КОМПОЗИЦИИ ФРАГМЕНТОВ ТКАНИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕДЕРЖАНИЯ
TISSUE FRAGMENT COMPOSITIONS FOR INCONTINENCE

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Это изобретение относится к композициям для лечения недержания. Более конкретно, это изобретение относится к композициям, содержащим фрагменты жизнеспособной мышечной ткани и носитель, для лечения недержания.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Повреждения мягкой ткани, например, сосудистой, кожной или костно-мышечной, являются вполне обычными. Многие из этих нарушений встречаются в отсутствие системного заболевания и являются последствием хронической повторяющейся травмы слабой степени и чрезмерного применения.
Одним примером довольно обычного повреждения мягкой ткани является недержание. Недержание является жалобой на любое непроизвольное подтекание мочи или фекалий. Оно может вызывать затруднения и приводить к социальной изоляции, депрессии, потери нормального качества жизни и является главной причиной помещения в специальное лечебное учреждение популяции пожилого возраста. Имеются несколько типов недержаний, включающих императивное (приступообразное) недержание мочи (подтекание мочи при сильном желании мочиться), стрессовое недержание мочи (при напряжении), непроизвольное мочеиспускание при перерастяжении мочевого пузыря (парадоксальную ишурию) и смешанное недержание, или смешанное недержание мочи. Смешанным недержанием или смешанным недержанием мочи называют случай, когда пациент страдает от более, чем одной формы недержания мочи, например, стрессового недержания мочи и императивного (приступообразного) недержания мочи.
Медицинская потребность в эффективных фармакологических способах лечения, особенно для смешанного недержания и стрессового недержания мочи (SUI), является очень высокой.
Эта высокая медицинская потребность является результатом отсутствия эффективной фармакологической терапии в сочетании с высокими количествами пациентов. Недавние оценки показали количество 18 миллионов людей, страдающих от SUI в США, причем преимущественно женщин.
2
2
Стрессовое недержание мочи может подтверждаться наблюдением потери мочи, совпадающей с увеличением брюшного давления, в отсутствие сокращения мочевого пузыря или наличия перерастяженного мочевого пузыря. Это состояние стрессового недержания может быть классифицировано либо как уретральная гипермобильность, либо как врожденная недостаточность сфинктера. При уретральной гипермобильности, шейка мочевого пузыря и уретра (мочеиспускательный канал) опускаются во время кашля или напряжения и уретра открывается с видимым подтеканием мочи (давление точки подтекания находится между 60 и 120 см НО). При врожденной недостаточности сфинктера, шейка мочевого пузыря открывается во время наполнения мочевого пузыря без сокращения мочевого пузыря. Видимое подтекание наблюдается при минимальном напряжении (стрессе) или в отсутствие напряжения (стресса). Имеется вариабельное опускание шейки мочевого пузыря и уретры, часто вообще отсутствие опускания, и давление точки подтекания является низким (<60 см HO) (J. G. Blaivas, 1985, Urol. Clin. N. Amer., 12:215-224; D. R. Staskin et al., 1985, Urol. Clin. N. Amer., 12:271-278).
Императивное (приступообразное) недержание мочи определяется как непроизвольная потеря мочи, ассоциированная с внезапным и сильным желанием мочиться. Хотя непроизвольные сокращения мочевого пузыря могут быть ассоциированы с неврологическими нарушениями, они могут также встречаться у индивидуумов, которые, по-видимому, являются неврологически нормальными (P. Abrams et al., 1987, Neurol. & Urodynam., 7:403-427).
Обычными неврологическими нарушениями, ассоциированными с императивным (приступообразным) недержанием мочи, являются инсульт, диабет и рассеянный склероз (E. J. McGuire et al., 1981, J. Urol, 126:205-209). Императивное недержание мочи вызывается непроизвольными сокращениями мышцы-сжимателя, которые могут быть также обусловлены воспалением мочевого пузыря и нарушенной сократимостью мышцы-сжимателя, при которой мочевой пузырь не опустошается полностью.
Непроизвольное мочеиспускание при переполнении мочевого пузыря (парадоксальная ишурия) характеризуется потерей мочи, связанной с перерастяжением мочевого пузыря. Недержание мочи вследствие переполнения мочевого пузыря может быть вызвано нарушенной сократимостью мочевого пузыря или непроходимостью мочевого пузыря, приводящей к перерастяжению и обильному выделению мочи. Мочевой пузырь может быть неполностью активным вторично относительно неврологических состояний, таких как диабет и повреждение спинного мозга, или после радикальной хирургии органов тазовой полости.
Другой обычной и серьезной причиной недержания мочи (императивного недержания мочи и недержания мочи вследствие перерастяжения мочевого пузыря) является нарушенная сократимость мочевого пузыря. Это является все более обычным состоянием в гериатрической популяции у людей пожилого и старческого возраста) и у пациентов с неврологическими заболеваниями, в частности с сахарным диабетом (N. M. Resnick et al., 1989, New Engl. J. Med., 320: 1-7; M.B. Chancellor and J.G. Blaivas, 1996, Atlas of Urodynamics, Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa.). Мочевой пузырь с недостаточной сократимостью не может опорожнять его содержимое от мочи; это вызывает не только недержание, но также инфицирование мочевых путей и почечную недостаточность. В настоящее время клиницисты являются очень ограниченными в их способности лечения нарушенной сократимости мышцы-сжимателя. Не существует эффективных лекарственных средств для улучшения сократимости мышцы-сжимателя. Хотя урехолин может слегка увеличивать внутрипузырное давление, в контролируемых исследованиях не было показано, что он способствует эффективному опорожнению мочевого пузыря (A. Wein et al., 1980, J. Urol, 123:302). Наиболее обычным лечением является обход этой проблемы посредством периодической или постоянной катетеризации.
Имеются ряд способов лечения стрессового недержания мочи. Наиболее часто практикуемые существующие способы в случае стрессового недержания мочи включают следующее: абсорбирующие продукты; постоянную катетеризацию; пессарий, т.е. вагинальное кольцо, помещаемое для поддержания шейки мочевого пузыря; и лекарственное лечение (Agency for Health Care Policy and Research. Public Health Service: Urinary Incontinence Guideline Panel. Urinary Incontinence in Adults: Clinical Practice Guideline. AHCPR Pub. No. 92-0038. Rockville, Md. U.S. Department of Health and Human Services, March 1992; M.B. Chancellor, Evaluation and Outcome. В: The Health of Women With Physical Disabilities: Setting a Research Agenda for the 90's. Eds. Krotoski D.M., Nosek, M., Turk, M., Brooks Publishing Company, Baltimore, Md., Chapter 24, 309-332, 1996). Физические упражнения являются другим способом лечения для стрессового недержания мочи. Например, обычным и популярным способом лечения стрессового недержания мочи являются упражнения Кегеля. Эти упражения могут помочь половине людей, которые выполняют их четыре раза в день в течение 3-6 месяцев. Хотя 50% пациентов сообщают некоторое улучшение с упражнениями Кегеля, коэффициент излечения в отношении недержания после упражнений Кегеля равен только 5 процентам. Кроме того, большинство пациентов прекращают эти упражнения и выпадают из протокола вследствие необходимости очень продолжительного времени и ежедневной дисциплины.
Другим способом лечения для недержания мочи является уретральный тампон. Он представляет собой одноразовый пробкообразный тампон для женщин со стрессовым недержанием мочи. К сожалению, этот тампон ассоциирован с более 20% инфекции мочевых путей и, к сожалению, не излечивает недержание.
Биологическую обратную связь и функциональную электрическую стимуляцию с применением вагинального зонда также использовали для лечения императивного (приступообразного) недержания и стрессового недержания мочи. Однако эти способы являются длительными и дорогостоящими, а результаты являются лишь умеренно превосходящими упражнения Кегеля. Хирургические операции, такие как лапароскопические операции или открытые абдоминальные подвешивания шейки мочевого пузыря; абдоминальные подвешивания шейки мочевого пузыря с трансвагинальным доступом; искусственный мочевой сфинктер (дорогостоящая сложная хирургическая процедура с 40% коэффициентом возврата к прежнему состоянию), также используют для лечения стрессового недержания мочи).
