АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПОЗИЦИИ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В КАЧЕСТВЕ НЕ ЯВЛЯЮЩЕГОСЯ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКИМ ПРАЙМЕРА И АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО БЛОКАТОРА

1. Композиция олигонуклеотидов, включающая
олигонуклеотид в качестве блокатора, включающий функциональную группу или некомплементарный участок последовательности на 3'-конце или вблизи него, которая предотвращает ферментативное удлинение, где олигонуклеотид в качестве блокатора включает первую последовательность, включающую нейтральную по отношению к мишени подпоследовательность и блокаторную вариабельную подпоследовательность, где блокаторная вариабельная подпоследовательность фланкирована на ее 3'- и 5'-концах нейтральной по отношению к мишени подпоследовательностью и неразрывна с нейтральной по отношению к мишени подпоследовательностью.
олигонуклеотид в качестве первого праймера, который является достаточным для вызова ферментативного удлинения; где олигонуклеотид в качестве первого праймера включает вторую последовательность, где вторая последовательность перекрывается с нейтральной по отношению к мишени подпоследовательностью на протяжении по крайней мере 5 нуклеотидов, так что вторая последовательность включает перекрывающуюся подпоследовательность и неперекрывающуюся подпоследовательность, и где вторая последовательность не включает блокаторную вариабельную подпоследовательность.
2. Композиция олигонуклеотидов по п. 1, где функциональная группа включает 3-углеродный спейсер или дидезоксинуклеотид.
3. Композиция олигонуклеотидов по п. 1, где перекрывающаяся последовательность включает часть 5'-конца нейтральной по отношению к мишени подпоследовательности, где указанная часть составляет от приблизительно 5 нуклеотидов до приблизительно 40 нуклеотидов.
4. Композиция олигонуклеотидов по п. 1, где перекрывающаяся последовательность включает часть 5'-конца нейтральной по отношению к мишени подпоследовательности, где указанная часть составляет от приблизительно 7 нуклеотидов до приблизительно 30 нуклеотидов.
ο
ο
PT
BT
5. Композиция олигонуклеотидов по п. 1, где вторая последовательность создает стандартную свободную энергию гибридизации (ΔG), а первая последовательность создает стандартную свободную энергию гибридизации (ΔG), которая удовлетворяет следующему условию:
ο
ο
PT
BT
+2 ккал/моль≥ΔG-ΔG≥-8 ккал/моль
ο
3
6. Композиция олигонуклеотидов по п. 1, где неперекрывающаяся подпоследовательность создает стандартную свободную энергию гибридизации (ΔG), которая удовлетворяет следующему условию:
ο
3
-4 ккал/моль≥ΔG≥-12 ккал/моль
7. Композиция олигонуклеотидов по п. 1, где концентрация олигонуклеотида в качестве блокатора в приблизительно 2 - приблизительно 10000 раз выше концентрации олигонуклеотида в качестве первого праймера.
8. Композиция олигонуклеотидов по п. 1, где концентрация олигонуклеотида в качестве блокатора в приблизительно 5 - приблизительно 1000 раз выше концентрации олигонуклеотида в качестве первого праймера.
9. Композиция олигонуклеотидов по п. 1, дополнительно включающая олигонуклеотид в качестве второго праймера, достаточный для вызова ферментативного удлинения, где олигонуклеотид в качестве второго праймера включает третью последовательность, где третья последовательность не перекрывается с первой последовательностью или второй последовательностью, и где третья последовательность является нейтральной по отношению к мишени и достаточной для использования с олигонуклеотидом в качестве первого праймера для амплификации участка нуклеиновой кислоты, используя полимеразную цепную реакцию.
