УКОРЕНЕНИЕ ГИБИСКУСА В МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ

УДК 2788

Амосова М.А.,

кандидат сельскохозяйственных наук, заведующая лабораторией вирусологии

Авакимян А.О. аспирант,

Северо-Кавказский федеральный научный центр садоводства, виноградарства, виноделия, г. Краснодар

УКОРЕНЕНИЕ ГИБИСКУСА В МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ

Аннотация

В данной статье изучена эффективность укоренения гибискуса (Hibiscus) в процессе микроклонального размножения. Описываются различные методы и техники, применяемые для увеличения процента успешного укоренения гибискуса. Было проведено сравнение различных субкультур и проведено анализ генетической стабильности укорененных растений. Полученные результаты позволяют оптимизировать процесс микроклонального размножения гибискуса и повысить его выживаемость и рост.

Ключевые слова:

укоренение, гибискус, микроклональное размножение, эффективность, генетическая стабильность.

Amosova M.A.

candidate of agricultural sciences heads the Virology Laboratory Avakimyan A.O. graduate student, North Caucasus Federal Scientific Center of Horticulture, Viticulture, Winemaking, Krasnodar

HIBISCUS ROOTING IN MICROCLONAL PROPAGATION Abstract

This article explores the effectiveness of hibiscus (Hibiscus) rooting in the process of microclonal propagation. Various methods and techniques used to increase the successful rooting percentage of hibiscus are described. A comparison of different subcultures and an analysis of the genetic stability of rooted plants were conducted. The obtained results enable the optimization of the microclonal propagation process of hibiscus and enhance its survival rate and growth.

Keywords:

rooting, hibiscus, microclonal propagation, effectiveness, genetic stability.

Более 250 видов, принадлежащих к семейству Malvaceae, включены в род Hibiscus. Они включают в том числе однолетние и многолетние травянистые формы и небольшие древесные кустарники. Современные сорта травянистого гибискуса получены с участием многочисленных природных видов (H.cocineus, H.militaris, H.moscheutos, H.grandiflorus и др.), Различные виды гибискуса используются в пищевой, фармацевтической промышленности и как декоративные растения[11].

Е.Л. Тыщенко (2019) отмечает большую перспективность гибридных гибискусов для использования

в ландшафтном дизайне[5]. Имеются данные о перспективности экстракта Hibiscus rosa-sinensis L. (китайской розы) для лечения паркинсонизма у людей, поскольку содержащиеся в нем антоцианы -мощные антиоксиданты, снижающие окислительное повреждение нейронов и подавляющие гибель дофаминергических клеток[2]. Таким образом, потребность в массовом размножении гибискуса большая.

Традиционно гибискус размножают укоренением черенков одревесными или зелеными черенками, семенами и отводками (как правило, воздушными). Для стимулирования корнеобразования рекомендуется обработка черенков фитогормонами [3, 6]. По данным У.И. Рузметова (2017) в этих целях используется индолилмасляная кислота (ИМК) в водных растворах в концентрации 0,005 % при продолжительности обработки черенков 12часов, а также гибереллин в концентрации 200 мг/л с экспозицией 16 часов. Отмечается, что более высокие концентрации снижают эффективность укоренения и биометрические показатели растений.

Большинство современных исследователей отмечают, что вегетативное размножение гибискусов малоэффективно. Причина этому - сравнительно низкая укореняемость черенков, большие трудозатраты и длительный период времени. Поэтому размножение гибискуса в промышленных масштабах целесообразно проводить методами микроклонального размножения.

Микроклональное размножение (микроразмножение) - технология быстрого размножения исходного растительного материала в тканевой культуре для получения большого количества растений. Это позволяет производить целые растения из небольших количеств частей растения, таких как корни, листья или стебли, или даже из одной клетки растения в лабораторных условиях.

Микроразмножение дает возможность быстрого размножения генетически модифицированных сортов, бессеменных сортов или тех растений, которые плохо реагируют на вегетативное размножение. Технология позволяет круглогодично получать достаточное количество посадочного материала, повышать его однородность, дает возможность длительно хранить генетический материал и создавать новые генотипы, а также исключает заражение растений патогенами. С помощью микроклонального размножения возможно быстрое получение стабильно качественного и здорового посевного материала, что успешно применяется для массового производства безвирусного посадочного материала ряда технических, овощных, плодовых и ягодных культур, культур промышленного цветоводства и др.

Технология представляет собой изоляцию почек илимеристем растения с последующим их культивированием на средах сфитогормонами и индукцией побегообразования. Чаще всего для микроразмножения используют активацию развития меристем (апикальных, пазушных и спящих почек, интеркалярных зон стебля)[7].

