ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЯ ПОЛИСЦИАС КУСТАРНИКОВЫЙ 6a №2 (Polyscias fruticosa (L.) Harms) В УСЛОВИЯХ IN VITRO - ПРОДУЦЕНТ ИЗОПРЕНОИДОВ
STRAIN OF CULTIVATED CELLS OF MING ARALIA 6a №2 (Polyscias fruticosa (L.) Harms) IN VITRO - ISOPRENOID PRODUCER

Область применения
Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения полисциаса кустарникового, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений - изопреноидов, которые широко используются в фармацевтической промышленности и косметологии.
Уровень техники
Некоторые авторы называют род полисциас Polyscias самым богатым по содержанию и многообразию изопреноидов, что делает его перспективным для исследований синтеза этих соединений и для создания их биотехнологического производства (Hostettmann K., Kizu H., Tomimori Т. Molluscicidial properties of various saponins, Planta medica, 1982. V.44, p.34-35).
Растение полисциас кустарниковый Polyscias fruticosa (L.) Harms используется как тонизирующее, повышающее работоспособность и сопротивляемость к инфекционным заболеваниям средство, а также как средство против головокружений. Экстракты этого растения усиливают лактацию, ускоряют ранозаживление и в сочетании с другими растениями используются против невралгии и ревматизма (Котин A.M. В поисках средства от всех заболеваний. СПб, ЗАО НПФ «Биофармтокс», 2001).
Помимо Вьетнама и Кубы данный вид встречается в Малайзии, Индонезии, Новой Гвинее, Полинезии (Грушвицкий И.В. Конспект семейства аралиевых и некоторые биологические особенности его представителей. Материалы к изучению женьшеня и других лекарственных растений Дальнего Востока, 1963, вып.5, стр.173-191).
Из листьев и корней Р.fruticosa были выделены 11 изопреноидов-гликозидов олеоноловой кислоты: полисциозиды А, В, С, D, Е, F, G, H, ладигинозид А (впервые выделенный из Ladyginia bucharica), зингиброзид R1 (впервые выделенный из Panax zingiberensis) и сложный эфир 3-O-[β-D-глюкопиранозил (1-4)-β-D-глюкопиранозил]олеаноловой кислоты и 28-O-β-D глюкопиранозила, выделенный из Swartzia simplex) (Vo D.H, Yamamura S., Ohtani K., Kasai R., Yamasaki K., Nguyen T.N., Hoang M.C. Oleanane saponions from Polyscias fruticosa. Phytochemistry, 1998, V.47, №3, pp.451-457). Широкий спектр синтезируемых гликозидов делает это растение перспективным для биотехнологического производства.
Однако авторы не обнаружили в литературе данных о получении культуры клеток in vitro полисциаса кустарникового P.fruticosa и о количественном содержании изопреноидов в листьях.
Задача изобретения
Задача изобретения - получение суспензионного штамма полисциаса кустарникового Polyscias fruticosa (L.) Harms - продуцента изопреноидов со стабильными ростовыми параметрами, устойчивым синтезом изопреноидов и отсутствием сезонной зависимости их получения.
Решение задачи
Эта задача была решена получением штамма культивируемых клеток растения полисциас кустарниковый (Polyscias fruticosa (L.) Harms) в условиях in vitro, депонированного в Российскую Коллекцию Культивируемых Клеток Высших Растений при учреждении Российской Академии Наук Институте Физиологии Растений им. К.А. Тимирязева РАН под обозначением 6а №2 - продуцент изопреноидов.
Новизна изобретения
Новизной настоящего изобретения является то, что впервые был получен штамм растения полисциас кустарниковый - продуцент изопреноидов.
Сущность изобретения
По мнению авторов, предлагаемое изобретение состоит в том, что за основу был взят не штамм растения полисциаса кустарникового, а сформированные листья среднего яруса, которые стерилизуют и помещают в жидкую питательную среду в качестве эксплантов. В результате был получен суспензионный штамм - продуцент изопреноидов.
