Определение кинетических констант гидролиза белковых субстратов разными протеолитическими препаратами

УДК 637.146.4

Определение кинетических констант гидролиза белковых субстратов разными протеолитическими препаратами

М.А. Калинченко, Л.Я. Телишевская, ФГУ «ВГНКИ»

Ключевые слова: белки, гидролиз, ферменты

Сокращения: БСМ — белки сыворотки молока; ИСБ — изолят соевого белка; ПЖ — поджелудочная железа

Белковые гидролизаты являются доступным источником азотсодержащих соединений для человека и животных. По своему аминокислотно-пептидному составу гидролизаты, получаемые из источников белков естественного происхождения, аналогичны биологическим жидкостям. В настоящее время их широко используют в пищевой промышленности и животноводстве в качестве соответственно пищевых и кормовых добавок; в последнем случае — для улучшения развития молодняка и повышения продуктивности. Их применяют в медицине и ветеринарии с целью компенсации белкового дефицита, повышения неспецифической резистентности и иммунного ответа организма, в биотехнологии — для изготовления питательных сред [1].

Материалом для гидролиза служат белки животных, растений и микроорганизмов. Его осуществляют разными ферментными системами. Ранее были изучены кинетические константы гидролиза ферментами ПЖ мясного сырья: вторичных субстратов мясоперерабатывающих предприятий [2], боенской крови [3], кератинсодержащих отходов [4], мясокостного фарша [5]. В данной работе рассматривается кинетика гидролиза белков немясного сырья в соответствии

при рН 7,5. За ходом гидролиза следили по изменению рН и аминного азота (определяли методом формольного титрования). С этой целью пробы отбирали в первый час через каждые 15 мин, а затем с интервалом в 1 ч.

При изучении кинетических закономерностей ферментативного гидролиза использовали модель А.И. Костнера, С.В. Богаткова и А.Д. Неклюдова.

Основные макрокинетические константы гидролиза определяли по уравнениям [2]: 1. Vt = P/t =Vmax e—Kt; 2. LnV = ln(P/ t) = lnVmax — K.t; 3. KM = Vmax/ K. , где Р — концентрация в 1 л реакционной смеси расщепленных пептидных связей к моменту времени t, выраженная в граммах условного азота свободных аминогрупп (г-л—1), Vmax — максимальная скорость гидролиза в г-л-1-с-1 или в моль-л—1-с—1 (при определении Ea), К. — константа интенсивности процесса гидролиза пептидных связей (с—1), КМ — константа Михаэлиса (г-л—1).

Энергию активации процесса (Ea, кДж/моль) рассчитывали по уравнению Аррениуса: LnVmax = - Ea/ RT + const, где R — универсальная газовая постоянная, равная 1,987 кал/ моль.град; Т — абсолютная температура (°К).

Результаты и обсуждение

Накопление азота аминогрупп в процессе гидролиза белков БСМ и ИСБ характеризуют данные, представленные в таблице 1.

с методами, отраженными в предшествующих публикациях, посвященных этому процессу. Использование гидро-лизатов немясных белков представляет интерес в экономическом отношении, а также позволяет предотвратить распространение инфекционных агентов, в т.ч. прионов.

Цель настоящей работы состояла в сравнении активности ферментных препаратов разного происхождения для гидролиза белков немясных субстратов на основании кинетических констант процесса.

Материалы и методы

В качестве объектов исследования выбрали дисперсные немясные источники белка, очищенные от жира, углеводов и растительной клетчатки, с содержанием протеинов не менее 80 % от сухого вещества: ИСБ и БСМ. 10%-й раствор ИСБ, концентрат БСМ (БСМ-1) и 40%-й раствор изолята БСМ (БСМ-2) гидролизо-вали неактивированными и термически активированными [2] суспензиями ПЖ КРС и свиней (ОАО «Самсон», г. Санкт-Петербург), гепатопанкреасом (ферментным комплексом, изготовляемым из крабов ЗАО «Биопрогресс», г. Щелково) и растительным ферментом бромелайном.

