Токсикологический профиль препарата аимпила в хроническом эксперименте на крысах

Оригинальные статьи

79

токсикологический профиль препарата аимпила в хроническом эксперименте на крысах

и.д. трещалин1, в.А. Голибродо1, м.и. трещалин1, Н.в. Еремкин1, С.А. Цуркан2, Э.Р. Переверзева1

1ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе»; Россия, 119021 Москва, ул. Большая Пироговская, 11, стр. 1; 2ООО «Фармацевтический научный центр «ФармАксесс»»; Россия, 127322 Москва, ул. Милашенкова, 10, оф. 195

Контакты: Василиса Антоновна Голибродо vasilisa2006@gmail.com

Введение. Лекарственная терапия злокачественных опухолей, как правило, сопряжена с развитием побочных эффектов различной степени тяжести. Это связано с недостаточной избирательностью действия противоопухолевых агентов и, как следствие, высокой неспецифической токсичностью. Один из путей решения этой проблемы — создание таргетных лекарственных средств, обеспечивающих доставку активного агента непосредственно к опухолевым клеткам. В последние десятилетия были проведены многочисленные экспериментальные и клинические исследования таргетных препаратов, но только единицы из них продемонстрировали эффективность в клинической практике. Это обусловливает необходимость дальнейших поисков в этом направлении.

Цель исследования — выявление токсических свойств препарата аимпила, их зависимости от величины дозы и обратимости. Материалы и методы. На беспородных крысах (самках и самцах) проведено токсикологическое изучение противоопухолевого препарата аимпила, разработанного в ООО «ФНЦ «ФармАксесс»». Аимпила представляет собой нековалентный комплекс альфа-фетопротеина с атрактилозидом. Препарат в виде взвеси капсульной массы в крахмальном геле вводили перорально в 1 и 10 терапевтических дозах (0,1 и 1 мг/кг ежедневно в течение 30 сут). В ходе исследования определяли массу тела, проводили клинический и биохимический анализы крови, анализ мочи, снимали электрокардиограмму. На 1-е и 30-е сутки по окончании курса по 5 животных из каждой группы подвергали эвтаназии.

Результаты. Показано, что применение аимпилы не оказывает влияния на изученные клинико-лабораторные показатели состояния животных. Гепато-, нефро-, кардио-, панкреа- и гастроинтестинальная токсичность проявляются только при патоморфологическом исследовании органов животных, получавших высокую дозу препарата. Повреждения печени, найденные при микроскопическом изучении, подтверждаются результатами биохимического анализа сыворотки крови, который выявил значимое увеличение уровня аспартатаминотрансферазы. Обнаруженные изменения обратимы в течение 30 дней.

Выводы. В целом из результатов работы следует, что лекарственная форма аимпилы имеет благоприятный токсикологический профиль. Зависимость повреждающего действия препарата от величины примененной дозы и обратимость токсических эффектов позволяют рекомендовать изученную лекарственную форму аимпилы для дальнейшего продвижения.

Ключевые слова: аимпила, альфа-фетопротеин, атрактилозид, хроническая токсичность, крысы

DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-3-79-85

toxicological profile of aimpila drug in chronic experiment on rats

I.D. Treshchalin1, V.A. Golibrodo1, M.I. Treshchalin1, N.V. Eremkin1, S.A. Tsurkan2, E.R. Pereverzeva1

1G.F. Gause Institute of New Antibiotics; 11 Bldg. 1 Bol'shaya Pirogovskaya St., Moscow 119021, Russia; 2PharmaceuticalScientific Center "PharmAccess" Ltd.; of. 195, 10Milashenkova St., Moscow 127322, Russia

Introduction. As a rule, pharmacotherapy of neoplastic diseases is associated with side effects varying degrees of severity. This is determined by the insufficient selective action of antitumor agents and, as a result, high nonspecific toxicity. One way to solve this problem is the development of the targeted drugs, delivered the active agent to the tumor cells. Over the past decades many experimental and clinical studies were undertake, but only few of them have demonstrated clinical efficacy of targeted drugs. This determines the necessity of further search in this direction.

Objective: to investigate the toxicity of aimpila, its correlation with dose and reversibility.

