СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ МЕМБРАН С СОХРАНЕНИЕМ ИХ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ
METHOD FOR PRODUCING ERYTHROCYTIC MEMBRANES WITH RESERVED LONG STORAGE MORPHOFUNCTIONAL STATUS

Изобретение относится к фундаментальной медицине и может быть использовано при проведении научных исследований, связанных с выделением мембран эритроцитов животных и человека и дальнейшей оценкой их структурных и функциональных свойств, а также активности мембраносвязанных ферментов.
Подавляющее большинство современных лекарственных препаратов действуют через структуры (ионные каналы, рецепторы), локализованные на клеточных мембранных. Фармакологическая доступность этих структур и само их наличие во многом зависит от морфофункционального состояния мембраны. Одним из важных показателей состояния клеточной мембраны является вязкость ее липидного бислоя. В настоящее время для оценки вязкостных характеристик мембран используют флюоресцентные зонды, а в качестве объекта исследования мембраны эритроцитов, получаемые из образцов цельной крови.
Известен способ получения эритроцитарных мембран для исследовательских целей заключается в том, что используют свежую гепаринизированную кровь с последующим гемолизом эритроцитарной массы в 0,4 М трисНС1 с осаждением мембран центрифугированием при 15 000 об/мин [Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan. D.J. The Preparation and Chemical Characteristics of Hemoglobin-Free Ghosts of Human Erythrocytes Arch. Biochem. Biophys., 1962, vol.201, P.119-130.].
Данный способ является наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.
Недостатком данного способа является то, что забор крови должен проводиться в непосредственной близости от лаборатории и предполагает непрерывное проведение всех этапов выделения эритроцитарных мембран. Способ не позволяет получать эритроцитарные мембраны для оценки их физико-химических свойств из проб крови пациентов в ходе экспедиционной работы. В связи с этим разработка способа получения эритроцитарных мембран с сохранением их морфофункционального состояния после длительного хранении и пригодных для последующего лабораторного исследования является весьма актуальным.
Задача изобретения - разработать способ получения эритроцитарных мембран человека и животных, позволяющий сохранить у них физико-химические характеристики липидного бислоя, содержание белка и показатели активности ферментов при длительном хранении.
Поставленная задача решается тем, что для получения эритроцитарных мембран используют гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М растворе трисНСl, с осаждением мембран центрифугированием при 15 000 об/мин, отличающийся тем, что для гемолиза используют эритроцитарную массу, которую предварительно инкубируют в равном объеме буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО (диметилсульфоксид), в течение 30 минут при температуре (+4)-(+8)°С, а затем замораживают и хранят при температуре (-20)-(-40)°С. Собственно выделение мембран может быть отложено на срок, необходимый для формирования полного массива исследуемых образцов или доставки образцов в специализированную лабораторию.
Действие способа связано с защитой мембран эритроцитов от хаотичной деструкции в результате заморозки.
Новым в предлагаемом изобретении является обработка эритроцитарной массы равным объемом буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО, в течение 30 минут при температуре (+4)-(+8)°С с последующим замораживанием и хранением, до этапа лабораторного исследования, при температуре (-20)-(-40)°С.
Проведенные нами исследования дали возможность подобрать необходимые условия обработки эритроцитарной массы и режим ее криохранения, обеспечивающие сохранность физико-химических характеристик липидного бислоя эритроцитарных мембран.
Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не являющиеся очевидными для специалиста.
Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научно-медицинской литературы.
Данное изобретение может быть использовано при проведении научных исследований, связанных с выделением мембран эритроцитов животных и человека и дальнейшей оценкой их структурных и функциональных свойств, а также активности мембраносвязанных ферментов.
Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемый способ соответствующим условиям патентоспособности: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Изобретение будет понятно из следующего описания.
Образец свежей гепаринизированной крови центрифугируется 15 мин при 3000 об/мин. Образовавшийся слой плазмы удаляется. К оставшейся в пробирке эритроцитарной массе добавляется равный ей объем буфера Кребса-Хензелайта рН 7,5, содержащего 20% ДМСО. Содержимое пробирки перемешивается путем мягкого покачивания и оставляется на 30 минут при температуре (+4)-(+8)°С. Подготовленные образцы переносятся в холодильник с температурой (-20)-(-40)°С, где они хранятся до момента исследования. Образцы размораживаются при комнатной температуре, после чего проводится гемолиз эритроцитарной массы в 0,4 М трисHCl с осаждением мембран центрифугированием при 15000 об/мин. Выделенные мембраны используются в исследованиях в соответствии с стандартными указаниями.
Пример. У экспериментального животного производили забор крови в пробирку, содержащую гепарин, стандартным методом. Кровь перемешивали со стабилизатором и центрифугировали с целью отделения форменных элементов от плазмы в течение 15 мин при 3000 об/мин. Аккуратно при помощи пипетки удаляли плазму. К эритроцитарному осадку добавляли равный объем буфера Кребса-Хензелайта (рН 7,5), содержащего 20% ДМСО, мягко перемешивали содержимое пробирки и оставляли пробу при температуре (+4)-(+8)0С на 30 мин. Затем пробирку с образцом стабилизированных эритроцитов переносили для хранения в морозильную камеру с температурой (-25)°С. Перед процедурой выделения мембран пробу размораживали при комнатной температуре и центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин с последующим удалением надосадочной жидкости. Затем приступали к получению эритроцитарных мембран стандартным методом. Полученный эритроцитарный осадок трижды отмывали 0,145 М NaCl в 10 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4). В процессе отмывки эритроциты осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. К отмытым эритроцитам добавляли двадцатикратный объем гипотонической гемолизирующей среды и пробирку с образцом помещали на 30 минут в ледяную баню. Эритроцитарные мембраны осаждали центрифугированием пробы при 15 000 об/мин в течениеи 20 минут. Полученный осадок эритроцитарных мембран трижды промывали 18 мл промывочной среды и осаждали в центрифуге при 15 000 об/мин в течение 20 минут. Выделенные мембраны для дальнейших исследований разводили в 10 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4).
Эффективность предлагаемого способа получения эритроцитарных мембран человека и животных проверена в 20 сравнительных исследованиях (табл.1).
Таблица 1.
Показатели общего белка и активность K<sup>+</sup>/Na<sup>+</sup>АТФазы мембран эритроцитов
Группа
Общий белок мг/пробу
Активность K<sup>+</sup>/Na<sup>+</sup>АТФазы мкмоль Pi/час × мг белка
Нативные пробы
8,3±0,7
0,021±0,003
Пробы после криохранения
7,9±0,8
0,026±0,014
+
+
Из таблицы видно, что проведенная авторами обработка и последующее криохранение эритроцитарной массы, а также размораживание и выделение эритроцитарных мембран не повлияли на показатель общего белка по сравнению с аналогичными образцами, полученными из незамороженной крови. Также не были выявлены достоверные различия в активности K/Na-АТФ-азы, определенной в эритроцитарных мембранах, полученных из нативных эритроцитов и эритроцитов, обработанных нашим способом.
Предлагаемое изобретение позволяет сохранить эритроцитарные мембраны человека или животных при длительном хранении с неизменными физико-химическими характеристиками липидного бислоя, содержания белка и активности ферментов.