Метод латекс-агглютинации для выявления антител к вирусу инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб

Физиологические исследования

УДК 619: 616 - 002.4: 639.371.1: 616 - 078 М.И. Доронин, В.А. Пыльное, С.С. Рыбаков

МЕТОД ЛАТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИНФЕКЦИОННОГО НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ

Разработаны способы приготовления и контроля латекс-агглютинационных препаратов для выявления антител к вирусу инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб. Определена степень сенсибилизации латексных частиц. Аналитическая чувствительность приготовленных препаратов равна 0,9 мг/мл. При исследовании 40 сывороток крови в реакции агглютинации латекса диагностическая чувствительность и специфичность были равны 90 % и 100 % соответственно. Данный метод простой и быстрый в исполнении, может применяться в качестве скринингового для выявления сывороточных антител, специфичных к вирусу инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб. Подобраны условия получения латексных препаратов, которые позволяют выявлять антитела к вирусу инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых, а также критерии оценки результатов латекс-агглютинационного анализа.

Ключевые слова: вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани, реакция латекс-агглютинации, антитела, аналитическая чувствительность, диагностическая специфичность и чувствительность.

В настоящее время аквакультура является самым быстрорастущим сектором производства продуктов питания в мире. В Российской Федерации сегодня выращивают 70-75 тыс. т рыбы, что почти в 4 раза меньше, чем производилось в 1990 г. [1]. Основным фактором, тормозящим развитие аква-культуры, являются инфекционные болезни, одной из которых является инфекционный некроз гемопоэтической ткани (ИНГТ) лососевых рыб, высококонтагиозное вирусное заболевание. Вирус ИНГТ, имеющий линейный одноцепочечный отрицательный РНК-геном, принадлежит к роду Novirhabdovirus семейства Rhabdoviridae [2].

Заболевание, вызванное вирусом ИНГТ, проявляется в форме экссудативно-геморрагического синдрома, развитие которого обусловлено размножением вируса в соединительной, гемопоэтической ткани и клетках экскреторной части почек, что ведет к нарушению водно-минерального баланса и выходу плазмы и клеток крови в окружающие ткани и полости тела. Первыми признаками заболевания являются: анорексия и угнетенное состояние рыб, утрата реакции на внешние раздражители. Больные рыбы приобретают темную окраску, ложатся на дно или поднимаются к поверхности воды и перемещаются к краям бассейна или канала, где течение слабее. Острая вспышка ИНГТ начинается с внезапной массовой гибели, причем первоначально рыбы могут погибать без внешних признаков заболевания. У больных рыб отмечают экзофтальм, побледнение жабр, точечные кровоизлияния в пе-риокулярной соединительной ткани глаз и в межлучевой ткани оснований плавников. Из ануса отдельных больных рыб свисают длинные тяжи слизеподобной консистенции с сероватым оттенком и иногда с примесью крови. У личинок наблюдаются множественные кровоизлияния в желточный мешок и гидроцефалия в виде припухлости на голове. При вскрытии в полости тела обнаруживают скопление прозрачного желтоватого экссудата, множественные петехиальные кровоизлияния в перивис-церальной жировой ткани, на брюшине, стенках кишечника и плавательного пузыря, иногда в мускулатуре. Желудочно-кишечный тракт свободен от пищи, иногда наполнен слизеподобным содержимым молочно-белого цвета. Хроническая форма течения болезни характеризуется менее выраженными клиническими признаками и умеренной, растянутой во времени гибелью рыб. Внешние признаки ИНГТ, за исключением более темной окраски тела, у больных рыб, как правило, отсутствуют. Эта форма заболевания обусловлена поражением центральной нервной системы, и нередко вирус у этих рыб обнаруживают только в головном мозге. Больные рыбы обычно имеют те или иные признаки заболевания из вышеописанного комплекса. Лишь у немногих пораженных особей в период эпизоотии можно встретить весь набор характерных клинических признаков и патологоанатомических изменений. Ни один из описанных признаков не является патогномоничным. У 1-5 % рыб, переболевших ИНГТ, развивается искривление позвоночника [2].

