Каталитическая рнк: лекарство из добиологической жизни

С. АЛЬТМАН

Каталитическая РНК:

лекарство из добиологической жизни

Основная идея концепции «мира РНК», появившейся в 1960-х гг., проста: на ранних стадиях предбиологической эволюции репликаторы, т. е. некие объекты, способные размножаться и конкурировать за ограниченные ресурсы, представляли собой отдельные молекулы РНК. Белки и ДНК появились позднее и стали всего лишь дополнением, хотя и очень важным, к общей схеме потока генетической информации, облегчив его и сделав более эффективным. Эта концепция, поначалу граничившая с фантастикой, с 1980-х начала находить все больше и больше подтверждений в исследованиях свойств РНК как катализатора и как хранилища генетической информации, и сейчас прочно заняла свое место в мировой биологии. Новосибирский Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, давно занимающийся фундаментальными и прикладными исследованиями разных видов РНК, в 2013 г. получил Грант Правительства РФ для продолжения и развития этих работ под руководством профессора Йельского университета С. Альтмана, получившего Нобелевскую премию за открытие каталитических свойств РНК

Сегодня мы можем наблюдать реликты, дожившие до нас с загадочных времен предбиологической эволюции - молекулы РНК, занятые не обычной передачей генетической информацию от ДНК к белку, но совершенно другими вещами, важнейшими для жизнедеятельности организма. Само существование множества регуляторных, каталитических, адапторных и структурных РНК показывают, каким образом могла быть когда-то организована самая ранняя, еще добиологическая жизнь.

Один из таких реликтов за последние сорок лет прошел путь от экзотического биохимического курьеза до возможной «панацеи» от всех болезней. Эта история показывает, как, казалось бы, в исключительно фундаментальных исследованиях может внезапно родиться новая идея, потенциально способная преобразить важнейшую область человеческой деятельности -медицину. В нашем случае этим объектом является РНКаза P - фермент, вовлеченный в посттранскрипционные (т. е. после считывания с ДНК) модификации РНК.

АЛЬТМАН Сидней - Стерлингский профессор молекулярной и клеточной биологии и биологии развития Йельского университета, профессор химии Йельского университета (США), заведующий российско-американской лабораторией биомедицинской химии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Лауреат Нобелевской премии по химии (1989), полученной совместно с Т. Чехом «за открытие каталитических свойств РНК»

79

Про РНК «для чайников»

В соответствии с центральной догмой молекулярной биологии «текст» наследственной информации, написанный буквами-нуклеотидами РНК (например, ...AAAUUUCGAUC...), в процессе трансляции переводится в другой текст, записанный буквами-аминокислотами. Трансляцией, т. е. синтезом белков на матрице кодирующей РНК, занимаются рибосомы - специальные клеточные макромолекулярные машины по производству белка. Функционирование рибосом невозможно без еще двух классов РНК, уже некодирующих: рибосомной РНК (рРНК) и транспортной РНК (тРНК).

Ключевые слова: рибозимы, мир РНК, РНКаза P, антибиотики, лекарственная устойчивость.

Key words: ribozymes, RNA world,

RNase P, antibiotics, drug resistance

МЕГАГРАНТЫ

Рибосомы кишечной палочки (бактерии Escherichia coli), «рабочей лошадки» молекулярной биологии, содержат три разные молекулы рРНК, а у нас с вами - четыре. Чтобы жизнь не казалась биологам медом, каждая из этих рРНК у E. coli кодируется семью разными генами, которые очень схожи друг с другом; ситуация у человека примерно такая же.

Если же взглянуть на тРНК, то здесь все еще сложнее: у кишечной палочки насчитывается 86 генов, кодирующих тРНК для 20 стандартных аминокислот, но бактерий оставляет далеко позади человек со своими 497 ядерными и 22 митохондриальными транспортными РНК. Разумеется, такого количества разных тРНК более чем достаточно для кодирования 20 аминокислот или даже 61 триплета-антикодона. Известно, что некоторые из различий между молекулами тРНК, содержащими один и тот же триплет, имеют функциональное значение, и клетка использует какой-то конкретный вид тРНК в зависимости от обстоятельств.

Структуру тРНК часто изображают в виде «клеверного листа». На самом деле удивительно, что такая относительно короткая цепочка (большинство тРНК имеют в длину от 75 до 95 нуклеотидов) способна сворачиваться в структуру, содержащую четыре ветви -«стебель» и три петли. На одной из петель расположен антикодон - участок из трех нуклеотидов, узнающий кодон, кодирующий определенную аминокислоту, в матричной РНК.

Помимо основных петель, тРНК содержит и так называемую вариабельную петлю, длина которой служит основным признаком, по которому тРНК делят на две группы: у тРНК класса I она короткая (3—5 нуклеотидов), а у класса II может быть даже длиннее основных петель. Акцепторный стебель содержит короткий одноцепочечный участок на З’-конце (обычно 4 нуклеотида длиной), заканчивающийся последовательностью ...CCA, которая способна ковалентно присоединять аминокислоту с образованием аминоацил-тРНК, основного «кирпичика» белкового синтеза.

Но такая привычная всем картинка с клеверным листом является лишь схемой: истинная пространственная структура тРНК совершенно другая и напоминает скорее букву Г размерами ~6х6 нм, в которой антикодон и З’-конец акцепторного стебля разнесены на максимально большое расстояние друг от друга.

«Неразборчивый» рибозим

Обычно тРНК синтезируется в виде длинной молекулы-предшественника (например, у бактерий несколько рядом стоящих генов обычно «считываются» вместе одной молекулой РНК). Поэтому в ходе своего созревания тРНК вырезается из более длинных транскриптов. Этот процесс осуществляет фермент РНКаза E, однако при этом на 5’- и 3’-концах предшественника тРНК

остается несколько лишних нуклеотидов, и для их удаления требуется действие других, специфичных нуклеаз.

