Способ получения биологически активной добавки на основе молочной сыворотки и растительного экстракта
METHOD FOR OBTAINING A BIOLOGICALLY ACTIVE ADDITIVE BASED ON WHEY AND PLANT EXTRACT

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой и фармацевтической промышленности для получения биологически активной добавки с антиоксидантными свойствами на основе молочной сыворотки (творожной и подсырной) и экстрактов каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу).
В настоящее время наиболее быстрым, экономически приемлемым и научно обоснованным способом решения проблемы рационализации питания человека является широкое применение биологически активных добавок (БАД) к пище в повседневной практике.
Молочная сыворотка (творожная и/или подсырная) является побочным продуктом производства творога или сыра. Молочная сыворотка зачастую не используется, а сливается в канализацию либо в водоемы, что ухудшает экологическую ситуацию, приводит к техногенной нагрузке на очистные сооружения и окружающую среду. В то же время молочная сыворотка содержит легкоусвояемые компоненты - белки, углеводы (лактоза), минеральные соли и др. [1].
По химическому составу подсырная и творожная сыворотка содержит в среднем (мас. %): сухих веществ 6,0-6,5, лактозы 4,2-4,5, белковых веществ 0,6-0,8, минеральных солей 0,5-0,6, а также витамины А, Е, группы В и другие [2].
Молочная сыворотка вследствие высокой массовой доли влаги и возможности порчи должна скармливаться скоту в течение 12 часов. В течение 2 суток без специальной обработки питательность сыворотки снижается: содержание лактозы уменьшается на 40%, белка на 14%, сухих веществ на 10%. Эффективны способы использования сыворотки в сухом и сгущенном виде [3].
Использование жидкой молочной сыворотки нецелесообразно, так как усвоение основных питательных веществ из сыворотки достигается только на 20% [4].
Имеется опыт применения сгущенной молочной сыворотки в виде белково-углеводного концентрата. Например, указанный концентрат рекомендуется для приготовления кормовой смеси для выращивания телят-молочников. Смесь включает в себя молочную сыворотку, муку гороховую и овсяную, дрожжи кормовые, рыбий жир, поваренную соль и другие компоненты. Концентрат достаточно сложен по составу и в приготовлении. Скармливание смеси молодняку крупного рогатого скота увеличивает ежесуточный прирост живой массы на 25-30% [5].
Антиоксиданты - это молекулы, борющиеся с окислительными процессами в организме, вызванными свободными радикалами. К главным факторам, увеличивающим выработку свободных радикалов, относят: внутренние воспаления, загрязненный воздух, чрезмерное воздействие ультрафиолета, сигаретный дым. Оксидативный стресс, возникающий из-за свободных радикалов, провоцирует различные заболевания, включая сердечнососудистые, диабет, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и проблемы с глазами, такие как катаракта и возрастная дегенерация желтого пятна [6]. Антиоксиданты способны замедлить эти процессы, а в некоторых случаях и обратить их вспять, восстанавливая поврежденные клетки. Борьба с окислительными процессами - основная задача антиоксидантов. Как следствие, они могут: укреплять функцию тканей человека, омолаживать, повышать иммунитет человека, улучшать метаболическую функцию, снижать риск развития рака, укреплять функцию лимфатических тканей и противостоять перекисному окислению [7].
Антиоксиданты, производимые организмом самостоятельно, называются эндогенными, а поступающие извне - экзогенными. Наиболее активными в борьбе со свободными радикалами считаются вторичные метаболиты растений (флавоноиды, полифенолы, гликозиды, дубильные вещества, витамины) [8]. В качестве источников вторичных метаболитов, обладающих антиоксидантными свойствами, интерес представляет тимьян обыкновенный (Thymus vulgaris L.) и женьшень настоящий (Panax ginseng С.А. Меу).