Реализация изобретения
Культуру клеток полисциаса кустарниковго Polyscias fruticosa (L.) Harms не удалось получить стандартным способом - через каллусную культуру.
2
В качестве эксплантов используют сформированные листья среднего яруса. Листья промывают детергентом и стерилизуют 0,1% раствором сулемы (HgCl) в течение 1 мин. После стерилизации материал ополаскивают, а затем 3-кратно отмывают в течение 20 мин в дистиллированной стерильной воде. Листовые пластинки разрезают скальпелем на сегменты размером 5×5 мм и используют в качестве эксплантов, помещая их в жидкую питательную среду.
Для экспериментов используют жидкую питательную среду следующего состава (мг/л):
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
1650,000±2,0000
KNO<sub>3</sub>
1900,000±2,0000
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
370,000±1,0000
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
170,000±0,1000
СаС1<sub>2</sub>×2H<sub>2</sub>O
440,000±0,5000
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
6,200±0,0100
MnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
22,300±0,0200
ZnSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
8,600±0,0100
KI
0,830±0,0010
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,250±0,0010
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,025±0,0001
CoCl2×6H<sub>2</sub>O
0,025±0,0001
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
2,785±0,001
Na-ЭДТА
3,725±0,001
Гидролизат казеина
500,000±0,1000
Мезо-инозит
100,000±0,0500
Тиамин
0,100±0,0010
Пиридоксин
0,100±0,0010
Никотиновая кислота
0,500±0,0010
6-бензиламинопурин
1,000±0,0010
2,4-дихлорфеноскиуксусная кислота
2,000±0,0010
Сахароза
30000,000±100,0000
Культивирование проводят в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, на качалке (100±10 об./мин), в колбах объемом 250 мл (30-40 мл суспензии в колбе). Цикл субкультивирования составляет 2 недели. При пересеве на 1 объем инокулюма вносят от 3 до 10 частей свежей среды в зависимости от ростовых параметров культуры на данный момент.
Полученные суспензионные культуры клеток выращивают в течение более ста циклов. В процессе культивирования определяют ростовые и биосинтетические характеристики.
Штамм Polyscias fruticosa (L.) Harms 6a №2 обладает следующими признаками.
Культуральные признаки.
Биомасса клеток гомогенная, светло-желтой окраски, культуральная жидкость прозрачная. Описание визуальных и цитологических наблюдений.
Культура представлена меристемоподобными клетками, собранными в компактные агрегаты.
Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по числу клеток, по сырому и сухому весу биомассы. Число клеток подсчитывают в камере Фукса-Розенталя после мацерации суспензии в 20% растворе хромовой кислоты при 60°±1С в течение 15-20 минут в зависимости от возраста суспензии. Для определения веса сырой биомассы клетки отделяют от среды культивирования на бумажных фильтрах на вакуумном насосе, промывают водой и взвешивают. Сухую биомассу клеток получают после высушивания образцов при 25°±1С в потоке теплого воздуха. Жизнеспособность оценивают по проценту неокрашенных клеток в 0,1% растворе феносафранина.
В результате постоянного мониторинга состояния культур установлено, что жизнеспособность суспензионных культур постепенно повышается в процессе культивирования: с 5-50% в первые месяцы культивирования до 85-97% в последующие. В течение первого года выращивания отмечено постепенное улучшение ростовых характеристик, что скорее всего обусловлено постепенным отбором активно растущих клеток. Однако ростовые показатели, заметно улучшившись к 28 циклу культивирования, несколько снизились при дальнейшем выращивании. К 70-80 циклам субкультивирования рост культуры стабилизировался, что свидетельствует о формировании устойчивой популяции клеток. Ростовые характеристики культуры клеток полисциаса кустарникового представлены на чертеже 1.
