Особенности дифференциальной окраски хромосом радиомутантных форм персика

Елманова Т.С., Лищук А.И. // Помология. - Т. 3. Абрикос, персик, алыча. - К.: Урожай, 1997. - 279 с.

6. Соколова С.А., Соколов Б.В. Персик. - Кишинев, 1987. - 326 с.

7. Соколова С.А., Соколов Б.В. Состояние и перспективы культуры персика в Молдове. - Кишинев, 1991. - 53 с.

ОСОБЕННОСТИ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ОКРАСКИ ХРОМОСОМ РАДИОМУТАНТНЫХ ФОРМ ПЕРСИКА

Е.В. ГОСТЕВА, кандидат биологических наук;

А.В. СМЫКОВ, кандидат сельскохозяйственных наук Никитский ботанический сад - Национальный научный центр

Введение

Процесс создания новых сортов может включать этапы получения мутантных форм исходных сортов с последующим отбором наиболее перспективных, выделяющихся хозяйственно полезными признаками. Радиационный мутагенез экспериментально является наиболее приемлемым по причине простоты экспонирования материала и точности установления поглощенной дозы. Он может быть использован методологически в случае достижения максимального (оптимального) эффекта в виде наблюдаемого разнообразия «уклоняющихся форм».

Не вызывает сомнения, что в основе фенотипического изменения «уклоняющихся» форм лежит изменение генотипическое - качественные или количественные изменения генетического аппарата исходных сортов. Эти изменения, возможно, затрагивают различные уровни в организации наследственного аппарата: от изменения нуклеотидной последовательности ДНК (точковые мутации), до структурных перестроек хромосом, изменения плоидности генома, что нередко отмечается у растений.

Изучение точковых мутаций у растительных объектов в настоящее время практически не ведется. Исследования изменчивости хромосомного аппарата короткохромосомных растений значительно ограничены и касаются, в основном, методов регистрации изменения как общего количества ДНК на ядро, так и изменение плоидности (включая эндополиплоидию). Крупные хромосомные перестройки наблюдаются при этом редко. Последние предполагают регистрировать на основании изучения нарушений в коньюгации гомологов в мейозе. Процесс обнаружения перестроек хромосом у плодовых растений с короткими хромосомами достаточно трудоемкий и работы в этой области до настоящего времени немногочисленны.

Одна из возможностей более детального анализа индуцированного изменения хромосом - это использование методов дифференциальной окраски хромосомных структур на ранних этапах митотического деления - в профазе [2]. Анализ хромосом основан на существовании феномена идентичности: сходства рисунка расположения «бэндов» (сегментов) на хромосомах гомологов. Сегменты четко распределяются на светлые (называемые «эухроматином») и темные (назывемые «гетерохроматином») участки. Предполагается, что такое изменение может являться «материальной основой» устойчивости - адаптации растительного организма к тем или иным стрессовым условиям окружающей среды в зависимости от того локусы каких именно генов были затронуты такого типа изменениями. То же относится и к хромосомным абберациям, транслокациям, сопровождающимся «потерей» или «приобретением» участков хромосом, проводящих к изменению дозы генов.

Если коррелятивная связь между изменением хромосомного аппарата и наблюдаемым морфологическим «уклонением» существует, то «детерминированные» изменения кариотипа возможно использовать в качестве генетических маркеров, характеризующих изменения испытуемого сорта. Этот подход представляет определенный интерес для расширения возможностей селекции плодовых культур, особенно на ранних этапах развития, до вступления в период плодоношения.

Целью исследований являлось изучение особенностей дифференциальной окраски хромосом у гамма-облученных форм персика и выявление мутационных изменений.

Объекты и методы исследований

В исследования были включены облученные в дозе 50 Гр сорта персика Бархатистый, Советский, Кудесник (контроль - без облучения) и семь радиомутантных форм персика сорта Советский с морфобиологическими изменениями (табл. 1).

