ШТАММ Bifidobacterium bifidum, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИФИДОСОДЕРЖАЩЕЙ ПРОДУКЦИИ
Bifidobacterium bifidum STRAIN USED FOR OBTAINING BIFIDO-CONTAINING PRODUCT

Изобретение относится к пищевой, косметической, биотехнологической и медицинской промышленности, в частности, используется для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов
В связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, длительной антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим бифидобактерии.
В кишечнике человека, в основном, встречаются 5 видов бифидобактерий - B.bifidum, B.longum, B.adolescentis, B.breve и B.infantis. Из них с наибольшей частотой в биоценозе обнаруживаются виды B.bifidum и B.longum. Вид B.adolescentis чаще встречается у взрослых людей, а виды B.breve и B.infantis - преимущественно у детей грудного возраста.
Известны зарубежные моно- и комплексные препараты-эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерии видов B.bifidum, B.lonqum, B.adolescentis, B.breve (патент 2336886, патент 2411008, Франция; патент 637297, Швейцария; патент 2134179, патент 2421066, ФРГ; патент 05227946, патент 0430642, Япония; патент 4645667, США, патент 6063935, Япония, патент 5922375, США, патент 5902743, США, патент 6746672, США, патент 6548057, США). У нас в стране для приготовления бактерийных препаратов, биологически активных добавок, продуктов лечебно-диетического питания применяют отечественные штаммы бифидобактерий видов B.bifidum 1,791,792; B.lonqum B379M, Я-2, Я-4; B.adolescentis MC-42, Г 7513; В.breve 79-119; B.infantis 79-43 (авторское свидетельство №343588, патент РФ 1347221, патент РФ 849779, патент РФ 2108383, патент РФ 2152993, патент 863639, патент РФ 2120991, патент РФ 2078814, патент РФ 2111248).
Качество лечебных продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебного питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстановить его нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.
Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида B.bifidum 79-12 с высокой биологической активностью, устойчивостью к условиям внешней среды, обладающего стабилизирующим кислотообразованием во всем температурном диапазоне развития клеток, антагонистически активного по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, быстро размножающегося на искусственных питательных средах.
Штамм Bifidobacterium bifidum 79-12 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка грудного возраста и депонирован в Государственной коллекции нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №242.
Заявляемый штамм может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов, например квас, пиво и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например соки, напитки и т.п., заквасок для приготовления кисломолочной продукции и биологически активных добавок к пище. Штамм Bifidobacterium bifidum 79-12 может широко использоваться так же для производства гигиенических и косметических средств, например кремов, лосьонов, салфеток, мыла, присыпок, тампонов, питательных масок, гелей, женских прокладок, косметического молочка, различных пудр и т.д.
Кроме того, штамм Bifidobacterium bifidum 79-12 может быть использован при производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других средств.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма Bifidobacterium bifidum 79-12, который может быть использован в качестве биологически активного вещества в составе кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Штамм Bifidobacterium bifidum 79-12 обладает биологически и технологически значимыми свойствами, такими как высокая кислотообразующая активность и способность наращивать микробную биомассу в короткие сроки культивирования. Штамм Bifidobacterium bifidum 79-12 антагонистически активен по отношению к патогенным и условно-патогенной микроорганизмам. Это позволит использовать штамм Bifidobacterium bifidum 79-12 в качестве биологически активного компонента в составе различных пробиотических средств, обеспечивающих нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов, и расширит арсенал аналогичных средств.
Культурально-морфологические свойства штамма.
Клетки представляют собой гр + полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2 концах, в жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Отдельно выросшие колонии на печеночной питательной среде имеют удлиненную форму колоний. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 12-24 часам культивирования.
Физико-биохимические свойства штамма.
Бесспоровый, неподвижный анаэроб. Оптимальная температура выращивания 38,0±0,5°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L+молочной кислот, без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,3-3,9. Ферментирует лактозу, фруктозу, галактозу, сахарозу. Не ферментирует сорбит, арабинозу, салицин, инулин, целлобиозу, ксилозу, маннозу, манит. Штамм сквашивает молоко к 18-24 ч.
Штамм Bifidobacterium bifidum 79-12 обладает антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре (Таблица 1).
Таблица 1
Антагонистическая активность штамма В.bifidum 79-12
Штамм
Зона задержки роста тест-культур мм/ М±m
Sh.sonnei
Sh.flexneri
E.coli
S.aureus
Pr.vulgaris
В.bifidum 79-12
30±2.6
28±1,6
12±2,0
28±2,6
18±2,0
Штамм активно наращивает микробную массу при росте на гидролизатно-молочной среде (ГМ), Бифидум-среде (БФ), продуцируя кислоты (Таблица 2).