Другие способы лечения включают процедуры интрауретральных инъекций с экзогенными инъецируемыми материалами, такими как силикон (кремнийсодержащее соединение), покрытые углем частицы, Тефлон, коллаген и аутологичный жир. Каждый из этих инъецируемых веществ имеет свои недостатки. Патенты США №№5007940; 5158573 и 5116387, выданные Berg, сообщают о биосовместимых композициях, содержащих дискретные, полимерные и состоящие из силиконового (кремнийсодержащего) каучука тельца, инъецируемые в уретральную ткань с целью лечения недержания мочи посредством придания объемности ткани. Далее, патент США №5451406, выданный Lawin, сообщает о биосовместимых композициях, содержащих субстраты их покрытых углем частиц, которые могут быть инъецированы в ткань, такую как ткань уретры и ткань, которая покрывает уретру и шейку мочевого пузыря, с целью лечения недержания мочи посредством увеличения объема ткани. Одним недостатком или неблагоприятным результатом, ассоциированным с методологиями или терапиями придания объемности ткани является миграция твердых частиц в агентах-наполнителях из исходного участка помещения в участки депонирования в различных органах тела и последующая хроническая воспалительная реакция ткани на частицы, которые являются слишком малыми. Эти неблагоприятные эффекты сообщаются в литературе по урологии, в частности, в Malizia A.A. et al., "Migration and Granulomatous Reaction After Periurethral Injection of Polytef (Teflon)", JAMA, 251:3277-3281 (1984) и в in Claes H., Stroobants D. et al., "Pulmonary Migration Following Periurethral Polytetrafluoroethylene Injection For Urinary Incontinence", J. Urol., 142:821-822 (1989). Одним важным фактором в гарантии отсутствия миграции является введение частиц правильного размера. Если частицы являются слишком маленькими, они могут поглощаться лейкоцитами тела (фагоцитами) и переноситься к отдаленным органам или переноситься из сосудистой системы и перемещаться, пока они не достигнут участка большего сужения. Органы-мишени для депонирования частиц включают легкие, печень, селезенку, головной мозг, почку и лимфатические узлы. Применение сферических частиц малого диаметра и удлиненных фибрилл в водной среде, имеющей биосовместимый смазывающий агент, было раскрыто Wallace et al., патент США №4803075. Хотя эти материалы показали положительные, кратковременные результаты стимуляции, этот результат был краткосрочным, так как этот материал имеет тенденцию мигрировать и/или абсорбироваться тканью хозяина.
Инъекции коллагена обычно используют бычий коллаген, который абсорбируется в течение 4-6 месяцев, что приводит к необходимости повторяемых инъекций. Дополнительным недостатком коллагена является то, что приблизительно 5% пациентов имеют аллергию в отношении коллагена бычьего источника и вырабатывают антитела.
Трансплантация аутологичного жира в качестве инъецируемого придающего объем агента имеет существенный недостаток, заключающийся в том, что наибольшая часть инъецированного жира резорбируется. Кроме того, степень и продолжительность выживания трансплантата аутологичного жира остается дискуссионной. В месте имплантата обычно имеет место воспалительная реакция. Осложнения от трансплантации жира включают резорбцию жира, узелки и асимметрию ткани.
Недавние подходы с инъекционной терапией мышечных клеток, использующие полученные генной инженерией мышечные клетки, могут предоставлять альтернативную терапию для лечения недержания, в частности стрессового недержания мочи, и усиления континенции (удерживания) мочи. Предпочтительно, инъекция полученных из мышц клеток может быть аутологичной, так что аллергические реакции будут минимальными или отсутствующими. Миобласты, предшественники мышечных волокон, являются одноядерными мышечными клетками, которые отличаются по многим признакам от других типов клеток. Миобласты природно сливаются с образованием постмитотических многоядерных мышечных трубочек и, следовательно, могут быть использованы для долгосрочной экспрессии и доставки биоактивных белков (T.A. Partridge and K.E. Davies, 1995, Brit. Med. Bulletin, 51: 123-137; J. Dhawan et al., 1992, Science, 254: 1509-1512; A.D. Grinnell, 1994, In: Myology. Ed 2, Ed. Engel AG and Armstrong CF, McGraw-Hill, Inc, 303-304; S. Jiao and J.A. Wolff, 1992, Brain Research, 575: 143-147; H. Vandenburgh, 1996, Human Gene Therapy, 7:2195-2200).
Применение миобластов для лечения мышечной дегенерации, для рапарации повреждения ткани или лечения заболевания описано в патентах США №№5130141 и 5538722. Трансплантацию миобластов использовали также для репарации миокардиальной дисфункции (S.W. Robinson et al., 1995, Cell Transplantation, 5:77-91; C.E. Murry et al., 1996, J. Clin. Invest., 98:2512-2523; S. Gojo et al., 1996, Cell Transplantation, 5:581-584; A. Zibaitis et al., 1994, Transplantation Proceedings, 26:3294). Использование миобластов для лечения недержания мочи описано в Патенте США №6866842, а также в Transplantation. 2003 Oct 15;76(7): 1053-60; J Urol. 2001 Jan; 165(l):271 и Yokoyama T.J., Urology, 165:271-276, 2001. Заявка WO 2004055174 описывает состав культуральной среды, способ культивирования и полученные миобласты и их применения. Стимуляция мягкой ткани и кости и придание объмности с использованием полученных из мышц клеток-предшественников, композиции и способы лечения описаны в WO 0178754. Миобластная терапия для заболеваний человека описана в US 9909451.
Хотя клеточная терапия предоставляет преимущества над другими инъекциями, она имеет большие недостатки. Одним из самых больших недостатков, ассоциированных с применением миобластов для лечения стрессового недержания мочи, является то, что миобласты требуют экстенсивного культивирования в течение 3-4 недель для достижения количеств клеток, требуемых для инъекции, что делает эту терапию очень дорогой и недоступной для многих пациентов.
Ввиду вышеупомянутых недостатков и осложнений лечения недержания мочи и сократимости мочевого пузыря, в данной области требуются новые и эффективные альтернативные способы.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Этим изобретением является композиция для лечения недержания, содержащая фрагменты жизнеспособной мышечной ткани и носитель. Эта композиция содержит по меньшей мере один фрагмент мышечной ткани, имеющий по меньшей мере одну жизнеспособную клетку, которая может мигрировать из этого фрагмента ткани и на сайт трансплантации для образования новой ткани. Эти фрагменты жизнеспособной мышечной ткани могут быть получены из аутологичной, аллогенной или ксеногенной ткани. Носитель включает, но не ограничивается ими, физиологический буферный раствор, инъекционный раствор геля, солевой раствор и воду. Эти композиции применимы в лечении недержания инъецированием этой композиции в мочеполовую ткань, такую как уретра, уретральный сфинктер и мочевой пузырь, в случае недержания мочи, и в колоректальную ткань, такую как ободочная кишка, прямая кишка и колоректальный сфинктер, в случае фекального недержания.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
3
3
Жизнеспособные фрагменты мышечной ткани могут быть получены из аутологичной, аллогенной или ксеногенной ткани. В одном варианте осуществления, эти фрагменты жизнеспособной мышечной ткани получают из аутологичной ткани. Эту мышечную ткань получают при асептических условиях. Эта жизнеспособная мышечная ткань может быть получена с использованием любого из различных общепринятых способов, включающих биопсию или другие хирургические способы удаления тканей. После получения жизнеспособной мышечной ткани эту ткань затем фрагментируют при стерильных условиях. Кроме того, эта ткань может быть фрагментирована в любой стандартной среде для культуры клеток, известной специалистам с обычной квалификацией в данной области, либо в присутствии, либо в отсутствие сыворотки. Размер фрагмента жизнеспособной мышечной ткани может находиться в диапазоне приблизительно 0,1 - приблизительно 3 мм, но предпочтительно фрагменты жизнеспособной мышечной ткани имеют размер приблизительно 0,1 - приблизительно 1 мм.
Композиция данного изобретения включает также носитель. Этот носитель является биосовместимым и имеет достаточные физические свойства для обеспечения легкости инъекции. Этот носитель включает, но не ограничивается ими, физиологический буферный раствор, инъекционный раствор геля, солевой раствор и воду. Физиологический буферный раствор включает, но не ограничивается ими, забуференный солевой раствор, раствор фосфатного буфера, сбалансированный солевой раствор Хенкса, забуференный Трисом солевой раствор и забуференный HEPES солевой раствор. В одном варианте осуществления, этим буфером является сбалансированный солевой раствор Хенкса. Инъекционный раствор геля может быть в форме геля перед инъекцией или может желатинироваться и оставаться в месте введения.
Инъекционный раствор геля состоит из воды, солевого раствора или физиологического буферного раствора и желатинирующего материала. Желатинирующие материалы включают, но не ограничиваются ими, белки, такие как коллаген, эластин, тромбин, фибронектин, желатин, фибрин, тропоэластин, полипептиды, ламинин, протеогликаны, фибриновый клей, фибриновый сгусток, сгусток богатой тромбоцитами плазмы (PRP), сгусток бедной тромбоцитами плазмы (РРР), самособирающиеся пептидные гидрогели и ателоколлаген; полисахариды, такие как пектин, целлюлоза, окисленная целлюлоза, хитин, хитозан, агароза, гиалуроновая кислота; полинуклеотиды, такие как рибонуклеиновые кислоты, дезоксирибонуклеиновые кислоты, и другие, такие как альгинат, сшитый альгинат, поли(N-изопропилакриламид), поли(оксиалкилен), сополимеры поли(этиленоксида) и поли(пропиленоксида), поли(виниловый спирт), полиакрилат, сополимеры моностеароилглицеринсукцината и полиэтиленгликоля (MGSA/PEG) и их комбинации.