Один из таких ферментов, РНКаза P, занимается тем, что удаляет нуклеотиды с 5’-конца предшественника тРНК. Эта нуклеаза стала главным объектом работ в моей лаборатории с начала 1970-х гг., когда мы открыли, что тРНК синтезируется из РНК-предшественника. Но, безусловно, самое главное и неожиданное наше открытие, касающееся этой нуклеазы, опубликованное в 1983 г. в журнале Cell, заключалось в обнаружении каталитических свойств входящей в ее состав молекулы РНК. Другими словами, фермент оказался не белком, а РНК - сейчас такие катализаторы называются ри-бозимами.

На самом деле РНК в РНКазе P никогда не работает сама по себе. Она может катализировать реакцию в пробирке, но во всех живых организмах она находится в комплексе как минимум с одним белком, а у высших организмов (эукариот) число последних достигает десяти. Хотя РНК даже и при удалении белков сохраняет частично каталитическую активность, она не может работать в клетках, полностью лишенных одного из белковых компонентов РНКазы P. Однако достаточно логично предположить, что все известные сегодня РНКазы P произошли от предшественника, содержавшего только РНК, когда бы этот «предок» ни существовал: в самые ранние эволюционные времена «мира РНК» или позже, когда конвейер белкового синтеза стал приобретать современный вид.

Наши исследования механизма действия РНКазы P позволили установить минимальные требования к ее субстрату. Как должна выглядеть молекула РНК, чтобы ее мог узнавать и расщеплять этот рибозим?

Поразительно, но структура в виде клеверного листа для этого совершенно не требуется. РНКаза P эффективно расщепляет любую РНК, которая напоминает стебель тРНК, т. е. является частично двуцепочечной со свободным одноцепочечным З’-концом ...RCCA (где R - остаток аденина либо гуанина). РНКаза P расщепляет такие субстраты с 5’-конца в том месте, где кончается двуцепочечная ДНК и начинается одноцепочечный «хвост». Даже если взять в качестве мишени одну РНК с любой последовательностью, а другую - комплементарную ей - снабдить .RCCA-хвостиком (так называемая внешняя направляющая последовательность), то мишень все равно будет расщеплена.

Причины такой «неразборчивости» ясно следуют из строения РНКазы P, которое было расшифровано методом рентгеноструктурного анализа. Рибозим связывает субстрат в основном за счет соответствия своей структуры форме субстрата, а специфичные комплементарные связи образуются лишь в области 3’-конца, где расположен неизменный «хвостик». Более того, можно использовать даже химически

L

Фермент РНКаза P (вверху) во всех живых организмах находится в комплексе как минимум с одним белком. Бактериальный фермент помимо каталитической РНК содержит только один белок (RnpA).

У архей - одноклеточных прокариот, которые по некоторым генам и метаболическим путям стоят ближе к эукариотам, чем к бактериям, -для образования РНКазы P ее РНК связывается с 4—5 белками, ни один из которых не похож на RnpA. У эукариот с каталитической РНК связано до десяти белков, ряд из которых гомологичен белкам архей, а другие являются уникальными для эукариот

измененную направляющую РНК, лишь бы только она содержала последовательности, требуемые для распознавания.

Против

лекарственной

устойчивости

Объяснение субстратной специфичности РНКазы P стало отправной точкой для дальнейших поисков. Раз мы можем при помощи РНКазы P расщепить практически любую РНК, почему бы не превратить ее в инструмент для разрушения нежелательных РНК? Если бы мы могли, например, ввести внешнюю направляющую РНК в клетки патогенных бактерий, их собственная РНКаза P разрушила бы комплементарную им клеточную РНК-мишень, потеря которой была бы для бактерии летальна.

Нужное ли это дело? Широкое неконтролируемое использование антибиотиков привело к росту встречаемости микробов с лекарственной устойчивостью. Одна из главных причин ее появления в том, что бактерии легко обмениваются кусками

Предковая форма из «мира РНК»

Археи

Эукариоты

(Л) рнк

в

Бактериальный белок

А Гомологичные белки архей V и эукариот

Белки эукариот

РНКаза P

5'

\

RCCA 3'

- Акцепторный стебель

5'

AUG

РНКаза P

RCCA 3'

Антикодоновая

петля

тРНК-предшественник

3'

мРНК-мишень

Направляющая

последовательность

5'

Фермент РНКаза P занимается удалением нуклеотидов с 5’-конца предшественника тРНК, находящихся рядом с 3’-«хвостиком». Однако оказалось, что для ее работы не требуется структура «клеверного листа», в которой обычно представляют тРНК. РНКаза P эффективно расщепляет любую РнК, которая напоминает «стебель» тРНК, т. е. частично двуцепочечную, со свободным одноцепочечным 3’-концом. Фермент расщепляет такие субстраты с 5’-стороны в месте, где кончается двуцепочечная ДНК и начинается одноцепочечный хвост

генетического материала (плазмидами), которые зачастую несут гены устойчивости к антибиотикам. Так что если подобная плазмида появляется в популяции каких-то бактерий или даже в микробной экосистеме, состоящей из разных видов, то очень скоро все ее члены становятся ее носителями в случае, если в окружающей среде присутствует соответствующий антибиотик. Все другие бактериальные клетки просто вымрут.