Тимьян обыкновенный (Thymus vulgaris L.) широко используют в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности [9]. Трава тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) содержит [10]:
- эфирное масло (примерно 0,6%), в состав которого входят тимол (до 42%), карвакрол, n-цимол, α-терпинеол, борнеол, гераниол;
- дубильные вещества;
- горечи;
- камедь;
- тритерпеновые соединения - урсоловая и олеаноловая кислоты;
- флавоноиды - апигенин, нарингенин, цинарозид, космоссиин, скутеллярин;
- минеральные соли;
- пигменты - зеаксантин, лютеин, лутеолин;
- сахара - глюкозу, галактозу, арабинозу, рамнозу, ксилозу, глюкуроновую кислоту, галактуроновую кислоту;
- аминокислоты - цистин, аланин, лейцин;
- жирные кислоты - пальмитиновая, линолевая, линоленовая кислоты;
- органические кислоты - лимонная, яблочная, малоновая, щавелевая кислоты. Также в метанольном и этанольном экстракте тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) были обнаружены галловая, гидроксибензойная, хлорогеновая, сиринговая, кумаровая, бензойная, коричная и розмариновая кислоты [11]. Биологически активными свойствами растение обладает благодаря содержанию фенольных веществ, среди которых особое внимание уделяется тимолу, карвакролу и дубильным веществам. Благодаря наличию данных веществ тимьян обыкновенный (Thymus vulgaris L.) обладает противовоспалительной, антимикробной, болеутоляющей активностью [11].
Женьшень настоящий (Panax ginseng С.А. Меу), или женьшень обыкновенный - медленно растущее многолетнее растение рода Panax, которое часто используется в качестве компонента для функциональных продуктов и в качестве фитотерапевтического средства для предотвращения, лечения заболеваний (рака, аллергий, воспалительных заболеваний, сахарного диабета) [12]. По данным ученых женьшень настоящий (Panax ginseng С.А. Меу) используется в качестве адаптогенного агента, для повышения физической работоспособности, жизнеспособности, иммунитета, устойчивости к стрессу и старению [13].
К основным биологически активным компонентам женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) относят:
1. полисахариды (гликаны - гинсенан РА и гинсенан РВ, состоящие из L-арабинозы, D-галактозы, L-рамнозы, D-галактуроновой кислоты и D-глюкуроновой кислоты);
2. сапонины, в особенности гинзенозиды, которые можно классифицировать как олигогликозиды даммаранового, окотиллольного и олеананового типа, и разделить на протопанаксадиол и протопанаксатриол;
3. флавоноиды (кемпферол, трифолин и панасенозид);
4. полиацетилены (панаксинол и панаксидол).
Гинзенозиды (Re, Rg1, Rd, S-Rg2, Rb2, F1, Rc, S-Rh1, Rb3, R-Rg2, LC1) являются основными активными ингредиентами женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу), они относятся к классу природных продуктов стероидных гликозидов и тритерпеновых сапонинов и накапливаются в корнях, ягодах и листьях растения [14].
Исследования показали, что гинзенозиды проявляют ярко выраженные фармакологические эффекты, такие как снятие усталости, улучшение иммунитета, замедление старения, ингибирование метастазирования раковых клеток, регулирование уровня глюкозы в крови и защита функций печени и почек [15]. Гинзенозиды обладают противоаллергической активностью в моделях бронхиальной астмы и атопических заболеваний у мышей. К тому же они подавляют развитие воспалительного процесса путем ингибирования активации NF-κВ, и повышают иммунитет.
Полифенолы являются естественными, безопасными антиоксидантами, способными предотвращать ряд заболеваний (сердечно-сосудистые, рак, гипертония, диабет, атеросклероз). Многие природные полисахариды являются высоко ценными биоматериалами, которые характеризуются биосовместимостью, низкой токсичностью и биоразлагаемыми свойствами [16]. Полисахариды растительного происхождения обладают различными фармакологическими свойствами, в том числе антиоксидантными, противоопухолевыми и иммуномодулирующими. Экстракт женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) индуцирует улучшение липидного профиля крови, главным образом, за счет снижения уровня общего и ЛПНП-холестерина [17].
С развитием науки и техники в области человеческого потенциала и высокой конкуренции на молочном рынке стоит ожидать появления молочных продуктов с добавлением антиоксидантов для усиления иммунного эффекта.
Из существующего уровня техники известен способ получения БАД к пище (патенте РФ №2370151, опубл. 20.10.2009). БАД к пище получают на основе растительного сырья. Готовят медовые экстракты календулы, одуванчика, мяты перечной, солодки, взятые в виде настоев (отваров), пророщенных в сыворотке семян тыквы, нута и расторопши. К основному недостатку данного способа получения БАД к пище относится применение в качестве экстрагента меда. Во-первых, у некоторых потребителей БАД наблюдается индивидуальная непереносимость меда. Во-вторых, мед является достаточно дорогим экстрагентом. Также данная БАД характеризуется низкой антиоксидантной активностью из-за отсутствия фенольных кислот и стероидоподобных соединений.
