НОВАЯ МУТАЦИЯ, ВОВЛЕЧЕННАЯ В ПОВЫШЕННУЮ ТОЛЕРАНТНОСТЬ РАСТЕНИЙ К ИМИДАЗОЛИНОНОВЫМ ГЕРБИЦИДАМ
NOVEL MUTATION INVOLVED IN INCREASED TOLERANCE TO IMIDAZOLINONE HERBICIDES IN PLANTS

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Настоящее изобретение относится к растениям, обладающим повышенной толерантностью к имидазолиноновым гербицидам. В частности, настоящее изобретение касается растений, полученных путем мутагенеза, перекрестного скрещивания и трансформации, которые обладают повышенной толерантностью к имидазолиноновым гербицидам.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Ацетогидроксикислотасинтаза (AHAS; ЕС 4.1.3.18; ацетолактатсинтаза (ALS)), которая кодируется Als нуклеиновой кислотой, представляет собой первый фермент, который катализирует биохимический синтез разветвленной цепи аминокислот валина, лейцина и изолейцина (Singh В. К., 1999, Biosynthesis ofvaline, leucine and isoleucine in: Singh B. K. (Ed) Plant amino acids. Marcel Dekker me. New York, New York. стр.227-247). AHAS представляет собой сайт воздействия четырех структурно различных семейств гербицидов, в том числе, сульфонилмочевин (LaRossa RA и Faico SC, 1984, Trends Biotechnol. 2:158-161), имидазолинонов (Shaner и др., 1984, Plant Physiol. 76:545-546), триазолпиримидинов (Subramanian и Gerwick, 1989, Inhibition of acetolactate by triazolopyrimidines: в (ред.) Whitaker JR, Sonnet PE Biocatalysis in agricultural biotechnology. ACS Symposium Series, American Chemical Society. Washington, D.C. стр.277-288) и пиримидилоксибензоатов (Subramanian и др., 1990, Plant Physiol. 94: 239-244). Гербициды на основе имидазолинона и сульфонилмочевины широко используются в настоящее время в сельском хозяйстве благодаря своей эффективности при низких нормах расхода и относительной нетоксичности для животных. Путем ингибирования активности AHAS эти семейства гербицидов предотвращают дальнейшее развитие чувствительных растений, в том числе большого количества различных видов сорняков. Некоторые примеры коммерчески доступных имидазолиноновых гербицидов представляют собой PURSUIT (имазетапир), SCEPTER (имазаквин) и ARSENAL (имазапир). Примеры гербицидов на основе сульфонилмочевины представляют собой хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлоримурон этил, тифенсульфурон метил, трибенурон метил, бенсульфурон метил, никосульфурон, этаметсульфурон метил, римсульфурон, трифлусульфурон метил, триасульфурон, примисульфурон метил, циносульфурон, амидосульфурон, флузасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфурон этил и галосульфурон.
(0003] Благодаря своей высокой эффективности и низкой токсичности имидазолиноновые гербициды являются благоприятными для применения путем распыления на надземную часть растений, занимающих значительную площадь. Способность гербицида к распылению на надземную часть растений, занимающих значительную площадь, снижает затраты, ассоциированные с высаживанием и выращиванием, а также снижает необходимость подготовки места обработки перед применением таких химических средств. Распыление на надземную часть желательно толерантных видов также приводит к возможности достижения максимального потенциального урожая желательных видов благодаря отсутствию конкурентных видов растений. Однако возможность применения таких методик на основе распыления на надземную часть растений зависит от наличия толерантных к имидазолинону видов желательных растений на площади, которую подвергают воздействию распыления.
[0004] Среди основных сельскохозяйственных культур некоторые виды бобовых растений являются естественно толерантными к имидазолиноновым гербицидам благодаря своей способности быстро метаболизировать гербицидные соединения (Shaner и Robson, 1985, Weed Sci. 33:469-471). Другие растения, такие, как кукуруза (Newhouse и др., 1992, Plant Physiol. 100:882-886) и рис (Barrett и др., 1989, Crop Safeners for Herbicides, Academic Press New York, стр.195-220), являются чувствительными к имидазолиноновым гербицидам. Различная чувствительность к имидазолиноновым гербицидам зависит от химической природы частного гербицида и различного метаболизма соединения от токсичной до нетоксичной формы в каждом растении (Shaner и др., 1984, Plant Physiol. 76:545-546; Brown и др., 1987, Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29). Другие физиологические различия растений, такие, как поглощение и перемещение веществ, также играют важную роль в чувствительности (Shaner та Robson, 1985, Weed Sci. 33:469-471).
[0005] Культивары растений, чувствительные к имидазолинонам, сульфонилмочевинам и триазолпиримидинам были успешно получены при использовании мутагенеза семян, микроспор, пыльцы, каллусов у Zea mays, Brassica napus, Glycine max и Nicotiana tabacum (Sebastian и др., 1989, Crop Sci. 29:1403-1408; Swanson и др., 1989, Theor. Appl. Genet. 78:525-530; Newhouse и др., 1991, Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan и др., 1991, Plant Physiol. 97:1044-1050; Mourand и др., 1993, J. Heredity 84:91-96). Во всех случаях толерантность обеспечивал единственный частично доминантный ядерный ген. Четыре растения пшеницы, толерантные к имидазолинонам, были также ранее изолированы с помощью мутагенеза семян Triticum aestivum L. cv Fidel (Newhouse и др., 1992, Plant Physiol. 100:882-886). Исследования наследственности подтвердили, что толерантность обеспечивает единственный частично доминантный ген. На основе аллельных исследований авторы пришли к выводу, что мутации в четырех идентифицированных линиях размещались в одном и том же локусе. Один из генов толерантности культивара обозначали как FS-4 (Newhouse и др., 1992, Plant Physiol. 100:882-886). [0006] Компьютерное моделирование пространственной конформации AHAS-ингибиторного комплекса предоставило возможность предсказать некоторые аминокислоты в предложенном кармане связывания ингибитора в качестве сайтов, в которых индуцированные мутации, вероятно, обеспечивали бы селективную толерантность к имидазолинонам (Ott и др., 1996, J. Mol. Biol. 263:359-368). Растения табака, полученные с использованием некоторых из этих рационально соответствующих мутаций в предложенных сайтах связывания фермента AHAS, действительно демонстрировали специфическую толерантность к одному классу гербицидов (Ott и др., 1996, J. Mol. Biol. 263:359-368).
[0007] Толерантность растений к имидазолиноновым гербицидам также была описана в ряде патентов. Патенты США №4,761,373, 5,331,107, 5,304,732, 6,211,438, 6,211,439 и 6,222,100 в общих чертах описывают применение измененной Als нуклеиновой кислоты для получения толерантности к гербицидам у растений. Патент США №.5,013,659 описывает растения, демонстрирующие толерантность к гербицидам, которые имеют мутации, по крайней мере, одной аминокислоты в одном или более консервативных участках. Описанные в этом патенте мутации кодируют либо перекрестную толерантность для имидазолинонов и сульфонилмочевин, либо специфическую для сульфонилмочевины толерантность, однако при этом специфическая для имидазолинона толерантность не была описана. Кроме того, патент США №5,731,180 и патент США №5,767,361 обсуждают изолированный ген, который имеет единственную аминокислотную замену в аминокислотной последовательности однодольных растений дикого типа, которая приводит к специфической для имидазолинона толерантности.
[0008] На сегодняшний день в уровне техники не было описано мутаций в гене Als1, которые обеспечивали бы толерантность к имидазолиноновому гербициду, отличных от мутации в толерантной к имидазолинону линии FS-4. В уровне техники также не было описано толерантности к имидазолинону у растений пшеницы и тритикале, которые включают, по крайней мере, одну измененную Als нуклеиновую кислоту из Triticum aestivum культивара Shiloh. Таким образом, в области техники существует потребность в идентификации дополнительных мутаций, которые обеспечивают толерантность к имидазолиноновым гербицидам. В области техники также существует потребность в растениях пшеницы и тритикале, которые обладают повышенной толерантностью к гербицидам, таким как имидазолинон, и содержат, по крайней мере, одну Als нуклеиновую кислоту. Также необходимы способы борьбы с ростом сорняков, произрастающих рядом с такими растениями пшеницы и тритикале. Такие композиции и способы позволили бы использовать методики опрыскивания надземной части при применении гербицидов к площадям, на которых произрастают растения пшеницы и тритикале.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0009] Настоящее изобретение обеспечивает растения пшеницы, которые включают IMI нуклеиновые кислоты, при этом растение пшеницы обладает повышенной толерантностью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением дикого типа. Растения пшеницы могут содержать один, два, три или более IMI аллелей. В одном воплощении растение пшеницы включает, по крайней мере, одну IMI нуклеиновую кислоту. В другом воплощении, по крайней мере, одна нуклеиновая кислота представляет собой Imi1 нуклеиновую кислоту. В другом воплощении, по крайней мере, одна IMI нуклеиновая кислота включает IMI нуклеиновую кислоту Triticum aestivum. В другом воплощении, по крайней мере, одна IMI нуклеиновая кислота включает IMI нуклеиновую кислоту культивара Shiloh. Еще в одном воплощении растение пшеницы включает множество IMI нуклеиновых кислот, которые размещаются в различных геномах. В другом воплощении многочисленные IMI нуклеиновые кислоты включают Imi1 нуклеиновую кислоту Triticum aestivum культивара Shiloh. Предпочтительно, когда Imi1 нуклеиновая кислота культивара Shiloh кодирует белок, содержащий мутацию в консервативной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из Домена А, Домена В, Домена С, Домена D и Домена Е. Более предпочтительно, когда мутация находится в консервативном Домене С. Также обеспечиваются части растений и семена растений, полученные из растений пшеницы, описанных в данной заявке.
[0010] Настоящее изобретение также обеспечивает растения тритикале, которые включают IMI нуклеиновые кислоты, при этом растение тритикале обладает повышенной толерантностью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением тритикале дикого типа. В одном воплощении растение тритикале включает, по крайней мере, одну IMI нуклеиновую кислоту. В другом воплощении, по крайней мере, одна нуклеиновая кислота представляет собой Imi1 нуклеиновую кислоту. В другом воплощении, по крайней мере, одна IMI нуклеиновая кислота включает IMI нуклеиновую кислоту Triticum aestivum культивара Shiloh. В другом воплощении растение тритикале включает множество IMI нуклеиновых кислот, которые размещаются в различных геномах. Еще в одном воплощении многочисленные IMI нуклеиновые кислоты кодируют белок, содержащий мутацию в консервативной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из Домена А, Домена В, Домена С, Домена D и Домена Е. Более предпочтительно, когда мутация находится в консервативном Домене С. Даже более предпочтительно, когда мутация кодирует полипептид, который имеет замену аланина на треонин в положении 96 полипептида ALS. Также обеспечиваются части растений и семена растений, полученные из растений тритикале, описанных в данной заявке.
[0011] IMI нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут включать полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из полинуклеотида, как определено в SEQ ID NO:1;
полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, как определено в SEQ ID NO:2; полинуклеотида, включающего, по крайней мере, 60 последовательных нуклеотидов любого из упомянутых выше полинуклеотидов; полинуклеотида, комплементарного любому из упомянутых выше полинуклеотидов.
[0012] Растения в соответствии с настоящим изобретением могут быть трансгенными или нетрансгенными. Пример нетрансгенного растения пшеницы, обладающего повышенной толерантностью к имидазолиноновому гербициду, представляет собой растение пшеницы, которое имеет ссылочный номер депонирования для целей патентной процедуры в АТСС РТА-5625; или мутант, рекомбинант или полученную с помощью генетической инженерии производную растения с ссылочным номером депонирования для целей патентной процедуры в АТСС РТА-5625; или любого потомка растения со ссылочным номером депонирования для целей патентной процедуры в АТСС РТА-5625; или растение, которое является потомком какого-либо из этих растений.
[0013] В дополнение к композициям в соответствии с настоящим изобретением обеспечиваются также несколько способов. В данной заявке описаны способы модификации толерантности растений к имидазолиноновому гербициду, включающие модификацию экспрессии IMI нуклеиновой кислоты в растении. Также описаны способы получения трансгенного растения, обладающего повышенной толерантностью к имидазолиноновому гербициду, включающие трансформацию растительной клетки с помощью экспрессионного вектора, включающего одну или более IMI нуклеиновых кислот, и получение растения из этой растительной клетки. Изобретение также включает способ борьбы с сорняками, которые произрастают поблизости растения пшеницы или тритикале, включающий применение имидазолинонового гербицида к сорнякам и к растению пшеницы или тритикале, при этом растение пшеницы или тритикале имеет повышенную толерантность к имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением пшеницы или тритикале дикого типа, и где растение включает одну или более IMI нуклеиновых кислот. В некоторых предпочтительных воплощениях этих способов растения включают множественные IMI нуклеиновые кислоты, которые расположены в различных геномах.
[0014] Также обеспечиваются экспрессионные кассеты, векторы трансформации, трансформированные хозяйские клетки, отличные от человеческих, трансформированные растения, растительные клетки, части растений и семена, которые включают одну или более IMI нуклеиновых кислот в соответствии с изобретением.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
[0015] Фигура 1 показывает сравнение последовательности кДНК нуклеиновой кислоты Imi1 Shiloh-8 (SEQ ID NO:1), нуклеиновой кислоты Als1 дикого типа (SEQ ID NO:3) и консенсусной последовательности нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:5). Пара оснований, замененная в последовательности Imi1, обозначена жирным шрифтом.
[0016] Фигура 2 показывает сравнение дедуцированной аминокислотной последовательности IMI1 полипептида Shiloh-8 (SEQ ID NO:2), ALS1 полипептида дикого типа (SEQ ID NO:4) и консенсусной аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:6). Аминокислота, замененная в IMI1 аминокислотной последовательности, указана жирным шрифтом.
[0017] Фигура 3 является схематическим представлением консервативных аминокислотных последовательностей в генах AHAS, вовлеченных в толерантность к различным ингибиторам AHAS. Специфический аминокислотный сайт, ответственный за толерантность, обозначен подчеркиванием (с изменением от Devine, M. D. и Eberlein, С.V., 1997, Physiological, biochemical, and molecular aspects of herbicide tolerance based on altered target sites в: Herbicide Activity: Toxicity, Biochemistry, and Molecular Biology, IOS Press Amersterdam, стр.159-185).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0018] Настоящее изобретение направлено на изолированные нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, которые обеспечивают повышенную толерантность к имидазолиноновому гербициду, когда экспрессируются в растении. Настоящее изобретение также направлено на растения пшеницы или тритикале, части растений пшеницы или тритикале и клетки растения пшеницы или тритикале, обладающие повышенной толерантностью к имидазолиноновым гербицидам. Настоящее изобретение также включает семена, полученные от растений пшеницы или тритикале, описанных в данной заявке, и способы для борьбы с сорняками, произрастающими рядом с растениями пшеницы или тритикале, описанными в данной заявке.
[0019] Как используется в данной заявке, термин "растение пшеницы" относится к растению, которое является членом рода Triticum. Растения пшеницы в соответствии с настоящим изобретением могут быть членами рода Triticum, включая, но не ограничиваясь, Т. aestivum, Т. turgidum, Т. timopheevii, Т. monococcum, Т. zhukovskyi и Т. urartu, а также их гибриды. Примеры подвидов Т. aestivum, включенных в настоящее изобретение, представляют собой aestivum (пшеница обычная), compactum (пшеницы карликовая), macha (пшеница имеретинская), vavilovi (пшеница Вавилова), spelta (пшеница спельта) и sphaerococcum (пшеница круглозерная). Примеры подвидов Т. turgidum. которые включены в настоящее изобретение, представляют собой turgidum, carthlicum, dicoccom, durum, paleocolchicum, polonicum, turanicum и dicoccoides. Примеры подвидов Т. monococcum, включенных в настоящее изобретение, представляют собой monococcum (пшеница однозернянка) и aegilopoides. В одном воплощении в соответствии с настоящим изобретением растение пшеницы представляет собой члена видов Triticum aestivum L., и в частности, культивар Shiloh.
[0020] Термин "растение пшеницы" предназначен для того, чтобы охватывать растения пшеницы на любой стадии зрелости и развития, а также любые ткани или органы (части растений), которые взяты или имеют происхождение от каких-либо таких растений, если иное четко не указано в контексте. Части растений без ограничения включают следующие: стебли, корни, цветы, семяпочки, тычинки, листья, зародыши, меристематические участки, каллусные ткани, культуры пыльников, гаметофиты, спорофиты, пыльцу, микроспоры, протопласты и тому подобное. Настоящее изобретение также включает семена, полученные от растений пшеницы в соответствии с настоящим изобретением. В другом воплощении семена представляют собой таковые, полученные путем разведения гомозигот для увеличения толерантности к имидазолиноновому гербициду по сравнению с семенами растения пшеницы дикого типа.
[0021] Настоящее изобретение также охватывает растения тритикале, части растений тритикале и клетки растений тритикале, которые имеют повышенную толерантность к имидазолиноновым гербицидам. Как используется в данной заявке, термин "растение тритикале" относится к растению, полученному путем скрещивания растения ржи (Secale cereale) либо с тетраплоидным растением пшеницы (например, Triticum turgidum), либо с гексаплоидным растением пшеницы (например, Triticum aestivum). Настоящее изобретение также включает семена, полученные от растений тритикале, описанных в данной заявке, и способы борьбы с сорняками, произрастающими рядом с растениями тритикале, описанными в данной заявке.
