Влияние метформина на продукцию провоспалительных цитокинов и инсулинорезистентность (NF-kB-сигнальный путь)

Влияние метформина на продукцию провоспалительных цитокинов и инсулинорезистентность

А.В. ЛАВРЕНКО, к.м.н. Н.Л. КУЦЕНКО, к.с-х.н. Л.А. КУЦЕНКО, к.б.н. Т.В. МАМОНТОВА, д.м.н. И.П. КАЙДАШЕВ*

The action of metformin on the production of pro-inflammatory cytokines and insulin resistance

A.V. LAVRENKO, N.L. KUTSENKO, L.A. KUTSENKO, T.V. MAMONTOVA, I.P. KAIDASHEV

НИИ генетических и иммунологических основ развития патологии и фармакогенетики Украинской медицинской стоматологической академии, Полтава

Цель данного исследования — оценка роли NF-kB-сигнального пути в реализации противовоспалительного и инсули-носенситайзерного действия метформина у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) на фоне метаболического синдрома (МС). Включение ежемесячного курса метформина в комплексную терапию ИБС снижало продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-ip, ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-а и уменьшало концентрацию С-пептида в сыворотке, действуя на NF-kB-сигнальный путь. Включение метформина в комплексную терапию ИБС при МС препятствует активации NF-kB под действием эндогенных провоспалительных цитокинов.

Ключевые слова: метформин, ишемическая болезнь сердца, метаболический синдром, инсулинорезистентность, NF-kB-сигнальные пути.

The objective of the present study was to estimate the role of the NF-kB signal pathway in the realization of the antiinflammatory and insulin-synthesizing activities of metformin in the patients presenting with coronary heart disease (CHD) associated with metabolic syndrome (MS). It was shown that the introduction of a one-month course of metformin therapy in the combined treatment of CHD resulted in the decreased production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1-beta, IL-6, IL-8, and TNF-alpha. Simultaneously, the serum C-peptide level decreased. These effects of metformin were mediated through the NF-kB-signal pathway. It is concluded that the inclusion of metformin in the combined treatment of coronary heart disease in the patients with metabolic syndrome prevent activation of NF-kB under the influence of endogeneous pro-inflammatory cytokines.

Key words: metformin, coronary heart disease, metabolic syndrome, insulin resistance, F-kB-signal pathway.

Инсулинорезистентность является основным признаком сахарного диабета 2-го типа (СД2) и ассоциируется с рядом метаболических и сердечнососудистых нарушений (дислипидемия, гипертен-зия, ожирение, особенно висцеральное, эндотели-альная дисфункция), каждое из которых является независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний. Молекулярной основой развития инсулинорезистентности является нарушение проведения сигнала от инсулинового рецептора по фосфоинозитол-3-киназному пути с сохранением передачи сигнала по МАР-киназному [1]. МАР-киназный путь активирует NF-kB, обладающий многими провоспалительными эффектами. Кроме того, через NF-kB реализуется липотоксичность не-эстерифицированных жирных кислот, внутриклеточных ^А-жирных кислот, некоторые эффекты ангиотензина II [2].

Таким образом, NF-kB-сигнальный путь является одним из ключевых пунктов внутриклеточной сигнализации, ответственных за развитие инсули-норезистентности, СД2, атеросклероза и артериальной гипертензии. В этой связи актуален поиск лекарственных препаратов, способных блокировать

NF-kB-сигнализацию, особенно среди веществ, обладающих противовоспалительным и инсулинсен-ситайзерным эффектами. Одним из таких препаратов является метформин [3].

Цель данного исследования — оценка роли NF-kB-сигнального пути в реализации противовоспалительного и инсулинсенситайзерного действия метформина у больных с метаболическим синдромом (МС) и ишемической болезнью сердца (ИБС).

Материал и методы

В исследование включены 18 мужчин в возрасте 45—65 лет, которые страдали ИБС на фоне МС. Исследование проводилось с 2008 по 2010 г. на базе 1-й городской клинической больницы Полтавы и Научно-исследовательского института генетических и иммунологических основ развития патологии и фармакогенетики Украинской медицинской стоматологической академии. Перед началом исследования было получено одобрение комиссии по биоэтике этого учреждения. Включение пациентов мужского пола объяснялось необходимостью устранения влияния различных гормональных изменений.

© Коллектив авторов, 2012 ПРОБЛЕМЫ ЭНДОКРИНОЛОГИИ, 2, 2012

*e-mail: kaidashev@yandex.ru

ИБС диагностировали по общепринятым критериям, а наличие МС устанавливали по критериям ВОЗ [4].

