СПОСОБ ВИТАЛЬНОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
METHOD FOR VITAL IMMOBILISATION OF HUMAN AND ANIMAL SPERM CELLS

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к андрологии и репродуктологии и к ветеринарии, а именно к способам для размножения или оплодотворения животных. Изобретение также применимо в научных исследованиях.
Из существующего уровня техники известен способ иммобилизации (обездвиживания) сперматозоидов путем механического переламывания или перетирания хвоста сперматозоида микроинъекционной иглой о дно чашки Петри непосредственно перед процедурой ICSI (intracytoplasmic sperm injection - внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида). Данный методический прием является неотъемлемой частью вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия (в рамках процедуры ICSI), широко используется и стал классическим (In vitro fertilization: a practial approach / edited by David K, Gardner. Informa Healthcare USA. Inc: ISBN-13: 978-0-8493-3335-4; p.167-169). Аналогично, данный подход к иммобилизации сперматозоидов используется при ICSI яйцеклеток домашних и лабораторных животных (Kimura Y, Yanagimachi R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod 1995; 52:709-720).
Недостатком данного технического решения является тот факт, что иммобилизованные таким образом сперматозоиды нежизнеспособны в связи с нарушением целостности цитоплазматической мембраны клетки и аппарата передвижения - хвоста и должны быть немедленно использованы в процедуре ICSI. То есть данный методический прием иммобилизации является мортальным (смертельным) для сперматозоида, и по истечении короткого промежутка времени такой сперматозоид становится непригодным для искусственного оплодотворения яйцеклетки методом ICSI.
Наиболее близким по принципу действия (но не по целям и задачам) к заявленному техническому решению является Hypo Osmotic Swelling Test (HOS-Test), основанный на способности хвостов живых сперматозоидов набухать в гипоосмолярной среде, который используется для оценки целостности цитоплазматической мембраны сперматозоида и определения, таким образом, его жизнеспособности. Принцип действия HOS-Test основан на гидратировании цитоплазмы сперматозоидов с неповрежденной цитоплазматической мембраной в гипоосмотической среде, что приводит к видимым морфологическим изменениям в его хвосте. Таким образом, принцип действия HOS-Test (эффект воздействия гипоосмотической среды на сперматозоиды) аналогичен принципу действия, заложенному в патентуемом способе, однако служит для решения совершенно иных целей и задач. Непосредственно HOS-Test не предназначен и не пригоден для витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является осуществление витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных для использования их в дальнейшем в диагностических либо лечебных целях.
Данная задача решается за счет того, что заявленный способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных характеризуется тем, что сперматозоиды получают из нативной или размороженной спермы или центрифугируют эякулят в градиенте плотности, или сперматозоиды отбирают в результате флотации и переносят в среду для иммобилизации на время от 1 мин до 4 часов и характеризующейся пониженной осмоляльностью (100-170 mOsmol/kg), значением рН, находящимся в диапазоне от 7,0 до 8,0, газовой средой, содержащей от 0,1 до 8% углекислого газа, температурой среды от 0 до 39°C для поддержания жизнеспособности иммобилизованных сперматозоидов.
2
4
2
4
4
2
2
2
3
Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для создания необходимой осмоляльности 100-170 mOsmol/kg содержит химические соединения, преимущественно соли: натрия хлорид (NaCl) - 41-70 mmol/l, калия хлорид (KCl) - 1,25-4,8 mmol/l, калий фосфорнокислый однозамещенный (КНРО) - 0-0,8 mmol/l, натрий фосфорнокислый двузамещенный (NaHPO) - 0-0,3 mmol/l, сульфат магния семиводный (MgSO×7HO) - 0-0,8 mmol/l, хлорид кальция двуводный (CaCl×2НО) - 0,3-1,2 mmol/l, бикарбонат натрия (NaHCO) - 0-27,0 mmol/l, натрия пируват - 0-0,25 mmol/l, L-натрия лактат - 0-7,0 mmol/l.
Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения необходимого уровня рН=7,0-8,0 содержит буферные системы на основе HEPES (0-15,0 mM/l), бикарбоната натрия (0-27,0 mM/l), фосфатного буфера (калий фосфорнокислый однозамещенный - 0-0,8 mM/l, натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0-0,3 mM/l), цитратного буфера (цитрат натрия - 0-70,0 mM/l).
Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в энергии содержит: натрия пируват (0-0,25 mmol/l), L-натрия лактат (0-7,0 mmol/l), глюкозу (0-5,0 mmol/l), фруктозу (0-5,0 mmol/l).
Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в аминокислотах содержит аланин (0-0,05 mmol/l), аспарагиновую кислоту (0-0,05 mmol/l), аспарагин (0-0,05 mmol/l), аргинин (0-0,5 mmol/l), цистин (0-0,07 mmol/l), глутамин (0-0,5 mmol/l), аланил-глутамин (0-1,0 mmol/l), глицин (0-0,05 mmol/l), гистидин (0-0,06 mmol/l), изолейцин (0-0,01 mmol/l), лейцин (0-0,05 mmol/l), лизин (0-0,08 mmol/l), метионин (0-0,02 mmol/l), фенилаланин (0-0,02 mmol/l), пролин (0-0,05 mmol/l), серин (0-0,05 mmol/l), таурин (0-0,05 mmol/l), треонин (0-0,02 mmol/l), триптофан (0-0,002 mmol/l), тирозин (0-0,005 mmol/l), валин (0-0,02 mmol/l).
Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в витаминах и биогенных аминах содержит холина хлорид (0-0,003 mmol/l), фолиевую кислоту (0-0,002 mmol/l), инозитол (0-0,003 mmol/l), никотинамид (0-0,003 mmol/l), пантотенат (0-0,001 mmol/l), пиридоксаль (0-0,0005 mmol/l), рибофлавин (0-0,0005 mmol/l), тиамин (0-0,002 mmol/l).
Среда для иммобилизации сперматозоидов человека и животных для обеспечения потребности сперматозоидов в белках или макромолекулах содержит человеческий сывороточный альбумин (0-20,0 mg/ml), бычий сывороточный альбумин (0-20,0 mg/ml), заменитель белков сыворотки (0-20,0 mg/ml), поливинилпирролидон (0-10,0 mg/ml), поливинилалкоголь (0-10,0 mg/ml).
Результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является гипоосмотический шок сперматозоидов, находящихся в среде иммобилизации, обусловленный притоком воды из внеклеточного пространства через цитоплазматическую мембрану в цитоплазму сперматозоида и характеризующийся выключением аппарата передвижения - то есть иммобилизацией сперматозоида без потери последним жизнеспособности в течение от 1 мин до 2 часов.
Изобретение поясняется рецептами сред для иммобилизации сперматозоидов человека и животных (Табл.1), которые не охватывают и тем более не ограничивают весь объем притязаний данного методического решения, а являются лишь поясняющими материалами частного случая исполнения.
Способ иммобилизации сперматозоидов реализуется следующим образом.
Сперматозоиды концентрируют центрифугированием при 400-600 g в среде для культивирования сперматозоидов (например, М2, ТН, TL-HEPES, SOF или DPBS), супернатант удаляют, а 100-200 µl осадка, содержащего сперматозоиды, ресуспендируют в 1-2 ml среды для иммобилизации. Полученную взвесь сперматозоидов вновь осаждают центрифугированием, супернатант удаляют, а осадок, содержащий иммобилизованные сперматозоиды, разбавляют средой для иммобилизации до необходимой концентрации.
Иммобилизованные таким образом сперматозоиды могут быть использованы для процедуры ICSI. оценки и отбору по ультаморфологическим признакам с последующим использованием в процедурах ВРТ.
Таблица 1
Примеры рецептов сред для иммобилизации сперматозоидов человека и животных
Состав:
Рецепт №:
1
2
3
4
5
NaCl, mmol/l
56,8
68,4
64,6
63,3
68,4
KCl, mmol/l
2,86
1,89
4,30
1,90
1,34
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>, mmol/l
0,71
-
0,71
0,30
0,74
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O, mmol/l
0,71
-
-
0,32
-
L-натрия лактат, mmol/l
2,0
6
2,0
-
-
Глюкоза, mmol/l
3,0
3,0
-
3,0
-
NaHCO<sub>3</sub>, mmol/l
2,4
1,2
15,4
7,1
-
Натрия пируват, mmol/l
0,2
-
0,2
0,5
-
CaCl<sub>2</sub>×2H<sub>2</sub>O, mmol/l
1,02
1,2
1,02
0,30
0,50
HEPES, mmol/l
12,6
6
-
-
-
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>×H<sub>2</sub>O, mmol/l
-
0,21
-
-
-
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>, mmol/l
-
-
-
0,54
4,05
MgCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O, mmol/l
-
-
0,3
-
0,25
Бычий сывороточный альбумин, mg/ml
-
3
19
5
-
Поливинилпирролидон, mg/ml
-
-
-
-
1,0
Аланин, mmol/l
-
-
-
0,05
-
Аспарагиновая кислота, mmol/l
-
-
-
0,05
-
Аспарагин, mmol/l
-
-
-
0,05
-
Аргинин, mmol/l
-
-
-
0,5
-
Цистин, mmol/l
-
-
-
0,07
-
Глутамин, mmol/l
-
-
-
0,5
-
Аланил-глутамин, mmol/l
-
-
-
1,0
-
Глицин, mmol/l
-
-
-
0,05
-
Гистидин, mmol/l
-
-
-
0,06
-
Изолейцин, mmol/l
-
-
-
0,01
-
Лейцин, mmol/l
-
-
-
0,05
-
Лизин, mmol/l
-
-
-
0,08
-
Метионин, mmol/l
-
-
-
0,02
-
Фенилаланин, mmol/l
-
-
-
0,02
-
Пролин, mmol/l
-
-
-
0,05
-
Серин, mmol/l
-
-
-
0,05
-
Таурин, mmol/l
-
-
-
0,05
-
Треонин, mmol/l
-
-
-
0,02
-
Триптофан, mmol/l
-
-
-
0,002
-
Тирозин, mmol/l
-
-
-
0,005
-
Валин, mmol/l
-
-
-
0,02
-
Холина хлорид, mmol/l
-
-
-
0,003
-
Фолиевая кислота, mmol/l
-
-
-
0,002
-
Инозитол, mmol/l
-
-
-
0,003
-
Никотинамид, mmol/l
-
-
-
0,003
-
Пантотенат, mmol/l
-
-
-
0,001
-
Пиридоксаль, mmol/l
-
-
-
0,0005
-
Рибофлавин, mmol/l
-
-
-
0,0005
-
Тиамин, mmol/l
-
-
-
0,002
-