СОСТАВ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ COVID-19
COVID-19 VACCINE COMPOSITION

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Создана фармацевтическая композиция для индукции специфического иммунитета против вируса острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащая нуклеокапсидный белок NSARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в количестве от 20 до100 мкг/мл и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, выбранные из группы, включающей буферные агенты, поверхностно-активные вещества, адъювант, изотонический агент в фармацевтически приемлемых количествах.
Предшествующий уровень техники
В 2019 г. в Китае был обнаружен новый одноцепочечный РНК-содержащий вирус, относящимся к семейству Coronaviridae, к линии Beta-CoV B. Новый коронавирус быстро распространился по всем континентам, вызывая тяжелые состояния: вирусную пневмонию, сосудистые нарушения, усугубление хронических заболеваний. В феврале 2020 г. Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) присвоила новому вирусу официальное название SARS-CoV-2, а болезнь в случае этого вируса - название COVID-19 («Coronavirusdisease 2019»).
В настоящее время проблема профилактики инфекции коронавируса SARS-CoV-2 является большой проблемой, т.к. эффективного лекарственного средства до сих пор не разработано. Основным профилактическим средством в случае вирусных инфекцией является вакцина – средство, включающее антиген, который вызывает иммунную реакцию организма и приводит к индукции более сильного вторичного иммунного ответа. Таким образом, вакцинированный пациент либо не заражается инфекцией либо в организме происходит реакция быстрой элиминации вируса, что позволяет в этом случае переносить заболевание в более легкой форме.
Известны различные композиции вакцин для индукции иммунного ответа в случае коронавирусных инфекций нового типа.
Так, например, согласно патенту RU 2709659 известно иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих консенсусную последовательность полного протективного антигена S коронавируса на основании последовательностей генов белка S современных штаммов вируса 2015-2017 гг. с определенной последовательностью.
Также из патента US 10953089 известна вакцина, включающая наночастицы с гликопротеином S коронавируса SARS-CoV-2 и ядро из неионогенное ПАВ, а также буфер и адъювант на основе сапонина. Предлагаемые частицы обладают стабильностью и лучшей презентацией эпитопа антигена.
Патент CN111944064 описывает вакцину, включающую белок S-S-RBD, белок домена сборки, сигнальные белки, а также адъювант на основе сквалена. Полученная композиция представляет собой наноэмульсию «вода-в-масле».
Таким образом, техническая задача состоит в разработке и получении стабильной композиции, способной при ее введении в организм вызывать иммунный ответ и индуцировать специфический иммунитет против SARS-CoV-2. Поставленная задача решается получением композиции, содержащей нуклеокапсидный белок N SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в количестве от 20 до 100 мкг/мл и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, выбранные из группы, включающей буферные агенты, поверхностно-активные вещества, адъювант, изотонические агенты в фармацевтически приемлемых количествах. При этом полученная композиция обладает стабильностью, способностью вызывать стойкий и длительный иммунный ответ, с высоким титром антител к инфекции коронавируса SARS-CoV-2, а также композицию можно достаточно просто получить с технологической точки зрения.
Описание фигур
На Фиг. 1 представлены примеры выявленных изменений в легком: показано развитие тяжелой интерстициальной пневмонии и некроз эпителия, при исследовании согласно примеру 7, группа 8.
На Фиг. 2 представлены примеры выявленных изменений легких: показаны выраженные гиперплазия альвеолярных эпителиальных клеток II типа, а также смешанная выраженная смешанно клеточная воспалительная инфильтрация, при исследовании согласно примеру 7, группа 8.
На Фиг. 3 показано нормальное строение легкого, спустя 2 недели после выздоровления животных, при исследовании согласно примеру 7, группа 7.
Подробное описание изобретения
Вакцины, как правило, представляют собой композицию, включающую антиген в виде белка или смеси белков, а также вспомогательные веществ.
Антиген является фармацевтически активной субстанцией, ответственной за развитие иммунного ответа в организме пациента. Однако, по различным причинам, вводимый антиген может быть нестабильным, например, его невозможно хранить и технологически обрабатывать без потери активности в течение определенного времени, под воздействием окружающей среды. Кроме того, при введении в организм антиген может разрушаться под действием ферментов или иных веществ организма (например, среды кровотока).
Согласно настоящему изобретению, предложена фармацевтическая композиция, предназначенная для индукции специфического иммунного ответа против вируса острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащая нуклеокапсидный белок NSARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQIDNO: 1, в количестве от 20 до 100 мкг/мл и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, выбранные из группы, включающей буферные агенты, поверхностно-активные вещества, адъюванты, изотонические агенты. Данные вспомогательные вещества, как правило, содержатся в композиции в фармацевтически приемлемых количествах. В одном из вариантов реализации, композиция согласно изобретению содержит нуклеокапсидный белок NSARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в количестве от 20 до 50 мкг/мл.
