СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРОЛИТИНА D, ОБЛАДАЮЩЕГО ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ
METHOD OF PRODUCING UROLITHIN D, HAVING HYPOGLYCEMIC ACTION

Изобретение относится к области биоорганической химии и касается способа получения уролитина D, обладающего гипогликемическим действием.
Ингибиторы ферментов амилазы и альфа-глюкозидазы способствуют снижению процесса расщепления и абсорбции углеводов в кишечнике, в связи с чем рассматриваются в качестве антидиабетических лекарственных средств [1]. Наиболее выраженными ингибиторами данных ферментов являются полифенольные соединения эллаготаннины [2]. Установлено, что эллаготаннины метаболизируются in vivo до активных метаболитов уролитинов при участии кишечной микробиоты человека [3]. При изучении антиглюкозидазной активности уролитинов была выявлена значительная фармакологическая активность уролитина D, превышающая активность соединений-предшественников [4], что позволяет говорить о высоком потенциале уролитина D как матрицы для создания новых антидиабетических средств. Следует отметить, что выделение уролитина D из биологических жидкостей человека - многоэтапный и затратный процесс. В свою очередь, целенаправленный химический синтез уролитина D в условиях in vitro достаточно легко реализуем.
Известен способ получения уролитина D [5]. Согласно этому способу уролитин D получают из 8,9-диметилуролитина D, который нагревают в смеси с ледяной уксусной и бромоводородной кислотами в течение 11 часов. После охлаждения продукт выпадает в осадок, который подвергают очистке методом препаративной ВЭЖХ на обращено-фазовом силикагеле. Недостатками известного способа получения уролитина D являются низкий выход целевого продукта и применение дорогостоящего этапа хроматографической очистки методом ВЭЖХ с использованием обращено-фазового силикагеля в качестве сорбента. В связи с этим задачей данного изобретения является усовершенствование способа получения уролитина D путем модификации условий синтеза и применения колоночной хроматографии на дешевом сорбенте силикагеле.
Техническим результатом изобретения является повышение выхода уролитина D. Для достижения технического результата 2-бром-4,5-диметоксибензойную кислоту (БДБК) смешивают с пирогаллолом в мольном соотношении 1:(3-4) и приливают раствор гидроксида калия в воде в мольном соотношении БДБК:гидроксид калия 1:2. Смесь нагревают на водяной бане 40 минут при 80°C, после чего приливают 7% раствор сульфата меди в массовом соотношении БДБК : сульфат меди 6.19:1 и нагревают 15 минут при 80°C. Выпавший осадок полупродукта I отфильтровывают, промывают водой очищенной и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Далее к полупродукту I добавляют 350 мл ледяной уксусной кислоты и 200 мл бромоводородной кислоты и нагревают на водяной бане 9 часов при 80°C. Выпавший осадок полупродукта II отфильтровывают, промывают водой очищенной и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Полупродукт II растворяют в этаноле при нагревании в соотношении 1:2, раствор отфильтровывают и после охлаждения смешивают с силикагелем с размером частиц 100-150 мкм в соотношении 1:2 и наносят на колонку, заполненную силикагелем в соотношении полупродукт : сорбент 1:40. Колонку элюируют смесью гексан:этилацетат 8:2 (об./об.) в объеме, равном 3 объемам сорбента. Далее колонку элюируют смесью гексан:этилацетат  2:8 (об./об.) в объеме, равном 3 объемам сорбента. Элюат, полученный в результате элюирования смесью гексан:этилацетат 2:8 (об./об.), концентрируют в вакууме до полного удаления органического растворителя. Сухой остаток растворяют в этилацетате при нагревании в соотношении 1:2 (об./об.), отфильтровывают и оставляют при комнатной температуре в течение 48 часов. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают на фильтре ледяным 95% этанолом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Выход готового продукта 7.17-7.96 г, что составляет 78-82% от теоретического выхода.
Выявленные отличительные признаки помогают сделать вывод о соответствии предлагаемого технологического решения критерию «новизна». Предложенный способ позволяет получить уролитин D в виде рассыпчатого гигроскопичного порошка белого цвета без запаха. Потеря в массе при высушивании - 5-6%. Способ иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1. В грушевидную колбу вместимостью 250 мл, снабженную обратным холодильником, помещают 13 г 2-бром-4,5-диметоксибензойной кислоты, добавляют 18.8 г пирогаллола и 5.6 г гидроксида калия, растворенного в 50 мл воды очищенной. Смесь нагревают на водяной бане в течение 40 минут при 80°C, после чего приливают 30 мл 7% раствора сульфата меди и нагревают 15 минут при 80°C. Выпавший осадок полупродукта I отфильтровывают, промывают 150 мл воды очищенной и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Далее к полупродукту I добавляют 350 мл ледяной уксусной кислоты и 200 мл бромоводородной кислоты и нагревают на водяной бане 9 часов при 80 ℃. Выпавший осадок полупродукта II отфильтровывают, промывают 150 мл воды очищенной и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Полупродукт II растворяют в 20 мл этанола при нагревании, раствор отфильтровывают и после охлаждения смешивают с 20 г силикагеля с размером частиц 100-150 мкм и наносят на колонку, заполненную 400 г силикагеля. Колонку элюируют 2.7 л смеси гексан:этилацетат  8:2 (об./об.). Далее колонку элюируют 2.7 л смеси гексан:этилацетат 2:8 (об./об.). Элюат, полученный в результате элюирования смесью гексан:этилацетат 2:8 (об./об.), концентрируют в вакууме до полного удаления органического растворителя. Сухой остаток растворяют в 15 мл этилацетата при нагревании, отфильтровывают и оставляют при комнатной температуре в течение 48 часов. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл ледяного этанола и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Выход готового продукта 7.17 г, что составляет 78% от теоретического выхода.
