Роль компонентов матрикса во взаимодействии бактериофагов с бактериями биопленок

Роль компонентов матрикса во взаимодействии бактериофагов с бактериями биопленок

Г.В. Тец, Н.К. Артеменко, М.Ф. Вечерковская, В.В. Тец

Взаимодействие бактерий и бактериофагов играет важную роль в поддержании функций микробиоты, а также может приводить к ее "болезням" и развитию патологических состояний макроорганизма. Многие компоненты матрикса биопленок принимают большое участие в защите бактерий от внешних воздействий. Целью исследования было изучение роли матрикса биопленок и его компонентов - амилоида и внеклеточной ДНК - в регуляции взаимодействия бактерий с бактериофагами. Результаты исследования свидетельствуют о том, что матрикс бактериальных биопленок и его компоненты участвуют в регуляции взаимодействия бактерий и бактериофагов. Ключевые слова: бактериофаги, бактериальные биопленки, матрикс биопленок, бактериальный амилоид.

Введение

Представления о состоянии микробиоты и свойствах патогенных бактерий претерпевают очередное принципиальное обновление. Новый взгляд на жизнедеятельность бактерий связан с вирусами бактерий - бактериофагами. Известно, что бактериофагов в микробиоте человека в 10 раз больше, чем бактерий, и их число оценивают как 1015 [1]. Более того, в недавно проведенных исследованиях впервые было установлено, что бактериофаги могут выступать как неизвестные ранее возбудители вирусных болезней млекопитающих [2]. Полученные данные свидетельствуют о важности изучения взаимодействия фагов и бактерий в микробиоте.

На сегодняшний день остаются малоизученными процессы взаимодействий и их регуляции, происходящие внутри бактериальных биопленок. Микробные биопленки состоят из ряда структур, в число которых входят клетки и окружающий их внеклеточный матрикс. Выявлено, что многие компоненты матрикса биопленок играют важную роль в защите бактерий от внешних воздействий. Среди компонентов матрикса внимание исследователей привлекли молекулы, контролирующие кооперативное поведение клеток, внеклеточная ДНК матрикса как молекула,

ФГБОУ ВО "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова" МЗ РФ.

Георгий Викторович Тец - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаборатории иммунологии Научно-исследовательского центра.

Наталья Константиновна Артеменко - канд. мед. наук, доцент кафедры микробиологии и вирусологии. Мария Федоровна Вечерковская - канд. мед. наук, доцент кафедры микробиологии и вирусологии. Виктор Вениаминович Тец - докт. мед. наук, профессор, зав. кафедрой микробиологии и вирусологии. Контактная информация: Тец Виктор Вениаминович, vtetzv@yahoo.com

перераспределяющая генетическую информацию, и совсем недавно - амилоид, способствующий удержанию биопленок на поверхности и противодействующий потоку жидкости [3-5].

Внеклеточная ДНК биопленок играет различную роль на разных стадиях формирования биопленки, в том числе она необходима для образования в матриксе нерастворимой ß-формы амилоида [6]. По данным проведенных исследований, амилоид бактериальных биопленок, в том числе биопленок возбудителей заболеваний дыхательной системы, может оказывать патологическое воздействие на организм человека [7-14]. Вместе с тем роль компонентов матрикса в регуляции взаимодействия бактерий биопленок и бактериофагов остается практически неизученной.

Целью исследования было изучение влияния матрикса биопленок и отдельных его компонентов - внеклеточной ДНК и ß-амилоида - на взаимодействия бактерий с бактериофагами.

Материал и методы

Изученные штаммы бактерий: Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa VT-16-20B.

Использованные бактериофаги: стафилококковый бактериофаг VTSA-29213 и бактериофаг Pseudomonas aeruginosa VTPA-20B, выделенные из сточных вод.

Питательные среды: жидкие и агаризо-ванные колумбийская и Лурия-Бертани среды (Oxoid, Великобритания) с добавлением эритроцитов барана.

