T
T
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pEstPc, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ЭСТЕРАЗЫ Psychrobacter cryohalolentis K5, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ЭСТЕРАЗЫ Psychrobacter cryohalolentis K5
T
T
RECOMBINANT PLASMID DNA pEstPc, ENCODING POLYPEPTIDE WITH PROPERTIES OF ESTERASE Psychrobacter cryohalolentis K5, Escherichia coli BACTERIA STRAIN - PRODUCER OF POLYPEPTIDE WITH PROPERTIES OF ESTERASE Psychrobacter cryohalolentis K5

Область изобретения
Psychrobacter cryohalolentis
Psychrobacter cryohalolentis
T
T
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Может быть использовано для получения фермента эстеразы K5, обладающей высокой каталитической активностью при пониженных температурах в реакциях гидролиза сложноэфирных соединений. Эстераза K5может быть использована в пищевой промышленности при хлебопекарном производстве в качестве добавок к тесту и в производстве молочных продуктов для ускорения созревания сыров; в легкой промышленности при производстве бытовой химии  в качестве компонентов стиральных порошков и пятновыводителей [Hasan, F., A. Shah, et al.  Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology. 2006. V. 39(2). P. 235-251].
Уровень техники
Aspergillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus
Candida
Fusarium oxysporum
Fusarium oxysporum
vasinfectum
Основными продуцентами холодоактивных эстераз являются штаммы грибов , некоторые дрожжи () [Coenen, T., P. Aughton, et al.  Safety evaluation of lipase derived from Rhizopus oryzae: Summary of toxicological data. Food and chemical toxicology. 1997.  V. 35(3-4). P. 315-322; Zhang, N., W. C. Suen, et al. Improving tolerance of Candida antarctica lipase B towards irreversible thermal inactivation through directed evolution. Protein engineering. 2003. V. 16(8). P. 599]. Известен способ получения эстеразы, основанный на культивировании штамма грибов  [P.Rapp. Production, regulation and some properties of lipase activity from   f. sp. . Enzyme and Microbial Technology. 1995. V.17. P. 832-838]. При культивировании при 30ºС в течение 150 часов достигается максимальное накопление в культуральной жидкости специфической эстеразной активности - 150 ед. акт./мг сухой биомассы. Недостатком этого способа является длительность культивирования (6 - 7 суток) и трудоемкость процедуры получения культуральной жидкости (освобождение от грибного мицелия).
Serratia marcescens
Serratia marcescens
Pseudomonas fluorescens
Achromobacter lipolyticum
Achromobacter lipolyticum.
Известен способ получения холодоактивных эстераз и липаз при помощи культивирования бактерий, например   [Н. А. Башкатова, Л.О. Северина. Влияние условий культивирования на биосинтез липазы у . Микробиология.  1979. Т. 68, Вып. 5.  С. 826],  [Dieckelmann, M., L. Johnson, et al. The diversity of lipases from psychrotrophic strains of Pseudomonas: a novel lipase from a highly lipolytic strain of Pseudomonas fluorescens.  Journal of applied microbiology. 1998. V. 85(3). P. 527-536],  [Khan, I. M., C. Dill, et al. Production and properties of the extracellular lipase of Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Enzymology. 1967. V. 132(1) P. 68-77]. Использование бактерий обладает по сравнению с грибами преимуществом, заключающимся в ускорении процесса культивирования. Недостатком получения эстераз путем культивирования бактерий-продуцентов  является сложная процедура их очистки и низкая специфическая активность полученных ферментов.
E. coli
Psychrobacter sp.
Psychrobacter sp.
E. coli
Другим известным способом получения холодоактивных липаз и эстераз является конструирование систем экспрессий генов этих ферментов в с использованием методов генетической инженерии. Примером может служить система экспрессии гена липазы Lip1A психротрофного микроорганизма  [Zhang, J., S. Lin, et al. Cloning, expression, and characterization of a cold-adapted lipase gene from an antarctic deep-sea psychrotrophic bacterium,  7195. J Microbiol Biotechnol. 2007. V. 17(4). P. 604-10] в клетках  BL21(DE3)/ pUC-lipA1, обеспечивающая выход  0,45 мг белка с 1 л культуры. Недостатком этой системы является низкий выход целевого белка, а также сложная процедура его очистки.
His
His
His
Psychrobacter sp.
Psychrobacter sp
Psychrobacter sp.
E. coli
Psychrobacter sp.
