ВСТРЕЧАЮЩИЕСЯ В ПРИРОДЕ миРНК ДЛЯ КОНТРОЛИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
NATURALLY OCCURRING IN NATURE SIRNA TO CONTROL GENE EXPRESSION AND USE THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
[0001]
Настоящее изобретение относится к миРНК природного типа, которая ингибирует экспрессию генов, и ее применению.
Уровень техники
[0002]
МикроРНК (миРНК) известна как молекула нуклеиновой кислоты, которая ингибирует экспрессию генов и, как сообщается, ингибирует транскрипцию белка, кодированного геном, посредством, например, следующего синтетического процесса. То есть, в ядре образуется продукт транскрипции миРНК (прай-миРНК), имеющий кэп-структуру на 5'-конце и поли(А)-хвост на 3'-конце. Вышеуказанная прай-миРНК расщепляется под действием РНКазы (Drosha) с образованием предшественника миРНК (пре-миРНК). Вышеуказанная пре-миРНК образует структуру «шпильки», имеющую область «петли» и область «стебля». Пре-миРНК выходит из ядра и разрушается под действием РНКазы (Dicer) в цитоплазме, и высвобождается двухцепочечная миРНК (зрелая миРНК), имеющая «свисающий конец» из 1-4 оснований на 3'-конце. Одна из цепей двухцепочечной миРНК называется ведущей цепью, и другая цепь называется «пассажирской» цепью, и вышеуказанная ведущая цепь связывается с комплексом, подобным комплексу сайленсинга, индуцированного РНК (RISC). Данный комплекс миРНК/RISC связывается с 3'-нетранслируемой областью (3'UTR) определенной мРНК, приводя к ингибированию трансляции белка из вышеуказанной мРНК.
[0003]
Было установлено, что миРНК тесно вовлечена в жизненно важные процессы, такие как дифференцировка, пролиферация клеток, апоптоз и тому подобное, и также развитие многих заболеваний, таких как вирусные инфекции, рак и тому подобное (патентный документ 1, непатентный документ 1, непатентный документ 2). Отсюда предполагается ее применение, в частности, в области медицины.
Список документов
Патентный документ
[0004]
Патентный документ 1: WO 2010/056737 A2
Непатентные документы
[0005]
Непатентный документ 1: Deiters, 2009, AAPS Journal, 12, 51-60
Непатентный документ 2: Takeshita et al., 2010, Mol. Ther., 18, 181-187
Сущность изобретения
Проблемы, решаемые изобретением
[0006]
Для применения вышеуказанной миРНК, например, имеется способ, включающий применение двухцепочечной зрелой миРНК или пре-миРНК и тому подобное. Однако в первом случае до применения необходим отжиг двух молекул одноцепочечных нуклеиновых кислот, что создает возможность развития аутоиммунитета с участием TLR3 и тому подобное, который распознает двойную цепь. С другой стороны, в последнем случае большое количество нуклеотидов затрудняет синтез, что является невыгодным с точки зрения стоимости, и также создает проблемы, связанные с переносом внутрь клеток и фармакокинетикой.
[0007]
Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечение миРНК природного типа, для которой используется структура зрелой миРНК.
В настоящем описании «миРНК природного типа» означает молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащую ведущую нить и «пассажирскую» цепь природной зрелой миРНК и обладающую таким же качеством активности, как зрелая миРНК (т.е. активности ингибирования экспрессии гена-мишени), и фрагмент, отличный от ведущей цепи и «пассажирской» цепи, который может содержать искусственный составляющий элемент.
Способы решения проблем
[0008]
Для достижения вышеуказанной цели миРНК природного типа по настоящему изобретению представляет собой одноцепочечную нуклеиновую кислоту, содержащую область X и область Y, отличающуюся тем, что 3'-конец вышеуказанной области Х и 5'-конец вышеуказанной области Y связаны посредством линкерной области ненуклеотидной структуры,
вышеуказанная область Х содержит (а) последовательность ведущей цепи или (b) последовательность «пассажирской» цепи зрелой миРНК,
когда область X содержит (а), то вышеуказанная область Y содержит последовательность «пассажирской» цепи вышеуказанной зрелой миРНК,
когда область X содержит (b), то вышеуказанная область Y содержит последовательность ведущей цепи вышеуказанной зрелой миРНК, и
вышеуказанная последовательность ведущей цепи и вышеуказанная последовательность «пассажирской» цепи образуют двухцепочечную структуру.
[0009]
Композиция по настоящему изобретению представляет композицию для ингибирования экспрессии гена и специфически содержит вышеуказанную миРНК природного типа по настоящему изобретению.
[0010]
Композиция по настоящему изобретению представляет фармацевтическую композицию, которая специфически содержит вышеуказанную миРНК природного типа по настоящему изобретению.
[0011]
Способ ингибирования экспрессии по настоящему изобретению представляет способ ингибирования экспрессии гена-мишени, в котором специфически используется вышеуказанная миРНК природного типа по настоящему изобретению.
[0012]
Способ лечения заболевания по настоящему изобретению включает стадию введения вышеуказанной миРНК природного типа по настоящему изобретению пациенту, где вышеуказанная последовательность ведущей цепи в вышеуказанной миРНК природного типа представляет последовательность ведущей цепи зрелой миРНК, которая ингибирует экспрессию генов, участвующих в развитии вышеуказанных заболеваний.
Эффект изобретения
[0013]
миРНК природного типа по настоящему изобретению можно легко синтезировать при низкой стоимости, и она может ингибировать трансляцию белка, кодированного вышеуказанным геном.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлено схематическое изображение одного варианта осуществления миРНК природного типа по настоящему изобретению.
На фиг. 2 представлен график, показывающий относительные значения количества мРНК AXL в примере 1.
На фиг. 3 представлен график, показывающий относительные значения количества мРНК AXL в примере 2.
На фиг. 4 представлен график, показывающий относительные значения количества мРНК AXL в примере 3.
На фиг. 5 представлен график, показывающий относительные значения количества мРНК HMGA2 в примере 4.
На фиг. 6 представлен график, показывающий относительные значения количества мРНК COL1A1 в примере 5.
На фиг. 7 представлен график, показывающий относительные значения количества мРНК AXL в примере 6.
На фиг. 8 представлен график, показывающий относительные значения количества мРНК HMGA2 в примере 7.
На фиг. 9 представлен график, показывающий относительные значения количества мРНК COL1A1 в примере 8.
На фиг. 10 представлен график, показывающий относительные значения количества мРНК AXL в примере 9.
На фиг. 11 представлен график, показывающий относительные значения количества мРНК COL1A1 в примере 10.
На фиг. 12 представлен т график, показывающий относительные значения количества мРНК COL1A1 в примере 11.
На фиг. 13 представлен график, показывающий относительные значения количества мРНК COL1A1 в примере 11.
Описание вариантов осуществления
[0015]
Если не указано иное, то термины, использованные в настоящем описании, означают то, что обычно они означают в данной области техники.
[0016]
(1) миРНК природного типа
миРНК природного типа по настоящему изобретению представляет, как упоминалось выше, одноцепочечную нуклеиновую кислоту, содержащую область X и область Y, отличающуюся тем, что 3'-конец вышеуказанной области Х и 5'-конец вышеуказанной области Y связаны посредством линкерной области ненуклеотидной структуры,
вышеуказанная область Х содержит (а) последовательность ведущей цепи или (b) последовательность «пассажирской» цепи зрелой миРНК,
когда область X содержит (а), то вышеуказанная область Y содержит последовательность «пассажирской» цепи вышеуказанной зрелой миРНК,
когда область X содержит (b), то вышеуказанная область Y содержит последовательность ведущей цепи вышеуказанной зрелой миРНК, и
вышеуказанная последовательность ведущей цепи и вышеуказанная последовательность «пассажирской» цепи образуют двухцепочечную структуру.
Насколько вышеуказанная область Х содержит (a) последовательность ведущей цепи или (b) последовательность «пассажирской» цепи, ограничивается необязательно. Предпочтительно последовательность ведущей цепи и последовательность «пассажирской» цепи расположены в одном и том же направлении, что и встречающаяся в природе пре-миРНК (то есть, 5'→3' направлении или 3'→5' направлении). Когда встречающаяся в природе пре-миРНК состоит из ведущей цепи - области петли - «пассажирской» цепи в таком порядке в 5'-направлении, то миРНК природного типа по настоящему изобретению предпочтительно содержит последовательность ведущей цепи в вышеуказанной области Х. С другой стороны, когда встречающаяся в природе пре-миРНК состоит из ведущей цепи - области петли - «пассажирской» цепи в таком порядке от 3'-направления, то миРНК природного типа по настоящему изобретению предпочтительно содержит последовательность «пассажирской» цепи в вышеуказанной области Х.
В нижеприведенных примерах miR-34a и let-7a предпочтительно содержат последовательность ведущей цепи в вышеуказанной области X, и miR-29b предпочтительно содержит последовательность «пассажирской» цепи в вышеуказанной области Х.
[0017]
миРНК природного типа по настоящему изобретению может ингибировать, например, экспрессию гена-мишени. Ингибирование экспрессии означает, например, ингибирование трансляции вышеуказанного гена-мишени, то есть ингибирование трансляции белка, кодированного вышеуказанным геном-мишенью, более конкретно, ингибирование трансляции вышеуказанного белка из мРНК вышеуказанного гена-мишени. Вышеуказанное ингибирование экспрессии гена-мишени может быть подтверждено, например, снижением количества продукта транскрипции, полученного из гена-мишени; снижением активности вышеуказанного продукта транскрипции; снижением количества продукта трансляции, продуцированного из вышеуказанного гена-мишени; снижением активности вышеуказанного продукта трансляции; или т.п. Вышеуказанные белки могут представлять, например, зрелые белки, белки-предшественники, до того, как они подвергаются процессингу или посттрансляционной модификации.
[0018]
Поскольку миРНК природного типа по настоящему изобретению представляет собой молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты, то отжиг двух одиночных цепей не является необходимым, в отличие от зрелой миРНК, и ее можно получить с низкой стоимостью. Кроме того, поскольку миРНК природного типа по настоящему изобретению представляет собой молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты, то, например, она может избежать распознавания TLR3, RIG-I, MDA5 и т.п., участвующих в аутоиммунитете.
В миРНК природного типа по настоящему изобретению последовательность ведущей цепи и последовательность «пассажирской» цепи связаны посредством линкерной молекулы ненуклеотидной структуры. Таким образом, миРНК можно легко синтезировать и обеспечить с низкой стоимостью, и также она имеет улучшенные показатели по фармакокинетике и переносу внутрь клеток по сравнению с молекулой одноцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей пре-миРНК, имеющую сравнительно длинную нуклеотидную петлю.
[0019]
Схема конфигурационной связи между вышеуказанной областью Х и вышеуказанной областью Y в миРНК природного типа по настоящему изобретению показана на фиг. 1. На фиг. 1 показана схема и, например, длина, форма и т.п. каждой области не ограничиваются. миРНК природного типа по настоящему изобретению содержит, как показано на фиг. 1, вышеуказанную область Х на 5'-конце и вышеуказанную область Y на 3'-конце, и 3'-конец вышеуказанной области Х и 5'-конец вышеуказанной области Y связаны посредством линкерной области (показана на фиг. в виде «Р») ненуклеотидной структуры.
[0020]
В миРНК природного типа по настоящему изобретению вышеуказанная область Х содержит последовательность ведущей цепи или последовательность «пассажирской» цепи любой зрелой миРНК. Когда вышеуказанная область Х содержит вышеуказанную последовательность ведущей цепи, то вышеуказанная область Y содержит последовательность «пассажирской» цепи вышеуказанной зрелой миРНК, и когда вышеуказанная область Х содержит вышеуказанную последовательность «пассажирской» цепи, то вышеуказанная область Y содержит последовательность ведущей цепи вышеуказанной зрелой миРНК, где вышеуказанная область Х и вышеуказанная область Y подвергаются внутримолекулярному отжигу (также называемому самоотжигом) между вышеуказанной последовательностью ведущей цепи и вышеуказанной последовательностью «пассажирской» цепи. Следовательно, миРНК природного типа по настоящему изобретению образует двухцепочечную структуру в вышеуказанной области внутримолекулярного отжига.
[0021]
миРНК природного типа по настоящему изобретению представляет линейную молекулу одноцепочечной нуклеиновой кислоты, где ее 5'-конец и ее 3'-конец не связаны. Для того чтобы сохранить отсутствие связывания обоих концов, 5'-конец миРНК природного типа по настоящему изобретению предпочтительно представляет, например, нефосфатную группу.
В миРНК природного типа по настоящему изобретению вышеуказанная область Х содержит, как упомянуто выше, последовательность ведущей цепи (последовательность «пассажирской» цепи) зрелой миРНК. С другой стороны, вышеуказанная область Y содержит последовательность «пассажирской» цепи (последовательность ведущей цепи) вышеупомянутой зрелой миРНК. Последовательность ведущей цепи и последовательность «пассажирской» цепи зрелой миРНК, например, зарегистрированы в различных базах данных (например, http://www.mirbase.org и т.д.). Следовательно, вышеуказанная область Х и вышеуказанная область Y могут быть на основе, например, информации об известных зрелых миРНК. Ведущая цепь вышеуказанной зрелой миРНК представляет цепь, которая входит в белок Argonaute (Ago) комплекса сайлесинга, индуцированного РНК (RISC) и связывается с мРНК мишени, и «пассажирская» цепь вышеуказанной зрелой миРНК представляет цепь, комплементарную ведущей цепи зрелой миРНК, и, в конечном счете удаляется из RISC. Как правило, ведущая цепь и «пассажирская» цепь зрелой миРНК не являются полностью комплементарными, и каждая содержит от 1 до нескольких непарных оснований.
В последующем пояснении вышеуказанная область Х, содержащая вышеуказанную последовательность ведущей цепи, подробно описана в качестве примера. Специалисты в данной области техники могут легко понять из нижеследующего описания строение миРНК природного типа по настоящему изобретению в варианте осуществления, где вышеуказанная область Х содержит вышеуказанную последовательность «пассажирской» цепи.
[0023]
Вышеуказанная область Х может состоять, например, только из вышеуказанной последовательности ведущей цепи или может также содержать дополнительную последовательность. В последнем случае вышеуказанная область Х состоит, например, из вышеуказанной последовательности ведущей цепи и вышеуказанной дополнительной последовательности, и вышеуказанная дополнительная последовательность связана, например, с 3'-концом вышеуказанной последовательности ведущей цепи.
[0024]
В миРНК природного типа в настоящем изобретении, когда вышеуказанная последовательность ведущей цепи и вышеуказанная последовательность «пассажирской» цепи выравниваются, и область 3'-конца ведущей цепи имеет «свисающий конец», то вышеуказанная область Y содержит последовательность, комплементарную последовательности вышеуказанного «свисающего конца» в области 5'-конца вышеуказанной «пассажирской» цепи. Когда вышеуказанная область Х содержит дополнительную последовательность, и вышеуказанная область Х и вышеуказанная область Y выравниваются, то вышеуказанная область Y имеет последовательность, комплементарную дополнительной последовательности вышеуказанной области Х. Когда дополнительная последовательность вышеуказанной области Х связана с 3'-концом вышеуказанной последовательности ведущей цепи, то вышеуказанная дополнительная последовательность связана с 5'-концом вышеуказанной последовательности «пассажирской» цепи. Несмотря на то, что вышеуказанная комплементарная последовательность необязательно должна быть полностью комплементарной, при условии, что она может образовать двухцепочечную структуру, непрерывную до двойной цепи вышеуказанной последовательности ведущей цепи и вышеуказанной «пассажирской» последовательности, желательно, чтобы она была полностью комплементарной. Вышеуказанная область Y может состоять только из вышеуказанной последовательности «пассажирской» цепи и последовательности, комплементарной дополнительной последовательности вышеуказанной области Х, и может дополнительно иметь «свисающий конец», не спаренный с вышеуказанной областью Х. То есть, в миРНК природного типа по настоящему изобретению, когда, например, вышеуказанная область Y и вышеуказанная область X выравниваются, то вышеуказанная область Y может иметь «свисающий конец» на 3'-конце. Как здесь используется, вышеуказанный «свисающий конец» в области Y представляет, например, концевое основание, которое вышеуказанная область Y имеет в избытке, по сравнению с вышеуказанной областью Х, когда вышеуказанная область Y и вышеуказанная область Х выравниваются. Длина (O) «свисающего конца» представляет, например, показанную в следующей формуле:
длина (O) «свисающего конца»=[число оснований по полной длине (Y) области Y] - [число оснований по полной длине (X) области X].
Поскольку многие зрелые миРНК имеют «свисающий конец», неспаренный с ведущей цепью, на 3'-конце «пассажирской» цепи, то дальнейшее добавление искусственного «свисающего конца» к вышеуказанному 3'-концу «пассажирской» цепи, как правило, не является необходимым в вышеуказанной области Y.
[0025]
В миРНК природного типа по настоящему изобретению длина каждой области особым образом не ограничивается. Несмотря на то, что примеры условий показаны ниже, миРНК природного типа по настоящему изобретению не ограничивается приведенным описанием. В настоящем изобретении цифровой диапазон числа оснований раскрывает все положительные целые числа, которые попадают в диапазон, и, например, «1-4 основания» означает все «1, 2, 3, 4 основания» (ниже то же самое).
[0026]
В вышеуказанной области X длина вышеуказанной последовательности ведущей цепи особым образом не ограничивается и может представлять, например, длину последовательности ведущей цепи зрелой миРНК, известной по литературе. Ее конкретные примеры включают нижний предел длину 19 оснований, длину 20 оснований, и верхний предел длину 25 оснований, длину 24 основания, и диапазоны длины 19-25 оснований, длины 20-24 оснований.
[0027]
Длина вышеуказанной дополнительной последовательности вышеуказанной области X особым образом не ограничивается, и нижний предел представляет, например, длину 0 оснований, длину 1 основание, длину 2 основания, и верхний предел представляет, например, длину 7 оснований, длину 5 оснований, длину 4 оснований, длину 3 основания, и диапазон составляет, например, длину 0-7 оснований, длину 0-5 оснований, длину 1-5 оснований, длину 1-4 основания, длину 2-3 основания, длину 3-5 оснований. Диапазон длины вышеуказанной дополнительной последовательности предпочтительно составляет длину 3-7 оснований, более предпочтительно длину из 3-5 оснований.