[0022] Настоящее изобретение описывает растение пшеницы, включающее, по крайней мере, одну IMI нуклеиновую кислоту, где растение пшеницы имеет повышенную толерантность к имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением дикого типа. Является возможным для растений пшеницы в соответствии с настоящим изобретением обладать множественными IMI нуклеиновыми кислотами из различных геномов, поскольку эти растения могут содержать более одного генома. Например, растение пшеницы Triticum aestivum содержит три генома, обозначенные как геномы А, В и D. Поскольку AHAS представляет собой необходимый метаболический фермент, предполагается, что каждый геном имеет, по крайней мере, ген, кодирующий фермент AHAS (то есть, по крайней мере, один ген Als), который обычно наблюдается с другими метаболическими ферментами в гексаплоидной пшенице, которая была картирована. Как используется в данной заявке, термин "локус гена Als" относится к положению гена Als в геноме, а термин "ген Als " и "Als нуклеиновая кислота" относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей фермент AHAS. Als нуклеиновая кислота в каждом геноме отличается своей нуклеотидной последовательностью от Als нуклеиновой кислоты в другом геноме. Специалист в данной области может определить геном, который имеет происхождение от каждой Als нуклеиновой кислоты посредством генетического скрещивания и/или способов секвенирования, или способов на основе экзонуклеазного переваривания, известных специалисту в данной области техники. Как используется в данной заявке, термины "Als1 нуклеиновая кислота," "Als2 нуклеиновая кислота" и "Als3 нуклеиновая кислота" относятся к Als нуклеиновым кислотам, которые расположены в трех различных геномах. Для целей данного изобретения локус гена Als3 расположен в геноме А, локус гена Als2 расположен в геноме В, а локус гена Als1 расположен в геноме D. Также для целей данного изобретения следует указать, что IMI нуклеиновые кислоты, имеющие происхождение от геномов А, В или D, являются отличными и обозначаются как Imi3, Imi2 или Imi1 нуклеиновые кислоты, соответственно.
[0023] Как используется в данной заявке, термин "IMI нуклеиновая кислота" относится к Als нуклеиновой кислоте, которая имеет последовательность, полученную путем мутации Als нуклеиновой кислоты дикого типа, и такой, которая придает повышенную толерантность к имидазолиновому гербициду растению, в котором она экспрессируется. Как используется в данной заявке, термины "Imi1 нуклеиновая кислота" "Imi2 нуклеиновая кислота" и "Imi3 нуклеиновая кислота" представляют собой IMI нуклеиновые кислоты, которые относятся к аллелям имидазолиноновой толерантности Als1, Als2 и Als3 генов, соответственно. Поскольку растения пшеницы содержат две копии каждого генома, то растение пшеницы содержит две копии каждой частной Als нуклеиновой кислоты. Например, растение пшеницы Triticum aestivum включает две копии каждого генома А, В и D и, таким образом, две копии каждого гена Als3, Als2 и Als1. Как используется в данной заявке, термин "IMI аллель" относится к единственной копии частной IMI нуклеиновой кислоты. Соответственно, для целей настоящего изобретения растение пшеницы может содержать два Imi1 аллеля, один в каждой из двух копий генома D.
[0024] В другом воплощении растение пшеницы включает множественные IMI нуклеиновые кислоты. Как используется в данной заявке, когда описывается растение, которое включает "множественные IMI нуклеиновые кислоты" фраза "множественные IMI нуклеиновые кислоты" относится к присутствию различных IMI нуклеиновых кислот в растении, но не к тому, является ли растение гомозиготным или гетерозиготным в частном локусе Als. Например, растение, включающее множественные IMI нуклеиновые кислоты, может включать Imi1 и Imi2 нуклеиновые кислоты, в противоположность такому, которое имеет две копии Imi1 нуклеиновой кислоты.
[0025] Imi1 класс нуклеиновых кислот включает FS-4 ген, как описано Newhouse и др. (1992 Plant Physiol. 100:882-886) и Shiloh-8 ген, описанный более подробно ниже. Каждый Imi класс может включать членов из различных видов пшеницы. Таким образом, каждый Imi класс включает IMI нуклеиновые кислоты, которые отличаются своей нуклеотидной последовательностью, но которые тем не менее обозначаются как такие, которые имеют происхождение от, или такие, которые расположены в одном и том же геноме пшеницы, при использовании опытов по наследованию, как известно среднему специалисту в данной области техники.
[0026] Соответственно, настоящее изобретение включает растение пшеницы, включающее, по крайней мере, одну IMI нуклеиновую кислоту, где растение пшеницы имеет повышенную толерантность к имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением дикого типа и где, по крайней мере, одна IMI нуклеиновая кислота представляет собой Imi1 нуклеиновую кислоту. В предпочтительном воплощении Imi1 нуклеиновая кислота включает полинуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1. В другом предпочтительном воплощении растение пшеницы включает множественные IMI нуклеиновые кислоты.
[0027] Настоящее изобретение также охватывает толерантное к имидазолинону растение тритикале. Как используется в данной заявке, "растение тритикале" относится к растению, которое получено путем скрещивания растения ржи (Secale cereale) либо с тетраплоидным растением пшеницы (например, Triticum turgidum), либо с гексаплоидным растением пшеницы (например, Triticum aestivum). Для целей в соответствии с настоящим изобретением толерантное к имидазолинону растение тритикале включает, по крайней мере, одну IMI нуклеиновую кислоту, где растение тритикале имеет повышенную толерантность к имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением дикого типа и где, по крайней мере, одна IMI нуклеиновая кислота представляет собой Imi1 нуклеиновую кислоту. В предпочтительном воплощении Imi1 нуклеиновая кислота включает полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1. В другом предпочтительном воплощении растение тритикале включает множественные IMI нуклеиновые кислоты.
[0028] Как используется в данной заявке по отношению к нуклеиновым кислотам, термин "полученный из" относится к нуклеиновой кислоте, "расположенной в" или "имеющей происхождение от" частного генома. Термин "расположен в" относится к нуклеиновой кислоте, содержащейся в частном геноме. Как такой, который также используется в данной заявке в отношении генома, термин "имеющий происхождение от" относится к нуклеиновой кислоте, которая была удалена или изолирована из такого генома. Термин "изолированный" определяется более подробно ниже.
[0029] Настоящее изобретение включает растения пшеницы, содержащие один, два, три или более аллелей IMI, где растение пшеницы имеет повышенную толерантность к имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением дикого типа. IMI аллели могут включать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из полинуклеотида, как определено в последовательности SEQ ID NO:1; полинуклеотида, кодирующего полипептид, как определено в последовательности SEQ ID NO:2; полинуклеотида, содержащего, по крайней мере, 60 последовательных нуклеотидов любого из вышеупомянутых полинуклеотидов; и полинуклеотида, комплементарного любому из вышеупомянутых полинуклеотидов.
[0030] Настоящее изобретение также включает растения тритикале, включающие один, два, три или более аллелей IMI, где растение тритикале имеет повышенную толерантность к имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением дикого типа. IMI аллели могут включать полинуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из полинуклеотида, как определено в SEQ ID NO:1; полинуклеотида, кодирующего полипептид, как определено в SEQ ID NO:2; полинуклеотида, включающего, по крайней мере, 60 последовательных нуклеотидов любого из упомянутых выше полинуклеотидов; и полинуклеотида, комплементарного любому из упомянутых выше полинуклеотидов.
[0031] В одном воплощении растение пшеницы или растение тритикале включает две различные IMI нуклеиновые кислоты. Предпочтительно, когда, по крайней мере, одна из двух нуклеиновых кислот представляет собой Imi1 нуклеиновую кислоту. Более предпочтительно, когда, по крайней мере, одна из двух IMI нуклеиновых кислот включает полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1. В другом воплощении растение пшеницы или растение тритикале включает одну IMI нуклеиновую кислоту, где нуклеиновая кислота включает полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1. Еще в одном воплощении растение пшеницы включает более чем две IMI нуклеиновые кислоты, где каждая IMI нуклеиновая кислота происходит из различного генома. Предпочтительно, когда, по крайней мере, одна из IMI нуклеиновых кислот включает полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность SEQ ID NO:2, или полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1.
[0032] В предпочтительном воплощении в соответствии с настоящим изобретением изолированная IMI нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность, включающую мутацию в домене, который является консервативным среди нескольких белков AHAS. Эти домены обозначаются в данной заявке как Домен А, Домен В, Домен С, Домен D и Домен Е. Фигура 3 показывает общее расположение каждого домена в белке AHAS. Домен А содержит аминокислотную последовательность ATTGQVPRRMIGT (SEQ ID NO:7). Домен В содержит аминокислотную последовательность QWED (SEQ ID NO:8). Домен С содержит аминокислотную последовательность VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO:9). Домен D содержит аминокислотную последовательность AFQETP (SEQ ID NO:10). Домен Е содержит аминокислотную последовательность IPSGG (SEQ ID NO:11). Настоящее изобретение также предполагает, что могут существовать незначительные вариации в консервативных доменах, например, в растениях дурнишника остаток серина в Домене Е заменен остатком аланина.
[0033] В соответствии с этим, настоящее изобретение включает растение пшеницы или растение тритикале, включающее IMI нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, имеющую мутацию в консервативном домене, выбранном из группы, состоящей из Домена А, Домена В, Домена С, Домена D и Домена Е. В одном воплощении растение пшеницы или растение тритикале включает IMI нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, имеющую мутацию в Домене Е. В дальнейших предпочтительных воплощениях мутации в консервативных доменах возникают в местах, обозначенных в приведенных ниже последовательностях подчеркиванием:
P
W
ATTGQVRRMIGT (SEQ ID NO:7); OED (SEQ ID NO:8);
A
A
S
VFAYPGGSMEIHQALTRS (SEQ ID NO:9); FQETP (SEQ ID NO:10) и IPGG (SEQ ID NO:11). Одна предпочтительная замена представляет собой замену аланина на треонин в Домене С. Даже более предпочтительной является замена аланина на треонин в положении 96 ALS полипептида.
[0034] Настоящее изобретение обеспечивает способы для повышения толерантности или устойчивости растения, ткани растения, растительной клетки или другой хозяйской клетки, по крайней мере, к одному гербициду, который препятствует активности фермента AHAS. Настоящее изобретение также обеспечивает растения, клетки растений, части растений, органы растений, семена и хозяйские клетки, обладающие толерантностью, по крайней мере, к одному гербициду, в частности к гербициду, ингибирующему AHAS. Предпочтительно, когда такой ингибирующий AHAS гербицид представляет собой имидазолиноновый гербицид, гербицид на основе сульфонилмочевины, триазолпиримидиновый гербицид, гербицид на основе пиримидинилоксибензоата, сульфониламинокарбонилтриазолиноновый гербицид или их смесь. Более предпочтительно, когда такой гербицид представляет собой имидазолиноновый гербицид или смесь двух или более имидазолиноновых гербицидов. Для данного изобретения имидазолиноновые гербициды без ограничения включают следующие PURSUIT (имазетапир), CADRE (имазапик), RAPTOR (имазамокс), SCEPTER (имазаквин), ASSERT (имазетабенз), ARSENAL (имазапир), производную любого из упомянутых выше гербицидов, например, имазапир/имазамокс (ODYSSEY). В частности, имидазолиноновый гербицид может быть без ограничения выбран из следующих: 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2- имидазолин-2-ил)никотиновая кислота, [2-(4-изопропил)-4-] [метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-3-хинолинкарбоновая]кислота, [5-этил-2-(4-изопропил-]-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновая кислота, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновая кислота, [2-(4-изопропил-4-метил-5 -оксо-2-]-имидазолин-2-ил)-5-метилникотиновая кислота и смесь метил [6-(4-изопропил-4-]-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-м-толуата и метил [2-(4-изопропил-4-метил-5-]-оксо-2-имидазолин-2-ил)-п-толуата. Применение 5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновой кислоты и [2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2]-ил)-5-(метоксиметил)никотиновой кислоты является предпочтительным. Применение [2-(4-изопропил-4]-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновой кислоты является особенно предпочтительным.
[0035] Для целей данного изобретения сульфонилмочевинные гербициды без ограничения включают следующие: хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлоримурон этил, тифенсульфурон метил, трибенурон метил, бенсульфурон метил, никосульфурон, этаметсульфурон метил, римсульфурон, трифлусульфурон метил, триасульфурон, примисульфурон метил, циносульфурон, амидосульфурон, флузасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфурон, галосульфурон, азимсульфурон, циклосульфурон, этокоасульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон метил, форамсульфурон, иодсульфурон, оксасульфурон, мезосульфурон, просульфурон, сульфосульфурон, трифлоксисульфурон, тритосульфурон, производную любого из упомянутых выше гербицидов, смесь двух или более упомянутых выше гербицидов. Триазолпиримидиновые гербициды в соответствии с настоящим изобретением без ограничения включают следующие: хлорамсулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам и пеноксулам. Гербициды на основе пиримидинилоксибензоата в соответствии с изобретением без ограничения включают следующие: биспирибак, пиритиобак, пириминобак, пирибензоксим и пирифталид. Сульфониламинокарбонилтриазолиноновые гербициды без ограничения включают следующие: флукарбазон и пропоксикарбазон.
[0036] Является признанным, что гербициды на основе пиримидинилоксибензоата являются весьма близкими с гербицидами на основе пиримидинилтиобензоата, и они обобщены под названием последних Американским Обществом по борьбе с сорняками. Таким образом, гербициды в соответствии с настоящим изобретением также включают гербициды на основе пиримидинилтиобензоата, включая без ограничения пиримидинилоксибензоатные гербициды, описанные выше.
[0037] Растения пшеницы, описанные в данной заявке, могут быть либо трансгенными растениями пшеницы, либо нетрансгенными растениями пшеницы. Подобно этому растения тритикале, описанные в данной заявке, могут быть либо трансгенными растениями тритикале, либо нетрансгенными растениями тритикале. Как используется в данной заявке, термин "трансгенный" относится к любому растению, растительной клетке, каллусу, ткани растений или части растений, которые содержат весь или, по крайней мере, часть одного рекомбинантного полинуклеотида. Во многих случаях весь рекомбинантный полинуклеотид или его часть является стабильно интегрированным в хромосому или стабильный экстрахромосомный элемент, так, что он переходит к последующим поколениям. Для целей настоящего изобретения термин "рекомбинантный полинуклеотид" относится к полинуклеотиду, который является измененным, перестроенным или модифицированным с помощью генетической инженерии. Примеры включают любой клонированный полинуклеотид или полинуклеотиды, которые связаны или соединены с гетерологическими последовательностями. Термин "рекомбинант" не относится к изменениям полинуклеотидов, которые происходят вследствие природных событий, таких как спонтанные мутации, или вследствие спонтанного мутагенеза, который сопровождается селективным размножением. Растения, имеющие мутации, возникшие благодаря неспонтанному мутагенезу и селективному разведению, обозначаются в данной заявке как нетрансгенные растения или включены в объем настоящего изобретения. В воплощениях, в которых растение пшеницы или растение тритикале является трансгенным и включает множественные IMI нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты могут иметь происхождение от различных геномов или от одного и того же генома. Альтернативно, в воплощениях, в которых растение пшеницы или растение тритикале не является трансгенным и включает множественные IMI нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты являются расположенными в различных геномах или в одном и том же геноме.
[0038] Пример культивара нетрансгенного растения пшеницы, включающего одну IMI нуклеиновую кислоту, представляет собой растительный культивар, задепонированный под ссылочным номером депонирования для целей патентной процедуры в АТСС РТА-5625АТСС и обозначенный в данной заявке как линия Shiloh-8. Линия Shiloh-8 содержит Imi1 нуклеиновую кислоту. Нуклеотидная последовательность неполной длины, соответствующая гену Shiloh-8, представлена в SEQ ID NO:1.
[0039] Депонирование 2500 семян линии Shiloh-8 (обозначены как i4417-8) было осуществлено в Американской коллекции типовых культур, Манассас, Вирджиния, 30 октября, 2003. Это депонирование было проведено в соответствии со сроками и условиями Будапештского Договора, касающегося депонирования микроорганизмов. Депонирование было осуществлено на срок, по крайней мере, тридцать лет и, по крайней мере, пять лет после получения АТСС самого последнего запроса на предоставление депонированного образца. Депонированным семенам был предоставлен ссылочный номер депонирования для целей патентной процедуры РТА-5625.
[0040] Настоящее изобретение включает растения пшеницы, имеющие ссылочный номер депонирования для целей патентной процедуры РТА-5625; мутант, рекомбинант или генетически полученную производную растения со ссылочным номером депонирования для целей патентной процедуры РТА-5625; любое потомство растения со ссылочным номером депонирования для целей патентной процедуры в АТСС РТА-5625; и растение, которое является потомком какого-либо из этих растений. В предпочтительном воплощении растение пшеницы в соответствии с настоящим изобретением дополнительно имеет характеристики гербицидной толерантности растения со ссылочным номером депонирования для целей патентной процедуры РТА-5625.
