ТРАНСПОЗИЦИЯ С СОХРАНЕНИЕМ СЦЕПЛЕНИЯ ГЕНОВ

1. Композиция, содержащая
множество твердых носителей,
где каждый из твердых носителей содержит множество иммобилизованных олигонуклеотидов, и
где каждый из олигонуклеотидов на указанной твердом носителе содержит
(a) комплементарную последовательность для захвата, которая способна гибридизоваться с по меньшей мере частью последовательности адаптера на транспозоне;
(b) первую последовательность со штрих-кодом, где первая последовательность со штрих-кодом с каждого твердого носителя из множества твердых носителей отличается от первой последовательности со штрих-кодом с других твердых носителей из множества твердых носителей.
2. Композиция по п. 1, где иммобилизованные олигонуклеотиды дополнительно содержат (a) вторую последовательность со штрих-кодом или (b) вторую последовательность со штрих-кодом и третью последовательность со штрих-кодом.
3. Композиция по п. 1, где твердый носитель представляет собой микросферу, сферу или частицу.
4. Композиция по п. 1, где каждый из олигонуклеотидов на указанной твердом носителе содержит сайт связывания с праймером, где сайт связывания с праймером представляет собой сайт связывания с праймером P5 или P7 или его комплемент.
5. Композиция по любому из пп. 1-4, где иммобилизованный олигонуклеотид на указанном твердом носителе в пределе множества твердых носителей содержит частично двухцепочечную структуру и частично одноцепочечную структуру.
6. Композиция по п. 5, где одна цепь иммобилизованного олигонуклеотида иммобилизована на твердом носителе, и другая цепь частично комплементарна цепи, иммобилизованной на твердом носителе, и содержит комплементарную последовательность для захвата.
7. Композиция по п. 6, где комплементарная последовательность для захвата иммобилизованного олигонуклеотида на указанном твердом носителе в пределах множества твердых носителей гибридизована с последовательностью адаптера транспозона.
8. Композиция по п. 7, где комплементарная последовательность для захвата лигирована с последовательностью адаптера транспозона.
9. Композиция по п. 7 или 8, где транспозон содержит перенесенную цепь и неперенесенную цепь, и последовательность адаптера находится на перенесенной цепи транспозона.
10. Композиция по п. 9, дополнительно содержащая фрагмент нуклеиновой кислоты-мишени, лигированной к 3'-концу перенесенной цепи транспозона.
11. Композиция по п. 9, дополнительно содержащая транспозазу, связанную с транспозоном, который формирует транспозомный комплекс.
12. Композиция по п. 11, где транспозаза представляет собой транспозазу Tn5.
13. Композиция по п. 11, где транспозомный комплекс связан с нуклеиновой кислотой-мишенью.
14. Композиция по п. 13, где нуклеиновая кислота-мишень содержит множество фрагментов, и транспозомный комплекс связан с по меньшей мере одним фрагментом нуклеиновой кислоты-мишени.
15. Композиция по п. 13, где перенесенная цепь вставлена в нуклеиновую кислоту-мишень с получением фрагмента, в котором перенесенная цепь лигирована с 3'-концом перенесенной цепи транспозона.
16. Композиция по п. 15, где перенесенная цепь вставлена в 5'-конец по меньшей мере одной цепи из фрагментов с сохранением сцепления нуклеиновой кислоты-мишени.
17. Композиция по п. 5, где иммобилизованный олигонуклеотид на указанном твердом носителе в пределах множества твердых носителей содержит одноцепочечную структуру.
18. Композиция по п. 17, где иммобилизованный олигонуклеотид иммобилизован к твердому носителю через линкер на 5'-конце олигонуклеотида, и комплементарная последовательность для захвата расположена на 3'-конце иммобилизованного олигонуклеотида.
19. Композиция по п. 17, где комплементарная последовательность для захвата иммобилизованного олигонуклеотида на указанном твердом носителе в пределах множества твердых носителей гибридизована с последовательностью адаптера транспозона.
20. Композиция по п. 19, где комплементарная последовательность для захвата лигирована с последовательностью адаптера транспозона.
21. Композиция по п. 19 или 20, где транспозон содержит перенесенную цепь и неперенесенную цепь, и последовательность адаптера находится на неперенесенной цепи транспозона.
22. Композиция по п. 21, где комплементарная последовательность для захвата гибридизована с последовательностью адаптера на неперенесенной цепи.
23. Композиция по п. 22, где комплементарная последовательность для захвата лигирована с перенесенной цепью транспозона.
24. Композиция по п. 19 или 20, где транспозон содержит перенесенную цепь и неперенесенную цепь, и последовательность адаптера находится на перенесенной цепи транспозона.
25. Композиция по п. 24, где комплементарная последовательность для захвата гибридизована с последовательностью адаптера на перенесенной цепи.
26. Композиция по п. 25, где комплементарная последовательность для захвата лигирована с 5'-концом неперенесенной цепи.
