ПРОИЗВОДНЫЕ FGF21 СО СВЯЗУЮЩИМ АЛЬБУМИНА А-В-С-D-E- И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
FGF21 DERIVATIVES WITH ALBUMIN BINDING AGENT A-B-C-D-E- AND THEIR APPLICATION

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к фактору роста фибробластов 21 (FGF21), более конкретно к производным соединений FGF21, имеющим ковалентно присоединенное связующее альбумина формулы A-B-C-D-E-. Изобретение также относится к новым аналогам FGF21, а также к фармацевтическому применению этих производных и аналогов FGF21, в частности, для лечения диабета, дислипидемии, ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний, метаболического синдрома и/или неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП).
Производные по настоящему изобретению обладают пролонгированным действием, например способны поддерживать низкий уровень глюкозы в течение более длительного периода времени, способны к увеличению времени полувыведения in vivo FGF21 и/или приводят в результате к более низкому клиренсу FGF21. Производные по изобретению предпочтительно, кроме того, обладают улучшенной устойчивостью к окислению.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Факторы роста фибробластов представляют собой полипептиды, экспрессирующиеся при развитии и в тканях взрослого организма. Они вовлечены в несколько физиологических механизмов, включая, например, регуляцию метаболизма и клеточную дифференциацию. Существует целое семейство более чем двадцати факторов роста фибробластов (семейство FGF). Три члена этого семейства FGF, включающие FGF19, FGF21 и FGF23, образуют подсемейство, функционирующее как эндокринные факторы, вовлеченные в регуляцию метаболизма.
Фактор роста фибробластов 21 или FGF-21, в данной заявке для краткости FGF21, экспрессируется преимущественно в печени, и показано, что он проявляет гормоноподобные метаболические эффекты.
Например, продемонстрировано, что FGF21 активирует захват глюкозы в адипоцитах мыши для защиты мыши от рациона, индуцирующего ожирение, при гиперэкспрессии у трансгенных мышей, и снижает уровни глюкозы и триглицеридов в крови при введении грызунам с диабетом (Kharitonenkov et al., J. Clin. Invest. (2005), 115: 1627-1635).
Понижающий эффект FGF21 на глюкозу и триглицериды крови также показан у обезьян с диабетом. FGF21 был также способен значительно снижать ЛПНП и повышать ЛПВП у обезьян с диабетом (Kharitonenkov et al., Endocrinology (2007), 148 (2): 774-81).
У мышей с ожирением, индуцированным диетой, и у мышей было, кроме того, показано, что FGF21 снижает массу тела, преимущественно за счет увеличения расхода энергии и уменьшения ожирения (Coskun et al., Endocrinology (2008), 149 (12): 6018-6027).
На основании этих результатов FGF21 предложен в качестве фармакологического агента с потенциалом лечения диабета, дислипидемии, ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний и метаболического синдрома. Метаболический синдром включает такие аспекты, как устойчивость к инсулину, дислипидемия, висцеральное ожирение и гипертензия, см., например, определение метаболического синдрома в Grundy et al., Circulation (2004), (109): 433-438.
FGF21 можно, кроме того, применять в качестве фармакологического агента с потенциалом лечения неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), см. Coskun et al. Endocrinology, 2008, цитируется выше, и Xu et al. Diabetes (2009, 58 (1): 250-9, опубликованную в электронном виде 07-ОКТ-2008 перед выходом в печать). НАЖБП определена в статье Erickson, J. Lipid Res. (2008), опубликованной в электронном виде 12-ДЕК-2008 перед выходом в печать.
Авторами Yie et al. Исследована роль N- и С-концов FGF21 при взаимодействии с рецептором и его активации, см. FEBS Letters, 583 (2009), 19-24.
В WO 2003/011213 A2 раскрыт способ лечения диабета типа 1 и 2 или ожирения путем применения соединений FGF21 по меньшей мере с 95% идентичностью аминокислотной последовательности предшественника FGF21.
В WO 2003/061712 А1 раскрыты мутеины FGF21 с улучшенными фармацевтическими свойствами, например, А145Е.
В WO 2005/091944 A2 раскрыты пегилированные производные FGF21, FGF21-K59C и FGF21-K122C.
В WO 2005/113606 A2 раскрыты различные слитые белки FGF21 с участком Fc иммуноглобулина IgG4 или сывороточного альбумина человека.
В WO 2006/028595 A2 раскрыты дополнительные мутеины FGF21 со сниженной способностью к O-гликозилированию при экспрессии в дрожжах, например, L118C-A134C-S167A.
В WO 2006/028714 А1 раскрыты дополнительные мутеины FGF21 со сниженной чувствительностью к протеолитическому расщеплению при экспрессии в дрожжах, например, L153I.
В WO 2006/065582 A2 раскрыты еще дополнительные мутеины FGF21 со сниженным деамидированием, например, des-HPIP-L118C-A134C-N121D.
В WO 2006/078463 A2 раскрыт способ лечения сердечно-сосудистого заболевания посредством применения нативного зрелого FGF21 или его указанных вариантов.
В WO 2008/121563 раскрыты полипептиды FGF21, модифицированные включением не кодируемых в природе аминокислот, а также их производные.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Кратко, данное изобретение определено в п.1 приведенной ниже формулы изобретения.
Настоящее изобретение относится к производным соединений FGF21, имеющим связующее альбумина, ковалентно присоединенное к соединению FGF21, где связующее альбумина имеет формулу A-B-C-D-E-, в которой компонент А представляет собой жирную кислоту или ее производное. Изобретение также относится к новым аналогам FGF21, а также к применению производных и аналогов по изобретению в фармацевтических композициях, в частности, для лечения диабета, дислипидемии, ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний, метаболического синдрома и/или неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП).
Производные по настоящему изобретению обладают пролонгированным действием, например, способны поддерживать низкий уровень глюкозы в течение более длительного периода времени, способны к увеличению времени полувыведения in vivo FGF21 и/или приводят в результате к более низкому клиренсу FGF21. Пролонгированные производные FGF21 сохраняют удовлетворительную биологическую активность, и их можно вводить менее часто. Производные по изобретению предпочтительно, кроме того, обладают улучшенной устойчивостью к окислению.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к производным соединения FGF21, имеющим ковалентно присоединенное связующее альбумина формулы A-B-C-D-E-, где
А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
;
где n равно 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, и * представляет собой точку присоединения к -В-;
-В- отсутствует, представляет собой связь или выбран из -В1-, -В2- или их комбинаций, где
-В1- представляет собой элемент формулы IV, V, VI или VII:
, ,
;
где * представляет собой точку присоединения к -В2- или -С-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В2-; и
-В2- представляет собой элемент формулы IIX, IX или XXVIII или комбинацию вплоть до четырех элементов формулы IIX, и/или формулы IX, и/или формулы XXVIII:
,
где b равно 0, 1 или 2, с равно 0, 1 или 2, при условии, что b равно 1 или 2, когда с равно 0, и b равно 0, когда с равно 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С-, -В1- или к другому -В2-, и # представляет собой точку присоединения к А-, -В1- или к другому -В2-;
,
где d равно 1 или 2, е равно 0, 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1-; либо
где u равно 2, 3 или 4, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1-;
-С- отсутствует, представляет собой связь или представляет собой элемент формулы Х или XI:
,
где р равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, q равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -В-; либо
,
где k равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 или 23, m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21; и # представляет собой точку присоединения к -В-;
-D- отсутствует, представляет собой связь или представляет собой элемент формулы XII или XIII:
,
где r равно 2, 3, 4 или 5, s равно 1, 2, 3 или 4, t равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -Е- или к соединению FGF21 и # представляет собой точку присоединения к -С-;
-Е- отсутствует, представляет собой связь или представляет собой элемент формулы XXII, XXIII, XXIIIa, XXIV, XXIVa, XXV, XXVI или XXVII:
, ,
, ,
, ,
,
где * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21 и # представляет собой точку присоединения к -D- или -С-;
или к их фармацевтически приемлемой соли.
Изобретение также относится к новым аналогам FGF21, включающим (а) по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций по сравнению с SEQ ID NO:1: -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, А26Е, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, 871 С, D102T, K122R, 1152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E и/или S181K,R; независимо необязательно с N-концевым М (например, -1М); и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1 из аминокислотных остатков в количестве вплоть до 25, предпочтительно вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% удлиняющих с N-конца аминокислотных остатков представляет собой G или S. SEQ ID NO:1 является последовательностью зрелого пептида дикого типа FGF21 человека, имеющего 181 аминокислотный остаток.
Наконец, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество аналогов или производных по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель; а также к способам лечения пациентов, проявляющих диабет, дислипидемию, ожирение, сердечнососудистые заболевания, метаболический синдром и/или неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП), включающим введение пациенту терапевтически эффективного количества аналога, производного или композиции по изобретению.
В первом аспекте производное по изобретению имеет связующее альбумина формулы A-B-C-D-E-, ковалентно присоединенное к тиольной группе соединения FGF21, то есть к остатку цистеина.
Во втором аспекте производное по изобретению имеет связующее альбумина формулы А-В-С-, ковалентно присоединенное к аминогруппе соединения FGF21, которая может представлять собой N-концевую аминогруппу и/или внутреннюю аминогруппу, такую как эпсилон-аминогруппа остатка лизина.
Производные по данному изобретению и аналоги по данному изобретению должны обладать биологическим эффектом, подобным эффекту FGF21, например, в отношении эффекта снижения глюкозы, улучшения при дислипидемии, ожирении, сердечно-сосудистых заболеваниях, метаболическом синдроме и/или неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП).
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Термин "соединение FGF21", как используют в данной заявке, относится как к нативному FGF21 человека, так и к его аналогам.
Последовательность нативного белка FGF21 человека доступна из базы данных UNIPROT с номером доступа Q9NSA1. 209-аминокислотный белок-предшественник включает сигнальный пептид (аминокислоты 1-28) и зрелый белок (аминокислоты 29-209). Зрелый белок включен в данную заявку как SEQ ID NO:1 (аминокислоты 1-181), а сигнальный пептид как SEQ ID NO:2 (аминокислоты 1-28).
Изоформа или аллельная форма нативного FGF21 человека, имеющая Pro вместо Leu в зрелом белке в положении 146 SEQ ID NO:1, в данной заявке среди прочего известна из US 2001012628 А1 (остаток №174 SEQ ID NO:2 в опубликованной заявке США).
Другая изоформа, имеющая более короткий сигнальный пептид, в котором Leu в положении 23 SEQ ID NO:2, отсутствующая в данной заявке, известна из WO 2003/011213 (см. SEQ ID NO: 2 публикации WO, имеющую сигнальный пептид из 27 аминокислотных остатков).
Таким образом, конкретными примерами нативного FGF21 человека являются: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:1, имеющая замену L146P, а также любая из этих последовательностей, которой предшествует 27- или 28-аминокислотный сигнальный пептид, на который ссылаются выше. Предпочтительными примерами FGF21 человека являются зрелые участки, а именно SEQ ID NO:1 и ее изоформа L146P.
Термин "аналог", на который ссылаются в данной заявке в контексте FGF21, то есть аналог FGF21, относится к полипептидам, которые выведены или имеют происхождение, либо могут быть выведены или могут иметь происхождение от нативного FGF21, от SEQ ID NO:1 в частности, в результате модификации его аминокислотной последовательности. Такая модификация, изменение или замена может включать замену, делецию и/или добавление одной или более чем одной аминокислоты. Например, аминокислоты могут быть добавлены и/или делегированы с С-конца, с N-конца или внутри в аминокислотной последовательности. Предпочтительно аминокислоты добавлены и/или делегированы с С- и/или N-конца, более предпочтительно с N-конца. Аминокислотные последовательности с делегированными аминокислотами с С- или N-конца могут также называться укороченными последовательностями, как известно в данной области техники. Подобным образом, аминокислоты, добавленные внутри последовательности, могут называться инсерциями. Термин "вариант" или "мутеин" здесь и далее используют в данной заявке вместо термина "аналог".
Одним из примеров аналога FGF21 является укороченная форма нативного зрелого FGF21, в котором четыре N-концевых аминокислотных остатка зрелого белка (HPIP) удалены, которая раскрыта, например, в WO 2006/065582. Указано, что данная укороченная форма стимулирует захват глюкозы в адипоцитах мышей 3T3-L1 на том же уровне, что и FGF21 дикого типа. Данный белок имеет аминокислотную последовательность из аминокислот 5-181 SEQ ID NO:1 в данной заявке.
Следующим примером аналога FGF21 является полипептид SEQ ID NO:1, который имеет N-концевой Met (также обозначенный "Met-FGF21" или как замена, -1М ((минус 1)М) SEQ ID NO:1). N-концевой Met присоединяется, когда соединение FGF21 экспрессируют в Е. coli, см., например, WO 2006/050247, Таблица 6.
Другими примерами аналогов FGF21 являются модифицированные последовательности FGF21 (часто называемые мутеинами), которые раскрыты, например, в WO 2003/061712, WO 2005/091944, WO 2006/028595, WO 2006/028714, WO 2006/065582 и WO 2008/121563 (см. раздел предшествующего уровня техники данной заявки).
Следующие примеры аналогов FGF21 раскрыты в экспериментальном разделе данной заявки, а также в прилагаемой формуле изобретения.
3
3
Термин "аминокислота" или "аминокислотный остаток", на который ссылаются в данной заявке в контексте модификаций FGF21, включает двадцать стандартных альфа-аминокислот, используемых клетками в биосинтезе белка и определяемых генетическим кодом, а именно аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутамин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин. Этот термин также включает нестандартные аминокислоты, такие как селеноцистеин и пирролизин, которые также кодируются генетическим кодом, но редки в белках. Другие нестандартные аминокислоты, обнаруженные в белках, могут образоваться в результате посттрансляционной модификации, например, γ-карбоксиглутамат и гидроксипролин. Дополнительными примерами нестандартных или неприродных аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, являются орнитин и фосфосерин. Другими дополнительными примерами нестандартных аминокислот являются синтетические аминокислоты, включающие аминокислоты, полученные путем химического синтеза, например, D-изомеры аминокислот, кодируемых генетическим кодом, такие как D-аланин, D-глутамин, D-гистидин и D-лейцин, Aib (α-аминоизомасляная кислота), Abu (α-аминомасляная кислота), Tle (трет-бутилглицин), β-аланин, 3-аминометилбензойная кислота, антраниловая кислота, дез-аминогистидин (сокращенно DesaminoHis, альтернативное название имидазопропионовая кислота, сокращенно Impr), бета-аналоги аминокислот, такие как 3-аланин, 2-аминогистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, Na-ацетил гистидин, α-фторметилгистидин, α-метилгистидин, α,α-диметилглутаминовая кислота, m-CF-фенилаланин (сокращенно m-CF-Phe), α,β-диаминопропионовая кислота (сокращенно Dap), 3-пиридилаланин, 2-пиридилаланин или 4-пиридилаланин, (1-аминоциклопропил)карбоновая кислота, (1-аминоциклобутил)карбоновая кислота, (1-аминоциклопентил)карбоновая кислота, (1-аминоциклогексил)карбоновая кислота, (1-аминоциклогептил)карбоновая кислота и (1-аминоциклооктил)карбоновая кислота.
Для целей настоящего изобретения два принятых кода стандартных аминокислот (однобуквенный и трехбуквенный) используют взаимозаменяемо, либо здесь и далее название аминокислоты пишут полностью. Эти термины, конечно, считают полностью эквивалентными (например, S=Ser=серин).
Термин "производное", как используют в данной заявке, относится к соединению FGF21, которое ковалентно модифицировано. Этот термин как таковой является не ограничивающим, скорее, описательным, поскольку он предназначен, чтобы отметить различие между изменениями, осуществленными в соединении, составляющем полипептид FGF21 как таковой ("аналогами"), и ковалентным связыванием боковой цепи с соединением FGF21, посредством чего соединение "дериватизировано". Если желательно, этот термин может быть заменен другими общими химическими терминами, например соединение.
Термин "связующее альбумина" как таковой также не предназначен для ограничения. Опять же, он, скорее, является описательным, поскольку отражает общее направление или цель присоединения цепи A-B-C-D-E- к соединению FGF21, а именно, что полученное в результате соединение (производное) способно к связыванию с сывороточным альбумином человека, которое обеспечивает или по меньшей мере вносит вклад в пролонгированный эффект, на который направлены производные по изобретению. Если желательно, этот термин может быть также заменен другими общими химическими терминами, например соединение.
Номенклатура: Аналоги и производные названы в данной заявке с использованием взаимозаменяемо полипептидной номенклатуры, номенклатуры органической химии и химических формул или их смеси, что считается лучше подходящим для упрощения понимания обсуждаемого технического предмета. Например, производное Примера 4 может быть названо S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(8)-4-карбокси-4-(17-карбокси-гептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-этил)-2,5-диоксо-пирролидин-3-ил] [Cys122]-Met-FGF21 (что означает, что [Cys122] Met-FGF21 модифицирован 1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(3)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-этил)-2,5-диоксопирролидин-3-илом по тиольной группе в Cys в положении 122). Но это соединение может быть также определено как K122С Met-FGF21, дериватизированное при С122 нижеследующим соединением:
Номенклатура вариантов (Номенклатура аналогов): Варианты (или аналоги) FGF21 названы в данной заявке с использованием взаимозаменяемо полипептидной номенклатуры, номенклатуры органической химии, химических формул, аминокислотных последовательностей или их смеси, что считается лучше подходящим для упрощения понимания обсуждаемого технического предмета.
Например, замена в варианте может быть указана как: "Исходная аминокислота-положение-замененная аминокислота". Может быть использован трех- или однобуквенный код. Соответственно, обозначение "K122С" или "Lys122Cys" означает, что вариант включает замену лизина цистеином в положении аминокислоты варианта, соответствующем аминокислоте в положении 122 в FGF21 (SEQ ID NO:1), когда вариант и FGF21 выровнены, как дополнительно описано ниже ("выравнивание").
Множественные модификации, такие как замены, могут быть разделены запятыми (с пробелом после запятой), и, если желательно, окружены скобками, чтобы сделать понятным, что они принадлежат одному и тому же варианту. Аналог, который дериватизирован в Примере 7, может быть обозначен, например, "K56R, K59R, K69R, K122R Met-FGF21" или "(K56R, K59R, K69R, K122R) Met-FGF21", либо на него могут ссылаться как на "SEQ ID NO:1 с K56R, K59R, K69R и K122R и N-концевым М". См. Соединение Y Примера 2 для номенклатуры варианта с множественными модификациями в форме смеси замен и инсерций.
Альтернативные модификации, такие как альтернативные замены в данном положении, могут быть разделены запятыми, как, например, в обозначении "S181K,R", что означает, что Ser в положении 181 может быть заменен Lys или Arg.
Удлинение может быть описано путем ссылки на SEQ ID NO:1 путем добавления номеров положений (продолжающиеся положительные числа на С-конце и отрицательные числа на N-конце) или, проще, путем добавления аминокислот обсуждаемого удлинения, используя их правильную последовательность, к обсуждаемому соединению, которому в этом случае часто дают тривиальное название, такое как FGF21, опять же, чтобы упростить понимание релевантного технического пункта. В качестве примера, соединение (s) MGGGGG-FGF21 обозначает полипептид SEQ ID NO:1 (FGF21) с G в положении -1, G в положении -2, G в положении -3, G в положении -4, G в положении -5 и М в положении -6, относительно SEQ ID NO:1. Подобным образом, соединение (q) MS-FGF21 (или Met-Ser-FGF21) обозначает полипептид SEQ ID NO:1 (FGF21) с S в положении -1 и М в положении -2 относительно SEQ ID NO:1.
Инсерция в варианте может быть указана как: "номер положения аминокислоты перед инсерцией-индекс-вставленная аминокислота". Номер положения аминокислоты перед инсерцией относится к положению аминокислоты в FGF21 (SEQ ID NO:1) непосредственно перед гэпом, который создают, когда выравнивают FGF21, как дополнительно описано ниже ("выравнивание"). Для аминокислот может быть использован трех- или однобуквенный код. Индекс представляет собой строчную букву в алфавитном порядке, например, "а" для первого вставленного аминокислотного остатка, "b" для второго вставленного аминокислотного остатка, как приемлемо. Соответственно, все обозначения "V169aT" (или "Val169aThr") или просто "169аТ" (или "169aThr") означают, что вариант включает инсерцию треонина после валина в положении 169 в FGF21 (SEQ ID NO:1), когда вариант и FGF21 выравнивают, как дополнительно описано ниже ("выравнивание").
В случаях, где существует дополнительный дисульфидный мостик в соединении FGF, два Cys напечатаны по соседству друг с другом и соединены тире, как, например, в "L118C-A134C", где имеется дисульфидный мостик между Cys в положении 118 и Cys в положении 134.
Для целей настоящего изобретения выравнивание двух аминокислотных последовательностей можно осуществить, используя программу Needle из пакета программ EMBOSS (http://emboss.org). Предпочтительной версией является 2.8.0. В программе Needle использован алгоритм глобального выравнивания, описанный в Needleman, S.В. and Wunsch, С.D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. Используемой матрицей замен является BLOSUM62, штраф на открытие гэпа составляет 10, и штраф на удлинение гэпа составляет 0,5.
Степень или процент идентичности между последовательностью аналога FGF21 по настоящему изобретению ("последовательностью по изобретению"; например, SEQ ID NO:1 с K56R, K59R и K69R) и другой аминокислотной последовательностью ("чужеродной последовательностью"; например, последовательностью FGF21 SEQ ID NO:1) вычисляют как число точных совпадений при выравнивании двух последовательностей, деленное на длину "последовательности по изобретению" или длину "чужеродной последовательности", той, которая является более короткой. Результат выражают в проценте идентичности.
Точное совпадение происходит, когда "последовательность по изобретению" и "чужеродная последовательность" имеют идентичные аминокислотные остатки в одних и тех же положениях перекрывания (в приведенном ниже примере выравнивания это представлено "*"). Длина последовательности представляет собой число аминокислотных остатков в последовательности (например, длина SEQ ID NO:1 равна 181).
Данный пример представляет собой пример выравнивания "последовательности по изобретению" и "чужеродной последовательности", на которые ссылаются выше:
Соответственно, процент идентичности данного аналога FGF21 и FGF21 равен 178/181×100%=98,3%.
В качестве альтернативы, степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с помощью программы "align", которая представляет собой выравнивание Needleman-Wunsch (то есть глобальное выравнивание). Последовательности выравнивают с помощью программы, используя матрицу оценки по умолчанию BLOSUM50. Штраф на первый остаток гэпа составляет 12, и для последующих остатков гэпа штрафы составляют 2. Алгоритм Needleman-Wunsch описан в Needleman, S.B. and Wunsch, CD. (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, а программа align описана Myers and W. Miller в Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17. "Align" составляет часть пакета программ FASTA версия v20u6 (см. W.R.Pearson and D.J.Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444-2448, и W.R.Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA," Methods in Enzymology 183:63-98).
Фармацевтическая композиция, содержащая производное соединения FGF21 или аналог FGF21 по изобретению, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Для инъекции носитель может представлять собой воду, если желательно, с добавлением других веществ, например, солевого раствора, такого как физиологический солевой раствор. Можно также использовать другие фармацевтически приемлемые агенты, такие как разбавители и подходящие буферы. Если желательно, можно также использовать дополнительные фармацевтически приемлемые агенты, такие как эмульгаторы, суспендирующие агенты, растворители, наполнители, объемообразующие агенты, адъюванты, консерванты, антиоксиданты, красители и/или корригенты. Производное соединения FGF21 или аналог FGF21 можно использовать в форме очищенного полипептида или его производного, либо включать в препарат, используя подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты, как известно в данной области техники. Фармацевтическую композицию можно вводить любым путем, как известно в данной области техники, например, инъецировать, например, внутривенно (i.v.) или подкожно (s.c.).
