Биолого-вирусологическое обоснование антипротеазной терапии гриппа

2010 г.

штаммов вируса гриппа в клетках MDCK, стабилизации и лиофилизации вируссодержащего материала, получению и контролю готовых форм культуральных гриппозных вакцин. Созданы и аттестованы посевные и рабочие банки культуры клеток МDCK, получены рекомендации Ученого совета ГИСК им. Л.А. Тарасеви-ча на использование клеток МDCK в производстве профилактических препаратов.

Для создания вакцины против пандемического гриппа А/Н1Ж использовали вакцинный штамм А/17/Калифор-ния/2009/38, полученный из НИИ экспериментальной

медицины СЗО РАМН. На базе экспериментально-производственного участка отработаны режимы культивирования клеток MDCK и вакцинного штамма вируса гриппа в ферментерах с объемом культурального сосуда 10 и 14 л; исследована репродукция штамма А/Н1Ж в бессывороточных питательных средах; подобраны составы стабилизаторов, которые позволили сохранить специфическую активность вируса на этапах лиофили-зации и последующего режимного хранения. Разработанные технологические приемы легли в основу заявки на патент.

БИОЛОГО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ АНТИПРОТЕАЗНОЙ ТЕРАПИИ ГРИППА

Дивоча В.А.

ГП «Украинский НИИ медицины транспорта», г. Одесса, Украина

Целью работы являлось изучение состояния и роли ан-типротеиназных систем вируса и реципиента в развитии гриппозной инфекции для обоснования получения и использования принципиально новых лечебных препаратов на основе ингибиторов трипсиноподобных протеиназ.

Работа посвящена изучению взаимодействия проте-олитической системы клетки - хозяина с вирусом гриппа, который размножается в ней. В работе разрабатывается новое направление борьбы с гриппозной инфекцией, основанное на блокировании вируса в межклеточном пространстве или при сборке его в самой клетке путем использования специфических ан-типротеиназных иммунных сывороток или ингибитора трипсиноподобной протеиназы.

В работе использовались вирусы гриппа А и В, трип-синоподобные протеиназы и их ингибиторы, куриные эмбрионы, легкие и кровь белых мышей и крыс, природные и синтетические ингибиторы трипсина, кровь человека. Исследования проводились с использованием вирусологических, биохимических, иммунологических, молекулярно-биологических и радиоизотопных методов исследований.

Установлено, что очистка и концентрация вируса гриппа методами центрифугирования не освобождали вирус гриппа от белков с протеиназной активностью. Доочистка вируса гриппа в ступенчатом градиенте сахарозы показала, что в зоне 38 - 43% концентрации сахарозы локализовалось основное количество вируса гриппа и большая часть протеолитической активности. Первоначально ассоциированная с вирусом гриппа протеиназа в градиенте сахарозы разделилась на четыре изоформы, а из нормальных хорионаллантоисных оболочек - на три изоформы, которые в 345 раз были ниже, чем вирусассоциированные. Эллюция и адсорбция вируса гриппа на формалинизированных эритроцитах показали, что протеолитическая активность не связана с У-антигеном, а, по-видимому, связана с РНП.

Метод электрофореза в ПААГе вируса гриппа в нево-сстанавливающих условиях показал чёткое разделение

протеиназы на 7 - 9 фракций, которые владели высокой протеолитической активностью и различным электрическим зарядом. Протеиназа, ассоциированная с вирусом гриппа, является клеточным ферментом, так как иммунные сыворотки к нормальным хорионаллантоис-ным оболочкам куриного эмбриона нейтрализовали протеиназу в зоне 35 - 45% сахарозы, где локализовался очищенный вирус гриппа, при этом гемагглютиниру-ющая активность сохранялась. При заражении белых мышей вирусом гриппа А происходило нарушение фер-ментно-ингибирующего баланса. Наиболее глубокие изменения происходили в первые часы после заражения. Снижение протеиназной активности в первые часы после заражения объясняются увеличением ингибиру-ющей протеиназу активности. При заражении куриных эмбрионов вирусом гриппа А в первые часы происходит увеличение как протеиназной, так и ингибирующей активности. В лёгких заражённых мышей и в куриных эмбрионах имеется соответствие между накоплением инфекционного агента и наступающим снижением протеиназной и ингибирующей активности. При заражении мышей вирусом гриппа В профиль протеиназной активности был не так резко выражен в лёгких и имел отличия по сравнению с вирусом гриппа А. Сходство было отмечено только в первые часы после заражения. Вирусиндуцированный клеточный ингибитор в первые часы после заражения играет важную роль в блокировке протеиназы, после его истощения главную роль в развитии патологии берут на себя трипсиноподобные протеиназы, которые начинают расщеплять гемагглю-тинин и при этом происходит возрастание инфекционного титра. Из лёгких незаражённых мышей выделено шесть изоформ трипсиноподобной протеиназы, из заражённых вирусом гриппа - восемь изоформ, обладающих высокой удельной протеолитической активностью. Изучены их физико-химические свойства. Установили, что ингибиторы трипсина: триэлин, ово-мукоид, ингибитор из ячменя и Э-АКК не одинаково ингибировали их протеиназную активность. Оптимальная рН изоформ, выделенных из лёгких незара-

