Способ определения интегральной антибиотикорезистентности микроорганизмов
METHOD FOR DETERMINING THE INTEGRAL ANTIBIOTIC RESISTANCE OF MICROORGANISMS

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии. Проблема антибиотикорезистентности (АР) становится с каждым днем острее [Maillard, J.Y, Bloomfield, S.F., Courvalin, P., Essack, S.Y, Gandra, S., Gerba, C.P., … & Scott, E.A. (2020). Reducing antibiotic prescribing and addressing the global problem of antibiotic resistance by targeted hygiene in the home and everyday life settings: a position paper. American journal of infection control.]. Данную проблему усугубляют такие факторы как: недостаточный контроль над использованием антибиотиков; широкое использование антибиотиков в сельском хозяйстве; проблемы экологии фарм-производства антибиотиков; развитие устойчивых штаммов бактерий в лечебных учреждениях. Для каждого отдельного фактора требуется свой способ оценки АР.
Для научного решения фундаментальных задач оценки интегральной антибиотикорезистентности (ИАР) требуется способ, который позволит учесть доминирующие параметры, влияющие на АР, такие как: процессы конъюгации, мобилизации, число детерминант в трансконъюгантах, приоритетность колонизации и относительная концентрация того или иного вида микроорганизмов.
В связи с развитием пилотируемой космонавтики, подводного флота, трансконтинентального авиасообщения возникает необходимость в оценке ИАР микроорганизмов в условиях искусственной среды обитания и в том числе гермообъектов. Специфика гермообъектов, как одной из форм искусственных сред обитания, заключается в значительном ограничении жизненного объема рассчитанного на одного человека и ограниченного числа людей находящихся в гермообъекте. Стоит отметить еще одну важную черту гермообъектов - это частично или полностью замкнутая система жизнеобеспечения. В связи с этими особенностями гермообъектов возникают особые условия для развития микроорганизмов и их ИАР.
Для медицинских целей используют фенотипический способ определения АР микроорганизмов к антимикробным препаратам, который основан на методах серийного разведения на агаре и диско-диффузионный метод. «Золотым стандартом» микробиологической диагностики АР является метод серийных разведений. Все большую распространенность приобретают автоматизированные системы культивирования микроорганизмов и определения их лекарственной чувствительности, такие как VITEK ВАСТЕС (Becton Dickinson, США), Sensititre TREK Diagnostic Systems (Thermo Scientific, США). С использованием данных систем можно получить количественную информацию об уровне устойчивости микроорганизмов к различным препаратам, однако время проведения анализа для получения данных о профиле резистентности составляет от 7 суток до нескольких недель. И в результате исследования становится известен сам факт чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, но при этом не будет известен механизм ее возникновения.
Из науки и техники известен способ: RU 2685188 С2 ДНК-чип для идентификации генетических детерминант антибиотикорезистентности возбудителей инфекций, приводящих к нарушению репродуктивных функций человека, набор олигонуклеотидов для иммобилизации на днк-чипе, характеризующийся тем, что он представляет собой матрицу из 168 ячеек, размещенных на подложке из стекла или пластика, причем матрица должна охватывать максимально возможный спектр молекулярных параметров, ассоциированных с АР.
Близкое техническое решение описано в патенте: RU 2636457 С2 Олигонуклеотидный биочип для идентификации генетических детерминант резистентности neisseria gonorrhoeae к антимикробным препаратам, набор олигонуклеотидов, используемых для иммобилизации на биочипе. Изобретения позволяют за короткое время точно определять генетические детерминанты резистентности N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам в клиническом материале.
Оба описанных выше изобретения (RU 2636457 C2, RU 2685188 C2) нацелены на определение АР строго на определенный круг микроорганизмов и расширение этого списка микроорганизмов потребует создание новых биочипов с расширенными возможностями, что в значительной степени ограничивает потенциал данных изобретений.