Пример 2. В грушевидную колбу вместимостью 250 мл, снабженную обратным холодильником, помещают 13 г БДБК, добавляют 22 г пирогаллола и 5.6 г гидроксида калия, растворенного в 50 мл воды очищенной. Смесь нагревают на водяной бане в течение 40 минут при 80°C, после чего приливают 30 мл 7% раствора сульфата меди и нагревают 15 минут при 80°C. Выпавший осадок полупродукта I отфильтровывают, промывают 150 мл воды очищенной и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Далее к полупродукту I добавляют 350 мл ледяной уксусной кислоты и 200 мл бромоводородной кислоты и нагревают на водяной бане 9 часов при 80°C. Выпавший осадок полупродукта II отфильтровывают, промывают 150 мл воды очищенной и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Полупродукт II растворяют в 20 мл этанола при нагревании, раствор отфильтровывают и после охлаждения смешивают с 20 г силикагеля с размером частиц 100-150 мкм и наносят на колонку, заполненную 400 г силикагеля. Колонку элюируют 2.7 л смеси гексан:этилацетат  8:2 (об./об.). Далее колонку элюируют 2.7 л смеси гексан : этилацетат 2:8 (об./об.). Элюат, полученный в результате элюирования смесью гексан:этилацетат 2:8 (об./об.), концентрируют в вакууме до полного удаления органического растворителя. Сухой остаток растворяют в 15 мл этилацетата при нагревании, отфильтровывают и оставляют при комнатной температуре в течение 48 часов. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл ледяного этанола и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Выход готового продукта 7.96 г, что составляет 82% от теоретического выхода.
Пример 3. В грушевидную колбу вместимостью 250 мл, снабженную обратным холодильником, помещают 13 г БДБК, добавляют 25.1 г пирогаллола и 5.6 г гидроксида калия, растворенного в 50 мл воды очищенной. Смесь нагревают на водяной бане в течение 40 минут при 80°C, после чего приливают 30 мл 7% раствора сульфата меди и нагревают 15 минут при 80°C. Выпавший осадок полупродукта I отфильтровывают, промывают 150 мл воды очищенной и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Далее к полупродукту I добавляют 350 мл ледяной уксусной кислоты и 200 мл бромоводородной кислоты и нагревают на водяной бане 9 часов при 80°C. Выпавший осадок полупродукта II отфильтровывают, промывают 150 мл воды очищенной и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Полупродукт II растворяют в 20 мл этанола при нагревании, раствор отфильтровывают и после охлаждения смешивают с 20 г силикагеля с размером частиц 100-150 мкм и наносят на колонку, заполненную 400 г силикагеля. Колонку элюируют 2.7 л смеси гексан : этилацетат  8:2 (об./об.). Далее колонку элюируют 2.7 л смеси гексан : этилацетат 2:8 (об./об.). Элюат, полученный в результате элюирования смесью гексан:этилацетат 2:8 (об./об.), концентрируют в вакууме до полного удаления органического растворителя. Сухой остаток растворяют в 15 мл этилацетата при нагревании, отфильтровывают и оставляют при комнатной температуре в течение 48 часов. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл ледяного этанола и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Выход готового продукта 7.56 г, что составляет 80% от теоретического выхода.
Количественный анализ и показатели качества субстанции уролитина D.
Для осуществления химической стандартизации субстанции уролитина D разработана методика количественного анализа уролитина D методом ВЭЖХ-УФ.
Методика количественного анализа уролитина D методом ВЭЖХ-УФ. Испытуемый раствор. 1 мг уролитина D помещают в пластиковую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1 мл, прибавляют 1 мл смеси этанол : диметилсульфоксид 9:1 (об./об.) и растворяют в ультразвуковой ванне при 30°C в течение 15 минут.  Охлаждают и центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. Надосадочную жидкость фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.
Раствор сравнения. 1 мг уролитина D растворяют в метаноле и доводят до объема 1 мл этим же растворителем.