[0041] Настоящее изобретение также включает гибриды растений пшеницы Shiloh-8, описанные в данной заявке, и гибриды Shiloh-8 с другими растениями пшеницы. Другие растения пшеницы включают без ограничения следующие: Т. aestivum L. cv Fidel и любое растение пшеницы, которое несет мутантные гены FS-1, FS-2, FS-3 или FS-4. (Смотри патент США №6,339,184 и заявку на патент США №08/474.832).
[0042] Термины "культивар" и "сорт" относятся к группе растений в пределах видов, которая характеризуется тем, что имеет общий набор характеристик или характерных особенностей, принимаемых специалистом в данной области техники как достаточные для различения одного культивара или сорта от другого культивара или сорта. При этом не подразумевается ни то, что все растения какого-либо данного культивара или сорта будут генетически идентичными либо в цельном гене, либо на молекулярном уровне, ни то, что какое-либо данное растение будет гомозиготным во всех локусах. Культивар или сорт считается таким, который получен разведением гомозигот в отношении частной характеристики, если при самоопылении полученного при таком разведении гомозигот культивара или сорта все потомство имеет эту характеристику. Термины "селекционная линия" или "линия" относятся к группе растений в пределах культивара, которая характеризуется тем, что имеет общий набор характеристик или характерных особенностей, принимаемых специалистом в данной области техники как достаточные для различения одной селекционной линии или линии от другой селекционной линии или линии. При этом не подразумевается ни то, что все растения какой-либо данной селекционной линии или линии будут генетически идентичными либо в цельном гене, либо на молекулярном уровне, ни то, что какое-либо данное растение будет гомозиготным во всех локусах. Селекционная линия или линия считается такой, которая получена разведением гомозигот в отношении частной характеристики, если при самоопылении полученной при таком разведении гомозигот селекционной линии или линии все потомство имеет эту характеристику. В данном изобретении характерная особенность возникает вследствие мутации в гене Als растения пшеницы или тритикале или семян.
[0043] Кроме того, применение терминов "культивар" и "сорт" в данной заявке не предназначено для ограничения растений в соответствии с настоящим изобретением одним или более сортами растений. Несмотря на то, что настоящее изобретение охватывает сорта растений, растения в соответствии с настоящим изобретением включают любые растения, которые обладают характеристиками толерантности к гербицидам растения со ссылочным номером депонирования для целей патентной процедуры в АТСС 5625 и/или одной или более IMI нуклеиновыми кислотами в соответствии с настоящим изобретением.
[0044] При этом понятно, что растение пшеницы или растение тритикале в соответствии с настоящим изобретением может включать Als нуклеиновую кислоту дикого типа в дополнение к IMI нуклеиновой кислоте. Как описано в Примере 1, предполагается, что линия Shiloh-8 содержит мутацию только в одном из множества изоферментов AHAS. Таким образом, настоящее изобретение включает растение пшеницы или растение тритикале, содержащее, по крайней мере, одну IMI нуклеиновую кислоту в дополнение к одной или более Als нуклеиновым кислотам дикого типа.
[0045] В дополнение к растениям пшеницы и тритикале настоящее изобретение охватывает IMI белки и нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты включают полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из полинуклеотида, как определено в SEQ ID NO:1; полинуклеотида, кодирующего полипептид, как определено в SEQ ID NO:2; полинуклеотида, включающего, по крайней мере, 60 последовательных нуклеотидов любого из упомянутых выше полинуклеотидов; и полинуклеотида, комплементарного любому из упомянутых выше полинуклеотидов. В предпочтительном воплощении IMI нуклеиновая кислота включает полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1.
[0046] Термины "AHAS белок", "AHAS полипептид", "ALS белок" и "ALS полипептид" относятся к белку ацетогидроксикислотасинтазы, а термины "IMI белок" или "IMI полипептид" относятся к любому AHAS белку, который является полученным путем мутации белка AHAS дикого типа и который придает повышенную толерантность к имидазолиновому гербициду растению, растительной клетке, части растения, семенам растения или растительной ткани, когда экспрессируется в них. В предпочтительном воплощении IMI белок включает полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью, включающей SEQ ID NO:1. Такие IMI белки включают гербицид-толерантную активность AHAS, в частности, имидазолинон-толерантную активность AHAS. Такая гербицид-толерантная активность AHAS может быть оценена путем анализов активности AHAS. Смотри, например, Singh и др. (1988) Anal. Biochem. 171:173-179, которая введена в данную заявку в качестве ссылки.
[0047] В другом предпочтительном воплощении IMI белок включает полипептид, содержащий SEQ ID NO:2. Как также используется в данной заявке, термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" относятся к РНК или ДНК, которые являются линейными или разветвленными, одноцепочечными или двухцепочечными, или к их гибридам. Термин также охватывает гибриды РНК/ДНК. Эти термины также охватывают нетранслируемую последовательность, расположенную как на 3' конце, так и на 5' конце кодирующего участка гена: по крайней мере, приблизительно 1000 нуклеотидов последовательности выше 5' конца кодирующего участка и, по крайней мере, 200 нуклеотидов последовательности ниже 3' конца кодирующего участка гена. Менее обычные основания, такие как инозин, 5-метилцитозин, 6-метиладенин, гипоксантин и другие, также могут использоваться для антисмысловой дцРНК и рибозимного спаривания. Например, полинуклеотиды, которые содержат С-5 пропиновые аналоги уридина и цитидина, были продемонстрированы как такие, которые связывают РНК с высокой степенью аффинности и представляют собой эффективные антисмысловые ингибиторы генной экспрессии. Также могут быть осуществлены другие модификации, такие как модификация фосфодиэфирного скелета или 2'-гидрокси в группе сахара рибозы РНК. Антисмысловые полинуклеотиды и рибозимы могут полностью состоять из рибонуклеотидов или могут содержать смешанные рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды. Полинуклеотиды в соответствии с изобретением могут быть получены с помощью любых способов, включая геномные препараты, препараты кДНК, синтез in vitro, ПЦР в реальном времени и транскрипцию in vitro или in vivo.
[0048] "Изолированная" молекула нуклеиновой кислоты представляет собой такую, которая существенно отделена от молекул нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в природном источнике нуклеиновой кислоты (то есть последовательностей, кодирующих другие полипептиды). Предпочтительно, когда "изолированная" нуклеиновая кислота является свободной от последовательностей, которые обычно фланкируют нуклеиновую кислоту (то есть, последовательностей, расположенных на 5' и 3' концах нуклеиновой кислоты) в ее существующем в природе репликоне. Например, клонированная нуклеиновая кислота считается изолированной. В различных воплощениях изолированная молекула IMI нуклеиновой кислоты может содержать менее чем приблизительно 5 кб, 4 кб, 3 кб, 2 кб, 1 кб, 0,5 кб или 0,1 кб нуклеотидных последовательностей, которые в природе фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой получена эта нуклеиновая кислота (например, клетки Triticum aestivum). Нуклеиновая кислота также считается изолированной, если она была изменена путем вмешательства человека или помещена в локус или такое расположение, которое не является ее природным сайтом, или если она была введена в клетку путем метода агроинфицирования, биолистики или с использованием любого другого способа трансформации растений. Кроме того, "изолированная" молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула ДНК, может быть свободной от некоторого другого клеточного материала, с которым она ассоциирована в природе, или культуральной среды, когда ее получают с помощью рекомбинантных способов, или химических предшественников или других химических агентов, используемых при химическом синтезе.
[0049] Из определения "изолированных нуклеиновых кислот", в частности, исключаются: существующие в природе хромосомы (такие, как препараты хромосом), искусственные хромосомные библиотеки, геномные библиотеки и библиотеки кДНК, которые существуют либо как in vitro препарат нуклеиновой кислоты или как препарат трансфецированной/трансформированной хозяйской клетки, где хозяйские клетки представляют собой либо in vitro гетерогенный препарат, либо таковые, высаженные как гетерогенная популяция единичных колоний. В частности, также исключаются упомянутые выше библиотеки, в которых указанная нуклеиновая кислота составляет менее чем 5% числа вставок нуклеиновой кислоты в векторных молекулах. В частности, также исключается геномная ДНК цельных клеток или препараты РНК цельных клеток (включая препараты цельной клетки, которые являются механически разрушенными или подвергнуты ферментативному перевариванию). Также специфически исключаются препараты цельных клеток, обнаруженные либо как in vitro препарат, либо как гетерогенная смесь, разделенная с помощью электрофореза, где нуклеиновая кислота в соответствии с изобретением не была в дальнейшем отделена от гетерологических нуклеиновых кислот в электрофоретической среде (например, последующее разделение посредством вырезания одной полоски из популяции гетерогенных полос в агарозном геле или нейлоновом блоте).
[0050] Молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, например, молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или ее часть, может быть изолирована при использовании стандартных методик молекулярной биологии и информации о последовательностях, которые приведены в данной заявке. Например, IMI кДНК Т. aestivum может быть изолирована из библиотеки Т. aestivum при использовании всей или части последовательности SEQ ID NO:1. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты, охватывающая всю или часть последовательности SEQ ID NO:1, может быть изолирована путем полимеразной цепной реакции при использовании олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе этой последовательности. Например, мРНК может быть изолирована из растительных клеток (например, с помощью процедуры гуанидиний-тиоцианатной экстракции, описанной Chirgwin и др., 1979, Biochemistry 18:5294-5299), а кДНК может быть получена при использовании обратной транскриптазы (например, Moloney MLV обратной транскриптазы, доступной от Gibco/BRL, Bethesda, MD; или AMV обратной транскриптазы, доступной от Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Синтетические олигонуклеотидные праймеры для полимеразной цепной реакции амплификации могут быть сконструированы на основе нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:1. Молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением может быть амплифицирована при использовании кДНК или альтернативно, геномной ДНК, в качестве матрицы и приемлемых олигонуклеотидных праймеров в соответствии со стандартной методикой ПЦР амплификации. Молекула нуклеиновой кислоты, амплифицированная таким образом, может быть клонирована в приемлемый вектор и охарактеризована с помощью анализа последовательности ДНК. Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие нуклеотидной последовательности IMI могут быть получены с помощью стандартных методик синтеза, например, при использовании автоматического синтезатора ДНК.
[0051] IMI нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут включать последовательности, кодирующие IMI белок (то есть, "кодирующие участки"), а также 5' нетранслируемые последовательности и 3' нетранслируемые последовательности. Альтернативно, молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут включать только кодирующие участки IMI гена или могут содержать цельные геномные фрагменты, изолированные из геномной ДНК. Кодирующий участок этих последовательностей обозначается как "ORF положение". Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением может включать часть кодирующего участка IMI гена, например, фрагмент, который может использоваться в качестве зонда или праймера. Нуклеотидные последовательности, определенные в результате клонирования IMI генов из Т. aestivum, позволяют осуществлять получение зондов и праймеров, предназначенных для использования при идентификации и/или клонировании гомологов IMI в других типах клеток и организмов, а также в качестве IMI гомологов из других растений пшеницы и родственных видов. Часть кодирующего участка может также кодировать биологически активный фрагмент IMI белка.
[0052] Как используется в данной заявке, термин "биологически активная часть" IMI белка предназначен для включения части, например, домена/элемента IMI белка, которая при продуцировании в растении повышает толерантность растения к имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением дикого типа. Способы для количественной оценки повышенной толерантности к имидазолиноновым гербицидам обеспечиваются в примерах, приведенных ниже. Биологически активные части IMI белка включают пептиды, имеющие происхождение от SEQ ID NO:2, которая включает меньше аминокислот, чем IMI белок полной длины, и придает повышенную толерантность к имидазолиноновому гербициду при экспрессии в растении. Типично, биологически активные части (например, пептиды, которые содержат например, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 или более аминокислот в длину) включают домен или элемент, по крайней мере, с одной активностью IMI белка. Кроме того, другие биологически активные части, в которых другие участки полипептида являются делегированными, могут быть получены с помощью рекомбинантных методик и оценены на одну или более активностей, описанных в данной заявке. Предпочтительно, когда биологически активные части IMI белка включают один или более консервативных доменов, выбранных из группы, состоящей из Домена А, Домена В, Домена С, Домена D и Домена Б, где консервативный домен содержит мутацию.
[0053] Изобретение также обеспечивает химерные или слитые IMI полипептиды. Как используется в данной заявке, IMI "химерный полипептид" или "слитый полипептид" включает IMI полипептид, оперативно связанный с не-IMI полипептидом. "He-IMI полипептид" относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, которая не является существенно идентичной таковой IMI полипептида, например, полипептид, который не является IMI изоферментом, при этом пептид выполняет функцию, отличную от таковой IMI полипептида. Как используется в данной заявке в отношении слитого полипептида, термин "оперативно связанный" предназначен для указания, что IMI полипептид и не-IMI полипептид являются слитыми друг с другом так, что обе последовательности дополняют предлагаемую функцию, присущую используемой последовательности. He-IMI полипептид может быть слит с N-терминальным концом или С-терминальным концом IMI полипептида. Например, в одном воплощении слитый полипептид представляет собой GST-IMI слитый полипептид, в котором IMI последовательность является слитой с С-терминальным концом последовательности GST. Такие слитые полипептиды могут улучшать очистку рекомбинантных IMI полипептидов. В другом воплощении слитый полипептид представляет собой IMI полипептид, содержащий гетерологическую сигнальную последовательность на своем N-терминальном конце. В некоторых хозяйских клетках (например, в хозяйских клетках млекопитающих), экспрессия и/или секреция IMI полипептида может быть повышена посредством использования гетерологической сигнальной последовательности.
[0054] Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая IMI полипептид, имеющий определенный процент идентичности последовательности с полипептидом последовательности SEQ ID NO:2, может быть получена путем введения одной или более нуклеотидных замен, дополнений или делеций в нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, так что одна или более аминокислотных замен, дополнений или делеций вводится в кодируемый полипептид. Мутации могут быть введены в последовательность SEQ ID NO:1 с помощью стандартных методик, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Предпочтительно, когда консервативные аминокислотные замены осуществляются в одном или более предсказанных несущественных аминокислотных остатков.
[0055] "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой такую, в которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, который имеет подобную аминокислотную цепь. Семейства аминокислотных остатков, которые имеют подобную аминокислотную цепь, являются определенными в уровне техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, вычисленный заранее несущественный аминокислотный остаток IMI полипептида предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. Альтернативно, в другом воплощении мутации могут быть введены случайно вдоль всей или части кодирующей последовательности IMI как, например, путем насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на IMI активность, описанную в данной заявке для идентификации мутантов, которые сохраняют IMI активность. После мутагенеза последовательности SEQ ID NO:1 кодируемый полипептид может быть экспрессирован рекомбинантно, и активность полипептида может быть определена путем анализа толерантности к имидазолинону растений, экспрессирующих полипептид, так, как описано в примерах, приведенных ниже.
[0056] Для определения процента идентичности последовательности двух аминокислотных последовательностей эти последовательности подвергают сравнению с целью оптимального сравнения (например, пробелы могут быть введены в последовательность одного полипептида для оптимального сравнения с другим полипептидом). Аминокислотные остатки в соответствующих положениях аминокислот потом сравнивают. Когда положение в одной последовательности занимает тот же аминокислотный остаток, что и в соответствующем положении в другой последовательности, то молекулы являются идентичными в этом положении. Такой же тип сравнения может быть проведен между двумя последовательностями нуклеиновых кислот. Процент идентичности последовательности между двумя последовательностями представляет собой функцию количества идентичных положений, разделяемых последовательностями (то есть, процент идентичности последовательности = количество идентичных положений/общее количество положений × 100). Для целей данного изобретения процент идентичности последовательности между двумя аминокислотными или полипептидными последовательностями определяется при использовании программного обеспечения Vector NTI 6.0 (PC) (InforMax, 7600 Wisconsin Ave., Bethesda, MD 20814). Штрафная санкция в отношении раскрытия пробела 15 и штрафная санкция удлинения пробела 6,66 используются для определения процента идентичности двух нуклеиновых кислот. Штрафная санкция в отношении раскрытия пробела 10 и штрафная санкция удлинения пробела 0,1 используются для определения процента идентичности двух полипептидов. Все другие параметры устанавливаются при умолчании.
[0057] При этом понятно, что для целей определения идентичности последовательностей, когда ДНК последовательность сравнивается с РНК последовательностью, тимидиновый нуклеотид является эквивалентным урациловому нуклеотиду. Предпочтительно, когда изолированные IMI нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением являются, по крайней мере, приблизительно на 50-60%, предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 60-70% и более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, или 90-95% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 96%, 97%, 98%, 99%, или более идентичными цельной полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1. В другом воплощении изолированные IMI нуклеиновые кислоты, включенные в настоящее изобретение, являются, по крайней мере, приблизительно на 50-60%, предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 60-70% и более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% или 90-95% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичными цельной полинуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1.
[0058] Предпочтительно, когда изолированные IMI полипептиды в соответствии с настоящим изобретением являются, по крайней мере, приблизительно на 50-60%, предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 60-70% и более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% или 90-95% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичными цельной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2. В другом воплощении изолированные IМI полипептиды, включенные в настоящее изобретение, являются, по крайней мере, приблизительно на 50-60%, предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 60-70% и более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% или 90-95% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичными цельной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2.