Наиболее близким к заявленному способу получения белка с эстеразной активностью является способ получения белка LipX с активностью липазы психрофильной бактерии C18 [Chen, R., L. Guo, et al. Gene cloning, expression and characterization of a cold-adapted lipase from a psychrophilic deep-sea bacterium . C18. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2011. P. 1-11]. Рекомбинантная плазмида pET28a(+)/lipX содержит ген липазы C18 под контролем  промотора бактериофага T7. Рекомбинантный штамм  BL21(DE3)/ pET28a(+)/lipX обеспечивает синтез белка LipX  с 6 остатками гистидина на С-конце, что позволяет проводить его очистку с помощью Ni-аффинной хроматографии.  Синтез белка осуществляют при добавлении индуктора изопропил - β - D - тиогалактопиранозида (ИПТГ) до конечной концентрации 0,2 мМ. В результате получают белок с активностью липазы C18 с выходом 3,8 мг из 1 л культуры. К недостаткам способа получения белка LipX можно отнести его относительно невысокий уровень синтеза и недостаточно высокую специфическую активность.
Сущность изобретения
Psychrobacter cryohalolentis
T
Технической задачей изобретения является получение полипептида со свойствами эстеразы K5, а также увеличение уровня его биосинтеза.
Psychrobacter cryohalolentis
Escherichia coli
Psychrobacter cryohalolentis
T
T
Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pEstPc, кодирующей полипептид с эстеразной активностью c мол. массой 4,05 Md (6,235 т.п.о.), состоящей из NdeI/XhoI - фрагмента ДНК плазмиды pET32a(+) длиной 5,366 т.п.о., включающего промотор бактериофага T7, терминатор транскрипции бактериофага T7, ген bla β-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pEstPc клеток к ампициллину, участок ori инициации репликации; и NdeI/SalI - фрагмента ДНК размером 0,869 т.п.о., содержащего ген EstPc, кодирующий аминокислотную последовательность зрелой формы эстеразы K5;  содержащей уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: NdeI - 367,  XhoI - 840, а также  за счет штамма бактерий  BL21(DE3)/pEstPc- продуцента полипептида со свойствами эстеразы K5.
Psychrobacter cryohalolentis
Escherichia coli
Psychrobacter cryohalolentis
,
T
T
Рекомбинантная плазмидная ДНК pEstPc  кодирует индуцибельный синтез полипептида со свойствами эстеразы K5, а штамм   BL21(DE3)/pEstPc обеспечивает синтез этого полипептида с уровнем экспрессии не ниже 20% суммарного клеточного белка. Индуцибельный высокий уровень синтеза целевого полипептида обеспечивается тем, что плазмида pEstPc содержит промотор бактериофага T7 и усилитель трансляции гена 10 бактериофага T7, а также делецией  5'-концевой последовательности гена эстеразы K5 кодирующей сигнальный пептид.
Psychrobacter cryohalolentis
,
Psychrobacter cryohalolentis
Escherichia coli
.
T
T
Особенностью предложенной плазмидной конструкции является наличие в ее составе кодирующей последовательности зрелой формы эстеразы K5лишенной сигнального пептида (SEQ ID NO 1), под контролем сильного регулируемого промотора T7lac, что, в сочетании с наличием в плазмиде гена репрессора LacI и в хромосоме хозяйского штамма гена РНК-полимеразы бактериофага T7, обеспечивает индуцибельный синтез целевого белка (SEQ ID NO 2) с надежной регуляцией и высоким выходом, достигаемым при малых концентрациях индуктора.  Ранее при клонировании полноразмерного гена эстеразы  K5 нами было установлено, что уровень экспрессии этого гена в клетках крайне низок Делеция фрагмента гена, соответствующего сигнальному пептиду, приводит к повышению уровня синтеза рекомбинантного белка в цитоплазме клеток бактерий. На 3'-конце гена расположена последовательность, кодирующая шесть остатков гистидина, для облегчения очистки целевого белка при помощи металлоаффинной хроматографии.
Psychrobacter cryohalolentis
Escherichia coli
T
Для получения штамма-продуцента полипептида со свойствами эстеразы K5 компетентные клетки  штамма  BL21(DE3) трансформируют рекомбинантной плазмидой  pEstPc.
E. coli
Psychrobacter cryohalolentis
E. coli
T
Технический результат заявленного изобретения заключается в том, что полученный штамм   BL21(DE3)/pEstPc позволяет получать полипептид со свойствами эстеразы K5 в количестве не менее 20% от суммарного клеточного белка при концентрации индуктора 0,1 мМ. В отличие от прототипа в данном штамме достигается в 7,2 раза более высокий выход целевого белка при использовании в 2 раза меньшего количества индуктора (ИПТГ). Совокупность перечисленных свойств штамма  BL21(DE3)/pEstPc обусловливает большую технологичность процесса получения холодоактивной эстеразы.
Перечень фигур
Изобретение иллюстрируют графические материалы.
