БАКТЕРИОФАГИ, БЕЛКИ БАКТЕРИОФАГОВ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
BACTERIOPHAGES, PROTEINS OF BACTERIOPHAGES AND METHODS FOR USE THEREOF

Данная международная заявка претендует на приоритет перед Предварительной Заявкой США Сер. №61/150585, от 6 февраля 2009 г., озаглавленной «Бактериофаги и их применение», и Предварительной Заявкой США Сер. №61/218345, от 18 июня 2009 г., озаглавленной «Бактериофаги, белки бактериофагов и их применение». Все допустимые объекты и содержание, включая последовательность списка этих предварительных заявок, включены здесь ссылками во всей полноте.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к области бактериофаговой терапии для лечения и контроля бактериальных инфекций. В частности настоящее изобретение относится к новым бактериофагам F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 и F91a/06, выделенным из них белкам, композициям, содержащим один или несколько новых бактериофагов и/или выделенных полипептидов, и способам лечения и профилактики бактериальных инфекций, вызванных Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, Е. faecium, Pseudomonas aeruginosa и/или Staphylococcus aureus по отдельности или в комбинации с другой антибактериальной терапией, например, антибиотиками или другой бактериофаговой терапией.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Бактериофаги (или фаги) представляют собой вирусы, которые специфически
инфицируют и лизируют бактерии. Бактериофаговая терапия как способ использования целых фаговых вирусов для лечения заболеваний, вызванных бактериальными инфекциями, была предложена Felix  в 1920-х годах. На первом этапе бактериофаговую терапию активно изучали и появлялись многочисленные работы, посвященные выяснению возможностей бактериофаговой терапии в лечении бактериальных инфекций у людей и животных. Первый успех стимулировал разработку многих промышленных бактериофаговых препаратов. Например, в 1940 г. Eli Lilly Company выпустила 7 бактериофагов для людей, включая бактериофаговые препараты для лечения различных недомоганий, вызываемых Staphylococcus sp., Е. coli и другими патогенными бактериями. Эти препараты использовали для лечения инфекций, которые вызывают абсцессы, гнойные раны, вагиниты, острые и хронические заболевания верхних дыхательных путей и отиты.
Однако с развитием антибиотиков в 1940-ых годах на Западе интерес к бактериофаговой терапии снизился. Одним из наиболее важных факторов, повлиявших на это снижение интереса, было отсутствие стандартизованных методов тестирования и способов производства. Отсутствие промышленных стандартов для тестирования бактериофаговой терапии, а также документирования результатов исследований привело к потере эффективности и к проблемам надежности при оценке бактериофаговой терапии. Кроме того, первоначальное изучение и поиски осложнялись проблемами, связанными с получением образцов/препаратов бактериофагов. Вначале для повышения срока службы бактериофаговых препаратов использовали различные стабилизаторы и консерванты. Однако, поскольку биология как бактериофагов, так и различных стабилизаторов была слабо изучена, многие ингредиенты, добавляемые для повышения срока службы бактериофаговых препаратов, оказались либо токсичными для людей, либо не обеспечивали длительные сроки хранения. Другая проблема, связанная с получением бактериофагов, заключалась в степени чистоты промышленных препаратов этих вирусов. В то время препараты бактериофаговой терапии обычно состояли из сырых лизатов клеток-хозяев бактерий, которые обрабатывали для получения бактериофага. Таким образом, многие препараты содержали то, что теперь известно как нежелательные бактериальные компоненты, например, эндотоксины. Соответственно, отрицательные случаи часто ассоциировали с препаратами, особенно у пациентов, получавших их внутривенно. Тем не менее, в Восточной Европе и в бывшем Советском Союзе, где доступность антибиотиков была ограниченной, разработка и применение бактериофаговой терапии продолжались наряду с антибиотиками либо вместо них.
По мере того, как росла устойчивость бактерий к антибиотикам, на Западе возродился интерес к бактериофаговой терапии. Даже несмотря на то, что можно разработать новые классы антибиотиков, опасение того, что возрастает устойчивость бактерий к новым лекарствам, стимулировало поиск нехимиотерапевтических средств регулирования, профилактики и лечения бактериальных инфекций. Известны три основные стратегии применения бактериофаговой терапии в клинической практике: 1) назначение вирулентных бактериофагов; 2) использование эндолизинов или очищенных лизинов, кодированных бактериофагами; 3) использование структурных белков идентифицированных бактериофагов в качестве метаболических ингибиторов основных ферментов синтеза бактериального пептидогликана.
Поэтому необходимо разрабатывать новые бактериофаги в качестве потенциальных терапевтических и профилактических реагентов для применения in vivo против патогенных бактерий. В частности необходимы бактериофаги, способные разрушать нозокомиальные бактерии, включая Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, Е. faecium, Pseudomonas aeruginosa и/или Staphylococcus aureus. Поскольку большинство бактериофагов и фаговых белков, изученных к настоящему времени, часто активны только против родственных видов или подвидов бактерий, из которых они получены, новая бактериофаговая терапия может найти особое применение в больницах для избирательного лечения патогенных инфекций, не оказывающего влияния на нормальную окружающую флору.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к выделенным бактериофагам и выделенным из бактериофагов антибактериальным полипептидам, применяемым для лечения, профилактики или управления состояниями, связанными с инфицированием грамположительными или грамотрицательными бактериями. В частности, выделенные бактериофаги или полипептиды по данному изобретению можно применять для лечения, профилактики или управления инфекциями, вызванными патогенными нозокомиальными бактериями, например, грамположительными бактериями, включая, но не ограничиваясь ими, Enterococcus faecalis, Е. faecium, Е. hirae, Е. avium, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans и S. xylosis; и/или грамотрицательными бактериями, включая, но не ограничиваясь этим, Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa. В некоторых вариантах фармацевтические композиции по данному изобретению используют для лечения состояний, связанных с инфицированием устойчивыми к антибиотикам штаммами бактерий, например, устойчивыми к метициллину штаммами Staphylococcus aureus (MRSA). В некоторых вариантах выделенные бактериофаги или полипептиды используют для местного лечения инфекций, вызванных нозокомиальными патогенными бактериями у субъекта, который в этом нуждается. В других вариантах выделенные бактериофаги или полипептиды по данному изобретению используют для диагностики инфицирующего реагента во взятом у пациента образце ткани, крови, мочи или мокроты. В других вариантах выделенные бактериофаги или полипептиды по данному изобретению используют в качестве профилактического дезинфицирующего или противоинфицирующего реагента при подготовке твердых поверхностей, включая кожу или другие эпидермальные поверхности.
В некоторых вариантах данное изобретение предлагает выделенный бактериофаг F168/08 или F170/08 с геномом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 соответственно, проявляющий антибактериальную активность по отношению к одному или нескольким штаммам Enterococcus faecalis и/или Е. faecium. В других вариантах изобретение предлагает выделенный бактериофаг F770/05 с геномом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, обладающий антибактериальной активностью по отношению к одному или нескольким штаммам Pseudomonas aeruginosa. В еще других вариантах изобретение предлагает выделенные бактериофаги F197/08, F86/06, F87s/06 или F91a/06 с геномом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 соответственно; эти бактериофаги обладают антибактериальной активностью по отношению к одному или нескольким штаммам Staphylococcus aureus. В других вариантах изобретение предлагает выделенный бактериофаг F1245/05 с геномом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 760, обладающий антибактериальной активностью по отношению к одному или нескольким штаммам Acinetobacter baumannii.
Настоящее изобретение также включает выделенные бактерии, инфицированные одним или несколькими бактериофагами по данному изобретению. В конкретных вариантах изобретение предлагает выделенные Е. faecalis, инфицированные бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2. В других вариантах изобретение предлагает выделенные Е. faecium, инфицированные бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2. В следующих вариантах изобретение предлагает выделенные P. aeruginosa, инфицированные бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3. В других вариантах изобретение предлагает выделенные S. aureus, инфицированные одним или несколькими бактериофагами с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и/или SEQ ID NO: 7. В еще других вариантах изобретение предлагает выделенные А. baumannii Н, инфицированные бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 760.
Настоящее изобретение включает полипептиды, выделенные из бактериофага F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 и/или F91a/06, обладающие антибактериальной активностью по отношению к одному или нескольким видам или штаммам грамположительных или грамотрицательных бактерий, например, А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и/или S. aureus. В конкретных вариантах полипептиды по данному изобретению, выделенные или полученные из F168/08 или F/170/08, обладают антибактериальной или антимикробной активностью, например литической активностью по меньшей мере по отношению к Е. faecalis и/или Е. faecium; выделенные или полученные из F770/05 - по отношению по меньшей мере к P. aeruginosa; выделенные или полученные из F197/08, F86/06, F87s/06 или F91a/06 - по отношению по меньшей мере к S. aureus; и выделенные или полученные из F1245/05 - по отношению по меньшей мере к А. baumannii.
В некоторых вариантах полипептиды по данному изобретению содержат или состоят из выделенного эндолизина или его фрагмента (например, домена CHAP, который проявляет антибактериальную активность по отношению к одному или нескольким видам или штаммам бактерий, например, грамположительных или грамотрицательных бактерий, таких как А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и/или S. aureus. В конкретных вариантах полипептид по данному изобретению представляет собой выделенный белок лизин, например, эндолизин или лизин белок хвостового отростка, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 или SEQ ID NO: 712. В еще других вариантах изобретение предлагает полипептиды, содержащие или состоящие из аминокислотной последовательности, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 761 и до SEQ ID NO: 816.
В других вариантах полипептид по данному изобретению содержит фрагмент, вариант или производное SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 или SEQ ID NO: 712, причем указанный фрагмент обладает антибактериальной или антимикробной активностью, например, литической активностью, по отношению к одному или нескольким штаммам Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и/или S. aureus. В конкретных примерах по этому варианту вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202 и/или SEQ ID NO: 203 проявляет антибактериальную или антимикробную активность, (например, литическую активность) по отношению к одному или нескольким штаммам Е. faecalis и/или Е. faecium. В других примерах по этому варианту вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 и/или SEQ ID NO: 712 обладает антибактериальной или антимикробной активностью (например, литической активностью) по отношению к одному или нескольким штаммам S. aureus.
В конкретных вариантах выделенный полипептид по данному изобретению содержит или состоит из домена CHAP последовательности SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 или SEQ ID NO: 712. В некоторых вариантах выделенный полипептид по изобретению содержит или состоит из домена CHAP последовательности SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 или SEQ ID NO: 712, например, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758 или SEQ ID NO: 759 соответственно. В еще других вариантах полипептид по изобретению содержит фрагмент, вариант или производное последовательности SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758 или SEQ ID NO: 759, причем указанный фрагмент, вариант или производное обладает антибактериальной или антимикробной активностью, например, литической активностью, по отношению по меньшей мере к одному или нескольким штаммам Е. faecalis, Е. faecium, Р. aeruginosa и/или S. aureus. В следующих вариантах полипептид по изобретению содержит фрагмент, вариант или производное последовательности SEQ ID NO: 761 до SEQ ID NO: 816, причем указанный фрагмент, вариант или производное обладает антибактериальной или антимикробной активностью, например, литической активностью, по отношению по меньшей мере к одному или нескольким штаммам А. baumannii.
В других вариантах полипептид по данному изобретению содержит или состоит из выделенного белка «рулетки» (tape measure protein), определяющего длину хвостового отростка, или белка хвостового отростка (например, компонента хвостового отростка, белка хвостовой фибриллы, белка хвостового отростка, связанного с адсорбцией), или его фрагмента, биологическая функция которого связана с бактериофагом, из которого он получен, который проявляет антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) по отношению по меньшей мере к одному или нескольким видам или штаммам Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus и/или А. baumannii. В конкретных вариантах полипептид по данному изобретению представляет собой выделенный белок «рулетка», определяющий длину хвостового отростка или белок*, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 или SEQ ID NO: 796. В других вариантах полипептид по изобретению представляет собой фрагмент, вариант или производное последовательности SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 или SEQ ID NO: 796, причем биологическая функция указанного фрагмента, его варианта или производного связана с бактериофагом, из которого он получен, например, обуславливает антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) по отношению к одному или нескольким штаммам Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus и/или А. baumannii.
В некоторых вариантах данное изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61 или SEQ ID NO: 63, и их биологическая функция определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) по отношению к одному или нескольким штаммам Е. faecalis и/или Е. faecium. В других вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 204 или SEQ ID NO: 214, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) по отношению к одному или нескольким штаммам Е. faecalis и/или Е. faecium.
В некоторых вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 435 или SEQ ID NO: 438, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) по отношению к одному или нескольким штаммам P. aeruginosa.
В некоторых вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO:532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538 или SEQ ID NO: 539, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) по отношению к одному или нескольким штаммам S. aureus. В других вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 567 или SEQ ID NO: 568, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) по отношению к одному или нескольким штаммам S. aureus. В еще других вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 632 или SEQ ID NO:633, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID  NO: 6, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) по отношению к одному или нескольким штаммам S. aureus. В других вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703 или SEQ ID NO: 704, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:7, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) по отношению к одному или нескольким штаммам S. aureus.
В некоторых вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NOS: 761-816, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 760, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) по отношению к одному или нескольким штаммам А. baumannii.
В некоторых вариантах изобретение предлагает выделенные полипептиды, обладающие антимикробной или антибактериальной активностью (например, литической активностью) по отношению к одному или нескольким штаммам бактерий (например, грамположительных бактерий типа Е. faecalis, Е. faecium, S. aureus, грамотрицательных бактерий типа А. baumannii, P. aeruginosa или бактерий, не относящихся к числу грамположительных или грамотрицательных), причем выделенные полипептиды содержат аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более процентов идентична второй аминокислотной последовательности той же длины (т.е. состоящей из такого же числа аминокислотных остатков), которая представляет собой последовательность SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NOS: 761-816 и/или ее фрагмент.
Кроме того, данное изобретение предлагает выделенные полипептиды, содержащие или состоящие из любой аминокислотной последовательности SEQ ID NOS: 8-130, SEQ ID NOS: 131-343, SEQ ID NOS: 344-438, SEQ ID NOS: 439-553, SEQ ID NOS: 554-616, SEQ ID NOS: 617-681, SEQ ID NOS: 682-759 и SEQ ID NOS: 761-816. В других вариантах предлагаются выделенные полипептиды по данному изобретению, которые рекомбинантно объединены или химически соединены (например, ковалентными или нековалентными связями) с терапевтическими реагентами (например, с гетерологичными полипептидами или малыми молекулами).
