Сравнительный анализ содержания клещей домашней пыли и их аллергенов в жилых помещениях г. Москвы

ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2013

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ

© И. г. АХАПКИНА, т. М. ЖЕЛТИКОВА, 2013 УДК 616-056.43:613.5

И. Г. Ахапкина, Т. М. Желтикова

сравнительный анализ содержания клещей домашней пыли и их аллергенов в жилых помещениях г. москвы

ФГБУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН, Москва

Создание гипоаллергенной среды для уменьшения активности аллергических реакций, как и общий экологический мониторинг аллергенной нагрузки помещений предполагает определение концентрации аллергенов (Ал) и их источников. Результаты акарологического анализа проб пыли продемонстрировали, что доминирующим видом в Московском регионе в настоящее время является Dermatophagoides farinae. Общая численность D. pteronyssinus колебалась от 545 до 0 экз. на 1 г пыли, составив в среднем 43,39 ± 59,1 экз. на 1 г пыли. Численность D. farinae равнялась 95,43 ± 90,71 экз. на 1 г пыли, при этом максимальное количество было 804 экз. на 1 г пыли, минимальное - 0 экз. на 1 г пыли. Показано, что для количественного определения содержания Ал клещей домашней пыли (семейство Pyroglyphidae) целесообразно применять непрямой (обратный) иммуноферментный анализ, основанный на использовании поликлональных кроличьих антисывороток, полученных против аллергенных экстрактов пироглифидных клещей. Средняя концентрация Ал D. pteronyssinus равнялась 71,65 ± 59,51 мкг/г на 1 г пыли, а D. farinae - 72,37 ± 50,72 мкг на 1 г пыли, при этом количество клещевых Ал изменялось от 2,22 до 184,44 и от 2,22 до 182,22 мкг на 1 г пыли соответственно для представленных видов клещей.

Ключевые слова: Dermatophagoides farinae, D. pteronyssinus, поликлональные антисыворотки, численность популяции клещей, доминирующий вид, концентрация клещевых аллергенов

I.G. Akhapkina, T.M. Zheltikova

COMPARATIVE RESEARCH OF QUANTITY OF DUST MITES AND THEIR ALLERGENS IN DWELLING OF MOSCOW

Making hypoallergenic environment for decrease activity of allergic reactions and ecology monitoring allergic load of dwelling are needed for attribute of allergen concentration and their sources. Acarological analyses is showed that Dermatophagoides farinae is dominant dust mite in Moscow region now. It's show that for quantity determination of concentration of mite dust allergens reasonably to apply indirect ELIZA is based on use polyclonal antisera received against allergic extracts from corresponding dust mites. Concentration of allergens was equal to 71,65±59,51mkg/g dust for D. pteronyssinus and 72,37±50,72 mkg/g dust for D. farinae. General quantity of allergens of D. pteronyssinus vary from 2,22 to 184,44 mkg/g dust and for D. farinae 2,22 to 182,22 mkg/g dust correspondently.

Keywords: dermatophagoides farinae, D. pteronyssinus, polyclonal antisera, quantity of mite population, dominant species, concentration of mite allergens

Проблема распространения аллергии к клещам домашней пыли семейства Pyroglyphidae не теряет своей остроты вот уже почти полвека. Клинически гиперчувствительность к аллергенам (Ал) пироглифидных клещей может проявляться в виде бронхиальной астмы, аллергического ринита, атопического дерматита [3, 6]. Одним из направлений уменьшения активности аллергических реакций в данном случае является снижение аллергенной нагрузки окружающей больного среды. Как следует из названия статьи - клещи домашней пыли, эти членистоногие, живут в непосредственной близости с человеком в помещениях. Местами их обитания являются постель и постельные принадлежности, прикроватные ковры, мягкие мебель и игрушки. Пищей им служат слущенные чешуйки эпидермиса человека, перо и др. Человек дает клещам тепло, влагу и соли с потовыми выделениями. Особенности биологии развития клещей, а именно покоящаяся протонимфа, которая не питается и легче переносит неблагоприятное внешнее воздействие, достаточно эффективно препятствуют различным методам снижения численности популяции клещей из окружающей среды. При элиминационных мероприя-

Желтикова Татьяна Михайловна - д-р биол. наук, проф., зав. лаб., +7(495)917-42-55, e-mail: t-zheltikova@yandex.ru.

