Влияние воспалительного процесса в легких у свиней на функцию альвеолярных макрофагов

УДК 616.24-002:636.4

Ключевые слова: макрофаг, воспаление, фагоцитоз, метаболизм

Keywords: macrophage, inflammation, phagocytosis, metabolism

Крячко О. В.

влияние воспалительного процесса в легких у свиней на функцию альвеолярных макрофагов

the influence of the inflamma tory process in the l ungs in pigs on the function of alveolar macrophages

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» Адрес: 196084, Россия, Санкт-Петербург, Черниговская, д. 5. Тел. (812) 388-20-86

Saint-Petersburg State Academy of veterinary Medicine, Federal State Budget Institution of Higher Education Adress: 196084, Russia, Saint-Petersburg, Chernigovskaya str., 5. Tel. +7 812 388-20-86

Крячко Оксана Васильевна, д. в. н., проф., зав. гаф. патологической физиологии

Kryachko Oksana V., Doctor of Veterinary Science, Professor, Head of the Dept. of Pathological Physiology

Аннотация. Целью наших исследований было изучение влияния воспалительного процесса в легких на функциональную активность воспалительных и резидентных альвеолярных макрофагов. Исследования проведены на свиньях 3,5 месячного возраста, содержащихся в условиях крупного свинокомплекса. Проводили бронхо-альвеолярный лаваж изолированного легкого после убоя животных больных бронхопневмонией и интактных. Для определения функциональной активности воспалительных альвеолярных макрофагов изучали поглотительную (по поглощению частиц латекса) и окислительную (по продукции супероксиданионрадикала) активность. Функциональную активность резидентных альвеолярных макрофагов из участков легких, не задействованных в воспалительном процессе, оценивали в гистоэнзимологических реакциях по метаболическим характеристикам аэробного и анаэробного гликолиза и активности окислительных ферментов. По результатам исследований выявили снижение функции воспалительных альвеолярных макрофагов по всем изученным показателям. Резидентные альвеолярные макрофаги из участков легочной ткани, не задействованных в воспалительной реакции, также имели метаболические нарушения по сравнению с аналогичными клетками у интактных животных. Таким образом, выявленные изменения свидетельствуют о негативном влиянии воспалительного процесса в легких на функцию альвеолярных макрофагов, как воспалительных, так и резидентных, что может привести к затяжному течению процесса в легких или переходу его в хроническую форму.

Summary. The purpose of this study was to investigate the effect of the inflammatory process in the lungs on functional activity of resident and inflammatory alveolar macrophages. The study was conducted on 3.5 month oldpigs. Pigs were kept on a large pig farm. Bronchoalveolar lavage was performed on isolated lung after the animals ill with bronchopneumonia and intact animals have been slaughtered. The functional activity of the inflammatory alveolar macrophages was studied by absorption (the absorption of latex particles) and oxidation (the production of superoxide anion) activity. Functional activity of resident alveolar macrophages from areas of lungs not involved in the inflammatory process was evaluated in histoenzymatic reactions on the metabolic characteristics of aerobic and anaerobic glycolysis and activity of oxidative enzymes. According to the results of the studies the reduction of all functions of inflammatory alveolar macrophages was observed. Resident alveolar macrophages from areas of lung tissue not involved in the inflammatory response also had metabolic abnormalities in comparison with similar cells in intact animals. Thus, the revealed changes indicate the negative impact of the inflammatory process in the lungs on the function of alveolar macrophages, both inflammatory and resident, this can lead to a protracted course ofpneumonia in lungs or its transition into the chronic form.

Введение

Макрофаги - ключевые клетки иммунитета, обладающие выраженной двигательной активностью и способностью к фагоцитозу. Происходят из моноцитов крови, которые после выхода из кровотока попадают в органы и ткани, где превращаются в макрофаги. Макрофаги несут на своей поверхности разнообразные молекулы адгезии (интегрины, селектины), ТЬ-рецепторы, позволяющие

распознавать молекулы, свойственные патогенам, а также рецепторы для антител, компонентов комплемента, цитокинов и других биологически значимых молекул [6].

Выделяют резидентные и воспалительные макрофаги. Резидентные макрофаги происходят от моноцитов, спонтанно мигрирующих в ткани, где они выполняют ре-гуляторную и гомеостатическую функции. Продолжительность их жизни составляет

месяцы и годы. Воспалительные макрофаги покидают кровоток в ответ на хемотаксиче-ские сигналы, поступающие из очага воспаления, в который они мигрируют. Срок их жизни обычно составляет несколько недель.

Под влиянием факторов воспаления воспалительные макрофаги активируются, приобретая способность секретировать про-воспалительные цитокины (интерлейкины 1, 6, 18, фактор некроза опухоли и многие другие), простагландины, лейкотриены, некоторые компоненты комплемента и другие белки, участвующие в реакциях врожденного иммунитета.

