ПЕПТИД ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОЗРАСТНОЙ МАКУЛЯРНОЙ ДЕГЕНЕРАЦИИ
PEPTIDE FOR TREATMENT OF AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION

Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к пептиду, полинуклеотиду, вектору, клетке, способу получения пептида, пептиду, полученному данным способом, композиции, содержащей пептид, фармацевтической композиции, содержащей пептид, фармацевтической композиции для лечения или профилактики различных заболеваний, содержащей пептид, применению пептида для лечения или профилактики различных заболеваний, способу лечения различных заболеваний, включающему стадию введения пептида и т.д.
Уровень техники
[0002] Индуцируемая тепловым шоком А сериновая пептидаза 1 (HTRA1) представляет собой трипсиноподобную сериновую протеазу (PRSS11; клан PA, семейство S1) и состоит из N-концевого домена, включающего IGFBP-подобный мотив и Kazal-подобный мотив, протеазного домена и С-концевого PDZ-домена. HTRA1 относится к семейству HTRA, включающему HTRA2, HTRA3 и HTRA4, и обратимо имеет активные и неактивные структуры, аналогично, как и другие молекулы HTRA (непатентные документы 1 и 2). Ее экспрессия неравномерно распределена в организме человека и обнаруживается на относительно высоких уровнях в хряще, синовиальной оболочке, плаценте и тому подобное. Известно, что HTRA1 расщепляет многие компоненты внеклеточного матрикса, такие как белок-предшественник амилоида, фибромодулин, кластерин, ADAM9 и витронектин, в качестве субстратов, и она связана с заболеваниями, такими как артрит и кальциноз костной ткани (непатентные документы 3, 4, 5 и 6). Также известно, что если промоторная область HTRA1 обладает генетическим полиморфизмом (rs11200638), то уровень транскрипции HTRA1 повышается. Общегеномный анализ ассоциации также выявил, что полиморфизм высоко коррелирует с возрастной макулярной дегенерацией (именуемой в дальнейшем «AMD») (непатентные документы 7 и 8).
AMD является хроническим дегенеративным заболеванием, проявляющимся со старением, и характеризуется потерей центрального зрения. Это заболевание является основной причиной приобретенной слепоты в США и представляет четвертую по частоте причину приобретенной слепоты после глаукомы, диабетической ретинопатии и пигментного ретинита в Японии (непатентный документ 12). Уровни мРНК и белка HTRA1 повышены в лимфоцитах или клетках ретинального пигментного эпителия у пациентов с AMD (непатентный документ 13). Также сообщалось, что экспрессия белка HTRA1 повышена в клетках друза диска зрительного нерва или дегенерированных клетках ретинального пигментного эпителия, которые являются предшественниками очагов поражения при AMD или неоваскулярных мембран (непатентные документы 11 и 14-16). Сообщалось также, что белок HTRA1 обнаруживается в стекловидном теле в сочетании с отслойкой сетчатки, окклюзией вен сетчатки, кровоизлиянием в стекловидное тело, макулярным отверстием и т.п., и его количество синхронизирует с маркером ангиогенеза VEGF (непатентный документ 17). Кроме того, расщепление белков, составляющих базальную мембрану, таких как фибулин 5 или тропоэластин, и фрагментацию эластичного слоя мембраны Бруха наблюдали у трансгенных по HTRA1 мышей (непатентный документ 9). Однако прямо не было показано, что ингибирование протеазной активности HTRA1 является эффективным или неэффективным для лечения заболеваний, описанных выше, и для защиты сетчатки.
[0003] SPINK2 (ингибитор сериновой протеазы Kazal-типа 2) представляет собой Kazal-подобный домен, содержащий три дисульфидные связи и функционирующий в качестве ингибитора трипсина/акрозина (непатентный документ 10). Однако его ассоциация с AMD еще не выяснена.
Известны модели на мышах и кроликах в качестве животных моделей для исследования AMD (непатентные документы 18, 19 и 20). В отношении кроликов, которые являются более предпочтительными в качестве моделей за счет того, что результаты, полученные на них, можно экстраполировать на болезни глаз человека (непатентный документ 21), то обычные модели используются просто для наблюдения за аномальными явлениями в сетчатке и сосудистой оболочке, и имеются трудности с оценкой аномальных функций клеток ретинального пигментного эпителия (клеток RPE) и т.д. Еще одной проблемой является длительный период до 8 месяцев, необходимый для формирования модели (непатентный документ 20).
Перечень ссылок
Непатентные документы
[0004] Непатентный документ 1: Truebestein L. et al., 2011, Nat. Struct. Mol. Biol., Vol. 18 (No. 3): p. 386-8
Непатентный документ 2: Eigenbrot C. et al., 2012, Structure, Vol. 20 (No. 6): p. 1040-50
Непатентный документ 3: Grau S. et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 102 (No. 17): p. 6021-26
Непатентный документ 4: Grau S. et al., 2006, J. Biol. Chem., Vol. 281 (No. 10): p. 6124-29
Непатентный документ 5: Hadfield K.D. et al., 2008, J. Biol. Chem., Vol. 283, (No. 9): p. 5928-38
Непатентный документ 6: An E. et al., 2010, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., Vol. 51 (No. 7): p. 3379-86
Непатентный документ 7: Yang Z. et al., 2006, Science, Vol. 314 (No. 5801): p. 992-93
Непатентный документ 8: Tang N.P. et al., 2009, Ann. Epidemiol., Vol. 19 (No. 10): p. 740-45
Непатентный документ 9: Vierkotten S. et al., 2011, PLoS One, Vol. 6 (No. 8): p. e22959
Непатентный документ 10: Chen T, et al., 2009, Proteins, Vol. 77 (No. 1): p. 209-19
Непатентный документ 11: Yang Z. et al., Science, 2006, Vol. 314, No. 5801: p. 992-93
Непатентный документ 12: Kimihiro Nakae et al., 2007 Annual report of the Research Committee on Chorioretinal Degenerations and Optic Atrophy, Research on Measures for Intractable Diseases, the Ministry of Health, Labour and Welfare of Japan (2007)
Непатентный документ 13: Black J.R. and Clark S.J., Genet. Med., 2016, Vol. 18, No. 4: p. 283-89
Непатентный документ 14: Cameron D.J. et al., Cell Cycle, 2007, Vol. 6, No. 9: p. 1122-25
Непатентный документ 15: Chan C.C. et al., Trans. Am. Soc., 2007, Vol. 105: p. 92-97
Непатентный документ 16: Tuo J. et al., 2008, Vol. 115, No. 11: p. 1891-98
Непатентный документ 17: Ng TK et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2011, Vol. 52, No. 6: p. 3706-12
Непатентный документ 18: Espinosa-Haidemann D.G et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2006, Vol. 47 (No. 2): p. 729-37
Непатентный документ 19: Pons M. et al., American Journal of Pathology, 2010, Vol. 177: p. 1198-1213
Непатентный документ 20: Trivino A. et al., Experimental Eye Research, 2006, Vol. 83: p. 357-366
Непатентный документ 21: Zernii E.Y. et al., CNS & Neurological Disorders-Drug Targets, 2016, Vol. 15: p. 267-291.
Сущность изобретения
Техническая задача
[0005] Целью настоящего изобретения является обеспечение нового ингибитора индуцируемой тепловым шоком А сериновой пептидазы 1 (HTRA1).
Решение задачи
[0006]
Настоящее изобретение обеспечивает следующее:
(1) Мутантный пептид SPINK2, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 30 (фиг. 42), и ингибирует протеазную активность человеческой HTRA1;
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
(2) Пептид по п.(1), где первая Xaa (X) представляет Asp, Glu, Ser, Gly или Ile, вторая Xaa (X) представляет Ala, Gly, Leu, Ser или Thr, третья Xaa (X) представляет Asp, His, Lys, Met или Gln, четвертая Xaa (X) представляет Asp, Phe, His, Ser или Tyr, пятая Xaa (X) представляет Ala, Asp, Glu, Met или Asn, шестая Xaa (X) представляет Met или Trp, седьмая Xaa (X) представляет Gln, Trp, Tyr или Val, восьмая Xaa (X) представляет Phe, Leu или Tyr, девятая Xaa (X) представляет Phe или Tyr, десятая Xaa (X) представляет Ala, Glu, Met или Val, и одиннадцатая Xaa (X) представляет Ala, Thr или Val;
(3) Пептид по пп.(1) или (2), который содержит аминокислотную последовательность, показанную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и 23-29 (фиг. 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 и 35-41);
(4) Пептид по любому из пп.(1)-(3), который содержит аминокислотную последовательность, полученную связыванием пептидной связью одной-трех аминокислот с аминоконцевым участком аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 30 (фиг. 42);
(5) Пептид по любому из пп.(1)-(4), который содержит аминокислотную последовательность, полученную связыванием пептидной связью одной-двух аминокислот с карбоксиконцевым участком аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 30 (фиг. 42);
(6) Пептид по любому из пп.(1)-(5), который имеет трехмерную структуру, отличающуюся наличием трех дисульфидных связей и включающую петлевую структуру, α-спираль и β-лист;
(7) Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде по любому из пп.(1)-(6);
(8) Вектор, содержащий полинуклеотид по п.(7);
(9) Клетка, содержащая полинуклеотид по п. (7) или вектор по п.(8) или продуцирующая пептид по любому из пп.(1)-(6);
(10) Способ получения мутантного пептида SPINK2, который ингибирует протеазную активность HTRA1, включающий следующие стадии (i) и (ii):
(i) культивирование клетки по п.(9); и
(ii) выделение мутантного пептида SPINK2 из культуры;
(11) Мутантный пептид SPINK2, полученный способом по п.(10);
(12) Конъюгат, содержащий пептид по любому из пп.(1)-(6) и (11), связанный с дополнительной молекулой;
(13) Конъюгат по п.(12), который представляет полипептид;
(14) Антитело, которое связывается с пептидом по любому из пп.(1)-(6) и (11), или его функциональный фрагмент;
(15) Композиция, содержащая пептид по любому из пп.(1)-(6) и (11), полинуклеотид по п.(7), вектор по п.(8), клетку по п.(9), конъюгат по пп.(12) или (13) и/или антитело или его функциональный фрагмент по п.(14);
(16) Фармацевтическая композиция, содержащая пептид по любому из пп. (1)-(6) и (11) и/или конъюгат по пп. (12) или (13);
(17) Фармацевтическая композиция по п.(16) для лечения или профилактики заболевания, связанного с HTRA1;
(18) Фармацевтическая композиция по п. (17), где заболевание, связанное с HTRA1, представляет одно, два или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из влажной формы возрастной макулярной дегенерации, сухой формы возрастной макулярной дегенерации, географической атрофии, диабетической ретинопатии, ретинопатии недоношенных, полипоидной хориоидальной васкулопатии, ревматоидного артрита и остеоартрита;
(19) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (16)-(18), которая содержит один, два или более дополнительных лекарственных средств;
(20) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (16)-(18), которая применяется в комбинации с одним, двумя или более дополнительными лекарственными средствами;
(21) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (16)-(20), которая представляет агент для защиты сетчатки;
(22) Способ идентификации терапевтического средства или профилактического средства для возрастной макулярной дегенерации, включающий следующие стадии 1-3:
[стадия 1] инкубация протеазы HTRA1 и субстрата в присутствии и в отсутствии тестируемого вещества;
[стадия 2] детектирование активности протеазы HTRA1 в присутствии и в отсутствии тестируемого вещества; и
[стадия 3] определение тестируемого вещества как положительного, когда активность протеазы HTRA1 в присутствии тестируемого вещества ниже активности протеазы HTRA1 в отсутствии тестируемого вещества;
(23) Способ идентификации агента для защиты сетчатки, включающий следующие стадии 1-3:
[стадия 1] инкубация протеазы HTRA1 и субстрата в присутствии и в отсутствии тестируемого вещества;
[стадия 2] детектирование активности протеазы HTRA1 в присутствии и в отсутствии тестируемого вещества; и
[стадия 3] определение тестируемого вещества как положительного, когда активность протеазы HTRA1 в присутствии тестируемого вещества ниже активности протеазы HTRA1 в отсутствии тестируемого вещества;
(24) Способ получения модели повреждения сетчатки на кроликах, включающий стадию скармливания кроликам рациона с высоким содержанием жира, включающего гидрохинон, в течение 3-6 месяцев, где клетки ретинального пигментного эпителия модельного кролика гипертрофированы по сравнению с клетками ретинального пигментного эпителия нормального кролика;
(25) Модель повреждения сетчатки на кроликах, полученная способом по п. (24), где модель повреждения сетчатки на кроликах имеет гипертрофированные клетки ретинального пигментного эпителия по сравнению с нормальным кроликом;
(26) Способ идентификации терапевтического средства или профилактического средства для возрастной макулярной дегенерации или агента для защиты сетчатки, включающий следующие стадии (i) и (ii):
(i) оценка гипертрофии клеток ретинального пигментного эпителия у кролика по п. (25) с и без введения тестируемого вещества; и
(ii) определение тестируемого вещества как положительного, когда гипертрофия клеток ретинального пигментного эпителия при введении тестируемого вещества подавляется по сравнению с гипертрофией клеток ретинального пигментного эпителия без его введения;
(27) Способ по п. (26), где оценка на стадии (i) представляет измерение средней площади клеток ретинального пигментного эпителия или числа гипертрофированных клеток ретинального пигментного эпителия;
(28) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (16)-(18) для лечения или профилактики сухой формы возрастной макулярной дегенерации; и
(29) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (16)-(18) для лечения или профилактики влажной формы возрастной макулярной дегенерации; и т.п.
Преимущественные эффекты изобретения
[0007] Пептид, обеспеченный настоящим изобретением, и фармацевтическая композиция, содержащая данный пептид, обладают активностью ингибирования HTRA1, и пригодны в лечении или профилактике и т.д. возрастной макулярной дегенерации.
Краткое описание фигур
[0008] [Фиг. 1(A)] На фиг. 1(A) представлена схема, показывающая результаты сравнения сходства последовательностей HTRA1 человека, мыши, крысы и обезьяны. Пунктирная линия показывает ферментативно активный домен (от 204Gly до 364Leu).
[Фиг. 1(B)] На фиг. 1(B) представлена схема, показывающая результаты сравнения сходства последовательностей HTRA1 человека, мыши, крысы и обезьяны (продолжение).
[Фиг. 2] На фиг. 2 представлен график, показывающий результаты оценки активностью ингибирования HTRA1 (каталит) HTRA1-ингибирующего пептида с использованием скорости расщепления пептидного субстрата в качестве показателя. На панелях А-С показаны результаты оценки для каждого ингибирующего пептида, и на панели D показаны результаты оценки контрольного SPINK2 дикого типа.
[Фиг. 3] На фиг. 3 представлен график, показывающий результаты оценки активностью ингибирования HTRA1 (полной), HTRA1-ингибирующего пептида с использованием скорости расщепления пептидного субстрата в качестве показателя (панели А-С).
[Фиг. 4(A)] На фиг. 4(A) представлена диаграмма, показывающая результаты оценки активностью ингибирования HTRA1 (каталит) HTRA1-ингибирующего пептида с использованием расщепления человеческого витронектина в качестве показателя. Анализ проводили вестерн-блоттингом с использованием антитела к человеческому витронектину (R & D Systems, Inc.; MAB2349).
[Фиг. 4(B)] На фиг. 4(B) представлена диаграмма, показывающая результаты оценки активностью ингибирования HTRA1 (каталит) HTRA1-ингибирующего пептида с использованием расщепления человеческого витронектина в качестве показателя (продолжение).
[Фиг. 5(А)] На фиг. 5(А) представлены графики, показывающие результаты оценки перекрестной реактивности HTRA1-ингибирующего пептида с каждой протеазой с использованием расщепления пептидного субстрата в качестве показателя (часть 1). Название каждой использованной протеазы и ее концентрацию, и название субстрата и его концентрацию и т.д. см. в примере 3.
[Фиг. 5(B)] На фиг. 5(B) представлены графики, показывающие результаты оценки перекрестной реактивности HTRA1-ингибирующего пептида с каждой протеазой с использованием расщепления пептидного субстрата в качестве показателя (часть 2).
[Фиг. 5(С)] На фиг. 5(С) представлены графики, показывающие результаты оценки перекрестной реактивности HTRA1-ингибирующего пептида с каждой протеазой с использованием расщепления пептидного субстрата в качестве показателя (часть 3).
[Фиг. 5(D)] На фиг. 5(D) представлены графики, показывающие результаты оценки перекрестной реактивности HTRA1-ингибирующего пептида с каждой протеазой с использованием расщепления пептидного субстрата в качестве показателя (часть 4).
[Фиг. 6] На фиг. 6 представлена схема, показывающая комплекс HTRA1 (каталит)/HTRA1-ингибирующий пептид, полученная с помощью рентгеновской кристаллографии. Ингибирующий пептид связан с каждой молекулой тримера HTRA1, образованного HTRA1 (каталит).
[Фиг. 7] На фиг. 7 представлена схема, показывающая комплекс HTRA1 (каталит)/HTRA1-ингибирующий пептид, полученная рентгеновской кристаллографией, в виде мономера. Ингибирующий пептид связан с областью, содержащей активный центр HTRA1 (каталит).
[Фиг. 8] На фиг. 8 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 54) H2-Opt. N-концевой "Mca-I" означает N-(4-метилкумарил-7-амид)изолейцин, и C-концевой "(Dnp)K" означает N-эпсилон-(2,4-динитрофенил)лизин.
[Фиг. 9] На фиг. 9 представлена схема, показывающая, что экспрессия HTRA1 была повышена в стекловидном теле крысиной модели повреждения сетчатки, вызванного воздействием света. Анализ проводили вестерн-блоттингом с использованием антитела к человеческой HTRA1/PRSS11 (R & D Systems, Inc.; AF2916).
[Фиг. 10] На фиг. 10 представлен график, показывающий, что в группе с введением HTRA1-ингибирующего пептида на крысиной модели повреждения сетчатки, вызванного воздействием света, подавлялось снижение количества ядер в наружном ядерном слое на поперечном разрезе сетчатки. n=4 для группы, получавшей физиологический раствор, и n=5 для других групп.
[Фиг. 11] На фиг. 11 представлен график, показывающий результаты оценки активностью ингибирования HTRA1 (каталит) пяти производных HTRA1-ингибирующего пептида, с использованием скорости расщепления пептидного субстрата в качестве показателя.
[Фиг. 12] На фиг. 12 представлена диаграмма, показывающая результаты оценки связывания трех HTRA1-ингибирующих пептидов с HTRA1 (каталит) методом иммунопреципитации.
[Фиг. 13] На фиг. 13 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 1) человеческого SPINK2.
[Фиг. 14] На фиг. 14 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 2), кодирующая аминокислотную последовательность человеческого SPINK2.
[Фиг. 15] На фиг. 15 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 3) пептида H218.
[Фиг. 16] На фиг. 16 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 4), кодирующая аминокислотную последовательность пептида H218.
[Фиг. 17] На фиг. 17 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 5) пептида H223.
[Фиг. 18] На фиг. 18 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 6), кодирующая аминокислотную последовательность пептида H223.
[Фиг. 19] На фиг. 19 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 7) пептида H228.
[Фиг. 20] На фиг. 20 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 8), кодирующая аминокислотную последовательность пептида H228.
[Фиг. 21] На фиг. 21 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 9) пептида H308.
[Фиг. 22] На фиг. 22 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 10), кодирующая аминокислотную последовательность пептида H308.
[Фиг. 23] На фиг. 23 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 11) пептида H321.
[Фиг. 24] На фиг. 24 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 12), кодирующая аминокислотную последовательность пептида H321.
[Фиг. 25] На фиг. 25 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 13) пептида H322.
[Фиг. 26] На фиг. 26 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 14), кодирующая аминокислотную последовательность пептида H322.
[Фиг. 27] На фиг. 27 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 15) пептидного производного H308AT.
[Фиг. 28] На фиг. 26 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 16), кодирующая аминокислотную последовательность пептидного производного H308AT.
[Фиг. 29] На фиг. 29 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 17) пептидного производного H321AT.
[Фиг. 30] На фиг. 30 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 18), кодирующая аминокислотную последовательность пептидного производного H321AT.
[Фиг. 31] На фиг. 31 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 19) пептидного производного H322AT.
[Фиг. 32] На фиг. 32 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 20), кодирующая аминокислотную последовательность пептидного производного H322AT.
[Фиг. 33] На фиг. 33 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 21) пептида М7.
[Фиг. 34] На фиг. 34 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 22), кодирующая аминокислотную последовательность пептида М7.
[Фиг. 35] На фиг. 35 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 23) пептидного производного H308_S16A.
[Фиг. 36] На фиг. 36 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 24) пептидного производного H308_D1G_S16A.
[Фиг. 37] На фиг. 37 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 25) пептидного производного H308_D1S_S16A.
[Фиг. 38] На фиг. 38 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 26) пептидного производного H308_D1E_S16A.
[Фиг. 39] На фиг. 39 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 27) пептидного производного H308_D1SLI_S16A.
[Фиг. 40] На фиг. 40 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 28) пептидного производного H321ATS16A.
[Фиг. 41] На фиг. 41 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 29) пептидного производного H322ATS16A.
1
11
[Фиг. 42] На фиг. 42 показана общая формула (SEQ ID NO: 30) HTRA1-ингибирующего пептида. X-X каждая представляет произвольную аминокислоту.
[Фиг. 43] На фиг. 43 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 31), состоящая из S-метки и линкера.
[Фиг. 44] На фиг. 44 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 32) С-концевого гексамера.
[Фиг. 45] На фиг. 45 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 33) праймера 1.
[Фиг. 46] На фиг. 46 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 34) праймера 2.
[Фиг. 47] На фиг. 47 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 35) праймера 3.
[Фиг. 48] На фиг. 48 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 36) праймера 4.
[Фиг. 49] На фиг. 49 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 37) праймера 5.
[Фиг. 50] На фиг. 50 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 38) праймера 6.
[Фиг. 51] На фиг. 51 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 39) праймера 7.
[Фиг. 52] На фиг. 52 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 40) праймера 8.
[Фиг. 53] На фиг. 53 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 41) праймера 9.
[Фиг. 54] На фиг. 54 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 42) праймера 10.
[Фиг. 55] На фиг. 55 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 43) праймера 11.
[Фиг. 56] На фиг. 56 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 44) праймера 12.
[Фиг. 57] На фиг. 57 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 45) праймера 13.
[Фиг. 58] На фиг. 58 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 46) праймера 14.
[Фиг. 59] На фиг. 59 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 47) праймера 15.
[Фиг. 60] На фиг. 60 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 48) праймера 16.
[Фиг. 61] На фиг. 61 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 49) праймера 17.
[Фиг. 62] На фиг. 62 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 50) праймера 18.
[Фиг. 63] На фиг. 63 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 51) праймера 19.
[Фиг. 64] На фиг. 64 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 52) праймера 20.
[Фиг. 65] На фиг. 65 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 53) человеческой HTRA1 (полной).
[Фиг. 66(A)] На фиг. 66(A) представлен график, показывающий результаты оценки активностью ингибирования HTRA1 (каталит) HTRA1-ингибирующих пептидов с использованием скорости расщепления пептидного субстрата в качестве показателя.
[Фиг. 66(B)] На фиг. 66(B) представлен график, показывающий результаты оценки активностью ингибирования HTRA1 (каталит) HTRA1-ингибирующего пептида с использованием скорости расщепления пептидного субстрата в качестве показателя.
[Фиг. 67] На фиг. 67 представлена диаграмма, показывающая результаты оценки активностью ингибирования HTRA1 (каталит) HTRA1-ингибирующего пептида с использованием расщепления человеческого витронектина в качестве показателя. Анализ проводили вестерн-блоттингом с использованием антитела к человеческому витронектину (R & D Systems, Inc.; MAB2349).
[Фиг. 68(А)] На фиг. 68(А) представлены графики, показывающие результаты оценки перекрестной реактивности HTRA1-ингибирующих пептидов с каждой протеазой с использованием расщепления пептидного субстрата в качестве показателя (часть 1).
[Фиг. 68(B)] На фиг. 68(B) представлены графики, показывающие результаты оценки перекрестной реактивности HTRA1-ингибирующего пептида с каждой протеазой с использованием расщепления пептидного субстрата в качестве показателя (часть 2).
[Фиг. 68(С)] На фиг. 68(С) представлены графики, показывающие результаты оценки перекрестной реактивности HTRA1-ингибирующего пептида с каждой протеазой с использованием расщепления пептидного субстрата в качестве показателя (часть 3).
[Фиг. 68(D)] На фиг. 68(D) представлены графики, показывающие результаты оценки перекрестной реактивности HTRA1-ингибирующего пептида с каждой протеазой с использованием расщепления пептидного субстрата в качестве показателя (часть 4).
[Фиг. 68(E)] На фиг. 68(E) представлены графики, показывающие результаты оценки перекрестной реактивности HTRA1-ингибирующего пептида с каждой протеазой с использованием расщепления пептидного субстрата в качестве показателя (часть 5).
[Фиг. 69] На фиг. 69 представлена диаграмма, показывающая результаты оценки связывания трех HTRA1-ингибирующих пептидов с HTRA1 (каталит) методом иммунопреципитации.
[Фиг. 70(A)] На фиг. 70(A) представлен график, показывающий, что в группе с введением HTRA1-ингибирующего пептида H308_D1G_S16A на крысиной модели повреждения сетчатки, вызванного воздействием света, подавлялось снижение количества ядер в наружном ядерном слое на поперечном срезе сетчатки. n=6 для всех групп. Доза HTRA1-ингибирующего пептида H308_D1G_S16A составляла 0,2 и 1 мкг/глаз.
[Фиг. 70(В)] На фиг. 70(В) представлен график, показывающий, что в группе с введением HTRA1-ингибирующего пептида H321AT_D1G_S16A на крысиной модели повреждения сетчатки, вызванного воздействием света, подавлялось снижение количества ядер в наружном ядерном слое на поперечном срезе сетчатки. n=6 для всех групп. Доза HTRA1-ингибирующего пептида H321AT_D1G_S16A составляла 0,2 и 1 мкг/глаз.
[Фиг. 70(C)] На фиг. 70(C) представлен график, показывающий, что в группе с введением HTRA1-ингибирующего пептида H322AT_D1G_S16A на крысиной модели повреждения сетчатки, вызванного воздействием света, подавлялось снижение количества ядер в наружном ядерном слое на поперечном срезе сетчатки. n=6 для всех групп. Доза HTRA1-ингибирующего пептида H322AT_D1G_S16A составляла 0,2 и 1 мкг/глаз.
