Идентификация белковых компонентов кератинового ферментативного гидролизата

высокой способностью хранения, гарантирующей их активное биологическое начало.

ЛИТЕРАТУРА

1. Клычкова Г.Ю. Разработка технологии комплексного препарата из хрящевой ткани кальмара, лосося и осетра // Материа -лы Всерос. Интернет-конф. молодых ученых. - Владивосток: ТИН -РО-Центр, 2004. - С. 164-170.

2. Мецлер Д. Биохимия. Т. 2. - М., 1980. - 605 с.

3. Суховерхова Г.Ю. Биохимическая характеристика хрящевой ткани гидробионтов и технология БАД к пище: Дис. ... канд. техн. наук. - Владивосток, 2006. - 157 с.

4. Сытова М.В. Научное обоснование комплексной переработки амурских осетровых рыб: Автореф. дис. ... канд. техн. наук

- М.: ВНИРО, 2005. - 24 с.

Кафедра пищевой биотехнологии

Поступила 07.02.07 г.

637.631

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ КЕРА ТИНОВОГО ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА

Ч.Ю. ШАМХАНОВ, Л.В. АНТИПОВА

Грозненский государственный нефтяной институт Воронежская государственная технологическая академия

Одним из наиболее эффективных способов обработки вторичных ресурсов мясной и птицеперерабатывающей промышленности является применение методов современной биотехнологии для получения пищевых гидролизатов [1-3]. Функционально-технологические свойства полученных продуктов зависят от биохимического состава и молекулярной массы его белковых компонентов.

При использовании физико-химических методов для определения молекулярной массы белков результат зависит не только от массы, но и от электрического заряда и формы молекулы белка, особенно при изменении скорости диффузии белка, скорости седиментации в гравитационном поле [4]. В связи с этим при определении молекулярных масс белков предпочтительнее использовать статистические методы, когда белковый раствор находится в состоянии равновесия, например, при пропускании его через колонку, заполненную гелем [5].

Цель работы - определение молекулярной массы М белковых компонентов кератинового ферментативного гидролизата и его биохимического состава.

Для определения молекулярной массы белковых компонентов кератинового гидролизата применяли метод гель-фильтрации [4, 6]. Использовали сефадекс в-100 (средний, диаметр частиц 40-120 мкм) с пределами фракционирования 4000-150000 Да.

Колонку размерами 46,0 х 1,9 см заполняли сефа-дексом, обработанным 0,02 М универсальным буфером с рН 7,0. Наносили на нее 1,5 см3 раствора -7 мг/см3 - кератинового гидролизата и элюировали тем же универсальным буфером со скоростью 12 см3/ч. Собирали фракции по 3 см3 и затем определяли в них содержание белка спектрофотометрически на СФ-46 при 280 нм. Для определения молекулярной массы фракций кератинового гидролизата колонку с сефадексом предварительно проградуировали в тех же условиях при помощи нескольких чистых (маркерных) белков с известной М. Калибровочную кривую строили, используя линейную зависимость между ^ М и объемом

элюата Уе, вышедшего с колонки. В табл. 1 представлены некоторые физико-химические характеристики маркерных белков.

Таблица 1

Маркерный белок М, Да 1§ м V, см3

Лизоцим 13930 4,143 54

Трипсин 25700 4,409 48

Пероксидаза 34000 4,531 45

Бычий альбумин 68000 4,832 36

Голубой декстран 2000000 6,301 21

Водорастворимая фракция

керопептида <10000 2,845 72

Водорастворимая фракция кератинового гидролизата выходит с колонки в значительно меньшем объеме, чем маркерный белок лизоцим с наименьшей молекулярной массой. Следовательно, в кератиновом гидролизате (керопептиде) отсутствуют белковые фракции с М > 13930 Да. Ориентировочная масса продуктов гидролиза находится ниже уровня 10000 Да, определяемого методом гель-фильтрации на сефадексе в-100 маркерными белками. Линейная зависимость между ^ М белков и объемом элюата Уе, вышедшего с колонки, представлена на рис. 1 (1 - голубой декстран; 2 - бычий альбумин; 3 - пероксидаза; 4 - трипсин; 5 -лизоцим; 6 - водорастворимая фракция керопептида).