До включения в исследование все больные получали общепринятое лечение. Затем применялся стандартный комплекс медикаментозной терапии: изосорбида динитрат 20 мг 2 раза в день, ацетилсалициловая кислота 75 мг 1 раз в день на ночь, амло-дипин 10 мг 1 раз в день, метапролол 25 мг 1 раз в день, аторвастатин 10 мг 1 раз в день утром, больные получали также рекомендации относительно диеты и образа жизни. Общепринятое лечение больные получали не менее 1 мес (до достижения стабильных показателей).

В 1-й день у всех пациентов брали пробы крови и проводили клиническое обследование. Затем в комплексную терапию 8 пациентов был включен метформин в дозе 500 мг 2 раза в день, т.е. впервые назначали пероральный сахарснижающий препарат (группа наблюдения). Повторное обследование выполнялось через 1 мес. Остальные 10 пациентов продолжали стандартное медикаментозное лечение (контрольная группа). Обследование включало: общий анализ крови, общий анализ мочи, определение глюкозы в крови и моче, биохимический анализ крови, определение общего холестерина, а-холестерина, триглицеридов, р-липопротеинов, общих липидов, УЗИ почек, УЗИ сердца, ЭКГ. Все методы были рутинными и использовались для верификации и установления тяжести основного заболевания, а также выявления сопутствующей патологии. Определяли концентрацию глюкозы и гли-кированного гемоглобина (HbA1c) в крови («Био-Ла-Тест», Чехия) и проводили глюкозотолерантный тест (ГТТ). Концентрацию С-пептида в сыворотке определяли иммуноферментным методом («DRG International, Inc.», США). Регистрировали антропометрические показатели — рост (см), массу тела (кг), рассчитывали индекс массы тела (ИМТ, кг/м2).

Воспалительную реакцию оценивали по концентрации ИЛ-1р, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а, определяемой иммуноферментным методом (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).

Для определения экспрессии NF-kB СD40+-клетками суспензию мононуклеаров периферической крови инкубировали с моноклональными антителами (мкАТ) к поверхностным антигенам CD40. К 50 мкл суспензии (105 клеток) добавляли 5 мкл мкАТ, меченых FITC, против CD40 («Caltag», США) и инкубировали 20 мин при 4 °С. Затем клетки отмывали, центрифугируя с 1 мл ФСБ при 1500 об/мин в течение 5 мин. Ресуспендированные клетки фиксировали раствором («Caltag», США) 20 мин при 4 °С. Пермеабилизацию проводили в присутствии мкАТ против субъединицы р65 молекулы NF-kB («BD Biosciences Pharmingen», США) в течение 40 мин при 4 °С. После одноразового от-

мывания к ресуспендированным клеткам добавляли вторые мкАТ, меченные РЕ («Caltag», США). После 20-минутной инкубации клетки отмывали и добавляли 0,5 мл ФСБ. Исследования выполнены на проточном цитофлюориметре EPIX LX-MCL («Beckman Coulter», США).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программы STATISTICA 6.0 («StatSoft», США) с расчетом выборочного среднего, выборочного стандартного отклонения, вероятности полученных результатов для попар-носвязанных величин (t). Данные приведены в виде выборочного среднего (М), выборочного стандартного отклонения (S/D), нижней и верхней квартили. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

У всех 18 пациентов имело место нарушение толерантности к глюкозе, ИМТ превышал 30 кг/м2 и регистрировался один из дополнительных критериев МС (артериальная гипертензия, повышение уровня триглицеридов >1,7 ммоль/л или уровень холестерина ЛПВП <0,9 ммоль/л). Из общей группы больных с МС и ИБС были отобраны 8 пациентов с четкими признаками ожирения (ИМТ=34,12±5,12 кг/м2), нарушения углеводного обмена и инсулинорезистент-ностью (уровень С-пептида=15,97±2,59 нг/мл, HbA1c 6,54±2,19 мкмоль фруктозы/г Hb) и системного воспаления (повышение концентраций ИЛ-1р, ИЛ-6 и ИЛ-8 и ФНО-а в сыворотке в 2—3 раза).

В то же время исходные уровни ИМТ, HbA1c, C-пептида и исследованных цитокинов в группе наблюдения не отличались от таковых в контрольной группе (p>0,05) (рис. 1, 2).

