ШТАММ GPA ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ in vivo И ОЦЕНКИ СХЕМ КУПИРОВАНИЯ НЕЖЕЛАТЕЛЬНЫХ ПОСТВАКЦИНАЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ ПРИ ПЕРВИЧНОМ ОСПОПРИВИВАНИИ
SMALLPOX VIRAL STRAIN GPA FOR STUDYING EFFICACY OF ANTIVIRAL PREPARATIONS in vivo AND ASSESSING REDUCTION ROUTINES UNDESIRED VACCINE REACTIONS ACCOMPANYING PRIMARY SMALLPOX VACCINATION

Изобретение относится к штаммам вируса осповакцины и может быть использовано в медицинской вирусологии при исследовании in vivo эффективности лечебных и профилактических препаратов, включая возможность их исследования по купированию побочного действия живых оспенных вакцин при проведении первичной вакцинации.
В связи с обширным перечнем противопоказаний к применению живых оспенных вакцин для вакцинации существует необходимость создания безопасных способов вакцинации, позволяющих исключить риск развития нежелательных поствакцинальных реакций и осложнений у вакцинируемых людей [Arvin A.M. and Patel D.M. Live Variola Virus: Considerations for Continuing Research. Committee on the Assessment of Future Scientific Needs for Live Variola Virus; Institute of Medicine.2009, P. 170; Борисевич С.В., Маренникова С.С, Логинова С.Я., Перекрест В.В., Краснянский В.П., Бондарев В.П., Рыбак С.И. Оспа обезьян: особенности распространения после отмены обязательного оспопрививания. Журнал микробиология, 2012; (2): 69-73].
Одной из основных причин невозможности проведения оспопрививания является наличие нарушений в иммунной системе макроорганизма: некоторые заболевания человека сопровождаются либо снижением функции иммунной системы, либо, наоборот, патологической активацией ее звеньев [Centers for Disease Control and Prevention. Smallpox vaccination and adverse reactions: guidance for clinicians. MMWR 2003; 52(No. RR-4): [inclusive page numbers]. При таких заболеваниях у человека, подлежащего прививанию против натуральной оспы, существует высокий риск развития поствакцинальных реакций и осложнений.
В случае возникновения эпидемической угрозы, обусловленной ортопоксвирусной инфекцией, будет необходима массовая вакцинация населения, как единственная эффективная на сегодняшний день мера борьбы с данными заболеваниями. В этой связи необходимы препараты и схемы их применения, позволяющие исключить или существенно снизить риск развития нежелательных поствакцинальных реакций и осложнений при прививании живыми оспенными вакцинами у лиц с нарушениями в иммунной системе. Кроме того, для лечения уже инфицированных или заболевших людей будут необходимы противовирусные препараты, обладающие лечебно-профилактической эффективностью в отношении ортопоксвирусных инфекций.
В этой связи для поиска средств купирования нежелательных реакций при противооспенной вакцинации, а также для разработки противовирусных препаратов, обладающих лечебно-профилактической эффективностью, необходимы модели, позволяющие оценивать эффективность препаратов и схем их применения у животных с оротопксвирусной инфекцией.
Предшествующий уровень техники
В настоящее время для поиска препаратов, обладающих лечебно-профилактической активностью в отношении ортопоксвирусных инфекций, используют аналоги предлагаемой разработки - разные штаммы ортопоксвирусов. Так, ST-246 в 8000 раз более активен, чем цидофовир, против ортопоксвирусов. Он оказался эффективным для блокирования репликации всех протестированных в лабораторных условиях ортопоксвирусов и для защиты мышей от заражения ортопоксвирусами [Yang, М., and Schneller S.W.. 5′-Homoaristeromycin. Synthesis and antiviral activity against orthopox viruses. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2005; 15 (1): 149-151; Quenelle, D.C, R.M. Buller, S. Parker, K.A. Keith, D.E. Hruby, R. Jordan, and E.R. Kern. 2007a. Effcacy of delayed treatment with ST-246 given orally against systemic orthopoxvirus infections in mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 51:689-695], кроликов [Nalca, A., J.M. Hatkin, N.L. Garza, D.K. Nichols, S.W. Norris, D.E. Hruby, and R. Jordan. 2008. Evaluation of orally delivered ST-246 as postexposure prophylactic and antiviral therapeutic in an aerosolized rabbitpox rabbit model. Antiviral Research 79:121-127] и земляных белок [Sbrana, E., R. Jordan, D.E. Hruby, R.I. Mateo, S.Y. Xiao, M. Siirin, P.C. Newman, A.P. Da Rosa, and R.B. Tesh. 2007. Effcacy of the antipoxvirus compound ST-246 for treatment of severe orthopoxvirus infection. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 76:768-773].
