Рекомбинантный белок GM, обладающий способностью связывать α2-макроглобулин и его применение в качестве лиганда в аффинной хроматографии для выделения α2-макроглобулина из сыворотки крови человека
RECOMBINANT GM PROTEIN CAPABLE OF BINDING Α2-MACROGLOBULIN AND APPLICATION THEREOF AS A LIGAND IN AFFINITY CHROMATOGRAPHY FOR EXTRACTING Α2-MACROGLOBULIN FROM HUMAN BLOOD SERUM

Изобретение относится к области молекулярной микробиологии, генной инженерии и биотехнологии и может применяться в качестве доступного реагента для выделения α2-макроглобулина (α2-М) из плазмы крови человека аффинной хроматографией. Изобретение также может применяться в медицинской практике, в качестве необходимого компонента иммунодиагностикумов, используемых для оценки воспалительных процессов и способности организма освобождаться от избытка экзо- и эндогенных протеиназ.
Стрептококки группы G человека представляют собой часть нормальной флоры кожи, глотки и женских половых путей, но также вызывают и тяжелые инфекции человека [Malke H. Microbiol. Spectr. 7(2), (2019)]. О механизмах, участвующих в вирулентности группы G стрептококков, известно мало. Однако белки структурно относящиеся к М белкам, основным факторам вирулентности стрептококков группы А, были определены и в группе G стрептококковых штаммов [Rasmussen M. et al. The Journal of Biological Chemistry. 274 (22):15336-15344, (1999)].
Штаммы группы G, выделенные от человека, экспрессируют рецепторы для таких белков плазмы, как иммуноглобулин G (IgG) [Gupalova T., et al. Folia Microbiol. (Praha). 44 (6): 703-705, (1999); Gupalova T.V., et al. J.Chromatogr. A. 949 (1-2):185-193, (2002)], альбумин (ЧСА) [Гупалова Т.В., и соавт. Биотехнология. 3: 75-84, (2012), Rasmussen M et al. The Journal of Biological Chemistry. 274 (22):15336-15344, (1999)], фибронектин [Malke H. Microbiol. Spectr. 7(2), (2019)], плазминоген [Malke H. Microbiol. Spectr. 7(2), (2019)] и α2-макроглобулин (α2-М) [Malke H. Microbiol. Spectr. 7(2), (2019), Muller H-P., et al. Infection and Immunity. 63 (8): 2833-2839 (1995)]. Среди них хорошо изучен IgG-связывающий белок, белок G, т.к. он применяется в иммунохимии и в биотехнологии (Gupalova T.V., et al. J. Chromatogr. A. 949 (1-2):185-193, (2002), Malke H. Microbiol. Spectr. 7(2), (2019)].
Согласно анализу последовательностей гена и белка, G белок состоит из двух или трех повторяющихся доменов, имеющих IgG-связывающую активность [Бормотова Е.А. et al. Вестн. СПбГУ. Медицина. 3:74-841, (2014), Malke H. Microbiol. Spectr. 7(2), (2019)]. В G белке штамма стрептококка группы G - G148 - перед IgG-связывающими доменами имеются домены, связывающие ЧСА [Гупалова Т.В., et al. Биотехнология. 3: 75-84, (2012); Malke H. Microbiol. Spectr. 7(2), (2019)]. Кроме того, ранее показано, что штамм G148 также связывает α2-М человека [Бормотова, Е.А. и др. Прикл. биохим. и микробиол. 51 (3): 354-360; Malke H. Microbiol. Spectr. 7(2), (2019)].
В 1999 году был обнаружен в референс-штамме G4223 (ФГБНУ «ИЭМ») G-белок, содержащий, как и штамм G148, три IgG-связывающих домена, три ЧСА-связывающих домена и α2-М-связывающую область [Gupalova T., et al. Folia Microbiol. (Praha). 44 (6): 703-705, (1999)].
Штаммы группы C стрептококков, выделенные от быка и лошади, связывают только протеиназо-комплексную форму α2-M, но штаммы группы стрептококков G, выделенные от человека, связывают только нативный α2-M [Бормотова Е.А., Гупалова Т.В., Бюлл. Эксперим. Биологии и медицины. 165 (3): 349-354, (2018)].
О поверхностных белках, ответственных за связывание нативного α2-M с группой G стрептококков известно немного. Было показано, что связывающая область с α2-M находится на молекуле G белка перед ЧСА-связывающими доменами [Zhang H. et al. Mol. Med.Rep. 2 (4):6311-6315, (2015)]. Поверхностный белок GRAB [Protein G-related α2-M (α2-макроглобулин) - связывающий белок] один из компонентов, ответственный за вирулентность стрептококка группы А, идентифицирован с высокой степенью гомологии N-терминальной части α2-M-связывающего белка, находящегося в Е домене G белка из стрептококков группы G. Это указывает на подобный механизм связывания с α2-M в обоих белках [Zhang H. et al. Mol. Med.Rep. 2 (4):6311-6315, (2015)].
α2-M - большой гликопротеин плазмы (718 кД) с несколькими функциями. Он является уникальным эндогенным ингибитором протеиназ, который, взаимодействуя с энзимами, лишает их протеиназной активности, но сохраняет их способность гидролизовать пептиды. Нативный белок состоит из четырех одинаковых субъединиц [Gupalova T., et al. Folia Microbiol. (Praha). 44 (6): 703-705, (1999)].
Взаимодействие между α2-M и протеиназами приводит к конформационным изменениям молекулы ингибитора, которые проявляются в увеличении его электрофоретической подвижности и экспозиции особого гидрофобного рецептор-связывающего участка [Borth W. Faseb J. 6 (15):3345-53, (1992)].
Это приводит к быстрому удалению α2-М из сосудистого русла за счет поглощения гепатоцитами, макрофагами и фибробластами. Было показано, что различные формы α2-М связывают такие цитокины, как IL-1, 2, 6, 8, TNF-а, PDGF, FGF, NGF, TGF [Зорин Н. А. и др. Иммунология. 25 (5):302-304, (2004)].
α2-М является самым большим белком плазмы, не относящимся к иммуноглобулинам. В основном синтезируется гепатоцитами, в небольших количествах производится макрофагами, фибробластами, клетками надпочечников. Метаболизируется в печени, выводится через желудочно-кишечный тракт. Из-за высокой молекулярной массы через почечный фильтр не проходит. В организме выполняет функции блокатора протеаз, участвует в процессах гемокоагуляции, транспорта белков и ионов, влияет на протекание воспалительных реакций, снижает иммунологическую реактивность организма.
С точки зрения практики, интерес к исследованию данного соединения в настоящее время связан с фиброзом печени, а именно с использованием α2-М как непрямого маркера фиброза [Poynard T. et al. Adv Clin Chem. 46:131-60 (2008)].
