УСТРОЙСТВО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЖИДКИХ СРЕД В ПРОЦЕССЕ АМПЛИФИКАЦИИ И/ИЛИ ГИБРИДИЗАЦИИ
DEVICE FOR DIAGNOSTICS OF LIQUID MEDIA IN PROCESS OF AMPLIFICATION AND/OR HYBRIDISATION

Область техники
Изобретение относится к устройству для сканирования результатов диагностики в медицине, ветеринарии, контроле пищевых продуктов, в криминалистике и других сферах диагностики, связанной с анализом биологически активных компонентов. В частности, изобретение относится к устройствам сканирования разных типов биологических объектов в растворах, размещенных в ячейках, гибридизационных камерах биочипов или плашках.
Уровень техники
Существует множество технических решений, связанных с регистрацией оптических сигналов, полученных в процессе диагностики жидких биологических образцов. Для регистрации сигнала и идентификации объектов чаще всего используют флуоресцентные метки.
При детектировании флуоресценции в ячейках мультиплат [1, 2] или в кюветах [3] или в гибридизационных устройствах [4] формируют падающий поток ультрафиолетового излучения, используя конфокальный принцип измерения при фокусировании в одной точке или применяют лазерное излучение.
Известно устройство, предназначенное для нагрева луночного планшета. Для повышения эффективности нагрева устройство снабжено стержнями, которые осуществляют теплопередачу с верхней части планшета. Однако такая конструкция не предполагает осуществлять освещение лунок с помощью источников света и представляет собой закрытую систему [5].
Известны устройства для мониторинга проведения ПЦР или устройства для мониторинга одновременно проходящих процессов ПЦР и гибридизации в реальном времени. Известно оптическое устройство (Gambini M. et al., 2006) для мониторинга ПЦР в ячейках, установленных в блок с регулировкой температуры. Эмиссионный световой поток от каждой ячейки формируется с помощью линзы Френеля и регистрируется в ПЗС детекторе. Дополнительные оптические элементы (например, линзы Френеля) удорожают устройство.
Известно устройство для амплификации и детектирования нуклеиновых кислот в реальном времени [4]. В качестве источника света используется лазерное излучение. К недостатку устройства относится необходимость перемещения камеры, в случае если необходимо сканировать всю рабочую площадь камеры.
Известно устройство для проведения ПЦР в режиме реального времени [7], которое содержит биологический чип, установленный внутри реакционного объема. Температура чипа меняется в соответствии с заданными циклами ПЦР. В устройстве используют привод, осуществляющий перемещение образца в ХУ координатах под управлением компьютера.
Известен микроскоп [8], в котором формируют двойное прохождение пучка света через прозрачный исследуемый образец с помощью двух объективов, имеющих идентичные оптические характеристики и зеркала. Зеркало размещено с обратной стороны исследуемого объекта, размещенного на прозрачном носителе, за вторым объективом и отражает поток света, проходящий через исследуемый образец.
Однако данное решение относится к конкретному типу оптического микроскопа и не предполагает возможности его применения в устройствах, которые предназначены для проведения ПЦР и/или гибридизации, поскольку в данной оптической системе невозможно обеспечить контакт подложки, на котором размещен образец с нагревательным элементом.
Таким образом, при применении конфокального принципа измерения флуоресценции или при освещении объектов лазерным излучением, в разных ячейках микроплат или в разных точках рабочего поля биочипов необходимо применение механических узлов для перемещения биочипов или микроплат в координатах ХУ. В некоторых случаях используют механические узлы для перемещения оптической системы относительно неподвижного объекта [9]. Использование сложной и точной механики является существенным недостатком устройств с конфокальным принципом измерения сигналов флуоресценции, поскольку усложняет и удорожает конструкцию. Другим недостатком является неравномерность пучка светового потока в случае использования лазеров в качестве источников возбуждающего излучения.
Известны устройства для научно-исследовательских лабораторий [10, 11]. Устройства предназначены для параллельного проведения ПЦР в 96 ячейках плашки. Устройство содержит механизмы для сканирования плашки по координатам ХУ, устройства для автоматической смены фильтров, регуляторы температуры 96 луночных плашек, ПЗС матрицу и программное обеспечение. Сложность устройства и его высокая цена ограничивают его применение для рутинных диагностик в небольших лабораториях.
Известны оптические сканеры и микроскопы, использующие темнопольный принцип формирования изображения, в соответствии с которым поверхность биочипа или кюветы освещается под углом к оптической оси устройства либо с лицевой стороны поверхности биочипа или кюветы [4, 12], либо с обратной стороны биочипа или кюветы [13-15]. Тем не менее, в большинстве оптических схем, использующих темнопольный принцип освещения, формируется узкий световой пучок, например, с помощью лазеров или светодиодов, что также требует применения устройств перемещения биочипов или кювет в координатах ХУ [15].
Известны устройства, использующие темнопольный принцип освещения, в которых не требуется перемещения биочипов в процессе сканирования результатов диагностики, для этого используют разные технические решения для освещения рабочей зоны, с которой снимают сигнал. В патенте [13] для обеспечения более широкой зоны освещения ячейки с биологическим материалом на задней поверхности ячейки сформирована ребристая поверхность. При этом боковая поверхность ребер перпендикулярна оптической оси осветителя. В устройство дополнительно введен механизм подстройки угла освещения, который управляется от компьютера. Применение специальных видов прозрачных носителей объекта и формирование на их поверхности ребристой структуры удорожает процесс диагностики. Кроме того, введение в структуру устройства дорогостоящих механизмов поворота угла освещения, под управлением компьютера с помощью специализированного программного обеспечения, также значительно удорожает и усложняет конструкцию.
Наиболее близким к изобретению является устройство, описанное в заявке [7]. Устройство предназначено для контроля реакции гибридизации в режиме реального времени. Устройство использует терморегулируемую ячейку 9×9 мм с возможностью ее освещения под углом от 45 до 135 градусов. Ячейка установлена в терморегулятор, который управляется от отдельного устройства. К недостатку устройства относится малые размеры реакционной ячейки, а также недостаточно высокую интенсивность возбуждающего света около 15 мВ и большую неравномерность освещения, которую компенсируют с помощью от 2 до 4 лазеров, освещающих поверхность ячейки перпендикулярно к поверхности или под углом с боковой стороны.
К недостатку указанного изобретения относится недостаточно высокий уровень полезного сигнала и малое отношение сигнал-шум, которые связаны с особенностью конструкции устройства, поскольку устройство не содержит поглотителей отраженного света.
Анализ уровня техники показал, что существует необходимость в разработке простого и надежного устройства для работы с прозрачными реакционными емкостями, выполненными в виде разборных ячеек, герметичных ячеек, кювет или микроплашек или биочипов с герметичным объемом, с обеспечением процесса in-situ, при работе с гомогенными растворами в разных температурных диапазонах для проведения гибридизации и/или ПЦР.
Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание устройства с простой оптической системой, но с большим уровнем сигнала и высоким соотношением сигнал шум при измерении флюоресценции или люминесценции в процессе проведения ПЦР и/или гибридизации в режиме реального времени.
