СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННЫХ ТРОМБОЦИТОВ
METHOD FOR PRODUCING PURIFIED THROMBOCYTES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Настоящее изобретение относится к способу получения очищенных тромбоцитов из культуры мегакариоцитов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Препараты тромбоцитов вводят пациентам, страдающим потерей большого объема крови при хирургическом вмешательстве или травме, или склонностями к кровотечению, связанными с тромбоцитопенией после противораковой терапии, с целью лечения и профилактики симптомов. В настоящее время препараты тромбоцитов зависят от донорской крови от здоровых волонтеров. Однако количество доноров крови в Японии снижается из-за изменения структуры популяции, и, как оценивается, сократится приблизительно до 1 миллиона доноров крови к 2027 году. Таким образом, обеспечение стабильного снабжения тромбоцитами является важным направлением на данном уровне техники.
[0003] Кроме того, так как традиционные препараты тромбоцитов несут высокий риск бактериальной инфекции, для препаратов тромбоцитов существует возможность вызывать серьезные инфекции после их трансфузии. Следовательно, существует постоянная потребность в безопасных препаратах тромбоцитов для клинического применения. Для того чтобы соответствовать этой цели в настоящее время разработан способ получения тромбоцитов из мегакариоцитов, культивируемых in vitro.
[0004] При трансфузии препарата тромбоцитов существуют редкие случаи, при которых эта трансфузия вызывает трансфузионную реакцию (такую как крапивница или анафилактическая реакция). Как предполагается, одной из причин является наличие плазмы в препарате тромбоцитов. Следовательно, чтобы предотвратить такие трансфузионные реакции, был разработан способ, с помощью которого плазму, присутствующую в препарате тромбоцитов, заменяли искусственно полученной жидкостью (раствором для промывки/хранения). Например, один способ включает промывку тромбоцитов с использованием центрифужного сепаратора, снабженного сепарационным резервуаром для промывки тромбоцитов из концентрата тромбоцитов. Концентрат тромбоцитов, как обозначается в настоящем документе, представляет собой концентрат, полученный путем сбора компонентов крови, удаления основной части лейкоцитов и суспендирования собранных тромбоцитов в плазме.
[0005] С другой стороны, в случае получения тромбоцитов путем культивирования мегакариоцитов in vitro необходимо отделять тромбоциты от мегакариоцитов и концентрировать их. Так как они не могут быть отделены с помощью клеточного сортера, поскольку оба типа клеток имеют одинаковые маркеры поверхности, для разделения тромбоцитов и мегакариоцитов используется способ, включающий разделение с помощью фильтра или мембран из полых волокон на основе использования различия в размерах, или способ, включающий центрифужное разделение с использованием центрифужной пробирки. Однако в случае способов, использующих фильтр или мембрану из полых волокон, в дополнение к тому, что тромбоциты теряют физиологическую активность из-за повреждения белков поверхности, степень выхода тромбоцитов является низкой и составляет приблизительно только 10%. Кроме того, способы с использованием центрифужного разделения имеют ряд проблем, связанных с низкой степенью удаления мегакариоцитов из-за использования низкой скорости центрифугирования для предотвращения снижения функции, с низкой степенью выхода тромбоцитов приблизительно 10%, и с лимитированием объемом центрифужной пробирки количества тромбоцитов, которое может быть очищено одновременно.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача
[0006] Целью настоящего изобретения является предоставление способа получения очищенных тромбоцитов высокого качества из культуры мегакариоцитов путем отделения и очистки большого количества тромбоцитов в одной загрузочной партии и с высокой степенью выхода.
Решение задачи
[0007] В результате проведения интенсивных исследований для решения указанных выше задач изобретатели настоящего изобретения обнаружили, что тромбоциты высокого качества могут быть очищены с высокой степенью выхода из культуры мегакариоцитов в результате подвергания культуры мегакариоцитов центрифужной обработке при предварительно определенной силе центрифугирования с последующей повторной центрифужной обработкой жидкого компонента, полученного с помощью указанной выше центрифужной обработки, при более высокой центробежной силе.
[0008] А именно изобретение относится к указанному ниже.
[1] Способ получения очищенных тромбоцитов из культуры мегакариоцитов, который включает:
первую стадию центрифужного разделения для центрифужного разделения культуры при центробежной силе от 150×g до 550×g; и
вторую стадию центрифужного разделения для центрифужного разделения при центробежной силе от 600×g до 4000×g жидкого компонента, полученного на первой стадии центрифужного разделения.
[2] Способ, описанный в п.[1], где стадии центрифужного разделения осуществляются с помощью центрифужного сепаратора, снабженного: сепарационным резервуаром, предоставляемым с внутренней стенкой, к которой пристают вещества, имеющие высокий удельный вес, соответствующий центробежной силе, и выходным отверстием, через которое жидкий компонент вытекает после разделения; и получение обозначает получение жидкого компонента, который вытекает из выходного отверстия.
[3] Способ, описанный в п.[2], который включает:
стадию отмывки путем добавления раствора для отмывки к сепарационному резервуару с последующим вращением после второй стадии центрифужного разделения; и
стадию получения тромбоцитов путем добавления полученного раствора с последующим вращением после стадии отмывки.
[4] Способ, описанный в п.[2] или [3], где на первой стадии центрифужного разделения культуру вводят в сепарационный резервуар, позволяя культуре по каплям попадать туда под действием силы тяжести.
[5] Способ, описанный в любом из пп. с [1] по [4], где культуру мегакариоцитов получают с помощью стадий:
гиперэкспрессии ракового гена и гена Polycomb в клетках, менее дифференцированных, чем мегакариоциты;
гиперэкспрессии гена Bcl-xL в клетках; и
терминации всякой гиперэкспрессии.
[6] Способ получения препарата крови, который включает: стадию смешивания очищенных тромбоцитов, полученных способом, описанным в любом из пп. с [1] по [3] выше, с другим компонентом.
