein of proteoglycan in human vertebral cartilaginous endplate of adolescent idiopathic scoliosis. // Spine. 2005. Vol.30. Issue 17 P.1973-1978. Wang S., Qiu Y., Zhu Z., Ma Z., Xia C., Zhu F. Histomorphological study of the spinal growth plates from the convex side and the concave side in adolescent idiopathic scoliosis. // Journal of Orthopaedic Surgery and Research 2007, 2:19. Qiu G.-X., Li Q.-Y., Liu Y., Wu Z.-H., Zhang J.-G., Wang Y.-P., Weng X.-S., Wang T. Expression of transforming growth factor-β1 and basic fibroblast growth factor in articular process cartilages of adolescent idiopathic scoliosis // National Medical Journal of China 2006, 86 (21) pp.1478-1483]. В научно-медицинской литературе опубликовано достаточно большое число исследований ассоциаций различных классов генов с предрасположенностью к идиопатическому сколиозу в различных популяциях мира [Zhang HQ, Lu SJ, Tang MX, Chen LQ, Liu SH, Guo CF, Wang XY, Chen J, Xie L. Association of estrogen receptor beta gene polymorphisms with susceptibility to adolescent idiopathic scoliosis. Spine (Phila Pa 1976). 2009 Apr 15; 34(8):760-4. Liu WJ, Qiu Y, Chen ZJ, Liu Z, Shu H, Wang XH, Sun C. Association between insulin-like growth factor-1 receptor gene polymorphisms and with susceptibility to adolescent idiopathic scoliosis. Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 2009 Dec 1; 47(23):1813-6. Yang Y, Wu Z, Zhao T, Wang H, Zhao D, Zhang J, Wang Y, Ding Y, Qiu G. Adolescent idiopathic scoliosis and the single-nucleotide polymorphism of the growth hormone receptor and IGF-1 genes. Orthopedics. 2009 Jun; 32(6):4H. dot: 10.3928/01477447-20090511-08. Mórocz M, Czibula A, Grózer ZB, Szécsényi A, Almos PZ, Raskó I, Illós T. Association study of BMP4, IL6, Leptin, MMP3, and MTNR1B gene promoter polymorphisms and adolescent idiopathic scoliosis. Spine (Phila Pa 1976). 2011 Jan 15; 36(2):E123-30]. Во всех обнаруженных нами работах полиморфизмы исследованных генов не рассматривались с целью прогнозирования риска развития сколиоза. В русских популяциях генетических исследований связи генов с риском развития ИС до настоящего времени не проводилось.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе нами не было обнаружено способа прогнозирования развития идиопатического сколиоза на основе данных о функционально значимом и распространенном однонуклеотидном полиморфизме - транзиции С-509Т в промоторе гена трансформирующего фактора роста β1 (TGF/β1).
В биомедицинской литературе нами было обнаружено лишь одно исследование (прототип), в рамках которого трансформирующий фактор роста β1 рассматривался в качестве маркера предрасположенности к ИС [Qiu GX, Li QY, Liu Y, Wu ZH, Zhang JG, Wang YP, Weng XS, Shen JX, Qian WW, Wang T. Expression of transforming growth factor-beta1 and basic fibroblast growth factor in articular process cartilages of adolescent idiopathic scoliosis. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2006 Jun 6; 86(21):1478-83]. В данном исследовании авторами было обнаружено увеличение экспрессии трансформирующего фактора роста β1 в области суставного хряща у пациентов с ИС. В данной работе не рассматривался вопрос об использовании данного биохимического маркера с целью прогнозирования риска ИС. Недостатком данной работы было отсутствие данных генотипирования полиморфизмов гена TGF β1, которые могли бы дать более объективную информацию и использоваться для прогнозирования риска развития ИС у детей.
Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования риска развития идиопатического сколиоза удетей на основании выявления генотипов функционально важного полиморфизма С-509Т гена трансформирующего фактора роста β1.
Технический результат использования изобретения - получение критерия прогнозирования риска развития идиопатического сколиоза, что позволяет своевременно определить стратегию и тактику врачей по предупреждению развития и прогрессирования деформации позвоночника у детей.
Способ осуществляют следующим образом.
2
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных гипертонической болезнью стандартным методом фенол-хлороформной экстракции и прецитпитации этанолом [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с анг. М.: Мир, - 1984. - 480 с.]. Выделенную геномную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров [Tamizifar В, Lankarani K.B., Naeimi S., Rismankar Zadeh М., Taghavi A., Ghaderi A. Promoter polymorphism of transforming growth factor-β1 gene and ulcerative colitis // World J Gastroenterol. - 2008. - Vol.14, issue 2. - P.243-247]. При приготовлении растворов для проведения ПЦР используют импортные реагенты высокой степени очистки (Ultra pure и Biotechnology Grade). ПНР проводится в 12 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включает: 67 мМ Трис-НСl рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мкМ ЭДТА, 1 mM MgCl, 1 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ каждого dNTPs (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), 15 нМ каждого из праймеров и 1U (1 единица активности) термостабильной Taq-ДНК-полимеразы. Для предотвращения испарения амплификационной смеси и образования конденсата на реакционную смесь наслаивают по 30 мкл минерального масла.