Эпизоотическую ситуацию по ИНГТ лососевых рыб в России можно охарактеризовать как неблагополучную. В 2000 г. в экспериментальном форелевом хозяйстве п. Рыбное Московской области у молоди радужной форели впервые возникла эпизоотия ИНГТ. Вирус был занесен в хозяйство с икрой неизвестного происхождения. В 2001 г. вирус регулярно выявляли у тихоокеанских лососевых, заходивших на нерест в реки Камчатки. В 2004 г. вирус ИНГТ обнаружили в ООО «Селекцентр» в г. Удомля Тверской области [1]. Данное заболевание представляет опасность не только для аква-культуры, но и для диких популяций лососевых [3], и его контроль позволяет сохранять биоразнообразие рыб в природе.

Своевременная диагностика и предотвращение вспышек ИНГТ способствует укреплению производственной продовольственной безопасности страны, позволяет сохранять и развивать межрегиональные и межгосударственные связи. Следовательно, необходимо осуществлять масштабный контроль заболевания в аквакультуре, главным звеном которого является эпизоотологический мониторинг. В настоящее время разрабатываются различные диагностические методы, позволяющие контролировать иммунный статус аквакультуры и обеспечить биозащиту рыбоводных хозяйств. Серологические обследования перенесших вирусную инфекцию лососевых рыб проводят в летнее время, когда в крови появляются специфические антитела и вероятность выделения вируса ИНГТ незначительна. Работа заключается в выявлении имевшего место контакта рыб с вирусом путем детектирования продуцируемых ими антител и имеет целью проведение предварительной оценки эпизоотической ситуации для последующего осуществления прямых вирусологических исследований в хозяйствах. Поиск антител, нейтрализующих антигены вируса ИНГТ, осуществляют с помощью реакции нейтрализации в культуре клеток папулозной эпителиомы карпа (ЕРС) и иммуноферментного анализа (ИФА) [4]. Однако для всех этих методов характерны весьма существенные недостатки: значительная трудоемкость при проведении и учете результатов, высокие требования к условиям постановки анализов, наличие дорогостоящего и высокоточного оборудования, специально подготовленного персонала.

Наряду с зарекомендовавшими себя методами разрабатываются и используются другие, позволяющие повысить экспрессность и упростить проведение анализа, в частности реакция агглютинации латекса (РАЛ) [5-7], являющаяся доступным и простым методом иммунодиагностики. Важным преимуществом латекс-агглютинационного анализа является возможность его проведения как в условиях лаборатории, так и непосредственно на рыбоводных хозяйствах. Создание латексных наборов является сравнительно простой задачей, не требующей особых условий и глубокой методической подготовки. Стоимость исследования значительно ниже, чем при использовании других диагностических тестов. Реакция длится от 10 до 30 минут. При этом метод является достаточно чувствительным и специфичным. Сущность РАЛ основана на использовании латексных препаратов, представляющих собой микроскопические полимерные частицы органического происхождения, на поверхности которых предварительно адсорбируют биоспецифические антигены. При последующем нанесении подлежащих тестированию жидкостей (сыворотка крови, асцитная жидкость) специфические антитела адсорбируются на поверхности носителя и происходит специфическая реакция агглютинации. Основным недостатком РАЛ является вероятность получения неспецифической агглютинации. Однако количество ложнопо-ложительных результатов минимизируют благодаря использованию положительных и отрицательных контролей и применению современных технологий изготовления латексных препаратов [5].

Основной целью исследований являлась разработка метода выявления антител к антигенам вируса ИНГТ лососевых на основе полистирольных латексных частиц, сенсибилизированных специфичными антигенами.

Материалы и методы исследований

В работе использовали вирус ИНГТ штамма «Аркус 32/87», репродуцированный в монослой-ной перевиваемой культуре клеток папулезной эпителиомы карпа (ЕРС) в среде ДМЕМ, с титром инфекционной активности 7,25 ^ ТЦД50/мл. Полученную вирусную клеточную суспензию очищали и концентрировали так, как описано ранее [8].

