Использование математических моделей для определения достоверности различий параметров в динамических биологических системах

Физико-химическая биология Вестник Нижегородского университета им. H.H. Лобачевского, 2010, № 2 (2), с. 566-570

УДК 541.186

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАТЕМАТИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОСТОВЕРНОСТИ РАЗЛИЧИЙ ПАРАМЕТРОВ В ДИНАМИЧЕСКИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

© 2010 г. А.С. Пимашкин, А.А. Лебединский, А.В. Семьянов

Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского aspimashkin@neuro.nnov.ru

Поступила в редакцию 24.03.2010

Анализ взаимосвязи процессов в биологических системах чаще всего осуществляется с помощью корреляционных методов. Оценка значимости корреляции в различных приложениях имеет частный характер и зависит от типа анализируемых данных и гипотез исследования. В данной работе нами предложен статистический метод с применением математической модели для определения достоверности корреляции активностей астроцитов - глиальных клеток мозга, осуществляющих непосредственное влияние на нейрональную активность.

Ключевые слова: нейробиология, астроциты, корреляция, спонтанная активность, статистическая значимость.

Введение

Целью данной работы является анализ механизмов передачи кальциевых сигналов в астроцитах и формирование пространственно-временных паттернов кальциевой активности в ас-троцитарных сетях с помощью статистических методов.

Астроциты являются наиболее распространенным типом глиальных клеток в центральной нервной системе. Традиционно астроциты рассматривались как вспомогательные элементы мозга, обеспечивающие структурную (опорномеханическую), гомеостатическую, метаболическую, защитную (участие в гематоэнцефали-ческом барьере) и трофическую поддержку нейронов. Исследования с использованием современных электрофизиологических методов и оптического имиджинга значительно расширили понимание функций этих клеток.

Данные ряда исследований [1-4] указывают на наличие у электрически невозбудимых аст-роцитов собственной сигнальной сети, основанной на генерации и передаче кальциевого сигнала.

Долгое время роль астроцитарных кальциевых сигналов оставалась неясной, пока не было показано, что увеличение внутриклеточной концентрации кальция в астроците приводит к локальной регуляции внутримозгового кровообращения [5] и высвобождению астроцитами передатчиков, в том числе глутамата [6]. В экспериментах кальциевый сигнал в астроците

провоцировал кальциевый сигнал в соседнем нейроне. Таким образом, было показано наличие кальций-зависимого высвобождения глио-передатчиков, способных модулировать активность и вызывать медленные токи в соседних с активными астроцитами нейронах.

Следовательно, можно говорить о наличии двухсторонней связи между астроцитами и нейронами. Изучая фундаментальную проблему модулирующего эффекта глиопередатчиков на нейрональную активность, прежде всего необходимо изучить взаимодействие астроцитов.

В исследованиях сетей астроцитов и передачи паттернов импульсов от клетки к клетке чаще всего используются корреляционные методы [7-9]. Важнейшим параметром в детектировании связи между активностями клеток является доказательство значимости корреляции. Для этого устанавливается пороговое значение коэффициента корреляции. Если коэффициент корреляции превышает порог, то считается, что существует связь между парой астроцитов. Значение этого порога зависит от временных характеристик кальциевых сигналов в индивидуальных астроцитах (частоты, стационарности процессов), поэтому субъективная установка единого значения порога для всех пар не является правомерной.

Для оценки реалистичного значения порога мы смоделировали активности пар астроцитов с идентичными экспериментальным частотами кальциевых сигналов. Затем эти кальциевые сигналы были перераспределены случайным

Рис. 1. Активность кальция в астроцитах гиппокампа, dF/F - изменение флуресценции относительно базового уровня

образом и было построено распределение коэффициентов корреляции. Анализируя это распределение, получили реалистичный порог.

1. Методы

1.1. Получение экспериментальных данных. Активность астроцитов представляла собой набор экспериментальных данных, полученных при помощи оптического кальциевого имиж-динга срезов мозга крыс. Для экспериментов были использованы крысы в возрасте от 5 до 14 дней. Анастезированных ингаляцией 2-бромо-2-хлоро-1,1,1-трифторэтана крыс декапитировали, после чего выделяли мозг, погружали его в ледяной раствор для резки и приготавливали на вибротоме срезы толщиной 350-360 мкм, включающие гиппокамп. Срезы помещали затем в раствор для хранения и использовали спустя не менее часа после их получения. В среднем на одном срезе удавалось зарегистрировать от 20 до 80 активных клеток.

Для записи спонтанной кальциевой активности астроцитов была использована конфокальная система Carl Zeiss: Zeiss LSM-510 NLO DuoScan. Записи производились в режиме полного фрейма, с цифровым разрешением изображения 256^256 пикселей, частотой сканирования 1 Гц и пространственным разрешением 400^400 мкм. Данные в виде временной последовательности фреймов длительностью от 20 до 120 минут конвертировались в последовательность графических файлов формата BMP RGB для последующей компьютерной обработки.