В одном варианте осуществления, эта композиция дополнительно содержит микрочастицы. Квалифицированные в этой области специалисты называют микрочастицы также микрогранулами или микросферами. Эти микрочастицы обеспечивают как временный объемный эффект, так и субстрат, на котором могут прикрепляться и расти фрагменты жизнеспособной мышечной ткани. Эти микрочастицы должны быть достаточно большими, чтобы препятствовать локальной или отдаленной миграции после инъекции иглой для подкожных инъекций. Таким образом, микрочастицы имеют по существу круглую форму со средним поперечным размером в диапазоне приблизительно 100 - приблизительно 1000 микрон, предпочтительно в диапазоне приблизительно 200 - приблизительно 500 микрон. Эти микрочастицы предпочтительно образованы из биосовместимого полимера. Биосовместимые полимеры могут быть синтетическими полимерами, природными полимерами или их комбинациями. В данном контексте термин "синтетический полимер" относится к полимерам, которые не обнаружены в природе, даже если эти полимеры изготовлены из природно-встречающихся биоматериалов. Термин "природный полимер" относится к полимерам, которые являются природно-встречающимися. Эти биосовместимые полимеры могут быть также биодеградируемыми. Биодеградируемые полимеры легко разрушаются на маленькие сегменты при контактировании с влажной тканью тела. Затем эти сегменты либо абсорбируются телом, либо выводятся телом. Более конкретно, эти биодеградированные сегменты не вызывают перманентной хронической реакции чужеродного тела, так как они абсорбируются телом или выводятся из тела, так что никакой перманентный след или остаток этого сегмента не удерживается телом.
В одном варианте осуществления, микрочастица состоит по меньшей мере из одного синтетического полимера. Подходящие биосовместимые синтетические полимеры включают, но не ограничиваются ими, полимеры алифатических сложных полиэфиров, поли(аминокислоты), сополимеры (простой эфир-сложный эфир), полиалкиленоксалаты, полиамиды, полученные из тирозина поликарбонаты, поли(иминокарбонаты), полиортоэфиры, полиоксаэфиры, полиамидоэфиры, полиоксаэфиры, содержащие аминогруппы, поли(ангидриды), полифосфазены, поли(пропиленфумарат), полиуретан, сложный полиэфируретан, простой полиэфируретан, и их смеси и сополимеры. Подходящие синтетические полимеры для применения в данном изобретении могут также включать биосинтетические полимеры на основе последовательностей, обнаруженных в коллагене, ламинине, гликозаминогликанах, эластине, тромбине, фибронектине, крахмалах, поли(аминокислоте), желатине, альгинате, пектине, фибрине, окисленной целлюлозе, хитине, хитозане, тропоэластине, гиалуроновой кислоте, шелке, рибонуклеиновых кислотах, дезоксирибонуклеиновых кислотах, полипептидах, белках, полисахаридах, полинуклеотидах, и их комбинации.
Для цели этого изобретения алифатические сложные полиэфиры включают, но не ограничиваются ими, гомополимеры и сополимеры мономеров, включающих лактид (который включает молочную кислоту, D-, L- и мезолактид); гликолид (включающий гликолевую кислоту); эпсилон-капролактон; п-диоксанон (1,4-диоксан-2-он); триметиленкарбонат (1,3-диоксан-2-он); алкилпроизводные триметиленкарбоната; и их смеси. Алифатические сложные полиэфиры, используемые в данном изобретении, могут быть гомополимерами или сополимерами (статистическими сополимерами, блоксополимерами, сегментированными, коническими блоксополимерами, привитыми сополимерами, триблок-сополимерами и т.д.), имеющими линейную, разветвленную или звездообразную структуру. В вариантах, в которых скелет включает по меньшей мере один природный полимер, подходящие примеры природных продуктов включают, но не ограничиваются ими, материалы на основе фибрина, материалы на основе коллагена, материалы на основе гиалуроновой кислоты, материалы на основе гликопротеина, материалы на основе целлюлозы, разновидности шелка и их комбинации.
Специалисту в данной области будет понятно, что выбор подходящего материала для образования биосовместимых микрочастиц зависит от нескольких факторов. Эти факторы включают механические свойства in vivo; реакцию клеток на этот материал, включающую присоединение, пролиферацию, миграцию и дифференцировку; и необязательно кинетику биодеградации. Другие релевантные факторы включают химический состав, пространственное распределение компонентов, молекулярную массу полимера и степень кристалличности.
В другом варианте осуществления, в композиции этого изобретения может быть включен биологический эффектор. Эти биологические эффекторы стимулируют заживление и/или регенерацию пораженной ткани (например, факторы роста и цитокины), предотвращают инфекцию (например, противомикробные агенты и антибиотики), уменьшают воспаление (например, противовоспалительные агенты), предотвращают или минимизируют образование адгезии, такие как окисленная регенерированная целлюлоза (например, INTERCEED и Surgicel, доступные из Ethicon, Inc.) и гиалуроновая кислота, и подавляют иммунную систему (например, иммуносупрессоры).
Биологические эффекторы включают, но не ограничиваются ими, гетерологичные и аутологичные факторы роста, белки матрикса, пептиды, антитела, ферменты, гликопротеины, гормоны, цитокины, гликозаминогликаны, нуклеиновые кислоты, обезболивающие агенты. Понятно, что в этой композиции могут быть включены один или несколько биологических эффекторов одной и той же или различной функциональности.
Известно, что гетерологичные или аутологичные факторы роста стимулируют заживление и/или регенерацию травмированной или поврежденной ткани. Примеры факторов роста включают, но не ограничиваются ими, TGF-β, костный морфогенный белок, фактор-5 дифференцировки роста (GDF-5), полученный из хряща морфогенный белок, фактор роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста, эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF), эпидермальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста, фактор роста гепатоцитов и их фрагменты. Подобным образом, подходящие эффекторы включают агонисты и антагонисты вышеуказанных агентов.
Гликозаминогликаны являются высокозаряженными полисахаридами, которые играют роль в клеточной адгезии. Примеры гликозаминогликанов, применимых в качестве биологических эффекторов, включают, но не ограничиваются ими, гепарансульфат, гепарин, хондроитинсульфат, дерматансульфат, кератинсульфат, гиалуронан (также известный как гиалуроновая кислота) и их комбинации.
Биологический эффектор может быть также ферментом, таким как расщепляющие матрикс ферменты, которые облегчают миграцию клеток из внеклеточного матрикса, окружающего клетки. Подходящие расщепляющие матрикс ферменты включают, но не ограничиваются ими, коллагеназу, хондроитиназу, трипсин, эластазу, гиалуронидазу, пептилазу, термолизин, матриксную металлопротеазу и протеазу.
Специалисту в данной области будет понятно, что подходящий биологический эффектор (подходящие биологические эффекторы) могут определяться хирургом на основе принципов медицинской науки и целей применяемого лечения. Количество биологического эффектора, включаемого с этой композицией, будет варьироваться в зависимости от различных факторов, в том числе от конкретного применения, такого как стимуляция выживаемости клеток, пролиферация, дифференцировка, или облегчение и/или ускорение заживления ткани. Этот биологический эффектор может быть включен в композиции жизнеспособных фрагментов мышечной ткани и носителя до или после введения этой композиции в зону повреждения ткани.
3
Композиция для лечения недержания может быть приготовлена сначала получением пробы мышечной ткани из донора (аутологичного, аллогенного или ксеногенного) с использованием подходящих инструментов для забора проб. Затем эту пробу мышечной ткани либо тонко измельчают и делят на малые фрагменты при заборе ткани, либо альтернативно, проба мышечной ткани может быть измельчена после взятия и сбора пробы вне тела. В экспериментах, в которых эту пробу ткани измельчают после ее забора, эти пробы ткани могут быть взвешены и затем промыты три раза в забуференном фосфатом солевом растворе. Затем приблизительно 100-500 мг ткани могут быть измельчены на маленькие фрагменты в присутствии небольшого количества, например, приблизительно 1 мл, физиологического буферящего раствора, такого как забуференный фосфатом солевой раствор, или расщепляющего матрикс фермента, такого как 0,2% коллагеназа, в среде Ham F12. Эту мышечную ткань измельчают с получением фрагментов размером приблизительно 0,1-1 мм. Измельчение этой ткани может выполняться различными способами. В одном варианте осуществления, измельчение выполняют двумя стерильными скальпелями в параллельном и противоположном направлениях, а в другом варианте осуществления, эту ткань измельчают обрабатывающим инструментом, который автоматически делит эту ткань на частицы желаемого размера. В одном варианте осуществления, эта измельченная ткань может быть отделена от физиологической жидкости и сконцентрирована при помощи любого из различных способов, известных специалистам с обычной квалификацией в данной области, например, просеиванием, осаждением или центрифугированием. В вариантах в которых измельченную ткань фильтруют и концентрируют, суспензия измельченной ткани предпочтительно сохраняет небольшое количество жидкости в этой суспензии для предотвращения высыхания этой ткани. Эту суспензию фрагментов жизнеспособной мышечной ткани объединяют с носителем, описанным выше, и необязательно с микрочастицами и доставляют в участок репарации ткани посредством инъекции. Кроме того, биологический эффектор может быть добавлен к этой композиции с микрочастицами или без микрочастиц перед введением в участок репарации ткани.