[0059] Дополнительно могут быть получены оптимизированные IMI нуклеиновые кислоты. Предпочтительно, когда оптимизированная IMI нуклеиновая кислота кодирует IMI полипептид, который модулирует растительную толерантность к имидазолиноновым гербицидам и более предпочтительно повышает толерантность растений к имидазолиноновому гербициду при сверхэкспрессии в растении. Как используется в данной заявке, термин "оптимизированный" относится к нуклеиновой кислоте, которая является полученной с помощью методов генетической инженерии, повышает ее экспрессию в данном растении или животном. Для обеспечения оптимизированных для растений IMI нуклеиновых кислот последовательность ДНК гена может быть модифицирована для 1) включения кодонов, предпочтительных для высокоэкспрессируемых растительных генов; 2) для изменения содержания А+Т в составе нуклеотидных оснований до уровня, который в основном обнаружен у растений; 3) для формирования растительных последовательностей инициации, 4) для устранения последовательностей, которые вызывают дестабилизацию, неприемлемое полиаденилирование, деградацию и терминацию РНК или которые образуют вторичную структуру шпилек или сайтов сплайсинга РНК. Повышенная экспрессия IMI нуклеиновых кислот в растениях может быть достигнута путем использования кривой распределения употребимости кодона в растениях вообще или в частном растении. Способы оптимизации экспрессии нуклеиновой кислоты в растениях могут быть найдены в ЕРА 0359472; ЕРА 0385962; заявке РСТ WO 91/16432; патенте США №5,380,831; патенте США №5,436,391; Perlack и др., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328; и Murray и др., 1989, Nucleic Acids Res. 17:477-498.
n
n
n
n
n
[0060] Как используется в данной заявке, "частота употребимости предпочтительного кодона" относится к предпочтению, демонстрируемому специфической хозяйской клеткой, в отношении употребимости нуклеотидных кодонов для определения данной аминокислоты. Для определения частоты употребимости частного кодона в гене частоту встречаемости этого кодона в гене делят на общее количество встречаемости всех кодонов, определяющих ту же самую аминокислоту в гене. Подобно этому частота употребимости предпочтительного кодона, которая демонстрируется хозяйской клеткой, может быть подсчитана путем усреднения частоты употребимости предпочтительного кодона в большом количестве генов, экспрессируемых хозяйской клеткой. Процент отклонения частоты употребимости предпочтительного кодона для синтетического гена от таковой, которая является характерной для хозяйской клетки, подсчитывается путем определения процента отклонения частоты употребимости одного кодона от таковой хозяйской клетки, после чего получают среднее значение отклонения для всех кодонов. Как определено в данной заявке, такой подсчет включает уникальные кодоны (то есть, ATG и TGG). В общих чертах, суммарное среднее отклонение употребимости кодона оптимизированного гена от такового хозяйской клетки подсчитывают при использовании уравнения 1A=n=1ZX-YX раз 100 Z, где Х= частота применимости кодона в хозяйской клетке; Y= частота употребимости кодона в хозяйском гене, n представляет собой индивидуальный кодон, который определяет аминокислоту, а общее количество кодов представляет Z. Суммарное отклонение частоты употребимости кодона. А, для всех аминокислот предпочтительно должно составлять менее приблизительно 25% и более предпочтительно менее чем приблизительно 10%.
[0061] Таким образом, IMI нуклеиновая кислота может быть оптимизирована так, что ее кривая распределения употребимости кодона отклоняется предпочтительнее не более чем на 25% от таковой растительных генов, экспрессируемых на высоком уровне, и более предпочтительно не более чем приблизительно на 10%. В дополнение приведено рассмотрение для процентного содержания G+C вырожденного третьего основания (однодольные растения, как выяснилось, отдают предпочтение G+C в этом положении, в то время как двудольные - нет). Признается также, что XCG (где Х представляет собой А, Т, С или G) нуклеотид является наименее предпочтительным кодоном у двудольных растений, в то время как и однодольные и двудольные растения избегают ХТА кодона. Оптимизированные IMI нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением также предпочтительно имеют индексы избегания CG и ТА дублетов, что близко приближает таковые к выбранному хозяйскому растению (то есть, Triticum aestivum). Более предпочтительно эти индексы отклоняются от таковых хозяйского организма не более чем приблизительно на 10-15%.
[0062] В дополнение к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют IMI полипептиды, описанные выше, другой аспект данного изобретения относится к изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, которые являются антисмысловыми. Антисмысловые полинуклеотиды, как предполагается, ингибируют генную экспрессию целевого полинуклеотида путем специфического связывания с целевым полинуклеотидом и препятствования транскрипции, сплайсингу, транспорту, трансляции и/или стабильности целевого полинуклеотида. В уровне техники описаны способы для нацеливания антисмыслового полинуклеотида на хромосомную ДНК, на первичный РНК транскрипт или процессированную мРНК. Предпочтительно, целевые участки включают сайты сплайсинга, кодоны инициации трансляции, кодоны терминации трансляции и другие последовательности в открытой рамке считывания.
[0063] Термин "антисмысловой" для целей настоящего изобретения относится к нуклеиновой кислоте, включающей полинуклеотид, который является в достаточной мере комплементарным всему или части гена, первичному транскрипту или процессированной мРНК, так, что препятствует экспрессии эндогенного гена. "Комплементарные" полинуклеотиды представляют собой те, которые являются способны к спариванию оснований в соответствии со стандартным правилом Уотсона-Крика. В частности, пурины будут спариваться с пиримидинами с образованием комбинации гуанина, спаренного с цитозином (G:C), и аденина, спаренного либо с тимином (А:Т) в случае ДНК, либо аденина, спаренного с урацилом (A:U) в случае РНК. При этом понятно, что два полинуклеотида могут гибридизоваться друг с другом даже если они не являются полностью комплементарными друг другу. Термин "антисмысловая нуклеиновая кислота" включает экспрессионные кассеты одноцепочечной РНК, а также двухцепочечной ДНК, которые могут транскрибироваться с образованием антисмысловой РНК. "Активные" антисмысловые нуклеиновые кислоты представляют собой РНК молекулы, которые способны селективно гибридизоваться с первичным транскриптом или с мРНК, кодирующей полипептид, обладающий, по крайней мере, 80% идентичностью последовательности с полипептидной последовательностью SEQ ID NO:2.
[0064] В дополнение к IMI нуклеиновым кислотам и полипептидам, описанным выше, настоящее изобретение охватывает нуклеиновые кислоты и полипептиды, присоединенные к остатку. Такие остатки без ограничения включают остатки, предназначенные для определения, остатки для гибридизации, остатки для очистки, остатки для доставки, реакционные остатки, связывающие остатки и тому подобное. Типичная группа нуклеиновых кислот, обладающих присоединенными остатками, являются зонды и праймеры. Зонды и праймеры типично включают участок нуклеотидной последовательности, который гибридизуется в строгих условиях, по крайней мере, с приблизительно 12, предпочтительно приблизительно с 25, более предпочтительно приблизительно с 40, 50 или 75 последовательными нуклеотидами смысловой цепи последовательности, как представлено в SEQ ID NO:1, антисмысловой последовательности к последовательности, как представлено в SEQ ID NO:1, или их существующими в природе мутантами. Праймеры на основе нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 могут использоваться в реакциях ПЦР для клонирования IMI гомологов. Зонды на основе IMI нуклеотидных последовательностей могут использоваться для определения транскриптов или геномных последовательностей, кодирующих те же самые или гомологичные полипептиды. В предпочтительных воплощениях зонд дополнительно включает группу метки, присоединенную к нему, например, группа метки может представлять собой радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или фермент-кофактор. Такие зонды могут использоваться как часть набора геномного маркерного теста для идентификации клеток, которые экспрессируют IMI полипептид, такого как путем измерения уровня нуклеиновой кислоты, кодирующей IMI в образце клеток, например, посредством определения уровней мРНК IMI или определения того факта, что геномный IMI ген был мутирован или делегирован.
[0065] Изобретение также обеспечивает изолированный рекомбинантный экспрессионный вектор, включающий IMI нуклеиновую кислоту, как описано выше, где экспрессия вектора в хозяйской клетке приводит к повышенной толерантности к имидазолиноновому гербициду по сравнению с хозяйской клеткой дикого типа. Как используется в данной заявке, термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к транспорту другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Один тип вектора представляет собой "плазмиду", этот термин относится к кольцевой двухцепочечной ДНК петле, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы являются способными к автономной репликации в хозяйской клетке, в которую они могут быть введены (например, бактериальные векторы, которые имеют бактериальный источник репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) являются интегрированными в геном хозяйской клетки в результате интродукции в хозяйскую клетку и, таким образом, реплицируются вместе с хозяйским геномом. Кроме того, некоторые векторы являются способными направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы называются в данной заявке "экспрессионными векторами". В общем случае, экспрессионные векторы, которые используются в методиках рекомбинантной ДНК, часто находятся в форме плазмид. В данном описании термины "плазмида" и "вектор" могут использоваться попеременно, поскольку плазмида представляет собой наиболее часто используемую форму вектора. Тем не менее, изобретение предназначено для включения таких других форм экспрессионных векторов, таких как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
[0066] Рекомбинантные экспрессионные векторы в соответствии с изобретением включают нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением в форме, приемлемой для экспрессии нуклеиновой кислоты в хозяйской клетке, что означает, что рекомбинантные экспрессионные векторы включают одну или более регуляторных последовательностей, выбранных на основе хозяйских клеток, используемых для экспрессии, которые являются оперативно связанными с экспрессируемой последовательностью нуклеиновой кислоты. В отношении рекомбинантного экспрессионного вектора термин "оперативно связанный предназначен для обозначения того факта, что нуклеотидная последовательность, которая представляет интерес, является связанной с регуляторной(ными) последовательностью(последовательностями) таким образом, что позволяет осуществлять экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в in vitro транскрипционной/трансляционной системе или в хозяйской клетке тогда, когда вектор вводится в хозяйскую клетку). Термин "регуляторная последовательность" предназначен для включения промоторов, энхансеров и других элементов контроля экспрессии (например, сигналов полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описываются, например, в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) и Gruber и Crosby, в: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, ред. Glick и Thompson, Глава 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, включая ссылки, приведенные там. Регуляторные последовательности включают такие, которые направляют конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности во многих типах клеток, и такие, которые направляют экспрессию нуклеотидной последовательности только в определенных хозяйских клетках или при определенных условиях. При этом специалисту в данной области техники будет понятно, что конструирование экспрессионного вектора может зависеть от таких факторов, как выбор хозяйской клетки, которую подвергают трансформации, уровня экспрессии желаемого полипептида и тому подобное. Экспрессионные векторы в соответствии с изобретением могут быть введены в хозяйские клетки для получения полипептидов или пептидов, включая слитые полипептиды или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, как описано в данной заявке (например, IMI полипептиды, слитые полипептиды, и тому подобное).
[0067] В предпочтительном воплощении в соответствии с настоящим изобретением IMI полипептиды экспрессируются в растениях и растительных клетках, таких как клетки одноклеточных растений (таких, как водоросли) (Смотри Falciatore и др., 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251 и ссылки, которые там приведены) и растительных клетках, полученных от высших растений (например, сперматофитов, таких как растения, употребляемые в пищу). IMI полинуклеотид может быть "введен" в растительную клетку с помощью любого способа, включая трансфекцию, трансформацию или трансдукцию, электропорацию, бомбардировку частицами, агроинфцирование, биолистику и тому подобного.
[0068] Приемлемые способы для трансформации или трансфекции хозяйских клеток, которые включают клетки растений, могут быть найдены в Sambrook и др. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2-ое изд.. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) и других лабораторных руководствах, таких, как Methods in Molecular Biology, 1995, Vol.44, Agrobacterium protocols, ред.: Gartland и Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Поскольку повышенная толерантность к имидазолиноновьм гербицидам представляет собой общую желательную для наследования характерную особенность у широкого круга растений, подобных кукурузе, пшенице, ржи, овсу, тритикале, рису, ячменю, сое, хлопчатнику, рапсу и каноле, маниоку съедобному, перцу, подсолнечнику и бархатцам, пасленовым растениям, подобным картофелю, табаку, баклажанам и томатам, видам Vicia, гороху, люцерне, кустарниковым растениям (кофе, какао, чай), видам Salix, древесным растениям (гвинейской масличной пальме, кокосовой пальме), щетиннику безбородому и фуражным культурам, эти растения также представляют собой предпочтительные целевые растения для генетического конструирования в качестве дополнительного воплощения настоящего изобретения. В предпочтительном воплощении это растение представляет собой растение пшеницы. Фуражные культуры без ограничения включают пырей ползучий, канареечник канарский, костер, волосянец сибирский, мятлик, ежу сборную, люцерну, Salfoin, лядвенец, шведский клевер, красный клевер и сладкий клевер.
[0069] В одном воплощении в соответствии с настоящим изобретением трансфекция IMI полинуклеотида в растение достигается с помощью опосредованного Agrobacterium генного переноса. Один способ трансформации, известный специалисту в данной области, представляет собой погружение цветкового растения в раствор, содержащий Agrobacteria, где Agrobacteria содержит IMI нуклеиновую кислоту, после чего осуществляют размножение трансформированных гамет. Опосредованная Agrobacterium трансформация растений может быть осуществлена при использовании, например, GV3101(pMP90) (Koncz и ScheU, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) или LBA4404 (Clontech) штамма Agrobacterium tumefaciens. Трансформация может быть осуществлена с помощью способов стандартной трансформации и регенерации (Deblaere и др., 1994, Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton В. и Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2-ое изд. - Dordrecht: Kluwer Academic PubL, 1995, - в Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Benard R. и Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology и Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Например, рапс может быть трансформирован посредством трансформации семядоли или гипокотиля (Moloney и др., 1989. Plant Cell Report 8:238-242; De Block и др., 1989. Plant Physiol. 91:694-701). Применение антибиотиков для Agrobacterium и растительной селекции зависит от бинарного вектора и штамма Agrobacterium, используемого для трансформации. Селекцию рапса обычно осуществляют при использовании канамицина в качестве растительного селективного маркера. Опосредованный Agrobacterium перенос генов в хлопчатнике может быть осуществлен при использовании, например, методики, описанной Mlynarova и др., 1994, Plant Cell Report 13:282-285. Кроме того, трансформация сои может быть осуществлена при использовании, например, способа, описанного в европейском патенте №0424 047, патенте США №5,322,783, европейском патенте №0397 687, патенте США №5,376,543 или патенте США №5,169,770. Трансформация кукурузы может быть достигнута с помощью бомбардировки частицами, опосредованного полиэтиленгликолем захвата ДНК или с помощью методики на основе волокон карбида кремния (смотри, например, Freeling и Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Специфический пример трансформации кукурузы может быть найден в патенте США №5,990,387, а специфический пример трансформации пшеницы может быть найден в заявке РСТ WO 93/07256.
[0070] В соответствии с настоящим изобретением введенный IMI полинуклеотид может стабильно поддерживаться в растительной клетке, если он вводится в нехромосомный автономный репликон или интегрируется в растительные хромосомы. Альтернативно, введенный IMI полинуклеотид может быть представлен в экстрахромосомном нереплицирующемся векторе и может быть транзиентно экспрессирован или транзиентно активным. В одном воплощении может быть получен гомологичный рекомбинантный микроорганизм, в котором IMI полинуклеотид интегрирован в хромосому, при этом получают вектор, который содержит, по крайней мере, часть гена AHAS, в который введена делеция, дополнение или замена для его изменения, например, функциональный разрыв, для изменения, таким образом, эндогенного гена AHAS и для создания IMI гена. Для создания точечной мутации посредством гомологической рекомбинации можно использовать гибриды ДНК-РНК в методике, известной как химеропластика (Cole-Strauss и др., 1999, Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330 и Kmiec, 1999, Gene therapy American Scientist 87(3):240-247). Другие процедуры гомологической рекомбинации в видах Triticum являются также известными в области техники и рассматриваются для применения в данной заявке.
[0071] В векторе гомологической рекомбинации IMI ген может быть фланкирован на своих 5' и 3' концах дополнительной молекулой нуклеиновой кислоты AHAS гена, для того чтобы позволить осуществить гомологическую рекомбинацию между экзогенным геном IMI, которую несет вектор, и эндогенным AHAS геном, в микроорганизме или растении. Дополнительная фланкирующая AHAS молекула нуклеиновой кислоты имеет достаточную длину для гомологической рекомбинации с эндогенным геном. Типично, в вектор включается от несколько сотен пар оснований до килобаз фланкирующей ДНК (как на 5', так и на 3' конце) (смотри, например, Thomas, К. R. и Capecchi, M. R., 1987, Cell 51:503 для описания векторов гомологической рекомбинации или Strepp и др., 1998, PNAS, 95(8):4368-4373 для описания рекомбинации на основе кДНК в Physcomitrella patens). Тем не менее, поскольку IMI ген в норме отличается от AHAS очень незначительным количеством аминокислот, фланкирующая последовательность не всегда является необходимой. Вектор гомологической рекомбинации вводится в микроорганизм или растительную клетку (например, посредством опосредованной полиэтиленгликолем ДНК), и клетки, в которых введенный IMI ген является гомологически рекомбинированным с эндогенным AHAS геном, подвергают селекции при использовании хорошо известных в уровне техники методик.