Макрофаги осуществляют фагоцитоз патогенных микроорганизмов и чужеродных частиц, в особенности нагруженных антителами и факторами комплемента, которые они распознают с помощью своих рецепторов. Это обеспечивает им центральную роль в реализации неспецифического иммунного ответа. Естественным активатором макрофагов является интерферон у, секретируемый ТЫ-лимфоцитами, в кооперации с которыми макрофаги выступают в качестве основных эффекторных клеток одной из главных форм адаптивного иммунного ответа - клеточного ответа воспалительного типа, играющего ключевую роль в защите от внутриклеточных патогенов (микобактерии, некоторые формы простейших и т. д.). Макрофаги выполняют также роль «мусорщиков», освобождая ткани (в особенности при воспалении) от погибших клеток. Благодаря присутствию на их поверхности молекул главного комплекса гистосовместимости и костимулирующих молекул макрофаги обладают способностью представлять антигены Т-лимфоцитам. Благодаря этой способности макрофаги участвуют в запуске специфического иммунного ответа [6, 7, 8].

Макрофаги, находящиеся в легких, - альвеолярные макрофаги - являются важным клеточным элементом аэрогематического барьера легких [3, 4], в связи с этим целью наших исследований было изучение функциональных и количественных характеристик альвеолярных макрофагов из очага воспаления и из участков легких, не задействованных в воспалительном процессе.

Материалы и методы исследований

Объект исследования - свиньи 3,5-месячного возраста, больные неспецифической бронхопневмонией. Животные содержались в условиях свинокомплекса на стандартном рационе и подбирались по принципу аналогов (порода, живая масса, общее развитие). Были сформированы две группы животных: 1-я - с клиническими признаками заболевания легких (поросятам этой группы вводили внутримышечно бициллин-3 в дозе 10 000 ЕД/кг и тривитамин в дозе 0,1 мл/кг по 5 инъекций в течение 15 суток) и 2-я -клинически здоровых, в дальнейшем именуемые «интактные». Диагноз «бронхопневмония» ставился на основании результатов клинического осмотра, термометрии, наличия кашля, истечений из носовых ходов. Для исключения специфической бронхопневмонии проводились бактериологические исследования бронхиальной слизи, в результате которых специфический возбудитель выделен не был.

На первом этапе для получения макрофагов мы проводили бронхоальвеолярный лаваж изолированного легкого, полученного после убоя свиней 3,5-месячного возраста, больных бронхопневмонией. Убой животных проводили до лечения и спустя 21 сутки после его начала.

Фагоцитарная активность альвеолярных макрофагов оценивалась по поглощению частиц латекса (диаметр 1 мкм, Sigma, США) [5]. Способность клеток БАЛЖ к спонтанной и стимулированной продукции супероксид-анион-радикала определялась по методу Leslie R.G.Q. (1987) [9]. В качестве стимуляторов использовались форбол-мири-стат-ацетат (ФМА, 2 мкг/мл, Serva, ФРГ) и опсонизированный зимозан (ОЗ, 0,5 мг/мл, Serva, ФРГ).

На втором этапе проводили убой больных и интактных животных и для гистоэн-зимологических исследований использовали участки легочной ткани, вырезанные вне макроскопически видимых участков повреждения, которые затем помещали для хранения в жидкий азот (t -179 °С). Постановку реакций осуществляли на криостатных срезах толщиной 10 мкм.

Для характеристики энергетических процессов в клетке в цикле Кребса и в качестве маркеров митохондрий изучали активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ, К.Ф.1.1.1.42), фермента завершающей стадии цикла три-карбоновых кислот. Исследовали также активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ, К.Ф.1.3.99.1), являющейся ферментом терминального этапа гликолиза и одним из регуляторов пируватдегидрогеназного комплекса, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ, К.Ф.1.1.1.49), характеризующей активность гексозомонофосфатного шунта, работающего в цитоплазме; глицерофосфат-дегидрогеназы (ГФДГ) - цитоплазматиче-ской НАД-зависимой (цГФДГ, К.Ф.1.1.1.8) и митохондриальной ФАД-зависимой (мГФДГ, К.Ф.1.1.2.1), обеспечивающих работу гли-церофосфатчелночного механизма по интеграции дыхания митохондрий и внемитохон-дриального гликолиза. Из гидролитических ферментов изучали кислую фосфатазу (КФ, К.Ф.3.1.3.2), являющуюся показателем функционального состояния лизосом и катаболизма в клетке, гидролизующего моноэфиры ор-тофосфорной кислоты, маркера АМ. Данные ферменты определяли по методике М. Берн-

стона [1]. Активность дезоксирибонуклеино-вой кислоты (ДНК) определяли по реакции с голоцианин-хромовыми квасцами [2].

