СРЕДСТВО ГЕМОРЕОЛОГИЧЕСКОЕ, СНИЖАЮЩЕЕ ИНСУЛИНОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ И ВОССТАНАВЛИВАЮЩЕЕ ТОЛЕРАНТНОСТЬ ОРГАНИЗМА К ГЛЮКОЗЕ, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ
HAEMORHEOLOGIC AGENT CAPABLE OF REDUCING INSULING RESISTANCE AND RESTORING BODY TOLERANCE TO GLUCOSE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION BASED ON SAID AGENT

Изобретение относится к фармакологии, а именно к биологически активным веществам и композициям, обладающим одновременно гемореологическими свойствами и свойствами снижать инсулинорезистентность и восстанавливать толерантность организма к глюкозе, которые могут быть использованы при создании препаратов, снижающих инсулинорезистентность и подавляющих агрегацию эритроцитов. Данное сочетание двух видов активности чрезвычайно важно, так как при сахарном диабете на ранних стадиях развития отмечается нарушение микроциркуляции, проявление синдрома повышенной вязкости крови и развития сладж синдрома (Дедов И.И., Фадеев В.В. Введение в диабетологию. - М., 1998. - 199 с.).
Известно, что при сахарном диабете 2 типа ведущим механизмом развития заболевания является снижение чувствительности организма к инсулину - синдром инсулинорезистентности (Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений. Руководство для врачей. - М.: Медицина, 2005, с.18-21). При этом происходит существенное изменение тромбогенного потенциала крови и ее гемореологических свойств. Так повышается способность тромбоцитов к агрегации, что и определяет высокую способность к тромбообразованию (повышается тромбогенный потенциал крови). Кроме того, повышается способность эритроцитов к агрегации с развитием сладж синдрома, в конечном итоге проявляющегося увеличением вязкости крови и нарушением микроциркуляции (Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений. Руководство для врачей. - М.: Медицина, 2005, с.283).
Существует ряд синтетических гипогликемических препаратов, снижающих инсулинорезистентность, восстанавливающих толерантность организма к углеводам и предназначенных для лечения сахарного диабета при пероральном применении. Все эти препараты делятся на две основные группы: бигуаниды и производные сульфонилмочевины.
Наиболее близким по выполнению и достигаемому результату является диабетон (гликлазид) 1-(3-азабицикло[3,3,0]октил-3)-3-(пара-толилсульфонил) мочевина (М.Д. Машковский. - Лекарственные средства. - 15-е изд., перераб., исп.и доп.- М.: Новая волна, 2006. - С.561.), разработанный фирмой «Сервье» (Франция). Действие его связано главным образом с восстановлением физиологического профиля продукции инсулина, снижением инсулинорезистентности и снижением агрегации тромбоцитов. Этот препарат уже длительное время используется при сахарном диабете 2 типа не только для сахароснижающего эффекта, но и для стабилизации тромбогенного потенциала крови и гемореологии. Так гликлазид снижает способность тромбоцитов к агрегации, нормализует нарушенный фибринолитический потенциал сосудистой стенки и процесс фибринолиза, замедленный при сахарном диабете. Гликлазид как сахароснижающее средство начинает действовать через 1 час после приема, максимум эффекта наблюдается между 4-м и 8-м часом, продолжительность действия немного меньше 20 часов. Ангиопротективное влияние проявляется лишь после 3-х месяцев лечения и еще более отчетливо через 6-12 месяцев.
Таким образом, применяемые в настоящее время в клинической практике гипогликемические препараты, сочетающие сахароснижающий эффект с микроваскулярным действием, не являются совершенными, так как у некоторых из них ангиопротективное влияние проявляется только после 3-12 месяцев после начала приема (гликлазид) (Балаболкин М.Н., Клебанова Е.М., Креминская В.М. - Лечение сахарного диабета и его осложнений. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.167-177). Поэтому потребность в препаратах, сочетающих сахароснижающий эффект с ангиопротективным действием, но более эффективных, чем уже применяемые в клинической практике, весьма велика, и создание лекарственных средств с подобным оригинальным механизмом действия является актуальным.
Техническим результатом изобретения является повышение эффективности гемореологического действия (способности снижать повышенную вязкость крови и агрегацию эритроцитов), а также проявление свойства снижения инсулинорезистентности и восстановления толерантности организма к глюкозе при сахарном диабете, преддиабете, синдроме инсулинорезистентности и ожирении.
Технический результат достигается дигидрохлоридом 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола (I):
Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола известен как соединение, обладающее гипогликемической (сахаропонижающей) и антиагрегантной активностью (способностью к снижению тромбогенного потенциала крови, т.е. снижению вероятности образования тромбов в кровеносном русле) (Anisimova V.A., Levchenko M.V., Korochina T.B., Spasov A.A., Kovalev S.G., Dudchenko G.P. Fr.Pat. 2691462 (1995), Bull., 95/23; EP 0571253. Ковалев Г.В., Спасов A.A., Анисимова В.А., Вдовина Г.П., Ковалев С.Г., Балаболкин М.И., Мамаева Г.Г., Дудченко Г.П., Левченко М.В. Пат. РФ №206148 (1996); бюл. №20). У соединения выявлена дополнительно гемореологическая активность (способность снижать повышенную вязкость крови, агрегацию эритроцитов и в конечном итоге приводить к восстановлению микроциркуляции), а также активность, снижающая инсулинорезистентность и восстанавливающая толерантность организма к глюкозе при сахарном диабете, преддиабете, синдроме инсулинорезистентности и ожирении.