тиях возникает необходимость проводить контрольные измерения численности клещей и количества их Ал. В основном сейчас осуществляют визуальный подсчет особей в образце пыли для контроля за величиной популяции клещей. Однако клещам свойственно так называемое гнездовое распределение, поэтому в образце пыли их может просто не оказаться вследствие несовершенства стадии отбора проб. Также с помощью данного метода совершенно невозможно определить количество Ал клещей в домашней пыли. Поэтому в последнее время в практику внедряются методы определения количества Ал, основанные на иммуноферментном анализе (ИФА).

В связи с вышесказанным задача работы заключалась в сравнении таких параметров характеристики клещевой аллергенной нагрузки помещений, как численность клещей и количество Ал, определяемых разными методами ИФА.

Материалы и методы. В работе использовали диагностические антитела (АТ) к IgG(H+L) кролика, меченные пероксидазой (РАМН, предприятие по производству бакпре-паратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), коммерческие аллергенные экстракты Dermatophagoides farinae и D. pteronyssinus (30 000 au/мл, "Miles Inc.", США), кроличьи поликлональные антисыворотки (ПА), полученные против Ал D. farinae и D. pteronyssinus (30 000 au/мл; "Miles Inc.", США).

- 108 -

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ

В течение года в 88 жилых помещениях Москвы были собраны комплексные образцы пыли. Образцы пыли собирали на стерильный хлопчато-бумажный фильтр при обработке поверхности помещения пылесосом. Образцы пыли до проведения анализа хранили 2-4 нед при -20ОС. В 75 образцах определяли концентрацию и видовое разнообразие клещей домашней пыли и их Ал. 13 образцов использовали для проведения сравнительного определения концентрации клещевых Ал двумя способами ИФА.

Для определения количества клещей из навески пыли массой 20 мг готовили водную суспензию и всю ее просматривали под бинокуляром МБС-3. Для определения видового разнообразия препараты клещей готовили в 40% молочной кислоте с привлечением определительных таблиц [4, 5, 11].

Для определения концентрации Ал клещей домашней пыли обратным ИФА к 10 мг пыли прибавляли 1 мл карбонатбикарбонатного буфера (КББ) рН 9,6, экстрагировали при перемешивании при комнатной температуре в течение 60 мин. В две параллельные лунки 96-луночного планшета («Costar", ) помещали по 100 мкл разведений стандартного аллергенного экстракта D. pteronyssinus или D. farinae в КББ рН 9,4 (в первые две лунки 1 мкг/мл, в последующие - соответственно

0. 5, 0,25, 0,125 мкг/мл), в следующие - по 100 мкл КББ, в следующие - по 100 мкл исследуемого экстракта (надоса-дочная жидкость). Инкубировали 1 ч при 37ОС, затем ночь при 4ОС, удаляли жидкость из лунок, промывали 245 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,4 в присутствии 0,5% Tween-20. В лунки вносили по 100 мкл соответствующей ПА в разведении 1:1000, инкубировали 45 мин при 37ОС. Лунки освобождали от реакционной массы, промывали 3 раза ФСБ, прибавляли по 100 мкл конъюганта (диагностические АТ к IgG (H + L) кролика, меченные пероксидазой) в разведении 1:2000, инкубировали 30 мин при 370С. Реакционную смесь удаляли из лунок, промывали 3 раза ФСБ, затем 2 раза дистиллированной водой. В лунки вносили по 100 мкл субстрата - ТМБ. Инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 3-5 мин. Реакцию останавливали прибавлением 100 мкл 5% раствора серной кислоты. Измеряли оптическую плотность (ОП) растворов в лунках при длине волны, равной 450 нм. Для построения калибровочной кривой использовали данные ОП, полученные для разведений стандартного Ал клещей домашней пыли, за вычетом средней величины ОП, полученной для лунок, в которые был помещен КББ. По калибровочной кривой определяли концентрацию соответствующего Ал в образцах пыли.

Для определения концентрации Ал клещей домашней пыли ингибиторным ИФА к 5 мг пыли прибавляют 500 мкл ФСБ, экстрагируют при перемешивании при комнатной температуре в течение 60 мин. В две параллельные лунки 96-луночного планшета помещают по 100 мкл раствора, стандартного соответствующего Ал клещей домашней пыли в КББ концентрацией 1 мкг/мл. Количество лунок рассчитывают, исходя из следующих данных: 10 лунок для построения калибровочной кривой плюс количество образцов, умноженное на 2. Инкубируют 1 ч при 370С, затем ночь при 40С, удаляют жидкость из лунок, промывают 245 мл ФСБ в присутствии 0,5% Tween-20. В первые две лунки вносят по 50 мкл стандартного аллергенного экстракта клещей домашней пыли концентрацией 2 мкг/мл, в последующие - соответственно