[0072] В другом воплощении могут быть получены рекомбинантные микроорганизмы, которые содержат отобранные системы, которые позволяют осуществлять регулированную экспрессию встроенного гена. Например, включение IMI гена в вектор, находящийся под контролем lac оперона, позволяет осуществлять экспрессию IMI гена только в присутствии IPTG. Такие регуляторные системы являются хорошо известными в области техники.
[0073] Либо в случае присутствия в экстрахромосомном нереплицирующемся векторе, либо в векторе, который является интегрированным в хромосому, IMI полинуклеотид предпочтительно находится в растительной экспрессионной кассете. Растительная экспрессионная кассета предпочтительно содержит регуляторные последовательности, способные направлять генную экспрессию в растительных клетках, которые являются оперативно связанными таким образом, чтобы каждая последовательность могла осуществлять свою функцию, например, терминации транскрипции с помощью сигналов полиаденилирования. Предпочтительные сигналы полиаденилирования являются такими, которые имеют происхождение от t-ДНК Agrobacterium tumefaciens, такими как ген 3, известный в качестве октопинсинтазы Ti-плазмиды pTiACH5 (Gielen и др., 1984, EMBO J. 3:835) или функциональными эквивалентами, однако все другие функционально активные в растениях терминаторы являются приемлемыми. Поскольку генная экспрессия очень часто не является ограниченной на транскрипционных уровнях, растительная экспрессионная кассета предпочтительно содержит другие оперативно связанные последовательности, подобные трансляционных энхансерам, таким как овердрайв-последовательность, содержащая 5'-нетранслируемую лидерную последовательность из вируса мозаики табака, которая повышает соотношение полипептида к РНК (Gallic и др., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711). Примеры растительных экспрессионных векторов включают такие, подробно описанные в: Becker, D. и др., 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border. Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; Bevan, M.W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721; и Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol.1, Engineering и Utilization, ред.: Kung и R. Wu, Academic Press, 1993, стор. 15-38.
[0074] Экспрессия растительного гена должна быть оперативно связанной с приемлемым промотором, который осуществляет экспрессию гена своевременно, зависимым от предпочтительного типа клеток или зависимым от предпочтительного типа тканей образом. Промоторы, полезные в экспрессионных кассетах в соответствии с изобретением, включают любой промотор, который является способным к инициации транскрипции в растительной клетке. Такие промоторы включают без ограничения такие, которые могут быть получены из растений, растительных вирусов и бактерий, которые содержат гены, экспрессируемые в растениях, таких как, например, Agrobacterium и Rhizobium.
[0075] Промотор может быть конститутивным, индуцибельным, предпочтительным для определенной стадии развития, предпочтительным для определенного типа клеток, предпочтительным для ткани или специфическим для органа. Конститутивные промоторы являются активными при большинстве условий. Примеры конститутивных промоторов включают промоторы CaMV 19S и 35S (Odell и др., 1985, Nature 313:810-812), sX CaMV 35S промотор (Кау и др., 1987, Science 236:1299-1302), Sepi промотор, актиновый промотор риса (McElroy и др., 1990, Plant Cell 2:163-171), актиновый промотор Arabidopsis, убиквитиновый промотор (Christensen и др., 1989, Plant Molec. Biol. 18:675-689); pEmu (Last и др., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588), промотор 35S вируса мозаики норичника шишковатого, Smas промотор (Velten и др., 1984, EMBO J. 3:2723-2730), GRP1-8 промотор, промотор циннамилалкогольдегидрогеназы (патент США №5,683,439), промоторы из Т-ДНК Agrobacterium, такие как маннопинсинтаза, нопалинсинтаза и октопинсинтаза, промотор малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы, (ssuRUBISCO) и тому подобное.
[0076] Индуцибельные промоторы являются активными при определенных условиях окружающей среды, таких как присутствие или отсутствие питательного вещества или метаболита, тепла или холода, света, инфекцией патогенов, анаэробные условия и тому подобное. Например, hsp80 промотор из Brassica индуцируется тепловым шоком; PPDK промотор индуцируется светом, PR-1 промоторы из табака, Arabidopsis и кукурузы индуцируются инфекцией патогена; и Adh1 промотор индуцируется гипоксией и холодовым стрессом. Экспрессия растительных генов может быть также усовершенствована при использовании индуцибельного промотора (для обзора смотри Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Химически индуцируемые промоторы являются особенно приемлемыми, если является желательной время-специфическая генная экспрессия. Примеры таких промоторов представляют собой промотор, индуцируемый салициловой кислотой (заявка РСТ WO 95/19443), промотор, индуцируемый тетрациклином (Gatz и др., 1992, Plant J. 2:397-404), и этанол-индуцируемый промотор (заявка РСТ WO 93/21334).
[0077] Желательные для определенной стадии развития промоторы предпочтительно экспрессируются на определенных стадиях развития. Желательные для ткани и органа промоторы включают такие, которые предпочтительно экспрессируются в определенных тканях или органах, таких как листья, корни, семена или ксилема. Примеры предпочтительных для ткани и предпочтительных для органа промоторов включают без ограничения таковые, предпочтительные для плода, предпочтительные для семяпочки, предпочтительные для мужской ткани, предпочтительные для семян, предпочтительные для оболочки, предпочтительные для клубней, предпочтительные для стебля, предпочтительные для перикарпия, предпочтительные для листьев, предпочтительные для рыльца, предпочтительные для пыльцы, предпочтительные для пыльника, предпочтительные для лепестков, предпочтительные для чашелистиков, предпочтительные для плодоножки, предпочтительные для стручка, предпочтительные для стебля, предпочтительные для корня и тому подобное. Предпочтительные для семян промоторы предпочтительно экспрессируются во время развития семян и/или прорастания. Например, предпочтительные для семян промоторы могут быть предпочтительными для зародыша, предпочтительными для эндосперма, предпочтительными для оболочки семян. Смотри Thompson и др., 1989, BioEssays 10:108. Примеры предпочтительных для семян промоторов включают без ограничений таковые целлюлозасинтазы (се1А), Cim1, гамма-зеина, глобулина-1, зеина 19 кД кукурузы (сZ19В1) и тому подобное
[0078] Другие приемлемые предпочтительные для ткани или предпочтительные для органа промоторы включают промотор напинового гена из семян рапса (патент США №5,608,152), USP-промотор mViciafaba (Baeumlein и др., 1991, Mol Gen Genet. 225(3):459-67), олеозиновый промотор из Arabidopsis (заявка РСТ WO 98/45461), фазеолиновый промотор из Phaseolus vulgaris (патент США №5,504,200), Все4-промотор из Brassica (заявка РСТ WO 91/13980), или легуминовый В4 промотор (LeB4; Baeumlein и др., 1992, Plant Journal, 2(2):233-9), а также промоторы, обеспечивающие специфическую для семян экспрессию в однодольных растениях, подобных кукурузе, ячменю, пшенице, ржи, рису и т.д. Приемлемые промоторы, которые следует отметить, представляют собой промотор lpt2 или lpt1 гена из ячменя (Заявка РСТ WO 95/15389 и заявка РСТ WO 95/23230) или те, которые описаны в заявке РСТ WO 99/16890 (промоторы из гордеинового гена ячменя, глутелинового гена риса, оризинового гена риса, проламинового гена риса, глиадинового гена пшеницы, глутелинового гена пшеницы, казеринового гена сорго и секалинового гена ржи).
[0079] Другие промоторы, полезные в экспрессионных кассетах в соответствии с изобретением, без ограничения включают промотор основного связывающего хлорофилл а/b белка, промоторы гистона, Ар3 промотор, β-конглициновый промотор, напиновый промотор, промотор пектина сои, промотор зеина 15 кД кукурузы, промотор зеина 22 кД, промотор зеина 27 кД, g-промотор зеина, восковой промотор, промоторы shrunken 1, shrunken 2 и бронзовый промотор, Zm13 промотор (патент США №5,086,169), промоторы полигалактуроназы кукурузы (PG) (патенты США №№5,412,085 и 5,545,546) и SGB6 промотор (патент США №5,470,359), а также синтетические или другие природные промоторы.
[0080] Дополнительная гибкость в контроле гетерологической генной экспрессии в растениях может быть получена при использовании доменов, связывающих ДНК, и элементов ответа, полученных из гетерологических источников (то есть домены, связывающие ДНК, полученные из нерастительных источников). Пример такого домена, связывающего ДНК, представляет собой LexA ДНК-связывающий домен (Brent и Ptashne, 1985, Cell 43:729-736).
[0081] Настоящее изобретение обеспечивает экспрессионные кассеты для экспрессии молекул полинуклеотида в соответствии с изобретением в растениях, растительных клетках и других хозяйских клетках, отличных от человеческих. Экспрессионные кассеты включают промотор, способный к экспрессии в растении, растительной клетке, или других хозяйских клетках, представляющих интерес, которые являются оперативно связанным с IMI нуклеиновой кислотой. Если необходимо нацеливание экспрессии на хлоропласт, то экспрессионная кассета может также включать оперативно связанную хлоропласт-нацеливающую последовательность, которая кодирует хлоропластный транзитный пептид, для направления экспрессированного IMI белка в хлоропласт.
[0082] В одном воплощении IMI нуклеиновые кислоты являются нацеленными для экспрессии в хлоропластах. Таким образом, если IMI нуклеиновая кислота не является непосредственно встроенной в хлоропласт, то экспрессионная кассета будет дополнительно содержать хлоропласт-нацеливающую последовательность, включающую нуклеотидную последовательность, которая кодирует хлоропластный транзитный пептид для направления генного продукта, который представляет интерес, в хлоропласты. Такие транзитные пептиды являются известными в уровне техники. В отношении хлоропласт-нацеливающих последовательностей "оперативно связанный" означает, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей транзитный пептид (то есть, хлоропласт-нацеливающая последовательность), является связанной с IMI нуклеиновой кислотой в соответствии с изобретением так, что две последовательности являются смежными в одной и той же рамке считывания. Смотри, например, Von Heijne и др. (1991) Plant Mol. Biol. Rep.9:104-126; dark и др. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa и др. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer и др. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; и Shah и др. (1986) Science 233:478-481. Тогда как IMI белки в соответствии с изобретением могут включать нативный хлоропластный транзитный пептид, любой хлоропластный транзитный пептид, известный в уровне техники, может быть слит с аминокислотной последовательностью зрелого IMI белка в соответствии с изобретением путем оперативного связывания хлоропласт-нацеливающей последовательности с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей зрелый IMI белок в соответствии с изобретением.
[0083] Хлоропласт-нацеливающие последовательности являются известными в уровне техники и включают хлоропластную малую субъединицу рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы (Rubisco) (de Castro Silva Filho и др. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell и др. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5-(енолпирувил)шикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS) (Archer и др. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); триптофансинтазу (Zhao и др. (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087); пластоцианин (Lawrence и др. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); хоризматсинтазу (Schmidt и др. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); и белок, связывающий светособирающий хлорофилл a/b (LHBP) (Lamppa и др. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Смотри также Von Heijne и др. (1991) Plant Mol. Biol. Rep.9:104-126; dark и др. (1989) У. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa и др. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer и др. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; и Shah и др. (1986) Science 233:478-481.
[0084] IMI нуклеиновые кислоты или экспрессионная кассета, включающая IMI нуклеиновые кислоты, может также быть введена в хлоропласт для экспрессии в нем. Способы трансформации хлоропластов являются известными из уровня техники. Смотри, например, Svab и др. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab и Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab и Maliga (1993) EMBOJ. 12:601-606. Способ основывается на доставке с помощью пушки для частиц ДНК, содержащей селективный маркер, и нацеливании ДНК на пластидный геном посредством гомологической рекомбинации. Кроме того, пластидная трансформация может быть осуществлена с помощью трансактивации молчащего происходящего от пластид трансгена путем тканеспецифической экспрессии кодируемой ядром и пластид-направленной РНК-полимеразы. Такая система была описана у McBride и др. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.
[0085] IMI нуклеиновые кислоты, нацеленные на хлоропласт, могут быть оптимизированы для экспрессии в хлоропласте для учета различий касательно употребимости кодонов между ядром растения и этой органеллой. Таким образом, нуклеиновые кислоты, представляющие интерес, могут быть синтезированы при использовании предпочтительных для хлоропласта кодонов. Смотри, например, патент США №5,380,831, который введен в данную заявку в качестве ссылки. Если это необходимо для хлоропластной экспрессии, то экспрессионная кассета может дополнительно включать хлоропластный промотор, оперативно связанный с IMI нуклеиновой кислотой. Такие хлоропластные промоторы являются хорошо известными в уровне техники.
[0086] Другой аспект настоящего изобретения относится к хозяйским клеткам, в которые рекомбинантный экспрессионный вектор в соответствии с изобретением был введен. Термины "хозяйская клетка" и "рекомбинантная хозяйская клетка" используются попеременно в данной заявке. При этом понятно, что такие термины относятся не только к частной клетке, но они также приложимы к потомству или потенциальному потомству такой клетки. Поскольку определенные модификации могут возникать в последующих генерациях благодаря либо мутации, либо влиянию окружающей среды, такое потомство может фактически не быть идентичным родительской клетке, однако все же включается в объем терминов, используемых в данной заявке. Хозяйская клетка может быть прокариотической или эукариотической клеткой. Например, IMI полинуклеотид может экспрессироваться в бактериальных клетках, таких как С.glutamicum, клетки насекомых, клетки грибов или клетки млекопитающих (такие, как клетки яичника китайского хомячка (СНО) или COS клетки), водоросли, инфузории, клетки растений, грибы или других организмах, подобных С.glutamicum. Другие приемлемые хозяйские клетки являются известными специалисту в данной области техники.
[0087] Хозяйская клетка в соответствии с изобретением, такая как прокариотическая или эукариотическая хозяйская клетка в культуре, может использоваться для получения IMI полинуклеотида. Соответственно, данное изобретение дополнительно обеспечивает способы для получения IMI полипептидов при использовании хозяйских клеток в соответствии с изобретением. В одном воплощении способ включает культивирование хозяйской клетки в соответствии с изобретением (в которую был введен рекомбинантный экспрессионный вектор, кодирующий IMI полипептид, или в геном которой был введен ген, кодирующий IMI полипептид дикого типа) в приемлемой среде до получения IMI полипептида. В другом воплощении способ дополнительно включает изолирование IMI полипептидов из среды или хозяйской клетки. Другой аспект в соответствии с изобретением относится к изолированным IMI полипептидам и их биологически активным частям. "Изолированный" или "очищенный" полипептид или его биологически активная часть являются свободными от некоторого клеточного материала, когда они получены с помощью способа рекомбинантной ДНК, или при использовании химических предшественников или других химических реактивов, когда они синтезируются химически. Выражение "существенно свободный от клеточного материала" включает препараты IMI полипептида, в которых полипептид является отделенным от некоторых компонентов клеток, в которых он был естественным или рекомбинантным способом получен. В одном воплощении выражение "существенно свободный от клеточного материала" включает препараты IMI полипептида, содержащие менее чем приблизительно 30% (от сухого веса) материала, отличного от IMI (который также в данной заявке именуется как "контаминирующий полипептид"), более предпочтительно менее чем приблизительно 20% материала, отличного от IMI, еще более предпочтительно менее, чем приблизительно 10% материала, отличного от IMI, и наиболее предпочтительно менее, чем приблизительно 5% материала, отличного от IMI.
[0088] Когда IMI полипептид или его биологически активная часть является полученным рекомбинантным способом, также является предпочтительно, чтобы он был существенно свободным от культуральной среды, то есть культуральная среда представляет менее, чем приблизительно 20%, более предпочтительно менее, чем приблизительно 10% и наиболее предпочтительно менее, чем приблизительно 5% от объема препарата полипептида. Выражение "существенно свободный от химических предшественников или других химических агентов" включает препараты IMI полипептида, в которых полипептид отделен от химических предшественников или других химических агентов, которые вовлечены в синтез полипептида. В одном воплощении выражение "существенно свободный от химических предшественников или других химических агентов" включает препараты IMI полипептида, содержащие менее чем приблизительно 30% (от сухого веса) химических предшественников или химических агентов, более предпочтительно менее чем приблизительно 20% химических предшественников и химических агентов, еще более предпочтительно менее чем приблизительно 10% химических предшественников и химических агентов и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 5% химических предшественников и химических агентов. В предпочтительных воплощениях изолированные полипептиды или их биологически активные части не содержат контаминирующих полипептидов из того же организма, из которого получен IMI полипептид. Обычно такие полипептиды получают с помощью рекомбинантной экспрессии, например, IMI полипептида Triticum aestivum в растениях, отличных от Triticum aestivum, или микроорганизмах, таких как С.glutamicum, инфузории, водоросли или грибки.
[0089] Полинуклеотидная и полипептидная последовательности IMI в соответствии с изобретением имеют множество способов применения. Последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться для трансформации растений, модулируя, таким образом, толерантность растений к имидазолиноновым гербицидам. Соответственно, изобретение обеспечивает способ получения трансгенного растения, обладающего повышенной толерантностью к имидазолиноновому гербициду, включающий (а) трансформацию растительной клетки одним или более экспрессионными векторами, включающими одну или более IMI нуклеиновых кислот и (b) получение из растительной клетки трансгенного растения с повышенной толерантностью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением дикого типа. В одном воплощении множественные IMI нуклеиновые кислоты имеют происхождение от различных геномов. В настоящее изобретение также включаются способы получения трансгенного растения, обладающего повышенной толерантностью к имидазолиноновому гербициду, включающие (а) трансформацию растительной клетки экспрессионным вектором, включающим IMI нуклеиновую кислоту, где нуклеиновая кислота является не-Imi1 нуклеиновой кислотой и (b) получение из растительной клетки трансгенного растения с повышенной толерантностью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением дикого типа.
