Способ получения ортотопической PDX-модели плоскоклеточного рака пищевода человека для исследования лучевой терапии в эксперименте
METHOD FOR OBTAINING AN ORTHOTOPIC PDX MODEL OF SQUAMOUS CELL CARCINOMA OF THE HUMAN ESOPHAGUS FOR THE STUDY OF RADIATION THERAPY IN AN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается способа получения ортотопической PDX-модели (Patient derived xenografts) плоскоклеточного рака пищевода человека на иммунодефицитных мышах для исследования лучевой терапии в эксперименте. Изобретение позволяет проводить доклинические испытания ионизирующего излучения на модели, характеризующейся схожими морфологическими особенностями с опухолевым материалом, полученным от пациента-донора.
Рак пищевода отличается неблагоприятным течением, а также высокими показателями смертности среди больных (см. Napier K.J., Scheerer M., Misra S., Napier K.J. Esophageal cancer: A Review of epidemiology, pathogenesis, staging workup and treatment modalities // World J. Gastrointest. Oncol. - 2014. - 6. - P. 112-120; Siegel R., Naishadham D., Jemal A. Cancer statistics, 2013 // Cancer Journal for Clinicians. - 2013. - V. 63. - №. 1. - P. 11-30). Данное заболевание подразделяется на две формы, которые способны развиваться в различных частях пищевода: плоскоклеточный рак и аденокарцинома (см. Salem M.E., Puccini A., Xiu J., Raghavan D., Lenz H.J., Korn W.M., Shields A.F., Shi J.-j. Cancer Letters. - 2019. - 459. 145 - 151; Philip P.A., Marshall J.L., Goldberg R.M. Comparative molecular analyses of esophageal squamous cell carcinoma, esophageal adenocarcinoma, and gastric adenocarcinoma // Oncol. - 2018. - 23. - 1319-1327). В России наблюдается преобладание по встречаемости плоскоклеточного рака пищевода (89-92 %) (см. Кит О.И., Колесников Е.Н., Максимов А.Ю., Протасова Т.П., Гончарова А.С., Лукбанова Е.А. Методы создания ортотопических моделей рака пищевода и их применение в доклинических исследованиях // Современные проблемы науки и образования. 2019. № 2. 6 с.).
Плоскоклеточный рак пищевода является одним из самых распространенных и смертельных новообразований в мире (см. Bray F., Ferlay J., Soerjomataram I., Siegel R.L., Torre L.A., Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries, CA A // Cancer J. Clin. - 2018. - 68. - 394-424). Стандартом лечения данного заболевания является хирургическая, лучевая и химиолучевая терапия. При этом 5-летняя выживаемость пациентов составляет всего 15-25%, а рецидивы наблюдаются в 40-60% случаев (см. Pennathur A., Gibson M.K., Jobe B.A., Luketich J.D. Oesophageal carcinoma // Lancet. - 2013. - 381. - 400-412; Gwynne S., Hurt C., Evans M., Holden C., Vout L., Crosby T. Definitive chemoradiation for oesophageal cancer - a standard of care in patients with non-metastatic oesophageal cancer // Clin Oncol. - 2011. - 23. - 182-188). Поэтому первоочередной задачей экспериментальной онкологии является разработка или усовершенствование, а также внедрение более совершенных методов терапии, в том числе лучевой и мультимодальной (Miyata H., Yamasaki M., Takiguchi S., Nakajima K., Fujiwara Y., Nishida T. Salvage esophagectomy after definitive chemoradiotherapy for thoracic esophageal cancer // J Surg Oncol. - 2009. - 100. - Р. 442-446).
Известно исследование лучевой терапии в разовой дозе 15 Гр и ее сочетания с флавопиридолом на ксенографтах, полученных в результате трансплантации культуры клеток SEG-1 с использованием 137°Cs c-ray аппарата (Raju U., Ariga H., Koto M., Lu X., Pickett J., Valdecanas D., Mason K.A., Milas L. Improvement of esophageal adenocarcinoma celland xenograft responses to radiation by targeting cyclin-dependent kinases // Radiotherapy and Oncology 80. - 2006. Р. 185-191 doi:10.1016/j.radonc.2006.07.027).
В другом исследовании на подкожных ксенографтах, созданном путем трансплантации культур клеток аденокарциномы (ОЕ19) и плоскоклеточного рака пищевода (ОЕ21) показали противоопухолевый эффект сочетания фракционированной лучевой терапии (3 Â 2 Гр, использовали линейный ускоритель Varian, Palo Alto, CA) с препаратом TH-302 (50 мг / кг, внутрибрюшинно) (см. Spiegelberg L., van Hoof S.J., Biemans R., Lieuwes N.G., Marcus D., Niemans R., Theys J., Yaromina A., Lambin P., Verhaegen F., Dubois L.J. Evofosfamide sensitizes esophageal carcinomas to radiation without increasing normal tissue toxicity // Radiotherapy and Oncology. - 2019. - 141. - 247-255. preclinhttps://doi.org/10.1016/j.radonc.2019.06.034).