Psychrobacter cryohalolentis
T
Фиг. 1. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pEstPc. Указаны уникальные сайты эндонуклеаз рестрикции.  T7 promotor - промотор бактериофага T7, T7 terminator- терминатор транскрипции бактериофага T7, lacI - ген lac-репрессора, Ap - ген устойчивости к ампициллину, ori - участок инициации репликации плазмиды, EstPc - рекомбинантный ген EstPc, кодирующий аминокислотную последовательность зрелой формы эстеразы K5.
E. coli
Фиг. 2. Электрофореграмма лизатов клеток штамма-продуцента  BL21(DE3)/ pEstPc до (дорожка 1) и после индукции (дорожки 2) в 13%-ном полиакриламидном геле (М - белковые маркеры молекулярной массы); стрелкой указан полипептид с эстеразной активностью.
Escherichia coli
Описание. Полученный штамм  BL21(DE3)/ pEstPc характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки
:  клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, подвижные,  размером 1 × 3-5 мкм,  неспороносные.
Культуральные признаки
: при росте на агаризованной LB-среде  преобладают  мелкие колонии  диаметром  1-3 мм;  круглые, гладкие,   полупрозрачные, блестящие, серые,  край ровный;     консистенция пастообразная.  Могут встречаться  крупные колонии  диаметром  4-5 мм;  круглые, гладкие,   матовые,  край волнистый.   Рост  в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется равномерным помутнением   среды.
Физиолого-биохимические признаки.
Клетки штамма продуцента могут расти в диапазоне  температур 20-42°С,  оптимальная температура роста  составляет 37ºС.   Наиболее  благоприятные для роста  значения рН находятся в интервале  6,8 - 7,2.  При росте в аэробных условиях культура может усваивать азот как органических соединений (пептон, триптон, аминокислоты, дрожжевой экстракт), так и аммонийных солей. Углерод усваивается в форме углеводов, многоатомных спиртов (глицерин), аминокислот.
Устойчивость к антибиотикам.
Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена бета-лактамазы.
Способ, условия и состав среды для хранения штамма.
о
LB-бульон с 15% глицерином,  при температуре  - 70С,  в криовиалах.
Примеры
Изобретение иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.  Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pEstPc.
Psychrobacter cryohalolentis
E. coli
Т
4
2
4
2
Культуру К5 выращивают в течение ночи на чашке с агаризованной средой TSB (Difco, USA)+2% NaCl. 20 мкл полученной биомассы суспендируют в 50 мкл буфера для Taq-полимеразы (75 мМ трис-HCl, pH 8,8, 20 мМ (NH)SO, 0,1% Tween 20) и разрушают в течение 15 мин прогреванием на кипящей водяной бане. После центрифугирования 5 мин при скорости 13000 об/мин 5 мкл полученного супернатанта добавляют в реакционную смесь для ПЦР объемом 50 мкл, содержащую (50 pmol праймера PC231F (SEQ ID NO 3), 50 pmol праймера PC231R (SEQ ID NO 4), 2 мМ каждого из четырех dNTP, 5 мкл 10х буфера для Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas), 2.5 е.а. Pfu ДНК-полимеразы и 0.5 е.а. Taq ДНК-полимеразы (Fermentas). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят в следующем режиме: денатурация - 1 мин, 94°С; отжиг - 45 с, 52°С; достройка - 45 с, 72°С; количество циклов - 35. 10 мкг ПЦР-продукта обрабатывают рестриктазами NdeI и SalI (Fermentas) в условиях, рекомендованных производителем ферментов, фрагмент длиной  0,869 т.п.о. выделяют из 1% агарозного геля. 1 мкг полученного фрагмента и 0.2 мкг плазмидного вектора pET32a(+), линеаризированного обработкой рестриктазами NdeI и XhoI, длиной 5366 п.о. лигируют в течение 4 ч при 12°С в 10 мкл раствора, содержащего 40 мМ трис-HCl (pH 7,8), 10 мМ MgCl,10 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ аденозинтрифосфата и 3 е.а. Т4 ДНК-лигазы (Fermentas, Литва). 5 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток  XL-1 Blue (Stratagene, США). Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина.
Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК и обрабатывают рестриктазами NdeI и XhoI с последующим электрофоретическим анализом длин рестрикционных фрагментов в 1% агарозном геле. Структуру клонированного гена в отобранных клонах подтверждают определением нуклеотидной последовательности. В результате получают целевую плазмидную ДНК pEstPc (фиг. 1).
Пример 2. Получение штамма-продуцента полипептида с эстеразной активностью.
E. coli
о
Рекомбинантной плазмидной ДНК pEstPc трансформируют компетентные клетки  BL21(DE3) (Novagen) и после  выращивания рекомбинантных клонов на LB-агаре с ампициллином (100 мкг/мл) при 37С получают штамм-продуцент полипептида с эстеразной активностью.
Пример 3. Определение продуктивности штамма-продуцента полипептида с эстеразной активностью.