α2-М вырабатывается в очагах воспаления и фиброзных изменений в печени разнообразными клетками, в том числе гепатоцитами, а также звездчатыми клетками. Отмечается положительная корреляция содержания α2-М с прогрессированием фаз процесса фиброзирования. Хронические воспалительные процессы в печени - гепатиты (В, С, а также другие), остаются и сегодня актуальной клинической проблемой. Проявления процесса могут быть выражены незначительно, однако имеется риск прогрессирующего течения патологического процесса с развитием цирроза печени. Оценка выраженности фиброза имеет важное значение для формирования заключения о необходимости и целесообразности лечения и для его выбора. Применяющийся сегодня забор фрагмента ткани печени с помощью метода биопсии как своеобразный «золотой стандарт» выявления фиброза, даже будучи выполнен безупречно, к сожалению, не исключает возможности ложноотрицательных результатов и может, кроме того, приводить к развитию осложнений. В числе других маркеров α2-М может применяться для неинвазивной оценки степени риска возникновения, развития фиброза у больных, страдающих какой-либо из хронических патологий печени, как один из информативных факторов [Xueying Chen, et al. Chin J Cancer Res. 26(5):611-621, (2014)].
Концентрация α2-М в сыворотке крови может повергаться колебаниям в случае как острых, так и хронических заболеваний, однако изменения в целом сравнительно умеренны и не связаны с определенной конкретной патологией. Понижение содержания α2-М, является обычно результатом усиленного удаления комплексов α2-М с протеиназами и выявляется в случаях, связанных с усиленной протеолитической активностью (среди прочего и при воспалениях поджелудочной железы), при состояниях активации фибринолиза. В случае нефротического синдрома выявляется увеличение концентрации α2-М в результате понижения объема плазмы и, как следствие, компенсаторного усиления его образования, что рассматривается как ответ на выведение белков с низким молекулярным весом и понижение онкотического давления плазмы крови.
Повышенное содержание α2-М обнаруживается при сахарном диабете, причем чаще у больных с большей продолжительностью заболевания, а также имеющих осложнения. Понижение уровня α2-М отмечается при остром панкреатите, после операций, сопровождающихся массивной кровопотерей, при септицемии. У пациентов, перенесших острый инфаркт миокарда, имеющих низкий уровень α2-М, отмечается статистически более благоприятный прогноз после выживаемости более одного года.
Одним из современных методов диагностики α2-М в сыворотке крови является иммунотурбидиметрический метод. Он позволяет определить концентрацию белка по изменению мутности раствора в результате реакции антиген-антитело и используется при невозможности определения содержания белка по его ферментативной активности.
α2-М является необходимым компонентом иммунодиагностикумов, используемых для оценки воспалительных процессов и способности организма освобождаться от избытка экзо- и эндогенных протеиназ.
Известно несколько принципиально различных способов очистки α2-М. Один из них заключается в осаждении целевого продукта сульфатом аммония (40-55% насыщения), диализе и цинк-хелатной аффинной хроматографии с удалением примесей 0,02М натрий-фосфатным буфером, рН 6,0, а затем элюировании МГ 0,02М какодилатным буфером, рН 5,0. Однако этот способ отличается большой длительностью, относительно низким выходом искомого белка, наличием примесей и значительным снижением биологической активности МГ.
Другой способ заключается в получении α2-М из плазмы крови путем удаления плазминогена экстракцией лизин-сефарозой при рН 7,4, осаждением полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000 Д в диапазоне концентраций последнего от 6 до 16%, диализом, анионообменной хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе при рН 7,0 с градиентом концентраций хлористого натрия (0,05-0,5М) и цинк-хелатной аффинной хроматографией на иминодиуксуснокислой сефарозе с градиентом рН от 7,0 до 5,0. Недостатком описанного способа является его многоэтапность, а также снижение иммуногенности α2-М и его активности по отношению к протеиназам из-за длительной процедуры очистки.
Существует метод непосредственного извлечения белка из плазмы крови при помощи цинкового производного иминодиуксуснокислой агарозы и дополнительно осуществляется гель-хроматографией на колонке 6% поперечно-сшитой агарозы и лиофилизацией целевого продукта. Использование в этом способе очистки α2-М сочетания известных методов металл-хелатной и гель-хроматографии позволяет достичь лучшего качества и быстрого получения целевого продукта [Зорин Н.А. Способ получения альфа макроглобулина. - https://findpatent.ru/patent/204/2049470.html]. Однако и этот способ получения α2-М включает несколько стадий очистки и занимает много времени.
При разработке способа выделения и очистки α2-М применяли методы высаливания глобулинов сульфатом аммония 40%-ной насыщенности, центрифугирование при 6000 об/мин, ионообменную хроматографию на DEAE-сефадексе А-50 в ступенчатом восходящем градиенте ионной силы, рабочий буфер 0,01 М трис-HCl, рН 7,2, гельпроникающую хроматографию на Toyopearl-65, рабочий буфер 0,15 М фосфатный, рН 7,4. [Кривенцев Ю.А. и др., Современные проблемы науки и образования 3, (2016)].
Описанные выше способы получения α2-М занимают много времени и несколько стадий очистки.
Нынешний высокий спрос на крове-производные продукты делает приоритетной проблему выделения этих продуктов из плазмы крови.По-прежнему наиболее часто для фракционирования плазмы человека используют метод Кона. Он основан на разнице в растворимости основных белков плазмы благодаря взаимодействию пяти параметров: рН, температуры, ионной силы, концентрации этанола и концентрации белка [Cohn EJ, et.al, 1946]. На протяжении многих лет этот метод изменялся для улучшения качества, чистоты и стоимости продукции. Эти модификации, в основном, основывались на замене или сочетании одной, или более стадий фракционирования [Oncley JL, et.al, 1959; Kistler P, et.al, 1962]. Однако процесс последовательного осаждения по методу Кона вызывает существенные потери белков, в результате выход продукта достаточно низкий. Были введены и другие изменения, такие как введение других агентов для осаждения белков, в том числе каприловой кислоты [Steinbuch M, et.al., 1969], полиэтиленгликоля [Polson A, et.al., 1972; Hao Y, et.al., 1980], сульфата аммония и риванола [Steinbuch M., et.al., 1980]. Но эти изменения в настоящее время не используются в масштабах производства.
За последние годы сложилось мнение о том, что одним из недостатков существующих препаратов является наличие измененных молекулярных форм, оказывающие существенное влияние на иммунологические свойства препаратов. Эта причина, а также соосаждение вместе с основным продуктом посторонних белковых примесей, обусловили переход зарубежных фирм на более современную хроматографическую технологию.
Традиционно процесс очистки крове-производных продуктов включает стадию осаждения и фильтрации, затем несколько стадий ионообменной хроматографии, используя либо анионит, либо катионит. На последнем этапе, чтобы достичь высокой степени очистки антител, часто используют гельфильтрацию. [G.Li.R. Stewart et.al, 2002; D.K. Follmann, et.al., 2004; Ana C.A. Roque et.al, 2007; K. Tanaka, et.al, M.Vargas et.al, 2012]. При этом получение очищенных препаратов включает в себя 5-6 стадий хроматографии, которые в данном изобретении предлагается заменить аффинной хроматографией с использованием в качестве лиганда рекомбинантного G-белка стрептококка, специфически связывающего, как иммуноглобулин G (IgG), человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), так и α2-макроглобулин.
