Генетический полиморфизм глутатион-S-трансфераз при немелкоклеточном раке легкого

Генетический полиморфизм глутатион^-трансфераз при немелкоклеточном раке легкого

Резюме. В работе представлены результаты сопоставления полиморфных вариантов генов GSTM1, GSTT1, GSTP1 и клинических проявлений немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), позволяющие прогнозировать характер заболевания. Обнаружена ассоциация генотипа GSTTI(del) с риском развития плоскоклеточного рака легкого (ОШ=2,54,95% ДИ 1,13-5,72; р=0,035). Анализ выживаемости пациентов (n=173) показал, что в группе с плоскоклеточным типом патологии (n=91) у лиц с генотипом GSTT1(del) медиана выживаемости оказалась достоверно выше - 84 мес. (95% ДИ 12,4-155,7), чем улиц с генотипом GSTT1(+) - 36 мес. (95% ДИ 25,2-46,8), р=0,045. В группе с аденокарциномой (n=82) медиана выживаемости у лиц с генотипом GSTT1(del) составила 19 мес. (95% ДИ 6,2-33,5), с генотипом GSTT1(+) - 67 мес. (95% ДИ 50,1-84,0). Гипотетически эти различия могут быть обусловлены гендерной принадлежностью носителей НМРЛ, в частности участием ферментов GST в метаболизме эстрогенов при аденокарциноме у женщин, иным гормональным фоном, а также реактивностью мужского организма при плоскоклеточном раке легкого.

Ключевые слова: плоскоклеточный рак легкого, аденокарцинома, глутатион-S-трансферазы, выживаемость, генетический полиморфизм, ферменты GST.

Рак легкого - наиболее распространенное из злокачественных новообразований, имеющее самый неблагоприятный прогноз. В Республике Беларусь в 2016 г. было зарегистрировано более 4 тыс. новых случаев карциномы легкого, что составило 10,4% от общей онкологической заболеваемости. Несмотря на качественный прогресс медицинских технологий, смертность от этой патологии сохраняется на катастрофически высоком уровне (85% от числа заболевших). Показатель одногодичной летальности в 2016 г. составил 54,9% [1].

Агрессивность течения обусловлена преимущественно поздней диагностикой и высоким метастатическим потенциалом опухоли.

Риск развития немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) существенно возрастает у курящих лиц, особенно в условиях загрязнения вдыхаемого атмосферного воздуха канцерогенными веществами, способными вызывать серьезные нарушения в генетическом аппарате человека. Ведущими причинами формирования опухоли считаются воздействие повреждающих факторов внешней среды и нарушения в системе поддержания стабильности клеточного генома [2, 3]. В силу то-

го, что альвеолы и воздухоносные пути находятся на границе раздела двух сред - внутренней среды организма и внешней, они постоянно оказываются подверженными неблагоприятному влиянию вредных веществ, загрязняющих атмосферный воздух. Эффективное противодействие различным ксенобиотикам, поступающим в организм человека, осуществляется системой согласованно функционирующих ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК). С точки зрения современной биологии и медицины, именно от метаболического статуса зависит риск развития, характер течения и резуль-

тативность лечения злокачественных новообразований, и поэтому наиболее перспективный объект исследования предрасположенности к раку легкого - полиморфные варианты генов ФБК, экспрессия которых, в отличие от других классов генов, непосредственно регулируется влияниями средовых факторов химической природы [4, 5].

Глутатион-Б-трансферазы -мультигенное семейство ферментов, катализирующих химические взаимодействия восстановленного глутатиона (GSH) с широким спектром электрофильных соединений. Кроме того, в качестве белков GST способны модулировать сигнальные пути, которые контролируют пролиферацию и дифференциров-ку клеток, апоптоз и другие процессы, непосредственно вовлеченные в канцерогенез. GSTT1, GSTM1 и GSTP1 - наиболее важные ферменты семейства GST [6, 7].

