Уровень растворимых дифференцировочных молекул клеток иммунной системы в сыворотке крови детей

Общая биология

Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 98-102

УДК 612.014.1

УРОВЕНЬ РАСТВОРИМЫХ ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫХ МОЛЕКУЛ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ДЕТЕЙ

© 2011 г. Л.А. Пашева 1, Н.Б Преснякова 2, А.В. Караулов 3, В.В. Новиков 1,2

1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского 2 Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной 3 Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

lyubashechka@yandex. т

Поступила в редакцию 23.05.2011

Проведен сравнительный анализ среднего уровня суммарных и олигомерных фракций растворимых молекул CD25, CD38, CD95 и HLA-DR в сыворотке крови детей от 3 до 17 лет и взрослых. Определение уровня растворимых молекул проводили двухсайтовым иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител серии ИКО. Показано, что уровень растворимых форм мембранных белков клеток иммунной системы у детей отличается от уровня взрослых. Кроме того, уровень указанных протеинов отличается в раннем и позднем детстве.

Ключевые слова: растворимые дифференцировочные молекулы клеток иммунной системы, суммарные и олигомерные фракции растворимых CD25, CD38, CD95 и HLA-DR.

К настоящему времени охарактеризованы 363 дифференцировочные молекулы клеток человека - HCDM («human cell differentiation molecules»), большую часть которых составляют антигенные структуры, локализованные на мембране клеток различных ростков гемопоэза [1]. Для некоторых мембранных молекул показано существование растворимых гомологов. Растворимые дифференцировочные молекулы образуются путем протеолитического шеддинга или альтернативного сплайсинга матричной РНК и могут формировать олигомеры. Изменение их концентрации в сыворотке крови становится причиной нарушения взаимодействий иммунокомпетентных клеток, а значит и модуляции иммунного ответа. При этом они могут выполнять функции ограничителей или активаторов иммунологических процессов. Детекция содержания растворимых форм мембранных белков клеток иммунной системы и, в частности, растворимых протеинов CD25 (sCD25), CD38 (sCD38), CD95 (sCD95) и HLA-DR (sHLA-DR) в сыворотке крови человека имеет дифференциально-диагностическое и мониторинговое значение при многочисленных имму-ноопосредованных патологиях [2].

Применение вышеуказанных иммунологических показателей находится в критической зависимости от знания их сывороточного содержания в норме. Уровень растворимых антигенов в сыворотке взрослых здоровых доноров

характеризуется высокой вариабельностью, зависит от метода определения, при этом данные разных авторов отличаются [3-10].

Знание пределов нормы особенно существенно в педиатрии. У детей гемопоэз отличается возрастной изменчивостью, необычной реакцией на воздействия эндогенного и экзогенного характера. Данные о концентрации растворимых форм мембранных белков у детей весьма ограничены [11-14].

Цель настоящего исследования - сравнительный анализ среднего уровня суммарных (sum) и олигомерных (ol) фракций растворимых молекул CD25, CD38, CD95 и HLA-DR в сыворотке крови детей от 3 до 17 лет и взрослых.

Материалы и методы

Использованы 100 образцов сыворотки крови детей от 3 до 17 лет, в том числе детей 3-7 лет (26 человек), детей 8-12 лет (41 человек), детей 13-17 лет (33 человека), находившихся на амбулаторном обследовании в детской поликлинике № 48 Н. Новгорода. В качестве группы сравнения исследовали 30 образцов сыворотки крови здоровых доноров Нижегородской областной станции переливания крови в возрасте 18-50 лет. Определение уровня растворимых молекул проводили двухсайтовым иммунофер-ментным методом с использованием монок-

Группа, лет Коли- чество образцов Наименование растворимого белка

CD25sum CD25ol CD38sum CD38ol CD95sum CD95ol HLA- DR

18-50 30 406±21 407±27 200±17 257±14 374±23 250±6 99±11

3-7 26 778±77* 564±68* 270±34* 468±90* 579±80* 426±89 98±8

8-12 41 590±36*,** 497±39* 239±20* 326±31** 571±60* 370±45 99±6

13-17 33 590±37*,** 471±43 252±26* 324±44 542±68* 410±5 5 * 95±7

*Статистически значимые различия с группой взрослых 18-50 лет (р < 0.05). “Статистически значимые различия с группой детей 3-7 лет (р < 0.05).

Рис. 1. Суммарное содержание sCD25 в сыворотке крови лиц разных возрастных групп. * - Статистически значимые различия с группой взрослых 18-50 лет

лональных антител серии ИКО [15]. Результаты выражали в условных единицах (и/т1). Статистический анализ проводили с использованием критериев Манна-Уитни и Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Исследовано сывороточное содержание суммарных и олигомерных фракций растворимых молекул CD25, CD38, CD95 и HLA-DR в сыворотке крови детей трех возрастных групп и взрослых (таблица).

