60
Применение водно-солевого раствора фуллерена Cв качестве терапевтического средства при заболеваниях атопическим дерматитом
APPLICATION OF FULLERENE C60 AQUEOUS SOLUTION AS THERAPEUTIC AGENT AT ATOPIC DERMATITIS DISEASE

Изобретение относится к фармакологии и медицине, преимущественно к аллергологии, дерматологии, и может быть использовано для лечения аллергодерматозов и других заболеваний, связанных с аллергической реакцией.
Лечение АД часто испытывает большие трудности и настоятельно нуждается в развитии новых подходов. Традиционной основой медикаментозного лечения атопического дерматита, особенно при обострениях, являются топические глюкокортикостероиды (ГКС) и, более редко, топические ингибиторы кальциневрина, нестероидные средства с противовоспалительным и иммуносупрессивным действием. Однако длительное применение топических ГКС может приводить к подавлению функции коры надпочечников и развитию атрофии кожи вследствие подавления синтеза коллагена и задержки пролиферации фибробластов. Наиболее известными ингибиторами кальциневрина являются такролимус и пимекролимус, блокирующие опосредовано, через сигнальные пути, продукцию провоспалительных цитокинов [Sidbury R, Hanifin JM. Systemic therapy of atopic dermatitis. Clin Exp Dermatol. 2000, 25: 559-66]. Однако, несмотря на высокую активность, всеобъемлющие данные по их долгосрочной клинической безопасности пока не представлены [Кутасевич Я.Ф., Уманец Т.Р. Эффективность и безопасность применения топических ингибиторов кальциневрина в педиатрии. http://www.umj.com.ua/wp/wp-content/uploads/2014/06/4255.pdf]. Терапия с использованием системных кортикостероидов показана только при тяжелых случаях (псориаз), но и в этом случае их использование должно быть ограничено во времени из-за возможных побочных эффектов. Кортикостероиды индуцируют лизис некоторых подтипов Т-клеток и блокируют также транскрипцию генов IL-1, IL-6 TNFα в макрофагах. Наиболее известные системные средства для подавления воспаления: преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон, метотрексат. Другие препараты из этого класса, особенно иммунодепрессанты (известны более 30 препаратов), имеют еще большие ограничения к регулярному использованию. К ним можно отнести циклоспорин (Сандимун), интерферон-гамма, Целлсепт, тазатиоприн (Имуран) и ряд других [J. Am. Acad. Dermatol., 2005; 52: 156; J Am Acad Dermatol. 2004; 50: 391-404]. Циклоспорин блокирует транскрипцию генов цитокинов IL-2, IL-4, IFN-α и IL-2R, тем самым ингибирует и продукцию самих цитокинов, которые вызывают индукцию, активацию и дифференцировку Т-клеток, элементов воспалительной реакции.
В последние годы стали также доступны в качестве лекарств моноклональные антитела против цитокина IL-4 и его рецепторов, иммуноглобулина Е (IgE), активированных Т и В-клеток [Yalcin A.D. An overview of the effects of anti-IgE therapies," Medical Science Monitor, 2014, 20: 1691-1699; Ganzetti G., Campanati A., Molinelli E., Offidani A. Biologic therapy in inflammatory and immunomediated skin diseases: safety profile. Current Drug Safety, 2015, 10 (999): 1-10]. Однако применение таких препаратов для многих групп больных ограничено из-за очень высокой их стоимости. Кроме того, ни один из этих препаратов пока не рекомендован для лечения АД, ввиду недостаточности данных об их эффективности и безопасности.
Пациентам с доказанной сенсибилизацией к определенным группам аллергена возможно проведение аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ). Эффективность имеющихся методов лечения доказана клиническими исследованиями, однако, в настоящее время отмечается тенденция к развитию тяжелых, непрерывно рецидивирующих форм АД, устойчивых к стандартной терапии.
