Влияние экзогенных низкомолекулярных веществ на регуляцию опухолевого роста

© ЗАМАЙ Т.Н., ЗАМАЙ А.С., BEREZOVSKIM., БОРОДИНА Н.А., ЗАМАЙ О.С., РОГОЗИН Д.Ю., ЧЕЧИК А.В.

УДК 57.021

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЕЩЕСТВ НА РЕГУЛЯЦИЮ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА

Т.Н. Замай, А.С. Замай, M. Berezovski, Н.А. Бородина, О.С. Замай, Д.Ю.

Рогозин, А.В. Чечик Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.

Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П.Артюхов; кафедра биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, зав. - д.м.н., проф. А.Б. Салмина; University of Ottawa, Department of Chemistry; Сибирский федеральный университет,

ректор - акад. РАН Е.А. Ваганов.

Резюме. В работе исследовалось влияние инсулина, строфантина G, фуросемида и гипертонического раствора NaCl на скорость роста асцитной карциномы Эрлиха в условиях in vivo. Выявлено, что инсулин и строфантин G, индуцирующие увеличение размеров клетки, ускоряли скорость опухолевого роста, а фуросемид и гипертонический раствор NaCl, вызывающие снижение клеточных размеров, ее подавляли. При этом доля асцитных клеток в опухоли в состоянии апоптоза под воздействием инсулина снижалась в 2 раза, тогда как под влиянием фуросемида возрастала в 3 раза. На основании полученных результатов сделан вывод о том, что скорость роста асцитной карциномы Эрлиха в условиях in vivo зависит от факторов, регулирующих объем клеток.

Ключевые слова: асцитная карцинома Эрлиха, инсулин, фуросемид, пролиферация, апоптоз.

Замай Татьяна Николаевна - к.б.н. каф. биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ; email: szamay@akadem.ru.

Замай Анна Сергеевна - к.б.н. каф. биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ; email: annazamay@yandex.ru.

Berezovski Maxim - PhD, prof. University of Ottawa, Department of Chemistry; e-mail: maxim.berezovski@uottawa.ca.

Механизмы, регулирующие рост клеточных популяций в условиях in vivo, до настоящего времени до конца не ясны. Трудности в их понимании связаны со многими причинами и, в первую очередь, со слишком большой совокупностью факторов, воздействующих на клеточную популяцию, учесть которые не всегда удается. В последнее время, благодаря развитию молекулярной биологии, большие надежды на раскрытие механизмов, контролирующих митотическую активность клеток, стали возлагаться на исследование белков, являющихся компонентами сложных разветвленных внутриклеточных сигнальных систем, регулирующих функциональное состояние клетки. Было выявлено множество внеклеточных факторов и внутриклеточных сигнальных путей, запускающих процессы клеточного роста, пролиферации, дифференцировки и апоптоза. В то же время выяснилось, что одни и те же внеклеточные сигнальные молекулы и внутриклеточные мессенджерные системы могут стимулировать различные, часто противоположные, клеточные эффекты - от пролиферации до апоптоза [5]. Стало очевидно, что для понимания механизмов, регулирующих рост клеточных популяций в норме и при патологии, зачастую недостаточно только молекулярно-биологических исследований, так как в них игнорируется специфичность условий, в которых функционируют белки в

условиях in vivo, хотя, как известно, физико-химические свойства среды играют важную роль в определении конформации биополимеров. В частности, усиление гидратации белковой молекулы, зависящей от содержания катионов натрия в среде, вызывает удлинение молекулы, а ослабление гидратации - ее сокращение [6,11]. Очевидно, что физикохимические свойства внутри- и внеклеточной среды предопределяют стратегию клеточного поведения, модулируя конформацию белков и, таким образом, межбелковые взаимодействия. Следовательно, разрешение противоречий, которые накопились в биологии регуляции клетки, без учета физико-химических свойств внутри- и внеклеточной среды, в которой функционируют биомолекулы, невозможно.

Цель работы - исследование противоопухолевого эффекта веществ, регулирующих ионный гомеостаз клеток.

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на белых мышах-самцах линии ICR массой 2735 г. Объектом исследования служили асцитные клетки карциномы Эрлиха, изолированные на 13-е сутки после их внутрибрюшинной трансплантации в количестве трех млн. клеток. Животные были разделены на 5 групп по 10 мышей в каждой. Каждой особи ежедневно, начиная с 5-х суток развития опухоли, вводили инсулин (1-я группа), фуросемид (2-ая группа), 1 мл 2,7% NaCl (3-я группа), строфантин G (4-я группа) или 1 мл физиологического раствора (5-я группа - контроль).