Другой задачей является повышение эффективности съема сигналов флюоресценции или люминесценции за счет построения оптической системы, позволяющей формировать освещение максимально большого рабочего поля реакционной емкости без применения сложных механических устройств и перемещения образца в процессе съема данных.
В рассматриваемом изобретении возможность увеличения уровня детектируемого флюоресцентного сигнала осуществляется за счет установки дополнительной подложки со светоотражающей поверхностью, которая расположена на лицевой поверхности терморегулятора, на которую устанавливают заднюю поверхность реакционной емкости перпендикулярно оптической оси приемного устройства. Отражающая поверхность преобразует падающий световой поток и обеспечивает двойное прохождение светового луча через прозрачный гомогенный раствор, в котором размещен исследуемый объект, что позволяет увеличить уровень измеряемого сигнала.
Одним объектом настоящего изобретения является устройство для диагностики жидких сред в процессе амплификации и/или гибридизации, содержащее оптическую приемную систему, регистрирующую и управляющую системы, первый и второй осветители, размещенные на держателях, источник питания, терморегулирующий блок с управляющей системой регулирования температуры реакционную емкость, причем терморегулирующий блок дополнительно содержит подложку с нанесенным на нее светоотражающим слоем, которая закреплена на лицевой рабочей поверхности терморегулирующего блока, с помощью термопроводящего клеевого покрытия с возможностью замены типа светоотражающего слоя, причем подложка выполнена из металла, а светоотражающий слой выполнен из зеркального или световозвращающего покрытия и расположен на расстоянии от 0,3 мм до 10 мм от рабочей поверхности реакционной емкости, причем рабочая поверхность терморегулирующего блока перпендикулярна оптической оси оптической системы и установлена с возможностью поворота на 90 градусов вместе с оптической системой для заполнения ячеек, плашек или биочипов и для проведения ПЦР как в горизонтальном, так и в вертикальном положении. При этом терморегулирующий блок дополнительно снабжен крышкой, с возможностью вывода ее из оптической траектории оптической системы при регистрации флюоресценции.
Следующим объектом изобретения является реакционная емкость, которая выполнена в форме открытой или герметичной ячейки, или биочипа, оснащенного крышкой или планшеты оснащенной крышкой или выполнена из двух биочипов, установленных через прокладку рабочими поверхностями друг к другу, причем прокладка выполнена из герметика или гибкого слоя, снабженного двухсторонним клеевым покрытием. Возможен вариант, в котором реакционная емкость выполнена из ячейки, в которой установлен биочип.
Следующим объектом изобретения является светоотражающий слой, который размещен на подложке и выполнен в виде сплошного или дискретно распределенного слоя, рабочие зоны которого совпадают с положением кластеров на биочипах или с рабочими зонами ячеек или плашек, причем подложка выполнена из алюминия или нержавеющей стали. Зеркальный слой выполнен из напыленного слоя на полированную металлическую поверхность подложки или выполнен из полимерного слоя, снабженного с одной стороны зеркальным слоем, и с другой стороны термопроводящим клеевым покрытием. Световозвращающий слой выполнен из полимерного слоя, снабженного с одной стороны светоотражающим слоем и с другой стороны снабжен термопроводящим клеевым покрытием.
Перечень чертежей
Фиг.1 - Блок-схема устройства для гибридизации и/или ПЦР, подключенного к управляющей системе.
Фиг.2 - Фрагмент сечения ячейки с исследуемым образцом в комбинации с зеркальной отражающей поверхностью, размещенной на терморегулирующем блоке.
Фиг.3 - Фрагмент сечения ячейки с исследуемым образцом в комбинации со световозвращающей поверхностью, размещенной на терморегулирующем блоке,
Фиг.4 - Схема формирования коллимированного пучка света, где а) диаграмма направленности (индикатриса) излучения СИД; б) индикатриса излучения СИД, установленного в черном цилиндре; в) сечение держателя СИД.
Фиг.5 - Внешний вид элементов излучателей светового потока.
Фиг.6 - Схема конструктивного размещения узлов устройства.
Фиг.7 - Изображение кластеров, состоящих из 13 точек, при разных расстояниях от ячейки до зеркальной поверхности, где а) фотография без зеркальной поверхности; б) расстояние до зеркала 1,1 мм; в) расстояние до зеркала - 2,0 мм; г) расстояние до зеркала - 3,0 мм; д) расстояние до зеркала - 6,0 мм; е) расстояние до зеркала - 11,0 мм.
Структурная схема
Структурная блок-схема устройства приведена на фиг.1. Устройство состоит из оптической приемной системы (10), подключенной к входу регистрирующей и управляющей системы (80), первого (31а) и второго (31б) осветителей, терморегулируемого блока (90) и ячейки с исследуемым образцом (91). Первый (31а) и второй (31б) осветители, формируют световые потоки с углом конуса 2β. При этом оптические оси осветителей расположены под углом α к оптической оси (15) приемной системы (10), которая имеет угол сбора света γ. Падающий свет освещает терморегулируемую ячейку (91), в которой проходит реакция гибридизации и/или ПЦР в режиме реального времени. Терморегулируемая ячейка (91) установлена на рабочую часть терморегулирующего блока (90), который снабжен нагревательными элементами и элементом Пельтье (93). На горизонтальную часть рабочей поверхности блока (90) закреплена отражающая поверхность (93).
Оптическая система (10) состоит из первой (11) и второй (12) части, между которыми введен первый (14) светофильтр, и детектора (21). В регистрирующую и управляющую систему (80) входит компьютер (83) для сбора и обработки данных, поступающих от светочувствительного детектора (21), дисплей (81) для отображения данных, а также узел преобразования сигналов (82), вход которого подключен к выходу детектора (21), первый выход узла (82) подключен к компьютеру, а второй выход к источнику питания (84) для управления режимами работы осветителей (31), третий выход подключен к первому входу блока регулирования температуры (95), второй вход которого подключен к датчику температуры (94), причем первый выход блока (95) связан с нагревателем (96), а второй выход подключен к элементам Пельтье (93).
На фиг.2 представлен вариант, в котором приведено сечение фрагмента герметичной ячейки (91) и схема преобразования падающего света (22) при прохождении через ячейку, выполненную в виде кюветы с параллельными стенками. В ячейке размещены исследуемые образцы в виде кластеров (2) с зондами (1), на которые гибридизуются молекулы, снабженные флуоресцентными метками. Причем зеркальная отражающая поверхность расположена за задней стенкой ячейки на минимальном расстоянии L. Это расстояние может быть равно толщине защитного слоя отражающей поверхности, если ячейка располагается непосредственно на защитном слое. Это расстояние может быть равно расстоянию от задней поверхности ячейки до внешней поверхности зеркала (54), размещенного в выемке. Выемку заполняют теплопроводящим веществом в виде прозрачного геля, масла или через выемку пропускают поток воздуха или жидкости для осуществления быстрой смены температуры на поверхности ячейки. В общем случае это расстояние может лежать в диапазоне от 0,01 мм до 10,0 мм. С учетом минимальной толщины носителя, на котором могут быть иммобилизованы биомолекулы, расстояние от слоя биомолекул до отражающего слоя может лежать в пределах от 0,3 мм до 10 мм.