Заявляемый в настоящем изобретении новый штамм-продуцент позволяет нарабатывать достаточное количество G белка для аффинных колонок.
Аффинная хроматография является одним из наиболее широко используемых методов для очистки антител. Использование аффинной очистки уменьшает неспецифические взаимодействия, повышает выход и устраняет нежелательные примеси. Аффинная хроматография представляет собой метод разделения биологических молекул, который основан на специфических взаимодействиях между белком и специфическим лигандом, связанным с матрицей. Техника обладает высокой селективностью и, следовательно, дает высокое разрешение, а само вещество может быть очищено в несколько тысяч раз. Аффинная хроматография является уникальной технологией очистки, так как только она позволяет очистить биомолекулы на основе их биологической функции или химической структуры. Один шаг аффинной очистки дает огромную экономию времени по сравнению с менее селективными многоступенчатыми процедурами. Успешная аффинная очистка требует биоспецифического лиганда, который может быть ковалентно связан с хроматографической матрицей. Матрица является инертным носителем и должна быть однородной, макропористой, обеспечивающей высокую связывающую способность даже для больших биомолекул, химически и механически стабильной, обладать чрезвычайно низкой неспецифической адсорбцией. Кроме того, матрица должна способствовать химической активации, тем самым, обеспечивая присоединение необходимых лигандов.
Наиболее изученным и широко используемым реагентом активации является бромистый циан - CNBr. Выпускаются предварительно активированные матрицы, что позволяет избежать проблемы химической активации матрицы. Всем перечисленным выше свойствам отвечает сефароза - агароза в виде шариков. В основном, все виды агарозы отличаются диаметром частиц и количеством внутренних их сщивок. Одной из лучших матриц считается коммерческая CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow.
Выбор лиганда для аффинной хроматографии зависит от двух факторов: лиганд должен обладать обратимым сродством к целевому белку и должен содержать химические группы, через которые он может быть иммобилизован на матрице без нарушения связывающей активности. За последнее десятилетие было разработано множество лигандов для улучшения очистки белков.
Появление и использование бактериальных рецепторов в качестве биоспецифического лиганда для очистки антител явилось мощным инструментом для их обнаружения и очистки. Использование технологии рекомбинантных ДНК дало возможность манипулировать их свойствами для решения многих задач.
2
Белки А и G - это бактериальные протеины, выделенные из клеточных структур Staphylococcus aureus и Streptococcus, соответственно, которые на сефарозной матрице образуют чрезвычайно полезный и простой сорбент. Белок G обладает способностью связывать Fc часть иммуноглобулина G большинства видов млекопитающих. В отличие от хорошо изученного IgG-связывающего рецептора - стафилококкового белка А, белок G связывает все подклассы иммуноглобулина G человека (белок А не связывает третий подкласс человеческого IgG), а также имеет более широкий спектр связывания IgG различных млекопитающих. Однако белок G связывает также альбумин и α-макроглобулин.
2
Описано использование рекомбинантного бифункционального белка G для освобождения сыворотки человека от IgG и альбумина и для получения очищенных препаратов IgG и альбумина из той же сыворотки аффинной хроматографией, в которой в качестве лигандов использованы бифункциональный и рекомбинантный монофункциональный IgG-связывающий белок, полученный из штамма стрептококка группы G, G148 [Е.А. Бормотова, Т.В. Гупалова. Биотехнология, № 2: 49-55, 2009]. Данное техническое решение принято в качестве прототипа заявляемой группы изобретений. Однако в используемом в этом случае белке отсутствуют сайты связывания для α-М.
Поверхностный белок GRAB [Protein G-related α2-M (α2-макроглобулин) - связывающий белок] - это один из компонентов, ответственный за вирулентность стрептококка группы А, который идентифицирован с высокой степенью гомологии N-терминальной части α2-M-связывающего белка, находящегося в Е домене G белка из стрептококков группы G. Это указывает на подобный механизм связывания с α2-M в обоих белках. Известен рекомбинантный белок GRAB, в котором на N-конце молекулы находится область, ответственная за связывание с α2-M. Эта область имеет 71% гомологии с Е областью белка G [Rasmussen, M., Muller, H.P. and Bjorck, L.J. Biol. Chem. 274, 15336-15344, (1999)]. Данное техническое решение принято в качестве второго прототипа заявляемой группы изобретений.
Задачей изобретения является решение актуальной проблемы - создание способа получения очищенного препарата α2-М из сыворотки крови, основанного на взаимодействии «белок-белок» с использованием рекомбинантного G белка, полученного из стрептококка группы G, штамма G4223, имеющего IgG-, ЧСА- и α2-M- связывающие области, качество очистки которого обеспечивает практически 100% специфичность сорбента.
Заявлена группа изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом, которая включает следующие объекты:
1. Рекомбинантная ДНК (обозначенная как pGM), полученная в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием хромосомной ДНК штамма G4223 стрептококка группы G, уникальных праймеров PGM1 и PGM2 и последующего клонирования с использованием экспрессионной плазмиды pQE-31(The QIAexpress System, Qiagen, США).
2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pQE-31-pGM, несущая рекомбинантную ДНК pGM.
3. Штамм-продуцент E.coli M15-GM, позволяющий при определенных условиях экспрессировать рекомбинантный полипептид GM.
4. Рекомбинантный полипептид GM, содержащий последовательность α2-M-связывающей области, трех IgG-связывающих доменов и трех ЧСА-связывающих доменов, обладающий высокой способностью связывать все три белка плазмы крови человека.
5. Аффинный сорбент, в котором к матрице - активированной циан бромом сефарозе 4 В, присоединен, в качестве лиганда, рекомбинантный полипептид GM.
6. Кроме того, заявлено применение рекомбинантного полипептида GM для получения очищенного препарата α2-М человека с использованием вышеупомянутого аффинного сорбента.
Техническая суть и достигаемый при использовании заявленной группы изобретений технический результат состоят в следующем.
α2-M - один из наиболее распространенных белков плазмы крови человека. Он нашел широкое применение в медицине, диагностике и научных исследованиях.
В последние десятилетия выявлен и изучен белок бактерий, обладающий рецепторной активностью в отношении α2-M, IgG ЧСА, так называемый белок G, выделенный из стрептококков группы G. Изучение структуры этого белка имеет большое значение для технологии создания белковых реагентов, актуальных в иммунохимии, протеомике, биотехнологии и клинической диагностике.
Использование рекомбинантных полипептидов позволяет: исключить трудоемкий процесс приготовления специфических антител к α2-M, IgG и ЧСА (для которых используются лабораторные животные), избежать неспецифических "фоновых" реакций, часто встречающихся в иммунологии, стандартизовать используемый G белок, выделять как α2-M, так и IgG и ЧСА из сыворотки крови в одну стадию очистки.
Белок G может быть выделен из стрептококка энзиматическим расщеплением папаином (нативный белок), либо получен генно-инженерным путем (рекомбинантный белок). Выделение G белка из стрептококка энзиматическим путем характеризуется низким выходом, гетерогенностью получаемого продукта и трудоемкостью технологического процесса, связанного с использованием патогенного микроба. Ввиду этого предпочтительным является получение рекомбинатного белка.