[Фиг. 71(A)] На фиг. 71(A) представлена диаграмма, показывающая результаты иммуноокрашивания клеток RPE у 12-недельного кролика, 3-летнего кролика и 3-летнего кролика, которому скармливали рацион HFD-HQ, антителом ZO-1 (Thermo Fisher Scientific Inc.).
[Фиг. 71(B)] На фиг. 71(B) показаны средние площади клеток RPE у 12-недельного кролика, 3-летнего кролика и 3-летнего кролика, которому скармливали рацион HFD-HQ.
[Фиг. 71(C)] На фиг. 71(C) представлен график, показывающий повышенную экспрессию мРНК компонента 3 комплемента «C3», который является фактором, связанным с AMD, в ткани сетчатки 3-летнего кролика, которому скармливали рацион HFD-HQ.
[Фиг. 71(D)] На фиг. 71(D) представлен график, показывающий повышенную экспрессию мРНК компонента 3 комплемента «С3», который является фактором, связанным с AMD, в RPE/ткани сосудистой оболочки 3-летнего кролика, которому скармливали рацион HFD-HQ.
[Фиг. 71(E)] На фиг. 71(E) представлен график, показывающий результаты измерения концентрации HTRA1 в стекловидном теле 12-недельного кролика, 3-летнего кролика и 3-летнего кролика, которому скармливали рацион HFD-HQ, по данным ЖХ-МС/МС.
[Фиг. 72(А)] На фиг. 72(А) представлен график, показывающий, что в группе с введением HTRA1-ингибирующего пептида H308 3-летним кроликам, которым скармливали рацион HFD-HQ, проявлялось подавляющее действие на гипертрофию клеток RPE. n=5 для всех групп. Среднюю площадь использовали в качестве показателя.
2
[Фиг. 72(B)] На фиг. 72(B) представлен график, показывающий, что в группе с введением HTRA1-ингибирующего пептида H308 3-летним кроликам, которым скармливали рацион HFD-HQ, проявлялось подавляющее действие на гипертрофию клеток RPE. n=5 для всех групп. Количество клеток RPE, имеющих клеточную площадь 1500 м или выше, использовали в качестве показателя.
[Фиг. 73] На фиг. 73 представлена схема, показывающая результаты сравнения сходства последовательностей HTRA1 человека, обезьяны, кролика, мыши и крысы. Пунктирная линия изображает ферментативно активный домен (от 204Gly до 364Leu).
2
2
[Фиг. 74] На фиг. 74 представлен график, показывающий, что HTRA1-ингибирующий пептид проявлял супрессивный эффект на мРНК VEGF, индуцированный в линии клеток ретинального пигментного эпителия человека ARPE-19 добавлением HO, нормального человеческого сывороточного комплемента и HTRA1.
[Фиг. 75] На фиг. 75 представлен график, показывающий, что HTRA1-ингибирующий пептид проявлял супрессивный эффект на миграцию эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), индуцированную сывороткой.
[Фиг. 76] На фиг. 76 показана нуклеотидная последовательность праймера 21.
[Фиг. 77] На фиг. 77 показана нуклеотидная последовательность праймера 22.
В настоящем изобретении выражение «SEQ ID NO: X (фиг. Y)» или «фиг. Y (SEQ ID NO: X)» означает, что последовательность показана в SEQ ID NO: X или показана на фиг. Y.
Описание вариантов осуществления
1. Определения
[0009] В настоящем изобретении термин «ген» используется для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащуюся в белке, или его комплементарной цепи. Ген состоит из одной цепи, двойной цепи или тройной или более цепи. Ассоциация цепи ДНК и цепи РНК, рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, находящихся в одной цепи, и двухцепочечной или трехцепочечной или более цепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей такую цепь, также включается в значение термина «ген».
[0010] В настоящем изобретении термины «ген», «полинуклеотид» и «молекула нуклеиновой кислоты» являются синонимами друг друга и не ограничиваются количеством их составляющих единиц, таких как рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, нуклеотиды и нуклеозиды, любым способом. Например, ДНК, РНК, мРНК, кДНК, кРНК, зонд, олигонуклеотид, праймер и тому подобное также включаются в объем этих терминов. Термин «молекула нуклеиновой кислоты» также сокращенно обозначается как «нуклеиновая кислота».
[0011] В настоящем изобретении термины «полипептид», «пептид» и «белок» являются синонимами друг друга. Пептид, который ингибирует или подавляет одну, две или более активностей или функций молекулы-мишени X (такие ингибирующие или подавляющие эффекты в совокупности именуются здесь в дальнейшем «активностью ингибирования Х»), может называться «Х-ингибирующим пептидом».
[0012] Термин «SPINK2» используется для обозначения ингибитора сериновой протеазы Kazal-типа 2. Данный белок с молекулярной массой 7 кДа состоит из Kazal-подобного домена, имеющего три дисульфидные связи. SPINK2 предпочтительно происходит от человека. В настоящем изобретении человеческий SPINK2 именуется просто «SPINK2», если не указано иное.
[0013] Термин «HTRA1» используется для обозначения индуцируемой тепловым шоком А сериновой пептидазы 1. Данный белок состоит из N-концевого домена, включающего IGFBP-подобный мотив и Kazal-подобный мотив, протеазного домена и C-концевого PDZ-домена и относится к семейству HTRA. HTRA1 предпочтительно происходит от человека. В настоящем изобретении человеческая HTRA1 также просто именуется «HTRA1», если не указано иное.
[0014] Термин «HTRA1-ингибирующий пептид» используется для обозначения пептида, который ингибирует или подавляет одну, две или более активностей или функций HTRA1. Фрагмент пептида, аддукт пептида с дополнительной молекулой или конъюгат пептида, которые сохраняют активность ингибирования HTRA1, включаются в объем термина «HTRA1-ингибирующий пептид». В частности, фрагмент, аддукт и модифицированная форма пептида, которые сохраняют активность ингибирования HTRA1, также включаются в термин «HTRA1-ингибирующий пептид».
[0015] В настоящем изобретении термин «клетка» используется для обозначения различных клеток, полученных от животных, субкультивированных клеток, первичных культивированных клеток, клеточных линий, рекомбинантных клеток, дрожжей, микроорганизмов и тому подобное.
[0016] В настоящем изобретении термин «сайт», с которым связывается пептид, т.е. «сайт», который распознается пептидом, используется для обозначения непрерывной или прерывистой неполной аминокислотной последовательности или неполной конформации на молекуле-мишени, которая связывается или распознается пептидом. В настоящем изобретении такой сайт может именоваться «эпитопом» или «сайтом связывания» на молекуле-мишени.
[0017] Термин «мутант SPINK2» используется для обозначения пептида, содержащего аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности SPINK2 дикого типа, посредством замены одной, двух или более аминокислот аминокислотами, отличными от аминокислот в последовательности дикого типа, делеции одной, двух или более аминокислот из последовательности дикого типа, инсерции одной, двух или более аминокислот, отсутствующих в последовательности дикого типа, и/или добавления аминокислоты(т), отсутствующей в последовательности дикого типа, к аминоконцу (N-концу) и/или карбоксиконцу (C-концу) последовательности дикого типа (именуемые в совокупности в дальнейшем термином «мутация»). «Мутант SPINK2», обладающий активностью ингибирования HTRA1, включается в термин «HTRA1-ингибирующий пептид». В настоящем изобретении «инсерция» также может быть включена в термин «добавление».
[0018] В настоящем изобретении термин «несколько» в выражении «одна или несколько» относится к 3-10.
[0019] В настоящем изобретении выражение «гибридизоваться в жестких условиях» используется для обозначения того, что гибридизацию проводят в условиях, обеспечивающих проведение гибридизации при 65°С в растворе, содержащем 5× SSC, и затем полученный продукт промывают при 65°С в течение 20 мин в водном растворе, содержащем 2× SSC С и 0,1% SDS, при 65°С в течение 20 мин в водном растворе, содержащем 0,5× SSC и 0,1% SDS, и при 65°С в течение 20 мин в водном растворе, содержащем 0,2× SSC и 0,1% SDS, или в условиях, эквивалентным указанным. SSC означает водный раствор 150 мМ NaCl и 15 мМ цитрата натрия, и n × SSC означает n-кратную концентрацию SSC.
[0020] В настоящем изобретении термины «специфический» и «специфичность» являются синонимичными и взаимозаменяемыми с терминами «селективный» и «селективность» соответственно. Например, HTRA1-специфический ингибирующий пептид является синонимом HTRA1-селективного ингибирующего пептида.
[0021] 2. Пептид
[0022] 2-1. Аминокислота
Термин «аминокислота» используется для обозначения органического соединения, содержащего аминогруппу и карбоксильную группу, и для обозначения α-аминокислоты, содержащейся в качестве составляющей единицы, предпочтительно в белке и более предпочтительно в природном белке. В настоящем изобретении аминокислота более предпочтительно представляет Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val. Термин «аминокислота» используется для обозначения данных 20 аминокислот в общем, если не указано иное. Данные 20 аминокислот в общем можно назвать «природными аминокислотами». HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению предпочтительно содержит природные аминокислоты.
[0023] В настоящем изобретении термин «аминокислотный остаток» также относится к термину «аминокислота».
[0024] В настоящем изобретении аминокислота может представлять L-аминокислоту, D-аминокислоту или их смесь (DL-аминокислоту) и означает L-аминокислоту, если не указано иное.
[0025] Природные аминокислоты можно разделить, например, на следующие группы, на основе общих свойств боковых цепей:
(1) группа гидрофобных аминокислот: Met, Ala, Val, Leu и Ile;
(2) группа нейтральных гидрофильных аминокислот: Cys, Ser, Thr, Asn и Gln;
(3) группа кислых аминокислот: Asp и Glu;
(4) группа основных аминокислот: His, Lys и Arg;
(5) группа аминокислот, влияющих на направление основной цепи: Gly и Pro; и
(6) группа ароматических аминокислот: Trp, Tyr и Phe.
Однако классификация природных аминокислот не ограничивается этим.
[0026] В настоящем изобретении каждая природная аминокислота может подвергаться консервативной аминокислотной замене.
[0027] «Консервативная аминокислотная замена» означает замену функционально эквивалентной или сходной аминокислотой. Консервативная аминокислотная замена в пептиде вызывает примерно статическое изменение аминокислотной последовательности пептида. Например, одна, две или более замен аминокислот, имеющих сходную полярность, действуют функционально эквивалентно и вызывают статическое изменение аминокислотной последовательности пептида. В общем, замену в определенной группе можно рассматривать в качестве консервативной замены с точки зрения структур и функций. Однако, как очевидно специалистам в данной области, роль конкретного аминокислотного остатка может быть определена его положением в трехмерной структуре молекулы, содержащей аминокислоту. Например, остаток цистеина может принимать окисленную (дисульфидную) форму, имеющую более низкую полярность, чем восстановленная (тиольная) форма. Длинная алифатическая группа боковой цепи аргинина способна определять структурно и функционально важные признаки. Альтернативно, боковая цепь, содержащая ароматическое кольцо (триптофан, тирозин и фенилаланин), способна вносить свой вклад в ион-ароматическое взаимодействие или катион-пи взаимодействие. В таком случае даже замена аминокислот, имеющих эти боковые цепи, аминокислотами, относящимися к группе кислых или неполярных аминокислот, может быть структурно и функционально консервативной. Остатки, такие как пролин, глицин и цистеин (дисульфидная форма), могут оказывать прямое влияние на трехмерную структуру основной цепи и часто не могут замещаться без структурной деформации.
[0028] Консервативная аминокислотная замена включает, как показано ниже, специфическую замену, основанную на сходстве боковых цепей (L. Lehninger, Biochemistry, 2nd edition, pp. 73-75, Worth Publisher, New York (1975)), и типичную замену.
(1) Группа неполярных аминокислот: аланин (именуемый в дальнейшем «Ala» или просто «A»), валин (именуемый в дальнейшем «Val» или просто «V»), лейцин (именуемый в дальнейшем «Leu» или просто «L»), изолейцин (именуемый в дальнейшем «Ile» или просто «I»), пролин (именуемый в дальнейшем «Pro» или просто «P»), фенилаланин (именуемый в дальнейшем «Phe» или просто «F»), триптофан (именуемый в дальнейшем «Trp» или просто «W») и метионин (именуемый в дальнейшем «Met» или просто «M»);
(2) Группа незаряженных полярных аминокислот: глицин (именуемый в дальнейшем «Gly» или просто «G»), серин (именуемый в дальнейшем «Ser» или просто «S»), треонин (именуемый в дальнейшем «Thr» или просто «T»), цистеин (именуемый в дальнейшем «Cys» или просто «C»), тирозин (именуемый в дальнейшем «Tyr» или просто «Y»), аспарагин (именуемый в дальнейшем «Asn» или просто «N»), и глутамин (именуемый в дальнейшем ь «Gln» или просто «Q»);
(3) Группа кислых аминокислот: аспарагиновая кислота (именуемая в дальнейшем «Asp» или просто «D») и глутаминовая кислота (именуемая в дальнейшем «Glu» или просто «E»);
(4) Группа основных аминокислот: лизин (именуемый в дальнейшем «Lys» или просто «K»), аргинин (именуемый в дальнейшем «Arg» или просто «R») и гистидин (именуемый в дальнейшем «His» или просто «Н»).
В настоящем изобретении аминокислоты могут представлять аминокислоты, отличные от природных аминокислот. Их примеры могут включать селеноцистеин, N-формилметионин, пирролизин, пироглутаминовую кислоту, цистин, гидроксипролин, гидроксилизин, тироксин, O-фосфосерин, десмосин, β-аланин, саркозин, орнитин, креатин, γ-аминомасляную кислоту, опин, теанин, трихоломовую кислоту, каиновую кислоту, домоевую кислоту и акромелевую кислоту, которые встречаются в природных пептидах или белках, и могут включать: N-защищенные аминокислоты, такие как норлейцин, Ac-аминокислоту, Boc-аминокислоту, Fmoc-аминокислоту, Trt-аминокислоту и Z-аминокислоту; С-защищенные аминокислоты, такие как трет-бутиловый эфир, бензиловый эфир, циклогексиловый эфир и флуорениловый эфир аминокислот; и другие аминокислоты, которые не встречаются в природе, включая диамин, ω-аминокислоту, β-аминокислоту, γ-аминокислоту, Tic-производные аминокислот и аминофосфоновую кислоту. Аминокислоты, отличные от 20 «природных аминокислот», не ограничиваются ими и для удобства в совокупности именуются «неприродными аминокислотами» в настоящем изобретении.
[0029] 2-2. HTRA1-ингибирующий пептид
HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению представляет мутант SPINK2, который, по меньшей мере, частично сохраняет каркас SPINK2 (именуемый в дальнейшем «мутант SPINK2»), и ингибирует или подавляет протеазную активность HTRA1 или фрагмента, который сохраняет ее ферментативную активность (именуемый в дальнейшем «функциональный фрагмент») (такое ингибирование и подавление в совокупности в дальнейшем именуется термином «активность ингибирования HTRA1»).
[0030] HTRA1, которая является мишенью ингибирующего пептида по настоящему изобретению, предпочтительно представляет HTRA1 млекопитающих, более предпочтительно HTRA1 приматов и еще более предпочтительно HTRA1 человека. Аминокислотная последовательность полноразмерной зрелой человеческой HTRA1 (именуемой в дальнейшем «HTRA1 (полная))» имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 53 (фигура 65). Данная аминокислотная последовательность состоит из положений 23-480 и не содержит сигнальной последовательности, состоящей из положений 1-22. Аминокислотная последовательность функционального фрагмента человеческой HTRA1 (именуемого в дальнейшем «HTRA1 (каталит)») особым образом не ограничивается, при условии, что функциональный фрагмент сохраняет протеазную активность. Его примеры могут включать функциональный фрагмент, состоящий из 158Gly-373Lys в SEQ ID NO: 53 (фиг. 65), и функциональный фрагмент, содержащий 158Gly-373Lys. HTRA1 или ее функциональный фрагмент, которые являются мишенью для ингибирующего пептида по настоящему изобретению, также относятся к «протеазе HTRA1». Протеаза HTRA1 предпочтительно происходит от позвоночных, более предпочтительно от млекопитающих, еще более предпочтительно от приматов и наиболее предпочтительно от человека, и может быть получена выделением из тканей или клеток любого из этих животных или с помощью способа, известного специалистам в данной области, такого как рекомбинация генов, трансляция in vitro или пептидный синтез. HTRA1 или ее функциональный фрагмент могут быть связаны с сигнальной последовательностью, Fc-областью иммуноглобулина, меткой, маркером или тому подобное.
[0031] Активность ингибирования HTRA1 можно оценить, используя протеазную активность HTRA1 в качестве показателя. Например, HTRA1 или ее функциональный фрагмент, субстрат и ингибирующий пептид по настоящему изобретению или его кандидат подвергают контактированию друг с другом. В этом случае, когда протеазная активность HTRA1 составляет 70% или ниже, 50% или ниже, 30% или ниже, 20% или ниже, 10% или ниже, 5% или ниже, 1% или ниже или 0% по сравнению чем в присутствии контроля или в отсутствии ингибитора или его кандидата, то ингибирование HTRA1 имеет место с ингибирующей активностью на уровне 30% или выше, 50% или выше, 70% или выше, 80% или выше, 90% или выше, 95% или выше, 99% или выше или 100% соответственно. Активность ингибирования HTRA1 может различаться в зависимости от условий реакции, типа субстрата, концентрации и т.д. Примеры условий реакции могут включать, не ограничиваясь этим, условия, описанные в примерах. Активность фермента можно оценить добавлением пептидного субстрата или белкового субстрата к определенной концентрации HTRA1 и взаимодействием смеси в течение определенного периода времени с последующим детектированием флуоресценции пептидного субстрата или детектированием белкового субстрата с использованием SDS-PAGE, вестерн-блоттинга, жидкостной хроматографии или тому подобное. Например, забуференный фосфатом физиологический раствор (именуемый в дальнейшем «PBS»), боратный буфер (50 мМ бората, рН 7-9, например, рН 8,5) или Трис-буфер (50 мМ Трис, рН 6-9, например, рН 8,0) можно использовать в качестве буферного раствора. NaCl (от 50 до 300 мМ, например, 150 мМ) или детергент, такой как CHAPS, или октил-D-глюкопиранозид можно добавить в реакционную систему, хотя добавка не ограничивается этим.
50
[0032] Примеры субстрата для протеазы HTRA1 включают, не ограничиваясь этим, эндогенные субстраты, экзогенные субстраты и синтетические субстраты. Примеры человеческого эндогенного субстрата включают витронектин. Примеры синтетического субстрата включают, без ограничения, H2-Opt (Mca-IRRVSYSFK(Dnp)K), β-казеин и другие субстраты HTRA1. Активность ингибирования HTRA1 (IC или Ki) пептида по настоящему изобретению составляет 1 мкМ или ниже, более предпочтительно, 100 нМ или ниже.
[0033] Предпочтительно, чтобы ингибирующий пептид по настоящему изобретению не ингибировал или не подавлял активность протеазы, отличной от HTRA1, или обладал относительно слабой степенью ингибирования или подавления такой активности. Другими словами, ингибирующий пептид по настоящему изобретению предпочтительно обладает высокой специфичностью к HTRA1. Предпочтительно ингибирующий пептид по настоящему изобретению не ингибирует и не подавляет активность протеаз, таких как трипсин, α-химотрипсин, триптаза, плазмин, тромбин, матриптаза, белок С, тканевой активатор плазминогена (tPA), урокиназа (uPA), плазмин и плазменный калликреин, или обладает относительно слабой степенью ингибирования или подавления таких активностей. Такой предпочтительный пептид по настоящему изобретению не проявляет побочной реакции, вызванной ингибированием или подавлением активности других протеаз, и его можно предпочтительно использовать в качестве терапевтического средства или профилактического средства для заболевания, связанного с HTRA1 (указано ниже).
Как упомянуто выше, HTRA1, которая является мишенью для пептида по настоящему изобретению, предпочтительно происходит от позвоночных, более предпочтительно от млекопитающих, еще более предпочтительно от приматов и наиболее предпочтительно от человека. Альтернативно, HTRA1, которая является мишенью для пептида по настоящему изобретению, может быть получена от животного, отличного от человека, например, грызуна, такого как крыса или мышь, или от примата, такого как яванский макак, обыкновенная игрунка или макак-резус. Пептид, обладающий активностью ингибирования HTRA1, происходящий от животного, отличного от человека, можно использовать для диагностики, обследования, лечения или профилактики и т.д. заболевания, связанного с HTRA1, у животного, отличного от человека. Когда такой пептид также ингибирует человеческую HTRA1, то животное, отличное от человека, можно использовать: в доклинических исследованиях и в процессе разработки пептида для применения в качестве терапевтического средства или профилактического средства для заболевания, связанного с человеческой HTRA1; или для проведения фармакологического исследования или фармакокинетического исследования, используя животное, отличное от человека, в качестве модели заболевания на животных; или для проведения испытания на безопасность, испытания на токсичность и т.п. с использованием животного, отличного от человека, в качестве здорового животного.
[0034] HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению обладает такими преимуществами: меньшая молекулярная масса, чем у других биологических молекул, таких как антитела, которые применяются в качестве лекарственных средств и диагностических средств в данной области; относительно простое получение (описано ниже); превосходные физические свойства с точки зрения проникновения в ткани, стабильности при хранении, термостабильности и тому подобное; и широкий диапазон выбора пути введения, способа введения, приготовления и тому подобное для применения в виде фармацевтической композиции (указано ниже). Период полураспада в крови пептида по настоящему изобретению, используемого в виде фармацевтической композиции, можно корректировать для удлинения посредством применения известного способа, такого как добавление биологической молекулы или полимера, и, таким образом, повышения молекулярной массы пептида. Молекулярная масса такого HTRA1-ингибирующего пептида по настоящему изобретению составляет ниже 10000, предпочтительно ниже 8000 и более предпочтительно примерно от 7000 до 7200. Фрагмент вариабельной петли, состоящий из 15Cys-31Cys в SEQ ID NO: 23 (фиг. 29) или фрагмент, состоящий из 15Cys-63Cys (именуемый в дальнейшем «фрагмент, содержащий шесть остатков Cys») и обладающий активностью ингибирования HTRA1, также включается в термин «HTRA1-ингибирующий пептид» по настоящему изобретению. Молекулярная масса фрагмента вариабельной петли составляет ниже 2500, и предпочтительно примерно 1800-2000. Молекулярная масса фрагмента, содержащего шесть остатков Cys, составляет ниже 6000, предпочтительно примерно 5300-5500.
[0035] Мутант SPINK2, который, по меньшей мере, частично сохраняет каркас SPINK2 (именуемый в дальнейшем «мутант SPINK2»), включенный в объем термина «HTRA1-ингибирующий пептид» по настоящему изобретению, может связываться с HTRA1 и предпочтительно способен связываться с HTRA1 млекопитающих, более предпочтительно HTRA1 приматов и еще более предпочтительно HTRA1 человека. Такой пептид, который связывается с HTRA1, распознает или связывается с неполным пептидом, неполной конформацией или тому подобное HTRA1 (такие эффекты распознавания и связывания в совокупности именуются в дальнейшем «активностью связывания мишени»).
В одном аспекте ингибирующий пептид по настоящему изобретению способен связываться с иммуногенным фрагментом HTRA1. Иммуногенный фрагмент HTRA1 имеет один, два или более эпитопов, мимотопов или других антигенных детерминант и, следовательно, способен индуцировать иммунный ответ или способен вызывать выработку антитела против фрагмента.
Связывание мутанта SPINK2 по настоящему изобретению с HTRA1 или ее иммуногенным фрагментом можно оценить, измерить или определить с помощью метода, известного специалистам в данной области, такого как определение детектируемой аффинности связывания (ELISA, поверхностный плазмонный резонанс (именуемый в дальнейшем «SPR») (также именуемый методом «BIAcore»), изотермическая калориметрия титрования (именуемая в дальнейшем «ITC»), проточная цитометрия, метод иммунопреципитации и т.д.).
[0036] Примеры ELISA включают метод, который включает детектирование HTRA1-ингибирующего пептида, который распознает и связывается с HTRA1, иммобилизованной на планшете. Для иммобилизации HTRA1 можно использовать биотин-стрептавидин, а также, например, иммобилизованное антитело, которое распознает метку, слитую с HTRA1. Для детектирования HTRA1-ингибирующего пептида можно использовать меченый стрептавидин, а также, например, меченое антитело для детектирования, которое распознает метку, слитую с HTRA1-ингибирующим пептидом. При мечении может использовать биотин, а также метод, подходящий для биохимического анализа, такой как HRP, щелочная фосфатаза или FITC. Для детектирования с использованием ферментативного мечения можно использовать хромогенный субстрат, такой как TMB (3,3',5,5'-тетраметилбензидин), BCIP (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат), п-NPP (п-нитрофенилфосфат), OPD (о-фенилендиамин), ABTS (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) или хемилюминесцентный субстрат SuperSignal ELISA Pico (Thermo Fisher Scientific Inc.), флуоресцентный субстрат, такой как флуорогенный субстрат пероксидазы QuantaBlu (TM) (Thermo Fisher Scientific Inc.) и хемилюминесцентный субстрат. При измерении сигнала детектирования можно использовать планшетный ридер для измерения поглощения, планшетный ридер для измерения флуоресценции, планшетный ридер для измерения люминесценции, жидкостный сцинтилляционный счетчик RI или тому подобное.
[0037] Примеры прибора для применения в анализе SPR могут включать BIAcore™ (GE Healthcare), ProteOn™ (Bio-Rad Laboratories, Inc.), SPR-Navi™ (Oy BioNavis Ltd.), Spreeta(TM) (Texas Instruments Inc.), SPRi-PlexII(TM) (HORIBA, Ltd.) и Autolab SPR(TM) (Metrohm AG). Примеры прибора для применения в BLI могут включать Octet(TM) (Pall Corp.).
[0038] Примеры метода на основе иммунопреципитации включают метод, который включает детектирование HTRA1, которая распознает и связывается с HTRA1-ингибирующим пептидом, иммобилизованным на шариках. В качестве шариков можно использовать магнитные шарики, агарозные шарики или тому подобное. Для иммобилизации HTRA1-ингибирующего пептида можно использовать биотин-стрептавидин, а также антитело, которое распознает пептид или метку, слитую с пептидом, белок А или белок G и т.д. Шарики отделяют с помощью магнита, центрифугирования или тому подобное, и HTRA1, преципитированная с шариками, детектируется с использованием SDS-PAGE или вестерн-блоттинга. Для детектирования HTRA1 можно использовать меченый стрептавидин, а также, например, меченое антитело для детектирования, которое распознает метку, слитую с HTRA1. При мечении можно использовать биотин, а также метод, подходящий для биохимическом анализа, такой как HRP, щелочная фосфатаза или FITC. Для детектирования с использованием ферментативного мечения можно использовать тот же субстрат, что и в ELISA. Для измерения сигнала детектирования можно использовать ChemiDoc™ (Bio-Rad Laboratories, Inc.), LuminoGraph (ATTO Corp.) или тому подобное.