60
60
60
60
60
60
24
60
60
24
60
С другой стороны, фуллерен С - многообещающая субстанция для высокотехнологичных материалов и новых лекарственных средств. После открытия простого способа его получения были синтезированы множественные производные фуллерена, многие из которых обладают явной биологической активностью [Kratschmer W., Lamb L.D., Fostiropoulos K., Huffman D.R. Solid C60: a new form of carbon. Nature; 1990, 347:354-356; Bosi, S., T. Da Ros, G. Spalluto, et al. Fullerene derivatives: an attractive tool for biological applications. Eur. J. Med. Chem., 2003, 38: 913-923; Пиотровский Л.Б. Фуллерены в биологии / Л.Б. Пиотровский, О.И. Киселев. СПб.: ООО «Издательство „Росток"», 2006. 336 с.]. С является единственной молекулярной формой чистого углерода, имеющей вид идеального сфероида с 60 атомами. Основой уникального действия фуллерена являются три его важных свойства: гидрофобность, электрон-акцепторная активность и легкая поляризуемость частиц, определяющая как его внутримолекулярные взаимодействия, так и облегченный перенос электронов от донорных молекул. Как сильнейший акцептор электронов, С проявляет высокую антиоксидантную активность и способен in vivo и in vitro эффективно инактивировать все формы АФК и свободные радикалы [Krustic P.J., Wasserman Е., Keizer P.N. Radical reactions of C. Science, 1991, 254: 1183-1185; Gharbi N., Pressac M., Hadchouel M., Szwarc H., Wilson S.R., Moussa F. [60] Fullerene is a powerful antioxidant in vivo with no acute or subacute toxicity. Nano Letters, 2005, 5 (12): 2578-2585]. Такая активность предполагает, что фуллерен может являться перспективным терапевтическим средством для лечения заболеваний, связанных с окислительным стрессом. Важным свойством фуллерена является его низкая токсичность и возможность использовать разные пути его введения. Так, длительные (6 лет) эксперименты на крысах показали, что фуллерен, растворенный в оливковом масле, не проявляет хронической токсичности, более того, он значительно продлевает время жизни животных. Данные демонстрировали, что его эффект, по-видимому, связан с нивелированием окислительного стресса [Baati Т., Bourasset F., Gharbi N., Njim L. et al. The prolongation of the lifespan of rats by repeated oral administration of [60] fullerene. Biomaterials, 2012, 33: 4936-4946]. Также показана значительная противовоспалительная активность различных форм С (фуллеренола С(ОН), катионных аминокислотных производных С) на модели отека стопы крыс и мышей (модель реакции гиперчувствительности замедленного типа, ГЗТ), вызванной макромолекулярными агентами [Dragojevic-Simic V., Jacevic V., Dobric S. et al. Anti-inflammatory activity of fullerenol C(OH) nanoparticles in a model of acute inflammation in rats. Digest J. Nanomater. Biostr., 2011, 6 (2): 819-827; Башкатова E.H., Андреев С.М., Шершакова Н.Н., Бабахин А.А., Шиловский И.П., Хаитов М.Р. Изучение модулирующей активности производных фуллерена С на реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Физиология и патология иммунной системы, 2012, №2, 17-27].
60
n
60
2
3
n
В отношении противоаллергических эффектов фуллерена показано, что полигидроксифуллерен (С(ОН) и N-этилполиаминофуллерен (C(NHCHCH) ингибировали in vitro IgE-зависимую дегрануляцию тучных клеток, секрецию цитокинов и простагландинов в ответ на стимуляцию аллергеном. Авторы предположили, что этот эффект связан со снижением уровня АФК в клетках, т.е. блокированием окислительного стресса при аллергической реакции за счет антиоксидантной активности фуллерена [Magoulas G.Е., Garnelis Т., Athanassopoulos С.М et al. Synthesis and anti-oxidative/anti-inflammatory activity of novel fullerene-polyamine conjugates. Tetrahedron, 2012, 68 (35): 7041-7049]. При их инкубировании с тучными клетками и базофилами крови человека они подавляли их реакцию на аллерген, а в модели анафилаксии тормозили высвобождение гистамина. Отмечалось также, что такие производные ингибируют продукцию провоспалительных цитокинов, секреция которых опосредована фактором некроза опухоли (TNF-α) в синовиальных фибробластах, лимфоцитах и макрофагах, и он, очевидно, является перспективным препаратом для лечения артрита [Park E. - J., Kim Н., Kim Y., Yi J., Choi K., and Park K. Carbon fullerenes (C60s) can induce inflammatory responses in the lung of mice. Toxicology and Applied Pharmacology, 2010, 244 (2): 226-233].
