МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КОАГУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР VIIa С ПРОДЛЕННЫМ ВРЕМЕНЕМ ПОЛУЖИЗНИ
MODIFIED COAGULATION FACTOR VIIa WITH EXTENDED HALF-LIFE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к области слитых с альбумином полипептидов фактора VII (FVII) и фактора VIIa (FVIIa). Более конкретно, изобретение относится к последовательностям кДНК, кодирующим человеческие фактор VII, фактор VIIa и производные, генетически слитые с кДНК, кодирующими человеческий сывороточный альбумин, который может быть связан через олигонуклеотиды, которые кодируют промежуточные пептидные линкеры, где подобные кодированные производные демонстрируют улучшенную стабильность и удлиненное функциональное время полужизни в плазме, к рекомбинантным векторам экспрессии, содержащим такие последовательности кДНК, клеткам-хозяевам, трансформированным такими рекомбинантными векторами экспрессии, рекомбинантным полипептидам и производным, которые имеют биологическую активность немодифицированного белка дикого типа, но обладают повышенной стабильностью и удлиненным сроком годности, и к способам получения таких рекомбинантных белков и их производных. Изобретение также охватывает вектор переноса для применения в генной терапии человека, который содержит такие модифицированные последовательности ДНК.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Фактор VII и фактор VIIa
Гемофилия А представляет собой врожденное нарушение свертываемости крови. Она представляет собой следствие дефицита фактора коагуляции крови VIII, связанного с Х-хромосомой, и поражает почти исключительно мужчин, число случаев заболевания составляет между одним и двумя людьми на 10000 человек. Дефект Х-хромосомы передается носителями женского пола, которые сами гемофилией не страдают. Клиническое проявление гемофилии А состоит в повышенной тенденции к кровотечению. До введения в обиход лечения концентратами фактора VIII продолжительность жизни человека с тяжелой формой гемофилии составляла менее 20 лет. Использование концентратов фактора VIII из плазмы и позже рекомбинантных форм фактора VIII значительно улучшило ситуацию для пациентов, страдающих гемофилией, существенно увеличив среднюю продолжительность их жизни, давая большинству из них возможность жить более или менее нормальной жизнью. Гемофилия В, которая в 5 раз меньше распространена, чем гемофилия А, вызвана нефункциональным или недостающим фактором IX и лечится концентратами фактора IX из плазмы или рекомбинантной формой фактора IX. Как при гемофилии А, так и при гемофилии В самой серьезной медицинской проблемой при лечении болезни является образование алло-антител к заменяющим факторам. До 30% всех пациентов, страдающих гемофилией А, вырабатывает антитела к фактору VIII. Антитела к фактору IX встречаются реже, но с более тяжелыми последствиями, поскольку они менее восприимчивы к терапии путем индукции иммунной толерантности.
Принятая в настоящее время модель коагуляции констатирует, что физиологическим триггером коагуляции является образование комплекса между тканевым фактором (TF) и фактором VIIa (FVIIa) на поверхности клеток, экспрессирующих TF, которые обычно расположены вне сети сосудов. Это приводит к активации фактора IX и фактора X, что, в конечном счете, приводит к получению некоторого количества тромбина. В петле положительной обратной связи тромбин активирует фактор VIII и фактор IX, так называемый "врожденный" рычаг каскада коагуляции крови, усиливая, таким образом, образование фактора Ха, который необходим для формирования полного вброса тромбина, чтобы получить полный гемостаз. Было показано, что при введении сверхфизиологических концентраций фактора VIIa гемостаз достигается без необходимости в факторе VIIIa и факторе IXa. Клонирование кДНК для фактора VII (US 4784950) позволило разработать активированный фактор VII в качестве фармацевтического продукта. Фактор VIIa впервые был успешно применен в 1988 году. С тех пор количество показаний для применения фактора VIIa устойчиво растет, выявляя его потенциал для того, чтобы стать универсальным гемостатическим средством для остановки кровотечения (Erhardtsen, Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 2002, Vol.23, Supplement 1, стр.47-52). Однако короткое время полужизни фактора VIIa, составляющее около 2 часов, ограничивает возможности его применения.
FVII представляет собой одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой приблизительно 50 кДа, который секретируется клетками печени в кровоток как неактивный профермент в 406 аминокислот. Он содержит 10 γ-карбокси-остатки глютаминовой кислоты (положения 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 и 35), расположенные в N-концевом Gla-домене белка. Для биосинтеза остатков Gla требуется витамин K. С C-концевой стороны Gla-домена расположены два домена эпидермального фактора роста, за которыми идет сопровождаемый домен сериновой протеазы трипсинового типа. Дополнительные посттрансляционые модификации FVII включают гидроксилирование (Asp 63) и гликозилирование N-(Asn145 и Asn322), а также O-типа (Ser52 и Ser60).
FVII преобразуется в свою активную форму, фактор VIIa, протеолизом одной пептидной связи Arg152-Ile153, что приводит к образованию двух полипептидных цепей - N-концевой легкой цепи (24 кДа) и C-концевой тяжелой цепи (28 кДа), которые удерживаются вместе одним дисульфидным мостиком. В противоположность другим зависимым от витамина К факторам коагуляции, для случая FVII не был описан никакой активационный пептид, который бы отщеплялся во время активации этих других факторов коагуляции, зависимых от витамина К. Сайт расщепления Arg152-Ile153 и некоторые аминокислоты ниже демонстрируют гомологию активационному сайту расщепления других зависимых от витамина К полипептидов.
Существенным для достижения активной конформации фактора VIIa является образование солевого мостика после активационного расщепления между Ile153 и Asp343. Активационное расщепление фактора VII может быть достигнуто in vitro с помощью фактора Ха, фактора XIIa, фактора 1Ха, фактора VIIa, фактора 7 активации протеазы (FSAP) и тромбина. Mollerup et al. (Biotechnol. Bioeng. (1995) 48: 501-505), сообщили, что некоторое расщепление также имеет место в тяжелой цепи в Arg290 и/или Arg315.
Фактор VII присутствует в плазме в концентрации 500 нг/мл. 1%, например, 5 нг/мл фактора VII присутствует как фактор VIIa. Было найдено, что время полужизни в плазме фактора VII равно приблизительно 4 часам, а фактора VIIa - приблизительно 2 часам. Хотя время полужизни фактора VIIa, равное 2 часам, сравнительно велико для активированного фактора коагуляции (для других активированных факторов коагуляции оно куда более порядка минут из-за необратимого ингибирования серпинами типа антитромбина III), это, тем не менее, представляет собой серьезный недостаток для терапевтического применения фактора VIIa, поскольку приводит к необходимости многократных внутривенных инъекций или непрерывного вливания, чтобы достичь гемостаза. Это сильно увеличивает стоимость лечения и создает неудобства для пациента. До нынешнего момента коммерчески не доступен никакой фармацевтический препарат фактора VIIa с улучшенным временем полужизни в плазме; также не опубликовано никаких данных, показывающих варианты FVII/FVIIa с удлиненным временем полужизни in vivo. Поскольку фактор VII/VIIa имеет потенциал для того, чтобы использоваться как универсальное гемостатическое средство, все еще существует большая медицинская потребность в разработке форм фактора VIIa, который имеет более длительное функциональное время полужизни in vivo.
Ballance et al. (WO 01/79271) описывает слитые полипептиды множества различных терапевтических белков или вариантов и/или фрагментов указанных терапевтических белков, которые, когда они слиты с человеческим сывороточным альбумином или вариантами и/или фрагментами указанного альбумина, как предсказывается, имеют увеличенное функциональное время полужизни in vivo и удлиненный срок хранения. Описаны длинные перечни потенциальных партнеров по слитию клеток без показа посредством экспериментальных данных, почти для всех этих белков, что соответствующие слитые с альбумином полипептиды на деле сохраняют биологическую активность партнера по слитию терапевтического белка и имеют улучшенные свойства. Также согласно WO 01/79271 каждый член из перечня терапевтических белков может быть слит во многих различных ориентациях с альбумином, например, две молекулы терапевтического белка могут быть слиты одна с N-концом, а другая - с С-концом альбумина, или одна молекула терапевтического белка может быть слита или с N-концом, или С-концом альбумина, или множественные области каждого белка могут быть слиты с множественными областями другого белка. Среди множества терапевтических белков, перечисленных в WO 01/79271, как потенциальные партнеры альбумина по слитию упомянуты факторы IX и FVII/FVIIa, но ни для одного из этих белков не представлены никакие экспериментальные доказательства принципа действия.
