Компоненты урокиназной системы оказывают реципрокное влияние на накопление антивоспалительных регуляторных и провоспалительных цитотоксических T-лимфоцитов в селезенке

Иммунология. 2018; 39

DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-38-43

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

13. Murphy G., Devesa S.S., Cross A.J., Inskip P.D., McGlynn K.A. et al. Sex disparities in colorectal cancer incidence by anatomic subsite, race and age. Int. J. Cancer. 2010; 128: 1668-75.

14. Loftus C.G., Loftus E.V. Jr, Harmsen W.S., Zinsmeister A.R., Tremaine W.J. et al. Updated Incidence and Prevalence of Crohn's Disease and Ulcerative Colitis in Olmsted County, Minnesota (19702011). Inflamm. Bowel Dis. 2007; 13(3): 254-61.

15. Gao Y., Postovalova E.A., Dobrynina M.T., Makarova O.V. Sex-related differences in morphological changes and immune disorders during experimental acute ulcerative colitis. Klinicheskaya i experimentalnaya morfologiya. 2016; 1

16. Maul J., Loddenkemper C., Mundt P., Berg E., Giese Peripheral and intestinal regulatory CD4+ CD25(high) T cells in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2005; 128: 1868-78.

17. Vignali D.A.A., Collison L.W., Workman C.J. How regulatory T cells work. Nat.Rev. Immunol. 2008; 7(8): 523-32.

18. Wang Y., Liu X.P., Zhao Z.B., Chen J.H., Yu C.G. Expression of CD4+ forkhead box P3 (FOXP3)+ regulatory T cells in inflammatory bowel disease. J. Dig. Dis. 2011; 12: 286-94.

19. Makita S., Kanai T., Oshima S., Uraushihara K., Totsuka T. et al. CD4+CD25bright T cells in human intestinal lamina propria as regulatory cells. J. Immunol. 2004; 173: 3119-30.

20. Holmen N., Lundgren A., Lundin S., Bergin A.M., Rudin A. et al. Functional CD4+CD25high regulatory T cells are enriched in the colonic mucosa of patients with active ulcerative colitis and increase with disease activity. Inflamm. Bowel Dis. 2006; 12: 447-56.

21. Dige A., Hvas C.L., Deleuran B., Kelsen J., Bendix-Struve M. et al. Adalimumab treatment in Crohn's disease does not induce early changes in regulatory T cells. Scand. J. Gastroenterol. 2011; 46: 1206-14.

22. Saruta M., Yu Q.T., Fleshner P.R., Mantel P.Y., Schmidt-Weber C.B. et al. Characterization of FOXP3+CD4+ regulatory T cells in Crohn's disease. Clin. Immunol. 2007; 125: 281-90.

23. Brandhorst G., Petrova D.T., Weigand S., Eberle C., Nicolas von Ahsen et al. Lack of correlation between Treg quantification assays in inflammatory bowel disease patients. World J. Gastroenterol. 2015; 21(11): 3325-9.

Поступила 15.06.17 Принята в печать 16.08.17

КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 616-002-092:612.015.1.017.1

Кулебякина М.А.1, Дыйканов Д.Т.1, Рубцов Ю.П.1, Семина Е.В12, Ткачук В.А12

КОМПОНЕНТЫ УРОКИНАЗНОЙ СИСТЕМЫ ОКАЗЫВАЮТ РЕЦИПРОКНОЕ ВЛИЯНИЕ НА НАКОПЛЕНИЕ АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ И ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ^ЛИМФОЦИТОВ В СЕЛЕЗЕНКЕ

1Факультет фундаментальной медицины ФГБОУ МГУ им. М.В. Ломоносова, 119192, г. Москва, Россия; 2Лаборатория молекулярной эндокринологии ФГБУ «НМИЦК» Минздрава РФ, 121552, г. Москва, Россия

