ДЕТЕКЦИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗНЫХ ТЕМПЕРАТУР ДЕТЕКЦИИ

1. Способ детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции, включающий:
(a) инкубирование образца с двумя средствами генерации сигнала для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде и детекцию генерируемого сигнала с использованием детектора одного типа; при этом каждую из нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом одна из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет относительно высокую температуру детекции, а другая имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции; при этом сигналы, генерируемые этими двумя средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции;
(b) определение присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней на основе сигналов, детектируемых на стадии (а); при этом (1) присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, определяют на основе сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, а (2) присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.
2. Способ по п. 1, где стадию (а) проводят в процессе амплификации сигнала одновременно с амплификацией нуклеиновой кислоты.
3. Способ по п. 1, где стадию (а) проводят в процессе амплификации сигнала без амплификации нуклеиновой кислоты.
4. Способ по п. 1, где средства генерации сигнала для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса.
5. Способ по п. 1, где средства генерации сигнала для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала с использованием образования дуплекса способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с данной нуклеотидной последовательностью-мишенью.
6. Способ по п. 1, где средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием образования дуплекса.
7. Способ по п. 1, где средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием образования дуплекса способом, зависящим от расщепления опосредующего олигонуклеотида, специфически гибридизованного с данной нуклеотидной последовательностью-мишенью.
8. Способ по п. 1, где два средства генерации сигнала содержат идентичную метку, и сигналы от этой метки не различаются детектором одного типа.
9. Способ по п. 1, где указанная разница представляет собой разницу, получаемую в результате математической обработки сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, и сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции.
10. Способ по п. 1, где, если сигнал не детектируется при относительно высокой температуре детекции, то определение присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, проводят на основе сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции, с учетом отсутствия детекции сигнала при относительно высокой температуре детекции.
11. Способ по п. 1, где, если присутствует нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая относительно высокую температуру детекции, то для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, используют референсное значение.
12. Способ по п. 11, где для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, в данном способе используют референсное значение, полученное посредством (1) инкубирования нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, со средством генерации сигнала для детекции нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, в другом реакционном сосуде, нежели реакционный сосуд на стадии (а), (2) детекции сигналов как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции и (3) затем получения разницы между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.
13. Способ по п. 1, где две нуклеотидные последовательности-мишени содержат нуклеотидную вариацию, и одна из этих двух нуклеотидных последовательностей-мишеней содержит нуклеотидную вариацию одного типа, а другая содержит нуклеотидную вариацию другого типа.
14. Способ SNP-генотипирования нуклеотидной последовательности в образце с использованием разных температур детекции, включающий:
(а) инкубирование образца, содержащего нуклеотидную последовательность, содержащую сайт SNP (однонуклеотидного полиморфизма), и средство генерации сигнала для детекции SNP-содержащих аллелей в одном реакционном сосуде, и детекцию генерируемого сигнала с использованием детектора одного типа; при этом каждый из SNP-содержащих аллелей детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; где один из SNP-содержащих аллелей имеет относительно высокую температуру детекции, а другой имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции; при этом сигналы, генерируемые такими средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют как при относительно высокой температуре детекции, так и при относительно низкой температуре детекции;
(b) определение SNP-генотипа по разнице между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции, на стадии (а).
15. Способ детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции, включающий:
(a) инкубирование образца по меньшей мере с тремя средствами генерации сигнала для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде и детекцию генерируемого сигнала с использованием детектора одного типа; при этом каждую из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом каждая из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет свою температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование не только сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную температуру детекции, но также и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей более высокую температуру детекции, чем данная температура детекции; при этом сигналы, генерируемые этими средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют при каждой из разных температур детекции; и
(b) определение присутствия по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней на основе сигналов, детектируемых на стадии (а); при этом, если определяют присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, среди по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретую температуру детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции; при этом, если данная конкретная температура детекции является самой относительно высокой температурой детекции среди температур детекции, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени определяют на основе сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции.
16. Способ по п. 15, где стадию (b) проводят, сначала определяя присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, а затем последовательно определяя присутствие нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих относительно более низкие температуры детекции, в порядке убывания.
17. Способ по п. 15, где средства генерации сигнала для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса.