Шеффилд экспрессировал полипептид фактора IX (фактора протромбина, состоящего из 415 аминокислот), слитого с альбумином, и показал в фармакокинетических экспериментах, что поведение полипептида фактора IX, слитого с альбумином, в плане клиренса у кроликов более точно напоминало поведение фактора IX, нежели альбумина, с демонстрацией только умеренного увеличения окончательного времени полужизни (менее чем двукратного) (Sheffield W.P. et al. (2004) Br. J. Haematol. 126:565-573).
Исходя из результатов Шеффилда и из-за высокой гомологии между факторами IX и VII (оба являются факторами протромбина, зависимыми от витамина K) и их сопоставимого размера, специалист в данной области предположил бы, что фактор VII также не выиграет от слияния с альбумином в отношении функционального времени полужизни in vivo.
Техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, таким образом, состояла в том, чтобы разработать функциональные слитые белки FVIIa-альбумин, которые сохраняют биологическую активность и демонстрируют увеличенное функциональное время полужизни in vivo.
В этом отношении биологическая активность полипептида фактора VII/VIIa относится к его способности активировать факторы коагуляции IX и Х в присутствии тканевого фактора, после того как он сам активирован.
Функциональное время полужизни в плазме in vivo относится к времени полужизни биологической активности слитого полипептида фактора VII/VIIa, когда он введен в плазму. Предпочтительно, плазма представляет собой человеческую плазму.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что слитые с альбумином полипептиды, содержащие, по меньшей мере, один полипептид фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмент, или вариант, слитые с альбумином, или его фрагмент, или вариант, в котором, по меньшей мере, одна молекула фактора VII или фактора VIIa расположена на N-конце слитого белка, дают слитые полипептиды с биологически активной частью фактора VII/фактора FVIIa.
Одним аспектом изобретения являются, таким образом, биологически активные слитые белки, в которых полипептиды фактора VII/VIIa слиты с N-концом человеческого сывороточного альбумина. Слитые белки демонстрируют, по меньшей мере, 25%, предпочтительно, более 40%, даже более предпочтительно, более 70% и, наиболее предпочтительно, более 90% молярной специфической активности фактора VII/VIIa дикого типа.
Дополнительно, к удивлению, было найдено, что в отличие от слитий фактора IX с N-концом человеческого сывороточного альбумина, как опубликовано Шеффилдом, альбуминовые слития фактора VII/VIIa с N-концом человеческого сывороточного альбумина давали слитые белки фактора VII/FVIIa, которые не только сохраняли биологическую активность фактора VII/FVIIa, но также показывали значительное увеличение функционального времени полужизни в плазме фактора VII/VIIa in vivo.
Экспрессия конструкций слитого альбумина с желаемой частью FVII/FVIIa на С-конце альбумина не была успешной, потому что экспрессированные слитые с альбумином белки не секретировались как интактные молекулы. После перехода через клеточную мембрану наблюдалась расщепление с получением зрелой молекулы FVII/FVIIa, у которой, из-за нарушенного гамма-карбоксилирования, была пониженная молярная специфическая активность, и альбуминовой части с пропептидом FVII, присоединным к ее С-концу. Таким образом, в противоположность раскрытию Ballance et al., было найдено, что только слияние части FVII/FVIIa с N-концом человеческого сывороточного альбумина дает слитый белок с желаемыми биологическими свойствами, соответственно, сохранение биологической активности FVII/FVIIa и увеличенное время полужизни в плазме.
Следующим аспектом изобретения являются, таким образом, биологически активные слитые белки, в которых полипептиды фактора VII/VIIa слиты с N-концом альбумина, которые демонстрируют значительное увеличение функционального времени полужизни в плазме по сравнению с неслитым фактором VII/VIIa. В предпочтительных вариантах осуществления полипептиды FVII/FVIIa, слитого с альбумином, по настоящему изобретению, содержащие полипептид FVII/FVIIa, имеют удлиненное функциональное время полужизни in vivo или более долго длящуюся или повышенную терапевтическую активность по сравнению со временем полужизни in vivo или терапевтической активностью неслитого FVII/FVIIa.
Одним аспектом настоящего изобретения является, таким образом, FVII/FVIIa, слитый с N-концом альбумина, что приводит к удлинению времени полужизни в плазме по сравнению со временем полужизни неслитого FVII/FVIIa, по меньшей мере, на 100%, предпочтительно, более чем на 200%, даже более предпочтительно, более чем на 500% и, наиболее предпочтительно, более чем на 1000%.
В дальнейшем удивительном аспекте настоящего изобретения авторы обнаружили, что полипептиды слитого с альбумином FVII/FVIIa без линкера показывают значительно пониженную биологическую активность, тогда как полипептиды слитого с альбумином FVII/FVIIa, в которых части FVII/FVIIa отделены от альбумина линкером, демонстрируют зависящее от длины линкера повышение биологической активности фактора VII/VIIa. Часть, соответствующая пептиду фактора VII или фактора VIIa, связана с частью, соответствующей альбумину, пептидным линкером, что позволяет, таким образом, слитой молекуле принять конформацию, которая позволяет достичь более высокой молярной специфической активности по сравнению со слитой молекулой без такой линкерной последовательности.
Следовательно, дальнейшим аспектом настоящего изобретения являются полипептиды связанного с альбумином фактора VII/VIIa содержащие линкерный пептид между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и N-концом альбумина, которые имеют повышенную активность биологического фактора VII/VIIa, например, измеренную как молярную специфическую активность, по сравнению со слитыми белками фактора VII/VIIa без таких линкеров. Увеличение молярной специфической активности слитых белков, в которых часть, относящаяся к фактору VII/VIIa, слита с N-концом альбумина через пептидный линкер, по сравнению с соответствующими слитыми белками без такого линкера, составляет, по меньшей мере, 25%, предпочтительно, по меньшей мере, 50% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 100%. Эти несущие линкер полипептиды слитого с альбумином фактора VII/VIIa также демонстрируют увеличенное функциональное время полужизни in vivo по сравнению с фактором FVIIa дикого типа. Однако химические линкеры или линкерные системы, такие как, без ограничения, авидин-биотин, будут функционировать аналогично, коль скоро имеются сопоставимые интервалы между частью фактора VII/FVIIa и альбуминовой частью. Ниже термин "пептидный линкер" или ему подобные включают такие другие функциональные линкерные средства, когда они пригодны.
Изобретение охватывает терапевтические полипептиды фактора VII/VIIa, связанного с N-концом альбумина, композиции, фармацевтические композиции, составы и наборы. Изобретение также охватывает применение указанных терапевтических слитых с альбумином полипептидов при определенных медицинских показаниях. Изобретение также охватывает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые с альбумином полипептиды по настоящему изобретению, а также векторы, содержащие эти нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, трансформированные этими нуклеиновыми кислотами и векторами, и способы получения слитых с альбумином полипептидов по настоящему изобретению путем использования этих нуклеиновых кислот, векторов и/или клеток-хозяев.
Изобретение также обеспечивает композицию, содержащую полипептид слитого с альбумином фактора VII/FVIIa, содержащий пептид фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмент, или вариант, необязательно, пептидный линкер, и альбумин, или его фрагмент, или вариант и фармацевтически приемлемый носитель. Еще одной целью изобретения является обеспечение способа лечения пациентов, страдающих нарушениями свертываемости крови. Способ включает стадию введения эффективного количества полипептида, связанного с альбумином FVII/FVIIa.
Еще одной целью изобретения является обеспечение молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность полинуклеотида, кодирующую полипептид связанного с альбумином фактора VII/VIIa, содержащий пептид фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмент, или вариант, необязательно, пептидный линкер, и альбумин, или его фрагмент, или вариант, а также вектора, который содержит такую молекулу нуклеиновой кислоты. Указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, расположена на 3'-конце последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пропептид, опосредующий гамма-карбоксилирование слитой части, относящейся к фактору VII/VIIa.
Изобретение также обеспечивает способ получения полипептида слитого с альбумином фактора VII/FVIIa, содержащего пептид фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмент, или вариант, пептидный линкер и альбумин, или его фрагмент, или вариант, где способ включает:
(а) обеспечение нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид связанного с альбумином фактора VII/VIIa, которую можно экспрессировать в клетке млекопитающего;
(b) экспрессию указанной нуклеиновой кислоты в организме с образованием полипептида связанного с альбумином фактора VII/VIIa; и
(c) очистку полипептида связанного с альбумином фактора VII/VIIa.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептидам слияния с альбумином и способам лечения, предотвращения или смягчения симптомов заболеваний или нарушений. Используемый здесь термин "полипептид слитого с альбумином фактора VII/VIIa" относится к полипептиду, который образован путем слияния, по меньшей мере, одной молекулы фактора VII/VIIa (или ее фрагмента, или варианта) с N-концом, по меньшей мере, одной молекулы альбумина (или ее фрагмента, или варианта), причем обе части необязательно разделены пептидным линкером.
