Разработка и валидация методики определения амлодипина в плазме крови

Разработка и валидация методики определения амлодипина в плазме крови

УДК 543.544.5:615.074

Амлодипин (амлодипина бесилат) - антагонист кальция из группы дигидропиридинов; оказывает антиангинальное, гипотензивное действие вследствие блокады кальциевых каналов и торможения поступления ионов кальция в кардиомиоциты и гладкомышечные клетки сосудов. Препарат ингибирует вход ионов кальция в фазу деполяризации кардиомиоцитов и гладкомышечных клеток сосудов. Обладает пролонгированным дозозависимым антигипертензивным эффектом; постепенно дилатирует периферические и коронарные артерии на срок около суток. Снижает общее периферическое сосудистое сопротивление, мало изменяет число сердечных сокращений, уменьшает потребность миокарда в кислороде. Расширение коронарных артерий и артериол увеличивает поступление кислорода в миокард. Благодаря пролонгированному действию плавно снижает артериальное давление, не вызывая рефлекторной стимуляции симпатической нервной системы.

В рандомизированных клинических исследованиях (ALLHAT [1, 2], VALUE [3], ELVERA [4], PREVENT [5], CAPARES [6], CAMELOT [7] и др.) показано, что применение амлодипина у больных с артериальной гипертензией приводит к значительному снижению как диастолического, так и систолического артериального давления и обратному развитию гипертрофии левого желудочка, а также снижению риска развития сердечно-сосудистых осложнений. Уровень убедительности доказательств клинической эффективности - А. В ходе упомянутых исследований были получены также подтверждения возможности торможения атеросклеротического процесса в коронарных сосудах на фоне длительного лечения амлодипином (PREVENT, CAPARES). В сравнительном исследовании CAMELOT показаны преимущества антагониста кальция амлодипина по сравнению с ингибитором АПФ эналапри-лом в лечении пациентов с артериальной гипертензией и ишемической болезнью сердца благодаря наличию выраженного антиангинального, антиишемического и антиатеросклеротического эффектов.

Одним из основных препятствий к широкому применению в клинической практике современных антигипертен-зивных препаратов является их высокая стоимость. Разработка и внедрение на фармацевтический рынок Беларуси отечественного препарата-генерика позволит существенно расширить имеющийся в распоряжении практического здравоохранения республики арсенал новейших высокоэффективных лекарственных средств для специфической антигипертензивной терапии, а также значительно снизить стоимость лечения пациентов. В рамках реализации задач импортозамещения на РУП «Белмедпрепараты» разработали генерический препарат «Амлодипин, таблетки 5 мг».

Решением Фармакологического комитета Минздрава Республики Беларусь (Протокол заседания №3 от 31.03.2008 г.) и распоряжением Минздрава Республики Беларусь №01-03-09/3227 от 15.04.2008 г. были назначены сравнительные клинические испытания биоэквивалентности данного лекарственного средства на базе 4-й городской клинической больницы Минска.

Целью настоящего исследования является разработка и валидация методики, предназначенной для определения содержания амлодипина в плазме крови при выполнении испытания биоэквивалентности.

Валидация методики количественного определения амлодипина в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проводилась в лаборатории технологии биологически активных веществ отдела разработки и внедрения технологий фармацевтических субстанций РУП «Белмедпрепараты».

Процедура валидации методики выполнена на образцах, полученных методом твердофазной экстракции из плазмы крови, содержащей амлодипин (Maprimed, Аргентина). В качестве внутреннего стандарта применяли ремантадин (China).

В работе использовали следующие реактивы: ацетонитрил для ВЭЖХ, метанол для ВЭЖХ, калий дигидрофосфат (ч.д.а), натрия дигидрофосфат (ч.д.а), аммиак (о.с.ч.), кислоту хлористоводородную (ч.д.а), кислоту ортофосфорную (о.с.ч.), триэтиламин (для ВЭЖХ), кислоту борную

(ч.д.а.), 4-хлоро-7-нитро-бензофуразан (NBD-CI) (для ВЭЖХ).

Анализ проводили на жидкостном хроматографе «SHIMADZU UFLC», оснащенном вакуумным дегазатором, двумя градиентными насосами модели LC-20AD XR, автосамплером SIL-20AC XR, термостатом и флуориметрическим детектором модели RF-10AXL.

