МЕТОД ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО УДАЛЕНИЯ ИЗ КРОВИ ПАТОГЕННЫХ МИКРОБОВ, КЛЕТОК ВОСПАЛЕНИЯ ИЛИ БЕЛКОВ ВОСПАЛЕНИЯ
METHOD OF EXTRACORPORAL BLOOD PURIFICATION FROM PATHOGENIC MICROBES, INFLAMMATION CELLS OR INFLAMMATION PROTEINS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу экстракорпорального удаления из крови млекопитающих патогенных микробов, клеток воспаления и белков воспаления; применению прибора, содержащего углеводы, иммобилизованные на твердой подложке, причем указанные углеводы обладают сродством связывания к патогенным микробам, клеткам воспаления и белкам воспаления для экстракорпорального удаления из крови млекопитающих указанных патогенных микробов, клеток воспаления и белков воспаления; применению углеводов, обладающих сродством к патогенным микробам, клеткам воспаления или белкам воспаления, где указанные углеводы иммобилизованы на твердой подложке, для создания прибора для лечения состояний, вызванных или осложненных указанными патогенными микробами, клетками воспаления и белками воспаления; методу лечения представителей млекопитающих, страдающих от состояний, вызванных или осложненных патогенными микробами, клетками воспаления или белками воспаления.
Уровень техники
Биология
В процессе длительной эволюции многие патогенные микроорганизмы научились использовать гликоконъюгаты на поверхности эукариотических клеток, т.е. гликолипиды, гликопротеины и протеогликаны, в качестве рецепторных молекул для прикрепления к клетке, чтобы облегчить колонизацию тканей и процессы инвазии. Вкратце, специфические белки на поверхности бактерий, вирусов, грибов и паразитов, получившие название «адгезины», взаимодействуют с углеводными цепями гликоконъюгатов, которые позволяют микробам колонизировать слизистые оболочки и тканевые поражения.
Роль сиаловой кислоты в связывании патогенов с клетками хозяина показывается уже много лет. И только недавно было показано, что протеогликаны с их углеводными цепями (гликозаминогликаны) связывают множество различных патогенов. Путем удаления концевых углеводных фрагментов этих различных гликоконъюгатов сиалидазой и другими экзогликозидазами или ферментами, разрушающими гликозаминогликан (ГАГ) на клетках в монослое, было доказано, что эти структуры являются рецепторными молекулами для различных сиалоадгезинов и белков, связывающих гепарансульфат (HeBP).
Эти механизмы суммированы в обзорной статье Siiri Hirmo, Meeme Utt и Torkel Wadstrom, Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry, Volume 12, включая Слушания 17-той Международной встречи Lectin, в Wtirzburg, 1997, отредактированной Edilbert van Driessche, Sonia Beeckmans и Thorkild C. Bog-Hansen, изданный TEXTOP, Lemchesvej 11, DK-2900 Hellerup, Denmark, ISBN number 87-984583-0-2.
В ходе микробной инфекции высвобождаются и активируются медиаторы воспаления. К этим так называемым «про-воспалительным цитокинам» относятся факторы некроза опухоли альфа и бета, интерлейкин-1 и интерлейкин-6. Эти цитокины являются частью воспалительного ответа сепсиса. Недостаточность многих органов, вызванная сепсисом, в настоящее время является причиной множества смертей в отделениях интенсивной терапии.
Применительно к микробным инфекциям и сердечно-сосудистой хирургии, например искусственному кровообращению, возникающие воспалительные процессы вызывают множество биологических последствий, от субклинических дисфункций различных органов до серьезной недостаточности многих органов. Цитокины, как полагают, являются важными медиаторами в этих ответах.
Вышеупомянутые цитокины обладают способностью избирательно связывать широкий спектр гликозаминогликанов (ГАГ), включая гепарансульфат, в тканях и на поверхности как эндотелиальных клеток, так и лейкоцитов.
Рецепторы
Гепарансульфат - это гликозаминогликан, который представлен на поверхности практически всех клеток млекопитающих. Он состоит из чередующихся остатков D-глюкозамина и уроновой кислоты. Гепарансульфаты представляют собой высокозаряженные гетерогенные полисахариды и являются углеводной частью многих гликоконъюгатов (синдекана, перлекана, глипикана) на поверхности клетки.
Многие микроорганизмы используют гепарансульфаты на поверхности клеток млекопитающих в качестве рецепторов. Этот механизм является универсальным и распространяется практически на все бактерии, вирусы и паразиты. Некоторые микроорганизмы используют более одного рецептора-гликоконъюгата. В качестве примеров других рецепторов, использующихся наряду с гепарансульфатом, можно привести специфические хондроитинсульфаты и содержащие сиаловую кислоту гликопротеины.
Helicobacter pylori, Streptococcus sanguis, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis
Plasmodium falciparum
Trypanosoma cruzi
Связывающие гепарансульфат и хондроитинсульфат микробы представлены такими вирусами, как вирус простого герпеса типа 1 (возбудитель герпеса на губах и в углах рта), вирус простого герпеса типа 2 (возбудитель генитального герпеса), цитомегаловирус, вызывающий сильные осложнения у пациентов с ослабленной иммунной системой, вирус денге, вызывающий повторяющиеся приступы лихорадки, вирус иммунодефицита человека, а также некоторыми бактериями, такими как , и паразитами, такими как (возбудитель малярии) и  (возбудитель трипаносомоза).
