Лекарственный препарат для лечения рака молочной железы
MEDICINAL PRODUCT FOR TREATMENT OF BREAST CANCER

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано для терапии рака молочной железы в виде препарата для внутривенного введения без какого-либо внешнего воздействия (нагревания, действия магнитного поля и т.д.).
Онкологические заболевания по показателю смертности среди всех заболеваний занимают второе место, уступая лишь заболеваниям сердечно-сосудистой системы. Аденокарцинома является преимущественной формой рака молочной железы, который диагностируется у каждой девятой женщины. Данная статистика говорит о существовании острой необходимости в эффективной терапии этого заболевания.
Одним из лекарств, применяемых в химиотерапии аденокарциномы молочной железы, является доксорубицин (Докс), обладающий целым рядом побочных эффектов, которые связаны с применением высоких доз лекарства ввиду его низкой селективности. Для снижения побочных эффектов и увеличения эффективности химиотерапии предлагается использовать наноконтейнер на основе  магнитных наночастиц (МНЧ) оксида железа, который обеспечит направленную доставку Докс к опухоли, а значит и уменьшит дозу вводимого препарата и его общую токсичность.
3
Известен лекарственный препарат на основе магнитных наночастиц для лечения и/или профилактики рака, в том числе рака молочной железы (RU 2490027 С2, 20.08.2013). Магнитные наночастицы оксида железа, в частности FеO4, покрыты барьерным слоем - защитной коллоидной полимерной оболочкой, обеспечивающей присоединение терапевтически активных веществ, в том числе доксорубицина, непосредственно или через линкер, а также присоединение молекул, придающих наночастицам способность находить мишень, в частности, таких как различные антитела, в том числе моноклональные антитела.
Недостатком известного препарата является то, что для высвобождения активного вещества с поверхности наночастиц требуется воздействие магнитным полем. Кроме того, для связывания активного вещества требуется наличие специальных молекул линкера. Барьерный слой препятствует интенсивному высвобождению препарата в клетках, так как на первом этапе необходимо, чтобы сам барьерный слой распался в клетке, чтобы позволить активному компоненту выйти с поверхности наночастиц. Таким образом, распад барьерного слоя лимитирует процесс высвобождения лекарства.
Наличие линкера усложняет процесс разрушения связи между активным веществом и наночастицами, что также снижает интенсивность высвобождения активного вещества в клетках. Во-первых, после внешнего воздействия магнитным полем лабильные связи в линкере могут распасться не полностью, в результате чего некоторое количество лекарственного препарата останется связанным с магнитными наночастицами. Во-вторых, ковалентное связывание наночастиц с активным веществом путем образования новых химических связей может негативно повлиять на терапевтические функции активного вещества, так как происходит образование новых химических связей в молекуле лекарства, меняется химическая структура препарата, которая влечет за собой и изменение свойств активной молекулы, в том числе лекарственных.
Техническая проблема, решаемая изобретением, заключается в создании противоопухолевого препарата на основе магнитных наночастиц оксида железа с доксорубицином, обладающего высокой терапевтической активностью.
Технический результат изобретения заключается в улучшении доставки активного вещества в опухолевые клетки и повышении эффективности высвобождения активного вещества.
3
4
Технический результат достигается лекарственным препаратом для лечения рака молочной железы, включающим магнитные наночастицы оксида железа FeO, покрытые защитной оболочкой и связанные с моноклональными антителами и с доксорубицином, в котором, согласно изобретению, защитная оболочка сформирована из бычьего или человеческого сывороточного альбумина (БСА или ЧСА) и полиэтиленгликоля (ПЭГ), моноклональные антитела представляют собой моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов (VEGF), а наночастицы связаны с доксорубицином нековалентно, при следующем соотношении компонентов, мас. %:
3
4
оксид железа FeO 30-40
БСА или ЧСА 40-50
ПЭГ 5-10
доксорубицин 5-10
антитела к VEGF 0,5-1,0
Технический результат достигается следующим образом.