Materials and methods. Toxicological study of aimpila, developed by Pharmaceutical Scientific Center "PharmAccess" Ltd. (Moscow), was performed in male and female outbred rats. Aimpila is atractyloside alpha-fetoprotein noncovalent complex. Capsule mass of the drug in starch gel was administrated per os at the 1 and 10 therapeutic dose (30 x 0.1 mg/kg or 30 x 1 mg/kg with 24-h interval). Dynamics of body weight, hematological parameters, blood biochemical parameters, electrocardiography and urinalysis were performed for all animals. 5 animals in each group were sacrificed 1 and 30 days post treatment.

Results. The results of the study demonstrate that the treatment with aimpila does not produce any changes in examined clinical-labora-

80 Оригинальные статьи

tory parameters. Liver, renal, cardio, pancreatic and gastrointestinal toxicity of aimpila have been documented by microscopic pathology observation only in groups of rats, treated with high dose of drug. Histopathological findings of hepatotoxicity were supported by the results of clinical chemistry. Marked elevation of aspartate aminotransferase in serum was found after high dose aimpila treatment. These abnormalities were reversible during a month. Conclusion. The overall result of this study suggests the aimpila formulation has favorable toxicological profiles. Dose dependence and reversibility of toxic effects allows us to recommend it to further advance. Key words: aimpila, alpha-fetoprotein, atractyloside, chronic toxicity, rats Введение сах — самцах и самках массой тела 150—180 г. После Лекарственная терапия злокачественных опухо- 2-недельного карантина было сформировано 6 групп лей, как правило, сопряжена с развитием побочных животных (по 3 группы самцов и самок) по 10 осо-эффектов различной степени тяжести. Это связано бей. Крысам экспериментальных групп перорально с недостаточной избирательностью действия проти- вводили взвесь капсульной массы аимпилы в 1 % воопухолевых агентов и, как следствие, высокой крахмальном геле в течение 30 дней с интервалом неспецифической токсичностью. Один из путей ре- 24 ч. Была использована капсульная масса следую-шения этой проблемы — создание таргетных лекар- щего состава: 0,001 г субстанции аимпила; 0,02 г ственных средств, обеспечивающих доставку актив- лактозы; 0,112 г микрокристаллической целлюлозы ного агента непосредственно к опухолевым клеткам. 102; 0,007 г кремния диоксида коллоидного. Разовые Несмотря на то что в последние десятилетия были дозы, эквивалентные 1 и 10 терапевтическим дозам, проведены многочисленные экспериментальные составляли 0,1 и 1 мг/кг соответственно. Величина и клинические исследования таргетных препаратов, терапевтической дозы для крыс была получена основанных на различных принципах направленной при пересчете с эффективной терапевтической дозы доставки цитотоксических веществ к клеткам-мише- для мышей с использованием кт-фактора. ням, лишь единицы из них продемонстрировали Клинико-лабораторные и патоморфологические эффективность в клинической практике, что обу- исследования проводили в соответствии с «Руковод-словливает необходимость дальнейших поисков ством по проведению доклинических исследований в этом направлении. лекарственных средств» [8]. Перед началом введения В ООО «ФНЦ «ФармАксесс»» разработан таргет- определяли фоновые показатели (массу тела, клиниче-ный противоопухолевый препарат аимпила, в кото- ский анализ крови). На протяжении всего эксперимен-ром в качестве средства направленной доставки ис- та наблюдали за состоянием и поведением животных, пользуется альфа-фетопротеин (АФП) [1]. Выбор регистрировали изменения массы тела. Гематологиче-АФП в данном случае обусловлен как имеющимся ское исследование производили на 1, 8 и 16-й дни положительным опытом его применения для лечения во время курса и на 1, 3, 5, 7, 10, 20 и 30-е сутки после опухолей, клетки которых несут рецепторы к АФП окончания курса введений препарата. Кровь брали на своей поверхности, так и его свойствами транс- из хвостовой вены и при помощи автоматического портного белка, способного образовывать некова- гематологического анализатора Abacus Junior Vet лентные комплексы с различными биологически (Diatron, Австрия) устанавливали количество лей-активными веществами [2—5]. Так, при создании коцитов, эритроцитов, гемоглобина, тромбоцитов, препарата аимпила был получен нековалентный лейкоцитарную формулу, величину гематокрита. комплекс АФП с атрактилозидом (АТР) — природ- На 1-й и 30-й дни по окончании курса введений ным гликозидом, выделенным из растения Atractylis с помощью автоматического биохимического анали-gummifera. Механизм цитотоксического действия АТР затора ChemWell (Awareness Technology, Inc., США) связан с воздействием на митохондриальную функ- в сыворотке крови определяли уровни аланинами-цию клеток [6, 7], вызывающим их апоптоз. В экспе- нотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы риментах на сингенных перевиваемых опухолях (АСТ), щелочной фосфатазы, креатинина, мочеви-продемонстрирована высокая противоопухолевая ны, билирубина (прямого и общего), общего белка, активность комплекса. Для дальнейшего продвиже- альбумина, глюкозы. На 1-й и 30-й дни после курса ния аимпилы необходимо изучение ее токсических введений, используя электрокардиограф ЭК1Т-07 свойств. («Аксион», Россия), регистрировали электрокардиограмму во II стандартном отведении, определяли Материалы и методы суточный диурез и осуществляли клинический ана-Изучение хронической токсичности препарата лиз мочи (рН, лейкоциты, эритроциты, кетоновые аимпила было проведено на 60 неинбредных кры- тела, белок, уробилиноген, удельный вес, глюкоза,