Изобретение также относится к полинуклеотидам, которые кодируют полипептиды по данному изобретению. В конкретном варианте изобретение предлагает выделенную нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует любой полипептид из SEQ ID NOS: 8-130, SEQ ID NOS: 131-343, SEQ ID NOS: 344-438, SEQ ID NOS: 439-553, SEQ ID NOS: 554-616, SEQ ID NOS: 617-681, SEQ ID NOS: 682-759 и SEQ ID NOS: 761-816. В других вариантах изобретение предлагает нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует любой полипептид из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NOS 761-816 или его активный фрагмент, вариант или производное, причем полипептид или его активный фрагмент, вариант или производное обладает биологической функцией, обусловленной бактериофагом, из которого его выделили и/или получили, например, антимикробной или антибактериальной активностью (например, литической активностью). Изобретение также относится к вектору, включающему указанную нуклеиновую кислоту. В одном конкретном варианте указанный вектор является вектором экспрессии. Кроме того, изобретение предлагает клетки-хозяева, содержащие вектор, включающий полинуклеотиды, кодирующие полипептиды по данному изобретению.
Настоящее изобретение включает способы получения полипептидов по изобретению или их активных фрагментов, в частности для использования в фармацевтических композициях, т.е. антимикробных композициях. Например, полипептиды по данному изобретению можно выделить непосредственно из клеточных культур, (например, из бактериальных клеточных культур), инфицированных бактериофагом F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 или F91a/06. Альтернативно полипептиды по настоящему изобретению можно получить рекомбинантными методами с использованием векторов экспрессии, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды по изобретению, например, используя векторы экспрессии, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды по данному изобретению, например SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO:538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO:567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NOS: 761-816 или их активные фрагменты, производные или разновидности. Полипептиды по данному изобретению или их фрагменты можно получить любым способом, известным в данной области, в частности химическим синтезом или способами рекомбинантной экспрессии. В конкретных вариантах изобретение относится к способу рекомбинантного получения фагового белка, например, белка лизина, концевого белка или его активного фрагмента, разновидности или производного, причем указанный способ включает: (i) культивирование в условиях, пригодных для экспрессии указанного белка в среде, клетки-хозяина, содержащей вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NOS: 761-816 или его фрагмента; и (ii) выделение указанного белка из указанной среды. В некоторых вариантах нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды по данному изобретению, функционально связывают с гетерологичными промоторами.
Настоящее изобретение также включает способы диагностики возбудителей болезни при клиническом проявлении бактериальной инфекции. Выделенные бактериофаги или полипептиды по изобретению можно использовать для распознавания видов бактерий в образцах, взятых у пациента, путем анализа чувствительности бактерий в образце к бактериофагам и/или полипептидам по данному изобретению. Такие способы включают также методы оценки антибактериальной активности выделенных бактериофагов и/или полипептидов по данному изобретению. Антибактериальную активность бактериофагов или полипептидов по изобретению или чувствительность неизвестных образцов к такой активности можно определить любыми способами, известными в данной области, и/или описанными здесь. В некоторых вариантах антибактериальную активность и/или чувствительность определяют путем культивирования известных бактерий и/или образцов ткани, крови, жидкости или мазка по стандартной методике (например, в жидкой культуре или на агаровых пластинках), контактирования культуры с бактериофагами и/или полипептидами по изобретению и мониторинга роста клеток после указанного контактирования. Например, в жидкой культуре (например, А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus) можно выращивать клетки до достижения величины оптической плотности ("OD"), представляющей среднюю точку экспоненциального роста культуры; культуру приводят в контакт с одним или несколькими бактериофагами и/или полипептидами по данному изобретению при одной или нескольких концентрациях и отслеживают величину OD по сравнению с контрольной культурой. Снижение величины OD относительно контрольной культуры указывает на антибактериальную активность бактериофага и/или полипептида, обладающего антибактериальной активностью (например, литической активностью) по отношению к тестируемому образцу или видам бактерий и/или штаммов в культуре. Аналогично, колонии бактерий выращивают на агаровой пластинке, пластинку приводят в контакт с бактериофагом или полипептидом по данному изобретению и оценивают последующий рост колоний относительно контрольных пластинок. Уменьшившиеся в размере колонии или уменьшившееся общее число колоний указывает на антибактериальную активность бактериофага и/или полипептида по отношению к тестируемому образцу и/или культивируемому виду или штамму.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим или состоящим из бактериофага с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 760. В некоторых вариантах фармацевтическая композиция по данному изобретению включает бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 760 наряду с одним или несколько другими бактериофагами. Один или несколько других бактериофагов могут представлять собой один или несколько бактериофагов по данному изобретению (например, с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 760), один или несколько штаммов или один или несколько бактериофагов, известных в данной области. Кроме того, один или несколько бактериофагов в фармацевтической композиции по данному изобретению могут воздействовать на одни и те же или на разные виды или штаммы бактерий. В некоторых вариантах фармацевтические композиции, содержащие один или несколько бактериофагов по изобретению, включают также один или несколько полипептидов по изобретению и/или другие бактериофаги, как описано здесь или известно в данной области.
В некоторых вариантах данное изобретение предлагает фармацевтические композиции, содержащие полипептиды или их активные фрагменты, в частности обладающие антимикробной и/или антибактериальной активностью, выделенные из бактериофагов с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 760. В конкретных вариантах фармацевтические композиции по изобретению содержат один или несколько полипептидов с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759 или SEQ ID NOS: 761-816. В других вариантах фармацевтические композиции по изобретению содержат полипептид, который является вариантом, производным или фрагментом SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759 или SEQ ID NOS: 761-816, причем вариант, производное или фрагмент сохраняет биологическую функцию полипептида, из которого он получен, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) предпочтительно по отношению к одному или нескольким штаммам А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, Р. aeruginosa и/или S. aureus.
Фармацевтические композиции по данному изобретению могут также содержать фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или стабилизатор. В некоторых вариантах предлагаемые фармацевтические композиции содержат композиции антибиотиков (когда они проявляют антибактериальную активность) или терапевтические композиции для лечения, профилактики и/или облегчения симптомов заболевания или недомогания, вызванных бактериальными инфекциями, у субъекта, который в этом нуждается. В отдельных вариантах фармацевтические композиции по данному изобретению представляют собой антибактериальные или терапевтические композиции для лечения, предупреждения и/или облегчения симптомов болезни или расстройства, вызванного заражением штаммами А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и/или S. aureus. В некоторых вариантах субъектом, получающим фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению, является млекопитающее (например, коровы, овцы, козы, непарнокопытные животные, приматы (например, люди), грызуны, зайцы или птицы (цыплята, утки, гуси)).
Настоящее изобретение предлагает способы лечения или профилактики бактериальных инфекций, включающие введение субъекту, который в этом нуждается, фармацевтической композиции, содержащей один или более бактериофагов или продуктов фагов (например, выделенный из бактериофага полипептид или его активный фрагмент, вариант или производное), необязательно в дополнение к одному или нескольким другим описанным здесь бактериофагам или продуктам фагов. В контексте настоящего изобретения термин «лечение» относится как терапевтическому лечению, так и к профилактическим или упреждающим мерам, причем объект надо удалить, сократить, уменьшить его неблагоприятное воздействие, замедлить прогрессирование, а также устранить или упредить симптомы основной причины (например, бактериальной инфекции), связанные с патологическим состоянием или недомоганием. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать при лечении или управлении инфекциями, вызванными любой бактериальной инфекцией, включая, но не ограничиваясь этим, А. baumanni, S. aureus, S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosis, M. luteus, B. subtilis, B. pumilus, E. faecalis, E. hirae, E. faecium, E. avium, P. aeruginosa и их комбинации. В некоторых вариантах фармацевтические композиции можно использовать для лечения состояний или недомоганий, связанных с бактериальными инфекциями, включая, но не ограничиваясь ими, постоперационный эндофтальмит, эндокардит, инфекции центральной нервной системы, пневмонию, остеомиелит, раневые инфекции (например, диабетическую стопу), мастит, сепсис, пищевое отравление и менингит и/или другие состояния, вызванные нозокомиальными бактериальными инфекциями.
В некоторых вариантах настоящее изобретение предлагает использовать бактериофаг или выделенный из бактериофага продукт (например, выделенный из бактериофага полипептид или его активный фрагмент, вариант или производное) в качестве единственного терапевтического реагента. В других вариантах изобретение предлагает использовать бактериофаг или его продукт (например, выделенный из бактериофага полипептид или его активный фрагмент, вариант или производное) в комбинации со стандартным или экспериментальным лечением бактериальной инфекции. Такая комбинированная терапия может повысить эффективность стандартного или экспериментального лечения. Примерами терапевтических реагентов, которые особенно часто используют в комбинации с полипептидом по данному изобретению, являются противовоспалительные средства, стандартные хемиотерапевтические антибиотики (например, пенициллин, синтетические пенициллины, бацитрацин, метициллин, цефалоспорин, полимиксин, цефаклор, Цефадроксил, цефамандол нафат, цефазолин, цефиксим, цефметазол, цефониоид, цефоперазон, цефоранид, цефотам, цефотаксим, цефотетан, цефокситин, цефподоксим проксетил, цефтазидим, цефтизоксим, цефтриаксон, цефриаксон моксалактам, цефуроксим, цефалексин, цефалоспорин С, натриевая соль цефалоспорина С, цефалотин, натриевая соль цефалотина, цефапирин, цефпадин, цефуроксимаксетил, дигидратцефалотин, моксалактам, лоракарбеф мафат и хелатирующие реагенты), местные анестетики и/или кортикостероиды. В еще одном варианте композиции по настоящему изобретению можно комбинировать с одним или несколькими бактериофагами или их продуктами, известными в данной области. Комбинированные терапии в объеме изобретения можно осуществлять в виде одной фармацевтической композиции или их можно назначать как отдельные композиции, но в виде частей суммарного режима лечения.
Фармацевтические композиции по данному изобретению можно назначать любым способом, известным в данной области, пригодным для введения антибактериального соединения (например, перорально или парентерально (например, ингаляцией, внутримышечно, внутривенно или эпидермально)). В предпочтительных вариантах фармацевтические композиции по данному изобретению назначают местно, например, в местных препаратах. Композиции по изобретению можно использовать местно для лечения и/или профилактики распространенных нозокомиальных инфекций, таких как инфекции в местах хирургического вмешательства или связанных с катетерами и дренажами. В других вариантах композиции по данному изобретению используют для лечения бактериальных инфекций кожи или верхних слоев кожи (например, инфекции при диабетической стопе).
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно также применять традиционно для нетерапевтического лечения, например, в косметике или в виде спреев либо растворов для обработки твердых поверхностей с целью предотвращения колонизации бактерий (т.е. как дезинфицирующие средства).
Настоящее изобретение также относится к способам поиска пептидов с антибактериальной активностью. В одном варианте способ включает поиск непрерывной аминокислотной последовательности длиной по меньшей мере 6, 10, 15, 20 или 25 остатков, которые кодируются открытыми рамками считывания нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 760, с антибактериальной активностью, причем указанная антибактериальная активность определена по способности пептидов ингибировать рост бактерий в агаровой или жидкой культуре.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Использованный здесь термин «фрагмент» относится к пептиду или полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность по меньшей мере из 5 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 10 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 15 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 20 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 25 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 40 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 50 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 60 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 70 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 80 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 90 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 100 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 125 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 150 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 175 соседних аминокислотных остатков, по меньшей мере из 200 соседних аминокислотных остатков или по меньшей мере из 250 соседних аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности белка. В конкретном варианте фрагмент представляет собой функциональный фрагмент, в котором он сохраняет по меньшей мере одну функцию белка, из которого он выделен (например, антимикробную или антибактериальную активность (например, лизис клеток)).
Использованные здесь термины «активный продукт бактериофага» и «продукты бактериофага» относятся к полипептидам или их фрагментам, разновидностям или производным, выделенным из бактериофага по данному изобретению, причем полипептид или его фрагмент, вариант или производное обладает биологической функцией или активностью, обусловленной бактериофагом, из которого он выделен или получен (например, антимикробной или антибактериальной активностью (например, литической активностью)).
Использованный здесь термин «выделенный» в контексте пептида, полипептида или гибридного белка относится к пептиду, полипептиду или гибридному белку, который практически не содержит клеточного материала или не загрязнен клеточными белками или белками ткани, из которых он взят, или практически не содержит химических предшественников или других химически синтезированных веществ. Термин «практически не содержит клеточного материала» включает препараты пептида, полипептида или гибридного белка, в которых пептид, полипептид или гибридный белок отделен от клеточных компонентов клетки, из которой он выделен или рекомбинантно получен. Таким образом, пептид, полипептид или гибридный белок, который практически не содержит клеточного материала, включает препараты пептида, полипептида или гибридного белка, содержащие менее примерно 30%, 20%, 10% или 5% (в расчете на сухую массу) разнородных белков (также называемых здесь «загрязняющим белком»). При рекомбинантном получении пептида, полипептида или гибридного белка предпочтительно, чтобы он также не содержал культурной среды, т.е. чтобы культурная среда составляла менее примерно 20%, 10% или 5% объема препарата белка. При получении пептида, полипептида или гибридного белка химическим синтезом предпочтительно, чтобы они не содержали химических предшественников или других химических соединений, т.е. были отделены от химических предшественников, участвующих в синтезе пептида, полипептида или гибридного белка. Соответственно такие препараты пептида, полипептида, гибридного белка или антител содержат менее примерно 30%, 20%, 10%, 5% (в расчете на сухую массу) химических предшественников или веществ, отличных от рассматриваемых пептидов, полипептидов или гибридного белка.
Использованный здесь термин «выделенный» в контексте молекул нуклеиновых кислот относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая отделена от других молекул нуклеиновых кислот, присутствующих в природном источнике первой молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме того, «выделенная» молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, практически не содержит других клеточных веществ или культурной среды при получении по рекомбинантной методике или практически не содержит химических предшественников или других химических соединений при химическом синтезе и может не содержать кДНК или других геномных молекул ДНК, например, была выделена из других клонов в библиотеке нуклеиновых кислот.
Термин «очищенный» означает, что концентрация пептида, полипептида, гибридного белка или молекул нуклеиновой кислоты измеримо увеличивается в результате применения любого способа очистки, включая, но не ограничиваясь этим, колоночную хроматографию, ВЭЖХ, осаждение, электрофорез и т.п., в результате которого частично, практически полностью или полностью удаляются примеси, такие как предшественники или другие химические соединения, участвующие в получении пептидов, полипептидов, гибридных белков или молекул нуклеиновых кислот. Специалист в данной области определит необходимый объем очистки. Например, выделенный белок, предназначенный для использования в терапевтических композициях для назначения людям обязательно должен быть высокой чистоты в соответствии с регулирующими стандартами и совершенными способами производства.
Использованный здесь термин «производное» в контексте полипептидов относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая была изменена путем введения замен аминокислотных остатков, исключения или добавления аминокислотных остатков. Использованный здесь термин «производное» относится также к полипептиду, который был модифицирован, т.е. к нему была ковалентно присоединена молекула любого типа. Например, при этом никоим образом не лимитируя проблему, полипептид можно модифицировать, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, получения производных с известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления, связывания с клеточными лигандами или другими белками и т.п.Производное полипептида можно получить химическим модифицированием по методикам, известным специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь этим, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.д. Кроме того, производное полипептида может содержать одну или несколько неклассических аминокислот. Производное полипептида обладает близкими или такими же функциями, как полипептид, из которого он был получен. Термин «получен» в отношении к полипептиду, «полученному» из организма, может также относиться к выделению полипептида непосредственно из указанного организма (например, из бактериальных клеток или бактериофага).