Суммарное содержание 8СБ25 у детей в каждой возрастной группе было в среднем статистически значимо выше, чем у взрослых в 1.9, 1.45 и 1.45 раз соответственно. Обнаружены статистически значимые различия уровней sCD25sum между группами детей 3-7 лет и детей 13-17 лет (рис. 1).

Содержание sCD25ol у детей в каждой возрастной группе было в среднем статистически значимо выше, чем у взрослых в 1.4, 1.22 и 1.16 раз соответственно. Более выраженные отличия

с группой взрослых наблюдались в группе детей 3-7 лет. Можно отметить незначительную тенденцию приближения к уровню взрослых лиц обеих фракций sCD25 с увеличением возраста.

Полученные результаты подтверждают более ранние исследования, в которых было показано, что уровень sCD25 у детей выше, чем у взрослых в норме, и выявлено прогрессивное снижение концентрации sCD25 с возрастом у детей старше 3 лет [12-14].

Известно, что уровень растворимого рецептора CD25 коррелирует с экспрессией мембранной формы [2]. Молекула CD25 экспрессируется преимущественно на Т-лимфоцитах, а также на В-лимфоцитах, NK-клетках, моноцитах, макрофагах. Возрастная инволюция тимуса приводит к снижению абсолютного количества моно-нуклеарных клеток периферической крови, снижению уровня зрелых Т-лимфоцитов, к значительному уменьшению пролиферативной активности цитотоксических клонов, снижению продукции интерлейкина-2 в ответ на антиген-

350

300

и 200 А

50 -\

о

Деш 3-7 лет

Дети 8-12лет

Дети 13-17 лет

Взрослые

Рис. 2. Суммарное содержание sCD38 в сыворотке крови лиц разных возрастных групп. * - Статистически значимые различия с группой взрослых 18-50 лет

ную стимуляцию [16, 17]. Исследователи указывают разные сроки начала возрастной инволюции тимуса: и с 2-3 лет, и в пубертатный период, с 13-20 лет [16, 18, 19]. Однако, вне зависимости от этих сроков, доказано прогрессивное снижение абсолютного количества Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов с увеличением возраста детей [20]. Таким образом, снижение уровня растворимых молекул СБ25 с возрастом у детей может быть связано как со снижением количества мононуклеарных клеток периферической крови, несущих этот антиген, так и с уменьшением их функциональной активности (снижением уровня экспрессии мембранной формы СБ25).

Кроме того, обнаружена отрицательная корреляция между возрастом и сывороточной концентрацией интерлейкина-2 у детей [21]. Изменение сывороточного уровня sCD25 принято трактовать как ограничительную реакцию на изменение уровня интерлейкина-2, поэтому снижение сывороточного содержания этих молекул с возрастом у детей представляется закономерным явлением.

Повышенный в сравнении со взрослыми уровень sCD25 в крови детей - свидетельство более высокого уровня активации иммуноком-петентных клеток, в первую очередь Т-хелперов I типа. Кроме рассмотренных выше физиологических причин, процесс активации может быть индуцирован пролонгированным действием вакцинации в рамках национального календаря профилактических прививок.

Суммарное содержание 8СБ38 в сыворотке крови детей в каждой возрастной группе в среднем статистически значимо выше, чем у взрослых в 1.35, 1.2 и 1.26 раз соответственно. В то же время, содержание олигомерной фрак-

ции sCD38 у детей 3-7 лет статистически значимо выше, чем у взрослых в 1.8 раз, а в других возрастных группах отмечается лишь тенденция к превышению уровня взрослых лиц. Обнаружены статистически значимые различия между уровнем sCD38ol у детей 3-7 лет и детей 8-12 лет (рис. 2).

Физиологическая роль повышенного по сравнению со взрослыми содержания фракций sCD38 у детей не ясна. Ключ к ее пониманию необходимо искать в функциональном значении этой молекулы, ее взаимодействии с развитым, динамичным рецепторным аппаратом иммуно-компетентных клеток. CD38 является эктоэнзимом, участвующим в трансмембранной сигнализации и клеточной адгезии, и используется в качестве маркера заболевания лейкозами и мие-ломой. Это уникальный образец мембранного белка клеток иммунной системы человека, который экспрессируется на лимфатических и миелоидных предшественниках, исчезает на последующих стадиях дифференцировки и повторно экспрессируется с высокой плотностью на активированных Т- и В-лимфоцитах, NK-клетках, а также моноцитах, макрофагах, тромбоцитах, клетках эндотелия. Лигандом CD38 является CD31, экспрессируемый клетками эндотелия, Т-клетками, моноцитами и тромбоцитами. Взаимодействие между CD38, хемокина-ми и их рецепторами влияет на клеточную миграцию. Последние исследования показывают, что CD38 является одним из компонентов сложной сети передачи сигналов роста и выживания клеток при хроническом лимфолейкозе, а изменение уровня его экспрессии на клетках имеет прогностический характер [22].

