СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦИИ ХЛОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ
METHOD OF MICROBIOLOGICAL DEGRADATION OF ORGANOCHLORINE PESTICIDES

Изобретение относится к области экологии и биотехнологии и может быть использовано при очистке почв от хлорорганических пестицидов.
Проблема очистки объектов окружающей среды, загрязненных пестицидами, а также утилизация избыточных количеств этих веществ, находящихся на складах, является чрезвычайно актуальной для современной экологии.
По принадлежности к классу химических соединений наибольшее применение получили хлорорганические пестициды.
Из хлорорганических пестицидов наибольшую опасность представляют стойкие пестициды (производные карбаминовый, тио - и дикарбаминовой кислот) и их метаболиты, способные накапливаться и сохраняться в природной среде до нескольких десятков лет, даже при внесении их в рекомендуемой дозировке.
В естественных условиях все химические соединения, используемые в качестве пестицидов, в той или иной мере подвержены деструкции, обусловленной не биотическими и биотическими факторами и процессами. Из биотических факторов ведущая роль в данном процессе принадлежит микрофлоре почвы.
В настоящее время выделено значительное количество штаммов грибов, бактерий, актиномицетов, водорослей, способных разлагать пестициды до нетоксичных соединений. Активнее в разложении растворимых пестицидов участвуют бактерии, а слаборастворимых - микрогрибы. Продолжительность деструкции пестицидов микроорганизмами может колебаться от нескольких дней до нескольких месяцев, а иногда и десятки лет, в зависимости от химического состава вещества, видов микроорганизмов, свойств почв (температура, аэрация и т.д.).
Из всех известных способов дезактивации токсичных органических соединений наиболее перспективными являются биотехнологические способы. Преимущества микробиологических методов дезактивации над другими методами объясняются тем, что микроорганизмы обладают огромным разнообразием ферментных систем и большой лабильностью метаболизма, что позволяет разлагать широкий спектр химически устойчивых соединений.
В настоящее время не существует эффективных микробиологических способов переработки больших объемов запрещенных и вышедших из употребления химических средств защиты растений.
Ряд авторов предлагают разработки по очистке почв от избыточных количеств пестицидов с использованием определенных микроорганизмов для деструкции конкретных пестицидов.
Например: известны изобретения, где используют штамм бактерий Streptomyces roches ВКМ АС 1284 D для деструкции хлорфенолов (2,4,6-трихлорфенол) (авт. свид. СССР №1775471), Pseudomonas pseudoalcaligenes штамм NRRL В-18087 для разложения хлорированных ароматических пестицидов (2,4-дихлорфенокси-уксусной кислоты и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты (патент США №4804629), разложение 2-хлорбензойной кислоты микроорганизмом Pseudomonas putida YNK-1 (патент США №4803166), ДДТ, полихлорфенолы, бензопирен, диоксин поддаются деструкции с помощью микрогриба Phanerochate chrysosporium (патент США N 4891320), разложение хлорированных углеводородов с помощью микроорганизмов Moraxella и Arthrobacter (патент ФРГ №3729127). Фосфорорганические пестициды предлагают советские авторы разлагать с помощью бактерий Bacillus megaterium (Ав. свид. №1735359).
Наиболее эффективным является использование для деструкции пестицидов, не монокультуры, а адаптированной ассоциации микроорганизмов. Ассоциация или консорциум почвенных микроорганизмов имеет метаболические возможности выше и разнообразнее, чем отдельно взятый организм. Совместная деятельность микроорганизмов ассоциации позволяет довести до полной минерализации пестициды, что не всегда может сделать популяция одного вида микроорганизма.
Немецкие авторы предлагают способ получения и применения - ассоциацию микроорганизмов для деструкции гексахлорциклогексана и других полихлорированных циклических углеводородов (патент Германии №4212479).
