Филогенетическое положение галотолерантного штамма Brevibacterium sp. U1, выделенного из засоленной почвы, в системе рода Brevibacterium

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2019 БИОЛОГИЯ Вып. 4

ГЕНЕТИКА

УДК 579.871.8

DOI: 10.17072/1994-9952-2019-4-459-463. Л. Н. Ананьина

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН - филиал ПФИЦ УрО РАН, Пермь, Россия

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ ГАЛОТОЛЕРАНТНОГО ШТАММА BREVIBACTERIUM SP. U1, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ЗАСОЛЕННОЙ ПОЧВЫ, В СИСТЕМЕ РОДА BREVIBACTERIUM

Исследовано филогенетическое положение галотолерантного штамма Brevibacterium sp. U1, выделенного ранее из почвы района промышленной соледобычи (г. Березники, Пермский край), в системе рода Brevibacterium на основе анализа нуклеотидных последовательностей ect-генов, кодирующих ферменты биосинтеза осмопротекторного вещества - этоина, и 16S рДНК. Анализ нуклеотидных последовательностей генов ectB и ectC согласовался с результатами анализа 16S рДНК. Однако было выявлено значительное эволюционное расстояние нуклеотидных последовательностей ectC-гена штамма Brevibacterium sp. U1 от филогенетически близкородственного вида B. aurantiacum.

Ключевые слова: Brevibacterium; 16S рДНК; ect-гены; филогения.

L. N. Anan'ina

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch RAS, Perm, Russian Federation

PHILOGENETIC STATUS OF THE HALOTOLERANT STRAIN BREVIBACTERIUM SP. U1, ISOLATED FROM SALINE SOIL, IN THE BREVIBACTERIUM GENUS SYSTEM

The position of the previously isolated from the soil of the industrial salt production area halotolerant strain Brevibacterium sp. U1 in the system of the genus Brevibacterium was studied based on the analysis of the nucleotide sequences of ect-genes encoding the biosynthesis enzymes of the osmoprotective substance, ectoine, and the 16S rDNA. Phylogenetic analysis of the nucleotide sequences of the ectB and ectC genes was consistent with the results of the analysis of 16S rDNA. However, a significant evolutionary distance of the nucleotide sequences of the ectC gene of the strain Brevibacterium sp. U1 from phylogenetically closely related species B. aurantiacum was observed.

Key words: Brevibacterium; 16SrDNA; ect-genes; phylogeny.

Представители рода Brevibacterium семейства Brevibacteraceae класса Actinobacteria, выделены из молокосодержащих продуктов, включая сыры, встречаются у людей и птиц в качестве комменсалов или условно-патогенных микроорганизмов; населяют морские и почвенные экосистемы [Ivanova et al., 2004]. Особое внимание исследователи уделяют ассоциированным с созреванием сыра бревибактериям. Поскольку в процессе производства сыров их поверхность солят или погружают в насыщенный рассол, изучена осмоадапация бревибактерий к условиям высокой осмолярности внешней среды. На примере био-технологически значимого вида B. linens было показано, что преобладающим осмопротектором является эктоин [Bernard et al., 1993].

Последующее изучение геномов представителей рода Brevibacterium показало наличие генов,

кодирующих биосинтез эктоина у большинства исследованных видов, за исключением видов, ассоциированных с человеком ^ат et а1., 2017]. В других работах выявлена колинеарность эволюционных расстояний между нуклеотидными последовательностями 16S рДНК и аминокислотными последовательностями ферментов синтеза эктоина близкородственных организмов (эволюционное расстояние менее 0.15) [Cai et а1., 2011; Widderich et а1., 2014].

Ранее из почвы района солеразработок Верхнекамского месторождения солей был выделен гало-толерантный грамположительный бактериальный штамм и1, способный к активному росту по сравнению с другими исследованными в этой работе штаммами в полноценной среде Раймонда в присутствии 12%-ного №С1. На основе морфологиче-

© Ананьина Л. Н., 2019

ских характеристик штамм был отнесен к роду Brevibacterium [Плотникова и др., 2006].

Цель настоящей работы - определение филогенетического положения штамма Brevibacterium sp. U1 в системе рода Brevibacterium на основе анализа последовательностей 16S рДНК и генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина.

Материалы и методы исследования

Объекты исследования

Brevibacterium sp. U1 был выделен из почвы района солеразработок Верхнекамского месторождения солей [Плотникова и др., 2006].