Использованный здесь термин «клетка-хозяин» относится к конкретной клетке, перенесенной с молекулой нуклеиновой кислоты и потомством или потенциальным потомством такой клетки, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты или ее хромосомально интегрированную версию. Потомство такой клетки может быть не идентичным родительской клетке, которая была перенесена с молекулой нуклеиновой кислоты в результате мутации или влияния окружающей среды, которое может проявиться в ускоренной генерации молекулы нуклеиновой кислоты или ее интеграции в геном клетки-хозяина. Для экспрессии белков и полипептидов бактериофага предпочтительно, чтобы клетка-хозяин не принадлежала к тому же виду или штамму, из которого бактериофаг был выделен или культивирован.
Использованный здесь термин «в комбинации» относится к использованию нескольких профилактических и/или терапевтических препаратов. Использование термина «в комбинации» не ограничивает порядок, в котором профилактические и/или терапевтические препараты вводят больному или страдающему недомоганием. Первый профилактический и/или терапевтический препарат можно ввести субъекту с заболеванием или расстройством до (например, за 5 минут, 25 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель), вместе или после (например, спустя 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель) введения второго профилактического или терапевтического агента (отличного от первого профилактического или терапевтического препарата).
Использованные здесь термины «нуклеиновые кислоты» и «последовательности нуклеотидов» включают одноцепочечные и двухцепочечные молекулы ДНК и/или РНК или их комбинации. Использованный здесь термин «кодированный нуклеиновой кислотой» относится к аминокислотной последовательности, образовавшейся при трансляции прямой, обратной, комплементарной или обратно-комплементарной референтной нуклеотидной последовательности с использованием стандартного генетического кода (т.е. стандартных кодон-триплетов), как хорошо известно специалистам в данной области.
Использованные здесь термины «профилактический агент» и «профилактические агенты» относятся к бактериофагам и/или полипептидам по данному изобретению, которые можно использовать для профилактики, лечения, управления или облегчения одного или нескольких симптомов, связанных с бактериальной инфекцией.
Использованные здесь термины «терапевтический агент» и «терапевтические агенты» относятся к бактериофагам и/или полипептидам по изобретению, которые можно использовать для профилактики, лечения, управления или облегчения одного или нескольких симптомов болезни или недомогания, вызванных бактериальной инфекцией.
Использованный здесь термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству терапевтического агента, достаточному для облегчения одного или нескольких симптомов болезни или недомогания, в частности, болезни или недомогания, вызванных бактериальной инфекцией.
Использованные здесь термины «лечить», «лечение» относятся к облегчению одного или нескольких симптомов болезни или недомогания, вызванных бактериальной инфекцией, которое наступает при введении одного или нескольких бактериофагов и/или полипептидов по данному изобретению. Как указано выше, «лечение» и сопутствующие термины относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или упреждающим мерам, причем объект воздействия надо удалить, сократить, уменьшить его неблагоприятное воздействие, замедлить прогрессирование, а также устранить или упредить симптомы от основной причины (например, бактериальной инфекции), вызвавшие патологическое состояние или недомогание.
Использованные здесь термины «антибактериальная активность» и «антимикробная активность» в отношении бактериофага, выделенного белка бактериофага (или его разновидности, производного или фрагмента) или продукта бактериофага относят неизменно к способности прекращать и/или ингибировать рост или репродукцию микроорганизмов, в частности бактерий в виде штамма, который инфицирует бактериофаг. В некоторых вариантах антибактериальную или антимикробную активность достигают в результате культивирования бактерий (например, грамположительных бактерий (Е. faecalis, Е. faecium, S. aureus), грамотрицательных бактерий (например, А. baumannii, P. aeruginosa) или бактерий, не относящихся к числу грамположительных или грамотрицательных), по стандартным методикам (например, в жидкой культуре или на агаровых пластинках) путем контактирования культуры и бактериофага или полипептида по данному изобретению и мониторинга роста клеток после указанного контакта. Например, в жидкой культуре бактерии могут расти до оптимальной оптической плотности ("OD"), представляющей среднюю точку экспоненциального роста культуры; культуру приводят в контакт с одним или несколькими бактериофагами и/или полипептидами по данному изобретению в одной или нескольких концентрациях и отслеживают OD по сравнению с контрольной культурой. Снижение OD относительно контрольной культуры указывает на антибактериальную активность бактериофага и/или полипептида (например, литическую активность) Аналогично, колонии бактерий выращивают на агаровой пластинке, пластинку вводят в контакт с бактериофагом или полипептидом по данному изобретению и оценивают последующий рост колоний относительно контрольных пластинок. Уменьшившиеся в размере колонии или уменьшившееся общее число колоний указывает на антибактериальную активность бактериофага и/или полипептида.
Использованный здесь термин «домен СНАР» относится к консервативному домену амидазы, найденному в нескольких кодирующих бактериофаги пептигликангидролазах и также в «цистеин, гистидин-зависящих амидогидролазах/пептидазах». См., например, Rigden D, и др., Trends Biochem Sci. 2003 May 28(5): 230-4. Его находят в суперсемействе амидаз, включая GSP амидазу и пептидогликангидролазу. Семейство включает по меньшей мере два разных типа активности по отношению к расщеплению пептидогликана: активность L-мурамоил-L-аланинамидазы и D-аланилглицилэндопептидазы. Домены СНАР обычно содержат консервативные остатки цистеина и гистидина и гидролизуют γ-глютамилсодержащие субстраты. Считается, что эти остатки цистеина обуславливают активность некоторых этих амидаз и их тиольные группы по-видимому функционируют как нуклеофилы в механизме каталитического действия всех ферментов, содержащих этот домен. Домены СНАР часто находят в связи с другими доменами, которые расщепляют пептидогликан, например, действуя совместно в расщеплении специальных субстратов. См. также Bateman А, и др., Trends Biochem Sci. 2003 May 28(5): 234-7.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
ФИГУРА 1: Схема организации генома F168/08, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1. Открытые рамки считывания ("ORF"), предсказанные в геноме, показаны стрелками и черными цифрами. Направление стрелки показывает направление транскрипции. Цветовое кодирование: черный - открытые рамки считывания ORF, которым можно приписать функции на основе известных функций гомологических белков (открытые рамки считывания ORF, кодирующие продукты с гомологией с одинаковыми или близкими белками, указаны одними и теми же цифрами и различаются благодаря подстрочным буквам); серые - открытые рамки считывания ORF, кодирующие продукты, близкие к белкам с неизвестной функцией; белые или пустые - открытые рамки считывания, кодирующие белки, не обладающие заметной гомологией с белками в доступных базах данных. На фигуре также приведены функционально определенные рамки считывания ORF. Информация фигуры также включена в таблицу на фигуре 2.
ФИГУРЫ 2А-Х: Особенности генома бактериофага F168/08, включая продукты гена и отнесение предполагаемых функций. Фигура включает рамки ORF список генома и предлагает для каждой ORF (i) ее положение в геноме, (ii) кодируемую аминокислотную последовательность, (iii) список гомологических белков и консервативных доменов в кодируемом полипептиде и (iv) отнесение предполагаемых функций. Рамки ORF 1-116, приведенные на FIG. 2, кодируют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8-130 соответственно.
ФИГУРЫ 3А-В: Круг хозяев генома бактериофага F168/08 определен по результатам spot-теста штаммов 105 Enterococcus faecalis (EFS) (3А) и 56 Enterococcus faecium (EFM) (3В), выделенных из клинических образцов. Каждое пятно содержало 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами (приготовленной из очищенного с CsCl лизата). Чувствительность каждого штамма к бактериофагу оценивали на основании относительной шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к инфицированию бактериофагом указана как (-).
ФИГУРА 4: Схема организации генома F170/08, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2. Предсказанные в геноме открытые рамки считывания ORF показаны стрелками и черными цифрами. Направление стрелки указывает направление транскрипции. Цветовое кодирование: черный - открытые рамки считывания, которым можно приписать функции на основе известных функций гомологических белков (ORF, кодирующие продукты с гомологией к одинаковым или близким белкам, указаны одними и теми же цифрами и различаются с помощью подстрочных букв); серые - открытые рамки считывания, кодирующие продукты, близкие к белкам с неизвестной функцией; белые или пустые - рамки считывания, кодирующие белки, не обладающие заметной гомологией с белками в доступных базах данных. На фигуре также приведены функционально определенные рамки считывания. Информация фигуры также включена в таблицу на ФИГ. 5.
ФИГУРЫ 5A-AU: Особенности генома бактериофага F170/08, включая продукты гена и отнесение предполагаемых функций. Фигура включает список открытых рамок считывания ORF генома и предлагает для каждой ORF (i) ее положение в геноме, (и) кодируемую аминокислотную последовательность, (Hi) список гомологических белков и консервативных доменов в его кодируемом полипептиде и (iv) отнесение предполагаемых функций. Открытые рамки считывания ORF 1-213, приведенные на FIG. 5, кодируют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 131-343 соответственно.
FIGS. 6А-В: Круг хозяев F170/08 по данным spot-теста для штаммов 105 Enterococcus faecalis (EFS) (6А) и 56 Enterococcus faecium (EFM) (6B), выделенных из клинических образцов. Каждое пятно содержало 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами (приготовленного из очищенного с CsCl лизата). Чувствительность каждого штамма к бактериофагу оценивали на основании относительной шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к фагу указана как (-).
ФИГ. 7: Схема организации генома F770/05, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3. Открытые рамки считывания, предсказанные геномом, представлены стрелками и черными цифрами. Направление стрелки показывает направление транскрипции. Цветовое кодирование: черный - открытые рамки считывания ORF, которым можно приписать функции на основе известных функций гомологических белков (открытые рамки считывания, кодирующие продукты с гомологией к одинаковым или близким белкам, указаны одними и теми же цифрами и различаются благодаря подстрочным буквам); серые -открытые рамки считывания, кодирующие продукты, близкие к белкам с неизвестной функцией; белые или пустые - открытые рамки считывания, кодирующие белки, не обладающие заметной гомологией с белками в доступных базах данных. На фигуре также приведены функционально определенные рамки считывания. Информация фигуры также указана в таблице на ФИГ. 8.
ФИГУРЫ 8А-АЕ: Особенности генома бактериофага F770/05, включая продукты гена и отнесение предполагаемых функций. Фигура включает список открытых рамок считывания генома и предлагает для каждой рамки считывания (i) ее положение в геноме, (ii) кодируемую аминокислотную последовательность, (iii) список гомологических белков и консервативных доменов в его кодируемом полипептиде и (iv) отнесение предполагаемых функций. Открытые рамки считывания ORF 1-95, приведенные на ФИГ. 8, кодируют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 344-438, соответственно.
ФИГ. 9: Круг хозяев F770/05 по данным spot-теста с пятном в штамме 100 Pseudomonas aeruginosa (PSA), выделенном из клинических образцов. Каждое пятно содержало 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами (приготовленного из очищенного с CsCl лизата). Чувствительность каждого штамма к бактериофагу оценивали на основании относительной шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к фагу указана как (-).
ФИГ. 10: Схема организации генома F197/08, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4. Открытые рамки считывания, предсказанные в геноме, представлены стрелками и черными цифрами. Направление стрелки показывает направление транскрипции. Цветовое кодирование: черный - рамки считывания, которым можно приписать функции на основе известных функций гомологических белков (рамки считывания, кодирующие продукты с гомологией к одинаковым или близким белкам, указаны одними и теми же цифрами и различаются благодаря подстрочным буквам); серые -рамки считывания, кодирующие продукты, близкие к белкам с неизвестной функцией; белые или пустые - рамки считывания, кодирующие белки, не обладающие заметной гомологией с белками в доступных базах данных. На фигуре также приведены функционально определенные рамки считывания. Информация фигуры также включена в таблицу на ФИГ. 11.
ФИГУРЫ 11А-АА: Особенности генома бактериофага F197/08, включая продукты гена и отнесение предполагаемых функций. Фигура включает список рамок считывания генома и предлагает для каждой рамки считывания (i) ее положение в геноме, (ii) кодируемую аминокислотную последовательность, (Hi) список гомологических белков и консервативных доменов в кодируемом полипептиде и (iv) отнесение предполагаемых функций. Рамки считывания ORF 1-66, приведенные на ФИГ. 11, кодируют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 439-553 соответственно.
ФИГ. 12: Круг хозяев F197/08 по данным spot-теста с пятном в штамме 100 Staphylococcus aureus (STA), выделенном из клинических образцов. Каждое пятно содержало 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами (приготовленной из очищенного с CsCl лизата). Чувствительность каждого штамма к бактериофагу оценивали на основании относительной шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к фаговой инфекции обозначена как (-).
ФИГ. 13: Схема организации генома F86/06, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5. Рамки считывания, предсказанные геномом, представлены стрелками и черными цифрами. Направление стрелки показывает направление транскрипции. Цветовое кодирование: черный - рамки считывания, которым можно приписать функции на основе известных функций гомологических белков (рамки считывания, кодирующие продукты с гомологией к одинаковым или близким белкам, указаны одними и теми же цифрами и различаются благодаря подстрочным буквам); серые - рамки считывания, кодирующие продукты, близкие к белкам с неизвестной функцией; белые или пустые - рамки считывания, кодирующие белки, не обладающие заметной гомологией с белками в доступных базах данных. На фигуре также приведены функционально определенные рамки считывания. Информация фигуры также включена в таблицу на ФИГ. 14.
ФИГУРЫ 14A-U: Особенности генома бактериофага F86/06, включая продукты гена и отнесение предполагаемых функций. Фигура включает список рамок считывания генома и предлагает для каждой (i) ее положение в геноме, (ii) кодируемую аминокислотную последовательность, (iii) список гомологических белков и консервативных доменов в кодируемый полипептиде и (iv) отнесение предполагаемых функций. Рамки считывания ORF 1-63, приведенные на ФИГ. 14, кодируют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 554-616 соответственно.
ФИГ. 15: Круг хозяев F86/06 по данным spot-теста с пятном в штамме 100 Staphylococcus aureus (STA), выделенном из клинических образцов. Каждое пятно содержало 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами (приготовленной из очищенного с CsCl лизата). Чувствительность каждого штамма к бактериофагу оценивали на основании относительной шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к фаговой инфекции обозначена как (-).
ФИГ. 16: Схема организации генома F87s/06, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6. Рамки считывания, предсказанные геномом, представлены стрелками и черными цифрами. Направление стрелки показывает направление транскрипции. Цветовое кодирование: черный - рамки считывания, которым можно приписать функции на основе известных функций гомологических белков (рамки считывания, кодирующие продукты с гомологией к одинаковым или близким белкам, указаны одними и теми же цифрами и различаются благодаря подстрочным буквам); серые - рамки считывания, кодирующие продукты, близкие к белкам с неизвестной функцией; белые или пустые- рамки считывания, кодирующие белки, не обладающие заметной гомологией с белками в доступных базах данных. На фигуре также приведены функционально определенные рамки считывания. Информация фигуры также включена в таблицу на ФИГ. 17.
