Механизмы регуляции системы крови под влиянием гемостимуляторов на фоне цитостатической миелосупрессии

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СИСТЕМЫ КРОВИ ПОД ВЛИЯНИЕМ ГЕМОСТИМУЛЯТОРОВ НА ФОНЕ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ МИЕЛОСУПРЕССИИ

ЛА Гурьянцева, В.В. Удут, Е.В. Симанина, Т.Ю. Хричкова, В.В. Жданов

НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Изучали действие различных стимуляторов кроветворения на восстановление гранулоцитарного ростка в условиях миелосупрессии, вызванной введением циклофосфана. В работе использовали культуральные и морфологические методы исследования кроветворных клеток и гемопоэзиндуцирующего микроокружения. Показано, что гранулоцитарный колониестимулирующий фактор непосредственно стимулирует пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических клеток, пантогематоген усиливает пролиферацию гранулоцитов за счет активации регуляторных систем, D-глюкуроновая кислота и глицирам нормализуют структурно-функциональную организацию костного мозга, обеспечивая интенсивное созревание колониеобразующих единиц.

MECHANISMS OF BLOOD SYSTEM REGULATION UNDER THE INFLUENCE OF HEMOSTIMULATORS IN CONDITIONS OF MYELOSUPRESSION L.A. Guryantseva, V.V. Udut,

E.V. Simanina, T.Yu. Khrichkova, V.V. Zhdanov Pharmacology Research Institute of Tomsk Scientific Center, SB RAMS The effect of various hemopoiesis stimulators on the granulocytic stem-cell recovery under the condition of cyclophosphane-induced myelosupression was studied. Cultural and morphological methods of studying the hemopoietic cells and hemopoiesis-induced microenvironment were used. Granulocytic colony-stimulating factor was shown to stimulate proliferation and differentiation of hemopoietic cells. Pantogematogen enhanced proliferation of granulocytes due to activation of regulatory systems. D-glucuronic acid and glyciram normalized structural-functional organization of bone marrow producing the intensive maturation of colony-forming units.

Известно, что цитостатические препараты вызывают дизрегуляцию гемопоэза на разных уровнях организации контролирующих его систем, а также оказывают непосредственное токсическое влияние на гемопоэтические клетки, что приводит к угнетению кроветворения [1]. В связи с этим целенаправленная разработка высокоэффективных, патогенетически обоснованных методов фармакологической коррекции требует учета сложных механизмов функционирования кроветворной ткани в норме и при патологии. Такой подход к указанной проблеме открывает перспективу использования препаратов на основе производных гликозаминоглика-нов, рекомбинантных форм цитокинов, а также препаратов с ноотропным типом действия, способных корригировать возникающие нарушения в системе крови за счет модуляции функции гемопоэзиндуцирующего микроокружения, центральных нейроэндокринных механизмов регу-

ляции кроветворения либо изменения уровней цитокинов путем введения их извне [2].

В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение механизмов действия различных по своей природе гемостимуляторов на гра-нулоцитопоэз в сравнительном аспекте в условиях цитостатической миелосупрессии.

Методика исследования

Эксперименты проведены на 200 мышах -самцах линии CBA/CaLac в возрасте 2 - 2,5 мес. Животные I категории, конвенциональные линейные мыши, получены из коллекционного фонда лаборатории экспериментального моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. Животным вводили внугрибрюшинно однократно циклофосфан (ЦФ) в максимально переносимой дозе (250 мг/кг). После введения цитостатика мыши опытных групп получали per os

