КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПОЛИСАХАРИДОВ АЛОЭ
COMPOSITIONS AND METHODS OF ALOE POLYSACCHARIDES

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области полисахаридов алоэ, и, болей конкретно, к составам полисахаридов алоэ и использованию данных составов в качестве иммуномодулирующих средств и для лечения различных видов раковых заболеваний.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Не ограничивая объем изобретения, его уровень описан в связи с составами, способами изготовления и терапевтическим использованием полисахаридов Алоэ Вера.
Патент США No. 7,196,072 опубликованный Pasco и др. (2007) описывает соединение, где фракция водорастворимого полисахарида, выделенного из Алоэ Вера, имеет иммуностимулирующее действие. Полисахаридная фракция имеет молекулярный вес около 2 миллионов Дальтон, с глюкозой, галактозой, маннозой и арабинозой в качестве ее основных компонентов. Изобретение далее описывает фармацевтические составы, содержащие растворимую полисахаридную фракцию, желательно в комбинации с подходящими фармацевтическими носителями и/или индифферентными веществами, вводимыми в лекарственную форму для придания массы. Данные фармацевтические соединения могут использоваться для обеспечения иммуностимуляции отдельному человеку с целью лечения путем введения этому индивидууму оптимального количества соединения.
Патент США No. 6,083,508, опубликованный Avalos и Danhof (2000), описывает процесс получения продукта алоэ только из вещества листа, происходящее после рассечения на сегменты листьев алоэ, которые имеют внутреннее наполнение, удаляющееся после. В соответствии с '508 патентом вещество превращается в кашицу после толчения в ступке, а продукт алоэ затем выделяется из кашицы. Дополнительно этапы изготовления продукта алоэ содержат очистку листа алоэ перед рассечением на сегменты, отделение жидкости от твердых веществ в кашице, и далее очистка выделенной жидкости для удаления слабительных веществ перед изготовлением продукта алоэ. Также, способ, включающий в себя все описанные выше этапы, может быть использован для изготовления жидкости.
Заявка на патент США No. 2006/0084629 (Needleman и Needleman, 2006) описывает соединение двух определенных фракций с высоким молекулярным весом и имеющих длинные цепочки, полученных из Алоэ Вера и грифолы курчавой, для стимулирования активности иммунной системы, содержащие длинные цепочки полисахаридов с высоким молекулярным весом, которые активируют естественную иммунную реакцию тела, запускают механизм увеличения образования макрофагов, Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, естественных клеток-киллеров, цитокинов и антител. Эти длинные цепочки полисахаридов вместе с другими активными веществами могут обеспечить иммунной системе подходящую поддержку и, таким образом, предотвратить тяжело протекающие заболевания, такие как рак, болезни сердца и старение
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение описывает соединение полисахарида алоэ и использование соединения в качестве иммуномодулирующего вещества и при лечении различных типов раковых заболеваний, таких как лейкемия и лимфома, рак простаты, рак груди, рак толстой кишки, иммунных заболеваний, особенно опухоли с иммунной природой.
Настоящее изобретение раскрывает способ приготовления тонокозернистого порошка экстракта полиманнана, состоящего из следующих этапов: (i) дозирование определенного количества сублимированного порошка алоэ, где количество регулируется для степени увлажненности, (ii) растворение сублимированного порошка алоэ в деионизированной воде для получения раствора, (iii) добавление органического растворителя в раствор для получения первой смеси; где соотношение органического растворителя и деионизированной воды как минимум 2.5:1, (iv) первая смесь отставляется на 8 часов для образования осадка, (v) извлечение определенного объема надосадочной жидкости из первой смеси и добавление превышающего объема надосадочного раствора для получения второй смеси, (vi) обработка второй смеси в центрифуге, (vii) отслеживание появления осадка во второй смеси, (vii) добавление дополнительного количества органического растворителя в первую смесь, если наблюдается образование любого осадка во второй смеси, (viii) сцеживание надосадочной жидкости первой смеси через сифон, где сцеживание происходит только в том случае, если не наблюдается никакой осадок во второй смеси, (ix) фильтрация осадка из первой смеси с помощью фильтровальной бумаги и воронки Бюхнера в вакууме, (х) извлечение порошка экстракта полиманнана из воронки Бюхнера путем соскабливания, (xi) помещение порошка экстракта полиманнана в колбу с колпачком для сублимиционной сушки в морозильную установку как минимум на 8 часов, (xii) сублимирование замороженного порошка экстракта полиманнана в сублимиционной сушке, и (xiii) измельчение сублимированного порошка экстракта полиманнана в аппарате для измельчения до очень тонкозернистой текстуры.
Особенностью описанного способа является наличие этапов дозирования, прикрепления этикеток и хранения тонкозернистого порошка экстракта полиманнана в контейнере. Сублимированный порошок алоэ, как описано в варианте настоящего изобретения, получен из видов Алоэ, выделенных из группы, содержащей Алоэ Вера, Алоэ древовидное, Алоэ остистое, Алоэ дрожащее, Aloe nyeriensis, Алоэ тигровое, Алоэ барбадосское и Алоэ wildii. Сублимированный порошок алоэ, использующийся в настоящем изобретении, содержит полисахариды алоэ, где полисахариды алоэ содержат одну или несколько небольших, средних, больших, очень больших цепочек полисахаридов, или другие их комбинации. Одна из особенностей заключается в том, что органический растворитель выбирается из группы, состоящей из метанола, этанола, изопропилового спирта и пропанола. Другая особенность заключается в том, что полисахариды алоэ также включают в себя сахара, выбранные из группы, состоящей из глюкозы, маннозы, арабинозы и галактозы, и имеющие молекулярный вес от 11,500 Дальтон до более 10,000,000 Дальтон.
