КОМПОЗИЦИИ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КОЖНЫХ ПРИЗНАКОВ СТАРЕНИЯ
COMPOSITIONS SUITABLE TO TREAT DERMAL SIGNS OF AGING

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композициям, включающим витамин Е, витамин С и экстракт белого чая, для лечения профилактически и/или радикально кожных признаков старения. В предпочтительном осуществлении изобретение относится к использованию витамина Е, витамина С и экстракта белого чая или включающих их композиций для снижения кожных признаков старения путем улучшения высвобождения задержанных в G-1 клеток, благодаря чему клетки быстрее восстанавливаются.
stratum corneum
Кожа человека является композитным материалом из эпидермиса и дермы. Самой верхней частью эпидермиса является  (роговой слой). Этот слой является самым жестким слоем кожи, а также наиболее подверженным влиянию окружающей среды. Ниже рогового слоя находится внутренняя часть эпидермиса. Ниже эпидермиса самым верхним слоем дермы является папиллярная дерма, которая состоит из относительно рыхлых соединительных тканей. Ретикулярная дерма, расположенная ниже папиллярной дермы, представляет собой плотную соединительную ткань, которая имеет пространственную организацию. Ретикулярная дерма также связана с крупными морщинами. Внизу дермы лежит подкожный слой.
Основные функции кожи включают защиту, экскрецию, секрецию, абсорбцию, терморегулирование, пигментогенез, аккумуляцию, сенсорное восприятие и регуляцию иммунологических процессов. На эти функции отрицательно влияют структурные изменения кожи, вызванные старением и избыточным воздействием солнца. Физиологические изменения, связанные со старением кожи, включают, например, ослабление барьерной функции и пониженный круговорот клеток эпидермиса [Cerimele, D., et al., Br. J. Dermatol., 122 Suppl. 35, p. 13-20 (April 1990)].
Механические свойства кожи, такие как эластичность, регулируются плотностью и геометрией ткани из сетки коллагеновых и эластиновых волокон в ней. Поврежденные коллаген и эластин теряют свои сократительные свойства, приводя в результате к сморщиванию кожи и к шероховатости поверхности кожи. Когда кожа стареет или становится нездоровой, она приобретает провисания, растяжки, вздутия, кровоподтеки, морщины, она грубеет и имеет пониженную способность к синтезу витамина D. Состарившаяся кожа становится также тоньше и имеет уплощенную дермоэпидермальную границу раздела из-за альтерации коллагена, эластина и гликозаминогликанов [Fenske, N.A. and Lober, C.W., J. Am. Acad. Dermatol., 15:571-585 (October 1986); Motnagna, W. and Carisle, K., Journal of Investigative Dermatol., 73(1): 47-53 (1979)].
Ряд витаминов и минералов вводили пациентам для лечения некоторых кожных и иных проблем, которые возникают, когда пациент имеет недостаток такого витамина или минерала. Витамин А, например, помогает при лечении акне и ускоряет заживление ран; витамин С (аскорбиновая кислота) помогает при предотвращении появления синяков на коже и при заживлении ран, витамин Е является антиоксидантом, и медь помогает при лечении дефектов эластичной ткани [Neidner, K.H., Amer. Acad. Derm. Ann. Mtg., Wash. D.C., Dec. 6, 1993]. Считают также, что топическое применение витамина С предотвращает вред от солнечного света, уменьшает разрушение соединительных тканей и, возможно, промотирует синтез коллагена [Dial, W., Medical World News, p. 12, March 1991]. Витамин Е используют топически как противовоспалительный агент для улучшения увлажнения кожи, для защиты клеток от УФ-лучей и для замедления преждевременного старения кожи.
Препараты на основе катехина, включающие проантанолы и проантоцианидины, являются мощными природными антиоксидантами. Эти соединения были обнаружены в цветках, листьях растений и, например, в семенах винограда [Lubell, A., Cosmetic Dermatol. 9 (7): 58 & 60 (July 1996)]. Потенциальная важность питания для процесса старения была предметом интереса в течение многих десятилетий и охватывала не только влияние диеты на старение и гибель клеток, но и роль, которую играют питательные вещества в отсрочке ухудшения иммунокомпетентности, целостности скелета, гормонального баланса и других жизненных функций организма, часто связанного старением организма. Несколько питательных веществ, включая витамины и незаменимые минералы, оказывают благотворное влияние, уменьшая этим расстройства.
Старение ассоциировано с изменениями физических характеристик и угасанием у людей многих физиологических функций. Хотя явление старения хорошо известно, основная природа старения не очень хорошо понятна. Из нескольких теорий старения в последние десятилетия все возрастающее внимание привлекает свободнорадикальная теория старения, впервые предложенная Харманом в 1956 (J. Gerontol. 1956, 11, 198-300). Теория постулирует, что свободнорадикальная реакция является единственным общим процессом, который может быть ответственен за старение и тесно вовлечен во многие связанные с возрастом расстройства. Современная концепция этой теории поддерживается накопленными за последние годы данными, трактующими зависящий от времени сдвиг баланса антиоксидант/прооксидант в пользу окислительного стресса, который может привести к дисрегуляции клеточной функции и старению.
Сложный механизм внутренней антиоксидантной защиты, присутствующий у многих аэробных организмов, улавливает свободные радикалы и уменьшает окислительный стресс. Свободные радикалы и окислительный стресс приводят к цитотоксичности и вносят свой вклад в процесс старения. Сильная положительная корреляция между продолжительностью жизни и потенциальной антиоксидантной способностью была установлена в нескольких механизмах окислительной защиты (Cutler, R.G., 1991, Am. J. Clin. Nutr., 53, 373S-379S). Кроме того, была выявлена положительная корреляция между концентрациями в тканях специфичных антиоксидантов и врожденной продолжительностью жизни у млекопитающих.
Антиоксидантная активность обеспечивается встречающимися в природе веществами, включающими витамин С, витамин Е, глутатион, бета-каротин и гистидин. Далее, внутриклеточные ферменты, такие как супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, тиоредоксинредуктаза и каталаза, также обеспечивают защиту от активированных кислородных радикалов. Различные клинические картины старения под воздействием облучения хорошо известны и широко описаны в литературе. Главные связанные с возрастом изменения кожи включают сухость, образование морщин, вялость и развитие различных доброкачественных новообразований. Конечным результатом и естественного старения и хронического воздействия ультрафиолетового света и других внешних потенциальных опасностей является кожа, которая является морщинистой, желтой, вялой, сухой и жесткой. Кроме того, как следствие повторяющегося солнечного облучения развиваются предраковые состояния, а также раковые поражения.
Антиоксидантные витамины Е и С и β-каротин привлекли значительное внимание ввиду их потенциальной роли в предотвращении дегенеративных заболеваний, таких как рак и сердечно-сосудистые заболевания.
Известно, что витамин С действует как антиоксидант и ловушка свободных радикалов, который непосредственно реагирует с супероксидными и гидроксильными радикалами и синглетом кислорода, образованными при нормальном клеточном метаболизме. Кислород необходим для жизни. Кислород поступает также в нескольких радикальных формах, которые вовлечены в стадии, и инициирования, и постинициирования карциногенных процессов, а также в процессы инвазии и метастазирования.
Нет единого универсального приемлемого и доказанного объяснения противораковых свойств витамина С, кроме его антиоксидантных свойств. Вероятно, что вовлечено множество различных путей, которые включают (1) укрепление иммунной системы повышенным продуцированием лимфоцитов; (2) препятствования клеточному повреждению свободными радикалами; (3) ингибирование гиалуронидазы, поддерживающее основное вещество вокруг опухоли незатронутым и предотвращающее метастазирование; (4) уничтожение онкогенных вирусов за счет улучшения фагоцитарной активности; (5) коррекцию дефицита аскорбата, обычно наблюдаемую у онкологических пациентов; (6) стимулирование образования коллагена и его стабилизацию, необходимую для "огораживания барьером" опухоли; и (7) нейтрализацию карциногенных токсинов.
Роль витамина Е как ключевого питательного вещества, требующегося для сильной иммунной реакции, и важного жирорастворимого антиоксиданта в профилактике рака была хорошо подтверждена. При раке в стадии ремиссии использование витамина Е в качестве профилактического пищевого агента для предотвращения добавочного окислительного стресса является краеугольным камнем любой диеты при ремиссии рака.
