СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА IX ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR MAKING HUMAN COAGULATION FACTOR IX CONCENTRATE

Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтической промышленности и касается способов получения лиофилизированного высокоочищенного препарата фактора IX из плазмы крови.
Фактор IX - белок, который играет ключевую роль в процессе свертывания крови и предназначен для заместительной терапии при гемофилии В.
Лекарственные препараты, содержащие фактор IX, представляют собой обогащенные данным белком концентраты. Их основными компонентами являются факторы II, VII, IX и X, известные как протромбиновый комплекс. Очевидно, что при длительном переливании таких концентратов возможны осложнения, связанные с активацией примесных белков. Поэтому одной из ведущих задач при создании лекарственных средств, содержащих фактор IX, является минимизация количества примесей.
Поскольку удельное содержание фактора IX в плазме невелико и составляет около 0,01 МЕ/мг общего белка, все известные методы сводятся на первом этапе к концентрированию целевого продукта. Чаще всего для этого используется ионообменная хроматография. Однако неселективность данного метода позволяет сконцентрировать и другие белки, в том числе и компоненты протромбинового комплекса. Удельная активность при этом возрастает до 10-20 МЕ/мг общего белка. Существуют препараты, где способ получения концентрата ограничен только одним типом хроматографии (например, патент РФ 2163140 от 20 февраля 2001 г.). Естественно, что этого недостаточно, и для получения лекарственного средства длительного использования необходима дополнительная очистка. При двухстадийной технологии получения концентрата фактора IX вторым этапом очистки чаще всего является хроматография (аффинная, гидрофобная и т.д.), основанная на использовании других свойств данного белка.
Например, известен способ, объединяющий две последовательные хроматографии: с использованием ионообменника, на котором получают протромбиновый комплекс, и аффинной хроматографии на гепарин сефарозе (патент США 5457181 от 10 октября 1995 года). Удельная активность фактора IX в конечном препарате составляла около 130 МЕ/мг белка.
Однако и двух этапов недостаточно, чтобы получить высокоочищенный белок. Потому поиск дополнительных приемов очистки фактора IX является в настоящее время важной задачей.
Например, известен способ, объединяющий ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию и хроматографию на гепарин сефарозе (патент США 5919909 от 6 июля 1999 года), позволяющий получить конечный препарат с удельной активностью более 100 МЕ/мг белка.
На этом примере видно, что определяющим моментом является подбор комбинации второго и третьего этапа очистки фактора IX.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения и очистки фактора IX из плазмы крови, который включает многоступенчатую последовательно проводимую хроматографию на различных сорбентах (ионообменные смолы, например ДЭАЭ-сефароза, аффинной гепаринсодержащей смолы, например, гепарин-сефароза, гидроксиапатитные смолы, например, Ceramic-Hydroxyapatite, и аффинные сорбенты с иммобилизованными металлами) со специально подобранными буферами для элюции целевого белка, в результате получают продукт с высокой специфической активностью (240 В/мг) (ЕР 1571208, 07.09.2005).
Недостатком данного способа является его трудоемкость и сложность осуществления каждого этапа, использование специфических дорогостоящих типов сорбентов.
Задачей изобретения является упрощение технологии получения препарата фактора IX из плазмы крови с достижением достаточно высокой активности получаемого продукта, что позволит успешно применять его в клинической практике. Способ получения его основан на более простой методике и использовании более доступных средств. Таким образом, техническим результатом, достигаемым при реализации данного изобретения, является упрощение способа получения фактора IX свертывания крови при высоком уровне активности препарата.
В настоящем изобретении супернатант, полученный из плазмы и подвергнутый сольвент-детергентной обработке, наносится на колонну с анионообменником для концентрирования фактора IX и удаления компонентов вирусной инактивации. Затем проводят высаливание с помощью сульфата аммония. Это недорогая и эффективная стадия позволяет отбросить большинство примесных факторов протромбинового комплекса и оставить те компоненты, которые хорошо отделяются от целевого белка на следующей стадии. На последнем этапе проводят окончательную очистку с помощью металл-хелаторной хроматографии. Это позволяет добиться повышения удельной активности фактора IX до 150-200 МЕ/мг белка.
