ГЛЮКОАМИЛАЗЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Способ осахаривания крахмального субстрата, включающий приведение в контакт крахмального субстрата с глюкоамилазой, выбранной из группы, состоящей из:
a. полипептида, содержащего аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 7, или 8, или 9;
b. полипептида, который по меньшей мере на 83% идентичен аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 7 или 8;
c. полипептида, который по меньшей мере на 83% идентичен каталитическому домену с последовательностью SEQ ID NO: 7 или 8;
d. полипептида, содержащего аминокислотную последовательность каталитического домена с SEQ ID NO: 9; или
зрелого полипептида, полученного обработкой полипептида с SEQ ID NO: 1, 2 или 3 сигнальной пептидазой или посттрансляционной модификацией во время секреции из экспрессирующего хозяина;
при этом осахаривание проводят при pH от 2,0 до 6,0.
2. Способ по п. 1, где осахаривание крахмального субстрата приводит к получению сиропа с высоким содержанием глюкозы.
3. Способ по п. 1 или 2, где содержание глюкозы в сиропе с высоким содержание глюкозы, выбранном из списка, составляет не менее 95,5% глюкозы.
4. Способ согласно любому из пп. 1-3, дополнительно включающий ферментацию сиропа с высоким содержанием глюкозы до конечного продукта.
5. Способ по п. 4, где осахаривание и ферментацию проводят как процесс одновременного осахаривания и ферментации (SSF).
6. Способ по п. 4 или 5, где конечный продукт представляет собой спирт, например этанол.
7. Способа по п. 4 или 5, где конечный продукт представляет собой биохимикат, выбранный из группы, состоящей из аминокислоты, органической кислоты, лимонной кислоты, молочной кислоты, янтарной кислоты, глутамата натрия, глюконовой кислоты, глюконата натрия, глюконата кальция, глюконата калия, глюконо-дельта-лактона, эриторбата натрия, жирной кислоты омега-3, бутанола, лизина, итаконовой кислоты, 1,3-пропандиола, биодизеля и изопрена.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где содержание сухого вещества (DS) в крахмальном субстрате составляет от примерно 5% до 99%, от 15% до 50% или 40-99%.
9. Способа по любому из пп. 1-8, где крахмальный субстрат выбирают из пшеницы, ячменя, кукурузы, ржи, риса, сорго, отрубей, маниоки, дурры, проса, картофеля, батата, тапиоки и любой их комбинации.
10. Способа по любому из пп. 1-9, где крахмальный субстрат содержит разжиженный крахмал, желатинизированный крахмал или гранулированный крахмал.
11. Способ по любому из пп. 1-10, дополнительно включающий внесение в крахмальный субстрат гексокиназы, ксиланазы, глюкозоизомеразы, ксилозоизомеразы, фосфатазы, фитазы, пуллуланазы, бета-амилазы, альфа-амилазы, глюкоамилазы, протеазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, липазы, кутиназы, треалазы, изоамилазы, окисиредуктазы, эстеразы, трансферазы, пектиназы, гидролазы, альфа-глюкозидазы, бета-глюкозидазы или их комбинации.
12. Способ осахаривания и ферментации крахмального субстрата для получения конечного продукта, включающий приведение в контакт крахмального субстрата с глюкоамилазой, выбранной из группы, состоящей из:
a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 7, или 8, или 9;
b) полипептида, который по меньшей мере на 83% идентичен аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 7 или 8;
c) полипептида, который по меньшей мере на 83% идентичен каталитическому домену с последовательностью SEQ ID NO: 7 или 8;
d) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность каталитического домена с SEQ ID NO: 9; или
e) зрелого полипептида, полученного обработкой полипептида с SEQ ID NO: 1, 2 или 3 сигнальной пептидазой или посттрансляционной модификацией во время секреции из экспрессирующего хозяина;
при этом осахаривание и ферментацию проводят при pH от 2,0 до 6,0, предпочтительно - от pH 2,0 до 5,0, предпочтительно - от pH 2,0 до 4,0, более предпочтительно - от pH 2,0 до pH 3,0.
13. Способ по п. 12, где осахаривание и ферментацию проводят как процесс одновременного осахаривания и ферментации (SSF).
14. Способ по п. 12 или 13, где конечный продукт представляет собой спирт, например этанол.
15. Способ по п. 12, где осахаренный и ферментированный крахмальный субстрат характеризуется пониженным уровнем DP3+ и повышенным уровнем DP1 по сравнению с результатом от контакта того же крахмального субстрата с AnGA.
