Способ выделения некультивируемых форм стафилококков
METHOD OF EXTRACTING UNCULTIVATED FORMS OF STAPHYLOCOCCI

Изобретение относится к области медицины, более конкретно к сфере медицинской микробиологии и может быть широко использовано, в лабораторной диагностике для выявления стафилококковой инфекции.
Существует проблема в создании безопасной среды для пребывания пациентов в стационарах и обеспечения качества медицинской помощи как приоритетных задач здравоохранения. Стафилококковые инфекции признаны одними из наиболее опасных, осложняющими результат оказания медицинской помощи в стационарных и особенно в родовспомогательных учреждениях. Широкое использование антибиотикотерапии привело к возникновению некультивируемых форм микроорганизмов. Наибольшая опасность заключается в способности стафилококков при кратном попадании в организм других людей рекультивироваться (оживляться) и восстанавливать свою патогенность. В связи с этим существует проблема быстрого и достоверного обнаружения стафилококковой инфекции, как при диспансеризации населения, так и при госпитализации в стационары, роддома.
Известен, например, способ культивирования культуры Staphilococcus aureus (См.: Лабинская А.С. «Микробиология с техникой микробиологических исследований»/ издательство «Медицина», 1978. – 394 с.) на мясопептонном агаре (МПА) и на желточно-солевом агаре при температуре +37°С. Однако известный способ не позволяет выявить все возможные формы стафилококка. Бактерии, обладающие некультивируемыми свойствами не растут на питательных средах, применяемых для микробиологических исследований, но обладают патогенными свойствами, за счёт этого в микробиологических лабораториях регистрируют ложно-отрицательные результаты исследований.
Наиболее близким аналогом (прототипом) заявленного изобретения является способ выделения некультивируемых форм стафилококков по патенту РФ № 2470074 от 14.11.2011 на изобретение (МПК C12Q 1/04). Данный способ основан на культивировании исследуемого материала на мясопептонном агаре в течение 24 ч при температуре 37°С, а затем выросшую культуру бактерий выдерживают при температуре +4°С в течение 48 ч.м. Недостатком прототипа является то, что культивирование на мясопептонном агаре некультивируемых форм стафилококков не представляется возможным. При воспроизведении способа не удаётся получить положительный результат.
Задача заявленного изобретения состояла в разработке нового способа для достоверного выделения некультивируемых форм стафилококков, лишённого недостатков известных аналогов. Техническим результатом заявленного изобретения является создание простого, не требующего значительных материальных затрат способа выделения некультивируемых форм стафилококков.
Сущность изобретения заключается в том, что способ выделения некультивируемых форм стафилококков, включает посев исследуемого биоматериала, причем тампон с биоматериалом предварительно инкубируют от 18 до 24 часов в термостате при температуре +37˚С в 2,0 мл жидкой питательной среды - ГРМ-бульоне, содержащем от 1% до 4% глюкозы, затем осуществляют посев полученной взвеси микроорганизмов самим тампоном или калибровочной петлёй по методу Голда, параллельно на 3 чашки Петри - с мясопептонным агаром, 5% кровяным агаром и 10% желточно-солевым агаром, после чего посевы культивируют от 24 до 48 часов при температуре +37˚С, с последующим проведением качественного и количественного учёта роста культур стафилококков по видовым признакам.