Полиморфизм генов GSTT1 и GSTM1 характеризуется частичной или полной делецией в кодирующей области, из-за чего в организме человека может отсутствовать соответствующий фермент. Однонуклео-тидный полиморфизм в гене GSTP1 c.313A>G (rs1695; Ile105Val) сопровождается уменьшением детокси-кационной способности фермента.

Показано, что GST, принадлежащие к различным классам, могут обладать перекрывающейся субстратной специфичностью. Это свойство, наряду с генетическим полиморфизмом, обусловливает неодинаковую восприимчивость к факторам риска окружающей среды у людей и индивидуальную чувствительность к генотоксическим агентам. В некоторых эпидемиологических исследованиях доказывается, что полиморфизмы GST вли-

яют на предрасположенность к возникновению рака легкого, а у носителей генотипов ОБТМ1(йе1) или ОБТТ1(йе1) риск развития рака легкого выше в сравнении с обладателями по меньшей мере одного функционального аллеля [8-10]. В немногих публикациях сообщается об ассоциации между полиморфизмом в С5Т-генах, прогнозом и ответом на химиотерапию у пациентов с НМРЛ [11, 12]. Однако большинство выводов неубедительно и противоречиво,что может объясняться популяционны-ми различиями в генотипической структуре, а также нарушениями принципов формирования выборок пациентов.

В данной работе представлены результаты исследования ассоциаций полиморфных вариантов генов ОБТМи ОБТТи ОБТР1 с основными морфологическими типами, степенью распространения опухоли и прогнозом при НМРЛ.

В исследование вошли 173 пациента с диагнозом «немелкоклеточ-ный рак легкого» (плоскоклеточный рак и аденокарцинома), находившиеся на лечении в Минском городском клиническом онкологическом диспансере с 2005 по 2015 г., постоянно проживающие на территории Республики Беларусь.

Гистологический тип рака и стадия болезни устанавливались по морфологическим критериям интраоперационной биопсии в процессе хирургического лечения или биопсии опухоли. Использовались Международная классификация ТММ/рТММ (7-е изд., 2009) и Международная гистологическая классификация опухолей легкого (2004).

Пациенты были оценены по следующим критериям: наличие или отсутствие основных клинических

симптомов рака легкого, возраст на момент возникновения заболевания, сопутствующая патология, статус курения, данные клинических и специальных методов исследования, характеристика первичной опухоли и степень ее распространения, морфология опухоли, подписанное информированное согласие для участия в исследовании. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности по результатам анкетирования, с разрешения Комитета по биомедицинской этике Белорусского государственного медицинского университета.

В исследование не включали пациентов с мелкоклеточным раком легкого и с первично-множественным характером опухолевого процесса.

Выделение тотальной ДНК из периферической крови выполняли по Matthew [13], с последующей фенол-хлороформной экстракцией и очисткой этанолом. Геноти-пирование полиморфизмов GSTT и GSTM осуществляли методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР), полиморфизма GSTP - методом ПЦР с последующим анализом длин рестрикцион-ных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). Затем образцы ДНК визуализировали в УФ-свете. В работе использовали праймеры ОДО «Праймтех» (Минск), реагенты - Thermo Fisher Scientific (Вильнюс).

Статистические расчеты проводили с помощью прикладных программ GraphPad InStat 3.05, SPSS Statistics 17.0 и пакета анализа данных Microsoft Excel. Для проверки достоверности при сравнении частот генотипов в группах применяли стандартный критерий х2 Пирсона или точный критерий

Характеристика Полиморфизм йВТТ1 Полиморфизм ОЗТМ1

НМРЛ GSTM1

Гистология

Плоскоклеточный рак 67

Аденокарцинома 72

ОШ (95% ДИ) p-value 1,00 2, 54 (1,13-5,72) 0,035 1,00 0,71 (0,39-1,31) 0,34

Пол пациента

мужской 102

женский 37

ОШ (95% ДИ) p-value 1,00 3,75 (1,08-12,99) 0,047 1,00 1,26 (0,62-2,57) 0,64

Статус курения

Курит 87

Не курит 44

ОШ (95%ДИ) p-value 1,00 1,50 (0,62-3,62) 0,36 1,00 1,05 (0,54-2,05) 0,98

Стадия НМРЛ

I-II 87

III-IV 52

ОШ (95% ДИ) p-value 1,00 1,43 (0,66-3,09) 0,36 1,00 0,69 (0,37-1,30) 0,25

Примечание: Здесь и в табл. 2 значение р скорректировано с учетом пола, возраста, статуса курения.

