ПОЛИПЕПТИД, СПОСОБНЫЙ БЛОКИРОВАТЬ РЕЦЕПТОР КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ CCR5 И/ИЛИ ВЫЗЫВАТЬ ИНТЕРНАЛИЗАЦИЮ И/ИЛИ ПОДАВЛЯЮЩУЮ РЕГУЛЯЦИЮ CCR5 В КЛЕТКЕ-МИШЕНИ, КОДИРУЮЩАЯ ЕГО НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, ПРИМЕНЕНИЕ (ВАРИАНТЫ), ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ У ПАЦИЕНТА (ВАРИАНТЫ)
POLYPEPTIDE ABLE TO BLOCK CELL SURFACE RECEPTOR CCR5 AND/OR TO INDUCE CCR5 INTERNALISATION AND/OR INHIBITORY REGULATION IN TARGET CELL, NUCLEIC ACID CODING IT, HOST CELL, USE (VERSION), PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND METHOD OF TREATING OR PREVENTING HIV INFECTION IN PATIENT (VERSIONS)

Область техники
Данное изобретение относится к производным цитокинов, обладающим активностью против ВИЧ, противовоспалительной или другими видами активности.
Предшествующий уровень техники
Неизвестны лекарственные средства, способные излечить инфекцию вирусом иммунодефицита человека (HIV, ВИЧ) и синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). До настоящего времени нет доступной вакцины, способной предотвратить инфекцию ВИЧ.
С существующими ВИЧ инфекциями можно во многих случаях бороться с использованием высокоактивной антиретровирусной терапии (HAART), которая включает комбинацию трех или более лекарственных средств против ретровирусов. Однако под селективным давлением ингибиторов обратной транскриптазы и протеиназы (RTI и RI), используемых в настоящее время при HAART, постоянно возрастает частота штаммов ВИЧ, устойчивых к одному, двум или трем лекарственным средствам.
Поэтому существует неотложная потребность в новых типах лекарственных средств против ВИЧ. Предпочтительно, такие новые лекарственные средства должны быть нацелены на такие аспекты вируса, которые менее склонны к развитию устойчивости, чем процессы обратной транскрипции и созревания вируса, на которые нацелены указанные выше RTI и RI. В отсутствие ВИЧ вакцины, кроме того, имеется потребность в средствах, которые способны предотвратить передачу ВИЧ во время полового контакта.
Эта потребность может быть потенциально удовлетворена средствами, которые ингибируют проникновение ВИЧ в клетки-мишени, т.е. средства из класса «ингибиторов проникновения» (EI). Такие средства могут, например, локально и местно наноситься на гениталии человека для предотвращения инфицирования клеток ВИЧ во время полового контакта. Средства, которые могут предотвращать передачу ВИЧ во время полового контакта, часто (хотя неуместно) именуются «микробицидами».
Проникновение ВИЧ в клетки-мишени человека зависит от прикрепления вириона ВИЧ к белку CD4 поверхности клеток человека и к так называемому корецептору. Основные корецепторы, используемые ВИЧ, включают семь связанных с трансмембранным G-белком рецепторов CXCR4 и CCR5. Было обнаружено, что природные лиганды хемокинов CCR5, в частности RANTES (CCR5), ингибируют проникновение R5-тропных штаммов ВИЧ (штаммов ВИЧ, которые используют CCR5 в качестве корецептора) в клетки человека [1]. RANTES представляет собой провоспалительный цитокин, который, как известно, способствует накоплению и активации клеток при хронических воспалительных заболеваниях.
1
Определенные производные RANTES с модификациями на N-конце проявили повышенную активность против ВИЧ, например, AOP-RANTES, аминооксипентаоксим [глиоксилил]RANTES(2-68) [2], где «(2-68)» обозначает остатки 2-68 природного пептида RANTES. Другие химически модифицированные производные RANTES с активностью против ВИЧ включают NNY-RANTES (н-нонаноил-RANTES(2-68) [3,4]) и PSC-RANTES [5].
Однако указанные выше химически модифицированные производные RANTES не только ингибируют проникновение ВИЧ в клетки, но также являются относительно сильными агонистами CCR5: AOP-, NNY- и PSC-RANTES вызывают провоспалительный каскад передачи сигналов, вовлекающий цитозольный приток кальция. Применение средств с такой активностью передачи сигналов в качестве лекарственных средств против ВИЧ может привести к нежелательным побочным эффектам, включая, например, воспаление. Индукция воспаления представляет собой очень нежелательный побочный эффект для профилактических средств против ВИЧ, поскольку было признано, что риск инфекции ВИЧ действительно увеличиваться в воспаленной ткани.
Такие средства, как производные RANTES, могут также вызвать передачу сигналов в клетках-мишенях вследствие отсутствия избирательности или специфичности средства к CCR5, т.е. того, что средство связывается также с белками рецепторов CCR1 и CCR3.
Недостаток химически модифицированных полипептидов заключается в том, что их нельзя получить прямыми биотехнологическими средствами (экспрессией и ферментацией). Также сообщалось о полностью кодированных производных RANTES против ВИЧ, т.е. производных, состоящих только из природных кодированных аминокислот [6, 7]. Однако сила действия против ВИЧ всех первоначально описанных полностью кодированных производных RANTES была ниже, чем сила действия химически модифицированного варианта PSC-RANTES [5].
Описание изобретения
Молекулы по изобретению
В настоящее время были идентифицированы полностью кодированные пептидные средства с высокой активностью против ВИЧ. Такие пептидные средства можно легко получить стандартными биотехнологическими способами, избегая расходов и усилий, требуемых для химического синтеза или модификации. Неожиданно было обнаружено, что в предпочтительных вариантах осуществления пептидные средства по настоящему изобретению сочетают в себе высокую активность против ВИЧ со способностью вызывать лишь низкую степень провоспалительной передачи сигналов, таким образом, избегая воспалительных побочных эффектов.
В других вариантах осуществления средства по изобретению ведут к интернализации CCR5 в клетку (секвестрацию, подавляющую регуляцию или подавляющую модуляцию рецепторов). Этот удивительный механизм действия имеет преимущества, поскольку (i) сравнительно длительная защита может быть достигнута одной дозой препарата, и (ii) менее вероятно возникновение устойчивых R5-тропных штаммов ВИЧ, если ни CCR5, ни его связанная с лекарственным средством форма недоступны на поверхности клетки-мишени для взаимодействия с вирусом.
Особенно предпочтительные пептидные средства сочетают в себе высокую активность против ВИЧ как с высокой активностью секвестрации рецепторов, так и с низкой активностью передачи сигналов. Другие предпочтительные пептидные средства по изобретению сочетают в себе по меньшей мере одно желаемое свойство, выбранное из группы, состоящей из высокой активности против ВИЧ, высокой активности секвестрации рецепторов и низкой активности передачи сигналов с высокой селективностью к рецепторам, т.е. предпочтительным связыванием с CCR5 относительно CCR1 и/или CCR3.
Пептидные средства по изобретению включают характерную последовательность, включающую QGP[P или L], т.е. в четвертом положении характерной последовательности может присутствовать или P, или L. Предпочтительно, такая характерная последовательность расположена около N-конца полипептида. Предпочтительно, характерная последовательность расположена так, что начало характерной последовательности лежит в пределах 15 остатков N-конца полипептида, предпочтительно, в пределах 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 1 остатка N-конца. В настоящем описании выражение «начало характерной последовательности» относится к N-концу характерной последовательности. Характерная последовательность может быть также расположена на краю N-конца полипептида, т.е. N-концы полипептида, как в целом и характерная последовательность, могут совпадать.
Таким образом, изобретение относится к полипептиду, включающему N-концевую часть и С-концевую часть, где указанная N-концевая часть включает характерную последовательность QGP[P или L], и аминокислотная последовательность указанной С-концевой части по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:1.
Предпочтительно, указанная характерная последовательность представляет собой
QGP[P или L][L или G, или S, или M][M или D, или S, или Q, или G] или в еще одном предпочтительном варианте осуществления
QGP[P или L][L или G][M или D, или S].
Предпочтительно, указанная характерная последовательность представляет собой
QGP[P или L][L или G, или S, или M][M или D, или S, или Q, или G]XX[Q или G, или L, или A, или T, или S]X или в еще одном предпочтительном варианте осуществления
QGP[P или L][L или G][M или D, или S]XX[Q или L]X, где Х означает любую природную или модифицированную аминокислоту.
Более предпочтительно, указанная характерная последовательность представляет собой QGP[P или L]LM или QGPPG[D или S].
Более предпочтительно, указанная характерная последовательность представляет собой QGPPLM или QGPPGD.
В одном варианте осуществления указанная характерная последовательность представляет собой
QGP[P или L][L или M][M или Q][A или W, или G, или Q, или N]X[Q или G, или L][S или V, или T, или G] или в других предпочтительных вариантах осуществления
QGP[P или L][L или M][M или Q][A или W, или G, или Q, или N][L или T, или M, или S, или G, или Q,или R, или Y][Q или G, или L] [S или V, или T, или G] или
QGP[P или L]LM[A или W][L или T, или M][[Q или G][S или V, или T, или G].
Предпочтительно, указанная характерная последовательность представляет собой QGPPLM[A или W][L или T, или M] [Q или G][S или V, или T, или G].
В дополнительном варианте осуществления указанная характерная последовательность представляет собой
QGP[P или L][L или G, или S][D или S, или G, или Q]XX[L или A, или T, или Q][W или A, или V] или в других вариантах осуществления
QGP[P или L][L или G, или S][D или S, или G, или Q][T или I, или S, или W, или Q][V или L, или A, или S, или G][L или A, или T, или Q][W или A, или V] или
QGPPG[D или S][T или I]VL[W или A].
Предпочтительно, указанная характерная последовательность представляет собой QGPPGD[T или I]VL[W или A].
В еще одном варианте осуществления указанная характерная последовательность представляет собой
QGPP[G или L][M или Q]XX[Q или S][S или V] или в других вариантах осуществления
QGPP[G или L][M или Q][S или G, или W, или A, или T][L или F, или T, или S, или G, или Y][Q или S][S или V] или
QGPPLM[S или G][L или F, или T]Q[S или V].
В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления полипептид по настоящему изобретению включает характерную последовательность, выбранную из группы QGPPLMALQS, QGPPLMWMQV, QGPPLMWLQV, QGPPLMWTQS, QGPPLMWLQT, QGPPLMWTQV, QGPPLMWMQS, QGPPLMATQS, QGPPLMWLQS, QGPPLMALQV, QGPPLMWLGG, QGPPLMWRGS, QGPLLMWLQV, QGPPLMQTTP, QGPPLSWLQV, QGPPLSWLQS, QGPPGQWSQV, QGPPMMAGLS, QGPPLSWQQS, QGPPGMWSQS, QGPPLQWRQS, QGPPLMGTQS, QGPPLMQLQV, QGPPLSWSQV, QGPPMSWSQS, QGPPLMNLQV, QGPPMSAYQV и QGPPMQGGLS.
В соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления полипептид по настоящему изобретению включает характерную последовательность, выбранную из группы QGPPGDTVLW, QGPPGDIVLA, QGPPGSYDYS, QGPPGDGGSV, QGPLSGQSTP, QGPPGDWLQV, QGPPLMSLAV, QGPPLMSLTV, QGPLSGWAQV, QGPLSQSSQV, QGPLSSQSQV и QGPLGQQGQV.
В соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления полипептид по настоящему изобретению включает характерную последовательность, выбранную из группы QGPPLMSFQS, QGPPLMSTQS, QGPPLMSLQV, QGPPLMGLQV, QGPLSGWLQV, QGPPLQWFQV, QGPPLQWTQV, QGPPLMALSV, QGPPLMWSQV, QGPPGQWGQV, QGPPGSWSQV, QGPPLMSSQS, QGPPLMGLSV, QGPPLMTLQV и QGPPGQWYQS.
В соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления полипептид по настоящему изобретению включает характерную последовательность, выбранную из группы QGPPLMSVLA, QGPPGSWSSV, QGPPLGSMGP, QGPPLQWMQA, QGPPLQWMQV, QGPPLMSTQV, QGPPLMSLSV, QGPPLMSLQS, QGPPLMSLQA, QGPPLMSVQS, QGPPLMSAQS, QGPPLMSGQS и QGPPLMSGQV.
В еще одном варианте осуществления указанная N-концевая часть состоит из не более чем 15 аминокислот, предпочтительно, не более чем 14, 13, 12, 11, 10 аминокислот. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления указанная N-концевая часть состоит из 10 аминокислот.
В соответствии с одним вариантом осуществления N-конец С-концевой части непосредственно примыкает к С-концу N-концевой части, т.е. N-концевая часть и С-концевая часть непосредственно примыкают друг к другу.
В еще одном варианте осуществления С-концевая часть полипептидной цепи идентична SEQ ID NO:1.
В еще одном варианте осуществления характерная последовательность расположена на краю N-конца.
Предпочтительные варианты осуществления характерных последовательностей производных RANTES по настоящему изобретению представлены в таблице 1:
<b>Таблица 1</b>
<b>SEQ ID NO</b>
<b>Характерная последовательность</b>
SEQ ID NO:2
QGPPLMALQS
SEQ ID NO:3
QGPPLMWMQV
SEQ ID NO:4
QGPPLMWLQV
SEQ ID NO:5
QGPPLMWTQS
SEQ ID NO:6
QGPPLMWLQT
SEQ ID NO:7
QGPPLMWTQV
SEQ ID NO:8
QGPPLMWMQS
SEQ ID NO:9
QGPPLMATQS
SEQ ID NO:10
QGPPLMWLQS
SEQ ID NO:11
QGPPLMALQV
SEQ ID NO:12
QGPPLMWLGG
SEQ ID NO:13
QGPPLMWRGS
SEQ ID NO:14
QGPLLMWLQV
SEQ ID NO:15
QGPPLMQTTP
SEQ ID NO:16
QGPPGDTVLW
SEQ ID NO:17
QGPPGDIVLA
SEQ ID NO:18
QGPPGSYDYS
SEQ ID NO:19
QGPPGDGGSV
SEQ ID NO:20
QGPLSGQSTP
SEQ ID NO:21
QGPPGDWLQV
SEQ ID NO:22
QGPPLMSFQS
SEQ ID NO:23
QGPPLMSTQS
SEQ ID NO:24
QGPPLMSLQV
SEQ ID NO:25
QGPPLMGLQV
SEQ ID NO:26
QGPLSGWLQV
SEQ ID NO:27
QGPPLMSVLA
SEQ ID NO:28
QGPPGSWSSV
SEQ ID NO:29
QGPPLGSMGP
SEQ ID NO:30
QGPPLSWLQV
SEQ ID NO:31
QGPPLSWLQS
SEQ ID NO:32
QGPPGQWSQV
SEQ ID NO:33
QGPPMMAGLS
SEQ ID NO:34
QGPPLSWQQS
SEQ ID NO:35
QGPPGMWSQS
SEQ ID NO:36
QGPPLQWRQS
SEQ ID NO:37
QGPPLMGTQS
SEQ ID NO:38
QGPPLMQLQV
SEQ ID NO:39
QGPPLSWSQV
SEQ ID NO:40
QGPPMSWSQS
SEQ ID NO:41
QGPPLMNLQV
SEQ ID NO:42
QGPPMSAYQV
SEQ ID NO:43
QGPPMQGGLS
SEQ ID NO:44
QGPPLMSLAV
SEQ ID NO:45
QGPPLMSLTV
SEQ ID NO:46
QGPLSGWAQV
SEQ ID NO:47
QGPLSQSSQV
SEQ ID NO:48
QGPLSSQSQV
SEQ ID NO:49
QGPLGQQGQV
SEQ ID NO:50
QGPPLQWFQV
SEQ ID NO:51
QGPPLQWTQV
SEQ ID NO:52
QGPPLMALSV
SEQ ID NO:53
QGPPLMWSQV
SEQ ID NO:54
QGPPGQWGQV
SEQ ID NO:55
QGPPGSWSQV
SEQ ID NO:56
QGPPLMSSQS
SEQ ID NO:57
QGPPLMGLSV
SEQ ID NO:58
QGPPLMTLQV
SEQ ID NO:59
QGPPGQWYQS
SEQ ID NO:60
QGPPLQWMQA
SEQ ID NO:61
QGPPLQWMQV
SEQ ID NO:62
QGPPLMSTQV
SEQ ID NO:63
QGPPLMSLSV
SEQ ID NO:64
QGPPLMSLQS
SEQ ID NO:65
QGPPLMSLQA
SEQ ID NO:66
QGPPLMSVQS
SEQ ID NO:67
QGPPLMSAQS
SEQ ID NO:68
QGPPLMSGQS
SEQ ID NO:69
QGPPLMSGQV
Настоящее изобретение относится к описанным выше пептидным агентам и, кроме того, к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные пептидные агенты. Указанные нуклеиновые кислоты могут именоваться «нуклеиновыми кислотами в соответствии с настоящим изобретением». В следующем описании термин «агент» охватывает как пептидные агенты по настоящему изобретению, так и нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные пептидные агенты. Специалисту в данной области известно, как осуществить конструирование и идентификацию нуклеиновых кислот, кодирующих указанные пептидные агенты, в соответствии с генетическим кодом.
Таким образом, настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, включающим один или несколько сегментов, кодирующих один или несколько пептидных агентов, в соответствии с настоящим изобретением. Указанная нуклеиновая кислота может представлять собой РНК или ДНК. Указанная нуклеиновая кислота может, кроме того, представлять собой вектор, т.е. нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды по настоящему изобретению, могут быть включены внутрь вектора. Нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды по настоящему изобретению, могут, кроме того, быть включены в вирус. Таким образом, изобретение также относится к вирусу, который содержит внутри своего генома один или несколько сегментов, кодирующих один или несколько пептидных агентов в соответствии с настоящим изобретением.
Предпочтительно, пептидные агенты по настоящему изобретению являются очень сильнодействующими ингибиторами проникновения ВИЧ в клетки, т.е. обладают высокой активностью против ВИЧ. В соответствии с настоящим изобретением выражения «высокая активность против ВИЧ», «высокая активность» или «высокоактивный» используются в отношении агентов или пептидов, имеющих величину IC50, измеренную анализами слияния клеток и репликации ВИЧ, описанными в разделе «Материалы и методы» 1000 пкМ (1 нМ) или ниже, предпочтительно, менее чем 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 пкМ.
В литературе активность средств иногда выражается с точки зрения величин «IC50», полученных в анализе конкурентного связывания, т.е., обычно, в отношении конкуренции с меченой меткой молекулой, за связывание с представляющим интерес рецептором. В этом случае IC50 определяется как концентрация агента, при которой 50% метки вытесняется с рецептора указанным агентом, и иногда также именуется «видимое сродство». Однако для агентов по настоящему изобретению было обнаружено, что величины IC50 такого видимого сродства, полученные, например, в отношении нативного RANTES или MIP-1бета, не всегда пропорциональны активности молекулы против ВИЧ. Таким образом, предпочтительно использовать величины IC50, полученные в анализах, описанных в разделе «Материалы и методы».
В предпочтительных вариантах осуществления пептидные агенты представляют собой пептиды или полипептиды, которые относятся к пептиду RANTES. Пептидные агенты могут включать последовательность SEQ ID NO:1 или ее вариант, гомолог (ортолог, аллельный вариант, производное, функциональный мутант) или фрагмент. Предпочтительно, указанная последовательность или ее вариант, гомолог или фрагмент составляет или локализуется внутри части пептидного агента, отличной от характерной последовательности. Однако характерная последовательность может также содержаться внутри варианта или гомолога SEQ ID NO:1.
Указанные варианты, гомологи или фрагменты могут содержать замещения, вставки, делеции, добавления или усечения последовательности.
В соответствии с настоящим изобретением считается, что последовательность имеет аналогию или является гомологом SEQ ID NO:1, если указанная последовательность более чем на 70% идентична SEQ ID NO:1. Предпочтительно, указанная последовательность имеет идентичность последовательности SEQ ID NO:1 более чем 70%, предпочтительно, идентичность последовательности SEQ ID NO:1 более чем 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 99,9%.
Считается также, что последовательность имеет аналогию или является гомологом SEQ ID NO:1, если она содержит одно или несколько консервативных замещений в отношении SEQ ID NO:1. Консервативные замещения представляют собой замещения в последовательности пептидного или полипептидного агента, которые не ведут к значительной потере функции указанного агента или которые ведут лишь к небольшой потере функции. Такая потеря функции вследствие одного или нескольких консервативных замещений может считаться незначительной, если указанная потеря составляет менее чем 20% (предпочтительно, менее чем 15%, 10%, 6% или 4%) относительно функции агента, имеющего незамещенную последовательность. Консервативные замещения часто представляют собой замещения, где боковая цепь аминокислоты заменена боковой цепью аминокислоты, которая связана или аналогична по физико-химическим свойствам замененному остатку. Такие консервативные замещения могут осуществляться, например, в соответствии с представленной ниже таблицей. Аминокислоты в одном и том же блоке в среднем столбце и, предпочтительно, в одной и той же строке в правом столбце могут быть замещены друг другом:
<b>Таблица 2</b>
алифатические
неполярные
G A P
I L V
полярные незаряженные
C S T M
N Q
полярные заряженные
D E
K R H
ароматические
H F W Y
В соответствии с настоящим изобретением считается, что последовательность имеет аналогию или является гомологом SEQ ID NO:1, если более чем 30% остатков в указанной последовательности идентичны или консервативно замещены относительно SEQ ID NO:1. Предпочтительно, более чем 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% или 99,9% указанной последовательности идентичны или консервативно замещены относительно SEQ ID NO:1.