Недостатком обоих методик проведения исследований является использование ксенографтов, созданных путем подкожной трансплантации культур клеток. Подобные модели не способны точно отражать реальную картину онкогенеза и поэтому результаты подобных исследований могут подвергаться сомнению.
В настоящее время PDX-модели считаются ценным инструментом для трансляционных исследований, поскольку они, в отличие от моделей ксенотрансплантатов клеточных линий, способны сохранять характеристики опухоли пациента, а также гетерогенность состава. Это позволяет более точно прогнозировать чувствительность опухоли к лечению (Choi Y.Y., Lee J.E., Kim H. et all. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer // Sci. Rep. - 2016. - 6: 22172. doi:10.1038/srep22172).
Известно исследование противоопухолевого эффекта препарата CYH33 (12,5 мг / кг, один раз в день), радиации (2 Гр на 0, 1, 7, 8, 9, 28 сутки) и их комбинации на подкожной PDX-модели плоскоклеточного рака пищевода на иммунодефицитных мышах Balb/c Nude (Shi J.-j., Xing H., Wang Y.-Х., Zhang X., Zhan Q.-М., Geng M.-Y., Ding J., Meng L.-H. PI3Kα inhibitors sensitize esophageal squamous cell carcinoma to radiation by abrogating survival signals in tumor cells and tumor microenvironment // Cancer Letters. - 2019. - 459. - Р. 145 - 155. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.040). Ответ ксенотрансплантата на воздействия может считаться наиболее приближенным к ответу первичной опухоли пациента, однако данная модель не способна отражать процессы миграции клеток и метастазирования ввиду гетеротопического сайта трансплантации.
Технический результат изобретения заключается в получении ортотопической PDX-модели плоскоклеточного рака пищевода человека на иммунодефицитных мышах для исследования лучевой терапии в эксперименте, сохраняющей гистологические характеристики донорской опухоли, адаптированной к росту и имеющей стабильную кинетику роста в организме мышей линии Balb/c Nude.
Поставленная задача решается тем, что создана ортотопическая PDX-модель плоскоклеточного рака пищевода человека на иммунодефицитных мышах, гистологически схожая с опухолью пациента-донора и адаптированная к росту на иммунодефицитных мышах линии Balb/c Nude.
Способ иллюстрируется следующими фигурами:
Фиг. 1. Создание PDX-модели плоскоклеточного рака пищевода человека путем трансплантации фрагмента опухоли в шейный отдел пищевода иммунодефицитной мыши Balb/c Nude;
Фиг. 2. Облучение иммунодефицитной мыши Balb/c Nude с установленным ксенографтом плоскоклеточного рака пищевода при помощи установки Xstrahl 150;
Фиг. 3. Плоскоклеточный рак пищевода пациента-донора. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100х;
Фиг. 4. PDX-модель плоскоклеточного рака пищевода в 6 пассаже без воздействия. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100х;
Фиг. 5. Мышь с ксенографтом плоскоклеточного рака пищевода в 6 пассаже после ионизирующего излучения в суммарной дозе 40 Гр.;
Фиг. 6. PDX-модель плоскоклеточного рака пищевода после ионизирующего излучения в суммарной дозе 40 Гр. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100х.
Способ осуществляют следующим образом.
Для создания ортотопической PDX-модели плоскоклеточного рака пищевода использовали опухоль от пациента В., которая была представлена пластами плоских клеток без ороговения (фиг. 3).
3
3
После иссечения опухоли из организма донора, выделяют опухолевый фрагмент без некроза и васкуляризации, помещают в питательную среду 199 с 1% гентамицина. Наркоз мышей осуществляют при помощи препаратов Ксилазин и «Золетил 100» согласно протоколу (см. Патент RU № 2712916, опубл. 03.02.2020, Бюл. №4). Далее проводят трансплантацию фрагмента опухи объемом 27 мм, рассекая кожу на шее. Разрез начинается у основания правого уха и заканчивают у основания левого уха. Далее выделяли тупым способом пищевод, рассекали его адвентициально-мышечный слой, после чего подшивали фрагмент опухоли объемом 27 мм над повреждением при помощи лигатуры из полипропилена размером 5-0 (фиг. 1). Операционную рану ушивали скорняжным швом при помощи лигатуры из полипропилена размером 4-0.
