БЕЛОК, ОБУСЛАВЛИВАЮЩИЙ СВОЙСТВО АУТОАГГЛЮТИНАЦИИ КЛЕТОК ЧУМНОГО МИКРОБА, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
PROTEIN CAUSEING CELL AUTOAGGLUTINATION PROPERTY OF PLAGUE MICROBES, AND METHOD FOR PRODUCING IT

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения белка, обусловливающего признак аутоагглютинации (АА) клеток возбудителя чумы (Yersinia pestis). Полученный препарат белка ФА может быть использован для изучения его физиологической роли, протективных свойств, создания новых препаратов для вакцинирования, а также оценки его возможного участия в реализации вирулентных свойств возбудителя чумы.
Известны фенотипические характеристики белка Ail, предположительно участвующего в проявлении свойства АА у Yersinia pestis KIM (см. статью Kolodziejek A.M., Sinclair D.J., Seo K.S., Schnider D.R., Deobald C.F., Rohde H.N., Viall A.K., Minnich S.S., Hovde C.J., Minnich S.A., Bohach G.A. Fhenotypic characterization of OmpX, an Ail homologue of Yersinia pestis KIM // Microbiology. - 2007. - V.153. - P.2941-2951). В этой работе авторы обнаружили, что делеция гена ail в штамме Y.pestis KIM приводит к утрате способности к АА, однако эти данные не были подтверждены в работе Felek et al. (см. статью Felek S., Muszynski A., Carlson R.W., Tsang T.M., Hinnebusch B.J., Krukonis E.S. Phosphoglucomutase of Yersinia pestis is required for autoaggregation and polymyxin В resistance // Infect. Immun. - 2010. - V.78. - P.1163-1175).
Авторами другой статьи (см. статью Bartra S.S., Styer K.L., O'Bryant D.M., Nilles M.L., Hinnebusch B.J., Aballay A., Piano G.V. Resistance of Yersinia pestis to complement dependent killing is mediated by the Ail outer membrane protein // Infect. Immun.- 2008. - V.76. - P.612-622) было обнаружено, что Ail практически не экспрессируется возбудителем чумы при 6°С, хотя известно, что в этих условиях признак аутоагглютинации сохраняется. Также Ail не вызывает аутоагглютинацию клеток Yersinia pseudotuberculosis, которые синтезируют белок, практически идентичный по структуре белку Y.pestis.
-
-
-
+
-
-
Наиболее близким по технической сущности является способ идентификации фактора аутоагглютинации Hms-клеток возбудителя чумы (см. статью Подладчикова О.Н., Рыкова В.А. «Идентификация фактора аутоагглютинации Hms-клеток возбудителя чумы», журнал «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология», Москва. - 2006. - №2. - С.25-29), заключающийся в том, что из Hms-клеток моноплазмидного варианта штамма Yersinia pestis EV76, содержащего одну плазмиду пестициногенности (pYP), получают мутанты по признаку АА, затем проводят сравнение трех АА-клонов родительского штамма и трех АА-мутантов, все содержат плазмиду pYP и сходны по биохимическим свойствам, а фенотипические признаки различны, потом определяют поверхностную гидрофобность родительских и мутантных клеток, способность взаимодействовать с бактериофагом Л-413с и чумными диагностическими препаратами, после этого осуществляют идентификацию и делают вывод, что у АА-мутантов отсутствует белок 17 кДа, снижается гидрофобность, утрачивается АА, фагочувствительность и иммунохимическая активность с чумным иммуноглобулиновым диагностикумом.
Это обстоятельство указывает на то, что этот белок может отвечать за вышеперечисленные свойства и представлять собой фактор аутоагглютинации (ФА) возбудителя чумы.
Однако в известной работе авторами, как один из начальных этапов, проведена идентификация фактора аутоагглютинации, но не разработан еще способ выделения препаративных количеств белка и не исследованы его физико-химические свойства.
Техническая задача предполагаемого изобретения состояла в разработке способа получения белка, обусловливающего свойство аутоагглютинации чумного микроба, для изучения его участия в проявлении вирулентности и иммуногенности возбудителя чумы.