Другой особенностью являются то, что сублимированный порошок алоэ содержит как минимум 25% полисахаридов алоэ. Другой особенностью является то, что сублимированный порошок алоэ содержит 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 95% полисахаридов алоэ. Сублимированный порошок алоэ, как описано в способе настоящего изобретения, содержит как минимум 14% полисахаридов алоэ, имеющих молекулярный вес 66,000 Дальтон, как минимум 9% полисахаридов алое, имеющих молекулярный вес 480,000 Дальтон, как минимум 3.5% полисахаридов алоэ, имеющих молекулярный вес 1,000,000 Дальтон, как минимум 2.4% полисахаридов алоэ, имеющих молекулярный вес 2,000,000 Дальтон.
Отличительной особенностью способа является то, что соотношение соединения полисахаридов алоэ в сублимированном порошке алоэ около 1.32%-6.36% полисахаридов алоэ, имеющих молекулярный вес 2,000,000 Дальтон, 2.55%-3.89%, имеющих молекулярный вес 1,000,000, и 63.85%-73.36% полисахаридов алоэ, имеющих молекулярный вес 480,000 Дальтон. Особенность заключается в том, что сублимированный порошок алоэ может содержать один или более вид осадочных веществ с маленьким молекулярным весом, выбранных из группы, содержащей глюкозу, органические кислоты, молочную кислоту, яблочные кислоты, лимонные кислоты и аспарагиновую кислоту. Особенность заключается в том, что один или более вид осадочных веществ с маленьким молекулярным весом представлены в размере от 14%-24%. Еще одна особенность заключается в том, что тонкозернистый порошок экстракта полиманнана используется для приготовления фармацевтического соединения для использования в качестве лечения одного или более злокачественного образования, выбранного из группы, содержащей лейкемию и лимфому, рак простаты, рак груди, рак толстой кишки, и для лечения одного или более иммунологических нарушений.
В качестве варианта настоящего изобретения описывается стерильный инъекционный состав экстракта полиманнана, который содержит: определенное количество очень тонкозернистого экстракта полиманнана, растворенного в деионизированной воде, и один или несколько фармацевтических консервантов. Один или несколько фармацевтических консервантов, которые могут использоваться в составе, описанном выше, выбраны из группы, содержащей парааминобензойную кислоту, бензойную кислоту и их соли, ртутные вещества, четвертично-аммониевые соли, бензиловый спирт и другие схожие спирты, и фенолы. Важная особенность состоит в том, что консервантом является бензиловый спирт. Особенностью является то, что экстракт полиманнана содержит полисахариды алоэ, где полисахариды алоэ содержат одну или несколько небольших, средних, больших, очень больших цепочек полисахаридов, или другие их комбинации. Особенностью является то, что полисахариды алоэ также содержат простые сахара, выбранные из группы, содержащей глюкозу, маннозу, арабинозу и галактозу.
Особенностью является то, что полисахариды алоэ имеют молекулярный вес от 11,500 Дальтон до более 10,000,000 Дальтон, а экстракт полиманнана содержит как минимум 25% полисахаридов алоэ, где экстракт полиманнана содержит 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 95% полисахаридов алоэ. Важной особенностью является то, что экстракт полиманнана содержит как минимум 14% полисахаридов алоэ, имеющих молекулярный вес 66,000 Дальтон, как минимум 9% полисахаридов алое, имеющих молекулярный вес 480,000 Дальтон, как минимум 3.5% полисахаридов алоэ, имеющих молекулярный вес 1,000,000 Дальтон, как минимум 2.4% полисахаридов алоэ, имеющих молекулярный вес 2,000,000 Дальтон. Состав настоящего изобретения используется в лечении одного или нескольких видов раковых заболеваний, выбранных из группы, содержащей лейкемию и лимфому, рак простаты, рак груди, рак толстой кишки, для иммуномодуляции, иммуностимуляции, или для лечения человека со сниженной иммунной системой или с иммунными заболеваниями. Состав настоящего изобретения вызывает 75-80% увеличение одного или более видов натуральных клеткок-киллеров.
Еще один пример осуществления настоящего изобретения описывает лечение одного или нескольких видов раковых заболеваний, выбранных из группы, содержащей лейкемии и лимфомы, рак простаты, рак груди, рак толстой кишки, состоящее из следующих этапов: определение того, что человек нуждается в лечении одного или нескольких видов раковых заболеваний и введение стерильного инъекционного состава экстракта полиманнана два или три раза в неделю в дозировке, подходящей для лечения одного или нескольких видов раковых заболеваний, где стерильный инъекционный состав экстракта полиманнана содержит определенное количество очень тонкозернистого экстракта, растворенного в деионизированной воде; и один или несколько фармацевтических консервантов. Способ также содержит следующие этапы: извлечение образцов крови у человека в один или несколько определенных временных промежутков, и измерение уровня каспазы 3 протеина в крови, и сравнение наблюдаемого уровня с тем уровнем, который был перед инъекцией, где повышенный уровень каспазы 3 напрямую относится к повышенному уровню апоптозы одной или нескольких раковых клеток.
Особенностью является то, что дозировка стерильного инъекционного состава экстракта полиманнана основывается на весе, возрасте, этнической принадлежности и поле человека. Особенностью является то, что экстракт полиманнана содержит полисахариды алоэ, где полисахариды алоэ содержат одну или несколько небольших, средних, больших, очень больших цепочек полисахаридов, или другие их комбинации. Особенностью является то, что полисахариды алоэ имеют молекулярный вес от 11,500 Дальтон до 10,000,000 Дальтон. Экстракт полиманнана, как описано в способе настоящего изобретения, имеет как минимум 25% полисахаридов алоэ. Экстракт полиманнана в способе настоящего изобретения вызывает 75-80% увеличение одного или более видов натуральных клеткок-киллеров.
