Значение экспрессии онкогенов HPV е6/Е7 и человеческого гена-регулятора клеточного цикла p16ink4a в развитии предрака и рака шейки матки в эксперименте

НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Значение экспрессии онкогенов HPV Е6/Е7 и человеческого гена-регулятора клеточного цикла P16ink4a в развитии предрака и рака шейки матки в эксперименте

Вергейчик Г.И.1, Северин И.Н.2, Стрибук Ж.А.3

1 Гомельский государственный медицинский университет

2 РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий, Минск

3 ООО «ЦитоГен», Гомель

Viarheichyk H.I.1, Severin I.N.2, Stribuk ZhA3

1 Gomel State Medical University, Belarus 2RSPC of Hematology and Transfusiology, Minsk 3«CitoGene»Ltd, Gomel, Belarus

Value of HPV Е6/Е7 oncogenes expression and human p16ink4a gene-supressor

in development of precancer and cervical cancer

Резюме. Рассмотрена роль экспрессии онкогенов Е6/Е7 вирусов папилломы человека и человеческого гена-регулятора клеточного цикла p16ink4a в развитии предрака и рака шейки матки. В результате проведенного исследования выявлено, что роль вирусных онкогенов максимальна на стадии CIN2-3 и последующего перехода в инвазивный рак. В то же время выявление экспресии Е6/Е7 у пациенток с вирусоносительтвом или CIN1 может послужить критерием отбора в группу риска по развитию вирусассоциированного канцерогенеза. В 75% случаев рака шейки матки отмечается повышение экспрессии гена р16, что также может являться потенциальным маркером канцерогенеза в предраковых поражениях эпителия шейки матки.

Ключевые слова: ВПЧ-инфекция, E6/E7 онкогены, ген p16ink4a.

Summary. The article covers the role of HPV Е6/Е7 oncogenes expression and human regulator of р16юк4а cell cycle in development of precancer and cervical cancer. ^s a result of the performed research it has been revealed that the role of the viral oncogenes are highest possible at CN2-3 stage and the subsequent into invasive cancer. However the detection of Е6/Е7 expression in infected patients or in patients with CIN1 can serve as a criterion for the selection I the risk group for the development of HPV-associated carcinogenesis. 75% cases of cervical cancer reveal the increase of р16 gene expression which can be a potential carcinogenesis marker in precancerous lesions of cervical epithelium. Keywords: HPV-infection, E6/E7 oncogenes, p16ink4a gene.

Онкогенные вирусы папилломы человека (ВПЧ) - причина аногени-тальных раков и 20% случаев рака полости рта и гортани. Молекулярные изменения, лежащие в основе ВПЧ-инду-цированного злокачественного преобразования эпителиальных клеток, лишь недавно были тщательно проанализированы и в определенной степени поняты [11].

Индукция непрерывного роста клеток человека, содержащихся в тканевой культуре (иммортализация), - одна из особенностей подгруппы вируса папилломы, которая связана с человеческим раком. Три вирусных онкогена были выявлены в канцерогенных генотипах вируса папилломы: гены Е5, Е6 и Е7. Ген Е5, очевидно, не является необходимым для им-мортализации и поддержания злокачественного фенотипа клеток, но может быть необходим для начальных преобразований в клетках, пораженных вирусами папилломы [7]. Онкогены Е6 и Е7, напротив, вызывают озлокачествление широкого

спектра человеческих клеток при индивидуальной или совместной экспрессии [5]. Хотя онкогены Е6 и Е7 необходимы для иммортализации ВПЧ-инфицирован-ных клеток, а также для проявления злокачественного фенотипа цервикальных клеток карциномы, их экспрессии явно недостаточно для того, чтобы трансформировать клетки. Вирусные онкогены должны действовать совместно с рядом генов клетки-хозяина для изменения функций инфицированной клетки [12].

Функции онкобелков Е6 и Е7 были неоднократно рассмотрены. Обнаружено, что они взаимодействуют с большим количеством белков хозяйских клеток, особый интерес представляет взаимодействие E6 с многофункциональным белком хозяйской клетки p53, которое приводит к существенно увеличенной деградации последнего. Одна из функций р53 - арест клеточного цикла в контрольной точке G1/S. После повреждения ДНК соответствующей клетки происходит

Е6-опосредованная деградация р53. Это одна из причин накопления мутагенных изменений в хозяйских клетках, носящих Е6, и последующего развития анеупло-идного кариотипа. Похоже, однако, что Е6 - не единственный фактор, вызывающий хромосомную нестабильность, так как подобные наблюдения, хотя и в меньшей степени, также были сделаны в клетках с высокой экспрессией Е7. Таким образом, мутагенная активность и развитие анеуплоидии - общие последствия ВПЧ-инфекции [2].