[0090] Настоящее изобретение включает способы модификации растительной толерантности к имидазолиноновому гербициду, предусматривающие модификацию экспрессии одной или более IMI нуклеиновых кислот. Толерантность растений к имидазолиноновому гербициду может быть повышена или снижена, что достигается путем повышения или снижения экспрессии IMI полинуклеотида, соответственно. Предпочтительно, толерантность растений к имидазолиноновому гербициду повышается путем повышения экспрессии IMI полинуклеотида. Экспрессия IMI полинуклеотида может быть модифицирована с помощью любого способа, известного специалисту в данной области техники. Способы повышения экспрессии IMI полинуклеотидов могут использоваться, когда растение является либо трансгенным, либо нетрансгенным. В случаях, когда растение является трансгенным, растение может быть трансформировано с помощью вектора, содержащего какую-либо из нуклеиновых кислот, кодирующих IMI, или растение может быть трансформировано с помощью промотора, который, например, управляет экспрессией эндогенных IMI полинуклеотидов в растении. Данное изобретение предусматривает, что такой промотор может быть специфическим для тканей или таким, который регулируется развитием. Альтернативно, нетрансгенное растение может иметь экспрессию эндогенного IMI полинуклеотида, модифицированную путем индукции нативного промотора. Экспрессия полинуклеотидов, включающих полинуклеотидные последовательности, как определено в SEQ ID NO:1, в растениях, которые представляют интерес, может быть без ограничения осуществлена, с помощью одного из следующих примеров: (а) конститутивного промотора, (b) химически индуцируемого промотора и (с) сконструированного промотора сверхэкспрессии при использовании, например, транскрипционных факторов, имеющих происхождение от "цинковых пальцев" (Greisman и Pabo, 1997, Science 275:657).
[0091] В предпочтительном воплощении транскрипция IMI полинуклеотида модулируется при использовании транскрипционных факторов, имеющих происхождение от "цинковых пальцев" (ZFP), как описано у Greisman и Pabo, 1997, Science 275:657 и применено на практике Sangamo Biosciences, Inc. Такие ZFP включают как домен узнавания ДНК, так и функциональный домен, который вызывает активацию или репрессию целевой нуклеиновой кислоты, такой как IMI нуклеиновая кислота. Таким образом, может быть осуществлена активация и репрессия ZFP при использовании специфического узнавания IMI полинуклеотидных промоторов, описанных выше, это может быть использовано для повышения или снижения экспрессии IMI полинуклеотида в растении, что дает возможность, таким образом, модулировать гербицидную толерантность растения.
[0092] Как описано более подробно выше, растения, полученные с помощью способов в соответствии с настоящим изобретением, могут быть однодольными или двудольными. Растения могут быть выбраны, например, из кукурузы, пшеницы, ржи, овса, тритикале, риса, ячменя, сои, хлопчатника, рапса, канолы, маниока съедобного, перца, подсолнечника, бархатцев, пасленовых растений, картофеля, табака, баклажанов и томатов, видов Vicia, гороха, люцерны, кофе, какао, чая, видов Salix, гвинейской масличной пальмы, кокосовой пальмы, щетинника безбородого и фуражных культур. Фуражные культуры без ограничения включают пырей ползучий, канареечник канарский, костер, волосянец сибирский, мятлик, ежу сборную, люцерну, Salfoin, лядвенец, шведский клевер, красный клевер и сладкий клевер. В предпочтительном воплощении растение представляет собой растение пшеницы или растение тритикале. В каждом из способов, описанных выше, растительная клетка без ограничения включает протопласт, клетку, вырабатывающую гамету, клетку, которая регенерирует в цельное растение. Как используется в данной заявке, термин "трансгенный" относится к любому растению, растительной клетке, каллусу, растительной ткани или части растения, которые содержат весь или часть, по крайней мере, одного рекомбинантного полинуклеотида. Во многих случаях весь или часть рекомбинантного полинуклеотида является стабильно интегрированной в хромосому или стабильный экстрахромосомный элемент, так что он передается последующим поколениям.
[0093] Как описано выше, настоящее изобретение представляет композиции и способы для и повышения имидазолиноновой толерантности растения или семян по сравнению с растением или семенами дикого типа. В предпочтительном воплощении имидазолиноновая толерантность растения или семян пшеницы повышается так, что растение или семена могут противостоять применению имидазолинонового гербицида в дозе предпочтительно приблизительно 10-300 г/га, более предпочтительно 20-160 г/га и наиболее предпочтительно 40-80 г/га. Как используется в данной заявке, "противостоять" к применению имидазолинонового гербицида означает, что растение либо не уничтожается, либо не повреждается при таком применении.
[0094] Настоящее изобретение обеспечивает растения, части растений, органы растений, ткани растений, клетки растений, семена и хозяйские клетки, обладающие повышенной толерантностью, по крайней мере, к одному имидазолиноновому гербициду, когда сравниваются с растением, частью растения, органом растения, тканью растения, клеткой растения, семенами и хозяйской клеткой растения дикого типа, соответственно. Под такими "растением, частью растения, органом растения, тканью растения, клеткой растения, семенами и хозяйской клеткой растения дикого типа" понимается, что растение, часть растения, орган растения, ткань растения, клетки растения, семена и хозяйская клетка растения, соответственно, является таковой дикого типа в отношении характеристик толерантности к гербицидам растения со ссылочным номером депонирования для целей патентной процедуры в АТСС 5625 и/или не включает IMI нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением. То есть, такое растение дикого типа, часть растения, орган растения, ткань растения, клетка растения, семена или хозяйская клетка не имеет характеристик толерантности к гербициду растения со ссылочным номером депонирования для целей патентной процедуры в АТСС 5625 и/или не включает IMI нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением. Применение термина "дикого типа" не является, таким образом, предназначенным для того, чтобы подразумевать, что растение, часть растения, орган растения, ткань растения, клетки растения, семена и хозяйская клетка растения не содержат рекомбинантной ДНК в своем геноме и/или, что они не обладают характеристиками гербицидной толерантности, и/или что IMI нуклеиновые кислоты отличаются от таких для характеристик гербицидной толерантности и IMI нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением.
[0095] Кроме того, в данной заявке обеспечивается способ контроля сорняков, произрастающих поблизости растения пшеницы или тритикале, включающий применение имидазолинонового гербицида к сорнякам и к растению пшеницы или тритикале, при этом растение пшеницы или тритикале обладает повышенной толерантностью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением пшеницы или тритикале дикого типа, и где толерантное к имидазолинону растение пшеницы или тритикале включает, по крайней мере, одну IMI нуклеиновую кислоту. В одном воплощении растение включает множественные IMI нуклеиновые кислоты В другом воплощении растение включает Imi1 нуклеиновую кислоту. Путем обеспечения растений пшеницы и тритикале, обладающих повышенной толерантностью к имидазолинону, широкое разнообразие композиций может использоваться для защиты растений пшеницы и тритикале от сорняков, для того, чтобы улучшить рост растений и снизить конкуренцию за питательные вещества. Имидазолиноновый гербицид может использоваться сам по себе для предвсходового, послевсходового, предпосадочного, послепосадочного контроля сорняков на участках, которые окружают растения пшеницы, описанные в данной заявке, или может использоваться композиция имидазолинонового гербицида, которая содержит добавки. Имидазолиноновый гербицид может также использоваться для обработки семян. Добавки, используемые в композиции имидазолинонового гербицида, включают другие гербициды, детергенты, вспомогательные вещества, агенты для распыления, склеивающие агенты, стабилизирующие агенты или подобные. Композиция имидазолинонового гербицида может представлять собой влажный или сухой препарат и может без ограничения представлять собой текучие порошки, эмульгируемые концентраты и жидкие концентраты. Имидазолиноновый гербицид и гербицидные композиции могут применяться в соответствии с традиционными способами, например, путем разбрызгивания, орошения, распыления или подобных способов.
[0096] Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает векторы трансформации, включающие ген селективного маркера в соответствии с изобретением. Ген селективного маркера включает промотор, который управляет экспрессией в хозяйской клетке, оперативно связанный с IMI нуклеиновой кислотой в соответствии с изобретением. Вектор трансформации может дополнительно включать интересующий ген, который подвергают экспрессии в хозяйской клетке, и может также, если это является желательным, включать хлоропласт-нацеливающую последовательность, оперативно связанную с полинуклеотидом в соответствии с изобретением.
[0097] Настоящее изобретение также обеспечивает способы применения векторов трансформации в соответствии с изобретением для отбора клеток, трансформированных геном, который представляет интерес. Такие способы вовлекают трансформацию хозяйской клетки с помощью вектора трансформации, обработку клетки таким уровнем имидазолинонового гербицида или гербицида на основе сульфонилмочевины, который будет уничтожать или ингибировать рост нетрансформированной хозяйской клетки, и идентификацию трансформированной хозяйской клетки на ее способность к росту в присутствии гербицида. В одном воплощении в соответствии с изобретением хозяйская клетка представляет собой клетку растения, а ген селективного маркерного гена включает промотор, который управляет экспрессией в растительной клетке.
[0098] Векторы трансформации в соответствии с изобретением могут использоваться для получения растений, трансформированных с помощью гена, который представляет интерес. Вектор трансформации будет включать ген селективного маркерного гена в соответствии с изобретением и интересующий ген, который встраивается и типично экспрессируется в трансформированном растении. Такой селективный маркерный ген включает IMI нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением, оперативно связанную с промотором, который управляет экспрессией в хозяйской клетке. IMI нуклеиновая кислота включает полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, функциональные фрагменты и варианты любой из этих полинуклеотидных последовательностей, где фрагмент или вариант кодирует полипептид, который включает замену аланина на треонин в положении 96, соответствующем AHAS полипептиду дикого типа. Для использования в растениях и растительных клетках вектор трансформации включает селективный маркерный ген, включающий IMI нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением, оперативно связанную с промотором, который управляет экспрессией в растительной клетке.
[0099] Изобретение также относится к растительному экспрессионному вектору, включающему промотор, который управляет экспрессией в растении, оперативно связанный с IMI нуклеиновой кислотой в соответствии с изобретением. IMI нуклеиновая кислота включает полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, и функциональные фрагменты и варианты любой из этих полинуклеотидных последовательностей, где фрагмент или вариант кодирует полипептид, который включает замену аланина на треонин в положении 96, соответствующем AHAS полипептиду дикого типа. Растительный экспрессионный вектор в соответствии с изобретением не зависит от частного промотора, за исключением того, что такой промотор является способным направлять экспрессию в растительной клетке. Предпочтительные промоторы включают конститутивные промоторы и специфические для ткани промоторы.
[00100] Интересующие гены в соответствии с изобретением варьируют в зависимости от желаемого результата. Например, различные изменения в фенотипе могут быть такими, которые представляют интерес, включая модификацию состава жирных кислот в растении, изменение содержания аминокислот растения, изменение растительных механизмов защиты от насекомых и/или патогенов и тому подобное. Эти результаты могут быть достигнуты путем обеспечения экспрессии гетерологических продуктов или повышенной экспрессии эндогенных продуктов в растениях. Альтернативно, результаты могут быть достигнуты путем обеспечения снижения экспрессии одного или более эндогенных продуктов, в частности, ферментов или кофакторов, в растении. Такие изменения приводят к изменению фенотипа трансформированного растения.
[00101] В одном воплощении в соответствии с изобретением гены, представляющие интерес, включают гены резистентности к насекомьм, такие как, например, гены белка токсина Bacillus thuringiensis (патенты США №№5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; и Geiser и др. (1986) Gene 48:109).
[00102] IMI белки или полипептиды в соответствии с изобретением могут быть получены, например, от растений канолы и могут использоваться в составе композиций. Кроме того, IMI нуклеиновая кислота, кодирующая IMI белок в соответствии с изобретением, может использоваться для экспрессии IMI белка в соответствии с изобретением в микроорганизме, таком как Е.coli или дрожжи. Экспрессированный IMI белок может быть очищен от экстрактов Е.coli или дрожжей любым из способов, известных среднему специалисту в данной области техники.
[00103] В некоторых воплощениях в соответствии с изобретением способы вовлекают применение гербицид-толерантных растений или гербицид-резистентных растений. Под "гербицид-толерантным" или "гербицид-резистентным" растением понимают, что растение является толерантным или резистентным, по крайней мере, к одному гербициду при уровне, который в норме убивает или ингибирует рост обычного растения или растения дикого типа. В одном воплощении в соответствии с изобретением, толерантные к гербициду растения в соответствии с изобретением включают IMI нуклеиновую кислоту, которая кодирует IMI белок.
[00104] Для целей данного изобретения термины "гербицид-толерантный" и "гербицид-резистентный" используются попеременно и имеют эквивалентное значение и эквивалентный объем. Подобно этому, термины "гербицид-толерантность" и "гербицид-резистентность" используются попеременно и предназначены для обозначения эквивалентный понятий и эквивалентного объема. Кроме того, "имидазолинон-резистентный" и "имидазолинон-резистентность" используются попеременно и предназначены быть эквивалентными понятиями и имеют эквивалентный объем, что и термины "имидазолинон-толерантный" и "имидазолинон-толерантность", соответственно.
[00105] Настоящее изобретение обеспечивает растения, ткани растений, растительные клетки и хозяйские клетки с повышенной резистентностью или толерантностью, по крайней мере, к одному гербициду, в частности, гербициду, который препятствует активности AHAS фермента, особенно имидазолинонового или сульфонилмочевинного гербицида. Предпочтительное количество или концентрация гербицида является "эффективным количеством" или "эффективной концентрацией". Под "эффективным количеством" и "эффективной концентрацией" понимают количество и концентрацию, соответственно, которые являются достаточным для того, чтобы привести к гибели или ингибировать рост подобного растения, растительной ткани, растительной клетки, микроспоры дикого типа или хозяйской клетки, но это указанное количество не убивает или не ингибирует так сильно резистентные к гербициду растения, растительные ткани, растительные клетки, микроспоры и хозяйские клетки в соответствии с настоящим изобретением. Типично, эффективное количество гербицида представляет собой количество, которое обычно используется в системах производства сельскохозяйственной продукции для уничтожения сорняков. Такое количество является известным среднему специалисту в данной области техники или может быть легко определено при использовании способов, известных в области техники. Кроме того, признается, что эффективное количество гербицида в системе производства сельскохозяйственной продукции может существенно отличаться от эффективного количества гербицида в системе растительной культуры in vitro.
[00106] IMI нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться для трансформации любого вида растений, которые представляют интерес, включая без ограничения кукурузу или маис (Zea mays), Brassica sp.(например, В.napus, В.rapa, B.juncea), в частности, те виды Brassica, которые являются полезными в качестве источников масла, получаемого из семян, люцерну (Medicago sativa), рис (Oryza sativa), рожь (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), просо (например, пеннисету рогозовидный (Pennisetum glaucum), просо обыкновенное (Panicum miliaceum), итальянское просо (Setaria italicd), элевзине (Eleusine coracand)), подсолнечник (Helianthus annuus), сафлор красильный (Carthamus tinctorius), пшеницу (Triticum aestivum, Т. Turgidum ssp.durum), сою (Glycine max), табак (Nicotiana tabacum), картофель (Solatium tuberosum), земляной орех (Arachis hypogaea), хлопчатник (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), сладкий картофель (Ipomoea batatus), маниоку (Manihot esculenta), кофе (Coffea spp.), кокос (Cocos nucifera), ананас (Ananas comosus), цитрусовые растения (Citrus spp.), какао (Theobroma cacao), чай (Camellia sinensis), бананы (Musa spp.), авокадо (Persea americana), инжир (Ficus casica), гуайяву (Psidium guajava), манго (Mangifera indica), маслины (Olea europaea), папайю (Carica papaya), орех кешью (Anacardium occidentale), макадамию (Macadamia integrifolia), миндаль (Prunus amygdalus), сахарную свеклу (Beta vulgaris), сахарный тростник (Saccharum spp.), овес, ячмень, овощные культуры, декоративные растения и хвойные растения. Предпочтительно, когда растения в соответствии с настоящим изобретением представляют собой возделываемое растение (например, подсолнечник, Brassica sp., хлопчатник, сахарная свекла, соя, земляной орех, люцерна, сафлор, табак, кукуруза, рис, пшеница, рожь, ячмень, тритикале, сорго, просо и тому подобное).
[00107] Резистентные к гербициду растения в соответствии с изобретением находят применение в способах контроля сорняков. Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает способ контроля сорняков, произрастающих поблизости с резистентными к гербициду растениями в соответствии с изобретением. Способ включает применение эффективного количества гербицида к сорнякам и к гербицид-резистентным растениям, где растение обладает повышенной резистентностью, по крайней мере, к одному гербициду, в частности, имидазолиноновому или сульфонилмочевинному гербициду по сравнению с растением дикого типа. В таком способе для контроля сорняков гербицид-резистентные растения в соответствии с изобретением представляют собой предпочтительно возделываемые растения, включая без ограничения, подсолнечник, люцерну, Brassica sp., сою, хлопчатник, сафлор, земляной орех, табак, томаты, картофель, пшеницу, рис, кукурузу, сорго, ячмень, рис, просо и сорго.