Один из вариантов настоящего изобретения описывает способ иммуномодуляци или иммуностимуляции у человека со сниженной иммунной системой или с иммунным заболеванием, содержащий следующие этапы: (i) определение сниженной иммунной системы у человека или иммунного заболевания и потребности иммуномодуляции или иммуностимуляции, (ii) введение внутривенно определенной дозы стерильного инъекционного состава экстракта полиманнана, где стерильный инъекционный состав экстракта полиманнана содержит определенное количество очень тонкозернистого экстракта полиманнана, растворенного в деионизированной воде; и один или несколько фармацевтических консервантов, где дозировка стерильного инъекционного состава экстракта полиманнана зависит от веса, возраста, этнической принадлежности и пола человека, (iii) взятие образцов крови у человека в один или несколько определенных временных промежутков, и измерение уровня фактора некроза опухоли (ФНО) альфа в крови, и сравнение наблюдаемого уровня с тем уровнем, который был перед инъекцией; где повышенный уровень фактора некроза опухоли альфа обозначает иммуномодуляцию или иммуностимуляцию. Особенностью является то, что иммунное заболевание - это опухоль с иммунной природой. Особенностью является то, что экстракт полиманнана содержит полисахариды алоэ, где полисахариды алоэ содержат одну или несколько небольших, средних, больших, очень больших цепочек полисахаридов, или другие их комбинации. Особенностью является то, что экстракт полиманнана вызывает 75-80% увеличение одного или нескольких видов натуральных клеткок-киллеров. Другой особенностью являются то, что экстракт полиманнана содержит как минимум 25% полисахаридов алоэ.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Для более полного понимания характеристик и преимуществ настоящего изобретения дается ссылка на подробное описание изобретения в совокупности с прилагающимися фигурами, где:
ФИГ.1 изображает хромотограмму по размеру молекул полисахарида алоэ, показывающую время пребывания различных элементных групп глюкозы и маннозы;
ФИГ.2 изображает хромотограмму по размеру молекул полисахарида алоэ, показывающую максимальное соответствие различных элементных групп глюкозы и маннозы;
ФИГ.3 это протонная магнитно-резонансная схема экстракта полиманнана настоящего изобретения;
ФИГ.4А является высокоэффективной жидкостной хроматограммой (ВЭЖХ), показывающей количество полисахаридов в каждой полисахаридной молекулярной группе в концентрате полисахарида алоэ в осадке метилового спирта;
ФИГ.4В это протонная магнитно-резонансная схема концентрата полисахарида алоэ в осадке метилового спирта;
ФИГ.5А является высокоэффективной жидкостной хроматограммой (ВЭЖХ), показывающей количество полисахаридов в каждой полисахаридной молекулярной группе в концентрате полисахарида алоэ в осадке этилового спирта;
ФИГ.5В это протонная магнитно-резонансная схема концентрата полисахарида алоэ в осадке этилового спирта;
ФИГ.6А является высокоэффективной жидкостной хроматограммой (ВЭЖХ), показывающей количество полисахаридов в каждой полисахаридной молекулярной группе в концентрате полисахарида алоэ в осадке изопропилового спирта;
ФИГ.5В это протонная магнитно-резонансная схема концентрата полисахарида алоэ в осадке изопропилового спирта;
ФИГ.7А является высокоэффективной жидкостной хроматограммой (ВЭЖХ), показывающей количество полисахаридов в каждой полисахаридной молекулярной группе в концентрате полисахарида алоэ в осадке пропанола; и
ФИГ.7В это протонная магнитно-резонансная схема концентрата полисахарида алоэ в осадке пропанола.
Описание Изобретения
В то время, как ниже подробно рассматриваются создание и использование различных вариантов настоящего изобретения, следует понимать, что настоящее изобретение касается множества применений самой идеи изобретения, которые могут быть осуществлены в широком спектре конкретных контекстов. Конкретные варианты, обсуждаемые здесь же, являются только иллюстрациями описываемых способов для создания и использования изобретения и не определяют границы объема изобретения.
Для облегчения понимания данного изобретения ниже приведен список терминов. Термины, используемые здесь, имеют такие значения, которые были бы понятны специалисту в областях, относящихся к настоящему изобретению. Данная терминология используется, чтобы описать конкретные примеры изобретения, но их использование не определяет границы изобретения, кроме того, что подчеркнуто в формуле.
Настоящее изобретение описывает процесс изготовления экстракта полиманнана и использование указанного экстракта в виде инъекций в качестве вещества, стимулирующего иммунную систему. Иммунная стимуляция достигается при использовании макрофагов/моноцитов человеческого происхождения, и тип клетки определяется из выделения фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α).
Полисахаридами алоэ обычно считаются такие молекулы, которые преимущественно состоят из простых сахаров глюкозы и маннозы, имеющих цепочки длиной от 10,000 Дальтон и молекулярный вес 10,000,000 Дальтон. Чем выше содержание маннозы и чем длиннее цепочка, тем сильнее выражается иммуномодуляторная активность полисахаридов. Неразветвленные цепочки различной длины таких полисахаридов алоэ представлены в Таблице 1.
Таблица 1
Составы полисахаридов алоэ и фармакологические действия
# Вещества сахара
Молекулярный вес (Дальтон)
Фармакологические действия
Полисахариды с маленькими цепочками
70-650
11,500->100,000
ДиабетыЗадержка тирозинана (отбеливание кожи)Противовоспалительное действие (ЦОГ-2 ингибирование)
Полисахариды со средними цепочками
1500
250,000
АнтиоксидантЗащищает сердце, легкие (эмфизема) и нервную систему (болезнь Паркинсона)
Полисахариды с большими цепочками
4000-5000
650,000
АнтибактериальноеЗаживляющее действие
Очень крупные полисахариды
8000-9000
2,000,000-10,000,000
Иммуномодуляторное действиеСтимуляция β-лимфоцитов с выработкой антителУвеличение уровня натуральных клеток-киллеровВыброс большого количества ФНОα вызывает регенерацию тканей в ранах и способствует заживлению
Полисахариды алоэ с молекулярным весом 100,000 Дальтон или более представлены в Таблице 2.