5
Известен способ получения БАД к пище «ЭРАМИН» (патент РФ №2435455, опубл. 10.12.2011). Способ получения БАД включает подготовку растительного сырья, взвешивание компонентов рецептуры, приготовление раствора из сухой смеси сена люцерны, микроэлементов и дистиллированной воды, экстрагирование при температуре 180-190°С 5-6 ч при давлении 6⋅10 Па, сушку экстракта в сушильном шкафу при температуре 55-60°С продолжительностью 4 ч. К недостаткам данного способа относят высокую температуру и продолжительность экстрагирования растительного сырья, а также низкую антиоксидантную активность.
Описан метод получения биологически активной пищевой добавки (патент РФ №2449600, опубл. 10.05.2012). БАД представляет собой комплекс из растительного сырья, инозина, янтарной кислоты и вспомогательного компонента - стеарата магния. В качестве компонентов растительного происхождения используют сухие экстракты из элеутерококка колючего, плодов расторопши пятнистой, якорцев стелющихся и зеленого чая. К недостатку данного метода относят недостаточно сбалансированные по своему составу БАВ, невысокую антиоксидантную активность из-за отсутствия фенольных кислот и стероидоподобных соединений.
Существует способ получения сухой смеси для приготовления спортивного напитка (патент РФ №2579211, опубл. 10.04.2016). Способ предусматривает получение сухой биологически активной добавки, которая содержит, масс. %: сыворотку подсырную сухую 25,0-27,0, сухой экстракт ягод годжи 22,2-24,2, сухой экстракт ананаса 20,1-20,4, пыльцу цветочную 11,1-12,2, молочко пчелиное маточное 4,3-4,5, фруктозу - остальное. Недостатком этой композиции является непереносимость у некоторых пациентов отдельных компонентов, например, пчелиного маточного молочка и цветочной пыльцы.
Также у данной БАД имеется низкая антиоксидантная активность из-за отсутствия фенольных кислот и стероидоподобных соединений.
Патент РФ №2672914, опубл. 21.11.2018 описывает получение молочной сыворотки с антиоксидантными свойствами. Изобретение описывает получение антиоксидантного комплекса, который содержит: антиоксидант растительного происхождения и молочный гидролизат, обогащенный лактатами в процессе гидролиза, из молочной сыворотки и/или пахты, и/или обезжиренного молока. Недостатком способа является несбалансированный состав витаминно-минерального комплекса, который не обладает антиоксидантными свойствами.
Известен метод получения БАД к пище капсулированной формы (патент РФ №2756855, опубл. 06.10.2021). Способ включает получение БАД капсулированной формы, содержащей комплекс БАВ в форме сухого экстракта в качестве активного компонента, включающего в себя корни заманихи высокой, траву хвоща полевого, плоды кизила, плоды череды трехраздельной, корни и корневища девясила, побеги черники обыкновенной, траву гелеги, листья шелковицы и листья земляники. Способ получения БАД капсулированной формы включает получение жидкого экстракта с последующим выпариванием, очистку экстракта с последующим получением сухого экстракта, перемешивание с вспомогательными веществами и инкапсулирование. В числе недостатков способа получения такой БАД следует назвать ультразвуковую экстракцию растительного сырья, так как при таком методе экстракции используется дорогое оборудование, высокая агрессивность ультразвука в отношении антиоксидантных веществ. В качестве экстрагента используется вода, такой экстрагент не способен выделять достаточно высокое количество антиоксидантного комплекса БАВ.
Описан способ получения БАД на основе растительного источника для комплексного эффективного питания собак (патент CN №104026419А, опубл. 10.09.2014). Способ приготовления комплексной БАД растительного происхождения для собак, предназначенной для самостоятельного питания, включает этапы: добавление сухого обезжиренного молока, сухой молочной сыворотки, сахарозы и галактоолигосахарида в контейнер, равномерное перемешивание и добавление микрокристаллической целлюлозы, смешивание питательного вещества с растительным источником (экстракт грецкого ореха, экстракт ореха пекан и экстракт банана), повторное перемешивание, затем вся смесь таблетируется. Недостатками являются длительность процесса выпаривания экстрактов грецкого ореха, ореха пекан и банана, а также низкая антиоксидантная активность из-за отсутствия фенольных кислот и стероидоподобных соединений.