Количественную оценку перечисленных ферментов осуществляли цитофотометри-чески плаг-методом в 30 клетках (альвеолярные макрофаги). В качестве контроля использовали альвеолярные макрофаги и ткань легких от интактных животных-аналогов.

Все полученные результаты были обработаны статистически с использованием пакета ORIGIN на персональном компьютере. Достоверность различий рассчитана на уровне Р < 0,05.

Результаты исследований

В результате проведенных исследований установили (табл. 1), что при острой бронхопневмонии у свиней достоверно на 21,7 % снижается (Р < 0,05) количество клеток в легких, способных к фагоцитозу. Поглотительная активность альвеолярных макрофагов воспалительного экссудата также ниже на 34,4 % (Р < 0,05) по сравнению с альвеолярными макрофагами бронхолегоч-ного пространства у интактных животных.

Таблица 1.

Влияние воспалительного процесса в легких поросят на показатели фагоцитарной активности альвеолярных макрофагов воспалительного экссудата

Показатели Интактные Больные животные

до лечения после лечения

Фагоцитарное число 84,00±5,03 69,00±2,98* 70,00±2,00*

Фагоцитарный индекс 19,87±0,68 14,78±0,31* 15,00±0,42*

Примечание. Различия статистически достоверны (Р < 0,05) при сравнении показателей: * - больных и интактных животных.

Таблица 2.

Влияние воспалительного процесса в легких поросят на показатели продукции супероксидного аниона макрофагами воспалительного экссудата

Продукция супероксидного аниона нмоль / млн кл. /10 мин. Интактные Больные животные

до лечения после лечения

Спонтанная 24,00±1,53 13,00±1,73* 15,00±1,53*

Стимулированная: - ФМА 81,00±4,04 35,67±0,33* 35,00±3,79*

- ОЗ 57,67±3,18 25,33±2,18* 24,33±2,60*

Примечание. Различия статистически достоверны (Р < 0,05) при сравнении показателей: * - больных и интактных животных.

Таблица 3.

Состояние метаболизма в резидентных альвеолярных макрофагах при неспецифической бронхопневмонии поросят

Показатели Интактные животные Больные животные

ЛДГ 0,363±0,011 0,312±0,008*

СДГ 0,195±0,006 0,163±0,007*

Г-6ФДГ 0,279±0,008 0,231±0,007*

ГФДГ-ц 0,164±0,005 0,197±0,006*

ГФДГ-м 0,206±0,006 0,149±0,006*

КФ 0,298±0,008 0,282±0,009

ДНК 0,097±0,003 0,119±0,004*

Примечание: * - статистически достоверно (Р < 0,05) при сравнении с группой интактных животных.

В наших исследованиях мы также выявили нарушение окислительной способности альвеолярных макрофагов у больных свиней (табл. 2), о чем свидетельствовало снижение (Р < 0,05) продукции ими супероксидного аниона, как спонтанной - на 84,6 %, так и стимулированной - на 27,1 % по сравнению с альвеолярными макрофагами бронхолегочного пространства у интактных животных.

При оценке состояния метаболических процессов (табл. 3) в резидентных альвеолярных макрофагах вне очага воспаления отмечали подавление процессов анаэробного и аэробного гликолиза: активность СДГ была ниже на 19,6 % (Р < 0,05), активность Г-6-ФДГ - на 20,8 % (Р < 0,05), активность ЛДГ - 16,3 % (Р < 0,05), чем в группе сравнения. Отмечали разобщение цитоплазма-тического и митохондриального компонентов глицерофосфат-челночного механизма: активность цитоплазматической ГФДГ была выше на 20,1 % (Р < 0,05), а митохондриаль-ной ГФДГ - на 38,3 % ниже (Р < 0,05), чем у интактных животных.

Обсуждение результатов исследований

Основная функция макрофагов - поглотительная - связана с их способностью к фагоцитозу чужеродного материала. Являясь одним из факторов естественной резистентности организма, они осуществляют защиту тех регионов легких, которые первыми вступают в контакт с микробами и абиогенными агентами, т. е. поддерживают стерильность эпителиальной выстилки легких на всем

ее протяжении. Большая часть чужеродного материала, а также фрагменты разрушенных клеточных элементов практически полностью перевариваются после конъюгации фагосомной вакуоли макрофага (некрофага, гемосидерофага) с лизосомами, содержащими протеолитические ферменты [6]. В наших исследованиях мы определили снижение адгезивной и поглотительной активности альвеолярных макрофагов, выделенных из воспалительного экссудата при бронхопневмонии поросят.