27. Композиция по любому из пп. 17-26, дополнительно содержащая фрагмент нуклеиновой кислоты-мишени, лигированной к 3'-концу перенесенной цепи транспозона.
28. Композиция по п. 19, дополнительно содержащая транспозазу, связанную с транспозоном, который формирует транспозомный комплекс.
29. Композиция по п. 28, где транспозаза представляет собой транспозазу Tn5.
30. Композиция по п. 28, где транспозомный комплекс связан с нуклеиновой кислотой-мишенью.
31. Композиция по п. 30, где нуклеиновая кислота-мишень содержит множество фрагментов, и транспозомный комплекс связан с по меньшей мере одним фрагментом нуклеиновой кислоты-мишени.
32. Композиция по п. 31, где перенесенная цепь вставлена в нуклеиновую кислоту-мишень с получением фрагмента, в котором перенесенная цепь лигирована с 3'-концом перенесенной цепи транспозона.
33. Композиция по п. 32, где перенесенная цепь вставлена в 5'-конец по меньшей мере одной цепи из фрагментов с сохранением сцепления нуклеиновой кислоты-мишени.
34. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где последовательность адаптера транспозона содержит последовательность со штрих-кодом.
35. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где последовательность адаптера транспозона содержит сайт связывания с праймером.
36. Композиция по п. 35, где сайт связывания с праймером транспозона представляет собой сайт связывания с праймером P5 или P7 или его комплемент.
37. Композиция, содержащая
множество транспозомных комплексов, где каждый транспозомный комплекс содержит транспозон и транспозазу, где каждый транспозон имеет перенесенную цепь и неперенесенную цепь; и
множество композиций по любому из пп. 1-36.
38. Композиция по п. 3, где каждый их твердых носителей во множестве твердых носителей представляет собой сферу, которая имеет диаметр примерно 0,5-5 мкм.
39. Способ получения библиотеки фрагментов ДНК нуклеиновой кислоты-мишени со штрих-кодами, где указанный способ включает:
(a) контактирование нуклеиновой кислоты-мишени с множеством транспозомных комплексов, каждый из которых включает:
транспозоны и транспозазы, где транспозоны содержат перенесенные цепи и неперенесенные цепи, где по меньшей мере один из транспозонов транспозомного комплекса включает последовательность адаптера, способную гибридизоваться с комплементарной последовательностью для захвата;
(b) фрагментирование нуклеиновой кислоты-мишени с образованием множества фрагментов, и встраивание перенесенных цепей из траспозона в 5'-конец по меньшей мере одной цепи каждого из фрагментов с сохранением сцепления фрагментированной нуклеиновой кислоты-мишени;
(c) контактирование нуклеиновой кислоты-мишени со множеством твердых носителей, где каждый из твердых носителей во множестве содержит множество иммобилизованных олигонуклеотидов, где каждый из олигонуклеотидов содержит комплементарную последовательность для захвата и первую последовательность со штрих-кодом, и где первая последовательность со штрих-кодом, происходящая от каждого твердого носителя из множества твердых носителей, отличается от первой последовательности со штрих-кодом, происходящей от других твердых носителей из множества твердых носителе; и
(d) перенос информации о последовательности со штрих-кодом во фрагменты нуклеиновой кислоты-мишени с получением библиотеки двухцепочечных фрагментов, где по меньшей мере одна цепь помечена у 5'-конца первым штрих-кодом, и где по меньшей мере два фрагмента одной и той же нуклеиновой кислоты-мишени получают идентичную информацию по штрих-коду.
40. Способ по п. 39, где сцепление нуклеиновой кислоты-мишени сохраняется с помощью транспозаз транспозомного комплекса.
41. Способ по п. 39 или 40, где одна последовательность со штрих-кодом присутствует во множестве иммобилизованных олигонуклеотидов на каждом отдельном твердом носителе.
42. Способ по любому из пп. 39-40, где различные последовательности со штрих-кодом присутствуют во множестве иммобилизованных олигонуклеотидов на каждом отдельном твердом носителе.
43. Способ по любому из пп. 39-42, где перенос информации о последовательности со штрих-кодом во фрагменты нуклеиновой кислоты-мишени осуществляют путем лигирования.
44. Способ по любому из пп. 39-42, где перенос информации о последовательности со штрих-кодом во фрагменты нуклеиновой кислоты-мишени осуществляют путем удлинения под действием полимеразы.
45. Способ по любому из пп. 39-42, где перенос информации о последовательности со штрих-кодом во фрагменты нуклеиновой кислоты-мишени осуществляют путем лигирования и удлинения под действием полимеразы.
46. Способ по п. 44 или 45, где удлинение под действием полимеразы осуществляют путем удлинения 3'-конца нелигированной транспозонной цепи под действием ДНК-полимеразы с использованием лигированного иммобилизованного олигонуклеотида в качестве матрицы.
47. Способ по любому из пп. 39-46, где по меньшей мере часть последовательностей адаптера дополнительно включает вторую последовательность со штрих-кодом.