Технический результат достигается также фармацевтической композицией при следующем соотношении ингредиентов, вес.%:
дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола
20-92
крахмал и/или поливинилпирролидон М.м 7800-35000 (ПВП),
и/или натрий карбоксиметилцеллюлоза (NаКМЦ)
или оксипропилметилцеллюлоза (ОПМЦ)
7-40
кальция и/или магния стеараты
0,3-1,0
микрокристаллическая целлюлоза (мкц) и/или лактоза
остальное (до 100)
Крахмал и/или поливинилпирролидон, NаКМЦ, ОПМЦ, мкц, лактозу использовали в качестве наполнителя и связывающего компонента гранул, кальция и/или магния стеарат - в качестве смазывающего антифрикционного компонента (Чуешев В.И., Чернов Н.Е., Хохлова Л.Н. и др. Промышленная технология лекарств, Харьков, Издательство НФАУ МКТ-книга, 2002, т.2, с.330-334). В то же время поливинилпирролидон, NaKМЦ, ОПМЦ и микрокристаллическая целлюлоза использовалась для пролонгирования действия субстанции (Чуешев В.И., Чернов Н.Е., Хохлова Л.Н. и др. Промышленная технология лекарств, Харьков, Издательство НФАУ МКТ-книга, 2002, т.2, с.352-355).
Фармацевтическую композицию получают следующим образом: для этого активное вещество дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола смешивают с рассчитанным количеством лактозы до получения однородной массы, затем увлажняют водным раствором связующего вещества: крахмала, и/или ПВП, и/или (NAKMЦ), и/или ОПМЦ, гранулируют, получая гранулы до 2 мм, сушат при температуре не более 100 градусов, гранулируют, получая гранулы не более 1 мм. Полученные гранулы опудривают антифрикционными веществами: кальция и/или магния стеаратами и мкц. Полученную смесь помещают в твердые желатиновые капсулы с крышечкой или прессуют таблетки массой от 0,1-0,5 г.
Способ получения соединения I заключается в конденсации 2-амино-1-диэтиламиноэтилбензимидазола II с избытком дибромэтана, выделении из образующегося в результате реакции дигидробромида 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола III основания Io действием щелочного агента и последующем переводе последнего в дигидрохлорид I обычными приемами, например действием раствора HCl.
Ниже приведен пример получения соединения I.
Пример 1. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а] бензимидазола (I).
15
22
4
max
2
3
2
2
2
2
2
-1
1
Перемешиваемую суспензию 69,6 г (0,3 моль) 2-амино-1-диэтиламиноэтилбензимидазола (II) в 104 мл (1,2 моль) дибромэтана нагревают 30 мин при 140-145°С. Добавляют 80 мл ДМФА и нагревают смесь еще 10-15 мин. Охлаждают до 20-25°С, осадок отфильтровывают, промывают ДМФА и ацетоном, получая 106 г дигидробромида III (84%). Последний растворяют в 230 мл воды и подщелачивают 40%-ным раствором едкого натра до рН 10. Выделяющееся на поверхности светло-желтое масло (основание Tо) экстрагируют толуолом. Толуольную вытяжку промывают водой и сушат. Толуольный раствор подкисляют добавлением насыщенного раствора хлористого водорода в 2-пропаноле до рН 1. Выделившийся тяжелый бесцветный осадок дигидрохлорида I через 4-5 ч отфильтровывают, промывают ацетоном и высушивают при 100-110°С до постоянного веса. Выход 75 г (90,9%, считая на дигидробромид III, и 75%, считая на исходный амин II). Очищают технический «диабенол» до фармакопейной чистоты перекристаллизацией из 2-пропанола. Т.пл. 258-259°С. Найдено, %: С 54,4; Н 7,2; Cl 21,2; N 16,8. CHN·2HCl. Вычислено, %: С 54,4; Н 7,3; Cl 21,4; N 16,9. УФ-спектр (0,0025%-ный раствор дигидрохлорида I в 95%-ном EtOH), λ, нм: 217±2, 279±2 и плечо при (282-286)±2. ИК-спектр (ваз. масло) соединения I, см: 1665 (C=N). Спектр ЯМР Н (DO), внутренний стандарт - ГМДС, м.д.: 1,29 (6Н, т, 2СН), 3,35 (4Н, к, 2СН), 3,69 (2Н, т, CHN), 4,41 (4Н, с, внутрицикл. (СН)), 4,62 (2Н, т, NCH), 7,41 (4Н, м, аромат. Н).
Реакцию с дибромэтаном можно проводить и в других растворителях, например ксилол, диоксан, диэтиленгликоль, диэтоксиэтан, бензонитрил, пропиленкарбонат, диметилсульфоксид, диметилформамид, однако лучшие результаты все же получены при проведении реакции в избытке дибромэтана.
Ниже приведены примеры получения композиции.
Пример 2. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а] бензимидазола (0,1 г) увлажняют 0,02 г NAKMЦ в виде раствора, гранулируют, сушат, гранулируют и просеивают через сито с диаметром отверстий не более 1 мм. Полученную массу опудривают 0,001 г кальция стеарата с размером частиц не более 0,16 мм и прессуют таблетки на таблеточном прессе.
Пример 3. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола (0,15 г) увлажняют 0,04 г ОПМЦ в виде раствора, гранулируют, сушат, гранулируют и просеивают через сито с диаметром отверстий не более 1 мм. Полученную массу опудривают 0,007 г кальция стеарата с размером частиц не более 0,16 мм и прессуют таблетки на таблеточном прессе.
Пример 4. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]-бензимидазола (0,1 г) смешивают с 0,355 г лактозы, увлажняют 0,04 г ПВП в виде раствора, гранулируют, сушат, гранулируют и просеивают через сито с диаметром отверстий не более 1 мм. Полученную массу опудривают 0,005 г кальция стеарата с размером частиц не более 0,16 мм и прессуют таблетки на таблеточном прессе.