Кроме того, цитокины, такие как фактор некроза опухоли бета, также используют гепарансульфаты клеточной поверхности для связывания и активации.
Гепарин как рецептор
Гепарин является полисахаридом, который был выделен из тканей млекопитающих. Со времени его открытия в 1916 году американским ученым МакЛином были замечены антикоагулянтные свойства гепарина, и более 50 лет гепарин использовался в клинической практике как антикоагулянт крови и агент, препятствующий образованию тромбов. Тогда как гепарансульфат является повсеместным компонентом всех форм животных, имеющих тканевую организацию, гепарин имеет ограниченное распределение в тканях млекопитающих. Гепарин, в отличие от гепарансульфата представлен только в базофильных гранулах тучных клеток. Однако сегодня в дополнение к традиционной роли в предотвращении и терапии тромбоэмболических состояний гепарин демонстрирует широкий спектр свойств, не связанных с антикоагуляцией.
Большое количество белков крови связываются с высокой степенью сродства с гепарином и/или гепарансульфатом. В качестве примеров можно привести антитромбин, фибронектин, витронектин, факторы роста (например, фактор роста фибробластов, инсулин-подобный фактор роста и т.д.). Человеческий сывороточный альбумин также связывается, но с более низкой степенью сродства. С другой стороны, человеческий сывороточный альбумин содержится в крови в больших количествах.
Чтобы использовать эти свойства гепарина для торможения инфекции, было рассмотрено введение фрагментов гепарина и/или сиалсодержащих фрагментов в сосудистую систему.
Таким образом, предполагалось, что эти фрагменты могли бы связываться с лектинами на поверхности микробов, блокировать их и, следовательно, препятствовать их связыванию с рецепторами на поверхности клеток млекопитающих. Эта концепция была опробована многими учеными, но с ограниченным успехом, в большинстве случаев из-за кровотечений, возникающих при введении в сосудистую систему больших доз гепарина.
US 6,197,568 содержит методы выделения и детекции флавивирусов и других вирусов, вызывающих геморрагическую лихорадку, таких как вирус денге, основанные на полианионзависимых взаимодействиях флавивирусов и вирусов геморрагической лихорадки.
Экстракорпоральные приборы используются в различных клинических ситуациях, например при почечном диализе, искусственном кровообращении и плазмаферезе.
«Экстракорпоральная терапия» означает процедуры, в которых необходимые компоненты, такие как кислород, антикоагулянты, анестетики и т.д., могут быть введены в жидкости тела. И напротив, нежелательные компоненты, такие как токсины и т.д. могут быть удалены их жидкостей тела за его пределами. В качестве примеров можно привести гемодиализ и гемофильтрацию, представляющие собой методы очистки крови от продуктов жизнедеятельности.
Сущность изобретения
Целью данного изобретения является разработка метода лечения млекопитающих, страдающих от заболеваний или состояний, вызванных или осложненных различными патогенными микробами, клетками воспаления или белками воспаления путем удаления указанных патогенных микробов, клеток воспаления или белков воспаления из крови млекопитающих.
Другой целью данного изобретения является разработка метода экстракорпорального удаления патогенных микробов, клеток воспаления или белков воспаления из крови млекопитающих.
Вышеупомянутые цели, также как и дальнейшие цели изобретения, которые должны быть очевидны для человека, знакомого с состоянием проблемы после изучения приведенного ниже описания, завершаются рассмотрением различных аспектов данного изобретения, как описано в данном документе.
Первый аспект данного изобретения представляет метод экстракорпорального удаления патогенных микробов, клеток воспаления или белков воспаления из крови млекопитающих, и состоит из следующих этапов:
а) взятие образцов крови млекопитающих,
б) приведение указанных образцов в контакт с углеводами, иммобилизованными на твердой подложке, причем указанные углеводы обладают сродством связывания к патогенным микробам, клеткам воспаления и белкам воспаления в условиях, позволяющих любым патогенным микробам, клеткам воспаления и белкам воспаления связываться с указанными углеводами в данном образце крови,
в) отделение образца от твердой подложки таким образом, чтобы вышеупомянутые патогенные микробы, клетки воспаления и белки воспаления хотя бы частично остались на твердой подложке, и
г) возвращение в организм указанного образца, содержащего меньшее количество вышеупомянутых патогенных микробов, клеток воспаления или белков воспаления.
Известный уровень техники введения фрагментов гепарина и/или сиалсодержащих фрагментов в сосудистую систему пациентов имел ограниченный успех, в большинстве случаев из-за кровотечений при введении больших доз гепарина в сосудистую систему. Метод согласно изобретению позволяет преодолеть эти проблемы путем иммобилизации углеводов на твердой подложке, как в числе прочего описано в подготовительном примере 6.