[00108] Путем обеспечения растений, обладающих повышенной резистентностью к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, широкое разнообразие композиций может использоваться для защиты растений от сорняков, для того, чтобы улучшить рост растений и снизить конкуренцию за питательные вещества. Гербицид может использоваться сам по себе для предвсходового, послевсходового, предпосадочного, посадочного контроля сорняков на участках, которые окружают растения, описанные в данной заявке, или может использоваться композиция имидазолинонового гербицида, которая содержит другие добавки. Гербицид может также использоваться для обработки семян. То есть эффективная концентрация или эффективное количество гербицида может применяться непосредственно к семенам перед посевом или во время посева семян. Добавки, используемые в композиции имидазолинонового гербицида или сульфонилмочевинного гербицида, включают другие гербициды, детергенты, вспомогательные вещества, агенты для распыления, склеивающие агенты, стабилизирующие агенты или подобные. Гербицидная композиция может представлять собой влажный или сухой препарат и может без ограничения представлять собой текучие порошки, эмульгируемые концентраты и жидкие концентраты. Гербицид и гербицидные композиции могут применяться в соответствии с традиционными способами, например, путем разбрызгивания, орошения, распыления или подобных способов.
[00109] Настоящее изобретение обеспечивает нетрансгенные и трансгенные семена с повышенной толерантностью, по крайней мере, к одному гербициду, в частности AHAS-ингибирующему гербициду, особенно имидазолиноновому гербициду. Такие семена включают, например, нетрансгенные семена пшеницы, обладающие характеристиками толерантности к гербицидам растения со ссылочным номером депонирования для целей патентной процедуры в АТСС 5625, и трансгенные семена, включающие молекулу IMI нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением, которая кодирует IMI белок.
[00110] Настоящее изобретение обеспечивает способы получения резистентного к гербициду растения, в частности, резистентного к гербициду растения пшеницы или тритикале, посредством традиционного разведения растений, вовлекающего половое размножение. Способ включает скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, со вторым растением, которое является резистентным ко второму гербициду. Первое растение может представлять собой любое гербицид-резистентное растение в соответствии с настоящим изобретением, включая, например, трансгенные растения, включающие, по крайней мере, один из полинуклеотидов в соответствии с настоящим изобретением, который кодирует резистентный к гербициду IMI белок, и нетрансгенные растения пшеницы, которые обладают характеристиками резистентности к гербициду растения пшеницы со ссылочным номером депонирования для целей патентной процедуры в АТСС 5625. Второе растение может быть любым растением, которое является способным образовывать жизнеспособные растения потомства (то есть семена), когда скрещивается с первым растением. Типично, но не необходимо, когда первое и второе растение принадлежат к одному и тому же виду. Способы в соответствии с изобретением могут также вовлекать одно или более поколений обратного скрещивания потомства растений первого скрещивания с растением той же линии генотипа, что и либо первое, либо второе растение. Альтернативно, потомство первого скрещивания или какого-либо последующего скрещивания может быть скрещено с третьим растением, которое представляет собой такое, отличное от первого либо второго растения линии или генотипа. Способы в соответствии с изобретением могут дополнительно вовлекать отбор растений, которые обладают характеристиками толерантности к гербициду первого растения.
(00111] Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способы повышения гербицид-резистентности растения, в частности резистентного к гербициду растения пшеницы, посредством традиционного разведения растений, вовлекающего половое размножение. Способы включают скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, со вторым растением, которое может быть или может не быть резистентным к гербициду или может быть резистентным к гербициду или гербицидам, отличным от таковых для первого растения. Первое растение может представлять собой любое резистентное к гербициду растение в соответствии с настоящим изобретением, включая, например, трансгенные растения, содержащие, по крайней мере, одну из IMI нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением, которые кодируют IMI белок, и нетрансгенным растением пшеницы и тритикале, которые обладают характеристиками толерантности к гербициду растения пшеницы со ссылочным номером депонирования для целей патентной процедуры в АТСС 5625. Второе растение может быть любым растением, способным образовывать жизнеспособные растения потомства (то есть, семена), когда скрещивается с первым растением. Типично, но не необходимо, когда первое и второе растения принадлежат к одному и тому же виду. Растения потомства, полученные с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, обладают повышенной резистентностью к гербициду по сравнению либо с первым растением, либо со вторым, либо с двумя. Когда первое и второе растения являются резистентными к различным гербицидам, то растения потомства будут иметь комбинированные характеристики толерантности к гербициду первого и второго растений. Способы в соответствии с изобретением могут также вовлекать одно или более поколений обратного скрещивания потомства растений первого скрещивания с растением той же линии или генотипа, что и первое растение, либо второе. Альтернативно, потомство первого скрещивания или какого-либо последующего скрещивания может быть скрещено с третьим растением, которое представляет собой такое, отличное от первого либо второго растения линии или генотипа. Способы в соответствии с изобретением могут дополнительно вовлекать отбор растений, которые обладают характеристиками толерантности к гербициду первого растения, второго растения, или и первого и второго растений.
[00112] Растения в соответствии с настоящим изобретением могут быть трансгенными или нетрансгенными. Пример нетрансгенного растения пшеницы, обладающего повышенной резистентностью к имидазолинону, представляет собой растение пшеницы (Shiloh-8), имеющего ссылочный номер депонирования для целей патентной процедуры АТСС 5625; или мутант, рекомбинант, или генетически сконструированную производную растения, имеющего ссылочный номер депонирования АТСС 5625, или любое потомство растения, имеющего ссылочный номер депонирования АТСС 5625; или растение, которое является потомством какого-либо из этих растений; или растение, которое обладает характеристиками толерантности к гербициду растения, имеющего ссылочный номер депонирования АТСС 5625.
[00113] Настоящее изобретение также обеспечивает растения, органы растений, ткани растений, растительные клетки, семена и хозяйские клетки, отличные от человеческих, которые являются трансформированными с помощью, по крайней мере, одной молекулы полинуклеотида, экспрессионной кассеты или вектора трансформации в соответствии с изобретением. Такие трансформированные растения, органы растений, ткани растений, растительные клетки, семена и хозяйские клетки, отличные от человеческих, обладают повышенной толерантностью или резистентностью, по крайней мере, к одному гербициду, при уровнях гербицида, которые убивают или ингибируют рост нетрансформированного растения, органов растений, тканей растений, растительных клеток, семян и хозяйских клеток, отличных от человеческих, соответственно. Предпочтительно, когда трансформированное растение, органы растений, ткани растений, растительные клетки и семена в соответствии с изобретением являются такими Arabidopsis thaliana и возделываемых растений.
[00114] Настоящее изобретение обеспечивает способы, которые вовлекают применение, по крайней мере, одного ингибирующего AHAS-гербицида, выбранного из группы, состоящей из имидазолиноновых гербицидов, сульфонилмочевинных гербицидов, триазолпиримидиновых гербицидов, гербицидов на основе пиримидинилоксибензоата, гербицидов на основе сульфониламинокарбонилтриазолинона и на основе их смесей. В этих способах гербицид, ингибирующий AHAS, может применяться с помощью любого способа, известного в уровне техники, включающего без ограничения обработку семян, обработку почвы и обработку листьев.
[00115] Перед применением гербицид, ингибирующий AHAS, может быть переведен в обычные композиции, например, растворы, эмульсии, суспензии, пудру, порошки, пасты и гранулы. Форма применения зависит от частной цели; в каждом случае она должна обеспечивать точное и равномерное распределение соединения в соответствии с изобретением.
[00116] Композиции готовят известным способом (смотри, например, для обзора US 3,060,084, ЕР-А 707 445 (для жидких концентратов). Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4,1967,147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4-oe изд., McGraw-Hill, New York, 1963, стр.8-57 и все последующие. WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701, US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley и Sons, me., New York, 1961, Hance и др., Weed Control Handbook, 8-ое изд., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 и Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry и Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), например, путем дополнения активного соединения вспомогательными веществами, приемлемыми для композиции агрохимических средств, такими, как растворители и/или носители, если это является желательным, то эмульгаторами, сурфактантами и диспергирующими агентами, консервантами, противовспенивающими агентами, агентами против замерзания, для композиций, предназначенных для обработки семян также необязательно могут использоваться красители и/или связывающие вещества и/или желатирующие агенты.
[00117] Примеры приемлемых растворителей представляют собой воду, ароматические растворители (например, продукты Solvesso, ксилен), парафины (например, фракции минерального масла), спирты (например, метанол, бутанол, пентанол, бензиловый спирт), кетоны (например, циклогексанон, гамма-бутирлактон), пирролидоны (NMP, NOP), ацетаты (гликольдиацетат), гликоли, диметиламиды жирных кислот, жирные кислоты и эстеры жирных кислот. В принципе, также могут использоваться смеси растворителей.
[00118] Примеры приемлемых носителей представляют собой природные минералы (например, каолины, глину, тальк, мел), и синтетические минералы (например, высоко дисперсный кремнезем, силикаты).
[00119] Приемлемые эмульгаторы представляют собой неионные и анионные эмульгаторы (например, жирные спиртовые этеры полиоксиэтилена, алкилсульфонаты и арилсульфонаты).
[00120] Примеры диспергирующих агентов представляют собой жидкие отходы лигнинсульфита и метилцеллюлозу.
[00121] Приемлемые сурфактанты, который используются, представляют собой, щелочные металлы, щелочно-земельные металлы и соли аммония лигносульфоновой кислоты, нафталинсульфоновой кислоты, фенолсульфоновой кислоты, дибутилнафталинсульфоновой кислоты, алкиларилсульфонаты, алкилсульфаты, алкилсульфонаты, сульфаты жирных спиртов, жирные кислоты и сульфатированные гликолевые этеры жирного спирта, а также конденсаты сульфированного нафталина и производных нафталина с формальдегидом, конденсаты нафталина или нафталинсульфоновой кислоты с фенолом и формальдегидом, полиоксиэтиленоктилфеноловый этер, этоксилированный изооктилфенол, октилфенол, нонилфенол, полигликолевые этеры полиоксиэтилена, полигликолевый этер трибутилфенила, полигликолевый этер тристеарилфенила, алкиларилполиэфирные спирты, конденсаты этиленоксида и спирта и жирного спирта, этоксилированное касторовое масло, алкиловые этеры полиоксиэтилена, этоксилированный полиоксипропилен, полигликольэтерацеталь лаурилового спирта, эстеры сорбита, жидкие отходы лигносульфита и метилцеллюлоза.
[00122] Вещества, которые являются приемлемыми для приготовления разбрызгиваемых непосредственно растворов, эмульсий, паст или масляных дисперсий представляют собой фракции минерального масла от средней до высокой точки кипения, такие, как керосин или дизельное топливо, а также каменноугольный деготь и масла растительного или животного происхождения, алифатические, циклические и ароматические углеводороды, например, толуол, ксилен, парафин, тетрагидронафталин, алкилированные нафталины или их производные, метанол, этанол, пропанол, бутанол, циклогексанол, циклогексанон, изофорон, высоко полярные растворители, например, диметилсульфоксид, N-метилпирролидон или воду.
[00123] К композиции также могут прибавляться такие вещества, как агенты против замерзания, такие как глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль и бактерициды.
[00124] Приемлемые антивспенивающие агенты представляют собой, например, антивспенивающие агенты на основе кремния или стеарата магния.
[00125] Приемлемые консерванты представляют собой, например, дихлорофен и бензилалкогольгемиформаль.
[00126] Композиции для обработки семян могут дополнительно включать связующее вещество и необязательно красители.
[00127] Связующие агенты могут прибавляться для повышения адгезии активных материалов на семенах после обработки. Приемлемые связующие агенты представляют собой блок-сополимеры ЕО/РО сурфактантов, а также поливиниловые спирты, поливинилпирролидоны, полиакрилаты, полиметакрилаты, полибутены, полиизобутилены, полистирены, полиэтиленамины, полиэтиленамиды, полиэтиленимины (Lupasol, Polymin), полиэтеры, полиуретаны, поливинилацетаты, тилозу и сополимеры, которые имеют происхождение от этих полимеров.
[00128] В композицию также необязательно могут включаться красящие вещества. Приемлемые красящие вещества или красители для композиций, предназначенных для обработки семян, представляют собой родамин В, C.I. Красный пигмент 112, C.I. растворитель красный 1, голубой пигмент 15:4, голубой пигмент 15:3, голубой пигмент 15:2, голубой пигмент 15:1, голубой пигмент 80, желтый пигмент 1, желтый пигмент 13, красный пигмент 112, красный пигмент 48:2, красный пигмент 48:1, красный пигмент 57:1, красный пигмент 53:1, оранжевый пигмент 43, оранжевый пигмент 34, оранжевый пигмент 5, зеленый пигмент 36, зеленый пигмент 7, белый пигмент 6, коричневый пигмент 25, основной фиолетовый 10, основной фиолетовый 49, кислый красный 51, кислый красный 52, кислый красный 14, кислый голубой 9, кислый желтый 23, основной красный 10, основной красный 108.
[00129] Примеры приемлемых желатинирующих агентов представляют собой ирландский мох (Satiagel).
[00130] Порошки, материалы для рассеивания и распыляемые продукты могут быть получены путем смешивания или параллельного измельчения активных веществ с твердым носителем.
[00131] Гранулы, например, покрытые оболочкой гранулы, импрегнированные гранулы и гомогенные гранулы могут быть получены путем связывания активных соединений с твердыми носителями. Примеры твердых носителей представляют собой минералы, такие как силикагели, силикаты, тальк, каолин, аттапульгит, известняк, известь, мел, железистую известковую глину, лесс, глину, доломит, диатомовую землю, сульфат кальция, сульфат магния, оксид магния, синтетические минеральные материалы, удобрения, такие, как, например, сульфат аммония, фосфат аммония, нитрат аммония, мочевины и продукты растительного происхождения, такие как зерновая мука, мука из древесной коры, древесная мука и мука из ореховой кожуры, порошки целлюлозы и другие твердые носители.
[00132] В общем случае композиции включают от 0,01 до 95 вес.%, предпочтительно от 0,1 до 90 вес.%, ингибирующего AHAS гербицида. В этом случае ингибирующие AHAS гербициды используются при чистоте от 90 вес.% до 100 вес.%, предпочтительно от 95 вес.% до 100 вес.% (в соответствии со спектром ЯМР). Для целей обработки семян соответствующие композиции могут быть разведены в 2-10 раз, что приводит к получению концентрации в готовых к применению препаратах от 0,01 до 60 вес.% активного соединения, предпочтительно от 0,1 до 40 вес.%.
[00133] Ингибирующий AHAS гербицида может использоваться как таковой в форме своих композиций или форм, которые из него готовятся, например, в форме непосредственно разбрызгиваемых растворов, порошков, суспензий или дисперсий, эмульсий, масляных дисперсий, паст, распыляемых продуктов, материалов для распыления или гранул, которые используют путем разбрызгивания, атомизации, распыления, разбрасывания или разливания. Применение форм полностью зависит от преследуемых целей; они предназначены для обеспечения в каждом случае по возможности более тонкого распределения ингибирующего AHAS гербицида в соответствии с изобретением.
[00134] Используемые водные формы могут быть получены из эмульсионных концентратов, паст и смачиваемых порошков (способные к разбрызгиванию порошки, масляные дисперсии) путем прибавления воды. Для приготовления эмульсий, паст или масляных дисперсий вещества непосредственно или в растворенном в масле или растворителе виде могут быть гомогенизированы в воде при использовании смачивающего агента, вещества для повышения клейкости, диспергирующего агента или эмульгатора и, если это является приемлемым, растворителя или масла, и такие концентраты являются приемлемыми для разведения водой.
[00135] Концентрации активных соединений в готовых к использованию препаратах могут варьировать в относительно широких пределах. В общем случае они составляют от 0,0001 до 10 вес.%, предпочтительно от 0,01 до 1 вес.%
[00136] Ингибирующий AHAS гербицид может также успешно использоваться в ультрамелкосерийном процессе (ULV), является возможным применять композиции, содержащие более 95 вес.% активного соединения, или даже применять активное соединение без добавок.
[00137] Ниже приведены примеры композиций.
[00138] 1. Продукты, предназначенные для разведения водой при применении для обработки листьев. Для обработки семян такие продукты могут применяться к семенам в разведенном или неразведенном виде.
[00139] А) Водорастворимые концентраты (SL, LS)
[00140] Десять весовых частей ингибирующего AHAS гербицида растворяли в 90 весовых частях воды или водорастворимого растворителя. Как альтернативный вариант, прибавляли смачивающие агенты или другие вспомогательные вещества. Ингибирующеий AHAS гербицид растворялся при разведении с помощью воды, что обеспечивало получение композиции ингибирующего AHAS гербицида с концентрацией 10% (вес./вес.)
[00141] В) Диспергируемые концентраты (DC)
[00142] Двадцать весовых частей ингибирующего AHAS гербицида растворяли в 70 весовых частях циклогексанона с добавлением 10 весовых частей диспергирующего агента, например поливинилпирролидона. Разведение водой обеспечивало получение дисперсии, при этом получали композицию ингибирующего AHAS гербицида с концентрацией 20% (вес./вес.).
