ПРОМОТОРЫ LACTOCOCCUS И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая промотор (Р), который является природным промотором вида Lactococcus, или его функциональный вариант или функциональный фрагмент, функционально связанный с одной или несколькими открытыми рамками считывания (ORF) гетерологичными для промотора (Р), отличающаяся тем, что в Lactococcus промотор (Р) сильнее промотора гена тимидилатсинтазы (thyA) Lactococcus lactis.
2. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, в которой промотор (Р) выбран из группы, состоящей из природных промоторов генов Lactococcus, предпочтительно Lactococcus lactis, для
28) HU-подобного ДНК-связывающего белка (hllA),
1) бета'-субъединицы/субъединицы с М.м. 160 кДа ДНК-зависимой РНК-полимеразы (rpoC),
3) связывающего негемное железо ферритина (dpsА),
4) пируваткиназы (pyk),
5) глютаминил-тРНК-синтетаз (gltX),
6) фосфопируватгидратазы (eno),
9) дипептидазы РepV (pepV),
12) глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (gapA),
13) ацетаткиназы (ackA),
18) фруктозобифосфатальдолазы (fbaA),
20) супероксиддисмутазы (sodA),
21) рибосомного белка S12 (rpsL) и рибосомного белка S7 (rpsG),
22) рибосомного белка L18 (rplR), и рибосомного белка S5 (rpsE), и рибосомного белка L30/L7E (rpmD),
24) рибосомного белка L19 (rplS),
26) рибосомного белка L10 (rplJ),
29) белка L28 50S-субъединицы рибосомы (rpmB),
30) компонента фосфотрансферазной системы IIB (ptcB),
31) альфа-субъединицы АТФ-синтазы F0F1-типа (atpA),
32) связывающего множество сахаров транспортного АТФ-связывающего белка (msmK),
33) альфа-субъединицы компонента пируватдегидрогеназы Е1 (pdhA),
34) белка клеточного деления (diflVA или ftsA),
35) UDP-галактопиранозомутазы (glf1),
36) глютамиламинопептидазы (pepA),
37) спрогнозированного относящегося к дегидрогеназе белка (llmg 0272),
38) рибосомного белка S2 (rpsB),
39) фактора 3 инициации трансляции (IF-3) (infC),
40) рибосомного белка L4 (rplD) и рибосомного белка L23 (rplW) и рибосомного белка L2 (rplB),
41) бета-цепи фенилаланил-тРНК-синтетазы (pheT),
42) фактора элонгации транскрипции GreA (greA),
43) протеолитической субъединицы АТФ-зависимой протеазы Clp (clpP),
44) рибосомного белка L15 (rplO),
45) рибосомного белка L11 (rplK),
46) рибосомного белка S8 (rpsH),
47) рибосомного белка L21 (rplU),
48) рибосомного белка S13 (rpsM),
49) рибосомного белка S19 (rpsS) и рибосомного белка L22 (rplU), и рибосомного белка L16 (rplP), и рибосомного белка L14 (rplN),
50) рибосомного белка S10 (rpsJ),
51) шаперонина GroES (Hsp10) (groES),
52) рибосомного белка L24 (rplX), и
53) предполагаемой резольвазы, осуществляющей разделение-соединение (llmg_0151), и
их функциональных вариантов и функциональных фрагментов указанных природных промоторов.
3. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, в которой промотор (Р) выбран из группы, включающей или состоящей из нуклеиновых кислот, приведенных в SEQ ID NO: 28, 1, 3-6, 9, 12, 13, 18, 20-22, 24, 26, 29-54, 160, 163-165, 167, 169, 171-180, и их гомологов, и их функциональных вариантов и функциональных фрагментов.
4. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, дополнительно содержащая:
последовательность терминатора транскрипции, расположенную в направлении 3' от указанной одной или нескольких открытых рамок считывания;
оператор, сконструированный для контроля транскрипции с указанного промотора (Р);
последовательности, сконструированные для вставки указанной рекомбинантной нуклеиновой кислоты в хромосому клетки-хозяина, предпочтительно, с помощью гомологичной рекомбинации; и/или
сигнальную последовательность, предпочтительно usp45 или usp45N4.
5. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, в которой указанные одна или несколько открытых рамок считывания кодируют:
полипептид, способный вызывать терапевтическую реакцию или иммунный ответ у индивида, предпочтительно у человека или животного;
антиген и/или
невакциногенный терапевтически активный полипептид.
6. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.5, где:
указанный антиген способен индуцировать иммунный ответ, предпочтительно иммунологическую толерантность, у человека или животного,
указанный невакциногенный терапевтически активный полипептид способен вызывать терапевтический эффект у человека или животного;
указанный антиген способен индуцировать иммунный ответ и используется в качестве вакцины для человека или животного;
указанным невакциногенным терапевтически активным полипептидом является hIL-10, GLP-2, GLP-1, TFF или hPYY; и/или
указанная рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит:
(a) PdpsA, usp45 и hIL-10 (sAGX0012); PdpsA, usp45N4 и hIL-10;
PpepV, usp45 и hIL-10 (sAGX0018); PpepV, usp45N4 и hIL-10;
PsodA, usp45 и hIL-10 (sAGX0029); PsodA, usp45N4 и hIL-10;
PhllA, usp45 и hIL-10 (sAGX0037); PhllA, usp45N4 и hIL-10;
(b) PdpsA, usp45N4 и hTFF1; PdpsA, usp45 и hTFF1;
PpepV, usp45N4 и hTFF1; PpepV, usp45 и hTFF1;
PsodA, usp45N4 и hTFF1; PsodA, usp45 и hTFF1;
PhllA, usp45N4 и hTFF1 (sAGX0048); PhllA, usp45 и hTFF1 (sAGX0049);
(c) PdpsA, usp45N4 и hTFF3; PdpsA, usp45 и hTFF3 (sAGX0048);
PpepV, usp45N4 и hTFF3; PpepV, usp45 и hTFF3;
PsodA, usp45N4 и hTFF3; PsodA, usp45 и hTFF3;
PhllA, usp45N4 и hTFF3 (sAGX0057); PhllA, usp45 и hTFF3;
(d) PdpsA, usp45N4 и hPYY; PdpsA, usp45 и hPYY (sAGX0048);
PpepV, usp45N4 и hPYY; PpepV, usp45 и hPYY;
PsodA, usp45N4 и hPYY; PsodA, usp45 и hPYY;
PhllA, usp45N4 и hPYY (sAGX0057); PhllA, usp45 и hPYY; PhllA, usp45 и hPYY G9 (3-36) (sAGX0213);
(e) PdpsA, usp45N4 и GLP-1; PdpsA, usp45 и GLP-1;
PpepV, usp45N4 и GLP-1; PpepV, usp45 и GLP-1;
PsodA, usp45N4 и GLP-1; PsodA, usp45 и GLP-1;
PhllA, usp45N4 и GLP-1; PhllA, usp45 и GLP-1;
(f) PdpsA, usp45N4 и GLP-2; PdpsA, usp45 и GLP-2;
PpepV, usp45N4 и GLP-2; PpepV, usp45 и GLP-2;
PsodA, usp45N4 и GLP-2; PsodA, usp45 и GLP-2;
PhllA, usp45N4 и GLP-2; или PhllA, usp45 и GLP-2.
7. Вектор, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту, определенную по любому из пп.1-6, предпочтительно указанный вектор получают из pT1NX.
8. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантную нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-6, или вектор по п.7.
9. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантную нуклеиновую кислоту, определенную по любому из пп.1-6, в которой указанный промотор (Р) присутствует в хромосоме указанной клетки-хозяина, и указанный промотор (Р) функционально связан с одной или несколькими открытыми рамками считывания, гетерологичными для указанного промотора (Р).
10. Клетка-хозяин по п.9, в которой указанный промотор (Р), кроме того, содержит:
сигнальную последовательность, предпочтительно usp45 или usp45N4; и/или
оператор, сконструированный для контроля транскрипции с указанного промотора (Р).
11. Клетка-хозяин по п.8, в которой промотор (Р) выбран из группы, состоящей из нуклеиновых кислот, приведенных в SEQ ID NO: 28, 1, 3-6, 9, 12, 13, 18, 20-22, 24, 26, 29-54, 160, 163-165, 167, 169, 171-180, и их гомологов, и их функциональных вариантов и функциональных фрагментов.
12. Клетка-хозяин по п.8, в которой указанные одна или несколько открытых рамок считывания кодируют:
полипептид, способный вызывать терапевтическую реакцию или иммунный ответ у индивида, предпочтительно у человека или животного;
антиген; и/или
невакциногенный терапевтически активный полипептид.
