СПОСОБ ИНДИВИДУАЛЬНОГО ПОДБОРА ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ЛАКТОБАКТЕРИИ И/ИЛИ БИФИДОБАКТЕРИИ ДЛЯ ЭЛИМИНАЦИИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ПАЦИЕНТА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ НА ДИСБАКТЕРИОЗ КИШЕЧНИКА
METHOD OF INDIVIDUAL SELECTION OF PROBIOTIC PREPARATIONS CONTAINING LACTIC ACID BACILLI AND/OR BIFIDUS BACTERIA FOR ELIMINATION OF OPPORTUNISTIC PATHOGENS RECOVERED FROM PATIENT EXAMINED FOR INTESTINAL DYSBACTERIOSIS

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, и может использоваться в бактериологических лабораториях для индивидуального подбора пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии для элиминации условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
Антагонизм против произвольного набора патогенных микроорганизмов и адгезивность к стандартной культуре клеток (не к эпителию пациентов) могут использоваться в научно-производственных объединениях при поиске новых штаммов для будущих пробиотиков, но не используются в лабораториях для индивидуального подбора пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии для элиминации условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
Адгезивность является важным свойством для успешного приживления пробиотических штаммов. Интенсивность адгезии может существенно варьировать в зависимости от используемых пробиотических штаммов и от экспериментальных условий [1, 2, 3, 4, 5, 6].
Известен способ определения адгезивной активности лактобактерии к буккальному и влагалищному эпителию, где доказана возможность использования буккального эпителия при оценке адгезивности пробиотических штаммов к влагалищному эпителию, т.к. определена высокая корреляционная взаимосвязь между степенью адгезии лактобацилл к двум видам эпителия: буккальному и вагинальному (коэффициент ранговой корреляции Спирмена 0,7) [5].
Этот способ описан только для характеристики адгезивной активности лактобактерий к влагалищному эпителию, но не использовался для оценки адгезивной активности и ее степени у других пробиотических препаратов, содержащих как лактобактерии, так и бифидобактерии, к кишечному эпителию для индивидуального подбора препарата для коррекции дисбиотических состояний у данного пациента.
Пробиотические штаммы лактобактерий и/или бифидобактерий могут вступать в конкурентные взаимоотношения с собственными лактобактериями пациента [7]. Для успешного применения пробиотиков необходимо определить их биосовместимость. Известен способ определения биосовместимости пробиотических и индигенных лактобактерий, представляющий собой метод совместного культивирования (капельная методика) [7].
В литературе нами не обнаружено сведений о способах определения биосовместимости пробиотических и индигенных бифидобактерий.
Для выявления антагонистической активности пробиотических штаммов существуют 2 основные методики: 1) метод штрихов [8]; 2) метод двухслойного агара [9]. Кроме этого, описан метод перевернутого агара [10] и метод прямого совместного культивирования - капельная методика [11], которые широко не применяются.
При использовании метода штрихов по диаметру чашки Петри с питательной средой петлей наносят культуру пробиотика, инкубируют в течение двух суток при 37°С в анаэробных условиях, затем штрихом перпендикулярно выросшим культурам пробиотиков подсевают тест-штаммы УПМ. Инкубируют в аэробных условиях при 37°С. Учет результатов проводят через 24 ч по величине зоны задержки роста тест-культур в мм. Контролем роста тест-культур служит параллельный посев на чашки с той же средой, но без пробиотиков. В соответствии с требованиями к штаммам-пробиотикам зоны угнетения роста тест-культур должны составлять не менее 20 мм [8].
6
При использовании классического метода изучения антагонистической активности - метода двухслойного агара - в питательную среду вносят пробиотический микроорганизм в определенной концентрации, разливают в чашки Петри, а после застывания на поверхность нижнего слоя наливают второй слой питательной среды. Далее на поверхность верхнего слоя засевают тест-культуры условно-патогенных микроорганизмов в концентрации 10 КОЕ/мл [9]. Снижение концентрации тест-штаммов в присутствии пробиотика по сравнению с контролем без пробиотика свидетельствует об антагонистической активности пробиотика.
