СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ БИОВАРА БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER BAUMANNII BV. TRYPTOPHANDESTRUENS
METHOD FOR IDENTIFYING ACINETOBACTER BAUMANNII BV. TRYPTOPHANDESTRUENS

Изобретение относится к области биотехнологии. Может быть использовано при бактериологических исследованиях по идентификации биовара A.baumannii bv. tryptophandestruens, а также в производстве питательных сред для этих исследований.
3
4
4
3
2
4
2
4
2
4
4
Известен способ идентификации биовара бактерий A. baumannii bv. tryptophandestruens (Сиволодский Е.П., Краева Л.А., Старкова Д.А., Михайлов Н.В., Горелова Г.В. Acinetobacter baumannii bv. tryptophandestruens bv. nov., выделенный из клинического материала. Инфекция и иммунитет 2021, Т. 11, №5, с. 965-972..doi.org/10.15789/2220-7619-ABB-1676). Авторы представили первое описание основных генетических и фенотипических характеристик биовара tryptophandestruens A. baumannii. Бактерии этого биовара имели специфическую совокупность признаков, отличающих их от штаммов А. baumannii и других видов бактерий группы A. baumannii: наличие хромо-генной биотрансформации L-триптофана (антранилатным путем) и антрани-ловой кислоты при однозначном отсутствии этих признаков у других бактерий; отсутствие утилизации гиппурата натрия и L-арабинозы при однозначном наличии утилизации у других бактерий; отсутствие утилизации L-триптофана, путресцина, L-орнитина при наличии утилизации у большинства штаммов других видов. Авторы предлагали осуществлять идентификацию бактерий биовара A.baumannii bv. tryptophandestruens в лабораториях любого уровня тестами на хромогенную биотрасформацию L-триптофана и утилизацию гиппурата натрия. Тест на хромогенную биотрансформацию антраниловой кислоты не предлагали использовать, ввиду ограничения доступа лабораторий к этому веществу как прекурсору наркотических средств. В соответствии с способом для биотрансформации L-триптофана и других ароматических аминокислот применяли жидкие и плотные питательные среды. Состав жидкой среды: пептон ферментативный 1 г; NaCI 0,5 г; L-триптофан 0,5 г; вола дистиллированная 100 мл; рН 7,0; стерилизация при 121°С 20 мин. Другие аминокислоты использовали в среде по 0,5%; антраниловую кислоту 0,3% Плотную питательную среду готовили следующим образом: в колбу с 200 мл расплавленного стерильного колумбийского агара вносили 0,2 г L-триптофана,, кипятили до его растворения, добавляли 1 мл 10% водного раствора FCI и 1N раствор NaOH до рН 7,0, разливали в стерильные чашки Петри. Другие аминокислоты вносили в среды по 0,1%. Методика биотрансформации ароматических аминокислот на плопной питательной среде: предварительно суточные агаровые культуры исследуемых бактерий суспендировали по полной петле в 0,2 мл 0,85% раствора хлорида натрия в лунках стерильных полимерных планшетов, засевали по полной петле взвеси из лунки радиальным штрихом на сектор сред с субстратом (L-триптофан, другие ароматические аминокислоты) и без субстрата (контроль), инкубировали аэробно при 37°С в течение 24-48 ч; положительным результатом хромогенной биотрансформации субстрата считали появление четко выраженного изменения окраски газона бактерий и/или окружающей его питательной среды (темно-коричневая окраска) при отсутствии изменения окраски контрольной среды. Утилизацию субстратов в качестве единственного источника углерода осуществляли на минимальном солевом агаре (г/л): NHCI-5; NHNO-I; NaSO-2; KHPO-3; KHPO-1; MgSO-0,1; агар - 15; 1,6%-ный водный раствор бромтимолового синего - 4 мл; дистиллированная вода - 1 л; рН 7,2; стерилизация при 121°С - 20 мин. Каждый субстрат вносили по 0,1 г в отдельную колбу с 50 мл стерильной горячей среды, устанавливали рН 7,2; в одну колбу субстрат не вносили (контроль среды), разливали в стерильные чашки Петри. Использовали субстраты: гиппурат натрия, L-арабиноза, L-триптофан, L-орнитин гидрохлорид (Merck, Германия).Методика утилизации субстратов в качестве единственного источника углерода. Суточные агаровые культуры бактерий по полной петле (диаметром 2 мм) суспендировали в 0,2 мл 0,85% раствора хлорида натрия в лунках полимерного планшета. Чашки сред с субстратом (состав сред указан выше) и контрольную среду без субстрата разделяли на 8 секторов и маркировали по номерам штаммов. Засевали исследуемые культуры по полной петле взвеси из лунок радиальным штрихом на сектора сред. Посевы выращивали аэробно при 37°С в течение 3 суток, просматривая ежедневно. Положительным результатом утилизации субстрата считали наличие четко выраженного газона бактерий по следу посева при отсутствии роста бактерий на контрольной среде без субстрата. Дальнейшие наши исследования после опубликования указанной статьи показали значительное распространение биовара A.baumannii bv. tryptophandestruens среди клинических штаммов, однако, обнаружили единичные атипичные штаммы этого биовара отрицательные по хромогенной биотрансформации L-триптофана, что снижало диагностическую чувствительность идентификации биовара по способу этого аналога. Другие аналоги способа не известны.