Таблица 1. Ассоциации между генетическим полиморфизмом в5ТМ1, в5ТТ1 и клиническими характеристиками НМРЛ, абс.

Фишера для маленьких выборок. Связь между генотипами и характеристиками заболевания оценивали по отношению шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (95% ДИ); с кодоминантной и доминантной моделями 8МР81а1Б. Под общей выживаемостью подразумевали время от момента операции до даты смерти. Выживание оценивали методом Каплана - Мейера и сравнивали с помощью лог-рангового теста. Прогностические факторы определяли с использованием модели пропорциональных рисков Кокса. Переменные с р<0,10 после однофакторного анализа вводили в многофакторный анализ с исполь-

зованием регрессии Кокса. Коэффициент опасности (ИЯ) и 95% ДИ рассчитывали для каждого фактора, р<0,05 свидетельствовало о статистической значимости.

Характеристика пациентов группы наблюдения (п=173). Средний возраст -62±0,73 года. Пол: женский - 40 чел. (23,1%), мужской -133 (76,9%). Курение: постоянно курили - 112 чел. (64,7%), факт курения отрицался или был спорадическим - 52 (30,1%), неизвестно - 9 чел. (5,2%). Этническая принадлежность - славяне.

Стадии заболевания: I - 81 чел. (46,8%), II - 25 (14,5%), III - 54 (31,2%), IV - 13 (7,5%).

Гистологические формы НМРЛ: плоскоклеточный рак - 91 чел. (52,6%), 92,3% - мужчины; аденокар-цинома - 82 чел. (47,4%), в том числе 59,8% - мужчины, 40,2% - женщины.

Хирургическое лечение: лобэк-томия/билобэктомия проведена у 106 чел. (61,1%), пневмонэкто-мия - у 36 (20,8%), резекция легкого - у 12 (6,9%). Биопсия выполнялась у 8 чел. (4,65%). Операция не проводилась (в связи с низкими резервными показателями или распространением опухолевого процесса) у 11 чел. (6,1%); в этих случаях диагноз устанавливался на основании инцизионной биопсии опухоли при трахеобронхоскопии.

Генотип ОБТТ1(+) обнаруживался в пять раз чаще, чем генотип ОБТТ1(йе1): 139 чел. (80,4%) и 34 (19,6%) соответственно. Генотипы ОБТМ1(+) и ОБТМ1(йе1) распределились практически поровну: 79 чел. (45,7%) и 94 (54,3%) соответственно. Минорный генотип ОБТР1(ОО) - 17 чел. (9,8%), ОБТР(ЛЛ) - 88 (50,9%), ОБТР1(ОЛ) - 68 (39,3%).

На первом этапе работы проведено сопоставление генетических полиморфизмов ОБТМ1, ОБТТ1, ОБТР1 с клиническими характеристиками НМРЛ (табл. 1, 2).

Среди носителей генотипа ОБТТ1^е1) количественно преобладал диагноз «плоскоклеточный рак» - 23 пациента, аденокарцино-ма была у 10 чел. Установлена ассоциация генотипа ОБТТ1(йе\) с риском развития именно плоскоклеточного рака легкого (ОШ 2,54; 95% ДИ 1,13-5,72; р=0,035). У мужчин в три раза чаще встречался генотип ОБТТ1(йе1) (ОШ 3,75; 95% ДИ 1,0812,99; р=0,047). У курящих пациентов реже, чем у некурящих, выявлялся генотип ОБТР1(ОО) (ОШ 0,28; 95% ДИ 0,08-0,94; р=0,043).

В ходе исследования был проведен анализ выживаемости пациентов в зависимости от клинических показателей и полиморфных вариантов генов ОБТ.