Для экспериментов использовали полистирольные латексные частицы производства ООО «Диафарм» (г. Санкт-Петербург), имеющие диаметр 340 нм и несущие на своей поверхности функциональные группы -СООН, -КН2, ^О4. Латексные препараты готовили по схеме, предложенной в предыдущей работе [8]. При этом отмывание латексных частиц от раствора сурфактанта, в котором они находились, осуществляли с помощью глицин-солевого буферного раствора (ГСБР) (0,1 М хло-

ристый натрий, 0,1 М глицин) с оптимальными для сенсибилизации латексов значениями рН (8,3 -для карбоксилированных частиц, 6,7 - для аминированных частиц, 6,3 - для частиц с SO^^yn^M^. Сенсибилизацию латексных частиц с разными функциональными группами (-COOH, -NH2, -SO4) проводили антигенами вируса ИНГТ с концентрациями 2000, 1000, 500, 250 мкг/мл. Для блокирования сайтов неспецифического связывания на поверхности латексов применяли глицин-белковый буферный раствор (ГББР), содержащий 1 % бычьего сывороточного альбумина в ГСБР.

Для определения аналитической чувствительности синтезированных латексных препаратов готовили серию разведений (1:100- 1:12800) сывороток крови, содержащих поликлональные антитела, нейтрализующие антигены вируса ИНГТ (с концентрациями 29, 14,5, 7,2, 3,6, 1,8 мг/мл, 900, 450, 225 мкг/мл), в ГСБР с рН 7,0, при котором вирус ИНГТ стабилен [9]. Положительными и отрицательными контрольными препаратами служили сыворотки крови, содержащие и не содержащие антитела против вируса ИНГТ соответственно. Тест на неспецифическую агглютинацию проводили с помощью ГББР. Для определения диагностической чувствительности разработанной тест-системы в РАЛ и непрямом варианте ТФ ИФА исследовали 20 позитивных сывороток крови от лососевых рыб, больных ИНГТ. С целью определения диагностической специфичности латексных препаратов с помощью этих же методов исследовали 20 негативных сывороток крови от здоровых рыб. Постановку диагноза осуществляли при анализе эпизоотической ситуации, клинических признаков, патологоанатомических изменений у рыб, а также на основании результатов реакции вирусовыделения в культуре клеток ЕРС, непрямого варианта ТФ ИФА, РИФ и ОТ ПЦР в соответствии с требованиями OIE Aquatic Animal Health Code (2014) [2]. Для постановки реакции использовали обычные стекла размером 8x12 см. Реакцию учитывали в течение 10-30 минут от начала постановки реакции. Результаты оценивали визуально по системе 4 крестов: ++++ - крупнозернистая агглютинация на фоне прозрачной жидкости; +++ - мелкозернистая агглютинация на полупрозрачном фоне; ++ - мелкозернистая агглютинация на мутном фоне; + - слабозаметная агглютинация на мутном фоне; — - отсутствие агглютинации, фон равномерно мутный (рис. 1).

Положительным результатом считали агглютинацию на 2-4 креста, сомнительным - 1 крест. При отсутствии агглютинации результат считали отрицательным. РАЛ учитывали, если с положительной контрольной сывороткой наблюдалась агглютинация на 3-4 креста (рис. 1, а), а с отрицательной сывороткой (рис. 1, б) и с ГББР отсутствовала (рис. 1, в).

Рис. 1. Реакция агглютинации латекса на выявление антигенов вируса ИНГТ: а) положительный контроль; б) отрицательный контроль; в) - тест на спонтанную агглютинацию

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью критерия Мак-Нимара, рассчитывая распределение х . Экспериментальное значение х2 рассчитывали по формуле

Х2эк= (|Ь - с| - 1)2/(Ь + с),

где Ь - ложноположительные результаты, с - ложноотрицательные результаты. Критическое значение определяли, пользуясь таблицей доверительных границ критерия ( со степенью свободы f = 1

для разных уровней значимости р. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Для оценки диагностической ценности тест-систем определяли диагностическую чувствительность и специфичность и общую точность которые рассчитывали по формулам:

Se = а/(а + с)* 100 %, Sp = А/(А + Ь)*100 %, S = (а + А)/(а + Ь + с + А),

где а - достоверноположительные результаты, Ь - ложноположительные результаты, с - ложноотри-цательные результаты, А - достоверноотрицательные результаты [10].