В патенте (патент RO №134736А2, опубл. 26.02.2021) описан способ получения микрокапсулированной БАД различной функциональности на основе экстрактов антоцианов из кожуры баклажанов и молочнокислых бактерий, и ее применение. Согласно изобретению, способ заключается в сублимационной сушке этанолового экстракта из кожуры баклажанов, имеющего высокое содержание антоциановых соединений, и выбранных молочнокислых бактерий в комбинации матриц на основе сывороточных белков и гидролизатов, карбоксиметилцеллюлозы и пектина, с получением натуральных ингредиентов с биосовместимостью in vitro, с высокой антиоксидантной и метаболической активностью. Недостатком данного способа является лиофилизационное высушивание экстракта кожуры баклажанов, так как для лиофилизации необходима тщательная подготовка высушиваемого сырья к сушке, создание вакуума для полноты высыхания, длительность сушки и достаточно высокие энергозатраты. Также для данной БАД отмечена низкая антиоксидантная активность из-за отсутствия фенольных кислот и стероидоподобных соединений.
Известен способ получения БАД к пище с антиоксидантными свойствами (патент MD №1480Y, опубл. 31.01.2021). Изобретение относится к пищевой промышленности и санокреатологии, а именно к биологически активной добавке к пище, обладающей антиоксидантной активностью. Пищевая добавка, согласно изобретению, содержит, в мас. %: сухой экстракт семян амаранта 25, сухой экстракт листьев полыни горькой 35, сухой экстракт дигидрокверцетина 10, сухой экстракт скорлупы грецкого ореха 10, сухой экстракт корней одуванчика 10 и активированный уголь 10. К недостаткам данного способа относят высокую температуру и продолжительность экстрагирования растительного сырья, что приводит к разрушению антиоксидантных БАВ.
Наиболее близким к заявляемому способу (ближайшим аналогом) является способ производства биологически активной добавки к пище капсулированной формы (патент РФ №2759731, опубл. 17.11.2021). Данный способ подразумевает получение БАД капсулированной формы, содержащей комплекс БАВ в форме сухого экстракта в качестве активного компонента, включающей в себя траву тысячелистника, цветки ноготков, листья березы, траву хвоща полевого, корни солодки голой, листья крапивы, плоды фенхеля в соотношении 2:2:1,5:1,5:1:1:1, и комплекс вспомогательных веществ, включающий в себя наполнитель, связующее, дезинтегрант, противоприлипающее, скользящее. Способ получения БАД капсулированной формы включает получение жидкого экстракта с последующим выпариванием, очистку экстракта с последующим получением сухого экстракта, перемешивание с вспомогательными веществами и инкапсулирование. БАД применяют в качестве источника флавоноидов и глицизирриновой кислоты. Недостатком данной БАД является многокомпонентность состава, которая ведет к низкой стабильности из-за химического взаимодействия ингредиентов. Также данная БАД характеризуется низкой антиоксидантной активностью из-за отсутствия фенольных кислот и стероидоподобных соединений, также не содержит дополнительный источник лактозы, белка, витаминов, макро- и микроэлементов.
Техническая задача, решаемая использованием разработанного изобретения, состоит в разработке нового способа получения биологически активной добавки к пище с антиоксидантными свойствами на основе молочной сыворотки и экстрактов клеточных культур тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу).
Техническим результатом, полученным при реализации заявленного способа, является получение капсулированной формы биологически активной добавки, содержащей сухую молочную сыворотку и антиоксидантный комплекс биологически активных веществ (БАВ) растительного происхождения.
Для достижения указанного технического результата предложено использовать способ получения капсулированной БАД на основе сухой молочной сыворотки и экстрактов клеточных культур тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу), включающий последовательные этапы: выращивание клеточных культур растений, водно-спиртовая экстракция высушенной биомассы клеточных культур растений, фильтрование экстракта, выпаривание этилового спирта, распылительное высушивание молочной сыворотки и экстрактов клеточных культур растений in vitro, смешивание и капсулирование компонентов БАД: сухой молочной сыворотки, сухих растительных экстрактов и вспомогательных веществ.
В настоящее время особенное внимание привлекает метод получения изолированных клеток и тканей растений с последующим выделением из них БАВ. Клеточные культуры растений в сравнении с традиционным растительным сырьем имеют ряд преимуществ: возможность круглогодичного получения сырья независимо от природных условий региона и климатических параметров года; возможность оптимизации и стандартизации условий выращивания; способность клеточных культур растений синтезировать высокий уровень вторичных метаболитов, превосходящий уровень традиционных растений.
Разработанный способ реализуют следующим образом.