Энергетические процессы в цитоплазме макрофагов поддерживаются в основном за счет окислительного фосфорилирования липопротеидов, с катаболизмом которых связана одна из основных функций этих клеток, входящих в систему легочного сур-фактанта. Извлечение энергии, локализация окислительных процессов затрагивают ми-тохондриальную систему, развитие которой коррелирует с функциональным состоянием фагоцита. Здесь же локализуется суперок-сиддисмутаза - фермент антиоксидантной защиты, катализирующий дисмутацию син-глетного кислорода, образующегося при прохождении электронов по дыхательной цепи. Это коренным образом отличает макрофагов легких от полиморфноядерных лейкоцитов, получающих кислород и биоэнергию преимущественно за счет гликолиза [9]. В основе бактерицидности фагоцитов лежат кислородзависимые процессы, поэтому мы исследовали продукцию супероксидного аниона макрофагами воспалительного экссудата как основного метаболита кислорода,

участвующего в окислении поглощенных объектов. Причем мы сравнивали продукцию супероксидного аниона макрофагами в ответ на неподготовленный к фагоцитозу антиген (форбол-миристат-ацетат) и подготовленный (опсонизированный зимозан). В обоих случаях мы отмечали достоверное снижение окислительной способности альвеолярных макрофагов поросят при бронхопневмонии.

Для макрофагов легких характерно высокое содержание кислой фосфатазы, неспецифической эстеразы, катепсинов, фосфоли-пазы А2, а также ферментов цикла Кребса, особенно сукцинатдегидрогеназы [8]. Это и определило выбор исследованных показателей, при изучении которых мы выявили достоверное подавление процессов аэробного и анаэробного гликолиза, энергозависимых процессов в клетках резидентных макрофагов в участках легочной ткани, не задействованных в воспалительном процессе.

Заключение

Таким образом, воспалительный процесс в легких оказывает влияние на функциональную активность макрофагов воспалительного экссудата: снижается количество клеток, способных к фагоцитозу, а также снижаются поглотительная и окислительная активность этих клеток. Реакция участков легочной ткани, не задействованных в воспалительной реакции, также свидетельствует о вовлеченности всего органа в реализацию воспали-

го 2 ГО

тельной реакции и подтверждает системный характер изменений функциональной активности клеток, способных к фагоцитозу. Выявленные изменения могут способствовать затяжному течению бронхопневмонии или к переходу воспалительного процесса в легких в хроническую форму.

Список литературы

1. Бернстон, М. Гистохимия ферментов [Текст] / М. Бернстон. - М. : Мир, 1965. - 470 с.

2. Кисели, Д. Практическая микротехника и гистохимия [Текст] / Д. Кисели. - Будапешт : Изд. Акад. Наук Венгрии, 1962. - 312 с.

3. Крячко, О. В. Состояние гистогематических барьеров легких поросят вне зоны воспаления [Текст] / О. В. Крячко, В. В. Томсон // Ветеринария, 2001. -№ 3. - С. 43-46.

4. Лютинский, С. И. Влияние пептидных биорегуляторов на местный иммунитет при бронхопневмонии [Текст] / С. И. Лютинский, О. В. Крячко, В. Х. Хавинсон, А. Л. Кожемякин // Ветеринария, 1993. - № 1. - С. 44-47.

5. Фрейдлин, И. С. Система мононуклеарных фагоцитов / И. С. Фрейдлин. - М. : Медицина, 1984. - 272 с.

6. Ярилин, А. А. Иммунология [Текст] / А. А. Яри-лин. - М. : ГЭОТАР-МЕДИЯ, 2010. - 752 с.

7. Leslie, R. G. Q. Evaluation and improvement of a rapid microassay for measuring superoxide anion by production by phagocytes [Текст] / R. G. Q. Leslie // J. Immunol. Meth. - 1987. - Vol. 103. - N 2. - P. 253-266.

8. Okabe, Y. Tissue biology perspective on macrophages [Текст] / Y. Okabe, R. Medzhitov // Nature Immunology, 2015. - V. 17 (1). - P. 9-17.

9. Varol, C. Macrophages: development and tissue specialization [Текст] / C. Varol, A. Mildner, S. Jung // Annual Review of Immunology, 2015. - V 33. -P. 643-675.

Ветеринарное Дерматологическое Общество стран СНГ Российский ветеринарный журнал Журнал JSAP /Российское издание

Уважаемые коллеги!

Представляем вашему вниманию Российскую версию официального издания Европейского Общества Ветеринарной Дерматологии, Американской Академии Ветеринарной Дерматологии, Всемирной Ассоциации Ветеринарной Дерматологии -журнал «Veterinary Dermatology».

Главный редактор российского издания - Дипломант Европейского колледжа Ветеринарной Дерматологии, Президент Ветеринарного Дерматологического Общества стран СНГ, Заведующая дерматологическим отделением сети клиник «Белый клык» Кузнецова Е. С.

E-mail: info@logospress.ru Тел/факс: (495) 220-4816, 689-0575

(РВЖ;

Veterinary Dermatology