АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTIGEN RECEPTORS AND THEIR APPLICATIONS

Уровень техники настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антигенным рецепторам и их применениям. T-клетки, сконструированные для экспрессии таких антигенных рецепторов, являются пригодными в лечении заболеваний, характеризующихся экспрессией одного или нескольких антигенов, связанных антигенными рецепторами.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
T-клетки играют центральную роль в клеточно-опосредованном иммунитете у людей и животных. Распознавание и связывание конкретного антигена опосредовано T-клеточными рецепторами (TCR), экспрессируемыми на поверхности T-клеток. TCR T-клетки способен взаимодействовать с иммуногенными пептидами (эпитопами), связанными с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) и представленными на поверхности целевых клеток. Специфическое связывание TCR запускает сигнальный каскад внутри T-клетки, что приводит к пролиферации и дифференцировке в зрелую эффекторную T-клетку.
TCR является частью сложного сигнального аппарата, который предусматривает гетеродимерный комплекс α- и β-цепей TCR, корецептор CD4 или CD8 и модуль сигнальной трансдукции CD3 (фиг. 1). Гетеродимер α/β TCR отвечает за распознавание антигена и, вместе с CD3, за передачу сигнала активации через клеточную мембрану, тогда как цепи CD3 сами по себе передают входящий сигнал к адапторным белкам внутри клетки. Таким образом, перенос цепей α/β TCR дает возможность перенацеливать T-клетки на любой представляющий интерес антиген.
Иммунотерапия на основе адоптивного переноса клеток (ACT) в широком смысле может быть определена как форма пассивной иммунизации предварительно сенсибилизированными T-клетками, которые переносят в организм неиммунизированных реципиентов или аутологичного хозяина после ex vivo размножения из малого количества предшественников до клинически значимого числа клеток. Типы клеток, которые применяли для экспериментов по ACT, включают лимфокин-активированные клетки-киллеры (LAK) (Mule, J.J. et al. (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S.A. et al. (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) (Rosenberg, S.A. et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), лимфоциты донора после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT), а также опухолеспецифические линии или клоны T-клеток (Dudley, M.E. et al. (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173). Было показано, что с помощью адоптивного переноса T-клеток обеспечивается терапевтическая активность в отношении вирусных инфекций человека, например, вызванных CMV. Для адоптивной иммунотерапии меланомы Rosenberg и коллеги разработали подход с использованием ACT, основанный на инфузии in vitro размноженных аутологичных инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL), выделенных из удаленных опухолей, в сочетании с немиелоаблятивной химиотерапией с истощением циркулирующих лимфоцитов и высокими дозами IL2. По результатам клинического исследования доля пациентов с объективным ответом составляла ~50% от общего числа прошедших лечение пациентов, страдающих от метастатической меланомы (Dudley, M.E. et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23: 2346-2357).
Альтернативным подходом является адоптивный перенос аутологичных T-клеток, перепрограммированных для экспрессии реактивного в отношении опухоли рецептора иммунной клетки с определенной специфичностью в процессе кратковременного ex vivo культивирования с последующей реинфузией пациенту (Kershaw M.H. et al. (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8):525-41). Эта стратегия делает ACT применимым к различным распространенным злокачественным новообразованиям, даже если у пациента отсутствуют реактивные в отношении опухоли Т-клетки. Поскольку антигенная специфичность T-клеток целиком обусловлена гетеродимерным комплексом из α- и β-цепей TCR, перенос клонированных генов TCR в T-клетки дает возможность перенаправить их на любой представляющий интерес антиген. Следовательно, генная терапии с использованием TCR обеспечивает перспективную стратегию для разработки в качестве метода лечения антигенспецифической иммунотерапии с применением аутологичных лимфоцитов. Основными преимуществами переноса генов TCR являются получение терапевтических количеств антигенспецифических Т-клеток в течение нескольких дней и возможность привнесения свойств специфичности, которые отсутствуют в эндогенном репертуаре TCR пациента. Несколько исследовательских групп продемонстрировали, что перенос генов TCR является перспективной стратегией для перенаправления специфичности к антигену первичных T-клеток (Morgan, R.A. et al. (2003) J. Immunol. 171, 3287-3295; Cooper, L.J. et al. (2000) J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio, K. et al. (2000) J. Immunol. 165, 528-532; Kessels, H.W. et al. (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. et al. (1986) Nature 320, 232-238). Осуществимость генной терапии с использованием TCR у людей впервые была продемонстрирована в рамках клинических испытаний по лечению злокачественной меланомы Rosenberg и его группой. Адоптивный перенос аутологичных лимфоцитов, трансдуцированных с использованием ретровирусов специфичными к антигенам меланомы/меланоцитов TCR, приводил к регрессии злокачественной опухоли у вплоть до 30% пациентов, у которых лечили меланому (Morgan, R.A. et al. (2006) Science 314, 126-129; Johnson, L.A. et al. (2009) Blood 114, 535-546). В настоящее время поле клинических исследований по генной терапии с использованием TCR также было расширено до злокачественных опухолей, отличных от меланомы, с нацеливанием на различные опухолевые антигены (Park, T.S. et al., (2011) Trends Biotechnol. 29, 550-557).
Применение подходов генной инженерии для введения в T-клетки нацеленных на антиген рецепторов с определенной специфичностью значительно расширило потенциальные возможности ACT. Химерные антигенные рецепторы (CAR) представляют собой вид нацеленного на антиген рецептора, состоящего из внутриклеточных сигнальных доменов T-клетки, слитых с внеклеточными антигенсвязывающими доменами, как правило, одноцепочечными вариабельными фрагментами (scFv) из моноклональных антител. CAR непосредственно распознают антигены клеточной поверхности, независимо от опосредованного MHC представления, что дает возможность применять отдельную конструкцию в виде рецептора, специфическую к любому данному антигену у всех пациентов. В первых CAR сливали домены распознавания антигена с цепью активации CD3ζ комплекса, представляющего собой T-клеточный рецептор (TCR) (фиг. 2). Последующие варианты CAR включали вторичные костимулирующие сигнализаторы вместе с CD3ζ, в том числе внутриклеточные домены из CD28 или ряда молекул семейства рецепторов TNF, таких как 4-1BB (CD137) и OX40 (CD134). Следующие рецепторы третьего поколения в дополнение к CD3ζ включают два костимулирующих сигнализатора, как правило, из CD28 и 4-1BB. CAR второго и третьего поколения характеризовались значительно улучшенной противоопухолевой эффективностью in vitro и in vivo (Zhao et al., (2009) J. Immunol., (183) 5563-5574), в некоторых случаях индуцируя полную ремиссию у пациентов с развившейся злокачественной опухолью (Porter et al., (2011) N.Engl.J.Med., (365) 725-733).
Классический CAR состоит из фрагмента антигенспецифического одноцепочечного антитела (scFv), слитого с трансмембранным и сигнальным доменом, таким как CD3ζ. После введения в T-клетки он экспрессируется в виде мембраносвязанного белка и индуцирует иммунные ответы после связывания с его когнатным антигеном (Eshhar et al., (1993) PNAS, (90) 720-724). Индуцированный антигенспецифический иммунный ответ приводит к активации цитотоксических CD8+ T-клеток, что в свою очередь приводит к устранению экспрессирующих специфический антиген клеток, таких как опухолевые клетки или инфицированные вирусом клетки, экспрессирующие специфический антиген. Однако такие классические CAR-конструкции не активируют/стимулируют T-клетки через их эндогенный CD3-комплекс, который обычно необходим для активации Т-клеток. Благодаря слиянию антигенсвязывающего домена с CD3ζ, активация T-клеток индуцируется по биохимическому «короткому пути» (Aggen et al., (2012) Gene Therapy, (19) 365-374). Такая отличная от физиологической активация T-клеток посредством такого биохимического короткого пути опасна для пациента, которого лечат таким способом, поскольку чрезмерная активация T-клеток может привести к нежелательным побочным эффектам. Например, in vitro наблюдали длительную базальную активацию рекомбинантных T-клеток в результате экспрессии CAR («фоновая передача сигнала»), которая приводила к повышенному скоплению ингибиторных молекул, таких как LAG-3, TIM-3 и PD-1, на поверхности рекомбинантных экспрессирующих CAR T-клеток, что в свою очередь приводило к преждевременному истощению Т-клеток, что впоследствии оказывало сильное негативное воздействие на ответ в отношении опухолевых клеток in vivo (Long et al., (2015) Nat. Med., (21) 581-590). Такая нежелательная реакция была ассоциирована с нерегулярной кластеризацией scFv-фрагментов посредством каркасных остатков такого антитела. Кроме того, хотя классические CAR-конструкции такого типа успешно были протестированы в отношении различных форм неоплазии, например, лейкоза (Porter et al., (2011) N.Engl.J.Med., (365) 725-733), они также повлекли за собой развитие опасных для жизни аутоиммунных заболеваний вследствие базальной экспрессии целевого антигена (целевого опухолевого антигена) в нормальных тканях (реакция «on-target/off-tumor»; Morgan et al., (2010) Mol Ther., (18) 843-51).
Альтернативный подход, согласно которому активация T-клетки происходит посредством механизма, более близкого к физиологическому, заключался в обеспечении аналогичного одноцепочечного TCR (scTv)-фрагмента, слитого с константным доменом Cβ, происходящим из T-клеточного рецептора (TCR), и его коэкспрессии с происходящим из TCR константным доменом Cα (Voss et al., (2010) Blood, (115) 5154-5163), последний из которых рекрутирует необходимый эндогенный гомодимер CD3ζ (Call et al., (2002) Cell, (111) 967-79.). Однако для того, чтобы такие конструкции выполняли функцию активаторов иммунной системы, было необходимо, чтобы происходящие из TCR константные домены происходили из TCR мышей, или чтобы в них были включены последовательности мыши (Cohen et al., (2006) Cancer Res., (66) 8878-86), для обеспечения спаривания цепей scTCR и Cα. Тот факт, что такие конструкции для выполнения функции должны содержать ксеногенные последовательности, повышает риск того, что иммунная система при введении будет на них реагировать и снижать или нарушать их терапевтическую эффективность.
Таким образом, существует потребность в обеспечении альтернативных рекомбинантных антигенных рецепторов, при этом, например, рецептор, после связывания антигена, в достаточной мере способен активировать T-клетку, в которой он экспрессирован естественным физиологическим образом, посредством эндогенного CD3-комплекса и, необязательно, без необходимости наличия каких-либо аминокислотных последовательностей, происходящих не из организма человека, по меньшей мере в домене передачи сигнала антигенного рецептора, которые могут индуцировать нежелательный иммунный ответ на сам рекомбинантный антигенный рецептор.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антигенным рецепторам по меньшей мере с двумя антигенсвязывающими центрами. Антигенные рецепторы содержат две пептидные цепи. Согласно одному аспекту каждая из пептидных цепей содержит по меньшей мере два домена, в дополнение к домену передачи сигнала от рецептора иммунной клетки, причем каждый из двух доменов на одной пептидной цепи образует антигенсвязывающий центр с одним из доменов на другой пептидной цепи. Согласно другому аспекту одна из пептидных цепей содержит по меньшей мере четыре домена, в дополнение к домену передачи сигнала от рецептора иммунной клетки, причем два их четырех доменов образуют два антигенсвязывающих центра с двумя остальными доменами на той же пептидной цепи.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к антигенному рецептору, причем рецептор содержит первую пептидную цепь и вторую пептидную цепь, где первая пептидная цепь содержит по меньшей мере первый и второй домены и домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки; вторая пептидная цепь содержит по меньшей мере первый и второй домены и домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки; где первый домен из первой пептидной цепи вместе с одним из доменов из второй пептидной цепи образует первый антигенсвязывающий центр, и где второй домен из первой пептидной цепи вместе с другим доменом из второй пептидной цепи образует второй антигенсвязывающий центр. У антигенного рецептора согласно этому аспекту домены, образующие соответствующие антигенсвязывающие центры, предпочтительно расположены на разных пептидных цепях. Следовательно, антигенсвязывающие центры образованы за счет межмолекулярного взаимодействия доменов.
Согласно одному варианту осуществления каждый из первого и/или второго доменов предусматривает вариабельную область цепи иммуноглобулина или вариабельную область цепи T-клеточного рецептора или участок вариабельной области.
Согласно одному варианту осуществления один из доменов, образующих первый антигенсвязывающий центр, предусматривает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина со специфичностью к антигену или ее участок, а другой домен, образующий первый антигенсвязывающий центр, предусматривает вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина со специфичностью к антигену или ее участок. Согласно одному варианту осуществления один из доменов, образующих второй антигенсвязывающий центр, предусматривает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина со специфичностью к антигену или ее участок, а другой домен, образующий второй антигенсвязывающий центр, предусматривает вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина со специфичностью к антигену или ее участок.
Согласно одному варианту осуществления первый домен из первой пептидной цепи предусматривает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина со специфичностью к антигену или ее участок, а домен из второй пептидной цепи, образующий антигенсвязывающий центр с первым доменом из первой пептидной цепи, предусматривает вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина со специфичностью к антигену или ее участок. Согласно одному варианту осуществления второй домен из первой пептидной цепи предусматривает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина со специфичностью к антигену или ее участок, а домен из второй пептидной цепи, образующий антигенсвязывающий центр со вторым доменом из первой пептидной цепи, предусматривает вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина со специфичностью к антигену или ее участок.
Согласно одному варианту осуществления каждый из первого и второго доменов из первой пептидной цепи предусматривает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина или ее участок; а каждый из первого и второго доменов из второй пептидной цепи предусматривает вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина или ее участок.
Согласно одному варианту осуществления N-концевой домен из первой пептидной цепи вместе с N-концевым доменом из второй пептидной цепи образует антигенсвязывающий центр; и C-концевой домен из первой пептидной цепи вместе с C-концевым доменом из второй пептидной цепи образует антигенсвязывающий центр.
Согласно одному варианту осуществления N-концевой домен из первой пептидной цепи вместе с C-концевым доменом из второй пептидной цепи образует антигенсвязывающий центр; и C-концевой домен из первой пептидной цепи вместе с N-концевым доменом из второй пептидной цепи образует антигенсвязывающий центр.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к антигенному рецептору, причем рецептор содержит первую пептидную цепь и вторую пептидную цепь, где первая пептидная цепь содержит по меньшей мере четыре домена и домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки; вторая пептидная цепь содержит домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки; где два из доменов из первой пептидной цепи образуют первый антигенсвязывающий центр, и где другие два домена из первой пептидной цепи образуют второй антигенсвязывающий центр. У антигенного рецептора согласно этому аспекту домены, образующие соответствующие антигенсвязывающие центры, предпочтительно расположены на одной и той же пептидной цепи. Следовательно, антигенсвязывающие центры образованы за счет внутримолекулярного взаимодействия доменов.
Согласно одному варианту осуществления каждый из четырех доменов предусматривает вариабельную область цепи иммуноглобулина или вариабельную область цепи T-клеточного рецептора или участок вариабельной области.
Согласно одному варианту осуществления один из доменов, образующих первый антигенсвязывающий центр, предусматривает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина со специфичностью к антигену или ее участок, а другой домен, образующий первый антигенсвязывающий центр, предусматривает вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина со специфичностью к антигену или ее участок. Согласно одному варианту осуществления один из доменов, образующих второй антигенсвязывающий центр, предусматривает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина со специфичностью к антигену или ее участок, а другой домен, образующий второй антигенсвязывающий центр, предусматривает вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина со специфичностью к антигену или ее участок.
Согласно одному варианту осуществления два N-концевых домена из четырех доменов вместе образуют антигенсвязывающий центр; и два C-концевых домена из четырех доменов вместе образуют антигенсвязывающий центр.
Согласно одному варианту осуществления один из двух N-концевых доменов из четырех доменов предусматривает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина или ее участок, а другой из двух N-концевых доменов из четырех доменов предусматривает вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина или ее участок; и один из двух C-концевых доменов из четырех доменов предусматривает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина или ее участок, а другой из двух C-концевых доменов из четырех доменов предусматривает вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина или ее участок.
Согласно одному варианту осуществления антигенных рецепторов по настоящему изобретению домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки предусматривает константную или инвариантную области цепи T-клеточного рецептора или константную или инвариантную области цепи Fc-рецептора иммунной клетки или участок константной или инвариантной областей. Согласно одному варианту осуществления антигенных рецепторов по настоящему изобретению (i) первая пептидная цепь предусматривает константную область альфа-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, а вторая пептидная цепь предусматривает константную область бета-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, или (ii) первая пептидная цепь предусматривает константную область бета-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, а вторая пептидная цепь предусматривает константную область альфа-цепи T-клеточного рецептора или ее участок.
Согласно одному варианту осуществления антигенных рецепторов по настоящему изобретению домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки происходит из организма человека.
Согласно одному варианту осуществления антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит (a) линкер(-ы), соединяющий(-ие) домены антигенного рецептора. Согласно одному варианту осуществления антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит один или несколько линкеров между доменами, образующими антигенсвязывающие центры, и/или между доменами, образующими антигенсвязывающие центры, и доменами передачи сигнала от рецептора иммунной клетки. Линкер может представлять собой случайную аминокислотную последовательность любой длины, при условии, что она не нарушает функции антигенного рецептора, как, например, способность антигенного рецептора связывать антиген или связываться с эндогенным CD3-комплексом, или не нарушает способность антигенного рецептора индуцировать иммунный ответ после связывания антигена.
Согласно одному варианту осуществления антигенных рецепторов по настоящему изобретению первый и второй антигенсвязывающие центры связываются с одним и тем же антигеном или с разными антигенами. Согласно одному варианту осуществления антигенных рецепторов по настоящему изобретению первый и второй антигенсвязывающие центры связываются с разными эпитопами на одном и том же антигене. Следовательно, тогда как домены, образующие первый антигенсвязывающий центр, предпочтительно происходят из одного и того же иммуноглобулина, и домены, образующие второй антигенсвязывающий центр, предпочтительно происходят из одного и того же иммуноглобулина, домены, образующие первый антигенсвязывающий центр, и домены, образующие второй антигенсвязывающий центр, происходят из одного и того же или из разных иммуноглобулинов, причем указанные разные иммуноглобулины связываются с одним и тем же или с разными антигенами.
Согласно одному варианту осуществления антиген является специфическим для заболевания антигеном, предпочтительно опухолевым антигеном. Согласно одному варианту осуществления антиген экспрессируется на поверхности клетки.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к пептидной цепи любого из антигенных рецепторов по настоящему изобретению. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к пептидной цепи, содержащей первый и второй домены, каждый из которых предусматривает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина или ее участок, или предусматривает вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина или ее участок, и где пептидная цепь дополнительно содержит домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к пептидной цепи, которая содержит по меньшей мере четыре домена и домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки, где два из доменов из пептидной цепи образуют первый антигенсвязывающий центр, а другие два домена из пептидной цепи образуют второй антигенсвязывающий центр. Дополнительные варианты осуществления пептидных цепей по настоящему изобретению являются такими, как описано в настоящем документе для антигенных рецепторов по настоящему изобретению.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к клетке, в частности, иммунной эффекторной клетке, такой как T-клетка, генетически модифицированной для экспрессии антигенного рецептора по настоящему изобретению. Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке, в частности, иммунной эффекторной клетке, такой как T-клетка, экспрессирующей первую пептидную цепь, вторую пептидную цепь, или как первую, так и вторую пептидные цепи антигенного рецептора по настоящему изобретению, или экспрессирующей пептидную цепь по настоящему изобретению. Дополнительные варианты осуществления клетки или рекомбинантной клетки по настоящему изобретению являются такими, как описано в настоящем документе для антигенных рецепторов по настоящему изобретению или пептидных цепей по настоящему изобретению.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу получения клетки, экспрессирующей антигенный рецептор по настоящему изобретению, причем способ предусматривает: (a) получение клетки; (b) получение первой генетической конструкции, кодирующей первую пептидную цепь антигенного рецептора по настоящему изобретению; (c) получение второй генетической конструкции, кодирующей вторую пептидную цепь антигенного рецептора по настоящему изобретению; (d) введение первой и второй генетических конструкций в клетку; и (e) обеспечение возможности экспрессии конструкций в клетке. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу получения клетки, экспрессирующей антигенный рецептор, при этом рецептор содержит первую пептидную цепь и вторую пептидную цепь, причем способ предусматривает: (a) получение клетки; (b) получение первой генетической конструкции, кодирующей первую пептидную цепь, содержащую по меньшей мере первый и второй домены и домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки; (c) получение второй генетической конструкции, кодирующей вторую пептидную цепь, содержащую по меньшей мере первый и второй домены и домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки; (d) введение первой и второй генетических конструкций в клетку; и (e) обеспечение возможности экспрессии конструкций в клетке, где первый домен из первой пептидной цепи вместе с одним из доменов из второй пептидной цепи способен образовывать первый антигенсвязывающий центр, и где второй домен из первой пептидной цепи вместе с другим доменом из второй пептидной цепи способен образовывать второй антигенсвязывающий центр. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу получения клетки, экспрессирующей антигенный рецептор, при этом рецептор содержит первую пептидную цепь и вторую пептидную цепь, причем способ предусматривает: (a) получение клетки; (b) получение первой генетической конструкции, кодирующей первую пептидную цепь, содержащую по меньшей мере четыре домена и домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки; (c) получение второй генетической конструкции, кодирующей вторую пептидную цепь, содержащую домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки; (d) введение первой и второй генетических конструкций в клетку; и (e) обеспечение возможности экспрессии конструкций в клетке, где два из доменов из первой пептидной цепи способны образовывать первый антигенсвязывающий центр, и где другие два домена из первой пептидной цепи способны образовывать второй антигенсвязывающий центр. Согласно одному варианту осуществления способов по настоящему изобретению экспрессия антигенного рецептора имеет место на клеточной поверхности. Согласно одному варианту осуществления способов по настоящему изобретению первая пептидная цепь и вторая пептидная цепь предусмотрены в одной генетической конструкции. Согласно одному варианту осуществления способов по настоящему изобретению клетка представляет собой клетку человека. Согласно одному варианту осуществления способов по настоящему изобретению клетка представляет собой иммунную эффекторную клетку, такую как T-клетка. Согласно одному варианту осуществления способов по настоящему изобретению генетические конструкции предусматривают ДНК и/или РНК. Дополнительные варианты осуществления способов по настоящему изобретению являются такими, как описано в настоящем документе для антигенных рецепторов по настоящему изобретению.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке, в частности, иммунной эффекторной клетке, такой как T-клетка, полученной с помощью способов получения клетки, экспрессирующей антигенный рецептор, по настоящему изобретению. Дополнительные варианты осуществления рекомбинантной клетки по настоящему изобретению являются такими, как описано в настоящем документе для антигенных рецепторов по настоящему изобретению или способов получения клетки, экспрессирующей антигенный рецептор, по настоящему изобретению.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, такой как ДНК или РНК, кодирующей первую пептидную цепь, вторую пептидную цепь или как первую, так и вторую пептидные цепи антигенного рецептора по настоящему изобретению, или кодирующей пептидную цепь по настоящему изобретению. Дополнительные варианты осуществления нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению являются такими, как описано в настоящем документе для антигенных рецепторов по настоящему изобретению или пептидных цепей по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение в целом охватывает лечение заболеваний путем целенаправленного воздействия на клетки, экспрессирующие на клеточной поверхности один или несколько антигенов, такие как пораженные заболеванием клетки, экспрессирующие на клеточной поверхности один или несколько специфических для заболевания антигенов, в частности, клетки злокачественной опухоли, экспрессирующие на клеточной поверхности один или несколько опухолевых антигенов, с применением антигенных рецепторов по настоящему изобретению. Способы предусматривают избирательное уничтожение клеток, которые экспрессируют на своей поверхности один или несколько антигенов, за счет чего сводится к минимуму неблагоприятное воздействие на нормальные клетки, не экспрессирующие антиген(-ы). Согласно одному варианту осуществления вводят T-клетки, генетически модифицированные для экспрессии антигенного рецептора по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на клетки посредством связывания с антигеном(-ами). T-клетки способны распознавать пораженные заболеванием клетки, экспрессирующие на клеточной поверхности антиген(-ы), что приводит в результате к уничтожению пораженных заболеванием клеток. Согласно одному варианту осуществления популяция целевых клеток или целевая ткань представляют собой опухолевые клетки или опухолевую ткань.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антигенный рецептор по настоящему изобретению, рекомбинантную клетку по настоящему изобретению или нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно применять в качестве лекарственного препарата, в частности, в лечении заболевания, такого как злокачественная опухоль, характеризующаяся экспрессией одного или нескольких антигенов, которые связываются антигенным рецептором по настоящему изобретению, как, например, один или несколько опухолевых антигенов.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, предусматривающему введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по настоящему изобретению, где заболевание характеризуется экспрессией по меньшей мере одного антигена, такого как опухолевый антиген, который связывается антигенным рецептором.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта с заболеванием, нарушением или состоянием, ассоциированными с экспрессией или повышенным уровнем экспрессии по меньшей мере одного антигена, причем способ предусматривает введение субъекту T-клеток, генетически модифицированных для экспрессии антигенного рецептора по настоящему изобретению, нацеленного по меньшей мере на один антиген. Согласно одному варианту осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой злокачественную опухоль. Согласно одному варианту осуществления T-клетки могут быть аутологичными, аллогенными или сингенными по отношению к субъекту.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения антигенный рецептор связывается только с одним антигеном (например, будучи моноспецифическим и распознавая один и тот же эпитоп, или будучи биспецифическим или полиспецифическим и распознавая разные эпитопы на одном и том же антигене) или связывается с разными антигенами, в частности, двумя разными антигенами.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения способ лечения дополнительно предусматривает получение образца клеток от субъекта, причем образец содержит T-клетки или предшественники T-клеток, и трансфицирование клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей антигенный рецептор по настоящему изобретению, с получением T-клеток, генетически модифицированных для экспрессии антигенного рецептора. Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения T-клетки, генетически модифицированные для экспрессии антигенного рецептора, стабильно или транзиентно трансфицированы нуклеиновой кислотой, кодирующей антигенный рецептор. Таким образом, нуклеиновая кислота, кодирующая антигенный рецептор, интегрирована или не интегрирована в геном T-клеток. Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения T-клетки и/или образец клеток происходят из организма субъекта, которому вводят T-клетки, генетически модифицированные для экспрессии антигенного рецептора. Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения T-клетки и/или образец клеток происходят из организма млекопитающего, отличного от млекопитающего, которому вводят T-клетки, генетически модифицированные для экспрессии антигенного рецептора.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения T-клетки, генетически модифицированные для экспрессии антигенного рецептора, инактивированы в отношении экспрессии эндогенного T-клеточного рецептора и/или эндогенного HLA.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения антиген экспрессируется в пораженной заболеванием клетке, такой как клетка злокачественной опухоли. Согласно одному варианту осуществления антиген экспрессируется на поверхности пораженной заболеванием клетки, такой как клетка злокачественной опухоли. Согласно одному варианту осуществления антигенный рецептор связывается с внеклеточным доменом или эпитопом внеклеточного домена антигена. Согласно одному варианту осуществления антигенный рецептор связывается с нативными эпитопами антигена, находящегося на поверхности живых клеток. Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения антиген представляет собой опухолевый антиген. Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения антиген выбран из группы, состоящей из клаудинов, таких как клаудин 6 и клаудин 18.2, CD19, CD20, CD22, CD33, CD123, мезотелина, CEA, c-Met, PSMA, GD-2 и NY-ESO-1. Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения антиген представляет собой патогенный антиген. Патоген может представлять собой патоген, относящийся к грибам, вирусам или бактериям. Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения экспрессия антигена имеет место на клеточной поверхности. Согласно одному варианту осуществления антигеном является клаудин, в частности, клаудин 6 или клаудин 18.2, и при этом указанный антигенный рецептор связывается с первой внеклеточной петлей указанного клаудина. Согласно одному варианту осуществления связывание указанного антигенного рецептора, который экспрессируется T-клетками и/или присутствует на поверхности T-клеток, с присутствующим на поверхности клеток антигеном, приводит к осуществлению иммунных эффекторных функций указанных T-клеток, как, например, высвобождение цитокинов. Согласно одному варианту осуществления связывание указанного антигенного рецептора, который экспрессируется T-клетками и/или присутствует на поверхности T-клеток, с антигеном, присутствующим на поверхности клеток, таких как антиген-представляющие клетки, приводит к стимуляции, примированию и/или размножению указанных T-клеток. Согласно одному варианту осуществления связывание указанного антигенного рецептора, который экспрессируется T-клетками и/или присутствует на поверхности T-клеток, с антигеном, присутствующим на поверхности пораженных заболеванием клеток, таких как клетки злокачественной опухоли, приводит к цитолизу и/или апоптозу пораженных заболеванием клеток, при этом из указанных T-клеток предпочтительно высвобождаются цитотоксические факторы, например, перфорины и гранзимы.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения образующие антигенсвязывающие центры домены антигенного рецептора составляют экзодомен антигенного рецептора. Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит трансмембранный домен. Согласно одному варианту осуществления трансмембранный домен представляет собой гидрофобную альфа-спираль, которая пересекает мембрану.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит сигнальный пептид, который направляет образующийся белок к эндоплазматическому ретикулюму. Согласно одному варианту осуществления сигнальный пептид предшествует доменам, образующим антигенсвязывающие центры.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения антигенный рецептор по настоящему изобретению предпочтительно является специфическим к антигену, на который он нацелен, в частности, который присутствует на поверхности клетки, такой как пораженная заболеванием клетка или антиген-представляющая клетка.
