КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИТЕЛА К FEL D1, И СПОСОБЫ УМЕНЬШЕНИЯ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ОДНОГО СИМПТОМА ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ АЛЛЕРГИИ НА КОШЕК
COMPOSITIONS CONTAINING ANTIBODIES TO FEL D1 AND METHODS FOR REDUCING AT LEAST ONE SYMPTOM OF HUMAN ALLERGY TO CATS

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/449,883, поданной 24 января 2017 г., описание которой включено в настоящий документ путем данной ссылки.
Предпосылки создания изобретения
Приблизительно 20% взрослых людей страдают от аллергии на кошек и/или их перхоть. Симптомы аллергии на кошек варьируются от легкого ринита и конъюнктивита до угрожающих жизни астматических реакций, и аллергия на кошек является основным фактором, не позволяющим людям заводить кошек. Например, аллергия на кошек является основной причиной возврата кошек их владельцами в приюты для животных.
Многие аллергии на кошек вызваны мелким стабильным гликопротеином, известным под названием Fel D1 (аллерген Feline domesticus, номер 1). Этот белок попадает в перхоть кошки в процессе ухода за животным и переносится воздушно-капельным путем. При вдыхании кошачьей перхоти с присоединенным Fel D1 запускается аллергический каскад из-за распознавания Fel D1 человеческими иммунными клетками.
Изложение сущности изобретения
Настоящее описание относится к адгезии/мукоадгезии при пероральном введении молекулы, которая специфически связывается с Fel D1, гидрогелевой технологии контролируемого высвобождения молекулы к Fel D1 и способам обработки для получения порошка из гидрогеля. Эта молекула к Fel D1 (например, яичный иммуноглобулин, такой как IgY, птицы, иммунизированной Fel D1) может уменьшать по меньшей мере один симптом человеческой аллергии на кошек за счет блокирования ею распознавания Fel D1 человеческими иммунными клетками. Предлагаемый участок действия данной молекулы к Fel D1 находится в полости рта кошки, где секретируется белок Fel D1, и/или на шерсти кошки, на которой Fel D1 осаждается в процессе ухода за животным.
Авторы настоящего изобретения предлагают доставлять кошкам молекулы к Fel D1 с помощью пищи. Начальные испытания на животных показали, что введение этой молекулы кошкам с помощью пищи приводит к уменьшению свободного Fel D1 в кошачьей слюне только приблизительно на 30–35%. Авторы настоящего изобретения считают, что главным ограничением является необходимость сохранения молекулы к Fel D1 в полости рта кошки в течение длительного периода времени, но в процессе приема пищи и питья происходит проглатывание большого количества молекулы, введенной в пищу, и, следовательно, эффект отсутствует. Увеличение длительности пребывания IgY в полости рта может быть определено двумя различными способами. В одном аспекте можно определять наличие у IgY более высокой концентрации в определенный момент времени, например через 5 минут приема пищи. В другом аспекте можно определять наличие потребности в большем количестве времени для снижения количества IgY ниже определенного порога, например более 10 мкг/мл, ≥ 1 мкг/мл или даже > 100 нг/мл.
Авторы настоящего изобретения считают, что одной из главных проблем при создании гидрогелей с контролируемым высвобождением для доставки в рот кошки является обеспечение мгновенного растворения вместо растапливания гидрогеля в полости рта кошки, наличие мукоадгезивных свойств и привлекательность для кошек. Хитозан является хорошо известным полимером с высокой мукоадгезией, но он проявляет мукоадгезивные свойства при кислом рН, а полость рта кошек и типичные корма для домашних животных имеют нейтральный pH. Другим основным мукоадгезивным полимером является желатин свиньи, но гели, полученные из желатина, растапливаются при температуре тела.
Как подробно описано в разделе экспериментальных результатов ниже в настоящем документе, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что дополнительный биополимер может контролировать растапливание/растворение желатинового гидрогеля. В частности, влажные гидрогели, которые представляли собой сложные гели желатина/каппа-каррагинана, обеспечивали более медленное высвобождение иммуноглобулина к Fel D1 (IgY). Неожиданность данного вывода обусловлена тем, что из комбинации биополимеров, как правило, не получаются хорошие гели, поскольку оба полимера подвергаются разделению фаз. Lundin, L.O., Odic, K. and Foster, T.J. (1999) Phase separation in mixed carrageenan systems. Proceedings to Supermolecular and Colloidal Structures in Biomaterials and Biosubstrates, Mysore, India.
Соответственно, в одном варианте осуществления предложен пищевой порошок, обеспечивающий замедленное высвобождение молекулы к Fel D1. Пищевой порошок может содержать высушенный гидрогель и молекулу к Fel D1; причем высушенный гидрогель содержит желатин, коллагеновые пептиды или желатиновые и коллагеновые пептиды; и каррагинан; при этом молекула к Fel D1 инкапсулирована в высушенном гидрогеле.
Кроме того, в варианте осуществления в настоящем описании предложен способ получения пищевого порошка, обеспечивающего замедленное высвобождение молекулы к Fel D1. Способ включает: нагревание раствора, содержащего желатин, каррагинан и молекулу к Fel D1; формирование капель нагретого раствора; превращение капель в гель путем помещения капель в гелеобразующую ванну, содержащую соль или масло, с образованием желированных гранул, в которых инкапсулирована молекула к Fel D1; и высушивание желированных гранул с образованием пищевого порошка.
Капли могут быть образованы путем пропускания нагретого раствора через сопло. Нагревание раствора может включать воздействие на раствор температурой около 60°C. Гелеобразующая ванна может содержать около 100 мМ хлорида калия. Сушка может включать сушку гранул в псевдоожиженном слое.
Авторы настоящего изобретения также отметили, что наиболее распространенным способом сушки в пищевой промышленности является распылительная сушка, однако было установлено, что стандартная распылительная сушка желатиновых или желатиновых/каррагинановых композиций приводит к быстрому высвобождению молекулы к Fel D1 (IgY) во время исследования in vitro из-за высокопористой структуры порошка. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что при желировании композиций перед сушкой высвобождение молекулы к Fel D1 во время исследования in vitro проходило значительно медленнее. Например, процесс экструзии обеспечивал увеличение процентной доли инкапсуляции и большую способность контролировать конечный размер частиц порошка. Интересно, что процесс экструзии обеспечивал более хорошую структуру (более гладкую поверхность, меньшее количество включений) при встраивании каррагинана в смесь перед экструзией.
Соответственно, в варианте осуществления в настоящем описании предложен способ получения пищевого порошка, обеспечивающего замедленное высвобождение молекулы к Fel D1. Способ включает: нагревание раствора, содержащего желатин, каррагинан и молекулу к Fel D1; экструзию нагретого раствора для охлаждения нагретого раствора и образования экструдированного гидрогеля, в который инкапсулирована молекула к Fel D1; и сушку экструдированного гидрогеля.
Способ может включать измельчение высушенного гидрогеля до заданного размера. Нагревание раствора может включать воздействие на раствор температурой по меньшей мере около 60°C перед экструзией и может дополнительно включать помещение раствора в сборную емкость, имеющую температуру по меньшей мере приблизительно 40°C, а затем перенос раствора из сборной емкости в другое устройство, в котором раствор подвергается воздействию температуры по меньшей мере около 60°C. Экструзию можно выполнять с помощью трубчатого теплообменника, имеющего температуру от около 5°C до около 55°C или в одном аспекте от около 5°C до около 35°C, и по меньшей мере частично нагревание раствора можно проводить в воронке и/или насосе трубчатого теплообменника. Способ может включать погружение экструдированного гидрогеля перед сушкой в композицию, содержащую кальций, магний, калий, рубидий или цезий. Сушка может включать помещение экструдированного гидрогеля в туннельную сушилку, сушильный шкаф или сушилку с псевдоожиженным слоем.
В другом варианте осуществления в настоящем описании предложен пищевой порошок, обеспечивающий замедленное высвобождение молекулы к Fel D1. Пищевой порошок содержит высушенный гидрогель, содержащий желатин, коллаген или желатиновые и коллагеновые пептиды; каррагинан; и молекулу к Fel D1; причем молекула к Fel D1 инкапсулирована в высушенном гидрогеле. Порошок может быть получен с помощью одного из двух описанных выше способов.
