Композиция, снижающая окислительный стресс в глазу
COMPOSITION WHICH REDUCES OXIDATIVE STRESS IN EYE

Изобретение относится к области химической энзимологии и лекарственных средств для местного применения и касается композиции, которая может быть использована при лечении воспалительных процессов, сопровождающихся окислительным стрессом в глазу.
Известна композиция, снижающая окислительный стресс в глазу, состоящая из антиоксидантного фермента пероксиредоксина VI и дигидролипоевой кислоты, которая может быть использована при лечении воспалительных процессов в глазу (патент RU 2280448 С2, A61K 31/38, 2004, см. описание).
Данная композиция содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как использование в составе композиции антиоксидантного фермента.
Известна композиция, снижающая окислительный стресс в глазу, состоящая из кальций-фосфатных биодеградируемых наночастиц, покрытых дисахаридами, с включениями антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы (СОД) (патент RU 2577236 C1, A61K 33/08, 2014).
Данная композиция содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как использование в композиции суспензии частиц, содержащих антиоксидантный фермент СОД.
Наиболее близким к заявляемому является известная композиция, снижающая окислительный стресс в глазу, состоящая из фосфатного буферного раствора и действующего вещества на основе частиц антиоксидантного фермента СОД, покрытой сшитым блок-сополимером (блок-СПЛ) метокси-поли (этиленгликоля) и поли(L-лизина) (патент RU 2508123 C1, A61K 33/44, 2012 - прототип, см. описание).
Данную композицию получали путем диспергирования 1 мг действующего вещества в 3,2 мл фосфатного буферного раствора, что
соответствует композиции, содержащей 0,03 мас. % действующего вещества, а остальное буферный раствор (см. пример 4 прототипа).
Данная композиция содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как наличие в композиции фосфатного буферного раствора и действующего вещества на основе частиц антиоксидантного фермента СОД.
Для лечения любых, в том числе офтальмологических заболеваний, сопровождающихся (обусловленных) окислительным стрессом, необходимо, чтобы действующее вещество в композиции на основе частиц, содержащих антиоксидантный фермент СОД, обладало высоким суммарным выходом СОД по активности у частиц, рассчитанным как произведение выхода СОД по активности у частиц и выхода СОД у них по белку, стабильностью значений активности СОД у них в процессе хранения, а также стабильностью размеров частиц в процессе их хранения. Значения вышеуказанных параметров в прототипе не приведено, однако, в прототипе указано, что используемые в композиции частицы были получены по методике (патент США 2010/0291065 А1, 2010). Однако и в данном патенте вышеуказанные параметры не приведены.
Проведенный контрольный опыт (см. пример 7) показал, что недостатками известного технического решения действительно являются относительно низкий суммарный выход СОД по активности у использованных в композиции частиц, недостаточная стабильность значений активности СОД у частиц в процессе их хранения и недостаточная стабильность размеров частиц в процессе хранения.
Техническая проблема изобретения заключается в создании композиции, снижающей окислительный стресс в глазу, лишенной вышеуказанных недостатков.
Технический результат изобретения состоит в увеличении суммарного выхода СОД по активности у частиц в композиции и повышении стабильности значений активности СОД у частиц в процессе их хранения и стабильности размеров частиц в процессе хранения.
Предварительно были проведены эксперименты с различными композициями, снижающими окислительный стресс в глазу, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда композиция, снижающая окислительный стресс в глазу, состоящая из фосфатного буферного раствора и действующего вещества на основе частиц антиоксидантного фермента СОД, в качестве действующего вещества она содержит частицы, полученные путем смешения буферных растворов СОД в концентрации 2,5-10,0 мг/мл и поликатиона в концентрации 2,5-10,0 мг/мл, где поликатион выбирают из группы, включающей протамин, полилизин и полиаргинин, перемешивания и выдерживания смеси, добавления в нее буферного раствора полианиона в концентрации 2,5-10,0 мг/мл, где полианион представляет собой блок-СПЛ полиглутаминовой кислоты (ПГ) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) или блок-СПЛ полиаспарагиновой кислоты (ПА) и ПЭГ, перемешивания и выдерживания полученной смеси с последующим добавлением в смесь водного раствора глутарового альдегида, взятого в количестве, обеспечивающем его мольное соотношение с аминогруппами поликатиона 0,3-1,5, выдерживанием смеси, добавлением в смесь водного раствора боргидрида натрия в концентрации 1-2 мг/мл и очисткой смеси с использованием мембранной фильтрующей системы с пределом пропускания 90-130 килодальтон (кДа) при конечном значением рН композиции 6,8-7,6 и следующем соотношении компонентов, мас. %:
действующее вещество
0,01-2,00
буферный раствор
остальное
Предлагаемая композиция является новой и не описана в патентной и научно-технической литературе. Используемые в композиции частицы, также является новыми.