Согласно изобретению свет направляют под углом α (лежащим в диапазоне от (α-β) до (α+β) по отношению к оптической оси (15) к поверхности ячейки (91), в которой осуществляют реакцию амплификации или гибридизации. На фиг.2 показан световой поток (22), который излучает источник (31а). Падающий свет преломляется на нескольких границах раздела (45, 47, 49) между первой (44) и второй (48) стенками ячейки (91), жидкостью (46) и воздушной или жидкостной средой, находящейся в промежутке L. В растворе (46) осуществляется амплификация или гибридизация биомолекул, при которой увеличивается количество флуоресцентных маркеров, связанных с зондами (1), которыми снабжены кластеры (2) биомолекул. Возбужденные потоком (22) маркеры испускают поток флюоресценции S1, который фиксируется приемной оптической системой (10). Часть флуоресцентного потока, пройдя через прозрачную стенку ячейки (91) и отразившись от отражающей поверхности (54), возвращается в приемное оптическое устройство в форме потока флюоресценции S2. От отражающей поверхности (54) световой поток (22) вторично проходит через ячейку (91), вызывая следующий поток флюоресценции S3. Часть потока флюоресценции также отражается от зеркальной поверхности (54) и возвращается в оптическую систему в форме сигнала флюоресценции S4. Пучок света (23), прошедший через прозрачную ячейку (91), поглощается на поверхностях поглотителя (38), размещенного на лицевой поверхности источника света (31).
2
За счет двойного прохождения света через исследуемый раствор освещенность кластеров возрастает до двух раз. Общий сигнал флюоресценции, поступающий в оптическую систему (10), теоретически может быть в (1+k) раз больше (k - коэффициент отражения зеркала), чем в обычных схемах измерения флуоресценции в жидкостных устройствах для проведения реакции гибридизации и/или ПЦР.
Зеркальная поверхность (54) может быть выполнена в виде зеркала, непосредственно напыленного на полированную рабочую поверхность термоблока, в виде полированной металлической подложки (54), например, из алюминия или нержавеющей стали, прикрепленной к поверхности термоблока термопроводящим слоем (56). В других вариантах формирования отражающей поверхности, зеркальная поверхность может быть защищена от повреждения прозрачными слоем, выполненным из тонкого слоя L стекла или полимера.
Для проведения реакции гибридизации и/или ПЦР, в том числе ПЦР в режиме реального времени, держатель ячейки (57) дополнительно снабжен нагревателем (58) и/или элементом Пельтье для того, чтобы осуществить регулирование температуры при реакции гибридизации или амплификации. Элемент Пельтье размещен между рабочей поверхностью терморегулируемого блока и радиатором, который охлаждается с помощью вентилятора (не показан). Возможны другие варианты терморегулирующих блоков, широко известных в области устройств для гибридизации и/или ПЦР.
Конструкция держателя ячейки, биочипа, плашки может быть снабжена крышкой, которая обеспечивает более высокое качество терморегулирования, и выполнять функции пассивного или активного термостатирования, для чего крышка может быть снабжена дополнительным регулятором температуры. При наличии непрозрачной крышки съем оптического сигнала осуществляется циклически после выведения крышки из траектории оптических сигналов в автоматическом или ручном режиме.
Зеркальная поверхность (54) может быть выполнена в виде отдельного узла или наклеена на рабочую зону терморегулирующего блока. При этом расстояние между задней поверхностью ячейки (49) и лицевой поверхностью отражающего слоя (54) выбирают минимально возможным в диапазоне от 0,01 мм до 10,0 мм.
Оптическую схему установки с использованием зеркала легко представить, если вместо него поместить сзади чипа мнимые источники света, эквивалентные действительным (светящиеся кластеры и осветители), симметрично относительно поверхности зеркала. Реальные кластеры всегда изображаются на картинке резко. Так как мнимое их изображение находится за зеркалом (на удвоенном расстоянии между передней поверхностью чипа и зеркалом), оно будет расфокусировано тем больше, чем дальше находится зеркало от поверхности с иммобилизованными кластерами.
Так как мнимые источники удаляются по мере перемещения зеркала, суммарная регистрируемая яркость кластеров уменьшается, что демонстрируют данные табл.1 в примере 1. Очевидно, что зеркало следует располагать на минимально возможном расстоянии от иммобилизованных кластеров чипа.
На фиг.3 представлен фрагмент сечения ячейки (91), выполненной в виде кюветы с параллельными стенками, расположенной над световозвращающей отражающей поверхностью (59), размещенной на поверхности рабочей зоны терморегулирующего блока на расстоянии L от задней поверхности ячейки. Световозвращающее покрытие позволяет возвратить световой поток, который попадает внутрь треугольных призм, стеклянных шариков или других световозвращающих структур. Один из падающих потоков (22) света, например от второго источника (316), преломляется на внешней (42) и внутренней (45) поверхности верхней стенки (44) ячейки (91) и проходит через гомогенный раствор (46), в котором помещен исследуемый образец с зондами (1), возбуждая флуоресценцию образца. Далее поток преломляется на внутренней (47) и внешней (49) поверхности нижней стенки кюветы (91) и, пройдя через промежуток L, световой поток попадает на световозвращающую поверхность (59). За счет полного внутреннего отражения происходит преломление хода пучка света внутри световозвращающих элементов, после чего поток возвращается и падает на обратную сторону (49) нижней стенки (48) ячейки (91), и далее, пройдя слой раствора и верхнюю стенку кюветы, возвращается на гасящую поверхность (38) источника света (31).
Падающий поток (22) вызывает поток флуоресценции R1, отразившись от световозвращающей поверхности (59) отраженным потоком (28), вновь вызывает поток флуоресценции R1 образца. В свою очередь, сигнал флуоресценции от первого R1 и второго R2 потоков проникает через прозрачный носитель (48) и, отразившись от световозвращающего слоя (59), возвращается через прозрачные носители (44, 48) третьим R3 и четвертым R4 сигналами. Таким образом, общий сигнал, равный сумме потоков Rсум.=R1+R2+R3+R4, поступающий в оптическую систему (10), теоретически может быть в четыре раза больше, чем в обычных схемах сканеров флуоресценции.
Однако с учетом поглощения и рассеяния света на носителе образца и с учетом эффективности работы световозвращающей поверхности, которая снижается при увеличении угла наклона α падающего потока (22), данное техническое решение позволяет обеспечить возврат светового потока через заднюю поверхность (49) носителя (91) и повысить дополнительную освещенность объекта не в четыре раза, как в случае с зеркалом, а от двух до трех раз, в зависимости от типа световозвращающего материала и величины угла наклона α. Следует отметить, что световозвращающее покрытие существенно дешевле зеркального.
В качестве световозвращающего слоя предпочтительно использовать световозвращающие материалы, выполненные в виде панелей, листов или пленок, снабженных клеевым покрытием.
