Перенос Sym-плазмид в симбиотически активные и асимбиотические штаммы ризобий: свойства рекомбинантов и возможные эволюционные последствия

СИМБИОГЕНЕТИКА

H.A. Проворов, И.Г. Фокина, M.JI. Румянцева, Б. В. Симаров

Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, Санкт-Петербург

При переносе Sym-плазмид ризобий клевера в асимбиоти-ческие мутанты этого же вида ризобий, а также ризобий люцерны получены рекомбинанты, у которых восстановилась способность к азотфиксирующему симбиозу с бобовыми растениями. При переносе этих плазмид в изогенные штаммы дикого типа наблюдали снижение их симбиотической активности. Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что асимби-отические штаммы ризобий играют важную роль в переносе Sym-плазмид, который определяет эволюцию этих бактерий.

Ключевые слова: клубеньковые бактерии, бобовые растения, хозяйская специфичность, Sym-плазмиды, эволюция симбиоза, азотфиксирующая активность, агробактерии, перенос генов.

ПЕРЕНОС БУМ-ПЛАЗМИД В СИМБИОТИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ И АСИМБИОТИЧЕСКИЕ ШТАММЫ РИЗОБИЙ: СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТОВ И ВОЗМОЖНЫЕ ЭВОЛЮЦИОННЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ

ВВЕДЕНИЕ

У большинства быстрорастущих клубеньковых бактерий (ризобий) способность к симбиозу с бобовыми растениями кодируется Sym-плазмидами (pSym), размер которых у Rhizobium обычно составляет 100-300 т.п.н., а у Sinorhizobium достигает 1700 т.п.н. [19]. Эти плазмиды в совокупности с криптическими («несимбиотическими») плазмидами (до 10 на штамм) составляют до 50% бактериального генома. Перенос pSym играет важную роль в формировании популяций ризобий, о чем говорит часто выявляемое равновесие по сцеплению (свободное комбинирование) маркеров Sym-плазмид и хромосомы [18]. В Sym-плазмидах (Sino) Rhizobium и в Т1(К1)-плазмидах родственных им агробактерий обнаружены обширные области гомологии, которые содержат гены конъюгативно-го переноса и репликации. Это свидетельствует об общности происхождения данных плазмид и о важной роли их переноса в эволюции бактерий сем. Rhizobiaceae [12].

В то же время, в лабораторных условиях у большинства Sym-плазмид трансмиссивность не проявляется, либо частоты переноса малы [12], в связи с чем их мобилизация может быть осуществлена только с использованием гетерологичных систем, например Tn5-mob+pRP4-4 [24]. Поэтому логично предположить, что «подвижность» этих плазмид в природных популяциях определяется факторами, не связанными с высокой частотой конъюгативного переноса. К их числу может быть отнесено действие отбора в пользу рекомбинантов, которые приобрели Sym-плаз-миды. Действительно, при переносе этих плазмид между разными видами ризобий, а также в другие микроорганизмы (Agrobacterium, Escherichia, Pseudomonas, Sphingobacterium), часто возникают рекомбинанты, способные колонизировать растения-хозяева донорного штамма [3, 13]. Однако степень проявления признаков, кодируемых Sym-плазми-дами, может быть ограничена несовместимостью плазмид (при внутривидовых скрещиваниях) или отсутствием экспрессии перенесенных генов на чужеродном генетическом фоне (при межвидовых скрещиваниях) [3, 13, 19, 25].

