СПОСОБ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ПЕРЕВИВНОЙ ПОВЕРХНОСТНОЙ СОЛИДНОЙ СОЕДИНИТЕЛЬНОТКАННОЙ САРКОМЫ М-1 КРЫС
METHOD FOR PHOTODYNAMIC THERAPY OF RAT SURFACE SOLID CONNECTIVE TISSUE SARCOMA M-1

Изобретение относится к экспериментальной медицине, конкретно к онкологии, в частности к фотодинамической терапии (ФДТ) перевивной поверхностной солидной соединительнотканной опухоли саркома М-1 крыс.
2
2
Для этого впервые в экспериментальных исследованиях провели ФДТ с новым отечественным фотосенсибилизатором Гелиохлорин. Гелиохлорин содержит трисмеглуминовую соль хлорина е6, а в качестве криостабилизатора - меглумин в соотношении 1:0,1-0,2 вес. ч., обладает свойством накапливаться в опухоли и при локальном воздействии лазерного излучения с длиной волны в диапазоне 660–670 нм обеспечивает фотосенсибилизирующий эффект. Фотосенсибилизатор вводили внутривенно крысам в дозе 2,5 мг/кг. Соблюдая оптимальное время между введением препарата и облучением, так называемый лекарственно-световой интервал (ЛСВИ) от 15 до 90 минут, а конкретно через 30 минут после введения, и применяя параметры лазерного излучения (плотность мощности лазерного излучения 0,48 Вт/см и плотность энергии (Е) – 150 Дж/см), используя полупроводниковый аппарат «Аткус-2» (ЗАО «Полупроводниковые приборы», Санкт-Петербург) с длиной волны излучения 662 нм, получили полную регрессию опухолей до 21 сутки.
При проведении ФДТ пациенту вводится фотосенсибилизатор (ФС), избирательно накапливающийся в злокачественных новообразованиях. Затем опухоль подвергается облучению лазерным светом определенной длины волны, в соответствии со спектром возбуждения ФС. В результате облучения происходит фотохимическая реакция, где ФС фактически играет роль катализатора, и происходит образование активных форм кислорода (основным из которых является синглетный кислород) и различных радикалов, которые являются цитотоксическими агентами и вызывают разрушение клеток опухоли. Второй механизм ФДТ - деструкция эндотелия кровеносных сосудов в зоне лазерного облучения, в результате которой имеет место тромбоз сосудов и нарушение питания в опухоли.
Эффективность фотодинамического воздействия зависит от трех составляющих: ФС, света и кислорода. Избирательность разрушения опухоли связана с избирательностью накопления ФС в опухоли по отношению к здоровой ткани и с воздействием света определенной длины волны. Не пораженные опухолью ткани в меньшей степени поглощают ФС, но в результате лазерного облучения имеет место нежелательная частичная деструкция здоровых тканей.
Известен способ квантовой ФДТ (RU 2448745). Способ включает введение препарата Фотодитазин в дозе 5 мг на 20 мл физиологического раствора. Через 1-1,5 часа после введения проводят лазерное облучение новообразования с использованием излучателя с выходной мощностью оптического элемента 100 мВт, световой энергией 60-80 Дж/см2 и длиной волны 402 нм, что соответствует максимальному пику поглощения введенного внутрипузырно Фотодитазина и образованию свободных радикалов или атомарного кислорода, которые необратимо повреждают клеточные структуры опухоли.
Используемый ФС Фотодитазин не образуется в организме животных и при его введении накапливается в основном в патологически измененной ткани. В то же время его тропность все же недостаточно высока и при реально возможном времени воздействия излучением на опухоль не достигается полной регрессии опухолевых узлов.
2
Известен также cпособ ФДТ злокачественных новообразований (заявка на изобретение N 96107054/14, МПК A 61 N 5/00, публ. Бюл. 1998 г. N 21), включающий, так же как и заявляемое изобретение, введение в организм пациента фотосенсибилизатора и лазерное облучение зоны опухолевого роста световой дозой 300-500 Дж/см.
Предлагаемый способ направлен на повышение концентрации фотосенсибилизатора в опухоли, однако сами параметры лазерного облучения остаются высокими, что приводит к развитию местных осложнений во время и после ФДТ.
2
Известен также способ ФДТ злокачественных опухолей (RU 2146159), включающий системное введение ФС и лазерное дистанционное облучение зоны опухолевого роста световой дозой 300-500 Дж/см.
Однако лазерное облучение с используемыми параметрами приводит к развитию геморрагического некроза в здоровых тканях во время и после ФДТ.
(
2
2
Самым близким прототипом является способ фотодинамической терапии злокачественных опухолейRU 2704202 С1) и предназначен для терапии злокачественного новообразования  Саркомы М-1 крыс. Для этого животным вводят фотосенсибилизатор «Фоторан Е6 в дозе 5,0 мг/кг и через 2,5 часа проводят облучение лазером с длиной волны 660-670 нм с плотностью энергии 300 Дж/см, плотностью мощности 250 мВт/см. Время облучения составляет 20 минут. Это позволяет добиться полной эрадикации опухолевых узлов вплоть до 90-х суток после сеанса ФДТ.