Таблица 2
Составы и молекулярный вес полисахаридов алоэ, имеющих молекулярный вес от 100,000 или более
Молекулярный вес (Дальтон)
Основные компоненты
Алоэрид
2,000,000-10,000,000
Арабиноза, галактоза, глюкоза, манноза
Ацеманнан
900,000-1,500,000
Глюкоза, манноза
Манапол
500,000-900,000
Глюкоза, манноза
Алоэманнан
100,000-500,000
Глюкоза, манноза
Предшествующий материал по экстракту полиманнана описан в предыдущем патенте (Патент США No. 6,083,508 - Avalos и Danhof, 2000), который называется "Способ Обработки Листьев Алоэ". Свидетельство изучения предшествующего материала по экстракту полиманнана представлено в Таблице 3.
ФИГ.1 изображает хромотограмму по размеру молекул полисахарида алоэ, показывающую время пребывания элементных групп глюкозы и маннозы различных размеров. ФИГ.2 изображает хромотограмму по размеру молекул полисахарида алоэ при препарировании с молекулярным весом от 100 до 10,000,000 Дальтон. ФИГ.3 это протонная магнитно-резонансная схема экстракта полиманнана настоящего изобретения. ФИГ.3 изображает: (i) отсутствие стандартных консервантов - бензоата натрия и сорбата калия, (ii) наличие меньших моногексоз, (iii) выбросы изолимонной кислоты, указывающие, что в процессе обработки сырьевого продукта алоэ используется весь лист, (iv) наличие выброса яблочной кислоты - главный показатель Алоэ вера, (v) наличие выброса алоэрида/ацеманнана в части схемы полисахарида, подтверждающее наличие больших соединений полисахарида, и (vi) присутствуют ацетильные группы, подтверждающие наличие частично ацетилированных глюкоманнанов полисахарида.
Хромотография по размеру молекул препарирования алоэ перед выделением полиманнана:
1
Оборудование: ВЭЖХ система это насосный механизм Hitachi L-7100 и автоматический дозатор 7250, спаренные для соединения с дифференциальным рефрактометром Waters 410. Хромотография по размеру молекул выполняется Tosoh Biosep G6000 PWXL TSK Gel 30 см×7.8 мм, работающим в нагревателе колонки при 70°С. Стандарты молекулярного веса - от сигмы до 2,000,000 Дальтон, 1,000,000 Дальтон, 480,000 Дальтон, 66,000 Дальтон и 180 Дальтон (глюкоза). Подвижная фаза - деионизированная вода со скоростью потока 0.70 мл/мин. Объем инъекции - 10 мкл. Способ хромотографии по размеру молекул описан Pugh и др. (2001).
Таблица 3
Свидетельство об изучении предыдущего материала по экстракту полиманнана
Параметры
Допустимый диапазон
Полученное значение
Оценка
Порошок:
Цвет:
От белого до светло-коричневого
Белый с металлическим оттенком
Удовлетворяет
Характеристики:
Тонкозернистый
Тонкозернистый
Удовлетворяет
Текучесть:
Свободнотекучий
Свободнотекучий
Удовлетворяет
Вкус:
Соленый
Соленый
Удовлетворяет
Тест на йод:
Отрицательный
Отрицательный
Удовлетворяет
Влагосодержание:
2.2-7.0%
3.70%
Удовлетворяет
Растворяемость:
Полная
Полная
Удовлетворяет
Минералы:
Са<sup>++</sup>
>25 мг/г
56.3 мг/г
Удовлетворяет
Mg<sup>++</sup>
>10 мг/г
14.3 мг/г
Удовлетворяет
Органические кислоты:
Лимонная:
Присутствует
Присутствует
Удовлетворяет
Изолимонная:
Присутствует
Присутствует
Удовлетворяет
Молочная:
<25 мг/г
12 м.д
Удовлетворяет
Яблочная:
>250 мг/г
410 мг/г
Удовлетворяет
Антрохиноны:
Алоин А:
<0.05 м.д
0.02 м.д
Удовлетворяет
Алоин В:
<0.03 м.д
0.01 м.д
Удовлетворяет
Алоэ-эмодин:
<0.02 м.д
0.005 м.д
Удовлетворяет
Эмодин:
<0.01 м.д
0.001 м.д
Удовлетворяет
Градус Брикса:
<0.1
Отсутствует
Удовлетворяет
Таблица 4
Результаты хромотографии по размеру молекул препарирования алоэ перед выделением полиманнана
Алоэ
#09116
Время отстаивания
Показатель преломления
Площадь
Σ Площади
% Площади
Молекулярный размер
0:30
0.0000
0.0000
1:00
0.0000
0.0000
1:30
0.0000
0.0000
2:00
0.0000
0.0000
2:30
0.0000
0.0000
3:00
0.0000
0.0000
3:30
0.0000
0.0000
4:00
0.0000
0.0000
4:30
0.0000
0.0000
5:00
0.0000
0.0000
5:30
0.0000
0.0000
6:00
0.0000
0.0000
6:30
0.0000
0.0000
7:00
0.0000
0.0000
7:30
0.0000
0.0000
8:00
0.0000
0.0000
8:30
0.0000
0.0000
9:00
0 0000
0.0000
9:30
0.0010
0.0014
10:00
0.0020
0.0046
10:30
0.0015
0.0058
0.012
2.44%
2×10<sup>6</sup>
11:00
0.0010
0.0042
11:30
0.0015
0.0039
12:00
0.0015
0.0049
12:30
0.0015
0.0049
0.018
3.69%
1×10<sup>6</sup>
13:00
0.0015
0.0049
13:30
0.0020
0.0056
14:00
0.0020
0.0065
14:30
0.0025
0.0072