Для построения калибровочных кривых и проведения валидационных испытаний были приготовлены образцы с заданным содержанием амлодипина в плазме крови, полученной в РНПЦ гематологии и трансфузиологии. Образцы были приготовлены путем внесения в точно отмеренный объем плазмы определенного объема (меньше 5% объема плазмы) рабочих растворов амлодипина соответствующей концентрации. Полученные растворы аликвотировали и замораживали при температуре минус 220С. Рабочие растворы амлодипина готовили разбавлением метанолом промежуточных растворов. Промежуточные растворы были приготовлены из исходного раствора амлодипина в метаноле 1 мг/мл.

Выделение амлодипина из плазмы крови и очистку экстракта осуществляли методом твердофазной экстракции. Для приготовления образцов использовали вакуумную систему для твердофазной экстракции фирмы Agilent и картриджи для твердофазной экстракции SamplyQ C2 (Agilent).

Картриджи для твердофазной экстракции предварительно уравновешивали: 2 мл ацетонитрила, затем 1 мл воды, далее на картридж добавляли 2,5 мл 25 мМ калий-фосфатного буфера рН 7,0. На картриджи наносили 3 мл пробы, содержащей 2 мл плазмы и 1 мл раствора внутреннего стандарта ремантадина (30 нг/мл в 25 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,0). Затем картриджи промывали 2 мл 20%-ного ацетонитрила и 1 мл ацетони-трила, амлодипин и внутренний стандарт экстрагировали 2,5 мл 2,5%-ного аммиака в ацетонитриле. Пробы выпаривали под вакуумом. Сухой остаток растворяли в 200 мкл метанола.

К 200 мкл метанольных растворов, полученных после твердофазной экстракции образцов, прибавляли 200 мкл 0,2 М

боратного буфера (рН = 8,6) и 200 мкл метанольного раствора NBD-Cl (0,5 мг/мл). Перемешивали при 480 об/мин в течение 5 мин. После этого пробирки помещали на водяную баню на 15 мин. (800С). Пробирки охлаждали и добавляли 200 мкл 2 М НС1. Центрифугировали 1 мин. при 3000 об/мин. Полученный образец использовали для хроматографического анализа.

Хроматографическое разделение осуществляли на колонке Purospher STAR RP-18, 125^4,0 мм, 5 мкм (Merck). Элюи-рование проводили в градиентом режиме при температуре 620С, подвижная фаза подавалась со скоростью 2 мл/мин. В качестве подвижной фазы А использовали 50 мМ раствор натрия дигидрофосфата, содержащий 1 мл/л триэтиламина, рН 2,5; подвижной фазы Б - метанол. Объем вводимой пробы образца составлял 20 мкл. Детектирование осуществляли при длине волны возбуждения 470 нм, эмиссии 537 нм. Хроматограммы были получены и обработаны на программном обеспечении LC solution.

На рис. 1 представлена типичная хроматограмма образца плазмы, содержащего амлодипин.

Хроматографические параметры разработанной методики: время удерживания - 3,6 мин. для амлодипина и 6,9 мин. для ремантадина (внутреннего стандарта); эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику амлодипина, составила более 4000 теоретических тарелок, по пику ремантадина - более 18000

теоретических тарелок; фактор асимметрии для пика амлодипина - 0,9, для пика ремантадина - 1,0; коэффициенты емкости исследуемых компонентов составили 2,7 и 5,9 для амлодипина и ремантадина соответственно. Степень извлечения амлодипина - 93% (для концентрации 30 нг/мл), степень извлечения внутреннего стандарта (ремантадина) - 99,5%. Пики исследуемого компонента (амлодипина) и внутреннего стандарта (ремантадина) достоверно детектируются и надежно отделяются как друг от друга (разрешение более 5), так и от эндогенных компонентов образца плазмы.

Валидацию методики количественного определения амлодипина в плазме крови методом ВЭЖХ проводили в соответствии с «Guidance for industry. Bioanalytical method validation», US DHHS, FDA, CDER 2001 [8] «Reviewer Guidance. Validation of chromatographic methods», CDER, 1994, и Государственной фармакопеей Республики Беларусь [9].

В ходе валидационных испытаний исследовали избирательность, линейность, воспроизводимость, внутрилабораторную воспроизводимость и правильность, оценили предел количественного определения методики, исследовали стабильность образцов в автосамплере, а также стабильность амлодипина в биоматериале при комнатной температуре. Кроме того, определили степень извлечения амлоди-пина и внутреннего стандарта (ремантадина) из биологического материала.