Полезные эффекты изобретения
[0009] В соответствии со способом по настоящему изобретению, так как тромбоциты высокого качества могут быть очищены из культуры мегакариоцитов в одной загрузочной партии и с высокой степенью выхода, могут быть получены безопасные препараты тромбоцитов, характеризующиеся низким риском бактериального загрязнения, которые могут предлагаться в больших количествах.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0010] На фиг. 1 представлены результаты измерения количества тромбоцитов до и после очистки с помощью способа очистки по настоящему изобретению.
На фиг. 2 представлены результаты измерения физиологической активности тромбоцитов после очистки с помощью способа очистки по настоящему изобретению.
На фиг. 3 представлены результаты измерения процента необычных тромбоцитов после очистки с помощью способа очистки по настоящему изобретению.
На фиг. 4 представлены результаты измерения физиологической активности тромбоцитов через 6 дней после очистки тромбоцитов с помощью способа очистки по настоящему изобретению.
На фиг. 5 представлены результаты измерения процента необычных тромбоцитов через 6 дней после очистки тромбоцитов с помощью способа очистки по настоящему изобретению.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0011] Способ получения тромбоцитов по настоящему изобретению включает две или более стадий центрифужного разделения для центрифужного разделения образца, содержащего мегакариоциты, при разных центробежных силах. Например, первую стадию центрифужного разделения можно осуществлять при центробежной силе от приблизительно 150×g до приблизительно 550×g, и вторую стадию центрифужного разделения можно осуществлять при центробежной силе от приблизительно 600×g до приблизительно 4000×g. Стадии центрифужного разделения могут быть осуществлены с помощью центрифужного сепаратора, снабженного: вращающимся сепарационным резервуаром, предоставляемым с внутренней стенкой, к которой пристают вещества, имеющие высокий удельный вес, соответствующий центробежной силе, и выходным отверстием, через которое жидкий компонент вытекает после разделения; и получение обозначает получение жидкого компонента, который вытекает из выходного отверстия.
[0012] В этом центрифужном сепараторе, когда вводят жидкую смесь при вращении сепарационного резервуара вокруг оси, проходящей через него и перпендикулярной его дну, компоненты, имеющие высокий удельный вес, пристают к внутренней стенке сепарационного резервуара и откладываются на ней в соответствии с центробежной силой, тогда как компоненты, имеющие более низкий удельный вес, остаются в жидкости.
[0013] Жидкость, содержащая компоненты, имеющие низкий удельный вес, получают с помощью средств получения. Средства получения состоят, например, из трубки, соединенной с выходным отверстием сепарационного резервуара, и заменяемого мешка для получения, соединенного с трубкой. Не существует особых ограничений в отношении мешка для получения, предлагаемого так, чтобы он не влиял на качество тромбоцитов, и могут быть использованы имеющиеся в продаже мешки для хранения крови или компонентов крови.
[0014] Так как центрифужный сепаратор способен осуществлять центрифужное разделение при введении жидкой смеси в сепарационный резервуар при предварительно определенной скорости и одновременно позволяет получать отделенную жидкость с помощью средств получения, большое количество жидкой смеси может быть разделено непрерывно независимо от объема сепарационного резервуара.
[0015] Примеры центрифужных сепараторов, которые можно использовать в способе получения очищенных тромбоцитов по настоящему изобретению, включают устройство, раскрытое в публикации патента JP-A-2005-296675, и устройство, раскрытое в публикации патента JP-A-H07-284529. Кроме того, может быть также использован имеющийся в продаже центрифужный сепаратор, используемый для разделения компонентов крови, или имеющееся в продаже устройство, используемое для отмывки тромбоцитов из концентрированных тромбоцитов. Например, может быть использована система ACP215, производимая Haemonetics Corporation, или система COBE2991, производимая Terumo Corporation.
[0016] В конкретном аспекте настоящего изобретения первая стадия центрифужного разделения может осуществляться с помощью вращения сепарационного резервуара при центробежной силе от приблизительно 150×g до приблизительно 550×g. Эта центробежная сила предпочтительно составляет от приблизительно 160×g до приблизительно 500×g, более предпочтительно от приблизительно 170×g до приблизительно 400×g и более предпочтительно от приблизительно 180×g до приблизительно 300×g. Мегакариоциты, присутствующие в культуре, пристают к внутренней стенке сепарационного резервуара и откладываются на ней в результате осуществления центрифужного разделения с центробежной силой в этих диапазонах. Если центробежная сила растет выше этих диапазонов, механическое раздражение действует на тромбоциты, вызывая реализацию физиологической активности в результате агрегации.
Кроме того, так как существуют следующие отношения между центробежной силой (g), скоростью вращения (об/мин) и радиусом вращения (см), скорость вращения может быть определена в соответствии с размером используемого вращающегося резервуара.
2
-8
Центробежная сила (g)=1119×радиус ротора (см) ×(скорость вращения (об/мин))×10
[0017] На этой стадии к культуре мегакариоцитов может быть добавлен раствор хранящихся тромбоцитов. Его примером является раствор A (кислота-цитрат-декстроза: ACD-A) сохраненных стандартов биологических продуктов крови. ACD-A обладает антикоагуляторным действием в отношении крови и тромбоцитов, а также функционирует как источник снабжения глюкозой, которая используется тромбоцитами как источник энергии.
[0018] В течение первой стадии центрифужного разделения не существует особых ограничений в отношении метода, используемого для введения культуры мегакариоцитов в сепарационный резервуар, и может быть использована помпа, предлагаемая с устройством, или сосуд, содержащий культуру, и сепарационный резервуар могут быть соединены с трубкой, сосуд может быть подвешен на более высоком уровне, чем сепарационный резервуар, и культуре можно позволить вытекать по каплям через трубку в резервуар под действием силы тяжести. Скорость введения может, например, составлять от приблизительно 50 мл/мин до приблизительно 150 мл/мин, от приблизительно 80 мл/мин до приблизительно 130 мл/мин или приблизительно 100 мл/мин.
[0019] Первую стадию центрифужного разделения можно осуществлять при комнатной температуре. Продолжительность первой стадии центрифужного разделения может быть равна или более того количества времени, которое получают при делении объема культуры на скорость введения культуры.
На первой стадии центрифужного разделения тромбоциты остаются в растворе и их получают средствами получения.