Изобретение, кроме того, относится к полипептидам, включающим фрагменты SEQ ID NO:1 или ее указанные гомологи. Фрагменты должны включать по меньшей мере n последовательных аминокислот из SEQ ID NO:1 или ее указанного гомолога, и, в зависимости от конкретной последовательности, n равен 5 или более (предпочтительно, более чем 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32,34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 56, 57).
max
Пептидные агенты по изобретению предпочтительно имеют низкую активность передачи сигналов, т.е. их введение и/или связывание с CCR5 вызывает лишь низкую степень провоспалительной передачи сигналов в клетках-мишенях. Пептидные агенты с «низкой активностью передачи сигналов» в соответствии с настоящим изобретением ведут к реакции передачи сигналов, составляющей 30% или менее максимальной реакции (E), вызванной PSC-RANTES, при испытании в концентрации 300 нМ в анализе передачи сигналов кальциевого тока (см. в разделе «Материалы и методы»). Предпочтительно, пептидные агенты по изобретению обладают активностью передачи сигналов по данным измерения в указанном анализе менее чем 30%, предпочтительно, менее чем 26%, 22%, 20%, 18%, 16%, 14%, 12%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1%.
max
Пептидные агенты по изобретению предпочтительно избирательны к CCR5 относительно CCR1 и CCR3. В соответствии с настоящим изобретением агент, который связывается с CCR1 и/или CCR3, все же считается имеющим избирательность к CCR5 относительно CCR1 и CCR3, если он по существу не активирует CCR1 или CCR3. Наиболее предпочтительно, агенты по настоящему изобретению по существу не связываются, не активируют CCR1 и CCR3. В контексте настоящего изобретения агент считается по существу не связывающимся с CCR1 и/или CCR3, если величина IC50 агента в отношении связывания с CCR1 и/или CCR3 составляет более чем 50 нМ, предпочтительно, более чем 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 нМ, по данным измерения с использованием анализа различительного связывания с CCR1 и/или анализа различительного связывания с CCR3 (см. раздел «Материалы и методы»). Избирательность активации CCR5 относительно активации CCR1 и/или CCR3 можно оценить посредством анализа тока кальция, как описано в разделе «Материалы и методы». В контексте настоящего изобретения агент считается по существу не активирующим CCR1 и/или CCR3, если его активность передачи сигналов меньше чем 30%, предпочтительно, меньше чем 26%, 22%, 20%, 18%, 16%, 14%, 12%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1% E, вызываемой на этом рецепторе нативным RANTES/CCL5, по данным измерения анализом тока кальция.
Пептидные агенты по изобретению предпочтительно имеют высокую активность секвестрации рецепторов, т.е. введение и/или связывание с CCR5 вызывает высокую степень секвестрации рецепторов. Указанная секвестрация представляет собой предпочтительно интернализацию, подавляющую регуляцию или подавляющую модуляцию рецепторов. Пептидные агенты с «высокой активностью секвестрации рецепторов», в соответствии с настоящим изобретением, ведут к секвестрации по меньшей мере 50% контрольного уровня поверхностных молекул CCR5 при испытании в анализе поверхностной подавляющей модуляции/секвестрации рецепторов CCR5 (см. раздел «Материалы и методы»). Предпочтительно, пептидные агенты по изобретению имеют величины активности секвестрации рецепторов более чем 50% контрольного уровня поверхностного CCR5, например, по меньшей мере 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95% контрольного уровня поверхностного CCR5.
Предпочтительно, агенты по изобретению сочетают в себе высокую активность против ВИЧ с низкой активностью передачи сигналов или сочетают в себе высокую активность против ВИЧ с высокой активностью секвестрации рецепторов. Предпочтительно, агенты по изобретению сочетают в себе высокую активность против ВИЧ как с низкой активностью передачи сигналов, так и с высокой активностью секвестрации рецепторов. Кроме того, агенты по изобретению предпочтительно сочетают в себе по меньшей мере одно свойство, выбранное из группы, состоящей из высокой активности против ВИЧ, высокой активности секвестрации рецепторов и низкой активности передачи сигналов, с избирательностью к CCR5. В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления изобретения агенты по изобретению характеризуются комбинацией промежуточных уровней активности против ВИЧ (уровни IC50, по данным измерения в анализе слияния клеток, например, от 0,15 до 1 нМ, от 0,15 до 0,7 нМ, от 0,3 до 1 нМ или от 0,5 до 1 нМ) с промежуточными уровнями активности передачи сигналов (например, от 30% до 50% или от 30% до 45%, по данным измерения анализом тока кальция) и промежуточными уровнями активности секвестрации рецепторов (например, от 20% до 60%, от 30% до 50%, от 20% до 50% или от 30% до 60%) по данным измерения в анализе подавляющей модуляции поверхностного CCR5. Анализы описаны ниже в разделе «Материалы и методы».
Термины «белок», «пептид» или «полипептид» используются взаимозаменяемо и относятся к аминокислотным полимерам любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может включать модифицированные аминокислоты, и он может прерываться неаминокислотами. Данные термины также охватывают аминокислотный полимер, который был модифицирован природно или путем вмешательства, например, образованием дисульфидной связи, гликозилированием, липидированием, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией или модификацией, такой как сопряженное связывание с метящим компонентом. В определение также включены, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области. Полипептиды могут встречаться в виде одиночных цепей или ассоциированных цепей. Полипептиды по изобретению могут быть природно или неприродно гликозилированы (т.е. полипептид имеет тип гликозилирования, который отличается от типа гликозилирования, обнаруживаемого в соответствующем природном полипептиде).
Получение пептидных агентов
Пептидные агенты по изобретению можно получить многими путями, например, с использованием известных методик молекулярной биологии (т.е. генной инженерии и ферментации - в целом, биотехнологией) или белковой химии (например, химическим пептидным синтезом).
Пептидные агенты и агенты в виде нуклеиновых кислот предпочтительно получают с использованием известных методик генной инженерии, как описано, например, в ссылке [13]. Таким образом, изобретение относится к способу получения пептидных агентов или полипептидов по изобретению, включающему стадию культивирования клетки-хозяина в условиях, которые вызывают экспрессию полипептида.
Например, пептидные агенты по настоящему изобретению могут быть получены в рекомбинантной форме путем экспрессии в клетке-хозяине. Такие способы экспрессии хорошо известны специалистам в данной области и многие из них подробно описаны в ссылке [13]. Подходящий вектор экспрессии можно выбрать для хозяина выбора. Вектор может содержать молекулу рекомбинантной ДНК, кодирующую пептидный агент, связанный с контрольной последовательностью экспрессии, которая распознается механизмом транскрипции хозяина. Когда пептидный агент по изобретению получен таким образом рекомбинантной экспрессией, агент извлекается очисткой из культуры клеток-хозяев.
Предпочтительный способ включает химический синтез in vitro [8, 9]. Таким образом, изобретение относится к способу получения пептидного агента, где пептидный агент синтезирован частично или в целом с использованием химических средств. Особенно предпочтителен твердофазный пептидный синтез, такой как способы на основе химии tBoc или Fmoc [10]. Можно также частично или полностью использовать ферментативный синтез [11].
Можно использовать биологический синтез, отличный от экспрессии у хозяина, например, полипептиды могут быть получены трансляцией из РНК in vitro. Пептидные агенты по изобретения могут быть также получены, например, расщеплением более длинных полипептидов с использованием протеаз.
Биологические способы, включающие генную инженерию, ферментацию и экспрессию, как правило, ограничены получением полипептидов на основе L-аминокислот, но можно использовать манипулирование механизмом трансляции in vivo или in vitro для обеспечения возможности (например, молекул аминоацил тРНК) введения D-аминокислот (или других неприродных аминокислот, таких как йодтирозин или метилфенилаланин, азидогомоаланин и т.д.) [12]. Однако, когда включены D-аминокислоты, предпочтительно использовать химический синтез. Полипептиды по изобретению могут иметь ковалентные модификации на С-конце и/или на N-конце.
Клетки-хозяева
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, включающей нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением.
В соответствии с одним аспектом изобретения клетка-хозяин подходит для биотехнологического получения агентов по настоящему изобретению. Подходящие хозяева для биотехнологического получения агентов по настоящему изобретению включают обычно используемые прокариотические виды, такие как E. coli, или эукариотические дрожжи, которые могут быть получены для экспрессии высоких уровней рекомбинантных белков и которые можно легко вырастить в больших количествах. Подходят также линии клеток, выращенные in vitro, в частности, при использовании запускаемых вирусом систем экспрессии, таких как система экспрессии бакуловируса, которая включает использование клеток насекомых в качестве хозяев. Пептидные агенты могут быть также экспрессированы in vivo, например в личинках насекомых или в тканях млекопитающих. Предпочтительно, пептидный агент экспрессирован в E. coli; например, подходит штамм BLR(DE3), хотя специалисту в данной области понятно, что эквивалентные системы равным образом целесообразны.
В соответствии с еще одним аспектом изобретения предоставляется клетка-хозяин, которая способна выживать и размножаться в кишечнике (желудочно-кишечном тракте) или влагалище человека или животного и предпочтительно экспрессировать в них пептидный агент, кодируемый указанной нуклеиновой кислотой. Предпочтительно, клетка-хозяин в соответствии с данным аспектом изобретения также секретирует указанный пептидный агент в периплазму или среду. Далее термин «агент», кроме того, включает описанные в настоящем описании клетки-хозяева.
Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой обладающий высокой способностью к расселению и непатогенный микроорганизм. Обладающие высокой способностью к расселению микроорганизмы, в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой штаммы, которые способны конкурировать с местными микробами за длительное заселение внутренних поверхностей слизистых оболочек. Клетка-хозяин представляет собой предпочтительно микроорганизм, который относится к флоре кишечника или влагалища человека, предпочтительно, микроорганизм, который обычно обнаруживается во флоре просвета кишечника или влагалища. Более предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой пробиотик и/или микроорганизм-комменсал, т.е. род, вид или штамм, который благоприятен по меньшей мере для человека-хозяина. Предпочтительно, клетка-хозяин, в соответствии с настоящим изобретением, является частью кишечной или влагалищной флоры нормального или здорового человека или животного. В соответствии с одним вариантом осуществления клетка-хозяин относится к роду, выбранному из группы, состоящей из Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Streptococcus, Escherichia и Lactobacillus. Клетка-хозяин представляет собой предпочтительно вид, выбранный из группы, состоящей из Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus GG, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum и Streptococcus gordonii. Предпочтительно, обладающий высокой способностью к расселению микроорганизм, в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой Escherichia coli Nissle 1917. Однако любой другой, обладающий высокой способностью к расселению штамм или Escherichia coli, или другой из указанных выше видов, также представляет собой предпочтительный штамм, в соответствии с настоящим изобретением. В другом варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой дрожжевой грибок. Предпочтительно, дрожжевой грибок представляет собой дрожжевой грибок-комменсал, такой как Pichia guelliermondii или Saccharomyces boulardii. В еще одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку человека.
Специалисту в данной области хорошо известны способы трансформации микроорганизмов чужеродными нуклеиновыми кислотами и последующего использования трансформированных микроорганизмов для экспрессии полипептида, кодируемого указанными нуклеиновыми кислотами, во внутриклеточной, периплазматической или секретируемой форме [см. ссылки 13, 15, 16, 17].