Мономерная форма sCD38 является фактором супрессии, обеспечивая снижение имму-

600

"g *00 ЁЗ

и 4

| -•‘00 О

п

с; :оо

юо -

Дети 3-7 лет

Дети S-12 лет

Дети 13-17 лет

Взрослые

Рис. 3. Суммарное содержание sCD95 в сыворотке крови лиц разных возрастных групп. * - Статистически значимые различия с группой взрослых 18-50 лет

норегуляторной функции мембранной формы протеина за счет блокады межклеточных адгезивных взаимодействий. Димерный СБЭБ в мембранной форме в большей степени проявляет энзиматическую активность [2].

Суммарное содержание 8СБ95 в сыворотке крови детей в каждой возрастной группе статистически значимо выше, чем у взрослых в 1.5, 1.5 и 1.45 раза соответственно. Характер возрастных изменений уровня олигомерной фракции 8СБ95 у детей в каждой возрастной группе соответствует изменению суммарного содержания 8СБ95 и в среднем выше, чем у взрослых в 1.7, 1.5 и 1.6 раза соответственно (рис. 3). Вероятно, выявленные особенности связаны с возрастными закономерностями CD95-опосредо-ванного апоптоза. Известно, что уровень экспрессии этого антигена на лимфоцитах периферической крови у детей низок и прогрессивно повышается с возрастом человека [23]. Таким путем происходит ограничение апоптотических процессов у детей. Повышеннный по сравнению со взрослыми сывороточный уровень растворимой формы СБ95 у детей блокирует действие мембранного аналога, что также оказывает негативное влияние на апоптоз.

Усредненное содержание растворимых молекул HLA-DR в сыворотке крови детей 3-7 лет составило 98±8 и/т1, у детей 8-12 лет было 99±6 и/т1 и у детей 13-17 лет равнялось 95±7 и/т1. У здоровых доноров крови содержание sHLA-DR составило 99±11 и/т1. Таким образом, сывороточный уровень sHLA-DR у детей существенно не отличается от уровня взрослых. HLA-DR экспрессируется главным образом на профессиональных антиген-представляющих клетках, но может экспрессироваться и на Т-лимфоцитах при активации. По данным ряда

исследователей, абсолютное количество HLA-DR+ клеток в крови у детей уменьшается с возрастом, приближаясь к показателям взрослых лиц [20]. Вероятно, отсутствие связи между уровнями экспрессии мембранной и растворимой формы HLA-DR обусловлено различными механизмами их регуляции.

Таким образом, исследованы особенности сывороточного пула растворимых дифференци-ровочных молекул и молекул гистосовместимости у детей разного возраста. Выявлено, что уровень исследованных белков в сыворотке крови детей, как и у взрослых лиц, характеризуется высокой вариабельностью. Показано, что, за исключением sHLA-DR, содержание этих протеинов у детей отличается от взрослых. В большинстве случаев наблюдается статистически значимое повышение уровня исследованных растворимых белков или тенденция к повышению у детей в сравнении со взрослыми. Более выраженные отличия от взрослых наблюдались у детей 3-7 лет. В основе обнаруженных возрастных изменений сывороточного содержания растворимых мембранных белков клеток иммунной системы лежат физиологические процессы становления иммунной системы, процессы активации и ограничения иммунных реакций.

Список литературы

1. http://www.hcdm.org/HLDA9Workshop/tabid/60 / Default.aspx (дата обращения: 15.02.2011).

2. Новиков В.В., Караулов А.В., Барышников А.Ю. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы. М: МИА, 2008. 243 с.

3. Brusko T.M., Wasserfall C.H., Hulme M.A., Cabrera R., Schatz D., Atkinson MA. Influence of membrane CD25 stability on T lymphocyte activity: implica-

tions for immunoregulation // PLoS One. 2009. V. 4. № 11. Р. 79-80.

4. Kart L., Buyukoglan H., Tekin I.O., Altin R. et al. Correlation of serum tumor necrosis factor-alpha, interleukin-4 and soluble interleukin-2 receptor levels with radiologic and clinical manifestations in active pulmonary tuberculosis // Mediators Inflamm. 2003. V. 12. № 1. Р. 9-14.

5. Ge C.J., Hu S.J., Zheng X., Chen Z.K., Sun J., Wu Y.S. Serum levels of soluble Fas soluble Fas ligand and soluble IL-2 receptor in patients with coronary heart disease // Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2002. V. 31. № 5. Р. 337-339.