В еще одном варианте реализации композиция согласно изобретению в качестве адъюванта содержит токоферол, сквалан или их комбинацию. В другом варианте реализации композиция согласно изобретению может содержать в качестве буферных агентов любой фармацевтически приемлемый буфер, который может быть использован для поддержания рН около 7, например, фосфатно-солевой буфер, малеатный буфер, тетрабутиламмония буферный раствор, боратный буфер, HEPES буфер, трис(гидроксиметил)аминометана буферный раствор, или любой другой физиологически приемлемый буфер, используемый для поддержания рН в диапазоне 7-8, предпочтительно, в диапазоне 7,2-7,6.
Также композиция согласно изобретению может содержать фармацевтические приемлемые поверхностно-активные вещества (ПАВ), например, полисорбаты, твины, сорбитаны и другие подходящие ПАВ, например, лаурилсульфата натрия, диоктилсульфосукцината натрия, диоктилсульфоната натрия, хенодезоксихолевой кислоты, натриевой соли N-лаурилсаркозина, додецилсульфата лития, натриевой соли 1-октансульфокислоты, гидрата холата натрия, дезоксихолата натрия, натриевой соли гликодезоксихолевой кислоты, бензалконийхлорида илибензетонийхлорида, моногидрата цетилпиридинийхлорида, гексадецилтриметиламмония бромида,CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, дигитонина, Тритона Х-100, Тритона Х-114, лауромакрогола 400,полиоксил-40-стеарата, полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла 10, 40, 50 и 60, моностеаратаглицерина, полисорбата 20, 40, 60, 65 и 80, лецитина из сои, DOPC, DMPG, DMPC и DOPG; эфира сахарозы и жирных кислот, метилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы. Предпочтительная концентрация ПАВ может составлять от 0,005 до 5% масс, или, например, 1-10 мг на 1 мл. Также в композиции могут содержаться изотонические агенты, например, калия хлорид, натрия хлорид. Изотонический агент действует не только для поддержания подходящего осмотического давления, но и может выполнять функции вспомогательного стабилизатора белка в жидкой форме иди лиофилизате. Примеры изотонического агента включают растворимые в воде неорганические соли, например, хлорид натрия, сульфат натрия, цитрат натрия, хлорид кальция и их комбинация. Наиболее предпочтительным является хлорид натрия. Предпочтительно концентрация изотонического агента составляет порядка от 5 до 200 мМ, или, например, 0,1-8,5 мг на мл. В пределах данного диапазона концентрация изотонического агента может регулироваться в соответствии с видами и количествами содержащихся компонентов, с тем чтобы жидкая композиция была изотонической.
Адъюванты представляют собой компоненты, используемые в композициях вакцин, которые потенцируют иммунный ответ на антиген, и/или модулирующий его с целью получения требуемого иммунного ответа. В качестве адъювантов могут использоваться минеральные соли, например, гели алюминия гидроксида и алюминия или кальция фосфата; препараты на основе масляных эмульсий и сурфактантов, например, MF59 (микросжиженный детергент, стабилизированный в эмульсии «масло в воде»), QS21 (очищенный сапонин), AS02 [SBAS2] (эмульсия «масло в воде» + MPL + QS-21), монтанид ISA-51 и ISA-720 (стабилизированная эмульсия «вода в масле»), дисперсные адъюванты, например, виросомы (однослойные липосомальные носители, включающие гемагглютинин гриппа), AS04 ([SBAS4] соль Al с MPL), ИСКОМы (структурный комплекс сапонинов и липидов), полилактид ко-гликолид (PLG), микробные производные (естественные и синтетические), например, монофосфориллипид A (MPL), детокс (MPL + скелет клеточной стенки M. phlei), AGP [RC-529] (синтетический ацилированный моносахарид), DC_Chol (липоидные иммуностимуляторы, способные к самоорганизации в липосомы), OM-174 (производное липида A), CpG-последовательности (синтетические олигонуклеотиды, содержащие CpG-последовательности с иммуностимулирующей активностью), токоферол, сквален и сквалан и их производные, модифицированные LT и CT (генетически модифицированные бактериальные токсины для обеспечения нетоксичного действия адъювантов), эндогенные иммуномодуляторы человека, например, ГМ-КСФ человека и ИЛ-12 человека (цитокины, которые можно вводить в виде белка или кодировать плазмидами), иммудаптин (C3d тандемный повтор), инертные носители, такие как частицы золота. В предпочтительном варианте реализации композиция согласно изобретению включает в качестве адъюванта α-токоферол, сквалан и их комбинации.