Результаты и их обсуждение

Результаты определения степени адсорбции антигенов вируса ИНГТ на поверхности полисти-рольных латексных частицах с разными функциональными группами (-СООН, -КН2, ^О4) методом Лоури приведены в табл. 1.

Таблица 1

Определение степени сенсибилизации полистирольных латексных частицах с разными функциональными группами

№ п/п Функциональная группа латексных частиц Концентрация антигена вируса ИНГТ до адсорбции, мкг/мл Средняя концентрация адсорбированного белка, мкг/мл Степень адсорбции, % Степень сенсибилизации латексных частиц, %

1 -СООН 2000 711,33±0,06 35,57±0,05 100

2 1000 708,67±0,09 70,83±0,10 100

3 750 708,33±0,08 94,46±0,09 100

4 500 500 100 70,45±0,05

5 250 250 100 35,24±0,04

6 -КН2 2000 715,33±0,06 35,77±0,04 100

7 1000 714,33±0,08 71,37±0,07 100

8 750 714,17±0,09 95,22±0,14 100

9 500 500 100 69,71±0,20

10 250 250 100 34,85±0,10

11 ^О4 2000 699,05±0,05 34,95±0,07 100

12 1000 699,67±0,06 69,77±0,10 100

13 750 699,77±0,12 93,29±0,33 100

14 500 500 100 71,55±0,05

15 250 250 100 35,75±0,02

Из табл. 1 видно, что в зависимости от исходной концентрации антигенов вируса ИНГТ степень сенсибилизации карбоксилированных полистирольных латексных частиц колебалась от 35,24 ± 0,04 % до 100 %, аминированных - от 34,85 ± 0,10 % до 100 %, латексных частиц с SO4-группами - от 35,75 ± ± 0,02 % до 100 %. При сенсибилизации полистирольных латексных частиц антигеном с концентрациями 500 и 250 мкг/мл на поверхности микросфер адсорбировался весь белок, однако возможно адсорбировать большое количество антигена, что подтверждали данные, полученные при использовании антигенов вируса с концентрациями 750, 1000 и 2000 мкг/мл. Максимальная степень сенсибилизации микросфер достигалась при исходной концентрации антигенов вируса ИНГТ 750 мкг/мл и более.

Анализируя данные таблицы 1, определяли максимальное количество антигена вируса ИНГТ, которое адсорбировано на поверхности полистирольных латексных частиц с разными функциональными группами (-СООН, -КН2, ^О4) (табл. 2).

Таким образом, наибольшее количество антигенов вируса ИНГТ адсорбировалось на поверхности аминированных полистирольных частиц (714,61±0,29 мкг/мл), наименьшее - на поверхности частиц с группами ^О4 (699,81±0,52 мкг/мл). Оптимальная концентрация антигенов вируса ИНГТ для сенсибилизации латексных препаратов с разными функциональными группами (-СООН, -КН2, ^О4), проявляющих наибольшую аналитическую чувствительность, составляла 750 мкг/мл. Выявлена зависимость степени сенсибилизации латексных частиц с разными функциональными группами от концентрации антигенов вируса ИНГТ (рис. 2).