Vitis vinifera
В патент США 5648377 описаны составы и комбинации липофильных и гидрофильных антиоксидантов и их использование в терапевтической, пищевой, диетической и косметической областях. Эти рецептуры основываются на использовании каротиноидов, прокаротиноидов и их производных с полифенолами катехиновой структуры. Эти рецептуры могут быть использованы для предотвращения физиопатологических состояний, связанных, по меньшей мере частично, с перепроизводством свободных радикалов, в особенности со старением, атеросклерозом и раком. Соответственно, было неожиданно обнаружено, что комбинация гидрофильного антиоксиданта с липофильным вызывает намного более сильное антиоксидантное действие, чем действие суммы отдельных соединений, испытанных при равных концентрациях. Конкретно названными антиоксидантами или их источниками являются олигомер процианидола, экстрагированный из , ликопин, витамин Е и процианидин А2.
В патенте США 5156852 описана композиция для улавливания свободных радикалов и других окислителей, ассоциируемых с заболеваниями глаз, включающую витамины Е и С, ацетат цинка, медь, селен, марганец и по меньшей мере одно из L-цистеина, пиридоксина и рибофлавина. Витамины С и Е служат антиоксидантами, тогда как ацетат цинка, медь, селен и марганец служат кофакторами для металлоферментов, улавливающих окислители. Остальные три соединения склонны увеличивать концентрацию глутатиона.
Антиоксиданты являются важными элементами защиты организма от окислительного стресса и известны как обладающие общими свойствами, препятствующими старению, а также специфическую функцию защиты от заболеваний. В этом отношении важными антиоксидантами являются, например, витамин Е, витамин С и каротины, которые в сочетании обеспечивают синергическую защиту клетки (Boehm, F., Edge, R., McGarvey, D.J., FEBS Lett. 436, 387-389, 1998). Кроме того, другие антиоксиданты без витаминных функций, происходящие из пищи, такие как флавоноиды, полифенолы или ликопин, имеют очень важные антиоксидантные функции.
Общеизвестно, что некоторые витамины и минералы, антиоксиданты и растительные экстракты оказывают благотворное влияние на здоровье. Например, некоторые благоприятные аспекты антиоксидантов известны на протяжении многих лет. Антиоксиданты являются химическими соединениями, которые реагируют со свободными радикалами, такими как гидроксильный радикал, защищая некоторые биологические системы. Было высказано предположение, что удаление свободных радикалов из организма увеличивает продолжительность жизни человека; в частности, предполагалось, что присутствие антиоксидантов, включающих каротиноиды, витамин Е и мочевую кислоту, имеет положительную корреляцию с сопротивлением спонтанному автоокислению тканей и окислительному повреждению ДНК у млекопитающих (Cutler, R., Am. J. Clin. Nutr. 53: 373S-9S (1991)). Известно также, что антиоксиданты ограничивают разрушение исцеляемых тканей мозга свободными радикалами, как показано методом реанимации тканей мозга с использованием витаминов, таких как А, Е и С и селена (US 5149321).
Хорошо известно, что в дополнение к своей антиоксидантной активности витамины В, С, Е обладают другим полезным для здоровья действием. Например, известно, что витамин Е поддерживает надлежащие уровни сахара в крови. В качестве другого примера известно, что витамин С играет интегрирующую роль в целостности соединительных и структурных тканей в организме. Витамин А известен как играющий роль в хорошем зрении, а также в росте и развитии. Следовательно, адекватное снабжение этими витаминами необходимо для поддержания оптимального здоровья. Использование витаминов А, Е, С и селена было предложено как способ торможения или предотвращения сшивки коллагена в коже человека при использовании в комбинации с некоторыми активными пептидами (WO 90/06 102).
Vitis vinifera
Патент США 5648377 относится к сочетанию ликопина с экстрактом  (экстракт виноградных косточек), проявляющему синергическое антиоксидантное действие. Патент США 6627281 описывает неожиданное открытие того, что введение сочетания экстракта виноградных косточек, ликопина, витамина С, витамина Е и β-каротина значительно увеличило синергическим образом защиту клеток. Соответственно этому описанию защита клеток вышеупомянутыми веществами статистически больше, чем при сочетании экстракта виноградных косточек и ликопина или витамина Е и ликопина.
WO 01/78674 раскрывает композиции, используемые при лечении старения кожи, в форме, среди прочего, капсул и таблеток. Эти композиции включают активные начала ликопин, экстракт виноградных косточек, витамин С и витамин Е.
WO 99/48386 раскрывает пищевую добавку, которая включает пикногенол, ликопин, витамин С и витамин Е.
US 5895652 относится к программе пероральных добавок для максимизации врожденных биохимических путей организма для того, чтобы в результате ограничить вред, иначе вызываемый дефицитом во время нормального процесса старения. Индивидуальные компоненты этой добавки приведены в очень длинном списке, занимающем несколько страниц, и включают ликопин, витамин С, витамин Е и экстракт виноградных косточек.
WO 98/33494 описывает питательные и терапевтические композиции, используемые против сосудистых и капиллярных расстройств, которые также объединяют различные антиоксиданты или компоненты, имеющие антиоксидантный эффект, включающие ликопин, экстракт виноградных косточек, витамин С, витамин Е и полифенолы чая.
WO 01/51088 описывает композиции для снижения риска сердечно-сосудистых заболеваний, которые включают ликопин, витамин Е, витамин С и экстракт виноградных косточек.
WO 02/071874 композиции, предназначенные предотвращать или восстанавливать связанный со старением функциональный дефицит у млекопитающих, которые включают витамин С, витамин Е, ликопин, сухой экстракт ромашки, экстракт виноградных косточек и катехины чая.
Таким образом, предшествующие работы сообщают о комбинированном действии по меньшей мере витамина С, витамина Е, ликопина и экстракта виноградных косточек для снижения окислительного повреждения клеток и тем самым предупреждения различных симптомов, связанных со старением.
Главная роль антиоксидантов - защитить клетки от окисления реакционно-способными кислородсодержащими веществами (РКВ) или другими свободными радикалами. РКВ являются высокоактивными промежуточными соединениями, которые несут неспаренный электрон и легко взаимодействуют с другими молекулами в тканях человека, приводя в результате к окислительной реакции. РКВ образуются как обычный побочный продукт митохондриального дыхания и являются необходимыми для нормальной работы клетки. Однако РКВ могут также быть результатом окислительного стресса, вызванного экзогенными факторами и связанными с рядом болезненных процессов. Обычно антиоксиданты, обнаруживаемые в организме, улавливают эти не необходимые РКВ и превращают их в стабильные соединения путем переноса электрона. Это действие антиоксиданта предотвращает окислительное повреждение, которое РКВ наносят клеточным компонентам. Однако, когда окислительный стресс избыточен, антиоксиданты организма могут быть исчерпаны, приводя к повреждению клеток. Избыточный окислительный стресс может быть вызван некоторыми противоопухолевыми агентами (которые генерируют РКВ), а также самим раком. Из-за этого были проведены исследования для определения влияния антиоксидантов на раковые клетки и на действие противоопухолевых агентов.
В периоды окислительного стресса избыточные РКВ приводят к более высокому образованию липидной пероксидазы. Липидная пероксидаза впоследствии нарушает клеточный цикл, увеличивая продолжительность G1 фазы или заставляя клетки войти в G1 фазу.
У пролиферирующих клеток клеточный цикл состоит из четырех фаз. Фаза 1 (G1) представляет собой интервал между митозом и репликацией ДНК, который характеризуется ростом клетки. Переход, который возникает в точке рестрикции (R) в G1, коммитирует клетку в пролиферативный цикл. Репликация ДНК происходит во время фазы синтеза (S), за которой следует вторая фаза перерыва (G2), во время которой происходит рост и подготовка к делению клетки. Митоз и образование двух дочерних клеток происходят в фазе М.
Прохождение четырех фаз клеточного цикла регулируется семейством циклинов, которые действуют как регуляторные субъединицы для циклинзависимых киназ (цзк). Активность различных комплексов циклин/цзк, которые регулируют продвижение через фазы G1-S-G2 клеточного цикла, регулируется синтезом соответствующих циклинов во время специфической фазы клеточного цикла. Комплекс циклин/цзк затем активируется последовательным фосфорилированием и дефосфорилированием ключевых остатков комплекса, расположенных главным образом на субъединицах цзк.
.