При оценке избирательности с целью определения степени влияния эндогенных компонентов плазмы крови на хромато-графирование производных амлодипина и ремантадина после предварительной дериватизации были проанализированы образцы плазмы крови 6 различных доноров, не содержащие амлодипин и ремантадин. На полученных хроматограммах отсутствуют пики, совпадающие со временем удерживания пиков производных амлодипина и ремантадина (рис. 2).

Для оценки линейности были построены калибровочные кривые, связывающие отношения площади пика производного амлодипина к площади пика производного ремантадина и различную концентрацию амлодипина (0,5, 1, 4, 8, 16, 24, 32 и 40 нг/мл) в плазме крови. Методом наименьших квадратов с помощью программного обеспечения построено 8 линейных зависимостей отношения площадей пиков производных амлодипина и внутреннего стандарта к концентрации

амлодипина в плазме крови. Наименьшее значение коэффициента корреляции составило 0,989, что удовлетворяет критерию приемлемости (не менее 0,97). Рассчитаны средние значения отношений площадей пиков производных амлодипина и внутреннего стандарта. Относительные стандартные отклонения (RSD, %) для каждой из концентраций удовлетворяют критерию приемлемости (не более 10% для всех точек, кроме точки, близкой к пределу количественного определения, для которой значение RSD не более 15%). По средним значениям отношений площадей пиков производных амлоди-пина и внутреннего стандарта построена линейная зависимость для расчета концентрации амлодипина в плазме крови добровольцев. На рис. 3 приведен график зависимости средних значений отношений площадей пиков амлодипина и ремантадина от концентрации амлодипина в плазме крови. Зависимость носит линейный характер в диапазоне концентраций

0,5-40 нг/мл и описывается линейным уравнением у = 14,19х с коэффициентом корреляции 0,999.

Оценку правильности и прецизионности методики проводили при повторных анализах на трех уровнях концентраций амлодипина в плазме - 1,5; 12 и 30 нг/мл -как в один, так и в разные дни. Результаты исследования приведены в табл. 1.

Предел количественного определения методики оценивали как минимальную концентрацию лекарственного средства, при которой соотношение сигнал/шум составляет около 10:1 и значение RSD не превышает 20%. Он оказался равен 0,5 нг/мл.

В процессе выполнения аналитического этапа исследования биоэквивалентности лекарственного средства хроматографическому анализу подлежит большое количество образцов. В связи с этим в аналогичных работах, как правило, используют хроматографические комплексы, оснащенные устройством для автоматического ввода проб (автосамплерами). Однако это возможно лишь при стабильности исследуемых образцов при температуре, поддерживаемой автосамплером Результаты исследования стабильности образцов при 150С (температура, поддерживаемая в автосамплере) демонстрируют стабильность исследуемых проб как минимум 24 часа (табл. 2).

Разработанная методика определения амлодипина в плазме крови сочетает

Таблица 1. Метрологические характеристики разработанной методики

НАЙДЕНО В ТЕЧЕНИЕ 1 ДНЯ ЗА НЕСКОЛЬКО ДНЕЙ

ВВЕДЕНО Средняя концентрация, нг/мл Станд. откл. % восстановления Средняя концентрация, нг/мл Станд. откл. % восстановления

1,5 нг/мл 1,51 0,11 100,8 1,51 0,11 100,7

12 нг/мл 12,02 0,87 100,2 12,10 0,79 100,8

30 нг/мл 31,11 1,51 103,7 30,52 1,32 101,7

Таблица 2. Стабильность образца производных амлодипина и ремантадина в автосамплере