Прототипом заявляемого способа нами избран способ фенотипической идентификации биовара бактерий A.baumannii bv. tryptophandestruens по статье (Сиволодский Е.П., Краева Л.А., Старкова Д.А., Михайлов Н.В., Горелова С.В. Acinetobacter baumannii bv. tryptophandestruens, выделенный из клинического материала. Инфекция и иммунитет.2021, Т.11, №5, с. 965-972.doi.org/10.15789/2220-7619-ABB-1676), так как он наиболее близок заявляемому способу по совокупности существенных признаков.
Недостатком прототипного способа является снижение диагностической чувствительности идентификации бактерий биовара A.baumannii bv. tryptophandestruens, ввиду неточной идентификации атипичных штаммов биовара с отсутствием хромогенной биотрансформации L-триптофана.
Целью изобретения является повышение диагностической чувствительности способа идентификации биовара бактерий A.baumannii bv. tryptophandestruens.
3
2
3
2
В соответствии с изобретением поставленная цель достигается тем, что исследуемую суточную агаровую культуру бактерий A. baumannii засевают в виде бляшки диаметром 5 мм на поверхность плотной питательной среды, содержащей пептон ферментативный, NaCI, субстрат для хромогенной реакции бензоат натрия (или бензоат калия, или бензойную кислоту), FeCl6HO, бромтимоловый синий, NaOH для корректировки рН, агар микробиологический, дистиллированную воду при следующем содержании ингредиентов: пептон ферментативный 5,0 г; NaCI 5,0 г; бензоат натрия (или бензоат калия, или бензойная кислота) 1,0-2,0 г; FeCI 6HO (10% водный раствор) 0,1-1 мл; бромтимоловый синий (1,6% водный раствор) 3 мл; агар микробиологический 15,0 г; NaOH (4% раствор) 2,6-3 мл или 15,5-30 мл; вода дистиллированная 1 л; при этом бензоат натрия (или бензоат калия, или бензойную кислоту) вносят после растворения при нагревании всех остальных компонентов; устанавливают рН среды 7,2±0,2; стерилизуют среду при 121°С в течение 20 мин; инкубируют посевы аэробно при 37°С в течение 18-24 ч; определяют принадлежность бактерий к биовару tryptophandestruens А. baumannii по прявлению темно-коричневой окраски питательной среды вокруг газонов исследуемых бактерий. Примечание: бактериологический контроль качества питательной среды заявляемого способа проводят при изготовлении среды; суточные агаровые культуры контрольных штаммов (клинические штаммы A. baumannii и A. baumannii bv. tryptophandestruens) засевают по одной петле в виде бляшки диаметром 5 мм на поверхность испытуемой среды в чашках Петри, инкубируют аэробно при 37°С в течение 18-24 ч, учитывают результат - питательная среда пригодна к использованию, если вокруг газона штамма A. baumannii bv. tryptophandestruens имеется четко выраженная зона темно-коричневой окраски питательной среды (положительный контроль) при отсутствии зоны окраски питательной среды вокруг газона штамма A. baumannii (отрицательный контроль). Готовая питательная среда в чашках Петри пригодна к использованию в течение 30 суток при хранении от 4°С до 8°С.