В предпочтительном варианте реализации композиция согласно изобретению имеет следующий состав на 1 мл:
Нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQIDNO: 1
20- 100 мкг
Сквалан
15-40 мг
α-токоферол
5- 15 мг
Полисорбат 80
1-10 мг
Натрий фосфорнокислый двузамещенный
0,1- 2,0 мг
Калий фосфорнокислый однозамещенный
0,01-0,25 мг
Калия хлорид
0,01-0,2 мг
Натрия хлорид
0,1-8,5 мг
Вода для инъекций
до 1 мл
В более предпочтительном варианте реализации композиция согласно изобретению имеет следующий состав на 1 мл:
Нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQIDNO: 1
50-100 мкг
Сквалан
24-36 мг
α-токоферол
8-12 мг
Полисорбат 80
10-12 мг
Натрий фосфорнокислый двузамещенный
1,5-1,8 мг
Калий фосфорнокислый однозамещенный
0,1-0,122 мг
Калия хлорид
0,1-0,21 мг
Натрия хлорид
4-8,1 мг
Вода для инъекций
до 1 мл
Композиции согласно изобретению могут представлять собой раствор, эмульсию или лиофилизат. Лиофилизат может быть получен из раствора или эмульсии стандартными для этого способами, например из раствора при лиофилизации.
Композиция согласно изобретению может применяться для профилактики или индукции специфического иммунитета против вируса острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, т.е. использоваться в качестве вакцины. При этом содержание белка N в композиции согласно изобретению может варьироваться в зависимости от требуемой дозы для вакцинации, возраста пациента и других клинических факторов.
Применение указанной композиции для профилактики против вируса острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 включает однократно или двукратно введение композиции. Решение об однократном или двукратном введении принимает терапевт, с учетом возраста, анамнеза пациента, наличия хронических заболеваний и иных клинических факторов. В случае двукратного введения композиция может вводиться 2 раза последовательно с интервалом не менее 2 недель, с одинаковым или различным содержанием нуклеокапсидного белка N в композиции.
Далее изобретение также предлагает способ получения композиции, содержащей белок N, который включает:
1) обеспечение нуклеокапсидного белка NSARS-CoV-2, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в количестве от 20 до 100 мкг/мл;
2) растворение белка в водном растворителе и доведение содержания белка N в растворе до требуемой концентрации;
3) приготовление водного раствора адъюванта;
4) смешение водного раствора, содержащего белок N, и водного раствора адъюванта;
5) гомогенизация полученной смеси до получения однородного по цвету раствора;
6) регулирование полученного композиции рН до 7,2-7,6.
В одном из вариантов реализации способ получения композиции может дополнительно включать лиофилизацию полученной композиции с получением лиофилизата, используемого для восстановления растворителем перед введением пациенту. В некоторых вариантах реализация полученная композиция представляет собой эмульсию, например, типа «вода-в-масле», или «масло-в-воде».
Далее композиция согласно изобретению будет описана в примерах, которые не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1
Получение плазмиды, содержащей ген белка
Плазмиду, содержащую ген белка N (Genbank YP_009724397.2), использовали для получения модифицированной оптимизированной по кодонам нуклеотидной последовательности с использованием CodonAdaptationIndex (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/). Кодоны выбраны таким образом, чтобы по возможности использовались наиболее часто встречающиеся у E. coli кодоны, а также содержание нуклеотидов гуанин и цитозин был в диапазоне 50-55%. Последовательность на 5’ и 3’ концах фланкировалась последовательностями для распознавания эндонуклеазами NcoI (CCATGG) и XhoI (CTCGAG), соответственно. Синтез гена и клонирование по указанным сайтам рестрикции в плазмиду без вставки pET-28a(+) были заказаны на коммерческой основе. Полученную плазмиду секвенировали с помощью праймеров T7_promotor (TAATACGACTCACTATAGGG), fwd_122 (GCCTTATGGTGCAAATAAGG) и fwd_300 (AAACATTGGCCGCAGATTGC) для подтверждения нуклеотидной последовательности и проверки на однонуклеотидные мутации.
Нуклеотидная последовательность соответствовала последовательностиSEQ ID NO:2.
Пример 2
Получение клеточной линии E. coli, модифицированной плазмидой
Клеточную линию E. coli трансформировали по следующему протоколу. Пробирку с компетентными клетками извлекали из морозильной камеры хранения на -80°C. Давали оттаять льду в течение 10 мин. Далее вносили1 мкл, содержащий 1 пкг-100 нг плазмиды. Аккуратно перемешивали пробирку 4-5 раз. Полученную смесь помещали на лёд на 30 мин. Далее смесь подвергали тепловому шоку при 42°C на 30-60 c. Полученную обработанную смесь помещали на лёд на 5 мин. Вносили 950 мкл среды SOC при комнатной температуре. Инкубировали при 30°C-37°C в течение 1 - 2 ч при перемешивании 250 оборотов в минуту. Высевали 10-50 мкл на чашку с твердой селективной средой, содержащей антибиотик канамицин. Инкубировали при 30°C-37°C в течение ночи. Выросшие колонии содержат клетки E. coli, трансформированные плазмидой, несущей искусственный ген нуклеокапсидного белка N.