ФИГУРЫ 17A-V: Особенности генома бактериофага F87s/06, включая продукты гена и отнесение предполагаемых функций. Фигура включает список рамок считывания генома и предлагает для каждой рамки считывания (i) ее положение в геноме, (ii) кодируемую аминокислотную последовательность, (iii) список гомологических белков и консервативных доменов в кодируемом полипептиде и (iv) отнесение предполагаемых функций. Рамки считывания ORF 1-61, приведенные на ФИГ. 17, кодируют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 617-681, соответственно.
ФИГ. 18: Круг хозяев F87s/06 по данным spot-теста с пятном в штамме 100 Staphylococcus aureus (STA), выделенном из клинических образцов. Каждое пятно содержало 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами (приготовленного из очищенного с CsCl лизата). Чувствительность каждого штамма к бактериофагу оценивали на основании относительной шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к фаговой инфекции обозначена как (-).
ФИГ. 19: Схема организации генома F91a/06, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7. Рамки считывания, предсказанные геномом, представлены стрелками и черными цифрами. Направление стрелки показывает направление транскрипции. Цветовое кодирование: черный - рамки считывания, которым можно приписать функции на основе известных функций гомологических белков (рамки считывания, кодирующие продукты с гомологией к одинаковым или близким белкам, указаны одними и теми же цифрами и различаются благодаря подстрочным буквам); серые - рамки считывания, кодирующие продукты, близкие к белкам с неизвестной функцией; белые или пустые - рамки считывания, кодирующие белки, не обладающие заметной гомологией с белками в доступных базах данных. На фигуре также приведены функционально определенные рамки считывания. Информация фигуры также включена в таблицу на ФИГ. 20.
ФИГУРЫ 20A-U: Особенности генома бактериофага F91a/06, включая продукты гена и отнесение предполагаемых функций. Фигура включает список рамок считывания генома и предлагает для каждой рамки считывания (i) ее положение в геноме, (ii) кодируемую аминокислотную последовательность, (iii) список гомологических белков и консервативных доменов в кодируемом полипептиде и (iv) отнесение предполагаемых функций. Рамки считывания ORF 1-64, приведенные на ФИГ. 20, кодируют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 682-754, соответственно.
ФИГ. 21: Круг хозяев F91a/06 по данным spot-теста с пятном в штамме 100 Staphylococcus aureus (STA), выделенном из клинических образцов. Каждое пятно содержало 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами (приготовленного из очищенного с CsCl лизата). Чувствительность каждого штамма к бактериофагу оценивали на основании относительной шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к фаговой инфекции обозначена как (-).
ФИГ. 22: Схема организации генома F1245/05, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 760. Рамки считывания, предсказанные геномом 43kb, представлены стрелками и черными цифрами. Для функционально отнесенных рамки считывания номер заменен предсказанной функцией. Направление стрелки показывает направление транскрипции. Цветовое кодирование: черный - рамки считывания, которым можно приписать функции на основе гомологических белков; серые - рамки считывания, кодирующие продукты, близкие к белкам с неизвестной функцией; полосатые - рамки считывания с приписанными функциями на основе его положения относительного генома и присутствия предполагаемых доменов трансмембраны в кодируемом продукте; пустые стрелки - рамки считывания, кодирующие белки, не обладающие заметной гомологией с белками в базах данных.
ФИГУРЫ 23А-O: Показаны особенности генома бактериофага F1245/05, включая продукты гена и отнесение предполагаемых функций.
ФИГУРЫ 24А-Е: Предложен круг хозяев F1245/05 по данным spot-теста с пятном в штамме 100 Acinetobacter baumannii, выделенном из клинических образцов. Каждое пятно содержало 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами (приготовленной из очищенного с CsCl лизата). Чувствительность каждого штамма к бактериофагу оценивали на основании относительной шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к фаговой инфекции обозначена как (-).
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к выделенным бактериофагам и выделенным из них полипептидам с антибактериальной активностью по отношению к одному или нескольким видам или штаммам нозокомиальных патогенных бактерий А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и S. aureus. В одном варианте предложены выделенные бактериофаги или полипептиды, обладающие антимикробной и/или антибактериальной активностью по отношению к одному или нескольким штаммам S. aureus, устойчивым к метициллину (MRSA). Кроме того, бактериофаги или полипептиды по данному изобретению обладают антибактериальной и/или антимикробной активностью по отношению к одному или нескольким видам или штаммам патогенных бактерий, включая, но не ограничиваясь ими, S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosis, Micrococcus luteus, Bacilus subtilis, B. pumilus, E. hirae и E. avium.
В одном варианте данное изобретение предлагает бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1. Конкретным примером согласно этому варианту является выделенный бактериофаг F168/08, активный по отношению к ряду штаммов Е. faecalis и Е. faecium. Открытые рамки считывания (ORF) в геноме F168/08, аминокислотные последовательности, кодируемые ORF, и отнесение предполагаемых функций кодируемой аминокислотной последовательности (т.е. кодируемых белков и/или полипептидов) показаны на ФИГ. 2 (также показаны аминокислотные последовательности SEQ ID NOS: 8-130).
Enterococci представляют собой грамположительные сферические бактерии, которые образуют колонии в виде групп или цепочек. Их находят во флоре пищеварительного тракта многих млекопитающих, в том числе людей. Enterococcus инфекции составляют 12% всех нозокомиальных инфекций. Enterococcus могут вызвать осложненные абдоминальные инфекции, инфекции кожи и кожных структур, инфекции мочевых путей и инфекции кровяного потока, которые с трудом поддаются лечению, особенно в случаях, когда штамм обладает повышенной устойчивостью к нескольким антибиотикам. В этих примерах инфекция может угрожать жизни, особенно когда пациент уже страдает иммунодефицитом.
Enterococcus faecalis вызывает большинство Enterococci инфекций и является грамположительной комменсальной бактерией, обитающей в желудочно-кишечном тракте людей и других млекопитающих. Они неподвижны и иногда анаэробны. Е. faecalis могут вызвать эндокардит, а также инфекции легких, простаты и эпидимальные инфекции, включая инфекции, угрожающие жизни людей, особенно в нозокомиальной среде. Е. faecalis устойчивы ко многим распространенным антимикробным препаратам (таким, как, например, аминогликозиды, азтреоны, цефалоспорины, клиндамицин, полусинтетические пенициллины нафциллин и оксациллин, триметопримсульфаметоксазол и т.п.).
Известно, что Enterococcus faecium устойчивы к некоторым типам антибиотиков, включая хинолоны и аминогликозиды. Известны также штаммы Е. Faecium, устойчивые к ванкомицину. Устойчивость к некоторым антибиотикам и толерантность к неблагоприятным условиям привели к тому, что Е. faecium стал одной из главных проблем медицинского сообщества, которое назвало этот микроорганизм «супермикробом». В другом варианте изобретение предлагает бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Конкретным примером по изобретению является выделенный бактериофаг F170/08, который активен по отношению ко многим штаммам Е. faecalis и Е. faecium. Открытые рамки считывания (ORFs) в геноме F178/08, аминокислотные последовательности, кодируемые в ORFs, и отнесение предполагаемых функций кодируемых аминокислотных последовательностей (т.е. кодируемых белков и/или полипептидов) показаны на ФИГ. 5 (также показаны аминокислотные последовательности SEQ ID NOS: 131-343).
В еще одном варианте изобретение предлагает бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. Конкретным примером по изобретению является выделенный бактериофаг F770/05, который активен по отношению ко многим штаммам P. aeruginosa. Открытые рамки считывания (ORFs) в геноме F770/05, аминокислотные последовательности, кодируемых в ORFs, и отнесение предполагаемых функций кодируемых аминокислотных последовательностей (т.е. кодируемых белков и/или полипептидов) показаны на ФИГ. 8 (также показаны аминокислотные последовательности SEQ ID NOS: 344-438).
Pseudomonas aeruginosa является распространенной грамотрицательной бактерией в форме палочки, которую находят в почве, воде, на коже и во многих рукотворных средах. Она бурно разрастается не только в обычной атмосфере, но также при дефиците кислорода как анаэроб и может инфицировать поврежденные ткани или людей с ослабленным иммунитетом. Если такое размножение происходит в критических органах человека, таких как легкие, мочевые пути и почки, результаты могут быть фатальными. Поскольку она размножается на поверхностях, эту бактерию также находят на и внутри медицинского оборудования, включая катетеры, что вызывает перекрестные инфекции в больницах и клиниках. P. aeruginosa является одной из наиболее распространенных условно-патогенных нозокомиальных бактерий и, как было установлено, одной из десяти приобретаемых в больнице инфекций из группы Pseudomonas. P. aeruginosa также является наиболее распространенной причиной ожоговых инфекций и наиболее часто размножается в медицинских устройствах типа катетеров. В еще одном варианте изобретение предлагает бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. Конкретным примером по изобретению является выделенный бактериофаг F197/08, который активен по отношению ко многим штаммам S. aureus. Открытые рамки считывания (ORFs) в геноме F197/08, аминокислотной последовательности, кодируемые в ORFs, и отнесение предполагаемых функций кодируемых аминокислотных последовательностей (т.е. кодируемых белков и/или полипептидов) показаны на ФИГ. 11 (также показаны аминокислотные последовательности SEQ ID NOS:439-553).
В еще одном варианте изобретение предлагает бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5. Конкретным примером по изобретению является выделенный бактериофаг F86/06, который активен по отношению ко многим штаммам S. aureus. Открытые рамки считывания (ORFs) в геноме F86/06, аминокислотные последовательности, кодируемые в ORFs, и отнесение предполагаемых функций кодируемых аминокислотных последовательностей (т.е. кодируемых белков и/или полипептидов) показаны на ФИГ. 14 (также показаны аминокислотные последовательности SEQ ID NOS: 554-616).
В следующем варианте изобретение предлагает бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. Конкретным примером по изобретению является выделенный бактериофаг F87s/06, который активен по отношению ко многим штаммам S. aureus. Открытые рамки считывания (ORFs) в геноме F86s/06, аминокислотные последовательности, кодируемые в ORFs, и отнесение предполагаемых функций кодируемых аминокислотных последовательностей (т.е. кодируемых белков и/или полипептидов) показаны на ФИГ. 17 (также показаны аминокислотные последовательности SEQ ID NOS:617-681).
В еще одном варианте изобретение предлагает бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. Конкретным примером по изобретению является выделенный бактериофаг F91a/06, который активен по отношению ко многим штаммам S. aureus. Открытые рамки считывания (ORFs) в геноме F91a/06, аминокислотные последовательности, кодируемые в ORFs, и отнесение предполагаемых функций кодируемых аминокислотных последовательностей (т.е. кодируемых белков и/или полипептидов) показаны на ФИГ. 20 (также показаны аминокислотные последовательности SEQ ID NOS:682-754).
S. aureus представляет собой сферическую, иногда анаэробную, грамположительную бактерию, которая часто является частью кожной флоры и живет в носу и на коже. S. aureus может вызвать ряд заболеваний от небольших кожных инфекций типа прыщей до гастроэнтерита, угрожающих жизни болезней типа пневмонии, менингита, остеомиэлита, эндокардита, токсического шокового синдрома (TSS), бактеремии и сепсиса. Она является одной из пяти наиболее распространенных причин нозокомиальных инфекций и часто причиной постхирургических раневых инфекций. Сегодня S. aureus приобрела устойчивость ко многим часто применяемым антибиотикам, и было установлено, что только 2% всех изолятов S. aureus чувствительны к пенициллину. Для лечения инфекций, вызванных устойчивыми к пенициллину S. aureus, были разработаны пенициллины второго поколения, такие как метициллин, оксациллин, клоксациллин и флуклоксациллин. Метициллин был первым антибилтиком этого класса, который начали применять, но уже через два года был опубликован первый пример S. aureus (MRSA), устойчивых к метициллину. С 1990-ых годов был отмечен взрыв распространения MRSA в больницах, который сейчас рассматривают как эндемию.
В еще одном варианте изобретение предлагает бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 760. Конкретным примером по этому варианту является выделенный бактериофаг F1245/05, который активен по отношению ко многим штаммам А. baumannii. Открытые рамки считывания (ORFs) в геноме F1245/05, аминокислотные последовательности, кодируемые в ORFs, и отнесение предполагаемых функций кодируемых аминокислотных последовательностей (т.е. кодируемых белков и/или полипептидов) показаны на ФИГ. 23 (также показаны аминокислотные последовательности SEQ ID NOS: 761-816).
Acinetobacter baumannii относится к числу бактерий, которые вызывают различные тяжелые клинические инфекции, особенно у людей с ослабленной иммунной системой. Acinetobacter baumannii является плеоморфной аэробной грамотрицательной бациллой, которую обычно выделяют из больничной среды и нозокомиализированных пациентов. Бактерия часто проникает через открытые раны на теле, катетеры или дыхательные трубки. Acinetobacter baumannii обычно размножается в водной среде и часто ее выделяют из мокроты нозокомиализированных пациентов или респираторных секреций, ран и мочи. В больнице Acinetobacter baumannii обычно размножается в растворах для орошения и внутривенных растворах. Известно также, что она устойчива ко многим антибиотикам и число нозокомиальных инфекций, вызываемых A. baumanni, в последние годы выросло.
В некоторых вариантах бактериофаг по данному изобретению содержит или состоит из генома с последовательностью, идентичной по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 760, причем бактериофаг проявляет по меньшей мере одну биологическую активность, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность), присущую одному или нескольким бактериофагам F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06, F91a/06 и F1245/05. Альтернативно или вдобавок к этому бактериофаг по данному изобретению может содержать геном, содержащий функциональный фрагмент нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 760, включая последовательности любых открытых считывающих рамок, приведенные на ФИГУРАХ 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 и 23.
Настоящее изобретение также предлагает выделенные бактерии, инфицированные одним или несколькими бактериофагами по изобретению. В некоторых вариантах изобретение предлагает выделенные Е. faecalis или Е. faecium, инфицированные бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2. В других вариантах изобретение предлагает выделенные Р. aeruginosa, инфицированные бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:3. В следующих вариантах изобретение предлагает выделенные S. aureus, инфицированные бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 6 и/или SEQ ID NO: 7. В еще других вариантах изобретение предлагает выделенные А. baumannii, инфицированные бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 760.