При ряде аутоиммунных заболеваний выявляется взаимосвязь с нарушением функции регуляторных Т-лимфоцитов (Treg), выполняющих в организме функцию иммуносупрессии. Существуют свидетельства того, что в функционировании регуляторных Т-лимфоцитов участвует урокиназа (uPA), сериновая протеаза крови и межклеточного матрикса, стимулирующая процессы фибринолиза, а также способная запускать внутриклеточную сигнализацию, регулирующую миграцию, пролиферацию и выживаемость клеток. Несмотря на имеющиеся данные, на сегодняшний день до конца не установлено, является ли влияние uPA на функционирование Treg физиологически значимым в регуляции иммунного ответа. Кроме того, также остается неизвестным, участвует ли в uPA-зависимой регуляции функционирования этой субпопуляции лимфоцитов специфический мембранный рецептор uPA, uPAR (Сй87), представляющий собой гликозилфосфатидилинозитол- ^Р|-) заякоренный белок. Мы провели оценку влияния урокиназы и её рецептора на содержание различных субпопуляций лимфоцитов в селезенке мышей. Для этого мы использовали мышей, нокаутных по урокиназе, а также мышей, нокаутных по урокиназному рецептору. Обнаружено, что выключение урокиназной системы приводит к двукратному снижению в селезенке количества Т-регуляторных лимфоцитов, подавляющих активацию иммунной системы. Более того, в селезенке нокаутных мышей обоих линий увеличивается содержание цитотоксических (СР8+) Т-лимфоцитов и активированных (СР25+) лимфоцитов, что может являться свидетельством избыточной лимфопролиферации. Тот факт, что наблюдаемые изменения происходят как у животных, лишенных иРА, так и у лишённых uPAR, позволяет нам предположить, что все эти эффекты опосредованы зависимым от uPAR механизмом действия иРА, а не её протеолитической активностью.

Ключевые слова: урокиназа; рецептор урокиназы; Т-лимфоциты; цитотоксические Т-лимфоциты; регулятор-ные Т-лимфоциты.

Для цитирования: Кулебякина М.А., Дыйканов Д.Т., Рубцов ЮП., Семина Е.В., Ткачук В.А. Компоненты урокиназной системы оказывают реципрокное влияние на накопление антивоспалительных регуляторных и про-воспалительных цитотоксических Т-лимфоцитов в селезенке. Иммунология. 2018; 39(1): 38-43. DOI: http://dx.doi. 0^/10.18821/0206-4952-2018-39-1-38-43

Для корреспонденции: Семина Екатерина В., канд. биол. наук, старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории генных и клеточных технологий кафедры биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной эндокринологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии», E-mail: e-semina@yandex.ru

Список сокращений: Treg - регуляторные Т-лимфоциты, uPA - активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа), CD87 или uPAR - рецептор урокиназы, WT - животные дикого типа, uPA-/- - мыши, нокаутные по гену урокиназы, uPAR-/- - мыши, нокаутные по гену урокиназного рецептора.

Immunology. 2018; 39

DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-38-43

ORIGINAL ARTICLE

KulebiakinaM.A.1, DyikanovD.T.1, Rubtsov Yu.P.1, SeminaE.V.,2, Tkachuk V.A.'2

UROKINASE SYSTEM COMPONENTS HAVE RECIPROCAL EFFECTS ON REGULATORY AND CYTOTOXIC T-CELLS ACCUMULATION IN SPLEEN

'Faculty of Fundamental Medicine, Lomonosov Moscow State Univercity, 119192, Moscow, Russia;

^Laboratory of Molecular Endocrinology, National medical research center of cardiology of the Ministry of healthcare of the

Russian Federation 121552, Moscow, Russia

Plenty of autoimmune diseases correlates with dysfunction of regulatory T-cells (Treg) responsible for immunosuppression. There is evidence that a specific protease found in blood and extracellular matrix - urokinase (uPA) - plays an important role in Treg function. It is known that urokinase stimulates fibrinolysis and triggers intracellular signaling, affecting cell migration, proliferation and survival. Despite the available data, the physiological effect of uPA/uPAR on Treg function still has not been discovered. Besides, it is still unknown whether uPA-dependent regulation of Treg functioning requires presence of its specific membrane receptor uPAR (CD87), a membrane glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored protein. We evaluated the effect of uPA and uPAR on content of different lymphocyte subpopulations in mouse spleen. We used uPA-knockout mice and uPAR-knockout mice. We discovered that downregulation of urokinase system leads to two-fold decrease in immunosuppressive Treg content in spleen. Moreover, both mice lines demonstrated an increased quantity of cytotoxic (CD-8+) T-cells and activated (CD25+) lymphocytes in spleen. It can be an evidence of excess lymphoproliferation. The fact that these changes observed in both mice lacking uPA and mice lacking uPAR suggest these effects to be mediated by uPAR-dependent mechanism, but not by proteolytic action of uPA.

Keywords: Urokinase-type plasminogen activator, urokinase-type plasminogen activator receptor, T-lymphocytes, CD8-positive T-lymphocytes, regulatory T-lymphocytes.