Установлено, что определяющим фактором результата лечения была стадия заболевания. Одногодичная (12 мес.) общая выживаемость при I стадии НМРЛ составила 91%, II - 70%, III - 45% и IV - 14%. Трехлетняя выживаемость: I стадия - 74%, II - 37%, III - 28%; пятилетняя: 60%, 16% и 14% соответственно (рис. 1).

Анализ пропорциональных рисков Кокса показал, что пациенты с Ш-^ стадиями НМРЛ имеют худший прогноз в отношении выживаемости, чем с I—II (НЯ=1,60; 95% ДИ 1,30-1,95; р<0,0001). Достоверной зависимости общей выживаемости от полиморфных вариантов генов ОБТ и от гистологического типа рака легких в целом в группе исследования не выявлено (табл. 3).

На следующем этапе работы было установлено, что в группе с диагнозом «плоскоклеточный рак легкого» у пациентов с генотипом ОSTТ1(del) медиана выживаемости достоверно выше - 84 мес. (95% ДИ 12,4-155,7), чем у пациентов с генотипом GSTТ1(+) - 36 мес. (95% ДИ 25,2-46,8), р=0,045 (рис. 2). В группе с диагнозом «аденокарцинома», напротив, медиана выживаемости у пациентов с генотипом ОSTТ1(del) составила 19 мес. (95% ДИ 6,2-33,5), с генотипом ОSTТ1(+) - 67 мес. (95% ДИ 50,1-84,0).

Поскольку ферменты ОБТ участвуют в детоксикации вдыхаемых опасных и канцерогенных элек-трофильных соединений, генетические полиморфизмы этих ферментов являются потенциальными факторами предрасположенности

Характеристика Полиморфизм й5ТР1

НМРЛ GG GA+GG

Гистология

Плоскоклеточный рак 47

Аденокарцинома 41

ОШ (95% ДИ) p-value 1,00 1,11 (0,60-2,06) 0,86 0,59 (0,21-1,63) 0,44 0,91 (0,50-1,67) 0,89

Пол пациента

мужской 66

женский 22

ОШ (95% ДИ) p-value 1,00 1,52 (0,69-3,36) 0,18 0,62 (0,21-1,88) 0,25 1,22 (0,60-2,49) 0,58

Статус курения

Курит 61

Не курит 22

ОШ (95% ДИ) p-value 1,00 0,70 (0,31-1,55) 0,96 0,28 (0,08-0,94) 0,043 0,61 (0,31-1,19) 0,20

Стадия НМРЛ

I-II 50

III-IV 38

ОШ (95% ДИ) p-value 1,00 0,82 (0,43-1,59) 0,94 0,29 (0,08-1,08) 0,053 0,69 (0,37-1,28) 0,24

Таблица 2. Ассоциация между генетическим полиморфизмом в5ТР1 и клиническими характеристиками НМРЛ, абс.

Функции дожития

Продолжительность наблюдения (мес.) заболевания

Выживаемость, , ,

„ Кол-во Кол-во p log-rank ____

Показатель медиана, ;* HR (95% ДИ) p value

умерших живых _____test

' к мес.

Стадия НМРЛ

I-II 44 (41,5%) 62 (58,5%) 84,0 (45,6-122,5) <0,0001 1,00 <0,0001

III-IV 44

Гистология

плоскоклеточный рак 53 (58,2%) 38 (41,8%) 39,6 (24,5-54,7) 0,079 1,00 0,86

аденокарци-нома 35

Пол пациента

женский 9 (22,5%) 31 (77,5%) 108,5 (87,2-129,8) <0,0001 1,00 0,007

мужской 79

GSTT1

GSTTI(del) 16 (47,1%) 18 (52,9%) 49,8 (0,2-105,1) 0, 60 1,00 0,18

GSTT1

GSTM1

GSTMI(del) 47 (50,0%) 47 (50,0%) 51,6 (30,5-72,8) 0,72 1,00 0,09

GSTM1

GSTP1

AA 43 (48,9%) 45 (51,1%) 52,1 (25,5-78,7) 1,00

GA 38 (55,9%) 30 (44,1%) 40,9 (20,4-61,4) 0,43 1,10 (0,48-2,48) 0,97

GG 7

Таблица3. Влияние клинических характеристик и генетического полиморфизма в5ТМ1, в5ТТ1, в5ТР1 на общую выживаемость пациентов с НМРЛ, абс.

