Линкерные звенья и содержащие их молекулярные конструкции
LINKER LINKS AND MOLECULAR STRUCTURES CONTAINING THEM

Ссылки на родственные заявки
[001] Настоящая заявка имеет отношение к предварительной заявке США №62/472011, поданной 16 марта 2017 года, и к предварительной заявке США №62/613401, поданной 3 января 2018 года, содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки, и для нее испрашивается приоритет на основе указанных заявок.
[002] Область техники, к которой относится изобретение
[003] Настоящее изобретение относится к области фармацевтики, в частности, к многофункциональным молекулярным конструкциям, в частности, содержащим нацеливающие и эффекторные свойства и улучшающим фармакокинетику.
[004] Уровень техники
[005] Разработка фармацевтических препаратов с нацеливающими и терапевтическими свойствами стала весьма востребованной областью исследований. Например, разветвленные линкеры, описанные в документе № WO 2016112870(A1) и связанных с ней заявках, представляют собой основные химические объекты для конструирования молекул с двумя и более функциональными частями. В документе WO 2016112870 для клик-реакций используются аминокислоты со встроенными функциональными группами, такими как тетразин, циклооктен и циклооктин. Тем не менее, эти аминокислоты недоступны для включения в пептидное ядро в ходе твердофазного пептидного синтеза. Кроме того, согласно публикации WO 2016112870, соединительная ветвь с тетразиновой, циклооктеновой или циклооктиновой группой встроена путем реакции между тиольной группой остатка цистеина и малеимидной группой гетеробифункционального линкера, содержащего малеимидную группу на одном конце и тетразиновую, циклооктеновую или циклооктиновую группу на другом конце. Известно, что продукт реакции тиола и малеимида нестабилен, подвержен обратной реакции или реакции обмена с соседними молекулами, содержащими тиольную группу, что может влиять на стабильность конъюгированных линкеров при хранении. Кроме того, когда пептидное ядро содержит остаток цистеина, согласно публикации WO 2016112870, не представляется возможным проводить непрерывный твердофазный синтез (разветвление пептида) связывающих ветвей с функциональной группой, способной реагировать с тиольной группой на пептидном ядре. Кроме того, альфа-аминогруппа на N-конце пептидного ядра требует дополнительной стадии блокирования, что снижает продуктивность и степень гомогенности пептидного ядра или линкерного звена.
[006] В свете вышеизложенного, в предшествующем уровне техники существует потребность в новом разветвленном линкере для решения, по меньшей мере, одной из проблем, описанных выше. Например, такой новый разветвленный линкер может быть синтезирован с применением непрерывного твердофазного синтеза и/или может демонстрировать более желательную стабильность и/или эффективность сопряжения с функциональными элементами (например, нацеливающими элементами, эффекторными элементами и/или элементами для улучшения фармакокинетики).
Раскрытие изобретения
[007] Далее представлено упрощенное краткое описание настоящего изобретения в целях обеспечения базового понимания читателем. Данное краткое описание не является полным изложением настоящего изобретения, в нем не определены ключевые или критически важные элементы настоящего изобретения и не очерчен его объем. Его единственной целью является представление некоторых раскрытых здесь идей в упрощенной форме в качестве вступления к более подробному описанию, представленному далее.
[008] I. Разветвленные линкерные звенья
[009] В первом аспекте настоящее изобретение направлено на реализацию нового разветвленного линкерного звена на основе пептидного ядра, содержащего множество связывающих ветвей для конъюгирования с функциональными элементами.
[0010] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, ядро содержит множество связывающих аминокислотных остатков, один или несколько спейсеров и один или два конъюгирующих фрагмента. Каждый из связывающих аминокислотных остатков может представлять собой природный или искусственный аминокислотный остаток, содержащий аминогруппу боковой цепи (например, остаток лизина (K)) или карбоксильную группу (например, остаток аспарагиновой кислоты (D) или глутаминовой кислоты (Е)). В различных вариантах осуществления любые два из связывающих аминокислотных остатков являются смежными или разделены одним из спейсеров.
[0011] Каждый из спейсеров включает в себя, независимо друг от друга, (1) один или несколько не-K-аминокислотных остатков (т.е. аминокислотных остатков, отличных от K-остатка) или (2) пегилированную аминокислоту, содержащую от 2 до 12 этиленгликолевых (EG) звеньев. Согласно некоторым иллюстративным вариантам осуществления, спейсер может содержать один или несколько глициновых (G) и/или сериновых (S) остатков. В некоторых примерах спейсер состоит из 1-20 аминокислотных остатков; предпочтительно 2-5 аминокислотных остатков.
[0012] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, один из спейсеров связан с N-концом первого связывающего аминокислотного остатка, начиная с N-конца, и, соответственно, образует N-концевой спейсер. В качестве дополнения или альтернативы один из спейсеров связан с С-концом последнего связывающего аминокислотного остатка, начиная с N-конца, образуя С-концевой спейсер.
2
2
[0013] Конъюгирующий фрагмент содержит либо карбоксильную группу (т.е. группу -COH), либо аминогруппу (т.е. группу -NH) на одном конце и связывающую группу на другом. Например, связывающая группа представляет собой азидную, алкиновую, тетразиновую, циклооктеновую или циклооктиновую группу. В частности, в том случае, когда спейсер связан с N-концом первого связывающего аминокислотного остатка (т.е. представляет собой N-концевой спейсер), конъюгирующий фрагмент содержит карбоксильную группу. Таким образом, он связан с N-концом N-концевого спейсера путем образования амидной связи с альфа-аминогруппой N-концевого спейсера. В качестве альтернативы, когда спейсер связан с С-концом последнего связывающего аминокислотного остатка (т.е. представляет собой С-концевой спейсер), конъюгирующий фрагмент содержит аминогруппу и связан с С-концом С-концевого спейсера путем образования амидной связи с карбоксильной группой С-концевого спейсера. Связанный таким образом конъюгирующий фрагмент содержит конъюгирующую группу на свободном конце (т.е. на конце, не вступающем в реакцию с N- или С-концевым спейсером).
[0014] Связывающие ветви отходят от связывающих аминокислотных остатков в пептидном ядре. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, каждая связывающая ветвь содержит реакционноспособную группу на одном конце и функциональную группу на другом. Реакционноспособной группой может быть сукцинимидиловый сложный эфир (SE), например, гидроксисукцинимидный сложный эфир или N-гидроксисукцинимидиловый (NHS) сложный эфир, тетрафторфениловый (TFP) сложный эфир, карбоксильная группа или гидроксильная группа (т.е. группа -ОН). Функциональная группа выбирается из аминовой, карбоксильной, гидроксильной, трет-бутилдиметилсилильной (TBDMS), NHS, малеимидной, винилсульфоновой, моносульфоновой, метилсульфонилбензотиазольной, йодной, йодацетамидной, азидной, алкиновой, циклооктиновой, тетразоциновой и циклооктеновой групп.
[0015] Конструктивно каждая связывающая ветвь связана с одним связывающим аминокислотным остатком путем образования амидной связи между реакционноспособной группой связывающей ветви и аминогруппой или карбоксильной группой, в которой находится связывающая аминокислота. В некоторых вариантах осуществления, если ядро содержит множество остатков K, то каждая связывающая ветвь имеет реакционноспособную аминогруппу (такую как сукцинимидиловый сложный эфир, сложный эфир TFP или карбоксильная группа). В этом случае связывающая ветвь может быть связана с остатками K путем образования амидной связи с аминогруппой остатка К. В качестве альтернативы, при наличии в ядре множества остатков D и/или Е, каждая связывающая ветвь содержит карбоксильную группу (например, гидроксильную группу) и, соответственно, связывающая ветвь может быть связана с остатками D и/или Е путем образования амидной связи с карбоксильной группой остатка D и/или Е. После соединения с ядром каждая связывающая ветвь содержит функциональную группу на свободном конце (т.е. на конце, который не прикреплен к ядру).
[0016] При выборе конъюгирующей группы и функциональной группы желательно, чтобы конъюгирующая группа конъюгирующего фрагмента и функциональная группа связывающей ветви не могли вступать в клик-реакцию друг с другом. Например, когда конъюгирующая группа конъюгирующего фрагмента представляет собой азидную, алкиновую или циклооктиновую группу, функциональная группа связывающей ветви представляет собой тетразиновую или циклооктеновую группу. В альтернативном варианте, когда конъюгирующая группа конъюгирующего фрагмента представляет собой тетразиновую или циклооктеновую группу, функциональная группа связывающей ветви представляет собой азидную, алкиновую или циклооктиновую группу. Та же методика проектирования применима к условиям, когда линкерное звено содержит два конъюгирующих фрагмента, соответственно, связанных с N- и С-концевыми спейсерами, т.е. функциональная группа связывающей ветви и конъюгирующие группы двух конъюгирующих фрагментов не могут вступать в клик-реакцию друг с другом. Следовательно, в таких случаях функциональной группой связывающей ветви может быть малеимидная, винилсульфоновая, моносульфоновая, йодная или йодацетамидная группа, при этом конъюгирующая группа одного конъюгирующего фрагмента представляет собой азидную, алкиновую или циклооктиновую группу, а конъюгирующая группа другого конъюгирующего фрагмента представляет собой тетразиновую или циклооктеновую группу. Понятно, что в ситуации, когда два конъюгирующих фрагмента предназначены для соединения с одинаковыми элементами, конъюгирующие группы двух конъюгирующих фрагментов могут быть одинаковыми или могут вступать в одну и ту же клик-реакцию.
[0017] Согласно некоторым рабочим примерам настоящего изобретения, каждая из связывающих ветвей представляет собой пептид, содержащий от 2 до 12 не-K-аминокислотных остатков или цепь полиэтиленгликоля (PEG), содержащую от 2 до 24 этиленгликолевых (EG) звеньев. В одном конкретном примере каждая из связывающих ветвей представляет собой пептид, содержащий от 5 до 10 аминокислотных остатков, которые независимо друг от друга выбираются из остатков G, S, Е и аргинина (R). В альтернативном примере каждая из связывающих ветвей представляет собой цепочку PEG, содержащую от 6 до 12 звеньев EG.
N
N
[0018] В зависимости от требуемого функционального назначения, различные функциональные элементы (выступающие в качестве нацеливающих или эффекторных элементов) могут быть связаны со свободными концами связывающих ветвей и конъюгирующей группы линкерного звена, соответственно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, линкер содержит множество связывающих ветвей и один конъюгирующий фрагмент, в котором множество первых элементов связано с множеством связывающих ветвей путем образования амидной связи или сложноэфирной связи между ними или с использованием тиол-малеимидной реакции, реакции S2, катализируемой медью реакции азид-алкинового циклоприсоединения (CuAAC), химически активированной азид-алкиновой щелочной реакции (SPAAC) или реакции Дильса-Альдера с обратными электронными требованиями (iEDDA); второй элемент связан с конъюгирующей группой путем реакции CuAAC, реакции SPAAC или реакции iEDDA. В альтернативном варианте линкер может содержать множество связывающих ветвей и два конъюгирующих фрагмента. В связи с этим несколько элементов могут быть связаны со связывающими ветвями и двумя конъюгирующими фрагментами, соответственно. В частности, множество первых элементов связаны со связывающими ветвями путем образования амидной связи или сложноэфирной связи между ними или путем тиол-малеимидной реакции или реакции S2, соответственно; второй элемент связан с конъюгирующей группой одного конъюгирующего фрагмента путем реакции SPAAC или реакции iEDDA; третий элемент связан с конъюгирующей группой другого конъюгирующего фрагмента путем реакции CuAAC, реакции SPAAC или реакции iEDDA. Понятно, что эти второй и третий элементы могут быть одинаковыми или разными. Поскольку первые элементы соединены со связывающими аминокислотными остатками (например, остатками K) пептидного ядра через связывающие ветви, то можно регулировать количество первого элемента, переносимого линкерным звеном, путем изменения числа связывающих аминокислотных остатков. В связи с этим, отношение количества первого элемента ко второму (или ко второму и третьему) может быть изменено по желанию и необходимости.
[0019] В соответствии с необязательными вариантами осуществления настоящего изобретения, циклооктеновой группой является норборнен или транс-циклооктен (ТСО) или их производные. Иллюстративные примеры циклооктиновой группы включают в себя дибензоциклооктин (DIBO), дифторированный циклооктин (DIFO), бициклононин (BCN) и дибензоазациклооктин (DIBAC или DBCO) и их производные. Примеры тетразиновой группы включают в себя 1,2,3,4-тетразин, 1,2,3,5-тетразин и 1,2,4,5-тетразин и их производные, но не ограничиваются ими.
[0020] II. Молекулярные конструкции с двумя и более линкерными звеньями (соединения-линкеры)
[0021] В другом аспекте настоящее изобретение относится к молекулярной конструкции, содержащей по меньшей мере два линкерных звена, соединяющихся друг с другом через соответствующую конъюгирующую группу. Каждое линкерное звено способно нести один или несколько элементов, так что при их соединении друг с другом полученная таким образом молекулярная конструкция может содержать элементы с различными функциональными группами (с целевыми, терапевтическими или фармакокинетическими функциями). В этом случае количественное соотношение между различными функциональными элементами можно регулировать путем изменения количества связывающих аминокислотных остатков пептидного ядра соответствующего линкерного звена.
[0022] Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, молекулярная конструкция содержит первое и второе линкерные звенья. Базовая структура первого или второго линкерного звена по существу совпадает с описанной выше в связи с первым аспектом настоящего изобретения. В частности, первое линкерное звено содержит первое ядро и множество связывающих ветвей (далее - первые связывающие ветви), соответственно, связанных с первым ядром, при этом первое ядро содержит конъюгирующий фрагмент (далее - первый конъюгирующий фрагмент), соединенный с его N- или С-концом; второе линкерное звено содержит второе ядро и множество связывающих ветвей (далее - вторые связывающие ветви), соответственно, связанных со вторым ядром, при этом второе ядро содержит конъюгирующий фрагмент (далее - второй конъюгирующий фрагмент), связанный с его N- или С-концом. Затем первое и второе линкерные звенья соединяются друг с другом путем реакции iEDDA, SPAAC или CuAAC между конъюгирующими группами первого и второго конъюгирующих фрагментов.
N
[0023] В лечебных целях различные функциональные элементы (выступающие в качестве нацеливающих и эффекторных элементов) могут быть связаны, соответственно, с первой и второй связывающими ветвями за счет образования амидной связи или сложноэфирной связи между ними или путем тиол-малеимидной реакции, реакции S2, реакции CuAAC, реакции SPAAC или реакции iEDDA.
[0024] Данная конструкция позволяет легко синтезировать молекулярную конструкцию со сложной структурой. Таким образом, квалифицированный специалист сможет создавать наборы молекулярных конструкций, соответственно, несущих различные функциональные элементы, а затем выбирать и попарно объединять молекулярные конструкции (или линкерные звенья) из этих наборов для создания нужных конструкций в зависимости от потребностей и/или предполагаемых областей применения. При этом количеством функциональных элементов для линкерного звена можно управлять путем изменения количества связывающих аминокислотных остатков ядер.
[0025] III. Применение линкерного звена или молекулярной конструкции при лечении заболеваний
[0026] Линкер и молекулярная конструкция могут быть использованы для конструирования фармацевтических молекул для лечения различных заболеваний, например, диффузных опухолей и плотных опухолей. Следовательно, объекты, которые также входят в другие аспекты настоящего изобретения, включают в себя фармацевтические композиции, содержащие линкерные звенья и молекулярные конструкции, способ лечения заболеваний с использованием линкерных звеньев и молекулярных конструкций или фармацевтические композиции, содержащие их, а также использование линкерных звеньев и молекулярных конструкций в производстве лекарственного средства для применения при лечении заболеваний.
[0027] Для конструирования фармацевтических молекул, подходящих для лечения диффузных опухолей, первый элемент может представлять собой фрагмент антитела, такой как одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), однодоменное антитело (sdAb) и т.д., который специфичен для первого белка клеточной поверхности, а второй элемент может представлять собой цитотоксическое лекарственное средство или фрагмент антитела, специфичный для второго белка клеточной поверхности. Первый антиген клеточной поверхности, подходящий для использования в качестве нацеливающего элемента для лечения диффузной опухоли, включает в себя, в частности, CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD43, CD72a, CD78, CD79a, CD79b, CD86, CD134, CD137, CD138 и CD319. Неограничивающие примеры второго антигена клеточной поверхности, подходящего для использования в качестве эффекторного элемента, включают в себя CD3 и CD16a. В качестве альтернативы, первый и второй антигены клеточной поверхности представляют собой, соответственно, CD79a и CD79b.
[0028] Примеры диффузных опухолей, которые можно лечить с помощью линкерного звена и/или молекулярной конструкции, включают в себя острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому и миелому, но не ограничиваются ими.
[0029] Чтобы создать молекулярную конструкцию для лечения плотных опухолей, первый элемент (т.е. нацеливающий элемент) может быть выбран из пептидного гормона, фактора роста и первого фрагмента антитела, специфичного к опухоль-ассоциированному антигену, а второй элемент (т.е. эффекторный элемент) может представлять собой цитотоксическое лекарственное средство, агонист TLR2/4 толл-подобного рецептора, хелатор, образующий комплекс с радиоактивным нуклидом, цитокин или второй фрагмент антитела, специфичный ко второму фактору роста, антигену клеточной поверхности, гаптену или цитокину.
[0030] Например, пептидный гормон может представлять собой секретин, холецистокинин (CCK), соматостатин и его аналоги (например, октреотид) или тиреотропный гормон (TSH). Что касается первого фактора роста, это может быть эпидермальный фактор роста (EGF), мутантный EGF, эпирегулин, гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF), сосудистый эндотелиальный фактор роста А (VEGF-A), основной фактор роста фибробластов (bFGF) или фактор роста гепатоцитов (HGF). Иллюстративные примеры опухолевого специфического антигена включают в себя рецептор эпидермального фактора роста (HER1, HER2, HER3, HER4), углеводный антиген 19-9 (СА 19-9), углеводный антиген 125 (СА 125), карциноэмбриональный антиген (СЕА), муцин 1 (MUC 1), ганглиозид GD2, ассоциированный с меланомой антиген (MAGE), простат-специфический мембранный антиген (PSMA), антиген стволовых клеток простаты (PSCA), мезотелин, родственный муцину Tn, сиалированный Tn, глобо-Н, стадиеспецифический эмбриональный антиген-4 (SSEA-4) и адгезивную молекулу эпителиальных клеток (ЕрСАМ).
[0031] Примеры цитотоксического лекарственного средства, подходящего для использования с линкерным звеном или молекулярной конструкцией для лечения диффузных опухолей или плотных опухолей, включают в себя, в частности, мертанзин, ауристатин, майтансин, доксорубицин, калихеамицин и камптотецин. Неограничивающий агонист TLR включает в себя липополисахарид (LPS), монофосфориллипид А, мотолимод, имиквимод, ресиквимод, гардиквимод, CpG олигодезоксинуклеотид (CpG DON), липотейхоевую кислоту, β-глюкан и зимозан. Хелатор выбирается из
1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA),
1,4,7-триаза-циклононан-1,4,7-триуксусной кислоты (NOTA),
1,4,7-триазациклононан-1,4-диуксусной кислоты (NODA) и
111
131
177
диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), а радиоактивный нуклид представляет собой In, I, или Lu. Что касается цитокина, он может быть выбран из интерлейкина-2 (IL-2), IL-10, IL-12, интерферона-альфа (IFN-α), IFN-γ, TGF-β или фактора некроза опухолей альфа (TNF-α). Вторым фактором роста, способным специфически распознаваться и связываться вторым фрагментом антитела, может быть EGF, мутантный EGF, VEGF-A, bFGF или HGF. Антиген клеточной поверхности, специфически распознаваемый и связываемый вторым фрагментом антитела, может быть выбран из CD3, CD16a, CD28, CD134, цитотоксического Т-лимфоцит-ассоциированного белка 4 (CTLA-4 или CD152), белка 1 программируемой смерти клеток (PD-1 или CD279) и первого лиганда белка 1 программируемой смерти клеток (PD-L1 или CD274). Цитокин, специфически распознаваемый и связываемый вторым фрагментом антитела, может быть выбран из IL-2, IFN-α, IFN-γ и TNF-α. В этих случаях второй фрагмент антитела представляет собой ненейтрализующий фрагмент антитела. Гаптен может быть выбран из динитрофенола (DNP), тринитрофенола (TNP) и короткого пептида, содержащего аминокислотную последовательность WADWPGPP (SEQ ID NO: 23).
[0032] Типичные плотные опухоли, которые можно лечить с использованием линкерного звена и/или молекулярной конструкции, включают в себя меланомы, рак пищевода, рак желудка, опухоль головного мозга, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак ободочной и прямой кишки, рак почки, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичника, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак яичка и эпидермоидный рак головы и шеи.
[0033] Многие из сопутствующих признаков и преимуществ настоящего изобретения поясняются в следующем подробном описании, рассматриваемом в связи с приложенными чертежами.
Краткое описание чертежей
[0034] Настоящее изобретение поясняется в следующем подробном описании с учетом сопровождающих графических материалов, коротко описанных ниже.
[0035] На фиг. 1А-1З представлены схемы, иллюстрирующие ядра в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0036] На фиг. 2А-2Е показаны схемы, иллюстрирующие линкерные звенья в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0037] На фиг. 3А-3В представлены схемы, иллюстрирующие линкерные звенья, содержащие связанные с ними функциональные элементы, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения.
[0038] На фиг. 4А-4В представлены схемы, иллюстрирующие линкерные звенья, содержащие различные функциональные элементы, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0039] На фиг. 5А-5В представлены схемы, иллюстрирующие молекулярные конструкции в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0040] На фиг. 6 представлена схема, иллюстрирующая молекулярную конструкцию в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0041] На фиг. 7 представлена схема, иллюстрирующая молекулярную конструкцию, содержащую три линкерных звена, в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего изобретения.
[0042] На фиг. 8А и 8Б показаны результаты ВЭЖХ и масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF норборнен-модифицированного пептида 4 в соответствии с Примером 1 настоящего изобретения.
[0043] На фиг. 9А и 9Б показаны результаты ВЭЖХ и масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF азид-модифицированного пептида 5 в соответствии с Примером 2 настоящего изобретения.
[0044] На фиг. 10А и 10Б показаны результаты ВЭЖХ и масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF DBCO-модифицированного пептида 7 в соответствии с Примером 3 настоящего изобретения.
[0045] На фиг. 11А и 11Б, соответственно, показаны результаты анализа алкин-модифицированного пептида 9 и азид-модифицированного пептида 10 в соответствии с Примером 3 настоящего изобретения.
[0046] На фиг. 12А и 12Б, соответственно, показаны результаты масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF ССK8-содержащего пептида и СС8-содержащего связывающего звена в соответствии с Примерами 5 и 6 настоящего изобретения.
[0047] На фиг. 13А и 13Б показаны результаты масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF линкерного звена, содержащего ядро и связывающие звенья, в соответствии с Примером 8 настоящего изобретения.
[0048] На фиг. 14 показан результат масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF линкерного звена, содержащего ядро и связывающие ветви, в соответствии с Примером 9 настоящего изобретения.
