Биотехнологические методы тестирования стоматологических имплантационных материалов

3. Основы компьютерной биостатистики / Ю. Е. Лях, В. Г. Гурьянов, В. Н. Хоменко, О. А. Панченко - Д., 2006.- 211 с.

4. Berridge M. G. Calcium- a life and death signal / Berridge M. G., Bootman M. D., Lipp P. // Nature. - 1998. - Vol. 395.- P.645-648.

5. Capeau J. Insulin signaling: mechanisms altered in insulin resistance / Capeau J. // Med. Sci. - 2005. -Vol. 21. - P. 34-39.

6. Chakraborty C. Biochemical and molecular basis of insulin resistance / Chakraborty C. // Curr. Protein Pept. Sci.- 2006. - Vol. 7, N 2.- P. 113-121.

7. Dinh T.L. A review of the mechanisms implicated in the pathogenesis of the diabetic foot / T. L. Dinh, A. A. Veves // Int. J. Low Extrem. Wounds. - 2005; № 4. - Р. 154 -159.

8. Hu X. In silico modeling of protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors with cellular activity //Bioorg Med Chem Lett.- 2006.- Vol. 16, № 24.- P. 6321-6327.

9. Hunter T. Tyrosine phosphorilation: past, present and future / T. Hunter // Biochem. Soc. Trans.- 1996,-Vol. 24, Pt. 2.- P. 307-327

10. Lobmann R. Molecular fundamentals of wound healing in diabetic foot syndrome / Lobmann R., Schultz G., Lehnert H. // Med. Klin. - 2003. - Vol. 98. - P.292 -301.

11. Ogawa W., Kasuga M. Insulin signaling and pathophysiology of type 2 diabetes mellitus / Ogawa W., Kasuga M. // Nippon Rinsho.- 2006.- Vol. 64, N 7.- P. 1381-1389.

РЕЗУЛЬТАТ РАНОВОГО ПРОЦЕСУ ЗА УМОВ ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ 2 ТИПУ - РОЛЬ ТИРОЗИНО-ВОГО ФОСФОРИЛЮВАННЯ БІЛКІВ В КЛІТИНАХ Барінова М.Е.

C метою з'ясування ролі тирозинового фосфорилювання білків в гоєнні ран стопи за умов цукрового діабету проведено оцінку тирозинкіназ (ТЗК) і тирозинфосфатаз (ТЗФ) тромбоцитів в тесті in vitro, а також CD45+ клітин в шкірі у 56 пацієнтів з синдромом діабетичної стопи (СДС) під час госпіталізації, на 3-5, 10-14 і 30 добу лікування. Показано, що розвиток СДС відбуваєтсяь на тлі пригнічення ТЗК та стимуляції ТЗФ в тромбоцитах, лімфоцитах, макрофагах, нейтрофілах та клітинах Лангерганс епідермісу. Виразність та тривалість гіперекспресії ТЗФ були асоційовані з глибиною деструкції та дизрегенераторних змін всіх тканин шкіри. Загоєння ран шкіри супроводжувалося пригніченням активності ТЗФ (на 3-5 добу) і підвищенням активності ТЗК (з 10-14 доби) тромбоцитів, що було асоційоване з розрішенням запалення та розвитком грануляційної тканини в рановому дефекті.

Ключові слова: цукровий діабет, загоєння ран, тирозинкінази, тирозинфосфатази.

RESULT OF WOUND HEALING AT 2nd TYPE DIABETES MELLITUS - THE ROLE OF TYROSINE PHOSPHORYLATION IN CELLS Barinova M. E.

To estimate the role of tyrosine phosphorylation in wound healing at diabetes mellitus the estimation of tyrosinkinases and tyrosinphosphatases activity in platelets was performed parallel with quantification of CD45+ cells in skin of 56 patients with diabetic foot syndrome (DFS) during hospitalisation, at 3-5, 10-14 and 30 days of therapy. It was shown, that DFS is related with inhibition of tyrosine kinases and hyperstimulation of tyrosine phosphatases in platelets, lymphocytes, neutrophils, macrophages and Langerhance cells of epidermis. Degree and duration of tyrosine phosphatases stimulation were associated with deepness of destruction and disregeneration of all skin tissues. Wound healing was accompanied by inhibition of tyrosinphosphatase activity at 3-5 day and stimulation of tyrosinkinase activity at 10-14 day of therapy, which were associated with resolution of inflammation and granulations development in wound region.