Однако, данный способ предполагает введение большой дозы фотосенсибилизатора и применение лазерного воздействия в течение длительного времени и с высокой плотностью энергии.
С целью снижения количества применяемого фотосенсибилизатора и снижения дозы лазерного воздействия для получения щадящего органосохраняющего способа лечения, а также снижения времени воздействия была разработана схема терапии, приводящая к максимальному противоопухолевому эффекту (100% излечение животных на 90 сутки после терапии) с улучшенными параметрами.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа достижения полной эрадикации новообразования.
(
)
,
Технический результат достигается тем, что также как и в известном способеRU 2704202 однократновводят  фотосенсибилизатор и  воздействуют на опухоль лазерным излучением с длиной волны 662 нм.
2
Особенностью заявляемого способа является то, что внутривенно животным вводят фотосенсибилизатор Гелиохлорин в дозе 2,5 мг/кг, и через лекарственно-световой интервал равный 30 минутам применяют воздействие света с плотностью мощности Ps = 0,48 Вт/см.
Изобретение поясняется подробным описанием, таблицами и иллюстрацией, на которых изображено:
Фиг. 1 – Динамика накопления гелиохлорина в опухоли и окружающей ткани бедра крыс после внутривенного введения в дозе 2,5 мг/кг; по оси абсцисс – срок после внутривенного введения ФС; по оси ординат: слева интенсивность флуоресценции, справа – индекс контрастности.
Способ осуществляют следующим образом.
В эксперименте in vivo нами использовались белые аутбредные лабораторные крысы, в качестве экспериментальной модели опухоли использовали саркому М-1. Работа выполнена с соблюдением международных рекомендаций по проведению исследований с использованием лабораторных животных, изложенных в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1987).
3
Работа выполнена на 48 половозрелых самках крыс массой тела 165–190 г с имплантированной подкожно с внешней стороны бедра саркомой М-1 (кусочками опухоли донора, размером 1*1*2 мм). При достижении наибольшего диаметра опухолевых узлов 0,8-1,0 см животных методом рандомизации распределяли на опытную и контрольную группы.
in vivo
Для установления времени лазерного облучения после введения ФС определяли лекарственно световой интервал (ЛСВИ). Фотодинамическая активность фотосенсибилизаторов и сохранность окружающих тканей реализуются за счет селективного накопления фотосенсибилизаторов в опухолевой ткани. Поэтому их регистрация с целью определения концентрации и динамики содержания в тканях  необходима для определения оптимального времени от момента введения ФС до лазерного воздействия – ЛСВИ. Накопление ФС в опухоли и здоровой ткани бедра изучали методом лазерной спектрометрии с помощью установки ЛЭСА-01-Биоспек, Россия. Уровень концентрации ФС оценивали по интенсивности флуоресценции в усл. ед., селективность определяли по индексу контрастности (опухоль/окружающая ткань). ФС вводили крысам внутривенно в дозе 2,5 мг/кг. Первое измерение проводили до введения препарата (0 часа), а затем 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 мин.
Проведение ФДТ.
Контролемслужили крысы-опухоленосители без какого-либо воздействия (Таблица 1).
Таблица 1
Схема эксперимента
Опухоль
Тест-система
Препарат
Доза ФСмг/кг
МетодВведения
Параметры облучения
ЕДж/см<sup>2</sup>
PsВт/см<sup>2</sup>
СаркомаМ-1
крысы
Гелиохлорин
2,5
Внутривенно
150
0,48
<b>Контроль</b>
крысы
–
Источником лазерного излучения при проведении ФДТ служил полупроводниковый лазерный аппарат «Аткус–2» производства ЗАО «Полупроводниковые приборы» (Санкт-Петербург) с длиной волны излучения 662 ± 1 нм. Диаметр светового пятна составлял 1,5 см. Животныепри облучении находились под общим тиопенталовым наркозом (внутрибрюшинно 2,5 % раствор в объеме 0,2 мл/100 г массы животного). ФДТ проводили локально однократно, ФС вводили внутривенно.
0
Объём опухоли измеряли: до проведения лечения (V), и на 3, 7, 10, 14, и 21 сутки после терапии. Конечный срок исследования был выбран исходя из необходимости сравнения динамики роста опухоли у крыс с продолженным ростом после терапии с контрольными животными, так как на данный срок исследования уже начинается гибель контрольных животных.
В качестве критериев определения противоопухолевой эффективности использовали:
1. Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К). Для этого сначала вычисляли объёмы опухолей по формуле:
(1)
1,
2
3,
где: dd,d- три взаимно перпендикулярные диаметры опухоли,
3
V - объем опухоли в см.
Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К) рассчитываем по формуле:
(2)
0
где: V -объем опухоли до воздействия,
t
V – объем опухоли на определенный срок наблюдения;
2. Торможение роста опухоли (ТРО%) по формуле:
(3)
3. Процент животных в группе с полной регрессией (ПР) опухоли (К = -1,00). За полную регрессию опухоли принимали отсутствие видимой и пальпируемой опухоли.