1.2. Компьютерная обработка записей и анализ кальциевой активности астроцитов. Анализ полученных временных последовательностей графических файлов с последующей обработкой и статистическим анализом осуществляли при помощи специально разработанной програм-

мы Astroman. Программа была разработана в среде CodeGear™ C++Builder 2007 R2.

Временная кривая значений интенсивности флуресценции красителя отражала внутриклеточную динамику концентраций кальция в астроците (рис. 1). Так как временная динамика флуресценции имела различного рода трэнды (фотоотбеливание, фотоповреждение и т.д.), поиск импульсов производился по первой производной сигнала от времени. Начало и конец импульсов характеризуются резким увеличением и уменьшением производной, пороговые значения вычисляются на основе распределения производной для каждой клетки.

2. Анализ сетей астроцитов

2.1. Определение связей. Метод случайного распределения последовательностей импульсов в парах потенциально взаимосвязанных источников активности широко используется для оценки статистической значимости корреляции между последовательностями. Основной гипотезой о распространении последовательности импульсов в сети астроцитов является наличие статистически значимых связей между парами астроцитов, определяемых надпороговыми значениями коэффициента корреляции их активностей. Для подтверждения данной гипотезы использовался метод случайного распределения последовательностей, опровергающий нуль-гипотезу о случайности обнаружения связей. Наличие связи между парой клеток в данном случае определяется над-пороговым значением максимального коэффициента кросс-корреляции в пределах допустимого временного сдвига между их активностями:

T

2

K

T5 25 2

-400 -350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400

Время, сек

N 300

250 200 150 100

50 О

0 206 0 256 0 306 0 356 0 406 0 456 0 506

М+2ст

Рис. 3. Распределение максимальных корреляций активностей после случайного перераспределения импульсов в оригинальных временных последовательностях. М - медиана распределения; а - с. к. о. распределения

Рис. 2. Кросс-корреляция пары активностей

где x(t), у(і) - относительная флуресценция кальция в астроцитах (активность), т - временной сдвиг между активностями, 52, 5 2 - средние квадратичные ошибки, T - длительность активности. Максимальный временной сдвиг т был установлен в 5 минут.

Алгоритм определения максимальных коэффициентов кросс-корреляций в случайно перераспределённых последовательностях импульсов был следующий. Для пары клеток находилась максимальная кросс-корреляция между их активностями (рис. 2). Далее, изменив последовательность импульсов случайным образом, максимальная корреляция находилась снова. Этот процесс повторялся заданное число итераций = 1000), после чего строилось распределение максимальных корреляций (рис. 3). Полученное распределение принадлежит нуль-гипотезе о случайности появления высокой корреляции. Среднее значение и средняя квадратичная ошибка данного распределения характеризуют собой порог значимости или стати-

стический критерий нулевой гипотезы, а множество значений, превышающее порог значимости, определяют критическую область данной гипотезы. Порог значимости (K а) определялся средней квадратичной ошибкой а :

K^= по .

В приложении статистических методов в биологии часто используется порог Kа = 2а , при котором вероятность обнаружения значений за пределами данного порога равно 5%. Далее, если максимальная корреляция между исходными сигналами находится в критической области, то данная пара клеток считалась статистически достоверно связанной.

Для проверки ложных результатов данного метода были проанализированы данные с заведомо несуществующими связями. Порог подбирался так, чтобы метод не детектировал связи между парами клеток, принадлежащих разным срезам. Такое увеличение порога значимости может также привести к потере полезной информации. Для поиска оптимального порога,

Рис. 4. Симуляция спонтанной активности

кх

к.

Рис. 5. Количество верно найденных связей NT в сети в зависимости от порога

при котором детектируется наименьшее число ложных связей при максимальном сохранении полезной информации, была использована симуляция активности астроцитов с заданными связями.

2.2. Симуляция активности сети астроцитов. Симуляция активности в данной задаче представляла собой набор последовательностей импульсов с длительностью импульсов и частотой, аналогичными активности астроцитов (рис. 4).

Связь задавалась по следующему правилу: во-первых, генерировалась последовательность импульсов с заданными характеристиками, затем генерировалась последовательность, которая содержала искажённую исходную последовательность. Искажение образа производилось путём удаления части последовательности и добавлением случайных импульсов (до 50% от количества импульсов). Данные последовательности ассоциировались с активностями двух связанных между собой модельных клеток. Из

связанных и не связанных между собой клеток формировалась искусственная сеть. Таким образом, мы получили искусственную сеть с заданными характеристиками. Используя эту сеть, мы определили значимость статистического порога детектирования связей.

На основе симуляции были найдены соотношения детектирования ошибочных и пропуска истинных связей в сети клеток в зависимости от порога значимости Ка (рис. 5).