При анализе представленных кривых роста следует отметить отсутствие лаг-фазы, а также наличие «ступеньки» на 5-10 сутки, что особенно выражено у кривой, описывающей изменение числа клеток в суспензии. Возможно, это связано с наличием двух субпопуляций клеток в культуре либо с особенностью утилизации сахарозы - ее расщеплением в среде выращивания с дальнейшим последовательным потреблением глюкозы и фруктозы. Замедление роста на 12-14 сутки культивирования позволяет использовать 2-недельный цикл выращивания. На 17 сутки в культуре клеток P.fruticosa отмечено начало стадии деградации.
Ростовые параметры (кроме индекса роста) рассчитывали по сухому весу биомассы. Результаты представлены в табл.1.
Для высокоэффективного жидкостного хроматографического (ВЭЖХ) анализа 35 мг воздушно-сухой биомассы культуры клеток экстрагируют 70% водным метанолом под действием ультразвука при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем полученный экстракт центрифугируют при 10 тыс.об./мин 6 мин. Супернатант фильтруют через нейлоновой фильтр с порами 0,2 мкм (Acrodisc, Германия).
2
4
ВЭЖХ анализ проводят на приборе Perkin Elmer Series 200 (PerkinElmer, США), укомплектованном автоматическим инжектором, бинарным градиентным насосом и спектрофотометрическим детектором. Разделение проводят на колонке Pecosphere 3CR С18, 83×4,6 мм, 3 мкм (PerkinElmer, США) при скорости потока подвижной фазы 1,5 мл/мин, температуре 25°С и детектировании на длине волны 207 нм. Элюирование осуществляют в градиентном режиме с использованием в качестве компонентов подвижной фазы ацетонитрила и 8 мМ раствора KHPO в воде. Состав подвижной фазы (% ацетонитрила) меняют по следующему закону: 0-3 мин - 20%, 3-3,5 мин - 20-22%, 3,5-14,5 мин - 22-26%, 14,5-15 мин -26-29%, 15-26 мин - 29-36%, 26-74 мин - 36-90%, 27-29 мин - 90%. Объем пробы 30 мкл.
1
13
5
2
Количественное содержание индивидуальных гликозидов определяют с помощью метода внешней калибровки. В качестве стандартов используют индивидуальные гликозиды, выделенные из листьев полисциаса папортниколистного, структура которых установлена методом H - и С-ЯМР: растворитель смесь пиридин-d/DO, прибор Bruker Avance AV600 (Германия), внутренний стандарт тетраметилсилан.
Результаты изобретения
4
6
Как видно из таблицы 1, штамм обладает высокой жизнеспособностью - около 95% при стабильных ростовых характеристиках. В штамме 6а №2 культуры клеток полисциаса кустарникового Polyscias fruticosa (L.) Harms было обнаружено 4 полисциозида (гликозиды олеаноловой кислоты) - D, P, А, P. Их количественное содержание на 14 сутки культивирования представлено в табл.2.
В результате изобретения была показана возможность получения суспензионной культуры клеток нестандартным путем - напрямую из эксплантов. Таким образом была получена суспензионная культура клеток P.fruticosa со стабильными ростовыми параметрами и устойчивым синтезом изопреноидов. Удобство такого способа получения этих соединений состоит в отсутствии сезонной зависимости их производства.
Табл.1.
Ростовые параметры культуры клеток Polyscias fruticosa (L.) Harms.
Показатели
Значения
Индексы роста по
весу сухой биомассы
2,8±0,7
весу сырой биомассы
3,7±1,2
числу клеток
2,1±0,5
Удельная скорость роста, сут<sup>-1</sup>
0,14±0,03
Время удвоения, сут.
4,8±0,8
Максимальное содержание биомассы, г/л
8,7±1,5
Жизнеспособность, %
95±1,7
Табл.2.
Содержание гликозидов в культуре клеток Polyscias fruticosa (L.) Harms
Полисциозиды, мг/г сух. массы
Сумм., мг/г
% сух. масс.
D
P<sub>4</sub>
А
Р<sub>6</sub>
3,24
7,34
0,23
3,87
14,68
1,47