Известно применение световозвращающих элементов в изготовлении световозвращающих панелей [16] и световозвращающих элементов, выполненных в форме листа [17]. Известны гибкие световозвращающие материалы, которые содержат световозвращающую структуру с плоской лицевой поверхностью и с множеством расположенных на ее тыльной поверхности основных и дополнительных световозвращающих элементов [18].
Наиболее предпочтительно использовать в качестве световозвращающих материалов покрытия, разработанные фирмой 3М [19]. Фирма предлагает широкий спектр мультислойных световозвращающих покрытий, которые выполнены с применением сфер [20], микроструктурированных поверхностей [21-23].
Наиболее перспективны световозвращающие пленки алмазного типа. Например, пленка серии 3990 VIP фирмы 3М представляет собой материал на основе микропризм, которые обеспечивают более высокую световозвращающую способность. Пленки с нанесенным световозвращающим слоем снабжены самоклеящим составом и наклеиваются при комнатной температуре. Наиболее продолжительный срок службы достигается при наклейке на предварительно подготовленную алюминиевую поверхность экрана.
Световозвращающая поверхность материалов, основанная на использовании кубических уголковых призм, изготавливается методом литья или формовки призматических элементов на нижней поверхности очень тонкой подложки. В зависимости от типа материала, на одном квадратном сантиметре поверхности размещается от 7300 до более чем 15500 призм [19].
Реакционная емкость (91) может быть выполнена в форме открытой или герметичной ячейки, или биочипа, оснащенного крышкой, или планшета, оснащенного крышкой. Реакционная емкость может содержать жидкостной вход и выход для введения реакционной смеси. Крышка реакционной емкости снабжена, по меньшей мере, одной прокладкой для герметизации объема.
Положение реакционной емкости (91) должно быть строго перпендикулярно оптической оси (15) устройства таким образом, чтобы рабочее пространство, на котором размещен исследуемый объект, располагалось внутри поля зрения АВ регистрирующей оптической системы (10), а рабочая поверхность совмещалась с передней фокальной плоскостью первой части (11) оптической системы (10). Возможна конструкция реакционной емкости, выполненной из двух биочипов, установленных лицом друг к другу через прокладку, выполненную из герметика или гибкой ленты, снабженной двухсторонним клеевым покрытием или, из комбинации герметика и ленты.
Рабочий объем реакционной емкости или, по меньшей мере, одна внутренняя сторона емкости может быть снабжена слоем иммобилизующего материала, который выбирают из группы, состоящей из прозрачного геля, прозрачных капсул, прозрачных полых волокон, прозрачных мембран, твердых прозрачных носителей. В качестве прозрачного носителя можно использовать стекло или полимеры, например ППМА. Иммобилизирующие материалы должны обладать возможностью иммобилизации зондов или должны быть снабжены модифицирующим слоем для иммобилизации биомолекул.
Иммобилизирующий слой может занимать все рабочее поле рабочего объема или может быть выполнен в виде дискретно-распределенного слоя, в виде нескольких рабочих зон, на которых размещают кластеры с зондами. Один из вариантов может включать установку в объем реакционной емкости прозрачного твердого носителя, выполненного в виде биочипа на стеклянном или полимерном носителе.
В свою очередь, отражающий слой может быть расположен под всей рабочей поверхностью реакционной емкости или занимать или быть выполнен в виде дискретных зон, форма которых может быть выбрана из прямоугольника, квадрата, круга, треугольника, многоугольника. Положение дискретных отражающих зон должно совпадать с положением отдельных кластеров или группы кластеров с зондами на расстоянии, обеспечивающем световозвращающий принцип прохождения оптических сигналов, и с учетом типа носителя в форме биочипов, плашек, ячеек.
Устройство позиционирования и крепления носителей объектов исследования (на фиг.1 не показано) должно быть выполнено с возможностью смены разных типов носителей в форме ячейки, биочипа с реакционной емкостью или плашки.
Оптическая система
Поле зрения АВ на рабочей поверхности носителя (91) (см. фиг.1) освещается с помощью двух одинаковых, симметрично расположенных относительно оптической оси (15) устройства, источников возбуждающего излучения (31а, 31б). Конструкция держателей осветителей выполнена с возможностью ручной или автоматической смены осветителей.
В устройстве реализован принцип темнопольного освещения. Оптическая ось (16а, 16б) осветителей составляет острый угол α с оптической осью (15) устройства, при этом выполняется соотношение (α-β)>γ/2. В этом случае возбуждающее излучение (в том числе зеркально отраженное от объекта) не попадает в оптическую систему (10).
Угол α и расстояние от осветителей (31а, 31б) до исследуемого объекта можно менять в процессе юстировки устройства для улучшения равномерности освещения. На фиг.1 пунктиром показаны крайние лучи AD и ВС, собираемые регистрирующей оптикой. При поглощении возбуждающего излучения молекулы флуорохрома, связанные с объектом, флуоресцируют. Свет флуоресценции собирается первой частью (11) оптической системы (10), имеющей числовую апертуру NA=sin(γ/2). Входной люк CD ограничивает поле зрения оптической системы. На ее выходе имеет место телецентрический ход лучей, т.к. рабочая поверхность объекта совмещена с фокальной плоскостью первой части (11) оптической системы. Формирование телецентрического хода лучей необходимо для корректной работы первого интерференционного светофильтра (14). Далее свет проходит через полосовой интерференционный светофильтр (14), спектральные характеристики которого выбираются таким образом, чтобы с одной стороны пропустить максимум полезного сигнала (света флуоресценции метки), а с другой - обеспечить минимум проникновения паразитного фонового света на детектор (21).
Последнее условие обеспечивается, в основном, тремя факторами: а) минимальным проникновением возбуждающего света в канал регистрации. На этот фактор влияют угол падения пучка возбуждающего света α, угол расходимости пучка β, качество поверхностей объекта и зеркал (отсутствие паразитного рассеяния света), общее поглощение возбуждающего излучения внутри прибора, б) минимальным интегралом перекрывания спектров пропускания возбуждающего (32а, 32б) и регистрирующего (14) светофильтров, а также способностью светофильтра (14) подавлять возбуждающее излучение; в) минимальной собственной флуоресценцией материала носителя (91) объекта и светофильтра (14) в полосе пропускания светофильтра (14). Конструкция устройства позволяет менять светофильтры (14) в ручном или автоматическом режиме. Свет, прошедший через светофильтр (14), собирается второй частью (12) оптической системы, в задней фокальной плоскости которой находится фоточувствительный слой матрицы светочувствительных элементов (21), например ПЗС-матрицы. Заметим, что размер поля зрения АВ связан с размером изображения А'В', формируемого на поверхности матрицы, соотношением AB=A'B'x(F1/F2), где F1 - фокусное расстояние первой части (11) оптической системы, a F2 - фокусное расстояние второй части (12) оптической системы. Параметры оптических систем выбираются таким образом, чтобы изображение А'В' полностью заполняло матрицу (21), входное отверстие PQ второй части (12) оптической системы равнялось выходному отверстию КМ первой, а числовые апертуры были максимально большими.