Поставленная задача достигается тем, что способ получения белка, обусловливающего свойство аутоагглютинации клеток чумного микроба, включает следующие стадии:
а) в качестве штамма-продуцента используют Y.pestis KM 1279 (депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» ФГУЗ Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» Роспотребнадзора), который получен из Y.pestis EV76;
б) Y.pestis KM 1279 выращивают на 1,5% агаре LB (рН 7,2) при 26°С в течение 48 часов, бактерии смывают холодным забуференным физраствором (ЗФР) и высушивают ацетоном;
в) бакмассу (1 г) отмывают от остатков питательной среды и осаждают центрифугированием (8000 об/мин) на холоду (4°С) в течение 15 минут;
г) клеточный осадок суспендируют в 200 мл раствора 5 мМ NaOH (рН 9,0), выдерживают, при встряхивании, при 26°С два часа и отделяют клетки центрифугированием (8000 об/мин) при 20°С в течение 15 минут, получают щелочной раствор, в котором содержится белок, смытый с поверхности клеток;
д) супернатант фильтруют через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм;
е) к фильтрату добавляют нейтрализованный раствор (рН 7,1) сульфата аммония до 25% насыщения, выдерживают 20 часов при 4°С до формирования осадка, последний отделяют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 минут;
ж) осадок освобождают от сульфата аммония, для этого его растворяют в 50 мл 5 мМ NaOH (рН 9,0) и диализуют против 5 мМ NaOH в объеме 2,5-3,0 литров при 4°С в течение 24 часов, меняя раствор дважды;
з) к диализованному раствору добавляют соляную кислоту до получения изоэлектрической точки белка (рН 4,6), затем 20 часов инкубируют при 4°С для формирования осадка, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 30 минут, осадок растворяют в 50 мл 5 мМ NaOH, процедуру повторяют трижды, исключая примеси других белков;
и) белок осаждают ацетоном, для чего осадок растворяют в 50 мл раствора 5 мМ NaOH и добавляют три объема холодного ацетона, выдерживают при -20°С в течение 20 часов с последующим центрифугированием на холоду (4°С) при 10000 об/мин в течение 30 минут;
й) полученный осадок подвергают лиофильному высушиванию, предварительно суспендируя его в 10 мл деионизированной дистиллированной воды и фасуя по ампулам с последующей сушкой.
Кроме того, белок, обусловливающий свойство аутоагглютинации клеток чумного микроба,который расположен на поверхности клетки Y.pestis, и его наличие коррелирует со способностью бактерий к аутоагглютинативному росту в жидких питательных средах и с повышением гидрофобности клеток, характеризуется:
- молекулярной массой - 17,485 кДа,
- присутствием белка - 80%,
- присутствием нейтральных углеводов - 6%.
Для применения способа необходим штамм-продуцент, не содержащий примесей поверхностных антигенов, кодируемых плазмидными репликонами. Заявителем из штамма Y.pestis EV76 был получен штамм Y.pestis EV76 б/п, лишенный трех характерных для возбудителя чумы плазмид, который депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под номером Y.pestis KM 1279.
Культурально-морфологические свойства штамма типичны для Y.pestis EV76. В мазках - грамотрицательные полиморфные биполярные палочки. В 0,7% агаре не подвижен. В жидких питательных средах растет придонно без помутнения среды, в более поздние сроки (3-5 суток) на поверхности среды образуется пленка. На плотных питательных средах штамм образует бугристые зернистые колонии с характерной кружевной зоной.
Биохимическая активность штамма. На средах Гисса штамм ферментирует глюкозу, мальтозу, манит, арабинозу, не ферментирует сахарозу, лактозу, рамнозу, сорбит, мочевину, глицерин. Не сорбирует пигменты (гемин, Конго красный) на индикаторных средах для определения признака пигментсорбции, обладает нитрифицирующей и денитрифицирующей активностью, не продуцирует щелочную фосфотазу. В отличие от родительского штамма, не продуцирует капсульный антиген Cafl, не обладает кальций-зависимостью, не продуцирует пестицин 1 и активатор плазминогена.