Связывание белка Е6 с р53, однако, не является обязательным условием клеточной иммортализации [4]. Тем не менее необходимость в модификациях в клеточных генах для эффективной иммортали-зации и злокачественной конверсии указывает на важную роль деградации р53 как фактора, влияющего на прогрессию путем устранения важного контроля за восстановлением ДНК и апоптозом [11]. Подобно Е6, Е7 способен вызывать му-

№6 • 2012

МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ |б9

тации в ДНК хозяйских клеток, повышать мутагенность химических канцерогенов и интеграцию чужеродных ДНК. Механизм этих взаимодействий в настоящее время еще недостаточно изучен. Индукция мутаций и хромосомных перестроек, однако, должна способствовать изменению тех клеточных генов, которые контролируют экспрессию ВПЧ в инфицированных кератиноцитах человека [11].

Индивидуальная и совместная мутагенность онкобелков Е6 и Е7 указывает на их двойную роль в канцерогенезе: кроме того, действуя в качестве онкогенных факторов при стимулировании пролиферации хозяйской клетки, они способны изменять характер экспрессии генов хозяйской клетки, в частности тех, которые задействованы в своем собственном контроле.

Существуют некоторые предположения, что ингибиторы циклинзависимых киназ могут играть важную роль в ограничении функций вирусных онкобелков. Первая серия исследований показала, что уроэпителиальные клетки или керати-ноциты крайней плоти, инфицированные ВПЧ-16, экспрессирующим ген Е6, как правило, лишены экспрессии р16№К4. Соответствующий ген переставал функционировать за счет метилирования или мутации. Эти данные позволяют предположить, что для активного функционирования белку Е6 требуется инактивация р16№К4 [6]. 1ен р16|пк4а является геном-супрессором и играет важное значение в регулировании клеточного цикла.

Белок Е7 индуцирует приостановку клеточного цикла путем ингибирования фосфорилирования pRB с помощью цик-линзависимой киназы CDK4 и CDK6 [8]. Взаимодействие между Е7 и pRB обходит эту блокаду. Экспрессия белка Е7 в кератиноцитах может подавлять р21С1Р1-опосредованное торможение CDK [1, 3], а также блокировать ингибитор циклин-зависимых киназ р27К1Р1. Возможно, что существует эффект зависимости от концентрации и что при низком уровне экспрессии Е7 к функциональным нарушениям этого онкобелка могут привести высокие концентрации белков р2^!Р1 и р27К1Р1 [9, 10].

В течение последнего десятилетия был выявлен ряд цитокинов, способных регулировать опасную онкогенную транскрипцию ВПЧ. Из этого можно сделать вывод, что помимо функционального нарушения вирусных онкобелков деятельность онкогенов могут регулировать дополнительные механизмы контроля. Иммортализованные клетки в отличие от ВПЧ-содержащих злокачественных

клеток показали резкое снижение транскрипционной активности по сравнению с теми же клетками, находящимися в тканевой культуре. В некоторой степени это соотносилось с обычно очень низкой транскрипционной активностью генов E6/E7 ВПЧ-16 в клетках базального слоя при цервикальных внутриэпителиальных поражениях низкой степени тяжести, в противоположность повреждениям высокой степени тяжести, содержащим тот же тип вируса. Это наводит на мысль о существовании межклеточного регуляторного пути, блокирующего транскрипцию ВПЧ и тем самым подавляющего потенциально инвазивный рост ВПЧ-иммортализиро-ванных клеток [12].

Итак, злокачественное преобразование ВПЧ-иммортализованных клеток требует приостановления второго сигнального пути, который внутриклеточно (скорее всего, через макрофаги и другие цитокиновыделяющие клетки) препятствует ВПЧ-транскрипционным процессам. Однако и другие молекулярные процессы должны способствовать ускользанию этих потенциально опухолевых клеток от иммунных механизмов контроля, что и приводит к развитию злокачественной опухоли [12].