Производное соединения FGF21 или аналог FGF21 можно включать в фармацевтическую композицию в терапевтически или профилактически эффективном количестве. Количество зависит от терапевтической или профилактической цели, такой как обсуждаемое показание, состояние пациента, нуждающегося в лечении, желаемый путь введения и т.д. Практикующему специалисту в области медицины может потребоваться регулировать дозировку и модифицировать введение в зависимости от этих факторов, что обычно в данной области техники.
Конкретные формы осуществления
Ниже приведены конкретные формы осуществления производного по изобретению, в частности, производного первого аспекта изобретения, в котором связующее альбумина формулы A-B-C-D-E- ковалентно присоединено к тиольной группе соединения FGF21, то есть к остатку цистеина:
В одной форме осуществления А- представляет собой элемент формулы I:
, в которой n равно 14, 16 или 18.
В одной форме осуществления -В- включает -В1-, предпочтительно элемент формулы IV или V:
.
В одной форме осуществления -В- включает -В2-, предпочтительно один или два элемента формулы IIX или IX:
или ,
в котором более предпочтительно с равно 0 и b равно 2 (гамма-Glu) или с равно 0 и b равно 1 (бета-Asp), либо в котором более предпочтительно d равно 1 и е равно 2 или d равно 2 и е равно 1.
В одной форме осуществления -В- включает -В2-, предпочтительно один или два элемента формулы IIX:
, в которой более предпочтительно с равно 0 и b равно 2 (гамма-Glu) или с равно 0 и b равно 1 (бета-Asp).
В одной форме осуществления -С- представляет собой элемент формулы X:
, в которой предпочтительно q равно 0, 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно q равно 1 или 2.
В одной форме осуществления -С- представляет собой элемент формулы X:
, в которой предпочтительно р равно 1 или 2, более предпочтительно р равно 1, даже более предпочтительно р равно 1 и q равно 1 или 2, или наиболее предпочтительно р равно 1 и q равно 2.
В одной форме осуществления -С- представляет собой элемент формулы XI:
, в которой предпочтительно m равно 0, 1 или 2, более предпочтительно m равно 1 или 2.
В одной форме осуществления, -С- представляет собой элемент формулы XI:
, в которой предпочтительно k равно 1, 2, 3, 4, 5 или 11, более предпочтительно k равно 5.
В одной форме осуществления -С- представляет собой элемент формулы XI:
, в которой m равно 1 и k равно 4, 5 или 11, предпочтительно m равно 1 и k равно 5.
В одной форме осуществления -D- представляет собой элемент формулы XII: , в которой предпочтительно r равно 2 и/или в которой предпочтительно s равно 1 или 2, наиболее предпочтительно r равно 2 и s равно 2.
В одной форме осуществления -D- представляет собой элемент формулы XIII: , в которой предпочтительно t равно 1, 2 или 3, более предпочтительно t равно 2.
В одной форме осуществления -D- отсутствует.
В одной форме осуществления -Е- представляет собой элемент формулы XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI или XXVII:
, ,
, ,
или связь.
В одной форме осуществления -Е- представляет собой элемент формулы XXII, XXIII, XXV или XXVI:
, ,
,
или связь.
В одной форме осуществления -Е- представляет собой продукт взаимодействия соединения FGF21 с активированным сложным эфиром, например с N-гидроксисукцинимидом (формула XIV), но не ограничиваясь им, или с реакционным элементом формулы XV, XVI, XVII, IIXX, IXX, XX или XI:
,  или его амид (йодоацетамид),
, ,
,
или ,
где # представляет собой точку присоединения к -С- или -D-.
В одной форме осуществления производное имеет одно или два связующих 5 альбумина формулы A-B-C-D-E-.
В одной форме осуществления производное имеет два связующих альбумина, предпочтительно, где А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,  или
; где n равно 8, 9, 10, 11, 12 или 13.
В одной форме осуществления имеет два связующих альбумина, предпочтительно, где А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,  или
; где n равно 10, 11, 12 или 13.
В одной форме осуществления производное имеет одно связующее альбумина, в котором предпочтительно А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,  или
; где n равно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18.
В одной форме осуществления производное имеет одно связующее альбумина, в котором предпочтительно А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,  или
; где n равно 14, 15, 16, 17 или 18.
В одной форме осуществления A-B-C-D-Е- выбрано из приведенных ниже формул (1)-(12):
(1):
(2):
(3):
(4):
(5):
(6):
(7):
(8):
(9):
(10):
(11):
(12):
(13):
(14):  или фармацевтически приемлемых солей любых из соответствующих производных. Производные, включающие (2) и (3), могут быть, впрочем, образованы путем расщепления производного, включающего формулу (1).
В одной форме осуществления A-B-C-D-E- выбрано из приведенных ниже формул (1)-(12):
(1):
(2):
(3):
(4):
(5):
(6):
(7):
(8):
(9):
(10):
(11):
(12):
или фармацевтически приемлемой соли любого из соответствующих производных. Производные, включающие (2) и (3), могут быть, впрочем, образованы путем расщепления производного, включающего формулу (1).
В одной форме осуществления связующее альбумина присоединено к остатку цистеина в одном или более чем одном (например, в двух) положении, выбранном из положений -1 (например, в аналоге MetCys-FGF21), 6, 71 и 122 соединения FGF21, где нумерация положений соответствует SEQ ID NO:1.
В одной форме осуществления соединение по данному изобретению выбрано из производных Примеров 4, 5 и 6, предпочтительно приведенных ниже: S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-этил)-2,5-диоксопирролидин-3-ил] [Cys122]-Met-FGF21; S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(8)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-этил)-2,5-диоксопирролидин-3-ил] [Cys71]Met-FGF21 и S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(8)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [Cys71]Met-FGF21; или фармацевтически приемлемой соли любого из этих соединений.
Ниже следуют конкретные формы осуществления производного по изобретению, в частности, производного второго аспекта изобретения, в котором связующее альбумина формулы А-В-С- ковалентно присоединено к аминогруппе соединения FGF21:
В одной форме осуществления А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,  или ; где n равно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, и * представляет собой точку присоединения к -В-;
-В- представляет собой -В1-, -В2- или их комбинации, где
-В1- представляет собой элемент формулы IV, V, VI или VII:
, ,  или ;
где * представляет собой точку присоединения к -В2- или -С-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В2-; и
-В2- представляет собой элемент формулы IIX, IX или XXVII или комбинацию вплоть до четырех элементов формулы IIX и/или формулы IX и/или XXVII:
, где b равно 0, 1 или 2, с равно 0, 1 или 2, при условии, что b равно 1 или 2, когда с равно 0, и b равно 0, когда с равно 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С-, -В1- или другому -В2-, и # представляет собой точку присоединения к А-, -В1- или другому -В2-, или
, где d равно 1 или 2, е равно 0, 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1-; или
где u равно 2, 3 или 4, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1- и
-С- представляет собой элемент формулы Х или XI:
, где р равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, q равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -В-; или
, где k равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 или 23, m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21; и # представляет собой точку присоединения к -В-;
или его фармацевтически приемлемую соль.
В одной форме осуществления А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,  или
; где n равно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, и * представляет собой точку присоединения к -В-;
-В- представляет собой -В1-, -В2- или их комбинации, где
-В1- представляет собой элемент формулы IV, V, VI или VII:
, ,  или ;
где * представляет собой точку присоединения к -В2- или -С-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В2-; и
-В2- представляет собой элемент формулы IIX или IX или комбинацию вплоть до четырех элементов формулы IIX и/или формулы IX:
, где b равно 0, 1 или 2, с равно 0, 1 или 2, при условии, что b равно 1 или 2, когда с равно 0, и b равно 0, когда с равно 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С-, -В1- или другому -В2-, и # представляет собой точку присоединения к А-, -В1- или другому -В2-, или
, где d равно 1 или 2, е равно 0, 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1-;
-С- представляет собой элемент формулы Х или XI:
, где р равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, q равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -В-; или
, где k равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 или 23, m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21; и # представляет собой точку присоединения к -В-;
или его фармацевтически приемлемую соль.
В одной форме осуществления А- представляет собой элемент формулы I:
, в которой n предпочтительно равно 14, 16 или 18.
В одной форме осуществления -В- включает -В1-, предпочтительно элемент формулы IV или V:
или .
В одной форме осуществления -В- включает -В2-, предпочтительно один или два элемента формулы IIX:
, в которой более предпочтительно с равно 0 и b равно 2 (гамма-Glu) или с равно 0 и b равно 1 (бета-Asp).
В одной форме осуществления -В- включает -В2-, предпочтительно один или два элемента формулы IX:
, в которой более предпочтительно d равно 1 и е равно 2, или d равно 2 и е равно 1.
В одной форме осуществления -В- включает -В2-, предпочтительно один или два элемента формулы XXVIII:
, в которой более предпочтительно и равно 3.
В одной форме осуществления -С- представляет собой элемент формулы X:
, в которой предпочтительно q равно 0, 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно q равно 1 или 2. В одной форме осуществления -С- представляет собой элемент формулы X:
, в которой предпочтительно р равно 1 или 2, более предпочтительно р равно 1.
В одной форме осуществления -С- представляет собой элемент формулы X:
, в которой р равно и q равно 1 или 2, предпочтительно р равно 1 и q равно 2.
В одной форме осуществления -С- представляет собой элемент формулы XI:
, в которой предпочтительно m равно 0, 1 или 2, более предпочтительно m равно 1 или 2.
В одной форме осуществления -С- представляет собой элемент формулы XI:
, в которой предпочтительно k равно 1, 2, 3, 4, 5 или 11, более предпочтительно k равно 5, даже более предпочтительно m равно 1 и k равно 4, 5 или 11, или наиболее предпочтительно m равно 1 и k равно 5.
В одной форме осуществления соединение по данному изобретению представляет собой производное, имеющее одно или два связующих альбумина формулы А-В-С-.
В одной форме осуществления соединение по данному изобретению представляет собой производное, которое имеет два связующих альбумина, где предпочтительно А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,  или
; где n равно 8, 9,10, 11, 12 или 13.
В одной форме осуществления соединение по данному изобретению представляет собой производное, которое имеет два связующих альбумина, где предпочтительно А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,  или
; где n равно 10, 11, 12 или 13.
В одной форме осуществления соединение по данному изобретению представляет собой производное, которое имеет одно связующее альбумина, где предпочтительно А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,  или
; где n равно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18.
В одной форме осуществления соединение по данному изобретению представляет собой производное, которое имеет одно связующее альбумина, где предпочтительно А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,  или
; где n равно 14, 15, 16, 17 или 18.
В одной форме осуществления соединение по данному изобретению представляет собой производное, где А-В-С- выбрано из приведенных ниже формул (13)-(19):
(13):
(14):
(15):
(16):
(17):
(18):
(19):
или фармацевтически приемлемой соли любого из соответствующих производных.
В одной форме осуществления соединение по данному изобретению представляет собой производное, где А-В-С- выбрано из приведенных ниже формул (13)-(15):
(13):
(14):
(15):
;
или фармацевтически приемлемой соли любого из соответствующих производных.
В одной форме осуществления соединение по данному изобретению является таким, где присоединение связующего альбумина осуществляется посредством аминогруппы N-концевого аминокислотного остатка, предпочтительно с образованием амидной связи.
В одной форме осуществления соединение по данному изобретению является таким, где присоединение связующего альбумина осуществляется посредством эпсилон-аминогруппы остатка лизина, предпочтительно с образованием амидной связи.
В одной форме осуществления соединение по данному изобретению является таким, где одно связующее альбумина присоединено к N-концевому аминокислотному остатку, а другое к внутреннему остатку лизина.
В одной форме осуществления соединение по данному изобретению является таким, где связующее (связующие) альбумина присоединено/присоединены к остатку лизина в одном или более чем одном (например, в двух) положении, выбранном из положений 56, 59, 69, 122 и 152 соединения FGF21, где нумерация положений соответствует SEQ ID NO:1.
В одной форме осуществления соединение по данному изобретению представляет собой соединение Примера 7, предпочтительно приведенное ниже: N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(8)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] [Arg56, Arg59, Arg69, Arg122]-Met-FGF21; или его фармацевтически приемлемую соль.
Ниже приведены дополнительные конкретные формы осуществления производного по изобретению, которые характеризуются структурой составляющего соединения FGF21:
Предпочтительно соединение FGF21 обладает идентичностью по меньшей мере 80% SEQ ID NO:1, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95%.
Предпочтительно соединение FGF21 имеет максимум 36 аминокислотных замен (модификаций) по сравнению с SEQ ID NO:1, предпочтительно максимум 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотную замену; более предпочтительно максимум 15, 14, 13, 12, 11 или 10 аминокислотных модификаций; даже более предпочтительно максимум 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислотных модификаций; или наиболее предпочтительно максимум 4, 3, 2 или 1 аминокислотную модификацию.
Предпочтительно соединение FGF21 имеет N-концевое удлинение из аминокислотных остатков в количестве вплоть до 25. Такие удлинения могут быть обозначены, используя отрицательные номера остатков, то есть номера остатков от -1 до -25 SEQ ID NO:1. Это N-концевое удлинение представляет собой линкер, который рассматривают как облегчающий присоединение связующего альбумина, как определено и заявлено в данной заявке, к N-концу соединения FGF21. Когда используют этот линкер, производное может включать (или состоять из него) только элемент А-, что означает, что элементы -В-, -С-, -D- и -Е- могут полностью отсутствовать. Предпочтительно, однако, элемент -В- и/или элемент -С- включен в дополнение к А-, более предпочтительно элемент -В1- Trx или Inp, или наиболее предпочтительно элемент -В2- формулы IIX, IX или XXVII, в частности, гамма-Glu. N-концевое удлинение предпочтительно имеет вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков.
Предпочтительно по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислотных остатков N-концевого удлинения аминокислотных остатков представляет собой глицин или серин.
В одной форме осуществления соединение FGF21 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.
В одной форме осуществления соединение FGF21 включает (а) по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций по сравнению с SEQ ID NO:1: -1М, -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, А26Е, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, L118C, K122С, K122R, А134С, 1152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е и/или S181K,R (предпочтительно по меньшей мере одну из приведенных ниже: -1М, -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, А26Е, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, L118C, K122С, K122R, А134С, 1152K и/или M168L); и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1 вплоть до 25 аминокислотных остатков, предпочтительно вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислотных остатков N-концевого удлинения представляет собой G или S.
В одной форме осуществления соединение FGF21 включает (а) по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций по сравнению SEQ ID NO:1: (i) K122С, (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K), D102T, А26Е, (Q28R, А31Е), Q27E, M168L, (Y179F, А180Е, S181R), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) и/или (L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) (предпочтительно K122С, (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K), D102T, А26Е, (Q28R, А31Е), Q27E и/или M168L), (ii) -1G и (-1G, M168L) или (iii) S6C, (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R) и (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R), где соединение FGF21 (i) и (iii) могут дополнительно, необязательно включать N-концевой М; и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1, выбранное из приведенных ниже: (iv) MG-, МС-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG- и MSGSGSG-, где N-концевой М в каждом из соединений FGF21 (iv) может быть необязательно делегирован.
В одной форме осуществления соединение FGF21 включает Y179F, А180Е и S181K или S181R (i); предпочтительно оно дополнительно включает V169aT, P171L, S172E, Q173A и G174V (ii); более предпочтительно оно дополнительно включает L166F, S167G и M168L (iii); наиболее предпочтительно оно включает (i), (ii) и (iii). Каждая из трех форм осуществления (i)-(iii) необязательно включает N-концевой М (например, -1М).
В одной форме осуществления соединение FGF21 включает приведенные ниже замены по сравнению с SEQ ID NO:1: (a) K122C; (b) (K59R, K69R, K122R); (c) (K56R, K69R, K122R); (d) (K56R, K59R, K69R); (e) S71C; (f) S6C; (g) (K56R, K59R, K69R, K122R); (h) (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K); (i) (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R); (j) (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R); или (k) M168L.
В одной форме осуществления соединение FGF21 включает приведенные ниже изменения по сравнению с FGF21 (SEQ ID NO:1): (i) Met-Gly- на N-конце, (ii) M168L, (iii) форму осуществления (i) и (ii), (iv) Met-Cys- на N-конце, (v) Gly- на N-конце, (vi) форму осуществления (v) и (ii), (vii) Met-Ser- на N-конце или (iix) Ser- на N-конце; предпочтительно соединение FGF21 выбрано из приведенных ниже: (l) Met-Gly-FGF21, (m) Met-Gly-FGF21-M168L, (n) Met-Cys-FGF21, (о) Gly-FGF21-M168L, (p) Gly-FGF21, (q) Met-Ser-FGF21 или (r) Ser-FGF21; где FGF21 относится к полипептиду SEQ ID NO:1.
В одной форме осуществления соединение FGF21 включает приведенные ниже N-концевые удлинения по сравнению с SEQ ID NO:1: (q) MS-FGF21, (s) MSGSGSGSGSG-, (t) MGGGGG-, (u) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, (v) MSGGGGG-, (x) MSGSGGS-, (y) MSGGSSG- и (z) MSGSGSG-; а также одну из форм осуществления (q), (s), (t), (u), (v), (x), (y) и (z) без N-концевого Met.
В одной форме осуществления соединение FGF21 выбрано из приведенных ниже вариантов полипептида SEQ ID NO:1: (а) K122C, (e) S71C, (f) S6C, (n) Met-Cys-FGF21, любого из соединений (а), (e) и (f) с N-концевым Met и соединения (n) без N-концевого Met.
В одной форме осуществления соединение FGF21 выбрано из приведенных ниже вариантов полипептида SEQ ID NO:1: (b) (K59R, K69R, K122R); (с) (K56R, K69R, K122R); (d) (K56R, K59R, K69R); (g) (K56R, K59R, K69R, K122R); (h) (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K); (i) (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R); (j) (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R); (k) (179F, 180E, 181R); (l) (169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K); и (m) (166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K); а также любого из соединений (b), (с), (d), (g), (h), (i), (j), (k), (l) и (m) с N-концевым Met (предпочтительно (b)-(j) +/- N-концевой Met).
В одной форме осуществления соединение FGF21 имеет пролин в положении 146, где номер положения относится к SEQ ID NO:1, которая представляет собой аллельную форму дикого типа FGF21, известную из предшествующего уровня техники.
Ниже приведены дополнительные конкретные формы осуществления производного по данному изобретению, которые характеризуются биологическими и химическими свойствами:
В одной форме осуществления производное по данному изобретению предпочтительно обладает пролонгированным действием, см. Пример 11 Экспериментального раздела данной заявки.
В одной форме осуществления производное по данному изобретению имеет Т½ при дозировании s.c. у мышей по меньшей мере 1,5 часа, предпочтительно по меньшей мере 2 часа, более предпочтительно по меньшей мере 4 часа, даже более предпочтительно по меньшей мере 5 часов или наиболее предпочтительно по меньшей мере 6 часов.
В одной форме осуществления производное имеет ТА при дозировании s.c. у мышей по меньшей мере 10 часов, предпочтительно по меньшей мере 15 часов, более предпочтительно по меньшей мере 24 часа или наиболее предпочтительно по меньшей мере 48 часов. Мыши представляют собой мышей db/db, предпочтительно мышей, у которых отсутствует рецептор лептина.
В одной форме осуществления дозировка производного составляет 0,5 мг/кг, хотя можно также применять дозировку в диапазоне от 0,1 до 1,0 мг/кг.
В другой форме осуществления производное по данному изобретению имеет Т½ при дозировании i.v. у минипига по меньшей мере 15 часов, предпочтительно по меньшей мере 20 часов, более предпочтительно по меньшей мере 30 часов, даже более предпочтительно по меньшей мере 40 часов или наиболее предпочтительно по меньшей мере 50 часов.
Производное по данному изобретению может даже иметь T½ при дозировании i.v. у минипига по меньшей мере 60 часов, предпочтительно по меньшей мере 70 часов, более предпочтительно по меньшей мере 75 часов. Минипиги предпочтительно представляют собой нормальных самцов геттингенских минипигов. Число свиней в каждой группе обработки предпочтительно составляет n=3-4. Свиньи предпочтительно находятся в возрасте 12-15 месяцев и более предпочтительно весят примерно 25 кг. Свиньям предпочтительно дозируют однократную внутривенную дозу предпочтительно 0,1 мг/кг (примерно 5 нмоль/кг).
Концентрация в плазме как производных и аналогов по изобретению, так и сравнительных соединений FGF21 может быть определена любым подходящим методом, известным в данной области техники. Предпочтительным анализом является ELISA фактора-21 роста фибробластов человека, доступного от фирмы BioVendor с №по каталогу RD191108200R (например, BioVendor GmbH, Im Neuenheimer Feld 583, D-69120 Гейдельберг, Германия).
Производное предпочтительно обладает приемлемой эффективностью, см. Пример 8 Экспериментального раздела данной заявки.
В одной форме осуществления эффективность составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 10%, даже более предпочтительно по меньшей мере 20% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 30% эффективности Met-FGF21, где эффективность определяют путем измерения захвата глюкозы в адипоцитах 3Т3-L1.
В одной форме осуществления эффективность составляет по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, даже более предпочтительно по меньшей мере 70% относительно эффективности Met-FGF21.
В одной форме осуществления эффективность может даже составлять по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 100%, даже более предпочтительно по меньшей мере 110% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 120% относительно эффективности Met-FGF21.
Для каждой из этих форм осуществления эффективность предпочтительно определяют путем измерения захвата глюкозы в адипоцитах 3T3-L1.
50
50
Эффективность вычисляют как ЕС производного относительно ЕС Met-FGF21.
Адипоциты 3T3-L1 имеют происхождение от фибробластов мыши 3T3-L1, предпочтительно АТСС CL-173.
Захват глюкозы в адипоцитах 3T3-L1 можно измерить, как описано в Примере 8.
Производное по данному изобретению предпочтительно обладает приемлемой эффективностью и пролонгированным временем полувыведения:
В одной форме осуществления производное по данному изобретению имеет Т½ при дозировании s.c. у мышей по меньшей мере 1,5 часа, предпочтительно по меньшей мере 2 часа, более предпочтительно по меньшей мере 4 часа, даже более предпочтительно по меньшей мере 5 часа или наиболее предпочтительно по меньшей мере 6 часов - и в то же время эффективностью, как описано в любой из приведенных выше форм осуществления.
В одной форме осуществления производное по данному изобретению имеет Т½ при дозировании s.c. у мышей по меньшей мере 10 часов, предпочтительно по меньшей мере 15 часов, более предпочтительно по меньшей мере 24 часа или наиболее предпочтительно по меньшей мере 48 часов - и в то же время эффективностью, как описано в любой из приведенных выше форм осуществления.
В одной форме осуществления производное по данному изобретению имеет Т½ при дозировании i.v. у минипига по меньшей мере 15 часов, предпочтительно по меньшей мере 20 часов, более предпочтительно по меньшей мере 30 часов, даже более предпочтительно по меньшей мере 40 часов или наиболее предпочтительно по меньшей мере 50 часов - и в то же время эффективностью, как описано в любой из приведенных выше форм осуществления.
В одной форме осуществления производное по данному изобретению имеет Т½ при дозировании i.v. у минипига по меньшей мере 60 часов, предпочтительно по меньшей мере 70 часов, более предпочтительно по меньшей мере 75 часов - и в то же время эффективностью, как описано в любой из приведенных выше форм осуществления.
Производное обладает эффектом in vivo на уровень глюкозы в крови мышей db/db, см. Пример 11 Экспериментального раздела данной заявки:
Производное способно снижать глюкозу в крови in vivo у мышей db/db относительно контроля растворителем.
В одной форме осуществления значение глюкозы в крови снижается через 24 часа, предпочтительно через 48 часов после того, как введена последняя доза производного.