ST-246 в комбинации с CMX-001 проявляет синергетический антивирусный эффект против вируса осповакцины (ВОВ) и коровьей оспы у животных без повышения токсичности [Quenelle, D.С, М.N. Prichard, К.A. Keith, D.Е. Hruby, R. Jordan, G.R. Painter, A. Robertson, and E.R. Kern. 2007b. Synergistic effcacy of the combination of ST-246 with CMX001 against orthopoxviruses. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 51:4118-4124; Whitley, R. 2008. Development of Small Molecule Therapies of Orthopoxvirus Replication. Presentation to Committee, December 2008. Washington, DC].
Инбредные линии мышей также используются в моделях с применеием вируса оспы коров [Bray, М., М. Martinez, D.F. Smee, D. Kefauver, E. Thompson, and J.W. Huggins. Cidofovir protects mice against lethal aerosol or intranasal cowpox virus challenge. Journal of Infectious Diseases 2000; 181:10-19; Ferrier-Rembert, A., R. Drillien, B. Meignier, D. Garin, and J.M. Crance. Safety immunogenicity and protective efficacy in mice of a new cell-cultured Lister smallpox vaccine candidate. Vaccine 2007; 25(49):8290-8297] и оспы мышей [Fenner, F., 1949. Mouse-pox (infectious ectromelia of mice): A review. The Journal of Immunology 63: 341-373], этот вирус также вызывает летальную инфекцию у мышей. Модель мышь/вирус оспа коров широко схожа с моделью мышь/ВОВ и ценна тем, что при ее использовании может быть расширен диапазон представителей ортопоксвирусов, применяемых на одном виде хозяина для оценки мер возможного контроля ортопоксвирусной инфекции. Модель мышь/вирус оспа мышей несколько отличается от предыдущих моделей тем, что заболевание у мышей сопровождается их гибелью при введении малых доз вируса, в связи с чем данное заболевание можно рассматривать как модель высоковирулентной инфекции. Однако вирус оспы мышей не вызывает заболеваний у других животных, таких как, например, кролики или морские свинки, что, соответственно, ограничивает возможность оценки эффективности препаратов у разных видов животных, инфицированных одним видом ортопоксвирусов.
Также в качестве модели используют модель кролик/вирус миксомы. Тяжесть болезни у инфицированных этим вирусом европейских кроликов напоминает натуральную оспу, несмотря на то что оба вируса существенно разнятся в характере вызываемого ими заболевания. Точно также ведут себя и модели, основанные на использовании других вирусов, например ВОВ, вирус оспы коров и вирус оспы мышей [Stanford, М.М., S.J. Werden, and G. McFadden. 2007. Myxoma virus in the European rabbit: Interactions between the virus and its susceptible host. Veterinary Research 38: 299-318]. Однако вирус миксомы существенно отличается от ортопоксвирусов в антигенном отношении и поэтому не защищает европейских кроликов от миксоматоза. Кроме того, от данной инфекции не защищает и препарат ST-246, являющийся многообещающим кандидатом для противовирусной терапии ортопоксвирусных заболеваний.