[0049] На фиг. 15 показан результат масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF линкерного звена, содержащего ядро и связывающие ветви, в соответствии с Примером 10 настоящего изобретения.
[0050] На фиг. 16 показан результат анализа обратно-фазовой ВЭЖХ алкин-содержащего линкерного звена с малеимид-модифицированными связывающими ветвями, в соответствии с Примером 12 настоящего изобретения.
[0051] На фиг. 17 показан результат масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF линкерного звена в соответствии с Примером 12 настоящего изобретения.
[0052] На фиг. 18 показан результат анализа обратно-фазовой ВЭЖХ линкерного звена, содержащего пять цитотоксических лекарственных средств, в соответствии с Примером 14 настоящего изобретения.
[0053] На фиг. 19 показан результат обратно-фазовой ВЭЖХ линкерного звена, содержащего пять цитотоксических лекарственных средств, в соответствии с Примером 15 настоящего изобретения.
[0054] На фиг. 20 показан результат масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF линкерного звена, содержащего пять цитотоксических лекарственных средств, в соответствии с Примером 15 настоящего изобретения.
[0055] На фиг. 21 показан результат обратно-фазовой ВЭЖХ линкерного звена, содержащего ССK8 в качестве нацеливающего элемента, в соответствии с Примером 16 настоящего изобретения.
[0056] На фиг. 22 показан результат масс-спектрометрического анализа ESI-TOF линкерного звена, содержащего ССK8 в качестве нацеливающего элемента, в соответствии с Примером 16 настоящего изобретения.
[0057] На фиг. 23А-23В, соответственно, показана чистота специфического фрагмента scFv и его аффинность связывания с Т-клетками, в соответствии с Примерами 17-19 настоящего изобретения.
[0058] На фиг. 24 представлены данные проточного цитометрического анализа фрагмента scFv DBCO-конъюгированного взаимосвязанного антитела CD3, в соответствии с Примером 20 настоящего изобретения.
[0059] На фиг. 25 показан результат масс-спектрометрического анализа связывающего звена и молекулярной конструкции, в соответствии с Примером 22 настоящего изобретения.
[0060] На фиг. 26А и 26Б показан результат масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF линкерного звена в соответствии с Примером 23 настоящего изобретения.
[0061] На фиг. 27 показан результат цитотоксического действия линкерного звена, содержащего пять цитотоксических лекарственных средств, влияющих на опухолевые клетки, в соответствии с Примером 25 настоящего изобретения.
[0062] В соответствии с принятой практикой, различные описанные здесь признаки или элементы показаны с отклонением от масштаба для наилучшей иллюстрации конкретных признаков или элементов, относящихся к настоящему изобретению. Одинаковые номера позиций и обозначения на различных графических материалах используются для указания одинаковых элементов или частей там, где это возможно.
Осуществление изобретения
[0063] Подразумевается, что подробное описание, представленное далее вместе с приложенными графическими материалами, является описанием примеров настоящего изобретения и не представляет собой единственную форму, в которой пример настоящего изобретения может быть реализован или использован. В настоящем описании изложены примеры функций и последовательность этапов конструирования и осуществлении примера. При этом в различных примерах могут быть реализованы одинаковые или эквивалентные функции и последовательности.
[0064] Для удобства здесь собраны некоторые термины, используемые в описании, примерах и приложенной формуле изобретения. Если не указано иное, научные и технические термины, используемые в настоящем изобретении, имеют значения, обычно понимаемые и используемые средним специалистом в данной области.
[0065] Если иное не требуется по контексту, должно быть понятно, что термины в единственном числе включают в себя и формы множественного числа, а термины во множественном числе включают в себя формы единственного числа. В частности, используемые здесь и в формуле изобретения формы единственного числа включают в себя ссылку на множественное число, если в контексте явно не указано иное. Кроме того, используемые здесь и в формуле изобретения термины «по меньшей мере, один» и «один или более» имеют одинаковое значение и обозначают один, два, три или более. Аналогичным образом, термин «по меньшей мере, два» имеет значение два, три, четыре или более. Более того, подразумевается, что фразы «по меньшей мере, один из А, В и С», «по меньшей мере, один из А, В или С» и «по меньшей мере, один из А, В и/или С», используемые во всем описании и в приложенной формуле изобретения, охватывают А в отдельности, B в отдельности, С в отдельности, А и В вместе, В и С вместе, А и С вместе, а также А, В и С вместе.
[0066] Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, отражающие общий объем настоящего изобретения, являются приблизительными величинами, числовые значения, изложенные в конкретных примерах, представлены как можно более точно. Тем не менее, любое числовое значение по своей сути имеет определенные погрешности, неизбежно возникающие вследствие обычного отклонения, обнаруживаемого в соответствующих тестовых измерениях. Кроме того, используемый здесь термин «приблизительно», как правило, означает «в пределах 10%, 5%, 1% или 0,5% от указанного значения или диапазона». В качестве альтернативы, термин «приблизительно» означает «в пределах обычного допустимого отклонения среднего» при рассмотрении средним специалистом в данной области. За исключением примеров эксплуатации или рабочих примеров или если в явной форме не указано иное, все числовые диапазоны, количества, значения и процентные доли, как, например, количества материалов, продолжительности периодов времени, температур, условий эксплуатации, соотношения количеств и т.п., раскрытые здесь, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином «приблизительно». Соответственно, если не указано иное, числовые параметры, приведенные в настоящем изобретении и приложенной формуле изобретения, являются приблизительными величинами, которые при желании могут изменяться. Как минимум, каждый числовой параметр следует интерпретировать по меньшей мере с учетом количества приводимых значащих цифр и путем применения обычных методик округления. Диапазоны в данном документе могут быть выражены от одной конечной точки или до другой конечной точки или между двумя конечными точками. Все диапазоны, раскрытые в данном документе, включают в себя конечные точки, если не указано иное.
[0067] Настоящее изобретение в целом относится к молекулярным конструкциям, при этом каждая молекулярная конструкция содержит нацеливающий элемент (Т) и эффекторный элемент (Е) и эти молекулярные конструкции иногда здесь называют «молекулами Т-Е», «фармацевтическими средствами Т-Е» или «лекарственными средствами Т-Е».
[0068] Используемый здесь термин «нацеливающий элемент» относится к части молекулярной конструкции, которая непосредственно или опосредованно связывается с мишенью, представляющей интерес (например, с рецептором на клеточной поверхности или с белком в ткани), облегчая таким образом транспортировку молекулярной конструкции по настоящему изобретению к мишени, представляющей интерес. В некоторых примерах нацеливающий элемент может направлять молекулярную конструкцию в окрестность клетки-мишени. В других случаях нацеливающий элемент специфично связывается с молекулой, присутствующей на поверхности клеток-мишеней, или со второй молекулой, которая специфично связывается с молекулой, присутствующей на поверхности клетки. В некоторых случаях нацеливающий элемент может интернализироваться вместе с молекулярной конструкцией по настоящему изобретению после его связывания с мишенью, представляющей интерес, а значит, перемещаться в цитозоль клетки-мишени. Нацеливающий элемент может представлять собой антитело или лиганд рецептора клеточной поверхности или он может представлять собой молекулу, которая связывается с таким антителом или лигандом, таким образом опосредованно нацеливая молекулярную конструкцию по настоящему изобретению на участок-мишень (например, на поверхность выбранной клетки). Молекулярная конструкция по настоящему изобретению усиливает локализацию или содействует локализации эффектора (терапевтического средства) в пораженном участке по сравнению с терапевтическим средством без нацеливающей функции. Локализация относится к степени или относительной доле; она не означает абсолютную или полную локализацию эффектора в пораженном участке.
[0069] В соответствии с настоящим изобретением, термин «эффекторный элемент» относится к части молекулярной конструкции, которая вызывает биологическую активность (например, индуцирует иммунные ответы, оказывает цитотоксические эффекты и т.п.) или другую функциональную активность (например, мобилизует иммуноциты или другие терапевтические молекулы) после направления молекулярной конструкции к участку-мишени. Этот «эффект» может быть терапевтическим или диагностическим. Эффекторные элементы включают в себя элементы, связывающиеся с клетками и/или внеклеточными иммунорегуляторными факторами. Эффекторный элемент включает в себя такие средства, как белки, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы, гликопептиды, компоненты лекарственных средств (как низкомолекулярных лекарственных средств, так и биологических лекарственных средств), химические соединения, элементы и изотопы, а также их фрагменты.
[0070] Несмотря на то, что термины «первый», «второй», «третий» и т.д. могут использоваться для описания различных элементов, компонентов, областей и/или частей, эти элементы (а также компоненты, области и/или части) не должны ограничиваться данными терминами. Кроме того, использование таких порядковых числительных не предполагает наличие последовательности или порядка, если это четко не указано в контексте. Данные термины используются лишь для указания различия между одними и другими элементами. Таким образом, первый элемент, обсуждаемый ниже, можно называть вторым элементом без отступления от существа иллюстративных вариантов осуществления.
[0071] В данной работе термины «связывать», «соединять» и «конъюгировать» используются взаимозаменяемо для обозначения любого способа присоединения двух элементов друг к другу с помощью непосредственной связи или с использованием опосредованной связи между двумя элементами.
[0072] Термин «полипептид» относится к полимеру, содержащему по меньшей мере два аминокислотных остатка. Как правило, полипептид содержит аминокислотные остатки в диапазоне длины от 2 до приблизительно 200 остатков, предпочтительно от 2 до 50 остатков. Если представлена аминокислотная последовательность, то также предусматриваются варианты данной последовательности, содержащие L-, D- или бета-аминокислоты. Полипептиды также включают в себя полимеры аминокислот, в которых один или более аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический аналог соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также встречающиеся в природе полимеры аминокислот. Кроме того, данный термин применяется в отношении аминокислот, сочлененных друг с другом пептидной связью или другими «модифицированными связями» (например, в случаях, когда пептидная связь заменена α-сложноэфирной, β-сложноэфирной, тиоамидной, фосфорамидной, карбаматной, гидроксилатной и т.п.).
[0073] В некоторых вариантах осуществления предусматриваются консервативные замещения аминокислот, образующих любую из последовательностей, описанных здесь. В различных вариантах осуществления могут быть замещены один, два, три, четыре или пять различных остатков. Термин «консервативное замещение» используется для обозначения аминокислотных замещений, которые не изменяют активности молекулы (например, биологическую или функциональную активность и/или специфичность) в значительной степени. Как правило, консервативные аминокислотные замещения включают в себя замещение одной аминокислоты другой аминокислотой со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Некоторые консервативные замещения включают в себя «замещения аналогом», при которых стандартная аминокислота заменяется необычной (например, редкой, синтетической и т.д.) аминокислотой, минимально отличающейся от исходного остатка. Аналоги аминокислот считаются получаемыми синтетическим методом из обычных аминокислот без значительного изменения структуры исходной молекулы, являются изомерами или являются метаболитными предшественниками. Аминокислотные остатки (1) лизин, содержащий аминогруппу в боковой цепи, (2) цистеин, содержащий тиольную группу в боковой цепи, (3) серии и треонин, содержащие гидроксильную группу в боковых цепях, и (4) аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, содержащие карбоксильную группу в боковой цепи, считаются четырьмя различными группами аминокислот. Каждая из этих четырех групп аминокислот содержит в боковых цепях уникальную функциональную группу, которую можно применять для конъюгирования с различными химическими компонентами. Неприродные аминокислоты, содержащие одинаковые функциональные группы в боковых цепях, могут быть заменены для аналогичных целей.
[0074] В некоторых вариантах осуществления также предусмотрено, что полипептиды содержат последовательности с по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% или 90% и более предпочтительно по меньшей мере 95% или 98% идентичностью любой из последовательностей, описанных здесь.
[0075] «Процентная (%) идентичность аминокислотных последовательностей» по отношению к полипептидным последовательностям, идентифицированным здесь, определяется как процентная доля остатков полипептида в последовательности-кандидате, идентичных аминокислотным остаткам в конкретной полипептидной последовательности, после выравнивания этих последовательностей и, при необходимости, введения гэпов для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей и без рассмотрения каких-либо консервативных замещений в отношении идентичности этих последовательностей. Выравнивания в целях определения процентной идентичности последовательностей можно достичь различными способами, которые относятся к компетенции специалиста в данной области, например, с помощью общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области способны определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Для целей, изложенных здесь, сравнение последовательностей между двумя полипептидными последовательностями проводили с помощью компьютерной программы Blastp (protein-protein BLAST), предоставляемой в режиме онлайн Национальным центром биотехнологической информации (NCBI). Процентную идентичность аминокислотных последовательностей для некоторой полипептидной последовательности А и некоторой полипептидной последовательности В (что можно в качестве альтернативы сформулировать как определенное процентное значение идентичности аминокислотной последовательности А и полипептидной последовательности В, которым характеризуется полипептидная последовательность А) рассчитывают по следующей формуле:
где X представляет собой количество аминокислотных остатков, подсчитанных как идентичные совпадения в программе для выравнивания последовательностей BLAST при выравнивании последовательностей А и B в данной программе, a Y представляет собой общее количество аминокислотных остатков в последовательности А или в последовательности В, в зависимости от того, какая из них короче.
2
2
2
n
2
[0076] Термин «пегилированная аминокислота», используемый здесь, относится к цепи полиэтиленгликоля (PEG) с одной аминогруппой и одной карбоксильной группой. Как правило, пегилированная аминокислота имеет формулу NH-(CHCHO)-COH. В настоящем изобретении значение n находится в диапазоне от 1 до 20; предпочтительно в диапазоне от 2 до 12.
[0077] Используемый здесь термин «конъюгирующий фрагмент» относится к молекуле, содержащей одну или несколько функциональных групп, которая является химически активной и способна ковалентно связываться с другими химическими единицами. Неограничивающие примеры функциональной группы включают в себя гидроксил-, карбонил-, карбоксил-, тиол-, амино-, трет-бутилдиметилсилил- (TBDMS), N-гидроксисукцинимидил- (NHS), малеимид-, винилсульфон-, моносульфон-, метилсульфонилбензотиазол-, йод-, иодацетамид- азид-, алкин-, тетразин-, циклооктен- и циклооктин- группы. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, конъюгирующий фрагмент линкерного звена содержит две функциональные группы, одна из которых представляет собой карбоксильную или аминовую группу для связывания с альфа-аминовой или карбоксильной группой спейсера путем образования амидной связи между ними. Таким образом, конъюгирующий фрагмент соединен с N- или С-концом спейсера, а другой конъюгирующий фрагмент представляет собой азидную, алкиновую, тетразиновую, циклооктеновую или циклооктиновую группу для связывания с элементом или с другим линкерным звеном с использованием реакции CuAAC, iEDDA или SPAAC.
[0078] Используемый здесь термин «концевой» по отношению к полипептиду относится к аминокислотному остатку на N- или С-конце полипептида. Применительно к полимеру, термин «концевой» относится к составному звену полимера (например, полиэтиленгликоля в настоящем изобретении), расположенному на конце основной цепи полимера. В описании и в формуле изобретения термин «свободный конец» используется для обозначения концевого аминокислотного остатка или составного звена, химически не связанного с какой-либо другой молекулой.
[0079] Термин «антиген» или «Ag», используемый здесь, определяется как молекула, вызывающая иммунный ответ. Этот иммунный ответ может включать в себя секреторный, гуморальный и/или клеточный антиген-специфический ответ. В настоящем изобретении термин «антиген» может означать любое из белка, полипептида (включая его мутантные формы или биологически активные фрагменты), полисахарида, гликопротеина, гликолипида, нуклеиновой кислоты или их комбинации.
2
L
H
[0080] В описании и в формуле изобретения термин «антитело» используется в наиболее широком смысле и охватывает полностью собранные антитела, фрагменты антител, которые связываются с антигенами, такие как антиген-связывающий фрагмент (Fab/Fab'), F(ab')-фрагмент (содержащий две антиген-связывающие Fab-части, связанные друг с другом дисульфидными связями), вариабельный фрагмент (Fv), одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), биспецифический одноцепочечный вариабельный фрагмент (bi-scFv), нанотела, одновалентные антитела и диатела. «Фрагменты антител» включают в себя часть интактного антитела, предпочтительно антиген-связывающую область или вариабельную область интактного антитела. Как правило, «антитело» относится к белку, состоящему из одного или более полипептидов, кодируемых, главным образом, генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов. Широко известные гены иммуноглобулинов включают в себя гены константных областей каппа-, лямбда-, альфа-, гамма-, дельта-, эпсилон- и мю-цепей, а также множество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируются как «каппа» или «лямбда». Тяжелые цепи классифицируются как «гамма», «мю», «альфа», «дельта» или «эпсилон», что, в свою очередь, определяет классы иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Как известно, типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела) образует тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара содержит одну «легкую» цепь (приблизительно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (приблизительно 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область из приблизительно 100-110 или более аминокислот, преимущественно отвечающих за распознавание антигена. Термины «вариабельная область легкой цепи (V)» и «вариабельная область тяжелой цепи (V)» относятся, соответственно, к этим легким и тяжелым цепям. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, фрагмент антитела можно получить путем изменения природы антитела или путем синтеза de novo с применением методов рекомбинантных ДНК. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело и/или фрагмент антитела могут быть биспецифическими и могут находиться в различных конфигурациях. Например, биспецифические антитела могут содержать два различных антиген-связывающих участка (вариабельные области). В различных вариантах осуществления биспецифические антитела можно получить с применением гибридомной методики или методики рекомбинантных ДНК. В некоторых вариантах осуществления биспецифические антитела обладают специфичностью связывания с по меньшей мере двумя различными эпитопами. Во многих конфигурациях молекул, в которых используются фрагменты антител, фрагменты антител могут быть заменены миметиками антител, которые связываются с теми же антигенными компонентами, что и фрагменты антител. Миметики антител включают в себя антикалины, DARP, белок-миметик антител (аффитело), фломеры, анкирины, авимеры и другие.
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
[0081] Термин «специфично связывается», используемый здесь, относится к способности антитела или его антиген-связывающего фрагмента к связыванию с антигеном с константой диссоциации (Kd), составляющей не более чем приблизительно 1×10 М, 1×10 М, 1×10 М, 1×10 М, 1×10 М, 1×10 М, 1×10 М и/или к связыванию с антигеном с аффинностью, по меньшей мере в два раза превышающей его аффинность к неспецифическому антигену.
[0082] Термин «лечение», используемый здесь, включает в себя предупреждающее (например, профилактическое), радикальное или паллиативное лечение и термин «осуществление лечения» также включает в себя предупреждающее (например, профилактическое), радикальное или паллиативное лечение. В частности, термин «осуществление лечения», используемый здесь, относится к применению молекулярной конструкции или содержащей ее фармацевтической композиции в отношении к субъекта, имеющего медицинское состояние или симптом, связанный с медицинским состоянием, заболевание или нарушение вследствие медицинского состояния или предрасположенность к медицинскому состоянию, или к ее введению ему с целью частичного или полного снижения интенсивности, ослабления, облегчения, задерживания начала проявления, сдерживания прогрессирования, уменьшения тяжести и/или снижения частоты возникновения одного или более симптомов или характерных особенностей конкретного заболевания, нарушения и/или состояния. Лечение может проводиться в отношении субъекта, у которого не проявляются признаки заболевания, нарушения и/или состояния, и/или в отношении субъекта, у которого проявляются только ранние признаки заболевания, нарушения и/или состояния, в целях снижения риска развития патологии, связанной с заболеванием, нарушением и/или состоянием.
[0083] Термин «эффективное количество», используемый здесь, относится к количеству молекулярной конструкции согласно настоящему изобретению, достаточному для достижения желаемого терапевтического отклика. Эффективное количество средства не гарантирует излечения заболевания или состояния, но обеспечивает такое лечение заболевания или состояния, при котором начало проявления заболевания или состояния задерживается, приостанавливается или предупреждается или при котором симптомы заболевания или состояния ослабляются. Эффективное количество можно разделить на одну, две или более доз в форме, подходящей для введения один, два или более раз в течение всего указанного периода времени. Конкретное эффективное или достаточное количество зависит от таких факторов, как конкретное состояние, подвергаемое лечению, физическое состояние пациента (например, масса тела, возраст или пол пациента), вид субъекта, подвергаемого лечению, продолжительность лечения, характер сопутствующей терапии (если таковая имеется), а также конкретные используемые составы и структура химических соединений или их производных. Эффективное количество может быть выражено, например, в виде общей массы активного компонента (например, в граммах, миллиграммах или микрограммах) или в виде соотношения массы активного компонента и массы тела, например, в виде миллиграммов на килограмм (мг/кг).
[0084] Термины «применение» и «введение» используются здесь взаимозаменяемо для обозначения применения молекулярной конструкции или фармацевтической композиции по настоящему изобретению в отношении субъекта, нуждающегося в лечении.
[0085] Термины «субъект» и «пациент» используются здесь взаимозаменяемо и подразумевается, что они означают животное, в том числе человека, которое подвергается лечению с помощью молекулярной конструкции, фармацевтической композиции и/или способа по настоящему изобретению. Подразумевается, что термин «субъект» или «пациент» относится как к мужскому, так и к женскому полу, если пол явно не указан. Соответственно, термин «субъект» или «пациент» включает любое млекопитающее, для которого способ лечения по настоящему изобретению может дать благоприятный эффект. Примеры «субъекта» или «пациента» включают в себя человека, крысу, мышь, морскую свинку, обезьяну, свинью, козу, корову, лошадь, собаку, кошку, птицу и домашнюю птицу, но не ограничиваются ими. В типичном варианте осуществления пациентом является человек. Термин «млекопитающее» относится ко всем представителям класса млекопитающих, в том числе к людям, приматам, домашним и сельскохозяйственным животным, таким как кролик, свинья, овца и крупный рогатый скот, к зоопарковым животным, к животным, используемым в спорте, к домашним животным, к грызунам, таким как мышь и крыса. Термин «млекопитающее, отличное от человека» относится ко всем представителям класса млекопитающих, за исключением человека.
[0086] Настоящее изобретение основано по меньшей мере на конструировании фармацевтических средств Т-Е, которые можно доставлять в клетки-мишени, ткани-мишени или органы в увеличенных долях по сравнению с кровотоком, лимфоидной системой и другими клетками, тканями или органами. За счет этого терапевтический эффект фармацевтических средств увеличивается, а масштаб и тяжесть побочных эффектов и токсичности уменьшаются. Также возможно вводить терапевтический эффектор в виде молекулы Т-Е в более низкой дозе, чем в форме без нацеливающего элемента. Таким образом, терапевтический эффектор можно вводить в более низких дозах без потери действенности, при этом побочные эффекты и токсичность уменьшаются.
[0087] ЧАСТЬ I. Новая конструкция разветвленных линкерных звеньев
[0088] I-(i) Новые формы разветвленных линкерных звеньев
[0089] Первый аспект настоящего изобретения относится к разветвленному линкеру, содержащему (1) ядро, в состав которого входит множество связывающих аминокислотных остатков, и (2) множество связывающих ветвей, соответственно, соединенных со связывающими аминокислотными остатками ядра. Ядро характеризуется наличием одного или двух конъюгирующих фрагментов, связанных с его N- или/и С-концом. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, конъюгирующий фрагмент применяется для эффективного соединения функционального элемента (например, нацеливающего элемента, терапевтического эффекторного элемента или элемента для улучшения фармакокинетики) с ядром в целях улучшения терапевтического эффекта линкерного звена.