[0028]
Последовательность оснований вышеуказанной дополнительной последовательности в вышеуказанной области Х особым образом не ограничивается. Когда длина вышеуказанной дополнительной последовательности представляет длину 3 основания, то, например, можно упомянуть UAA, UGG, UCC, CAA, CGG, CCC и тому подобное. Когда длина вышеуказанной дополнительной последовательности составляет длину 4 основания, то, например, можно упомянуть UAAU, UUAA, UUGG, UUUU и тому подобное. Когда длина вышеуказанной дополнительной последовательности составляет длину 5 оснований, то, например, можно упомянуть UAAUU, UCCGG, UUUUU, UUUUA, UUUAU, UUAUU, UAUUU, UUUAA, UUAUA, UAUUA, UUAAU, UAUAU, UUAAA, UAUAA, UAAUA, UAAAU, UAAAA, UUUGG, AUUAA, AUUUU, CUUAA, CUUUU, GUUAA, GUUUU и тому подобное. Когда длина вышеуказанной дополнительной последовательности представляет длину 7 оснований, то, например, можно упомянуть UAAUUAA, UCCGGCC и тому подобное. Последовательность оснований вышеуказанной дополнительной последовательности и последовательность оснований последовательности, комплементарной вышеуказанной дополнительной последовательности, предпочтительно богаты AU.
[0029]
Длина вышеуказанной области Х особым образом не ограничивается, нижний предел составляет, например, длину 19 оснований, длину 21 основание, длину 23 основания, верхний предел составляет, например, длину 35 оснований, длину 30 оснований, длину 28 оснований, длину 26 оснований, и диапазон составляет, например, длину 19-35 оснований, длину 19-30 оснований, длину 21-28 оснований, длину 23-26 оснований.
[0030]
Длина вышеуказанного «свисающего конца» в вышеуказанной области Y (когда сама вышеуказанная «пассажирская» цепь имеет «свисающий конец», длина включает то же самое) особым образом не ограничивается, и нижний предел представляет, например, длину 0 оснований, длину 1 основание, и верхний предел представляет, например, длину 4 основания, длину 3 основания, и диапазон составляет, например, длину 0-4 оснований, длину 1-3 оснований, длину 2 основания.
[0031]
Последовательность вышеуказанного «свисающего конца» особым образом не ограничивается и представляет, например, UU, CU, GC, UA, AA, CC, UG, CG, AU, TT и т.п. с 3'-конца. Вышеуказанному «свисающему концу» можно придать устойчивость к рибонуклеазе, например, включением TT.
[0032]
Длина вышеуказанной области Y особым образом не ограничивается, и нижний предел представляет, например, длину 19 оснований, длину 21 основание, длину 23 основания, и верхний предел представляет, например, длину 37 оснований, длину 32 основания, длину 30 оснований, длину 28 оснований, и диапазон составляет, например, длину 19-37 оснований, длину 19-32 основания, длину 21-32 основания, длину 21-30 оснований, длину 23-28 оснований.
[0033]
Полная длина (T) миРНК природного типа по настоящему изобретению особым образом не ограничивается, и нижний предел представляет, например, длину 38 оснований, длину 42 основания, длину 46 оснований, верхний предел составляет, например, длину 72 основания, длину 62 основания, длину 58 оснований, длину 54 основания, и диапазон составляет, например, длину 38-72 основания, длину 40-68 оснований, длину 38-62 основания, длину 42-58 оснований, длину 46-54 основания.
[0034]
В миРНК природного типа по настоящему изобретению тип вышеуказанной зрелой миРНК особым образом не ограничивается и может быть соответствующим образом выбран согласно типу гена-мишени.
[0035]
Примеры вышеуказанной зрелой миРНК включают зрелые миРНК, такие как hsa-miR-34a (инвентарный номер MI0000268 в miRBase), hsa-let-7a (инвентарный номер MI0000060 в miRBase), hsa-let-7f (инвентарный номер MI0000067 в miRBase), Hsa-miR-150 (инвентарный номер MI0000479 в miRBase), hsa-miR-29b (инвентарный номер MI0000105 в miRBase) и тому подобное.
hsa-miR-34a (SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU/CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU
hsa-let-7a (SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU/CUAUACAAUCUACUGUCUUUC
hsa-let-7f (SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6)
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU/CUAUACAAUCUAUUGCCUUCCC
hsa-miR-150 (SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 8)
UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG/CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG
hsa-miR-29b (SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 9)
GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGA/UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
Здесь каждая нуклеотидная последовательность описывается в направлении 5'→3' в порядке последовательность ведущей цепи/ последовательность «пассажирской» цепи (последовательность «пассажирской» цепи/последовательность ведущей цепи только для hsa-miR-29b).
Ведущая цепь miR-34a нацелена, например, на AXL, MET, CDK4, CDK6, SIRT1, CCND1, SIRT1, BCL-2 и тому подобное, и ингибирование экспрессии данных генов-мишеней может профилактировать или лечить такие заболевания, как рак легкого, колоректальный рак, рак желудка, рак печени, рак молочной железы и тому подобное.
Ведущая цепь let-7a нацелена, например, на HMGA2 (группу AT-hook 2 высокой подвижности), KRAS, NRAS, HRAS, MYC, TLR4 и тому подобное, и ингибирование экспрессии этих генов-мишеней может профилактировать или лечить заболевания, такие как рак легких, колоректальный рак, рак желудка, рак печени, рак молочной железы и тому подобное.
Ведущая цепь let-7f нацелена, например, на HMGA2 (группу AT-hook 2 высокой подвижности), KRAS, NRAS, HRAS, MYC, TLR4 и тому подобное, и ингибирование экспрессии этих генов-мишеней может профилактировать или лечить заболевания, такие как рак легких, колоректальный рак, рак желудка, рак печени, рак молочной железы и тому подобное.
Ведущая цепь miR-150 нацелена, например, на COL1A1, COL4A4, SMAD2, SP1 и тому подобное, и ингибирование экспрессии этих генов-мишеней может профилактировать или лечить заболевания, такие как фиброз легких, фиброз печени и тому подобное.
Ведущая цепь miR-29b нацелена, например, например, на COL1A1, MCL1, DNMT3A, DNMT3B, TCL1A, TGFb3 и тому подобное, и ингибирование экспрессии этих генов-мишеней может профилактировать или лечить заболевания, такие как рак легкого, колоректальный рак, рак желудка, рак печени, рак молочной железы, фиброз легких, фиброз печени и тому подобное.
[0037]
Составляющие звенья миРНК природного типа по настоящему изобретению особым образом не ограничиваются. Их примеры включают нуклеотидные остатки. Примеры вышеуказанных нуклеотидных остатков включают рибонуклеотидный остаток и дезоксирибонуклеотидный остаток. В миРНК природного типа по настоящему изобретению вышеуказанный нуклеотидный остаток предпочтительно представляет, например, рибонуклеотидный остаток. Вышеуказанной нуклеотидный остаток может представлять, например, остаток, который является немодифицированным (немодифицированный нуклеотидный остаток), или остаток, который был модифицирован (модифицированный нуклеотидный остаток). Можно сконструировать миРНК природного типа по настоящему изобретению с включением вышеуказанного модифицированного нуклеотидного остатка, например, для повышения устойчивости миРНК природного типа к нуклеазе, что позволит повысить стабильность миРНК природного типа. Кроме того, миРНК природного типа по настоящему изобретению дополнительно может включать, например, ненуклеотидный остаток в дополнение к вышеуказанному нуклеотидному остатку.
[0038]
Когда миРНК природного типа включает, например, вышеуказанный модифицированный рибонуклеотидный остаток(и) в дополнение к вышеуказанным немодифицированным рибонуклеотидным остаткам, то число вышеуказанных модифицированных рибонуклеотидных остатков особым образом не ограничивается и, например, в частности, равно, «от одного до нескольких», в частности, например, 1-5, предпочтительно 1-4, более предпочтительно 1-3 и наиболее предпочтительно 1 или 2. Вышеуказанный модифицированный рибонуклеотидный остаток в противоположность немодифицированному рибонуклеотидному остатку может представлять, например, вышеуказанный дезоксирибонуклеотидный остаток, полученный замещением остатка рибозы на остаток дезоксирибозы. Когда миРНК природного типа по настоящему изобретению включает, например, вышеуказанный дезоксирибонуклеотидный остаток(и) в дополнение к вышеуказанному немодифицированному рибонуклеотидному остатку(ам), то число вышеуказанного дезоксирибонуклеотидного остатка(ов) особым образом не ограничивается, и равно, например, «от одного до нескольких», в частности, например, 1-5, предпочтительно 1-4, более предпочтительно 1-3 и наиболее предпочтительно 1 или 2.
[0039]
Вышеуказанный нуклеотидный остаток включает, например, сахар, основание и фосфат в качестве его компонентов. Вышеуказанный рибонуклеотидный остаток содержит, например, остаток рибозы в качестве сахара; и аденин (А), гуанин (G), цитозин (С) или урацил (U) в качестве основания. Вышеуказанный дезоксирибонуклеотидный остаток содержит, например, остаток дезоксирибозы в качестве сахара; и аденин (А), гуанин (G), цитозин (С) или тимин (T) в качестве основания.
[0040]
Вышеуказанные компоненты вышеуказанного немодифицированного нуклеотидного остатка являются такими же или, по существу, такими же, как, например, компоненты встречающегося в природе нуклеотидного остатка. Конкретно, например, компоненты являются такими же или по существу такими же, как компоненты нуклеотидного остатка, встречающегося в природе в организме человека.
[0041]
Например, вышеуказанный модифицированный нуклеотидный остаток может быть таким, как и любой из компонентов вышеуказанного немодифицированного нуклеотидного остатка, но который является модифицированным. Примеры вышеуказанного модифицированного нуклеотидного остатка включают встречающиеся в природе нуклеотидные остатки и искусственно модифицированные нуклеотидные остатки.
[0042]
Вышеуказанный модифицированный нуклеотидный остаток может представлять, например, остаток альтернативы вышеуказанного нуклеотида. Примеры вышеуказанной альтернативы включают мономерные остатки искусственной нуклеиновой кислоты. Конкретные примеры включают PNA (пептидную нуклеиновую кислоту), LNA (замкнутую нуклеиновую кислоту) и ENA (нуклеиновые кислоты с 2'-O,4'-этиленовыми мостиками).
В вышеуказанном нуклеотидном остатке вышеуказанное основание особым образом не ограничивается. Вышеуказанное основание может представлять, например, природное основание или неприродное основание. Вышеуказанное основание может представлять, например, основание, полученное из природного основания, или синтетическое основание. В качестве вышеуказанного основания, например, может использоваться обычное основание, его модифицированный аналог и тому подобное.
[0044]
В миРНК природного типа по настоящему изобретению линкерная область вышеуказанной ненуклеотидной структуры предпочтительно содержит, по меньшей мере, одно, выбранное из группы, состоящей из аминокислотного остатка, остатка полиамина и остатка поликарбоновой кислоты. Вышеуказанная линкерная область может содержать или не содержать остаток, отличный от аминокислотного остатка, остатка полиамина и остатка поликарбоновой кислоты. Например, вышеуказанная линкерная область может содержать любой остаток, выбранный из остатка поликарбоновой кислоты, остатка терефталевой кислоты и аминокислотного остатка.
[0045]
2
2
В настоящем изобретении «полиамин» означает любое соединение, содержащее несколько (две, три или более) аминогрупп. Вышеуказанная «аминогруппа» не ограничивается группой -NH и также включает иминогруппу (-NH-). В настоящем изобретении вышеуказанный полиамин особым образом не ограничивается, и его примеры включают 1,4-диаминобензол, 1,3-диаминобензол, 1,2-диаминобензол и тому подобное. Кроме того, в настоящем изобретении «поликарбоновая кислота» означает любое соединение, содержащее несколько (две, три или более) карбоксильных групп. В настоящем изобретении вышеуказанная поликарбоновая кислота особым образом не ограничивается, и ее примеры включают 1,4-бензолдикарбоновую кислоту (терефталевая кислота), 1,3-бензолдикарбоновую кислоту (изофталевая кислота), 1,2-бензолдикарбоновую кислоту (фталевая кислота) и тому подобное. Кроме того, в настоящем изобретении «аминокислота» означает любое органическое соединение, содержащее одну или более аминогрупп и одну или более карбоксильных групп в молекуле, как указано ниже. Вышеуказанная «аминогруппа» не ограничивается группой -NH и также включает иминогруппу (-NH-).
[0046]
В миРНК природного типа по настоящему изобретению вышеуказанный аминокислотный остаток может состоять из множества связанных между собой аминокислотных остатков. В настоящем изобретении аминокислотный остаток, который представляет собой множество связанных между собой аминокислотных остатков, представляет, например, остаток, содержащий пептидную структуру. Более конкретно, вышеуказанный аминокислотный остаток, который представляет собой множество связанных между собой аминокислотных остатков, представляет, например, аминокислотный остаток приведенной ниже химической формулы (I), где приведенная ниже химическая формула (Ia) представляет пептид (например, димер на основе глицина или тример на основе глицина и т. д.).
[0047]
В миРНК природного типа по настоящему изобретению вышеуказанный аминокислотный остаток может представлять остаток глицина, остаток амида терефталевой кислоты, остаток пролина или остаток лизина. Вышеуказанный аминокислотный остаток может представлять модифицированный аминокислотный остаток или производное аминокислоты.
[0048]
В миРНК природного типа по настоящему изобретению вышеуказанная линкерная область представлена, например, следующей химической формулой (I-0).
[0049]
[0050]
в вышеуказанной химической формуле (I-0),
11
12
2
Q и Q каждый независимо представляет простую связь, CH (метиленовую группу), NH (иминогруппу), C=O (карбонильную группу), C=S (тиокарбонильную группу), C=NH (иминометиленовую группу), O или S;
1
2
2
Q и Q каждый независимо представляет простую связь, CH (метиленовую группу), NH (иминогруппу), C=O (карбонильную группу), C=S (тиокарбонильную группу), C=NH (иминометиленовую группу), O или S;
1
2
2
Y и Y каждый независимо представляет простую связь, CH, NH, O или S;
1
a
a
a
a
2
L представляет алкиленовую цепь, содержащую n атомов углерода, и атом водорода при атоме углерода алкилена может быть замещен или может быть не замещен ОН, OR, NH, NHR, NRRb, SH или SR; или
1
L представляет полиэфирную цепь, полученную замещением, по меньшей мере, одного атома углерода в вышеуказанной алкиленовой цепи атомом кислорода;
1
1
1
1
1
при условии, что: когда Y представляет NH, O или S, то атом, связанный с Y в L, представляет углерод, атом, связанный с OR в L, является атомом углерода, и атомы кислорода не являются смежными друг с другом;
2
c
c
c
d
c
2
L представляет алкиленовую цепь, содержащую m атомов углерода, и атом водорода при атоме углерода алкилена может быть замещен или не замещен OH, OR, NH, NHR, NRR, SH или SR; или
2
L представляет полиэфирную цепь, полученную замещением, по меньшей мере, одного атома углерода в вышеуказанной алкиленовой цепи атомом кислорода;
2
2
2
2
2
при условии, что: когда Y представляет NH, О или S, то атом, связанный с Y в L, представляет атом углерода, атом, связанный с OR в L, является атомом углерода, и атомы кислорода не являются смежными друг с другом;
a
b
c
d
R, R, R и R каждый независимо является заместителем или защитной группой;
m равно целому числу в диапазоне от 0 до 30;
n равно целому числу в диапазоне от 0 до 30;
1
2
вышеуказанные области X и Y связаны посредством вышеуказанного линкерного остатка через -OR- или -OR-,
1
2
1
2
где R и R могут присутствовать или отсутствовать, и когда они присутствуют, то R и R каждый независимо представляет нуклеотидный остаток или вышеуказанную структуру (I-0);
А представляет любую атомную группу.
[0051]
1
2
Комбинация вышеуказанных областей (X) и (Y) с -OR- и -OR- особым образом не ограничивается и может представлять, например, любое из следующих условий.
Условие (1):
2
1
вышеуказанные области (X) и (Y) связаны со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR- и -OR-, соответственно.
Условие (2):
1
2
вышеуказанные области (X) и (Y) связаны со структурой вышеуказанной формулы (I) через -OR- и -OR-, соответственно.
11
1
11
1
12
2
12
2
В вышеуказанной химической формуле (I-0), например, Q может представлять C=O (карбонильную группу), и Q может представлять NH (иминогруппу). Кроме того, например, Q может представлять NH (иминогруппу), и Q может представлять C=O (карбонильную группу). Кроме того, например, Q может представлять C=O (карбонильную группу), и Q может представлять NH (иминогруппу). Кроме того, например, Q может представлять NH (иминогруппу), и Q может представлять C=O (карбонильную группу).
[0053]
11
12
1
2
В вышеуказанной химической формуле (I-0) каждый из Q и Q может представлять, например, карбонильную группу. В этом случае каждый из Q и Q предпочтительно является иминогруппой. Кроме того, в этом случае структура следующей химической формулы (Iα) более предпочтительно представлена следующей химической формулой (Iα2).
[0054]
[0055]
100
100
a
b
c
d
В вышеуказанной химической формуле (Iα2), R представляет любой заместитель, который может присутствовать или отсутствовать. Когда он присутствует, то может присутствовать один или несколько. Когда присутствует несколько, то они могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Примеры вышеуказанного любого заместителя для R включают указанные ниже заместители, примеры которых приведены для вышеуказанных R, R, R и R. Более конкретные примеры включают атом галогена, гидрокси, алкокси, амино, карбокси, сульфо, нитро, карбамоил, сульфамоил, алкил, алкенил, алкинил, галогеналкил, арил, арилалкил, алкиларил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкилалкил, циклоалкил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, аминоалкил, силил, силилоксиалкил, пирролил, имидазолил и тому подобное. Структура вышеуказанной химической формулы (Iα2) более предпочтительно представлена следующей химической формулой (Iα3).