Светочувствительные элементы матрицы (21) преобразуют световой сигнал в электрический. Далее этот сигнал считывается, преобразуется линейным образом, оцифровывается и передается электронным устройством (82) в компьютер (83), на дисплее (81) которого формируется изображение рабочей области объекта.
Первая 11 и вторая 12 части оптической системы (10) представляют собой высококачественные оптические системы (объективы) с высоким светопропусканием, свободные в значительной степени от геометрических и хроматических аберраций. Хроматические аберрации в меньшей степени способны влиять на точность измерений, т.к. оптика работает в квазимонохроматическом свете, выделяемом светофильтром 14. Неточность фокусировки, возникающая при смене длин волн, не сказывается на работе, т.к. глубина резкости оптической системы достаточно велика (порядка 0,5-0,7 мм).
Среди прочих характеристик объективов можно выделить: разрешающую способность, коэффициент передачи контраста, коэффициент интегрального и спектрального пропускания света, коэффициент светорассеяния, падение освещенности по полю изображения.
Большинство известных оптических систем для формирования первой части оптической системы (11) используют короткофокусные объективы с небольшим рабочим отрезком. Это приводит к сокращению пространства между первой частью (11) оптической системы и поверхностью носителя (91) объекта исследования. Сокращение пространства создает проблемы с формированием освещения рабочей зоны. В известном патенте RU 2182328 [15] в одном из вариантов устройства держатели осветителей устанавливают непосредственно на объектив. Такое решение не позволяет включать между первой частью оптической системы и поверхностью носителя образца вспомогательные элементы, например конструкции держателей ячеек или нагреватели ячеек для регистрации процессов в режиме реального времени.
В предлагаемом устройстве в качестве первой части (11) оптической системы (10) использован объектив с большим фокусным расстоянием, что позволяет расширить размеры рабочей области. Размер рабочей области объекта можно варьировать в широких пределах (например, от 10 до 90 мм) в зависимости от выбранного соотношения F1/F2. В качестве первой части (11) оптической системы целесообразно использовать проекционный или фотографический пленочный объективы, серийно выпускаемые промышленностью. Важными параметрами являются фокусное расстояние, рабочий отрезок, линейное поле зрения, числовая апертура, входной и выходной люки. Например, фокусное расстояние F1 фото- и проекционных объективов может меняться от 50 до 110 мм, апертура от 0,17 до 0,26, поле зрения от 36×24 мм до 90×60 мм, рабочий отрезок от 45 до 95 мм.
Рабочий отрезок (расстояние от первой линзы до фокальной плоскости) объектива 11 должен быть достаточно большим, чтобы не препятствовать прохождению света от осветителей. Разрешение первой оптической системы должно быть не менее 20 линий на 1 мм.
В качестве второй оптической системы целесообразно выбирать объектив, специально рассчитанный на работу со светочувствительными матрицами, например ТВ-объектив или объектив цифровой камеры. Достаточно использовать объектив с фиксированным фокусным расстоянием (монофокальный) и с ручной установкой диафрагмы. ТВ-объективы целесообразно использовать с фокусным расстоянием F2 от 25 до 12 мм, рассчитанными на матрицу 2/3" или 1/2". ТВ-объективы необходимо выбирать с высоким разрешением («мегапиксельные»), предназначенные для машинного зрения (минимум геометрических аберраций).
Используемый объектив должен быть рассчитан на работу с матрицей определенного размера. Однако он может использоваться и с матрицами меньшего размера. Например, объектив, имеющий маркировку 2/3 "может также работать с матрицами 1/2", 1/3" и т.д. В настоящее время выпускается широкая номенклатура монохромных ПЗС и КМОП-матриц с типоразмерами от 1/6" до 1,8" и более. Наиболее употребительными являются размеры 1/3" (диагональ 6 мм), 1/2" (диагональ 8 мм) и 2/3" (диагональ 11 мм). Матрицы от 1" и более дороги, а матрицы 1/4" и менее имеют малый динамический диапазон и большие шумы.
Линейное увеличение, даваемое системой, равно Г=F2/F1. Поэтому фокусное расстояние ТВ-объектива выбирают исходя из размеров рабочей зоны объекта исследования, фокусного расстояния первого объектива и размеров матрицы. Важно, чтобы входной люк PQ второго объектива примерно равнялся выходному люку КМ первого объектива и светопропускающему диаметру интерфенционного светофильтра 14 (Все три примерно одинаковы).
6
8
Интерференционный светофильтр (32а, 32б) имеет полосу пропускания от 40 до 60 нм. Светофильтры 14 - от 30 до 50 нм. Очень важно, чтобы интеграл перекрывания спектров пропускания светофильтров был минимальным, т.к. от этого напрямую зависит соотношение сигнал-шум устройства. Фильтры, которые мы используем, имеют гарантированное ослабление света вне полосы пропускания, равное 10, а фактически 10 (данные производителя Semrock Inc., США). Эмпирически установлен критерий подбора пары фильтров 14-32 как отсутствие видимого свечения светоизлучающих диодов (СИД), оцениваемое визуально в темном помещении, при наложении светофильтра 14 на светофильтр 32 при включенном на максимальную мощность осветителе.
Используемые технические решения позволяют работать с ПЗС-матрицами без охлаждения.
Осветитель
Для того чтобы реализовать возможности сканирования больших поверхностей в простых оптических системах, необходимо добиваться максимальной равномерности освещенности объекта. Эта задача не является тривиальной. Существуют ограничения в использовании лазерных источников из-за резкой неравномерности плотности излучения по сечению лазерного пучка, а также ламп, формирующих широкий спектр светового потока, из-за необходимости введения в конструкцию элементов, которые увеличивают ее габариты и стоимость. Более предпочтительными в настоящее время являются осветители на основе матриц СИД, имеющих малую стоимость и габариты.
Известно применение СИД для создания флуоресцентных сканеров или микроскопа, ориентированного на сканирование биочипов [15, 24]. С помощью СИД возможно обеспечить освещение образца и возбуждение его флуоресценции для разных схем регистрации флуоресценции. Из-за малых размеров СИД их можно размещать рядом с объективом или в корпусе объектива, или использовать световоды для передачи возбуждающего света от удаленных источников света, или создавать освещение, падающее под углом к лицевой или к задней поверхности биочипа, или формировать пучок, который направлен перпендикулярно задней поверхности прозрачного твердого носителя [25].
При использовании интерференционной оптики в устройствах необходимо формировать параллельный пучок света. Эту проблему решают введением дополнительных коллимационных линз [26, 27], параболических рефлекторов [28], комбинаций щелевых экранов и цилиндрических линз [29], а также с помощью комбинаций матриц СИД с матрицами, состоящими из множества линз [30]. К недостаткам таких решений можно отнести дополнительное увеличение стоимости осветителей и увеличение количества конструктивных узлов.