Авторы настоящего изобретения также отметили, что хорошо известна значительная сложность распылительной сушки желатина. Причина заключается в высокой эластичности желатиновых растворов с высоким общим содержанием твердых веществ, за счет чего в процессе распыления при распылительной сушке формируются длинные волокна. Образование волокон во время распылительной сушки приводит к получению порошка, который имеет очень низкую пористость и является очень рыхлым, и оба этих признака сильно ограничивают сыпучесть и способность к обработке порошка.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что оптимизированные условия распылительной сушки, а также тщательный выбор свойств желатина (например, молекулярной массы) и материалов стенок позволяют разработать состав, способный к высушиванию распылением, причем полученный порошок сохраняет свои мукоадгезивные свойства. В частности, за счет порошка, который создают просто путем сухого смешивания желатина и молекулы к Fel D1, нельзя увеличить длительность нахождения молекулы к Fel D1 в полости рта, поскольку молекула к Fel D1 не инкапсулирована.
Соответственно, в варианте осуществления в настоящем описании предложен способ получения пищевого порошка, обеспечивающего замедленное высвобождение молекулы к Fel D1. Способ включает распылительную сушку раствора, содержащего молекулу к Fel D1, и 5,0–20,0 мас.% желатина, имеющего значение прочности студня по Блюму 40–300 в одном аспекте, 40–300 или даже около 100, с образованием высушенного гидрогеля, в котором инкапсулирована молекула к Fel D1.
3
Полученный порошок может представлять собой пищевой порошок, обеспечивающий замедленное высвобождение молекулы к Fel D1 и содержащий высушенный гидрогель, содержащий молекулу к Fel D1 и 0,5–90 мас.% желатина. Молекула к Fel D1 инкапсулирована в высушенном гидрогеле, и порошок может иметь плотность от около 0,265 до около 0,3 г/см. В варианте осуществления желатин может представлять собой свиной желатин типа А, имеющий положительный заряд при pH ниже 7,0, и может быть единственным биополимером, обладающим способностью к гелеобразованию при температуре ниже 60°C в высушенном гидрогеле. В одном варианте осуществления желатиновые и коллагеновые пептиды могут иметь молекулярную массу от 2000 до 1 миллиона дальтон и/или значение прочности студня по Блюму от 40 до 300.
В настоящем описании также предложен способ уменьшения симптомов человеческой аллергии на кошку. Способ включает пероральное введение кошке эффективного количества любого из вариантов осуществления пищевого порошка, описанного в настоящем документе, и/или пищевого порошка, полученного в результате реализации любого из способов получения пищевого порошка, описанного в настоящем документе. Порошок можно вводить в составе корма для домашних животных, дополнительно содержащего по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из белка, жира, углевода, витамина и минеральных веществ.
Преимуществом одного или более вариантов осуществления, предложенных в настоящем описании, является уменьшение, сведение к минимуму или предотвращение по меньшей мере одного симптома аллергической реакции на кошку у чувствительного человека.
Другим преимуществом одного или более вариантов осуществления, предложенных в настоящем описании, является снижение, сведение к минимуму или предотвращение аллергии, вызванной кошками.
Другим преимуществом одного или более вариантов осуществления, предложенных в настоящем описании, является помещение молекулы, которая связывается с FelD1, в рот кошки до контакта с чувствительным человеком; связанный аллерген не может взаимодействовать с тучными клетками человека и, таким образом, не может вызывать аллергическую реакцию.
Дополнительным преимуществом одного или более вариантов осуществления, предложенных в настоящем описании, является система носителя/доставки, которая увеличивает продолжительность пребывания молекулы к Fel D1 в полости рта кошки, и является привлекательной для кошки (например, может быть помещена в корм для домашних животных).
Дополнительным преимуществом одного или более вариантов осуществления, предложенных в настоящем описании, является повышение привлекательности для владельца, увеличение числа владельцев кошек и улучшение здоровья взрослых и детей, имеющих домашние хозяйства с кошками.
Еще одним преимуществом одного или более вариантов осуществления, предложенных в настоящем описании, является применение множества технологий для уменьшения у человека симптомов аллергии на кошек.
Еще одним преимуществом одного или более вариантов осуществления, предложенных в настоящем описании, является контроль растапливания/растворения гидрогеля, инкапсулирующего активную молекулу.
Другим преимуществом одного или более вариантов осуществления, предложенных в настоящем описании, является устранение аллергии на кошек с помощью рациона питания кошки и, таким образом, уменьшение или устранение необходимости в приеме лекарственного препарата или предотвращении контакта с кошкой для человека с аллергией.
Дополнительным преимуществом одного или более вариантов осуществления, предложенных в настоящем описании, является получение порошка, имеющего высокое содержание молекулы к Fel D1, из-за высокой эффективности инкапсуляции (например, путем использования гелеобразования in situ вместо гелеобразующей ванны) и/или минимальной потери молекулы к Fel D1 (например, путем применения матриц с более высокой вязкостью, связанных с более низкими температурами).
Еще одним преимуществом одного или более вариантов осуществления, предложенных в настоящем описании, является легкое образование экструдированных инкапсулированных материалов из-за температурного профиля гелеобразования, прочности цепи и смазочных свойств.
Дополнительные признаки и преимущества описаны в настоящем документе и будут очевидны после прочтения представленного ниже подробного описания и изучения фигур.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1A представлена принципиальная схема системы, которую можно использовать в варианте осуществления первого способа получения пищевого порошка, который уменьшает по меньшей мере один симптом человеческой аллергии на кошек («капельный способ»).
На фиг. 1B представлена принципиальная схема варианта осуществления пищевого порошка, полученного капельным способом.
На фиг. 2A представлена принципиальная схема системы, которую можно использовать в варианте осуществления второго способа получения пищевого порошка, который уменьшает по меньшей мере один симптом человеческой аллергии на кошек («экструзионный способ»).
На фиг. 2B представлены сравнительные фотографии варианта осуществления пищевого порошка, полученного экструзионным способом, и пищевого порошка, полученного с помощью стандартной распылительной сушки.
На фиг. 2C представлена фотография варианта осуществления системы, которую можно использовать в экструзионном способе.
На фиг. 2D представлена фотография системы, показанной на фиг. 2C, в процессе применения.
На фиг. 3 представлена принципиальная схема системы, которую можно использовать в варианте осуществления третьего способа получения пищевого порошка, который уменьшает по меньшей мере один симптом человеческой аллергии на кошек («способ управляемой распылительной сушки»).
На фиг. 4 представлен график зависимости от времени относительного высвобождения IgY к Fel D1 из гидрогелей различных композиций.
На фиг. 5 представлены фотографии, показывающие внешний вид различных гидрогелей, полученных из растворов, содержащих 10 мас.% желатина типа А и 2 мас.% экстракта яичного желтка. Образцы получали следующим образом: (I) кусок геля 3 x 20 x 20 мм, (II) порошок распылительной сушки (диаметр, D4,3 32 мкм), (III) влажные гранулы, полученные капанием в масло, и (IV) высушенные гранулы, полученные из (III).
На фиг. 6 представлены изображения, полученные путем сканирующей электронной микроскопии (SEM), поперечного сечения порошков, полученных из растворов, содержащих 10 мас.% желатина и 2 мас.% экстракта яичного желтка. Порошки получали: (I) путем распылительной сушки или (II) путем капания с последующей сушкой в псевдоожиженном слое.
На фиг. 7A–D представлен SEM-анализ сложности микроструктуры влажных (А–С) и сухих (D) гранул. Состав: 9,81 мас.% желатина (тип А), 1,99 мас.% активного ингредиента, 1,47 мас.% каррагинана WR78 и без соли. (A) криоскалывающая SEM, (B) крио-SEM с сублимацией льда, (C) крио-SEM с удлиненной сублимацией льда и (D) SEM высушенных гранул.
На фиг. 8 представлен график влияния различных способов получения геля на высвобождение IgY к Fel из гидрогелей, содержащих 10 мас.% желатина типа А и 2 мас.% экстракта яичного желтка. Образцы получали следующим образом: (I) кусок геля 3 x 20 x 20 мм, (II) порошок распылительной сушки (диаметр, D4,3 32 мкм), (III) влажные гранулы, полученные капанием в масло, и (IV) высушенные гранулы, полученные из (III).