Таким образом получали клеточную линию E. coli с включением искусственного гена согласно изобретению.
Данная клеточная линия была депонирована во ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельско-хозяйственной микробиологии (ФГБНУ ВНИИСХМ) под номером RCAM05390 (от 14.05.2021 г.).
Пример 3
Получение рекомбинантного белка N SARS-CoV-2
Биомассу E. coli, содержащую экспрессированный белок N, ресуспендировали в буфере для лизиса (Трис-HCl 50 мM, pH 9) и гомогенизировали с помощью лабораторного гомогенизатора, например, GEA Panda 1000. Все буферы, кроме буферов для хроматографии на третьей стадии очистки, содержали ингибиторы протеаз ЭДТА и ФМСФ. Затем нерастворимую фракцию биомолекул осаждали центрифугированием при 20000 x g, 4°C, 30 мин. Растворимую фракцию переносили в чистую посуду, и к ней добавляли 20% (по массе на объем) сульфата аммония для осаждения белка N. Осажденную фракцию собирали центрифугированием при 20000 x g, 4°C, 30 мин, с последующим растворением в буфере Трис-HCl 50 мM, pH 9. После фильтрации через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм раствор использовали для хроматографической очистки. Первую стадию очистки на анион-обменной хроматографии проводили в режиме проскока (буфер Трис-HCl 50 мM, pH 9). Вторую стадию очистки на катион-обменной хроматографии проводили в режиме захвата с элюцией градиентом NaCl от 0 M до 1 M (буфер Трис-HCl 50 мM, pH 9). Третью стадию очистки на гидрофобной хроматографии проводили в режиме захвата с элюцией градиентом сульфата аммония от 1 M до 0 M (буфер NaH2PO4 50 мM, pH 7,5).
Далее проводили процесс диализа в диализных кассетах в 5 л фосфатно-солевом буфере. Процесс проходил при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем проводили замену буфера на 5 л свежего буфера и проводили процесс при +4°С в течение 10 ч.
После окончания диализа белок извлекали из диализных кассет и фильтровали. Полученный осадок растворяли в воде для инъекций для получения лиофилизата или полученный раствор белка доводили до нужной концентрации белка путем добавления ранее полученного лиофилизата.
Полученный раствор исследовали по следующим показателям: содержание белка, рН, механические включения, прозрачность, стерильность, размер частиц. Для этого использовали стандартные методики анализа.
Пример 4
Приготовление композиции согласно изобретению
Получали водный раствор, содержащий белок N, полученный согласно примеру 3, с различными концентрациями белка: 20 мкг/мл, 30 мкг/мл, 40 мкг/мл, 50 мкг/мл, 60 мкг/мл, 70 мкг/мл, 80 мкг/мл, 90 мкг/мл, 100 мкг/мл.
В отдельную емкость помещали в зависимости от содержания белка рассчитанное количество токоферола, сквалана и полисорбата 80, частями добавляли фосфатно-солевой буфер, при постоянном перемешивании. Например, при содержании 20 мкг/мл использовали 45 г токоферола, 15 г полисорбата 80, и 15 г сквалана и 750 мл буферного раствора. После растворения полученный раствор (раствор адъюванта) разделяли на равные части и обрабатывали ультразвуком. Затем обработанные растворы объединяли в один стакан и перемешивали. Далее проводили фильтрацию раствора через мембрану 0,22 мкм. Полученный отфильтрованный раствор объединяли с растворов белка N и перемешивали до гомогенного раствора.
В некоторых случаях образовывалась эмульсия белого или желтоватого цвета.
Полученный раствор, содержащий белок N и адъювант, доводили дорН 7,2-7,6 раствором гидроксида натрия или хлороводородной кислотой. Далее, полученный раствор разливали по стерильным флаконам и закупоривали. При необходимости, из раствора получали лиофилизат путем лиофилизации в аппарате. Для восстановления раствора для вакцинирования использовали воду для инъекций или стерильный физиологический раствор.
Пример 5
Анализ свойств композиций согласно изобретению
Для исследования свойств композиции согласно изобретению были получены следующие составы (представлены в таблице ниже).