Key words: diabetes mellitus, wound healing, tyrosine kinases, tyrosine phosphatases.

УДК 616.314-74-089.843-078

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ТЕСТИРОВАНИЯ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИХ

ИМПЛАНТАЦИОННЫХ МАТЕРИАЛОВ

А.П. А.П.

(////////////////////////Л

Фрагмент НИР МЗ Украины «Оптимизация регенерации костной ткани путём комплексного лечения с включением тканевой и клеточной терапии», № госрегистрации 0103и007860.

Новым и перспективным является метод восстановления костных дефектов с использованием клеточных и тканевых технологий [2, 3]. Активно ведутся научные

разработки по использованию остеогенных прогениторных клеток путём их забора у пациента, культивации in vitro до нужного объёма и подсадки к месту дефекта. Известно, что успех клеточной трансплантации при восстановлении дефектов костной ткани зависит от количества клеток в переносимой суспензии, условий костной раны, степени адгезии и жизнеспособности клеточного пула в переносимой композиции и в условиях раны. Немаловажным фактором успеха является правильный выбор носителя для культуры [1].

Для восполнения объёма костных дефектов, в качестве клеточных носителей предлагается использовать всевозможные объёмные структуры - волокнистые пористые материалы на основе коллагена синтетических биополимеров; гидрогели и материалы на основе гидроксиаппатита или биостекла [4, 8, 9]. На сегодняшний день существует большой перечень таких материалов.[6]. Однако, залогом успеха является выбор оптимального носителя для культуры [5, 7]. В данной связи имеется потребность как в оценке остеотропного материала быть носителем культуры клеток, так и совершенствованию методик отбора существующих препаратов для этих целей.

Целью работы была отработка методики тестирования имплантологических материалов, используемых в стоматологической практике для восстановления костной ткани и отбор материала, пригодного для переноса стволовых клеток в рану.

Материал и методы исследования. Для достижения целей нашей работы проведено исследование в ходе которого на первом этапе отработана методика тестирования остеопластического материала на совместимость с культурой клеток, на втором этапе - проверка транспортного потенциала отобранного нами материала. Изучения данной проблемы осуществилялось в специализированных условиях боксов Лаборатории клеточного и тканевого культивирования ИНВХ им. Г.К.Гусака.

Для скрининга были взяты следующие материалы. Bas-HA -синтетическая нерезорбируемая керамика на основе фосфата кальция, гранулы размером 0,3 мм. Hypro -sorb F -рассасываемая аттело-коллагеновая мембрана (двуслойная), производимая из высокоочищенного несетевого биополимера, коллагена 99,9% лиенных телопептидов. Дизайн мембраны выполнен таким образом, что одна сторона (гладкая) должна иметь направление к надкостнице, а шероховатая - к костной ране. Коллапан-Л - препарат для восстановления костной ткани, профилактики и лечения гнойных осложнений, состоящий из искусственного гидроксиапатита, коллагена и линкомицина. Fortoss «Vital» синтетический ß-3-кальций фосфат (ß-ТСР) с гидроксил сульфатной матрицей.

Перед подсадкой клеток остеотропный материал готовили для рецепиенции. Для этого материал Bas-HA (гидроксилапатит), Hypro-sorb F (двуслойная атело-коллагеновая мембрана) и Коллапан-Л (коллаген с гидроксилапатитом) смачивали в 0,9% растворе NaCl. Культуру ФФ на Hypro-sorb F подсаживали как на гладкую, так и на шероховатую поверхность. «Витал» (ß-3-кальций фосфат) замешивали с прилагаемой жидкостью согласно инструкции к применению. Для проведения эксперимента использовали клеточную культуру фибробластов, полученную из одного 7-дневного эмбриона. Эмбрион помещали в консервант, содержащий питательную среду и антибиотик, и доставляли в Лабораторию клеточного и тканевого культивирования. Материал забирался в условиях операционной в стерильный стеклянный сосуд с питательной средой, содержащей антибиотик. В лабораторных условиях фрагменты ткани подвергались ферментативной обработке, суспензию клеток пипетировали и центрифугировали.