В отличие от RU 2490027 С2 в предложенном препарате для высвобождения активного вещества с поверхности наночастиц не требуется применение магнитного поля. Лекарственный препарат без каких-либо внешних воздействий за счет пассивного и активного методов транспорта оказывается в опухолевых клетках, где и происходит высвобождение активного вещества (доксорубицина) без внешних воздействий на пациента.
Пассивный транспорт осуществляется благодаря реализации EPR-эффекта в опухолевой ткани (Enhanced permeation and retention effect). Суть эффекта состоит в том, что опухолевая ткань гиперваскуляризована за счет образования очень большого количества сосудов, которые питают опухоль. Сосуды образуются и растут очень быстро, из-за чего многие из них дефектны. Все вместе это приводит к тому, что опухолевая ткань очень рыхлая, в ней ослаблен лимфатический дренаж, вследствие чего частицы нанометрового размера естественным образом накапливаются в опухоли и достаточно продолжительное время удерживаются в ней.
В предложенном препарате активный транспорт обусловлен наличием моноклональных антител к VEGF. Моноклональные антитела на поверхности наночастиц взаимодействуют с VEGF, который экспрессируется в опухолевых клетках в большом количестве (больше, чем в клетках нормальной, здоровой ткани). В результате транспорт наночастиц с активным компонентом в клетку улучшается.
Высвобождение активного вещества (доксорубицина - Докса) происходит вследствие разрушения электростатической связи между Доксом и карбоксильными группами альбумина на поверхности наночастиц. Во многих опухолях из-за процесса гипоксии и последующего ацидоза значение рН понижается по сравнению с обычным физиологическим значением рН здоровой ткани. Благодаря этому связь между активным веществом и наночастицей разрушается без какого-либо внешнего воздействия. Помимо электростатических взаимодействий доксорубицина с оболочкой наночастиц из альбумина также имеют место гидрофильные и гидрофобные взаимодействия, поэтому связь компонентов является нековалентной, но достаточно прочной (85% активного компонента и более остаются прочно связанными с поверхностью наночастиц после центрифугирования со скоростью 2000 оборотов в минуту).
В RU 2490027 С2 имеет место ковалентная связь активного вещества с наночастицей (непосредственной или через линкер). В предложенном препарате связь является нековалентной, ионной и не требует наличия какого-либо линкера. В принципе в RU 2490027 С2 связь активного вещества с наночастицей может быть нековалентной, но тогда необходимо вносить внешний барьерный слой.
В предложенном препарате активное вещество иммобилизуется сверху на модифицированных оболочкой наночастицах с помощью ионных взаимодействий без линкеров и барьерных слоев, что увеличивает эффективность высвобождения активного вещества в клетках. Барьерный слой препятствует интенсивному высвобождению препарата в клетках, т.к. на первом этапе необходимо, чтобы сам барьерный слой распался в клетке, чтобы позволить выход активного вещества с поверхности наночастиц. Этот процесс лимитирует процесс высвобождения лекарства. Наличие линкера усложняет процесс разрушения связи между активным веществом и наночастицами, что также снижает интенсивность высвобождения активного вещества в клетках. Во-первых, после внешнего воздействия магнитным полем лабильные связи в линкере могут распасться не все, в результате чего некоторое количество активного вещества останется связанным с наночастицами. Во-вторых, ковалентное связывание наночастиц с активным веществом путем образования новых химических связей может негативно повлиять на терапевтические функции активного вещества, так как происходит образование новых химических связей в молекуле лекарства, меняется химическая структура препарата, которая влечет за собой и изменение свойств активной молекулы, в том числе лекарственных.
Использование ионных (электростатических) взаимодействий в предложенном препарате позволяет сохранить химическую структуру активного компонента в неизменном состоянии, а также не препятствует и не лимитирует процесс высвобождения активного компонента с поверхности магнитных наночастиц в клетках опухоли, в результате чего высвобождение происходит интенсивно и с высокой эффективностью, следовательно, лекарственный препарат практически полностью высвобождается в клетке, не оставаясь на наночастицах.