Известен рекомбинатный белок G, получаемый рядом лабораторий путем клонирования гена G белка в непатогенном хозяине [Guss B., et.al., 1986; Fahhnestock. S.R., et.al, 1986; Goward C. R., 1990]. Описанные препараты G белка были либо гетерогенны, либо при получении белка в высокоочищенном состоянии выход его довольно низкий.
Получение рекомбинантного белка, описано Гупаловой Т.В. [Гупалова Т.В. с соавт., 1996]. Был сконструирован банк генов стрептококка G148 в фаговом EMBL 3а лямбда-векторе. При скрининге банка хромосомных генов стрептококка группы G серотипа G148 среди рекомбинантных клонов было выявлено 16 клонов, дающих положительный ответ (связывание IgG) в блоттинге, с IgG, меченным пероксидазой. Из фагового клона, дающего наибольшую экспрессию G белка, была выделена рекомбинантная фаговая ДНК, EMBL 3A-5 и проведено клонирование в E. coli в плазмидный вектор pUC 8. Клонирование неполного Hind III перевара ДНК фага EMBL 3A-5 проводили в Hind III сайте плазмидного вектора E. coli pUC 8. Лигазной смесью проводили трансформацию JM109 E. coli. Среди трансформантов положительный ответ дали 8 клонов. Был отобран клон, дающий наибольшую экспрессию. Из этого клона была выделена рекомбинантная плазмида. Рекомбинантный белок, кодируемой этой плазмидой, имел и IgG и ЧСА-связывающие активности. α2-M-связывающей активности обнаружено не было.
Поэтому необходимо создать новый штамм-продуцент, способный экспрессировать большое количество рекомбинантного G-белка, обладающего высокой способностью связывать α2-M.
Появление современной технологии, такой, как полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяет намного быстрее производить клонирование только нужного фрагмента гена. В данном изобретении клонирование гена G белка проводили с помощью ПЦР.
Согласно заявленному изобретению получен рекомбинантный полипептид GM и его штамм-продуцент. Полипептид GM содержит последовательность α2-M-связывающей области, трех IgG-связывающих и трех ЧСА-связывающих доменов. Этот полипептид обладает высокой способностью связывать все три белка плазмы крови человека: α2-M, IgG и ЧСА. Его использование возможно для выделения и очистки человеческого IgG, ЧСА и α2-M.
Поставленная задача решалась конструированием уникальных праймеров, направленных к участкам гена, кодирующих полипептид, состоящий α2-M, IgG и ЧСА-связывающих областей. С целью быстрого и простого получения рекомбинантного полипептида GM для клонирования фрагмента ДНК была использована система экспрессионных плазмид pQE. Для создания штамма-продуцента рекомбинантного полипептида GM был использован штамм E.coli M15. В результате экспериментальной работы этот штамм приобрел новые свойства: способность экспрессировать рекомбинантный полипептид GM. Новый штамм получил название E. coli M15-GM. Штамм депонирован в коллекции ФГБНУ «ИЭМ» под № 785.
В процессе работы была создана уникальная рекомбинантная ДНК р GM, полученная в результате ПЦР, с использованием хромосомной ДНК штамма G4223 стрептококка группы G, уникальных праймеров PGM1 и PGM2, и последующего клонирования с использованием экспрессионной плазмиды pQE-31 (The QIAexpress System, Qiagen, США). Была также создана рекомбинантная плазмидная ДНК pQE 31-pGM несущая рекомбинантную ДНК pGM и штамм-продуцент E. coli M15-GM, позволяющий при определенных условиях экспрессировать рекомбинантный полипептид GM.
В процессе работы получен фрагмент гена, кодирующий α2-M-связывающую часть и область с тремя IgG-связывающими и тремя ЧСА-связывающими доменами штамма G4223 стрептококка группы G, размером 1503 п.н. с помощью ПЦР с использованием праймеров PGM1 и PGM2 и хромосомной ДНК штамма G4223 стрептококка группы G (фиг. 1) Также авторами осуществлено клонирование pGM с использованием экспрессионной плазмиды pQE-31 и последующей трансформацией полученной рекомбинантной плазмиды (обозначенной как pQE31-pGM) в гетерологическую систему E.coli М15. Авторами получены штамм-продуцент рекомбинантного полипептида GM, обозначенный как E. coli М15-GM. Также авторами реализована экспрессия рекомбинантного полипептида GM клетками штамма E. coli М15-GM с последующей одноступенчатой аффинной очисткой с использованием Ni-сефарозы (GE Healthcare, Sweden).
Получение рекомбинантного полипептида.
Источником хромосомной ДНК послужил референс-штамм G4223 стрептококка группы G, выделенный от человека. ДНК, выделенная фенольно-хлороформной экстракцией, была использована в качестве матрицы в ПЦР с целью получения фрагмента гена pGM (1503 п.н.). Олигонуклеотидные праймеры представлены в таблице 1.
Таблица. 1. Олигонуклеотидные праймеры
Название
Ориентация
Нуклеотидная последовательность от 5' к 3'
PGM1
прямой
CG<u>GGATCC</u>CGCAGCTTTTGGGTTAGCATCC
PGM2
обратный
GG<u>GGTACC</u>CCTAACCATTTCAGTTACCGT
pQE 1
прямой
GCGGATAACAATTTCACACAGAA
pQE 2
обратный
CCGTAATATCCAGCTGAACG
Выделенные звенья нуклеотидной последовательности указывают на сайты рестрикции эндонуклеазами, использованными при создании конструкции.
Анализ результатов ПЦР осуществлен путем разделения фрагментов ДНК в 1% агарозном геле при помощи горизонтального электрофореза, как показано на фиг. 1. Выделение искомого амплифицированного участка ДНК проведено с использованием набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США).
Полученный фрагмент клонировали с использованием экспрессионной плазмиды pQE 31. При подготовке к клонированию была проведена рестрикция выделенного из агарозы фрагментов pGM (1503 н.п.) и плазмиды pQE 31 ферментами BamHI и KpnI с образованием липких концов. Продукты рестрикции разделяли с помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле, а затем лигировали.
Продуктом лигирования проводили кальциевую трансформацию штамма E.coli M 15. Процесс трансформации осуществляли по методике трансформации кишечной палочки, используя плотные селективные среды, содержащие 100 мкг/мл ампициллина, 25 мкг/мл канамицина. [Maniatis T, Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. - Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 867, 1982].
Антибиотик-устойчивые трансформанты откалывали на две параллельные чашки Петри с антибиотиками. Колонии с одной чашки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и вскрывали раствором, содержащим 0,2 N NaOH, 0,1% SDS и 0,5 % β-меркаптоэтанола. Мембрану инкубировали 1 час при комнатной температуре в блокирующем растворе (2 части 3% молока и 1 часть фосфатно-солевого буфера (ФСБ)) для удаления неспецифического связывания и затем в блокирующем растворе, содержащем, α2-M, меченный пероксидазой хрена (Sigma, USA).