Таблица 1

Объекты исследований

Сорт, форма Доза облучения, Гр Измененный признак

Советский (контроль) 0 -

Советский 3712 20 Морозостойкость цветковых почек, сдержанный рост, засухоустойчивость

Советский 372 20 Морозостойкость цветковых почек, сдержанный рост, засухоустойчивость

Советский 379 20 Сдержанный рост, морозостойкость цветковых почек

Советский 638 50 Сдержанный рост, позднее цветение, засухоустойчивость, устойчивость к курчавости

Советский 403 50 Морозостойкость цветковых почек, сдержанный рост, засухоустойчивость

Советский 6330 30+20 Позднее цветение, крупные плоды, повышенное содержание витамина С

Советский 6312 50 Слаборослость

Для изучения особенностей кариотипа сортов и форм персика была применена методика дифференциального окрашивания короткохромосомных объектов при увеличении х 1600 [1-5]. Особенностью этой методики является введение в окраску препаратов хромосом реактива Фёльген. Он является известным ДНК-специфическим красителем и при отработанном процессе гидролиза (создание апуриновых оснований ДНК, связывающих фиолетовый краситель Шиффа - реакция Фельген) окрашивает хромосомы количественно. При этом темные сегменты характеризуются более плотной упаковкой ДНК в хромосомах (большим количеством ДНК на единицу обьема хромосом), чем светлые участки хромосом. Ряд опубликованных данных показывает, что «молчащие» гены преимущественно находятся в темных компактизованных участках хромосом. Примененная в настоящем исследовании методика позволяет красить хромосомы не только дифференциально, но и количественно. Последняя особенность технологии окраски делает возможным компьютерную обработку хромосомных образов на системах анализа изображений. Этот этап имеет важное значение, так как позволяет проводить анализ хромосом более объективно, то есть осуществлять идентификацию хромосом не визуально, а на основе машинного количественного анализа.

Для оценки дифференциально окрашенных коротких хромосом использована анализирующая система IBAS-2000. В качестве основного критерия описания хромосом использовалась денситометрическая характеристика - интегрированная оптическая плотность (Integrated optical density).

В количественно прокрашенных хромосомах показатель IOD (абсорбированный свет, проходящий через тело хромосомы на препарате) коррелирует с количеством ДНК на хромосому. Этот показатель является отправным во всей последующей, более детальной оценке хромосом в профазе-прометафазе анализа индивидуальных бэндов.

Для получения препаратов хромосом форм персика были использованы молодые листочки верхушечных побегов. Среди ряда образцов были отобраны варианты с интенсивно делящимися клетками, а, соответственно, с количеством митозов, достаточным для сбора хромосомных пластинок и оценки.

Для каждой из форм, приведенной в таблице, было набрано по 10-20 пластинок на стадиях профазы-прометафазы. Из этих пластинок были отобраны те, где отсутствовали или были минимальными наложения хромосом. Все свободнолежащие хромосомы накапливались с целью проведения классификации хромосом и создания кариотипа дифференциально окрашенных хромосом. Была предложена классификация хромосом персика, основанная на измерении величины (IOD) количества и порядка расположения «темных» и «светлых» сегментов, наименьших по величине, зарегистрированных у короткохромосомных растительных объектов. В цитогенетических исследованиях для выявления нарушений в митозах наиболее используемыми критериями являются:

- оценка количества клеток с микроядрами;

- подсчет количества клеток с мостами (различные случаи нерасхождения хроматид/хромосом) в анафазе;

- подсчет количества клеток с абберациями хромосом.