[0090] Ядро представляет собой полипептид длиной от 3 до 120 аминокислотных остатков, содержащий по меньшей мере два связывающих аминокислотных остатка, которые независимо друг от друга представляют собой остатки лизина (K), аспарагиновой кислоты (D) и/или глутаминовой кислоты (Е); например, ядро может содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более остатков K, D и/или Е. Предпочтительно ядро содержит от 2 до 20 остатков К или от двух до двадцати остатков D и/или Е. Следует иметь в виду, что связывающий аминокислотный остаток может представлять собой неприродный аминокислотный остаток, содержащий аминогруппу или карбоксильную группу в боковой цепи. Согласно вариантам осуществления изобретения, любые два связывающих аминокислотных остатка могут быть смежными или могут быть разделены спейсером.
[0091] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения пептидное ядро содержит по меньшей мере один (т.е. 1, 2, 3 или более) спейсер. В некоторых вариантах осуществления один спейсер связан с N-концом первого связывающего аминокислотного остатка, начиная с N-конца полипептида. В последующем описании такой спейсер, при необходимости, обозначается как N-концевой спейсер, поскольку он расположен на N-конце ядра. Дополнительно или в качестве альтернативы, один спейсер связан с С-концом последнего связывающего аминокислотного остатка, начиная с N-конца полипептида. Такой спейсер иногда упоминается далее как С-концевой спейсер, поскольку он расположен на С-конце ядра.
[0092] Как правило, спейсер может представлять собой (1) один аминокислотный остаток, отличный от связывающего аминокислотного остатка, (2) пептид из 2-20 (т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) аминокислотных остатков, отличных от связывающего аминокислотного остатка, или (3) пегилированную аминокислоту с 2-12 звеньями EG (т.е. с 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 звеньями EG). При этом если ядро содержит множество остатков K, спейсер может содержать либо пегилированную аминокислоту, содержащую 2-12 звеньев EG, либо содержать 1-12 не-K-аминокислотных остатков, где каждый из не-K-аминокислотных остатков, соответственно, выбран из остатков глицина (G), аспарагиновой кислоты (D), глутаминовой кислоты (Е), серина (S), аргинина (R), гистидина (Н), треонина (Т), аспарагина (N), глутамина (Q), пролина (Р), аланина (А), валина (V), изолейцина (I), лейцина (L), метионина (М), фенилаланина (F), тирозина (Y) и триптофана (W). Предпочтительно, каждый из не-K-аминокислотных остатков, соответственно, выбран из остатков G, S, R, Н, Т, N, Q, Р, А, V, I, L, М, F, Y, и W; более предпочтительно, каждый из не-K-аминокислотных остатков представляет собой, соответственно, остаток G и/или S. В альтернативном варианте, если ядро содержит множество остатков D или Е, спейсер может включать в себя пегилированную аминокислоту, содержащую от 2 до 12 звеньев EG, или содержать 1-12 не-D/E-аминокислотных остатков, где каждый из не-D/E-аминокислотных остатков, соответственно, выбран из остатков: K, G, S, R, Н, Т, N, Q, Р, А, V, I, L, М, F, Y и W; предпочтительно, каждый из не-D/E-аминокислотных остатков, соответственно, выбран из остатков G, S, R, Н, Т, N, Q, Р, А, V, I, L, М, F, Y и W; более предпочтительно, каждый из не-D/E-аминокислотных остатков представляет собой, соответственно, остаток G и/или S.
[0093] Следует иметь в виду, что когда ядро содержит более одного спейсера, эти спейсеры могут быть одинаковыми или разными, т.е. каждый спейсер может содержать одинаковые или разные аминокислотные последовательности и/или звенья EG. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, ядро содержит три спейсера, в которых один спейсер представляет собой пегилированную аминокислоту, содержащую 8 звеньев EG, а два других спейсера представляют собой, соответственно, один остаток S и один остаток G. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, ядро содержит пять спейсеров, из которых один спейсер состоит из четырех остатков G и двух остатков S, а другие четыре спейсера, соответственно, состоят из одного остатка G и одного остатка S. В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения, ядро содержит пять спейсеров, каждый из которых представляет собой пегилированную аминокислоту, содержащую 4 звена EG.
[0094] При получении линкерного звена пептид или цепь PEG, содержащая аминогруппу (например, сукцинимидиловый сложный эфир, сложный эфир TFP или карбоксильную группу) или карбоксильную реакционноспособную группу (например, аминогруппу), связывается со связывающими аминокислотными остатками (т.е. с остатками K, D и/или Е) ядра. В частности, пептид или цепь PEG, содержащая аминогруппу на одном конце и функциональную группу на другом конце, может связываться с остатком K ядра путем образования амидной связи между реакционноспособной аминогруппой пептида или цепи PEG и аминогруппой остатка К. Сукцинимидиловый сложный эфир может представлять собой сложный эфир NHS. В качестве альтернативного варианта, пептид или цепь PEG, содержащая карбоксил-реакционноспособную группу на одном конце и функциональную группу на другом конце, может связываться с карбоксильной группой остатка D или Е ядра путем образования амидной связи между аминогруппой пептида или цепи PEG и карбоксильной группой остатка D или Е. В настоящем изобретении пептид или цепь PEG, связанная со связывающим аминокислотным остатком, называется связывающей ветвью, содержащей функциональную группу на свободном конце (т.е. на конце, не связанном со связывающим аминокислотным остатком ядра). Как правило, функциональная группа выбирается из аминовой, карбоксильной, гидроксильной, TBDMS, NHS, малеимидной, винилсульфоновой, моносульфоновой, метилсульфонилбензотиазольной, йодной, йодацетамидной, азидной, алкиновой, циклооктиновой, тетразиновой и циклооктеновой групп, в которых тетразиновой группой является 1,2,3,4-тетразин, 1,2,3,5-тетразин, 1,2,4,5-тетразин или их производные, циклооктеновая группа представляет собой норборненовую или транс-циклооктеновую (ТСО) группу, а циклооктиновая группа выбрана из дибензоциклооктина (DIBO), дифторированного циклооктина (DIFO), бициклононина (BCN) и дибензоазациклооктина (DIBAC или DBCO). Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения тетразиновой группой является 6-метилтетразин.
[0095] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, связывающая ветвь представляет собой пептид, содержащий от 2 до 12 (т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12) аминокислотных остатков (каждый из которых может представлять собой природный или неприродный аминокислотный остаток), отличных от связывающего аминокислотного остатка. В некоторых вариантах осуществления ядро содержит множество остатков K, а связывающая ветвь представляет собой пептид, содержащий от 2 до 12 не-K-аминокислотных остатков (т.е. аминокислотных остатков, независимо выбранных из остатков G, Е, D, S, R, Н, Т, N, Q, Р, А, V, I, L, М, F, Y и W). В соответствии с одним рабочим примером, ядро содержит множество остатков K, а связывающая ветвь представляет собой пептид, содержащий от 5 до 10 аминокислотных остатков, которые независимо друг от друга выбраны из остатков G, S, Е и R. В качестве альтернативного варианта, связывающая ветвь может представлять собой цепь PEG, содержащую от 2 до 24 (т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24) звеньев EG; предпочтительно, от 5 до 15 звеньев EG; более предпочтительно, от 6 до 12 звеньев EG. Следует иметь в виду, что пептид или цепь PEG связывающей ветви может быть замещена полимером приблизительно такой же длины. Для использования в качестве связывающих ветвей подходит полимер, содержащий углеводы или другие гидрофильные структурные элементы.
[0096] В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один конъюгирующий фрагмент связан с альфа-аминогруппой N-концевого спейсера и/или с карбоксильной группой С-концевого спейсера. Конъюгирующий фрагмент не может быть аминокислотным остатком, поскольку аминокислотный остаток содержит как аминовую, так и карбоксилатную группы, и эти две группы мешают друг другу в образовании пептидной связи с пептидным ядром.
[0097] При этом конъюгирующий фрагмент линкерного звена содержит реакционноспособную аминогруппу (например, карбоксильную или карбонилхлоридную группу) или реакционноспособную карбоксильную группу (например, аминогруппу или гидразиновую группу) на одном конце и конъюгирующую группу на другом конце, при этом конъюгирующая группа выбрана из азидной, алкиновой, тетразиновой, циклооктеновой и циклооктиновой групп (см. иллюстративные примеры выше). Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, одним из спейсеров является N-концевой спейсер. В этих вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент содержит карбоксильную группу и, соответственно, может быть связан с альфа-аминогруппой N-концевого спейсера путем образования амидной связи между карбоксильной группой конъюгирующего фрагмента и альфа-аминогруппой N-концевого спейсера. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, один из спейсеров представляет собой С-концевой спейсер. В этих вариантах осуществления конъюгирующий фрагмент содержит аминогруппу и, таким образом, может быть связан с карбоксильной группой С-концевого спейсера путем образования амидной связи между аминогруппой конъюгирующего фрагмента и карбоксильной группой С-концевого спейсера. Как и в случаях, когда ядро содержит как N-концевой спейсер, так и С-концевой спейсер, ядро также содержит два конъюгирующих фрагмента, из которых один конъюгирующий фрагмент связан с альфа-аминогруппой N-концевой части спейсера, а другой конъюгирующий фрагмент связан с карбоксильной группой С-концевого спейсера. Таким образом, конъюгирующий фрагмент, связанный с ядром, содержит конъюгирующую группу на свободном конце (т.е. на конце, не связанном с ядром).
[0098] При необходимости конъюгирующий фрагмент дополнительно содержит цепь PEG, содержащую от 2 до 10 (т.е. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) звеньев EG, расположенных между карбоксильной или аминогруппой и конъюгирующей группой, например, цепь PEG может иметь 4, 6, 7 или 8 звеньев EG.
[0099] Следует иметь в виду, что если ядро содержит два конъюгирующих фрагмента, связанные с ним, их конъюгирующие группы могут быть одинаковыми или разными. Предпочтительно, это две разные конъюгирующие группы. Согласно предпочтительным примерам, одна конъюгирующая группа представляет собой азидную, алкиновую или циклооктиновую группу, а другая конъюгирующая группа представляет собой тетразиновую или циклооктеновую группу.
[00100] Предпочтительно, если конъюгирующая группа конъюгирующего фрагмента представляет собой азидную, алкиновую или циклооктиновую группу, то функциональная группа связывающей ветви представляет собой тетразиновую или циклооктеновую группу; если конъюгирующей группой конъюгирующего фрагмента является тетразиновая или циклооктеновая группа, то функциональной группой связывающей ветви является азидная, алкиновая или циклооктиновая группа. В состоянии, когда линкерное звено содержит два конъюгирующих фрагмента, соответственно связанные с N- и С-концевыми спейсерами, функциональная группа связывающей ветви в предпочтительном варианте представляет собой малеимидную, винилсульфоновую, моносульфоновую, йодную или йодацетамидную группу, конъюгирующая группа одного из двух конъюгирующих фрагментов представляет собой азидную, алкиновую или циклооктиновую группу, а конъюгирующая группа другого конъюгирующего фрагмента представляет собой тетразиновую или циклооктеновую группу.
[00101] Как показано на фиг. 1А-1Д, каждое из ядер 10а, 10b, 10с, 10d и 10е содержит конъюгирующий фрагмент, связанный с ней. На фиг. 1A-1D конъюгирующие фрагменты, содержащие, соответственно, тетразиновую группу, ТСО-группу, азидную группу и алкиновую группу, связаны с альфа-аминогруппами N-концевых спейсеров ядер 10а, 10b, 10с и 10d. На фиг. 1Д представлен альтернативный пример, в котором ацетильная группа, служащая в качестве защитной группы, связана с альфа-аминогруппой спейсера пептидного ядра 10е, а конъюгирующий фрагмент, содержащий группу DBCO (в качестве конъюгирующей группы), связан с карбоксильной группой С-концевого спейсера ядра 10е.
[00102] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ядро содержит две конъюгирующие группы. На фиг. 1Е проиллюстрирован такой пример, в котором конъюгирующие фрагменты, соответственно, содержащие тетразиновую группу и группу DBCO, связаны с альфа-аминогруппой N-концевого спейсера и карбоксильной группой С-концевого спейсера пептидного ядра 10f. На фиг. 1Ж представлен другой пример, в котором конъюгирующие фрагменты, соответственно, содержащие группу ТСО и группу DBCO, связаны с альфа-аминогруппой N-концевого спейсера и карбоксильной группой С-концевого спейсера пептидного ядра 10g. В альтернативном примере альфа-аминогруппа N-концевого спейсера и карбоксильная группа С-концевого спейсера пептидного ядра 10h, соответственно, связаны с конъюгирующим фрагментом, содержащим алкиновую группу, и с конъюгирующим элементом, содержащим группу DBCO.
[00103] На схемах 1-3 приведены примеры синтеза ядра, содержащего один или два связанных с ним конъюгирующих фрагмента.
[00104]
Схема 1. Получение ядра, содержащего тетразиновую или ТСО-группу, связанную с его N-концом
Схема 2. Получение ядра, содержащего группу DBCO, связанную с его С-концом
Схема 3. Получение ядра, содержащего два конъюгирующих фрагмента, соответственно, связанные с его N- и С-концами
[00105] Синтез пептидного ядра с использованием пегилированных аминокислот в качестве спейсеров имеет меньшее количество стадий, чем синтез с обычными аминокислотами, такими как G и S. Кроме того, при этом могут быть использованы пегилированные аминокислоты различной длины (т.е. с разным количеством звеньев этиленгликоля), обеспечивающие гибкость в отношении растворимости и расстояния между соседними аминогруппами остатков K. В дополнение к пегилированным аминокислотам, ядра также могут содержать искусственные аминокислоты, такие как аминокислоты в D-форме, гомоаминокислоты, N-метиламинокислоты и т.д. Предпочтительно для конструирования ядра используются пегилированные аминокислоты с различной длиной цепи PEG, поскольку элементы цепи PEG, содержащиеся в молекулах аминокислот, обеспечивают конформационную гибкость и должное расстояние между конъюгирующими группами, повышают растворимость в воде и, как правило, являются слабо иммуногенными. Синтез ядра, содержащего пегилированные аминокислоты, аналогичен процессу синтеза регулярных полипептидов.
[00106] В целях обеспечения стабильности, если N-конец ядра не связан с конъюгирующим фрагментом, он в предпочтительном варианте реализации изобретения связан с ацетильной группой.
[00107] Следует иметь в виду, что количество связывающих ветвей, связанных с ядром, в основном определяется количеством связывающих аминокислотных остатков (т.е. остатков K, D и/или Е), содержащихся в ядре. Поскольку в ядре содержатся, по меньшей мере, два связывающих аминокислотных остатка, линкерное звено может содержать множество связывающих ветвей.
[00108] Как показано на фиг. 2А, линкерное звено 20А содержит ядро, содержащее два смежных остатка K и спейсер 210 (т.е. «N-концевой спейсер»), связанный с N-концом первого остатка K. Конъюгирующий фрагмент, содержащий карбоксильную группу 230 и циклооктеновую группу 240, связан с альфа-аминогруппой спейсера 210 путем образования амидной связи между карбоксильной группой 230 конъюгирующего фрагмента и альфа-аминогруппой спейсера 210. В этом примере две связывающих ветви 220а, 220b независимо связаны с остатками K. Как отмечается ниже, свободный конец связывающей ветви (т.е. конец, не связанный с остатком K) применяется для соединения с функциональным элементом, а циклооктеновая группа 240, расположенная на N-конце ядра, позволяет создавать соединение с дополнительным функциональным элементом или с другим линкерным звеном.
[00109] На фиг. 2Б представлен альтернативный пример линкерного звена. На фиг. 2Б линкерное звено 20В содержит четыре остатка K и четыре связывающих ветви 220a-220d, соответственно, связанных с четырьмя остатками K. Первый и второй остатки K связаны путем образования между ними амидной связи, а второй, третий и четвертый остатки K отделены друг от друга спейсерами 210b или 201с. Конъюгирующий фрагмент, содержащий карбоксильную группу 230 и азидную группу 250, связан с N-концевым спейсером 210а путем образования амидной связи между карбоксильной группой 230 конъюгирующего фрагмента и альфа-аминогруппой N-концевого спейсера 210а. В соответствии с вышесказанным, спейсеры 210а-210с могут содержать одинаковые или разные аминокислотные последовательности и/или звенья EG.
[00110] На фиг. 2В показано линкерное звено 20С, содержащее пять остатков K, соответственно, разделенных спейсерами 210b-210е, и пять связывающих ветвей 220а-220е, соответственно, связанных с пятью остатками K. Кроме того, спейсеры 210а, 210f, служащие в качестве N- и С-концевых спейсеров, соответственно, связаны с N-концом первого остатка K и с С-концом последнего остатка K. В этом примере конъюгирующий фрагмент, содержащий карбоксильную группу 230 и алкиновую группу 260, связан со спейсером 210а путем образования амидной связи между карбоксильной группой 230 конъюгирующего фрагмента и альфа-аминогруппой спейсера 210а.
[00111] Как показано на фиг. 2Г, линкерное звено 20D имеет структуру, аналогичную линкерным звеньям 20А-20С, за исключением того, что конъюгирующий фрагмент связан с С-концом ядра, а не с N-концом ядра. Как показано на фиг. 2Г, конъюгирующий фрагмент, содержащий аминогруппу 235 и циклооктиновую группу 270, связан с С-концевым спейсером 210с путем образования амидной связи между аминогруппой 235 конъюгирующего фрагмента и карбоксильной группой С-концевого спейсера 210с.
[00112] На фиг. 2Д представлен альтернативный пример, в котором линкерное звено 20Е содержит четыре спейсера 210a-210d. В данном примере спейсеры 210а и 210d, служащие в качестве N- и С-концевых спейсеров, соответственно, связаны с N-концом первого остатка K и С-концом последнего остатка K. Спейсер 210b расположен между третьим и четвертым остатками K. Спейсер 210с расположен между пятым и шестым остатками K. Конъюгирующий фрагмент, содержащий аминогруппу 235 и тетразиновую группу 280, связан со спейсером 210d путем образования амидной связи между аминогруппой 235 конъюгирующего фрагмента и карбоксильной группой спейсера 210d.
[00113] На фиг. 2Е представлено линкерное звено 20F, содержащее два связывающих фрагмента, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения. Ядро содержит семь остатков К. Два спейсера 210а, 210f, служащие в качестве N- и С-концевых спейсеров, соответственно, расположены на N-конце и С-конце ядра. Конъюгирующий фрагмент, содержащий циклооктиновую группу 270, связан с альфа-аминогруппой спейсера 210а, а конъюгирующий фрагмент, содержащий циклооктеновую группу 240, связан с карбоксильной группой спейсера 210f. Как отмечается ниже, линкерное звено 20F может служить в качестве носителя для связи с тремя видами функциональных групп, соответственно, через соединяющие ветви 220а-220g, циклооктиновую группу 270 и циклооктеновую группу 240.
[00114] Следует иметь в виду, что отличительные признаки, описанные выше в отношении линкерных звеньев 20A-20F или любых других последующих линкерных звеньев, являются общими для других линкерных звеньев, раскрытых здесь, и, следовательно, некоторые или все эти отличительные признаки также применимы в следующих примерах, если это не противоречит контексту конкретной реализации изобретения. Тем не менее, для краткости изложения эти общие отличительные признаки могут не повторяться в дальнейшем в явной форме.
[00115] В зависимости от функциональной группы (т.е. аминовой, карбоксильной, гидроксильной, TBDMS, NHS, малеимидной, винилсульфоновой, моносульфоновой, метилсульфонилбензотиазольной, йодной, йодацетамидной, азидной, алкиновой, циклооктиновой, тетразиновой или циклооктеновой группы), присутствующих на свободном конце связывающей ветви, с применением соответствующей функциональной группы можно проектировать функциональный элемент (например, нацеливающий элемент, терапевтический эффекторный элемент или элемент для улучшения фармакокинетических свойств), таким образом, чтобы функциональный элемент был связан со свободным концом связывающей ветви путем любой из следующих химических реакций:
1) образование между ними амидной связи: в этом случае связывающая ветвь содержит аминовую, карбоксильную или NHS-группу на свободном конце, а функциональный элемент содержит аминовую или карбоксильную группу;
2) образование сложноэфирной связи между ними: в этом случае связывающая ветвь содержит гидроксильную или TBDMS-группу на свободном конце, а функциональный элемент содержит гидроксил-реакционноспособную группу (например, тозил-О-группу);
3) тиол-малеимидная (или винилсульфоновая) реакция: в этом случае связывающая ветвь содержит малеимидную, винилсульфоновую, моносульфоновую или метилсульфонилбензотиазольную группу на свободном конце, а функциональный элемент содержит тиольную группу;
N
4) реакция S2: в этом случае связывающая ветвь содержит йодную или йодацетамидную группу на свободном конце, а функциональный элемент содержит тиольную группу;
5) реакция катализируемого медью (I) азид-алкинового циклоприсоединения (реакция CuAAC): один из свободных концов связывающей ветви и функционального элемента содержит азидную группу или пиколилазидную группу, а другой содержит алкиновую группу; реакция CuAAC проиллюстрирована на схемах 4 и 5;
6) реакция Дильса-Альдера с обратными электронными требованиями (iEDDA): один из свободных концов связывающей ветви и функционального элемента содержит тетразиновую группу, а другой содержит циклооктеновую группу (например, ТСО или норборненовую группу); реакция iEDDA проиллюстрирована на схемах 6 и 7; или
7) реакция промотируемого напряжением азид-алкинового циклоприсоединения (SPAAC): один из свободных концов связывающей ветви и функционального элемента содержит азидную группу, а другой содержит циклооктиновую группу; реакция SPAAC проиллюстрирована на схеме 8.
[00116] В результате реакции CuAAC получают 1,5-дизамещенный 1,2,3-триазол. Реакция между алкином и азидом является весьма селективной и в природных биомолекулах отсутствуют алкиновые и азидные группы. Более того, эта реакция является быстрой и нечувствительной к рН. Было выдвинуто предположение, что вместо применения меди (I), например, бромида или йодида меди, для катализа клик-реакции лучше применять смесь меди (II) и восстановителя, такого как аскорбат натрия, для получения меди (I) в реакционной смеси in situ. В качестве альтернативы, второй элемент может быть связан с N- или С-концом ядра путем реакции без использования меди, в которой в качестве катализатора для катализа азид-алкинового циклоприсоединения применяется пентаметилциклопентадиенильный комплекс хлорида рутения.