Пример 5. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]-бензимидазола (0,1 г) увлажняют 0,07 г крахмала в виде клейстера, гранулируют, сушат, гранулируют и просеивают через сито с диаметром отверстий не более 2 мм. Полученную массу опудривают 0,004 г магния стеаратом с размером частиц не более 0,16 мм и прессуют таблетки на таблеточном прессе.
Пример 6. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]-бензимидазола (0,15 г) увлажняют 0,06 г ОПМЦ в виде раствора, гранулируют, сушат, гранулируют и просеивают через сито с диаметром отверстий не более 1 мм. Полученную массу опудривают 0,004 г магния стеарата с размером частиц не более 0,16 мм, фасуют и упаковывают в желатиновые капсулы с крышечкой.
Пример 7. Дигидрохлорид 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]-бензимидазола (0,1 г) увлажняют 0,009 г ПВП в виде раствора, гранулируют, сушат, гранулируют и просеивают через сито с диаметром отверстий не более 1 мм, смешивают с 0,09 г мкц до получения однородной смеси. Полученную массу опудривают 0,0017 г магния стеарата с размером частиц не более 0,16 мм, фасуют и упаковывают в желатиновые капсулы с крышечкой. Все полученные таблетки и капсулы дигидрохлорида 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо-[1,2-а]бензимидазола удовлетворяют требованиям ГФ XI издания. Эти данные представлены в табл.1.
Таблица 1
Показатели качества гранулятов, таблеток и капсул препарата на основе дигидрохлорида 9-диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола, приготовленных с различными вспомогательными веществами
Состав
Сыпучесть, г/с
Сила выталкивания, Н
Механическая прочность
Распадаемость, с
сжатие, Н
истирание, %
2
6,25±0,23
130
76,82±1,56
99,1±0,4
294±19
3
5,63±0,17
288
82,57±1,92
99,3±0,7
210±18
4
5,41±0,15
171
62,93±1,97
98,7±0,5
222±29
5
6,20±0,34
190
82,57±2,72
99,1±0,6
480±11
6
6,39±0,35
-
-
-
666±7
7
5,87±0,19
-
597±18
Предлагаемое соотношение действующих и вспомогательных веществ является оптимальным, обеспечивает получение качественных таблетированных и капсулированных лекарственных препаратов соединения I и достижение необходимого терапевтического эффекта.
Изучение биодоступности фармацевтической композиции
Исследование биодоступности фармацевтической композиции - в соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению фармакокинетики лекарственных средств» (Фирсов А.А. Методические указания по проведению доклинических исследований фармакокинетики фармакологических веществ и лекарственных средств / А.А.Фирсов, В.П.Жердев и др. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ: под общ. ред. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.217-229).
Эксперименты по изучению фармакокинетики субстанции препарата I и ее фармацевтической композиции с ПВП были выполнены на 100 белых беспородных крысах-самцах массой 160-200 г. Субстанцию и композицию вводили зондом внутрижелудочно в дозе 25 мг/кг (из расчета на субстанцию). Взятие проб крови проводили через 0,5; 1; 2; 3 и 5 часов и мочи через 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 25, 36,48, 60 и 72 часа после введения изучаемого соединения или композиции. Сбор мочи осуществляли в метаболических камерах «Termoplast» (Италия). Кровь стабилизировали 5% раствором цитрата натрия.
Содержание соединения I определяли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «HEWLETT PACKARD» (США) серии 1050 с колонкой той же фирмы размером 100×2,1 мм, с сорбентом Hypersil MOS 5 мкм, при помощи элюента, содержащего 30% ацетатного буфера с рН 5.0 и 70% ацетонитрила, со скоростью потока 1 мл/мин, давлением 135 bar и чувствительностью 0,01 AU. Детектирование проводили на УФ-детекторе при длине волны 280 nm. При этих условиях время удержания препарата I - 5 минут. Чувствительность 100 нг/мл. Извлечение данного препарата проводили из цельной крови при экстракции ацетонитрилом в соотношении 1:1. Пробы центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Концентрацию препарата I определяли с помощью калибровочного графика.
Фармакокинетические параметры рассчитывали методом статистических моментов (Пиотровский В.К. Метод статистических моментов и интегральные модельно независимые параметры фармакокинетики. - Фармакология и токсикология. - 1986. - №5. - т.49. - с.118-127).
Фармакокинетическая кривая (фиг.1) при изучении композиции имеет аналогичный вид по сравнению с кинетикой кривой при введении субстанции соединения I с той лишь разницей, что снижение концентрации происходит не к 3-му, а к 5-му часу. Следует отметить, что при введении субстанции соединения I несколько быстрее достигается максимальная концентрация в крови.
Таким образом, при введении композиции наблюдается увеличение циркуляции соединения I в крови крыс, сопровождающееся увеличением периода полувыведения, временем пребывания молекулы соединения I в организме (MRT) и снижением общего клиренса на 21,4%. Фармакокинетические параметры субстанции I и композиции препарата представлены в табл.2. Относительная биодоступность композиции по отношению к раствору субстанции составляет 127,02%.
Таким образом, можно сделать вывод о биоэквивалентности композиции препарата по отношению к субстанции соединения I и пролонгации терапевтического эффекта этого соединения, связанной с уменьшением клиренса и увеличением периода его полувыведения.
Таблица 2
Фармакокинетические параметры субстанции соединения и композиции (при пероральном введении в дозе 25 мг/кг)
AUC, (мкг/мл) час
<img file="00000003.tif" he="8" wi="6" img-content="undefined" img-format="tif" />, час
Kel, час<sup>-1</sup>
Cl, мл/час
MRT, час
Субстанция соединения I
10,29
1,58
0,44
2,43
2,33
Композиция
13,07
1,63
0,42
1,91
3,03
При исследовании экскреции соединения I через почки (фиг.2) было отмечено повышение его концентрации в моче со 2-го по 5-й час до максимума, а затем снижение концентрации к 12-му часу после введения субстанции I и к 24-му часу после введения композиции.
