Консервирование ядерных клеток крови при температуре +2÷0°с

УДК 615.38.014.41

КОНСЕРВИРОВАНИЕ ЯДЕРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ +2-0С

Д. С. Лаптев

Лейкоцитный концентрат как трансфу-зионная среда в силу быстрой потери жизнеспособности клеток и трудностей получения терапевтических доз нуждается в разработке надежных методов консервирования. Наиболее эффективным способом долгосрочного хранения лейкоцитов является замораживание. Но когда речь идет о кратковременном хранении (до 5—6 суток), использование низкотемпературных методов консервирования представляется весьма трудоемким и дорогостоящим. Альтернативным является хранение белых клеток крови в условиях гипотермии. Известно [1], что снижение температуры от физиологических значений до 0°С сопровождается изменением свойств жидкой среды, ведущим к структурной нестабильности и развитию комплекса биохимической патологии в клетке. При хранении лейкоцитов при +4°С процессы деструкции начинают развиваться уже в первые сутки хранения [4], однако применение консервирующих растворов, регулирующих энергетический обмен клеток, позволяет продлить срок сохранности. Например, еще в 1968 г. Минздравом СССР для консервирования лейкоцитов крови человека при температуре холодильника (+4^—6°С) был утвержден консервирующий раствор, содержащий сахарозу, глюкозу, аскорбиновую кислоту, левомицетин, ЭДТА Ш2, желатину и бидистиллированную воду, под защитой которого через 5 дней хранения жизнеспособными (устойчивыми к витальному красителю) остаются 70—80% клеток. Необходимо отметить, что антикоа-

гулянт ЭДТА Ш2 является токсичным, антибиотик левомицетин может вызвать аллергические реакции, а желатина, по причине большой молекулярной массы, может седи-ментировать эритроциты при внутривенном введении. Следовательно, вопрос разработки новых малотоксичных консервирующих растворов остается открытым, а температура +2^0°С для хранения ядерных клеток, судя по имеющимся публикациям, мало изучена.

Методика исследования

Для достижения данной цели нами использован оригинальный ограждающий раствор (патент РФ № 2311027 от 27.11.2007 г.), который не требует отмывания от клеточной суспензии перед применением ввиду отсутствия токсичности. Данный раствор содержит ингредиенты только отечественного производства: криопротектор смешанного действия (производное мочевины), реставрирующую добавку (производное янтарной кислоты), желатиноль, цитрат натрия, глюкозу и бидистиллированную воду.

В качестве объекта исследования использованы лейкоцитные концентраты (ЛК), полученные из цельной крови доноров-добровольцев с их информированного согласия путем цитафереза (центрифуга SorveП (США), 2500 об/мин, c охлаждением в течение 5 минут). Среднее количество биообъекта в пластикатном контейнере «Компопласт-300» составляло 25±5 мл.

Пермский медицинский журнал

2008 том XXV № 5

Выполнено две серии исследований (в каждой и=10). В контрольной серии на-тивный ЛК, а в опытной — нативный ЛК, смешанный в соотношении 1:1 с криопро-текторным раствором и выдержанный при комнатной температуре 20 минут, помещали в холодильник (+2^0°С) в полипропиленовых пробирках по 1,5 мл на хранение. Отогрев производили через 4, 6 и 7 суток в условиях комнатной температуры в течение 2— 3 минут при покачивании пробирки 2 раза в секунду.

Подсчет количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы проводили с использованием общепринятых в клинико-лаборатор-ной практике методов, жизнеспособность лейкоцитов определяли с помощью витального красителя эозина [5], фагоцитарную активность нейтрофилов — по модифицированному методу С. Г. Потаповой и соавторов [5], сохранность лизосомально-

катионных белков (ЛКБ) в нейтрофилах оценивали по методу А. А. Славинского, Г. В. Никитиной [6], содержание супероксидного анион-радикала в нейтрофилах определяли с помощью НСТ-теста [2].

При статистической обработке полученных данных вычисляли среднее арифметическое значение и среднее квадратичное отклонение, достоверность (р<0,05) различий между показателями оценивали по парному критерию Уилкокосона [3].