Схема 4. Реакция CuAAC между азидной и алкиновой группами
Схема 5. Реакция CuAAC между пиколилазидной и алкинильной группами
Схема 6. Реакция iEDDA между ТСО и тетразиновой группами
Схема 7. Реакция iEDDA между норборненовой и тетразиновой группами
Схема 8. Реакция SPAAC между азидной и DBCO группами
[00117] В целях иллюстрации функциональные элементы, связанные со связывающими ветвями, называются первыми элементами. Очевидно, что количество первых элементов, которые несет линкерное звено, зависит от количества связывающих аминокислотных остатков (т.е. остатков K, D и/или Е) в ядре (и, таким образом, от числа связывающих ветвей). Соответственно, средний специалист в данной области при необходимости способен регулировать количество первых элементов линкерного звена по мере необходимости, например, для достижения нужного эффекта нацеливания или терапевтического эффекта.
[00118] Пример линкерного звена 30А, содержащего два первых элемента, показан на фиг. 3А. Линкерное звено 30А имеет структуру, аналогичную линкерному звену 20А на фиг. 2А, за исключением того, что два первых элемента 310а и 310b, соответственно, связаны с остатками K ядра через связывающие ветви 220а и 220b. На фиг. 3Б представлен другой пример, в котором линкерное звено 30В содержит пять первых элементов 310а-310е, соответственно, связанных с ним через связывающие ветви 220а-220е. Аналогичным образом, на фиг. 3В связывающие ветви 310а-310с обеспечивают конъюгирование трех первых элементов 310а-310с.
[00119] В целях усиления намеченного или желаемого эффекта (например, терапевтического эффекта) линкерное звено в дополнение к первому элементу может содержать второй элемент. Например, второй элемент может представлять собой нацеливающий элемент или эффекторный элемент. В опциональных вариантах осуществления настоящего изобретения первый элемент представляет собой эффекторный элемент, а второй элемент может представлять собой другой эффекторный элемент, действующий аддитивно или синергично с первым элементом или независимо от него. Также опционально первый и второй элементы проявляют разные свойства, например, первый элемент представляет собой нацеливающий элемент, а второй элемент представляет собой эффекторный элемент и наоборот. В качестве альтернативы, первый элемент представляет собой эффекторный элемент, а второй элемент представляет собой элемент, способный к улучшению фармакокинетических свойств линкерного звена, таких как растворимость, скорость выведения, период полураспада и биодоступность. Выбор конкретного первого элемента и/или второго элемента зависит от предполагаемого применения, при котором должно использоваться это линкерное звено (или разветвленное линкерное звено). Примеры этих функциональных элементов рассматриваются ниже в части I-(ii) описания.
[00120] В структурном плане второй элемент связан с конъюгирующей группой (т.е. с азидной, алкиновой, тетразиновой, циклооктеновой или циклооктиновой группой) конъюгирующего фрагмента, связанного с N- или С-концом ядра. В частности, второй элемент может быть дополнительно конъюгирован с короткой цепью PEG (предпочтительно содержащей от 2 до 12 звеньев EG) и дополнительно связан с конъюгирующей группой.
[00121] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, конъюгирующая группа ядра представляет собой азидную, алкиновую, тетразиновую, циклооктеновую или циклооктиновую группу. Соответственно, второй элемент, содержащий азид-реакционноспособную группу, азид-реакционноспособную группу (например, алкиновую или DBCO группы), алкин-реакционноспособную группу (например, азидную группу), тетразин-реакционноспособную группу (например, группу норборнена или ТСО), циклооктен-реакционноспособную группу (например, тетразиновую группу) или циклооктин-реакционноспособную группу (например, азидную группу), может быть связан с конъюгирующей группой ядра путем подходящей клик-реакции, например реакции CuAAC, iEDDA или SPAAC.
[00122] Фигура 4А, за исключением признаков, рассматриваемых ниже, подобна фиг. 2А. Во-первых, линкерное звено 40А содержит два первых элемента 410а и 410b, соединенных со связывающими ветвями 220а и 220b, соответственно. Во-вторых, на N-конце ядра имеется циклооктеновая группа 240, и, соответственно, второй элемент, содержащий реакционноспособную по отношению к циклооктенам группу (например, тетразиновую группу 280), может быть связан с циклооктеновой группой 240 путем реакции iEDDA.
[00123] На фиг. 4Б представлен альтернативный пример, в котором линкерное звено 40 В имеет структуру, аналогичную структуре линкерного звена 20Е на фиг. 2Д, за исключением того, что азидная группа 250 присутствует на С-конце ядра, а не на тетразиновой группе 280. Кроме того, шесть первых элементов 410а-410f связаны со связывающими ветвями 220a-220f, соответственно, а второй элемент, содержащий алкиновую группу 260, связан с азидной группой 250 путем реакции CuAAC.
[00124] В качестве альтернативы, линкерное звено может иметь две конъюгирующие группы, присутствующие на его N- и С-концах, соответственно. Как указано выше, если первая конъюгирующая группа представляет собой азидную, алкиновую или циклооктиновую группу, то вторая конъюгирующая группа предпочтительно представляет собой тетразиновую или циклооктеновую группу. Соответственно, два функциональных элемента могут быть связаны с ядром путем реакций SPAAC и iEDDA или путем реакций CuAAC и iEDDA. Например, второй элемент, содержащий циклооктин-реакционноспособную группу (например, азидную группу), может быть связан с первой связывающей группой путем реакции SPA АС, а третий элемент, содержащий алкин-реакционноспособную группу (например, азидную группу), тетразин-реакционноспособную группу (например, норборненовую группу или группу ТСО) или циклооктен-реакционноспособную группу (например, тетразиновую группу), может быть связан со второй связывающей группой путем реакции CuAAC или iEDDA. В качестве альтернативы, второй элемент, содержащий тетразин-реакционноспособную группу (например, норборненовую или ТСО-группу) или циклооктен-реакционноспособную группу (например, тетразиновую группу), может быть связан с первой связывающей группой путем реакции iEDDA, а третий элемент, содержащий азид-реакционноспособную группу (например, алкиновую группу или группу DBCO), алкин-реакционноспособную группу (например, азидную группу) или циклооктин-реакционноспособную группу (например, азидную группу), может быть связан со второй связывающей группой путем реакции CuAAC или SPAAC.
[00125] На фиг. 4В представлен пример линкерного звена 40С, которое содержит две конъюгирующие группы, соответственно, связанные со вторым и третьим элементами. Линкерное звено 40С имеет структуру, аналогичную структуре линкерного звена 20F на фиг. 2Д, за исключением того, что первые элементы 410a-410g, соответственно, соединены со связывающими ветвями 220a-220g, второй элемент 420, содержащий азидную группу 250, соединен с циклооктином 270 путем реакции SPAAC, а третий элемент 430, содержащий тетразин 280, соединен с циклооктеном 240 путем реакции iEDDA.
[00126] Если требуется высвобождение эффекторных элементов на целевом участке, в связывающей ветви может быть реализована расщепляемая связь. Такая связь разрывается кислотным или щелочным гидролизом, восстановлением, окислением или ферментами. Одним из вариантов реализации расщепляемых цепей PEG, которые можно использовать для образования связывающей ветви, является NHS-PEG2-20-SS-малеимид (или винилсульфон), где SS представляет собой дисульфидную связь, которая может быть медленно восстановлена, а группа NHS используется для конъюгирования с аминогруппой ядра, связывая цепь PEG с ядром. Малеимидная (или винилсульфоновая) группа на свободном конце связывающей ветви может быть замещена азидной, алкиновой, тетразиновой или напряженной алкиновой группой. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, связывающая ветвь представляет собой цепь PEG, содержащую от 2 до 20 звеньев EG с дисульфидной связью на свободном конце (т.е. на конце, не связанном с ядром).
[00127] На схеме 9 приведены примеры сульфгидрил-реакционноспособных химических групп (например, малеимидов, винилсульфонов и галоацетилов), которые могут быть заменены в целях конъюгирования с сульфгидрил-содержащими молекулами.
Схема 9. Тиол-специфическое соединение
[00128] Малеимидная группа вступает в специфическую реакцию с сульфгидрильными группами, когда показатель рН реакционной смеси составляет от 6,5 до 7,5. Тиосукцинимидный аддукт является в незначительной степени обратимым, при этом элиминация малеимида в физиологических условиях происходит медленно. Чтобы избежать обратной реакции Михаэля по тиолу, дециклизацию тиосукцинимидного аддукта проводят с помощью основного катализа в нежестких условиях (>рН 9,0) и полученный продукт является химически стабильным.
[00129] Винилсульфоновая группа может вступать в селективную реакцию со свободной тиольной группой. Реакция Михаэля присоединения винилсульфоновой группы подходит для выборочного изменения сульфгидрильных групп предполагаемых молекул в нежестких условиях (рН 7-8).
N
[00130] Прямая реакция S2 йодацетильной группы с сульфгидрильной группой дает стабильную тиоэфирную связь. Группа R представляет собой фрагмент scFv, пептиды, низкомолекулярные лекарственные средства или пептидное ядро (для разветвленных линкерных звеньев), содержащие сульфгидрильную группу.
2
[00131] На схеме 10 представлен способ конъюгирования белкового элемента с ядром, содержащим гидроксильные группы. Образование линкерного звена PEG (3) может осуществляться путем прямой этерификации гидроксилсодержащего ядра (1) с помощью тозилатной связывающей ветви (2) в условиях стехиометрического количества NaH с каталитическим количеством NaI. Желаемое этерифицированное ядро с фрагментом scFv (4) может быть получено дополнительным 1,4-добавлением интермедиата (3) с фрагментом scFv. Группа Y представляет собой малеимидную или винилсульфоновую группу, которая вступает в реакцию с группой Y'. Группа Y' представляет собой группу SH белкового элемента или группу SH или группу NH пептида.
Схема 10. Способ конъюгирования белкового элемента с ядром, содержащим гидроксильные группы
[00132] На схеме 11 приведен пример конъюгирования низкомолекулярных соединений с ядром, содержащим гидроксильные группы. Различные реакции перекрестного связывания могут быть использованы при образовании связывающей ветви тозилата с лекарственным средством (6) с использованием связывающей ветви (5) и Y'-модифицированного низкомолекулярного лекарственного средства в качестве исходных компонентов. Желаемое этерифицированное ядро с лекарственным средством (7) может быть получено путем этерификации гидроксисодержащего ядра (1) с помощью тозилатной связывающей ветви с лекарственным средством (6) в условиях стехиометрического количества NaH с каталитическим количеством NaI. Группа Y представляет собой концевую функциональную группу связывающей ветви, выбранную из TBDMS, гидроксильной, малеимидной, NHS, винилсульфоновой, азидной, алкиновой, ТСО, BCN, DBCO и тетразиновой групп. Группа Y' представляет собой концевую функциональную группу модифицированного низкомолекулярного лекарственного средства, выбранную из группы карбоновой кислоты, сульфгидрильной, аминовой, NHS, винилсульфоновой, азидной, алкиновой, ТСО, BCN, DBCO и тетразиновой групп. Обозначение X представляет поперечную связь между двумя концевыми функциональными группами Y и Y' после реакции связывания.
Схема 11. Способ конъюгирования низкомолекулярного элемента с ядром, содержащим гидроксильные группы
6
6
6
6
[00133] На схеме 12 приведен пример получения связывающей ветви TsO-PEG-OTBDMS, используемой на схеме 11. Гексаэтиленгликоль (HO-PEG-OH) производится серийно. TsCl/NaOH-опосредованное образование моносульфоната гексаэтиленгликоля может привести к образованию тозилатной связывающей ветви (8) (TsO-PEG-OH). Дальнейшая TBDMSCl/имидазол-опосредованная силилэтерификация тозилатной связывающей ветви (8) может обеспечить нужную связывающую ветвь с тозилом и защитной группой OTBDMS (9) (TsO-PEG-OTBDMS).
Схема 12. Подготовка линкерной ветви для связывания с гидроксильной группой
6
2
6
6
3
[00134] На схеме 13 представлен альтернативный пример получения связывающей ветви Cl-PEG-OTBDMS, используемой на схеме 11. SOCl-опосредованное монохлорирование гексаэтиленгликоля может дать этанилхлорид (10) (Cl-PEG-OH). Дальнейшая TBDMS-Cl/имидазол-опосредованная силилэтерификация этанилхлорида (10) может обеспечить нужную связывающую ветвь (11) (Cl-PEG-OTBDMS). Сокращения: TBAF - тетрабутиламмонийфторид; DCC - N,N'-дициклогексилкарбодиимид; EtN - триэтиламин; TBDMS - трет-бутилдиметилсилил; NHS - N-гидроксисукцинимид; Ts - п-толуолсульфонил; DMF - диметилформамид.
Схема 13. Получение альтернативной линкерной ветви для соединения с гидроксильной группой ядра
2
3
2
[00135] На схеме 14 представлен способ конъюгирования белкового элемента с ядром, содержащим группы карбоновой кислоты. Прямая этерификация ядра, содержащего СОН (12), с помощью связывающих ветвей, содержащих ОН-группу (13), в типичных условиях DCC/NHS/EtN может обеспечить соответствующее этерифицированное ядро (14). Затем присоединение по Михаэлю с участием сульфаниламида или азагетероцикла модифицированного сложным эфиром ядра (14) к фрагменту scFv может обеспечить необходимое этерифицированное ядро с фрагментом scFV (15). Другой конец связывающей ветви содержит Y-группу, представляющую собой малеимидную или винилсульфоновую группу, которая реагирует с Y' группой. Группа Y' представляет собой группу SH белкового элемента или группу SH или группу NH пептида.
Схема 14. Способ конъюгирования белкового элемента с ядром, содержащим группы карбоновой кислоты
2
2
3
[00136] На схеме 15 приведен пример конъюгирования низкомолекулярных элементов с ядром, содержащим группы карбоновой кислоты (СОН). Прямая этерификация ядра, содержащего СОН (12), с помощью связывающих ветвей с ОН-группой (16) в типичных условиях DCC/NHS/EtN может обеспечить соответствующее модифицированное сложным эфиром ядро (17). Затем конъюгирование модифицированного сложным эфиром ядра (17) с модифицированными низкомолекулярными лекарственными средствами в надлежащих условиях может обеспечить нужное модифицированное сложным эфиром ядро с лекарственным средством (18). Группа Y представляет собой концевую функциональную группу связывающей ветви, выбранную из OTBDMS, гидроксильной, малеимидной, NHS, винилсульфоновой, азидной, алкиновой, ТСО, BCN, DBCO и тетразиновой групп. Группа Y' представляет собой концевую функциональную группу модифицированного низкомолекулярного лекарственного средства, выбранную из группы карбоновой кислоты, сульфгидрильной, аминовой, NHS, винилсульфоновой, азидной, алкиновой, ТСО, BCN, DBCO и тетразиновой групп. Обозначение X представляет связь между двумя концевыми функциональными группами Y и Y' после реакции связывания.
Схема 15. Способ конъюгирования низкомолекулярных элементов с ядром, содержащим группы карбоновых кислот
6
6
6
6
2
6
6
3
[00137] На схеме 16 приведен пример получения связывающей ветви TsO-PEG-OH, использованной на схеме 15. В этом примере TsCl/NaOH-опосредованное моносульфонатное образование гексаэтиленгликоля (HO-PEG-OH) может привести к образованию тозилатной связывающей ветви (8) (TsO-PEG-OH). Альтернативный пример получения связывающей ветви Cl-PEG-OTBDMS показан на схеме 17. В этом примере SOCl-опосредованное монохлорирование гексаэтиленгликоля (HO-PEG-OH) может обеспечить этанилхлорид (10) (Cl-PEG-OH). Сокращения: TBAF - тетрабутиламмонийфторид; DCC - N,N'-дициклогексилкарбодиимид; EtN - триэтиламин; NHS - N-гидроксисукцинимид; Ts - п-толуолсульфонил; ДМФА - диметилформамид.
Схема 16. Получение связывающей ветви для связывания с группой карбоновой кислоты
Схема 17. Получение альтернативной связывающей ветви для связывания с группой карбоновой кислоты
12
12
12
3
12
12
3
12
[00138] На схеме 18 показано получение линкерной ветви и ее конъюгирование с ОН-группами сериновых остатков в пептидном ядре. Процесс получения HO-PEG-Cl (19) схож с процессом, описанным на схеме 17. При этом НО-PEG-винилсульфон (20) можно получить путем взаимодействия HO-PEG-Cl (19) с винилсульфонатом натрия. TsCl/EtN - опосредованное моносульфонатное образование НО-PEG-винилсульфона (20) может привести к образованию тозилатной связывающей ветви (21) (TsO-PEG-винилсульфон). В отдельной реакции пептидное ядро Ac-ZSZSZSC вступает в реакцию с коротким линкером малеимид-PEG-DВСО для присоединения DBCO путем клик-реакции. Затем модифицированное пептидное ядро (22) вступает в реакцию с тозилатной связывающей ветвью (21) (TsO-PEG-винилсульфон) в условиях стехиометрического количества NaH с каталитическим количеством NaI, чтобы получить пептидное ядро (23), модифицированное линкером PEG. Затем присоединение по Михаэлю с участием сульфаниламида пептидного ядра (23), модифицированного линкером PEG, к SH-содержащему фрагменту scFv может обеспечить нужное пептидное ядро (24), модифицированное линкером PEG, с фрагментом scFv.
Схема 18. Способ конъюгирования связывающих ветвей с пептидным ядром, содержащим сериновые остатки
[00139] На схеме 19 показан способ конъюгирования низкомолекулярных элементов с пептидным ядром, содержащим сериновые остатки. Процесс схож с процессом, описанным на схеме 17. В этом случае небольшие молекулы лекарственного средства конъюгируются со связывающими ветвями до того, как связывающие ветви конъюгируются с гидроксигруппами пептидного ядра. Для образования связывающей ветви тозилата с лекарственным средством (6) путем взаимодействия связывающей ветви тозилата (5) с Y'-модифицированным низкомолекулярным лекарственным средством могут быть использованы различные реакции перекрестного связывания. Нужное эффекторное линкерное звено (28) с лекарственными средствами может быть получено путем этерификации серин-содержащего пептидного ядра (22) тозилат-связывающей ветвью с лекарственным средством (6) в условиях стехиометрического количества NaH с каталитическим количеством NaI. Группа Y представляет собой концевую функциональную группу связывающей ветви, выбранную из OTBDMS, гидроксильной, малеимидной, NHS, винилсульфоновой, азидной, алкиновой, ТСО, BCN, DBCO и тетразиновой групп. Группа Y' представляет собой концевую функциональную группу модифицированного низкомолекулярного лекарственного средства, выбранную из группы карбоновой кислоты, сульфгидрильной, аминовой, NHS, винилсульфоновой, азидной, алкиновой, ТСО, BCN, DBCO и тетразиновой групп. Обозначение X представляет связь между двумя концевыми функциональными группами Y и Y' после реакции связывания.
Схема 19. Способ конъюгирования низкомолекулярных элементов с линкерным звеном пептидного ядра, содержащего сериновые остатки
[00140] I-(ii) Функциональные элементы, подходящие для использования в разветвленном линкере
[00141] В том случае, если линкерное звено (или разветвленный линкер) содержит только первый элемент, но не второй и/или третий элемент, то первый элемент является эффекторным элементом, который может оказывать терапевтическое воздействие на субъект. С другой стороны, если это линкерное звено в дополнение к первому элементу содержит другие элементы, то по меньшей мере один из таких элементов представляет собой эффекторный элемент, а другой может быть другим эффекторным элементом, нацеливающим элементом или элементом, способным улучшать одно или несколько фармакокинетических свойств линкерного звена (например, растворимость, скорость выведения, период полураспада и биодоступность). Например, линкерное звено может иметь два эффекторных элемента различного вида, один эффекторный элемент и один нацеливающий элемент или один элемент, улучшающий фармакокинетические свойства, два нацеливающих элемента различного вида и один эффекторный элемент, два эффекторных элемента различного вида и один нацеливающий элемент или один нацеливающий элемент, один эффекторный элемент и один элемент, способный улучшать фармакокинетическое свойство линкерного звена.
[00142] В целях лечения диффузной опухоли один из первого и второго элементов линкерного звена представляет собой фрагмент антитела (например, фрагмент scFv), специфичный к поверхностному антигену, который ассоциирован с диффузной опухолью и/или сверхэкспрессирован на диффузной опухоли, а другой из первого и второго элементов линкерного звена представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или фрагмент антитела, специфичный к поверхностному антигену CD3 или CD16a. Предпочтительно первый элемент линкерного звена представляет собой фрагмент антитела, специфичный к опухоль-ассоциированному антигену, а второй элемент линкерного звена представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или фрагмент антитела, специфичный к поверхностному антигену CD3 или CD16a. Согласно вариантам осуществления настоящего изобретения, поверхностный антиген, ассоциированный с диффузной опухолью и/или сверхэкспрессируемый из диффузной опухоли, представляет собой CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD43, CD72a, CD78, CD79a, CD79b, CD86, CD134, CD137, CD138 или CD319. В некоторых случаях цитотоксическое лекарственное средство выбрано из мертанзина, ауристатина, майтансина, доксорубицина, калихеамицина и камптотецина.
[00143] К диффузным опухолям, которые можно лечить с помощью линкерного звена, можно отнести: острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз (CML), лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому или миелому.
[00144] В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения линкерное звено используется для лечения лимфомы или лейкемии, вызванной В-лимфоцитами, при этом первый элемент представляет собой фрагмент антитела (например, фрагмент scFv), специфичный к CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD37, CD79a или CD79b, а второй элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или фрагмент антитела (например, фрагмент scFv), специфичный к CD3 или CD16a.
[00145] В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения линкерное звено используется для лечения лимфомы или лейкемии, вызванной В-лимфоцитами, при этом первый элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к CD79a, а второй элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к CD79b, или наоборот.
[00146] В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения заболевание, подвергаемое лечению линкерным звеном, представляет собой плазмоцитому или множественную миелому, при этом первый элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к CD38, CD78, CD138 или CD319, а второй элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или фрагмент антитела, специфичный к CD3 или CD16a.
[00147] В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения линкерное звено оказывает влияние на Т-клеточную лимфому или лейкоз, при этом первый элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к CD5, CD30 или CD43, а второй элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или фрагмент антитела, специфичный к CD3 или CD16a.
[00148] В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения линкерное звено используется для лечения миелогенного лейкоза, при этом первый элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к CD33 или CD34, а второй элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или фрагмент антитела, специфичный к CD3 или CD16a.
[00149] При лечении плотных опухолей первый элемент линкерного звена представляет собой пептидный гормон, фактор роста или фрагмент антитела, специфичный к опухоль-ассоциированному антигену, а второй элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство, агонист толл-подобных рецепторов, хелатор, образующий комплекс с радиоактивным нуклидом, цитокин или фрагмент антитела, специфичный к фактору роста, антигену клеточной поверхности, гаптену или цитокину.
Y
Y
A
x
[00150] Опухоль-ассоциированный антиген выбран из рецептора 1 эпидермального фактора роста человека (HER1), рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2), рецептора 3 эпидермального фактора роста человека (HER3), рецептора 4 эпидермального фактора роста человека (HER4), углеводного антигена 19-9 (СА 19-9), углеводного антигена 125 (СА 125), муцина 1 (MUC 1), ганглиозида GD2, ганглиозида GD3, ганглиозида GM2, фукозила GM1, Neu5GcGM3, меланом-ассоциированного антигена (MAGE), простат-специфического мембранного антигена (PSMA), антигена стволовых клеток простаты (PSCA), мезотелина, родственного муцину Tn, сиалированного Tn, Lewis, сиалированного Lewis, Lewis, Lewis, гепарин-связывающего эпидермального фактора роста (HB-EGF), глобо-Н и стадиеспецифического эмбрионального антигена-4 (SSEA-4).