ВОВ, включая его некоторые штаммы, является одним из наиболее широко используемых для изучения эффективности действия лечебно-профилактических препаратов вследствие его доступности, хорошей изученности и чувствительности к нему модельных лабораторных животных (кроликов и мышей) [Ferrier-Rembert, A., R. Drillien, В. Meignier, D. Garin, and J.M. Crance. Safety immunogenicity and protective efficacy in mice of a new cell-cultured Lister smallpox vaccine candidate. Vaccine 2007; 25(49): 8290-8297; Adams, M.M., A.D. Rice, and R.W. Moyer. 2007. Rabbitpox virus and vaccinia virus infection of rabbits as a model for human smallpox. Journal of Virology 81 (20): 11084-11095].
При исследовании влияния препарата Марборан (метисазон) у кроликов, привитых накожно штаммом дермовакцины ВОВ, на способность вируса выделяться из места поражения, возникающего в области введения дермовакцины, установили, что данный препарат оказывал некоторое подавление продукции вируса только при местном его применении [Kackell M.Y., Schneweis К.Е. u. Spiess Н. Untersuchungen uber die Wirkung von Marboran, Antivaccine-Hyperimmun-Serum und Vorimpfung mit Vaccineantigen auf die intracutane Pockenimpfung beim Kaninchen // 44. Jg. - 1966. - Heft 20. - P. 1199-1204].
Однако более достоверным подтверждением эффективности действия препаратов в отношении инфекции, вызванной ортопоксвирусами, является способность препаратов защищать животных от гибели.
Наиболее близким по технической сущности аналогом (прототипом) является штамм WR вируса осповакцины (ВОВ), используемый в качестве модели для интраназального введения животным при исследовании противооспенной активности препаратов [Grosenbach D.W., Jordan R., King D.S., Berhanu A., Warren Т.К., Kirkwood-Watts D.L., Tyavanagimatt Sh., Tan Y., Wilson R.L., Jones K.F., Hruby D.E. Immune responses to the smallpox vaccine given in combination with ST-246, a small-molecule inhibitor of poxvirus dissemination // Vaccine. - 2008. - Vol.26, N 7. - P. 933-946; Berhanu A., King D.S., Mosier S., Jordan R., Jones K.F., Hruby D.E. and Grosenbach D.W. ST-246 Inhibits In Vivo Poxvirus Dissemination, Virus Shedding, and Systemic Disease Manifestation // Antimicrob Agents Chemother. - 2009. - Vol.53, N 12. - P. 4999-5009]. Лабораторные мыши чувствительны к инфицированию многими штаммами ВОВ при интраназальном или аэрозольном методах введения. Заболевание у мышей, которое развивается при интраназальном заражении штаммом WR ВОВ, сопровождается гибелью этих животных в зависимости от вводимой дозы вируса. Хотя данная модель сопряжена с более быстрым наступлением болезни (инкубационный период - около 3 дней), чем при обычной оспе, и не характеризуется высыпаниями, она также была использована для сравнения эффективности новых и традиционных вакцин и для проведения исследований по антивирусной терапии [Law, М., М.М. Putz, and G.L. Smith. An investigation of the therapeutic value of vaccinia-immune IgG in a mouse pneumonia model. Journal of General Virology 2005; 86:991-1000; Abdalrhman, I., I. Gurt, and E. Katz. Protection induced in mice against a lethal orthopoxvirus by the Lister strain of vaccinia virus and modified vaccinia virus Ankara (MVA). Vaccine 2006; 24(19): 4152-4160].
Однако основным недостатком данного прототипа можно считать то, что штамм WR ВОВ, а также другие известные штаммы ВОВ не вызывают какого-либо клинически заметного заболевания у морских свинок, а также не приводят их к гибели.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание нового штамма ВОВ, вызывающего при интраназальном заражении морских свинок острую летальную инфекцию с более ярко выраженной клинической картиной, моделируя, таким образом, оспенное заболевание человека.
Указанный технический результат достигается получением штамма GPA вируса осповакцины для исследования in vivo эффективности противовирусных препаратов и оценки схем купирования нежелательных поствакцинальных реакций и осложнений при первичном оспопрививании, депонированного в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером № V-624.