15:00
0.0030
0.0088
15:30
0.0040
0.0111
0.044
9.09%
4.80×10<sup>5</sup>
16:00
0.0050
0.0144
16:30
0.0055
0 0169
17:00
0.0060
0.0186
17:30
0.0070
0.0209
0.071
14.59%
6.6×10<sup>4</sup>
18:00
0.0080
0.0241
18:30
0.0090
0.0274
19:00
0.0110
0.0320
19:30
0.0130
0.0385
20:00
0.0155
0.0457
20:30
0.0170
0.0524
21:00
0.0240
0.0649
21:30
0.0005
0.0457
22:00
0.0004
0.0015
22:30
0.0005
0.0014
23:00
0.0004
0.0015
23:30
0.0003
0.0012
24:00
0.0000
0.0000
0.340
70.20%
0.0000
0.4849
100.00%
Анализ изучения осаждающего вещества алоэ: 25 мл образца концентрированного алоэ были помещены в 200 мл колбу, и 125 мл осаждающих жидкостей различных полисахаридов было добавлено в колбу и тщательно размешено. Осевшие полисахариды были собраны после фильтрации через пропитанную дегтем обезвоженную фильтрованную бумагу, и после фильтрации размещены в сушильном шкафу на ночь. На следующее утро был определен сухой вес осевших полисахаридов. Разработчики изучили четыре спиртовых осадителя, где изучение включало метиловый спирт, этиловый спирт, изопропиловый спирт и пропанол. Порошки были подвергнуты процедуре ВЭЖХ, что определило различное количество всех молекулярных веществ, которые были связаны с определением количества полисахаридов в каждой молекулярной группе полисахаридов, включая большую, чем 2,000,000 Дальтон, большую чем 1,000,000 Дальтон, большую, чем 480,000 Дальтон, большую, чем 66,000 Дальтон, и осадочную часть, состоящую из очень маленьких молекулярных видов, как например глюкоза, имеющая молекулярный вес 180. (данные ВЭЖХ продемонстрированы в Таблицах 6-9). Хромотограммы ВЭЖХ, указывающие на четыре осадителя - метиловый спирт, этиловый спирт, изопропиловый спирт и пропанол, показаны в ФИГ.4А, 5А, 6А и 7А соответственно. Протонные Магнитно-Резонансные Схемы осадителей также были получены, и показаны в ФИГ.4В, 5В, 6В и 7В соответственно. Собранные данные показаны в Таблице 5.
Таблица 5
Данные анализа изучения осаждающего вещества алоэ
Осадитель:
Мол. вес 2.0×10<sup>6</sup>
Мол. вес 1.0×10<sup>6</sup>
Мол. вес 4.8×10<sup>5</sup>
Мол. вес 6.6×10<sup>4</sup>
Мол. вес Остаток
метиловый спирт
6.36%
3.89%
68.56%
6.92%
14.27%
этиловый спирт
2.52%
3.21%
70.70%
6.94%
16.57%
изопропиловый спирт
1.32%
3.43%
73.36%
5.91%
15.99%
пропанол
2.74%
2.55%
63.85%
6.92%
23.94%
Таблица 6
Данные ВЭЖХ показывают количество полисахаридов в каждой полисахаридной молекулярной группе в концентрате полисахарида алоэ в осадке метилового спирта
Алоэ
#09423-А
Время отстаивания
Показатель преломления
Площадь
Σ Площади
% Площади
Молекулярный размер
0:30
0.0000
0.0000
1:00
0.0000
0.0000
1:30
0.0000
0.0000
2:00
0.0000
0.0000
2:30
0.0000
0.0000
3:00
0.0000
0.0000
3:30
0.0010
0.0014
4:00
0.0010
0.0033
4:30
0.0010
0.0033
5:00
0.0005
0.0026
5:30
0.0005
0.0016
6:00
0.0005
0.0016
6:30
0.0080
0.0119
7:00
0.0030
0.0191
0.045
6.36%
2×10<sup>6</sup>
7:30
0.0020
0.0084
8:00
0.0030
0.0079
8:30
0.0040
0.0111
0.027
3.89%
1×10<sup>6</sup>
9:00
0.0060
0.0158
9:30
0.0070
0.0209
10:00
0.0090
0.0255
10:30
0.0130
0.0348
11:00
0.0180
0.0491
11:30
0.0220
0.0640
12:00
0.0250
0.0756
12:30
0.0230
0.0785
13:00
0.0170
0.0665
13:30
0.0040
0.0374
14:00
0.0050
0.0144
0.482
68.56%
4.80×10<sup>5</sup>
14:30
0.0050
0.0163
15:00
0.0050
0.0163
15:30
0.0050
0.0163
0.049
6.93%
6.6×10<sup>4</sup>
16:00
0.0060
0.0176
16:30
0.0070
0.0209
17:00
0.0050
0.0200
17:30
0.0040
0.0149
18:00
0.0030
0.0116
18:30
0.0020
0.0084
19:00
0.0010
0.0051
19:30
0.0000
0.0019
20:00
0.0000
0.0000
20:30
0.0000
0.0000
21:00
0.0000
0.0000
21:30
0.0000
0.0000
22:00
0.0000
0.0000
22:30
0.0000
0.0000
23:00
0.0000
0.0000
23:30
0.0000
0.0000
24:00
0.0000
0.0000
0.100
14.27%
0.0000
0.7036
100.00%
Таблица 7
Данные ВЭЖХ показывают количество полисахаридов в каждой полисахаридной молекулярной группе в концентрате полисахарида алоэ в осадке этилового спирта
Алоэ
#09423-В
Время отстаивания
Показатель преломления
Площадь
Σ Площади
% Площади
Молекулярный размер
0:30
0.0000
0.0000
1:00
0.0000
0.0000
1:30
0.0000
0.0000
2:00
0.0000
0.0000
2:30
0.0000
0.0000
3:00
0.0000
0.0000
3:30
0.0000
0.0000
4:00
0.0005
0.0007
4:30
0.0010
0.0023
5:00
0.0005
0.0026
5:30
0.0005
0.0016
6:00
0.0010
0.0023
6:30
0.0010
0.0033
7:00
0.0015
