Влияние регуляторов роста на клеточную культуру Silene vulgaris и на химические характеристики продуцируемых ею полисахаридов

Химия растительного сырья. 2001. №2. С. 57-62.

УДК: 577.114:581.143.6:577.175.1

ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА КЛЕТОЧНУЮ КУЛЬТУРУ SILENE VULGARIS И НА ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРОДУЦИРУЕМЫХ ЕЮ ПОЛИСАХАРИДОВ

© Е.А. Гюнтер', Ю.С. Оводов

Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, ул. Первомайская, 50, Сыктывкар, 167982 (Россия) e-mail: elena@physiol. komisc. ru

Целью данной работы было изучение влияния экзогенных фитогормонов на рост каллуса Silene vulgaris (M.) G. и на химические характеристики продуцируемых им полисахаридов.

В результате нами разработан биотехнологический подход к получению растительных полисахаридов с использованием культуры ткани Silene vulgaris. Показано, что полисахариды, выделенные из каллусной культуры

S. vulgaris, культивированной в присутствии различных регуляторов роста, представляют собой кислый арабиногалактан и пектин. Полисахариды обладают идентичным качественным моносахаридным составом и имеют некоторые отличия в соотношении моносахаридных остатков. Регуляторы роста оказывают большее влияние на рост клеточной культуры S. vulgaris, чем на биосинтез полисахаридов.

Исследование поддержано грантом №00-04-48063 РФФИ и грантом №8.1.13 Научного совета "Химия и технология переработки возобновляемого растительного сырья".

Введение

В настоящее время клеточная биология представляет значительный интерес в области поиска и получения новых биологически активных соединений. Подобно нативным растениям клеточные культуры синтезируют широкий спектр полисахаридов, таких как пектины, арабиногалактаны, галактаны, арабинаны, ксилоглюканы и т.д. [1, 2]. Культура растительных клеток, имея ряд преимуществ перед традиционным сырьем (отсутствие организменного контроля, независимость от климатических условий, возможность оптимизации и стандартизации процессов, гомогенность системы), служит удобной модельной системой для изучения структуры и биосинтеза полисахаридов. Кроме того, культуры клеток и тканей в перспективе могут иметь практическое значение для получения физиологически активных полисахаридов.

Ранее нами была получена каллусная культура смолевки обыкновенной (Silene vulgaris (M.) G.), выделены арабиногалактан и пектиновый полисахарид из каллуса и выявлена их иммуномодулирующая активность в отношении усиления фагоцитоза [3, 4].

В настоящее время изучается влияние различных факторов на рост культур клеток и биосинтез полисахаридов. В ряде работ было показано, что различные ауксины влияют на биосинтез пектинов, арабиногалактанов и ксилоглюканов как компонентов полисахаридов клеточных стенок [5, 6]. Однако

* Автор, с которым следует вести переписку.

это направление требует дальнейшего детального исследования с целью использования клеточных культур для направленного продуцирования физиологически активных полисахаридов.

В связи с этим целью данной работы было изучение влияния экзогенных фитогормонов на рост каллуса смолевки и на химические характеристики продуцируемых им полисахаридов.

Результаты

Были проведены эксперименты по выяснению значимости экзогенных ауксинов и цитокининов для роста культивируемой каллусной ткани S. vulgaris. На среде, не содержащей регуляторов роста, каллусная ткань имеет незначительный прирост сухой биомассы 5.6 г/л, как и на среде с одним цитокинином 6-бензиламинопурином (БАП), где прирост сухой биомассы составляет 8.3 г/л (рис. 1А). На среде только с аксином 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) наблюдали значительное увеличение роста каллуса до 12.9 г/л. При сочетании ауксинов и цитонининов также показано значительное улучшение роста (рис. 2А).

При добавлении в среду различных цитонининов в концентрации 0.5 мг/л в сочетании с 1.0 мг/л 2,4-Д наблюдали достоверное снижение интенсивности роста каллусной ткани в вариантах с кинетином и зеатином по сравнению с БАП (рис. 1А).

