Клеточная линия huFSHKKc6 - продуцент рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и способ получения ФСГ с использованием данной линии
CELL LINE HUFSHKKC6, PRODUCER OF RECOMBINANT HUMAN FOLLICLE STIMULATING HORMONE (FSH) AND METHOD FOR PRODUCING FSH USING SAID LINE

Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для получения рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) - аналога человеческого фолликулостимулирующего гормона.
Уровень техники
Фолликулостимулирующий гормон или фоллитропин (далее также указывается как ФСГ) - гетеродимерный белок, синтезируемый и секретируемый передней долей гипофиза, играющий ведущую роль в регуляции репродуктивной функции человека.
Мишенью действия гормона являются ФСГ-рецепторы, расположенные на поверхности гранулезных клеток или клеток Сертоли, при активации которых осуществляется регуляция роста фолликулов яичников в женском организме, а также регуляция сперматогенеза у мужчин. Недостаток эндогенного фоллитропина в организме является одной из причин бесплодия. ФСГ используют для лечения некоторых патологий в половой сфере, для корректировки ановуляции и во вспомогательных репродуктивных технологиях.
ФСГ относится к семейству гликопротеиновых гормонов, включающему также лютеинизирующий и тиреотропный гормоны передней доли гипофиза и гормон плаценты - хорионический гонадотропин. Гормоны этой группы состоят из двух нековалентно связанных α- и β-субъединиц, функционирующих только в составе димера. Первичные структуры α-субъединиц этих гормонов практически идентичны, а структуры β-субъединиц различаются более существенно и обеспечивают их специфическое взаимодействие с мембранными рецепторами клеток-мишеней. Аминокислотные последовательности зрелых α- и β-субъединиц ФСГ человека представлены в последовательностях SEQ ID NO: 2 (аминокислотные остатки 25-116) и SEQ ID NO: 4 (аминокислотные остатки 19-129) соответственно, при этом подчеркиванием в последовательностях SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 отмечены сигнальные пептиды, соответственно, α- и β-субъединиц ФСГ (аминокислотные остатки 1-24 и 1-18 последовательностей SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 соответственно). Сигнальные пептиды удаляются при посттрансляционном процессинге α- и β-субъединиц ФСГ и отсутствуют в составе зрелого гетеродимерного белка ФСГ. Нуклеотидные последовательности генов α- и β-субъединиц ФСГ (FSH α и FSH β соответственно) представлены в последовательностях SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3, при этом подчеркиванием в последовательностях SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3 отмечены нуклеотиды, кодирующие сигнальные пептиды α- и β-субъединиц ФСГ.
Олигосахаридные цепи в молекуле ФСГ присоединяются по остаткам аспарагина (Asn-52 и Asn-78 у α-субъединицы и Asn-7 и Asn-24 у β-субъединицы). Сборка молекулы ФСГ и ее гликозилирование осуществляются в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи клетки-продуцента ФСГ (Yongna Xing, Rebecca V. Myers, et al. Glycoprotein Hormone Assembly in the Endoplasmic Reticulum: I. The glycosylated end of human α-subunit loop 2 is threaded through a β-subunit hole. // "The Journal of Biological Chemistry", volume 279, №34, August 20, 2004, pp. 35426-35436). ФСГ секретируется клеткой в форме димера (34-45 кДа). Процесс гликозилирования приводит к образованию разных изоформ гормона (что является причиной формирования микрогетерогенности), различающихся составом углеводных цепей, который важен для биологической активности, т.к. влияет на связывание с рецепторами ФСГ и скорость клиренса. Углеводная часть рекомбинантного ФСГ составляет до 36% от общей массы. Для биологической активности важную роль играет трехмерная структура димера и пост-трансляционные модификации. Источником для получения ФСГ служит моча женщин в период постменопаузы, а также клетки-продуценты рекомбинантного человеческого ФСГ Препараты, полученные с использованием рекомбинантных технологий, характеризуются высокой степенью чистоты, низкой вариабельностью от серии к серии, отсутствием биологических примесей, а их производство не лимитирует объем исходного сырья, что делает их более доступными для медицинского применения. Препараты, содержащие ФСГ, разрешены к применению в России, при этом имеется 2 клинически одобренные разновидности: Гонал Ф (фоллитропин α), производимый Merk Serono S.A., и Пурегон (или фоллистим/ фоллитропин β), производимый NV Organon.
Известен способ получения фоллитропина α, основанный на создании двух плазмид, экспрессирующих α- и β-субъединицы ФСГ и котрансфекции данных плазмид в клетки яичника китайского хомячка, дефектные по дигидрофолатредуктазе (далее - СНО dhfr- клетки), описанный в работе Chappel, S.C. et al. (1992). "Expression of human gonadotropins by rDNA methods." In "Humans in Gynecological Endocrinology", Parthenon Press, Carnforth, UK, 179-184 и в патенте США US 5240832 А, опубл. 31.08.1993 (МПК: C07K 14/575, C07K 14/59, C12N 15/00, C12N 15/16, C12N 15/67, C12N 15/79, C12N 15/85, С12Р 21/04).
6
Согласно способу, предложенному Chappel, S.C. et al. (1992), первая плазмида содержит полноразмерный ген α-субъединицы (содержащий все экзоны и интроны) и ген дигидрофолатредуктазы (dhfr) как маркер для селекции и амплификации. Вторая плазмида содержит частичный ген β-субъединицы. Гены α и β клонируются из человеческой геномной библиотеки. Экспрессия генов субъединиц находится под контролем металлотеонеинового промотора (МТ), не являющегося наиболее сильным для экспрессии белков. Дизайн плазмид основан на предпосылке, что интроны содержат энхансерные элементы, способствующие повышению экспрессии белка. Для получения продукта клетки-продуценты культивируются в биореакторе на микроносителях как адгезионная культура. При данном способе уровень секреции ФСГ клетками-продуцентами в среднем составляет 1 пг/клетку в день, что соответствует 12,6 МЕ/10 клеток в день. Получение белка включает 5 стадий хроматографической очистки, в том числе аффинную хроматографию с использованием дорогостоящих ФСГ-специфичных моноклональных антител. В патенте отсутствует информация о стабильности продукции целевого белка, кроме того, культивирование клеток на микроносителях не является оптимальным способом промышленной наработки белков.
2+
7
6
Из публикации Olijve W.et al. (1996). Molecular biology and biochemistry of human recombinant follicle stimulating hormone. // Molecular Human Reproduction, 2(5), 371-382 известен способ получения рекомбинантного фоллитропина β, в соответствии с которым ген α-субъединицы ФСГ, включающий некоторые интроны, и кодирующую ДНК (кДНК) β-субъединицы ФСГ клонируют в вектор pKMS, созданный на основе вектора pBR327. Экспрессия генов находится под контролем раннего промотора SV40 и металлотеонеинового промотора МТ-II, соответственно. Отбор клонов с высокой копийностью генов ФСГ производят при помощи котрансфекции вспомогательной селекционной плазмиды pAG60/MT2, содержащей ген металлотеонеина, обеспечивающей резистентность к тяжелым металлам, и дальнейшей селекции в присутствии Cd. Продуктивность линии-продуцента при культивировании в биореакторе на микроносителях составляет 50-80 МЕ/мл в день при плотности 10/мл, что соответствует 5-8 МЕ/10 клеток в день. Очистку проводят с использованием анионо- и катионообменной, гидрофобной и эксклюзионной хроматографии. Данный способ обладает теми же недостатками, что и способ создания плазмид согласно патенту US 5240832 А, поскольку для него характерен выбор неоптимальных промоторов для экспрессии гетерологического белка, а также наличие возможных отрицательных элементов регуляции в присутствующих элементах интронов генов субъединиц ФСГ. Также не указана продолжительность стабильной экспрессии белка.
