Синтез и анти-ВИЧ-1 активность 1-[2-(фенокси)этокси]метил]производных урацила

Таблица 4

Результаты компьютерного прогноза и экспериментальной проверки уровня антиоксидантной активности производных имидазобензимидазола

Шифр соединения Компьютерная оценка наличия высокой активности1 Экспериментальная оценка активности Совпадение оценок

Конс. Норм. Риск. Общая

РУ-17 отказ - - - Умеренная +

РУ-121 + + + + Низкая -

РУ-122 ± - + ± Низкая ±

РУ-252 - - - - Низкая +

РУ-375 + + + + Высокая +

РУ-506 - - - - Умеренная +

РУ-574 - - - - Низкая +

РУ-

1139 - - - - Неактивно +

РУ-

1178 - - - - Неактивно +

РУ-

1231 - - - - Низкая +

Примечание. По консервативной, нормальной и рисковой стратегиям соответственно.

100 "фармакофоров" высокой антиоксидантной активности и только 16 "анти-фармакофоров". Производя суперпозицию подструктур-"фармако-форов", можно выявить фрагмент структуры (2), ответственный за высокую антиоксидантную активность этого соединения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На базе информационной технологии "Микрокосм" создана высокоточная система компьютерного прогноза уровня антиоксидантной активности производных имидазобензимидазола; технология может быть использована для прогноза уровня других видов фармакологической активности в других рядах структурно однородных химических соединений.

ЛИТЕРАТУРА

1. Анисимова В.А., Спасов А.А., Косолапов В.А. и др. // Хим.-фарм. журнал. - 2002. - Т. 36, № 11. - С. 3-8.

2. Васильев П.М., Спасов А.А. // Вестн. ВолГМУ. -2005. - № 1 (13). - С. 23-30.

3. Васильев П.М., Спасов А.А., Косолапов В.А. и др. // Молекулярное моделирование: тез. докл. IV Всерос. конф. - М., 2005. - С. 51.

4. Косолапов В.А. Антиоксидантные средства: стратегия отбора, перспективы применения. автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. - Волгоград, 2005. - 41 с.

5. Панкин В.З., Гуревич С.М., Бурлакова Е.Б. // Труды московского общества испытателей природы. -М., 1975. - Т. 52. - С. 73-78.

6. Пожарский А.Ф. Теоретические основы химии гетероциклов. - М.: Химия, 1985. - 278 с.

Vassiliev P.M., Spasov A.A., Kosolapov V.A., Anisimova V.A. A computer prognosis and experimental testing of antioxidant activity of new chemical compounds using QSAR-dependences // Vestnik of Volgograd State Medical University. - 2005. - № 2(14). - P. 16-19.

The designing of computer system for prognosticating antioxidant activity of imidazobenzimidazole derivatives on the basis of the information technology of «Microcosm» was described. It was shown that information technology of «Microcosm» makes possible to prognosticate the level of antioxidant activity for these substances with high precision; the technology may be also used for prognoshcating other types of pharmacological activity of other classes of structurally similar chemical compounds.

УДК 615,3:547.854.4:542.91:616.984-097-022-085

СИНТЕЗ И АНТИ-ВИЧ-1 АКТИВНОСТЬ 1-[2-(ФЕНОКСИ)ЭТОКСИ]МЕТИЛ]ПРОИЗВОДНЫХ УРАЦИЛА

М.С. Новиков, А.А. Озеров, Ю.А. Орлова, Р.У. Букхайт*

Лаборатория фармацевтической химии ВНЦ РАМН и Администрации Волгоградской области,

Кафедра фармацевтической химии ВолГМУ, * ImQuest BioSciences, Inc.

С момента открытия вируса иммунодефицита новных класса: ингибиторы вирусной протеазы

человека (ВИЧ) как этиологического агента син- и обратной транскриптазы (ОТ). Их использование

дрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) сопровождается серьезными побочными эффек-

[2, 3] до настоящего времени инфекция ВИЧ явля- тами и возникновением резистентных штаммов ется серьезной клинической проблемой [4]. Приме- ВИЧ. Таким образом, поиск новых ингибиторов няемые в клинике препараты делятся на два ос- ВИЧ является чрезвычайно актуальной проблемой.