10. Композиция олигонуклеотидов по п. 9, дополнительно включающая олигонуклеотид в качестве второго блокатора, включающий вторую функциональную группу или второй некомплементарный участок последовательности на 3'-конце или вблизи него, которая предотвращает ферментативное удлинение, где олигонуклеотид в качестве второго блокатора включает четвертую последовательность, включающую вторую нейтральную по отношении к мишени подпоследовательность и вторую блокаторную вариабельную подпоследовательность, где вторая блокаторная вариабельная подпоследовательность является последовательностью, комплементарной блокаторной вариабельной подпоследовательности, где вторая блокаторная вариабельная подпоследовательность фланкирована на ее 3'- и 5'-концах второй нейтральной по отношению к мишени подпоследовательностью и неразрывна со второй нейтральной по отношению к мишени подпоследовательностью, где третья последовательность перекрывается со второй нейтральной по отношению к мишени подпоследовательностью на протяжении по крайней мере 5 нуклеотидов, так что третья последовательность включает вторую перекрывающуюся подпоследовательность и вторую неперекрывающуюся подпоследовательность, и где третья последовательность не включает вторую блокаторную вариабельную подпоследовательность.
11. Композиция олигонуклеотидов по п. 10, где вторая функциональная группа включает 3-углеродный спейсер или дидезоксинуклеотид.
12. Композиция олигонуклеотидов по п. 10, где вторая перекрывающаяся последовательность включает часть 5'-конца второй нейтральной по отношению к мишени подпоследовательности, где указанная часть составляет от приблизительно 5 нуклеотидов до приблизительно 40 нуклеотидов.
13. Композиция олигонуклеотидов по п. 10, где вторая перекрывающаяся последовательность включает часть 5'-конца второй нейтральной по отношению к мишени подпоследовательности, где указанная часть составляет от приблизительно 7 нуклеотидов до приблизительно 30 нуклеотидов.
ο
ο
PT2
BT2
14. Композиция олигонуклеотидов по п. 10, где третья последовательность создает стандартную свободную энергию гибридизации (ΔG), а четвертая последовательность создает стандартную свободную энергию гибридизации (ΔG), которая удовлетворяет следующему условию:
ο
ο
PT2
BT2
+2 ккал/моль≥ΔG-ΔG≥-8 ккал/моль
ο
6
15. Композиция олигонуклеотидов по п. 10, где вторая неперекрывающаяся подпоследовательность создает стандартную свободную энергию гибридизации (ΔG), которая удовлетворяет следующему условию:
ο
6
-4 ккал/моль≥ΔG≥-12 ккал/моль
16. Композиция олигонуклеотидов по п. 10, где концентрация олигонуклеотида в качестве второго блокатора в приблизительно 2 - приблизительно 10000 раз выше концентрации олигонуклеотида в качестве второго праймера.
17. Композиция олигонуклеотидов по п. 10, где концентрация олигонуклеотида в качестве второго блокатора в приблизительно 5 - приблизительно 1000 раз выше концентрации олигонуклеотида в качестве второго праймера.
18. Композиция олигонуклеотидов по любому из п.п. 1-17, дополнительно включающая реагент, необходимый для полимеразной цепной реакции.
19. Композиция олигонуклеотидов по любому из п.п. 1-17, дополнительно включающая множество нуклеозидтрифосфатов.
20. Композиция олигонуклеотидов по любому из п.п. 1-17, дополнительно включающая ДНК-полимеразу.
21. Композиция олигонуклеотидов по любому из п.п. 1-17, дополнительно включающая реагент, необходимый для полимеразной цепной реакции, множество нуклеозидтрифосфатов, ДНК-полимеразу.
22. Композиция олигонуклеотидов по любому из п.п. 1-17, где блокаторная вариабельная подпоследовательность представляет собой один нуклеотид.