Конъюгирование пероксидазы хрена с α2-M проводили перйодатным методом [Фримель Г. Иммунологические методы: М. Медицина: 438-439, 1987]. Затем мембрану последовательно отмывали блокирующим раствором и ФСБ. Пероксидазную активность проявляли раствором ТМБ для мембран (Sigma, USA). Из трансформантов с наиболее выраженной экспрессией α2-M -связывающей активности выделяли рекомбинантные плазмиды с помощью Mini-prep. plasmid DNA purification kit (Qiagen, USA). Наличие в них рекомбинантных ДНК подтверждали в ПЦР с исходными праймерами PGM1 и PGM2. Плазмидную ДНК pQE 31-pGM использовали как матрицу в ПЦР с праймерами pQE1 и pQE2. Амплификат выделяли после электрофореза в 1% агарозном геле и секвенировали.
Культуру штамма E. coli M 15, содержащую рекомбинантную плазмиду pQE 31-pGM, обозначенную как E. coli M 15-GM культивировали в жидкой среде LB с добавлением антибиотиков (ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл)) до поздней логарифмической фазы роста (OD600 = 0,9). Затем экспрессию рекомбинантного белка индуцировали добавлением изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (IPTG), и клетки культивировали еще 4 часа. После этого клетки осаждали центрифугированием, отмывали лизирующим буфером А (20 мМ Na2HPO4, 20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, pH 8,0) и суспендировали в том же буфере, добавляя ингибитор протеаз, фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), до концентрации 1 мМ. Суспензию клеток вскрывали ультразвуком и центрифугировали. Надосадочную жидкость наносили на колонку, заполненную Ni-сефарозой. После того, как белок связывался с Ni-сефарозой, колонку промывали буфером А для удаления не связавшихся белков. Рекомбинантный белок элюировали буфером Б (20 мМ Na2HPO4, 20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, 250 мМ имидазола, pH 8,0). После аффинной хроматографии белок диализовали 18 часов против дистиллированной воды.
Выделенный рекомбинантный полипептид анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле, который позволил сделать заключение об удовлетворительном качестве очистки полипептида и также об его молекулярной массе, сравнивая пробег полипептида GM с пробегом белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standards (161-0373), Bio-Rad, США). Молекулярная масса полипептида GM оказалась равной (55,0±0,5) кДа (фиг. 2).
Таким образом, рекомбинантный полипептид GM содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 G белка стрептококка группы G штамма G4223, содержащую 512 аминокислот, ковалентно связанную с 11 аминокислотными остатками, кодируемыми pQE 31.
Взаимодействие рекомбинантного полипептида с α2-М.
Избирательность взаимодействия полипептида GM с α2-М оценивали методом ИФА.
450
На планшет сорбировали одинаковое количество IgG, ЧСА и α2-М в концентрации 1 мкг/мл, разведенного в ФСБ и инкубировали в течение 18 часов при 4°С. Во все лунки вносили двукратные разведения полипептида GM, меченного пероксидазой, и инкубировали 1 час. Полипептид GM обладал IgG-, ЧСА- и α2-М-связывающими активностями, α2-М-связывающая активность этого полипептида была ниже, чем IgG и ЧСА-связывающие активности. Средние значения оптической плотности по данным нескольких опытов приведены на гистограмме (фиг. 3), где черный столбик - IgG, белый столбик - ЧСА, серый столбик - α2-М, по оси абсцисс - кратность разведения меченого полипептида GM, по оси ординат - оптическая плотность (OD).
Полученный полипептид может быть использован для получения, очищенного α2-М с последующим отделением IgG и ЧСА от α2-М на комбинированном сорбенте, состоящем из смеси равных количеств двух сорбентов, содержащих IgG- и ЧСА-связывающие полипептиды.
Создание аффинного носителя: сефарозы 4B-GM полипептида. Выделение очищенного препарата α2-М.
В качестве матрицы аффинного носителя использовали сефарозу 4В, активированную бромцианом, (“Sigma”, США). Лигандом, иммобилизованным на матрице, служил рекомбинантный GM полипептид.
Предварительно сефарозу 4В, активированную бромцианом, промывали несколько раз холодной 1mM HCl, каждый раз центрифугировали, надосадок выбрасывали, добавляя свежую порцию холодной 1mM HCl. Затем суспензию сефарозы промывали 0,1 М бикарбонатным буфером, рН 8,3.
Рекомбинантный полипептид GM, 35 мг, иммобилизовали на 5 мл сефарозы 4В, активированной бромцианом в 0,1 М бикарбонатном буфере, рН 8,3, содержащем 0,5 М NaCl и заполняли полученным сорбентом колонку. Количество GM полипептида, присоединившегося к матрице, составило 30 мг. Сорбент промывали в колонке (1.5 × 5 см) последовательно 0,1M ацетатным буфером, pH 4,0, и 0,1М бикарбонатным буфером, рН 8,3, содержащим 0,5 М NaCl, затем уравновешивали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7.4, содержащим 0.85% NaCl, (ФСБ) и хранили при 4°С.
Для проверки емкости сорбента на сорбент, уравновешенный ФСБ, рН 7,4, последовательно наносили 5, 10 и 15 мл сыворотки человека. Полноту связывания α2-М проверяли методом блоттинга. Для этого на нитроцеллюлозную мембрану (НЦ) наносили пробу исходной сыворотки, пробу сыворотки, не связавшуюся с сорбентом, и элюированную с сорбента пробу. НЦ мембрану переносили в блокирующий раствор, содержащий GM- полипептид, меченный пероксидазой, и выдерживали их 15 минут при перемешивании. Мембрану последовательно отмывали блокирующим раствором и ФСБ. Отмытую мембрану подсушивали на воздухе и помещали в раствор 3,3/,5,5/-Тетраметилбензидин (ТМБ, жидкий субстрат для мембран, Sigma). Окрашивание происходило в течение нескольких секунд.
В пробе сыворотки, не связавшейся с сорбентом, при нанесении 5, 10 и 15 мл человеческой сыворотки, практически полностью отсутствовал α2-М. Связавшиеся с сорбентом IgG, ЧСА и α2-М элюировали 0,1 М глициновым буфером, рН 2,2. Во фракциях объемом 1 мл определяли оптическую плотность (ОП) при 280 нм. Фракции с высокими значениями ОП объединяли и значение рН доводили 2.0 М NaOH до значения 7.5 и диализовали 18 часов против ФСБ. Полученные фракции, содержащие три белка плазмы крови IgG и ЧСА, и α2-М диализовали против раствора ФСБ и наносили на колонку с комбинированным сорбентом, состоящем из смеси равных количеств двух сорбентов, содержащих IgG- и ЧСА-связывающие полипептиды. При этом α2-М не связывался с сорбентом. Во фракциях, не связавшихся с сорбентом и содержащими α2-М, объемом 1 мл, определяли оптическую плотность (ОП) при 280 нм. Фракции с высокими значениями ОП объединяли.