[0056]
[0057]
11
12
1
2
Когда Q и Q являются карбонильными группами, и Q и Q представляют иминогруппы, то линкерный остаток вышеуказанной химической формулы (I-0) может представлять остаток амида карбоновой кислоты или остаток карбоновой кислоты. Например, структура «ТРА» в приведенном ниже примере может представлять остаток терефталамида или остаток терефталевой кислоты, представленный вышеуказанной химической формулой (Iα3).
[0058]
11
12
1
2
В вышеуказанной химической формуле (I-0) каждый из Q и Q может быть иминогруппой. В этом случае каждый из Q и Q предпочтительно представляет карбонильную группу. В этом случае структура следующей химической формулы (Iβ) более предпочтительно представлена следующей химической формулой (Iβ2).
[0059]
[0060]
100
100
В вышеуказанной химической формуле (Iβ2), R представляет любой заместитель, который может присутствовать или отсутствовать. Когда он присутствует, то может присутствовать один или несколько заместителей. Когда присутствует несколько, то они могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. В частности, например, он является таким же как R в вышеуказанной химической формуле (Iα2). Кроме того, структура вышеуказанной химической формулы (Iβ2) более предпочтительно представлена следующей химической формулой (Iβ3).
[0061]
[0062]
В миРНК природного типа по настоящему изобретению, когда вышеуказанной линкерный остаток представляет аминокислотный остаток, то вышеуказанный аминокислотный остаток представлен, например, следующей химической формулой (I). Структура следующей химической формулы (I) является одним из примеров структуры, представленной вышеуказанной химической формулой (I-0).
[0063]
[0064]
1
2
1
2
1
2
В вышеуказанной формуле (I), например, X, X, Y, Y, L и L имеют значения, определенные выше.
1
2
Последовательность, комплементарная последовательности вышеуказанной микроРНК, каждая связана с вышеуказанным аминокислотным остатком через -OR- или -OR-,
1
2
1
2
где R и R могут присутствовать или отсутствовать, и когда они присутствуют, то R и R каждый независимо представляет нуклеотидный остаток или вышеуказанную структуру (I); и
А представляет любую атомную группу, при условии, что следующая химическая формула (Ia) представляет аминокислоту или пептид.
[0065]
[0066]
a
b
c
d
a
b
c
d
Атомная группа А в вышеуказанной химической формуле (I), (Iα) или (Ia) может содержать или не содержать, например, по меньшей мере, одно, выбранное из группы, состоящей из атомной группы с цепью, алициклической атомной группы, ароматической атомной группы, гетероароматической атомной группы и гетероалициклической атомной группы. Несмотря на то, что вышеуказанная атомная группа с цепью особым образом не ограничивается, можно упомянуть, например, алкил, алкенил, алкинил, галогеналкил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, аминоалкил, силил, силилоксиалкил и тому подобное. Несмотря на то, что вышеуказанная алициклическая атомная группа особым образом не ограничивается, можно упомянуть, например, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкилалкил, циклилалкил и тому подобное. Несмотря на то, что вышеуказанная ароматическая атомная группа особым образом не ограничивается, можно упомянуть, например, арил, арилалкил, алкиларил, арил, конденсированный с кольцом арил, конденсированный с кольцом арилалкил, конденсированный с кольцом алкиларил и тому подобное. Не смотря на то, что вышеуказанная гетероароматическая атомная группа особым образом не ограничивается, и ее примеры включают гетероарил, гетероарилалкил, алкилгетероарил, конденсированный с кольцом гетероарил, конденсированный с кольцом гетероарилалкил, конденсированный с кольцом арил, конденсированный с кольцом алкилгетероарил и тому подобное. В атомной группе А в вышеуказанной химической формуле (I), (Iα) или (Ia) каждая из вышеуказанных атомных групп может или может дополнительно не содержать заместитель или защитную группу. Когда имеется несколько вышеуказанных заместителей или защитных групп, то они могут быть одинаковыми или различными. Вышеуказанные заместители представляют, например, заместители, которые были приведены для вышеуказанных R, R, R и R, более конкретно, например, атом галогена, гидрокси, алкокси, амино, карбокси, сульфо, нитро, карбамоил, сульфамоил, алкил, алкенил, алкинил, галогеналкил, арил, арилалкил, алкиларил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкилалкил, циклилалкил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, аминоалкил, силил, силилоксиалкил, пирролил, имидазолил и тому подобное. Вышеуказанные защитные группы являются, например, такими же, как те, которые были приведены в качестве примера для вышеуказанных R, R, R и R.
[0067]
2
2
В настоящем изобретении «аминокислота» относится, как было упомянуто выше, к любому органическому соединению, содержащему, по меньшей мере, одну аминогруппу и, по меньшей мере, одну карбоксильную группу в молекуле. Вышеуказанная «аминогруппа» особым образом не ограничивается группой -NH, и также включает иминогруппу (-NH-). Например, пролин, гидроксипролин и тому подобное, не содержащие -NH-группу в молекуле, но содержащие иминогруппу (-NH-), включаются в определение «аминокислоты» в настоящем изобретении. В настоящем изобретении вышеуказанная «аминокислота» может быть, как упомянуто ниже, природной аминокислотой или искусственной аминокислотой. Например, поскольку соединение, представленное приведенной ниже химической формулой (Ia2) или (Ia3), содержит аминогруппу и карбоксильную группу в молекуле, то оно включается в определение «аминокислоты» в настоящем изобретении. Следовательно, например, вышеуказанная химическая формула (I), в которой атомная группа А представляет собой структуру, показанную приведенной ниже химической формулой (А2) или химической формулой (А2а), включается в определение «аминокислотного остатка» в настоящем изобретении. Например, структура «ТРА» в приведенном ниже примере также включается в определение «аминокислотного остатка» в настоящем изобретении. «Пептид» в настоящем изобретении относится к органическому соединению, имеющему структуру, в которой не менее 2 молекул аминокислоты связаны пептидной связью. Вышеуказанная пептидная связь может представлять структуру амида кислоты или структуру имида кислоты. Когда присутствуют многочисленные аминогруппы в молекуле аминокислоты или пептида, представленной вышеуказанной химической формулой (Ia), то аминогруппа, четко показанная в вышеуказанной химической формуле (Ia), может представлять любую аминогруппу. Кроме того, когда в молекуле аминокислоты или пептида, представленной вышеуказанной химической формулой (Ia), присутствуют многочисленные карбоксильные группы, то карбоксильная группа, четко показанная в вышеуказанной химической формуле (Ia), может представлять любую карбоксильную группу.
[0068]
a
b
c
d
a
b
c
d
В вышеуказанном аминокислотном остатке миРНК природного типа по настоящему изобретению, то вышеуказанная аминокислота может быть, как упомянуто выше, природной аминокислотой или искусственной аминокислотой. В настоящем изобретении «природная аминокислота» относится к аминокислоте, имеющей встречающуюся в природе структуру или ее оптическому изомеру. Способ получения вышеуказанной природной аминокислоты особым образом не ограничивается и, например, она может быть получена из природы или может быть синтезирована. В настоящем изобретении, кроме того, «искусственная аминокислота» относится к аминокислоте, имеющей структуру, не встречающуюся в природе. То есть, вышеуказанная искусственная аминокислота представляет аминокислоту, то есть производное карбоновой кислоты, содержащее аминогруппу (органическое соединение, содержащее, по меньшей мере, одну аминогруппу и, по меньшей мере, одну карбоксильную группу в молекуле) и имеющую структуру, не встречающуюся в природе. Вышеуказанная искусственная аминокислота предпочтительно не содержит, например, гетероцикл. Вышеуказанная аминокислота может быть аминокислотой, составляющей, например, белок. Вышеуказанная аминокислота может представлять, например, по меньшей мере, один вид, выбранный из группы, состоящей из глицина, α-аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, цистина, глутамина, глутаминовой кислоты, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, гидроксилизина, метионина, фенилаланина, серина, треонина, тирозина, валина, пролина, 4-гидроксипролина, триптофана, β-аланина, 1-амино-2-карбоксициклопентана, аминобензойной кислоты, аминопиридинкарбоновой кислоты и аминокислоты, представленной следующей химической формулой (Ia2) и может или может дополнительно не содержать заместитель или защитную группу. Примеры вышеуказанного заместителя включают заместители, примеры которых приведены для вышеуказанных R, R, R и R. Более конкретно, можно упомянуть, например, атом галогена, гидрокси, алкокси, амино, карбокси, сульфо, нитро, карбамоил, сульфамоил, алкил, алкенил, алкинил, галогеналкил, арил, арилалкил, алкиларил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкилалкил, циклилалкил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, аминоалкил, силил, силилоксиалкил, пирролил, имидазолил и тому подобное. Вышеуказанная защитная группа является такой же, как, например, защитные группы, примеры которых приведены для вышеуказанных R, R, R и R. Когда аминокислота вышеуказанной химической формулы (Ia), которая не является пептидом, содержит изомеры, такие как оптический изомер, геометрический изомер, стереоизомер и тому подобное, то может быть использован любой изомер.
[0069]
[0070]
100
100
a
b
c
d
В вышеуказанной химической формуле (Ia2) R является необязательным заместителем и может присутствовать или отсутствовать. Когда он присутствует, то его число может составлять один или более, и, когда присутствует несколько заместителей, то они могут быть одинаковыми или различными. Примеры вышеуказанного необязательного заместителя для R включают заместители, примеры которых приведены для вышеуказанных R, R, R и R, более конкретно, например, атом галогена, гидрокси, алкокси, амино, карбокси, сульфо, нитро, карбамоил, сульфамоил, алкил, алкенил, алкинил, галогеналкил, арил, арилалкил, алкиларил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкилалкил, циклилалкил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, аминоалкил, силил, силилоксиалкил, пирролил, имидазолил и тому подобное. Структура вышеуказанной химической формулы (Ia2) может представлять, например, следующую химическую формулу (Ia3).
[0071]
[0072]
100
Когда структура вышеуказанной химической формулы (Ia) представляет вышеуказанную химическую формулу (Ia2), то структура атомной группы A в вышеуказанной химической формуле (I) представлена следующей химической формулой (A2). R в следующей химической формуле (А2) является таким же, как в вышеуказанной химической формуле (Ia2). Когда структура вышеуказанной химической формулы (Ia) представляет вышеуказанную химическую формулу (Ia3), то структура атомной группы A в вышеуказанной химической формуле (I) представлена следующей химической формулой (A2a).
[0073]
[0074]
Структура вышеуказанной химической формулы (I) представляет, например, следующие химические формулы (I-1)-(I-7), где n и m являются такими же, как в вышеуказанной химической формуле (I).
[0075]
[0076]
В вышеуказанных химических формулах (I-1)-(I-7) n и m особым образом не ограничиваются, и имеют значения, определенные выше. Конкретные примеры включают n=11 и m=12 или n=5 и m=4 в вышеуказанной химической формуле (I-1), n=5 и m=4 в вышеуказанной химической формуле (I-4), n=4 и m=4 в вышеуказанной химической формуле (I-6), и n=5 и m=4 в вышеуказанной химической формуле (1-7). Их структуры показаны в следующих химических формулах (I-1a), (I-1b), (I-4a), (I-6a) и (I-7a).
[0077]
[0078]
В миРНК природного типа по настоящему изобретению вышеуказанная линкерная область представлена, например, следующей формулой (II):
(II)
[0079]
1
2
2
В вышеуказанной формуле (II), например, X и X каждый независимо представляет H, O, S или NH;
1
2
2
Y и Y каждый независимо представляет простую связь, CH, NH, O или S;
3
R представляет атом водорода или заместитель, который связан с C-3, C-4, C-5 или C-6 в кольце A;
1
a
a
a
b
a
2
L представляет алкиленовую цепь, содержащую n атомов, и атом водорода при атоме углерода алкилена может быть замещен или не замещен ОН, OR, NH, NHR, NRR, SH или SR; или
1
L представляет полиэфирную цепь, полученную замещением, по меньшей мере, одного атома углерода в вышеуказанной алкиленовой цепи атомом кислорода;
1
1
1
1
1
при условии, что: когда Y представляет NH, O или S, то атом, связанный с Y в L, представляет атом углерода, атом, связанный с OR в L, является атомом углерода, и атомы кислорода не являются смежными друг с другом;
2
c
c
c
d
c
2
L представляет алкиленовую цепь, содержащую m атомов, и атом водорода при атоме углерода алкилена может быть замещен или не замещен OH, OR, NH, NHR, NRR, SH или SR; или
2
L представляет полиэфирную цепь, полученную замещением, по меньшей мере, одного атома углерода в вышеуказанной алкиленовой цепи атомом кислорода;
2
2
2
2
2
при условии, что: когда Y представляет NH, О или S, то атом, связанный с Y в L, является атомом углерода, атом, связанный с OR в L, является атомом углерода, и атомы кислорода не являются смежными друг с другом;
a
b
c
d
R, R, R и R каждый независимо является заместителем или защитной группой;
l равно 1 или 2;
m равно целому числу в диапазоне от 0 до 30;
n равно целому числу в диапазоне от 0 до 30; и
в кольце А один атом углерода, отличный от вышеуказанного С-2 в кольце А, может быть замещен атомом азота, кислорода или серы, и может содержать в вышеуказанном кольце А двойную углерод-углеродную связь или двойную связь углерод-азот;
1
2
вышеуказанные области (X) и (Y) каждая связаны с вышеуказанной ненуклеотидной структурой через -OR- или -OR-,
1
2
1
2
где R и R могут присутствовать или отсутствовать, и когда они присутствуют, то R и R каждый независимо представляет нуклеотидный остаток или вышеуказанную структуру (II).
[0080]
1
2
1
1
1
2
2
2
2
В вышеуказанной формуле (II), например, X и X каждый независимо представляет H, O, S или NH. В вышеуказанной формуле (II) «X представляет H» означает, что X образует CH (метиленовую группу) вместе с атомом углерода, с которым связан X. То же самое относится к X.
[0081]
1
2
2
В вышеуказанной формуле (II) Y и Y каждый независимо представляет простую связь, CH, NH, O или S.
[0082]
В вышеуказанной формуле (II) l в кольце A равно 1 или 2. Когда l=1, то кольцо A представляет собой 5-членное кольцо, например, вышеуказанный пирролидиновый скелет. Вышеуказанный пирролидиновый скелет представляет, например, пролиновый скелет, пролиноловый скелет или тому подобное, и иллюстрируется его двухвалентными структурами. Когда l=2, то кольцо A представляет 6-членное кольцо, например, вышеуказанный пиперидиновый скелет. В кольце А один атом углерода, отличный от С-2 в кольце А, может быть замещен атомом азота, кислорода или серы. Кольцо А может содержать, в кольце А, двойную углерод-углеродную связь или двойную связь углерод-азот. Кольцо A представляет, например, тип L или тип D.
[0083]
3
3
3
3
В вышеуказанной формуле (II) R представляет атом водорода или заместитель, связанный с C-3, C-4, C-5 или C-6 в кольце A. Когда R является вышеуказанным заместителем, то заместитель R может быть одним или несколькими, или может отсутствовать. Когда присутствует несколько R, то они могут быть одинаковыми или различными.
[0084]
3
4
4
2
4
4
5
Заместитель R представляет, например, атом галогена, OH, OR, NH, NHR, NRR, SH, SR, оксогруппу (=O) и тому подобное.
[0085]
4
5
3
R и R каждый независимо представляют, например, заместитель или защитную группу и могут быть одинаковыми или различными. Примеры вышеуказанного заместителя включают атом галогена, алкил, алкенил, алкинил, галогеналкил, арил, гетероарил, арилалкил, циклоалкил, циклоалкенил, циклоалкилалкил, циклоалкил, гидроксиалкил, алкоксиалкил, аминоалкил, гетероциклилалкенил, гетероциклилалкил, гетероарилалкил, силил, силилоксиалкил и тому подобное. То же самое относится и далее. Заместитель R может быть выбран из заместителей, указанных выше.
[0086]
3
4
Вышеуказанная защитная группа представляет функциональную группу, которая инактивирует, например, высокореакционноспособную функциональную группу. Примеры защитной группы включают известные защитные группы и тому подобное.В отношение вышеуказанной защитной группы, то, например, здесь может быть включено описание, имеющееся в литературе (J.F.W. McOmie, «Protecting Groups in Organic Chemistry», Prenum Press, London and New York, 1973). Вышеуказанная защитная группа особым образом не ограничивается, и ее примеры включают трет-бутилдиметилсилил (TBDMS), бис(2-ацетоксиэтилокси)метил (АСЕ), триизопропилсилилоксиметил (ТОМ), 1-(2-цианоэтокси)этил (CEE), 2-цианоэтоксиметил (CEM), толилсульфонилэтоксиметил (TEM), диметокситритил (DMTr) и тому подобное. Когда R представляет OR, то вышеуказанная защитная группа особым образом не ограничивается, и ее примеры включают группу TBDMS, группу ACE, группу TOM, группу CEE, группу CEM, группу TEM и тому подобное. Другие примеры защитной группы включают силилсодержащие группы. То же самое относится и далее.
[0087]
1
a
a
a
b
a
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
В вышеуказанной формуле (II) L представляет алкиленовую цепь, содержащую n атомов. Атом(ы) водорода при вышеуказанном атоме(ам) углерода алкилена может быть замещен или не замещен, например, OH, OR, NH, NHR, NRR, SH или SR. Альтернативно, L может представлять полиэфирную цепь, полученную замещением, по меньшей мере, одного атома углерода в вышеуказанной алкиленовой цепи атомом кислорода. Вышеуказанная полиэфирная цепь представляет, например, полиэтиленгликоль. Когда Y представляет NH, О или S, то атом, связанный с Y в L, является атомом углерода, атом, связанный с OR в L, является атомом углерода, и атомы кислорода не являются смежными друг с другом. То есть, например, когда Y представляет О, то этот атом кислорода и атом кислорода в L не являются смежными друг с другом, и атом кислорода в OR и атом кислорода в L не являются смежными друг с другом.