Результаты исследования

Установлено, что уже на 4-е сутки хранения лейкоцитов при температуре +2^0°С количество эозинорезистентных клеток и число гранулоцитов в опытной серии (с применением консервирующего раствора) достоверно выше, чем в контрольной (табл. 1). Кроме того, наработка суперок-

Таблица 1

Сохранность лейкоцитов при температуре +2^0°С

Морфофункциональный показатель (в % к исходному уровню) Контроль Опыт

Количество клеток в 1 мкл 4 суток 80,2±6,8 84,0±15,9

6 суток 75,7±12,1 86,9±7,2*

7 суток 68,6±11,2 79,6±11,6 *

Эозинорезистентность 4 суток 67,8±5,0 92,8±5,5 *

6 суток 45,1±18,7 84,1±6,3 *

7 суток 30,1±4,5 45,0±12,8 *

Гранулоциты 4 суток 58,4±9,3 95,2±14,8 *

6 суток 25,4±7,3 64,8±5,5 *

7 суток 23,4±9,7 55,7±9,3 *

Фагоцитарная активность нейтрофилов 4 суток 60,1±7,2 57,8±9,9

6 суток 16,8±8,5 53,4±8,7 *

7 суток 12,8±3,4 20,0±4,8 *

Средний цитохимический коэффициент (ЛКБ-тест) 4 суток 94,9±4,0 96,5±6,1

6 суток 89,3±8,3 97,2±8,4 *

7 суток 87,5±8,0 95,8±4,2 *

Количество НСТ-положительных нейтрофилов 4 суток 169,5±24,2 120±4,4 *

6 суток 218,8±31,8 179,2±15,5 *

7 суток 445,4±54,8 383,0±6,7 *

Примечание. * — данные достоверно (р<0,05) отличаются от данных контрольной серии.

сидного анион-радикала в нейтрофилах опытной серии по сравнению с контрольной была достоверно ниже, что указывает на большую степень стабилизации процессов метаболизма в данных клетках. На 6-е сутки хранения в опытной серии отмечается достоверно высокий уровень общего количества лейкоцитов и нейтрофилов, способных к фагоцитозу, а также повышенное содержание в них лизосомально-катионных белков, обеспечивающих микробицидность без участия кислорода. Таким образом, предложенный нами метод консервирования ядерных клеток крови в условиях околонулевых температур (+2^0°С) с применением нового нетоксичного консервирующего раствора позволяет увеличить срок хранения ядерных клеток крови до 6 суток включительно и может быть рекомендован к применению в научно-исследовательских учреждениях биологического и медицинского профиля.

Библиографический список

1. Белоус А. М. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении/ А. М. Белоус, В. А. Бондаренко.— Киев: Нау-кова думка, 1982.— 256 с.

2. Герасимов И. Г. Функциональная неравнозначность нейтрофилов крови человека: генетика активных форм кислорода/ И. Г. Герасимов, Д. Ю. Игнатов///Цитология.— 2001.— Т. 43.— № 5.— С. 432—436.

3. Гланц С. Медико-биологическая статистика/С. Гланц.— М.: Практика, 1998.— 459 с.

4. Румянцев А. Г. Клиническая трансфузио-логия/А Г. Румянцев, О. А Аграненко.— М.: ГЭОТАР «Медицина», 1998.— 575 с.

5. Способ введения лейкоцитов крови человека в холодовой анабиоз при -50°С/ Е. П. Сведенцов, Т. В. Туманов, С. А Якшина и др.//Бюл. эксперим. биол. и мед.— 2003.— Т. 136.— № 11.— С. 594—597.

6. Славинский А. А. Цитохимическое выявление катионных белков в гранулоцитах крови амидочерным 10Б для визуальной оценки и компьютерного анализа изображения/А. А. Славинский, Г. В. Никитина/ /Клиническая лабораторная диагностика.— 1999.— № 2.— С. 35—37.

D. S. Laptev

CONSERVATION OF NUCLEAR BLOOD CELLS AT THE TEMPERATURE +2-0C

Comparative investigation of functional properties of leukocytes stored at the temperature of +2^0°C under protection of original preserving low-toxic solution requiring no washing before application was fulfilled. Use of the given solution permits to preserve leukocytes in functionally adequate state during 6 hours.

Keywords: leukocytes, temperature close to 0°C, preservative.

Лаборатория криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН,

г. Сыктывкар

Материал поступил в редакцию 07.02.2008