Растворы белков гидролизовали 20 ч в термостате

1. Накопление азота аминогрупп в процессе гидролиза,

Время БСМ ИСБ

гидролиза, ч ПЖА, БСМ-1 ПЖА , БСМ-2 ПЖ А , БСМ-2 ГП, БСМ-2 ПЖА ПЖНА ГП Б

0 3,3 3,1 3,1 3,0 2,2 2,2 2,2 1,5

0,25 4,2 3,8 4,2 4,4 2,9 2,9 2,7 1,8

0,5 4,6 4,2 4,7 4,9 3,3 3,15 2,9 2,0

0,75 5,0 4,6 4,8 5,2 3,4 3,25 3,1 2,1

1 5,3 4,9 5,1 5,5 3,6 3,45 3,3 2,2

2 6,4 5,9 5,7 6,3 4 4 3,9 2,4

3 7,5 6,8 6,2 7 4,4 4,5 4,6 2,5

4 8,5 7,3 6,7 7,4 4,6 4,9 5 2,6

5 9,3 7,9 7,1 7,9 4,8 5,1 5,4 2,7

6 9,8 8,4 7,6 8,3 5,1 5,4 5,8 2,75

20 13,4 12,1 11,3 14,7 8,05 7,7 10,2 3,2

Обозначения. Б — бромелайн; ГП — гепатопанкреас; ПЖА ПЖ; ПЖНА — неактивированная суспензия ПЖ.

активированная суспензия

Их анализ показал, что в течение 6 ч наиболее высокая степень конверсии происходила при гидролизе БСМ-1 суспензиями ПЖ. Однако БСМ-2 в течение всего процесса, а БСМ-1 - к 20-му часу гидролиза в наибольшей степени расщеплялись ферментами гепатопанкреаса.

При гидролизе белков сои гепатопанкреас также позволил получить максимальную степень конверсии.

Полученные данные, представленные в виде функции

скоростей гидролиза от времени [Р/t = f(t)], графически выражают гиперболическими кривыми. Линеаризацией этих кривых получают участки, которые можно рассматривать как отрезки прямых псевдопервого порядка (рис. 1). При этом условно выделяют 2 стадии процесса: «быструю» (первые 3 ч) и «медленную» (3...20 ч), обеспечивающие накопление приблизительно равных количеств аминного азота. На второй стадии скорость гидролиза значительно снижается, происходит насыщение системы продуктами реакции, и процесс приближается к стационарной фазе.

Представленные графики позволяют рассчитать максимальные скорости реакции и эффективное время ферментативного гидролиза: точки, соответствующие пересечению линейных отрезков при экстраполяции с осью ординат, рассматривают как максимальные скорости гидролиза (Vmax), а с осью абсцисс — как эффективное время гидролиза.

Обозначения. См. таблицу 1.

Максимальная скорость и эффективное время гидролиза

Зависимость логарифма скоростей от времени позволяет определить константу интенсивности процесса гидролиза К1, а значит, и эффективную константу Михаэлиса Км.

Рассчитанные макрокинетические характеристики гидро-

2. Макрокинетические характеристики «быстрой стадии» гидролиза белков

Фермент/ субстрат V 10-4, max ' г-л-с-1 К-10-4, с-1 Км- гл-1 Еа, кДж/ моль

ПЖА /БСМ-1 10,0 ± 0,3 3,62 2,76 22,46

ПЖА /БСМ-2 7,78 ± 0,3 2,68 2,90 22,98

ПЖНА/БСМ-2 12,2 ± 0,3 3,52 3,46 21,24

ГП/БСМ-2 15,6 ± 0,3 4,29 3,64 20,41

ПЖА /соя 7,78 ± 0,2 2,68 2,90 22,98

ПЖНА/соя 7,78 ± 0,4 4,30 1,81 24,07

ГП/соя 5,55 ± 0,5 3,94 1,41 25,39

Б/соя 3,33 ± 0,3 1,89 1,76 26,58

ПЖА /мясо [2] 3,2 ± 0,28 2,02 1,59 28,25

Обозначения. См. таблицу 1.

лиза белковых субстратов различными ферментными комплексами для «быстрой» и «медленной» стадий представлены в таблицах 2 и 3.

