СВОБОДНОЕ ОТ БЕЛКА ДЕТСКОЕ ПИТАНИЕ
PROTEIN-FREE INFANT FOOD

Настоящее изобретение относится к укреплению здоровья младенцев за счет приема детского питания на основе аминокислот.
Кормление материнской грудью является предпочтительным способом вскармливания младенцев. Однако часто после начального периода грудного вскармливания младенцев его прекращают, и тогда рацион младенца содержит в основном лишь молочную смесь («детское питание»).
Однако у небольшой группы младенцев кормление грудью или традиционным детским питанием вызывает отрицательные реакции, такие как боль и аллергические реакции. Люди, страдающие от аллергии, могут испытывать затруднения при переваривании или метаболизме некоторых веществ, входящих в состав пищевых продуктов, что в свою очередь приводит к кишечным аллергическим реакциям или системным аллергическим реакциям. Аллергические реакции главным образом вызываются белковой фракцией пищевого продукта. Для снижения нежелательного воздействия часто требуется значительно изменить рацион.
Для профилактики аллергической реакции на белок в рецептурном составе смеси для детского питания используют гидролизованный молочный белок, аминокислоты и немолочные белки, например соевый белок и другие питательные компоненты, не вызывающие аллергические реакции.
TM
Известны композиции смесей для детского питания, включающие аминокислоты в качестве источника азота, к которым относится Neocate для применения у пациентов, страдающих от аллергии, расстройства желудочно-кишечного тракта, экземы, синдрома недостаточного всасывания или нарушения пищеварения.
В предшествующем уровне техники используется небольшое число различных источников нутриентов для предотвращения попадания аллергенов в рецептурный состав смеси для детского питания при добавлении этих ингредиентов. Однако недостатком является то, что младенцы лишены положительного воздействия, оказываемого такими дополнительными ингредиентами.
В WO 2005/039319 описывается применение синбиотиков в смеси для детского питания, включающей белок в гидролизованном виде, что снижает риск возникновения аллергии (страница 11, строки 35-37).
В WO 2006/091103 описывается питательная композиция, включающая синбиотики для лечения и профилактики иммунологических нарушений, включая аллергию. Описывается, что применение гидролизата белка и/или свободных аминокислот снижает риск возникновения аллергии. Целью настоящего изобретения является улучшение рецептурных составов смеси для детского питания для этой группы риска за счет обеспечения дополнительной питательной ценности, без введения в композиции аллергенов.
Авторы настоящего изобретения понимают, что если исходная композиция смеси для детского питания содержит различные свободные аминокислоты без интактного белка, то это очень не предсказуемо для развития кишечной флоры. Вместо бифидобактерий и лактобактерий, являющихся доминантной флорой младенцев, в норме получающих грудное вскармливание, в желудочно-кишечном тракте младенцев, получающих пищевые продукты на основе аминокислот, превалирует множество других видов бактерий, включая потенциально патогенные виды бактерий.
Развитие здоровой кишечной флоры очень важно для всех младенцев, поскольку часто младенцы уже страдают от ослабления иммунологической функции, что часто приводит к коликам, запору, сопливости, сопению, рвоте, диарее, кровянистому стулу, слизи в стуле, сыпи или экземе.
Авторы настоящего изобретения признают, что развитие здоровой флоры очень важно для младенцев, получающих рацион, содержащий главным образом свободные аминокислоты в качестве источника белка. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения признают, что хорошая флора, то есть богатая бифидобактериями и Lactobacilli, по существу оказывает благотворное воздействие на созревание (мукозальной) иммунной системы. Хорошая флора предотвращает развитие аллергий или, по меньшей мере, снижает тяжесть аллергий у таких младенцев. Следовательно, авторы настоящего изобретения признают огромную важность и благотворное воздействие развития флоры на этих младенцев.
Несмотря на ограничения в рецептурном составе смеси для детского питания младенцев из группы риска, авторы настоящего изобретения обнаружили, что подобранные определенные пищевые олигосахариды, предпочтительно фруктаны и/или продукты деградации пектинов, могут быть добавлены с благотворным эффектом в основной рецептурный состав смеси для стимуляции развития флоры, без риска возникновения каких-либо побочных аллергических реакций.