Нужно уточнить, что лекарственная устойчивость может развиваться и по другим причинам, связанным с мутацией белка-мишени в лекарстве, с производством клетками слишком большого количества белка-мишени, а также с активацией генов, ответственных за выведение лекарства из организма. В целом же масштаб проблемы лекарственной устойчивости и связанных с ней рисков огромен. Например, сегодня во всем мире наблюдаются формы туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, нечувствительные к противотуберкулезным антибиотикам первой линии (изониазиду и рифампицину) и ответственные за 4 % новых случаев и 20 % рецидивов заболевания. Если же туберкулезные бактерии выработали еще и устойчивость к хинолоновым антибиотикам и средствам второй линии - канамицину и др., то они вызывают заболевание с экстремальной лекарственной устойчивостью. И такие случаи в мире насчитываются десятками тысяч ежегодно. Добавим, что в Индии, Иране и Италии уже наблюдаются случаи туберкулеза с тотальной лекарственной устойчивостью, которые в принципе не поддаются никаким современным антибиотикам.

Ситуацию не улучшает и тот факт, что разработка нового антибиотика стоит миллионы долларов, и фармацевтические компании не выстраиваются в очередь,

чтобы потратить эти миллионы на создание недорогих лекарств для узкой группы потребителей. Пациенты же, которые, не раздумывая, потратили бы десятки тысяч долларов за курс химиотерапии при раке, продлевающий жизнь на несколько месяцев, неохотно платят сотню долларов за лечение инфекции.

Точное попадание

Осознав терапевтический потенциал внешних направляющих последовательностей РНКазы P, мы стали искать способ эффективно доставлять их в клетки бактерий. Для этого направляющие последовательности соединили с особыми пептидами (короткими белковыми фрагментами), которые могли проделывать дыру в клеточной стенке бактерий либо активно транспортироваться в клетку. Направляющая последовательность в этом случае играет роль своеобразного «пассажира».

Другим важным решением стал выбор химических свойств направляющих последовательностей: мы использовали не обычные РНК или ДНК, а так называемые морфолиновые олигонуклеотиды, в которых вместо углеводного остатка рибозы или дезоксирибозы стоит гетероциклическая морфолиновая группа. Такие конструкции более стабильны в клетках и образуют более тесные комплексы с РНК-мишенями.

В качестве мишени мы использовали бактериальную мРНК, транскрибируемую с гена gyrA, который кодирует фермент ДНК-гиразу, необходимый для репликации бактерий. Инактивация ДНК-гиразы смертельна для бактериальных клеток. Поэтому гираза - известная мишень для таких важных групп антибиотиков, как

I

фторхинолоны (например, популярный в последнее время антибиотик ципрофлоксацин) и аминокумари-ны.

Ген gyrA настолько консервативен, что оказалось возможным создать направляющую последовательность, общую для целого ряда патогенов. В нашей лаборатории бактерицидные свойства направляющих последовательностей были исследованы на нескольких видах бактерий, которые либо сами патогенны, либо являются моделью опасных бактерий. В большинстве случаев при применении нашего препарата выживало менее 1 % бактерий, хотя нужно признать, что концентрация препарата была при этом достаточно высока по сравнению с рабочими концентрациями привычных антибиотиков.

Воодушевившись первым успехом, мы обратили внимание на другую болезнь - малярию. Один из возбудителей малярии, Plasmodium falciparum, относится не к бактериям, а к одноклеточным эукариотам. Однако в клинических изолятах этого паразита также наблюдается устойчивость ко многим противомалярийным препаратам. Когда мы разработали направляющую последовательность для направленного расщепления мРНК, кодирующей ДНК-гиразу плазмодия, и ввели ее в зараженные эритроциты, то паразит прекратил расти. Однако он чувствовал себя прекрасно, если мы вводили направляющие последовательности, разработанные для бактериального гена gyrA, т. е. в этом случае специфично разрушалась именно целевая мРНК P. falciparum.

Многие лекарства с несчастливой судьбой кончают свою карьеру в тот момент, когда, несмотря на многообещающие предварительные результаты, не показывают активности в условиях живого организма. Поэтому на следующем этапе мы опробовали свой подход в ситуации, более приближенной к реальности, - на гнойных ранах.

Разумеется, ради науки страдали не люди, а лабораторные мыши, которым в область спины делали укол, а в получившуюся ранку вносили суспензию золотистого стафилококка - частого возбудителя кожных инфекций человека. На следующий день рану покрывали специальным гелем, содержащим морфолиновый олигонуклеотид, направленный на мРНК бактериального гена gyr, ранее прекрасно зарекомендовавший себя на чувствительных и устойчивых к антибиотикам штаммах; контролем служила либо неспецифичная последовательность, либо обычный физиологический раствор. Оказалось, что раны заживали значительно быстрее у мышей, пролеченных активным морфолино-вым олигонуклеотидом, по сравнению с контрольными группами. Судя по данным микроскопии, лечение приводило к лучшей регенерации эпителия и зрелого коллагенового слоя. Более того, в ранах таких мышей численность бактерий была также намного меньше. Таким образом, строгий тест на активность в организ-

ме млекопитающих был пройден - по крайней мере, на мышах.

тратегия лечения, основанная на действии рибозима РНКазы P, обещает человечеству победу в гонке, которая до сих пор считалась проигранной: между новыми лекарствами и устойчивостью к ним, которую приобретают бактерии. Ведь когда разработка нового препарата стоит 100 млн долларов, а путь от идеи до аптечной полки занимает 10 лет, а бактерии за один-два года становятся совершенно к нему устойчивы, то гадать о победителе не приходится.