Среды и условия культивирования

Минеральная среда Раймонда (г/л деионизиро-ванной воды): NH4NO3 - 2.0, MgSO4 х 7H2O - 0.2, KH2PO4 - 2.0, Na2HPO4 - 3, CaCl2 х 6H2O - 0.01, Na2CO3 - 0.1, pH - 7.0 [Raymond, 1961].

Агаризованная богатая среда Раймонда следующего состава (г/л среды Раймонда): триптон - 5, дрожжевой экстракт - 2.5, NaCl - 30, агар - 15.

Культивирование штамма проводили на агари-зованной богатой среде Раймонда в термостатиру-емом шкафу ТС-1/80 СПУ (Россия) при температуре 28оС.

Молекулярно-генетические и

биоинформационные методы исследования

Геномную ДНК из бактериальных клеток выделяли SDS-CTAB методом [Wilson, 1995].

С препаратов ДНК амплифицировали фрагмент гена 16S рРНК согласно методике, описанной ранее [Anan'ina et al., 2011].

Амплификацию и детекцию ect-генов на матрице ДНК выполняли, используя систему прайме-ров G2F/G2R согласно протоколу, описанному в статье [Ананьина, Шестакова, Плотникова, 2018].

Секвенирование генов проводили с помощью соответствующих праймеров и Big Dye Terminator Ready Reaction Kit v3.1 («Thermo Fisher Scientific», «Fisher Scientific», США), следуя инструкциям фирмы-производителя на приборе Genetic Analyzer 3500xl в лаборатории молекулярной биологии и генетики при кафедре ботаники и генетики растений ПГНИУ.

Биоинформационное обеспечение

Сервис публичной базы данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) - Blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Пакет программ Mega v. 5.0, позволяющий выравнивать нуклеотидные последовательности, рассчитывать эволюционные расстояния с последующим графи-

ческим представлением результатов.

Результаты и обсуждение

Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК длиной 1425 п.н. штамма Brevibacterium sp. U1 с помощью программы Blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) выявил высокий уровень сходства с нуклеотидными последовательностями генов представителей рода Brevibacterium, что подтвердило результат предварительной идентификации штамма на основе мор-фо-физиологических характеристик. На филогенетическом дереве штамм входил в кластер Brevibacterium sensu stricto, формируя подкластер с видами B. aurantiacum и B. antiquum, уровень сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК составил 99.29 и 97.8%, соответственно. Следует отметить, что уровень 16S рДНК сходства между видами кластера Brevibacterium sensu stricto находился в пределах 93.5-99.2%. Максимальное значение сходства 99.2% отмечено между видами B. linens и B. iodinum. Таким образом, уровень сходства штамма Brevibacterium sp. U1 и представителя вида B. aurantiacum сопоставим с межвидовым для группы Brevibacterium sensu stricto (рис. 1). Кроме того, типовой штамм вида B. aurantiacum VKM Ac-2111T был выделен из сыра сорта Camambert (http://www.vkm.ru/Catalogue.htm). Современное исследование показало доминирование представителей вида B. aurantiacum в пяти различных сырах, созревающих в рассоле [Cogan et al., 2014]; в то время как исследуемый штамм Brevibacterium sp. U1 был выделен из засоленной почвы, загрязненной отходами соледобывающего предприятия [Плотникова и др., 2006]. Принимая во внимание вышесказанное, становится очевидной необходимость дополнительного исследования для уточнения таксономического (филогенетического) положения штамма Brevibacterium sp. U1 с применением других генов.

Использование разработанной нами ранее системы праймеров [Ананьина, Шестакова, Плотникова, 2018] позволило получить ПЦР-продукт ожидаемой длины около 800 п.н., включающий фрагменты ectB- и ectC-генов, на ДНК-матрице исследуемого штамма Brevibacterium sp. U1. Предварительный скрининг в публичных базах данных нуклеотидной последовательности фрагмента ect-оперона с помощью программы Blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) выявил его гомологию с ect-генами бактерий рода Brevibacterium.

В настоящее время только у 6 из 15 видов группы Brevibacterium sensu stricto представлены нуклеотидные последовательности ect-генов в публичной базе данных Национального центра биотехнологической информации США. Уровни сход-

ства нуклеотидных последовательностей ectB-и ectC-генов типовых штаммов видов группы Brevibacterium sensu stricto находились в пределах 64.2-93.2 и 74.6-97.6%, соответственно. Результаты свидетельствуют о более высоком уровне дивергенции ect-генов по сравнению с геном 16S рРНК (рис. 2а, б). При этом ectC-ген имел меньшие значения эволюционного расстояния между видами группы Brevibacterium sensu stricto, чем ectB-ген (рис. 2а, б). Наиболее высокий уровень сходства нуклеотидных последовательностей ectB-и ectC-генов, 97.3 и 94.3%, соответственно, исследуемый штамм проявил с видом B. aurantiacum (рис. 2а, б). Примечательно, что значение сходства нуклеотидной последовательности ectB-гена штамма U1 было выше уровня межвидового сход-