Известен из патента RU 2560596 С2, опубл. 20.08.2015 (МПК: C12N 15/63, C12N 15/16, C12N 15/79, C12N 5/10, С12Р 21/02) способ создания продуцента ФСГ с использованием клеток яичника китайского хомячка, трансформированных экспрессионной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий цепи α- и β-субъединиц фолликулостимулирующего гормона человека или индивидуальную цепь β-субъединицы ФСГ человека под контролем промотора и регуляторных элементов, функционирующих в эукариотической клетке. Для очистки белка согласно способу по патенту RU 2560596 С2 используют двухступенчатую схему, включающую последовательное применение катионообменной (Capto ММС) и аффинной хроматографии (Blue Sepharose FF).
Однако основной акцент в патенте RU 2560596 С2 сделан на создании экспрессионной системы для увеличения продуктивности линии. При этом предложенный в патенте RU 2560596 С2 способ получения рекомбинантного ФСГ не является оптимальным, поскольку требует культивирования клеток-продуцентов ФСГ в колбах Эрленмейера, что является недостаточным для наработки ФСГ в больших объемах. Также следует заметить, что, кроме электрофоретических данных, в патенте RU 2560596 С2 отсутствуют какие-либо другие доказательства чистоты целевого продукта, что при двухступенчатой схеме очистки, используемой согласно патенту RU 2560596 С2, недостаточно для оценки соответствия целевого продукта фармакопейным требованиям, а также для оценки возможности его использования в медицинских целях.
Из опубликованной заявки на патент США US 2009/0291473 A1, опубл. 26.11.2009 (МПК: С12Р 21/06) известен способ создания линии клеток яичника китайского хомячка - продуцента ФСГ. Согласно способу по US 2009/0291473 A1, для экспрессии ФСГ кодирующие ДНК (кДНК) субъединиц ФСГ клонируют в вектор pEhygr, при этом кДНК α-субъединицы ФСГ получают путем полимеразноцепной реакции (ПЦР) из кДНК библиотеки человеческой плаценты, а кДНК β-субъединицы - из кДНК-библиотеки человеческого гипофиза. Описана схема очистки рекомбинантного человеческого ФСГ с высокой удельной активностью (14000-18000 ед./мг).
6
Метод очистки рекомбинантного человеческого ФСГ согласно US 2009/0291473 A1 включает последовательное применение катионообменной хроматографии, такой как CaptoMMC, аффинной хроматографии, такой как Blue Sepharose FF, гидрофобной хроматографии, такой как Phenyl Sepharose FF, и гель-фильтрации, Superdex 75. Способ согласно US 2009/0291473 A1 обладает рядом недостатков, поскольку промотор EF-1, использованный для индукции экспрессии обеих субъединиц ФСГ, является слабым промотором для экспрессии белков. Продуктивность адаптированной к росту в суспензии в бессывороточной среде линии клеток согласно US 2009/0291473 A1 не превышает 12 МЕ/10 клеток в день. Основной акцент в US 2009/0291473 A1 сделан на способе очистки конечного продукта, а не на создании оптимальной экспрессионной системы для увеличения продуктивности линии-продуцента. Стабильность продукции ФСГ линией-продуцентом в данной заявке не упоминается.
Из опубликованной заявки на патент США US 2007/0129295 A1, опубл. 07.06.2007 (МПК: C07K 14/59) известен способ получения ФСГ, включающий хроматографическую очистку ФСГ на сильном анионите, металл-хелатную хроматографию, очистку на слабом анионите, гидрофобную хроматографию, обращенно-фазовую хроматографию, ультра- и нанофильтрацию.
В соответствии с указанным способом, для выделения целевого продукта используется культуральная жидкость с низкой концентрацией ФСГ (2,7-5,4 мг/л). Также к недостаткам данного метода можно отнести использование буферных растворов с высоким содержанием изопропилового спирта, использование металл-хелатной хроматографии с дорогостоящими сорбентами. Кроме того, среди недостатков данного метода следует отметить низкую активность препаратов ФСГ, получаемых данным способом, составляющую 4900-8870 ЕД/мг.
Из публикации WO 2010/115586 А2, опубл. 14.10.2010 (МПК: C07K 1/18, C07K 1/20, C07K 14/59) известен способ очистки рекомбинантного ФСГ, предусматривающий очистку рекомбинантного ФСГ на сильном анионите (UNOsphere Q), гидрофобную хроматографию (Phenyl Sepharose FF), аффинную хроматографию на Blue Sepharose FF, ультрафильтрацию/диафильтрацию, адсорбцию на катионной мембране, повторную очистку на сильном катионите (Q-Sepharose FF), повторную ультрафильтрацию, гель-хроматографию и нанофильтрацию. К недостаткам этого метода можно отнести многостадийность очистки, приводящую к удорожанию производства, и использование клеточной линии с низкой производительностью (содержание целевого продукта в культуральной жидкости составляет 8,1 мг/л на 28-ой день культивирования).
Из документа WO 2007/065918 А2, опубл. 14.06.2007 (МПК: C07K 1/36, C07K 14/00, C07K 14/59 известен способ очистки рекомбинантного ФСГ, включающий следующие этапы: анионную хроматографию на сильном анионите Q-Sepharose FF, аффинную хроматографию на Blue Sepharose FF, анионообменную хроматографию на слабом анионите DEAE-Sepharose FF, гидрофобную хроматографию на Butyl Sepharose FF, ультрафильтрацию, хроматографию на сильном анионите Fractogel EMD ТМАЕ HICAP и нанофильтрацию. На всех стадиях очистки мутантного ФСГ используют L-метионин в качестве антиоксиданта. Данный способ обладает такими же недостатками, как и способ согласно WO 2010/115586 А2. Кроме того, хотя специфическая активность препаратов ФСГ человека, полученных способом согласно WO 2007/065918 А2, достаточно высока и составляет 11000-17000 ЕД/мг, производство препарата по этой схеме будет очень дорогостоящим из-за его многостадийности.
-
Наиболее близким к заявленному изобретению является способ создания линии клеток яичника китайского хомячка huFSHIK - продуцента рекомбинантного ФСГ, описанных в патенте RU 2502798 С2, опубл. 27.12.2013 (МПК: C12N 5/00). Клетки huFSHIK согласно RU 2502798 С2 получают на основе дефицитных по дигидрофолатредуктазе (dhfr) клеток СНО K1 DXB11 (Urlaub G., Chasin L. Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. -"Proceedings of the National Academy of Sciences", 1980, volume 77, pp. 4216-20) путем котрансфекции указанных клеток экспрессионными плазмидами pcDNA/ FSHα и pOptiVEC/FSHβ, где экспрессионная плазмида pcDNA/FSHα состоит из последовательности  длиной 9 пар оснований, синтетической последовательности длиной 348 пар оснований, кодирующей полноразмерную α-субъединицу человеческого ФСГ, включающую сигнальный пептид, стоп-кодон длиной 3 пар оснований, фрагмент плазмиды pcDNA-TOPO длиной 5407 пар оснований, содержащего промотор-энхансер цитомегаловируса (CMV), сигнал полиаденилирования тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV TK), ген устойчивости к антибиотику неомицину (neo), промотор и сигнал полиаденилирования вируса SV40, а экспрессионная плазмида pOptiVEC/FSHβ состоит из последовательности  длиной 9 пар оснований, синтетической последовательности длиной 387 пар оснований, кодирующей полноразмерную β-субъединицу человеческого ФСГ, включающую сигнальный пептид, стоп-кодон длиной 3 пар оснований, фрагмента плазмиды pOptiVEC-TOPO длиной 4402 пар оснований, содержащего промотор-энхансер цитомегаловируса (CMV), ген фактора устойчивости трансфицированных клеток к воздействию метотрексата-дигидрофолатредуктазы (DHFR) и регуляторные элементы для экспрессии DHFR-последовательности IRES вируса энцефаломиокардита (EMCV), сигнал полиаденилирования, ген устойчивости к антибиотику ампициллину и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину.