[0020] Вторая стадия центрифужного разделения в способе очистки тромбоцитов по настоящему изобретению представляет собой стадию отделения тромбоцитов от жидкого компонента, полученного на первой стадии центрифужного разделения.
После первой стадии центрифужного разделения жидкий компонент, полученный на первой стадии центрифужного разделения, вводят при вращении сепарационного резервуара после замены или отмывки сепарационного резервуара. Введение можно осуществлять тем же способом, что и на первой стадии центрифужного разделения. Полученный мешок, используемый на первой стадии центрифужного разделения, подвешивают на высоком уровне, и жидкий компонент может быть введен в сепарационный резервуар в результате возможности вытекания по каплям жидкого компонента под действием силы тяжести через трубку.
[0021] В конкретном аспекте настоящего изобретения вторая стадия центрифужного разделения может также осуществляться путем вращения сепарационного резервуара при центробежной силе от приблизительно 600×g до приблизительно 4000×g. Эта центробежная сила может предпочтительно составлять от приблизительно 800×g до приблизительно 3000×g и более предпочтительно от приблизительно 100×g до приблизительно 2000×g. Тромбоциты могут приставать к внутренней стенке сепарационного резервуара и откладываться на ней без возникновения потери физиологической активности в результате выполнения центрифужного разделения с центробежной силой в пределах этих диапазонов.
Вторую стадию центрифужного разделения можно осуществлять при комнатной температуре. Продолжительность первой стадии центрифужного разделения может быть равна или более того количества времени, которое получают при делении объема жидкого компонента, полученного на первой стадии центрифужного разделения, на скорость введения жидкости.
Жидкий компонент, отделенный на второй стадии центрифужного разделения, получают и отбрасывают средствами получения.
[0022] В другом аспекте стадию отмывки можно осуществлять после второй стадии центрифужного разделения. На второй стадии центрифужного разделения вместе с тромбоцитами к внутренней стенке сепарационного резервуара пристают среды и добавки и откладываются на ней. Стадию отмывки осуществляют, чтобы удалить эту среду.
На стадии отмывки раствор для отмывки добавляют к сепарационному резервуару с последующим вращением при центробежной силе от приблизительно 600×g до приблизительно 3600×g. В виде раствора для промывки может быть использован бикарбонатный раствор Рингера, такой как Bicarbon. Кроме того, раствор для хранения тромбоцитов может быть добавлен к Bicarbon. Раствор ACD, например, может быть добавлен к раствору для хранения тромбоцитов. Более того, раствор для отмывки вводят с постоянной скоростью при добавлении раствора к сепарационному резервуару. В это время тромбоциты поддерживаются прикрепленными к внутренней стенке сепарационного резервуара, и раствор для отмывки, содержащий среду и добавки, получают с помощью средств получения.
[0023] В другом аспекте стадия получения тромбоцитов может быть осуществлена после стадии отмывки. На стадии получения раствор для получения добавляют для получения тромбоцитов, прикрепленных к внутренней стенке сепарационного резервуара, с последующим вращением при центробежной силе от приблизительно 600×g до приблизительно 3600×g. В результате тромбоциты отделяются от сепарационного резервуара и суспендируются в растворе для получения. Bicarbon, например, может быть использован в качестве раствора для получения, и он вводится в сепарационный резервуар с постоянной скоростью. 5% ACD может быть добавлен к Bicarbon. Раствор для получения, содержащий тромбоциты, вытекает из выходного отверстия сепарационного резервуара и поступает в мешок для получения или в другие средства для получения. Они могут быть использованы в качестве конечного продукта.
[0024] В представленном описании «мегакариоцит» относится к наиболее крупной клетке, присутствующей в организме в костном мозге и характеризующейся высвобождением тромбоцитов. Мегакариоциты характеризуются как позитивные в отношении маркеров клеточной поверхности CD41a, CD42a и CD42b, и могут дополнительно экспрессировать маркеры клеточной поверхности CD9, CD61, CD62p, CD42c, CD42d, CD49f, CD51, CD110, CD123, CD131 и CD203c. Когда мегакариоциты становятся многоядерными (полиплоидными), они имеют геном, превышающий геном нормальных клеток от 16 до 32 раз. В представленном описании в случае простого обращения к «мегакариоцитам» включаются как многоядерные мегакариоциты, так и предшественники многоядерных мегакариоцитов, с учетом того, что они имеют представленные выше характеристики. «Предшественники многоядерных мегакариоцитов» имеют то же значение, что и «незрелые мегакариоциты» или «мегакариоциты в фазе роста».
[0025] Мегакариоциты могут быть получены с помощью различных известных способов. Неограничивающим примером способа получения мегакариоцитов является способ, описанный в патенте WO 2011/034073. В этом способе клеточная линия неограниченно пролиферирующих иммортализованных мегакариоцитов может быть получена путем гиперэкспрессии ракового гена или гена Polycomb в «клетках, менее дифференцированных, чем мегакариоциты». Кроме того, в соответствии с методом, описанным в патенте WO 2012/157586, клеточная линия иммортализованных мегакариоцитов может быть получена путем гиперэкспрессии гена супрессора апоптоза в «клетках, менее дифференцированных, чем мегакариоциты». Эти клеточные линии иммортализованных мегакариоцитов могут быть доведены до многоядерных и высвобождающих тромбоциты путем терминации гиперэкспрессии гена.
[0026] Для того, чтобы получить мегакариоциты, указанные выше способы, описанные в литературе, можно также сочетать. В этом случае гиперэкспрессия ракового гена, гена Polycomb и гена супрессора апоптоза может быть осуществлена одновременно или последовательно. Например, многоядерные мегакариоциты могут быть получены путем гиперэкспрессии ракового гена и гена Polycomb, подавления их гиперэкспрессии, гиперэкспрессии гена супрессора апоптоза и, наконец, подавления его гиперэкспрессии. Кроме того, многоядерные мегакариоциты могут быть также получены путем одновременной гиперэкспрессии ракового гена, гена Polycomb и гена супрессора апоптоза с последующим одновременным подавлением их гиперэкспрессии. Альтернативно, многоядерные мегакариоциты могут быть получены сначала с помощью гиперэкспрессии ракового гена и гена Polycomb с последующей гиперэкспрессией гена супрессора апоптоза и затем с одновременным подавлением гиперэкспрессии всех трех генов.