Как видно из таблиц 2 и 3, одни и те же ферментные системы имеют более высокие максимальные скорости и константы при гидролизе БСМ в сравнении с ИСБ, что, вероятно, связано с присутствием в ИСБ остатков ингибиторов протеаз. Протеазы ПЖ и гепатопанкреаса быстрее гидролизуют БСМ, чем ИСБ.

Ферменты ПЖ свиньи и КРС показали достаточно высокую активность. При этом активирование фермента не дало существенных результатов.

3. Макрокинетическия характеристики «медленной стадии» гидролиза белков

Фермент/ субстрат V -10-4, max ' г-л-с-1 К!-10-4, с-1 Км- гл-1 Еа, кДж/ моль

ПЖА /БСМ-1 3,89 ± 0,4 0,21 18,52 9,21

ПЖА /БСМ-2 3,43 ± 0,3 0,45 7,62 20,45

ПЖНА/БСМ-2 2,87 ± 0,3 0,38 7,55 20,99

ГП/БСМ-2 3,70 ± 0,3 0,53 6,98 20,89

ПЖА /ИСБ 2,04 ± 0,3 0,56 3,64 26,00

ПЖНА/ИСБ 2,13 ± 0,2 0,35 6,09 23,24

ГП/ИСБ 2,22 ± 0,2 0,37 6,00 23,00

Б/ИСБ 0,95 ± 0,1 0,62 1,53 32,97

ПЖА /мясо [2] 1,13 ± 0,08 0,37 3,09 32,20

Обозначения. См. таблицу 1.

______Сравнение действия разных ферментных препаратов на одни и те же источу ники белка на основании расчета максима мальных скоростей реакции показало в Время, ч «быстрой» фазе гидролиза наиболее высокую активность гепатопанкреаса для БСМ, ПЖ — для ИСБ (табл. 2); на «медленной» стадии - гепатопанкреаса для обоих белков (табл. 3).

Бромелайн не позволил получить полноценный гидроли-зат БСМ и вызывал желирование субстрата. Эта растительная протеаза проявила достаточно высокое сродство с белками сои (Км = 1,76 для быстрой стадии; 1,53 - для медленной), но имела самую низкую скорость гидролиза и наименьший выход аминного азота при наибольших затратах энергии активации (табл. 1).

Наблюдения, сделанные при изучении максимальных скоростей протеолиза и кинетических констант, подтверждаются данными по энергиям активации этих процессов: реакции с высокими максимальными скоростями имеют низкие энергии активации.

Сравнение кинетических характеристик гидролиза белков немясного происхождения ферментами ПЖ с характеристиками аналогичного гидролиза мясного сырья, проведенное нами на основании литературных данных [2, 4], свидетельствует о более высокой степени конверсии первых: большей скорости гидролиза и меньшей энергии активации.

Выводы

1. БСМ подвержены более глубокому гидролизу разными ферментными системами, чем ИСБ.

2. Из числа испытанных ферментных препаратов гепато-панкреас подвергает белки БСМ и ИСБ наиболее глубокому расщеплению в течение длительного гидролиза (20 ч), однако при краткосрочном гидролизе, принятом в производстве (5... 6 ч), ПЖ дает сравнимые с гепатопанкреасом результаты по

РВЖ СХЖ №1-2009

43

СВИНЬЯ

ферментированию белков и имеет более высокие кинетические характеристики для белков сои, что позволяет рекомендовать их применение в промышленных условиях.

3. Растительная протеаза бромелайн при гидролизе ИСБ дает наиболее низкий выход конечного продукта.

4. Белки немясного сырья в сравнении с белками мяса имеют более высокие скорости расщепления и являются перспективными для получения ферментативных гидролизатов.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты. - М.: Аграрная наука, 2000. УДК 619:616.98:579.887.111

2. Бердутина А.В. Разработка технологии белковых гидролизатов из вторичного сырья мясной промышленности. - М., 2000.

3. Евстафьева Е.А. Автореферат диссертации на соиск. уч. степени к.т.н. Разработка технологии комплексного использования боенской крови. - М., 2000.

4. Неклюдов А.Д., Бердутина А.В., Иванкин А.Н. и соавт. Определение кинетических констант гидролиза кератинсодержащего сырья. Прикладная биохимия и микробиология, 1999, 35, 1, 45—49.