Использование иммобилизованных углеводов, как определено методом согласно изобретению, также дает весьма неожиданное преимущество. Изобретатели обнаружили, что углевод должен быть иммобилизован на твердой подложке, чтобы обеспечить связывание значительных количеств компонентов, которые должны быть удалены. Это неожиданное свойство описывается в сравнительном примере 1 и примере 1 для вируса простого герпеса типа 1 и состоит в том, что в растворе менее 3% вирусов связывается с избытком гепарина (сравнительный пример 1), в то время как 94% вирусов связывается с иммобилизованным гепарином (Пример 1).
Staphylococcus aureus
E.coli
Метод, предлагаемый в данном изобретении, делает возможным безопасное и эффективное лечение пациентов, страдающих от сепсиса или септического шока путем удаления патогенов, вызывающих эти состояния, из кровяного русла пациентов. Данный метод позволяет удалить множество различных патогенных микробов, клеток воспаления и белков воспаления. Примерами патогенных микробов, обычно ассоциированных с сепсисом, которые могут быть удалены с помощью данного метода, являются стафилококки, такие как , стрептококки и .
Т.к. гепарин и гепарансульфат связываются с большим количеством компонентов, как описано в разделе Уровень техники, ожидалось, что поверхность гепарина должна быть покрыта многими из этих белков при контакте с кровью, таким образом предотвращая прикрепление микробов. Но изобретатели неожиданно обнаружили, что высокоэффективная очистка сыворотки и цельной крови млекопитающих, включая человека, может быть достигнута с использованием метода и прибора согласно данному изобретению. Здесь показано, что колонка среднего размера способна практически полностью удалить значительное количество вирусов из сыворотки крови и цельной крови. См. Примеры 2, 3 и 4.
В варианте осуществления патогенные микробы, выбранные из группы, включающей бактерии, вирусы и паразиты.
В варианте осуществления вышеупомянутыми патогенными микробами являются вирусы. В более специфическом варианте осуществления упомянутые вирусы выбраны из группы, включающей вирус простого герпеса типа 1, вирус простого герпеса типа 2, вирус гриппа А, цитомегаловирус и вирус иммунодефицита человека. В другом еще более специфическом варианте осуществления вышеупомянутые вирусы выбраны из группы, состоящей из вируса простого герпеса типа 1 и вируса простого герпеса типа 2.
Helicobacter pylori, Streptococcus sanguis, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Mycobacterium tuberculosis
Helicobacter pylori и Staphylococcus aureus
В другом варианте осуществления вышеупомянутые патогенные микробы это бактерии. В более специфическом варианте осуществления вышеупомянутые бактерии выбраны из группы, включающей . В предпочтительном варианте осуществления вышеупомянутые патогенные микробы это .
Plasmodium falciparum и Trypanosoma cruzi.
В другом варианте осуществления вышеупомянутые патогенные микробы это паразиты. В более специфическом варианте осуществления упомянутые паразиты выбраны из группы, включающей
В следующем варианте осуществления вышеупомянутые клетки воспаления выбраны из группы, состоящей из лимфоцитов воспаления и макрофагов воспаления.
В дальнейшем варианте осуществления вышеупомянутые белки воспаления это про-воспалительные цитокины. В более специфическом варианте осуществления упомянутые про-воспалительные цитокины выбраны из группы, состоящей из фактора некроза опухоли альфа, фактора некроза опухоли бета, интерлейкина-1 и интерлейкина-6.
В варианте осуществления вышеупомянутая кровь млекопитающих это человеческая кровь.
В варианте осуществления изобретательского метода вышеупомянутые углеводы выбраны из группы, включающей гепарин, гепарансульфат, хондроитинсульфат, углеводы, включающие сиаловую кислоту, и углеводы, включающие нейраминовую кислоту. В более специфическом варианте осуществления вышеупомянутый углевод это гепарин.
В другом варианте осуществления вышеупомянутая твердая подложка состоит из микрочастиц или полых волокон. В конкретных вариантах осуществления изобретения материал вышеупомянутой твердой подложки был выбран из группы, включающей стекло, целлюлозу, ацетат целлюлозы, хитин, хитозан, сшитый декстран, сшитую агарозу, полипропилен, полиэтилен, полиакрилонитрил, силикон, Тефлон и полиуретаны.
2
В дальнейшем варианте осуществления вышеупомянутые углеводы ковалентно связаны с твердой подложкой. В более специфическом варианте осуществления вышеупомянутые углеводы связаны с твердой подложкой путем ковалентного концевого присоединения. Ковалентное присоединение углеводов к твердой подложке обеспечивает лучший контроль таких параметров, как поверхностная плотность и ориентация иммобилизованных молекул по сравнению с нековалентным присоединением. Эти параметры, как показали изобретатели, важны для обеспечения оптимального связывания патогенов с иммобилизованными молекулами углеводов. Поверхностная концентрация углеводов на твердой подложке должна быть в пределах 1-10 мкг/см.
Ковалентное концевое присоединение означает, что углеводы ковалентно присоединяются к твердой подложке через концевой остаток углеводной молекулы. Второй аспект данного изобретения заключается в применении прибора, состоящего из иммобилизованных на твердой подложке углеводов, причем указанные углеводы обладают сродством связывания к патогенным микробам, клеткам воспаления или белкам воспаления, для экстракорпорального удаления данных патогенных микробов, клеток воспаления или белков воспаления из крови млекопитающих.