[0027] В настоящем описании «клетки, менее дифференцированные, чем мегакариоциты», относятся к клеткам, обладающим способностью к дифференцировке в мегакариоциты на одной из различных стадий дифференцировки от гематопоэтических стволовых клеток к мегакариоцитам. Неограничивающие примеры клеток, менее дифференцированных, чем мегакариоциты, включают гематопоэтические клетки-предшественники, CD34-позитивные клетки и клетки-предшественники мегакариоцитного-эритроидного ряда (MEP). Эти клетки могут быть выделены и получены, например, из костного мозга, крови пуповины или периферической крови, и могут быть получены путем индукции их дифференцировки из менее дифференцированных клеток в виде плюрипотентных стволовых клеток, таких как клетки ES или клетки iPS.
[0028] В настоящем описании «раковый ген», относится к гену, который индуцирует злокачественную трансформацию клеток организма, и его примеры включают гены семейства MYC (такие как c-MYC, N-MYC или L-MYC), гены семейства SRC, гены семейства RAS, гены семейства RAF и гены семейства протеинкиназ, такие как c-Kit, PDGFR или Abl.
[0029] В настоящем описании «ген Polycomb» известен как ген, который функционирует для избегания клеточного старения в результате негативной регуляции гена CDKN2a (INK4a/ARF) (Okura, et al., Regenerative Medicine, Vol. 6, No. 4, pp. 26-32; Jseus et al., Jseus et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology, Vol. 7, pp. 667-677, 2006; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 100, pp. 211-216, 2003). Неограничивающие примеры генов Polycomb включают BMI1, Mel18, Ring1a/b, Phc1/2/3, Cbx2/4/6/7/8, Ezh2, Eed, Suz12, HADC и Dnmt1/3a/3b.
[0030] В настоящем описании «ген супрессор апоптоза», относится к гену, обладающему функцией подавления апоптоза клетки, и примеры его включают ген BCL2, ген BCL-xL, ген Survivin и ген MCL1.
[0031] Усиленной экспрессии гена и терминации гиперэкспрессии можно достигнуть с помощью методов, описанных в патентах WO 2011/034073, WO 2012/157586, WO 2014/123242, метода, описанного в статье Nakamura, S., et al., Cell Stem Cell, 14, 535-548, 2014, или с помощью других известных методов.
[0032] В настоящем описании «тромбоциты» характеризуются как представляющие собой одни из клеточных компонентов крови, которые являются CD41a-позитивными и CD42b-позитивными. В дополнение к осуществлению важной роли в образовании тромбов и гемостазе тромбоциты также вовлечены в регенерацию тканей после повреждения и патофизиологию воспаления. Когда тромбоциты активируются в результате гемостаза и тому подобного, на их мембране появляются рецепторы факторов клеточной адгезии, такие как интегрин αIIBβ3 (гликопротеин IIb/IIIa: комплекс CD41a и CD61). В результате тромбоциты агрегируют друг с другом, и образуется сгусток фибрина под действием различных типов факторов свертывания крови, высвобождаемых из тромбоцитов, что ведет к образованию тромбов.
[0033] Тромбоциты, очищенные с помощью способа по настоящему изобретению, характеризуются высоким качеством. Очищенные тромбоциты высокого качества в терминах настоящего описания относятся к тромбоцитам, которые поддерживают высокий уровень физиологической активности на фракцию и имеют достаточно низкое количество необычных тромбоцитов в результате удаления по существу всех мегакариоцитов.
[0034] Физиологическая активность тромбоцитов может быть оценена путем ее измерения в соответствии с известным методом. Например, количество активированных тромбоцитов может быть измерено с использованием антитела против PAC-1, которое специфически связывается с интегрином αIIBβ3 на мембранах активированных тромбоцитов. Кроме того, количество активированных тромбоцитов может быть также измерено путем сходного определения маркера активации тромбоцитов, CD62p (P-селектина), с помощью антитела. Например, количество активированных тромбоцитов может быть измерено путем установки дискриминационного окна для антитела против независимого от активации маркера тромбоцитов CD61 или CD41 с использованием проточной цитометрии, с последующим определением связывания антитела против PAC-1 и антитела против CD62p. Эти стадии могут осуществляться в присутствии аденозиндифосфата (АДФ).
[0035] Кроме того, оценка функции тромбоцитов может быть осуществлена путем выявления того, будет ли фибриноген связываться в присутствии АДФ или нет. Активация интегрина, требуемая на ранней стадии образования тромба, наступает в результате связывания тромбоцитов с фибриногеном.
Более того, оценка функции тромбоцитов может быть также осуществлена с помощью метода, включающего визуализацию способности образовывать тромбы in vivo, как показано на фиг. 6 патента WO 2011/034073.
[0036] С другой стороны, тромбоциты оценивают как поврежденные или необычные в тех случаях, когда степень экспрессии CD42b или частота присутствия аннексина V является низкой. Эти тромбоциты не образуют адекватные тромбы или не имеют гемостазных функций и не пригодны клинически.
[0037] В настоящем описании «повреждение тромбоцитов» относится к снижению CD42b (GPIbα) на поверхности тромбоцитов. Таким образом, поврежденные тромбоциты включают тромбоциты, у которых экспрессия CD42b снижена, и тромбоциты, у которых внеклеточная область CD42b отщеплена в результате реакции шеддинга. В том случае, когда CD42b больше не присутствует на поверхности тромбоцита, связь с фактором фон Виллебранда (VWF) становится больше невозможной и в результате этого функция тромбоцитов в отношении свертывания крови теряется. Повреждение тромбоцитов может быть оценено с использованием в качестве показателя отношения частоты отсутствия CD42b (или количества CD42b-негативных частиц) к частоте присутствия CD42b (или количества CD42b-позитивных частиц) во фракции тромбоцитов. Тромбоциты становятся все более поврежденными, чем выше частота отсутствия CD42b относительно частоты присутствия CD42b или чем выше количество CD42b-негативных частиц относительно количества CD42b-позитивных частиц. Количество CD42b-позитивных частиц относится к проценту тромбоцитов, способных связываться с антителом против CD42b, среди всех тромбоцитов, содержащихся во фракции тромбоцитов, тогда как количество CD42b-негативных частиц относится к проценту тромбоцитов, не способных связываться с антителом против CD42b, среди всех тромбоцитов, содержащихся во фракции тромбоцитов.
