Способ очистки бактериальной целлюлозы
METHOD FOR CLEANING BACTERIAL CELLULOSE

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки бактериальной целлюлозы на основе штаммов различных бактерий от остатков культуральной жидкости и для удаления белка клеток.
Известен способ очистки бактериальной целлюлозы, получаемой культивированием симбиотической культуры Medusomycesgisevii на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата мискантуса, или плодовых оболочек овса, или соломы льна-межеумка. Процесс очистки химически чистой бактериальной целлюлозы включает удаление клеток бактерий путем выдерживания образцов пленок бактериальной целлюлозы в течение 24 ч в растворе NaOH концентрацией 0,5% для удаления клеток бактерий, промывание в дистиллированной воде до нейтральной реакции, отбелку бактериальной целлюлозы от красящих компонентов питательной среды путем выдерживания в течение 24 ч в растворе HCl концентрацией 0,5%, промывание дистиллированной водой, сушку при комнатной температуре в расправленном состоянии (патент RU 2597291, МПК C12N 1/22 (2016.01), С12Р 19/04 (2016.01)).
Основными недостатками описанного способа являются повышенная трудоемкость и продолжительность очистки. Кроме того, данный способ предусматривает очистку только бактериальной целлюлозы, получаемой культивированием симбиотической культуры Medusomycesgisevii, что сужает сферу его использования.
Наиболее близким к заявляемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату (прототипом) является способ очистки бактериальной целлюлозы, получаемой на основе штамма бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans Н-110, выращенных на нативной молочной сыворотке в течение 3-5 суток при температуре 28-30°С. При этом культивирование бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans Н-110 осуществляют на нативной молочной сыворотке при температуре 28-30°С в течение 3-5 суток, после чего гель-пленку бактериальной целлюлозы или хлопья отделяют от культуральной среды. Процесс очистки бактериальной целлюлозы включает удаление клеток бактерий и компонентов культуральной среды путем обработки 0,1 Н раствором NaOH при 90°С в течение 30 минут, последующей промывки дистиллированной водой, 0,5% водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Процесс очистки бактериальной целлюлозы повторяют 3 раза (патент RU 2536257, МПК C12N 1/20 (2006.01), C12R 1/01 (2006.01)).
Основными недостатками описанного способа являются продолжительность очистки, а также энергоемкость процесса очистки бактериальной целлюлозы, связанная с трехкратной обработкой при 90°С раствором щелочи с последующими промывками кислотой и водой до нейтральной реакции. Кроме того, данный способ предусматривает очистку именно бактериальной целлюлозы, получаемой на основе штамма бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans Н-110, что сужает сферу его использования.
Техническая проблема, решение которой обеспечивается при осуществлении изобретения, заключается в создании способа очистки бактериальной целлюлозы, характеризующегося пониженной энергоемкостью и длительностью при расширенной сфере использования.
Решение настоящей технической проблемы достигается тем, что в способе очистки бактериальной целлюлозы, включающем удаление клеток бактерий и компонентов культуральной среды путем обработки в заданном растворе при 90°С, последующей промывки кислотой и водой до нейтральной реакции, согласно изобретению в качестве заданного раствора используют раствор перманганата калия концентрацией 0,1-10,0%, обработку производят в течение 5-30 минут, а промывку ведут сначала раствором щавелевой кислоты до нейтральной реакции на перманганат-ион, диоксид марганца и белок, затем водой до нейтральной реакции на кислоту.
Снижение энергоемкости и длительности процесса очистки бактериальной целлюлозы обусловлены одновременным неэнергоемким удалением клеток бактерий и компонентов культуральной среды путем однократного выдерживания в растворе перманганата калия в течение 5-30 минут.
Расширение сферы использования предлагаемого способа обусловлено реализацией очистки приведенной совокупностью операций любой бактериальной целлюлозы, получаемой на основе штаммов различных бактерий.