Обнаружение полиморфизма С-509Т гена TGFβ1 проводится путем обработки ампликона размером 153 пар нуклеотидов (п.н.) 5U эндонуклеазы Bse21I (прототип Есо811) согласно протоколу, описанному производителем фермента (OOO "Сибэнзим", г.Новосибирск). Рестрикционную смесь термостатируют 16 часов при температуре 37°С. После инкубации фрагменты ДНК фракционируют с помощью электрофореза в 3% агарозном геле, приготовленном на основе ТАЕ буфера (0,089М Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,089М борная кислота) с 0,01% бромистым этидием. Разделенные фрагменты ДНК визуализируют на трансиллюминаторе с помощью прибора компьютерной видеосъемки GDS-8000 ("UVP", США). Документирование и обработка изображений электрофоретических гелей проводится с помощью аналитического пакета Labworks.
Интерпретация результатов электрофоретического разделения фрагментов ДНК осуществляется следующим образом: фрагмент длиной 153 п.н. соответствует аллелю -509Т гена TGFβ1 (генотип -509ТТ); фрагменты длиной 111 и 42 п.н. - аллелю -509С (генотип -509СС); фрагменты длиной 153111 и 42 п.н. наблюдаются у гетерозигот -509СТ.
2
2
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляют с использованием программы STATISTICA 8.0. Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга используется критерий χ. Сравнение частот аллелей и генотипов полиморфизма С-509Т гена TGFβl проводится путем анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ с поправкой Йетса на непрерывность. Об ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к идиопатическому сколиозу судят по величине отношения шансов (OR, odds ratio) [Pearce N. What does the odds ratio estimate in a case-control study? // Int. J.Epidemiol. - 1993. - Vol.22, №6. - P.1189-1192] - показателю, отражающему, во сколько раз вероятность оказаться в группе "случай" (больные ИС) отличается от вероятности оказаться в группе "контроль" (здоровые) для носителя изучаемого генотипа.
Возможность использования предложенного способа прогнозирования идиопатического сколиоза подтверждает анализ результатов наблюдений 300 больных с ИС и 300 здоровых детей. Всем пациентам проведено клинико-рентгенологическое обследование. Исключались случаи врожденных деформаций позвоночника, первичной неврологической патологии, синдромальной патологии (синдром Марфана, синдром Элерса-Данло), нейрофиброматоз, эндокринные заболевания, системные заболевания соединительной ткани. Все дети были русской национальности и не имели родства между собой.
Статистический анализ показал, что носительство гомозиготного мутантного генотипа -509ТТ TGFβ1 сопряжено более чем с двукратным увеличением риска развития идиопатического сколиоза у детей. Как видно из таблицы, аллель -509Т (OR=1.73 95% CI 1.32-2.27, р=0.0001) и генотип -509ТТ (OR=4.60 95% CI 2.14-9.90, р=0.00004) статистически значимо ассоциировались с повышенным риском развития идиопатического сколиоза. Как известно, мутантный аллель -509Т обусловливает увеличение содержания трансформирующего фактора роста β1 в плазме крови и экспрессии его в тканях [Grainger DJ, Heathcote К, Chiano M et al. Genetic control of the circulating concentration of transforming growth factor type betal.
Hum. Mol. Genet. 1999; 8:93-97. Silverman ES, Palmer LJ, Subramaniam V et al. Transforming growth factor-β1 promoter polymorphism С-509Т is associated with asthma. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004; 169:214-19]. Наличие гомозиготного мутантного генотипа -509TT TGFβ1 вызывает повышение экспрессии самого фактора роста, что может способствовать асимметричному росту позвонков в период интенсивного роста организма и, в свою очередь, быть причиной развития первичной деформации позвоночника.
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма С-509Т гена TGFβ1 в группах больных ИС и здоровых
Частоты аллелей
Частоты генотипов, n (%)
Исследуемые группы
-509С
-509Т
-509CC
-509CT
-509TT
163
102
35
Больные ИС (n=300)
0,713
0,287
(54,3)
(34,0)
(11,7)
195
97
8
Здоровые (n=300)
0,812
0,188
(65,0)
(32,3)
(2,7)
Критерий различий,
15,48
7,09
0,19
16,93
χ<sup>2</sup>(р)
(0,0001)
(0,01)
(0,66)
(0,00004)
Таким образом, выявление генотипа -509TT гена TGFβ1 гена можно рассматривать в качестве прогностически информативного генетического маркера предрасположенности к развитию идиопатического сколиоза у детей. Генетическое тестирование пациентов в отношении полиморфизма -509ТТ гена TGFR1 на этапе постановки первичного диагноза идиопатического сколиоза позволяет идентифицировать пациентов, имеющих потенциально высокий риск развития деформации позвоночника, и разработать для таких больных индивидуальные лечебно-профилактические мероприятия, направленные на предупреждение возможности развития данного заболевания.