[0038] В настоящем описании «необычные тромбоциты» относятся к тромбоцитам, у которых отрицательно заряженный фосфолипид, фосфатидилсерин, начинает экспонироваться не внутри, а снаружи липидного бислоя. В организме фосфатидилсерин экспонируется на поверхности тромбоцитов, сопровождая их активацию, и каскад реакций свертывания крови, как известно, усиливается в результате связывания с ним многочисленных факторов свертывания крови. С другой стороны, у необычных тромбоцитов большое количество фосфатидилсерина постоянно экспонируется на поверхности тромбоцитов и, если эти тромбоциты вводят больному, можно вызвать реакцию избыточного свертывания крови, что может привести к серьезным заболеваниям, таким как синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Так как аннексин V связывается с фосфатидилсерином, фосфатидилсерин на поверхности тромбоцитов может быть определен с помощью проточной цитометрии, используя количество флуоресцентно меченного аннексина V, связанного с ним, в качестве индикатора. Соответственно, количество необычных тромбоцитов может быть оценено на основе частоты присутствия аннексина V во фракции тромбоцитов, или, другими словами, на основе процента или количества тромбоцитов, связанных с аннексином. Количество необычных тромбоцитов тем выше, чем выше частота присутствия аннексина V, или чем больше количество частиц, связанных с аннексином V.
2
2
2
[0039] Обычные условия могут быть использованы для культивирования мегакариоцитов по настоящему изобретению. Например, мегакариоциты можно культивировать при температуре от приблизительно 35°С до приблизительно 42°С, от приблизительно 36°С до приблизительно 40°С или от приблизительно 37°С до приблизительно 39°С при от 5% CO до 15% CO и/или 20% O.
[0040] не существует особых ограничений относительно среды, используемой при культивировании мегакариоцитов, и может подходить для использования известная среда, предпочитаемая для получения тромбоцитов из мегакариоцитов, или среда, соответствующая ей. Например, среда может быть получена путем подходящего использования среды, применяемой в качестве базальной среды для культивирования клеток животных. Примеры базальных сред включают среду IMDM, среду 199, минимально необходимую среду Игла (EMEM), среду αMEM, модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM), среду Ham's F12, среду RPMI 1640, среду Фишера, нейробазальную среду (Life Technologies Inc.) и их смеси.
[0041] Среда может содержать сыворотку или плазму или может быть свободна от сыворотки. Если необходимо, в среде может также содержаться одно или более таких веществ, как альбумин, инсулин, трансферрин, селен, жирные кислоты, микроэлементы, 2-меркаптоэтанол, тиоглицерин, монотиоглицерин (MTG), липиды, аминокислоты (такие как L-глутамин), аскорбиновая кислота, гепарин, заменимые аминокислоты, витамины, факторы роста, соединения низкой молекулярной массы, антибиотики, антиоксиданты, пировиноградная кислота, буферы, неорганические соли или цитокины. Цитокины относятся к белкам, которые стимулируют дифференцировку гематопоэтических клеток, и их примеры включают фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), тромбопоэтин (TPO), различные типы агентов, подобных TPO, фактор стволовых клеток (SCF), добавка ITS (инсулин-трансферрин-селен) и ингибиторы ADAM. Предпочтительная среда по настоящему изобретению представляет собой среду IMDM, содержащую сыворотку, инсулин, трансферрин, селен, тиоглицерин, аскорбиновую кислоту и TPO. Среда может дополнительно содержать SCF и может дополнительно содержать гепарин. Хотя не существует особых ограничений относительно концентрации каждого вещества, и TPO, например, может содержаться в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 200 нг/мл или от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, SCF может содержаться в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 200 нг/мл или приблизительно 50 нг/мл, и гепарин может содержаться в концентрации от приблизительно 10 Е/мл до приблизительно 100 Е/мл или приблизительно 25 Е/мл. Может быть также добавлен форболовый эфир (такой как форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA)).
[0042] В случае использования сыворотки предпочтительна сыворотка человека. Кроме того, вместо сыворотки может быть использована плазма человека и тому подобное. В соответствии со способом по настоящему изобретению тромбоциты, эквивалентные тромбоцитам, полученным при использовании сыворотки, могут быть получены даже при использовании этих компонентов.

[0043] Система индукции экспрессии генов, чувствительная к лекарственным средствам, типа системы Tet-on или Tet-off может быть использована для гиперэкспрессии гена или для терминации этой гиперэкспрессии. В этом случае на стадии гиперэкспрессии гиперэкспрессию можно ингибировать в результате содержания в среде соответствующего лекарственного средства, такого как тетрациклин или доксициклин, с последующим удалением его из среды.
[0044] Так как стадия культивирования мегакариоцитов по настоящему изобретению осуществляется в суспензионной культуре, культивирование может осуществляться в отсутствии клеток-фидеров.
[0045] «Культура мегакариоцитов» по настоящему изобретению относится к культуре, полученной на указанной выше стадии культивирования, и она содержит культуральный бульон, содержащий мегакариоциты и различные добавки.
[0046] Настоящее изобретение также включает тромбоциты, очищенные с помощью способа по настоящему изобретению.
[0047] Способ получения препарата крови по настоящему изобретению включает стадию получения препарата тромбоцитов с использованием способа по настоящему изобретению и стадию смешивания препарата тромбоцитов с другим компонентом. Примером другого компонента являются эритроциты.
Настоящее изобретение также включает препарат крови, очищенный этим методом.
Другие компоненты, вносящие вклад в стабилизацию клеток, также могут быть добавлены к препарату тромбоцитов и препарату крови.
[0048] Все раскрытия патентных документов и непатентных документов, цитируемые в настоящем описании, включены в настоящий документ в полном объеме в качестве ссылки.