Цель исследования - изучить значение экспрессии онкогенов Е6/Е7 ВПЧ и человеческого гена-регулятора клеточного цикла p16ink4a в развитии предрака и рака шейки матки.

Материалы и методы

В работе использовались 37 проб кДНК, синтезированные на матрице РНК, выделенной из образцов многослойного плоского эпителия шейки матки женщин с различной патологией шейки матки, являющихся носителями ВПЧ высокого онкогенного риска.

Тестировались и использовались в исследовании пары праймеров к гену Е6/Е7 вируса папилломы человека и к гену р16 человека.

Для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени использовался набор MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master

Mix (Fermentas, # K0221). Реакция проводилась в стрипах Masterclear (Eppendorf, # 0030 132.890) по инструкции производителя набора. Постановка ПЦР осуществлялась на приборе Mastercycler epGradient S realplex 4. Состав 1 реакции ПЦР включал 10 мкл набора MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix, 2 мкл кДНК, праймеры в конечной концентрации 0,5 мкмоль каждый и воду до объема 20 мкл. Программа ПЦР состояла из: 95 °С - 10 мин, 55 циклов по (95 °С -20 с, 60 °С - 20 с, 72 °С - 30 с) и кривой плавления от 50 до 95 °С. Дополнительно отдельные образцы разгонялись электрофорезом в 2%-ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия в конечной концентрации 0,1 мкг/мл.

Анализ наличия продуктов кДНК производился методом агарозного гель-электрофореза с последующей съемкой на системе документирования «Kodak Molecular Image Station 2000R».

Результаты и обсуждение

На наличие экспрессии гена Е6/Е7 методом ПЦР были протестированы пробы кДНК, полученные из образцов многослойного плоского эпителия шейки матки от пациенток с различной патологией. В исследование были включены 37 образцов, полученных от женщин со следующими диагнозами: доброкачественная патология шейки матки (эктопия плоского эпителия (ПЭ), хронический цервицит), CIN 1-3 (включая рак in situ), инвазивный рак шейки матки. В качестве отрицательного контроля использовался образец нормального многослойного плоского эпителия (МПЭ), в котором не выявлена ДНК онкогенных генотипов ВПЧ.

Ампликоны визуализировались с помощью агарозного электорофореза (см. рисунок).

Распределение образцов, положительных по гену E6/E7, по группам с различной нозологией представлено в табл. 2.

Из 37 образцов 19 (51,35%) оказались положительны по данному признаку, 18 -отрицательны.

Среди обследованных пациенток были выявлены различные ВПЧ-генотипы.

Таблица 1 Последовательности праймеров, используемых в исследовании

Название Последовательность 5'^3' Длина продукта кДНК, п.н. Название маркера

P16 F CAGACATCCCCGATTGAAAG 129 р16

P16 R TGAAAACTACGAAAGCGGG

Ep1 TGTCAAAAACCGTTGTGTC 230 Е6/Е7

Ep2 GAGCTGTCGCTTAATTGCTC

Рисунок

I Фотографии агарозного электрофореза образцов кДНК после ПЦР на наличие транскриптов гена Е6/Е7: М - маркер GeneRuler 50 bp

Таблица 2 Распределение положительных по гену Е6/Е7 образцов по нозологическим группам

Диагноз Количество образцов Количество положительных по гену E6/E7 образцов Относительное содержание положительных по гену E6/E7 образцов, %

Доброкачественная патология шейки матки (эктопия ПЭ, цервицит, койлоцитоз МПЭ) 8 2 25

С!1Ч1 5 1 20

С!№-3 13 11 84,6

Рак шейки матки 11 5 45,4

Распределение образцов по различным генотипам представлено в табл. 3.

Как видно из табл. 3, наиболее часто встречались ВПЧ-16 (54,05%), ВПЧ-33 (16,22%), ВПЧ-31 (13,51%).

При сравнении частоты встречаемости экспрессии онкогенов Е6/Е7 в пробах с одним ВПЧ-генотипом и пробах с двумя и более вирусными генотипами было выявлено, что экспрессия Е6/Е7 получена в 6 (35,29%) пробах с моноинфекцией и в 11 (64,71%) пробах с микс-инфекцией различными ВПЧ-генотипами. Однако достоверных различий в сравниваемых показателях получено не было (х2 = 1,88 (с поправкой Йетса), р = 0,17).