Известно, что в природных экосистемах широко распространены асим-биотические (невирулентные) штаммы ризобий, которые иногда составляют более 90% от общей численности популяций [23]. У Rhizobium и Sinorhizobium их накопление происходит за счет утраты pSym и приводит к формированию экотипически полиморфных популяций, в которых стабильно сосуществуют симбиотически активные и неактивные штаммы. Ранее [4] было высказано предположение о том, что авирулентные штаммы ризобий

играют роль основных «посредников» в природной миграции pSym, поскольку: 1) проявление переносимых генов не ограничено несовместимостью плазмид донора и реципиента; 2) перенос Sym-плазмид сопровождается приобретением способности инфицировать растения, которое определяет расширение адаптивного потенциала рекомбинантов. Справедливость этого предположения может быть оценена путем анализа наследования признаков, кодируемых Sym-плазмидами, при их переносе в генетически родственные симбиотические и асимбио-тические штаммы. Для решения этой задачи мы использовали Sym-плазмиды ризобий клевера (R. leguminosarum bv. trifolii), которые переносили в пределах этого же вида бактерий, а также в ризобии люцерны и в агробактерии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы 343 и 345а клубеньковых бактерий клевера (Rhizobium leguminosarum bv. trifolii) получены из Всероссийской коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии. Мы маркировали их мутациями устойчивости к рифампицину (Rif), высевая на среду 79 [9] с этим антибиотиком (частота возникновения мутантов 10'8-10'9 на клетку). Авирулен-тный мутант СХМ1-46 клубеньковых бактерий люцерны (Sinorhizobium meliloti) получен после обработки УФ-лучами высокоактивного устойчивого к стрептомицину штамма СХМ1 [6]. От этого же штамма получены УФ-мутанты СХМ1 -105 и СХМ1-214, обладающие повышенной симбиотической эффективностью (Eff*4). GM 19023 Agrobacterium tumefaciens — невирулентный, лишенный Ti-плазмиды мутант, который благодаря близкому родству с Rhizobium и Sinorhizobium, широко используется как реципиент Sym-плазмид при изучении их переноса и экспрессии кодируемых симбиотических признаков [10, 22].

Маркирование плазмид транспозоном Tn5-mob и их последующую мобилизацию проводили с помощью не-реплицирующегося в ризобиях вектора pSUP5011 ; штамм-донор транспозона S17-1 Escherichia coli получен из отдела генетики Билефельдского университета, ФРГ [24].

Для культивирования ризобий и проведения конъюгации использовали твердую агаризованную ( 15 г/л агар-агара) среду 79 с добавлением 10 мл/л аминопептида (не поддерживает рост Е. coli). Антибиотики, необходимые для отбора мутантов и рекомбинантов, добавляли в следующих концентрациях (мг/л среды): стрептомицин — 800, канамицин — 200, рифампицин — 40, тетрациклин — 10.

Симбиотические свойства бактерий оценивали в условиях стерильных микровегетационных [6] и вегетационных [5] опытов (повторность 8-10-кратная). Нит-рогеназную активность определяли ацетиленовым методом, эффективность симбиоза — по сухой массе надземной части растений. Семена клевера лугового (Trifolium pratense, с. Сиворецкий), клевера сходного (T. ambiguum, дикорастущий образец N 38440) и люцерны изменчивой (Medicago varia, с. Зайкевича) получены из отдела кормовых культур ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова. Для статистической обработки использовали метод однофакторного дисперсионного анализа, а также t-критерий Стьюдента [1].

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Идентификация Sym-плазмид Rhizobium leguminosarum bv. trifolii

Для маркировки и последующей мобилизации Sym-плазмид штаммов 343 и 345а ризобий клевера (R. leguminosarum bv. trifolii) в них вводили транспозон Тп5-mob из штамма S17-1 Е. coli (частота возникновения устойчивых к канамицину (Ктг) транспозантов — 10‘6), после чего в независимо полученные транспозанты вводили плазмиду-помощник pRP4-4. Для идентификации Sym-плазмид использовали предложенную ранее [7] методику, основанную на их переносе в невирулентный мутант СХМ 1-46 ризобий люцерны (S. meliloti). Способность этого мутанта формировать азотфиксирую-щие клубеньки на люцерне восстанавливается при переносе в него Sym-плазмид из R. leguminosarum [8], что может быть связано с нарушением у СХМ 1-46 «общих» генов вирулентности, гомологичных у всех ризобий.