50
D
D
-4
-5
-6
-6
-6
-7
-7
-7
-8
-8
-8
-9
-9
-9
[0039] В настоящем изобретении термин «специфическое распознавание», т.е. «специфическое связывание», используется для обозначения связывания, которое не является неспецифической адсорбцией. Примеры критерия для определения того, является ли связывание специфическим, могут включать значение EC в активности связывания в ELISA. Другие примеры критерия определения могут включать константу диссоциации (именуемую в дальнейшем «K»). Значение K HTRA1-ингибирующего пептида по настоящему изобретению для HTRA1 составляет 1×10 М или ниже, 1×10 М или ниже, 5×10 М или ниже, 2×10 М или ниже или 1×10 М или ниже, более предпочтительно 5×10 М или ниже, 2×10 М или ниже, или 1×10 М или ниже, еще более предпочтительно 5×10 М или ниже, 2×10 М или ниже, или 1×10 М или ниже, еще более предпочтительно, 5×10 М или ниже, 2×10 М или ниже, или 1×10 М или ниже. Другие примеры критерия определения могут включать результаты анализа методом иммунопреципитации. Предпочтительный HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению иммобилизуется на шариках, и HTRA1 добавляется к ним. Затем шарики отделяют и детектируют HTRA1, преципитированную с шариками. В этом случае детектируется сигнал HTRA1.
Несмотря на вышеприведенное описание, способность связываться с HTRA1 или ее иммуногенным фрагментом не является существенной для мутанта SPINK2, служащего в качестве ингибирующего пептида по настоящему изобретению, при условии, что мутант SPINK2 обладает активностью ингибирования HTRA1.
[0040] Ингибирующий пептид по настоящему изобретению может быть конкурентным в связывании субстрата протеазы с HTRA1.
[0041] В некоторых предпочтительных аспектах ингибирующий пептид по настоящему изобретению обладает защитным действием для сетчатки. Например, предпочтительный ингибитор по настоящему изобретению может подавлять индуцированное воздействием света снижение количества ядер в наружном ядерном слое на модели повреждения сетчатки, вызванного воздействием света, что подробно описано в примерах. В стекловидном теле было обнаружено большее количество белка HTRA1 в группе с воздействием света на данной модели по сравнению с группой без воздействия. Таким образом, настоящее изобретение раскрывает, что: HTRA1 участвует в повреждении сетчатки; и активность ингибирования HTRA1 обеспечивает защитный эффект для сетчатки.
[0042] Мутант SPINK2, служащий в качестве ингибирующего пептида по настоящему изобретению, может обладать активностями, свойствами, функциями, признаками и т.д., описанными выше, в то время как его полноразмерная аминокислотная последовательность имеет высокую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью человеческого SPINK2 дикого типа. Мутант SPINK2 по настоящему изобретению обладает 60% или выше, 70% или выше, 75% или выше, 80% или выше, 85% или выше, 90% или выше, 95% или выше, 98% или выше или 99% или более высокой идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 1: фигура 13) человеческого SPINK2.
[0043] Термин «идентичность» используется для обозначения свойства, которое указывает на степень сходства или отношения между двумя последовательностями. Идентичность (%) аминокислотных последовательностей рассчитывают делением числа идентичных аминокислот или аминокислотных остатков на общее число аминокислот или аминокислотных остатков и умножением полученного числового значения на 100.
[0044] Термин «гэп» используется для обозначения пространства при выравнивании двух или более последовательностей в результате делеции и/или добавления, по меньшей мере, в одной из двух или более последовательностей.
[0045] Идентичность между двумя аминокислотными последовательностями, имеющими полностью идентичные аминокислотные последовательности, составляет 100%. При условии, что одна из аминокислотных последовательностей имеет замену, делецию или добавление одной, двух или более аминокислот или аминокислотных остатков по сравнению с другой аминокислотной последовательностью, идентичность между этими двумя аминокислотными последовательностями ниже, чем 100%. Примеры алгоритма или программы для определения идентичности двух последовательностей с учетом гэпов могут включать такие, которые известны специалистам в данной области, такие как BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res., Vol. 25, p. 3389-3402, 1997), BLAST2 (Altschul et al., J. Mol. Biol., Vol. 215, p. 403-410, 1990) и Smith-Waterman (Smith et al., J. Mol. Biol., Vol. 147, p. 195-197, 1981).
[0046] В настоящем изобретении термин «мутированный» используется для обозначения того, что один, два или более нуклеотидов или нуклеотидных остатков или аминокислот или аминокислотных остатков замещены, делецированы или вставлены в нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность в сравнении с встречающейся в природе последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты или пептида. Аминокислотная последовательность мутанта SPINK2 по настоящему изобретению имеет одну, две или более мутированных аминокислот или аминокислотных остатков в сравнении с аминокислотной последовательностью человеческого SPINK2.
[0047] В аспекте настоящего изобретения аминокислотная последовательность мутанта SPINK2 может иметь любое из:
замены 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот из 16Ser-22Gly другими аминокислотами или аминокислотными остатками;
замены 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот из 24Pro-28Asn другими аминокислотами или аминокислотными остатками;
замены 1 или 2 аминокислот из 39Ala-43Thr другими аминокислотами или аминокислотными остатками в аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 1: фиг. 13) человеческого SPINK2;
или могут иметь эти аминокислоты в виде аминокислот дикого типа (2 аминокислоты или 2 аминокислотных остатка включены в α-спираль) при условии, что третичная структура основной цепи петли, состоящая из аминокислотных остатков в положениях с 16 по 30 и т.д., способна, по меньшей мере, частично проявлять активность ингибирования HTRA1; каждая из 15Cys, 23Cys, 31Cys, 42Cys, 45Cys и 63Cys предпочтительно представляет Cys, как в диком типе, для сохранения природных дисульфидных связей. 1, 2, 3, 4, 5 или 6 из них могут быть заменены другими аминокислотами для делеции природных дисульфидных связей или образования неприродной дисульфидной связи. Некоторые предпочтительные HTRA1-ингибирующие пептиды среди мутантов SPINK2 по настоящему изобретению сохраняют Cys в этих 6 положениях, как имеет место в природном SPINK2, и сохраняют дисульфидные связи. В некоторых более предпочтительных формах такого ингибирующего пептида 15Cys-45Cys, 23Cys-42Cys и 31Cys-63Cys соответственно образуют дисульфидные связи.
[0048] Когда аминокислотная последовательность такого мутанта SPINK2 содержится в HTRA1-ингибирующем пептиде, то предпочтительно, чтобы трехмерная структура состояла, например, из петлевой структуры, состоящей из 16Ser-30Val, β-листа, состоящего из «β-цепи» (1), состоящей из 31Cys и 32Gly, и β-цепи (2), состоящей из 57Ile-59Arg, α-спирали, состоящей из 41Glu-51Gly, или петлевой структуры, β-листа или α-спирали, сходных с ними или, по меньшей мере, частично соответствующих им (или этим положениям), содержащимся в аминокислотной последовательности SPINK2 дикого типа, должны сохраняться в той степени, в которой может проявляться активность ингибирования HTRA1.
[0049] Аминокислотные последовательности некоторых HTRA1-ингибирующих пептидов среди мутантов SPINK2 по настоящему изобретению будут упомянуты ниже. Как указано выше, в настоящем изобретении термин «аминокислотный остаток» также просто именуется «аминокислотой».
1
11
[0050] Каждая из первой-одиннадцатой Xaa (которые являются такими же, как X-X соответственно) в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 30 (фиг. 42), представляет любую произвольную аминокислоту без особых ограничений, при условии, что полученный мутант связывается к HTRA1 и ингибирует активность HTRA1. Далее будут описаны предпочтительные аминокислоты X1-X11. Однако эти аминокислоты могут включать природные аминокислоты, т.е. аминокислоты, идентичные аминокислотам в аминокислотной последовательности человеческого SPINK2 дикого типа.
[0051] X1 в положении 1 предпочтительно представляет Asp, Glu, Gly, Ser или Ile, более предпочтительно Asp или Gly и еще более предпочтительно Gly;
Х2 в положении 16 предпочтительно представляет Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr или Tyr, более предпочтительно Ala, Asp, Gly, His, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, Ser или Thr, еще более предпочтительно Ala, Gly, Lys, Leu, Ser или Thr, еще более предпочтительно Ala, Gly, Leu, Ser или Thr и еще более предпочтительно Ala или Ser;
X3 в положении 17 предпочтительно представляет Ala, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr или Tyr, более предпочтительно Asp, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr или Tyr, еще более предпочтительно Asp, His, Lys, Met или Gln и еще более предпочтительно Asp или Gln;
X4 в положении 18 предпочтительно представляет Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr, более предпочтительно Asp, Phe, His, Met, Asn, Gln, Ser или Tyr, еще более предпочтительно Asp, Phe, His, Ser или Tyr и еще более предпочтительно Phe или His;
Х5 в положении 19 предпочтительно представляет Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val или Tyr, более предпочтительно Ala, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser или Val, еще более предпочтительно Ala, Asp, Glu, Met или Asn и еще более предпочтительно Ala, Asp или Glu;
X6 в положении 21 предпочтительно представляет Ala, Glu, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Trp или Tyr, более предпочтительно Glu, Phe, Ile, Leu, Met, Gln, Arg или Trp, еще более предпочтительно Met или Trp, еще более предпочтительно Met;
X7 в положении 24 предпочтительно представляет Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr, более предпочтительно Asp, Glu, His, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr, еще более предпочтительно Gln, Trp, Tyr или Val и еще более предпочтительно Tyr или Val;
Х8 в положении 26 предпочтительно представляет Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Val, Tyr, более предпочтительно Ala, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Val или Tyr, еще более предпочтительно Phe, Leu или Tyr и еще более предпочтительно Phe или Leu;
Х9 в положении 27 предпочтительно представляет Glu, Phe, Leu, Ser, Thr или Tyr, более предпочтительно Phe, Leu, Ser, Thr или Tyr, еще более предпочтительно Phe или Tyr, еще более предпочтительно Tyr;
Х10 в положении 39 предпочтительно представляет Ala, Glu, Met или Val и более предпочтительно Ala или Glu; и
Х11 в положении 43 предпочтительно представляет Ala, Thr или Val, более предпочтительно Thr или Val.
[0052] Аминокислоты X1-X11 дикого типа представляют Asp, Ser, Gln, Tyr, Arg, Pro, Pro, His, Phe, Ala и Thr соответственно. Положение 20 представляет Leu, положение 22 представляет Gly, положение 25 представляет Arg, и положение 28 представляет Asn.
[0053] В настоящем изобретении одна, несколько, или более аминокислот могут быть дополнительно добавлены к N-концевому участку первой аминокислоты. Примеры таких аминокислот, которые можно добавить, включают Ser-Leu и аминокислотную последовательность, состоящую из S-метки и линкера (SEQ ID NO: 31: фиг. 43).
[0054] Одна или несколько аминокислот могут быть дополнительно добавлены к 63Cys, расположенному на С-конце. Примеры такой аминокислотной последовательности могут включать аминокислотную последовательность, имеющую 64Gly на С-конце, и аминокислотную последовательность, имеющую 65Gly на С-конце, посредством добавления Gly-Gly. Примеры такой аминокислоты, которую можно добавить, включают Gly-Gly и C-концевой гексамер (SEQ ID NO: 32: фигура 44).
[0055] Более предпочтительная форма аминокислотной последовательности, полученной добавлением других аминокислот к N-концу и/или С-концу аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 30 (фигура 42), или аминокислотной последовательности, полученной из SEQ ID NO: 30, включает аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и 23-29 (фиг.15, 17, 19, 21 23, 25, 27, 29, 31, 33 и 35-41) и аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и 22 (фиг. 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 и 34). Еще более предпочтительная ее форма включает аминокислотную последовательность, показанную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 24, 28 и 29 (фиг. 36, 40 и 41).
[0056] В настоящем изобретении пептид, полученный заменой, добавлением и/или делецией одной, двух или более аминокислот к или из мутантного пептида SPINK2, или N-концевого и/или C-концевого аддукта мутантного пептида SPINK2 (далее называемого «родительский пептид») относится к «производному родительского пептида» или «производному родительского пептида» (например, пример 6). Такое «производное» также входит в объем термина «пептид» по настоящему изобретению.
[0057] Аминокислотная последовательность мутанта SPINK2, включенного в объем термина «ингибирующий пептид» по настоящему изобретению, может содержать природную аминокислотную или мутированную аминокислотную последовательность или аминокислотную последовательность в фрагментах, отличных от X1-X11, т.е. в положениях от 2Pro до 15Cys, 20Pro, 22Gly, 23Cys, 25Arg, 28Asn-38Tyr, 41Glu, 42Cys и 44Thr-63Cys, в аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 1: фиг. 13) человеческого SPINK2 дикого типа. Например, мутант SPINK2 может иметь мутацию в одном, двух или более положениях, при условии, что ингибирующая активность для HTRA1 или фолдинг HTRA1, по меньшей мере, частично не затруднены и не нарушены. Такая мутация достигается применением стандартного метода, известного специалистам в данной области. Типичные примеры мутации в аминокислотной последовательности могут включать замену, делецию или добавление одной, двух или более аминокислот. Примеры замены могут включать консервативную замену. Консервативная замена приводит к замене определенного аминокислотного остатка аминокислотным остатком, сходным с ним по химическим характеристикам с точки зрения не только объемности, но и полярности. Примеры консервативной замены описаны в других разделах настоящего описания. С другой стороны, фрагменты, отличные от X1-X11, могут подвергаться неконсервативной замене одной, двух или более аминокислот, при условии, что ингибирующая активность для HTRA1 или фолдинг HTRA1, по меньшей мере, частично не затруднены и не нарушены.
[0058] В аминокислотной последовательности мутанта SPINK2, служащего в качестве ингибирующего пептида по настоящему изобретению, X1-X11 предпочтительно представляют аминокислоты X1-X11 соответственно в любой из последовательностей SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и 23-29 (фиг. 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 и 35-41) и более предпочтительно SEQ ID NO: 24, 28 и 29 (фиг. 36, 40 и 41), и фрагменты, отличные от X1-X11, могут иметь аминокислоты или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, частично не затрудняет или не нарушает ингибирующую активность или фолдинг HTRA1.
Примеры аминокислотной последовательности мутанта SPINK2, служащего HTRA1-ингибирующим пептидом по настоящему изобретению, могут включать любую из следующих аминокислотных последовательностей (а)-(е):
(а) аминокислотную последовательность, показанную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и 23-29 (фиг. 15, 17, 19, 21, 23, 25, 25, 29, 31, 33 и 35-41);
(b) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность (а), и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем активностью ингибирования HTRA1;
(c) аминокислотную последовательность, которая получена из аминокислотной последовательности (a) заменой, делецией, добавлением и/или инсерцией от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, 1 или 2, или 1 аминокислоты, и содержится в пептиде, обладающем активностью ингибирования HTRA1;
(d) аминокислотную последовательность, которая обладает 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентичностью с аминокислотной последовательностью (а) и содержится в пептиде, обладающем активностью ингибирования HTRA1; и
(е) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной в любой из последовательностей SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и 22 (фиг. 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 и 34).
[0059] Однако молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая HTRA1-ингибирующий пептид, не ограничивается (а)-(е). Любая молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащуюся в мутанте SPINK2, обладающем активность ингибирования HTRA1, и предпочтительно аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 30 (фиг. 42), включается в объем термина «молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая HTRA1-ингибирующий пептид».
[0060] Мутация может быть введена в ингибирующий пептид по настоящему изобретению с целью повышения его стабильности при фолдинге, термостабильности, стабильности при хранении, периода полураспада в крови, растворимости в воде, биологической активности, фармакологической активности, вторичного эффекта и т.д. Например, новая реакционноспособная группа, такая как Cys, может быть введена в пептид посредством мутации для конъюгации ингибирующего пептида с дополнительным соединением, таким как полиэтиленгликоль (PEG), гидроксиэтилкрахмал (HES), биотин, пептид или белок. В настоящем изобретении HTRA1-ингибирующий пептид, можно добавить, связать или соединить с дополнительной молекулой. Такие конъюгаты в совокупности именуются «конъюгатом HTRA1-ингибирующего пептида». В настоящем изобретении термин «конъюгат» используется для обозначения молекулы пептида по настоящему изобретению или его фрагмента, добавленного, связанного или соединенного с дополнительной молекулой. Термин «конъюгат» или «конъюгация» включает форму, в которой определенная молекула связана или соединена через агент или тому подобное, подходящий для связывания определенной молекулы с боковой цепью аминокислоты, включая химическое соединение, такое как сшивающий агент, с N-концом и/или C-концом пептида по настоящему изобретению посредством синтетического химического подхода, генно-инженерного подхода или тому подобное. Примеры такой «молекулы» для удлинения периода полураспада в крови могут включать молекулы полиалкиленгликоля, такого как полиэтиленгликоль (ПЭГ), гидроксиэтилкрахмал, молекулы жирных кислот, таких как пальмитиновая кислота, Fc-области иммуноглобулина, СН3-домены иммуноглобулина, CH4-домены иммуноглобулина, альбумин или его фрагменты, альбумин-связывающие пептиды, альбумин-связывающие белки, такие как стрептококковый белок G и трансферрин. Альтернативно, «молекула» может быть связана с пептидом по настоящему изобретению через линкер, такой как пептидный линкер.
[0061] HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению можно конъюгировать с дополнительным лекарственным средством для усиления или повышения фармакологической активности. В области антител методика или форма, известная специалистам в данной области, например, конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC), составляет некоторые аспекты настоящего изобретения заменой антитела на пептид по настоящему изобретению.
[0062] HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению может дополнительно содержать одну, две или более молекул, которые проявляют аффинность связывания, ингибирующую активность, антагонистическую активность, агонистическую активность или тому подобное для молекулы-мишени, отличной от HTRA1, или его можно конъюгировать с такими молекулами. Примеры «молекулы» могут включать антитела или их фрагменты, и белки, имеющие каркас, отличный от антитела, такие как мутанты SPINK2, или их фрагменты. В области антител методика или форма, известная специалистам в данной области, например, мультиспецифические антитела и биспецифические антитела, составляет некоторые аспекты конъюгата по настоящему изобретению заменой, по меньшей мере, одного, двух или более «антител», содержащихся в нем, на пептид по настоящему изобретению.
[0063] Пептид по настоящему изобретению или его предшественник может содержать сигнальную последовательность. Сигнальная последовательность, присутствующая или добавленная к N-концу определенного полипептида или его предшественника, пригодна для доставки полипептида в специфический компартмент клетки, например, в периплазматическое пространство E.coli или эндоплазматический ретикулум эукариотической клетки. Специалистам в данной области известно много сигнальных последовательностей, и сигнальную последовательность можно выбрать в соответствии с клетками-хозяевами. Примеры сигнальной последовательности для секреции требуемого пептида в периплазматическое пространство E.coli могут включать OmpA. Форма, содержащая сигнальную последовательность, также может быть включена в некоторые аспекты «конъюгата» по настоящему изобретению.
[0064] Пептид по настоящему изобретению можно пометить заранее и тем самым обеспечив очистку аффинной хроматографией. Пептид по настоящему изобретению может включать, например, биотин, Strep(TM)-метку, Strep II(TM)-метку, олигогистидин, такой как His6, полигистидин, иммуноглобулиновый домен, мальтоза-связывающий белок, глутатион-S-трансферазу (GST), кальмодулин-связывающий пептид (CBP), гаптен, такой как дигоксигенин или динитрофенол, эпитоп-метку, такую как FLAG(TM), метку myc или метку HA (именуемые в дальнейшем в совокупности «аффинной меткой»), на его С-конце. Меченая форма также может быть включена в некоторые аспекты «конъюгата» по настоящему изобретению. В общем, конъюгат по настоящему изобретению может представлять пептид (полипептид).
[0065] Пептид по настоящему изобретению может содержать молекулу для мечения. В частности, пептид по настоящему изобретению можно конъюгировать с молекулой метки, такой как ферментативная метка, радиоактивная метка, цветная метка, флуоресцентная метка, красящая метка, люминесцентная метка, гаптен, дигоксигенин, биотин, комплекс металла, металл или коллоидное золото. Форма, содержащая молекулу для мечения, также может быть включена в некоторые аспекты «конъюгата» по настоящему изобретению.
[0066] Ингибирующий пептид по настоящему изобретению может содержать любые природные аминокислоты и неприродные аминокислоты в своем пептидном фрагменте и может содержать L-аминокислоту и D-аминокислоту в качестве природной аминокислоты.
[0067] Аминокислотная последовательность ингибирующего пептида по настоящему изобретению может содержать любые природные аминокислоты и неприродные аминокислоты и может содержать L-аминокислоту и D-аминокислоту в качестве природной аминокислоты.
[0068] Ингибирующий пептид по настоящему изобретению может находиться в виде мономера, димера или тримера, или олигомера более высокого порядка или мультимера. Димер или тример или олигомер более высокого порядка или мультимер могут представлять любую из гомоформы, состоящей из одинаковых мономеров, и гетероформы, состоящей из двух или более разных мономеров. Мономер может быстро диффундировать и превосходно проникать, например, в ткани. Димер, олигомер и мультимер могут иметь преимущественный аспект, например, высокую локальную аффинность или активность связывания с молекулой-мишенью, низкую скорость диссоциации или высокую активность ингибирования HTRA1. В дополнение к спонтанной димеризации, олигомеризации и мультимеризации, намеренная димеризация, олигомеризация и мультимеризация достигается посредством введения домена jun-fos, «лейциновой застежки-молнии» или тому подобное в ингибирующий пептид по настоящему изобретению.
[0069] Ингибирующий пептид по настоящему изобретению может связываться с одной, двумя или более молекулами-мишенями или ингибировать активность молекул-мишеней в форме мономера, димера или тримера или более олигомера более высокого порядка или мультимера.
[0070] Примеры формы, которую может принимать ингибирующий пептид по настоящему изобретению, могут включать, не ограничиваясь этим, выделенные формы (лиофилизированные препараты, растворы и т.д.), конъюгаты, указанные выше, и формы, связанные с другими молекулами (иммобилизованные формы, ассоциированные с другой молекулой, формы, связанные с молекулой-мишенью и т.д.). Форма, совместимая с экспрессией, очисткой, применением, хранением и т.п., может быть выбрана произвольно.
[0071] 3. Идентификация HTRA1-ингибирующего пептида
HTRA1-ингибирующий пептид можно идентифицировать способом, хорошо известным специалистам в данной области, с использованием исходного материала, такого как аминокислотная последовательность SPINK2 или аминокислотная последовательность (например, аминокислотная последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и 23-29, или группы, состоящей из фиг. 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 и 35-41) HTRA1-ингибирующего пептида по настоящему изобретению, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, или молекула нуклеиновой кислоты, содержащая такую нуклеотидную последовательность. В качестве предпочтительного примера HTRA1-ингибирующий пептид можно идентифицировать из библиотеки мутантов человеческого SPINK2, используя активность ингибирования HTRA1 в качестве показателя, которую можно комбинировать с активностью связывания HTRA1 в качестве еще одного показателя.
[0072] Например, молекула нуклеиновой кислоты, служащая в качестве исходного материала, может быть мутагенизирована и ею можно трансфектировать соответствующий бактериальный хозяин или эукариотический хозяин с использованием метода рекомбинантной ДНК. Библиотека мутантов SPINK2 известна в качестве способа идентификации связывающего агента или ингибитора молекулы-мишени. Например, раскрытие WO2012/105616 также в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки. После экспрессии мутагенизированной нуклеотидной последовательности в соответствующем хозяине клон, в котором мутант SPINK2, имеющий требуемые свойства, активность, функцию и т.д., связан с его генотипом, может быть обогащен и/или отобран из библиотеки и идентифицирован. При обогащении и/или отборе клона используется метод, известный специалистам в данной области, такой как метод бактериального дисплея (Francisco J.A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,Vol. 90, p. 10444-10448), метод дрожжевого дисплея (Boder E.T. et al. (1997) Nat. Biotechnol., Vol. 15, p. 553-557), метод дисплея на клетках млекопитающих (Ho M. et al. (2009) Methods Mol Biol., Vol. 525: p. 337-52), метод фагового дисплея (Smith G.P. (1985) Science., Vol. 228, p. 1315-1317), метод рибосомного дисплея (Mattheakis L.C. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, № 19, p. 9022-9029), метод дисплея нуклеиновых кислот, такой как дисплей мРНК (Nemoto N. et al. (1997) FEBS Lett., Vol. 414, No. 2, p. 405-408), или метод скрининга колоний (Pini A. et al. (2002) Comb. Chem. High Throughput Screen., Vol. 5, p. 503-510). Нуклеотидная последовательность мутанта SPINK2, находящаяся в клоне, отобранном и идентифицированном таким образом, может быть определена для установления аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, в качестве аминокислотной последовательности мутанта SPINK2, находящегося в клоне, т.е. HTRA1-ингибирующего пептида.
[0073] Мутант SPINK2 по настоящему изобретению можно получить, например, мутагенизацией природного SPINK2. Термин «мутагенез» используется для обозначения того, что одна, две или более аминокислот в их соответствующих положениях определенной аминокислотной последовательности могут быть замещены другими аминокислотами или делецированы, или аминокислота, отсутствующая в аминокислотной последовательности может быть добавлена или вставлена в нее. Такая делеция или такое добавление или инсерция могут изменить длину последовательности. В мутанте SPINK2 по настоящему изобретению мутагенез может предпочтительно иметь место в одном, двух или более положениях от X1 до X11 в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 30 (фиг. 42).
[0074] Однако, форма, которая сохраняет, после такого предпочтительного мутагенеза природные аминокислоты в одном, двух или более положениях от X1 до X11, т.е. ту же аминокислоту, которая присутствует в определенном положении в природной аминокислотной последовательности, также включается в объем термина «мутант» при условии, что, по меньшей мере, одна аминокислота мутирует в общем. Аналогично, в аспекте настоящего изобретения форма, которая сохраняет после мутагенеза в одном или более положениях группы, отличные от X1-X11, природные аминокислоты в этих положениях, т.е. ту же аминокислоту, которая присутствует в определенном положении в природной аминокислотной последовательности, также входит в объем термина «мутант» при условии, что, по меньшей мере, одна аминокислота мутирует в общем.