Препараты, способные целенаправленно расщеплять бактериальную РНК, могут кардинально изменить эту ситуацию. После подтверждения безопасности и эффективности этой группы соединений, например, морфолиновых олигонуклеотидов, соединенных с определенным пептидом, способным проникать в клетку, можно достаточно свободно варьировать направляющую последовательность, нацеливая ее на различные жизненно важные гены болезнетворного микроорганизма. Или даже комбинировать мишени, что делает появление лекарственной устойчивости практически невозможным. Наконец и для фармакологии это, скорее, исключение, чем правило - один и тот же тип лекарств может действовать как на бактерий, простейшие и грибки, так, возможно, даже на вирусы и определенные типы раковых клеток. Для этого достаточно лишь найти способ доставки препарата в нужное место.

Почему же врачи до сих пор при лечении инфекций полагаются на ампициллин, хлорохин и прочий арсенал многолетней давности? Ответ лежит в основном в экономической плоскости. Морфолиновые (да и любые другие) нацеливающие последовательности действительно дороже традиционных антибиотиков, массовое производство которых налажено, и фармацевтические компании боятся того, что пациенты и врачи будут предпочитать продолжать использовать старые лекарства. Однако разница в цене не столь велика: одна доза может стоить на 2-3 доллара дороже, чем доза обычного антибиотика. Терапия на основе нацеливающих последовательностей РНКазы P эффективна и сопряжена с меньшими побочными эффектами. На наш взгляд, пришло время объединить усилия ученых, врачей, фармацевтических компаний и государства и вложиться в новую технологию, которая сулит огромную выгоду для всех.

Автор благодарит проф., д. б. н. Д. Жаркова

МЕГАГРАНТЫ

Приручение древней молекулы

РНК всегда были в центре внимания исследователей, а в новосибирском Институте химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ) - даже раньше, чем он стал институтом. Еще в 1960-х гг., когда будущий институт был всего лишь Отделом биохимии в составе Новосибирского института органической химии СО РАН, его руководитель Д. Г. Кнорре с коллегами сформулировал идею комплементарно адресованной модификации - «нацеливания» по принципу комплементарноети на молекулы РНК других, коротких, молекул нуклеиновых кислот (олигонуклеотидов), несущих химически активные группы.

Сотрудники ИХБФМ внесли большой вклад в изучение транспортной РНК и рибосом, в проверку гипотезы «мира РНК» и в создание новых методов химического синтеза молекул РНК. Не обошли вниманием в институте и каталитические РНК - рибозимы. Поэтому предложение создать в составе института лабораторию под руководством нобелевского лауреата, открывшего каталитические свойства РНК, возникло совершенно естественно и было поддержано Министерством образования и науки, выделившим для этого один из своих немногочисленных и крайне престижных мегагрантов

ВЛАСОВ Валентин Викторович -академик РАН, председатель /Объединенного ученого совета { СО РАН по биологическим наукам, l" директор Института химической : биологии и фундаментальной '  медицины СО РАН (Новосибирск), заведующий кафедрой молекулярной биологии Новосибирского государственного университета. Лауреат государственной премии РФ |(1999). Автор и соавтор более 460 научных работ и 29 патентов

ЖАРКОВ Дмитрий Олегович -доктор биологических наук, заведующий группой взаимодействий биополимеров Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск).

В течение восьми лет работал в лаборатории А. Гроллмана (США). Автор и соавтор 80 научных работ

ПЫШНЫЙ Дмитрий Владимирович - доктор химических наук, заместитель директора по научной работе, заведующий лабораторией бионанотехнологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Автор и соавтор более 140 научных работ и 10 патентов

Ключевые слова: некодирующие РНК, комплементарно адресованная модификация, РНК-интерференция, стволовые клетки, геномное редактирование. Key words: non-coding RNA, targeted nucleic acid modification, RNA interference, stem Jcells, genome engineering

© В. В. Власов, Д. О. Жарков, Д. В. Пышный, 2014

В. В. ВЛАСОВ, Д. О. ЖАРКОВ, Д. В. ПЫШНЫЙ

начале было слово из трех букв. И слово это было - РНК...

Когда С. Альтман начал заниматься ферментом РНКазой P, которая в конце концов принесла ему Нобелевскую премию, в биологии бытовало совершенно однозначное мнение: все катализаторы в клетке - это белки. Мнение это было подкреплено Нобелевской премией (1946) американских биохимиков Д. Самнера, Д. Нортропа и У. Стэнли, ставшей эпохальным событием: американское трио доказало, что ферменты - это биологические катализаторы, т. е. представляют собой конкретные химические соединения. Тем самым была окончательно похоронена идея витализма, «жизненной силы», пронизывавшая всю биологию до XX в.

С тех пор белковая природа ферментов сомнению не подвергалась. Поэтому Альтман и его коллега Т Чех, открывший каталитическую роль РНК в удалении из самой себя некодирующих участков (интронов), приложили очень большие усилия, чтобы опубликовать свои результаты, которые не вписывались в тогдашнюю парадигму. Но настоящая наука тем и отличается, что даже самые невероятно выглядящие результаты быстро превращаются в общепризнанные факты, если их в состоянии воспроизвести другие ученые. Признание к Чеху и Альтману пришло очень быстро: их пионерные статьи появились в 1982 и 1983 гг., а премия нашла своих героев в 1989 г. - по нынешним временам, практически мгновенно.

Работа Альтмана и его коллег вызвала всплеск интереса к РНК. Еще одна несокрушимая парадигма тех времен - так называемая «центральная догма молекулярной биологии», гласила, что РНК (а именно матричная РНК, мРНК) служит переносчиком информации между ДНК и белком. Были хорошо известны и некодирующие РНК: рибосомная и транспортная, играющие главные роли в процессе трансляции - синтеза белка по матрице РНК.