Условия хроматографирования:
- колонка длиной 75 мм и внутренним диаметром 2 мм, заполненная силикагелем октадецилсилильным для хроматографии с размером частиц 5 мкм;
- температура: 35°C;
- подвижная фаза:
- подвижная фаза А: 21 г/л лития перхлората раствор в 1 г/л кислоте перхлорной;
- подвижная фаза B: ацетонитрил;
- спектрофотометрический детектор, длина волны 280 нм;
- время уравновешивания системы: 3 мин перед каждым вводом (5% B);
- объем вводимой пробы: 1 мкл;
- программа градиентного режима элюирования представлена в таблице 1
Таблица 1
Программа градиентного режима элюирования
Время (мин)
Подвижная фаза А (%, об/об)
Подвижная фаза B (%, об/об)
Скорость подвижной фазы (мкл/мин)
0-15
85→60
15→40
150
Результаты: на хроматограмме должен быть доминирующий пик, совпадающий по подвижности с РСО уролитина D.
Расчет: содержание уролитина D в субстанции в процентах (X) вычисляют по формуле:
Где S - площадь пика уролитина D в исследуемом растворе; m - масса навески субстанции, г;  - площадь пика уролитина D в растворе сравнения;  - масса навески уролитина D, г.
Метрологический анализ разработанной методики показал, что относительная ошибка определения уролитина D методом ВЭЖХ не превышает 3% (таблица 2). Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительных валидационных параметрах методик, что указывает на возможность их использования в практике фармакопейного анализа для определения показателей качества разработанной субстанции.
Таблица 2
Метрологические характеристики методики количественного анализа
<maths num="1"><img file="00000004.jpg" he="6" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" /></maths>, %
S<sup>2</sup>
S<sub>x</sub>
±Δ<maths num="2"><img file="00000005.jpg" he="6" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" /></maths>, %
E, %
Уролитин D (n = 5, P = 0.95, t<sub>Pf </sub> = 2.78)
99.18
2.11
0.65
1.82
1.84
По данным проведенных исследований определены общие показатели качества субстанции, обобщенные в таблице 3. Для стандартизации субстанции было предложено определение внешнего вида, подлинности (присутствие уролитина D методом ВЭЖХ), потери в массе при высушивании, количественное определение содержания уролитина D в субстанции и содержание посторонних примесей.
Таблица 3
Показатели качества субстанции уролитина D
Показатель
Метод
Норма
Описание, внешние признаки
Визуальный, органолептический
Рассыпчатый гигроскопичный порошок, белого цвета, запах отсутствует
Подлинность:- уролитин D
ВЭЖХ
На хроматограмме, полученной при качественном анализе субстанции, должен присутствовать пик, совпадающий по подвижности с таковым уролитина D.
Потеря в массе при высушивании
Гравиметрический
Не более 5%
Количественное определение:- уролитин D
ВЭЖХ
Не менее 98%
Посторонние примеси
ВЭЖХ
На хроматограмме, полученной при количественном анализе субстанции, должен присутствовать пик, совпадающий по подвижности с таковым уролитина D. Суммарная площадь других пиков не должна превышать 2%.
Хранение
В защищенном от света месте при температуре 12-15°C
Рассчитать экономическую целесообразность предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным, однако вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения определяют перспективность внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.
Источники информации
1. Li Y.P., Bai B., Ye J. Reviews on preparation and determination of α-glucosidase inhibitor // Food Science. 2008. Vol. 29. P. 617–619.
2. McDougall G.J., Shpiro F., Dobson P., Smith P., Blake A., Stewart D. Different polyphenolic components of soft fruits inhibit alpha-amylase and alpha-glucosidase // Journal Agricultural Food Chemistry. 2005. Vol. 53. No. 7. P. 2760–2766.
3. Tomás-Barberán F.A., González-Sarrías A., García-Villalba R., Núñez-Sánchez M.A., Selma M.V., García-Conesa M.T., Espín J.C. Urolithins, the rescue of "old" metabolites to understand a "new" concept: Metabotypes as a nexus among phenolic metabolism, microbiota dysbiosis, and host health status // Molecular Nutrition and Food Research. 2017. Vol. 61. No. 1. DOI: 10.1002/mnfr.201500901.
4. Круглова М.Ю., Кащенко Н.И., Горностай Т.Г., Свиридов И.В. Эллаготаннины Rubus matsumuranus, как источники уролитинов, обладающих антиамилазной активностью. Материалы Международной научной конференции «Перспективы лекарственного растениеведения». 1-2 ноября 2018 г. Москва: Издательство ВИЛАР, 2018. С.474-478.
5. Bialonska D., Kasimsetty S.G., Khan S.I., Ferreira D. Urolithins, intestinal microbial metabolites of Pomegranate ellagitannins, exhibit potent antioxidant activity in a cell-based assay // Journal Agricultural Food Chemistry. 2009. Vol. 57. P. 10181-10186.