Применение биосовместимых сорбентов для конструирования иммобилизованных пробиотиков

2008 г.

КОНСТРУИРОВАНИЯ

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ

ПРОБИОТИКОВ

2Бондаренко В.М., 2Рыбальченко О.В.,2Болдырев А.Г., 2Потокин И.Л., 2Добрица В.П.

2НИИ эпидемиологии и микробиологии им .Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва; ТосНИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА, Санкт-Петербург

г \

Предложен сорбент «Сфероцелл ДЕАЕ», состоящий из глобул макропористой целлюлозы с иммобилизованными на поверхности клетками производственного штамма Lactobacillus plantarum 8РА-3. Композиция обеспечивает эффективное сосуществование клеток и бактериальных метаболитов, взаимодействующих в условиях регулируемого сорбентом рН, способствуя пролонгированию жизнеспособности жидкой культуры лактобацилл. Ключевые слова: сорбенты, макропористая целлюлоза, лактобациллы, адсорбция, иммобилизованный пробиотик

V /

Адсорбционная иммобилизация бактериальных культур в настоящее время используется в различных направлениях исследований, а в отдельных случаях уже находит технологическое применение. Популярность этого подхода обусловлена тем, что получаемые таким образом композиционные препараты по своим позитивным свойствам существенно превосходят таковые с обычным наполнителем [3, 5, 7].

Высокоэффективные сорбенты могут использоваться непосредственно для коррекции бактериальной флоры в местах ее локализации в организме. Примером такого подхода является применение лактофильт-рума, содержащего гидролизный лигнин, энтеросгеля (полиметилсилоксана) и коллоидного диоксида кремния, предложенных для лечения пищевых токсикоин-фекций и неинфекционных воспалительных заболеваний [4-6, 8].

Следует отметить, что в реальных условиях организма процессы десорбции компонентов из препарата и сорбции компонентов из окружающей среды макроорганизма протекают одновременно и потому использование сорбентов определяется такими их характеристиками, как селективность сорбции и емкость по целевым компонентам.

Цель работы — оценка адсорбционных свойств в отношении бактерий производственного штамма Lactobacillus plantarum 8РА-3 трех вариантов глобул макропористой целлюлозы «Сфероцелл»: с нейтральным, положительным и отрицательным зарядами матрицы.

Материалы и методы_

В работе использованы анионит диэтиламиноэтил (ДЕАЕ) с положительным зарядом, катионит СП (сульфо-

з

пропил) с отрицательным зарядом и нейтральная матрица сорбента «Сфероцелл». Особенности строения сорбентов Сфероцелл были установлены ранее в ходе структурных исследований с использованием целого ряда методов: электронной микроскопии, ртутной по-рометрии, проницаемости сорбента по данным гель-проникающей хроматографии [1, 2].

Метод иммобилизации. Отработку способа иммобилизации бактериальных клеток на различных типах сорбентов проводили на бактериальных клетках 1_.р1ап1агит 8РА-3. Для иммобилизации бактерий проводили совместную инкубацию при 37 °С в течение 30 мин. аликвот сорбента в объеме 1 мл с 9 мл культуральной среды, содержащей бактерии в концентрации 109 КОЕ/мл. Количество адсорбированных клеток определяли по разности концентрации лактобацилл в исходной культуральной среде и надосадке после инкубации с сорбентом по результатам высева на агаризованную среду МРС-4.

Коэффициент концентрирования (КК) рассчитывали по формуле:

КОЕ исходной культуры

КК= -

КОЕ иммобилизованных бактерий

Электронно-микроскопические методы. Морфо-физиологическую характеристику образцов проводили с использованием модифицированных для препаратов с сорбентами «Сфероцелл» электронно-микроскопических методов: 1) метод позитивного окрашивания уранилацетатом, позволяющим выявлять клетки лактобацилл и оценивать их физиологическое состояние; 2) метод ультратонких срезов, позволяющий исследовать внутреннее содержимое клеток, выявить признаки деструкции клеточных компонентов, а также проанализировать характер взаимодействия бактериальных кле-

ПРЕПАРАТЫ

ток с сорбентом; 3) метод сканирующей электронной микроскопии, важный для оценки количества прикрепленных клеток лактобацилл на поверхности сорбента.