Рис. 1. Влияние цитокининов на рост каллуса Рис. 2. Влияние ауксинов на рост каллуса Silene Silene vulgaris (А) и на биосинтез полисахаридов vulgaris (A) и на биосинтез полисахаридов (В).

(В).

Из каллусной культуры смолевки экстракцией водой и раствором оксалата аммония выделены кислый арабиногалактан и пектин. В составе кислого арабиногалактана содержатся в качестве основных составляющих остатки галактозы и арабинозы. Кроме них, в гидролизате полисахарида обнаружены уроновые кислоты, а также в небольших количествах рамноза, манноза, ксилоза, глюкоза (табл. 1, 2). В состав углеводной цепи пектина входят остатки галактуроновой кислоты (60-80%), галактозы, арабинозы, рамнозы, глюкозы, маннозы, ксилозы, среди которых первые четыре являются основными (табл. 1 , 2). Исключение составляет полисахарид из каллуса, культивированного на среде только с ауксином 2,4-Д, где, наряду с арабинозой и галактозой, содержится большое количество глюкозы.

Выходы кислого арабиногалактана и пектина из каллуса, культивированного на средах без фитогормонов, в присутствии только ауксина (2,4-Д) или одного цитокинина (БАП), и в присутствии сочетаний различных ауксинов с цитокинином изменялись незначительно (рис. 1В, 2В). Достоверных отличий по сравнению с контролем (2,4-Д + БАП) не отмечено. Выход кислого арабиногалактана составляет в среднем 3-4% от сухой массы, пектина - 8-12%.

Таблица 1 . Характеристика полисахаридных фракций, выделенных из каллуса Silene vulgaris, культивированного в присутствии различных ауксинов

Ауксины 2,4-Д 2,4-Д+БАП ИУК+БАП НУК+БАП ИМК+БАП

Фракция I II I II I II I II I II

Содержание, %

Белок 17 7 17 12 25 13 23 12 23 7

Гликуроновые кислоты 11 75 9 75 9 76 8 73 8 82

Рамноза 1.9 1.2 6.2 1.8 2.9 1.0 2.6 1.0 2.3 1.4

Арабиноза 7.7 1.7 7.4 2.6 7.4 1.3 6.8 1.1 8.1 2.2

Ксилоза 3.3 0.7 4.0 0.5 3.2 0 4.4 0.2 3.8 0.5

Манноза 2.5 3.7 3.0 0.7 3.3 0.9 3.4 0.7 2.2 0.8

Глюкоза 5.1 7.9 8.3 1.7 4.4 1.3 6.0 0.5 6.4 0.8

Галактоза 46.6 3.0 38.8 3.1 48.3 2.9 45.4 1.5 39.1 5.5

Таблица 2. Характеристика полисахаридных фракций, выделенных из каллуса Silene vulgaris, культивированного в присутствии различных цитокининов

Цитокинины БАП 2,4-Д+БАП 2,4-Д+ кинетин 2,4-Д+ зеатин

Фракции I II I II I II I II I II

Содержание (%): Белок 27 7 26 24 17 12 20 25 17 10

Уроновые кислоты 9 79 8 60 9 75 12 66 10 77

Рамноза 2.8 1.4 1.7 1.1 6.2 1.8 2.6 1.3 3.0 1.2

Арабиноза 8.8 2.0 6.8 2.3 7.4 2.6 9.9 2.0 9.6 2.1

Ксилоза 4.0 1.1 2.7 0 4.0 0.5 3.9 0.4 4.0 1.0

Манноза 2.8 1.4 3.0 1.0 3.0 0.7 2.2 0.5 4.0 1.5

Глюкоза 5.7 1.6 4.2 1.3 8.3 1.7 3.3 0.6 6.6 2.7

Галактоза 35.0 5.1 34.7 4.3 38.8 3.1 41.3 2.5 44.7 3.2

Изучение влияния различных цитокининов на биосинтез полисахаридов показало, что присутствие кинетина достоверно увеличивает выход кислого арабиногалактана по сравнению с контролем (2,4-Д + БАП) до 5.6%. Достоверного влияния различных различных цитокининов на выход пектина по сравнению с контролем не выявлено. Выход пектина составляет 1 0-11% (рис. 1В).