Таблица 1
№ композиции
Содержание
Белка, мкг
сквалана, мг
токоферола, мг
поли-сорбата 80, мг
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4, </sub>мг
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>, мг
KCl, мг
NaCl, мг
воды для инъекций
1
20
15
5
1
0,1
0,01
0,01
0,1
До 1 мл
2
50
25
10
5
0,71
0,122
0,101
4,003
До 1 мл
3
100
40
10
10
1,42
0,244
0,2
8,005
До 1 мл
4
0
25
10
5
0,71
0,212
0,101
4,003
До 1 мл
Композиции с различным содержанием белка, полученные согласно примеру 5, исследовали на стабильность перед началом исследования и по истечении 6 недель хранения в стресс-условиях (условия «ускоренного хранения»). Перед началом исследования измеряли рН, содержание белка, визуально оценивали прозрачность, гомогенность, если композиция представлял собой эмульсию. Композиции с различным содержанием нуклеокапсидного белка N разливали по стерильным флаконам, закупоривали и помещали в камеру ускоренного хранения для испытания на стабильность. В камере поддерживали температуру +20°С в течение 6 недель. По истечении времени флаконы извлекали и проводили анализ на рН и содержание белка нуклеокапсидного N. Измерение рН проводили непосредственно в растворе с помощью рН-метра. Анализ на содержание белка проводили методом спектрофотометрии, при длине волны 280 нм. Далее высчитывали снижение концентрации нуклеокапсидного белка N в исследуемом растворе после хранения в течение 6 недель по отношению к первоначальному значению.
Результаты представлены в таблице ниже.
Таблица 2
№ композиции
Стабильность в течение 2 недель
рН
Содержание белка (% от исходного содержания)
Выводы
1
Стабильна, осадка или изменения цвета не выявлено
7,5
99,25%
Стабильна
2
Стабильна, осадка или изменения цвета не выявлено
7,4
99,13%
Стабильна
3
Стабильна, осадка или изменения цвета не выявлено
7,5
99,37%
Стабильна
4
Стабильна, осадка или изменения цвета не выявлено
7,3
99,27%
Стабильна
Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что полученные композиции, содержащие нуклеокапсидный белок N в концентрации от 20 мкг/мл до 100 мкг/мл, являются стабильными.
Пример 6
Исследование иммуногенных свойств полученных композиций
Полученные композиции исследовали на возможность индукции специфического иммунитета (иммуногенность)
Животных вида хомячки сирийские (самки) в количестве 240 шт. случайным образом делили на следующие равные группы:
Группа № 1 – вводили композицию, содержащую 20 мкг/ мл белка.
Группа № 2 – вводили композицию, содержащую 50 мкг/ мл белка.
Группа № 3 – вводили композицию, содержащую 100 мкг/ мл белка.
Группа № 4 – вводили композицию, не содержащую белок (плацебо).
Более подробные данные по составу представлены в таблице ниже.
Таблица 3
Группа
Содержание
Белка, мкг
сквалана, мг
токоферола, мг
поли-сорбата 80, мг
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4, </sub>мг
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>, мг
KCl, мг
NaCl, мг
воды для инъекций
1
20
15
5
1
0,1
0,01
0,01
0,1
До 1 мл
2
50
25
10
5
0,71
0,122
0,101
4,003
До 1 мл
3
100
40
10
10
1,42
0,244
0,2
8,005
До 1 мл
4
0
25
10
5
0,71
0,212
0,101
4,003
До 1 мл
* - все значения приведены в расчете на 1 мл композиции.
На момент начала эксперимента возраст животных составлял 6-8 недель, диапазон массы – 56,37-149,28 г. Адаптационный период составлял 5 дней, при ежедневном осмотре животных (состояние, измерение температуры). Животных содержали в стандартных условиях в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза от 22.09.2010 г. по охране животных, используемых в научных целях.
Композиции вводили внутримышечно, в дозе по 0,5 мл на животное, при этом использовали дробное введение, с перерывом на 14 дней (введение в 1 день и в 15 день).
Схема эксперимента представлена в таблице ниже.
Таблица 4
Манипуляции
Дни эксперимента
Внутримышечное дробное введение исследуемых объектов
1-й и 15-й день
Регистрация массы тела животных
1-й (до введения исследуемых объектов), 15-й, 29-й, 43-й, 57-й, 71-й, 85-й, 99-й, 113-й, 127-й, 141-й, 155-й, 169-й, 183-й, 197-й, 211-й, 225-й, 239-й, 253-й, 267-й, 281-й, 295-й, 309-й, 323-й, 337-й, 351-й, 365-й, 379-й
Регистрация отклонений в общем состоянии животных и летальности
Ежедневно
Клинический осмотр животных
2-й, 15-й, 29-й, 43-й, 57-й, 71-й, 85-й, 99-й, 113-й, 127-й, 141-й, 155-й, 169-й, 183-й, 197-й, 211-й, 225-й, 239-й, 253-й, 267-й, 281-й, 295-й, 309-й, 323-й, 337-й, 351-й, 365-й, 379-й
Эвтаназия по 5 животных каждой группы с последующим взятием образцом крови из сердца для проведения иммуноферментного анализа (ИФА)
1-й (до введения исследуемых объектов), далее – на 8-й, 15-й, 22-й, 29-й, 43-й, 162-й и 386-й.
Анализ ИФА на специфические антитела проводили по следующей методике.
После иммунизации композициями 1-4 мышей типа Balb/c, в возрасте 6-8 недель, дозой в объёме 500 мкл, по 250 мкл в каждое заднее бедро.