В одной форме осуществления значение глюкозы в крови снижается по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 15%, более предпочтительно по меньшей мере на 20%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 25% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 30% на основе измерений среднего значения глюкозы в крови в мМ и относительно соответствующего контроля растворителем. В качестве примера, со ссылкой на данные таблицы 3: через 48 часов после последней дозы производное Примера 4, дозированное как 0,22 мг/кг, дает измерение среднего значения глюкозы в крови 17,1 мМ. В тот же момент времени растворитель дает измерение среднего значения глюкозы в крови 23,9 мМ. Соответственно, производное Примера 4, дозированное как 0,22 мг/кг, вызывает снижение или уменьшение глюкозы в крови на 100% - (100×17,1/23,9)%=28% по сравнению с контролем носителя.
В одной форме осуществления значение глюкозы в крови снижается по меньшей мере на 35%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 45% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 50%, см. метод тестирования Примера 10.
Производные по изобретению предпочтительно устойчивы к окислению, со ссылкой на Пример 9 данной заявки.
2
2
В одной форме осуществления производное по данному изобретению является более устойчивым, чем Met-FGF21, в отношении окисления. Это можно протестировать путем хранения при различных температурах и проверки на окисление или путем инкубации в присутствии 300 мМ HO в течение 1 часа при 25°С.
Термин "устойчивый", то есть устойчивость, относится к эффективности, определенной, как описано выше.
2
2
2
2
После инкубации с HO производное обладает эффективностью по меньшей мере 15%, предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, даже более предпочтительно по меньшей мере 40% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 50%, где эффективность является относительной к Met-FGF21, обработанного таким же путем, но без HO.
Ниже приведены конкретные формы осуществления аналогов FGF21 по изобретению, прежде всего, определяемых структурой, затем биологическими и химическими свойствами и, наконец, несколькими дополнительными структурными формами осуществления:
Одну форму осуществления составляет аналог FGF21, включающий (а) по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций по сравнению с SEQ ID NO:1: -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, А26Е, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, K122R, 1152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E и/или S181K,R (предпочтительно -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, А26Е, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, K122R, 1152K и/или M168L); и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1 вплоть до 25 аминокислотных остатков, предпочтительно вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислотных остатков N-концевого удлинения представляет собой G или S.
Одну форму осуществления составляет аналог FGF21, который включает (а) приведенные ниже модификации по сравнению с SEQ ID NO:1: (i) (K122C), (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K), D102T, А26Е, (Q28R, А31Е), Q27E, M168L, (Y179F, А180Е, S181R), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) или (L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) (предпочтительно (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R) и/или (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K), D102T, А26Е, (Q28R, А31Е), Q27E и/или M168L), (ii) -1G и (-1G, M168L), или (iii) S6C, (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R) и (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R), где аналог FGF21 (i) и (iii) может дополнительно, необязательно включать N-концевой М; и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1, выбранное из приведенного ниже: (iv) MG-, МС-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG- и MSGSGSG-, где N-концевой М в каждом из аналогов FGF21 (iv) может быть необязательно делетирован.
Одну форму осуществления составляет аналог FGF21, который включает (а) приведенные ниже модификации по сравнению с SEQ ID NO:1: (i) (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K), D102T, А26Е, (Q28R, А31Е), Q27E, M168L, (Y179F, А180Е, S181R), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) или (L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) (предпочтительно (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R) и/или (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K), D102T, А26Е, (Q28R, А31Е), Q27E и/или M168L), (ii) -1G и (-1G, M168L) или (iii) S6C, (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R) и (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R), где аналог FGF21 (i) и (iii) может дополнительно, необязательно включать N-концевой М; и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1, выбранное из приведенного ниже: (iv) MG-, МС-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG- и MSGSGSG-, где N-концевой М в каждом из аналогов FGF21 (iv) может быть необязательно делетирован.
Одну форму осуществления составляет аналог FGF21, включающий одну или более чем одну из приведенных ниже модификаций по сравнению с полипептидом SEQ ID NO:1: S6C, S6K, K56R, K59R, K69R, S71C, K122R, I152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E и/или S181K.R (предпочтительно S6C, S6K, K56R, K59R, K69R, S71C, K122R, I152K и/или M168L). Данная форма осуществления включает новые одиночные замены в зрелом участке FGF21 в нумерационном порядке.
Одну форму осуществления составляет аналог FGF21, включающий одну или более чем одну из приведенных ниже модификаций по сравнению с полипептидом SEQ ID NO:1: S6C, S71C, M168L, (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), (K56R, K69R, K122R), (K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K) и (K56R, K59R, K69R, K122R, L118C-A134C), (L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) и/или (Y179F, A180E, S181R); предпочтительно: S6C, S71C, M168L, (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), (K56R, K69R, K122R), (K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K) и/или (K56R, K59R, K69R, K122R, L118C-A134C). Данная форма осуществления включает новые аналоги по изобретению с их составляющими одиночными и множественными или комбинированными заменами в зрелом участке FGF21. Перечислены сначала одиночные замены, затем комбинированные замены в нумерационном порядке после первой замены, затем по возрастающему числу замен.
Одну форму осуществления составляет аналог FGF21, включающий Y179F, A180E и S181K или S181R (i); предпочтительно дополнительно включающий V169aT, P171L, S172E, Q173A и G174V (ii); более предпочтительно дополнительно включающий L166F, S167G и M168L (iii); наиболее предпочтительно включающий (i), (ii) и (iii).
В одной форме осуществления аналог FGF21 любой из приведенных выше форм осуществления может дополнительно включать Met в положении -1 SEQ ID NO:1.
Одну форму осуществления составляет аналог FGF21, выбранный из приведенных ниже: (l) Met-Gly-FGF21, (m) Met-Gly-FGF21-M168L, (n) Met-Cys-FGF21, (о) Gly-FGF21-M168L, (p) Gly-FGF21, (q) Met-Ser-FGF21 или (r) Ser-FGF21; где FGF21 обозначает полипептид SEQ ID NO:1.
Одну форму осуществления составляет аналог FGF21, который имеет N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1 вплоть до 25 аминокислотных остатков, предпочтительно вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислотных остатков N-концевого удлинения представляет собой глицин или серин.
Одну форму осуществления составляет аналог FGF21, который включает приведенные ниже N-концевые удлинения по сравнению с SEQ ID NO:1: (q) MS-FGF21, (s) MSGSGSGSGSG-, (t) MGGGGG-, (u) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, (v) MSGGGGG-, (x) MSGSGGS-, (y) MSGGSSG- и (z) MSGSGSG-; а также любую из форм осуществления (q), (s), (t), (u), (v), (x), (y) и (z) без N-концевого Met.
Одну форму осуществления составляет аналог FGF21, который выбран из приведенных ниже: (r) MSGSGSGSGSG-FGF21, (s) MGGGGG-FGF21, (t) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-FGF21, (u) MSGGGGG-FGF21, (v) MSGSGGS-FGF21, (x) MSGGSSG-FGF21 и (y) MSGSGSG-FGF21, а также любой из форм осуществления (r), (s), (t), (u), (v), (x) и (у) без N-концевого Met; где FGF21 относится к SEQ ID NO:1.
Одну форму осуществления составляет аналог FGF21 любой из приведенных выше форм осуществления, который имеет Р (пролин) в положении 146, где номер положения относится к SEQ ID NO:1.
В одной форме осуществления аналог FGF21 обладает эффективностью по меньшей мере 1% относительно эффективности Met-FGF21, где эффективность определяют путем измерения захвата глюкозы в адипоцитах 3T3-L1.
В одной форме осуществления аналог FGF21 обладает эффективностью по меньшей мере 5%, предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, даже более предпочтительно по меньшей мере 30% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 40% относительно эффективности Met-FGF21.
В одной форме осуществления аналог FGF21 обладает эффективностью по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% относительно эффективности Met-FGF21.
В одной форме осуществления аналог FGF21 обладает эффективностью по меньшей мере 100%, предпочтительно по меньшей мере 120%, более предпочтительно по меньшей мере 140%, даже более предпочтительно по меньшей мере 160% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 180% относительно эффективности Met-FGF21.
В одной форме осуществления аналог FGF21 обладает эффективностью по меньшей мере 200%, предпочтительно по меньшей мере 250%, более предпочтительно по меньшей мере 300%, даже более предпочтительно по меньшей мере 350% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 400% относительно эффективности Met-FGF21.
Эффективность определяют, как описано выше для производных FGF21.
Аналоги FGF21 по данному изобретению способны к снижению глюкозы в крови у мышей db/db относительно контроля растворителем.
В одной форме осуществления глюкоза в крови снижается по меньшей мере на 1%, предпочтительно по меньшей мере на 2%, более предпочтительно по меньшей мере на 3%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 4% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 5% на основе измерений средней глюкозы в крови в мМ и относительно соответствующего контроля растворителем, см. метод тестирования в Примере 10.
Термин "устойчивый" или устойчивость относится к эффективности, определенной, как описано выше.
2
2
2
2
В одной форме осуществления эффективность аналога по данному изобретению после инкубации с HO составляет по меньшей мере 15%, предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, даже более предпочтительно по меньшей мере 40% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 50%, где эффективность представляет собой эффективность относительно Met-FGF21, обработанного таким же путем, но без HO.
Эти аналоги предпочтительны, поскольку устойчивы к окислению:
В одной форме осуществления аналоги включают приведенные ниже изменения по сравнению с FGF21 (SEQ ID NO:1): (i) Met-Gly- на N-конце, (ii) M168L, (iii) форму осуществления (i) и (ii), (iv) Met-Cys- на N-конце, (v) Gly- на N-конце, (vi) форму осуществления (v) и (ii), (vii) Met-Ser- на N-конце или (iix) Ser- на N-конце; предпочтительно аналог FGF21 выбран из приведенных ниже: (l) Met-Gly-FGF21, (m) Met-Gly-FGF21-M168L, (n) Met-Cys-FGF21, (о) Gly-FGF21-M168L, (p) Gly-FGF21, (q) Met-Ser-FGF21 или (r) Ser-FGF21; где FGF21 относится к полипептиду SEQ ID NO:1 - если желательно, с Р (пролином) в положении 146.
Соединения FGF21, включающие аналоги FGF21 и производные соединений FGF21, могут быть получены аналогично тому, как описано для подобных соединений. Более конкретно сделана ссылка на приведенные ниже конкретные рабочие примеры.
В приведенном ниже Примере 1 и 2 описано клонирование и экспрессия FGF21 и аналогов FGF21 в E. coli. Альтернативно FGF21 и аналоги FGF21, необязательно с N-концевыми удлинениями, могут быть получены в дрожжах, как описано ниже:
FGF21 с N-концевыми аминокислотными удлинениями можно экспрессировать в S. cerevisiae. В одной форме осуществления для этого требуется конструирование штамма, при котором создают штамм с прерванным РМТ2, РЕР4 и YPS1. Этот штамм можно сконструировать, используя классические методы, основанные на гомологичной рекомбинации, дающей возможность специфичной интеграции в соответствующих локусах. FGF21 с N-концевым удлинением кодируется на экспрессионном векторе S. cerevisiae, который можно поддерживать в S. cerevisiea. Чтобы направить аналог FGF21 в секреторный биохимический путь, в рекомбинантном экспрессионном векторе может быть получена пре-про-последовательность, включающая сигнальный пептид (например, пре-про-лидерная последовательность МFальфа). Эта последовательность соединена с ДНК, кодирующей аналог FGF21 в правильной рамке считывания. Этот сигнальный пептид обеспечивает секрецию в среду. Выше и по соседству с последовательностью аналога FGF21 располагают последовательность двухосновных аминокислот, обеспечивающую отщепление пре-про-последовательности от аналога FGF21 перед его секрецией в среду. Отщепление, вероятно, вызвано активностью KЕХ2. Аналог FGF21 может быть собран из среды.
Производные соединения FGF и аналоги FGF21 можно, если желательно, включать в препарат вместе с другими лекарствами, такими как инсулин.
Все формы осуществления в последующей главе, то есть формы осуществления 1-180, до возможной степени соответствуют п.1 приведенной ниже формулы изобретения.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ КОНКРЕТНЫЕ ФОРМЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
1. Производное соединения FGF21, имеющее ковалентно присоединенное связующее альбумина формулы A-B-C-D-E-, где
А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, и * представляет собой точку присоединения к -В-;
-В- отсутствует, представляет собой связь или выбран из -В1-, -В2- или их комбинаций, где
-В1- представляет собой элемент формулы IV, V, VI или VII:
,
,
или
;
где * представляет собой точку присоединения к -В2- или -С-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В2-; и
-В2- представляет собой элемент формулы IIX или IX или комбинацию вплоть до четырех элементов формулы IIX и/или формулы IX:
,
где b равно 0, 1 или 2, с равно 0, 1 или 2, при условии, что b равно 1 или 2, когда с равно 0, и b равно 0, когда с равно 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С-, -В1- или другому -В2-, и # представляет собой точку присоединения к А-, -В1- или другому -В2-, или
,
где d равно 1 или 2, е равно 0, 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1-;
-С- отсутствует, представляет собой связь или представляет собой элемент формулы Х или XI:
,
где р равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, q равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -В-; или
,
где k равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 или 23, m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21; и # представляет собой точку присоединения к -В-;
-D- отсутствует, представляет собой связь или представляет собой элемент формулы XII или XIII:
или
,
где r равно 2, 3, 4 или 5, s равно 1, 2, 3 или 4, t равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -Е- или к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -С-;
-Е- отсутствует, представляет собой связь или элемент формулы XXII, XXIII, XXIIIa, XXIV, XXIVa, XXV, XXVI или XXVII:
,
или ,
или ,
,
или
,
где * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -D- или -С-;
или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Производное соединения FGF21, имеющее ковалентно присоединенное связующее альбумина формулы A-B-C-D-E-, где
А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, и * представляет собой точку присоединения к -В-;
-В- отсутствует, представляет собой связь или выбран из -В1-, -В2- или их комбинаций, где
-В1- представляет собой элемент формулы IV, V, VI или VII:
,
,
;
где * представляет собой точку присоединения к -В2- или -С-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В2-; и
-В2- представляет собой элемент формулы IIX или IX или комбинацию вплоть до четырех элементов формулы IIX, и/или формулы IX, и/или формулы XXVII:
,
где b равно 0, 1 или 2, с равно 0, 1 или 2, при условии, что b равно 1 или 2, когда с равно 0, и b равно 0, когда с равно 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С-, -В1- или другому -В2-, и # представляет собой точку присоединения к А-, -В1- или другому -В2-, или
,
где d равно 1 или 2, е равно 0, 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1- или
где u равно 2, 3 или 4, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1-;
-С- отсутствует, представляет собой связь или представляет собой элемент формулы Х или XI:
,
где р равно 0, 1,2, 3, 4, 5 или 6, q равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -В-; или
,
где k равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 или 23, m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21; и # представляет собой точку присоединения к -В-;
-D- отсутствует, представляет собой связь или представляет собой элемент формулы XII или XIII:
или
,
где r равно 2, 3, 4 или 5, s равно 1, 2, 3 или 4, t равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -Е- или к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -С-;
-Е- отсутствует, представляет собой связь или элемент формулы XXII, XXIII, XXIIIa, XXIV, XXIVa, XXV, XXVI или XXVII:
,
или ,
или ,
,
или
,
где * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -D- или -С-;
или его фармацевтически приемлемая соль.
3. Производное формы осуществления 1 или 2, где если А представляет собой элемент формулы (III), то по меньшей мере один из -В-, -С-, -D- и -Е- присутствует и/или представляет собой не связь.
4. Производное по любой из форм осуществления 1-3 до возможной степени, где -В- и -С- присутствуют и представляют собой не связь.
5. Производное соединения FGF21, имеющее ковалентно присоединенное связующее альбумина формулы A-B-C-D-E- по любой из форм осуществления 1-4 до возможной степени, где
А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, и * представляет собой точку присоединения к -В-;
-В- представляет собой -В1-, -В2- или их комбинации, где
-В1- представляет собой элемент формулы IV, V, VI или VII:
,
,
;
где * представляет собой точку присоединения к -В2- или -С-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В2-; и
-В2- представляет собой элемент формулы IIX, IX или XXVIII или комбинацию вплоть до четырех элементов формулы IIX, и/или формулы IX, и/или формулы XXVIII:
,
где b равно 0, 1 или 2, с равно 0, 1 или 2, при условии, что b равно 1 или 2, когда с равно 0, и b равно 0, когда с равно 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С-, -В1- или другому -В2-, и # представляет собой точку присоединения к А-, -В1- или другому -В2-,
,
где d равно 1 или 2, е равно 0, 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1-; или
где и равно 2, 3 или 4, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1-;
-С- представляет собой элемент формулы Х или XI:
,
где р равно 0,1,2, 3, 4, 5 или 6, q равно 0,1,2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -В-; или
,
где k равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 или 23, m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21; и # представляет собой точку присоединения к -В-;
-D- является необязательным, и, когда присутствует, представляет собой элемент формулы XII или XIII:
или
,
где r равно 2, 3, 4 или 5, s равно 1, 2, 3 или 4, t равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -Е- или к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -С-;
-Е- является необязательным, и, когда присутствует, представляет собой связь или элемент формулы XXII, XXIII, XXIIIa, XXIV, XXIVa, XXV, XXVI или XXVII:
,
, ,
, ,
,
или
,
где * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -D- или -С-;
или его фармацевтически приемлемая соль.
6. Производное соединения FGF21, имеющее ковалентно присоединенное связующее альбумина формулы A-B-C-D-E- по любой из форм осуществления 1-5 до возможной степени, где
А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, и * представляет собой точку присоединения к -В-;
-В- представляет собой -В1-, -В2- или их комбинации, где
-В1- представляет собой элемент формулы IV, V, VI или VII:
,
,
;
где * представляет собой точку присоединения к -В2- или -С-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В2-; и
-В2- представляет собой элемент формулы IIX или IX или комбинацию вплоть до четырех элементов формулы IIX и/или формулы IX:
,
где b равно 0, 1 или 2, с равно 0, 1 или 2, при условии, что b равно 1 или 2, когда с равно 0, и b равно 0, когда с равно 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С-, -В1- или другому -В2-, и # представляет собой точку присоединения к А-, -В1- или другому -В2- или
,
где d равно 1 или 2, е равно 0, 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1-;
-С- представляет собой элемент формулы Х или XI:
,
где р равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, q равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -В-; или
,
где k равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 или 23, m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21; и # представляет собой точку присоединения к -В-;
-D- является необязательным, и, когда присутствует, представляет собой элемент формулы XII или XIII:
или
,
где r равно 2, 3, 4 или 5, s равно 1, 2, 3 или 4, t равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -Е- или к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -С-;
-Е- является необязательным, и, когда присутствует, представляет собой элемент формулы XXII, XXIII, XXIIIa, XXIV, XXIVa, XXV, XXVI или XXVII:
,
или ,
или ,
,
или
,
где * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -D- или -С-;
или его фармацевтически приемлемая соль.
7. Производное соединения FGF21, имеющее ковалентно присоединенное связующее альбумина формулы A-B-C-D-E- по любой из форм осуществления 1-6 до возможной степени, где
А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, и * представляет собой точку присоединения к -В-;
-В- представляет собой -В1-, -В2- или их комбинации, где
-В1- представляет собой элемент формулы IV, V, VI или VII:
,
,
;
где * представляет собой точку присоединения к -В2- или -С-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В2-; и
-В2- представляет собой элемент формулы IIX или IX или комбинацию вплоть до четырех элементов формулы IIX и/или формулы IX:
,
где b равно 0, 1 или 2, с равно 0, 1 или 2, при условии, что b равно 1 или 2 когда с равно 0, и b равно 0, когда с равно 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С-, -В1- или к другому -В2-, и # представляет собой точку присоединения к А-, -В1- или к другому -В2- или
,
где d равно 1 или 2, е равно 0, 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1-;
-С- представляет собой элемент формулы Х или XI:
,
где р равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, q равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -В-; или
,
где k равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 или 23, m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21; и # представляет собой точку присоединения к -В-;
-D- представляет собой элемент формулы XII или XIII:
или
,
где r равно 2, 3, 4 или 5, s равно 1, 2, 3 или 4, t равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -Е- или соединение FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -С-;
-Е- представляет собой элемент формулы XXII, XXIII, XXIIIa, XXIV, XXIVa, XXV, XXVI или XXVII;
,
или ,
или  ,
,
или
,
где * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -D- или -С-;
или его фармацевтически приемлемая соль.
8. Производное по любой из форм осуществления 1-7 до возможной степени, в частности, по форме осуществления 7, где -Е- представляет собой элемент формулы XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI или XXVII
,
,
,
,
или
.
где * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -D- или -С-.
9. Производное по любой из форм осуществления 1-8 до возможной степени, в котором А- представляет собой элемент формулы I:
, где n является таким, как определено здесь.
10. Производное по любой из форм осуществления 1-9 до возможной степени, в котором n равно 14, 16 или 18, предпочтительно 14 или 16.
11. Производное по любой из форм осуществления 1 -10 до возможной степени, в котором А- представляет собой элемент формулы I, предпочтительно такое, где n равно 13.
12. Производное по любой из форм осуществления 1-11 до возможной степени, в котором -В- включает -В1-, предпочтительно элемент формулы IV или V:
или
.
13. Производное по любой из форм осуществления 1-12 до возможной степени, в котором -В- включает -В2-, предпочтительно один или два элемента формулы IIX:
,
в котором более предпочтительно с равно 0 и b равно 2 или с равно 0 и b равно 1.
14. Производное по любой из форм осуществления 1-13 до возможной степени, в котором -В- представляет собой -В2-, более точно элемент формулы IX,
,
предпочтительно такое, где d равно 1 и е равно 2.
15. Производное по любой из форм осуществления 1-14 до возможной степени, в котором -В- представляет собой связь.
16. Производное по любой из форм осуществления 1-15 до возможной степени, в котором -С- представляет собой элемент формулы X:
,
в котором предпочтительно q равно 0, 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно q равно 1 или 2 и даже более предпочтительно q равно 2.
17. Производное по любой из форм осуществления 1-16 до возможной степени, в котором -С- представляет собой элемент формулы X:
,
в котором предпочтительно р равно 1 или 2, более предпочтительно р равно 1.
18. Производное по любой из форм осуществления 1-17 до возможной степени, в котором р равно 1 и q равно 1 или 2, предпочтительно р равно 1 и q равно 2.
19. Производное по любой из форм осуществления 1-18 до возможной степени, в котором -С- представляет собой элемент формулы XI:
,
в котором предпочтительно m равно 0, 1 или 2, более предпочтительно m равно 1 или 2.
20. Производное по любой из форм осуществления 1-19 до возможной степени, в котором -С- представляет собой элемент формулы XI:
,
в котором предпочтительно к равно 1, 2, 3, 4, 5 или 11, более предпочтительно k равно 5.
21. Производное по любой из форм осуществления 1-20 до возможной степени, в котором m равно 1 и k равно 4, 5 или 11, предпочтительно m равно 1 и k равно 5.
22. Производное по любой из форм осуществления 1-21 до возможной степени, в котором -D- представляет собой элемент формулы XII:
2
r
2
s
*
#-NH-(CH)-NH-CO-(CH)- (формула XII),
в котором предпочтительно r равно 2, и/или в котором предпочтительно s равно 1 или 2, наиболее предпочтительно r равно 2 и s равно 2.
23. Производное по любой из форм осуществления 1-22 до возможной степени, в котором -D- представляет собой элемент формулы XIII:
,
в котором предпочтительно t равно 1, 2 или 3, более предпочтительно t равно 2.
24. Производное по любой из форм осуществления 1-23 до возможной степени, в котором -D- отсутствует.
