СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВАГИНИТА У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА ПО УРОВНЮ ЭКСПРЕССИИ мРНК ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ ВО ВЛАГАЛИЩНЫХ МАЗКАХ
METHOD FOR DETECTING VAGINITIS IN FEMALES OF REPRODUCTIVE AGE BY EXPRESSION LEVEL OF mRNA OF CYTOKINE GENES IN VAGINAL SMEARS

1. Область техники
Изобретение относится к области медицины, акушерства, гинекологии, иммунологии и молекулярной биологии и может быть использовано для определения локальной воспалительной реакции во влагалище (диагностика неспецифического вагинита) у женщин репродуктивного возраста.
2. Уровень техники
Вагинит - воспаление слизистой оболочки влагалища, является одной из наиболее частых причин обращения женщин для консультации к врачу акушеру-гинекологу. Согласно данным IUSTI 2011 года (International Union against Sexually Transmitted Infections) основными причинами инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища являются бактериальный вагиноз (22-50%), вульвовагинальный кандидоз (17-39%) и трихомониаз (4-35%), а также аэробный вагинит [Sherrard J.]. В последние годы в России отмечена тенденция к снижению доли специфических вагинитов, обусловленных абсолютными патогенами (Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Treponema pallidum, Mycobacterium tuberculosis и Chlamydia trachomatis). При этом все большее распространение приобретают неспецифические вагиниты, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами (УГГМ), такими как грибы, стрептококки, стафилококки, кишечная палочка, а также облигатные анаэробы [Серов В.Н., Eckert L.O., Owen М.К.]. В норме в составе биоценоза доминируют лактобактерии, а УПМ представлены в незначительном количестве. Сдвиг баланса микробиоты в сторону увеличения доли УПМ приводит с дисбиотическим состояниям, которые характеризуются разнообразием клинических проявлений: от бессимптомного носительства до клинически выраженных признаков воспаления.
На сегодняшний день единственным лабораторным методом оценки воспалительной реакции и состояния локального иммунитета служит микроскопический метод подсчета количества лейкоцитов в поле зрения бинокуляра в нативном материале. Обнаружение во влагалищных мазках более 10 лейкоцитов в поле зрения микроскопа (более 20 у беременных женщин) является признаком воспаления. Установление более точных маркеров, описывающих состояние локального иммунитета, является крайне актуальным.
Известно, что персистирование патогенных и условно-патогенных микроорганизмов на слизистой влагалища приводит к стимуляции клеток иммунной системы и эпителия, что проявляется в изменении профиля цитокинов, экспрессируемых клетками. При взаимодействии высококонсервативных структур микроорганизмов с паттерн-распознающими рецепторами, прежде всего толл-подобными рецепторами ТЛР-2, ТЛР-4 на поверхности макрофагов, дендритных и других клетках врожденного иммунитета, происходит активация синтеза ряда провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1в, ИЛ-6, IL-8, IL-12) [Долгушина В.Ф., Medzhitov R.]. Вместе с тем научные разработки, полученные в отношении диагностической и прогностической значимости иммунологических показателей в алгоритме диагностики воспалительных состояний влагалища на сегодняшний день не нашли широкого применения [Campos A. et. al., 2012; Hickey D. et. al., 2011].
В данном патенте предложен метод определения локальной воспалительной реакции, необходимой для верификации диагноза вагинит. К преимуществам предложенного способа диагностики локального воспаления с помощью определения экспрессии мРНК генов цитокинов можно отнести возможность одновременного исследования полученного биоматериала на наличие абсолютно и условно-патогенных микроорганизмов с помощью метода полимеразной цепной реакции, который все чаще применяется для установления этиологического агента заболевания. Предложенный метод может быть полностью автоматизирован.
Предложенный способ определения локальной воспалительной реакции может быть особенно актуальным в тех случаях, когда этиологический агент заболевания остается неустановленным. По данным литературы до 30% случаев заболевания могут быть представлены вагинитами неясного генеза [Anderson M.R.].
