СПОСОБ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ СТРЕССОВЫХ РЕАКЦИЙ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ
METHOD TO PREVENT STRESS REACTIONS IN ANIMALS

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии, и может быть использовано в фармакологии, медицине и в животноводстве для парентерального введения и включения в рационы животных и птицы с целью повышения их стрессоустойчивости и продуктивности.
Активно развиваемые ныне промышленные технологии производства животноводческой продукции сталкиваются с задачами преодоления возникающих противоречий между биологическими и технологическими аспектами одной и той же проблемы. Высокая концентрация животных, наличие громадного количества работающей техники, облегчает условия работы обслуживающего персонала, однако все это часто приводит к менее физиологичными условия существования животных. Возникает ряд дополнительных стрессфакторов. Неотъемлемым следствием стрессов любой этиологии является избыточное образование свободных радикалов, что крайне неблагоприятно сказывается на обмене веществ, а, следовательно, на здоровье животных, их продуктивности, качестве продукции и затратах кормов и труда на ее производство.
Из уровня техники известно большое количество всевозможных нейро-тропных веществ и для людей, и для животных. Эти биологически активные вещества предназначены для предотвращения, смягчения и ликвидации последствий стрессовых воздействий на организм. Они призваны помочь животному нормализовать ответные реакции на неадекватные раздражители, инициирующие метаболические отклонения, выходящие за пределы колебаний естественных биологических параметров динамического гомеостаза. Все эти вещества самой различной природы, представляют собой в основном продукты химического синтеза. Все они, в большей или меньшей степени, являются чужеродными для живого организма, все они далеко не безразличны для здоровья животных, практически все они не могут быть применены при производстве экологически чистых продуктов питания для человека (Фомичев Ю.П. Биотехнология производства говядины. М.: Россельхозиздат, 1984., 238 с., Байдевлятов А.Б., Николаенко В.П. Профилактика стрессов перемещения и ветеринарных обработок птицы. Научно-технический бюллетень. Харьков. (НО Украина. НИИ птицеводства). - 1983. - №15. - С. 37-39, Афанасьева А.И., Огуй В.Г., Мякушко Н.В., Тараненко В.Н. Технологические приемы адаптивных методов выращивания телят. Барнаул, АГАУ, 2006, 319 с.).
В конце 2010 года появилась работа, наиболее близко относящаяся к описанной в данной заявке, использующая в качестве антистрессового препарата литиевую соль гамма-аминомасляной кислоты и используемая нами в качестве прототипа (Галочкин В.А., Галочкина В.П., Остренко К.С., Патент №2402205 от 27.10.2010. Способ повышения стрессоустойчивости животных).
Настоящее изобретение направлено на решение технической задачи по разработке нового более совершенного, более физиологичного и более эффективного способа борьбы с любыми формами стресса у животных путем предотвращения развития стрессовых реакций или для смягчения и ликвидации последствий, если реакции на стресс-фактор своевременно не удалось предотвратить.
Возникает необходимость разработки новых, более эффективных и более физиологичных способов повышения стрессоустойчивости, неспецифической резистентности, продуктивности с.-х. животных и птицы, улучшения качества производимой продукции, снижения затрат кормов, труда и финансовых средств на ее производство.
Суть авторской рабочей гипотезы заключается в следующем: гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) - один из основных естественных медиаторов процессов торможения в центральной нервной системе всех высших животных. Возбудимость, нервозность, чувствительность животных и человека к стрессоу, в первую очередь, связаны с этой кислотой. Сложности возникают в связи с тем, что молекула ГАМК это типичный цвиттерион, и в силу своей выраженной полярности и гидрофильности она в обычных условиях практически не проникает через гематоэнцефалический барьер и действует преимущественно либо периферически, либо непосредственно в местах синтеза (Сытинский И.А. Гамма-аминомасляная кислота - медиатор торможения. Ленинград. Наука, 1977. - 139 с.).