Данная композиция может быть использована в качестве лекарственного средства местного применения при лечении глазных заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом, например, таких как, иммуногенный увеит, химический ожог роговицы глаза, первичная открытоугольная глаукома и др. Однако, в других источниках информации отмечалась перспективность применения нативной СОД при увейте [de Kozak Y., Nordman J.P., Faure J.P., Rao N.A., Marak G.E. Effect of antioxidant enzymes on experimental uveitis in rats. (1989) Ophtalmic. Res., 21, 230-234. Yamada M., Shichi H., Yuasa Т., Tanouchi Y., Mimura Y. Superoxide in ocular inflammation: human and experimental uveitis. (1986) J. Free Radio. Biol. Med., 2, 111-117], а также при повреждении глаза щелочью [Alio J.L., Ayala M.J., Mulet M.E., Artola A., Ruiz J.M., Bellot J. Antioxidant therapy in the treatment of experimental acute corneal inflammation. (1995) Ophtalmic. Res., 27, 136-143]. При лечении тяжелых форм заболеваний может быть использовано комплексное лечение, включающее совместное использование предлагаемой композиции и других лекарственных средств.
Все реагенты и расходные материалы (фильтрующие мембраны), использованные при создании данной композиции, коммерчески доступны. Так, СОД коммерчески доступна (http://sodferment.ru, ООО НПП «Ферментные технологии», Россия) и является известным антиоксидантным ферментом, инактивирующим супероксидные радикалы [McCord J.М., Fridovich I. Superoxide dismutase an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein) // Journal of Biological chemistry. - 1969. - T. 244. - №. 22. - C. 6049-6055.].
Использованные в качестве поликатиона протамин, полилизин или полиаргинин также коммерчески доступны (Sigma-Aldrich, США). Использованные в качестве полианиона блок-сополимеры ПГ-ПЭГ и ПА-ПЭГ, можно заказать (Alamanda Polymers, США). Глутаровый альдегид также коммерчески доступен и является, как известно, неизбирательным сшивающим агентом химических соединений, содержащих первичные аминогруппы [Migneault I. et al. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking // Biotechniques. - 2004. - T. 37. - №. 5. - C. 790-802.]. Боргидрид натрия является широко распространенным восстанавливающим агентом (Sigma-Aldrich, США). Используемые при получении предлагаемой композиции ультрафильтрационные мембраны (фильтры) можно заказать (Sigma-Aldrich, США).
2
Предлагаемая фармацевтическая композиция может быть получена при использовании любого водного буферного раствора, содержащего по крайней мере, гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия. Кроме этого используемый буфер может также содержать различные целевые добавки, например, такие как, NaCl, CaCl, глюкоза, KCl и др. При этом концентрация вышеуказанных реагентов, ионная сила раствора и значения рН буферного раствора (буфера) могут быть различными, однако конечное значение рН композиции должно находиться в диапазоне 6,8-7,6, который физиологически приемлем для офтальмологии. Изменение исходных значений рН буферного раствора при получении до оптимальных его конечных значений в композиции 6,8-7,6 при необходимости может быть достигнуто в процессе очистки суспензии полученных частиц с использованием мембранной фильтрующей системы с пределом пропускания 90-130 кДа.
При получении используемых в композиции частиц концентрация СОД в буферном растворе составляет 2,5-10,0 мг/мл. При этом
концентрация поликатиона в буферном растворе может варьироваться и составлять 2,5-10,0 мг/мл. Следует отметить, что при получении частиц раствор поликатиона следует по каплям добавлять к раствору СОД при перемешивании. Если вышеуказанные растворы смешивать не по каплям, а, например, за один прием, то возрастает вероятность образования частиц с широким распределением по размеру, что нежелательно, поскольку это затрудняет очистку суспензии частиц. При этом количество использованных СОД и поликатиона может варьироваться, однако заряд СОД после модификации поликатионом должен быть положительным для обеспечения возможности последующего покрытия частиц слоем одного из вышеуказанных полианионов. После смешения компонентов полученную смесь необходимо выдерживать при перемешивании в течение, например, 25-40 мин для обеспечения возможности получение более однородных по размеру частиц, затем по каплям добавлять в нее водный буферный раствор одного из вышеуказанных блок - СПЛ. Если растворы смешивать не по каплям, а, например, за один прием, то возрастает вероятность образования частиц с широким распределением по размеру, что нежелательно, поскольку это затрудняет очистку суспензии частиц. При проведении данной стадии синтеза концентрация блок-СПЛ в буферном растворе может варьироваться и составлять 2,5-10,0 мг/мл. При этом общее количество использованных СОД и блок-СПЛ может варьироваться, однако после повторной модификации заряд полученных частиц СОД должен поменять знак, т.е. стать отрицательным.
Образование в предлагаемом техническом решении на частицах СОД слоя поликатиона в ходе вышеуказанной обработки антиоксидантного фермента буферным раствором поликатиона, а также образование дополнительного внешнего слоя из блок-СПЛ в ходе обработки модифицированной СОД буферным раствором полианиона подтверждено
инструментальными методами, такими как тушение флуоресценции и динамическое светорассеяние.
После смешения вышеуказанных компонентов полученную смесь перемешивают и выдерживают в течение, например, 25-40 мин для обеспечения возможности получение более однородных по размеру частиц. При этом для обеспечения сохранности активности фермента СОД выдерживание целесообразно проводить при пониженной относительно комнатной температуре, например, в холодильнике при 3-8°С.