Описанные здесь композиции применимы в лечении мягкой ткани. Мягкой тканью называют обычно находящиеся вне скелета структуры, расположенные по всему телу, и мягкая ткань включает, но не ограничивается ими, периодонтальную ткань, кожную ткань, ткань сосудов, мышечную ткань, фасциальную ткань, глазную ткань, перикардиальную ткань, легочную ткань, синовиальную ткань, нервную ткань, почечную ткань, эзофагеальную ткань (ткань пищевода), урогенитальную ткань, кишечную ткань, колоректальную ткань, ткань печени, ткань поджелудочной железы, ткань селезенки, жировую ткань, и их комбинации. Предпочтительно, описанные здесь композиции применимы в лечении урогенитальной ткани, такой как уретра, уретральный сфинктер и мочевой пузырь, эзофагеальной ткани, такой как пищевод и кардиальный (кардиоэзофагеальный) сфинктер, и колоректальной ткани, такой как ободочная кишка, прямая кишка и колоректальный сфинктер. Эти композиции могут быть также использованы для придания объемности ткани, нарастания ткани, косметических обработок, терапевтических способов лечения и герметизации (уплотнения) ткани.
3
Один неограничивающий пример приготовления композиции для лечения недержания является следующим. Пациента готовят для операции по репарации ткани общепринятым образом с использованием общепринятых хирургических способов. Пробу мышечной ткани, используемую для образования этой композиции, получают из пациента с использованием общепринятых инструментов для изъятия ткани. Эту пробу мышечной ткани тонко измельчают и делят на фрагменты жизнеспособной мышечной ткани, имеющие размер частиц в диапазоне приблизительно 0,1 - приблизительно 3 мм. Эту ткань измельчают с использованием общепринятого способа измельчения, такого как разрезание двумя стерильными скальпелями в противоположных параллельных направлениях. Измельчают приблизительно 100-500 мг ткани в присутствии приблизительно 1 мл физиологического буферящего раствора, требуемое количество ткани зависит от степени повреждения ткани в участке репарации. Эти фрагменты жизнеспособной мышечной ткани фильтруют и/или концентрируют для отделения фрагментов жизнеспособной мышечной ткани от физиологического буферящего раствора. Фрагменты жизнеспособной мышечной ткани концентрируют центрифугированием. Затем фрагменты жизнеспособной мышечной ткани объединяют со сбалансированным солевым раствором-носителем Хенкса и необязательно с микрочастицами и инъецируют в участок репарации ткани. В приготовлении этих композиций может быть использован набор. Этот набор включает инструмент для взятия проб, стерильный контейнер, в который помещен реагент для поддержания жизнеспособности ткани, обрабатывающий инструмент, носитель и доставляющее устройство. Инструмент для взятия проб используют для получения жизнеспособной мышечной ткани из субъекта. Эта ткань может быть помещена в стерильном контейнере, содержащем реагент для поддержания жизнеспособности ткани. Подходящие реагенты для поддержания жизнеспособности пробы ткани включают, но не ограничиваются ими, солевой раствор, забуференный фосфатом раствор, сбалансированный солевой раствор Хенкса, стандартную среду для культивирования клеток, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, аскорбиновую кислоту, HEPES, заменимую аминокислоту, L-пролин, аутологичную сыворотку и их комбинации. Обрабатывающий инструмент используют для измельчения ткани до фрагментов жизнеспособной мышечной ткани, или, альтернативно, инструмент для взятия проб может быть адаптирован для забора пробы ткани и для обработки этой пробы до тонко измельченных частиц ткани. Этим носителем может быть физиологический буферный раствор, инъекционный раствор геля, солевой раствор или вода, как описано здесь, и он может включать микрочастицы. Устройство доставки позволяет депонировать эту композицию фрагментов жизнеспособной мышечной ткани в носителе в патологические ткани, например, смежные с участками уретрального сфинктера или окружающий уретральный сфинктер.
ПРИМЕР 1
Эффективность новой терапии на основе применения композиции фрагментов жизнеспособной мышечной ткани для восстановления давления точки подтекания (LPP) исследовали на модели стрессового недержания мочи (SUI) у крыс. Фрагменты жизнеспособной мышечной ткани генерировали из скелетных мышц самцов крыс. В целом 24 самки крыс Lewis относили случайным образом к одной из 3 групп (8 животных на группу), а именно, животных с недержанием мочи, животных с недержанием мочи, инъецированных носителем + фрагментами жизнеспособной мышечной ткани. SUI создавали в 2-х последних группах рассечением билатерального полового нерва (PNT). Спустя одну неделю после хирургии композицию вводили каждой группе животных интрауретральной инъекцией. Спустя 5 недель LPP измеряли по меньшей мере 4 раза у каждой крысы и определяли среднее.
Уход за животными
За животными, используемыми в этом исследовании, ухаживали и их поддерживали в соответствии со всеми применимыми разделами норм the Final Rules of the Animal Welfare Act (9 CFR), the Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals, the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Этот протокол и любые исправления или процедуры, включающие уход за животными или применение животных в этом исследовании, были рассмотрены и одобрены the Testing Facility Institutional Animal Care and Use Committee перед началом таких процедур.
Крысы Lewis были выбраны вследствие их сингенного фенотипа. Он позволяет оценивать композицию для лечения SUI, полученную из одной крысы и имплантированную в другую крысу, без использования иммуносупрессии. Этих животных содержали раздельно в микроизоляторах. Контроли окружающей среды устанавливали на поддержание температур 18-26°C (64-79°F) с относительной влажностью 30-70%. Поддерживали цикл 12-часовой свет/12-часовая темнота, за исключением прерывания для аккомодации к процедурам исследования. В помещениях животных поддерживали десять или более замен воздуха в час 100% свежим воздухом (без рециркуляции воздуха). Животным обеспечивали рацион Purina Certified Diet и отфильтрованную водопроводную воду ad libitum.
Материалы и способы
Животные. SUI создавали ранее установленным способом рассечения билатерального полового нерва (PNT). Все процедуры выполняли при асептических условиях. Крыс готовили для асептической хирургии и анестезию индуцировали с использованием изофлурана при 2,5-4%. После индукции анестезию поддерживали изофлураном, доставляемым через носовой конус при 0,5-2,5%. Для PNT-хирургии, шерсть на участке, простирающемся от тазобедренного сустава до основания хвоста, на седалищной области и на обратной стороне задних конечностей сбривали и животное помещали в вентральное лежачее положение. Посредством дорсального продольного разреза билатерально открывали седалищно-прямокишечную ямку. С использованием увеличения лупы выделяли и рассекали половой нерв. Разрез закрывали с использованием жидкого локального тканевого клея Nexaband. Группу животных без недержания мочи подвергали той же самой хирургической процедуре, за исключением фактического рассечения нерва.
Приготовление и введение композиции
2+
2+
. Трех самцов крыс Lewis эвтанизировали избыточной дозой внутривенного натрий-пентобарбитала (100 мг/кг). Извлекали ткань из их обеих четырехглавых мышц. Кусок скелетной мышцы мелко измельчали на фрагменты скальпелем и затем наносили в сетчатый фильтр для клеток с отверстиями 300 микрометров. Фрагменты проталкивали через эту сетку поршнем шприца на 10 мл. Нижнюю сторону этого фильтра выскребали лезвием скальпеля и полученные фрагменты жизнеспособной мышечной ткани ресуспендировали в 3 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) без Ca и без Mg (cat#: 14175-095 Invitrogen, CA) с получением однородной композиции. Общая концентрация ткани была равна 0,3 г/мл. Эту жизнеспособную измельченную мышечную ткань суспендировали в HBSS, загружали в шприц Гамильтона на 100 микролитров и инъецировали в уретру крыс иглой для подкожного введения. Животных подвергали этой обработке спустя одну неделю после создания повреждения SUI. Самок крыс анестезировали и выполняли затем две инъекции (10 микролитров каждая) на крысу при положении уретры 2 часа и 10 часов. Обработанные носителем животные получали только HBSS таким же образом.