В основной рецептуре смеси не используют никаких продуктов, получаемых из молока, поскольку это может привести к введению молочных аллергенов в продукт. Следовательно, пребиотические волокна по настоящему изобретению тщательно выбирают из известных пребиотических волокон, во избежание добавления в не аллергенную композицию молочного или других интактных и потенциально аллергенных белков, присутствующих в волокнах.
Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что в повсеместно признанной модели для аллергии при комбинировании пребиотических волокон с пробиотическими бактериями (предпочтительно бифидобактериями) проявляется синергетический эффект, заключающийся в предотвращении аллергической реакции. Этот синергетический эффект потенциально очень благотворен для младенцев, но также может быть таковым для взрослых.
На чертежах:
Фиг.1 - аллергический ответ на различные композиции, тестированные в соответствии с международно признанной вакцинацией на мышиной модели.
Bifidobacterium breve
Фиг.2 - синергетический эффект TD1 () и пищевых волокон (OS) на мышиной модели аллергии на казеин.
В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к применению композиции, включающей свободные аминокислоты в качестве единственного источника белка, источник жирных кислот, включающий длинноцепьевые полиненасыщенные жирные кислоты, источник углеводов, включающий усвояемые и неусвояемые углеводы, и свободные от молочного белка бифидобактерии, для получения композиции для лечения индивидуумов, страдающих от:
a. колик, запора, сопливости, сопения, рвоты, диареи, кровянистого стула, слизи в стуле, сыпи, экземы, гастроэзофагеального рефлюкса, эозинофильного эзофагита или астмы;
b. аллергии на коровье молоко и/или непереносимости пищевого белка; и/или
c. инфекций, где неусвояемые углеводы выбирают из источника, свободного от молочного белка, и вся композиция по существу свободна от интактного белка.
Используемый здесь термин «единственный источник белка» означает, что композиция по настоящему изобретению (предпочтительно) содержит, по меньшей мере, 99 вес.% аминокислот от всего белка, предпочтительно, по меньшей мере, 99,5 более предпочтительно, по меньшей мере, 99,9 вес.%.
Дополнительно настоящее изобретение относится к композиции, включающей белковый компонент, жировой компонент, усвояемый углеводный компонент, неусвояемый углеводный компонент и бифидобактерии, где:
a) белковый компонент содержит более 99 вес.% свободных аминокислот от всех белков и включает, по меньшей мере, следующие аминокислоты: аланин, аргинин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, метионин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин, валин и глютамин;
b) усвояемый углеводный компонент содержит менее 2 вес.% лактозы от всех усвояемых углеводов;
c) неусвояемый углеводный компонент включает растворимый фруктан со средней степенью полимеризации (СП) от 2 до 200 и растворимую галактуроновую кислоту со средней СП от 2 и 200; и
d) жировой компонент включает от 0,1 до 5 вес.% LCPUFA (длинноцепьевых полиненасыщенных жирных кислот) от общего содержания жирных кислот.
Как показано на Фиг.1, комбинация длинноцепьевых растворимых фруктанов (LFOS) с кислыми олигосахаридами (AOS), которой в данном случае является гидролизат пектина, работает как бифидобактерии при тестировании на мышиной модели. Ясно, однако, что если олигосахариды комбинировать с бифидобактериями, воздействие значительно повышается.
Bifidobacteria breve
В предпочтительном варианте изобретения питательная композиция включает неусвояемые волокна и бифидобактерии, поскольку эта композиция дает наилучшие результаты на мышиной модели на аллергию (смотрите Фигуру 1). Предпочтительно используют .
Неусвояемые углеводы
Фруктаны представляют собой нейтральные олигосахариды на основе фруктозы (>50% монозных единиц представляют собой фруктозу), предпочтительно инулин, фруктан и/или фруктоолигосахариды, наиболее предпочтительно смесь длинноцепьевых фруктоолигосахаридов ((lcFOS)) со средней СП от 10 до 60 и короткоцепьевых фруктоолигосахаридов (scFOS) со средней СП от 3 до 10. Предпочтительный вариант изобретения включает смесь (lcFOS) и (scFOS) в соотношении 1:9, поскольку это соотношение ближе всего к композиции олигосахаридов грудного молока и обеспечивает эффективную стимуляцию роста бифидобактерий у младенцев.