For citation: Kulebiakina M.A., Dyikanov D.T., Rubtsov Yu.P., Semina E.V, Tkachuk V.A. Urokinase system components have reciprocal effects on regulatory and CYTOTOXIC T-cells accumulation in spleen. Immunologiya. 2018; 39(1): 38-43. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-38-43

For correspondence: Semina Ekaterina V., senior researcher at Laboratory of gene and cell technologies, Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Lomonosov Moscow State Univercity; leading researcher at Laboratory of Molecular Endocrinology, National medical research center of cardiology of the Ministry of healthcare of the Russian Federation, E-mail: e-semina@yandex.ru Information about authors:

Mariia A. Kulebiakina, http://orcid.org/0000-0003-1300-9250 Daniyar T. Dyikanov, http://orcid.org/0000-0003-3159-6620 Yury P. Rubtsov, http://orcid.org/0000-0001-9175-3013 Ekaterina V. Semina, http://orcid.org/0000-0002-3927-9286 Vsevolod A. Tkachuk, http://orcid.org/0000-0002-7492-747X

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgments. he study was carried out at the expense of the grant of the Russian science Foundation

(project №14-24-00086) and equipment purchased at the expense of the development program of MSU. M.V. Lomonosov..

Received 15.10.17 Accepted 16.12.15

Введение

Патогенез ряда аутоиммунных заболеваний связан с нарушением функционирования регуляторных Т-лимфоцитов (Ъ^) - субпопуляции Т-лимфоцитов, способных подавлять активацию и пролиферацию лимфоцитов других субпопуляций (эффекторных) [1]. Регуляторные Т-лимфоциты относятся к CD4+ лимфоцитам и развиваются при обязательном участии транскрипционного фактора FOXP3, специфичного для Treg [2]. При реакции организма на инфекцию, опухоль, а также при аутоиммунных процессах Treg играют важную роль в сдерживании иммунного ответа [3]. Эффекторные Т-лимфоциты представлены двумя основными субпопуляциями - CD4+ (так называемые Т-хелперы, отвечающие за активацию гуморального и клеточного иммунного ответа), и CD8+ (так называемые Т-киллеры, или цитотокси-ческие Т-лимфоциты), которые осуществляют клеточный цитотоксический иммунный ответ. Обе эти субпопуляции Т-лимфоцитов подвергаются иммуносупрессии в результате функциональной активности [1, 3, 4]. В последнее время появляются данные о том, что особую роль в функционировании регуляторных Т-лимфоцитов играет активатор плаз-миногена урокиназного типа, или урокиназа.

Урокиназа (иРА) представляет собой сериновую протеазу, экспрессируемую клетками в межклеточное пространство и обнаруживаемую в крови. В норме синтезируемая клетками урокиназа неактивна и присутствует в крови в наномоляр-ных концентрациях, однако при её активации запускается

каскад протеолитических реакций [5]. В результате этого процесса активируется плазминоген, переходя при этом в активное состояние плазмин, который, в свою очередь, запускает каскад внеклеточного протеолиза, активируя далее матриксные металлопротеиназы и проангиогенные и нейро-трофные факторы роста, задепонированные в матриксе [5, 6]. Помимо активации внеклеточного протеолиза, иРА также запускает внутриклеточную сигнализацию, регулирующую миграцию, пролиферацию и дифференцировку клеток. Активация иРА-зависимых внутриклеточных сигнальных путей осуществляется с участием её специфичного рецептора иРА^ который представляет собой GPI-заякоренный белок [6, 7]. Высокая латеральная подвижность uPAR делает возможным его взаимодействие с мембранными адаптерными белками, обеспечивая векторность процессов протеолиза за счёт мобилизации сигнального комплекса uPA/uPAR на активированным полюсе клетки [8].

В отношении иммунной системы показано, что как иРА, так и uPAR опосредуют процессы миграции и пролиферации лимфоцитов [9-13]. В некоторых работах были исследования эффектов иРА, специфичных в отношении регуляторных Т-лимфоцитов [14, 15]. Так, в работе Не F. и соавт. [15] показано, что при активации Treg экспрессия иРА в них возрастала в сотни раз, а при экспериментальном подавлении иРА экспрессия специфичного для Treg транскрипционного фактора FOXP3 существенно снижалась. Известно, что нокаут генов, необходимых для нормального развития и функцио-

Иммунология. 2018; 39

DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-38-43 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

160 140 120 100 80 60 40 20 0

Количество клеток, млн

а

160 140 120 100 80 60 40 20

Количество клеток, млн

б

uPA-/-

WT1

uPAR-/-

WT2

Рис. 1, а, б - отсутствие иРА и иРАИ не влияет на общее число спленоцитов.