[00143] С) Эмульгируемые концентраты (ЕС)
[00144] Пятнадцать весовых частей ингибирующего AHAS гербицида растворяли в 7 весовых частях ксилена с добавлением додецилбензолсульфоната кальция и этоксилата касторового масла (в каждом случае 5 весовых частей). Разведение водой обеспечивало получение эмульсии, при этом получали композицию ингибирующего AHAS гербицида с концентрацией 15%(вес./вес.).
[00145] D) Эмульсии (EW, ЕО, ES)
[00146] Двадцать пять весовых частей ингибирующего AHAS гербицида растворяли в 35 весовых частях ксилена с добавлением додецилбензолсульфоната кальция и этоксилата касторового масла (в каждом случае 5 весовых частей). Смесь вносили в 30 весовых частей с помощью устройства для эмульгирования (например, Ultraturrax), и смесь превращали в гомогенную эмульсию. Разведение водой обеспечивало получение эмульсии, при этом получали композицию ингибирующего AHAS гербицида с концентрацией 25% (вес./вес.).
[00147] Е) Суспензии (SC, OD, FS)
[00148] В шаровой мельнице с перемешиванием соединяли 20 весовых частей ингибирующего AHAS гербицида с добавленными 10 весовьми частями диспергирующих агентов, смачивающих агентов и 70 весовыми частями воды или органического растворителя для получения тонкой суспензии ингибирующего AHAS гербицида. Разведение водой обеспечивало получение стабильной суспензии ингибирующего AHAS гербицида, при этом получали композицию ингибирующего AHAS гербицида с концентрацией 20% (вес./вес.).
[00149] F) Диспергируемые в воде гранулы и водорастворимые гранулы (WG, SG)
[00150] Пятьдесят весовых частей ингибирующего AHAS гербицида тонко измельчали с добавлением 50 весовых частей диспергирующих агентов и смачивающих агентов и готовили диспергируемые в воде гранулы и водорастворимые гранулы при использовании технических средств (например, при использовании экструзии, колонны с распылительным орошением, псевдоожиженного слоя). Разведение водой обеспечивало получение стабильной дисперсии или раствора ингибирующего AHAS гербицида, при этом получали композицию ингибирующего AHAS гербицида с концентрацией 50% (вес./вес.).
[00151] G) Диспергируемые в воде порошки и водорастворимые порошки (WP, SP, SS, WS)
[00152] Семьдесят весовых частей ингибирующего AHAS гербицида измельчали в роторно-статорной мельнице с добавлением 25 весовых частей диспергирующих агентов, смачивающих агентов и силикагеля. Разведение водой обеспечивало получение стабильной дисперсии или раствора ингибирующего AHAS гербицида, при этом получали композицию ингибирующего AHAS гербицида с концентрацией 75% (вес./вес.).
[00153] I) Гелевая композиция (GF)
[00154] В шаровой мельнице с перемешиванием соединяли 20 весовых частей ингибирующего AHAS гербицида с добавленными 10 весовыми частями диспергирующих агентов, 1 частью желатинирующего агента, смачивателя и 70 весовыми частями воды или органического растворителя для получения тонкой суспензии ингибирующего AHAS гербицида. Разведение водой обеспечивало получение стабильной суспензии ингибирующего AHAS гербицида, при этом получали композицию ингибирующего AHAS гербицида с концентрацией 20% (вес./вес.). Эта гелевая композиция является приемлемой для обработки семян.
[00155] 2. Продукты, которые применяются в неразведенном виде для обработки листьев. Для обработки семян такие продукты могут применяться к семенам в разведенном виде.
[00156] А) Порошки, способные к распылению (DP, DS)
[00157] Пять весовых частей ингибирующего AHAS гербицида тонко измельчали и тщательно смешивали с 95 весовыми частями тонко измельченного каолина. Это обеспечивало получение способного к распылению продукта, содержащего 5% (вес./вес.) ингибирующего AHAS гербицида.
[00158] В) Гранулы (GR, FG, GG, MG)
[00159] Половину весовой части ингибирующего AHAS гербицида тонко измельчали и соединяли с 95,5 весовыми частями носителей, получая таким образом композицию ингибирующего AHAS гербицида с концентрацией 0,5% (вес./вес.). Современными способами являются использование экструзии, использование колонны с распылительным орошением, псевдоожиженного слоя. Это обеспечивает получение гранул, которые используются в неразведенном виде для обработки листьев.
[00160] Традиционные композиции для обработки семян включают, например, текучие концентраты FS, растворы LS, порошки для сухой обработки DS, диспергируемые в воде порошки для обработки глинистой суспензией WS, водорастворимые порошки SS и эмульсии ES, а также ЕС и гелевые композиции GF. Эти композиции могут использоваться для обработки семян разведенными или неразведенными. Применение для обработки семян осуществляют перед посевом либо непосредственно наносят на семена.
[00161] В предпочтительном воплощении FS композиция используется для обработки семян. Типично, FS композиция может включать 1-800 г/л активного ингредиента, 1-200 г/л сурфактанта, от 0 до 200 г/л агента против замерзания, от 0 до 400 г/л связывающего агента, от 0 до 200 г/л пигмента и растворитель до 1 литра, предпочтительно воды.
[00162] Настоящее изобретение относится к нетрансгенным и трангенным семенам резистентных к гербициду растений в соответствии с настоящим изобретением. Такие семена включают, например, нетрансгенные семена пшеницы, обладающие характеристиками толерантности к гербициду растения, имеющего ссылочный номер депонирования для целей патентной процедуры 5625, и трансгенные семена, включающие молекулу полинуклеотида в соответствии с изобретением, которая кодирует IMI белок.
[00163] Для обработки семян семена резистентных к гербициду растений в соответствии с настоящим изобретением обрабатывают гербицидами, предпочтительно гербицидами, выбранными из группы, состоящей из ингибирующих AHAS гербицидов, таких, как амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфурон, этаметсульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, имазосульфурон, иодсульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, никосульфурон, оксасульфурон, примисульфурон, просульфурон, пиразосульфурон,римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенсульфурон, триасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, имазамегабенз, имазамокс, имазапик, имазапир, имазаквин, имазетапир, клорамсулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пеноксулам, биспирибак, пириминобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пирибензоксим, пирифталид, пиритиобак и их смеси, или с композицией, включающей ингибирующий AHAS гербицид.
[00164] Термин "обработка семян" включает все приемлемые методики обработки семян, известные в области техники, такие как протравливание семян, нанесение веществ на семена, опудривание посевного материала, замачивание семян и дражирование семян.
[00165] В соответствии с вариантом настоящего изобретения дополнительный объект настоящего изобретения представляет собой способ обработки почвы путем применения, в частности, в машине для высевания семян, либо гранулярной препаративной формы, содержащей ингибирующий AHAS гербицид, в виде композиции/препарата (например, гранулярной композиции необязательно с одним или более твердыми или жидкими приемлемыми для сельского хозяйства носителями и/или необязательно с одним или более приемлемыми для сельского хозяйства поверхностно-активными веществами. Этот способ преимущественно используется, например, при подготовке почвы к посеву зерновых культур, кукурузы, хлопчатника и подсолнечника.
[00166] Настоящее изобретение также включает семена, покрытые или содержащие композицию для обработки семян, содержащую, по крайней мере, один ингибирующий AHAS гербицид, выбранный из группы, включающей амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфурон, этаметсульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, имазосульфурон, иодсульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, никосульфурон, оксасульфурон, примисульфурон, просульфурон, пиразосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенсульфурон, триасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, имазаметабенз, имазамокс, имазапик, имазапир, имазаквин, имазетапир, клорамсулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пеноксулам, биспирибак, пириминобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пирибензоксим, пирифталид и пиритиобак.
[00167] Термин "семена" охватывает семена и ростки всех видов, включая без ограничения истинные семена, части семян, отростки, клубнелуковицы, луковицы, плоды, клубни, зерно, черенки, побеги и тому подобное, и означает в предпочтительном воплощении истинные семена.
[00168] Термин "покрытый и/или содержащий" в общем случае означает, что активный ингредиент находится для большей части на поверхности продукта размножения во время применения, несмотря на то, что большая или меньшая часть ингредиента может проникать в продукт размножения, в зависимости от способа применения. Когда указанный продукт размножения подвергается высаживанию или пересаживанию, то он может абсорбировать этот активный ингредиент.
[00169] Применение обработки семян с помощью ингибирующего AHAS гербицида или с помощью композиции, содержащей ингибирующий AHAS гербицид, осуществляют путем разбрызгивания или распыления на семена перед высевом растений или перед появлением всходов растений.
[00170] При обработке семян соответствующие композиции применяются посредством обработки семян эффективным количеством ингибирующего AHAS гербицида или композицией, содержащей ингибирующего AHAS гербицид. В данной заявке нормы применения в общем случае составляют от 0,1 г до 10 кг активного ингредиента (или смеси активного ингредиента или композиции) на 100 кг семян, предпочтительно от 1 г до 5 кг на 100 кг семян, в частности, от 1 г до 2.5 кг на 100 кг семян. Для специфических культур, таких, как салат-латук, норма может быть выше.
[00171] Настоящее изобретение обеспечивает способ борьбы с нежелательной растительностью или контроля сорняков, который включает контакт семян устойчивых растений в соответствии с настоящим изобретением перед высевом и/или после предварительного проращивания с ингибирующим AHAS гербицидом. Способ также включает высевание семян, например, в почву на поле или в среду, которая содержится в горшках в теплице. Способ находит, в частности, применение при борьбе с нежелательной растительностью или контроля сорняков, произрастающих в непосредственной близости с семенами.
[00172] Контроль нежелательной растительности понимается в значении уничтожения сорняков и/или угнетения иным образом или ингибирования нормального роста сорняков. Сорняки в широком смысле понимаются в значении всех тех растений, которые произрастают в местах, где они являются нежелательными.
[00173] Сорняки в соответствии с настоящим изобретением включают, например, двудольные и однодольные сорняки. Двудольные сорняки включают без ограничения сорняки родов: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindemia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus и Taraxacum. Однодольные сорняки включают без ограничения сорняки родов: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus и Ареrа.
[00174] Кроме того, сорняки в соответствии с настоящим изобретением могут включать, например, культурные растения, которые выращиваются в нежелательных местах. Например, самосевное растение пшеницы, которое находится на поле, которое преимущественно включает растения сои, может считаться сорняком, если растение кукурузы является нежелательным на поле, где произрастают растения сои.
[00175] Неопределенные артикли используются в данной заявке для обозначения одного или более (то есть, по крайней мере, одного) объектов. В качестве примера, указание на элемент означает один или более элементов.
[00176] Как используется в данной заявке, слово "включающий" или вариации этого слова, такие как "включает" или "содержащий", будут пониматься для того, чтобы подразумевать включение указанного элемента, чего-то цельного или действия, группы элементов, множества цельных объектов или действий.
[00177] Следующие примеры предлагаются для иллюстрации, но не для ограничения данного изобретения.
ПРИМЕР 1
Мутагенез и селекция линий толерантной пшеницы
[00178] Образцы семян сорта 1,500 Shiloh каждый помещали в 1000 мл лабораторный стакан и заполняли стакан водой, по крайней мере, на 1 дюйм выше уровня семян. Стаканы потом помещали в холодильник при 4°С на15-20 часов. Образцы семян вынимали из холодильника и переносили в условия комнатной температуры на период приблизительно 3 часов путем переноса лабораторного стакана в указанные условия. В некоторых случаях процесс нагревания ускоряли путем прибавления деионизированной воды к содержимому стаканов.
2
4
3
4
3
[00179] Сцеживали деионизированные воду и осушали семена, а лабораторный стакан наполняли раствором азида натрия, по крайней мере, на 1 дюйм выше уровня семян. Раствор азида натрия готовили путем прибавления 27,218 г KНРO к 1500 мл деионизированной воды, доводили значение рН раствора до рН 3 с помощью концентрированной НРO и доводили полученный раствор до объема 2 л при использовании деионизированной воды. Непосредственно перед применением прибавляли 0,2604 г NaN, и раствор выдерживали в темноте. После прибавления раствора азида натрия к семенам, содержимое стаканов инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 2 часов при нерегулярном перемешивании.
[00180] Раствор для обработки, содержащий азид натрия, декантировали, и образцы семян дважды промывали деионизированной водой. Потом образцы семян покрывали водой, по крайней мере, на 1 дюйм выше уровня семян, и подвергали замачиванию при комнатной температуре в течение периода 1 часа при нерегулярном перемешивании. Деионизированную воду декантировали, и семена равномерно распределяли на бумажном полотенце для осушения. Семена высевали в поле, поблизости Бертуда, Колорадо на шести участках размером 5 футов на 40 футов. Собирали приблизительно 15 фунтов М2 семян, и приблизительно 466000 семян высевали поблизости Платтевилля, Колорадо. Поля опрыскивали с помощью 1×(40 г/га (имазамокс)) или 2×(80 г/га (имазамокс)).
[00181] Растения, толерантные к гербициду, идентифицировали и высаживали в горшки емкостью 1 галлон, после чего подвергали яровизации в течение 4 недель при 45°F. Получали четырнадцать выборок по одному растению для 2× нормы площади. Толерантные М2 растения забирали для яровизации и выращивали в теплице Бертуда, Колорадо. Делянки подвергали опрыскиванию дозой 80 г/га (имазамокс), когда растения находились на стадии трех листьев, результаты для четырнадцати потомков подсчитывали так, как показано в Таблице 1.
[00182]
Таблица 1
Толерантность М3 растений Shiloh к дозе 80 г/га имазамокса
Все имели хороший MR-R
Средний MR-MS
Отбраковка по чувствительности
Shiloh-08
Shiloh-01
Shiloh-03
Shiloh-14
Shiloh-04
Все имели хороший MR-R
Средний MR-MS
Отбраковка по чувствительности
Shiloh-05
Shiloh-06
Shiloh-07
Shiloh-09
Shiloh-10
Shiloh-11
Shiloh-12
Shiloh-13
[00183] Двенадцать семян Shiloh-08 высевали в теплице Бертуда, Колорадо и подвергали скринингу при использовании дозы 40 г/га имазамокса на стадии трех листьев, результаты подтвердили наследуемую гомозиготную реакцию.
[00184] Проводили два анализирующих скрещивания Shiloh-8 с известной Als1 линией. Оба эксперимента показали отсутствие генетической сегрегации для толерантности в F2 популяциях, что дает возможность предположить, что Shiloh-8 являлся аллельным по Als1 в отношении толерантности к гербициду. Результаты показаны в Таблицах 2 и 3.
Таблица 2
Анализирующеескрещивание
Дата скрещивания
Дата сбора
#F2'sотсортированные
F2 номер
FS4?
iShiloh-8/iGDN
зима 99-00
лето 00
168
15-40 г
да
все R
Таблица 3
Опыт 2001-2,зима,анализирующеескрещивание
Общее#F2'
Хорошосохранившиеся
Вытесненныеилиугнетенные
Отмершиеили с отмершейточкой роста
DGP +коричневаяобвертка
iShiloh-8/imi
167
140
27
0
0
GDN
iShiloh-8
8
7
1
0
0
Shiloh
7
0
0
0
7
imi GDN
2
1
1
0
0
ПРИМЕР 2
Молекулярная характеристика линии пшеницы Shiloh-8
[00185] Последующая молекулярная характеристика выявила, что линия Shiloh-08 содержит новую замену пары оснований аденина на гуанин в положении 142 гена Als1. Этот мутант полинуклеотида Als1 кодирует мутант AHAS полипептида, который содержит замену аланина на треонин в положении 96 соответствующего AHAS полипептида дикого типа, обеспечивая тем самым растению толерантность к имидазолиноновым гербицидам. Линия Shiloh-8 не несет мутации в генах Als2 или Als3.
ПРИМЕР 3
Характеристика свойства толерантности к имидазолинону линии Shiloh-8
[00186] Агрономическую и сравнительную толерантность к имидазолиноновому гербициду имазамоксу оценивали в полевых условиях. Таблица 4 суммирует полевые и агрономические опыты по сравнению линии Shiloh-8 и растений Shiloh дикого типа. Эти опыты представляли собой типичные эксперименты по оценке на зерновых культурах, в которых используется модель рандомизированных трехкратных повторностей. Делянки представляли собой таковые размером 1,54 м × 4,62 м на момент уборки урожая. В Таблице 5 подсуммированы многократные сравнения толерантности к имидазолиноновому гербициду имазамоксу между Shiloh-8 и стандартным толерантным контролем 9804. Эти делянки находились в диапазоне от одного ряда длиной 1 м до больших делянок размером 1,54 м × 4,62 м.
[00187] Все публикации и патентные заявки, упомянутые в описании, являются показательными для уровня специалиста в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Все публикации и патентные заявки введены в данное описание в качестве ссылки в той мере, в которой каждая индивидуальная публикация или патентная заявка была специфически и индивидуально указана для того, чтобы быть введенной в качестве ссылки.
[00188] Несмотря на то что приведенное изобретение было описано подробно с целью иллюстрации и примеры приведены из соображений ясности и понимания, является очевидным, что некоторые изменения и модификации могут быть осуществлены в рамках приложенных пунктов формулы.