Таблица 2

Максимальное количество антигенов вируса ИНГТ, адсорбированного на поверхности латексных частиц с разными функциональными группами

Функциональная группа полистирольных латексных частиц Концентрация антигенов вируса ИНГТ, адсорбированного на поверхности частиц, мкг/мл Максимальная концентрация вируса ИНГТ, адсорбированного на поверхности частиц, мкг/мл

-СООН 711,33 709,44±0,77

708,67

708,33

-КН2 715,33 714,61±0,29

714,33

714,17

^О4 698,05 699,60±0,52

699,67

699,77

Рис. 2. Зависимость степени сенсибилизации латексных частиц от концентрации антигенов вируса ИНГТ до адсорбции: а) для латексных частиц с группами -СООН; б) для латексных частиц с группами -№Н2; в) для латексных с группами ^О4

Определяли аналитическую чувствительность приготовленных латексных препаратов для более точной оценки их диагностических возможностей. Для этого готовили серию разведений сывороточных белков против антигенов вируса ИНГТ в ГСБР с диапазоном концентраций от 29 мг/мл до 230 мкг/мл. Латекс-агглютинационный анализ проводили в течение 10 минут при комнатной температуре, затем стекла с реагентами на 20 минут помещали во влажную камеру. Учет результатов проводили через 10-30 минут (табл. 3).

Таблица 3

Аналитическая чувствительность полистирольных латексных препаратов с разными функциональными группами

Характеристика полистирольного латексного Концентрация специфических поликлональных

препарата антител, мг/мл

функцио- концентрация титр ин- 29 14,5 7,2 3,6 1,8 0,9 0,45 0,23

нальная к антигенов фекци-

группа d микросфер, вируса ИНГТ для адсорбции, мкг/мл онной активности виру-

са ИНГТ, ^ ТЦД50/мл

-КН2 340 2000 6,95 4+ 4+ 4+ 3+ 2+ 2+ 1+ 0

1000 6,65 4+ 4+ 4+ 3+ 2+ 2+ 1+ 0

750 6,50 4+ 4+ 4+ 3+ 2+ 2+ 1+ 0

500 6,35 4+ 3+ 3+ 2+ 1+ 0 0 0

250 6,05 2+ 2+ 2+ 1+ 1+ 0 0 0

-СООН 340 2000 6,95 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ 1+ 1+ 0

1000 6,65 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ 1+ 1+ 0

750 6,50 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ 1+ 1+ 0

500 6,35 4+ 3+ 3+ 2+ 1+ 0 0 0

250 6,05 3+ 2+ 2+ 1+ 1+ 0 0 0

^О4 340 2000 6,95 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ 1+ 0 0

1000 6,65 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ 1+ 0 0

750 6,50 4+ 4+ 3+ 2+ 2+ 1+ 0 0

500 6,35 4+ 3+ 3+ 2+ 1+ 1+ 0 0

250 6,05 2+ 2+ 2+ 1+ 0 0 0 0

Табл. 3 показывает, что визуальный предел обнаружения на 2 креста поликлональных антител, специфичных к антигенам вируса ИНГТ, при использовании аминированных латексных частиц, сенсибилизированных 750 мкг антигена/мл, составил 0,90 мг/мл, латексных микросфер с группами -СООН и ^О4 с той же концентрацией вируса - 1,80 мг/мл при учете реакции через 10 минут. Аналогичные данные получены через 30 минут. Эксперименты показали, что для проведения РАЛ достаточно 10 минут.

Таким образом, наилучшие показатели аналитической чувствительности синтезированных ла-тексных препаратов отмечали при иммобилизации микросфер антигенами вируса ИНГТ с концентрациями 2000, 1000 и 750 мкг/мл. Достаточной для сенсибилизации латексов являлась концентрация вируса ИНГТ 750 мкг/мл (714,61 ± 0,29 мкг/мл - для аминированных латексов; 709,44 ± 0,77 - для карбоксилированных латексов; 699,60 ± 0,52 мкг/мл - для частиц латекса с группами ^О4). Следовательно, с экономической точки зрения использовать поликлональные антитела с концентрациями 1000 и 2000 мкг/мл для сенсибилизации латексов нецелесообразно. При повышении исходной концентрации антигенов степень их адсорбции и аналитическая чувствительность синтезированных ла-тексных препаратов не изменялись (0,90 мг/мл антител - для аминированных латексов, 1,80 мг/мл антител - для латексных микросфер с -СООН и ^О4 группами). При понижении исходной концентрации антигенов вируса ИНГТ значения аналитической чувствительности препаратов и степени ад-

сорбции значительно снижались. Таким образом, сенсибилизированные вирусом ИНГТ аминирован-ные латексные частицы позволяли выявлять специфические антитела в сыворотках крови с концентрацией иммуноглобулинов более 0,90 мг/мл.