1, 0,5, 0,25 мкг/мл, в следующие - по 50 мкл ФСБ, в следующие - по 50 мкл исследуемого экстракта. В лунки вносят по 50 мкл ПА в разведении 1:500, инкубируют 40 мин при 370С. Лунки освобождают от реакционной массы, промывают 3 раза ФСБ, прибавляют по 100 мкл конъюганта (диагностические АТ к IgG (H + L) кролика, меченные пероксидазой) в разведении 1:2000, инкубируют 30 мин при 37ОС. Реакционную смесь удаляют из лунок, промывают 3 раза ФСБ, затем 2 раза дистиллированной водой. В лунки вносят по 100 мкл субстрата - ТМБ. Инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 3-5 мин. Реакцию останавливают при-

бавлением 100 мкл 5% раствора серной кислоты. Измеряют ОП растворов в лунках при длине волны, равной 450 нм. Для построения калибровочной кривой используют данные ОП, полученные для разведений соответствующего стандартного Ал клещей домашней пыли, и ОП, полученной для лунок, в которые был помещен ФСБ.

Статистическую обработку результатов проводили при помощи программ Microsoft Office Excel 2007 и Statistica 6,0.

Результаты и обсуждение. При анализе видового разнообразия клещей в образцах домашней пыли, собранных в 2009 г., установили, что farinae в настоящее время является доминирующим видом в пыли городских квартир в Московском регионе (рис. 1). Общая численность D. pteronyssinus колебалась от 545 до 0 экз. на 1 г пыли, составив в среднем 43,39 ± 59,1 экз. на 1 г пыли. Численность D. farinae равнялась 95,43 ± 90,71 экз/г пыли, при этом максимальное количество было 804 экз. на 1 г пыли, минимальное - 0 экз. на 1 г пыли. Этот факт весьма примечателен и требует отдельного изучения, в частности, предстоит выяснить, каковы причины, изменение каких условий привело к смене доминирующего вида, поскольку в 1980-2000 гг. в Московском регионе в пыли городских квартир преобладали клещи вида D. pteronyssinus [2].

За основной критерий аллергенной опасности помещения чаще принимают количество экземпляров клещей на 1 г пыли. В настоящее время вернулись к прежним показателям, согласно которым присутствие клещей в концентрации 100

Рис. 1. Частота (в %) выявления различных видов клещей в домашней пыли.

1 - D. pteronyssinus; 2 - D. farinae.

Рис. 2. Частота выявления квартир (в %) с различной численностью клещей.

1 - < 100 экз. на 1 г пыли; 2 - 100-500 экз. на 1 г пыли; 3 - > 500 экз. на 1 г пыли.

- 109 -

ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2013

Рис. 3. Частота (в %) выявления квартир с различной концентрацией клещевых Ал в домашней пыли.

1 - < 2 мкг на 1 г пыли; 2 - 2-10 мкг на 1 г пыли; 3 - > 10 мкг на 1 г пыли.

экз. на 1 г пыли полагают условием развития сенсибилизации к клещевым аллергенам [9]. На рис. 2 представлена частота выявления квартир с различным количеством клещей. Как видно из рис. 2, чаще (84 и 64 %) встречаются квартиры, где численность популяции клещей домашней пыли того и другого видов составляет 100-500 экз. на 1 г пыли. Интересно отметить, что в данном случае доминирующим видом по-прежнему является D. pteronyssinus. В группе квартир с низким содержанием клещей в образцах пыли результаты акарологического анализа показали доминирование уже D. farinae.

Известно, что концентрация клещей 100 экз. на 1 г пыли приравнивается к 2 мкг на 1 г пыли клещевых Ал, и концентрация 500 экз. на 1 г пыли соответствует 10 мкг на 1 г пыли клещевых Ал [8]. Соотношение количества клещей и количества их Ал изучали при помощи гуанинового метода, который основан на выявлении в окружающей среде гуанина и является в целом полуколичественным методом, тем более что источниками гуанина в помещениях могут быть другие членистоногие, например тараканы, а также растения. Главным образом, эта зависимость строилась на изучении концентрации клещевых Ал при помощи ИФА. Но в этом слу-

Результаты сравнения аллергенной нагрузки образцов пыли, полученной разными способами ИФА