Наибольшее содержание положительных по экспрессии гена Е6/Е7 образцов наблюдается в группе с Ш2-3 (84,6%), где наиболее активно работают вирусные онкогены и способствуют процессам канцерогенеза. После нее следуют группы с диагнозом рака шейки матки (45,4%). Можно предположить, что при развитии инвазивного рака шейки матки роль онкогенов папилломавирусов снижается, процессы прогрессии заболевания и метастазирования опухоли обусловлены механизмами, которые уже не связаны с вирусными онкогенами.

В качестве отрицательного контроля (калибратора), относительно которого рассчитывалась экспрессия гена р16 во всех остальных образцах, был выбран образец с эктопией ПЭ, в котором от-

сутствовала ДНК ВПЧ. Увеличение экспрессии гена р16, рассчитанное таким образом, произошло в 5 образцах из 16, снижение экспрессии - в 4 образцах из 16, в 7 образцах не было зафиксировано статистической разницы в экспрессии по сравнению с контролем.

Таким образом, в 75% случаев рака шейки матки и в 14,2% случаев СШ отмечается повышенная экспрессия гена р16. В 14,2% случаев СШ, в 33,3% С!М и С№2 и во всех случаях клинически здоровых пациенток отмечается снижение экспрессии гена-регулятора клеточного цикла р16.

Учитывая роль папилломавирусов в канцерогенезе, исследования, направленные на глубокое изучение механизмов взаимодействия этого фактора с клеткой-мишенью, позволят получить полезную информацию для понимания различных изменений на этапах трансформации в рак. Фактически при всех

формах рака шейки матки были выявлены специфические вирусные гены Е6 и Е7. Эти же гены были обнаружены при других формах рака аногенитальной области. Экспрессия этих генов приводит к малигнизации эпителиальных клеток шейки матки, в то время как супрессия генов Е6, Е7 приводит к старению раковых клеток и их апоптозу.

Взаимодействие онкогенов ВПЧ с регуляторами клеточного цикла эпите-лиоцитов представляет особый интерес, так как может являться в дальнейшем ресурсом для детального раскрытия механизмов канцерогенеза и послужить мишенью для целевого воздействия посредством лекарственных препаратов и остановки процесса малигнизации в клетке, пораженной канцерогеном.

На сегодняшний день существует необходимость выяснения вопросов функционирования вирусных онкогенов, определения связи между инфекцией и клеточным от-

Таблица 3 Частота встречаемости различных ВПЧ-генотипов в исследуемых пробах

ВПЧ-генотип N % 95% ДИ, %

16 20 54,05 33,02-83,48

18 1 2,70 0,06-15,05

31 5 13,51 4,39-31,54

33 6 16,22 5,95-35,3

35 2 5,40 0,65-19,52

39 4 10,81 2,95-27,68

45 4 10,81 2,95-27,68

52 4 10,81 2,95-27,68

56 3 8,10 1,67-23,69

58 2 5,40 0,65-19,52

59 3 8,10 1,67-23,69

66 1 2,70 0,06-15,05

ДНК не выявлена 3 8,10 1,67-23,69

№6 • 2012

МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ |71

ветом, препятствующим развитию злокачественной трансформации эпителия. Эти ответы должны позволить найти методы целевой терапии ВПЧ-обусловленных предраковых заболеваний и рака.

Проведенное исследование позволило сделать следующие выводы:

1. Экспрессия вирусных онкогенов отмечена в 84,6% случаев С№2-3, что указывает на наиболее активные вирусас-социированные изменения в этой группе патологических процессов в эпителии, снижение частоты экспрессии до 45,4% в образцах рака шейки матки указывает на уменьшении роли вируса в процессах жизнедеятельности уже сформировавшейся злокачественной опухоли.

2. В 25% образцов цервикального эпителия с легкой степенью ВПЧ-обусловленного поражения выявили экспрессию Е6/Е7, что

указывает на высокий риск вирусассоции-рованного канцерогенеза. То есть выявление экспрессии Е6/Е7 вирусов папилломы человека у пациенток с латентной формой ВПЧ-инфекции и с С№1 может быть маркером канцерогенеза в эпителии и позволит отбирать группы риска среди большого количества инфицированных женщин.