Российские авторы предлагают использовать для деструкции пестицидов адаптированную культуру консорциума микроорганизмов, выращиваемую на твердофазных средах, где в качестве субстрата-носителя используются естественные материалы: почва, торф, солома, древесная стружка, опилки и т.д. (Патент 2279325).
Предложен метод деструкции трихлорацетат натрия (2М-4Х, гексилор, симазин, прометрин, кенозон, рамрот, бенлат) с использованием спонтанной микрофлоры компоста, полученного из навоза сельскохозяйственных животных и птиц (Пат. РФ N 2077398).
Наиболее близким к предлагаемому нами способу детоксикации пестицидов является метод деструкции фосфорорганических пестицидов ассоциацией культур, выращенных на гуматных средах (авт. свид. 1443345).
По данному способу торфяной препарат, представляющий собой ассоциацию микроорганизмов, предварительно выращен на гуматной питательной среде при 20-30°С в течение трех недель и внесен на грунт, загрязненный актеликом и базудином. Содержание актелика снижается в тепличном грунте за 20 дней до 97-98%, базудина на 87,5%.
Цель предлагаемого изобретения заключается в разработке биотехнологического способа деструкции хлорорганических пестицидов (фюзилад-форте, зенкор, чистолан, 2М-4Х, пума-супер) с помощью почвенной ассоциации микроорганизмов.
Технический результат: повышение эффективности утилизации хлорорганических пестицидов и улучшение экологии.
Сущность предлагаемого способа заключается в следующем: в загрязненную пестицидами почву вносится адаптированная ассоциация микроорганизмов, выделенная из зараженной пестицидом почвы, и гумат калия.
4
3
5
3
4
4
4
Сначала получают деструктирующий агент (ассоциацию микроорганизмов) путем культивирования на элективной питательной среде. Ассоциация микроорганизмов представлена (кл/г): целлюлозоразлагающими микроорганизмами (10), азотобактером (10), гетеротрофными бактериями (10), углеводородокисляющими микроорганизмами (10), микрогрибами (10 КОЕ/г), дрожжами (10 КОЕ/г) и актиномицетами (10 КОЕ/г).
Следующий этап - адаптация выделенной ассоциации микроорганизмов к пестицидам. Адаптация производилась в условиях принудительного перемешивания и аэрации на минеральной среде следующего состава (мг/л):
4
3
Азотнокислый аммоний (NHNO) - 100 мг;
2
4
Фосфорнокислый калий однозамещенный (КНРО) - 100 мг;
2
4
Фосфорнокислый двузамещенный (КНРO) - 100 мг;
4
Сернокислый магний (MgSO) - 20 мг;
2
Хлористый кальций (СаСl) - 2 мг;
3
Хлористое железо (FeCl) - 0,2 мг.
В экспериментах использовали хлорорганические пестициды (фюзилад-форте, зенкор, чистолан, 2М-4Х, пума-супер).
В качестве единственного источника углерода вносили раствор пестицида, концентрацию которого постепенно увеличивали от ферментации к ферментации до 2% (вес.) максимально.
Известно, что пестициды разлагаются гетеротрофными микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности. Для этого им необходим энергетический материал и основные источники питания в виде органических и минеральных соединений, в также соответствующие оптимальные физико-химические условия среды (почвы с слабокислой и нейтральной средой (рН 6-7), оптимальной влажности 50-70%, диапазон температур от 20-30°С, аэробные условия).
Продолжительность процесса деструкции колебалась от 14 до 28 суток в зависимости от вариантов экспериментов.
Пример №1
Определенное влияние на микробную ассоциацию оказывает сам пестицид. Многие пестициды в высоких концентрациях токсичны и вследствие этого недоступны для микроорганизмов. При высоком содержании пестицидов увеличивается вероятность отравления клеток этими веществами или продуктами их метаболизма. Низкие концентрации, составляющие несколько мкг или нг на кг почвы, могут оказаться ниже порога концентраций, при которых индуцируется синтез соответствующих ферментов, что исключает прямое участие микроорганизмов в деградации этих веществ. Поэтому при очень малых концентрациях эти вещества неспособны индуцировать соответствующие ферменты и разложение имеет случайный характер. Экспериментально установлено, что количество индуктора - пестицида должно находиться в пределах от 10-100 мг/кг исходной смеси.