Способ выделения некультивируемых форм стафилококков. Вначале в соответствии с Методическими указаниями МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» осуществляют забор биоматериала из носа, глотки и нёбных миндалин одноразовым стерильным зондом-тампоном. Затем способ осуществляют в два этапа. Первый этап – предварительный. На данном этапе в стандартную стерильную пластиковую пробирку объёмом 10,0 мл наливают в количестве 2,0 мл 1-4% глюкозный бульон, приготовленный на основе питательной среды ГРМ-бульона. ГРМ-бульон предназначен для культивирования различных микроорганизмов, неприхотливых по своим питательным потребностям, при проведении исследований в санитарной и клинической микробиологии. «ГРМ-бульон» представляет собой мелкодисперсный гигроскопичный порошок светло-желтого цвета. Производят «ГРМ-бульон»  в ФБУН «ГНЦПМБ», Россия, Московская обл., Серпуховской р-он, п. Оболенск, в двух вариантах (из расчета, г/л): 1) панкреатический гидролизат рыбной муки 18,0 и натрия хлорид 2,0; 2) панкреатический гидролизат рыбной муки 8,0, пептон сухой ферментативный 8,0 и натрия хлорид 4,0. Затем окунают зонд-тампон с биоматериалом и оставляют в термостате при температуре 37˚С на 18-24 часа для инкубации. Далее готовят глюкозный бульон: из расчета на 1 литр дистиллированной воды, добавляют 20,0 г коммерческого порошка ГРМ-бульона , непрерывно помешивая, доводят раствор до кипения, добавляют от 1% до 4 % порошка глюкозы (10-40 грамм соответственно) и в течение 3 минут кипятят до полного его растворения. Приготовленный таким образом глюкозный бульон разливают в стеклянные флаконы по 500,0 мл, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм (121˚С) в течение 30 минут. Второй этап предполагает осуществление посева калибровочной петлёй (d=3мм) бактериальной взвеси из пробирки с 1% глюкозным ГРМ-бульоном секторами по методу Голда на чашки Петри, заполненные питательными средами: мясопептонным агаром (МПА), 5% кровяным агаром (КА) и 10% желточно-солевым агаром (ЖСА).
Таблица 1
Желточно-солевой агар (ЖСА)
Среда предназначена для выделения стафилококков, выявления липохромного пигмента и лецитовителлазы.Для приготовления используют мясопептонный агар (рН 7,3+0,1) с добавлением 10% натрия хлорида. После розлива во флаконы по 100,0-200,0 мл агар стерилизуют в автоклаве в течение 20 минут при температуре 121°С.Перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до 45-50˚С и добавляют 20% (к объёму) стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150,0-200,0 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида). Среду быстро перемешивают, разливают в чашки, которые продолжительное время могут оставаться в холодильнике в полиэтиленовых пакетах. Готовая среда полупрозрачная, имеет беловатый цвет с лёгким кремовым оттенком.Учёт результатов производят через 36-48 ч инкубации в термостате при 35-37°С.
Кровяной агар (КА)
К 100,0 мл растопленного и остуженного до 45°С  2% стерильного МПА рН 7,5+0,1, соблюдая правила асептики, добавляют 5,0 мл МПА стерильной дефибринированной крови лошади, кролика, барана или человека, не содержащей консервантов или антибактериальных препаратов. Смесь тщательно перемешивают, остерегаясь образования пены. Готовую среду разливают равномерным слоем не более 4,0 мм в стерильные чашки Петри.
Мясопептонный агар (МПА)
МПА применяют для выращивания неприхотливых микроорганизмов и как основу для приготовления плотных специальных сред для культивирования более требовательных микробов (сывороточного, кровяного агара и др.)Состав:Пептон – 10,0 гВода мясная – 1000,0 млАгар – 1,0 – 20,0 грН  7,3+0,2Смесь кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Бульон фильтруют, усиливают рН и добавляют измельчённый агар (в зависимости от качества агара и назначения среды). После добавления агара среду кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды её просветляют одним из известных способов.Приготовленную среду разливают в пробирки или флаконы, стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 20 мин.
После инкубации, произведённых посевов при 37°С в течение 18-24
часов, осуществляют качественный и количественный учёт стафилококков (в
микробных единицах - МЕ). Качественный учёт роста микроорганизмов
проводят визуально, оценивая морфологические особенности золотистых и
коагулазоотрицательных стафилококков, традиционно подтверждая
достоверность оценки тестом на плазмокоагулазу. Таким образом, в
пробирке с биоматериалом в 1% глюкозном ГРМ-бульоне осуществляется
переход стафилококка из некультивируемой формы в культивируемую за
счёт повышения питательных свойств среды.