23. Способ амплификации последовательности-мишени, включающий стадии
(а) получения образца, содержащего одну или более копий первой нуклеиновой кислоты, включающей вариант последовательности, и возможно содержащего по крайней мере одну копию второй нуклеиновой кислоты, включающей последовательность-мишень, где каждая из последовательности-мишени и варианта последовательности включает гомологичную подпоследовательность и вариабельную подпоследовательность, где вариабельная подпоследовательность включает по крайней мере один нуклеотид, и где вариабельная подпоследовательность последовательности-мишени представляет собой мишень-специфическую подпоследовательность, а вариабельная подпоследовательности варианта последовательности не является мишень-специфической подпоследовательностью;
(b) введения олигонуклеотида в качестве блокатора в образце, где олигонуклеотид в качестве блокатора включает первую последовательность, включающую нейтральную по отношению к мишени подпоследовательность и блокаторную вариабельную подпоследовательность, где нейтральная по отношению к мишени подпоследовательность комплементарна части гомологичной подпоследовательности, а блокаторная вариабельная подпоследовательность комплементарна не являющейся мишень-специфической подпоследовательности, где блокаторная вариабельная подпоследовательность фланкирована на ее 3'- и 5'-концах нейтральной по отношению к мишени подпоследовательностью и неразрывна с нейтральной по отношению к мишени подпоследовательностью;
(c) введения олигонуклеотида в качестве первого праймера в образец, где олигонуклеотид в качестве первого праймера является достаточным для вызова ферментативного удлинения, где олигонуклеотид в качестве первого праймера включает вторую последовательность, где вторая последовательность является комплементарной второй части гомологичной подпоследовательности, где вторая последовательность перекрывается с нейтральной по отношению к мишени подпоследовательностью на протяжении по крайней мере 5 нуклеотидов, так что вторая последовательность включает перекрывающуюся подпоследовательность и неперекрывающуюся подпоследовательность, и где вторая последовательность не включает какую-либо последовательность, комплементарную вариабельной подпоследовательности;
(d) введения в образец ДНК-полимеразы, нуклеозидтрифосфатов и одного или более реагентов, необходимых для полимеразной амплификации нуклеиновых кислот; и
(е) вызова реакции в образце в условиях, достаточных для достижения амплификации нуклеиновых кислот.
24. Способ по п. 23, в котором олигонуклеотид в качестве блокатора включает функциональную группу или некомплементарный участок последовательности на 3'-конце или вблизи него, которая предотвращает ферментативное удлинение.
25. Способ по п. 24, в котором функциональная группа включает 3-углеродный спейсер или дидезоксинуклеотид.
26. Способ по п. 23, в котором ДНК-полимераза является термостабильной ДНК-полимеразой.
ο
ο
27. Способ по п. 26, в котором условия, достаточные для достижения амплификации нуклеиновых кислот, включают подвергание образца по крайней мере 10 циклам, где в каждом цикле осуществляются по крайней мере 2 различных температурных воздействия, одно воздействие температуры, составляющей по крайней мере 85С, и одно воздействие температуры, составляющей не более 75С.
28. Способ по п. 23, дополнительно включающий стадию введения в образец фермента, выбираемого из группы, состоящей из делающего одноцепочечный разрыв фермента, рекомбиназы, геликазы, РНКазы, обратной транскриптазы или любой их комбинации.
29. Способ по п. 23, в котором перекрывающаяся последовательность включает часть 5'-конца нейтральной по отношению к мишени подпоследовательности, где указанная часть составляет от приблизительно 5 нуклеотидов до приблизительно 40 нуклеотидов.
30. Способ по п. 23, в котором перекрывающаяся последовательность включает часть 5'-конца нейтральной по отношению к мишени подпоследовательности, где указанная часть составляет от приблизительно 7 нуклеотидов до приблизительно 30 нуклеотидов.
ο
ο
PT
BT
31. Способ по п. 23, в котором вторая последовательность создает стандартную свободную энергию гибридизации (ΔG), а первая последовательность создает стандартную свободную энергию гибридизации (ΔG), которая удовлетворяет следующему условию:
ο
ο
PT
BT
+2 ккал/моль≥ΔG-ΔG≥-8 ккал/моль
ο
3
32. Способ по п. 23, в котором неперекрывающаяся подпоследовательность создает стандартную свободную энергию гибридизации (ΔG), которая удовлетворяет следующему условию:
ο
3
-4 ккал/моль≥ΔG≥-12 ккал/моль
33. Способ по п. 23, в котором концентрация олигонуклеотида в качестве блокатора, вводимого в образец, в приблизительно 2 - приблизительно 10000 раз выше концентрации олигонуклеотида в качестве первого праймера, вводимого в образец.