Генетическая характеристика штамма. В отличие от родительского штамма, содержащего три характерные для возбудителя чумы плазмиды, в штамме Y.pestis KM 1279 не выявляются автономные плазмидные репликоны. Отсутствие интеграции плазмид с хромосомной ДНК подтверждено методом ПЦР с праймерами, комплементарными плазмидным генам cafl (плазмида рМТ), lcrV (плазмида pCD), pla (плазмида pYP).
Отношение к гомо- и гетерологичным фагам - чувствителен к фагам Покровской и Лариной (Л-413 с) до рабочего титра.
Отношение штамма к видовым диагностическим сывороткам - агглютинируется чумной гипериммунной лошадиной сывороткой.
8
Вирулентность штамма - авирулентен для белых мышей в дозе 10м.кл./мл при подкожном и внутрибрюшинном заражении, принадлежит к III группе патогенности на основании СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортировки микроорганизмов I-IV групп патогенности».
Антигенные свойства штамма - агглютинируется чумной гипериммунной лошадиной сывороткой, реагирует в реакции пассивной гемагглютинации с чумным эритроцитарным иммуноглобулиновым диагностикумом.
Способ получения белка фактора аутоагглютинации (ФА) осуществляется следующим образом.
Клетки Y.pestis KM 1279 используют как штамм-продуцент, который выращивают на 1,5% агаре LB (рН 7,2) при 26°С в течение 48 часов. Полученную бакмассу смывают холодным забуференным физраствором (ЗФР) и высушивают ацетоном. Затем 1 г полученных клеток суспендируют в 200 мл холодного ЗФР и осаждают центрифугированием на холоду (4°С) при 8000 об/мин в течение 15 минут для удаления остатков питательной среды.
Далее проводят смыв ФА с клеток слабощелочным раствором, для этого клеточный осадок суспендируют в 200 мл раствора 5 мМ NaOH (рН 9,0), выдерживают, при встряхивании, при 26°С 2 часа и отделяют клетки центрифугированием (8000 об/мин) при 20°С в течение 15 минут.На данном этапе ФА, смываясь с поверхности клеток, переходит в щелочной раствор.
Полученный супернатант фильтруют через фильтр Millex GP (Millipore) с диаметром пор 0,22 мкм. К фильтрату добавляют нейтрализованный раствор (рН 7,1) сульфата аммония до 25% насыщения и выдерживают 20 часов при 4°С, формируя осадок, который отделяют центрифугированием на холоду при 10000 об/мин в течение 30 минут.
Полученный осадок освобождают от сульфата аммония, для этого его растворяют в 50 мл 5 мМ NaOH (рН 9,0) и диализуют против 5 мМ NaOH (в объеме 2,5-3 литра) при 4°С в течение 24 часов, меняя раствор дважды.
Следующей стадией процесса осуществляют изоэлектрическое осаждение ФА. Для этого к диализованному раствору добавляют соляную кислоту (НСl) до рН 4,6. Данное значение рН является изоэлектрической точкой белка, смываемого с поверхности клеток 5 мМ NaOH. После 20 часов инкубации при 4°С осадок отделяют центрифугированием на холоду при 10000 об/мин в течение 30 минут. Осадок растворяют в 50 мл 5 мМ NaOH. Процедуру изоэлектрического осаждения повторяют трижды с целью очистки ФА от примесей других белков.
Затем проводят осаждение ФА ацетоном. Осадок растворяют в 50 мл раствора 5 мМ NaOH и добавляют три объема холодного ацетона, выдерживают при -20°С в течение 20 часов. Осадок отделяют центрифугированием на холоду при 10000 об/мин в течение 30 минут.
Заключительным этапом осуществляют лиофильное высушивание. Осадок суспендируют в 10 мл деионизированной дистиллированной воды, фасуют по ампулам или флаконам и лиофильно высушивают. В таком виде препарат может храниться, не меняя своих свойств, длительное время.
