Использование мезенхимальных стромальных клеток для лечения посттравматических язв роговицы у кошек

использование мезенхимальных стромальных клеток для лечения посттравматических язв роговицы у КОШЕК

ЕЮ. Закирова 1, А.Н. Валеева 2, Р.Р. Файзуллина 2, Р.Ф. Ахметшин 3, Л.В. Нефедовская1, А.А. Ризванов 1

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

2 Казанская государственная академия ветеринарной медицины, Казань, Россия

3 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия

Transplantation of allogeneic mesenchymal stromal cell for treating corneal ulcers in cats

E.Y. Zakirova 1, A.N. Valeeva 2, R.R. Faizullina 2, R.F. Akhmetshin 3, L.V. Nefedovskaya 1, AA. Rizvanov 1

1 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia

2 Kazan State Academy of Veterinary Medicine, Kazan Russia

3 Kazan State Medical University, Kazan, Russia

В настоящее время большой интерес для практической ветеринарии представляет возможность использования стволовых клеток для лечения заболеваний глаз . Настоящее исследование проводилось для оценки терапевтического эффекта аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, полученных из жировой ткани, для лечения травматических язв роговицы кошек . Полученные результаты свидетельствуют о том, что стромальные клетки стимулируют регенеративные процессы в поврежденной роговице .

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, язва роговицы глаза, кошка

At present, a great interest for the veterinary practice is the use of stem cells to treat diseases of the eye . This study was conducted to evaluate the therapeutic effect of allogeneic multipotent mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue for the treatment of traumatic corneal ulcers in cats . Our results indicate that the stem cells stimulate regenerative processes in the damaged cornea

Keywords: multipotent mesenchymal stromal cells, corneal ulcers, cat .

Введение

Язвы роговицы являются распространенным заболеванием у кошек, а разработанные на сегодняшний день методы лечения не всегда эффективны .

При эрозиях и язвах роговицы глубокие патологические изменения, возникающие на субклеточном и клеточном уровнях, затрагивают, в первую очередь, эпителиально-стромальные слои, что приводит к нарушению процессов диффузии и осмоса, отеку стромы, угнетению пролиферации фибро-бластов и замедляет восстановление целостности и прозрачности . Длительно существующий воспалительный процесс препятствует формированию прочных стромально-эпителиальных взаимоотношений и, как следствие, полной эпителизации поврежденной роговицы. Поэтому становится крайне актуальным поиск новых эффективных средств, способствующих стимуляции регенеративных процессов в роговице

Среди новых направлений в различных областях ветеринарии в последние годы внимание привлекают исследования возможности терапевтического применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) . Регенераторный потенциал МММСК достаточно высок по сравнению с детерминированными пролиферирующими клетками, что обеспечивает обновление тканей на протяжении жизни [1]. Будучи мультипотентными, ММСК являются мощным восстановительным клеточным резервом в организме . Они способствуют замещению дефектов, возникающих при различных повреждающих воздействиях на какой-либо ткани или органы [2].

Известно, что в склере имеется запас собственных стволовых клеток . Это лимбальные стволовые клетки . Их успешно используют для лечения пациентов с ожоговыми повреждениями роговицы, при этом остаются неизвестными основные молекуляр-

e-mail: rizvanov@gmail . com

ные механизмы происходящих регенеративных процессов [3].

Так же существуют работы, демонстрирующие положительный эффект лечения посттравматических язв роговицы с использованием аллогенных ММСК костного мозга и СР117+ гемопоэтических клеток [4].

Некоторые исследователи для лечения травмированной роговицы животных (кроликов) вводили клетки непосредственно в кровоток через ушную вену . При этом также достигался лучший эффект по сравнению с контролем [5].

Цель работы — оценить терапевтическую эффективность субконъюнктивальной трансплантации аллогенных ММСК костного мозга при лечении травматических язв роговицы кошек

Материал и методы

Исследования проведены на кафедре ветеринарной хирургии ФГБОУ ВПО КГАВМ им . Баумана, ветеринарной клинике «Академ-сервис», Институте фундаментальной медицины и биологии и НОЦ фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета

Объектом исследования служили кошки с посттравматическими язвами . Животные на время лечения помещались в стационар со стандартными условиями лечения, кормления и содержания Возраст животных варьировал от 1,5 до 3 лет, средняя живая масса около 3,5 кг; порода — метис . Диагноз у всех животных: глубокий эрозивно-язвенный процесс роговицы (подтвержден методом бокового осмотра и тестом с окрашиванием дефекта метиленовым синим в разведении 1:1000) .