Тестирование давления точки подтекания (LPP)
. При 5 неделях после хирургии, крыс анестезировали и помещали в лежащее положение на спине при нулевом уровне давления и опустошали мочевой пузырь мануально. Затем мочевой пузырь наполняли солевым раствором при комнатной температуре (5 мл в час) через надлобковый катетер. Этот надлобковый катетер соединяли с насосом типа шприца и датчиком давления. Все давления мочевого пузыря относили к давлению воздуха на уровне мочевого пузыря. Сигналы давления и силы датчика усиливали и оцифровывали для сбора данных компьютером с использованием AD-инструментов, компьютерной программы Power Lab при 10 пробах в секунду.
Максимальное давление мочевого пузыря генерировали увеличением медленно и мануально абдоминального давления до появления подтекания и в этот момент наружное абдоминальное давление быстро сбрасывали. LPP-тестирование выполняли минимально четыре раза в каждой крысе. Мочевой пузырь опустошали при помощи приема Crede и повторно заполняли между измерениями LPP. Величины LPP получали с использованием датчика давления инструментов AD и анализировали с использованием компьютерной программы Power Lab Chart™. Индивидуальные нетипичные величины в сеансах тестирования LPP для каждого животного количественно идентифицировали как артефакты давления и исключали из исследования. Артефактные результаты давления определяли как величины давления (мм Hg), которые считались артифициально высокими или низкими в сравнении с другими результатами давления из того же самого сеанса тестирования LPP. Во время тестирования LPP артефакты давления могли быть генерированы многочисленными путями, включающими: неумышленную закупорку кончика катетера контактом со слизистой стенкой либо мочевого пузыря, либо уретры, неполное опустошение мочи и/или солевого раствора мочевого пузыря, пребывание животного в состоянии легкой анестезии во время тестирования, приводящей к сокращению мочевого пузыря животного.
Результаты и обсуждение
Ниже приведены среднее LPP и стандартное отклонение.
Группа обработки
Количество животных
Среднее LPP (мм Hg)
Стандартное отклонение
Животные без недержания
4
42,6
5,4
Животные с недержанием, инъецированные носителем
8
22,9
3,1
Животные с недержанием, инъецированные носителем + фрагментами жизнеспособной мышечной ткани
7
28,8
3,0
Выводы
Эти результаты показывают, что наблюдалось функциональное улучшение после четырех недель в страдающих от недержания мочи животных, обработанных фрагментами жизнеспособной мышечной ткани, в сравнении со страдающими от недержания мочи животными, инъецированными только носителем. Достигнутое улучшение было равно приблизительно 68% животных, не страдающих от недержания мочи, что дает 42%-ное улучшение относительно животных с недержанием мочи, инъецированных только носителем. Эти результаты показывают, что фрагменты жизнеспособной мышечной ткани производили видимое улучшение в сравнении с обработкой носителем и, следовательно, могут быть использованы в качестве терапии для лечения стрессового недержания мочи.
ПРИМЕР 2
Эффективность новой терапии на основе применения композиции фрагментов жизнеспособной мышечной ткани для восстановления давления точки подтекания (LPP) в 2 крысиных моделях стрессового недержания мочи (SUI) может быть испытана последовательно. Композиции фрагментов жизнеспособной мышечной ткани могут быть приготовлены, как описано в примере 1. Двумя различными крысиными моделями, которые могут сравниваться, являются животные с недержанием, происходящим из рассечения билатерального полового нерва и из уретролиза (разрыва мочеточника). Модель уретролиза создают ранее установленным способом. Вкратце, животных анестезируют внутрибрюшинной инъекцией кетамина (60 мг/кг массы тела) и ксилазина (5 мг/кг массы тела). Их помещают на спину на грелку-подушку с циркулирующей водой. Живот подготавливают и обкладывают салфетками стандартным хирургическим способом. Делают разрез по нижней срединной линии живота и идентифицируют мочевой пузырь и уретру. Проксимальную и дистальную уретру отделяют по окружности разрезом внутритазовой фасции и отделением уретры от передней вагинальной стенки и лобковой кости резким иссечением. Следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить мочеточники или не нарушить нижнюю сосудистую сеть мочевого пузыря. Во влагалище помещают ватный тампон для облегчения иссечения. Ректальную фасцию и кожу закрывают швами с использованием 4-0 полиглактина (Vicryl) и 4-0 найлона, соответственно.
Получают 3 группы на одну модель повреждения и крысы могут быть случайным образом отнесены к одной из трех групп, а именно животных без недержания, животных с недержанием, инъецированных носителем и животных с недержанием, инъецированных носителем + фрагментами жизнеспособной мышечной ткани. Спустя одну неделю после хирургии, может выполняться обработка каждой группы животных посредством интрауретральной инъекции. После 5 недель может быть измерено LPP 5 или 6 раз в каждой крысе и может быть определено среднее.
ПРИМЕР 3
Описание различных способов введения этой композиции в уретру.
Периуретральный способ инъекции измельченной ткани
. Помещают композицию измельченной ткани, содержащую микрочастицы, в специальный шприц высокого давления, соединенный с иглой 17-го калибра. Медленно вставляют иглу рядом с отверстием уретры и в подслизистые ткани. После установления правильного положения иглы инъецируют эту суспензию в 3 места вокруг уретры: в положения 2 часа, 6 часов и 10 часов. При прогрессировании инъекции уретральный просвет может наблюдаться закрывающимся и затем раскрытие исчезает. Для гарантии успеха визуализируют полное смыкание (т.е. «поцелуйное» смыкание) уретральной слизистой оболочки в конце этой процедуры. Могут быть инъецированы один или два шприца для получения полного закрытия уретры.
Трансуретральный способ
. С использованием специальной иглы инъецируют композицию измельченной ткани под прямым визуальным контролем под уретральную слизистую оболочку. Вставляют цистоскоп в середину уретры. При наблюдении под цистоскопом осторожно вставляют кончик иглы под уретральную слизистую оболочку. Точно помещают измельченную ткань в подслизистые ткани, пока не будет визуализирована полная коаптация (полное сближение) уретральной слизистой оболочки.
Антеградный способ
. Антеградный способ резервируется для самцов, которые имеют недержание мочи после простатэктомии. Создают надлобковый канал при достаточной анестезии. Предпочтительной является общая анестезия. Вставляют цистоскоп в мочевой пузырь через этот надлобковый канал. Находят шейку мочевого пузыря. Под цистоскопическим наблюдением осторожно вставляют кончик иглы под слизистую оболочку шейки мочевого пузыря. Точно помещают препарат измельченной ткани в подслизистые ткани, пока не будет отмечена полная коаптация.
ПРИМЕР 4
3
Недержание мочи у крыс создают посредством валидизированной модели недержания мочи. Биопсии скелетных мышц могут быть собраны из скелетных мышц крыс (например, двухглавой мышцы, трехглавой мышцы и четырехглавой мышцы) и мелко измельчены на фрагменты 0,1-0,4 мм. Эти жизнеспособные фрагменты ткани могут быть объединены с требуемым объемом носителя, такого как забуференный фосфатом солевой раствор (ЗФР) или HBSS, или другого носителя, такого как водный раствор коллагена, водный раствор гиалуроновой кислоты, и микроносителя, такого как поли(гликолевая кислота) (PGA) или поли(молочная кислота) (PLA).
За процессом смешивания следует инъекция в среднюю часть уретры или шейку мочевого пузыря имеющих недержание животных. При базовой линии (фоне) и 3-4 неделях после операции, все животные могут быть подвергнуты уродинамическому тестированию. Уретральная ткань может быть собрана для изометрических исследований с ваннами для органов для тестирования уретральной функции и для иммунохимии.
ПРИМЕР 5
3
Целью является демонстрация того, что у свиней аутологичные фрагменты жизнеспособной мышечной ткани (размером <1 мм) могут быть собраны, смешаны с носителем (ЗФР, HBSS, водным раствором коллагена, водным раствором гиалуроновой кислоты (HA) и инъецированы под контролем с использованием ультразвуковой эхографии (сонографии) в уретру. Кроме того, эта процедура может быть использована для оценивания композиции, описанной здесь, в качестве терапевтического подхода к лечению недержания мочи, в частности стрессового недержания мочи. Пробы скелетных мышц могут быть получены посредством операционной инцизионной биопсии. Приблизительно 100-500 мг мышечной ткани могут быть получены из каждой свиньи. Пробы мелко измельчают на фрагменты < 1 мм. Эти фрагменты жизнеспособной мышечной ткани могут быть объединены с носителем и/или микрочастицами. При помощи трансуретрального ультразвукового зонда и инъекционной системы пробы могут быть инъецированы в рабдосфинктер (образованный поперечнополосатой мышечной тканью) и в уретральную подслизистую основу. Профили уретрального давления могут измеряться до и после инъекции для определения послеоперационных изменений давлений уретрального закрытия. На образцах, полученных из свиней после операции, может также выполняться гистология.