Для оценки взаимного влияния пробиотиков и УПМ можно использовать метод прямого совместного культивирования на поверхности плотной питательной среды (капельная методика) [11]. Суточную культуру пробиотика наносят на поверхность питательной среды бактериологической петлей диаметром 3 мм. Посев оставляют при комнатной температуре до полного впитывания капли. После этого, отступив 1-2 мм от края первого пятна, наносят каплю культуры тестируемого микроорганизма. Растекаясь, вторая капля затекает на пятно культуры пробиотика до половины диаметра. В той части, где произошло наложение капель, возникают конкурирующие отношения культур. Свободные части пятен каждой культуры служат контролем жизнеспособности каждой из культур и всхожести питательной среды. После подсыхания капель чашки инкубируют в анаэростате в микроаэрофильных условиях при 37°С. Наличие антагонизма выявляют визуально по наличию признаков подавления одной культуры другой.
Метод перевернутого агара описан для выявления антагонистической активности пробиотиков, содержащих Bacillus subtilis и Escherichia coli, в отношении оппортунистических дрожжей [10]. Для этого штаммы Bacillus subtilis и Escherichia coli засевают газоном на плотную питательную среду, через 2 суток агар переворачивают и на его обратную сторону засевают предварительно оттитрованную посевную дозу дрожжей. Инкубируют 24 ч в аэробных условиях при 37°С. Наличие антагонизма выявляют по подавлению роста дрожжей по сравнению с аналогичным посевом без пробиотических штаммов не менее чем на 1 порядок.
Одним из основных показателей качества пробиотиков при выборе кандидатов для создания новых пробиотиков является их антагонистическая активность, определяемая in vitro. Их антагонистическая активность в организме человека может быть обусловлена многими факторами: конкуренцией за рецепторы, выработкой биологически активных веществ, бактериоцинов и бактериоциноподобных веществ, лизоцима, молочной, уксусной и других кислот, перекиси водорода. Однако эти механизмы не универсальны для различных штаммов, входящих в состав пробиотиков. Также неизвестно, какой из этих факторов оказывает решающее значение в подавлении тех или иных микроорганизмов. Поэтому выбор методики выявления антагонизма пробиотических культур обычно осуществляется разными авторами произвольно. Вероятно, каждая из предложенных методик не позволяет оценить всю совокупность факторов, влияющих на выраженность антагонизма, а выявляет какую-либо ее составляющую, при этом какую именно, определить не представляется возможным. Анализируя потенциальную эффективность методов определения антагонистической активности пробиотических препаратов, следует отметить ограниченные возможности каждого отдельно взятого способа.
Так, например, достоинством метода штрихов является его очевидная простота. Однако такой подход не позволяет определить мощность антагонистической активности, так как посев проводится не количественно. Кроме этого, эта методика эффективна при выявлении антагонистической активности в отношении патогенных микроорганизмов, по данным литературы [8]. Но при использовании тест-культур условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при дисбактериозе кишечника, выявляемость антагонистической активности, по собственным данным, крайне низкая (табл.1 - Антагонизм лакто- и бифидобактерий пробиотиков в отношении условно-патогенных микроорганизмов (метод штрихов)). Возможно, это связано с тем, что условно-патогенные микроорганизмы приспособлены к сосуществованию с лакто- и бифидобактериями и такие факторы антагонизма, как закисление среды в процессе культивирования, на них не действуют. Также, возможно, при перпендикулярном подсеве УПМ играет роль феномен «quorum sensing», не дающий реализовать пробиотическим штаммам свои антагонистические возможности.
6
Недостатком метода двухслойного агара, по мнению авторов заявляемого способа, является неудобство посева и учета полученного результата. Метод двухслойного агара требует подтитровки, так как посев тест-культур должен производиться с таким расчетом, чтобы после инкубации количество микроорганизмов было считабельным, т.е. не превышало бы 300 КОЕ на питательной среде. При проведении посева суспензии шпателем в количестве от 10 до 100 мкл с концентрацией микроорганизмов 10 KOE/мл, если в процессе инкубации количество микроорганизмов не уменьшится, это приведет к сложности (сплошной рост) и даже невозможности (зарост) учета результата. Это, безусловно, требует подтитровки и дополнительных исследований при тестировании каждого штамма. Подтитровка подразумевает приготовление дополнительных разведений и высевов из каждого разведения на отдельную чашку с питательной средой, что влечет за собой дополнительный расход питательных сред и лабораторной посуды.
Кроме этого, по собственным данным, интенсивность антагонистического воздействия на условно-патогенные микроорганизмы при использовании метода двухслойного агара в большинстве случаев недостаточно интенсивна - происходит снижением УПМ на 1 порядок по сравнению с контролем - посевом тех же культур УПМ без пробиотика (табл.2 - Различия в степени антагонистической активности пробиотиков в отношении условно-патогенных микроорганизмов. Метод двухслойного агара). Данная степень подавления ничтожно мала для успешного применения пробиотика. Следовательно, при использовании только метода двухслойного агара может потребоваться дополнительное тестирование с другими пробиотическими препаратами, поскольку единовременно охватить весь спектр имеющихся на рынке препаратов невозможно.