[0075] Термин «случайный мутагенез» используется для обозначения того, что в отношении определенного положения в последовательности одна, две или более разных аминокислот вводятся с определенной вероятностью в положение посредством мутагенеза. Вероятности введения, по меньшей мере, двух разных аминокислот не всегда могут быть одинаковыми. Настоящее изобретение не исключает, что указанные, по меньшей мере, две разные аминокислоты включаются из встречающейся в природе аминокислоты (в виде одной из аминокислот). Такой случай также входит в объем термина «случайный мутагенез».
[0076] Можно использовать стандартный метод, известный специалистам в данной области, в качестве метода случайного мутагенеза в определенном положении. Мутагенез может быть достигнут, например, с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) с использованием смеси синтетических олигонуклеотидов, включающей композицию вырожденных нуклеотидов в определенном положении в последовательности. Например, использование кодона NNK или NNS (N = аденин, гуанин, цитозин или тимин; K = гуанин или тимин; и S = гуанин или цитозин) вызывает мутагенез с введением любой из всех 20 природных аминокислот, а также стоп-кодона, в то время как применение кодона VVS (V = аденин, гуанин или цитозин) исключает возможность введения Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr и Val и вызывает мутагенез с введением любой из оставшихся 12 природных аминокислот. Например, использование кодона NMS (М = аденин или цитозин) исключает возможность введения Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp и Val и вызывает мутагенез с введением любой из оставшихся 11 природных аминокислот. Конкретный кодон, искусственный кодон или тому подобное можно использовать для мутагенеза с введением неприродной аминокислоты.
[0077] Сайт-направленный мутагенез также можно выполнить посредством использования структурной информации о мишени, содержащей конформацию и/или пептид против мишени или пептид дикого типа, из которого получен данный пептид. В настоящем изобретении сайт-направленная мутация может быть введена посредством использования структурной информации, включая информацию более высокого порядка о целевой HTRA1 и/или мутанте SPINK2 к мишени или SPINK2 дикого типа, или комплекса между ними. В одном примере идентифицируется мутант SPINK2, обладающий активностью ингибирования HTRA1. Затем получают кристаллический комплекс HTRA1 и мутанта SPINK2 и подвергают рентгеновской кристаллографии. На основе результатов анализа идентифицируют сайт на молекуле HTRA1, с которым связывается мутант SPINK2, и аминокислотный остаток в мутанте SPINK2, участвующий во взаимодействии с сайтом. Можно найти корреляцию структурной информации, полученной с помощью таких процедур, с активностью, ингибирующей HTRA1. На основе такой корреляции структура-активность, можно сконструировать замену аминокислоты в определенном положении определенной аминокислотой, инсерцию или делецию аминокислоты в определенное положение или тому подобное для фактического подтверждения активности HTRA1.
[0078] Мутагенез также может быть достигнут с использованием, например, нуклеотидной составляющей единицы с модифицированной специфичностью пары оснований, такой как инозин.
[0079] Кроме того, мутагенез в случайном положении достигается, например, с помощью допускающей ошибки ПЦР с использованием ДНК-полимеразы, такой как ДНК-полимераза Taq, у которой отсутствует функция коррекции ошибок и которая дает высокую степень ошибок, или химического мутагенеза.
[0080] HTRA1-ингибирующий пептид может быть обогащен и/или отобран из библиотеки, такой как фаговая библиотека или библиотека колоний, которая подходит для соответствующего способа скрининга и известна специалистам в данной области, с использованием бактериального дисплея, дрожжевого дисплея, дисплея на клетках млекопитающих, фагового дисплея, рибосомного дисплея, дисплея нуклеиновых кислот, скрининга колоний или тому подобное. Данные библиотеки можно сконструировать с использованием вектора и метода, такого как фагемида для фаговой библиотеки или космида для скрининга колоний, которые подходят для каждой библиотеки и известны специалистам в данной области. Такой вектор может представлять собой вирус или вирусный вектор, который инфицирует прокариотические клетки или эукариотические клетки. Такие рекомбинантные векторы можно получить способом, известным специалистам в данной области, таким как генетические манипуляции.
[0081] Бактериальный дисплей представляет собой метод слияния требуемого белка, например, с участком липопротеина наружной мембраны (Lpp) E.coli и белка OmpA наружной мембраны, и экспонирования требуемого белка на поверхности E.coli. Группа ДНК, полученная в результате случайного мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность определенного белка, вставляется в векторы, подходящие для бактериального дисплея, и бактериальные клетки можно трансформировать векторами с получением библиотеки, экспонирующей группу случайно мутагенизированных белков на поверхности трансформированной бактериальной клетки (Francisco J.A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90, p. 10444-10448).
[0082] Дрожжевой дисплей представляет метод слияния требуемого белка с белком оболочки, таким как α-агглютинин, который находится на клеточной поверхности дрожжей, и экспонирования требуемого белка на поверхности дрожжей. α-агглютинин содержит C-концевой гидрофобный участок с предполагаемым сигналом присоединения гликозилфосфатидилинозитольного якоря (GPI), сигнальной последовательности, активного домена, домена клеточной стенки и тому подобное. Требуемый белок может быть экспонирован на клеточной поверхности дрожжей посредством манипулирования ими. Группа ДНК, полученная в результате случайного мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность определенного белка, вставляется в векторы, подходящие для дрожжевого дисплея, и дрожжевые клетки можно трансформировать векторами с получением библиотеки, экспонирующей группу случайно мутагенизированных белков на клеточной поверхности трансформированных дрожжей (Ueda M. & Tanaka A., Biotechnol. Adv., Vol. 18, p. 121-, 2000; Ueda M. & Tanaka A., J. Biosci. Bioeng., Vol. 90, p. 125-, 2000, и т.д.).
[0083] Дисплей на клетах животных представляет метод слияния требуемого белка, например, с трансмембранной областью мембранного белка, типичным для которого является рецептор тромбоцитарного ростового фактора (PDGFR), и экспонирования требуемого белка на поверхности клеток млекопитающих (например, HEK293) и клеток яичника китайского хомячка (СНО). Группа ДНК, полученная в результате случайного мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность определенного белка, вставляется в векторы, подходящие для экспонирования на клетках животных, и клетки животных можно трансфицировать векторами с получением библиотеки, экспонирующей группу случайно мутагенизированных белков на поверхности трансфицированных клеток животных (Ho M. et al. (2009) Methods Mol Biol., Vol. 525: p. 337-52).
[0084] Требуемую библиотеку, экспонированную на клетках, таких как дрожжевые клетки, бактериальные клетки или клетки животных, можно инкубировать в присутствии молекулы-мишени или подвергнуть контактированию с молекулой-мишенью. Например, клетки, включающие библиотеку, инкубируют в течение определенного времени с HTRA1, модифицированной биотином или тому подобное. Затем к ним добавляют подложку, такую как магнитные шарики, и клетки отделяют от подложки. Затем подложку можно промыть для удаления неспецифического адсорбированного вещества и связанного вещества, чтобы извлечь группу клеток, которые экспонируют пептид, коллекцию пептидов или обогащенную коллекцию пептидов, связанную с подложкой (с которой связана HTRA1). Аналогично, группа клеток, экспонирующая пептид, коллекцию пептидов или обогащенную коллекцию пептидов, связанных с подложкой (с которой связана HTRA1), или группа клеток, экспонирующая пептид, коллекцию пептидов или обогащенную коллекцию коллекцию, связанных с HTRA1, можно выделить с использованием магнитно-активированного сортинга клеток (MACS) после добавления магнитных шариков или с помощью FACS после окрашивания клеток с использованием антитела к HTRA1 соответственно. Например, можно блокировать (насытить) сайт неспецифической адсорбции и/или сайт связывания. Можно включить здесь стадию блокирования, при условии, что блокирование выполняется соответствующим способом. Полученный таким образом вектор экспрессированного пептида, коллекции пептидов или обогащенной коллекции пептидов выделяют, и можно определить нуклеотидную последовательность полинуклеотида, вставленного в вектор, для установления аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью. Кроме того, вектором можно снова трансфектировать клетки-хозяева, и цикл операций, указанных выше, может повторять от одного до нескольких раз, чтобы значительно обогатить коллекцию пептидов, которая связывается с молекулой-мишенью.
[0085] Например, в случае фагового дисплея фагемида представляет собой бактериальную плазмиду, содержащую ориджин репликации плазмиды, а также второй ориджин репликации, полученный из однонитевого бактериофага. Клетка, имеющая фагемиду, может реплицировать фагемиду посредством однонитевой репликации коинфекцией с М13 или аналогичным ей бактериофагом-помощником. В частности, одноцепочечная фагемидная ДНК упакована в инфекционную частицу, покрытую белком оболочки бактериофага. Таким образом, фагемидная ДНК может формироваться в виде клона двухцепочечной плазмидной ДНК в инфицированной бактерии, в то время как фагемида может быть сформирована в виде бактериофаг-подобной частицы из супернатанта культуры коинфицированных клеток. Бактериофаг-подобную частицу вводят в бактерию, имеющую F-пилус, для инфицирования бактерии ДНК, таким образом, что сама частица может быть преобразована в плазмиду.
[0086] Гибридный ген, содержащий полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность тестируемого пептида, и ген белка оболочки бактериофага, вставляется в фагемиду, и бактерия инфицируется полученной фагемидой. Клетки культивируют таким образом, что пептид может экспрессироваться или экспонироваться на бактерии или на фагоподобной частице, или может быть получен в виде гибридного белка с белком оболочки в фаговую частицу или в супернатант культуры бактерии.
[0087] Например, гибридный ген, содержащий полинуклеотид и ген белка оболочки бактериофага gpIII, вставляется в фагемиду, и E.coli коинфицируется полученной фагмидой и M13 или фагом-помощником, сходным с ним, так что гибридный белок, содержащий пептид и белок оболочки, может продуцироваться и высвобождаться в культуральный супернатант E. coli.
[0088] В случае применения различных циклических или нециклических векторов, например, вирусного вектора вместо фагемиды, пептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью полинуклеотида, вставленного в вектор, может экспрессироваться или экспонироваться на клетках или вирусоподобных частицах, несущих вектор, или может продуцироваться и высвобождаться в культуральный супернатант клеток в соответствии со способом, известным специалистам в данной области.
[0089] Полученную таким образом библиотеку, экспрессирующую пептид, можно инкубировать в присутствии молекулы-мишени или подвергнуть контактированию с молекулой-мишенью. Например, подложку с иммобилизованной HTRA1 инкубируют в течение определенного периода времени с подвижной фазой, содержащей библиотеку. Затем подвижную фазу отделяют от подложки. Затем подложку промывают для удаления неспецифического адсорбированного вещества и связанного вещества. Пептид, коллекцию пептидов или обогащенную коллекцию пептидов, связанных с подложкой (с которой связан HTRA1), можно извлечь элюированием. Элюирование может быть выполнено неселективно, например, в присутствии относительно высокой ионной силы, низкого pH, условий умеренной денатурации или хаотропной соли, или может быть выполнено селективно добавлением растворимой молекулы-мишени, такой как HTRA1, антитела, которое связывается с молекулой-мишенью, природного лиганда, субстрата или тому подобное и конкуренцией с иммобилизованной молекулой-мишенью. Например, можно блокировать сайт неспецифической адсорбции и/или сайт связывания. Стадию блокирования можно включить здесь, если блокирование выполняется соответствующим способом.
[0090] Полученный таким образом вектор экспрессированного пептида, коллекции пептидов или обогащенной коллекции пептидов выделяют, и можно определить нуклеотидную последовательность полинуклеотида, вставленного в вектор, для установления аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью. Кроме того, вектором можно снова трансфектировать клетки-хозяева, и цикл операций, указанных выше, можно повторить от одного до нескольких раз, чтобы значительно обогатить коллекцию пептидов, которые связываются с молекулой-мишенью.
[0091] Рибосомный дисплей представляет метод, в котором используется, например, мРНК, которая кодирует требуемый белок и не имеет стоп-кодона, и бесклеточная система синтеза белков, и тем самым обеспечивается синтез in vitro молекулы требуемого белка, соответствующей ему мРНК, и рибосома, связанная друг с другом. Библиотека, экспонирующая группу случайно мутагенизированных белков на рибосомах, может быть получена применением группы мРНК, полученной случайным мутагенезом нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность определенного белка, и бесклеточной системой синтеза белков (Mattheakis L.C. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, № 19, p. 9022-9029).
[0092] Дисплей нуклеиновых кислот, также называемый мРНК-дисплеем, представляет метод, в котором используеся, например, линкер, такой как пуромицин, структурно сходный с 3'-концом тирозил-тРНК, и, тем самым обеспечивается синтез молекулы требуемого белка, кодирующей его мРНК и рибосома, связанная друг с другом. В данном методе используется бесклеточная система синтеза белков, а не живые клетки, и, следовательно, обеспечивается синтез in vitro. Библиотека, экспонирующая группу случайно мутагенизированных белков на рибосоме, может быть получена применением группы мРНК, полученной в результате случайного мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность определенного белка, линкера, такого как пуромицин, и бесклеточной системы синтеза белков (Nemoto N. et al. (1997) FEBS Lett., Vol. 414, № 2, p. 405-408).
[0093] Библиотека, экспонирующая пептиды, полученная с использованием бесклеточной системы синтеза, такой как рибосомный дисплей или дисплей нуклеиновых кислот, может быть инкубирована в присутствии молекулы-мишени или подвергнута контактированию с молекулой-мишенью. Например, подложку с иммобилизованной HTRA1 инкубируют в течение определенного периода времени с подвижной фазой, содержащей библиотеку. Затем подвижную фазу отделяют от подложки. Затем подложку промывают для удаления неспецифического адсорбированного вещества и связанного вещества. Пептид, коллекцию пептидов или обогащенную коллекцию пептидов, связанных с подложкой (с которой связана HTRA1), можно выделить элюированием. Элюирование может быть выполнено неселективно, например, в присутствии относительно высокой ионной силы, низкого pH, условий умеренной денатурации или хаотропной соли, или может быть выполнено селективно добавлением растворимой молекулы-мишени, такой как HTRA1, антитела, которое связывается с молекулой-мишенью, природного лиганда, субстрата или тому подобное и конкуренцией с иммобилизованной молекулой-мишенью. Например, можно блокировать сайт неспецифической адсорбции и/или сайт связывания. Стадию блокирования можно включить здесь, если блокирование выполняется соответствующим методом.
[0094] Нуклеиновую кислоту экспрессированного пептида, коллекцию пептидов или обогащенную коллекцию пептидов, полученные таким образом, выделяют. В случае мРНК нуклеотидная последовательность может быть определена после реакции обратной транскрипции в кДНК для установления аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью. Кроме того, выделенная нуклеиновая кислота транскрибируется в мРНК, и цикл операций, указанных выше, можно повторять от одного до нескольких раз, чтобы существенно обогатить коллекцию пептидов, которая связывается с молекулой-мишенью.
[0095] Если пептид, коллекцию пептидов или обогащенную коллекцию пептидов предварительно конъюгировать с аффинной меткой, то пептид или коллекцию можно эффективно очистить. Например, коллекцию пептидов предварительно конъюгируют с субстратом протеазы в виде метки таким образом, что пептид можно элюировать расщеплением посредством активности протеазы.
[0096] На основе полученной информации о последовательности и функции пептида и т.д., полученный клон или библиотеку можно дополнительно мутагенизировать, и из мутированной библиотеки можно получить пептид с улучшенными функциями (например, активностью ингибирования HTRA1), физическими свойствами (термостабильностью, стабильностью при хранении и т.д.), кинетикой in vivo (распределение и период полураспада в крови) и т.д..
[0097] HTRA1-ингибирующий пептид можно идентифицировать определением того, обладает ли полученный пептид активностью ингибирования HTRA1.
[0098] HTRA1-ингибирующий пептид предпочтительно способен сохранить трехмерную структуру, состоящую, например, из петлевой структуры, состоящей из 16Ser-30Val, β-листа, состоящего из β-цепи (1), состоящей из 31Cys и 32Gly, и β-цепи (2), состоящей из 57Ile-59Arg, и α-спирали, состоящей из 41Glu-51Gly, или петлевой структуры, β-листа или α-спирали, сходных с ними или, по меньшей мере, частично соответствующих им (или этим положениям), содержащихся в аминокислотной последовательности дикого типа SPINK2, в той степени, в которой может проявляться активность ингибирования HTRA1. Более предпочтительный HTRA1-ингибирующий пептид можно идентифицировать с использованием такой трехмерной структуры (полной структуры или неполной структуры) в качестве части показателя.
[0099] 4. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая HTRA1-ингибирующий пептид, вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, и способ получения рекомбинантного HTRA1-ингибирующего пептида
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащуюся в HTRA1-ингибирующем пептиде (именуемому в дальнейшем «молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей HTRA1-ингибирующий пептид»), рекомбинантному вектору, имеющему вставку гена, клетке, несущей ген или вектор (именуемой в дальнейшем «клеткой, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую HTRA1-ингибирующий пептид»), или клетке, продуцирующей HTRA1-ингибирующий пептид (именуемой в дальнейшем «клеткой, продуцирующей HTRA1-ингибирующий пептид»).
[0100] Некоторые предпочтительные примеры молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению, могут включать молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую любую из следующих нуклеотидных последовательностей (а)-(е) (именуемых в дальнейшем «нуклеотидной последовательностью HTRA1-ингибирующего пептида»), молекулу нуклеиновой кислоты, состоящую из нуклеотидной последовательности, содержащей последовательность гена антитела, и молекулу нуклеиновой кислоты, состоящую из последовательности гена антитела:
(а) нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и 23-29 (фиг. 15, 17, 19, 21, 23, 25, 25, 29, 31, 33 и 35-41);
(b) нуклеотидная последовательность, показанная в любой из последовательностей SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и 22 (фиг. 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 и 34);
(c) нуклеотидная последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности (a) или (b), и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем активностью ингибирования HTRA1;
(d) нуклеотидная последовательность, которая получена из нуклеотидной последовательности (а) или (b) заменой, делецией, добавлением и/или инсерцией от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, 1-5, 1-4, 1-3, 1 или 2, или 1 нуклеотида или нуклеотидного остатка, и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем активностью ингибирования HTRA1; и
(е) нуклеотидная последовательность, которая обладает 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентичностью с нуклеотидной последовательностью (а) или (b), и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем активностью ингибирования HTRA1.
[0101] Однако молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая HTRA1-ингибирующий пептид, не ограничивается нуклеотидными последовательностями (а)-(е). Любая молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащуюся в мутанте SPINK2, обладающем активностью ингибирования HTRA1, и предпочтительно аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 30 (фиг. 42), включается в объем термина «молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая HTRA1-ингибирующий пептид».
[0102] Один, два или более кодонов, соответствующих каждой аминокислоте, можно использовать для конструирования нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность. Следовательно, нуклеотидная последовательность, кодирующая одну аминокислотную последовательность определенного пептида, может иметь множество вариаций. Для выбора таких кодонов, кодоны можно соответствующим образом выбрать с учетом использования кодонов клетками-хозяевами, предназначенными для экспрессии, для включения полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, или вектора, содержащего полинуклеотид, или частоту или скорость множества используемых кодонов можно соответствующим образом корректировать. Например, в случае применения клеток Escherichia coli в качестве клеток-хозяев нуклеотидная последовательность может быть сконструирована с использованием кодонов с высокой частотой использования в Escherichia coli.
[0103] Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая HTRA1-ингибирующий пептид, может быть операбельно связана с одной, двумя или более регуляторными последовательностями. Выражение «операбельно связанная» используется для обозначения того, что связанная молекула нуклеиновой кислоты может быть экспрессирована, или нуклеотидная последовательность, содержащаяся в молекуле, является экспрессируемой. Регуляторная последовательность содержит элемент последовательности, включающий информацию о регуляции транскрипции и/или регуляции трансляции. Несмотря на то, что регуляторная последовательность варьируется в зависимости от вида, регуляторная последовательность обычно включает промотор и включает 5' некодирующие последовательности, участвующие в инициации транскрипции и трансляции, например, прокариотический -35/-10 бокс и последовательность Шайна-Дальгарно или эукариотический TATA-бокс, последовательность CAAT и 5'-кэппирующая последовательность. Такая последовательность может содержать энхансерный элемент и/или репрессорный элемент, и транслируемую сигнальную последовательность, лидерную последовательность или тому подобное для доставки природного или зрелого пептида в определенный компартмент внутри или вне клетки-хозяина. Регуляторная последовательность может дополнительно включать 3' некодирующую последовательность, и эта последовательность может содержать элемент, участвующий в терминации транскрипции или полиаденилировании и т.д. Однако последовательность, связанная с терминацией транскрипции, при недостаточном функционировании в определенных клетках-хозяевах, может быть заменена на последовательность, которая подходит для клеток.
[0104] Примеры промоторной последовательности могут включать прокариотический tet-промотор, промотор lacUV5 и промотор T7, и промотор SV40 и промотор CMV для эукариотических клеток.
[0105] Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая HTRA1-ингибирующий пептид, может находиться в выделенной форме или в форме, находящейся в векторе или другом клонирующем носителе (именуемые в дальнейшем просто «вектор; плазмида, фагемида, фаг, бакуловирус, космида» и т.д.), или в хромосоме, хотя форма не ограничивается этим. Вектор может содержать, в дополнении к нуклеотидной последовательности HTRA1-ингибирующего пептида и регуляторной последовательности, реплицирующуюся последовательность и контрольную последовательность, подходящие для клеток-хозяев, которые используются для экспрессии, и селективный маркер, который придает фенотип, позволяющий отбирать клетки, несущие молекулу нуклеиновой кислоты посредством трансформации или тому подобное.
[0106] Молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей HTRA1-ингибирующий пептид, или вектором, содержащим нуклеотидную последовательность HTRA1-ингибирующего пептида, можно трансфицировать клетки-хозяева, способные экспрессировать пептид или нуклеотидную последовательность, способом, известным специалистам в данной области, таким как трансформация. Клетки-хозяева, несущие молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, можно культивировать в условиях, подходящих для экспрессии пептида или нуклеотидной последовательности. Клетками-хозяевами могут быть любые прокариотические и эукариотические клетки. Примеры прокариот могут включать E.coli и Bacillus subtilis. Примеры эукариотических клеток могут включать клетки дрожжей, такие как Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris, клетки насекомых, такие как SF9 и High 5, и клетки животных, такие как клетки HeLa, клетки CHO, клетки COS и NS0. Пептид по настоящему изобретению, экспрессируемый с использованием клеток-хозяев, таких как эукариотические клетки, может подвергаться требуемой посттрансляционной модификации. Примеры посттрансляционной модификации могут включать добавление функциональной группы, такой как сахарная цепь, добавление пептида или белка и преобразование химических свойств аминокислоты. Альтернативно, пептид по настоящему изобретению может быть искусственно модифицирован по желанию. Такая модифицированная форма пептида также включается в объем термина «пептид» по настоящему изобретению.
[0107] Настоящее изобретение также включает способ получения HTRA1-ингибирующего пептида. Способ включает: стадию 1 культивирования клетки-хозяина, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую HTRA1-ингибирующий пептид, или вектор, содержащий нуклеотидную последовательность HTRA1-ингибирующего пептида, или клетки, экспрессирующей HTRA1-ингибирующий пептид; и/или стадию 2 выделения HTRA1-ингибирующего пептида из культур, полученных на стадии 1. Операции, такие как фракционирование, хроматография или очистка, известные специалистам в данной области, можно применить для стадии 2. Например, аффинная очистка с использованием антитела по настоящему изобретению, упомянутого ниже, применима к этому.
[0108] В некоторых аспектах настоящего изобретения HTRA1-ингибирующий пептид содержит внутримолекулярную дисульфидную связь. Может быть предпочтительным, чтобы пептид, содержащий внутримолекулярную дисульфидную связь, доставлялся в клеточный компартмент, имеющий окислительно-восстановительную среду, с использованием сигнальной последовательности или тому подобное. Окислительная среда может быть обеспечена периплазматическим пространством грамотрицательной бактерии, такой как Е.coli, внеклеточной средой грамположительной бактерии, просветом эндоплазматического ретикулума эукариотической клетки или тому подобное. Такая среда способна обеспечить образованию структурной дисульфидной связи. Альтернативно, пептид, содержащий внутримолекулярную дисульфидную связь, можно получить в цитоплазме клетки-хозяина, такой как клетка E.coli. В этом случае пептид может быть непосредственно получен в растворимом уложенном состоянии или выделен в форме тельца включения и затем восстановлен in vitro. Кроме того, выбирается клетка-хозяин, имеющая окислительную внутриклеточную среду, и пептид, содержащий внутримолекулярную дисульфидную связь, также можно получить в ее цитоплазме. С другой стороны, когда HTRA1-ингибирующий пептид не имеет внутримолекулярной дисульфидной связи, то пептид может быть получен в клеточном компартменте, имеющем восстанавливающую среду, например цитоплазму грамотрицательной бактерии.
[0109] HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению также можно получить другими способами, известными специалистам в данной области, такими как химический синтез, например, метод твердофазного синтеза пептидов, Merrifield et al. и метод органического химического синтеза пептидов с использованием трет-бутоксикарбонила (Boc) или 9-флуоренилметоксикарбонила (Fmoc) и трансляции in vitro.
[0110] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с мутантным пептидом SPINK2, обладающим активностью ингибирования HTRA1, и его функциональному фрагменту. Антитело может представлять любое из поликлонального антитела и моноклонального антитела. Моноклональное антитело особым образом не ограничивается, если моноклональное антитело является иммуноглобулином или получено из него. Функциональный фрагмент антитела не ограничивается при условии, что функциональный фрагмент обладает антигенсвязывающей активностью, т.е. связывающей активностью в отношении мутантного пептида SPINK2. Его примеры включают обе или одну из тяжелых и легких цепей или их фрагмент, фрагмент антитела, в котором отсутствует константная область или Fc-область, и конъюгат с дополнительным белком или соединением для мечения. Такое антитело и его функциональный фрагмент можно получить способом, известным специалистам в данной области, и можно использовать, например, для очистки мутантного пептида SPINK2 с помощью аффинной хроматографии, проведения клинического исследования, связанного с фармацевтической композицией, содержащей пептид, или его применения, детектирования пептида при диагностике или тому подобное, и в иммуноанализе. Антитело по настоящему изобретению можно очистить аффинной хроматографией с использованием пептида по настоящему изобретению, с которым связывается антитело.