В поисках аналогов ГАМК, способных проникать через гематоэнцефалический барьер и оказывать преимущественно центральное действие, в медицине в конце шестидесятых годов прошлого столетия было обращено внимание на гамма-оксимасляную кислоту, которая в эксперименте и клинике проявила отчетливое гипнотическое, транквилизирующее и антигипоксическое действие. В виде натриевой соли препарат, получивший название натрия оксибутират, нашел широкое применение в хирургии, анестезиологии, офтальмологии, неврологии и психиатрии (Закусов В.В., Ред. Оксибутират натрия. Нейрофармакологическое и клиническое исследование, М. Медицина 1968, с. 134). Ценным свойством оксибутирата натрия оказалась его способность усиливать действие наркотических и анальгетических веществ, оказывать антигипоксическое и антитоксическое действие. В психиатрической практике находит использование транквилизирующий и снотворный эффекты препарата.
Несколькими годами позже получила клиническое применение в качестве психотропного средства литиевая соль гамма-оксимасляной кислоты. (Любимов Б.И., Толмачева Н.С., Островская Р.У., Митрофанов B.C. Экспериментальное изучение нейротропной активности лития оксибутирата. Фармакол. и токсикол., 1980, 43, 395-401). Фармакологическое и клиническое изучение препарата показало, что его действие не является простой суммой эффектов катиона лития и аниона оксибутирата, а характеризуется своим собственным спектром, сочетающим в себе антиманиакальное действие лития с транквилизирующим эффектом гамма-оксимасляной кислоты. Эффект лития при этом оказывается усиленным за счет большего накопления в мозговой ткани, что позволяет использовать его в меньших дозах. В клинике препарат проявляет отчетливое профилактическое действие при депрессивных состояниях, обладая при этом собственным седативным эффектом.
Не ограничиваясь на этом, более двадцати лет тому назад были предприняты первые попытки использовать в качестве ингибиторов переаминирования ГАМК карбонильные реагенты - гидроксиламин и оксиаминоуксусную кислоту (оксиглицин). Теоретическое обоснование этим попыткам заключалось в том, что подобные соединения способны взаимодействовать с альдегидной группой пиридоксальфосфата и тем самым ингибировать ГАМК-трансферазу, катализирующую основной путь деградации ГАМК в организме. Пиридоксальфосфат является кофактором ГАМК-трансферазы. Эффект оксиглицина по ингибированию этого пиридоксалевого фермента был хорошо выражен и не ослаблялся даже в присутствии избытка пиридоксальфосфата. После этих наблюдений оксиглицин был испытан в клинике в качестве противосудорожного средства у детей, где в ряде случаев обнаружил положительный эффект (Раевский К.С., Георгиев В.П. Медиаторные аминокислоты, Москва: Медицина, 1986, с. 239). Естественно, на основе этих знаний было постулировано, что оксиглицин может занять серьезное место в качестве средства для ингибирования ГАМК-трансферазы с целью последующего повышения концентрации ГАМК в мозге.
Из уровня техники известно, что минеральные соли лития также, обладают ноотропными (психотропными) свойствами, но, при этом, они свободно преодолевают гематоэнцефалический барьер и проникают в головной мозг (Schou М. Lithium studies. Acta Pharmacol. Toxicol., 1998. 45(2): 115-124). Следовательно, логично было допустить, что при введении оксиглицина в соединении с литием, ГАМК будет медленнее разрушаться, легче преодолевать гематоэнцефалический барьер и ее концентрация в мозге возрастет. В свою очередь, возрастание концентрации ГАМК, на основе знаний о ее физиологическом действии, повлечет за собой одновременное снижение возбудимости животных с повышением стрессоустойчивости.
Основываясь на этих данных, можно сказать, что конкретная цель разработки нового, более рационального способа повышения стрессоустойчивости на основе созданного нами комплексного соединения лития с оксиглицином, заключается в необходимости и возможности достижения поставленной цели при использовании такого комплексного препарата, который будет способен проявить более физиологичный и более высокий положительный эффект, чем это имеет место при применении животным отдельно лития и отдельно оксиглицина. Такое соединение нами синтезировано, (Галочкин В.А., Галочкина В.П., Остренко К.С., Патент №2409556 от 10.12.2010. Способ синтеза органического соединения предотвращающего развитие стрессовых реакций в организме животных).