Согласно одному варианту осуществления всех аспектов настоящего изобретения антигенный рецептор по настоящему изобретению может экспрессироваться T-клеткой и/или присутствовать на поверхности T-клетки, предпочтительно цитотоксической T-клетки. Согласно одному варианту осуществления T-клетка является реактивной в отношении антигена(-ов), на который(-ые) нацелен антигенный рецептор по настоящему изобретению.
Согласно дополнительному аспекту в настоящем изобретении предусмотрены описанные в настоящем документе средства и композиции для применения в описанных в настоящем документе способах.
Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Хотя настоящее изобретение подробно описано ниже, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено описанными в настоящем документе конкретными методиками, протоколами и реагентами, поскольку они могут различаться. Также следует понимать, что применяемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все применяемые в настоящем документе технические и научные термины имеют те же значения, которые обычно понятны рядовому специалисту в данной области.
Ниже будут описаны признаки настоящего изобретения. Такие признаки перечислены в конкретных вариантах осуществления, однако следует понимать, что их можно комбинировать любым способом и в любом количестве для создания дополнительных вариантов осуществления. Различные описанные примеры и предпочтительные варианты осуществления не должны толковаться как ограничивающие настоящее изобретение только до явно описанных вариантов осуществления. Следует понимать, что настоящее описание является основанием и охватывает варианты осуществления, которые объединяют явным образом описанные варианты осуществления с любым числом раскрытых и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые изменения и комбинации всех описанных признаков в настоящей заявке должны рассматриваться как раскрытые с помощью описания настоящей заявки, если контекстом не указано иное.
Предпочтительно применяемые в настоящем документе термины определены, как описано в “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland.
nd
При осуществлении настоящего изобретения на практике будут использовать, если не указано иное, традиционные в области биохимии, клеточной биологии, иммунологии и методиках рекомбинантных ДНК способы, которые пояснены в литературе в данной области (ср., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
В настоящем описании и нижеследующей формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово «содержать» и варианты, такие как «содержит» и «содержащий», будут подразумевать включение заявленного элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий, хотя согласно некоторым вариантам осуществления такие другие элемент, целое число или стадия или группа элементов, целых чисел или стадий могут быть исключены, т. е. заявляемый объект находится в пределах включения указанных элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий. Формы единственного числа и аналогичные ссылки, применяемые в контексте описания настоящего изобретения (в особенности в контексте формулы изобретения), должны толковаться как охватывающие как единственное, так и множественное число, если в настоящем документе не указано иное или явно не противоречит контексту. Подразумевается, что описание диапазонов значений в настоящем документе служит лишь в качестве сокращенного способа индивидуального указания каждого отдельного значения, подпадающего под диапазон. Если не указано иное, в настоящем документе каждое отдельное значение включено в настоящее описание, как если бы оно было отдельно описано в настоящем документе.
Все описанные в настоящем документе способы можно осуществлять в любом подходящем порядке, если в настоящем документе не указано иное или иным образом явно не противоречит контексту. Применение всех возможных примеров или уточняющих слов (например, «такой как»), предусмотренных в настоящем документе, предназначено просто для лучшей иллюстрации настоящего изобретения, и не является ограничением объема настоящего изобретения, заявленного иным образом. Никакая из формулировок в настоящем описании не должна истолковываться как указание какого-либо незаявленного элемента, необходимого для осуществления настоящего изобретения на практике.
В тексте настоящего описания приведены несколько документов. Каждый из документов, приведенных в настоящем документе (в том числе все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), независимо от того, приведены они выше или ниже, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. Ничто в настоящем документе не должно толковаться как признание того, что настоящее изобретение не имеет права претендовать на первенство в подаче настоящего раскрытия в силу предшествующего изобретения.
Термин «иммунный ответ» относится к интегрированному системному ответу на антиген и предпочтительно относится к клеточному иммунному ответу или клеточному, а также гуморальному иммунному ответу. Иммунный ответ может быть защитным/превентивным/профилактическим и/или терапевтическим.
«Стимуляция иммунного ответа» может означать, что иммунный ответ на конкретный целевой антиген, целевую клетку и/или целевую ткань до стимуляции иммунного ответа отсутствовал, но он также может означать, что до стимуляции иммунного ответа имел место определенный уровень иммунного ответа на конкретный целевой антиген, целевую клетку и/или целевую ткань, и после стимуляции иммунного ответа указанный иммунный ответ был усилен. Таким образом, «стимуляция иммунного ответа» включает «индуцирование иммунного ответа» и «усиление иммунного ответа». Предпочтительно после стимуляции у субъекта иммунного ответа у указанного субъекта предотвращается развитие заболевания, такого как заболевание, относящееся к злокачественной опухоли, или в результате стимуляции иммунного ответа происходит улучшение в отношении болезненного состояния. Например, иммунный ответ на опухолевый антиген может быть вызван у пациента с заболеванием, относящимся к злокачественной опухоли, или у субъекта с риском развития заболевания, относящегося к злокачественной опухоли. Стимуляция иммунного ответа в таком случае может означать, что у субъекта происходит улучшение в отношении болезненного состояния, что у субъекта не развиваются метастазы, или что у субъекта с риском развития заболевания, относящегося к злокачественной опухоли, не развивается заболевание, относящееся к злокачественной опухоли.
+
+
Подразумевается, что «клеточно-опосредованный иммунитет» или «клеточный иммунитет» или подобные термины включают клеточный ответ, направленный на клетки, характеризующиеся экспрессией антигена, в частности, характеризующиеся представлением антигена с помощью MHC класса I или класса II. Клеточный ответ относится к клеткам, называемым T-клетками или T-лимфоцитами, которые выполняют роль либо «хелперов», либо «киллеров». Хелперные T-клетки (также называемые CD4 T-клетками) играют центральную роль, осуществляя регуляцию иммунного ответа, а клетки-киллеры (также называемые цитотоксическими T-клетками, цитолитическими T-клетками, CD8 T-клетками или CTL) уничтожают пораженные заболеванием клетки, такие как клетки злокачественной опухоли, предотвращая образование большего количества пораженных заболеванием клеток.
Термин «антиген» относится к веществу, содержащему эпитоп, на который будет вырабатываться и/или направляться иммунный ответ. Предпочтительно в контексте настоящего изобретения антиген представляет собой молекулу, которая, необязательно после процессирования, индуцирует иммунную реакцию, которая предпочтительно является специфической в отношении антигена или клеток, экспрессирующих антиген, предпочтительно на клеточной поверхности. Термин «антиген» включает, в частности, белки и пептиды. Антиген предпочтительно является продуктом, который соответствует встречающемуся в природе антигену, или происходит из него. Такие встречающиеся в природе антигены могут включать или могут происходить из аллергенов, вирусов, бактерий, грибов, паразитических организмов и других инфекционных агентов и патогенов, или антиген также может представлять собой опухолевый антиген. В соответствии с настоящим изобретением антиген может соответствовать встречающемуся в природе продукту, например, вирусному белку или его части.
Термин «патоген» относится к патогенным микроорганизмам и предусматривает вирусы, бактерии, грибы, одноклеточные организмы и паразитические организмы. Примерами патогенных вирусов являются вирус иммунодефицита человека (HIV), цитомегаловирус (CMV), вирус герпеса (HSV), вирус гепатита A (HAV), HBV, HCV, вирус папилломы и Т-лимфотропный вирус человека (HTLV). Одноклеточные организмы предусматривают плазмодиев, трипаносом, амеб и т. д.
Согласно предпочтительному варианту осуществления антиген является специфическим для заболевания антигеном или ассоциированным с заболеванием антигеном. Термин «специфический для заболевания антиген» или «ассоциированный с заболеванием антиген» относится ко всем антигенам, которые имеют патологическое значение. Согласно одному особенно предпочтительному варианту осуществления антиген присутствует в пораженных заболеванием клетках, тканях и/или органах, но отсутствует или присутствует в малом количестве в здоровых клетках, тканях и/или органах, и, таким образом, его можно применять для целенаправленного воздействия на пораженные заболеванием клетки, ткани и/или органы, например, с помощью T-клеток, несущих антигенный рецептор, нацеленный на антиген. Согласно одному варианту осуществления специфический для заболевания антиген или ассоциированный с заболеванием антиген присутствует на поверхности пораженной заболеванием клетки.
Согласно предпочтительному варианту осуществления антиген представляет собой опухолевый антиген или опухоль-ассоциированный антиген, т. е. компонент клеток злокачественной опухоли, который может происходить из цитоплазмы, клеточной поверхности и клеточного ядра, в частности, такие антигены, которые продуцируются, предпочтительно в большом количестве, в виде поверхностных антигенов на клетках злокачественной опухоли.
В контексте настоящего изобретения термин «опухолевый антиген» или «опухоль-ассоциированный антиген» относится к белкам, которые в нормальных условиях специфично экспрессируются в ограниченном числе тканей и/или органов или на определенных стадиях развития, например, опухолевый антиген в нормальных условиях может специфично экспрессироваться в ткани желудка, предпочтительно в слизистой оболочке желудка, в репродуктивных органах, например, в яичке, ткани трофобласта, например, в плаценте, или в клетках зародышевой линии, и которые экспрессируются или аномально экспрессируются в одной или нескольких тканях опухоли или злокачественной опухоли. В таком контексте «ограниченное число» предпочтительно означает не более 3, более предпочтительно не более 2. Опухолевые антигены в контексте настоящего изобретения включают, например, дифференцировочные антигены, предпочтительно дифференцировочные антигены, специфичные для типа клеток, т.е. белки, которые в нормальных условиях специфично экспрессируются в клетках определенного типа на определенной стадии дифференцировки, антигены злокачественной опухоли/яичка, т.е. белки, которые в нормальных условиях специфично экспрессируются в яичке и в некоторых случаях в плаценте, и специфичные для зародышевой линии антигены. В контексте настоящего изобретения опухолевый антиген предпочтительно ассоциирован с клеточной поверхностью клетки злокачественной опухоли и предпочтительно не экспрессируется или экспрессируется крайне редко в здоровых тканях. Предпочтительно опухолевый антиген или аномальная экспрессия опухолевого антигена определяют клетки злокачественной опухоли. В контексте настоящего изобретения опухолевый антиген, который экспрессируется клеткой злокачественной опухоли у субъекта, например, пациента, страдающего от заболевания, относящегося к злокачественной опухоли, предпочтительно является собственным белком организма указанного субъекта. Согласно предпочтительным вариантам осуществления опухолевый антиген в контексте настоящего изобретения в нормальных условиях специфично экспрессируется в ткани или органе, которые не являются критически важными, т.е. тканях или органах, которые при повреждении с участием иммунной системы не приводят к смерти субъекта, или в органах или структурах организма, которые являются недоступными или труднодоступными для иммунной системы. Предпочтительно аминокислотная последовательность опухолевого антигена является идентичной у опухолевого антигена, который экспрессируется в здоровых тканях, и опухолевого антигена, который экспрессируется в тканях, пораженных злокачественной опухолью.
Примерами опухолевых антигенов, которые могут быть пригодны согласно настоящему изобретению, являются p53, ART-4, BAGE, бета-катенин/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, белки клеточной поверхности семейства клаудинов, такие как КЛАУДИН-6, КЛАУДИН-18.2 и КЛАУДИН-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (или hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, предпочтительно MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 или MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, миозин/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 минорный BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, протеиназа 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 или RU2, SAGE, SART-1 или SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, СУРВИВИН, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE и WT. Особенно предпочтительные опухолевые антигены включают КЛАУДИН-18.2 (CLDN18.2) и КЛАУДИН-6 (CLDN6).
В контексте настоящего документа термин «CLDN» или просто «Cl» означает клаудин и включает CLDN6 и CLDN18.2. Предпочтительно клаудин представляет собой клаудин человека. Клаудины представляют собой семейство белков, которые являются наиболее важными компонентами плотных контактов, где они образуют параклеточный барьер, который контролирует поток молекул в межклеточном пространстве между клетками эпителия. Клаудины представляют собой трансмембранные белки, пересекающие мембрану 4 раза, причем как N-, так и C-конец расположены в цитоплазме. Первая внеклеточная петля, называемая EC1 или ECL1, состоит в среднем из 53 аминокислот, а вторая внеклеточная петля, называемая EC2 или ECL2, состоит из около 24 аминокислот. Такие белки клеточной поверхности семейства клаудинов экспрессируются в опухолях различного происхождения, и особенно подходят в качестве целевых структур применительно к целевой иммунотерапии злокачественной опухоли ввиду их избирательной экспрессии (не экспрессируются в важной с точки зрения токсичности здоровой ткани) и локализации на плазматической мембране.
CLDN6 и CLDN18.2 были идентифицированы как дифференциально экспрессируемые в опухолевых тканях, причем единственной здоровой тканью, в которой экспрессируется CLDN18.2, является желудок (дифференцированные эпителиальные клетки слизистой оболочки желудка), и единственной здоровой тканью, в которой экспрессируется CLDN6, является плацента.
CLDN18.2 экспрессируется в злокачественных опухолях различного происхождения, таких как карцинома поджелудочной железы, карцинома пищевода, карцинома желудка, бронхиальная карцинома, карцинома молочной железы и ENT-опухоли. CLDN18.2 является ценной мишенью для предупреждения и/или лечения первичных опухолей, таких как злокачественная опухоль желудка, злокачественная опухоль пищевода, злокачественная опухоль поджелудочной железы, злокачественная опухоль легкого, как, например, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), злокачественная опухоль яичника, злокачественная опухоль толстой кишки, злокачественная опухоль печени, злокачественная опухоль головы и шеи и злокачественные опухоли желчного пузыря и их метастазы, в частности, метастаз злокачественной опухоли желудка, как, например, опухоли Крукенберга, метастаз в брюшину и метастаз в лимфатический узел. Антигенные рецепторы, нацеленные по меньшей мере на CLDN18.2, являются пригодными в лечении таких заболеваний, относящихся к злокачественным опухолям.
Было обнаружено, что CLDN6 экспрессируется, например, в злокачественной опухоли яичника, злокачественной опухоли легкого, злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли кожи, формах меланомы, злокачественной опухоли головы и шеи, формах саркомы, злокачественной опухоли желчевыводящих путей, при почечно-клеточном раке и в злокачественной опухоли мочевого пузыря. CLDN6 является особенно предпочтительной мишенью для предупреждения и/или лечения злокачественной опухоли яичника, в частности, аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, злокачественной опухоли легкого, включая мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), в частности, плоскоклеточную карциному легкого и аденокарциному, злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли печени, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли кожи, в частности, базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, злокачественной опухоли головы и шеи, в частности, злокачественной плеоморфной аденомы, саркомы, в частности, синовиальной саркомы и карциносаркомы, злокачественной опухоли желчевыводящих путей, злокачественной опухоли мочевого пузыря, в частности, переходно-клеточной карциномы и папиллярной карциномы, злокачественной опухоли почки, в частности, почечно-клеточной карциномы, в том числе светлоклеточной почечно-клеточной карциномы и папиллярной почечно-клеточной карциномы, злокачественной опухоли толстой кишки, злокачественной опухоли тонкого кишечника, в том числе злокачественной опухоли подвздошной кишки, в частности, аденокарциномы тонкого кишечника и аденокарциномы подвздошной кишки, эмбриональной карциномы яичка, хориокарциномы, злокачественной опухоли шейки матки, злокачественной опухоли яичка, в частности, семиномы яичка, тератомы яичка и эмбриональной злокачественной опухоли яичка, злокачественной опухоли матки, герминогенных опухолей, таких как тератокарцинома или эмбриональная карцинома, в частности, герминогенные опухоли яичка, и их метастатических форм. Антигенные рецепторы, нацеленные по меньшей мере на CLDN6, являются пригодными в лечении таких заболеваний, относящихся к злокачественным опухолям.
В контексте вариантов осуществления настоящего изобретения антиген предпочтительно присутствует на поверхности клетки, предпочтительно антиген-представляющей клетки или пораженной заболеванием клетки. В соответствии с настоящим изобретением антиген при связывании антигенным рецептором предпочтительно способен индуцировать, необязательно в присутствии соответствующих костимулирующих сигнализаторов, стимуляцию, примирование и/или размножение T-клетки, несущей антигенный рецептор, связывающий антиген. Распознавание антигена на поверхности пораженной заболеванием клетки может обуславливать иммунную реакцию на антиген (или экспрессирующую антиген клетку).
В соответствии с различными аспектами настоящего изобретения целью предпочтительно является стимуляция иммунного ответа на экспрессирующие антиген пораженные заболеванием клетки, такие как экспрессирующие антиген клетки злокачественной опухоли, например, опухолевый антиген, в частности, CLDN6 или CLDN18.2, и лечение заболевания, такого как заболевание, относящееся к злокачественной опухоли, предусматривающее клетки, экспрессирующие антиген, такой как опухолевый антиген. Предпочтительно настоящее изобретение предусматривает введение иммунных эффекторных клеток со сконструированным антигенным рецептором, таких как T-клетки, нацеленные на экспрессирующие антиген пораженные заболеванием клетки. Клетки, экспрессирующие антиген на поверхности, могут быть мишенью иммунных эффекторных клеток, несущих антигенный рецептор, нацеленный на антиген.
Термин «клеточная поверхность» применяют в соответствии с его обычным значением в данной области, и, следовательно, он включает внешнюю поверхность клетки, доступную для связывания белками и другими молекулами. Антиген экспрессирован на поверхности клеток, если он находится на поверхности указанных клеток и доступен для связывания антигенсвязывающими молекулами, такими как антигенные рецепторы или антигенспецифические антитела, добавленные к клеткам. Согласно одному варианту осуществления экспрессируемый на поверхности клеток антиген представляет собой интегральный мембранный белок с внеклеточным участком, распознаваемым антигенным рецептором. Антигенный рецептор экспрессирован на поверхности клеток, если он находится на поверхности указанных клеток и доступен для связывания, например, антигеном, в отношении которого антигенный рецептор является специфическим, при добавлении к клеткам. Согласно одному варианту осуществления экспрессируемый на поверхности клеток антигенный рецептор представляет собой интегральный мембранный белок с внеклеточным участком, распознающим антиген.
Термин «внеклеточный участок» или «экзодомен» в контексте настоящего изобретения относится к участку молекулы, такой как белок, который обращен к внеклеточному пространству клетки и предпочтительно доступен со стороны внешней поверхности указанной клетки, например, для связывающих молекул, таких как антитела, находящиеся снаружи клетки. Предпочтительно термин относится к одной(-ому) или нескольким внеклеточным петлям или доменам или их фрагментам.
Термины «участок» или «часть» применяют в настоящем документе взаимозаменяемо, и они относятся к непрерывному или прерывающемуся элементу структуры, такой как аминокислотная последовательность. Термин «фрагмент» относится к непрерывному элементу структуры, такой как аминокислотная последовательность. Участок, часть или фрагмент структуры предпочтительно предусматривает одно или несколько функциональных свойств указанной структуры, например, антигенных, иммунологических свойств и/или свойств связывания. Участок или часть последовательности белка предпочтительно содержит по меньшей мере 6, в частности, по меньшей мере 8, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 100 последовательных и/или непоследовательных аминокислот последовательности белка. Фрагмент последовательности белка предпочтительно содержит по меньшей мере 6, в частности, по меньшей мере 8, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 100 последовательных аминокислот последовательности белка.
В соответствии с настоящим изобретением антиген (практически) не экспрессируется в клетке, если уровень экспрессии ниже порога обнаружения и/или если уровень экспрессии слишком мал, чтобы обеспечить связывание антигенспецифическими антителами, добавленными к клетке. В соответствии с настоящим изобретением антиген экспрессируется в клетке, если уровень экспрессии превышает порог обнаружения и/или если уровень экспрессии является достаточно высоким, чтобы обеспечить связывание антигенспецифическими антителами, добавленными к клетке. Предпочтительно экспрессируемый в клетке антиген экспрессирован или представлен на поверхности, то есть присутствует на поверхности указанной клетки и, таким образом, доступен для связывания антигенспецифическими молекулами, такими как антитела или антигенные рецепторы, добавленные к клетке.
Под «целевой клеткой» понимают клетку, которая является мишенью иммунного ответа, такого как клеточный иммунный ответ. Целевые клетки включают любую нежелательную клетку, такую как клетка злокачественной опухоли. Согласно предпочтительным вариантам осуществления целевая клетка представляет собой клетку, экспрессирующую целевой антиген, в частности, специфический для заболевания антиген, который предпочтительно присутствует на клеточной поверхности.
Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте молекулы, такой как антиген, т.е. части или фрагменту молекулы, которая распознается, т.е. связывается элементами иммунной системы, например, распознается антителом или антигенным рецептором. Например, эпитопы являются прерывистыми, трехмерными участками на антигене, которые распознаются иммунной системой. Эпитопы обычно состоят из химически активных групп на поверхности молекул, таких как аминокислоты и боковые цепи из сахаров, и обычно обладают специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Конформационный и неконформационный эпитоп отличаются тем, что связывание с первым, но не с последним, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. Предпочтительно эпитоп способен вызывать иммунный ответ на антиген или экспрессирующую антиген клетку. Предпочтительно термин относится к иммуногенному участку антигена. Эпитоп белка, такого как опухолевый антиген, предпочтительно предусматривает непрерывный или прерывающийся участок указанного белка, и его длина предпочтительно составляет 5-100, предпочтительно 5-50, более предпочтительно 8-30, наиболее предпочтительно 10-25 аминокислот, например, длина эпитопа может составлять предпочтительно 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот.
«Процессирование антигена» относится к разрушению антигена с образованием продуктов процессирования, которые представляют собой фрагменты указанного антигена (например, разрушению белка с образованием пептидов) и ассоциации одного или нескольких из таких фрагментов (например, посредством связывания) с молекулами MHC для представления клетками, предпочтительно антиген-представляющими клетками, специфичным T-клеткам.
Антиген-представляющая клетка (APC) представляет собой клетку, которая экспонирует антиген на своей поверхности в контексте главного комплекса гистосовместимости (MHC). T-клетки могут распознавать такой комплекс с помощью их T-клеточного рецептора (TCR). Антиген-представляющие клетки процессируют антигены и представляют их T-клеткам. В соответствии с настоящим изобретением термин «антиген-представляющая клетка» включает профессиональные антиген-представляющие клетки и непрофессиональные антиген-представляющие клетки.
Профессиональные антиген-представляющие клетки являются крайне эффективными в отношении интернализации антигена, либо посредством фагоцитоза, либо посредством опосредованного рецептором эндоцитоза, и последующего экспонирования на их мембране фрагмента антигена, связанного с молекулой MHC класса II. T-клетка распознает комплекс антиген-молекула MHC класса II на мембране антиген-представляющей клетки и взаимодействует с ним. Затем антиген-представляющая клетка продуцирует дополнительный костимулирующий сигнал, что приводит к активации T-клетки. Экспрессия костимулирующих молекул является отличительным признаком профессиональных антиген-представляющих клеток. Основными типами профессиональных антиген-представляющих клеток являются дендритные клетки, которые представляют наиболее широкий спектр антигенов, и, вероятно, являются наиболее важными антиген-представляющими клетками, макрофаги, B-клетки и определенные типы активированных эпителиальных клеток.
Непрофессиональные антиген-представляющие клетки не экспрессируют конститутивно белки MHC класса II, необходимые для взаимодействия с наивными T-клетками; такие белки экспрессируются только при стимуляции непрофессиональных антиген-представляющих клеток определенными цитокинами, такими как IFNγ.
Дендритные клетки (DC) представляют собой популяции лейкоцитов, которые представляют захваченные в периферических тканях антигены T-клеткам посредством путей представления антигена с участием MHC как класса II, так и класса I. Хорошо известно, что дендритные клетки являются эффективными индукторами иммунных ответов, и активация этих клеток является ключевой стадией для индукции противоопухолевого иммунитета. Дендритные клетки и клетки-предшественники могут быть получены из периферической крови, костного мозга, инфильтрирующих опухоль клеток, клеток, инфильтрирующих окружающие опухоль ткани, лимфатических узлов, селезенки, кожи, пуповинной крови или любой другой подходящей ткани или жидкости организма. Например, дендритные клетки могут быть дифференцированы ex vivo при добавлении к культурам моноцитов, собранных из периферической крови, комбинации цитокинов, таких как GM-CSF, IL-4, IL-13 и/или TNFa. В качестве альтернативы, CD34-положительные клетки, собранные из периферической крови, пуповинной крови или костного мозга, могут быть дифференцированы в дендритные клетки при добавлении в культуральную среду комбинаций GM-CSF, IL-3, TNFα, лиганда CD40, LPS, лиганда flt3 и/или другого(-их) соединения(-ий), которые индуцируют дифференцировку, созревание и пролиферацию дендритных клеток. Дендритные клетки условно делят на «незрелые» и «зрелые» клетки, что можно применять как простой способ различать два хорошо охарактеризованных фенотипа. Однако такая классификация не должна быть истолкована как исключение всех возможных промежуточных стадий дифференцировки. Незрелые дендритные клетки характеризуют как антиген-представляющие клетки с выраженной способностью к захвату и процессированию антигена, что коррелирует с высоким уровнем экспрессии Fcγ-рецептора и маннозного рецептора. Зрелый фенотип, как правило, характеризуется низким уровнем экспрессии таких маркеров, но высоким уровнем экспрессии ответственных за активацию T-клеток молекул клеточной поверхности, таких как MHC класса I и класса II, молекулы адгезии (например, CD54 и CD11) и костимулирующие молекулы (например, CD40, CD80, CD86 и 4-1 BB). Созревание дендритных клеток рассматривается как статус активации дендритных клеток, при котором такие антиген-представляющие дендритные клетки обеспечивают примирование Т-клеток, тогда как представление незрелыми дендритными клетками приводит к толерантности. Созревание дендритных клеток главным образом обусловлено характерными для микроорганизмов биомолекулами, выявляемыми естественными рецепторами (бактериальная ДНК, вирусная РНК, эндотоксин и т.д.), провоспалительными цитокинами (TNF, IL-1, IFN), связыванием CD40 на поверхности дендритных клеток CD40L и веществами, высвобождаемыми из клеток, подлежащих вызванной стрессовым фактором гибели клеток. Дендритные клетки могут быть получены путем культивирования клеток костного мозга in vitro с цитокинами, такими как гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и фактор некроза опухоли альфа.
Термин «иммуногенность» относится к условной эффективности антигена в отношении индукции иммунной реакции.
+
+
Термин «иммунные эффекторные функции» в контексте настоящего изобретения включает любые функции, опосредованные компонентами иммунной системы, которые обеспечивают, например, уничтожение пораженных заболеванием клеток, таких как опухолевые клетки, или ингибирование роста опухоли и/или ингибирование развития опухоли, включая ингибирование распространения опухоли и метастазирования. Предпочтительно иммунными эффекторными функциями в контексте настоящего изобретения являются опосредованные T-клетками эффекторные функции. В случае хелперной T-клетки (CD4 T-клетки) такие функции предусматривают высвобождение цитокинов, таких как интерлейкин-2, и/или активацию CD8 лимфоцитов (CTL) и/или B-клеток, а в случае CTL – устранение клеток, т.е. характеризующихся экспрессией антигена клеток, например, посредством апоптоза или перфорин-опосредованного лизиса клеток, продукцию цитокинов, таких как IFN-γ и TNF-α, и специфическое уничтожение экспрессирующих антиген целевых клеток посредством цитолиза.
