КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
CULTURE ENVIRONMENT FOR MESENCHYMAL STEM CELLS OF HUMAN

Данное изобретение касается новой культуральной среды для мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSC). Более конкретно данное изобретение касается культуральной среды, в которой hMSC линии могут расти, включая те, которые не растут в культуральных средах, которые обычно используют для клеток данного типа, потому что они адаптировались к специфическим культуральным средам.
hMSC представляют собой мультипотентные клетки, принципиально отличающиеся своей способностью дифференцироваться в различных мезенхимальных тканях, таких как костная, хрящевая, сухожильная, мышечная и жировая ткань, среди других. hMSC может быть выделена из различных тканей взрослых людей, включая те, которые, как найдено, находятся в костном мозге, жировой ткани и крови пуповины.
Антипролиферативное, иммуномодулирующее и противовоспалительное действие hMSC сконцентрировало внимание на данных клетках как на потенциальных терапевтических агентах при заболеваниях, вызванных иммунной системой, включая заболевание "трансплантат против хозяина", отторжение после трансплантации цельных органов и аутоиммунные заболевания.
Известно, что для культуры hMSC in vitro является обязательным сохранить их полипотенциальную способность, и для этого является необходимым добавление экзогенных факторов, таких как, например, основной фактор роста фибробластов (bFGF), эпидермальный фактор роста (EGF) и трансформирующий фактор роста (TGFβ-1), к общепринятым культуральным средам. Однако большинство hMSC зависят от конкретной культуральной среды и к тому же не могут быть культивированными на средах, которые традиционно использовали для культур мезенхимальных стволовых клеток, таких как DMEM/F12 среда, дополненная эмбриональной бычьей сывороткой, подходящей для мезенхимальных стволовых клеток (MSCQ).
Для того чтобы преодолеть эти проблемы, данное изобретение касается новой культуральной среды для hMSC, на которой hMSC, которые не растут в культуральной среде других составов, могут расти. Культуральная среда в соответствии с данным изобретением содержит:
a) базальную среду, обычно используемую для культуры мезенхимальных стволовых клеток;
b) лизат наружного слоя лейкоцитов/тромбоцитов человека (лейкоцитарная пленка; LBC);
c) инсулин;
d) селенит натрия;
e) этаноламин;
f) основной фактор роста фибробластов (bFGF).
Как используется в данном документе, термин "культуральная среда" относится к питательному раствору для культивирования, роста или пролиферации клеток. Термин "клеточная культура" относится к клеткам, которые сохраняются, культивируются или выращиваются в искусственной окружающей среде in vitro.
Термин "базальные среды" или "базальная среда", используемый в данном документе, относится к какой-либо среде, в которой мезенхимальные клетки человека способны расти, которая дополнена различными добавками, которая может или не может содержать сыворотку. Базальные среды предусматривают стандартные неорганические соли, такие как цинка, железа, магния, кальция или калия, вместе с витаминами, глюкозой, буферной системой и незаменимыми аминокислотами.
Предпочтительно базальная среда, обычно используемая для культуры мезенхимальных клеток, в культуральной среде в соответствии с данным изобретением представляет собой DMEM/F12 + пируват, DMEM/F12 среда, будучи смесью из равных частей модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (DMEM), которая является модификацией минимальной эссенциальной среды, разработанной Гарри Иглом (Налу Eagle), и среды F12 Хэма, разработанной Хэмом (Ham) для роста СНО (яичник китайского хомячка) клеток, F10 Хэма, F12 Хэма, MCDB 131, среда, разработанная Кнедлером (Knedler) и Хэмом (Ham), как среда с пониженным добавлением сыворотки для роста клеток человека, или RPMI 1640, название которой происходит от заглавных букв Roswell Park Memorial Institute, где среда была разработана Муром (Moore) и сотрудниками для культуры нормальных и неопластических лимфоцитом, хотя, когда добавлена в достаточной мере, в ней могут выращивать другие различные типы клеток. Состав и композиция данных сред широко известны и могут быть получены от какого-либо производителя или поставщика, такого как, например, Gibco (Life Technologies). Более предпочтительно средой является DMEM/F12 + пируват.