40
50
60
70
60
Известно изобретение (US 7947262 B2), где водорастворимый С, С, С или С фуллерен, модифицированный ковалентным присоединением одного или более фрагментов, выбранных из группы, состоящей из пиридина, гидроксила, циклодекстрина, поливинилпирролидона, бис -(моносукцинимид-, р, р'-бис (2-амино-этил) дифенила, полиаминов и N-этилполиаминов, предполагают применять для лечения заболеваний, опосредованных реакцией тучных клеток и базофилов периферической крови в ответ на аллерген. Заявлен очень широкий спектр заболеваний от аллергии до сердечно-сосудистых. Однако немодифицированный фуллерен С не применяли для этих целей.
Известно изобретение (WO 2009145982), где для лечения поврежденной кожи заявлены соединения различных классов с антиоксидантными свойствами, включая липофильные катионы, нацеленные на транспорт в митохондрии, кератиноциты и фибробласты кожи. В качестве антиоксидантов также применяются витамин Е, аскорбиновая кислота, липоевые кислоты, ацетил-цистеин и другие классы веществ, включая химические производные фуллерена.
60
Известно изобретение (US 20110251158), где соединения фуллерена заявлены как противовоспалительные препараты для лечения атеросклероза сосудов. В патенте заявлен широкий ряд производных фуллерена С60 с формулой Zm-F-Yn, где F - фуллерен. Однако немодифицированный фуллерен С не заявлен для этих целей.
32
44
60
70
76
90
96
Описана композиция, предназначенная для сглаживания морщин и улучшения состояния кожи (WO 200913426 А1), представляющая собой раствор фуллеренов С, С, С, С, С, С, С и др. в масле. Однако представленные составы являются неводными, и их нельзя вводить парентерально.
60
-11
Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о явных противоаллергических свойствах фуллерена. Однако фуллерен пока не применяют в клинической практике. Одна из причин - коммерческая недоступность приемлемых по цене и нетоксичных водорастворимых форм фуллерена, химически немодифицированных. Другая причина - отсутствие результатов по долговременным всеобъемлющим клиническим испытаниям препаратов фуллерена, отсутствие знаний о возможных путях его метаболизма и выведения. Очень низкая растворимость фуллерена С в воде (<10 г/л) ограничивает возможность его непосредственного применения для биомедицинских исследований. При этом химическая модификация, введение заместителей в ядро фуллерена часто уменьшает его антиоксидантную активность из-за нарушения его электронной структуры (снижая уровень делокализации электронов).
60
60
Ранее мы описали простой способ получения стабильного водного раствора (коллоидный раствор или дисперсия) фуллерена С (ВРФ), пригодного по токсикологическим показателям для биомедицинского применения. Метод основан на проведении исчерпывающего диализа раствора С в смеси вода-N-метилпирролидон (МП) против воды [Андреев С.М., Пургина Д.Д., Башкатова Е.Н., Гаршев А.В., Маерле А.В., Хаитов М.Р. Эффективный способ получения водных нанодисперсий фуллерена. С. 60. Российские нанотехнологии, 2014, №7-8: 11-17; Патент RU 2548971 «Способ получения водных нанодисперсий фуллерена»]. ВРФ представляет собой опалесцирующий раствор желто-коричневого цвета с концентрацией частиц фуллерена 130-150 мг/л, имеет характерные максимумы поглощения при 220, 265 и 345 нм, размер частиц 60-80 нм, и поверхностный заряд (z-потенциал) - ξ=-25-30 mV. По этим параметрам дисперсия ВРФ имеет сходные характеристики с дисперсиями, получаемыми распространенным толуол-ультразвуковым методом [Andrievsky G.V., Kosevich M.V., Vovk О.М., Shelkovsky V.S., Vashcenko L.A. Chem. Soc. 1995, 12: 1281-1282], но с одним существенным отличием. В наночастицах ВРФ присутствуют молекулы МП, образующие с фуллереном донорно-акцепторный комплекс, что повышает их гидрофильность и стабильность в водной среде.