Отличительный существенный признак способа - применение в составе питательной среды заявляемого способа бензоата натрия или бензоата калия, или бензойной кислоты в качестве субстрата для специфической цветной реакции бактерий биовара A. baumannii bv. tryptophandestruens. Этот признак не применялся в прототипе. Бензоат натрия (CAS 532-32-1), бензоат калия (CAS 582-25-2), бензойная кислота (CAS 65-85-0) известные вещества, которые широко используют в биотехнологии в качестве консервантов пищевых продуктов (пищевые добавки Е 211, Е 212, Е 210, соответственно). Из уровня техники не известна цветная биотрансформация этих веществ бактериями, в том числе A. baumannii. Нами впервые неожиданно в эксперименте выявлено неизвестное ранее свойство бензойной кислоты и ее солей бензоата натрия и бензоата калия осуществлять цветную биотрансформацию при взаимодействии с бактериями биовара A. baumannii bv. tryptophandestruens. Отличительный существенный признак не следует очевидным образом из уровня техники. Хромогенная биотрансформация бактериями этого биовара обнаружена нами только у некоторых химических соединений на основе бензойной кислоты: бензойная кислота, бензоат натрия, бензоат калия, орто-амино-бензойная кислота (антраниловая кислота); не обнаружена - у орто-гидро-бензойной кислоты, пара-амино-бензойной кислоты; была вариабельной у гиппурата натрия (N- бензоил глицин натрия). При изучении нами 88 штаммов A. baumannii, выделенных в 2021 году в Санкт-Петербурге, было установлено, что все типичные и атипичные штаммы A. baumannii bv. tryptophandestruens (n-28) осуществляли хромогенную биотрансформацию бензоата натрия, бензоата калия, бензойной кислоты, а также впервые выявлена хромогенная биотрансформация антраниловой кислоты атипичными штаммами этого биовара (табл.1). Не обнаружена нами хромогенная биотрансформация бензоата натрия и бензойной кислоты на питательной среде заявляемого способа бактериями других видов рода Acinetobacter - A. nosocomial (n-8), A. pittii (n-8), A.calcoaceticus (1), A.baylyi (n-6), а также 34 видов других 22 родов (Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Alcaligenes, Shewanella, Klebsiella, Proteus, Morganella, Providencia, Echerichia, Shigella, Salmonella, Kluyvera, Serratia, Hafnia, Enterobacter, Citrobacter, Yersinia, Vibrio,
Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus), что указывает на специфичность этой хромогенной биотрансформации как маркера бактерий биовара A.baumannii bv. tryptophandestruens. Сравнительное изучение диагностической чувствительности идентификации бактерий биовара tryptophandestruens прототипным и заявляемым способами 88 первичных штаммов A. baumannii, выделенных в 2021 г. в Санкт-Петербурге, показало, что прототипным способом (по наличию хромогенной биотрансформации L-триптофана и отсутствию утилизации гиппурата натрия) были идентифицированы 20 (22,7±4,46%) типичных штаммов биовара, заявляемым спсобом (по наличию хромогенной биотрансформации бензоата натрия) - 28 (31,2±4,93%) типичных и атипичных штаммов этого биовара, то-есть больше на 8,5%) штаммов (табл.2). Следовательно, отличительный существенный признак непосредственно определяет решение поставленной технической задачи повышения диагностической чувствительности способа идентификации бактерий биовара А. baumannii bv. tryptophandestruens. Механизм достижения технического результата представлен только в материалах данной заявки. Химическая сущность хромогенной биотрансформации бензойной кислоты и ее солей (бензоата натрия, бензоата калия) еще неизвестна и подлежит специальному химическому исследованию.