На фиг. 9A и 9B представлены микрофотографии со сканирующего электронного микроскопа порошков (A) и (B), полученных распылительной сушкой растворов, содержащих 10 мас.% желатина, 1 мас.% каппа-каррагинана и 2 мас.% экстракта яичного желтка.
На фиг. 10A–10C представлены фотографии (A и B) и микрофотография со сканирующего электронного микроскопа (C) влажных и сухих гранул, полученных распылительной сушкой растворов, содержащих 10 мас.% желатина (типа А, прочность студня по Блюму 280), 1 мас.% каппа-каррагинана и 2 мас.% экстракта яичного желтка.
На фиг. 11A и 11B представлены графики, показывающие влияние различных способов получения геля на высвобождение IgY из сложных гидрогелей, содержащих 10 мас.% желатина типа А и 1 мас.% каппа-каррагинана и полученных с добавлением 2 мас.% экстракта яичного желтка. Образцы получали следующим образом: (I) влажные гранулы, полученные капанием в 100 мМ раствора KCl, (II) высушенные гранулы, полученные из (I), (III) влажные гранулы, полученные капанием 10 мас.% желатина (тип A) и 2 мас.% экстракта яичного белка в масло и (IV) высушенные гранулы, полученные из (III).
На фиг. 12 представлены графики экспериментальных данных, касающихся эффективности денатурации и инкапсуляции IgY к Fel D1, инкапсулированных капельным и экструзионным способами.
На фиг. 13 представлены графики экспериментальных данных, касающихся контролируемого высвобождения IgY к Fel D1, инкапсулированных капельным и экструзионным способами.
На фиг. 14 представлен график экспериментальных данных, касающийся адгезии в полости рта IgY к Fel D1, инкапсулированных экструзионным способом.
На фиг. 15 представлен график экспериментальных данных, касающийся продолжительности пребывания в ротовой полости in vivo неинкапсулированных IgY к Fel D1.
На фиг. 16 представлен график экспериментальных данных, касающийся адгезии в полости рта IgY к Fel D1, инкапсулированных способом управляемой распылительной сушки.
На фиг. 17 представлена таблица, показывающая состав и свойства (физический внешний вид и плотность) различных высушенных распылением желатиновых порошков. Показатель качества порошка: 1 — невозможно накачать жидкость, 2 — засоренное сопло, 3 — обширные паутины, 4 — рыхлый порошок, 5 — порошок средней плотности, 6 — плотный порошок.
На фиг. 18 представлена схема, на которой показан план клинического исследования по оценке воздействия инкапсуляции на продолжительность нахождения IgY в полости рта.
На фиг. 19 представлен состав двух исследуемых проб, использованных в клиническом исследовании на людях по оценке влияния инкапсуляции на продолжительность нахождения IgY в полости рта.
Фиг. 20. Изменение концентрации IgY в слюне человека по времени при двух типах обработки i) 140 мг IgY, доставленные в 1 г порошка яйца, ii) 140 мг IgY, доставленные в виде полученного распылительной сушкой порошка желатина (тип А, прочность студня по Блюму 100) и белков обезжиренного яичного желтка. Планки погрешностей отражают 95%-е доверительные интервалы n = 12 участников.
Подробное описание
Определения
В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя ссылки на множественное число, если из контекста явным образом не следует иное. Слова «содержать», «содержит» и «содержащий» следует интерпретировать как включающие, а не исключающие. Аналогично термины «включать», «включающий» и «или» следует толковать во включающем смысле, если такое толкование явно не запрещено контекстом. Однако устройства, описанные в настоящем документе, могут не содержать ни один из элементов, который конкретно в нем не описан. Таким образом, описание варианта осуществления с помощью термина «содержащий» включает в себя описание вариантов осуществления, «состоящих, по существу, из» и «состоящих из» указанных компонентов.
Термин «и/или», применяемый в контексте «X и/или Y», следует интерпретировать как «X», или «Y», или «X и Y». В настоящем документе термины «пример» и «такой как», особенно с последующим перечислением терминов, имеют только примерный и иллюстративный характер, и их не следует считать исключающими или исчерпывающими. Любой вариант осуществления, описанный в настоящем документе, можно комбинировать с любым другим вариантом осуществления, описанным в настоящем документе, если явным образом не указано иное.
Диапазоны в настоящем документе указаны сокращенно для предотвращения перечисления каждого значения в пределах диапазона. Любое подходящее значение в пределах диапазона можно выбирать в качестве верхнего значения или нижнего значения диапазона. Более того, числовые диапазоны в настоящем документе включают в себя все целые или дробные числа, входящие в диапазон.
Если не указано иное, в настоящем документе все процентные содержания выражены в расчете на массу от общей массы композиции. При ссылке на pH его значения соответствуют pH, измеренному при 25°C с помощью стандартного оборудования. В настоящем документе под «около» или «по существу» в отношении числа понимают числа в диапазоне чисел, например в диапазоне от -10% до +10%, от -5% до +5%, от -1% до +1% или в одном аспекте от -0,1% до +0,1% от упомянутого числа.
Термин «пищевой» означает, что порошок годится в пищу кошке и не токсичен для кошки. Например, пищевой порошок содержит не более 5,0 мас.% глицерина.
Термин «аллергия» является синонимом терминов «аллергический ответ» или «аллергическая реакция». Каждый из терминов относится к состоянию иммунологической реактивности у животного, специфичной к экзогенному антигену (или «аллергену»), который в остальном не является вредным для животного. «Симптом» аллергического ответа относится к любой степени иммунологической реактивности, например, на молекулярном уровне (в том числе измерение активности или экспрессии белка, или транскрипта, или гена), клеточном уровне, уровне органов, системном уровне или на уровне организма. Такие симптомы могут включать в себя один или более таких уровней. Термин «уменьшение по меньшей мере одного симптома» включает в себя уменьшение таких симптомов до их возникновения, тем самым препятствуя возникновению симптомов аллергической реакции и, следовательно, предотвращая аллергическую реакцию.
Симптомы могут включать в себя генерализованные явления, такие как воспаление, респираторные жалобы, отечность или расстройство, обычно связанные с аллергией, ринит, отек и аллергические кожные расстройства, включая, без ограничений, атопический дерматит (например, экзему), аллергическую сыпь (например, крапивницу), и ангионевротический отек, и аллергический контактный дерматит. Более специфические явления, которые являются «симптомами» аллергического ответа, включают в себя любое измеримое или наблюдаемое изменение, например, на клеточном уровне, включая, без ограничений, локальные или системные изменения в популяциях клетки, эозинофилию, рекрутинг и/или активацию иммунных клеток, включая, например, тучные клетки и/или базофилы, изменения в антигенпрезентирующих клетках (включая, без ограничений, FcεRI-несущие дендритные клетки), внутриклеточные или молекулярные изменения, включая измерение или наблюдения одной или более ступеней в иммунологическом каскаде, высвобождение внутриклеточных соединений, которые опосредуют аллергический ответ (например, медиаторов), и изменения в одном или более цитокинах (например, IL-3, IL-5, IL-9, IL-4 или IL-13) или их родственных соединениях или антагонистах. Специалисту в данной области будет понятно, что некоторые симптомы, как определено в настоящем документе, измерять легче, чем другие, и некоторые симптомы измеряют с помощью субъективной оценки или самооценки симптома. Для других симптомов существуют удобные или быстрые способы анализа или измерения для объективной оценки изменений.
Используемый в настоящем документе термин «эффективное количество» означает количество любых композиций, описанных в настоящем документе, вводимых кошке, которое уменьшает по меньшей мере один симптом аллергии на кошек у чувствительного человека в той же среде, что и кошка (например, дом, комната, автомобиль, офис, отель, двор, гараж). Относительный термин «уменьшение по меньшей мере одного симптома» и схожие термины означают уменьшение степени тяжести в результате применения композиций и способов, описанных в настоящем документе, относительно степени тяжести, наблюдаемой в случае неприменения таких композиций и способов, в идентичных условиях. В контексте настоящего документа термин «уменьшение по меньшей мере одного симптома» включает в себя, без ограничений, уменьшение таких симптомов до их возникновения, тем самым препятствуя возникновению симптомов аллергической реакции и, следовательно, предотвращая аллергическую реакцию.