Заявляемый штамм GPA ВОВ вызывает при интраназальном заражении морских свинок острую летальную инфекцию с ярко выраженной клинической картиной, моделируя, таким образом, оспенное заболевание человека, что позволяет проводить оценку эффективности купирования патологического действия ВОВ.
При интраназальном заражении указанным штаммом морских свинок, которым также вводят исследуемые препараты по лечебно-профилактической схеме и проводят последующее наблюдение за их выживаемостью в группах, обработанных препаратами в сравнении с группой контроля (нелеченые морские свинки) для исследования in vivo эффективности противовирусных препаратов и оценки схем купирования нежелательных поствакцинальных реакций и осложнений.
Характеристика заявляемого штамма. Штамм GPA ВОВ является представителем вида Vaccinia virus, рода Orthopoxviridae, семейства Poxviridae. Заявляемый штамм был получен на 8-м пассаже штамма Л-ИВП ВОВ на морских свинках, инфицированных интраназально и интрацеребрально. Вирус выделен из гомогената тканей легких морских свинок, инфицированных 7-м пассажем ВОВ. Выделенный штамм прошел 8 пассажей на интраназально и интрацеребрально инфицированных морских свинках и приобрел вирулентные свойства в сравнении с родительским штаммом, т.е. приводил к развитию клинических признаков заболевания, а именно: взъерошенность шерсти, ринит, конъюнктивит, снижение двигательной активности, отказ от пищи, нарушение частоты дыхания и хрипы. Кроме того, инфицирование штаммом GPA приводило к гибели морских свинок и накоплению вируса в высоких концентрациях (более 6,5 lg БОЕ/мл) в легких. Штамм депонирован в коллекцию культур микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»).
Источник получения. Из легких морских свинок, интраназально инфицированных ВОВ.
Адаптация штамма GPA вируса осповакцины к морским свинкам. Штамм Л-ИВП ВОВ адаптировали в серии последовательных пассажей через мозг и легкие морских свинок. Для этого интрацеребрально и интраназально инфицировали морских свинок штаммом Л-ИВП ВОВ в дозе 6,9 lg БОЕ/гол. Через 2 суток после инфицирования морских свинок умерщвляли (метод цервикальной дислокации), извлекали мозг и легкие, из которых готовили 10%-ные гомогенаты. Для 2-го пассажа морским свинкам интраназально и интрацеребрально вводили осветленную с помощью низкоскоростного центрифугирования (3000 об./мин) надосадочную жидкость 10%-ного гомогената мозга и легких от 1-го пассажа, содержащую 6,0 lg БОЕ/0,2 мл. Через двое суток животных умерщвляли, вскрывали, отбирали мозг и легкие, из которых готовили 10%-ные гомогенаты. Гомогенатом мозга и легких вновь интрацеребрально и интраназально инфицировали морских свинок в дозе 6,1 lg БОЕ/гол. (3-й пассаж). Процедуру повторяли для 4 и 5-го пассажей. Первую гибель морских свинок наблюдали после 5-го пассажа ВОВ. При проведении 6-го пассажа на морских свинках их инфицировали только интраназально осветленной надосадочной жидкостью 10%-ных гомогенатов мозга и легких 5-го пассажа.
Через 2-4 суток после заражения (п/з) наблюдали развитее клинической картины заболевания у морских свинок в виде взъерошенности шерсти, ринита, конъюнктивита, снижения двигательной активности, отказа от пищи, нарушения частоты дыхания и хрипов, а через 6-7 суток п/з регистрировали гибель морских свинок. У погибших через 6-7 суток п/з морских свинок отбирали легкие, готовили 10%-ный гомогенат, который вводили интраназально группе морских свинок для заключительных 7 и 8-го пассажей. Инфекционный титр вируса в органах инфицированных животных определяли методом титрования на культуре клеток Vero. После проведения восьмого, заключительного, пассажа 10%-ный гомогенат легких осветляли с помощью низкоскоростного центрифугирования (3000 об./мин). Концентрация штамма GPA ВОВ в надосадочной жидкости составила 6,9 lg БОЕ/мл. Осветленную надосадочную жидкость 8-го пассажа штамма GPA ВОВ проверяли на стерильность путем посева на питательные среды. Наличие в образце ВОВ подтверждали методом секвенирования и путем посева надосадочной жидкости на хорионаллантоисную оболочку (ХАО) развивающихся куриных эмбрионов с последующим контролем образования специфических поражений на ХАО (оспин).