Фармацевтические композиции
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим агент, в соответствии с настоящим изобретением, и фармацевтически приемлемый носитель. Таким образом, агенты по настоящему изобретению или фармацевтически приемлемая соль пептидных агентов или соответствующих нуклеиновых кислот предоставлен для применения в качестве лекарственного средства. Композиции по настоящему изобретению могут содержать любой агент по настоящему изобретению, т.е. здесь и далее пептидный агент, его фармацевтически приемлемую соль, нуклеиновую кислоту, ее фармацевтически приемлемую соль или клетку-хозяин в соответствии с настоящим изобретением. Получение фармацевтических композиций хорошо известно специалисту в данной области.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут, в частности, содержать более одного агента (несколько) по настоящему изобретению, например, два или более агентов. Изобретение также относится к фармацевтическому препарату или системе, содержащей (а) первый агент, который представляет собой агент по изобретению; и (b) второй фармацевтический агент. В соответствии с определенными вариантами осуществления второй фармацевтический агент может включать ингибиторы обратной транскриптазы (RTI), ингибиторы протеазы (PI), ингибиторы интегразы и ингибиторы вирусной сборки. В соответствии с другими вариантами осуществления второй фармацевтический агент может включать ингибиторы проникновения, отличные от ингибиторов проникновения по настоящему изобретению, например, полианионные вещества (например, сульфат целлюлозы), агенты, связывающие гликаны, или лектины, агенты, связывающие рецепторы гликанов (например, растворимый маннан), антитела, ингибиторы проникновения мелких молекул, ингибиторы проникновения пептидов или агенты, связывающие CXCR4 (блокирующие CXCR4). В соответствии с еще одними вариантами осуществления второй фармацевтический агент может включать детергент или агент, который модифицирует рН, например, кислоту или агент, забуферивающий рН. В соответствии с еще дополнительными вариантами осуществления второй фармацевтический агент может включать ингибиторную РНК (siPHK), где siPHK может быть химически модифицирована.
В соответствии с другими аспектами изобретения указанный второй агент может также представлять собой противовоспалительное лекарственное средство или иммуносупрессант. Указанные множественные агенты по изобретению или указанные первый и второй агенты составлены или в смеси, или в виде отдельных композиций, например, для одновременного, хотя раздельного, или последовательного введения (см. ниже).
Фармацевтически приемлемые соли агентов по изобретению, конечно, могут быть получены обычными методиками, такими как взаимодействие свободного основания и/или кислоты агента по меньшей мере со стойхиометрическим количеством желаемой образующей соль кислоты или основания.
Фармацевтически приемлемые соли агентов по изобретению включают соли с неорганическими катионами, такими как натрий, калий, кальций, магний, цинк и аммоний, и соли с органическими основаниями. Подходящие органические основания включают N-метил-D-глюкамин, аргинин, бензатин, диоламин, оламин, прокаин и трометамин. Фармацевтически приемлемые соли агентов по изобретению также включают соли, полученные из органических или неорганических кислот. Подходящие анионы включают ацетат, адипат, бесилат, бромид, камсилат, хлорид, цитрат, эдисилат, эстолат, фумарат, глюцептат, глюконат, глюкауронат, гиппурат, гиклат, гидробромид, гидрохлорид, йодид, изетионат, лактат, лактобионат, малеат, месилат, метилбромид, метилсульфат, напсилат, нитрат, олеат, памоат, фосфат, полигалактуронат, стеарат, сукцинат, сульфат, сульфосалицилат, таннат, тартрат, терефталат, тосилат и триэтйодид.
Фармацевтические дозированные формы агента по изобретению могут быть предоставлены в системе немедленного высвобождения, контролируемого высвобождения, непрерывного высвобождения или целевой доставки лекарственного средства.
Обычно применяемые дозированные формы включают, например, растворы и суспензии, (микро)эмульсии, мази, гели, кремы, пасты, пены, суппозитории, яйцевидные влагалищные суппозитории, имплантаты, трансдермальные системы, липосомы, таблетки, драже, лепешки, капсулы из мягкой или твердой оболочки, аморфные или кристаллические порошки, быстро растворимые порошки или таблетки, аэрозоли и лиофилизированные составы. В зависимости от используемого пути введения, для нанесения или введения препарата могут потребоваться специальные устройства, такие как, например, шприцы и иглы, ингаляторы, насосы, инъекционные ручки, аппликаторы, специальные колбы или другие устройства для введения, которые могут также имплантироваться внутрь тела. В частности, агенты по настоящему изобретению могут, например, также содержаться или быть связаны с контрацептивным устройством или агентом, например внутриматочным или внутришеечным устройством, спиралью или диафрагмой, или распределяться на презервативе, например, содержаться в виде покрывающей жидкости, раствора, геля или порошка. Однако в соответствии с настоящим изобретением агенты по настоящему изобретению необязательно должны быть связаны с контрацептивным устройством или агентом. Предпочтительно, агент по изобретению содержится внутри системы доставки в виде депо и вводится ею. Предпочтительно, указанная система доставки в виде депо включает влагалищное кольцо или другой имплантат, который подходит для введения и/или имплантации во влагалище или шейку матки и обеспечивает медленное (контролируемое и/или непрерывное) высвобождение агента по настоящему изобретению.
Фармацевтические дозированные формы часто составлены из лекарственного средства, эксципиента (эксципиентов) и системы упаковки/укупоривания. Один или несколько эксципиентов, также называемых неактивными ингредиентами, могут добавляться к агенту по изобретению для улучшения или содействия изготовлению, стабильности, введению и безопасности лекарственного средства и могут обеспечить средство достижения желаемого профиля высвобождения лекарственного средства. Поэтому тип эксципиента (эксципиентов), добавляемых к лекарственному средству, может зависеть от различных факторов, таких как, например, физические и химические свойства лекарственного средства, путь введения и методика изготовления. Фармацевтически приемлемые эксципиенты доступны в данной области и включают такие, которые перечислены в различных фармакопеях (см., например, ссылки [18, 19]).
Фармацевтические дозированные формы агента по настоящему изобретению могут быть изготовлены любым из способов, хорошо известных в данной области, например способами обычного смешивания, просеивания, растворения, плавления, гранулирования, изготовления драже, таблетирования, суспендирования, экструзии, сушки распылением, растирания в жидкой среде, эмульгирования, (нано/микро)инкапсулирования, захвата или лиофилизации. Как отмечено выше, композиции по настоящему изобретению могут содержать один или несколько физиологически приемлемых неактивных ингредиентов, которые облегчают переработку активных молекул в препараты для фармацевтического применения.
Должное получение композиции зависит от желаемого пути введения. Например, для внутривенной инъекции композицию можно составлять в водном растворе, если необходимо, с использованием физиологически совместимых буферов, включая, например, фосфат, гистидин или цитрат, для доведения рН композиции, и агент тоничности, такой как, например, хлорид натрия или декстроза. Для введения через слизистые оболочки и интраназального введения могут быть предпочтительны полутвердые, жидкие композиции или накладки, возможно содержащие усилители проникновения. Такие усилители проникновения в целом известны в данной области. Для перорального введения агенты могут быть включены в состав жидких или твердых дозированных форм и в виде композиций немедленного или контролируемого/непрерывного высвобождения. Подходящие дозированные формы для перорального введения субъекту внутрь включают таблетки, пилюли, драже, капсулы из мягкой или твердой оболочки, жидкости, гели, сиропы, кашицеобразные пасты, суспензии и эмульсии. Агенты могут быть также включены в состав ректальных композиций, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие обычные основы суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды. Для влагалищных суппозиториев можно использовать много различных основ суппозиториев, известных специалистам в данной области, например глицеринированный желатин, деполяризованный желатин, масло какао, полиэтиленгликоль, полисорбат или другие.
Для перорального введения агенты по изобретению в целом будут представлены в твердых дозированных формах, например в форме таблеток или капсул, или в виде водного раствора или суспензии.
Твердые дозированные формы можно получить с использованием эксципиентов, которые могут включать инертные разбавители, наполнители, разрыхлители, связующие агенты (сухие и влажные), агенты, задерживающие растворение, лубриканты, глиданты, агенты против прилипания, смолы катионного обмена, смачивающие агенты, антиоксиданты, консерванты, красящие агенты, подслащивающие и ароматизирующие агенты. Такие эксципиенты могут быть из синтетического или природного источника. Примеры таких эксципиентов включают производные целлюлозы, лимонную кислоту, дикальций фосфат, желатин, карбонат магния, лаурилсульфат магния/натрия, маннит, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, силикаты, диоксид кремния, бензоат натрия, сорбит, крахмалы, стеариновую кислоту или ее соль, сахара (т.е. декстрозу, сахарозу, лактозу и т.д.), тальк, слизь трагаканта, растительные масла (гидрированные) и воски. Этанол и вода могут служить в качестве агентов, способствующих гранулированию. В определенных случаях желательно покрытие таблеток, например, маскирующей вкус пленкой, пленкой, устойчивой к кислоте желудка, или пленкой, задерживающей высвобождение. Природные и синтетические полимеры в комбинации с красящими агентами, сахарами и органическими растворителями или водой часто используют для покрытия таблеток, что приводит к получению драже. Когда капсула предпочтительна таблетке, то порошок лекарственного средства, его суспензия или раствор может доставляться в совместимую капсулу из мягкой или твердой оболочки.
Подходящие инертные разбавители включают карбонат натрия и кальция, фосфат натрия и кальция и лактозу. Кукурузный крахмал и альгиновая кислота представляют собой подходящие разрыхляющие агенты. Связующие агенты могут включать крахмал и желатин. Смазывающий агент, в случае его присутствия, как правило, будет представлять собой стеарат магния, стеариновую кислоту или тальк. При желании, таблетки могут быть покрыты таким материалом, как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, для задержки всасывания в желудочно-кишечном тракте.
Капсулы для перорального введения включают твердые желатиновые капсулы, в которых активный ингредиент смешан с твердым разбавителем, и мягкие желатиновые капсулы, где активный ингредиент смешан с водой или маслом, таким как арахисовое масло, жидкий парафин или оливковое масло.
В одном варианте осуществления агенты по настоящему изобретению можно вводить местно, через кожу или слизистую оболочку, например, через трансдермальную систему, полутвердый или жидкий состав, например, гель, (микро)эмульсию, мазь, раствор, (нано/микро)суспензию или пену. Проникновение препарата в кожу или слизистую оболочку и подлежащие ткани можно регулировать, например, используя агенты, усиливающие проникновение; соответствующим выбором и комбинацией липофильных, гидрофильных и амфифильных эксципиентов, включая воду, органические растворители, воски, масла, синтетические и природные полимеры, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы; регулируя рН; и используя образующие комплексы агенты. Другие методики, такие как ионтофорез, можно использовать для регулирование проникновения агента по изобретению через кожу. Предпочтительным является трансдермальное или местное введение, например, в ситуациях, в которых желательна местная доставка при минимальном системном воздействии.
Для введения ингаляцией или введения в носовую полость агенты для применения, в соответствии с настоящим изобретением, могут доставляться в форме раствора, суспензии, эмульсии или полутвердого аэрозоля из находящихся под избыточным давлением контейнеров, или распылителя, обычно с использованием газа-вытеснителя, например, галогенированных углеродов, полученных из метана и этана, диоксида углерода или любого другого подходящего газа. Для местных аэрозолей можно использовать углеводороды, подобно бутану, изобутену и пентану. В случае находящегося под избыточным давлением аэрозоля соответствующую дозированную единицу можно определить предоставлением клапана для доставки отмеренного количества. Могут составляться капсулы и кассеты, например, из желатина, для использования в ингаляторе или инсуффляторе. Они обычно содержат порошковую смесь агента и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
Композиции, составленные для парентерального введения инъекцией, обычно стерильные и могут быть представлены в единичных дозированных формах, например, ампулах, шприцах, инъекционных ручках или многодозовых контейнерах, причем последние обычно содержат консервант. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и могут содержать составляющие агенты, такие как буферы, агенты тоничности, агенты, повышающие вязкость, поверхностно-активные вещества, суспендирующие и диспергирующие агенты, антиоксиданты, биологически совместимые полимеры, хелатообразующие агенты и консерванты. В зависимости от участка инъекции носитель может содержать воду, синтетическое или растительное масло и/или органические совместные растворители. В определенных случаях, например, при лиофилизированном продукте или концентрате, композицию для парентерального введения восстанавливают растворением или разбавляют непосредственно перед введением. Составы депо, обеспечивающие контролируемое или непрерывное высвобождение агента по изобретению, могут включать инъецируемые суспензии нано/микрочастиц или нано/микро- или немикронизированные кристаллы. Полимеры, такие как поли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота) или их сополимеры, могут служить в качестве матриц контролируемого/непрерывного высвобождения в дополнение к другим, хорошо известным в данной области. Другие депо системы доставки могут быть представлены в форме имплантатов и насосов, требующих разреза.