60
Показано, что ВРФ значительно снижает кожное воспаление, вызванное аллергенным белком овальбумином, обеспечивает снижение уровня специфического IgE и Th2-цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-5) [Shershakova N, Baraboshkina Е, Andreev S, Purgina D, Struchkova I, Kamyshnikov O, Nikonova A, Khaitov M Anti-inflammatory effect of fullerene С in a mice model of atopic dermatitis. Journal of Nanobiotechnology, 2016, 14:8 doi: 10.1186/s12951-016-0159-z]. Однако частицы фуллерена в ВРФ диспергированы в деионизированной/дистиллированной воде, т.е. в среде, неизотоничной по отношению к биологической среде (кровь, ткани). Из литературы известно, что водные растворы (коллоидные дисперсии) немодифицированного фуллерена в присутствии солей неустойчивы. Таким образом, при прямом введении ВРФ в кровяное русло за счет присутствия солей фуллерен будет выпадать в осадок. Поэтому применять ВРФ как системное средство, например, для лечения аллергических дерматитов (АД), нельзя. Внутримышечное введение ВРФ чревато тяжелыми осложнениями (инфильтрат, абсцесс, флегмона и т.д.).
60
Суть настоящего изобретения состоит в использовании для противоаллергической терапии, включая АД, водно-солевого раствора фуллерена C (ВСРФ), устойчивого в условиях биологической среды, имеющего низкую гемолитическую активность, и пригодный для парентерального введения. Указанный способ основан на введении в ВРФ небольшой добавки биосовместимого неионного полимера плуроник F-127. В таком случае ВСРФ может быть использован в любой форме: либо путем накожной аппликации, например, с использованием лечебных повязок, заживляющих бинтов и салфеток, содержащих ВСФР, либо путем перорального приема, либо путем внутривенных и внутримышечных инъекций.
Техническим результатом настоящего изобретения является уменьшение аллергического воспаления, улучшение регенерации кожи.
In vivo исследования на мышах (BALB/c) показали наличие у ВСРФ заметного противовоспалительного действия. Визуальная оценка остаточного поражения кожного покрова показала, что процесс заживления раны при его участии идет примерно в два раза интенсивнее, чем при отсутствии терапии. По результатам анализа экспрессии таких факторов, как IgE (Рис. 3), IL-4, IL-5, IL-12 (Рис. 4), IFN-γ (Рис. 5), Foxp3, гена филаггрина и данных гистологии (Рис. 2) было установлено, что ВСРФ уменьшает аллергическое воспаление, стимулирует процесс эпителизации раны и способствует нормальной регенерации
60
60
60
60
60
Технический результат достигается применением водно-солевого раствора фуллерена С, содержащего, кроме активного вещества - фуллерена С, плуроник F-127, в качестве терапевтического средства для парентерального введения при заболеваниях атопическим дерматитом. При этом соотношение плуроника к фуллерену С 1:1, или 1:2, раствор подвергается фильтрации через 0,45 мкм фильтр. Концентрация С в растворе находится в пределах 70-120 мкг/мл. Содержание в 1 мл раствора: фуллерен С - 120 мкг, F-127 - 120 мкг, остальное - физиологический раствор.
60
Ниже приводится подробное описание получения и использование водно-солевого раствора фуллерена С.
Краткое описание чертежей.
60
Фиг. 1 УФ-Вид спектр дисперсии фуллерена С/плуроник F-127/вода. (С60:F-127=1:1) разбавлен в 10 раз.
Фиг. 2. Гистологический анализ кожи: А - модель АД; Б - после внутривенного введения ВСРФ; В - после внутримышечного введения ВСРФ; Г - интактные мыши.
60
60
60
Фиг. 3. Изменение концентрации IgE-антител против овальбумина после введения ВСРФ. 1 - модель АД; 2 - С + ланолин; 3 - С в/м; 4 - С60 в/в; 5 - С и/г; 6 - PBS. * - достоверно отличается от группы «модель АД», р<0,05. Методы введения: в/м - внутримышечный, в/в - внутривенный, и/г - пероральный. Все группы достоверно отличаются от группы «интактные» (PBS).
60
Фиг. 4. Изменения концентраций а - ИЛ-4; b - ИЛ-5 и c - ИЛ-12 после введения ВСРФ. 1 - модель АД; 2 - С в/м; 3 - С60 в/в; 4 - интактные. * - достоверно отличается от группы «модель АД», р<0,05. Методы введения: в/м - внутримышечный, в/в - внутривенный.