Культивирование проводили в СО2-инкубаторе при температуре 37°С и 5% СО2, до образования монослоя, затем культуру переводили в суспензию путём обработки трипсином

0,25% в растворе Versen (ЭТС) 1:5. При этом концентрация клеток в суспензии доводили до 1,5 млн. в 1 мл. Стандартизированную концентрацию клеток в объёме 5 мл вносили в культуральную посуду со стандартизированным количеством остеотропного материала. Для объективизации исследования в каждой изучаемой группе проводили по 5-ть опытных посевов, а так же культивирование в 2-х контрольных пробирках (без внесения остеотропного материала). Группы, в зависимости от исследуемого материала, распределились следующим образом (таблица 1). Культивирование проводили в стандартных условиях при температуре 37°С и 5% СО2 в течение 7-и суток. Количественную оценку проводили визуально, с использованием флуоресценции на микроскопах LEICA DM IL и LEICA DM LS при увеличении х100, путём подсчёта свечения

маркированных (окрашенных) клеток в поле зрения при стандартизированных параметрах видеозахвата изображения с помощью программного обеспечения рабочей станции LEICA Q500/550/Win. Подсчёт производили в 10 полях зрения по диагонали объекта с определением средних величин.

Таблица 1

Распределение по группам в зависимости от исследуемого материала

№группы Остеотропный материал Количество пробирок

1. Баэ-НА 5 Опыт

2. р-3-кальций фосфат 5

3. Коллапан-Л 5

4. Нурго^огЬ F (гладкая поверхность) 5

5. Нурго^огЬ F (шероховатая поверхность) 5

6. Культура ФФ без остеотропного материала 2 Контроль

После оценки результатов микроскопии отбирали материал, пригодный для культивирования.

На втором этапе - отобранные носители с культурой ФФ были пересажены на пустую лунку с сохранением условий культивации. Контроль витальности определялся микроскопически, на 3-е, 5-е и 8-е сутки последующего культивирования. По степени роста клеток на пустых лунках с клеточно-остеопластическим композитом определяли возможность использования такового для транспорта стволовых клеток в рану.

Результаты исследования и их обсуждение. Микроскопия исследуемых на первом этапе материалов на 7-е сутки дала следующие результаты (табл. 2).

Таблица 2

Результаты культивирования культуры ФФ на остеотропных материалах

№ груп- пы Остеотропный материал Среднее количество клеток, M±m, кл./п.з. Среднее количество колоний, M±m, кол./п.з. Форма клеток

1. Bas-HA - - -

2. ß-3-кальций фосфат 2,5 ± 1,4 - округлые

3. Коллапан-Л 29 ± 5,2 1,5 ± 0,5 округлые

4. Hypro-sorb F (гладкая повер-ть) 57,1 ± 17,2 2,4 ± 1,3 округлые

5. Hypro-sorb F (шероховатая поверхность) 76,3 ± 38,8 10,6 ± 8,5 вытянутые

6. Контроль

В I-й исследуемой композиции (Bas-HA + культура ФФ) флюорисценции клеток и, соответственно, их пролиферации, не выявлялось, то есть, экспозиция культуры с Bas-HA показала отсутствие адгезии и пролиферации клеток ФФ крыс на данном материале (рис. 2).

Результаты колонизации II-й композиции («Витал» + культура ФФ) показали, что материал в присутствии питательной среды распадался на взвесь микрогранул, культура фибробластов подвергалась апоптозу в связи с отсутствием адгезии (рис. 3).

Микроскопия III-го композиции (Коллапан-Л+культура ФФ) показала наличие свечения, характерного для одиночных витально окрашенных клеток, средний показатель которых составил 29 клеток в 1-ом поле зрения (кл./п.з.). Признаков колонизации клеток практически не отмечалось - 1-2 колонии в 1-ом поле зрения (кол./п.з.), фибробласты были округлой формы. Таким образом, культивирование клеток на данном материале позволяет судить об адгезии клеток на материал, но слабо выраженной пролиферации и дифференциации их (рис. 4).