Изобретение иллюстрируется графическими материалами.
На фиг. 1 приведен график доли выживших экспериментальных животных в зависимости от времени при введении а) предложенного препарата на основе магнитных наночастиц; б) физиологического раствора; в) доксорубицина.
На фиг. 2 приведены зависимости оптической плотности препаратов (а) предложенного препарата на основе магнитных наночастиц; б) клетки 4Т1; в) доксорубицина, от степени разведения.
На фиг. 3 приведены изображения частиц предложенного лекарственного препарата, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии.
Предложенный лекарственный препарат получают следующим образом.
3
4
Пример 1. Синтез магнитных наночастиц FeO, покрытых БСА/ЧСА
3+
К 20 мг магнитных наночастиц оксида железа добавляют 5 мл дистиллированной воды, доводят рН до 11 и перемешивают вплоть до полного растворения. Затем добавляют 5 мл раствора БСА/ЧСА в воде с концентрацией 8 мг/мл при том же значении рН. Полученную смесь инкубируют 15 минут при комнатной температуре и постоянном перемешивании, затем фильтруют (диаметр пор фильтра 0,2-0,5 мкм) и диализуют напротив воды в течение 4-24 ч. К 20 мл полученного раствора с концентрацией белка и Fe мг/мл и 2 мг/мл соответственно добавляют 250 мкл 1М щелочи, а затем по каплям при перемешивании 230 мкл 25% водного раствора глутарового альдегида. Полученную смесь инкубируют при перемешивании 15 мин, а затем добавляют 250 мкл 3М водного раствора глицина с рН 9,2 и инкубируют 1 ч. Затем к раствору добавляют 332 мкл раствора боргидрида натрия в фосфатно-солевом буфере с концентрацией 10 мг/мл и инкубируют 2-20 ч, после чего промывают реакционную смесь буфером и измеряют концентрацию железа.
3
4
Пример 3. Синтез магнитных наночастиц FeO, покрытых БСА/ЧСА и ПЭГ
3
4
3+
К раствору магнитных наночастиц FeO, покрытых БСА/ЧСА и содержащих 5 мг железа, в фосфатно-солевом буфере с концентрацией Fe0,95 мг/мл добавляют 265 мкл раствора N-гидроксисукцинимида в фосфатно-солевом буфере с концентрацией 10 мг/мл и 430 мкл раствора 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида в фосфатно-солевом буфере с концентрацией 10 мг/мл. Реакционную смесь инкубируют при перемешивании 10 мин при комнатной температуре, после чего добавляют 470 мкл водного раствора аминопроизводного полиэтиленгликоля с концентрацией 10 мг/мл. Время инкубирования -1 ч при комнатной температуре. Для отделения МНЧ-БСА-ПЭГ от избытка полимера реакционную смесь очищали методом гель-фильтрации.
3
4
Пример 4. Синтез магнитных наночастиц FeO, покрытых БСА/ЧСА и ПЭГ и конъюгированных с моноклональными антителами к фактору роста эндотелия сосудов (VEGF)
3
4
3+
К раствору магнитных наночастиц FeO, покрытых БСА/ЧСА и ПЭГ, в фосфатно-солевом буфере с концентрацией Fe- 1 мг/мл, содержащему 5 мг железа, добавляют 29,9 мкл раствора N-гидроксисукцинимида в фосфатно-солевом буфере с концентрацией 0,5 мг/мл и 19,9 мкл раствора 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида в PBS с концентрацией 0,5 мг/мл. Реакционную смесь инкубируют при перемешивании 15 мин, после чего добавляют 150 мкг антител. После перемешивания в течение часа при комнатной температуре реакционную смесь инкубируют 2-20 ч при перемешивании и температуре +4°С. Дальнейшую очистку образцов проводят методом гель-хроматографии.