Данное изобретение предлагает способы получения и выделения бактериофага с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 760. В некоторых вариантах изобретение предлагает способ получения и/или выделения бактериофага с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, включающий (i) получение культуры Е. faecalis или Е. faecium, (ii) инфицирование ее бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2; (iii) наблюдение за размножением культуры до заметного уровня лизиса и (iv) выделение бактериофага из культуры. В других вариантах изобретение предлагает способ получения и/или выделения бактериофага с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, включающий (i) получение культуры P. aeruginosa, (ii) инфицирование ее бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) наблюдение за размножением культуры до заметного уровня лизиса и (iv) выделение бактериофага из культуры. В еще нескольких вариантах изобретение предлагает способ получения и/или выделения бактериофага с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7, включающий (i) получение культуры S. aureus, (ii) инфицирование ее бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7; (iii) наблюдение за размножением до заметного уровня лизиса культуры и (iv) выделение бактериофага из культуры. В следующих вариантах изобретение предлагает способ получения и/или выделения бактериофага с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 760, включающий (i) получение культуры А. baumannii, (ii) инфицирование ее бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 760; (iii) наблюдение за размножением до заметного уровня лизиса культуры и (iv) выделение бактериофага из культуры.
th
Бактериофаг можно выделить из бактериального образца любым способом, описанным здесь или известным в данной области (см., например, Carlson, "Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches," In, Kutter and Sulakvelidze (Eds) Bacteriophages: Biology and Applications, 5 ed. CRC Press (2005); включенные здесь ссылкой во всей полноте).
Настоящее изобретение также предлагает полипептиды, выделенные из бактериофагов по изобретению. Выделенные полипептиды могут представлять собой непроцессированные белки бактериофагов или фрагменты, разновидности или производные белков бактериофагов, причем фрагменты, разновидности или производные белков бактериофагов обладают по крайней мере одним видом биологической активности, обусловленной бактериофагом или полипептидом, из которого они получены. В некоторых вариантах полипептиды по изобретению выделяют из бактериофага F1245/05 (которым обычно инфицируют А. baumannii), F168/08 или F170/08 (которым обычно инфицируют Е. faecalis и/или Е. faecium), бактериофага F770/05 (которым обычно инфицируют P. aeruginosa) или бактериофага F197/08, F86/06, F87s/06 или F91a/06 (которым обычно инфицируют S. aureus).
В конкретных вариантах полипептид по данному изобретению представляет собой эндолизин, который выделен из бактериофага с геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 760 (например, бактериофага F168/08, F170/08, F197/08, F86/06, F87s/06, F91a/06, или F1245/05 соответственно). В конкретных вариантах полипептид по изобретению представляет собой эндолизин или лизин с аминокислотной последовательностью, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 или SEQ ID NO: 712. В других вариантах выделенный полипептид по изобретению представляет собой фрагмент, вариант или производное эндолизина или лизина, выделенных из бактериофага по изобретению, причем фрагмент, вариант или производное обладают по меньшей мере одним видом биологической активности, предпочтительно антибактериальной активностью (например, литической активностью) эндолизина, лизина или бактериофага, из которого он был выделен или получен. Соответственно в некоторых вариантах изобретение предлагает выделенные полипептиды, которые являются фрагментами, разновидностями или производными эндолизинов или лизинов, выделенных из бактериофагов по изобретению, причем фрагменты, разновидности или производные проявляют антибактериальную или антимикробную активность (например, литическую активность) по отношению к одному или нескольким видам бактерий из А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium или S. aureus. В других вариантах выделенные полипептиды, которые являются фрагментами, разновидностями или производными эндолизинов или лизинов, выделенных из бактериофагов по изобретению, проявляют антибактериальную или антимикробную активность (например, литической активностью) по отношению к одному или нескольким видам бактерий, отличных от А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium или S. aureus (например, P. aeruginosa). В некоторых вариантах полипептид по изобретению содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202 или SEQ ID NO: 203 или ее фрагмента, разновидности или производного, причем полипептид проявляют антибактериальную или антимикробную активность по отношению к Е. faecalis или Е. faecium. В других вариантах полипептид по изобретению содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 или SEQ ID NO: 712, или ее фрагмента, разновидности или производного, причем полипептид проявляют антибактериальную или антимикробную активность по отношению к S. aureus. В еще других вариантах полипептид по изобретению содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 798 или ее фрагмента, разновидности или производного и проявляет антибактериальную или антимикробную активность по отношению к A. baumanni.
В некоторых вариантах полипептид по данному изобретению содержит или состоит из домена СНАР, выделенного из эндолизина или лизина бактериофага F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 или F91a/06. Было показано, что выделенные домены СНАР сохраняют антибактериальную активность, например, литическую активность, эндолизина или лизина, из которых они выделены; домены СНАР можно идентифицировать и выделить обычными способами, известными в данной области (см., например, Rigden et al., 2003, Trends Biochem. Sci. 28:230-234; Bateman et al., 2003, Trends Biochem. Sci. 28:234-237, обе работы включены здесь ссылкой во всей полноте). В конкретных вариантах полипептид по изобретению содержит или состоит из домена СНАР, выделенного из полипептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 или SEQ ID NO: 712. В конкретных вариантах изобретение предлагает выделенный полипептид, который содержит или состоит из домена СНАР, полученного из вторичного полипептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 или SEQ ID NO: 712, причем домен CHAP содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758 или SEQ ID NO: 759 соответственно. Т.е. SEQ ID NO: 755 соответствует домену CHAP, полученному из полипептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 756 соответствует домену CHAP, полученному из полипептида с последовательностью SEQ ID NO: 446 и т.д. В других вариантах изобретение предлагает фрагмент, вариант или производное домена СНАР, выделенного из эндолизина или лизина бактериофага F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 или F91a/06, причем фрагмент, вариант или производное проявляют по меньшей мере один вид биологической активности, например, литическую активность, обусловленную доменом СНАР, из которого он был получен, причем указанный домен СНАР содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758 или SEQ ID NO: 759. Аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 755-SEQ ID NO: 759 показаны в таблице 1.
В некоторых вариантах полипептид по данному изобретению содержит или состоит из белка «рулетки» (tape measure protein), определяющего длину хвостового отростка, или белка хвостового отростка (например, компонента хвостового отростка, белка хвостовой фибриллы, белка хвостового отростка, связанного с адсорбцией) или его фрагмента, выделенного из бактериофага с геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 760 (например, бактериофага F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06, F9la/06 или F1245/05 соответственно), причем белок «рулетка» хвостового отростка или белок хвостового отростка либо его фрагмент обладают биологической функцией, обусловленной бактериофагом, из которого он получен, например, антимикробной или антибактериальной активностью (например, литической активностью). В конкретных вариантах белок «рулетка» хвостового отростка или белок хвостового отростка обладает антимикробной или антибактериальной активностью по отношению по меньшей мере к одному или нескольким видам или штаммам А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и/или S. aureus. В конкретных вариантах полипептид по данному изобретению представляет собой белок «рулетка» хвостового отростка или белок хвостового отростка с аминокислотной последовательностью, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 или SEQ ID NO: 796. В других вариантах выделенный полипептид по изобретению представляет собой фрагмент, вариант или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO:61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 или SEQ ID NO: 796, причем фрагмент, вариант или производное обладают по меньшей мере одним видом биологической активности или функцией бактериофага, из которого он выделен или получен, например, антимикробной или антибактериальной активностью (например, литической активностью). В предпочтительных вариантах по меньшей мере один вид биологической активности или функции фрагмента, разновидности или производного направлены на один или несколько штаммов Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus и/или А. baumannii.
В некоторых вариантах данного изобретения выделенный полипептид является вариант полипептида бактериофага и содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичной второй аминокислотной последовательности той же длины (т.е. состоящей из такого же количества аминокислотных остатков), причем вторая аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 796 или SEQ ID NO: 798 и/или их фрагмент, причем указанный вариант проявляет по меньшей мере один вид биологической функции или активности бактериофага, из которого она была получена (например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность)) по отношению к одному или нескольким штаммам бактерий (например, грамположительных бактерий (например, Е. faecalis, Е. faecium, S. aureus), грамотрицательных бактерий (например, P. aeruginosa, А baumannii) или бактерий, не относящихся к числу грамположительных или грамотрицательных).
В некоторых вариантах данное изобретение предлагает выделенный полипептид с любой аминокислотной последовательностью из SEQ ID NOS: 2-124, SEQ ID NOS: 126-338, SEQ ID NOS: 340-434, SEQ ID NOS: 436-550, SEQ ID NOS: 552-614, SEQ ID NOS: 616-680, SEQ ID NOS: 682-759, SEQ ID NOS: 761-816 и его активные биологические фрагменты. В предпочтительных вариантах вариант полипептида по изобретению обладает по меньшей мере одним видом биологической активности, обусловленной полипептидом или бактериофагом, из которого он был выделен или получен, по меньшей мере по отношению к одному или нескольким штаммам Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus и/или А. baumannii.
В других вариантах изобретение предлагает выделенную нуклеотидную последовательность, кодирующую одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOS: 8-130, SEQ ID NOS: 131-343, SEQ ID NOS: 344-438, SEQ ID NOS: 439-553, SEQ ID NOS: 554-616, SEQ ID NOS: 617-681, SEQ ID NOS: 682-759, SEQ ID NOS: 761-816, и ее активный фрагмент. В других вариантах изобретение предлагает нуклеотидную последовательность любой из открытых рамок считывания, показанных на ФИГУРАХ 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 и 23.
В некоторых вариантах полипептиды по настоящему изобретению рекомбинируют или химически связывают (включая ковалентное и нековалентное взаимодействие) с терапевтическими реагентами, например, с различными полипептидами или малыми молекулами с образованием гибридных белков или гибридных полипептидов. Прямое связывание не является необходимым, и его можно осуществить с помощью последовательных линкеров или путем химического сопряжения. Неограничивающие примеры терапевтических реагентов, с которыми можно сопрягать полипептиды по данному изобретению, включают пептидные или непептидные цитотоксины (включая антимикробные средства и антибиотики), молекулы с меченым атомом/маркером (например, радионуклиды и фторофоры) и другие антибиотики и антибактериальные соединения, известные в данной области.
6.1. КОМПОЗИЦИИ АНТИБИОТИКОВ
Выделенные бактериофаги или полипептиды по настоящему изобретению можно назначать отдельно или в составе фармацевтической композиции для лечения или профилактики бактериальных инфекций, например, инфекций, вызванных бактериями, включая, но не ограничиваясь ими, А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и S. aureus. Полипептиды можно объединять с фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом или стабилизатором. Примеры фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов или стабилизаторов включают, но не ограничиваются ими, буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин и желатин; гидрофильные полимеры типа поливинилпирролидона; аминокислоты типа глицина, глютамина, аспарагина, аргинина или лизина; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатные реагенты типа ЭДТА; гидроксилсодержащие сахара типа маннита или сорбита; солеобразующие противоионы типа натрия и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, полиэтиленгликоль (PEG) и PLURONICS™. Помимо указанных ингредиентов фармацевтическая композиция по настоящему изобретению (например, антибактериальная композиция) может также включать смазку, увлажнитель, подсластитель, отдушку, эмульгатор, суспендирующий реагент и консервант.
Бактериофаги и/или полипептиды по настоящему изобретению можно также объединять с одним или несколькими терапевтическими и/или профилактическими реагентами, применяемыми для лечения бактериальной инфекции, как здесь описано и/или как известно в данной области (например, одним или несколькими лизинами). Поэтому фармацевтические композиции по изобретению могут включать два или несколько выделенных бактериофагов по изобретению (с антибактериальной активностью по отношению к тем же или другим видам или штаммам бактерий), комбинацию бактериофага и полипептида по изобретению или комбинацию бактериофага и/или терапевтического полипептида, известного в данной области. В конкретных вариантах терапевтические компоненты комбинации активны по отношению к двум или нескольким видам или штаммам бактерий или проявляют различную ферментативную активность. Например, лизины в целом проявляют активность типа амидазы или эндопептидазы либо мурамидазы или глюкозамидазы. Соответственно комбинация лизинов различной активности может проявить синергетическое повышение терапевтической активности фармацевтической композиции по изобретению.
Примеры других терапевтических реагентов, которые можно использовать в комбинации с полипептидом по данному изобретению, включают, но не ограничиваются этим, стандартные антибиотики, противовоспалительные реагенты, антивирусные реагенты, местные анестетики и кортикостероиды.
Стандартные антибиотики, которые можно использовать в фармацевтических композициях, содержащих полипептиды по изобретению, включают, но не ограничиваются этим, амикацин, гентамицин, канамицин, неомицин, нетилмицин, паромоммицин, родострептомицин, стрептомицин, тобрамицин, апрамицин, рифамицин, нафтомицин, мупиоцин, гелданамицин, анзамитоцин, карбацефемы, имипенем, меропенем, эртапенем, фаропенем, дорипенем, панипенем/бетамипрон, биапенем, PZ-601, цефалоспорины, цефацетрил, цефадроксил, цефалексин, цефалоглицин, цефалоний, цефалоридин, цефалотин, цефапирин, цефатризин, цефазафлур, цефазедон, цефазолин, цефрадин, цефроксадин, цефтезол, цефаклор, цефоницид, цефпроцил, цефуроксим, цефузонам, цефметазол, цефотетан, цефокситин, цефкапен, цефдолоксим, цефдинир, цефдиторен, цефетамет, цефиксим, цефменоксим, цефтерам, цефтибутен, цептиофур, цефтиолен, цефтизоксим, цефтриаксон, цефоперазон, цефтазидим латамоксеф, цефклидин, цефепим, цефлупренам, цефоселис, цефозопран, цефпиром, цефхином, фломоксеф.цефтобипрол, азитромицин, кларитромицин, диритромицин, эритромицин, рокситромицин, азтреонам, пенициллин и производные пенициллина, актиномицин, бацитрацин, колистин, полимиксин В, циноксацин, флюмехин, налидиксовая кислота, оксолиновая кислота, пиромидиновая кислота, пипемидовая кислота, розоксацин, ципрофлоксацин, эноксацин, флероксацин, ломефлоксацин, надифлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин, перфлоксацин, руфлоксацин, балофлоксацин, гатифлоксацин, грепафлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, пазуфлоксацин, спарфлоксацин, темафлоксацин, тозуфлоксацин, клинафлоксацин, гареноксацин, гемифлоксацин, стифлоксацин, тровалфлоксацин, прулифлоксацин, ацетазоламид, бензоламид, буметанид, целекоксиб, хлорталидон, клопамид, дихлорфенамид, дорзоламид, этоксизоламид, фуросемид, гидрохлоротиазид, индапамид, мафендид, мефрузид, метолазон, пробенецид, сульфацетамид, сульфадиметоксин, сульфадоксин, сульфаниламиды, сульфаметоксазол, сульфасалазин, султиам, суматриптан, ксипамид, тетрациклин, хлортетрациклин, окситетрациклин, доксициклин, лимециклин, меклоциклин, метациклин, миноциклин, ролитетрациклин и любые их комбинации в количествах, эффективных в дополнительном или синергетическом увеличении терапевтического эффекта бактериофага или полипептида по изобретению по отношению к данной инфекции.