Способ ИФА

обратный ингибиторный

22,5 26,0

47,5 28,0

50,0 46,0

10,0 18,0

16,4 18,0

14,5 36,0

11,3 34,0

28,5 44,0

101,0 140,0

42,0 182,0

54,0 180,0

11,5 50,0

28,0 47,8

чае обычно использовали моноклональные Ат, которые, как известно, бывают направлены строго к одному компоненту аллергенного экстракта, т.е. часть компонентов аллергенного экстракта просто не могла быть учтена в таких условиях. В нашем определении мы использовали ПА, полученные против цельного аллергенного экстракта клещей, поэтому, как мы предполагаем, в иммунохимическое взаимодействие при проведении ИФА вступали практически все компоненты, способные участвовать в провокации реакций гиперчувствительности к клещевым Ал домашней пыли. Следует заметить, что в 41 образце пыли клещи D. pteronyssinus отсутствовали, в 5 образцах отсутствовали клещи D. farinae. Но, поскольку мы использовали для проведения ИФА ПА, то, безусловно, в иммунохимическое взаимодействие с ПА, полученной против аллергенного экстракта клещей D. pteronyssinus, вступал, например, аллерген Der f2, являющийся наряду с Der p2 родовым. Здесь, очевидно, сыграла роль и мозаичность распределения клещей. При ингибиторном способе проведения ИФА в качестве ингибиторного агента использовали стандартный аллергенный экстракт, против которого была получена ПА. Казалось бы, в результате мы должны были получить данные о содержании компонентов аллергенного экстракта, присущих строго определенному виду клещей домашней пыли. Однако (см. таблицу) мы наблюдали в отдельных случаях значительное несовпадение с концентрациями клещевых Ал, полученными при использовании обратного способа проведения ИФА, причем чаще концентрация Ал была выше. Вероятно, такое несоответствие данных о количестве клещевых Ал, полученных разными методами, обусловлено использованием в ингибиторном способе именно ПА, которым свойственны обратимые перекрестные реакции относительно родовых Ал. Заметим лишь, что параллельно в исследованных пробах проводили иммуноферментное определение активности перекрестных взаимодействий с ПА, полученными против Ал и суспензий грибов (данные не приведены), которые показали незначительную активность связывания. На наш взгляд, несоответствие результатов определения содержания клещевых Ал двумя способами проведения ИФА ни в коей мере не умаляет как сам принцип применения ПА, так и выбранный нами способ проведения ИФА для получения данных о концентрации клещевых Ал. Возможно, продолжая данную работу, целесообразнее использовать смесь ПА, полученных против двух видов пироглифидных клещей, поскольку это позволит получить более полную картину о содержании клещевых Ал в окружающей среде. А именно это и важно для конкретного человека, особенно с выраженной реакцией гиперчувствительности, тем более что чаще выявляется сочетанная аллергическая реакции на аллергенный экстракт D. pteronyssinus и D. farinae [1]. Ингибиторный метод ИФА, очевидно, следует использовать в тех случаях, когда необходимо определить количество специфичного для данного человека компонента аллергенной смеси. В обследованных нами квартирах выявили следующие средние концентрации клещевых Ал: D. pteronyssinus 71,65 ± 59,51 мкг на 1 г пыли, а D. farinae 72,37 ± 50,72 мкг на 1 г пыли, при этом количество клещевых Ал изменялось от 2,22 до 184,44 и от 2,22 до 182,22 мкг на 1 г пыли соответственно для представленных видов клещей.

На рис. 3 представлены данные о соотношении количества квартир, в образцах пыли которых были определены концентрации клещевых Ал разных видов клещей. Как видно из рис. 3, значительно выросло количество квартир с высоким содержанием клещевых Ал (более 10 мкг на 1 г пыли). Возможно, разницу между количеством Ал и количеством самих клещей можно объяснить тем, что численность клещей значительно изменяется в зависимости от условий, и при низкой численности популяции и мозаичности распределения клещей в домашней пыли в пробе их может просто не оказаться. При разрастании популяции происходит, например, накопление токсичных веществ в данном

- 110 -

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

месте обитания и популяция просто мигрирует в другое место. При этом экспозиция клещевых Ал может быть значительной, поскольку часть Ал представляет собой продукты жизнедеятельности клещей [10]. Более того, ранее показано, что высокий уровень Ал в пыли может сохраняться в течение нескольких месяцев после резкого снижения численности клещей [7]. Миграция клещей домашней пыли, разные фазы жизненного цикла, изменение внешних условий (воздействие различных методов элиминации клещей и дезактивации клещевых Ал), вероятно, и демонстрируют такое резкое различие между численностью клещей и концентрацией клещевых Ал. Это лишний раз подтверждает то, что при определении степени аллергенности помещений целесообразно учитывать количественную характеристику аллергенной нагрузки, а не величину популяции клещей домашней пыли.

