СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ К БЕЛКУ р17 ВИЧ
METHOD OF OBTAINING ANTIBODIES TO PROTEIN p17HIV

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано для диагностики, профилактики и лечения ВИЧ-инфекции.
Капсидный белок вируса иммунодефицита человека (белок р17) выполняет важную структурообразующую роль в вирионе ВИЧ и принимает участие в обеспечении жизненного цикла вируса в клетке, а также в патогенезе ВИЧ-инфекции (Marini E, Tiberio L, Caracciolo S, Tosti G, HIV-1 matrix protein р17 binds to monocytes and selectively stimulates MCP-1 secretion: role of transcriptional factor AP-1. 2008, Cell Microbiol. 10(3): 655-666). В частности, белок р17 белок циркулирует в крови ВИЧ-инфицированных, выполняя функцию «вирусного цитокина». Так, связываясь со специфическим рецептором, белок р17 взаимодействует с моноцитами, а также с преактивированными В-клетками и Т-клетками периферической крови, усиливая их пролиферацию, что способствует репликации вируса (De Franchesco M., Caruso A., Fallacara F. et al. HIV p17 enhances lymphocyte proliferation and HIV-1 replication after binding to a human serum factor. 1998, AIDS, vol. 12: 245-252). Показано также, что в лимфоузлах ВИЧ-инфицированных, длительное время принимающих антивирусную терапию, белок р17 обнаруживается даже спустя много месяцев после начала терапии, возможно персистенция р17 оказывает стимулирующее действие на скорость размножения вируса после окончания курса противовирусной терапии (Fiorentini S., Riboldi E., Facchetti F. et al. HIV-1 matrix protein p17 induces human plasmacytoid dendritic cells to acquire a migratory immature cell phenotype. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2008, 105(10): 3867-3872).
Известно (Fiorentini S., Marini E., Bozzo L. et al. Preclinical studies on immunogenicity of the HIV-1 p17-based synthetic peptide AT20-KLH. Biopolymers (Peptide science) 2004, 76(1): 334-343), что связывание с клеточным рецептором осуществляется через участок белка р17 с координатами 11-18. При этом данный участок частично перекрывается иммуногенными эпитопами 17-22 и 12-19, к которым были получены вируснейтрализующие антитела. (Papsidero LD., Sheu M., Ruscetti F.W. Human Immunodeficiency virus type 1 neutralizing monoclonal antibodies which react with p17 core protein: characterization and epitope mapping. J. of Virology, 1989, 63(1): 267-272)
С учетом имеющихся данных о структуре белковой молекулы белка р17 для инактивации цитокиновой активности белка р17 необходимы антитела, блокирующие более широкий участок белка р17 с координатами 10-30. Однако до настоящего времени не удавалось получить такие антитела с достаточно высоким выходом, т.к. при введении в организм белка р17 образуются антитела преимущественно к другим иммуногенным эпитопам (участкам) белка, при этом титры антител к участку 10-30 весьма незначительные, что указывает на его слабую иммуногенность.
Известен способ получения антител путем введения в организм пептида АТ-20, представляющего собой фрагмент белка р17 с координатами 9-28, коньюгированного с белком-носителем гемоцианином. (Fiorentini S., Marini E., Bozzo L. et al. Preclinical studies on immunogenicity of the HIV-1 p17-based synthetic peptide AT20-KLH. Biopolymers (Peptide science) 2004, 76(1): 334-343). Коньюгат в неполном адьюванте Фрейнда трехкратно вводили мышам внутриперитонеально. В результате у мышей были индуцированы антитела к белку р17 в титрах от 1:25000 до 1:102600. При этом титр антител к пептиду АТ-20 колебался от 1:400 до 1:6400 и только сыворотки с титром антител к белку р17, равным 1:102600, обладали способностью полностью ингибировать связывание белка р17 с клеточным рецептором. Указанные результаты свидетельствуют о преобладании в сыворотках иммунизированных животных антител к другим эпитопам белка р17, не имеющим отношения к участку, связывающемуся с клеточным рецептором.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа повышения образования антител против участка 10-30 вирусного белка р17 в организме.
Техническая задача решалась путем неоднократного введения в организм рекомбинантного белка р17 в сочетании с интерлейкином-1β. При этом белок р17 вводят по крайней мере дважды в разовой дозе 5-10 мкг, а интерлейкин-1β (ИЛ-1β) в дозе 5-50 мкг/кг. Оптимальный вариант достигался при двукратном введении 10 мкг/кг белка р17 и трехкратном введении интерлейкина-1β (одновременно с белком р17; через 24 и 48 часов после первого введения интерлейкина-2β). При этом белок р17 вводили подкожно с интервалом 14 дней в адьюванте на основе гидроокиси алюминия, а интерлейкин-2β внутрибрюшинно в 200 мкл фосфатно-солевого раствора.