5. Баер Н.А., Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. и соавт. Способ получения белкового гидролизата из мясного и мясокостного сырья убойных животных. Патент РФ № 2112397, 1999._

М.А. Kalinichenko, L.Y. Telishevskaya. Determination kinetic constants of hydrolysis protein substances by different proteolytic preparates.

Макролиды — препараты выбора для борьбы с микоплазмозами животных

И.И. Лещинский, Представительство АО «Хювефарма» (Болгария) в Москве

Ключевые слова: антибиотики, микоплазмы,птица ти-лозин

Макролиды, история применения которых в ветеринарии насчитывает уже почти 50 лет, представляют собой один из наиболее интересных и перспективных классов антибиотиков.

Основой химической структуры макролидов служит макроциклическое лактонное кольцо, к которому присоединены один или несколько углеводных остатков в виде боковых цепей. Антимикробное действие таких соединений обусловлено нарушением синтеза белка на этапе трансляции в клетках чувствительных бактерий.

Макролиды обладают уникальным комплексом фар-макокинетических свойств. Они хорошо аккумулируются в клетках многих тканей и органов, что позволяет им действовать на внутриклеточные возбудители, такие как, например, хламидии и микоплазмы, причем активность макролидов in vivo нередко бывает выше, чем in vitro [1]. В этом заключается их существенное преимущество перед бета-лактамными антибиотиками и аминогликозидами. Кроме того, макролиды способны действовать на ряд грам-положительных кокков, резистентных к пенициллинам. Несомненным достоинством макролидов является надежный профиль безопасности, что существенно отличает их, например, от тетрациклинов, также хорошо проникающих внутрь клеток.

Среди антибиотиков этого класса в ветеринарии наиболее широко применяют тилозин. Болгарские ученые получили его чистую субстанцию в 1976 г. Тилозин состоит из нескольких компонентов, основным из которых является тилозин А. От соотношения этого компонента с другими зависит эффективность и безопасность препарата [3].

Уже первые исследования тилозина, проведенные Дж.М. МакГуиром и соавт. [2], показали, что этот антибиотик проявляет высокую активность в отношении ми-коплазм. На протяжении многих лет он остается лучшим средством контроля микоплазмозов животных. Интенсивное применение тилозина в животноводстве и особенно в птицеводстве не ведет к появлению резистентных к нему штаммов микоплазм. Одним из подтверждений тому служит недавно опубликованная статья датских исследователей [4], которые протестировали 17 полевых изолятов M. sinoviae на чувствительность к наиболее часто применяемым антибактериальным препаратам (рисунок). Основываясь на начальных и конечных значениях минимальной ингибирующей концентрации, они установили, что

все исследованные штаммы чувствительны к макролидам тилозину и тилмикозину. В то же время было отмечено повышение уровня резистентности этой микоплазмы к фторхинолоновым антибиотикам (рисунок). О снижении чувствительности микоплазм к применяемым в птицеводстве фторхинолоновым антибиотикам сообщали и другие исследователи [5].

El I I I

5 Энрофлоксацин ДтЬлоксзцин Тилозин Тилмикозин

Чувствительность штаммов M. sinoviae к антибиотикам по [4]

Микоплазмы оказывают на животных иммунодепрес-сивный эффект. В частности, наблюдали снижение иммунного ответа птиц, инфицированных M. gallisepticum, на заражения вирусом болезни Марека и Haemophilus gallinarum [6, 7]. Это имеет по меньшей мере 2 нежелательных последствия: снижает интенсивность поствакцинального иммунитета у инфицированных микоплазмами животных и их резистентность к инфекционным болезням. Применение макролидов, обладающих выраженной антимикоплазмозной активностью, позволяет избежать таких осложнений. Кроме того, эти антибиотики аккумулируются в нейтрофилах в высокой концентрации, помогая последним справиться с фагоцитированными бактериями. Это обеспечивает не только непосредственное воздействие макролидов на микроорганизмы, но и стимуляцию ими экзоцитоза, что предотвращает инги-бирование рядом бактерий фаголизосомальной функции нейтрофилов [8]. Благодаря таким эффектам ряд иссле-