Общее количество спленоцитов у мышей, нокаутных по гену урокиназы

0

нирования Treg, например, гена транскрипционного фактора FOXP3, приводит к развитию тяжёлого генерализованного аутоиммунного заболевания, характеризуемого избыточной лимфопролиферацией и мультиорганным воспалением [16].

Несмотря на имеющиеся данные, на сегодняшний день до конца не установлено является ли влияние иРА/иРАИ на функционирование Treg физиологически значимым в регуляции иммунного ответа. Кроме того, также неизвестен молекулярный механизм участия иРА и иРАИ в развитии и функционировании Treg, в частности, участвует ли иРАИ в иРА-зависимой регуляции функционирования этой субпопуляции лимфоцитов. В данной работе, используя трансгенных мышей, лишенных генов иРА и иРАИ, мы оценили влияние иРА и иРАИ на количество различных субпопуляций Т-лимфоцитов в селезёнке, в том числе на субпопуляцию Тreg.

Материал и методы

Лабораторные животные

В работе использованы мыши, нокаутные по гену уроки-назы (иРА-/-), полученные на основе мышей инбредной линии С57BL6 [17], контрольные к ним мыши дикого типа (инбредная линия С57BL6); мыши, нокаутные по гену уро-киназного рецептора (иРАИ-/-), полученные на основе мышей С57BL6хSV129 [18], а также контрольные к ним мыши дикого типа (инбредная линия С57BL6хSV129). При

проведении экспериментов соблюдали «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», приказ Министерства среднего и высшего специального образования СССР .№742 от 13.11.1984 и нормы, утвержденные Комиссией по биоэтике факультета фундаментальной медицины МГУ им. М. В. Ломоносова. В работе использовали самцов в возрасте 8-10 нед, число мышей в каждой экспериментальной группе равнялось трём. Было поставлено по три независимых эксперимента. Все манипуляции проводили в стерильных условиях. Мышей наркотизировали изофлура-ном (IsoFlo ^Р), умерщвляли методом цервикальной дислокации и далее извлекали селёзенку.

Методика получения суспензии спленоцитов мыши

Суспензию клеток селезенки получали путём механического измельчения в среде ИРМ1 (НуС1опе), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (НуС1опе), 2тМ L-глутамина (НуС1опе) и 50 ^М в-меркаптоэтанола, используя сито с размером ячейки 40 мкм. Лизис эритроцитов проводили с помощью буфера, содержащего 150 тМ ЫН4С1, 10 тМ КНС03, 0,1 тМ EDTA. Клетки считали в камере Горяе-ва, предварительно окрасив трипановым синим для выявления мёртвых клеток.

Иммунофлуоресцентное окрашивание и проточная ци-тометрия спленоцитов мыши

Перед окрашиванием на внутриклеточные антигены (FOXP3) спленоциты фиксировали с применением набора BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) по протоколу, предложенному производителем: клетки инкубировали в буфере для фиксации/пермеабилизации в течение 20 мин при температуре 4оС, затем подвергали отмывке в буфере (BD Perm/ WashT в течение 15 мин. Окрашивание на мембранные маркеры Т-лимфоцитов CD4, CD8, CD25 проводили без предварительной фиксации спленоцитов. Иммунофлуоресцентное окрашивание выполняли c использованием флуоресцентно меченых антител, специфичных к CD8a (BD-Pharmingen), к FOXP3 (Sony), к CD4 (Sony), к CD25 (Sony). Анализ окрашивания делали методом проточной цитометрии (FACSCanto II, BD Bioscienses). Данные проточной цитометрии анализировали с использованием программы FlowJo.

Статистическая обработка результатов

Статистический анализ данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. Для оценки достоверности различий между экспериментальными группами нами использован двухвыборочный /-тест Стьюдента. На гистограммах представлены значения среднего и среднеквадратичное отклонение. Различия между данными считали достоверными при р<0,05.