Извлечение асцита производили на 13-е сутки после трансплантации опухолевых клеток. Весь асцит из брюшной полости собирали пипеткой, брюшину трижды промывали физиологическим раствором для извлечения всех клеток. Для подсчета количества асцитных клеток в опухоли использовали камеру Горяева. Идентификацию клеток в состоянии апоптоза и некроза оценивали флуоресцентным методом на микроскопе Olympus BX51 с помощью флуоресцентных красителей - Hoechst 33342 и Propidium iodide [7]. Статистическую обработку проводили в программе Statistica 7,0.

Достоверность различий оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

Вещества, способствующие внутриклеточному накоплению катионов натрия и анионов хлора, как известно, увеличивают размеры клеток, а вещества, снижающие содержание этих ионов - их уменьшают. Даже небольшие колебания размеров клетки заметно изменяют их функциональное состояние, поэтому в норме клетки имеют множество различных механизмов, как энергозависимых, так и не зависимых от энергообмена, способных поддерживать стабильность клеточного объема. Увеличение размеров клетки активирует анаболические процессы и стимулирует клеточную пролиферацию, а снижение - индуцирует катаболизм и апоптоз [2,4,8]. Следовательно, можно предположить, что скорость опухолевого роста возможно скорректировать изменением объема опухолевых клеток, подавляя его или активируя. В частности, увеличивая размер асцитных клеток, можно вызывать ускорение роста карциномы Эрлиха, а уменьшая размеры асцитных клеток - подавление опухолевого роста. Экспериментальную проверку такого предположения проводили путем введения в асцитную опухоль веществ, вызывающих разнонаправленные изменения клеточного размера, а именно, строфантина

О, инсулина, фуросемида и 2,7%-ного раствора КаС1. Строфантин О -специфический ингибитор Ка,К-АТРазы - повышает внутриклеточное содержание катионов натрия и, таким образом, увеличивает размер клетки [1]. Эффект инсулина подобен гипоосмотическому набуханию, инсулин стимулирует увеличение объема клетки путем активации Ка+/И+-обмена и Ка+-К+-2СГ-котранспорта [10]. Фуросемид, наоборот, ингибирует Ка+/И+-обмен и Ка+-К+-2СГ-котранспорт, снижая внутриклеточное содержание катионов натрия, и, таким образом, вызывает уменьшение размеров клетки [9], а 2 ,7%-ный раствор КаС1 снижает размер клетки, вызывая гипертонический шок [3].

Результаты проведенных исследований подтвердили наше предположение о влиянии веществ, изменяющих объем клеток, на опухолевый рост. Так, в группах мышей, которым вводили фуросемид и 2,7%-ный раствор КаС1, способствующие снижению объема клетки, количество асцитных клеток в опухоли было уменьшено по сравнению с контролем на 26% и 59%, соответственно. В группах животных с введением инсулина и строфантина О количество асцитных клеток в опухоли, наоборот, превысило уровень контроля на 100% и 30%, соответственно (рис.1). При этом общий объем асцита в группе мышей, которым вводили фуросемид, уменьшился на 15%, а в группе животных, которым инъецировали инсулин, повысился на 23%, что соответствовало изменениям количества в нем опухолевых клеток. Однако в группе мышей, которым в опухоль вводили по 1 мл 2,7%-ного раствора КаС1, создавая гипертонический шок асцитным клеткам, объем асцита возрос на 22%, несмотря на более чем двукратное снижение количество клеток (рис.2). Таким образом, концентрация асцитных клеток в опухоли мышей-опухоленосителей, в зависимости от вводимого препарата, резко менялась. Так, под влиянием фуросемида концентрация клеток в асците снизилась на 15%, а в условиях воздействия инсулина повысилась на 46%. Однако самые большие изменения наблюдались при введении в асцит гипертонического раствора КаС1 - он вызывал снижение концентрации клеток в опухоли более чем в 3 раза (рис.3).