Существует способ оценки АР, основанный на математическом моделировании представлен в работе [D'Agata, Е.М., Webb, G, & Horn, М. (2005). A mathematical model quantifying the impact of antibiotic exposure and other interventions on the endemic prevalence of vancomycin-resistant enterococci. The Journal of infectious diseases, 192(11), 2004-2011.]. Математическая модель построена для оценки резистентности энтерококков к ванкомицину. Модель построена для условий клиники, и входящими параметрами этой модели являются 20 параметров, которые зависят от времени и используются в системе 7 дифференциальных уравнений. Сложность модели ограничивает ее применение.
Известен способ определения интегральной атибиотикорезистентности (ИАР) путем выделения ДНК бактерии из сточных вод (при предварительной вакуумной микро-фильтрации сточных вод), и определение концентрации фрагментов ДНК различных микроорганизмов отвечающих за АР [Korzeniewska, Е., & Harnisz, М. (2018). Relationship between modification of activated sludge wastewater treatment and changes in antibiotic resistance of bacteria. Science of the Total Environment, 639, 304-315.].
Недостаток его заключается в низкой чувствительности метода, что вызывает необходимость в большом объеме исходных проб (требуется исходно 1-2 литра сточных вод). Близким аналогом изобретения является способ метагеномного анализа, основанный на секвенировании, описан в статье [Hu, Y., Yang, X., Qin, J., Lu, N., Cheng, G., Wu, N., … & Zhu, B. (2013). Metagenome-wide analysis of antibiotic resistance genes in a large cohort of human gut microbiota. Nature communications, 4(1), 1-7.]. Благодаря секвенированию определяются фрагменты ДНК бактерий из кишечного микробиома отвечающие за АР. Метод ограничен тем, что необходимо постоянно обновлять базу генетических данных с целью достоверного выявления тех фрагментов ДНК бактерий, которые отвечают за АР. Помимо этого, необходимо учитывать и возможности мутаций той части ДНК бактерий, которая отвечает за АР, что требует постоянной коррекции базы данных.
Наиболее близким способом к заявленному (прототипом изобретения) является способ, включающий кластерный анализ для определения ИАР, который дает только субъективную оценку ИАР [Кузьменков, А.Ю., Младов, В.В., & Трушин, И.В. (2015). Иерархический кластерный анализ как способ интегральной оценки антибиотикорезистентности микроорганизмов. Аспирант, 2(8-2), 10-13.].
Недостатком этого известного способа является то, что он не позволяет провести комплексный анализ влияния различных внешних условий, таких как: температура, давление, состав воздуха (что особенно важно для искусственных сред обитания) и внутренних (состав микрофлоры, параметров конъюгации, мобилизации, приоритетности и числа детерминант резистентности) через определение ИАР микроорганизмов и параметров, определяющих ИАР.
Техническим результатом изобретения является возможность комплексной оценки влияния условий космического полета на интегральную антибиотикорезистентность всех микроорганизмов в пробе за счет того, что в расчет берутся все виды микроорганизмов в пробе (не только патогенные бактерии, но и условно-патогенные и даже безопасные бактерии), поскольку они способны аккумулировать и передавать свою антибиотикорезистентность болезнетворным бактериям, за счет процессов конъюгации и мобилизации.