Результаты

1. Нокаут по генам uPA и uPAR не влияет на общее количество лимфоцитов в селезенке мышей

Одной из основных функций Treg в организме является сдерживание избыточной пролиферации эффекторных Т-лимфоцитов (Т-хелперов и Т-киллеров). Изменение количества спленоцитов может свидетельствовать об избыточной или недостаточной лимфопролиферации. В связи с этим на первом этапе наших исследований мы проанализировали общее содержание спленоцитов у мышей линий uPA-/-, uPAR-/-, а также у диких мышей соответствующих линий (WT1 и WT2). Согласно полученным результатам, нокаутные по генам uPA и uPAR мыши (uPA-/- и uPAR-/- на рис. 1) не демонстрировали существенных отличий в общем количестве спленоцитов по сравнению с мышами дикого типа WT1 и WT2 соответственно. Таким образом, отсутствие экспрессии белков uPA и uPAR не влияет на общую численность лимфоцитов в селезёнке.

2. uPA и uPAR участвуют в поддержании численности регуляторных Т-лимфоцитов

Есть данные, свидетельствующие в пользу участия uPA и uPAR в регуляции функции иммунной системы через контроль созревания и активации Т-регуляторных лимфоцитов (Treg). Характеристическим маркером ^eg является транскрипционный фактор Foxp3, который необходим для развития и поддержания фенотипа данной субпопуляции лимфо-

Immunology. 2018; 39

DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-38-43

ORIGINAL ARTICLE

1,2

1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

Количество Foxp3+ клеток, млн

а

1,6 1,4 1,2

1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

Количество Foxp3+ клеток, млн б

uPA-/-

WT1

uPAR-/-

WT2

Рис. 2. Отсутствие uPA и uPAR приводит к снижению числа Treg (Foxp3+) в селезёнке.

а - количество Foxp3+ клеток в селезёнках мышей, нокаутных по гену урокиназы (uPA-/-) и мышей дикого типа (WT1), б - количество Foxp3+ клеток в селезенках мышей, нокаутных по гену рецептора урокиназы (uPAR-/-) и мышей дикого типа (WT2). * - р<0,05 (n=3).

цитов [2]. Мы сравнили содержание Рохр3+-клеток у мышей линий uPA-/- и WT1 и uPAR-/- и WT2 (рис. 2). Нами обнаружено, что у мышей линии uPA-/- число Рохр3+-клеток в селезенке заметно снижено по сравнению с мышами дикого типа (0,56±0,15 млн у uPA-/- и 1,0±0,129 млн у WT1 соответственно) (рис. 2, а). Аналогичные результаты получены для мышей, нокаутных по гену uPAR (0,684±0,24 млн у uPAR-/- и 1,32±0,18 млн у WT2 соответственно) (рис. 2, б). Таким образом, отсутствие экспрессии uPA и uPAR приводит к двукратному уменьшению количества Treg в селезёнке.

3. Нокаут по генам uPA и uPAR приводит к увеличению числа цитотоксических Т-лимфоцитов (Т-киллеров) в селезёнке

Для оценки функциональной активности регуляторных Т-лимфоцитов важны данные не только об общем количестве лимфоцитов, но и об изменении уровня конкретных субпопуляций Т-лимфоцитов: хелперных и цитотоксических. Известно, что снижение функции Тге§ может приводить к избыточной пролиферации эффекторных Т-лимфоцитов. В связи с этим мы проанализировали содержание основных субпопуляций эффекторных Т-лимфоцитов: CD4+ (Т-хелперов) и CD8+ (Т-киллеров) в селезёнках экспериментальных животных.

Обнаружено, что число CD8+ Т-лимфоцитов в селезёнке мышей линии иРА-/-, как и линии иРАР-/-, значительно повышено по сравнению с мышами дикого типа (5,72±0,89 млн

a

7 6 5 4

3 2

1 0

б

30 25 20 15 10 5 0

Количество CD8+ клеток, млн

—*—

Количество CD8+ клеток, млн

uPA-/-

WT1

Количество CD4+ клеток, млн

12 10 8 6 4 2 0

25 20 15 10 5 0

uPAR-/-

WT2

Количество CD4+ клеток, млн

uPA-/-

WT1

uPAR-/-

WT2

Рис. 3. Отсутствие uPA и uPAR не влияет на число Т-хелперов (CD4+), но приводит к значительному увеличению количества цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) в селезёнке мышей по сравнению с мышами дикого типа.

a - количество CD8+ клеток в селезёнках мышей линий uPA-/- , uPAR-/-, а также в селезёнках мышей линий соответствующего им дикого типа (WT1 или WT2), б - количество CD4+ клеток в селезёнках мышей линий uPA-/- , uPAR-/-, а также в селезёнках мышей линий соответствующего дикого типа (WT1 или WT2).*-р<0,01 (n=3).