Ниже будет приведен обзор технологий, применяемых в микроклональном размножении гибискуса.

S.S. Kumar (2016) было проведено микроразмножения Hibiscus sabdariffa эксплантов пазушных почек. Мультипликации побегов проводилась на базовой среде Мурашиге и Скуга (MS - Murashige and Skoog, 1962)с добавлением 2,0 мг/л бензиламинопурина (БАП), 0,5 мг/л индол-3-уксусной кислоты (ИУК) и 10 мкМ нитрата серебра, что позволило получить 7- 8 побегов / эксплант. или 20 мкг/л триаконтанола (4-5 побегов / эксплант). Самая высокая частота удлинения и укоренения побегов была получена на среде MS с концентрацией 0,5 с добавлением 0,1-0,5 мг/л гибберелловой кислоты (ГК-3), на этой среде также хорошо шло дальнейшее разрастание побегов [9].

Seo S. G. et al. (2017) использовали экспланты листа, черешки и корня. Эффективность регенерации была самой высокой у корней и самой низкой - у листьев. Хотя частота дифференциации побегов от листовых эксплантов составляла всего 50%, авторы считают его более перспективным для использования в микроклонировании, так как листья - более доступный материал. Стерилизацию проводили в 70% этаноле (30 сек), после промывания выдерживали 1 мин. в 1% -ном растворе гипохлорита натрия.

Культивация эксплантов проводилась на среде MS, рH = 5,8 с добавлением регуляторов роста. Для быстрой индукции побегов наиболее эффективным оказался тидиазурон (ТДЗ) в концентрации 0,01 мг/л в среде MS, для увеличения количества побегов - и сочетание 0,01 мг/л ТДЗ и 1,0 мг/л БАП в среде 0,5 MS. По данным авторов, укоренение H. syriacus, на которое обычно требуется 1 месяц, полностью зависело от экзогенного ауксина. Для укоренения в среде MS половинной концентрации с добавлением 1,0 мг/л индол-3-уксусной кислоты (ИУК) требовалось 18,5 дней. Другие концентрации ИУК задерживали укоренение на 1-3 дня [14].

В работе М.М.Середы (2018) в качестве эксплантов использовались пазушные почки гибридных сортов гибискуса. Наиболее эффективная стерилизация обеспечивалась 10% раствором перекиси водорода. Для введения побегов в культуру предложена среда Андерсона без добавления фитогормонов, на которой активация начиналась на 2-й неделе культивирования. Наиболее высокий коэффициент размножения (3-3,5) при мультипликации побегов был достигнут на среде Андерсона с добавлением бензиламинопурина в концентрации 0,2 мг/л. Корнеобразование на полученных побегах эффективно происходит на безгормональной среде Андерсона на 2-й неделе культивирования. Укоренившиеся побеги адаптировали на торфо-песчаном субстрате в соотношении 1:1, через 3 недели высаживали в открытый грунт [4].

Greenwell Z. L. (2018) проведена оценка эффекта глутамина, добавленного в среду для тканевых культур с действием других регуляторов роста. Глутамин обеспечивает более высокое потребление азота, и используется для стимуляции процессов дифференциации тканевых культур, индукции каллуса, муьлтипликации побегов, укоренения. В качестве эксплантов использовались листья H. Moscheutos. Культивирование тканей проводили на среде MS, дополненной 30г сахарозы и 7 г агара, pH = 5.7.

Для укоренения выбирали двухузловые побеги и переносили на среды MS с добавлением регуляторов роста - БАП (6-бензиламинопурин), ГК-3 (гибберелловая кислота), ТДЗ (тидиазурон) или аминокислоты глутамина. Добавление в среду 50 мг/л глутамина способствовали укоренению 90% побегов, это превосходило результаты других регуляторов роста. Побеги на среде с ГК-3 не укоренялись вообще. Добавление БАП в концентрации 1,5 мг/лпоказало большую эффективность в индукции разрастания побегов [9].

Проведено микроклональное размножение сорта H. rosa-sinensis с использованием фенилмочевины (Faisal M. et al., 2020). N- (2-хлор-4-пиридил) - N'-фенилмочевина (4-CPPU) стимулировала образование побегов в концентрации 2,5 мкМ на среде МС, pH-5,8.После восьми недель культивирования на этой среде было получено в среднем 6,7 побегов с высотой побегов 4,2 см от каждого экспланта. Регенерированные скопления побегов растений субкультивировали на новой среде каждые две недели до начала процесса укоренения. Укоренение побегов длиной 4-5 см проводилось через 8 недель на среде 0,5МС с добавлением 0,5 мкМ ИМК (индол-3-масляная кислота).Через 6-недельного выращивания на среде для укоренения проростки высадили в горшки с почвенной смесью и выращивали с 16-часовым периодом освещения. и дневными / ночными температурами 24/16 ±2°C. Для орошения в течение нескольких недель использовали раствор половинной соли MS, а затем - воду. Через 4 недели здоровые акклиматизированные растения поместили в теплицу при нормальных климатических условиях [8].