13. Клетка-хозяин по п.12, в которой:
указанный антиген способен индуцировать иммунный ответ, предпочтительно иммунологическую толерантность, у человека или животного,
указанный невакциногенный терапевтически активный полипептид способен вызывать терапевтический эффект у человека или животного;
указанным невакциногенным терапевтически активным полипептидом является hIL-10, GLP-2, GLP-1, TFF или hPYY,
указанный антиген способен индуцировать иммунный ответ и используется в качестве вакцины для человека или животного; и/или
указанная клетка-хозяин содержит:
(a) PdpsA, usp45 и hIL-10 (sAGX0012); PdpsA, usp45N4 и hIL-10;
PpepV, usp45 и hIL-10 (sAGX0018); PpepV, usp45N4 и hIL-10;
PsodA, usp45 и hIL-10 (sAGX0029); PsodA, usp45N4 и hIL-10;
PhllA, usp45 и hIL-10 (sAGX0037); PhllA, usp45N4 и hIL-10;
(b) PdpsA, usp45N4 и hTFF1; PdpsA, usp45 и hTFF1;
PpepV, usp45N4 и hTFF1; PpepV, usp45 и hTFF1;
PsodA, usp45N4 и hTFF1; PsodA, usp45 и hTFF1;
PhllA, usp45N4 и hTFF1 (sAGX0048); PhllA, usp45 и hTFF1 (sAGX0049);
(c) PdpsA, usp45N4 и hTFF3; PdpsA, usp45 и hTFF3 (sAGX0048);
PpepV, usp45N4 и hTFF3; PpepV, usp45 и hTFF3;
PsodA, usp45N4 и hTFF3; PsodA, usp45 и hTFF3;
PhllA, usp45N4 и hTFF3 (sAGX0057); PhllA, usp45 и hTFF3;
(d) PdpsA, usp45N4 и hPYY; PdpsA, usp45 и hPYY (sAGX0048);
PpepV, usp45N4 и hPYY; PpepV, usp45 и hPYY;
PsodA, usp45N4 и hPYY; PsodA, usp45 и hPYY;
PhllA, usp45N4 и hPYY (sAGX0057); PhllA, usp45 и hPYY; PhllA, usp45 и hPYY G9 (3-36) (sAGX0213);
(e) PdpsA, usp45N4 и GLP-1; PdpsA, usp45 и GLP-1;
PpepV, usp45N4 и GLP-1; PpepV, usp45 и GLP-1;
PsodA, usp45N4 и GLP-1; PsodA, usp45 и GLP-1;
PhllA, usp45N4 и GLP-1; PhllA, usp45 и GLP-1;
(f) PdpsA, usp45N4 и GLP-2; PdpsA, usp45 и GLP-2;
PpepV, usp45N4 и GLP-2; PpepV, usp45 и GLP-2;
PsodA, usp45N4 и GLP-2; PsodA, usp45 и GLP-2;
PhllA, usp45N4 и GLP-2; или PhllA, usp45 и GLP-2.
14. Клетка-хозяин по п.8, являющаяся непатогенной и неинвазивной бактерией, предпочтительно грамположительной бактерией, более предпочтительно молочно-кислой бактерией, еще более предпочтительно бактерией Lactococcus или бактерий Lactobacillus и наиболее предпочтительно бактерией Lactococcus lactis или Lactobacillus casei.
15. Применение рекомбинантной нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-6 или вектора по п.7 для экспрессии продуктов экспрессии, кодируемых указанными одной или несколькими открытыми рамками считывания, в клетке-хозяине.
16. Способ рекомбинантной экспрессии представляющего интерес полипептида, включающий
а) культивирование клетки-хозяина, определенной по любому из пп.8-13, в которой указанные одна или несколько открытых рамок считывания кодируют представляющий интерес полипептид, и
b) выделение представляющего интерес полипептида, продуцированного клеткой-хозяином при указанном культивировании.
17. Применение клетки-хозяина, определенной по любому из пп.8-13 для получения лекарственного средства, для доставки полипептида, кодируемого указанными одной или несколькими открытыми рамками считывания рекомбинантной нуклеиновой кислоты, человеку или животному.
18. Применение по п.17, в котором указанным полипептидом является антиген и/или невакциногенный терапевтически активный полипептид, предпочтительно hIL-10, GLP-2, GLP-1, TFF или hPYY.
19. Фармацевтическая композиция, содержащая клетку-хозяина, определенную по любому из пп.8-13.
20. Клетка-хозяин по любому из пп.8-13, использующаяся в качестве лекарственного средства.