2
В контексте настоящего документа термина «молекула к Fel D1» означает любую молекулу, способную специфически связываться с аллергеном Feline domesticus номер 1 (Fel D1), например антитело, аптамер, агонист/антагонист Fel D1 или части таких молекул (например, антигенсвязывающий фрагмент (Fab) антитела). Термин «антитело» включает в себя поликлональные и моноклональные антитела любого типа и любых видов, а также фрагменты иммуноглобулина, такие как Fv, Fab, Fab', F(ab') или другие антигенсвязывающие фрагменты антитела, последовательности или подпоследовательности, которые взаимодействуют с молекулярной специфичностью (например, демонстрируют специфическое связывание) с антигеном.
В одном варианте осуществления молекула к Fel D1 представляет собой антитело (например, IgY), полученное путем иммунизации птицы, такой как курица, имеющей Fel D1, для обеспечения производства антитела в яйцах. Антитела можно отделять от яйца и вводить животному; или яйца и/или часть яиц, например яичный желток, можно наносить непосредственно животному или смешивать с едой или другой композицией, подходящей для введения животному. В одном аспекте молекула к Fel D1 может представлять собой один из вариантов осуществления молекул, описанных в патенте США № 8,454,953 (Wells et al., “Methods for reducing allergies caused by environmental allergens”), полностью включенном в настоящий документ путем ссылки.
Способы и устройства, а также другие преимущества, описанные в настоящем документе, не ограничены конкретными методиками, протоколами и реагентами, поскольку, как будет понятно специалистам в данной области, они могут варьироваться. Дополнительно применяемая в настоящем документе терминология служит только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не ограничивает объем того, что описано или заявлено в формуле изобретения.
Если не определено иное, все технические и научные термины, специальная терминология и сокращения, применяемые в настоящем документе, имеют значения, обычно понятные обычному специалисту в области (-ях), к которой (-ым) относится настоящее описание, или в области (-ях), в которой (-ых) применяется термин. Хотя можно применять любые композиции, способы, изделия или другие средства или материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, в настоящем документе описаны конкретные устройства, способы, изделия или другие средства или материалы.
Варианты осуществления
Настоящее описание, по существу, относится к композициям и способам применения активной молекулы, которая уменьшает по меньшей мере один симптом человеческой аллергии на кошек. Более конкретно, настоящее описание относится к повышению эффективности активной молекулы путем продления времени пребывания активной молекулы в полости рта кошки, которой вводят активную молекулу, и/или увеличения концентрации активной молекулы, обнаруженной во рту. Увеличение длительности удерживания активной молекулы, например IgY, в полости рта может быть определено двумя различными способами. В одном аспекте можно определять наличие более высокой концентрации активной молекулы в определенный момент времени, например через 5 минут приема пищи. В другом аспекте можно определять наличие потребности в большем количестве времени для снижения количества активной молекулы ниже определенного порога, например более 10 мкг/мл, ≥ 1 мкг/мл или даже > 100 нг/мл.
Один аспект настоящего описания представляет собой пищевой порошок, который обеспечивает замедленное высвобождение молекулы к Fel D1. Молекулу к Fel D1 инкапсулируют в высушенный гидрогель.
В варианте осуществления пищевой порошок содержит высушенный гидрогель, содержащий желатин, каррагинан и молекулу к Fel D1. В одном аспекте желатин и каррагинан являются единственными биополимерами, обладающими способностью к гелеобразованию при температуре ниже 60°C в высушенном гидрогеле. В другом аспекте желатин и каррагинан являются единственными уменьшающими аллергию биополимерами. Желатин может быть получен из любого источника, такого как свинина, говядина или рыба. В одном аспекте желатин, используемый с каррагинаном, представляет собой желатин типа А (обработанный кислотой), имеет положительный заряд и среднюю молекулярную массу 2000–2 000 000 дальтон (т.е. прочность студня по Блюму 40–300) или в одном аспекте имеет прочность студня по Блюму 100–200. Например, в одном конкретном варианте осуществления желатин свиньи имеет положительный заряд при pH ниже 7,0.
Каррагинан может представлять собой любой каррагинан из водорослей или овощей (например, каппа-, йота- или гамма-каррагинан). В одном аспекте каррагинановые гели могут включать в себя ионы солей (например, калий, кальций, магний, натрий). Например, каррагинан может представлять собой каппа-каррагинан, йота-каррагинан, сополимер каппа-каррагинана и йота-каррагинан или смесь каппа-каррагинана и йота-каррагинана. Один аспект представляет собой каррагинан, который образует гель в присутствии калия, т.е. каппа-каррагинан или сополимера каппа-каррагинана и йота-каррагинана.
Пищевой порошок может содержать источник молекулы к Fel D1. В одном аспекте молекула к Fel D1 может представлять собой IgY к Fel D1, а источник может представлять собой частично обезжиренный порошок яичного желтка из птицы, иммунизированной Fel D1. Порошок может содержать от 0,5 до 90 мас.% желатина, от 0,1 до 50 мас.% каррагинана и от 10 до 99,5 мас.% источника молекулы к Fel D1; в одном аспекте от 10,0 до 80,0 мас.% желатина, от 0,5 до 20 мас.% каррагинана и от 20 до 89,5 мас.% источника молекулы к Fel D1; и в одном конкретном аспекте от 20,0 до 80,0 мас.% желатина, от 1 до 10 мас.% каррагинана и от 19 до 79 мас.% источника молекулы к Fel D1; и в еще одном аспекте от 25,0 до 60,0 мас.% желатина, от 1 до 10 мас.% каррагинана и от 39 до 74 мас.% источника молекулы к Fel D1.
Другой аспект настоящего описания представляет собой способ получения пищевого порошка, обеспечивающего замедленное высвобождение молекулы к Fel D1, например порошка, содержащего желатин, каррагинан и молекулу к Fel D1, как описано выше. Способ может включать нагревание раствора, содержащего желатин, каррагинан и молекулу к Fel D1, в одном аспекте до температуры около 60°C. Способ может дополнительно включать формирование капель нагретого раствора, например путем пропускания нагретого раствора через сопло. Материал матрицы (желатин и каррагинан) можно распылять посредством сопла. На фиг. 1A представлена принципиальная схема не имеющего ограничительного характера примера подходящего устройства для выполнения этого способа, а на фиг. 1B представлена иллюстрация активного соединения (молекулы к Fel D1), инкапсулированного в сополимер желатина и каррагинана, образованного данным способом.
Капли можно желировать, помещая их в гелеобразующую ванну, содержащую соль или масло, например путем капания, впрыскивания струей или приллирования капель в ванну с образованием желированных гранул, в которых инкапсулирована молекула к Fel D1. В варианте осуществления шприцевой насос или волюметрический насос проталкивает нагретый раствор через сопло в гелеобразующую ванну.
Ванна может содержать около 25–100 мМ хлорида калия, или 100 мМ хлорида кальция, или и то и другое. В связи с этим авторы настоящего изобретения обнаружили, что некоторые варианты осуществления, в которых используют более 100 мМ концентрации хлорида калия, обеспечивают чрезмерное повышение температуры растапливания каррагинана и, таким образом, увеличение температур обработки и приводят к значительному снижению (на 30–80%) активности молекулы к Fel D1 из-за денатурации. В некоторых вариантах осуществления хлорид калия может быть частично или полностью заменен хлоридом кальция.
3
Желированные гранулы могут быть собраны, необязательно промыты и высушены с образованием пищевого порошка. В одном аспекте желированные гранулы могут быть высушены с помощью сушки в псевдоожиженном слое. Например, промытые влажные гранулы могут быть высушены в сушилке с псевдоожиженным слоем при температуре входящего воздуха 25°C и скорости потока воздуха 80 м/мин в течение 3–5 часов.
Хотя описанный выше способ подходит для получения пищевого порошка, обеспечивающего замедленное высвобождение молекулы к Fel D1, авторы настоящего изобретения разработали способ экструзии, при котором происходит инкапсулирование более высокого процента молекулы к Fel D1 и имеется большая возможность контроля конечного размера частиц порошка. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что с помощью этого способа экструзии получали более хорошую структуру (например, более гладкую поверхность, меньшее количество включений) при встраивании каррагинана в смесь перед экструзией.