+
+
+
Термин «иммунореактивная клетка» или «иммунная эффекторная клетка» в контексте настоящего изобретения относится к клетке, которая проявляет эффекторные функции при иммунной реакции. «Иммунореактивная клетка» предпочтительно способна связывать антиген, такой как экспрессируемый на поверхности клетки антиген, и опосредовать иммунный ответ. Например, такие клетки секретируют цитокины и/или хемокины, уничтожают микроорганизмы, секретируют антитела, распознают инфицированные или раковые клетки и необязательно устраняют такие клетки. Например, иммунореактивные клетки предусматривают T-клетки (цитотоксические T-клетки, хелперные T-клетки, инфильтрирующие опухоль T-клетки), B-клетки, естественные клетки-киллеры, нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки. Предпочтительно в контексте настоящего изобретения «иммунореактивные клетки» представляют собой T-клетки, предпочтительно CD4 и/или CD8 T-клетки. В соответствии с настоящим изобретением термин «иммунореактивная клетка» также включает клетку, которая при подходящей стимуляции может созревать в иммунную клетку (такую как T-клетка, в частности, хелперная T-клетка или цитолитическая T-клетка). Иммунореактивные клетки предусматривают CD34 гемопоэтические стволовые клетки, незрелые и зрелые T-клетки и незрелые и зрелые B-клетки. Дифференцировка предшественников T-клеток в цитолитическую T-клетку, при воздействии антигена, подобна селекции клонов в рамках иммунной системы.
+
+
Предпочтительно «иммунореактивная клетка» или «иммунная эффекторная клетка» распознает антиген с определенной степенью специфичности, в частности, если он присутствует на поверхности антиген-представляющих клеток или пораженных заболеванием клеток, таких как клетки злокачественной опухоли. Предпочтительно указанное распознавание дает клетке, которая распознает антиген, статус чувствительной или реактивной. Если клетка представляет собой хелперную T-клетку (CD4 T-клетку), такая чувствительность или реактивность может предусматривать высвобождение цитокинов и/или активацию CD8 лимфоцитов (CTL) и/или B-клеток. Если клетка представляет собой CTL, такая чувствительность или реактивность может предусматривать устранение клеток, т.е. характеризующихся экспрессией антигена клеток, например, посредством апоптоза или перфорин-опосредованного лизиса клеток. В соответствии с настоящим изобретением чувствительность CTL может предусматривать индукцию непрерывного потока кальция, деление клеток, продукцию цитокинов, таких как IFN-γ и TNF-α, усиление экспрессии маркеров активации, таких как CD44 и CD69, и специфическое уничтожение экспрессирующих антиген целевых клеток посредством цитолиза. Чувствительность CTL также может быть определена с применением искусственного репортера, который позволяет с высокой точностью выявить чувствительность CTL. Такой CTL, который распознает антиген и является чувствительным или реактивным, в настоящем документе также называют «антиген-чувствительным CTL».
«Клетка лимфоидного ряда» представляет собой клетку, которая, необязательно после подходящей модификации, например, после переноса T-клеточного рецептора или антигенного рецептора, способна стимулировать иммунный ответ, например, клеточный иммунный ответ, или клетку-предшественник такой клетки, и включает лимфоциты, предпочтительно T-лимфоциты, лимфобласты и плазматические клетки. Клетка лимфоидного ряда может представлять собой иммунореактивную клетку или иммунную эффекторную клетку, как описано в настоящем документе. Предпочтительной клеткой лимфоидного ряда является T-клетка, которая может быть модифицирована для экспрессии T-клеточного рецептора или антигенного рецептора на клеточной поверхности. Согласно одному варианту осуществления у клетки лимфоидного ряда отсутствует эндогенная экспрессия T-клеточного рецептора.
Термины «T-клетка» и «T-лимфоцит» в настоящем документе применяют взаимозаменяемо, и они включают хелперные T-клетки (CD4+ T-клетки) и цитотоксические T-клетки (CTL, CD8+ T-клетки), которые предусматривает цитолитические T-клетки.
Т-клетки относятся к группе лейкоцитов, известных как лимфоциты, и играют центральную роль в клеточно-опосредованном иммунитете. Также они отличаются от других типов лимфоцитов, таких как B-клетки и естественные клетки-киллеры, наличием на их клеточной поверхности особых рецепторов, называемых T-клеточными рецепторами (TCR). Тимус является основным органом, ответственным за созревание Т-клеток. Было обнаружено несколько различных субпопуляций Т-клеток, каждая из которых характеризуется отдельной функцией.
Хелперные T-клетки, среди прочих функций, содействуют другим лейкоцитам в осуществлении иммунологических процессов, включая созревание B-клеток в плазматические клетки и активацию цитотоксических T-клеток и макрофагов. Такие клетки также известны как CD4+ T-клетки, поскольку они экспрессируют на своей поверхности белок CD4. Хелперные T-клетки становятся активированными после представления им пептидных антигенов молекулами MHC класса II, которые экспрессируются на поверхности антиген-представляющих клеток (APC). Сразу после активации они быстро делятся и секретируют небольшие белки, называемые цитокинами, которые регулируют или принимают участие в активном иммунном ответе.
Цитотоксические T-клетки разрушают инфицированные вирусом клетки и опухолевые клетки, а также вовлечены в отторжение трансплантата. Такие клетки также известны как CD8+ T-клетки, поскольку они экспрессируют на своей поверхности гликопротеин CD8. Такие клетки распознают свои мишени путем связывания с антигеном, ассоциированным с MHC класса I, который присутствует на поверхности почти каждой клетки организма.
Большинство T-клеток имеют T-клеточный рецептор (TCR), существующий в виде комплекса из нескольких белков. Данный T-клеточный рецептор состоит из двух отдельных пептидных цепей, которые являются продуктами независимых генов T-клеточного рецептора альфа и бета (TCRα и TCRβ), и называются α- и β-TCR-цепями. γδ T-клетки (гамма-, дельта-T-клетки) являются небольшой субпопуляцией T-клеток, которые содержат на своей поверхности отличающийся T-клеточный рецептор (TCR). При этом у γδ T-клеток TCR состоит из одной γ-цепи и одной δ-цепи. Такая группа T-клеток является гораздо менее распространенной (2% от всех T-клеток), чем αβ T-клетки.
Все T-клетки происходят из гемопоэтических стволовых клеток костного мозга. Гемопоэтические клетки-предшественники, происходящие из гемопоэтических стволовых клеток, заселяют тимус и размножаются путем деления клеток с образованием крупной популяции незрелых тимоцитов. Наиболее ранние тимоциты не экспрессируют ни CD4, ни CD8, и, следовательно, их классифицируют как дважды негативные (CD4-CD8-) клетки. По мере развития они становятся дважды положительными тимоцитами (CD4+CD8+), и, в конечном счете, созревают до одинарно положительных (CD4+CD8- или CD4-CD8+) тимоцитов, которые затем перемещаются из тимуса в периферические ткани.
T-клетки обычно можно получать in vitro или ex vivo с применением стандартных процедур. Например, T-клетки могут быть выделены из костного мозга, периферической крови или клеточной фракции костного мозга или периферической крови млекопитающего, например, пациента, с применением коммерчески доступной системы разделения клеток. В качестве альтернативы, T-клетки могут быть получены от родственных или не родственных людей, животных, отличных от людей, клеточных линий или культур. Содержащий T-клетки образец может представлять собой, например, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC).
T-клетки, которые будут применять в соответствии с настоящим изобретением, могут экспрессировать эндогенный T-клеточный рецептор, или у них может отсутствовать экспрессия эндогенного T-клеточного рецептора.
Нуклеиновые кислоты, такие как РНК, кодирующая антигенный рецептор, могут быть введены в T-клетки или другие клетки с цитолитической способностью, в частности, клетки лимфоидного ряда.
Термин «антигенный рецептор, нацеленный на антиген» или подобные термины относятся к антигенному рецептору, который, когда он присутствует на поверхности иммунной эффекторной клетки, такой как T-клетка, распознает антиген, например, на поверхности антиген-представляющих клеток или пораженных заболеванием клеток, таких как клетки злокачественной опухоли, вследствие чего иммунная эффекторная клетка становится стимулированной, примированной и/или размножается или проявляет эффекторные функции иммунных эффекторных клеток, как описано выше.
Термин «антигенспецифическая T-клетка» или подобные термины относятся к T-клетке, которая, в частности, когда она обеспечена антигенным рецептором, распознает антиген, на который нацелен антигенный рецептор, например, на поверхности антиген-представляющих клеток или пораженных заболеванием клеток, таких как клетки злокачественной опухоли, и предпочтительно проявляет эффекторные функции T-клетки, как описано выше. T-клетки и другие клетки лимфоидного ряда считаются специфическими в отношении антигена, если клетки уничтожают экспрессирующие антиген целевые клетки. Специфичность T-клеток можно оценивать с применением любой из множества стандартных методик, например, в анализе с высвобождением хрома или анализе пролиферации. В качестве альтернативы, можно определять синтез лимфокинов (таких как интерферон-γ).
Термин «главный комплекс гистосовместимости» и сокращение «MHC» включают молекулы MHC класса I и MHC класса II, и относятся к комплексу генов, которые встречаются у всех позвоночных. Белки или молекулы MHC являются важными для передачи сигналов между лимфоцитами и антиген-представляющими клетками или пораженными заболеванием клетками в рамках иммунных реакций, где белки или молекулы MHC связывают пептиды и представляют их для распознавания T-клеточными рецепторами. Белки, кодируемые MHC, экспрессируются на поверхности клеток, и они экспонируют как свои собственные антигены (пептидные фрагменты из самой клетки), так и чужие антигены (например, фрагменты инвазивных микроорганизмов), для T-клетки.
В соответствии с настоящим изобретением термин «антигенный рецептор» включает сконструированные рецепторы, которые придают иммунной эффекторной клетке, такой как T-клетка, определенную специфичность, такую как специфичность моноклонального антитела. Таким образом, для адоптивного переноса клеток можно получать большое число антигенспецифических T-клеток. Таким образом, антигенный рецептор в соответствии с настоящим изобретением может присутствовать на T-клетках, например, в дополнение к собственному T-клеточному рецептору T-клеток, или вместо него. Для таких T-клеток не является обязательным процессинг и представление антигена для распознавания целевой клетки, а скорее они могут распознавать предпочтительно с определенной специфичностью любой антиген, присутствующий на целевой клетке. Предпочтительно указанный антигенный рецептор экспрессируется на поверхности клеток. Для целей настоящего изобретения T-клетки, содержащие антигенный рецептор, охвачены применяемым в настоящем документе термином «T-клетка». В частности, в соответствии с настоящим изобретением термин «антигенный рецептор» включает искусственные рецепторы, содержащие одну молекулу или комплекс молекул, которые распознают, т.е. связываются с целевой структурой (например, антигеном) на целевой клетке, такой как клетка злокачественной опухоли (например, путем связывания антигенсвязывающего центра или антигенсвязывающего домена с антигеном, экспрессируемым на поверхности целевой клетки), и которые могут придавать специфичность иммунной эффекторной клетке, такой как T-клетка, экспрессирующая на клеточной поверхности указанный антигенный рецептор. Предпочтительно распознавание целевой структуры антигенным рецептором приводит к активации иммунной эффекторной клетки, экспрессирующей указанный антигенный рецептор. Антигенный рецептор может содержать один или несколько белковых компонентов, причем указанные белковые компоненты предусматривают один или несколько описанных в настоящем документе доменов. Термин «антигенный рецептор» предпочтительно не включает T-клеточные рецепторы. В соответствии с настоящим изобретением термин «антигенный рецептор» предпочтительно является синонимичным с терминами «химерный антигенный рецептор (CAR)», «химерный T-клеточный рецептор» и «искусственный T-клеточный рецептор».
В соответствии с настоящим изобретением антиген может быть распознан антигенным рецептором посредством любых доменов распознавания антигена (в настоящем документе также упоминаемых просто как «домены»), способных образовывать антигенсвязывающий центр, например, посредством антигенсвязывающих участков антител и T-клеточных рецепторов, которые могут находиться на одной и той же или на разных пептидных цепях. Согласно одному варианту осуществления два домена, образующие антигенсвязывающий центр, происходят из иммуноглобулина. Согласно другому варианту осуществления два домена, образующие антигенсвязывающий центр, происходят из T-клеточного рецептора. Особенно предпочтительными являются вариабельные домены антител, такие как одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), происходящие из моноклональных антител, и вариабельные домены T-клеточного рецептора, в частности, отдельные цепи TCR альфа и бета. Фактически, в качестве домена распознавания антигена можно применять практически все объекты, которые с высокой аффинностью связывают данную мишень.
Согласно одному варианту осуществления антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит по меньшей мере четыре вариабельных домена иммуноглобулина, образующих по меньшей мере два связывающих центра, где два связывающих центра могут связываться с одним и тем же или с разными эпитопами, причем эпитопы могут находиться на одном и том же или на разных антигенах. Согласно одному варианту осуществления антигенный рецептор содержит вариабельный домен (или область) тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) со специфичностью к первому эпитопу (VH(1)), вариабельный домен (или область) легкой цепи иммуноглобулина (VL) со специфичностью к первому эпитопу (VL(1)), вариабельный домен (или область) тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) со специфичностью ко второму эпитопу (VH(2)) и вариабельный домен (или область) легкой цепи иммуноглобулина (VL) со специфичностью ко второму эпитопу (VL(2)), причем первый и второй эпитопы могут быть одинаковыми или разными и могут находиться на одном и том же или на разных антигенах. Согласно одному варианту осуществления VH(1) способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(1), а VH(2) способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(2), тогда как VH(1) не способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(2), а VH(2) не способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(1). Однако согласно другому варианту осуществления VH(1) способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(1), а также с VL(2), а VH(2) способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(2), а также с VL(1). Согласно последнему варианту осуществления VH(1) и VH(2) могут быть идентичными или по меньшей мере происходить из одного иммуноглобулина, и VL(1) и VL(2) могут быть идентичными или по меньшей мере происходить из одного иммуноглобулина.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к антигенному рецептору, также называемому в настоящем документе комбинационным антигенным рецептором, причем рецептор содержит первую пептидную цепь и вторую пептидную цепь, где первая пептидная цепь содержит по меньшей мере первый и второй домены и домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки; вторая пептидная цепь содержит по меньшей мере первый и второй домены и домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки; где первый домен из первой пептидной цепи вместе с одним из доменов из второй пептидной цепи образует первый антигенсвязывающий центр, и где второй домен из первой пептидной цепи вместе с другим доменом из второй пептидной цепи образует второй антигенсвязывающий центр.
Согласно одному варианту осуществления комбинационный антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, соединенный с вариабельным доменом легкой цепи на каждой из обеих пептидных цепей, где образование двух антигенсвязывающих центров происходит за счет взаимодействия вариабельного домена тяжелой цепи с вариабельным доменом легкой цепи на разных пептидных цепях. Согласно одному варианту осуществления комбинационный антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит две пептидные цепи, где одна пептидная цепь содержит VL(1) и VH(2), а другая полипептидная цепь содержит VH(1) и VL(2). Согласно другому варианту осуществления комбинационный антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, соединенный с вариабельным доменом тяжелой цепи на одной пептидной цепи, и вариабельный домен легкой цепи, соединенный с вариабельным доменом легкой цепи на другой пептидной цепи, где образование двух антигенсвязывающих центров происходит за счет взаимодействия вариабельного домена тяжелой цепи с вариабельным доменом легкой цепи на разных пептидных цепях. Согласно одному варианту осуществления комбинационный антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит две пептидные цепи, где одна пептидная цепь содержит VH(1) и VH(2), а другая пептидная цепь содержит VL(1) и VL(2).
Согласно одному варианту осуществления комбинационный антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит первую пептидную цепь, где вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL) предпочтительно расположены, от N-конца к C-концу, в порядке VH(1)-VL(2), и вторую пептидную цепь, где вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL) предпочтительно расположены, от N-конца к C-концу, в порядке VL(1)-VH(2). Домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки предпочтительно расположен в направлении C-конца по отношению к порядку расположения вариабельных областей, и предпочтительно содержит константную область альфа-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, расположенные на одной из пептидных цепей, и константную область бета-цепи T-клеточного рецептора, расположенную на другой из пептидных цепей.
Согласно одному варианту осуществления комбинационный антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит первую пептидную цепь, где вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL) предпочтительно расположены, от N-конца к C-концу, в порядке VH(1)-VH(2), и вторую пептидную цепь, где вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL) предпочтительно расположены, от N-конца к C-концу, в порядке VL(1)-VL(2). Домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки предпочтительно расположен в направлении C-конца по отношению к порядку расположения вариабельных областей, и предпочтительно содержит константную область альфа-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, расположенные на одной из пептидных цепей, и константную область бета-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, расположенные на другой из пептидных цепей.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к антигенному рецептору, также называемому в настоящем документе тандемным антигенным рецептором, причем рецептор содержит первую пептидную цепь и вторую пептидную цепь, где первая пептидная цепь содержит по меньшей мере четыре домена и домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки; вторая пептидная цепь содержит домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки; где два из доменов из первой пептидной цепи образуют первый антигенсвязывающий центр, и где другие два домена из первой пептидной цепи образуют второй антигенсвязывающий центр.
Согласно одному варианту осуществления тандемный антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, соединенный с вариабельным доменом легкой цепи, соединенным с дополнительным вариабельным доменом тяжелой цепи, соединенным с вариабельным доменом легкой цепи на первой пептидной цепи, где образование двух антигенсвязывающих центров происходит за счет взаимодействия вариабельного домена тяжелой цепи с вариабельным доменом легкой цепи на одной и той же пептидной цепи. Таким образом, первая пептидная цепь содержит VH(1) и VL(1), а также VH(2) и VL(2), на одной и той же пептидной цепи. Предполагается, что согласно одному варианту осуществления тандемный антигенный рецептор по настоящему изобретению может содержать две молекулы scFv, соединенные посредством линкерного пептида, на первой пептидной цепи.
Согласно одному варианту осуществления тандемный антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит первую пептидную цепь, где вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL) предпочтительно расположены, от N-конца к C-концу, в порядке VH(1)-VL(1)-VH(2)-VL(2), VL(1)-VH(1)-VH(2)-VL(2), VH(1)-VL(1)-VL(2)-VH(2) или VL(1)-VH(1)-VL(2)-VH(2). Домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки предпочтительно расположен в направлении C-конца по отношению к порядку расположения вариабельных областей, и предпочтительно содержит константную область альфа-цепи T-клеточного рецептора или ее участок или константную область бета-цепи T-клеточного рецептора или ее участок. Домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки расположенный на второй пептидной цепи, предпочтительно предусматривает константную область альфа-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, если первая пептидная цепь содержит константную область бета-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, или константную область бета-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, если первая пептидная цепь содержит константную область альфа-цепи T-клеточного рецептора или ее участок.
Антигенные рецепторы по настоящему изобретению содержат по меньшей мере два антигенсвязывающих центра, и, таким образом, являются по меньшей мере двухвалентными. Как упоминалось выше, связывающие центры антигенных рецепторов по настоящему изобретению могут связываться с одним и тем же или с разными эпитопами, причем эпитопы могут находиться на одном и том же или на разных антигенах. Если связывающие центры связываются с одинаковыми эпитопами, в частности, на одном и том же антигене, два связывающих центра могут быть идентичными или практически идентичными и/или могут быть образованы идентичными или практически идентичными доменами, где такие идентичные или практически идентичные домены могут происходить, например, из одного и того же иммуноглобулина. Если связывающие центры связываются с разными эпитопами, либо на одном и том же, либо на разных антигенах, два связывающих центра являются разными и они образованы разными доменами, где такие разные домены могут происходить из разных иммуноглобулинов. В случае таких разных доменов предпочтительным является, чтобы домены со специфичностью к разным эпитопам не взаимодействовали или практически не взаимодействовали друг с другом, т.е. VH(1) не способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(2), а VH(2) не способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(1). Следовательно, VH(1) взаимодействует и образует антигенсвязывающий центр с VL(1), а VH(2) взаимодействует и образует антигенсвязывающий центр с VL(2). Если комбинационный антигенный рецептор по настоящему изобретению содержит две пептидные цепи, где одна пептидная цепь содержит VH(1) и VL(2), а другая пептидная цепь содержит VH(2) и VL(1), это обуславливает тот факт, что пептидные цепи не способны образовывать антигенсвязывающие центры посредством внутримолекулярного взаимодействия доменов.
Два домена антигенного рецептора по настоящему изобретению, образующие антигенсвязывающий центр, также могут происходить из T-клеточного рецептора и могут представлять собой его фрагменты или участки, обеспечивающие антигенспецифическое связывание, в частности, связывание с комплексом пептид-MHC, такие как вариабельные области T-клеточного рецептора.
В соответствии с настоящим изобретением термин «вариабельная область T-клеточного рецептора» относится к вариабельным доменам цепей TCR. Вариабельная область как α-цепи, так и β-цепи TCR содержит три гипервариабельные или определяющие комплементарность области (CDR), тогда как вариабельная область β-цепи содержит дополнительный гипервариабельный участок (HV4), который обычно не вступает в контакт с антигеном, и, следовательно, не рассматривается как CDR. CDR3 является основной CDR, ответственной за распознавание процессированного антигена, хотя было показано, что CDR1 α-цепи также взаимодействует с N-концевой частью антигенного пептида, а CDR1 β-цепи взаимодействует с C-концевой частью пептида. CDR2, как полагают, распознает MHC. Полагают, что CDR4 β-цепи не участвует в распознавании антигена, однако, как было показано, взаимодействует с суперантигенами.
Вышеприведенное раскрытие, относящееся к вариабельным доменам иммуноглобулинa, соответствующим образом применимо к вариабельным доменам рецептора Т-клеток. Антигенный рецептор по настоящему изобретению вместо вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) со специфичностью к первому эпитопу (VH(1)) и вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина (VL) со специфичностью к первому эпитопу (VL(1)) может содержать вариабельный домен TCR-α-цепи TCR со специфичностью к первому эпитопу и вариабельный домен TCR-β-цепи TCR со специфичностью к первому эпитопу. В качестве альтернативы, или дополнительно, антигенный рецептор по настоящему изобретению вместо вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) со специфичностью ко второму эпитопу (VH(2)) и вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина (VL) со специфичностью ко второму эпитопу (VL(2)) может содержать вариабельный домен TCR-α-цепи TCR со специфичностью ко второму эпитопу и вариабельный домен TCR-β-цепи TCR со специфичностью ко второму эпитопу.
Поскольку каждый антигенсвязывающий центр образован из двух доменов, каждый домен может содержать участок или фрагмент иммуноглобулина или T-клеточного рецептора соответственно. Отдельные участок или фрагмент сами по себе могут быть неспособны связывать антиген, но когда два отдельных участка или фрагмента ассоциированы, вместе они образуют или восстанавливают антигенсвязывающую структуру исходного иммуноглобулина или T-клеточного рецептора и, таким образом, способны связывать один и тот же антиген, предпочтительно с одинаковой аффинностью.
2+
После распознавания антигена предпочтительно происходит кластеризация рецепторов и передача сигнала в клетку. В этом отношении «домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки» или «сигнальный домен T-клетки» представляет собой домен, который вовлечен в передачу сигнала активации T-клетке после связывания антигена. Возможность такой передачи сигнала обеспечивается антигенными рецепторами по настоящему изобретению, содержащими константную или инвариантную области цепи T-клеточного рецептора или константную или инвариантную области цепи Fc-рецептора иммунной клетки или участок константной или инвариантной областей, например, константную область альфа-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, на одной пептидной цепи, и содержащими соответствующие константную или инвариантную области цепи T-клеточного рецептора или соответствующие константную или инвариантную области цепи Fc-рецептора иммунной клетки или участок константной или инвариантной областей, например, константную область бета-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, на другой пептидной цепи. В этом отношении CD3-комплекс обозначает антиген, который экспрессируется на зрелых T-клетках, тимоцитах и субпопуляции естественных клеток-киллеров человека как часть мультимолекулярного комплекса, представляющего собой T-клеточный рецептор (TCR). Корецептор T-клетки является белковым комплексом и состоит из четырех отдельных цепей. У млекопитающих комплекс содержит CD3γ-цепь, CD3δ-цепь и две CD3ε-цепи. Эти цепи связываются с T-клеточным рецептором (TCR) и ζ-цепью для генерации сигнала активации T-лимфоцитов. TCR, ζ-chain и молекулы CD3 вместе образуют TCR-комплекс. CD3 отвечает за сигнальную трансдукцию TCR. Как описывают Lin and Weiss, Journal of Cell Science 114, 243-244 (2001), активация TCR-комплекса путем связывания представленных MHC специфических эпитопов антигена приводит к фосфорилированию активирующих мотивов иммунорецептора на основе тирозина (ITAM) киназами семейства Src, запуская рекрутирование дополнительных киназ, что в результате приводит к активации T-клетки, включающей высвобождение Ca. Кластеризация CD3 на T-клетках, например, посредством иммобилизированных антител к CD3, приводит к активации T-клетки, аналогично ситуации с вовлечением T-клеточного рецептора, но не зависит от его клональной специфичности.
Домен передачи сигнала антигенного рецептора предпочтительно, как минимум, служит для взаимодействия с нативным клеточным комплексом сигнальной трансдукции, например, CD3-комплексом, который отвечает за передачу сигнала связывания антигена с антигенным рецептором в клетку, что приводит к активации иммунной клетки. Особенность домена передачи сигнала ограничена только тем, что он имеет способность взаимодействовать с нативным комплексом сигнальной трансдукции для индукции активации иммунной клетки после связывания антигена с антигенным рецептором.
Предпочтительно домен передачи сигнала на одной пептидной цепи будет образовывать димер с доменом передачи сигнала на второй цепи, например, посредством дисульфидных мостиков. Предпочтительные домены передачи сигнала могут предусматривать константную или инвариантную области цепи T-клеточного рецептора или константную или инвариантную области цепи Fc-рецептора иммунной клетки или участок константной или инвариантной областей. Предпочтительные домены передачи сигнала могут предусматривать константную область альфа-, бета-, гамма- или дельта-цепей T-клеточного рецептора или их участок, а также инвариантные области D2 или D3 константного домена Fc-рецептора иммунной клетки или их участок. Согласно предпочтительному варианту осуществления первая пептидная цепь предусматривает константную область альфа-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, а вторая пептидная цепь предусматривает константную область бета-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, или первая пептидная цепь предусматривает константную область бета-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, а вторая пептидная цепь предусматривает константную область альфа-цепи T-клеточного рецептора или ее участок. Согласно другому варианту осуществления первая пептидная цепь предусматривает константную область гамма-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, а вторая пептидная цепь предусматривает константную область дельта-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, или первая пептидная цепь предусматривает константную область дельта-цепи T-клеточного рецептора или ее участок, а вторая пептидная цепь предусматривает константную область гамма-цепи T-клеточного рецептора или ее участок. Необязательно домены передачи сигнала можно модифицировать таким образом, чтобы между цепями образовывались дополнительные дисульфидные связи, обеспечивающие более эффективное образование димера и более высокую стабильность димера.