Клетки huFSHIK по патенту RU 2502798 С2 депонированы в Российской коллекции клеточных культур при Институте цитологии Российской академии наук (институт цитологии РАН), номер депонирования РККК (П) 744Д.
Согласно патенту RU 2502798 С2, экспрессионные плазмидные ДНК pcDNA/ FSHα и pOptiVEC/FSHβ создают с использованием нуклеотидных последовательностей, кодирующих, соответственно, α- и β-субъединицы ФСГ, синтезированных на основе консенсусных аминокислотных последовательностей с учетом оптимизации кодонов для повышенной экспрессии в клетках млекопитающих. Экспрессия генов субъединиц находится под контролем промотора-энхансера цитомегаловируса (CMV). Экспрессионные плазмиды pcDNA/FSHα и pOptiVEC/FSHβ котрансфицируют в клетки линии СНО K1 DXB11 методом липосомальной трансфекции. После двойной селекции в среде, не содержащей гипоксантина и тимидина с добавлением селекционного агента генетицина, получают пул стабильно трансфицированных клеток. Дальнейшую амплификацию экспрессионных кассет осуществляют посредством культивирования клеток в присутствии возрастающих доз метотрексата (далее - МТХ).
6
Решение, предложенное в соответствии с патентом RU 2502798 С2, обладает рядом недостатков, среди которых следует отметить низкую продуктивность клеточной линии huFSHIK. Так, согласно примеру 6, приведенному на стр. 13-14 описания указанного патента, продуктивность линии huFSHIK, адаптированной к росту в суспензии в бессывороточной среде, не превышает 5 мкг ФСГ на 1 мл кулыуральной жидкости на 3-4-й дни культивирования клеток, что при пересчете на 10 клеток в день составляет 2,046 мкг/мл и соответствует примерно 25 МЕ/10клеток в день.
Также следует отметить, что, согласно патенту RU 2502798 С2, клетки huFHSIK культивируют в присутствии 50-100 нМ метотрексата, что является недостаточным для получения максимальной амплификации экспрессионных кассет в геноме. Кроме того, в связи с конструктивной особенностью векторов, амплификация экспрессионных кассет может наблюдаться только для последовательности, кодирующей β-субъединицу ФСГ, что может приводить к значительному стехиометрическому дисбалансу в продукции α- и β-субъединиц ФСГ Наконец, основное внимание в патенте RU 2502798 С2 уделено созданию экспрессионной системы для увеличения продуктивности линии-продуцента ФСГ, тогда как другие способы оптимизации получения целевого продукта в данном патенте не рассматриваются.
Задачей изобретения является создание способа получения рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона для использования в фармацевтической промышленности (для получения ФСГ в промышленных масштабах). Поставленная задача решается в рамках настоящего изобретения за счет получения высокопродуктивной стабильной линии клеток-продуцента рекомбинантного человеческого ФСГ, являющейся объектом настоящего изобретения, далее обозначаемой как huFSHKKc6. Клетки huFSHKKc6 получают путем внедрения в геном клеток huFSHIK, описанных в патенте RU 2502798 С2 и депонированных в Российской коллекции клеточных культур при Институте Цитологии РАН под номером РККК (П) 744Д, экспрессионной плазмиды размером 7719 п.о., кодирующей α-субъединицу ФСГ, состоящей из следующих ключевых генетических элементов:
(а) гена устойчивости к пуромицину PuroR с сигналом полиаденилирования вируса SV40 (SV40 polyA),
(б) укороченного 3'-длинного концевого повтора вируса HIV-1 (3'LTR),
(в) гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpR promoter),
(г) ориджина репликации вируса SV40 (SV40 ori),
(д) ориджина репликации pBR322,
(е) промотора NP гена р53 человека гена,
(ж) конститутивного промотора гена фосфоглицераткиназы (pgk),
(з) синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, кодирующей полноразмерную α-субъединицу фолликулостимулирующего гормона человека, представленную в SEQ ID NO: 2 и включающую сигнальный пептид (аминокислотные остатки 1-24 последовательности SEQ ID NO: 2),
(и) сигнал терминации трансляции, состоящий из 3 пар оснований,
и
(к) консенсусную сигнальную последовательность  состоящую из 9 пар оснований.
Структура указанной плазмиды, состоящей из ключевых генетических элементов (а) - (к), приведена на Фигуре 1.
Как уже указывалось выше, для клеток huFSHIK по патенту RU 2502798 С2, выбранных в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения, характерна избыточная продукция β-субъединицы и недостаточная - α- субъединицы ФСГ, что приводит к нарушению стехиометрического баланса между α- и β-субъединицами ФСГ. Характерное для ближайшего аналога нарушение стехиометрического баланса, как будет показано ниже, устраняется в рамках настоящего изобретения благодаря трансфекции клеток huFSHIK, плазмидной ДНК (плазмидой) длиной 7719 п.о., состоящей из ключевых генетических элементов (а) - (к) и представленной на Фигуре 1, обеспечивающей дополнительную экспрессию α-субъединицы ФСГ в клетках, трансфицированных указанной плазмидной ДНК.
Аминокислотная последовательность α-субъединицы ФСГ человека, транслируемая с указанной плазмидной ДНК, включает в себя N-концевой сигнальный пептид (аминокислотные остатки 1-24 последовательности SEQ ID NO: 2) и зрелую α-субъединицу молекулы ФСГ (остатки 25-116 последовательности SEQ ID NO: 2). N-концевой сигнальный пептид отделяется при посттрансляционном процессинге и, таким образом, отсутствует в зрелом секретируемом гетеродимерном фоллитропине (Pierce J.G., Parsons T.F. Glycoprotein hormones: structure and function. // "Annual Review of Biochemistry", 1981, volume 50, pp. 465-495). Поскольку описанная в настоящем изобретении плазмида, раскрытая на Фигуре 1 и состоящая из ключевых генетических элементов (а) - (к), используется для трансфекции клеток huFSHIK по патенту RU 2502798 С2, которые уже продуцируют, в том числе, и β-субъединицы ФСГ человека, то трансфекция клеток huFSHIK экспрессионной плазмидой длиной 7719 п.о., состоящей из ключевых генетических элементов (а) - (к), структура которой раскрыта на Фигуре 1 позволяет получить в трансфицированных данной плазмидой клетках зрелый рекомбинантный ФСГ человека, при этом посттрансляционный процессинг и образование молекулы зрелого ФСГ человека из отдельных α- и β-субъединиц ФСГ осуществляется в эндоплазматическом ретикулуме клетки-продуцента. Это приводит к восстановлениюнарушенного стехиометрического баланса между α- и β-субъединицами ФСГ, характерный для клеток huFSHIK.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения рекомбинантного человеческого ФСГ при помощи клеток huFSHKKc6. Способ получения рекомбинантного человеческого ФСГ согласно настоящему изобретению включает культивирование клеток huFSHKKc6, продуцирующих рекомбинантный человеческий ФСГ, предпочтительно, в бессывороточной среде, с последующим выделением целевого продукта - рекомбинантного ФСГ человека - из получаемой культуральной жидкости. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, выделение целевого продукта проводят с помощью трехстадийной хроматографической очистки белка, включающей последовательное применение анионообменной, аффинной и гидрофобной хроматографии. Технический результат предлагаемого изобретения заключается в обеспечении рекомбинантной линии клеток huFSHKKc6 - продуцента ФСГ человека, обладающей высокой продуктивностью, превышающей в 8 раз продуктивность исходного продуцента - клеток huFSHIK, а также высокой жизнеспособностью. В рамках настоящего изобретения удалось показать, что клетки huFSHKKc6 стабильно секретируют ФСГ на протяжении по крайней мере 25 пассажей в культуральную среду, не содержащую продуктов животного происхождения.