После окончания данной стадии синтеза в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют свежеприготовленный водный раствор глутарового альдегида. При этом экспериментально было показано, что для увеличения суммарного выхода СОД по активности у частиц, повышения стабильности значений активности СОД у частиц в процессе их хранения и повышения стабильности размеров частиц в процессе их хранения, необходимо добавлять водный раствор глутарового альдегида, взятого в количестве, обеспечивающем его мольное соотношение с первичными аминогруппами поликатиона 0,3-1,5. При этом концентрация раствора глутарового альдегида может быть различной. Затем для обеспечения полноты протекания ковалентного связывания (сшивки) аминогрупп компонентов полученную смесь необходимо выдерживать, например, в течение 8-12 ч при пониженной относительно комнатной температуре, например, в холодильнике при 3-8°С. После чего для повышения стабильности полученных частиц в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют избыток свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с целью восстановления неустойчивых двойных связей между углеродом и азотом в полученных основаниях Шиффа с образованием стабильной ковалентной связи. При этом концентрация раствора боргидрида натрия может варьироваться и составлять 1-2 мг/мл.
Ввиду того, что точно описать строение полученных частиц после их обработки раствором глутарового альдегида, затем раствором боргидрида натрия не представляется возможным, в предлагаемой композиции действующее вещество - полученный продукт охарактеризован способом его получения.
Полученную суспензию частиц очищают от побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов с использованием мембранной фильтрующей системы с пределом пропускания 90-130 кДа. При этом можно использовать мембранную фильтрующую систему, например, в комбинации с перистальтическим насосом, подающим полученную суспензию частиц на мембрану (фильтр) под давлением, или применять центрифугирование с использованием помещенного в пробирку центрифуги фильтра (мембраны). В последнем случае скорость вращения ротора центрифуги может варьироваться и составлять, например, 3000-4000 оборотов (об) /мин. При этом используют мембранную фильтрующую систему с экспериментально подобранным пределом пропускания 90-130 кДа. Например, мембрана с пределом пропускания 90 кДа пропускает вещества с молекулярной массой менее 90 кДа.
При использовании центрифугирования в пробирку центрифуги помещают фильтр на основе ультрафильтрационной мембраны, заполненный аликвотой вышеописанной суспензии, с последующим введением перед каждой стадией центрифугирования свежей порции буферного раствора с физиологически приемлемыми для офтальмологии значениями рН 6,8-7,6.
При использовании поточной фильтрующей системы в накопительную емкость наливают полученную суспензию частиц. Далее фильтруемая суспензия из накопительной емкости с помощью перистальтического насоса под давлением подается на фильтрационный картридж с мембраной с пределом пропускания 90-130 кДа и двигается вдоль
мембраны. Часть жидкости с низкомолекулярными побочными продуктами и не вступившими в реакцию реагентами проходит сквозь поры фильтрующей системы и накапливается в емкости. Очищенные от низкомолекулярных компонентов частицы, не прошедшие сквозь мембрану (фильтр), потоком жидкости рециркулируются обратно в накопительную емкость, где смешиваются с постоянно поступающим буферным раствором с приемлемыми для офтальмологии значениями рН 6,8-7,6. В результате общая концентрация низкомолекулярных побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов в накопительной емкости уменьшается, а рН композиции становится приемлемым для офтальмологии. На завершающем этапе фильтрации останавливают подачу жидкости в накопительную емкость, и может быть осуществлено концентрирование очищенной суспензии (уменьшают ее объем), например, в 2-4 раза.
Предлагаемая композиция может быть приготовлена путем определения концентрации частиц в суспензии после ее очистки, например, методом анализа траектории (движения) частиц, или путем определения концентрации белка в полученной суспензии, и разбавления полученной композиции буферным раствором до получения суспензии, содержащей 0,01-2,00 мас. % частиц. При этом оптимальное содержание частиц в композиции было установлено экспериментально.
Непосредственно перед использованием полученной композиции целесообразно проводить ее стерильную фильтрацию, например, через фильтры «Millipore» 0,22 мкм.
Вышеописанный способ дает возможность получать предлагаемую композицию, содержащую частицы, у которых ядро из СОД покрыто внутренним слоем из поликатиона и внешним слоем из полианиона с определенным методом динамического светорассеяния средним гидродинамическим диаметром частиц 90-200 нм. При этом погрешность
измерений составляет не более 4%. Размер получаемых частиц можно варьировать изменением рН и ионной силы использованного буферного раствора, например, изменением в буферном растворе концентрации NaCl.
Образование внутреннего слоя поликатиона на поверхности СОД было доказано методом динамического светорассеяния, образование внешнего слоя на частицах также было доказано методом динамического светорассеяния, поскольку это приводит к увеличению размеров частиц.