Таблица 1

Перенос Sym-плазмид ризобий клевера в авирулентный мутант СХМ1-46 ризобий люцерны и в агробактерии

Штамм-донор Количество транспозантов донора, которые Частоты переноса Sym-плазмид из Rhizobium leguminosarum bv. trifolii

скрещивали с СХМ1-46 передавали в СХМ1-46 (в присутствии pRP4-4) В СХМ1-46 Sinorhizobium meliloti В GM19023 Agrobacterium tumefaciens

маркер Ктг способность формировать клубеньки на люцерне

343 76 10 4 0.8-2.2410-7 2.6-8.0410-7 320

345а 20 4 2 1.0410-9-1.0410-8 1.1-1.3410-8 270

Примечание: * — В отсутствие рЯР4-4 перенос маркера Ктг из транспозантов ризобий клевера в мутант СХМ1-46 не наблюдали (часто та менее 10-11).

штамм ОМ 19023 А. Штпе/аЫет не приводил к появлению у него симбиотической активности.

Электрофоретический анализ симбиотически активных рекомбинантов штамма СХМ1-46 показал, что все они содержат (в дополнение к имеющимся у 5. теШоН мегаплазмидам) меньшую из 3 выявленных у штамма 343 плазмид (эта плазмида, имеющая размер 320 т.п.н., обозначена р8уш343), тогда как невирулентные рекомбинанты содержат дополнительные плазмиды, соответствующие большим по размеру плазмидам штамма 343. Аналогичным образом была выявлена Буш-плазмида штамма 345а, размер которой составил 270 т.п.н. {рис. 1).

2. Симбиотическая активность рекомбинантов, полученных при переносе Бут-плазмид

Все транспозанты штаммов 343 и 345а, содержащие инсерции Тп5-шоЬ в Буш-плазмидах, сохранили способность к эффективному симбиозу с клевером, что позволило использовать маркированные плазмиды для анализа экспрессии кодируемых симбиотических признаков в различных реципиентах. Выяснилось, что рекомбинанты авирулентного мутанта СХМ1-46, у которых способность к симбиозу с люцерной восстановилась благодаря приобретению рБуш343 или рБут345а, уступали по эффективности симбиоза с люцерной штамму СХМ1 — родителю СХМ1-46 (табл. 2). Мы предположили, что это связано с нарушением у реципиента экспрессии генов, контролирующих азотфиксацию. В пользу данного предположения говорит снижение симбиотической эффективности у рекомбинантов, полученных при введении р8уш343 в штаммы СХМ1-105 и СХМ1-214 (см. табл. 2).

У большинства рекомбинантов, полученных при переносе рБут343 или р8ут345а в симбиотически активные штаммы ризобий клевера, нитрогеназная активность и эффективность снижена (табл. 3), что может быть связано с функциональной несовместимостью плазмид родительских'штаммов. В то же время рекомбинанты, возникшие

Таблица 2

Симбиотическая активность рекомбинантов, полученных при переносе плазмиды р8ут343

в клубеньковые бактерии люцерны

Опыты* Реципиент плазмиды р8уш343 Сухая масса растений люцерны, инокулированных**

СХМ1 Рекомбинантами Реципиентом Контроль без инокуляции НСР0.05

1 (мв)*** СХМ1-46 10.9 7.1 5.8 5.5 0.51

2 (мв) СХМ1-105 16.4 13.0 17.8 10.2 2.03

СХМ1-214 14.1 18.6

3 (в) СХМ1-105 12.1 9.9 10.9 10.4 1.35

СХМ1-214 10.2 12.2

Примечания: * — мв — микровегетационные опыты (изучали по 10 рекомбинантов, полученных от каждого реципиента), в — вегетационный опыт (по 4 рекомбинанта от каждого реципиента);

** — мг на пробирку для микровегетационных опытов, г на сосуд для вегетационного опыта;

*** — ацетилен-редуктазная активность в опыте 1 составила (в мкМ С2Н4 на пробирку в сутки): 1,81 для рекомбинантов СХМ1-46::р8ут343; 2.48 для СХМ1; НСРою=0,664.