R
При исследовании экскреции соединения с мочой оценивали почечный клиренс (Cl), определяемый отношением кумулятивной экскреции препарата I с мочой к AUC препарата в крови.
R субст.
R лек. формы.
Установлено, что почечный клиренс композиции препарата I был ниже данного показателя субстанции I на 26,9% (Cl=2,91 мл/час, Cl=2,91 мл/час).
Таким образом, и по скорости выведения соединения с мочой можно сделать вывод о пролонгации его содержания в организме (при введении в виде композиции) вследствие уменьшения интенсивности выведения через почки.
Фармакологические свойства заявленного соединения
Данное соединение (I) снижает инсулинорезистентность и, тем самым, восстанавливает толерантность организма к глюкозе, подавляет агрегацию эритроцитов и, тем самым, снижает вязкость крови.
1. Влияние соединения на инсулинорезистентность определяли по изменению толерантности животных к глюкозе (пероральная глюкозная нагрузка) (Функциональные методы исследования в эндокринологии / З.И.Цюхно [и др.]. - Киев: Здоровье, 1981. - 240 с.) при:
- латентной форме стрептозотоцинового диабета (преддиабет);
- экспериментальном ожирении;
- экзогенной гиперинсулинемии (инсулинорезистентность)
и по взаимодействию с экзогенным инсулином на собаках с удаленной поджелудочной железой.
2. Влияние соединения на гемореологические свойства крови изучались в опытах при стрептозотоциновом диабете:
- по изменению вязкости крови;
- по подавлению агрегации эритроцитов, вызванной алциановым голубым.
Влияние соединения I на толерантность к глюкозе при латентной форме стрептозотоцинового диабета (преддиабет)
Действие соединения I на содержание глюкозы в крови животных с синдромом измененной толерантности к глюкозе исследовали на животных с латентной формой стрептозотоцинового диабета. Латентную форму стрептозотоцинового диабета воспроизводили по Колесник Ю.М. (Колесник Ю.М. Состояние островкового аппарата поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете. - Архив патологии. - 1992. - T.54. - 12. - c.24-27) на белых беспородных крысах массой 160-220 г при внутрибрюшинном введении свежеприготовленного на цитратном буфере стрептозотоцина (Sigma) в дозе 30 мг/кг. Не ранее чем через три дня проводили отбор животных с нарушенной толерантностью к глюкозе. Пероральный глюкозотолерантный тест проводили по утрам после ночного (в течение 10-14 ч) голодания животных при интрагастральном введении раствора глюкозы в дозе 3 г/кг. Содержание глюкозы в крови крыс определяли глюкозооксидазным методом, используя наборы Био-Ла-Тест (Чехия, Лахема диагностика). При изучении антигипергликемических эффектов на модели нарушенной толерантности к углеводам у животных с латентной формой стрептозотоцинового диабета предполагалось уточнить влияние вещества на динамику секреции гормона (инсулин). Изучаемое соединение I и препарат сравнения с комбинированным механизмом действия - гликлазид (с выраженным панкреотропным действием) животные получали внутрижелудочно за 2 часа до начала эксперимента в дозах 25 и 50 мг/кг соответственно. По истечении данного времени им перорально вводили раствор глюкозы (3 г/кг) и в течение последующих 2 часов наблюдали за динамикой изменений глюкозы в крови. Для более объективной оценки изменения показателей глюкозной нагрузки считали показатели площади под кривой динамики изменения глюкозы в крови по А.В.Древаль (2005) (Древаль А.В. Анализ результатов перорального нагрузочного теста глюкозой с помощью простой математической модели / А.В.Древаль // Лаб. дело. - 1985. - №12. - С.737-741).
Активность соединений оценивали, принимая во внимание их гипогликемическую активность у животных с латентной формой стрептозотоцинового диабета и фиксируя антигипергликемический эффект исследуемых веществ у этих же животных после пероральной нагрузки глюкозой. Результаты исследования представлены на фиг.1 и в табл.3. Исходное содержание глюкозы у крыс, получавших различные исследуемые вещества, колебалось в пределах от 4,43±0,28 до 5,50±0,29 ммоль/л.
Однако следует отметить, что все животные, которые были взяты в эксперимент, прошли предварительную индивидуальную диагностику (пероральный нагрузочный тест глюкозой). По результатам ее в исследовании были использованы только крысы с нарушенной толерантностью к углеводам. Через два часа после начала эксперимента у животных всех групп, в том числе и контрольных, наблюдалось снижение глюкозы, однако у контрольных крыс эти изменения были статистически не значимы. Вещество I, подобно препарату сравнения гликлазиду, оказывало статистически значимое (Р<0,05) гипогликемическое действие. На фоне экзогенной гипергликемии в группе животных, получавших гликлазид и соединение I, было отмечено достоверное по абсолютным значениям, по сравнению с контрольными животными, снижение уровня глюкозы. Следует отметить, что уменьшение прироста глюкозы в крови в процентах относительно начала проведения глюкозотолерантного теста было зафиксировано у животных, которым вводили гликлазид только через час после углеводной нагрузки. В течение первых 30 минут процентный прирост глюкозы у животных этой группы не отличался от контрольных крыс, получавших растворитель веществ. В то время как соединение I уже на 30 минуте достоверно (Р<0,05) замедляло темпы прироста глюкозы в крови подопытных крыс. По показателям изменения площади под кривой глюкозной нагрузки соединение I превосходило препарат сравнения гликлазид.
Таблица 3
Влияние гликлазида и соединения I при внутрижелудочном введении на уровень глюкозы в крови крыс с экспериментальным сахарным диабетом (стрептозотоцин 30 мг/кг внутрибрюшинно) на фоне пероральной нагрузки глюкозой (3 г/кг) (М±m)
Исследуемые группы
Ед. изм.