Полипептид слитого с альбумином фактора VII/FVIIa по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, фрагмент или вариант фактора VII/FVIIa и, по меньшей мере, фрагмент или вариант человеческого сывороточного альбумина, которые связаны друг с другом, например, генетическим слиянием (т.е. слитый с альбумином полипептид генерирован трансляцией нуклеиновой кислоты, в которой полинуклеотид, кодирующий весь фактор VII/FVIIa или его часть, присоединен «в рамке» к 5'-концу полинуклеотида, кодирующего весь альбумин или его часть, и они необязательно связаны полинуклеотидом, который кодирует линкерную последовательность, вводя линкерный пептид между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и альбуминовой частью).
В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает полипептид слитого с альбумином фактора VII/VIIa, включающий биологически активный и/или терапевтически активный фактор VII/VIIa, слитый с N-концом полипептида сывороточного альбумина, или, альтернативно, состоящий из него.
В других вариантах осуществления изобретение обеспечивает слитый полипептид с альбумином, включающий биологически активный и/или терапевтически активный фрагмент фактора VII/VIIa и пептидный линкер, слитый с N-концом сывороточного альбумина, или, альтернативно, состоящий из этого.
В других вариантах осуществления изобретение обеспечивает слитый с альбумином полипептид, включающий биологически активный и/или терапевтически активный вариант фактора VII/VIIa, слитый с N-концом полипептида сывороточного альбумина, и, необязательно, пептидный линкер, или, альтернативно, состоящий из этого.
В дальнейших вариантах осуществления изобретение обеспечивает полипептид слитого с альбумином фактора VII/VIIa, включающий биологически активные и/или терапевтически активные фрагмент или вариант FVII/FVIIa, слитые с N-концом фрагмента или варианта сывороточного альбумина, и, необязательно, пептидный линкер, или, альтернативно, состоящий из этого.
В некоторых вариантах осуществлениях изобретение обеспечивает слитый с альбумином полипептид, включающий зрелую часть FVII/FVIIa, слитую с N-концом зрелой части сывороточного альбумина, и, необязательно, пептидный линкер, или, альтернативно, состоящий из этого.
В соответствии с WO 01/79271 полипептид слития с альбумином, содержащий FVII/FVIIa, может использоваться как терапевтическое средство при показаниях "нарушения свертываемости крови", "гемофилия A и B", "нарушение функции печени" и "геморрагические случаи, связанные с хирургическим вмешательством".
Другим аспектом изобретения является то, что слитый с альбумином полипептид, содержащий FVII/FVIIa, может также использоваться терапевтически при других показаниях. Наиболее предпочтительными показаниями являются "случаи кровотечения и хирургическое вмешательство у пациентов с врожденной или приобретенной гемофилией с ингибиторами к факторам коагуляции (FVIII или FIX)", "обращение дефицитов гемостаза, развившихся как последствие лечения лекарственными средствами, такими как лекарственные средства против тромбоцитов или лекарственные средства против коагуляции", "улучшение вторичного гемостаза", "дефициты гемостаза, развившиеся во время инфекций или во время болезней, такие как дефицит витамина К или тяжелое заболевание печени", "резекция печени", "дефициты гемостаза, развившиеся в результате укусов змеи", "гастроинтестинальные кровотечения", "травма", "последствия массивного переливания (дилюционная коагулопатия)", "дефициты фактора коагуляции отличных от FVIII и FIX", "VWD", "дефицит FI", "дефицит FV", "дефицит FVII", "дефицит FX", "дефицит FXIII", "HUS", "врожденные или приобретенные тромбоцитарные болезни и нарушения, подобные тромбоцитопении, ITP, ТТР, синдром HELLP, синдром Бернара-Сулье, тромбастения Гланцмана, HIT", "синдром Чедиака-Хигаси", "синдром Германски-Пудлака", "синдром Ренду-Ослера", "пурпура Геноха-Шенлейна" и "заживление ран".
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является обеспечение человеческого фактора VII и человеческого фактора VIIa или их фрагментов или вариантов, слитых с N-концом человеческого альбумина или их фрагментов и вариантов с более продолжительным функциональным временем полужизни in vivo по сравнению с человеческим фактором VII и человеческим фактором VIIa, или их фрагментами, или вариантами. Другая цель изобретения состоит в том, чтобы обеспечить человеческий фактор VII и человеческий фактор VIIa, или их фрагменты, или варианты, слитые с N-концом человеческого альбумина, или фрагменты, или варианты с увеличенной молярной специфической активностью. Чтобы достичь этой цели, слития фактора VII или фактора VIIa с N-концом сывороточного альбумина обеспечиваются необязательно с промежуточным пептидным линкером между FVII/FVIIa и альбумином.
В настоящем описании термины "человеческий сывороточный альбумин (HSA)" и "человеческий альбумин (НА)" взаимозаменяемы. Термины "альбумин" и "сывороточный альбумин" являются более широкими и охватывают человеческий сывороточный альбумин (и его фрагменты и варианты), так же как альбумин других разновидностей (и их фрагменты и варианты). Вместо альбумина также могут использоваться другие подобные альбумину белки, например, без ограничения, человеческий альфа-фетопротеин (как он описан в WO 2005/024044), так же как их функциональные фрагменты или варианты.
Термин "альбумин", как он используется здесь, совокупно относится к полипептиду альбумина или к аминокислотной последовательности, или к фрагменту, или варианту альбумина, имеющим одну или более функциональных активностей (например, биологических активностей) альбумина. В частности "альбумин" относится к человеческому альбумину или его фрагментам, особенно к зрелой форме человеческого альбумина, как показано здесь в SEQ ID No:22 или к альбумину других позвоночных или его фрагментам, или аналогам, или вариантам этих молекул или их фрагментам.
Альбуминовая часть слитых с альбумином полипептидов может содержать полноразмерную последовательность НА, как описано выше, или может включать один или более ее фрагментов, которые способны к стабилизации или продлению терапевтической активности. Такие фрагменты могут иметь 10 и более аминокислот в длину, или могут включать приблизительно 15, 20, 25, 30, 50 или более смежных аминокислот из последовательности НА, или могут включать часть или все домены НА.
Альбуминовая часть слитых с альбумином полипептидов по настоящему изобретению может представлять собой вариант нормального НА. Часть, относящаяся к фактору VII слитых с альбумином полипептидов по настоящему изобретению, может также быть вариантами полипептидов фактора VII, как описано здесь. Термин "варианты" включает вставки, удаления и замены, консервативные или неконсервативные, где такие изменения, в основном, не изменяют существенным образом активный центр или активный домен, которые сообщают терапевтическую активность полипептидам фактора VII.
В частности, слитые с альбумином полипептиды по настоящему изобретению могут включать встречающиеся в природе полиморфные варианты человеческого альбумина и фрагменты человеческого альбумина. Альбумин может быть получен из любого позвоночного, особенно любого млекопитающего, например человека, коровы, овцы или свиньи. Альбумины не-млекопитающих включают, без ограничения, альбумины курицы и лосося. Альбуминовая часть слитого с альбумином полипептида может быть получена от иного животного, нежели часть, соответствующая FVII/FVIIa.
Вообще говоря, фрагмент или вариант альбумина будет длиной, по меньшей мере, 20, предпочтительно, по меньшей мере, 40, наиболее предпочтительно, более чем 70 аминокислот. Вариант альбумина может предпочтительно состоять из, по меньшей мере, одного целого домена альбумина или фрагментов указанных доменов, например доменов 1 (аминокислоты 1-194 SEQ ID NO:22), 2 (аминокислоты 195-387 SEQ ID NO:22), 3 (аминокислоты 388-585 SEQ ID NO:22), 1+2 (1-387 SEQ ID NO:22), 2+3 (195-585 SEQ ID. NO:22) или 1+3 (аминокислоты 1-194 SEQ ID NO:22+аминокислоты 388-585 SEQ ID NO:22), или, альтернативно, содержать их. Каждый домен сам по себе образован двумя гомологичными субдоменами, а именно 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 и 512-585 с гибкими межсубдоменными линкерными областями, содержащими остатки от Lys106 до Glu119, от Glu292 до Val315 и от Glu492 до Ala511.