Определение наличия амилоида в биопленках. Бактерии выращивали на колумбийском или Лу-рия-Бертани агаре с добавлением конго красного в конечной концентрации 20 мкг/мл [15].

Выделение матрикса биопленок. Матрикс получали из 48-часовых биопленок, выделен-

http://atm-press.ru

Практическая пульмонология | 2017 | № 3

55

Микробиология

(а) (б) ^

Амилоид в биопленках Staphylococcus aureus ATCC 29213 (а) и Pseudomonas aeruginosa VT-16-20B (б).

ных на агаризованной среде. Клетки биопленки отделяли путем центрифугирования (MiniSpin, Eppendorf, Германия) c последующим фильтрованием через стерильные фильтры 0,22 мкм.

Выделение амилоида матрикса биопленок. Амилоид выделяли из матрикса после его отделения от бактерий [16]. Количество полученного амилоида оценивали по оптической плотности при длине волны 280 нм (SmartSpec Plus, Bio-Rad, США).

Выделение внеклеточной ДНК биопленок. ДНК биопленок выделяли из матрикса фенол-хлороформным методом [17]. Количество внеклеточной ДНК матрикса оценивали по оптической плотности при длине волны 260 нм (SmartSpec Plus, Bio-Rad, США).

Определение титра бактериофагов. Фаги титровали методом двукратных разведений с последующим внесением образца в полужидкий агар (0,7%), содержащий чувствительную к фагу культуру, и наслоением смеси на плотный агар (1,5%) в чашке Петри. Число негативных колоний определяли после 48 ч инкубации при 37°С.

Взаимодействие бактериофагов с матрик-сом и его компонентами. Изучали взаимодействие фага с цельным матриксом биопленок S. aureus и P. aeruginosa, а также его компонентами - внеклеточной ДНК и амилоидом. Концентрация ДНК в конечной инкубационной смеси составляла 0,10 ОЕ по оптической плотности. Амилоид добавляли в конечной концентрации 0,15 ОЕ. В качестве контроля использовали фаг, преинкубированный с изотоническим раствором хлорида натрия. Пробы инкубировали при 37°С в течение 1 ч.

Активность бактериофагов

Проба VTSA-29213 VTPA-20B

Контроль 6,5 ± 1,5 х 1010 2,0 ± 1,0 х 1011

Обработка матриксом 2,0 ± 1,0 х 108 5,0 ± 1,0 х 108

Обработка амилоидом 1,0 ± 0,5 х 109 5,0 ± 0,5 х 109

Обработка внеклеточной ДНК 2,0 ± 1,0 х 108 1,0 ± 1,0 х 109

Результаты и обсуждение

Использованные в работе штаммы бактерий после роста на среде с конго красным формировали биопленки, имеющие интенсивное окрашивание, характерное для комплекса амилоида с использованным красителем (рисунок) [18]. Содержание Р-амилоида в матриксе биопленок использованных бактерий было оценено как высокое. Для изучения влияния матрикса и его компонентов на взаимодействие бактерий и бактериофагов последние предварительно инкубировали с отдельными компонентами матрикса, а затем определяли способность бактериофагов образовывать негативные колонии при контакте с соответствующей бактериальной культурой (таблица).

Было установлено, что инкубация бактериофагов с матриксом, амилоидом или внеклеточной ДНК бактериальных биопленок приводит к снижению активности бактериофагов. Наибольшее снижение активности фагов зарегистрировано после их контакта с цельным матриксом. При этом число колониеобразующих единиц снижалось почти на два порядка, т.е. на 99%. При обработке амилоидом или внеклеточной ДНК активность бактериофагов снижалась примерно в 10 раз (на 90%). Хотя и амилоид, и внеклеточная ДНК были взяты в более высоких концентрациях, чем их содержание в матриксе, последний продемонстрировал большую эффективность ингибирующего действия, что можно связать как с особенностью взаимодействия, так и с синергическим результатом действия р-амилоида и внеклеточной ДНК.