Предварительно выращивают каллусную культуру тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневую культуру женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу).
Для определения и разработки качественного и количественного состава капсул БАД использованы результаты количественного определения фенольных кислот в биомассе каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и гинзенозидов в биомассе корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу), которые приведены в таблице 1.
На втором этапе осуществляется процесс водно-спиртовой экстракции высушенной биомассы каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу). Температура для экстракции биомассы каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris) составляет 70°С, для биомассы корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) - 50°С; концентрация этилового спирта для экстракции каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris) равна 70%, а для корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) - 30% при соотношении растительное сырье/экстрагент 1:86, продолжительность экстрагирования для обеих клеточный культур составляет 4 ч.
На третьем этапе полученные экстракты подвергают очистке с помощью фильтрационной установки - друк-фильтра, работающего под давлением углекислого газа, азота и флегматизированного воздуха.
Четвертый этап подразумевает выпаривание полученных экстрактов каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) на роторной вакуум-выпарной установке. В испарителе происходит концентрирование экстракта до 20% сухих веществ от общего объема.
Пятый этап заключается в высушивании экстрактов каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) и молочной сыворотки. Высушивание осуществляется распылительным способом.
Шестой стадией в рамках описанного способа является смешивание и капсулирование компонентов БАД: сухой молочной сыворотки, сухих растительных экстрактов и вспомогательных веществ.
Экспериментальным путем установлен оптимальный состав БАД капсулированной формы на основе сухой молочной сыворотки и сухих экстрактов каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу), обладающих антиоксидантными свойствами. Для капсулирования компонентов БАД используют желатиновые капсулы, вмещающие 700 мг биодобавки. Помимо сухих растительных экстрактов и сухой молочной сыворотки в состав БАД входят вспомогательные вещества: микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ), диоксид кремния коллодный (аэросил) и стеарат магния.
Необходимое количество фенольных кислот в высушенной биомассе каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и гинзенозидов в высушенной биомассе корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) на основании рекомендованных доз, указанных в методических рекомендациях MP 2.3.1.1915-04 «Рекомендуемый уровень потребления пищевых и биологически активных веществ», представлено в таблице 2 [18]. В составе суточной порции БАД содержание фармакологически активных соединений лекарственного растения должно быть не более 50-60% от разовой терапевтической дозы (РТД) при использовании данного растения в качестве лекарственного средства. При этом нижняя граница содержания этих соединений в БАД не должна быть менее 10% от разовой терапевтической дозы.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1. Подготавливают каллусную культуру тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.). На первом этапе получения каллусной культуры тимьяна обыкновенного используют стерильные семена. Стерилизация семян тимьяна обыкновенного осуществляется следующим образом: семена промывают детергентом, затем помещают в 70%-ный этиловый спирт на 1 мин, после чего в 5%-ный раствор гипохлорита натрия на 50 мин. После стерилизации материал трехкратно отмывают в течение 20 мин в дистиллированной стерильной воде. После стерилизации для получения стерильных проростков семена высаживают на питательную среду, следующего состава: макросоли по Гамборгу (В5)×20 - 50 мл; микросоли В5×20 - 10 мл; Fe-ЭДТА - 5 мл; сахароза - 30 мг; никотиновая кислота - 1 мг; пиридоксин - 1 мг; тиамин - 10 мг; инозит - 100 мг; агар - 20; дистиллированная вода - 1000 мл. Первые проростки тимьяна обыкновенного наблюдаются спустя 4-5 недель. Для индукции каллусных культур клеток используют 2-8 недельные стерильные проростки с 2-4 настоящими листьями. Для этого листья и стебли проростков разрезают на части и высаживают на агаризованные среды в чашки Петри диаметром 60 и 90 мм, а также в баночки с вентилируемыми крышками. Образование первичных каллусов наблюдают на 7-14 сутки культивирования. Питательной средой для дальнейшего выращивания каллусной культуры тимьяна обыкновенного служит питательная среда, следующего минерального и гормонального состава: макросоли В5х20 - 50,00 мл; микросоли В5 - 10,00 мл; Fe-ЭДТА - 5,00 мл; тиамин - 10,00 мг; пиридоксин - 1,00 мг; никотиновая кислота - 1,00 мг; сахароза - 30,00 г; инозит - 100,00 мг; кинетин - 2,00 мг; 6-бензиламинопурин (6-БАП) - 0,10 мг; р-индолилуксусная кислота (ПУК) - 2,00 мг; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) - 2,00 мг; агар - 20,00 г; дистиллированная вода - 1000 мл. Из образовавшихся проростков в качестве эксплантов используют стебли и листья (через 8 суток после появления первого листа). Все экспланты помещают на питательную среду аналогичного минерального и гормонального состава и инкубируют около 25 суток. Первичный каллус отделяют от остатков растительных эксплантов и переносят на свежую питательную среду. Дальнейший цикл выращивания культуры составляет 4-5 недель.