Таблица 2
Накопление микробной массы (КОЕ / мл lg 10) и активность кислотообразования (в градусах Тернера) штамма В.bifidum 79-12 в динамике развития
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА
ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
12 ч
24 ч
48 ч
КОЕ
Т°
КОЕ
T°
КОЕ
T°
ГМ
8,2
86
8,8
102
7,4
168
БФ
8,4
82
9,0
96
7,6
142
Штамм максимально накапливает микробную массу к 12-24 часам, достигая в 1 мл lg 8-9 микробных клеток, активно продуцирует кислоты.
Таким образом, предлагаемый штамм В.bifidum 79-12 технологичен, поскольку размножается в различных питательных средах с накоплением производственной биомассы с высокой концентрацией бифидобактерий; обладает кислотообразующей активностью, а также антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.
Кисломолочные, ферментированные, неферментированные пищевые продукты, гигиенические, косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, содержащие штамм В. bifidum 79-12, могут найти широкое применение в пищевой, медицинской, биотехнологической и косметической промышленности.
Способность штамма В.bifidum 79-12 наращивать биомассу в питательной среде в короткие сроки культивирования, кислотообразующая активность, антагонистическая активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, а также другие полезные для организма человека свойства, характерные для вида В.bifidum, делают возможным использование штамма в составе различных корригирующих средств лечебно-профилактического назначения.
Пример 1. Использование штамма В.bifidum 79-12 в составе биологически активных добавок:
-9
1 пассаж: лиофилизированный штамм В.bifidum 79-12 в количестве 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10. Инкубируют при температуре 38,0±0,5°С до образования видимого роста в последних разведениях;
-7-9
2 пассаж: выросшую культуру из 10 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38,0±0,5°С в течение 12-24 ч до образования густого роста с видимой зоной аэробиоза;
8
3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 38,0±0,5°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10/мл.
8
7
В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10/мл, содержанием бифидобактерий. При выслушивании биомассы с защитными средами (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко или другие) получают сухую биологически активную добавку с содержанием бифидобактерий не менее 10/мл.
Пример 2. Использование штамма В.bifidum 79-12 для приготовления ферментированных и неферментированных пищевых продуктов:
-9
1 пассаж: лиофилизированный штамм В.bifidum 79-12 в количестве 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10. Инкубируют при 38,0±0,5°С до образования видимого роста в последних разведениях;
-7-9
2 пассаж: выросшую культуру из 10 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38,0±0,5°С в течение 12-24 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза;
8
3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 38,0±0,5°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10/мл.
6
Получение ферментированного или неферментированного пищевого продукта: выросшую биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки, пиво, квас и пр.) в количестве до 10% от объема, перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 10/мл.
Пример 3. Использование штамма В.bifidum 79-12 для приготовления кисломолочного продукта:
-9
7
1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10. Инкубируют при 38,0±0,5°С до образования видимого роста в последних разведениях. Или сухую лиофилизированную биомассу бифидобактерий вносят в количестве 1-2 дозы в пробирку с 30 мл питательной среды. Культивируют при температуре 38,0±0,5°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10/мл;
8
2 пассаж: выросшую культуру штамма В.bifidum 79-12 из последних разведений или из пробирки с выросшей биомассой вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 38,0±0,5°С до получения биомассы с содержанием бифидобактерий не менее 10 /мл.
3 пассаж: полученную биомассу штамма В.bifidum 79-12 в объеме до 10% вносят в стерильное молоко, культивируют до образования сгустка (кисломолочный продукт). Количество пассажей 2 может быть увеличено в зависимости от объема производства;
Пример 4. Использование штамма В.bifidum 79-12 для получения бактерийных препаратов:
8
7
Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 38,0±0,5°С до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10 в 1 мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, флаконы и другие емкости, замораживают при температуре минус 35-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10 живых клеток бифидобактерий. Данное содержание бифидобактерий согласуется с научно-технической документацией на аналогичный бифидосодержащий препарат - "Бифидумбактерин сухой" и является достаточным для использования полученного средства в качестве препарата-эубиотика.
Пример 5. Использование штамма Bifidobacterium bifidum 79-12 для получения гигиенических и косметических средств
8
Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 37-38 градусов по Цельсию до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10 в 1 мл, высушивают методом распыления или лиофилизации.
Полученную сухую биомассу бифидобактерий штамма Bifidobacterium bifidum 79-12 вводят в состав питательного крема в количестве не более 1% к объему.
7
Безвредность: при введении трем беспородным белым мышам дозы per os микробной культуры штамма в количестве 5×10 КОЕ на животное гибели, отклонений в состоянии здоровья мышей в период наблюдения не отмечено.