Механизмы, лежащие в основе взаимодействия бактериофагов с амилоидом и внеклеточной ДНК, требуют дополнительного изучения. Можно предположить, что подобное снижение активности фагов происходит за счет полимерной структуры амилоида и ДНК, ограничивающей попадание фагов к бактериальным клеткам. Это предположение обусловлено тем, что именно полимерные компоненты матрикса биопленок ограничивают взаимодействие антибиотиков с бактериями, приводя к сниженной чувствительности бактерий микробных сообществ к противо-микробным агентам.

Кроме того, можно предположить, что снижение активности фагов связано со свойствами прионоподобных белков, недавно обнаруженных в составе практически всех бактериофагов [19]. Важно отметить, что прионоподобные белки характеризуются самоорганизующейся структурой и способствуют образованию комплексов с измененными функциями, в том числе формированию неактивных форм.

Известно, что свойства прионоподобных белков бактерий имеет р-амилоид, а внеклеточная ДНК взаимодействует с прионоподобными белками в матриксе бактериальных биопленок [20,

56

Практическая пульмонология | 2017 | № 3

http://atm-press.ru

Микробиология

21]. В этой связи возможно, что в основе инакти-вирующего действия компонентов матрикса на бактериофаги лежат межбелковые взаимодействия прионоподобных белков с образованием их неактивных форм.

Ограничение продуктивной инфекции бактериофагов в биопленках, очевидно, имеет значение для защиты генетической информации от изменения и дополнительного перераспределения в биопленках, в зависимости от условий, в которых они находятся. Полученные результаты указывают на существование ранее неизвестных процессов регуляции эффективности взаимодействия бактерий биопленок и бактериофагов. Такие процессы в естественных условиях постоянно происходят в микробиоте за счет поступления различных бактериофагов из окружающей среды. В недавно проведенных исследованиях было установлено, что инфицирование микробиоты бактериофагами способно вызывать "болезни микробиоты", которые, в свою очередь, приводят к повышению проницаемости эпителия и развитию различных заболеваний, в том числе нейродегенеративных [22].

Выводы

Компоненты матрикса бактериальных биопленок участвуют в регуляции взаимодействия бактерий и бактериофагов.

Матрикс, амилоид и внеклеточная ДНК мат-рикса биопленок угнетают взаимодействие бактерий и бактериофагов.

^исок литературы

1. Dalmasso M, Hill C, Ross RP. Exploiting gut bacteriophages for human health. Trends in Microbiology 2014;22(7): 399-405.

2. Tetz GV, Ruggles KV, Zhou H, Heguy A, Tsirigos A, Tetz V. Bacteriophages as potential new mammalian pathogens. Scientific Reports 2017 Aug;7:7043.

3. Schwartz K, Syed AK, Stephenson RE, Rickard AH, Bole BR. Functional amyloids composed of phenol soluble modulins stabilize Staphylococcus aureus biofilms. PLoS Pathogenes 2012;8(6 P):e1002744.

4. Zeng G, Vad BS, Dueholm MS, Christiansen G, Nilsson M, Tolker-Nielsen T, Nielsen PH, Meyer RL, Otzen DE. Functional bacterial amyloid increases Pseudomonas biofilm hy-drophobicity and stiffness. Frontiers in Microbiology 2015 Oct;6:1099.

5. Zhou Y, Blanco LP, Smith DR, Chapman MR. Amyloid proteins. Methods in Molecular Biology 2012;849:302-20.

6. Villar-Piqué A, Ventura S. Modeling amyloids in bacteria. Microbial Cell Factories 2012 Dec;11:166.

7. Schwartz K, Boles BR. Microbial amyloids - functions and interactions within the host. Current Opinion in Microbiology 2013 Feb;16(1):93-9.

8. Romero D, Kolter R. Functional amyloids in bacteria. International Microbiology 2014 Jun;17(2):65-73.

9. Hill M, Lukiw WJ. Microbial-generated amyloids and Alzheimer's disease (AD). Frontiers in Aging Neuroscience 2015 Feb;7:9.