Способ по настоящему изобретению предпочтительно включает введение порции, включающей от 0,05 до 25 грамм неусвояемых сахаридов, предпочтительно от 0,1 до 5 грамм. Предпочтительно способ по настоящему изобретению включает от 0,05 до 25 грамм (scFOS), предпочтительно от 0,1 до 5 грамм (scFOS). Предпочтительно способ по настоящему изобретению включает введение неусвояемых сахаридов от 0,05 до 25 грамм в день, предпочтительно от 0,1 до 5 грамм в день.
Продукты деградации пектина
Пектин подразделяется на две основные категории: высокометоксилированный пектин, характеризующийся степенью метоксилирования выше 50% и низкометоксилированный пектин со степенью метоксилирования ниже 50%. Используемый здесь термин «степень метоксилирования» (также указываемая, как СЭ или «степень этерификации») относится к количеству свободных групп карбоновых кислот, содержащихся в этерифицированной (например, метилирование) цепочке полигалактуроновой кислоты. Предпочтительно пектин по настоящему изобретению получают из высокометоксилированного пектина.
Предпочтительно пектин характеризуется степенью метоксилирования выше 20%, предпочтительно выше 30%, еще более предпочтительно выше 50%.
Пектин, используемый в способе по настоящему изобретению, имеет среднюю степень полимеризации (СП) от 2 до 500, предпочтительно от 10 до 250 и наиболее предпочтительно от 20 до 50. При использовании смеси пектинов с различной степенью полимеризации средняя СП кислых олигосахаридов смеси предпочтительно составляет от 3 до 1000, более предпочтительно от 3 до 250, еще более предпочтительно от 3 до 50. Было обнаружено, что более низкая СП олигосахаридов улучшает вкусовую привлекательность и снижает вязкость продукта, если кислые олигосахариды добавлять в жидкой форме.
Пектин предпочтительно добавляют от 0,1 до 100 грамм в день, предпочтительно от 0,4 до 50 грамм в день, еще более предпочтительно от 1 до 20 грамм в день.
Предпочтительный вариант изобретения включает фруктаны и продукты деградации пектина в соотношении 50:50-95:5. Предпочтительно соотношение составляет 85:15, поскольку в таком соотношении нейтральные олигосахариды и кислые олигосахариды присутствуют в грудном молоке.
Пробиотические бактерии
Пробиотические бактерии, подходящие для применения по настоящему изобретению, по меньшей мере, оказывают положительное воздействие на мышиную модель на аллергию, как показано в примерах ниже. Дополнительно пробиотики по существу не должны содержать пищевых аллергенов. Для получения таких пробиотических бактерий требуются специальные процедуры или культуральная среда без интактного белка.
Следовательно, предпочтительный вариант изобретения включает пробиотические бактерии, по существу не содержащие интактного пищевого белка или пищевых аллергенов, в частности, по существу отсутствует молочный белок.
Bifidobacterium breve
В предпочтительном варианте изобретения пробиотические бактерии представляют собой бифидобактерии. Еще более предпочтительно пробиотические бактерии представляют собой . Бифидобактерии обладают очень высокой толерантностью, индуцируя воздействие на используемые мышиные модели и, следовательно, предпочтительны. В частности, очень эффективны Bifidobacterium breve.
В другом предпочтительном варианте изобретения Bifidobacteria не жизнеспособны. Это является преимуществом, поскольку увеличивает срок годности пищевых продуктов, и иммуномодулирующая активность бактерий становится независимой от количества живых бифидобактерий. Эксперименты показали, что иммуностимулирующее воздействие нежизнеспособных бактерий аналогично, а иногда даже лучше, чем активность живых бифидобактерий.
2
13
2
12
5
10
4
9
Композиция по настоящему изобретению предпочтительно включает от 10 до 10 колония образующих единиц (КОЕ) бифидобактерий на грамм сухой массы композиции по настоящему изобретению, предпочтительно от 10 до 10 КОЕ, более предпочтительно от 10 до 10 КОЕ, наиболее предпочтительно от 10 до 5×10 КОЕ.