Варианты осуществления по второму аспекту изобретения соответствуют приведенным выше для метода по первому аспекту настоящего изобретения, касающегося патогенных микробов, клеток воспаления, белков воспаления, крови млекопитающих, углеводов, твердой подложки и иммобилизации.
Третий аспект изобретения заключается в применении углеводов, обладающих сродством связывания к патогенным микробам, клеткам воспаления или белкам воспаления, где указанные углеводы иммобилизованы на твердой подложке, для создания прибора для лечения состояний, вызванных или осложненных указанными патогенными микробами, клетками воспаления или белками воспаления.
Варианты осуществления по третьему аспекту изобретения соответствуют приведенным выше для метода по первому аспекту настоящего изобретения, касающегося патогенных микробов, клеток воспаления, белков воспаления, крови млекопитающих, углеводов, твердой подложки и иммобилизации.
Роль прибора, упоминавшегося в изобретении, может выполнять обычный прибор для экстракорпоральной очистки крови и сыворотки пациентов, страдающих, например, почечной недостаточностью.
Характер местного кровотока в контактирующих с кровью приборах для экстракорпоральной циркуляции оказывает влияние на образование сгустков крови из-за агрегации тромбоцитов в застойных участках. Как следствие, прибор, упомянутый во втором, третьем и четвертом аспектах изобретения, должен быть сконструирован таким образом, чтобы избежать подобных проблем.
Прибор, упоминаемый в некоторых вариантах осуществления изобретения, может обладать, например, следующими характеристиками:
- скорость кровотока в пределах 1-500 мл/мин, предпочтительно 5-250 мл/мин;
- низкое сопротивление кровотока;
2
- большая площадь поверхности с иммобилизованными углеводами, т.е. 0,1-1 м;
- стабильное покрытие (углеводы не должны попадать в кровоток при контакте);
- оптимальные гемодинамические параметры прибора (без застойных зон);
- оптимальная биологическая совместимость.
Одним из примеров такого прибора, который может быть использован согласно данному изобретению, является педиатрическая установка для диализа, такая как Prisma M10 гемофильтр/диализатор, производимая в Швеции. Также могут использоваться и другие модели или типы приборов для экстракорпорального лечения крови.
Четвертым аспектом данного изобретения является метод лечения представителей млекопитающих, страдающих от состояний, вызванных или осложненных патогенными микробами, клетками воспаления или белками воспаления, состоящий из следующих этапов:
а) получение крови пациента,
б) обеспечение контакта полученной крови с прибором, состоящим из иммобилизованных на твердой подложке углеводов, причем указанные углеводы обладают сродством связывания к патогенным микробам, клеткам воспаления или белкам воспаления в условиях, позволяющих указанным патогенным микробам, клеткам воспаления или белкам воспаления связываться с углеводами,
в) повторное введение очищенной от вышеуказанных патогенных микробов, клеток воспаления или белков воспаления крови в кровоток пациента.
В варианте осуществления метода лечения согласно настоящему изобретению получение и повторное введение крови осуществляется с помощью протяженной петли, которая является продолжением кровотока пациента.
Варианты осуществления метода лечения по четвертому аспекту изобретения соответствуют приведенным выше вариантам по первому аспекту, касающимся патогенных микробов, клеток воспаления, белков воспаления, крови млекопитающих, углеводов, твердой подложки и иммобилизации.
При этом термин «патогенный микроб» означает микроб, способный вызвать заболевание живого организма при проникновении в данный организм. Примерами «патогенных микробов» являются бактерии, вирусы и паразиты.
Термин «клетки воспаления» в данном случае означает клетки, вовлеченные в воспалительный процесс у млекопитающих. Примерами «клеток воспаления» являются воспалительные лимфоциты и воспалительные макрофаги.
Термин «белок воспаления» в данном случае означает белок, такой как цитокин, высвобождаемый, например, в ответ на микробную инфекцию или иммунизацию.
Термин «цитокин» в данном случае обозначает белок, высвобождаемый в ответ на микробную инфекцию или иммунизацию, выбранный из группы белков, включающей интерлейкины, интерфероны, хемокины и факторы некроза опухоли.
Примеры
Подготовительный пример 1
Аминирование Сефадекса G 25
4,
3
Метапериодат натрия (NaIO 6 г) растворяли в воде (994 мл) и добавляли к Сефадексу G 25 (Pharmacia Biotech, Уппсала, Швеция) (50 г) в 1 л воды. Смесь хранили в темноте при качании в течение 24 часов. После фильтрования и пятикратной отмывки водой (5×1 л) и финальной промывки 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,0 конечный продукт ресуспендировали в фосфатном буфере рН 7,0 (350 мл) и добавляли раствор полиэтиленимина (100 мл Lupasol, (BASF, Германия), 5% в воде). Гель стабилизировали добавлением водного раствора NaBHCN, цианоборогидрида натрия (0,5 г в 100 мл фосфатного буфера, 0,1 М, рН 7,0). Гель фильтровали и отмывали, как описано выше, и в конце промывали ацетатным буфером (500 мл, 0,1 М, рН 4,0). В результате получили аминированный Сефадекс G 25 (85 г).