Были сформированы две группы по три особи в каждой. В I группе (контроль) лечение проводилось общепринятым способом: выполнялся туалет раны,

затем тарзорафия третьим веком на срок 2 нед . , антибактериальные капли с широким антимикробным спектром и средства, стимулирующие регенеративные процессы в роговице. В качестве антибактериального средства использовали капли «Ципровет» 4—5 раз/сут . , местно . Для стимуляции регенеративных процессов в роговице с интервалом 12 ч . местно использовали «Корнерегель» (Др . Герхард Манн, Германия).

Во II группе животным после проведенного туалета раны однократно субконъюктивально в область лимба поражённого глаза была введена суспензия аллогенных ММСК в объеме 0,2 мл содержащая 300 тыс . клеток . После чего в течение 2 нед . проводилась антибиотикотерапия, для которой использовали капли «Ципровет» (Агроветзащита, Россия), 4—5 раз/сут . , местно .

Источником донорского материала для выделения ММСК служил красный костный мозг клинически здоровой кошки, взятый в асептических условиях операционной под общим наркозом . Образец ткани был доставлен в лабораторию в стерильном контейнере с физиологическим раствором в течение 1 ч Все манипуляции по выделению ММСК проводились в стерильных условиях при ламинарном токе воздуха . Костный мозг в среде культивирования подвергали механической дезагрегации до формирования клеточной суспензии Клеточную суспензию высевали в культуральную посуду и культивировали при 37°С в 5% СО2-инкубаторе . Через 48 ч . среду культивирования с неприкрепившимися клетками удаляли, культуры бережно отмывали DPBS (ПанЭ-ко, Россия) и добавляли свежую среду Дальнейшие смены среды проводили через 2—3 сут . В состав среды культивирования входил a-MEM (Пан-Эко, Россия) с добавлением 10% сыворотки плодов коров (FBS, ПанЭко, Россия), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина (ПанЭко, Россия) По мере роста и достижения субконфлюентного состояния клетки снимали трип-сином-ЭДТА (Gibco, США) и пересевали в новые флаконы с разведением 1:3. В эксперименте использовали культуру 3 пассажа

Перед трансплантацией определяли количество жизнеспособных клеток Тест на жизнеспособность проводили после ферментативного снятия клеток с дна культурального флакона Клетки суспендировали в физиологическом растворе . Для окраски к алик-воте клеток добавляли эквивалентный объем 4% раствора трипанового синего (ПанЭко, Россия), экспозиция 5 мин Полученную клеточную суспензию после окраски переносили в камеру Горяева и производили подсчет Во всех случаях количество жизнеспособных клеток составило более 93% .

Иммунофенотип ММСК оценивали по экспрессии ряда поверхностных маркеров Окрашивание ММСК костного мозга кошки проводили по протоколу фирм-изготовителей антител При окрашивании маркеров неконьюгированными антителами в качестве вторичных антител применялись антивидовые антитела, меченные флуоресцентными красителями В качестве контроля использовали пробы с добавлением неиммунных меченых FITC (Сорбент, Россия) и PE моноклональных антител (BD Biosciences, США) того же изотипа, что и антитела против исследуемого маркера Для окрашивания ядер использовали DAPI (Sigma, США) в концентрации 1 мкг/мл .

Микрофотографирование выполнено с помощью конфокального микроскопа (CarlZeiss, LSM 780, Германия) .

Контроль общего состояния животного и контроль заживления дефекта роговицы при посттравматической язве роговице проводили на 1, 7, 14, 25 сут . лечения . Для этого выполняли общие клинические, офтальмологические, гематологические и морфологические исследования

Общие клинические исследования включали в себя: учет общего состояния животного, контроль аппетита, пульсометрию, термометрию, подсчет количества дыхательных движений .

Офтальмологические исследования состояли из бокового осмотра дефекта после нанесения раствора метиленовой сини . Проводилась фотофиксация результатов . Глубину и диаметр дефекта при поступлении и в динамике определяли с помощью штангенциркуля .

Гематологические исследования включали: взятие и морфологические исследования крови. Образцы крови для исследования брали из вен тазовой конечности . Предварительно область подготавливали, удаляли шерсть Кожу обрабатывали ватным тампоном, смоченным 70% спиртом . Пробы крови отбирались стерильными иглами в стерильные одноразовые пробирки с антикоогулянтом (ЭДТА) в объеме 1—3 мл венозной крови .