[0111] 5. Фармацевтическая композиция
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей HTRA1-ингибирующий пептид или его конъюгат.
[0112] Фармацевтическая композиция, содержащая HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению или его конъюгат, пригодна для лечения и/или профилактики различных заболеваний, которые индуцируются или обостряются под действием HTRA1, и позволяет подавлять индукцию или обострение, лечить, сдерживать или подавлять симптомы, предупреждать вторичное заболевание и т.д. посредством ингибирования или подавления экспрессии или функции HTRA1 (в дальнейшем эти заболевания именуются «заболеваниями, связанными с HTRA1»). Заболевания, связанные с HTRA1, также включают различные заболевания, которые позволяют подавлять индукцию или обострение, лечить, сдерживать или подавлять симптомы, предупреждать вторичное заболевание и т.д. посредством защитного действия для сетчатки. HTRA1-ингибирующий пептид обладает защитным действием для сетчатки и пригоден в лечении и/или профилактике этих заболеваний, связанных с HTRA1.
[0113] Примеры заболеваний, связанных с HTRA1, могут включать, не ограничиваясь этим, возрастную макулярную дегенерацию, ретинопатию недоношенных, полипоидную хориоидальную васкулопатию, ревматоидный артрит и остеоартрит. Примеры возрастной макулярной дегенерации могут включать, не ограничиваясь этим, влажную форму возрастной макулярной дегенерации, сухую форму возрастной макулярной дегенерации и географическую атрофию. Кроме того, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в качестве агента для защиты фоторецепторных клеток, агента для защиты сетчатки и тому подобное (именуемые в дальнейшем в совокупности «агент для защиты сетчатки»).
Возрастная макулярная дегенерация подразделяется на влажную и сухую формы. Влажная форма дополнительно классифицируется на типичную возрастную макулярную дегенерацию (типичная AMD), полипоидную хориоидальную васкулопатию (PCV) и ретинальную ангиоматозную пролиферацию (RAP). Для влажной формы существуют такие методы лечения, как анти-VEGF препараты и фотодинамическая терапия (PDT), которые, однако, не всегда достаточны. Для сухой формы практикуются только изменение рациона или потребление добавок на основе исследования возрастных заболеваний глаз (AREDS).
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для лечения или профилактики возрастной макулярной дегенерации, например, как следует из результатов, показывающих, что: количество ядер в наружном ядерном слое снижалось в контрольной группе на крысиной модели повреждения сетчатки, вызванного воздействием света, в то время как введение HTRA1-ингибирующего пептида по настоящему изобретению до или после воздействия света подавляло снижение количества ядер в наружном ядерном слое в группе с введением на крысиной модели (примеры 5, 10 и 14); и площадь клеток ретинального пигментного эпителия (клеток RPE) или количество клеток RPE, имеющих клеточную площадь, равную или большую, чем заданное значение, повышалось в контрольной группе на кроличьей модели повреждения сетчатки (указано ниже), полученной скармливанием рациона с высоким содержанием жира и включением гидрохинона, тогда как введение HTRA1-ингибирующего пептида по настоящему изобретению подавляло это повышение в группе с введением на кроличьей модели (пример 11). На модели повреждения сетчатки на кроликах учитываются факторы риска развития сухой формы макулярной дегенерации у человека и, следовательно, она является превосходной моделью сухой формы возрастной макулярной дегенерации, в частности.
В тесте индукции мРНК VEGF с использованием клеток ретинального пигментного эпителия (RPE) было подтверждено, что введение HTRA1-ингибирующего пептида подавляет экспрессию мРНК VEGF (пример 12). Индукция VEGF в клетках ретинального пигментного эпителия вовлечена в патогенез влажной формы возрастной макулярной дегенерации (Klettner A. et al. (2009) Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., Vol. 247: p. 1487-1492). Кроме того, полагается, что такая аномальная индукция VEGF также вовлечена в поддержание патологического состояния, указывая на то, что HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению пригоден для лечения и профилактики сухой формы возрастной макулярной дегенерации и влажной формы возрастной макулярной дегенерации.
В тесте миграции эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) было подтверждено, что введение HTRA1-ингибирующего пептида подавляет миграцию (пример 13), указывая на то, что HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению пригоден для лечения и профилактики влажной формы возрастной макулярной дегенерации, характеризующейся ангиогенезом.
Влажная форма возрастной макулярной дегенерации имеет тенденцию к прогрессированию. Несмотря на то, что введение анти-VEGF препарата может временно подавить болезненное состояние, проблемой является повторное рецидивирование с высокой частотой (Yand S. et al., Drug Des. Devel. Ther., Vol. 2, No. 10: p. 1857-67, 2016). Проблемой лекарственных препаратов, открытых в последние годы, является развитие атрофии и снижение остроты зрения у пациентов с влажной формой возрастной макулярной дегенерации (Berg K. et al., Acta Ophthalmologica, Vol. 95, No. 8: p. 796-802, 2017). Введение HTRA1-ингибирующего пептида по настоящему изобретению самостоятельно или в комбинации с анти-VEGF препаратом может оказывать терапевтическое действие на влажную форму возрастной макулярной дегенерации (включая полипоидную хориоидальную васкулопатию и ретинальную ангиоматозную пролиферацию). Кроме того, профилактическое введение пептида может предотвратить или отсрочить рецидивирование болезненного состояния и отсрочить начало или возобновление лечения, например, анти-VEGF препаратом. Кроме того, пептид подавляет развитие атрофии у пациентов с влажной формой возрастной макулярной дегенерации и, следовательно, способен обеспечить долгосрочные эффекты с точки зрения остроты зрения.
HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению является преимущественным с точки зрения проникновения в ткани (пример 11), и также преимущественным с точки зрения его физических свойств, стабильности, безопасности, кинетики после введения, продуктивности и т.д. и, таким образом, предпочтительно может входить в состав фармацевтической композиции в виде активного ингредиента.
[0114] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать терапевтически или профилактически эффективное количество HTRA1-ингибирующего пептида или его конъюгата, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, солюбилизатор, эмульгатор, консервант и/или адъювант.
[0115] Термин «терапевтически или профилактически эффективное количество» используется для обозначения количества, которое оказывает терапевтическое или профилактическое действие на конкретное заболевание при введении в лекарственной форме и определенным путем введения, и является синонимом «фармакологически эффективного количества».
[0116] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать вещество для изменения, поддержания или сохранения pH, осмотического давления, вязкости, прозрачности, окраски, изотоничности, стерильности или стабильности, растворимости, скорости замедленного высвобождения, абсорбции, проникновения, лекарственной формы, активности, свойств, формы и т.д. композиции или пептида по настоящему изобретению или конъюгата содержащихся в ней (именуемое в дальнейшем «фармацевтическим веществом»). Фармацевтическое вещество особым образом не ограничивается, если это соединение является фармакологически приемлемым. Например, отсутствие или низкая токсичность представляет собой свойство, которым предпочтительно обладает фармацевтическое вещество.
[0117] Примеры фармацевтического вещества могут включать следующие вещества, не ограничиваясь этим: аминокислоты, такие как глицин, аланин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин и лизин; антимикробные агенты; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, сульфат натрия и бисульфит натрия; буферы, такие как фосфатный, цитратный или боратный буферы, бикарбонат натрия и Трис-HCl; наполнители, такие как маннит и глицин; хелатообразующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); комплексообразующие агенты, такие как кофеин, поливинилпирролидин, β-циклодекстрин и гидроксипропил-β-циклодекстрин; объемообразующие агенты, такие как глюкоза, манноза и декстрин; другие углеводы, такие как моносахариды, дисахариды, глюкоза, манноза и декстрин; красители; ароматизаторы; разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидин; низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы; антисептики, такие как хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота и перекись водорода; растворители, такие как глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль; сахарные спирты, такие как маннит и сорбит; суспендирующие агенты; поверхностно-активные вещества, такие как ПЭГ, сложный эфир сорбитана, полисорбаты, такие как полисорбат 20 и полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин и холестерин; соединения, повышающие стабильность, такие как сахароза и сорбитол; усилители упругости, такие как хлорид натрия, хлорид калия, маннит и сорбит; транспортные агенты; разбавители: эксципиенты; и/или фармацевтические адъюванты.
[0118] Такое фармацевтическое вещество добавляют к HTRA1-ингибирующему пептиду в количестве, превышающем массу HTRA1-ингибирующего пептида в 0,001-1000 раз, предпочтительно 0,01-100 раз и более предпочтительно 0,1-10 раз.
[0119] Липосома, содержащая HTRA1-ингибирующий пептид или его конъюгат, или фармацевтическая композиция, содержащая модифицированную форму, включающую HTRA1-ингибирующий пептид или его конъюгат, конъюгированные с липосомой, также включается в термин «фармацевтическая композиция» по настоящему изобретению.
[0120] Эксципиент или носитель особым образом не ограничивается, если эксципиент или носитель обычно представляет жидкость или твердое вещество и представляет воду для инъекций, физиологический раствор, искусственную спинномозговую жидкость или другие вещества для применения в препаратах для перорального или парентерального введения. Примеры нормального физиологического раствора могут включать нейтральный нормальный физиологический раствор или нормальный физиологический раствор, содержащий сывороточный альбумин.
[0121] Примеры буфера могут включать Трис-буфер, приготовленный для доведения конечного значения рН фармацевтической композиции до 7,0-8,5, ацетатный буфер, приготовленный для доведения ее конечного значения рН до 4,0-5,5, цитратный буфер, приготовленный для доведения ее конечного значения рН до 5,0-8,0 и гистидиновый буфер, приготовленный для доведения ее конечного значения рН до 5,0-8,0.
[0122] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению представляет твердое вещество, жидкость, суспензию или тому подобное. Другой пример фармацевтической композиции по настоящему изобретению может включать лиофилизированные препараты. Лиофилизированные препараты можно получить с использованием эксципиента, такого как сахароза.
[0123] Путь введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть любым: инстилляция в глаза, энтеральное введение, местное введение и парентеральное введение. Его примеры могут включать инстилляцию в конъюнктивальную полость, интравитреальное введение, внутривенное введение, внутриартериальное введение, внутримышечное введение, внутрикожное введение, подкожное введение, внутрибрюшинное введение, чрескожное введение, внутрикостное введение и внутрисуставное введение.
50
D
[0124] Состав фармацевтической композиции можно определить в соответствии со способом введения, аффинностью связывания HTRA1 с пептидом, ингибирующим HTRA1, и т.д. HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению, обладающий более высокой ингибирующей активностью (более низкое значение IC) в отношении целевой HTRA1 или имеющий более высокую аффинность (более низкое значение K) к белку HTRA1, способен оказывать свое терапевтическое действие в более низкой дозе.
[0125] Доза HTRA1-ингибирующего пептида по настоящему изобретению или его конъюгата не ограничивается, при условии, что доза представляет фармакологически эффективное количество. Дозу можно соответственно определить с учетом вида субъекта, типа заболевания, симптомов, пола, возраста, ранее имевшихся патологических состояний, аффинности связывания пептида с белком HTRA1 или его биологической активности и других факторов. Доза обычно составляет 0,01-1000 мг/кг и предпочтительно 0,1-100 мг/кг, ее можно вводить от одного раза в день до одного раза в 180 дней, или два или три или более раз в день.
[0126] Примеры формы фармацевтической композиции могут включать инъекционные препараты (включая лиофилизированные препараты и капельные инфузии), суппозитории, препараты абсорбционного типа для трансназального введения, препараты абсорбционного типа для чрескожного введения, сублингвальные агенты, капсулы, таблетки, мази, гранулы, аэрозоли, пилюли, порошки, суспензии, эмульсии, глазные капли и формуляции биологических имплантатов.
[0127] Фармацевтическую композицию, содержащую HTRA1-ингибирующий пептид или его конъюгат в качестве активного ингредиента, можно вводить одновременно или отдельно от дополнительного лекарственного средства. Например, фармацевтическую композицию, содержащую HTRA1-ингибирующий пептид или его конъюгат в качестве активного ингредиента, можно вводить после введения дополнительного лекарственного средства, или дополнительное лекарственное средство можно вводить после введения фармацевтической композиции. Альтернативно, фармацевтическую композицию и дополнительное лекарственное средство можно вводить одновременно. Для одновременного введения HTRA1-ингибирующий пептид или его конъюгат и дополнительное лекарственное средство могут входить в состав одного препарата или могут входить в состав отдельных препаратов (множества препаратов).
[0128] Примеры дополнительного лекарственного средства, используемого в комбинации с фармацевтической композицией по настоящему изобретению, могут включать анти-VEGF агенты, противовоспалительные агенты, агенты, нейтрализующие воспалительные цитокины, и ингибиторы пути активации комплемента. Анти-VEGF агенты подразделяются на антитела против VEGF, ингибиторы VEGF, антагонисты рецепторов VEGF и растворимые рецепторы VEGF и т.д. и включают бевацизумаб, ранибизумаб, афлиберцепт, пегаптаниб, бролуцизумаб и тому подобное. Противовоспалительный агент особым образом не ограничивается при условии, что противовоспалительный агент можно вводить местно для подавления внутриглазного или внутрисуставного воспаления. Примеры агента, нейтрализующего воспалительные цитокины, включают анти-TNFα-антитела, антитела к интерлейкину-6 (именуемому в дальнейшем «IL-6»), антитела против рецептора IL-6 и растворимые рецепторы TNF и могут, в частности, включать инфликсимаб, адалимумаб, голимумаб, цертолизумаб, тоцилизумаб и этанерцепт. Примеры ингибитора пути активации комплемента могут включать лампализумаб. Эти лекарственные средства подходят для лечения или профилактики заболеваний, связанных с HTRA1, и могут также комбинироваться с фармацевтической композицией по настоящему изобретению при лечении или профилактике заболеваний, отличных от заболеваний, связанных с HTRA1.
[0129] Можно использовать одно из этих дополнительных лекарственных средств, или два, три или более из них могут быть введены или получены. Такие подходы именуются в совокупности «комбинированное применение с дополнительным лекарственным средством» или «комбинация с дополнительным лекарственным средством» и фармацевтической композицией по настоящему изобретению. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая дополнительное лекарственное средство в дополнение к антителу по настоящему изобретению, его связывающему фрагменту или модифицированной форме антитела или фрагменту, или применяемая в комбинации с дополнительной терапией, также включается в настоящее изобретение в виде аспекта изобретения «комбинированное применение с дополнительным лекарственным средством» или «комбинации с дополнительным лекарственным средством».
[0130] Настоящее изобретение также относится к способу лечения или профилактики заболевания, связанного с HTRA1, такого как возрастная макулярная дегенерация, включающему стадию введения HTRA1-ингибирующего пептида или его конъюгата, применению HTRA1-ингибирующего пептида по настоящему изобретению или его конъюгата для приготовления фармацевтической композиции для лечения или профилактики заболевания, и применению HTRA1-ингибирующего пептида или его конъюгата для лечения или профилактики заболевания. Настоящее изобретение также включает набор для лечения или профилактики, содержащий HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению или его конъюгат.
[0131] Настоящее изобретение дополнительно относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность HTRA1-ингибирующего пептида или его конъюгата, вектору, содержащему полинуклеотид, и фармацевтической композиции, содержащей полинуклеотид или вектор, или клетке, экспрессирующей HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению или его конъюгат. Например, полинуклеотид и вектор могут применяться для генной терапии заболеваний, связанных с HTRA1, с использованием известного подхода. Клетка может применяться для клеточной терапии заболеваний, связанных с HTRA1, с использованием известного подхода. Также полинуклеотидом или вектором можно трансфектировать, например, аутологичные клетки или аллогенные клетки (гомологичные клетки) для подготовки клеток для клеточной терапии. Такой полинуклеотид и вектор также включаются в состав композиций лекарственного препарата для клеточной терапии по настоящему изобретению. Однако форма фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включающей полинуклеотид, вектор, клетку или тому подобное, не ограничивается вышеописанным.
[0132] 6. Композиция для диагностики и способы детектирования и выделения HTRA1
HTRA1-ингибирующий пептид по настоящему изобретению или его конъюгат могут обладать активностью связывания HTRA1 в дополнение к активности ингибирования протеазы HTRA1, и их можно использовать в различных исследованиях, таких как применение в качестве положительного контроля в исследованиях по поиску ингибиторов HTRA1, детектирование HTRA1, обследование и диагностика с использованием детектирования, разделение HTRA1, в качестве реагентов и других целей. Для детектирования или отделения HTRA1, по меньшей мере, один из пептида по настоящему изобретению и HTRA1 можно иммобилизовать.
Настоящее изобретение обеспечивает композицию для детектирования или диагностики (именуемую в дальнейшем в совокупности «композицией для диагностики»), содержащую пептид по настоящему изобретению, который связывается с HTRA1, или его конъюгат.
Композиция для диагностики по настоящему изобретению пригодна при обследовании или диагностике заболеваний, связанных с HTRA1, экспрессии HTRA1 и т.д. В настоящем изобретении примеры обследования или диагностики включают, не ограничиваясь этим, определение или оценку риска развития заболевания, определение наличия или отсутствия заболевания, оценку степени прогрессирования или обострения, оценку или определение эффективности лечения фармацевтической композицией, содержащей HTRA1-ингибирующий пептид или его конъюгат, оценку или определение эффективности лечения, отличного от данной терапии, оценку риска рецидивирования и определение наличия или отсутствия рецидива.
Композиция для диагностики по настоящему изобретению пригодна при идентификации субъекта-реципиента для пептида по настоящему изобретению или его конъюгата, композиции, содержащей пептид или его конъюгат, или фармацевтической композиции, содержащей пептид или его конъюгат.
Композиция для диагностики может содержать буфер рН, регулятор осмотического давления, соли, стабилизатор, антисептик, проявитель, сенсибилизатор, агент, предотвращающий агрегацию, и тому подобное.
Настоящее изобретение также относится к способу обследования или диагностики заболевания, связанного с HTRA1, применению пептида по настоящему изобретению для приготовления композиции для диагностики заболевания и применению пептида по настоящему изобретению, который связывается с HTRA1, или его конъюгата для обследования или диагностики заболевания. Настоящее изобретение также включает набор для обследования или диагностики, включающий пептид по настоящему изобретению или его конъюгат.
Способом обследования или диагностики, включающим пептид по настоящему изобретению, который связывается с HTRA1, желательно является ELISA сэндвич-типа. Альтернативно, можно использовать обычный метод детектирования, такой как ELISA, RIA, ELISPOT, дот-блот, метод Оухтерлони, CIE, CLIA или проточная цитометрия. Обследование или диагностика также достигается способом, основанным на методе иммунопреципитации.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ детектирования или измерения HTRA1 в тестируемом образце. В таком способе детектирования или измерения можно использовать композицию для диагностики по настоящему изобретению. HTRA1 в тестируемом образце может быть детектирована посредством: контактирования HTRA1-ингибирующего пептида или его конъюгата с тестируемым образцом (стадия 1); и последующего измерения количества HTRA1, связанной с пептидом (стадия 2). Стадия 1 может включать, например, иммобилизацию конъюгата HTRA1-ингибирующего пептида с Fc-областью иммуноглобулина на магнитных шариках через белок G и добавление к нему тестируемого образца. Стадия 2 может включать, например, отделение магнитных шариков и анализ растворимого белка, преципитированного с шариками, с использованием SDS-PAGE или вестерн-блоттинга для детектирования HTRA1. В дополнение к образцу человека или животного, отличного от человека, этому измерению может подвергаться даже образец, обработанный искусственно, такой как рекомбинантный белок. Примеры тестируемого образца из организма субъекта могут включать, не ограничиваясь этим, кровь, синовиальную жидкость, асцитную жидкость, лимфу, спинномозговую жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюну, мокроту, супернатанты гомогенатов ткани и срезы тканей.
Детектирование HTRA1 можно проводить не только in vitro, но и in vivo. В случае диагностической визуализации можно использовать HTRA1-ингибирующий пептид или его конъюгат, меченный фармацевтически приемлемым радионуклидом или светоизлучателем. Стадия 1 может включать, например, введение меченого пептида или его конъюгата испытуемому субъекту. Стадия 2 может включать, например, получение изображения с использованием метода диагностической визуализации, такого как ПЭТ/КТ, и определение или исследование присутствия HTRA1.
Пептид или его конъюгат, содержащиеся в композиции для диагностики по настоящему изобретению, связывается с HTRA1 и предпочтительно обладает HTRA1-специфической связывающей активностью.
Настоящее изобретение также включает способ идентификации субъекта-реципиента для фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В таком способе идентификации HTRA1 в образце, полученном от субъекта, измеряется с использованием HTRA1-связывающего пептида по настоящему изобретению, и субъект может быть определен как положительный, когда HTRA1 детектируется в образце или когда большее количество HTRA1 детектируется в нем в сравнении с количеством HTRA1, детектированном в образце, полученном от здорового субъекта. В данном способе можно использовать композицию для диагностики по настоящему изобретению.
В предпочтительном аспекте способа идентификации субъект страдает заболеванием, связанным с HTRA1, или имеет риск развития такого заболевания.
В одном аспекте фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить субъекту, определенному как положительный, в способе идентификации.
[0133] HTRA1 можно специфически отделить от образца, в котором HTRA1 находится вместе с другими компонентами, используя пептид по настоящему изобретению, обладающий HTRA1-специфической связывающей активностью, или его конъюгат. Высвобождение HTRA1 от пептида можно выполнить неселективно, например, в присутствии относительно высокой ионной силы, низкого pH, условий умеренной денатурации или хаотропной соли, и предпочтительно выполнить без ослабления протеазной активности HTRA1.
[0134] 7. Способ идентификации терапевтического средства или профилактического средства для заболевания, связанного с HTRA1.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации терапевтического средства или профилактического средства для заболевания, связанного с HTRA1, и предпочтительно возрастной макулярной дегенерации, или его кандидата с использованием активности ингибирования HTRA1 в качестве показателя. Способ может включать: стадию 1 инкубации протеазы HTRA1 и субстрата в присутствии или в отсутствии тестируемого вещества (или в присутствии носителя); стадию 2 определения активности протеазы HTRA1 в присутствии и в отсутствии тестируемого вещества; и/или стадию 3 определения тестируемого вещества в качестве терапевтического средства или профилактического средства для возрастной макулярной дегенерации или его кандидата, когда активность протеазы HTRA1 в присутствии тестируемого вещества ниже, чем активность протеазы HTRA1 в отсутствии тестируемого вещества. Тестируемое вещество может быть пептидным или непептидным. Пептидное тестируемое вещество не ограничивается мутантами SPINK2. Его примеры могут включать, не ограничиваясь этим, антитела, пептиды, отличные от мутантов SPINK2, имеющих белковый каркас, отличный от иммуноглобулина, и аналоги субстратов HTRA1. Примеры непептидного тестируемого вещества могут включать, не ограничиваясь этим, синтетические низкомолекулярные соединения и нуклеиновые кислоты. Одна или две или более стадий, описанных выше, также предпочтительно могут быть включены в способ идентификации вещества, обладающего защитным действием для сетчатки, или его кандидата. Настоящее изобретение также относится к способу идентификации вещества, обладающего защитным действием для сетчатки, или его кандидата.
[0135] 8. Модель повреждения сетчатки на кроликах
Настоящее изобретение также обеспечивает кроличью модель повреждения сетчатки, вызванного скармливанием рациона с высоким содержанием жира (именуемого в дальнейшем «HFD»), включающего гидрохинон (именуемый в дальнейшем «HQ»), способ получения модели, способ тестирования с использованием модели и т.д.
[0136] Для данной модели можно использовать произвольного белого кролика, такого как NZW или JW, в возрасте 2 лет и старше, независимо от пола.
[0137] HFD может содержать произвольное количество произвольного жира или масла, например, от 0,1 до 2% (мас./об.) холестерина, от 1 до 10% (мас./об.) кокосового масла, от 1 до 10% (мас./об.) арахисового масла, от 1 до 10% (мас./об.) соевого масла, от 10 до 20% (мас./об.) говяжьего жира, от 10 до 50% (мас./об.) свиного жира или от 1 до 10% (мас./об.) кукурузного масла, хотя компоненты рациона не ограничиваются этим, при условии, что компоненты подходят для воспроизведения модели.
[0138] Количество HQ, содержащегося в HQ-HFD, составляет от 0 до 4% (мас./об.), предпочтительно от 0,5 до 3,5% (мас./об.), более предпочтительно от 1,0 до 3,0% (мас./об.), еще более предпочтительно от 2,2 до 2,8% (мас./об.) и наиболее предпочтительно 2,4% (мас./об.).
[0139] Период скармливания HQ-HFD составляет от 3 до 6 месяцев, предпочтительно от 3,5 до 5 месяцев и более предпочтительно 4 месяца. Следует избегать продолжения скармливания рациона в течение 8 месяцев или более.
[0140] Модель по настоящему изобретению является предпочтительной, поскольку модель больше подходит для человека по размеру глазного яблока и функциям по сравнению с мышиными моделями (непатентные документы 18 и 19). Для обычных моделей на кроликах (непатентный документ 20) требуется 8 месяцев для их воспроизведения. Напротив, модель по настоящему изобретению может быть получена в более короткий период и, кроме того, более предпочтительна в качестве модели возрастной макулярной дегенерации, поскольку на модели может индуцироваться гипертрофия клеток RPE, что является неопределенным на обычных моделях.
Клетки ретинального пигментного эпителия (клетки RPE) на модели по настоящему изобретению гипертрофированы по сравнению с клетками RPE у нормального кролика, что позволяет выявить раннее развитие патологического состояния возрастной макулярной дегенерации. С другой стороны, гипертрофию клеток RPE невозможно визуально подтвердить, когда кроликам в возрасте 10 недель, представляющим обычную кроличью модель (непатентный документ 20), скармливали HQ-HFD в течение 4 месяцев.
Терапевтическое средство и/или профилактическое средство для возрастной макулярной дегенерации или агент для защиты сетчатки можно идентифицировать с использованием данной модели, позволяющей выявить патологическое состояние. Способ идентификации может включать следующие стадии: (i) оценку гипертрофии клеток ретинального пигментного эпителия у кролика на данной модели с или без введения тестируемого вещества; и (ii) определение тестируемого вещества как положительного, когда гипертрофия клеток ретинального пигментного эпителия при введении тестируемого вещества подавляется по сравнению с гипертрофией клеток ретинального пигментного эпителия без его введения. Оценка на стадии (i) предпочтительно представляет собой измерение средней площади клеток ретинального пигментного эпителия и/или количества гипертрофированных клеток ретинального пигментного эпителия.