60
60
60
60
Фиг. 5. Изменения концентрации интерферона-гамма (IFNg). 1 - модель АД; 2 - С + ланолин; 3 - С в/м; 4 - С60 в/в; 5 - С и/г; 6 - PBS. * - достоверно отличается от группы «модель АД», р<0,05; ** - достоверно отличается от группы «PBS», р<0,05; x - достоверно отличается от группы «С + ланолин», p<0,05.
1. Получение ВСРФ.
60
60
60
340
100 мг кристаллического фуллерена С60 (99.9%) растворяют в 125 мл N-метилпирролидона (МП), раствор перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения фуллерена. Полученный раствор С в МП темно-фиолетового цвета фильтруют через 3-мкм стекловолоконный фильтр. Затем к фильтрату добавляют 250 мл 0.04% раствора плуроника F-127 в дистиллированной воде или в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) при постоянном перемешивании. Цвет получаемых растворов меняется от темно-фиолетового до красно-оранжевого, также наблюдается легкая опалесценция. Раствор перемешивают на магнитной мешалке приблизительно час и затем подвергают исчерпывающему диализу против физиологического раствора с рН 7.4. Для диализа используют диализные мембраны SpectraPor с порами отсечки от 10 до 50 кДа. В результате получают желто-оранжевый раствор. Для расчета концентрации фуллерена в растворе используют УФ-Вид спектрофотометрию на основе молярной экстинкции фуллерена С при 340 нм, ε=50200 (фиг. 1). Полученный раствор фильтруют для стерильности и разливают в ампулы из темного прозрачного стекла по 1 мл. Содержание в 1 мл раствора: фуллерен С - 120 мкг, F-127 - 120 мкг, остальное - физиологический раствор. Содержание фуллерена вместе с F-127 можно изменять (в меньшую сторону) путем разбавления полученного раствора физиологическим раствором для инъекций.
2. Моделирование АД и способ терапевтического введения препарата.
60
Моделирование АД осуществляли путем сенсибилизации мышей аллергеном овальбумином (OA) (Sigma). На предварительно выбритый участок спины мышей накладывали стерильную марлю размером 1×1 см, пропитанную 0,1% раствором OA, закрепляя ее специальным материалом (Bioclusive, Johnson), который предохраняет накладку от высыхания. Повязки с аллергеном выдерживали 7 дней, после чего повязки снимали. Через две недели 7 дневную аппликацию 0,1% OA повторяли еще два раза с двухнедельным интервалом (группа «модель»). Учет результатов проводили в конце периода третьей аппликации. Отрицательным контролем являлись мыши, эпидермально получавшие вместо OA ФСБ (группа «интактные»). Внутримышечные и внутривенные (хвостовая вена) введения осуществлялись между аппликациями OA через недельные интервалы (5 введений по 5 мкг С/мышь, или 50 мкл р-ра ВСРФ). По окончании эксперимента проводили забор материала для ПЦР и гистологического анализа.
3. Гистологический анализ.
Образцы иссеченной кожи фиксировали в 10% растворе забуференного формалина (рН 6,8-7,2). Обезвоживание, проводку образцов и пропитывание парафином производили в гистопроцессоре автоматического типа SLEE MAINZ (Германия), заливку в парафин проводили с использованием заливочной станции SLEE MAINZ (Германия). Микротомирование парафиновых блоков для получения срезов толщиной 4 мкм осуществляли с помощью автоматизированного ротационного микротома Finesse Е+ (Финляндия), окрашенные по общепринятой методике гематоксилином и эозином гистологические срезы заключали в монтирующую среду под покровные стекла для получения постоянных микропрепаратов. Микроскопический анализ гистологических препаратов кожи мышей разных групп и фотографирование проводили на микроскопе Leica DM2000 с камерой DFC295 (Leica, Германия).