ПРИМЕР
[0049] Несмотря на то, что далее предлагается подробное объяснение настоящего изобретения на основе его примеров, настоящее изобретение не ограничивается этим. Специалист в данной области техники способен модифицировать настоящее изобретение относительно его различных аспектов не выходя за рамки его существа, и все такие модификации включены в объем настоящего изобретения.
[0050] 1. Получение иммортализованных мегакариоцитов
1-1. Получение гематопоэтических прогениторных клеток из клеток iPS
2
2
Клетки iPS человека (TKDN SeV2: клетки iPS, происходящие из фибробластов кожи плода человека, полученные с использованием вирусов Сендай) культивировали для дифференцировки в клетки крови в соответствии с методом, описанным в статье Takayama, N., et al., J. Exp. Med., 2817-2830 (2010). А именно, колонии клеток ES/iPS человека культивировали совместно с клетками-фидерами C3H10T1/2 в присутствии 20 нг/мл VEGF (R&D Systems, Inc.) в течение 14 дней для получения гематопоэтических прогениторных клеток (HPC). Культивирование осуществляли в условиях 20% O и 5% CO (применяемых сходно в настоящем описании далее, если специально не указано иначе).
[0051] Система переноса генов

Систему лентивирусного вектора использовали в качестве системы переноса генов. Лентивирусные векторы представляют собой контролируемые тетрациклином Tet-on системы векторов для индукции экспрессии генов. Лентивирусные векторы получают путем рекомбинации кассеты mOKS LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G (Kobayashi, T., et al., Cell, 142, 787-799 (2010)) с c-MYC, BMI1 и BCL-xL. Полученные векторы представляют собой LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G, LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G и LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G, соответственно.
Вирусные частицы получали путем переноса в клетки 293T с указанными выше лентивирусными векторами.
Гены BMI1, MYC и BCL-xL переносили в последовательность генома клеток-мишеней путем инфицирования клеток-мишеней вирусными частицами. Эти гены были способны стабильно переноситься в клетки-мишени и затем гиперэкспрессироваться при добавлении к среде доксициклина (Clontech Laboratories, Inc., #631311).
[0052] 1-3. Вирусное инфицирование c-MYC и BMI1 гематопоэтических прогениторных клеток
4
HPC, полученные в соответствии с указанным выше способом, высевали в количестве 5×10 клеток/лунка в 6-луночный планшет с предварительно высеянными клетками-фидерами C3H10T1/2 для гиперэкспрессии c-MYC и BMI1 в соответствии с лентивирусным методом. В этот момент каждую из 6 лунок использовали для одного типа клеточной линии. А именно, вирусные частицы добавляли к среде до MOI 20, и клетки инфицировали вращательным инфицированием (центрифугированием в течение 60 минут при 32°С и 900 об/мин). Эту процедуру осуществляли дважды каждые 12 часов.
Используемую среду получали путем добавления 50 нг/мл тромбопоэтина человека (TPO, R&D Systems, Inc.), 50 нг/мл фактора стволовых клеток человека (SCF, R&D Systems, Inc.) и 2 мкг/мл доксициклина (Dox) к базальной среде (IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Sigma-Aldrich, Inc.), содержащей 15% сыворотки плодов телят (GIBCO), 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин (GIBCO), 1% раствор инсулин-трансферрин-селен (ITS-G, GIBCO), 0,45 мМ 1-тиоглицерин (Sigma-Aldrich, Inc.) и 50 мкг/мл L-аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich, Inc.)) (полученную среду обозначали как среда для дифференцировки), с последующим дополнительным добавлением в нее протамина до конечной концентрации 10 мкг/мл.
[0053] 1-4. Получение и поддержание культивирования саморазмножающихся линий мегакариоцитов
Линии мегакариоцитов
Определяя день, на который клетки инфицировали с помощью вируса c-MYC и BMI1 в соответствии с указанным выше методом, как день 0 инфицирования, получали каждую из саморазмножающихся линий мегакариоцитов путем культивирования мегакариоцитов с переносом генов c-MYC и BMI1 способом, описанным ниже. Форсированную экспрессию гена BMI1 и гена c-MYC осуществляли путем добавления к среде 1 мкг/мл доксициклина (Clontech Laboratories, Inc., #631311).
[0054] *Дни с 2 по 11 инфицирования
5
Инфицированные вирусом клетки крови, полученные в соответствии с указанным выше способом, получали пипетированием, и после удаления супернатанта центрифугированием в течение 5 минут при 1200 об/мин клетки ресуспендировали в свежей среде для дифференцировки и высевали на свежие клетки-фидеры C3H10T1/2 (6-луночный планшет). Субкультивирование осуществляли с помощью выполнения той же процедуры на 9 день. После подсчета количества клеток клетки высевали на клетки-фидеры C3H10T1/2 в количестве 1×10 клеток/2 мл/лунка (6-луночный планшет).
[0055] *Дни с 12 по 13 инфицирования
5
Выполняли такую же процедуру, что и на 2 день инфицирования. После подсчета количества клеток клетки высевали на клетки-фидеры C3H10T1/2 в количестве 3×10 клеток/10 мл/100 мм чашка (100 мм чашка).
[0056] *14 день инфицирования
5
Получали инфицированные вирусом клетки и давали взаимодействовать с антителом при использовании 2 мкл, 1 мкл и 1 мкл аликвоты антитела против CD41a-APC человека (BioLegend, Inc.), антитела против CD42b-PE человека (eBioscience) и антитела против CD235ab человека Pacific Blue (BioLegend, Inc.), соответственно, на 1,0×10 клеток. После взаимодействия клетки анализировали с использованием FACS Verse (Becton, Dickinson and Company). На 14 день инфицирования те клетки, которые имели степень позитивной реакции на CD41a 50% или более, обозначали как саморазмножающиеся линии мегакариоцитов.
[0057] 1-4. Инфицирование с помощью вируса саморазмножающихся мегакариоцитов BCL-xL
BCL-xL переносили в указанные выше линии саморазмножающихся мегакариоцитов на 14 день инфицирования в соответствии с лентивирусным методом. Вирусные частицы добавляли к среде до MOI 10, и клетки инфицировали вращательным инфицированием (центрифугированием в течение 60 минут при 32°С и 900 об/мин). Форсированную экспрессию гена BCL-xL осуществляли путем добавления к среде 1 мкг/мл доксициклина (Clontech Laboratories, Inc., #631311).