Интервалы времени (мин)
Площадь под кривой (у.е.)
-120
0
30
60
90
120
Содержание глюкозы в крови
Интактные крысы (контр. 1)
мМ
4,25±0,14
3.93±0,08
5,19±0,12
5,07±0,20
4,58±0,15
3,95±0,12
504,61
%
-7,5
+32,1
+29,0
+16,5
+0,5
Диабет (контр.2)
мМ
5,50±0,29
4,87±0,22
8,13±0,38
7,93±0,43
7,31±0,40
6,09±0,26
792,28
% к К1
+29,4 *
+23,9*
+56,6*
+56,4*
+59,6*
+54,1*
%
-11,4
+66,9
+62,8
+50,1
+25,1
Диабет + Гликлазид (25 мг/кг)
мМ
4,43±0,28
2,78±0,05
4,93±0,22
4,76±0,14
4,31±0,07
3,40±0,04
595,83
%
-37,2**
+77,34
+71,22<sup>+</sup>
+55,04<sup>+</sup>
+22,25<sup>+</sup>
Диабет + соедине-ние I(25 мг/кг)
мМ
4,57+0,17
3,93±0,13
5,87±0,29
5,40±0,35
4,67±0,26
4,37±0,23
543,75
%
-14,1**
+49,4+
+37,4<sup>+</sup>
+18,8<sup>+</sup>
+11,2<sup>+</sup>
* - изменения достоверны по сравнению с контролем 1 (Р<0,05)+ - изменения достоверны по сравнению с контролем 2 (Р<0,05)** - изменения достоверны по сравнению с исходными данными (Р<0,05)
По результатам проведенных исследований можно утверждать, что соединение I улучшает сниженные показатели толерантности к глюкозе.
Исследования на животных с экспериментальным ожирением
Ожирение моделировали у старых крыс самцов (возраст 2 года, массой до начала эксперимента 290-350 г), находящихся более трех месяцев на субкалорийной диете с повышенным содержанием жиров (более 80% от общей калорийности рациона и углеводами с высоким гликемическим инсулином. В течение указанного периода животных не ограничивали в пище. В исследование отбирали животных с нарушенной толерантностью к глюкозе и сниженной чувствительностью к инсулину (по пробе Химсворда). Пероральный глюкозотолерантный тест проводили по утрам после ночного (в течение 10-14 ч) голодания животных при интрагастральном введении раствора глюкозы в дозе 3 г/кг. Содержание глюкозы в крови крыс определяли глюкозооксидазным методом, используя наборы Био-Ла-Тест (Чехия, Лахема диагностика).
Животных с ожирением, у которых диагностировали нарушение толерантности к углеводам и синдром инсулинрезистентности, делили на две группы, одна из которых служила контролем, а животным другой вводили исследуемое вещество и наблюдали за изменениями уровня глюкозы в течение двух часов до глюкозной нагрузки и двух часов после нее. Результаты исследования гипо- и антигипергликемического действия изучаемого соединения I представлены на фиг.2 и в табл.4.
Соединение I через 2 часа после введения оказывало гипогликемическое действие в пределах 10%. После нагрузки глюкозой тенденция к снижению уровня глюкозы сохранилась. Следует отметить, что антигипергликемический эффект, наблюдаемый на протяжении всего эксперимента, был стабильным. Достоверные отличия по сравнению с животными контрольной группы наблюдались после 30 минуты перорально введенной глюкозы.
Таблица 4
Влияние соединения I (25 мг/кг) при внутрижелудочном введении на уровень глюкозы в крови крыс с нарушенной толерантностью к углеводам и инсулинорезистентностью на фоне пероральной нагрузки глюкозой (3 г/кг) (М±m)
Исследуемые группы
Ед. изм.
Интервалы времени (мин)
-120
0
30
60
90
120
Содержание глюкозы в крови
Интактные крысы (контроль 1)
мМ
4,25±0,14
3,93±0,08
5,19±0,12
5,07±0,20
4,58±0,15
3,95±0,12
%
-7,5
+32,1
+29,0
+16,5
+0,5
Крысы с нарушенной толерантностью к углеводам (контроль 2)
мМ
4,15±0,11
3,77±0,21
4,93±0,21
5,22±0,24
5,43±0,33
5,20±0,15
%
-9,2
+30,8
+38,5
+44,0
+37,9
% к К1
-2,4
-4,1
-5,3
+2,9
+18,6*
+31,6*
Крысы с нарушенной толерантностью к углеводам + соединение I (25 мг/кг)
мМ
4,30±0,17
3,87±0,07
5,30±0,15
4,63±0,19
4,23±0,19
4,37±0,09
%
-10,0
+37,0
+19,6
+9,3<sup>+</sup>
+12,9<sup>+</sup>
* - изменения достоверны по сравнению с контролем 1 (Р<0,05)+ - изменения достоверны по сравнению с контролем 2 (Р<0,05)
Оценка эффективности соединения I у крыс с экзогенной гиперинсулинемией (модель инсулинорезистентности)
Синдром инсулинорезистентности воспроизводили по методу Гордиенко О.Е. с соавторами (Гордиенко О.Е., Мертвецов Н.П., Салганик Р.И. Нарушение толерантности к глюкозе у крыс при длительном введении инсулина - Проблемы эндокринологии. - 1973. - Т.19. - №6. - С.83-91) на белых беспородных крысах массой 160-220 г. Животным на протяжении 27 дней ежедневно подкожно вводили протамин-цинк-инсулин (Elli-Zilly, США) из расчета 2 ЕД/животное. Для исследования отбирали животных с нарушенной толерантностью к глюкозе. Инсулинорезистентность определяли, используя пробу Химсворда (Цюхно З.И., Славнов В.И., Панченко Н.И. и др. Функциональные методы исследования в эндокринологии, Киев: Здоровье. - 1981. - 240 с.). Пероральный глюкозотолерантный тест проводили по утрам после ночного (в течение 10-14 ч) голодания животных при интрагастральном введении раствора глюкозы в дозе 3 г/кг. Содержание глюкозы в крови крыс определяли глюкозооксидазным методом, используя наборы Био-Ла-Тест (Чехия, Лахема диагностика).