Исследование крови проводилось в ветеринарной клинике «Академ-сервис» в течение 1—2 ч . после взятия образца Для исследования использовали гематологический анализатор Подсчет клеточных элементов проводили в камере Горяева . СОЭ определяли методом Панченкова, гемоглобин методом Сали

Микроскопические исследования для контроля течения воспалительного процесса включали: взятие и микроскопическое исследование мазков-отпечатков с конъюнктивы и роговицы пораженного глаза в различные периоды болезни . При этом проводили учет десквамированных клеток эпителия, характер микрофлоры и гематогенных клеток, явление фагоцитоза . Мазки-отпечатки окрашивали по Романовскому — Гимзе .

В группе I проведение тарзорафии и в группе II субконъюнктивальное введение культуры клеток проводилось под общим и местным обезболиванием . В качестве седативного средства использовали кси-лазин 2% 0,5—1,5 мг/кг массы, в качестве местного анестетика проводили орошение роговицы 2% раствором новокаина

Тарзорафия выполнялась следующим образом . Животное после введения в наркоз фиксировали в боковом положении, таким образом, чтобы пораженный глаз оказался сверху Операционное поле подготавливали традиционно: удаляли шерстный покров, загрязнения с кожи вокруг глаза, обезжиривали и дезинфицировали 70% раствором спирта-ректификата Третье веко захватывали глазным пинцетом и петле-видным швом фиксировали к наружному углу глаза

Статистическая обработка результатов

Все значения, приведенные в таблицах, представлены в виде средней (М) ± стандартная ошибка среднего значения (m) . Вычисления проводились с помощью пакета программ Microsoft Excel . Статистическая значимость различий определялась по тесту Вилкоксона — Манна — Уитни . Различие считалось достоверным при p<0,05 .

Результаты

Выделенные из костного мозга ММСК имели фибробластоподобную морфологию и характерный фенотип: СР10 + , ТЬ:у-1+, Stra-1+, СР166 + , СР71+, СР34-, Сй14- (рис . 1).

Все животные поступили с глубокими язвами роговицы, сопровождающимися угнетением общего состояния, снижением аппетита, нормальной, либо незначительно повышенной температурой тела, выраженным блефароспазмом, отеком век, конъюнктивы, болезненностью, истечениями гнойного характера

Язва роговицы диагностировалась при боковом осмотре Края язвы были неровными, дно матовым Она сопровождалась болезненностью, светобоязнью, блефароспазмом, гиперемией и отеком конъюнктивы и век, обильными слизисто-гнойными истечениями, помутнением роговицы

Зрительная способность пораженного органа зрения была снижена (в 50% случаев), либо отсутствовала (в 50% случаев), что зависело от диаметра поражения и интенсивности помутнения

роговицы Глубина и диаметр дефекта имели приблизительно равные значения у кошек обеих исследуемых групп

При исследовании мазков-отпечатков с конъюнктивы и роговицы констатирована следующая картина: большое количество эритроцитов, эпителий конъюнктивы и роговицы, клетки лейкоцитарного ряда, единичный фагоцитоз, микроорганизмы, преимущественно кокки . Это говорит о септическом продолжительном воспалительном процессе с поражением глубоких слоев роговицы и конъюнктивы . Результаты представлены в табл . 2 .

Результаты гематологических исследований выявили, что показатели гемоглобина, общего количества эритроцитов, лейкоцитов находились в пределах физиологической нормы СОЭ составила в среднем 9 мм/ч, что было выше физиологических показателей и свидетельствовало о наличии острого воспалительного процесса . В лейкограмме — увеличение числа палочкоядерных лейкоцитов

На основании проведённых исследований всем кошкам был поставлен диагноз — глубокий язвенный кератит, и начато лечение.

Таблица 1. Результаты замеров дефекта роговицы у кошек за весь период лечения, см

На момент начала лечения 7 сут. 14 сут. 25 сут.

I II I II I II I II

Глубина дефекта роговицы 0,043±0,006 0,04±0,007 0,05±0,002 0,01±0,003* 0,026±0,016* Не набл. Не набл. Не набл.

Диаметр дефекта роговицы 1,5±0,15 1,35±0,2 1,1± 0,05* 0,5±0,12* 0,7±0,08* Не набл. 0,06±0,09 Не набл.

Диаметр помутнения роговицы — - - 1±0,08 1,2±0,2 0,35±0,15* 0,5±0,1* 0,17±0,06*

Диаметр рубца - - - - - - - 0,07±0,02

* — р<0,05 по сравнению с предыдущим значением по группе .