ПРИМЕР 6
Цель: Целью этого эксперимента является оценивание композиций фрагментов жизнеспособной мышечной ткани для лечения стрессового недержания мочи. Эти фрагменты жизнеспособной мышечной ткани были охарактеризованы в отношении размера, жизнеспособности клеток и легкости введения через иглы разного калибра.
Способ
Часть скелетной мышцы крысы, взятую из четырехглавой мышцы (приблизительно 1 г), мелко нарезают скальпелем и затем наносят на сетчатый фильтр для клеток с отверстиями 300 микрометров. Фрагменты жизнеспособной мышечной ткани проталкивают через эту сетку поршнем шприца на 10 мл. Эти фрагменты промывают 30 мл ЗФР и эту суспензию осаждают центрифугированием при 1600 об/мин в течение 5 минут. Осадки ресуспендируют в 500 микролитрах ЗФР и дополнительно характеризуют.
3
3
Распределение среднего размера может находиться в диапазоне 100-300 микрометров (приблизительно 0,1-1 мм). Иногда могут наблюдаться длинные фрагменты (> 1 мм).
Тестируют также легкость инъекции этой композиции через иглы разного калибра. Испытывали три разных размера (G): 18, 21 и 25. Эта суспензия фрагментов ткани будет легко проходить через все иглы даже с размером 25 G. Кроме того, не будет наблюдаться агрегация/закупорка. Пробы композиции анализируют также под микроскопом после каждого прохождения через иглу и не наблюдают никакого нарушения/разрушения этой смеси, что позволяет предполагать, что эти фрагменты ткани испытывали свободное (незакупоренное) течение.
ПРИМЕР 7
Биопсии скелетной мышцы или ткани из соответствующего источника могут быть собраны, как подробно описано в предыдущих примерах. Ткань биопсии может быть измельчена до тонко измельченной пасты для образования фрагментов мышечной ткани. Фрагменты могут быть объединены с требуемым объемом носителя и необязательно с микрочастицами, как подробно описано в предыдущих примерах, и могут быть инъецированы во внутренний или наружный анальные сфинктеры с использованием способов, известных в данной области для лечения недержания фекалий.
ПРИМЕР 8
Биопсии скелетной мышцы или ткани из соответствующего источника могут быть собраны, как подробно описано в предыдущих примерах. Ткань биопсии может быть измельчена до тонко измельченной пасты для образования фрагментов мышечной ткани. Фрагменты могут быть объединены с требуемым объемом носителя и необязательно с микрочастицами, как подробно описано в предыдущих примерах, и с использованием способов, известных в данной области, могут быть инъецированы в нижний кардиоэзофагеальный (кардиальный) сфинктер и/или сфинктер привратника для лечения кислого рефлюкса и других связанных с пищеварительной системой болезней.
ПРИМЕР 9

ueOus
Свежую пробу скелетной мышцы свиньи получали из Farm-to-Farm (Warren, NJ). Пробы измельчали вручную парой скальпелей. Измельченную ткань скелетной мышцы дополнительно фрагментировали проталкиванием через сито из стали с размерами отверстий либо 300 (L3-50, ATM Products) либо 425 (L3-40, ATM Products) микрометров. Этот процесс дополнительно измельчал ткань до более однородного размера. Пробы каждого размера взвешивали и устанавливали при следующих количествах: 10, 20 и 40 микрограммах. Жизнеспособность измельченной ткани определяли анализом MTS (CellTiter 96 AQ One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI), выполняемым в соответствии с протоколом, обеспечиваемым изготовителем. Калибровочную кривую строили также с использованием клеток, выделенных из скелетной мышцы свиньи. Таблица 1 показывает результаты этого анализа.
Таблица 1Результаты анализа MTS, выполненного на различном размере и различных количествах измельченных скелетных мышц свиньи
Размер
Испытанное количество в мкг
Количество клеток
300 мкм
10
24558±3547
20
62929±2306
30
79137±6216
40
105588±2904
425 мкм
10
21087±923
20
63646±1364
30
86824±14785
40
110533±978
МТ
10
22654±948
20
40951±652
30
58339±468
40
74637±978
Как можно видеть, процесс измельчения сохраняет жизнеспособность ткани скелетных мышц. Эта жизнеспособность не изменялась прохождением через металлическое сито для контроля размера измельченных фрагментов.
Жизнеспособность измельченной ткани скелетной мышцы дополнительно оценивали на протяжении времени в сбалансированном солевом растворе Хенкса в качестве носителя (HBSS, Invitrogen, Carlsbad, CA) при 4°C и при комнатной температуре. Исследовали три количества ткани: 5 микрограммов, 10 микрограммов и 20 микрограммов в течение периода времени до 4 часов. Во всех случаях пробы инкубировали либо на льду (4°C), либо при комнатной температуре (RT). Использованным способом был анализ MTS (Promega). Таблица 2 показывает результаты этого эксперимента.
Таблица 2Результаты анализа MTS assay, выполняемого для исследования жизнеспособности измельченной ткани в течение периода времени до 4 часов
Условие
Т = 0 ч
Т = 1 ч
Т = 2 ч
Т = 4 ч
5 мкг RT
16132±970
8330±602
8356±1476
2261±331
10 мкг RT
33384±1182
12088±1297
19680±7331
11462±4296
20 мкг RT
49093±742
28880±1348
25422±2544
11866±6451
5 мкг 4°C
16132±970
16107±1770
12992±2939
5667±1118
10 мкг 4°C
33384±1182
17504±4999
18013±786
16003±1200
20 мкг 4°C
49093±742
22551±12023
28799±1892
29043±3346
Обсуждение
Жизнеспособность ткани уменьшалась со временем. Наилучшую жизнеспособность регистрировали при времени = 0. Однако, только минорные изменения регистрировали между 1 и 2 часами. Слегка лучшую жизнеспособность получали при 4°С.
Вывод
Этот эксперимент ясно показывает, что ткань должна измельчаться быстро, в диапазоне менее 1 часа общей обработки. Жизнеспособность также слегка улучшалась уменьшенной температурой 4°С.
ПРИМЕР 10
+
+
+
Характеристика клеток, выращенных из эксплантатов измельченной мышечной ткани. Свежую пробу скелетной мышцы свиньи получали из Farm-to-Farm (Warren, NJ). Пробы измельчали вручную парой скальпелей. Фрагменты ткани культивировали либо в среде DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA), содержащей 10% ФТС (Hyclone, Logan, UT), пенициллин/стрептомицин (Invitrogen, Carlsbad, CA) либо в среде EGM-2 (Lonza, Walkerville, MD). Клетки, которые были выращены из эксплантатов скелетной мышцы свиньи либо в среде DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA), содержащей 10% ФТС (Hyclone, Logan, UT), пенициллин/стрептомицин (Invitrogen, Carlsbad, CA), либо в среде EGM-2 (Lonza, Walkerville, MD), были фенотипически охарактеризованы окрашиванием антител и анализированы с использованием прибора Guava (Guava Technologies, Inc., Hayward, CA). Миобласты идентифицировали по популяциям CD56 (N-cam, Abcam, Cambridge, MA), а эндотелиальные клетки идентифицировали по двойным положительным популяциям CD34/CD144 (BD Pharmingen, San Jose, CA, eBiosciences, San Diego, CA, соответственно). В качестве контролей использовали полученные из человека скелетную мышцу и эндотелиальные клетки. Таблица, приведенная ниже, суммирует результаты этого эксперимента.
Маркер
Клетки, выращенные в DMEM
Клетки, выращенные в EGM-2
Клетки скелетной мышцы в качестве контроля
Эндотелиальные клетки в качестве контроляОбсуждение
CD34<sup>+</sup>
<1%
<1%
<1%
9%
CD56<sup>+</sup>
97%
21%
75%
<1%
CD144<sup>+</sup>
<1%
<1%
<1%
99%
Как можно видеть из этой таблицы, фенотип клеток, мигрирующих из фрагментов ткани, зависит от культуральной среды. В то время как скелетные миобласты составляли 97% популяции клеток, выращенных из эксплантатов в среде DMEM, содержащей 10% ФТС, которая является обычно средой для выращивания, предназначенной для миобластов, этот процент миобластов уменьшался до 21% в среде EGM-2. Поскольку остальные 79% клеток не окрашивались красителем, положительным для эндотелиальных маркеров, авторы постулировали, что остальные клетки являются фибробластами. Похожие популяции клеток были получены Hannes Strasser et al., а также другими исследователями, которые продемонстрировали, что как миобласты, так и фибробласты являются двумя основными типами клеток в ткани скелетных мышц (Lancet 2007, 369:2179-86).