Животных с нарушенной толерантностью к углеводам (по результатам проведения глюкозотолерантного теста) и синдромом инсулинрезистентности (диагностика с использованием пробы Химсворда) делили на две группы: первой вводили однократно перорально исследуемое соединение, второй группе - растворитель изучаемого вещества. За динамикой изменений уровня глюкозы в крови начинали наблюдать через 2 часа после введения соединений, а затем на фоне перорального глюкозотолерантного теста глюкозой еще в течение последующих двух часов, отбирая пробы крови через каждые 30 минут.
Результаты по изучению влияния соединения на уровень глюкозы в крови крыс с нарушенной толерантностью к углеводам после длительного введения инсулина представлены на фиг.3 и в табл.5.
По исходному содержанию глюкозы контрольные животные и крысы, получавшие исследуемое вещество, практически не различались (4,15±0,11 ммоль/л, 4,30±0,17 ммоль/л соответственно). При анализе проб крови, которые отбирали через 2 часа после начала эксперимента и через 30 минут после введения глюкозы, достоверных различий у животных контрольной (-9,16% и +18,8%) и опытной групп (-10,0% и +23,26%) также не было обнаружено. Однако по истечение следующих 30 минут было отмечено антигипергликемическое действие соединения I, которое носило достоверный характер (Р<0,05). Прирост глюкозы снизился в 2 раза по сравнению с группой контрольных крыс. Между 60 и 90 минутами эффект продолжал нарастать и к полутора часам после моделирования гипергликемии достигал всего +9,30% против +44,03% в контроле (Р<0,05). К 120 минуте, что соответствовало 4 часу эксперимента, уровень глюкозы стал несколько повышаться, однако разница между приростом глюкозы, в процентном выражении, в группе животных, получавших препарат I, и контрольных крыс по-прежнему оставалась в пределах 60% (Р<0,05). Значения концентрации глюкозы у животных, получавших вещество, практически приблизились к исходным данным, в то время как у крыс контрольной группы превышали на 25% содержание глюкозы, отмеченное в начале эксперимента.
Таким образом, антигипергликемический эффект подтверждает присутствие у вещества I помимо панкреотропного действия, которое не может быть реализовано на данной экспериментальной модели, экстрапанкреатических эффектов.
Таблица 5
Влияние соединения I (25 мг/кг) при внутрижелудочном введении на уровень глюкозы в крови крыс с нарушенной толерантностью к углеводам (старые животные с ожирением) после пероральной нагрузки глюкозой (3 г/кг) (М±m)
Исследуемые группы
Ед. изм.
Интервалы времени (мин)
-120
0
30
60
90
120
Содержание глюкозы в крови
Интактные крысы (контроль 1)
мМ
4,25±0,14
3,93±0,08
5,19±0,12
5,07±0,20
4,58±0,15
3,95±0,12
%
-7,5
+32,1
+29,0
+16,5
+0,5
Крысы с нарушенной толерантностью к углеводам (контроль 2)
мМ
4,27±0,22
4,26±0,29
5,51±0,35
5,54±0,32
5,47±0,37
5,23±0,36
%
-0,2
+29,3
+30,1
+28,4
+22,8
% к К1
+0,5
+8,4
+6,2
+9,3
+19,4*
+32,4*
Крысы с нарушенной толерантностью к углеводам + соединение I (25 мг/кг)
мМ
4,75±0,15
4,30±0,12
4,75±0,25
4,70±0,10
4,60±0,10
4,65±0,25
%
-9,5
+10,5
+9,3<sup>+</sup>
+7,0<sup>+</sup>
+8,1
* - изменения достоверны по сравнению с контролем 1 (Р<0,05)+ - изменения достоверны по сравнению с контролем 2 (Р<0,05)
Влияние соединения I на сахароснижающее действие экзогенно введенного инсулина
Одним из косвенных показателей повышения чувствительности тканей организма к инсулину может быть влияние новых веществ на выраженность гипогликемического действия инсулина в опытах на животных с удаленной поджелудочной железой по схеме В.A.Houssay (1960).
Опыты проводили на 5-ти панкреатэктомированных собаках массой 8,6-11,5 кг. Удаление поджелудочной железы проводили под гексеналовым наркозом (50 мг/кг внутрибрюшинно) в асептических условиях. Исследование проводили на 3-4 день после операции, когда содержание глюкозы достигло 23-26 ммоль/л. К этому времени животные худели, у них развивалась полиурия, полидипсия, полифагия, т.е. клинические признаки, характерные для тяжелой формы сахарного диабета, основной причиной развития которого является дефицит инсулина. Влияние соединения I на сахароснижающий эффект инсулина проводили в три этапа.
1. Изучали влияние соединения I на глюкозу крови у панкреатэктомированных собак. Исследуемое вещество I вводили животным однократно внутривенно в дозе 5 мг/кг. Сахароснижающее действие соединения изучали на протяжении 6 часов. Пробы крови забирали через каждый час.
2. Изучали сахароснижающее действие инсулина для инъекций (Минмедпром, Московский эндокринный завод), введенного многократно внутривенно в дозе 0,04 ЕД/кг в течение 3-х часов с 30-минутными интервалами.
3. Изучали влияние инсулина в комплексе с соединением I на содержание глюкозы крови. Вещество в дозе 5 мг/кг вводили внутривенно с первой порцией инсулина. Наблюдение за содержанием глюкозы в крови опытных животных продолжали до исчезновения гипогликемического эффекта. Пробы крови отбирали через каждый час на протяжении всего эксперимента. Обобщенные данные по влиянию инсулина и вещества I, введенным отдельно, и инсулина, введенного в комплексе с соединением I, на концентрацию глюкозы в крови панкреатэктомированных собак приведены на фиг.4.