Не вдаваясь в конкретный механизм действия, полагают, что две пептидные цепи антигенного рецептора по настоящему изобретению, когда они экспрессированы на поверхности иммунной клетки, за счет взаимодействий (например, дисульфидных связей) образуют димер по меньшей мере между отдельными доменами передачи сигнала от рецептора иммунной клетки на двух цепях, а также образуют комплекс с эндогенным CD3-комплексом, вовлеченным в физиологическую передачу сигнала с участием T-клеточного рецептора. Однако настоящее изобретение вместо Cα- и Cβ-доменов TCR также может включать прямое слияние с CD3ζ или любым другим сигнальным доменом иммунной клетки (CD3, CD3-субъединица FcγR). Полагают, что после связывания антигена сигнал передается в клетку, что приводит к активации иммунной клетки и к выработке антигенспецифического иммунного ответа. Кроме того, полагают, что межцепочечное связывание антигена обеспечивает более стабильный модуль сигнальной трансдукции антиген-антигенный рецептор-эндогенный CD3, при этом более высокая стабильность в свою очередь обеспечивает более эффективную стимуляцию антигенспецифического иммунного ответа, по сравнению с одновалентными рецепторами и двухвалентными рецепторами, способными только к внутрицепочечному связыванию антигена. Также полагают, что такая более высокая стабильность обеспечивает возможность применения доменов передачи сигнала от рецептора иммунной клетки исключительно человеческого происхождения (например, замена аминокислотной последовательности, происходящей из организма человека, на аминокислотную последовательность, происходящую из организма другого вида, например, мыши, является минимальной или отсутствует вовсе). Таким образом, можно избежать любого потенциального нежелательного иммунного ответа на сам антигенный рецептор.
Антигенные рецепторы в соответствии с настоящим изобретением или их пептидные цепи в дополнение к доменам, образующим антигенсвязывающие центры, и доменам передачи сигнала от рецептора иммунной клетки, включая CD3ζ или любой другой сигнальный домен иммунной клетки, могут также содержать один или несколько костимулирующих доменов. Костимулирующие домены служат для повышения степени пролиферации и выживания T-клеток, таких как цитотоксические T-клетки, после связывания антигенного рецептора с целевой молекулой. Особенность костимулирующих доменов ограничена только тем, что они обладают способностью повышать степень пролиферации и выживания клеток после связывания целевой молекулы антигенным рецептором. Подходящие костимулирующие домены включают CD28, CD137 (4-1BB), представителя семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF), CD134 (OX40), представителя суперсемейства рецепторов TNFR и CD278 (ICOS), экспрессируемую на активированных T-клетках костимулирующую молекулу суперсемейства CD28. Специалисту в данной области будет понятно, что варианты последовательностей этих указанных костимулирующих доменов можно применять без негативного влияния на настоящее изобретение, причем варианты обладают активностью, аналогичной или подобной таковой у домена, на основе которого они смоделированы. Такие варианты будут характеризоваться по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательностей с аминокислотной последовательностью домена, из которого они происходят. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения конструкции антигенных рецепторов или их пептидные цепи содержат два костимулирующих домена. Хотя определенные комбинации включают все возможные варианты четырех указанных доменов, к конкретным примерам относятся CD28+CD137 (4-1BB) и CD28+CD134 (OX40).
Антигенные рецепторы по настоящему изобретению или их пептидные цепи могут содержать один или несколько костимулирующих доменов и домены передачи сигнала от рецептора иммунной клетки, соединенных в направлении от N-конца к C-концу. Однако антигенные рецепторы по настоящему изобретению или их пептидные цепи не ограничены таким расположением, и другие варианты расположения являются приемлемыми, и они включают домены передачи сигнала от рецептора иммунной клетки и один или несколько костимулирующих доменов.
Будет понятно, что, поскольку домены, образующие антигенсвязывающие центры, должны быть свободным для возможности связывания антигена, размещение таких доменов в слитом белке обычно будет таким, чтобы обеспечивалось экспонирование области на внешней поверхности клетки. Аналогичным образом, поскольку костимулирующие домены и домены передачи сигнала от рецептора иммунной клетки служат для индукции активности и пролиферации T-клеток, в слитом белке эти домены обычно будут экспонированы на внешней поверхности клетки. Антигенные рецепторы могут включать дополнительные элементы, такие как сигнальный пептид для обеспечения надлежащего экспорта слитого белка на поверхность клеток, трансмембранный домен для обеспечения поддержания слитого белка как интегрального мембранного белка и шарнирный домен (или спейсерная область), который придает гибкость доменам, образующим антигенсвязывающие центры, и обеспечивает сильное связывание с антигеном.
Необязательно антигенные рецепторы по настоящему изобретению могут дополнительно содержать линкер, причем линкер может представлять собой случайную аминокислотную последовательность или другое химическое соединение, пригодное в качестве спейсера между аминокислотными последовательностями. Обычно линкер предназначен для обеспечения гибкости и устойчивости к протеазам. Например, линкер может быть расположен между первым и вторым доменами на первой пептидной цепи и/или между первым и вторым доменами на второй пептидной цепи комбинационного антигенного рецептора по настоящему изобретению. Согласно другому варианту осуществления линкер может быть расположен между любыми двумя по меньшей мере из четырех доменов на первой пептидной цепи, т.е. между первым и вторым доменами, и/или между вторым и третьим доменами, и/или между третьим и четвертым доменами тандемного антигенного рецептора по настоящему изобретению. Необязательно линкер может находиться между доменами, которые образуют антигенсвязывающие центры, и доменом передачи сигнала от рецептора иммунной клетки. Любой известный в данной области тип линкера, который допускает образование доменами антигенсвязывающего центра или не препятствует связыванию антигена, охвачен объемом настоящего изобретения. Согласно конкретным вариантам осуществления линкер может представлять случайную аминокислотную последовательность, и его длина может составлять по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или по меньшей мере 100 аминокислотных остатков. Аминокислотный линкер, как правило, обогащен глицином для обеспечения гибкости, а также серином и треонином для обеспечения растворимости. Согласно одному варианту осуществления линкер составляют один или несколько (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) повторов из четырех глициновых остатков, за которыми следует сериновый остаток (Gly4Ser). Согласно определенным вариантам осуществления линкер может представлять собой шарнирную область антитела или ее фрагмент.
Антигенный рецептор по настоящему изобретению может дополнительно содержать другой домен, заякоривающий антигенный рецептор на мембране, такой как типичный трансмембранный домен. Предпочтительно трансмембранный домен включен в домен передачи сигнала, или является его частью.
Согласно другим вариантам осуществления антигенные рецепторы или пептидные цепи антигенных рецепторов по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие домены, такие как дополнительные домены, вовлеченные в связывания антигена, или усиливающие его, сигнальные последовательности для экспрессии мембраносвязанных белков или для возможности секреции, домены, которые обеспечивают улучшенную димеризацию, и трансмембранный домен, если он не является уже частью домена передачи сигнала от рецептора иммунной клетки. Согласно определенным вариантам осуществления трансмембранный домен может представлять собой гидрофобную альфа-спираль, которая пересекает мембрану.
Предпочтительно сигнальная последовательность или сигнальный пептид представляет собой последовательность или пептид, которая(-ый) обеспечивает надлежащее прохождение по секреторному пути и экспрессию на клеточной поверхности так, что антигенный рецептор, например, может связывать антиген, присутствующий во внеклеточном пространстве. Предпочтительно сигнальная последовательность или сигнальный пептид являются расщепляемыми и удаляются из зрелых пептидных цепей. Сигнальная последовательность или сигнальный пептид предпочтительно выбирают с учетом клетки или организма, в которых продуцируются пептидные цепи.
Согласно конкретному варианту осуществления пептидная цепь комбинационного антигенного рецептора по настоящему изобретению может предусматривать следующую структуру: NH2-сигнальный пептид-первый домен, вовлеченный в связывание антигена-необязательный линкер-второй домен, вовлеченный в связывание антигена-необязательный линкер-домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки-COOH.
Согласно конкретному варианту осуществления первая пептидная цепь тандемного антигенного рецептора по настоящему изобретению может предусматривать следующую структуру: NH2-сигнальный пептид-первый домен, вовлеченный в связывание антигена-необязательный линкер-второй домен, вовлеченный в связывание антигена-необязательный линкер-третий домен, вовлеченный в связывание антигена-необязательный линкер-четвертый домен, вовлеченный в связывание антигена-необязательный линкер-домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки-COOH.
В отношении тандемных антигенных рецепторов по настоящему изобретению в настоящем документе первый и второй (от N-конца к C-концу) домены, вовлеченные в образование антигенсвязывающего центра, первой пептидной цепи, также называют «N-концевыми доменами», а третий и четвертый (от N-конца к C-концу) домены, вовлеченные в образование антигенсвязывающего центра, первой пептидной цепи, также называют «C-концевыми доменами».
Иллюстративные антигенные рецепторы по настоящему изобретению включают без ограничения таковые, образованные первой и второй пептидными цепями, характеризующимися структурами, приведенными в таблице I ниже (VH представляет собой вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина или ее участок; VL представляет собой вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина или ее участок; C1 и C2 представляют собой домены передачи сигнала от рецептора иммунной клетки, которые друг с другом будут образовывать димер, например, константная или инвариантная области цепи Fc-рецептора иммунной клетки или константная или инвариантная области цепи T-клеточного рецептора или участок константной или инвариантной областей):
Таблица I
Первая пептидная цепь
Вторая пептидная цепь
VH(1)-VL(2)-C1
VL(1)-VH(2)-C2
VH(1)-VH(2)-C1
VL(1)-VL(2)-C2
VH(1)-VH(2)-C1
VL(2)-VL(1)-C2
VH(1)-VL(2)-C1
VH(2)-VL(1)-C2
VH(1)-VL(1)-VH(2)-VL(2)-C1
C2
VL(1)-VH(1)-VH(2)-VL(2)-C1
C2
VH(1)-VL(1)-VL(2)-VH(2)-C1
C2
VL(1)-VH(1)-VL(2)-VH(2)-C1
C2
Как определено выше, антигенный рецептор содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) со специфичностью к первому эпитопу (VH(1)), вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (VL) со специфичностью к первому эпитопу (VL(1)), вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) со специфичностью ко второму эпитопу (VH(2)) и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (VL) со специфичностью ко второму эпитопу (VL(2)), причем первый и второй эпитопы могут быть одинаковыми или разными и могут находиться на одном и том же или на разных антигенах. Согласно одному варианту осуществления VH(1) способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(1), а VH(2) способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(2), тогда как VH(1) не способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(2), а VH(2) не способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(1). Однако согласно другому варианту осуществления VH(1) способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(1), а также с VL(2), а VH(2) способен взаимодействовать и образовывать антигенсвязывающий центр с VL(2), а также с VL(1). Согласно последнему варианту осуществления VH(1) и VH(2) могут быть идентичными или по меньшей мере происходить из одного иммуноглобулина, и VL(1) и VL(2) могут быть идентичными или по меньшей мере происходить из одного иммуноглобулина.
Согласно конкретным вариантам осуществления домены C1 и C2 первой и второй пептидных цепей, приведенных в таблице I, представляют собой константные области альфа- и бета-цепей T-клеточного рецептора соответственно, или их участки.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, если два домена на одной пептидной цепи оба представляют собой вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина или ее участок, а два домена на другой цепи оба представляют собой вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина или ее участок, то линкер присутствует между первым и вторым доменами на обоих пептидных цепях. Линкер может представлять собой случайную аминокислотную последовательность длиной 10-25 аминокислот, более предпочтительно длиной 15 аминокислот. Согласно конкретному варианту осуществления линкер представляет собой 3 повтора аминокислотной последовательности из 5 мономерных единиц (Gly4Ser).
Согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения аминокислотные последовательности первой и второй пептидных цепей, например, таковых, которые содержат один или несколько доменов, которые образуют антигенсвязывающие центры, или домен передачи сигнала от рецептора иммунной клетки, происходят из организма млекопитающего, предпочтительно мыши, и более предпочтительно человека. Согласно одному варианту осуществления аминокислотные последовательности происходят из организма человека, но в них были включены последовательности мыши посредством замены одной или нескольких аминокислот в последовательности человека на аминокислоту, находящуюся в соответствующем положении в последовательности мыши. Такая замена может обеспечить более высокую степень димеризации или стабильности или способность передавать сигнал в клетку после связывания антигена. Согласно еще одному варианту осуществления аминокислотные последовательности происходят из организма мыши, и они были гуманизированы.
В соответствии с настоящим изобретением антигенный рецептор может заменять функцию описанного выше T-клеточного рецептора и, в частности, может придавать клетке, такой как описанная выше T-клетка, реактивность, такую как цитотоксическая активность. Однако в отличие от связывания T-клеточного рецептора с комплексом антигенный пептид-MHC, как описано выше, антигенный рецептор согласно определенным вариантам осуществления может связываться с антигеном, в частности, когда он экспрессирован на поверхности клетки.
Аминокислотные последовательности пептидных цепей, включая любые из доменов или линкеров, можно модифицировать. Например, и как будет понятно специалистам в данной области, последовательности вариабельных областей антител и Т-клеточных рецепторов можно модифицировать без потери их способности связываться с мишенью, и, следовательно, аминокислотную последовательность антигенсвязывающих центров можно аналогичным образом модифицировать без потери их способности связывать мишень. Например, аминокислотная последовательность домена, образующего антигенсвязывающий центр, может быть идентичной или в значительной степени гомологичной вариабельной области антитела, из которого она происходит. Под «в значительной степени гомологичный» подразумевается, что может быть выполнено 1-5, предпочтительно 1-4, как, например, 1-3 или 1, или 2 замены. Согласно одному варианту осуществления пептидная цепь может содержать природные аминокислоты и искусственные аминокислоты. Согласно другому варианту осуществления пептидная цепь содержит только природные аминокислоты. Термин «искусственная аминокислота» относится к аминокислоте, характеризующейся структурой, отличной от таковой у 20 природных молекул аминокислот. Поскольку искусственные аминокислоты характеризуются структурой, подобной таковой у природных аминокислот, искусственные аминокислоты могут быть классифицированы как производные или аналоги данных природных аминокислот.
Настоящее изобретение также охватывает производные антигенных рецепторов и пептидных цепей, описанных в настоящем документе. В соответствии с настоящим изобретением «производные» являются модифицированными формами белков и пептидов. Такие модификации включают любую химическую модификацию и предусматривают одиночные или множественные замены, делеции и/или добавления любых молекул, ассоциированных с антигенным рецептором или пептидной цепью, таких как углеводы, липиды и/или белки или пептиды. Согласно одному варианту осуществления «производные» белков или пептидов включают такие модифицированные аналоги, полученные в результате гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, пальмитоилирования, миристоилирования, изопренилирования, липидизации, алкилирования, дериватизации, введения защитных/блокирующих групп, протеолиза или связывания с антигеном. Термин «производное» также распространяется на все функциональные химические эквиваленты указанных антигенных рецепторов и пептидных цепей. Предпочтительно модифицированный антигенный рецептор или его пептидная цепь обладают повышенной способностью к связыванию или димеризации и/или повышенной способностью к активации иммунного ответа.
Клетки, применяемые с системой на основе антигенного рецептора по настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой T-клетки, в частности цитотоксические лимфоциты, предпочтительно выбранные из цитотоксических T-клеток, естественных клеток-киллеров (NK) и лимфокин-активированных клеток-киллеров (LAK). После активации каждый из этих типов цитотоксических лимфоцитов запускает разрушение целевых клеток. Например, цитотоксические T-клетки запускают разрушение целевых клеток с помощью одного или обоих из следующих способов. Первый заключается в том, что после активации из T-клеток высвобождаются цитотоксины, такие как перфорин, гранзимы и гранулизин. Перфорин и гранулизин создают поры в целевой клетке, а гранзимы проникают в клетку и запускают каспазный каскад в цитоплазме, что индуцирует апоптоз (запрограммированную гибель клеток) клетки. Второй заключается в том, что апоптоз может быть индуцирован посредством взаимодействия Fas-лиганд Fas между T-клетками и целевыми клетками. Цитотоксические лимфоциты предпочтительно будут представлять собой аутологичные клетки, хотя можно применять и гетерологичные клетки или аллогенные клетки.
L
L
H
H
H
H
H
Термин «иммуноглобулин» относится к белкам суперсемейства иммуноглобулинов, предпочтительно к антигенным рецепторам, таким как антитела или B-клеточный рецептор (BCR). Иммуноглобулины характеризуются структурным доменом, т.е. иммуноглобулиновым доменом, с типичной иммуноглобулиновой (Ig) укладкой. Термин охватывает мембраносвязанные иммуноглобулины, а также растворимые иммуноглобулины. Мембраносвязанные иммуноглобулины также называют поверхностными иммуноглобулинами или мембранными иммуноглобулинами, которые, как правило, являются частью BCR. Растворимые иммуноглобулины, как правило, называют антителами. Иммуноглобулины обычно содержат несколько цепей, обычно две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи, которые соединены дисульфидными связями. Такие цепи главным образом состоят из иммуноглобулиновых доменов, таких как V-домен (вариабельный домен легкой цепи),C-домен (константный домен легкой цепи) и C-домены (константные домены тяжелой цепи) C1, C2, C3 и C4. Существует пять типов тяжелых цепей иммуноглобулинов млекопитающих, т.е. α, δ, ε, γ и µ, которые соответствуют разным классам антител, т.е. IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В отличие от тяжелых цепей растворимых иммуноглобулинов, тяжелые цепи мембранных или поверхностных иммуноглобулинов содержат трансмембранный домен и короткий цитоплазматический домен на их карбокси-конце. У млекопитающих имеется два типа легких цепей, т. е. лямбда и каппа. Цепи иммуноглобулинов содержат вариабельную область и константную область. Константная область является преимущественно консервативной среди различных изотипов иммуноглобулинов, где вариабельная часть в значительной степени различается и отвечает за распознавание антигена.
Термин «антитело» относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Термин «антитело» включает моноклональные антитела, рекомбинантные антитела, антитела человека, гуманизированные антитела и химерные антитела. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (в настоящем документе сокращено как VH) и константной области тяжелой цепи. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в настоящем документе сокращено как VL) и константной области легкой цепи. VH- и VL-области дополнительно могут быть разделены на гипервариабельные области, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных, от амино-конца к карбокси-концу, в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки), и первым компонентом (Clq) классической системы комплемента.
В контексте настоящего документа термин «моноклональное антитело» относится к препарату молекул антител одного молекулярного состава. Моноклональное антитело характеризуется одной специфичностью связывания и аффинностью. Согласно одному варианту осуществления моноклональные антитела продуцируются гибридомой, которая предусматривает B-клетку, полученную от животного, отличного от человека, например мыши, слитую с бессмертной клеткой.
В контексте настоящего документа термин «рекомбинантное антитело» включает все антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные с помощью рекомбинантных способов, такие как (a) антитела, выделенные из организма животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным по генам иммуноглобулинов, или гибридомы, полученной с его применением, (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например, из трансфектомы, (c) антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные с помощью других способов, которые включают объединение последовательностей генов иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК.
Подразумевается, что в контексте настоящего документа термин «антитело человека» включает антитела с вариабельными и константными областями, происходящими из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Антитела человека могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, в случае мутаций, введенных с применением случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo).
Термин «гуманизированное антитело» относится к молекуле с антигенсвязывающим центром, который преимущественно происходит из иммуноглобулина от вида, отличного от человека, причем остальная часть иммуноглобулиновой структуры молекулы основана на структуре и/или последовательности иммуноглобулина человека. Антигенсвязывающий центр может содержать либо полные вариабельные домены, слитые с константными доменами, либо только определяющие комплементарность области (CDR), привитые на соответствующие каркасные области вариабельных доменов. Антигенсвязывающие центры могут быть дикого типа или модифицированными с помощью замен одной или нескольких аминокислот, например, модифицированными так, чтобы в большей степени походить на иммуноглобулины человека. В некоторых формах гуманизированных антител сохранены все CDR-последовательности (например, гуманизированное антитело мыши, которое содержит все шесть CDR из антитела мыши). Другие формы содержат одну или несколько CDR, которые изменены по сравнению с исходным антителом.
Термин «химерное антитело» относится к таким антителам, в которых один участок из каждой из аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепей является гомологичным соответствующим последовательностям антител, происходящих из конкретного вида или относящихся к конкретному классу, тогда как остальной сегмент цепи является гомологичным соответствующим последовательностям других антител. Как правило, вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепей имитирует вариабельные области антител, происходящих из одного вида млекопитающих, тогда как константные участки являются гомологичными последовательностям антител, происходящих из другого вида. Одно явное преимущество таких химерных форм состоит в том, что вариабельная область удобным образом может быть получена из известных на данный момент источников с применением легкодоступных B-клеток или гибридом организмов-хозяев, отличных от человека, в сочетании с константными областями, полученными, например, из препаратов клеток человека. В то время как вариабельная область обладает преимуществом, состоящим в легкости получения и наличии специфичности, которая не зависит от источника происхождения, константная область человека в случае введения антител с меньшей вероятностью вызовет иммунный ответ у субъекта-человека, чем константная область из источника, отличного от человека. Однако определение не ограничено этим конкретным примером.
Антитела могут происходить из разных видов, включая без ограничения мышь, крысу, кролика, морскую свинку и человека.
Описанные в настоящем документе антитела включают IgA, такие как антитела IgA1 или IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM и IgD. Согласно различным вариантам осуществления антитело представляет собой антитело IgG1, более конкретно изотип IgG1, каппа, или IgG1, лямбда (т.е. IgG1, κ, λ), антитело IgG2a (например, IgG2a, κ, λ), антитело IgG2b (например, IgG2b, κ, λ), антитело IgG3 (например, IgG3, κ, λ) или антитело IgG4 (например, IgG4, κ, λ).
2
Описанные в настоящем документе антигенные рецепторы могут содержать антигенсвязывающие участки одного или нескольких антител. Термины «антигенсвязывающий участок» антитела (или просто «связывающий участок») или «антигенсвязывающий фрагмент» антитела (или просто «связывающий фрагмент») или подобные термины относятся к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что функция антитела, заключающаяся в связывании антигена, может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий участок» антитела, включают (i) Fab-фрагменты, одновалентные фрагменты, состоящие из VL-, VH-, CL- и CH-доменов; (ii) F(ab')-фрагменты, двухвалентные фрагменты, содержащие два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагменты, состоящие из VH- и CH-доменов; (iv) Fv-фрагменты, состоящие из VL- и VH-доменов одного плеча антитела, (v) dAb-фрагменты (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), которые состоят из VH-домена; (vi) выделенные определяющие комплементарность области (CDR) и (vii) комбинации двух или более выделенных CDR, которые необязательно могут быть соединены синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены, с применением рекомбинантных способов, синтетическим линкером, который позволяет получать их в виде одной белковой цепи, в которой VL- и VH-области объединяются в пару с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Подразумевается, что такие одноцепочечные антитела также охвачены термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела. Дополнительным примером являются слитые белки на основе связывающего домена иммуноглобулина, предусматривающие (i) полипептид, представляющий собой связывающий домен, слитый с полипептидом, представляющим собой шарнирную область иммуноглобулина, (ii) константную область CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с шарнирной областью, и (iii) константную область CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с константной областью CH2. Полипептид, представляющий собой связывающий домен, может представлять собой вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи. Слитые белки на основе связывающего домена иммуноглобулина дополнительно раскрыты в US 2003/0118592 и US 2003/0133939. Такие фрагменты антител получают с применением известных специалистам в данной области традиционных методик, и фрагменты подвергают скринингу на предмет полезности аналогичным образом, что и в случае интактных антител.
Одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) представляет собой слитый белок на основе вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой цепей (VL) иммуноглобулинов, соединенных линкерным пептидом. Линкер может соединять N-конец VH с C-концом VL, или наоборот. Бивалентные (или двухвалентные) одноцепочечные вариабельные фрагменты (di-scFvs, bi-scFvs) могут быть сконструированы путем соединения двух scFv. Это может быть выполнено путем получения одной пептидной цепи с двумя VH- и двумя VL-областями, с образованием тандемных scFv.
Термин «связывающий домен» или просто «домен» применительно к настоящему изобретению обозначает структуру, например, антитела, которая связывается с/взаимодействует с данной целевой структурой/антигеном/эпитопом, необязательно при одновременном взаимодействии с другим доменом. Таким образом, такие домены в соответствии с настоящим изобретением обозначают «антигенсвязывающий центр».
Антитела и производные антител являются пригодными для получения связывающих доменов, таких как фрагменты антитела, в частности, для получения VL- и VH-областей.
Связывающие домены для антигена, которые могут присутствовать в антигенном рецепторе, обладают способностью связываться с (целевым) антигеном, т. е. способностью связываться с (целевым) эпитопом, присутствующим в антигене, предпочтительно эпитопом, находящимся в пределах внеклеточного домена антигена. Предпочтительно связывающие домены для антигена являются специфическими для антигена. Предпочтительно связывающие домены для антигена связываются с антигеном, экспрессируемым на клеточной поверхности. Согласно особенно предпочтительным вариантам осуществления связывающие домены для антигена связываются с нативными эпитопами антигена, находящегося на поверхности живых клеток.
Все антитела и производные антител, такие как фрагменты антител, как описано в настоящем документе для целей настоящего изобретения, охвачены термином «антитело».
Антитела могут быть получены с помощью ряда методик, включая традиционную методологию получения моноклональных антител, например, стандартную методику гибридизации соматических клеток по Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Хотя процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в целом, можно использовать другие методики получения моноклональных антител, например, вирусную или онкогенную трансформацию B-лимфоцитов или методики фагового дисплея с применением библиотек генов антител.
Предпочтительной системой с использованием животного для получения гибридом, которые секретируют моноклональные антитела, является система с использованием мыши. Получение гибридомы у мыши является очень хорошо отработанной процедурой. Протоколы по иммунизации и методики выделения иммунных спленоцитов для слияния известны в данной области. Партнеры по слиянию (например, миеломные клетки мыши) и процедуры слияния также известны.
Другими предпочтительными системами с использованием животного для получения гибридом, которые секретируют моноклональные антитела, являются системы с использованием крысы и кролика (например, описанные в Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), см. также Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124. 295 (2005)).
Для получения антител мышей можно иммунизировать конъюгированными с носителем пептидами, происходящими из антигенной последовательности, т.е. последовательности, на которую будут направлены антитела, препаратом, обогащенным рекомбинантно экспрессированным антигеном или его фрагментами, и/или описанными клетками, экспрессирующими антиген. В качестве альтернативы, мышей можно иммунизировать ДНК, кодирующей антиген или его фрагменты. В том случае, когда в результате иммунизаций с применением очищенного или обогащенного препарата антигена антитела не образуются, для стимуляции иммунных ответов мышей также можно иммунизировать клетками, экспрессирующими антиген, например, из клеточной линии.
Иммунный ответ можно отслеживать в процессе выполнения протокола иммунизации с применением образцов плазмы и сыворотки крови, полученных путем заборов крови из хвостовой вены или ретроорбитального синуса. Мышей с достаточными титрами иммуноглобулина можно применять для слияний. Мышей можно подвергать повторной антигенной стимуляции внутрибрюшинно или внутривенно с использованием экспрессирующих антиген клеток за 3 дня до умерщвления и удаления селезенки для увеличения доли гибридом, секретирующих специфические антитела.
Для получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, у иммунизированных мышей можно выделять спленоциты и клетки лимфатического узла и сливать их с подходящей бессмертной клеточной линией, такой как клеточная линия миеломы мыши. Полученные гибридомы затем можно подвергать скринингу на предмет продукции антигенспецифических антител. Отдельные лунки затем можно подвергать скринингу с помощью ELISA на предмет наличия гибридом, секретирующих антитела. Антитела со специфичностью к антигену можно идентифицировать с помощью иммунофлуоресцентного анализа и FACS с применением экспрессирующих антиген клеток. Гибридомы, секретирующие антитела, можно пересевать, снова подвергать скринингу и, если они все еще положительные в отношении продукции моноклональных антител, можно субклонировать методом серийных разведений. Стабильные субклоны затем можно культивировать in vitro для получения антитела в среде для культивирования тканей с целью определения его характеристик.
Способность антител и других связывающих средств связывать антиген можно определять с применением стандартных анализов связывания (например, ELISA, вестерн-блоттинг, иммунофлуоресцентный анализ и проточная цитометрия).
Термин «связывание» в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно относится к специфическому связыванию.
D
D
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
В соответствии с настоящим изобретением средство, такое как антигенный рецептор, способно связываться с предварительно определенной мишенью (нацеливаться на нее), если оно характеризуется значительной степенью аффинности к указанной предварительно определенной мишени и связывается с указанной предварительно определенной мишенью в стандартных анализах. «Аффинность» или «аффинность связывания» зачастую определяется равновесной константой диссоциации (K). Предпочтительно термин «значительная степень аффинности» относится к связыванию с предварительно определенной мишенью с константой диссоциации (K) 10 M или ниже, 10 M или ниже, 10 M или ниже, 10M или ниже, 10M или ниже, 10M или ниже, 10M или ниже или 10M или ниже.