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 3'2017 том 16 |vol. 16

Оригинальные статьи 81

нитраты) с использованием автоматического анализатора мочи Laura Smart (Erba Lachema, Чехия).

Половину животных из каждой группы подвергали эвтаназии на 1-е сутки после окончания курса, остальных — спустя 30 сут после окончания курса. Животных обследовали на предмет внешних патологических признаков. На вскрытии проводили макроскопическое исследование состояния органов грудной и брюшной полости. Сердце, печень, почку, селезенку, тимус взвешивали при помощи весов СЕ153-С («Сартогосм», Россия) и определяли их массовые коэффициенты.

Для патоморфологического исследования были взяты печень, почки, сердце, легкие, желудок, все отделы кишечника, поджелудочная и щитовидная железы, надпочечник, мочевой пузырь, тимус, селезенка, лимфатические узлы, у самцов — семенник, у самок — матка и яичник. Участки органов фиксировали в 10 % нейтральном формалине, по стандартной методике заливали в парафин, гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Все полученные количественные данные подвергали статистической обработке при помощи компьютерных программ StatPlus 2006 и Microsoft Excel с использованием критерия t Фишера—Стьюдента. Отличия считали достоверными приp <0,05.

Результаты

Токсикологическое исследование показало, что ежедневное пероральное введение аимпилы в течение 30 дней в дозах, эквивалентных 1 и 10 терапевтическим, хорошо переносится животными, не вызывает их гибели. Изученные клинико-лабораторные показатели на протяжении всего исследования оставались в пределах физиологической нормы и не отличались от контроля. Даже при превышении терапевтической дозы в 10 раз никаких клинических проявлений гемато-, нефро- и кардиотоксичности обнаружено не было.

У крыс, получавших аимпилу в разовой дозе, 10-кратно превышающей терапевтическую, при биохимическом исследовании сыворотки крови на 1-е сутки по окончании курса введений препарата были выявлены признаки гепатотоксичности в виде увеличения активности АСТ (рис. 1). На этом же сроке наблюдения при патоморфологическом исследовании были обнаружены изменения в ткани печени в виде микронекрозов, мелких кровоизлияний, белковой и жировой дистрофии небольших групп гепатоцитов (рис. 2). К концу эксперимента уровень АСТ возвращался к нормальным значениям, структура печени восстанавливалась.

Патоморфологическое исследование также показало, что при 10-кратном превышении терапевтической дозы препарат вызывает повреждения разной

300

о 50

а.

>

1

30

Сутки после курса  Контроль ^ 0,1 мг/кг ^ 1,0 мг/кг

Рис. 1. Активность АСТ в сыворотке крови самцов крыс на 1-е и 30-е сутки после курса введений аимпилы

а

аШШШШШШШШж

ж

б

s  <

:.:>• ' "о п , -Л" • • ;„, , i

Рис. 2. Печень (у-20): а — интактный контроль; б — аимпила 1 мг/ кг у 30 сут, 1-е сутки после курса введений: очаг микронекроза вблизи триады

степени выраженности в тканях почек, сердца, желудка и поджелудочной железы.