Комплексом циклин/цзк раннего G1 является или цзк2, цзк4, или цзк6, связанная с изоформой циклина D. Имеется несколько протеинов, которые могут ингибировать клеточный цикл в G1. Если произошло повреждение ДНК, р53 накапливается в клетке и вызывает р21-опосредованное ингибирование циклина D/цзк Mdm2, ускоряя ядерный экспорт/инактивацию р53, становится частью ингибиторной петли обратной связи, которая инактивирует р21-опосредованную остановку G1. Подобным образом, активация рецепторов TGF-b вызывает ингибирование циклина D/цзк посредством р15, тогда как циклический AMФ ингибирует комплекс циклин D/цзк через р27. Если комплекс циклин D/цзк является ингибированным, протеин ретинобластомы (Rb) находится в состоянии низкого фосфорилирования и прочно связан с фактором транскрипции E2F, ингибируя его активность.
14
15
Прохождение через точку рестрикции и переход к фазе S запускается активацией комплекса циклин D/цзк, который фосфорилирует Rb. Фосфорилированная Rb диссоциирует от E2F, который затем свободен для инициирования репликации ДНК. Циклин E/цзк2 накапливается во время поздней G-фазы и запускает переход в S-фазу. Весь геном реплицируется во время S-фазы. Во время S-фазы начинается также синтез и накопление циклина B/cdc2, но комплекс фосфорилирован по Thr - Tyr и является неактивным. Циклин A/цзк2 накапливается во время фазы S, и его активация запускает переход к G2, фазе, характеризуемой накоплением циклина B/cdc2, ингибированием репликации ДНК, ростом клетки и синтезом нового протеина.
Суммируя, каждая клетка снабжена очень сложным механизмом для заживления повреждений ДНК перед новым синтезом ДНК (в S-фазе) и делением клетки во время митоза (M-фаза). Как реакция на повреждение ДНК, увеличиваются некоторые регуляторы клеточного цикла, такие как p16 и p53, что приводит в результате к ингибированию прохождения клеточного цикла через ингибирование специфических циклинзависимых киназ (цзк4 и цзк2). Это дает возможность клетке восстановить повреждение ДНК до того, как начнется новый синтез ДНК в так называемом пропускном пункте G1/S, предотвращая переход клетки из G1 в фазу S (фигура 1). p53 возрастает в коже после вызванного УФ-повреждения, как было показано биопсией кожи, и возврат к базовому уровню является мерой восстановительного статуса кожи. p16 возрастает на стадии старения кожи.
В ранней работе (Emri et al., J. Invest Dermatol. 115: 435-440, 2000) зависимое от дозы увеличение фибробластов было обнаружено в G2/M спустя 4 суток после УФ-облучения.
Высвобождение задержанных в G1 клеток в фазу S зависит от степени повреждения ДНК. Поскольку степень повреждения ДНК прямо связана с окислительным уровнем клеток, следует ожидать, что наиболее эффективное снижение окислительного уровня в свою очередь, должно вызвать наиболее быстрое высвобождение задержанных в G1 клеток в фазу S. Судя по предшествующим работам, это должно быть следствием совместного действия по меньшей мере витамина С, витамина Е, ликопина и экстракта виноградных косточек.
Abid-Essefi et al. (Toxicology, 192 (2-3):237-248, Nov. 5 2003) описывает, что витамин Е может действовать, поддерживая продолжительную задержку клеточного цикла, в течение которой имеет место восстановление ДНК.
Galli et al. (Archives of Biochemistry and Biophysics, 423 (1): 97-102, Mar. 1 2004) описывают, что витамин Е вызывает ингибиторный эффект на экспрессию циклина D параллельно с замедлением роста клетки.
Gysin et al. (Faseb. Journal, 16 (12), Oct. 2002) описывают, что витамин Е ингибирует развитие клеточного цикла снижением концентраций циклина D1 и циклина Е.
Panaro et al. (British Journal of Cancer (1999) 80, 1905-1911) показали, что клеточный цикл блокируется различными антиоксидантами, включающими витамин С и многочисленные флавоноиды.
Следовательно, предшествующие источники утверждают, что введение антиоксидантов приводит к удлинению блокировки клеточного цикла.
Было показано, что УФ (УФ-А и УФ-В) радиация вызывает различные типы повреждения в коже. УФ-В радиация (длины волн 280-315 нм) непрерывно индуцируют поражение (ДНК) в верхнем слое нашей кожи - эпидермисе. УФ-А радиация (315-400 нм) проникает глубже в более низкий слой кожи, дерму, но, к счастью, этот тип радиации намного менее вреден, чем высокоэнергетическая УФ-В радиация.
Повреждение ДНК, вероятно, является наиболее серьезным повреждением, которое может быть вызвано УФ-излучением, поскольку оно непосредственно затрагивает генетический потенциал клетки. Вызванное УФ-В повреждение ДНК ведет к индукции регуляторов клеточного цикла с последующей остановкой клеточного цикла, во время которой может иметь место восстановление ДНК. УФ-А облучение клеток может вызвать повреждение ДНК путем непрямых механизмов, включающих образование кислородных радикалов. До сих пор не вполне ясно, как вызванное УФ-А повреждение влияет на управление клеточным циклом и будет ли предотвращение окислительного повреждения положительно влиять на прохождение клеточного цикла.
Неожиданно заявитель обнаружил, что совместное действие витамина С и витамина Е, предпочтительно в сочетании с экстрактом белого чая, порождает быстрое высвобождение клеток от задержания в G1.
Это показывает, что окислительный уровень клеток и связанное с ним повреждение ДНК не может напрямую коррелировать со временем, требуемым для того, чтобы клетки регенерировались и вошли в S-фазу. Эффективный режим лечения кожных признаков старения будет, конечно, зависеть от способности клеток к продолжению роста после имевшего место окислительного повреждения.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один аспект изобретения направлен на вводимую перорально композицию, включающую витамин Е, витамин С и экстракт белого чая, для лечения или профилактически или радикально пациентов, страдающих от кожных признаков старения. Признаки старения особенно уменьшаются, когда композиция воздействует на фибробласты.
Согласно настоящему изобретению потенциальная польза от перорального введения пищевой добавки, содержащей витамины Е и С и экстракт белого чая вместе с различными растительными экстрактами, гликозаминами и минералами, достигается при реверсировании некоторых клинических характерных черт кожного старения (например, образования морщин). По определению, нутрицевтики представляют собой вещества, которые обладают оздоровительным действием, включая предотвращение и лечение заболеваний.
Роль нескольких минералов в клеточной защите от внутренних и от внешних факторов была описана ранее. Селен, кремний, медь, цинк и марганец являются минералами, которые могут быть включены в композиции согласно настоящему изобретению. Цинк действует как кофактор с супероксиддисмутазой (SOD), которая, в свою очередь, действует во взаимодействии с медной SOD, митохондриальной марганцевой SOD, глутатионпероксидазой и каталазой как незаменимые клеточные антиоксиданты. Марганец, переходный металл, укрепляет коллагеновые волокна и ингибирует эластазу - фермент, который разрушает и коллагеновую, и эластиновую ткань. Марганец играет также ключевую роль в синтезе коллагена и гликопротеинов и действует как кофактор для катализа превращения глюкозамина в гиалуроновую кислоту. Кроме того, было показано, что марганец защищает культивируемые фибробласты кожи человека от окислительного поражения УФ-А и перекисью водорода.
Композиция может дополнительно включать ингредиенты, о которых известно, что они тормозят процесс старения. В частности, растительные экстракты, такие как экстракт белого чая, экстракт виноградных косточек, экстракт томата с высоким содержанием ликопина, экстракт сои, масло бурачника, масло семян льна, сухой экстракт ромашки и особым образом фракционированное кокосовое масло, являются пригодными в связи с настоящим изобретением. Кроме того, в композицию могут быть включены такие ингредиенты, как содержащиеся в экстрактах из различных тканей, включая хрящ.
Композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены в любой подходящей форме. Предпочтительно композиции по изобретению готовят в формах для перорального введения. Для перорального введения композиции по изобретению могут быть представлены в любой подходящей форме, в частности в форме раствора для приема внутрь, таблетки, капсулы, диетического питания или пищевой добавки. Такие композиции дополнительно включают по меньшей мере один соответствующий наполнитель и/или соадъювант, подходящий для перорального введения.
ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Была создана композиция для уменьшения морщин и улучшения других состояний кожи, таких как увеличенная эластичность и мягкость кожи. Кроме того, предотвращение или лечение нездоровой кожи, такой как стареющая кожа или кожа, передержанная на солнечном свету, может быть успешно осуществлено введением композиций по настоящему изобретению человеку, нуждающемуся в таком лечении. Композиция включает сочетание ряда различных компонентов, которые взаимодействуют для обеспечения желаемых улучшений кожи.
Полезная фармацевтическая композиция по настоящему изобретению предотвращает и улучшает состояния кожи путем использования витамина Е и витамина С в количествах, достаточных для того, чтобы клетки кожи избежали задержки в G1. Дополнительные полезные ингредиенты композиций могут включать природные антиоксиданты, экстрагированные из, например, виноградных косточек и томата, экстракт, включающий гликозаминоглюканы, компонент переходного металла, в количестве, эффективном для того, чтобы укрепить коллагеновые и эластиновые волокна и увеличить толщину кожи, и соединение на основе катехина, присутствующее в количестве, достаточном для того, чтобы ингибировать присутствие в коже антиколлагенового фермента.
Более толстая кожа в соответствии с пожеланием уменьшает морщинистость и крупные морщины, которые появляются, когда участки кожи становятся тонкими. В дополнение к неожиданному эффекту деблокирования клеточного цикла антиоксиданты, такие как витамин С, ингибируют коллагеназу и эластазу, ферменты, которые разрушают коллагеновые и эластиновые ткани. Эти антиоксиданты помогают предотвращению появления дополнительных морщин и ускоряют оздоровление кожных тканей. Наконец, компоненты переходных металлов включены для того, чтобы укрепить коллагеновые волокна и ингибировать эластазу, фермент, который также разрушает коллагеновую и эластиновую ткань.
Композиция включает основной антиоксидант, которым обычно является источник витамина С и предпочтительно является аскорбиновая кислота или ее фармацевтически приемлемые соль или эфир и более предпочтительно аскорбилпальмитат, дипальмитат L-аскорбинат, L-аскорбинат-2-сульфат натрия, или соль аскорбиновой кислоты, такая как аскорбинат натрия, калия или кальция, или их смеси. Если используют пероральную готовую форму композиции, предпочтительно, чтобы была использована некислотная форма витамина С, чтобы уменьшить раздражение желудка, которое может возникнуть при использовании кислотной формы.
Подразумевается, что термин "экстракт, включающий гликозаминглюканы" включает хрящ, компоненты которого могут быть экстрагированы из него, и его производные, включающие синтетические формы соединений, экстрагируемых из хряща, и синтетически полученные соединения. Такие соединения могут быть найдены также в других тканях, содержащих соединительную ткань, например коже, и могут быть извлечены оттуда. Хрящ может быть выбран из группы, состоящей из хряща морских животных, хряща рыб, хряща моллюсков и хряща наземных млекопитающих. Морские животные могут быть выбраны из группы, состоящей из китов, дельфинов и котиков, и рыба может быть выбрана из группы, состоящей из акул, лосося, тунца, трески и других известных рыб, моллюском может быть кальмар, и наземные животные могут быть выбраны из группы, состоящей из коров, свиней, цыплят, уток и индеек.
Хрящ или экстракты из него предпочтительно выбирают из бычьего хряща, свиного хряща, хряща акулы, хряща кальмара, хряща цыплят и хряща лосося. Может быть использован сам хрящ. Он может быть использован обычно в виде высушенного, например, лиофилизированного измельченного хряща. Используемые экстракты вышеупомянутых типов хряща или других тканей, содержащих соответствующие компоненты, обычно могут быть получены частичным ферментативным протеолитическим гидролизом сваренных тканей с последующими фильтрацией и сушкой и/или лиофилизацией. Экстракт хряща обычно включает одно или несколько соединений, экстрагируемых из хряща, и предпочтительно включает гликозаминоглюканы, необязательно связанные с пептидом.
Экстракт хряща предпочтительно включает хондроитинсульфат, гиалуроновую кислоту или дерматансульфат или их смеси. Подразумевается, что термин "экстракт хряща" включает соединения, экстрагируемые из хряща, но соединения могут быть в действительности получены из других источников.
Термин "экстракт хряща" может относиться к соединениям, экстрагируемым из хряща, или к их производным. Как указано, экстракт хряща может происходить из других природных источников, но может быть получен из синтетического сырья, т.е. получен синтетически или полусинтетически.
Экстракт хряща предпочтительно включает гликозаминоглюканы, выбранные из группы, состоящей из сложного эфира хондроитина, сложного эфира кератана, гиалуроновой кислоты или ее эфира, сложного эфира дерматана, гепарина и сложного эфира гепарана. Они могут быть связаны с протеином или пептидом или как эпимерные или полимерные формы сложного эфира хондроитина, сложного эфира кератана, гиалуроновой кислоты или ее эфира, сложного эфира дерматана, гепарина и сложного эфира гепарана, предпочтительно хондроитинсульфата, кератансульфата, гиалуроновой кислоты или ее эфира, дерматансульфата, гепарина и гепарансульфата. Гликозаминглюканы могут быть выбраны из группы, состоящей из хондроитинсульфата и кератансульфата, каждый из которых может быть, необязательно, связан с пептидом. Наиболее предпочтительно композиция по настоящему изобретению включает 5% экстракта хряща, включающего хондроитинсульфат, необязательно связанный с пептидом.
В предпочтительном осуществлении композиция по настоящему изобретению включает менее 1 мас.% коллагена, предпочтительно менее 0,5%, особо предпочтительно менее 0,1% коллагенового протеина. Приготовленный обычным образом коллагеновый экстракт не включает коллаген в сколько-нибудь принимаемом внимание количестве. Экстракт предпочтительно получают ферментативным протеолитическим гидролизом, превращая таким образом коллагеновые протеины в пептиды. Коллаген или его источник предпочтительно не добавляют дополнительно в композицию по настоящему изобретению. В наиболее предпочтительном осуществлении композиция практически не содержит коллаген.
Композиции по настоящему изобретению могут также включать одну или несколько аминокислот для повышения плотности кожи. Предпочтительно две или более аминокислоты используют в комбинации. Приемлемыми являются или L-, или D- формы аминокислот. Лизин и пролин являются наиболее предпочтительными аминокислотами и преимущественно используются в сочетании. Цистеин, метионин или другие аминокислоты также могут быть использованы, если требуется. Аминокислоты могут быть включены в растворимой форме, такой как гидрохлорид, т.е. L-пролина гидрохлорид и L-лизина гидрохлорид. Аминокислоты присутствуют в количестве от примерно 2 до 25 мас.% каждая, предпочтительно от примерно 4 до 20 мас.% каждой и наиболее предпочтительно от примерно 6 до 15 мас.% каждой. Единичная доза для каждой аминокислоты составляет обычно от примерно 35 мг до 200 мг каждого, предпочтительно от примерно 50 мг до 150 мг каждой и более предпочтительно от примерно 70 мг до 120 мг, в фармацевтической композиции. Дополнительные используемые формы аминокислот включают следующие: источник цистеина, предпочтительно N-ацетилцистеин, может присутствовать в количестве от примерно 1 до 10 мас.%, предпочтительно от примерно 2 до 8 мас.% и более предпочтительно от примерно 3 до 6 мас.% от композиции. Источник метионина, предпочтительно L-селенометионин, может присутствовать в количестве от примерно 0,1 до 5 мас.%, предпочтительно от примерно 0,2 до 3 мас.%, и более предпочтительно от примерно 0,3 до 1 мас.%, от композиции, в которой селеновый компонент составляет от примерно 0,1 до 3 мас.% от источника метионина.
Один или несколько компонентов переходного металла включают в количестве, эффективном для того, чтобы побудить коллагеновые и эластиновые ткани восстанавливать кожу. Некоторые компоненты переходных металлов ингибируют фермент эластазу, чтобы затормозить распад коллагеновых и эластиновых тканей. Предпочтительные переходные металлы включают цинк, марганец и медь.
Компонент цинка может быть добавлен для того, чтобы помочь в укреплении коллагеновых и эластиновых волокон, которые и те, и другие способствуют предотвращению морщин и восстановлению морщинистой кожи. Известно также, что цинк является важным кофактором для целого множества металлоферментов, не в последнюю очередь супероксиддисмутазы, которая улавливает мощный окислитель супероксид.