D
D
D
D
3
4
5
6
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
Средство (практически) не способно связываться с мишенью (нацеливаться на нее), если оно не характеризуется значительной степенью аффинности к указанной мишени и не связывается в значительной степени, в частности, не связывается на выявляемом уровне, с указанной мишенью в стандартных анализах. Предпочтительно средство не связывается на выявляемом уровне с указанной мишенью, если оно присутствует в концентрации до 2, предпочтительно 10, более предпочтительно 20, в частности, 50 или 100 мкг/мл или выше. Предпочтительно средство не характеризуется значительной степенью аффинности к мишени, если оно связывается с указанной мишенью с K, которая по меньшей мере в 10 раз, 100 раз, 10 раз, 10 раз, 10 раз или 10 раз превышает K связывания с предварительно определенной мишенью, с которой средство способно связываться. Например, если K связывания средства с мишенью, с которой средство способно связываться, составляет 10 M, то K связывания с мишенью, в отношении которой средство не характеризуется значительной степенью аффинности, будет составлять по меньшей мере 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M или 10 M.
D
D
D
D
3
4
5
6
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
Средство является специфическим к предварительно определенной мишени, если оно способно связываться с указанной предварительно определенной мишенью, при этом оно (практически) не способно связываться с другими мишенями, т.е. не характеризуется значительной степенью аффинности к другим мишеням и не связывается в значительной степени с другими мишенями в стандартных анализах. Предпочтительно средство является специфическим к предварительно определенной мишени, если степень аффинности и связывания с такими другими мишенями не значительно превышает степень аффинности или связывания белков, которые не относятся к предварительно определенной мишени, таких как бычий сывороточный альбумин (BSA), казеин или сывороточный альбумин человека (HSA). Предпочтительно средство является специфическим к предварительно определенной мишени, если оно связывается с указанной мишенью с K, которая по меньшей мере в 10 раз, 100 раз, 10 раз, 10 раз, 10 раз или 10 раз ниже K связывания с мишенью, к которой оно является специфическим. Например, если K связывания средства с мишенью, к которой оно является специфическим, составляет 10 M, то K связывания с мишенью, к которой оно не является специфическим, будет составлять по меньшей мере 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M или 10 M.
D
50
Связывание средства с мишенью можно определять экспериментально с применением любого подходящего способа; см., например, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992) и описанные в настоящем документе способы. Показатели аффинности можно легко определять с применением традиционных методик, например, с помощью равновесного диализа; с применением прибора BIAcore 2000, с применением общих процедур, описанных производителем; с помощью радиоиммунологического анализа с применением меченного радиоактивным изотопом целевого антигена; или с помощью другого способа, известного специалисту в данной области. Данные по аффинности можно анализировать, например, с помощью способа из Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). Измеренная аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может варьировать, если измерения проводили в разных условиях, например, концентрации соли, pH. Таким образом, измерения аффинности и других параметров связывания антигена, например, K, IC, предпочтительно выполняют с применением стандартизированных растворов антитела и антигена и стандартизированного буфера.
Настоящее изобретение может включать введение, т.е. трансфекцию, кодирующих антигенные рецепторы нуклеиновых кислот в клетки, такие как T-клетки, in vitro или in vivo.
Для целей настоящего изобретения термин «трансфекция» включает введение нуклеиновой кислоты в клетку или поглощение нуклеиновой кислоты клеткой, где клетка может находиться в организме субъекта, например, пациента. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением клетка, подлежащая трансфекции описанной в настоящем документе нуклеиновой кислотой, может находиться in vitro или in vivo, например, клетка может образовывать часть органа, ткани и/или организма пациента. В соответствии с настоящим изобретением трансфекция может быть транзиентной или стабильной. Для некоторых вариантов применения трансфекции достаточно, чтобы трансфицированный генетический материал был экспрессирован только транзиентно. Поскольку нуклеиновая кислота, включенная в процесс трансфекции, обычно не интегрируется в ядерный геном, чужеродная нуклеиновая кислота будет утрачена после митоза или будет разрушена. В клетках, допускающих эписомную амплификацию нуклеиновых кислот, скорость утрачивания снижена. Если требуется, чтобы трансфицированная нуклеиновая кислота постоянно сохранялась в геноме клетки и ее дочерних клетках, должна иметь место стабильная трансфекция. РНК можно трансфицировать в клетки для транзиентной экспрессии кодируемого ею белка.
В соответствии с настоящим изобретением для введения нуклеиновых кислот в клетки, т.е. переноса или трансфицирования, можно применять любой пригодный метод. Предпочтительно нуклеиновую кислоту, такую как РНК, трансфицируют в клетки с помощью стандартных методик. Такие методики включают электропорацию, липофекцию и микроинъекцию. Согласно одному особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения РНК вводят в клетки путем электропорации. Электропорация или электропермеабилизация относится к значительному повышению электропроводимости и проницаемости плазматической мембраны клетки, обусловленному прилагаемым извне электрическим полем. Указанную методику обычно применяют в молекулярной биологии в качестве способа введения в клетки некоторых веществ. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно, чтобы введение в клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или пептид, приводило в результате к экспрессии указанных белка или пептида.
Для включения конструкций антигенных рецепторов в T-клетки можно применять ряд способов, в том числе трансфекцию на основе ДНК, отличной от вирусной, системы на основе транспозонов и системы на основе вирусов.Трансфекция на основе ДНК, отличной от вирусной, характеризуется незначительным риском инсерционого мутагенеза. С помощью систем на основе транспозонов трансгены можно интегрировать более эффективно, чем с помощью плазмид, которые не содержат интегрирующий элемент. Системы на основе вирусов включают применение γ-ретровирусов и лентивирусных векторов. γ-Ретровирусы относительно просто получать, они эффективно и стабильно трансдуцируют T-клетки, и для них была предварительно доказана безопасность с точки зрения интеграции в первичные T-клетки человека. Лентивирусные векторы также эффективно и стабильно трансдуцируют T-клетки, но являются более дорогостоящими в производстве. Они также потенциально более безопасны, чем системы на основе ретровирусов.
Для трансфекции клеток in vivo можно применять фармацевтическую композицию, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую антигенный рецептор. Средство для доставки, которое направляет нуклеиновую кислоту в определенную клетку, такую как T-клетка, можно вводить пациенту, в результате чего происходит трансфекция in vivo.
В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновую кислоту, кодирующую антигенный рецептор, предпочтительно вводить в «голой форме» или с носителем. Носители, такие как липидные носители, предназначенные для применения в настоящем изобретении, включают любые вещества или средства для доставки, с которыми может быть ассоциирована нуклеиновая кислота, такая как РНК, например, путем образования комплексов с нуклеиновой кислотой или образования везикул, в которые заключена или инкапсулирована нуклеиновая кислота. В результате этого может повышаться стабильность нуклеиновой кислоты по сравнению с «голой» нуклеиновой кислотой. В частности, может повышаться стабильность нуклеиновой кислоты в крови. Например, можно применять составы наночастиц на основе РНК с определенным размером частиц, такие каклипоплексы из РНК и липосом, например, липоплексы, содержащие DOTMA и DOPE или DOTMA и холестерин.
В контексте настоящего документа термин «наночастица» относится к любой частице с диаметром, который делает частицу подходящей для системного, в частности, парентерального введения, в частности, нуклеиновых кислот, как правило, диаметром менее 1000 нанометров (нм). Согласно некоторым вариантам осуществления наночастица имеет диаметр менее 600 нм. Согласно некоторым вариантам осуществления наночастица имеет диаметр менее 400 нм.
В контексте настоящего документа термин «состав на основе наночастиц» или подобные термины относится к любому веществу, которое содержит по меньшей мере одну наночастицу. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция на основе наночастиц представляет собой однородную совокупность наночастиц. Согласно некоторым вариантам осуществления композиции на основе наночастиц представляют собой дисперсии или эмульсии. Как правило, дисперсия или эмульсия образуются при объединении по меньшей мере двух несмешивающихся веществ.
Термин «липоплекс» или «липоплекс с нуклеиновой кислотой», в частности «липоплекс с РНК», относится к комплексу липидов и нуклеиновых кислот, в частности РНК. Липоплексы образуются спонтанно при смешивании катионных липосом, которые зачастую также содержат нейтральный «хелперный» липид, с нуклеиновыми кислотами.
Катионные липиды, катионные полимеры и другие вещества с положительными зарядами могут образовывать комплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Такие катионные молекулы можно применять для связывания нуклеиновых кислот в комплекс, за счет чего образуются, например, так называемые липоплексы или полиплексы соответственно, и такие комплексы, как было показано, доставляют нуклеиновые кислоты в клетки.
Препараты наночастиц на основе нуклеиновых кислот для применения в настоящем изобретении можно получать с применением ряда протоколов и из любых соединений, образующих комплексы с нуклеиновыми кислотами. Комплексообразующими средствами, как правило, являются липиды, полимеры, олигомеры или амфифильные вещества. Согласно одному варианту осуществления комплексообразующее соединение предусматривает по меньшей мере одно средство, выбранное из группы, состоящей из протамина, полиэтиленимина, поли-L-лизина, поли-L-аргинина или гистона.
В соответствии с настоящим изобретением протамин является пригодным в качестве катионного средства-носителя. Термин «протамин» относится к любому из ряда богатых аргинином сильноосновных белков с относительно низкой молекулярной массой и встречающихся в ассоциированном, в частности, с ДНК состоянии в сперматозоидах ряда животных (таких как рыба), вместо соматических гистонов. В частности, термин «протамин» относится к встречающимся в молоках рыбы белкам, которые являются сильноосновными, растворяются в воде, не коагулируют при нагревании, и при их гидролизе главным образом образуется аргинин. В очищенной форме их применяют в составе на основе инсулина длительного действия и для нейтрализации антикоагулянтных эффектов гепарина.
В соответствии с настоящим изобретением подразумевается, что применяемый в настоящем документе термин «протамин» предусматривает любую аминокислотную последовательность протамина, полученную из нативных или биологических источников, или происходящую из них, в том числе ее фрагменты и мультимерные формы указанной аминокислотной последовательности или ее фрагмента. Кроме того, термин охватывает (синтезированные) полипептиды, которые являются искусственными и специально сконструированными для конкретных целей, и не могут быть выделены из нативных или биологических источников.
Применяемый в соответствии с настоящим изобретением протамин может представлять собой сульфатированный протамин или гидрохлорид протамина. Согласно предпочтительному варианту осуществления источник протамина, применяемого для получения описанных в настоящем документе наночастиц, представляет собой протамин 5000, который предусматривает протамин в концентрации более 10 мг/мл (5000 гепарин-нейтрализирующих единиц на мл) в изотоническом солевом растворе.
Липосомы представляют собой микроскопические липидные везикулы, часто имеющие один или несколько бислоев из образующего везикулу липида, такого как фосфолипид, и способны инкапсулировать лекарственное средство. В контексте настоящего изобретения можно использовать различные типы липосом, в том числе без ограничения многослойные везикулы (MLV), малые однослойные везикулы (SUV), крупные однослойные везикулы (LUV), стерически стабилизированные липосомы (SSL), мультивезикулярные тела (MV) и крупные мультивезикулярные тела (LMV), а также другие бислойные формы, известные в данной области. Размер и количество слоев липосомы будет зависеть от способа получения, а выбор типа подлежащих применению везикул будет зависеть от предпочтительного способа введения. Существует несколько других форм надмолекулярной организации, в виде которых липиды могут находиться в водной среде, предусматривающие ламеллярные фазы, гексагональные фазы и инверсные гексагональные фазы, кубические фазы, мицеллы, инвертированные мицеллярные фазы, состоящие из монослоев. Такие фазы также могут быть получены в комбинации с ДНК или РНК, и взаимодействие с РНК и ДНК может существенно влиять на фазовое состояние. Описанные фазы могут иметь место в составах наночастиц на основе нуклеиновых кислот по настоящему изобретению.
Для образования липоплексов с нуклеиновой кислотой из нуклеиновой кислоты и липосом можно применять любой подходящий способ образования липосом, если он обеспечивает получение ожидаемых липоплексов с нуклеиновой кислотой. Липосомы могут быть образованы с применением стандартных способов, таких как способ выпаривания в обращенной фазе (REV), способ инжекции этанола, способ дегидратации-регидратации (DRV), обработка ультразвуком или другие подходящие способы.
После образования липосом липосомы можно разделять по размеру с получением популяции липосом, характеризующейся в значительной степени гомогенным диапазоном частиц.
Образующие бислой липиды, как правило, содержат две углеводородные цепи, в частности, ацильные цепи, и концевую группу, либо полярную, либо неполярную. Образующие бислой липиды состоят либо из встречающихся в природе липидов, либо из липидов синтетического происхождения, в том числе фосфолипидов, таких как фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидная кислота, фосфатидилинозитол и сфингомиелин, у которых длина углеводородных цепей, как правило, составляет приблизительно 14-22 атомов углерода, и они характеризуются отличающимися степенями ненасыщенности. Другие подходящие липиды для применения в композиции по настоящему изобретению включают гликолипиды и стерины, такие как холестерин, и их различные аналоги, которые также можно применять в липосомах.
Катионные липиды, как правило, содержат липофильный фрагмент, такой как стерин, ацильную или диацильную цепь, и имеют суммарный положительный заряд. Концевая группа липида, как правило, несет положительный заряд. Катионный липид предпочтительно имеет положительный заряд, соответствующий 1-10 валентностям, более предпочтительно положительный заряд, соответствующий 1-3 валентностям и более предпочтительно положительный заряд, соответствующий 1 валентности. К примерам катионных липидов относятся без ограничения 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA); диметилдиоктадециламмоний (DDAB); 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP); 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропан (DODAP); 1,2-диацилокси-3-диметиламмоний-пропан; 1,2-диалкилокси-3-диметиламмоний-пропан; диоктадецилдиметиламмония хлорид (DODAC), 1,2-димиристоилоксипропил-1,3-диметилгидроксиэтиламмоний (DMRIE) и 2,3-диолеоилокси-N-[2(спермин-карбоксамид)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминия трифторацетат (DOSPA). Предпочтительными являются DOTMA, DOTAP, DODAC и DOSPA. Наиболее предпочтительным является DOTMA.
Кроме того, описанные в настоящем документе наночастицы предпочтительно дополнительно содержат нейтральный липид с учетом стабильности структуры и т.д. Нейтральный липид может быть соответствующим образом выбран с учетом эффективности доставки комплекса нуклеиновая кислота-липид. К примерам нейтральных липидов относятся без ограничения 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC), диацилфосфатидилхолин, диацилфосфатидилэтаноламин, церамид, сфингомиелин, цефалин, стерин и цереброзид. Предпочтительными являются DOPE и/или DOPC. Наиболее предпочтительным является DOPE. В случае, когда катионная липосома содержит как катионный липид, так и нейтральный липид, молярное соотношение катионного липида и нейтрального липида может быть определено соответствующим образом с учетом стабильности липосомы и т.д.
В соответствии с одним вариантом осуществления описанные в настоящем документе наночастицы могут содержать фосфолипиды. Фосфолипиды могут представлять собой глицерофосфолипид. К примерам глицерофосфолипида относятся без ограничения три типа липидов: (i) цвиттерионные фосфолипиды, которые включают, например, фосфатидилхолин (PC), фосфатидилхолин яичного желтка, происходящий из соевых бобов PC в естественной, частично гидрогенизированной или полностью гидрогенизированной форме, димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), сфингомиелин (SM); (ii) отрицательно заряженные фосфолипиды, которые включают, например, фосфатидилсерин (PS), фосфатидилинозитол (PI), фосфатидную кислоту (PA), фосфатидилглицерин (PG), дипальмитоил-PG, димиристоил-фосфатидилглицерин (DMPG); синтетические производные, в которых конъюгат содержит цвиттерионный фосфолипид с отрицательным зарядом, как в случае метоксиполиэтиленгликоль-дистеароилфосфатидилэтаноламина (mPEG-DSPE); и (iii) катионные фосфолипиды, которые включают, например, фосфатидилхолин или сфингомиелин, фосфомоноэфир которых был O-метилирован с образованием катионных липидов.
Ассоциация нуклеиновой кислоты с липидным носителем может происходить, например, путем заполнения нуклеиновой кислотой пустых пространств носителя так, что носитель физически захватывает нуклеиновую кислоту, или путем ковалентного, ионного или водородного связывания, или посредством адсорбции за счет неспецифических связей. Независимо от способа ассоциации, нуклеиновая кислота должна сохранять свои терапевтические, т.е. антиген-кодирующие свойства.
В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота, кодирующая антигенный рецептор, согласно одному варианту осуществления представляет собой РНК, предпочтительно мРНК. РНК предпочтительно получена посредством in vitro транскрипции.
Подразумевается, что в контексте настоящего документа термин «нуклеиновая кислота» включает ДНК и РНК, как, например, геномную ДНК, кДНК, мРНК, полученные рекомбинантным путем и химически синтезированные молекулы. Нуклеиновая кислота может быть однонитевой или двунитевой. РНК включает in vitro транскрибированную РНК (IVT-РНК) или синтетическую РНК. В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота предпочтительно является выделенной нуклеиновой кислотой.
Нуклеиновые кислоты могут находиться в составе вектора. В контексте настоящего документа термин «вектор» включает любые векторы, известные специалисту в данной области, включая плазмидные векторы, космидные векторы, векторы на основе фагов, например, фага лямбда, вирусные векторы, такие как аденовирусные или бакуловирусные векторы, или векторы на основе искусственной хромосомы, например, искусственные бактериальные хромосомы (BAC), искусственные дрожжевые хромосомы (YAC) или искусственные хромосомы Р1 (PAC). Указанные векторы включают векторы экспрессии, а также клонирующие векторы. Векторы экспрессии предусматривают плазмиды, а также вирусные векторы, и обычно содержат требуемую кодирующую последовательность и соответствующие последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине (например, у бактерий, дрожжей, растения, насекомого или млекопитающего) или в системах in vitro экспрессии. Клонирующие векторы обычно применяют для конструирования и амплификации определенного требуемого ДНК-фрагмента, и они могут не содержать функциональные последовательности, необходимые для экспрессии требуемых ДНК-фрагментов.
В контексте настоящего изобретения термин «РНК» относится к молекуле, которая содержит рибонуклеотидные остатки и предпочтительно полностью или преимущественно состоит из рибонуклеотидных остатков. Термин «рибонуклеотид» относится к нуклеотиду с гидроксильной группой в 2’-положении β-D-рибофуранозильной группы. Термин включает двунитевую РНК, однонитевую РНК, выделенную РНК, такую как частично очищенная РНК, практически чистая РНК, синтетическую РНК, полученную рекомбинантным путем РНК, а также модифицированную РНК, которая отличается от встречающейся в природе РНК добавлением, делецией, заменой и/или изменением одного или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут включать добавление вещества, отличного от нуклеотида, например, к концу(-ам) РНК или внутрь нее, например, к одному или нескольким нуклеотидам РНК. Нуклеотиды в молекулах РНК могут также предусматривать нестандартные нуклеотиды, такие как не встречающиеся в природе нуклеотиды или химически синтезированные нуклеотиды или дезоксинуклеотиды. Такие измененные РНК могут называться аналогами или аналогами встречающейся в природе РНК.
В соответствии с настоящим изобретением термин «РНК» включает и предпочтительно относится к «мРНК», что означает «матричная РНК», и относится к «транскрипту», который может быть получен с применением ДНК в качестве матрицы, и кодирует пептид или белок. мРНК, как правило, содержит 5'-нетранслируемую область (5'-UTR), кодирующую белок или пептид область и 3'-нетранслируемую область (3'-UTR). мРНК имеет ограниченное время полужизни в клетках и in vitro. Предпочтительно мРНК получают посредством in vitro транскрипции с применением ДНК-матрицы. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения РНК получают посредством in vitro транскрипции или химического синтеза. Методика по in vitro транскрипции известна специалисту в данной области. Например, существует ряд коммерчески доступных наборов для in vitro транскрипции.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения РНК представляет собой самореплицирующуюся РНК, такую как однонитевая самореплицирующаяся РНК. Согласно одному варианту осуществления самореплицирующаяся РНК представляет собой однонитевую плюс-смысловую РНК. Согласно одному варианту осуществления самореплицирующаяся РНК представляет собой вирусную РНК или РНК, происходящую из вирусной РНК. Согласно одному варианту осуществления самореплицирующаяся РНК представляет собой геномную РНК альфа-вируса или происходит из геномной РНК альфа-вируса. Согласно одному варианту осуществления самореплицирующаяся РНК представляет собой вектор экспрессии на основе вирусных генов. Согласно одному варианту осуществления вирус представляет собой вирус леса Семлики. Согласно одному варианту осуществления самореплицирующаяся РНК предусматривает один или несколько трансгенов, причем по меньшей мере один из указанных трансгенов кодирует описанные в настоящем документе средства. Согласно одному варианту осуществления, если РНК представляет собой вирусную РНК или происходит из вирусной РНК, трансгены могут частично или полностью заменять вирусные последовательности, такие как вирусные последовательности, кодирующие структурные белки. Согласно одному варианту осуществления самореплицирующаяся РНК представляет собой транскрибированную in vitro РНК.
С целью повышения уровня экспрессии и/или стабильности РНК, применяемой в соответствии с настоящим изобретением, она может быть модифицирована, предпочтительно без изменения последовательности экспрессируемого пептида или белка.
Термин «модификация» в контексте РНК, применяемой в соответствии с настоящим изобретением, включает любую модификацию РНК, которая в естественных условиях не встречается в указанной РНК.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения РНК, применяемая в соответствии с настоящим изобретением, не содержит некэпированные 5'-трифосфаты. Удаление таких некэпированных 5'-трифосфатов можно обеспечить путем обработки РНК фосфатазой.
РНК в соответствии с настоящим изобретением может содержать модифицированные встречающиеся в природе или синтетические рибонуклеотиды с целью повышения ее стабильности и/или снижения цитотоксичности. Например, согласно одному варианту осуществления в РНК, применяемой в соответствии с настоящим изобретением, цитидин заменен на 5-метилцитидин, частично или полностью, предпочтительно полностью. В качестве альтернативы, или дополнительно, согласно одному варианту осуществления в РНК, применяемой в соответствии с настоящим изобретением, уридин заменен на псевдоуридин, частично или полностью, предпочтительно полностью.
Согласно одному варианту осуществления термин «модификация» относится к получению РНК с 5'-кэпом или аналогом 5'-кэпа. Термин «5'-кэп» относится к кэп-структуре, которая находится на 5'-конце молекулы мРНК и обычно состоит из гуанозинового нуклеотида, присоединенного к мРНК посредством нетипичной 5'-5'-трифосфатной связи. Согласно одному варианту осуществления такой гуанозин метилирован по 7-положению. Термин «типичный 5'-кэп» относится к 5'-кэпу встречающейся в природе РНК, предпочтительно к кэпу, представляющему собой 7-метилгуанозин (m7G). В контексте настоящего изобретения термин «5'-кэп» включает аналог 5'-кэпа, который напоминает кэп-структуру РНК и модифицирован таким образом, что он обладает способностью стабилизировать РНК, когда присоединен к ней, предпочтительно in vivo и/или в клетке.
Обеспечение РНК 5'-кэпом или аналогом 5'-кэпа может быть осуществлено посредством in vitro транскрипции ДНК-матрицы в присутствии указанного 5'-кэпа или аналога 5'-кэпа, где указанный 5'-кэп включается в образующуюся нить РНК в процессе транскрипции или РНК может быть образована, например, посредством in vitro транскрипции, а 5'-кэп может быть присоединен посттранскрипционно с помощью кэпирующих ферментов, например, кэпирующих ферментов вируса коровьей оспы.
РНК может предусматривать дополнительные модификации. Например, дополнительная модификация РНК, применяемой в настоящем изобретении, может представлять собой удлинение или усечение встречающегося в природе поли(A)-хвоста или изменение 5'- или 3'-нетранслируемых областей (UTR), как, например, введение UTR, которая не связана с кодирующей областью указанной РНК, например, вставка одной или нескольких, предпочтительно двух копий 3'-UTR, происходящих из гена глобина, например, альфа-2-глобина, альфа-1-глобина, бета-глобина, предпочтительно бета-глобина, более предпочтительно бета-глобина человека.
Следовательно, с целью повышения стабильности и/или уровня экспрессии РНК, применяемой в соответствии с настоящим изобретением, ее можно модифицировать таким образом, чтобы она присутствовала вместе с поли-A-последовательностью, предпочтительно длиной 10-500, более предпочтительно 30-300, еще более предпочтительно 65-200 и особенно 100-150 аденозиновых остатков. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления длина поли-A-последовательности составляет примерно 120 аденозиновых остатков. Кроме того, включение двух или более 3'-нетранслируемых областей (UTR) в 3'-нетранслируемую область молекулы РНК может обеспечить увеличение эффективности трансляции. Согласно конкретному варианту осуществления 3'-UTR происходит из гена β-глобина человека.
Термин «стабильность» РНК относится к «времени полужизни» РНК. «Время полужизни» относится к периоду времени, который требуется для устранения половины активности, количества или числа молекул. В контексте настоящего изобретения время полужизни РНК является показателем стабильности указанной РНК. Время полужизни РНК может влиять на «продолжительность экспрессии» РНК. Можно ожидать, что РНК с длительным временем полужизни будет экспрессироваться в течение продолжительного периода времени.
В контексте настоящего изобретения термин «транскрипция» относится к процессу, в котором генетический код последовательности ДНК транскрибируется в РНК. Впоследствии РНК может быть транслирована в белок. В соответствии с настоящим изобретением термин «транскрипция» предусматривает «in vitro транскрипцию», причем термин «in vitro транскрипция» относится к процессу, в котором РНК, в частности мРНК, синтезируется in vitro в бесклеточной системе, предпочтительно с применением соответствующих клеточных экстрактов. Предпочтительно для получения транскриптов применяют клонирующие векторы. Такие клонирующие векторы обычно обозначаются как векторы транскрипции и в соответствии с настоящим изобретением охватываются термином «вектор».
Термин «трансляция» в соответствии с настоящим изобретением относится к процессу, осуществляемому на рибосомах клетки, посредством которого нить матричной РНК направляет сборку последовательности аминокислот с образованием пептида или белка.
Нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут присутствовать в отдельности или вместе с другими нуклеиновыми кислотами, которые могут быть гомологичными или гетерологичными. Согласно предпочтительным вариантам осуществления нуклеиновая кислота функционально связана с последовательностями контроля экспрессии, которые могут быть гомологичными или гетерологичными по отношению к указанной нуклеиновой кислоте. Термин «гомологичный» означает, что в естественных условиях нуклеиновые кислоты также функционально связаны, а термин «гетерологичный» означает, что в естественных условиях нуклеиновые кислоты не связаны функционально.
Нуклеиновая кислота и последовательность контроля экспрессии «функционально» связаны друг с другом, если они связаны ковалентно друг с другом таким образом, что экспрессия или транскрипция указанной нуклеиновой кислоты находится под контролем или под влиянием указанной последовательности контроля экспрессии. Если нуклеиновая кислота подлежит трансляции в функциональный белок, то, вместе с последовательностью контроля экспрессии, функционально связанной с кодирующей последовательностью, индукция указанной последовательности контроля экспрессии приводит в результате к транскрипции указанной нуклеиновой кислоты, причем она не приводит к смещению рамки считывания в кодирующей последовательности или неспособности указанной кодирующей последовательности транслироваться в требуемый белок или пептид.
Термин «последовательность контроля экспрессии» или «элемент контроля экспрессии» в соответствии с настоящим изобретением предусматривает промоторы, сайты связывания рибосом, энхансеры и другие элементы контроля, которые осуществляют регуляцию транскрипции гена или трансляции мРНК. Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения можно осуществлять регуляцию последовательностей контроля экспрессии. Конкретная структура последовательностей контроля экспрессии может варьировать в зависимости от вида или типа клеток, но, как правило, предусматривает 5'-нетранскрибируемые и 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности, вовлеченные в инициацию транскрипции и трансляции соответственно, такие как TATA-бокс, кэпирующая последовательность, последовательность CAAT и т.д. Более конкретно, 5'-нетранскрибируемые последовательности контроля экспрессии предусматривают промоторную область, которая предусматривает промоторную последовательность для контроля транскрипции функционально связанной нуклеиновой кислоты. Последовательности контроля экспрессии могут также предусматривать энхансерные последовательности или вышележащие активаторные последовательности.