25. Производное по любой из форм осуществления 1-24 до возможной степени, в котором -Е- представляет собой элемент формулы XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI или XXVII:
, ,
, ,
,  или связь.
26. Производное по любой из форм осуществления 1-25 до возможной степени, в котором -Е- представляет собой элемент формулы XXII, XXIII, XXIIIa, XXV или XXVI:
, , , , , или связь.
27. Производное по любой из форм осуществления 1-26 до возможной степени, в котором -Е- представляет собой элемент формулы XXIV.
28. Производное по любой из форм осуществления 1-27 до возможной степени, имеющее одно или два связующих альбумина формулы A-B-C-D-E-.
29. Производное по любой из форм осуществления 1-28 до возможной степени, имеющее связующие альбумина формулы A-B-C-D-E-, где А- представляет собой элемент формулы I или II, -В- представляет собой связь или элемент формулы IIX или IX, -С- представляет собой элемент формулы X, -D- представляет собой элемент формулы XII или XIII, и -Е- представляет собой элемент формулы XXII или XXIV, и предпочтительно n равно 13, 14 или 16, b равно 2, d равно 1, е равно 2, р равно 1, q равно 2, r равно 2, s равно 2 и t равно 2.
30. Производное по любой из форм осуществления 1-29 до возможной степени, которое имеет два связующих альбумина.
31. Производное по любой из форм осуществления 1-30 до возможной степени, где А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 10, 11, 12 или 13.
32. Производное по любой из форм осуществления 1-31 до возможной степени, где А- представляет собой элемент формулы I, II или,
или
;
где n равно 8, 9, 10, 11, 12 или 13.
33. Производное по любой из форм осуществления 1-32 до возможной степени, которое имеет одно связующее альбумина.
34. Производное по любой из форм осуществления 1-33 до возможной степени, где А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 14, 15, 16, 17, 18 или 19.
35. Производное по любой из форм осуществления до возможной степени, где А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18.
36. Производное соединения FGF21, имеющее ковалентно присоединенное связующее альбумина формулы A-B-C-D-E-, по любой из форм осуществления 1-35 до возможной степени, где A-B-C-D-E- выбрано из приведенных ниже формул (1)-(14):
(1):
(2):
(3):
(4):
(5):
(6):
(7):
(8):
(9):
(10):
(11):
(12):
(13):
(14): ; или
фармацевтически приемлемая соль любого из соответствующих производных.
37. Производное соединения FGF21, имеющее ковалентно присоединенное связующее альбумина формулы A-B-C-D-E-, по любой из форм осуществления 1-36 до возможной степени, где A-B-C-D-E- выбрано из приведенных ниже формул (1)-(12):
(1):
(2):
(3):
(4):
(5):
(6):
(7):
(8):
(9):
(10):
(11):
(12):
;
или фармацевтически приемлемая соль любого из соответствующих производных.
38. Производное по любой из форм осуществления 1-37 до возможной степени, где присоединение связующего альбумина происходит посредством тиольной группы остатка цистеина.
39. Производное по любой из форм осуществления 1-38 до возможной степени, где связующее альбумина присоединено к остатку цистеина в одном или более чем одном положении, выбранном из положений -1, 6, 71 и 122 соединения FGF21, где нумерация положений осуществляется относительно SEQ ID NO:1.
40. Соединение, выбранное из производных Примеров 4, 5 и 6, по любой из форм осуществления 1-39 до возможной степени, предпочтительно приведенное ниже:
S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-этил)-2,5-диоксопирролидин-3-ил] [Cys122]-Met-FGF21 (Соединение F);
S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-этил)-2,5-диоксопирролидин-3-ил] [Cys71]Met-FGF21 (Соединение Н); и
S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [Cys71]Met-FGF21 (Соединение О);
или фармацевтически приемлемая соль любого из этих соединений.
41. Производное соединения FGF21, имеющее связующее альбумина формулы А-В-С-, ковалентно присоединенное к аминогруппе соединения FGF21, по любой из форм осуществления 1-40 до возможной степени, где
А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, и * представляет собой точку присоединения к -В-;
-В- представляет собой -В1-, -В2- или их комбинации, где
-В1- представляет собой элемент формулы IV, V, VI или VII:
, ,  или ;
где * представляет собой точку присоединения к -В2- или -С-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В2-; и
-В2- представляет собой элемент формулы IIX или IX или комбинацию вплоть до четырех элементов формулы IIX и/или формулы IX:
,
где b равно 0, 1 или 2, с равно 0, 1 или 2, при условии, что b равно 1 или 2, когда с равно 0, и b равно 0, когда с равно 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С-, -В1- или к другому -В2-, и # представляет собой точку присоединения к А-, -В1- или к другому -В2- или
,
где d равно 1 или 2, е равно 0, 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1-; и
-С- представляет собой элемент формулы Х или XI:
,
где р равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, q равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -В-; или
,
где k равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 или 23, m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21; и # представляет собой точку присоединения к -В-;
или его фармацевтически приемлемая соль.
42. Производное соединения FGF21, имеющее связующее альбумина формулы А-В-С-, ковалентно присоединенное к аминогруппе соединения FGF21, по любой из форм осуществления 1-41 до возможной степени, где
А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, и * представляет собой точку присоединения к -В-;
-В- представляет собой -В1-, -В2- или их комбинации, где
-В1- представляет собой элемент формулы IV, V, VI или VII:
, ,  или ;
где * представляет собой точку присоединения к -В2- или -С-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В2-; и
-В2- представляет собой элемент формулы IIX или IX или комбинацию вплоть до четырех элементов формулы IIX и/или формула IX:
,
где b равно 0, 1 или 2, с равно 0, 1 или 2, при условии, что b равно 1 или 2, когда с равно 0, и b равно 0, когда с равно 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С-, -В1- или к другому -В2-, и # представляет собой точку присоединения к А-, -В1- или к другому -В2- или
,
где d равно 1 или 2, е равно 0, 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А-
где и равно 2, 3 или 4, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1- и;
-С- представляет собой элемент формулы Х или XI:
,
где р равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, q равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -В-; или
,
где k равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 или 23, m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21; и # представляет собой точку присоединения к -В-;
или его фармацевтически приемлемая соль.
43. Производное, по любой из форм осуществления 1-42 до возможной степени, предпочтительно по любой из форм осуществления 1-3 и 29, в котором А- представляет собой элемент формулы I:
.
44. Производное, по любой из форм осуществления 1-43 до возможной степени, в котором n равно 14, 16 или 18.
45. Производное, по любой из форм осуществления 1-44 до возможной степени, в котором -В- включает -В1-, предпочтительно элемент формулы IV или V:
или,
.
46. Производное, по любой из форм осуществления до возможной степени, в котором -В- включает -В2-, предпочтительно один или два элемента формулы IIX:
,
в котором более предпочтительно с равно 0 и b равно 2, или с равно 0 и b равно 1.
47. Производное, по любой из форм осуществления 1-46 до возможной степени, в котором -В- включает -В2-, предпочтительно один или два элемента формулы IX:
,
в котором более предпочтительно d равно 1 и е равно 2 или d равно 2 и е равно 1.
48. Производное по любой из форм осуществления 1-47 до возможной степени, в котором -В- включает -В2-, предпочтительно один или два элемента формулы XXVIII:
,
в котором более предпочтительно и равно 3.
49. Производное по любой из форм осуществления 1-48 до возможной степени, в котором -С- представляет собой элемент формулы X:
,
в котором предпочтительно q равно 0, 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно q равно 1 или 2.
50. Производное по любой из форм осуществления 1-49 до возможной степени, в котором -С- представляет собой элемент формулы X:
,
в котором предпочтительно р равно 1 или 2, более предпочтительно р равно 1.
51. Производное по любой из форм осуществления 1-50 до возможной степени, в котором р равно 1 и q равно 1 или 2, предпочтительно р равно 1 и q равно 2.
52. Производное по любой из форм осуществления 1-51 до возможной степени, в котором -С- представляет собой элемент формулы XI:
,
в котором предпочтительно m равно 0, 1 или 2, более предпочтительно m равно 1 или 2.
53. Производное по любой из форм осуществления 1-52 до возможной степени, в котором в котором -С- представляет собой элемент формулы XI:
,
в котором предпочтительно k равно 1, 2, 3, 4, 5 или 11, более предпочтительно k равно 5.
54. Производное по любой из форм осуществления 1-53 до возможной степени, в котором m равно 1 и k равно 4, 5 или 11, предпочтительно m равно 1 и k равно 5.
55. Производное по любой из форм осуществления 1-54 до возможной степени, имеющее одно или два связующих альбумина формулы А-В-С-.
56. Производное по любой из форм осуществления 1-55 до возможной степени, которое имеет два связующих альбумина.
57. Производное по любой из форм осуществления 1-56 до возможной степени, где А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 10, 11, 12 или 13.
58. Производное по любой из форм осуществления 1-57 до возможной степени, где А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 8, 9, 10, 11, 12 или 13.
59. Производное по любой из форм осуществления 1-58 до возможной степени, которое имеет одно связующее альбумина.
60. Производное по любой из форм осуществления 1-59 до возможной степени, где А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 14, 15, 16, 17, 18 или 19.
61. Производное по любой из форм осуществления 1-60 до возможной степени, где А- представляет собой элемент формулы I, II или III:
,
или
;
где n равно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19.
62. Производное соединения FGF21, имеющее ковалентно присоединенное связующее альбумина формулы А-В-С-, по любой из форм осуществления 1-61 до возможной степени, где А-В-С- выбран из приведенных ниже формул (13)-(19):
(13):
(14):
(15):
(16):
(17):
(18):
(19): ; или фармацевтически приемлемая соль любого из соответствующих производных.
63. Производное соединения FGF21, имеющее ковалентно присоединенное связующее альбумина формулы А-В-С-, по любой из форм осуществления 1-62 до возможной степени, где А-В-С- выбран из приведенных ниже формул (13)-(15):
(13):
(14):
(15):
;
или фармацевтически приемлемая соль любого из соответствующих производных.
64. Производное по любой из форм осуществления 1-63 до возможной степени, где присоединение связующего альбумина происходит через аминогруппу N-концевого аминокислотного остатка.
65. Производное по любой из форм осуществления 1-64 до возможной степени, где присоединение связующего альбумина происходит через эпсилон-аминогруппу остатка лизина.
66. Производное по любой из форм осуществления 1-65 до возможной степени, в котором одно связующее альбумина присоединено к N-концевому аминокислотному остатку, а другое к внутреннему остатку лизина.
67. Производное по любой из форм осуществления 1-66 до возможной степени, где связующее (связующие) альбумина присоединено/присоединены к остатку лизина в одном или более чем одном положении, выбранном из положений 56, 59, 69, 122 и 152 соединения FGF21, где нумерация положений соответствует SEQ ID NO:1.
68. Производное по любой из форм осуществления 1-67 до возможной степени, предпочтительно Примера 7, предпочтительно приведенное ниже:
N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] [Arg6, Arg59, Arg69, Arg122] Met-FGF21 (Соединение V);
или его фармацевтически приемлемая соль.
69. Производное по любой из форм осуществления 1-68 до возможной степени, где соединение FGF21 обладает идентичностью по меньшей мере 80% с SEQ ID NO:1, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95%.
70. Производное по любой из форм осуществления 1-69 до возможной степени, где соединение FGF21 имеет максимум 36 аминокислотных модификаций по сравнению с SEQ ID NO:1, предпочтительно максимум 30, 25, 20, 15, 10 или 5 аминокислотных замен или максимум 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотную замену; более предпочтительно максимум 15, 14, 13, 12, 11 или 10 аминокислотных модификаций; даже более предпочтительно максимум 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислотных модификаций; или наиболее предпочтительно максимум 4, 3, 2 или 1 аминокислотную модификацию.
71. Производное по любой из форм осуществления 1-70 до возможной степени, где соединение FGF21 имеет N-концевое удлинение вплоть до 25 аминокислотных остатков, предпочтительно вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков.
72. Производное по любой из форм осуществления 1-71 до возможной степени, в котором по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислотных остатков N-концевого удлинения представляет собой глицин или серин.
73. Производное по любой из форм осуществления 1-72 до возможной степени, где соединение FGF21 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.
74. Производное по любой из форм осуществления 1-73 до возможной степени, где соединение FGF21 включает
(a) по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций по сравнению c SEQ ID NO:1: -1М, -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, А26Е, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, L118C, K122С, K122R, А134С, 1152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L. S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E и/или S181K.R (предпочтительно по меньшей мере одну из приведенных ниже: -1М, -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, А26Е, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, L118C, K122С, K122R, А134С, 1152K и/или M168L); и/или
(b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1 вплоть до 25 аминокислотных остатков, предпочтительно вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислотных остатков N-концевого удлинения представляет собой G или S.
75. Производное по любой из форм осуществления 1-74 до возможной степени, где соединение FGF21 включает
(а) приведенные ниже модификации по сравнению с SEQ ID NO:1:
(i) K122С, (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K), D102T, А26Е, (Q28R, А31Е), Q27E, M168L, (Y179F, A180E, S181R), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) и/или (L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) (предпочтительно K122С, (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K), D102T, А26Е, (Q28R, А31Е), Q27E и/или M168L),
(ii) -1G и (-1G, M168L), или
(iii) S6C, (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R) и (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R),
где соединение FGF21 (i) и (iii) может дополнительно, необязательно включать N-концевой М; и/или
(b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1, выбранное из приведенного ниже:
(iv) MG-, МС-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG- и MSGSGSG-,
где N-концевой М в каждом из соединений FGF21 (iv) может быть необязательно делетирован.
76. Производное по любой из форм осуществления 1-75 до возможной степени, где соединение FGF21 включает приведенные ниже замены по сравнению с SEQ ID NO:1: (а) K122С; (b) (K59R, K69R, K122R); (с) (K56R, K69R, K122R); (d) (K56R, K59R, K69R); (е) S71C; (f) S6C; (g) (K56R, K59R, K69R, K122R); (h) (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K); (i) (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R); (j) (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R); или (k) M168L.
77. Производное по любой из форм осуществления 1-76 до возможной степени, где соединение FGF21 включает приведенные ниже изменения по сравнению с SEQ ID NO:1: Y179F, А180Е и S181K или S181R (i); предпочтительно дополнительно V169aT, P171L, S172E, Q173A и G174V (ii); более предпочтительно дополнительно L166F, S167G и M168L (iii); наиболее предпочтительно (i), (ii) и (iii), где каждая форма осуществления независимо и необязательно включает N-концевой М (например, -1М).
78. Производное по любой из форм осуществления 1 -77 до возможной степени, где соединение FGF21 включает приведенные ниже изменения по сравнению с FGF21 (SEQ ID NO:1): (i) Met-Gly- на N-конце, (ii) M168L, (iii) форму осуществления (i) и (ii), (iv) Met-Cys- на N-конце, (v) Gly- на N-конце, (vi) форму осуществления (v) и (ii), (vii) Met-Ser- на N-конце или (iix) Ser- на N-конце; предпочтительно соединение FGF21 выбрано из приведенных ниже: (I) Met-Gly-FGF21, (m) Met-Gly-FGF21 -M168L, (n) Met-Cys-FGF21, (о) Gly-FGF21 -M168L, (p) Gly-FGF21, (q) Met-Ser-FGF21 или (r) Ser-FGF21; где FGF21 относится к полипептиду SEQ ID NO:1.
79. Производное по любой из форм осуществления 1-78 до возможной степени, где соединение FGF21 включает приведенные ниже N-концевые удлинения по сравнению с SEQ ID NO:1: (q) MS-FGF21, (s) MSGSGSGSGSG-, (t) MGGGGG-, (u) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, (v) MSGGGGG-, (x) MSGSGGS-, (y) MSGGSSG- и (z) MSGSGSG-; а также любую из форм осуществления (q), (s), (t), (u), (v), (x), (y) и (z) без N-концевого Met.
80. Производное по любой из форм осуществления 1-79 до возможной степени, где соединение FGF21 выбрано из приведенных ниже вариантов полипептида SEQ ID NO:1: (а) K122С, (е) S71C, (f) S6C, (n) Met-Cys-FGF21, любого из соединений (а), (е) и (f) с N-концевым Met и соединения (n) без N-концевого Met.
81. Производное по любой из форм осуществления 1 -80 до возможной степени, где соединение FGF21 выбрано из приведенных ниже вариантов полипептида SEQ ID NO:1: (b) (K59R, K69R, K122R); (с) (K56R, K69R, K122R); (d) (K56R, K59R, K69R); (д) (K56R, K59R, K69R, K122R); (h) (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K); (i) (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R); (j) (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R); (k) (179F, 180E, 181R); (l) (169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K); и (m)(166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172E, 173A, 174V, 179F, 180E, 181K); a также любого из соединений (b), (с), (d), (g), (h), (i) и (j) с N-концевым Met (предпочтительно (b)-G)+/-N-концевой Met).
82. Производное по любой из форм осуществления 1-81 до возможной степени, которое имеет пролин в положении 146, где номер положения относится к SEQ ID NO:1.
83. Производное по любой из форм осуществления 1-82 до возможной степени, которое имеет Т½ при дозировании s.c. у мышей по меньшей мере 1,5 часа, предпочтительно по меньшей мере 2 часа, более предпочтительно по меньшей мере 4 часа, даже более предпочтительно по меньшей мере 5 часов, или наиболее предпочтительно по меньшей мере 6 часов.
84. Производное по любой из форм осуществления 1-83 до возможной степени, которое имеет Т½ при дозировании s.c. у мышей по меньшей мере 10 часов, предпочтительно по меньшей мере 15 часов, более предпочтительно по меньшей мере 24 часа или наиболее предпочтительно по меньшей мере 48 часов.
85. Производное по любой из форм осуществления 1-84 до возможной степени, в котором (i) мыши представляют собой мышей db/db, предпочтительно мышей, у которых отсутствует рецептор лептина, и/или (ii) дозировка производного равна 0,5 мг/мг.
86. Производное по любой из форм осуществления 1-85 до возможной степени, или аналог FGF в соответствии с любой из форм осуществления 87-180 до возможной степени, которое обладает эффективностью по меньшей мере 1%, предпочтительно по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 10%, даже более предпочтительно по меньшей мере 20% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 30% относительно эффективности Met-FGF21, где эффективность измеряют по захвату глюкозы в адипоцитах 3T3-L1.
87. Производное по любой из форм осуществления 1-86 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 88-180 до возможной степени, который обладает эффективностью по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, даже более предпочтительно по меньшей мере 70% относительно эффективности Met-FGF21.
88. Производное по любой из форм осуществления 1-87 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 89-180 до возможной степени, который обладает эффективностью по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 100%, даже более предпочтительно по меньшей мере 110% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 120% относительно эффективности Met-FGF21.
50
50
89. Производное по любой из форм осуществления 1-88 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 89-180 до возможной степени, эффективность которого вычисляют как EC производного относительно ЕС Met-FGF21.
90. Производное по любой из форм осуществления 1-89 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 91-180 до возможной степени, где адипоциты 3T3-L1 имеют происхождение от фибробластов мыши 3T3-L1, предпочтительно АТСС CL-173.
91. Производное по любой из форм осуществления 1-90 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 92-180 до возможной степени, где захват глюкозы в адипоцитах 3T3-L1 измеряют, как описано в Примере 8.
92. Производное по любой из форм осуществления 1-91 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 93-180 до возможной степени, который обладает эффективностью по меньшей мере 1% относительно эффективности Met-FGF21, где эффективность определяют, как описано в любой из форм осуществления 64-69.
93. Производное по любой из форм осуществления 1-92 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 94-180 до возможной степени, где эффективность относительно Met-FGF21 составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 10%, даже более предпочтительно по меньшей мере 20% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 30%.
94. Производное по любой из форм осуществления 1-93 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 95-180 до возможной степени, где эффективность относительно Met-FGF21 составляет по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 70%.
95. Производное по любой из форм осуществления 1-94 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 96-180 до возможной степени, где эффективность относительно Met-FGF21 составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 100%, даже более предпочтительно по меньшей мере 110% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 120%.
96. Производное по любой из форм осуществления 1-95 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 97-180 до возможной степени, который способен к снижению глюкозы в крови in vivo у мышей db/db относительно контроля растворителем.
97. Производное по любой из форм осуществления 1-96 до возможной степени, где глюкоза в крови снижается через 24 часа, предпочтительно через 48 часов после последней введенной дозы производного.
98. Производное по любой из форм осуществления 1-97 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 99-180 до возможной степени, где глюкоза в крови снижается по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 15%, более предпочтительно по меньшей мере на 20%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 25% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 30% на основе измерений среднего уровня глюкозы в крови в мМ и относительно соответствующего контроля растворителем.
99. Производное по любой из форм осуществления 1-98 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 100-180 до возможной степени, где глюкоза в крови снижается по меньшей мере на 35%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 45% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 50%.
100. Производное по любой из форм осуществления 1-99 до возможной степени, где (i) мыши db/db представляют собой самцов в возрасте 9-11 недель, (ii) производное вводят s.c., (iii) дозировка производного находится в диапазоне 0,2-1,0 мг/кг, предпочтительно 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 или 1,0 мг/кг, (iv) производное растворяют в ФСБ, (v) производное дозируют один раз в сутки, предпочтительно на сутки 1, сутки 2 и сутки 3, (vi) контроль растворителем обрабатывают ФСБ, предпочтительно 250 мкг/50 г мышь, и/или (vii) глюкозу в крови измеряют, используя глюкозооксидазный метод, предпочтительно используя анализатор глюкозы, такой как Biosen 5040.
101. Производное по любой из форм осуществления 1-100 до возможной степени, где контроль растворителем заменяют Met-FGF21.
2
2
102. Производное по любой из форм осуществления 1-101 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 103-180 до возможной степени, который является более устойчивым, чем Met-FGF21, после окисления путем инкубации в присутствии 300 мМ HO в течение 1 часа при 25°С.
103. Производное по любой из форм осуществления 1-102 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 104-180 до возможной степени, где устойчивость относится к эффективности, определенной в соответствии с любой из форм осуществления 70-75.
2
2
2
2
104. Производное по любой из форм осуществления 1-103 до возможной степени или аналог FGF по любой из форм осуществления 105-180 до возможной степени, который после инкубации с HO обладает эффективностью по меньшей мере 15%, предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, даже более предпочтительно по меньшей мере 40% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 50%, где эффективность является относительной к Met-FGF21, обработанному таким же путем, но без HO.
105. Производное по любой из форм осуществления 1-104 до возможной степени, в котором (i) и производное, и Met-FGF21 растворяют в ФСБ, рН 7,2, и/или (ii) концентрация производного и Met-FGF21 равна 1 мг/мл.
106. Производное по любой из форм осуществления 1-105 до возможной степени, которое представляет собой любое из конкретных производных, упомянутых в приведенных выше примерах 4-7 и 12-55.
107. Производное по любой из форм осуществления 1-106 до возможной степени, которое представляет собой S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71 С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, des181K] Ala-FGF21.
108. Производное по любой из форм осуществления 1-107 до возможной степени, которое представляет собой S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [28R, 56R, 59R, 69R, S71C, 102Т, 121Q, 122R, 166F, 167G, 168L, 170Т] Ala-FGF21.
109. Производное по любой из форм осуществления 1-108 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] [Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T] Ala-FGF21.
110. Производное по любой из форм осуществления 1-109 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] [K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des S181] Ala-FGF21.
111. Производное по любой из форм осуществления 1-110 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[4-(16-1Н-тетразол-5-илгексадеканоилсульфамоил)-бутирил] [K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des S181] Ala-FGF21.
112. Производное по любой из форм осуществления 1-111 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[4-(16-1Н-тетразол-5-илгексадеканоилсульфамоил)-бутирил] [Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T] Ala-FGF21.