Аминокислоты
Аминокислоты могут быть использованы в питательной смеси для питания детей младшего возраста и младенцев. Однако композиция аминокислот в смеси для питания предпочтительно включает все незаменимые аминокислоты, за исключением композиций для пациентов с фенилкетонурией (ФКУ) и для пациентов с неФКУ врожденными пороками метаболизма и предпочтительно оптимальна для питания детей младшего возраста или питания младенцев. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что наиболее оптимальная аминокислотная композиция должна быть как можно ближе к аминокислотной композиции белковой фракции грудного молока. Предпочтительная аминокислотная композиция в результате приведена в Таблице 1 (смотрите ниже). В предпочтительном варианте изобретения композиция включает менее 1 вес.% пептидов от общей массы белка и более 99 вес.% свободных аминокислот от всего белка, включает, по меньшей мере, следующие аминокислоты: аланин, аргинин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, метионин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин, валин и глютамин.
Смесь для детского питания
Смесь для детского питания по изобретению включает свободные аминокислоты в качестве источника азота, жир, включая смесь жиров, включающую LCPUFA, и углеводы. Витамины и минеральные вещества добавляют согласно нормативным требованиям.
Предпочтительно композиция по изобретению предназначена для кормления младенцев и включает липидный компонент, белковый компонент и углеводный компонент. Предпочтительно липидный компонент обеспечивает от 5 до 50% всех калорий, предпочтительно белковый компонент обеспечивает от 5 до 50% всех калорий и предпочтительно углеводный компонент обеспечивает от 15 до 90% всех калорий. Предпочтительно композицию по настоящему изобретению используют в качестве смеси для питания младенцев, где липидный компонент обеспечивает от 35 до 50% всех калорий, белковый компонент обеспечивает от 7,5 до 12,5% всех калорий и углеводный компонент обеспечивает от 40 до 55% всех калорий. Для расчета % всех калорий для белкового компонента необходимо брать общую энергию, обеспечиваемую аминокислотами.
LCPUFA
Содержание LCPUFA с от 20 до 22 атомов углерода в композиции по настоящему изобретению предпочтительно не превышает 15 вес.% от общего содержания жира, предпочтительно не превышает 10 вес.%, еще более предпочтительно не превышает 5 вес.% от общего содержания жира. Предпочтительно композиция включает, по меньшей мере, 0,1 вес.%, предпочтительно, по меньшей мере, 0,25 вес.%, более предпочтительно, по меньшей мере, 0,5 вес.%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 0,75 вес.% LCPUFA с от 20 до 22 атомов углерода от общего содержания жира. Предпочтительно содержание докозагексаеновой кислоты (ДГК) не превышает 5 вес.%, более предпочтительно не превышает 1 вес.% и составляет, по меньшей мере, 0,1 вес.% от общего содержания жиров. Поскольку было обнаружено, что арахидоновая кислота (AA) эффективно снижает проницаемость кишечной непроницаемой перегородки, композиция по настоящему изобретению включает относительно высокие количества, предпочтительно, по меньшей мере, 0,1 вес.%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 0,25 вес.%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 0,5 вес.% от общего содержания жиров. Предпочтительно содержание AA не превышает 5 вес.%, более предпочтительно не превышает 1 вес.% от общего содержания жиров. Избыток метаболитов из АА может вызвать воспаление. Однако композиция по настоящему изобретению предпочтительно включает AA и ДГК при массовом соотношении AA/ДГК предпочтительно выше 0,25, предпочтительно выше 0,5, еще более предпочтительно выше 1. Предпочтительно соотношение составляет ниже 25.
LCPUFA предпочтительно представляют собой нерыбные, полученные из одноклеточных масла, доступные например от Martek.
Предпочтительные признаки композиций по настоящему изобретению приведены в Таблицах 1-3.