Термин «экспрессия» в соответствии с настоящим изобретением применяют в его наиболее общем значении и он предусматривает продукцию РНК и/или пептидов или белков, например, посредством транскрипции и/или трансляции. В отношении РНК термин «экспрессия» или «трансляция» относится, в частности, к продукции пептидов или белков. Он также предусматривает частичную экспрессию нуклеиновых кислот. Кроме того, экспрессия может быть транзиентной или стабильной. В соответствии с настоящим изобретением термин экспрессия также включает «аномальную экспрессию» или «нарушенную экспрессию».
«Аномальная экспрессия» или «нарушенная экспрессия» в соответствии с настоящим изобретением означает, что экспрессия является измененной, предпочтительно повышенной по сравнению с эталоном, например, состоянием субъекта, у которого не наблюдают заболевание, ассоциированное с аномальной или нарушенной экспрессией определенного белка, например, опухолевого антигена. Повышение уровня экспрессии относится к повышению по меньшей мере на 10%, в частности, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50% или по меньшей мере на 100% или больше. Согласно одному варианту осуществления экспрессию обнаруживают только в пораженной заболеванием ткани, тогда как экспрессия в здоровой ткани репрессирована.
Термин «специфически экспрессированный» означает, что белок преимущественно экспрессируется только в конкретных ткани или органе. Например, «опухолевый антиген специфически экспрессируется в слизистой оболочке желудка» означает, что указанный белок главным образом экспрессируется в слизистой оболочке желудка и не экспрессируется в других тканях или не экспрессируется в значительной степени в других типах тканей или органов. Таким образом, белок, который экспрессируется исключительно в клетках слизистой оболочки желудка и в значительно меньшей степени в другой ткани, такой как ткань яичка, специфически экспрессируется в клетках слизистой оболочки желудка. Согласно некоторым вариантам осуществления опухолевый антиген также может специфически экспрессироваться в нормальных условиях более чем в одном типе тканей или органов, как, например, в 2 или 3 типах тканей или органов, но предпочтительно не более чем в 3 разных типах тканей или органов. Таким образом, в этом случае опухолевый антиген специфически экспрессируется в этих органах. Например, если опухолевый антиген в нормальных условиях экспрессируется предпочтительно примерно в равной степени в легком и желудке, то указанный опухолевый антиген специфически экспрессируется в легком и желудке.
В соответствии с настоящим изобретением термин «нуклеиновая кислота, кодирующая» означает, что нуклеиновая кислота, если она находится в соответствующем окружении, предпочтительно в клетке, может экспрессироваться с образованием белка или пептида, которые она кодирует.
Термин «пептид» в соответствии с настоящим изобретением предусматривает олиго- и полипептиды и относится к веществам, содержащим две или более, предпочтительно 3 или более, предпочтительно 4 или более, предпочтительно 6 или более, предпочтительно 8 или более, предпочтительно 9 или более, предпочтительно 10 или более, предпочтительно 13 или более, предпочтительно 16 или более, предпочтительно 21 или более и до предпочтительно 8, 10, 20, 30, 40 или 50, в частности, 100 аминокислот, соединенных ковалентно с помощью пептидных связей. Термин «белок» относится к крупным пептидам, предпочтительно к пептидам более чем с 100 аминокислотными остатками, но в целом термины «пептид», «пептидная цепь» и «белок» являются синонимами, и в настоящем документе их применяют взаимозаменяемо.
Как упоминалось выше, аминокислотные последовательности пептидных цепей и антигенных рецепторов, описанных в настоящем документе, можно модифицировать с тем, чтобы получить варианты указанных аминокислотных последовательностей. Соответственно, настоящее изобретение включает варианты последовательностей пептидов и белков, описанных в настоящем документе, и включает варианты встречающихся в природе аминокислотных последовательностей, что обеспечивает получение последовательностей, которые функционально эквивалентны указанным последовательностям, например, аминокислотных последовательностей, характеризующихся свойствами, идентичными или подобными таковым у указанных последовательностей. Важными свойствами являются сохранение связывания антигенного рецептора с его мишенью или передача сигнала после связывания антигена в клетку, такую как T-клетка. Согласно одному варианту осуществления вариантная молекула или последовательность является иммунологически эквивалентной исходной молекуле или последовательности.
Термин «вариант» в соответствии с настоящим изобретением относится, в частности, к мутантам, сплайс-вариантам, конформациям, изоформам, аллельным вариантам, видовым вариантам и видовым гомологам, в частности, таковым, которые существуют в естественных условиях. Аллельный вариант относится к изменению обычной последовательности гена, значение которого зачастую не установлено. С помощью полного секвенирования гена обычно идентифицируют множество аллельных вариантов для данного гена. Видовой гомолог представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотную последовательность, происходящую от другого вида по сравнению с данной последовательностью нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательностью. Термин «вариант» должен охватывать любые посттрансляционно модифицированные варианты и конформационные варианты.
Термин «иммунологически эквивалентный» означает, что иммунологически эквивалентная молекула, такая как иммунологически эквивалентная аминокислотная последовательность, характеризуется такими же или практически такими же иммунологическими свойствами и/или проявляет такие же или практически такие же иммунологические эффекты, например, что касается типа иммунологического эффекта. В контексте настоящего изобретения термин «иммунологически эквивалентный» предпочтительно применяют в отношении иммунологических эффектов или свойств антигенных рецепторов, применяемых для терапии.
Специалистам в данной области будет понятно, что, в частности, последовательности CDR-последовательностей, гипервариабельных и вариабельных областей можно модифицировать без потери способности связываться с мишенью. Например, CDR-области могут быть либо идентичными, либо в значительной степени гомологичными областям исходных антител. Под «в значительной степени гомологичный» подразумевается, что может быть выполнено 1-5, предпочтительно 1-4, как, например, 1-3 или 1, или 2 замены в CDR.
Для целей настоящего изобретения «варианты» аминокислотной последовательности предусматривают варианты со вставкой аминокислоты, варианты с добавлением аминокислоты, варианты с делецией аминокислоты и/или варианты с заменой аминокислоты. Варианты с делецией аминокислоты, которые предусматривают делецию по N-концу и/или C-концу белка, также называют вариантами с N-концевым и/или C-концевым усечением.
Варианты со вставкой аминокислоты предусматривают вставки одной, или двух, или более аминокислот в конкретную аминокислотную последовательность. В случае вариантов аминокислотной последовательности со вставкой, один или несколько аминокислотных остатков вставляют в конкретный участок аминокислотной последовательности, хотя также возможна случайная вставка с соответствующим скринингом полученного продукта.
Варианты с добавлением аминокислоты предусматривают амино- и/или карбокси-концевые слияния одной или нескольких аминокислот, например, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 или более аминокислот.
Варианты с делецией аминокислоты характеризуются удалением из последовательности одной или нескольких аминокислот, например, удалением 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 или более аминокислот. Делеции можно выполнять по любому положению белка.
Варианты с заменой аминокислоты характеризуются тем, что по меньшей мере один остаток последовательности удаляют, а на его место вставляют другой остаток. Предпочтение отдают модификациям в положениях аминокислотной последовательности, которые не являются консервативными среди гомологичных белков или пептидов, и/или замещению аминокислот на другие аминокислоты с подобными свойствами. Предпочтительно изменения по аминокислотам в вариантах белка представляют собой изменения по консервативным аминокислотам, т.е. замены одинаково заряженных или незаряженных аминокислот. Изменение по консервативной аминокислоте включает замену одной из семейства аминокислот, которые обладают сходством по их боковым цепям. Встречающиеся в природе аминокислоты обычно делят на четыре семейства: кислотные (аспартат, глутамат), основные (лизин, аргинин, гистидин), неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан) и незаряженные полярные (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин) аминокислоты. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда вместе относят к ароматическим аминокислотам.
Предпочтительно степень сходства, предпочтительно идентичности между данной аминокислотной последовательностью и аминокислотной последовательностью, которая является вариантом указанной данной аминокислотной последовательности, будет составлять по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Степень сходства или идентичности учитывается предпочтительно для аминокислотной области, которая составляет по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90% или приблизительно 100% от всей длины эталонной аминокислотной последовательности. Например, если эталонная аминокислотная последовательность состоит из 200 аминокислот, степень сходства или идентичности учитывается предпочтительно для по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 40, по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 80, по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере приблизительно 120, по меньшей мере приблизительно 140, по меньшей мере приблизительно 160, по меньшей мере приблизительно 180 или приблизительно 200 аминокислот, предпочтительно непрерывных аминокислот. Согласно предпочтительным вариантам осуществления степень сходства или идентичности учитывается для полной длины эталонной аминокислотной последовательности. Выравнивание с целью определения сходства последовательностей, предпочтительно идентичности последовательностей, можно выполнять с помощью известных в данной области инструментов, предпочтительно с применением наилучшего выравнивания последовательностей, например, с применением Align, с применением стандартных настроек, предпочтительно EMBOSS::needle, матрица: Blosum62, штраф за открытие гэпа 10,0, штраф за продолжение гэпа 0,5.
«Сходство последовательностей» означает процентную долю аминокислот, которые являются либо идентичными, либо представляют собой консервативные аминокислотные замены. «Идентичность последовательностей» между двумя аминокислотными последовательностями означает процентную долю аминокислот, которые являются идентичными между последовательностями.
Подразумевается, что термин «процентная идентичность» обозначает процентную долю аминокислотных остатков, которые являются идентичными между двумя сравниваемыми последовательностями, полученными после наилучшего выравнивания, причем такая процентная доля является чисто статистической, и различия между двумя последовательностями распределены случайным образом и по всей длине последовательности. Сравнения последовательностей для двух аминокислотных последовательностей обычно осуществляют путем сравнения таких последовательностей после их оптимального выравнивания, причем указанное сравнение осуществляют по сегменту или по «окну сравнения» с целью идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно выполнять, помимо выполнения вручную, с помощью алгоритма поиска локальной гомологии по Смиту–Уотерману, 1981, Ads App. Math. 2, 482, с помощью алгоритма поиска локальной гомологии по Нидлману–Вуншу, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, с помощью способа поиска сходства по Пирсону–Липману, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 или с помощью компьютерных программ, в которых применяются такие алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мадисон, Висконсин).
Процентную идентичность рассчитывают путем определения числа идентичных положений для двух сравниваемых последовательностей, деления этого числа на число сравниваемых положений и умножения результата на 100, с получением тем самым процентной идентичности для таких двух последовательностей.
Гомологичные аминокислотные последовательности в соответствии с настоящим изобретением характеризуются по меньшей мере 40%, в частности, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% и предпочтительно по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% идентичностью аминокислотных остатков.
В соответствии с настоящим изобретением вариант, фрагмент, часть, участок или производное аминокислотной последовательности, пептида или белка предпочтительно обладают функциональным свойством аминокислотной последовательности, пептида или белка соответственно, из которых они были получены, т.е. являются функционально эквивалентными. Согласно одному варианту осуществления вариант, фрагмент, часть, участок или производное аминокислотной последовательности, пептида или белка являются функционально эквивалентными, например иммунологически эквивалентными, аминокислотной последовательности, пептиду или белку соответственно, из которых они происходят. Согласно одному варианту осуществления функциональное свойство представляет собой свойство в отношении связывания с антигеном или передачи сигнала после связывания в клетку.
Термин «происходящий» в соответствии с настоящим изобретением означает, что конкретная структура, в частности конкретная последовательность, находится в пределах объекта, из которого она происходит, в частности, организма или молекулы. В случае аминокислотных последовательностей, главным образом конкретных областей последовательностей, «происходящий», в частности, означает, что соответствующая аминокислотная последовательность происходит из аминокислотной последовательности, в пределах которой она находится.
Термин «клетка» или «клетка-хозяин» предпочтительно относится к интактной клетке, т.е. клетке с интактной мембраной, из которой не были высвобождены ее типичные внутриклеточные компоненты, такие как ферменты, органеллы или генетический материал. Интактная клетка предпочтительно представляет собой жизнеспособную клетку, т.е. живую клетку, способную осуществлять ее типичные метаболические функции. Предпочтительно указанный термин в соответствии с настоящим изобретением относится к любой клетке, которую можно трансфицировать экзогенной нуклеиновой кислотой. Предпочтительно в случае трансфекции экзогенной нуклеиновой кислотой и переноса реципиенту клетка может экспрессировать нуклеиновую кислоту у реципиента. Термин «клетка» включает клетки бактерий; другими пригодными клетками являются клетки дрожжей, клетки грибов или клетки млекопитающих. Подходящие клетки бактерий включают клетки штаммов грамотрицательных бактерий, таких как штаммы Escherichia coli, Proteus и Pseudomonas, и штаммов грамположительных бактерий, таких как штаммы Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus и Lactococcus. Подходящие клетки грибов включают клетки видов Trichoderma, Neurospora и Aspergillus. Подходящие клетки дрожжей включают клетки видов Saccharomyces (например, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (например, Schizo saccharomyces pombe), Pichia (например, Pichia pastoris и Pichia methanolica) и Hansenula. Подходящие клетки млекопитающих включают, например, клетки CHO, клетки BHK, клетки HeLa, клетки COS, 293 HEK и т.д. Однако также можно применять клетки амфибий, клетки насекомых, клетки растений и любые другие клетки, применяемые в данной области для экспрессии гетерологичных белков. Для адоптивного переноса особенно предпочтительными являются клетки млекопитающих, такие как клетки людей, мышей, хомяков, свиней, коз и приматов. Клетки могут происходить из множества типов тканей, и они включают первичные клетки и клеточные линии, например, клетки иммунной системы, в частности, антиген-представляющие клетки, такие как дендритные клетки и T-клетки, стволовые клетки, такие как гемопоэтические стволовые клетки и мезенхимальные стволовые клетки, и другие типы клеток. Для применения в соответствии с настоящим изобретением особенно предпочтительными клетками являются иммунореактивные или иммунные эффекторные клетки, в частности, T-клетки.
Клетка, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно экспрессирует пептид или белок, кодируемые нуклеиновой кислотой.
Термин «клональное размножение» или «размножение» относится к процессу, где конкретная структура увеличивается в числе. В контексте настоящего изобретения термин предпочтительно применяют в контексте иммунологического ответа, при котором лимфоциты подвергаются стимуляции антигеном, пролиферируют и происходит размножение конкретного лимфоцита, распознающего указанный антиген. Предпочтительно клональное размножение приводит к дифференцировке лимфоцитов. Термин «примирование» относится к процессу, где T-клетка впервые вступает в контакт со своим специфическим антигеном и обуславливает дифференцировку в эффекторные T-клетки.
Молекулы, такие как нуклеиновые кислоты, пептидные цепи или антигенные рецепторы, или описанные в настоящем документе клетки могут быть рекомбинантными и/или выделенными.
Подразумевается, что в контексте настоящего документа термин «выделенный» относится к структуре, которая практически не содержит других молекул, таких как другой клеточный материал. Термин «выделенный» предпочтительно означает, что выделенная структура была извлечена из своего естественного окружения. Выделенная структура может находиться в практически очищенном состоянии. Термин «практически очищенный» предпочтительно означает, что структура практически не содержит других веществ, с которыми она ассоциирована в природе или in vivo.
Термин «рекомбинантный» в контексте настоящего изобретения означает «созданный с помощью генной инженерии». Предпочтительно «рекомбинантный объект», такой как рекомбинантная клетка, в контексте настоящего изобретения не встречается в природе.
Применяемый в настоящем документе термин «встречающийся в природе» относится к тому факту, что объект может быть найден в природе. Например, пептид или нуклеиновая кислота, которые находятся в организме (в том числе вирусах) и могут быть выделены из источника в природе, и которые не были намеренно модифицированы человеком в лаборатории, являются встречающимися в природе.
Термин «аутологичный» применяют для описания чего угодно, что происходит из одного субъекта. Например, «аутологичный трансплантат» относится к трансплантату ткани или органов, происходящих из организма одного и того же субъекта. Такие процедуры являются преимущественными, поскольку они позволяют преодолеть иммунологический барьер, который в противном случае приведет к отторжению.
Термин «аллогенный» применяют для описания чего угодно, что происходит из организмов разных индивидуумов одного вида. Два или более индивидуумов считаются аллогенными по отношению друг к друг, если гены по одному или нескольким локусам не являются идентичными.
Термин «сингенный» применяют для описания чего угодно, что происходит из организмов индивидуумов или тканей с идентичными генотипами, т.е. идентичных близнецов или животных одной инбредной линии или их тканей.
Термин «гетерологичный» применяют для описания чего угодно, что состоит из нескольких разных элементов. Например, перенос костного мозга одного индивидуума другому индивидууму представляет собой гетерологичную трансплантацию. Гетерологичный ген представляет собой ген, происходящий из источника, отличного от субъекта.
В контексте настоящего документа «снижать» или «ингибировать» означает способность вызывать общее уменьшение предпочтительно на 5% или больше, 10% или больше, 20% или больше, более предпочтительно на 50% или больше и наиболее предпочтительно на 75% или больше от исходного уровня. Термин «ингибировать» или подобные фразы включает полное или практически полное ингибирование, т.е. снижение до нуля или практически до нуля.
Такие термины как «повышать» или «усиливать» предпочтительно относятся к повышению или усилению на приблизительно по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 100%.
Поскольку антигенный рецептор по настоящему изобретению может быть сконструирован для нацеливания практически на любой антиген, включая специфические для заболевания антигены, антигенный рецептор по настоящему изобретению характеризуется широким спектром терапевтического применения. Соответственно, настоящее изобретение относится к применению антигенного рецептора по настоящему изобретению, его пептидных цепей, кодирующих их нуклеиновых кислот и других связанных молекул в терапевтических и профилактических способах. Одним из таких применений является получение антигенспецифических иммунных клеток, которые можно вводить пациенту для предупреждения или лечения заболевания, причем заболевание характеризуется экспрессией одного или нескольких антигенов, которые могут быть связаны антигенным рецептором по настоящему изобретению, экспрессированным в иммунных клетках. Предпочтительно заболеванием является злокачественная опухоль. Кроме того, антигенный рецептор по настоящему изобретению и связанные молекулы также можно применять для избирательного устранения клеток, экспрессирующих предварительно определенный антиген, а также для иммунизации или вакцинации от заболевания, при котором экспрессируется предварительно определенный антиген, причем антиген может быть связан по меньшей мере одним антигенсвязывающим центром антигенного рецептора по настоящему изобретению.
Согласно одному варианту осуществления способ лечения или предупреждения заболевания предусматривает введение пациенту эффективного количества нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенный рецептор по настоящему изобретению, при этом по меньшей мере один антигенсвязывающий центр антигенного рецептора способен связывать антиген, который ассоциирован с заболеванием (например, вирусный или опухолевый антиген), подлежащим лечению или предупреждению. Согласно другому варианту осуществления способ лечения или предупреждения заболевания предусматривает введение пациенту эффективного количества рекомбинантной иммунной эффекторной клетки или размноженной популяции указанных иммунных эффекторных клеток, причем иммунная эффекторная клетка или популяция клеток рекомбинантно экспрессируют антигенный рецептор по настоящему изобретению, при этом по меньшей мере один антигенсвязывающий центр антигенного рецептора способен связывать антиген, который ассоциирован с заболеванием, подлежащим лечению или предупреждению. Согласно предпочтительным вариантам осуществления заболевание представляет собой злокачественную опухоль, а антиген представляет собой опухоль-ассоциированный антиген.
Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу иммунизации или вакцинации от заболевания, ассоциированного со специфическим антигеном, или от вызывающего заболевание организма, у которого экспрессируется специфический антиген, причем способ предусматривает введение пациенту эффективного количества нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенный рецептор по настоящему изобретению, при этом по меньшей мере один антигенсвязывающий центр антигенного рецептора способен связывать специфический антиген. Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу иммунизации или вакцинации от заболевания, ассоциированного со специфическим антигеном, или от вызывающего заболевание организма, у которого экспрессируется специфический антиген, причем способ предусматривает введение пациенту эффективного количества рекомбинантной иммунной эффекторной клетки или размноженной популяции указанных иммунных эффекторных клеток, причем иммунная эффекторная клетка или популяция клеток рекомбинантно экспрессируют антигенный рецептор по настоящему изобретению, при этом по меньшей мере один антигенсвязывающий центр антигенного рецептора способен связываться со специфическим антигеном.
Согласно определенным вариантам осуществления популяция иммунных эффекторных клеток может представлять собой клонально размноженную популяцию. Рекомбинантные иммунные эффекторные клетки или их популяции обеспечивают терапевтическую или профилактическую иммунную эффекторную функцию антигенспецифическим образом. Предпочтительно антигенный рецептор по настоящему изобретению экспрессируется на клеточной поверхности иммунной эффекторной клетки.
Клетки, используемые применительно к терапевтическим и профилактическим способам по настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой иммунные эффекторные клетки, и при этом иммунные эффекторные клетки предпочтительно представляют собой T-клетки. В частности, применяемые в настоящем документе клетки представляют собой цитотоксические лимфоциты, предпочтительно выбранные из цитотоксических T-клеток, естественных клеток-киллеров (NK) и лимфокин-активированных клеток-киллеров (LAK). После активации/стимуляции каждый из этих типов цитотоксических лимфоцитов запускает разрушение целевых клеток. Например, цитотоксические T-клетки запускают разрушение целевых клеток с помощью одного или обоих из следующих способов. Первый заключается в том, что после активации из T-клеток высвобождаются цитотоксины, такие как перфорин, гранзимы и гранулизин. Перфорин и гранулизин создают поры в целевой клетке, а гранзимы проникают в клетку и запускают каспазный каскад в цитоплазме, что индуцирует апоптоз (запрограммированную гибель клеток) клетки. Второй заключается в том, что апоптоз может быть индуцирован посредством взаимодействия Fas-лиганд Fas между T-клетками и целевыми опухолевыми клетками. T-клетки и другие цитотоксические лимфоциты предпочтительно будут представлять собой аутологичные клетки, хотя можно применять и гетерологичные клетки или аллогенные клетки.
Соответственно, описанные в настоящем документе средства, композиции и способы можно применять для лечения субъекта с заболеванием, например, заболеванием, характеризующимся наличием пораженных заболеванием клеток, экспрессирующих антиген. Особенно предпочтительными заболеваниями являются заболевания, относящиеся к злокачественным опухолям.
Описанные в настоящем документе средства, композиции и способы также можно применять для иммунизации или вакцинации с целью предупреждения описанного в настоящем документе заболевания.
Термин «заболевание» относится к аномальному состоянию, которое негативно воздействует на организм индивидуума. Под заболеванием зачастую подразумевают медицинское состояние, ассоциированное со специфичными симптомами и признаками. Заболевание может быть вызвано факторами, происходящими от внешнего источника, как, например, инфекционное заболевание, или оно может быть вызвано внутренними функциональными нарушениями, как, например, аутоиммунные заболевания. В случае людей «заболевание» зачастую применяют в более широком значении для обозначения любого состояния, которое является причиной боли, функционального нарушения, дистресса, нарушений социального характера или смерти страдающего от заболевания индивидуума, или подобных проблем для тех, кто находится в контакте с индивидуумом. В таком более широком смысле термин иногда включает травмы, формы инвалидизации, нарушения, синдромы, инфекции, изолированные симптомы, формы девиантного поведения и атипичные варианты структуры и функции, тогда как в других контекстах и для других целей перечисленное может рассматриваться как отдельные категории. Заболевания обычно негативно воздействуют на индивидуумов не только в физическом отношении, но и в эмоциональном, поскольку возникновение и жизнь с множеством заболеваний может изменить отношение к жизни и характер. В соответствии с настоящим изобретением термин «заболевание» включает инфекционные заболевания и заболевания, относящиеся к злокачественным опухолям, в частности, такие формы злокачественной опухоли, которые описаны в настоящем документе. В настоящем документе любое упоминание злокачественной опухоли или конкретных форм злокачественной опухоли также включает метастазирование злокачественной опухоли.
Заболевание, подлежащее лечению в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно представляет собой заболевание, предусматривающее антиген. «Заболевание, предусматривающее антиген», «заболевание, ассоциированное с экспрессией или повышенным уровнем экспрессии антигена» или подобные выражения в соответствии с настоящим изобретением означают, что антиген экспрессируется в клетках пораженных заболеванием ткани или органа. Уровень экспрессии в клетках пораженных заболеванием ткани или органа может быть повышен по сравнению с уровнем в здоровых ткани или органе. Согласно одному варианту осуществления экспрессию обнаруживают только в пораженной заболеванием ткани, тогда как экспрессию в здоровой ткани не обнаруживают, например, экспрессия репрессирована. В соответствии с настоящим изобретением заболевания, предусматривающее антиген, включают инфекционные заболевания и заболевания, относящиеся к злокачественным опухолям, где ассоциированный с заболеванием антиген предпочтительно представляет собой антиген инфекционного агента и опухолевый антиген соответственно. Предпочтительно заболевание, предусматривающее антиген, предпочтительно представляет собой заболевание, предусматривающее клетки, экспрессирующие антиген, предпочтительно на клеточной поверхности.
Термин «здоровый» или «нормальный» относится к не патологическим состояниям, и предпочтительно означает неинфекционное или не связанное со злокачественной опухолью состояние.
С помощью терминов «заболевание, относящееся к злокачественной опухоли» или «злокачественная опухоль» описывают, или они относятся к физиологическому состоянию индивидуума, которое, как правило, характеризуется неконтролируемым клеточным ростом. К примерам злокачественных опухолей относятся без ограничения карцинома, лимфома, бластома, саркома и лейкоз. Более конкретно, к примерам таких злокачественных опухолей относятся злокачественная опухоль костей, гемобластоз, злокачественная опухоль легкого, злокачественная опухоль печени, злокачественная опухоль поджелудочной железы, злокачественная опухоль кожи, злокачественная опухоль головы или шеи, интраокулярная меланома или меланома кожи, злокачественная опухоль матки, злокачественная опухоль яичника, злокачественная опухоль прямой кишки, злокачественная опухоль анальной области, злокачественная опухоль желудка, злокачественная опухоль толстой кишки, злокачественная опухоль молочной железы, злокачественная опухоль предстательной железы, злокачественная опухоль матки, карцинома половых и репродуктивных органов, болезнь Ходжкина, злокачественная опухоль пищевода, злокачественная опухоль тонкого кишечника, злокачественная опухоль эндокринной системы, злокачественная опухоль щитовидной железы, злокачественная опухоль паращитовидной железы, злокачественная опухоль надпочечника, саркома мягкой ткани, злокачественная опухоль мочевого пузыря, злокачественная опухоль почки, почечно-клеточная карцинома, карцинома почечной лоханки, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), нейроэктодермальная злокачественная опухоль, опухоли позвоночника, глиома, менингиома и аденома гипофиза. Термин «злокачественная опухоль» в соответствии с настоящим изобретением также предусматривает метастазы злокачественной опухоли. Предпочтительно «заболевание, относящееся к злокачественной опухоли» характеризуется наличием клеток, экспрессирующих опухолевый антиген, и клетка злокачественной опухоли экспрессирует опухолевый антиген.
Согласно одному варианту осуществления заболевание, относящееся к злокачественной опухоли, представляет собой злокачественное заболевание, которое характеризуется свойствами анаплазии, инвазивности и метастазирования. Злокачественное новообразование может отличаться от нераковой доброкачественной опухоли тем, что злокачественное образование не является самоограничивающимся в отношении своего роста, способно проникать в соседние ткани и может распространяться в отдаленные ткани (метастазирование), тогда как доброкачественная опухоль не обладает ни одним из этих свойств.
В соответствии с настоящим изобретением термин «опухоль» или «опухолевое заболевание» относится к нарастанию или поражению, образуемым при аномальном росте клеток (называемых неопластическими клетками или опухолевыми клетками). Под «опухолевой клеткой» подразумевают аномальную клетку, которая растет в процессе быстрой, неконтролируемой пролиферации клеток и продолжает расти после прекращения воздействия стимулами, которые инициировали новообразование. Опухоли характеризуются частичным или полным отсутствием структурной организации и функциональной координации с нормальной тканью, и обычно образуют обособленную массу ткани, которая может быть доброкачественной, предопухолевой или злокачественной.