[0058] 1-5. Получение и поддержание культуры иммортализованных линий мегакариоцитов
*Дни с 14 по 18 инфицирования
5
Линии саморазмножающихся мегакариоцитов с перенесенным BCL-xL, полученные в соответствии с указанным выше способом, получали и центрифугировали в течение 5 минут при 1200 об/мин. После центрифугирования осажденные клетки суспендировали в свежей среде для дифференцировки с последующим высеванием на свежие клетки-фидеры C3H10T1/2 в количестве 2×10 клеток/2 мл/лунка (6-луночный планшет).
[0059] *18 день инфицирования: субкультивирование
5
После подсчета количества клеток клетки высевали в количестве 3×10 клеток/10 мл/100 мм чашка.
[0060] *24 день инфицирования: субкультивирование
5
После подсчета количества клеток клетки высевали в количестве 1×10 клеток/10 мл/100 мм чашка. Затем осуществляли субкультивирование каждые от 4 до 7 дней для осуществления поддержания культивирования.
5
[0061] Линии саморазмножающихся мегакариоцитов с перенесенным BCL-xL получали на 24 день и подвергали иммуноокрашиванию с использованием 2 мкл, 1 мкл и 1 мкл аликвоты антитела против CD41a-APC человека (BioLegend, Inc.), антитела против CD42b-PE человека (eBioscience) и антитела против CD235ab человека Pacific Blue (Anti-CD235ab-PB, BioLegend, Inc.), соответственно, на 1,0×10 клеток с последующим анализом клеток с использованием FACS Verse (Becton, Dickinson and Company), и те клетки, которые имели степень позитивной реакции на CD41a 50% или более на 24 день инфицирования, также обозначали линией иммортализованных мегакариоцитов. Эти клетки, способные пролиферировать на 24 день инфицирования и далее, обозначали линией иммортализованных мегакариоцитов SeV2-MKCL.
[0062] Полученные клетки SeV2-MKCL статически культивировали в 10 см чашках (10 мл/чашка). Используемую среду получали путем добавления следующих компонентов к среде IMDM, которая являлась базальной средой (в конечной концентрации).
FBS (sigma #172012, Lot. 12E261) 15%
L-глутамин (Gibco #25030-081) 2 мМ
ITS (Gibco #41400-045) 100-кратное разведение
MTG (монотиоглицерин, sigma #M6145-25ML) 450 мкМ
Аскорбиновая кислота (sigma #A4544) 50 мкг/мл
Пуромицин (sigma #P8833-100MG) 2 мкг/мл
SCF (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., #193-15513) 50 нг/мл
TPO-подобный агент, 200 нг/мл
2
Условия культивирования: 37°C, 5% CO
[0063] 2. Получение тромбоцитов
5
Затем гиперэкспрессию останавливали путем культивирования в среде, не содержащей доксициклин. Более конкретно, линию иммортализованных мегакариоцитов (SeV2-MKCL), полученную в соответствии со способом 1, промывали дважды PBS(-) и суспендировали в среде для получения тромбоцитов, как описано ниже. Плотность высевания клеток составляла 1,0×10 клеток/1 мл.
[0064] Тромбоциты получали путем культивирования в среде для получения тромбоцитов в течение 6 дней.
[0065] Среду для получения тромбоцитов (среда получения тромбоцитов) получали путем добавления следующих компонентов к среде IMDM, которая являлась базальной средой (в конечной концентрации).
FBS 15%
L-глутамин (Gibco #25030-081) 2 мМ
ITS (Gibco #41400-045) 100-кратное разведение
MTG (монотиоглицерин, sigma #M6145-25ML) 450 мкМ
Аскорбиновая кислота (sigma #A4544) 50 мкг/мл
SCF (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., #193-15513) 50 нг/мл
TPO-подобный агент, 200 нг/мл
Ингибитор ADAM, 15 мкМ
SR1, 750 нМ
Ингибитор ROCK, 10 мкМ
[0066] 3. Очистка тромбоцитов
3-1. Удаление мегакариоцитов
Полученный мешок заменяли одноразовым мешком для отходов одноразового набора ACP215, используя стерильный соединяющий аппарат. Мешок Hicaliq IVH (Terumo Corporation, HC-B3006A) использовали в качестве мешка для клеток.
Затем получали 2,4 л культурального бульона, содержащего мегакариоциты и полученные тромбоциты, выработанные на стадии получения тромбоцитов. 10% по объему раствор ACD-A добавляли к 2,4 л культурального бульона. Затем культуральный бульон, к которому был добавлен раствор ACD-A, вводили в мешок для клеток. Мешок Hicaliq IVH (Terumo Corporation, HC-B3006A) использовали в качестве мешка для клеток.
Затем мешок для клеток, содержащий культуральный бульон, соединяли с одноразовым набором ACP215 с использованием стерильного соединяющего аппарата.
ACP215 запускали в режиме обслуживания, и скорость центрифугирования устанавливали на 2000 об/мин (223,8 g).
Одноразовый набор ACP215 устанавливали в ACP215, и мешок для клеток, содержащий среду, помещали на подставку.
ACP215 запускали, и культуральный бульон, присутствующий в мешке для клеток, вводили в сепарационный резервуар со скоростью приблизительно 100 мл/мин. Элюат, который элюировался из резервуара, получали в мешок для получения.
После того, как все количество культурального бульона, присутствующее в мешке для клеток, было добавлено к резервуару, добавляли 500 мл раствора для отмывки.
После того, как раствор для отмывки был введен в сепарационный резервуар, центрифугирование прекращали, и мешок для получения, содержащий полученную жидкость (содержащую тромбоциты), отсоединяли с использованием герметизатора.
[0067] 3-2. Концентрирование, отмывка и получение
(1) Стадия концентрирования
Мешок для получения, содержащий полученную жидкость (содержащую тромбоциты), соединяли с новым одноразовым набором ACP215 с использованием стерильного соединяющего аппарата.