На этом функции РНК в клетке считались исчерпанными. Впрочем, уже тогда были известны короткие ядерные РНК с неясными функциями, но вряд ли кто-нибудь в то время ожидал от РНК каких-то сюрпризов. Однако и сам создатель цетральной догмы биологии Ф. Крик, и некоторые другие известные ученые, занимавшиеся происхождением жизни (Л. Оргелл, К. Вёзе), высказывали идею, что когда-то, на заре жизни, РНК могла играть большую роль, чем сейчас. Но эти теории основывались на очень косвенных соображениях. Например, что многие ферменты-белки работают только в присутствии «помощников» - коферментов нуклеотидной природы, - которые, возможно, представляют собой «ископаемые останки» предковых форм всего живого.

Открытие ферментов-РНК (далее мы будем использовать общепринятый термин «рибозим») перевернуло

представление о том, что эта молекула может делать и чего не может. В 1986 г. еще один нобелевский лауреат У. Гилберт впервые произнес слова «мир РНК», подразумевая наш мир на самых ранних стадиях эволюции, когда не было еще ни ДНК, ни белков, и за «выживание» конкурировали между собой лишь самовоспроизводящиеся каталитические молекулы РНК.

С тех пор в пользу этой смелой гипотезы находятся все новые и новые подтверждения. Число известных рибозимов, как природных, так и искусственных, измеряется уже сотнями, а роль РНК проявляется во все новых и новых биологических системах. Забавный факт: в 1998 г. в Норвегии даже появилась рок-группа под названием «Ribozyme».

РНК тут, РНК там

И все же одного лишь открытия рибозимов было бы недостаточно, чтобы РНК из скромного промежуточного звена между главным хранителем генетической информации, ДНК, и главными исполнителями клеточных функций, белками, превратилась в центральный элемент, связующий воедино огромную долю процессов клеточной жизнедеятельности. В конце концов, по сравнению с белками число рибозимов очень мало, а функции их в природе ограничены. Но после работ Альтмана и Чеха РНК стала преподносить сюрпризы чуть ли не каждый год!

Какие же новые функции этой молекулы стали известны за пределами простой схемы Крика, в которой фигурировали только матричная, рибосомная и транспортная РНК? Начать можно, собственно, никуда от нее не уходя: оказывается, в такой сложной структуре, как рибосома (которая даже у бактерий состоит из трех цепей разных рРНК и нескольких десятков белков), главную реакцию - образование пептидной связи - катализируют не белки, а одна из молекул РНК!

Случаев, когда РНК выполняет каталитическую функцию, находясь в комплексе с белками, или организует сборку функционального РНК-белкового комплекса, сегодня известно очень много. Один из самых красивых и важных примеров такого комплекса - фермент тело-мераза, существование которого сначала «на кончике пера» предсказал советский ученый А. М. Оловников, а затем его открыли американские биологи Э. Блэкберн и К. Грейдер, удостоенные за это Нобелевской премии.

Как известно, у человека и всех эукариот хромосомы линейные, а синтез концов линейной ДНК представляет особую проблему: из-за особенностей механизма инициации синтеза ДНК каждый цикл клеточного деления теоретически должен сопровождаться утерей ее у самого конца. Однако особая структура концевых

МЕГАГРАНТЫ

последовательностей ДНК (теломер) позволяет обойти эту проблему.

Впервые репликация теломеров была исследована Блэкберн и Грейдер у инфузории Tetrahymena, у которой в ядре соматической клетки имеется много тысяч линейных минихромосом. Теломеры состоят из большого числа консервативных коротких гексамерных повторов: у человека - TTAGGG, у Tetrahymena - TTGGGG. В активно делящихся клетках присутствует специальный фермент для репликации концов ДНК - теломераза, которая у инфузории содержит небольшую молекулу РНК, а в этой РНК имеется последовательность AACCCCAAC.

Нетрудно увидеть, что эта последовательность комплементарна полному гексамерному повтору и еще его половине. Теломераза связывает конец ДНК, достраивает шесть нуклеотидов GGGTTG по матрице своей РНК, а затем сдвигается опять же на шесть нуклеотидов так, чтобы повторить весь цикл. В этом случае все ферментативные функции выполняет белковая часть теломеразы, а РНК используется только как матрица для синтеза.

Подобных функциональных рибонуклеопротеинов в клетке предостаточно. Процесс сплайсинга (удаления из мРНК интронов) выше уже упоминался в связи с открытием Чехом рибозимов. Любопытно, что он открыл рибозимы для сплайсинга в той же инфузории Tetrahymena, так что этот скромный организм прочно вписал себя в историю молекулярной биологии.

Так или иначе, но у большинства организмов, в том числе и человека, сплайсингом занимаются не рибо-зимы в чистом виде, а так называемые малые ядерные рибонуклеиновые частицы, представляющие собой комплексы РНК с белками, в которых РНК играет и структурную, и каталитическую роль. Или другой, достаточно неожиданный пример: оказывается, что белки, секретируемые клеткой, при синтезе пересекают мембрану эндоплазматической сети, а для этого они взаимодействуют с так называемой «частицей, узнающей сигнал» (SRP) - рибонуклеопротеином, состоящим из одной молекулы РНК и шести белков.

В начале 2000-х годов были открыты и так называемые рибосвитчи - РНК-переключатели биохимических процессов. Это участки молекул мРНК, которые сами ничего не кодируют, могут, связывая какую-то сигнальную молекулу в клетке, менять свою структуру и тем самым влиять на процесс транскрипции. Например, тиаминовый рибосвитч, открытый российскими учеными из Института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва), связывается с тиаминпирофосфатом - производным витамина В4, что снижает трансляцию мРНК генов, участвующих в синтезе витамина Br Раз этого витамина много, клетке можно не тратить силы на его производство.