ства. В то время как для ectC-гена это значение находилось в вычисленном интервале, а на филогенетическом дереве штамм формировал отдельную ветку в группе B. aurantiacum/ B. antiquum (рис. 2б). При этом положение видов относительно друг друга в кластере Brevibacterium sensu stricto на «ectB»- и «ectC^-деревьях отличалось, что может быть следствием горизонтального переноса генов. Современные исследования геномов штаммов, близкородственных виду B. aurantiacum, выявили большое количество транспозаз и интеграз, а также фрагменты гомологичных последовательностей ДНК, что предполагает горизонтальный перенос генов, который, по мнению авторов, обеспечивает приспособление к условиям экологической ниши [Levesque et al., 2019].

"U1

В. aurantiacum

-Б. antiquum VKM Ас-21181

ко

В. marinum В. picturae LMG 2206 Г

-Б. saadardmm ОЫе-ООЗ'ОТОРЗЗ??.!)

С

<1

-В. ceiere КММ 36371

-В. ammoniilyticum Al1

- Б oceani ВВН Г1

-В. siligurisnss MB 181

-В. epidermidis NCDO 22861

-В. permense VKM Ac-22801

—Я sedimims CGMCC 1.154721

-B.lmens DSM 204251

'B.iodinum

OJOl

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей 16S рДНК с использованием метода «ближайшего соседа»; масштаб соответствует 1 замене на каждые 100 нуклеотидов

и и

jrtpiniu DSM 2МТУ51 (Н2 LTHSMi 1) В ^JrrMiti НВЙС I«IL1! HZ КЫШОМООЗ I) J

s кчь^ч ATXwi'^nmanoaaoi] I)

—6 tewoATCC^ir:1 (FfYYHmnW I) cam Clt 1031I [ ' fRCZCOlHHM ] J

________ArajTO'mg

l.u>unw tuiit'/tr

ainww DSM П6ЯШ >

I'trxr

i mDe« ЛТСС 4>.'H'

CIPlDitll'lFXiOHO

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов (а) е^В и (б) е^С с использованием метода «ближайшего соседа»; масштаб соответствует 1 замене на каждые 100 нуклеотидов

Заключение

Полученные в ходе исследования данные выявили высокий уровень сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина, штамма Brevibacterium sp. U1 с видом B. aurantiacum. Тем не менее, выявлено значительное эволюционное расстояние нуклеотидных последовательностей ectC-гена исследованного штамма и близкородственного вида B. aurantiacum. В связи с вышеска-

занным можно предположить, что исследуемый штамм может быть представителем нового вида.

Работа выполнена в рамках государственного задания, номер госрегистрации темы: 01201353247.

Библиографический список

Ананьина Л.Н., Шестакова Е.А., Плотникова Е.Г. Детекция генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина, у актинобактерий, выделен-

ных из почвы района разработки Верхнекамского соленосного бассейна // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2018. Вып. 3. С. 264-269.

Плотникова Е.Г. и др. Характеристика микроорганизмов, выделенных из техногенных почв Прикамья // Экология. 2006. № 4. С. 261-268.

Anan'ina L.N. et al. Naphthalene-degrading bacteria of the genus Rhodococcus from the Verkh-nekamsk salt mining region of Russia // Antonie Van Leeuwenhoek. 2011. Vol. 100. P. 309-316.

Bernard T. et al. Ectoine accumulation and osmotic regulation in Brevibacterium linens // J. Gen. Microbiol. 1993. Vol. 139. P. 129-136.

Cai L. et al. Comparative genomics study of polyhydrox-yalkanoates (PHA) and ectoine relevant genes from Halomonas sp. TD01 revealed extensive horizontal gene transfer events and co-evolutionary relationships // Microb. Cell Fact. 2011. Vol. 1. P. 88.

Cogan T. M. et al. Biodiversity of the surface micro-bial consortia from Limburger, Reblochon, Livarot, Tilsit, and Gubbeen cheeses // Microbiol. Spectr. 2014. Vol. 2. doi: 10.1128/microbiolspec. CM-0010-2012.

Ivanova E.P. et al. Brevibacterium celere sp. nov., isolated from degraded thallus of a brown alga // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. Vol. 54. P. 2107-2111.