В патентной и научно-технической литературе отсутствует описание способа борьбы со стрессами человека, животных и птицы с использованием синтезированной нами литиевой соли оксиглицина. Данное обстоятельство позволяет считать заявленное изобретение патентоспособным, как отвечающее условию патентоспособности «изобретательский уровень». Часть четвертая Гражданского кодекса РФ №230-ФЗ от 18.12.2007.
Препарат безвреден для животных - выдерживает испытание, относится к третьему классу опасности по ГОСТ 12.1.007-76. Все исходные компоненты допущены министерством здравоохранения РФ для использования в медицине.
Объект и методы исследования
Пример 1
Опыт проведен на двух группах супоросных свиноматок (опытная и контрольная) породы ландрас по второму опоросу по три головы в каждой. Через 1 месяц после плодотворного осеменения свиноматкам опытной группы осуществлена однократная инъекция разработанной нами пролонгированной формы литиевой соли оксиглицина в дозе 2 мг/кг живой массы.
Контрольная группа свиноматок находилась на основном рационе без указанной инъекции. Через 2,5 месяца после инъекции у свиноматок опытной и контрольной групп взята кровь (за неделю до опороса) для проведения биохимических анализов. У поросят взята кровь перед отъемом в возрасте 30 дней.
После опороса опыт продолжен на поросятах, полученных от каждой из этих двух групп свиноматок. Всего сформировано 4 группы поросят по 18 голов в каждой (по две свиноматки с пометом).
Первая группа поросят (контрольная) набрана от свиноматок контрольной группы и сами поросята не были инъецированы оксиглицинатом лития. Вторая (опытная группа) (также взята от свиноматок контрольной группы. Поросятам этой группы в трехсуточном возрасте проведена инъекция пролонгированной формы оксиглицината лития в той же дозе на кг живой массы. Третья группа поросят подобрана от свиноматок опытной группы, но сами поросята дополнительным обработкам не подвергались. Четвертая группа также комплектовалась от свиноматок опытной группы, а сами поросята были обработаны пролонгированной формой литиевой соли оксиглицина в такой же дозе, как и свиноматки и 1 опытная группа поросят. Опыт продолжен до отъема поросят в 35-дневном возрасте, когда было осуществлено взвешивание и взята кровь у всех животных для анализов.
Основываясь на изложенной информации, мы заостряем внимание на оригинальной гипотезе. Суть гипотезы заключается в допущении, согласно которому синтезированное нами химическое соединение будет способно проявить суммарный эффект свойств, присущих исходным компонентам. Иными словами, цель синтеза комплексного препарата лития с оксиглицином заключается в надежде получить более высокий положительный эффект, чем это имеет место при применении животным в отдельности лития и оксиглицина. Т.е. мы ожидаем, что в синтезированных нами сочетаниях исходные компоненты проявят суммарное (аддитивное, потенциирующее) и, вместе с тем, более физиологичное действие. А это, в свою очередь, позволит внести и свой вклад в решение проблемы смягчения и ликвидации последствий стрессовых воздействий на организм, защитит от пагубного, неблагоприятного действия сложных условий кормления и содержания животных, положительно повлияет на неспецифическую резистентность и приведет к улучшению здоровья и повышению продуктивности. 2. Методы исследований.
В крови свиноматок и поросят в процессе проведения экспериментов определены:
1. Концентрация продуктов перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид, нм/мл);
2. Концентрация восстановленного глутатиона, мкМ/л;
3. Концентрация окисленного глутатиона мкМ/л;
4. Тиол-дисульфидное соотношение;
5. Активность супероксиддисмутазы Е;
6. Активность глутатионпероксидазы Е;
7. Концентрация триацилглицеролов мМ/л;
8. Концентрация общего холестерола мМ/л;
9. Концентрация холестерола липопротеинов низкой плотности мМ/л;
10. Концентрация холестерола липопротеинов очень низкой плотности мМ/л;
11.Концентрация холестерола липопротеинов высокой плотности мМ/л;
12. Концентрация адреналина, нг/мл;
13. Концентрация норадреналина, нг/мл.