Для выявления нарушений в митозах клеток облученных черенков мы использовали критерий нерасхождения хромосом (мостов) в анафазе, микроядерный тест. В целях выявления нарушений в митотическом делении клеток у трех образцов персика в дозе облучения 50 Гр сортов Бархатистый, Советский, Кудесник был дополнительно использован анализ изменения количества ДНК в ядрах дочерних клеток при их расхождении в анафазе митоза, основанный на цитофотометрическом сканировании ядер клеток с помощью системы анализа изображений IBAS-2000. Неравное распределение количества ДНК между ядрами дочерних клеток регистрирует различные случаи нерасхождения хромосом [7], приводящие к появлению анеуплоидных клеток, тандемно дуплицированных хромосом. Изменения, затрагивающие значительные объемы ядерной ДНК, свидетельствуют об интенсивности процесса и вероятности нарушения дальнейшего хода деления клеток, так как значительные потери ДНК приводят к элиминированию ядра и гибели клеток.

Результаты исследований и их обсуждение

Было установлено, что в кариотипе персика присутствует наименьшая хромосома, выявленная нами ранее для высших короткохромосомных растений (6). В данной хромосоме (типа «а») гетерохроматиновый сегмент наименьший по размеру и равен по величине половине этой хромосомы. В самой короткой хромосоме возможна минимальная дифференциация участков на гетерохромативный сегмент и эухромативный участок. Иными словами, все разнообразие рисунка неоднородности хромосомы сводится к 4-м вариантам (3 визуально различимы), исходя из двоичного логарифма: log2 4 = 2 (один гетерохромативный сегмент, один эухромативный участок и их различные комбинации). Порядок расположения гетеро-и эухроматиновых

сегментов начинается с короткого плеча у акроцентрических хромосом и с 4-го участка гетерохроматина, если у метацентрических хромосом только один конец представлен «темным» (гетерохроматиновым) сегментом. Такой порядок, подробно описанный для короткохромосомных растений, произволен, но раз выбранный и получивший определенный «реестр», остается неизменным. Таким образом возможно сравнивать и идентифицировать хромосомы в исходном кариотипе (например, контрольном) и в измененном (в ходе эволюции, при индуцированном мутагенезе).

Далее наблюдается увеличение размеров хромосом в кариотипе персика за счет кратного «прибавления» хромосомных участков, которые также могут быть представлены гетерохроматиновыми сегментами и/или участками эухроматина. Для хромосом в два раза больших, чем наименьшая хромосома высших растений, количество вариантов сочетания, поочередности расположения гетеро- и эухроматина на хромосомах увеличивается до 16, исходя, опять же, из двоичного логарифма: log2 16 = 4 (гетеро-, эухроматин, как сегмент-участок в количестве в два раза большем). Визуально, однако, в этих хромосомах устанавливается 12 типов хромосом, так как до момента коньюгации хромосом в мейозе невозможно определить где «начало» и где «конец» хромосом только по чередованию сегментов. Этим вопросом занимается наука секвентирования генов и их положения на хромосоме.

Таким образом, в целях систематизирования хромосом персика предложено самые короткие хромосомы обозначать латинской буквой «а»; далее, при их усложнении (увеличении размеров), соответственно буквами «в», «с» и т.д. Арабскими цифрами предложено обозначать соответствующий тип хромосомы, как определенное взаиморасположение гетерохроматиновых сегментов и эухроматиновых участков. При этом под сегментом подразумевается наименьший по размеру гетерохроматиновый участок, а под бэндами - гетерохроматиновые участки, куда могут входить один, два, три и т.д. сегментов. Результат такой систематизации хромосом персика представлен на рис. 1.

Данные анализа профазных

хромосомных пластинок показали различие по двум-трем параметрам хромосом между контролем (рис. 2) и мутантными формами. Основные отличия - появление пары хромосом с крупным и гетерохроматиновым блоком. Так, у формы № 403 (рис. 3) хорошо визуально различимы хромосомы со значительной конденсацией, практически состоящие из гетерохроматина. Аналогичные хромосомы с конденсированными участками были отмечены у форм № 6330, 6312, 372. На стадии прометофазы у формы № 379 отмечали наличие протяженных эухроматиновых участков (рис. 4).