[00151] Пептидный гормон выбран из секретина, гастрина, холецистокинина (ССK), гастриносвобождающего пептида, глюкагоноподобного полипептида 1 (GLP-1), нейромедина, октреотида, тиреотропного гормона (TSH), адренокортикотропного гормона (АСТН), гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) и соматостатина.
[00152] Фактор роста выбран из эпидермального фактора роста (EGF), мутантного EGF, эпирегулина, гепарин-связывающего эпидермального фактора роста (HB-EGF), сосудистого эндотелиального фактора роста A (VEGF-A), основного фактора роста фибробластов (bFGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF). В одном рабочем примере первым нацеливающим элементом является EGF, мутантный EGF, HB-EGF, VEGF-A, bFGF или HGF. В другом рабочем примере первый эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к EGF, мутантному EGF, VEGF-A, bFGF или HGF.
[00153] Поверхностный антиген представляет собой PD-1, PD-L1, CTLA-4, CD3, CD16a, CD28 или CD134.
[00154] Гаптен представляет собой динитрофенол (DNP), тринитрофенол (TNP), дансил, пенициллин, п-аминобензойную кислоту или короткий пептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23.
[00155] Цитокин представляет собой IL-2, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, TGF-β или TNF-α. Предпочтительно, второй элемент представляет собой фрагмент ненейтрализующего антитела, специфичный к цитокину, выбранному из IL-2, IFN-α, IFN-γ и TNF-α.
2+
[00156] Следует принять во внимание, что цитотоксическое лекарственное средство, проявляющее цитотоксическое действие на опухолевые клетки, может представлять собой антиэстрогены (например, тамоксифен, ралоксифен и мегестрол), агонисты LHRH (например, госкрклин и лейпролид), антиандрогены (например, флутамид и бикалутамид), средство фоторадиоционной терапии (например, вертопорфин, фталоцианин, фотосенсибилизатор Рс4 и деметокси-гипокреллин А), азотистые иприты (например, циклофосфамид, ифосфамид, трифосфамид, хлорамбуцил, эстрамустин и мелфалан), нитрозомочевина (например, кармустин и ломустин), алкилосульфаты (например, бусульфан и треосульфан), триазены (например, дакарбазин, темозоломид), платиносодержащие соединения (например, цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин), алкалоиды барвинка (например, винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин), таксоиды (например, паклитаксел, доцетаксел и таксол), эпиподофиллины (например, этопозид, этопозид фосфат, тенипозид, топотекан, 9-аминокамптотецин, камптоиринотекан, иринотекан, криснатол, митомицин С), антиметаболиты, ингибиторы DHFR (например, метотрексат,, дихлорометотрексат, триметрексат, эдатрексат), ингибиторы ИМФ-дегидрогеназы (например, микофеноловая кислота, тиазофурин, рибавирин и EICAR), ингибиторы рибонуклеотидредуктазы (например, гидроксимочевина и дефероксамин), аналоги урацила (например, 5-флуроурацил (5-FU), флоксуридин, доксифлуридин, ратитрексед, тегафур-урацил, капецитабин), аналоги цитозина (например, цитарабин (ara С), арабинозид цитозина и флударабин), аналоги пурина (например, меркаптопурин и тиогуанин), аналоги витамина D3 (например, ЕВ 1089, СВ 1093 и KH 1060), ингибиторы изопренилирования (например, ловастатин), дофаминергические нейротоксины (например, 1-метил-4-фенилпиридин-ион), ингибиторы клеточного цикла (например, стауроспорин), актиномицин (например, актиномицин D, дактиномицин), блеомицин (например, блеомицин А2, блеомицин В2, пепломицин), антрациклин (например, даунорубицин, доксорубицин, идарубицин, эпирубицин, пирарубицин, зорубицин, митоксантрон), ингибиторы MDR (например, верапамил), ингибиторы Са АТФ-аза (например, тапсигаргин), иматиниб, талидомид, леналидомид, ингибиторы тирозинкиназы (например, акситиниб, бозутиниб, цедираниб, дазатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, лестартиниб, нератиниб, нилотиниб, семаксаниб, сунитиниб, тоцераниб, вандетаниб, ваталаниб, ритуксимаб, нилотиниб, сорафениб, эверолимус, темсиролимус, ингибиторы протеасом (например, бортезомиб), ингибиторы mTOR (например, рапамицин, темсиролимус, эверолимус и ридафоролимус), облимерсен, гемцитабин, карминомицин, лейковорин, пеметрексед, циклофосфамид, дакарбазин, прокарбазин, преднизолон, дексаметазон, кампатецин, пликамицин, аспарагиназа, аминоптерин, метоптерин, порфиромицин, мелфалан, лейрозидин, лейрозин, хлорамбуцил, трабектин, прокарбазин, дискодермолид, карминомицин, аминоптерин или гексаметилмеламин. В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения, цитотоксическим лекарственным средством является мертанзин, ауристатин, майтанзин, доксорубицин, калихеамицин или камптотецин.
[00157] Агонист толл-подобного рецептора представляет собой липотейхоевую кислоту, глюкан, мотолимод, имиквимод, ресиквимод, гардиквимод, CpG-олигодезоксинуклеотид (CpG-DON), липополисахарид (LPS), монофосфориллипид А или зимозан.
[00158] К плотной опухоли, которую можно лечить с применением данного метода, можно отнести меланомы, рак пищевода, рак желудка, опухоль головного мозга, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, рак почки, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичника, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак яичка или эпидермоидный рак рак головы и шеи.
[00159] I-(iii) Использование разветвленного линкерного звена
[00160] Настоящее изобретение также относится к способу лечения различных заболеваний с использованием описанного здесь подходящего линкерного звена. В целом, способ включает в себя стадию введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества линкерного звена в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[00161] По сравнению с ранее известными терапевтическими конструкциями, линкерное звено, обсуждаемое в Части I, обладает преимуществом по нескольким пунктам.
(1) Количество функциональных элементов можно регулировать в соответствии с потребностями и/или способами применения. Линкерное звено может содержать два элемента (т.е. первый и второй элементы) или три элемента (т.е. первый, второй и третий элементы) в соответствии с требованиями способа применения (например, в соответствии с заболеванием, подвергаемым лечению, путем введения линкерного звена и авидностью и/или аффинностью связывания антитела, переносимого линкерным звеном по настоящему изобретению). Например, в случаях прямой доставки линкерного звена в ткань или орган, может быть достаточно одного элемента, выступающего в качестве эффекторного элемента, устраняя необходимость во втором элементе, выступающем в качестве нацеливающего элемента. В случаях периферической доставки линкерного звена по настоящему изобретению (например, при пероральном, энтеральном, назальном, местном, чресслизистом введении, внутримышечной, внутривенной или внутрибрюшинной инъекции) может быть необходимо, чтобы линкерное звено одновременно содержало нацеливающий элемент, специфично нацеливающий линкерное звено на очаг поражения, и эффекторный элемент, проявляющий терапевтический эффект в очаге поражения. В целях повышения эффективности нацеливания или лечения, или для повышения стабильности линкерного звена в него можно дополнительно включать третий элемент (например, второй нацеливающий элемент, второй эффекторный элемент или цепь PEG).
(2) Первый элемент представлен в виде «связки». Как описано ранее, количество первых элементов может изменяться в зависимости от количества связывающих аминокислотных остатков, содержащихся в ядре. Если количество связывающих аминокислотных остатков в ядре находится в диапазоне от 2 до 20, то в каждом линкерном звене может содержаться по меньшей мере два первых элемента. Таким образом, вместо обеспечения всего одной молекулы (например, цитотоксического лекарственного средства и антитела), что может выполняться в рамках традиционных терапевтических конструкций или способов, линкерное звено способно обеспечивать большее количество функциональных элементов (в качестве нацеливающих элементов или в качестве эффекторных элементов) одновременно, что существенно улучшает терапевтический эффект.
(3) Линкерное звено может быть эффективно связано с функциональным элементом или с другой молекулярной конструкцией (см. Часть II ниже) через связанную с ним конъюгирующую группу. Линкерное звено может быть синтезировано в промышленных масштабах. В качестве альтернативы, ядро может быть легко получено в соответствии с процедурами, представленными на схемах 4-9, где N-концевой
9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc), выступающий в качестве защитной группы для защиты α-аминовой группы синтетического полипептида, заменен на конъюгирующую группу (т.е. азидную, алкиновую, тетразиновую, циклооктеновую или циклооктиновую группу). Дополнительно или в качестве альтернативы, конъюгирующая группа может быть связана с полипептидом путем взаимодействия с карбоксильной группой полипептида. Полученное таким образом ядро содержит одну или две конъюгирующие группы, которые играют роль соединителя для функциональных элементов (например, второго и/или третьего элемента) и ядра.
[00162] ЧАСТЬ II. Молекулярные конструкции с сочлененными линкерными звеньями и их применение
2
[00163] В другом аспекте настоящее изобретение направлено на реализацию молекулярной конструкции, содержащей два или более линкерных звеньев, соединяющихся друг с другом через их конъюгирующие фрагменты, и использование такой молекулярной конструкции. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, молекулярная конструкция содержит первое линкерное звено и второе линкерное звено. В целом, первое или второе линкерное звено, соответственно, имеют структуру, описанную выше в связи с другим аспектом (аспектами) и вариантом (вариантами) настоящего изобретения. В частности, первое линкерное звено содержит первое ядро и две или более связывающие ветви (далее - первые связывающие ветви), соединенных с первым ядром, второе линкерное звено содержит второе ядро и две или более связывающие ветви (далее - вторые связывающие ветви), соединенных со вторым ядром. Согласно описанию в части I настоящего изобретения, ядро отличается тем, что содержит по меньшей мере один конъюгирующий фрагмент, непосредственно связанный с N- и/или С-концом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, каждое из первого и второго ядер содержит конъюгирующий фрагмент, связанный с ним. Для удобства описания конъюгирующий фрагмент, связанный с первым ядром, назван первым фрагментом, а конъюгирующий фрагмент, связанный со второй ядром, назван вторым фрагментом. Первые элементы сопряжены с первыми связывающими ветвями, а вторые элементы сопряжены со вторыми связывающими ветвями. Затем первое и второе линкерные звенья связываются друг с другом путем реакции iEDDA, SPAAC или CuAAC между первым и вторым конъюгирующими фрагментами. Первый и второй элементы имеют разные функции и могут представлять собой небольшие молекулы или пептиды и белки. Например, первый и второй элементы могут быть фрагментами антител, такими как svFv, sdAb, Fab или F(ab)', или миметиками антител, специфичными к двум разным антигенам.
[00164] В частности, каждый из первого и второго конъюгирующих фрагментов содержит конъюгирующую группу на одном конце и аминогруппу или карбоксильную группу на другом конце, при этом конъюгирующая группа выбирается из азидной, алкиновой, тетразиновой, циклооктеновой и циклооктиновой групп. Соответственно, конъюгирующий фрагмент может быть связан с альфа-аминогруппой N-концевого спейсера через карбоксильную группу. В качестве альтернативы, конъюгирующий элемент может быть связан с карбоксильной группой С-концевого спейсера через аминогруппу. Таким образом, конъюгирующий фрагмент, связанный с ядром, содержит конъюгирующую группу на свободном конце.
[00165] В ряде случаев конъюгирующий фрагмент дополнительно содержит цепь PEG, содержащую от 2 до 10 звеньев EG, расположенных между конъюгирующей группой и соединительной группой. Например, цепь PEG может иметь 4, 6, 7 или 8 звеньев EG.
[00166] Опционально, одно из первого и второго линкерных звеньев может дополнительно содержать третий конъюгирующий фрагмент. Третий конъюгирующий фрагмент может быть использован для соединения с третьим элементом (таким как элемент антитела или длинноцепочечный PEG) или с третьим линкерным звеном. В этом случае первый и второй линкерные звенья связаны клик-реакцией. Как следствие, третий конъюгирующий фрагмент первого и второго линкерных звеньев соединяется с третьим элементом или с линкерным звеном путем различных клик-реакций.
[00167] II-(i) Структура молекулярной конструкции с сочлененным линкером
[00168] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, молекулярная конструкция содержит два линкерных звена, а линкерные звенья связаны друг с другом путем реакции CuAAC, SPAAC или iEDDA. В некоторых вариантах осуществления изобретения одно линкерное звено связано с множеством первых элементов, действующих в качестве нацеливающих элементов, а другое линкерное звено связано с множеством вторых элементов, действующих в качестве эффекторных элементов.
[00169] На фиг. 5А-5В показана связь между двумя линкерными звеньями.
[00170] На фиг. 5А изображена молекулярная конструкция, включающая в себя два линкерных звена 50А и 55А, которые связаны друг с другом путем реакции CuAAC. Первый блок 50А линкера содержит первое ядро 510, связывающую ветвь 520 (т.е. первую связывающую ветвь), связанную с первым ядром 510, и функциональный элемент 530 (т.е. первый элемент), связанный со связывающей ветвью 520, в которой N- или С-концевой спейсер первого ядра 510 содержит конъюгирующий фрагмент со связанной с ним азидной группой 515. Аналогичным образом, второе линкерное звено 55А содержит второе ядро 550, связывающую ветвь 560 (т.е. вторую связывающую ветвь), связанную со вторым ядром 550, и функциональный элемент 570 (т.е. второй элемент), связанный со связывающей ветвью 560, в которой N- или С-концевой спейсер второго ядра 550 содержит конъюгирующий фрагмент с присоединенной к нему алкиновой группой 516. В соответствии с этим, линкерные звенья 50А и 55А могут быть связаны путем реакции CuAAC между азидной группой 515 и алкиновой группой 516. Обозначение 541 на фиг. 5А представляет химическую связь, образованную путем реакции CuAAC.
[00171] На фиг. 5Б изображен другой пример молекулярной конструкции, в которой N-или С-концевой спейсер первого ядра 511 содержит конъюгирующий фрагмент со связанной с ним циклооктиновой группой 517, a N- или С-концевой спейсер второго ядра 551 содержит конъюгирующий фрагмент со связанной с ним азидной группой 515. Затем линкерные звенья 50В и 55В могут быть связаны друг с другом путем реакции SPAAC между циклооктиновой группой 517 и азидной группой 515. Обозначение 542 на фиг. 5Б представляет химическую связь, образованную путем реакции SPAAC.
[00172] В качестве альтернативы, первое и второе линкерные звенья могут быть связаны путем реакции iEDDA. Как показано на фиг. 5В, линкерные звенья 50С и 55С, соответственно, имеют структуру, схожую со структурой линкерных звеньев 50А/50В и 55А/55В, за исключением того, что ядра 512 и 552 имеют конъюгирующий фрагмент с тетразиновой группой 518 и конъюгирующий элемент со связанной с ним циклооктеновой группой 514, соответственно. Линкерные звенья 50С и 55С могут быть связаны друг с другом путем реакции iEDDA между тетразиновой группой 518 и циклооктеновой группой 514. Обозначение 543 на фиг. 5В представляет химическую связь, образованную путем реакции iEDDA.
[00173] Предпочтительно, если по меньшей мере одна из первой и второй связывающих ветвей связана с функциональным элементом путем реакции CuAAC или SPAAC, то первое и второе линкерные звенья соединяются друг с другом путем реакции iEDDA. В альтернативном варианте, если по меньшей мере одна из первой и второй связывающих ветвей связана с функциональным элементом путем реакции iEDDA, то первое и второе линкерные звенья соединяются друг с другом путем реакции CuAAC или SPAAC.
[00174] По сравнению с другими терапевтическими конструкциями, данная молекулярная конструкция имеет преимущество как минимум в следующих трех аспектах.
(1) Линкерные звенья, содержащие указанное количество и/или вид нацеливающего или эффекторного элемента, могут быть получены отдельно друг от друга, а затем они соединяются путем подходящей клик-реакции (например, реакции iEDDA, CuAAC или SPAAC).
(2) Количество и виды нацеливающих и/или эффекторных элементов могут варьироваться в соответствии с требованиями предполагаемого назначения (например, в зависимости от заболевания, требующего лечения, авидности связывания и/или аффинности нацеливающего и/или эффекторного элемента). Комбинация целевых и эффекторных элементов может быть скорректирована в соответствии с конкретными потребностями и/или областями применения. Каждый из нацеливающих и эффекторных элементов может варьироваться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, подлежащее лечению, физическое состояние пациента и/или вид заболевания, подлежащего лечению. Специалист в данной области способен объединить наиболее подходящий нацеливающий элемент и наиболее подходящий эффекторный элемент для достижения наилучшего терапевтического результата. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, нацеливающий элемент может представлять собой фактор роста, пептидный гормон, цитокин или фрагмент антитела, а эффекторный элемент может выступать в качестве иммуномодулятора, хелатора, образующего комплекс с радиоактивным нуклидом, цитотоксического лекарственного средства, цитокина, растворимого рецептора или антитела.
(3) По сравнению с другими реакциями связывания, реакция iEDDA или реакция SPAAC более эффективна с точки зрения связывания любых двух линкерных звеньев.
[00175] На фиг. 6 показаны шесть библиотек линкерных звеньев, которые могут быть подготовлены отдельно друг от друга. В этом варианте осуществления изобретения библиотеки 1-6, соответственно, содержат множество линкерных звеньев 60А, 60В, 60С, 65А, 65В и 65С, связанных с функциональными элементами. Линкерные звенья 60А, 60В и 60С имеют схожую структуру, при этом каждое из линкерных звеньев 60А, 60В и 60С содержит одно ядро 610 и определенное количество связывающих ветвей 620, причем N-или С-конец ядра 610 связан с конъюгирующим фрагментом, содержащим азидную группу 615. Например, линкерное звено 60А содержит три связывающие ветви 620 и, соответственно, три нацеливающих элемента 630а могут быть связаны с тремя связывающими ветвями 620. Аналогично, четыре нацеливающих элемента 630b и пять нацеливающих элементов 630с могут быть, соответственно, связаны с линкерными звеньями 60В и 60С. Нацеливающие элементы 630а, 630b и 630с могут быть одинаковыми или разными. Что касается линкерных звеньев 65А, 65В и 65С, то каждое из этих линкерных звеньев содержит одно ядро 650 и определенное количество связывающих ветвей 660, при этом N- или С-конец ядра 650 связан с конъюгирующим фрагментом с циклооктиновой группой 617. Как показано, два эффекторных элемента 670а, три эффекторных элемента 670b и шесть эффекторных элементов 670 с могут быть, соответственно, связаны с линкерными звеньями 65А, 65В и 65С. Эффекторные элементы 670а, 670b и 670с могут быть одинаковыми или разными. Библиотеки 1-6 могут быть подготовлены отдельно друг от друга. Специалист в данной области способен выбрать первое линкерное звено из библиотек 1, 2 и 3 и второе линкерное звено из библиотек 4, 5 и 6, а затем приступить к соединению первого и второго линкерных звеньев путем проведения реакции iEDDA между азидной группой 615 и циклооктиновой группой 617, получая молекулярную конструкцию, содержащую заданное количество нацеливающих и эффекторных элементов.
[00176] Следует иметь в виду, что молекулярная конструкция может содержать три линкерных звена, в которых первое и второе линкерные звенья связаны друг с другом путем реакции iEDDA, а затем третье линкерное звено соединено с первым или вторым линкерным звеном путем реакции CuAAC. В качестве альтернативы, первое и второе линкерные звенья связаны друг с другом путем реакции iEDDA, а третье линкерное звено связано с первым или вторым линкерным звеном путем реакции SPAAC. В некоторых вариантах реализации первое, второе и третье линкерные звенья, соответственно, несут множество первого, второго и третьего элементов, при этом первый, второй и третий элементы могут быть одинаковыми или разными.
[00177] На фиг. 7 показано, что линкерные звенья 70А, 70В и 70С связаны друг с другом путем реакций iEDDA и SPAAC. По своей структуре каждое линкерное звено 70А, 70В, 70С содержит ядро (710а, 710b, 710с), связывающую ветвь (720а, 720b, 720с), связанную с ядром (710а, 710b, 710 с), и функциональный элемент (730а, 730b, 730с), соединенный со связывающей ветвью (720а, 720b, 720с). Для обеспечения связывания N- или С-конец линкерного звена 70А содержит конъюгирующий фрагмент с тетразиновой группой, связанной с ним, N- и С-концы линкерного звена 70В, соответственно, имеют конъюгирующий фрагмент с циклооктеном и конъюгирующий фрагмент с азидными группами, связанными с ними, a N- или С-конец линкерного блока 70С содержит конъюгирующий фрагмент с циклооктиновой группой, связанной с ним. Соответственно, линкерные звенья 70А и 70В связаны путем реакции iEDDA между тетразиновыми и циклооктеновыми группами, при этом обозначение 750 на фиг. 7 представляет химическую связь, образованную реакцией iEDDA. С другой стороны, линкерные звенья 70В и 70С связаны путем реакции SPAAC между азидной и циклооктиновой группами, при этом обозначение 760 на фиг. 7, представляет химическую связь, образованную реакцией SPAAC.
[00178] Следует иметь в виду, что количество каждого из функциональных элементов 730а, 730b, 730с, соответственно, связанных с линкерными звеньями 70А, 70В и 70С, может быть одинаковыми или разными в зависимости от предполагаемой области применения. В соответствии с концепцией библиотеки, изображенной на фиг. 6, линкерные звенья, соответственно, несущие различные количества и/или виды функциональных элементов, могут быть подготовлены независимо друг от друга в качестве разных библиотек, и любой специалист в данной области способен выбрать и объединить требуемые линкерные звенья из библиотек в свете предполагаемого применения молекулярной конструкции.
[00179] Опционально молекулярная конструкция может дополнительно содержать относительно длинную цепь PEG, присоединенную к первому или ко второму ядру так, чтобы эта молекулярная конструкция могла разделяться вдали от ретикулоэндотелиальной системы и имела более длительный период полураспада после введения субъекту. В случае, когда белок модифицирован цепью PEG, чтобы улучшить его фармакокинетические свойства и/или снизить иммуногенность, предпочтительным является PEG массой до 20000-50000 Да. Соответственно, в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для присоединения нацеливающих и эффекторных элементов применяются связывающие ветви относительно меньшей длины, а цепь PEG массой 20000-50000 Да присоединяют к любому из линкерных звеньев с целью увеличения периода полураспада молекулярной конструкции in vivo.
[00180] В некоторых вариантах осуществления множественные фрагменты антител используются в качестве нацеливающих и/или эффекторных элементов при конструировании молекулярной конструкции. Фармацевтические средства с нацеливающими или эффекторными элементами, основанные на таких молекулярных конструкциях, содержащих фрагменты антител, должны иметь более длительный период полураспада in vivo, чем отдельные фрагменты антител. Для некоторых способов клинического применения желательно значительно увеличить период полураспада фармацевтических средств, чтобы устранить необходимость в их частом введении. В этих случаях цепи PEG массой 20000-50000 Да можно применять в качестве связывающих ветвей для связывания с фрагментами scFv, служащими в качестве нацеливающих или эффекторных элементов. Цепи PEG соответствующей длины применяются для модификации большого количества терапевтических белков с целью увеличения их периода полураспада.