50
50
Анализ активности СОД в образцах проводят с использованием метода, в основе которого лежит реакция ингибирования СОД автоокисления пирогаллола [Marklund S., Marklund G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase // European journal of biochemistry. - 1974. - T. 47. - №. 3. - C. 469-474.]. Измерения проводят в 96-луночном планшете. Для одного образца используют 8 лунок (один столбец). Последовательным разбавлением получают 8 точек объемом 20 мкл с концентрациями СОД от 1000 до 0,45 мкг/мл. В каждую из лунок добавляют 160 мкл 50 мМ Трис-буфера с рН 8,2 и 20 мкл раствора пирогаллола, полученного путем растворения навески пирогаллола в рассчитанном объеме ацетона с получением раствора с концентрацией 5 мг/мл и его разбавлением в 10 раз водой. Затем в течение 5 мин через каждые 30 сек с помощью спектрофотометра определяют изменение оптической плотности раствора от времени в результате окисления пирогаллола растворенным в воде кислородом в отсутствии и присутствии СОД и строят график зависимости скорости окисления пирогаллола от концентрации СОД в логарифмическом масштабе. С помощью программного обеспечения Origin 8.1 полученную зависимость аппроксимируют кривой «доза-ответ» и находят концентрацию, соответствующую 50%-ному ингибированию реакции (ЕС, мкг/мл). Далее рассчитывают активность СОД по формуле: А=1000000/(20*ЕС)
[Ед/мг]. Выход СОД по активности у частиц определяют как отношение активности СОД частиц к начальной активности используемого в синтезе раствора СОД и измеряют в процентах. Стабильность частиц в композиции в процессе хранения и использования определяют по изменению их активности и размеров. Следует отметить, что активность зависит от концентрации раствора СОД и снижается с ее уменьшением, а также от строения частиц и реагентов, используемых при их получении. Например, от конкретного поликатиона и полианиона. Поэтому корректное сравнение значений активности СОД в частицах возможно проводить с учетом только вышеуказанных условий. Стабильность частиц в суспензии в процессе их хранения и использования определяют по изменению их активности и размеров.
+
2+
Определение концентрации белка в образцах проводят с помощью набора Micro ВСА™ Protein Assay Kit в соответствии с инструкцией производителя. Метод основан на колориметрическом определении комплекса бицинхониновой кислоты с ионами Cu, образующегося путем восстановления ионов Cu белками. Выход СОД по белку (ферменту) определяют как отношение конечной массы белка в суспензии частиц к начальной массе используемого белка в синтезе.
Раздражающую способность предложенной композиции при ее введении в глаз определяют на группах кроликов линии серая шиншилла, самцов, массой 2,0-2,5 кг, в возрасте 6 месяцев. Выбор данного вида лабораторных животных связан с крупным размером их глаз и возможностью детального наблюдения за реакцией различных структур глаза на вводимые вещества. Исследуемые композиции инсталлируют (закапывают) в конъюнктивальный мешок глаза кролика с помощью автоматического дозатора в количестве 50 мкл. Для оценки реакции инсталляции проводят в режиме терапевтической для человека кратности инсталляций: 3 раза в день в течение 5 дней по 0,05 мл в оба глаза, что
соответствует 0,3 мл в сутки на животное. Биомикроскопию проводят перед первой инсталляцией и через 30 мин после последней инсталляции на пятые сутки. Метод биомикроскопии, основанный на прижизненном получении так называемых оптических срезов путем освещения глаза с использованием щелевой диафрагмы и увеличения изображения, позволяет визуально исследовать оптические среды и ткани глаза.
По данным биомикроскопии оценивают: отек и гиперемию век; отек и гиперемию бульбарной конъюнктивы; фолликулярную реакцию; расширение сосудов лимба; наличие краевых точечных инфильтратов в роговице; наличие дефектов эпителия роговицы (витальное окрашивание 0,5%-ным раствором флуоресцеина); прозрачность оптических сред глаза (роговица, хрусталик, влага передней и задней камер, стекловидное тело). Ставят оценки выраженности признака в баллах: 0 - отсутствие признака; 1 - слабо выраженный признак; 2 - средне выраженный признак; 3 - ярко выраженный признак. Затем оценивают общий балл выраженности признаков и сравнивают с общим баллом группы кроликов, не подвергавшихся действию фармацевтической композиции.
Влияние композиции на протекание иммуногенного увеита, химического (щелочного) ожога роговицы глаза и первичной открытоугольной глаукомы было проведено на группах кроликов линии серая шиншилла, самцах, массой 2,0-2,5 кг, в возрасте 6 месяцев.
У животных моделировали иммуногенный увеит по методике [Нероев В.В., Давыдова Г.А., Перова Т.С. Моделирование иммуногенного увеита у кроликов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 142. - №. 11. - С. 598-600]. Каждому кролику двукратно вводили нормальную лошадиную сыворотку, сначала подкожно в количестве 5 мл, затем на 10-е сутки после подкожной инъекции в оба глаза интравитреально вводили дозу сыворотки в количестве 70 мкл. После введения сыворотки у подопытных животных
возникал иммунный ответ на чужеродный белок, сопровождающийся возникновением вышеуказанного офтальмологического заболевания.
При моделировании щелочного ожога роговицы использовали круги диаметром 7 мм из тонкой хлопчатобумажной ткани, пропитанные 10%-ным раствором NaOH, которые наносили на центральную область роговицы на 40 с, затем промывали глаза физиологическим раствором порциями по 20 мл. При этом для обезболивания животных использовали 2,5%-ный раствор аминазина в сочетании с 0,5%-ным раствором седуксена (1:1), который вводили подкожно в дозировке 0,5 мл/кг. Одновременно проводили местную анестезию путем инсталляции на роговицу 0,5%-ного раствора дикаина.