Кроме того, в рамках настоящего изобретения удалось оптимизировать условия культивирования созданной в рамках настоящего изобретения клеточной линии huFSHKKc6 в условиях суспензионной культуры. В рамках настоящего изобретения предложены дополнительные приемы, позволяющие проводить эффективную наработку ФСГ за счет оптимизации условий культивирования клеток СНО и этапов выделения и очистки ФСГ.
Предложенный способ наработки белка делает экономически выгодным получение фармацевтической субстанции рекомбинантного ФСГ и может широко использоваться в биофармацевтическом производстве для получения целевого продукта.
Задачей настоящего изобретения является создание клеточной линии -продуцента рекомбинантного ФСГ человека на основе оптимизированных генетических конструкций и разработке способа выделения и очистки рекомбинантного ФСГ человека, позволяющих значительно повысить его выход. Достигаемый в рамках настоящего изобретения технический результат заключается в обеспечении клеточной линии - продуцента рекомбинантного ФСГ человека, отличающейся повышенной продуктивностью и стабильностью, сохраняющей способность секретировать ФСГ на протяжении длительного времени (по крайней мере на протяжении 25 пассажей).
Раскрытие изобретения
Создание экспрессионной плазмиды.
В предлагаемом изобретении для оптимизации экспрессии ФСГ создают плазмидную ДНК (плазмиду) длиной 7719 пар оснований (далее - п. о.), обеспечивающую дополнительную экспрессию α-субъединицы ФСГ в клетках яичника китайского хомячка huFSHIK, трансфицированных указанной плазмидой. Указанная плазмида, далее обозначаемая как pL4-Puro-αFSH, состоит из следующих ключевых генетических элементов, расположенных в соответствии с Фигурой 1:
(а) гена устойчивости к пуромицину PuroR с сигналом полиаденилирования вируса SV40 (SV40 polyA),
(б) укороченного 3'-длинного концевого повтора вируса HIV-1 (3'LTR),
(в) гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpR promoter, pbla),
(г) ориджина репликации вируса SV40 (SV40 ori),
(д) ориджина репликации pBR322,
(е) промотора NP гена р53 человека гена,
(ж) конститутивного промотора гена фосфоглицераткиназы (pgk),
(з) синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, кодирующей полноразмерную α-субъединицу фолликулостимулирующего гормона человека последовательности SEQ ID NO: 2, включающую сигнальный пептид (аминокислотные остатки 1-24 последовательности SEQ ID NO: 2),
(и) сигнала терминации трансляции, состоящего из 3 пар оснований,
(к) консенсусной сигнальной последовательности  повышающей эффективность инициации трансляции.
В вышеуказанной плазмиде, строение которой раскрыто на Фигуре 1 настоящего описания, ген PuroR предназначен для селекции стабильных клеточных линий. Сигнал полиаденилирования вируса SV40 (SV40 polyA) предназначен для его экспрессии.
Укороченный 3'-длинный концевой повтор вируса ВИЧ-1 (3'-LTR HIV-1) в вышеуказанной плазмиде необходим для увеличения стабильности транскрипта, при этом 3'-LTR используется в качестве дополнительного сигнала полиаденилирования гена α-субъединицы ФСГ; указанный дополнительный сигнал полиаденилирования предназначен для повышения стабильности транскрипта (согласно работе Zufferey R., et al. Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery. // "Journal of Virology", volume 72, №12, Dec. 1998, pp. 9873-9880; см. абзац, соединяющий стр. 9873 и 9874 указанной статьи).
R
R
Ген устойчивости к ампициллину Amp и бактериальный промотор гена Amp(pbla) в вышеуказанной плазмиде необходимы для осуществления препаративной наработки плазмиды в бактериях рода Escherichia. Предпочтительно (без ограничения), бактерии рода Escherichia представляют собой Escherichia coli.
Ориджин репликации pBR322, созданный в 1970-е годы (Bolivar F., Rodriguez R.L., et al. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. // "Gene" (1977), volume 2, issue 2, pp. 95-113), широко используется для создания экспрессионных векторов.
Продуктом трансляции синтетической последовательности SEQ ID NO: 1 является полипептид последовательности SEQ ID NO: 2, включающий сигнальный пептид (аминокислотные остатки 1-24 последовательности SEQ ID NO: 2) и полноразмерную α-субъединицу фолликулостимулирующего гормона человека (аминокислотные остатки 25-92 последовательности SEQ ID NO: 2). Далее при посттрансляционном процессинге (Pierce J.G., Parsons T.F., 1981) происходит отщепление сигнального полипептида таким образом, что зрелая α-субъединица рекомбинантного ФСГ, полученная в линии клеток согласно изобретению, содержит только аминокислотные остатки 25-92 последовательности SEQ ID NO: 2.
Сигнал терминации трансляции состоит из 3 пар оснований. Предпочтительно (без ограничения), сигнал терминации трансляции представляет собой taa, tag или tga.
Консенсусная сигнальная последовательность  необходима для повышения эффективности инициации трансляции. См.: Kozak М. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. // "Nucleic Acids Research", 1987 October, volume 15, №20, pp. 8125-8148. Предпочтительно (без ограничения), консенсусная сигнальная последовательность  представляет собой последовательность gccgccacc.
Структура указанной плазмидной ДНК (плазмиды), состоящей из ключевых генетических элементов (а) - (к), представлена на Фигуре 1.
Плазмиду согласно изобретению получают из плазмидного вектора pLenti-puro, описанного в предшествующем уровне техники в работе Guan В., Wang Т. L., Shih Ie. М. ARID1A, a factor that promotes formation of SWI/SNF-mediated chromatin remodeling, is a tumor suppressor in gynecologic cancers. // "Cancer Research", 2011 November 1, volume 71, №21, pp. 6718-6127 (далее - Guan В., et al., 2011). Для получения плазмиды по изобретению из вектора pLenti-puro удаляют последовательности промотора вируса SV40 и участка поликлонирования по сайтам рестрикции SalI и Pfl23II и замещая их промотором NP гена р53 человека (согласно работе Tuck S.P., Crawford L.I. Characterization of the human p53 gene promoter. // "Molecular and cellular biology", 1989 May 1; volume 9, №5, pp. 2163-2172), отжигают взаимно комплементарные синтетические олигонуклеотиды PL4_FLAG-forw и PL4_FLAG-rev, получая новый участка поликлонирования PL4 с отличающимися нуклеотидной последовательностью, набором сайтов рестрикции и дополнительной последовательностью FLAG-tag, встраивают полученный дуплекс с "липкими" концами в плазмиду по сайту рестрикции SalI, заменяют промотор цитомегаловируса (CMV) на конститутивный промотор гена фосфоглицераткиназы (pgk). Синтез нуклеотидной последовательности промотора pgk осуществляют путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидных праймеров Ppgk-forw и Ppgk-rev последовательностей SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно.