Таблица 2. Результаты исследования мазков-отпечатков с конъюнктивы и роговицы у животных за весь период лечения

Гр. животных Показатели На момент поступления 7 сут. 14 сут. 25 сут.

I II I II I II I II

Десквамированный эпителий ++++ ++++ ++++ ++ +++ ++ ++ +

Микрофлора (кокки) +++ ++++ ++++ ++++ +++ + ++ -

Эритроциты ++++ +++ ++++ + ++ - - -

Клетки лейкоцитарного ряда +++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ +

Фагоцитоз ++ + ++ ++ ++ + +++ -

Состояние животных на 7 сут. лечения

В группе I на седьмой день лечения наблюдалась ярко выраженная местная воспалительная реакция и угнетение общего состояния животного, в единичных случаях полное отсутствие аппетита. Местная клиническая картина характеризовалась следующими симптомами: выраженная болезненность, выраженный отек век, выраженный блефароспазм, выраженный гнойный конъюнктивит, тилоз (утолщение края век) вследствие отека, конъюнктивальная инъекция сосудов

В группе II общее состояние животных удовлетворительное . У всех животных в группе сохранен аппетит. Местная воспалительная реакция сохраняется, она является менее интенсивной по отношению к группе I . Гнойные истечения слабо выражены, все показатели общего состояния в пределах норм, свойственных данному виду животных

В результатах гематологических исследований у животных группы I присутствуют неспецифические показатели воспалительного процесса, свидетельствующие о наличии его в организме кошек

В мазках-отпечатках группы I сохраняется большое количество слущенного эпителия, эри-

троцитов, клеток лейкоцитарного ряда, а также кокки, фагоцитарная активность слабо выражена (табл. 2).

Местная клиническая картина в группе II была представлена симптомами: болезненность, отек век, выраженный блефароспазм, незначительные гнойные истечения, незначительный тилоз, кератит, глубокая конъюнктивальная инъекция сосудов, глубокая васкуляризация роговицы . При осмотре дефекта наблюдалось глубокое прорастание сосудов в роговицу (васкуляризация) . Начало эпителизации язвы, ее диаметр и глубина, по сравнению с исходной, сократился в 3 раза . Помутнение роговицы сохранялось .

В группе II результаты общего анализа крови (ОАК) находились в пределах норм, свойственных данному виду животных

У особей этой группы в мазках-отпечатках наблюдается снижение количества десквамированных клеток эпителия, отсутствие или единичное количество эритроцитов, выраженный фагоцитоз . Полученные результаты исследований в совокупности с клинической местной картиной говорят о снижении интенсивности воспалительного процесса в данной группе животных

Состояние животных на 14 сут. лечения

В I группе животных общее состояние было удовлетворительным, аппетит сохранен, физиологические показатели находились в пределах нормы, свойственной данному виду животных Местная воспалительная реакция: сохранялись обильные гнойные истечения, болезненность, блефарит, веки были утолщены и отечны, дефект диагностировался при боковом осмотре после окрашивания метиленовым синим Края язвы были неровными, дно матовым, наблюдалось диффузное помутнение роговицы, единичные явления васкуляризации роговицы .

По результатам ОАК у кошек I группы зафиксировано повышение СОЭ до 10 мм/ч, в мазках-отпечатках фагоцитоз, кокки, большое количество эпителия роговицы и конъюнктивы, эритроциты (табл . 2) . Все это говорит о сохранении гнойного воспаления

Во II группе показатели ОАК были без отклонений от норм, свойственных данному виду животных В мазках отпечатках визуализировались эпителиальные клетки, лимфоциты, единичные кокки . Учитывая данные клинического осмотра и лабораторной диагностики, можно говорить о начале стадии пролиферации

Состояние животных на 25 сут. лечения

Общее состояние животных I группы было удовлетворительным, аппетит хорошим . Местная клиническая картина в этой группе характеризовалась симптомами: болезненностью, блефаритом, блефа-роспазмом, незначительными гнойно-слизистыми истечениями, кератитом, глубокой васкуляризацией роговицы Физиологические показатели и показатели ОАК не превышали установленных норм для животных данного вида . В мазках-отпечатках наблюдался выраженный фагоцитоз, клетки эпителия, кокки, клетки лейкоцитарного ряда (табл . 2) . Учитывая клиническую картину, осмотр, лабораторную диагностику, в роговице имела место воспалительная реакция в стадии эмиграции

Общее состояние животных во II группе на 25 сут было хорошим, аппетит выражен, физиологические показатели не превышали норм, свойственных данному виду животных Местное проявление клинических признаков воспаления не наблюдалось ни у одного из животных . Местная клиническая картина в данной группе была представлена симптомами: отек век, болезненность, блефароспазм, единичная глубокая васкуляризация роговицы, кератит, истечения не наблюдались, дефект роговицы визуально не наблюдался, рубец на роговице до 0,05 см Сохранялось локальное помутнение роговицы Зрительная способность сохранена В мазках-отпечатках визуализировались эпителий, лимфоциты (табл . 2).