Хотя показатели суточного диуреза, состав мочи, уровень креатинина и мочевины в сыворотке крови не изменялись, 10-кратное превышение терапевтической дозы приводило к возникновению повреждений структуры почек. На 1-е сутки после окончания введений препарата в корковой и юкстамедуллярной зонах почек были обнаружены периваскулярный отек, дистрофические и деструктивные изменения эпителия извитых канальцев (рис. 3). Деструктивным процессам подвергались и отдельные клубочки, повреждение которых завершалось рубцеванием.

Повреждающее действие аимпилы на структуру сердечной мышцы проявлялось только у отдельных животных, получавших препарат в разовой дозе, 10-кратно превышающей терапевтическую. Оно выражалось в появлении единичных небольших очагов отека интерстиция, в области которого

кардиомиоциты имели признаки токсической кар-диомиопатии (рис. 4). В течение 30 дней происходило полное восстановление структуры миокарда.

При курсовом применении аимпилы в высокой дозе у 2 крыс сразу по окончании курса введений были обнаружены признаки панкреатоксического действия в виде резкого полнокровия капилляров в островках Лангерганса (рис. 5). У отдельных животных в части островков были найдены кровоизлияния. Через 30 дней после окончания введений у 1 самца был обнаружен очаг некроза вблизи крупного протока.

Ежедневное пероральное применение аимпилы в течение 30 дней в обеих изученных дозах вызывало местно-тканевые реакции в слизистой оболочке желудка. При курсовом применении препарата в однократной терапевтической дозе морфологические изменения слизистой оболочки были умеренно выражены и обратимы. Десятикратное превышение терапевтической дозы приводило к возникновению

Рис. 3. Почка (у20): а — интактный контроль; б — юкстамедуллярная зона, аимпила 1 мг/кг х 30 сут, 1-е сутки после курса: сильный периваскулярный отек, резкое расширение просвета капсулы клубочков, очаги деструкции извитых канальцев

Рис. 4. Миокард (х 20): а — интактный контроль; б — аимпила 1 мг/кг х 30 сут, 1-е сутки после курса: умеренный отек интерстиция, очаги токсической кардиомиопатии

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN J0URNAL 0Р ВЮТШАРУ

3'2017 том 16 | voL 16

Оригинальные статьи

83

атрофических и деструктивных изменений покров-но-ямочного эпителия и эпителия желез (рис. 6). У отдельных животных повреждения эпителия желез завершались формированием кист либо склерозированием очагов деструкции.

Обсуждение

Фармацевтическая субстанция аимпила представляет собой нековалентный комплекс АФП и АТР — гли-козида растительного происхождения. Многочисленные экспериментальные исследования, проведенные на крысах, кроликах и обезьянах, продемонстрировали, что АФП является безопасным соединением [9]. Длительное (до 3 мес) ежедневное внутривенное, подкожное или внутрибрюшинное введение АФП в дозах, значительно превышающих терапевтические, не вызывало у животных каких-либо токсических реакций. Так, при подкожном введении препарата приматам

в дозах, 100- и 1000-кратно превышающих терапевтическую, не удалось обнаружить изменений клеточного состава периферической крови, структуры и функции сердечно-сосудистой системы, печени, почек, щитовидной железы и коры надпочечников [9].

Напротив, АТР является высокотоксичным соединением. Попытки использования АТР в терапии злокачественных новообразований связаны с его способностью как к угнетению окислительного фос-форилирования [10, 11], так и к ингибированию анаэробного гликолиза [12—14], что в совокупности приводит к энергетическому истощению и последующему апоптозу опухолевых клеток. Однако выраженные нефротоксические свойства соединения препятствовали его использованию в качестве лекарственного средства. Даже однократное внутрибрюшинное введение АТР крысам в дозе, составляющей 1/3 от расчетной дозы, вызывающей гибель 50 % животных

Рис. 5. Поджелудочная железа (х 20): а — интактный контроль; б — аимпила 1 мг/кг х 30 сут, 1-е сутки после курса: полнокровие капилляров в островке

Рис. 6. Желудок (у. 20): а — интактный контроль; б — аимпила 1 мг/кг х 30 сут, 1-е сутки после курса: атрофия эпителия желез с замещением клетками покровно-ямочного эпителия, просвет желез резко расширен

(ЛД), приводило к повреждению структуры и функции почек [15]. Уже через 180 мин после введения возникал тубулярный некроз клеток дистального отдела проксимальных канальцев, который сопровождался увеличением количества выделенной мочи, повышенной экскрецией альбуминов, глюкозы, кетоновых тел и повышением содержания калия в моче. При биохимическом анализе сыворотки крови было выявлено увеличение содержания мочевины в 3 раза и небольшое повышение уровня креатинина. Прямое повреждающее действие на ткань почек было установлено и в экспериментах на собаках [16].