Примеры
[0141] Далее некоторые аспекты настоящего изобретения будут описаны более подробно со ссылкой на примеры. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.
[0142] В следующих примерах, если не указано иное, то отдельные операции, касающиеся генетических манипуляций, выполнялись в соответствии с методами, описанным в Molecular Cloning» (Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., published Cold Spring Harbor Laboratory Press. in 1982 and 1989) или другими методами, описанными в экспериментальных руководствах, используемых специалистами в данной области, или, в случае, когда использовали коммерчески доступные реагенты или наборы, то примеры выполняли в соответствии с инструкциями, включенными в коммерчески доступные продукты.
[0143] Пример 1. Получение HTRA1-ингибирующего пептида
(1-1) Конструирование экспрессионного вектора HTRA1-ингибирующего пептида
(1-1-1) Конструирование pET 32a (модифицированный)_HTRA1-ингибирующий пептид
Вначале конструировали экспрессионный вектор HTRA1-ингибирующего пептида, с каркасом SPINK2 в качестве основной цепи. Фрагмент ингибитора амплифицировали с помощью ПЦР ((94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 30 с) × 30 циклов) с использованием нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и 22) каждого ингибирующего пептида и нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 2) SPINK2 в качестве матриц, используя следующие праймеры и KOD-plus - (Toyobo Co., Ltd.).
Праймер 1: 5'-AAAAGAATTCTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
Праймер 2: 5'-AAAACTCGAGTTATGCGGCCGCAGACGCGCCGCACGGACC-3'
Каждый амплифицированный фрагмент подвергали электрофорезу в агарозном геле. Затем требуемый фрагмент ДНК вырезали из геля, и ДНК получали с использованием набора для выделения ДНК из геля QIAquick (Qiagen N.V.). Полученный фрагмент ДНК и pET 32a (модифицированный) каждый обрабатывали рестриктазами EcoRI (New England BioLabs Inc.) и XhoI (New England BioLabs Inc.) при 37°C в течение 1 ч или более. После электрофореза в агарозном геле требуемые фрагменты ДНК вырезали из геля и очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR Purification (Qiagen N.V.). Очищенные фрагменты подвергали реакции в течение ночи при 16°С для лигирования с использованием ДНК-лигазы Т4 (New England BioLabs Inc.). Раствор для лигирования добавляли к E.coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), и смесь выдерживали на льду в течение 30 мин, затем подвергали тепловой обработке при 42°С в течение 45 с, затем выдерживали на льду в течение 5 мин, и инокулировали в планшет со средой 2YT, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, с последующим статическим культивированием в течение ночи при 37°С для трансформации E.coli. На следующий день трансформированную E.coli инокулировали в среду с бульоном Terrific (Invitrogen Corp.), содержащую 0,1 мг/мл ампициллина, и культивировали в течение ночи при 37°С. Затем плазмидную ДНК выделяли с использованием набора QIAprep 96 Turbo Miniprep (Qiagen N.V.) (в дальнейшем такая обработка именуется «обработкой минипреп») и подвергали анализу последовательности для конструирования «pET 32a (модифицированный)_HTRA1-ингибирующий пептид».
(1-1-2) Конструирование pET 32a_HTRA1-ингибирующий пептид_Kex2
Аналогично, фрагмент ингибитора амплифицировали с помощью ПЦР ((94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 30 с) × 30 циклов) с использованием последовательности (список последовательностей) каждого ингибитора и нуклеотидной последовательности SPINK2 в качестве матриц, используя следующие праймеры и KOD-plus - (Toyobo Co., Ltd.).
Праймер 3: 5'-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
Праймер 4: 5'-AAAACTCGAGTTAGCCGCCGCACGGACCATTGCGAATAATTTTA-3'
Каждый амплифицированный фрагмент подвергали электрофорезу в агарозном геле. Затем требуемый фрагмент ДНК вырезали из геля, и ДНК получали с использованием набора для выделения ДНК из геля QIAquick (Qiagen N.V.). Полученный фрагмент ДНК и pET 32a (Novagen) каждый обрабатывали рестриктазами BamHI (New England BioLabs Inc.) и XhoI (New England BioLabs Inc.) при 37°C в течение 1 ч или более. После электрофореза в агарозном геле требуемые фрагменты ДНК вырезали из геля и очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR Purification (Qiagen N.V.). Очищенные фрагменты подвергали реакции в течение ночи при 16°С для лигирования с использованием ДНК-лигазы Т4 (New England BioLabs Inc.). Раствор для лигирования добавляли к E.coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), и смесь выдерживали на льду в течение 30 мин, затем подвергали тепловой обработке при 42°С в течение 45 с, затем выдерживали на льду в течение 5 мин, инокулировали в планшет со средой 2YT, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, с последующим статическим культивированием в течение ночи при 37°С для трансформации E.coli. Трансформированную E.coli культивировали, и затем проводили минипреп и анализ последовательности для конструирования «pET 32a_HTRA1-ингибирующий пептид_Kex2». Операцию выполняли в соответствии с методом, описанным в (1-1-1).
(1-2) Экспрессия и очистка HTRA1-ингибирующего пептида
E.coli Origami B (DE3) (Novagen) трансформировали вектором pET 32a (модифицированный)_HTRA1-ингибирующий пептид, сконструированным в примере (1-1-1), и культивировали при 37°C с использованием среды 2YT, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина. Затем к этому добавляли IPTG (конечная концентрация: 1 мМ) и E.coli культивировали в течение ночи при 16°C. На следующий день после сбора с помощью центрифугирования (3000 g, 20 мин, 4°C) готовили лизат с использованием смеси BugBuster Master Mix (Novagen) и представляющий интерес гибридный белок с His-меткой очищали с использованием металл-хелатной аффинной смолы TALON (Clontech Laboratories, Inc.). Затем тиоредоксиновую метку и требуемый белок расщепляли с использованием набора Thrombin Cleavage Capture (Novagen) и очищали с использованием TALON. Полученный продукт подвергали гель-фильтрации (Superdex 75 10/300 GL) или обращеннофазовой хроматографии (YMC-Pack ODS-AM) с получением HTRA1-ингибирующего пептида. Полученный пептид конъюгировали на его N-конце с фрагментом, состоящим из S-метки и линкера (SEQ ID NO: 31: фиг. 43), и на его С-конце с C-концевым гексамером (SEQ ID NO: 32: фиг. 44) вместо Gly-Gly.
[0144] Аналогично, E.coli Origami B (DE3) (Novagen) трансформировали вектором pET 32a_HTRA1-ингибирующий пептид Kex2, сконструированным в примере (1-1-2), и культивировали при 37°C, используя среду 2YT, содержащую 0,1 мг/мл ампициллина. Затем к этому добавляли IPTG (конечная концентрация: 1 мМ) и E.coli культивировали в течение ночи при 16°C. На следующий день после сбора с помощью центрифугирования (3000 g, 20 мин, 4°C) готовили лизат с использованием смеси BugBuster Master Mix (Novagen) и представляющий интерес гибридный белок с His-меткой очищали с использованием металл-хелатной аффинной смолы TALON TALON (Clontech Laboratories, Inc.). Затем тиоредоксиновую метку и требуемый белок расщепляли с использованием Kex2 (Saccharomyces cerevisiae: инвентарный номер CAA96143) и очищали с использованием TALON. Полученный продукт подвергали гель-фильтрации (Superdex 75 10/300 GL) или обращенно-фазовой хроматографии (YMC-Pack ODS-AM) с получением HTRA1-ингибирующего пептида (ни с N-концом, ни с С-концом, конъюгированным с меткой, линкером или тому подобное).
[0145] Пример 2. Оценка HTRA1-ингибирующего пептида на активность ингибирования HTRA1
Сходство последовательностей HTRA1 человека, мыши, крысы и обезьяны показано на фиг. 1. Первичная последовательность, составляющая протеазный домен HTRA1 (от 204Gly до 364Leu), который является ферментативно активным доменом, полностью идентична между человеком и обезьяной. Последовательности протеазных доменов HTRA1 человека, мыши или крысы различаются на 1 остаток. Однако этот остаток структурно расположен на участке, противоположном активному центру фермента и, следовательно, предположительно не влияет на активный центр фермента (фиг. 1). Следовательно, протеазный домен HTRA1 имеет практически одинаковую последовательность независимо от вида (человек/мышь/крыса/обезьяна). Таким образом, никаких конкретных заключений в отношении видов не было сделано.
(2-1) Получение HTRA1 протеазного домена HTRA1 (каталит)
(2-1-1) Конструирование pET 21b_HTRA1 (каталит)
Протеазный домен (от 158Gly до 373Lys), за исключением N-концевого домена и PDZ-домена, человеческой HTRA1 (Q92743) использовали в качестве HTRA1 (каталит) для конструирования экспрессионного вектора HTRA1 (каталит). Требуемый фрагмент ДНК амплифицировали с помощью ПЦР ((94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 45 с) × 30 циклов) с использованием плазмиды с встроенной человеческой HTRA1 (GeneCopoeia, Inc.; GC-M0558) в качестве матрицы, используя следующие праймеры и KOD-plus - (Toyobo Co., Ltd.).
Праймер 5: 5'-AAACATATGGGGCAGGAAGATCCCAACAGTTTGC-3'
Праймер 6: 5'-AAACTCGAGTTTGGCCTGTCGGTCATGGGACTC-3'
Амплифицированный фрагмент подвергали электрофорезу в агарозном геле. Затем требуемый фрагмент ДНК вырезали из геля, и ДНК получали с использованием набора для выделения ДНК из геля QIAquick (Qiagen N.V.). Полученный фрагмент ДНК и pET 32a (Novagen) каждый обрабатывали рестриктазами NdeI (New England BioLabs Inc.) и XhoI (New England BioLabs Inc.) при 37°C в течение 1 ч или более. После электрофореза в агарозном геле требуемые фрагменты ДНК вырезали из геля и очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR Purification (Qiagen N.V.). Очищенные фрагменты подвергали реакции в течение ночи при 16°С для лигирования с использованием ДНК-лигазы Т4 (New England BioLabs Inc.). Раствор для лигирования добавляли к E.coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), и смесь выдерживали на льду в течение 30 мин, затем подвергали тепловой обработке при 42°С в течение 45 с, затем выдерживали на льду в течение 5 мин инокулировали в планшет со средой 2YT, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, с последующим статическим культивированием в течение ночи при 37°С для трансформации E.coli. Трансформированную E.coli культивировали, и затем проводили минипреп и анализ последовательности для конструирования «pET 21b_HTRA1 (каталит)». Операцию выполняли в соответствии с методом, описанным в примере (1-1-1).
(2-1-2) Получение HTRA1 (каталит)
E.coli BL21 (DE3) (Novagen) трансформировали сконструированным pET 21b_HTRA1 (каталит) и культивировали при 37°С, используя среду 2YT, содержащую 0,1 мг/мл ампициллина. Затем к этому добавляли IPTG (конечная концентрация: 1 мМ) и E.coli культивировали в течение ночи при 28°С. После сбора лизат готовили суспендированием в фосфатном буфере (50 мМ фосфата натрия и 300 мМ NaCl), содержащем 1 мг/мл лизоцима, и ультразвуковой обработкой, и требуемый гибридный белок с His-меткой выделяли с использованием TALON (Clontech Laboratories, Inc.). Полученный продукт подвергали гель-фильтрации (Superdex 200 10/300 GL) для очистки HTRA1 (каталит).
(2-2) Получение полноразмерной HTRA1 (HTRA1 (полная))
(2-2-1) Конструирование pcDNA3.1_HTRA1 (полная)_His
Требуемый фрагмент ДНК амплифицировали с помощью ПЦР ((94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 90 с) × 30 циклов) с использованием синтезированной ДНК человеческой HTRA1 (Q92743) (GeneArt) в качестве матрицы, используя следующие праймеры и KOD-plus - (Toyobo Co., Ltd.).
Праймер 7: 5'-AAAAGAATTCGCCACCATGCAGATTCCTAGAGCCG-3'
Праймер 8: 5'-AAAACTCGAGTCAGTGGTGATGGTGGTGGTGGCCGG-3'
Амплифицированный фрагмент подвергали электрофорезу в агарозном геле. Затем требуемый фрагмент ДНК вырезали из геля, и ДНК получали с использованием набора для выделения ДНК из геля QIAquick (Qiagen N.V.). Полученный фрагмент ДНК и pcDNA3.1 (Thermo Fisher Scientific Inc.) каждый обрабатывали рестриктазами EcoRI (New England BioLabs Inc.) и XhoI (New England BioLabs Inc.) при 37°C в течение 1 ч или более. После электрофореза в агарозном геле требуемые фрагменты ДНК вырезали из геля и очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR Purification (Qiagen N.V.). Очищенные фрагменты подвергали реакции в течение ночи при 16°С для лигирования с использованием ДНК-лигазы Т4 (New England BioLabs Inc.). Раствор для лигирования добавляли к E.coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), и смесь выдерживали на льду в течение 30 мин, затем подвергали тепловой обработке при 42°С в течение 45 с, затем выдерживали на льду в течение 5 мин и инокулировали в планшет со средой 2YT, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, с последующим статическим культивированием в течение ночи при 37°С для трансформации E.coli. Трансформированную E.coli культивировали, и затем проводили минипреп и анализ последовательности для конструирования «pcDNA3.1_HTRA1 (полная)_His». Операцию выполняли в соответствии с методом, описанным в примере (1-1-1).
(2-2-2) Конструирование pcDNA3.3_HTRA1 (полная)_FLAG_His
Фрагмент А амплифицировали с помощью ПЦР ((94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 90 с) × 30 циклов) с использованием pcDNA3.1_HTRA1 (полная)_His, сконструированным в примере (2-2-1) в качестве матрицы, используя следующие праймеры и KOD-plus - (Toyobo Co., Ltd.).
Праймер 7
Праймер 9: 5'-CTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCGCCGGGGTCGATTTCCTC-3'
Затем фрагмент В амплифицировали с помощью ПЦР ((94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 90 с) × 30 циклов), используя следующие праймеры и KOD-plus - (Toyobo Co., Ltd.).
Праймер 10: 5'-GCGACTACAAGGACGATGACGACAAGCACCACCACCATCATCAC-3'
Праймер 11: 5'-AAAAACTCGAGCTAGTGATGATGGTGGTGGTGCTTGTCGTC-3'
Требуемый фрагмент ДНК амплифицировали с помощью ПЦР ((94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 90 с) × 30 циклов) с использованием фрагмента А и фрагмента B в качестве матриц, используя праймеры 7 и 11 и KOD-plus - (Toyobo Co., Ltd.). Амплифицированный фрагмент подвергали электрофорезу в агарозном геле. Затем требуемый фрагмент ДНК вырезали из геля, и ДНК получали с использованием набора для выделения ДНК из геля QIAquick (Qiagen N.V.). Полученный фрагмент ДНК и pcDNA3.3 (Thermo Fisher Scientific Inc.) каждый обрабатывали рестриктазами EcoRI (New England BioLabs Inc.) и XhoI (New England BioLabs Inc.) при 37°C в течение 1 ч или более. После электрофореза в агарозном геле требуемые фрагменты ДНК вырезали из геля и очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR Purification (Qiagen N.V.). Очищенные фрагменты подвергали реакции в течение ночи при 16°С для лигирования с использованием ДНК-лигазы Т4 (New England BioLabs Inc.). Раствор для лигирования добавляли к E.coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), и смесь выдерживали на льду в течение 30 мин, затем подвергали тепловой обработке при 42°С в течение 45 с, затем выдерживали на льду в течение 5 мин и инокулировали в планшет со средой 2YT, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, с последующим статическим культивированием в течение ночи при 37°С для трансформации E.coli. Трансформированную E.coli культивировали, и затем проводили минипреп и анализ последовательности для конструирования «pcDNA3.3_HTRA1 (полная)_FLAG_His». Операцию выполняли в соответствии с методом, описанным в примере (1-1-1).
(2-2-3) Получение HTRA1 (полная)
Клетки FreeStyle 293F (Thermo Fisher Scientific Inc.) трансфектировали pcDNA3.3_HTRA1 (полная)_FLAG_His, сконструированным в примере (2-2-2), с использованием полиэтиленимина Max (Polysciences, Inc.). Через шесть дней культуральный супернатант выделяли. Гибридный белок с His-меткой выделяли с использованием колонки HisTrap excel (GE Healthcare), и HTRA1 (полная) дополнительно очищали с использованием аффинного геля анти-FLAG M2 (Sigma-Aldrich Co. LLC).
[0146] (2-3) Получение неактивной HTRA1, мутантной HTRA1 (S328A)
(2-3-1) Конструирование pcDNA3.3_HTRA1 (S328A)_FLAG_His
Для конструирования экспрессионного вектора неактивной HTRA1, мутантной HTRA1 (S328A) проводили ПЦР ((95°C в течение 30 с, 55°C в течение 1 мин и 68°C в течение 7 мин)) × 18 циклов) с использованием вектора «pcDNA3.3_HTRA1 (полная)_FLAG_His», сконструированного в примере (2-2-2), в качестве матрицы, используя следующие праймеры и наборы для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II (Agilent Technologies Japan, Ltd.).
Праймер 21: 5'-CCATCATCAACTACGGCAACGCGGGCGGACCCCTCGTGAACC-3' (SEQ ID NO: 55: фиг. 76)
Праймер 22: 5'-GGTTCACGAGGGGTCCGCCCGCGTTGCCGTAGTTGATGATGG-3' (SEQ ID NO: 56: фиг. 77)
После реакции ПЦР E.coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.) трансформировали реакционным раствором ПЦР, обработанным DpnI, следуя протоколу, прилагаемому к набору. Трансформированную E.coli культивировали, и затем проводили минипреп и анализ последовательности для конструирования «pcDNA3.3_HTRA1 (S328A)_FLAG_His». Операцию выполняли в соответствии с методом, описанным в примере (1-1-1).
(2-3-2) Получение HTRA1 (S328A)
HTRA1 (S328A) экспрессировали с использованием клеток FreeStyle 293F в соответствии с методом, описанным в примере (2-2-3), и HTRA1 (S328A) получали аффинной очисткой.
Пример 3. Оценка HTRA1-ингибирующего пептида на активность ингибирования HTRA1
(3-1) Оценка HTRA1-ингибирующего пептида на активность ингибирования HTRA1 с использованием пептидного субстрата
Пептидный субстрат H2-Opt (Mca-IRRVSYSFK (Dnp) K) (Peptide Institute, Inc.: SEQ ID NO: 54, фиг. 8) растворяли при 10 мМ в ДМСО, разбавляли буфером для анализа (50 мМ бората и 150 мМ NaCl, рН 8,5) и использовали в конечной концентрации 10 мкМ. HTRA1 (HTRA1 (каталит) или HTRA1 (полная)) и каждый HTRA1-ингибирующий пептид, разведенный буфером для анализа, смешивали при 25 мкл каждый и подвергали реакции при 37°C в течение 20 мин. Затем к смеси добавляли 50 мкл субстрата, разведенного буфером для анализа. Флуоресцентный сигнал (волна возбуждения 328 нм/волна эмиссии 393 нм) измеряли с использованием Enspire (PerkinElmer, Inc.). Конечная концентрация HTRA1 составляла 100 нМ, и конечная концентрация HTRA1-ингибирующего пептида составляла от 1,875 до 1000 нМ. В реакции и при измерении использовали черный планшет PROTEOSAVE R9696 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.).
50
[0147] Рассчитывали скорость расщепления пептидного субстрата в присутствии HTRA1-ингибирующего пептида при каждой концентрации. Когда скорость расщепления при концентрации ингибитора 0 нМ принимали за 100%, то оценивали активность ингибирования HTRA1 (каталит) и HTRA1 (полная) для каждого HTRA1-ингибирующего пептида (фиг.2 и 3). В результате расчета 50% ингибирующей концентрации (IC) с использованием GraphPad Prism (версия 5.0; GraphPad Software Inc.) было установлено, что все HTRA1-ингибирующие пептиды ингибируют активность фермента HTRA1 (каталит) и HTRA1 (полная) в низкой концентрации (фиг. 2А-2С и фиг. 3). В качестве контроля: SPINK2 дикого типа не проявлял активность ингибирования HTRA1 (фиг. 2D).
[0148] Активность ингибирования HTRA1 HTRA1-ингибирующего пептида
[0149]
Таблица 1
ID
IC50 (нМ) для HTRA1 (каталит)
IC50 (нМ) для HTRA1 (полная)
H218
72
55
H223
41
66
H228
71
38
H308
37
15
H321
48
29
H322
50
17
H308AT
49
31
H321AT
46
18
H322AT
45
25
M7
43
24
[0150]
(3-2) Оценка HTRA1-ингибирующего пептида на активность ингибирования HTRA1 с использованием белкового субстрата
Активность ингибирования HTRA1 HTRA1-ингибирующего пептида оценивали с человеческим витронектином в качестве белкового субстрата. HTRA1 (каталит) и каждый HTRA1-ингибирующий пептид, разведенный буфером для анализа (50 мМ Трис и 150 мМ NaCl, рН 8,0), смешивали и подвергали реакции при 37°С в течение 1 ч. Затем к смеси добавляли человеческий витронектин (BD Biosciences; 354238), разведенный буфером для анализа, и проводили реакцию при 37°С в течение 2 ч. К смеси добавляли буфер для образцов SDS и ферментативную реакцию останавливали обработкой при 99°С в течение 5 мин. Затем расщепление человеческого витронектина оценивали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Конечная концентрация HTRA1-ингибирующего пептида составляла от 0 до 25 мкМ, конечная концентрация HTRA1 (каталит) составляла 1 мкМ, и конечная концентрация человеческого витронектина равнялась 1 мкМ. Для вестерн-блоттинга в качестве первичного антитела использовали антитело против человеческого витронектина (R & D Systems, Inc.; MAB2349), и в качестве вторичного антитела использовали антимышиное овечье IgG полное Ab, конъюгированное с HRP (GE Healthcare; NA931).
[0151] Как и в примере (3-1), HTRA1-ингибирующие пептиды также четко демонстрировали ингибирование HTRA1 (каталит), когда человеческий витронектин использовали в качестве субстрата (фиг.4).
(3-3) Оценка HTRA1-ингибирующего пептида на специфичность
Специфичность для других протеаз оценивали с использованием расщепления пептидного субстрата в качестве показателя. Аналогично тому, как описано в примере (3-1), каждая протеаза и каждый образец (конечная концентрация: 1 мкМ), разведенные буфером для анализа, смешивали при 25 мкл каждый и подвергали реакции при 37°С в течение 20 мин. Затем к смеси добавляли 50 мкл каждого субстрата, разведенного буфером для анализа. Флуоресцентный сигнал (волна возбуждения 380 нм/волна эмиссии 460 нм) измеряли с использованием Enspire (PerkinElmer, Inc.). Для оценки активности HTRA2 использовали тот же буфер для анализа (50 мМ бората и 150 мМ NaCl, pH 8,5), что и в примере 2. Буфер для анализа (50 мМ Трис и 150 мМ NaCl, рН 8,0) использовали для оценки активности протеаз, отличных от активности HTRA2. В реакции и при измерении использовали черный планшет PROTEOSAVE R9696 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). Комбинации протеазы и субстрата, использованные при оценке специфичности, были следующими.
Оценка активности ингибирования для бычьего трипсина: 5 нМ (конечная концентрация) трипсина (Pierce; 20233) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Boc-VPR-AMC, флуорогенный пептидный субстрат (R & D Systems, Inc.; ES011).
Оценка активности ингибирования для бычьего α-химотрипсина: 10 нМ (конечная концентрация) химотрипсина (Worthington Biochemical Corporation; LS001434) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3120-v).
Оценка активности ингибирования для человеческой триптазы: 1 нМ (конечная концентрация) триптазы (Sigma-Aldrich Co. LLC; T7063) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3107-v).
Оценка активности ингибирования для человеческой химазы: 100 нМ (конечная концентрация) химазы (Sigma-Aldrich Co. LLC; C8118) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3120-v).
Оценка активности ингибирования для человеческого плазмина: 50 нМ (конечная концентрация) плазмина (Sigma-Aldrich Co. LLC; P1867) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Boc-Val-Leu-Lys-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3104-v).
Оценка активности ингибирования для человеческого тромбина: 1 нМ (конечная концентрация) тромбина (Sigma-Aldrich Co. LLC; T6884) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Boc-VPR-AMC, флуорогенный пептидный субстрат (R & D Systems, Inc.; ES011).
Оценка активности ингибирования для человеческой матриптазы: 1 нМ (конечная концентрация) матриптазы (R & D Systems, Inc.; E3946-SE) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Boc-QAR-AMC, флуорогенный пептидный субстрат (R & D Systems, Inc.; ES014).
Оценка активности ингибирования для человеческого белка С: 100 нМ (конечная концентрация) белка C (Sigma-Aldrich Co. LLC; P2200) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3112-v).
Оценка активности ингибирования для человеческого tPA: 10 нМ (конечная концентрация) tPA (Sigma-Aldrich Co. LLC; T0831) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Pyr-Gly-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3145-v).
Оценка активности ингибирования для человеческого uPA: 10 нМ (конечная концентрация) uPA (Sigma-Aldrich Co. LLC; T0831) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Pyr-Gly-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3145-v)
Оценка активности ингибирования для человеческого плазменного калликреина: 0,125 мкг/мл (конечная концентрация) плазменного калликреина (Sigma-Aldrich Co. LLC; T0831) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Z-Phe-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3095-v).
Оценка активности ингибирования для человеческой HTRA2: 200 нМ (конечная концентрация) HTRA2 (R & D Systems, Inc.; 1458-HT) и 50 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата H2-Opt (Peptide Institute, Inc.).
Перекрестную реактивность с протеазами, отличными от HTRA1, оценивали с использованием расщепления пептидного субстрата в качестве показателя аналогично тому, как описано в примере (3-2). Каждый HTRA1-ингибирующий пептид не подавлял протеазную активность какой-либо из тестированных протеаз при конечной концентрации ингибитора 1 мкМ, указывая на то, что HTRA1-ингибирующий пептид обладает HTRA1-специфическим ингибирующим эффектом (фиг.5).
[0152] Пример 4. Анализ HTRA1-ингибирующего пептида с использованием рентгеновской кристаллографии
(4-1) Получение комплекса HTRA1 (каталит)/HTRA1-ингибирующий пептид
HTRA1 (каталит) и HTRA1-ингибирующий пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, каждый получали в соответствии с методами, описанными в примерах (1-2) и (2-1). Их смешивали в следующих условиях: 20 мМ Трис-HCl и 150 мМ NaCl, рН 7,6. Затем комплекс выделяли и очищали гель-фильтрацией (Superdex 200 10/300 GL).