В процессе разработки устройства было обнаружено, что смещение индивидуального СИД, имеющего цилиндрическую форму и сферическую или параболическую линзу на торце, относительно внешней поверхности держателя СИД внутрь цилиндрического отверстия, в которое установлен СИД, на глубину Н позволяет, в случае нанесения поглощающего слоя (36) на стенки отверстия, сформировать коллимированный пучок света без применения дополнительных линз или сложных конструктивных решений. Таким образом, устраняется часть паразитного фона, которая возникала бы при облучении поверхности объекта источником, рассеивающим свет на окружающие поверхности осветителя и держателя образца.
На фиг.4 представлена схема формирования коллимированного пучка с помощью черного цилиндра, выполненного в корпусе осветителя. На фиг.4а представлена диаграмма направленности (индикатриса) излучения СИД (34). На фиг.4б представлена индикатриса излучения СИД, установленного в черном цилиндре или в отверстии, сформированном в держателе (33) в соответствии с фиг.4в и снабженном поглощающим слоем (36). В устройстве используются СИД с собирающей линзой на торце, излучающий узконаправленный пучок света (угол расходимости β лежит в пределах от 4 до 7,5 градусов). Расстояние Н между лицевой поверхностью держателя СИД (33) и торцом СИД лежит в пределах от 1 до 5 мм, что обеспечивает формирование пучка светового потока, удовлетворяющего условию допустимой расходимости пучка, при котором угол β не превышает предельно допустимого угла, указанного в технических условиях эксплуатации используемого светофильтра (32) (обычно 5 градусов). Необходимо отметить, что в данном устройстве поглощается не более 10% излучаемого света.
На фиг.5 представлен один из вариантов конструкции осветителя (31), который включает, но не ограничивает объем изобретения. Каждый осветитель (31) состоит из основных элементов - светонепроницаемого кожуха (37), внутренние поверхности которого снабжены светопоглощающим слоем (38), интерференционного светофильтра (32) и держателя (33), в котором выполнены отверстия для крепления индивидуальных СИД (34), формирующих упорядоченный массив СИД, отверстия для крепления светофильтра (32) и кожуха (37).
Держатель (33) представляет собой металлическую пластину, в которой сформирован упорядоченный массив круглых сквозных отверстий, диаметр которых соответствуют диаметру СИД (предпочтительно 5,0 мм или 3,0 мм). Оси отверстий перпендикулярны передней поверхности держателя.
Существенным отличием технического решения, используемого в данном изобретении по отношению к известным схемам гашения паразитного фона [31-35], является включение поглотителей светового потока не в виде отдельных узлов, предназначенных для гашения отраженного сигнала от лицевой поверхности твердого носителя, а в виде слоя, нанесенного на лицевую поверхность держателя и кожуха СИД. Таким образом, компоненты, входящие в состав осветителя выполняют две независимые функции, тем самым снижая конструктивную сложность устройства.
Поглощающий слой (38а, 38б) может быть размещен на дополнительных элементах имеющих прямоугольную или квадратную форму. Поверхность элементов (38а, 38б) может быть выполнена в виде планарной, вогнутой цилиндрической или сферической формы. Предпочтительно чтобы размеры гасящего экрана превышали или были равны размерам светового пучка, отраженного от поверхности (42) носителя образца. В качестве поверхности, на которой размещен поглощающий слой, может выступать поверхность держателя (33), отверстий (36) и кожуха (37). Поглотитель света может быть выполнен в виде абсорбирующего покрытия (Харрис Д. и др., 2005), поглощающей краски или за счет химического чернения внутренней поверхности держателя СИД после выполнения в нем отверстий. В последнем случае держатель диодов выполняют из дюралюминия. В нем сверлят отверстия для установки светодиодов и затем чернят по известным технологиям. В общем случае поглощающий слой может быть выполнен на основе абсорбирующего материала, входящего в группу, состоящую из пленок, формируемых химическим способом, композиции, включающей носитель и диспергированный пигмент, полимерных или текстильных материалов, снабженных клеящим слоем.
Упорядоченный массив отверстий обладает свойствами поворотной симметрии 6-го или 4-го порядка (гексагональная или ортогональная упаковка). Благодаря этому достигаются максимальная плотность монтажа СИД и/или равномерность освещения. В отверстия плотно монтируются круглые СИД стандартного типоразмера (диаметром 5,0 мм или 3,0 мм). Металлический держатель (33) служит теплоотводящим элементом. Круглые отверстия позволяют в процессе изготовления осветителя поворачивать СИД относительно их продольной оси на произвольный угол, располагая их в совокупности так, чтобы обеспечить максимальную равномерность освещения рабочей области объекта.
Форма и размеры образованного таким образом массива СИД выбирается так, чтобы его (массива) проекция на плоскость объекта примерно соответствовала форме рабочей области исследуемого объекта. Массив СИД может образовывать форму круга, овала, прямоугольника, квадрата, многоугольника, треугольника. На фиг.5 приведен вариант выполнения массива в виде многоугольника с соотношением длины горизонтальной оси к длине вертикальной оси, составляющей 3/4. Форму массива выбирают с учетом размера и формы серийно выпускающихся интерференционных светофильтров. Светофильтр должен полностью покрывать все отверстия массива, не ограничивая свет. Предпочтительным являются светофильтры круглой формы, с внешними диаметрами 25 мм, 30 мм, 50 мм, как наиболее массово производимые и, следовательно, дешевые.
Светофильтр (32) плотно примыкает к передней поверхности держателя (33), располагаясь строго перпендикулярно продольным осям СИД. С этой целью держатель СИД имеет круглую проточку для точной фиксации светофильтра, являющуюся одновременно оптическим затвором, препятствующим боковому распространению света СИД.
Собранный таким образом осветитель является распределенным излучателем. Равномерность и интенсивность освещения зоны измерения возрастает за счет наложения световых пятен от каждого СИД. Применение двух симметрично расположенных осветителей повышает равномерность и мощность освещения.
Расстояние от осветителей (31а, 31б) до центра рабочей зоны АВ, в которой размещен исследуемый объект, выбирается таким образом, чтобы световое пятно, формируемое на поверхности объекта одним СИД, примерно соответствовало минимальному размеру освещаемой зоны.
Угол падения лучей α может меняться от 40 до 60 градусов и зависит от параметров (рабочего отрезка, числовой апертуры) первой части (11) оптической системы (10). Чем больше угол α, тем меньше расстояние от задней поверхности носителя объекта до экранов (компактнее конструкция), но тем меньше освещенность объекта.
Расстояние между осветителями (31а, 31б) и лицевой поверхностью носителя (42), а также угол α можно менять незначительно во время юстировки устройства. При этом оптические оси осветителей (16а, 16б) после настройки могут не проходить через центр объекта, сопряженный с оптической осью (15). Предпочтительное расстояние между осветителями (31а, 31б) и центром объекта исследования составляет порядка 70 мм при угле α=55° для объектов, размещенных на биочипах размером 26×76 мм.
Конструкция устройства выполнена с возможностью смены осветителей, предназначенных для возбуждения флуоресценции различных флуорохромов.
Полосовые интерференционные светофильтры (32а, 326) выделяют такой спектральный диапазон света, который необходим для возбуждения флуоресценции метки. Полоса пропускания может варьировать в пределах 30-50 нм.