18. Способ по п. 15, где средства генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, представляют собой средства генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средства генерации сигнала для других нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала с использованием образования дуплекса.
19. Способ по п. 15, где по меньшей мере три средства генерации сигнала содержат идентичную метку, и сигналы от этой метки не различаются детектором одного типа.
20. Способ по п. 15, где указанная разница представляет собой разницу, получаемую в результате математической обработки сигнала, детектируемого при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции.
21. Способ по п. 15, где, если сигнал не детектируется при температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, то определение присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, проводят на основе сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции, с учетом отсутствия детекции сигнала при температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции.
22. Способ по п. 15, где, если присутствует нуклеотидная последовательность-мишень, имеющая температуру детекции выше указанной конкретной температуры детекции, то в данном способе для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, используют по меньшей мере одно референсное значение.
23. Способ по п. 22, где для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, в данном способе используют по меньшей мере одно референсное значение из референсных значений, полученных посредством (1) инкубирования всех комбинаций нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих более высокие температуры детекции, чем данная конкретная температура детекции, с соответствующими средствами генерации сигнала в другом реакционном сосуде, нежели реакционный сосуд на стадии (а), (2) детекции сигналов не только при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, но также и при данной конкретной температуре детекции, и (3) затем получения разницы между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции.
24. Способ детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции и анализа плавления, включающий:
(а) инкубирование образца с двумя средствами генерации сигнала для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде и детекцию генерируемого сигнала с использованием детектора одного типа; при этом каждую из нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом одна из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет относительно высокую температуру детекции, а другая имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции; при этом сигналы, генерируемые этими двумя средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют при относительно высокой температуре детекции;
(b) проведение анализа плавления для продукта инкубирования со стадии (а) в диапазоне температур для определения присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции; и
(c) определение присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, на основе сигнала, детектируемого на стадии (а), и присутствия нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, с использованием результата анализа плавления со стадии (b).
25. Способ по п. 24, где средства генерации сигнала для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средство генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса.
26. Способ по п. 24, где средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием образования дуплекса.
27. Способ по п. 24, где два средства генерации сигнала содержат идентичную метку, и сигналы от этой метки не различаются детектором одного типа.
28. Способ детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием анализа температур детекции и анализа плавления, включающий:
(а) инкубирование образца по меньшей мере с тремя средствами генерации сигнала для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в одном реакционном сосуде и детекцию генерируемого сигнала с использованием детектора одного типа; при этом каждую из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом каждая из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет свою температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала не только для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную температуру детекции, но также и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей более высокую температуру детекции, чем данная температура детекции; при этом сигналы, генерируемые этими средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом некоторые из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием анализа температур детекции, и детекцию осуществляют как при температуре детекции для указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, так и при одной или более температурах детекции, превышающих данные температуры детекции;
(b) проведение анализа плавления для продукта инкубирования со стадии (а) в диапазоне температур для определения присутствия других нуклеотидных последовательностей-мишеней, отличающихся от указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней; и
(c) определение (1) присутствия указанных некоторых из нуклеотидных последовательностей-мишеней на основе сигнала, детектируемого на стадии (а); при этом, если определяют присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, среди указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции; при этом, если данная конкретная температура детекции является самой относительно высокой температурой детекции среди температур детекции, то присутствие этой нуклеотидной последовательности-мишени определяют на основе сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции; и (2) присутствия других нуклеотидных последовательностей-мишеней, отличающихся от указанных некоторых из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, определяемых по результату анализа плавления на стадии (b).
29. Способ по п. 28, где стадию (с) проводят, сначала определяя присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, а затем последовательно определяя присутствие нуклеотидных последовательностей-мишеней, имеющих относительно более низкие температуры детекции, в порядке убывания.
30. Способ по п. 28, где средства генерации сигнала для каждой из нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средства генерации сигнала для генерирования сигнала способом, зависящим от образования дуплекса.
31. Способ по п. 28, где средство генерации сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей самую относительно высокую температуру детекции, представляет собой средство генерации сигнала с использованием расщепления детектирующего олигонуклеотида, а средство генерации сигнала для других нуклеотидных последовательностей-мишеней представляют собой средство генерации сигнала с использованием образования дуплекса.