(4-2) Рентгеновская кристаллография
Раствор комплекса, приготовленный в примере (4-1), концентрировали до 18 мг/мл и затем смешивали с резервуарным раствором (1,0 М LiCl, 7,5% PEG6000 и 0,1 М Трис/HCl (pH 8,5)) в соотношении 1:1, и смесь кристаллизовали методом диффузии пара. Полученные кубические монокристаллы погружали в резервуарный раствор, содержащий 20% этиленгликоля, и затем замораживали в жидком азоте. Замороженные кристаллы подвергали воздействию рентгеновских лучей в криогенном воздушном потоке для получения дифракционного изображения (photon factory BL5A: High Energy Energy Accelerator Research Organization). Данные масштабирования с максимальным разрешением 2,6  получали анализом с использованием HKL2000. Фазу определяли методом молекулярной замены с использованием сериновой протеазы HTRA1 (ID PDB:3NZI) в качестве матрицы. После уточнения структуры определяли кристаллический комплекс HTRA1 (каталит) и пептида с разрешением 2,6 . Каждая из молекул HTRA1 и SPINK2 находилась в элементарной ячейке. В отношении молекулы SPINK2, то неполная молекулярная модель, содержащая сайт взаимодействия с HTRA1 (каталит), была сконструирована на основе информации о последовательности и наблюдаемой электронной плотности. Было подтверждено, что HTRA1-ингибирующий пептид связывается с областью, содержащей активный центр фермента HTRA1 (фиг. 6 и 7).
[0153]
Пример 5. Защитное действие для сетчатки, обеспеченное ингибированием HTRA1 на крысиной модели повреждения сетчатки, вызванного воздействием света
(5-1) Получение крысиной модели повреждения сетчатки, вызванного воздействием света
Модели повреждения сетчатки на крысах, вызванного воздействием света, представляют модели, которые вызывают гибель фоторецепторных клеток сетчатки под воздействием света и повсеместно используются в качестве модельных животных дегенерации сетчатки (Daniel T. Organisciak et al. (1996) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. Vol. 37 (№11): p. 2243-2257). Офтальмологический раствор, состоящий из 0,5% (мас./об.) тропикамида и 0,5% фенилэфрина гидрохлорида, закапывали в глаз крысам при адаптации к темноте, адаптированным к темноте, в течение 72 ч. Затем крыс подвергали воздействию белого света с освещенностью 5500 люкс в течение 3 ч. Крыс, подвергшихся такому воздействию, вновь адаптировали к темноте в течение примерно 24 ч и затем содержали в течение 2 дней в условиях свет-темнота, имеющихся при обычном содержании. После эвтаназии образцы глазного яблока вырезали и фиксировали погружением в фиксатор, состоящий из пикриновой кислоты 3,7% (мас./об.), формальдегида 0,5-1% (мас./об.), метанола 0,2% (мас./об.), в течение 24 ч или более. После заливки в парафин готовили тонкие срезы. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином, и для оценки ретинального повреждения определяли количество ядер в наружном ядерном слое поперечного среза сетчатки. На крысиной модели повреждения сетчатки, вызванного воздействием света, наблюдали заметное снижение количества ядер в наружном ядерном слое в результате воздействия света.
(5-2) Подтверждение экспрессии внеклеточной HTRA1 во время повреждения сетчатки
В целях исследования на крысиной модели вовлечения HTRA1 в повреждение сетчатки, вызванного воздействием света, у модельных крыс, полученных в примере (5-1), отбирали образцы стекловидного тела и оценивали уровень экспрессии HTRA1 с помощью вестерн-блоттинга. Образцы стекловидного тела подвергали SDS-PAGE в восстановительных условиях. Крысиную HTRA1 детектировали с использованием антитела к человеческой HTRA1/PRSS11 в качестве первичного антитела (R & D Systems, Inc.; AF2916) и овечий IgG, конъюгированный с пероксидазой хрена, в качестве вторичного антитела (R & D Systems, Inc.; HAF016). Повышенное количество HTRA1 в стекловидном теле было подтверждено в группе с воздействием света по сравнению с группой без воздействия, позволяя предположить о том, что HTRA1 вовлечена на данной модели в процесс повреждения сетчатки, вызванного воздействием света (фиг. 9).
(5-3) Защитное действие для сетчатки HTRA1-ингибирующего пептида на крысиной модели повреждения сетчатки, вызванного воздействием света
Непосредственно перед воздействием света на крыс под анестезией интравитреально вводили 5 мкл HTRA1-ингибирующего пептида H308, имеющего концентрацию 0,04 мг/мл или 0,2 мг/мл. n=4 для группы, получающей физиологический раствор, и n=5 для других групп. Воздействие света приводило к снижению количества ядер в наружном ядерном слое на поперечном срезе сетчатки в группе с введением нормального физиологического раствора, тогда как эффект подавления снижения количества ядер в наружном ядерном слое был подтвержден в группе с введением HTRA1-ингибирующего пептида (фиг. 10). Полученные результаты показали, что HTRA1-ингибирующий пептид проявляет лечебное действие на повреждение тканей, вызванное HTRA1.
[0154] Пример 6. Оценка HTRA1-ингибирующего пептидного производного
(6-1) Конструирование pET 32a_HTRA1-ингибирующий пептид H308_S16A_Kex2
Производное S16A, имеющее аминокислотную последовательность, в которой 16Ser в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 9 (фиг. 21), была заменена на Ala, получали с использованием HTRA1-ингибирующего пептида H308 в качестве матрицы. Фрагмент С амплифицировали с помощью ПЦР ((94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 15 с) × 30 циклов), используя следующие праймеры и KOD-plus - (Toyobo Co., Ltd. ).
Праймер 12: 5'-CCGCAGTTTGGTCTGTTTAGCAAATATCGTACCCCGAATTGT-3'
Праймер 13: 5'-GCCATACCAGCATGGTCCGCACAATTCGGGGTACGATATTTGC-3'
Затем фрагмент D амплифицировали с помощью ПЦР ((94°C в течение 15 с, 60°C в течение 30 с и 68°С в течение 20 с) × 30 циклов) с использованием HTRA1-ингибирующего пептида H308 в качестве матрицы, используя следующие праймеры и KOD-plus - (Toyobo Co., Ltd.).
Праймер 14: 5'-GCGGACCATGCTGGTATGGCATGTGTTGCTCTGTATGAAC-3'
Праймер 15: 5'-AAAACTCGAGTTAGCCGCCGCACGGACCATTGCGAATAA-3'
Требуемый фрагмент ДНК амплифицировали с помощью ПЦР ((94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 20 с) × 30 циклов) с использованием фрагментов С и D, следующих праймеров и KOD-plus - (Toyobo Co., Ltd.).
Праймер 16: 5'-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
Праймер 15
Амплифицированный фрагмент подвергали электрофорезу в агарозном геле. Затем требуемый фрагмент ДНК вырезали из геля, и ДНК получали с использованием набора для выделения ДНК из геля QIAquick (Qiagen N.V.). Полученный фрагмент ДНК и pET 32a (Novagen) каждый обрабатывали рестриктазами BamHI (New England BioLabs Inc.) и XhoI (New England BioLabs Inc.) при 37°C в течение 1 ч или более. После электрофореза в агарозном геле требуемые фрагменты ДНК вырезали из геля и очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR Purification (Qiagen N.V.). Очищенные фрагменты подвергали реакции в течение ночи при 16°С для лигирования с использованием ДНК-лигазы Т4 (New England BioLabs Inc.). Раствор для лигирования добавляли к E.coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), и смесь выдерживали на льду в течение 30 мин, затем подвергали тепловой обработке при 42°С в течение 45 с, затем выдерживали на льду в течение 5 мин и инокулировали в планшет со средой 2YT, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, с последующим статическим культивированием в течение ночи при 37°С для трансформации E.coli. Трансформированную E.coli культивировали, и затем проводили минипреп и анализ последовательности для конструирования «pET 32a_HTRA1-ингибирующий пептид H308_S16A_Kex2». Операцию выполняли в соответствии с методом, описанным в примере (1-1-1).
(6-2) Получение экспрессионного вектора HTRA1-ингибирующий пептид_ N-концевое производное
Для получения четырех производных N-концевой последовательности (обозначенных D1G, D1S, D1E и D1SLI соответственно) HTRA1-ингибирующего пептида, имеющего аминокислотную последовательность, в которой 1Asp в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 9 (фиг. 21) заменяли на Gly, Ser, Glu или Ser-Leu-Ile, экспрессионные векторы конструировали аналогично тому, как описано в примере (6-1). Четыре представляющих интерес фрагмента каждый амплифицировали с помощью ПЦР ((94°С в течение 15 с, 60°С в течение 30 с и 68°С в течение 20 с) × 30 циклов) с использованием фрагментов С и D, следующих праймеров и KOD-plus - (Toyobo Co., Ltd.).
Праймеры для получения D1G
Праймер 17: 5'-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGGCCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
Праймер 15
Праймеры для получения D1S
Праймер 18: 5'-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTAGCCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
Primer 15
Праймеры для получения D1E
Праймер 19: 5'-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGAACCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
Праймер 15
Праймеры для получения D1SLI
Праймер 20: 5'-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTAGCCTGATTCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
Праймер 15
Каждый из четырех амплифицированных фрагментов подвергали электрофорезу в агарозном геле. Затем требуемый фрагмент ДНК вырезали из геля, и ДНК получали с использованием набора для выделения ДНК из геля QIAquick (Qiagen N.V.). Полученный фрагмент ДНК и pET 32a (Novagen) каждый обрабатывали рестриктазами BamHI (New England BioLabs Inc.) и XhoI (New England BioLabs Inc.) при 37°C в течение 1 ч или более. После электрофореза в агарозном геле требуемые фрагменты ДНК вырезали из геля и очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR Purification (Qiagen N.V.). Очищенные фрагменты подвергали реакции в течение ночи при 16°С для лигирования с использованием ДНК-лигазы Т4 (New England BioLabs Inc.). Раствор для лигирования добавляли к E.coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), и смесь выдерживали на льду в течение 30 мин, затем подвергали тепловой обработке при 42°С в течение 45 с, затем выдерживали на льду в течение 5 мин и инокулировали в планшет со средой 2YT, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, с последующим статическим культивированием в течение ночи при 37°С для трансформации E.coli. Трансформированную E.coli культивировали, и затем проводили минипреп и анализ последовательности для конструирования «pET 32a_HTRA1-ингибирующий пептид H308_D1G_S16A_Kex2», «pET 32a_HTRA1-ингибирующий пептид H308_D1S_S16A_Kex2», «pET 32a_HTRA1-ингибирующий пептид H308_D1E_S16A_Kex2» и «pET 32a_HTRA1-ингибирующий пептид H308_D1SL1_S16A_Kex2». Операцию выполняли в соответствии с методом, описанным в примере (1-1-1).
(6-3) Получение производного HTRA1-ингибирующего пептида
E.coli Origami B (DE3) (Novagen) трансформировали каждым из пяти векторов, сконструированных в примерах (6-1) и (6-2), и культивировали при 37°С, используя среду 2YT, содержащую 0,1 мг/мл ампициллина. Затем к смеси добавляли IPTG (конечная концентрация: 1 мМ) и E.coli культивировали в течение ночи при 16°C. На следующий день после сбора с помощью центрифугирования (3000 g, 20 мин, 4°C) готовили лизат, используя смесь BugBuster Master Mix (Novagen), и представляющий интерес гибридный белок с His-меткой очищали, используя металл-хелатную аффинную смолу TALON (Clontech Laboratories, Inc.). Затем тиоредоксиновую метку и требуемый белок расщепляли с использованием Kex2 (указана выше) и очищали с использованием TALON. Полученный продукт подвергали гель-фильтрации (Superdex 75 10/300 GL) или обращенно-фазовой хроматографии (YMC-Pack ODS-AM) с получением пяти производных HTRA1-ингибирующего пептида. Аминокислотные последовательности производных показаны в SEQ ID NO: 23-27 (фиг. 35-39).
(6-4) Оценка производного HTRA1-ингибирующего пептида
В результате определения активности ингибирования HTRA1 (каталит) в соответствии с методом, описанным в примере (3-1), все производные обладали ингибирующей активностью, эквивалентной активности H308 (фигура 11).
[0155] Пример 7. Оценка HTRA1-ингибирующего пептида на связывающую активность с HTRA1 (каталит)
Связывающую активность оценивали методом иммунопреципитации с использованием трех HTRA1-ингибирующих пептидов (H308, H321AT и H322AT), полученных в примере (1-2), и HTRA1 (каталит), полученной в примере (2-1). 2,5 мкг каждого HTRA1-ингибирующего пептида и 10 мкг HTRA1 (каталит) подвергали реакции при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем к смеси добавляли 10 мкл металл-хелатной аффинной смолы TALON (Clontech Laboratories, Inc.). После дополнительной реакции в течение 30 мин смолу выделяли в виде фракции иммунопреципитации (IP) и подвергали SDS-PAGE для оценки активности связывания. В реакции PBS использовали в качестве буфера.
[0156] Когда каждый из трех HTRA1-ингибирующих пептидов или HTRA1 (каталит) реагировали с TALON, то детектировали полосу HTRA1 (каталит), слитой только с His-меткой, на входной дорожке. С другой стороны, полоса каждого ингибирующего пептида и фермента обнаруживалась только в полосе IP, где ингибирующий пептид реагировал с HTRA1 (каталит). Следовательно, было подтверждено, что каждый из трех HTRA1-ингибирующих пептидов связывается с HTRA1 (каталит).
[0157] Пример 8. Оценка HTRA1-ингибирующего пептида на активность ингибирования HTRA1
(8-1) Оценка HTRA1-ингибирующего пептида на активность ингибирования HTRA1 с использованием пептидного субстрата
Три HTRA1-ингибирующих пептида (H308_D1G_S16A, H321AT_D1G_S16A и H322AT_D1G_S16A), сконструированные в примере 6, оценивали на их активность ингибирования HTRA1 (каталит) или HTRA1 (полная) с использованием пептидного субстрата H2-Opt (n=3). Пептидный субстрат H2-Opt (Mca-IRRVSYSFK (Dnp) K) (Peptide Institute, Inc.: SEQ ID NO: 54, фигура 8) растворяли при 10 мМ в ДМСО, разбавляли буфером для анализа (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl и 0,25% CHAPS, pH 8,0) и использовали в конечной концентрации 10 мкМ. HTRA1 (HTRA1 (каталит) или HTRA1 (полная)); пример 2) и каждый HTRA1-ингибирующий пептид, разведенный буфером для анализа, смешивали при 25 мкл каждый и подвергали реакции при 37°C в течение 20 мин. Затем к смеси добавляли 50 мкл субстрата, разведенного буфером для анализа. Флуоресцентный сигнал (волна возбуждения 328 нм/волна эмиссии 393 нм) измеряли с использованием Enspire (PerkinElmer, Inc.). Конечная концентрация HTRA1 составляла 100 нМ, и конечная концентрация HTRA1-ингибирующего пептида составляла от 1,875 до 1000 нМ. В реакции и при измерении использовали черный планшет PROTEOSAVE R9696 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.).
[0158] Рассчитывали скорость расщепления пептидного субстрата в присутствии HTRA1-ингибирующего пептида при каждой концентрации. Когда скорость расщепления при концентрации ингибитора 0 нМ принимали за 100%, то оценивали активность ингибирования HTRA1 (каталит) и HTRA1 (полная) каждого HTRA1-ингибирующего пептида.
50
В результате расчета 50% ингибирующей концентрации (IC) с использованием GraphPad Prism (версия 5.0; GraphPad Software Inc.) было установлено, что все HTRA1-ингибирующие пептиды ингибируют активность фермента HTRA1 (каталит) и HTRA1 (полная) в низкой концентрации (фиг. 66).
[0159] Активность ингибирования HTRA1 HTRA1-ингибирующего пептида
[0160]
Таблица 2
IC50 (нМ) для HTRA1 (каталит)
IC50 (нМ) для HTRA1 (полная)
H308_D1G_S16A
7,9±1,3
9,1±1,4
H321AT_D1G_S16A
9,0±0,6
12,0±1,9
H322AT_D1G_S16A
12,9±0,2
12,2±2,2
[0161] (8-2) Оценка HTRA1-ингибирующего пептида на активность ингибирования HTRA1 с использованием белкового субстрата
Активность ингибирования HTRA1 HTRA1-ингибирующего пептида оценивали с человеческим витронектином в качестве белкового субстрата. Операцию проводили, как описано в примере (3-2).
Как и в примере (8-1), HTRA1-ингибирующие пептиды также четко демонстрировали ингибирование HTRA1 (каталит), когда человеческий витронектин использовали в качестве субстрата (фиг. 67).
[0162] (8-3) Оценка HTRA1-ингибирующего пептида на специфичность
Специфичность для других протеаз оценивали с использованием расщепления пептидного субстрата в качестве показателя. Операции для бычьего трипсина, бычьего β-химотрипсина, белка C, триптазы, химазы, тромбина, плазмина, tPA, плазменного калликреина, матриптазы, uPA и HTRA2 выполняли по методу, описанному в примере (3-3) (n=3). Процедуры измерения ингибирующей активности для других протеаз и комбинаций протеазы и субстрата были следующими.

[0163] В реакции и при измерении использовали черный планшет PROTEOSAVE R9696 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). Каждую протеазу и каждый образец (конечная концентрация: 1 мкМ), разведенные буфером для анализа, смешивали при 25 мкл каждый и подвергали реакции при 37°С в течение 20 мин. Затем к смеси добавляли 50 мкл каждого субстрата, разведенного буфером для анализа. Флуоресцентный сигнал измеряли с использованием Enspire (PerkinElmer, Inc.).
[0164] Оценка активности ингибирования для человеческого трипсина: 1 нМ (конечная концентрация) трипсина (Sigma-Aldrich Co. LLC; T6424) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Boc-VPR-AMC, флуорогенный пептидный субстрат (R & D Systems, Inc.; ES011), флуоресцентный сигнал: волна возбуждения 380 нм/волна эмиссии 460 нм.
[0165] Оценка активности ингибирования для человеческого химотрипсина: 10 нМ (конечная концентрация) химотрипсина (Sigma-Aldrich Co. LLC; C8946) и 10 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3120-v), флуоресцентный сигнал: волна возбуждения 380 нм/волна эмиссии 460 нм.
[0166] Оценка активности ингибирования для человеческого фактора XIIa: 100 нМ (конечная концентрация) фактора альфа-XIIa (Enzyme Research Laboratories Inc.) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата Pyr-Gly-Arg-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3145-v), флуоресцентный сигнал: волна возбуждения 380 нм/волна эмиссии 460 нм.
[0167] Оценка активности ингибирования для человеческой ММР-2: 1 нМ (конечная концентрация) триптазы (Calbiochem; PF023) и 100 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата MOCAx-KPLGL-A2pr (Dnp)-AR (Peptide Institute, Inc.; 3226-v), флуоресцентный сигнал: волна возбуждения 328 нм/волна эмиссии 393 нм.
[0168] Оценка активности ингибирования для человеческой TPP1: 0,5 мкг/мл (конечная концентрация) TPP1 (Calbiochem; 2237-SE) и 200 мкМ (конечная концентрация) пептидного субстрата AAF-MCA (Peptide Institute, Inc.; 3201-v), флуоресцентный сигнал: волна возбуждения 380 нм/волна эмиссии 460 нм.
[0169] Перекрестную реактивность с протеазами, отличными от HTRA1, оценивали с использованием расщепления пептидного субстрата в качестве показателя. Каждый HTRA1-ингибирующий пептид не подавлял протеазную активность любой из протеаз при конечной концентрации 1 мкМ, указывая на то, что HTRA1-ингибирующий пептид обладает HTRA1-специфическим ингибирующим эффектом (фиг. 68).
[0170] Пример 9. Оценка HTRA1-ингибирующего пептида на связывающую активность с HTRA1 (каталит)
Связывающую активность оценивали методом иммунопреципитации в соответствии с процедурой, описанной в примере 7 с использованием трех HTRA1-ингибирующих пептидов, полученных в примере 6, и HTRA1 (каталит), полученной в примере (2-1).
Когда каждый из трех HTRA1-ингибирующих пептидов или HTRA1 (каталит) реагировали с TALON, то детектировали только полосу HTRA1 (каталит), слитой с His-меткой, на входной дорожке. С другой стороны, полоса каждого ингибирующего пептида и фермента детектировалась только в полосе IP, где ингибирующий пептид реагировал с HTRA1 (каталит). Следовательно, было подтверждено, что каждый из трех HTRA1-ингибирующих пептидов связывается с HTRA1 (каталит) (фиг. 69).
[0171] Пример 10. Защитное действие для сетчатки, обеспеченное ингибированием HTRA1 на крысиной модели повреждения сетчатки, вызванного воздействием света (часть 2)
Защитное действие для сетчатки трех HTRA1-ингибирующих пептидов, полученных в примере 6, оценивали с использованием крысиной модели повреждения сетчатки, вызванного воздействием света, полученной в примере (5-1). Операцию проводили, следуя примеру 5. n=6 для всех групп.
Результаты патологической оценки сетчатки показаны на фиг. 70. Три HTRA1-ингибирующих пептида демонстрировали выраженное подавляющее влияние на снижение количества ядер в наружном ядерном слое, вызванное воздействием света.
[0172] Пример 11. Защитное действие для клеток ретинального пигментного эпителия посредством ингибирования HTRA1 на кроличьей модели повреждения сетчатки, вызванного скармливанием рациона с высоким содержанием жира, включающего гидрохинон
(11-1) Получение модели повреждения сетчатки на кроликах скармливанием рациона с высоким содержанием жира, включающего гидрохинон
Модель повреждения сетчатки, полученная с использованием рациона с высоким содержанием жира (HFD) и присутствием гидрохинона (HQ), представляет модель, в которой окислительный стресс индуцируется прооксидантом, вызывая повреждение сетчатки. Данная модель описана только на мышах (Diego G. Espinosa-Heidmann et al. (2006) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., Vol. 47 (№ 2): p. 729-737). Следовательно, 3-летним кроликам JW в течение 4 месяцев скармливали рацион RC4 (Oriental Yeast Co., Ltd.), содержащий 1,5% (мас./об.) кокосового масла - 0,25% (мас./об.) холестерина - 1,5% (мас./об.) арахисового масла - 2,4% (мас./об.)) гидрохинона (HFD-HQ) для получения модели повреждения сетчатки на кроликах. После эвтаназии образцы глазного яблока извлекали, и передний сегмент глаза удаляли наружным разрезом на расстоянии примерно 5 мм от роговичного лимба. Затем дополнительно отделяли стекловидное тело. Затем сетчатку-сосудистую оболочку-склеру фиксировали погружением в 4% (мас./об.) параформальдегид, фиксатор на 24 ч или более. После фиксации сосудистую оболочку отделяли и иммуноокрашивали, используя моноклональное антитело ZO-1 в качестве первичного антитела (ZO1-1A12) (Thermo Fisher Scientific Inc.; 33-9100) и куриное антимышиное IgG (H+L) вторичное антитело с перекрестной адсорбцией, конъюгированное с Alexa Fluor 594, в качестве вторичного антитела (Thermo Fisher Scientific Inc.; A-21201). Окрашенную сосудистую оболочку исследовали под флуоресцентным микроскопом (BZ-9000; Keyence Corp.). Определяли площадь окрашенных клеток ретинального пигментного эпителия (RPE) для оценки повреждения клеток RPE.
На фиг. 71 приведены окрашенные изображения клеток RPE 12-недельного кролика, 3-летнего кролика и 3-летнего кролика, которому скармливали рацион HFD-HQ (фиг. 71 (A)) и график средних площадей клеток RPE (фиг. 71 (B)). Было подтверждено, что клетки RPE были в большей степени гипертрофированы у 3-летнего кролика, чем у 12-недельного кролика, и они подвергались дополнительной гипертрофии в результате скармливания рациона HFD-HQ. Было подтверждено, что повреждение появилось в клетках RPE. Подобные изменения наблюдали в глазных яблоках пациентов с возрастной макулярной дегенерацией (Ding J.D. et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., Vol. 108 (№ 28): p. 279-87).
[0173] (11-2) Повышение уровня экспрессии связанного с AMD фактора C3 во время повреждения сетчатки

Для оценки экспрессии AMD-связанного фактора, образцы тканей были соответственно отобраны из сетчатки и RPE/сосудистой оболочки на кроличьей модели повреждения сетчатки. мРНК экстрагировали с использованием мини-набора RNeasy (Qiagen N.V.) и затем подвергали реакции обратной транскрипции с использованием реакционной смеси для оценки уровня экспрессии TaqMan Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher Scientific Inc.). Уровни мРНК компонента 3 комплемента (С3) и внутреннего стандарта β-актина количественно анализировали с использованием набора для оценки уровня экспрессии генов TaqMan Gene Expression Assay (Oc03397832_g1 и Oc03824857_g1; Thermo Fisher Scientific Inc.) с использованием системы 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Inc.). Анализ проводили при n=4 для 3-летних кроликов и n=10 для 3-летних кроликов, которым скармливали рацион HFD-HQ.
[0174] Уровни экспрессии C3 в сетчатке и в клетках RPE и сосудистой оболочке показаны на фиг. 71 (C) и (D). Для обеих тканей было подтверждено, что уровень экспрессии C3 был повышен в группе кроликов, получавших рацион HFD-HQ.
[0175] (11-3) Повышение уровня белка HTRA1 во время повреждения сетчатки
Для исследования на кроличьей модели вовлечения HTRA1 в повреждение сетчатки, у модельных кроликов, полученных в примере (11-1), отбирали образцы стекловидного тела и ферментативно переваривали смесью трипсин/Lys-C (Promega Corp.). Затем пептидный фрагмент HTRA1 определяли количественно с использованием ЖХ (EASY-nLC 1000; Thermo Fisher Scientific Inc.)-МС (TripleTOF 6600; AB Sciex Pte. Ltd). Было установлено, что уровень белка HTRA1 повышается в стекловидном теле кроликов, которым скармливали рацион HFD-HQ (фиг. 71 (E)). На основе этих результатов была подтверждена гипертрофия клеток RPE и повышенная экспрессия связанного с AMD фактора C3 и HTRA1, указывая на то, что кроличья модель повреждения сетчатки пригодна в исследованиях возрастных заболеваний сетчатки.