Применение вышеописанной схемы выделения ФА в трех независимых экспериментах показало, что из 1 г сухой бакмассы штамма Y.pestis KM 1279 выделялось от 80 до 100 мг сухого препарата ФА. Высокий выход ФА (8-10%) свидетельствовал о его присутствии на поверхности клеток данного штамма в значительных количествах.
Характеристика препарата белка ФА.
Лиофильно высушенный препарат растворялся в щелочных растворах и не растворялся в воде, что свидетельствовало о его гидрофобности. Препарат содержал 80% белка, 6% нейтральных углеводов и не содержал примесей ЛПС, выявляемых методом иммуноблоттинга с моноклональными антителами к ЛПС Y.pestis.
О наличии в препарате одного белка свидетельствовали данные масс-спектрометрического анализа. Максимальная молекулярная масса, зарегистрированная в препарате этим методом, составляла 17,485 кДа. Однако при электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия ФА был представлен множественными полосами, что могло указывать на склонность данного белка к образованию комплексов, устойчивых к прогреванию в присутствии 2-меркаптоэтанола и додецилсульфата натрия.
ФА обладает антигенной активностью, и антитела к нему присутствуют в чумных иммунных сыворотках. ФА является перекрестно реагирующим антигеном. Иммунохимически сходные, но не идентичные с ФА Yersinia pestis антигены были выявлены у Yersinia pseudotuberculosis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris.
С помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии препарата ФА, гидролизованного трипсином, белок ФА был идентифицирован как аналог белка YPO0502 (нумерация как в штамме Y.pestis CO92). Этот белок, гены которого присутствуют у всех секвенированных к настоящему времени штаммов Y.pestis, принадлежит к суперсемейству белков Hcp (hemolisin coregulated protein), являющихся пилеподобными компонентами аппарата шестой системы секреции (T6SS), обнаруженной недавно у грамотрицательных бактерий (см. обзоры Bönemann G., Pietrosiuk A., Mogk A. Tubules and donuts: a type VI secretion story // Mol Microbiol. - 2010. - V.76. - P.815-821; Bernard C.S., Brunet Y.R., Gueguen E., Cascales E. Nooks and crannies in type VI secretion regulation // J. Bacteriol. - 2010. - V.192. - P.3850-3860). В настоящее время известно, что T6SS обеспечивает секрецию белков, лишенных гидрофобной N-концевой последовательности, контролируется глобальными регуляторами и необходима для проявления бактериями таких свойств, как адгезия к эпителиальным клеткам, внутриклеточное выживание, разрушение макрофагов и вирулентность для млекопитающих. Изучение ФА показало, что он участвует в межклеточном взаимодействии возбудителя чумы, обеспечивая аутоагглютинацию бактерий.
Пример 1, иллюстрирующий способность препарата ФА восстанавливать аутоагглютинацию бактерий штамма Y.pestis KM 1279.
10
а) Для определения АА использовали метод «высаливания» (Lindahl M., Farris A., Wadstrom Т., Hjerten S. A new test based on "salting out" to measure relative surface hydrophobicity of bacterial cells // Biochim. Biophys. Acta. - 1981. - V.677. - P.471-476), который основан на способности бактериальных клеток склеиваться (агглютинировать) на стекле в растворе сульфата аммония. Чем менее концентрированный раствор необходим для склеивания клеток, тем выше способность клеток к АА. Для постановки опыта в каплю раствора сульфата аммония различной концентрации вносили каплю суспензии бактериальных клеток, содержащую 10 м.кл./мл. Минимальная концентрация соли, способствующая видимому глазом склеиванию клеток, использовалась как критерий количественной оценки АА.
10
ФА смывали с поверхности клеток штамма Y.pestis КМ 1279 раствором 5 мМ NaOH. Процедуру проводили не менее 5 раз, контролируя наличие ФА на поверхности клеток с помощью чумного иммуноглобулинового диагностикума (Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций). Отрицательный результат реакции взвеси бактерий в 5 мМ NaOH с диагностикумом свидетельствовал об отсутствии ФА на поверхности клеток. Отмытые от ФА клетки (10 м.кл./мл) не оседали на дно пробирок в физрастворе в течение 24 часов (срок наблюдения), в то время как аналогичная суспензия интактного штамма выпадала на дно пробирок за 3 часа. В тесте «высаливания» отмытые клетки агглютинировали в растворе 3 М сульфата аммония, а интактные клетки - в 0,25М.