3
По достижении опухолевым материалом объема 150-250 мм ксенографты рака пищевода человека перевивали указанным способом до 6 пассажа (табл.1).
Доля приживления ксенотрансплантата увеличивалась с каждой генерацией и составляла в 1, 2 и 3, 4-м пассажах 40, 50, 70 и 90% соответственно. Начиная с 5-го пассажа, наблюдалась адаптация ксенографта к росту (100% приживления).
Данным способом было создано 100 ортотопических PDX-моделей плоскоклеточного рака пищевода на иммунодефицитных мышах.
Гистологическую верификацию PDX-модели плоскоклеточного рака пищевода для сравнения клеточного состава с исходной донорской опухолью проводили в каждом пассаже при помощи световой микроскопии срезов опухоли, окрашенных гематоксилином и эозином.
Таблица 1
Характеристика роста PDX-модели рака пищевода человека различных генераций на иммунодефицитных мышах
№ пассажа
Сайт имплантации
% приживления опухолевого материала в организме мыши-реципиента
Объем, при котором проводили пересадку опухолевого материала
Время от момента имплантации опухолевого материала до его пересадки
1
Ортотопический
40%
150 мм<sup>3</sup>
85 суток
2
50%
180 мм<sup>3</sup>
72 суток
3
70%
210 мм<sup>3</sup>
58 суток
4
90%
230 мм<sup>3</sup>
40суток
5
100%
250 мм<sup>3</sup>
35 суток
6
100%
250 мм<sup>3</sup>
32 суток
В результате морфологического исследования PDX-модели рака пищевода опухоль была представлена пластами плоских клеток без ороговений, что соответствовало гистологической структуре опухоли пациента-донора. В толще опухолевой ткани были видны очаги митотической активности опухолевых клеток, а также незначительные участки с некротическими изменениями, занимающие 10% площади в поле зрения при увеличении 100х (фиг. 4).
Для исследования лучевого воздействия использовали 6-ую генерацию PDX-модели плоскоклеточного рака пищевода на 25 самках мышей линии Balb/c Nude, разделенных на 5 групп, n=5 (табл. 2). Время наблюдения составило 15 суток.
Облучение животных проводили при помощи аппарата Xstrahl 150 с фильтром 1 (Al 0,2) и аппликаторами 1,5 и 2 см (фиг. 2).
3
Объем опухолевых узлов рассчитывали по формуле Шрека для эллипсоида - V=а×в×с×p/6, где V - объем опухоли (мм), а, в, с - максимальные диаметры эллипсоида в трех плоскостях (мм).
Таблица 2.
Распределение мышей по группам в соответствии с режимами облучения
№ группы
Количество мышей в группе
Разовая доза облучения, Гр
Суммарная доза облучения, Гр
1 (контроль)
5
0
0
2
5
4
16
3
5
6
24
4
5
8
32
5
5
10
40
3
Наименьший противоопухолевый эффект отмечался в группе мышей, который получали разовую долю излучения 4 Гр, хотя после воздействия суммарной дозы 16 Гр объемы ксенографтов значимо отличались от объемов ксенографтов контрольной группы (р≤0,05). В остальных опытных группах, получавших разовую долю излучения 6, 8 и 10 Гр наблюдалась остановка роста опухоли, объем которой не превышал 250 мм и значимо отличался от объема ксенографтов в контроле. Следует отметить, что статистически значимых различий между средними объемами опухолевых узлов в группах 3, 4 и 5 не наблюдалось, что позволяет предложить в качестве эффективного излучение в разовой дозе 6 Гр. Остановка же роста ксенографта начиналась после 2-хкратного воздействия. Таким образом, наименьшей суммарной эффективной дозой ионизирующего излучения в отношении PDX-модели плоскоклеточного рака пищевода может считаться доза в 12 Гр.
У мышей, получивших суммарную дозу излучения 40 Гр, наблюдается в области опухолевого узла на шее изъязвление кожи и некроз опухоли с выделением гнойных масс молочного цвета (фиг. 5). При проведении морфологического анализа PDX-модели плоскоклеточного рака пищевода наблюдали пласты плоских раковых клеток без ороговений со значительными участками некроза (50% площади поля зрения), в которых отмечались клетки с карио- и цитолизисом, а также массы, образованные разрушенными клетками (фиг. 6).
Технико-экономическая эффективность заключается в том, что изобретение позволяет получить ортотопическую PDX-модель плоскоклеточного рака пищевода человека на иммунодефицитных мышах для исследования лучевой терапии в эксперименте, которая сохраняет гистологические характеристики опухолевого материала, полученного от пациента-донора, и может быть использована для получения адекватного характера роста, инвазии индуцированного новообразования, для доклинического изучения противоопухолевых эффектов лучевой терапии.