6. Grungreiff K., Reinhold D., Ansorge S. Serum concentrations of sIL-2R, IL-6, TGF-beta1, neopterin, and zinc in chronic hepatitis C patients treated with inter-feron-alpha // Cytokine. 1999. V. 11. № 12. Р. 10761080.

7. Beguin Y., Lampertz S., De Groote D., Igot D., Malaise M., Fillet G. Soluble CD23 and other receptors (CD4, CD8, CD25, CD71) in serum of patients with chronic lymphocytic leukemia // Leukemia. 1993. V. 7. № 12. Р. 2019-2025.

8. Аббасова С.Г. Растворимый Fas при онкологических заболеваниях. Автореферат дис. ... д-ра. мед. наук. М.: ВОНС им. В.Н. Блохина, 2009. 51 с.

9. Verbruggen L.A., Dumarey N., Van de Velde H. et al. Soluble HLA-DR antigen levels in serum correlate with rheumatoid arthritis disease activity and the presence of disease-associated epitopes // Tissue Antigens. 2000. V. 56. № 5. P. 436-440.

10. Hosoi K., Hagihara M., Kagawa T., Watanabe N., Matsuzaki S. The serum soluble HLA-DR antigens as a predictive marker of the response to inter-feron-alpha treatment in patients with chronic hepatitis C // Tokai J. Exp. Clin. Med. 2000. V. 25. № 3. P. 117-124.

11. Chan K.N., Phillips A.D., Walker-Smith J.A., MacDonald T.T. Serum interleukin-2 receptor in infants and young children // Acta Paediatr. 1995. V. 84. № 2. Р. 151-155.

12. Sack U., Burkhardt U., Borte M., Schadlich H. et al. Age-dependent levels of select immunological media-

tors in sera of healthy children // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998. V. 5. № 1. Р. 28-32.

13. Gotoh Y., Okamoto Y., Uemura O., Mori N. et al. Determination of age-related changes in human soluble interleukin 2 receptor in body fluids of normal subjects as a control value against disease states // Clin. Chim. Acta. 1999. V. 289. № 1-2. P. 89-97.

14. Matsumoto T., Miike T., Yamaguchi K. et al. Serum levels of soluble IL-2 receptor, IL-4 and IgE-binding factors in childhood allergic diseases // Clin. Exp. Immunol. 1991. V. 85. № 2. P. 288-292.

15. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. М.: Медицина, 1997. 212 с.

16. Караулов А.В., Земсков А.М., Земсков В.М. Клиническая иммунология и аллергология. М.: Медицинское информационное агентство, 2002. 651с.

17. Чиркин В.В., Карандашов В.И., Палеев Ф.Н. Иммунореабилитация (патофизиологические и клинические аспекты). М.: Медицина, 2003. 400 с.

18. Ивановская Т.Е., Зайратьянц О.В., Леонова Л.В., Волощук И.Н. Патология тимуса у детей. СПб.: СОТИС, 1996. 270 с.

19. Appay V., Sauce D., Prelog M. The role of the thymus in immunosenescence: lessons from the study of thymectomized individuals // Aging (Albany NY). 2010. V. 2. № 2. P. 78-81.

20. Пичугина Л.В. Изменение фенотипа лимфоцитов при некоторых патологиях. М.: БХМ, 2006. 36 с.

21. Culic S., Labar B., Marusic A., Salamunic I. Correlations among age, cytokines, lymphocyte subtypes, and platelet counts in autoimmune thrombocytopenic purpura // Pediatr. Blood Cancer. 2006. V. 47. № 5. P. 671-674.

22. Deaglio S., Aydin S., Vaisitti T., Bergui L., Malavasi F. CD38 at the junction between prognostic marker and therapeutic target // Trends Mol. Med. 2008. V. 14. № 5. P. 210-218.

23. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. М.: Эдиториал УРСС, 2002. 320 с.

LEVELS OF SOLUBLE DIFFERENTIATION MOLECULES OF IMMUNE SYSTEM CELLS IN CHILDREN’S SERUM

L.A. Pasheva, N.B. Presnyakova, A. V. Karaulov, V. V. Novikov

A comparative analysis has been carried out of the average level of total and oligomeric fractions of molecules sCD25, sCD38, sCD95 and sHLA-DR in the serum of different children aged from 3 to 17 years and adults. The analysis was performed by the sandwich ELISA method using monoclonal antibodies of the ICO series. The children’s level of membrane protein soluble forms of immune system cells has been shown to differ in most cases from that of adults. Moreover, it is different in early and late childhood.

Keywords: soluble differentiation molecules of immune system cells, total and oligomeric fractions of sCD25, sCD38, sCD95 and sHLA-DR.