Проведено микроклонирование гибридных сортов гибискуса из эксплантов - сегментов черенков с верхушечной и пазушной почками (Lobodina E. et al., 2020). Результат дезинфекции составил 85% (70% спирт в течение 1 мин., после промывания водой помещали в раствор 0,5% активного хлора на 12 мин.). Эффективная инициация достигалась на питательной среде DKW, содержащий 6 г/л агар-агара, 30 г/л сахарозы,0,5 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП). Автоклавировали 20 мин. при 121°C, pH среды 5,9. Пересев на свежую питательную среду проводили каждые 3-4 недели. Отмечено снижение всхожести при повышении концентрации 6-БАП. Корнеобразование началось на второй неделе выращивания.

Укоренение проводилось после 5-6 пересевов на безгормональной среде DKW, что дало 100% результат.

Укорененные растения высаживали в емкости со стерильным субстратом, состоящим из садовой земли, торфа, вермикулита, песка в соотношении 1: 1: 0,5: 0,5. Адаптировали при освещении 1500 Лки температуре 24-25° С, поддерживая высокую влажность (85%) до появления первого нового листа[11].

PlessisH. J. (2021) отмечает, что при культивировании на средах без регуляторов роста лучшую выживаемость показывают более крупные экспланты (3-4 узла) по сравнению с 1-2-х узловыми.

Расположение экспланта при инокуляции предпочтительнее вертикальное, чем горизонтальное (впоследствии укоренились соответственно 40% и 15%). Лучший результат индукции побегов был достигнут на эксплантах из базальных побегов при культивировании ввертикальное положение на среде без БАП. Добавление БАП к среде MSухудшало образование корней. Авторы считают, что для акклиматизации в почве нужны среды без добавления регуляторов роста, так как образование придаточных корней может тормозиться высокими концентрациями цитокининов.

Акклиматизацию саженцев проводили в горшках с влажным вермикулитом, с поддержанием влажного микроклимата. Через 2-3 недели растения пересаживали в субстрат из смеси почвы, вермикулита песка в соотношении 5: 3: 1[12].

Sakhanokho Н. F (2021) отмечает, что использование листовых и корневых эксплантов Н. moscheutos малоэффективно, большинство из них гибнет. При этом отмечается феномен ризогенеза у некоторых листовых эксплантов через 28-42 дней культивирования, без образования побегов. Использовались экспланты с 2 узлами и экспланты верхушечных побегов на среде MS с добавлением регуляторов роста цитокининов - 6 -бензиламинопурина (БАП) и мета-тополина (МТ). Несмотря на образование множественных побегов, высокие концентрации регуляторов роста (4 или 6 мкМ) препятствовали образованию корней у эксплантов, даже после 90 дней культивирования. Результат был достигнут при переносе растений после 56 дней культивировании на среде MS с добавлением 2 мкМ или 4 мкМ на среду без регуляторов роста, что существенно улучшило корнеобразование в течение последующих 49 дней. Укоренение и адаптацию проводили на субстрате из тонкоизмельченной сосновой коры, при начальных параметрах микроклимата - 26° С, влажность 70%. С 3-го по 7-й день постепенно проводили акклиматизацию[7].

Использование зрелых листьев в качестве экспланта изучалось Son J. Н. et а1. (2019). Для каллусообразования оптимальной оказалась модифицированная среда MS, содержащаяе 0,46 мг/л нафталинуксусной кислоты (НУК) и 0,5 мг/л БАП. Затем каллуспомещали в среду для повторной дифференцировки содержащую 0,5 мг/л БАПи культивировали в течение 3 недель. Сформированные побеги отрезали от каллуса и культивировали в среде MS с добавлением ГК-3 в концентрации 0,5 мг/л. Для индукции укоренения ростки, вырастающие более чем примерно на 1 см, переносили и в среду с добавлением ИУК (индоламиноуксусная кислота) 0,5 мг/л, которая показала хорошее укоренение побегов. Все эксперименты по повторной дифференцировке проводили при 23 ± 1 ° С и 16-часовом фотопериоде.Установлено, что комбинированная обработка гормонами роста НУКи БАП подходит для индукции каллуса из «поврежденных» эксплантов зрелых листьев[14].