Культивирование в IV-ой группе

Рис. 1. Микст культура ФФ крысы. Окраска PKH 67 Green и PKH 26 Red. Ув. х100.

Рис. 2. Гранула Bas-HA в лучах флюорисцентного микроскопа. Ув. хЮО.

Рис. 3. Материал «Витал» в лучах Рис. 4. Культура ФФ крыс на Коллапане-Л в

флюорисцентного микроскопа. Ув. х100. лучах флюорисцентного микроскопа. Ув. х100.

Культивирование в V-ой (Hypro-sorb F +культура ФФ на шероховатой поверхности) показала множественное свечение фибробластов - 76 кл./п.з. (в некоторых полях зрения количество клеток превышало 100 кл./п.з.). Клетки ФФ располагались преимущественно группами - 11 кол./п.з., в большом количестве; имели вытянутую форму, близкую к зрелому фибробласту. Таким образом, культивирование на шероховатой поверхности мембраны Hypro-sorb F показало, что у фибробластов возникает хорошая адгезия на данном материале, способствующая их пролиферации и дифференцировке (рис. 6).

Культивирование в VI (контрольной) группе показало множественный рост в культуральной посуде. Культура фибробластов вновь образовывала монослой. Их форма соответствовала исходной форме ФФ (рис.1).

Рис. 5. Культура ФФ крыс на гладкой Рис. 6. Культура ФФ крыс на гладкой

поверхности Hypro-sorb F в лучах флюорисцентного поверхности Hypro-sorb F в лучах флюорисцентного

микроскопа. Ув. х100. микроскопа. Ув. х100.

Рис 7.

Культура ФФ крыс на Коллапане-Л (слева) и Нурго-БогЬ F (справа) в лучах рассеянного света на момент

пересадки в чистую лунку, увеличение х100.

Рис 8.

Культура ФФ крыс на Коллапане-Л (слева) и Нурго-БогЬ F (справа) в лучах рассеянного света на 3-е сутки культивирования в пустой лунке,

увеличение х100.

Рис. 9. Культура ФФ крыс на Коллапане-Л (слева) и Нурго-БогЬ F (справа) в лучах рассеянного света на 8-е сутки культивирования в пустой лунке, увеличение х100.

Наблюдения на втором этапе показали, что образцы носителей с ФФ после отмывки (рис.7), взятые для последующего культивирования на чистой лунке, показали визуальный рост культуры ФФ уже на 3-е сутки, в виде отдельных скоплений фибробластов у края носителя и формирования «дорожек» (рис.8). На 3-е, 5-е и 8-е сутки наблюдалась миграция клеток на лунку их адгезия и пролиферация. На 8-е сутки культура ФФ, мигрировавшая с носителей, образовывала монослой и выполняла всё поле зрения (рис.9). Рост культуры клеток ФФ на пустую лунку с носителя позволяет судить о том, что носитель содержал активную жизнеспособную клеточную культуру, способную к пролиферации в ране.

Полученную культуру клеток ФФ крыс на носителях использовали при подсадке в экспериментальную рану для изучения предлагаемого нами способа.

1. Материалы Bas-HA и «Витал» не пригодны для переноса клеток, так как культивирование их показало, что адгезия и пролиферация фибробластов на них не наступает.

2. Материалы Коллапан-Л и Нурго^огЬ Р пригодны для адгезии и дальнейшего культивирования и транспортировки культуры стволовых клеток в область подсадки.

3. Культивирование фетальных фибробластов крыс на остеотропных материалах Коллапане-Л и Нурго^огЬ Р после переноса на чистые лунки дают активный рост. Таким образом, культуру клеток на данных носителях можно использовать при подсадке в экспериментальную рану для изучения предлагаемого нами способа оптимизации регенераторного процесса в кости.

1. Астахова В. С. Вивчення властивостей матеріалів, які застосовуються в імплантології / В. С. Астахова, В. О. Маланчук, Л. М. Панченко // Стоматологічна імплантологія. Остеоінтеграція. Матеріали другого Українського міжнародного конгресу. - Київ, 2006. - С. 28-30.