Для оценки диагностической чувствительности (Se) и специфичности (Sp) разработанной тест-системы 20 сывороток крови от рыб больных ИНГТ и 20 - от здоровых параллельно исследовали в РАЛ и ИФА на выявление антител, нейтрализующих антигены данного вируса. Готовили разведения испытуемых сывороток в диапазоне 1:100-1:12800 в ГСБР. РАЛ проводили, как описано выше, применяя аминированный латексный препарат, сенсибилизированный вирусом ИНГТ с исходной концентрацией 750 мкг/мл, имеющий лучшие диагностические характеристики. Результаты учитывали визуально через 10 минут после постановки реакции. Положительными считались образцы, дающие агглютинацию на 2-4 креста, сомнительными - вызывающие агглютинацию на 1 крест, отрицательными - не вызывающие агглютинацию. Параллельно сыворотки тестировали в непрямом варианте ТФ ИФА. При анализе в ИФА концентрацию сывороточных антител определяли с помощью калибровочной кривой (по 3 измерениям) на многоканальном спектрофотометре (компьютерная программа Magellan for F50 V 7.0). Со всеми 20 сыворотками, не содержащими антитела к антигенам вируса ИНГТ, в РАЛ отмечалось отсутствие агглютинации (b = 0, d = 20). Таким образом, диагностическая специфичность латексного препарата, полученного на основе аминированного латекса с диаметром частиц 340 нм (ООО «Диафарм»), составила в РАЛ 100 %.

Таблица 4

Результаты исследования в РАЛ и ИФА сывороток, содержащих антитела, специфичные к антигенам вируса ИНГТ

№ Результаты исследования в ИФА Результаты исследования в РАЛ

сыворотки

+/- концентрация антител, специфичных к вирусу ИНГТ, мг/мл титр антител, специфичных к вирусу ИНГТ, lg титр антител, специфичных к вирусу ИНГТ, lg количество крестов (через 10 и 30 минут одинаковое) положительный/ сомнительный/ отрицательный

1 + 1,90 3,2 3,2 2 положительный

2 + 3,50 3,5 3,5 3 положительный

3 + 1,40 3,2 2,9 2 положительный

4 + 2,10 3,2 3,2 2-3 положительный

5 + 6,90 3,8 3,8 4 положительный

6 + 7,10 3,8 3,8 4 положительный

7 + 2,30 3,2 3,2 2-3 положительный

8 + 1,80 3,2 3,2 2 положительный

9 + 1,70 3,2 3,2 2 положительный

10 + 3,30 3,5 3,2 3 положительный

11 + 3,90 3,5 3,5 3 положительный

12 + 2,10 3,2 3,2 2-3 положительный

13 + 1,60 3,2 2,9 2 положительный

14 + 1,80 3,2 3,2 2 положительный

15 + 7,10 3,8 3,8 4 положительный

16 + 1,20 3,2 2,9 2 положительный

17 + 3,00 3,5 3,5 3 положительный

18 + 3,50 3,5 3,5 3 положительный

19 + 1,00 3,2 2,3 1 сомнительный

20 + 0,90 3,2 2,0 0 отрицательный

Результаты исследования в ИФА и РАЛ сывороток, содержащих антитела, которые нейтрализуют антигены вируса ИНГТ, представлены в табл. 4. Из 20 положительных в ИФА сывороток в РАЛ 18 были положительными, 1 - сомнительной и 1 - отрицательной (а = 18, с = 2). Диагностическая чувствительность аминированного латексного препарата составила в РАЛ 90 %, общая точность теста - 95 %. Расчеты проводили в соответствии с методикой оценки эффективности диагностических исследований, описанной выше [10]. Статистическую обработку данных проводили с помощью критерия Мак-Нимара. Экспериментальное значение %2 составляло 13,13. Критическое значение при / = 1 и р = 0,001 было равно 10,8. В итоге выявлено, что экспериментальные значения критерия больше критического с вероятностью ошибки р < 0,001. Таким образом, с достоверностью более 99 % можно утверждать, что разработанная тест-система позволяет выявлять антитела к антигенам вируса ИНГТ.