Компонентом цинка может быть любое соединение цинка или его фармацевтически приемлемая соль, предпочтительно глюконат цинка, где цинк обычно присутствует в количестве от 1 до 30 мас.% от композиции. Компонент цинка присутствует в количестве от примерно 1 до 10 мас.%, более предпочтительно от примерно 2 до 7 мас.% и наиболее предпочтительно от 3 до 5 мас.%, от композиции.
Vitis vinifera, Camelia sinensis, Aesculus hippocastanum, Gingo biloba, Cardus marianim, Vaccinium myrtillus, Silybum marianum
Антиоксиданты в композициях по настоящему изобретению могут происходить из натурального или синтетического сырья. В типичном осуществлении натуральное сырье выбирают из группы, состоящей из сосновой коры, .
Vitis vinifera
В соответствующих осуществлениях один или несколько натуральных антиоксидантов являются извлекаемыми из виноградных косточек .
Природный источник одного или нескольких антиоксидантов обычно содержит до 25 мас.% катехина, эпикатехина и галловой кислоты, до 90 мас.% димера эпикатехина, тримера, и/или тетрамера, и/или их галлатов и до 1,0 мас.% пентамера, гексамера и/или гептамера эпикатехина или их галлатов.
Один или несколько натуральных антиоксидантов могут быть выбраны из группы, состоящей из полифенолов и их сложных эфиров, аскорбиновой кислоты (витамина С) и ее эфиров, и ее фармацевтически приемлемых солей. Полифенолами обычно являются катехины, лейкоантоцианидины и флавононы, флавонины, изофлавоны и антоцианидины, флавонолы, флавонолигнаны и их олигомеры.
Такие полифенолы, флаволигнаны или флавоноиды являются антиоксидантами, которые встречаются в природе во многих растениях. В настоящем изобретении изофлавоны экстрагированы из сои, флавоны экстрагированы из бурачника, тимьяна или петрушки, катехины экстрагированы из чая (предпочтительно белого чая) и проантоцианидины экстрагированы из винограда, предпочтительно из виноградных косточек.
В предпочтительном осуществлении натуральным антиоксидантом является катехин, выбранный из группы, состоящей из проантоцианина А2 и олигомерного процианидола (ОРС), наиболее предпочтительно олигомерного процианидола. Флавонолигнанами обычно являются силимарин или одно из его соединений, таких как силибин, силидианин, силихристин и изосилибин.
Vitis vinifera
Как указывалось, особо предпочтительным натуральным антиоксидантом является экстракт виноградных косточек, т.е. семян , где указанный экстракт обычно получают путем экстрагирования семян винограда с использованием органических растворителей, таких как ацетон и/или этилацетат или подобное, испарения растворителей, повторного растворения остатка в воде, и фильтрации, и сушки фильтрата, например распылительной сушкой или лиофилизацией. В особо предпочтительном осуществлении такой экстракт обычно содержит до 25 мас.% катехина, эпикатехина и галловой кислоты, до 90 мас.% димера эпикатехина, тримера, и/или тетрамера, и/или их галлатов и до 10 мас.% пентамера, гексамера, и/или гептамера эпикатехина, и/или их галлатов.
Кроме того, антиоксидантами обычно являются каротиноиды, прокаротиноиды, токоферолы, фитостеролы и убихиноны. Каротиноиды являются особенно интересными липофильными антиоксидантами и могут быть выбраны из группы, состоящей из α-каротина, β-каротина, γ-каротина, δ-каротина, ликопина, зеаксантина, криптоксантина, лютеина и ксантофилла.
Композиции по настоящему изобретению обычно включают менее 25 мас.% бета-каротина, предпочтительно меньше 10 мас.% бета-каротина, в особенности меньше 0,1 мас.% бета-каротина. Таким образом, следующий аспект изобретения относится к композиции, которая может достичь благоприятных эффектов, описанных выше, при очень малом содержании или практическом отсутствии бета-каротина.
Экстракт томатов включает ликопин. Предпочтительно экстракт включает от примерно 5 до 12 мас.%, обычно приблизительно 10 мас.% ликопина. Экстракт томатов может быть получен из одних томатов или из смеси томатов.
Lycopersicum aesculentum
В типичном осуществлении сортом томатов, который используют для получения экстракта томата, является .
В предпочтительном осуществлении настоящего изобретения композиция включает от 0,1 до 5 мас.% ликопина, предпочтительно от 0,2 до 4 мас.% ликопина, столько, как от 0,3 до 2 мас.% ликопина, наиболее предпочтительно от 0,3 до 1 мас.% ликопина, в особенности от 0,3 до 0,8 мас.%, как от 0,3 до 0,6 мас.% ликопина.
Согласно альтернативному определению композиции по настоящему изобретению композиция включает растительный экстракт и экстракт хряща, где растительный экстракт включает экстракт виноградных косточек и ликопин в массовом соотношении от примерно 5:1 до 15:1, предпочтительно примерно 10:1.
Следующая подходящая композиция согласно изобретению включает ряд следующих ингредиентов: 10-200 мг, предпочтительно 20-100 мг, более предпочтительно 30-80 мг, еще более предпочтительно 35-65 мг и наиболее предпочтительно 45-55 мг, экстракта хряща; 10-200 мг, предпочтительно 20-100 мг, более предпочтительно 30-80 мг, еще более предпочтительно 35-65 мг и наиболее предпочтительно 45-55 мг, растительных экстрактов; 1-50 мг, предпочтительно 3-40 мг, более предпочтительно 5-30 мг, еще более предпочтительно 8-25 мг и наиболее предпочтительно 10-20 мг, витамина С; 0,1-30 мг, предпочтительно 0,5-20 мг, более предпочтительно 1-15 мг, еще более предпочтительно 2-10 мг и наиболее предпочтительно 3-7 мг, витамина Е; 1-50 мг, предпочтительно 3-40 мг, более предпочтительно 5-30 мг, еще более предпочтительно 8-25 мг и наиболее предпочтительно 10-20 мг, экстракта белого чая; и 1-40 мг, предпочтительно 2-30 мг, более предпочтительно 3-20 мг, еще более предпочтительно 5-15 мг и наиболее предпочтительно 7-12 мг, глюконата цинка, где растительные экстракты включают олигомерный процианидол и ликопин и экстракт хряща включает гликозаминогликаны.
Единичная доза для введения может быть между 50 и 2000 мг, предпочтительно между 100 и 1500 мг, более предпочтительно между 150 и 900 мг, еще более предпочтительно между 200 и 700 мг и наиболее предпочтительно между 250 и 600 мг.
Хотя любой подходящий путь введения может быть применен для обеспечения пациента эффективной дозой композиции согласно настоящему изобретению, пероральный ввод является предпочтительным. Подходящие пути, которые могут быть применены, включают, например, пероральный, ректальный, парентеральный, внутривенный, местный, чрескожный, подкожный, внутримышечный и подобные формы введения.
Подходящие дозированные формы включают таблетки, драже, дисперсии, суспензии, растворы, капсулы, пластыри, суппозитории и т.п., хотя пероральные формы являются предпочтительными. Фармацевтические композиции, используемые в способах по настоящему изобретению, включают описанные выше активные ингредиенты и могут также содержать фармацевтически приемлемые носители, наполнители и т.п. и, необязательно, другие терапевтические ингредиенты.
Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли, полученной из фармацевтически приемлемых нетоксичных кислот или оснований, включающих неорганические или органические кислоты. Примерами таких неорганических кислот являются хлористоводородная, бромистоводородная, йодистоводородная, серная и фосфорная. Подходящие органические кислоты могут быть выбраны, например, из алифатических, ароматических карбоновых и сульфоновых классов органических кислот, примерами которых являются муравьиная, уксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, глюкуроновая, малеиновая, фуроевая, глютаминовая, бензойная, антраниловая, салициловая, фенилуксусная, миндальная, эмбоновая (памовая), метансульфсульфоновая, этансульфоновая, пантотеновая, бензолсульфоновая, стеариновая, сульфаниловая, альгиновая и галактуроновая. Примеры таких неорганических оснований для потенциального образования солей с сульфатными или фосфатными соединениями по изобретению включают соли металлов, полученные из алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия и цинка. Подходящие органические основания могут быть выбраны, например, из N,N-дибензилэтилендиамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, меглумаина (N-метилглюкамина) и прокаина.