Исследуемые композиции инсталлируют (закапывают) в конъюнктивальный мешок глаза кролика с помощью автоматического дозатора. Для оценки реакции инсталляции проводят в режиме терапевтической для человека кратности инсталляций: 3 раза в день в течение 8-21 дней в случае иммуногенного увеита и 6-7 раз в течение 30 мин утром и вечером в течение 10 дней в случае открытоугольной глаукомы.
Основные клинические проявления воспалительного процесса оценивают в условных единицах. Оценку проводят путем биомикроскопии с помощью щелевой лампы. По данным биомикроскопии оценивают клинические симптомы при иммуногеном увейте и первичной открытоугольной глаукоме: отек век, гиперемию конъюнктивы, отек роговицы, отек радужки, количество фибрина в передней камере, реакцию на свет, помутнение хрусталика, неоваскуляризацию роговицы.
Также оценивают в условных единицах основные клинические проявления при химическом (щелочном) ожоге глаза: отек век, гиперемию конъюнктивы, отделяемое. Ставят оценки выраженности признака в баллах: 0 - отсутствие признака; 1 - слабо выраженный признак; 2 -
средне выраженный признак; 3 - ярко выраженный признак. Выраженность признаков, таких как перикорнеальная инъекция, длина и густота сосудов, отек роговицы, площадь и глубина изъявлений, оценивают визуально и в соответствии с таблицей выраженности данных признаков выставляют балл для каждого признака.
Затем оценивают общий балл выраженности признаков и сравнивают с общим баллом группы кроликов, не подвергавшихся действию композиции и подвергавшихся лечению раствором нативного фермента СОД.
То, что предлагаемая композиция действительно снижает окислительный стресс в глазу, может быть доказано успешным лечением с помощью предлагаемой композиции глазных заболеваний, для которых достоверно известно, что они сопровождаются окислительным стрессом.
Также возможно измерение активных форм кислорода и активности СОД в слезе до и в процессе лечения подопытного животного с помощью предлагаемой композиции.
В этом случае слезную жидкость отбирают утром с помощью кругов из фильтровальной бумаги диаметром 5 мм, которые на 5 мин закладывают в нижний конъюнктивальный мешок, а потом помещают в пробирки с физиологическим раствором для элюирования компонентов слезы в соотношении 50 мкл на 1 кружок. Элюат слезы центрифугируют для отделения нерастворимых компонентов, надосадочную жидкость используют для дальнейших исследований.
2
2
Для измерения показателей активности СОД была использована модельная система гемоглобин - HO - люминол. В качестве субстрата окисления в данной системе выступает люминол [Гулидова О.В, Любицкий О.Б., Клебанов Г.И., Чеснокова Н.Б. Изменение антиокислительной активности слезной жидкости при экспериментальной ожоговой болезни глаз // Бюлл. экспер. биол. и медицины. - 1999. - Т. 128,
№11. - С. 571-574]. При взаимодействии с активными формами кислорода люминол подвергается свободнорадикальному окислению, в ходе которого испускаются кванты света, которые регистрируются с помощью хемилюминометра. Введение в модельную систему СОД приводит к торможению свободнорадикального окисления люминола.
2
2
Измерение антиокислительной активности в модельной системе гемоглобин - HO - люминол проводят следующим образом.
2
2
Контрольная проба: в пробирку вносят 370 мкл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,4) и добавляют 50 мкл раствора 0,1 мМ люминола, 50 мкл раствора 5,0 мМ гемоглобина и тщательно перемешивают. Для инициирования реакции свободнорадикального окисления люминола добавляют 30 мкл раствора 0,98 мМ HO, перемешивают и точно фиксируют время внесения реактива. Пробирку помещают в хемилюминометр, с помощью которого регистрируют кинетику свободнорадикальной реакции в модельной системе.
2
2
Опытная проба: в пробирку вносят 340 мкл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,4) и добавляют последовательно 50 мкл раствора 0,1 мМ люминола, 50 мкл раствора 5,0 мМ гемоглобина и 30 мкл исследуемого материала и тщательно перемешивают. Затем вносят 30 мкл раствора 0,98 мМ HO, фиксируют время внесения, перемешивают и регистрируют кинетику свободнорадикального окисления на хемилюминометре марки "Биотокс-7" (Россия, НПО Энергия).
Измеряемыми параметрами являются величина латентного периода и интенсивность хемилюминисценции. По величине латентного периода судят о значении антиокислительной активности по отношению к гидроксильному радикалу, по величине максимальной интенсивности хемилюминисценции судят о значении антиокислительной активности по отношению к супероксидному радикалу.
Определение активных форм кислорода в слезе также возможно осуществить амперометрическим методом [Определение активных форм кислорода в биологических жидкостях с помощью платинового наноэлектрода амперометрическим методом / А.Н. Ванеев, А.В. Алова, А.С. Ерофеев и др. // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2018].
Полученную композицию хранят при пониженной температуре в холодильнике, например, при 3-8°С.
Схема лечения воспалительных процессов, сопровождающихся окислительным стрессом в глазу, в зависимости от вида заболеваний и их тяжести может быть различна.