Данные, получаемые микробиологическим и электронно-микроскопическими методами, позволяют в совокупности получить достоверную информацию о характере сорбции бактерий и морфо-функциональном состоянии бактериальной популяции в процессе хранения образцов.

Результаты и обсуждение_

Прежде всего, была исследована электронно-микроскопическая структура глобул. На рис. 1 и 2 представлены глобулы и их поверхность, визуализированные при разном увеличении.

Далее была оценена эффективность иммобилизации лактобацилл на глобулах «Сфероцелл», отличающихся по заряду. Данные по количественной оценки емкостных характеристик адсорбентов Сфероцелл в отношении лактобацилл, полученные после 30 мин. инкубирования бактерий с сорбентами и рассчитанные по количеству лактобацилл в млн на 1 г сорбента, представлены в табл. 1. Как видно из данных табл. 1, анионит «Сфероцелл ДЕАЕ» способен увеличить концентрацию бактериальных клеток в 60 раз, в то время как катионит «Сфероцелл СП» — только в 4 раза.

Представленные данные убедительно подтверждают эффективность сорбента «Сфероцелл ДЕАЕ», несу-

Рис. 1-

СЭМ. Глобулы сорбента «Сфероцелл». Ув. 400

Рис. 2.

СЭМ. Структура матрицы «Сфероцелл». Ув. 10 ООО

Рис. 3.

СЭМ. Иммобилизация множества клеток лактобацилл на поверхности глобул «Сфероцелл ДЕАЕ» (заряд «+»). Ув. 600

Рис. 4.

СЭМ. Иммобилизация клеток лактобацилл на поверхности глобул «Сфероцелл ДЕАЕ» при большем увеличении. Ув. 2000

Рис. 5.

СЭМ. Иммобилизация единичных клеток лактобацилл на поверхности глобул «Сфероцелл СП» (заряд «-»). Ув. 600

щего положительный заряд, как средства иммобилизации и концентрирования лактобацилл и продуктов их метаболизма. Визуальным подтверждением иммобилизации клеток являются электронограммы (рис. 3-5).

Вместе с тем, являясь по существу результатами статических экспериментов, эти данные не дают представления об уровне обратимости сорбции, важной для процесса культивирования, и об эффекте пролонгирования жизнеспособности культуры.

Для определения этих характеристик были проведены опыты по контрольным высевам культуры из композиционного препарата после различных сроков его хранения, результаты которых представлены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что данные по оценке жизнеспособности культуры, совпадая для обычных клеточных концентратов и препаратов, содержащих сорбент, для малых сроков хранения (30 сут.), существенно, более чем на 2 и 3 порядка расходятся для более продолжительных сроков (90 и 60 сут., соответственно).

Важно отметить еще одно неожиданное наблюдение. Эффективная адсорбция лактобацилл и кислых продуктов метаболизма естественна для анионной модификации сорбента, несущей положительный заряд. Вместе с тем при использовании катионной формы сорбента, несущей отрицательный заряд, также происходит адсорбционная иммобилизация лактобацилл, хотя и более чем на порядок менее выраженная, чем для анионита (табл. 2, рис. 5).

В настоящее время идеологическая основа применения сорбентов в составе препаратов пробиотиков состоит в следующем: 1) благодаря адсорбционной иммобилизации оказывается возможным получение стабильных высококонцентрированных препаратов культуры; 2) благодаря связыванию (нейтрализации) продуктов жизнедеятельности культуры должно увеличиваться время ее активности и, следовательно, суммарный выход целевых метаболитов; 3) иммобилизованная форма как самой культуры, так и целевых метаболитов в рН-корректирующей среде (каковой является ионообменный сорбент) должна характеризоваться повышенной устойчивостью по отношению к деструктивным факторам среды: изменениям рН, окислению, высушиванию и, следовательно, характеризоваться пролонгированной эффективностью.