[00181] Применение полипептида в качестве ядра обеспечивает универсальность молекулярной конструкции, где в одной конструкции могут присутствовать множественные копии или виды нацеливающих или эффекторных элементов, соответственно, при этом достигается улучшенная специфичность введения лекарственного средства и их эффективность в предполагаемых участках-мишенях. Большое количество конфигураций может быть достигнуто путем использования молекулярной конструкции, содержащей несколько линкерных звеньев. Несколько неограничивающих примеров: первое линкерное звено, несущее три фрагмента scFv в качестве нацеливающих элементов, и второе линкерное звено, несущее пять молекул терапевтического лекарственного средства; первое линкерное звено, несущее три фрагмента scFv в качестве нацеливающих элементов, и второе линкерное звено, несущее три фрагмента scFv в качестве эффекторных элементов; первое линкерное звено, несущее два первых фрагмента scFv (служащих первыми нацеливающими элементами), второе линкерное звено, несущее два вторых фрагмента scFv (служащих вторыми нацеливающими элементами), и третье линкерное звено, несущее пять молекул терапевтического лекарственного средства; первое линкерное звено, несущее два фрагмента bi-scFv в качестве нацеливающих элементов, и второе линкерное звено, несущее два фрагмента scFv в качестве эффекторных элементов; или первое линкерное звено, несущее три фрагмента scFv в качестве нацеливающих элементов, и второе линкерное звено, несущее два фрагмента scFv в качестве эффекторных элементов, плюс одна связывающая ветвь, присоединенная удлиненной цепью PEG массой 20000-50000 Да с целью улучшения фармакокинетических свойств.
[00182] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения бифункциональная цепь PEG, действующая в качестве связывающей ветви, используется для связывания антигенсвязывающих фрагментов антител (служащих в качестве нацеливающих или эффекторных элементов) с аминогруппами, расположенными в полипептидном ядре. Каждая цепь PEG может иметь группу NHS на одном конце и малеимидную и/или винилсульфоновую группу на другом конце. Группа NHS может связываться с аминогруппой в полипептидном ядре, а малеимидная или винилсульфоновая группа может связываться с сульфгидрильной группой остатка С фрагмента антитела, например, фрагмента scFv, bi-scFv или Fab антитела. Фрагменты ScFv и bi-scFv сконструированы так, чтобы иметь полипептидный линкер с концевым остатком С на С-конце. Фрагмент Fab может быть получен из целого IgG путем расщепления пепсином, а свободные сульфгидрильные группы могут быть получены из межцепочечной дисульфидной связи путем реакции мягкого восстановления.
[00183] Если все нацеливающие и эффекторные элементы представляют собой фрагменты scFv и применяются связывающие ветви массой 600 Да (12 звеньев EG), то молекулярная конструкция в общей сложности с шестью фрагментами scFv имеет молекулярную массу приблизительно 170000 Да. Молекулярная конструкция с семью фрагментами scFv имеет молекулярную массу приблизительно 200000 Да, а молекулярная конструкция с восемью фрагментами scFv имеет молекулярную массу приблизительно 230000 Да. Большинство молекулярных конструкций по настоящему изобретению имеют значение молекулярной массы менее 200000 Да, а несколько молекулярных конструкций имеет значение молекулярной массы 200000-250000 Да.
L
H
L
H
H
L
H
L
L
L
H
H
H
H
L
L
[00184] Если одна молекулярная конструкция должна нести четыре различных набора фрагментов scFv, то предпочтительным является наличие одного линкерного звена, несущего сочлененный одноцепочечный биспецифический фрагмент scFv (bi-scFv), такой как фрагменты scFv1-scFv2 (например, специфичный к HER2 и HER3), и двух других линкерных звеньев, каждое из которых несет один фрагмент scFv (т.е., соответственно, scFv3 и scFv4). Существует два способа конструирования биспецифических фрагментов scFv1-scFv2. В «тандемной» конфигурации реализовано расположение V1-V1-V2-V2 или V1-V1-V2-V2; в конфигурации «диатела» реализовано расположение V2-V1-V1-V2 или V2-V1-V1-V2. Подходящие линкеры с повторами последовательности GGGGS (SEQ ID NO: 24) или других последовательностей расположены между доменами иммуноглобулинов.
[00185] Как показывает практика, пептидный или PEG-линкер, содержащий малеимидную и азидную группы, при длительном хранении может полимеризоваться вследствие спонтанной реакции присоединения между малеимидной и азидной группами. Таким образом, предпочтительно, чтобы каждое линкерное звено получали заново и независимо, присоединяли к нацеливающим или эффекторным элементам в линкерных звеньях и незамедлительно проводили соединение линкерных звеньев путем клик-реакции. Альтернативный предпочтительный вариант осуществления заключается в том, что как нацеливающие элементы, так и эффекторные элементы конъюгируют с линкерными звеньями с алкиновыми группами и алкиновую группу в одном из линкерных звеньев далее превращают в азидную группу с помощью короткого гомобифункционального линкерного звена с азидными группами на обоих концах. Линкерные звенья, одно с алкиновой группой, а другое с азидной группой, далее соединяют путем клик-реакции. В еще одном варианте осуществления функциональной группой на свободном конце связывающей ветви является винилсульфон, который реагирует с сульфгидрильной группой и образует стабильную ковалентную связь при обычном физиологическом значении рН.
12
12
[00186] Предпочтительные связывающие ветви для настоящего изобретения представляют собой цепи PEG. Длина связывающих ветвей важна по нескольким соображениям. Они должны быть достаточно длинными, чтобы обеспечивать гибкость связанных фрагментов scFv или других видов функциональных элементов для достижения антигенных участков-мишеней на поверхности клеток-мишеней без стерических ограничений, но не настолько длинными, чтобы вызывать образование внутримолекулярных и межмолекулярных сплетений связывающих ветвей и связанных с ними фрагментов scFv или функциональных элементов или излишне увеличивать размер целой молекулярной конструкции, препятствуя ее проникновению в ткани. Слишком длинные связывающие ветви также могут быть неспособны обеспечивать сближение молекул антигенов с образованием компактных кластеров, если такие кластеры необходимы для инициирования процесса передачи сигнала для осуществления апоптоза или других клеточных эффектов. Оптимальную длину связывающих ветвей для различных видов комбинаций антигенов-мишеней и связывающихся с ними средств способен определить любой специалист в данной области техники без проведения излишних экспериментов. Связывающая ветвь NHS-(PEG)-малеимид (или винилсульфон) (массой приблизительно 500 Да) является предпочтительной в ряде молекулярных конструкций по настоящему изобретению. Полностью вытянутый (PEG) имеет длину 40-50.
[00187] Применимые связывающие ветви и соединительные ветви не ограничены цепями PEG. Можно применять пептиды, содержащие глицин, серии и другие гидрофильные аминокислотные остатки, а также полисахариды и другие биосовместимые линейные полимеры, модифицированные таким образом, чтобы они содержали NHS- и малеимидные группы (или винилсульфоновые группы).
2-12
[00188] Для определенных способов терапевтического применения желательно, чтобы эффекторные элементы в молекулярных конструкциях по настоящему изобретению высвобождались из связывающих ветвей, чтобы они могли поступать в клетки участка-мишени, в том числе, в клетки, связанные с нацеливающими элементами, или в окружающие клетки, вызывая фармакологические эффекты. В этих случаях в связывающую ветвь встраивают расщепляемую связь. Разработаны расщепляемые связи, восприимчивые к расщеплению путем гидролиза, воздействия кислот, восстановления и под действием ферментов. Например, в конструировании терапевтических конструкций применяются пептидные сегменты, восприимчивые к действию матриксных металлопротеиназ, присутствующих в воспаленных тканях. Пептидные сегменты, чувствительные к катепсинам В или С, которые присутствуют в эндосомах или липосомах различных клеток, также используются в линкерных звеньях конъюгатов антител с лекарственными средствами. Один вариант осуществления настоящего изобретения заключается в применении PEG-линкеров с S-S-связью, смежной с малеимидной или винилсульфоновой группой NHS-PEG-S-S-малеимид (или винилсульфон), где S-S представляет собой дисульфидную связь, которую можно подвергнуть медленному восстановлению.
[00189] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, нацеливающий элемент, описанный в вышеупомянутых вариантах осуществления, выбран из фактора роста, пептидного гормона, цитокина и фрагмента антитела, а эффекторный элемент представляет собой иммуномодулятор, например, агонист толл-подобного рецептора, хелатообразователь в комплексе с радиоактивным нуклидом, терапевтическое лекарственное средство, цитокин, растворимый рецептор или антитело.
[00190] В некоторых опциональных вариантах осуществления фрагмент антитела находится в форме антиген-связывающего фрагмента (Fab), вариабельного фрагмента (Fv), одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), однодоменного антитела (sdAb) или биспецифического одноцепочечного вариабельного фрагмента (bi-scFv). В соответствии с одним вариантом осуществления фрагмент bi-scFv представляет собой биспецифический тандемный фрагмент scFv или биспецифический фрагмент scFv в форме диатела.
L
H
L
H
H
L
[00191] Для сохранения диффундирующей способности молекулярных конструкций предпочтительным является размер молекулы менее 250000 Да. Таким образом, фрагменты scFv являются предпочтительными для большинства вариантов осуществления. На уровне ДНК гены конструируют так, чтобы V и V были связаны в виде единого полипептида в любом порядке (V-V или V-V) пептидным линкером из 10-25 аминокислотных остатков, преобладающими остатками в котором являются глицин и серин. На С-конце встраивают короткий пептидный фрагмент с глициновым и сериновым остатками и с концевым цистеиновым остатком. Расширение пептида может также включать другие гидрофильные и заряженные аминокислотные остатки, такие как остатки Н, K, R, N и Q, которые позволяют реализовать пептидное расширение и концевой остаток С в растянутой конфигурации, так что группа SH остатка С находится в свободном доступе для сопряжения со связывающими ветвями разветвленных линкерных звеньев. Рекомбинантные фрагменты scFv и bi-scFv можно получать в бактериях, таких как Е. coli и Pseudomonas putida, в дрожжах, таких как Pichia pastoris, или в клетках млекопитающих, таких как линии клеток СНО и HEK293.
H
[00192] Авторами было получено большое количество антител IgG, фрагментов Fab, scFv и различных антител, белков на основе Fc и других рекомбинантных антител в линиях клеток НЕK293 и СНО для проведения экспериментов в системах in vitro и в животных моделях. Также были разработаны линии клеток для получения антител для клинических испытаний с участием людей. Удобно использовать систему транзиентной экспрессии HEK293 для получения до 1 г IgG или фрагментов антител с применением нескольких колб объемом 1-2 литра в научно-исследовательской лаборатории. Фрагменты scFv, примененные в молекулярных конструкциях по настоящему изобретению, как правило, не имеют углеводной модификации, и углеводная модификация не требуется для активности связывания scFv с их антигенными мишенями. Более того, во фрагменте scFv имеется лишь одна дисульфидная связь и один концевой цистеин. Поэтому для получения фрагмента scFv были разработаны маломасштабные бактериальные системы экспрессии в качестве производственной альтернативы. В случае с Е. coli использовали системы экспрессии для извлечения фрагмента scFv из внутриклеточных телец-включений, из периплазмы и в секретируемой форме. В большинстве случаев фрагмент scFv можно очищать с применением аффинной колонки с белком L, который взаимодействует с V большинства легких κ-цепей, или, в других случаях, с применением ионообменных колонок.
[00193] В основе примеров настоящего изобретения лежит платформа с сочлененными линкерами, в которой в качестве нацеливающих и/или эффекторных элементов используются главным образом фрагменты scFv и Fab. Тем не менее, также можно подвергать скринингу конкретные связывающие молекулы из больших библиотек связывающих молекул на основе sdAb или других фрагментов антител. Библиотеки связывающих молекул, в основе которых не лежат домены иммуноглобулинов, но которые напоминают антитела тем, что они характеризуются аффинностью специфичного связывания с выбранными молекулами-мишенями, содержат (1) аптамеры, представляющие собой олигонуклеотиды или короткие пептиды, выбранные для связывания с молекулами-мишенями, (2) финомеры, представляющие собой небольшие связывающие белки, полученные из домена SH3 человеческого Fyn, (3) аффимеры, представляющие собой связывающие белки, полученные из семейства цистатинов - ингибиторов цистеиновых протеиназ, и (4) дарпины (искусственные белки с анкириновыми повторами), представляющие собой белки, полученные методами генной инженерии, со структурами, полученными из природных белков-анкиринов, и состоящие из 3, 4 или 5 повторяющихся мотивов этих белков. Эти миметики антител имеют молекулярные массы приблизительно 10000-20000 Да.
[00194] II-(ii) Функциональные элементы, подходящие для использования совместно с молекулярной конструкцией с сочлененным линкером
[00195] Как описано выше, сочлененный линкер содержит как минимум два линкерных звена, в которых первое линкерное звено несет один или несколько нацеливающих элементов, а второе линкерное звено несет один или несколько эффекторных элементов или элементов, улучшающих фармакокинетические свойства, и наоборот. Специалист в данной области способен выбрать подходящие функциональные элементы в качестве нацеливающего элемента, эффекторного элемента и/или элемента, улучшающего фармакокинетические свойства, в соответствии с первым и вторым элементами, выбранными в части I-(ii) описания, для получения желаемого эффекта.
[00196] II-(iii) Использование молекулярной конструкции с сочлененным линкером
[00197] Настоящее изобретение также относится к способу лечения различных заболеваний с использованием подходящей молекулярной конструкции с сочлененным линкером. Как правило, этот способ включает в себя стадию введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества молекулярной конструкции с сочлененным линкером в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
[00198] Следует иметь в виду, что примеры функциональных элементов, описанных выше в связи с другим аспектом (аспектами) или вариантом (вариантами) настоящего изобретения, также применимы в этих молекулярных конструкциях, поэтому эти примеры не повторяются здесь для краткости изложения.
[00199] Тем не менее, в качестве иллюстрации здесь обсуждается использование такой молекулярной конструкции при лечении различных видов рака легких. Для лечения пациентов с различными видами рака легких эффекторный элемент линкерного звена или молекулярная конструкция, которая должна вводиться пациенту, могут представлять собой одно из следующих лекарственных средств.
(1) Цитотоксические лекарственные средства - мертанзин, монометилауристатин Е (ММАЕ), пирролобензодизепин (PBD), леналидомид, помалидомид, эрибулин, тубулизин А, тубулизин В, доксорубицин, калихеамицин и камптотецин.
(2) Иммуностимуляторы-агонисты толл-подобных рецепторов, монофосфориллипид А.
(3) Иммунные ингибиторы контрольных точек - антитела, фрагменты антител или миметики антител, специфичные к CTLA-4, PD-1 и PD-L1.
[00200] Следующие экспериментальные примеры приведены для пояснения определенных аспектов настоящего изобретения и для помощи специалистам в данной области техники при практическом применении настоящего изобретения. Приведенные примеры никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Предполагается, что специалист в данной области способен, основываясь на приведенном здесь описании, без дальнейшей разработки в полной мере использовать настоящее изобретение.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫ
[00201] Пример 1: прямой синтез пептида 1-4 в качестве пептидного ядра
[00202] Были сконструированы четыре пептида, содержащие конъюгирующую группу, которая может использоваться в качестве ядра для конструирования разветвленных линкерных звеньев. Каждый из пептидов, содержащий конъюгирующие группы 1-4 (изготовленный на заказ компанией ChinaPeptide Co. Ltd., Shanghai, China), синтезировали непосредственно обычным твердофазным методом, а затем очистили путем обратно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием системы 3D HPLC Shimadzu Nexera-i LC-2040C, до чистоты не менее 95%. Для выполнения ВЭЖХ использовалась колонка Kromasil 100-5С18 (250 мм × 4,6 мм; 5 мкм) с подвижной фазой ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом ацетонитрила от 5% до 20% в течение 15 минут при скорости потока 1,0 мл/мин и температуре колонки 25°С.
[00203] Пептид 1 (чистота: 95,52%) содержит пептидную последовательность SEQ ID NO: 1 (GGSGGSGGSKGSGSKGSK), в которой и N-, и С-концы химически модифицированы. В частности, N-конец последовательности SEQ ID NO: 1 был модифицирован путем амидирования 4-пентиновой кислотой, а С-конец был этерифицирован метиловым спиртом. Пептид 2 (чистота: 97,05%) имел пептидную последовательность SEQ ID NO: 2 (GGSGGSKGSKGSKGSKGSK) с N- и С-концами, соответственно, модифицированными 2-азидоуксусной кислотой и метиловым спиртом. Для получения пептида 3 (чистота 98,71%) пептид SEQ ID NO: 3 (GSSGSSKGSGKGSGKGSGKGSGK) подвергли N-концевому амидированию 3-бутиновой кислотой с образованием С-концевого первичного амида с использованием амидной смолы. Аналогичным образом, для получения пептида 4 (чистота 95,95%) пептид SEQ ID NO: 4 (GSSGSSGSSGSKGSGSKGSGSK) амидировали с экзо-5-норборненкарбоновой кислотой на конце и его С-конец также модифицировали амидированием.
[00204] Синтезированные таким образом пептиды были идентифицированы с применением масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) (API 150 EX производства компании Applied Biosystems).
[00205] Пептид 1 (SEQ ID NO: 1), проиллюстрированный ниже, имеет молекулярную массу 1532,58 Да.
[00206] Пептид 2 (SEQ ID NO: 2), проиллюстрированный ниже, имеет молекулярную массу 1734,84 Да.
[00207] Пептид 3 (SEQ ID NO: 3), проиллюстрированный ниже, имеет молекулярную массу 2004,977 Да.
[00208] Пептид 4 (SEQ ID NO: 4), проиллюстрированный ниже, имеет молекулярную массу 1935,98 Да.
[00209] Очищенный образец норборнен-содержащего пептида 4 анализировали с применением аналитической ВЭЖХ на колонке Supelco С18 (250 мм × 4,6 мм; 5 мкм), с подвижной фазой ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом ацетонитрила от 0% до 100% в течение 30 минут при скорости потока 1,0 мл/мин и температуре колонки 25°С; поглощение ультрафиолета (УФ) измеряли на длине волны 210 нм (OD210). На фиг. 8А представлен профиль аналитической ВЭЖХ с обратной фазой для норборнен-содержащего пептида 4, который показывает пик норборнен-содержащего пептида 4 со временем удержания 14,17 минут (стрелка #2; стрелка #1 указывает на пик элюированного растворителя). На фиг. 8Б показан результат MALDI-TOF для масс-спектрометрии пептида 4. Если не указано иное, все масс-спектрометрические анализы выполнялись в лаборатории Mass Core Facility of Institute of Molecular Biology (IMB), Academia Sinica, Taipei, Taiwan; измерения проводились на масс-спектрометре Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF (производства компании Bruker Daltonics, Bremen, Germany).
[00210] Пример 2. Прямой синтез пегилированного пептида 5 в качестве пептидного ядра
4
4
4
4
4
[00211] Пептид 5 (изготовленный на заказ компанией Shanghai WuXi AppTech Co. Ltd., Shanghai, China), как показано ниже, также синтезировали непосредственно с использованием обычного твердофазного метода, в котором пегилированный пептид с последовательностью SEQ ID NO: 5 (-Хаа-K-Хаа-K-Хаа-K-Хаа-K-Хаа-K) был модифицирован азидоуксусной кислотой на N-конце и метиловым спиртом на С-конце. Авторы изобретения разработали пептиды и заказали изготовление этих двух пептидов компании Shanghai WuXi AppTech Co. Ltd., Shanghai, China.
[00212] Азид-содержащий пегилированный пептид 5 очистили с применением обратно-фазовой ВЭЖХ, используя систему ВЭЖХ-ВЕ Agilent Nexera-i 1200, до чистоты 97,58%. При обратно-фазовой ВЭЖХ использовали колонку Gemini-NX С18 (150 мм × 4,6 мм; 5 мкм) с подвижной фазой в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом ацетонитрила 10-40% в течение 20 минут при скорости потока 1,0 мл/мин и температуре колонки 25°С. На фиг. 9А представлен профиль аналитической обратно-фазовой ВЭЖХ азид-содержащего пегилированного пептида 5, который показывает, что пик азид-содержащего пегилированного пептида 5 имеет время удержания 7,941 минуты.
[00213] Идентификацию азид-содержащего пегилированного пептида 5 в качестве ядра выполняли методом ESI-MS. Фигура 9Б показывает, что представленный пегилированный пептид 5 представляет собой пептидное ядро, содержащее одну соединительную ветвь с азидной группой. Результат анализа ESI-MS указывает на то, что представленная молекулярная структура имеет молекулярную массу 996,6 Да.
[00214] Пример 3. Прямой синтез пептидов 6-10 в качестве пептидного ядра
[00215] Были получены пять пептидов, содержащих конъюгирующую группу, которая может использоваться в качестве ядра для получения линкерных звеньев с разветвленной структурой. Каждый из пептидов 6-10 синтезировали непосредственно обычным твердофазным методом (пептиды 6 и 10 изготавливали на заказ в компании ChinaPeptide Co. Ltd.; пептиды 7-9 изготавливали на заказ в компании NingBo KareBay Co. Ltd., Ningbo, China).
5
[00216] Пептид 6 (проиллюстрирован ниже) также содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (GGSGGSKGSKGSKGSKGSK), его N-конец был модифицирован азидо-Xaa-кислотой, а С-конец был модифицирован путем С-терминального амидирования. В качестве ядра пептид 6 содержит пять остатков K, разделенных спейсером, содержащим последовательность GS, а азидная группа на N-конце может быть подвергнута клик-реакции с элементом или другим линкерным звеном, содержащим соответствующую реакционноспособную группу.
[00217] Очищенный образец пептида 6 анализировали с применением обратно-фазовой аналитической ВЭЖХ на колонке Kromasil 100-5 С18 (250 мм × 4,6 мм; 5 мкм), с подвижной фазой в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом ацетонитрила 15-30% в течение 12 минут при скорости потока 1,0 мл/мин и температуре колонки 35°С.
[00218] Синтезированный таким образом пептид 6 исследовали методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Результат указывает на то, что молекулярная структура имеет молекулярную массу 1954,15 Да.
[00219] Как показано ниже, пептид 7 с последовательностью GGSGGSGGSKGSGSKGSK (SEQ ID NO: 1), был модифицирован дибензоциклооктиновой кислотой (DBCO-кислотой) на N-конце и амидирован амидной смолой на С-конце. Пептид 7 служит ядром, содержащим одну DBCO-группу на N-конце для клик-реакции с элементом или линкерным звеном.
[00220] Очищенный образец DBCO-содержащего пептида 7 анализировали с применением обратно-фазовой аналитической ВЭЖХ на колонке Supelco С18 (250 мм × 4,6 мм; 5 мкм), с подвижной фазой в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом ацетонитрила 0-73% в течение 30 минут при скорости потока 1,0 мл/мин и температуре колонки 25°С; УФ-поглощение измеряли на длине волны 300 нм. На фиг. 10А представлен профиль аналитической обратно-фазовой ВЭЖХ DBCO-содержащего пептида 7, пик которого имеет время удержания 19,166 минуты.