Преимущества предлагаемой композиции иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
Предлагаемую композицию получают следующим образом. В пластиковую пробирку объемом 15 мл помещают 1,8 мл раствора СОД с концентрацией 5,0 мг/мл в фосфатном буферном растворе, содержащем гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,6 мг/мл и 0,1 мг/мл, соответственно, с рН 7,4 с добавлением NaCl с концентрацией 130 мМ, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 1,0 мл раствора поликатиона протамина с концентрацией 5,0 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, что соответствует 32,8 мкмолям аминогрупп протамина, и полученную смесь выдерживают в течение 30 мин при перемешивании. После этого в полученный раствор при перемешивании по каплям добавляют 1,1 мл раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ с концентрацией 5,0 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, и полученную смесь при перемешивании выдерживают в течение 30 мин при 4°С. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,9 мл свежеприготовленного
водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 0,4% по объему (39,6 мкмоль), что соответствует его мольному соотношению с аминогруппами поликатиона 1,2, и полученную смесь выдерживают в течение 10 ч при 4°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,2 мл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 1,0 мг/мл. Для очистки суспензии полученных частиц используют поточную мембранную фильтрующую систему. Полученную суспензию наливают в накопительную емкость, откуда суспензия с помощью перистальтического насоса поступает на фильтрационный картридж, содержащий мембрану с пределом пропускания 90 кДа, и двигается вдоль мембраны. Часть буферного раствора с низкомолекулярными побочными продуктами и не вступившими в реакцию реагентами проходит сквозь поры мембраны и накапливается в емкости. Остальная часть суспензии частиц, не прошедшая сквозь мембрану, рециркулируется обратно в накопительную емкость, где смешивается с постоянно поступающим вышеописанным буферным раствором с рН 7,4.
Суспензию из накопительной емкости переносят в пластиковую пробирку и хранят при 4°С. Получают 2,5 мл суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из протамина и внешней оболочкой из блок-СПЛ. Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 90 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии, определенная вышеописанным методом, равна 13500±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц составляет 52%.
Предлагаемая композиция была приготовлена путем определения методом анализа траектории частиц концентрации частиц, определения концентрации белка в суспензии после ее очистки, и разбавления
полученной суспензии буферным раствором с рН 7,4 до получения композиции, содержащей 1,00 мас. %. частиц.
После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 7%, а размер частиц в композиции практически не изменился.
Раздражающую способность композиции при ее введении в глаз определяют на группах кроликов по вышеуказанной методике. До начала исследования состояние структур переднего отдела глаза у всех животных соответствовало физиологической норме: конъюнктива - видны единичные сосуды, гиперемия отсутствует; конъюнктива век розовая, гладкая, неотечная, отделяемое отсутствует; роговица гладкая, блестящая, без помутнений; флуоресцеиновая проба отрицательная; радужка равномерно пигментирована, зрачок круглый, реагирует на свет; внутренние среды глаза прозрачны.
В процессе эксперимента животные не проявляли беспокойства и негативной реакции на инсталляции.
По данным флуоресцеиновой пробы нарушений целостности эпителия роговицы не выявлено: после закапывания 0,5% - ным раствора флуоресцеина определяется равномерное зеленоватое свечение всей поверхности роговицы (флуоресцеиновая проба отрицательная). Оптические среды глаз во всех группах оставались прозрачными.
Опыт показал, что ежедневное применение вышеописанной композиции не оказывает местное раздражающее действие на слизистую оболочку глаз.
Оценку влияния композиции на протекание иммуногенного увеита определяют на группах кроликов по вышеуказанной методике. Композицию вводят в конъюнктивальный мешок 3 раза в день по 30 мкл в оба глаза в течение 8 дней.
Под влиянием композиции происходит быстрая нормализация проявлений иммуногенного увеита во внешних структурах глаза, в сравнении с раствором нативного фермента СОД - раньше снижаются гиперемия конъюнктивы, количество отделяемого, отек роговицы и несколько снижается неоваскуляризация роговицы. Снижение воспалительных проявлений во внутренних структурах глаза под влиянием композиции было еще больше выражено: количество фибрина во влаге передней камеры было значительно меньше при лечении композицией, чем при лечении раствором нативной СОД, также меньше был выражен отек радужки.
Биохимическое исследование слезной жидкости в динамике, показало, что под влиянием композиции активность СОД, сниженная в острый период заболевания, восстанавливается в более ранние сроки и в дальнейшем остается выше, чем у нелеченных животных и леченных раствором нативного фермента.
Опыт показал, что композиция эффективно подавляет окислительный стресс в глазу и эффективно лечит увеит.
Пример 2.
Предлагаемую композицию получают следующим образом. В пластиковую пробирку объемом 15 мл помещают 1,8 мл раствора СОД с концентрацией 2,50 мг/мл в фосфатном буферном растворе, содержащем гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,03 мг/мл и 0,57 мг/мл, соответственно, с рН 5 с добавлением NaCl с концентрацией 140 мМ, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 1,0 мл раствора поликатиона полилизина с концентрацией 2,50 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, что соответствует 16,4 мкмолям аминогрупп поликатиона, и полученную смесь выдерживают в течение 25 мин при перемешивании. После этого в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 1,1 мл раствора полианиона блок-сополимера
ПГ-ПЭГ с концентрацией 2,50 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, и полученную смесь при перемешивании выдерживают в течение 25 мин при 3°С. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,9 мл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 0,1% по объему (4,92 мкмоль), что соответствует его мольному соотношению с аминогруппами поликатиона 0,3, и полученную смесь выдерживают в течение 8 ч при 3°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,2 мл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 1,00 мг/мл. Очистку суспензии полученных частиц осуществляют аналогично примеру 1, однако используют мембрану с пределом пропускания 130 к Да.