4. Средняя продолжительность жизни животных (СПЖ, сут) животных и увеличение продолжительности жизни (УПЖ%) по сравнению с контролем. Значимым считается УПЖ  ≥ 50%.
(4)
5. Критерий излеченности животных - отсутствие рецидивирования опухоли в течение 90 суток после ФДТ
Статистическую обработку результатов для независимых групп выполняли с использованием программ Statistica 6.0. Описательная статистика представлена в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (M±m). Для оценки уровня значимости межгрупповых различий использовали U-критерий Манна–Уитни при p<0,05.
I. Изучение динамики накопления ФС в опухоли и окружающей ткани.
Изучение накопления различных фотоактивных веществ в клетках является важным аспектом скрининговых исследований, позволяющим оптимизировать условия фотодинамического воздействия (определения лекарственно-светового интервала (ЛСВИ) – время от момента введения ФС до облучения лазером, что позволяет проводить лечение на высоком уровне накопления ФС в опухоли при минимальной концентрации его в нормальной ткани -  при максимальном индексе контрастности.
Из данных, представленных на диаграмме (Фиг. 1) видно, что в течение 90 мин после внутривенного введения гелиохлорина в дозе 2,5 мг/кг происходит постепенное увеличение уровня накопления, как в опухоли, так и в окружающей ткани бедра.
Максимальный уровень накопления ФС в опухоли наблюдался в интервале 15 – 90 мин после введения ФС. Что касается индекса контрастности, то самый высокий (1,5) определяли через 15 мин.
Таким образом, оптимальное время проведения лазерного облучения после введения ФС наступает через 15-90 мин – т.е. в это время мы имеем высокое накопление ФС в опухолевой ткани и минимальное содержание его в здоровых тканях.
II. Изучение эффективности ФДТ с Гелиохлорином.
На 3 сутки после ФДТ на облученной коже над опухолями появлялись эрозии, покрытые тонкими струпами. На 7-10 сутки формировались плотные струпы с демаркационной линией между окружающей кожей и некротизированной тканью новообразований. В опытной группе у крыс до 21 суток после ФДТ отмечалась полная регрессия опухоли (табл. 2). Животные были оставлены для дальнейшего наблюдения для определения показателей продолжительности жизни (табл. 3) и отсутствия рецидивирования новообразований до 90 суток после ФДТ (табл.2).
По данным сравнительного анализа, после ФДТ, проведенной в оптимальные сроки после введения ФС и подбора параметров лазерного излучения в опытной группе зарегистрировано значимое увеличение продолжительности жизни крыс (табл.3).
Таблица 2
2
2
Показатели противоопухолевой эффективности ФДТ саркомы М-1 крыс с внутривенным введением Гелиохлорина в дозе 2,5 мг/кг и при параметрах: плотность энергии лазерного излучения (Е) – 150 Дж/см;. плотность мощности (Ps) – 0,48 Вт/см
№гр.
ДозаФС(мг/кг)
Срок наблюдений (сут)
3
7
10
14
21
90
1
2,5
1) 100
5) 100
Контроль
V
1,2±0,2
2,7±0,5
7,7±1,4
10,2 ± 2,1
17,1 ±4,2
К
3,0±0,4
9,1±1,4
20,1±2,8
42,1±7,4
83,8±24,9
3
Примечание: (1) объем опухоли (V, см); (2) коэффициент прироста опухоли у животных с продолженным ростом (К); (3) торможение роста опухоли (ТРО,%); (4) процент животных с полной регрессией опухоли (ПР); (5) – процент излеченных животных на 90 сутки
* р < 0,05 по сравнению с контролем
Таблица 3
Увеличение продолжительности жизни крыс после ФДТ с внутривенным введением Гелиохлорина
Параметры лазерного излучения: Е = 150 Дж/см<sup>2</sup>, Ps = 0,48 Вт/см<sup>2</sup>
Доза ФС (мг/кг)
СПЖ
УПЖ
2,5
>90*
>100*
Контроль
37,3 ± 2,2
-
Примечание: СПЖ – средняя продолжительность жизни, сутки; УПЖ – увеличение продолжительности жизни, %; * значимое увеличение продолжительности жизни по сравнению с контролем (УПЖ ≥ 50%).
in vivo
2
2
Таким образом, проведенное исследование установило высокую противоопухолевую эффективность изучаемого препарата на перевиваемую злокачественную опухоль саркома М-1 крыс до 90 суток после лечения с внутривенным введением Гелиохлорина в дозе 2,5 мг/кг (при экстраполяции на дозу человека составляет 0,42 мг/кг) и параметрах лазерного облучения Е–150 Дж/см,  Ps–0,48 Вт/см.
Способ позволил  увеличить  продолжительность жизни крыс после  ФДТ перевиваемой  злокачественной  опухоли саркома М-1 с отсутствием рецидивирования новообразований до 90 суток после ФДТ.