Вывод
В культуре клеток in vitro авторы изобретения определили, что по меньшей мере некоторые из клеток, которые вырастали из фрагментов измельченной мышечной ткани, были миобластами, однако эти результаты зависят от среды. Присутствие миобластов в измельченной ткани является выгодным для регенеративной терапии для лечения SUI.
ПРИМЕР 11
Выделение свиных уретральных клеток
Свиные мочеиспускательные каналы (уретры) получали из Farm-to-Pharm (Warren, NJ). Уретры очищали от жира и соединительной ткани и мелко измельчали парой скальпелей. Массу ткани регистрировали (13,1 г) и ткань помещали в коническую пробирку на 50 мл в смеси (коктейле) пищеварительных ферментов (см. ниже) в DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% ФТС (Hyclone, Logan, UT), содержащей пенициллин/стрептомицин (Invitrogen, Carlsbad, CA).
6
2
Эту пробирку обертывали парафильмом (Parafilm M) для герметизации. Пробирку переносили в термостат на 37°С, встряхивающийся при 225 об/мин в течение 2 часов. Полноту переваривания проверяли каждый час во время инкубации выниманием пробирки из термостата и стоянием этой пробирки вертикально в течение 1-2 минут. Когда переваривание было полным (не более 2 часов), пробирку ставили вертикально и выдерживали в течение 1-2 минут для осаждения больших фрагментов. Эту суспензию клеток переносили в новую коническую пробирку и разбавляли свежей средой DMEM, содержащей 10% ФТС, пенициллин/стрептомицин. Суспензию клеток центрифугировали при 150 × g в течение 5 минут и супернатант аспирировали. Добавляли свежую среду (до 50 мл в общем объеме) и ресуспендировали. Суспензию клеток центрифугировали и супернатант удаляли. Добавляли свежую среду (до 30 мл в общем объеме) и клетки ресуспендировали с использованием пипетки пипетированием вверх и вниз. Ресуспендированный осадок клеток фильтровали через фильтр 100 мкм. Суспензию клеток центрифугировали при 150 × g в течение 5 минут, супернатант аспирировали и осадок клеток ресуспендировали в ЗФР. Клетки считали счетчиком клеток GUAVA (Guava Technologies, Inc, Hayward, CA). Получали всего ~6×10 клеток. Клетки высевали в EGM-2 (Lonza, Walkersville, MD) при 5000 клеток/см и помещали в термостат при 37°С.
Пищеварительные ферменты
Коллагеназа 0,25 Е/мл (Serva Electrophoresis, GmbH, Heidelberg, Germany), 2,5 Е/мл диспаза (Dispase II 165859, Ruche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) и 1 Е/мл гиалуронидаза (Vitrase, ISTA Pharmaceuticals, Irvine, CA).
Анализ пролиферации
Для оценивания действия свиной измельченной мышечной ткани на пролиферацию клеток, выделенных из свиной уретры, клетки уретры (выделенные в соответствии с вышеописанным способом) высевали на 24-луночные чашки при плотности 10000 клеток на лунку. Экспериментальные условия были следующими:
- Низкая сыворотка (20% сред для выращивания),
- Низкая сыворотка (20% сред для выращивания) + различные количества измельченной ткани (500, 250 или 50 микрограммов на лунку).
Измельченную ткань добавляли внутрь транс-лунок (размер пор 0,4 микрон). Испытывали два типа сред - EGM-2 и DMEM/EGM-2 (50/50, об./об.). При 2, 3 и 7 днях клетки собирали для получения количества и жизнеспособности клеток при помощи прибора Guava.
Результаты
:
EGM-2
2 день
3 день
7 день
контроль
7655±370
5754±1772
2167±2254
MT 500
9293±107
8261±1192
8119±5741
MT 250
11800±854
10656±1282
3672±2393
MT 50
10324±2009
8569±2088
3795±4485
DMEM/EGM-2
2 день
3 день
7 день
контроль
17444±1947
20786±4198
123±87
MT 500
17972±4265
26062±1331
795±355
MT 250
19168±4644
30875±3289
568±334
MT 50
15166±3688
25818±4422
331±43
Обсуждение
Клетки, выделенные из уретры свиньи, проявляли более быстрые скорости пролиферации после двух и трех дней сокультирования с измельченной мышечной тканью, чем при инкубации в базальной среде. Скорость пролиферации зависела от базальной среды, однако наблюдалось явное действие измельченной мышечной ткани на дополнительную скорость пролиферации клеток, выделенных из уретры свиньи. Это действие было наиболее сильно выражено при 3 днях культуры, после чего оно уменьшалось, преимущественно вследствие отсутствия свежих нутриентов и присутствия отработанных продуктов культуры. Наивысшее действие было замечено с 250 мкг на лунку измельченной мышечной ткани, которая давала 77%-ное и 93%-ное увеличение скорости пролиферации полученных из уретры клеток после 2 и 3 дней, соответственно, в EGM-2 и 74%-ное увеличение скорости пролиферации полученных из уретры клеток после 3 дней в среде DMEM/EGM-2.
Вывод
Представленные выше данные ясно показывают, что фрагменты измельченной мышечной ткани оказывают положительное действие in vitro на скорость пролиферации полученных из свиной уретры клеток. Это позволяет предположить, что, по меньшей мере частично, механизмом действия этих клеток, ответственных за восстановление давления точки подтекания (LPP) у крыс с недержанием мочи (представленное в примере 1), является увеличение здоровых клеток и, следовательно, регенерация уретральной ткани. Это также позволяет предположить, что их терапевтическим действием является не просто действие создания объема, а скорее трофическое действие, которое ускоряет bona fide долгосрочную регенеративную реакцию.
ПРИМЕР 12
Введение
Целью этого исследования было определение безопасности этого тест-изделия, а также регистрации функциональных изменений в уродинамике и гистологических изменений в уретре самок свиней, индуцированных инъекцией полученных из аутологичной ткани продуктов в мышечную стенку, окружающую просвет уретры, до периода трех месяцев после инъекции в здорового животного.
Это исследование выполняли в соответствии с нормами Food and Drug Administration Good Laboratory Practice Regulations, Title 21 of the U.S. Code of Federal Regulations, Part 58, issued December 22, 1978 (со всеми прилагаемыми пересмотрами). Все изменения или пересмотры в отношении одобренного протокола сохранены с исходным протоколом в файле исследования.
Схема эксперимента
Семь животных (плюс одно запасное животное) исследовали на протяжении максимально 3 месяцев ± 5 дней после обработки. Процедуру предобработки выполняли минимально за 7 дней до обработки. Животным в обеих группах имплантировали постоянные катетеры для мочевого пузыря (день ≥7). Запасное животное было исключением. Введения доз в виде инъекций в день 0: тестируемые животные получали полученные из аутологичной ткани продукты, генерированные из донации мышцы. Контрольные животные получали инъекции изделия-носителя (сбалансированного солевого раствора Хенкса-HBSS-Invitrogen). Животных в тест-группе подвергали мышечной биопсии из каждой задней конечности. Эксплантированную ткань обрабатывали на месте для генерирования тест-изделия, используемого для инъекции обработки. Животные восстанавливались и выживали в течение периода приблизительно 3 месяцев. Уродинамическое оценивание мочевого пузыря выполняли при указанных интервалах времени при предобработке, в день 21, 29, 57 и 94 после обработки. Уродинамическое тестирование включало измерения давления точки подтекания (LPP) и профиля уретрального давления (UPP). Всех животных эвтанизировали при ~3 месяцах после обработки и мочевые пути подвергали микроскопическому оцениванию.
Карантин
Всех животных, полученных в лаборатории, подвергали физическому обследованию перед выпуском из карантина в день 6. Наблюдаемые морфология и поведение были в пределах нормы, и ветеринар лаборатории выпускал животных без ограничения условий.
Обработка
Мышечная биопсия
: Мышечную биопсию для приготовления тест-изделия выполняли с использованием иглы 8 мм для трепанобиопсии.
Приготовление тест-изделия и приготовление носителя:
3
Носителем, используемым для этого исследования был сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS, Invitrogen, Carlsbad, CA). Тест-изделие готовили следующим образом. Выполняли биопсию мышцы и получали 500-700 мг ткани. Эту ткань очищали от жира и мелко измельчали парой скальпелей. Ткань хранили во влажном виде во время этого процесса с использованием небольшого количества HBSS. После измельчения ткань помещали в фильтр с металлической сеткой с размерами отверстий 425 микрометров (L3-40, ATM Products) и дополнительно фрагментировали проталкиванием с использованием поршня шприца (5 см). Брали пробу и ресуспендировали ее в HBSS (1,5 мл общего объема).
Процедура обработки
:
Доставку тест-изделия и контрольного изделия проводили под анестезией при уретральном отверстии. Процедуру обработки во всех животных изменяли для согласования инъекционных объемов с доступной зоной обработки. Инъекции выполняли по окружности (6-8 инъекций на участок) в 4 разных местах вдоль уретры между каудальной и средней третью от шейки мочевого пузыря с цистоскопическим наблюдением.