Подходящие носители для внутривенной инъекции молекул по изобретению хорошо известны в данной области и включают растворы на водной основе, содержащие основание, такое как, например, гидроксид натрия, для образования ионизированного агента, сахарозу или хлорид натрия, например, в качестве агента тоничности. Раствор на водной основе может включать буфер, содержащий фосфат или гистидин. Могут добавляться со-растворители, такие как, например, полиэтиленгликоли. Такие системы на водной основе эффективны при растворении агентов по изобретению и создают низкую токсичность после системного введения. Пропорции компонентов системы раствора может значительно варьироваться без нарушения характеристик растворимости и токсичности. Кроме того, может варьироваться идентичность компонентов. Например, можно использовать низкотоксичные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты или полоксамеры, а также могут быть добавлены полиэтиленгликоль или другие со-растворители, биологически совместимые полимеры, такие как поливинилпирролидон, и другие сахара и полиолы могут быть замещены декстрозой.
Другие аспекты изобретения
Настоящее изобретение, кроме того, относится к набору, например диагностическому набору, включающему один или несколько пептидных агентов, нуклеиновых кислот или клеток-хозяев, в соответствии с изобретением.
Виды применения молекул по изобретению
Виды применения на основе биологической функции; лечение и профилактика заболеваний
Настоящее изобретение относится к применению пептидных агентов по настоящему изобретению для блокирования и/или вызова секвестрации CCR5. Секвестрация может быть в форме интернализации CCR5 в клетки-мишени и/или подавляющей регуляции (подавляющей модуляции) CCR5 в клетках-мишенях. Изобретение также относится к применению нуклеиновых кислот, кодирующих указанные пептидные агенты, или клетки-мишени, в соответствии с настоящим изобретением (см. выше), включающей нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, для экспрессии и необязательно секреции указанных пептидных агентов.
Как указано выше в отношении настоящего изобретения, термин «агент» охватывает пептидные агенты, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные пептидные агенты, и клетки-хозяева, в соответствии с изобретением. Изобретение относится к применению указанных агентов для лечения и/или профилактики (предотвращения) заболеваний, которые можно лечить блокированием и/или вызовом секвестрации ССК5. Таким образом, агенты по настоящему изобретению предоставляются для применения в качестве лекарственных средств.
Субъекту может быть введен один или несколько агентов по настоящему изобретению. Когда вводят более одного агента, указанные агенты можно вводить вместе (в виде смеси или раздельно, хотя по существу одновременно) или последовательно. Указанный один или несколько агентов по настоящему изобретению можно вводить в комбинации с одним или несколькими другими фармацевтически активными агентами, которые не содержатся внутри агентов по настоящему изобретению. Затем агент или агенты по настоящему изобретению можно также вводить вместе (в виде смеси или раздельно, хотя по существу одновременно) с указанным одним или несколькими другими фармацевтически активными агентами, или последовательно.
В соответствии с предпочтительным аспектом настоящее изобретение относится к применению указанных пептидных агентов или нуклеиновых кислот, кодирующих пептидные агенты, для лечения и/или профилактики у субъекта ВИЧ инфекций и/или вспышки синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа), и/или связанных с ними расстройств и заболеваний.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики ВИЧ инфекции (передачи ВИЧ) у субъекта, включающему введение композиции, содержащей агент по настоящему изобретению. Кроме того, предоставлен способ лечения или профилактики вспышки синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа) у субъекта, включающий введение композиции, содержащей агент по настоящему изобретению.
Например, передачу ВИЧ, т.е. инфекции клеток-мишеней ВИЧ, можно предотвратить применением композиции в соответствии с изобретением (например, суппозитория, крема, геля, пены, пасты, раствора, жидкости или порошка, содержащих агент в соответствии с настоящим изобретением). В данном варианте осуществления указанную композицию предпочтительно наносят на гениталии человека (влагалище, прямую кишку, кишечник) перед или во время, или после полового контакта, для предотвращения передачи ВИЧ во время полового контакта. Наиболее предпочтительно, указанную композицию наносят перед половым контактом.
Настоящее изобретение также относится к применению агентов по настоящему изобретению в качестве противовоспалительных средств. Таким образом, агенты можно применять для лечения и/или профилактики воспалительных заболеваний и аутоиммунных заболеваний. В соответствии с еще одним аспектом изобретения агенты по настоящему изобретению можно применять для лечения и/или профилактики злокачественных заболеваний, а также для лечения и/или профилактики бактериальных и вирусных инфекций. В данном случае вирус может представлять собой ВИЧ или вирус, отличный от ВИЧ.
В соответствии с другими аспектами изобретения предоставлен также способ лечения или профилактики воспаления, воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний или бактериальных и вирусных инфекций, включающий введение композиции, содержащей агент по настоящему изобретению. В частности, например, предоставлен способ лечения или профилактики воспалительного заболевания кишечника, ревматоидного артрита, атеромы или артериосклероза, астмы, аллергического ринита или атопического дерматита, отторжения трансплантированных органов, тканей или клеток, рассеянного склероза и/или других демиелинизирующих заболеваний, периферической нейропатии, а также злокачественных опухолей, включая метастазирующие злокачественные опухоли.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения в отношении любого из указанных выше заболеваний и состояний предоставлен способ лечения и профилактики, где описанную выше клетку-хозяин вводят субъекту, причем указанная клетка-хозяин экспрессирует и секретирует пептидный агент в соответствии с настоящим изобретением.
Изобретение также относится к применению нуклеиновых кислот по настоящему изобретению для генной терапии, где указанные нуклеиновые кислоты включены в вирус для введения субъекту.
Способы введения
Композиции по настоящему изобретению могут быть доставлены непосредственно или в виде фармацевтических композиций, содержащих эксципиенты (см. выше), что хорошо известно в данной области. Настоящие способы лечения включают введение субъекту терапевтически эффективного количества агента по настоящему изобретению.
Используемый в настоящем описании термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству агента в соответствии с настоящим изобретением, необходимому для лечения, облегчения или профилактики целевого патологического состояния, или проявления выявляемого терапевтического или профилактического эффекта. Как правило, терапевтически эффективное количество можно оценить первоначально или в анализах культуры клеток или на экспериментальной модели, например на нечеловекообразных приматах, мышах, кроликах, собаках или свиньях. Экспериментальную модель можно также использовать для определения целесообразного диапазона концентрации и пути введения. Затем такую информацию можно использовать для определения полезных доз и путей введения для людей.
Точное эффективное количество для человека будет зависеть от тяжести патологического состояния, общего состояния здоровья субъекта, возраста, массы тела и пола субъекта, рациона, времени и частоты введения, комбинации (комбинаций) препаратов, реакционной чувствительности и устойчивости/реакции на лечение. Это количество можно определить обычным экспериментированием и находится в компетенции клинициста. Обычно, эффективное количество, т.е. доза агента, будет составлять от 0,005 до 50 мг/кг, предпочтительно, от 0,125 до 20 мг/кг.
Эффективные схемы лечения для предпочтительных агентов по изобретению включают введение один, два или три раза в день и/или один, два, три, четыре, пять или шесть раз в неделю. Поэтому такие схемы особенно предпочтительны для применения в настоящем изобретении.
Эффективный и удобный путь введения и целесообразный состав агентов по изобретению в фармацевтических композициях (см. выше) можно также легко определить обычным экспериментированием. Различные композиции и системы введения лекарственных средств доступны в данной области (см. например, ссылки [20, 21]).
Подходящие пути введения могут, например, включать влагалищный, прямокишечный, кишечный, пероральный, в нос (интраназальный), легочный или другое введение через слизистые оболочки, местное, трансдермальное, глазное, ушное и парентеральное введение.
Первичные пути для парентерального введения включают внутривенное, внутримышечное и подкожное введение. Вторичные пути введения включают внутрибрюшинное, внутриартериальное, внутрисуставное, внутрисердечное, внутрицистернальное, внутрикожное, внутрь поражения, внутриглазное, внутриплевральное, подоболочечное, внутриматочное и внутрижелудочковое введение. Подлежащее лечению показание, наряду с физическими, химическими и биологическими свойствами лекарственного средства, диктует подлежащие применению тип композиции и путь введения, а также предпочтительность местной или системной доставки.
Для композиций, используемых для настоящих способов лечения, терапевтически эффективную дозу можно первоначально оценить с использованием разнообразных методик, хорошо известных в данной области. Первоначальные дозы, используемые в исследованиях на животных, могут быть основаны на эффективных концентрациях, установленных в анализах клеточной культуры. Диапазоны дозировок, целесообразные для людей, можно определить, например, используя данные, полученные в исследованиях на животных и анализах клеточной культуры.
Терапевтически эффективная доза или количество агента или лекарственного средства по настоящему изобретению относится к количеству или дозе агента или лекарственного средства, которые приводят к облегчению симптомов или продлению выживания субъекта. Токсичность и терапевтическую эффективность таких молекул можно определить стандартными фармацевтическими методиками на клеточной культуре или на экспериментальных животных, например, определением LD50 (дозы, летальной для 50% популяции). Отношение дозы, вызывающей токсический эффект, к дозе, вызывающей терапевтический эффект, представляет собой терапевтический индекс, который может быть выражен в виде соотношения LD50/ED50. Предпочтительны агенты, которые проявляют высокие терапевтические индексы.
Эффективное количество или терапевтически эффективное количество представляет собой количество агента или фармацевтической композиции, которое будет вызывать биологическую или медицинскую реакцию ткани, системы, животного или человека, искомую исследователем, ветеринаром, врачом или другим клиницистом, например, регуляцию метаболизма глюкозы, снижение повышенных или увеличенных уровней глюкозы в крови, лечение или предотвращение расстройства, связанного с измененным метаболизмом глюкозы, например, диабета и т.д.
Дозировки предпочтительно укладываются в диапазон циркулирующих концентраций, который включает ED50 с небольшой или отсутствующей токсичностью. Дозировки могут варьироваться в зависимости от используемой дозированной формы и/или используемого пути введения. Точный состав, путь введения, дозировку и интервал между введением дозировок следует выбирать в соответствии со способами, известными в данной области, с учетом специфики состояния субъекта.
Количество и интервал дозировки можно индивидуально подобрать для обеспечения уровней активной части в плазме, которые достаточны для достижения желаемых эффектов, т.е. минимальной эффективной концентрации (МЕС). МЕС будет варьироваться для каждого агента, но может оцениваться, например, по данным in vitro и экспериментам на животных. Дозировки, необходимые для достижения МЕС, будут зависеть от индивидуальных характеристик и пути введения. В случаях местного введения или селективного захвата эффективная местная концентрация лекарственного средства может быть не связана с концентрацией в плазме.
Количество вводимого агента или композиции может зависеть от разнообразных факторов, включая пол, возраст и массу тела получающего лечение субъекта, тяжести поражения, способа введения и оценки назначающего лечение врача.