Доминантные длины волн выпускаемых СИД УФ и видимого диапазона: 365÷375 нм; 405±5 нм; 475±5 нм; 505 нм; 525 нм; 565 нм; 575 нм; 595 нм; 625±5 нм; 660 нм; белый свет. Мощность излучения СИД выбирают в диапазоне от 10 до 25 мВт. СИД выбираются таким образом, чтобы их доминантная длина волны излучения попадала в полосу пропускания фильтра и максимально соответствовала максимуму спектра возбуждения флуорохрома. Использование массива СИД не только многократно повышает интенсивность возбуждающего света, но и значительно увеличивает равномерность освещения рабочей области объекта.
Таким образом, повышение отношения сигнал-шум за счет введения поглощающего слоя в конструкцию излучателя без дополнительного усложнения конструкция излучателя позволяет достичь поставленных задач.
Питание СИД.
Источник питания (84) позволяет осуществлять четыре режима питания СИД или их комбинацию.
1. Последовательное включение СИД и питание их высокостабильным током. Все диоды работают в одинаковых условиях.
2. Последовательное включение СИД и питание их стабильным по амплитуде импульсным током с ШИМ (широтно-импульсная модуляция). Амплитуда тока равна максимально допустимой для данного СИД согласно ТУ. Позволяет регулировать интенсивность света осветителя (31) не изменяя спектр свечения СИД.
3. Параллельное включение СИД и питание их стабильным током. Позволяет индивидуально подстраивать интенсивность свечения каждого СИД для улучшения равномерности освещения.
4. Параллельное включение СИД и питание их стабильным по амплитуде импульсным током с ШИМ позволяет как подстраивать свечение каждого СИД, так и регулировать светоотдачу осветителя (31).
Источник питания (84) содержит отключаемую электронную цепь синхронизации питания СИД с сигналом, управляющим длительностью работы электронного затвора светочувствительной матрицы (21) и формирует питающие напряжения (85 а-n), поступающие на источники света (31). Включение синхронизации позволяет питать СИД (освещать объект) только на короткое время экспозиции кадра (не более 10 с). При этом средний ток питания СИД может быть увеличен в несколько раз (до 4 раз), что, в свою очередь, примерно во столько же раз увеличивает интенсивность освещения объекта. Отключение синхронизации переводит работу осветителя в непрерывный режим, например, когда ведется непрерывный покадровый ввод изображений в компьютер.
Особенности объектов исследований
Для повышения чувствительности анализа важно, чтобы материал, из которого изготовлен объект, не флуоресцировал под действием возбуждающего излучения. В частности, при работе со стеклянными ячейками и кюветами целесообразно использовать возбуждающее излучение с максимумом в районе 625-635 нм.
В качестве носителя объекта исследования может выступать, по крайней мере, одна тонкая (толщина 1 мм) стандартная спектрофотометрическая кювета. В этом случае измеряется флуоресценция раствора объекта в кювете. В случае дифференциального способа измерения возможна установка кюветы сравнения. Носителем объекта может быть проточная кювета. Устройство может работать как ПЦР в реальном времени (Real Time PCR). В этом случае в качестве носителя объекта будет выступать специализированная камера ПЦР. Предлагаемое устройство может быть произвольно ориентировано в пространстве, например, с помощью штатива или зажимов осуществляющих возможность фиксации положения устройства относительно горизонтальной поверхности. В частности, оптическая ось 15 может располагаться в диапазоне до 90 градусов от горизонтальной до вертикальной плоскости. Это позволяет использовать как закрытые, так и открытые кюветы, ячейки, микроплашки.
Узел преобразования сигналов (82)
Узел преобразования сигналов (82) содержит схемы управления работой матрицы 21, производит аналого-цифровое преобразование сигнала яркости от каждой ячейки матрицы 21, задает параметры съемки (экспозицию кадра, усиление и т.д.), осуществляет взаимодействие с компьютером (прием и передачу данных) по заданному интерфейсу (например, шине USB), синхронизирует работу осветителей, управляя работой источников питания.
Конструкция устройства
На фиг.6 приведен пример размещения основных узлов устройства, который обеспечивает четырехкратное увеличение сигнала флуоресценции или люминесценции при проведении гибридизации и/или ПЦР. Устройство содержит оптическую систему (10), состоящую из первой (11) и второй (12) части, между которыми установлен первый (14) светофильтр, светочувствительный детектор (21), узел (82) для связи с регистрирующей и управляющей системой (80) (приведенной на фиг.1), первый (31а) и второй (31б) осветители, снабженные вторыми светофильтрами (32а, 32б), узел крепления (40) терморегулирующего блока (90), на котором имеется узел крепления (76) ячейки или кюветы или микроплашки (91), жидкостные входы которых размещены на элементе (77).
Проведение ПЦР в режиме реального времени
Для проведения ПЦР в режиме реального времени необходимо, чтобы терморегулирующий блок (90) обеспечивал возможность регулирования температуры в режиме создания температурных циклов, а также непрерывного или периодического освещения реакционной ячейки, в которой проходит ПЦР. Для упрощения конструкции термоблока, обеспечивающего термические циклы границы освещения, ограничиваются световым полем АВ (см. фиг.1). В варианте непрерывного освещения объекта [4, 6] эффективность проведения ПЦР достаточно низка из-за неравномерного прогрева зоны нагрева. Более эффективным вариантом является конструкция, в которой прогрев и охлаждение осуществляется с верхней и нижней стороны ячейки, а измерение результатов ПЦР проводится при выводе верхней непрозрачной крышки из зоны освещения верхней лицевой части ячейки. Следует отметить, что расположение элементов оптической системы и узлов крепления держателей терморегулирующего блока и устройства перемещения экрана на одной общей платформе (9) (см. фиг.6) позволяет устанавливать платформу под разными углами в диапазоне от 0 до 90 градусов по отношению к горизонтальной плоскости. Поворот платформы позволяет обеспечить применение открытых ячеек в условиях, когда платформа закреплена под углом 90 градусов в вертикальном положении, или загрузку реакционных блоков под углом в пределах от 60 до 35 градусов с целью исключения воздушных пузырьков при заполнении ячейки или работу устройства в горизонтальном положении, ориентированном на работу вертикальных ячеек и сдвоенных биочипов с вертикальной загрузкой.
Примеры
Ниже показан пример, который подтверждает возможности устройства. Приведено измерение зависимости яркости свечения кластеров, размещенных в ячейке, от расстояния между задней поверхностью ячейки и зеркалом.
Таблица 1Зависимость яркости свечения кластеров в ячейке толщиной 1,0 мм от расстояния между задней поверхностью ячейки и зеркалом, которое имеет коэффициент отражения света k=0,87
Условия регистрации
Расстояние от задней поверхности ячейки до зеркала (мм)
Среднее значение яркости свечения кластеров (усл. ед.)