Предлагается способ получения концентрата IX фактора свертывания крови из плазмы крови человека, включающий ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефарозе, осаждение сульфатом аммония и металлохелаторную хроматографию с последующим диализом против буфера, отличающийся тем, что предварительно плазму центрифугируют, супернатант при перемешивании обрабатывают 0.5-2% Твином 80 и 0,1-1% три-н-бутилфосфатом, при хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе используют 15-15 мМ трис-HCl буфер, рН 7,5, содержащим 40-60 мМ цитрата натрия, 30-60 мМ хлорида натрия, с элюцией тем же буфером, содержащим 100-200 мМ хлорида натрия, элюат обрабатывают сульфатом аммония до степени насыщения 25-35% с последующим центрифугированием, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость диафильтруют и подвергают хроматографии на колонке с Cu-хелат сефарозой с использованием 5-15 мМ трис HCl буфера, содержащего 30-60 мМ цитрата натрия, рН 7.0-7.8, проводят удаление балластных белков буфером, содержащим дополнительно 50 мМ хлорида натрия, и элюируют целевой белок 5-15 мМ трис HCl буфером, рН 7,2, содержащим 30-60 мМ цитрат натрия, 90-140 мМ глицина и 100-200 мМ хлорида натрия, который диализуют против 5-15 мМ трис HCl буфера, содержащего 30-60 мМ цитрата натрия, 30-60 мМ глицина, рН 7,2.
Осуществление способа поясняется следующими примерами.
Пример 1.
100 л плазмы, содержащей 80080 ME фактора IX, размораживали и подвергали центрифугированию. После отделения осадка к 95 л супернатанта добавляли твин 80 до конечной концентрации 1% и три-н-бутилфосфат до конечной концентрации 0,3%, а затем инкубировали в течение 16 часов. Смесь наносили на колонну, заполненную ДЕАЕ-сефарозой. Затем промывали вначале уравновешивающим буфером, содержащим 10 мМ трис-HCl и 50 мМ цитрат натрия, после этого тем же буфером, но содержащим дополнительно 50 мМ хлорид натрия. Элюцию проводили тем же буфером, но содержащим 150 мМ хлорид натрия. Полученные 4,5 л элюата, содержащие 62635 ME фактора IX, диафильтровали против уравновешивающего буфера и наносили на колонну с Cu-хелат сефарозой. После промывки уравновешивающим буфером (10 мМ трис HCl, 50 мМ цитрат натрия, рН 7,5) проводили удаление балластных белков буфером, содержащим дополнительно 50 мМ хлорида натрия. Целевой продукт элюировали 10 мМ трис HCl буфером, рН 7,2, содержащим 50 мМ цитрат натрия, 120 мМ глицина и 150 мМ хлорида натрия. Элюат в 3,5 л содержал 56372 ME активности фактора IX. После диализа против формулирующего буфера (10 мМ трис HCl, рН 7,2, 50 мМ цитрат натрия, 50 мМ глицин) раствор подвергали стерильному розливу и лиофильной сушке. Удельная активность фактора IX в препарате составляла 118 МЕ/мг белка.
Пример 2.
Как и в примере 1, но полученный после колонны с ДЕАЕ-сефарозой элюат охлаждали до +6°С, добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 30% и оставляли на 16 часов при той же температуре. После этого суспензию центрифугировали, осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость диафильтровали и наносили на колонну с Cu-хелат сефарозой. После промывки уравновешивающим буфером (10 мМ трис HCl, 50 мМ цитрат натрия, рН 7,5) проводили удаление балластных белков буфером, содержащим дополнительно 50 мМ хлорида натрия. Целевой продукт элюировали 10 мМ трис HCl буфером, рН 7,2, содержащим 50 мМ цитрат натрия, 120 мМ глицина и 150 мМ хлорида натрия. Элюат содержал 51175 ME активности фактора IX в 3,5 л. После диализа против формулирующего буфера (10 мМ трис HCl, рН 7,2, 50 мМ цитрат натрия, 50 мМ глицин) раствор подвергали стерильному розливу и лиофильной сушке. Удельная активность фактора IX в препарате составляла 287 МЕ/мг белка.