У формы 638 на стадии профазы-прометафазы наблюдалось нерасхождение одной из пар хромосом (рис. 5), а также был установлен мозаицизм тканей. Он выражался в присутствии значительного количества гаплоидных клеток (до 60%) в тканях листочка.

Нерасхождение хромосом является основой к предположению о наличии особой устойчивости растительного организма к неблагоприятным условиям окружающей

Рис. 1. Классификация типов хромосом персика на стадии

деления клетки профазе-прометафазе

среды в зависимости от того, как именно «генетические программы» расположены на данных хромосомах.

Рис. 2. Хромосомы персика сорта Советский

Рис. 3. Хромосомы персика Советский 403

Рис. 4. Хромосомы персика формы Советский 379

Рис. 5. Хромосомы персика формы Советский 638

Распределение количества ДНК между ядрами дочерних клеток в соматических тканях облученных побегов персика определяли вычислением площади ядра клеток и его суммарной оптической плотности (количество ДНК на ядро). Также фиксировали нарушения в митотическом делении соматических клеток (количество микроядер, клеток с мостами, полиплоидных клеток) (табл. 2). У сорта Бархатистый в варианте

облучения 50 Гр наблюдалось появление микроядер (4 шт., в контроле 0 шт.), клеток с мостами (7 шт., 2 шт.), полиплоидных клеток (2 шт., 1 шт.). У сорта Советский в дозе обработки 50 Гр отмечали уменьшение площади ядра (2827,7 pixel2, в контроле 3342,9 pixel2), суммарной оптической плотности (12,3 sumgrey, 10,9 sumgrey), возрастание коэффициента вариации этих признаков (38,9%, в контроле 28,0% и 39,4%, в контроле 23,3%), а также появление клеток с мостами (5 шт., в контроле 0 шт.). У сорта Кудесник при облучении 50 Гр проявилось уменьшение площади ядра (5262,7 pixel2, в контроле 7565, pixel2), увеличение суммарной оптической плотности ядра (26,8 sumgrey, в контроле 23,4 sumgrey), возрастание их коэффициента вариации (32,5%, в контроле 26,6%; 19,0%, в контроле 14,6%) и возрастание количества микроядер (6 шт., в контроле 1 шт.), клеток с мостами (7 шт., 2 шт.) и полиплоидных клеток (4 шт., 0 шт.).

Таблица 2

Нарушения в митотическом делении соматических клеток у облученного персика

Вари- Коли- Суммарная Ко- Ко- Коли-

ант чество Площадь оптическая ли- ли- чество

облу- изу- ядра плотность чес- чес- поли-

Сорт че- чен- ядра тво тво плоид-

ния, ных Pixel 2 sumgrey мик- кле- ных

Гр клеток р°-ядер ток с мостами клеток

Бархатистый 0 100 2515,9 20,4 10,7 18,4 0 2 1

Бархатистый 50 96 2402,8 22,2 9,5 19,7 4 7 2

Советский 0 100 3342,9 28,0 12,3 23,3 1 0 0

Советский 50 100 2827,7* 38,9 10,9* 39,4 0 5 0

Кудесник 0 100 7565,9 26,6 23,4 14,6 1 2 0

Кудесник 50 112 5262,7* 32,5 26,8* 19,0 6 7 4

* Существенные различия с контролем при Р = 0,95 по площади ядра и суммарной оптической плотности

Выводы

1. Разработана классификация хромосом персика, отражающая величину хромосом и порядок расположения гетерохроматиновых сегментов и блоков по длине хромосом.

2. У радиомутантных форм персика № 403, 3712, 372, 6330 наблюдалось появление хромосом с крупными гетерохроматиновыми блоками.

3. У формы 379 отмечали наличие протяженных эухроматиновых участков, у мутанта № 638 - нерасхождение одной из пар хромосом, а также мозаицизм тканей листочков с гаплоидными клетками.