Очень часто мы знаем, что в каком-то клеточном

процессе участвует некодирующая РНК, но не можем пока определить механизм, по которому этот процесс происходит. Например, во всех клетках женского организма одна из двух X-хромосом сконденсирована и практически не принимает участия в синтезе белков. Для такой конденсации необходима некодирующая РНК Xist, множество копий которой как бы покрывает одну из X-хромосом. Как именно РНК Xist связывается с хромосомой, какая хромосома выбирается - до сих пор не очень понятно. Кстати, в исследование функций этой РНК внесли большой вклад новосибирские ученые из лаборатории С. М. Закияна Института цитологии и генетики СО РАН.

А для того чтобы в клетке человека началась репликация - удвоение генома, нужна так называемая Y-РНК, которая связывается с точками начала репликации. Но что происходит дальше, пока остается тайной.

Наконец, некодирующие РНК часто выступают как регуляторы активности генов по принципу комплементарности - эта идея, высказанная академиком Д. Г. Кнорре, оказалась востребована самой природой. Взять, например, феномен РНК-интерференции, обнаруженный в 1998 г. американцами К. Мелло и Э. Файером. Кстати сказать, оказалось, что у растений подобное являение наблюдали еще в 1920-х гг., но тогда не смогли правильно истолковать. Суть его в том, что линейные двуцепочечные, или шпилечные, РНК могут подавлять экспрессию генов, содержащих гомологичные им последовательности. Усилиями многих ученых был очень скоро установлен механизм этого процесса. Как правило, при наличии точного комплементарного соответствия мРНК и коротких интерферирующих РНК (киРНК) происходит деградация мРНК, а при неполном комплементарном соответствии трансляция мРНК просто блокируется. Однако молекулярные детали этих процессов полностью еще не выяснены. РНК-интерференция может также регулировать структуру и уровень конденсации хроматина.

Когда механизм РНК-интерференции прояснился и стало понятно, что можно использовать ее для подавления экспрессии практически любого гена в клетке, ему начали придумывать разные полезные приложения. Сначала, разумеется, в лабораторной практике: подавление экспрессии гена при помощи РНК-интерференции, или нокдаун гена (по аналогии с нокаутом, т. е. удалением гена), прочно вошло в практику молекулярнобиологических лабораторий. Сейчас существуют даже специальные сервисы: вы даете им последовательность нужного гена, а они и интерферирующую РНК разработают и синтезируют генную конструкцию, которая будет эту РНК производить.

Но, конечно, лабораторными инструментами дело не ограничилось - на основе РНК-интерференции начали разрабатывать терапевтические средства. Первыми в клинических испытаниях стали исследовать

I' i 11 ~T7T7T

nun iznniQ

Двуцепочечная РНК

Короткие шпилечные РНК

3'-HO

Dicer

OH-3'

2 нт. 2 нт.

I____________________________________I

Расщепление РНК на короткие фрагменты

21—22 нт.

I

3'-HO

Расплетение двуцепочечной РНК

Короткая интерферирующая РНК

¥

¥

¥

Комплекс RISC J

Сборка комплекса RISC

3'

ПШ 2ТЛ1

5

о'ь а ь

3'

/

'.”118

______

5'

Полная комплементарность киРНК и мРНК - деградация мРНК

мРНК

Неполная комплементарность киРНК и мРНК - репрессия трансляции

Суть механизма РНК-интерференции заключается в подавлении экспрессии генов линейными двуцепочечными или шпилечными РНК, ссодержащими гомологичные им последовательности. Сначала фермент-эндонуклеаза Dicer расщепляет такие РНК на короткие двуцепочечные РНК длиной 21—22 пары нуклеотидов, содержащие выступающие 3’-концы по два нуклеотида. Такие РНК затем «расплетаются» другим ферментом - РНК-геликазой Armitage. Эта стадия очень важна, потому что именно в это время определяется, какая из двух коротких цепочек будет работать дальше - «рабочей» цепочкой становится та, 5’-конец которой в дуплексе менее стабилен и легче расплетается. Далее на этом одноцепочечном кусочке РНК («короткой интерферирующей РНК», киРНК) собирается комплекс RISC, в состав которого входит, в частности, белок Argonaut, который опосредует образование комплементарного дуплекса между киРНК и конкретной мРНК, регулируемой при помощи РНК-интерференции

МЕГАГРАНТЫ

интерферирующие РНК для обращения дегенерации сетчатки глаза и лечения инфекции респираторным синцитиальным вирусом, который вызывает больше всего заболеваний дыхательных путей у новорожденных и маленьких детей. Этим дело не ограничилось - сейчас готовятся к клиническим испытаниям и антивирусные РНК против герпеса, гепатитов A и B, вируса иммунодефицита человека, гриппа, кори и даже онкологичесих заболеваний.

РНК-интерференция нашла свое место даже в сельском хозяйстве. Так, известная биотехнологическая фирма «Монсанто» сейчас работает над сортами культурных растений, производящих инсектицидные интерферирующие РНК. А американские ученые вывели сорт хлопка, семена которого съедобны, потому что в них методом РНК-интерференции нарушено производство токсина госсипола.

К концу прошлого столетия оставался неясным один момент. Если в клетке есть специальный механизм, работающий с молекулами РНК, которые вводят в клетку исследователи, значит, это, наверное, неспроста? Иначе зачем клетке содержать несколько белков, которые выполняют скоординированную работу по использованию того, что «подсунули» ей ученые?

И вот, в начале 2000-х гг. прогремело новое открытие - микроРНК. Как обычно, оказалось, что первая такая РНК была обнаружена ранее в микроскопическом почвенном черве-нематоде Caenorhabditis elegans, модельном организме для генетики развития, но в то время сущность этого открытия не была понята.