48. Способ по любому из пп. 39-47, где транспозомные комплексы являются мультимерными, и где последовательности адаптера транспозонов каждой мономерной единицы отличаются от другой мономерной единицы в одном и том же транспозомном комплексе.
49. Способ по любому из пп. 39-48, где последовательность адаптера дополнительно включает первую последовательность, связывающуюся с праймером.
50. Способ по п. 49, где первый сайт связывания с праймером не имеет последовательности, гомологичной последовательности для захвата или комплементу последовательности для захвата.
51. Способ по любому из пп. 39-50, где олигонуклеотиды, иммобилизованные на твердом носителе, дополнительно содержат вторые последовательности, связывающиеся с праймером.
52. Способ по п. 39-51, где транспозомные комплексы являются мультимерными, и где транспозомные мономерные единицы связаны друг с другом в одном и том же транспозомном комплексе.
53. Способ по п. 52, где транспозаза транспозомной мономерной единицы связана с другой транспозазой другой транспозомной мономерной единицы одного и того же транспозомного комплекса.
54. Способ по п. 52, где транспозоны транспозомной мономерной единицы связаны с транспозонами другой транспозомной мономерной единицы одного и того же транспозомного комплекса.
55. Способ по любому из пп. 39-54, где информация о сцеплении последовательности нуклеиновой кислоты-мишени представляет собой информацию о гаплотипе.
56. Способ по любому из пп. 39-54, где информация о сцеплении последовательности нуклеиновой кислоты-мишени представляет собой информацию о геномных вариантах.
57. Способ по п. 56, где геномные варианты выбраны из группы, состоящей из делеций, транслокаций, межхромосомных сцеплений генов, дупликаций и паралогов.
58. Способ по любому из пп. 39-57, где олигонуклеотиды, иммобилизованные на твердом носителе, содержат частично двухцепочечную область и частично одноцепочечную область.
59. Способ по п. 58, где частично одноцепочечная область олигонуклеотида содержит вторую последовательность со штрих-кодом и вторую последовательность, связывающуюся с праймером.
60. Способ по любому из пп. 39-59, где фрагменты нуклеиновой кислоты-мишени, имеющие штрих-коды, амплифицируют до определения последовательности фрагментов нуклеиновой кислоты-мишени.
61. Способ по п. 60, где стадии (a)-(d) и последующую амплификацию проводят в одном реакционном сосуде до определения последовательности фрагментов нуклеиновой кислоты-мишени.
62. Способ по п. 60, где третью последовательность со штрих-кодом вводят во фрагменты нуклеиновой кислоты-мишени во время амплификации.
63. Способ по любому из пп. 39-61, который также включает:
объединение фрагментов нуклеиновой кислоты-мишени, содержащих штрих-коды стадии (d) из множества первой серии реакционных сосудов в пул фрагментов нуклеиновой кислоты-мишени, содержащих штрих-коды;
перераспределение пула фрагментов нуклеиновой кислоты-мишени, содержащих штрих-коды, с получением множества второй серии реакционных сосудов; и
введение третьего штрих-кода во фрагменты нуклеиновой кислоты-мишени путем амплификации фрагментов нуклеиновой кислоты-мишени во вторую серию реакционных сосудов до секвенирования.
64. Способ по любому из пп. 38-63, который дополнительно включает предварительное фрагментирование нуклеиновой кислоты-мишени до контактирования нуклеиновой кислоты-мишени с транспозомными комплексами.
65. Способ по п. 64, где предварительное фрагментирование нуклеиновой кислоты-мишени осуществляют способом, выбранным из группы, состоящей из обработки ультразвуком и расщеплением рестриктирующими ферментами.
66. Способ получения иммобилизованной библиотеки меченных фрагментов ДНК, включающий:
(а) получение множества твердых носителей, имеющих транспозомные комплексы, иммобилизованные на этих носителях, где указанные транспозомные комплексы являются мультимерными, а транспозомные мономерные единицы одного и того же транспозомного комплекса являются сцепленными друг с другом, и где указанные транспозомные мономерные единицы содержат транспозазу, связанную с первым полинуклеотидом, где указанный первый полинуклеотид включает:
(i) 3' часть, содержащую концевую последовательность транспозона, и
(ii) первый адаптер, содержащий первый штрих-код; и,
(b) нанесение ДНК-мишени на множество твердых носителей в условиях, при которых ДНК-мишень фрагементируется транспозомными комплексами, и перенос 3'-концевой последовательности транспозона первого полинуклеотида в 5'-конец по меньшей мере одной цепи фрагментов с получением иммобилизованной библиотеки двухцепочечных фрагментов, в которых по меньшей мере одна цепь помечена у 5'-конца первым штрих-кодом.
67. Способ по п. 66, где транспозаза транспозомной мономерной единицы связана с другой транспозазой другой транспозомной мономерной единицы одного и того же транспозомного комплекса.
68. Способ по п. 66, где транспозоны транспозомной мономерной единицы связаны с транспозонами другой транспозомной мономерной единицы одного и того же транспозомного комплекса.