Таким образом, в настоящем описании предложен другой вариант осуществления способа получения пищевого порошка, обеспечивающего замедленное высвобождение молекулы к Fel D1 и содержащего желатин, каррагинан и молекулу к Fel D1. Способ может включать нагревание раствора, содержащего желатин, каррагинан и молекулу к Fel D1, в сборной емкости до температуры по меньшей мере около 40°C. Затем раствор может быть нагрет до температуры по меньшей мере около 50–60°C, например в воронке и/или насосе трубчатого теплообменника. Затем трубчатый теплообменник может охлаждать нагретый раствор и экструдировать гидрогель, в котором инкапсулирована молекула к Fel D1. Например, трубчатый теплообменник может иметь температуру от около 15°C до около 25°C. В одном аспекте в способе не используют гелеобразующую ванну и тем самым предотвращают потери, связанные с такой ванной, например при промывке и сборе желированных гранул.
На фиг. 2A представлена принципиальная схема не имеющего ограничительного характера примера подходящего устройства для выполнения этого способа, на фиг. 2B представлены фотографии, на которых сравниваются плотная порошковая структура, полученная данным способом, с высокопористой порошковой структурой, полученной посредством стандартной распылительной сушки, а на фиг. 2C представлена фотография не имеющего ограничительного характера примера подходящего устройства для выполнения данного способа. Теплообменник может экструдировать гидрогель в требуемой форме, например цепочки гидрогеля, как показано на фотографии на фиг. 2D.
В варианте осуществления экструдированный гидрогель перед сушкой погружают в композицию, содержащую хлорид кальция. В другом варианте осуществления экструдированный гидрогель перед сушкой погружают в композицию, содержащую хлорид калия, например в ванну, содержащую около 1 мМ хлорида калия. В одном аспекте экструдированный гидрогель может быть высушен в туннельной сушилке или сушилке с псевдоожиженным слоем. Способ может включать измельчение высушенного гидрогеля до предварительно заданного размера с образованием порошка.
3
3
Например, цепочки (или их отрезанные части) экструдированного материала могут быть высушены в сушилке с псевдоожиженным слоем при температуре входящего воздуха 20–25°C и скорости потока воздуха 120 м/мин в течение 30–60 минут, затем при температуре около 40°C и скорости потока воздуха около 120 м/мин в течение дополнительных 60–90 минут. Полученный сухой материал может быть собран и либо использован без дальнейших модификаций, либо измельчен для дополнительного уменьшения размера частиц до желаемого размера.
3
3
В качестве еще одного примера цепочки (или их отрезанные части) экструдированного материала могут быть высушены в туннельной сушилке при температуре входящего воздуха 20–25°C и скорости потока воздуха 20–80 м/мин в течение 30–60 минут, затем при температуре около 40°C и скорости потока воздуха 20–120 м/мин в течение дополнительных 60–90 минут. Полученный сухой материал может быть собран и либо использован без дальнейших модификаций, либо измельчен для дополнительного уменьшения размера частиц до желаемого размера.
3
3
3
3
3
3
Как отмечено выше, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что оптимизированные условия распылительной сушки, а также тщательный выбор свойств желатина (например, молекулярной массы) и материалов стенок позволяют разработать состав, способный к высушиванию распылением, причем полученный порошок сохраняет свои мукоадгезивные свойства. Таким образом, еще один аспект настоящего описания представляет собой пищевой порошок, который обеспечивает замедленное высвобождение молекулы к Fel D1 и содержит высушенный распылительной сушкой гидрогель, содержащий молекулу к Fel D1 и от 0,5 до 90,0 мас.% желатина. Плотность порошка, содержащего высушенный распылительной сушкой гидрогель, составляет от около 0,1 г/смдо около 0,6 г/см, от около 0,265 г/смдо около 0,5 г/см, или в одном аспекте от около 0,4 г/смдо около 0,5 г/см. Молекулу к Fel D1 можно инкапсулировать в высушенный распылительной сушкой гидрогель. В варианте осуществления желатин может быть единственным биополимером, обладающим способностью к гелеобразованию при температуре ниже 60°C в высушенном распылительной сушкой гидрогеле. В некоторых аспектах желатин может иметь значение прочности студня по Блюму от 40 до 300, или от 40 до 200, или даже около 100. В одном аспекте желатин может представлять собой желатин типа А (обработанный кислотой).
В одном варианте осуществления порошок может содержать от 10,0 до 99,5 мас.% источника молекулы к Fel D1 (например, частично обезжиренного яичного желтка из птицы, иммунизированной Fel D1). В одном аспекте порошок может содержать от 10,0 до 80,0 мас.% желатина и от 20 до 90 мас.% источника молекулы к Fel D1. В другом аспекте порошок может содержать от 25,0 до 80,0 мас.% желатина и от 20 до 75 мас.% источника молекулы к Fel D1. В еще одном аспекте порошок может содержать от 25,0 до 60,0 мас.% желатина и от 40 до 75 мас.% источника молекулы к Fel D1.
На фиг. 3 показан не имеющий ограничительного характера пример подходящего устройства для получения этого варианта осуществления порошка. Способ получения этого варианта осуществления порошка может включать распылительную сушку раствора, содержащего молекулу к Fel D1, и 5,0–20,0 мас.% желатина, имеющего значение прочности студня по Блюму 40–200, с образованием высушенного гидрогеля, в котором инкапсулирована молекула к Fel D1. В варианте осуществления желатин может быть единственным биополимером, который обладает способностью к гелеобразованию при температуре ниже 60°C в растворе. В другом варианте осуществления желатин может иметь значение прочности студня по Блюму 40–200 или в одном аспекте около 100.
Раствор может содержать от 0,5 до 30,0 мас.% источника молекулы к Fel D1 (например, частично обезжиренного яичного желтка из птицы, иммунизированной Fel D1). В одном аспекте раствор может содержать от 2,0 до 15,0 мас.% желатина и от 2,0 до 20,0 мас.% источника молекулы к Fel D1; и в одном конкретном аспекте от 7,5 до 12,5 мас.% желатина и от 5 до 20 мас.% источника молекулы к Fel D1.
Еще один аспект настоящего описания представляет собой способ уменьшения симптомов человеческой аллергии на кошек. Способ включает пероральное введение кошке эффективного количества любого из пищевых порошков, описанных в настоящем документе, и/или пищевого порошка, полученного с помощью любого из способов, описанных в настоящем документе. Порошок можно вводить в составе корма для домашних животных, дополнительно содержащего по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из белка, жира, углевода, витамина и минеральных веществ. Способ позволяет связывать молекулу к Fel D1 с Fel D1 в полости рта кошки и тем самым предотвращать индуцирование гликопротеином Fel D1 аллергической реакции у человека, восприимчивого к аллергии или страдающего от аллергии, вызванной Fel D1.
Примеры
В качестве примера, но без ограничений, приведенные ниже не имеющие ограничительного характера примеры демонстрируют композиции и способы уменьшения симптомов человеческой аллергии на кошек в вариантах осуществления, предложенных в настоящем описании.
Пример 1
Первое исследование выполнено для понимания влияния различных способов сушки на высвобождение IgY к Fel D1 из гидрогелей для содействия в разработке способов производства системы доставки. Два различных состава гидрогеля; i) простой содержащий только желатин состав и ii) сложный гелевый состав, содержащий желатин и каппа-каррагинан, были созданы с использованием двух способов; i) прямая распылительная сушка и ii) формирование гранул с последующей сушкой. Центральная гипотеза заключалась в обеспечении желированием гидрогеля перед сушкой получения лучшей структуры капсулы, которая в большей степени способна замедлять скорость высвобождения IgY к Fel D1 из высушенного гидрогеля.