Большинство ненуклеозидных ингибиторов ОТ, изображенных на рисунке, применяемых в терапии ВИЧ-инфекции и СПИД, согласно данным рентгено-структурного анализа имеют бабочко-образную форму. Они содержат в составе "крыла 1", находящегося в непосредственной близости к каталитическому сайту вирусного фермента, атомы азота, входящие в состав гетероцикла; в состав "крыла 2", находящегося в гидрофобном кармане фермента, входит ароматический фрагмент; нижняя часть "тела" бабочки соответствует ли-пофильной области ОТ [5, 6].

Рис. Бабочкообразная форма ненуклеозидных ингибиторов ОТ ВИЧ-1: 1 - "крыло 1"

Известно, что некоторые производные ура-цила такие, как 1-(этокси-метил)-6-(3,5-диметил-фенилтио)урацил (1, Х = Б) и -6-(3,5-диметил-бензил)урацил (2, Х = СН2) обладают высокой анти-ВИЧ-1 активностью [8]. Ароматический фрагмент соединений 1 и 2 связан с остатком урацила либо через атом серы, либо через мети-леновую группу. Нами было сделано предположение, что при условии сохранения общей ба-бочкообразной структуры ингибитора ОТ ВИЧ-1 его ароматический фрагмент может быть связан с остатком урацила не через положение 6, а через атом азота При этом связывающая их цепь должна состоять из пяти-шести элементов. В этом случае могут образовываться "геометри-

Я

ОН

СН2О/НС1

Я

3, 4

ческие" аналоги б-(фенилтио)- и 6-бензилура-цилов. Наиболее близкими структурами, которые соответствуют этому критерию, являются 1-[[2-(фенокси)этокси]метил]урацилы, в состав цепи которых входят три метиленовые группы и два атома кислорода.

О

СН,

СН,

1, 2

новые

геометрические" аналоги 1 Х = S; 2 X = СН2; 1, 2 Р = алкил С1 - С3

Синтез 1 -[[2-(фенокси)этокси]метил]производ-ных урацила был осуществлен в соответствии с нижеприведенной схемой. Исходные 2-(4-хлор-фенокси)этанол (3) или 2-(4-метилфенокси)эта-нол (4) в условиях реакции Анри в действии па-раформа и газообразного хлористого водорода превращали в соответствующие 2-(4-хлорфе-нокси)- (5) или 2-(4-метил-фенокси)этоксиметил-хлориды (6), выход которых был равен 92 и 90 % соответственно. Следующим этапом явилась конденсация полученных а-хлорэфиров 5 и 6 с 2,4-бис(триметилсилилокси)пиримидинами, которую проводили в растворе безводного метилен-хлорида при комнатной температуре. Целевые 1-[[2-(фенокси)этокси]метил]урацилы (7-19) были получены с выходом 56-71 % после препаративной хроматографии. Основная стратегия синтеза подробно описана нами ранее [1 ].

Чистота полученных соединений 7-19 определялась методом тонкослойной хроматографии, состав доказан элементным анализом, строение -ПМР-спектроскопией и масс-спектрометрией. Физико-химические свойства соединений 7-19 представлены в табл. 1, данные ЯМР 1Н спектров приведены в табл. 2.

О&Ме

О С1

ХТ 2

Ме3&О N Я2

5, 6

О Я

И

3

Л.*

иы у

О

7-19

Схема. Синтез 1-[[2-(фенокси)этокси]метил]урацилов (7-19): Р1 = Н, Ме, Е1 Вг; Р2 = Н, Ме; Р3 = Ме, С1.