Альбуминовая часть слитого с альбумином полипептида по изобретению может содержать, по меньшей мере, один субдомен, или домен НА, или его консервативные модификации.
Изобретение относится к модифицированному полипептиду фактора VII или фактора VIIa, содержащему соединение полипептида фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмента, или варианта с N-концом, полипептида альбумина, или его фрагмента, или варианта, необязательно таким образом, что промежуточный пептидный линкер вводится между модифицированным фактором VII или фактором VIIa и альбумином так, что полипептид модифицированного фактора VII или фактора VIIa имеет увеличенное функциональное время полужизни in vivo по сравнению с полипептидом фактора VII или фактора VIIa, который не был связан с альбумином, или так, что молярная специфическая активность FVII/FVIIa, слитого с альбумином, с промежуточным пептидным линкером превышает молярную специфическую активность FVII/FVIIa, слитого с альбумином, без промежуточного пептидного линкера.
"Фактор VII/VIIa", как этот термин используется в настоящей заявке, означает терапевтический полипептид, состоящий или из неактивированной формы (фактор VII), или из активированной формы (фактор VIIa), или их смесей. "Фактор VII/VIIa" в рамках вышеупомянутого определения включает полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность нативного человеческого фактора VII/VIIa. Он также включает полипептиды с немного модифицированной аминокислотной последовательностью, например с модифицированным N-концом или С-концом, что включает концевые аминокислотные удаления или добавления, коль скоро эти полипептиды по существу сохраняют биологическую активность фактора VIIa. "Фактор VII" в рамках вышеупомянутого определения также включает природные аллельные вариации, которые могут существовать и происходить от человека к человеку. "Фактор VII" в рамках вышеупомянутого определения дополнительно включает варианты FVII/FVIIa. Такие варианты отличаются одним или более аминокислотными остатками от последовательности дикого типа. Примеры таких различий могут включать усечение N- и/или С-конца на один или более аминокислотных остатков (например, от 1 до 10 аминокислотных остатков) или добавление одного или более дополнительных остатков на N-и/или С-конце, так же как и консервативные аминокислотные замены, т.е. замены, выполняемые в рамках групп аминокислот с похожими характеристиками, например (1) малых аминокислот, (2) кислых аминокислот, (3) полярных аминокислот, (4) основных аминокислот, (5) гидрофобных аминокислот и (6) ароматических аминокислот. Примеры таких консервативных замен представлены в следующей таблице.
Таблица 1
(1)
Аланин
Глицин
(2)
Аспарагиновая кислота
Глютаминовая кислота
(3а)
Аспарагин
Глютамин
(3b)
Серин
Треонин
(4)
Аргинин
Гистидин
Лизин
(5)
Изолейцин
Лейцин
Метионин Валин
(6)
Фенилаланин
Тирозин
Триптофан
Слитые белки демонстрируют, по меньшей мере, 25%, предпочтительно, более 40%, даже более предпочтительно, более 70% и, наиболее предпочтительно, более 90% молярной специфической активности неслитого фактора VII/VIIa дикого типа, или соответствующего фрагмента FVII/FVIIa, или их варианта.
Полипептид FVII/VIIa по настоящему изобретению, связанный через промежуточный пептидный линкер с N-концом альбумина, имеет повышенную молярную специфическую активность по сравнению с молярной специфической активностью гомологичного фактора VII/VIIa, слитого с альбумином, без промежуточного пептидного линкера. Увеличение молярной специфической активности полипептида, связанного с альбумином фактора VII/VIIa по настоящему изобретению, по сравнению с молярной специфической активностью полипептида, слитого с альбумином фактора VII/VIIa, без промежуточного пептидного линкера, составляет, по меньшей мере, 25%, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 100% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 200%. Активность фактора VII/VIIa состоит в способности преобразовывать субстратный фактор Х в активный фактор Ха. Активность FVIIa фактора полипептида VII/VIIa, слитого с альбумином, может быть предпочтительно измерена с использованием STACLOT. Молярная специфическая активность, как она используется в настоящем изобретении, означает: активность, измеренная в анализе STACLOT после активации слитого белка, связанного с альбумином FVII, в Международных единицах (IU) на 100 IU антигена фактора VII/VIIa, как измерено ELISA.
Полипептиды фактора FVII/FVIIa, связанного с альбумином, по настоящему изобретению имеют, по меньшей мере, на 25% более высокую молярную специфическую активность по сравнению со слитым с альбумином фактором VII/FVIIa без промежуточного пептидного линкера и демонстрируют увеличение функционального времени полужизни in vivo по сравнению с несвязанной формой полипептида фактора VII или фактора VIIa. Функциональное время полужизни in vivo может быть определено, как описано у Lindley et al. (Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant Factor VIIa, Clin. Pharmacol Ther. (1994) 55: 638-648).
Полипептиды фактора FVII/FVIIa, связанного с альбумином, по настоящему изобретению имеют, по меньшей мере, на 25% более высокую молярную специфическую активность по сравнению со слитым с альбумином фактором VII/FVIIa без промежуточного пептидного линкера, и их функциональное время полужизни in vivo обычно увеличено, по меньшей мере, на 100%, предпочтительно, по меньшей мере, на 200%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 500% по сравнению с несвязанной формой полипептида фактора VII или фактора VIIa.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой, таким образом, полипептиды фактора FVII/FVIIa, связанного с альбумином, с пептидным линкером, состоящим, по меньшей мере, из одной аминокислоты, предпочтительно, по меньшей мере, из 3 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, из 7 аминокислот и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, из 25 аминокислот.
Функциональное время полужизни in vivo формы дикого типа человеческого фактора VII составляет приблизительно 4 часа в человеческом организме. Функциональное время полужизни полипептидов фактора VII, связанного с альбумином, по настоящему изобретению, составляет обычно, по меньшей мере, приблизительно 8 часов, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 12 часов, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 24 часа.
Функциональное время полужизни in vivo формы дикого типа человеческого фактора VIIa дикого типа составляет приблизительно 2 часа в человеческом организме. Функциональное время полужизни полипептидов фактора VIIa, связанного с альбумином, по настоящему изобретению составляет обычно, по меньшей мере, приблизительно 4 часа, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 6 часов, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 12 часов.
N
N
N
Согласно изобретению часть, относящаяся к фактору VII/VIIa, соединена с альбуминовой частью пептидным линкером. Линкер является предпочтительно гибким и неиммуногенным и создает интервал между человеческим альбумином и FVII/FVIIa, который минимизирует потенциальную интерференцию этих двух партнеров по слитию, что приводит к повышенной активности FVII/FVIIa слитого белка. Примеры линкеров включают (GGGGS), или (GGGS), или (GGS), где N представляет собой целое число, большее или равное 1, и где G представляет собой глицин, a S представляет собой серин. Эти аминокислоты принадлежат к группе природных аминокислот и были выбраны как примеры для всех возможных природных аминокислот.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения пептидный линкер между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и альбуминовой частью содержит консенсусные сайты для посттрансляционых модификаций. Предпочтительно, такие модификации состоят из сайтов гликозилирования. Более предпочтительно, такие модификации состоят, по меньшей мере, из одного сайта N-гликозилирования структуры Asn-X-Ser/Thr, где Х обозначает любую аминокислоту кроме пролина. Даже более предпочтительно, такие сайты N-гликозилирования вставлены около амино- и/или карбокси-конца пептиднного линкера так, что они способны экранировать потенциальные неоэпитопы, которые могут образоваться в последовательностях, где часть, относящаяся к фактору VII/VIIa, переходит в пептидный линкер, и где пептидный линкер переходит в последовательность альбуминовой части соответственно.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения пептидный линкер между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и альбуминовой частью состоит из последовательностей пептида, которые служат как естественные междоменные линкеры в человеческих белках. Предпочтительно, такие последовательности пептида в их естественном окружении расположены рядом с белковой поверхностью и доступны для иммунной системы, так что можно предположить существование естественной толерантности в отношении этой последовательности. Примеры приведены в таблице 2.
Таблица 2
Последовательность
Белок
Номер доступа
Положение линкера
EPQ GGGGSGGGGSG Е
Фотокадгерин-10
Q9P2E7
Около мембраны, внеклеточный
GGVGGGGGGAGI
Рецептор ANP
Р17342
Крайний N-конец, внеклеточный
PAR GGGGGG KAR
Frizzled-8
Q9H461
Междоменный, секретируется
GGPGGGGGGGPGG
Frizzled-8
Q9H461
С-конец, секретируется
TSR GGGGSGGG ЕРР
LRRFN2
Q9ULH4
Междоменный, внеклеточный
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения пептидный линкер между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и альбуминовой частью состоит из пептидных последовательностей, которые являются междоменными линкерами известных плазменных белков. Примеры приведены в таблице 3.