В соответствии с настоящим изобретением «карцинома» представляет собой злокачественное новообразование, происходящее из эпителиальных клеток. Эта группа представляет собой наиболее распространенные виды злокачественных опухолей, включая распространенные формы злокачественной опухоли молочной железы, предстательной железы, легкого и толстой кишки.
«Аденокарцинома» представляет собой злокачественную опухоль, которая возникает в железистой ткани. Эта ткань также является частью более широкой категории тканей, известной как эпителиальная ткань. Эпителиальная ткань включает кожу, железы и ряд других тканей, которые выстилают полости и органы организма. Эпителий с точки зрения эмбриологии происходит из эктодермы, эндодермы и мезодермы. Для причисления к аденокарциноме клетки не обязательно должны быть частью железы, при условии, что они обладают секреторными свойствами. Такая форма карциномы может возникать у некоторых высших млекопитающих, включая людей. Высокодифференцированные формы аденокарциномы часто напоминают железистую ткань, из которой они происходят, тогда низкодифференцированные могут не напоминать. Путем окрашивания клеток биоптата специалист по лабораторной диагностике определит, является ли опухоль аденокарциномой или другим типом злокачественной опухоли. Формы аденокарциномы могут возникать во множестве тканей организма ввиду повсеместного распространения желез в организме. Тем не менее каждая из желез может секретировать не одинаковые по составу вещества, но пока клетка сохраняет свою экзокринную функцию она рассматривается как железистая, и ее злокачественная форма, таким образом, называется аденокарциномой. Злокачественные формы аденокарциномы проникают в другие ткани и зачастую дают метастазы при наличии для этого достаточного времени. Аденокарцинома яичника является наиболее распространенным типом карциномы яичника. Она включает серозные и муцинозные формы аденокарциномы, светлоклеточную аденокарциному и эндометриоидную аденокарциному.
Лимфома и лейкоз являются злокачественными новообразованиями, происходящими из гемопоэтических (кроветворных) клеток.
Опухоль из бластных клеток или бластома представляет собой опухоль (обычно злокачественную), которая напоминает незрелую или эмбриональную ткань. Многие из этих опухолей наиболее распространены у детей.
Под «метастазом» подразумевают распространение клеток злокачественной опухоли из ее первичного очага в другую часть организма. Образование метастаза является очень сложным процессом и определяется откреплением злокачественных клеток от первичной опухоли, инвазией внеклеточного матрикса, проникновением через эндотелиальные базальные мембраны с выходом в полость организма и сосуды, а затем, после перенесения с кровью, инфильтрацией целевых органов. Наконец, рост новой опухоли в целевом участке зависит от ангиогенеза. Метастазирование опухоли зачастую происходит даже после удаления первичной опухоли, поскольку клетки или компоненты опухоли могут остаться и проявить метастатический потенциал. Согласно одному варианту осуществления термин «метастаз» в соответствии с настоящим изобретением относится к «отдаленному метастазу», который относится к метастазу, который удален от первичной опухоли и регионарной системы лимфатических узлов. Согласно одному варианту осуществления термин «метастаз» в соответствии с настоящим изобретением относится к метастазу в лимфатический узел.
Рецидив или повторное проявление имеет место, когда человек снова подвергается состоянию, которое затронуло его в прошлом. Например, если пациент, страдающий от опухолевого заболевания, получал успешное лечение указанного заболевания и у него снова развилось указанное заболевание, то указанное заново развившееся заболевание может считаться рецидивом или повторным проявлением. Однако в соответствии с настоящим изобретением рецидив или повторное проявление опухолевого заболевания может, но не обязательно, возникать в месте локализации первоначального опухолевого заболевания. Таким образом, например, если пациент страдал от опухоли яичника и получал успешное лечение, рецидив или повторное проявление может представлять собой случай опухоли яичника или случай опухоли в месте локализации, отличном от яичника. Рецидив или повторное проявление опухоли также включает ситуации, когда опухоль возникает в месте локализации, отличном от места локализации первоначальной опухоли, а также в месте локализации первоначальной опухоли. Предпочтительно первоначальная опухоль, в отношении которой пациент получал лечение, является первичной опухолью, а опухоль в месте локализации, отличном от места локализации первоначальной опухоли, является вторичной или метастатической опухолью.
Инфекционные заболевания, которые можно лечить или предупреждать с применением настоящего изобретения, вызваны инфекционными агентами, в том числе без ограничения вирусами, бактериями, грибами, простейшими, гельминтами и паразитическими организмами.
Патогенные вирусы как человека, так и отличных от человека позвоночных включают ретровирусы, РНК-содержащие вирусы и ДНК-содержащие вирусы. Примеры вирусов, которые были обнаружены у людей, включают без ограничения: Retroviridae (например, вирусы иммунодефицита человека, такие как HIV-1 (также называемый HTLV-III, LAV, или HTLV-III/LAV, или HIV-III; и другие изоляты, такие как HIV-LP); Picornaviridae (например, полиовирусы, вирус гепатита A; энтеровирусы, вирусы Коксаки человека, риновирусы, эховирусы); Calciviridae (например, штаммы, которые вызывают гастроэнтерит); Togaviridae (например, вирусы лошадиного энцефалита, вирусы краснухи); Flaviridae (например, вирусы денге, вирусы энцефалита, вирусы желтой лихорадки); Coronaviridae (например, коронавирусы); Rhabdoviridae (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); Filoviridae (например, вирусы Эбола); Paramyxoviridae (например, вирусы парагриппа, вирус эпидемического паротита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус человека); Orthomyxoviridae (например, вирусы гриппа); Bungaviridae (например, хантавирусы, бунгавирусы, флебовирусы и найровирусы); Arenaviridae (вирусы геморрагической лихорадки); Reoviridae (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); Birnaviridae; Hepadnaviridae (вирус гепатита B); Parvoviridaе (парвовирусы); Papovaviridae (вирусы папилломы, полиомавирусы); Adenoviridae (большинство аденовирусов); Herpesviridae (вирус простого герпеса (HSV) 1 и 2, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус (CMV), вирус герпеса; Poxviridae (вирусы натуральной оспы, вирусы коровьей оспы, поксвирусы); и Iridoviridae (например,вирус африканской чумы свиней) и неклассифицированные вирусы (например, возбудители губчатых энцефалопатий, возбудитель гепатита дельта (как полагают, дефектный сателлит вируса гепатита B), возбудители гепатита, отличного от A, B (класс 1 = передающиеся внутренним путем; класс 2 = передающиеся парентеральным путем (т.е. гепатит C); вирусы Норуолк и родственные вирусы, и астровирусы).
Рассматриваемые ретровирусы включают как простые, так и сложные ретровирусы. Сложные ретровирусы включают подгруппы, к которым относятся лентивирусы, Т-лимфотропные вирусы и пенящие вирусы. Лентивирусы включают HIV-1, а также включают HIV-2, SIV, вирус Висна, вирус иммунодефицита кошек (FIV) и вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV). Т-лимфотропные вирусы включают HTLV-1, HTLV-II, Т-лимфотропный вирус обезьян (STLV) и вирус коровьего лейкоза (BLV).  Пенящие вирусы включают пенящий вирус человека (HFV), пенящий вирус обезьян (SFV) и пенящий вирус коров (BFV).
Бактериальные инфекции или заболевания, которые можно лечить или предупреждать с применением настоящего изобретения, вызваны бактериями, в том числе без ограничения бактериями, которые характеризуются наличием внутриклеточной стадии в их жизненном цикле, такими как микобактерии (например, Mycobacteria tuberculosis, M. bovis, M. avium, M leprae или M. africanum), риккетсии, микоплазма, хламидии и легионелла. Другие примеры рассматриваемых бактериальных инфекций включают без ограничения инфекции, вызванные грамположительными бациллами (например, Listeria, Bacillus, как, например, виды Bacillus anthracis, Erysipelothrix), грамотрицательными бациллами (например, виды Bartonella, Brucella, Campylobacter, Enterobacter, Escherichia, Francisella, Hemophilus, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Vibrio и Yersinia), бактериями из порядка спирохет (например, виды Borrelia, включая Borrelia burgdorferi, которая вызывает болезнь Лайма), анаэробными бактериями (например, виды Actinomyces и Clostridium), грамположительными и грамотрицательными кокковидными бактериями, видами Enterococcus, видами Streptococcus, видами Pneumococcus, видами Staphylococcus, видами Neisseria. Конкретные примеры патогенных бактерий включают без ограничения: Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae, Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (стрептококк группы А), Streptococcus agalactiae (cтрептококк группы B), Streptococcus viridans, Streptococcus aecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphtheriae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia и Actinomyces israellii.
Вызываемые грибами заболевания, которые можно лечить или предупреждать с применением настоящего изобретения, включают без ограничения аспергиллез, криптококкоз, споротрихоз, кокцидиоидомикоз, паракокцидиоидомикоз, гистоплазмоз, бластомикоз, зигомикоз и кандидоз.
Паразитарные заболевания, которые можно лечить или предупреждать с применением настоящего изобретения, включают без ограничения амебиаз, малярию, лейшманиоз, кокцидиоз, лямблиоз, криптоспоридиоз, токсоплазмоз и трипаносомоз.  Также охвачены инфекции, вызываемые различными червями, такие как без ограничения аскаридоз, анкилостомидоз, трихоцефалез, стронгилоидоз, токсокароз, трихиноз, онхоцеркоз, филяриоз и дирофиляриоз. Также охвачены инфекции, вызываемые различными трематодами, такие как без ограничения шистосомоз, парагонимоз и клонорхоз.
Термин «лечение» или «терапевтическое лечение» относится к любому лечению, которое обеспечивает улучшение состояния здоровья и/или продление (увеличение) продолжительности жизни индивидуума. Указанное лечение может обеспечивать устранение заболевания у индивидуума, приостановку или замедление развития заболевания у индивидуума, ингибирование или замедление развития заболевания у индивидуума, снижение частоты проявления или тяжести симптомов у индивидуума и/или снижение вероятности повторного проявления у индивидуума, у которого на данный момент наблюдают заболевание или у которого ранее наблюдали заболевание.
Термины «профилактическое лечение» или «превентивное лечение» относятся к любому лечению, предназначенному для предупреждения возникновения заболевания у индивидуума. Термины «профилактическое лечение» или «превентивное лечение» применяют в настоящем документе взаимозаменяемо.
Термины «индивидуум» и «субъект» применяют в настоящем документе взаимозаменяемо. Термины относятся к людям, приматам, отличным от человека, или другим млекопитающим (например, мыши, крысе, кролику, собаке, кошке, крупному рогатому скоту, свинье, овце, лошади или примату), которые могут страдать от заболевания или нарушения (например, злокачественной опухоли), или иметь предрасположенность к их развитию, при этом у них может наблюдаться, или может не наблюдаться заболевание или нарушение. Согласно множеству вариантов осуществления индивидуумом является человек. Если не указано иное, термины «индивидуум» и «субъект» не указывают на конкретный возраст, и, таким образом, охватывают взрослых людей, людей пожилого возраста, детей и новорожденных. Согласно предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения «индивидуум» или «субъект» представляет собой «пациента». Термин «пациент» в соответствии с настоящим изобретением подразумевает подлежащего лечению субъекта, в частности, больного субъекта.
Под «с риском развития» подразумевают субъекта, т.е. пациента, который идентифицирован как пациент с повышенной вероятностью развития заболевания, в частности, злокачественной опухоли, по сравнению с общей популяцией. Кроме того, субъект, у которого наблюдалось, или у которого наблюдается на данный момент заболевание, в частности, злокачественная опухоль, представляет собой субъекта с повышенным риском развития заболевания, таким образом, у субъекта может продолжить развиваться заболевание. Субъекты, у которых наблюдается на данный момент, или у которых наблюдалась злокачественная опухоль, также имеют повышенный риск развития метастаз злокачественной опухоли.
Термин «иммунотерапия» относится к лечению, в которое вовлечены специфические иммунная реакция или ответ.
В контексте настоящего изобретения такие термины, как «предотвращать», «предупреждать», «профилактический», «превентивный» или «предотвращающий» относятся к предупреждению или лечению, или обоим, возникновения и/или развития заболевания у субъекта и, в частности, сведению к минимуму вероятности того, что у субъекта будет развиваться заболевание, или к задержке развития заболевания. Например, человек с риском развития описанной выше опухоли будет кандидатом на терапию с целью предупреждения развития опухоли.
Профилактическое применение иммунотерапии, например, профилактическое введение средства или композиции по настоящему изобретению, предпочтительно предотвращает развитие заболевания у реципиента. Терапевтическое применение иммунотерапии, например, терапевтическое введение средства или композиции по настоящему изобретению, может обеспечить ингибирование прогрессирования/развития заболевания. Такой случай предусматривает замедление прогрессирования/развития заболевания, в частности, прерывание прогрессирования заболевания, что предпочтительно приводит к устранению заболевания.
Иммунотерапию можно осуществлять с применением любой из ряда методик, в которых предусмотренные в настоящем документе средства предпочтительно функционируют с тем, чтобы удалить экспрессирующие определенный антиген клетки из организма пациента. Такое удаление может происходить в результате усиления или индуцирования у пациента иммунного ответа, специфического в отношении антигена или экспрессирующей антиген клетки.
С помощью термина «иммунизация» или «вакцинация» описывают процесс лечения субъекта с целью индуцирования иммунного ответа по терапевтическим или профилактическим причинам.
Термин «in vivo» относится к случаю, имеющему место у субъекта.
Антигенные рецепторы, пептидные цепи, нуклеиновые кислоты, рекомбинантные клетки, иммунные эффекторные клетки, предпочтительно T-клетки, по настоящему изобретению, а также другие описанные в настоящем документе соединения и средства можно вводить в форме любой подходящей фармацевтической композиции.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предпочтительно являются стерильными и содержат эффективное количество описанных в настоящем документе средств и необязательно обсуждаемые в настоящем документе дополнительные средства для обеспечения требуемой реакции или требуемого эффекта.
Фармацевтические композиции обычно предусмотрены в единообразной лекарственной форме и могут быть получены хорошо известным способом. Фармацевтическая композиция, например, может находиться в форме раствора или суспензии.
Фармацевтическая композиция может содержать соли, буферные вещества, консерванты, носители, разбавители и/или вспомогательные вещества, все из которых предпочтительно являются фармацевтически приемлемыми. Термин «фармацевтически приемлемый» относится к нетоксичному веществу, которое не нарушает действие активного (активных) компонента (компонентов) фармацевтической композиции.
Соли, которые не являются фармацевтически приемлемыми, можно применять для получения фармацевтически приемлемых солей, и они включены в настоящее изобретение. Фармацевтически приемлемые соли такого типа предусматривают без ограничения таковые, полученные из следующих кислот: соляная, бромистоводородная, серная, азотная, фосфорная, малеиновая, уксусная, салициловая, лимонная, муравьиная, малоновая, янтарная кислоты и т.д. Фармацевтически приемлемые соли также могут быть получены в виде солей щелочных металлов или солей щелочноземельных металлов, таких как соли натрия, соли калия или соли кальция.
Подходящие буферные вещества для применения в фармацевтической композиции включают уксусную кислоту в виде соли, лимонную кислоту в виде соли, борную кислоту в виде соли и фосфорную кислоту в виде соли.
Подходящие консерванты для применения в фармацевтической композиции включают хлорид бензалкония, хлорбутанол, парабен и тимеросал.
Инъекционный состав может содержать фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, такое как раствор Рингера с лактатом.
Термин «носитель» относится к органическому или неорганическому компоненту естественного или синтетического происхождения, с которым активный компонент объединяют с целью содействия, усиления его действия или обеспечения возможности применения. В соответствии с настоящим изобретением термин «носитель» также включает один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые подходят для введения пациенту.
Возможные вещества-носители для парентерального введения представляют собой, например, стерильную воду, раствор Рингера, раствор Рингера с лактатом, стерильный раствор хлорида натрия, полиалкиленгликоли, гидрированные нафталины и, в частности, биологически совместимые полимеры молочной кислоты, сополимеры молочной и гликолевой кислот или сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена.
Подразумевается, что термин «вспомогательное вещество» при применении в настоящем документе означает все вещества, которые могут присутствовать в фармацевтической композиции, и которые не являются активными ингредиентами, как, например, носители, связующие вещества, скользящие вещества, загустители, поверхностно-активные средства, консерванты, эмульгаторы, буферы, ароматизаторы или красители.
Описанные в настоящем документе средства и композиции можно вводить любым традиционным путем, таким как парентеральное введение, в том числе путем инъекции или инфузии. Введение предпочтительно осуществляют парентерально, например, внутривенно, внутриартериально, подкожно, внутрикожно или внутримышечно.
Композиции, подходящие для парентерального введения, обычно предусматривают стерильный водный или безводный препарат активного соединения, который предпочтительно изотоничен крови реципиента. Примерами совместимых носителей и растворителей являются раствор Рингера и изотоничный раствор хлорида натрия. Кроме того, обычно в качестве раствора или суспензионной среды применяют стерильные нелетучие масла.
Описанные в настоящем документе средства и композиции вводят в эффективных количествах. «Эффективное количество» относится к количеству, которое позволяет достичь требуемой реакции или требуемого эффекта в отдельности или вместе с дополнительными дозами. В случае лечения определенного заболевания или определенного состояния требуемая реакция предпочтительно относится к подавлению течения заболевания. Такой случай предусматривает замедление прогрессирования заболевания и, в частности, прерывание или обращение прогрессирования заболевания. Требуемая реакция при лечении заболевания или состояния также может обеспечивать задержку проявления или предотвращение проявления указанного заболевания или указанного состояния.
Эффективное количество описанных в настоящем документе средства или композиции будет зависеть от состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания, индивидуальных параметров пациента, в том числе возраста, физиологического состояния, размера и веса, длительности лечения, типа сопутствующей терапии (если имеется), конкретного пути введения и подобных факторов. Соответственно, дозы вводимых описанных в настоящем документе средств могут зависеть от ряда таких параметров. В случае, когда реакция у пациента является недостаточной при начальной дозе, можно применять более высокие дозы (или более высокие дозы, эффективность которых достигается другим, более локализованным путем введения).
Описанные в настоящем документе средства и композиции можно вводить пациентам, например, in vivo, для лечения или предупреждения ряда нарушений, таких как описанные в настоящем документе нарушения. К предпочтительным пациентам относятся пациенты-люди с нарушениями, течение которых может быть улучшено, или они могут быть устранены с помощью введения описанных в настоящем документе средств и композиций. Такой случай включает нарушения, предусматривающие клетки, характеризующиеся экспрессией антигена.
Например, согласно одному варианту осуществления описанные в настоящем документе средства можно применять для лечения пациента с заболеванием, относящимся к злокачественной опухоли, например, таким как описанное в настоящем документе заболевание, относящееся к злокачественной опухоли, характеризующееся наличием клеток злокачественной опухоли, экспрессирующих антиген.
Фармацевтические композиции и способы лечения, описанные в соответствии с настоящим изобретением, также можно применять для иммунизации или вакцинации с целью предупреждения описанного в настоящем документе заболевания.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить вместе с дополняющими усиливающими иммунный ответ веществами, такими как один или несколько адъювантов, и она может содержать одно или несколько усиливающих иммунный ответ веществ для дополнительного повышения ее эффективности, предпочтительно для достижения синергического эффекта иммуностимуляции. Термин «адъювант» относится к соединениям, которые продлевают, или усиливают, или ускоряют развитие иммунного ответа. В этом отношении возможными являются различные механизмы, в зависимости от различных типов адъювантов. Например, соединения, которые обеспечивают созревание DC, например, липополисахариды или лиганд CD40, составляют первый класс подходящих адъювантов. В целом любое средство, которое влияет на иммунную систему, типа «сигнал опасности» (LPS, GP96, dsRNA и т.д.), или цитокины, такие GM-CSF, можно применять в качестве адъюванта, который позволяет активировать иммунный ответ и/или влиять на него контролируемым образом. В этом отношении также необязательно можно применять CpG-олигодезоксинуклеотиды, однако следует принимать во внимание их побочные эффекты, которые возникают при определенных обстоятельствах, как объяснялось выше. Особенно предпочтительными адъювантами являются цитокины, такие как монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFNα, IFNγ, GM-CSF, LT-α или факторы роста, например, hGH. Дополнительными известными адъювантами являются гидроксид алюминия, адъювант Фрейнда или масло, такое как Montanide, наиболее предпочтительно Montanide ISA51. Липопептиды, такие как Pam3Cys, также подходят для применения в качестве адъювантов в фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
Фармацевтическую композицию можно вводить местно или системно, предпочтительно системно.
Термин «системное введение» относится к введению средства таким образом, чтобы средство повсеместно распределялось по организму индивидуума в значительных количествах и проявляло требуемый эффект. Например, средство может проявлять его требуемый эффект в крови и/или достигать места его действия через сосудистую систему. Типичные системные пути введения включают введение путем введения средства непосредственно в сосудистую систему или пероральное, ингаляционное или внутримышечное введение, при котором средство адсорбируется, поступает в сосудистую систему и доставляется к одному или нескольким требуемым местам действия через кровь.
В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно, чтобы системное введение осуществлялось путем парентерального введения. Термин «парентеральное введение» относится к введению средства таким образом, чтобы средство не проходило через кишечник. Термин «парентеральное введение» включает внутривенное введение, подкожное введение, внутрикожное введение или внутриартериальное введение, но не ограничивается ими.
Введение также можно осуществлять, например, перорально, внутрибрюшинно или внутримышечно.
Средства и композиции, предусмотренные в настоящем документе, можно применять по отдельности или в комбинации с традиционными схемами лечения, такими как хирургическое вмешательство, облучение, химиотерапия и/или трансплантация костного мозга (аутологичная, сингенная, аллогенная или неродственная).
Настоящее изобретение описано более детально с помощью нижеследующих чертежей и примеров, которые применяют исключительно в иллюстративных целях, и они не предназначены для ограничения. Благодаря описанию и примерам дополнительные варианты осуществления, которые также включены в настоящее изобретение, доступны специалисту в данной области.
Чертежи
На фиг. 1 представлено изображение комплекса TCR-CD3. TCR и CD3-субъединицы состоят из эктодоменов, «стеблевой» области, трансмембранного домена и цитоплазматических доменов, которые содержат ITAM. Экспрессия корецептора CD4 или CD8 определяет принадлежность к CD4+ или CD8+ субпопуляциям T-клеток. Внутрицитоплазматические активирующие мотивы иммунорецептора на основе тирозина (ITAM) CD3 показаны в виде цилиндров (взято из "The T cell receptor facts book", MP Lefranc, G Lefranc, 2001).
На фиг. 2 показана схема последовательных поколений CAR. Схематическое изображение разных поколений CAR (1G, первое поколение, 2G, второе поколение, 3G, третье поколение). Представители первого поколения содержат внеклеточную scFv- и цитоплазматическую CD3ζ-цепь/ZAP70, опосредующие немедленную эффекторную функцию, такую как секреция IFNγ или цитотоксичность, представители второго поколения дополнительно содержат CD28/PI3K, стимулирующий пролиферацию, и представители третьего поколения также содержат 4-1BB или OX40/TRAF, обеспечивающий выживание клеток (Casucci, M. et al. (2011) 2: 378-382).
На фиг. 3 представлено схематическое изображение разных форматов рецепторов для перенаправления T-клеток на антиген. Cα/β представляют собой константные домены TCR, которые также выполняют функцию домена передачи сигнала для передачи через клеточную мембрану сигнала от связанного антигена к сигнальным доменам рекрутированного CD3-комплекса в цитоплазме; VH и VL представляют собой вариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина соответственно, и они являются репрезентативными доменами на двух пептидных цепях, которые образуют антигенсвязывающий центр.
Слева: CAR второго поколения, состоящий из антигенспецифического scFv-фрагмента, происходящего из IgG1 спейсерного домена, костимулирующего CD28 и сигнального CD3ζ доменов (классический одноцепочечный CAR); посредине: новый формат CAR на основе связывания scFv с константным доменом TCRß-цепи мыши и коэкспрессии константного домена TCRα-цепи мыши (одновалентный некомбинационный антигенный рецептор); справа: TCR мыши, состоящий из α/β-цепей TCR (мю, мыши). Гетеродимер CD3δε и гомодимер CD3ζ ζ  рекрутируются Cα-доменом, а CD3γε рекрутируется Cβ-доменом.
На фигурах 4A и B показаны структуры некоторых описанных в настоящем документе антигенных рецепторов.
Названия доменов соответствуют описанным в пояснении к фиг. 3. Тандемный антигенный рецептор (тандемный AR) содержит цепь, содержащую 4 вариабельных фрагмента антитела, которые образуют 2 антигенсвязывающих центра. Внутри-/межкомбинационный AR способен к внутри- и межцепочечному связыванию антигенов. Межкомбинационный AR обеспечивает связывание антигенов исключительно посредством межцепочечного связывания. Одновалентный некомбинационный AR является одновалентным прототипом нового формата AR на основе вовлечения эндогенного CD3, двухвалентный некомбинационный AR представляет собой CAR, конструкция которого уже была предложена Gross et al., 1992 FASEB J.,(6) 3370-3378, и в нем связывание с каждым антигеном ограничивается до одной цепи. Одновалентный комбинационный AR служит в качестве эталонного AR или отрицательного контроля для доказательства улучшения функции за счет обеспечения в формате CAR более высоких валентностей с помощью scFv-фрагментов.
На фиг. 5 представлена гистограмма, на которой приведены относительные уровни экспрессии антигенных рецепторов в T-клетках. Экспрессия на T-клетках, в которые путем электропорации вводили РНК CAR, была подтверждена в анализе с использованием проточной цитометрии с применением идиотипического антитела к паратопу клаудин 6-специфического антитела IMAB206. Антитело для проточной цитометрии непосредственно метили Dylight-640, уровни экспрессии приведены в средних значениях интенсивности флуоресценции (MFI).
На фигурах 6A-6C представлены гистограммы, на которых приведены относительные индуцированные уровни продукции IFN-γ, который является показателем активации иммунной клетки. Фиг. 6A: Выявление продукции IFN-γ в ELISA для CD8+ T-клеток, в которые путем электропорации вводили разные экспрессирующие антигенный рецептор конструкции и контроли, и совместное культивирование с отрицательными и положительными по Cl6 незрелыми дендритными клетками (iDC). Для двухвалентных антигенных рецепторов, способных к межцепочечному связыванию антигена, была показана надлежащая продукция IFN-γ (межкомбинационный AR 2GS, 3GS, 4GS). Изменение длины линкера среди вариабельных доменов существенно не влияло не функцию рецептора, однако 3GS-линкер оказался несколько лучше, чем 2- и 4GS-линкер. Удаление N-концевых вариабельных доменов двухвалентного антигенного рецептора с получением одновалентного антигенного рецептора (одновалентный комбинационный AR) резко снижало функцию рецептора, что указывает на важность двухвалентного связывания антигена для обеспечения лучшей функции рецептора. Константные домены мыши в структуре антигенного рецептора обеспечивают несколько улучшенную продукцию IFN-γ (межкомб. AR Mu 3GS). Фиг. 6B: В повторе эксперимента, раскрытого на фиг. 6A, были показаны аналогичные результаты, но с T-клетками, полученными от другого донора, для доказательства того, что результаты не зависят от донора. Фиг. 6C: По сути, повторение экспериментов, раскрытых на фигурах 6A и 6B. Каждый из тандемного антигенного рецептора и внутри/межкомбинационного антигенного рецептора (обеспечивающего распознавание антигена с участием как внутри-, так и межцепочечной комбинации VH/VL-доменов) обеспечивают более высокую степень индукции экспрессии IFN-γ по сравнению с одновалентным антигенным рецептором (одновалентный некомбинационный AR) и по сравнению с антигенным рецептором только с внутрицепочечным связыванием антигена (двухвалентный некомбинационный AR).