Таким образом, удаление ФА с поверхности клеток Y. pestis приводило к утрате способности бактерий к аутоагглютинации.
10
б) Отмытую культуру суспендировали в ЗФР до концентрации 10м.кл./мл, добавляли равный объем препарата ФА (1 мг/мл), растворенного в 5 мМ NaOH, и инкубировали в течение 1 часа при 26°С. Затем определяли способность клеток к АА методом «высаливания». В качестве контролей использовали взвесь исходного штамма Y.pestis KM 1279 и отмытую от ФА взвесь этого штамма без инкубации с препаратом ФА. В результате опыта были получены следующие результаты: клетки исходного штамма агглютинировали в 0,25 М растворе сульфата аммония, отмытые от ФА клетки агглютинировали в 3 М растворе соли, отмытые клетки после инкубации с препаратом ФА восстанавливали свою агглютинативную способность и проявляли АА, как и родительский штамм, в 0,25 М растворе сульфата аммония.
Таким образом, препарат ФА восстанавливал способность к АА штамма Y.pestis KM 1279, с поверхности которого был смыт белок ФА.
Пример 2, подтверждающий способность препарата ФА восстанавливать АА клеток мутанта-штамма Y.pestis KM 1279, не проявляющего АА.
+
-
10
+
-
В опыте использовали штамм Y.pestis KM 1279 (АА) и полученный из него спонтанный мутант, не проявляющий аутоагглютинации, - Y.pestis KM 1279 (АА). Суспензии указанных штаммов в ЗФР (10 м.кл./мл) смешивали 1:1 с препаратом ФА (1 мг/мл), растворенным в 5 мМ NaOH. Контролем служили те же суспензии, к которым вместо ФА добавляли раствор 5 мМ NaOH. Суспензии инкубировали 1 час при 26°С, после чего по 50 мкл каждого образца вносили в 50 мкл раствора сульфата аммония различной концентрации (0-4 М). Через 5-10 минут оценивали видимую глазом АА исследуемых образцов. В таблице 1 показано, что родительский штамм Y.pestis КМ 1279 (АА) и в опыте, и в контроле агглютинировал в 0,25 М растворе сульфата аммония. Мутантный штамм Y.pestis KM 1279 (АА) без инкубации с ФА агглютинировал в 3 М растворе сульфата аммония, а после инкубации с ФА проявлял АА в 0,25 М растворе сульфата аммония.
Эти данные свидетельствовали о способности ФА восстанавливать аутоагглютинативную способность клеток мутанта до уровня родительского штамма.
Пример 3, демонстрирующий способность препарата ФА, выделенного из Y.pestis КМ 1279, повышать аутоагглютинативные свойства клеток гетерологичных бактерий {E.coli и K.pneumoniae).
10
Суспензии клеток E.coli К-12 и K.pneumoniae P-214 (штаммы из музея живых культур Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института) в ЗФР (10 м.кл./мл) смешивали 1:1 с препаратом ФА (1 мг/мл), растворенным в 5 мМ NaOH. Контролем служили те же суспензии, к которым вместо ФА добавляли раствор 5 мМ NaOH. Постановка опыта, как в примере 2. После инкубации указанных культур с препаратом ФА они начинали агглютинировать в 0.25 М растворе сульфата аммония, в то время как клетки без предварительной инкубации с ФА (контроль) проявляли АА в 2-3 М растворах сульфата аммония (см. таблицу 2).
Полученные данные свидетельствовали о способности белка ФА повышать аутоагглютинативные свойства клеток гетерологичных бактерий.