Подготовительный пример 2
Ковалентное концевое присоединение гепарина к хроматографическому гелю.
3
Аминированный Сефадекс G 25 (85 г), полученный, как описано в подготовительном примере 1, ресуспендировали в ацетатном буфере (800 мл, 0,1 М, рН 4,0) и добавляли 4 г обработанного азотистой кислотой гепарина (гепарин фирмы Pharmacia, Швеция). После качания в течение 0,5 ч добавляли NaBHCN (0,4 г). Реакционную смесь инкубировали при качании в течение 24 ч и затем обрабатывали, как описано выше. Получили гепаринизированный Сефадекс G 25 (80 г).
Гель содержит 2% гепарина (w/w, анализ на серу).
3
6
2
3
2
Средний диаметр частиц Сефадекса G 25 составляет 50-150 мкм. Приблизительные подсчеты показывают, что 1 см содержит 10 частиц, которые составляют площадь поверхности, равную 0,03 м/см. Кроме того, если гепарин присоединен только к поверхности частиц, гепаринизированный Сефадекс G 25 с 2% гепарина содержит около 0,003 мкг гепарина/см.
Подготовительный пример 3
Ковалентное присоединение гепарина к аминированной стекловате
Гепаринизирование стекловаты производится согласно нижеприведенному общему протоколу.
Стекловату тщательно очищали кислотой (HCl), промывали абсолютным этанолом и высушивали в духовом шкафу при температуре 100°С в течение 4 часов.
Реакционноспособные аминогруппы присоединяли к поверхности стекловаты путем обработки водным раствором полиамина, полиэтиленимина или хитозана. Для некоторых целей полиамины можно стабилизировать на поверхности путем сшивок с бифункциональными агентами, такими как кротоновый альдегид или глютаровый альдегид.
3
-
Далее покрытие стабилизировали посредством ионных сшивок с сульфатированными полисахаридами (декстрансульфатом или гепарином). В случае необходимости эти процедуры можно повторить и получить структуру, построенную по принципу сэндвича. Между стадиями необходимо проводить аккуратную промывку (водой или подходящими буферами). После последнего добавления полиэтиленимина или хитозана происходит концевое присоединение нативного гепарина к аминированной поверхности посредством восстановительного аминирования, за счет альдегидной группы восстановительного концевого остатка нативного гепарина. Присоединение осуществляется в водном растворе методом восстановительного аминирования (цианоборгидрид CNBH ) в точности, как описано в подготовительном примере 2.
2
Анализ поверхности, проведенный, как описано в подготовительном примере 2, показал, что приблизительно 10 мг/см гепарина присоединяется к поверхности стекловаты.
Подготовительный пример 4
Ковалентное присоединение гепарина к аминированным полимерным поверхностям
Полимерные поверхности гепаринизируются согласно общему протоколу, приведенному ниже.
3
Полимерные поверхности протравливают окислителями (перманганатом калия, пероксидисульфатом аммония) для придания гидрофильных свойств и введения некоторых реакционноспособных функциональных групп (-SOH, -OH, -C=O, -C=C-). Поверхности также можно протравить плазмой или коронным разрядом.
3
-
Реакционноспособные аминогруппы вводятся путем обработки полиаминами, полиэтиленимином или хитозаном. Для некоторых целей полиамины можно стабилизировать на поверхности путем сшивок с бифункциональными агентами, такими как кротоновый альдегид или глютаровый альдегид. Далее покрытие стабилизировали посредством ионных сшивок с сульфатированными полисахаридами (декстрансульфатом или гепарином). В случае необходимости эти процедуры можно повторить и получить структуру, построенную по принципу сэндвича. Между стадиями необходимо проводить аккуратную промывку (водой или подходящими буферами). После последнего добавления полиэтиленимина или хитозана происходит концевое присоединение нативного гепарина к аминированной поверхности посредством восстановительного аминирования, за счет альдегидной группы восстановительного концевого остатка нативного гепарина. Более реакционноспособная альдегидная группа в концевом остатке может быть получена путем частичной деградации гепарина азотистой кислотой. Это сокращает время реакции, но иммобилизованный гепарин имеет меньший молекулярный вес. Присоединение осуществляется в водном растворе методом восстановительного аминирования (цианоборгидрид CNBH ) в точности, как описано в подготовительном примере 2.
2
1-10 мкг/см гепарина может быть присоединено ко всем гидрофильным поверхностям, таким как стекло, целлюлоза, хитин и т.д. и к более или менее ко всем гидрофобным полимерам, таким как поливинилхлорид, полиэтилен, поликарбонат, полистирен и т.д.
Подготовительный пример 5
Ковалентное присоединение гепарина к полимерным поверхностям по одному или нескольким положениям
Осуществляется согласно протоколу, приведенному в подготовительном примере 2, за исключением того, что альдегидные группы вводятся в цепь гепарина путем окисления периодатом натрия в водном растворе.
Подготовительный пример 6
Присоединение гепарина к внутреннему просвету полых волокон
3
В данном подготовительном примере использовался педиатрический диализатор крови. Волокна диализатора сделаны из полисульфона. Внутренний диаметр составляет 200 микрон, толщина стенок 40 микрон. Общая площадь поверхности материала, контактирующего с кровью, составляет 4000 см, и исходный объем составляет 28 мл.