Локальные анестетики, которые можно использовать в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, включают тетракаин, тетракаин гидрохлорид, лидокаин, лидокаин гидрокаин, диметизокин гидрохлорид, дибукаин, дибукаин гидрохлорид, бутамбенпикрат и прамоксин гидрохлорид. Примерная концентрация локального анестетика составляет примерно 0.025-5 масс. % от всей композиции.
Кортикостериоды, которые можно использовать в комбинации с полипептидами, фагом и/или в фармацевтических композициях по изобретению, включают бетаметазон, дипропионат, флюоцинолон, актинид, бетаметазон валерат, триамцинолон актинид, клобетазол пропионат, дезоксиметазон, дифлоразон диацетат, амцинонид, флурандренолид, гидрокортизон валерат, гидрокортизон бутират и дезонид. Примерная концентрация кортикостероида составляет примерно 0.01-1 масс. % от всей композиции.
4
2
В некоторых вариантах препарат, содержащий бактериофаг и/или полипептид по изобретению, включает также SM-буфер (0.05 М Трис-HCl буфер (рН 7.4-7.5); 0.1 М NaCl; 10 мМ MgSO). В других вариантах препарат также включает SM-буфер и 10 мМ MgCl. В еще одних вариантах препарат также содержит SM-буфер и примерно 20% или примерно 30% этанола.
Фармацевтические композиции, содержащие бактериофаг и/или полипептид по настоящему изобретению, можно составлять в виде одной дозы или многих доз. Подходящий полипептид по настоящему изобретению можно вводить в одной дозе или многих дозах. Подходящие препараты можно выбрать из группы, состоящей из мазей, растворов, суспензий или эмульсий, экстрактов, порошков, гранул, спреев, лепешек, таблеток или капсул, и кроме того они включают диспергатор или стабилизатор.
Фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить в виде ингаляции, суппозитория или пессария, местно (например, в виде лосьона, раствора, крема, мази или распыляемого порошка) эпи- или чрескожно (например, с использованием кожного пластыря), перорально (например, в виде таблеток, которые могут содержать эксципиенты типа крахмала или лактозы), в виде капсул, суппозиториев, эликсиров, растворов или суспензий (каждый необязательно содержит отдушки, красители и/или эксципиенты), или их можно вводить парентерально (например, внутривенно, внутримышечно или подкожно). При парентеральном введении лучше всего использовать композиции в виде стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, соли или моносахариды, благодаря которым раствор изотоничен крови. При введении в полость рта или под язык композиции могут быть в виде традиционных таблеток или лепешек. В предпочтительном варианте бактериофаг и/или полипептид по настоящему изобретению вводят местно либо в виде одного реагента, либо в комбинации с другими антибиотиками, как здесь описано или известно в данной области.
Бактериофаг и/или полипептид по настоящему изобретению можно также вводить на кожу или через кожу. Для местного применения на кожу бактериофаги и/или полипептиды по настоящему изобретению можно объединять с одним носителем или с комбинацией носителей, которые включают, но не ограничиваются этим, водную жидкость, спиртовую жидкость, водорастворимый гель, лосьон, мазь, неводную жидкость, минеральное масло, смесь минерального масла и вазелина, ланолин, липосомы, белковые носители типа сывороточного альбумина или желатина, порошок целлюлозы и их комбинации. Способ местного введения включает мазок, спрей, пластырь пролонгированного действия, впитывающую влажную салфетку и их комбинации. Бактериофаг и/или полипептид по изобретению можно нанести на пластырь или бандаж либо непосредственно, либо в составе одного из носителей. Пластыри могут быть влажными или сухими, причем бактериофаг и/или полипептид (например, лизин) на нем находится в лиофилизованной форме. Носители для местных композиций могут содержать полутвердые или желеобразные переносчики, которые включают полимерный загуститель, воду, консерванты, активные поверхностно-активные вещества или эмульгаторы, антиоксиданты, светозащитные средства и растворитель или систему смешанных растворителей. В патенте США №5863560 описано много различных комбинаций, способствующих контакту кожи с медикаментом, и его содержание здесь включено.
Для введения бактериофага и/или полипептида в нос или ингаляцией их получают в виде сухого порошка или аэрозольного спрея из контейнера под давлением, насоса, спрея или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, частично фторированного алкана, такого как 1,1,1,2-тетрафторэтан (HFA 134А.ТМ.) или 1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан (HFA 227ЕА.ТМ.), диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением дозу можно определить, подав из крана отмеренное количество. Контейнер под давлением, насос, спрей или распылитель могут содержать раствор или суспензию активного соединения, например, смесь этанола и пропеллента в качестве растворителя, который может дополнительно содержать смазку, например, сорбитан триолеат. Капсулы и картриджи (например, желатиновые), используемые в ингаляторах или аппаратах для вдувания, могут содержать смесь порошков бактериофага и/или полипептида по изобретению и подходящую порошковую основу типа лактозы или крахмала.
Для введения в форме суппозитория или пессария терапевтические композиции можно нанести местно в виде геля, гидрогеля, лосьона, раствора, крема, мази или пылящего порошка. Композиции по изобретению можно также вводить в глаз. Для использования в офтальмологии композиции по изобретению готовят в виде микронных суспензий в изотоническом стерильном растворе соли с заданным рН или, предпочтительно, в виде растворов в изотоническом стерильном растворе соли с установленным рН, необязательно в комбинации с консервантом типа бензалконий хлорида. Альтернативно их можно приготовить в мази типа вазелина.
Дозы и необходимые лекарственные концентрации фармацевтических композиций по настоящему изобретению можно варьировать в зависимости от конкретного применения. Нужную дозировку или способ введения определяет врач как специалист в данной области. Эксперименты на животных могут дать надежные ориентиры при определении эффективных доз в терапии людей. Межвидовое масштабирование эффективных доз проводит специалист в данной области, руководствуясь принципами, описанными Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" in Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp42-96.
ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
Бактериофаги и полипептиды по настоящему изобретению обладают активностью по отношению ко многим штаммам Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus и/или А. baumannii, как показано на ФИГУРАХ 3А-В, 6А-В, 9, 12, 15, 18, 21 и 23. Поэтому композиции по настоящему изобретению можно использовать для профилактики и лечения инфекций, вызванных Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus и/или А. baumannii, как у людей, так и у животных. В других вариантах композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения инфекций, связанных с родственными видами или штаммами бактерий, в том числе, но не ограничиваясь этим, S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosis, Micrococcus luteus, Bacilus subtilis, B. pumilus, E. hirae и/или одним или несколькими штаммами А. baumannii, например, одним или несколькими штаммами, приведенными на ФИГ. 24.
В конкретных вариантах субъект, получающий фармацевтическую композицию по данному изобретению, является млекопитающим (например, корова, овца, коза, непарнокопытное животное, примат, (например человек), грызун, кролик или птица (например, цыплята, утки, гуси)). В контексте настоящего изобретения «лечение» относится к терапевтическому лечению, когда объект воздействия надо удалить, сократить, уменьшить его неблагоприятное воздействие, замедлить прогрессирование или предупредить симптомы основной причины (например, бактериальной инфекции), связанной с патологическим состоянием или недомоганием. «Лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или упреждающим мерам, когда объект надо удалить, сократить, уменьшить его неблагоприятное воздействие, замедлить прогрессирование, или устранить или упредить симптомы основной причины (например, бактериальной инфекции), вызывающей патологическое состояние или недомогание. Предполагается также, что бактериофаг и/или полипептид по данному изобретению действует как профилактическая или защитная мера, с тем чтобы предотвратить начало инфекции, вызванной одной или несколькими бактериями.
А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и S. aureus ответственны на многие тяжелые условно-патогенные инфекции, в частности у пациентов с ослабленной иммунной системой. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предназначены для лечения любой инфекции, вызванной другими видами или штаммами бактерий, в том числе, но не ограничиваясь этим, A. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa или S. aureus, или вызванной другими видами или штаммами бактерий, включая, но не ограничиваясь этим, инфекции кожи (включая, но не ограничиваясь этим, кожные язвы, пролежни и диабетическую стопу), инфекций в окружающих ранах, постоперационных инфекций, инфекций, связанных с катетерами и хирургическими дренажами, и инфекций крови.
А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и S. aureus также вызывают инфекции в различных органах с высоким содержанием жидкости, и предполагается, что бактериофаги и/или полипептиды по изобретению будут использовать в терапии и профилактике таких инфекций. Например, фармацевтические композиции по изобретению можно использовать для профилактики и лечения инфекций дыхательных путей, спинномозговой жидкости, жидкости брюшной полости и мочевых путей. Композиции по изобретению можно также использовать для предупреждения и/или лечения нозокомиальной пневмонии, инфекций, обусловленных непрерывным амбулаторным диализом брюшной полости (CAPD), бактериурии в результате использования катетеров и нозокомиального менингита.
В предпочтительном варианте бактериофаг и/или полипептид по изобретению используют профилактически в больницах, в частности для предупреждения инфекций, связанных с ранами, язвами и порезами на коже при катетеризации и многих других медицинских процедурах или применении различных устройств.
В некоторых вариантах бактериофаг и/или полипептид по данному изобретению применяют в качестве одного реагента для лечения или профилактики инфекций, вызванных А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus или другими бактериальными формами. В других вариантах бактериофаг и/или полипептид по изобретению используют в комбинации с другими реагентами, включая другие бактериофаги (например, активные по отношению к различным видам или штаммам бактерий) или антибиотики, эффективные по отношению к тем же или другим видам бактерий, включая бактерии, выбранные из любых грамположительных бактерий, любых грамотрицательных бактерий и любых других бактерий, которые не относятся к числу грамположительных или грамотрицательных. Композиции по данному изобретению можно также применять в комбинации с любыми другими средствами лечения бактериальной инфекции, известными специалистам в этой области.
Данное изобретение также охватывает способы профилактики и лечения инфекции, вызванной бактериями, в том числе, но не ограничиваясь этим, Е. faecalis, Е. faecium, Р. aeruginosa, S. aureus и/или А. baumannii, включающие введение млекопитающему, который в этом нуждается, композиции, содержащей лизин, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641, ID. NO: 712 и/или SEQ ID NO: 798, или ее фрагмента, разновидности или производного, причем фрагмент, вариант или производное обладает антибактериальной или антимикробной активностью по отношению к видам бактерий, из которых родительский бактериофаг был выделен. В конкретном примере по данному изобретению изобретение предлагает способ профилактики или лечения инфекций, вызванных бактериями, в том числе, но не ограничиваясь этим, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus и/или А. baumannii, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей выделенный домен СНАР лизина или его фрагмент, вариант или производное, который проявляет по меньшей мере один вид биологической активности домена СНАР, из которого он был выделен (например, литическую активность). В некоторых вариантах выделенный домен СНАР содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758 или SEQ ID NO: 759. В других вариантах изобретение предлагает способы профилактики и лечения инфекции, вызванной бактериями, в том числе, но не ограничиваясь ими, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus и/или А. baumannii, включающие введение млекопитающему, который в этом нуждается, композиции, содержащей длинномерный или белок хвостового отростка, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 и/или SEQ ID NO: 796, или ее фрагмента, разновидности или производного, причем фрагмент, вариант или производное обладает биологической активностью, обусловленной родительским бактериофагом. В еще других вариантах изобретение предлагает способы профилактики и лечения инфекции, вызванной бактериями, в том числе, но не ограничиваясь этим, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus и/или А. baumannii, включающие введение млекопитающему, который в этом нуждается, композиции, содержащей бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 760. Также предполагаются комбинации лизинов (или их фрагментов, разновидностей или производных, как описано выше) и длинномерных или концевых белков (или их фрагментов, разновидностей или производных, как описано выше) необязательно с одним или несколькими бактериофагами по изобретению или другим лечением, например, антибиотиками, так же как способы лечения и способы профилактики бактериальной инфекции с использованием одной или нескольких описанных здесь комбинаций.
Использованный здесь термин «в комбинации» относится к применению более чем одного профилактических и/или терапевтических агентов. Использование термина «в комбинации» не ограничивает порядок, в котором профилактические и/или терапевтические агенты вводятся субъекту с заболеванием или расстройством. Первый профилактический или терапевтический агент можно ввести субъекту заболеванием или расстройством до (например, за 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель), вместе или после (например, спустя 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель) введения второго профилактического или терапевтического агента (отличного от первого профилактического и/или терапевтического агента).
ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИЕ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ СРЕДСТВА
Патогенные бактерии чаще всего инфицируют центры на слизистых оболочках (например, в верхних и нижних дыхательных путях, брюшинных, урогенитальных и глазных). Сами по себе слизистые оболочки часто являются резервуаром, иногда единственным резервуаром, для многих патогенных бактерий, которые живут в окружающей среде (например, пневмококков, стафилококков и стрептококков). Известны несколько антибактериальных препаратов, разработанных для контроля носительства патогенных бактерий. Однако данные исследований показали, что путем уменьшения или удаления такого резервуара в окружающей среде, например, больнице и доме престарелых, можно заметно сократить частоту возникновения инфекций.
Бактериофаги и/или полипептиды по настоящему изобретению можно использовать в антибактериальных композициях для регулирования роста бактерий (например, грамположительных бактерий (например, Е. faecalis, Е. faecium, S. aureus), грамотрицательных бактерий (например, P. aeruginosa, А. baumannii) или бактерий, не относящихся к числу грамположительных или грамотрицательных), с тем чтобы предотвратить или уменьшить частоту возникновения серьезных инфекций. Помимо использования в композициях для нанесения на слизистые оболочки, бактериофаг и/или полипептид по настоящему изобретению можно включать в состав препаратов, таких как гели, кремы, мази или спреи, для регулирования или предотвращения размножения бактерий на поверхностях тела (например, на коже и слизистых оболочках) (например, для стерилизации хирургического поля или рук и доступных участков кожи медицинского персонала и/или пациентов) и других твердых поверхностях (например, приборах, столешницах и в частности больничном оборудовании).
СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ
Настоящее изобретение также включает диагностические способы для определения причинного компонента бактериальной инфекции. В некоторых вариантах диагностирование возбудителя заболевания в проявлении бактериальной инфекции проводят путем (i) культивирования тканевых, кровяных или жидкостных образцов, взятых у пациента, по стандартной методике, (ii) контактирования культуры с одним или несколькими бактериофагами и/или полипептидами по изобретению и (iii) мониторинга роста клеток и доказательством лизиса после указанного контактирования. Поскольку активность бактериофагов и/или выделенных из них продуктов (например, полипептидов или их биологически активных фрагментов, разновидностей или производных) специфична для каждого вида или штамма, то чувствительность или отсутствие чувствительности к одному или нескольким бактериофагам и/или полипептидам по данному изобретению может указывать на вид или штамм инфицирующих бактерий. Например, пониженный рост тестовых культур после контактирования с бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или с выделенным из полипептида продуктом может указывать на то, что тестовый образец содержит Е. faecalis или Е. faecium. Аналогично бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, или выделенный из него полипептид можно использовать для идентификации инфекции, вызванной P. aeruginosa; бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 760, или выделенный из него полипептид можно использовать для идентификации инфекции, вызванной А. baumannii, в то же время бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7, и выделенный из него полипептид можно использовать для идентификации инфекции, вызванной S. aureus.