[0088]
2
c
c
c
d
c
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В вышеуказанной формуле (II) L представляет алкиленовую цепь, содержащую m атомов. Атом(ы) водорода при вышеуказанном атоме углерода алкилена может быть замещен или не замещен, например, OH, OR, NH, NHR, NRR, SH или SR. Альтернативно, L может представлять полиэфирную цепь, полученную замещением, по меньшей мере, одного атома углерода в вышеуказанной алкиленовой цепи атомом кислорода. Когда Y представляет NH, O или S, то атом, связанный с Y в L, является атомом углерода, атом, связанный с OR в L, представляет атом углерода, и атомы кислорода не являются смежными друг с другом. То есть, например, когда Y представляет О, то этот атом кислорода и атом кислорода в L не являются смежными друг с другом, и атом кислорода в OR и атом кислорода в L не являются смежными друг с другом.
[0089]
1
2
n в L и m в L особым образом не ограничиваются, и нижний предел каждого из них может составлять, например, 0, и также верхний предел того же особым образом не ограничивается. Например, n и m могут быть установлены как соответствующие в зависимости от желаемой длины вышеуказанной ненуклеотидной структуры. Например, с точки зрения стоимости производства, выхода и т.п., n и m предпочтительно равны от 0 до 30, более предпочтительно от 0 до 20 и еще более предпочтительно от 0 до 15. Значения n и m могут быть одинаковыми (n=m) или различными. n+m представляет, например, от 0 до 30, предпочтительно от 0 до 20 и более предпочтительно от 0 до 15.
[0090]
a
b
c
d
Например, R, R, R и R каждый независимо представляет заместитель или защитную группу. Примеры вышеуказанного заместителя и вышеуказанной защитной группы являются такими же, как определено выше.
[0091]
В вышеуказанной формуле (II) каждый атом водорода может быть независимо замещен, например, атомом галогена, таким как Cl, Br, F, I и тому подобное.
[0092]
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
Вышеуказанная область Х и вышеуказанная область Y каждая связана с вышеуказанной ненуклеотидной структурой, например, через -OR- или -OR-. В данном случае R и R могут присутствовать или отсутствовать. Когда R и R присутствуют, то R и R каждый независимо представляет нуклеотидный остаток или структуру, представленную вышеуказанной формулой (II). Когда R и/или R представляют/представляет вышеуказанный нуклеотидный остаток, то вышеуказанная ненуклеотидная структура образована, например, вышеуказанным ненуклеотидным остатком, имеющим структуру вышеуказанной формулы (II), исключая нуклеотидный остаток R и/или R, и вышеуказанный нуклеотидный остаток(и). Когда R и/или R представляют/представляет структуру, представленную вышеуказанной формулой (II), то структура вышеуказанной ненуклеотидной структуры такова, что, например, два или более из вышеуказанных ненуклеотидных остатков, имеющих структуру вышеуказанной формулы (II), связаны друг с другом. Количество структур вышеуказанной формулы (II) может составлять, например, 1, 2, 3 или 4. Когда вышеуказанная структура включает несколько вышеуказанных структур, то структуры вышеуказанной формулы (II) могут быть связаны, например, либо непосредственно, либо посредством вышеуказанного нуклеотидного остатка(ов). С другой стороны, когда R и R отсутствуют, то вышеуказанная ненуклеотидная структура образована, например, вышеуказанным ненуклеотидным остатком, имеющим структуру вышеуказанной формулы (II).
[0093]
1
2
Комбинация вышеуказанных областей (X) и (Y) с -OR- и -OR- особым образом не ограничивается и может представлять, например, любое из следующих условий.
Условие (1):
2
1
вышеуказанные области (X) и (Y) связаны со структурой вышеуказанной формулы (II) через -OR- и -OR-, соответственно.
Условие (2):
1
2
вышеуказанные области (X) и (Y) связаны со структурой вышеуказанной формулы (II) через -OR- и -OR-, соответственно.
[0094]
Примеры структуры вышеуказанной формулы (II) включают структуры следующих формул (II-1)-(II-9). В следующих формулах n и m являются такими же, как в вышеуказанной формуле (II). В следующих формулах q равно целому числу от 0 до 10.
[0095]
В вышеприведенных формулах (II-1)-(II-9) значения n, m и q особым образом не ограничиваются и являются такими, как определено выше. Конкретным примером этого является вышеуказанная формула (II-1), где n=8, вышеуказанная формула (II-2), где n=3, вышеуказанная формула (II-3), где n=4 или 8, вышеуказанная формула (II-4), где n=7 или 8, вышеуказанная формула (II-5), где n=3 и m=4, вышеуказанная формула (II-6), где n=8 и m=4, вышеуказанная формула (II-7), где n=8 и m=4, вышеуказанная формула (II-8), где n=5 и m=4, и вышеуказанная формула (II-9), где q=1 и m=4. Один вариант осуществления (n=8) вышеуказанной формулы (II-4) показан в следующей формуле (II-4a), и один вариант осуществления (n=5, m=4) вышеуказанной формулы (II-8) показан в следующей формуле (II-8а).
[0096]
В настоящем изобретении термин «алкил» включает, например, алкильные группы с прямой или разветвленной цепью. Количество атомов углерода в вышеуказанном алкиле особым образом не ограничивается и составляет, например, от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4. Примеры вышеуказанной алкильной группы включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, изогексил, н-гептил, н-октил, н-нонил и н-децил и тому подобное. Среди них, например, предпочтительными являются метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, изогексил и тому подобное.
[0097]
В настоящем изобретении термин «алкенил» включает, например, алкенильные группы с прямой и разветвленной цепью. Примеры вышеуказанного алкенила включают вышеуказанные алкильные группы, содержащие одну или несколько двойных связей и тому подобное. Количество атомов углерода в вышеуказанном алкениле особым образом не ограничивается и равно, например, такому же, как в вышеуказанном алкиле, предпочтительно от 2 до 8. Примеры вышеуказанного алкенила включают винил, 1-пропенил, 2-пропенил, 1-бутенил, 2-бутенил, 3-бутенил, 1,3-бутадиенил, 3-метил-2-бутенил и тому подобное.
[0098]
В настоящем изобретении термин «алкинил» включает, например, алкинильные с прямой и разветвленной цепью. Примеры вышеуказанного алкинила включают вышеуказанные алкильные группы, содержащие одну или несколько тройных связей и тому подобное. Количество атомов углерода в вышеуказанном алкиниле особым образом не ограничивается и равно, например, такому же, как в вышеуказанном алкиле, предпочтительно от 2 до 8. Примеры вышеуказанного алкинила включают этинил, пропинил, бутинил и тому подобное. Вышеуказанный алкинил может дополнительно содержать, например, одну или несколько двойных связей.
[0099]
В настоящем изобретении термин «арил» включает, например, моноциклические ароматические углеводородные группы и полициклические ароматические углеводородные группы. Примеры вышеуказанной моноциклической ароматической углеводородной группы включают фенил и тому подобное. Примеры вышеуказанной полициклической ароматической углеводородной группы включают 1-нафтил, 2-нафтил, 1-антрил, 2-антрил, 9-антрил, 1-фенантрил, 2-фенантрил, 3-фенантрил, 4-фенантрил, 9-фенантрил и тому подобное. Среди них, например, предпочтительными являются фенил, нафтилы, такие как 1-нафтил и 2-нафтил, и тому подобное.
[0100]
В настоящем изобретении термин «гетероарил» включает, например, моноциклические ароматические гетероциклические группы и конденсированные ароматические гетероциклические группы. Примеры вышеуказанного гетероарила включают фурилы (например, 2-фурил, 3-фурил), тиенилы (например, 2-тиенил, 3-тиенил), пирролилы (например, 1-пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил), имидазолилы (например, 1-имидазолил, 2-имидазолил, 4-имидазолил), пиразолилы (например, 1-пиразолил, 3-пиразолил, 4-пиразолил), триазолилы (например, 1,2,4-триазол-1-ил, 1,2,4-триазол-3-ил, 1,2,4-триазол-4-ил), тетразолилы (например, 1-тетразолил, 2-тетразолил, 5-тетразолил), оксазолилы (например, 2-оксазолил, 4 -оксазолил, 5-оксазолил), изоксазолилы (например, 3-изоксазолил, 4-изоксазолил, 5-изоксазолил), тиазолилы (например, 2-тиазолил, 4-тиазолил, 5-тиазолил), тиадиазолилы, изотиазолилы (например, 3-изотиазолил, 4-изотиазолил, 5-изотиазолил), пиридилы (например, 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил), пиридазинилы (например, 3-пиридазинил, 4-пиридазинил), пиримидинилы (например, 2-пиримидинил, 4-пиримидинил, 5-пиримидинил), фуразанилы (например, 3-фуразанил), пиразинилы (например, 2-пиразинил), оксадиазолилы (например, 1,3,4-оксадиазол-2-ил), бензофурилы (например, 2-бензо[b]фурил, 3-бензо[b]фурил, 4-бензо[b]фурил, 5-бензо[b]фурил, 6-бензо[b]фурил, 7-бензо[b]фурил), бензотиенилы (например, 2-бензо[b]тиенил, 3-бензо[b]тиенил, 4-бензо[b]тиенил, 5-бензо[b]тиенил, 6-бензо[b]тиенил, 7-бензо[b]тиенил), бензимидазолилы (например, 1-бензимидазолил, 2-бензимидазолил, 4-бензимидазолил, 5-бензимидазолил), дибензофурилы, бензоксазолилы, бензотиазолилы, хиноксалинилилы (например, 2-хиноксалинил, 5-хиноксалинил, 6-хиноксалинил), циннолинилы (например, 3-циннолинил, 4-циннолинил, 5-циннолинил, 6-циннолинил, 7-циннолинил, 8-циннолинил), хиназолинилы (например, 2-хиназолинил, 4-хиназолинил, 5-хиназолинил, 6-хиназолинил, 7-хиназолинил, 8-хиназолинил), хинолилы (например, 2-хинолил, 3-хинолил, 4-хинолил, 5-хинолил, 6-хинолил, 7-хинолил, 8-хинолил), фталазинилы (например, 1-фталазинил, 5-фталазинил, 6-фталазинил), изохинолилы (например, 1-изохинолил, 3-изохинолил, 4-изохинолил, 5-изохинолил, 6-изохинолил, 7-изохинолил, 8-изохинолил), пурилы, птеридинилы (например, 2-птеридинил, 4-птеридинил, 6-птеридинил, 7-птеридинил), карбазолилы, фенантридинилы, акридинилы (например, 1-акридинил, 2-акридинил, 3-акридинил, 4-акридинил, 9-акридинил), индолилы (например, 1-индолил, 2-индолил, 3-индолил, 4-индолил, 5-индолил, 6-индолил, 7-индолил), изоиндолилы, феназинилы (например, 1-феназинил, 2-феназинил) и фенотиазинилы (например, 1-фенотиазинил, 2-фенотиазинил, 3-фенотиазинил, 4-фенотиазинил) и тому подобное.
[0101]
В настоящем изобретении, например, термин «циклоалкил» относится к циклическим насыщенным углеводородным группам, и число атомов углерода в циклоалкиле равно, например, от 3 до 15. Примеры вышеуказанного циклоалкила включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, мостиковые циклические углеводородные группы, спирановые углеводородные группы и тому подобное. Среди них предпочтительными являются циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, мостиковые циклические углеводородные группы и тому подобное.
[0102]
В настоящем изобретении примеры «мостиковых циклических углеводородных групп» включают бицикло[2.1.0]пентил, бицикло[2.2.1]гептил, бицикло[2.2.2]октил и бицикло[3.2.1]октил, трицикло[2.2.1.0]гептил, бицикло[3.3.1]нонан, 1-адамантил, 2-адамантил и тому подобное.
[0103]
В настоящем изобретении примеры «спирановых углеводородных групп» включают спиро[3,4]октил и тому подобное.
[0104]
В настоящем изобретении термин «циклоалкенил» включает, например, ненасыщенные циклические алифатические углеводородные группы, и число атомов углерода в циклоалкениле равно, например, от 3 до 7. Примеры вышеуказанного циклоалкенила включают циклопропенил, циклобутенил, циклопентенил, циклогексенил, циклогептенил и тому подобное. Среди них предпочтительными являются циклопропенил, циклобутенил, циклопентенил, циклогексенил и тому подобное. Вышеуказанный термин «циклоалкенил» также включает, например, мостиковые циклические углеводородные группы и спирановые углеводородные группы, имеющие ненасыщенную связь в их кольцах.
[0105]
В настоящем изобретении примеры «арилалкила» включают бензил, 2-фенэтил, нафталинилметил и тому подобное. Примеры «циклоалкилалкила» и «циклилалкила» включают циклогексилметил и адамантилметил и тому подобное. Примеры «гидроксиалкила» включают гидроксиметил и 2-гидроксиэтил и тому подобное.
[0106]
В настоящем изобретении «алкокси» включает, например, группы, состоящие из любой вышеуказанной алкильной группы и кислорода (алкил-О-группы), и их примеры включают метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси и тому подобное. Примеры «алкоксиалкила» включают метоксиметил и тому подобное. Примеры «аминоалкила» включают 2-аминоэтил и тому подобное.
[0107]
В настоящем изобретении примеры «гетероциклила» включают 1-пирролинил, 2-пирролинил, 3-пирролинил, 1-пирролидинил, 2-пирролидинил, 3-пирролидинил, пирролидинон, 1-имидазолинил, 2-имидазолинил, 4-имидазолинил, 1-имидазолидинил, 2-имидазолидинил, 4-имидазолидинил, имидазолидинон, 1-пиразолинил, 3-пиразолинил, 4-пиразолинил, 1-пиразолидинил, 3-пиразолидинил, 4-пиразолидинил, пиперидинон, пиперидино, 2-пиперидинил, 3-пиперидинил, 4-пиперидинил, 1-пиперазинил, 2-пиперазинил, пиперазинон, 2-морфолинил, 3-морфолинил, морфолино, тетрагидропиранил, тетрагидрофуранил и тому подобное.
[0108]
В настоящем изобретении примеры «гетероциклилалкила» включают пиперидинилметил, пиперазинилметил и тому подобное. Примеры «гетероциклилалкенила» включают 2-пиперидинилэтенил и тому подобное. Примеры «гетероарилалкила» включают пиридилметил, хинолин-3-илметил и тому подобное.
[0109]
3
В настоящем изобретении термин «силил» включает группы, представленные химической формулой RSi-, где R независимо может быть выбран из вышеуказанных алкилов, арилов и циклоалкилов. Примеры силила включают триметилсилильную группу, трет-бутилдиметилсилильную группу и тому подобное. Примеры «силилокси» включают триметилсилилоксигруппу и тому подобное. Примерами «силилоксиалкила» являются триметилсилилоксиметил и тому подобное.
[0110]
В настоящем изобретении примеры «алкилена» включают метилен, этилен, пропилен и тому подобное.
[0111]
3
2
3
2
3
3
В настоящем изобретении вышеописанные различные группы могут быть замещены. Примеры вышеуказанного заместителя включают гидрокси, карбокси, сульфо, атом галогена, алкилгалогенид (галогеналкил, например, CF, CHCF, CHCCl), нитро, нитрозо, циано, алкил (например, метил, этил, изопропил, трет-бутил), алкенил (например, винил), алкинил (например, этинил), циклоалкил (например, циклопропил, адамантил), циклоалкилалкил (например, циклогексилметил, адамантилметил), циклоалкенил (например, циклопропенил), циклолалкил, гидроксиалкил (например, гидроксиметил, гидроксиэтил), алкоксиалкил (например, метоксиметил, этоксиметил, этоксиэтил), арил (например, фенил, нафтил), арилалкил (например, бензил, фенэтил), алкиларил (например, п-метилфенил), гетероарил (например, пиридил, фурил), гетероарилалкил (например, пиридилметил), гетероциклил (например, пиперидил), гетероциклилалкенил, гетероциклилалкил (например, морфолилметил), алкокси (например, метокси, этокси, пропокси, бутокси), галогенированный алкокси (например, OCF), алкенилокси (например, винилокси, аллилокси), арилокси (например, фенилокси), алкилоксикарбонил (например, метоксикарбонил, этоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил), арилалкилокси (например, бензилокси), амино [алкиламино (например, метиламино, этиламино, диметиламино), ациламино (например, ацетиламино, бензоиламино), арилалкиламино (например, бензиламино, тритиламино), гидроксиамино], аминометил), алкиламиноалкил (например, диэтиламинометил), карбамоил, сульфамоил, оксо, силил, силилоксиалкил и тому подобное.
[0112]
2
13
15
17
18
33
34
36
миРНК природного типа по настоящему изобретению может включать, например, вещество для введения метки, и может быть помечена вышеуказанным веществом для введения метки. Вышеуказанное вещество для мечения особым образом не ограничивается и может представлять собой, например, флуоресцентное вещество, краситель, изотоп и тому подобное. Примеры вышеуказанного вещества для введения метки включают: флуорофоры, такие как пирен, TAMRA, флуоресцеин, краситель Cy3, краситель Cy5 и тому подобное. Примеры вышеуказанного красителя включают красители Alexa, такие как Alexa 488, и тому подобное. Примеры вышеуказанного изотопа включают стабильные изотопы и радиоизотопы. Среди них предпочтительными являются стабильные изотопы. Кроме того, например, вышеуказанный стабильный изотоп не изменяет физических свойств соединения, помеченного им, и, таким образом, обладает отличным свойством в качестве индикатора. Вышеуказанный стабильный изотоп особым образом не ограничивается, и его примеры включают H, C, N, O, O, S, S и S.
[0113]
Как описано выше, миРНК природного типа по настоящему изобретению может ингибировать вышеуказанную экспрессию гена-мишени. Таким образом, миРНК природного типа по настоящему изобретению может быть использована, например, в качестве терапевтического агента для лечения заболевания, вызванного геном. Когда миРНК природного типа по настоящему изобретению содержит последовательность ведущей цепи зрелой миРНК, которая ингибирует экспрессию гена, вызывающего вышеуказанное заболевание, то, например, вышеуказанное заболевание можно лечить, ингибируя экспрессию вышеуказанного гена-мишени. В настоящем изобретении термин «лечение» включает профилактику вышеуказанных заболеваний; ослабление заболеваний; и, например, улучшение прогноза, и этот термин может означать любое из них. Вышеуказанное заболевание особым образом не ограничивается, и, например, вышеуказанная последовательность, которая ингибирует экспрессию, может быть установлена соответствующим образом согласно целевому заболеванию. Примеры вышеуказанного заболевания включают рак, такой как рак молочной железы, рак легких, рак желудка, колоректальный рак, рак печени, рак поджелудочной железы, рак пищевода, рак предстательной железы, рак желчного пузыря, рак матки, рак шейки матки, остеосаркому, лейкоз и тому подобное, и такие заболевания, как фиброз легких, фиброз печени и тому подобное.