О

СН3 I

Таблица 1

Характеристики синтезированных соединений

Соеди- R1 R2 R3 T. пл., Rf Выход,

нение оС %

7 H H Cl 126-127 0,16 60

8 Br H Cl 155-156 0,38 56

9 Me H Cl 121-123 0,22 71

10 H Me Cl 146-148 0,20 64

11 Br Me Cl 157-159 0,39 63

12 Me Me Cl 167-168 0,31 57

13 H H Me 139-140 0,28 63

14 Br H Me 70-73 0,49 70

15 Me H Me 143-144 0,34 64

16 H Me Me 140-143 0,32 59

17 Br Me Me 149-150 0,51 58

18 Me Me Me 141-143 0,43 56

19 Et Me Me 120-121 0,48 71

Противовирусные свойства синтезированных соединений in vitro в отношении ВИЧ-1 были исследованы в ImQuest Biosciences, Inc. (Мериленд, США) в культуре CEM-SS клеток в соответствии с ранее описанным методом [8]. Результаты скрининга показали, что некоторые из производных урацила 7-19 проявляют заметную противовирусную активность. Наиболее активными соединениями этого ряда оказались 1-[[2-(4-хлорфенокси)этокси]метил]- (11) и 1-[[2-(4-метил-фенокси)этокси]-метил]- (17) производные 5-бром-6-метилурацила, которые ингибировали репродукцию ВИЧ-1 на 50 % в концентрации ИК50 7,2 и 7,8 цМ соответственно. Однако за счет относительно высокой токсичности их индекс селективности был равен 4,3 и 7,7. На порядок менее активными были производные урацила: 1-[[2-(4-хлорфенокси)этокси]метил]- (7) и 1-[[2-(4-метил-фенокси)этокси]метил]урацил (13), имеющие ИК50 23,7 и 16,1 цМ соответственно, но вследствие более низкой токсичности эти соединения имели индекс селективности, сопоставимый с индексом соединений 11 и 17. Остальные соединения оказались либо неактивными в отношении ВИЧ-1, либо показали слабое вирусингибирую-щее действие (табл. 3).

Таким образом, нами найден ряд соединений, некоторые из которых проявили выраженную ингибиторную активность в отношении ВИЧ-1 in vitro. Полученные данные будут использованы нами в поиске новых противовирусных агентов в этом ряду.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Спектры ЯМР Н регистрировали на спектрометре Bruker DRX-500 (500 МГц), в ДМСО-й6, внутренний стандарт ТМС. Интерпретацию спектров осуществляли с помощью лицензионной программы ACD/HNMR Predictor Pro 3,0 фирмы Advanced Chemistry Development (Канада). Масс-спектры регистрировали на спектрометре Varian MAT-111 (прямой ввод, ионизация методом электронного удара, 70 эВ). Тонкослойную хроматографию выполняли на пластинах Silufol UV-254 в системе этилацетат-хлороформ, 1 : 1, проявле-

ние в парах иода. Температуры плавления измерены в стеклянных капиллярах на приборе Mel-Temp 3.0 (Laboratory Devices Inc., США).

2-(4-Хлорфенокси)этоксиметилхлорид (5). Через перемешиваемую смесь 19,1 г (0.111 моль) 2-(4-хлорфенокси)этанола (3) и 3,5 г (0.117 моль) параформа в 100 мл безводного метиленхлорида при температуре 0-5 °С в течение 2 ч пропускают ток сухого хлористого водорода. Органический слой отделяют, сушат CaCl2, фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме и получают 22,6 г (92 %) 5 в виде вязкой жидкости, которую далее используют без дополнительной очистки. Спектр ЯМР 1H (СС14), 5, м.д., J (Гц): 3,66 т (2Н, J = 7, CH2O); 3,96 т (2Н, J=7, CH2OAr); 5,41 c (2H, CH2Cl); 6,96-7,31 м (4H, ароматические Н).

2-(4-Метилфенокси)этоксиметилхлорид (6) получают аналогично, выход 90 %. Спектр ЯМР 1H (СС14), 5, м.д., J (Гц): 2,11 с (3Н, 4-CH3); 3,72 т (2Н, J =7, CH2O); 4,10 т (2Н, J=7, CH2OAr); 5,51 c (2H, CH2Cl); 6,66-6,98 м (4H, ароматические Н).

1 -[[2-(4-Хлорфенокси)этокси]метил]урацил (7). К раствору 2,75 г (10.72 ммоль) 2,4-бис(три-метилсилилокси)пиримидина в 30 мл безводного метиленхлорида добавляют раствор 2,4 г (10.86 ммоль) хлорэфира 5 в 20 мл метиленхлорида и перемешивают при комнатной температуре в течение суток. Добавляют 10 мл 95 %-ного этанола, перемешивают 30 мин, фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме досуха. Полученный твердый остаток наносят на колонку с сили-кагелем (2x35 см) и элюируют смесью хлороформ-метанол (10: 1). Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и упаривают в вакууме, полученный продукт перекристаллизовывают из этилацетата и получают 1,9 г (60 %) 7 в виде белого мелкокристаллического вещества, Т. пл. 126-127оС, Rf 0.16 (этилацетат-хлороформ, 1 : 1). Масс-спектр, m/z: 296 [M]+.