СООТНОШЕНИЕ ПЛОЩАДЕЙ ПИКОВ

ОБРАЗЕЦ 1,5 нг/мл 0 часов 24 часа

Исходное Через 24 часа Восстановление,%

1 0,094 0,101 107,4

2 0,105 0,111 105,7

3 0,118 0,109 108,3

СРЕДНЕЕ 107,1

СООТНОШЕНИЕ ПЛОЩАДЕЙ ПИКОВ

ОБРАЗЕЦ 12 нг/мл 0 часов 24 часа

Исходное Через 24 часа Восстановление,%

1 0,909 0,866 105,0

2 0,804 0,850 94,6

3 0,824 0,872 105,9

СРЕДНЕЕ 101,8

СООТНОШЕНИЕ ПЛОЩАДЕЙ ПИКОВ

ОБРАЗЕЦ 30 нг/мл 0 часов 24 часа

Исходное Через 24 часа Восстановление,%

1 2,05 2,14 104,4

2 2,24 2,15 96,1

3 2,17 2,28 105,1

СРЕДНЕЕ 101,9

Таблица 3. Степень извлечения ремантадина из биологического материала

КОНЦЕНТРАЦИЯ РЕМАНТАДИНА В ОБРАЗЦЕ ПЛОЩАДЬ ПИКА, МОДЕЛЬНЫЙ РАСТВОР ПЛОЩАДЬ ПИКА, ЭКСТРАКЦИЯ ИЗ ПЛАЗМЫ ВОССТАНОВЛЕНИЕ

30 нг/мл 3324620 3807385 112,8

3182988 3122144 92,5

3377720 3329289 98,6

3299898 3403483 100,8

3440009 3382686 100,2

3629676 3242153 96,0

3063790 90,8

3484204 103,2

3388595 100,4

Среднее 3375819

Среднее 99,5

SD (±) 6,4

(%) 6,4

в себе выделение амлодипина из образца при помощи процедуры твердофазной экстракции, упаривание экстракта, дальнейшую дериватизацию образца для получения флуоресцирующего производного, а затем непосредственно хроматографиче-ский анализ. Так как пробоподготовка образцов для анализа является достаточно трудоемкой и длительной, необходимо оценить стабильность амлодипина в биологическом материале при комнатной температуре хранения. Стабильность образцов плазмы крови, содержащей ам-лодипин, при комнатной температуре хранения оценивали по величине отношения площадей пиков производных амлодипина и ремантадина через определенные интервалы времени относительно исходного соотношения площадей, в процентах.

Были приготовлены образцы амлодипина в плазме крови с концентрацией 1,5, 12 и 30 нг/мл. Часть проб сразу после приготовления была подвергнута процедуре экстракции и дериватизации, проанализирована на хроматографе (0 часов). Оставшаяся часть проб хранилась 2, 4 и 6 часов при комнатной температуре. Далее проводили экстракцию, дериватизацию и хрома-тографический анализ. Установлено, что амлодипин стабилен в растворе плазмы крови человека по крайней мере в течение 6 часов (среднее значение процента восстановления соотношений площадей пиков через 6 часов по отношению к исходным значениям составило 98,5, 102,2 и 101,92% для концентраций амлодипина в плазме крови 1,5, 12 и 30 нг/мл соответственно).

Степень извлечения компонентов из биологического материала. Степень извлечения амлодипина из плазмы крови в процессе экстракции (%) оценивали по соотношению площадей пиков производных амлодипина, полученных при анализе образцов плазмы крови, содержащих три различные концентрации амлодипина и модельных метанольных растворов амлодипина аналогичных концентраций, не подвергавшихся процедуре экстракции. Среднее значение степени извлечения составило 102,5, 98 и 93% для концентраций 1,5, 12 и 30 нг/мл соответственно, RSD -9,4, 9,1 и 6,8% соответственно. Оценка степени извлечения внутреннего стандарта

Таблица 4. Валидационные характеристики методики определения содержания амлодипина в плазме крови

ВАЛИДАЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Линейность г2>0,999

Предел количественного определения 0,5 нг/мл

Диапазон применения от 0,5 до 40 нг/мл

Правильность и прецизионность процент восстановления, %: от 100,2 до 103,7 RSD (%): от 4,9 до 7,4

Правильность и внутрилабораторная прецизионность процент восстановления, %: от 100,7 до 101,7 RSD (%): от 4,3 до 7,3

1,5 нг/мл - 102,5%

Степень извлечения амлодипина 12 нг/мл - 98,0% 30 нг/мл - 93,0%

Степень извлечения ремантадина 30 нг/мл - 99,5%

1,5,нг/мл - процент восстановления 107,1%

Стабильность амлодипина в автосамплере в течение 24 часов 12 нг/мл - процент восстановления от 101,8% 30 нг/мл - процент восстановления от 101,9%

Стабильность амлодипина в биоматериале при комнатной температуре 1,5 нг/мл - процент восстановления 98,5% 12 нг/мл - процент восстановления 102,2% 30 нг/мл - процент восстановления 103,7%

Литература

1. ALLHAT Officers and Coordinators for the ALLHAT Collaborative Research Group. The Antihypertensive and Lipid-Lowering Treatment to Prevent Heart Attack Trial. Major outcomes in high-risk hypertensive patients randomized to angiotensin-converting enzyme inhibitor or calcium channel blocker vs diuretic: the Antihypertensive and Lipid-Lowering Treatment to Prevent Heart Attack Trial (ALLHAT). JAMA 2002; 288: 2981-97.