В этом исследовании было установлено, что тип сушки, используемый для создания гидрогелевых порошков, может оказывать значительное влияние на скорость высвобождения IgY к Fel D1 из микрокапсул гидрогеля. Обнаружено, что желирование гидрогелевого состава перед сушкой приводило к образованию микрокапсул с более толстыми и более плотными структурами стенок. Полученные «высушенные после желирования» микрокапсулы имели скорость высвобождения IgY к Fel D1 в 2,75 раза выше, чем высушенные распылительной сушкой микрокапсулы. Отсутствовали различия в скорости высвобождения IgY к Fel D1 между простыми желатиновыми микрокапсулами и сложными гелями желатина/каппа-каррагинана. Во влажных гидрогелях из сложных гелей желатина/каппа-каррагинана высвобождение IgY к Fel D1 из сложных гелей происходило в десять раз медленнее, чем из гелей, содержащих только желатин.
В предыдущих работах по инкапсуляции оценивали несколько различных технологий (например, гидрогели, самособираемые структуры, липосомы и эмульсии «вода в масле») в отношении увеличения продолжительности пребывания IgY к Fel D1 в ротовой полости кошек. В целом было обнаружено, что желатиновые биополимерные гидрогели являются основной технологией, поскольку они обладают высокой эффективностью инкапсуляции и внутренней мукоадгезией.
Как показано на фиг. 4, ограничение гидрогелей на основе простого желатина (10 мас.%) заключается в быстром высвобождении ими всех инкапсулированных IgY при попадании в условия ротовой полости (37°C и имитация слюны). Однако было обнаружено, что комбинирование желатинового гидрогеля со вторым гидрогелем (например, агаровым, каррагинановым) позволяет влажным желатиновым/каппа-каррагинановым гидрогелям высвобождать IgY к Fel D1 в течение двух часов. Неожиданно было обнаружено, что все сложные гели имели гораздо более медленную кинетику высвобождения IgY к Fel D1 по сравнению с простыми гидрогелями, содержащими только желатин или только каппа-каррагинан, что указывает на уникальную синергию комбинирования двух биополимеров.
Эти гидрогели имеют высокий Aw (> 0,6), который демонстрирует значительные риски устойчивости IgY к Fel D1 к бактериальной порче, окислению/денатурации белка и ферментативному разложению. Следовательно, эти гидрогелевые структуры должны быть высушены без потери способности к замедленному высвобождению IgY к Fel D1 в течение 2–4 часов. Гидрогелевые матрицы могут быть высушены с использованием нескольких способов, каждый из которых влияет на конечную структуру порошка и, следовательно, на кинетику высвобождения IgY. Наиболее известным способом является распылительная сушка, при которой исходный раствор непосредственно сушат в распыляемом воздушном потоке без прохождения раствора через состояние геля. Второй способ представляет собой «гель → сушка», при котором перед стадией сушки создают влажные частицы геля исходного раствора (например, путем экструзии/капания или приллирования). Преимущество способов «гель → сушка» состоит в большей вероятности сохранения структуры гидрогеля.
Влияние различных способов сушки на высвобождение IgY к Fel D1 из гидрогелей сначала исследовали с использованием простых гидрогелей, состоящих из желатина. Исходный раствор состоял из 10 мас.% желатина (тип А, прочность студня по Блюму 280) и 2 мас.% экстракта яичного желтка. Как показано на фиг. 5, из этого раствора были получены различные структуры в зависимости от того, высушивали ли раствор непосредственно без гелеобразования (панель II) или желировали перед сушкой (панель IV).
Как показано на фиг. 6, при непосредственном высушивании раствора без гелеобразования полученные частицы были небольшими, очень пористыми и даже полыми (панель I). Такая порошковая структура является распространенной в порошках распылительной сушки, полученных из растворов с низким общим содержанием твердых веществ (12 мас.%). При желировании желатинового раствора перед сушкой посредством капания полученные частицы порошка были «сморщенными», но имели толстую, очень плотную структуру стенок порошка (панель II).
Очевидно, что гелеобразование гидрогеля перед сушкой приводило к образованию структуры, заметно отличающейся от полученной прямой сушкой посредством распылительной сушки. Для лучшего понимания формирования данной структуры исследовали микроструктуру гидрогеля с использованием крио-SEM с сублимацией льда. На фиг. 7A представлен вид снаружи гранулы геля, и единственным очевидным элементом ее структуры является ее сферообразная форма с шероховатой поверхностью. Анализ внутренней структуры гидрогеля в поперечном сечении может быть выполнен посредством криоскалывающей SEM (фиг. 7B и 7C). Как на фиг. 7B, так и на 7C показано, что желатиновый гидрогель образует сетчатую структуру с концентрацией желатина внутри стенок каждой ячейки и большими пустотами в середине каждой ячейки. Сублимация льда для удаления воды в структуре показывает сложность ячеистой структуры желатинового гидрогеля, в которой имеется иерархия клеточных структур, формирующих плотную сотовую матрицу.
При начальном рассмотрении может показаться, что размер этих ячеек (в микрометровом диапазоне) слишком велик для ограничения транспортировки IgY. Однако при изучении микроструктуры стенки желатиновых гелей была обнаружена очень толстая и плотная сеть (правая панель на фиг. 7B). При сушке эта ячеистая структура разрушается с образованием очень плотных стенок частиц порошка.
Высвобождение IgY к Fel D1 из этих различных частиц оценивали путем диспергирования порошка в солевом растворе при 37 °C для имитации условий ротовой полости. На фиг. 8 показано высвобождение IgY к Fel D1 из различных структур гидрогеля: (I) куски влажного геля, (II) частицы распылительной сушки, (III) влажные гранулы гидрогеля и (IV) сухие гранулы гидрогеля.
Высвобождение IgY к Fel D1 из контрольного образца (желированный кусок 10 мас.% желатина) показано на фиг. 8. Сначала при погружении куска геля в холодный солевой раствор практически отсутствовали IgY к Fel D1, что свидетельствует о высокой эффективности инкапсуляции IgY (> 98%). После погружения в физиологический раствор при 37°C наблюдается быстрое увеличение количества высвобожденных IgY к Fel D1 с достижением 80% через 5 минут и 100% через 15 минут. Такое быстрое высвобождение было ожидаемым, так как 10 мас.% желатиновые гели растапливаются при температурах выше 25–30°C.
Аналогичным образом мелкие влажные желатиновые гранулы быстро высвобождали IgY к Fel D1 при погружении в солевой раствор с температурой 37°C, высвобождая 100% IgY в течение 15 минут, опять же из-за растапливания гидрогеля (фиг. 8). Однако при высушивании влажных гранул высвобождение IgY к Fel D1 значительно замедлялось: через 15 минут высвобождалось только 33,5% IgY; через 30 минут высвобождалось 75% IgY; а через 60 минут высвобождалось 100% IgY (фиг. 8).
В противоположность этому прямая сушка желатиновых растворов с помощью распылительной сушки не приводила к замедлению высвобождения IgY. После погружения желатиновых порошков распылительной сушки в солевой раствор с температурой 37°C через 5 минут высвобождалось 50% IgY, а через 15 минут высвобождалось 100% (фиг. 8).
Существует значительное различие в скорости высвобождения IgY из порошков распылительной сушки по сравнению с гранулами, которые были высушены после гелеобразования. Это различие в высвобождении IgY, вероятно, связано с различиями в структуре стенок порошка, которую создают с помощью двух методов. Распылительная сушка приводила к получению капсул с очень тонкой структурой стенок, в которой относительно большая площадь поверхности будет подвержена воздействию солевого раствора. В противоположность этому сушка растворов желатина после гелеобразования приводила к созданию частиц порошка, которые имели толстую плотную структуру стенок с гораздо меньшей относительной площадью поверхности, подвергаемой воздействию солевого раствора. Вероятно, меньшее соотношение площади поверхности к объему и более толстая/плотная структура стенок порошка обуславливают гораздо более медленное растворение частиц порошка, что приводит к более медленному высвобождению IgY к Fel D1.
Влияние различных способов сушки на высвобождение IgY к Fel D1 из гидрогелей также исследовали с использованием сложных гидрогелей, состоящих из желатина и каррагинана. Исходный раствор состоял из 10 мас.% желатина (тип А, прочность студня по Блюму 280), 1 мас.% каппа-каррагинана и 2 мас.% экстракта яичного желтка. Влияние сушки сложных гелевых систем оценивали с использованием (i) распылительной сушки и (ii) капания с последующей сушкой в псевдоожиженном слое.