Соединения 8-19 получают аналогично (табл. 1 и 2).

Исследование анти-ВИЧ-1 активности in vitro. CEM-SS-клетки суспендировались в куль-туральной среде в количестве 105 клеток/мл и инфицировались ВИЧ-1 (штамм HTLV-IIIB) при мультипликации инфекции 0,2. Немедленно после инфицирования вирусом вносились растворы, содержащие различные концентрации исследуемого вещества в ДМСО, и инкубировались в течение 4-х дней при 37оС. Число живых клеток устанавливалось на 4-й день инкубации при помощи 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолий бромидом, при этом устанавливалась концентрация вещества, которая на 50 % защищала CEM-SS-клетки от цитопатического эффекта ВИЧ-1 (ИК50).

Цитотоксичность тестируемых соединений проводилась параллельными экспериментами, при этом устанавливалась концентрация вещества, которая на 50 % уменьшала количество CEM-SS-клеток (ТК50). Расчетным путем определяли индекс селективности, являющийся отношением цитотоксической концентрации к ингиби-торной концентрации: ТК50/ИК50 [8].

Данные Я1№Р 1H спектров синтезированных соединений

Таблица 2

Соединение Химический сдвиг, м.д., мультиплетность

7 3,81 т

8 3,82 т

9 1,78 с

10 2,27 с

11 2,36 с

12 1,81 с

13 2,22 с

14 2,21 с

15 1,77 с

16 2,22 с

17 2,21 с

18 1,82 с

19 1,09 т

Таблица 3

Анти-ВИЧ-1 активность синтезированных соединений in vitro

Соеди нение Эффективная концентрация, ИК50, цМ Цитотоксическая концентрация, ТК5о, цМ Индекс селективности, ТК50 / ИК50

7 23,7 > 100,0 > 4,2

8 > 100,0 48,2 -

9 50,9 > 100,0 > 2,0

10 > 100,0 > 100,0 -

11 > 100,0 96,3 -

12 7,2 31,1 4,3

13 16,1 > 100,0 > 6,2

14 69,1 > 100,0 > 1,5

15 > 100,0 > 100,0 -

16 > 100,0 > 100,0 -

17 76,8 > 100,0 > 1,3

18 7,8 60,0 7,7

19 > 100,0 19,8 -

Примечание. ЕС50 - эффективная концентрация, обеспечивающая защиту клеток от цитопатического эффекта вируса на 50%; ТС50 - цитотоксическая концентрация, уменьшающая выживаемость неинфицированных клеток на 50%

ЛИТЕРАТУРА

1. Новиков М.С., Озеров А.А., Брель А.К. и др. // ХГС. - 1996. -C. 380-385.

2. Barre-Sinoussi F., Chermann J.C., Rey F., et al. // Science. - 1983. - Vol. 220. - P. 868-871.

3. Gallo R.S., Salahuddin S.Z., Popovic M., et al. // Science. - 1984. - Vol. 224. - P. 500-503.

4. De Clercq E. // J. Clin. Virol. - 2002. - Vol. 22. -P. 73-89.

5. Ren J., Esnouf R, Garman E, et al. // Struct. Biol. -1995. Vol. 2. - P. 293-302.

6. Ding J., Das K., Tantillo C, et al. // Structure. -1995. - Vol. 3. - P. 365-379.

7. Hopkins A.L., Ren J., Esnouf R., et al. // J. Med. Chem. - 1996. - Vol. 39. - P. 1589-1600.

8. Buckheit R.W., White E.L., Fliakas-Boltz V, et al. // Antimicrob Agents Chemother. - 1999. - Vol. 43. - 18271834.

Novikov M.S., Ozerov A.A., Orlova Yu.A., Buckheit R.W. Synthesis and anti-HIV-1 effect of 1-[[2-(phenoxy)ethoxyjmethylj derivatives of uracil // Vestnik of Volgograd State Medical University. - 2005. - № 2(14). -P. 19-22.

Antiviral activity of new syntetized compounds was studied in vitro using CEM-SS gulture. 1-[[2-4(4-chlorphenoxy)ethoxy]methyl] and 1-[[2-(4-methylphenoxy)ethoxy]-methyl derivatives of 5-brome-6-methyluracyle demonstrate maximum inhibitory on HIV-1 virus comparing with the other ones.