0.0039
0.017
2.52%
2×10<sup>6</sup>
7:30
0.0020
0.0056
8:00
0.0020
0.0065
8:30
0.0040
0.0093
0.021
3.21%
1×10<sup>6</sup>
9:00
0.0050
0.0144
9:30
0.0070
0.0190
10:00
0.0100
0.0269
10:30
0.0130
0.0366
11:00
0.0160
0.0464
11:30
0.0200
0.0575
12:00
0.0240
0.0705
12:30
0.0210
0.0739
13:00
0.0185
0.0648
13:30
0.0050
0.0416
14:00
0.0060
0.0176
0.469
70.76%
4.80×10<sup>5</sup>
14:30
0.0050
0.0181
15:00
0.0040
0.0149
15:30
0.0040
0.0130
0.046
6.94%
6.6×10<sup>4</sup>
16:00
0.0050
0.0144
16:30
0.0075
0.0197
17:00
0.0080
0.0251
17:30
0.0035
0.0198
18:00
0.0025
0.0100
18:30
0.0050
0.0116
19:00
0.0000
0.0094
19:30
0.0000
0.0000
20:00
0.0000
0.0000
20:30
0.0000
0.0000
21:00
0.0000
0.0000
21:30
0.0000
0.0000
22:00
0.0000
0.0000
22:30
0.0000
0.0000
23:00
0.0000
0.0000
23:30
0.0000
0.0000
24:00
0.0000
0.0000
0.110
16.57%
0.0000
0.6630
100.00%
Таблица 8
Данные ВЭЖХ показывают количество полисахаридов в каждой полисахаридной молекулярной группе в концентрате полисахарида алоэ в осадке изопропилового спирта
Алоэ
#09423-С
Время отстаивания
Показатель преломления
Площадь
Σ Площади
% Площади
Молекулярный размер
0:30
0.0000
0.0000
1:00
0.0000
0.0000
1:30
0.0000
0.0000
2:00
0.0000
0.0000
2:30
0.0001
0.0001
3:00
0.0000
0.0002
3:30
0.0000
0.0000
4:00
0.0000
0.0000
4:30
0.0001
0.0001
5:00
0.0001
0.0003
5:30
0.0001
0.0003
6:00
0.0001
0.0003
6:30
0.0015
0.0023
7:00
0.0015
0.0049
0.009
1.32%
2×10<sup>6</sup>
7:30
0.0020
0.0056
8:00
0.0025
0.0072
8:30
0.0035
0.0095
0.022
3.43%
1×10<sup>6</sup>
9:00
0.0060
0.0148
9:30
0.0080
0.0223
10:00
0.0095
0.0281
10:30
0.0120
0.0343
11.00
0.0165
0.0452
11:30
0.0190
0.0571
12:00
0.0200
0.0631
12:30
0.0215
0.0671
13:00
0.0200
0.0678
13:30
0.0100
0.0513
14:00
0.0045
0.0249
0.476
73.36%
4.80×10<sup>5</sup>
14:30
0.0040
0.0139
15:00
0.0035
0.0123
15:30
0.0040
0.0121
0.038
5.91%
6.6×10<sup>4</sup>
16:00
0.0065
0.0164
16:30
0.0096
0.0254
17:00
0.0075
0.0283
17:30
0.0030
0.0182
18:00
0.0020
0.0084
18:30
0.0010
0.0051
19:00
0.0000
0.0019
19:30
0.0000
0.0000
20:00
0.0000
0.0000
20:30
0.0000
0.0000
21:00
0.0000
0.0000
21:30
0.0000
0.0000
22:00
0.0000
0.0000
22:30
0.0000
0.0000
23:00
0.0000
0.0000
23:30
0.0000
0.0000
24:00
0.0000
0.0000
0.104
15.99%
0.0000
0.6487
100.00%
Таблица 9
Данные ВЭЖХ показывают количество полисахаридов в каждой полисахаридной молекулярной группе в концентрате полисахарида алоэ в осадке пропанола
Алоэ
#09423-С
Время отстаивания
Показатель преломления
Площадь
Σ Площади
% Площади
Молекулярный размер
0:30
0.0000
0.0000
1:00
0.0000
0.0000
1:30
0.0000
0.0000
2:00
0.0000
0.0000
2:30
0.0001
0.0001
3:00
0.0000
0.0002
3:30
0.0000
0.0000
4:00
0.0000
0.0000
4:30
0.0001
0.0001
5:00
0.0001
0.0003
5:30
0.0001
0.0003
6:00
0.0001
0.0003
6:30
0.0015
0.0023
7:00
0.0015
0.0049
0.009
1.32%
2×10<sup>6</sup>
7:30
0.0020
0.0056
8:00
0.0025
0.0072
8:30
0.0035
0.0095
0.022
3.43%
1×10<sup>6</sup>
9:00
0.0060
0.0148
9:30
0.0080
0 0223
10:00
0.0095
0.0281
10:30
0.0120
0.0343
11:00
0.0165
0.0452
11:30
0.0190
0.0571
12:00
0.0200
0.0631
12:30
0.0215
0 0671
13:00
0.0200
0.0678
13:30
0.0100
0.0513
14:00
0.0045
0.0249
0.476
73.36%
4.80×10<sup>5</sup>
14:30
0.0040
0.0139
15:00
0.0035
0.0123
15:30
0.0040
0.0121
0.038
5.91%
6.6×10<sup>4</sup>
16:00
0.0065
0.0164
16:30
0.0096
0.0254
17:00
0.0075
0.0283
17:30
0.0030
0.0182
18:00
0.0020
0.0084
18:30
0.0010
0.0051
19:00
0.0000
0.0019
19:30
0.0000
0.0000
20:00
0.0000
0.0000
20:30
0.0000
0.0000
21:00
0.0000
0.0000
21:30
0.0000
0.0000
22:00
0.0000
0.0000
22:30
0.0000
0.0000
23:00
0.0000
0.0000
23:30
0.0000
0.0000
24:00
0.0000
0.0000
0.104
15.99%
0.0000
0.6487
100.00%
Экстракт полиманнана производится с помощью образования осадка. Сублимированный порошок алоэ, описанный выше, был взвешен после соответствующей корректировки содержания влаги. Например, если содержание влаги составляет 3.7% а нам необходимо 80 г, изобретатели отвешивают 82. 96 г (80 г + (3.7%×80) г). Взвешенный порошок алоэ был полностью растворен в одном галлоне деионизированной воды в осадочном чане из нержавеющей стали. Было добавлено 2.5 галлонов 95% этилового спирта и перемешано до образования однородной смеси. Чан был накрыт крышкой из нержавеющей стали, и смесь была отставлена на ночь.