Из данных зарубежной литературы патентов и патентных заявок на использование измерения уровня мРНК цитокинов во влагалищных мазках для диагностики вагинитов не известно. Наиболее близким аналогом является следующий патент:
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ ВЛАГАЛИЩА (патент РФ №2391664 С2) от 10.06.2010 г. Изобретение относится к медицине, в частности к дерматовенерологии и гинекологии. Предложен способ ранней иммунодиагностики вульвовагинальных инфекций. Диагностику инфекций влагалища проводят путем установления клинических признаков, определения количества лейкоцитов, эпителия, лактобактерий, проведения pH-метрии вагинального отделяемого и аминотеста. Дополнительно исследуют секреторный иммуноглобулин A (sIgA) и при его значении 200,5±26,3 диагностируют аэробный вагинит. При значении sIgA 168±29,9, pH более 5,6-6,0 и положительном аминотесте диагностируют бактериальный вагиноз. При значении sIgA 172,1±53,2, pH, не превышающем 6,2, и наличии лейкоцитов в присутствии трихомонад диагностируют трихомониаз. При значении sIgA 375,61±23,1, pH 4,0-4,5 и отрицательном аминотесте диагностируют кандидоз, значение sIgA 248,4±18,8 соответствует отсутствию инфекций.
3. Описание изобретения
Предложен способ диагностики вагинита путем оценки уровня мРНК определенных генов цитокинов в клетках вагинальных соскобов.
В частности, предложен способ диагностики вагинитов у женщин репродуктивного возраста путем определения индексов отношений уровней экспрессии мРНК генов TLR4/GATA3 и TNF/L18.
В клетках влагалищных соскобов женщин репродуктивного возраста с вагинитами грибковой, бактериальной и смешанной грибково-бактериальной этиологии по сравнению с контрольной группой существенно возрастает относительное количество мРНК генов TLR4 и TNF и снижается относительное количество IL18 и GATA3.
Для оценки уровня представленности мРНК исследуемых генов в мазках используются методы обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с регистрацией накопления продуктов реакции в режиме «реального времени».
На основании экспериментальных данных при сравнении женщин с неспецифическими вагинитами грибковой, бактериальной и смешанной грибково-бактериальной этиологии и условно-здоровых женщин без признаков воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы были получены и проанализированы результаты с применением методов математической статистики (бинарная логистическая регрессия), выбрана линейная функция, позволяющая вычислить вероятность наличия заболевания.
Уравнение функции имеет вид:
z=l,4*ln([TLR4]/[GATA3])+l,3*ln([TNF]/[IL18])+7,8 (формула 1),
где [TLR4]/[GATA3], [TNF]/[IL18] - отношение уровней экспрессии мРНК соответствующих генов.
Отношение уровней экспрессии исследуемых генов определяют по формулам:
GATA3
TLR4
[TLR4]/[GATA3]=2^(Cp-Cp) (формула 2)
IL18
THF
[TNF]/[IL18]=2^(Cp-Cp) (формула 3),
где Ср - значение порогового цикла соответствующего маркера в образце, определяемого автоматически.
Вероятность вагинита определяют по формуле:
-z
р=1/(1+е)*100% (формула 4).
Оптимальное значение величины порога отсечения (точки cut off) определено с помощью ROC-анализа (Receiver Operator Characteristic). Основой данного анализа является построение ROC-кривой, которая показывает зависимость количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров. Критерием выбора точки cut off выбрано требование максимальной суммарной чувствительности и специфичности модели.
-21
Для небеременных женщин площадь под ROC-кривой составила AUC=0,989±0,007 (p=3,4×10). Пороговое значение вероятности воспаления составило 57% (P=57%). Значения показателей P выше 57% следует классифицировать как маркер вагинитов. Чувствительность и специфичность предложенного метода - 95,4% и 96,2% соответственно.
-11
Для беременных женщин площадь под ROC-кривой составила AUC=0,985±0,015 (p=1,9×10). Пороговое значение вероятности воспаления составило 68,5% (P=68,5%). Значения показателей P выше 68,5% следует классифицировать как маркер вагинитов. Чувствительность и специфичность предложенного метода - 100% и 96% соответственно.
Ограничение метода - применение антибиотиков и антимикотических препаратов менее чем за месяц до исследования.