пантогематоген (!!!) («Пангопроею>, Бийск) семикратно по 50 мг/кг, подкожно гранулоцитар-ный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) (НИКТИ БАВ, Бердск) пятикратно по 125 мг/кг 1 раз в сутки ежедневно, глицирам (ГНЦЛС, Харьков) - per os 50 мг/кг 1 раз в сутки в течение 5 дней либо D-глюкуроновую кислоту (D-ГК) (Sigma, США) - внутривенно трехкратно в дозе 50 мг/кг на 3, 4, 5-е сут после введения ЦФ. Контрольным животным в аналогичных условиях вводили растворитель (дистиллированную воду) в эквивалентном объеме (0,2 мл). На 4, 5, 6,7,8,10 и 12-е сут после введения цитостатика определяли содержание грануломоноцитарных клеток-предшественников (КОЕ-ГМ) в костном мозге, их пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки, а также продукцию гуморальных гемопоэтических факторов отдельными фракциями гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) и структурно-функциональную организацию костного мозга [3].

Обработку полученных результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Проведенные исследования показали, что неодинаковый характер стимулирующего влияния сравниваемых препаратов на подавленный ЦФ гемопоэз обусловлен различными механизмами их действия. В частности, отмечались существенные различия содержания грануло-цитарно-макрофагальных предшественников в костном мозге опытных животных в зависимости от применяемого стимулятора. Так, выход прекурсоров грануломоноцитопоэза из суспензии костномозговых клеток мышей, получавших ПГ, достоверно возрастал на 5-е сут в 3,7 раза. И в дальнейшем, на 10-е, 12-е сут наблюдения содержание предшественников грануломоноцитопоэза в костном мозге мышей после применения гемостимулятора превосходило описанное в соответствующие сроки в контрольной группе. Мы предположили, что указанные изменения связаны с ускорением деления прекурсоров данного класса. И действительно, с 6-х сут наблюдалось опережающее возрастание их пролиферативной активности, а на 12-е сут эксперимента число ДНК-синтезирующих кле-

Рис. 1. Динамика содержания КОЕ-ГМ в костном мозге мышей (А), изменения скорости созревания предшественников грануломоноцитопоэза (Б), доля кроветворных клеток-предшественников грануломоноцитопоэза, находящихся в 8-фазе митотического цикла в костном мозге мышей (В) на фоне введения ииклофосфана (1), ииклофосфана и птицирама (2), циклофосфана и Г-КСФ (3), ииклофосфана и патогематогена (4), либо циклофосфана и 1>глюкуроновой кислоты (5).

По оси абсцисс - сроки исследования (сут), по оси ординат -содержание КОЕ-ГМ/105 нуклеаров (А), коэффициент дифференцировки (Б), % (В) (% от фона). Доверительные интервалы при р=0,05

ток-предшественников гранулоцитопоэза было достоверно выше контрольных значений (рис. 1А-В). В то же время рост гранулоцитарных колоний после применения Б-ГК был угнетен до 12-х сут с временным подъемом величины данного показателя на 8-е сут эксперимента.

Механизмы регуляции системы крови под влиянием гемостимуляторов

Это связано, вероятно, с различным соотношением процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток в динамике наблюдения, в частности, с более низкими темпами пролиферации кроветворных предшественников, начиная с 4-х сут после введения ЦФ, и активацией процессов созревания на 8-е, 10-е сут опыта (рис. 1А-В).

Изучение механизмов репарации кроветворной ткани под действием глицирама выявило постепенное накопление коммитированных клеток-предшественников в костном мозге мышей с максимумом на 10-е сут (количество КОЕ-ГМ в 2,3 раза превышало таковое у мышей, получавших только цитостатик), а также возрастание интенсивности созревания КОЕ-ГМ на А-е и 8 - 12-е сут эксперимента (рис. 1А, Б).

Введение Г-КСФ мышам, получавшим ЦФ, приводило к снижению количества гранулоцитар-ных прекурсоров во все сроки исследования с максимумом на 5-е сут (в 6 раз), несмотря на повышение их пролиферативной активности. Обнаруженный факт, с одной стороны, объясняется ускорением процессов созревания предшественников (величина коэффициента созревания возрастала на 5-е, 6-е сут опыта), с другой - их мобилизацией в периферическую кровь (рис. 1А-В), поскольку способность стимулировать выход стволовых клеток различных классов в циркуляцию является характерным свойством Г-КСФ [8].