3
2
Аминирование осуществляется согласно протоколу, приведенному в подготовительном примере 4, за исключением того, что стадия протравливания исключается. Полисульфон является гидрофильным материалом и не требует протравливания. Иммобилизация гепарина производилась путем закачивания раствора гепарина, обработанного азотистой кислотой (гепарин от фирмы Pharmacia) в комбинации с NaBHCN, как описано в подготовительном примере 2. Поскольку оценка количества гепарина является деструктивной процедурой, аналогичный диализатор был гепаринизирован в идентичных условиях, и его волокна были подвергнуты анализу на серу. Результаты показали, что содержание гепарина составляет около 5 мкг/см, что соответствует 20 г гепарина в приборе.
Подготовительный пример 7
Ковалентное присоединение олигомеров с концевыми остатками сиаловой кислоты к внутреннему просвету полых волокон
3
2
В данном подготовительном примере для присоединения использовалась альдегидная группа концевого восстановительного остатка. Аминирование волокон производилось, как описано в подготовительном примере 6, и присоединение олигосахарида (формула I), содержащего концевые остатки сиаловой кислоты, производилось путем циркуляции вещества (формула I), растворенного в ацетатном буфере (800 мл, 0,1 М, рН 4,0) с добавлением NaBHCN (0,4 г) при комнатной температуре в течение 24 часов. Результаты показали, что содержание сиаловой кислоты составляет 2 мкг/см.
Сравнительный пример 1
Связывание Вируса простого герпеса типа 1 с гепарином в растворе.
7
Раствор (10 мкл), содержащий 10 бляшкообразующих единиц вируса (Вирус простого герпеса типа 1 штамм KOS321), инкубировали с 20 мкл меченного тритием гепарансульфата в конечном объеме 400 мкл забуференного NaCl в течение 30 минут при 37°С. После этого смесь центрифугировали через фильтр Microstep 1 M, задерживающий вирус и связанный гепарансульфат. 2,3% гепарансульфата связалось с вирусом (479 имп/мин), тогда как 97,7% гепарансульфата не связалось и прошло через фильтр.
Пример 1
Удаление частиц вирусов простого герпеса типа 1 и типа 2 из забуференного физиологического раствора путем связывания с гепарином, иммобилизованным на гранулах Сефадекса
3
9
11
8
6
Гранулы Сефадекса, покрытые гепарином, как описано в подготовительном примере 2, смачивали в забуференном NaCl (Ф-СБ, фосфатно-солевой буфер) и 0,8 мл наносили на каждую из двух небольших одноразовых колонок, формируя слой геля толщиной около 1 см. После трехкратной промывки 50 мкл вирусов, меченных H-тимидином, суспендировали в 150 мкл Ф-СБ. 10бляшкообразующих единиц вируса простого герпеса типа 1 (ВПГ-1), что соответствует 10 вирусных частиц, наносили на колонку 1, и 10 бляшкообразующих единиц вируса простого герпеса типа 2 (ВПГ-2), что соответствует 10 вирусных частиц, наносили на колонку 2. Вирусы адсорбировались на соответствующей колонке. После этого на каждую колонку наносили 0,8 мл Ф-СБ, жидкость на выходе с колонки собирали для оценки количества несвязавшегося вируса. Далее обе колонки 4 раза промывали 1 мл Ф-СБ, фракции собирали для количественного измерения содержания смытых с колонки вирусов. Эти и последующие фракции помещали в сцинтилляционные кюветы и измеряли количественное содержание вирусов с помощью счетчика бета-частиц. На следующем этапе с колонок элюировали соответствующие связавшиеся с гепарином вирусы путем трехкратной промывки 1 мл раствора 2 М NaCl. С каждой колонки собрали по три фракции.
Вслед за этим элюцию проводили путем двукратного добавления 1 мл раствора 5% ДСН в Ф-СБ (Ф-СБ - ДСН) и собирали по две фракции с каждой колонки. На последнем этапе покрытые гепарином гранулы из обеих колонок были отдельно суспендированы в 1 мл раствора Ф-СБ - ДСН, и 200 мкл из каждой фракции были использованы для определения количественного содержания оставшихся связанными вирусов путем измерения радиоактивности.
Результаты приведены в таблице 1. Как показано, только 5,5% частиц ВПГ-1 и 11,7% частиц ВПГ-2 не адсорбируются на колонке. Более того, т.к. вирусная ДНК и белки, не связывающие гепарин, не подвергались радиоактивному мечению, эти неадсорбировавшиеся частицы могут представлять собой неинфекционные вирусы с поврежденными оболочками (т.е. внешними, хрупкими частями вируса, которые связываются с гепарином). Остальные вирусы (94,5% ВПГ-1 и 88,3% ВПГ-2) связываются с покрытыми гепарином гранулами на колонке. Связывание кажется достаточно сильным, судя по тому, что только 0,5% ВПГ-1 и 1,1% ВПГ-2 удаляется после четырех последовательных промывок. Ограниченная способность 2 М NaCl при трех последовательных промывках элюировать вирусы подчеркивает высокую связывающую способность обоих вирусов в отношении покрытых гепарином гранул. Напротив, значительные количества ВПГ-1 и ВПГ-2 элюируются с помощью Ф-СБ - ДСН.