Тестирование давления точки подтекания
Величины LPP получали с использованием датчика давления AD Instruments и анализировали с использованием компьютерной программы Power Lab Chart™. Результаты преобразовывали и сводили в таблицу (таблица 3). LPP в день 0 для всех подсоединенных к порту животных выполняли с использованием постоянного катетера для мочевого пузыря. Поскольку измерения UPP должны были выполняться в то же самое время, этот порт в конечном счете не использовали в будущих измерениях LPP.
Тестирование максимального уретрального давления
Величины UPP получали с использованием датчика давления AD Instruments и анализировали с использованием компьютерной программы Power Lab Chart™. Затем рассчитывали MUCP в соответствии со стандартными способами. Результаты преобразовывали и сводили в таблицу (таблица 3).
Аутопсия/взятие ткани/гистопатология
:
Спустя три месяца, животных эвтанизировали и подвергали ограниченной аутопсии и ограниченному взятию ткани, состоящей из всех мочевых путей. При аутопсии собирали уретру, мочевой пузырь, мочеточники и почки. Уретры фиксировали 10% забуференным нейтрально формалином под давлением в течение периода приблизительно 24 часов. После фиксации ткани передавали в Vet Path Services, Inc. (VPS) для гистологической обработки и гистопатологического обследования. Уретру очищали, заливали в парафин и делали срезы.
Микротомные срезы получали при интервалах 2,5 мм вдоль всей уретры, начиная при шейке мочевого пузыря, и окрашивали красителями гематоксилином и эозином и трихромом Массона. Уретральные измерения выполняли на окрашенных трихромом Масона предметных стеклах. Измерения получали гистоморфометрией анализа изображения. Получали общую толщину уретры, толщину гладкой мышцы и слоев скелетных мышц. Толщину соединительной ткани получали вычитанием объединенной толщины слоев гладких и скелетных мышц из общей толщины уретры.
Результаты
Уродинамическое тестирование
Результаты тестирования LPP и mUCP приведены в таблице 3.
Таблица 3Результаты тестирования LPP и mUCP для каждого животного в этом исследовании
Номер животного
Группа
День
LPP мм Hg
MUCP мм Hg
1
носитель
0
14,5
39,3
21
32,2
56,9
29
12,8
52,8
57
31,3
126,0
94
32,6
79,8
2
носитель
0
27,6
29,0
21
21,5
44,9
29
20,7
62,5
57
38,1
68,0
94
31,0
101,2
3
тест-изделие
0
27,9
40,9
21
21,6
145,5
29
38,4
59,3
57
51,9
71,7
94
41,8
127,9
4
тест-изделие
0
31,5
61,4
21
29,4
71,6
30
29,2
47,2
58
23,4
47,9
96
27,1
58,9
5
тест-изделие
0
не анал.
49,2
21
61,1
144,3
29
не анал.
67,0
57
16,1
90,4
94
25,5
101,7
6
тест-изделие
0
41,8
95,0
20
37,4
60,9
28
25,5
66,5
54
54,2
33,8
не анал.
не анал.
не анал.
7
тест-изделие
0
35,9
39,9
20
92,5
107,2
28
26,7
75,6
56
23,7
51,8
93
16,4
74,6
Не наблюдали различий LPP между контрольными и получающими тест-изделие животными. Однако результаты предполагают, что наблюдалось значимое увеличение (>250%) максимального давления уретрального закрытия (mUCP) в день 21 в 3/5 животных с тест-изделием. По мере прогрессирования времени эти величины mUCP выравнивались с величинами mUCP контрольных животных (см. таблицу 3). Обратите внимание на то, что тест-животное 6 должно было быть эвтанизировано перед днем 93 вследствие постороннего повреждения.
Гистологические наблюдения
Контрольные животные, получающие носитель
: Минимальную - умеренную эпителиальную гиперплазию (2/2) и отсутствие минимального хронического активного и эрозивного воспаления (1/2) наблюдали в уротелии контрольных животных. Минимальное или умеренное подострое воспаление наблюдали в эпителии и собственной пластинке (lamina propria) слизистой оболочки обоих контрольных животных. Не наблюдали ни умеренных кист (1/2), ни отека (2/2), ни минимального кровотечения (2/2), ни подобных лимфатическим узлам агрегатов (2/2) в lamina propria контрольных животных. Не наблюдали минимального подострого воспаления в сосудистой оболочке (1/2) контрольных животных. Средний балл эпителиальной гиперплазии был равен 1,3, балл хронического активного и эрозивного воспаления был равен 0,1, балл подострого воспаления был равен 1,7, балл кист был равен 0,2, балл отека был равен 0,8, балл кровотечения был равен 0,5 и балл лимфоидных агрегатов был равен 0,6. Средний балл подострого воспаления в мышечной пластинке слизистой оболочки был равен 0,1.
Тест-животные
: Не наблюдали умеренной эпителиальной гиперплазии в уретральном уротелии 5 из 6 (5/6) тест-животных. Минимальное или умеренное подострое воспаление наблюдали в эпителии и lamina propria 6 из 6 (6/6) тест-животных. Не наблюдали умеренных кист (2/6) и отека (6/6) и минимального кровотечения (5/6) и подобных лимфоидным узлам агрегатов (6/6) в lamina propria тест-животных. Не наблюдали минимального подострого воспаления в мышечной оболочке 4/6 тест-животных. Средний балл эпителиальной гиперплазии был равен 0,6, балл подострого воспаления в эпителии и lamina propria был равен 1,3, балл кист был равен 1,1, балл отека был равен 0,9, балл кровотечения был равен 0,2 и балл лимфоидных агрегатов был равен 0,4. Средний балл подострого воспаления в мышечной пластинке слизистой оболочки был равен 0,1.
Гистоморфометрия анализа изображения
Контрольные животные, получающие носитель
: В контрольных животных, получающих носитель, средняя общая толщина уретры была равна 1,4, средняя толщина гладкой мышцы была равна 0,7, средняя толщина скелетной мышцы была равна 0,0 и средняя толщина соединительной ткани была равна 0,8. Гладкая мышца представляла 47% толщины уретры, а поперечно-полосатая мышца представляла 0% толщины уретры.
Тест-животные
: В тест-животных средняя общая толщина уретры была равна 1,7, средняя толщина гладкой мышцы была равна 0,8, средняя толщина скелетной мышцы была равна 0,1 и средняя толщина соединительной ткани была равна 0,9. Гладкая мышца представляла 45,0% толщины уретры, а поперечно-полосатая мышца представляла 3,2% толщины уретры.
Обсуждение
Во временной точке 21 день можно было наблюдать явное увеличение максимальных давлений закрытия уретры (mUCP) в 3 из 5 животных, получавших тест-изделие. Два остальных животных не реагировали на инъекции подобным образом по неизвестным причинам. В дни 28, 57 и 94 наблюдали последующее уменьшение mUCP. Точный механизм, приводящий к уменьшению UPP, является невыясненным. Действительно, авторы не наблюдали фиброза (разрастания соединительной ткани) или воспаления. Возможно, то, что в этих животных не создавалось повреждение, влияло на эти результаты. Интегрирование поврежденной ткани в ткань уретры в группе с тест-изделием и образование новых мышечных волокон наблюдали в стандартном гистологическом исследовании. Другим важным моментом гистологического оценивания является то, что не удалось детектировать признаков инфекции, воспаления или фиброза в этих образцах. Кроме того, не было доказательства образования «скоплений» новой ткани или депо ткани, приводящих к сжатию или закупорке уретрального просвета. Таким образом, послеоперативное действие не было вызвано простой закупоркой или сжатием уретры.
Выводы
Имелось существенное (>250%) увеличение mUCP в 3 из 5 (3/5) животных группы с тест-изделием в день 21 после обработки. Не было доказательства какого-либо индуцированного обработкой локального раздражения при испытании уретр. Изменения уретр были относительно сходными среди тест-животных и контрольных, получающих носитель животных. Тяжесть эпителиальной гиперплазии и подострого воспаления в эпителии и lamina propria была слегка более низкой в тест-уретрах в сравнении с контрольными уретрами. Хроническое активное и эрозивное воспаление наблюдали только в уретрах контрольных групп с носителем. В тест-уретрах поперечно-полосатая мышца представляла 3,2% толщины уретры, но в контрольных уретрах с носителем не наблюдали присутствия поперечно-полосатой мышцы. Исследования безопасности этих измельченных мышечных фрагментов показали, что значимо вредных побочных действий не было. Существенное (>250%) увеличение mUCP в день 21, а также результат, касающийся поперечно-полосатых мышц, указывают на то, что измельченная мышечная ткань применима в лечении стрессового недержания мочи (SUI).