В определении интенсивности пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток большое значение имеют гуморальные факторы, как содержащиеся в сыворотке периферической крови, так и вырабатываемые клетками ГИМ [5,6,9]. Результаты наших экспериментов также показали, что активация грануломоноцитопоэза стояла в связи с усилением либо секреторной активности клеток микроокружения, либо с повышением содержания цитокинов, составляющих КСА, в сыворотке крови после введения гемостимуляторов на фоне ЦФ. Так, Г-КСФ вызывал подъем уровня КСА в супернатантах от неприлипающих миелокариоцитов на 5,7 и 10-е сут после введения ЦФ и практически не изменял продукцию гуморальных активностей прилипающими элементами костного мозга и их содержание в сыворотке крови.

Пантогематоген, напротив, усиливал секрецию КСА клетками прилипающей фракции микроокружения на 10-е и 12-е сут в 12 и 8 раз соответственно и не оказывал влияния на его неприлипающие клетки. Применение препарата животного происхождения на фоне ЦФ приводило также к достоверному повышению КСА в сыворотке крови с 8-х по 12-е сут опыта (рис. 2А-В).

Рис. 2. Динамика уровней колонне стимулирующей активности от прилипающих (А), неприлипающих (Б) миелокариоцитов и в сыворотке крови (В) мышей на фоне введения циклофосфана (1), циклофосфана и глицирама (2), циклофосфана и Г-КСФ (3), циклофосфана и пантогематогена (4) либо циклофосфана и D-глюкуроновой кислоты (5). По оси абсцисс - сроки исследования (сут), по оси ординат - КОЕ-ГМ/105 миелокариоцитов (% от фона).

Доверительные интервалы при р=0,05

Л.А. ГУРЬЯНЦЕВА, В.В. УДУТ, ЕВ. СИМАНИНА, Т.Ю. ХРИЧКОВА, В.В. ЖДАНОВ

Т аблица

Динамика содержании гем о поэтических островков

Сроки исследования, Группы Махрофагнегатив.чые Грануло цитарные

сутки ЖИБС'ГНЬК островки островки

До введения 100* 13,14 100+ 10,41

4-е 1 45,6 ± 7,54* 110,8 ±83,28

2 41,62 ±25,41 26,49 ± 4,79*

3 428,57 ± 94.2Я*# 304,76 ± 72,85*

4

5 47,2 ± 7,54* 151,08 ± 18,27*

5-е 1 58,15 ± 3,01* 110,81 ± 15,1

2 272,54 ± 154,07 127.86 ±48.16

3 585,71±155,71*# 485,71±117,14*#

4 62,68 ± 4,47* 113,19 ± 15,62

5 100,67 ±6,02** 179,37* 13,33*#

6-е 1 94.41 ±3.6 119.86 ±28.33

2 125,57 ±36,6 96,61 ±13,04

3 871,42*104,28*# 908,57*88.09*#

4 129,85 ±9,68# 256,41 * 23,68*#

5 313,07± 21.72*# 140,84 ± 10.16

7-е I 94,36 ±6,02 118,38 ±5,26

2

3

4 ! 05.24 ± 17.58 209.73 ± 0.24*#

5 106.98 ± 4,53 175,66 ± 13,01*#

8-е 1 91,24 ± 13,06 78,8 ±6.05

2 134,72 ±63,06 123,52 ±6.13#

3 514,28 ±85,71*# 308.09 ±49.52*#

4 298,11 ± 9,64*# 476,11 ± 8,33*#

5 108,15* 19,27 131,75 ± 4,75*#

10-е 1 96,8 ± 7,2 93,2 ±5,3

2 131.6 ±96,6 101.69 ± 12.86

3 405 ±0,71*# 254,76 ±36,19*#

4 107,46 ± 6,33 186,16 ±7,91*#

5

12-е ] 98,3 ± 5,4 97,5 ±8,!