Таким образом, на основании проведенных исследований нами выявлена динамика изменения

клинической картины в процессе заживления язв при использовании в качестве лечебного средства инъекций ММСК костномозгового происхождения в субконъюнктивальное пространство .

Клинически и при помощи дополнительных исследований, несмотря на малый объем выборки, было установлено, что применение ММСК в комплексной терапии посттравматических язв сопровождается:

— тенденцией к уменьшению частоты формирования глубоких дефектов роговицы по сравнению с контролем;

— тенденцией к уменьшению площади стромаль-ных дефектов во II группе, по сравнению с группой I, на протяжении всего срока наблюдения;

— более активным заживлением язвенного дефекта роговицы после трансплантации Так, уже к 25 сут . после трансплантации во II группе наблюдалась полная эпителизация роговой оболочки, тогда как на роговице животных в I группе к этому сроку сохранялся дефект стромы и эрозия роговицы;

— к концу эксперимента отмечалось закрытие эпителиального дефекта роговицы у всех кошек II группы, в то время как в I группе сохранялась пер-систирующая эрозия роговицы

Заключение

Применение ММСК красного костного мозга сопровождается менее агрессивным проявлением клинических признаков воспалительной реакции и ускорением сроков эпителизации дефекта роговицы в среднем на 7—10 сутй . Срок закрытия дефекта в I группе составил более 25 сут . , а именно на 34 сут . после начала лечения . Когда как во II группе, уже на 13 сут , мы не наблюдали дефекта роговицы

Показателем ранних регенеративных процессов в роговице служат фагоцитарная активность клеток лейкоцитарного ряда, количество сосудов в роговице при ее васкуляризации, степень проявления клинических признаков . Так, например, в группе II уже на 7 сут после начала лечения мы наблюдали глубокую васкуляризацию сосудов, выраженную фагоцитарную активность нейтрофилов и уменьшение дефекта до 0,6 см, когда в группе I сохраняется выраженный роговичный синдром и глубина дефекта до 1 мм . На 25 сут . лечения в группе II мы не наблюдали признаков местного воспаления, дефект при осмотре не диагностировался, когда как в группе I сохранялась местная воспалительная реакция и сохранялся дефект в диаметре до 0,2 см .

Следовательно, учитывая простоту и неинвазив-ность трансплантации суспензии аллогенных ММСК костного мозга в субконъюнктивальное пространство, данный метод может быть исследован с точки зрения безопасности и эффективности в широкой ветеринарной клинической практике для усиления регенеративных процессов в роговице и уменьшения сроков заживления

На момент поступления 7 день 14 день 25 день

в стационар лечения лечения лечения

Рис. 2. Динамика изменений состояния роговицы глаза во время лечения

Благодарности

Анализы выполнены в лаборатории лазерной конфокальной микроскопии Междисциплинарного центра аналитической микроскопии на приборе LSM 780 компании CARL ZEISS. Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидии, выделенной Казанскому федеральному универ-

ситету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета при финансовой поддержке государства в лице Минобрнауки России (Ю RFMEFI59414X0003) и Научно образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Пак Н . В ., Ченцова Е . В ., Зуева М . В . и др . Трансплантация ней-рональных стволовых клеток при экспериментальной ретинопатии . Вестник офтальмологии 2006; 1: 21-4 .

2 . Hofstetter С ., Schwarz E ., Hess D . et al . Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery . Proc . Nat . Acad . Sci . USA . 2002; 99(4): 2199-204 .

3 . Rama P . , Matuska S ., Paganoni G . et al . Limbal stem-cell

therapy and long-term corneal regeneration . N . Engl . J . Med . 2010; 363: 147-55 .

4 . Sel S ., Schilling U . M ., Nass N . et al . Bonemarrow cells and CD 117-positive haematopoietic stem cells promote corneal wound healing . Acta Ophthalmol . 2012; 90(5): 367-73 .

5 . Ye J . , Yao K ., Kim J . C . Mesenchymal stem cell transplantation in a rabbit corneal alkali burn model: engraftment and involvement inw ound healing . Eye (Lond) . 2006; 20(4): 482-90 .

Поступила: 09.07.2015