Иммунология. 2018; 39

DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-38-43 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Количество CD25+ клеток, млн

а

*

т

з5 30 25 20 15 10 5 0

uPA-/-

WT1

Количество CD25+ клеток, млн

б

uPAR-/-

WT2

Рис. 4. Отсутствие uPA и uPAR приводит к значительному увеличению числа активированных Т-лимфоцитов (CD25+) в селезёнке мышей. а - количество CD25+ клеток в селезёнках мышей, нокаутных по гену урокиназы (uPA-/-) и в селезёнках мышей дикого типа (WT1), б - количество CD25+ клеток в селезёнках мышей, нокаутных по гену рецептора урокиназы (uPAR-/-) и в селезёнках мышей дикого типа (WT2). * - р<0,01 (n=3).

у иРА-/- и 1,46±0,44 млн у WT1 соответственно; 9,84±0,2 млн у иРАР-/- и 4,07±0,28 млн у WT2 соответственно) (рис. 3, а). Количество же CD4+ Т-лимфоцитов у мышей линий иРА-/- и иРАР-/- достоверно не изменялось по сравнению с мышами WT1 и WT2 соответственно (рис. 3, б).

4. Нокаут по генам uPA и uPAR приводит к увеличению в селезенке числа активированных CD25+ Т-лимфоцитов

Наблюдаемое нами увеличение числа цитотоксических CD8 Т-лимфоцитов в селезёнке может быть следствием повышенной их активации. Ключевым маркером активации Т-лимфоцитов является мембранная молекула CD25, представляющая собой альфа-субъединицу рецептора интерлейкина-2. Экспонирование CD25 на мембране способствует пролиферации (клональной экспансии) Т-лимфоцитов [19]. Мы проанализировали содержание активированных Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности CD25 в селезёнках мышей линий иРА-/-, иРАР-/- и соответствующих линий диких мышей (WT1 и WT2; см. рис. 3). Как видно из представленных данных, в селезёнке мышей линии иРА-/- (4,73±0,04 млн у иРА-/-и 1,76±0,55 млн у WT1, рис. 4, а) и мышей линии иРАР-/-(25,2±3,6 млн у иРАР-/- и 2,75±0,88 млн у рис. 4, б) наблюдается значительное повышение CD25-положительных лимфоцитов по сравнению с мышами дикого типа.

Обсуждение

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что нокаут по гену иРА, как и по гену иРАР, приводит к почти к двукратному снижению количества Тreg. Возможно, поддержание нормального числа в селезенке требует достаточного уровня экспрессии как иРА, так и иРАР, поэтому отсутствие экспрессии этих белков может приводить к снижению способности к миграции и/или пролиферации этой субпопуляции лимфоцитов.

Наши результаты показывают, что отсутствие экспрессии белков иРА или иРАР не влияет на общую численность лимфоцитов в селезёнке молодых (8-10 нед) мышей. Можно говорить о том, что заметной избыточной лимфопролиферации у исследуемых нокаутных животных не наблюдается. Однако вместе с этим нами впервые получены данные об увеличении содержания ^киллеров и активированных (CD25+) лимфоцитов в селезёнке экспериментальных мышей. Поскольку экспонирование CD25 способствует пролиферации Т-лимфоцитов [19], то увеличение в селезёнке числа клеток, несущих этот маркер, может свидетельствовать об избыточной лимфопролиферации. Не исключено, что с возрастом у мышей, нокаутных по иРА или иРАР, признаки аутоиммунных процессов могут стать более выражены.

Кроме того, обнаруженное нами увеличение CD8+ Т-лимфоцитов у животных, несущих нокаут по генам иРА и иРАР, может быть свидетельством влияния урокиназы и её рецептора на созревание и/или пролиферацию/вы-

живаемость Т-киллеров в селезёнке. Наблюдаемое нами существенное увеличения числа CD25+-активированных спленоцитов позволяет предположить, что увеличение содержания CD8+-лимфоцитов в селезёнке напрямую может быть следствием их пролиферации в результате активации. Следует отметить, что количество CD4+-лимфоцитов в селезёнках нокаутных мышей (uPA-/- и uPAR-/-) существенно не менялось по сравнению с мышами дикого типа (WT1 и WT2). Это может объясняться тем, что у CD4+- и CD8+-лимфоцитов имеются различия в молекулярных механизмах активации. В частности, CD4+-лимфоциты сами экспресси-руют IL-2, который стимулирует выход Т-лимфоцитов из покоящегося состояния и их клональную экспансию, в то время как пролиферация активированных CD8+ лимфоцитов в большей степени зависит от присутствия экзогенного IL-2 [19, 20].