Таблица 3
Последовательность
Белок
Номер доступа
Положение линкера
MYGAKKPLNTEGVMKSRS
FXIIIa
P00488
Между каталитическим и Ig-подобным доменами
RGEVKYPLCTRKESK
FXIIIb
P05160
Между двумя доменами Sushi
ESGGPLSLS
FVIII
P00451
Внутри домена В
APEAPPPTLPP
vWF
P04275
Между двумя vWA
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения часть, относящаяся к фактору VII/VIIa, связана с альбуминовой частью пептидным линкером, освобождающим полипептид фактора VII/VIIa в месте коагуляции, где линкер содержит сайт расщепления протеазой плазмы. Предпочтительно, такие сайты расщепления протеазой плазмы представляют собой сайты сериновых протеаз. Более предпочтительно, сайт расщепления предоставляется сайтом расщепления коагуляционной протеазы. Наиболее предпочтительно, коагуляционная протеаза выбрана из группы, состоящей из фактора IIа, фактора IXa, фактора Xa, фактора XIa, фактора XIIa, активированного белка С, эластазы или калликреина. Аминокислотные последовательности, которые распознаются и расщепляются этими сериновыми протеазами, известны среднему специалисту; например, они описаны в "Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice", Fourth Edition, Colman et al. 2001. Фактор IIа: р34-35, р176, фактор IXa: p40-41, фактор Ха: р34-35, фактор ХIа p128-129, фактор XIIa: pl94, aPC: р34-35, p159, калликреин: p103-104 или эластаза (O'Reilly et al., 1999; Antiangiogenic activity of the cleaved conformation of the serpin antithrombin: Science 285: 1926-1928).
Изобретение далее относится к модифицированным полипептидам слитого с альбумином фактора VII/VIIa согласно изобретению, содержащим дополнительные модификации в части, относящейся к фактору VII/VIIa.
В частности, модификации фактора VII/FVIIa охвачены изобретением, в котором фактор VII/VIIa был изменен между Arg144 и Аrg152, добавлением, по меньшей мере, части активационного пептида, отличного зависимого от витамина К полипептида, или заменой, по меньшей мере, части предполагаемого активационного пептида полипептида фактора VII/FVIIa, по меньшей мере, частью активационного пептида, отличного зависимого от витамина К полипептида, как описано в европейской патентной заявке 04019485.4 (которая включена в настоящую заявку в качестве ссылки) и которая описана в следующем абзаце.
FVII особенно близко связан с другими белками с доменом Gla, такими как FIX, FX и белок С, в которых за N-концевым доменом Gla следуют два домена эпидермального фактора роста (EGF), за которыми следует домен сериновой протеазы трипсинового типа.
Удивляет большая разница во времени полужизни в плазме этих близко связанных плазматических белков:
FVII:
2-4 часа
Белок С:
6-8 часов
FIX:
18-30 часов
FX:
20-42 часа
Эти молекулы высоко консервированы, и наибольшее различие проявляется в домене активации. Для FVII не описано никакого активационного пептида. Однако, во время активации, в дополнение к расщеплению в Arg152, FVII также может быть расщеплен в Аrg144, что далее приводит к высвобождению предполагаемого активационного пептида из 8 аминокислот, содержащего консервированный сайт N-гликозилирования.
Последовательность между Arg144 и Arg152 в европейской патентной заявке 04019485.4 называется «предполагаемым активационным пептидом».
Удивительно, что длина активационных пептидов и посттрансляционных модификаций активационных пептидов коррелирует с увеличенным временем полужизни:
Таблица 4
Время полужизни в плазме
Длина активационного пептида в соответствующих человеческих белках
Сайты N-гликозилирования внутри соответствующего активационного пептида
FVII
2-4 часа
Активационного пептида нет (или предполагаемый активационный пептид из 8 аминокислот
1 в предполагаемом активационном пептиде из 8 аминокислот
Белок С
6-8 часов
16 аминокислот
0
FIX
18-30 часов
34 аминокислоты
2
FX
20-42 часа
51 аминокислота
2
Изобретение, таким образом, относится к способу получения модифицированного полипептида фактора VII/VIIa, связанного с альбумином, включающему модификацию полипептида фактора VII/VIIa в области между Arg144 и Arg152, так что модифицированный полипептид фактора VII/VIIa имеет увеличенное время полужизни по сравнению с полипептидом фактора VII/VIIa, в котором эта область не была модифицирована.
Изобретение далее относится к способу получения такого модифицированного полипептида фактора VII/VIIa, связанного с альбумином, включающему стадию модификации полипептида фактора VII/VIIa в области между Arg144 и Arg152 указанного полипептида слитого с альбумином фактора VII/VIIa путем добавления, по меньшей мере, части активационного пептида второго зависимого от витамина К полипептида или замены, по меньшей мере, части предполагаемого активационного пептида полипептида фактора VII/VIIa, по меньшей мере, частью активационного пептида другого зависимого от витамина К полипептида.
Изобретение дополнительно охватывает дополнительные мутации последовательности полипептида фактора VII/VIIa, которые усиливают каталитическую активность, удлиняют время полужизни в плазме или модифицируют взаимодействие с тканевым фактором. Особенно полезные мутации фактора VII описаны у Shah efc al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4229-4234, где сообщается об усилениях белковой функции. Другие полезные мутации фактора VII/VIIa приведены в описании уровня техники в европейской патентной заявке 04019485.4.
Изобретение далее относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид слитого с альбумином фактора VII/VIIa, как описано в настоящей заявке. Термин "полинуклеотид(ы)" в общем относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, которые может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК. Полинуклеотид может быть одно- или двухцепочечной ДНК, одно- или двухцепочечной РНК. Термин "полинуклеотид(ы)", как он используется здесь, также включает ДНК или РНК, которые содержат одно или более модифицированных оснований и/или необычных оснований, таких как инозин. Следует отметить, что в ДНК и РНК может быть сделано множество модификаций, которые служат многим полезным целям, известным специалистам в данной области. Термин "полинуклеотид(ы)", как он используется здесь, охватывает такие химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, так же как химические формы ДНК и РНК, характерные для вирусов и клеток, включая, например, простые и сложные клетки.
Специалист в данной области поймет, что, из-за вырожденности генетического кода, каждый конкретный полипептид может кодироваться различными полинуклеотидами. Эти "варианты" охвачены настоящим изобретением.
Предпочтительно, полинуклеотид по настоящему изобретению представляет собой выделенный полинуклеотид. Термин "выделенный" полинуклеотид относится к полинуклеотиду, который по существу свободен от других последовательностей нуклеиновой кислоты, таких как, без ограничения, другие хромосомные и нехромосомные ДНК и РНК. Выделенные полинуклеотиды могут быть очищены из клетки-хозяина. Могут использоваться известные специалистам в данной области общепринятые способы очистки нуклеиновых кислот, чтобы получить выделенные полинуклеотиды. Этот термин также включает рекомбинантные полинуклеотиды и химически синтезируемые полинуклеотиды.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является плазмида или вектор, содержащие полинуклеотид согласно изобретению. Предпочтительно, плазмида или вектор представляют собой вектор экспрессии. В частном варианте осуществления, вектор представляет собой вектор переноса для применения в генной терапии человека.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по настоящему изобретению или плазмиду или вектор по настоящему изобретению.
Клетки-хозяева по настоящему изобретению могут использоваться в способе получения слитого с альбумином полипептида FVII/VIIa, который является частью настоящего изобретения. Способ включает:
- культивирование клеток-хозяев по настоящему изобретению при таких условиях, что экспрессируется полипептид слитого с альбумином FVII/VIIa; и
- необязательно, извлечение полипептида слитого с альбумином FVII/VIIa из культуральной среды.
Экспрессия предложенных вариантов
Получение рекомбинантных белков в больших количествах в подходящих клетках-хозяевах требует сборки вышеупомянутых мофицированных кДНК в эффективные единицы транскрипции вместе с подходящими регуляторными элементами в рекомбинантном векторе экспрессии, который может быть размножен в различных системах экспрессии согласно способам, известным специалистам в данной области. Эффективные регуляторные элементы транскрипции могут быть получены из вирусов, имеющих животные клетки в качестве своих природных хозяев, или из хромосомной ДНК клеток животных. Предпочтительно, могут использоваться комбинации промотор-энхансер, полученные из обезьяньего вируса 40, аденовируса, вируса полиомы ВК, человеческого цитомегаловируса или длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса, или комбинаций промотор-энхансер, включающих крайне конститутивно транскрибированные гены в клетках животных, типа бета-актин или GRP78. Чтобы достичь устойчивых высоких уровней мРНК, транскрибированной с кДНК, единица транскрипции должна содержать в своей 3'-проксимальной части область ДНК, кодирующую последовательность полиаденилирования завершения транскрипции. Предпочтительно, эта последовательность получена из ранней области транскрипции обезьяньего вируса 40, гена бета-глобина кролика или человеческого гена активатора плазминогена ткани.