4. Реализация изобретения
4.1. Взятие материала
Взятие влагалищных соскобов осуществляют с помощью специальных зондов. Во избежание деградации сразу после взятия материала зонд погружают в пластиковую пробирку объемом 1,5 мл, в которую предварительно внесено 500 мкл транспортной среды для РНК. В качестве транспортной среды используется лизирующий раствор (Комплект реагентов “Проба НК”, регистрационное удостоверение № ФСР 2008/02938 от 4 мая 2010 г., ДНК-Технология, Россия). Зонд вращают в течение 10-15 секунд, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, отжав избыток жидкости, прижимая зонд к стенке пробирки, удаляют зонд, закрывают пробирку. Пробирку доставляют в лабораторию в течение 2 часов либо хранят при температуре 4-8°C в течение 1 суток.
Образцы можно хранить при температуре -20°C в течение 3 месяцев или при температуре -70°C в течение 1 года.
4.2. Выделение нуклеиновых кислот
Выделение РНК производят с использованием комплекта реагентов “Проба НК” или другим любым сопоставимым методом (с использованием колонок, магнитных частиц, сорбентов).
На этапе выделения РНК можно использовать только наконечники с маркировкой «RNAase-free, DNAase-free».
4.2.1. Пробирки, содержащие анализируемый материал в транспортной среде для РНК, разморозить при комнатной температуре. Осадить капли со стенок пробирок путем центрифугирования при 13000 об/мин в течение 15 сек. Довести объем образца до 500 мкл, добавив лизирующий раствор (комплект реагентов “Проба НК”). Встряхнуть пробирки на вортексе в течение 30 сек.
4.2.2. Прогреть пробирки при 65°C в течение 10 мин. Осадить капли со стенок путем центрифугирования при 13000 об/мин в течение 15 сек.
4.2.3. Добавить 500 мкл реагента для преципитации и встряхнуть пробирки на вортексе в течение 3-5 с.
4.2.4. Центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 15 мин.
4.2.5. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником.
4.2.6. Добавить к осадку 500 мкл промывочного раствора №1, закрыть крышки пробирок и перемешать, 3-5 раз аккуратно перевернув пробирки.
4.2.7. Центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 5 мин.
4.2.8. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником.
4.2.9. Добавить к осадку 300 мкл промывочного раствора №2, закрыть крышки пробирок и перемешать, 3-5 раз аккуратно перевернув пробирки.
4.2.10. Центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 5 мин.
4.2.11. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником.
4.2.12. Открыть крышки пробирок и высушить осадок при 65°C в течение 5 мин.
4.2.13. Добавить к осадку 100 мкл буфера для растворения и прогреть пробирки при 65°C в течение 10 мин, осадить конденсат центрифугированием при 13000 об/мин в течение 30 с.
Полученный препарат РНК/ДНК сразу использовать для постановки реакции обратной транскрипции. Оставшийся материал хранить при минус 70°C в течение 1 года, а также можно использовать для выявления ДНК патогенных и УПМ.
Для исключения коамплификации геномной ДНК желательно расположить праймеры на стыках экзонов. Тогда перед проведением обратной транскрипции не требуется обработка образцов ДНК-азой, т.к. при постановке ПЦР используются праймеры, не отжигающиеся на геномной ДНК.
4.3. Проведение реакции обратной транскрипции
4.3.1. Промаркировать необходимое количество новых пластиковых пробирок объемом 0,5 мл с учетом пробирок для отрицательного контрольного образца «К-».
4.3.2. Разморозить ОТ-буфер (4-кратный) и смесь дНТФ (концентрация 2,5 мМ каждого) и праймеров для обратной транскрипции (специфические олигонуклеотиды) при комнатной температуре (18-25°C), затем встряхнуть пробирки на вортексе в течение 3-5 с и осадить капли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 с.
4.3.3. В отдельной пластиковой пробирке приготовить ОТ-смесь путем смешивания ОТ-буфера, смеси праймеров+ дНТФ и обратной транскриптазы:
4,0×(N+1) мкл «ОТ-буфера»,
2,0×(N+1) мкл «смеси праймеров и дНТФ,
1,0×(N+1) мкл обратной транскриптазы,
где (N+1) - количество анализируемых образцов с учетом «К-» (N) с запасом на 1 образец.
4.3.4. По 7 мкл ОТ-смеси внести в промаркированные пробирки.
4.3.5. В пробирки с ОТ-смесью внести по 33 мкл соответствующего образца РНК (или образца «К-»), используя отдельные наконечники для каждого образца.
4.3.6. Пробирки встряхнуть на вортексе в течение 3-5 с и осадить капли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 с.