В таблицах 1 и 2 приведены аналитические данные полисахаридных фракций. При одинаковом качественом моносахаридном составе образцы кислого арабиногалактана из каллуса, культивированного в присутствии различных сочетаний ауксинов и цитокининов в среде, отличаются по соотношению моносахаридов, входящих в их состав. Это характерно и для образцов пектинового полисахарида. На средах без гормонов, с одним ауксином или с одним цитокинином в кислых арабиногалактанах, выделенных из соответствующих образцов каллуса, обнаружены следующие соотношения моносахаридных остатков Rha і Ara і Xyl і Man і Glc і Gal - i і 3 і i і i і 2 і 13; 1 і 4 і 2 і 1 і 3 і 24 и 1 і 4 і 2 і 2 і 3 і 21 соответственно. В присутствии различных ауксинов соотношения моносахаридных остатков были следующими а) на среде с 2,4-Д+БАП 2 і 3 і i і i і 3 і i3; b) на среде с ИУК+БАП i і 3 і 1 і 1 і 2 і 17; с) на среде с НУК+БАП 1 і 3 і 2 і 1 і 2 і i8; d) на среде с ИМК+БАП 1 і 4 і 2 і 1 і 3 і 18. На средах с кинетином и зеатином эти соотношения были как 1 і 5 і 2 і 1 і 2 і 1 9 и 1 і 3 і 1 і 1 і 2 і 1 5 соответственно. В среднем соотношение галактозы и арабинозы (Gal/Ara) в арабиногалактане составляет 4-5, тогда как при добавлении в среду ИУК соотношение было около 8. Содержание гликуроновых кислот составляет 8-11%. Соотношение Gal/Ara в пектине было около 2, содержание гликуроновых кислот оказалось близким в присутствии различных гормонов (табл. 1 , 2).

Экспериментальная часть

Условия культивирования каллусной культуры. Каллусная культура смолевки обыкновенной была получена, как описано ранее [3]. Каллус культивировали на модифицированной среде Мурасиге и Скуга [7] с добавлением различных ауксинов и цитокининов. В экспериментах были использованы такие ауксины, как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), индолилуксусная кислота (ИУК), нафтилуксусная кислота (НУК), индолилмасляная кислота (ИМК) в концентрации 1.0 мг/мл при постоянной концентрации БАП 0.5 мг/л. Исследованы следующие цитокинины: 6-бензиламинопурин (БАП), кинетин, зеатин в концентрации 0.5 мг/мл при постоянной концентрации 2,4-Д 1.0 мг/л. Каллус субкультивировали с интервалом в 21 день при 26 ± 1°С в темноте.

Общие аналитические методы. Сырую биомассу сушили при 60°С до постоянного веса, сухой вес биомассы определяли на аналитических весах. Общее содержание углеводов определяли фенол-сернокислотным методом [8], уроновых кислот - по реакции с конц. H2SO4 и с 2,3-диметилфенолом [9], белка - по методу Лоури [10]. Выход полисахаридов определяли от сухого веса каллуса, предварительно обработанного метанолом и хлороформом.

Полученные полисахаридные фракции (2 мг) гидролизовали с 2 М трифторуксусной кислотой при 100°С в течение 3-5 ч. Моносахаридный состав определяли методом ГЖХ, переводя моносахариды в соответствующие ацетаты полиолов [11]. Соотношение моносахаридов вычисляли из площадей пиков, используя молярные коэффициенты.

Выделение кислого арабиногалактана и пектина проводили по схеме, приведенной на рисунке 3.

Рис. 3. Выделение полисахаридных фракций из каллуса Silene vulgaris

Обсуждение результатов

Каллусная культура смолевки не прекращает рост на средах без добавления фитогормонов и в присутствии одного цитокинина, что объясняется, по-видимому, наличием в клетках достаточного для поддержания ростовых процессов количества эндогенных фитогормонов. Однако наличие ауксина и цитокинина в среде имеет важное значение, так как взаимодействие ауксинов с цитокининами обеспечивает интенсивный рост культуры [12].