Затем кДНК интегрируются в геном подходящей линии клетки-хозяина для экспрессии полипептидов связанного с альбумином фактора VII/VIIa. Предпочтительно, эта линия клетки должна быть линией клетки животного позвоночного происхождения, чтобы гарантировать правильное сворачивание, γ-карбоксилирование остатков глютаминовой кислоты в Gla-домен, образование дисульфидных связей, связанное с аспарагином гликозилирование, O-связанное гликозилирование и другие посттрансляционные модификации, так же как секрецию в среду культивирования. Примерами других посттрансляционных модификаций являются O-сульфатирование тирозина, гидроксилирование, протеолитическая обработка образующейся цепи полипептида и отщепление пропептидной области. Примерами клеточных линий, которые могут использоваться, являются COS-клетки обезьяны, L-клетки мыши, С127-клетки мыши, клетки хомяка ВНК-21, человеческие клетки эмбриональной почки 293 и, предпочтительно, СНО-клетки хомяка.
Рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий соответствующие кДНК, может быть введен в линию животной клетки несколькими различными способами. Например, могут быть созданы рекомбинантные векторы экспрессии из векторов, основанных на различных вирусах животных. Примерами этих векторов являются векторы, основанные на бакуловирусе, вирусе вакцинии, аденовирусе и, предпочтительно, бычьем вирусе папилломы.
Единицы транскрипции, кодирующие соответствующие ДНК, могут быть также введены в клетки животного вместе с другим рекомбинантным геном, который может функционировать как доминирующий селектируемый маркер в этих клетках, чтобы облегчить выделение определенных клеточных клонов, которые интегрировали рекомбинантную ДНК в свой геном. Примерами этого типа доминирующих селектируемых маркерных генов являются амино-гликозид-фосфотрансфераза Tn5, придающая устойчивость к генетицину (G418), гигромицин-фосфотрансфераза, придающая устойчивость к гигромицину, и пуромицин-ацетил-трансфераза, придающая устойчивость к пуромицину. Рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий такой селектируемый маркер, может либо находиться на том же самом векторе, что и вектор, кодирующий кДНК желаемого белка, либо он может быть кодирован на отдельном векторе, который одновременно введен и интегрирован в геном клетки-хозяина, что часто приводит к прочной физической связи между различными единицами транскрипции.
Другие типы селектируемых маркерных генов, которые могут использоваться вместе с кДНК желаемого белка, основаны на различных единицах транскрипции, кодирующих дигидрофолатредуктазу (dhfr). После ввода этого типа гена в клетки, испытывающие недостаток эндогенной dhfr-активности, предпочтительно, в СНО-клетки (DUKX-В11, DG-44), это позволит им расти в средах, в которых отсутствуют нуклеозиды. Примером такой среды является среда Ham's F12 без гипоксантина, тимидина и глицина. Эти dhfr-гены могут быть введены вместе с единицами транскрипции кДНК фактора коагуляции в CHO-клетки вышеупомянутого типа, или связанными на одном векторе, или на различных векторах, в силу чего возникают dhfr-положительные клеточные линии, производящие рекомбинантный белок.
Если вышеупомянутые клеточные линии клетки будут выращены в присутствии цитотоксического dhfr-ингибитора метотрексата, то появятся новые клеточные линии, устойчивые к метотрексату. Эти клеточные линии могут производить рекомбинантный белок с повышенной скоростью из-за повышенного числа связанных dhfr и единиц транскрипции желаемого белка. При размножении этих клеточных линий в повышающихся концентрациях метотрексата (1-10000 нм) могут быть получены новые клеточные линии, которые производят желаемый белок с очень высокой скоростью.
Вышеуказанные клеточные линии, производящие желаемый белок, могут быть выращены в большом масштабе либо в суспензионной культуре, либо на различных твердых подложках. Примерами таких подложек являются микроносители, основанные на декстрановых или коллагеновых матрицах, или твердые подложки в виде полых волокон, или различные керамические материалы. При выращивании в суспензионной клеточной культуре или на микроносителях культура вышеупомянутых клеточных линий может быть выполнена либо как периодическая культура, либо как перфузионная культура с непрерывным производством кондиционированной среды в течение длительных периодов времени. Таким образом, согласно настоящему изобретению, вышеупомянутые клеточные линии хорошо подходят для разработки производственного процесса получения желаемых рекомбинантных белков.
Рекомбинантный белок, который накапливается в питательной среде секретирующих клеток вышеупомянутых типов, может быть сконцентрирован и очищен различными биохимическими и хроматографическими методами, включая методы, использующие различия в размере, заряде, гидрофобности, растворимости, специфическом сродстве и т.д. между желаемым белком и другими веществами в среде для культивирования клеток.
Примером такой очистки является адсорбция рекомбинантного белка моноклональным антителом, которое иммобилизовано на твердой подложке. После десорбции белок может быть дополнительно очищен с помощью различных хроматографических методик, основанных на вышеупомянутых свойствах.
Предпочтительным является чистить полипептид связанного с альбумином фактора VII/VIIa по настоящему изобретению до ≥80% чистоты, более предпочтительно, до ≥95% чистоты, и наиболее предпочтительным является фармацевтически чистое состояние, которое выше 99,9% чистоты по отношению к загрязняющим макромолекулам, в частности другим белкам и нуклеиновым кислотам, и свободно от инфекционных и пирогенных средств. Предпочтительно, выделенный или очищенный полипептид связанного с альбумином FVII/VIIa по настоящему изобретению по существу не содержит других полипептидов.
Описанные в данном изобретении полипептиды связанного с альбумином фактора VII/VIIa могут быть приготовлены в виде фармацевтических препаратов для терапевтического применения. Очищенные белки могут быть растворены в общепринятых физиологически совместимых водных буферных растворах, в которые могут быть необязательно добавлены фармацевтические эксципиенты, с получением фармацевтических препаратов.
rd
Такие фармацевтические носители и эксципиенты, также как подходящие фармацевтические составы, хорошо известны в уровне техники (см., например, "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) or "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3 edition, Kibbe et al. Pharmaceutical Press (2000)). В частности, фармацевтическая композиция, содержащая вариант полипептида по настоящему изобретению, может быть приготовлена в лиофилизированном или стабильном растворимом виде. Вариант полипептида может быть лиофилизирован с помощью различных процедур, известных в уровне техники. Лиофилизированные составы ресуспендируются перед применением путем добавления одного или более фармацевтически приемлемых разбавителей, таких как стерилизованная вода для инъекцией или стерильный физиологический солевой раствор.
Составы композиции доставляют человеку любыми фармацевтически подходящими средствами введения. Различные системы доставки известны и могут использоваться для введения композиции любым общепринятым путем. Предпочтительно, композиции по настоящему изобретению вводятся системно. Для системного применения варианты связанного с альбумином фактора VII/VIIa по настоящему изобретению составлены для парентеральной (например, внутривенной, подкожной, внутримышечной, интраперитонеальной, внутрицеребральной, внутрилегочной, внутриносовый или трансдермальной) или для энтеральной (например, оральной, вагинальной или ректальной) доставки в соответствии с общепринятыми методами. Наиболее предпочтительным путем является внутривенное введение. Составы могут вводиться непрерывно путем вливания или путем болюсной инъекции. Некоторые составы охватывают системы медленного высвобождения.
Модифицированные биологически активные полипептиды слитого с альбумином фактора VII/VIIa по настоящему изобретению вводятся пациентам в терапевтически эффективной дозе, что означает дозу, которая достаточна, чтобы оказать желаемые эффекты, что приводит к предотвращению или ослаблению тяжести или распространения состояния или показания, в отношении которых осуществляется лечение, без достижения дозы, которая вызывает невыносимые неблагоприятные побочные эффекты. Точная доза зависит от многих факторов, таких как, например, показание, состав и способ введения, и она должна определяться в преклинических и клинических испытаниях для каждого соответствующего показания.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться сама по себе или совместно с другими терапевтическими средствами. Эти средства могут быть включены как часть того же самого фармацевтического продукта.