В сумме 48% ВПГ-1 и 68,8% ВПГ-2 были извлечены из колонки. Это может объясняться тем фактом, что 2 М NaCl спонтанно снижает радиоактивность образцов примерно на 30% согласно нашим прошлым наблюдениям, и что возможно Ф-СБ - ДСН оказывает аналогичный эффект.
В целом данные результаты подтверждают принцип, что вирусные частицы ВПГ-1 и ВПГ-2 могут быть удалены из жидкой фазы путем пропускания через короткую колонку, содержащую покрытые гепарином гранулы Сефадекса, и что выделенные вирусы с высоким сродством связываются с колонкой.
Таблица 1Связывание радиоактивно меченных вирусных частиц ВПГ, суспендированных в забуференном NaCl, с покрытыми гепарином гранулами Сефадекса
Связывание ВПГ с гепариновой колонкой(% входящего вируса = контроль=100%)
ВПГ-1
ВПГ-2
Входящий вирус (контроль)
100,0
100,0
Неадсорбированный вирус
5,5
11,7
Смытый с колонки
1-ая промывка
0,2
0,4
2-ая промывка
0,1
0,3
3-ая промывка
0,1
0,2
4-ая промывка
0,1
0,2
Сумма неадсорбированного и смытого
6,0
12,8
Элюированный 2 М NaCl
1-ая элюция
7,8
14,7
2-ая элюция
1,6
1,9
3-я элюция
0,1
1,3
Элюированный 5% ДСН
1-ая элюция
10,6
11,9
2-ая элюция
18,5
18,3
Сумма элюированного NaCl+ДСН
38,6
48,1
Неэлюированный с гранул
4,1
7,9
Сумма неэлюированного
4,1
7,9
Сумма выделенного (неадсорбированный + смытый + элюированный + неэлюированный)
48,7
68,8
Пример 2
Удаление вирусных частиц ВПГ-1 из сыворотки крови человека путем связывания с гепарином, иммобилизованным на гранулах Сефадекса
9
11
Использовался экспериментальный протокол, описанный в примере 1, с той разницей, что радиоактивно меченные вирусные частицы ВПГ-1 в количестве 10 бляшкообразующих единиц, что эквивалентно 10 вирусных частиц, смешивали с 0,5 мл сыворотки человека и наносили на одноразовую колонку с покрытыми гепарином гранулами. После этого проводили процедуры элюции и промывки, как описано в примере 1. Результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2Связывание радиоактивно меченных вирусных частиц ВПГ-1 (10<sup>11</sup>), суспендированных в сыворотке человека, с гранулами гепарин-Сефадекс (1 см<sup>3</sup>)
Связывание ВПГ-1 с гепариновой колонкой(% входящего вируса=контроль=100%)
Входящий вирус (контроль)
100,0
Неадсорбированный вирус
2,4
Смытый с колонки
1-ая промывка
0,9
2-ая промывка
0,2
3-ая промывка
0,1
4-ая промывка
0,2
Сумма неадсорбированного и смытого
3,8
Элюированный 2 М NaCl
1-ая элюция
2,1
2-ая элюция
0,4
3-я элюция
0,2
Элюированный 5% ДСН
1-ая элюция
3,5
Сумма элюированного NaCl+ДСН
6,2
Сумма выделенного (неадсорбированный + смытый + элюированный + неэлюированный)
10,0
Оставшиеся на гранулах
90,0
Как показано, 97,6% частиц ВПГ-1, суспендированных в сыворотке крови человека, связываются с колонкой. После четырехкратной промывки удаляются только 3,8% вирусных частиц. При использовании 2 М NaCl элюируется только 2,7% вируса и дополнительно 3,5% вируса элюируется ДСН. На основании данных результатов можно сделать вывод, что суспендирование вируса в сыворотке, что максимально отражает реальную ситуацию в ходе серьезной диссеминированной инфекции, улучшает продуктивность колонки для удаления вируса, что отражает связывание радиоактивно меченного вируса, и что только 2,4% частиц ВПГ-1 не адсорбируется. Возможным объяснением может служить то, что сывороточные белки стабилизируют вирусные частицы и таким образом способствуют удалению ВПГ-1 с помощью гепаринизированных гранул Сефадекса.
Пример 3
Удаление вирусных частиц ВПГ-1 из сыворотки крови человека путем связывания с гепарином, иммобилизованным на полых волокнах диализатора крови.
9
11
Использовался экспериментальный протокол, описанный в примере 1, с той разницей, что радиоактивно меченные вирусные частицы ВПГ-1 в количестве 10 бляшкообразующих единиц, что эквивалентно 10 вирусных частиц, смешивали с 0,5 мл сыворотки крови человека и наносили на покрытые гепарином полые волокна диализатора, описанного в подготовительном примере 6. Далее следовали процедуры элюции и промывки, как описано в примере 1. Результаты приведены в таблице 3.