Одним из компонентов культуральной среды для мезенхимальных клеток человека в соответствии с данным изобретением является лизат наружного слоя лейкоцитов/тромбоцитов. Наружный слой лейкоцитов/тромбоцитов, также известный как "лейкоцитарная пленка", является оболочкой, которая наблюдается между плазмой и красными клетками после центрифугирования или седиментации цельной крови. Он в своей основе содержит лейкоциты и тромбоциты. Лизат наружного слоя лейкоцитов/тромбоцитов (лейкоцитарная пленка) присутствует в культуральной среде в соответствии с данным изобретением в количестве от 5 до 20% (об./об.), более предпочтительно от 7 до 15% (об./об.) и наиболее предпочтительно 10% (об./об.).
Другим из компонентов культуральной среды в соответствии с данным изобретением является инсулин. Благотворный эффект инсулина на рост клеток известен (Cartwright, Т. y Shah, G.P Culture media. Basic cell culture, 2nd edition, Davis, J.M. ed. 2002. Oxford University Press, New York, USA). В культуральной среде в соответствии с данным изобретением инсулин предпочтительно присутствует в количестве от 2 до 20 мг/л, более предпочтительно от 5 до 15 мг/л и наиболее предпочтительно 10 мг/л.
Кроме того, другим компонентом культуральной среды в соответствии с данным изобретением является селен в форме селенита натрия. Селен является следовым элементом, которым обычно обеспечивается культуральная среда посредством сыворотки и который может быть для нее незаменимым. Селенит натрия присутствует в культуральной среде в количестве от 0,005 до 1,730 мг/л.
Более того, культуральная среда для мезенхимальных клеток в соответствии с данным изобретением содержит этаноламин. Известно, что этаноламин стимулирует строительство клеточных мембран. Этаноламин в культуральной среде в соответствии с данным изобретением присутствует в количестве от 1 до 8 мг/л, предпочтительно от 2 до 5 мг/л.
В заключение культуральная среда для мезенхимальных клеток в соответствии с данным изобретением, кроме того, содержит bFGF. Известно, что bFGF рекомендуется для культивирования мезенхимальных клеток (Sato, J. et al. Specific cell types and their requirements. Basic cell culture, 2nd edition, Davis, J.M. ed. 2002. Oxford University Press, New York, USA). bFGF присутствует в культуральной среде в соответствии с данным изобретением в количестве от 5 до 25 нг/мл.
Неожиданно, путем комбинации компонентов в культуральной среде в соответствии с данным изобретением является возможным культивировать линии мезенхимальных клеток человека, включая те, которые адаптированы к другим культуральным средам, которые, как правило, являются коммерчески доступными, которые не растут в культуральных средах, обычно используемых для данного типа клеток, таких как, например, мезенхимальные клетки человека, предлагаемые Lonza или PromoCell.
Необязательно культуральная среда в соответствии с данным изобретением содержит антибиотик. Применять могут какой-либо антибиотик, который, как правило, используют при культивировании данного типа клеток. Предпочтительно данный антибиотик представляет собой смесь гентамицина - амфотерицина. Количество антибиотика, которое должно быть использовано в культуральной среде, может быть легко определено квалифицированным специалистом в данной области.
Для роста мезенхимальных стволовых клеток является важным, чтобы культуральная среда в соответствии с данным изобретением была дополнена, например, эмбриональной бычьей сывороткой (FBS) или добавкой клеточной культуры, извлеченной из плазмы человека (CCS), полученной, например, как описано в патенте США 8252590 В2. Если используют FBS, считается, что количество от 10 до 20% (об./об.) является достаточным. С другой стороны, если CCS используют для того, чтобы добавить к культуральной среде в соответствии с данным изобретением, считается, что может быть достаточным количество от 10 до 40% (об./об.).