3
2
Существенными признаками способа являются: использование свежей (суточной) агаровой культуры исследуемых штаммов A. baumannii; посев ее на поверхность плотной питательной среды (радиальным штрихом или в виде бляшки) и аэробная инкубация при 37°С в течение 18-24 ч, так как этот режим культивирования оптимален для аэробных микроорганизмов; состав питательной среды, включающий пептон ферментативный (источник питательных веществ), натрий хлорид; FeCI 6HO, повышающий интенсивность специфической цветной окраски питательной среды (однако, специфическая цветная реакция происходит и визуально выявляется и без этого вещества); 1,6% водный раствор бромтимолового синего, позволяющий постоянно контролировать необходимый рН среды; NaOH для коррекции рН среды; режим стерилизации питательной среды при 121°С; визуальный учет биотрансформации бензоата натрия (или бензоата калия, или бензойной кислоты) по появлению специфической темно-коричневой окраски питательной среды вокруг газона исследуемых бактерий.
Примеры, подтверждающие возможность осуществления способа.
Пример 1. Исследуемый материал - суточные агаровые культуры бактерий A. baumannii трех штаммов №1, №2, №3 засевают петлей в виде бляшки диаметром 5 мм на поверхность питательной среды заявляемого способа в отдельных секторах чашки Петри (1/4 часть чашки). Посевы инкубируют аэробно при 37°С в течение 18 ч, затем учитывают результат. На секторах с штаммами №1 и №2 видна вокруг газонов бактерий интенсивная темно-коричневая окраска питательной среды, что указывает на принадлежность штаммов A. baumannii №1 и №2 к биовару tryptophandestruens. Контрольная проверка шаммов №1 и №2 по такой же методике на питательной среде заявляемого способа, в которой бензоат натрия был заменен L-триптофаном в таком же количестве, показала наличие темно-коричневой окраски питательной среды вокруг газона бактерий только штамма №1, следовательно, заявляемый способ позволяет идентифицировать типичные штаммы (штамм №1) и атипичные по биотрансформации L-триптофана штаммы (штамм №2) биовара A. baumannii bv. tryptophandestruens.
3
2
Примечание к примеру 1. Методика приготовления питательной среды заявляемого способа. В 1 л дистиллированной воды вносят: пептон ферментативный 5,0 г; NaCI 5,0 г; FeCI6HO (10% водный раствор) 0,1 мл; бром-тимоловый синий (1,6% водный раствор) 3 мл; агар микробиологический 15,0 г; NaOH (4% раствор) 2,6 мл; растворяют при нагревании все компоненты, затем добавляют бензоат натрия (CAS 532-32-1) 1,0 г; коррелируют рН 7,2±0,2; стерилизуют при 121°С в течение 20 мин; разливают в стерильные чашки Петри. Питательная среда имеет зеленую окраску, прозрачная, пригодна к использованию в течение 30 суток при хранении от 4°С до 8°С. Контроль питательной среды при изготовлении: суточные культуры контрольных штаммов (клинические штаммы A. baumannii и A. baumannii bv. tryptophandestruens) засевают по одной петле в виде бляшки диаметром 5 мм на поверхность испытуемой среды в чашке Петри, инкубируют аэробно при 37°С в течение 18 ч, учитывают результат - питательная среда пригодна к использованию, если вокруг газона бактерий штамма A. baumannii bv. tryptophandestruens имеется четко выраженная зона темно-коричневой окраски питательной среды (положительный контроль) при отсутствии зоны окраски питательной среды вокруг газона бактерий штамма A. baumannii (отрицательный контроль).
3
2
Пример 2. Исследуемый материал - суточные агаровые культуры бактерий A. baumannii трех штаммов №1, №2, №3 засевают в виде бляшки диаметром 5 мм на отдельных секторах (1/4 чашки Петри) питательной среды заявляемого способа, содержащей на 1 л дистиллированной воды 2,0 г бензоата натрия (CAS 532-32-1); 1 мл 10% водного раствора FeCI 6HO; 3 мл 4% раствора NaOH и остальные ингредиенты по примечанию к примеру 1; инкубируют посев аэробно при 37°С в течение 24 ч, затем учитывают результат. На секторах с штаммами №1 и №2 вокруг газонов бактерий видна интенсивная темно-коричневая окраска питательной среды, вокруг газона штамма №3 отсутствует зона окраски питательной среды, что указывает на принадлежность штаммов A. baumannii №1 и №2 к биовару tryptophandestruens. Контрольная проверка штаммов №1 и №2 по такой же методике и таком же варианте питательной среды заявляемого способа, в которой только бензоат натрия был заменен L-триптофаном в таком же количестве, показала наличие темно-коричневой окраски питательной среды вокруг газона бактерий только штамма №1, следовательно, заявляемый способ позволяет идентифицировать типичные штаммы (штамм №1) и атипичные по биотрансформации L-триптофана штаммы (штамм №2) биовара A baumannii bv. tryptophandestruens.