113. Производное по любой из форм осуществления 1-112 до возможной степени, которое представляет собой S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) (Q28R, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21.
114. Производное по любой из форм осуществления 1-113 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Gly-FGF21.
115. Производное по любой из форм осуществления 1-114 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Ala-FGF21.
116. Производное по любой из форм осуществления 1-115 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Ser-FGF21.
117. Производное по любой из форм осуществления 1-116 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) FGF21.
118. Производное по любой из форм осуществления 1-117 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Gly-FGF21.
119. Производное по любой из форм осуществления 1-118 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21.
120. Производное по любой из форм осуществления 1-119 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ser-FGF21.
121. Производное по любой из форм осуществления 1-120 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) FGF21.
122. Производное по любой из форм осуществления 1-121 до возможной степени, которое представляет собой S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) (S71C, 121Q, P143V, А145Е, L146E, 148aD, P149L, P150R, 1152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ala-FGF21.
123. Производное по любой из форм осуществления 1-122 до возможной степени, которое представляет собой S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) (S71 С, P143V, А145Е, L146E, 148aD, P149L, P150R, 1152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ala-FGF21.
124. Производное по любой из форм осуществления 1-123 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, А145Е, L146E, 148aD, P149L, P150R, 1152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ala-FGF21.
125. Производное по любой из форм осуществления 1-124 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, А145Е, L146E, 148aD, P149L, P150R, 1152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ala-FGF21.
126. Производное по любой из форм осуществления 1-125 до возможной степени, которое представляет собой S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) (S71 С, 121Q, P143V, А145Е, L146E, 148aD, P149L, P150R, 1152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ser-FGF21.
127. Производное по любой из форм осуществления 1-126 до возможной степени, которое представляет собой S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) (S71 С, P143V, А145Е, L146E, 148aD, P149L, P150R, 1152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ser-FGF21.
128. Производное по любой из форм осуществления 1-127 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, А145Е, L146E, 148aD, P149L, P150R, 1152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ser-FGF21.
129. Производное по любой из форм осуществления 1-128 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, А145Е, L146E, 148aD, P149L, P150R, 1152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ser-FGF21.
130. Производное по любой из форм осуществления 1-129 до возможной степени, которое представляет собой S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) (S71 С, 121Q, P143V, А145Е, L146E, 148aD, P149L, P150R, 1152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) FGF21.
131. Производное по любой из форм осуществления 1-130 до возможной степени, которое представляет собой S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) (S71 С, P143V, А145Е, L146E, 148aD, P149L, P150R, 1152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) FGF21.
132. Производное по любой из форм осуществления 1-131 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, А145Е, L146E, 148aD, P149L, P150R, 1152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) FGF21.
133. Производное по любой из форм осуществления 1-132 до возможной степени, которое представляет собой N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, А145Е, L146E, 148aD, P149L, P150R, 1152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) FGF21.
134. Производное по любой из форм осуществления 1-133 до возможной степени, в котором соединение FGF представляет собой аналог FGF, которое представляет собой любой из конкретных аналогов, упомянутых в приведенных выше примерах 2 (предпочтительно примеры 2a-2af), 56 (предпочтительно примеры 56a-56as) и 57 (предпочтительно примеры 57a-57v).
135. Производное по любой из форм осуществления 1-134 до возможной степени, в котором соединение FGF представляет собой соединение FGF, представленное в любом из примеров 4-7 и 12-55 данной заявки.
136. Производное по любой из форм осуществления 1-135 до возможной степени, в котором соединение FGF представляет собой (Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21.
137. Производное по любой из форм осуществления 1-136 до возможной степени, в котором соединение FGF представляет собой (S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des S181) Ala-FGF21.
138. Производное по любой из форм осуществления 1-137 до возможной степени, в котором соединение FGF представляет собой (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, 169аТ, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des S181) Ala-FGF21.
139. Производное по любой из форм осуществления 1-138 до возможной степени, в котором соединение FGF представляет собой (Q28R, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21.
140. Производное по любой из форм осуществления 1-139 до возможной степени, где соединение FGF21 представляет собой любой из аналогов FGF21, упомянутых в любой из приведенных ниже форм осуществления.
141. Аналог FGF21, включающий
(а) по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций по сравнению с SEQ ID NO:1: -1G, -1C, -18, -1А, S6C, S6K, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, S71C, D102E, D102T, N121Q, K122R, 1152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, G170T, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E и/или S181K,R (предпочтительно -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, A26E, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, K122R, 1152K и/или M168L); и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1 вплоть до 25 аминокислотных остатков, предпочтительно вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков, или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислотных остатков N-концевого удлинения представляет собой G или S.
142. Аналог FGF21, включающий
(a) по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций по сравнению с SEQ ID NO:1: -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, A26E, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, K122R, 1152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E и/или S181K.R (предпочтительно -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, A26E, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, K122R, 1152K и/или M168L); и/или
(b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1 вплоть до 25 аминокислотных остатков, предпочтительно вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислотных остатков N-концевого удлинения представляет собой G или S.
143. Аналог FGF21, включающий (а) по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций по сравнению с SEQ ID NO:1: -1А, -1C, -1S, -1G, S6K, S6C, Q15F, V16K, D24K, А26Е, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, S71C, D102E, D102N, D102T, des121D, D121D, D121Q, K122R, P143V, A145E, 145aP, 145bM, L146V, L146E, 148aD, P149L, P149E, P150R, G151E, I152E, I152K, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, I154F, I154R, P155S, P155G, Q156H, Q156S, P157L, P158L, P158E, D159E, D159S, V160D, V160T, G161M, G161D, S162F, S163M, D164S, L166F, S167E, S167G, M168T, M168A, M168I, M168L, M168S, V169D, 169aT, G170T, G170S, P171M, P171L, S172D, S172E, Q173P, Q173A, G174F, G174A, G174V, R175G, S176L, P177V, S178T, Y179G, Y179F, A180E, S181K, S181R, 182G, и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1 вплоть до 25 аминокислотных остатков, предпочтительно вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислотных остатков N-концевого удлинения представляет собой G или S, или по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций -15Е, -14Е, -13Е, -12А, -10А, -НА, -НЕ, -10S, -9G, -8G, -8А, -7А, -6А, -6G, -5G, -4S, -3А, -3G, -2А, -2G, -2S.
144. Аналог FGF21, включающий (а) по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций по сравнению с SEQ ID NO:1: -1А, -1C, -1S, -1G, S6K, S6C, Q15F, V16K, D24K, А26Е, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, S71C, D102E, D102N, D102T, des121D, D121D, D121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152K, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, I154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168A, M168I, M168L, M168S, 169aT, G170T, P171L, S172E, Q173A, G174A, G174V, Y179F, A180E, S181K, S181R, 182G, и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1 вплоть до 25 аминокислотных остатков, предпочтительно вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислотных остатков N-концевого удлинения представляет собой G или S, или по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций -15Е, -14Е, -13Е, -12А, -10А, -11А, -11Е, -10S, -9G, -8G, -8А, -7А, -6А, -6G, -5G, -4S, -3А, -3G, -2А, -2G, -28.
145. Аналог FGF21, включающий (а) по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций по сравнению с SEQ ID NO:1: -1А, -1C, -1S, -1G, S6K, S6C, Q15F, V16K, D24K, А26Е, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, S71C, D102E, D102N, D102T, des121D, D121D, D121Q, K122R, I152K, D159E, L166F, S167G, M168A, M168I, M168L, M168S, 169aT, G170T, P171L, S172E, Q173A, G174A, G174V, Y179F, A180E, S181K, S181R, 182G, и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1 вплоть до 25 аминокислотных остатков, предпочтительно вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислотных остатков N-концевого удлинения представляет собой G или S, или по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций -15Е, -14Е, -13Е, -12А, -10А, -11А, -11Е, -10S, -9G, -8G, -8А, -7А, -6А, -6G, -5G, -4S, -3А, -3G, -2А, -2G, -2S.
146. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, где аналог FGF21 содержит не более чем 210 аминокислотных остатков, предпочтительно не более чем 209 аминокислотных остатков, более предпочтительно не более чем 206 аминокислотных остатков.
147. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, где если N-концевое удлинение составляет только одна аминокислота, эта аминокислота является отличной от Met.
148. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который включает
(а) приведенные ниже модификации по сравнению с SEQ ID NO:1:
(i) (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, I152K), D102T, А26Е, (Q28R, А31Е), Q27E, M168L, (Y179F, A180E, S181R), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K), (L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) (предпочтительно (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K), D102T, А26Е, (Q28R, А31Е), Q27E или M168L),
(ii) -1G и (-1G, M168L), или
(iii) S6C, (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R) и (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R),
где аналог FGF21 (i) и (iii) может дополнительно, необязательно включать N-концевой М; и/или
(b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1, выбранное из приведенного ниже:
(iv) MG-, МС-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG- и MSGSGSG-,
где N-концевой М в каждом из аналогов FGF21 (iv) может быть необязательно делетирован.
149. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который включает
(а) приведенные ниже модификации по сравнению с SEQ ID NO:1: (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K), D102T, А26Е, (Q28R, А31Е), Q27E, M168L, (Y179F, А180Е, S181R), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K), или (L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) (предпочтительно (K59R, K69R, K122R), (K56R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), S71C, (K56R, K59R, K69R, K122R) или (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K), D102T, А26Е, (Q28R, А31Е), Q27E или M168L), где аналог FGF21 может дополнительно, необязательно включать N-концевой М; и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1, выбранное из приведенного ниже:
(iv) MG-, МС-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG- и MSGSGSG-, где N-концевой М в каждом из аналогов FGF21 (iv) может быть необязательно делетирован.
150. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который включает (а) приведенные ниже модификации по сравнению с SEQ ID NO:1: -1G и (-1G, M168L); и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1, выбранное из приведенного ниже: (iv) MG-, МС-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG- и MSGSGSG-, где N-концевой М в каждом из аналогов FGF21 (iv) может быть необязательно делетирован.
151. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который включает (а) приведенные ниже модификации по сравнению с SEQ ID NO:1: S6C, (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R) и (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R), где аналог FGF21 может дополнительно, необязательно включать N-концевой М; и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1, выбранное из приведенного ниже: (iv) MG-, МС-, MS-, MSGSGSGSGSG-, MGGGGG-, MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, MSGGGGG-, MSGSGGS-, MSGGSSG- и MSGSGSG-, где N-концевой М в каждом из аналогов FGF21 (iv) может быть необязательно делетирован.
152. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который включает (а) приведенные ниже модификации по сравнению с полипептидом SEQ ID NO:1: S6C, S6K, K56R, K59R, K69R, S71C, K122R, 1152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е и/или S181K.R (предпочтительно S6C, S6K, K56R, K59R, K69R, S71C, K122R, 1152K и/или M168L).
153. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который включает (а) приведенные ниже модификации по сравнению с полипептидом SEQ ID NO:1: S6C, S71C, M168L, (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), (K56R, K69R, K122R), (K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K) и (K56R, K59R, K69R, K122R, L118C-A134C), (L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K), (V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) и/или (Y179F, А180Е, S181R); предпочтительно (S6C, S71C, M168L, (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R), (K56R, K69R, K122R), (K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R), (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K) и/или (K56R, K59R, K69R, K122R, L118C-A134C).
154. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, включающий Y179F, А180Е и S181K или S181R (i); предпочтительно дополнительно включающий V169aT, P171L, S172E, Q173A и G174V (ii); более предпочтительно дополнительно включающий L166F, S167G и M168L (iii); наиболее предпочтительно включающий (i), (ii) и (iii).
155. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, предпочтительно по любой из форм осуществления 89-90, включая 90а, дополнительно включающий Met в положении -1 SEQ ID NO:1.
156. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, выбранный из приведенных ниже: (l) Met-Gly-FGF21, (m) Met-Gly-FGF21-M168L, (n) Met-Cys-FGF21, (о) Gly-FGF21-M168L, (p) Gly-FGF21, (q) Met-Ser-FGF21 или (r) Ser-FGF21;
где FGF21 обозначает полипептид SEQ ID NO:1.
157. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который имеет N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1 вплоть до 25 аминокислотных остатков, предпочтительно вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислотных остатков N-концевого удлинения представляет собой глицин или серин.
158. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, предпочтительно аналог формы осуществления 93, который включает приведенные ниже N-концевые удлинения по сравнению с SEQ ID NO:1: (q) MS-FGF21, (s) MSGSGSGSGSG-, (t) MGGGGG-, (u) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-, (v) MSGGGGG-, (x) MSGSGGS-, (y) MSGGSSG- и (z) MSGSGSG-; а также любую из форм осуществления (q), (s), (t), (u), (v), (x), (y) и (z) без N-концевого Met.
159. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который выбран из приведенных ниже: (r) MSGSGSGSGSG-FGF21, (s) MGGGGG-FGF21, (t) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-FGF21, (u) MSGGGGG-FGF21, (v) MSGSGGS-FGF21, (x) MSGGSSG-FGF21 и (у) MSGSGSG-FGF21, а также любую из форм осуществления (r), (s), (t), (u), (v), (x) и (y) без N-концевого Met; где FGF21 относится к SEQ ID NO:1.
160. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который имеет Р (пролин) в положении 146, где номер положения относится к SEQ ID NO:1.
161. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который обладает эффективностью по меньшей мере 1%, предпочтительно по меньшей мере 5%, более предпочтительно по меньшей мере 10% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 20% относительно эффективности Met-FGF21, где эффективность определяют путем измерения захвата глюкозы адипоцитами 3T3-L1.
162. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, где эффективность составляет по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, даже более предпочтительно по меньшей мере 60% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 70% относительно эффективности Met-FGF21.
163. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, где эффективность составляет (i) по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 100%, даже более предпочтительно по меньшей мере 110% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 120% относительно эффективности Met-FGF21; (ii) по меньшей мере 100%, предпочтительно по меньшей мере 120%, более предпочтительно по меньшей мере 140%, даже более предпочтительно по меньшей мере 160% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 180% относительно эффективности Met-FGF21; или (iii) по меньшей мере 200%, предпочтительно по меньшей мере 250%, более предпочтительно по меньшей мере 300%, даже более предпочтительно по меньшей мере 350% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 400% относительно эффективности Met-FGF21.
164. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, эффективность которого определяют, как описано в любой из форм осуществления 70-75.
165. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который способен к снижению глюкозы в крови у мышей db/db относительно контроля растворителем.
166. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, где глюкоза в крови снижается по меньшей мере на 1%, предпочтительно по меньшей мере на 2%, более предпочтительно по меньшей мере на 3%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 4% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 5%, на основании измерений среднего уровня глюкозы в крови в мМ и относительно соответствующего контроля растворителем.
167. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, где (i) мыши db/db представляют собой самцов в возрасте 9-11 недель, (ii) аналог вводят s.c., (iii) дозировка аналога находится в диапазоне 0,1-1,0 мг/кг, предпочтительно 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 или 1,0 мг/кг, (iv) аналог дозируют один раз в сутки, предпочтительно на сутки 1, сутки 2 и сутки 3, и/или (v) глюкозу в крови измеряют, используя глюкозооксидазный метод, предпочтительно используя анализатор глюкозы, такой как Biosen 5040.
2
2
168. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который является более устойчивым, чем Met-FGF21, после окисления путем инкубации в присутствии 300 мМ HO в течение 1 часа при 25°С.
169. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, в котором устойчивость относится к эффективности, определенной в соответствии с любой из форм осуществления 70-75.
2
2
2
2
170. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который после инкубации с HO обладает эффективностью по меньшей мере 15%, предпочтительно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 30%, даже более предпочтительно по меньшей мере 40% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 50%, где эффективность представляет собой эффективность относительно Met-FGF21, обработанного таким же путем, но без НО.
171. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который включает приведенные ниже изменения по сравнению с FGF21 (SEQ ID NO:1): (i) Met-Gly- на N-конце, (ii) M168L, (iii) форму осуществления (i) и (ii), (iv) Met-Cys- на N-конце, (v) Gly- на N-конце, (vi) форму осуществления (v) и (ii), (vii) Met-Ser- на N-конце или (iix) Ser- на N-конце; предпочтительно аналог FGF21 выбран из приведенных ниже: (l) Met-Gly-FGF21, (m) Met-Gly-FGF21-M168L, (n) Met-Cys-FGF21, (о) Gly-FGF21-M168L, (р) Gly-FGF21, (q) Met-Ser-FGF21 или (r) Ser-FGF21; где FGF21 относится к полипептиду SEQ ID NO:1.
172. Аналог FGF21 по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, который имеет Р (пролин) в положении 146, где номер положения относится к SEQ ID NO:1.
173. Аналог FGF по любой из форм осуществления аналогов FGF до возможной степени, который представляет собой любой из конкретных аналогов, упомянутых в приведенных выше примерах 2 (то есть 2a-2af), 56 (то есть 56a-56as) и 57.
174. Композиция, содержащая аналог по любой из приведенных выше форм осуществления аналогов или производное по любой из приведенных выше форм осуществления производных и фармацевтически приемлемый носитель.
175. Аналог по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, предпочтительно по любой из форм осуществления 141-173, производное по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к производным, до возможной степени, предпочтительно по любой из форм осуществления 1-140, или композиция формы осуществления 174 для применения в качестве лекарства.
176. Аналог по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, предпочтительно по любой из форм осуществления 141-173, производное по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к производным, до возможной степени, предпочтительно по любой из форм осуществления 1-140, или композиция формы осуществления 174 для применения в качестве лекарства при лечении или предупреждении диабета, дислипидемии, ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний, метаболического синдрома и/или неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП).
177. Аналог по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к аналогам, до возможной степени, предпочтительно по любой из форм осуществления 141-173, производное по любой из предшествующих форм осуществления, относящихся к производным, до возможной степени, предпочтительно по любой из форм осуществления 1-140, или композиция формы осуществления 174 для применения при получении лекарства для лечения или предупреждения диабета, дислипидемии, ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний, метаболического синдрома и/или неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП).
178. Способ лечения пациента, проявляющего диабет, дислипидемию, ожирение, сердечно-сосудистые заболевания, метаболический синдром и/или неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП), включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества аналога по любой из форм осуществления 141-173, производного по любой из форм осуществления 1-140 или фармацевтической композиции формы осуществления 174.
179. Способ лечения пациента, нуждающегося в интенсивной терапии, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества аналога по любой из форм осуществления 141-173, производного по любой из форм осуществления 1-140 или фармацевтической композиции формы осуществления 174.
180. Любая новая комбинация форм осуществления, признаков и формулы изобретения, описанных в данной заявке.
В данной заявке цитируются различные ссылки, описания которых полностью включены посредством ссылки.
ПРИМЕРЫ
Приведенные ниже примеры служат для иллюстрации изобретения.
Сокращения
Далее использованы сокращения, приведенные ниже в алфавитном порядке: DCM представляет собой дихлорметан, DIC представляет собой диизопропилкарбодиимид, DIPEA представляет собой диизопропилэтиламин, DPBS представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко, DVB представляет собой дивинилбензол, EDAC представляет собой (3-диметиламинопропил)этилкарбодиимида гидрохлорид, Fmoc представляет собой 9Н-флуорен-9-илметоксикарбонил, HEPES представляет собой 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту, HOAt представляет собой 1-гидрокси-7-азабензотриазол, HOBt представляет собой 1-гидроксибензотриазол, HPpCD представляет собой гидроксипропил-бета-циклодекстрин, ВЭЖХ представляет собой высокоэффективную жидкостную хроматографию, IBMX представляет собой 3-изобутил-1-метилксантин, Inp представляет собой изонипекотовую кислоту, ИПТГ представляет собой тест с изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом, ЖХМС представляет собой жидкостную хроматографию с масс-спектрометрией, MALDI-TOF МС представляет собой времяпролетную масс-спектрометрию с ионизацией лазерной десорбцией из матрицы, МеОН представляет собой метанол, NanoES-MS представляет собой тандемную масс-спектрометрию с наноэлектрораспылением, NMP представляет собой 1-метилпирролидин-2-он, OEG представляет собой 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту, OtBu представляет собой трет-бутиловый эфир, ФСБ представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор, КГ представляет собой комнатную температуру, ТФУ представляет собой трифторуксусную кислоту, THF представляет собой тетрагидрофуран, TIPS представляет собой триизопропилсилан, Трис представляет собой трис(гидроксиметил)аминометан или 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол, Trx представляет собой транексамовую кислоту, TSTU представляет собой O-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторборат и СЭЖХ представляет собой сверхэффективную жидкостную хроматографию.
Общие методы
Метод ЖХМС 1 (ЖХМС1)
Масс-спектрометр Agilent Technologies LC/MSD TOF (G1969A) использовали для идентификации массы образца после элюирования из системы ВЭЖХ Agilent серия 1200. Деконволюцию белковых спектров вычисляли с помощью программного обеспечения подтверждения структуры белка фирмы Agilent.
Элюенты:
А: 0,1% Трифторуксусная кислота в воде
В: 0,1% Трифторуксусная кислота в ацетонитриле
Колонка: Zorbax 5 мкм, 300SB-C3, 4,8×50 мм
Градиент: 25%-95% ацетонитрил за 15 мин
Метод ЖХМС 2 (ЖХМС2)
Масс-спектрометр Perkin Elmer Sciex API 3000 использовали для идентификации массы образца после элюирования из системы ВЭЖХ Perkin Elmer серия 200.
Элюенты:
А: 0,05% Трифторуксусная кислота в воде
В: 0,05% Трифторуксусная кислота в ацетонитриле
Колонка: Waters Xterra MS C-18×3 мм id 5 мкм
Градиент: 5%-90% ацетонитрил за 7,5 мин при 1,5 мл/мин
Метод ЖХМС 3 (ЖХМС3)
Масс-спектрометр Waters Micromass ZQ использовали для идентификации массы образца после элюирования из системы ВЭЖХ Waters Alliance HT.
Элюенты:
А: 0,1% Трифторуксусная кислота в воде
В: 0,1% Трифторуксусная кислота в ацетонитриле
Колонка: Phenomenex, Jupiter C4 50 X 4,60 мм id 5 мкм
Градиент: 10% - 90% В за 7,5 мин при 1,0 мл/мин
Пример 1: Клонирование и экспрессия FGF21
ДНК- и аминокислотные последовательности для FGF21 человека раскрыты, например, Nishimura et al. в Biochim. Biophys. Acta 1492 (1): 203-206 (2000). Эти последовательности также доступны из общедоступных баз данных с номерами доступа EMBLAB021975 и UNIPROTQ9NSA1, соответственно.
Нативный полипептид синтезируют с сигнальным пептидом 28 аминокислот для секреции:
Сигнальный пептид, показанный выше курсивом, включен в прилагаемую последовательность, обозначенную как SEQ ID NO:2. Зрелый полипептид FGF21, состоящий из остальной 181 аминокислоты, включен в последовательность, обозначенную как SEQ ID NO:1.
450
Зрелый полипептид FGF21 клонировали и экспрессировали как внутриклеточный белок в E. coli без сигнального пептида, но с добавленным N-концевым метионином. Более конкретно кодирующая область 550 п.о., включающая на 3'-конце кодон ATG для Met, а также сайты рестрикции Nde1 и BamH1 на 3'- и 5'-концах, соответственно, была встроена в экспрессионный вектор рЕТ 11 с в Nde1-BamH1 под контролем промотора фага Т7 и трансформирована в E. coli В BL21 (DE3). Клетки выращивали в среде LB amp 100 мкг/мл до OD 0,5, и экспрессию индуцировали 0,3 мМ ИПТГ в течение 4 часов при 37°С. Грубые экстракты клеток получали путем обработки ультразвуком для анализа экспрессии FGF21.