Заявленный способ поясняется конкретными примерами исполнения,
не ограничивающими объём правовой охраны.
Пример 1
. Подтверждается рост некультивируемых стафилококков на
разных вариантах питательных сред. В эксперименте сравнивают
количественный рост стафилококков на средах МПА, КА, ЖСА после
прямого посева биоматериала от больных людей и после предварительной
инкубации материала (24 часа при 37°С) на 1% глюкозном ГРМ-бульоне.
Рост НФ стафилококков в результате культивирования биоматериала от
людей на МПБ, 1% глюкозном МПБ и 1%, 2%, 3%, 4% глюкозных ГРМ-
бульонах представлен в таблице 2 и свидетельствует о положительном
результате в случае инкубации как на 1% глюкозном МПБ, так и на 1-4%
глюкозных ГРМ-бульонах. Однако ГРМ-бульон дешевле мясопептонного
(МПБ), в связи с чем, и был выбран нами для использования.
Таблица 2
Оценка роста некультивируемых форм стафилококков на разных вариантах жидких питательных сред
Вид микроба, выделенного от человека
Наличие роста на питательных средах
МПБ
1% глюкозный МПБ
1% глюкозный ГРМ-бульон
2% глюкозный ГРМ-бульон
3% глюкозный ГРМ-бульон
4% глюкозный ГРМ-бульон
НФ S.aureus
-
+
+
+
+
+
НФ стафилококки коагулазо-отрицательные
-
+
+
+
+
+
Количество КоЕ/млНФ S.aureus                на ЖСА
-
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
КоличествоКоЕ/мл коагулазо-отрицательных стафилококков            на ЖСА
-
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
Количество КоЕ/млНФ S.aureusна КА
-
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
Количество   КоЕ/мл коагулазо-отрицательных стафилококков             на КА
-
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
Пример 2.
Отражает количественный рост (в МЕ) некультивируемых
форм стафилококков при разных способах выращивания. Биоматериал,
взятый из глоток людей в количестве 200 проб, был посеян на
универсальную среду - 5% кровяной агар (КА) и 10% желточно-солевой агар.
После культивирования посевов при 37°С через 24-48 ч на ЖСА и КА рост
стафилококков отсутствовал. При этом на КА отмечался рост другой
микрофлоры, среди которой встречались: непатогенные нейссерии,
коринеформные бактерии, стрептококки всех групп (α-,β-,γ-гемолитические),
гемофильные палочки, иногда энтеробактерии. В соответствии с
методическими рекомендациями, биоматериал на тампонах вносили в
пробирку с МПБ и культивировали в течение суток при 37°С. В качестве
эксперимента второй тампон с тем же биоматериалом вносили в пробирку с
1% глюкозным ГРМ-бульоном (37°С, 24 часа). После суточного
инкубирования, параллельно из обеих пробирок осуществляли повторный
посев на среды (ЖСА, КА, Сабуро-агар) и снова культивировали при 37°С 24
часа. На чашках питательных сред с посевом из первой пробирки с МПБ рост
стафилококков отсутствовал, а на питательных средах с посевом из второй
пробирки с 1% глюкозным ГРМ-бульоном - присутствовал. Качественная
диагностика с использованием кроличьей плазмы позволяла установить
видовую принадлежность стафилококков и констатировать, что обнаружение
золотистого стафилококка происходило также часто, как и
коагулазоотрицательных видов. Культуры стафилококков вырастали на
обеих жидких средах - МПБ и 1% глюкозном ГРМ-бульоне, лишь в том
случае, если ранее они вырастали и на КА, а значит являлись
культивируемыми. При посеве из двух исследуемых пробирок
калибровочной петлёй (d=3мм) секторами по методу Голда на средах ЖСА и
КА, было установлено количественное преимущество роста стафилококков,
выросших во второй пробирке. Такая же закономерность прослеживалась
относительно роста дрожжеподобных грибов рода Candida на средах МПА и
Сабуро с антибиотиком хлорамфениколом после высева из двух
сопоставляемых сред (см. таблицу 3).