На фиг. 9A показан внешний вид системы желатин / каппа-каррагинан после ее распылительной сушки. Высушенный распылительной сушкой порошок желатина/каппа-каррагинана состоял из полых мелких частиц с тонкими стенками. Кроме того, в структурах присутствовали агрегаты, которые, как было обнаружено, представляют собой наборы мелких отдельных частиц порошков, соединенных вместе нитями раствора (фиг. 9B). Такая структура возникает из-за высокой вискоэластичности исходного раствора, содержащего 10 мас.% желатина, 1 мас.% раствора каппа-каррагинана. Растворы с высокой вискоэластичностью сложно распылять, поскольку мостик текучей среды между двумя разделяющими каплями замедляет разрушение капель, что приводит к образованию цепочек. Эти цепочки могут образовывать волокна или агрегаты, взаимодействуя друг с другом или с каплями в распылительной башне. В частности, это происходило при использовании для атомизации раствора вращающегося диска.
На фиг. 10A и 10B, соответственно, показан внешний вид влажных желатиновых/каппа-каррагинановых сложных гранул и гранул сухого сложного геля желатина/каппа-каррагинана, полученных путем капания исходного раствора в 100 мМ KCl. Процесс желирования гранул с последующей их сушкой создает частицы порошка, которые имеют толстую и очень плотную структуру стенок порошка (фиг. 10C). Большинство частиц порошка имеют внутри себя множество воздушных карманов, предположительно в результате уменьшения объема, вызванного удалением воды. Эксперименты по сублимации (не показаны), проводимые с использованием системы, похожей на ту, что содержит только желатин, показали, что сложные гели имеют схожую структуру влажных гранул по сравнению с системами, содержащими только желатин.
На фиг. 11A представлены профили высвобождения IgY к Fel D1 из порошков распылительной сушки сложного геля, содержащего 10 мас.% желатина и 1 мас.% каппа-каррагинана. Порошок распылительной сушки сложного геля, содержащего желатин/каррагинан, высвобождает 10% IgY при помещении в холодный солевой раствор, что указывает на высокую эффективность инкапсуляции IgY (~ 90%). Однако при помещении порошка сложного геля в солевой раствор с температурой 37 °C происходило быстрое высвобождение IgY: 30% IgY высвобождалось через 5 минут, 90% — через 15 минут, а 100% — через 30 минут. Данная скорость высвобождения сопоставима с капсулами, содержащими только желатин, и указывает на отсутствие влияния имеющегося каппа-каррагинана на высвобождение IgY.
На фиг. 11A также представлены профили высвобождения IgY из гранул сложного геля, содержащего 10 мас.% желатина и 1 мас.% каппа-каррагинана, во влажном и сухом вариантах. Как влажные, так и сухие гранулы демонстрируют высокую эффективность инкапсуляции IgY, высвобождая < 2 мас.% IgY при диспергировании гранул в холодном солевом растворе (4°C). При погружении влажных гранул в солевой раствор с температурой 37°C происходит быстрое высвобождение IgY: приблизительно 50% IgY высвобождается через 5 минут, а 100% высвобождается через 15 минут. Высушенные гранулы сложного геля показывают более медленное высвобождение IgY по сравнению с влажными гранулами сложного геля. При помещении гранул сложного геля в солевой раствор с температурой 37°C высвобождение IgY происходит медленно: через 5 минут высвобождается 17% IgY, через 15 минут высвобождение увеличивается до 40% и до 67% через 30 минут, при этом для полного высвобождения IgY требуется около 60 минут.
Желирование раствора сложного геля перед сушкой приводит к значительному замедлению скорости высвобождения IgY (приблизительно в 2,75 раза). Однако скорость высвобождения IgY высушенных гранул сложного геля сопоставима с таковой высушенных желатиновых гранул (фиг. 11B). Это указывает на отсутствие дополнительного замедления высвобождения IgY при наличии каппа-каррагинана. Этот результат отличается от результатов более ранней работы с использованием влажных гелей, в которой было показано, что скорость высвобождения IgY из сложных гелей желатина/каррагинана в 10 раз меньше, чем из гидрогелей, содержащих только желатин (фиг. 11B). Отсутствие уменьшения скорости высвобождения IgY из высушенных сложных гелей по сравнению с высушенными гранулами желатинового геля (как в сухом, так и во влажном состоянии) указывает на ненадлежащее формирование каррагинанового геля. Эти гранулы формировались путем капания раствора сложного геля в раствор 100 мМ KCl, так как вязкость раствора была слишком высокой для капания. Исходные куски сложного геля создавали путем добавления KCl в раствор сложного геля до желирования. Из предыдущих экспериментов очевидно, что удаление KCl из раствора сложного геля может быть одной из ключевых причин отсутствия замедления высвобождения IgY при наличии каррагинана в сложном геле.
Итак, тип сушки, используемый для создания гидрогелевых порошков, может оказывать значительное влияние на скорость высвобождения IgY из микрокапсул гидрогеля. Обнаружено, что желирование состава гидрогеля перед сушкой позволяет получить микрокапсулы с более толстыми и более плотными структурами стенок. Полученные «высушенные после желирования» микрокапсулы имели скорость высвобождения IgY в 2,75 раза меньше, чем высушенные распылительной сушкой микрокапсулы. Отсутствовали различия между скоростью высвобождения IgY у простых желатиновых микрокапсул и сложных гелей желатина/каппа-каррагинана. В случае влажных гидрогелей высвобождение IgY из сложных гелей желатина/каппа-каррагинана происходило в 10 раз медленнее, чем из гелей, содержащих только желатин.
Пример 2
Второй эксперимент проводили для исследования способа капания, описанного в настоящем документе, в котором используют гелеобразующую ванну, и способ экструзии, описанный в настоящем документе, в котором не используют гелеобразующую ванну. Использовали IgY к Fel D1 в геле сополимера желатина и каррагинана.
Носитель для пероральной доставки должен иметь высокое содержание активной молекулы. Типичные потери активной молекулы возникают из-за низкой эффективности инкапсуляции и денатурации IgY во время обработки/производства. Результаты способа капания и способа экструзии в отношении эффективности денатурации и инкапсуляции показаны на фиг. 12. В отношении денатурации IgY к Fel D1 от 20 до 60% IgY было потеряно в процессе производства капельным способом, и от 0 до 15% IgY было потеряно в процессе производства экструзионным способом. В отношении инкапсуляции IgY к Fel D1 около 20% IgY было потеряно в ванной на стадии желирования капельного способа, и менее 1% IgY было потеряно при применении экструзионного способа.
Носитель для пероральной доставки должен также обеспечивать контролируемое высвобождение активной молекулы; высвобождение IgY к Fel D1 в полости рта кошки происходит путем растворения. Высвобождение IgY к Fel D1 соответственно исследовали в имитации слюны при 37°C. Как показано на фиг. 13, IgY к Fel D1 в яичном порошке высвобождались быстро: 100% высвобождалось менее чем за 5 минут (контроль 1), а высвобождение IgY к Fel D1, инкапсулированных только в желатин, было также быстрым: 90% менее чем за 5 минут (контроль 2). Гель сополимера желатина и каррагинана позволял скорректировать время 100%-го высвобождения с 30 до 90 минут при использовании капельного способа и позволял скорректировать время 100%-го высвобождения с 30 до 60 минут при использовании экструзионного способа.
Носитель для пероральной доставки должен также иметь адгезию к полости рта, поскольку для замедленного высвобождения IgY к Fel D1 в полости рта кошки требуется сохранение IgY в полости рта в течение некоторого времени. Таким образом, мукоадгезивные частицы представляют собой преимущественный вариант, так как они могут прикрепляться к слюнной пленке. Адгезию к полости рта частиц, полученных экструзионным способом, сравнивали со свободными IgY путем исследования взаимодействия с человеческой слюнной пленкой при температуре около 37°C, в частности путем измерения адсорбции на слюнной пленке при температуре 36,8°C. Результаты представлены на фиг. 14. Свободные IgY не взаимодействовали со слюнной пленкой, но для частиц, полученных путем экструзии сложного геля, наблюдалось умеренное увеличение взаимодействия со слюнной пленкой, четкое отложение частиц на пленке (∆ массы в период D).
