СОЕДИНЕНИЯ И СПОСОБЫ ДВОЙНОГО МЕЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ, ПРЕДОСТАВЛЯЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ МУЛЬТИПЛЕКСИРОВАНИЯ ПРИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

1. Набор метящих реагентов для масс-спектрометрического анализа полипептидов, в котором каждый метящий реагент содержит:
компонент аллобарической метки,
группу, реагирующую с белком/пептидом, и
компонент изобарной метки, содержащий репортерную группу (RP) и уравновешивающую группу (BG).
2. Набор метящих реагентов по п.1, в котором компонент аллобарической метки представляет собой компонент изотопной метки.
3. Набор метящих реагентов по п.1, в котором компонент аллобарической метки содержится в репортерной и/или уравновешивающей группе изобарной метки.
4. Набор метящих реагентов по п.1, в котором группа, реагирующая с белком/пептидом, реагирует с цистеином в белке или полипептиде.
5. Набор метящих реагентов по п.1, в котором каждый метящий реагент также содержит аффинный маркер.
6. Набор метящих реагентов по п.5, в котором аффинный маркер является отщепляемым.
7. Реагент по п.5, в котором аффинный маркер представляет собой биотин.
8. Способ одновременного анализа присутствия одного или более полипептидов, содержащих функциональную группу в разных образцах, который включает следующие стадии:
a) стадию мечения, на которой каждый образец метится одним из наборов реагентов с дифференциальной двойной меткой посредством предоставления возможности метящим реагентам взаимодействовать с функциональной группой одного или более полипептидов в образцах или образованных из них пептидов;
при этом реагенты с дифференциальной двойной меткой в наборе имеют одну и ту же или в основном одну и ту же химическую структуру и содержат компонент аллобарической метки и компонент изобарной метки, и каждый метящий реагент содержит уникальную комбинацию компонента аллобарической метки и компонента изобарной метки,
b) объединение разных образцов, чтобы получить смесь полипептидных образцов,
c) селективное выделение полипептидов или пептидов с двойной меткой из смеси полипептидных образцов; и
d) анализ относительного содержания изолированных меченых полипептидов или пептидов посредством масс-спектроскопии.
9. Способ по п.8, в котором компоненты аллобарического мечения представляют собой компоненты изотопного мечения.
10. Способ по п.8, в котором метящие реагенты из набора метящих реагентов содержат аффинный маркер.
11. Способ по п.8, который дополнительно включает после стадии (a) стадию расщепления белков на пептиды.
12. Способ по п.11, в котором расщепление выполняется трипсином.
13. Способ по п.8, в котором на стадии (c) полипептиды или пептиды селективно выделяются на основании аффинного маркера, присутствующего на указанных меченых полипептидах или пептидах.
14. Способ по п.8, в котором функциональная группа представляет собой тиол.
15. Способ по п.8, в котором функциональная группа полипептидов или образованных из них пептидов присутствует как результат модификации другой функциональной группы.
16. Способ по п.8, в котором стадия (c) включает стадию выделения меченой полипептидной или пептидной фракции из указанных объединенных полипептидов электрофорезом или хроматографией.
17. Способ по п.8, в котором стадия (d) включает стадию определения посредством MS относительного количества разных масс в указанной выделенной меченой полипептидной или пептидной фракции, полученной на стадии (c).
18. Способ по п.17, в котором стадия (d) также включает стадию, на которой указанную выделенную фракцию меченого полипептида подвергают разложению, индуцированному столкновением, (CID) и определяют относительное количество в ней разных изобарно меченых полипептидов.
19. Способ по п.18, в котором относительное количество разных изобарно меченых полипептидов определяют посредством определения относительного количества репортерных групп, высвобожденных из изобарной метки после CID.
20. Способ по п.19, дополнительно включающий стадию определения последовательности указанного полипептида.
21. Способ мечения полипептидного образца метящим реагентом по п.1, содержащим компонент аллобарической метки и компонент изобарной метки, включающий стадию реакционного взаимодействия указанного метящего реагента с функциональной группой на полипептидах в указанном образце.