Данные литературы о влиянии АТР на структуру и функцию печени экспериментальных животных при парентеральном применении противоречивы. Так, F. Carpenedo и соавт., изучая токсичность АТР на крысах, не обнаружили у него гепатотоксических свойств [15], тогда как другими авторами в экспериментах на крысах и мышах были получены данные о гепато-токсическом действии соединения [17, 18]. У мышей при хроническом внутрибрюшинном введении АТР патологические изменения в ткани печени сопровождались значительным повышением активности АЛТ, АСТ и щелочной фосфатазы в сыворотке крови [18].

Токсические эффекты, возникающие при употреблении АТР внутрь, были описаны при отравлении людей и домашних животных Atractylis gummifera и другими растениями, содержащими этот гликозид [7]. Гибель людей наступала на фоне гипогликемиче-ской комы, которая сопровождалась острой печеночной недостаточностью [19—21]. У людей, выживших после отравления, при биопсии печени были выявлены центролобулярные некрозы и жировая дистрофия гепатоцитов, расположенных по периферии печеночных долек [21], повышение активности АСТ и лактатдегидрогеназы в крови в 5—10 раз [22]. Во многих случаях некротические изменения были найдены не только в печени, но и в почках [5, 23, 24]. Некрозу подвергались как извитые канальцы, так и канальцы петли Генле [21].

Выявленные в данном исследовании токсические свойства фармацевтической субстанции аимпила, проявляющиеся при значительном превышении терапевтической дозы препарата, по-видимому, не свя-

заны с токсичностью АФП, а определяются свойствами АТР. В целом результаты, характеризующие нефро-и гепатотоксичность аимпилы, согласуются с данными литературы о морфофункциональных изменениях, возникающих в печени и почках под действием АТР. Слабо выраженные кардиотоксические свойства аимпилы проявлялись у отдельных животных только морфологически. По данным экспериментальных исследований, применение АТР не оказывает влияния на сердце. Отсутствие повреждений структуры сердца и метаболических изменений в нем авторы объясняют тем, что АТР не проникает в кардиомио-циты [15]. Однако в отдельных клинических наблюдениях приводятся патофизиологические признаки повреждения миокарда, которые объясняются токсическим воздействием АТР на реактивность сосудов сердца [25]. Проявление кардиотоксичности аимпи-лы, по нашему мнению, может быть связано как с изменением биодоступности АТР, примененного в данной лекарственной форме, так и с его влиянием на сократительную способность гладкомышечных клеток стенки артерий миокарда [25].

С изменением реактивности сосудистой системы под действием АТР могут быть связаны и единичные случаи нарушения гемодинамики в поджелудочной железе при длительном применении аимпилы в высокой дозе.

Таким образом, разработанная лекарственная композиция позволила нивелировать тяжелые побочные эффекты цитотоксического компонента препарата и создать новое противоопухолевое средство, которое можно отнести к малотоксичным соединениям.

Заключение

Из результатов работы следует, что курсовое применение препарата в терапевтической дозе не оказывает влияния на структуру и функцию основных органов и систем крыс. При значительных передозировках возможно возникновение явлений гепато-, нефро-, кардио- и панкреатоксичности. Зависимость повреждающего действия препарата от величины примененной дозы и обратимость токсических эффектов позволяют рекомендовать изученную лекарственную форму аимпилы для дальнейшего изучения.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Biological activities of alpha-fetoprotein. Vol. 1. Ed. by G.J. Mezejewsky,

H.J. Jakobson. Boca Raton, Florida: CRC Press, Inc., 1987. Pp. 3-19.

2. Абелев Г. И. 25 лет изучения а-фето-протеина. Онтогенез 1989;20(6):607-15.

3. Решетников С.С. Иммуноферментный анализ альфа-фетопротеина, использование в диагностике заболеваний человека. В сб.: Диагностическая значимость выявления маркеров фетопла-центарного комплекса в контроле

развития беременности и онкозаболеваний. Кольцово, 2005. С. 9—30.

4. Эренпрейс Я.Г. Эмбриональные свойства опухолевых клеток: факты и гипотезы. Экспериментальная онкология 1982;4(6):13-8.