МикроРНК в клетке образуются из РНК таким же способом, как и искусственно внесенные двуцепочечные РНК: сначала молеклы нарезаются на куски, а затем идет процесс, аналогичный РНК-интерференции. С тех пор были открыты сотни микроРНК: по всей видимости, они входят в число важнейших регуляторов активности генов человека.

больных, поскольку лекарства убивают не только болезнетворных бактерий, но и полезных обитателей нашего желудочно-кишечного тракта.

Так возникла идея использовать для борьбы с патогенами ген-направленные соединения, которые будут убивать только вполне определенный микроб и не трогать другие. Ведь если строение бактериального гена известно, можно синтезировать подходящий олигонуклеотид - цепочку РНК, ДНК или каких-то модифицированных нуклеиновых кислот, которая «прилипнет» именно к конкретной нуклеиновой кислоте. Если к этой направляющей части присоединить молекулу, которая будет поражать нуклеиновую кислоту-мишень, то мы получим ген-направленный реагент, который будет действовать только на целевой геном. Конечно, нужно еще научиться защищать такое лекарство от разрушения в организме, сделать его нетоксичным, а главное - «научить» его проникать внутрь клетки.

В работе по мегагранту с российской стороны участвуют и химики, которые синтезируют нуклеиновые кислоты, и микробиологи, испытывающие эти соединения на реальных мишенях. Некоторых целей уже удалось достичь - так, создан вариант олигонуклеотида, который не разрушается в крови.

А вот проблема доставки препарата в бактериальные клетки пока остается неприступной. Для ее решения специалисты ИХБФМ СО РАН испытывают природные переносчики в виде разнообразных пептидов.

Параллельно идет работа над олигонуклеотидным препаратом против вируса гриппа - это относительно простая задача, потому что вирусные нуклеиновые кислоты уже находятся в инфицированной клетке человека, куда попасть гораздо легче, чем в бактериальную, окруженную плотной белково-полисахаридной оболочкой. В общем новосибирские ученые одновременно просчитывают много вариантов, и вполне вероятно, что какой-то из них окажется выигрышным.

Российские нуклеиновые кислоты

Задача у новосибирской лаборатории С. Альтмана, со-88 зданной на средства мегагранта, не из простых: создать новый вид соединений для лечения бактериальных, вирусных и протозойных инфекций. Микробы стали сейчас устойчивыми ко многим антибиотикам, и если смотреть правде в глаза, то становится ясным, что современное здравоохранение висит на волоске, ведь уже появились штаммы стафилококка и туберкулезной палочки, устойчивые практически ко всем известным антибиотикам. С другой стороны, бесконтрольное применение антибиотиков не только провоцирует развитие лекарственной устойчивости, но и опасно для самих

Новые трюки прирученной РНК

В институтской лаборатории нобелевского лауреата сейчас разворачивается и большой проект по «приручению» РНК для еще одной цели - клеточной терапии.

У этого направления есть своя занимательная и богатая история. Можно сказать, что она берет начало от овечки Долли, которую клонировал в 1996 г. из клетки вымени шотландец И. Вилмут. Для подобного клонирования - так называемого «переноса ядра соматической клетки» - требуется яйцеклетка, из которой удаляют ядро, и клетка-донор, из генетического материала которой потом развивается организм. На самых первых этапах развития клетки эмбриона, получившиеся

Новые лекарства

А

Л N Пациент

• * И

<7? 5 Трансплантация

Сбор клеток у

=с

<D

" /* -

*w

«Больные» клетки

Факторы репрограммирования

Коррекция гена

Пациент-специфичные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

Здоровые клетки А

-а

-&

Исправленные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

Новая парадигма лечения инфекционных и наследственных болезней базируется на возможности получить почти из любой клетки тела плюрипотентные клетки, способные превратиться в любую клетку взрослого организма. Современные молекулярно-генетические технологии открывают перспективы создания настоящей персонализированной медицины, а также практически неограниченные возможности создания эффективных и безопасных лекарств

в результате такого переноса, сохраняют свою плюри-потентность, т. е. способность превратиться в любую клетку взрослого организма.

После работ Вилмута перед человечеством замаячила довольно страшная, с этической точки зрения, перспектива: взрослый человек, который хочет подлечиться, создает свой клон, из которого изымаются либо клетки на ранней эмбриональной стадии, либо органы - на стадии более поздней. И это не беспочвенные страхи: в современной медицине известны случаи, когда родители специально рожали здорового ребенка, чтобы он стал донором костного мозга для старшего брата или сестры, страдающих от какой-нибудь редкой наслед ственной болезни.

Гордиев узел этических проблем клонирования одним

махом разрубил в 2006 г. японец С. Яманака, который нашел способ получать плюрипотентные клетки почти из любой клетки тела без необходимости создания и последующей разборки эмбриона. Оказалось, что для этого необходимо ввести в клетку активно рабо- 89 тающие копии всего четырех генов-регуляторов: Sox2,

Oct4, Klf4 и c-Myc. В результате клетка печени, например, превращается в индуцированную плюрипотент-ную стволовую клетку (ИПС-клетку), которую потом можно подтолкнуть к преобразованию хоть в клетку печени, хоть в нейрон, хоть в лейкоцит. В исследованиях на лабораторных мышах даже было показано, что из таких клеток могут рождаться мышата, вырастающие во вполне здоровых и плодовитых мышей.

Открытие Яманаки дало надежду, что скоро мы на-

МЕГАГРАНТЫ

90

учимся лечить почти любую наследственную болезнь. В самом деле, если бы из пациента можно было взять клетки, сделать из них ИПС-клетки, исправить в них генетический дефект и затем пересадить обратно пациенту, это помогло бы справиться со многими генетически обусловленными недугами.