2 127,39 ±29,49 83,74 ±7.46

3 200 ±46,62 170 ±83,57#

4 139,93 ± 13,43 197 ±23,6*#

5

Примечания: * - отличил от исходного уровня достоверны (р<0,05), # - отличия от инпроля (группа 1) достоверны (р<0,05).

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2005. №3

Результаты выполненных исследований показали, что введение мышам препарата Б-ГК на фоне ЦФ приводило к возрастанию КСА сыворотки крови на протяжении всего эксперимента с максимальным значением на 5-е сут. Продукция КСА неадгезирующими миелокариоцитами возрастала до 600 % от такового в контрольной группе и оставалась повышенной до 8-х сут. наблюдения включительно (рис. 2А-В).

При введении глицирама уровень КСА прилипающих и неадгезируюших элементов возрастал на 4-е и 6-е сут соответственно. В то же время изменения показателей, характеризующих накопление соответствующих цитокинов в сыворотке крови мышей, получавших препарат солодки на фоне ЦФ, не являлись статистически значимыми (рис. 2А-В),

Изучение структурно-функциональной организации костного мозга позволило выявить увеличение выхода гемопоэтических островков, в особенности макрофаготрицательного типа, под действием всех исследуемых гемостимуляторов. Кроме того, изучение качественного состава ГО показало увеличение числа клеточных ассоциаций гранулоцитарного типа в костном мозге мышей всех опытных групп в различные сроки наблюдения, что обеспечивало накопление нейтрофильных гранулоцитов в кроветворной ткани и способствовало развитию нейтрофильного лейкоцитоза в периферической крови (таблица).

Таким образом, важнейшим эффектом Г-КСФ, наряду с запуском перераспределительных реакций в системе крови, является, несомненно, как непосредственная, так и опосредованная

ГИМ стимуляция процессов пролиферации и созревания гемопоэтических клеток. В то же время основной механизм действия ПГ на кроветворную ткань заключается в активации пролиферации миелокариоцитов за счет стимуляции прилипающих элементов микроокружения. Учитывая ноотропные свойства ПГ [7], можно предположить, что он обладает модулирующим действием в отношении центральных нейро-эн-докринных механизмов стимуляции гемопоэза. Механизм ускоренной дифференцировки гемопоэтических предшественников задействован в большей степени при использовании D-глюку-роновой кислоты и глицирама вследствие активной нормализации структурно-функциональной организации костного мозга. Вскрытые особенности механизмов действия изученных гемостимуляторов необходимо учитывать при разработке дифференцированных подходов к терапии цитостатических миелосупрессий.

Литература

1. Галъдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Роль гемопо эзиндуцирующего микроокружения при цитостатических миелосупрессиях. Томск, 1999.

2. Голъдберг Е.Д., Дыгай A.M., Агафонов В.И. и др. II Эксперим. и клин, фармакол. 1995. Т. 58, № I. С. 3 - 7.

3. Голъдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы куль туры ткани в гематологии. Тонек, 1992.

4. Гурьянцева Л.А., Поженько Н.С., Хричкова Т.Ю. II Бюл летень СО РАМН. 2000. № 2. С. 53 - 58.

5. Дыгай A.M., Клименко Н.А. Воспаление и гемопоэз. Томск, 1992.

6. Натан Д.Г., Зифф К.А. II Гематол. и трансфузиол. 1994. Т. 39, № 2. С. 3 - 10.

7. Суслов Н.И., Гурьянов Ю.Г. Продукция на основе пантогематогена. Новосибирск, 2004.

8. HoglundM. II Med. Oncol. 1998. Vol. 15. P. 229 - 233.

9. Wilson J.G. //ActaHaematoI. 1997. Vol. 97, № 1-2. P. 6-12.

Поступила 25.12.04