На фиг. 7 представлена гистограмма, на которой приведены показатели эффективности CAR Cl6-модифицированных T-клеток в отношении клеток карциномы яичника Sk-ov-3. В опухолевые клетки путем электропорации вводили возрастающие количества РНК Cl6, а в CD8+ T-клетки путем электропорации вводили разные экспрессирующие антигенный рецептор конструкции. Эффекторная функция T-клеток, измеряемая по лизису клеток, снижалась по мере снижения количеств Cl6, экспрессируемого в клетках Sk-ov-3. Цитотоксичность T-клеток, рекомбинантно экспрессирующих двухвалентные антигенные рецепторы (тандемный AR и межкомбинационный AR), в меньшей степени зависела от плотности антигена на поверхности целевых клеток по сравнению с одновалентным некомбинационным антигенным рецептором и классическим scCAR.
На фигурах 8A-8D представлены гистограммы, на которых приведены результаты по активации иммунных клеток, определяемой по пролиферации клеток в ответ на iDC в качестве APC. Фигуры 8A и 8B: Пролиферация меченных с помощью CFSE CD4+ (фиг. 8A) и CD8+ T-клеток (фиг. 8B) соответственно в ответ на отрицательные по Cl6 незрелые дендритные клетки (iDC). После цис-костимуляции молекулами CD80 и 41BBL (т. е. при введении путем электропорации в T-клетки), в случае классического одноцепочечного химерного антигенного рецептора (классический scCAR) была выявлена фоновая пролиферация в отсутствие его когнатного антигена. Такую ситуацию также наблюдали для T-клеток, инкубированных без каких-либо целевых клеток, что свидетельствовало о том, что неспецифическая пролиферация является неотъемлемой характеристикой T-клеток, экспрессирующих классический scCAR (данные не приведены). Такой результат также наблюдали для отрицательной по Cl6 клеточной линии Sk-Ov-3. Фигуры 8C и 8D. Пролиферация меченных с помощью CFSE CD4+ (фиг. 8C) и CD8+ T-клеток (фиг. 8D) соответственно в ответ на Cl6+ iDC. CD4+ T-клетки пролиферировали в ответ на нагруженные Cl6 iDC при введении путем электропорации конструкции, экспрессирующей межкомбинационный AR. Классический формат scCAR обеспечивал меньшую степень пролиферации. В случае CD8+ T-клеток как для классического scCAR, так и межкомбинационного AR была показана практически одинаковая надлежащая пролиферация.
Cl6+CD80+41BBL+
Cl6+
На фигурах 9A-9B представлены гистограммы, на которых приведены результаты по активации иммунных клеток, определяемой по пролиферации клеток в ответ на опухолевые клетки в качестве APC. Пролиферация меченных с помощью CFSE CD4+ (фиг. 9A) и CD8+ (фиг. 9B) T-клеток в ответ на Cl6+ клетки клеточной линии карциномы яичника Ov-90, в которые путем электропорации вводили костимулирующие молекулы CD80 и 41BBL (транс-костимуляция). CD4+ T-клетки были способны к пролиферации в ответ на Ov-90 при введении путем электропорации межкомбинационного AR, аналогично iDC. Как одновалентные, так и двухвалентные антигенные рецепторы обеспечивали пролиферацию CD8+ T-клеток. Степень пролиферации была сопоставимой с классическим scCAR. Цис-костимуляция T-клеток дополнительно усиливала пролиферацию T-клеток.
На фиг. 10 представлена гистограмма, на которой приведены результаты по индукции продукции IFN-γ в зависимости от дозы. Выявление продукции IFN-γ в ELISA для CD8+ T-клеток, в которые путем электропорации вводили разные экспрессирующие антигенный рецептор конструкции и контроли, и совместное культивирование с незрелыми дендритными клетками (iDC), в которые путем электропорации вводили релевантную полноразмерную РНК Cl6 в концентрации в пределах от 0,01 мкг до 1 мкг и 1 мкг нерелевантного gp100. Двухвалентные антигенные рецепторы оценивали в отношении секреции цитокина, зависимой от предполагаемой степени комбинационного спаривания цепей в порядке интер- > внутри/меж- > двухвалентный некомбинационный AR. При более высокой плотности антигена (1 мкг Cl6) классический CAR способствовал секреции IFNγ в наибольшем количестве, после него следовали внутри- и внутри/межкомбинационный AR. Двухвалентный некомбинационный AR был менее функциональным, чем одновалентный комбинационный AR и одновалентный некомбинационный AR. Двухвалентный некомбинационный AR основан на спаривании цепей только между инвариантными C-доменами человека, тогда как в одновалентном комбинационном AR происходит более эффективное спаривание цепей между C-доменами человека и V-доменами мыши. Одновалентный некомбинационный AR является более функциональным, чем двухвалентный некомбинационный AR, поскольку межцепочечному спариванию вместо менее стабильных C-доменов человека содействуют C-домены мыши. Это также справедливо для любой дозы антигена, применяемой в этом анализе. Примечательно, что при снижении плотности антигена (клетки, в которые путем электропорации вводили 0,1 мкг, 0,01 мкг РНК Cl6) межкомбинационный AR по нарастающей становится более реактивным в отношении iDC, в которые вводили РНК релевантного антигена, при сравнении с классическим CAR. Это согласовывается с аналогичной тенденцией, продемонстрированной в анализе цитотоксичности в зависимости от дозы антигена (фиг. 7) в отношении клеток опухолевой клеточной линии Skov-3, в которые путем электропорации вводили Cl6.
На фиг. 11 представлена гистограмма, на которой приведены результаты по индукции продукции IFN-γ в зависимости от дозы. На фиг. 11A приведено сравнение форматов классического и нового комбинационного классического CAR. Оба CAR участвуют в передаче сигнала посредством слитой сигнальной молекулы CD3ζ независимо от эндогенного CD3-комплекса T-клеток. На фиг. 11B приведены результаты по выявлению продукции IFN-γ в ELISA для CD8+ T-клеток, в которые путем электропорации вводили конструкции клаудин 6-специфических классического CAR и нового комбинационного классического CAR, причем оба содержат CH2-CH3-домены антитела и CD28, и CD3ζ в качестве домена передачи сигнала. Указанные клетки совместно культивировали с незрелыми дендритными клетками (iDC), в которые путем электропорации вводили релевантную полноразмерную РНК Cl6 в концентрации в пределах от 0,002 мкг до 2 мкг и 2 мкг нерелевантного gp100.
При более высокой плотности антигена (от 2 мкг до 0,2 мкг Cl6) оба формата CAR способствовали секреции IFN γ в одинаково наибольших количествах.
В случае более низкой плотности антигена классический CAR, вероятно, является несколько более эффективным в отношении секреции IFN γ.
Важно отметить, что комбинационный классический CAR является функциональным в том же диапазоне доз антигена, что и классический CAR.
Примеры
nd
Применяемые в настоящем документе методики и способы описаны в настоящем документе или выполняются известным образом и как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Все способы, предусматривающие применение наборов и реагентов, выполняют в соответствии с информацией от производителя, если конкретно не указано иное.
Пример 1. Экспрессия антигенных рецепторов в T-клетках.
Экспрессию разных конструкций антигенных рецепторов оценивали через один день после введения путем электропорации в CD8+ T-клетки с применением идиотипспецифического антитела к scFv антитела к Cl6. Конструкции или комбинация конструкций, тестируемые на предмет экспрессии, представляли собой (i) константный домен альфа-цепи T-клеточного рецептора мыши отдельно (mCα); (ii) VH-VL-mCβ отдельно (scFv-mCβ); (iii) VH-VL-CH2-CH3-CD28-CD3ζ (классический scCAR); (iv) mCα и VH-VL-mCβ (одновалентный некомбинационный AR); (v) VH-VL-mCα и VH-VL-mCβ (двухвалентный некомбинационный AR); (vi) VL-VH-mCα и VH-VL-mCβ (внутри/межкомбинационный AR); (vii) mCα и VH-VL-VH-VL-mCβ (тандемный AR); (viii) VH-hCα и VL-hCβ (одновалентный комбинационный AR); (ix) VH-(GGGGS)3-VH-hCα и VL-(GGGGS)3-VL-hCβ (межкомбинационный AR 3GS); и (x) VH-(GGGGS)3-VH-mCα и VL-(GGGGS)3-VL-mCβ (межкомбинационный AR Mu 3GS) («m» или «мю» указывает на мышиное происхождение, а «h» указывает на человеческое происхождение константного домена). Эти разные конструкции антигенных рецепторов схематически представлены на фигурах 4A-4B. Данные на фиг. 5 представляют собой результаты двух отдельных измерений для двухвалентных некомбинационных, внутри/межкомбинационных и одновалентных комбинационных антигенных рецепторов; пяти измерений для тандемных и межкомбинационных антигенных рецепторов; и вплоть до десяти измерений для классических scCAR и одновалентных некомбинационных антигенных рецепторов. Значение MFI для каждого образца нормализовали к соответствующему отрицательному контролю (mCα или scFv-mCβ, принятым за 1).
Как показано на фиг. 5, для классического формата scCAR была показана наилучшая экспрессия. Для одновалентных некомбинационных, двухвалентных некомбинационных, внутри/межкомбинационных и межкомбинационных антигенных рецепторов с константными доменами человека (hC) или мыши (mC) была показана аналогичная экспрессия. Для одновалентного комбинационного AR была показана низкая степень поверхностного окрашивания, тогда как для тандемного антигенного рецептора была показана повышенная степень поверхностного окрашивания по сравнению с другими конструкциями, за исключением классического scCAR.
Пример 2. Анализ секреции IFN-γ.
В день 1 эксперимента свежие мононуклеарные клетки периферической крови («PBMC») выделяли из лейкоцитарной пленки от здорового донора. Из ¾ PBMC с применением MACS-сортинга выделяли CD14+ клетки. Клетки на выходе MACS и остаток PBMC затем подвергали MACS-сортингу в отношении CD8+ T-клеток. CD14+ клетки дифференцировались в незрелые дендритные клетки («iDC») в результате введения IL-4 и GM-CSF (1000 Ед./мл) в день 1, 3, 6. CD8+ T-клетки переносили в покрытые OKT3 6-луночные планшеты. В день 3 T-клетки переносили в новые 6-луночные планшеты. В день 7 в iDC путем электропорации вводили нерелевантную и IVT-РНК Cl6. В активированные с помощью OKT3 T-клетки затем путем электропорации вводили контроли или конструкции антигенных рецепторов, приведенные на отдельных фигурах и описанные в примере 1. С целью контроля качества в день 8 с применением меченного с помощью Dylight 650 идиотипспецифического антитела к антигенному рецептору Cl6 анализировали экспрессию антигенного рецептора на поверхности T-клеток. Подверженные электропорации T-клетки и iDC, в которые путем электропорации вводили антиген, затем совместно культивировали в 96-луночном планшете в течение 20 ч при соотношении E:T 10:1 в двух повторах. В день 9 отбирали супернатанты культуры и анализировали на предмет количества секретированного IFN-γ в ELISA формата «сэндвич» с применением набора для IFN-γ Ready Set Go! от eBioscience (№88-7316-88). Поглощение детектировали с применением ридера для ELISA Tecan Sunrise.
Как показано на фиг. 6A, для подверженных имитирующей электропорации (mCα) T-клеток в культуре с положительными и отрицательными по Cl6 iDC не была показана неспецифическая продукция IFN-γ. При культивировании с отрицательными по Cl6 целевыми клетками, из положительных по антигенному рецептору T-клеток только положительные по классическому scCAR клетки продуцировали цитокин на детектируемом фоновом уровне. Продукцию IFN-γ положительными по одновалентному антигенному рецептору клетками можно было наблюдать при культивировании с Cl6+ iDC. В этом случае классический scCAR обеспечивал продукцию высоких количеств IFN-γ. При введении путем электропорации отрицательного контроля только из одной цепи комбинационного антигенного рецептора, в данном случае VH-VH-Cα, продукцию IFN-γ не наблюдали. С помощью этого контроля было доказано, что для распознавания антигена и последующей активации T-клеток требуются обе цепи. В отличие от этого, для межкомбинационного AR (3GS) было показано выраженное улучшение в отношении продукции IFN-γ по сравнению с таковым, продуцированным в случае одновалентного AR (комбинационного и некомбинационного). Для разных длин линкеров между вариабельными доменами, 2 или 4 повтора линкера Gly4Ser, не наблюдали существенного влияния на функцию, в отличие от 3 повторов.
Важно отметить, что в случае удаления N-концевого вариабельного домена структуры в виде комбинационного антигенного рецептора было показано сильное снижение эффекторной функции. Это наблюдение явно доказывает тот факт, что активацию T-клеток обуславливает двухвалентное связывание антигена. Выраженное повышение в отношении функции одновалентного комбинационного AR и двухвалентного комбинационного AR также является явным признаком того, что помимо улучшения в отношении спаривания цепей, обусловленного межцепочечной комбинацией вариабельных доменов, само наличие связывания антигена в пределах двух цепей дополнительно стабилизирует спаривание цепей рецептора и, следовательно, улучшает включение в эндогенный CD3-комплекс и последующую активацию/функцию Т-клеток. Хорошо известно, что у двухцепочечных Т-клеточных рецепторов гетеродимеризация цепей является необходимым условием для эффективного включения в CD3-комплекс.
Включение остатков мыши в структуру комбинационного AR позволило дополнительно усилить активацию, что объясняется известным более сильным взаимодействием константных Cα/β-доменов TCR по сравнению с таковыми у человека. Таким образом, улучшенная гетеродимеризация пептидных цепей антигенного рецептора, либо за счет межцепочечного связывания антигена с вариабельными доменами, либо за счет димеризации константных доменов T-клеточного рецептора отдельных цепей, улучшала включение антигенного рецептора в эндогенный CD3-комплекс, и, таким образом, улучшала функцию T-клеток. Эти результаты были высоковоспроизводимыми с другим донором T-клеток (см. фиг. 6B).
Примечательно, что для классического scCAR в этом эксперименте была продемонстрирована неспецифическая фоновая продукция IFN-γ в отношении отрицательных по Cl6 iDC. Этот результат также является воспроизводимым и согласовывается с данными, опубликованными Long et al. ((2015) Nat. Med., (21) 581-590), где обсуждается фоновая передача сигнала с участием классического формата слияния scCAR-CD28-CD3ζ. Long et al. наблюдали антиген-независимую активацию для нескольких классический scCAR с различной антигенной специфичностью. Предполагается, что неспецифическая фоновая активация положительных по классическому scCAR Т-клеток не является специфическим эффектом донора Т-клеток.
Кроме того, и как показано на фиг. 6C, двухвалентные некомбинационные и внутри/межкомбинационные антигенные рецепторы вместе с тандемным двухвалентным антигенным рецептором тестировали на предмет продукции IFN-γ. Для сравнения на фигуре также показаны отрицательный контроль, одновалентный некомбинационный AR, и классический scCAR в качестве положительного контроля. Для тандемного двухвалентного антигенного рецептора было показано улучшение по сравнению с одновалентным антигенным рецептором. Двухвалентный некомбинационный антигенный рецептор VH-VL-Cα + VH-VL-Cβ вызывал более низкую продукцию IFN-γ по сравнению со схожим внутри/межкомбинационным антигенным рецептором VL-VH-Cα + VH-VL-Cβ. Эти наблюдения подтвердили гипотезу о том, что межцепочечные взаимодействия, обеспечиваемые как спариванием V-доменов, так и связыванием антигена с вариабельными доменами разных цепей, стабилизируют гетеродимерную конфигурацию и обеспечивают более сильный рецептор-зависимый ответ сигнальной системы с участием T-клеток.
Пример 3. Анализ цитотоксичности.
В день 1 эксперимента из двух лейкоцитарных пленок от здоровых доноров выделяли свежие PBMC. PBMC подвергали MACS-сортингу в отношении CD8+ T-клеток. CD8+ T-клетки переносили в покрытые OKT3 6-луночные планшеты. Их культивировали в среде, содержащей 50 Ед./мл IL-2. В день 3 T-клетки переносили в новые 6-луночные планшеты и заменяли культуральную среду. В день 7 в клетки клеточной линии карцинома яичника Sk-Ov-3 путем электропорации вводили РНК с различными количествами РНК Cl6 и 10 мкг РНК люциферазы. В активированные с помощью OKT3 T-клетки путем электропорации вводили конструкции нерелевантного классического scCAR, релевантного Cl6-специфического классического scCAR, одновалентного некомбинационного антигенного рецептора и тандемного антигенного рецептора, а также межкомбинационного антигенного рецептора по настоящему изобретению, как показано на фиг. 7 и описано выше в примере 1. С целью контроля качества в день 8 с применением меченного с помощью Dylight 650 идиотипспецифического антитела к антигенному рецептору Cl6 анализировали экспрессию антигенного рецептора на поверхности T-клеток. T-клетки, в которые путем электропорации вводили конструкцию антигенного рецептора, и Sk-Ov-3, в которые путем электропорации вводили антиген, затем совместно культивировали в 96-луночном планшете в течение 3 ч при соотношении E:T 30:1 в трех повторах. Спустя 3 ч инкубации к каждой культуре добавляли люциферин. Специфический лизис выявляли по снижению интенсивности сигнала люциферина в результате его превращения под действием высвобожденной люциферазы на ридере TECAN.
Данные по Sk-Ov-3 явно свидетельствуют о том, что для двухвалентных антигенных рецепторов (межкомбинационный AR и тандемный AR) по настоящему изобретению было показано заметное улучшение по сравнению с классическим scCAR и одновалентным некомбинационным AR. По сравнению со всеми другими конструкциями антигенных рецепторов, для классического формата scCAR был показан наиболее эффективный лизис, составляющий приблизительно 77%, в отношении клеток Sk-Ov-3, в которые путем электропорации вводили Cl6. Однако следует отметить, что 10 мкг РНК антигена не соответствует физиологическому условию, и не достоверно отражает ситуацию in vivo. При низких дозах антигена одновалентный некомбинационный AR был неспособен опосредовать лизис опухолевых клеток надлежащим образом (9,2%). В отличие от этого, для межкомбинационного AR (3GS) по-прежнему наблюдали надлежащий специфический лизис (41,3%) при сравнении с классическим форматом scCAR (48,1%), и, однозначно, он в меньшей степени зависел от плотности антигена для обеспечения значительной цитотоксической эффекторной функции.
Пример 4. Анализ пролиферации.
6
В день 1 эксперимента из лейкоцитарной пленки от здорового донора выделяли свежие PBMC. Из ¾ PBMC с применением MACS-сортинга выделяли CD14+ клетки, а оставшиеся PBMC замораживали. CD14+ клетки дифференцировались в iDC в результате введения IL-4 и GM-CSF (1000 Ед./мл) в день 1, 3, 6. В день 7 в iDC путем электропорации вводили нерелевантную и IVT-РНК Cl6. Замороженные PBMC в тот же день размораживали и подвергали MACS-сортингу в отношении CD4+ и CD8+ клеток. Затем, без какой-либо предварительной активации (OKT3), в наивные T-клетки, 6 и 7 × 10 клеток соответственно, путем электропорации вводили контроли, конструкции классических, одновалентных и двухвалентных антигенных рецепторов, как показано на фигурах 8A-8D, и при этом конструкции описаны в примере 1. В независимой группе иммунокомпетентных T-клеток те же конструкции антигенных рецепторов также вводили путем электропорации вместе с костимулирующими молекулами 41BBL и CD80 для обеспечения ауто-костимуляции, или цис-костимуляции, которая, как было продемонстрировано, улучшает эффекторную функцию.
С целью контроля качества в день 8 с помощью FACS с окрашиванием анализировали экспрессию антигенного рецептора и 41BBL + CD80 на T-клетках. T-клетки затем метили маркером для анализа пролиферации CFSE. Подверженные электропорации T-клетки и iDC, а также клеточную линию карциномы яичника OV-90 затем совместно культивировали в 96-луночном планшете в течение 5 дней при соотношении E:T 10:1 в двух повторах. В день 5 культивируемые клетки окрашивали в 96-луночных планшетах антителами к CD4 или CD8, меченными APC-Cy7. Пролиферацию T-клеток выявляли с применением FACS по снижению CFSE-сигнала вследствие разбавления в пролиферирующих дочерних клетках. С незначительными корректировками, размеры дочерних популяций оценивали с применением функции proliferation tool, реализуемой в Flowjo. Общее число пролиферирующих клеток обозначено как дочерние поколения.
Фоновую пролиферацию T-клеток оценивали для клеток, культивируемых либо с отрицательной по Cl6 клеточной линией Sk-Ov-3, либо с отрицательным по Cl6 iDC. Независимо от конструкции антигенного рецептора, которую вводили путем электропорации, ни CD4+, ни CD8+ T-клетки не пролиферировали в ответ на отрицательные по Cl6 клетки. После цис-костимуляции только сконструированные T-клетки с классическим scCAR неспецифически пролиферировали в ответ на отрицательные по Cl6 iDC и Sk-Ov-3 (данные по Sk-Ov-3 не приведены). CD4+ T-клетки в целом пролиферировали менее эффективно в ответ на Cl6+ клетки по сравнению с CD8+ T-клетками (см. фигуры 8C-8D). В частности, это было справедливо в случае применения в качестве целевых клеток Cl6+ опухолевых клеток Ov-90 (фигуры 9A-9B).
Результаты для T-клеток, которые совместно культивировали с iDC, подтвердили в целом надлежащую функцию межкомбинационного антигенного рецептора. В случае CD4+ T-клеток без цис-костимуляции, для межкомбинационного антигенного рецептора была показана лучшая пролиферация, и он даже превосходил классический формат scCAR. Такой эффект не был обусловлен сниженным уровнем поверхностной экспрессии классического scCAR, согласно анализу с применением окрашивания по идиотипу CAR. В случае CD8+ T-клеток для межкомбинационного формата антигенного рецептора была продемонстрирована существенная пролиферация в ответ на нагруженные Cl6 iDC (70%). Цис-костимуляция T-клеток могла дополнительно усиливать T-клеточные ответы.
Интересно, что пролиферацию клеток в ответ на Cl6+ клетки клеточной линии карцинома яичника OV-90 не наблюдали (данные не приведены). Это объяснялось отсутствием костимулирующих молекул на поверхности опухолевых клеток. Чтобы компенсировать такое отсутствие костимуляции в клетки Ov-90 путем электропорации вводили РНК CD80 и 41BBL. В этом случае можно было выявить пролиферацию CD4+ и CD8+ T-клеток (см. фигуры 9A и 9B). Примечательно, что для CD4+ клеток такая ситуация имела место только в случае межкомбинационного формата AR (15%). В случае CD8+ клеток профиль пролиферации выглядел иначе. Ответы одновалентного некомбинационного AR, классического scCAR и межкомбинационного AR были сопоставимы с 60% пролиферирующих клеток. После цис-костимуляции пролиферация, в частности CD4+ T-клеток, улучшалась.
Данные явно свидетельствуют о том, что при костимуляции конструкция двухвалентного антигенного рецептора (межкомбинационный AR) способна обеспечивать пролиферацию в ответ на Cl6+ опухолевые клеточные линии. В целом, межкомбинационный AR значительно превосходит одновалентный некомбинационный AR в отношении обеспечения пролиферации в ответ на iDC, нагруженные когнатным целевым антигеном. Классический scCAR имеет склонность опосредовать неспецифические ответы при цис-костимуляции в ответ на отрицательные по Cl6 iDC, что указывает на более высокую чувствительность к антиген-независимой передаче сигнала с участием T-клетки.
Пример 5. Анализ секреции IFNγ с титрованием антигена.
В день 1 эксперимента свежие мононуклеарные клетки периферической крови («PBMC») выделяли из лейкоцитарной пленки от здорового донора. Из ¾ PBMC с применением MACS-сортинга выделяли CD14+ клетки. Клетки на выходе MACS и остаток PBMC затем подвергали MACS-сортингу в отношении CD8+ T-клеток. CD14+ клетки дифференцировались в незрелые дендритные клетки («iDC») в результате введения IL-4 и GM-CSF (1000 Ед./мл) в день 1, 3, 6. CD8+ T-клетки переносили в покрытые OKT3 6-луночные планшеты. В день 3 T-клетки переносили в новые 6-луночные планшеты. В день 7 в iDC путем электропорации дозозависимым образом вводили нерелевантную и IVT-РНК Cl6. В активированные с помощью OKT3 T-клетки затем путем электропорации вводили контроли или конструкции антигенных рецепторов, приведенные на отдельных фигурах и описанные в примере 1. С целью контроля качества в день 8 с применением меченного с помощью Dylight 650 идиотипспецифического антитела к антигенному рецептору Cl6 анализировали экспрессию антигенного рецептора на поверхности T-клеток. Подверженные электропорации T-клетки и iDC, в которые путем электропорации вводили антиген, затем совместно культивировали в 96-луночном планшете в течение 20 ч при соотношении E:T 10:1 в двух повторах. В день 9 отбирали супернатанты культуры и анализировали на предмет количества секретированного IFN-γ в ELISA формата «сэндвич» с применением набора для IFN-γ Ready Set Go! от eBioscience (№88-7316-88). Поглощение детектировали с применением ридера для ELISA Tecan Sunrise. Результаты показаны на фиг. 10.
Двухвалентные антигенные рецепторы оценивали в отношении количества секретируемого цитокина, зависящего от предполагаемой склонности образовывать пары комбинационным способом, что способствует стабильной экспрессии, и, впоследствии, передачи сигнала с участием T-клетки. Авторы настоящего изобретения предположили, что для межкомбинационного AR наблюдалось исключительно комбинационное межцепочечное спаривание V-доменов, тогда как внутри/межкомбинационный AR может одновременно пребывать в соотношении менее благоприятного внутрицепочечного спаривания. При более высокой плотности антигена (1 мкг Cl6) классический CAR способствовал секреции IFNγ в наибольшем количестве, после него, как и ожидалось, следовали внутри- и внутри/межкомбинационный AR. Двухвалентный некомбинационный AR был менее функциональным, чем одновалентный комбинационный AR и одновалентный некомбинационный AR в качестве стандартов. Двухвалентный некомбинационный AR основан на спаривании цепей только между инвариантными C-доменами человека, тогда как в одновалентном комбинационном AR происходит более эффективное спаривание цепей между C-доменами человека и V-доменами мыши. В соответствии с ожидаемыми результатами, также одновалентный некомбинационный AR является более функциональным, чем двухвалентный некомбинационный AR, поскольку межцепочечному спариванию, несмотря на тот факт, что в данном случае оно ограничено до C-доменов, содействуют C-домены мыши вместо менее стабильных C-доменов человека. Это также справедливо для любой дозы антигена, применяемой в этом анализе.
Примечательно, что при снижении плотности антигена (клетки, в которые путем электропорации вводили 0,1 мкг, 0,01 мкг РНК Cl6) межкомбинационный AR по нарастающей становится более реактивным в отношении iDC, в которые вводили релевантную РНК, при сравнении с классическим CAR. Это согласовывается с аналогичной тенденцией, продемонстрированной в анализе цитотоксичности в зависимости от дозы антигена (фиг. 7) в отношении клеток опухолевой клеточной линии Skov-3, в которые путем электропорации вводили Cl6.
Классический CAR также сравнивали с новым комбинационным классическим AR в анализе секреции IFNγ с титрованием антигена (фиг. 11). Оба химерных антигенных рецептора содержат CH2-CH3-домены антитела и CD28, и CD3ζ в качестве домена передачи сигнала. Указанные клетки совместно культивировали с незрелыми дендритными клетками (iDC), в которые путем электропорации вводили релевантную полноразмерную РНК Cl6 в концентрации в пределах от 0,002 мкг до 2 мкг и 2 мкг нерелевантного gp100. При более высокой плотности антигена (от 2 мкг до 0,2 мкг Cl6) оба формата CAR способствовали секреции IFNγ в одинаково наибольших количествах. В случае более низкой плотности антигена классический CAR, вероятно, является несколько более эффективным в отношении секреции IFNγ. Важно отметить, что комбинационный классический CAR является функциональным в том же диапазоне доз антигена, что и классический CAR, вплоть до очень низких количеств эндогенно экспрессированного клаудина 6. Однако такой формат комбинационного AR, в отличие от формата комбинационного AR на основе Cα/Cβ TCR , по-видимому, обеспечивает такую же, но не более эффективную передачу сигнала с участием T-клетки, чем классический CAR, предположительно благодаря зависимой от экзогенного CD3ζ,  но независимой от эндогенного CD3 передачи сигнала. Предполагается, что первый механизм не зависит от рекрутирования эндогенного CD3 соответственно к TCR или CAR, что, в свою очередь, будет регулировать степень активации T-клеток.