Наличие и качество полученного α2-М определяли методом электрофореза по методу Лэммли [Laemmli U.K. Nature (London), 1970 p. 227] в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия (ДДС Na) на приборе “Bio_Rad” (США), а его концентрацию методом Лоури. Перед нанесением образцы белков в растворе, содержащем 2% ДДС Na и 0,5% β-меркаптоэтанола, погружали на 2 мин в кипящую водяную баню. Электрофорез проводили при силе тока 50-60 мА в течение 1-2 часов. Затем гель три раза промывали дистиллированной водой и в течение 30 минут окрашивали в растворе Кумасси синий R 250 «Bio-Rad» (США), после чего промывали в 10% ледяной уксусной кислоты с 10% изопропанола.
Проба α2-М, очищенная аффинной хроматографией, представлена на фиг. 4. Из рисунка следует, что препарат α2-М получен в высокоочищенном состоянии. Таким образом, создан сорбент сефароза 4B-GM полипептид, позволяющий получать очищенные препараты α2-М. На полученном сорбенте с таким же успехом можно получать очищенные препараты IgG и ЧСА.
Пример 1. Получение фрагмента ДНК pGM методом ПЦР
К 0,25 мкг геномной ДНК, выделенной фенольно-хромосомной экстракцией из штамма G4223 СГG добавляли по 10 микромолей каждого из специфических праймеров, фланкирующих исследуемую последовательность, по 0,2 мМ четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и 12,5 мкл смеси (ThermoScientific DreamTag Green PCR Master Mix (2х), объем доводили дистиллированной водой (Water, nuclease-free) до 25 мкл. Пробирку помещали в амплификатор и инкубировали при 94°С 2 мин. Программа ПЦР состояла из: денатурации при 94°С - 30 сек, отжига праймеров - 60°С - 1 мин и синтеза - 72°С - 1 мин. Этот цикл повторялся 30 раз, после чего смесь инкубировалась при 72°C 10 мин. В работе использовали олигонуклеотидные праймеры, приведенные в Таблице 1. ПЦР продукты разделяли в 1% агарозном геле в горизонтальном электрофорезе (фиг. 1). Выделение амплифицированного участка ДНК проводили с использованием набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США). Анализ размера полученного фрагмента ДНК проводили, исходя из сравнения его электрофоретической подвижности с электрофоретической подвижностью маркера молекулярных весов (100 п.н. ДНК-маркер, Хеликон).
Электрофореграмма амплифицированного ДНК-фрагмента pGM показана на фиг. 1, где цифрами обозначено: 1 - 100 п.н. ДНК - маркер, (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар), 2 - продукт ПЦР. В результате ПЦР с праймерами PGM1 и PGM2 был получен фрагмент гена 1536 п.н., характеризующийся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.
Пример 2. Клонирование ДНК-фрагмента pGM с использованием экспрессионной плазмиды pQE 31
Плазмида pQE 31 и фрагмент, полученный в результате ПЦР были обработаны двумя рестрикционными ферментами BamHI и KpnI, что привело к образованию липких концов. Продукты рестрикции разделяли с помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле, а затем выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США). В ходе клонирования к 5 мкл фрагмента ДНК pGM добавляли 1 мкл фрагмента ДНК pQE 31, полученных после рестрикции и вырезанных из агарозы, 2 мкл десятикратного лигазного буфера и 1 мкл лигазы фага Т4. Объем доводили дистиллированной водой до 20 мкл. Смесь инкубировали при 10° в течение 12 часов. В результате проведенного клонирования была получена рекомбинантная плазмида, обозначенная как pQE 30-pGM, несущая рекомбинантную ДНК (обозначенную как pGM), состоящую из 1503 п.н. и 33 п.н. фрагмента плазмиды pQE-31.
Пример 3. Трансформация культуры E. coli M 15 плазмидной ДНК pQE 31-pGM.
Рекомбинантную плазмиду трансформировали в гетерологичную систему E. coli M 15. В качестве положительного контроля параллельно проводили трансформацию E. coli M 15 исходной плазмидной ДНК pQE 31. Генетическим маркером плазмидной ДНК pQE 31 является маркер amp, кодирующий бета-лактомазу, что обеспечивает устойчивость к ампициллину клеток, несущих эту плазмиду.
600
2.
2
Культуру клеток E. coli M 15 культивировали в бульоне LB (США) с канамицином (25 мкг/мл) в течение 12 часов при 37° и интенсивном перемешивании. Затем инокулят пересевали на новый объем той же среды (на 10 мл среды - 0,1 мл инокулята) и инкубировали при 37° в течение 2-3 часов при перемешивании до ОД = 0,3. Выращенные клетки в объеме 1,5 мл центрифугировали в течение 1 мин. при 12000 об/мин., и полученный осадок суспендировали в 200 мкл раствора 0,1 М CaCl Далее смесь выдерживали во льду 1 час. После центрифугирования осадок ресуспендировали в 187, 5 мкл 0,1 М CaCl и 64,5 мкл дистиллированной воды. Затем в пробирку вносили 0,2 мкг плазмидной ДНК и инкубировали смесь во льду 1 час. Далее смесь выдерживали 2 мин. при 42°С. После этого к смеси добавляли 1 мл бульона LB и инкубировали 1 час при 37°С. После осаждения центрифугированием (8000 об/мин. в течение 1 мин) клетки высевали на чашки с 1% L-агаром (Difco, США), содержащим ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл). Через 18 часов роста клеток при 37°С проводили отбор клонов-трансформантов. Антибиотик устойчивые трансформанты переносили на две параллельные чашки Петри с антибиотиками. Колонии с одной чашки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и вскрывали раствором, содержащим 0,2 N NaOH, 0,1% SDS и 0,5% β-меркаптоэтанола. Мембрану инкубировали 1 час в блокирующем растворе, содержащем α2-М, меченный пероксидазой хрена (Sigma, США). Затем ее последовательно отмывали блокирующим раствором и раствором ФСБ. Пероксидазную активность проявляли раствором ТМБ для мембран.
Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что в результате проведенного клонирования был получен рекомбинантный клон, несущий плазмиду pQE 31-pGM с рекомбинантной ДНК pGM.
Пример 4. Очистка рекомбинантного полипептида GM
600
2
4
2
4,
Культуру штамма E. coli M 15-GM выращивали в бульоне LB с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг/мл и канамицина в концентрации 25 мкг/мл в течение ночи при интенсивном перемешивании. Затем клетки пересевали на 1000 мл той же среды и инкубировали при 37°С в течение 2-3 часов при интенсивном перемешивании до ОД = 0,9. Экспрессию рекомбинантного белка индуцировали добавлением раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида до конечной концентрации 2 мМ, после чего клетки инкубировали при тех же условиях еще 4 часа. Полученную суспензию клеток центрифугировали при 4000 об/мин. 20 мин. Надосадочную жидкость сливали, а клетки суспендировали в буфере А ((20 мМ NaHPO, 20 мМ NaHPO 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, pH 8,0), добавляя ингибитор протеаз фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) до конечной концентрации 1 мМ.
280
2
4
2
4,
280.