4.3.7. Пробирки поместить в термостат и инкубировать при температуре 40°C в течение 30 мин, затем при температуре 95°C в течение 5 мин.
4.3.8. Осадить конденсат центрифугированием при 13000 об/мин в течение 30 с.
Полученный препарат кДНК готов для проведения ПЦР.
Хранить кДНК можно при температуре минус 20°C в течение 1 года.
Перед постановкой ПЦР необходимо развести препарат кДНК, добавив 40 мкл ТЕ-буфера.
4.4.Проведение ПЦР
Для проведения ПЦР одновременно в постановке исследовать все изучаемые гены.
4.4.1. Разморозить при комнатной температуре (18-25 С) ПЦР-буфер, затем тщательно перемешать на вортексе и осадить капли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 с.
прим.
4.4.2. Для каждого образца кДНК промаркировать по 2 пробирки с запечатанной парафином реакционной смесью* по 2 пробирки на каждый онкомаркер и каждый референсный ген.
*Реакционная смесь объемом 20 мкл содержит ПЦР-буфер, дНТФ, специфические праймеры (прямой и обратный), специфические олигонуклеотиды, несущие флуоресцентную метку. Для обеспечения горячего старта реакционная смесь запечатывается под парафин.
4.4.3. В отдельной пластиковой пробирке, предварительно перемешав реагенты, приготовить смесь ПЦР-буфера с Taq-полимеразой:
10×(N+1) мкл ПЦР-буфера,
0,5×(N+1) мкл Taq-полимеразы,
где N+1 - количество анализируемых образцов с учетом (К-) и (К+), кДНК-СТ (N) с запасом на 1 образец.
Смесь можно хранить при комнатной температуре (18-25°C) не более 1 ч.
4.4.4. Перемешать приготовленную смесь ПЦР буфера с Taq-полимеразой на вортексе и осадить капли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 с.
4.4.5. Во все амплификационные пробирки, не повреждая слой парафина, добавить по 10 мкл тщательно перемешанной смеси ПЦР-буфера с Taq-полимеразой.
4.4.6. В каждую пробирку добавить по 1 капле (20 мкл) минерального масла, закрыть пробирки.
4.4.7. Внести в амплификационные пробирки, не повреждая слой парафина, по 5,0 мкл препарата кДНК.
4.4.8. В пробирки, промаркированные (К-), внести по 5,0 мкл отрицательного контрольного образца.
4.4.9. Закрыть крышки пробирок.
4.4.10. Осадить капли со стенок пробирок. Для этого провести центрифигирование при 1000 об/мин в течение 3-5 с.
4.4.11. Установить все пробирки в блок амплификатора и провести ПЦР в режиме, приведенном в таблице 1, с учетом объема реакционной смеси, равного 35 мкл.
Таблица 1
Режим амплификации для детектирующего амплификатора «DTprime» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»)
№№ пп.
Температура
Время
Количество циклов
1
80°C
1 мин
1
94°C
1 мин
2
94°C
10 с
50
64°C*
20 с
3
10°C
Хранение
* - регистрация результатов
4.5. Регистрация, учет, обработка и представление результатов
Регистрация и учет результатов амплификации проводится с помощью детектирующего амплификатора DTprime (ДНК-Технология, Россия), осуществляется прибором автоматически во время амплификации. Оформление протокола (тип анализа «Качественный», метод определения «Геометрический») и анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору («Руководство по эксплуатации»).
Полученные автоматически в ходе реакции значения пороговых циклов генов цитокинов (Cp) позволяют определить отношения уровней экспрессии соответствующих генов (формулы 2 и 3). На основании полученных уровней экспрессии вычисляется значение линейной функции z (формула 1). Далее вычисляется вероятность (P) локальной воспалительной реакции (формула 4). Если значение P≤57% (P≤68,5% для беременных) делается заключение об отсутствии вагинита. Значения P>57% (P>68,5% для беременных) соответствуют вагиниту.
Примеры использования изобретения
Пример №1. Проведено клинико-лабораторное обследование 50 беременных женщин без признаков вагинита и других воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы. Из них согласно предложенной методике вероятность локальной воспалительной реакции P<50% определена у 46 пациенток, 50<P<68% - у 2 пациенток, что может рассматриваться как отсутствие вагинита. У двух пациенток получен ложноположительный результат (P=70% и 99%).