ACP215 запускали в нормальном режиме. Для программы отбирали WPC, и одноразовый набор ACP215, обладающий соединенным с ним указанным выше мешком для получения, устанавливали в соответствии с инструкциями системы. Далее мешок для получения, содержащий полученную жидкость, помещали на подставку.
Затем скорость центрифугирования ACP215 изменяли на 5000 об/мин (1398,8 g), и начинали центрифугирование.
Когда полученную жидкость начинали вводить в сепарационный резервуар, введение переключали с автоматического введения на ручное введение. Более конкретно, полученную жидкость получали для введения в сепарационный резервуар при скорости приблизительно 100 мл/мин. После того, как все количество полученной жидкости было добавлено к сепарационному резервуару, добавляли 500 мл раствора для отмывки.
(2) Стадия отмывки
Отмывку осуществляли путем отмывки 2000 мл раствора для отмывки в соответствии с программой ACP215.
(3) Получение
200 мл отмытых тромбоцитов получали в мешке для получения тромбоцитов в соответствии с программой ACP215.
[0068] 4. Измерение количества мегакариоцитов, количества тромбоцитов, физиологической активности тромбоцитов и необычных тромбоцитов
4-1. Способ измерения
Количество мегакариоцитов, количество тромбоцитов, физиологическую активность тромбоцитов и количество необычных тромбоцитов измеряли в препарате очищенных тромбоцитов.
При измерении количества мегакариоцитов, количества тромбоцитов и физиологической активности тромбоцитов 900 мкл разбавителя добавляли к 1,5 мл микропробирке с последующим добавлением 100 мкл культуры мегакариоцитов или полученного продукта после очистки тромбоцитов и смешивания. 200 мкл полученного раствора вносили в пробирку FACS с последующим добавлением меченого антитела и окрашивания.
При измерении количества необычных тромбоцитов 100 мкл культуры мегакариоцитов или полученного продукта после очистки тромбоцитов вносили в пробирку FACS с последующим добавлением меченого антитела и белка, окрашивания и анализа с помощью проточной цитометрии после 5-кратного разведения буфером для связывания аннексина V (BD) непосредственно перед анализом.
Используемые антитела указаны ниже.
(1) Измерение количества мегакариоцитов и количества тромбоцитов
1,0 мкл антитела против CD41a, меченного APC (Bio Legend 303710)
1,0 мкл антитела против CD42a, меченного PB (eBioscience 48-0428-42)
1,0 мкл антитела против CD42b, меченного PE (Bio Legend 393906)
(2) Измерение физиологической активности тромбоцитов
0,5 мкл антитела против CD42a, меченного PB (eBioscience 48-0428-42)
0,5 мкл антитела против CD42b, меченного PE (Bio Legend 303906)
0,5 мкл антитела против CD62p, меченного APC (Bio Legend 304910)
10 мкл антитела против PAC-1, меченного ФИТЦ (BD 303704)
(3) Измерение количества необычных тромбоцитов
1,0 мкл антитела против CD41a, меченного APC (Bio Legend 303710)
1,0 мкл антитела против CD42b, меченного PE (Bio Legend 303906)
5 мкл аннексина V, меченного ФИТЦ (BD 556419)
[0069] 4-2. Результаты измерения количества мегакариоцитов и количества тромбоцитов
Количество CD41a-позитивных и CD41b-позитивных частиц считали количеством тромбоцитов, и количество позитивных частиц считали количеством мегакариоцитов. Измеряли количество тромбоцитов и количество мегакариоцитов, содержащихся в культуре перед очисткой (культуре, культивируемой в течение 6 дней с использованием Versus), и в полученном продукте после очистки, соответственно.
Результаты представлены ниже и на фиг. 1.
[Таблица 1]
Перед очисткой(2600 мл)
После очистки(200 мл)
Выход (%)
Тромбоциты
2,40 × 10<sup>10</sup>
7,41 × 10<sup>9</sup>
30,8
Мегакариоциты
6,91 × 10<sup>8</sup>
1,60 × 10<sup>7</sup>
3,3
[0070] Из таблицы 1 ясно, что выход тромбоцитов составлял 30,8%. Кроме того, количество мегакариоцитов снижалось до 2,3% от наблюдаемого до очистки (степень удаления мегакариоцитов: 97,7%). Уровень полученных тромбоцитов повышался в 3 раза по сравнению с традиционными методами (методом с использованием фильтра и центрифужного разделения, методом с использованием центрифужных пробирок).
[0071] 4-3. Результаты измерения физиологической активности тромбоцитов
Тромбоциты стимулировали при комнатной температуре с помощью 0,2 мкМ PMA (форбол-12-миристат-13-ацетата, sigma #P1585-1MG) или 100 мкМ ADP (sigma #A2754), или 0,5 Е/мл тромбина (sigma). Физиологическую активность тромбоцитов измеряли с помощью FACS Verse (Becton, Dickinson and Company) через 30 минут после начала стимуляции.
Измеряли уровень позитивного PAC-1 и уровень позитивного CD62p (p-селектина) во фракции CD42a-позитивных тромбоцитов для сравнительной оценки физиологической активности.
Результаты представлены на фиг. 2. Уровень позитивного PAC-1 и уровень позитивного CD62p (p-селектина) повышался после стимуляции, и было подтверждено, что очищенные тромбоциты поддерживают высокий уровень физиологической активности.
[0072] 4-4. Результаты измерения необычных тромбоцитов
Количество частиц, позитивных в отношении аннексина V, использовали как показатель количества необычных тромбоцитов. Результаты представлены на фиг. 3.
Уровень позитивных в отношении аннексина V тромбоцитов был низким, 14,5%, указывая на то, что необычность тромбоцитов адекватно ингибировалась.
[0073] 4-5. Результаты измерения физиологической активности и необычных тромбоцитов через 6 дней после очистки
Физиологическую активность и необычность тромбоцитов измеряли через 6 дней после очистки с использованием тех же методов, что и описанные в представленных выше разделах 3-2 и 3-3.
Результаты представлены на фиг. 4 и 5.
Физиологическая активность тромбоцитов поддерживалась на высоком уровне, и количество необычных тромбоцитов было достаточно низким даже через 6 дней после очистки.