2
Далее, на 42 сутки после введения второй дозы мышей усыпляли в камере, наполненной COгазом. Далее осуществляли забор крови на содержание специфических антител и внутренних органов на гистологические анализы.
Кровь помещали в пробирки типа Eppendorf, содержащие ЭДТА в концентрации 1-2 мг/мл. Пробирки с кровью и ЭДТА центрифугировали при +4°C, в течение 20 минут. Супернатант переносили в чистые пробирки в ламинарном боксе. Полученную плазму замораживали.
Процедура: проведение иммуноферментного анализа (ИФА)
Использовали следующие реагенты:
посадочные антигены, 1 мкг/мл, 100 мкл/лунку; блокировку 0,5 % молоком в отмывочном буфере (20 мMTрис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20, рН 7,4±0,1), 300 мкл/лунку.
Отмывку проводили следующим образом: сливали содержимое планшета, планшет промывали 4 раза по 300 мкл на лунку отмывочным буфером (20 мM Tрис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20, рН 7,4±0,1), лунки тщательно осушали, избегая образования пузырей, путем постукивания планшета о салфетку.
При нанесении сывороток подбирали титр для каждой отдельной сыворотки, 100 мкл/лунку, термостатировали и центрифугировали.
Нанесение вторичных антител проводили при исходном разведении 1:64000, 100 мкл/лунку, с термостатированием и перемешиванием.
Отмывку проводили следующим образом: сливали содержимое планшета, планшет промывали 4 раза по 300 мкл на лунку отмывочным буфером (20 мM Трис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20, рН 7,4±0,1), лунки тщательно осушали, избегая образования пузырей, путем постукивания планшета о салфетку.
Добавляли раствора хромогена, 100 мкл/лунку, 12 минут в защищенном от света месте. Далее вносили стоп-раствор, 50 мкл/лунку. Съем результатов проводили при длине волны 450 нм, референс 620 нм. Результаты считались приемлемыми, если выполнены критерии пригодности и критерии приемлемости.
Согласно IUPAC, предел обнаружения рассчитывают по стандартному отклонению холостой пробы. Для этого измеряют величину аналитического сигнала для достаточного количества холостых проб и рассчитывают стандартное отклонение их значений.
Как правило, используется формула (Kaiser H. Zurdefinitiondernachweisgrenze, dergarantiegrenzeundderdabeibenutztenbegriffe, Дёрффель К. Статистика в аналитической химии):
LOD = Average+k*SD
,
где k = 3
Предел обнаружения (LOD) рассчитывают по оптической плотности блокирующего буфера по формуле:
LOD = Average+10*SD
,
где  average – среднее значение оптической плотности блокирующего буфера,
SD - среднеквадратичное отклонение оптической плотности блокирующего буфера,
Принимается, что в образце присутствуют специфичные антитела, если средняя оптическая плотность образца больше, чем Сut-off, при этом Сut-off = LOD + 20% (20% соответствуют критерию пригодности иммуноферментной системы для оптической плотности на уровне поглощения блокирующего буфера (бланка)):
Cut-off = 1,2* LOD = 1,2*(Average+10*SD).
Титром сыворотки считается крайнее разведение, при котором оптическая плотность превышает сигнал дискриминационного уровня (cut-off), используется усредненная оптическая плотность.
Результаты по определению титра специфических антител IgG белок представлены в таблице ниже.
Таблица 5
№ группы
Средний титр антител на
1-й*
8-й
15-й
22-й
29-й
43-й
1
Nd
1:16000
1:16000
1:16000
1:32000
1:32000
2
Nd
1:64000
1:64000
1:64000
1:64000
1:64000
3
Nd
1:64000
1:64000
1:64000
1:128000
1:128000
4
Nd
2 из 5 позитивный(1 случай титра 800)**
2 из 5 позитивный(1 случай титра 800)**
2 из 5 позитивный(1 случай титра 800)**
2 из 5 позитивный(1 случай титра 800)**
2 из 5 позитивный(1 случай титра 800)**
* - измерение до введения.
** - обнаружены титры неспецифических антител, характерных для данного вида животных.
Nd – не определено, титр отсутствует.
Выраженный иммунный ответ регистрировали при однократном и двукратном внутримышечном введении композиций в группах №№ 1-3 в дозе 0,5 мл/животное с пиком титра специфических антител на 22-й день эксперимента и с сохранением до 43-го дня в диапазоне 1:32000-1:17800. Появление специфических антител регистрировали через 15 дней после первой вакцинации животных.
Пример 7
Исследование иммуногенных свойств полученных композиций (протективность)
Полученные композиции исследовали на возможность индукции специфического иммунитета (протективность).
Оценку протективных свойств композиций оценивали после двухкратной вакцинации и заражения культурой коронавируса.