При увеличении порога значимости количество ошибочно найденных связей уменьшалось быстрее, чем количество верно найденных связей. Это позволило определить оптимальный порог, при котором рассматриваемый метод максимально эффективен. Порог считался оптимальным, когда разница между NT(К*) и

ИР (К*) была максимальна.

Далее был проведен анализ активностей аст-роцитов с применением оптимального порога значимости. При этих условиях анализа количество верно найденных связей в данных с 5 сре-

зов было равно 0.8±0.32. Из 137 клеток в 5 срезах было обнаружено 8 связей, откуда следует, что активности астроцитов в срезах гиппокампа являются не связанными между собой. Таким образом, ранние представления о сети астроци-тов с распространяющимся сигналом, полученные на культурах клеток, не верны по отношению к взаимосвязи астроцитов мозга.

Заключение

На основе статистического метода оценки значимости характеристик процессов предложен метод настройки статистического критерия, порога значимости, для достоверного анализа механизмов передачи кальциевых сигналов между астроцитами. Основной особенностью предложенного метода было увеличение точности за счёт моделирования симуляции активности анализируемой сети. Задачей для проверки метода был поиск значительных коэффициентов корреляции активностей астроцитов. Данный подход представлял собой симуляцию активностей клеток с заданием механизма передачи паттернов импульсов. Это было сделано для настройки метода детектирования данного механизма в экспериментальных данных. Основным параметром в детектировании значительной взаимосвязи (высокие и неслучайные коэффициенты корреляции) между активностями клеток являлся порог значимости корреляции.

Определение порога значимости в оценке экспериментальных данных осуществлялось следующим образом: 1) Построение симуляции экспериментальных данных, с моделированием специфических функциональных особенностей передачи информации. 2) Поиск оптимального статистического порога на основе симуляции данных. 3) Применение метода анализа к экспериментальным данным.

На основании полученных с помощью предложенного метода результатов можно сказать,

что искомого механизма связи - передачи паттерна активности с клетки на клетку - не существует в сети астроцитов, что опровергает ранее предложенную точку зрения о сетях астроцитов, сформированную при изучении клеточных культур. Это также указывает на ограничения использования культур клеток для понимания механизмов сетевой активности в мозге.

Работа поддержана грантами РФФИ 08-0200724, 08-04-97109, Минобрнауки 2.1.1/6223 и Программой МКБ РАН.

Список литературы

1. Porter J.T., McCarthy K.D. Astrocytic neurotransmitter receptors in situ and in vivo // Prog. Neurobiology. 1997. V. 51(4). P. 439-455.

2. Petersen C.C., Petersen O.H., Berridge M.J. The role of endoplasmic reticulum calcium pumps during cytosolic calcium spiking in pancreatic acinar cells // Biological Chemistry. 1993. V. 268(30). P. 22262-22264.

3. Cornell-Bell A.H., Finkbeiner S.M., Cooper M.S., Smith S.J. Glutamate induces calcium waves in cultured astrocytes: long-range glial signaling // Science. 1990. V. 247(4941). P. 470-473.

4. Glaum S.R., Holzwarth J.A., Miller R.J. Glutamate receptors activate Ca2+ mobilization and Ca2+ influx into astrocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87(9). P. 3454-3458.

5. Rouach N., Koulakoff A., Abudara V., Willecke K., Giaume C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission // Science. 2008. V. 5. P. 1551-1555.

6. Parpura V., Basarsky T.A., Liu F. et al. Glutamate-mediated astrocyte-neuron signaling // Nature. 1994. V. 369(6483). P. 744-747.

7. Hashemi M., Buibas M., Silva GA. Automated detection of intercellular signaling in astrocyte networks using the converging squares algorithm // Journal of Neuroscience Methods. 2008. V. 170. P. 294-299.

8. Albert R. and Barabasi A.-L. Statistical mechanics of complex networks // Rev. Mod. Phys. 2002. V. 74. P. 47-97.

9. Aguado F., Espinosa-Parrilla J.F., Carmona M.A., Soriano E. Neuronal Activity Regulates Correlated Network Properties of Spontaneous Calcium Transients in Astrocytes In Situ // The Journal of Neuroscience. 2002. V. 22(21). P. 9430-9444.

THE USE OF MATHEMATICAL MODELS TO DETERMINE THE PARAMETER DIFFERENCE RELIABILITY IN DYNAMIC BIOLOGICAL SYSTEMS

A. S. Pimashkin, A.A. Lebedinsky, A. V. Semyanov

The analysis of interaction of processes in biological systems is often performed by means of correlation techniques. The assessment of correlation significance in different applications is case specific and depends on the type of data analysis and research hypotheses. In this paper, we propose a statistical method using a mathematical model to determine the reliability of correlation between the activity of astrocytes and glial cells of the brain that directly influence neuronal activity.

Keywords: neurobiology, astrocytes, correlation, spontaneous activity, statistical significance.