Все показатели, характеризующие антиоксидантный статус организма подопытных животных, проанализированы по методам, приведенным в методическом пособии: «Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo», Наука 1992 г. Все показатели, характеризующие липидно-холестероловый эффект проанализированы с использованием тест-систем фирмы «ЮНИМЕД». Концентрация адреналина и норадреналина определена на жидкостном хроматографе Agilent 1100 (Agilent Technologies, США), снабженном бинарным градиентным насосом, дегазатором подвижной фазы, автосэмплером, термостатом колонок, диодно-матричным и масс-спектрометрическим детекторами серии SL с источниками электрораспылительной и химической ионизации при атмосферном давлении.
3. Результаты исследования
Цифровой материал, представленный в таблице 1, свидетельствует, что однократное введение разработанной пролонгированной формы оксиглицината лития свиноматкам не повлияло на их плодовитость и живую массу поросят при рождении. Поросята второй и четвертой опытных групп, обработанные в трехсуточном возрасте препаратом оксиглицина лития имели более высокую сохранность (90 и 95%, против 76% в контроле). У этих же двух групп поросят живая масса к моменту отъема была на 10 и 13% выше, чем у поросят контрольной группы. У поросят третьей опытной группы (были обработаны только их матери) живая масса была на 5% выше, чем в контроле, но она была ниже, чем у поросят второй и четвертой групп. Сохранность поросят в этой группе была на уровне лучшей (четвертой группы) и также значительно выше контрольной группы.
Общие зоотехнические итоги эксперимента однозначно указывают, что однократное введение оксиглицината лития свиноматкам не оказывает влияния на их плодовитость. Вместе с тем, сохранность поросят в пометах этих животных была выше, чем в пометах необработанных свиноматок. Поскольку отход поросят в эксперименте полностью обусловливался за счет травмированных свиноматками поросят, то можно говорить, что свиноматки обработанные литиевой солью оксиглицина в дозе 2 мг/на кг живой массы через 1 месяц после плодотворного осеменения были более спокойными, чем контрольные свиноматки. Наилучшие результаты были получены по четвертой опытной группе поросят. Это говорит о том, что инъекции пролонгированной формы литиевой соли оксиглицина одновременно и свиноматкам и поросятам в трехсуточном возрасте (в той же дозе на единицу живой массы) оказали наиболее эффективное влияние на сохранность и продуктивность подсосных поросят. Вторая группа поросят (инъекции только поросятам) превосходила по сохранности и продуктивности, и третью (инъекции только свиноматкам), и контрольную группы.
У поросят второй опытной группы отмечалась тенденция к повышению концентрации фракции холестерола липопротеинов высокой плотности (на 8%), в то время как достоверное повышение концентрации этой фракции (на 18%) имело место только у поросят четвертой группы. Данный факт мы рассматриваем как весьма положительное влияние на липидно-холестероловый обмен оксиглицината лития. Связываем такую ситуацию в липидно-холестероловом обмене мы с положительным влиянием препарата на системы ответственные за стрессоустойчивость организма поросят. Налицо имело место проявление нейролептической (нормотимической, транквилизирующей, седативной функции).
Что касается липидно-холестеролового обмена в крови свиноматок после однократного введения оксиглицината лития за 11 недель до взятия крови, то никаких достоверных различий по всем изученным показателям нам обнаружить не удалось. (Такой длительный срок наша пролонгированная форма в указанной дозе не действует, тем не менее, некоторое последействие еще сохраняется и выражается в более спокойных поведенческих реакциях свиноматок, обусловивших меньший травматизм находящихся под ними поросят.) Что касается комплекса показателей характеризующих состояние системы редукции глутатиона, то можно с определенностью вновь отметить произошедшие сдвиги в крови поросят второй и четвертой групп (Таблица 4). В обеих этих группах концентрация малонового диальдегида снизилась на 7-8%, свидетельствуя о снижении интенсивности процессов перекисного окисления липидов в организме поросят этих групп. Концентрация сульфгидрильных групп низкомолекулярных соединений повысилась в обеих группах, но в более высокой степени в четвертой группе (на 20%). Концентрация дисульфидных групп снизилась в большей степени также у поросят четвертой группы (на 14%). Эти изменения явились следствием повышения тиол-дисульфидного отношения у поросят второй группы на 20%, а у поросят четвертой группы на 36%. Данные изменения мы рассматриваем как выраженное улучшение в организме поросят этих двух групп (особенно четвертой) состояния антиоксидантных процессов, поскольку тиол-дисульфидное соотношение относится к числу их значимых характеристик. Относительно активности ферментов супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы, то каких либо закономерных и значимых отличий нам выявить не удалось по всем четырем группам поросят. По этой группе показателей в крови опытной и контрольной групп свиноматок каких либо значимых изменений выявить не удалось, все величины укладывались в пределы естественных биологических колебаний.