Клетки huFSHIK согласно патенту RU 2502798 С2 создают на основе известных из уровня техники клеток яичника китайского хомячка СНО K1 DXB11 (Urlaub G., Chasin L.A., "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America", July 1980, volume 77, №7, pp. 4216-4220), трансфицированных, в том числе, экспрессионной плазмидой pOptiVEC/FSHβ, содержащей синтетическую последовательность длиной 387 п.о., кодирующую полноразмерную β-субъединицу ФСГ человека. Таким образом, трансфекция клеток huFSHIK созданной в рамках настоящего изобретения плазмидой, охарактеризованной на Фигуре 1, кодирующей α-субъединицу человеческого ФСГ и состоящей из ключевых генетических элементов (а) - (к), позволяет восстановить стехиометрический баланс между α- и β-субъединицами ФСГ, устраняя, таким образом, недостаток, характерный для клеток huFSHIK и обеспечивая более высокую и стабильную продукцию полноразмерного человеческого ФСГ.
Получение клеточной линии huFSHKKc6
2
Исходным материалом для создания линии клеток по изобретению, продуцирующих рекомбинантный ФСГ человека, является линия клеток яичников китайского хомячка huFSHIK по патенту RU 2502798 С2. Клетки huFSHIK культивируют на среде Игла в модификации Дульбекко (далее - среда DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (далее - FBS) как адгезионную культуру при температуре 37°С с 5% содержанием СО. Экспрессионную плазмиду длиной 7719 п.о., состоящую из ключевых генетических элементов (а) - (к), расположенных друг относительно друга так, как представлено на Фигуре 1, трансфицируют в клетки линии huFSHIK.
Предпочтительно (без ограничения), для введения указанной плазмиды в клетки huFSHIK используют метод липосомальной трансфекции, описанный в работе Straus S.E., Wilson Т., and Raskas H.J. Transfection of KB Cells by Liposomes Containing Adenovirus Type 2 DNA. // "Journal of Virology", 1981, July, volume 39, №1, pp. 290-294, включенной в настоящее описание посредством ссылки. Специалисту понятно, что в других воплощениях настоящего изобретения для введения плазмиды в клетки huFSHIK могут использоваться и другие методы трансфекции, известные из уровня техники, например, метод с использованием катионных полимеров, кальций-фосфатный метод, метод электропорации, метод нуклеофекции, метод микроинъекции, трансфекция с использованием магнитных частиц и так далее. Также для целей настоящего изобретения для введения в клетки huFSHIK плазмиды, представленной на Фигуре 1 и состоящей из ключевых генетических элементов (а) - (к), могут использоваться и другие методы трансфекции, не упомянутые в настоящем описании в явном виде, которые известны в уровне техники в настоящее время или будут созданы впоследствии. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод трансфекции клеток.
После селекции на среде с добавлением селекционного агента пуромицина до конечной концентрации пуромицина 4,5 мкг/мл клетки, устойчивые к пуромицину, клонируют методом лимитирующих разведений. Полученные из единичных клеток клоны анализируют методом иммуноферментного анализа. Клоны с уровнем секреции ФСГ, превышающим на 40-50% уровень, характерный для исходных клеток клона huFSHIK на ранних пассажах, сохраняют методом криоконсервирования для последующего создания мастер банка.
Культуральные свойства
2
Клетки выращивают в среде DMEM с добавлением 2 мМ глутамина, 10% диализованной FBS (Sigma), 100 нМ метотрексата (МТХ, Sigma) при температуре 37°С, в среде с содержанием CO составляющим 5%, как адгезионную культуру. Клеточная линия устойчива к МТХ, генетицину (G418) и пуромицину. Клетки отобранных клонов адаптируют к суспензионному росту на бессывороточной среде SFM4CHO. Отсутствие контаминации подтверждают культивированием клеток без антибиотиков. Линия проверена на отсутствие микоплазмы окрашиванием флуоресцентными красителями ДНК DAPI и/или Hoechst, а также с использованием MycoA1ert™ PLUS Mycoplasma Detection Kit (LONZA).
Идентичность человеческого ФСГ подтверждают методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблоттинг-анализа. Отобранный клон, получивший название huFSHKKc6, стабильно секретирует ФСГ в течение 25 пассажей. При культивировании штамма-продуцента huFSHKKc6 на бессывороточной среде SFM4CHO в среду секретируется 41 мкг/мл ФСГ при плотности клеток 0.90-1.21 млн/мл за 4 суток, что в 8 раз больше, чем у исходной культуры huFSHIK. При культивировании клеток без замены среды в течение 10-12 дней в среду секретируется 118 мкг/мл ФСГ.
Высокая стабильность и продуктивность при культивировании клеток в биореакторе позволяют сделать заключение о создании линии huFSHKKc6 - продуцента рекомбинантного ФСГ человека, применимой в фармацевтической промышленности.
Криоконсервирование клеток
Клетки по изобретению замораживают в ростовой среде с 10% диметилсульфоксида (ДМСО) в концентрации 2 млн/мл и хранят в жидком азоте. Размораживают быстрым оттаиванием пробирки в водяной бане при 37°С с последующей заменой среды с ДМСО на ростовую, разбавлением клеток 5 мл нагретой среды. Жизнеспособность клеток после размораживания - не менее 80% (оценивают по окрашиванию трипановым синим).
Получение, выделение и очистка рекомбинантного ФСГ человека
Способ получения рекомбинантного ФСГ человека включает культивирование линии клеток huFSHKKc6, полученной путем трансформации клеток huFSHIK раскрытой на Фигуре 1 плазмидой длиной 7719 п.о., состоящей из ключевых генетических элементов (а) - (к), в бессывороточной среде с получением культуральной жидкости, отделение культуральной жидкости от клеток и дебриса и выделение рекомбинантного ФСГ человека из полученной культуральной жидкости.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, культивирование клеток huFSHKKc6 в бессывороточной среде осуществляют на протяжении по меньшей мере 12 дней.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, отделение культуральной жидкости от клеток и дебриса осуществляют центрифугированием.
Наконец, в предпочтительном воплощении, однако также без ограничения, выделение рекомбинантного ФСГ из полученной культуральной жидкости осуществляют хроматографически. В более предпочтительных воплощениях, но без ограничения ими, выделение рекомбинантного ФСГ из культуральной жидкости осуществляют методом трехстадийной хроматографической очистки, последовательно применяя анионообменную, аффинную и гидрофобную хроматографию. В самом предпочтительном воплощении, хроматографическую очистку ФСГ осуществляют, последовательно применяя анионообменную хроматографию на DEAE-Sepharose FF, аффинную хроматографию на Affi-Gel Blue и гидрофобную хроматографию на Phenyl-Sepharose 6 FF. Полученный раствор очищенного рекомбинантного ФСГ обессоливают, переводят в фосфатный буфер и, при необходимости, концентрируют до 0,4-0,8 мг/мл с помощью ультрафильтрации на мембранах с пределом отсечения 5 кДа. Конечный продукт подвергают микрофильтрации на мембранах с диаметром пор 220 нм и нанофильтрации на мембранах с диаметром пор 15 нм.
Характеристика рекомбинантного ФСГ, продуцируемого клетками huFSHKKc6.
Полученный рекомбинантный ФСГ человека полностью соответствует требованиям Европейской фармакопеи (ЕР) 8.3 к растворам ФСГ. Он может быть использован для изготовления лекарственной формы. Биологическая активность полученного рекомбинантого ФСГ человека составляет 13 МЕ/мкг (при тестировании методом биологических проб по Steelman-Pohley в сравнении со стандартом рекомбинантного ФСГ NIBSC 08/282).