Суспензию из накопительной емкости переносят в пластиковую пробирку и хранят при 4°С. Получают 2,4 мл суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из полилизина и внешней оболочкой из блок-СПЛ. Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, равен 123 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии, определенная вышеописанным методом, составляет 6500±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 55%.
Предлагаемая композиция была приготовлена путем определения методом анализа траектории частиц концентрации частиц, определения концентрации белка в суспензии после ее очистки, и разбавления полученной суспензии буферным раствором с рН 6,8 до получения композиции, содержащей 0,01 мас. %. частиц.
После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 6%, а размер частиц в композиции практически не изменился.
Раздражающую способность суспензии частиц при ее введении в глаз кроликам определяют аналогично примеру 1. В процессе эксперимента животные не проявляли беспокойства и негативной реакции на инстилляции. Опыт показал, что ежедневное применение вышеописанной суспензии не оказывает местное раздражающее действие на слизистую оболочку глаз.
Оценку влияния композиции на протекание химического ожога определяют на группах кроликов по вышеуказанной методике. Композицию вводят в конъюнктивальный мешок 3 раза в день по 40 мкл в течение 21 дня.
Сравнение действия антиоксидантного фермента на заживление щелочного ожога роговицы у кроликов в виде предлагаемой композиции и в виде раствора нативного фермента СОД показало преимущество использования композиции. По данным оценки клинического течения ожоговой болезни глаз можно заключить, что под действием композиции площадь дефекта роговицы сокращается быстрее, чем при действии раствора нативной СОД. Опыт показал, что композиция эффективно подавляет окислительный стрессу в глазу и эффективно лечит щелочной ожог.
Пример 3.
Предлагаемую композицию получают следующим образом. В пластиковую пробирку объемом 15 мл помещают 1,8 мл раствора СОД с концентрацией 10,00 мг/мл в фосфатном буферном растворе, содержащем гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,58 мг/мл и 0,04 мг / мл, соответственно, с рН 8 с добавлением NaCl с концентрацией 150 мМ, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 0,1 мл раствора поликатиона полиаргинина с концентрацией 10,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, что соответствует 65,6 мкмолям аминогрупп поликатиона, и полученную смесь выдерживают в
течение 40 мин при перемешивании. После этого в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 1,1 мл раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ с концентрацией 10,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, и полученную смесь при перемешивании выдерживают в течение 40 мин при 8°С. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,9 мл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 0,5% по объему (98,4 мкмоль), что соответствует его мольному соотношению с аминогруппами поликатиона 1,5, и полученную смесь выдерживают в течение 12 ч при 8°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,2 мл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 2,00 мг/мл. Для очистки суспензии полученных частиц от побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов в пробирку центрифуги помещают фильтр с ультрафильтрационной мембраной с пределом пропускания 100 кДа, затем фильтр вначале заполняют 5,0 мл полученной суспензии частиц, после чего туда добавляют 10,0 мл буферного раствора с рН 7,6, содержащего гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,60 мг/мл и 0,10 мг/мл соответственно, с добавлением NaCl с концентрацией 150 мМ, пробирку с фильтром помещают в центрифугу и проводят центрифугирование в течение 12 мин при скорости вращения ротора центрифуги 3500 об/мин. После этого в фильтр повторно добавляют 10,0 мл буферного раствора с рН 7,6, в пробирку снова помещают в центрифугу и проводят повторное центрифугирование, затем снова добавляют 10,0 мл буферного раствора и осуществляют третье центрифугирование, после этого добавляют в фильтр 10,0 мл буферного раствора и проводят последнее четвертое центрифугирование. Находящуюся над фильтром очищенную суспензию переносят в пластиковую пробирку и хранят при 8°С. Получают 2,6 мл суспензии
частиц, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из полиаргинина и внешней оболочкой из блок-СПЛ. Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 196 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии, определенная вышеописанным методом, равна 26200±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 47%.
Предлагаемая композиция была приготовлена путем определения методом анализа траектории частиц концентрации частиц, определения концентрации белка в суспензии после ее очистки, и разбавления полученной суспензии буферным раствором с рН 7,6 до получения композиции, содержащей 2,00 мас. %. частиц.
После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 5%, а размер частиц в композиции практически не изменился.
Раздражающую способность композиции частиц при ее введении в глаз кроликам определяют аналогично примеру 1. В процессе эксперимента животные не проявляли беспокойства и негативной реакции на инсталляции. Опыт показал, что ежедневное применение вышеописанной композиции не оказывает местное раздражающее действие на слизистую оболочку глаз.
Оценку влияния композиции на протекание открытоугольной глаукомы определяют на группах кроликов линии серая шиншилла по вышеуказанной методике. Композицию вводят 6-7 раз в течение 30 мин утром и вечером по 30 мкл в течение 10 дней.