В образцы почв в количестве 2,5 кг с определенным набором физиологических групп (деструктирующий агент) вносили пестициды в количестве 250 мг, чтобы он не превышал пороговую концентрацию 100 мг/кг почвы. Превышение допустимого уровня по НД в 330 раз в случае использования фюзилат форте, в 500 раз при использовании зенкора и чистолана и в 2500 раз - 2М-4Х и пума-супер.
Инкубировали при t=27-30°C с периодическим перемешиванием и увлажнением. Минеральную подкормку (0,7% раствор нитроаммофоски) в количестве 25 мл вносили для увлажнения по мере подсыхания почвы.
После четырехнедельной деструкции содержание фюзилад-форте и зенкора снизилось до 0,5 мг/кг, чистолана до 0,7 мг/кг, 2М-4Х до 0,02 мг/кг, что не соответствует ПДК в почве. Для пестицида пума-супер ПДК (0,04 мг/кг) остаток составил 0,2 мг/кг, что превышает норму в 5 раз.
Пример №2
Среди важнейших факторов, определяющих судьбу пестицидов и эффективность процессов самоочищения почв от пестицидов, является органическое вещество, которое является энергетическим материалом и основным источником питания гетеротрофных микроорганизмов.
Количество и качественный состав органического вещества в почве определяют уровень микробной биомассы, биоразнообразие, структуру микробного комплекса и соответственно его метаболические возможности.
Для увеличения процента деструкции и сокращения время деструкции в следующей серии экспериментов вносили гумат калия. В образцы почв в количестве 2,5 кг с определенным набором физиологических групп до внесения токсикантов вносили гумат калия в количестве 300 г/кг для увеличения исходной концентрации микроорганизмов. Инкубировали при t=27-30°C с периодическим перемешиванием и увлажнением. После недельного культивирования титр физиологических групп увеличился на два порядка. В отдельные емкости вносили по 250 мг фюзилад форте, зенкор, пума-супер, 2М-4Х, чистолан. После 3-х недельной инкубации концентрация фюзилад форте и зенкора снизилась до 0,3 мг/кг, чистолана до 0,5 мг/кг, 2М-4Х до 0,01 мг/кг, что соответствует практически ПДК в почве. Для пестицида пума-супер необходимо увеличить время деструкции, так как за отведенное время не удалось выйти до норм ПДК (0,04 мг/кг), остаток составил 0,1 мг/кг.
Пример №3
Для увеличения количества микроорганизмов почвенного микробиоценоза (деструктирующего агента) в образцы почв в количестве 2,5 кг с определенным набором физиологических групп дополнительно вносили предварительно выращенную и адаптированную ассоциацию культур и 30% раствор гумата калия.
9
В каждый из вариантов внесли адаптированную 3-х суточную ассоциацию культур в количестве 100 мл с титром 10 кл/мл и по 250 мг фюзилад форте, зенкор, пума-супер, 2М-4Х, чистолан. Инкубировали при t=27-30°C с периодическим перемешиванием и увлажнением.
После 3-х недельной инкубации концентрация фюзилад форте и зенкора снизилась до 0,3 мг/кг (процент утилизации 99,88%), чистолана до 0,5 мг/кг (процент утилизации 99,8%), 2М-4Х до 0,01 мг/кг (процент утилизации 99,88%), что соответствует ПДК в почве. Содержание пестицида пума-супер снизилось до 0,1 мг/кг (процент утилизации 96%).
Таким образом, совместное внесение адаптированной ассоциации культур с гуматом калия позволяет увеличить степень деструкции пестицидов и сократит время деструкции.