Известно, что перманганат калия является антисептическим медпрепаратом, обладающим противомикробными свойствами. Образующийся при восстановлении препарата оксид образует с белками растворимые комплексные соединения - альбуминаты. Использование перманганата калия концентрацией менее 0,1% менее 5 минут нецелесообразно ввиду неполного окисления белка клеток бактерий и компонентов культуральной среды. Использование перманганата калия концентрацией более 10,0% более 30 минут способствует окислению и разрушению бактериальной целлюлозы.
Использование щавелевой кислоты способствует растворению и удалению как остатка, не прореагировавшего перманганата марганца:
так и диоксида марганца, образующегося при окислении перманганатом марганца белка клеток бактерий и компонентов культуральной среды и адсорбируемого на поверхности бактериальной целлюлозы, за счет образования растворимых в воде комплексов (Изучение кинетики растворения диоксида марганца в растворах лимонной и щавелевой кислот / Артамонова И.В. [и др.] // Известия МГТУ «МАМИ» - 2010. - №2. - С. 157-161.). Образующийся при взаимодействии с перманганатом калия нерастворимый осадок оксалата марганца (реакция 1) растворяется в избытке щавелевой кислоты.
Способ очистки бактериальной целлюлозы заключается в удалении клеток бактерий и компонентов культуральной среды путем однократной обработки при 90°С растворами перманганата калия концентрацией 0,1-10,0% в течение 5-30 минут с последующей промывкой раствором щавелевой кислоты сначала до отрицательной реакции на перманганат-ион, диоксид марганца, белок, затем водой до нейтральной реакции на кислоту.
Примеры конкретного выполнения способа.
Пример 1. Образцы пленок бактериальной целлюлозы, получаемой культивированием симбиотической культуры Medusomycesgisevii на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата мискантуса, или плодовых оболочек овса, или соломы льна-межеумка, очищают следующим образом: в течение 30 минут пленку обрабатывают при 90°С раствором перманганата калия концентрацией 0,1%, промывают раствором щавелевой кислоты до отрицательной реакции на перманганат-ион, диоксид марганца, белок, затем водой до нейтральной реакции на кислоту.
Отсутствие перманганат-ионов обуславливается отсутствием малиновой окраски исследуемой субстанции. Диоксид марганца контролируют по отсутствию темно-коричневого осадка.
Качественная реакция на белок: к 0,1 мл субстанции прибавляют 0,2 мл серной кислоты, разведенной 16%, 2 мл эфира, 0,2 мл 5% раствора калия дихромата и взбалтывают; эфирный слой при наличии белка должен окраситься в синий цвет.
Отсутствие щавелевой кислоты проверяют по универсальному индикатору.
Таким образом, получается бактериальная целлюлоза, очищенная от клеток бактерий и компонентов культуральной среды.
Пример 2. Очистка бактериальной целлюлозы осуществляется по примеру 1, отличие заключается в обработке при 90°С раствором перманганата калия концентрацией 0,25% в течение 15 минут.
Результаты, полученные в примере 2, показывают, что бактериальную целлюлозу можно очистить от клеток бактерий и компонентов культуральной среды при меньшем времени обработки раствором перманганата калия - 15 минут, по сравнению с примером 1, но при использовании большей концентрации перманганата калия - 0,25%.
Пример 3. Очистка бактериальной целлюлозы осуществляется по примеру 1, отличие заключается в обработке при 90°С раствором перманганата калия концентрацией 10,0% в течение 5 минут.
Результаты, полученные в примере 3, показывают, что бактериальную целлюлозу можно очистить от клеток бактерий и компонентов культуральной среды при минимальном времени обработки раствором перманганата калия - 5 минут, по сравнению с примером 1, однако в данном случае необходимо использовать максимальную концентрации перманганата калия - 10,0%.
Пример 4. Очистка бактериальной целлюлозы осуществляется по примеру 2, отличие заключается в использовании образцов пленок целлюлозы, получаемой на основе штамма бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans Н-110.
Результаты, полученные в примере 4, позволяют утверждать, что данным способом может быть очищена бактериальная целлюлоза, получаемая на основе использования разных штаммов бактерий.
Таким образом, описанный способ очистки бактериальной целлюлозы позволяет сократить продолжительность очистки и уменьшить энергозатраты.