[0114]
Способ применения миРНК природного типа по настоящему изобретению особым образом не ограничивается. Например, вышеуказанную миРНК природного типа можно вводить субъекту, имеющему вышеуказанный ген-мишень.
[0115]
Примеры вышеуказанного субъекта включают клетки, ткани и органы. Примерами вышеуказанного субъекта также являются люди, животные, отличные от человека, такие как млекопитающие, отличные от человека, исключая людей. Вышеуказанное введение может быть осуществлено, например, in vivo или in vitro. Вышеуказанные клетки особым образом не ограничиваются, и их примеры включают: различные культивируемые клетки, такие как клетки HeLa, клетки 293, клетки NIH3T3, клетки COS и тому подобное; стволовые клетки, такие как клетки ES, гемопоэтические стволовые клетки и тому подобное; и клетки, выделенные из живых организмов, такие как первичные культивируемые клетки и тому подобное.
[0116]
В настоящем изобретении вышеуказанный ген-мишень, экспрессия которого должна ингибироваться, особым образом не ограничивается, и любой требуемый ген может быть приравнен к гену-мишени. Как упоминалось выше, вышеуказанная зрелая миРНК может быть выбрана в соответствии с типом вышеуказанного гена-мишени.
[0117]
В отношение применения миРНК природного типа по настоящему изобретению, то можно обратиться к следующему описанию композиции, способа ингибирования экспрессии, способа лечения и тому подобное по настоящему изобретению, которое описано ниже.
[0118]
Поскольку миРНК природного типа по настоящему изобретению может ингибировать экспрессию гена-мишени, как описано выше, то, например, она пригодна в качестве фармацевтического продукта, диагностического агента, сельскохозяйственного химиката и инструмента для проведения исследований в области сельского хозяйства, медицинской науки, науки о жизни и т.п.
[0119]
Способ синтеза миРНК природного типа по настоящему изобретению особым образом не ограничивается, и может быть использован традиционно известный способ получения нуклеиновой кислоты. Примеры вышеуказанного метода синтеза включают методы синтеза на основе процедур генной инженерии, методов химического синтеза и тому подобное. Примеры методов генной инженерии включают: методы синтеза, в которых используется транскрипция in vitro; методы с использованием вектора; методы, выполняемые с использованием ПЦР-кассеты и т.п. Вышеуказанный вектор особым образом не ограничивается, и их примеры включают невирусные векторы, такие как плазмида и тому подобное, и вирусные векторы и тому подобное. Вышеуказанные методы химического синтеза особым образом не ограничиваются, и их примеры включают фосфорамидитный метод, H-фосфонатный метод и тому подобное. Вышеуказанные методы химического синтеза могут быть выполнены, например, с использованием коммерчески доступного автоматического синтезатора нуклеиновых кислот. В вышеуказанных методах химического синтеза обычно используется амидит. Вышеуказанный амидит особым образом не ограничивается. Примеры коммерчески доступных амидитов включают РНК-фосфорамидиты (2'-O-TBDMSi, торговое название, Samchully Pharm. Co., Ltd.), ACE-амидит, TOM-амидит, CEE-амидид, CEM-амидит, TEM-амидит и тому подобное.
[0120]
(2) Композиция
Ингибирующая экспрессию композиция по настоящему изобретению представляет, как описано выше, композицию для ингибирования экспрессии гена-мишени, специфически содержащую вышеуказанную миРНК природного типа по настоящему изобретению. Композиция по настоящему изобретению отличается тем, что она содержит вышеуказанную миРНК природного типа по настоящему изобретению, и другие конфигурации никоим образом не ограничиваются. Ингибирующую экспрессию композицию по настоящему изобретению можно также назвать, например, как ингибирующий экспрессию реагент.
[0121]
Согласно настоящему изобретению, например, путем введения субъекту, у которого присутствует вышеуказанный ген-мишень, можно ингибировать экспрессию вышеуказанного гена-мишени.
[0122]
Кроме того, как описано выше, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению специфически содержит вышеуказанную миРНК природного типа по настоящему изобретению. Композиция по настоящему изобретению отличается тем, что она содержит вышеуказанную миРНК природного типа по настоящему изобретению, и другие конфигурации никоим образом не ограничиваются. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно также назвать, например, как фармацевтический продукт.
[0123]
Согласно настоящему изобретению, например, введение пациенту с заболеванием, вызванным геном, может ингибировать экспрессию вышеуказанного гена, тем самым обеспечивая лечение вышеуказанного заболевания. В настоящем изобретении термин «лечение» включает, как упоминалось выше, профилактику вышеуказанных заболеваний; ослабление заболеваний; и, например, улучшение прогноза, и этот термин может означать любое из них.
[0124]
В настоящем изобретении заболевание, подлежащее лечению, особым образом не ограничивается, и его примеры включают заболевания, вызванные экспрессией генов. В зависимости от вида вышеуказанного заболевания ген, который вызывает заболевание, может быть установлен как вышеуказанный ген-мишень, и, кроме того, в зависимости от вышеуказанного гена-мишени может быть выбрана вышеуказанная последовательность ведущей цепи вышеуказанной зрелой миРНК.
[0125]
Способ применения ингибирующей экспрессию композиции и фармацевтической композиции по настоящему изобретению (ниже обе композиции просто называются «композициями») особым образом не ограничивается, и его примеры включают введение вышеуказанной миРНК природного типа субъекту, имеющему вышеуказанный ген-мишень.
[0126]
Примеры вышеуказанного субъекта включают клетки, ткани и органы. Примерами вышеуказанного субъекта также являются люди, животные, отличные от человека, такие как млекопитающие, отличные от человека, исключая людей. Вышеуказанное введение может быть осуществлено, например, in vivo или in vitro. Вышеуказанные клетки особым образом не ограничиваются, и их примеры включают: различные культивируемые клетки, такие как клетки HeLa, клетки 293, клетки NIH3T3, клетки COS и тому подобное; стволовые клетки, такие как клетки ES, гемопоэтические стволовые клетки и тому подобное; и клетки, выделенные из живых организмов, такие как первичные культивируемые клетки и тому подобное.
[0127]
Вышеуказанный способ введения особым образом не ограничивается, и может быть определен, например, как соответствующий в зависимости от конкретного субъекта. Когда вышеуказанный субъект представляет собой культивированную клетку, то способ введения может представлять, например, способ, в котором применяется реагент для трансфекции, метод электропорации или тому подобное.
[0128]
Например, каждая из композиций по настоящему изобретению может содержать только миРНК природного типа по настоящему изобретению или дополнительно может содержать добавку(и) в дополнение к миРНК природного типа. Вышеуказанная добавка особым образом не ограничивается и предпочтительно представляет, например, фармацевтически приемлемую добавку. Тип вышеуказанной добавки особым образом не ограничивается, и она может быть выбрана как соответствующая в зависимости, например, от типа субъекта.
[0129]
В композиции по настоящему изобретению, например, вышеуказанная миРНК природного типа может образовывать комплекс с вышеуказанной добавкой. Вышеуказанную добавку можно также отнести, например, к комплексообразователю. Вышеуказанное комплексообразование позволяет, например, получить вышеуказанную миРНК природного типа для эффективной доставки.
[0130]
Вышеуказанный комплексообразующий агент особым образом не ограничивается, и его примеры включают полимеры, циклодекстрины, адамантин и тому подобное. Примеры вышеуказанных циклодекстринов включают линейные сополимеры циклодекстрина, линейные сополимеры окисленного циклодекстрина и тому подобное.
[0131]
Другие примеры вышеуказанной добавки включают носитель, связующее вещество, которое связывается с клеткой-мишенью, конденсирующий агент, фузогенный агент, эксципиент и т.п.
[0132]
(3) Способ ингибирования экспрессии
Способ ингибирования экспрессии по настоящему изобретению, как описано выше, представляет способ ингибирования экспрессии гена-мишени, в котором специфически используется миРНК природного типа по настоящему изобретению. Способ ингибирования экспрессии по настоящему изобретению отличается тем, что в нем используется вышеуказанная миРНК природного типа по настоящему изобретению, и другие стадии и условия никоим образом не ограничиваются.
[0133]
В способе ингибирования экспрессии по настоящему изобретению механизм ингибирования экспрессии вышеуказанного гена-мишени особым образом не ограничивается, и его примеры включают ингибирование экспрессии под действием зрелой миРНК.
[0134]
Способ ингибирования экспрессии по настоящему изобретению включает, например, стадию введения вышеуказанной миРНК природного типа субъекту, где присутствует вышеуказанный ген-мишень. Посредством вышеуказанной стадии введения, например, вышеуказанная миРНК природного типа приводится в контакт с вышеуказанным субъектом. Примеры вышеуказанного субъекта включают клетки, ткани и органы. Примерами вышеуказанного субъекта также являются люди, животные, отличные от человека, такие как млекопитающие, отличные от человека, исключая людей. Вышеуказанное введение может быть осуществлено, например, in vivo или in vitro.
[0135]
В способе ингибирования экспрессии по настоящему изобретению, например, вышеуказанная миРНК природного типа может быть введена самостоятельно, или может быть введена вышеуказанная композиция по настоящему изобретению, содержащая вышеуказанную миРНК природного типа. Вышеуказанный способ введения особым образом не ограничивается и, например, может быть выбран в зависимости от типа субъекта.
[0136]
(4) Способ лечения
Как описано выше, способ лечения заболевания по настоящему изобретению включает стадию введения вышеуказанной миРНК природного типа по настоящему изобретению пациенту и отличается тем, что вышеуказанная последовательность ведущей цепи в вышеуказанной миРНК природного типа представляет последовательность ведущей цепи зрелой миРНК, которая ингибирует экспрессию гена, вызывающего вышеуказанное заболевание. Способ лечения по настоящему изобретению отличается применением вышеуказанной миРНК природного типа по настоящему изобретению, и другие стадии и условия никоим образом не ограничиваются.
[0137]
Вышеуказанный способ ингибирования экспрессии по настоящему изобретению также относится, например, к способу лечения по настоящему изобретению. Вышеуказанный способ введения особым образом не ограничивается и может представлять собой, например, любое пероральное введение и парентеральное введение.
[0138]
(5) Применение миРНК природного типа
Применение по настоящему изобретению представляет применение вышеуказанной миРНК природного типа по настоящему изобретению для вышеуказанного ингибирования экспрессии гена-мишени.
[0139]
Одноцепочечная нуклеиновая кислота по настоящему изобретению представляет собой одноцепочечную нуклеиновую кислоту для применения в лечении заболевания. Вышеуказанная одноцепочечная нуклеиновая кислота представляет вышеуказанную миРНК природного типа по настоящему изобретению и отличается тем, что вышеуказанная последовательность ведущей цепи в вышеуказанной миРНК природного типа представляет последовательность ведущей цепи зрелой миРНК, которая ингибирует экспрессию гена, вызывающего вышеуказанное заболевание.
[0140]
В дальнейшем настоящее изобретение будет подробно описано со ссылкой на примеры и тому подобное. Следует, однако, отметить, что настоящее изобретение никоим образом не ограничивается этим.
Примеры
[0141]
Пример 1
На основе информации о последовательности ведущей цепи и «пассажирской» цепи зрелой miR-34a (инвентарный номер MI0000268 в miRBase) синтезировали различные миРНК природного типа по настоящему изобретению, имеющие разную длину оснований дополнительной последовательности (спейсера), вводили в культивируемые клетки и оценивали ингибирующее действие на экспрессию мРНК гена-мишени AXL.
[0142]
(1) Синтез миРНК
Синтезировали двухцепочечную зрелую miR-34a человека (NI-0208), состоящую из ведущей цепи (SEQ ID NO: 1) и «пассажирской» цепи (SEQ ID NO: 2), показанных ниже, в качестве положительной контрольной миРНК, и синтезировали одноцепочечную miR-34a природного типа (NM-0004), в которой вышеуказанная ведущая цепь связана с вышеуказанной «пассажирской» цепью через последовательность области петли пре-miR-34a.
В качестве отрицательного контроля синтезировали двухцепочечную РНК (NI-0000), состоящую из последовательности, не обладающей комплементарностью ко всем последовательностям, зарегистрированным в базе данных по нуклеиновым кислотам, и последовательностью, комплементарную ей.
[0143]
[0144]
В вышеуказанной последовательности звездочка показывает основание, не комплементарное соответствующему основанию ведущей цепи.
[0145]
В следующей последовательности подчеркнутый участок представляет вышеуказанную последовательность ведущей цепи, и строчные буквы указывают вышеуказанную последовательность «пассажирской» цепи.
NM-0004 (SEQ ID NO: 11)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UGUGAGCAAUAGUAAGGAAGcaaucagcaaguauacugcccu-3'
NI-0208 (SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'--3'/5'-caaucagcaaguauacugcccu-3'
NI-0000 (SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 13)
5'-UACUAUUCGACACGCGAAGTT-3'/5'-CUUCGCGUGUCGAAUAGUATT-3'
[0146]
В качестве миРНК природного типа из примера синтезировали miR-34a природного типа, в которой область X, состоящая из вышеуказанной ведущей цепи (SEQ ID NO: 1) и дополнительной последовательности (длиной 0, 3, 5 или 7 оснований), и область Y, содержащая на 5'-конце вышеуказанной «пассажирской» цепи, «свисающий конец» вышеуказанной ведущей цепи, и последовательность, полностью комплементарную вышеуказанной дополнительной последовательности, связаны посредством ненуклеотидной структуры на основе производного пролина следующей формулы. В синтезе вышеуказанной миРНК природного типа ненуклеотидные структуры производных пролина следующих формул были вставлены с использованием амидита диамида L-пролина (см. WO 2012/017919).
[0147]
[0148]
[0149]
В вышеуказанных последовательностях звездочка показывает основание, не комплементарное соответствующей ведущей цепи. Кроме того, число после слова «спейсер» показывает длину оснований дополнительной последовательности вышеуказанной области Х.
[0150]
В следующей последовательности подчеркнутый участок представляет вышеуказанную последовательность ведущей цепи, и строчными буквами показана вышеуказанная последовательность «пассажирской» цепи. Кроме того, [P] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного пролина.
PH-0036 (SEQ ID NO: 14)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'--[P]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0038 (SEQ ID NO: 15)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCC-[P]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0066 (SEQ ID NO: 16)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCCGG-[P]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0068 (SEQ ID NO: 17)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCCGGCC-[P]-GGCCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
[0151]
(2) Определение уровня экспресии гена AXL
Каждую из вышеуказанных РНК растворяли в дистиллированной воде для инъекций (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) в концентрации 2 мкмоль/л, тем самым получали раствор РНК.
[0152]
2
В качестве клеток использовали клетки H1299 (АТСС). В качестве среды использовали среду RPMI 1640 (Life Technologies), содержащую 10% FBS. Условия культивирования устанавливали на 37°С, 5% СО.
[0153]
4
Вначале клетки культивировали в вышеуказанной среде и культированный раствор разливали в 24-луночный планшет таким образом, чтобы каждая лунка содержала 400 мкл культивированного раствора для достижения плотности 4×10 клеток/лунку. Клетки трансфицировали вышеуказанной РНК с использованием (А) реагента для трансфекции Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) согласно протоколу, приложенному к вышеуказанному реагенту для трансфекции. В частности, трансфекцию проводили при определении состава компонентов на лунку следующим образом. В следующей композиции (В) представляет Opti-MEM (Life Technologies), (C) представляет вышеуказанный раствор РНК с концентрацией 2 мкмоль/л, в общем добавляли 98,5 мкл реагентов. Конечную концентрацию вышеуказанной РНК в вышеуказанной лунке устанавливали равной 1 нмоль/л.
[0154]
Таблица 1
(состав на лунку: мкл)
культивированный раствор
400
реагент для трансфекции
1,5
(B)+(C)
98,5
в общем
500
[0155]
После трансфекции клетки в вышеуказанных лунках культивировали в течение 24 ч, и затем выделяли РНК с использованием набора RNeasy Mini (Qiagen, Netherlands) согласно протоколу, приложенному к набору. Затем синтезировали кДНК из вышеуказанной РНК с использованием набора для синтеза кДНК Transcriptor First Strand (Roche) согласно протоколу, приложенному к набору. Затем, как показано ниже, проводили ПЦР с использованием вышеуказанной синтезированной кДНК в качестве матрицы и измеряли уровень экспрессии гена AXL и гена GAPDH, который использовали в качестве внутреннего стандарта. Вышеуказанный уровень экспрессии гена AXL нормализовали по отношению к вышеуказанному гену GAPDH.
[0156]
Вышеуказанную ПЦР проводили с использованием LightCycler 480 SYBR Green I Master (торговая марка Roche) в качестве реагента и анализатор LightCycler 480 Instrument II (торговое название, Roche) в качестве прибора (в дальнейшем тоже самое). Вышеуказанные гены AXL и GAPDH амплифицировали с использованием следующих наборов праймеров, соответственно.
Набор праймеров для ПЦР для гена AXL
(SEQ ID NO: 18) 5'-CTCAACCAGGACGACTCCAT-3'
(SEQ ID NO: 19) 5'-AGACCGCTTCACTCAGGAAA-3'
Набор праймеров для гена GAPDH
(SEQ ID NO: 20) 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'
(SEQ ID NO: 21) 5'-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3'
[0157]
В качестве контроля 1 служили клетки, к которым добавляли 100 мкл только одного вышеуказанного раствора (В), без вышеуказанного культивированного раствора, и также измеряли уровни экспрессии генов (-). Кроме того, в качестве контроля 2 служили клетки, подвергшиеся тем же самым процедурам трансфекции, как описано выше, за исключением того, что вышеуказанный раствор РНК не добавляли, а добавляли вышеуказанный раствор (В) и 1,5 мкл вышеуказанного раствора (А), количество (А) и (В) должно было составлять 100 мкл, и также определяли уровень экспрессии гена («ложный» контроль).