Остается один маленький неясный момент: как исправить геном клетки? В принципе биологи уже умеют это делать, используя процесс гомологичной рекомбинации (таким образом с конца 1980-х гг. получают трансгенных животных), но у этой процеруды слишком низкая

Искусственная система редактирования геномов CRISPR/Cas создана по образу и подобию иммунной системы бактерий, направленной против ДНК бактериофагов. Система состоит из двух основных частей: некодирующей РНК (sgRNA) и белков-ферментов нуклеаз CAS. sgRNA с помощью Cas-белков присоединяется к протоспейсеру -комплементарному участку целевой ДНК. В месте посадки спейсера нуклеаза разрезает цепь ДНК-мишени. При репарации в место разреза возможно встроить любую донорскую молекулу ДНК

эффективность. И опять решение пришло, откуда не ждали. Еще в 1987 г. в геноме бактерий были обнаружены многочисленные участки-повторы CRISPR, с которых синтезируются маленькие РНК. Оказалось, что бактерии используют их для защиты от вирусов-бактериофагов: с их помощью уничтожаются «вражеские» нуклеиновые кислоты, которые вирус впрыскивает в бактерию. Бактерии же умеют распознавать это вторжение и посылают небольшие кусочки РНК, чтобы они связались с нуклеиновой кислотой «агрессора». Эти РНК действуют не сами по себе, а в комплексе с белком Cas9, который расщепляет ДНК или РНК вируса.

Но почему бы подобную систему использовать не только против вируса? Достаточно создать нужную нацеливающую РНК - и система CRISPR/Cas9 расщепит любую ДНК, какую мы захотим. А если в это же время ввести в клетку «донор» генетического материала (например, олигонуклеотид с исправленной последовательностью), то разрыв будет исправлен клеточными системами репарации ДНК. Таким образом, в геноме можно исправить любую мутацию. Справедливости ради стоит отметить, что это не единственный способ редактирования генома, но, по-видимому, система CRISPR/Cas9 является самой эффективной.

Разумеется, новосибирские ученые обратили внимание на такой многообещающий инструмент. С его помощью они собираются получить клетки, которые несут мутации, встречающиеся у пациентов с болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона и некоторыми другими наследственными заболеваниями. Такие клетки очень нужны исследователям, занимающимся поиском новых лекарств, ведь только клетки человека могут дать наиболее правильные представления о том, как развивается болезнь. Эксперименты на животных здесь зачастую вообще неприменимы, например, болезни Альцгеймера не подвержены даже человекообразные обезьяны. И наоборот, из клеток больных наследственными заболеваниями с помощью этой системы можно делать нормальные, здоровые клетки. Для этого ученые ИХБФМ в сотрудничестве с Институтом патологии кровообращения им. Е. Н. Мешалкина выбрали синдром длинного интервала QT - одну из частых причин наследственных болезней сердца.

Но даже для для такого хорошего редактора геномов, как CRISPR/Cas9, эффективность процесса оставляет желать лучшего. Понятно, что способы его усовершенствования имеются, ведь первые работы по геномному редактированию с использованием этой системы вышли в свет только в 2013 г.

Узкое место процесса - репарация разрыва ДНК с использованием донорного олигонуклеотида в качестве матрицы, так как эта реакция проходит с не очень высоким выходом. Однако - такая удача! - репарация ДНК также входит в число основных научных интере-

сов ИХБФМ.

Одно из подразделений института - группа взаимодействий биополимеров, занимается разработкой новых конструкций донорных олигонуклеотидов, которые должны резко повысить эффективность геномного редактирования. Более того, процесс репарации ДНК востребован и в конверсии обычных клеток в плюри-потентные, поэтому в группе также ведутся работы, поддержанные грантом Российского научного фонда, которые призваны значительно облегчить получение ИПС-клеток по сравнению с классической схемой Яманаки.

Представим теперь, что нам удалось исправить клетки и пересадить их обратно пациенту, где они начинают взаимодействовать со всем организмом. Читатель, не удивляйся - и здесь тоже замешана РНК! Совсем недавно было установлено, что клетки секретируют в кровь и другие биологические жидкости специальные частицы - экзосомы, состоящие из белка и РНК. Они, вероятно, представляют собой часть абсолютно нового механизма межклеточной сигнализации, при котором клетка передает часть генетического материала другим клеткам организма. Однако ни механизм образования экзосом, ни принципы, по которым отбираются для них белки и РНК, совершенно неизвестны. Но все эти вопросы также находятся в фокусе внимания новосибирских ученых.

онечно, неправильно говорить, что РНК - это самая важная молекула жизни. Без ДНК и белков жизнь также была бы невозможна, а «мир РНК», скорее всего, давным-давно кончился бы, если бы природа не придумала современное разделение функций между ДНК, РНК и белком.

Однако можно безошибочно утверждать, что РНК из «бедного родственника» за последние четверть века превратилась в выдающийся член этой триады. Исследования, идущие в ИХБФМ СО РАН, призваны наилучшим образом использовать многочисленные функции РНК для направленного влияния на клетки, что позволит создать новые высокоэффективные технологии для медицины.

91

Литература

Власов В. В, Воробьев П. Е. Мир РНК: вчера и сегодня // НАУКА из первых рук. 2012. № 3 (45). С. 40-49.

Горман К., Файн Марон Д. Революция в мире РНК //

В мире науки. 2014. №6. С. 70-77.

Григорович С. Вначале была РНК? В поисках молекулы первожизни // Наука и жизнь. 2004. № 2.

Работа поддержана грантом РНФ 14-24-00093