4. В вариантах с облучением 50 Гр наблюдались изменения площади, суммарной оптической плотности клеточного ядра, появление клеток с микроядрами, мостами и полиплоидным набором хромосом.

Дальнейшее продолжение этих исследований позволит определить корреляционные взаимосвязи между особенностями дифференциальной окраски хромосом и морфобиологическими признаками растений.

Список литературы

1. Башмакова Е.Ю. Особенности дифференциальной окраски хромосом персика // Бюл. Никит. ботан. сада. - 1986. - Вып. 61. - С. 97-1O2.

2. Чугункова Т.В, Шевцов И.А. Использование дифференциальной окраски хромосом для анализа кариотипов растений // Генетические методы ускорения селекционного процесса. - Кишинев, 1986. - С. 18-2S.

3. Шкуратова Н.И., Смыков А.В. Изучение мутантных форм персика методом дифференциальной окраски хромосом // Бюл. Никит. ботан. сада. - 1986. - Вып. 61 - С. 119-123.

4. Шкуратова Н.И. Хромосомный анализ персика при индуцированном мутагенезе // Труды Никит. ботан. сада. - 1992. - Т. 113. - С. 120-123.

5. Gostev A., Asker S.A. S-banding technique for small plant chromosomes // Hereditas. - 1919. - V. 91. - P. 14O-143.

6. Gosteva E., Gostev A. A conception of eukaryotic chromosome structure and evolution // Acta Zool. Fennica. - N 13O. - P. 8S-91.

l. Macieria-Coelho A. Effect of H3 Decays on DNA partition during cell division // Radiat. Res. - 1994. - N 131. - P. 111-113.

ИТОГИ ИНТРОДУКЦИИ НЕКТАРИНА В НИКИТСКОМ БОТАНИЧЕСКОМ

САДУ

Е.П. ШОФЕРИСТОВ, доктор биологических наук;

Т.В. ШИШОВА Никитский ботанический сад - Национальный научный центр

Введение

Родиной нектарина, персика обыкновенного и других известных видов, подвидов и разновидностей Pérsica Mill. (syn.: Prunus L.), является Китай. Культивируемые сорта и формы нектарина, принадлежащие к Pérsica vulgaris Mill. subsp. néctarina (Ait.) Shof. (syn.: Prunus pérsica (L.) Batsch subsp. néctarina (Ait.) Shof.; Prunus pérsica (L.) Batsch subsp. nucipérsica Dipp.) [8], известны в Китае 4-5 тыс. лет [1, 10]. В Крыму интродуцированный нектарин Белый (Blanche) известен в течение 141 года. Он упоминался в каталогах Никитского сада с 1866 г. Этот старинный сорт западноевропейского происхождения сохранил свое значение до наших дней. Вторым очень старым сортом, интродуцированным в Крыму, был нектарин Ананасный (Ananas). Упоминание о нем в Никитском ботаническом саду относится к 1879 г. [3].

Согласно данным Л.П. Симиренко, нектарин Blanche является французским сортом, который возник около 1660 г. Этот сорт воспроизводится довольно константно посевом семян. Нектарин Ananas выведен Т. Риверсом (Англия) путем посева семян нектарина Pitmaston Orange. Этот нектарин - очень достойный сорт. Он заслуживает места для выращивания в каждом домашнем саду. Ценна также весьма высокая морозостойкость его древесины [5].

Таким образом, нектарин является ценной и перспективной плодовой породой для садоводства в южных регионах Украины. Включенный в Государственный реестр сортов растений Украины нектарин Рубиновый 8 (2002 г.) селекции Никитского ботанического сада - Национального научного центра (НБС-ННЦ), дополняет многообразие районированных в стране сортов персика обыкновенного. Интродукция нового сортимента нектарина необходима для дальнейшей селекционной работы в НБС-ННЦ.