к раку легкого [5, 14]. Существует субстратная специфичность различных GST. GSTM1 метаболизи-рует большие гидрофобные электрофилы, такие как полицикличе-

ские ароматические углеводородные эпоксиды [6, 15]. ОБТТ1 участвует в реакциях с более мелкими соединениями, такими как монога-лометан и этиленоксид [16]. ОБТР1

играет важную роль в разрушении эпоксида диола бензо(а)пирена. Каталитическая активность GST обеспечивает клетку механизмом защиты от вредного воздействия этих веществ.

Результаты многочисленных исследований роли полиморфизмов GST-генов в возникновении рака легкого определяют GSTM1 и GSTT1 как гены с низкой пенетрантностью, ассоциированные с увеличением риска развития рака легкого от 15 до 21%. Так, Pan et al. [17] на азиатской популяции доказали, что риск рака легкого повышает носитель-ство делеций GSTT1 (ОШ 1,57; 95% ДИ 1,23-2,00) и GSTM1 (ОШ 1,87; 95% ДИ 1,46-2,39), р<0,01. Также ими обнаружено, что делеция гена GSTT1 связана с риском патологии у мужчин (ОШ 2,95; 95% ДИ 2,07-4,20, р<0,01), а делеция гена GSTM1 - у женщин (ОШ 2,95; 95% ДИ 2,07-4,20,р <0,01) [17].

В исследовании EAGLE, проведенном на европейской популяции, установлено, что снижение активности ферментов GSTM1 и GSTT1

и о

Функции дожития

ii IÂ1

4, L

\4

V L_

S L

f> Kig rari

1

Функции дожития

GSTT1

nçjnrçuq J "iSïT:.« _. cstti. №

, ятг.-;

ОД ЯС 1QCQ № ÎÎÛ

Продолжительность наблюдения

ПИ КцО JujU к» -t)C liOUi 1M.il 4L J

Продолжительность наблюдения

Рис. 2. Графики выживаемости по Каплану - Мейеру пациентов с плоскоклеточным раком (А) и аденокарциномой (Б) при GSTT1

у курящих мужчин повышает риск рака легких, а у некурящих женщин является защитным фактором. Также показана связь генотипа GSTTl(del) с повышенным риском возникновения плоскоклеточного рака легкого. Эти данные авторы связывают с тендерными различиями: плоскоклеточный рак легкого чаще встречается у курящих мужчин, а адено-карцинома - у некурящих женщин [9].

Тендерными различиями носителей гистологических типов НМРЛ можно объяснить особенности генетического полиморфизма GSTT1, что актуально для прогнозирования выживаемости. В пользу такого заключения говорят также данные об участии GSTM1 и GSTT1 в метаболизме эстрадиола и дезактивации/элиминации метаболитов, полученных из эстрогена [18, 19].

Таким образом, в проведенном нами исследовании показано, что носители гомозиготной делеции GSTT1 достоверно чаще встречаются среди пациентов с плоскоклеточным раком легкого. Установлены разнонаправленные проявления полиморфизма GSTT у пациентов с аденокарциномой и плоскоклеточным раком, что ассоциируется с различной выживаемостью. Полученные данные позволяют предположить, что причиной этих различий является вовлечение ферментов GST в метаболизм эстрогенов при аденокарциноме у женщин и иные метаболические приоритеты ферментов GST в организме мужчин при плоскоклеточном раке. Дальнейшие исследования и последующий анализ результатов будут направлены на детализацию этого заключения.

Статья поступила в редакцию 08.05.2018 г.