Пример №2. Проведено клинико-лабораторное обследование 24 беременных женщин с вагинитами бактериальной и грибковой этиологии. Во всех случаях подтверждено наличие локальной воспалительной реакции.
Образец №
Вероятность локальной воспалительной реакции, P, %
Вагинит бактериальной этиологии
67
100
71
80
72
99
90
96
122
100
124
81
Вагинит, обусловленный Candida albicans
65
100
80
93
104
96
110
77
133
70
134
70
136
92
146
97
148
99
Вагинит неясной этиологии
59
97
92
94
125
96
142
82
144
86
145
100
147
100
163
99
164
98
Пример №3. Вульвовагинальный кандидоз у беременных женщин более чем в 40% случаев протекает без жалоб и выраженных клинических проявлений, так называемое кандидоносительство [Jensen J.S.]. С помощью предложенного метода обследованы 11 беременных женщин, у которых во влагалище обнаружены грибы Candida albicans при отсутствии жалоб и воспалительной реакции.
Образец №
Вероятность локальной воспалительной реакции, P, %
63
6
81
9
88
29
93
1
95
35
99
1
102
1
103
28
121
0
127
12
130
3
Пример №4. Проведено клинико-лабораторное обследование 79 женщин репродуктивного возраста от 19 до 45 лет без признаков вагинита и других воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы. Из них согласно предложенной методике вероятность локальной воспалительной реакции P<50% определена у 75 пациенток, P=53% - у 1 пациентки, что может рассматриваться как отсутствие вагинита. У 3 пациенток получен ложноположительный результат (P=94%, 92% и 78%).
Пример №5. Проведено клинико-лабораторное обследование 196 женщин репродуктивного возраста от 19 до 45 лет с вагинитами бактериальной, грибковой этиологии, смешанной и неясной этиологии. У 187 женщин вероятность локальной воспалительной реакции превышала 57%, что подтверждает диагноз вагинит.
Заключения, сделанные на основании предложенного метода, подтверждены клиническими данными, результатами бактериальных посевов и ПЦР-анализа, а также результатами микроскопии окрашенных по Граму влагалищных мазков. При проведении ПЦР-анализа использованы следующие тест-системы:
- набор реагентов для исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени (ФЕМОФЛОР) (регистрационное удостоверение № ФСР 2009/04663 от 26 апреля 2010 г., ДНК-Технология, Россия);
- комплект реагентов для ПНР амплификации ДНК Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis в режиме реального времени (TNC комплекс) (регистрационное удостоверение № ФСР 2011/10428 от 31 марта 2011 г., ДНК-Технология, Россия).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Долгушина В.Ф., Долгушин И.И., Телешова Л.Ф.. Местный иммунитет половой системы у беременных с генитальной инфекцией // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2000. - №2. - С.92-95.
2. Серов В.Н.. Рациональная терапия влагалищных инфекций // Гинекология. - 2005. - Т.7. - №2.
3. Anderson M.R., Klink K., Cohrssen A. Evaluation of vaginal complains // JAMA. - 2004. - Vol.291. - p.1368-1379.
4. Campos A.C., Murta E.F., Michelin M.A., Reis C. Evaluation of Cytokines in Endocervical Secretion and Vaginal pH from Women with Bacterial Vaginosis or Human Papillomavirus // ISRN obstetrics and gynecology. - 2012. - Vol.2012. P.342075.
5. Eckert L.O. Clinical practice. Acute vulvovaginitis // N Engl J Med. - 2006. - Vol.21, N355(12). - p.1244-1252.
6. Hickey D.K., Patel M.V., Fahey J.V., Wira C.R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections // Journal of reproductive immunology. - 2011. - Vol.88. - №2. - P.185-194.
7. Jensen J.S., Sherrard J., Bonders G., White D. Guideline on the Management of Vaginal Discharge. 2011 European (IUSTI/WHO). 2011; 1-23.
8. Medzhitov R, Janeway CA. Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition // Cell. - 1997. - Vol.31, N91(3). - p.295-298.
9. Owen M.K., Clenney T.L. Management of vaginitis. American Family Physician // 2004. - Vol.70. - p.2125-2132.
10. Sherrard J., Donders G., White D., Jensen J.S. European (IUSTI/WHO) guideline on the management of vaginal discharge, 2011 // International journal of STD & AIDS. - 2011. - Vol.22. - №8. - P.421-429.