На следующий день было взято 2 мл чистой надосадочной жидкости, и было добавлено 5 мл 95% этилового спирта, и образец был подвержен центрифугированию при 3000 оборотах в минуту в течение 20 минут. Образец был рассмотрен на наличие осадка, если не наблюдался никакой осадок, то осаждение считалось полным. Если наблюдался какой-либо значимый процент осадков, добавлялся дополнительный 95% этиловый спирт перед продолжением исследования. Чистая надосадочная жидкость переливалась в осадочный чан сцеживанием через сифон, так, чтобы не поднимать осадок со дна чана. Белый осадок на дне был отделен с помощью воронки Бюхнера (Whatman No. 42) и фильтровальной беззольной бумаги. Осадочный материал был удален соскабливанием в 600 мл колбу лиофильной сушки Virtis, путем распределения материала по одной стенке колбы образовался тонкий слой с большой площадью поверхности. Колба лиофильной сушки была помещена в каркасный морозильный шкаф на ночь. На следующий день охлажденная колба лиофильной сушки с замороженным содержимым была помещена на лиофилизатор, работающий при -90°С и при 1/3 атмосфер на 24 часа. Лиофилизатор был выключен, и лиофилизированный порошок был помещен в маленький аппарат для измельчения порошка, пока он не превратился в равномерный тонкозернистый порошок. Тонкозернистый порошок был взвешен и помещен в маленькие пластиковые контейнеры, и контейнеры хранились в морозильной камере.
Изготовление инъекционного раствора экстракта Полиманнана: Порошок экстракта полиманнана, изготовленный, как описано выше, был взвешен (1.5 г) после корректировки содержания влаги, и содержал как минимум 2% алоэрида, как определено хромотографией по размеру молекул. К 125 мл теплой деионизированной воды был добавлен 1 мл концентрированной соляной кислоты, далее при постоянном помешивании медленно добавлялся порошок экстракта полиманнана. Помешивание было завершено, когда весь порошок экстракта полиманнана растворился, и раствор был чистым и бесцветным, дополнительное количество концентрированной соляной кислоты было добавлено для достижения уровня кислотно-щелочного баланса от 1.6 до 1.7 (который был измерен впоследствии с помощью измерителя рН). Дополнительная деионизированная вода была добавлена для доведения объема до 150 мл, далее последовало наблюдение за кислотно-щелочным балансом, чтобы убедиться, что он составляет - 1.6-1.7. Раствор экстракта полиманнана затем был перелит в 150 мл систему колб Corning с фильтром, где размер пор составляет 0.45 мкм. Система колб была помещена в холодильную камеру, где фильтрат выделялся в 150 мл систему колб Coming с фильтром, где размер пор составляет 0.22 мкм, и был оставлен в холодильной камере на ночь. При стерильных условиях фильтровальная заслонка на фильтровальной системе была удалена, и бутыль была закрыта стерильным колпаком. Бутыли были затем перемещены в лабораторию по смешиванию, и под стерильным колпаком был добавлен 0.9% бензиловый спирт в качестве консерванта (так как окончательный продукт предназначен для многоразового использования), затем раствор был помещен в стерильные 10 мл стеклянные пузырьки, закупоренные колпачками для многократного применения. Пузырьки помечены бирками с номером партии, контрольным номером, датой изготовления, датой истечения срока действия до 6 месяцев, а также с именами врача и пациента.
Оценка иммуномодуляторного действия экстракта полиманнана: Иммуностимулирующее действие определяется при помощи макрофагов/моноцитов человеческого происхождения, что было выявлено в Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС) в Мэриленде. Тип клетки был определен для выделения из ФНОα. При нормальных клеточных условиях маленькое количество окончательного продукта экстракта полиманнана было введено в культуру клетки. Образцы были зарисованы после 6, 12 и 24 часов и определены для уровней ФНОα. Определенное количество ФНОα не было использовано, в связи с изменчивостью различных клеточных групп. В клинических условиях ожидалось, что иммуномодуляторный ответ будет меняться в зависимости от изменений гематологических факторов, таких как общее количество лейкоцитов, различное количество макрофагов/моноцитов, число рецепторов маннозы на белых клетках, количество манноза-связывающих протеиновых носителей, и т.д.