Электрофорез в ДСН-ПААГ, окрашенном Кумасси синим, показал успешную экспрессию FGF21, который был идентифицирован, в основном, в растворимой фракции супернатанта с очень малым количеством в нерастворимом осадке. Хотя вычисленная MW экспрессированного таким путем FGF21 (Met-FGF21) (Соединение А) равна 19,5 кД, он мигрировал на геле как белок 25 кД, что, вероятно, является следствием большого количества пролинов, замедляющих движение белка.
Пример 2: Клонирование и экспрессия аналогов FGF21
12 приведенных ниже аналогов Met-FGF21 конструировали, как известно в данной области техники, и экспрессировали в Е. coli, как в целом описано в Примере 1, или в S. cerevisiae, используя подобные методы:
2а) K122С Met-FGF21 (Соединение В),
2b) (K59R, K69R, K122R) Met-FGF21 (Соединение С),
2с) (K56R, K69R, K122R) Met-FGF21 (Соединение D),
2d) (K56R, K59R, K69R) Met-FGF21 (Соединение G),
2е) S71C Met-FGF21 (Соединение Е),
2f) (K56R, K59R, K69R, K122R) Met-FGF21 (Соединение S),
2g) (K56R, K59R, K69R, K122R, 1152K) Met-FGF21 (Соединение R),
2h) D102T Met-FGF21 (Соединение М),
2i) A26E Met-FGF21 (Соединение N),
2j) (Q28R, А31Е) Met-FGF21 (Соединение Р),
2k) Q27E Met-FGF21 (Соединение Q) и
2l) M168L Met-FGF21 (Соединение К).
Еще 3 дополнительных аналога Met-FGF21, которые были получены, включают приведенные ниже:
2m)(179F, 180E, 181 R) Met-FGF21 (Соединение X),
2n) (169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180E, 181K) Met-FGF21 (Соединение Y) и
2o)(166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180E, 181K) Met-FGF21 (Соединение Z).
Следующие 2 аналога FGF21 были также получены, как описано выше:
2р) Gly-FGF21-M168L (Соединение J) и
2q) Gly-FGF21 (Соединение I).
Еще 14 дополнительных аналогов FGF21, которые получены, как описано выше, приведены ниже:
2r) S6C-Met-FGF21,
2s) (L118C-A134C, K56R, K59R, K69R, K122R)-Met-FGF21,
2t) (S6K, K56R, K59R, K69R, K122R)-Met-FGF21,
2u) Met-Gly-FGF21,
2v) Met-Gly-FGF21-M168L,
2x) Met-Cys-FGF21,
2y) Met-Ser-FGF21,
2z) (r) MSGSGSGSGSG-FGF21,
2aa) (s) MGGGGG-FGF21,
2ab) (t) MSHSGSGSGSGSGSGSGSGSG-FGF21,
2ac) (u) MSGGGGG-FGF21,
2ad) (v) MSGSGGS-FGF21,
2ae) (x) MSGGSSG-FGF21 и
2af) (y) MSGSGSG-FGF21.
Пример 3: Очистка FGF21 и аналогов
Полипептид FGF21 и его аналоги, полученные, как описано в Примерах 1-2, были дополнительно очищены, как описано ниже, или используя подобные методы:
Суспензию (20% масс/об) E. coli в 10 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,5 обрабатывали ультразвуком (интервалы включения/выключения 3 секунды на льду в течение 5 минут). Полипептид осаждали центрифугированием (10000 × g в течение 30 минут), повторно солюбилизировали путем обработки ультразвуком в 50 мМ Трис рН 8,0, и детрит удаляли центрифугированием (10000 × g в течение 30 минут). Полипептид в полученном в результате супернатанте очищали анионообменной хроматографией (50 мМ Трис рН 8,0, 50-250 мМ NaCl), используя смолу Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare), как в целом описано в Protein Purification. Principles and Practice Series: Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes, Robert K. 3rd ed., 1994. В некоторых случаях проводили дополнительную очистку эксклюзионной хроматографией, используя колонку HiLoad 26/60 Superdex pg 75 (GE Healthcare), работающую с 50 мМ Трис рН 8,0 и 200 мМ NaCl. Для хранения полипептид переносили в 50 мМ бикарбонат аммония рН 7,9, лиофилизировали и держали при -80°С.
Пример 4: Дериватизация соединений FGF21 при Cys связующими альбумина
Связующие альбумина, содержащие малеимид, можно синтезировать, как описано далее, и FGF21 и его аналоги, содержащие свободный цистеин, можно дериватизировать такими связующими альбумина, как также описано ниже.
Получение 17-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-диоксо-2.5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)-гептадекановой кислоты
Стадия 1: Fmoc-этилендиамин-2-хлортритиловая смола
5,8 г (7,5 ммоль) 2-хлортритилхлоридной смолы (100-200 меш, 1% DVB, загрузка 1,3 ммоль/г) подвергали набуханию в DCM (80 мл) в течение примерно 1 ч, а затем ее осушали. Fmoc-этилендиамингидрохлорид суспендировали в NMP (30 мл) и DCM (30 мл) и DIPEA (5 экв., 6,42 мл). Эту суспензию добавляли к смоле и встряхивали в течение 3 ч. Смолу осушали и промывали 17:2:1 DCM:MeOH:DIPEA, DCM, NMP и DCM (3×80 мл). Смолу высушивали над KOH/NaOH в эксикаторе.
Стадия 2: Fmoc-OEG-этилендиамин-2-хлортритиловая смола:
3 ммоль Fmoc-этилендиамин-2-хлортритиловой смолы модифицировали, используя микроволновой синтезатор пептидов СЕМ Liberty и твердофазную методологию синтеза пептидов на основе Fmoc. Смолу подвергали набуханию в NMP (60 мл) и осушали.
Из смолы удаляли защиту Fmoc, используя 5% пиперидин в NMP (60 мл), нагревали в течение 30 сек, осушали, промывали NMP (60 мл), а затем дополнительно 5% пиперидином в NMP (60 мл), нагревали в течение 3 мин при 70-75°С с последующим промыванием в NMP (4×60 мл). К смоле добавляли 0,3 М раствор Fmoc-8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты+0,3 М HOAt в NMP (45 мл) с последующим добавлением 0,75 М раствора DIC в NMP (18 мл). Реакционную смесь нагревали до 70-75°С в течение 10 мин с последующим промыванием NMP (4×60 мл).
Стадия 3: Fmoc-ОЕС-OEG-этилендиамин-2-хлортритиловая смола:
Из смолы удаляли защиту Fmoc, используя 5% пиперидин в NMP (60 мл), нагревали в течение 30 сек, осушали, промывали NMP (60 мл), а затем дополнительно 5% пиперидином в NMP (60 мл), нагревали в течение 3 мин при 70-75°С с последующим промыванием в NMP (4×60 мл). К смоле добавляли 0,3 М раствор Fmoc-8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты+0,3 М HOAt в NMP (45 мл) с последующим добавлением 0,75 М раствора DIC в NMP (18 мл). Реакционную смесь нагревали до 70-75°С в течение 10 мин с последующим промыванием NMP (4×60 мл).
Стадия 4: Fmoc-гамма-Glu-ОЕО-OEG-этилендиамин-2-хлортритиловая смола:
Из смолы удаляли защиту Fmoc, используя 5% пиперидин в NMP (60 мл), нагревали в течение 30 сек, осушали, промывали NMP (60 мл), а затем дополнительно 5% пиперидином в NMP (60 мл), нагревали в течение 3 мин при 70-75°С с последующим промыванием в NMP (4×60 мл). К смоле добавляли 0,3 М раствор Fmoc-Glu-OtBu+0,3 М HOAt в NMP (45 mL) с последующим добавлением 0,75 М раствора DIC в NMP (18 мл). Реакционную смесь нагревали до 70-75°С в течение 10 мин с последующим промыванием NMP (4×60 мл).
Стадия 5: С18-дикарбоновая кислота-гамма-Gluu-ОЕО-OEG-этилендиамин-2-хлортритиловая смола:
Из смолы удаляли защиту Fmoc, используя 5% пиперидин в NMP (60 мл), нагревали в течение 30 сек, осушали, промывали NMP (60 мл), а затем дополнительно 5% пиперидином в NMP (60 мл), нагревали в течение 3 мин при 70-75°С с последующим промыванием в NMP (4×60 мл). К смоле добавляли 0,3 М раствор октадекандиовой кислоты моно-трет-бутилового эфира+0,3 М HOAt в NMP (45 мл) с последующим добавлением 0,75 М раствора DIC в NMP (18 мл). Реакционную смесь нагревали до 70-75°С в течение 10 мин с последующим промыванием NMP (4×60 мл).
Стадия 6: 17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-аминоэтилкарбамоил)-метокси]-этокси}-этилкарбамоил)-метокси]-этокси}-зтилкарбамоил)-1-карбоксипропилкарбамоил]-гептадекановая кислота:
Смолу обрабатывали ТФУ/ПРЗ/водой 95:2,5:2,5 в течение 1 ч. Смолу отфильтровывали, и фильтрат концентрировали в вакууме. Добавляли ацетонитрил, и образец концентрировали повторно. Сырой продукт очищали ВЭЖХ (10-50% ацетонитрил, 0,1% ТФУ, 60 мл/мин, С18, 50 мм × 200 мм, 15Å)
ЖХМС2 m/z: 777 (M+1).
Стадия 7: 17-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)-гептадекановая кислота:
N-малеоил-бета-аланин (0,65 ммоль, 110 мг) растворяли в NMP. Добавляли EDAC (0,65 ммоль, 125 мг) и HOBt (0,65 ммоль, 88 мг), и смесь перемешивали в течение 1 ч при КТ. Добавляли раствор 17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-аминоэтилкарбамоил)-метокси]-этокси}-этилкарбамоил)-метокси]-этокси}-этилкарбамоил)-1-карбоксипропилкарбамоил]-гептадекановой кислоты (0,65 ммоль, 504 мг) в NMP (5 мл), и смесь перемешивали в течение 16 ч при КТ. Сырой продукт очищали ВЭЖХ (25-65% ацетонитрил, 0,1% ТФУ, 60 мл/мин, С18, 50 мм × 200 мм, 15Å) с получением 200 мг соединения, указанного в заголовке.
ЖХМС2 m/z: 927,8 (M+1).
Получение производного K122С Met-FGF21 S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-этил)-2,5-диоксопирролидин-3-ил] [Cys122] Met-FGF21 (Соединение F)
Остаток Cys в положении 122 в аналоге K122С Met-FGF21, полученном, как описано в Примерах 2 и 3 (SEQ ID NO:1 с K122С и N-концевым М) модифицировали по тиольной группе приведенным ниже реагентом, который получали, как описано выше:
4
3
[Cys122]-Met-FGF21 (лиофилизированный) растворяли в 20 мМ Трис буфере рН 7,5, и буфер обменивали 20 мМ Трис буфером, используя колонки PD-10 (GE Healthcare 170851-01). К 7 мл (1,48 мкмоль) этого раствора (4,1 мг/мл) добавляли 1,5 мл раствора, содержащего 17-((3)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)-гептадекановую кислоту в ацетонитриле/Трис буфере (1,3:1) (2,96 мкмоль). Реакции давали возможность протекать при КГ в течение 1 ч. Реакционную смесь фильтровали через фильтр 0,22 мкм и очищали, используя эксклюзионную хроматографию (GE Healthcare, Superdex 200, 26/60), элюируя 20 мМ Трис буфером рН 7,5, с последующей ионообменной хроматографией (Mono-Q 5/50, градиент 0-0,5 М NaCl в 20 мМ Трис, рН 7,5 за 60 объемов колонки). После анализа с помощью ЖХМС и ДСН-ПААГ электрофореза релевантные фракции объединяли и буфер обменивали на 50 мМ NHHCO и лиофилизировали.
ЖХМС1: Теоретическая масса = 20442,2, обнаружено 20442,3
Пример 5: Получение другого производного Cys аналога FGF21 Получение производного S71C Met-FGF21 3-71-И-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-этил)-2,5-диоксопирролидин-3-ил] [Cvs71] Met-FGF21 (Соединение Н)
Получение 19-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)-нонадекановой кислоты
Стадия 1: 19-{(S)-1-трет-бутоксикарбонил-3-[2-(2-{[2-(2-карбоксиметоксиэтокси)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-пропилкарбамоил}-нонадекановой кислоты трет-бутиловый эфир:
К раствору 2-(19-трет-бутоксикарбонилнонадеканоиламино)пентандиовой кислоты 1-трет-бутилового эфира 5-(2,5-диоксопирролидин-1-ил) эфира (2,50 г) и [2-(2-{2-[2-(2-аминоэтокси)-этокси]-ацетиламино}-этокси)-этокси]-уксусной кислоты (1,47 г) в этаноле (40 мл) добавляли DIPEA (1,26 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, а затем концентрировали в вакууме. К остатку добавляли водную 0,1 н. HCI (150 мл) и этилацетат (200 мл). Слои разделяли, и водный слой экстрагировали этилацетатом (100 мл). Объединенные органические слои промывали водой и рассолом, высушивали (сульфат магния) и концентрировали в вакууме с получением масла, которое кристаллизовалось при стоянии. Выход 96% (3,1 г). ЖХМС3: Теоретическая масса: 874,2. Обнаружено: 874,49.
Стадия 2: 19-((S)-1-трет-бутоксикарбонил-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонилметокси)-этокси]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)-нонадекановой кислоты трет-бутиловый эфир:
К раствору 19-{(3)-1-трет-бутокси карбон ил-3-[2-(2-{[2-(2-карбоксиметоксиэтокси)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-пропилкарбамоил}-нонадекановой кислоты трет-бутилового эфира (3,1 г) в ацетонитриле (50 мл) добавляли TSTU (1,39 г) и DIPEA (0,91 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, а затем концентрировали в вакууме. К остатку добавляли водную 0,1 н. HCI (150 мл) и этилацетат (200 мл). Слои разделяли, и водный слой экстрагировали этилацетатом (50 мл). Объединенные органические слои промывали водой и рассолом, высушивали (сульфат магния) и концентрировали в вакууме с получением масла. Выход 99% (3,4 г).
ЖХМС3: Теоретическая масса: 971,2. Обнаружено: 971,8.
Стадия 3: 19-((S)-1-Карбокси-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонилметокси)-этокси]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)-нонадекановая кислота:
19-((S)-1-трет-Бутоксикарбонил-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонилметокси)-этокси]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)-нонадекановой кислоты трет-бутиловый эфир (3,4 г) перемешивали в ТФУ (75 мл) в течение 45 мин, а затем концентрировали в вакууме. Остаток концентрировали с толуолом 3 раза с получением твердого вещества. Остаток кристаллизовали в 2-пропаноле и кристаллизовали с получением белого кристаллического соединения. Выход 80% (2,4 г).
ЖХМС3: Теоретическая масса: 859,03. Обнаружено: 859,44.
Стадия 4: 3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропионовой кислоты 2,5-диоксопирролидин-1-иловый эфир:
2
4
Налимидопропионовую кислоту (500 мг) растворяли в сухом THF (15 мл). Добавляли TSTU (790 мг) и DIPEA (0,62 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение ночи. Густую суспензию желтого цвета концентрировали. Остаток растворяли в DCM и экстрагировали 0,1 н. HCl (2×) и рассолом (1×). Органический слой высушивали (NaSO) и концентрировали с получением белого твердого вещества.
ЖХМС3: Теоретическая масса: 266,21. Обнаружено: 267,26 (М+1).
Стадия 5: 19-((S)-1 -Карбокси-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)-нонадекановая кислота:
К раствору N-бутоксикарбонилэтилендиамина (70 мг) в ацетонитриле (4 мл) добавляли DIPEA (0,07 мл) и 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропионовой кислоты 2,5-диоксопирролидин-1-иловый эфир (100 мг). После перемешивания в течение 1 ч смесь концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в DCM и промывали 5% лимонной кислотой, высушивали сульфатом магния и концентрировали. К остатку добавляли ТФУ (8 мл). После перемешивания в течение 1 ч при КГ смесь концентрировали в вакууме и дважды концентрировали совместно с толуолом. Остаток растворяли в THF (5 мл). Добавляли 19-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонилметокси)-этокси]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)-нонадекановую кислоту (75 мг) и DIPEA (0,09 мл). Смесь перемешивали при КГ в течение ночи. Очистка ВЭЖХ с использованием буфера А: 0,1% ТФУ в воде и буфера В: 0,1% ТФУ в ацетонитриле. Градиент 10-80% В за 45 мин. Скорость тока:
20 мл/мин, колонка С18 30 мм х 250 мм, 110А. Выход 116 мг (34%).
ЖХМС3: Теоретическая масса: 955,17. Обнаружено: 955,7.
Остаток Cys в положении 71 в аналоге S71C Met-FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 2 и 3 (SEQ ID NO:1 с S71C и N-концевым М), модифицировали по тиольной группе в положении 71 реагентом, полученным, как описано выше:
4
3
[Cys71] Met-FGF21 (1,68 мг, 85,9 ммоль), лиофилизированный из NHHCO, растворяли в воде MiliQ (1 мл). Буфер обменивали на 0,02 М Трис, рН 7,8, на колонке PD 10 (GE Healthcare 179851-01). Было собрано примерно 3,5 мл элюата. К этому элюату добавляли 19-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-({2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)-нонадекановую кислоту (0,86 мкмоль) в 0,02 М Трис, рН 7,8/ацетонитриле 1:1 (0,205 мл). Смесь оставляли при комнатной температуре на 1 ч, а затем при 5°С на ночь. Очистка анионообменной хроматографией на колонке monoQ 5/50 GL с использованием буфера А: 20 мМ Трис, рН 7,8; буфера В: 20 мМ Трис, 50 мМ NaCl, рН 7,8, ток 0,5 мл и градиент 0-100% В за 20 CV. Выделенные фракции, содержащие продукт, дополнительно очищали эксклюзионной хроматографией на колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 препаративной степени очистки в буфере DPBS от Bio Whittaker. Выход 0,466 г.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20511,3. Обнаружено: 20511,3.
Пример 6: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного S71C Met-FGF21 3-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [Cys71] Met-FGF21 (Соединение О)
Получение 9-{(S)-1-карбокси-3-[2-(2-{[2-(2-{(2-(2-йодоацетиламино)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-пропилкарбамоил}-нонадекановой кислоты
Стадия 1: 19-[(5)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-Аминоэтилкарбамоил)-метокси]-этокси}-этилкарбамоил)-метокси]-этокси}-этилкарбамоил)-1-трет-бутоксикарбонилпропилкарбамоил]-нонадекановой кислоты трет-бутиловый эфир:
К раствору 19-{(3)-1-трет-бутоксикарбонил-3-[2-(2-{[2-(2-карбоксиметоксиэтокси)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-пропилкарбамоил}-нонадекановой кислоты трет-бутилового эфира (500 мг) в ацетонитриле (15 мл) добавляли TSTU (224 мг) и DIPEA (0,13 мл). После перемешивания в течение 2 ч при КГ эту смесь наливали в раствор этилендиамина (0,50 мл) в ацетонитриле (5 мл). После перемешивания в течение 2 ч смесь концентрировали в вакууме. Остаток перемешивали в 1 н. NaOH (100 мл) и этилацетате (400 мл). Слои разделяли. Органический слой высушивали сульфатом магния и концентрировали в вакууме с получением белого твердого вещества. Это твердое вещество перемешивали в этаноле, а затем фильтровали. Фильтрат концентрировали с получением сиропа. Выход 250 мг (48%).
ЖХМС3: Теоретическая масса: 916,26. Обнаружено: 916,7.
Стадия 2: 19-{(S)-1-трет-Бутоксикарбонил-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-йодоацетиламино)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-пропилкарбамоил}-нонадекановой кислоты трет-бутиловый эфир:
К раствору йодоуксусной кислоты (60 мг) в DCM (8 мл) добавляли TSTU (90 мг) и DIPEA (0,05 мл), после перемешивания при КГ в течение 60 мин добавляли раствор 19-[(5)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-аминоэтилкарбамоил)-метокси]-этокси}-этилкарбамоил)-метокси]-этокси}-этилкарбамоил)-1-трет-бугоксикарбонилпропилкарбамоил]-нонадекановой кислоты трет-бутилового эфира (0,25 г) в DCM (8 мл) и DIPEA (0,05 мл). После перемешивания в течение 120 мин смесь разбавляли DCM (100 мл) и добавляли 1 н. HCl (50 мл). Слои разделяли. Органический слой высушивали сульфатом магния и концентрировали в вакууме. Остаток повторно концентрировали совместно с этанолом с получением твердого соединения. Выход 225 мг (76%).
ЖХМС3: Теоретическая масса: 1084,2. Обнаружено: 1084,8.
Стадия 3: 19-{(S)-1-Карбокси-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-йодоацетиламино)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-пропилкарбамоил}-нонадекановая кислота:
19-{(3)-1-трет-Бутоксикарбонил-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-йодоацетиламино)-этил-карбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-пропилкарбамоил}-нонадекановой кислоты трет-бутиловый эфир (225 мг) обрабатывали ТФУ (10 мл) в течение 90 мин. Смесь концентрировали в вакууме и дважды концентрировали совместно с толуолом. Остаток очищали ВЭЖХ, используя буфер А: 0,1% ТФУ в воде и буфер В: 0,1% ТФУ в ацетонитриле. Градиент 10-80% В за 45 мин. Ток: 20 мл/мин, колонка С18 30 мм × 250 мм, 110Å. Выход 45 мг (22%).
ЖХМС3: Теоретическая масса: 971,98. Обнаружено: 972,6.
Остаток Cys в положении 71 в аналоге S71C Met-FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 2 и 3 (SEQ ID NO:1 с S71C и N-концевым М), модифицировали по тиольной группе приведенным ниже реагентом:
Общий метод А
4
3
[Cys71] Met-FGF21 (7,53 мг, 385 нмоль), лиофилизированный из NHHCO, растворяли в 3×350 мкл 0,02 М Трис, рН 7,8, и обменивали буфер через колонку PD 10 на 0,02 М Трис, рН 7,8. Было собрано примерно 3,5 мл. 19-{(3)-1-Карбокси-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-йодоацетиламино)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-пропилкарбамоил}-нонадекановую кислоту (1,5 мг), которая была получена, как описано выше, растворяли в буфере 0,02 М Трис, рН 7,8/ацетонитриле 1:1 (0,75 мл). К раствору [Cys71] Met-FGF21 добавляли раствор йодоацетамида (0,561 мл, 3 экв.). Концентрация ацетонитрила составляла 7%. Смесь оставляли при КГ на 70 ч. Смесь подвергали ультрафильтрации через центрифужное устройство Amicon Ultra-4 MWCO 10000 при 4000 g в течение 10 мин. Ультрафильтрацию примерно с 4 мл буфера А повторяли еще 4 раза, чтобы удалить реагент. Образец очищали ионообменной хроматографией на колонке monoQ 5/50 GL, используя буфер А: 20 мМ Трис, рН 7,8; буфер В: 20 мМ Трис, 50 мМ NaCl, рН 7,8, ток 0,5 мл, и градиент 0-100% В за 60 CV. Выделенные фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали ультрацентрифугированием в центрифужном устройстве Amicon Ultra-4 MWCO 10000 при 6000 об/мин в течение 2х10 мин.
Обмен буфера на 50 мМ NKtHCOs осуществляли, используя колонки PD 10 (GE 179851-01). Было собрано примерно 4,0 мл элюата. Его фильтровали через стерильный фильтр Millex GV 0,22 мкм и лиофилизировали. Выход 2,18 мг.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20400,2. Обнаружено: 20400,13.