280
Для лизирования клеток была использована трехкратная ультразвуковая обработка при 4°С в течение 20 сек. с перерывом в 40 сек. в ультразвуковом дезинтеграторе (УЗДН-1У4.2, Англия). Лизат клеток центрифугировали при 20000 об/мин. и 4°С в течение 20 мин. Надосадочную жидкость пропускали через 0,45 мкм фильтр (Millipore, США) и затем ее наносили на колонку с Ni-сефарозой, предварительно уравновешенную буфером А. Далее колонку промывали тем же буфером до тех пор, пока значение ОД выходящего раствора не был больше, чем 0,01. Белок элюировали раствором буфера Б (20 мМ NaHPO, 20 мМ NaHPO 500 мМ NaCl, 250 мМ имидазола, pH 8,0). Элюат собирали по фракциям по 500 мкл и измеряли в них значения ОДФракции с наибольшими значениями ОД, объединяли и диализовали против дистиллированной воды в течение 12 часов. На фиг. 2 представлена электрофореграмма рекомбинантного полипептида GM, где 1 - маркер молекулярной массы, (сверху вниз: 250, 130, 95, 72, 55, 36, 28, и 17 кДа), 2 - препарат очищенного белка GM.
Молекулярную массу полипептида GM определяли, сравнивая пробег белка GM с пробегом белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standarts (161-0373), Bio-Rad, США). Молекулярная масса белка GM оказалась равной (55±0,5) кДа.
Пример 5. Связывание сывороточного меченого α2-М адсорбированным полипептидом GM
Анализ α2-М-связывающей активности проведен методом прямого ИФА. Для проведения ИФА использовали планшеты NUNC MaxiSorb (Denmark).
Приготовление разведенных препаратов меченого α2-М осуществляли с применением раствора ФСБ. Удаление не связавшихся реагентов проводили трехкратным промыванием планшетов раствором ФСБ с 0,05% твин 20 (ФСБТ).
На планшет сорбировали одинаковое количество IgG, ЧСА и α2-М в концентрации 1 мкг/мл, разведенного в ФСБ и инкубировали в течение 18 часов при 4°С. После трехкратного отмывания в планшеты вносили разведенный меченый α2-М. Инкубацию проводили при 37°С в течение 1 часа. Далее планшет 3 раза отмывали от несвязавшихся реагентов.
Активность фермента-метки пероксидазы хрена определяли с использованием хромогена - тетраметилбензидина (ТМБ), растворенного в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере, рН 5,0 с добавлением перекиси водорода. Реакцию останавливали добавлением 2N серной кислоты. Оптическую плотность определяли при длине волны 450 нм на мультискане.
Полипептид GM, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, обладал IgG-, ЧСА- и α2-М-связывающими активностями, α2-М-связывающая активность этого полипептида была ниже, чем IgG и ЧСА-связывающие активности.
450
Средние значения оптической плотности по данным нескольких опытов приведены на гистограмме (фиг. 3), где черный столбик - IgG, белый столбик - ЧСА, серый столбик - α2-М, по оси абсцисс - кратность разведения меченого полипептида GM, по оси ординат - оптическая плотность (OD).
Пример 6. Способ получения α2-М из сыворотки крови на аффинном носителе: сефарозе 4B-GM полипептид
На аффинный сорбент в колонке (1.5 × 5 см) сефароза 4B- α2-М- связывающий полипептид было нанесено 5, 10 или 15 мл сыворотки крови. Не связавшиеся белки элюировали ФСБ, связавшиеся с сорбентом IgG ЧСА и α2-М элюировали 0,1 М глициновым буфером, рН 2.2. Во фракциях объемом 1 мл определяли оптическую плотность (ОП) при 280 нм. Фракции с высокими значениями ОП объединяли и значение рН доводили 2.0 М NaOH до значения 7.5 и диализовали 18 часов против ФСБ. Полученные фракции, содержащие три белка плазмы крови IgG и ЧСА, и α2-М диализовали против раствора ФСБ и наносили на колонку с комбинированным сорбентом, состоящем из смеси равных количеств двух сорбентов, содержащих IgG- и ЧСА-связывающие полипептиды. При этом α2-М не связывался с сорбентом. Во фракциях, не связавшихся с сорбентом и содержащими α2-М, объемом 1 мл, определяли оптическую плотность (ОП) при 280 нм. Фракции с высокими значениями ОП объединяли. Проба α2-М, не связавшаяся с комбинированным сорбентом была проверена методом СДС-ПААГ электрофореза. На фиг. 4 показана электрофореграмма, где цифрами обозначено: 1 - маркер молекулярных весов (сверху вниз: 250, 130, 95, 72, 55, 36, 28, и 17 кДа); 2 - проба α2-М, очищенного аффинной хроматографией на сорбенте сефароза 4B-GM полипептид.
Таким образом, создан сорбент сефароза 4B-GM полипептид, позволяющий получать очищенные препараты α2-М. На полученном сорбенте с таким же успехом можно получать очищенные препараты IgG и ЧСА.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ФГБНУ «ИЭМ»  FSBSI “IEM”
<120> Рекомбинантный белок GM, обладающий способностью связывать
α2-макроглобулин и его применение в качестве лиганда
в аффинной хроматографии для выделения α2-макроглобулина
из сыворотки крови человека
2019140965
<140>
10.12.2019
<141>
<150>
<151>
<160> 2
<210> 1
<211> 1536
<212>  Нуклеотидная последовательность
<213>  Искусственная последовательность
<223>  Нуклеотидная последовательность фрагмента гена
Streptococcus
α2-макроглобулин-связывающего полипептида
Escherichia coli
группы G, экспрессированная в системе
<400>
atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac acggatcccg cagcttttgg gttagcatcc   60
gtatcagctg catttttagt gggatcaacg gtattcgctg ttgactcacc aatcgaagat  120
accccaatta ttcgtaatgg tggtgaatta actaatcttc tggggaattc agagacaaca  180
ctggctttgc gtaatgaaga gagtgctaca gctgatttga cagcagcagc ggtagccgat  240
actgtggcag cagcggcagc tgaaaatgct ggggcagcag cttgggaagc agcggcagca  300
gcagatgctc tagcaaaagc caaagcagat gcccttaaag aattcaacaa atatggagta  360
agtgactatt acaagaatct aatcaacaat gccaaaactg ttgaaggcgt aaaagacctt  420
caagcacaag ttgttgaatc agcgaagaaa gcgcgtattt cagaagcaac agatggctta  480
tctgatttct tgaaatcaca aacacctgct gaagatactg ttaaatcaat tgaattagct  540
gaagctaaag tcttagctaa cagagaactt gacaaatatg gagtaagtga ctatcacaag  600