Соединение не влияло на содержание глюкозы в крови у собак с удаленной поджелудочной железой. Так, изменения концентрации глюкозы колебались в пределах 2,7-4,6% и были статистически не достоверны. После введения инсулина панкреатэктомированным собакам через час гормон снизил содержание глюкозы в крови на 23%. Гипогликемический эффект продолжал нарастать и через 2 часа был максимально выражен, содержание глюкозы в крови собак к этому времени равнялось 16,6 ммоль/л вместо исходных 23,2 ммоль/л, что соответствовало снижению глюкозы в крови опытных животных на 28%. На 3-м часу эксперимента у 3-х из 5-ти собак глюкоза в крови удерживалась на этом уровне, однако (по обобщенным данным) прослеживалась тенденция к ее стабилизации, которая наблюдалась в последующее время. Между 5-м и 6-м часом эксперимента концентрация глюкозы в крови достигла исходного уровня, а через 6 часов у 3-х собак даже несколько превысила концентрацию глюкозы, которая отмечалась в крови животных до начала эксперимента. При совместном введении инсулина для инъекций с соединением I концентрация глюкозы в крови собак через час снизилась на 23%, что соответствовало гипогликемическому эффекту инсулина. Ко 2-му часу эксперимента наблюдалось усиление сахароснижающего действия инсулина, которое к 3-му часу после введения стало статистически значимым. Максимальное снижение глюкозы на 46% отмечалось к 4-5 часу наблюдения. Гипогликемическое действие инсулина, введенного в комплексе с соединением I в 2,7 раза превысило сахароснижающий эффект, который наблюдался при введении одного инсулина. Через 6 часов концентрация глюкозы в крови начала повышаться и к 9-му часу эксперимента содержание глюкозы в крови нормализовалось.
Таким образом, снижение уровня глюкозы в крови панкреатэктомированных собак под влиянием инсулина, введенного вместе с соединением, было более интенсивным и длительным, чем при применении одного инсулина.
Проведенные исследования дают основание сделать заключение, что изучаемое вещество повышает чувствительность тканей к действию инсулина.
Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что изучаемое соединение I снижает инсулинорезистентность тканей организма и восстанавливает толерантность организма к углеводам в условиях патологии углеводного обмена. Вероятно, выявленный эффект соединения I связан с его свойством повышать чувствительность тканей организма к действию инсулина.
Гемореологические свойства заявленного соединения I
Гемореологические изменения оценивали по двум важным показателям - вязкость крови и способность эритроцитов к агрегации, индуцированной алциановым голубым в условиях экспериментальной патологии - стрептозотоцинового диабета.
Синдром гипервязкости вызывали внутрибрюшинным введением стрептозотоцина («Serva», Германия) в дозе 40 мг/кг (Баранов В.Г. Экспериментальный сахарный диабет. Ленинград: Наука, 1983 - 216 С.). В опыт брали животных, у которых развивалась стойкая гипергликемия (не менее 17 ммоль/л). Исследуемые вещества, растворенные в физиологическом растворе, вводили крысам внутрижелудочно в течение семи дней в дозе 5 мг/кг. Контрольные животные получали эквивалентный объем растворителя. Пробы крови для исследования гемореологических показателей забирали из брюшного отдела аорты крыс, находящихся под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг), который по данным литературы не влияет на реологические параметры крови (Галенок В.А., Гостинская Е.В, Диккер В.Е. Гемореология при нарушениях углеводного обмена - Новосибирск: Наука, 1987. - 342.).
Измерение вязкости крови проводили на реологическом анализаторе крови АКР-2 (Россия) при семи скоростях сдвига, моделирующих различную интенсивность кровотока в сосудах (Анализатор вязкости крови / Н.А.Добровольский, Ю.М.Лопухин, А.С.Парфенов и др. // Реологические исследования в медицине: Сб. науч. тр. - М.: НЦХ РАМН, 1998. - С.45-51). Производилась стандартизация образцов крови к единому гематокриту 45% путем добавления или изъятия необходимого количества плазмы.
-1
Индекс агрегации эритроцитов (ИАЭ) получали расчетным путем - отношением вязкости крови при 20°С к вязкости крови при 200 с (Dintenfass L. Modifications of blood rheology during aging and agerelated pathological conditions // Aging (Milano). - 1989. - №1. - P.99-125). Агрегацию эритроцитов изучали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации (модель 220LA) научно-производственной фирмы «Биола» (Россия) (Спасов А.А., Островский О.В., Кучерявенко А.Ф., Дегтярев А.Н. Изучение агрегации эритроцитов на лазерном агрегогметре // Клиническая лабораторная диагностика. - 2000. - №5. - С.21-23).
Исследование агрегационной способности эритроцитов проводили на отмытых красных кровяных клетках, используя в качестве агрегирующего агента 50 мкМ водный раствор алцианового голубого («Sigma», США).
Результаты эксперимента представлены в табл.6 и в табл.7.
Таблица 6
Влияние соединения I и препарата сравнения гликлазида на вязкость крови (сП) крыс со стрептозотоциновым диабетом при различных скоростях сдвига (при семидневном внутрижелудочном введении в дозе 5 мг/кг) (М±m)
N п/п
Изучаемые соединения и препараты
Вязкость крови при различных скоростях сдвига
ИАЭ
200 с<sup>-1</sup>
100 с<sup>-1</sup>
20 с<sup>-1</sup>
1.
Контроль
3,93±0,09
4,03±0,09
5,95±0,04
1,51
2.
Соединение I
3,52±0,05*
3,6±0,06*
4,45±0,10*<sup>♣</sup>
1,26
3.