Таким образом, при микроклональном размножении гибискуса в основном применяют экспланты побегов, которые дают более надежный результат. Перспективным является использование эксплантов листьев, как более доступных. Необходим оптимальный подбор сред на каждом этапе культивирования. Обычно используются питательный среды MS, а также среда Александера и DKW. На разных этапа культивирования среды модифицируются различными добавками для оптимизация процессов.

Так, для каллусообразования и роста побегов используются регуляторы роста - чаще всего 6-бензиламинопурин, а также гиберрелловая кислота, тидиазурон, индол-3-уксусная кислота, нафталинуксусная кислота, а также аминокислоты (глутамин), фенилмочевина и др.

Многие авторы отмечают, что гормоны роста, в частности, гиберрелования кислота, 6-БАП, мета-

тополин могут угнетать ризогенез, особенно в высоких концентрациях. Для корнеобразования выбирают безгормональные среды, либо среды с добавлением индол-3-уксусной кислоты или индол-3-масляной кислоты.

Для акклиматизации побегов используют различные субстраты -вермикулит, торф, песок, почву в различных соотношениях. На ранних этапах поддерживают относительно высокую (24-26°С) температуру и влажность 70-85%.

Список использованной литературы:

1. Ишмуратова, М.М. Клональное микроразмножение in vitro: выбор эксплантов (на примере видов рода Valeriana) / М.М.Ишмуратова, Н.И. Барышникова, Э.М. Газиева // Вестник ПГУ. Биология. 2017. №4. - С. 442-449.

2. Колдаев В. М., Кропотов А. В. Антоцианы в практической медицине //Тихоокеанский медицинский журнал. - 2021. - №. 3 (85). - С. 24-28.

3. Рузметов У. И., Юнусов А., Хаитов Ж. Влияние гиббереллина на рост и развитие гибискуса сирийского вырашенного методом зеленого черенкования //перспективы развития науки и образования в современных экологических условиях. - 2017. - С. 369-374.

4. Середа М. М., Васильченко Е. В., Верещагина А. В. Микроклональное размножение гибридных сортов гибискуса (Hibiscussp.) //Биология клеток растений invitro и биотехнология. - 2018. - С. 204-205.

5. Тыщенко Е. Л., Мищенко И. Г., Кащиц Ю. П. Формирование адаптивного сортимента гибридного травянистого гибискуса (Hibiscusxmoschetousl.) В условиях южного садоводства //Плодоводство и виноградарство Юга России. - 2019. - №. 58. - С. 166-179.

6. Ширшова Д. С., Карпухин М. Ю. Размножение гибискуса //Современное направление в плодоовощеводстве и декоративном садоводстве. - 2020. - С. 10-11.

7. Espinosa-Leal C. A., Puente-Garza C. A., García-Lara S. In vitro plant tissue culture: means for production of biological active compounds //Planta. - 2018. - Т. 248. - №. 1. - С. 1-18.

8. Faisal M. et al. Effects of 4-CPPU on in vitro multiplication and sustainable generation of Hibiscus rosa-sinensis L.'White Butterfly' //Saudi journal of biological sciences. - 2020. - Т. 27. - №. 1. - С. 412-416

9. Greenwell Z. L., Ruter J. M. Effect of glutamine and arginine on growth of Hibiscus moscheutos "in vitro" //Ornamental Horticulture. - 2018. - Т. 24. - С. 393-399.

10.Kumar S. S., Manoj P., Giridhar P. Micropropagation for mass multiplication and enriched production of ascorbic acid in tissue culture foliage of roselle (Hibiscus sabdariffa L.) //In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. - 2016. - Т. 52. - №. 4. - С. 427-436.

11.Lobodina E. et al. Micropropagation of Hardy Hibiscus (Hibiscus Moscheutos L.) //BIO Web of Conferences. -EDP Sciences, 2020. - Т. 25.

12.Plessis H. J. et al. Preliminary study on in vitro shoot culture of Hibiscus coddii subsp. barnardii, an indigenous South African flowering plant //Ornamental Horticulture. - 2021. - Т. 27. - С. 408-416.

13. Sakhanokho H. F. et al. Micropropagation of Hibiscus moscheutos L.'Luna White': effect of growth regulators and explants on nuclear DNA content and ploidy stability of regenerants //In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. - 2021. - С. 1-9.

14.Seo S. G. et al. Development of an efficient protocol for high-frequency regeneration system in Hibiscus syriacus L //Journal of Plant Biotechnology. - 2017. - Т. 44. - №. 2. - С. 164-170.

15. Son J. H. et al. Establishment of an efficient regeneration system for Hibiscus syriacus 'Nanpa' //Journal of Plant Biotechnology. - 2019. - Т. 46. - №. 4. - С. 297-302.

© Амосова М.А., Авакимян А.О., 2023