Для установления причины изменения скорости опухолевого роста под влиянием различных препаратов была проанализирована доля апоптотических и некротических клеток в асцитной карциноме Эрлиха в разных экспериментальных группах мышей. Результаты исследований показали, что в опухоли контрольных животных общее число клеток в состоянии апоптоза и некроза составило 15%; в группе животных, которым вводили инсулин, она практически не отличалась от контроля. Однако в группе мышей, которым был инъецирован фуросемид, доля клеток в состоянии апоптоза и некроза возросла до 47% (рис.4). При этом инсулин

повысил число некротических и снизил долю апоптотических клеток в опухоли, а фуросемид увеличил количество некротических и апоптотических клеток, причем доля апоптотических клеток возросла многократно (рис.4).

В целом результаты наших исследований показали, что: введение мышам с асцитной карциномой Эрлиха веществ, способствующих увеличению размеров клеток, стимулирует опухолевый рост, а веществ, приводящих к уменьшению размеров клетки - его подавляют; основной причиной снижения скорости роста опухоли под влиянием фуросемида является стимуляция процессов апоптоза и некроза. Таким образом, данные, полученные нами, открывают перспективы, позволяющие разрабатывать способы подавления опухолевого роста веществами, снижающими размеры опухолевых клеток.

INFLUENCE OF EXOGENOUS LOW MOLECULAR WEIGHT SUBSTANCES ON TUMOR GROWTH

T.N. Zamay, A.S. Zamay, M. Berezovski, N.A. Borodina, O.S. Zamay, A.V.

Chechik

Krasnoyarsk State Medical University named after Professor V.F. Voyno-

Yasenetsky, University of Ottawa, Department of Chemistry, Siberian Federal

University.

Abstract. We studied insulin, G-strophantin, furosemide and NaCl hypertensive solution influence on growth speed of Ehrlich ascites carcinoma in vivo. We revealed that insulin and G-strophanin increase cell seize and induce tumor growth. Furosemide and NaCl hypertensive solution decrease cell seize. The part of apoptotic ascite cells in tumor decrease in to two times during insulin treatment and decrease three time after furosemide. We conclude that the growth speed of ascite Ehrlich carcinioma in vivo depend from the factors regulation cell volume.

Key words: ascite Ehrlich carcimona, insulin, furosemide, proliferation, apoptosis.

Литература

1. Болдырев А. А. Роль Na/К-насоса в возбудимых тканях (обзор) // Журнал Сибирского федерального университета. Серия «Биология». - 2008. - Т.1, №3. - С.206-225.

2. Широкова А.В. Апоптоз, сигнальные пути и изменение ионного и водного баланса клетки // Цитология. - 2007. - Т.49, №5. - C.385-394.

3. Friis M.B., Friborg C.R., Schneider L. et al. Cell shrinkage as a signal to apoptosis in NIH 3T3 fibroblasts // J.Physiol. - 2005. - Vol.567. - P.427-443.

4. Gomes-Angelats M., Bortner C.D., Cidlowski J.A. Protein Kinase C (PKC) Inhibits Fas Receptor-induced Apoptosis throw Modulation of the Loss of K+ and Cell Shrinkage // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol.275. - P.19609-19619.

5. Gomperts B., Kramer I., Tatham P. Signal transduction. - London: Elsevier Science, 2003. - 424 p.

6. Haussinger D., Lang F., Gorok W. Regulation of cell function by the cellular hydration state // Am. J. Physiol. - 1994. - Vol.267, №3. - P.343-355.

7. Izumov D.S., Avetisyan A.V., Pletjushkina O.Yu. “Wages of Fear”: transient threefold decrease in intracellular ATP level imposes apoptosis // Biochim. Biophys. Acta. - 2004. - Vol.1658. - P.141-147.

8. Lang F., Foller M., Lang K. et al. Cell volume regulatory ion channels in cell proliferation and cell death // Methods Enzymol. - 2007. - Vol.428. - P.209-225.

9. Liu R., Garvin J.L., Ren Y. Depolarization of the macula densa induces superoxide production via NAD(P)H oxidase // Am. J. Physiol. Renal Physiol. -2007. - Vol.292. - P.1867-1872.

10. Schliess F., Haussinger D. Cell volume and insulin signaling // Int. Rev. Cytol. - 2003. - Vol.225. - P.187-228.

11. Waldegger S., Busch G.L., Kaba N.K. et al. Effect of cellular hydration on protein metabolism // Mineral & Electrolyte Metabol. - 1997. - Vol.23, № 3-6. -P.201-205.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Государственный контракт № 16.512.11.2090) и Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности (Дополнительное соглашение к государственному контракту № 04/11).