Levesque S. et al. Mobilome of Brevibacterium au-rantiacum sheds light on its genetic diversity and its adaptation to smear-ripened cheeses // Front. Microbiol. 2019. Vol. 10. P. 1270.

Pham N.P. et al. Comparative genomic analysis of Brevibacterium strains: insights into key genetic determinants involved in adaptation to the cheese habitat // BMC Genomics. 2017. Vol. 7. P. 955.

Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons // Develop. Ind. Microbiol. 1961. Vol. 2. P. 23-32.

Widderich N. et al. Biochemical properties of ectoine hydroxylases from extremophiles and their wider taxonomic distribution among microorganisms // PLoS One. 2014. Vol. 8. doi: 10.1371/journal.pone.0093809.

Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria // Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. (eds). Current protocols in molecular biology. 3rd edn. Wiley; New York, 1995.

References

Anan'ina L.N., Shestakova E.A., Plotnikova E.G. [Detection of the genes coding ectoine biosynthesis enzymes for halotolerant actinobacteria isolat-

ed from the soil of area of industrial development of the upperkamian salted basin]. Vestnik Permskogo universiteta. Biologija. Iss. 3 (2018): pp. 264-269. (In Russ.).

Anan'ina L.N. et al. Naphthalene-degrading bacteria of the genus Rhodococcus from the Verkh-nekamsk salt mining region of Russia. Antonie Van Leeuwenhoek. V. 100 (2011): pp. 309-316.

Bernard T. et al. Ectoine accumulation and osmotic regulation in Brevibacterium linens. J. Gen. Microbiol. V. 139 (1993): pp. 129-136.

Cai L. et al. Comparative genomics study of polyhy-droxyalkanoates (PHA) and ectoine relevant genes from Halomonas sp. TD01 revealed extensive horizontal gene transfer events and co-evolutionary relationships. Microb. Cell Fact. V. 1 (2011): pp. 88.

Cogan T. M. et al. Biodiversity of the surface microbial consortia from Limburger, Reblochon, Livarot, Tilsit, and Gubbeen cheeses. Microbiol. Spectr. V. 2 (2014). doi: 10.1128/microbiolspec.CM-0010-2012

Ivanova E.P. et al. Brevibacterium celere sp. nov., isolated from degraded thallus of a brown alga. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V. 54 (2004): pp. 2107-2111.

Levesque S. et al. Mobilome of Brevibacterium au-rantiacum sheds light on its genetic diversity and its adaptation to smear-ripened cheeses. Front. Microbiol. V. 10 (2019): p. 1270.

Pham N.P. et al. Comparative genomic analysis of Brevibacterium strains: insights into key genetic determinants involved in adaptation to the cheese habitat. BMC Genomics. V. 7 (2017): p. 955.

Plotnikova E.G. et al. Characterization of microorganisms isolated from technogenic soil of Pre-Urals. Ëcologija, N 4 (2006): pp. 261-268. (In Russ.).

Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons. Develop. Ind. Microbiol., V. 2. (1961): pp. 23-32.

Widderich N. et al. Biochemical properties of ectoine hydroxylases from extremophiles and their wider taxonomic distribution among microorganisms. PLoS One., V. 8 (2014). doi:

10.1371/journal.pone.0093809.

Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria. In: Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. (eds.) Current protocols in molecular biology, 3rd edn. Wiley, New York, 1995.

Поступила в редакцию 12.09.2019

Об авторе

Ананьина Людмила Николаевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН - филиал ПФИЦ УрО РАН ORCID: 0000-0003-4721-2863 614081, Пермь, ул. Голева, 13; 1udaananyina@mai1.ru; (342)2808431

About the author

Anan'ina Lyudmila Nikolaevna, candidate of biology, researcher of laboratory of molecular microbiology and biotechnology Institute of Ecology and Genetics of Microorganism UB RAS.

ORCID: 0000-0003-4721-2863 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; ludaananyina@mail.ru; (342)2808431

Информация для цитирования:

Ананьина Л.Н. Филогенетическое положение галотолерантного штамма Brevibacterium sp. U1, выделенного из засоленной почвы, в системе рода Brevibacterium // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2019. Вып. 4. С. 459-463. DOI: 10.17072/1994-9952-2019-4-459-463.

Anan'ina L.N. [Philogenetic status of the halotolerant strain Brevibacterium sp. U1, isolated from saline soil, in the Brevibacterium genus system]. Vestnik Permskogo universiteta. Biologija. Iss. 4 (2019): pp. 459463. (In Russ.). DOI: 10.17072/1994-9952-2019-4-459-463.