10. Balczon R, Morrow KA, Zhou C, Edmonds B, Alexeyev M, Pittet JF, Wagener BM, Moser SA, Leavesley S, Zha X, Frank DW, Stevens T. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. The FASEB Journal July 2017;31:2785-96.

11. Glabe CG, Kayed R. Common structure and toxic function of amyloid oligomers implies a common mechanism of pathogene-sis. Neurology 2006 Jan;66(2 Suppl 1):S74-8.

12. Shahnawaz M, Soto C. Microcin amyloid fibrils A are reservoir of toxic oligomeric species. The Journal of Biological Chemistry 2012 Apr;287(15):11665-76.

13. Lundmark K, Westermark GT, Olsén A, Westermark P. Protein fibrils in nature can enhance amyloid protein A amyloidosis in mice: cross-seeding as a disease mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2005 Apr;102(17):6098-102.

14. Mc Laughlin AM, Crotty TB, Egan JJ, Watson AJ, Gallagher CG. Amyloidosis in cystic fibrosis: a case series. Journal of Cystic Fibrosis 2006 Jan;5(1):59-61.

15. Reichhardt C, Jacobson AN, Maher MC, Uang J, McCrate OA, Eckart M, Cegelski L. Congo red interactions with curli-pro-ducing E. coli and native curli amyloid fibers. PLoS One 2015 0ct;10(10):e0140388.

16. Nilsson MR. Techniques to study amyloid fibril formation in vitro. Methods 2004 Sep;34(1):151-60.

17. Peterson BW, van der Mei HC, Sjollema J, Busscher HJ, Shar-ma PK. A distinguishable role of eDNA in the viscoelastic relaxation of biofilms. MBio 2013 0ct;4(5):e00497-13.

18. Chen SG, Stribinskis V, Rane MJ, Demuth DR, Gozal E, Roberts AM, Jagadapillai R, Liu R, Choe K, Shivakumar B, Son F, Jin S, Kerber R, Adame A, Masliah E, Friedland RP. Exposure to the functional bacterial amyloid protein curli enhances alpha-synuclein aggregation in aged Fischer 344 rats and Cae-norhabditis elegans. Scientific Reports 2016 Oct;6:34477.

19. Tetz G, Tetz V. Prion-like domains in phagobiota. Frontiers in microbiology 2017 Nov;8:2239.

20. Cherny I, Rockah L, Levy-Nissenbaum O, Gophna U, Ron EZ, Gazit E. The formation of Escherichia coli curli amyloid fibrils is mediated by prion-like peptide repeats. Journal of Molecular Biology 2005 Sep;352(2):245-52.

21. Braun S, Humphreys C, Fraser E, Brancale A, Bochtler M, Dale TC. Amyloid-associated nucleic acid hybridisation. PLoS One 2011;6(5):e19125.

22. Tetz G, Tetz V. Bacteriophage infections of microbiota can lead to leaky gut in an experimental rodent model. Gut Pathogenes 2016;8:33.

The Role of Matrix Components in the Interaction of Bacteriophages with Bacterial Biofilms

G.V. Tets, N.K. Artemenko, M.F. Vecherkovskaya, and V.V. Tets

The interaction of bacteria and bacteriophages plays an important role in maintaining the functions of microbiota, but it can also lead to its disorders and pathological conditions of macroorganism. Many components of biofilm matrix take part in protecting bacteria from external influences. The study was aimed to investigate the role of biofilm matrix and its components (amyloid and extracellular DNA) in regulating the interaction of bacteria with bacterio-phages. The study showed that biofilm matrix and its components were involved in regulation of the interaction of bacteria and bacteriophages.

Key words: bacteriophages, bacterial biofilms, biofilm matrix, bacterial amyloid.

http://atm-press.ru

Практическая пульмонология j 2017 j № 3

57