Михаил Шепетько,

доцент кафедры онкологии Белорусского государственного медицинского университета, кандидат медицинских наук; shepetjko@gmail.com Эвелина Крупнова,

ведущий научный сотрудник лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии НАН Беларуси, кандидат биологических наук, доцент Елена Михаленко,

ведущий научный сотрудник лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии НАН Беларуси, кандидат биологических наук; michalenko75@mail.ru

Наталья Чеботарева,

научный сотрудник лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии НАН Беларуси Анна Щаюк,

младший научный сотрудник лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии НАН Беларуси

Игорь Лабунец,

доцент кафедры онкологии Белорусского государственного медицинского университета, кандидат медицинских наук; onko@bsmu.by Светлана Пашкевич,

завлабораторией нейрофизиологии Института физиологии НАН Беларуси, кандидат биологических наук; skypasht@gmail.ru Александр Прохоров,

заведующий кафедрой онкологии Белорусского государственного медицинского университета, доктор медицинских наук, профессор; onko@bsmu.by

In the article there are presented the results of comparison of polymorphic variants of the genes GSTM1, GSTT1, GSTP1 and clinical manifestations of non-small cell lung carcinoma, which allow predicting the nature of manifestation of the disease. The association of the genotype GSTTI(del) with the risk of developing squamous cell lung cancer has been revealed (OR = 2.54 CI: 1.13-5.72, p = 0.035). Analysis of patient survival rate (n = 173) in groups of various histological types of lung cancer showed that in the group of squamous cell lung cancer (n = 91) in patients with genotype GSTTI(del), the survival rate median was significantly higher - 84 months (95% CI 12.4— 155.7) than in patients with the genotype GSTT1(+)—36 months (95% CI 25.2—46.8), p = 0.045. In contrast, in the adenocarcinoma group (n = 82), the survival rate median in patients with the genotype GSTTI(del) was 19 months (95% CI 6.2 to 33.5), and in patients with genotype GSTT(+)—67 months (95% CI 50.1—84.0). Hypothetically, these differences may be due to differences in the gender characteristic of patients with squamous cell lung cancer and adenocarcinoma and the involvement of GST enzymes in the metabolism of estrogens in women with adenocarcinoma and other hormonal background, reactivity of the male organism with squamous cell carcinoma. Keywords: squamous cell lung carcinoma, adenocarcinoma, glutathione-S-transferase, survival rate, polymorphism, GST enzymes.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Dela Cruz C. S., Tanoue L. T., Matthay R. A. Lung Cancer: Epidemiology Etiology and Prevention // Clin. Chest Medicine. 2011. Vol. 32, issue 4. Р.605—644. https://doi.ORg/10.1016/j.ccm.2011.09.001

2. Wei S., Wang L. E., McHugh M.K. et al. Genome-wide gene environment interaction analysis for asbestos exposure in lung cancer susceptibility // Carcinogenesis. 2012. Vol. 33. P. 1531-1537. doi:10.1093/carCIn/bgs188.

3. Minina V. I., Soboleva O. A., Glushkov A. N. et al. Polymorphisms of GSTM1, GSTT1, GSTP1 genes and chromosomal aberrations in lung cancer patients // J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 2017. Vol. 143, N11. P. 2235-2243. doi:10.1007/s00432-017-2486-3.

4. Frova C. Glutathione transferases in the genomics era: new insights and perspectives // Biomol. Eng. 2006. Vol. 23, N4. P. 149-169. doi:10.1016/j. bioeng.2006.05.020.

5. Langevin S. M., loannidis J. P., Vineis P., Taioli E. Genetic Susceptibility to Environmental Carcinogens group (GSEC). Assessment of cumulative evidence for the association between glutathione S-transferase polymorphisms and lung cancer: application of the Venice interim guidelines // Pharmacogenet. Genomics. 2010. Vol. 20, N10. P. 586-597. doi:10.1097/FPC.0b013e32833c3892.

6. Hayes J. D., Strange R. C. Glutathione S-transferase polymorphisms and their biological consequences // Pharmacology. 2000. Vol. 61. P. 154-166.

Полный список литературы размещен на сайте

ЕшЁ» http://innosfera.by/2018/10/Genetic