Для выработки иммунитета использовали композиций и схему вакцинации, как описано в примере 5. Для иммунизации использовали композиции, содержащие белок N в различной концентрации, а также плацебо (композицию, не содержащую белок и содержащую только растворитель и вспомогательные вещества).
Композиции для вакцинации представлены в таблице ниже.
Таблица 6
Группа
Содержание
Белка, мкг
сквалана, мг
токоферола, мг
поли-сорбата 80, мг
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4, </sub>мг
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>, мг
KCl, мг
NaCl, мг
воды для инъекций
5
20
15
5
1
0,1
0,01
0,01
0,1
До 1 мл
6
50
25
10
5
0,71
0,122
0,101
4,003
До 1 мл
7
100
40
10
10
1,42
0,244
0,2
8,005
До 1 мл
8
0
25
10
5
0,71
0,212
0,101
4,003
До 1 мл
* - все значения приведены в расчете на 1 мл композиции.
Самок сирийских хомячков в количестве 50 шт. рандомно разделили на 5 групп, содержащих по 10 особей. Группы животных сначала иммунизировали на 1-й и 15-й день композициями с различным содержанием белка. Далее на 29-й день животных заражали вирусом SARS-CoV-2и регистрировали клинические проявления заболевания и выздоровления.
Обозначение группы в зависимости от введенной композиции и заражения вирусом приведены в таблице ниже.
Таблица 7
Группа №
Введение композиции
Заражение
5
Введение 20 мкг/мл белка
50 мкл в дозе 5 lgTCID50 на животное
6
Введение 50 мкг/мл белка
7
Введение 100 мкг/мл белка
8
Введение 0 мкг/мл белка
9
Интактная группа (не вводили композицию или плацебо), не заражали инфекцией
С целью формирования патологии животным под общим наркозом интраназально однократно вводили вирус SARS-CoV-2 (паспортизированный штамм ФГБНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН» №ПИК35 GISAID ID EPI_ISL_428852) в объеме 50 мкл в дозе 5 lgTCID50 на животное. На протяжении эксперимента у животных контролировали общее состояние и массу тела. Эвтаназию животных проводили на 3-й и 7-й дни после заражения. Легкие фотографировали и взвешивали для дальнейшей оценки массового коэффициента. Макроскопически проведена оценка изменений цвета и структуры легочной ткани. Правое легкое использовали для оценки микроскопических изменений. Гистологический анализ включал в себя оценку трех признаков: воспаление легких, клеточный инфильтрат и отек. Левое легкое и ткани носовых раковин использовали для оценки количества РНК вируса SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР по показателю Ct.
В период иммунизации не отмечено патологических изменений в общем состоянии экспериментальных животных и снижения массы тела.
Фотографии патологий представлены на Фиг. 1-2.
Общие результаты представлены в таблице ниже.
Таблица 8
Группа №
Массовый коэффициент легких (среднее)
Выздоровление
5
0,81±0,0,092
На 5-й день
6
0,83±0,0121
На 5-й день
7
0,80±0,0,097
На 5-й день
8
0,91±0,192
На 18-й день
9
0,75±0,046
На 20-й день
После заражения вирусом у животных отмечали: снижение массы на 10-15% входе инфекционного процесса, наличие клинической симптоматики, накопление РНКвируса в нижних и верхних дыхательных путях на 3-й день инфекции, макро- и микроскопическими изменения легких, наиболее выраженные на 7-й день развития патологии, увеличением массового коэффициента легких в 1,5 раза.
Гистологические исследования легких представлены на Фиг. 1-3.
В соответствии с полученными данными установлено, что введение композиции № 8 не привело к развитию фармакологических эффектов на течение коронавирусной инфекции у сирийских хомячков. Введение композиций, содержащих белок, №№ 5, 6, 7 оказало положительное влияние на инфекционный процесс в виде тенденции к увеличению массы тела и улучшению общего самочувствия животных на 5-й день патологии, и уменьшения выраженности гистологических изменений легочной ткани на 7-й день после заражения.