Таблица 1
<b>Содержание аминокислот в композиции по настоящему изобретению</b>
Аминокислота
Единицы
Содержание АА как процент от общего содержания АА (г/100 г)
Младенец 0-1 год
Ребенок младшего возраста 1-10 лет
Ala
г
3,95
4,01
3,12
3,03
Arg
г
6,99
7,02
14,24
13,91
Asp
г
6,54
6,57
5,73
5,59
Cys
г
2,59
2,58
1,85
2,91
GIu кислота
г
0,00
0,00
0,00
GIy
г
6,15
6,12
5,11
5,01
His
г
4,02
3,99
3,71
3,61
lso
г
6,15
6,12
5,11
5,01
Leu
г
10,56
10,51
8,54
8,32
Lys
г
7,19
7,19
6,25
6,11
Meth
г
1,68
1,69
4,02
3,90
Phe
г
7,51
7,47
7,10
6,93
Pro
г
4,73
4,72
5,97
5,82
Ser
г
4,60
4,61
3,71
3,61
Thr
г
5,18
5,17
4,29
4,19
Try
г
2,07
2,08
1,72
1,69
tyr
г
4,73
4,72
1,44
1,40
VaI
г
6,74
6,74
5,42
5,30
Car
г
0,06
0,06
0,10
0,12
tau
г
0,19
0,20
0,17
0,17
GIu
г
8,42
8,43
12,35
13,39
Итого
г
100
100
99,97
100
Таблица 2
<b>Питательная смесь для питания младенцев с аллергией</b>
Питательный профиль смеси для питания младенцев по настоящему изобретению (порошок)
Единицы
Содержание/100 г
Содержание/100 ккал
Эквивалент белка
г
13
2,9
Энергия
ккал
455
100
Азот
г
2,1
Углеводы
г
49
10,8
Жир (общий)
г
23
5,1
(МСТ)
%
33
(LCT)
%
67
Таблица 3
<b>Содержание длинноцепьевых полиненасыщенных (ДЦПН) жирных кислот в композиции</b>
% жирных кислот
Предпочтительный
Пределы +/-25%
Арахидоновая кислота
0,35
0,26
0,44
Докозагексаеновая кислота
0,20
0,15
0,25
Итого ДЦПН
0,55
0,41
0,69
Предпочтительные пределы олигосахаридной композиции составляют 0,4-1,2 г/100 мл, где 85 вес.% составляют (scFOS) и (lcFOS), и 15 вес.% составляет гидролизат пектина. Предпочтительно соотношение (scFOS) к (lcFOS) составляет от 2 до 20, еще более предпочтительно соотношение составляет 9.
В одном предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение представляет собой свободную от молочного белка и аллергенов полнорационную порошкообразную композицию по настоящему изобретению, подходящую для разведения водой, с получением энтерального питания, включающего:
<b>Компонент</b>
<b>На 100 г порошка</b>
Эквивалент белка (г)
13
Общее содержание аминокислот (г)
15,5
Общее содержание жира (г)
23
Подсолнечное масло (г)
4
Фракционированное кокосовое масло (г)
7
Масло канолы (г)
4
Подсолнечное масло с высоким содержанием олеина (г)
6,6
Масло ARASCO<sup>TM</sup> (г)
0,21
Масло DHASCO<sup>TM</sup> (г)
0,11
Углеводы: Мальтодекстрин (г)
49
Пребиотик (г)
5,33
(scFOS) (г)
4,1
(lcFOS) (г)
0,43
КОС (г)
0,8
Пробиотик: <i>B. Breve</i> (колония образующие единицы; КОЕ)
1×10<sup>10</sup>
Другие витамины/минеральные вещества/микроэлементы
Баланс
Указанная выше композиция обеспечивает около 455 ккал энергии на 100 г порошка.
Композиция может быть разведена холодной кипяченой водой с получением рекомендованной концентрации 15% масса/объем.
Применение
Предпочтительно композицию применяют для лечения младенцев (по существу с атопическим состоянием), страдающих от:
a. колик, запора, сопливости, сопения, рвоты, диареи, кровянистого стула, слизи в стуле, сыпи, экземы, гастроэзофагеального рефлюкса, эозинофильного эзофагита или астмы;
b. аллергии на коровье молоко и/или непереносимости пищевого белка; и/или
c. инфекций.