Пример 3. Исследуемый материал - суточные агаровые культуры бактерий A.baumannii трех штаммов №1, №2, №3 засевают петлей в виде бляшки диаметром 5 мм на отдельных секторах (1/4 чашки Петри) питательной среды заявляемого способа, содержащей на 1 л дистиллированной воды 1,0 г бензоата калия (CAS 582-25-2); 2,6 мл 4% раствора NaOH и остальные ингредиенты по примечанию к примеру 1; инкубируют посев аэробно при 37°С в течение 18 ч, затем учитывают результат. На секторах с штаммами №1 и №2 видны вокруг газонов бактерий зоны интенсивной темно-коричневой окраски питательной среды; вокруг газона штамма №3 отсутствует зона окраски питательной среды, что указывает на принадлежность штаммов №1 и №2 к биовару A. baumannii bv. tryptophandestruens.
3
2
Пример 4. Исследуемый материал - суточные агаровые культуры бактерий A. baumannii трех штаммов №1. №2. №3 засевают в виде бляшки диаметром 5 мм на отдельных секторах (1/4 чашки Петри) питательной среды заявляемого способа, содержащей на 1 л дистиллированной воды 2,0 г бензоата калия (CAS 582-25-2), 1 мл 10% водного раствора FeCl 6HO, 3 мл 4% раствора NaOH и остальные ингредиенты по приложению к примеру 1; инкубируют посев при 37°С в течение 24 ч, затем учитывают результат. На секторах с штаммами №1 и №2 видны вокруг газонов бактерий зоны интенсивной темно-коричневой окраски питательной среды; вокруг газона штамма №3 отсутствует зона окраски питательной среды, что указывает на принадлежность штаммов A. baumannii №1 и №2 к биовару tryptophandestruens.
Пример 5. Исследуемый материал - суточные агаровые культуры бактерий A. baumannii трех штаммов №1, №2, №3 засевают петлей в виде бляшки диаметром 5 мм на отдельных секторах (% чашки Петри) питательной среды заявляемого способа, содержащей на 1 л дистиллированной воды 1,0 г бензойной кислоты (CAS 65-85-0), 15,5 мл 4% раствора NaOH и остальные ингредиенты по примечанию к примеру 1; инкубируют посев аэробно при 37°С в течение 18 ч, затем учитывают результат. На секторах с штаммами №1 и №2 видны вокруг газонов бактерий зоны интенсивной темно-коричневой окраски питательной среды; вокруг газона штамма №3 отсутствует зона окраски питательной среды, что указывает на принадлежность штаммов A. baumannii №1 и №2 к биовару tryptophandestruens.
3
2
Пример 6. Исследуемый материал - суточные агаровые культуры бактерий A. baumannii трех штаммов №1, №2, №3 засевают петлей в виде бляшки диаметром 5 мм на отдельных секторах (1/4 чашки Петри) питательной среды заявляемого способа, содержащей на 1 л дистиллированной воды 2,0 г бензойной кислоты (CAS 65-85-0), 1 мл 10% водного раствора FeCI 6НО, 30 мл 4% раствора NaOH и остальные ингредиенты по приложению к примеру 1; инкубируют посев аэробно при 37°С в течение 24 ч, затем учитывают результат. На секторах с штаммами №1 и №2 видны вокруг газонов бактерий зоны интенсивной темно-коричневой окраски питательной среды; вокруг газона штамма №3 отсутствует зона окраски питательной среды, что указывает на принадлежность бактерий штаммов №1 и №2 к биовару tryptophandestruens.
Таким образом, при всех предельных концентрациях основных ингредиентов питательной среды заявляемого способа получены четкие результаты идентификации бактерий биовара A, baumannii bv. tryptophandestruens, в том числе атипичных по биотрансформации L-триптофана штаммов, что подтверждает достижение поставленной цели повышения диагностической чувствительности способа идентификации бактерий этого биовара A. baumannii.