aacctaatca acaatgccaa aactgttgaa ggtgtaaaag accttcaagc acaagttgtt  660
gaatcagcga agaaagcgcg tatttcagaa gcaacagatg gcttatctga tttcttgaaa  720
tcacaaacac ctgctgaaga tactgttaaa tcaattgaat tagctgaagc taaagtctta  780
gctaacagag aacttgacaa atatggagta agtgactatt acaagaacct aatcaacaat  840
gccaaaactg ttgaaggtgt aaaagcactg atagatgaaa ttttagctgc attacctaag  900
actgacactt acaaattaat ccttaatggt aaaacattga aaggcgaaac aactactgaa  960
gctgttgatg ctgctactgc agaaaaagtc ttcaaacaat acgctaacga caacggtgtt 1020
gacggtgaat ggacttacga cgatgcgact aagaccttta cagttactga aaaaccagaa 1080
gtgatcgatg cgtctgaatt aacaccagcc gtgacaactt acaaacttgt tattaatggt 1140
aaaacattga aaggcgaaac aactactgaa gctgttgatg ctgctactgc agaaaaagtc 1200
ttcaaacaat acgctaacga caacggtgtt gacggtgaat ggacttacga cgatgcgact 1260
aagaccttta cagttactga aaaaccagaa gtgatcgatg cgtctgaatt aacaccagcc 1320
gtgacaactt acaaacttgt tattaatggt aaaacattga aaggcgaaac aactactaaa 1380
gcagtagacg cagaaactgc agaaaaagcc ttcaaacaat acgctaacga caacggtgtt 1440
gatggtgttt ggacttatga tgatgcgact aagaccttta cggtaactga aatggttagg 1500
tacccccggg tcgacctgca gccaagctta attagc
<210> 2
<211> 512
<212>  Аминокислотная последовательность
<213>  Искусственная последовательность
<223>  Аминокислотная последовательность α2-макроглобулин-связывающего
полипептида GM
<400> 2
Met  Arg  Gly  Ser  His  His  His  His  His  His  Thr  Asp  Pro  Ala  Ala  Phe
5                       10                       15
Gly  Leu  Ala  Ser  Val  Ser  Ala  Ala  Phe  Leu  Val  Gly  Ser  Thr  Val  Phe
20                       25                       30
Ala  Val  Asp  Ser  Pro  Ile  Glu  Asp  Thr  Pro  Ile  Ile  Arg  Asn  Gly  Gly
35                       40                       45
Glu  Leu  Thr  Asn  Leu  Leu  Gly  Asn  Ser  Glu  Thr  Thr  Leu  Ala  Leu  Arg
50                       55                       60
Asn  Glu  Glu  Ser  Ala  Thr  Ala  Asp  Leu  Thr  Ala  Ala  Ala  Val  Ala  Asp
65                       70                       75                       80
Thr  Val  Ala  Ala  Ala  Ala  Ala  Glu  Asn  Ala  Gly  Ala  Ala  Ala  Trp  Glu
85                       90                       95
Ala  Ala  Ala  Ala  Ala  Asp  Ala  Leu  Ala  Lys  Ala  Lys  Ala  Asp  Ala  Leu
100                      105                      110
Lys  Glu  Phe  Asn  Lys  Tyr  Gly  Val  Ser  Asp  Tyr  Tyr  Lys  Asn  Leu  Ile
115                      120                      125
Asn  Asn  Ala  Lys  Thr  Val  Glu  Gly  Val  Lys  Asp  Leu  Gln  Ala  Gln  Val
130                      135                      140
Val  Glu  Ser  Ala  Lys  Lys  Ala  Arg  Ile  Ser  Glu  Ala  Thr  Asp  Gly  Leu
145                      150                      155                      160
Ser  Asp  Phe  Leu  Lys  Ser  Gln  Thr  Pro  Ala  Glu  Asp  Thr  Val  Lys  Ser
165                      170                      175
Ile  Glu  Leu  Ala  Glu  Ala  Lys  Val  Leu  Ala  Asn  Arg  Glu  Leu  Asp  Lys
180                      185                      190
Tyr  Gly  Val  Ser  Asp  Tyr  His  Lys  Asn  Leu  Ile  Asn  Asn  Ala  Lys  Thr
195                      200                      205
Val  Glu  Gly  Val  Lys  Asp  Leu  Gln  Ala  Gln  Val  Val  Glu  Ser  Ala  Lys
210                      215                      220
Lys  Ala  Arg  Ile  Ser  Glu  Ala  Thr  Asp  Gly  Leu  Ser  Asp  Phe  Leu  Lys
225                      230                      235                      240
Ser  Gln  Thr  Pro  Ala  Glu  Asp  Thr  Val  Lys  Ser  Ile  Glu  Leu  Ala  Glu
245                      250                      255
Ala  Lys  Val  Leu  Ala  Asn  Arg  Glu  Leu  Asp  Lys  Tyr  Gly  Val  Ser  Asp
260                      265                      270
Tyr  Tyr  Lys  Asn  Leu  Ile  Asn  Asn  Ala  Lys  Thr  Val  Glu  Gly  Val  Lys
275                      280                      285
Ala  Leu  Ile  Asp  Glu  Ile  Leu  Ala  Ala  Leu  Pro  Lys  Thr  Asp  Thr  Tyr
290                      295                      300
Lys  Leu  Ile  Leu  Asn  Gly  Lys  Thr  Leu  Lys  Gly  Glu  Thr  Thr  Thr  Glu
305                      310                      315                      320
Ala  Val  Asp  Ala  Ala  Thr  Ala  Glu  Lys  Val  Phe  Lys  Gln  Tyr  Ala  Asn
325                      330                      335
Asp  Asn  Gly  Val  Asp  Gly  Glu  Trp  Thr  Tyr  Asp  Asp  Ala  Thr  Lys  Thr
340                      345                      350
Phe  Thr  Val  Thr  Glu  Lys  Pro  Glu  Val  Ile  Asp  Ala  Ser  Glu  Leu  Thr
355                      360                      365
Pro  Ala  Val  Thr  Thr  Tyr  Lys  Leu  Val  Ile  Asn  Gly  Lys  Thr  Leu  Lys
370                      375                      380
Gly  Glu  Thr  Thr  Thr  Glu  Ala  Val  Asp  Ala  Ala  Thr  Ala  Glu  Lys  Val
385                      390                      395                      400
Phe  Lys  Gln  Tyr  Ala  Asn  Asp  Asn  Gly  Val  Asp  Gly  Glu  Trp  Thr  Tyr
405                      410                      415
Asp  Asp  Ala  Thr  Lys  Thr  Phe  Thr  Val  Thr  Glu  Lys  Pro  Glu  Val  Ile
420                      425                      430
Asp  Ala  Ser  Glu  Leu  Thr  Pro  Ala  Val  Thr  Thr  Tyr  Lys  Leu  Val  Ile
435                      440                      445
Asn  Gly  Lys  Thr  Leu  Lys  Gly  Glu  Thr  Thr  Thr  Lys  Ala  Val  Asp  Ala
450                      455                      460
Glu  Thr  Ala  Glu  Lys  Ala  Phe  Lys  Gln  Tyr  Ala  Asn  Asp  Asn  Gly  Val
465                      470                      475                      480
Asp  Gly  Val  Trp  Thr  Tyr  Asp  Asp  Ala  Thr  Lys  Thr  Phe  Thr  Val  Thr
485                      490                      495
Glu  Met  Val  Arg  Tyr  Pro  Arg  Val  Asp  Leu  Gln  Pro  Ser  Leu  Ile  Ser
500                      505                      510
<---