При желании, настоящие композиции могут быть представлены в упаковке или устройстве отпуска, содержащем одну или несколько единичных дозированных форм, содержащих активный ингредиент. Такая упаковка или устройство может, например, включать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка, или стеклянные и резиновые пробки, такие как во флакончиках. Упаковка или устройство отпуска могут сопровождаться инструкциями по введению. Могут быть также получены композиции, содержащие агент по изобретению, составленные в совместимом фармацевтическом носителе, помещены в соответствующий контейнер и маркированы для лечения указанного состояния.
Таким образом, настоящее изобретение относится к пептидному агенту, нуклеиновой кислоте или клетке-хозяину в соответствии с изобретением для применения при лечении или профилактике ВИЧ инфекций, при лечении и/или профилактике синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа), при лечении и/или профилактике передачи ВИЧ, и/или профилактике передачи ВИЧ во время полового контакта.
Таким образом, настоящее изобретение относится к пептидному агенту, нуклеиновой кислоте или клетке-хозяину в соответствии с изобретением для применения при лечении или профилактике воспаления, воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, бактериальных и вирусных инфекций, воспалительного заболевания кишечника, ревматоидного артрита, атеромы или артериосклероза, астмы, аллергического ринита или атопического дерматита, отторжения трансплантированных органов, тканей или клеток, рассеянного склероза и/или других демиелинизирующих заболеваний, периферической нейропатии, злокачественных заболеваний, злокачественных опухолей или метастазирующих злокачественных опухолей.
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению пептидного агента, нуклеиновой кислоты или клетки-хозяина в соответствии с изобретением для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики ВИЧ инфекций, для лечения и/или профилактики синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа), или его вспышки, и профилактики передачи ВИЧ, например, во время полового контакта.
Настоящее изобретение относится к применению пептидного агента, нуклеиновой кислоты или клетки-хозяина в соответствии с изобретением для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики воспаления, воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний или бактериальных и вирусных инфекций, ревматоидного артрита, атеромы или артериосклероза, астмы, аллергического ринита или атопического дерматита, отторжения трансплантированных органов, тканей или клеток, рассеянного склероза и/или других демиелинизирующих заболеваний, периферической нейропатии, злокачественных заболеваний, злокачественных опухолей или метастазирующих злокачественных опухолей.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показаны детали характеристики типичного полипептидного производного цитокина, состоящего из SEQ ID NO:21, слитого с N-концом SEQ ID NO:1. Полипептид получали общим химическим синтезом, как описано ниже в разделе «Материалы и методы». AU: Единицы всасывания. На панели А показана аналитическая ВЭЖХ неочищенного материала после расщепления под действием HF. На панели В показана аналитическая ВЭЖХ желаемого материала, очищенного из неочищенного препарата. На панели С показан след аналитической ВЭЖХ реакционной смеси после очистки и повторной укладки/образования дисульфидных мостиков. На панели D показан след, полученный аналитической ВЭЖХ с очищенным материалом после повторной укладки.
Способы осуществления изобретения
Материалы и методы
Получение полипептидов химическим синтезом
Получение хемокинов общим химическим синтезом проводили на модифицированном пептидном синтезаторе ABI 430, изготовленном по заказу для выполнения Boc химии с нейтрализацией in situ [22]. Стратегия синтеза также предусматривала стадию химического кэппинга (для окончания любых цепей свободными аминогруппами в конце стадии кэппинга), с использованием ацетилглицина в каждом цикле. После расщепления HF неочищенные продукты анализировали аналитической ВЭЖХ и MALDI (лазерной десорбционной ионизацией с матричным содействием) масс-спектрометрией. После очистки в препаративном масштабе желаемого продукта повторную укладку белков и образование дисульфидных мостиков проводили в соответствии с опубликованными методиками [23], и повторно уложенный материал верифицировали аналитической ВЭЖХ (более короткое время удерживания) и масс-спектрометрией с электрораспылением (потеря единиц массы вследствие окисления цистеиновой тиольной группы во время образования дисульфидного мостика). Конечные продукты подвергали очистке в препаративном масштабе и затем лиофилизировали. Детали характеризации промежуточного и частично очищенного материала ВЭЖХ для конкретного синтеза белка по изобретению, состоящего из SEQ ID NO:21, слитого с N-концом SEQ ID NO:1, показаны на фиг.1. Результаты характеризации очищенного материала указанного белка масс-спектрометрией представлены в следующей таблице:
<b>Таблица 3</b><b>Характеристика очищенного материала масс-спектрометрией</b>
Белок, состоящий из SEQ ID NO:21, слитой с N-концом SEQ ID NO:1
Рассчитанная масса
Наблюдаемая масса
Материал перед повторной укладкой
7976,26
7976,76±0,24
Материал после повторной укладки
7922,26
7972,68±0,36
Анализ конечного продукта аналитической ВЭЖХ показан на фиг.1.
Получение полипептидов экспрессией в организмах хозяина
Полипептидные агенты получали экспрессией в организмах хозяина с использованием обычных методик, которые известны в данной области, в соответствии с методиками, описанными, например, в ссылках [13] и [14].
Анализ слияния клеток
4
4
Данный анализ осуществляли, как описано в ссылке [5], используя линии клеток HeLa-P5L [2] и HeLa-Env-ADA [26]. Клетки HeLa-P5L высевали в 96-луночные планшеты (10 клеток на лунку). Через 24 часа среду удаляли и заменяли средой, содержащей 10 клеток HeLa-Env-ADA на лунку плюс хемокиновые пептидные агенты по настоящему изобретению. Еще через 24 ч клетки однократно промывали в PBS (забуференный фосфатом солевой раствор), лизировали и анализировали на активность β-галактозидазы добавлением придающего цвет субстрата CPRG (хлорфенол красный-β-D-галактопиранозид). Результаты выражали в соответствии со следующей формулой:
100×(средняя спектральная поглощательная способность [обработанные]-средняя спектральная поглощательная способность [клетки без оболочки])/(средняя спектральная поглощательная способность [без хемокина]-средняя спектральная поглощательная способность [клетки без оболочки]).
Измерения проводили в трех повторах по каждому независимому эксперименту, и величины IC50 получали по кривым доза-ингибирование, построенным с использованием программного обеспечения Prism (GraphPad). Величина IC50 представляет собой концентрацию пептидного агента, при которой слияние клеток ингибируется на 50%, по сравнению с контролем, который не подвергался воздействию какого-либо ингибирующего агента.
Анализ репликации вирусов
Репликацию вирусов анализировали, как описано в ссылках [24] и [25], с модификацией, заключающейся в том, что клетки HeLa использовали в качестве исходного материала, и клетки-репортеры SX22-1 добавляли только после экспрессии вируса.
Анализ тока кальция
max
Агенты анализировали для выявления стимуляции передачи сигналов кальция или через CCR5, CCR1, или CCR3 с использованием клеток (например, эмбриональных почечных (НЕК) клеток человека), трансформированных для получения стабильной экспрессии или CCR5, CCR1, или CCR3, соответственно. Анализ осуществляли по существу, как описано в ссылке [6], с использованием 96-луночных планшетов и флюориметра FLEXstation (Molecular Devices). Измерения температуры проводили на указанных клетках, загруженных Fluo-4 (Molecular Probes), в соответствии с рекомендациями изготовителя, и поддерживали при 37˚С. Измерения проводили в шести повторах (n=6) при концентрации одного агента (300 нМ; концентрации, которая дает E для PSC-RANTES и нативного RANTES).
Анализ поверхностной подавляющей модуляции CCR5
Клетки CHO-CCR5 [5] высевали в концентрации 80000 клеток/мл в 96-луночные планшеты. На следующий день среду удаляли и заменяли средой, содержащей хемокины в различных концентрациях, и клетки инкубировали в течение 1 ч при 37˚С. В конце этого периода среду удаляли и клетки фиксировали 4% параформальдегидом. После двух промываний PBS к клеткам добавляли растворы или конъюгированные с фикоэритрином анти-CCR5 антитела (клон 3А9, Pharmingen), или конъюгированные с фикоэритрином анти-CCR1 антитела (для отрицательного контроля) в PBS-1% BSA (бычий сывороточный альбумин). Планшеты оставляли на льду на 1 ч, затем три раза промывали PBS-1% BSA перед определением величин флюоресценции с использованием флюориметра FLEXstation. Результаты выражали в виде % контрольного уровня поверхностного CCR5:
100×(средняя флюоресценция [добавленный хемокин, анти-CCR5]-средняя флюоресценция отрицательного контроля [анти-CCR1])/средняя флюоресценция положительного контроля [без добавления хемокина, анти-CCR5]-средняя флюоресценция [анти-CCR1]).
Каждое определение выполняли в шести повторах (n=6), и PSC-RANTES использовали в качестве эталонного хемокина в каждом эксперименте.
Анализ различения CCR1
Избирательность CCR5 относительно CCR1 измеряли в анализе конкурентного связывания CCR1 с использованием меченого радиоактивной меткой природного лиганда CCR1 в качестве метки. Любой MIP-RANTES/CCL5 можно, например, использовать в качестве метки для данного анализа различения CCR1. Анализ проводили, как описано в ссылке [27].
Анализ различения CCR3
Избирательность CCR5 относительно CCR1 измеряли в анализе конкурентного связывания CCR3 с использованием меченого радиоактивной меткой природного лиганда CCR3 в качестве метки. Эотаксин/CCL11 или RANTES/CCL5 можно, например, использовать в качестве метки для данного анализа различения CCR3. Анализ проводили, как описано в ссылке [28].
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Измерение активности против ВИЧ анализом слияния клеток
Пептидные агенты получали химическим синтезом, как описано в разделе «Материалы и методы». Агенты отдельно оценивали с использованием анализа слияния клеток, как описано в разделе «Материалы и методы», и величины IC50 получали путем сравнения результата анализа в присутствии агентов с результатом анализа, полученным в отсутствие агентов. Полученные величины IC50 представлены в таблице 4.
В целом, низкие величины IC50, т.е. высокие величины активности против ВИЧ, были обнаружены для пептидных агентов, которые вполне соответствовали N-концевой консенсусной характерной последовательности QGP[P/L][L/G][M/D]XX[Q/L]X или QGP[P или L][L или G, или S, или M][M или D, или S, или Q, или G]XX[Q или G, или L, или A, или T, или S]X, где Х представляет любую аминокислоту, и “/” представляет «или». Примерами таких соединений являются производные RANTES, состоящие из N-концевых характерных последовательностей SEQ ID NO:2-69, слитых с положениями 10-68 нативной последовательности RANTES (SEQ ID NO:1).