[00221] Синтезированный таким образом DBCO-содержащий пептид 7 анализировали с использованием MALDI-TOF. На фиг. 10Б показано, что DBCO-содержащий пептид 7 имеет молекулярную массу 1734,73 Да.
6
[00222] Как показано ниже, пептид 8 с последовательностью SKSKSK (SEQ ID NO: 6), был модифицирован азидо-Хаа-кислотой на N-конце и амидирован амидной смолой на С-конце. Пептид 8 (как показано ниже) содержит три остатка K, разделенных одной и той же спейсерной последовательностью (т.е. одиночным остатком S). Этот азид-содержащий пептид 8 имеет молекулярную массу 1024,17 Да.
6
[00223] Как показано ниже, пептид 9 содержит последовательность KKK (т.е. между остатками K отсутствует спейсер), в которой N-конец модифицирован пропаргил-Хаа-кислотой, а С-конец модифицирован С-концевым первичным амидированием. Данные на фиг. 11А показывают, что алкиновый пептид 9 имеет молекулярную массу 732,454 Да.
8
[00224] Как показано ниже, N-конец пептида 10 (KSKGK; SEQ ID NO: 7) модифицирован уксусной кислотой, а его С-конец модифицирован амин-Хаа-азидом. В качестве ядра пептид 10 содержит одну ацетильную группу для блокирования аминогруппы на N-конце и одну азидную группу на С-конце для клик-реакции с элементом или линкерным звеном. Пептид 10 содержит три остатка K, причем спейсер между первым и вторым остатками K представляет собой остаток S, а спейсер между вторым и третьим остатками K представляет собой остаток G. На фиг. 11Б показано, что пептид 10 имеет молекулярную массу 1009 Да.
[00225] Пример 4: Прямой синтез пептида 11, содержащего двойные конъюгирующие группы, (SEQ ID NO: 8) в качестве пептидного ядра для реализации линкерного звена с разветвленной структурой
[00226] Как показано ниже, пептид 11 содержит аминокислотную последовательность GGSGGSKGSSGKGGSGGS (SEQ ID NO: 8), в которой N-конец модифицирована экзо-5-норборненкарбоновой кислотой, а С-конец модифицирован 3-азидо-пропиламином. Пептид 11 (показан ниже), служащий ядром для формирования центрального линкерного звена, содержит экзо-5-норборненильную группу на N-конце для присоединения одного элемента или линкерного звена с помощью клик-реакции и азидную группу на С-конце для присоединения другого элемента или линкерного звена с помощью клик-реакции. Пептид 11, содержащий двойные конъюгирующие группы, синтезировали на заказ в компании ChinaPeptide Co. Ltd.
[00227] Пример 5. Синтез сегмента (SEQ ID NO: 9) октапептида холецистокинина (CCK8)
[00228] CCK8-содержащий пептид с последовательностью CGGGGSDYMGWMDF (SEQ ID NO: 9) был модифицирован уксусной кислотой на N-конце и амидирован амидной смолой на С-конце. Этот CCK8-содержащий пептид был спроектирован так, что он состоит из восьми аминокислотных остатков CCK с последующим N-концевым удлинением шести аминокислотных остатков (CGGGGS; SEQ ID NO: 10), а его N-конец представляет собой цистеиновый остаток. N-концевой цистеиновый остаток обеспечил SH-группу для конъюгирования с PEG-малеимидными связывающими ветвями линкерного звена согласно настоящему изобретению. Этот пептид был синтезирован по заказу в компании ChinaPeptide Co. Ltd.
+
+
+
+
+
65
86
16
21
3
[00229] Синтезированный таким образом CCK8-содержащий пептид исследовали методом ESI-MS. Продукт анализировали методом масс-спектроскопии с использованием ионизации электрораспылением (фиг. 12А). Данные (ESI-TOF) показывают отношение масса/заряд [М+Н] для CHNOS: рассчитано 1523,67; определено 1523,5418. Четыре изотопических пика также наблюдались в спектре MS при отношении 1524,5448, 1525,5458, 1526,5458 и 1527,5458, что соответствует [М+Н+1], [М+Н+2], [М+Н+3] и [М+Н+4].
6
[00230] Пример 6. Конъюгирование CCK8-содержащего пептида с малеимид-PEG-NHS
6
6
6
[00231] Тиольная группа CCK8-содержащего пептида вступала в реакцию с гетеробифункциональным кросс-линкером малеимид-PEG-NHS. Пептид растворяли в 100% ДМСО с конечной концентрацией 10 мМ, а гетеробифункциональный кросс-линкер малеимид-PEG-NHS растворяли в 100% ДМСО с конечной концентрацией 250 мМ. Кросс-линкер малеимид-PEG-NHS добавляли к растворенному пептидному раствору с конечной концентрацией 10 мМ (в однократном молярном избытке по отношению к 10 мМ пептидного раствора). Реакционную смесь инкубировали в течение ночи при комнатной температуре.
6
6
[00232] CCK8-PEG-NHS очищали с применением обратно-фазовой ВЭЖХ на колонке Supelco С18 (250 мм × 10 мм; 5 мкм) с подвижной фазой в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом ацетонитрила 30-100%) в течение 30 минут при скорости потока 3,0 мл/мин и температуре колонки 25°С. Профиль элюирования обратно-фазовой ВЭЖХ DM1-PEG-NHS контролировали путем измерения УФ-поглощения на длине волны 254 нм.
6
91
125
19
34
3
2+
2+
2+
2+
2+
2+
[00233] Синтезированный таким образом CCK8-PEG-NHS (показан ниже) исследовали методом ESI-MS (фиг. 12Б). Данные (ESI-TOF) показывают отношение масса/заряд [М+2Н] для CHNOS: рассчитано 2125,28, определено 2123,79. Изотопические пики также наблюдались в спектре MS при отношении 1063,398, 1063,8978, 1064,4003, 1064,9022 и 1065,4061, что соответствует [М+2Н+1], [М+2Н+2], [М+2Н+3], [М+2Н+4] и [М+2Н+5].
6
2
[00234] Пример 7. Конъюгирование мертансина (DM1) с малеимид-PEG-COH.
[00235] DM1 приобрели у компании ALB Technology Inc., Hong Kong, China. Конъюгирование DM1 с группой SH с гетеробифункциональным кросс-линкером и очистка продукта были аналогичны описанным в предыдущем примере.
6
2
6
2
6
2
[00236] Вкратце, тиольная группа DM1 молекулы вступала в реакцию с гетеробифункциональным кросс-линкером малеимид-PEG-СОН. DM1 растворяли в 100% ДМСО с конечной концентрацией 10 мМ, а малеимид-PEG-СОН растворяли в 100% ДМСО с конечной концентрацией 250 мМ. Кросс-линкер малеимид-PEG-СОН добавляли к раствору растворенного DM1 с конечной концентрацией 10 мМ (в однократном молярном избытке по отношению к 10 мМ раствора DM1). Реакционную смесь инкубировали в течение ночи при комнатной температуре.
6
2
6
2
6
2
6
2
[00237] DM1-PEG-COH очищали с применением обратно-фазовой ВЭЖХ на колонке Supelco С18 (250 мм × 10 мм; 5 мкм) с подвижной фазой в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом ацетонитрила 30-100% в течение 30 минут при скорости потока 3,0 мл/мин и температуре колонки 25°С. Профиль элюирования обратно-фазовой ВЭЖХ DM1-PEG-COH указывает на то, что пик элюирования DM1-PEG-COH имеет время удержания 11,5 минут, которое контролировали путем определения УФ-поглощения на длине волны 254 нм. Результат масс-спектроскопического анализа синтезированного таким образом DM1-PEG-COH (показан выше) указывает на то, что эта молекулярная структура имеет молекулярную массу 1242,429 Да.
12
6
[00238] Пример 8: Синтез DBCO-содержащего линкерного звена с пептидом 7 в качестве пептидного ядра и TFP-PEG-малеимид или NHS-PEG-малеимид в качестве связывающих ветвей
12
12
12
[00239] В этом примере три связывающих ветви PEG-малеимида конъюгировали с пептидным ядром DBCO-пептида 7. Кросс-линкер сложный эфир TFP-PEG-малеимид [альфа-малеинимидо-омега- (2.3.5.6-тетрафторфенил-пропионамидо)додекаэтиленгликоля] приобрели у компании QuantaBiodesign Inc., Plain City, USA. Процесс конъюгирования выполняли согласно инструкции производителя. Пептид с остатками K растворяли в 100% ДМСО с конечной концентрацией 10 мМ. TFP-PEG-малеимидное кросс-линкер добавляли к растворенному пептиду с конечной концентрацией 60 мМ (в шестикратном молярном избытке по отношению к 10 мМ пептидного раствора). Катализатор, органическое основание DABCO (1,4-диазабицикло[2.2.2]октан) (5 экв.), добавляли в реакционные смеси. Реакционные смеси инкубировали в течение более 18 часов при комнатной температуре.
12
[00240] Как показано ниже, синтезированный таким образом DBCO-пептид 7, конъюгированный с PEG-малеимидом, содержит одну соединительную ветвь с DBCO-группой и три PEG-связывающих ветви с малеимидными группами. На фиг. 13А результат масс-спектрометрии MALDI-TOF показывает, что представленная молекулярная структура имеет молекулярную массу 3978 Да.
6
6
6
[00241] Три связывающих ветви PEG-малеимида конъюгировали с пептидным ядром DBCO-пептида 7. Кросс-линкер сложный эфир NHS-PEG-малеимид (сукцинимидил-[(N-малеимидо-пропионамидо)-гексаэтиленгликоля]) приобрели у компании Conju-probe Inc. Процедуру конъюгирования выполняли согласно инструкции производителя. Пептид с остатками K растворяли в 100% ДМСО с конечной концентрацией 10 мМ. Кросс-линкер NHS-PEG-малеимид добавляли к растворенному пептиду с конечной концентрацией 60 мМ (в шестикратном молярном избытке по отношению к 10 мМ раствору пептида). Катализатор, органическое основание DABCO (5 экв.), добавляли к реакционным смесям. Реакционные смеси инкубировали в течение более 18 часов при комнатной температуре.
6
[00242] Синтезированный азидный пептид 7, конъюгированный с PEG-малеимидом, содержит одну соединительную ветвь с DBCO-группой и три связывающих ветви PEG с малеимидными группами.
6
2
[00243] Пример 9: Синтез линкерного звена с несколькими связывающими ветвями путем конъюгирования NHS-PEG-малеимида с NH-группами азид-содержащего пептида 8
6
[00244] Конъюгирование кросс-линкеров проводили с использованием протокола, описанного в примерах выше. Синтезированный таким образом азидный пептид 8, конъюгированный с PEG-малеимидом, исследовали с применением MALDI-TOF.
6
[00245] Как показано ниже, синтезированный таким образом азидный пептид 8, конъюгированный с PEG-малеимидом, содержит одну соединительную ветвь с азидной группой и три PEG-связывающих ветви с малеимидными группами. На фиг. 14 результат масс-спектрометрии MALDI-TOF показывает, что эта молекулярная структура имеет молекулярную массу 1024,627 Да.
6
2
[00246] Пример 10. Синтез разветвленного линкерного звена путем конъюгирования NHS-PEG-малеимид с NH-группами алкин-содержащего пептида 9
6
[00247] Конъюгирование кросс-линкеров проводили с использованием протокола, описанного в примерах выше. Синтезированный таким образом алкиновый пептид 9, конъюгированный с PEG-малеимидом, исследовали с применением MALDI-TOF.
6
[00248] Как показано ниже, синтезированный таким образом алкиновый пептид 9, конъюгированный с PEG-малеимидом, содержит одну соединительную ветвь с азидной группой и три PEG-связывающих ветви с малеимидными группами. На фиг. 15 результат масс-спектрометрии MALDI-TOF показывает, что эта молекулярная структура имеет молекулярную массу 2194,13 Да.
[00249] Пример 11: Прямой синтез норборнен-содержащего линкерного звена с пептидом 12 (SEQ ID NO: 11) в качестве пептидного ядра и RSGSSG (SEQ ID NO: 12) в качестве связывающих ветвей
[00250] Норборнен-содержащее линкерное звено с пептидом 12 в качестве пептидного ядра и пептидом RSGSSG (SEQ ID NO: 12) в качестве связывающих ветвей синтезировали непосредственно обычной реакцией с использованием Fmoc путем синтеза вручную. Как показано ниже, N-конец связывающей ветви модифицирован фенилмалеимидной группой. Авторы изобретения разработали линкерное звено и передали изготовление норборнен-содержащего линкерного звена с фенилмалеимид-модифицированными связывающими ветвями компании ONTORES Co. Ltd, Hangzhou, China.
[00251] Очищенный образец норборнен-содержащего линкерного звена с фенилмалеимид-модифицированными связывающими ветвями анализировали с применением обратно-фазовой аналитической ВЭЖХ на колонке С18 (250 мм × 4,6 мм; 5 мкм) с подвижной фазой в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом ацетонитрила 27-47% в течение 20 минут при скорости потока 1,0 мл/мин и температуре колонки 30°С.
[00252] Идентификацию норборнен-содержащего линкерного звена с фенилмалеимид-модифицированными связывающими ветвями выполняли с применением масс-спектрометрии ESI-MS.
3+
[00253] Норборнен-содержащее линкерное звено с фенилмалеимид-модифицированными связывающими ветвями представляет собой линкерное звено на основе пептидного ядра, несущее одну соединительную ветвь с норборненовой группой и три связывающих ветви, соответственно, с модификацией фенилмалеимидом на свободном конце. Результат масс-спектрометрии синтезированного таким образом линкерного звена показывает сильный молекулярный ион массой 966 Да, соответствующий [М+3Н], что указывает на фактическую молекулярную массу линкерного звена 2895 Да.
[00254] Пример 12. Прямой синтез алкин-содержащего линкерного звена с пептидом 13 (SEQ ID NO: 1) в качестве пептидного ядра и RSGSSG (SEQ ID NO: 12) в качестве связывающих ветвей
[00255] Алкин-содержащее линкерное звено с пептидом 13 в качестве пептидного ядра и пептидом RSGSSG (SEQ ID NO: 12) в качестве связывающих ветвей синтезировали непосредственно обычной реакцией с использованием Fmoc путем синтеза вручную. Как показано ниже, N- и С-концы пептида 13 амидированы 4-пентиновой кислотой и этерифицированы метиловым спиртом, соответственно. N-конец связывающей ветви модифицирован 3-малеимидопропионовой кислотой. Авторы изобретения разработали линкерное звено и передали изготовление алкин-содержащего линкерного звена с малеимид-модифицированными связывающими ветвями компании Shanghai ChinaPeptide Co. Ltd., Shanghai, China.
[00256] Очищенный образец алкин-содержащего линкерного звена с малеимид-модифицированными связывающими ветвями анализировали с применением обратно-фазовой аналитической ВЭЖХ на колонке Kromasil 100-5 С18 (250 мм × 4,6 мм; 5 мкм) с подвижной фазой в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом ацетонитрила 5-48% в течение 15 минут при скорости потока 1,0 мл/мин и температуре колонки 35°С. На фиг. 16 представлен профиль обратно-фазовой ВЭЖХ алкин-содержащего линкерного звена с малеимид-модифицированными связывающими ветвями, пик которого обозначен стрелкой.
[00257] Идентификацию алкин-содержащего линкерного звена с малеимид-модифицированными связывающими ветвями выполняли с применением масс-спектрометрии MALDI-TOF.
[00258] Алкин-содержащее линкерное звено с малеимид-модифицированными связывающими ветвями представляет собой линкерное звено на основе пептидного ядра, несущее одну соединительную ветвь с алкиновой группой и три связывающих ветви, соответственно, с модификацией фенилмалеимидом на свободном конце. Фигура 17 показывает результат масс-спектрометрии MALDI-TOF, указывающий на то, что полученная молекулярная конструкция имеет молекулярную массу 3583,701 Да.
[00259] Прямой синтез метилтетразин-содержащего линкерного звена с пептидом 14 (SEQ ID NO: 13) в качестве пептидного ядра и SGSSGSSG (SEQ ID NO: 14) в качестве связывающего звена
[00260] Метилтетразин-содержащее линкерное звено с пептидом 14 в качестве пептидного ядра и SGSSGSSG (SEQ ID NO: 14) в качестве связывающих ветвей синтезировали непосредственно обычной реакцией с использованием Fmoc путем синтеза вручную. Как показано ниже, N-конец пептида 13 связывающей ветви модифицирован 3-малеимидопропионовой кислотой. Авторы изобретения разработали линкерное звено и передали изготовление метилтетразин-содержащего линкерного звена с малеимид-модифицированными связывающими ветвями компании Shanghai WuXi AppTech Co. Ltd.
[00261] Очищенный образец метилтетразин-содержащего линкерного звена с малеимид-модифицированными связывающими ветвями анализировали с применением обратно-фазовой аналитической ВЭЖХ на колонке Gemini-NX 5u С18 (150 мм × 4,6 мм; 4 мкм) с подвижной фазой в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом ацетонитрила 10-40% в течение 20 минут при скорости потока 1,0 мл/мин и температуре колонки 30°С.
[00262] Идентификацию метилтетразин-содержащего линкерного звена с малеимид-модифицированными связывающими ветвями выполняли с применением масс-спектрометрии MALDI-TOF.
[00263] Метилтетразин-содержащее линкерное звено с малеимид-модифицированными связывающими ветвями представляет собой линкерное звено на основе пептидного ядра, несущее одну соединительную ветвь с метилтетразиновой группой и три связывающих ветви, соответственно, с модификацией малеимидом на свободном конце. Результат масс-спектрометрии MALDI-TOF показывает, что полученная молекулярная конструкция имеет молекулярную массу 1038 Да.
6
2
[00264] Пример 14: Конъюгирование NHS-PEG-CCK8 с NH группами DBCO-содержащего пептида 7
6
6
[00265] В этом примере три PEG-CCK8 конъюгировали с DBCO-содержащим пептидом 7 в качестве пептидного ядра. NHS-PEG-CCK8 получали, как в предыдущем примере.
6
6
[00266] Процедуру конъюгирования выполняли согласно инструкции производителя. Пептид с остатками K растворяли в 100% ДМСО с конечной концентрацией 10 мМ. NHS-PEG-CCK8, полученный, как в предыдущем примере, добавляли к растворенному пептиду с конечной концентрацией 6 мМ (в шестикратном молярном избытке по отношению к 1 мМ раствору пептида). К реакционным смесям добавляли катализатор, органическое основание DABCO (50 экв.). Реакционные смеси инкубировали в течение более 18 часов при комнатной температуре. DBCO-пептид 7, конъюгированный с CCK8-PEG, очищали с применением обратно-фазовой ВЭЖХ на колонке Princeton SPHER-300 С18 (250 мм × 30 мм; 5 мкм) с подвижной фазой в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом ацетонитрила 0-73% в течение 28 минут при скорости потока 27,0 мл/мин и температуре колонки 25°С.
6
334
470
77
119
9
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
[00267] Как показано ниже, синтезированный таким образом DBCO-пептид 7, конъюгированный с CCK8-PEG, содержит одну соединительную ветвь с DBCO-группой и три PEG-связывающих ветви с ССK8 пептидом. Данные (ESI-TOF) показывают отношение масса/заряд [М+Н] для CHNOS: рассчитано 7751,0574, определено 7751,0533. Девять изотопических пиков в спектре MS также наблюдались на значениях 7752,0714, 7753,0759, 7754,0818, 7755,0820, 7756,0849, 7757,0353, 7758,0647, 7759,0844 и 7760,0636, что соответствует [М+Н+1], [М+Н+2], [М+Н+3], [М+Н+4], [М+Н+5], [М+Н+6], [М+Н+7], [М+Н+8] и [М+Н+9] (фиг. 18).
2
6
2
[00268] Пример 15: Конъюгирование COH-PEG-DM1 с NH группами азид-содержащего пептида 2
2
6
[00269] Синтезированный азид-содержащий пептид 2 производства ChinaPeptide Inc., Shanghai, China, растворяли в 100% ДМСО с конечной концентрацией 10 мМ. COH-PEG-DM1 получали, как в предыдущем примере.
2
2
2
6
2
6
2
6
2
2
2
2
6
2
6
2
6
2
2
[00270] Азид-содержащий пептид 2 и органическое основание DMAP смешивали при молярном соотношении 1/15 в 100% CHCl. Перед конъюгированием COH-PEG-DM1 с азид-содержащим пептидом 2 этил(диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) добавляли к раствору COH-PEG-DM1 при молярном соотношении 1/2 (COH-PEG-DM1:EDC) в 100% CHCl и инкубировали для активации группы СОН молекулы COH-PEG-DM1. Затем к раствору азид-содержащего пептида 2 добавляли EDC-активированный COH-PEG-DM1 при конечном молярном соотношении 1/6 (азид-содержащий пептид 2: COH-PEG-DM1) в 100% CHCl. Реакционную смесь дополнительно инкубировали в течение ночи при комнатной температуре.
[00271] Азид-содержащий пептид 2 очищали с применением обратно-фазовой ВЭЖХ на колонке Supelco С18 (250 мм × 10 мм; 5 мкм), с подвижной фазой в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом ацетонитрила 0-100% в течение 30 минут при скорости потока 3,0 мл/мин и температуре колонки 25°С.
[00272] Фигура 19 показывает профиль элюирования обратно-фазовой ВЭЖХ азид-содержащего пептида 2, конъюгированного с пятью молекулами DM1, который имеет пик со временем удержания 17,8 минут. Фигура 20 показывает результат масс-спектроскопии синтезированного таким образом азид-содержащего пептида 2, конъюгированного с пятью молекулами DM1 (показано ниже), указывающий на то, что полученная молекулярная конструкция имеет молекулярную массу 7856,2 Да.
[00273] Пример 16. Прямой синтез ССK8-содержащей нацеливающей связки с азид-содержащим пептидом 15 (SEQ ID NO: 15) в качестве пептидного ядра и EGGGGSDYMGWMDF (SEQ ID NO: 16) в качестве нацеливающего элемента и связывающей ветви с пептидами CCK8
[00274] В этом примере синтезировали CCK8-содержащую нацеливающую связку. Нацеливающая связка (как показано ниже) включает в себя азид-содержащий пептид 15 (в качестве пептидного ядра) и четырехцепочечные ветви с последовательностью EGGGGSDYMGWMDF (SEQ ID NO: 16). Эта ветвь состоит из последовательности связывающей ветви (EGGGGS; SEQ ID NO: 17) и октапептида ССK (DYMGWMDF, SEQ ID NO: 18) с модификацией первичным амидом на свободном конце. CCK8-содержащую нацеливающую связку синтезировали обычной реакцией с использованием Fmoc путем синтеза вручную. Авторы изобретения разработали CCK8-нацеливающую связку и передали производство линкерного звена компании Shanghai ChinaPeptide Co. Ltd., Shanghai, China.