Титры сывороток антител определяли в ИФА и РАЛ, исследуя 20 положительных сывороток в диапазоне разведений 1:100-1:12800. По сравнению с ИФА в РАЛ 14 образцов показали те же титры антител, в то время как у 6 сывороток (№ 3, 10, 13, 16, 19, 20) значения титров были ниже (рис. 3).

3,5

ш

я ^

и

ж >.

11

т m

Р m

О *

о. Z О

ш

а =

и -е-

2,5

-15

\ ИФА

0,5 -

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 №п/п сыворотки крови

Рис. 3. Корреляция между результатами по определению титров сывороточных антител, специфичных к вирусу ИНГТ, в РАЛ и ИФА

На основании данных, полученных в РАЛ и ИФА (табл. 4), можно выделить 3 группы исследуемых сывороток по диагностическому критерию, позволяющему точно интерпретировать результаты РАЛ. Положительная группа - сыворотки, вызывающие агглютинацию на 2-4 креста и содержащие антитела, специфичные к вирусу ИНГТ, с концентрацией 0,90 мг/мл и более, что соответствует установленному пределу аналитической чувствительности полученных латексных тестов. Сомнительная группа - сыворотки, которые вызывают агглютинацию на 1 крест и содержат антитела к антигенам вируса ИНГТ, с концентрацией ниже 0,90 мг/мл и являющиеся положительными в ИФА. Отрицательная группа - сыворотки, не проявляющие агглютинацию, содержащие антитела с концентрацией ниже 0,90 мг/мл и отрицательные по результатам ИФА.

Латексные тесты с разными функциональными группами (-COOH, -NH2, -SO4), сенсибилизированные антигенами вируса ИНГТ с концентрацией 750 мкг/мл, испытывали в РАЛ с неспецифичными антителами (к SVCV (ВВК) - вирусу весенней виремии карпа, Rhabdovirus carpio, р. Vesiculovirus; к VHSV - вирусу геморрагической септицемии, Viral haemorrhagic septicaemia, р. Novirhabdovirus). РАЛ проводили как описано ранее, результаты учитывали визуально через 10-30 минут после постановки реакции (табл. 5).

Из табл. 5 видно отсутствие агглютинации при испытании синтезированных латексных препаратов, имеющих разные функциональные группы и выявляющих антитела против антигенов вируса ИНГТ, с неспецифичными сыворотками, что свидетельствовало о высокой степени специфичности теста по отношению к антителам, нейтрализующим вирус ИНГТ.

Таблица 5

Результаты исследования сывороток, содержащих неспецифичные антитела, с применением латексных препаратов, сенсибилизированных антигенами вируса ИНГТ

Функциональные Результаты Отрицательный Положительный Неспецифичные антитела

группы латексных теста контроль контроль против против

тестов для выявления на спонтанную SVCV VHSV

антител против агглютинацию

вируса ИНГТ

-СООН отрицательный 0 4+ 0 0

отрицательный 0 4+ 0 0

отрицательный 0 4+ 0 0

Заключение

В результате проведенных исследований подобраны условия получения латексных препаратов для выявления сывороточных антител к антигенам вируса ИНГТ, разработаны критерии оценки результатов реакции агглютинации латекса для исследования сывороток, содержащих антитела к антигенам вируса ИНГТ лососевых.

Результаты, полученные с помощью полученных латексных препаратов, являются воспроизводимыми и специфичными при выявлении антител к антигенам вируса ИНГТ. Разработанный метод является простым, легко воспроизводимым и требует небольших затрат труда и времени. Его можно применять в качестве скринингового метода для выявления специфичных к вирусу ИНГТ антител, специфичных к антигенам вируса ИНГТ лососевых рыб.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Щелкунов И.С. Эпизоотическая ситуация по вирусным болезням культивируемых рыб // Ветеринария. 2006. № 4. С. 22-25.

2. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Aquatic Animals. Paris, 2014. Vol. 1. P. 300-313.

3. Рудакова С.Л. Некроз гемопоэтической ткани у производителей нерки и предполагаемые источники инфекции // Вопр. рыбол. 2003. Т. 4, № 1 (13). С. 93-102.

4. Jorgensen P.E.V., Olesen N.J., Lorenzen N., Winton J.R., Ristow S.S. Infectious hematopoietic necrosis (IHN) and viral hemorrhagic septicemia (VHS): detection of trout antibodies to the causative viruses by means of plaque neutralization, immunofluorescence, and enzyme-linked immunosorbent assay // J. Aquat. Anim. Health. 1991. Vol. 3. P. 100-108.

5. Molina-Bolivar J.A., Galisteo-Gonzalez F. Latex Immunoagglutination Assays. J. of Macromolecular Science Part C-Polymer Reviews. 2005. Vol. 45. P. 59-98.

6. Serra J., Javier Gella F., Gener J. Latex agglutination procedures in immunodiagnosis. Pure & Appl. Chem. 1991. Vol. 63, N 8. P. 1131-1134.

7. Назаров Н.А., Рыбаков С.С., Метлин А.Е. Латекс-агглютинационный тест для диагностики бешенства животных // Ветеринария. 2013. № 6. С. 56-61.

8. Доронин М.И., Пыльнов В.А., Рыбаков С.С., Назаров Н.А. Метод латекс-агглютинации для выявления антигенов вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых // Ветеринария. 2014. № 9. С. 56-61.

9. Gaudin Y., Ruigrok R.W., Brunner J. Low-pH induced conformational changes in viral fusion proteins: implications for the fusion mechanism // J. Gen. Virol. 1995. Vol. 76. P. 1541-1556.

10. Сошникова Л.А., Тамашевич В.Н. Многомерный статистический анализ. М.: Юнита-Дана, 1999. С. 350.

Поступила в редакцию 27.01.15

M.I. Doronin, V.A. Pylnov, S.S. Rybakov

METHOD OF LATEX AGGLUTINATION FOR DETECTING ANTIBODIES TO INFECTIOUS HEMATOPOIETIC NECROSIS VIRUS IN SALMON FISHES

Methods of preparation and control of latex-agglutination tests to detect specific antibodies to infectious hematopoietic necrosis virus in salmon fishes have been developed. The sensitization level of latex particles has been determined. The analytical sensitivity of latex preparations was estimated as 90 |g/ml. When analyzing 40 serums of blood of fishes in

latex agglutination test, the sensitivity was 90 % and 100 % correspondingly. This method is simple and quick-to-perform; it can be used as screening method to determine serumal antibodies specific to infectious hematopoietic necrosis virus in salmon fishes. Conditions of synthesizing latex preparations which allow to detect antibodies to infectious hematopoietic necrosis virus in salmon fishes have been selected; criteria of evaluating latex-agglutination test results have been formulated.

Keywords: infectious hematopoietic necrosis of salmon fishes, latex-agglutination test, antibodies, analytical sensitivity, diagnostic sensitivity, diagnostic specificity.

Доронин Максим Игоревич, аспирант E-mail: maks_doronin_2015@mail.ru

Пыльнов Владимир Александрович,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник E-mail: pylnov@arriah.ru

Рыбаков Сергей Сергеевич,

доктор биологических наук, профессор

E-mail: rybakov@arriah.ru

ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец

Doronin M.I., postgraduate student E-mail: maks_doronin_2015@mail.ru

Pylnov V.A.,

Candidate of Biology, Senior researcher E-mail: pylnov@arriah.ru

Rybakov S.S.,

Doctor of Biology, Professor E-mail: rybakov@arriah.ru

Federal Centre for Animal Health

Yurievets neighborhood, Vladimir, Russia, 600901