Специфика белых кровяных клеток изменяется, так как клетки постоянно возникают и исчезают в кровяном потоке. Сходство клеточных маннозных рецепторов с экстрактом полиманнана гораздо выше, чем сходство манноза-связывающего протеина с экстрактом полиманнана. Когда новые макрофаги/моноциты возникают в кровяном потоке, экстракт полиманнана перемещается в новые клетки из циркулирующего манноза-связывающего протеина. Соединение экстракта полиманнана с макрофагом/моноцитом манноза-связывающего протеина приводит к появлению набора цитокоммуникаторов. Цитокоммуникаторы, включающие ФНО-α, ИЛ-1β (интерлейкин), ИНТ-γ (интерферон), ИЛ-2 и ИЛ-6, возвращают иммунную систему с наблюдаемым повреждением к нормальному функционированию, функционирование было нарушено из-за выявленной опухоли у ракового пациента, что не позволяло иммунной системе пациента определять и удалять раковые клетки.
Полисахариды алоэ в эсктракте полиманнана, имеющие молекулярный вес 1,000,000, 300,000, 100,000, 50,000 и 25,000, все демонстрируют действие каспазы. Данная активность каспазы 3, каспазы 9 и цитохрома-С является ключом в лечении злокачественых образований составом настоящего изобретения, так как каспаза 3 является посредником при запрограмированной гибели опухолевой клетки. Иммуномодуляторное действие инициирующей (апикальной) каспазы 3 и действующей (исполняющей) каспазы 9, также как и цитохром-С, были продемонстрированы здесь, и признаны посреднической системой при запрограмированной гибели опухолевых клеток.
Изобретатели протестировали описанный здесь состав на 104 пациентах с различными типами раковых заболеваний. Лейкемия и лимфома были наиболее восприимчивы к экстракту полиманнана настоящего изобретения (>98%). Рак простаты, рак груди и рак толстой кишки также были восприимчивы к экстракту полиманнана настоящего изобретения. При тестировании экстракт полиманнана вводился в виде инъекций. 10 мг экстракта полиманнана были повторно растворены в стерильной воде для инъекции, чтобы окончательная концентрация составила ~10 мг/мл. Это вводилось 2 или 3 раза в неделю. Образцы сыворотки брались у пациентов через регулярные промежутки времени, и отслеживалось действие каспазы 3.
Цель заключается в том, что любой вариант, рассмотренный в данном описании изобретения, может быть осуществлен в отношении любого способа, набора реагентов или состава изобретения, и наоборот. Более того, составы изобретения могут быть использованы для достижения способов изобретения.
Следует иметь в виду, что конкретные варианты осуществления, описанные здесь, показаны с иллюстративной точки зрения, а не в качестве ограничений изобретения. Отличительные признаки данного изобретения могут быть применены в различных вариантах без отрыва от объема изобретения. Специалистам в данной области техники будет понятно, или у них будет возможность убедиться, используя не более чем рутинные эксперименты, в многочисленных эквивалентах конкретных процедур, описанных в данном документе. Данные эквиваленты присутствуют в объеме изобретения и обозначены в формуле изобретения.
Все публикации и патентные заявки, упомянутые в описании изобретения, указывают на уровень квалификации специалистов в данной области техники, к которой относится данное изобретение. Все публикации и патентные заявки представлены здесь в качестве ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно указана как включенная в качестве ссылки.
Термин "или" в формуле используется для обозначения "и/или", если явно не указано обратиться к только альтернативам или варианты являются взаимоисключающими, хотя раскрытие поддерживает определение, которое относится только к альтернативам и "и/или." В данной заявке термин "о" используется для определения того, что значение включает в себя присущие варианты ошибок данного изобретения, причем способ используется для определения значения или изменения, которое существует в процессе изучения предметов.
Используемые в данном описании и формуле слова "содержащий" (и любые другие формы, такие как "содержат" или "содержит"), "имеющий" (и любые другие формы, такие как "имеют" или "имеет"), включающий (и любые другие формы, такие как "включает" или "включают") или "включающий" (и любые другие формы, такие как "включает" или "включают") являются включающими или открытыми и не исключают дополнительных, неизложенных элементов или стадий способа.
Термин "или их комбинации", использующийся здесь, дает ссылку на все сочетания и комбинации из перечисленных пунктов предшествующего изложения. Например, "А, В, С, или их комбинации" предполагает включить как минимум один из: А, В, С, АВ, AC, ВС или АВС, и если в отдельном контексте важен порядок, то также ВА, СА, СВ, СВА, ВСА, АСВ, ВАС или CAB. Продолжая данный пример, специально включены комбинации, которые содержат повторы одного или нескольких элементов или термина, такие как ВВ, ААА, MB, ВВС, АААВСССС, СВВААА, САВАВВ и так далее. Специалисту в данной области будет понятно, что обычно в любой комбинации нет ограничения на количество элементов или терминов, если иное не вытекает из контекста.
Все составы и/или способы, описанные и заявленные здесь, могут быть сделаны и выполнены без излишнего экспериментирования в свете настоящего раскрытия. Поскольку составы и способы данного изобретения были описаны в терминах предпочтительных вариантов, то для специалиста в данной области будет очевидно, что изменения могут быть применены к составам и/или способам и на этапах, или в последовательности этапов, способом, описанным здесь, не отступая от концепции, сущности и объема изобретения. Все такие подобные заменители и модификации, очевидные для специалистов в данной области, считаются в соответствии с сущностью, объемом и концепцией изобретения, как отмечено в формуле изобретения.
ССЫЛКИ НА ДРУГИЕ ДОКУМЕНТЫ
Патент США No. 7,196,072: Фракция полисахаридов с высоким молекулярным весом, извлеченная из Алоэ вера с иммуностимуляторным действием.
Патент США No. 6,083,508: Способ переработки листьев алоэ.
Патент США No. 2006/0084629: Состав для стимуляции иммунной системы на основе полисахаридов с длинными цепочками, полученных из природных источников.
1
Pugh N., Ross S.A., ElSohly M.A., and Pasco, D.S. (2001). Характеристика Алоэрида, нового полисахарида с высоким молекулярным весом, полученного из Алоэ вера, обладающего возможным иммуномодуляторным действием. J Agr. Food Chem., 49, 1030-1034.