Этот технический результат достигается тем, что в известном способе оценки влияния условий космического полета на интегральную антибиотикорезистентность (ИАР) бактерий, включающем забор биоматериала, определение показателей антибиотикорезистентности и вынесение суждения об изменении антибиотикорезистентности:
- производят забор биопроб до и после воздействия условий космического полета;
- после забора биоматериала из него выделяют входящие в пробу культуры микроорганизмов;
- в качестве показателей антибиотикорезистентности АР определяют показатели Конъюгации К; Мобилизации М; Детерминант в трансконъюгантах Д; Приоритетность колонизации П; Относительную концентрацию С грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов для каждой выделенной культуры (тот факт, что описанные выше параметры так или иначе влияют на АР бактерий, и особенно в условиях космического полета можно найти в работах [Ilyin V.K., Shumilina G.A., Solovieva Z.O., Nosovsky A.M., Kaminskaya E.V., Some characteristics of the oral cavity and teeth of cosmonauts on missions to the international space station, (2016), Aviakosmicheskaia i ekologicheskaia meditsina, 50(6), 25-30. (Rus)] и [De Boever, P., Mergeay, M., Ilyin, V., Forget-Hanus, D., Van der Auwera, G., & Mahillon, J. (2007). Conjugation-mediated plasmid exchange between bacteria grown under space flight conditions. Microgravity Science and Technology, 19(5), 138-144. https://doi.org/10.1007/BF02919469]);
- после чего производят расчет антибиотикорезистентности каждой культуры с использованием формулы для расчета:
АР=С×Д×П×(М+К)
с последующим определением интегральной величины антибиотикорезистентности микроорганизмов всех культур путем раздельного суммирования величин антибиотикорезистентности каждой культур до и после воздействия условий космического полета, а оценку влияния условий космического полета на интегральную антибиотикорезистентности (ИАР) бактерий производят путем сравнения полученных интегральных величин антибиотикорезистентности микрорганизмов до и после воздействия условий космического полета и при статистически значимом снижении или повышении этого интегрального показателя, после воздействия условий космического полета, выносят суждение соответственно об уменьшении или увеличении интегральной антибиотикорезистентности бактерий.
Способ осуществляют следующим образом
1. Производят забор биоматериала до и после воздействия условий космического полета.
2. Из полученных проб, известными методами, производят раздельное выделение всех культур микроорганизмов.
3. Производят определение для каждой выделенной культуры таких параметров как:
Конъюгации К;
Мобилизации М;
Детерминант в трансконъюгантах Д;
Приоритетность колонизации П;
Относительную концентрацию С бактерий.
4. После чего производят расчет антибиотикорезистентности АР для каждой культуры микроорганизмов по формуле
АР=С×Д×П×(М+К)
5. Далее суммируя значения АР по каждому из исследуемых видов микроорганизмов получают интегральную антибиотикорезистентность микроорганизмов (ИАР) взятой биопробы.
6. Затем производят сравнение полученных интегральных величин до и после космического полета, и при наличии статистически значимого снижения или повышения интегрального показателя после воздействия условий космического полета выносят суждение соответственно об уменьшении или увеличении интегральной антибиотикорезистентности микроорганизмов в биопробе.
Пример
Заявленным способом было проведено определение влияния условий космического полета на интегральную величину антибиотикорезистентности.
1. Произвели забор биоматериала - мазок с поверхности слизистых носа у космонавтов до и после полета в космос.
2. Из полученных проб, известными методами, произвели раздельное выделение всех культур микроорганизмов.
3. Произвели лабораторное определение для каждой выделенной культуры микроорганизмов таких параметров как (см. таблицы 1 и 2):
Конъюгация К;
Мобилизация М;
Детерминант в трансконъюгантах Д;
Приоритетность колонизации П;
Относительную концентрацию С.
4. После чего произвели расчет антибиотикорезистентности АР для каждой культуры микроорганизмов по формуле
АР=С×Д×П×(М+К)
5. Далее, суммируя значения АР, по каждому из исследуемых видов бактерий получают интегральную антибиотикорезистентность микроорганизмов (ИАР) взятой биопробы.
6. Затем произвели сравнение полученных интегральных величин до, и после космического полета. По результатам сравнения было статистически достоверно показано уменьшение ИАР микроорганизмов в условиях космического полета.
Краткое описание таблиц
Таблица 1. Лабораторно измеренные параметры Конъюгация К; Мобилизация М; Детерминанты в трансконъюгантах Д; Приоритетность колонизации П; Относительная концентрация С грамположительных или грамотрицательных микроорганизмов, до полета в космос.
Таблица 2. Лабораторно измеренные параметры Конъюгация К; Мобилизация М; Детерминанты в трансконъюгантах Д; Приоритетность колонизации П; Относительная концентрация С грамположительных или грамотрицательных микроорганизмов, после полета в космос.