Изобретение иллюстрируют следующие рисунки:
Фигура 1. Карта плазмиды; обозначения:
pBR322 ori - ориджин репликации pBR322,
AmpRes - ген резистентности к ампициллину (ген β-лактамазы),
pbla - промотор гена β-лактамазы,
SV40 ori - ориджин репликации SV40,
SV40polyA - сигнал полиаденилирования SV40,
3'-LTR (delta-U3) - укороченный 3'-длинный концевой повтор ВИЧ-1,
PuroRes - ген резистентности к пуромицину,
NPpromoter - промотор человеческого гена р53,
FSH alpha - ген полноразмерной а-субъединицы человеческого ФСГ,
Kozak consensus sequence - консенсусная последовательность , сайты рестрикции: Cla I (2127), Eco RI (2671), Xho I (3037), Bam HI (3043) и Sal I (3076).
Последовательности праймеров для синтеза промотора:
pgk.Ppgk-forw: 5'-AGTTCATCGATTTGGGGTTGCGCCTTTTCCA-3' (SEQ ID NO: 5),
Ppgk-rev.: 5'-GTTCTCTAGACCCTGGGGAGAGAGGTCGG-3' (SEQ ID NO: 6).
Фигура 2. Электрофоретический анализ рекомбинантного ФСГ, продуцируемого клетками huFSHKKc6.
Восстанавливающие условия проведения электрофореза:
Дорожки геля 1,3: культуральная среда от линии huFSHKKc6;
Дорожки геля 2: внутренний стандарт ФСГ;
Дорожка геля 4: Стандарт CRS ФСГ;
Дорожки геля 5,9: Маркер молекулярных весов PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, Thermo, cat. 26619 (250 кДа, 130 кДа, 100 кДа, 70 кДа, 55 кДа, 35 кДа, 25 кДа, 10 кДа).
Невосстанавливающие условия проведения электрофореза (без добавления бета-меркаптоэтанола и без нагревания):
Дорожки геля 6: внутренний стандарт ФСГ;
Дорожки геля 7,10: культуральная среда от линии huFSHKKc6;
Дорожка геля 8: Стандарт CRS ФСГ.
Фигура 3. Определение ФСГ в культуральной бессывороточной среде антителами против β-субъединицы ФСГ методом иммуноблота. Электрофорез проводят в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (ДДС) в нативных условиях.
1,3 - культуральная среда от линии huFSHKKc6;
2 - культуральная среда от линии huFSHIK;
4 - Стандарт CRS ФСГ;
5 - Внутренний стандарт ФСГ;
6 - Маркер молекулярных весов PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, Thermo, cat. 26619 (250 кДа, 130 кДа, 100 кДа, 70 кДа, 55 кДа, 35 кДа, 25 кДа, 10 кДа).
Фигура 4. Распределение изоформ ФСГ методом изоэлектрического фокусирования белков (ИЭФ) в диапазоне pI 3,3-5,5
1 - распределение изоформ ФСГ от линии huFSHKKc6;
2 - распределение изоформ раствора стандартного образца (Follitropin, Eur. Ph., # Y0001629) в диапазоне pI 3-10;
3 - распределение изоформ стандарта для IEF pI 3-10.
Фигура 5. Определение качества рекомбинантного ФСГ методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Содержание окисленных форм. Образец - ФСГ после финальной очистки, в количестве 10 мкг.
Фигура 6. Определение количества ФСГ в растворе и содержания примеси высокомолекулярных соединений методом эксклюзионной хроматографии. Образец - ФСГ после финальной очистки, в количестве 8 мкг.
Фигура 7. Результаты оценки биологической активности рекомбинантного ФСГ. Полученный в клеточной линии huFSHKKc6 препарат сравнивался с препаратом сравнения - стандартом WHO IS 08/282.
Осуществление изобретения
Осуществление заявляемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами 1-6.
Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды
Созданную в рамках настоящего изобретения плазмидную ДНК (плазмиду) длиной 7719 п.о., состоящую из ключевых генетических элементов (а) - (к), строение которой раскрыто на Фигуре 1, получают из плазмидного вектора pLenti-puro, описанного в вышеуказанной работе Guan В., et al., 2011, следующим образом.
На первом этапе из вектора pLenti-puro удаляют последовательности промотора вируса SV40 и участка поликлонирования по сайтам рестрикции SalI и Pƒl23II и замещают промотором NP гена р53 человека согласно методике, предложенной в работе Tuck S.P., Crawford L.I. Characterization of the human p53 gene promoter. // "Molecular and cellular biology", 1989 May 1; volume 9, №5, pp. 2163-72. Нуклеотидную последовательность промотора NP получают путем синтеза в соответствии с информацией, взятой из базы данных (GenBank: J04238.1, URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J04238.l) и интегрируют в вектор pLenti-puro по сайтам рестрикции SalI и Pƒl23II с получением плазмиды, здесь и далее обозначаемой как pLCMV-pL4-Flag-Puro.
Затем путем отжига взаимно-комплементарных синтетических олигонуклеотидов PL4_FLAG-forw и PL4_FLAG-rev (последовательности SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8) получают новый участок поликлонирования PL4 с отличающимися нуклеотидной последовательностью, набором сайтов рестрикции и дополнительной последовательностью FLAG-tag. Полученный дуплекс с "липкими" концами встраивают в плазмиду pLCMV-pL4-Flag-Puro по сайту рестрикции SalI.
В полученном векторе производят замену промотора цитомегаловируса (CMV) на конститутивный промотор гена фосфоглицераткиназы (pgk), при этом в качестве источника нуклеотидной последовательности промотора гена pgk используют плазмиду pFS-sigHis-PGK (GenBank: JF313343, URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JF313343), описанную в работе Wilke S, Groebe L, Maffenbeier V,  V, Gossen M, Josewski J, Duda A, Polle L, Owens RJ, Wirth D, Heinz DW. Streamlining homogeneous glycoprotein production for biophysical and structural applications by targeted cell line development. // "PloS one", 2011 Dec 9; volume 6, №12, e27829.
Синтез нуклеотидной последовательности промотора pgk проводят путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидных праймеров Ppgk-forw и Ppgk-rev, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 соответственно. Синтезированную последовательность промотора интегрируют в векторную плазмиду по сайтам рестрикции ClaI и XbaI.
На заключительном этапе синтезируют методом ПЦР нуклеотидную последовательность, состоящую из 360 п.о. В состав последовательности входят структурная часть гена полноразмерной α-субъединицы человеческого ФСГ, включающая сигнальный пептид, сигнал терминации трансляции из 3 п.о. и консенсусная сигнальная последовательность Козак, повышающая эффективность инициации трансляции и располагающаяся перед инициирующим кодоном гена ФСГ. Синтез последовательности проводят с использованием праймеров fsh-α_EcoRI и fsh-α_XhoI, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 соответственно. Нуклеотидную последовательность интегрируют в полилинкер PL4 плазмиды по сайтам рестрикции EcoRI и XhoI с получением плазмидной ДНК, состоящей из ключевых генетических элементов (а) - (к), структура которой представлена на Фигуре 1.
Последовательности праймеров PL4_FLAG-forw и PL4_FLAG-rev для синтеза участка поликлонирования PL4 представлены в SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 соответственно.
Последовательности праймеров Ppgk-forw и Ppgk-rev для синтеза промотора pgk представлены в SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно.