[00275] Очищенный образец этой CCK8-содержащей нацеливающей связки анализировали с применением обратно-фазовой аналитической ВЭЖХ на колонке Kromasil 100-5 С18 (250 мм × 4,6 мм; 5 мкм) с подвижной фазой в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом ацетонитрила 35-84% в течение 15 минут при скорости потока 1,0 мл/мин и температуре колонки 35°С. Профиль элюирования обратно-фазовой ВЭЖХ на фиг. 21 показывает, что пик элюирования CCK8-нацеливающей связки имеет время удержания 8,988 минут. Измерения УФ-поглощения проводили на длине волне 254 нм. CCK8-содержащая нацеливающая связка имела чистоту 95,25%.
5+
[00276] Идентификацию этой CCK8-содержащей нацеливающей группы выполняли с применением масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Результат анализа методом масс-спектрометрии ESI-TOF на фиг. 22 указывает на то, что эта молекулярная структура имеет молекулярную массу 1608,6944 Да (ESI-TOF) и отношение масса/заряд (z=5) [М+5Н].
[00277] Пример 17: Получение scFv, специфичного к эктодомену человеческого CD3, с помощью системы сверхэкспрессии Expi293F
L
H
H
L
2
H
[00278] Для получения фрагмента scFv мутировавшего теплизумаба использовали последовательности ДНК V и V гуманизированных антител без дальнейшей оптимизации кодонов. Синтезировали последовательности ДНК, кодирующие V-GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO: 19)-V-(GGGGS)(SEQ ID NO: 20)-C. Молекула антитела мутировавшего теплизумаба содержит цистеиновый остаток в CDR3 последовательности V, который, как показано выше, препятствует конъюгированию SH-малеимида. Поэтому мутировавший теплизумаб получали заменой цистеинового остатка сериновым остатком. Аминокислотные последовательности фрагмента scFv, специфичные для человеческого CD3, полученные для экспериментов по изобретению, приведены в SEQ ID NO: 21.
[00279] Для получения рекомбинантных белков с использованием системы экспрессии клеток млекопитающих использовали систему сверхэкспрессии, основанную на клеточной линии Expi293F™. В системе использовался набор для трансфекции ExpiFectamine™ 293 производства компании Life Technologies, Carlsbad, USA, состоящий из линии клеток Expi293F™, реагента ExpiFectamine™ 293 на основе катионных липидов и усилителей 1 и 2 трансфекции ExpiFectamine™ 293, а также среды производства компании Gibco, New York, USA, которая была частью системы экспрессии.
6
8
[00280] Ген-кодирующие последовательности поместили в кассету экспрессии pcDNA3. Клетки Expi293F высевали при плотности 2,0×10 жизнеспособных клеток/мл в среду для экспрессии Expi293F и выдерживали в течение 18-24 часов перед трансфекцией, чтобы убедиться в том, что клетки на момент трансфекции активно делились. В процессе трансфекции 7,5×10 клеток в 255 мл среды в 2-литровой смесительной колбе Эрленмейера трансфицировали с помощью реагента для трансфекции ExpiFectamine™ 293. Трансфицированные клетки инкубировали при 37°С в течение 16-18 часов после трансфекции в орбитальном шейкере (125 об/мин), к клеткам в смесительную колбу добавляли усилитель трансфекции 1 и усилитель трансфекции 2 ExpiFectamine™ 293, и инкубировали их в течение 5-6 дней. Собирали образцы надосадочной жидкости культуры и экспрессированные рекомбинантные белки scFv в среде очищали с помощью аффинной хроматографии на белке L.
[00281] Результаты анализа методом масс-спектроскопии MALDI-TOF указывают на то, что фрагмент scFv имеет молекулярную массу 27 643 Да. Чистоту белков фрагмента scFv мутировавшего теплизумаба, специфичных к CD3, определяли путем окрашивания Кумасси синим 12% геля для SDS-PAGE. На фиг. 23А показаны анализы методом SDS-PAGE очищенного фрагмента scFv мутировавшего теплизумаба.
[00282] Пример 18. Анализ окрашивания для исследования связывания scFv мутировавшего теплизумаба с человеческим CD3 на линии Т-клеток Jurkat.
[00283] Способность мутировавшего теплизумаба связываться с человеческими Т-лимфоцитами, которые экспрессируют CD3, исследовали на линии Т-клеток Jurkat. Мутировавший теплизумаб анализировали на его способность связываться с молекулами человеческого CD3 на линии Т-клеток Jurkat. Клетки Jurkat представляют собой иммортализованную линию клеток Т-лимфоцитов человека, экспрессирующих комплексы рецептора Т-клетки (TcR)/CD3 на клеточной поверхности.
6
[00284] Анализ проводили инкубированием 2×10 Т-клеток Jurkat с 0,1 и 1 мкг/мл фрагмента scFv в фосфатно-солевом буферном растворе с 1% фетальной бычьей сыворотки и 0,1% азида натрия на льду в течение 30 минут. Клетки промывали и инкубировали с FITC-конъюгированным белком L производства компании ACROBiosystems Inc., Newark, USA, разведенным в соотношении 1:200 в фосфатно-солевом буферном растворе с фетальной бычьей сывороткой, при 4°С в течение 30 минут в темноте. Белок L-FITC и кроличьи мышиные антитела IgG. Fc, конъюгированные с FITC, производства компании AbD Serotec, использовали в качестве вторичных антител. Окрашивание чистых вторичных антител использовали в качестве отрицательного контроля. ОКТ3, мышиное моноклональное антитело, специфичное к человеческому CD3, использовали в качестве положительного контроля. Окрашивание клеток анализировали методом FACS (FACSCanto II; BD Biosciences). Ось X гистограммы представляет собой интенсивность флуоресценции. На фиг. 23Б показано, что мутировавший теплизумаб связывается с Т-клетками.
[00285] Пример 19: Получение DBCO-scFv, специфичного к CD3
H
L
H
L
[00286] Последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 12, синтезировали и экспрессировали, как в приведенных выше примерах. Последовательности V и V фрагмента scFv, специфичного к CD3, были последовательностями V и V мутировавшего теплизумаба. Для конъюгирования с малеимид-РЕG5-DВСО (производства компании Conju-probe, Inc.) цистеиновый остаток на С-конце очищенного scFv мутировавшего теплизумаба восстанавливали с помощью трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) в молярном соотношении 1:1 ([TCEP]:[scFv]) при комнатной температуре в течение 3 часов при осторожном встряхивании. Буфер, в котором находился восстановленный scFv анти-CD3, заменяли на буфер HEPES (100 мМ HEPES, рН 7,0, 100 мМ NaCl, 10% глицерин и 5 мМ EDTA) с использованием колонки NAP-10 Sephadex G-25 при 4°С. После реакции восстановления и замены буфера проводили конъюгирование в течение 1 часа при комнатной температуре в реакционном молярном соотношении 1:1 ([малеимид-PEG5-DBCO:[scFv]). Избыток кросс-линкера удаляли с помощью колонки для обессоливания и анализировали scFv-продукт, конъюгированный с DBCO.
[00287] Результаты анализа методом масс-спектроскопии MALDI-TOF указывают на то, что образец DBCO-конъюгированного фрагмента scFv, специфичного к CD3, имеет молекулярную массу 28148 Да. Чистоту DBCO-конъюгированного фрагмента scFv, специфичного к CD3, определяли путем окрашивания Кумасси синим 12% для SDS-PAGE (данные не приведены). На фиг. 23В показаны результаты проточного цитометрического анализа DBCO-конъюгированного фрагмента scFv, специфичного к CD3, и фрагмента scFv анти-CD3 (положительный контроль). Результаты указывают на то, что подобно неконъюгированному фрагменту scFv, представленный DBCO-конъюгированный фрагмент scFv, специфичный к CD3, также связывается с Т-клетками.
[00288] Пример 20: Анализ окрашивания, показывающий связывание молекулы пептида ССK8 с линией опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор В CCK-типа.
[00289] Молекулу пептида CCK8 анализировали на способность связываться с молекулами рецептора В CCK8-типа человека на линии опухолевых клеток Panc-1. Клетки Panc-1 получали из карциномы поджелудочной железы, извлеченной путем дуоденэктомии поджелудочной железы 56-летнего европеоидного мужчины. Злокачественность этой линии клеток была подтверждена с помощью анализов in vitro и in vivo.
6
[00290] Перед окрашиванием Cys-содержащий пептид CCK8 конъюгировали с малеимид-FITC для получения FITC-меченого пептида CCK8 в качестве детекторной CCK8 молекулы с FITC. Затем выполняли анализ путем инкубирования 2×10 клеток Panc-1 с 150 мкг/мл реакционной смеси CCK8-FITC молекулы в фосфатно-солевом буферном растворе с 1% фетальной бычьей сыворотки и 1% азида натрия на льду в течение 30 минут в темноте. Окрашивание чистого малеимид-FITC использовали в качестве отрицательного контроля. Окрашивание клеток анализировали методом FACS (FACSCanto II; BD Biosciences). Ось X гистограммы представляет собой интенсивность флуоресценции. На фиг. 24 темная область представляет фон распределения флуоресценции клеток Panc-1, пунктирная линия - распределение флуоресценции клеток Panc-1, окрашенных малеимид-FITC, а темная линия - распределение флуоресценции клеток Panc-1, окрашенных CCK8-FITC. Результат анализа окрашивания показывает, что меченая FITC молекула пептида CCK8 связывается с клетками Panc-1.
[00291] Пример 21: Получение молекулярной конструкции с четырехцепочечным ССK8-содержащим нацеливающим элементом и одним фрагментом scFv, специфичным к CD3, в качестве эффекторного элемента
[00292] В этом примере ССK8-содержащее связывающее линкерное звено из предыдущих примеров и эффекторный элемент DBCO-scFv, специфичный к CD3, были связаны путем реакции SPAAC. Как отмечалось выше, нацеливающее линкерное звено имеет разделенные ветви, содержащие последовательность SEQ ID NO: 16 и одну свободную азидную группу.
[00293] Реакцию SPAAC выполняли в соответствии с инструкциями производителя (компании Conju-Probe Inc.). Вкратце, 113 мкл нацеливающего линкерного звена (12,4 мг/мл) добавляли к раствору, содержащему эффекторный элемент, при молярном соотношении 1:1 ([азид]:[DBCO]). Реакционную смесь инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре.
[00294] Продукт, как показано ниже, представлял собой молекулярную конструкцию с одним линкерным звеном с четырьмя ветвями, содержащими CCK8 и один фрагмент scFv, специфичный к CD3, в качестве эффекторного элемента. Результат SDS-PAGE-анализа реакционной смеси после конъюгирования указывает на то, что размер представленной молекулярной конструкции соответствует ожидаемому размеру.
[00295] Пример 22. Получение молекулярной конструкции с объединенными линкерными звеньями, состоящей из нацеливающего линкерного звена с тремя молекулами пептида CCK8 и эффекторного линкерного звена с пятью молекулами DM1
[00296] Реакцию SPAAC проводили, как описано в предыдущем примере.
+
+
+
+
+
+
+
686
993
129
246
14
5
1
[00297] В этом примере нацеливающее линкерное звено с тремя пептидными молекулами CCK и одной свободной группой DBCO и эффекторное линкерное звено (связка лекарственных средств) с пятью молекулами DM1 и одной свободной азидной группой были связаны путем реакции SPAAC, как описано в предыдущем примере. Ниже показана полученная в результате молекулярная конструкция с объединенными линкерными звеньями, состоящая из трех пептидов CCK8 и одной связки лекарственных средств, содержащей пять молекул DM1. Данные (ESI-TOF) показывают отношение масса/заряд [М+Н] для CHNOSClNa: рассчитано 15632,07, определено 15630,6186. Шесть изотопических пиков в спектре MS также наблюдались для 15631,6699, 15632,6877, 15633,5712, 15634,4507, 15635,5302 и 15637,6933, что соответствует [М+Н+1], [М+Н+2], [М+Н+3], [М+Н+4], [М+Н+5] и [М+Н+6] (фиг. 25).
3
4
[00298] Пример 23: Анализ тиолообменных аддуктов пептида 16 (SEQ ID NO: 22), конъюгированного с синтезированным DBCO-PEG-малеимидом, и пептида 16 (SEQ ID NO: 22), конъюгированного с метилтетразином-PEG-малеимидом в присутствии глутатиона, методом масс-спектрометрии MALTI-TOF
[00299] Малеимидная группа может, в частности, вступать в реакцию с сульфгидрил-содержащими молекулами, когда рН реакционной смеси составляет от 6,5 до 7,5. В большинстве случаев реакция Михаэля присоединения тиола к малеимиду используется для различного биоконъюгирования с образованием тиол-малеимидных аддуктов. Тем не менее, тиол-малеимидный аддукт может подвергаться деструктивному расщеплению в результате тиольного обмена в физиологических условиях. Так называемая обратная тиол-реакция Михаэля может привести к деградации тиол-малеимидного аддукта и снизить стабильность аддукта.
3
4
3
3
3
[00300] В данном примере пептид 16, конъюгированный с DBCO-PEG-малеимидом, и пептид 16, конъюгированный с метилтетразином-PEG-малеимидом, исследовали на тиол-малеимидный обмен в ядрах синтезированного тиол-малеимидного пептида с группами связывания в присутствии тиол-содержащих молекул глутатиона в водном растворе методом анализа MALDI-TOF. Пептид 16, конъюгированный с DBCO-PEG-малеимидом, получали следующим образом: пептид 16 синтезировали с использованием обычного твердофазного метода (авторы изобретения передали изготовление пептида 16 компании Shanghai ChinaPeptide Co. Ltd.). Пептид 16 (ацетил-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK, SEQ ID NO: 22) имел чистоту 95%, при этом N-конец пептида 16 был модифицирован ацетильной группой. Гетеробифункциональный кросс-линкер DBCO-PEG-малеимид приобрели у компании Conju-probe Inc. Тиол-малеимидное конъюгирование кросс-линкера, DBCO-PEG-малеимида, с пептидом 16 было выполнено аналогично описанному в предыдущих примерах. Синтезированный таким образом DBCO-пептид 16 имеет молекулярную массу 2227 Да (показано ниже).
3
3
[00301] Затем синтезированный DBCO-PEG-малеимидный пептид 16 инкубировали с глутатионом при молярном соотношении 1:10 ([пептид]:[глутатион]) в течение 24, 48 и 72 часов при 37°С в 100 мМ буфере HEPES, рН 7,0, и 100 мМ NaCl. Далее полученную реакционную смесь анализировали методом MALDI-TOF. Результат указывает на то, что аддукт DBCO-PEG-малеимидного глутатиона (показано ниже) в результате тиол-малеимидного обмена после 72-часовой инкубации имеет молекулярную массу 940,385 Да (фиг. 26А).
4
3
4
[00302] Пептид 16, конъюгированный с метилтетразин-PEG-малеимидом, получали и анализировали так же, как пептид 16, конъюгированный с DBCO-PEG-малеимидом. Синтезированный таким образом метилтетразин-PEG-малеимидный пептид 16 имеет молекулярную массу 2111,2 Да (показано ниже).
4
3
4
[00303] Реакция синтезированного таким образом метилтетразин-PEG-малеимидного пептида 16 с глутатионом была такой же, как описано для условий, когда DBCO-PEG-малеимидный пептид 16 вступал в реакцию с глутатионом. Далее полученную реакционную смесь анализировали методом MALDI-TOF. Результат масс-спектрометрического анализа указывает на то, что аддукт метилтетразин-PEG-малеимид-глутатиона (показан ниже), анализированный методом MALDI-TOF после 72-часовой инкубации (фиг. 26Б), имеет молекулярную массу 826,397 Да.
[00304] Пример 24: Анализ опосредованной Т-клетками цитотоксичности молекулярной конструкции, состоящей из нацеливающего линкерного звена с четырьмя молекулами пептида CCK8 и эффекторного компонента с одной молекулой scFv анти-CD3, на линиях опухолевых клеток Panc-1
[00305] В качестве источника Т-клеток использовали Т-клетки периферической крови человека. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкоцитарных пленок у здоровых доноров (производитель Taiwan Blood Service Foundation) путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque PLUS (производства компании GE Healthcare) и криоконсервировали в растворе 90% фетальной бычьей сыворотки с 10% ДМСО. Человеческие Т-клетки получали из РВМС путем истощения не-Т-клеток (негативная селекция) с использованием набора для выделения Т-клеток человека (производства компании Miltenyl Biotech, Auburn, СА, USA). Т-клетки культивировали в присутствии 10 мкг/мл рекомбинантного человеческого IL-2 (PeproTech, Rocky Hill, USA). Анти-DNP AN02 mAb использовали в качестве изотипически сходного контроля.
2
[00306] Аликвоты из 5000 клеток-мишеней Panc-1 в 100 мкл полной среды RPMI культивировали с молекулярной конструкцией, состоящей из нацеливающего фрагмента с четырьмя пептидами CCK8 и эффекторного фрагмента с одной молекулой фрагмента scFv anra-CD3 или нацеливающего фрагмента с четырьмя пептидами CCK8 в качестве отрицательного контроля в течение 30 минут при 37°С в атмосфере с содержанием 5% СО, а затем комбинировали с человеческими Т-клетками при различных соотношениях Е:Т - 20, 10 или 5. После 24 часов инкубирования цитотоксичность анализировали люминесцентным методом с помощью набора aCella-Tox производства компании Cell Technology, Mountain View, СА в соответствии с инструкциями производителя. Планшет считывали люминометром (считывающее устройство для микропланшетов с множественным обнаружением производства компании DS Pharma, Osaka, Japan).
[00307] Опосредованный Т-клетками цитолиз опухолевых клеток с экспрессией рецептора пептида CCK8 типа В с помощью молекулярной конструкции, состоящей из нацеливающего фрагмента с четырьмя CCK8 пептидами и эффекторного фрагмента с одной молекулой scFv анти-CD3, изучали с использованием опухолевых клеток Panc-1. Молекулярную конструкцию, состоящую из нацеливающего фрагмента с четырьмя пептидами CCK8 и эффекторного фрагмента с одной молекулой фрагмента scFv анти-CD3, получали, как в предыдущем примере.
[00308] Выделенные человеческие Т-лимфоциты от донора отбирали для исследования опосредованной Т-клетками цитотоксичности. Клетки Panc-1 инкубировали с 10 мкг/мл молекулярной конструкции, состоящей из нацеливающего фрагмента с четырьмя пептидами CCK8 и эффекторного фрагмента с одной молекулой фрагмента scFv анти-CD3, при 37°С в течение 1 часа, а затем смешивали с человеческими Т-лимфоцитами при различных соотношениях Е:Т - 20, 10 или 5 и инкубировали в течение 24 часов. Нацеливающий фрагмент с четырьмя пептидами ССK8 отдельно (без эффекторного фрагмента) и эффекторный фрагмент с одним фрагментом scFv анти-CD3 (без нацеливающего фрагмента) использовали в качестве отрицательного контроля. Цитолиз анализировали с использованием набора aCella-Tox.
[00309] Пример 25: Анализ на цитотоксичность молекулярной конструкции с объединенными линкерными звеньями, состоящей из нацеливающего линкерного звена с тремя молекулами пептида CCK8 и эффекторного линкерного звена с 5 молекулами DM1, на линиях опухолевых клеток Panc-1
[00310] Молекулярная конструкция с объединенными линкерными звеньями, состоящая из нацеливающего линкерного звена с тремя молекулами пептида CCK8 и эффекторного линкерного звена с 5 молекулами DM1, была получена, как в предыдущем примере.
4
[00311] Клетки Panc-1 (2×10 на лунку) высевали в лунки 96-луночных планшетов в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Через 18 часов клетки обрабатывали различными концентрациями (10-кратное разведение от 1 мкМ) линкерного звена с тремя пептидами CCK-8 (без связки лекарственных средств), линкерного звена с пятью молекулами DM1 (связка лекарственных средств) и молекулярной конструкции с тремя пептидами CCK-8 в качестве нацеливающего фрагмента и пятью молекулами DM1 в качестве эффекторного фрагмента. После инкубирования в течение 6 часов питательную среду заменяли свежей средой и клетки дополнительно инкубировали в течение еще 48 часов. Затем определяли жизнеспособность клеток с помощью набора реагентов для проверки жизнеспособности клеток alamarBlue (производства компании Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя.
[00312] На фиг. 27 показаны результаты жизнеспособности клеток Panc-1 трех терапевтических групп. Молекулярная конструкция с нацеливающим линкерным звеном из трех пептидов CCK-8 и связкой лекарственных средств из пяти молекул DM1 вызывала приблизительно 35% цитолиз клеток Panc-1.
[00313] Очевидно, что вышеизложенное описание вариантов осуществления приведено лишь в качестве примера, и что специалисты в данной области способны выполнить их различные модификации. В вышеизложенном описании, примерах и данных представлено полное описание структуры и применения иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения. Несмотря на то, что различные варианты осуществления настоящего изобретения описаны выше с определенной степенью конкретности или со ссылкой на один или несколько отдельных вариантов осуществления, специалисты в данной области способны выполнить многочисленные изменения раскрытых вариантов осуществления без отступления от сущности или объема настоящего изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQUENCE LISTING
<110> CHANG Tse-Wen
CHU Hsing-Mao
<120> LINKER UNITS AND MOLECULAR CONSTRUCTS COMPRISING THE SAME
<130> P3010-PCT
<150> US62613401
<151> 2018-01-03
<150> US62472011
<151> 2017-03-16
<160> 24
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 1
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys Gly
1               5                   10                  15
Ser Lys
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 2
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys
1               5                   10                  15
Gly Ser Lys
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 3
Gly Ser Ser Gly Ser Ser Lys Gly Ser Gly Lys Gly Ser Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Lys Gly Ser Gly Lys
20
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 4
Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser
1               5                   10                  15
Lys Gly Ser Gly Ser Lys
20
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1,3,5,7,9
<223> Xaa is PEGylated amino acid with four EG units
<220>
<223> synthesized
<400> 5
Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys
1               5                   10
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 6
Ser Lys Ser Lys Ser Lys
1               5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 7
Lys Ser Lys Gly Lys
1               5
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 8
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Ser Gly Lys Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Ser
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 9
Cys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe
1               5                   10
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 10
Cys Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 11
Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Lys Gly Ser Gly Lys
1               5                   10                  15
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 12
Arg Ser Gly Ser Ser Gly
1               5
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 13
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Ser Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
Ser Ser Gly Lys
20
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 14
Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly
1               5
<210> 15
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 15
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Ser Gly Lys Gly
1               5                   10                  15
Ser Ser Gly Lys Gly Ser Ser Gly Lys
20                  25
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 16
Glu Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe
1               5                   10
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 17
Glu Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 18
Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe
1               5
<210> 19
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 19
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1               5                   10                  15
Lys Gly
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10
<210> 21
<211> 255
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val
50                  55                  60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
115                 120                 125
Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130                 135                 140
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145                 150                 155                 160
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro
165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
180                 185                 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
195                 200                 205
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
210                 215                 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
225                 230                 235                 240
Gln Ile Thr Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys
245                 250                 255
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 22
Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
1               5                   10                  15
Gly Ser Lys
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 23
Trp Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro
1               5
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthesized
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<---