[0158]
В отношение уровней экспрессии нормализованного гена AXL, то относительное значение уровня экспрессии в клетке, в которую вводили каждую РНК, определяли на основе уровня экспрессии в клетках контроля 1 (-).
[0159]
(3) Результаты
Как показано на фиг. 2, miR-34a природного типа из примера ингибировала экспрессию мРНК AXL на таком же уровне, что и положительный контрольный вариант зрелой miR-34a и пре-miR-34a. Кроме того, ингибирующее действие на экспрессию мРНК AXL сохранялось даже при изменении длины оснований дополнительной последовательности области X.
[0160]
Пример 2
В miR-34a природного типа из примера 1 ненуклеотидную структуру линкерной области модифицировали, и аналогично оценивали ингибирующее действие на экспрессию мРНК AXL.
[0161]
(1) Синтез миРНК
Как показано ниже, синтезировали молекулу (KH-0006), в которой ненуклеотидную структуру производного лизина следующей формулы замещали линкерной областью PH-0036,
[0162]
,
[0163]
молекулу (XH-0011), в которой ненуклеотидную структуру производного глицина следующей формулы замещали линкерной областью PH-0036,
[0164]
[0165]
молекулу (XH-0013), в которой ненуклеотидную структуру производного глицилглицина следующей формулы замещали линкерной областью PH-0036,
[0166]
[0167]
GlyGly в вышеуказанной химической формуле (G2) представляет атомную группу, представленную следующей химической формулой (GlyGly), где концевой карбонильный углерод связан с атомом N в вышеуказанной химической формуле (G2), и концевой атом азота в следующей химической формуле (GlyGly) связан с карбонильным углеродом в вышеуказанной химической формуле (G2),
[0168]
и
[0169]
молекулу (XH-0015), в которой ненуклеотидную структуру производного терефталевой кислоты следующей формулы замещали линкерной областью PH-0036,
[0170]
[0171]
Ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного лизина вставляли с использованием амидамидита L-лизина (см. WO 2013/103146), ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного глицина вставляли с использованием амидамидита глицина (см. WO 2013/103146), ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного глицилглицина вставляли с использованием амидимидита глицилглицина (см. WO 2013/133221), и ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного терефталевой кислоты вставляли с использованием амидита терефталевой кислоты (см. WO 2013/103221),
[0172]
[0173]
В следующей последовательности [K] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного лизина, [Gly] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного глицина, [GlyGly] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного глицилглицина, и [TP] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанной терефталевой кислоты. В следующих последовательностях область 5'-конца каждого линкера представляет область X, и в вышеуказанной области X подчеркнутый участок представляет вышеуказанную последовательность ведущей цепи, остальная часть представляет собой вышеуказанную дополнительную последовательность, и область 3'-конца каждого линкера является областью Y, и в вышеуказанной области Y строчными буквами указана вышеуказанная последовательность «пассажирской» цепи.
KH-0006 (SEQ ID NO: 14)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'--[K]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0011 (SEQ ID NO: 14)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'--[Gly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0013 (SEQ ID NO: 14)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'--[GlyGly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0015 (SEQ ID NO: 14)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'--[TP]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
Аналогично примеру 1, NM-0004 и NI-0208 использовали в качестве положительного контроля, и NI-0000 использовали в качестве отрицательного контроля.
[0174]
(2) Определение уровня экспрессии гена AXL
Способом, аналогичным описанному в примере 1, клетки H1299 (АТСС) трансфицировали каждой из вышеуказанных РНК и определяли уровень экспрессии мРНК AXL.
[0175]
(3) Результаты
Как показано на фиг. 3, ингибирующее действие на экспрессию мРНК AXL сохранялось даже, когда была изменена ненуклеотидная структура линкерной области.
[0176]
Пример 3
Затем исследовали эффект вставки дополнительной последовательности в область X в XH-0015, имеющей линкерную область ненуклеотидной структуры на основе производного терефталевой кислоты, которое использовали в примере 2. Ниже представлена структура и последовательность используемой miR-34a природного типа.
[0177]
[0178]
В вышеуказанной последовательности звездочка показывает основание, не комплементарное соответствующей ведущей цепи. «Спейсер» показывает, что вышеуказанная область Х содержит дополнительную последовательность.
[0179]
В следующей последовательности подчеркнутый участок представляет вышеуказанную последовательность ведущей цепи, и строчными буквами показана вышеуказанная последовательность «пассажирской» цепи. [TP] обозначает ненуклеотидную структуру на основе вышеуказанного производного терефталевой кислоты.
XH-0015 (SEQ ID NO: 14)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'--[TP]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0024 (SEQ ID NO: 15)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCC-[TP]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
[0180]
Способом, аналогичным описанному в примере 1, клетки H1299 (АТСС) трансфицировали каждой из вышеуказанных РНК и определяли уровень экспрессии мРНК AXL.
В результате, как показано на фиг. 4, ингибирующее действие на экспрессию мРНК AXL сохранялось даже, когда в область Х вставляли дополнительную последовательность.
[0181]
Пример 4
На основе информации о последовательности ведущей цепи и «пассажирской» цепи зрелой let-7a (инвентарный номер MI0000060 в miRBase) синтезировали различные мРНК природного типа по настоящему изобретению, имеющие другую ненуклеотидную структуру линкерной области, вводили в культивируемые клетки и оценивали ингибирующее действие на экспрессию мРНК гена-мишени HMGA2. Когда в мРНК природного типа используется линкер, имеющий ненуклеотидную структуру на основе производного пролина, то также синтезировали линкер, имеющий дополнительную последовательность, вставленную в область Х.
[0182]
(1) Синтез миРНК
Синтезировали двухцепочечную зрелую let-7a человека (NI-0205), состоящую из ведущей цепи (SEQ ID NO: 3) и «пассажирской» цепи (SEQ ID NO: 4), показанных ниже, в качестве положительной контрольной миРНК, и синтезировали одноцепочечную let-7a природного типа (NM-0003), в которой вышеуказанная ведущая цепь связана с вышеуказанной «пассажирской» цепью через последовательность области петли в пре-let-7a.
Кроме того, в качестве отрицательного контроля использовали вышеуказанную NI-0000.
[0183]
[0184]
В вышеуказанной последовательности звездочка показывает основание, не комплементарное соответствующей ведущей цепи.
[0185]
В следующих последовательностях подчеркнутый участок представляет вышеуказанную последовательность ведущей цепи, и строчными буквами показана вышеуказанная последовательность «пассажирской» цепи.
NM-0003 (SEQ ID NO: 22)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'-UUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
NI-0205 (SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 4)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'--3'/5'-cuauacaaucuacugucuuuc-3'
[0186]
Как показано ниже, синтезировали различные let-7a природного типа, в которых область X, состоящая из вышеуказанной ведущей цепи (SEQ ID NO: 3) и дополнительной последовательности (длиной 0-3 оснований), и область Y, имеющая, на 5'-конце вышеуказанной «пассажирской» цепи, область «свисающего конца» вышеуказанной ведущей цепи и последовательность, полностью комплентарную вышеуказанной дополнительной последовательности, связаны посредством линкера на основе вышеуказанного производного пролина ([P]), производного лизина ([K]), производного глицина ([Gly]), производного глицилглицина ([GlyGly]) или производного терефталевой кислоты ([TP]). В вышеуказанном синтезе мРНК природного типа каждую ненуклеотидную структуру вставляли таким же образом, как описано в примерах 1 и 2.
[0187]
[0188]
В вышеуказанной последовательности «спейсер» показывает, что вышеуказанная область Х содержит дополнительную последовательность.
[0189]
В следующей последовательности [P] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного пролина, [K] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного лизина, [Gly] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного глицина, [GlyGly] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного глицилглицина, и [TP] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанной терефталевой кислоты. В следующих последовательностях область 5'-конца каждого линкера представляет область X, и в вышеуказанной области X подчеркнутый участок представляет вышеуказанную последовательность ведущей цепи, остальная часть представляет собой вышеуказанную дополнительную последовательность, и область 3'-конца каждого линкера является областью Y, и в вышеуказанной области Y строчными буквами показана вышеуказанная последовательность «пассажирской» цепи.
PH-0011 (SEQ ID NO: 23)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'--[P]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
KH-0003 (SEQ ID NO: 23)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'--[K]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0002 (SEQ ID NO: 23)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'--[Gly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0004 (SEQ ID NO: 23)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'--[GlyGly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0006 (SEQ ID NO: 23)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'--[TP]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
PH-0014 (SEQ ID NO: 24)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'-UCC-[P]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
[0190]
(2) Определение уровня экспрессии гена HMGA2
Каждую из вышеуказанных РНК растворяли в дистиллированной воде для инъекций (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) в концентрации 0,2 мкмоль/л, тем самым получали раствор РНК.
[0191]
2
В качестве клеток использовали клетки A549 (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). В качестве среды использовали среду DMEM, содержащую 10% FBS (Life Technologies). Условия культивирования устанавливали при 37°С и 5% CO.
[0192]
4
Вначале клетки культивировали в вышеуказанной среде и культивированный раствор разливали в 24-луночный планшет таким образом, чтобы каждая лунка содержала 400 мкл культивированного раствора для достижения плотности 4×10 клеток/лунку. Клетки трансфицировали вышеуказанной РНК с использованием (А) реагента для трансфекции Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) согласно протоколу, приложенному к вышеуказанному реагенту для трансфекции. В частности, трансфекцию проводили при определении состава компонентов на лунку следующим образом. В следующей композиции (В) представляет Opti-MEM (Life Technologies), (C) представляет вышеуказанный раствор РНК с концентрацией 2 мкмоль/л, в общем, добавляли 98,5 мкл регентов. Конечную концентрацию вышеуказанной РНК в вышеуказанной лунке устанавливали равной 0,1 нмоль/л.
[0193]
Таблица 2
(состав на лунку: мкл)
культивированный раствор
400
реагент для трансфекции
1,5
(B)+(C)
98,5
в общем
500
[0194]
После трансфекции клетки в вышеуказанных лунках культивировали в течение 24 ч, и затем выделяли РНК с использованием набора RNeasy Mini (Qiagen, Netherlands) согласно протоколу, приложенному к набору. Затем синтезировали кДНК из вышеуказанной РНК с использованием набора для синтеза кДНК Transcriptor First Strand (Roche) согласно протоколу, приложенному к набору. Затем, как показано ниже, проводили ПЦР с использованием вышеуказанной синтезированной кДНК в качестве матрицы и измеряли уровень экспрессии гена HMGA2 и гена GAPDH, который использовали в качестве внутреннего стандарта. Вышеуказанный уровень экспрессии гена HMGA2 нормализовали по отношению к вышеуказанному гену GAPDH.
[0195]
Вышеуказанную ПЦР проводили с использованием LightCycler 480 SYBR Green I Master (торговая марка Roche) в качестве реагента и анализатор LightCycler 480 Instrument II (торговое название, Roche) в качестве прибора (в дальнейшем тоже самое). Вышеуказанные гены HMGA2 и GAPDH амплифицировали с использованием следующих наборов праймеров, соответственно.
Набор праймеров для ПЦР для гена HMGA2
(SEQ ID NO: 25) 5'-GAAGCCACTGGAGAAAAACG-3'
(SEQ ID NO: 26) 5'-CTTCGGCAGACTCTTGTGAG-3'
Набор праймеров для ПЦР для гена GAPDH
(SEQ ID NO: 20) 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'
(SEQ ID NO: 21) 5'-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3'
[0196]
В качестве контроля 1 служили клетки, к которым добавляли 100 мкл только одного вышеуказанного раствора (В), без вышеуказанного культивированного раствора, и также измеряли уровни экспрессии генов (-). Кроме того, в качестве контроля 2 служили клетки, подвергшиеся тем же самым процедурам трансфекции, как описано выше, за исключением того, что вышеуказанный раствор РНК не добавляли, а добавляли вышеуказанный раствор (В) и 1,5 мкл вышеуказанного раствора (А), количество (А) и (В) должно было составлять 100 мкл, и также определяли уровень экспрессии гена («ложный» контроль).
[0197]
В отношение уровня экспрессии нормализованного гена HMGA2, то относительное значение уровня экспрессии в клетке, в которую вводили каждую РНК, определяли на основе уровня экспрессии в клетках контроля 1 (-).
[0198]
(3) Результаты
Как показано на фиг. 5, let-7a природного типа из примера ингибировала экспрессию мРНК HMGA2 на таком же уровне, что и положительный контрольный вариант зрелой let-7a и пре-let-7a. Кроме того, ингибирующее действие на экспрессию мРНК HMGA2 сохранялось даже при изменении ненуклеотидной структуры линкера вставки дополнительной последовательности в область X.
[0199]
Пример 5
На основе информации о последовательности ведущей цепи и «пассажирской» цепи зрелой miR-29b (инвентарный номер MI0000105 в miRBase) синтезировали различные мРНК природного типа по настоящему изобретению, имеющие другую ненуклеотидную структуру линкерной области, вводили в культивируемые клетки и оценивали ингибирующее действие на экспрессию мРНК гена-мишени COL1A1. Когда в миРНК природного типа используется линкер, имеющий ненуклеотидную структуру на основе производного пролина, то также синтезировали молекулу, имеющую дополнительную последовательность, вставленную в область Х.
[0200]
(1) Синтез миРНК
Синтезировали двухцепочечную зрелую miR-29b человека (NI-0210), состоящую из ведущей цепи (SEQ ID NO: 9) и «пассажирской» цепи (SEQ ID NO: 10), показанных ниже, в качестве положительной контрольной миРНК, и синтезировали одноцепочечную miR-29b природного типа (NM-0005), в которой вышеуказанная ведущая цепь связана с вышеуказанной «пассажирской» цепью через последовательность области петли в пре-miR-29b.
Кроме того, в качестве отрицательного контроля использовали вышеуказанную NI-0000.
[0201]
[0202]
В вышеуказанной последовательности звездочка показывает основание, не комплементарное соответствующей ведущей цепи.
[0203]
В следующей последовательности подчеркнутый участок представляет вышеуказанную последовательность ведущей цепи, и строчными буквами показана вышеуказанная последовательность «пассажирской» цепи.
NM-0005 (SEQ ID NO: 27)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAAAUAGUGAUUGUC-3'
NI-0210 (SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 9)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-3'/5'--3'
[0204]
Как показано ниже, синтезировали различные miR-29b природного типа, в которых область X, состоящая из вышеуказанной ведущей цепи (SEQ ID NO: 10) и дополнительной последовательности (длиной 0-3 оснований), и область Y, имеющая на 5'-конце вышеуказанной «пассажирской» цепи, область «свисающего конца» вышеуказанной ведущей цепи, и последовательность, полностью комплентарную вышеуказанной дополнительной последовательности, связаны посредством линкера на основе вышеуказанного производного пролина ([P]), производного лизина ([K]), производного глицина ([Gly]), производного глицилглицина ([GlyGly]) или производного терефталевой кислоты ([TP]). В вышеуказанном синтезе мРНК природного типа, каждую ненуклеотидную структуру вставляли таким же образом, как описано в примерах 1 и 2.
[0205]
[206]
В вышеуказанной последовательности звездочка показывает основание, не комплементарное соответствующей ведущей цепи. «Спейсер» показывает, что вышеуказанная область Х содержит дополнительную последовательность.
[0207]
В следующей последовательности, [P] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного пролина, [K] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного лизина, [Gly] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного глицина, [GlyGly] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанного производного глицилглицина, и [TP] обозначает ненуклеотидную структуру вышеуказанной терефталевой кислоты. В следующих последовательностях область 5'-конца каждого линкера представляет область X, и в вышеуказанной области X строчными буквами показана вышеуказанная последовательности «пассажирской» цепи, остальная часть представляет собой вышеуказанную дополнительную последовательность, и область 3'-конца каждого линкера является областью Y, и в вышеуказанной области Y подчеркнутый участок показывает вышеуказанную последовательность ведущей цепи.
PH-0040 (SEQ ID NO: 28)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[P]-UC-3'
KH-0008 (SEQ ID NO: 28)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[K]-UC-3'
XH-0017 (SEQ ID NO: 28)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[Gly]-UC-3'
XH-0019 (SEQ ID NO: 28)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[GlyGly]-UC-3'
XH-0021 (SEQ ID NO: 28)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[TP]-UC-3'
PH-0042 (SEQ ID NO: 29)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[P]-GGAUC-3'
В качестве отрицательного контроля использовали NI-0000, синтезированную как описано в примере 1.
[0208]
(2) Определение уровня экспрессии гена COL1A1
Каждую из вышеуказанных РНК растворяли в дистиллированной воде для инъекций (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) в концентрации 2 мкмоль/л, тем самым получали раствор РНК.
[0209]
2
В качестве клеток использовали клетки A549 (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). В качестве среды использовали среду DMEM, содержащую 10% FBS (Life Technologies). Условия культивирования устанавливали при 37°С и 5% CO.
[0210]
4
Вначале клетки культивировали в вышеуказанной среде и культивированный раствор разливали в 24-луночный планшет таким образом, чтобы каждая лунка содержала 400 мкл культивированного раствора для достижения плотности 4×10 клеток/лунку. Клетки трансфицировали вышеуказанной РНК с использованием (А) реагента для трансфекции Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) согласно протоколу, приложенному к вышеуказанному реагенту для трансфекции. В частности, трансфекцию проводили при определении состава компонентов на лунку следующим образом. В следующей композиции (В) представляет Opti-MEM (Life Technologies), (C) представляет вышеуказанный раствор РНК с концентрацией 2 мкмоль/л, в общем, добавляли 98,5 мкл реагентов. Конечную концентрацию вышеуказанной РНК в вышеуказанной лунке устанавливали равной 1 нмоль/л.
[0211]
Таблица 3
(состав на лунку: мкл)
культивированный раствор
400
реагент для трансфекции
1,5
(B)+(C)
98,5
в общем
500
[0212]
После трансфекции клетки в вышеуказанных лунках культивировали в течение 24 ч, и затем выделяли РНК с использованием набора RNeasy Mini (Qiagen, Netherlands) согласно протоколу, приложенному к набору. Затем синтезировали кДНК из вышеуказанной РНК с использованием набора для синтеза кДНК Transcriptor First Strand (Roche) согласно протоколу, приложенному к набору. Затем, как показано ниже, проводили ПЦР с использованием вышеуказанной синтезированной кДНК в качестве матрицы и измеряли уровень экспрессии гена COL1A1 и гена GAPDH, который использовали в качестве внутреннего стандарта. Вышеуказанный уровень экспрессии гена COL1A1 нормализовали по отношению к вышеуказанному гену GAPDH.