Тот факт, что нокаутные по uPA и по uPAR мыши характеризуются значительным (в разы) повышением числа CD25+-спленоцитов, говорит о значимом влиянии урокиназы и её рецептора на процессы активации Т-лимфоцитов, и может быть обусловлено наличием специфического механизма воздействия uPA и uPAR на 1) экспрессию/презентацию CD25 в мембране Т-лимфоцитов, на 2) миграцию активированных Т-лимфоцитов, а также на 3) повышение уровня активации Т-лимфоцитов из-за снижения иммунносупрессии, в частности, за счёт обнаруженного в данном исследовании снижения содержания Treg в тканях uPA-/- и uPAR-/- мышей.

Заключение

Проанализировав численность различных субпопуляций Т-лимфоцитов в селезёнках мышей, нокаутных по генам uPA и uPAR, мы впервые получили данные, позволяющие предполагать существование новых механизмов регуляции функций иммунной системы in vivo. Установлена важная роль uPA и uPAR в поддержании численности Treg в организме. Генетический нокаут uPA и uPAR приводит к снижению в селезёнке количества Treg, которые способны ограничивать возможный аутореактивный иммунный ответ, сдерживая пролиферацию эффекторных Т-лимфоцитов. При нокауте генов uPA и uPAR в разы возрастает число активированных Т-лимфоцитов и происходит значительное увеличение числа цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) в селезёнках мышей, причем эти явления, вероятно, могут быть опосредованы снижением количества регуляторных Т-лимфоцитов. Обнаруженные эффекты делают перспективным дальнейшее изучение влияния уроки-назной системы на активацию клеток иммунной системы, в частности, при аутоиммунных заболеваниях.

Финансирование. Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда (проект №14-24-00086) и оборудования, приобретённого за счёт средств Программы развития МГУ им. М.В. Ломоносова.

Immunology. 2018; 39

DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-43-49

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Goodnow C.C., Sprent J., Fazekas de St Groth B., and Vinuesa C.G. Cellular and genetic mechanisms of self tolerance and autoimmunity. Nature. 2005; 435: 590-7.

2. Fontenot J.D., Rudensky A.Y. A well adapted regulatory contrivance: regulatory T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3. Nat. Immunol. 2005; 6: 331-7.

3. Sakaguchi S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nat. Immunol. 2005; 6(4): 345-52.

4. Sakaguchi S., Yamaguchi T., Nomura T., Ono M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 2008; 133: 775-87.

5. Collen D. The plasminogen (fibrinolytic) system. Thromb Haemost. 1999; 82(2): 259-70.

6. Tkachuk V., Stepanova V., Little P.J., Bobik A. Regulation and role of urokinase plasminogen activator in vascular remodelling. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1996; 23(9): 759-65.

7. Ploug M., R0nne E., Behrendt N., Jensen A.L., Blasi F., Dan0 K. Cellular receptor for urokinase plasminogen activator. Carboxyl-terminal processing and membrane anchoring by glycosyl-phosphatidylinositol. J. Biol. Chem. 1991; 266(3): 1926-33.

8. Blasi F., Carmeliet P. uPAR: a versatile signalling orchestrator. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002; 3(12): 932-43.

9. Gyetko M.R., Chen G.H., McDonald R.A., Goodman R., Huffnagle G.B., Wilkinson C.C., et al. Urokinase is required for the pulmonary inflammatory response to Cryptococcus neoformans. A murine transgenic model. J. Clin. Invest. 1996; 97(8): 1818-26.

10. Gyetko M.R., Libre E.A., Fuller J.A., Chen G.H., Toews G. Urokinase is required for T lymphocyte proliferation and activation in vitro. J. Lab. Clin. Med. 1999; 133(3): 274-88.

11. Gyetko M.R., Sud S., Sonstein J., Polak T., Sud A., Curtis J.L. Antigen-

ORIGINAL ARTICLE

driven lymphocyte recruitment to the lung is diminished in the absence of urokinase-type plasminogen activator (uPA) receptor, but is independent of uPA. J. Immunol. 2001; 167(10): 5539-42.

12. Gyetko M.R., Sud S., Chensue S.W. Urokinase-deficient mice fail to generate a type 2 immune response following schistosomal antigen challenge. Infect. Immun. 2004; 72(1): 461-7.