2
Культуральные свойства. Штамм GPA ВОВ при культивировании на монослое клеток Vero (перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки) вызывает цитопатическое действие (ЦПД) в виде бляшек через 2-3 суток (температура культивирования 37°C в атмосфере с 5% CO).
Патогенность для человека. Штаммы ВОВ являются патогенными для человека и относятся к патогенным биологическим агентам (ПБА) IV группы по классификации Минздрава РФ.
Патогенность для млекопитающих
50
Штамм GPA ВОВ является вирулентным для морских свинок, а именно вызывает тяжелое заболевание, сопровождающееся взъерошенностью шерсти, ринитом, конъюнктивитом, снижением двигательной активности, отказом от пищи, нарушением частоты дыхания, хрипами и гибелью морских свинок при интраназальном заражении. Вирулентность штамма GPA ВОВ, выраженная в показателе 50%-ной летальной дозы (LD) вируса для морских свинок, составила 3,7±0,8 lg БОЕ/гол.
50
Кроме того, морские свинки в состоянии подавленной иммунной системы, вызванном трехкратным введением препарата «Циклофосфан» (пр-ва ОАО «Биохимик») в дозе 35 мг/кг с интервалом в 2 суток, более чувствительны к штамму GPA ВОВ. Вирулентность штамма GPA ВОВ, выраженная в показателе 50%-ной летальной дозы (LD) вируса для иммуноподавленных «Циклофосфаном» морских свинок, составила 2,6±0,4 lg БОЕ/гол.
Для длительного хранения штамм необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в пропорции 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса, хранящегося при температуре минус 70°C, в течение не менее пяти лет.
Для культивирования штамма в монослое культуры клеток Vero используют следующие питательные среды: DMEM, Игла MEM, RPMI 1640, содержащие 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина, а также 2% эмбриональной телячьей сыворотки.
Пример 1. Моделирование патологической реакции с летальным исходом у морских свинок при интраназальном инфицировании штаммом GPA вируса осповакцины для оценки эффективности купирующего или лечебно-профилактического действия препаратов или схем их применения.
В эксперименте участвуют 5 - групп морских свинок с массой тела 200-300 г, инфицированных штаммом GPA ВОВ и обработанных противовирусными препаратами (ингавирин, ликопид, НИОХ-14) в разных схемах.
50
Морским свинкам 1-й экспериментальной группы в количестве 8 голов вводили однократно перорально препарат ингавирин (пр-ва ОАО «Валента-Фармацевтика», Россия) в дозе 15 мг/кг, через 4 суток инфицировали интраназально 10 ЛД штамма GPA ВОВ. Сразу после заражения вводили перорально препарат ингавирин в дозе 15 мг/кг и экспериментальное соединение НИОХ-14 (химическое соединение 7-[N′-(4-трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.02,4]нон-8-ен-6-карбоновой кислоты) в дозе 50 мг/кг (патент РФ №2412160, МПК С07С2 43/38, опубл. 20.02.2011 г.).
50
Морским свинкам 2-й экспериментальной группы в количестве 8 голов вводили однократно перорально препараты ликопид (пр-ва ЗАО Пептек, Россия) в дозе 10 мг/голову и ингавирин в дозе 15 мг/кг, через 4 суток инфицировали интраназально 10 ЛД штамма GPA ВОВ. Сразу после заражения вводили перорально препараты ликопид в дозе 10 мг/голову и ингавирин в дозе 15 мг/кг.