В связи с отсутствием маркерных белков в исследуемом диапазоне 10000-5000 Да поиск фракции водорастворимого белка осуществляли при помощи порис-

Таблица 2

М, Да Растворимый белок и пептиды, мг/см3 Суммарные пептиды и аминокислоты, мкг/см3 Тирозин, мкмоль/см3 Редуцирующие вещества, мкг/см3

0-10000 5,64 7337 7,835 2815

0-5000 4,21 5278 5,960 2272

% от исходной 74,6 71,9 76,1 80,7

тых мембран марок УПМ-100 и УАМ-50 на лабораторной ультрафильтрационной установке (ЗАО НПО «Техкон»). Схема включала саму установку с 5%-м раствором керопептида, помещенную для его постоянного перемешивания на магнитную мешалку. Для эффективного разделения белкового раствора в верхнюю часть установки под давлением подавали сжатый воздух Продукты гидролиза проходили через пористые мембраны, поочередно сменяемые в зависимости от желаемой молекулярной массы ультрафильтрата, в нижнюю часть установки и собирались в приемную емкость. В полученных ультрафильтратах определяли ряд биохимических показателей, позволяющих оценить распределение продуктов гидролиза по молекулярной массе (табл. 2).

В керопептиде присутствуют низкомолекулярные белки с М 5000-10000 Да. Их массовая доля оценивается как разница в показаниях для фракций 0-10000 и 0-5000 Да и составляет 1,43 мг/см3. Эта фракция дала также положительную реакцию на нингидриновую реакцию (2059 мкг/см3), тирозин (1,875 мкмоль/см3) и редуцирующие вещества (543 мкг/см3). Однако основная доля продуктов гидролиза сосредоточена в более низкомолекулярной фракции с М < 5000 Да, соответствующей по существующей классификации фракции пептидов. Массовая доля всех исследуемых показателей составляет более 7 0% от аналогичных значений во фракции 0-10000 Да.

Дальнейшее определение молекулярной массы водорастворимых белковых фракций керопептида проводили на сефадексе в-25 (средний, диаметр частиц 50-150 мкм), позволяющем устанавливать ее в пределах фракционирования 1000-5000 Да. Условия проведения гель-фильтрации оставались неизменными. По

результатам определения белка во фракциях строили профиль элюции. Во всех фракциях помимо белка определяли содержание низкомолекулярных веществ нингидриновым методом, тирозина и редуцирующих веществ (РВ), а также устанавливали количественное распределение белковых фракций. На рис. 2 представлена гель-хроматограмма ферментативного кератино-вого гидролизата через сефадекс в-25 (кривая 1 - белок; 2 - нингидриновая проба; 3 - тирозин; 4 - РВ).

В этом случае белок обнаруживается в виде двух небольших пиков практически в первых же фракциях. Массовая доля белка во фракциях № 1-8 с 3-24 см3

имеет достаточно высокие значения и составляет 0,12-0,18 мг/см3 (кривая 1).

Основная масса продукта выходила с колонки в виде максимального пика белка объемом 27 см3 элюата (фракция № 9, по 3 см3 элюата). Массовая доля белка в этой фракции зарегистрирована на уровне 0,66 мг/см3, что в 3-4 раза выше, чем в остальных исследуемых фракциях.

Дальнейшая элюция керопептида в диапазоне объемов 36-96 см3 выявила три пика с понижением в них массовой доли белка не более 0,08 мг/см3. Полностью раствор керопептида элюируется в конечном объеме 96 см3.

Во фракции № 9 обнаружено все количество имеющихся в наличии РВ массовой долей 66 мкг/см3 (кривая 4). Нингидриновую реакцию применяли при гель-хроматографии для идентификации распределения продуктов гидролиза по молекулярной массе. Установлено, что при взаимодействии избыточного количества нингидрина и белковых продуктов со свободной МН2-группой и в зависимости от количества этих групп можно определить местонахождение белковых