Последовательности праймеров fsh-α_EcoRI и fsh-α_XhoI для синтеза гена α-субъединицы ФСГ представлены в SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 соответственно.
Пример 2. Получение стабильного клона-продуцента.
Для создания продуцента ФСГ используют клетки huFSHIK по патенту RU 2502798 С2, депонированные в Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН под номером РККК(П)744Д.
2
Клетки huFSHIK культивируют на среде DMEM с 10% FBS как адгезионную культуру при 37°С с 5% СО и 100 нМ МТХ. Экспрессионную плазмиду полученную в примере 1, трансфицируют в клетки линии huFSHIK методом липосомальной трансфекции с использованием Lipofectamin 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. Через сутки среду заменяют на среду DMEM с 10% сыворотки. Селекцию проводят с использованием селективного агента пуромицина, который добавляют в среду до конечной концентрации 4.5 мкг/ мл. Отбор стабильного клона-продуцента проводят методом предельных разведений, рассевая растущие после обработки антибиотиком клетки в 96-луночные планшеты. На основании скорости роста, жизнеспособности и продуктивности отбирают клон huFSHKKc6, из клеток которого создают клеточный банк.
Культуральные свойства клеток huFSHKKc6
Клетки отобранных клонов адаптировали к суспензионному росту на бессывороточных средах SFM4CHO, CD4CHO (HyClone), CellVento СНО-200 (Merck Millipore), ChoMaster CD (Macs), ProCHO5 (Lonza), Ex-Cell DHFR, CD (Sigma Aldrich). Пересев осуществляют с кратностью 1:5 каждые 3-4 дня. Идентичность и продукцию человеческого ФСГ определят методами ВЭЖХ, ИФА и иммуноблота. Отобранный клон huFSHKKc6 стабильно секретирует ФСГ в количестве 36-41 мг/л в течение 4 суток. За 10-12 суток культивирования без замены среды содержание секретируемого белка составляет 118 мг/л. Отсутствие контаминации подтверждено культивированием клеток без антибиотиков. Линия проверена на отсутствие микоплазмы окрашиванием флуоресцентными красителями ДНК DAPI и/или Hoechst, а также с использованием MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection Kit (LONZA).
2
Наращивание инокулята проводят в биореакторе (50 мл, ТРР) при 37°С, 5% СО, 150 об/мин, с последующим культивированием в биореакторе CELLIGEN 310 (New Brunswick) с автоматизированной системой управления технологическим процессом по заданным параметрам культивирования. Длительность культивирования составляет 264-288 часа. Для оптимизации параметров культивирования в биореакторе использован метод факторного эксперимента с дробными репликами, который позволил учитывать влияние нескольких параметров друг на друга. В результате оптимизации продуктивность повышена в 1,5 раза. Отработанный способ позволяет проводить культивирование в периодическом режиме, с подпиткой или перфузией.
В зависимости от способа культивирования для выделения и очистки целевого белка клетки удаляют из среды центрифугированием или с использованием модуля тангенциальной фильтрации с полыми волокнами.
Пример 3. Выделение и очистка рекомбинантного ФСГ из культуральной жидкости продуцента ФСГ huFSHKKc6
Получение рекомбинантного ФСГ человека включает культивирование линии клеток продуцента, отделение культуральной среды от клеток и дебриса и хроматографическую очистку ФСГ из полученной культуральной жидкости с помощью анионообменной хроматографии на DEAE-Sepharose FF, аффинной хроматографии на Affi-Gel Blue и гидрофобной хроматрографии на Phenyl-Sepharose 6 FF. Все стадии хроматографической очистки проводят в 20 мМ Трис-НС1 с рН 7,9, содержащем 10 мМ L-метионина, в который по мере необходимости добавляют используемые на определенной стадии процесса солевые и органические компоненты. Очистка предусматривает микрофильтрацию растворов с помощью системы фильтрации Stericup с фильтрами 0,45 и 0, 22 мкм (Merck Millipore) и нанофильтрацию с использованием фильтров Planova 15N (Asahi Kasei Medical Co.). Все хроматографические процессы проводят при температуре (6±2)°С, используя хроматографическую систему Bio-Rad LP. Растворы ФСГ стабильны в условиях хранения при температуре 5°С в течение суток. Процесс выделения и очистки белка не предполагает хранения и замораживания проб на промежуточных этапах работы. Однако, растворы ФСГ могут быть однократно заморожены и храниться при температуре -20°С. Определение концентрации ФСГ в процессе выделения проводят методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Качество конечного и промежуточных продуктов определяют методами электрофореза в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, а также методами обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ и эксклюзионной хроматографии. Общий белок определяют с использованием метода Лоури и УФ спектрофотометрии.
1,25 л раствора культуральной жидкости (далее - КЖ), содержащей 145 мг рекомбинантного ФСГ, после микрофильтрации на мембране с размером пор 450 нм разбавляют в пять раз буферным раствором 20 мМ трис-HCl с рН 7,9, содержащим 10 мМ L-метионина, наносят на хроматографическую колонну с DEAE-сефарозой FF (GE Healthcare), предварительно уравновешенную тем же буферным раствором, и промывают уравновешивающим буферным раствором. ФСГ элюируют с сорбента хлористым натрием в градиенте концентраций от 0 до 0,2 М. Фракции, содержащие ФСГ объединяют и передают на следующую стадию очистки. Выход ФСГ на стадии составляет 123 мг.
К раствору белка, полученному после очистки на DEAE-сефарозе FF, добавляют хлористый натрий до концентрации 0,3M, Tween-20 до концентрации 0,5% и корректируют значение рН раствора до 7,9. Полученный раствор белка после микрофильтрации наносят на хроматографическую колонну с аффинным сорбентом Affi-Gel Blue (Bio-Rad), уравновешенным буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис-HCl, 10 мМ L-метионина, 0,3 М NaCl, 0,5% Tween-20 с рН 7,9. После нанесения образца сорбент промывают буферным раствором состава: 20 мМ Трис-HCl, 10 мМ L-метионин, 0,5 М КСl, 0,01% Tween-20, рН 7,9, а затем элюируют ФСГ хлористым калием в градиенте концентраций от 0,5 до 2,0 М. Фракции, содержащие ФСГ, объединяют и передают на следующую стадию. Выход ФСГ на стадии составляет 96 мг.
4
4
К раствору белка, полученному после очистки на сорбенте Affi-Gel Blue, добавляют сульфат аммония до концентрации 1,0 М и корректируют значения рН раствора до 7,9. Полученный раствор белка после микрофильтрации наносят на хроматографическую колонну с Phenyl-Sepharose 6 FF (Sigma Aldrich), уравновешенную буферным раствором 20 мМ Трис-HCl, 10 мМ L-метионина, 0,01% Tween-20, 1 М (NH)SO с рН 7,9. Элюцию целевого белка проводят в условиях линейно понижающейся концентрации сульфата аммония от 1,0 М до 0 М. Фракции, содержащие ФСГ необходимого качества, объединяют и передают на диафильтрацию. Выход ФСГ на стадии составляет 72 мг (данные эксклюзионной хроматографии), общий белок, определенный по методу Лоури составляет 73 мг и 72,6 мг по данным УФ-спектрометрии при длине волны 280 нм.
2
4
2
Раствор ФСГ, полученный на последней стадии хроматографической очистки, обессоливают, переводят в буферный раствор состава: 10 мМ NaHPO*HO, 10 мМ L- метионина, рН 7,4 и, если необходимо, концентрируют до 0,4-0,6 мг/мл с помощью ультрафильтрации на мембранах с пределом отсечения 5 кДа. Конечный продукт подвергают микрофильтрации на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм и нанофильтрации на мембранах с диаметром пор 15 нм. Выход целевого продукта после всех стадий очистки составляет 69 мг (по данным эксклюзионной хроматографии), что составляет около 48% от содержания ФСГ в исходной КЖ.