Об эффективности действия оксиглицината лития мы имели возможность судить также по концентрации в крови поросят катехоламинов (Таблица 4). Через 32 дня после инъекции пролонгированной формы литиевой соли оксиглицина во 2-й и 4-й группах поросят концентрация адреналина и норадреналина еще оставалась существенно пониженной во второй группе относительно первой снижение составило по адреналину в три раза, а по норадреналину в четыре раза. Наибольшим снижением характеризовалась концентрация обоих гормонов в крови поросят четвертой группы и достигло четырехкратной величины по адреналину и почти пятикратной величины по норадреналину.
В ряде наших предыдущих опытов на мышах, крысах и в опыте на растущих бычках было показано, что после инъекций пролонгированных форм литиевых солей ГАМК и оксиглицина у животных уже на вторые сутки резко снижалась концентрация в крови адреналина и норадреналина. Самое примечательное заключается в том, что возникший пониженный уровень этих гормонов во всех опытах продолжался в течение 20-30 дней. И, следовательно, эти признанные главные регуляторы приспособительных реакций, обеспечивающие быстрое, радикальное и адекватное реагирование организма, стали в меньшей степени оказывать стимулирующее влияние на нижеследующие метаболические процессы: а) инициирование распада гликогена и липидов; б) активирование окисления жирных кислот; в) повышения концентрации в крови глюкозы, неэстерифицированных жирных кислот, триглицеролов; г) усиление потребления тканями кислорода; д) изменение просвета сосудов и бронхов; е) увеличение работоспособности сердца и скелетной мускулатуры; ж) инициирование возбуждения центральной нервной системы.
Именно за катехоламинами признана сейчас основная связующая функция между нервной, иммунной и эндокринной системами организма через релизинг-факторы гипоталамуса, большую группу регуляторных пептидов, общих для всех трех главнейших жизненно важных систем и, продолжая гормонами гипофиза, и всех нижележащих гормонсинтезирующих желез и клеток в специфических и неспецифических органах. Нам предстоит еще более детально установить, каким образом, через посредство каких механизмов снижение интенсивности протекания всех описанных обменных процессов влечет повышение продуктивности животных. Какие звенья цепи и интенсивность протекания обмена веществ в целом переходят на пониженный и более рациональный режим функционирования организма животного. Иными словами, мы отмечаем интересную картину - напряженность (интенсивность) обмена веществ снижается, а интенсивность роста животных возрастает.
Таким образом, на основании этого первичного экспериментального материала можно с достаточной степенью определенности говорить, что на избранном нами пути достигнуть определенных успехов вполне возможно предотвращая и корректируя стрессовые ситуации различной этиологии при помощи испытанного препарата, относимого к группе нормотимиков, которые не только способны подавлять психотропную функцию животного, но, наоборот, приводят ее в нормальное, физиологическое состояние без потерь продуктивности. Т.е., синтезированный нами препарат обладает выраженными седативными (транквилизирующими стресспротекторными, адаптогенными) свойствами. Значительно пониженный во второй и четвертой опытных группах поросят уровень обоих катехоламинов, а также описанные изменения в липидно-холестероловом обмене, в системе редукции глутатиона по сравнению с контрольной группой имели следствием повышение живой массы и сохранности поросят, что говорит об уменьшении ответной реакции на стрессовые воздействия в организме этих двух опытных групп животных.