Каллусные культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) подвергают высушиванию при температуре 25°С в защищенном от действия света месте и измельчению. Высушенный растительный материал измельчают в мельнице марки ЛЗМ-1М (Россия, Олис) и просеивают через сито с размером отверстия 1 мм. Процесс экстракции каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris) осуществляют при температуре 70°С, концентрации этилового спирта 70% при соотношении растительное сырье/экстрагент 1:86 в течение 4 ч.
Полученные экстракты подвергают очистке с помощью фильтрационной установки - друк-фильтра, работающего под давлением углекислого газа, азота и флегматизированного воздуха.
После очистки экстракт подвергается выпариванию на роторной вакуум-выпарной установке. В испарителе происходит концентрирование экстракта до 20% сухих веществ от общего объема.
Дальнейшее высушивание экстракта осуществляют на распылительной сушилке при температурном режиме 90°С, скорости потока воздуха (аспирации) 100 м /ч и скорости подачи раствора в распылительную установку 7 мл/мин.
Высушенный экстракт каллусной культуры тимьяна обыкновенного является одним из компонентов БАД. Второй биоактивный компонент - сухая молочная сыворотка (творожная и/или подсырная).
Высушивание молочной сыворотки (творожная и/или подсырная) осуществляется на распылительной установке при заданных параметрах: температура высушивания составляет 100°С, скорость потока воздуха (аспирация) - 100 м /ч и скорость подачи раствора в распылительную установку 10 мл/мин.
Следующая стадия - смешивание компонентов БАД. Процесс смешивания подразумевает соединение в V-образном смесителе для сыпучих сред следующих компонентов: сухой экстракт каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.), сухая молочная сыворотка (творожная и/или подсырная) и вспомогательные вещества в соответствии с рецептурой БАД (таблица 3). После смешивания компонентов БАД происходит капсулирование в желатиновые капсулы. Полученные капсулы упаковываются в цельные блистеры по 10 ячеек.
Для готовой БАД проводят контроль показателей качества, в том числе устанавливают антиоксидантную активность (таблица 6, 7).
Пример 2. Аналогичен примеру 1, но способ предусматривает использование корневой культуры женьшеня настоящего.
2
600
Подготавливают корневую культуру женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу). На первом этапе получения корневой культуры женьшеня настоящего используют стерильные корневища. Корневища промывают детергентом и помещают в 0,1%-ный раствор сулемы (HgCl) на 1 мин. После стерилизации материал трехкратно отмывают в течение 20 мин в дистиллированной стерильной воде. Части корневища разрезают скальпелем на сегменты размером 5×5 мм и используют в качестве эксплантов. Для трансформации экспланты протыкают стерильной иглой и помещают на питательную среду В5, содержащую суспензию (OD=0.4) агробактерии Agrobacterium rhizogenes. Перед трансформацией суспензионную культуру агробактерии наращивают на среде YEB в течение 24 ч в темноте, при +23°С на качалке с круговым вращением (амплитуда 5-10 см, скорость вращения 90 об/мин). В качестве контроля используют проткнутые иглой экспланты, помещенные на твердую среду В5 без нанесения суспензии микроорганизма.
После 12-48 ч выдерживания в бактериальной суспензии экспланты промывают стерильной водой, удаляют с них влагу (насухо) стерильной фильтровальной бумагой, и помещают на твердую среду В5, содержащую 500 мг/л цефотаксима («Клафоран», Великобритания). Антибиотик добавляют для удаления остатков агробактерий. Через 30 суток культивирования оценивается частота трансформации (количество трансформированных эксплантов к их общему количеству).
Отбирают трансформированные экспланты, опираясь на фенотипические признаки (латеральное ветвление, отсутствие геотропизма, способность расти в среде без гормонов). В дальнейшем два пассажа полученных корней осуществляют на твердой среде В5, не содержащей гормоны, но содержащей уменьшенную дозу цефотаксима (250 мг/л). Культивирование происходит в отсутствии света при температуре +23°С на качалке с частотой 100 об/мин, продолжительность 5 недель. Последующую пересадку на свежую среду проводят по мере появления контаминации агробактерией.