Рис. 1. Выявление 8ут-плазмид ризобий клевера (штаммы 343 и 345а) при их утрате или переносе в невирулентный мутант СХМ1-46 ризобий люцерны

1 — СХМ1-46::р8ут343

Мы выявили 10 транспозантов штамма 343, которые в присутствии рЯР4-4 передавали (с частотой не менее 10-7) маркер Кшг в мутант СХМ1-46. Для 4 транспозантов эта передача сопровождалась восстановлением у мутанта СХМ1-46 способности формировать азот-фиксирующие клубеньки на люцерне (см. табл. 1). Предположение о том, что у этих 4 транспозантов Тп5-шоЬ встроился в Буш-плазмиду, было подтверждено тем, что перенос маркера Кшг в штамм ОМ 19023 А. Ште/аыет (частота 10-4—10~6) сопровождался приобретением способности формировать клубеньки на клевере. Передача маркера Ктг из остальных 6 транспозантов штамма 343 в мутант СХМ1-46 не восстанавливала его способность к симбиозу с люцерной, что говорит о встройке Тп5-шоЬ в «несимбиотические» плазмиды. Действительно, перенос этих плазмид в

Таблица 3

Свойства рекомбинантов, полученных при введении плазмид р8уга343 и р8уш345а в симбиотически активные

штаммы ризобий клевера

Реципиент Введенная плазмида Изучено рекомбинантов Сравнение рекомбинантов с реципиентом

По нитрогеназной активности По симбиотической эффективности

=Р <Р =р <р

345а pSym343 16 10 6 8 8

343 pSym345a 4 0 4 0 4

Таблица 4

Наследование специфичности Д. /е#ипипонагит Ьч. ¡п/оШ по отношению к клеверу сходному

при переносе вут-плазмид

Штаммы Проанализировано растений T. ambiguum % растений, на которых образовались клубеньки

343* 42 26,2+6,79

345а* 46 63,0+7,12

345a::pSym343** 150 35,3+3,90

343::pSym345a** 189 54,5+3,62

Примечания:* — Исходные штаммы не различались по специфичности в отношении Т. pratense

при переносе pSym345a в асимбиотический, лишенный собственной Бут-плазмиды мутант штамма 343 (получен путем температурной обработки [7]), не отличались по симбиотической активности симбиоза от штамма 343. Рекомбинанты, полученные в реципрокных скрещиваниях (перенос pSym343 в невирулентный мутант 345aDpSym345a, см. рис. 1), обладали повышенной эффективностью: в микровегетационном опыте масса растений клевера лугового, инокулированных рекомбинантами, составила 20,6-22,4 мг/пробирку, тогда как масса растений, инокулированных 345а— 16,7 мг/пробирку (НСР005 = 2,23 мг).

3. Наследование хозяйской специфичности при переносе Sym-плазмид

Для анализа роли pSym343 и pSym345a в определении хозяйской специфичности R. leguminosarum bv. trifolii мы изучили симбиотические свойства рекомбинантов, полученных при переносе этих плазмид, на двух видах клевера: луговом (Trifolium pratensè) и сходном (T. ambiguum). Выбор данных растений обусловлен тем, что Т. ambiguum отличается от T. pratense гораздо большей избирательностью по отношению к ризобиям, образуя клубеньки лишь с ограниченным спектром штаммов [15, 16].

Рекомбинанты, полученные при переносе pSym343 или pSym345a в S. meliloti, не проявили способности к симбиозу с клевером. Рекомбинанты, полученные при переносе этих плазмид в A. tumefaciens, формировали на Т. pratense мелкие не фиксирующие азот клубеньки, но не формировали клубеньки на Т. ambiguum.