50
Морским свинкам 3-й экспериментальной группы в количестве 8 голов вводили однократно перорально препарат ликопид в дозе 10 мг/голову, через 4 суток инфицировали интраназально 10 ЛД штамма GPA ВОВ. Сразу после заражения вводили перорально экспериментальное соединение НИОХ-14 в дозе 50 мг/кг.
50
Морских свинок 4-й экспериментальной группы в количестве 8 голов инфицировали интраназально 10 ЛД штамма GPA ВОВ. Сразу после заражения, и в течение двух дней п/з вводили перорально экспериментальное соединение НИОХ-14 в дозе 50 мг/кг.
50
Морским свинкам 5-й группы (контрольная группа) в количестве 8 голов вводили однократно перорально физ. раствор, через 4 суток инфицировали интраназально 10 ЛД штамма GPA ВОВ. Сразу после заражения, на следующий день и через день вводили перорально физ. раствор.
В течение 21 суток проводили наблюдение за гибелью животных в группах. В результате были получены данные, представленные в таблице 1.
Таблица 1
Влияние препаратов и схем их применения на выживаемость интраназально инфицированных штаммом GPA ВОВ морских свинок
Экспериментальные группы #
Показатели эффективности влияния препаратов на выживаемость морских свинок, инфицированных штаммом GPA ВОВ
% выживших животных
Коэффициент защиты, %
Уровень значимости отличий, р*
Группа 1
37,5
0
Группа 2
37,5
0
Группа 3
50
12,5
>0,05
Группа 4
100
62,5$
0,012
Группа 5
37,5
Примечание: # - подробное описание схем применения препаратов в группах дано по тексту,  - односторонний уровень надежности отличий (р) определяли с помощью точного теста Фишера, $ - достоверная защита животных в группе от летальной инфекции
Результаты исследования показали, что препарат НИОХ-14 в дозе 50 мг/кг в схеме трехкратного его применения, а именно: в день заражения и в течение двух дней п/з, достоверно защищает морских свинок от летальной инфекции, вызванной штаммом GPA ВОВ.
Таким образом, результаты свидетельствуют об эффективности купирования побочного действия вируса вакцины и выраженном лечебно-профилактическом действии экспериментального препарата НИОХ-14 в дозе 50 мг/кг в схеме трехкратного его применения.
Пример 2. Моделирование патологической реакции с летальным исходом у иммуноподавленных морских свинок при интраназальном инфицировании штаммом GPA вируса осповакцины для оценки эффективности купирующего или лечебно-профилактического действия препаратов или схем их применения.
Для оценки эффективности купирования побочного (летального) действия вируса вакцины с помощью препаратов (ингавирин, ликопид и противооспенная гипериммунная кроличья сыворотка) у иммуноподавленных морских свинок, инфицированных интраназально штаммом GPA ВОВ, использовали 36 морских свинок с массой тела 200-300 г. Морским свинкам (32 головы) трехкратно с интервалом в 2 суток вводили подкожно (в межлопаточную область) препарат «Циклофосфан» (пр-ва ОАО «Биохимик») в дозе 35 мг/кг. Через 5 суток после последнего введения препарата «Циклофосфан» проводили выборочно забор крови у 4 животных из группы, обработанной препаратом «Циклофосфан», а также у четырех морских свинок в контрольной группе, неполучавшей препарат «Циклофосфан». Наличие иммунодефицита определяли путем сравнения концентрации лейкоцитов в крови морских свинок, получавших «Циклофосфан» и неполучавших его. Данные приведены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние подкожного введения «Циклофосфана» на концентрацию лейкоцитов в крови морских свинок
Группы животных
Номер животного
Средняя концентрация лейкоцитов (кл/мл)
Уровень значимости отличий, р
Экспериментальная группа, получавшая «Циклофосфан»
1
1,4×10<sup>6</sup>
<0,025*
2
2,2×10<sup>6</sup>
3
1,7×10<sup>6</sup>
4
2,1×10<sup>6</sup>
Контрольная группа, неполучавшая «Циклофосфан»
1
8,7×10<sup>6</sup>
2
7,9×10<sup>6</sup>
3
8,8×10<sup>6</sup>
4
8,6×10<sup>6</sup>
Примечание: * концентрация лейкоцитов в группе контроля (морские свинки, неполучавшие «Циклофосфан»), достоверно выше, чем в группе опыта (морские свинки, обработанные «Циклофосфаном»). при сравнении непараметрическим методом Колмагорова-Смирнова
Результаты исследования показали, что концентрация лейкоцитов в крови обработанных «Циклофосфаном» морских свинок достоверно ниже, чем в крови морских свинок, неполучавших «Циклофосфан», что свидетельствуют о развившемся у них подавлении иммунной системы.