Также предпочтительно композиция может быть использована для улучшения характеристик стула у младенцев, страдающих от вышеуказанных симптомов. По существу композиция составлена для младенцев в возрасте от 0 до 3 лет. С некоторыми адаптациями по аминокислотному профилю (смотрите Таблицу 1) композиция также подходит для детей в возрасте от 3 до 10 лет. Младенцы с аллергией часто страдают от диареи, но также у них случаются запоры. Предпочтительно композиция, которая может быть использована для профилактики и лечения этих симптомов, включает пищевые волокна согласно композиции грудного молока, где соотношение (scFOS)/(lcFOS) составляет 9:1 и дополнительно присутствует гидролизат пектина.
ПРИМЕРЫ
Bifidobacterium breve
Для определения иммуностимулирующего воздействия олигосахаридов и пробиотика  (TD 1) проводят тесты в соответствии с международно признанной вакцинацией на мышиной модели (Фигура 1) и аллергической модели (Фигура 2).
Материалы и способы вакцинации на модели
Самок мышей в возрасте 6-8 недель C57BI/6JOIaHsd от Harlan (Horst, Нидерланды) содержат в нормальных условиях с 12-часовым циклом ночь/день и с неограниченным доступом к корму и воде. Все эксперименты одобрены независимой комиссией по экспериментам на животных (DEC Consult, Bilthoven, Нидерланды).
Рационы и препараты олигосахаридов
Все животные получают частично очищенные рационы на основе AIN-93G (Research Diet Services. Wijk bij Duurstede, Нидерланды). Все дополнительные олигосахаридные продукты заменяют с учетом того же количества общих углеводов, чтобы поддерживать этот параметр одинаковым. Кроме того, этот подход в результате позволяет сравнить все углеводные композиции различных рационов при гарантии того, что кишечная флора имеет минимальные воздействию различия между контролем и тестируемыми рационами по таким параметрам, как время прохождения через желудочно-кишечный тракт и задержка жидкости. Олигосахариды смешивают с рационом AIN-93G и прессуют в гранулы.
Протокол вакцинации и РКГ ответ (реакция кожной гиперчувствительности)
Эксперименты по вакцинации проводят с использованием Influvac (инфлювак) (Solvay Pharmaceuticals, Weesp, Нидерланды) сезона 2002/2003. Это вакцина инактивированного вируса гриппа на основе выделенных антигенов гемагглютинина (HA) и нейраминидазы трех штаммов миксовируса гриппа в дозе, эквивалентной 30 мкг/мл HA на штамм (90 [мкг/мл HA в общем). Для всех вакцинаций используют масляный адъювант (Stimune, ранее известный как Specol; Cedi-diagnostics, Lelystad, Нидерланды). Сначала мышам проводят вакцинацию и потом повторно вакцинируют подкожно (п/к) смесью вакцины и адъюванта 1:1 общим объемом 100 мкл. Повторную вакцинацию проводят через 21 день после первой вакцинации. Эксперименты заканчивают через 10 дней после повторной вакцинации. Образцы крови (делают ретро- орбитальный прокол) берут перед первой и второй вакцинацией и в конце эксперимента. Во все эксперименты включены негативные контрольные группы (указанные, как «ложная группа»), получающие инъекции смеси 1:1 PBS и адъювант общим объемом 100 мкл. Ложные группы никогда не используют для статистического сравнения, они служат только для демонстрации специфичности ответов, индуцированных вакциной. РКГ реакции были индуцированы через 9 дней после повторной вакцинации п/к инъекцией 25 мкл Influvac в ушные раковины обоих ушей. Толщину ушей измеряют дважды перед вакцинацией и через 24 часа после нее с использованием цифрового микрометра (Mitutoyo Digimatic 293561, Veenendaal, Нидерданды). РКГ ответ рассчитывают, вычитая базальную толщину уха из показателя через 24 часа после вакцинации.
Материалы и методы, применяемые для модели на аллергию на белок коровьего молока
Химические реактивы
Казеин и сыворотку получают от DMV international, Veghel, Нидерланды.
Токсин холеры доступен от Quadratech Diagnostics, Epsom, UK. PBS доступен от Cambrex Bio Science, Verviers, Бельгия. Буфер для сенсибилизации поверхностей Elisa доступен от Sigma, Alphen aan den Rijn, Нидерланды. Биотин, меченный крысиный анти мышиный IgE, доступен от BD Biosciences, Alphen aan den Rijn, Нидерланды. Все другие химические реагенты доступны от Sigma-Aldrich-Chemie, Zwijndrecht, Нидерланды.