РВ, мкг/см3 175 со Г 5 о л с; ,7 0,

120 150 2 ,6 0,

100 125 X - 3 со о о. 0,5

80 § 100 2 _ н 0,4

60 1 изин, 7 сл 0,3

40 1 л 5 о - (П 2 о I— 0,2

20 25 _ 2 ай О 0,1

0 0 1_ ш 0

^2

,1

1

4

_,3

/ N N s кл1

V

6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 V,, см

Рис. 2

производных при элюции через сефадекс. Так, низкая массовая доля нингидрина (4-6 мкг/см3) весьма точно отражает количество свободных аминогрупп и определяет нахождение высокомолекулярных пептидов с М 3000-5000 Да во фракциях J№ 1-8 (кривая 2). Известно, что в диапазон измерения молекулярной массы продуктов гидролиза < 5000 Да входят только пептиды и аминокислоты. При больших концентрациях белка (фракция № 9) соответственно увеличивается окрашивание его свободных аминогрупп нингидрином -64 мкг/см3. Этот диапазон элюции характеризует наличие во фракциях № 8-12 среднемолекулярных пептидов с М 300-3000 Да. Определяемый с помощью маркерных белков по калибровочной кривой lg M керопептида 2,845 также указывает на его ориентировочную массу > 700 Да. Дальнейший анализ профиля элю-ции по нингидриновой пробе (фракции № 12-36) выявил пик, не соответствующий его концентрации по белку, как наблюдалось для пептидов в предыдущих фракциях. Массовая доля низкомолекулярных веществ во фракции № 23 составила 157 мкг/см3, что более чем в 2 раза превышает аналогичный показатель для пептидов во фракции № 9. Обратная пропорциональная зависимость показателей белка и нингидрино-вой пробы во фракциях № 9 и 23 указывает по качественному анализу на присутствие в последней фракции продуктов гидролиза в виде свободных аминокислот. Принадлежность к ней и аминокислоты тирозина (0,06 мкмоль/см3) является еще одним доказательством высказанного положения.

Таким образом, гель-фильтрация кератинового гидролизата через сефадексы G-100 и G-25 свидетельствует о наличии в нем низкомолекулярного раствори-

мого белка (< 10000 Да), составляющего 25% от его общего количества в гидролизате. Преобладающая часть белковых продуктов - 75% - представлена среднемолекулярными пептидами (300-3000 Да) с ориентировочной М > 700 Да. В данном случае белковые цепочки содержат 5-20 аминокислотных остатков. Важно подчеркнуть, что фракция № 9 одновременно дает реакции на биуретовую связь, нингидрин, тирозин и РВ. Подобная характеристика предполагает наличие в белке кератине углеводов и их непосредственной связи с белком в составе единого комплекса.

ЛИТЕРАТУРА

1. Антипова Л.В., Пащенко Л.П., Шамханов Ч.Ю., Ку -рилова Е.С. Получение и характеристика пищевого кератинового гидролизата // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2003. - № 7.

- С. 63-66.

2. Антипова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осминин О.С., По -жалова Н.А. Биохимические характеристики процесса ферментативного гидролиза кератинсодержащего сырья птицеперерабаты -вающей отрасли // Изв. вузов. Пищевая технология. - 2003. - № 5-6.

- С. 69-71.

3. Антипова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осминин О.С. Со -

вершенствование технологии производства керопептида из перо-пу -хового сырья // Мясная индустрия. - 2004. - № 3. - С. 44-47.

4. Рогов И.А., Антипова Л.В., Дунченко Н.И., Жереб -цов Н.А. Химия пищи. В 2 кн. Кн. 1. Белки: структура, функции, роль в питании. - М.: Колос, 2000. - 384 с.

5. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985. - 536 с.

6. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимоло-гии. - 2-е изд., перераб. и доп. - М. : Высш. шк., 1980. - 272 с.

Кафедра технологии продуктов питания Кафедра технологии мяса и мясных продуктов

Поступила 0S.02.0? г.

664.951.3

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕХАНИЗМА КОНСЕРВИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ КОМПОНЕНТОВ КОПТИЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ

С.В. ЗОЛОТОКОПОВА, И.А. ПАЛАГИНА

Астраханский государственный технический университет Астраханский филиал Саратовского государственного социально-экономического университета

Важным направлением исследований последних лет является изучение влияния различных пищевых добавок не только на вкус и аромат, но и на увеличение сроков хранения продуктов питания. С древних времен для консервирования используют пряные растения, поваренную соль, копчение и др. Анализ показывает, что в настоящее время рынок завоевывают коптильные экстракты. Продукты питания с ароматом копчения пользуются у населения особой популярностью, а традиционное копчение уступает свои позиции бездымному.

Экологически выгодными и перспективными являются экстракты, получаемые при щадящих условиях.

Над усовершенствованием технологии экстракции не одно десятилетие работает Г.И. Касьянов - заслуженный деятель науки и техники РФ, заслуженный изобретатель РФ, доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой технологии мясных и рыбных продуктов Кубанского государственного технологического университета. Действующая при КубГТУ и Краснодарском научно-исследовательском институте хранения и переработки сельскохозяйственной продукции под его руководством научно-педагогическая школа «Теория и практика обработки сырья растительного и животного происхождения сжиженными и сжатыми газами» занимается проблемами повышения эффективности переработки различного сырья, позволяющими улучшить качество выпускаемой продукции, сократить продолжительность процессов обработки и одновременно снизить энергетические затраты.