<b>Таблица 4</b><b>Характеристика пептидных агентов по изобретению</b>
<b>Характерная последовательность SEQ ID NO:</b>
<b>Активность против ВИЧ (IC50, нМ) анализом слияния клеток</b>
<b>Активность против ВИЧ (IC50, нМ) анализом вирусной репликации</b>
<b>Передача сигналов CCR5 (%)</b><sup>(1)</sup>
<b>Секвестрация CCR5 (%)</b><sup>(1)</sup>
2
0,02
0,194
1,4
5
3
0,02
<5
3
4
0,02
0,380
4,6
3
5
0,02
0,576
5,3
0
6
0,02
0289
1,4
3
7
0,02
0,179
0,7
10
8
0,03
0,278
2,5
0
9
0,03
0,187
4,8
2
10
0,03
0,403
2,3
0
11
0,03
1,6
9
12
0,03
0,204
4,1
4
13
0,07
<5
9
14
0,13
1,4
8
15
0,65
2,4
2
16
0,02
0,091
96,3
70
17
0,02
129
87,7
70
18
0,08
90,1
69
19
0,28
85,1
66
20
0,66
95,6
71
21
0,54
14,2
54
22
0,02
0,470
2,4
12
23
0,03
0,625
5,3
35
24
0,03
0,174
2,4
35
25
0,03
0,0
13
26
0,58
9,4
41
27
0,03
14,6
40
28
0,03
0,213
45,0
59
29
0,39
22,6
36
30
0,01
4,1
4
31
0,02
3,6
6
32
0,03
6,0
5
33
0,03
0,2
0
34
0,03
5,1
8
35
0,05
4,9
5
36
0,05
5,1
7
37
0,09
0,7
5
38
0,10
0,3
3
39
0,10
1,7
5
40
0,11
0
6
41
0,12
0
9
42
0,16
0,2
0
43
0,29
0,3
4
44
0,02
68,5
60
45
0,02
77,4
62
46
0,40
97,6
72
47
0,44
96,9
78
48
0,64
100,5
78
49
0,74
97,2
77
50
0,02
7,6
11
51
0,02
5,0
12
52
0,02
8,3
11
53
0,02
5,1
16
54
0,06
2,1
12
55
0,07
7,3
33
56
0,15
7,5
15
57
0,16
4,9
18
58
0,23
0,7
25
59
0,23
6,0
15
60
0,02
11,8
8
61
0,02
12,7
7
62
0,03
29,6
45
63
0,03
42,7
50
64
0,04
17,2
28
65
0,04
11,5
30
66
0,07
33,4
42
67
0,12
10,3
15
68
0,17
10,6
24
69
0,22
20,1
38
(1) % передачи сигналов выражен в виде % максимальной реакции (F<sub>max</sub>), вызванной PSC-RANTES, при тестировании при концентрации 300 нМ в анализе передачи сигналов тока кальция, как описано в разделе «Материалы и методы».(2) % Секвестрация выражена в виде количества секвестрации в отношении контрольного уровня поверхностных молекул CCR5 при тестировании в анализе поверхностной подавляющей регуляции CCR5/секвестрации рецепторов, как описано в разделе «Материалы и методы».
Пример 2. Измерение активности против ВИЧ анализом вирусной репликации
Пептидные агенты получали химическим синтезом, как описано в разделе «Материалы и методы». Агенты отдельно оценивали с использованием анализа вирусной репликации, как описано в разделе «Материалы и методы», и величины IC50 получали путем сравнения результата анализа в присутствии агентов с результатом анализа, полученным в отсутствие агентов. Полученные величины IC50 представлены в таблице 4.
В целом, низкие величины IC50, т.е. высокие величины активности против ВИЧ, были обнаружены для пептидных агентов, которые вполне соответствовали N-концевой согласованной характерной последовательности QGP[P/L][L/G][M/D]XX[Q/L]X, где Х представляет любую аминокислоту, и “/” представляет «или». Примерами таких соединений являются те производные RANTES, которые состоят из N-концевых характерных последовательностей SEQ ID NO:2-29, слитых с положениями 10-68 нативной последовательности RANTES (SEQ ID NO:1).
Пример 3. Измерение клеточной передачи сигналов анализом тока кальция
Пептидные агенты, полученные химическим синтезом, как описано в разделе «Материалы и методы», оценивали, используя анализ тока кальция, как описано в разделе «Материалы и методы». Величины «передачи сигналов», полученные с использованием указанного анализа для отдельных пептидных агентов по настоящему изобретению, представлены в таблице 4.
В целом, низкие величины передачи сигналов, например, не более 6% или 10%, были обнаружены для пептидных агентов, которые вполне соответствовали N-концевой согласованной характерной последовательности QGPPLM[S/G][L/F/T]Q[S/V], где “/” представляет «или». Примерами таких соединений являются такие производные RANTES, которые состоят из N-концевых характерных последовательностей SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:25, слитых с положениями 10-68 нативной последовательности RANTES (SEQ ID NO:1). Однако производные RANTES по настоящему изобретению с другими характерными последовательностями, такими как SEQ ID NO:27 и SEQ ID NO:21, также проявляли низкие величины передачи сигналов 20% или менее, причем пептидный агент, несущий характерную последовательность SEQ ID NO:29, достигал низкой величины передачи сигналов 30% или менее, и пептидный агент, несущий характерную последовательность SEQ ID NO:28, достигал величины передачи сигналов ниже 46%. В целом, низкие величины передачи сигналов наблюдались для пептидных агентов, которые соответствовали N-концевой консенсусной характерной последовательности QGPP[G/L][M/Q]XX [Q/S][S/V] или QGPP[G/L][M/Q][S/G/W/A/T][L/F/T/S/G/Y][Q/S][S/V], например, включающих производные RANTES, которые состоят из N-концевых характерных последовательностей SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 или SEQ ID NO:55.
Пример 4. Анализ секвестрации рецепторов анализом поверхностной подавляющей регуляции CCR5
Пептидные агенты, полученные химическим синтезом, как описано в разделе «Материалы и методы», оценивали, используя анализ поверхностной подавляющей регуляции CCR5, как описано в разделе «Материалы и методы». Величины «секвестрации CCR5», полученные с использованием указанного анализа для отдельных пептидных агентов по настоящему изобретению, представлены в таблице 4. Величины секвестрации CCR5, полученные в эквивалентных тестах из документов предшествующего уровня техники, представлены в таблице 5.
В целом, высокие величины секвестрации CCR5, например по меньшей мере 60% или 65%, или более, были обнаружены для пептидных агентов, которые вполне соответствовали N-концевой консенсусной характерной последовательности QGPPGD[T/I]VL[W/A], где “/” представляет «или». Примерами таких соединений являются такие производные RANTES, которые состоят из N-концевых характерных последовательностей SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17, слитых с положениями 10-68 нативной последовательности RANTES (SEQ ID NO:1). Однако производные RANTES по настоящему изобретению с другими характерными последовательностями, такими как SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, также характеризовались высокой активностью секвестрации CCR5, составляющей, например, 60% или 65%, или более. Кроме того, производные RANTES пептидные агенты с характерными последовательностями SEQ ID NO:21 и SEQ ID NO:28 также характеризовались высокой активностью секвестрации CCR5, т.е. по меньшей мере 50% или по меньшей мере 54, 55 или 59%. В целом, высокие величины секвестрации CCR5 наблюдались для пептидных агентов, которые соответствовали N-концевой консенсусной характерной последовательности QGP[P/L][L/G/S][D/S/G/Q]XX[L/A/T/Q][W/A/V] или QGP[P/L][L/G/S][D/S/G/Q][T/I/S/W/Q][V/L/A/S/G][L/A/T/Q][W/A/V], например, включающих производные RANTES, имеющие N-концевые характерные последовательности SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49.
Пример 5. Сравнительный пример
Производные RANTES предшествующего уровня техники, представленные в таблице 5, оценивали, используя анализы, описанные для агентов по изобретению в примерах 1-4. Результаты, полученные в данных анализах с производными RANTES предшествующего уровня техники, представлены в таблице 5.
<b>Таблица 5</b><b>Характеристика выбранных производных цитокинов предшествующего уровня техники</b>
<b>Характерная последовательность SEQ ID NO:</b>
<b>Активность против ВИЧ (IC50, нМ) анализом слияния клеток</b>
<b>Активность против ВИЧ (IC50, нМ) анализом вирусной репликации</b>
<b>Передача сигналов CCR5 (%)</b><sup>(1)</sup>
<b>Секвестрация CCR5 (%)</b><sup>(2)</sup>
Met-RANTES <sup>(3)</sup>
75,14
15,0
26
AOP-RANTES <sup>(4)</sup>
1,12
80,7
71
NNY-RANTES <sup>(5)</sup>
0,29
84,5
77
PSC-RANTES <sup>(6)</sup>
0,02
0,281
100,0
75
P1<sup>(7)</sup>
6,59
0,0
5
P2<sup>(7)</sup>
1,61
93,8
68
(1) % передачи сигналов выражен в виде % максимальной реакции (F<sub>max</sub>), вызванной PSC-RANTES, при тестировании при концентрации 300 нМ в анализе передачи сигналов тока кальция, как описано в разделе «Материалы и методы».(2) % Секвестрация выражена в виде количества секвестрации в отношении контрольного уровня поверхностных молекул CCR5 при тестировании в анализе поверхностной подавляющей регуляции CCR5/секвестрации рецепторов, как описано в разделе «Материалы и методы».(3) соединение, описанное в ссылке [13](4) соединение, описанное в ссылке [2](5) соединение, описанное в ссылке [3](6) соединение, описанное в ссылке [5](7) соединение, описанное в ссылке [6]
Пример 6. Испытание in vitro эффективности новых молекул против географических подгрупп ВИЧ, встречающихся в различных регионах мира
Молекулы тестировали против представителей штаммов R5 из всех регионов мира.
Кратко, первичные изоляты ВИЧ, полученные из различных полевых участков во всем мире, которые стали доступны посредством хранилищ реагентов, тестировали на их чувствительность к ингибированию в анализах репликации с использованием человеческих первичных клеток.
Может быть осуществлена методика, как описано в ссылке [29], или следующим образом:
Клеточные культуры
. РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) очищали от крови различных ВИЧ-отрицательных людей-доноров центрифугированием в градиенте Ficoll-Paque. Очищенные РВМС ресуспендировали в среде RPMI (Mediatech, Inc., Md.), с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS; Life Technologies, Inc., Rockville, Md.), 100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина (pen/strep; Mediatech, Inc.) на 1 мл, 1 нг рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (IL-2; Life Technologies, Inc.) на 1 мл, и 1 ЕД фитогемагглютинина (PHA; Life Technologies, Inc.) на 1 мл.
Вирусы
. Следующие штаммы NSI R5 ВИЧ-1 получали в результате проведения программы исследования СПИДа и реагентов: A-92RW009, A-92RW008, A-93UG075, B-92BR021, B-92TH026, B-BaL, C-92BR025, C-93IN101, D-94UG108, E/A-92TH022, E-92TH001, B/F-93BR019, F-93BR029, G-92NG083-JV1083 и G-92NG003-G3. Два штамма SI X4 (HXB2 и F-93BR020) также получали в результате проведения программы исследования СПИДа и реагентов для использования в качестве контролей. Для большинства перечисленных выше штаммов буква перед штрихом указывает подтип вирусной оболочки и за ним следует год выделения, страна происхождения и номер штамма, например, A-92RW009 представляет собой географическую подгруппу А штамма ВИЧ, выделенного в Руанде в 1992 г. Все эти вирусы размножали в культурах РВМС до тех пор, пока не были получены высокие титры вируса (по данным определения активности обратной транскриптазы [RT]) в надосадочных жидкостях культур. Затем для каждого вируса рассчитывали величины 50% инфицирующей дозы тканевой культуры с использованием методики Reed-Muench [30].