Из таблиц видно, что значение ИАР, найденное заявленным способом, после космического полета было равно 0,023. До космического полета значение ИАР, найдено таким же образом, составляло 0,049. Это означает, что ИАР под действием космических условий уменьшилась в 2,13 раза по сравнению с до-полетным значением. Полученная, с помощью заявленного способа, оценка ИАР до полета и после космического полета позволила выявить заметное (статистически значимое) снижение АР микроорганизмов (2,13 раза), что позволяет дать благоприятный прогноз об эффективности использования антибиотиков в условиях длительных космических полетов, поскольку микроорганизмы становятся более чувствительными к антибиотикам (2,13 раза).
Полученные из исследуемой пробы, лабораторным способом значения бактериальной концентрации, приоритетности колонизации, конъюгации, мобилизации, числа детерминант в трансконъюгантах отражают различные аспекты (механизмы) формирования АР и при разных внешних условиях могут иметь различные значения. Если сравнивать эти значения между собой, в большинстве случаев будет наблюдаться разная динамика, что не позволяет сделать вывод о влиянии внешних факторов на АР опираясь только на конкретные параметры. По этой причине был заявлен данный способ, поскольку он позволяет интегрально (по всей совокупности параметров определяющих АР) оценивать ИАР и оценивать влияние внешних факторов на ИАР. Численные значения: бактериальной концентрации, приоритетности колонизации, конъюгации, мобилизации, числа детерминант в трансконъюгантах и найденное значение АР и ИАР - имеют значение при соответствующем сопоставлении между собой.
Стоит заметить, что в микробиологии каждый из перечисленных выше параметров (найденных экспериментально) обсуждается отдельно, в заявленном способе влияние всех перечисленных выше параметром учитывается в ИАР. Даже если параметры, определяющие АР, имеют разнонаправленный характер изменений.
Сущность, достигаемого технического результата заключается в определении ИАР, при этом формируется понимание, за счет каких факторов ИАР приобретает найденное значение. Поскольку на ИАР может влиять как процессы конъюгации или мобилизации, так и число детерминант в трансконъюгантах, приоритетность колонизации и относительная концентрация того или иного вида микроорганизмов. Предлагаемый способ дает широкие возможности для комплексного понимания формирования ИАР и влияния внешних и внутренних факторов на ИАР, что особенно ценно при проведении различных научно-практических работ и исследований.
В стандартных медицинских анализах достаточен сам факт наличия патогенных бактерий и это условие для начала лечения с использованием антибиотиков. В совокупности, заявленный способ определения ИАР является наиболее объективным
Способ подходит как для стандартного медицинского применения, так и для фундаментальных научных исследований, направленных на всестороннюю оценку ИАР и влияния внешних и внутренних условий (к внешним условиям можно отнести: уровень радиации, невесомость, атмосферное давление, состав атмосферы, влажность, температура и др., а к внутренним условиям можно отнести - состав микрофлоры) на ИАР.
Особенностью использования заявленного изобретения является возможность легко менять и адаптировать дизайн исследования по определению ИАР. Под понятием дизайн эксперимента применительно к понятию антибиотикорезистентности мы понимаем возможность использовать любые микробиологические пробы (с любых поверхностей), а так же моделирование внешних условий, способных повлиять на АР микроорганизмов.
Заявленный способ применим для различных типов проб, взятых при различных внешних условиях, для различных биотопов, для различного числа изучаемых антибиотиков и микроорганизмов и с минимальным объемом пробы.
Заявленный способ отвечает современным международным требованиям всестороннего изучения АР [Beloeil, Pierre Alexandre. "Борьба с устойчивостью к антибиотикам с позиций безопасности пищевых продуктов в Европе." (2011). Бюллетень ВОЗ.]. Одно из требований ВОЗ - это интегральная оценка антибиотикорезистентности. На данный момент, только заявленный способ оценки ИАР, на основе которого можно было бы делать объективные выводы об изменениях ИАР.