Гликлазид
3,7±0,06*
3,77±0,06
4,95±0,10*
1,33
* - данные достоверны по отношению к контролю (р<0,05)
<sup>♣</sup> - данные достоверны по отношению к гликлазиду (р<0,05)ИАЭ - индекс агрегации эритроцитов
Таблица 7
Влияние соединения I и препарата сравнения гликлазида на алциан-индуцируемую агрегацию эритроцитов крови крыс со стрептозотоциновым диабетом (при семидневном внутрижелудочном введении в дозе 5 мг/кг) (М±m)
№п/п
Изучаемые соединения и препараты
Агрегация эритроцитов, Δ% по отношению к контролю
1.
Соединение I
-78,76±2,05*<sup>♣</sup>
2.
Гликлазид
-53,66±2,59*
* - данные достоверны по отношению к контролю (р<0,05)
<sup>♣</sup> - данные достоверны по отношению к гликлазиду (р<0,05)
Так, в результате проведенного исследования было показано, что соединение I снижает вязкость крови крыс со стрептозотоциновым диабетом, при этом по активности превосходя препарат сравнения гликлазид.
Таким образом, заявленное соединение I оказывает выраженное гемореологическое свойство, ранее не известное (не описанное), которое заключается в снижении агрегации эритроцитов и нормализации реологических свойств крови (вязкость крови) у крыс с синдромом гипервязкости.
Изучение острой токсичности соединения I и фармацевтической композиции
50
50
Среднесмертельную дозу (ЛД) субстанции и лекарственной формы определяли по Арзамасцеву Е.В. с соавторами (Арзамасцев Е.В., Гуськова Т.А., Березовская И.В. и др. - Методические указания по изучению общетоксичекого действия фармакологических веществ.- Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией члена-корреспондента РАМН, профессора Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С.170-204). Эксперименты были выполнены на белых нелинейных крысах обоего пола массой 180-200 г. Препарат I вводили однократно перорально, крысам-самцам в дозах 1000, 1500, 3000, 4000, 5000 мг/кг, крысам-самкам в дозах 1200, 1500, 3000, 5000, 6000 мг/кг. Сразу после введения исследуемого вещества животные находились под постоянным наблюдением в течение 4-х часов, в последующие дни за ними наблюдали два раза в сутки: утром и вечером. Длительность эксперимента составила 14 дней. Оценку общего состояния и поведения животных проводили по следующим показателям: характеру двигательной активности, координации движений, наличию судорог и их характеру, наличию тремора, рефлекторных реакций на внешние раздражители - звуковые (постукивание по клетке), тактильные (прикосновение к коже), оценивали состояние шерстяного покрова (шерсть взъерошенная или гладкая, блестящая или тусклая). По окончании срока наблюдения подсчитывали процент павших и выживших животных и вычисляли ЛД по методу Litchfild и Wilcoxon (Беленький М.Л. - В кн.: Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л., 1968. - 151 с.).
По результатам исследований острой токсичности вещества I установлены уровни его летальных доз, различные для крыс-самок и самцов, и характерные признаки интоксикации.
Животные начинали гибнуть уже при употреблении ими соединения I в дозе 1500 мг/кг. Однако случаи гибели были единичными, и картина отравления не была четко выражена. Начиная с дозы 3000 мг/кг и заканчивая дозой 6000 мг/кг, у всех животных наблюдались признаки отравления. Картина отравления и гибели животных была примерно одинаковой во всех группах животных. Разница заключалась лишь в количестве погибших животных, зависящем от дозы употребляемого препарата, быстроте развития симптомом отравления и сроках наступления смерти. После введения препарата отмечалась резкая седация, снижение двигательной активности вплоть до полной неподвижности, затем возникали клонические судороги, и животное погибало. У животных, оставшихся в живых, на следующие сутки отмечалась вялость, снижение двигательной и пищевой активности.
50
На основании полученных данных по изучению острой токсичности субстанции препарата I была рассчитана среднесмертельная доза (ЛД). Также была определена среднесмертельная доза для лекарственной формы соединения I. Обобщенные данные острой интоксикации, вызываемой у крыс при пероральном введении изучаемого препарата, приведены в табл.8.
По результатам проведенных исследований дигидрохлорид I можно отнести к малотоксичным веществам. По сравнению с противодиабетическими препаратами (табл.9), применяемыми в клинической практике для лечения инсулиннезависимого сахарного диабета, он менее токсичен, чем производные гуанидина - препарата метформина, и практически равен по данному показателю производным сульфонилмочевины I и II генерации.
Таблица 8
Влияние соединения I и фармацевтической композиции при однократном пероральном введении на гибель крыс
Название препаратов
Среднесмертельная доза (ЛД<sub>50</sub>) мг/кг
Самки
Самцы
Субстанция соединения I
2321,0 (1646,27-3273,01)
2740,91 (2017,54-3723,62)
Композиция
3569,46 (2730,59-4666,05)
3554,45 (2320,17-5445,33)
Таблица 9
Среднесмертельная доза (ЛД<sub>50</sub>) антидиабетических препаратов при пероральном введении (данные литературы)
Название препарата
ЛД<sub>50</sub>, мг/кг
Автор
Толбутамид
2500
Галлер Г. и др., 1973°
Хлорпропамид
2390
Галлер Г. и др., 1973°
Гликлазид
3000
Duhault J. et al.,1972°°
Метформин
1000
Галлер Г. и др., 1973°
° - Галлер Г., Штрауцерберг С. Пероральная терапия диабета. - М.: Медицина, 1973. - 298 с.°° - Duhault J., Baulanger М., Beregi L. The pharmacology of S 1702. A new highly effective oral antidiabetic drug with unusual properties. - Arzneim. Forsch. - 1972. - V.22. - P.1682-1685.