Включение в комплекс терапии метформина и лечение приводили через 1 мес к снижению ИМТ до 33,16±4,77 кг/м2 (р=0,00049) и концентрации С-пептида 12,7±4,1 нг/мл (р=0,006); уровень HbA1c уменьшился слабо (до 5,44±1,93 мкмоль фруктозы/г Hb, р>0,05). Отчетливо снизилась концентрация провоспалительных цитокинов в сыворотке: ИЛ-1Р — 2,11±0,68 пг/мл (р=0,00005), ИЛ-6 — 16,57±16,65 пг/мл (р=0,000), ИЛ-8 — 7,97±11,4 пг/мл (р=0,00104) и ФНО-а — 5,7±3,8 пг/мл (р=0,00467) (рис. 3).

В контрольной группе, пациенты которой не принимали метформин, не отмечалось достоверных изменений изученных показателей.

В группе наблюдения до включения в терапию метформина концентрация общего холестерина составляла 6,5± 1,12 ммоль/л, холестерина ЛПВП — 1,27±0,16 ммоль/л, общих липидов — 4,67±0,97 г/л, триглицеридов — 1,76±0,59 ммоль/л, p-липопротеидов — 2,29±0,57 г/л. Через 1 мес терапии с включением метформина уровни всех этих по-

50 -

40 -

30 -

20 -

10 -

0 -

25 -

: 20 -

15 -

. 10 -

' 5 -

0 -

8 -

юл 10

§ з ¡8

II

§§ 4 " ¡1

2 -

>

До лечения

После лечения

До лечения

После лечения

До лечения

После лечения

25 | 20 = 15

е£

510

5 5

0 -

80

60 "

I

= 40 -

§ 20

I

=30 н о"

о 20

X

*10

4

0 -I

До лечения

4

До лечения

4

До лечения

-[

До лечения

После лечения

>

После лечения

^ >

После лечения

Рис. 1. Влияние метформина на антропометрические показатели (а), концентрацию С-пептида (б) и гликированного гемоглобина (в) больных с ИБС и МС (п=8).

Примечание. Здесь и на рис. 2 и 3: данные приведены в виде индивидуальных значений, среднего (жирная линия) и стандартного отклонения (скобка); р<0,05 при сравнении с контрольной группой.

казателей изменились незначительно (р>0,05). Аналогичные недостоверные сдвиги наблюдались нами и в контрольной группе.

Содержание внутриклеточного NF-kB определяли в CD40+-клетках. Молекула CD40 экспрес-сируется В-клетками различной степени зрелости, моноцитами и дендритными клетками. Взаимодействия CD40/CD40L играют важную роль в поражении сосудистой стенки при атеросклерозе [5, 6].

Как видно из данных, представленных на рис. 3, а, число CD40+-клеток, экспрессирующих NF-kB у пациентов с МС и ИБС до начала лечения и применения метформина, составило 72,43+17,09 (нижний квартиль — 57,5; верхний — 86,95). Применение метформина привело к увеличению числа клеток, экспрессирующих NF-kB, до 92,17+4,48 (р=0,00000). При этом наблюдалось не только увеличение относительного числа клеток, но и снижение дисперсии результатов (нижний квартиль — 88,45; верхний — 94,9). В контрольной группе от-

Рис. 2. Влияние метформина на уровень ИЛ-1 в (а), ИЛ-6 (б), ИЛ-8 (в) и ФНО-а (г) в сыворотке больных с ИБС и МС (п=8).

носительное число клеток, экспрессировавших NF-кВ, до начала периода наблюдения не отличалось от показателей группы наблюдения. Через 1 мес комплексной медикаментозной терапии без включения метформина не отмечали достоверные изменения числа этих клеток, отсутствовали NF-kB (рис. 3, б).

NF-kB-комплекс состоит из субъединиц р50 (ОТ-кВ1) и р65 (REL-A). Субъединица р65 содержит область из 300 аминокислот, гомологичную протоонкогенному продукту Rel ^Н-домен). RH-домен включает мотивы для димеризации, перемещения в ядро и присоединения к специфическим последовательностям ДНК. Кроме того, субъединица р65 содержит трансактивационный домен, ответственный за взаимодействие с ингибитором 1кВ, в котором присутствуют участки фосфорилирования. Образование комплекса NF-kB/IkB предотвращает ядерную транслокацию и активность NF-kB. В ответ на такие стимулы, как цитокины, липополиса-хариды, повреждение ДНК и вирусные инфекции, 1кВ фосфорилируется по критическим остаткам, что вызывает диссоциацию комплекса, позволяя свободным гетеродимерам NF-kB поступать в ядро клеток. Оптимальная активация NF-kB требует фосфорилирования и трансактивационного домена

II

§ I

¡1 5 »

II

SS Ed

¿а

о

° I

¡1 в Q.