[0213]
Вышеуказанную ПЦР проводили с использованием LightCycler 480 SYBR Green I Master (торговая марка Roche) в качестве реагента и анализатора LightCycler 480 Instrument II (торговое название, Roche) в качестве прибора (в дальнейшем то же самое). Вышеуказанные гены COL1A1 и GAPDH амплифицировали с использованием следующих наборов праймеров, соответственно.
Набор праймеров для ПЦР для гена COL1A1
(SEQ ID NO: 30) 5'-CCCAAGGACAAGAGGCATGT-3'
(SEQ ID NO: 31) 5'-CCGCCATACTCGAACTGGAA-3'
Набор праймеров для ПЦР для гена GAPDH
(SEQ ID NO: 20) 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'
(SEQ ID NO: 21) 5'-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3'
[0214]
В качестве контроля 1 служили клетки, к которым добавляли 100 мкл только одного вышеуказанного раствора (В), без вышеуказанного культивированного раствора, и также измеряли уровни экспрессии генов (-). Кроме того, в качестве контроля 2 служили клетки, подвергшиеся тем же самым процедурам трансфекции, как описано выше, за исключением того, что вышеуказанный раствор РНК не добавляли, а добавляли вышеуказанный раствор (В) и 1,5 мкл вышеуказанного раствора (А), количество (А) и (В) должно было составлять 100 мкл, и также определяли уровень экспрессии гена («ложный» контроль).
[0215]
В отношение уровня экспрессии нормализованного гена COL1A1, то относительное значение уровня экспрессии в клетке, в которую вводили каждую РНК, определяли на основе уровня экспрессии в клетках контроля 1 (-).
[0216]
(3) Результаты
Как показано на фиг. 6, miR-29b природного типа из примера ингибировала экспрессию мРНК COL1A1 на таком же уровне, что и положительный контрольный вариант зрелой miR-29b и пре-miR-29b. Кроме того, ингибирующее действие на экспрессию мРНК COL1A1 сохранялось даже при изменении ненуклеотидной структуры линкера или вставки дополнительной последовательности в область X.
[0217]
Пример 6
На основе информации о последовательности ведущей цепи и «пассажирской» цепи зрелой miR-34a (инвентарный номер MI0000268 в miRBase) синтезировали различные мРНК природного типа по настоящему изобретению, имеющие другую ненуклеотидную структуру линкерной области и другую длину оснований дополнительной последовательности в области Х, вводили в культивируемые клетки и оценивали ингибирующее действие на экспрессию мРНК гена-мишени AXL.
[0218]
(1) Синтез миРНК
Способом, аналогичным способу из примера 1, синтезировали miR-34a природного типа (PH-0036, PH-0038, PH-0066 и PH-0068), в которой область X, состоящая из ведущей цепи (SEQ ID NO: 1) и дополнительной последовательности (длиной 0, 3, 5 или 7 оснований), и область Y, имеющая, на 5'-конце «пассажирской» цепи, область «свисающего конца» вышеуказанной ведущей цепи и последовательность, полностью комплементарную вышеуказанной дополнительной последовательности, связаны посредством ненуклеотидной структуры на основе производного пролина.
[0219]
Кроме того, синтезировали вышеуказанную miR-34a природного типа, miR-34a природного типа (PH-0036, PH-0038 или PH-0066), имеющие дополнительную последовательность длиной 0, 3 или 5 оснований, где ненуклеотидная структура линкерной области модифицирована способом, аналогичным способу, описанному в примере 2.
[0220]
[0221]
В следующей последовательности, [K] обозначает ненуклеотидную структуру производного лизина, [TP] обозначает ненуклеотидную структуру производного терефталевой кислоты, [Gly] обозначает ненуклеотидную структуру производного глицина и [GlyGly] обозначает ненуклеотидную структуру производного глицилглицина. В следующих последовательностях область 5'-конца каждого линкера представляет область X, и в вышеуказанной области X подчеркнутый участок представляет последовательность ведущей цепи, остальная часть представляет вышеуказанную дополнительную последовательность, и область 3'-конца каждого линкера является областью Y, и в вышеуказанной области Y строчными буквами показана последовательность «пассажирской» цепи.
KH-0006 (SEQ ID NO: 14)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'--[K]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
KH-0018 (SEQ ID NO: 15)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCC-[K]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
KH-0019 (SEQ ID NO: 16)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCCGG-[K]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0015 (SEQ ID NO: 14)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'--[TP]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0024 (SEQ ID NO: 15)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCC-[TP]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0042 (SEQ ID NO: 16)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCCGG-[TP]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0011 (SEQ ID NO: 14)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'--[Gly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0043 (SEQ ID NO: 15)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCC-[Gly]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0044 (SEQ ID NO: 16)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCCGG-[Gly]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0013 (SEQ ID NO: 14)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'--[GlyGly]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0045 (SEQ ID NO: 15)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCC-[GlyGly]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
XH-0046 (SEQ ID NO: 16)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCCGG-[GlyGly]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
В качестве положительного контроля использовали NI-0208 из примера 1.
(2) Определение уровня экспрессии гена AXL
Способом, аналогичным способу из примера 1, за исключением того, что конечная концентрация каждой вышеуказанной РНК составляла 2 нмоль/л, определяли уровень экспрессии мРНК AXL.
(3) Результаты
Как показано на фиг. 7, miR-34a природного типа из примера ингибировала экспрессию мРНК AXL на таком же уровне, что и положительный контрольный вариант miR-34a. Кроме того, ингибирующее действие на экспрессию мРНК AXL сохранялось даже, когда изменяли ненуклеотидную структуру линкера или вставляли дополнительную последовательность в область Х.
[0222]
Пример 7
На основе информации о последовательности ведущей цепи и «пассажирской» цепи зрелой let-7a (инвентарный номер MI0000060 в miRBase) синтезировали различные мРНК природного типа по настоящему изобретению, имеющие другую ненуклеотидную структуру линкерной области и другую длину оснований дополнительной последовательности в области Х, вводили в культивируемые клетки и оценивали ингибирующее действие на экспрессию мРНК гена-мишени HMGA2.
[0223]
(1) Синтез миРНК
Способом, аналогичным способу из примера 4, синтезировали различные let-7a природного типа, в которых область X, состоящая из ведущей цепи (SEQ ID NO: 3) и дополнительной последовательности (длиной 0, 3 или 5 оснований), и область Y, имеющая на 5'-конце «пассажирской» цепи, область «свисающего конца» вышеуказанной ведущей цепи и последовательность, полностью комплементарную вышеуказанной дополнительной последовательности, связаны посредством линкера на основе производного пролина ([P]), производного лизина ([K]), производного терефталевой кислоты ([TP]), производного глицина ([Gly]) или производного глицилглицина ([GlyGly]). В вышеуказанном синтезе миРНК природного типа, каждую ненуклеотидную структуру вставляли таким же образом, как описано в примерах 1 и 2.
[0224]
[0225]
В следующей последовательности, [P] обозначает ненуклеотидную структуру на основе производного пролина, [K] обозначает ненуклеотидную структуру на основе производного лизина, [TP] обозначает ненуклеотидную структуру на основе производного терефталевой кислоты, [Gly] обозначает ненуклеотидную структуру на основе производного глицина, [GlyGly] обозначает ненуклеотидную структуру на основе производного глицилглицина. В следующих последовательностях область 5'-конца каждого линкера представляет область X, и в вышеуказанной области X подчеркнутый участок представляет вышеуказанную последовательность ведущей цепи, остальная часть представляет вышеуказанную дополнительную последовательность, и область 3'-конца каждого линкера является областью Y, и в вышеуказанной области Y строчными буквами показана вышеуказанная последовательность «пассажирской» цепи.
PH-0011 (SEQ ID NO: 23)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'--[P]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
PH-0014 (SEQ ID NO: 24)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'-UCC-[P]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
PH-0107 (SEQ ID NO: 32)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'-UCCGG-[P]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
KH-0003 (SEQ ID NO: 23)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'--[K]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
KH-0020 (SEQ ID NO: 24)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'-UCC-[K]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
KH-0021 (SEQ ID NO: 32)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'-UCCGG-[K]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0006 (SEQ ID NO: 23)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'--[TP]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0047 (SEQ ID NO: 24)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'-UCC-[TP]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0048 (SEQ ID NO: 32)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'-UCCGG-[TP]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0002 (SEQ ID NO: 23)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'--[Gly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0049 (SEQ ID NO: 24)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'-UCC-[Gly]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0050 (SEQ ID NO: 32)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'-UCCGG-[Gly]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0004 (SEQ ID NO: 23)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'--[GlyGly]-AAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0051 (SEQ ID NO: 24)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'-UCC-[GlyGly]-GGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
XH-0052 (SEQ ID NO: 32)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
5'-UCCGG-[GlyGly]-CCGGAAAcuauacaaucuacugucuuuc-3'
В качестве положительного контроля использовали NI-0205 из примера 4.
[0226]
(2) Определение уровня экспрессии гена HMGA2
Способом, аналогичным способу из примера 4, за исключением того, что клеткой, в которую вставляли вышеуказанную РНК, была клетка Hep2 (ATCC), и конечная концентрация каждой вышеуказанной РНК составляла 0,2 нмоль/л, определяли уровень экспрессии мРНК HMGA2.
[0227]
(3) Результаты
Как показано на фиг. 8, let-7a природного типа из примера ингибировала экспрессию мРНК HMGA2 на таком же уровне, что и положительный контрольный вариант пре-let-7a. Кроме того, ингибирующее действие на экспрессию мРНК HMGA2 сохранялось даже, когда изменяли нуклеотидную структуру линкера или вставляли дополнительную последовательность в область Х.
[0228]
Пример 8
На основе информации о последовательности ведущей цепи и «пассажирской» цепи зрелой miR-29b (инвентарный номер MI0000105 в miRBase) синтезировали различные мРНК природного типа по настоящему изобретению, имеющие другую ненуклеотидную структуру линкерной области и другую длину оснований дополнительной последовательности в области Х, вводили в культивируемые клетки и оценивали ингибирующее действие на экспрессию мРНК гена-мишени COL1A1.
[0229]
(1) Синтез миРНК
Способом, аналогичным способу из примера 5, синтезировали различные miR-29b природного типа, в которых область X, состоящая из «пассажирской» цепи (SEQ ID NO: 10) и дополнительной последовательности (длиной 0, 3 или 5 оснований), и область Y, имеющая на 5'-конце ведущей цепи, область «свисающего конца» вышеуказанной «пассажирской» цепи и последовательность, полностью комплементарную вышеуказанной дополнительной последовательности, связаны посредством линкера на основе производного пролина ([P]), производного лизина ([K]), производного глицина ([Gly]) или производного глицилглицина ([GlyGly]). В вышеуказанном синтезе миРНК природного типа каждую ненуклеотидную структуру вставляли таким же образом, как описано в примерах 1 и 2.
[0230]
[0231]
В следующей последовательности [P] обозначает ненуклеотидную структуру производного пролина, [K] обозначает ненуклеотидную структуру производного лизина, [TP] обозначает ненуклеотидную структуру производного терефталевой кислоты, [Gly] обозначает ненуклеотидную структуру производного глицина, [GlyGly] обозначает ненуклеотидную структуру производного глицилглицина. В следующих последовательностях область 5'-конца каждого линкера представляет область X, и в вышеуказанной области X строчными буквами показана вышеуказанная последовательность «пассажирской» цепи, остальная часть представляет вышеуказанную дополнительную последовательность, и область 3'-конца каждого линкера является областью Y, и в вышеуказанной области Y подчеркнутый участок представляет вышеуказанную последовательность ведущей цепи.
PH-0040 (SEQ ID NO: 28)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[P]-UC-3'
PH-0042 (SEQ ID NO: 29)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[P]-GGAUC-3'
PH-0108 (SEQ ID NO: 33)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[P]-CCGGAUC-3'
KH-0008 (SEQ ID NO: 28)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[K]-UC-3'
KH-0022 (SEQ ID NO: 29)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[K]-GGAUC-3'
KH-0023 (SEQ ID NO: 33)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[K]-CCGGAUC-3'
XH-0021 (SEQ ID NO: 28)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[TP]-UC-3'
XH-0053 (SEQ ID NO: 29)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[TP]-GGAUC-3'
XH-0054 (SEQ ID NO: 33)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[TP]-CCGGAUC-3'
XH-0017 (SEQ ID NO: 28)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[Gly]-UC-3'
XH-0055 (SEQ ID NO: 29)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[Gly]-GGAUC-3'
XH-0056 (SEQ ID NO: 33)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[Gly]-CCGGAUC-3'
XH-0019 (SEQ ID NO: 28)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[GlyGly]-UC-3'
XH-0057 (SEQ ID NO: 29)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[GlyGly]-GGAUC-3'
XH-0058 (SEQ ID NO: 33)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[GlyGly]-CCGGAUC-3'
В качестве положительного контроля использовали NI-0210 из примера 5.
[0232]
(2) Определение уровня экспрессии гена COL1A1
Способом, аналогичным способу из примера 5, за исключением того, что конечная концентрация каждой вышеуказанной РНК составляла 0,5 нмоль/л, определяли уровень экспрессии мРНК гена COL1A1.
[0233]
(3) Результаты
Как показано на фиг. 9, miR-29b природного типа из примера ингибировала экспрессию мРНК COL1A1 на таком же уровне, что и положительный контрольный вариант пре-miR-29b. Кроме того, ингибирующее действие на экспрессию мРНК COL1A1 сохранялось даже, когда изменяли ненуклеотидную структуру линкера или вставляли дополнительную последовательность в область Х.
[0234]
Пример 9
На основе информации о последовательности ведущей цепи и «пассажирской» цепи зрелой miR-29b (инвентарный номер MI0000268 в miRBase) синтезировали различные мРНК природного типа по настоящему изобретению, имеющие другую последовательность оснований дополнительной последовательности (длина 0, 3, 5 или 7 оснований) в области Х, вводили в культивируемые клетки и оценивали ингибирующее действие на экспрессию мРНК гена-мишени AXL.
[0235]
(1) Синтез миРНК
Способом, аналогичным способу из примера 1, синтезировали различные miR-34a природного типа, в которых область X, состоящая из ведущей цепи (SEQ ID NO: 1) и дополнительной последовательности (длиной 0, 3, 5 или 7 оснований), и область Y, имеющая на 5'-конце «пассажирской» цепи, «свисающий конец» вышеуказанной ведущей цепи и последовательность, комплементарную (последовательность, полностью комплементарную или частично комплементарную) вышеуказанной дополнительной последовательности, связаны посредством ненуклеотидной структуры на основе производного пролина.
[0236]
[0237]
В вышеуказанной последовательности звездочка показывает основание, не комплементарное соответствующей ведущей цепи. Число после слова «спейсер» показывает длину оснований в дополнительной последовательности вышеуказанной области Х.
[0238]
В следующей последовательности подчеркнутый участок представляет вышеуказанную последовательность ведущей цепи, и строчными буквами показана вышеуказанная последовательность «пассажирской» цепи. [P] обозначает ненуклеотидную структуру на основе вышеуказанного производного пролина.
PH-0036 (SEQ ID NO: 14)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'--[P]-Acaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0038 (SEQ ID NO: 15)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCC-[P]-GGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0058 (SEQ ID NO: 34)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UAA-[P]-UUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0059 (SEQ ID NO: 35)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UGG-[P]-UUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0060 (SEQ ID NO: 36)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-CGG-[P]-CCGAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0061 (SEQ ID NO: 37)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-CAA-[P]-UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0062 (SEQ ID NO: 38)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-CGG-[P]-UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0063 (SEQ ID NO: 39)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UGG-[P]-CCGAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0064 (SEQ ID NO: 40)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UAA-[P]-UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0065 (SEQ ID NO: 41)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UGG-[P]-UUGAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0066 (SEQ ID NO: 16)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCCGG-[P]-CCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0067 (SEQ ID NO: 42)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UAAUU-[P]-AAUUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0068 (SEQ ID NO: 17)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UCCGGCC-[P]-GGCCGGAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
PH-0069 (SEQ ID NO: 43)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
5'-UAAUUAA-[P]-UUAAUUAAcaaucagcaaguauacugcccu-3'
В качестве положительного контроля использовали NI-0208 из примера 1.
[0239]
(2) Определение уровня экспрессии гена AXL
Способом, аналогичным способу из примера 1, определяли уровень экспрессии мРНК гена AXL.
[0240]
(3) Результаты
Как показано на фиг. 10, miR-34а природного типа из примера ингибировала экспрессию мРНК AXL на таком же уровне, что и положительный контрольный вариант пре-miR-34а. Кроме того, ингибирующее действие на экспрессию мРНК AXL сохранялось даже, когда длина оснований дополнительной последовательности (длина 3, 5 или 7 оснований) в области Х была другой.
[0241]
Пример 10
На основе информации о последовательности ведущей цепи и «пассажирской» цепи зрелой miR-29b (инвентарный номер MI0000105 в miRBase) синтезировали различные мРНК природного типа по настоящему изобретению, имеющие другую последовательность оснований дополнительной последовательности (длина 0, 3, 5 или 7 оснований) в области Х, вводили в культивируемые клетки и оценивали ингибирующее действие на экспрессию мРНК гена-мишени COL1A1.
[0242]
(1) Синтез миРНК
Способом, аналогичным способу из примера 5, синтезировали различные miR-29b природного типа, в которых область X, состоящая из «пассажирской» цепи (SEQ ID NO: 10) и дополнительной последовательности (длиной 0, 3, 5 или 7 оснований), и область Y, имеющая на 5'-конце ведущей цепи «свисающий конец» вышеуказанной «пассажирской» цепи и последовательность, комплементарную (последовательность, полностью комплементарную или частично комплементарную) вышеуказанной дополнительной последовательности, связаны посредством ненуклеотидной структуры на основе производного пролина.