Увеличение яркости
Без зеркала
-
41,8
1
1,1
143,6
3,44
2
123,6
2,96
С зеркалом
3
114,0
2,73
6
92,0
2,20
11
70,0
1,67
Проведенный эксперимент показывает, что приведенная в описании конструкция устройства позволяет работать не только с хорошими и дорогими зеркалами (при k>0,95), но и с зеркалами среднего качества (например, с k=0,87). В последнем случае снижение яркости по отношению к теоретически достижимой величине (для k=0,87), равной 3,5, составляет несколько процентов (измеренная величина увеличения яркости равна 3,44).
На фиг.7 представлены фотографии кластеров при различных расстояниях от рабочей поверхности ячейки до зеркала, при которых проводились измерения (столбец 2 табл. 1).
Как видно из результатов эксперимента даже при расстоянии в 11 мм яркость точек кластеров увеличивается в 1,67 раза.
Промышленная применимость
Устройство предназначено для регистрации флуоресценции молекул флуорохрома(ов), иммобилизованных в тонком слое гомогенного раствора, размещенного в ячейках или кюветах, или микроплатах для проведения реакции гибридизации и/или ПЦР, в том числе и при съеме данных в режиме реального времени.
Устройство имеет простую оптическую схему, недорого в изготовлении и может быть доступно для проведения пищевой, медицинской, ветеринарной диагностики, в криминалистике и в определении параметров окружающей среды в небольших лабораториях.
Дополнительно устройство может работать в качестве флуориметра. Например, измерять концентрацию ДНК, белка и т.д. в растворе или контролировать количество выделенной ДНК, наработанной в ходе ПЦР и т.д.
Устройство позволяет проводить кинетические измерения с характерными временами, зависящими от быстродействия электронного устройства 82 (типично 0,1 с). Для этого используется режим непрерывного ввода изображений (например, видеопотока) с последующей обработкой каждого кадра.
Устройство может работать в произвольной ориентации в пространстве, т.к. объект фиксируется в устройстве позиционирования.
Устройство, созданное согласно изобретению, обладает рядом значительных преимуществ по сравнению с известными решениями. Оно имеет очень простую конструкцию, не предъявляет высоких требований к применяемым оптическим компонентам и, что особенно важно, не ставит никаких специальных условий для ввода излучения возбуждения флуорохрома и/или вывода флуоресцентного излучения. Кроме того, устройство позволяет проводить всевозможные биохимические исследования, а изготовление основных узлов устройства не требует высоких затрат, поэтому даже одноразовое использование, по меньшей мере, его отдельных деталей является возможным.
Литература:
1. Peukert M. et al. Apparatus for measuring in particular luminescent and/or fluorescent radiation. US Patent 6949754 (September 27, 2005).
2. Modlin D. et al. Multi-mode light detection system. US Patent 6825921 (November 30, 2004).
3. Montagu J. et al. Reading of fluorescent arrays. US Patent Appl. 20060127946 (June 15, 2006).
4. Bickel R. et al. Device for the amplification and detection of nucleic acids. US Patent Appl. 20060078929 (April 13, 2006).
5. Джоунз К. Теплообменное устройство для луночных планшетов, содержащих образцы. Патент RU 2272978 (2006.03.27).
6. Gambini M. et al. Instrument for monitoring polymerase chain reaction ofDNA. US Patent 7008789 (March 7, 2006).
7. Remade J. et al. Real-time quantification of multiple targets on a micro-array. US Patent Appl. 20060105354 (May 18, 2006).
8. Mueller G. et al. Microscope for reflected-light and transmitted-light microscopy. US Patent 7081994 (July 25, 2006).
9. Yokokawa N. et al. Method and apparatus for reading fluorescence. US Patent 6646271 (November 11, 2003).
10. iCycler iQTM Real-Time PCR Detection System. Instruction Manual. Catalog Number 170-87-40 (http://www.biorad.com).
11. Introducing a new generation of affordable choices from the leader in real-time PCR. Instruction Manual. 7300/7500 Real-Time PCR System (http://www.appliedbiosystems.com).
12. Trulson M. et al. Method and apparatus for imaging a sample on a device. US Patent Appl. 20050281708 (December 22, 2005).
13. Montagu J.I. et al. Excitation and imaging of fluorescent arrays. US Patent 7154598 (December 26, 2006).
14. Karasawa M. Dark field illumination device. US Patent Appl. 20040252372 (December 16, 2004).
15. Барский В.Е и др. Флуоресцентный микроскоп. Патент RU 2182328 (2002.05.10).
16. Велигдан Д. Светоперенаправляющая панель. Заявка RU 2001104428 (2003.04.10).
17. Араки Й. Светоизлучающий световозвращающий лист и способ его изготовления. Патент RU 2204154 (2003.05.10).
18. Молохина Л. и др. Гибкий световозвращающий материал. Патент RU 2183336 (2002.06.10).
19. 3М Diamond Grade VIP Reflective Sheeting Series 3990. Техническое описание фирмы Minnesota Mining and Manufacturing (3М) Product Bulletin 3990 November 2003 (http://multimedia.mmm.com/).
20. Mori Y. Retroreflective sheet comprising microspheres, the diameter and refractive index of which being specifically related to the refractive indices of layers directly in contact therewith. US Patent 5962121 (October 5, 1999).
21. Smith К. et al. Cube corner cavity based retroreflectors with transparent fill material. US Patent Appl. 20010033907 (October 25, 2001).
22. Smith К. et al. Flexible cube-corner retroreflective sheeting. US Patent Appl. 20020126382 (September 12, 2002).
23. Smith К. Retroreflective sheeting having high retroreflectance at low observation angles. US Patent Appl. 20070081245 (April 12, 2007).
24. Yershov G. et al. Biochip reader with enhanced illumination and bioarray positioning apparatus. US Patent 6620623 (September 16, 2003).
25. Douglas-Hamilton D. et al. Motility scanner and method. US Patent 4896967 (January 30, 1990).
26. Hart S. Light emitting diode (LED) array for excitation emission matrix (EEM) fluorescence spectroscopy. US Patent 6985224 (January 10, 2006).
27. Panagotacos G. et al. Illuminator assembly. US Patent 7163318 (January 16, 2007).
28. Stopa J. et al. Led light assembly. US Patent Appl. 20030156416 (August 21, 2003).
29. Tsikos С. et al. Planar LED-based illumination array (PLIA) chips. US Patent 6959870 (November 1, 2005).
30. Lee К. LED package, display panel, illumination system and projection system employing the same. US Patent Appl. 20060146297 (July 6, 2006).
31. Chhibber R. et al. Method and apparatus for illuminating a substrate during inspection. US Patent Appl. 20050146719 (July 7, 2005).
32. Xu J. et al. Defect review system and method. US Patent Appl. 20050094136 (May 5, 2005).
33. Engelhardt J. et al. Optical system in the ray path of a confocal fluorescence microscope. US Patent 6785302 (August 31, 2004).
34. Ince С. System and method for imaging the reflectance of a substrate. US Patent Appl. 20060241364 (October 26, 2006).
35. Rao N. et al. Optical method and apparatus for inspecting large area planar objects. US Patent Appl. 20020088952 (July 11, 2002).
36. Харрис Д. и др. Композиция покрытия, поглощающего УФ излучение. Заявка RU 2003133667 (2005.05.10).