Через 14 суток наблюдают ризогенез на отдельных эксплантах. Проростки женьшеня настоящего разрезают на сегменты по 0,5 см (0,5-1,0 г) и погружают штамм Agrobacterium rhizogenes на 15 мин. После инфицирования эксплантаты сушат на стерилизованной фильтровальной бумаге и культивируют при 23°С в темноте на среде 1/2 Мурасиге-Скуга (MS), содержащей 500 мг/л цефотаксима. Через 2 суток совместного культивирования эксплантаты переносят в среду 1/2 MS, содержащую 500 мг/л цефотаксима для уничтожения Agrobacterium. Цикл культивирования корневых культур женьшеня настоящего составляет 5 недель.
Корневые культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) подвергают высушиванию при 25°С в защищенном от действия света месте и измельчению. Высушенный растительный материал измельчают в мельнице марки ЛЗМ-1М (Россия, Олис) и просеивают через сито с размером отверстия 1 мм. Процесс водно-спиртовой экстракции корневой культуры женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу) осуществляется при температурном режиме 50°С и концентрации этилового спирта 30% при соотношении растительное сырье/экстрагент 1:86 продолжительностью 4 ч.
Стадии очистки и высушивания экстракта, получения сухой молочной сыворотки, смешивания компонентов БАД и капсулирования аналогичны примеру 1. Рецептура БАД на основе экстракта корневой культуры женьшеня настоящего приведена в таблице 4.
Результаты определения химического состава и антиоксидантной активности БАД представлены в таблицах 6,7.
Пример 3. Аналогичен примеру 1 и 2, но отличается рецептурой БАД. В данную БАД входит смесь сухих растительных экстрактов каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) и корневой культуру женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А. Меу), сухая молочная сыворотка и вспомогательные вещества, в соответствии с рецептурой (таблица 5).
Готовую БАД подвергают контролю показателей качества, в том числе проводят анализ антиоксидантной активности (таблица 6, 7).
В основе количественного определения комплекса БАВ антиоксидантной направленности лежит метод ВЭЖХ. Результаты проведенного анализа представлены в таблице 6.
+
Антиоксидантную способность очистки от радикалов 2,2'-азино-бис-(3-этил-бенотиазолина-6-сульфоновой кислоты) диаммониевой соли (ABTS) («Angene», Великобритания) определяли в соответствии с методикой [19]. Результаты определения антиоксидантной активности БАД представлены в таблице 7.
Определяющими существенными отличительными признаками заявляемого способа получения БАД капсулированной формы на основе молочной сыворотки и экстрактов Thymus vulgaris L. и Panax ginseng С.А. Меу по сравнению с ближайшим аналогом (патент РФ №2759731), являются:
- Использование каллусных и корневых культур in vitro Thymus vulgaris L. и Panax ginseng С.А. Меу позволяет получить высокий выход антиоксидантных БАВ в сравнении с традиционным растительным сырьем;
- Распылительное высушивание экстрактов каллусных и корневых культур in vitro Thymus vulgaris L. и Panax ginseng С.А. Меу, позволяет сократить продолжительность высушивания, что в свою очередь способствует сохранению БАВ и сокращению энергозатрат.
- Способ подразумевает использование молочной сыворотки как дополнительного источника легкоусвояемого белка, лактозы, витаминов, микро- и макроэлементов.
Список литературы:
1. Мякиньков, А.Г. Вторичные сырьевые ресурсы молочной промышленности и пути их рационального использования в условиях рыночной экономики / А. Г. Мякиньков // Пищевая и перерабатывающая промышленность. Реферативный журнал. - 2001. - №1. - С. 357.
2. Шувалова, Е.Г. Пищевая и биологическая ценность молочной сыворотки и ее рациональное использование / Е.Г. Шувалова, А.С. Арнатович, Е.Ю. Седых // Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства. - 2018. - №20. - С. 271-273.
3. Витушкина, М. А. Использование молочной сыворотки в пищевой промышленности / М. А. Витушкина // Вестник науки. - 2021. - Т. 5. - №1(34). -С.127-132.