АМИНОКИСЛОТНЫЕ ВАРИАНТЫ
Варианты аминокислотных последовательностей в полипептидах по данному изобретению можно выбирать таким образом, чтобы они были заменяемыми, внедряемыми (инсерционными) или удаляемыми. В варианте с удалением аминокислот теряется один или несколько остатков нативного белка, которые не существенны для его функционирования (например, для антимикробной или антибактериальной активности). Инсерционные мутанты обычно участвуют в присоединении материала в нетерминальной точке полипептида.
Заменяемые варианты обычно предполагают замену одной аминокислоты на другую в одном или нескольких центрах белка, и их составляют для модуляции одного или нескольких свойств полипептида, таких как устойчивость к протеолитическому расщеплению без потери других функций и свойств. Предпочтительно, чтобы такие замены были консервативными, т.е. одну аминокислоту заменяют на кислоту с близкой формой и зарядом. Консервативные замены хорошо известны в данной области и включают, например, замену аланина на серии; аргинина на лизин, аспарагина на глютамин или гистидин; аспартата на глютамат; цистеина на серии; глютамина на аспарагин; глютамата на аспартат; глицина на пролин; гистидина на аспарагин или глютамин; изолейцина на лейцин или валин; лейцина на валин или изолейцин; лизина на аргинин; метионина на лейцин или изолейцин; фенилаланина на тирозин, лейцин или метионин; серина на треонин; треонина на серии; триптофана на тирозин; тирозина на триптофан или фенилаланин и валина на изолейцин или лейцин.
К числу важнейших участков гена относятся те, которые кодируют особый белок лизин, как здесь описано, и для идентификации того, какие аминокислотные остатки ответственны за антибактериальную активность, можно применить точечный мутагенез. Таким образом, специалист в данной области сможет произвести единичные базовые замещения в нити ДНК, которые приведут к измененному кодону и миссенс-мутации.
Предпочтительно, чтобы мутация аминокислот белка приводила к эквивалентной или даже улучшенной молекуле второго поколения. Например, некоторые аминокислоты в структуре белка можно заменить на другие без заметной потери функции (например, антибактериальной или антимикробной активности). При таких заменах надо рассматривать индекс гидрофобности аминокислот. Важность индекса гидрофобности аминокислот для интерактивной биологической функции белка в целом известна в данной области. Считают, что относительный гидрофобная природа аминокислоты вносит вклад во вторичную структуру конечного белка, которая в свою очередь определяет взаимодействие белка с другими молекулами, например, взаимодействие с пептидогликаном в наружной оболочке грамположительной бактерии. Каждой аминокислоте был приписан индекс гидрофобности на основе их гидрофобности и зарядов; например: изолейцин(+4.5); валин(+4.2); лейцин(+3.8); фенилаланин(+2.8); цистеин/цистин(+2.5); метионин(+1.9); аланин(+1.8); глицин(-0.4); треонин(-0.7); серин(-0.8); триптофан 0.9); тирозин(-1.3); пролин(-1.6); гистидин(-3.2); глютамат(-3.5); глютамин(-3.5); аспартат (-3.5); аспарагин (-3.5); лизин (-3.9); и аргинин(-4.5).
Также известно в данной области, что замещение подобных аминокислот можно эффективно провести на основе гидрофильности. Так же, как в случае гидрофобности, каждой аминокислоте можно приписать значения гидрофильности: аргинин (+3.0); лизин (+3.0); аспартат (+3.0+1); глютамат (+3.0+1); серии (+0.3); аспарагин (+0.2); глютамин (+0.2); глицин (0); треонин (-0.4); пролин (-0.5+1); аланин (-0.5); гистидин (-0.5); цистеин (-1.0); метионин (-1.3); валин (-1.5); лейцин (-1.8); изолейцин (-1.8); тирозин (-2.3); фенилаланин (-2.5) и триптофан (-3.4). Эквивалентные молекулы можно получить замещением одной аминокислоты на другую, когда их индексы гидрофильности составляют +2, предпочтительно +1 или наиболее предпочтительно +5 по отношению друг к другу. В некоторых вариантах изобретение включает выделенные пептиды, которые содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более модификаций аминокислот (например, в результате внедрения, замещения, удаления и т.д.) относительно описанной здесь последовательности аминокислот. В предпочтительных вариантах проводят мутации при сохранении биологической активности конкретного полипептида. Например, предлагаемое изобретение включает полипептиды, выделенные из бактериофага F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 и/или F91a/06, которые мутируют и получают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более модификаций аминокислот относительно приведенной здесь аминокислотные последовательности, которые обладают антибактериальной активностью по отношению к одному или нескольким видам или штаммам грамположительных или грамотрицательных бактерий, например, А. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и/или S. aureus. В конкретных вариантах полипептиды по данному изобретению, полученные из бактериофага F168/08 или F/170/08, проявляют антибактериальную или антимикробную активность, например, литическую активность, по отношению по меньшей мере к Е. faecalis и/или Е. faecium; полученные из F770/05 - по отношению по меньшей мере к P. aeruginosa; полученные из F197/08, F86/06, F87s/06 или F91a/06 - по отношению по меньшей мере к S. aureus; и полученные из F1245/05 - по отношению к А. baumannii.
ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ, КОДИРУЮЩИЕ ПОЛИПЕПТИДЫ ПО ДАННОМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ
Настоящее изобретение предлагает полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по изобретению. Изобретение также включает полинуклеотиды, которые гибридизуются в строгих, промежуточных или менее строгих условиях, т.е. в условиях, описанных выше с полинуклеотидами, которые кодируют полипептид по изобретению и кодируют модифицированные полипептиды, обладающие антибиотической и/или другой биологической активностью.
th
Можно получать полинуклеотиды и определять нуклеотидную последовательность в полинуклеотидах любым способом, известным в данной области. Например, полинуклеотид, кодирующий полипептид по данному изобретению, можно получить из нуклеиноволй кислоты, взятой из подходящего источника (например, бактериофага F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F197/08, F86/06, F87s/06 или F91a/06). Последовательности нуклеотидов можно выделить из геномов бактериофагов обычными способами, известными в данной области (см., например, Carlson, "Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches," In, Kutter and Sulakvelidze (Eds) Bacteriophages: Biology and Applications, 5 ed. CRC Press (2005); включенные здесь ссылкой во всей полноте). Если источник нуклеиновой кислоты, кодирующей конкретный полипептид, не доступен, но аминокислотная последовательность в полипептиде по изобретению известна, нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, можно синтезировать химически и клонировать в реплицируемые векторы клонирования любым способом, хорошо известным в данной области.
Как только нуклеотидная последовательность полипептида по данному изобретению определена, можно сознательно менять последовательность нуклеотидов способами, хорошо известными в данной области, например, с помощью рекомбинантных ДНК, сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и т.п.(см., например, методики, описанные в Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, которые включены здесь ссылкой во всей полноте), для получения полипептидов с различной аминокислотной последовательностью, например, заменой аминокислот, их удалением и/или внедрением.
В другом варианте изобретение предлагает следующую нуклеотидную последовательность: нуклеотидную последовательность от нуклеотида 1 до нуклеотида 85 в последовательности SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 87 до нуклеотида 584 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 594 до нуклеотида 767 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 724 до нуклеотида 1035 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 1005 до нуклеотида 1823 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 1816 до нуклеотида 2130 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 2132 до нуклеотида 2383 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 2383 до нуклеотида 3690 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 3687 до нуклеотида 4469 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 4466 до нуклеотида 5458 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 5632 до нуклеотида 7956 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 8010 до нуклеотида 8912 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 8915 до нуклеотида 9262 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 9252 до нуклеотида 10223 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 10213 до нуклеотида 10782 в SEQ ID NO :760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 10769 до нуклеотида 11218 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 11202 до нуклеотида 11420 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 11413 до нуклеотида 12342 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 12339 до нуклеотида 12515 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 12512 до нуклеотида 13165 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 13170 до нуклеотида 15599 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 15609 до нуклеотида 15872 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 15979 до нуклеотида 16173 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 16175 до нуклеотида 16482 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 16494 до нуклеотида 18059 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 18072 до нуклеотида 18815 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 18857 до нуклеотида 19879 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 19930 до нуклеотида 20178 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 20180 до нуклеотида 20545 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 20646 до нуклеотида 21203 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 21212 до нуклеотида 23506 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 23506 до нуклеотида 24186 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 24201 до нуклеотида 27068 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 27084 до нуклеотида 30212 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 30214 до нуклеотида 32505 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 32515 до нуклеотида 32880 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 32873 до нуклеотида 33460 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 33460 до нуклеотида 33816 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 33825 до нуклеотида 35777 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 35774 до нуклеотида 35872 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 35869 до нуклеотида 36027 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 36038 до нуклеотида 36193 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 36916 до нуклеотида 36788 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 37209 до нуклеотида 37427 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 37868 до нуклеотида 38386 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 38383 до нуклеотида 38586 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 38912 до нуклеотида 39406 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 39406 до нуклеотида 39915 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 39917 до нуклеотида 40021 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 40018 до нуклеотида 40101 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 40101 до нуклеотида 40670 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 40720 до нуклеотида 41838 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 41822 до нуклеотида 42127 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 42105 до нуклеотида 42308 в SEQ ID NO: 760; нуклеотидную последовательность от нуклеотида 42382 до нуклеотида 42912 в SEQ ID NO: 760; и нуклеотидную последовательность от нуклеотида 42896 до нуклеотида 43015 в SEQ ID NO: 760.
РЕКОМБИНАНТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ МОЛЕКУЛ ПО ДАННОМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ
Как только определена нуклеотидная последовательность, кодирующая молекулу по изобретению (например, полипептид), можно создать вектор для формирования молекул методом рекомбинантной ДНК, хорошо известным в данной области. Хорошо известные специалистам в данной области способы можно использовать для конструирования векторов экспрессии, содержащих кодирующие последовательности для молекул по изобретению и соответствующих сигналов транскрипционного и трансляционного контроля. Эти способы включают, например, in vitro методики рекомбинантных ДНК, методики синтеза и генетическую рекомбинацию in vivo. (См., например, методики, описанные в Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
Настоящее изобретение предлагает векторы экспрессии, кодирующие полипептиды по изобретению. Вектор экспрессии, включающий нуклеотидную последовательность в молекуле, идентифицированной способами по изобретению, можно перенести на клетку-хозяина по традиционным методикам (например, методами электропорации, липосомальной трансфекции и осаждением фосфатом кальция) и затем культивировать трансфицированные клетки по традиционным методикам для получения молекул по данному изобретению. В предпочтительных вариантах клетка-хозяин отличается от родительской бактерии, из которой был получен бактериофаг, содержащий полученную последовательность. В особых вариантах экспрессию молекул по изобретению регулируют с помощью конститутивного, индуцируемого или ткане-специфичного промотора. В конкретных вариантах вектором экспрессии является pQE-30 (Qiagen) или рЕТ-29(а) (Novagen).
Клетки-хозяева, используемые для экспрессии молекул, идентифицированных способами по данному изобретению, могут быть любыми бактериальными клетками (не чувствительными к белку бактериофага по изобретению или его фрагменту), например, Escherichia coli. Для экспрессии молекул, идентифицированных способами по данному изобретению, можно использовать разнообразные векторные системы экспрессии генов. Такие системы экспрессии генов представляют собой переносчики, с помощью которых можно получать и затем очищать кодируемые последовательности молекул по изобретению, но они также представляют клетки, которые будучи трансформированы и трансфектированы с помощью соответствующих кодирующих последовательностей нуклеотидов могут экспрессировать молекулы по изобретению in situ. Они включают, но не ограничиваются ими, микроорганизмы, в том числе бактерии, которые не чувствительны к белку бактериофага по изобретению или его фрагменту (например, Е. coli и В. subtilis), трансформированные с помощью рекомбинантного бактериофага ДНК, плазмидной ДНК или космидных векторов экспрессии ДНК, содержащих кодирующие последовательности молекул, идентифицированных способами по изобретению; дрожжи (например, Saccharomyces Pichia), трансформированные с помощью рекомбинантных векторов экспрессии дрожжей, содержащих последовательности, кодирующие молекулы, идентифицированные способами по изобретению; системы клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными векторами экспрессии вируса (например, бакуловируса), содержащими последовательности, кодирующие молекулы, идентифицированные способами по изобретению; системы клеток растений, инфицированных рекомбинантными векторами экспрессии вируса (например, мозаичного вируса цветной капусты (CaMV) и мозаичного вируса табака (TMV)) или трансформированных с помощью рекомбинантных векторов экспрессии плазмидов (например, Ti плазмида), содержащих последовательности, кодирующие молекулы, идентифицированные способами по изобретению; или системы клеток млекопитающих (например, COS, СНО, ВНК, 293, 293Т, 3Т3 cells, лимфатические клетки (см. патент США 5807715), Per С. 6 клетки (человеческие клетки сетчатки, открытые Crucell), укрывающие конструкции рекомбинантной экспрессии, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотора металлотеонеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; или 7.5K промотор вируса осповакцины).
В бактериальных системах, не чувствительных к белку бактериофага по изобретению или его фрагменту, можно с успехом выбрать много векторов экспрессии в зависимости от использования экспрессированной молекулы. Например, когда надо получить большое количество такого белка для изготовления фармацевтических композиций полипептида, желательны векторы, которые направляют экспрессию с высокой концентрацией рекомбинантных белков, которые легко очищать. Такие векторы включают, но не ограничиваются этим, вектор экспрессии pUR278 Е. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), в котором последовательность белка можно лигировать по отдельности на вектор в рамке с кодирующей областью lac Z и получить рекомбинантный белок; векторы pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); и т.п. Вектор также можно использовать для экспрессии чужеродных полипептидов, таких как рекомбинантные белки с глютатион S-трансферазой (GST). Обычно такие рекомбинантные белки растворимы и их легко очистить от лизированных клеток путем адсорбции и связывания с гранулами глютатион-агарозы в матрице с последующим элюированием в присутствии свободного глютатиона. Векторы pGEX нужны для того, чтобы включить центры расщепления протеазы под действием тромбина или фактора Ха, чтобы продукты клонированного гена могли высвободиться из фрагмента GST.
В системах насекомых в качестве вектора экспрессии чужеродных генов используют вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV). Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующую полипептид последовательность можно клонировать отдельно в несущественных участках (например, в гене полиэдрина) вируса и поместить под контролем промотора AcNPV (например, промотора полиэдрина).
После проведения рекомбинантной экспрессии молекул по изобретению (т.е. полипептидов) их можно очистить любым известным в данной области способом очистки полипептидов, например, хроматографией (например, ионным обменом, аффинной хроматографией и гель-фильтрацией), центрифугированием, методом дифференциальной растворимости или любым другим стандартным методом очистки полипептидов или антител.