Пример 7: Дериватизация соединений FGF21 по N-концу связующими альбумина
Получение (производное K56R, K59R, K69R, K122R) Met-FGF21 N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] [Arg56, Ard59, Arg69, Arg122] Met-FGF21 (Соединение V)
N-концевой остаток Met в аналоге K56R, K59R, K69R, K122R Met-FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 2 и 3 (SEQ ID NO:1 с K56R, K59R, K69R и K122R и N-концевым М), модифицировали по альфа-аминогруппе приведенным ниже реагентом:
[Arg56, Arg59, Arg69, Arg122] Met-FGF21 (лиофилизированный) растворяли в буфере DPBS и буфер обменивали на буфер DPBS, используя колонки PD-10 (GE Healthcarel 70851-01) с получением 3,5 мл (4,3 мг/мл, 0,77 мкмоль). Образец разводили буфером DPBS (10,5 мл) и добавляли раствор 17-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонилметокси)-этокси]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)-гептадекановой кислоты (6,2 мкмоль), которая была получена, как в целом описано в Примере 4, в ацетонитриле (7,5 мл). После 1 ч при КГ смесь охлаждали до 0°С и добавляли холодный 0,2 М NaOH (21 мл). После 30 мин при 0°С смесь нейтрализовали соляной кислотой. Смесь концентрировали, используя центрифужные фильтры Amicon Centriprep Ultracel YM10 (10000 MWCO), затем разводили 5 мл буфера 20 мМ Трис, рН 7,5 и повторно концентрировали дважды (конечный объем примерно 5 мл). Смесь в виде раствора фильтровали через 0,22 мкм фильтр и очищали ионообменной хроматографией и лиофилизировали, как описано в Примере 4.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20368,1. Обнаружено: 20367,2.
Пример 8: Анализ эффективности - захват глюкозы в адипоцитах 3Т3-L1
Нижеописанный анализ использовали для определения биологической активности или эффективности соединений FGF21 по изобретению.
Фибробласты мыши 3T3-L1 (например, доступные из АТСС, номер по каталогу CL-173) поддерживали в базовой среде (DMEM (4500 мг/л глюкозы) с 10% фетальной бычьей сывороткой (ФБС) и пенициллином/стрептомицином). Клеткам не давали возможность достичь конфлюентности, и их следовало пересевать (переносить в новые флаконы) до достижения примерно 60% конфлюентности (на основании визуального осмотра).
Для анализа захвата глюкозы клетки высевают 80000 клеток/лунка в 24-луночный планшет или 20000 клеток/лунка в 96-луночный планшет, и, когда они достигают конфлюентности (высокой плотности с видом образования дифференцированных адипозных клеток), среду заменяют с базовой среды на базовую среду, содержащую Троглитазон, 1 ВМХ, Дексаметазон (имеющийся в продаже, например, от фирмы Sigma) и инсулин человека (имеющийся в продаже, например, от фирмы Novo Nordisk A/S).
3
2
2
50
50
Клетки использовали через 7-14, предпочтительно 7-10 суток после инициации дифференциации. Клетки стимулировали возрастающими концентрациями (0-300 нМ) полипептидов FGF21 или производных по изобретению в течение 20 часов в базовой среде. Перед добавлением H-дезоксиглюкозы (в дальнейшем: зонда) клетки промывают в теплом (примерно 37°С) аналитическом буфере (ФСБ с 1 мМ MgCl и 2 мМ CaCl, HEPES и 0,1% человеческий сывороточный альбумин), и клетки инкубируют с зондом в течение 1 часа. Эту инкубацию останавливают путем промывания дважды в охлажденном на льду аналитическом буфере. Клетки лизируют Тритоном Х-100, и лизаты переносят в 96-луночный планшет, добавляют Microscint-40 (имеющийся в продаже, например, от фирмы Perkin Elmer), и количество зонда считают в счетчике ТОР (например, Packard top-counter от фирмы Perkin Elmer). Вычисляют ЕС исследуемого полипептида. Результаты, которые показаны ниже в таблице 1, показывают EC (эффективность) соединений FGF21 по изобретению относительно эффективности Met-FGF21.
Таблица 1:
Эффективность соединений FGF21
Соединение из Примера номер
Соединение
Захват глюкозы 3T3-L1 Эффективность (%) относительно Met-FGF21
1
A
100
56h
20
56m
114
56l
198
2i
I
91
56af
8
2p
J
60
56as
9
56ae
10
56am
47
56ao
133
56c
38
47
1
Соединение из Примера номер
Соединение
Захват глюкозы 3T3-L1 Эффективность (%) относительно Met-FGF21
56a
T
50
46
10
53
12
54
25
56g
667
49
111
56b
U
33
48
6
56ab
4
56k
209
56j
341
16
131
56ag
403
15
182
56x
27
56r
91
2h
M
106
56ar
46
56z
122
2a
B
57
4
F
52
56ac
520
56ad
700
56s
68
2o
Z
356
56ai
7
2l
K
36
56aj
5
2n
Y
45
56u
14
2m
X
6
56t
5
Соединение из Примера номер
Соединение
Захват глюкозы 3T3-L1 Эффективность (%) относительно Met-FGF21
2i
N
85
2k
Q
72
2j
P
48
2d
G
89
2f
S
45
7
V
19
2g
R
26
2c
D
67
2b
C
130
2
36
2e
E
52
5
H
3
6 & 12
O
6
13
1
14
5
56aa
13
56ah
443
56al
4
56f
600
56i
329
56d
10
55
1
56y
7
На основании результатов таблицы 1 видно, что соединения FGF21 по изобретению обладают приемлемой, иногда даже очень хорошей эффективностью по сравнению с эффективностью Met-FGF21.
Пример 9: Устойчивость к окислению соединений FGF21
Устойчивость к окислению ряда соединений FGF21 по изобретению определяли в ускоренных экспериментах, используя пероксид водорода.
2
2
2
2
Исследуемое соединение, например, Met-FGF21, растворенное в ФСБ, рН 7,2, при концентрации 51 мкМ (1 мг/мл) инкубировали в течение 1 часа при 25°С в присутствии 300 мМ HO. Контроль (не окисленный Met-FGF21) обрабатывали таким же путем, но без HO. Реакции останавливали путем обессоливания на колонке для гель-фильтрации (Zeba или Superose 12), уравновешенной в ФСБ.
Состояние и кинетику окисления двух остатков Met (N-концевого Met в Met-FGF21 дикого типа, SEQ ID NO:1 с N-концевым Met, далее "Met1", и Met168 в SEQ ID NO:1, далее "Met168") определяли путем пептидного картирования, используя пищеварительный фермент трипсин (см., например, Patten, SMV et al., Journal of biological chemistry, 274, 10268-10276, 1999) при соотношении фермент: субстрат (то есть отношении трипсин: FGF21) 1:100 (масс/масс) в течение 2-18 ч при 37°С. Полученные в результате продукты расщепления гасили 1% ТФУ и картировали с помощью СЭЖХ с обращенной фазой (Waters) на колонке С18. Мониторинг элюирования пептида осуществляли по поглощению при 214 нм. Пептиды собирали, высушивали в Speed-Vac и восстанавливали в 50% ацетонитриле, 0,1% муравьиной кислоте. Масс-спектрометрию собранных пептидов, продуктов расщепления и интактного белка осуществляли, используя MALDI-TOF MC (Bruker Daltonics, Autoflex II, ToF/ToF) и NanoES-MS (Q-ToF Ultima, Waters), используя капилляры для распыления NanoES.
2
2
Анализ образцов не окисленного и окисленного Met-FGF21 с помощью СЭЖХ продемонстрировал полное окисление остатков Met1 и Met168 до Met-S-оксида (сульфоксида) в продуктах расщепления при 300 мМ HO (1 ч, 25°С). Анализ MALDI собранных пептидов подтвердил сайты окисления на пептидах, содержащих Met1 и Met168, и было показано, что остатки Met окисляются до Met-S-оксида с использованием МС/МС секвенирования пептидов. Подобную кинетику окисления двух пептидов наблюдали в присутствии различных концентраций пероксида водорода (25, 50, 100, 200 и 300 мМ W2 при инкубации в течение 30 мин при 0°С), используя анализ MALDI и СЭЖХ. Периоды полураспада, определенные с помощью СЭЖХ для пептида 1-18 и пептида 137-176, составляли 36,3 и 40,3 мин соответственно. Продукты окисления также наблюдали путем прямого анализа интактного белка, используя NanoES-MS.
Активность окисленного Met-FGF21 была снижена до 10% по сравнению с неокисленным Met-FGF21 в анализе жировых клеток Примера 8.
2
2
Подобным образом определяют устойчивость к окислению ряда соединений FGF21, и результаты показаны в таблице 2 ниже. Условиями окисления были 300 мМ НО, 1 ч, 25°С.
Таблица 2:
Эффективность соединений FGF21
Соединение FGF21
EC<sub>50</sub> относительно EC<sub>50</sub> Met-FGF21 (%)
Met-FGF21 (контроль) (Соединение А)
100
Met-FGF21+окисление
10
Gly-FGF21
88
Gly-FGF21-M168L
60
Met-FGF21-M168L (Соединение А1)
36
Пример 10: Тест in vivo соединений FGF21 - фармакодинамика
Мышь db/db является мышиной моделью для диабета типа 2. У этих мышей отсутствует рецептор лептина, и они характеризуются гипергликемией, устойчивостью к инсулину, гиперфагией и ожирением.
Самцов мышей db/db (возраст 9-11 недель) использовали для измерения эффекта на глюкозу крови приведенных ниже соединений FGF21: (1) FGF21 дикого типа (SEQ ID NO:1 с N-концевым Met), (2) аналог K122С FGF21 с N-концевым Met, дериватизированный по Cys122 связующим альбумина, как описано в Примере 4 (в двух дозировках) и (3) аналог S71C FGF21 с N-концевым Met, дериватизированный по Cys71 связующим альбумина, как описано в Примере 6. Эти аналоги экспрессировали в E.coli, как описано в Примерах 1-2, и очищали, как описано в Примере 3.
Соединения вводили s.c. 0,2-1,0 мг/кг в ФСБ один раз в сутки (дозирование на сутки 1, сутки 2 и сутки 3). Группу обработки растворителем (контроль) обрабатывали ФСБ (250 мкл/50 г мыши) s.c. один раз в сутки. Уровни глюкозы в крови измеряли на сутки 0, 1, 3, 4 и 5, используя анализатор глюкозы (Biosen 5040) на основе глюкозооксидазного метода. На сутки 0 глюкозу в крови измеряли с целью распределения мышей на 4 различные группы по 8-10 мышей в каждой, у которых средний уровень глюкозы в крови значимо не различался между ними. На сутки 1 глюкозу в крови измеряли через 2 часа после первой дозы. На сутки 3 глюкозу в крови измеряли через 2 часа после третьей дозы. На сутки 4 глюкозу в крови измеряли через 24 часа после третьей дозы. На сутки 5 брали образец крови, и таким образом, измеряли глюкозу в крови через 48 часов после последней (третьей) дозы.
Результаты представлены в таблице 3 ниже, в которой глюкоза в крови указана в мМ (среднее ± СКО (n=8 или 10)).
Таблица 3:
Эффект на глюкозу в крови у мышей db/db
Обработка/Дозировка
Сутки 0
Сутки 1
Сутки 3
Сутки 4
Сутки 5
Растворитель
21,7±1,4
23,6±1,2
22,8±1,1
22,3±2,1
23,9±1,6
Met-FGF21/0,24 мг/кг
21,6±1,0
24,0±0,8
20,5±1,2
20,6±1,8
22,5±1,9
Производное Примера 4/0,22 мг/кг (Соединение F)
22,8±1,5
21,0±1,4
18,5±1,4
14,7±1,3
17,1±1,5
Производное Примера 4/0,70 мг/кг (Соединение F)
21,5±1,7
17,3±2,2
13,8±1,8
11,6±1,5
13,6±1,5
Производное Примера 6/1,01 мг/кг (Соединение О)
20,6±2,0
16,8±2,0
15,7±2,1
12,4±2,2
12,9±1,5
Результаты показывают, что производные FGF21 по изобретению биологически активны in vivo, а именно эффективно снижают глюкозу в крови по сравнению с растворителем. Производные по изобретению даже оказались более эффективными, чем FGF21 дикого типа, в отношении их способности к снижению глюкозы в крови, а также продолжительности действия.
Пример 11: Тест in vivo соединений FGF21 - фармакокинетика
Мыши db/db
Фармакокинетический профиль соединений FGF21 по изобретению (Соединения F, Н, и О, полученные, как описано в Примерах 4, 5 и 6, соответственно) оценивали у самцов мышей db/db. Met-FGF21 (Соединение А) был включен для сравнения на трех уровнях дозы, а именно 0,125, 0,5 и 1 мг/кг подкожно.
Соединения по изобретению тестировали на одном уровне дозы, а именно 0,5 мг/кг подкожно (примерно 24 нМ/кг). За плазматическим уровнем сравнительного соединения следили в течение 6 часов, тогда как за плазматическими уровнями соединений по изобретению следили в течение 48 часов.
T½ в плазме оценивали как 1,3-1,7 часа для сравнительного соединения (1,4 часа при дозировании 0,5 мг/кг, как и тестируемых соединений), 8,2 часа для Соединения F, 15,9 часа для Соединения Н и 14,6 часа для Соединения О.
Минипиг
Фармакокинетический профиль Met-FGF21 (Соединение А) и соединения FGF21 по изобретению (Соединение F, полученное, как описано в Примере 4) тестировали у нормальных самцов геттингенских минипигов, n=3-4 (возраст 12-15 месяцев, 25 кг). Мониторинг плазматической концентрации Соединения А осуществляли в течение одной недели, тогда как мониторинг плазматической концентрации Соединения F осуществляли в течение двух недель. Оба соединения дозировали в виде однократной внутривенной дозы 0,1 мг/кг (примерно 5 нмоль/кг).
Среднее время полувыведения (Т½) сравнительного соединения (Соединение А) составляло 10,4 часа при стандартном отклонении 3,1 часа, тогда как среднее Т½ соединения по изобретению (Соединение F) составляло 91,9 часа при стандартном отклонении 17,1 часа.
Плазматические уровни соединений FGF21 определяли, используя ELISA фактора роста-21 фибробластов человека (доступного от BioVendor, № по каталогу RD191108200R).
Эти результаты дают сильное подтверждение пролонгированного эффекта производных FGF21 по изобретению.
Пример 12: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного S71C Met-FGF21 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [Cys711 Met-FGF21 (Соединение О)
Остаток Cys в положении 71 в аналоге S71C Met-FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 2 и 3 (SEQ ID NO:1 с S71C и N-концевым М), был модифицирован по тиольной группе приведенным ниже реагентом:
Общий метод В
4
3
[Cys71] Met-FGF21 (21,8 мг, 1,1 мкмоль), лиофилизированный из NI-UHCOs, растворяли в 20 мМ Трис, 0,5 NaCl, pH 8,0 (4,36 мл). 19-{(S)-1-карбокси-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-йодоацетиламино)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-пропилкарбамоил}-нонадекановую кислоту (5,4 мг, 5 экв.), которая была получена, как описано выше, растворяли в буфере 0,02 М Трис, 0,5 М NaCl pH 8,0/ацетонитриле 1:1 (1,09 мл) и добавляли к раствору [Cys71] Met-FGF21. После 2 ч и 15 мин смесь обессоливали на HiPrep 26/10 в буфере А (1,5 CV). Объединенные фракции очищали анионообменной хроматографией на колонке monoQ 5/50 GL, используя буфер А: 20 мМ Трис, pH 7,8; буфер В: 20 мМ Трис, 50 мМ NaCl, pH 7,8, ток 0,5 мл и градиент 0-100% В за 60 CV. Выделенные фракции, содержащие продукт, объединяли и осуществляли обмен буфера на 50 мМ NPHCO, используя колонки PD 10 (GE 179851-01). Элюат собирали и фильтровали через стерильный фильтр Millex GV 0,22 мкм и лиофилизировали. Выход 6,7 мг.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20400,2. Обнаружено: 20402,3.
Пример 13: Получение другого производного Cys аналога FGF21
Получение производного S71C Met-FGF21 S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-этил)-2,5-диоксопирролидин-3-ил] [Cys71] Met-FGF21
Остаток Cys в положении 71 в аналоге S71C Met-FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 2 и 3 (SEQ ID NO:1 с S71C и N-концевым М), был модифицирован по тиольной группе реагентом, полученным, как описано выше:
Соединение было получено с использованием общего метода А из Примера 5 без очистки эксклюзионной хроматографии. Выход 2,88 мг.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20483,3. Обнаружено: 20483.
Пример 14: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного S71C Met-FGF21 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [Cys71] Met-FGF21
Получение 17-{(S)-1-карбокси-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-йодоацетиламино)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-пропилкарбамоил}-гептадекановой кислоты
Стадия 1: 17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-Аминоэтилкарбамоил)-метокси]-этокси}-этилкарбамоил)-метокси]-этокси}-этилкарбамоил)-1-карбоксипропилкарбамоил]-гептадекановая кислота
К раствору этанола (10 мл) и этилендиамина (1 мл) добавляли 17-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонилметокси)-этокси]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)-гептадекановую кислоту (500 мг). После перемешивания в течение ночи при комнатной температуре смесь концентрировали в вакууме при 40°С. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (10-65% ацетонитрил, 0,1% ТФУ, 20 мл/мин, С18, 30 мм × 250 мм, ПОА). Выход 332 мг (70%).
ЖХМС3: Теоретическая масса: 776,0. Обнаружено: 776,6 (М+1).
Стадия 2: 17-{(S)-1-Карбокси-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-йодоацетиламино)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-пропилкарбамоил}-гептадекановая кислота
2
3
К раствору йодоуксусной кислоты (92 мг) в ацетонитриле (1 мл) добавляли TSTU (142 мг) и DIPEA (0,085 мл). После перемешивания при КГ в течение 60 мин добавляли раствор 17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(2-аминоэтилкарбамоил)-метокси]-этокси}-этилкарбамоил)-метокси]-этокси}-этилкарбамоил)-1-карбоксипропилкарбамоил]-гептадекановой кислоты (0,320 г) в 0,1 М NaCO (12 мл). После перемешивания в течение 120 мин рН смеси доводили до 11 н. HCl. Осадок отфильтровывали и промывали водой и высушивали в вакууме. Выход 350 мг (90%).
ЖХМС3: Теоретическая масса: 943,9. Обнаружено: 944,6 (М+1).
Остаток Cys в положении 71 в аналоге S71C Met-FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 2 и 3 (SEQ ID NO:1 с S71C и N-концевым М), был модифицирован по тиольной группе реагентом, полученным, как описано выше:
Общий метод В (NaCl)
Соединение было получено с использованием общего метода В из Примера 12, при рН 7,5 и без очистки эксклюзионной хроматографией. Выход 15,9 мг (38%).
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20372,19. Обнаружено: 20372,34.
Пример 15: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1G, 71С, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) F71C, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К] Gly-FGF21
Остаток Cys в положении 71 в аналоге (-1G, 71 С, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K) FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 56 (SEQ ID NO:1), модифицировали по тиольной группе в положении 71 реагентом, полученным, как описано выше:
Общий метод В (NaCl)
Соединение было получено с использованием общего метода В из примера 12. Реакцию проводили в смеси 1:1 20 мМ Трис, 0,5 NaCl, pH 7,5 и буфера DPBS. Очистка эксклюзионной хроматографией была исключена. Выход 19,5 мг (58%).
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20511. Обнаружено: 20511.
Пример 16: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (1G, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K1 GIV-FGF21
Общий метод С:
Остаток Cys в положении 71 в аналоге (-1G, 71 С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 56 (SEQ ID NO:1), модифицировали по тиольной группе в положении 71 реагентом, полученным, как описано выше:
К (-1G, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21 (33,8 мг, 1,7 мкмоль) в буфере DPBS (2,7 мг/мл) добавляли Трис (3 мг) и хлорид натрия (29 мг). 17-{(S)-1-Карбокси-3-[2-(2-{[2-(2-{[2-(2-йодоацетиламино)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-метокси}-этокси)-этилкарбамоил]-пропилкарбамоил}-гептадекановую кислоту (8 мг, 5 экв.), которая была получена, как описано выше, растворяли в буфере 0,02 М Трис, 0,5 М NaCl pH 7,5 (0,2 мл) и ацетонитриле (0,3 мл) и добавляли к раствору (-1G, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21. После 5 ч смесь фильтровали через стерильный фильтр Millex GV 0,22 мкм и обессоливали на двух колонках HiPrep 26/10 в ряд в буфере А (1,5 CV). Объединенные фракции очищали ионообменной хроматографией на колонке Source 15Q 4,6/100 РЕ, используя буфер А: 20 мМ Трис, pH 7,5; буфер В: 20 мМ Трис, 50 мМ NaCl, pH 7,5, ток 2,5 мл и градиент 5-40% В за 40 CV. Выделенные фракции, содержащие продукт, объединяли и обмен буфера на буфер DBPS осуществляли на колонке HiPrep 26/10. Элюат концентрировали, используя центрифужные фильтры Vivaspin 20 (10000 MWCO), собирали и фильтровали через стерильный фильтр Millex GV 0,22 мкм. Выход 10,9 мг (31%).
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20525. Обнаружено: 20525.
Пример 17: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K) FGF21 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К] Ala-FGF21
Остаток Cys в положении 71 в аналоге (-1А, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K) FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 56 (SEQ ID NO:1), модифицировали по тиольной группе в положении 71 реагентом, полученным, как описано выше:
Соединение было получено с использованием общего метода С из примера 16. Выход 11,4 мг (33%).
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20539,4. Обнаружено: 20539,5.
Пример 18: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1S, 71С, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K) FGF21 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K] Ser-FGF21
Остаток Cys в положении 71 в аналоге (-1S, 71С, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K) FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 56 (SEQ ID NO:1), модифицировали по тиольной группе в положении 71 реагентом, полученным, как описано выше:
Соединение было получено с использованием общего метода С из примера 16, используя колонку MonoQ 5/50 GI для очистки. Выход 20,9 мг (58%).
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20541. Обнаружено: 20541.
Пример 19: Получение следующего N-концевого производного аналога FGF21
Получение производного (-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, 56R, 59R, 69R, 102Е, 121Q, 122R, 168L) FGF21 N-альфа-3-[(17-карбоксигептадеканоил)-карбоксиметил-амино]-пропионил (-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, 56R, 59R, 69R, 102Е, 121Q, 122R, 168L) FGF21
Получение 17-{карбоксиметил-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонил)-этил]-карбамоил}-гептадекановой кислоты
17-{трет-Бутоксикарбонилметил-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонил)-этил]-карбамоил}-гептадекановой кислоты трет-бутиловый эфир (240 мг), полученный, как описано в WO 2005/012347, обрабатывали 95% ТФУ в течение 1 ч и концентрировали в вакууме. Остаток концентрировали совместно с ацетонитрилом с получением белого твердого вещества при количественном выходе, 200 мг.
ЖХМС3: Теоретическая масса: 540,7. Обнаружено: 541,3 (М+1).
N-концевое положение в аналоге (-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, 56R, 59R, 69R, 102Е, 121Q, 122R, 168L) FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 56 (SEQ ID NO:1), модифицировали реагентом, полученным, как описано выше:
Соединение было получено, используя метод из примера 7, используя колонку MonoQ 5/50 GI для очистки.
ЖХМС3: Теоретическая масса: 20301,9. Обнаружено: 1451,2 (М+14).
Производные FGF21 по изобретению в приведенных ниже примерах могут быть получены подобным образом:
Пример 20: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1G, 71С, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K) FGF21 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(3)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K] Gly-FGF21
Пример 21: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1G, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K) FGF21 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К] Gly-FGF21
Пример 22: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21 8-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(3)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K] Ala-FGF21
Пример 23: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1S, 71С, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K) FGF21 3-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К] Ser-FGF21
Пример 24: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1G, 71С, 102Е, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K) FGF21 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, 102Е, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К] Gly-FGF21
Пример 25: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1G, 71С, 102Е, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71 С, 102Е, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К] Gly-FGF21
Пример 26: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 102Е, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, 102Е, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К] Ala-FGF21
Были получены приведенные ниже примеры.