Таблица 3
Оценка количественного роста на твёрдых питательных средах
культивируемых и некультивируемых форм микроорганизмов после
предварительной их инкубации на МПБ и 1% глюкозном ГРМ-бульоне__
Вид микроорганизма
Название питательных сред
МПБ
1% глюкозный ГРМ-бульон
МПА
5% КА
10% ЖСА
Сабуро- агар
S.aureus6538рАТСС=209р
<b>+</b>
<b>+</b>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
НФ S.aureus
отр
отр
отр
отр
<b>+</b>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
НФ Стафилококки коагулазоотрицательные
отр
отр
отр
отр
<b>+</b>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
10<sup>8</sup>
Дрожжеподобные грибы рода Candida
<b>+</b>
10<sup>5</sup>
<b>+</b>
10<sup>8</sup>
Примечание: НФ – некультивируемая форма
Из таблицы 3 видно, что культивирование на 1% глюкозном ГРМ-
бульоне позволяет не только выделить некультивируемые формы
золотистых, коагулазоотрицательных стафилококков, но и увеличить
численность популяций культивируемых форм как стафилококков, так и
дрожжеподобных грибов рода Candida (не применяя в качестве добавки
антибиотики, как это делается при использовании жидкой среды Сабуро).
Выращивание на одной среде двух видов микроорганизмов без участия
дополнительных компонентов, увеличивает экономическую ценность
представленного варианта.
Пример 3.
Показывает наличие разной чувствительности к
антибиотикам у некультивируемых штаммов стафилококков (золотистых и
коагулазоотрицательных), выделенных от людей и штамма (S. aureus № 6538
pATCC=209р), взятого из коллекции музейных культур, полученной из
ГИСКа. В связи с тем, что выделенные от людей 199 штаммов
стафилококков не выросли при первичном посеве на КА, МПА и ЖСА, они
были отнесены к некультивируемым формам и исследованы на
резистентность которая представлена в таблице 4.
Таблица 4
Чувствительность к антибиотикам музейного штамма золотистого
стафилококка и штаммов некультивируемых коагулазоотрицательных и
золотистых стафилококков, выделенных от людей к антибиотикам,
Вид микроба
Количество штаммов
Название антибиотика
оксациллин
метициллин
амоксиклав
меропенем
имипенем
азитромицин
левофлоксацин
гентамицин
амикацин
левомицетин
ципрофлоксацин
цефепим
Ципрофлоксацин-сульбактам
кларитромицин
S.aureus 6538рАТСС=209р
1
в
в
в
в
в
в
в
в
в
в
в
в
в
в
НФ   S.aureus
99
р
р
у
у
у
у
у
у
у
у
у
у
в
у
НФСтафилококки коагулазо-отрицательные
100
р
р
у
у
в
у
у
в
у
в
у
в
у
у
Примечание: НФ - некультивируемая форма; в-высокая чувствительность, у-умеренная чувствительность, р-резистентность
Представленные в таблице 4 результаты свидетельствуют о наличии
устойчивости выделенных стафилококков ко многим антибиотикам, в том
числе 75,8% штаммов проявили резистентность к оксациллину
(полусинтетический пенициллин) и метициллину (бета-лактамный
антибиотик пенициллинового ряда), что указывает на принадлежность этих
культур к MRSA-штаммам, свидетельствующую об их инфекционной
агрессивности, что может быть опосредованно возможностью плазмидного
переноса с генами патогенности и антибиотикорезистентности.
Использование предполагаемого изобретения позволяет повысить
достоверность выделения возбудителей стафилококковых инфекций,
уменьшить количество отрицательных результатов исследований и
обеспечить в более полном объёме проведение противоэпидемических
мероприятий в очагах стафилококковых инфекций.