В ходе данного исследования было показано, что композиции, содержащие белок N в различных концентрациях и адъювант, обладают протективными свойствами при заражении инфекцией SARS-CoV-2. Обнаруженные свойства проявляются в виде сокращения периода болезни по полному отсутствию клинических признаков инфекции к 5-му дню после заражения, достоверного увеличения массы тела на 6-7-й дни развития инфекции с практически полным восстановлением до исходного уровня, тенденции к увеличению показателя Ct в легочной ткани на 3-й день, снижения выраженности макро- и микроскопических изменений в легочной ткани.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ФГУП СПбНИИВС ФМБА России
<120> СОСТАВ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ COVID-19
<160> NUMBER OF SEQ ID NOS: 3
<210> SEQIDNO 1
<211> 420
<212> искусственная последовательность
<213> искусственная аминокислотная последовательность
<400> SEQUENCE1:
MGSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQN    30
GERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQH    60
GKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRR    90
ATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEA    120
GLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTR    150
NPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGG    180
SQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPAR    210
MAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQ    240
QQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYN    270
VTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYK    300
HWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGT    330
WLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDA    360
YKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQ    3900
QTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA    420
<160> SEQIDNO: 2
<210> 3
<211> 6496
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<400> искусственная нуклеотидная последовательность
tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcg      60
cagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttc      120
ctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagg      180
gttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttc      240
acgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgtt      300
ctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattc      360
ttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgattta      420
acaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttt      480
tcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgta      540
tccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttat      600
tcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaa      660
actcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactc      720
gtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgaga      780
aatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttcc      840
agacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaac      900
cgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggac      960
aattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatat      1020
tttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcag      1080
tggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggca      1140
taaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctac      1200
ctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattg      1260
tcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatcca      1320
tgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacac      1380
cccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaa      1440
cgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttga      1500
gatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcg      1560
gtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagc      1620
agagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaag      1680
aactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgcc      1740
agtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcg      1800
cagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctac      1860
accgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggaga      1920
aaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagctt      1980
ccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgag      2040
cgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcg      2100
gcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgtta      2160
tcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc      2220
agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg      2280
tattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagta      2340
caatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactg      2400
ggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtct      2460
gctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagag      2520
gttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtc      2580
gtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccag      2640
aagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgttt      2700
ggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaa      2760
acgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacg      2820
ttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcaggg      2880
tcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcc      2940
tgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagacttta      3000
cgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagca      3060
gcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaacc      3120
ccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgc      3180
catgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaa      3240
ggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgc      3300
gctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctac      3360
gagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgccca      3420
ccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgccta      3480
atgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaa      3540
cctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtat      3600
tgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttca      3660
ccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa      3720
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgt      3780
atcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattg      3840
cgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattca      3900
gcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgcta      3960
tcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccg      4020
agacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagat      4080
gctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtct      4140
ggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatgg      4200
catcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagat      4260
tgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgc      4320
tggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgca      4380
gggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg      4440
ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttt      4500
tcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccgg      4560
catactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactct      4620
cttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccggga      4680
tctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgagg      4740
ccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtccc      4800
ccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtgg      4860
cgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtg      4920
gcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcga      4980
aattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataa      5040
ttttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcgataatggcccgcagaatcag      5100
cgtaatgcaccgcgtattacctttggcggcccgagtgatagtaccggtagtaatcagaat      5160
ggtgaacgcagtggtgcacgtagcaaacagcgccgcccgcagggcctgcctaataatacc      5220
gccagttggtttaccgccctgacccagcatggcaaagaagatctgaaatttccgcgcggt      5280
cagggcgtgccgattaataccaatagcagtccggatgatcagattggctattatcgccgc      5340
gccacccgccgcattcgcggtggtgacggtaaaatgaaagatctgagcccgcgttggtat      5400
ttttattatctgggcaccggcccggaagccggtctgccttatggtgcaaataaggatggt      5460
attatttgggtggcaaccgaaggtgcactgaataccccgaaagatcatattggtacccgt      5520
aatccggcaaataatgcagcaattgttctgcagctgccgcagggtaccaccctgccgaaa      5580
ggcttttatgccgaaggcagtcgcggcggcagtcaggctagtagccgtagcagtagccgt      5640
agtcgcaatagcagtcgcaatagtaccccgggcagcagccgtggcaccagtcctgctcgt      5700
atggcaggtaatggtggtgacgccgccctggcactgctgctgctggatcgcctgaatcag      5760
ctggaaagcaaaatgagtggtaaaggccagcagcagcagggccagaccgtgaccaaaaaa      5820
tctgcagcagaagcaagcaaaaaaccgcgccagaaacgtaccgcaaccaaagcatataat      5880
gtgacccaggcctttggtcgtcgtggtccggaacagacccagggcaattttggcgatcag      5940
gaactgattcgccagggcaccgattataaacattggccgcagattgcccagtttgccccg      6000
agcgcaagcgcatttttcggcatgagtcgcattggcatggaagttaccccgagcggtacc      6060
tggctgacctataccggtgcaattaagctggatgataaagatccgaattttaaagatcag      6120
gttattctgctgaacaaacatattgatgcctataaaaccttcccgccgaccgaaccgaaa      6180
aaagataaaaagaaaaaggcagatgagacccaggcactgccgcagcgtcagaaaaaacag      6240
cagaccgtgacactgctgccggcagccgatctggatgattttagtaaacagctgcagcag      6300
agtatgagtagcgcagatagtacccaggcataactcgagcaccaccaccaccaccactga      6360
gatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaa      6420
taactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaagga      6480
ggaactatatccggat                                                  6496
<---