После ознакомления с приведенным описанием специалистам в данной области будут очевидны некоторые модификации и усовершенствования. Следует понимать, что все такие модификации и усовершенствования, точно соответствующие объему последующей формулы, не были здесь включены по соображениям краткости и удобства чтения.
ПРИМЕРЫ
Приведенные примеры и варианты служат лишь для иллюстрации, и специалисты в данной области могут предложить различные модификации или изменения, которые можно включить в рамках смысла и объема данной заявки и приложенной формулы. Все упомянутые публикации, патенты и патентные заявки для всех целей включены ссылками во всей полноте.
Если не указано другое, бактериофаги по изобретению выделяли, обрабатывали и анализировали следующими способами.
СПОСОБЫ
ОЧИСТКА БАКТЕРИОФАГА
th
Исходные препараты бактериофага, выделенного из клинических образцов, готовили по методикам, описанным в Carlson, "Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches," In, Kutter and Sulakvelidze (Eds) Bacteriophages: Biology and Applications, 5 ed. CRC Press (2005) ("Carlson," включенный здесь ссылкой во всей полноте).
4
Исходные препараты бактериофага концентрировали осаждением PEG согласно методике, описанной в Carlson and Yamamoto et al., 2004, PNAS 101:6415-6420. Препарат инкубировали в 1 M NaCl в течение часа при 4°С и перемешивании. Затем постепенно добавили PEG 8000 (AppliChem, Cheshire, MA) до конечной концентрации 10% (масса/объем). После этого композицию инкубировали в течение суток при 4°С.После инкубационного периода композицию центрифугировали при 10000 х g в течение 30 мин при 4°С. Осадок затем снова суспендировали в SM-буфере (0.05 М Трис-HCl при рН 7.4, 0.1 М NaCl, 10 мМ MgSO) с желатином в концентрации 1% (масса/объем) и снова центрифугировали при 1000 об/мин при 4°С в течение 10 мин. Супернатант, содержащий суспендированный бактериофаг, сохраняли для дальнейшей очистки. Супернатант очищали, используя градиент CsCl, согласно методикам Carlson.
CsCl удалили из очищенного и сконцентрированного бактериофага диализом. Мембрану для диализа Cellu.Sep HI High Grade Regenerated Cellulose Tubular Membrane (Cellu.Sep, River Street, USA) готовили по инструкциям производителей. Диализ состоял из первой инкубации в течение 30 мин в 100 мМ Трис-HCl и 3М NaCl (рН 7.4) при 4°С. Затем последовала вторая инкубация в течение 30 мин в 100 мМ Трис-HCl и 0.3М NaCl (рН 7.4) при 4°С. После диализа суспендированный бактериофаг извлекли из сосуда для диализа и хранили при 4°С.
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ БАКТЕРИОФАГА
К 5 мл образцов очищенного и сконцентрированного бактериофага добавили 20 мМ ЭДТА при рН 8.0, SDS при 0.5% (масса/объем) и Протеиназу K до конечной концентрации 40 мкг/мл. Смесь инкубировали при 56°С в течение часа. Провели последовательные экстракции фенолом:хлороформом:спиртом в соотношении 25:24:1 до тех пор, пока граница раздела между водной и органической фазами не стала прозрачной. Затем водную фазу обработали равным объемом хлороформа и центрифугировали при 130000 х g в течение 10 мин при 4°С. Водную фазу снова удалили и осадили ДНК, добавив два объема абсолютного этанола с последующей инкубацией в течение тридцати минут при 20°С. Затем образцы центрифугировали при 11000 х g в течение 30 мин при 4°С. Таблетку осадка промыли 70% этанолом при комнатной температуре и снова суспендировали в 50 мкл сверхчистой воды (Gibco, California). Концентрацию ДНК определили, измеряя поглощение при 260 нм на спектрофотометре ND-1000. Целостность выделенной ДНК анализировали с помощью электрофореза на 1% агарозном геле.
АНАЛИЗ ГЕНОМОВ БАКТЕРИОФАГА
Секвенирование генома бактериофага позволило идентифицировать потенциальные открытые рамки считывания (ORF) в геноме. Предполагаемые ORF бактериофагов использовали для поиска базы данных NCBI коллекции нуклеотидов для гомологических последовательностей ДНК с помощью программы BLASTN (см., например, Zhang et al., 2000, J. Comput. Biol. 7:203-214).
ПРИМЕР 1: Бактериофаг F168/08
Сравнение предполагаемых ORF генома бактериофага F168/08 с последовательностями в базе данных NCBI для нуклеотидов показало, что только малые части генома (≤1%) обладают гомологией с известными последовательностями. Рамки считывания бактериофага F168/08, их кодируемые аминокислотные последовательности и известные гомологические белки приведены на ФИГ. 2. Открытые рамки считывания предсказаны путем интегрирования результатов, полученных GeneMark.hmm и по программам MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Поиски гомологии белков провели с помощью программы BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) с использованием базы данных NCBI для неповторяющихся последовательностей белков. Консервативные домены белков предсказаны с помощью специализированной программы BLAST от NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Открытые рамки считывания, чьи продукты обнаружили гомологию с теми же белками, показаны на ФИГ. 2 теми же цифрами, к которым добавлена подстрочная буква. Предполагаемые транспортные РНК (tRNA) идентифицировали с помощью программы tRNAscan-SE (Lowe, Т.М. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 955-964).
На ФИГУРАХ 3А-В представлены результаты spot-тестов для оценки активности бактериофага F168/08 по отношению к 105 штаммам Enterococcus faecalis (А) и 56 штаммам Enterococcus faecium (В), выделенным из клинических образцов. Каждое пятно состояло из 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами, приготовленной из очищенного с CsCl лизата. Чувствительность к фагу представлена в виде шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к бактериофаговой инфекции обозначена как (-).
ПРИМЕР 2: Бактериофаг F170/08
Сравнение предполагаемых ORF генома бактериофага F170/08 с последовательностями базы данных NCBI по нуклеотидам показало, что примерно 94% его генома очень близки к геному фага Enterococcus OEF24C при идентичности индивидуальных ORF в интервале 80-100%. Открытые рамки считывания бактериофага F170/08, их кодируемые аминокислотные последовательности и известные гомологические белки приведены на ФИГ. 5. Открытые рамки считывания предсказаны путем интегрирования результатов, полученных GeneMark.hmm и по программам MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Поиски гомологии белков провели с помощью программы BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) с использованием базы данных NCBI для неповторяющихся последовательностей белков. Консервативные домены белков предсказаны с помощью специализированной программы BLAST от NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Открытые рамки считывания, продукты которых обнаружили гомологию с теми же белками, показаны на ФИГ. 5 теми же цифрами, к которым добавлена подстрочная буква. Идентификацию предполагаемых транспортных РНК (tRNA) провели с помощью программы tRNAscan-SE (Lowe, Т.М. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 955-964).
На ФИГУРАХ 6A-B представлены результаты spot-тестов для оценки активности бактериофага F170/08 по отношению к 105 штаммам Enterococcus faecalis (А) и 56 штаммам Enterococcus faecium (В), выделенным из клинических образцов. Каждое пятно состояло из 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами, приготовленной из очищенного с CsCl лизата. Чувствительность к фагу представлена в виде шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к бактериофаговой инфекции обозначена как (-).
ПРИМЕР 3: Бактериофаг F770/05
Сравнение предполагаемых ORF генома бактериофага F770/05 с последовательностями нуклеотидов в базе данных NCBI показало, что только малые части генома (<1%) обладали гомологией с известными последовательностями. Открытые рамки считывания бактериофага F770/05, их кодируемые аминокислотные последовательности и известные гомологические белки приведены на ФИГ. 8. Открытые рамки считывания предсказаны путем интегрирования результатов, полученных GeneMark.hmm и по программам MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Поиски гомологии белков провели с помощью программы BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) с использованием базы данных NCBI для неповторяющихся последовательностей белков. Консервативные домены белков предсказаны с помощью специализированной программы BLAST от NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240).
На ФИГ. 9 представлены результаты spot-тестов для оценки активности бактериофага F170/05 по отношению к 100 штаммам Pseudomonas aeruginosa, выделенным из клинических образцов. Каждое пятно состояло из 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами, приготовленной из очищенного с CsCl лизата. Чувствительность к фагу представлена в виде шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к бактериофаговой инфекции обозначена как (-).
ПРИМЕР 4: Бактериофаг F197/08
Сравнение предполагаемых ORF генома бактериофага F197/08 с последовательностями нуклеотидов в базе данных NCBI показало, что геном в высшей степени гомологичен многим геномам стафилококковых фагов. В частности, примерно 90% генома F197/08 очень близки к геному бактериофага Staphylococcus phiSauS-IPLA35, причем индивидуальная идентичность ORF составляет 80-98%. Открытые рамки считывания бактериофага F197/08, их кодируемые аминокислотные последовательности и известные гомологические белки приведены на ФИГ. 11. Открытые рамки считывания предсказаны путем интегрирования результатов, полученных GeneMark.hmm и по программам MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Поиски гомологии белков провели с помощью программы BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) с использованием базы данных NCBI для неповторяющихся последовательностей белков. Консервативные домены белков предсказаны с помощью специализированной программы BLAST от NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Открытые рамки считывания, продукты которых обнаружили гомологию с теми же белками, обозначены на ФИГ. 11 теми же цифрами, к которым добавлена подстрочная буква.
На ФИГ. 12 представлены результаты spot-тестов для оценки активности бактериофага F197/08 по отношению к 100 штаммам Staphylococcus aureus, выделенным из клинических образцов. Каждое пятно состояло из 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами, приготовленной из очищенного с CsCl лизата. Чувствительность к фагу представлена в виде шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к бактериофаговой инфекции обозначена как (-).
ПРИМЕР 5: Бактериофаг F86/06
Сравнение предполагаемых ORF генома бактериофага F86/06 с последовательностями нуклеотидов в базе данных NCBI показало, что геном в высшей степени гомологичен многим геномам стафилококковых фагов. В частности, примерно 80% генома F86/06 очень близки к геному бактериофага Staphylococcus tp310-1, причем индивидуальная идентичность ORF составляет 85-100%. Открытые рамки считывания бактериофага F86/06, их кодируемые аминокислотные последовательности и известные гомологические белки приведены на ФИГ. 14. Открытые рамки считывания предсказаны путем интегрирования результатов, полученных GeneMark.hmm и по программам MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Поиски гомологии белков провели с помощью программы BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) с использованием базы данных NCBI для неповторяющихся последовательностей белков. Консервативные домены белков предсказаны с помощью специализированной программы BLAST от NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240).
На ФИГ. 15 представлены результаты spot-тестов для оценки активности бактериофага F86/06 по отношению к 100 штаммам Staphylococcus aureus, выделенным из клинических образцов. Каждое пятно состояло из 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами, приготовленной из очищенного с CsCl лизата. Чувствительность к бактериофагу представлена в виде шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к бактериофаговой инфекции обозначена как (-).
ПРИМЕР 6: Бактериофаг F87s/06
Сравнение предполагаемых ORF генома бактериофага F87s/06 с последовательностями нуклеотидов по базе данных NCBI показало, что геном в высшей степени гомологичен многим геномам стафилококковых фагов. В частности примерно 82% генома F87s/06 очень близки к геному бактериофага Staphylococcus ФNM3, причем индивидуальная идентичность ORF составляет 90-100%. Открытые рамки считывания бактериофага F87s/06, их кодируемые ими аминокислотные последовательности и известные гомологичные белки приведены на ФИГ. 17. Открытые рамки считывания предсказаны путем интегрирования результатов, полученных GeneMark.hmm и по программам MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920;
Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Поиски гомологии белков провели с помощью программы BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) с использованием базы данных NCBI для неповторяющихся последовательностей белков. Консервативные домены белков были предсказаны с помощью специализированной программы BLAST от NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Открытые рамки считывания, продукты которых обнаружили гомологию с теми же белками, обозначены на ФИГ. 17 теми же цифрами, к которым добавлена подстрочная буква.
На ФИГ. 18 представлены результаты spot-тестов для оценки активности бактериофага F87s/06 по отношению к 100 штаммам Staphylococcus aureus, выделенным из клинических образцов. Каждое пятно состояло из 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами, приготовленной из очищенного с CsCl лизата. Чувствительность к фагу представлена в виде шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к бактериофаговой инфекции обозначена как (-).
ПРИМЕР 7: Бактериофаг F91a/06
Сравнение предполагаемых ORF генома бактериофага F91a/06 с последовательностями нуклеотидов в базе данных NCBI показало, что геном в высшей степени гомологичен многим геномам стафилококковых фагов. В частности, примерно 82% генома F91a/06 очень близки к геному бактериофага Staphylococcus ФNM3, причем индивидуальная идентичность ORF составляет 86-99%. Открытые рамки считывания бактериофага F91a/06, их кодируемые аминокислотные последовательности и известные гомологические белки приведены на ФИГ. 20. Открытые рамки считывания предсказаны путем интегрирования результатов, полученных GeneMark.hmm и по программам MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Поиски гомологии белков провели с помощью программы BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) с использованием базы данных NCBI для неповторяющихся последовательностей белков. Консервативные домены белков предсказаны с помощью специализированной программы BLAST от NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Открытые рамки считывания, продукты которых обнаружили гомологию с теми же белками, обозначены на ФИГ. 20 теми же цифрами, к которым добавлена подстрочная буква
На ФИГ. 21 представлены результаты spot-тестов для оценки активности бактериофага F91a/06 по отношению к 100 штаммам Staphylococcus aureus, выделенным из клинических образцов. Каждое пятно состояло из 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами, приготовленной из очищенного с CsCl лизата. Чувствительность к фагу представлена в виде шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к бактериофаговой инфекции обозначена как (-).
ПРИМЕР 8: Бактериофаг F1245/05
Открытые рамки считывания бактериофага F1245/05, кодируемые в них аминокислотные последовательности и известные гомологические белки приведены на ФИГУРАХ 23A-I. Открытые рамки считывания предсказаны путем интегрирования результатов, полученных GeneMark.hmm и по программам MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Поиски гомологии белков провели с помощью программы BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) с использованием базы данных NCBI для неповторяющихся последовательностей белков. Консервативные домены белков предсказаны с помощью специализированной программы BLAST от NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Функция белка была предсказана на основе локализации соответствующего гена и присутствия предполагаемых трансмембранных доменов в кодируемом продукте (ТМНММ сервер v. 2.0; Krogh, A. et al., 2001. J. Mol. Biol., 305: 567-580.
На ФИГУРАХ 24 A-E представлены результаты spot-тестов для оценки активности бактериофага F1245/05 по отношению к 100 штаммам Acinetobacter baumanni, выделенным из клинических образцов. Каждое пятно состояло из 5 мкл суспензии бактериофага с указанными титрами, приготовленной из очищенного с CsCl лизата. Чувствительность к бактериофагу представлена в виде шкалы от мутного (+) до прозрачного (++++) лизисного пятна. Устойчивость к бактериофаговой инфекции обозначена как (-).