Морских свинок в количестве 32 голов с подавленной иммунной системой разделяли на 4 экспериментальные группы, а именно:
50
50
- 1-я экспериментальная группа в количестве 8 голов получала однократно перорально препарат ингавирин (пр-ва ОАО «Валента-Фармацевтика», Россия) в дозе 15 мг/кг, после чего морских свинок сразу инфицировали интраназальным способом 10 ЛД (показатель ЛД для иммуноподавленных морских свинок) штамма GPA ВОВ;
50
50
- 2-я экспериментальная группа в количестве 8 голов получала однократно перорально препарат ликопид (пр-ва ЗАО Пептек, Россия) в дозе 10 мг/голову, после чего морских свинок сразу инфицировали интраназально 10 ЛД (ЛД для иммуноподавленных морских свинок) штамма GPA ВОВ;
50
50
- 3-я экспериментальная группа в количестве 8 голов получала однократно подкожно 2 мл гипериммунной противооспенной кроличьей сыворотки с титром вируснейтрализующих антител 1:625, после чего морских свинок сразу инфицировали интраназальным способом 10 ЛД (ЛД для иммуноподавленных морских свинок) штамма GPA ВОВ;
50
50
- 4-я экспериментальная группа в количестве 8 голов получала однократно подкожно 2 мл физ. раствора, а также однократно перорально вводили физ. раствор в объеме 0,5 мл, после чего морских свинок сразу инфицировали интраназальным способом 10 ЛД (ЛД для иммуноподавленных морских свинок) штамма GPA ВОВ.
В течение 21 суток проводили наблюдение за гибелью животных в группах. В результате были получены данные, представленные в таблице 3.
Таблица 3
Влияние препаратов на выживаемость интраназально инфицированных штаммом GPA ВОВ иммуноподавленных «Циклофосфаном» морских свинок
Экспериментальные группы #
Показатели эффективности влияния препаратов на выживаемость морских свинок, инфицированных штаммом GPA ВОВ
% выживших животных
Коэффициент защиты, %
Уровень значимости отличий, р*
Группа 1
0
0
Группа 2
0
0
Группа 3
50
50$
0,04
Группа 4
0
Примечание: # - подробное описание схем применения препаратов в группах дано по тексту,  - односторонний уровень надежности отличий (р) определяли с помощью точного теста Фишера, $ - достоверная защита животных в группе от летальной инфекции
50
Результаты свидетельствуют о достоверной защите от смерти иммуноподавленных «Циклофосфаном» морских свинок, инфицированных интраназальным способом 10 ЛД штамма GPA ВОВ, которым до заражения подкожно вводили 2 мл гипериммунной противооспенной кроличьей сыворотки с титром вируснейтрализующих антител 1:625. Противооспенная гипериммунная кроличья сыворотка позволяет купировать побочное действие вируса вакцины и обладает лечебно-профилактическим действием.
Таким образом, из вышеизложенного (примеры 1 и 2) следует, что заявляемый штамм GPA ВОВ обеспечивает достижение заявляемого технического результата, а именно: вызывает при интраназальном заражении морских свинок острую летальную инфекцию с более ярко выраженной клинической картиной, моделируя, таким образом, оспенное заболевание человека, что позволяет исследовать in vivo эффективность противовирусных препаратов и оценивать схемы купирования нежелательных поствакцинальных реакций и осложнений при первичном оспопрививании.