2. Берсенёв А. В. Клеточная трансплантология - история, современное состояние и перспективы / А. В. Берсенёв // Клеточная трансплантология и тканевая инженения.- 2005.- №1.- С.49-56.

3. Волков А. В. Тканевая инженения: новые перспективы развития медицины / А. В. Волков // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.- 2005. - №1.- С.57-63.

4. Камалов Р. Х. Досвід використання остеотропних матеріалів в стоматологічній імплантології / Р. Х. Камалов, В. В. Коваленко, І. С. Сухан // Стоматологічна імплантологія. Остеоінтеграція. Матеріали другого Українського міжнародного конгресу. - Київ, 2006. - С.35-37.

5. Лысенок Л. Н. Клеточные аспекты замещения дефектов костной ткани стеклокристаллическими матеріалами / Л. Н. Лысенок // Клиническая имплантология и стоматология. - 2001. - № 3-4. - С. 109-111.

6. Опанасюк И. В. Костнопластические материалы в современной стоматологии / И. В. Опанасюк, Ю. В. Опанасюк // Современная стоматология. - 2002.- №3.- С.101

7. Применение костнопластического материала как носителя аутологичных стволовых клеток кролика для замещения костного дефекта челюсти / В. И. Куцевляк, В. Ф. Куцевляк, Ю. Е. Микулинский, Е. А. Щегельская // Стоматологічна імплантологія. Остеоінтеграція. Матеріали другого Українського міжнародного конгресу. - Київ, 2006. - С.72-84.

8. Development and in vitro characterisation of novel bioresorbable and bioactive composite materials based on polylactide foams and Bioglass for tissue engineering applications / Roether J.A., Boccaccini A.R., Hench L.L. [at al.] // Biomaterials. - 2002. - V. 23, N 18. - P. 3871-3878.

9. Marrow cell induced osteogenesis in porous hydroxyapatite and tricalcium phosphate: a comparative histomorphometric study of ectopic bone formation / Ohgushi H., Okumura M., Tamai S. [at al.] // J. Biomed. Mater. Res. - 1990. - Vol. 24, N 12. - P. 1563-1570.

БІОТЕХНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ТЕСТУВАННЯ СТОМАТОЛОГІЧНИХ ІМПЛАНТАЦІЙНИХ МАТЕРІАЛІВ Брашкин а.П.

Відпрацьована методика тестування матеріалів, використовуваних в стоматологічній практиці, для відновлення кісткової тканини і відбір матеріалу, придатного для перенесення стволових клітин в рану. Культивування фетальных фібробластів щурів на остеотропных матеріалах Коллапане-Л і Hypro-sorb F дають активне зростання. Таким чином, культуру кліток на даних носіях можна використовувати при підсадці в експериментальну рану для вивчення пропонованого нами способу оптимізації регенерат-торного процесу в кістці.

Ключові слова: фетальні фібробласти щурів, культивація, експериментальна рана.

BIOTECHNOLOGICAL METHODS OF TESTING OF STOMATOLOGICAL MATERIALS FOR IMPLANTATION Brashkin A.P.

The method of testing of materials, in-use in stomatological practice is exhaust, for renewal of bone issue and selection of material, suitable for the transfer of barrel cages in a wound. Cultivation of fetal rats’ fibroblasts on osteotrophic materials of Kollapane-l and Hypro-sorb F is given active growth. Thus, culture of cells on these transmitters it is possible to use for implantation in an experimental wound for the study of the method of optimization of regenerator process offered by us in a bone.

Key words: fetal rats’ fibroblasts,

cultivation, experimental wound.

УДК 611.611: 611 -018+611 -013. 7/8

ОСОБЕННОСТИ БИОСИНТЕЗА И ГИСТОТОПОГРАФИИ КОЛЛАГЕНОВ I, II, III И IV ТИПОВ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ВОЛОКНИСТОГО КАРКАСА ПЕРВИЧНОЙ И ОКОНЧАТЕЛЬНОЙ

ПОЧЕК У ЭМБРИОНОВ ЧЕЛОВЕКА

Значение соединительной ткани для функции каждого органа очень велико. Для объединения отдельных структурно-функциональных элементов в целостную конструкцию органа огромное значение имеет соединительнотканная строма [2]. Она разнообразна в