Различные продукты по настоящему изобретению являются полезными в качестве лекарственных средств. Соответственно, настоящее изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид слитого с альбумином фактора FVIIA/IIa, как описано здесь, полинуклеотид по настоящему изобретению или плазмиду или вектор по настоящему изобретению.
Модифицированные ДНК по настоящему изобретению могут также быть интегрированы в вектор переноса для применения в генной терапии человека.
Другим аспектом настоящего изобретения является применение полипептида связанного с альбумином фактора FVII/VIIa, полинуклеотида по настоящему изобретению, плазмиды или вектора по настоящему изобретению, или клетки-хозяина по настоящему изобретению для производства лекарственного средства для лечения или предотвращения нарушений свертываемости крови. Нарушения свертываемости крови включают, без ограничения, гемофилию A. В другом варианте осуществления настоящего изобретения лечение включает генную терапию человека.
Изобретение также касается способа лечения индивидуума с одним или более следующих показаний: "случаи кровотечения и хирургическое вмешательство у пациентов с врожденной или приобретенной гемофилией с ингибиторами к факторам коагуляции (FVIII или FIX)", "обращение дефицитов гемостаза, развившихся как последствие лечения лекарственными средствами, такими как лекарственные средства против тромбоцитов или лекарственные средства против коагуляции", "улучшение вторичного гемостаза", "дефициты гемостаза, развившиеся во время инфекций или во время болезней, такие как дефицит витамина К или тяжелое заболевание печени", "резекция печени", "дефициты гемостаза, развившиеся в результате укусов змеи" "гастроинтестинальные кровотечения". Также предпочтительными показаниями являются "травма", "последствия массивного переливания (дилюционная коагулопатия)", "дефициты фактора коагуляции, отличные от FVIII и FIX", "VWD", "дефицит FI", "дефицит FV", "дефицит FVII", "дефицит FX", "дефицит FXIII", "HUS", "врожденные или приобретенные тромбоцитарные болезни и нарушения, подобные тромбоцитопении, ITP, ТТР, синдром HELLP, синдром Бернара-Сулье, тромбастения Гланцмана, HIT", "синдром Чедиака-Хигаси", "синдром Германски-Пудлака", "синдром Ренду-Ослера", "пурпура Геноха-Шенлейна" и "заживление ран". Способ также включает введение указанному индивидууму эффективного количества полипептида FVII/VIIa, связанного с альбумином, как описано здесь. В другом варианте осуществления, способ включает введение индивидууму эффективного количества полинуклеотида по настоящему изобретению или плазмиды или вектора по настоящему изобретению. Как альтернатива, способ может включать введение индивидууму эффективного количества клеток-хозяев по настоящему изобретению, описанному здесь.
Описание таблиц и рисунков
Фигура 1.
Сайт рестрикции XhoI, введенный в сайт природного стоп-кодона FVII заменой TAG на TCG, подчеркнут. Сайт NotI, используемый для дальнейшего конструирования, подчеркнут двойной чертой. Аминокислотная последовательность С-конца фактора VII дана в трехбуквенном коде (заключены в рамку).
Фигура 2.
Схема линкерных последовательностей, вставленных между С-концом фактора VII и N-концом альбумина в различных конструкциях pFVII. Сайт расщепления тромбина в pFVII-834 подчеркнут. Аспарагины сайтов N-гликозилирования подчеркнуты двойной чертой.
Фигура 3. Слитые белки альбумина и FVII были активированы FXa, и активность FVIIa была измерена в анализе STACLOT. На графике показана активность белков с увеличением длины линкера по сравнению с белком без линкера (полученного из плазмиды pFVII-974).
Фигура 4.
Результаты экспериментов РК с фактором VII дикого типа (pFVII-659), слитых белков альбумина и FVII, полученного из плазмы FVII (pdFVII) и rFVIIa (NovoSeven), как измерено ELISA.
Примеры
Пример 1. Создание кДНК, кодирующих полипептиды FVII, слитого с альбумином
Кодирующая последовательность фактора FVII была амплифицирована ПЦР из библиотеки кДНК печени человека (ProQuest, Invitrogen) с использованием праймеров Wel303 и Wel304 (SEQ ID NO 1 и 2). После второго цикла ПЦР с использованием праймеров Wel286 и We 128 7 (SEQ ID NO 3 и 4) полученный фрагмент был клонирован в pCR4TOPO (Invitrogen). Оттуда кДНК FVII была перенесена в виде фрагмента EcoRI в сайт EcoRI в pIRESpuroS (BD Biosciences), где внутренний сайт XhoI был ранее удален. Полученная плазмида была обозначена как pFVII-659.
Затем сайт рестрикции XhoI был введен в pFVII-659 в сайте природного стоп-кодона FVII (фигура 1), путем сайт-направленного мутагенеза в соответствии со стандартными протоколами (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) с использованием олигонуклеотидов We1643 и We1644 (SEQ ID NO 5 и 6). Полученная плазмида была обозначена как pFVII-700.
Олигонуклеотиды We1731 и We1732 (SEQ ID NO 7 и 8) отжигали в эквимолярных концентрациях (10 пмоль) в стандартных условиях ПЦР, заполняли и амплифицировали с использованием протокола ПЦР: начальная денатурация в течение 2 минут при 94°C, далее 7 циклов по 15 секунд денатурации при 94°C, 15 секунд отжига при 55°C и 15 секунд элонгации при 72°C, что оканчивается стадией удлинения в течение 5 минут при 72°C. Полученный фрагмент расщепляли рестрикционными эндонуклеазами XhoI и NotI и лигировали в pFVII-700, расщепленную теми же самыми ферментами. Полученная плазмида была обозначена как pFVII-733 и содержала кодирующую последовательность для FVII и C-концевое удлинение отщепляемого глицин-серинового линкера тромбина.
Были вставлены другие линкеры, основанные на pFVII-733, без сайта расщепления тромбина и дополнительных сайтов N-гликозилирования. Для этого пары праймеров We2148 и We2149 (SEQ ID NO 9 и 10), We2148 и We2150 (SEQ ID NO 9 и 11), We2148 и We2151 (SEQ ID NO 9 и 12), We2152 и We2153 (SEQ ID NO 13 и 14), We2152 и We2154 (SEQ ID NO 13 и 15), We2152 и 2155 (SEQ ID NO 13 и 16) и We2156 и We2157 (SEQ ID NO 17 и 18) соответственно отжигали и амплифицировали, как описано выше. Соответствующие фрагменты ПЦР расщепляли рестрикционными эндонуклеазами XhoI и BamHI и вставляли в pFVII-733, расщепленную теми же ферментами. В сайт BamHI полученных плазмид, а также в сайт BamHI pFVII-733 вводили BamHI-фрагмент, содержащий кДНК зрелого человеческого альбумина. Этот фрагмент генерировали ПЦР на последовательности кДНК альбумина, используя праймеры We1862 и We1902 (SEQ ID NO 19 и 20) при стандартных условиях. Полученные плазмиды были обозначены как pFVII-935, pFVII-936, pFVII-937, pFVII-938, pFVII-939, pFVII-940, pFVII-941 и pFVII-834 соответственно. Их линкерные последовательности и С-концевая последовательность FVII и N-концевая последовательность альбумина схематически показаны на фигуре 2.
Более короткие линкерные последовательности, основанные на pFVII-938, генерировали делеционным мутагенезом. Для этого праймеры мутагенеза We2247 и We2248 (SEQ ID NO 23 и 24), We 2249 и We2250 (SEQ ID NO 25 и 26), We2251 и We2252 (SEQ ID NO 27 и 28) и We2253 и We2254 (SEQ ID NO 29 и 30) использовали в стандартных протоколах мутагенеза (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) с получением плазмид pFVII-1014, pFVII-1015, pFVII-1016 и pFVII-1370 соответственно.
Чтобы генерировать слитый белок альбумина и FVII без линкера, делеционный мутагенез, как описано выше, применяли в отношении плазмиды pFVII-935, используя праймеры We2181 и We2182 (SEQ ID NO 31 и 32). Полученная плазмида была обозначена как pFVII-974.
Основанный на плазмиде pFVII-974 инсерционный мутагенез применяли для генерирования линкеров из 1-3 аминокислот. Для этого праймеры мутагенеза We2432 и We2433 (SEQ ID NO 33 и 34), We2434 и We2435 (SEQ ID NO 35 и 36) и We2436 и We2437 (SEQ ID NO 37 и 38) использовали в стандартных протоколах мутагенеза (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) с получением плазмид pFVII-1158, pFVII-1159 и pFVII-1160 соответственно.