Оценку эффективности композиции при лечении открытоугольной глаукомы глаза у кроликов определяют аналогично примеру 1. Опыт показал, что композиция эффективно подавляет окислительный стресс в глазу и эффективно лечит глаукому.
Пример 4.
Предлагаемую композицию получают следующим образом. Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА - ПГ.
Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 153 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии составляет 13500±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 52%.
Предлагаемая композиция была приготовлена путем определения методом анализа траектории частиц концентрации частиц, определения концентрации белка в суспензии после ее очистки, и разбавления полученной суспензии буферным раствором до получения композиции, содержащей 0,10 мас. %. частиц.
После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 10%, а размер частиц в композиции практически не изменился.
Опыт показал, что ежедневное применение вышеописанной композиции не оказывает местное раздражающее действие на слизистую оболочку глаз, и композиция эффективно подавляет окислительный стресс в глазу при лечении иммуногенного увеита.
Пример 5.
Предлагаемую композицию получают следующим образом. Опыт проводят аналогично примеру 2, однако в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА - ПГ.
Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 118 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 7200±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 47%.
Предлагаемая композиция была приготовлена путем определения методом анализа траектории частиц концентрации частиц, определения
концентрации белка в суспензии после ее очистки, и разбавления полученной суспензии буферным раствором до получения композиции, содержащей 0,01 мас. %. частиц.
После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 7%, а размер частиц в композиции практически не изменился.
Опыт показал, что ежедневное применение вышеописанной композиции не оказывает местное раздражающее действие на слизистую оболочку глаз, и композиция эффективно подавляет окислительный стресс в глазу при лечении химического ожога.
Пример 6.
Предлагаемую композицию получают следующим образом. Опыт проводят аналогично примеру 3, однако в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА - ПГ.
Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 186 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 24900±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 49%.
Предлагаемая композиция была приготовлена путем определения методом анализа траектории частиц концентрации частиц, определения концентрации белка в суспензии после ее очистки, и разбавления полученной суспензии буферным раствором до получения композиции, содержащей 2,00 мас. %. частиц.
После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 8%, а размер частиц в композиции практически не изменился.
Опыт показал, что ежедневное применение вышеописанной композиции не оказывает местное раздражающее действие на слизистую
оболочку глаз, и композиция эффективно подавляет окислительный стресс в глазу при лечении открытоугольной глаукомы.
Пример 7 (контрольный, по прототипу)
Описанную в прототипе композицию получают следующим образом (по методу, основанному на патенте США 2010/0291065 А1, 2010). В пластиковую пробирку объемом 15,00 мл помещают 2,50 мл раствора СОД с концентрацией 1,00 мг/мл в 0,06 М фосфатном буферном растворе с рН 7,4, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 2,50 мл раствора поликатиона блок-СПЛ полилизина и полиэтиленгликоля (Alamanda Polymers, США) с концентрацией 0,25 мг/мл в вышеописанном буферном растворе и полученную смесь выдерживают в течение 30 мин при перемешивании. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,05 мл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 25,00% по объему, что соответствует его 100-кратному избытку по отношению к первичным аминогруппам, и полученную смесь выдерживают в течение 2 ч при 25°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют две порции 25 мкл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 0,05 М (1,89 мг/мл) в 1 М NaOH с интервалом в 20 минут. Далее очищают суспензию полученных частиц от побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов методом гель-фильтрации с использованием колонки Sephadex G25. Полученную суспензию наносят на колонку, после впитывания суспензии в гель, добавляют фосфатный буферный раствор объемом 5 мл, после чего собирают в пробирку очищенную суспензию. Получают 4,8 мл суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто сшитым блок-сополимером. Далее проводят лиофильную сушку полученной очищенной суспензии частиц. Суспензию переносят в круглодонную колбу, содержимое колбы замораживают при -78°С, после чего колбу соединяют с лиофильной
сушилкой, в ловушку сушилки заливают жидкий азот и с помощью форвакуумного насоса внутри сушилки с подвешенной колбой создают вакуум. В процессе сушки колба снаружи покрывается инеем из атмосферной влаги, и сушку осуществляют до тех пор, пока иней не исчезнет. Колбу с лиофилизатом снимают с сушилки, лиофилизат переносят в пластиковую пробирку с плотно прилегающей крышкой. Пробирку с полученным лиофилизатом хранят в морозильной камере при -18°С.
Для получения композиции 1 мг лиофилизата диспергируют в 3,2 мл 0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7,5, который содержит 150 мМ NaCl. Получают композицию, в которой масс. % действующего вещества равен 0,03, а остальное буферный раствор.
Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 43 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии составляет 11700±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 8%. После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 32%, а размер частиц в суспензии увеличился на 12%.
Из приведенных примеров видно, что предлагаемая композиция эффективно снижает окислительный стресс в глазу. При этом сравнение результатов, описанных в примерах 1-6, и контрольном примере 7, показывает, что у предлагаемой композиции суммарный выход СОД по активности увеличивается с 8 до 47-55%, и повышается в 3,2-6,4 раза стабильность значений активности СОД у частиц в процессе хранения, а также повышается стабильность размеров частиц в процессе хранения.