2. Weber M.A. The ALLHAT Report: A case of Information and Misinformation. J Clin Hypertens 2003; 5 (1): 9-13.

3. Julius S., Kjeldsen S.E, Weber M. et al. Outcomes in hypertensive patients at high cardiovascular risk treated with regimens based on valsartan or amlodipine: the VALUE randomized trial. Lancet 2004; 363 (9426): 2022-3.

4. Terpstra W.F., May J.F., Smit A.J. et al. Effects of amlodipine and lisinopril on intima-media thickness in previously untreated, elderly hypertensive patients (the ELVERA trial). J Hypertens 2004; 22 (7): 1309-16.

5. Byington R.P., Miller M.E., Herrington D., Riley W., Pitt B., Furberg C.D., Hunninghake D.B Mancini G.B.J. Rationale, design and baseline characteristics of the prospective randomized evaluation of the vascular effects of Norvasc trial (PREVENT) // Am J Cardiol 1997; 80: 1087-90.

6. Jorgensen B., Simonsen S., Forfang K. Amlodipine in post-angioplasty ischemia: results from the Coronary Angioplasty Amlodipine Restenosis Study (CAPARES) // Eur Heart J 1999; 20 Suppl 285.

7. Nissen S.E., Tuzcu E.M., Libbi P. et al. Effect of antihypertensive agents on cardiovascular events in patients with coronary disease and normal blood pressure: the CAMELOT study: a randomized controlled trial. JAMA 2004; 292 (18): 2217-25.

8. Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation. - CDER, CVM, FDA, U.S. department of health and human services. - 2001. - BP.

9. Государственная фармакопея Республики Беларусь. Т. 1. Общие методы контроля качества лекарственных средств. 5.8. Биодоступность и биоэквивалентность генерических лекарственных средств / Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении; под общ. ред. Г.В. Годовальникова. - Мн., 2006. С. 580-597.

10. Е.Л. Алькевич, М.А. Грецкая, С.В. Шляхтин, А.Н. Воробьев, Д.В. Леончик, М.К. Кевра, Т.В. Трухачева. Результаты биэк-вивалентных испытаний отечественного генерического средства «Амлодипин, таблетки 5 мг» // Кардиология в Беларуси. №3 (10), 2010. С. 138-146.

Мария Грецкая, ведущий химик РУП «Белмедпрепараты»

Екатерина Алькевич, биолог РУП «Белмедпрепараты»

Дмитрий Леончик, фармаколог РУП «Белмедпрепараты»

Татьяна Трухачева, заместитель генерального директора РУП «Белмедпрепараты» по вопросам инновационного развития, кандидат химических наук

(ремантадина) представлена в табл. 3. В целом валидационные характеристики разработанной методики, определенные в ходе исследования, приведены в табл. 4.

Таким образом, доказано, что разработанная методика количественного определения содержания амлодипина в плазме крови методом ВЭЖХ воспроизводима и позволяет получить достоверные результаты.

Методика была применена для изучения биоэквивалентности препарата «Амлодипин, таблетки 5 мг» (РУП «Белмедпрепараты») в сравнении с препаратом «Норваск, таблетки 5 мг» (производства компании «Пфайзер»). Результаты проведенных исследований [10] подтвердили биэквивалентность данных лекарственных средств. Препарат «Амлодипин, таблетки 5 мг» зарегистрирован в Реестре лекарственных средств Республики Беларусь (рег. № 10/04/1726 от 29.04.2010 г.).

Дата поступления статьи: 16.01.2012 г.

Summary

Sensitive and specific spectrofluorometric method has been developed and validated for the assay of amlodipine in human plasma. It is based on the reaction of amlodipine with 4-chloro-7-nitrobenzofurozan and subsequent separation by reversephase chromatography on C18 column. The method involves solid-phase extraction on C2 column and gradient elution. The HPLC method is based on measurement of the derivatized product using fluorescence detection at 540 nm (excitation at 470 nm). Using this method mean recovery of amlodipine from plasma was 98%. Run-time was about 15 min. Linear quantitative response curve was generated over the concentration range of 0.5-40 ng/ ml for plasma. The method was applied to a bioequivalence study in a healthy volunteer after a single oral dose of 10 mg amlodipine.