[0243]
[0244]
В вышеуказанной последовательности число после слова «спейсер» показывает длину оснований в дополнительной последовательности вышеуказанной области Х.
[0245]
В следующей последовательности область 5'-конца линкера представляет X-область, в вышеуказанной области Х строчными буквами показана вышеуказанная последовательность «пассажирской» цепи, остальная часть представляет вышеуказанную дополнительную последовательность, и область 3'-конца линкера представляет область Y, и в вышеуказанной области Y подчеркнутый участок представляет вышеуказанную последовательность ведущей цепи. [P] обозначает ненуклеотидную структуру на основе вышеуказанного производного пролина.
PH-0040 (SEQ ID NO: 28)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[P]-UC-3'
PH-0042 (SEQ ID NO: 29)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCC-[P]-GGAUC-3'
PH-0109 (SEQ ID NO: 44)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAA-[P]-UUAUC-3'
PH-0110 (SEQ ID NO: 45)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUGG-[P]-UUAUC-3'
PH-0111 (SEQ ID NO: 46)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaCGG-[P]-CCGUC-3'
PH-0112 (SEQ ID NO: 47)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaCAA-[P]-UUGUC-3'
PH-0113 (SEQ ID NO: 48)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaCGG-[P]-UUGUC-3'
PH-0114 (SEQ ID NO: 49)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUGG-[P]-CCGUC-3'
PH-0115 (SEQ ID NO: 50)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAA-[P]-UUGUC-3'
PH-0116 (SEQ ID NO: 51)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUGG-[P]-UUGUC-3'
PH-0108 (SEQ ID NO: 33)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGG-[P]-CCGGAUC-3'
PH-0117 (SEQ ID NO: 52)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUU-[P]-AAUUAUC-3'
PH-0118 (SEQ ID NO: 53)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUCCGGCC-[P]-GGCCGGAUC-3'
PH-0119 (SEQ ID NO: 54)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUUAA-[P]-UUAAUUAUC-3'
В качестве положительного контроля использовали NI-0210 из примера 5.
[0246]
(2) Определение уровня экспрессии гена COL1A1
Способом, аналогичным способу из примера 5, за исключением того, что конечная концентрация каждой вышеуказанной РНК составляла 0,5 нмоль/л, определяли уровень экспрессии мРНК гена COL1A1.
[0247]
(3) Результаты
Как показано на фиг. 11, miR-29b природного типа из примера ингибировала экспрессию мРНК COL1A1 на таком же уровне, что и положительный контрольный вариант пре-miR-29b. Кроме того, ингибирующее действие на экспрессию мРНК COL1A1 сохранялось даже, когда длина оснований дополнительной последовательности (длина 3, 5 или 7 оснований) в области Х была другой.
[0248]
Пример 11
На основе информации о последовательности ведущей цепи и «пассажирской» цепи зрелой miR-29b (инвентарный номер MI0000105 в miRBase) синтезировали различные мРНК природного типа по настоящему изобретению, имеющие другую ненуклеотидную структуру линкерной области и другую длину оснований дополнительной последовательности (длина 0, 4 или 5 оснований) в области Х, вводили в культивируемые клетки и оценивали ингибирующее действие на экспрессию мРНК гена-мишени COL1A1.
[0249]
(1) Синтез миРНК
Способом, аналогичным способу из примера 5, синтезировали различные miR-29b природного типа, в которых область X, состоящая из «пассажирской» цепи (SEQ ID NO: 10) и дополнительной последовательности (длиной 0, 4 или 5 оснований), и область Y, имеющая, на 5'-конце ведущей цепи, «свисающий конец» вышеуказанной «пассажирской» цепи и последовательность, комплементарную (последовательность, полностью комплементарную или частично комплементарную) вышеуказанной дополнительной последовательности, связаны посредством линкера на основе производного пролина [P] или производного глицилглицина ([GlyGly]). В вышеуказанном синтезе миРНК природного типа каждую ненуклеотидную структуру вставляли таким же образом, как описано в примерах 1 и 2.
[0250]
[0251]
[0252]
В следующей последовательности [P] обозначает ненуклеотидную структуру на основе производного пролина и [GlyGly] обозначает ненуклеотидную структуру на основе производного глицилглицина. В следующих последовательностях область 5'-конца каждого линкера представляет область X, и в вышеуказанной области X строчные буквы показывают вышеуказанную последовательность «пассажирской» цепи, остальная часть представляет вышеуказанную дополнительную последовательность, и область 3'-конца каждого линкера является областью Y, и в вышеуказанной области Y подчеркнутый участок представляет вышеуказанную последовательность ведущей цепи.
PH-0040 (SEQ ID NO: 28)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuaga-[P]-UC-3'
PH-0117 (SEQ ID NO: 52)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUU-[P]-AAUUAUC-3'
PH-0120 (SEQ ID NO: 55)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUUU-[P]-AAAAAUC-3'
PH-0121 (SEQ ID NO: 56)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUUA-[P]-UAAAAUC-3'
PH-0122 (SEQ ID NO: 57)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAU-[P]-AUAAAUC-3'
PH-0123 (SEQ ID NO: 58)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUAUU-[P]-AAUAAUC-3'
PH-0124 (SEQ ID NO: 59)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAUUU-[P]-AAAUAUC-3'
PH-0125 (SEQ ID NO: 60)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAA-[P]-UUAAAUC-3'
PH-0126 (SEQ ID NO: 61)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUAUA-[P]-UAUAAUC-3'
PH-0127 (SEQ ID NO: 62)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAUUA-[P]-UAAUAUC-3'
PH-0128 (SEQ ID NO: 63)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUAAU-[P]-AUUAAUC-3'
PH-0129 (SEQ ID NO: 64)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAUAU-[P]-AUAUAUC-3'
PH-0130 (SEQ ID NO: 65)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUAAA-[P]-UUUAAUC-3'
PH-0131 (SEQ ID NO: 66)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAUAA-[P]-UUAUAUC-3'
PH-0132 (SEQ ID NO: 67)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAAUA-[P]-UAUUAUC-3'
PH-0133 (SEQ ID NO: 68)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAAAU-[P]-AUUUAUC-3'
PH-0134 (SEQ ID NO: 69)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAAAA-[P]-UUUUAUC-3'
PH-0135 (SEQ ID NO: 70)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUGG-[P]-UUAAAUC-3'
PH-0136 (SEQ ID NO: 71)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUUU-[P]-UUAAAUC-3'
PH-0137 (SEQ ID NO: 72)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaAUUAA-[P]-UUAAUUC-3'
PH-0138 (SEQ ID NO: 73)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaAUUUU-[P]-AAAAUUC-3'
PH-0139 (SEQ ID NO: 74)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaCUUAA-[P]-UUAAGUC-3'
PH-0140 (SEQ ID NO: 75)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaCUUUU-[P]-AAAAGUC-3'
PH-0141 (SEQ ID NO: 76)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaGUUAA-[P]-UUAACUC-3'
PH-0142 (SEQ ID NO: 77)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaGUUUU-[P]-AAAACUC-3'
PH-0143 (SEQ ID NO: 78)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUAAU-[P]-AUUAUC-3'
PH-0144 (SEQ ID NO: 79)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUAA-[P]-UUAAUC-3'
PH-0145 (SEQ ID NO: 80)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUGG-[P]-UUAAUC-3'
PH-0146 (SEQ ID NO: 81)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUU-[P]-UUUAUC-3'
XH-0059 (SEQ ID NO: 60)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
5'-gcugguuucauauggugguuuagaUUUAA-[GlyGly]-UUAAAUC-3'
В качестве положительного контроля использовали NI-0210 из примера 5.
[0253]
(2) Определение уровня экспрессии гена COL1A1
Способом, аналогичным способу из примера 5, за исключением того, что конечная концентрация каждой вышеуказанной РНК составляла 0,5 нмоль/л, определяли уровень экспрессии мРНК гена COL1A1.
[0254]
(3) Результаты
Как показано на фиг. 12 и 13, miR-29b природного типа из примера ингибировала экспрессию мРНК COL1A1 на таком же уровне, что и положительный контрольный вариант пре-miR-29b. Кроме того, ингибирующее действие на экспрессию мРНК COL1A1 сохранялось даже, когда длина оснований дополнительной последовательности (длина 4 или 5 оснований) в области Х была другой.
[0255]
Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано выше со ссылкой на иллюстративные варианты осуществления, настоящее изобретение никоим образом не ограничивается ими. Различные изменения, которые могут стать очевидными для специалистов в данной области, могут быть сделаны в конфигурации и особенностях настоящего изобретения, не отступая от объема настоящего изобретения.
Кроме того, содержание, раскрытое в каждой публикации, приведенной в настоящем документе, включая патенты и патентные заявки, включено здесь в их полном объеме посредством ссылки в той степени, в которой они раскрыты здесь.
Промышленная применимость
[0256]
миРНК природного типа по настоящему изобретению может быть легко синтезирована с низкой стоимостью и может ингибировать трансляцию белка, кодируемого вышеуказанным геном. Следовательно, миРНК природного типа по настоящему изобретению применима, например, в качестве фармацевтического продукта, диагностического агента, сельскохозяйственного химиката и инструмента для проведения исследований в области сельского хозяйства, медицинской науки, науки о жизни и т. п.
Данная заявка основана на заявке на патент № 2014-266918, поданной в Японии (дата подачи заявки: 27 декабря 2014 года) и 2015-130496, поданной в Японии (дата подачи заявки: 29 июня 2015 года), содержание которых полностью включено в данное описание.
--->
Список последовательностей
<110>  BONAC CORPORATION
<120>  Встречающиеся в природе миРНК для контролирования экспрессии генов и их применение
<130>  092400
<150>  JP 2014-266918
<151>  2014-12-27
<150>  JP 2015-130496
<151>  2015-06-29
<160>  81
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  1
uggcaguguc uuagcugguu gu                                               22
<210>  2
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  2
caaucagcaa guauacugcc cu                                               22
<210>  3
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  3
ugagguagua gguuguauag uu                                               22
<210>  4
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  4
cuauacaauc uacugucuuu c                                                21
<210>  5
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  5
ugagguagua gauuguauag uu                                               22
<210>  6
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  6
cuauacaauc uauugccuuc cc                                               22
<210>  7
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  7
ucucccaacc cuuguaccag ug                                               22
<210>  8
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  8
cugguacagg ccugggggac ag                                               22
<210>  9
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  9
uagcaccauu ugaaaucagu guu                                              23
<210>  10
<211>  24
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  10
gcugguuuca uauggugguu uaga                                             24
<210>  11
<211>  64
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  11
uggcaguguc uuagcugguu guugugagca auaguaagga agcaaucagc aaguauacug      60
cccu                                                                   64
<210>  12
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  12
uacuauucga cacgcgaagt t                                                21
<210>  13
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  13
cuucgcgugu cgaauaguat t                                                21
<210>  14
<211>  45
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  14
uggcaguguc uuagcugguu guacaaucag caaguauacu gcccu                      45
<210>  15
<211>  51
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  15
uggcaguguc uuagcugguu guuccggaac aaucagcaag uauacugccc u               51
<210>  16
<211>  55
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  16
uggcaguguc uuagcugguu guuccggccg gaacaaucag caaguauacu gcccu           55
<210>  17
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>   олигонуклеотид
<400>  17
uggcaguguc uuagcugguu guuccggccg gccggaacaa ucagcaagua uacugcccu       59
<210>  18
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  18
ctcaaccagg acgactccat                                                  20
<210>  19
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  19
agaccgcttc actcaggaaa                                                  20
<210>  20
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  20
atggggaagg tgaaggtcg                                                   19
<210>  21
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  21
gggtcattga tggcaacaat atc                                              23
<210>  22
<211>  72
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  22
ugagguagua gguuguauag uuuuaggguc acacccacca cugggagaua acuauacaau      60
cuacugucuu uc                                                          72
<210>  23
<211>  45
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  23
ugagguagua gguuguauag uuaacuauac aaucuacugu cuuuc                      45
<210>  24
<211>  51
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  24
ugagguagua gguuguauag uuuccggaaa cuauacaauc uacugucuuu c               51
<210>  25
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  25
gaagccactg gagaaaaacg                                                  20
<210>  26
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  26
cttcggcaga ctcttgtgag                                                  20
<210>  27
<211>  64
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  27
gcugguuuca uauggugguu uagauuuaaa uagugauugu cuagcaccau uugaaaucag      60
uguu                                                                   64
<210>  28
<211>  49
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  28
gcugguuuca uauggugguu uagaucuagc accauuugaa aucaguguu                  49
<210>  29
<211>  55
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  29
gcugguuuca uauggugguu uagauccgga ucuagcacca uuugaaauca guguu           55
<210>  30
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  30
cccaaggaca agaggcatgt                                                  20
<210>  31
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  31
ccgccatact cgaactggaa                                                  20
<210>  32
<211>  55
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  32
ugagguagua gguuguauag uuuccggccg gaaacuauac aaucuacugu cuuuc           55
<210>  33
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  33
gcugguuuca uauggugguu uagauccggc cggaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  34
<211>  51
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  34
uggcaguguc uuagcugguu guuaauuaac aaucagcaag uauacugccc u               51
<210>  35
<211>  51
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  35
uggcaguguc uuagcugguu guugguuaac aaucagcaag uauacugccc u               51
<210>  36
<211>  51
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  36
uggcaguguc uuagcugguu gucggccgac aaucagcaag uauacugccc u               51
<210>  37
<211>  51
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  37
uggcaguguc uuagcugguu gucaauugac aaucagcaag uauacugccc u               51
<210>  38
<211>  51
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  38
uggcaguguc uuagcugguu gucgguugac aaucagcaag uauacugccc u               51
<210>  39
<211>  51
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  39
uggcaguguc uuagcugguu guuggccgac aaucagcaag uauacugccc u               51
<210>  40
<211>  51
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  40
uggcaguguc uuagcugguu guuaauugac aaucagcaag uauacugccc u               51
<210>  41
<211>  51
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  41
uggcaguguc uuagcugguu guugguugac aaucagcaag uauacugccc u               51
<210>  42
<211>  55
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  42
uggcaguguc uuagcugguu guuaauuaau uaacaaucag caaguauacu gcccu           55
<210>  43
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  43
uggcaguguc uuagcugguu guuaauuaau uaauuaacaa ucagcaagua uacugcccu       59
<210>  44
<211>  55
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  44
gcugguuuca uauggugguu uagauaauua ucuagcacca uuugaaauca guguu           55
<210>  45
<211>  55
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  45
gcugguuuca uauggugguu uagaugguua ucuagcacca uuugaaauca guguu           55
<210>  46
<211>  55
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  46
gcugguuuca uauggugguu uagacggccg ucuagcacca uuugaaauca guguu           55
<210>  47
<211>  55
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  47
gcugguuuca uauggugguu uagacaauug ucuagcacca uuugaaauca guguu           55
<210>  48
<211>  55
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  48
gcugguuuca uauggugguu uagacgguug ucuagcacca uuugaaauca guguu           55
<210>  49
<211>  55
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  49
gcugguuuca uauggugguu uagauggccg ucuagcacca uuugaaauca guguu           55
<210>  50
<211>  55
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  50
gcugguuuca uauggugguu uagauaauug ucuagcacca uuugaaauca guguu           55
<210>  51
<211>  55
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  51
gcugguuuca uauggugguu uagaugguug ucuagcacca uuugaaauca guguu           55
<210>  52
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  52
gcugguuuca uauggugguu uagauaauua auuaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  53
<211>  63
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  53
gcugguuuca uauggugguu uagauccggc cggccggauc uagcaccauu ugaaaucagu      60
guu                                                                    63
<210>  54
<211>  63
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  54
gcugguuuca uauggugguu uagauaauua auuaauuauc uagcaccauu ugaaaucagu      60
guu                                                                    63
<210>  55
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  55
gcugguuuca uauggugguu uagauuuuua aaaaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  56
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  56
gcugguuuca uauggugguu uagauuuuau aaaaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  57
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  57
gcugguuuca uauggugguu uagauuuaua uaaaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  58
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  58
gcugguuuca uauggugguu uagauuauua auaaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  59
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  59
gcugguuuca uauggugguu uagauauuua aauaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  60
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  60
gcugguuuca uauggugguu uagauuuaau uaaaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  61
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  61
gcugguuuca uauggugguu uagauuauau auaaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  62
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  62
gcugguuuca uauggugguu uagauauuau aauaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  63
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  63
gcugguuuca uauggugguu uagauuaaua uuaaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  64
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  64
gcugguuuca uauggugguu uagauauaua uauaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  65
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  65
gcugguuuca uauggugguu uagauuaaau uuaaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  66
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  66
gcugguuuca uauggugguu uagauauaau uauaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  67
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  67
gcugguuuca uauggugguu uagauaauau auuaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  68
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  68
gcugguuuca uauggugguu uagauaaaua uuuaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  69
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  69
gcugguuuca uauggugguu uagauaaaau uuuaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  70
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  70
gcugguuuca uauggugguu uagauuuggu uaaaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  71
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  71
gcugguuuca uauggugguu uagauuuuuu uaaaucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  72
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  72
gcugguuuca uauggugguu uagaauuaau uaauucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  73
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  73
gcugguuuca uauggugguu uagaauuuua aaauucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  74
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  74
gcugguuuca uauggugguu uagacuuaau uaagucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  75
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  75
gcugguuuca uauggugguu uagacuuuua aaagucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  76
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  76
gcugguuuca uauggugguu uagaguuaau uaacucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  77
<211>  59
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  77
gcugguuuca uauggugguu uagaguuuua aaacucuagc accauuugaa aucaguguu       59
<210>  78
<211>  57
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  78
gcugguuuca uauggugguu uagauaauau uaucuagcac cauuugaaau caguguu         57
<210>  79
<211>  57
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  79
gcugguuuca uauggugguu uagauuaauu aaucuagcac cauuugaaau caguguu         57
<210>  80
<211>  57
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  80
gcugguuuca uauggugguu uagauugguu aaucuagcac cauuugaaau caguguu         57
<210>  81
<211>  57
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  олигонуклеотид
<400>  81
gcugguuuca uauggugguu uagauuuuuu uaucuagcac cauuugaaau caguguu         57
<---