Пример 4, доказывающий роль белка ФА в АА клеток возбудителя чумы методом ингибирования синтеза белка Ypo0502 с помощью антисмысловой РНК.
trc
Для получения антисмысловой РНК ПЦР-копия гена уро0502 была клонирована в клетках кишечной палочки в составе плазмидного вектора pMos в обратной ориентации по отношению к промотору. Фрагмент ДНК, содержащий 123 п.н. 5′-концевой области гена уро0502, был вырезан из рекомбинантной плазмиды с помощью рестриктазы BamHI и клонирован в векторе для экспрессии pTRC99a (Amann E.B, Ochs В., Abel K-J. Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of fused and unfused proteins in Escherichia coli // Gene. - 1988. - V.69. - P.301-315). В результате была получена рекомбинантная плазмида pTRC99a-502as, кодирующая антисмысловую РНК уро0502 под контролем индуцируемого промотора P. Конструкция рекомбинантной плазмиды была подтверждена в ПЦР с праймерами, один из которых комплементарен векторной ДНК (M13-r), a другой - 5′-концевой области гена уро0502. Синтез ПЦР-продукта длиной 210 п.н. свидетельствовал о том, что фрагмент был клонирован в антисмысловой ориентации по отношению к промотору.
-
+
Полученная рекомбинантная плазмида pTRC99a-502as, а также векторная плазмида pTRC99a в качестве контроля были введены с помощью электропорации в два штамма Y.pestis: EV76 (Hms) и G8786 (Hms). Культуры были выращены в течение 24 часов без аэрации и индуцированы в течение 6 часов 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом. На фото продемонстрировано влияние антисмысловой уро 502 РНК на аутоагглютинацию Y.pestis. В то время как контрольные штаммы, содержащие векторную плазмиду - EV76 (1) и G8786 (3) - проявляли АА в этих условиях, штаммы с рекомбинантной плазмидой, продуцирующую уро0502 антисмысловую РЕК, после индукции промотора не проявляли АА (фото - 2,4).
Полученные данные подтверждают роль ФА в аутоагглютинации штаммов возбудителя чумы.
Таким образом, было установлено, что ФА является Нср-подобным компонентом шестой системы секреции, склонен к агрегации, присутствует на поверхности клеток возбудителя чумы в значительных количествах, способствует повышению гидрофобности бактериальных клеток и определяет свойство аутоагглютинации возбудителя чумы.
Использование предлагаемого изобретения позволяет с помощью полученного белка (ФА), относящегося к суперсемейству Hcp (hemolisin coregulated protein) белков шестой системы секреции грамотрицательных бактерий, изучать физиологическую роль этой системы у возбудителя чумы.
Полученный препарат может быть использован для выявления возможного участия ФА в межклеточных взаимодействиях Y.pestis и в образовании биопленок, связи с клетками хозяина в ходе инфекции и защите от бактерицидных факторов врожденной иммунной системы.
Препарат может быть применен для изучения механизма воздействия аутоагглютинации на вирулентность чумного микроба, а также для оценки роли ФА в реализации патогенных свойств возбудителя чумы. Изучение протективных свойств ФА может способствовать обнаружению нового кандидата для включения его в состав химической противочумной вакцины.
Таблица 1.
Конц. сульфата аммония (моль)
Y.pestis
КМ 1279 (АА<sup>+</sup>)
Y.pestis
КМ 1279 (АА<sup>-</sup>
Контроль
Инкубация с ФА
Контроль
Инкубация с ФА
4,0
+
+
+
+
3,0
+
+
+
+
2,0
+
+
-
+
1,0
+
+
-
+
0,5
+
+
-
+
0,25
+
+
-
+
0 (Н<sub>2</sub>О)
-
-
-
-
Таблица 2.
Конц. сульфата аммония (моль)
E.coli К-12
K.pneumoniae P-214
Контроль
Инкубация с ФА
Контроль
Инкубация с ФА
4,0
+
+
+
+
3,0
+
+
+
+
2,0
+
+
-
+
1,0
-
+
-
+
0,5
-
+
-
+
0,25
-
+
-
+
0 (Н<sub>2</sub>О)
-
-
-
-