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY

3'2017 том 16 | vol. 16

Оригинальные статьи 85

5. Neame P.B., Pillay V.K. Spontaneous hypoglycaemia, hepatic and renal necrosis following the intake of herbal medicines. S Afr Med J 1964;38:729-32. PMID: 14208883.

6. Klingenberg M., Grebe K., Scherer B. The binding of atractylate and carboxy-atractylate to mitochondria. Eur J Bio-chem 1975;52(2):351-63.

PMID: 1175588.

7. Stewart M.J., Steenkamp V. The biochemistry and toxicity of atractyloside: a review. Ther Drug Monit 2000;22(6):641-9. PMID: 11128230.

8. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К., 2012. Ч. 1. С. 13-24.

9. Черешнев В.А., Родионов С.Ю., Черкасов В.А. и др. Альфа-фетопро-теин. Екатеринбург, 2004. С. 104-19.

10. Bruni A., Contessa A., Luciani S. Atrac-tyloside as an inhibitor of energy transfer reactions in liver mitochondria. Biochim Biophys Acta 1962;60:301-11. PMID: 6552848.

11. Bruni A., Luciani S., Bortignon C. Competitive reversal by adenine nucleotides of atractyloside effect on mitochondrial energy transfer. Biochim Biophys Acta 1965;97:434-41. PMID: 14323588.

12. Obatomi D.K., Bach P.H. Atractyloside nephrotoxicity: in vitro studies with sus-

pensions of rat renal fragments and precision-cut cortical slices. In Vitr Mol Toxicol 2000;13(1):25-36. PMID: 10900405.

13. Obatomi D.K., Thanh N.T., Brant S., Bach P.H. The toxic mechanism and metabolic effects of atractyloside

in precision-cut pig kidney and liver slices. Arch Toxicol 1998;72(8):524-30. PMID: 9765068.

14. Pocciari F., Silano V. Effect of atractylo-side on glucose and pyruvate metabolism in rat diaphragm muscle. Biochem J 1968;107(2):305-9. PMID: 5641884.

15. Carpenedo F., Luciani F., Scaravilli F. et al. Nephrotoxic effect of atractyloside in rats. Arch Toxicol 1974;32(3):169-80. PMID: 4479740.

16. Koechel D.A., Krejci M.E. Extrarenal and direct renal actions of atractyloside contribute to its acute nephrotoxicity in pentobarbital-anesthetized dogs. Toxicology 1993;79(1):45-66. PMID: 8475499.

17. Hedili A., Warnet J., Thevenin M. et al. Biochemical investigation of Atractylis gummifera L. hepatotoxicyty in the rat. Arch Toxicol Suppl 1989;13:312-5. PMID: 2774952.

18. Wang Y., Han T., Xue L.M. et al. Hepa-totoxicity of kaurene glycosides from Xanthium strumarium L. fruits in mice. Pharmazie 2011;66(6):445-9. PMID: 21699085.

19. Bhoola K.A. Clinico-pathologic and biochemical study of the toxicity

of Callilepis laureola (Impila) [M. D.]. Durban: University of Natal, 1983. Pp. 28-33.

20. Hamouda C., Hedhili A., Ben Salah N. et al. A review of acute poisoning from Atractylis gummifera L. Vet Hum Toxicol 2004;46(3):144-6. PMID: 15171492.

21. Wainwright J., Schonland M.M. Toxic hepatitis in black patients in natal. S Afr Med J 1977;51(17):571-3.

PMID: 867172.

22. Watson A.R., Coovadia H.M., Bhoola K.D. The clinical syndrome of Impila (Callilepis laureola) poisoning in children. S Afr Med J 1979;55(8):290-2. PMID: 441880.

23. Obatomi D.K., Bach P.H. Biochemistry and toxicology of the diterpenoid glycoside atractyloside. Food Chem Toxicol 1998;36(4):335-46.

PMID: 9651051.

24. Seedat Y.K., Hitchcock P.J. Acute renal failure from Callilepis laureola. S Afr Med J 1971;45(30):832-3.

PMID: 5128528.

25. Song R., Bian H., Huang X.,

Zhao K.S. Atractyloside induces low contractile reaction of arteriolar smooth muscle through mitochondrial damage. J Appl Toxicol 2012;32(6):402-8. DOI: 10.1002/jat.1688. PMID: 21598287.