32. Набор для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции, содержащий:
(a) два средства генерации сигнала для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней; и
(b) инструкцию, в которой описан способ по любому из пп. 1-15.
33. Набор для SNP-генотипирования нуклеотидной последовательности в образце с использованием разных температур детекции, содержащий:
(a) средство генерации сигнала для детекции SNP-содержащих аллелей; и
(b) инструкцию, в которой описан способ по п. 16.
34. Набор для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции, содержащий:
(a) по меньшей мере три средства генерации сигнала для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней; и
(b) инструкцию, в которой описан способ по любому из пп. 17-31.
35. Набор для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции и анализа плавления, содержащий:
(a) два средства генерации сигнала для детекции двух нуклеотидных последовательностей-мишеней; и
(b) инструкцию, в которой описан способ по любому из пп. 32-40.
36. Набор для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием анализа температур детекции и анализа плавления, содержащий:
(a) по меньшей мере три средства генерации сигнала для детекции по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней; и
(b) инструкцию, в которой описан способ по любому из пп. 41-49.
37. Пригодный для ввода в компьютер информационный носитель, содержащий инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа определения присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции, где указанный способ включает:
(a) получение как сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, так и сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции; при этом каждую из нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом генерируемый сигнал детектируют, используя детектор одного типа; при этом одна из двух нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет относительно высокую температуру детекции, а другая имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции; и
(b) определение присутствия двух нуклеотидных последовательностей-мишеней на основе полученного сигнала; при этом (1) присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно высокую температуру детекции, определяют на основе сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, а (2) присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей относительно низкую температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при относительно высокой температуре детекции, и сигналом, детектируемым при относительно низкой температуре детекции.
38. Устройство для детекции нуклеотидной последовательности-мишени в образце с использованием разных температур детекции, содержащее (а) компьютерный процессор и (b) пригодный для ввода в компьютер информационный носитель по п. 55, соединенный с компьютерным процессором.
39. Пригодный для ввода в компьютер информационный носитель, содержащий инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа SNP-генотипирования нуклеотидной последовательности в образце с использованием разных температур детекции, где указанный способ включает:
(a) получение как сигнала, детектируемого при относительно высокой температуре детекции, так и сигнала, детектируемого при относительно низкой температуре детекции; при этом каждый из SNP-содержащих аллелей детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом один из SNP-содержащих аллелей имеет относительно высокую температуру детекции, а другой имеет относительно низкую температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом относительно высокая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции, а относительно низкая температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование как сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно низкую температуру детекции, так и сигнала для SNP-содержащего аллеля, имеющего относительно высокую температуру детекции;
(b) определение SNP-генотипа по разнице между полученными сигналами.
40. Пригодный для ввода в компьютер информационный носитель, содержащий инструкции для конфигурирования процессора с целью осуществления способа определения присутствия по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней в образце с использованием разных температур детекции, где указанный способ включает:
(а) получение сигналов, детектируемых по меньшей мере при трех температурах детекции; при этом каждую из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней детектируют с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом каждая из по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней имеет свою температуру детекции, определяемую с использованием соответствующего средства генерации сигнала; при этом температура детекции представляет собой температуру, допускающую генерирование не только сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную температуру детекции, но также и сигнала для нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей более высокую температуру детекции, чем данная температура детекции; при этом сигналы, генерируемые этими средствами генерации сигнала, не различаются детектором одного типа; при этом детекцию осуществляют при каждой из разных температур детекции; и
(b) определение присутствия по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней на основе полученного сигнала; при этом, если определяют присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей конкретную температуру детекции, среди по меньшей мере трех нуклеотидных последовательностей-мишеней, то присутствие нуклеотидной последовательности-мишени, имеющей данную конкретную температуру детекции, определяют по разнице между сигналом, детектируемым при одной или более температурах детекции, превышающих данную конкретную температуру детекции, и сигналом, детектируемым при данной конкретной температуре детекции; при этом, если данная конкретная температура детекции является самой относительно высокой температурой детекции среди температур детекции, то присутствие этой нуклеотидной последовательности-мишени определяют на основе сигнала, детектируемого при данной конкретной температуре детекции.