Результаты проведенного исследования позволяют сделать следующие выводы:

- в течение последних 20 лет произошло количественное изменение видового состава клещевого сообщества в городских квартирах Московского региона;

- в настоящее время как численность, так и частота встречаемости D. farinae превышают эти показатели для D. pteronyssinus в жилых помещениях Москвы;

- численность популяции клещей домашней пыли в помещении не соответствует клещевой аллергенной нагрузке;

- использование ПА реально для проведения мониторинговых обследований и характеристики помещений при создании гипоаллергенных помещений.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ахапкина И.Г., Краханенкова С.Н., Мамленкова Е.А. и др. Частота встречаемости гиперчувствительности к грибным и клещевым аллергенам // Клин. лаб. диагн. - 2009. - № 7. - С. 33-35.

2. Желтикова ТМ.Синантропные клещи (Acariformes: Pyroglyphidae, Acaridae, Glycyphagidae) - источник бытовых аллергенов: Дис. ... д-ра биол. наук. - Москва, 1998.

3. Bessot J.C., Pauli G. Mete allergens: an overview // Eur. Ann. Allergy Clin. Immunol. - 2011. - Vol. 43, N 5. - P. 141-156.

4. Blythe M.E. Some acpects of the ecological study of the house dust mites // Br. J. Dis. Chest. - 1976. - Vol. 70. - P.3-31.

5. Fain A., Guerin B., Hart B.J. Mites and Allergic Disease. - , 1990.

6. Global initiative for Asthma (GINA). Перевод с английского. - М., 2002.

7. Platts-Mills T.A.E., Hayben M.L., Chapman M.D. et al. Seasonal variation in dust mite and grass pollen allergens in dust from houses of patients with asthma // J. Clin. Immunol. - 1986. - Vol. 79. - P. 781-791.

8. Platts-Mills T.A.E., Sporik R.B., Chapman M.D., et. al. The role of indoor allergens in asthma // Allergy. - 1995. - Vol. 50, suppl. 22. - P. 5-12.

9. Platts-Mills T.A.E., Vorvloet D, Thomas W. et al. Indoor allergens and asthma: report of thrird international workshop // J. Allergy Clin. Immunol. - 1997. - Vol. 100. - P. 1-24.

10. Tovey E.R., ChapmanM.D., Platts-Mills T.A.E. Mite feces are a major source of house dust allergens // Nature. - 1981. - Vol. 289. - P. 592-593.

11. Wharton G.W. Hause dust mites // J. Med. Entomol. - 1976. - Vol. 12, N 6. - P. 577-621.

Поступила 01.02.12

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

© А. М. КОСЫРЕВА, М. Е. ДИАТРОПТОВ, 2013 УДК 616.24+616.36]-002-092:612.621.5]-078.33-091.8

А. М. Косырева, М. Е. Диатроптов

морфологические проявления системного воспалительного ответа в печени и легких крыс вистар в разные фазы эстрального цикла

ФГБУ НИИ морфологии человека РАМН

Циклические изменения содержания половых гормонов в течение менструального/эстрального цикла у особей женского пола могут оказывать влияние на устойчивость и восприимчивость к инфекционно-воспалительным заболеваниям. Цель работы - морфологическая оценка проявлений системного воспалительного ответа в печени и легких крыс Вистар в разные фазы эстрального цикла. Исследования проведены на половозрелых самках крыс Вистар, которым с целью моделирования системного воспалительного ответа внутрибрюшинно вводили липополисахарид (ЛПС) E. coli (1,5 мг/кг) в фазу проэструса и диэструса. По сравнению с крысами Вистар в фазу проэстру-са у самок в фазу диэструса развитие системного воспалительного ответа характеризуется более выраженными альтеративными и воспалительными изменениями в печени и легких, увеличением активности ферментов печени АлАТ и АсАТ и уровня эндотоксина в крови. На 1-е сутки после введения ЛПС самкам в фазу диэструса реактивные изменения тимуса, характеризующиеся расширением коркового вещества и субкапсулярной зоны, менее выражены, чем у крыс в фазу проэструса. Развитие системного воспалительного ответа в фазу диэструса сопровождается активацией Т- и B-зоны селезенки, а у крыс в фазу проэструса опустошается преимущественно Т-зависимая ПАЛМ-зона. Полученные данные необходимо учитывать при выполнении экспериментальных работ на особях женского пола, а также при разработке подходов к прогнозированию тяжести течения и терапии инфекционновоспалительных заболеваний у женщин репродуктивного возраста.

Ключевые слова: синдром системного воспалительного ответа, эстральный цикл, половые гормоны, липополисахарид, печень, легкие, иммунная система

Диатроптов Михаил Евгеньевич - канд. мед. наук, ст. науч. сотр., e-mail: diatrom@inbox.ru

- 111 -