Оральная сенсибилизация и введение веществ
мышам
Самок мышей, свободных от специфического патогена, в возрасте от трех до 5 недель C3H/HeOuJ (n=4-6 на группу) получают от Charles River Laboratories (Maastricht, the Нидерланды), содержат их на питании для мышей, свободном от молочного белка (Special Diets Services, Witham, Essex, Великобритания) и содержат их в виварии Утрехтского Университета (Utrecht University). Животных содержат и используют согласно требованиям Датской комиссии по экспериментам на животных. Мышей сенсибилизируют интра-гастрально (и/г) 0,5 мл гомогенизированного казеина (40 мг/мл PBS) токсином холеры в качестве адъюванта (CT, 20 мкл/мл PBS), используя тупую иглу. Контрольные мыши получают только CT или PBS. Мышей вакцинируют повторно еженедельно в течение 6 недель, через одну неделю после последней сенсибилизации мышам вводят и/г 100 мг казеина.
После этого собирают и центрифугируют образцы крови (15 минут при 13500 оборотов в минуту). Сыворотку хранят при -70°C. Мышей умерщвляют смещением шейных позвонков через полтора часа после и/г вакцинации.
Аллерген-специфический кожный ответ
Острый аллерген-специфический кожный ответ измеряют после инъекции специфического белка в ушную раковину. Перед и/г введением веществ (t=0), контроль, сенсибилизированным казеином мышам делают внутрикожную (в/к) инъекцию в левое ухо 20 мкл гомогенизированного казеина (0,5 мг/мл в PBS) соответственно. В правое ухо в качестве контроля делают инъекцию 20 мкл PBS. Также мышам, получившим CT и PBS, вводят казеином в ухо и PBS в качестве контроля. Толщину уха измеряют дважды с использованием цифрового микрометра (Mitutoyo, Veenendaal, Нидерланды), через 0, 1, 4 и 24 часа после введения. Отек уха с аллергенспецифической реакцией рассчитывают, вычитая базальную (0 ч) и контрольную (правое ухо) толщину из измеренного показателя в три различных момента времени (1, 4 и 24 ч).
Измерение сывороточного иммуноглобулина и уровней протеазы-1 в тучных клетках мыши
2
4
Концентрации общего IgE и уровни казеина или специфичного сывороточного IgE, IgGI и lgG2a определяют в сыворотке умерщвленных мышей при использовании ELISA. Пластинки микролона (Greiner, Alphen aan den Rijn, Нидерланды) покрывают казеином в буфере для сенсибилизации поверхностей или крысиным анти мышиным IgE (1 мкг/мл) в PBS в течение 18 часов при 4°C. Пластинки промывают и блокируют в течение 1 часа 5% BSA. Образцы сыворотки подвергают нескольким разведениям и инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре. Пластинки промывают 5 раз и инкубируют 1 мкг биотина меченного крысиным анти мышиным IgE в течение получаса при комнатной температуре. После промывания полоски инкубируют с пероксидазой хрена (HRP) в течение часа, промывают и выявляют o-фенилендиамином (OPD). Реакцию останавливают 4M HSO и абсорбцию измеряют при 490 нм на считывающем устройстве для микропланшетов Benchmark (Biorad, California, США). Концентрации сыворотки протеазы-1 в тучных клетках мышей (mMCP-1) определяют, как описано ранее, с использованием коммерчески доступного набора ELISA (Moredun Scientific Ltd., Midlothian, Великобритания).
Bifidobacterium breve
Результаты вакцинации на мышиной модели приведены на Фиг.1, из которой ясно видно, что комбинация (пищевых волокон и) TD 1 (=) обеспечивает самое сильное воздействие на РКГ ответ и значительно лучше, чем только TD1 или любой другой тестируемой комбинации.
Результаты аллергии на казеин на мышиной модели приведены на Фиг.2 и демонстрируют, что комбинация пищевых волокон и TD 1 синергетически ингибирует «аллергический» РКГ ответ на казеин.