E.coli
Psychrobacter cryohalolentis
E. coli
Для определения  продуктивности клетки  BL21(DE3)/pEstPc выращивают при  37ºС  в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, в течение 16 ч на качалке при 250 об/мин. Полученную ночную культуру в объеме 100 мкл переносят в 5 мл жидкой среды LB (разбавление до оптической плотности 0.15-0.20 при длине волны 560 нм), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и выращивают до оптической плотности 0,8 (длина волны 560 нм) при 37ºС и перемешивании 250 об/мин. Добавляют ИПТГ до конечной концентрации 0,1 мМ, после чего клетки выращивают в течение 4 ч при 27ºС и перемешивании 200 об/мин. Отбирают пробу культуры в количестве 1 оптическая единица (длина волны 560 нм) и центрифугируют 5 мин при скорости 7000 об/мин. Осажденные клетки суспендируют в 100 мкл буфера, содержащего 125 мМ трис-HCl, pH 6,8, 20% глицерин, 3% додецилсульфат натрия, 3% меркаптоэтанол, 0,005% бромфеноловый синий, инкубируют 10 мин в кипящей водяной бане, образцы объемом 10 мкл анализируют электрофорезом в 13% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. По окончании электрофореза гель прокрашивают при помощи кумасси R-250. После отмывки красителя гель сканируют и проводят математическую обработку результатов с помощью программы Scion Image (Scion Corp., США). По данным сканирования содержание  эстеразы  составляет 20% от общего клеточного белка. На фиг.2 представлена электрофореграмма лизатов клеток штамма-продуцента  BL21(DE3)/pEsyPc (дорожки 1 и 3) в 13%-ном полиакриламидном геле до (дорожка 1) и после индукции ИПТГ (дорожки 2) (М - белковые маркеры молекулярной массы; стрелкой указан полипептид с эстеразной активностью).
Psychrobacter cryohalolentis
Пример 4. Выделение и очистка  рекомбинантной эстеразы .
Psychrobacter cryohalolentis
E. coli
Проводят индукцию биосинтеза эстеразы  в клетках штамма-продуцента  BL21(DE3)/pEstPc ИПТГ (конечная концентрация 0,1 мМ) в течение 4 ч. Клетки центрифугируют 15 мин при 7000 об/мин.
1 г влажной биомассы индуцированных клеток ресуспендируют в 10 мл буфера (50 мМ Трис-HCl pH 8,0; 200 мМ NaCl), после чего разрушают клетки обработкой в ультразвуковом дезинтеграторе Branson Sonifier 450, не допуская нагрева выше 10°С. Полученную суспензию центрифугируют 15 мин при 17000 об/мин. Выделение и очистку искомого полипепептида из супернатанта проводят с помощью Ni-аффинной хроматографии на колонке Ni-Sepharose FastFlow (GE Healthcare)  объемом 2 мл в градиенте концентрации имидазола (0,1 - 0,5 М) в буфере (20 мМ Трис-HCl pH 8,0; 200 мМ NaCl). Объединенные фракции, содержащие очищенный белок и имеющие по данным белкового электрофореза чистоту более 90%, диализуют против буфера (20 мМ Трис-HCl pH 8,0; 50 мМ NaCl) и стерилизуют. Средний выход очищенной таким образом эстеразы составляет 28 мг из 1 л культуры, что в 7 раз больше, чем у прототипа.
Psychrobacter cryohalolentis
T
Пример 5. Определение активности  рекомбинантной эстеразы K5
Активность эстеразы определяют, используя паранитрофенил бутират (Sigma) в качестве субстрата [Kulakova, L., A. Galkin, et al. Cold-active esterase from Psychrobacter sp. Ant300: gene cloning, characterization, and the effects of Gly-->Pro substitution near the active site on its catalytic activity and stability. Biochim Biophys Acta. 2004. V.1696(1). P. 59-65]. К реакционной смеси объемом 1 мл, содержащей 50 мМ Трис-HCl  (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 0,5% Тритон Х100, 0,25 мМ паранитрофенил бутирата (Sigma), добавляют 1,5 мкг очищенного белка, смесь инкубируют 15 мин при 30ºС. По 200 мкл реакционной смеси после центрифугирования при 13000 об/мин в течение 5 мин раскапывают в лунки 96-луночного планшета (Costar). Измеряют величину абсорбции при 415 нм на ридере Model680 (BioRad). За единицу эстеразной активности принимают количество фермента, необходимое для высвобождения 1 мкмоль паранитрофенола за 1 мин. Специфическую активность определяют как количество единиц эстеразной активности на 1 мг белка. Общая эстеразная активность очищенного целевого полипептида по сравнению с прототипом в 15 раз больше, а специфическая активность составляет 1300 ед.акт./мг белка, что в 2 раза больше, чем специфическая активность прототипа.