[0176] (11-4) Защитное действие для сетчатки ингибитора HTRA1 на кроличьей модели повреждения сетчатки
Защитное действие для сетчатки HTRA1-ингибирующего пептида H308, полученного в примере 1, оценивали с использованием кроличьей модели. Через 2 месяца после начала скармливания рациона HFD-HQ 50 мкл раствора 40 мг/мл H308 вводили интравитреально в один глаз под анестезией. Нормальный физиологический раствор вводили интравитреально в противоположный глаз. n=5 для всех групп.
2
Через 4 месяца после начала скармливания оценивали гипертрофию клеток RPE у модельных животных. Результаты показаны на фиг. 72. Ингибитор HTRA1 проявлял подавляющий эффект на гипертрофию клеток RPE, как видно по обоим показателям, т.е. средней площади клеток RPE (фиг. 72 (A)) и количества гипертрофированных клеток RPE с клеточной площадью 1500 μм или выше (фиг. 72 (B)). Как показано на фиг. 71 (E), повышение HTRA1 было подтверждено в стекловидном теле моделей, что предполагает вовлечение HTRA1 в процесс повреждения клеток RPE в результате скармливания рациона HFD-HQ. Таким образом, HTRA1-ингибирующий пептид пригоден в качестве агента против возрастной макулярной дегенерации. Результаты данного теста показали, что HTRA1-ингибирующий пептид пригоден для предупреждения, в частности, сухой формы возрастной макулярной дегенерации.
Присутствие HTRA1-ингибирующего пептида было подтверждено в сетчатке нормального кролика, получавшего HTRA1-ингибирующий пептид, что указывает на высокое проникновение в ткани HTRA1-ингибирующего пептида.
[0177] Пример 12. Подавляющий эффект HTRA1-ингибирующего пептида в тесте индукции мРНК VEGF с использованием человеческих клеток ретинального пигментного эпителия ARPE-19
2
2
2

Клетки ARPE-19 культивировали до слияния в культуральных вставках 12 мм Transwell со стерильной полиэфирной мембраной с размером пор 0,4 мкм (Corning Inc.) в условиях 37°C и 5% CO с использованием среды DMEM/F-12 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и смесь пенициллин-стрептомицин (Thermo Fisher Scientific Inc.). Затем клетки культивировали в среде DMEM/F-12, не содержащей FBS, в течение 5 дней. Вносили HO (конечная концентрация: 500 мкМ) в верхний и нижний слои камеры, и добавляли нормальный человеческий сывороточный комплемент (Quidel Corp.) (конечная концентрация:25%) в верхний слой камеры. Каждый из HTRA1 (пример 2-2), неактивной протеазы HTRA1, мутантной HTRA1 (S328A) (пример 2-3) или HTRA1-ингибирующего пептида H308_D1G_S16A (пример 6) дополнительно вносили в конечной концентрации 1 мкМ в верхний и нижние слои камеры. Через четыре часа культуральный супернатант удаляли и клетки промывали PBS. Затем мРНК экстрагировали с использованием набора для лизиса клеток RT SuperPrep™ для кПЦР (Toyobo Co., Ltd.) и подвергали реакции обратной транскрипции. Уровень мРНК VEGF количественно анализировали с использованием набора для оценки уровня экспрессии генов TaqMan Gene Expression Assay (Hs000900055_m1 и Hs02786624_g1; Thermo Fisher Scientific Inc.) с использованием системы 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Inc.). GAPDH использовали для нормализации уровня мРНК.
2
2
2
2
Результаты показаны на фиг. 74. Внесение HO, нормального человеческого сывороточного комплемента и HTRA1 заметно повышало уровень мРНК VEGF по сравнению с условиями, включающими внесение HO, нормального человеческого сывороточного комплемента и неактивной HTRA1, мутантной HTRA1 (S328A). Было подтверждено, что совместное добавление HTRA1-ингибирующего пептида H308_D1G_S16A подавляет экспрессию VEGF. Сообщалось, что индукция VEGF в клетках ретинального пигментного эпителия важна для патогенеза влажной формы возрастной макулярной дегенерации (Klettner A. et al. (2009) Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., Vol. 247: p. 1487-1492). Кроме того, полагается, что такая аномальная индукция VEGF вовлечена не только в патогенез, но и в поддержание патологического состояния. Таким образом, введение пептида по настоящему изобретению, такого как HTRA1-ингибирующий пептид H308_D1G_S16A, эффективно для профилактики и лечения влажной формы возрастной макулярной дегенерации.
[0178] Пример 13. Подавляющее действие HTRA1-ингибирующего пептида H308_D1G_S16A на миграцию эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC)
(13-1) Тест миграции HUVEC
2
5
5
HUVEC (Kurabo Industries Ltd.) культивировали в течение 18 ч в условиях 37°C и 5% CO в среде (0,1% BSA-содержащая бессывороточная EGM), в которой базальная среда EBM (TM)-2 (Lonza Walkersville, Inc.), содержащая 0,1% BSA, была обогащена набором с аддитивным фактором EGM (TM)-2 SingleQuots (TM), за исключением сыворотки и VEGF. Затем клетки доводили до титра 4×10 клеток/мл с помощью 0,1% BSA-содержащей бессывороточной среды EGM. 4×10 клеток/мл суспензии HUVEC добавляли из расчета 50 мкл/лунку в верхний слой камеры 96-луночной системы Multiwell Permeable Support c мембраной из ПЭТ высокой плотности 3,0 мкм (Corning Inc.) с покрытой желатином мембраной. Затем каждый образец, описанный ниже (среда 1, 2 или 3), добавляли из расчета 210 мкл/лунку в нижний слой камеры (n=3). 0,1% BSA-содержащую бессывороточную среду EGM добавляли из расчета 50 мкл/лунку в верхний слой камеры без добавления HUVEC, и 0,1% BSA-содержащую бессывороточную среду EGM добавляли из расчета 210 мкл/лунку в нижний слой камеры (n=3).
Среда 1: 0,1% BSA-содержащая бессывороточная среда EGM
Среда 2: среда EBM (TM)-2, обогащенная всеми аддитивным фактором EGM (TM)-2 SingleQuots (TM) (ростовая среда EGM)
Среда 3: ростовая среда EGM, содержащая 300 нМ H308_D1G_S16A.
2
96-луночную систему FluoroBlok HTS Multiwell Permeable Support с добавлением клеток и образец инкубировали в течение 2 ч в условиях 37°C и 5% CO. HUVEC, мигрировавшие в нижний слой, промывали PBS и затем окрашивали в течение 15 мин 0,1% BSA-содержащей бессывороточной средой EGM, содержащей 4 мкг/мл кальцеина AM (Thermo Fisher Scientific Inc.). Затем среду заменяли PBS. Интенсивность флуоресценции (длина волны возбуждения/длина волны эмиссии: 485 нм/535 нм) каждой лунки измеряли с использованием планшетного ридера (ARVO-MX, PerkinElmer, Inc.), и мигрировавшие клетки подсчитывали для каждой лунки с использованием следующего уравнения:
мигрировавшие клетки=средняя интенсивность флуоресценции лунок, содержащих HUVEC (n=3) - средняя интенсивность флуоресценции пустых лунок (n=3).
Результаты показаны на фиг. 75. Было подтверждено, что HTRA1-ингибирующий пептид H308_D1G_S16A оказывает подавляющее действие на миграцию HUVEC, индуцированную в среде, содержащей сыворотку. Следовательно, было установлено, что пептид по настоящему изобретению проявляет подавляющий эффект на ангиогенез, который является признаком влажной формы возрастной макулярной дегенерации.
[0179] Пример 14. Защитное действие для сетчатки HTRA1-ингибирующего пептида на кроличьей модели повреждения сетчатки (часть 2)
HTRA1-ингибирующий пептид H308, полученный в примере 1, или один из трех HTRA1-ингибирующих пептидов, полученных в примере 6, оценивали на их терапевтическоое действие на повреждение сетчатки с использованием модели повреждения сетчатки на кроликах, полученной и оцененной в примерах (11-1)-(11-3). 50 мкл раствора ингибирующего пептида с концентрацией 40 мг/мл, вводили интравитреально в один глаз каждого модельного животного под анестезией, и животных выдерживали в течение 2 месяцев. Нормальный физиологический раствор вводили интравитреально в противоположный глаз. n=5 для всех групп.
Увеличение площади клеток RPE или увеличение количества клеток RPE обнаруживали в группе с введением физиологического раствора, тогда как увеличение площади клеток RPE или увеличение количества клеток RPE подавлялось в группе с введением HTRA1-ингибирующего пептида. Таким образом, можно подтвердить, что HTRA1-ингибирующий пептид можно использовать в качестве агента против возрастной макулярной дегенерации. В этом примере можно подтвердить, что HTRA1-ингибирующий пептид пригоден в лечении сухой формы возрастной макулярной дегенерации, в частности.
Промышленная применимость
[0180] Пептид, обеспеченный настоящим изобретением, и фармацевтическая композиция, содержащая этот пептид, пригодны для лечения или профилактики и т.д. возрастной макулярной дегенерации и тому подобное.
Свободный текст списка последовательностей
[0181]
SEQ ID NO: 1 - Аминокислотная последовательность человеческого SPINK2 (фиг. 13)
SEQ ID NO: 2 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность человеческого SPINK2 (фиг.14)
SEQ ID NO: 3 - Аминокислотная последовательность пептида H218 (фиг. 15)
SEQ ID NO: 4 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность пептида H218 (фиг. 16)
SEQ ID NO: 5 - Аминокислотная последовательность пептида H223 (фиг. 17)
SEQ ID NO: 6 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность пептида H223 (фиг. 18)
SEQ ID NO: 7 - Аминокислотная последовательность пептида H228 (фиг. 19)
SEQ ID NO: 8 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность пептида H228 (фиг. 20)
SEQ ID NO: 9 - Аминокислотная последовательность пептида H308 (фиг. 21)
SEQ ID NO: 10 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность пептида H308 (фиг. 22)
SEQ ID NO: 11 - Аминокислотная последовательность пептида H321 (фиг. 23)
SEQ ID NO: 12 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность пептида H321 (фиг. 24)
SEQ ID NO: 13 - Аминокислотная последовательность пептида H322 (фиг. 25)
SEQ ID NO: 14 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность пептида H322 (Фигура 26)
SEQ ID NO: 15 - Аминокислотная последовательность пептидного производного H308AT (фиг. 27)
SEQ ID NO: 16 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность пептидного производного H308AT (фиг. 28)
SEQ ID NO: 17 - Аминокислотная последовательность пептидного производного H321AT (фиг. 29)
SEQ ID NO: 18 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность пептидного производного H321AT (фиг. 30)
SEQ ID NO: 19 - Аминокислотная последовательность пептидного производного H322AT (фиг. 31)
SEQ ID NO: 20 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность пептидного производного H322AT (фиг. 32)
SEQ ID NO: 21 - Аминокислотная последовательность пептида M7 (фиг. 33)
SEQ ID NO: 22 - нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность пептида M7 (фиг. 34)
SEQ ID NO: 23 - Аминокислотная последовательность пептидного производного H308_S16A (фиг. 35)
SEQ ID NO: 24 - Аминокислотная последовательность пептидного производного H308_D1G_S16A (фиг. 36)
SEQ ID NO: 25 - Аминокислотная последовательность пептидного производного H308_D1S_S16A (фигура 37)
SEQ ID NO: 26 - Аминокислотная последовательность пептидного производного H308_D1E_S16A (фиг. 38)
SEQ ID NO: 27 - Аминокислотная последовательность пептидного производного H308_D1SLI_S16A (фиг. 39)
SEQ ID NO: 28 - Аминокислотная последовательность пептидного производного H321AT_D1G_S16A (фиг. 40)
SEQ ID NO: 29 - Аминокислотная последовательность пептидного производного H322AT_D1G_S16A (фиг. 41)
SEQ ID NO: 30 - Общая формула HTRA1-ингибирующего пептида (фиг. 42)
SEQ ID NO: 31 - Аминокислотная последовательность, состоящая из S-метки и линкера (фиг. 43)
SEQ ID NO: 32 - Аминокислотная последовательность С-концевого гексамера (фиг. 44)
SEQ ID NO: 33 - Нуклеотидная последовательность праймера 1 (фиг. 45)
SEQ ID NO: 34 - Нуклеотидная последовательность праймера 2 (фиг. 46)
SEQ ID NO: 35 - Нуклеотидная последовательность праймера 3 (фиг. 47)
SEQ ID NO: 36 - Нуклеотидная последовательность праймера 4 (фиг. 48)
SEQ ID NO: 37 - Нуклеотидная последовательность праймера 5 (фиг. 49)
SEQ ID NO: 38 - Нуклеотидная последовательность праймера 6 (фигура 50)
SEQ ID NO: 39 - Нуклеотидная последовательность праймера 7 (фиг. 51)
SEQ ID NO: 40 - Нуклеотидная последовательность праймера 8 (фигура 52)
SEQ ID NO: 41 - Нуклеотидная последовательность праймера 9 (фиг. 53)
SEQ ID NO: 42 - Нуклеотидная последовательность праймера 10 (фигура 54)
SEQ ID NO: 43 - Нуклеотидная последовательность праймера 11 (фиг. 55)
SEQ ID NO: 44 - Нуклеотидная последовательность праймера 12 (фиг. 56)
SEQ ID NO: 45 - Нуклеотидная последовательность праймера 13 (фиг. 57)
SEQ ID NO: 46 - Нуклеотидная последовательность праймера 14 (фиг. 58)
SEQ ID NO: 47 - Нуклеотидная последовательность праймера 15 (фиг. 59)
SEQ ID NO: 48 - Нуклеотидная последовательность праймера 16 (фиг. 60)
SEQ ID NO: 49 - Нуклеотидная последовательность праймера 17 (фиг. 61)
SEQ ID NO: 50 - Нуклеотидная последовательность праймера 18 (фиг. 62)
SEQ ID NO: 51 - Нуклеотидная последовательность праймера 19 (фиг. 63)
SEQ ID NO: 52 - Нуклеотидная последовательность праймера 20 (фиг. 64)
SEQ ID NO: 53 - Аминокислотная последовательность человеческой HTRA1 (полная) (фиг. 65)
SEQ ID NO: 54 - Аминокислотная последовательность H2-Opt (фиг. 8)
SEQ ID NO: 55 - Нуклеотидная последовательность праймера 21 (фиг. 76)
SEQ ID NO: 56 - Нуклеотидная последовательность праймера 22 (фиг. 77)
--->
Список последовательностей
<110>  DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED
<120>  Пептид для лечения возрастной макулярной дегенерации
<130>  FP1726
<150>  JP2016-249020
<151>  2016-12-22
<160>  56
<170>  Patent In version 3.5
<210>  1
<211>  63
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser
1               5                   10                  15
Gln Tyr Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg His Phe Asn Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys
50                  55                  60
<210>  2
<211>  192
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
gatccgcagt ttggtctgtt tagcaaatat cgtaccccga attgtagcca gtatcgtctg      60
cctggttgtc cgcgtcattt taatccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatgcaaat     120
gaatgtaccc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat     180
ggtccgtgct aa                                                         192
<210>  3
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  3
Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Leu
1               5                   10                  15
Lys Ser Glu Gly Met Ala Cys Tyr Ala Tyr Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  4
<211>  198
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  4
gatccgcagt ttggtctgtt tagcaaatat cgtaccccga attgtctgaa atctgaaggt      60
atggcttgtt acgcttacta cgaaccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatgcaaat     120
gaatgtaccc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat     180
ggtccgtgcg gcggctaa                                                   198
<210>  5
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  5
Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Thr
1               5                   10                  15
Met Asp Met Gly Met Ala Cys Trp Ala Phe Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  6
<211>  198
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  6
gatccgcagt ttggtctgtt tagcaaatat cgtaccccga attgtactat ggacatgggt      60
atggcttgtt gggctttcta cgaaccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatgcaaat     120
gaatgtaccc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat     180
ggtccgtgcg gcggctaa                                                   198
<210>  7
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  7
Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Gly
1               5                   10                  15
His Tyr Asn Gly Trp Ala Cys Gln Ala Phe Phe Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  8
<211>  198
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  8
gatccgcagt ttggtctgtt tagcaaatat cgtaccccga attgtggtca ttacaacggt      60
tgggcttgtc aggctttctt cgaaccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatgcaaat     120
gaatgtaccc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat     180
ggtccgtgcg gcggctaa                                                   198
<210>  9
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  9
Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser
1               5                   10                  15
Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Glu Asn Glu Cys Val Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  10
<211>  198
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  10
gatccgcagt ttggtctgtt tagcaaatat cgtaccccga attgtagcga ccatgctggt      60
atggcatgtg ttgctctgta tgaaccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatgaaaat     120
gaatgtgttc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat     180
ggtccgtgcg gcggctaa                                                   198
<210>  11
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  11
Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser
1               5                   10                  15
Asp Phe Asp Gly Met Ala Cys Tyr Ala Phe Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Met Asn Glu Cys Ala Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  12
<211>  198
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  12
gatccgcagt ttggtctgtt tagcaaatat cgtaccccga attgtagcga cttcgacggt      60
atggcatgtt acgctttcta tgaaccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatatgaat     120
gaatgtgctc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat     180
ggtccgtgcg gcggctaa                                                   198
<210>  13
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  13
Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser
1               5                   10                  15
Gln His Glu Gly Met Ala Cys Tyr Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Val Asn Glu Cys Ala Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  14
<211>  198
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  14
gatccgcagt ttggtctgtt tagcaaatat cgtaccccga attgtagcca gcatgaaggt      60
atggcatgtt acgctctgta tgaaccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatgttaat     120
gaatgtgctc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat     180
ggtccgtgcg gcggctaa                                                   198
<210>  15
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  15
Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser
1               5                   10                  15
Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  16
<211>  198
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  16
gatccgcagt ttggtctgtt tagcaaatat cgtaccccga attgtagcga ccatgctggt      60
atggcatgtg ttgctctgta tgaaccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatgcaaat     120
gaatgtaccc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat     180
ggtccgtgcg gcggctaa                                                   198
<210>  17
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  17
Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser
1               5                   10                  15
Asp Phe Asp Gly Met Ala Cys Tyr Ala Phe Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  18
<211>  198
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  18
gatccgcagt ttggtctgtt tagcaaatat cgtaccccga attgtagcga cttcgacggt      60
atggcatgtt acgctttcta tgaaccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatgcaaat     120
gaatgtaccc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat     180
ggtccgtgcg gcggctaa                                                   198
<210>  19
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  19
Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser
1               5                   10                  15
Gln His Glu Gly Met Ala Cys Tyr Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  20
<211>  198
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  20
gatccgcagt ttggtctgtt tagcaaatat cgtaccccga attgtagcca gcatgaaggt      60
atggcatgtt acgctctgta tgaaccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatgcaaat     120
gaatgtaccc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat     180
ggtccgtgcg gcggctaa                                                   198
<210>  21
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  21
Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser
1               5                   10                  15
Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Phe Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  22
<211>  198
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  22
gatccgcagt ttggtctgtt tagcaaatat cgtaccccga attgtagcga ccatgctggt      60
atggcatgtg ttgcttttta tgaaccggtt tgtggtagcg atatgagcac ctatgcaaat     120
gaatgtaccc tgtgcatgaa aattcgtgaa ggtggccata atattaaaat tattcgcaat     180
ggtccgtgcg gcggctaa                                                   198
<210>  23
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  23
Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala
1               5                   10                  15
Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Glu Asn Glu Cys Val Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  24
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  24
Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala
1               5                   10                  15
Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Glu Asn Glu Cys Val Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  25
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  25
Ser Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala
1               5                   10                  15
Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Glu Asn Glu Cys Val Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  26
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  26
Glu Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala
1               5                   10                  15
Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Glu Asn Glu Cys Val Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  27
<211>  67
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  27
Ser Leu Ile Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn
1               5                   10                  15
Cys Ala Asp His Ala Gly Met Ala Cys Val Ala Leu Tyr Glu Pro Val
20                  25                  30
Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Glu Asn Glu Cys Val Leu Cys Met
35                  40                  45
Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro
50                  55                  60
Cys Gly Gly
65
<210>  28
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  28
Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala
1               5                   10                  15
Asp Phe Asp Gly Met Ala Cys Tyr Ala Phe Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  29
<211>  65
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<400>  29
Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala
1               5                   10                  15
Gln His Glu Gly Met Ala Cys Tyr Ala Leu Tyr Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly
50                  55                  60
Gly
65
<210>  30
<211>  63
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  любая аминокислота
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (16)..(19)
<223>  любая аминокислота
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (21)..(21)
<223>  любая аминокислота
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (24)..(24)
<223>  любая аминокислота
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (26)..(26)
<223>  любая аминокислота
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (27)..(27)
<223>  любая аминокислота
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (39)..(39)
<223>  любая аминокислота
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (43)..(43)
<223>  любая аминокислота
<400>  30
Xaa Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Ala Cys Xaa Ala Xaa Xaa Glu Pro Val Cys Gly
20                  25                  30
Ser Asp Met Ser Thr Tyr Xaa Asn Glu Cys Xaa Leu Cys Met Lys Ile
35                  40                  45
Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys
50                  55                  60
<210>  31
<211>  39
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтезированный пептид
<400>  31
Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His
1               5                   10                  15
Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala
20                  25                  30
Asp Ile Gly Ser Ala Asn Ser
35
<210>  32
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтезированный пептид
<400>  32
Gly Ala Ser Ala Ala Ala
1               5
<210>  33
<211>  34
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  33
aaaagaattc tgatccgcag tttggtctgt ttag                                  34
<210>  34
<211>  40
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  34
aaaactcgag ttatgcggcc gcagacgcgc cgcacggacc                            40
<210>  35
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  35
aaaaggatcc ctggacaaac gtgatccgca gtttggtctg tttag                      45
<210>  36
<211>  44
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  36
aaaactcgag ttagccgccg cacggaccat tgcgaataat ttta                       44
<210>  37
<211>  34
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  37
aaacatatgg ggcaggaaga tcccaacagt ttgc                                  34
<210>  38
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  38
aaactcgagt ttggcctgtc ggtcatggga ctc                                   33
<210>  39
<211>  35
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  39
aaaagaattc gccaccatgc agattcctag agccg                                 35
<210>  40
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  40
aaaactcgag tcagtggtga tggtggtggt ggccgg                                36
<210>  41
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  41
cttgtcgtca tcgtccttgt agtcgccggg gtcgatttcc tc                         42
<210>  42
<211>  44
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  42
gcgactacaa ggacgatgac gacaagcacc accaccatca tcac                       44
<210>  43
<211>  41
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  43
aaaaactcga gctagtgatg atggtggtgg tgcttgtcgt c                          41
<210>  44
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  44
ccgcagtttg gtctgtttag caaatatcgt accccgaatt gt                         42
<210>  45
<211>  43
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность ь
<220>
<223>  праймер
<400>  45
gccataccag catggtccgc acaattcggg gtacgatatt tgc                        43
<210>  46
<211>  40
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  46
gcggaccatg ctggtatggc atgtgttgct ctgtatgaac                            40
<210>  47
<211>  39
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  47
aaaactcgag ttagccgccg cacggaccat tgcgaataa                             39
<210>  48
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  48
aaaaggatcc ctggacaaac gtgatccgca gtttggtctg tttag                      45
<210>  49
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  49
aaaaggatcc ctggacaaac gtggcccgca gtttggtctg tttag                      45
<210>  50
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  50
aaaaggatcc ctggacaaac gtagcccgca gtttggtctg tttag                      45
<210>  51
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  51
aaaaggatcc ctggacaaac gtgaaccgca gtttggtctg tttag                      45
<210>  52
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  52
aaaaggatcc ctggacaaac gtagcctgat tccgcagttt ggtctgttta g               51
<210>  53
<211>  458
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  53
Gln Leu Ser Arg Ala Gly Arg Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly Cys Pro
1               5                   10                  15
Asp Arg Cys Glu Pro Ala Arg Cys Pro Pro Gln Pro Glu His Cys Glu
20                  25                  30
Gly Gly Arg Ala Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys Glu Val Cys Gly Ala
35                  40                  45
Pro Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu Gly Pro Cys Gly Glu Gly
50                  55                  60
Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro Ala Ser Ala Thr Val Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val Cys Ala Ser Ser Glu Pro Val
85                  90                  95
Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr Tyr Ala Asn Leu Cys Gln Leu Arg Ala
100                 105                 110
Ala Ser Arg Arg Ser Glu Arg Leu His Arg Pro Pro Val Ile Val Leu
115                 120                 125
Gln Arg Gly Ala Cys Gly Gln Gly Gln Glu Asp Pro Asn Ser Leu Arg
130                 135                 140
His Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Pro Ala
145                 150                 155                 160
Val Val His Ile Glu Leu Phe Arg Lys Leu Pro Phe Ser Lys Arg Glu
165                 170                 175
Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile Val Ser Glu Asp Gly Leu
180                 185                 190
Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn Lys His Arg Val Lys Val
195                 200                 205
Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr Glu Ala Lys Ile Lys Asp Val Asp
210                 215                 220
Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ile Asp His Gln Gly Lys Leu
225                 230                 235                 240
Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu Phe
245                 250                 255
Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr Thr
260                 265                 270
Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly Lys Glu Leu Gly Leu Arg
275                 280                 285
Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ile Ile Asn Tyr Gly
290                 295                 300
Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp Gly Glu Val Ile Gly Ile
305                 310                 315                 320
Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp
325                 330                 335
Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr Glu Ser His Asp Arg Gln Ala Lys Gly
340                 345                 350
Lys Ala Ile Thr Lys Lys Lys Tyr Ile Gly Ile Arg Met Met Ser Leu
355                 360                 365
Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp Arg His Arg Asp Phe Pro
370                 375                 380
Asp Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu Val Ile Pro Asp Thr Pro
385                 390                 395                 400
Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp Val Ile Ile Ser Ile Asn
405                 410                 415
Gly Gln Ser Val Val Ser Ala Asn Asp Val Ser Asp Val Ile Lys Arg
420                 425                 430
Glu Ser Thr Leu Asn Met Val Val Arg Arg Gly Asn Glu Asp Ile Met
435                 440                 445
Ile Thr Val Ile Pro Glu Glu Ile Asp Pro
450                 455
<210>  54
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтезированный пептид
<220>
<221>  BINDING
<222>  (1)..(1)
<223>  N-(4-метилкумарил-7-амид)изолейцин
<220>
<221>  BINDING
<222>  (10)..(10)
<223>  N-эпсилон-(2,4-динитрофенил)лизин
<400>  54
Xaa Arg Arg Val Ser Tyr Ser Phe Lys Xaa
1               5                   10
<210>  55
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  55
ccatcatcaa ctacggcaac gcgggcggac ccctcgtgaa cc                         42
<210>  56
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  56
ggttcacgag gggtccgccc gcgttgccgt agttgatgat gg                         42z
<---