3. В 75% случаев рака шейки матки отмечается повышение экспрессии гена р16, что может быть потенциальным маркером канцерогенеза в предраковых поражениях эпителия шейки матки.

4. Формулировать определенные выводы об особенностях экспрессии человеческого гена регулятора клеточного цикла р16 на различных стадиях канцерогенеза на данном этапе исследования затруднительно, необходимо проведение более интенсивных работ.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Funk J.О., Waga S, Harry J.B. et al. // Genes Dev. -1997. - Vol. 11. - P. 2090-2100.

2. Huibregtse J.M., Scheffner M. // Semin Virol. -1994. - Vol. 5. - P. 357-367.

3. Jones D.L., Alani R.M., Munger K. // Genes Dev. -

1997. - Vol. 11. - P. 2101-2111.

4. Kiyono T, Foster S.A., Koop J.l. et al. // Nature. -

1998. - Vol. 396. - P. 84-88.

5. Mcüougall J.K. // Curr. Top Microbiol. Immunol. -1994. - Vol. 186. - P. 101-119.

6. Reznikoff C.A., Yeager TR, Beiair C.ü. et al. // Cancer Res. - 1996. - Vol. 56. - P. 2886-2890.

7. Schwarz E, Freese U.K., Gissmann L. et al. // Nature. - 1985. - Vol. 314. - P. 111-114.

8. Scott FJ, Bates S, James M.C. et al. // EMBO J. -1998. - Vol. 17. P. 5001-5014.

9. Wang J.L, Zheng BY, LiX.ü. // Clin. Cancer Res. -2004. - Vol. 1, N 10. - P. 2407-2414.

10. Zerfass-Thome K, Zwerschke W., Mannhardt B. et al. // Oncogene. - 1996. - Vol. 13. - P. 2323-2330.

11. Zur Hausen H. // Cancer Biology. - 1999. - Vol 9. - P. 405-411.

12. Zur Hausen H. // Biochem. Biophys. Acta Rev. Cancer. - 1996. - Vol. 1288. - F55-F78.

Поступила 22.03.2012 г.

Влияние [3-адреноблокаторов на растяжимость и эластичность общей сонной артерии пациентов с хронической ишемической болезнью сердца, перенесших интракоронарное стентирование

Пристром А.М.1, Гайшун Е.И.2

1 Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск 21-я городская клиническая больница, Минск

Prystrom A-М.1, Gaishun E.I.2

1 Beiarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk 2 City Clinical Hospital № 1, Minsk

Influence of ('-adrenoblockers on common carotid artery distensibility and elasticity for chronic coronary heart disease patients

after intracoronary stenting

Резюме. Изучено влияние в-адреноблокаторов на эластические свойства сосудистой стенки. Доказано, что небиволол значимо улучшает растяжимость и эластичность общей сонной артерии у пациентов с ишемической болезнью сердца, перенесших интракоронарное стентирование. Ключевые слова: эластичность и растяжимость общей сонной артерии, небиволол.

Summary. There was a study of the influence ofв -adrenoblockers on the vessel walls elastance. It was proved that nebivolol signfficantly improves common carotid artery distensibility and elasticity among coronary heart disease patients after intracoronary stenting. Keywords: common carotid artery distensibility and elasticity, nebivolol.

Стандартное лечение пациентов с хронической ишемической болезнью сердца (ИБС) включает четыре класса препаратов: антиагреган-ты, статины, ингибиторы АПФ (иАПФ) и р-адреноблокаторы [1]. Применение препаратов указанных классов направлено на улучшение прогноза развития заболевания. Антиангинальный эффект р-ад-реноблокаторов связан с уменьшением

потребности миокарда в кислороде и увеличением доставки кислорода к миокарду. Кроме того, р-адреноблокаторы обладают гипотензивным, антиаритмическим, антиагрегационным действием и снижают накопление кальция в ишемизированных кардиомиоцитах [1-3]. Среди препаратов этого класса уникальные свойства имеет небиволол - высокоселективный р1-адре-ноблокатор, обладающий способн1 остью

участвовать в процессе синтеза клетками эндотелия оксида азота, приводящего к расширению сосудов, что придает препарату дополнительный вазодилатирующий эффект.

Один из факторов, неблагоприятно влияющих на течение сердечно-сосудистых заболеваний, - нарушение упругих свойств крупных артерий. Оценка воздействия Р-адреноблокаторов на упругие