Штаммы 343 и 345а R. leguminosarum bv. trifolii различались по способности к симбиозу к Т. ambiguum:

доля растений, образующих клубеньки со штаммом 345а, в 2,4 раза выше, чем с 343 (табл. 4). Для изучения роли Sym-плазмид в контроле этого различия мы вводили pSym345a или pSym343 в невирулентные, лишенные собственных Sym-плазмид мутанты штаммов 343 и 345а, полученные путем температурной обработки. Анализ полученных рекомбинантов показал, что их специфичность к T. ambiguum наследуется совместно с переносимыми плазмидами (табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

Общая цель нашей работы состояла в оценке роли асимбиотических штаммов ризобий, составляющих значительную часть их популяций, в переносе Sym-плазмид, который играет важную роль в эволюции этих бактерий. Для этого мы изучили: а) возможность переноса Sym-плазмид из штаммов 343 и 345а клубеньковых бактерий клевера (Rhizobium leguminosarum bv. trifolii) в симбиотически активные и асимбиотические штаммы этого вида бактерий, а также в ризобии люцерны (Sinorhizobium meliloti) и в агробактерии; б) наследование кодируемых симбиотических свойств (способности формировать клубеньки, азотфиксирующей активности, хозяйской специфичности), которые определяют селективную ценность возникающих рекомбинантов.

Оказалось, что перенос в S. meliloti плазмид pSym343 или pSym345a, маркированных Tn5-mob, происходил только в присутствии плазмиды-помощника pRP4-4 с частотами не более 10‘6 на клетку реципиента (см. табл. 1). В то же время ранее мы [7] показали возможность переноса этих плазмид из ризобий клевера в авирулентный мутант

СХМ1 -46 без использования системы Tn5mob+pRP4-4: при инокуляции люцерны смесью изучаемых штаммов наблюдали образование азотфиксирующих клубеньков, из которых выделялись рекомбинанты штамма СХМ 1-46, содержащие Sym-плазмиды R. leguminosarum bv. trifolii. Эти данные показывают, что в присутствии растений либо создаются условия для отбора редко возникающих рекомбинантов (которые, в отличие от донора и реципиента, способны формировать клубеньки на люцерне), либо повышается частота переноса плазмид. Активация переноса Sym-плазмид ризобий в ризосфере и клубеньках бобовых показана рядом авторов [8,11,21 ]. У агробактерий, составляющих единую таксономическую группу с Rhizobium и Sinorhizobium, перенос Ti-плазмид происходит при активации tra/trb-генов опинами, которые синтезируются в растительных опухолях [12].

Мы показали, что у большинства рекомбинантов, возникших при переносе плазмид pSym343 или pSym345a в штаммы R. leguminosarum bv. trifolii «дикого типа», наблюдается нарушение симбиотической активности (см. табл. 3). Ранее подобные нарушения (функциональная несовместимость Sym-плазмид) были выявлены при гибридизации ризобий клевера и родственных им ризобий гороха [25]. В то же время при переносе pSym343 и pSym345a в невирулентные лишенные собственных Sym-плазмид штаммы R. leguminosarum bv. trifolii их симбиотическая активность полностью восстанавливалась или даже повышалась. Аналогичные результаты получены и при переносе Sym-плазмид из ризобий клевера в симбиотически активные и асимбио-тические штаммы ризобий люцерны (см. табл. 2).

Изученные нами плазмиды играют важную роль в контроле хозяйской специфичности ризобий: при рецип-рокном обмене штаммов 343 и 345а Sym-плазмидами наблюдали наследование различий по способности к симбиозу с T. ambiguum — видом клевера, обладающим высокой избирательностью по отношению к штаммам R. leguminosarum bv. trifolii (табл. 4). Однако проявление хозяйской специфичности зависит от реципиента: при переносе pSym в ризобии люцерны способность к симбиозу с клевером не проявляется, а при их переносе в агробактерии проявляется лишь частично (образование не фиксирующих азот клубеньков).