16. Способ по п. 12 или 13, где конечный продукт представляет собой биохимикат, выбранный из группы, состоящей из аминокислоты, органической кислоты, лимонной кислоты, молочной кислоты, янтарной кислоты, глутамата натрия, глюконовой кислоты, глюконата натрия, глюконата кальция, глюконата калия, глюконо-дельта-лактона, эриторбата натрия, жирной кислоты омега-3, бутанола, лизина, итаконовой кислоты, 1,3-пропандиола, биодизеля и изопрена.
17. Способ увеличения усвояемости крахмала у животного, который включает внесение по меньшей мере одной глюкоамилазы, выбранной из группы, состоящей из:
a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 7, или 8, или 9;
b) полипептида, который по меньшей мере на 83% идентичен аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 7 или 8;
c) полипептида, который по меньшей мере на 83% идентичен каталитическому домену с последовательностью SEQ ID NO: 7 или 8;
d) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность каталитического домена с SEQ ID NO: 9; или
e) зрелого полипептида, полученного обработкой полипептида с SEQ ID NO: 1, 2 или 3 сигнальной пептидазой или посттрансляционной модификацией во время секреции из экспрессирующего хозяина;
в качестве кормовой добавки к корму для животных, где указанная глюкоамилаза (а) проявляет по крайней мере 20% активности или по меньшей мере на 20% более высокую остаточную активность при pH меньше или равном 3 в присутствии пепсина или рубцового сока по сравнению с активностью ферментов при pH 6 отдельно или в присутствии рубцового сока, и (b) фермент действует вместе с амилазой поджелудочной железы, увеличивая выход глюкозы.
18. Способ по п. 17, где, если животное является жвачным, указанный фермент активен в по меньшей мере двух из трех пищеварительных камер жвачного животного, включая рубец, сычуг и тонкий кишечник.
19. Способ по п. 16 или 17, где указанная по меньшей мере одна глюкоамилаза способна гидролизовать сырой крахмал, как измерено в анализе высвобождения глюкозы с использованием сырого крахмала.
20. Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, 5 или 6.
21. Вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность по п. 20, функционально связанную с одной или несколькими управляющими последовательностями, которые регулируют продуцирование кодируемого полипептида в экспрессирующем хозяине, и где указанная регуляторная последовательность гетерологична кодирующей нуклеотидной последовательности, или указанные регуляторная последовательность и кодирующая последовательность не расположены вместе, как это бывает в природе.
22. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая полинуклеотиды по п. 20.
23. Рекомбинантная клетка-хозяин по п. 22, которая представляет собой клетку Trichoderma, Aspergillus, Myceliopthora или Saccharomyces.
E.coli, Bacillus, Streptomyces
Pseudomonas
24. Рекомбинантная клетка-хозяин по п. 22, которая представляет собой клетку или.
25. Рекомбинантная клетка-хозяин по п. 22, которая представляет собой этанолопродуцирующие микроорганизмы.
26. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из пп. 22-25, дополнительно экспрессирующая и секретирующая один или несколько дополнительных ферментов, выбранных из группы, состоящей из протеазы, гемицеллюлазы, целлюлазы, пероксидазы, липолитического фермента, металлолиполитического фермента, ксиланазы, липазы, фосфолипазы, эстеразы, пергидролазы, кутиназы, пектиназы, пектатлиазы, манназы, кератиназы, редуктазы, оксидазы, фенолоксидазы, липоксигеназы, лигниназы, пуллуназы, фитазы, танназы, пентосаназы, маланазы, бета-глюканазы, арабиносидазы, гиалуронидазы, хондроитиназы, лакказы, трансферазы или любой их комбинации.
27. Композиция кормовой добавки или премикс, содержащая по меньшей мере одну глюкоамилазу, выбранную из группы, состоящей из:
(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 7, 8 или 9;
(b) полипептида, который по меньшей мере на 83% идентичен аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 7, 8 или 9;
(c) полипептида, который по меньшей мере на 83% идентичен каталитическому домену с последовательностью SEQ ID NO: 7, 8 или 9;
(d) полипептида, который по меньшей мере на 83% идентичен линкеру и каталитическому домену с последовательностью SEQ ID NO: 7, 8 или 9; или
(e) зрелого полипептида, полученного обработкой полипептида с SEQ ID NO: 1, 2 или 3 сигнальной пептидазой или посттрансляционной модификацией во время секреции из экспрессирующего хозяина; и/или
(f) необязательно по меньшей мере один минерал и/или по меньшей мере один витамин.
28. Композиция кормовой добавки или премикса по п. 27, дополнительно включающая один или несколько ферментов, выбранных из группы, состоящей из протеазы, амилазы, ксиланазы и фитазы.
Bacillus
29. Композиция кормовой добавки или премикса по п. 27 или 28, дополнительно включающая один или несколько пробиотиков, выбранных из группы, состоящей из , молочнокислых бактерий и дрожжей.