Композиции для использования в настоящем изобретении включают такие композиции, как суспензии, растворы и эликсиры, аэрозоли; или носители, такие как крахмалы, сахара, микрокристаллическая целлюлоза, разбавители, гранулирующие агенты, лубриканты, связующие, разрыхлители и т.п. В случае пероральных твердых препаратов (таких как порошки, капсулы и таблетки) пероральные твердые препараты являются предпочтительными по сравнению с пероральными жидкими препаратами. Наиболее предпочтительными пероральными твердыми препаратами являются таблетки.
Из-за легкости их введения таблетки и капсулы представляют наиболее благоприятную пероральную единичную дозированную форму, и в этом случае применяют твердые фармацевтические носители. Если требуется, таблетки могут быть покрыты обычными водными или неводными способами.
Например, таблетка может быть приготовлена прессованием или формованием, необязательно, с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены прессованием в подходящей машине активного ингредиента в свободно текущей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связующим, лубрикантом, инертным разбавителем, поверхностно-активным или диспергирующим агентом. Формованные таблетки могут быть приготовлены формованием в подходящей машине смеси превращенного в порошок соединения с инертным жидким разбавителем.
ЭКСПЕРИМЕНТ 1.
Влияние композиции антиоксидантов на клеточный цикл
2
2
В ряде экспериментов влияние УФ на распределение клеточного цикла в культивированных фибробластах кожи исследовали методом FASC-анализа. Было найдено, что и УФ-В (1 кДж/м) и УФ-А (250 кДж/м) вызывают торможение клеточного цикла. Кроме того, для УФ-А было обнаружено повышение клеток в G1 спустя одни сутки после облучения. Было исследовано влияние обработки антиоксидантами на клеточный цикл фибробластов кожи.
Материалы и методы
Культура клеток и облучение (для подробной информации сделана ссылка на de Leeuw S.M., Smit N.P., Van Veidhoven M., Pennings E.M., Pavel S., Simons J.W., Schothorst A.A., Melanin content of cultured human melanocytes and UV-induced cytotoxicity. J. Photochem. Photobiol. B. 2001 61: 106-113):
2
Фибробласты кожи человека выращивали при 37°С под 5% двуокисью углерода в модифицированной по Дульбеко среде Игла, дополненной 2,5% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Logan, Utah) и 100 м.е./л пенициллина и 100 мкг/л стрептомицина. Для пересева клетки отделяли 0,25% раствором трипсин/ЭДТА (Gibco) и разделением 1:5 и выдерживали в контрольной среде в 90 мм чашках Грейнера-Петри. Спустя трое суток клетки инкубировали с различными средами: контроль; и витамин Е и С (7 и 10 мкМ) плюс белый чай (5 мкг/мл). Тремя сутками позже среду удаляли и клетки промывали 4 мл ФБСР и облучали в чашках с крышками на них в 5 мл балансированного солевого раствора по Хэнку. Для облучения использовали источник УФ-лампу Sellas Sunlight типа 2.001 (Sellas, Gevelsberg, Germany) с дозой УФ-А 250 кДж/м. Голубой экран UVASUN и голубой пленочный фильтр UVASUN отфильтровывали длины волн ниже 320 нм [2]. Дозы контролировали радиометром IL700A Research Radiometer, используя сенсор WBS320#801 (International Light Inc., Newburyport, MA, USA).
Распределение клеточного цикла по анализу FACS
После обработки УФ-А клетки выдерживали в течение ночи в контрольной среде. За один час до сбора клеток добавляли 100 мкМ BrdU (5-бром-2-деоксиуридин, Sigma, B5002) для ввода в ДНК. Клетки собирали трипсинизацией и фиксировали в 70% этаноле после промывки фосфатным буферным солевым раствором (ФБСР).
о
После удаления избыточного этанола клетки инкубировали в течение 35 минут в 0,9 мл 0,1% пепсина в 2М HCl. Добавляли 1 М Tris (2,1 мл) и клетки промывали 2 раза смесью ФБСР-Твин, 0,5%. Далее клетки инкубировали с 100 мкл антител mouse-αBrdU (DAKO, Bu20A), разбавленных 1:50 в ФБСР-Твин с 5% сыворотки новорожденных телят в течение 1 часа при комнатной температуре. После двукратной промывки клетки инкубировали в течение 1 часа при 4С в темноте с 100 мкл goat antimouse lgG1-FITC (Pharmingen, no 553443) 1:100 в ФБСР-Твин-NBCS. После двукратной промывки 400 мел 20 мкг/мл йодпропидия добавляли 0,1% рибонуклеазу (RNase, Sigma) в ФБСР и клетки анализировали методом FACS-анализа, используя FACS-Calibur 1 (Beckton Dickinson). Меченную FITC BrdU измеряли в Fl-1 и Pl в Fl-3 и 1000 событий регистрировали и анализировали программой Cell Quest (Beckton Dickinson).
Результаты
Фигура 1 показывает распределение клеток в фазе G1 и G2 одни сутки после УФ-А облучения (темное) в сравнении с имитационно облученными культурами фибробластов (серое).
Результаты определенно демонстрируют различия процентного количества клеток, обнаруженных в фазе G1 и G2 в клетках, обработанных композицией витамин С-витамин Е-белый чай, по сравнению с контрольными клетками. УФ-А облучение вызвало увеличение клеток, находящихся в фазе G1 в контрольных клетках (задержка G1). Процент клеток в фазе G1 у клеток, обработанных композицией витамин С-витамин Е-белый чай, был значительно ниже, показывая, что меньше клеток было задержано в фазе G1 по сравнению с контрольными культурами. Соответственно, число клеток, находящихся в фазе G2 у обработанных композицией витамин С-витамин Е-белый чай клеток был выше по сравнению с контрольными клетками.
РЕКОНСТРУИРОВАННЫЕ ЭКВИВАЛЕНТЫ КОЖИ
ЭКСПЕРИМЕНТ 2.
in vitro
Влияние композиции на развитие и структуру дермальной внеклеточной матрицы и эпидермиса с использованием выращенных  эквивалентов кожи
in vitro
Эксперименты имели целью проверку влияния специфичных композиций согласно настоящему изобретению (обозначаемых здесь далее как композиция высокая и композиция низкая или, в общем, композиция) с использованием 3-D  реконструированных эквивалентов кожи (ЭК).
ЭК, полученные из клеток 19- или 49-летних доноров, обрабатывали более низкими и более высокими концентрациями композиции (композиции высокой и композиции низкой) или оставляли без обработки и выращивали в течение 35, 42 или 60 суток. После этого культуры проверяли на структуру и организацию эпидермального и дермального слоя. Кроме того, определяли синтез компонентов основной внеклеточной матрицы (ЕСМ), таких как фибриллин, эластин и коллаген типа I, используя Q RT-PCR и иммунофлюоресценцию.
Материалы и методы
Клеточные культуры
2
Первичные культуры кератиноцитов и фибробластов выделяли из кожи человека, полученной из отходов операционных пластической хирургии. Фибробласты выращивали в модифицированной по Дульбеко среде Игла (DMEM with Glutamax-1, Life Technologies, Cergy Pontoise, France), дополненной 10% телячьей сывороткой (HyClone, Logan, Utah, USA), 20 мкг/мл гентамицина (Panpharma, Fougeres, France), 100 м.е./мл пенициллина (Sarbach, Suresnes, France) и 1 мкг/мл амфотерицина В (Bristol Myers Squibb, Puteaux, France). Для ЭК кератиноциты выращивали в смеси 3:1 DMEM и Ham's E12 (Life Technologies), соответственно, дополненной 10% телячьей сыворотки (FCS) (HyClone), 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EFG) (Austral Biologic, San Ramon, California, USA), 0,12 м.е./мл инсулина (Lilly, Saint-Cloud, France), 0,4 мкг/мл гидрокортизона (UpJohn, StQuentin en Yvelines, France), 5 мкг/мл трийод-L-тиронина (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 24,3 мкг/мл аденина (Sigma) и антибиотиками. Для приготовления монослоев кератиноцитов клетки выращивали в описанной среде K-SFM (Life Technologies), дополненной в течение 5 суток после слияния 12 мМ CaCl.