3
4
Пример 5. Синтез магнитных наночастиц FeO, покрытых БСА/ЧСА и ПЭГ, конъюгированных с моноклональными антителами к фактору роста эндотелия сосудов (VEGF) и загруженных доксорубицином
3
4
К 800 мкл раствора магнитных наночастиц FeO, покрытых БСА/ЧСА и ПЭГ, конъюгированных с моноклональными антителами к фактору роста эндотелия сосудов в фосфатно-солевом буфере с концентрацией 1 мг/мл добавляют 200 мкл водного раствора доксорубицина с концентрацией 1 мг/мл и инкубируют при перемешивании и комнатной температуре 1-5 ч.
Наночастицы представляют собой округлые ядра оксида железа, которые покрыты белково-полимерной оболочкой и связаны с моноклональными антителами к VEGF и загружены лекарственным препаратом Докс.
С помощью просвечивающей электронной микроскопии становится возможным детектировать ядра оксида железа. На фиг. 3 приведены полученные изображения частиц предложенного препарата в двух масштабах.
Ниже приведены примеры составов полученного лекарственного препарата.
Состав 1. 30% оксида железа, 50% ЧСА, 7,3% ПЭГ, 8% Доке, 1,0% антител
Состав 2. 40% оксида железа, 45,7% БСА, 5% ПЭГ, 5% Доке, 0,5% антител
Состав 3. 35,8% оксида железа, 40% БСА, 10% ПЭГ, 10% Доке, 0,8% антител
Эффективность предложенного лекарственного препарата
продемонстрирована на следующих примерах.
Пример 6. На фиг. 1 проиллюстрировано увеличение продолжительности жизни экспериментальных животных (мыши породы Balb/c, самки, вес 19±2 г, возраст 4 месяца) с опухолью молочной железы при проведении терапии с помощью разработанного препарата (эксперимент in vivo).
5
Для получения опухоли использовали ортотопическую подкожную инъекцию клеток аденокарциномы молочной железы 4Т1 (5 10 клеток) в область жировой клетчатки третьей пары молочных желез с помощью инсулинового шприца. Все манипуляции, причиняющие животным болевую или иную травму, выполняли при обезболивании.
Экспериментальные животные лечились с помощью свободного лекарственного препарата Докс или с помощью предложенного препарата магнитных наночастиц, загруженных Докс. Контрольной группе мышей вводился физиологический раствор. Введение препаратов осуществлялось внутривенно на 7, 14, 17 и 21-е сутки после подсадки опухолевых клеток 4Т1. Доза препаратов составляла 2 мг/кг в пересчете на содержание Докс. В результате проведенного эксперимента было установлено, что экспериментальные животные, погибшие позже остальных, получали в качестве лекарства препарат векторных магнитных наночастиц оксида железа с Докс.
Пример 7. Увеличение медианы выживаемости экспериментальных животных с опухолью молочной железы при проведении терапии с помощью разработанного препарата (эксперимент in vivo) представлено в таблице.
В ходе проведения эксперимента по терапии аденокарциномы молочной железы у мышей был проанализирован параметр медианы выживаемости животных - количество суток, по истечении которых погибло 50% животных, подвергшихся лечению. Значение медианы для мышей, получавших в качестве лечения препарат магнитных наночастиц с Доке, оказалось в полтора раза больше аналогичного параметра для мышей, лечение которых проводилось путем введения свободного лекарственного препарата Докс.
Пример 8. На фиг. 2 проиллюстрировано сохранение противоопухолевой активности доксорубицина после связывания с магнитными наночастицами (эксперимент in vitro на линии клеток 4Т1 опухоли молочной железы).
Производилось исследование цитотоксических свойств лекарственного препарата Докс и векторных магнитных наночастиц, загруженных Докс. Анализировалось влияние препаратов на жизнеспособность клеток линии 4Т1. Клетки аденокарциномы молочной железы инкубировались с препаратами в течение 24 ч при 37°С, после чего клетки отмывали и анализировали количество погибших и жизнеспособных клеток 4Т1. Препарат Доке обладает цитостатическим действием и приводит к гибели живых клеток, нарушая процесс репликации ДНК. Было установлено, что магнитные наночастицы с Докс также эффективно убивали клетки, как и свободный лекарственный препарат.