Полученные данные показывают, что перенос Sym-плазмид в симбиотически активные и асимбиотические штаммы ризобий вызывает разнонаправленные изменения их экологической приспособленности. У асимбиоти-ческих штаммов наблюдается повышение приспособленности (связанное с восстановлением способности к симбиозу, а при внутривидовых скрещиваниях — также и с наследованием хозяйской специфичности), а у симбиотически активных штаммов — ее уменьшение (снижение азотфиксирующей активности). Поскольку в популяциях ризобий асимбиотические штаммы весьма мно-

гочисленны [2,23], логично предположить, что они играют важную роль в природной миграции pSym, так как возникающие рекомбинанты (в отличие от рекомбинантов, получаемые при переносе pSym в симбиотически активные штаммы) могут быть поддержаны отбором. Действительно, штаммы ризобий, способные формировать клубеньки, поддерживаются в популяциях путем индивидуального или частот-зависимого отбора (клональное размножение in planta), а штаммы, способные к симбиотической азотфиксации — благодаря отбору родичей (связанному с активным снабжением азотфиксирующих клубеньков продуктами фотосинтеза) [2, 17,20].

Результаты нашей работы согласуются с предложенной ранее [4] схемой формирования типичных (экотипически полиморфных, панмиктичных) популяций ризобий, которая включает: 1) накопление асимбиотических мутантов, утративших pSym; 2) перенос в эти мутанты pSym из симбиотически активных штаммов; 3) размножение возникающих рекомбинантов in planta. Сходная стратегия микроэволюции (gain/loss), основанная на постоянно происходящих утратах и переносах плазмид (островков) патогенности, характерна для многих бактериальных патогенов животных и человека [14]. Очевидно, что мутанты, утратившие способность к взаимодействию с хозяевами, играют роль основных «посредников» при переносе генов симбиоза, который обеспечивает высокую скорость эволюции симбиотических бактерий.

Авторы признательны К.В. Квитко за обсуждение рукописи.

Работа поддержана грантами Президента России (НШ-1103.2003.4) Американского фонда гражданских исследований и развития, CRDF (ST-012-0), а также РФФИ (03-04-49555).

Литература

1. Лакин Г.Ф. Биометрия (4-е издание). — М., Высш. школа, 1990.— 352 с.

2. Проворов Н.А. Популяционная генетика клубеньковых бактерий // Журн. общ. биологии. — 2000. — Т. 61. — N 3. — С. 229-257.

3. Проворов Н.А., Аронштам А.А. Генетика симбиотической азотфиксации у клубеньковых бактерий // Итоги науки и техники, сер. микробиол. (ВИНИТИ). — 1991. — Т. 23. — С. 3-97.

4. Проворов Н.А., Воробьев Н. И. Эволюционная генетика клубеньковых бактерий: молекулярные и популяционные аспекты // Генетика. — 2000. — Т. 36, № 12,—С. 1573-1587.

5. Проворов Н.А., Федоров С.Н., Симаров Б.В. Зависимость симбиотической активности клубеньковых бактерий люцерны (Rhizobium meliloti) от метеорологических факторов // Труды ВНИИСХМ. — 1989 — Т. 59, —С. 45-52.

6. Федоров С.Н., Фокина И.Г. Симаров Б.В. Оценка симбиотических свойств клубеньковых бактерий люцерны (Rhizobium meliloti) в лабораторных условиях//С.-х. биология. — 1986. — № 1. — С. 112-118.

7. Фокина И.Г., Румянцева М.Л., Проворов Н.А. Выявление плазмид, контролирующих симбиотическую активность клубеньковых бактерий клевера//Бюлл. ВНИИСХМ. — 1988. —N 51. — С. 11-16.

8. Чернова Т.А., Аронштам А.А., Симаров Б.В. Изучение генетической природы невирулентных мутантов СХМ1-125 и СХМ1-126 Rhizobium meliloti II Генетика. — 1986. — T. 22, № 8. — С. 2066-2073.

9. Allen O.N. Experiments in soil bacteriology. Third edition. Menneapolis, Burgess Publishing Co., 1959. — P. 52-59.

10. Brom S., Girard L., Garcia-de los Santos A. et al. Conservation of plasmid-encoded traits among bean-nodulating Rhizobium species // Appl. Environ. Microbiol. — 2002. — Vol. 68, N 5. — P. 2555-2561.

11. Broughton W.J., Samrey U., Stanley J. Ecological genetics of Rhizobium meliloti: symbiotic plasmid transfer in the Medicago sativa rhizosphere // FEMS Microbiol. Lett. — 1987. — Vol. 40. — P. 251-255.