Анализы репликации
5
. РВМС, обработанные PHA/IL-2, добавляли в 96-луночные планшеты (2×10 клеток/лунка), содержащие серийно-разведенные ингибиторы. Затем добавляли соответствующий изолят ВИЧ-1 в полной среде RPMI (множественность инфекции [MOI] приблизительно 0,1). Со всеми изолятами NSI R5 ВИЧ-1 проводили эксперименты в трех повторах. На 3-й день после инфекции каждый планшет центрифугировали в течение 5 мин при 1200×g на центрифуге с качающейся корзиной. Затем из каждой лунки удаляли аликвотное количество (150 мкл) бесклеточной надосадочной жидкости и заменяли 150 мкл полной среды RPMI, содержащей соответствующие концентрации ингибитора. На 5, 10 и 15 дни после инфекции каждый планшет снова центрифугировали в течение 5 мин, образцы бесклеточной надосадочной жидкости (25 мкл) удаляли и хранили при -70˚С для последующего анализа. Культуры удаляли на 15-й день.
Продукцию вирусов в присутствии ингибиторов измеряли в бесклеточной надосадочной жидкости с использованием анализов RT, как описано ранее [31].
Пример 7. Демонстрация in vivo эффективности ингибиторов CCR5 на модели влагалищной передачи ВИЧ у нечеловекообразных обезьян
Для демонстрации эффективности молекул по изобретению in vivo использовали модель предотвращения передачи ВИЧ у макак.
50
Кратко, группы получавших прогестерон взрослых самок макак резус предварительно обрабатывали введением 4 мл или PBS, или растворами ингибиторов в PBS. Через 15 минут у животных проводили провокационную пробу 300 TCID (средней цитопатогенной дозой, инфицирующей 50% клеток) SHIV SF162 и проводили мониторинг до 24 недель для выявления развития виремии плазмы [32].
Данную методику можно осуществлять, как описано в ссылке [33], или следующим образом:
Использовали взрослых самок макак резус (Macacca mulata) с нормальным менструальным циклом в возрасте от 5 до 12 лет. Все исследования проводили в соответствии с требованиями «Руководства по уходу и использованию лабораторных животных», составленным Национальным советам по научным исследованиям Национальных институтов здоровья, и Руководством по уходу и использованию животных Комитета национального центра исследований на приматах в Тулейне. Весь ключевой персонал (ухаживающий за животными, осуществляющий лечение и лабораторный технический персонал, занятый подготовкой вирусного материала для заражения и вирусологическими анализами) не был информирован о включении в ту или иную группу обработки.
50
Животных обрабатывали одной внутримышечной инъекцией 30 мг депо медроксипрогестерона ацетата (Depo-Prover). Через 30-33 дня им вводили телазол для получения седативного эффекта, помещали в положение лежа на животе с приподнятыми бедрами, и в свод влагалища без травмы вводили 4 мл раствора ингибитора в PBS или только PBS, используя податливый калиброванный катетер. Этот объем обеспечивает наиболее эффективное покрытие стенок свода влагалища без ненужной утечки. Через 15 мин у животных проводили провокационную пробу 300 TCID SHIV SF162, полученным в результате проведения Программы исследований и эталонных реагентов СПИДа Национальных Институтов Здоровья, в 1 мл среды RPMI 1640. Кровь брали в пробирки c EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислотой). Содержание вирусов в плазме определяли количественным определением SIV gag РНК, используя анализ RT-PCR (полимеразная цепная реакция в реальном масштабе времени), как описано ранее [32]. Анализ имеет порог чувствительности 60 копий/мл РНК при коэффициенте вариации между анализами <25%. Состояние отсутствия инфекции определяли как согласованно неопределяемую виремию плазмы во всех анализах. Серопревращение контролировали вестерн-блоттингом с использованием набора вестерн-блоттинга Zeptometrix SIV Western Blot (Zeptometrix, Buffalo NY).
Ссылки
1. Samson M, Libert F, Doranz BJ, Rucker J, Liesnard C, Farber CM, Saragosti S, Lapoumeroulie C, Cognaux J, Forceille C, Muyldermans G, Verhofstede C, Burtonboy G, Georges M, Imai T, Rana S, Yi Y, Smyth RJ, Collman RG, Doms RW, Vassart G5 Parmentier M. Resistance to HIV-I infection in Caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene. Nature. 1996 Aug 22; 382(6593):722-5.
2. Simmons G, Clapham PR, Picard L, Offord RE, Rosenkilde MM, Schwartz TW, Buser R, Wells TN, Proudfoot AE. Potent inhibition of HIV-I infectivity in macrophages and lymphocytes by a novel CCR5 antagonist. Science. 1997 Apr 11; 276(5310):276-9.
3. Mosier DE, Picchio GR, Gulizia RJ, Sabbe R, Poignard P, Picard L, Offord RE, Thompson DA, Wilken J. Highly potent RANTES analogues either prevent CCR5-using human immunodeficiency virus type 1 infection in vivo or rapidly select for CXCR4-using variants. J Virol. 1999 May; 73(5):3544-50.
4. Sabbe R, Picchio GR, Pastore C, Chaloin O, Hartley O, Offord R, Mosier DE. Donor- and ligand-dependent differences in C-C chemokine receptor 5 reexpression. J Virol. 2001 Jan; 75(2):661-71.
5. Hartley O, Gaertner H, Wilken J, Thompson D, Fish R, Ramos A, Pastore C, Dufour B, Cerini F, Melotti A, Heveker N, Picard L, Alizon M, Mosier D, Kent S, Offord R. Medicinal chemistry applied to a synthetic protein: development of highly potent HIV entry inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Nov 23; 101(47):16460-5. Epub 2004 Nov l5.
6. Hartley O, Dorgham K, Perez-Bercoff D, Cerini F, Heimann A, Gaertner H, Offord RE, Pancino G, Debre P, Gorochov G. Human immunodeficiency virus type 1 entry inhibitors selected on living cells from a library of phage chemokines. J Virol. 2003 Jun; 77(12):6637-44.
7. WO 03/022884.
8. Lloyd-Williams P5 Albericio F, Giralt E. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC Press. 1997. ISBN 0849391423.
9. Benoiton NL. Chemistry of Peptide Synthesis. CRC Press. 2005. ISBN 1574444549.
10. Chan W, White P. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. Oxford University Press. 2000. ISBN: 0199637245.
11. Kullmann W. Enzymatic Peptide Synthesis. CRC Press. 1987. ISBN 0849368413.
12. Ibba M. Strategies for in vitro and in vivo translation with non-natural amino acids. Biotechnol Genet Eng Rev. 1996; 13:197-216.
13. Proudfoot, A.E., Power, C.A., Hoogewerf, A.J., Montjovent, M.O., Borlat, F., Offord, R.E., and Wells, T.N. J Biol Chem. 1996; 271:2599-2603.
14. Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (January 15, 2001). ISBN 087969576.
15. Rao S, Hu S, McHugh L, Lueders K, Henry K, Zhao Q, Fekete RA, Kar S, Adhya S, Hamer DH. Toward a live microbial microbicide for HIV: commensal bacteria secreting an HIV fusion inhibitor peptide. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 23; 102(34):11993-8. Epub 2005 Jul 22.
16. Chang TL, Chang CH, Simpson DA, Xu Q, Martin PK, Lagenaur LA, Schoolnik GK, Ho DD, Hillier SL, Holodniy M, Lewicki JA, Lee PP. Inhibition of HIV infectivity by a natural human isolate of Lactobacillus jensenii engineered to express functional two-domain CD4. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Sep 30; 100(20):11672-7. Epub 2003 Sep 12.
17. Lagenaur LA, Berger EA. An anti-HIV microbicide comes alive. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 30; 102(35):12294-5. Epub 2005 Aug 23.
18. FDA (US Food и Drug Administration) web page. Inactive Ingredient Guide. 1996. http://www.fda.gov/cder/drug/iig/default.htm
19. Ash M and Ash I. Handbook of Pharmaceutical Additives. Synapse Information Resources. 2nd Edition. 2002. ISBN 1890595349.
20. Gennaro AR (ed.). Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins. 21st edition. July 3, 2005. ISBN 0781763789.
21. Hardman JG, Limbird LE, Alfred G. Gilman AG. Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. McGraw-Hill; 10th edition. August 13, 2001. ISBN 0071354697.
22. Schnolzer M, Alewood P, Jones A, Alewood D, Kent SB. In situ neutralization in Boc-chemistry solid phase peptide synthesis. Rapid, high yield assembly of difficult sequences. Int J Pept Protein Res. 1992 Sep-Oct; 40(3-4):180-93.
23. Wilken J, Hoover D, Thompson DA, Barlow PN, McSparron H, Picard L, Wlodawer A, Lubkowski J, Kent SB. Total chemical synthesis and high-resolution crystal structure of the potent anti-HIV protein AOP-RANTES. Chem Biol. 1999 Jan; 6(l):43-51.
24. Klimkait T, Stauffer F, Lupo E, Sonderegger-Rubli C. Dissecting the mode of action of various HIV-inhibitor classes in a stable cellular system. Arch Virol. 1998; 143(11):2109-31.
25. Sune C, Brennan L, Stover DR, Klimkait T. Effect of polymorphisms on the replicative capacity of protease inhibitor-resistant HIV-I variants under drug pressure. Clin Microbiol Infect. 2004 Feb; 10(2):119-26.
26. Pleskoff O, Treboute C, Brelot A, Heveker N, Seman M, Alizon M. Identification of a chemokine receptor encoded by human cytomegalovirus as a cofactor for HIV-I entry. Science. 1997 Jun 20; 276(5320):1874-8.
27. Neote, K., DiGregorio, D., Mak, J.Y., Horuk, R., and Schall, T. J. Cell. 1993; 72:415-425.
28. Daugherty, B.L., Siciliano, S.J., DeMartino, J.A., Malkowitz, L., Sirotina, A., and Springer, M.S. J Exp Med. 1996; 183:2349-2354.
29. Torre VS, Marozsan AJ, Albright JL, Collins KR, Hartley O, Offord RE, Quinones-Mateu ME, Arts EJ. 2000. Variable sensitivity of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates to inhibition by RANTES analogs. J Virol 74:4868-76.
30. Coligan, J.E., A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, and R. Coico. 1999. Detection and analysis of HIV; isolation and quantitation of HIV in peripheral blood, alternate protocol: assessment of HIV titer using the Reed-Muench accumulative method, p. 12.2.5. In Current protocols in immunology, CD-ROM version. John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y.
31. Coligan, J.E., A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, and R. Coico. 1999. Detection and analysis of HIV; detection assays for HIV proteins, basic protocol: assay for HIV reverse transcriptase activity, p. 12.5.8. In Current protocols in immunology, CD-ROM version. John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y.
32. Lifson JD, Rossio JL, Piatak M, Jr., Parks T, Li L, Kiser R, Coalter V, Fisher B, Flynn BM, Czajak S, Hirsch VM, Reimann KA, Schmitz JE, Ghrayeb J, Bischofberger N, Nowak MA, Desrosiers RC, Wodarz D. 2001. Role of CD8(+) lymphocytes in control of simian immunodeficiency virus infection and resistance to rechallenge after transient early antiretro viral treatment. J Virol 75: 10187-99.
33. Lederman MM, Veazey RS, Offord R, Mosier DE, Dufour J, Mefford M, Piatak M, Jr., Lifson JD, Salkowitz JR, Rodriguez B, Blauvelt A, Hartley O. 2004. Prevention of vaginal SHIV transmission in rhesus macaques through inhibition of CCR5. Science 306:485-7.