Для активного роста клеток сочетание ауксина с БАП было более эффективным, чем с кинетином и зеатином. Аналогичные результаты были получены для каллусной культуры стевии [12, 13].

Изменяя гормональные условия культивирования каллусных культур, можно оптимизировать рост и продуцирование полисахаридов. При этом фитогормоны оказывают больший эффект на рост культуры, чем на биосинтез полисахаридов. Полисахаридный состав каллусной культуры смолевки остается постоянным независимо от гормональных факторов среды. Наблюдаемые изменения в количественном моносахаридном составе полисахаридов при культивировании каллуса с различными ауксинами свидетельствуют об участии ауксина в регуляции биосинтеза полисахаридов, что подтверждается литературными данными [5, 6]. Сведения о влиянии цитокининов на биосинтез полисахаридов в литературе отсутствуют.

Выводы

1. Разработан биотехнологический метод получения кислого арабиногалактана и пектина Silene vulgaris с использованием культуры ткани.

2. Показано, что регуляторы роста оказывают большее влияние на рост клеточной культуры S. vulgaris, чем на биосинтез полисахаридов. Стабильность полисахаридного состава сохраняется независимо от экзогенных фитогормонов.

3. Культивирование каллуса смолевки в присутствии различных регуляторов роста приводит к продуцированию полисахаридов с идентичным качественным моносахаридным составом и некоторыми различиями в соотношении моносахаридных остатков.

Список литературы

1. Goubet F., Morvan C. Synthesis of Cell Wall Galactans from Flax (Linum usitatissimum L.) Suspension-Cultured Cells // Plant Cell Physiol. 1994. V. 35. №5. P. 719-727.

2. Takeuchi Y., Nishiyauchi K., Aoyama K., Sato A. Polysaccharides in Primary Cell Walls of Japanese Cypress Cells in Suspension Culture // Phytochemistry. 1996. V. 41, №2. P. 461-463.

3. Мишарина Е.А., Оводова Р.Г., Бушнева О.А., Оводов Ю.С. Каллусообразование Silene vulgaris (Moench) Garcke in vitro // Растительные ресурсы. 1999. Т. 35. Вып. 2. С. 88-95.

4. Popov S.V., Popova G.Yu., Ovodova R.G., Bushneva O.A., Ovodov Yu.S. Effects of polysaccharides from Silene vulgaris on phagocytes // Int. J. Immunopharmacol. 1999. V. 21. P. 614-622.

5. Rubery P.H., Northcote D.H. The Effect of Auxin (2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid) on the Synthesis of Cell Wall Polysaccharides in Cultured Sycamore Cells // Biochem. Biophys. Acta. 1970. V. 222. P. 95-108.

6. Nishitani K., Masuda Y. Auxin-induced Changes in the Cell Wall Structure: Changes in the Sugar Compositions, Intrinsic Viscosity and Molecular Weight Distributions of Matrix Polysaccharides of the Epicotil Cell Wall of Vigna angularis // Physiol. Plant. 1981. V. 52. P. 482-494.

7. Murashige T., Skoog S. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobaco Tissue Cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-479.

8. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances // Anal. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.

9. Usov A.I., Bilan M.I., Klochkova N.G. Polysaccharides of Algae, 48. Polysaccharide Composition of Several Calcareous Red Algae: Isolation of Alginate from Corallina pilulitara // Bot. marina. 1995. V. 38. P. 43-51.

10. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

11. York W.S., Darvill A.G., McNeil M., Stevenson T.T., Albersheim P. Isolation and Characterisation of Plant Cell Walls and Cell-wall Components // Meth Enzymol. 1985. V. 188. P. 3-40.

12. Бондарев Н.И., Носов А.М., Корниенко А.В. Влияние экзогенных регуляторов роста на каллусогенез и рост культивируемых клеток Stevia rebaudiana // Физиология растений. 1998. Т. 45. №6. С. 888-892.

13. Бондарев Н.И., Носов А.М., Корниенко А.В. Влияние факторов культивирования на рост и продуктивность каллусной и суспензионной культур клеток стевии // Биотехнология. 1997. №7-8. С. 30-37.

Поступило в редакцию 16 декабря 2000 г.