Практическая применимость изобретения иллюстрируется следующим примером:
Пример 1. Индукция иммунного ответа у лабораторных мышей, иммунизированных рекомбинантным белком р17.
Рекомбинантный белок р17 и рекомбинантный интерлейкин-1β получали известным способом. Лабораторных мышей иммунизировали дважды, подкожно, с интервалом 14 дней, рекоминантным белком р17 в адъюванте на основе гидроокиси алюминия (Imject Alum (Pierce)) в дозе 5 и 10 мкг. Одновременно вводили внутрибрюшинно интерлейкин-1β в в дозах 5,25 и 50 мкг/кг веса в 200 мкл фосфатно-солевого раствора. Через 24 и 48 часов инъекции интерлейкина-2β повторяли. Животные контрольной группы получали в соответствующие дни внутрибрюшинно 200 мкл фосфатно-солевого раствора.
Сыворотку от животных собирали через 14 дней после второй иммунизации и методом твердофазного иммуноферментного анализа определяли титры антител к рекомбинантному белку р17 и синтетическому пептиду р17(10-30). Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Влияние доз ингредиентов на титры IgG к белку р17 и пептиду р17(10-30)
Белок р17
Адъювант
Титр антител к белку р17
Титр антител к пептиду р17(10-30)
По 10 мкг/кг двукратно
Контроль (ФСР)
10,4±1,1
1,3±2,7
По 5 мкг/кг двукратно
ИЛ-1β по 5 мкг/кг дважды по 3 раза
4,6±1,2
2,2±3,5**
По 10 мкг/кг двукратно
ИЛ-1β по 5 мкг/кг дважды по 3 раза
9,4±1,3
6,0±3,5**
По 10 мкг/кг двукратно
ИЛ-1β по 25 мкг/кг дважды по 3 раза
9,2±1,3
5,2±3,0**
По 10 мкг/кг двукратно
ИЛ-1β по 50 мкг/кг дважды по 3 раза
9,6±1,3
4,5±4,0*
* p<0.05 и ** p<0.01 - различия с контрольной группой достоверны
Как следует из таблицы 1, использование в композиции ИЛ-1β не приводит к увеличению титров антител к белку р17, однако, значительно повышает титры антител к пептиду р17(10-30). Лучшие результаты были получены при использовании дозы 5 мкг/кг, средний титр IgG к р17(10-30) составил 6,0±3,5 (p<0,01), при этом антитела определялись в 80% сывороток. При введении ИЛ-1β в дозе 50 мкг/кг титры IgG к р17(10-30) составили в среднем 4,5±4,0 (p<0,05), а измеряемые уровни специфических иммуноглобулинов к р17(10-30) были зафиксированы у 60% мышей.
Таким образом, иммунизация белком р17 в сочетании с интерлейкином-1β позволила значительно увеличить титры антител к слабоиммуногенному эпитопу p17(10-30).
Пример 2. В условиях примера 1 проводились опыты по вариантам многократного введения ингредиентов. Полученные результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние условий введения ингредиентов на титры IgG к белку р17 и пептиду p17(10-30)
Белок р17
Адъювант
Титр антител к белку р17
Титр антител к пептиду р17(10-30)
10 мкг/кг двукратно
ИЛ-1β по 5 мкг/кг дважды по 3 раза
9,4±1,3
6,0±3,5**
20 мкг/кг однократно
ИЛ-1β по 5 мкг/кг 3 раза
12,2±3,2
3,0±2,5**
По 10 мкг/кг трехкратно
ИЛ-1β по 5 мкг/кг трижды по 3 раза
9,5±1,3
5,8±3,0**
По 10 мкг/кг двукратно
ИЛ-1β 15 мкг/кг однократно одновременно с р17
9,3±1,3
2,5±2,0*
*p<0.05 и **p<0.01 - различия с контрольной группой достоверны
Как следует из данных таблицы 2 лучшие результаты достигаются при двукратном введении белка р17 и шестикратном (дважды по 3 раза) введении ИЛ-1β.
Полученные данные свидетельствуют, что использование настоящего способа позволяет в несколько раз повысить титр антител к пептиду р17(10-30), что открывает возможности их использования для диагностики и лечения ВИЧ.