Эквиваленты кожи и эквиваленты дермы
in vitro
stratum corneum
С использованием обшепринятых лабораторных методик в лаборатории были приготовлены 3-D  реконструированные эквиваленты кожи (ЭК). ЭК и морфологически, и биохимически близко сходны с нативной кожей человека с полностью развитыми дермой, эпидермисом и  (Saintigny G., Bonnard M., Damour O., Collombel C., Acta Derm. Venereol., 1993, 73:175-180; Sahuo F., Nakazawa K., Bethod F., Collombel C., Damour O., Wound Rep. Reg. 1996, 4: 93-102).
5
2
2
Эквиваленты кожи (ЭК) были приготовлены, как описано Duplan-Perrat et al., 2000. Вкратце, эквиваленты дермы (ЭД) готовили добавлением суспензии 2×10фибробласт/см на верх гликоген-гликозаминогликан-хитозановой микропористой губки Mimedisk (Coletica, Lyon). Все эквиваленты выращивали в течение 21 суток в среде фибробластов, содержащей 2-фосфатаскорбиновую кислоту (Sigma). Эквиваленты дермы (ЭД) подпитывали ежедневно. На 14-й день на эквивалент дермы высеивали кератиноциты с плотностью 250 000 клеток/см. После 7 суток погружного культивирования в среде кератиноцитов ЭД поднимали к поверхности раздела воздух-жидкость и выращивали в упрощенной среде для кератиноцитов, содержащей DMEM с дополнением 10% телячьей сыворотки, 10 нг/мл EGF, 0,12 м.е./мл инсулина, 0,4 мкг/мл гидрокортизона и антибиотиков. Среду дополняли 50 мкг/мл L-аскорбиновой кислоты и меняли каждый день. ЭК выращивали в сумме в течение 35, 42 или 60 суток.
Добавление композиции
Испытуемые композиции добавляли в двух концентрациях (для того, чтобы определить соотношение доза-ответ) к культуральной среде на ранней стадии развития ЭК (от первого изменения среды). Композицию добавляли к культуральной среде от первого изменения среды, за которым следовал высев фибробластов на Mimedisk, до конца эксперимента. Параллельно готовили контрольный эквивалент кожи со средой, содержащей только растворитель активных соединений композиции тетрагидрофуран (ТГФ).
Композицию добавляли в двух концентрациях:
<b>Композиция с высокой концентрацией</b>
<b>Композиция с низкой концентрацией</b>
Аскорбинат натрия (витамин С)
25 мкМ= 5 мкг/мл
12,5 мкМ
Токоферола ацетат (витамин Е)
17,5 мкМ= 7,5 мкг/мл
8,8 мкМ
Экстракт белого чая (WT)
5 мкг/мл
2,5 мкг/мл
Экстракт виноградных косточек (GE)
5 мкг/мл
2,5 мкг/мл
Экстракт томата (ТЕ)
10 мкг/мл
5 мкг/мл
Экстракт сои (SOY)
10 мкг/мл
5 мкг/мл
Экстракт хряща
70 мкг/мл
35 мкг/ил
Глюконат цинка
1 мкМ
0,5 мкМ
Анализ образцов
После 35, 42 или 60 дней выращивания культуры ЭК собирали и подвергали анализу. Три образца каждой кондиции ЭК фиксировали в формалине и заделывали в парафин. 5 мкм отрезки окрашивали гематоксилин-флоксин-шафраном и наблюдали под оптическим микроскопом для оценки дермальной и эпидермальной структуры. Далее три образца включали в Tissue-Tek для иммунофлюоресцентных измерений, а три замораживали при -80°С для количественного RT-PCR.
Иммуногистология и иммунофлюоресценция
Образцы эквивалентов кожи (ЭК) помещали в OCT Tissue-Tek (Miles, Immunotech, Marseille, France). Шесть микрометровых замороженных отрезков, полученных криотомом Frigocut 2800 (Reicherrt-Jung, Paris, France), сушили воздухом и закрепляли фосфатным буферным солевым раствором, содержащим 1 мас.%/об. альбумина бычьей сыворотки. Антитела, использованные для этого опыта, перечислены в следующей таблице:
<b>Основной антиген</b>
<b>Хозяин</b>
<b>Разведение</b>
<b>Источник</b>
Эластин
Кролик
1:100
Novotec (Lyon, France)
Фибриллин
Мышь
1:50
Neomarkers (Union City, CA)
Филагрин
Мышь
1:100
Biomedical Technologies Inc. (Soughton, MA)
Кератин 10
Мышь
1:50
Novocastra (Newcastle, UK)
К167
Мышь
1:100
Novocastra (Newcastle, UK)
Коллаген типа I
Кролик
1:1000
Novotec (Lyon, France)
J. Invest. Dermatol.
122
Антитела коллагена типа I, характерные для коллагена человека, не вступают в перекрестную реакцию с бычьими коллагенами, которые были использованы для приготовления дермального субстрата (Noblesse et al., , 2004; (3): 621-30).
Вторичные антитела, или козьи анти-кроличьи IgG (разведение 1:50, Sanofi Diagnostic Pasteur, France), или козьи анти-мышиные IgG (разведение 1:50, Cedaranе, Canada), меченные FITC, смешивали с 0,1% Evans Blue для уменьшения неспецифической пятнистости сетчатой структуры губки (Kieny и Mauger, 1984). Для контроля первичное антитело не учитывали. Обрабатывали множество отрезков одного и того же образца, чтобы гарантировать представительные пробы.
Количественный RT-PCR
о
Для того чтобы проследить образование мРНК для эластина, фибриллина 1 и коллагена типа I на 42-е и 60-е сутки, использовали количественный RT-PCR. Общую РНК эквивалентов кожи экстрагировали, используя систему SV60 выделения общей РНК от Promega. Для каждого образца получали 100 мкл очищенной общей РНК, определенной количественно при 260 нм спектрофотометром (Spectromax190; Molecular Devices) и содержавшейся замороженной при -80С до использования.
Для количественного RT-PCR авторы сконструировали праймеры, специфичные для каждого гена. Авторы проводили одноступенчатый количественный RT-PCR со специфичными праймерами, используя набор "QuantiTect SYBR Green RT-PCR" (Qiagen). Реакционная смесь содержала: SYBR Green Buffer 1X, два специфичных праймера с концентрацией 0,5 мкМ, 1 мкл смеси ферментов, 50 мкг общей пробы РНК, сколько требуется до 50 мкл не содержащей Rnase воды. Реакцию проводили в термоциклере OPTICON (MJ Research). После окончания пробы выливали на 2% агарозовый гель, чтобы убедиться, что продукты PCR были чистыми.
Результаты
Влияние композиции на эквивалент кожи, реконструированный из дермальных фибробластов 19-летнего донора
Независимо от концентрации композиция задерживала старение эпидермиса. Фигура 2 показывает влияние композиции с высокой и низкой концентрацией на эквивалент кожи, реконструированный из дермальных фибробластов 19-летнего донора. Окрашено гематоксилин-флоксин-шафраном. Увеличение 25×.
stratum corneum
На 42-е сутки выращивания эпидермис контрольных образцов показывал типичную структуру с несколькими слоями жизнеспособных эпидермальных клеток и  (фигура 2, контроль, 42 суток). При продленном времени выращивания (контроль, 60 суток) эпидермис становится более тонким, полностью дифференцированным и показывает некоторые черты, характерные для ухудшения ЭК, выдерживаемых в культуре в течение длительного времени (эпидермальное старение). Обработка композицией обеспечила в результате задержку старения, что демонстрируется образованием толстого, многослойного и обновленного эпидермиса (фигура 2, композиция высокая и низкая, 60 суток). Влияние на дерму не было очевидным.
Влияние композиции на эквивалент кожи, реконструированный из дермальных фибробластов 49-летнего донора
Фигура 3 показывает влияние композиции с высокой и низкой концентрацией на эквивалент кожи, реконструированный из дермальных фибробластов 49-летнего донора. Окрашено гематоксилин-флоксин-шафраном. Увеличение 40×.
Композиция задерживала эпидермальное старение, стимулировала образование плотной дермальной структуры и задерживала дермальное старение в ЭК от 49-летних доноров. Композиция с низкой концентрацией показала превосходящие эффекты (фигура 3).