Выход ФСГ по заявленному способу составляет около 55 мг в пересчете на 1 л культуральной жидкости.
Пример 4. Оценка количества рекомбинантного человеческого ФСГ, продуцируемого клетками huFSHKKc6.
4.1 Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА)
Для проведения твердофазного ИФА анализа используют набор «FSH ELISA» («DRG», Германия). Набор «FSH ELISA» предназначен для твердофазного анализа образцов, содержащих ФСГ, с использованием моноклональных антител к разным эпитопам димерной молекулы белка. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации ФСГ в образце, которую оценивают в мМЕд/мл относительно стандарта, калиброванного против Internetional Standart for Follicle Stimulation Hormone (FSH), human recombinant for immunoassay NIBSC code 92/510.
4.2. Иммуноферментный анализ с моноклональными антителами.
Для подтверждения секреции димерной молекулы ФСГ и количественных определений также используют иммуноферментный анализ с моноклональными антителами (Leinco Tecnologies) к α-субъединице ФСГ для обработки 96 луночных планшет и антитела к β-субъединице ФСГ, коньюгированными с пероксидазой хрена (HRP). В качестве субстрата используют раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ).
4.3. Высокоэффективная эксклюзионная хроматография
Количественное определение ФСГ и оценку содержания высокомолекулярных соединений в растворах целевого продукта осуществляют с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонок (300⋅7,8 мм), содержащих гидрофильный силикагель для хроматографии класса, подходящего для разделения глобулярных белков в диапазоне молекулярных масс от 10 до 500 кДа (5 μm). Подвижная фаза содержит 6,74 мл фосфорной кислоты, 14,2 г сульфата натрия безводного, рН 6,7. Детекцию проводят с помощью спектрофотометрического детектора при длине волны 214 нм в изократическом режиме. Скорость потока составляет 1 мл/мин. В качестве образца сравнения используют сертифицированный стандартный образец фоллитропина производства компании Sigma-Aldrich (Follitropin, Eur. Ph., # Y0001629). Результаты представлены на Фиг. 6.
Пример 5. Оценка качества растворов ФСГ
5.1. Электрофорез.
Электрофорез (ЭФ) белка КЖ и/или очищенного препарата проводят в 12% ПААГ с ДДС в невосстанавливающих и в восстанавливающих условиях по стандартной методике Лэммли в 12% геле с окрашиванием красителем Понсо S. Результаты представлены на Фиг. 2.
5.2. Иммуноблоттинг.
Белки КЖ и/или препараты, содержащие ФСГ, разделенные методом ДДС-ПААГ-электрофореза, переносят на нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,45 мкм (Bio-Rad, США) для мокрого переноса Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (170-3930, Bio-Rad, США). Для окрашивания мембраны последовательно используют мышиные антитела к α- и β-субъединицам, коньюгированные с пероксидазой хрена (Н116 и Н101 соответственно, Leinco Technologies, США). В качестве стандартов используют европейский стандартный образец (Follitropin, Eur. Ph., # Y0001629) и ФСГ, выделенный при культивировании клеточной линии huFSHIK (ИБХ, Россия). Обсчет интенсивности полос на гелях и мембранах проводится с помощью программы Imagine system VisionCapt v16.11a, Vilber Lourmat, Германия. Результаты представлены на Фиг. 3.
Пример 5.3. Изоэлектрическое фокусирование.
Распределение изоформ рекомбинантного ФСГ человека, полученного в клетках huFSKKc6, проводят методом изоэлектрического фокусирования белков (ИЭФ), с помощью прибора PROTEAN i12 IEF System (№164-6000, Bio-Rad) и одноразовых стрип-полосок, на которых иммобилизован полиакриамидный гель с градиентом pI 3-10 (полоска длиной 7 см - №163-2000, 11 см - №163-2014, 17 см - №163-2007, Bio-Rad). Образец ФСГ доводят буфером для изофокусирования до конечного объема 125 мкл - в случае использования стрип-полоски длиной 7 см, при этом количество ФСГ в пробе 10 мкг. В ячейку камеры для ИЭФ вносят весь полученный объем 125 мкл. Стандартный раствор (CRS, Follitropin, Eur. Ph., # Y0001629) и белковый маркер для ИЭФ с диапазоном pI 3-10, №17-0472-01 (Amersham) аналогичным образом разводят в 125 мкл буфера для внесения проб до конечной концентрации белка 15 мкг на одну стрип-полоску. Параметры разделения: стрип-полоски (7 см), рН 3-10 G, градиентный вольтаж до достижения 15000 вольт-часов, с предварительной активной регидратацией образца в течение 15 часов при 50 В. Окрашивание проводят 0.25% кумасси бриллиантовым голубым G-250 при комнатной температуре в течение 10-15 минут. Обесцвечивают гель в отмывочном растворе, содержащем 10% уксусной кислоты и 7.5% метанола при комнатной температуре, встряхивая, пока фон геля не станет прозрачным. Результаты представлены на Фиг. 4.
Пример 5.4. Определение качества рекомбинантного ФСГ методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Содержание примеси окисленных форм ФСГ.
Оценку содержания примесей окисленных форм в растворах целевого продукта и промежуточных соединений осуществляют с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с использованием колонок (250*4,6 мм), содержащих бутилсилилированный силикагель (5 μm).
Подвижная фаза А содержит 1,19 процента по объему (об. %) фосфорной кислоты, рН 2,5. Подвижная фаза В представляет собой смесь воды для хроматографии с ацетонитрилом (в объемном соотношении 40:60). Подвижная фаза С представляет собой воду для хроматографии. Детекцию проводят с помощью спектрофотометрического детектора при длине волны 210 нм. Скорость потока составляет 1 мл/мин. Объем инжекции составляет 25 мкл раствора с концентрацией ФСГ 0,4 мг/мл.
В качестве образца сравнения используют сертифицированный стандартный образец фоллитропина (Follitropin, Eur. Ph., # Y0001629). Результаты представлены на Фиг 5.
Пример 6. Оценка биологической активности рекомбинантного ФСГ, полученного в клетках по изобретению.
nd
th
Фолликулостимулирующую активность полученного рекомбинантного ФСГ оценивают, сравнивая степень увеличения яичников у неполовозрелых крыс, при введении им ИП и стандартного образца для биологических испытаний WHO IS FSH (WHO International Standard, 2 International Standard for Follicle-Stimulating Hormone, human, recombinant, for bioassay. NIBSC code: 08/282) с одновременным введением стандартного образца хорионического гонадотропина WHO IS CG (WHO International Standard, 5 WHO IS, Chorionic Gonadotrophin. NIBSC code: 07/364).
Для определения биологической активности используют неполовозрелых самок крыс одной линии в возрасте 19-28 дней, с различием по возрасту не более 3-х дней, по массе - не более 10 г. В опыт берут 30 самок крыс, делят на 6 групп случайным образом.
Подбирают 3 дозы препарата сравнения и 3 дозы исследуемого препарата таким образом, чтобы наименьшая доза вызывала положительный ответ хотя бы у некоторых крыс, а наибольшая доза - не давала максимального ответа ни у одной крысы. Через 72 часа после введения препарата каждую крысу подвергают эвтаназии. Удаленные яичники немедленно взвешивают. Ожидаемая активность должна быть не менее 80% и не более 125% от установленной активности. Результаты представлены на Фиг. 7.