Пример 3
Для дополнительного исследования с использованием инкапсуляции для увеличения продолжительности пребывания IgY к Fel D1 в полости рта проводили третий эксперимент. На фиг. 15 представлен график, на котором показана концентрация IgY к Fel D1 в слюне кошек после кормления 1 г или 2 г яичного желтка, содержащего IgY к Fel D1, в составе влажной или сухой еды. Менее 5% IgY к Fel D1 было обнаружено во рту кошки, оставшуюся часть кошка быстро проглотила.
Адгезию к полости рта частиц, полученных способом управляемой распылительной сушки, сравнивали со свободными IgY путем исследования взаимодействия с человеческой слюнной пленкой при температуре около 37°C, в частности путем измерения адсорбции на слюнной пленке при температуре 36,8°C. Результаты представлены на фиг. 16. Свободные IgY не взаимодействовали со слюнной пленкой, но для частиц, полученных способом управляемой распылительной сушки, наблюдалось значительное увеличение взаимодействия со слюнной пленкой, четкое отложение частиц на пленке (∆ массы в период D).
Пример 4
Проводили четвертый эксперимент, в ходе которого дополнительно анализировали высушенную распылением смесь желатин / IgY. Не ограничиваясь какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что мукоадгезия высушенной распылением смеси желатин / IgY обусловлена пористой структурой порошка, которая обеспечивает некоторую первоначальную гидратацию, что создает мукоадгезивные взаимодействия посредством комбинации i) электростатических взаимодействий (положительный заряд на желатине) и гидратации / конкуренции за воду (т.е. частицы являются липкими). Хотя стекловидный сложный гель из желатина и каррагинана по-прежнему остается эффективным, он может иметь более низкую адгезию к полости рта из-за гораздо более медленной гидратации.
Если частица может быть изготовлена с возможностью прилипания к поверхности полости рта, продолжительность пребывания в полости рта можно дополнительно повышать путем регулирования скорости растворения. Порошки, полученные капельным или экструзионным способами, описанными в настоящем документе, регулируют растворение за счет пористости порошка и контролируемой разборки каррагинановых гелей. В полученной распылительной сушкой смеси желатин / IgY используют пористые желатиновые порошки, которые относительно быстро растворяются in vitro, при этом основное внимание уделяется повышение адгезии к полости рта. Однако неофициальные данные, полученные в ходе клинических исследований, свидетельствуют о более медленном по сравнению с наблюдаемым in vitro растворении in vivo, и это может быть полезным.
Хорошо известно, что создание порошка из желатина может быть сложным. Основная техническая проблема заключается в ограничении разрыва капель во время распыления в сушилке за счет вискоэластичных свойств желатиновых растворов. При слишком высокой вязкости раствора или при слишком быстром распылении раствор создает нитевидные структуры, а не частицы порошка. Это приводит к получению «рыхлого» порошка, который имеет низкую плотность. Низкая плотность порошка создает проблемы при манипуляциях с порошком или при попытке его нанесения на продукт в качестве покрытия, а также ухудшает стабильность порошка.
Как показано на фиг. 17, для преодоления проблем, связанных с рыхлыми желатиновыми порошками с низкой плотностью, авторы настоящего изобретения обнаружили три фактора, которые могут повысить плотность: (1) концентрация желатина — концентрации желатина выше 16% приводят к созданию сильно нитевидных порошков, которые в связи с этим не могут быть высушены распылительной сушкой (таблица 1, серия TJW 040, сравнение ii); (2) молекулярная масса желатина (прочность студня по Блюму) — переход на желатин с меньшей молекулярной массой (прочность студня по Блюму 100, а не 280) уменьшает образование нитей, повышая плотность порошка (таблица 1, сравнение i); и (3) комбинирование с другими белками/молекулами — увеличение количества активного компонента / эксципиента уменьшает образование нитей, увеличивая плотность порошка (таблица 1 — серия TJW 040, сравнение ii).
3
3
3
Используя эти стратегии, плотность порошка можно повышать с непригодного для использования уровня (0,1–0,15 г/см, образец TJW 020A) до значения (0,265–0,3 г/см, порошки TJW 050 A и 106), приближающегося к плотности присутствующего на рынке молочного порошка из изолята сывороточного белка (WPI) (0,43 г/см).
Пример 5
max
Проводили пятый эксперимент с оцениванием влияния инкапсуляции на продолжительность нахождения IgY в полости рта. Двенадцать человек получали два порошка [(i) контроль IgY — обезжиренный порошок яичного желтка и ii) обезжиренный порошок яичного желтка, инкапсулированный в желатин (тип А, прочность студня по Блюму 100)] в рамках рандомизированного перекрестного исследования (фиг. 18), и их просили разжевывать порошок в течение 30 секунд, а затем проглатывать его. Состав и доза двух исследуемых образцов приведены на фиг. 19. Продолжительность нахождения IgY в полости рта оценивали путем измерения концентрации IgY в слюне на исходном уровне и в различные моменты времени согласно схеме клинического исследования, показанной на фиг. 18. Продолжительность нахождения в полости рта оценивали посредством следующих параметров: максимальная концентрация (С) и площадь под кривой (AUC).
-1
-1
-1
-1
-1
На фиг. 20i показано среднее изменение во времени концентрации IgY (нг*мл) в слюне участников для контрольных IgY и IgY, инкапсулированных в высушенном распылительной сушкой желатине. После потребления контрольных IgY концентрация IgY достигала максимального значения (206 645 ± 71 911 нг*мл) через 5 минут (первая временная отметка). После этого концентрация IgY в слюне подвергалась экспоненциальному снижению до 21 502 ± 6095 нг*мл через 15 минут, 3224 ± 905 нг*мл через 30 минут, 1329 ± 480 нг*мл через 60 минут, достигая плато 200–300 мкг*мл-1 через два часа после потребления контрольных IgY (обезжиренный порошок яичного желтка). Среднее общее количество IgY, обнаруженное в полости рта человека, составляло от 1,95 мг (одиночная интеграция) до 3–3,5 мг (двойная экспоненциальная ФК интеграция). Среднее количество IgY, обнаруженное в полости рта человека, составляло от 1,6 до 2,8% исходного введенного количества (~ 123 мг).
max
max
1
-1
-1
-1
-1
На фиг. 20ii также показано влияние инкапсуляции на концентрацию IgY в слюне человека. C высушенных распылительной сушкой IgY составляла 871 000 нг*мл через 5 минут, что в 4,2 раза превышало значение контрольных IgY (p < 0,001). После этого концентрацию IgY в слюне подвергали экспоненциальному снижению до 81 500 нг*мл через 15 минут, 10 200 нг*мл через 30 минут, 980 нг*мл через 60 минут, достигая плато 400–500 нг*мл через два часа после потребления контрольных IgY (обезжиренный порошок яичного желтка). Концентрация IgY в слюне после потребления высушенных распылительной сушкой инкапсулированных IgY была в 4 раза выше по сравнению с контрольными IgY в течение первых 30 минут (p < 0,05). Хотя концентрации IgY в слюне высушенных распылением инкапсулированных IgY и контрольных IgY были одинаковыми через 60 минут после приема внутрь, концентрация в слюне высушенных распылением инкапсулированных IgY была в два раза выше по сравнению с контролем через 90 и 120 минут (p < 0,15). Общее количество IgY, обнаруженное в случае высушенных распылительной сушкой инкапсулированных IgY, составляло от 7,8 (трапециевидная интеграция) до 13,2 (двойная экспоненциальная ФК интеграция) мг IgY, что эквивалентно 6,4–10,7% введенной дозы. Эти результаты демонстрируют повышение эффективности за счет инкапсуляции IgY в мукоадгезивный желатин с использованием распылительной сушки (как C, так и AUC) IgY в 4 раза (p < 0,001).
Следует понимать, что специалистам в данной области будут очевидны различные изменения и модификации настоящих вариантов осуществления, описанных в данном документе. Такие изменения и модификации можно вносить без отступления от сущности и объема объекта настоящего изобретения и без уменьшения его предполагаемых преимуществ. Следовательно, предполагается, что прилагаемая формула изобретения охватывает такие изменения и модификации.