12. FarrandS.K. Conjugal plasmids and their transfer // The Rhizobiaceae / Eds. Spaink H.P., Kondorosi A., Hooykaas P.J.J. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1998. — P. 199-233.

13. Garcia-de los Santos A., Brom S., Romero D. Rhizobium plasmids in bacteria-legume interactions // World J. Microb. Biotech. —1996. — Vol. 12.—P. 119-125.

14. Groisman E.A., Ochman H. Pathogenicity islands: bacterial evolution in quantum leaps // Cell. — 1996. — Vol. 87. — P. 791-794.

15. HelyF.W. Symbiotic variation in Trifolium ambiguum M. Bieb. with special reference to the nature of resistance // Austral. J. Biol. Sci. — 1957, — Vol. 10, N 1, — P. 1-16.

16. HelyF.W. Relationship between effective nodulation and time to initial nodulation in a diploid line of Trifolium ambiguum M. Bieb. // Austral. J. Biol. Sci. — 1963. — Vol. 16, N 1, —P. 43-54.

17. Jimenez J., Casadesus J. An altruistic model of Rhizobium-legume association // J. Heredity. — 1989. -— Vol. 80. — P. 335-337.

18. Laguerre G., Mazurier S.I., Amarger N. Plasmid profiles and restriction length polymorpism of Rhizobium leguminosarum bv. viceae in field populations//FEMS Microbial. Ecol. —1992. — Vol. 101. — P. 17-26.

19. Mercado-Bianco J., Toro N. Plasmids in rhizobia: the role of non-symbiotic plasmids // Molec. Plant-Microbe Interact. — 1996. — Vol. 9, N7, —P. 535-545.

20. Olivieri /., Frank S.A. The evolution of nodulation in Rhizobium: altruism in the rhizosphere // J. Heredity. — 1994. — Vol. 85. — P. 46-47.

21. Pretorius-Guth I.M., Puhler A., Simon R. Conjugal transfer of megaplasmid 2 between Rhizobium meliloti strains in alfalfa nodules // Appl. Environ. Microbiol. 1990. — Vol. 56. — P. 2354-2359.

22. Rosenberg C., Hughet T. The pAtC58 plasmid of Agrobacterium tumefaciens is not essential for tumor induction // Mol. Gen. Genet. — 1984. — Vol. 196, N 3. — P. 533-536.

23. SegoviaL., PineroD., PalaciosR., Martinez-RomeroE. Genetic structure of a soil population of non-symbiotic Rhizobium leguminosarum // Appl. Environ. Microbiol. — 1991. — Vol. 57. — P. 426-433.

24. Simon R., Priefer U., Puhler A. A broad host range mobilization system for in vitro genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria//Biotechnology. — 1983. — Vol. 1,N 11. — P. 784-791.

25. WangC.L., BeringerJ.E., HirschP.R. Host plant effects on inter-specific hybrids of Rhizobium leguminosarum biovars viceae and trifolii // J. Gen. Microbiol. — 1986. — Vol. 132, N 8. — P. 2063-2070.

Transfer of Sym-plasmids into symbiotically active and asymbiotic rhizobia strains: properties of recombinants and possible evolutionary consequences

N.A. Provorov, I.G Fokina., M.L. Roumiantseva, B. V. Simarov All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology, Saint-Petersburg, Pushkin

SUMMARY: Transfer of Sym-plasmids from the clover rhizobia to avirulent mutants of the same rhizobia species or of alfalfa rhizobia resulted in recombinants with a restored symbiotic activity. Transfer of these plasmids into the wild type isogenic strains lead to a decrease of their symbiotic activity. These data confirm the hypothesis on the crucial role of avirulent rhizobia strains in the transfer of Sym-plasmids which directs evolution of these bacteria.

ife KEY WORDS: nodule bacteria, leguminous plants, host specificity, Sym-plasmids, evolution of symbiosis, N2-fixing activity, agrobacteria, gene transfer.