34. Способ по п. 23, в котором концентрация олигонуклеотида в качестве блокатора, вводимого в образец, в приблизительно 5 - приблизительно 1000 раз выше концентрации олигонуклеотида в качестве первого праймера, вводимого в образец.
35. Способ по п. 23, дополнительно включающий стадию введения олигонуклеотида в качестве второго праймера в образец, где олигонуклеотид в качестве второго праймера включает третью последовательность, где третья последовательность не перекрывается с вариабельной подпоследовательностью, и где третья последовательность является нейтральной по отношению к мишени и достаточной для использования с олигонуклеотидом в качестве первого праймера для амплификации участка нуклеиновой кислоты, включающего последовательность-мишень.
36. Способ по п. 35, дополнительно включающий стадию введения олигонуклеотида в качестве второго блокатора в образец, где олигонуклеотид в качестве второго блокатора включает четвертую последовательность, включающую вторую нейтральную по отношению к мишени подпоследовательность и вторую блокаторную вариабельную подпоследовательность, где вторая блокаторная вариабельная подпоследовательность является последовательностью, комплементарной блокаторной вариабельной подпоследовательности, где вторая блокаторная вариабельная подпоследовательность фланкирована на ее 3'- и 5'-концах второй нейтральной по отношению к мишени подпоследовательностью и неразрывна со второй нейтральной по отношению к мишени подпоследовательностью, где третья последовательность перекрывается со второй нейтральной по отношению к мишени подпоследовательностью на протяжении по крайней мере 5 нуклеотидов, так что третья последовательность включает вторую перекрывающуюся подпоследовательность и вторую неперекрывающуюся подпоследовательность.
37. Способ по п. 36, в котором олигонуклеотид в качестве второго блокатора включает вторую функциональную группу или второй некомплементарный участок последовательности на 3'-конце или вблизи него, которая предотвращает ферментативное удлинение.
38. Способ по п. 37, в котором вторую функциональную группу выбирают из группы, состоящей из 3-углеродного спейсера или дидезоксинуклеотида.
39. Способ по п. 36, в котором вторая перекрывающаяся последовательность включает часть 5'-конца второй нейтральной по отношению к мишени подпоследовательности, где указанная часть составляет от приблизительно 5 нуклеотидов до приблизительно 40 нуклеотидов.
40. Способ по п. 36, в котором вторая перекрывающаяся последовательность включает часть 5'-конца второй нейтральной по отношению к мишени подпоследовательности, где указанная часть составляет от приблизительно 7 нуклеотидов до приблизительно 30 нуклеотидов.
ο
ο
PT2
BT2
41. Способ по п. 36, в котором третья последовательность создает стандартную свободную энергию гибридизации (ΔG), а четвертая последовательность создает стандартную свободную энергию гибридизации (ΔG), которая удовлетворяет следующему условию:
ο
ο
PT2
BT2
+2 ккал/моль≥ΔG-ΔG≥-8 ккал/моль
ο
6
42. Способ по п. 36, в котором вторая неперекрывающаяся подпоследовательность создает стандартную свободную энергию гибридизации (ΔG), которая удовлетворяет следующему условию:
ο
6
-4 ккал/моль≥ΔG≥-12 ккал/моль
43. Способ по п. 36, в котором концентрация олигонуклеотида в качестве второго блокатора, вводимого в образец, в приблизительно 2 - приблизительно 10000 раз выше концентрации олигонуклеотида в качестве второго праймера, вводимого в образец.
44. Способ по п. 36, в котором концентрация олигонуклеотида в качестве второго блокатора, вводимого в образец, в приблизительно 5 - приблизительно 1000 раз выше концентрации олигонуклеотида в качестве второго праймера, вводимого в образец.
45. Способ по п. 23, включающий, после стадии (е), стадию извлечения аликвоты из образца и повторения стадий с (b) по (e) включительно.