13. Gur-Wahnon D., Mizrachi T., Maaravi-Pinto F.Y., Lourbopoulos A., Grigoriadis N., Higazi A.A. et al. The plasminogen activator system: involvement in central nervous system inflammation and a potential site for therapeutic intervention. J. Neuroinflammation. 2013; 10: 124.

14. Karamanavi E., Angelopoulou K., Lavrentiadou S., Tsingotjidou A., Abas Z., Taitzoglou I. et al. Urokinase-type plasminogen activator deficiency promotes neoplasmatogenesis in the colon of mice. Transl Oncol. 2014; 7(2): 174-87

15. He F., Chen H., Probst-Kepper M., Geffers R., Eifes S., Del Sol A. et al. PLAU inferred from a correlation network is critical for suppressor function of regulatory T cells. Mol. Syst. Biol. 2012; 8: 624.

16. Wildin R.S., Ramsdell F., Peake J., Faravelli F., Casanova J.L., Buist N. et al. X-linked neonatal diabetes mellitus, enteropathy and endocrinopathy syndrome is the human equivalent of mouse scurfy. Nat. Genet. 2001; 27(1): 18-20.

17. Herbert J.M., Lamarche I., Carmeliet P. Urokinase and tissue-type plasminogen activator are required for the mitogenic and chemotactic effects of bovine fibroblast growth factor and platelet-derived growth factor-BB for vascular smooth muscle cells. J. Biol. Chem. 1997; 272(38): 23585-91.

18. Dewerchin M., Nuffelen A.V., Wallays G., Bouché A., Moons L., Carmeliet P. et al. Generation and characterization of urokinase receptor-deficient mice. J. Clin. Invest. 1996; 97(3): 870—8.

19. Boyman O., Sprent J. The role of interleukin-2 during homeostasis and activation of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 2012; 12(3): 180-90.

20. Wiesel M., Oxenius A. From crucial to negligible: functional CD8+ T-cell responses and their dependence on CD4+T-cell help. Eur. J. Immunol. 2012; 42(5): 1080-8.

Поступила 15.10.17 Принята в печать 16.12.17

ИММУНОПАТОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018

УДК 616.12-009.72-06:616.127-005.8]-008.9-036.11-078.33

Саидов М.З., Маммаев С.Н., Абдуллаев А.А., Алиева М.Г.

ИММУНОМАРКЁРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ МИОКАРДА КАК ПРЕДИКТОРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ИСХОДА ОСТРОГО КОРОНАРНОГО СИНДРОМА В СТЕНОКАРДИЮ НАПРЯЖЕНИЯ III ФУНКЦИОНАЛЬНОГО КЛАССА

ФГБОУ ВО «Дагестанский государственный медицинский университет», 367000, г. Махачкала, Республика Дагестан

Изучено прогностическое значение иммуномаркёров гипоксического повреждения миокарда, показателей неспецифического субклинического воспаления и эндотелиальной дисфункции при клиническом исходе острого коронарного синдрома (ОКС) в стенокардию напряжения III функционального класса (ФК). Показано, что при клиническом исходе ОКС в стенокардию напряжения III ФК наиболее информативными интервалами концентраций в сыворотке крови (точки разделения) являются: для иммуномаркёров НП от 24 до 43 нмоль/л и в 60% случаев встречаются АТ к миокардиальным клеткам, а также BNP-32 - от 30 до 80 пг/мл; для маркёров воспаления ИЛ-Iß от 0 до 0,5 пг/мл и ТНФ-а от 0 до 0,5 пг/мл; для маркёров эндотелиальной дисфункции NO от 20 до 30 мкмоль/л, ГЦ от 17 до 18 мкмоль/л, TIMP-1 от 90 до 150 нг/мл; На основании полученных данных рассчитаны значения относительного риска исхода ОКС в стенокардию напряжения III ФК и сформирована блок-схема персонифицированного прогноза клинического исхода ОКС в стенокардию напряжения III ФК на госпитальном этапе. Пациенты, имеющие показатели, попадающие в интервалы концентраций, представленных в прогностической блок-схеме при поступлении в стационар (точка отсчёта), являются группой высокого риска в отношении клинического исхода ОКС в стенокардию напряжения III ФК (конечная точка).

Для корреспонденции: Саидов Марат Зиявдинович, д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой патологической физиологии Дагестанского государственного медицинского университета, E-mail: marat2002@pochta.ru.