22. Применение способа по любому из пп.8-21 для идентификации белков, которые дифференцированным образом экспрессированы в контрольном белковом образце и одном или более экспериментальных белковых образцах или белковых образцах при заболевании.
23. Смесь полипептидов или пептидов, каждый из которых содержит метку, имеющую компонент изотопной метки и компонент изобарной метки, связанную с полипептидами или пептидами посредством функциональной группы в полипептидах или пептидах.
24. Смесь полипептидов или пептидов по п.23, в которой функциональная группа выбрана из группы, состоящей из:
первичного амина на N-конце или на лизине,
карбоксильной группы на аспарагиновой кислоте, глютаминовой кислоте или C-конце, и
тиоловой группы на цистеине.
25. Смесь пептидов по п.23, содержащая пептиды, которые являются триптическими пептидами белков.
26. Смесь по п.23, в которой число разных меток, присутствующих на полипептидах или пептидах, составляет, по меньшей мере, 4.
27. Набор, содержащий четыре или более метящих реагентов, где каждый метящий реагент содержит компонент изобарной метки, компонент аллобарической метки и группу, реагирующую с белком/пептидом, где каждый метящий реагент в указанном наборе имеет одну и ту же или в основном одну и ту же химическую структуру, и каждый метящий реагент в указанном наборе содержит уникальную комбинацию указанного компонента аллобарической метки и указанного компонента изобарной метки.
28. Набор по п.27, в котором указанные метящие реагенты содержат аффинный маркер.
29. Способ определения относительных количеств отдельных полипептидов или пептидов с одной и той же аминокислотной последовательностью в их объединенной смеси, где каждый отдельный полипептид или пептид перед объединением помечен одним из набора реагентов с дифференциальной двойной меткой, где реагенты с дифференциальной двойной меткой набора имеют одну и ту же или в основном одну и ту же химическую структуру и содержат компонент изотопной метки и компонент изобарной метки, и каждый метящий реагент содержит уникальную комбинацию разных компонентов изотопной и изобарной меток, включающий следующие стадии:
a) необязательное выделение полипептидов или пептидов жидкостной хроматографией с тем, чтобы получить выделенную фракцию, содержащую указанные отдельные полипептиды или пептиды с одной и той же аминокислотной последовательностью,
b) разделение полипептидов или пептидов в объединенной смеси или выделенной фракции полипептидов, полученной на стадии (a), на дополнительные фракции полипептидов или пептидов с разной массой посредством первого масс-спектрометрического (MS) анализа и определение относительного количества каждой пептидной фракциии с разной массой,
c) выполнение для пептидных фракций, полученных на стадии (b), второго масс-спектрометрического (MS) анализа при условиях, при которых компоненты изобарной метки отдельных полипептидов фрагментируются, и определение количества каждого из фрагментированных компонентов изобарной метки отдельных пептидов в пептидных фракциях,
d) определение на основании количества каждого из компонентов изобарной метки, определенного на стадии (c), относительного количества отдельных пептидов в пептидной фракции, полученной на стадии (b),
e) вычисление на основании относительных количеств каждой фракции с разной массой, определенных на стадии (b), и на основании относительных количеств отдельных пептидов, определенных на стадии (d), относительного количества каждого отдельного полипептида, имеющего одну и ту же аминокислотную последовательность, который присутствует в указанной объединенной смеси.
30. Устройство (100) для мультиплексного мечения и анализа белковых образцов, содержащее, по меньшей мере, два источника образцов (101), узел для мечения (103) и соответствующие источники меток (104), каждый из которых содержит метящий реагент, содержащий:
компонент аллобарической метки,
группу, реагирующую с белком/пептидом, и
компонент изобарной метки, содержащий репортерную группу (RP) и уравновешивающую группу (BG),
и дополнительно содержащее узел для разделения (107), масс-спектрометрический блок (108) и блок анализа данных (109).
31. Устройство по п.30, дополнительно содержащее один или более элементов, выбранных из группы, состоящей из узла для приготовления образцов (102), узла для расщепления белка (105) и узла аффинной очистки (106).