7 s tQ = U ,

Ш Щ

SS

H

о

120

m

¥ 80

£ 60 &

ф

§ 40 г

20 0

100 90 80 70 60 50 40 30 20 100 -

До лечения

После лечения

До лечения

После лечения

Рис. 3. Влияние метформина на относительное количество CD40-клеток, экспрессирующих молекулы у больных

ИБС и МС.

а — группа наблюдения (п=8); б — группа контроля (п=10).

р65. В ядре активированный NF-kB присоединяется к кВ сайтам промоторов и энхансеров и функционирует, стимулируя транскрипцию генов [7].

Недавно показано, что метформин в концентрации 100—1000 мкмоль/л ингибирует фосфорилиро-вание 1кВ-киназы и деградацию 1кВа в эндотелиаль-ных клетках пупочной вены человека. Этот эффект связан со способностью метформина увеличивать фосфорилирование АМР-активированной киназы с участием Р13-киназы [8, 9]. Такая способность мет-формина ставит его в ряд препаратов с потенциальной противоопухолевой активностью, в частности при раке молочной железы [10].

Таким образом, у пациентов с МС и ИБС наряду с повышением массы тела и инсулинорезистентностью наблюдается увеличение продукции провоспалитель-ных цитокинов, которые реализуют свои эффекты с участием NF-kB-сигнального пути. При этом формируется «порочный круг»: инсулинорезистентность — ожирение — системное воспаление — ремоделирова-ние тканей — артериальная гипертензия — гиперин-сулинемия — липотоксичность; компоненты этого круга могут взаимодействовать в различных последовательностях, приводя к активации NF-kB.

Такое состояние мы предлагаем называть пре-кондиционированием NF-kB-сигнального пути, приводящим к развитию и поддержанию метаболического синдрома.

Заключение

Включение метформина в комплексную терапию больных МС и ИБС приводит к блокаде активации NF-kB под действием эндогенных провоспалитель-ных цитокинов (на примере CD40+-мононуклеаров периферической крови) путем стабилизации комплексов NF-kB/IkB за счет ингибирования фосфо-рилирования IkB-киназы. Этот эффект метформина прерывает порочный круг, воздействуя на его ключевое звено — активацию NF-kB.

Участие авторов

Концепция и дизайн исследования: И.П. Кай-дашев.

Сбор и обработка материала: И.П. Кайда-шев, А.В. Лавренко, Н.Л. Куценко, Л.А. Куценко, Т.В. Мамонтова.

Статистическая обработка данных: Т.В. Мамонтова.

Написание текста: А.В. Лавренко, И.П. Кайда-шев.

Редактирование: И.П. Кайдашев

ЛИТЕРАТУРА

1. De Fronzo R.A. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes 2009; 58: 773—795.

2. De Fronzo R.A. Insulin resistase, lipotoxicity, type 2 diabetes and atherosclerosis: the missing links. The Claude Bernard Lecture 2009. Diabetologia. 2010; 53: 1270—1287.

3. Bulcao C., Ribeiro-Filho F.F., Sanudo A. Roberta Ferreira S.G. Effects of simvastatin and metformin on inflammation and insulin resistance in individuals with mild metabolic syndrome. Am J Cardiovasc Drugs 2007; 7: 3: 219—224.

4. Alberti K.G., Zimmet P.Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications, part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus. Prevocational report of WHO consultation. Diabet Med 1998; 15: 539—553.

5. Juan M., Ohishi M., Wang L. et al. Association between serum levels of soluble CD40/CD40L ligand and organ damage in hypertensive patients. Clin Exp Pharmacol Physiol 2010; 37: 8: 848—851.

6. Lütgens E., Levens D., Beckers L. et al. CD40 and its ligand in at-erosclerosis. Trends Cardiovasc Med 2007; 17: 4: 118—123.

7. Lawrens T. The nuclear factor NF-kB pathway in inflammation. Cold Spring Harb Perspect Biol 2009; 1: 6: a001651.

8. Hattori Y., Suzuki K., Hattori S., KasalK. Metformin inhibits cyto-kine-induced nuclear factor kappa B activation via AMP-activated protein kinase activation in vascular endothelial cells. Hypertension 2006. 47: 6: 1183—1186.

9. Huang N.L., Chiang S.H., Hsueh C.H. et al. Metformin inhibits TNF-alpha-induced I kappa B kinase phosphorylation, I kappa B alpha degradation and IL-6 production in ebdothelial cells through PI3-dependent AMPK phosphorylation. Int J Cardiol 2009; 134: 2: 169—175.

10. Wysocki P.J., Wizusz-Wysocka B. Obesity, hyperinsulinemia and breast cancer: novel targets and a novel role for metformin. Exp Rev Mol Diagn 2010; 10: 4: 509—519.