Имелись явные различия между контрольным ЭК, приготовленным с фибробластами 19- и 49-летних доноров. Контрольные образцы от 49-летних доноров показывали более быстрое ухудшение и эпидермальных, и дермальных структур в течение времени выращивания, чем контрольные образцы от 19-летних доноров (сравнение с контролем на 42-е и 60-е сутки на фигурах 2 и 3). И на 42-е, и на 60-е сутки контрольные образцы ЭК от 49-летних доноров выглядели даже более ухудшившимися и дифференцированными, показывая остаток ороговевшего эпидермиса, по сравнению с соответствующими контрольными образцами ЭК 19. Этот эффект был уменьшен обработкой композицией. Композиция с более низкой концентрацией давала более положительные результаты по сравнению с композицией с более высокой концентрацией. Полученные в результате ЭК были хорошо развитыми с плотной дермой и толстым хорошо стратифицированным эпидермисом (сравни контроль и композицию с более низкой концентрацией на 60-е сутки на фигуре 3).
Результаты убедительно подтверждают, что обработка эквивалентов кожи композицией оказывала положительное воздействие на структуру, качество и сохранение и эпидермиса, и дермы. Композиция задерживала эпидермальное старение путем стимулирования роста эпидермальных кератиноцитов, который проводил к толстому, хорошо структурированному и обновляющемуся эпидермису независимо от возраста клеток донора. Имелся также заметный эффект образования плотных дермальных структур и замедленного старения дермы в ЭК от 49-летних доноров.
Следовательно, лечение композицией, т.е. лечение композициями согласно настоящему изобретению, имеет весьма положительное влияние на эпидермис: оно уменьшало эпидермальное старение и стимулировало рост и обновление кератиноцитов независимо от возраста клеток, даже если эффект был более выражен на ЭК из старых клеток. В сравнении с необработанными клетками, которые показывают снижение толщины эпидермиса и отсутствие обновления клеток после 42 суток в культуре, обработка композицией приводит в результате к сохранению толстого обновляющегося эпидермиса. В дерме композиция стимулировала образование и отложение компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ).
Иммуногистохимия и количественный RT-PCR
Для ЭК, приготовленных с обработанными композицией (низкая, а также высокая концентрация) фибробластами от 49-летних доноров, показано значительное повышение синтеза мРНК коллагена типа I, фибриллина и эластина после 60 суток выращивания. Такие эффекты не наблюдались с фибробластами от 19-летних доноров. Этот эффект был подтвержден иммуногистохимическим окрашиванием протеинов коллагена типа I, фибриллина и эластина. Кроме того, число клеток, экспрессирующих маркер пролиферации Ki67 после 60 суток, у обработанных композицией фибробластов было в 4 раза выше относительно контроля; это относилось к фибробластам и от 19-летних, и от 49-летних доноров.
ЭКСПЕРИМЕНТ 3
IN VIVO
: ЭКСПЕРИМЕНТ
ТАБЛЕТКИ:
Таблетки были приготовлены согласно следующим спискам ингредиентов обычными методами:
ТАБЛЕТКА I
ТАБЛЕТКА II
Аскорбат натрия
Аскорбит натрия
d-α-иокоферилацетат
d-α-иокоферилацетат
Экстракт белого чая
Экстракт белого чая
Экстракт сои
Экстракт сои
Экстракт хряща
Экстракт хряща
Экстракт ромашки
Экстракт виноградных косточек
Экстракт виноградных косточек
Экстракт томатов
Экстракт томатов
Глюконат цинка
Глюконат цинка
Фармацевтически приемлемые наполнители
Фармацевтически приемлемые наполнители
ИСПЫТАНИЕ ПРОДУКТА
Таблетки (таблетка I утром и таблетка II вечером) вводили 50 испытуемым пациентам женского пола для определения влияния на плотность кожи, упругость и наличие мелких морщинок и морщин на коже. Испытания завершили после 6 месяцев. Испытуемые субъекты (не в контрольной группе, которым давали таблетки плацебо) получали две (2) таблетки из испытуемого материала таблетки I и две (2) таблетки из испытуемого материала таблетки II ежедневно с едой. Всего 38 субъектов завершили испытания с активными таблетками и 43 - с таблетками плацебо.
Применяли следующие критерии включения: (i) 45-65 лет (от одного года до пяти лет после менопаузы; 70% субъектов не использовали HRT и 30% субъектов использовали HRT минимум 3 месяца перед началом испытаний); (ii) типы кожи I-III (зарегистрированные Fitzpatrick; Fitzpatrick II-III и Glogau II-III); (iii) признаки старения от умеренных до развитых (Glogau II-III); (iv) фотоповреждения на обратной стороне кистей рук.
Результаты клинической оценки
Исследователь проверял субъектов на специфическую локализацию на правой или левой стороне лица, на обратной стороне кисти правой или левой руки и на декольте (грудь) по следующим параметрам старения кожи:
Лицо
- Морщины (лоб)
- Мелкие морщинки (окологлазная область)
- Шероховатость наощупь/Сухость
- Мелкие морщинки (околоротовая область/линии губ)
- Пятна гиперпигментации
- Вялость (подверженность вертикальному подъему кожи пальцами)
- Провисание (видимое глазом отвисание кожи вокруг области рта)
- Темные круги под глазами
- Телеангиэктазия
- Общий внешний вид лица
Руки
- Креповость
- Тонкость
- Пятна гиперпигментации
Декольте
- Креповость
- Пятна гиперпигментации
- Общий внешний вид
Результаты клинической оценки регистрировали, используя следующую шкалу:
0 < 3
слабое
3 < 6
умеренное
6 < 9
сильное
Было проведено сравнение активной таблетки и плацебо. Параметры, отмеченные звездочкой, показывают, где активная таблетка вела себя значимо лучше, чем плацебо (p < 0,05). Уменьшение значения (произвольные единицы) указывает улучшение.
Результаты клинической оценки
<b>Клиническая оценка изменения от базовой линии на 6-й месяц</b>
<b>Активная таблетка</b><b>(n=38)</b>
<b>Плацебо</b><b>(n=43)</b>
Лицо, морщины лба
-0,387*
-0,167
Лицо, окологлазные морщины
-0,761*
0,477
Лицо, околоротовые морщины
-0,626*
-0,296
Лицо, пигментные пятна
-0,718*
-0,33
Лицо, тактильная вялость
-0,961*
-0,651
Лицо, визуальное провисание
-0,618*
-0,302
Лицо, темные круги под глазами
-0,447*
-0,179
Лицо, общее
-0,813*
-0,377
Руки, креповость
-0,908*
-0,519
Декольте, общий внешний вид
-0,421*
-0,67
Ультразвуковая плотность кожи
Ультразвук более 20 лет используется в клинической и практической медицине. Это надежный неинвазивный способ измерения дермальной плотности. Ультразвуковые волны отражаются структурными элементами кожи, которые показываются как цветные пятна на ультразвуковой картине. Чем больше окрашенных пятен, тем плотнее структура кожи.
Ультразвуковую установку DUBplus (Taberna, Pro Medicum, AG) использовали для получения В-сканированного изображения области правой или левой "вороньей лапки" (выбранной оценщиком). Ультразвуковую установку DUBplus, имеющую стандартный 20 мГц приемник, использовали при фокусном расстоянии 12 мм и разрешении 40 дБ. Установка усиления 28 дБ давала наилучшую общую визуализацию полной толщины кожи в местах испытания. Измерения проводили с датчиком, ориентированным перпендикулярно оси тела в области вороньей лапки. Альтернативно измерение может быть проведено возле глабеллярной области лба. Увеличенные значения плотности говорят об утолщении эпидермальной и дермальной ткани и могут быть использованы как указание на улучшенную дермальную структуру. Было обнаружено значимое улучшение (p<0,05) дермальной плотности после 6 месяцев использования для группы, получавшей активную таблетку, по сравнению с группой плацебо.
Обобщение результатов:
<b>Статистическая значимость после 6 месяцев</b>
<b><u>Клиническая оценка. Лицо.</u></b><b><u>Активная таблетка против плацебо</u></b>
<b><u>Плотность кожи, ультразвуковое сканирование</u></b><b><u>Активная таблетка против плацебо</u></b>
<b>(p<0,05)</b>
Морщины лба р=0,01Окологлазные морщины р=0,046Околоротовые морщины р=0,01Пигментные пятна р=0,002Вялость (тактильная) р=0,007Обвисание (визуальное) р=0,006Темные круги под глазами р=0,01Общий внешний вид р=0,0001
Плотность кожи р=0,0001
<b><u>Клиническая оценка. Тело.</u></b><b><u>Активная таблетка против плацебо</u></b>
Декольте, общий вид р=0,0003Креповость рук р=0,004