Патоморфологическое исследование кожи у группы мышей, в которой производилось моделирование атопического дерматита без специфического лечения, выявило следующие изменения, характеризующие данный патологический процесс развития дерматита: выраженная воспалительная лейкоцитарная инфильтрация эпидермиса и дермы кожи полинуклеарными лейкоцитами, в составе которой обнаруживалось большое количество эозинофилов - специфического компонента аллергического воспаления. Инфильтрация в дерме располагалась преимущественно диффузно или полосовидно, часто отмечалось вовлечение в патологический воспалительный процесс и подкожной жировой клетчатки. Эпидермис кожи в этой группе животных над областями дермального воспаления некротизировался вплоть до дермы, а в прилежащих областях был утолщен преимущественно за счет шиповатого слоя, в клетках базального слоя отмечалось увеличение числа фигур митоза, как признак процесса регенерации. Над эпидермисом образовывался струп из кератиновых масс и дегенеративно измененных лейкоцитов. В дерме кожи помимо лейкоцитарной инфильтрации происходила пролиферация соединительнотканных фибробластоподобных клеточных элементов, как реакция в ответ на раздражение с целью компенсации поврежденной соединительной ткани дермы. Также в дерме отмечалось развитие геморрагий деструктивного типа, которые выглядели как скопления ярко-красных эритроцитов, придатки кожи - волосяные фолликулы и сальные железы в дерме кожи часто редуцировались и исчезали. Микрокартина гистологического препарата кожи группы АД (модель АД) показана на Фиг. 2А. После внутримышечного введения ВСРФ у мышей по сравнению с группой АД отмечалось уменьшение выраженности полиморфноядерной лейкоцитарной инфильтрации эпидермиса и дермы, однако эозинофильный компонент инфильтрации был сохранен. Также наблюдалось уменьшение проявлений некроза эпидермиса и дермы кожи, утолщение эпидермиса за счет шиповатого слоя сохранялось, в клетках базального слоя эпидермиса наблюдалось увеличение числа фигур митоза, что свидетельствует о более выраженном развитии регенерации по сравнению с группой АД-модель. Деструктивные геморрагии в дерме кожи в этой группе обнаруживались реже. Отмечалось умеренное развитие гиперкератоза эпидермиса, как проявление компенсаторного механизма защиты от повреждения. Пролиферация фибробластоподобных клеток соединительной ткани дермы была умеренной (Фиг. 2Б). В группе, получавшей внутривенное введение ВСРФ, по сравнению с группой АД наблюдали более выраженный лечебный эффект, связанный с уменьшением выраженности воспалительной лейкоцитарной инфильтрации с уменьшением количества эозинофилов в составе инфильтрата. Наблюдали уменьшение некроза эпидермиса и дермы кожи, а в клетках базального слоя эпидермиса увеличение числа фигур митоза, что свидетельствует о более выраженной регенерации кожи (Фиг. 2В). Фиг. 2Г отражает нормальное строение кожи мышей в группе контроля - интактные животные. Эпидермис тонкий, в нем хорошо различим лишь базальный, шиповатый и роговой слой. Подкожная жировая клетчатка представлена жировыми клетками с расположенными между ними сосудами и нервными волокнами. В этой группе животных не отмечалось явных признаков воспаления и некроза, лишь у единичных животных встречались очаговые лимфоцитарные инфильтраты, являющиеся, по-видимому, условной физиологической нормой мышей линии BALB/c.
Важным аспектом, отражающим уменьшение воспалительной клеточной реакции, является снижение концентрации IgE-антител (Фиг. 3) и уровня инфильтрации эозинофилами дермы кожи, что наблюдалось в группах мышей, получавших инъекции ВСРФ, и это коррелировало с уменьшением экспрессии ИЛ-5 (Фиг. 4). Кроме того, анализ цитокинового профиля показал существенное изменение поляризации Т-хелперных клеток с фенотипа Th2 (падение ИЛ-4, ИЛ-5 (Фиг. 4)) на Th1 (рост ИФН-гамма (Фиг. 5), ИЛ-12 (Фиг. 4)) и стимуляцию экспрессии филагрина, важного барьерного фактора кожи, и маркера FoxP3 (таблица 1), играющего важную роль в поддержании иммунологической толерантности к аллергической атаке. Суммирование показателей гистологического анализа (используя бальную систему), выявило, что введение ВСРФ снижает проявление признаков воспаления примерно на 45% и 27%, в группах с внутривенным и внутримышечным введением, соответственно.