4. Волкова, Т. А. К вопросу об эффективном использовании молочной сыворотки / Т. А. Волкова // Сборник научных трудов к 75-летию со дня основания ВНИИМС "Научные подходы к решению актуальных вопросов в области переработки молока", Углич, 05-06 сентября 2019 года. - Углич: Всероссийский научно исследовательский институт маслоделия и сыроделия, 2019. - С.120-124.
5. Патент №2363238 С1 Российская Федерация, МПК А23К 1/08. Способ получения молочно-растительной кормовой добавки: №2008114792/13: заявл. 15.04.2008: опубл. 10.08.2009 / И. М. Осадченко, И. Ф. Горлов, С.Е. Божкова [и др.]; заявитель Государственное учреждение Волгоградский научно-исследовательский технологический институт мясо-молочного скотоводства и переработки продукции животноводства Россельхозакадемии (ГУ ВНИТИ ММС и ППЖ Россельхозакадемии).
6. Berger RG, Lunkenbein S, Strohle A, Hahn A. Antioxidants in food: mere myth or magic medicine? Crit Rev Food Sci Nutr. 2012;52(2):162-71. doi: 10.1080/10408398.2010.499481.
7. Hagymasi K, Egresi A, Eengyel G. Antioxidansok-antioxidanssokk: tenyek es kerdesek, 2015 [Antioxidants-antioxidative stress: facts and questions, 2015]. Orv Hetil. 2015 Nov 22;156(47):1884-7. Hungarian. doi: 10.1556/650.2015.30302.
8. Naito Y, Yoshikawa T. [Antioxidants as anti-ageing medicine]. Nihon Rinsho. 2009 Jul;67(7): 1377-83.
9. Mahdavi, A. Variation in Terpene Profiles of Thymus vulgaris in Water Deficit Stress Response / A. Mahdavi, P. Moradi, A. Mastinu // Molecules. - 2020. -№25(5). - P. 1091. doi: 10.3390/molecules25051091.
10. Винокурова, О.А. Сравнительная характеристика различных видов тимьяна: состав, свойства, применение (обзор) / О.А. Винокурова, О.В. Тринеева, А.И. Сливкин // Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2016. - №4(17). - С134-150.
11. Винокурова, О.А. Сравнительная характеристика различных видов тимьяна: состав, свойства, применение (обзор) / О.А. Винокурова, О.В. Тринеева, А.И. Сливкин // Разработка и регистрация лекарственных средств. -2016. -№4(17).-С134-150.
12. Kang, O-J. Comparison of Ginsenoside Contents in Different Parts of Korean Ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) / O-J. Kang, J-S. Kim // Nutr. Food Sci. - 2016. - №21 (4). - P. 389-392. https://doi.Org/10.3746/rJnf.2016.21.4.389.
13. Kim, D. H. Chemical Diversity of Panax ginseng, Panax quinquifolium, and Panax notoginseng / D. H. Kim // Journal of ginseng research. - 2012. - №36 (1). - P. 1-15. https://doi.Org/10.5142/jgr.2012.36.l.l.
14. Kim, J-S. Investigation of phenolic, flavonoid, and vitamin contents in different parts of Korean Ginseng (Panax ginseng CA Meyer) / J-S. Kim // Preventive Nutrition and Food Science. - 2016. - №3 (21). - C. 263. DOI: 10.3746/pnf.2016.21.3.263.
15. Mancuso, C. Panax ginseng and Panax quinquefolius: from pharmacology to toxicology / C. Mancuso, R. Santangelo // Food and Chemical Toxicology. -2017. -№107. -P. 362-372. doi: 10.1016/j.fct.2017.07.019.
16. Oshima, Y. Isolation and hypoglycemic activity of panaxans I, J, К and L, glycans of Panax ginseng roots / Y. Oshima, C. Konno, H. Hikino // J Ethnopharmacol. - 1985. - №14 (2-3). - P. 255-9. DOI: 10.1016/0378-8741(85)90091-1.
17. Zhao, J.L. Microwave-Assisted Extraction, Purification, Partial Characterization, and Bioactivity of Polysaccharides from Panax ginseng / J. L. Zhao, M. Zhang, H. L. Zhou // Molecules (Basel, Switzerland). - 2019. - №24 (8). -P. 1605. https://doi.org/!0.3390/molecules24081605.
18. Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ: Методические рекомендации. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.
19. Study of antioxidant activity and phenolic compounds of extracts obtained from different craft beer by-products / M.J. Petron, A.I. Andres, G. Esteban, MX. Timon // Journal of Cereal Science. - 2021. №98. - c.103162. https://doi.org/10.1016/i.ics.2021.103162.