Очевидно, что все вышеперечисленные свойства должны обеспечиваться характеристиками сорбента. В данной работе в качестве сорбентов-носителей для препаратов пробиотиков были использованы сорбенты из ряда «Сфероцелл». Доводы в пользу такого выбора состояли в следующем: сфероцеллы, получаемые на основе регенерированной целлюлозы, характеризуются полным отсутствием токсичности и уникальной биосовместимостью. Кроме того, ионообменные формы сорбентов Сфероцелл характеризуются высокими емкостными характеристиками, особенно для молекул метаболитов средней молекулярной массы, и как показали данные электронной микроскопии, их «транспортная» пористость соразмерна и для адсорбции бактериальных клеток.

Таким образом, на модели штамма 1_.р1а^агит 8РА-3, входящего в состав пробиотика лактобакте-рина отечественного производства показано, что анионит «Сфероцелл ДЕАЕ» является эффективным носителем для получения композиционных иммоби-

(Е

2008 г.

Эффективность иммобилизации лактобацилл на глобулах «Сфероцелл», отличающихся по заряду

Таблица 1

L.plantarum 8РА-3

Образец сорбента сфероцелл Исходная концентрация клеток, млн/мл Емкость сорбции клеток (в млн на 1 г сорбента)*

1,4 33

Анионит ДЕАЕ (заряд «+») 5,0 288

15 804

130 3100

Катионит СП (заряд «-») 5,5 24

16,4 359

Примечание: *КК для катионита = 4,0 + 0,8; КК для анионита = 60,0 + 4,5.

КОЕ/мл лактобацилл в исходном клеточном концентрате и иммобилизованных на глобулах «Сфероцелл ДЕАЕ» Таблица 2

Хранение, сут. КОЕ/мл L.plantarum 8РА-3 в клеточном концентрате КОЕ/мл L. plantarum 8РА-3 на сфероцеллах

1 3,1x1010 3,1x1010

30 2,9x1010 3,1x1010

60 1,8x106 2,9x109

90 ШШШ 1,2x106 2,8x108

лизованных форм пробиотических препаратов, обладает высокой сорбционной емкостью как в отношении цельных клеток, так и бактериальных метаболитов, способствуя как интенсификации, так и пролонгированию жизнедеятельности культуры лактобацилл.

Литература

1. Болдырев А.Г., Зайцев П.И., Степанов В.В. и др. Диэтиламиноэтиловый эфир целлюлозы в качестве сорбента для выделения и очистки ферментных препаратов.//Патент RU № 2076870 от 04.10.1997.

2. Болдырев А.Г., Соколов A.A., Симбирцев A.C. и др.// Мед. экстрем, ситуаций. — 2006. — № 3(17). — С. 44-48.

3. Бондаренко В.М., Грачева Н.М.//Фарматека. — 2003. — №7. — С. 56-63.

4. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Воробьева М.А.// Биопрепараты. — 2003. — № 3. — С. 2-5.

5. Вайншток И.И., Мацулевич Т.В., Болотов В.Д. и др. Гепатопротекторный пробиотик.//Патент RU № 2310463 от 20.11.2007.

6. Воробейчиков Е.В., Волков М.Ю., A.B. Синица, А.Ж. Василенко//Антибиотики и химиотерапия. — 2006. — № 1. — С. 3-4.

7. Воробьев A.A., Бондаренко В.М., Лыкова Е.А. и др.// Вестн. РАМН. — 2004. — № 2. — С. 13-17.

8. Молохова Е.И., Тарасевич В.Н.//Фармация. — 2000. — № 49. — С. 55-58.