Дальнейшие конструкции генерировали в аналогичных процедурах, применяя в стандартных протоколах мутагенеза праймеры мутагенеза We2713 и We2714 (SEQ ID No 39 и 40) на плазмиде pFVII-1370, We2715 и We2716 (SEQ ID No 41 и 42) на плазмиде pFVII-1370, We2717 и We2718 (SEQ ID No 43 и 44) на плазмиде pFVII-1016 и We2756 и We2757 (SEQ ID No 45 и 46) на плазмиде pFVII-935 с получением плазмид pFVII-1361, pFVII-1362, pFVII-1363 и pFVII-1382 соответственно.
Линкерные последовательности и C-концевая последовательность FVII и N-концевая последовательность альбумина вышеописанных плазмид схематически показаны на фигуре 2.
Пример 2. Трансфекция и экспрессия слитых полипептидов фактора VII-альбумин
Плазмиды выращивали в E.coli TOP10 (Invitrogen) и очищали с использованием стандартных протоколов (Qiagen). Клетки НЕК-293 были трансфицированы, используя реактив Lipofectamine 2000 (Invitrogen), и их выращивали в бессывороточной среде (Invitrogen 293 Express) в присутствии 50 нг/мл витамина К и 4 мкг/мл пуромицина. Трансфицированные популяции клеток расширяли с помощью Т-колбы во вращающиеся бутыли, из которых супернатант собирался для очистки.
Пример 3. Очистка полипептидов FVII и слитого с альбумином FVII.
Собранную клеточную культуру, содержащую FVII или слитый белок FVII-альбумин, наносили на 2,06 мл-колонку с Q-sepharose FF, ранее уравновешенную 20-мМ буфером HEPES, pH 7,4. Затем колонку промывали 10 объемами указанного буфера HEPES. Элюцию связанных молекул FVII достигали путем прогона линейного градиента от 0 до 1,0 М NaCl в 20 мМ-буфере HEPES на объеме в 20 колонок. Элюат содержал приблизительно 85-90% нанесенного антигена FVII при концентрациях белка от 0,5 до 1 г/л.
Альтернативно, FVII очищали хроматографией, используя иммобилизованный тканевой фактор, как описано в ЕР 0770625 В1.
Антиген FVII и активность определяли, как описано в примере 4.
Пример 4. Определение активности FVII и антигена.
Активность FVII определяли с использованием коммерчески доступного хромогенного испытательного набора (Chromogenix Coaset FVII с использованием обычной человеческой плазмы [Dade Behring] в качестве стандарта) на основе метода, описанного Seligsohn et al. Blood (1978) 52:978-988.
Активность FVIIa определяли с использованием коммерчески доступного испытательного набора (STACLOT) VIIa-rTF, Diagnostica Stago на основе метода, описанного Morissey et al. (1993) Blood 81:734-744.
Антиген FVII определяли ELISA, принцип которого известен специалистам в данной области. Вкратце, микропластины инкубировали с 120 мкл захватывающего антитела на лунку (IgG овцы против FVII человека, Cedarlane CL20030AP, разбавленные 1:1000 в буфере А [Sigma C3041]) на ночь при температуре окружающей среды. После промывки пластин три раза буферным раствором В (Sigma P3563), каждую лунку инкубировали с 200 мкл буфера С (Sigma P3688) в течение одного часа при температуре окружающей среды. После еще трех стадий промывки буфером В, серийные разбавления исследуемого образца в буфере В, а также серийные разбавления стандартной человеческой плазмы (Dade Behring; 50-0,5 mU/мл [1 mU равна 0,5 нг]) в буфере В (объемы на клетку: 100 мкл), инкубировали в течение двух часов при температуре окружающей среды. После трех стадий промывки буфером В, 100 мкл антитела-определителя с разбавлением 1:5000 в буфере В (IgG овцы против FVII человека, Cedarlane CL20030K, пероксидазы) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение еще двух часов при температуре окружающей среды. После трех стадий промывки буфером В, 100 мкл раствора субстрата (ТМВ, Dade Behring, OUVF) добавляли в лунку и инкубировали в течение 30 минут при температуре окружающей среды в темноте. Добавлением 100 мкл неразбавленного стоп-раствора (Dade Behring, OSFA) приготовляли образцы к считыванию в подходящем планшет-ридере при длине волны 450 нм. Концентрации тестируемых образцов затем рассчитывали, используя стандартную кривую со стандартной человеческой плазмой в качестве эталона.
Пример 5. Активация фактором Ха слитых полипептидов FVII и FVIIa с альбумином
++
2
2
Полипептиды FVII, очищенные, как описано в примере 3, диализировали против буфера, состоящего из 20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 1 мМ цитрата натрия, 1 г/л каприлата натрия, рН8.5. В этом буферном окружении FVII активировали в FVIIa инкубацией с FXa (коммерчески доступный препарат, 100 IU/мл, ERL), фосфолипидами (Phospholipon 25P, 1 г/л, Rhone Poulenc-Nattermann, Köln) и Ca (раствор CaCl в Aqua dest, 1M) в течение различных временных интервалов при 37°C. Конечные концентрации были от приблизительно 30 до 65 IU/мл FVII, по измерениям хромогенного анализа; 0,5% FXa, отнесенный к FVII, т.е. 1 IU FXa и 200 IU FVII, 0,02 г/л фосфолипидов и 5 мл CaCl.
Активацию оканчивали добавлением 10% (v/v) буфера, состоящего из 20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 200 мм цитрата натрия, 1 г/л каприлата натрия, pH 5,0.
Для параллельного мониторинга расщепления молекул, образец активированной смеси и соответствующий неактивированный образец наносили на SDS-PAGE с окраской Кумасси синим и сканировали полосы на плотность.
Вкратце, образцы восстанавливали, наносили на SDS-PAGE (градиент 8-16% полиакриламид, гели Novex Tris-Glycin, Invitrogen; согласно инструкциям производителя) и окрашивали Кумасси синим G-250. Полученные полосы сканировали (Versa DOC, Bio-Rad), и относительные концентрации белка вычисляли, используя программное обеспечение Image Quant (V 4.20, Amersham).
Пример 6. Активность слитых белков FVII-альбумин зависит от длины линкера.
Слитые белки FVII-альбумин с длиной линкера от 0 до 31 аминокислот активировали как описано выше и активность FVIIa определяли анализом STACLOT. Хотя слитые полипептиды, независимо от длины линкера, показывали сопоставимую степень расщепления FXa, активности FVIIa слитых белков с альбумином, измеренные анализом активности, показали удивительный результат: чем длиннее линкер между FVII и альбуминовой частью, тем выше была измеренная молярная специфическая активность FVIIa (фигура 3 и таблица 5), а конструкция без линкера (974) показала менее половины активности FVIIa по сравнению с конструкциями с пептидными линкерами длиной 19 или более аминокислот. Даже одна аминокислота в качестве линкера (pFVII-1158) увеличивала молярную специфическую активность слитого белка на 31% по сравнению со слитым белком без линкера (pFVII-974). Это заставляет предположить, что прямое слияние FVII и альбуминных последовательностей могло бы привести к конформационной ситуации, где альбуминовая часть мешает либо принятию нужной конформации части, соответствующей FVIIa, либо взаимодействию с ее субстратом. По-видимому, эта помеха значительно уменьшена в конструкциях, имеющих промежуточный пептидный линкер между фактором VII/VIIa и альбумином.
Слитый с альбумином белок без линкера (974) показал приблизительно 25% молярной специфической активности по сравнению с NovoSeven (таблица 6).
Таблица 5
Слитый с альбумином белок, полученный из pFVII-
Длина линкера [аминокислоты]
Количество сайтов N-гликозилирования внутри линкера
% повышения активности Staclot по сравнению со слитым белком без линкера
974
0
0
0
1158
1
0
31,3
1159
2
0
75,6
1160
3
0
104,0
1370
4
0
81,6
1361
5
0
107,0
1362
6
0
98,5
1363
7
0
178,1
1015
10
1
155,7
1014
13
2
201,5
1382
16
0
149,8
935
19
0
194,5
936
25
0
255,7
937
31
0
249,8
Таблица 6.
Сравнение молярной специфической активности (выраженной в единицах FVIIa, измеренной анализом Staclot, на 100 единиц антигена FVII, как измерено ELISA) между слитым белком FVII-альбумин без линкера (974) и NovoSeven
Белок
Специфичная активность Staclot [IU/100 IU антиген FVII]
% специфичной активности
974
489
27.8
NovoSeven
1759
100.0