Как показано, 93,2% суспендированных в сыворотке крови человека частиц ВПГ-2 связываются с колонкой. Четырехкратная промывка приводит к удалению всего лишь 4,2% вирусных частиц. После обработки 2 М NaCl элюируется только 4,0% вируса, и еще 4,5% элюируется с помощью ДСН. Из приведенных результатов следует вывод, что связывание суспендированных в сыворотке вирусных частиц с гепаринизированными волокнами сравнимо со связыванием аналогичным образом суспендированных частиц с покрытыми гепарином гранулами Сефадекса, и что только 7,7% частиц ВПГ-2 не адсорбируются.
Таблица 3Связывание радиоактивно меченных вирусных частиц ВПГ-1, суспендированных в сыворотке, с гепаринизированными полыми волокнами
Связывание ВПГ-1 с гепариновой колонкой(% входящего вируса = контроль = 100%)
Входящий вирус (контроль)
100,0
Неадсорбировавшийся вирус
7,7
Смытый с колонки
1-ая промывка
3,1
2-ая промывка
0,8
3-ая промывка
0,1
4-ая промывка
0,2
Сумма неадсорбированного и смытого
4,2
Элюированный 2 М NaCl
1-ая элюция
3,3
2-ая элюция
0,5
3-я элюция
0,2
Элюированный 5% ДСН
1-ая элюция
4,5
Сумма элюированного NaCl+ДСН
8,5
Сумма выделенного (неадсорбированный + смытый + элюированный + неэлюированный)
12,7
Оставшиеся на гранулах
87,3
Пример 4
Удаление вирусных частиц ВПГ-1 и ВПГ-2 из цельной крови человека путем связывания с гепарином, иммобилизованным на гранулах Сефадекса
11
Использовали экспериментальный протокол, описанный в примере 1 с той разницей, что радиоактивно меченные вирусные частицы ВПГ-1 и ВПГ-2 в количестве, эквивалентном 10 частиц/мл, смешивали с 1 мл человеческой крови и наносили на одноразовую колонку, содержащую 1 мл покрытых гепарином гранул. После этого следовали процедуры элюции и отмывки, как описано в примере 1.
Результаты приведены в таблице 4, как показано, 99,1% частиц ВПГ-1 и 99,8% частиц ВПГ-2, суспендированных в крови, связываются с колонкой.
Таблица 4Связывание радиоактивно меченных вирусных частиц ВПГ, суспендированных в человеческой крови, с покрытыми гепарином гранулами Сефадекса (1 см<sup>3</sup>)
Связывание ВПГ цельной крови с гепариновой колонкой(% входящего вируса = контроль = 100%)
ВПГ-1%
ВПГ-2%
Входящий вирус (контроль)
100,0
100,0
Неадсорбировавшийся вирус
0,9
0,2
Пример 5
Удаление вируса гриппа А из человеческой сыворотки методом связывания с иммобилизованными олигосахаридами, содержащими сиаловую кислоту
6
Вирус гриппа А H1N1 реплицировался в клетках MDCK при 35°С в стандартных условиях в течение 3-х дней, после чего клетки гомогенизировали и титровали для оценки количества бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл. Вирусные частицы суспендировали в человеческой сыворотке до конечной концентрации 10 БОЕ/мл. 10 мл суспензии вводили в диализатор, содержащий покрытые сиаловой кислотой полые волокна и подготовленный согласно методу, описанному в подготовительном примере 7. На основании определения инфекционности сыворотки, содержащей вирус гриппа А после пропускания ее через диализатор и сравнения с инфекционностью той же сыворотки, не прошедшей обработку прибором, был сделан вывод, что 87% БОЕ вируса гриппа А остается на волокнах.
Пример 6
Удаление Helicobacter pylori и Staphylococcus aureus методом связывания с иммобилизованным гепарином
H.pylori
S.aureus
H.pylori
S.aureus
Четыре стерильные пипетки наполнили стекловатой (по 0,5 мл), которая была гепаринизирована, как описано в подготовительном примере 3. Полученную таким образом «колонку» промывали 3 мл стерильного Ф-СБ, рН 7,2. Были протестированы два разных штамма  и два разных штамма . Каждый из четырех образцов бактерий, суспендированных в Ф-СБ, наносили на отдельную «колонку». Количество бактерий в образцах измеряли до нанесения на колонку и после элюции с колонки путем определения оптической плотности (ОП) при 560 нм и подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ/мл). Как видно из приведенной ниже таблицы, приблизительно 90% и 50%  иммобилизуются на колонке.
Таблица 5Связывание <i>H.pylori </i>и <i>S.aureus</i> с гепаринизированной стекловатой
ОП<sub>560</sub>
КОЕ/мл
связывание
Бактерия
До
После
До
После
%
H.pylori ATCC 43504
8,33
0,81
2×10<sup>8</sup>
1,5×10<sup>7</sup>
~90,0
H.pylori ATCC 43504
8,33
1,86
2×10<sup>8</sup>
1×10<sup>7</sup>
~90,0
S.aureus CCUG 12600
9,30
5,5
7,7×10<sup>9</sup>
3,6×10<sup>9</sup>
~50,0
S.aureus CCUG 12600
9,30
6,9
7,7×10<sup>9</sup>
3,6×10<sup>9</sup>
~50,0