Пример 27: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 102Е, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21 S-71-({2-f2-(2-{2-[2-(2-{2-f(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси)-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, 102Е, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К], Ala-FGF21
Остаток Cys в положении 71 в аналоге (-1А, 71С, 102Е, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 56 (SEQ ID NO:1), модифицировали по тиольной группе в положении 71 реагентом, полученным, как описано выше:
Соединение было получено с использованием общего метода С из примера 16, используя колонку MonoQ 5/50 GI для очистки, за исключением буферов, к которым добавляли 5% этанол. Выход 18,2 мг (43%).
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20553,39. Обнаружено: 20552,88.
Производные FGF21 по изобретению в приведенных ниже примерах могут быть получены подобным образом:
Пример 28: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К, 182G) FGF21 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К, 182G] Gly-FGF21
Были получены приведенные ниже примеры.
Пример 29: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L. 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е) FGF21 S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е] Ala-FGF21
Остаток Cys в положении 71 в аналоге (-1А, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е) FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 56 (SEQ ID NO:1), модифицировали по тиольной группе в положении 71 реагентом, полученным, как описано выше:
Соединение было получено с использованием общего метода С из примера 16, используя колонку MonoQ 4,6/100 РЕ для очистки, за исключением буферов, к которым добавляли 5% этанол. Выход 19,8 мг (46%).
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20498,40. Обнаружено: 20498,07.
Пример 30: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, des181) FGF21 3-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, des181K] Ala-FGF21
Остаток Cys в положении 71 в аналоге (-1А, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, des181) FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 56 (SEQ ID NO:1), модифицировали по тиольной группе в положении 71 реагентом, полученным, как описано выше:
Соединение было получено с использованием общего метода С из примера 16, используя колонку MonoQ 4,6/100 РЕ для очистки, за исключением буферов, к которым добавляли 5% этанол. Выход 11,3 мг (40%).
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20411,32. Обнаружено: 20410,90.
Производные FGF21 по изобретению в приведенных ниже примерах могут быть получены подобным образом:
Пример 31: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 121Q, 143V, 145E, 146Е, 148aD, 149L, 150R, 152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, 154F, 155S, 156S, 158L, 159Е, 160Т, 161D, 163М, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е) FGF21 3-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [71С, N121Q, 143V, 145E, 146Е, 148aD, 149L, 150R, 152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, 154F, 155S, 156S, 158L, 159Е, 160Т, 161D, 163М, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е] Ala-FGF21
Пример 32: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 28R, 56R, 59R, 69R, S71C, 102Т, 121Q, 122R, 166F, 167G, 168L, 170Т) FGF21 8-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-метил) [28R, 56R, 59R, 69R, S71C, 102Т, 121Q, 122R, 166F, 167G, 168L, 170Т] Ala-FGF21
Пример 33: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1G, 71С, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K) FGF21 S-71-[(2-{3-[(17-карбоксигептадеканоил)-карбоксиметил-амино]-пропиониламино}-этилкарбамоил)-метил] [71С, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К] Gly-FGF21
Получение 17-(карбоксиметил-{2-[2-(2-йодоацетиламино)-этилкарбамоил]-этил}-карбамоил)-гептадекановой кислоты
Стадия 1: 17-{[2-(2-Аминоэтилкарбамоил)-этил]-карбоксиметилкарбамоил}-гептадекановая кислота
К раствору этилендиамина (0,3 мл) в THF (4 мл) добавляли раствор 17-{карбоксиметил-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-илоксикарбонил)-этил]-карбамоил}-гептадекановой кислоты (190 мг), полученной, как описано в Примере 19. Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и очищали непосредственно препаративной ВЭЖХ, используя 0,1% ТФУ в воде и 0,1% ТФУ в ацетонитриле в качестве элюентов. Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали. Выход 60 мг (35%).
ЖХМС3: Теоретическая масса: 485,67. Обнаружено: 486,38 (М+1).
Стадия 2: 17-(Карбоксиметил-{2-[2-(2-йодоацетиламино)-этилкарбамоил]-этил}-карбамоил)-гептадекановая кислота
2
3
К раствору йодоацетамида (35 мг) в ацетонитриле (0,50 мл) добавляли TSTU (56 мг) и DIPEA (0,032 мл). Смесь перемешивали в течение 1 ч, после чего добавляли раствор 17-{[2-(2-аминоэтилкарбамоил)-этил]-карбоксиметилкарбамоил}-гептадекановой кислоты (60 мг) в 0,1 М NaCO (5 мл). Смесь перемешивали в течение 2 ч и подкисляли до рН 1 1 н. HCl. Смесь осаждали центрифугированием. Супернатант декантировали и осадок дважды промывали водой и высушивали в вакууме. Выход 75 мг (93%).
ЖХМС3: Теоретическая масса: 653,60. Обнаружено: 654,27 (М+1).
Остаток Cys в положении 71 в аналоге (-1G, 71С, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21, полученном, как в целом описано в Примере 56, может быть модифицирован по тиольной группе в положении 71 реагентом, полученным, как описано выше, используя общий метод А, В или С.
Пример 34: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1G, 71 С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21 S-71-[(2-{3-[(17-карбоксигептадеканоил)-карбоксиметиламино]-пропиониламино}-этилкарбамоил)-метил] [71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K] Gly-FGF21
Был получен приведенный ниже пример.
Пример 35: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21 S-71-[(2-{3-[(17-карбоксигептадеканоил)-карбоксиметиламино]-пропиониламино}-этилкарбамоил)-метил] [71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K]Ala-FGF21
Остаток Cys в положении 71 в аналоге (-1А, 71C, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21, полученном, как в целом описано в Примерах 56 (SEQ ID NO:1), модифицировали по тиольной группе в положении 71 реагентом, полученным, как описано выше:
Соединение было получено, используя метод из примера 16. Выход 9,3 мг (33%).
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20249,05. Обнаружено: 20249,58.
Производные FGF21 по изобретению в приведенных ниже примерах могут быть получены подобным образом.
Пример 36: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1S, 71С, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21 8-71-[(2-{3-[(17-карбоксигептадеканоил)-карбоксиметиламино]-пропиониламино}-этилкарбамоил)-метил] [71 С, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К] Ser-FGF21
Пример 37: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1G, 71С, 102Е, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21 S-71-[(2-{3-[(17-карбоксигептадеканоил)-карбоксиметиламино]-пропиониламино}-этилкарбамоил)-метил] [71 С, 102Е, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180E, 181K] Gly-FGF21
Пример 38: Следующая дериватизация соединений FGF21 по N-концу связующими альбумина
Получение производного (Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21 N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] FQ28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, C170T] Ala-FGF21
N-концевой остаток Met в аналоге (Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21, полученном, как в целом описано в Примере 56 (SEQ ID NO:1 with Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) FGF21 и N-концевой Ala) может быть модифицирован по альфа-аминогруппе, как описано в примере 7.
Пример 39: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 102Е, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K) FGF21 S-71-[(2-{3-[(17-карбоксигептадеканоил)-карбоксиметиламино]-пропиониламино}-этилкарбамоил)-метил] [71С, 102Е, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К] Ala-FGF21
Пример 40: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К) FGF21 S-71-[(2-{3-[(17-карбоксигептадеканоил)-карбоксиметиламино]-пропиониламино}-этилкарбамоил)-метил] [71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181К] Ala-FGF21
Пример 41: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного -1А, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K, 182G-FGF21 S-71-[(2-{3-[(17-карбоксигептадеканоил)-карбоксиметиламино]-пропиониламино}-этилкарбамоил)-метил] [71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181K, 182G] Ala-FGF21
Пример 42: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е) FGF21 8-71-[([(2-{3-[(17-карбоксигептадеканоил)-карбоксиметиламино]-пропиониламино}-этилкарбамоил)-метил] [71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е], Ala-FGF21
Пример 43: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, des181K) FGF21 S-71-[(2-{3-[(17-карбоксигептадеканоил)-карбоксиметиламино]-пропиониламино}-этилкарбамоил)-метил] [71С, 121Q, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, des181K] Ala-FGF21
Пример 44: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 71С, 121Q, 143V, 145E, 146Е, 148aD, 149L, 150R, 152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, 154F, 155S, 156S, 158L, 159Е, 160Т, 161D, 163М, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е) FGF21 5-71-[(2-{3-[(17-карбоксигептадеканоил)-карбоксиметиламино]-пропиониламино}-этилкарбамоил)-метил] [71С, 121Q, 143V, 145E, 146Е, 148aD, 149L, 150R, 152Н, 153аЕ, 153bS, 153cD, 153dM, 154F, 155S, 156S, 158L, 159Е, 160Т, 161D, 163М, 166F, 167G, 168L, 169aT, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е] Ala-FGF21
Пример 45: Получение следующего производного Cys аналога FGF21
Получение производного (-1А, 28R, 56R, 59R, 69R, S71C, 102Т, 121Q, 122R, 166F, 167G, 168L, 170Т) FGF21 S-71-[(2-{3-[(17-карбоксигептадеканоил)-карбоксиметиламино]-пропиониламино}-этилкарбамоил)-метил] [28R, 56R, 59R, 69R, S71C, 102Т, 121Q, 122R, 166F, 167G, 168L, 170Т] Ala-FGF21
Пример 46: Дериватизация соединений FGF21 по N-концу связующими альбумина
Получение производного (K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21 N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] [K56R, K59R, K69R, K122R] Gly-FGF21
Производное FGF-21 было получено подобно тому, как описано в Примере 7.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20293,9. Обнаружено: 20294,2.
Пример 47: Дериватизация соединений FGF21 по N-концу связующими альбумина
Получение производного (28R, K56R, 59R, 69R, 102Т, 121Q, 122R, 168L, 179F, 180Е, 181R) Gly-FGF21 N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] [28R, K56R, 59R, 69R, 102Т, 121Q, 122R, 168L, 179F, 180Е, 181R] Gly-FGF21
Производное FGF-21 было получено подобно тому, как описано в Примере 7.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20415,1. Обнаружено: 20415,3.
Пример 48: Дериватизация соединений FGF21 по N-концу связующими альбумина
Получение производного (K56R, 59R, 69R, 122R, 168L) Gly-FGF21 N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] [K56R, 59R, 69R, 122R, 168] Gly-FGF21
Производное FGF-21 было получено подобно тому, как описано в Примере 7.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20275,9. Обнаружено: 20276,1.
Пример 49: Дериватизация соединений FGF21 по N-концу связующими альбумина
Получение производного (K56R, 59R, 69R, 122R, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181R) Gly-FGF21 N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] [K56R, 59R, 69R, 122R, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181R] Gly-FGF21
Производное FGF-21 было получено подобно тому, как описано в Примере 7.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20535,2. Обнаружено: 20535,6.
Пример 50: Дериватизация соединений FGF21 по N-концу связующими альбумина
Получение производного (K56R, 59R, 69R, 122R, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181R) Ser-FGF21 N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] [K56R, 59R, 69R, 122R, 166F, 167G, 168L, 169аТ, 171L, 172Е, 173А, 174V, 179F, 180Е, 181R] Gly-FGF21
Производное FGF-21 было получено подобно тому, как описано в Примере 7.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20565,2. Обнаружено: 20565,5.
Пример 51: Дериватизация соединений FGF21 по N-концу связующими альбумина
Получение производного (-14Е, -13Е, -12А, -11Е, -10А, -9G, -8G, -7А, -6G, -5G, -4S, -3G, -2G, -1S, K56R, 59R, 69R, 122R) FGF21 N-альфа-1-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутирил] [-14Е, -13Е, -12А, -11Е, -10А, -9G, -8G, -7А, -6G, -5G, -4S, -3G, -2G,-1S, K56R, 59R, 69R, 122R] FGF21
Производное FGF-21 было получено подобно тому, как описано в Примере 7.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 21063,6. Обнаружено: 21063,8.
Пример 52: Дериватизация соединений FGF21 по N-концу связующими альбумина
Получение производного (-5G, -4S, -3G, -2S-, 1G, K56R, 59R, 69R, 102Е, 1210, 122R, 168L) FGF21 N-альфа-1-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил] [-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, K56R, 59R, 69R, 102Е, 1210, 122R, 168L] FGF21
Производное FGF-21 было получено подобно тому, как описано в Примере 7.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20592,2. Обнаружено: 20592,9.
Пример 53: Дериватизация соединений FGF21 по N-концу связующими альбумина
Получение производного (K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21 N-альфа-1-(2-{2-[2-(16-1Н-тетразол-5-ил-гексадеканоиламино)-этокси]-этокси}-ацетил) [K56R, K59R, K69R, K122R] Gly-FGF21
10 мг (511 нмоль) (K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21 в 1,72 мл буфера подвергали обмену буфера на колонке 4 NAP-5 на буфер DPBS. Концентрация белка была определена как 2,5 мг/мл. К раствору добавляли 400 мкл 20% HPβCD (гидроксипропил-бета-циклодекстрин) и 400 мкл 10% N-ацетил-L-метионина, рН 7,5. К этому раствору добавляли 8 экв. (0,004086 ммоль) активного сукцинимидилового эфира 2-[2-(16-1Н-тетразол-5-илгексадеканоиламино)-этокси]-этокси}-уксусной кислоты в 200 мкл NMP при 7°С. Сукцинимидиловый эфир был получен с N,N-дисукцинимидилкарбонатом (CAS 74124-79-1) 1:1 в течение 20 мин. После 90 мин добавляли 4 мл охлажденного 0,2 М NaOH, и реакционная смесь стояла при 4°С в течение 30 мин. Затем добавляли 4 мл 0,2 М HCl, и рН доводили до 7,3.
Реакционную смесь фильтровали через фильтр 0,22 мкм, очищали ионообменной хроматографией и лиофилизировали, как описано в Примере 4.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20029,66. Обнаружено: 20029,82.
Пример 54: Дериватизация соединений FGF21 по N-концу связующими альбумина
Получение производного (K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21 N-альфа-1-[4-(16-1Н-тетразол-5-илгексадеканоилсульфамоил)-бутирил] [K56R, K59R, K69R, K122R] Gly-FGF21
Сукцинимидиловый эфир 4-(16-1Н-тетразол-5-илгексадеканоилсульфамоил)-масляной кислоты был получен путем растворения 139 мг 4-(16-1Н-тетразол-5-илгексадеканоилсульфамоил)-масляной кислоты и 115 мг N-гидроксисукцинимида в 1 мл DMF (нагретом под горячей водой в течение нескольких секунд). Добавляли 145 мг (3-диметиламинопропил)этилкарбодиимида гидрохлорида и смесь перемешивали в течение 20 мин при комнатной температуре. После 3,5 ч смесь наливали в 8 мл воды и центрифугировали. Супернатант удаляли и суспендирование и центрифугирование повторяли 2 раза.
10 мг (K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21 в 1,72 мл DPBS подвергали обмену буфера на DPBS, 4 мл после элюирования. Добавляли 400 мкл 10% N-ацетилметионина (рН доводили примерно до 8) и 400 мкл 20% циклодекстрина. 200 мкл раствора 330 мкг 4-(16-(тетразо-5-ил)гексадеканоилсульфамоил)масляной кислоты сукцинимидилового эфира в 1400 мкл NMP. Реакционная смесь стояла при 7°С в течение ночи. К реакционной смеси добавляли 4 мл 0,2 М NaOH при 4°С. Через 30 мин смесь нейтрализовали 3,9 мл 0,2 М HCl.
Смесь в виде раствора фильтровали через фильтр 0,22 мкм, очищали ионообменной хроматографией и лиофилизировали, как описано в Примере 4.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20033,67. Обнаружено: 20033,72.
Пример 55: Дериватизация соединений FGF21 по N-концу связующими альбумина
Получение производного (-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, K56R, 59R, 69R, 102Е, 121Q, 122R, 168L) FGF21 1N-альфа-1-[4-(16-1Н-тетразол-5-илгексадеканоилсульфамоил)-бутирил] [-5G, -4S, -3G, -2S, -1G, K56R, 59R, 69R, 102Е, 121Q, 122R, 168L] FGF21
Производное FGF-21 было получено и очищено подобно тому, как описано в Примере 54.
ЖХМС1: Теоретическая масса: 20331,94. Обнаружено: 20332,39.
Пример 56: Клонирование и экспрессия аналогов FGF21
Приведенные ниже соединения были получены и очищены, как описано в примере 2 и 3:
56а) (K56R, K59R, K69R, K122R) Gly-FGF21;
56b) (K56R, K59R, K69R, K122R, M168L) Gly-FGF21;
56с) (Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, M168L, Y179F, А180Е, S181R) Gly-FGF21;
56d) (K56R, K59R, K69R, D102E, N121Q, K122R, M168L) GSGSG-FGF21;
56e) (S71C, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) Gly-FGF21;
56f) (K56R, K59R, K69R, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181R) Ser-FGF21;
56g) (K56R, K59R, K69R, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181R) Gly-FGF21;
56h) (K56R, K59R, K69R, K122R) EEAEAGGAGGSGGS-FGF21;
56i) (S71C, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) Ser-FGF21;
56j) (S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) Gly-FGF21;
56k) (S71C, D102E, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) Gly-FGF21;
56l) (S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) Ala-FGF21;
56m) (S71C, D102E, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, S181K) Ala-FGF21;
56n) (Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21;
56o) (S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е) Ala-FGF21;
56p) (S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181 G) Ala-FGF21;
56q) (S71C, N121Q, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, desS181) Ala-FGF21;
56r) (D102N) Met-FGF21;
56s) (Q15F) Met-FGF21;
56t) (D24K) Met-FGF21;
56u (V16K) Met-FGF21;
56v) (S71C, M168I) Gly-FGF21;
56x) (S71C, M168L) Gly-FGF21;
56y) (K56R, K59R, K69R, K122R) FGF21;
56z) (N121Q)Met-FGF21;
56aa) (des N121) Met-FGF21;
56ab) (S71C) Gly-FGF21;
56ac) (P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) Met-FGF21;
56ad) (145aP, 145bM, L146V, P149E, G151E, I152D, A154R, P155G, Q156H, P157L, P158E, D159S, V160D, G161M, S162F, D164S, S167E, M168T, V169D, G170S, P171M, S172D, Q173P, G174F, R175G, S176L, P177V, S178T, Y179G, A180L, S181E, 182A, 183V, 184R, 185S, 186P, 187S, 188F, 189E, 190K) Met-FGF21;
56ae) (Q27E, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, Y179F, A180E, 8181R) Gly-FGF21;
56af) (Q15F, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, Y179F, A180E, S181R) Gly-FGF21;
56ag) (S71C, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) Gly-FGF21;
56ah) (L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181K) Ser-FGF21;
56ai) (M168A) Met-FGF21;
56aj) (M168S) Met-FGF21;
56ak) (K56R, K59R, K69R, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181R) FGF21;
56al) (M168S) Ser-FGF21;
56am) (Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, D159E, M168L, G174A, Y179F) Gly-FGF21;
56an) (K56R, K59R, K69R, K122R) EESAASGAAAGSAAA-FGF21;
56ao) (Q28R, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Gly-FGF21;
56ap) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, S181R) FGF21;
56aq) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, desS181) FGF21;
56ar) (N121D)Met-FGF21; и
56as) (A26E, K56R, K59R, K69R, D102T, N121Q, K122R, Y179F, А180Е, S181R) Gly-FGF21.
Пример 57: Клонирование и экспрессия аналогов FGF21
Приведенные ниже производные FGF21 могут быть получены и очищены подобно тому, как описано в примере 2 и 3:
57а) (Q28R, K56R, K59R, K69R, S71C, D102T, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21;
57b) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Gly-FGF21;
57с) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Ala-FGF21;
57d) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) Ser-FGF21;
57e)(K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R) FGF21;
57f) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Gly-FGF21;
57g) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ala-FGF21;
57h) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) Ser-FGF21;
57i) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, L166F, S167G, M168L, G170T) FGF21;
57j) P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ala-FGF21;
57k) (S71C, 121Q, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ala-FGF21;
57l) (S71C, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ala-FGF21;
57m) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ala-FGF21;
57n) (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ala-FGF21;
57o) (S71C, 121Q, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ser-FGF21;
57p) (S71C, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ser-FGF21;
57q) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ser-FGF21;
57r) (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) Ser-FGF21;
57s) (S71C, 121Q, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) FGF21;
57t) (S71C, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) FGF21;
57u) (K56R, K59R, K69R, N121Q, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E, V160T, G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, А180Е, des181) FGF21;
57v) (K56R, K59R, K69R, K122R, P143V, A145E, L146E, 148aD, P149L, P150R, I152H, 153aE, 153bS, 153cD, 153dM, A154F, P155S, Q156S, P158L, D159E V160T G161D, S163M, L166F, S167G, M168L, 169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E, des181) FGF21.
Пример 58: Анализ фосфорилирования Erk HEK293/beta-klotho
50
Анализ фосфорилирования Erk проводили на клетках НЕК293, которые были стабильно трансфицированы beta-Klotho человека. Стабильные клетки HEK293T/b-klotho высевали при 30000 клеток/лунка на 96-луночные планшеты. Через двое суток добавляли свежую среду и еще через 2 часа добавляли белки FGF21. Планшеты инкубировали в течение 12 минут и общее фосфорилирование ERK оценивали, используя набор для анализа AlphaScreen SureFire Phospho-ERK1/2 (Perkin Elmer, Waltham, MA) в соответствии с инструкциями изготовителя, и считывающее устройство для микропланшетов EnVision Multilabel Microplate Reader Model 2103 (Perkin Elmer) с опцией AlphaScreen HTS Turbo использовали для обнаружения сигнала. Данные представлены в виде средних +/-СКО. Значения EC определяли на основании 4-параметрического логистического нелинейного регрессионного анализа, используя программное обеспечение GraphPad Prism версия 5.02. Ссылки: Yie, J. et al.: FGF21 N- и C-termini play different roles in receptor interaction и activation, FEBS Letters 583 (2009) 19-24, и Micanovic R. et al.: Different roles of N- и С- termini in the functional activity of FGF21. J. Cell. Physiol. 2009 May; 219 (2): 227-34.
Таблица 4:
ERK
Соединение из примера №
Соединение
pERK-HEK293-Beta-klotho без HSA [ЕС<sub>50 </sub>нМ)] Медианное значение
1
A
1,6
56h
2,0
51
56n
12
56m
3,3
56l
2,0
17
3
2i
I
2,1
56af
75,0
2p
J
1,8
56as
44,0
56ae
36,0
Соединение из примера №
1 Соединение
pERK-HEK293-Beta-klotho без HSA [ЕС<sub>50 </sub>нМ)] Медианное значение
56am
15,0
56ao
1,0
56c
29,0
47
10,0
756a
V
7,4
56
3,9
53
6,4
54
4,2
56g
3,3
49
1,2
48
4,6
56ab
2,5
56k
1,8
56j
1,1
16
1,4
56ag
1,4
15
1,6
56r
,7
2h
M
1,7
56ar
1,2
56z
1,0
2a
B
nt
4
F
,9
56ac
9,5
56ad
17,0
56s
3,3
2o
1,0
56ai
100,0
2l
K
1,4
56aj
100,0
2n
3,9
2m
5,9
Соединение из примера №
Соединение
pERK-HEK293-Beta-klotho без HSA [EC<sub>50</sub> (нМ)] Медианное значение
56t
6,7
2i
N
4,7
2k
Q
2,2
2j
P
1,0
7
V
1,4
2
100,0
2e
E
3,0
5
H
1,1
6 & 12
O
1,5
13
4,8
14
2,9
56aa
1,0
56ah
1,0
56al
100,0
56f
3,8
50
2,0
56i
2,2
18
2,5
56d
6,6
55
2,0
52
11
56ap
3
56y
12,0