ПРЕПАРАТЫ

жённых мышей, находились в зоне 7,0 - 8,0, в то время, как для изоформ, выделенных из зараженных лёгких она отклонилась в кислую сторону (рН 4,0-5,0). При определении молекулярной массы изоформы клеточной трипсиноподобной протеиназы были не гомогенны и содержали низкомолекулярные белки, II и IV содержали по два белка, III и VI изоформы характеризовались только одним белком массой 31 тыс. Да, который отмечался в III изоформе. I, II и III изоформы, выделенные из заражённых лёгких, на электрофорег-рамме не выявлялись, а в IV, V и VI изоформах происходила замена белков. Установлено, что расщепление гемагглютинина вируса гриппа на две субъединицы происходило под воздействием III-й и VI-й изоформы трипсиноподобной протеиназы, а нарастание инфекционной активности происходило под действием III-й изоформы трипсиноподобной протеиназы, выделенных из лёгких здоровых мышей. Изоформы, выделенные из лёгких мышей, зараженных вирусом гриппа А, через 72 ч после заражения не обладали способностью повышать инфекционный титр вируса. Антип-ротеиназные иммунные сыворотки к изоформам, выделенным из лёгких незаражённых мышей, блокировали активность трипсина и вирус гриппа не размножался в культуре клеток МДСК. In vivo сниже-

ние летальности мышей на 60% выявлено только при действии антисывороток к III изоформе. Из лёгких здоровых мышей выделен ингибитор трипсинопо-добных протеиназ с молекулярной массой 47 500 Да, который обладал способностью подавлять развитие инфекционной и гемагглютинирующей активности вируса гриппа на куриных эмбрионах и блокировал развитие гриппозной инфекции у белых мышей в общей дозе 0,126 мкг/мышь. Обоснована возможность и разработана методика получения противовирусного препарата из промышленных отходов производства гамма-глобулина.

В результате проведенных исследований предложено:

1. Способ получения ингибитора трипсиноподобной протеиназы из легких здоровых мышей.

2. Использование данного ингибитора в качестве противовирусного препарата.

3. Способ лечения экспериментальной гриппозной инфекции путем введения ингибитора протеиназ или антипротеиназной сыворотки.

4. Биоматериал для получения данного ингибитора как противовирусного препарата для людей.

5. Методика определения защитных возможностей организма в эксперименте.

РЕГУЛИРОВАНИЕ МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ В РЕСПУБЛИКЕ УЗБЕКИСТАН

Джалилов Х.К., Нуриддинова Н.Р., Саркисянц Н.О.

Главное Управление по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники МЗ РУз, г. Ташкент, Республика Узбекистан

В Республике Узбекистан создана законодательная основа регистрации, стандартизации и сертификации медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП). В соответствии с действующим законодательством в Республике Узбекистан все МИБП могут быть закуплены с целью медицинского применения только после их регистрации МЗ РУз в установленном порядке.

По приказу МЗ РУз №566 от 31.10.2000 г. «О разрешении к применению в медицине медицинских иммунобиологических препаратов и о порядке их регистрации» организация и осуществление государственного контроля качества МИБП и их регистрация возложена на Главное Управление по контролю лекарственных средств и медицинской техники. В структуру Главного Управления входят Фармакологический комитет, Фармакопейный комитет, Государственный центр экспертизы и стандартизации лекарственных средств и медицинской техники, Комитет новой медицинской техники и Бюро по регистрации лекарственных, профилактических, диагностических средств и медицинской техники.

Контроль качества образцов МИБП, представленных для регистрации в РУз проводится в Государственном

Центре экспертизы и стандартизации лекарственных средств и медицинской техники, где функционируют Лаборатория вакцин, сывороточных препаратов и микробиологических исследований, Лаборатория контроля качества и стандартизации лекарственных средств, Лаборатория фармако-токсикологических исследований и Лаборатория контроля качества медицинской техники и медицинских изделий.

Экспертиза документов, вопросы по проведению клинических испытаний МИБП проводится комиссией по МИБП при Фармакологическом комитете. Экспертиза нормативно-аналитической документации проводится в Фармакопейном комитете.

На основании решений Президиумов Фармакологического и Фармакопейного комитетов и заключения Центра экспертизы и стандартизации лекарственных средств Экспертным Советом Главного Управление по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники МЗ РУз выносится решение о регистрации МИБП в РУз. Приказом МЗ РУз разрешается использование препаратов в медицинской практике на территории РУз, им присваивается регистрационный номер и выдается Регистрационное удостоверение.

(Е