Культуральная среда для мезенхимальных стволовых клеток в соответствии с данным изобретением может быть в сухой форме или в жидкой форме. Для использования в сухой форме ее компоненты могут быть растворены в подходящей жидкости для культуры мезенхимальных клеток. Тип жидкости, в которой компоненты культуральной среды в соответствии с данным изобретением могут быть растворены, является известным квалифицированному специалисту в данной области уровня техники, такой как, например, стерильная дистиллированная вода.
Данное изобретение более детально описывается ниже с ссылкой на количество вариантов осуществления. Данные примеры, однако, не предназначены для ограничения пределов данного изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1.
Готовят культуральную среду в соответствии с данным изобретением, содержащую DMEM/F12 + пируват как базальную среду 10% (об./об.) лизат наружного слоя лейкоцитов/тромбоцитов (лейкоцитарную пленку), 10 мг/л инсулина, 0.0067 мг/л селенита натрия, 2 мг/л этаноламина и 20 нг/мл bFGF. Данная среда называется LV2. Среда LV2 была использована сама или была дополнена 10% (об./об.) эмбриональной бычьей сывороткой (FBS), подходящей для мезенхимальных стволовых клеток (MSCQ) или 15% (об./об.) добавкой клеточной культуры, полученной из плазмы человека (CCS). hMSC, коммерчески доступные от Lonza (Basel, Switzerland) или PromoCell (Heidelberg, Germany), были культивированы. Культуральные среды, рекомендуемые производителем, использовали как положительный контроль. Только одну коммерчески доступную базальную среду использовали как отрицательный контроль. Результаты показаны в таблице 1.
Таблица 1.Экспериментальные результаты культивирования Lonza и PromoCell hMSC.
Культуральная среда
Рост клеток
Lonza hMSC
PromoCell hMSC
Рекомендуемая производителем
(+)
(+)
DMEM/F12
(-)
(-)
DMEM/F12+FBS (MSCQ)
(-)
(-)
DMEM/F12+CCS
(-)
(-)
LV2
(-)
(-)
LV2+FBS (MSCQ)
(+)
(+)
LV2+CCS
(+)
(+)
Как можно видеть из таблицы 1, Lonza hMSC не способна расти более длительное время, когда используют только DMEM/12 базальную среду как культуральную среду, в том числе когда данная базальная среда дополнена FBS или CCS. Они, кроме того, не растут, когда LV2 среда в соответствии с данным изобретением используется самостоятельно. Однако они способны к росту в культуральной среде в соответствии с данным изобретением, когда она дополнена FBS или CCS, и в культуральной среде, рекомендуемой производителем.
Пример 2.
Для того чтобы определить эффект комбинирования всех компонентов культуральной среды в соответствии с данным изобретением LV2 культуральную среду готовили, как описано в примере 1 и в дополнение, кроме того, готовили данные различные среды, в которых отсутствовал, по меньшей мере, один компонент культуральной среды в соответствии с данным изобретением. Приготовленные среды и полученные результаты показаны в таблице 2.
Таблица 2.
Эффект удаления компонентов из культуральной среды на рост Lonza и PromoCell hMSC.
Культуральная среда
Рост клеток
Lonza hMSC
PromoCell hMSC
Рекомендуемая производителем
(+)
(+)
DMEM/F12
(-)
(-)
LV2+CCS
(+)
(+)
LV2+CCS без инсулина, селенита натрия и этаноламина
(-)
(-)
LV2+CCS без лизата лейкоцитов/тромбоцитов (лейкоцитарной пленки)
(-)
(-)
LV2+CCS без bFGF
(-)
(-)
LV2+CCS без LBC/bFGF
(-)
(-)
Как можно видеть из таблицы 2, Lonza и PromoCell hMSC росли только в культуральной среде, рекомендуемой производителем, и в культуральной среде в соответствии с данным изобретением, дополненной CCS. Когда, по меньшей мере, один из компонентов культуральной среды в соответствии с данным изобретением удаляли, hMSC не были способными расти в ней более длительное время.
Хотя изобретение описано в соответствии с примерами предпочтительных вариантов осуществления изобретения, они не должны приниматься во внимание как ограничивающие изобретение, которое определяются наиболее широкой интерпретацией последующей формулы изобретения.