Метод перевернутого агара описан и протестирован для оценки антифунгального действия пробиотиков, содержащих Bacillus subtilis и Escherichia coli [10]. Но оценка антагонистического действия лакто- и/или бифидосодержащих пробиотиков на другие условно-патогенные микроорганизмы (не оппортунистические дрожжи) не производилась. Кроме этого, оригинальная методика подразумевает подбор посевной дозы дрожжей, при которой на агаре вырастало бы не более 70 колоний. Это, безусловно, требует подтитровки и дополнительных исследований при тестировании каждого штамма, как и при методе двухслойного агара. При использовании метода перевернутого агара также нередки случаи низкой антагонистической активности, поэтому применяя только метод перевернутого агара, невозможно дифференцированно подходить к выбору пробиотика или возникает необходимость в дополнительном тестировании с другими пробиотическими препаратами, как и при использовании метода двухслойного агара (табл.3 - Различия в степени антагонистической активности пробиотиков в отношении условно-патогенных микроорганизмов. Метод перевернутого агара).
Недостатком метода совместного культивирования, по мнению авторов заявляемого способа, является невозможность соблюдения обязательного условия для применения этого метода - способность обоих тестируемых микроорганизмов (пробиотика и условно-патогенного микроорганизма) к росту на используемой питательной среде и в используемой атмосфере инкубации. Так, бифидобактерии не растут в микроаэрофильных условиях, а УПМ при культивировании в анаэробных условиях вырастают в значительно меньшем количестве, чем при культивировании в присутствии кислорода. Поэтому эта методика наиболее подходит для тестирования пробиотических лактобактерий, которые менее требовательны по сравнению с бифидобактериями. Кроме этого, невозможность количественной оценки антагонистической активности в данной методике существенно ограничивает ее применение, т.к. не позволяет дать прогноз успешности применения пробиотика.
Все разработанные на сегодняшний день методики оценки антагонистической активности направлены на определение таковой при выборе производственных штаммов для массового производства пробиотических препаратов. Поэтому пробиотики могут оказаться неэффективны в отношении штаммов УПМ, выделенных от конкретного пациента.
В качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности нами выбран способ определения адгезивной активности лактобактерий к буккальному и влагалищному эпителию. Данный способ может быть использован для индивидуального подбора пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии для элиминации условно-патогенных микроорганизмов [5].
Способ выполняется следующим образом. Клетки вагинального эпителия забираются врачом-гинекологом с заднего свода влагалища с помощью ложки Фолькмана, после тщательного удаления слизи ватным тампоном. Соскоб буккального эпителия забирают с помощью стерильного деревянного шпателя. Соскобы помещают в цитрат-фосфатный буфер и доставляют в лабораторию в течение 2-3 часов. Непосредственно перед началом исследования эпителиальные клетки отмывают путем трехкратного центрифугирования (1000 об/мин - 5 минут). После отмывки из осадка готовят контрольные мазки. Для этого на поверхность предметного стекла наносят 1 каплю осадка и распределяют в диск диаметром около 1,5 см. Мазки фиксируют и окрашивают водным раствором метиленового синего. Образец считают пригодным для дальнейшего исследования, если при микроскопии (увеличение ×900) в каждом поле зрения обнаруживают не менее 2-3 эпителиальных клеток. Для изучения адгезивной активности в пробирку Эппендорфа вносят 800 мкл суспензии эпителиальных клеток и 600 мкл суспензии лактобактерий. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и инкубируют в течение 2 часов при температуре 37°C с периодическим повторным перемешиванием путем переворачивания пробирок. После инкубации неадсорбированные бактериальные клетки удаляют двухкратным отмыванием путем центрифугирования (1000 об/мин в течение 3 минут). Из осадка готовят мазки, которые после фиксации окрашивают метиленовым синим. При микроскопии препарата подсчитывают количество бактериальных клеток, прикрепившихся к поверхности каждой эпителиальной клетки. Результат выражают в виде среднеарифметического числа лактобактерий на поверхности одного эпителиоцита.
Этот способ описан только для характеристики адгезивной активности лактобактерий к влагалищному эпителию, но не использовался для оценки адгезивной активности и ее степени у других пробиотических препаратов, содержащих как лактобактерии, так и бифидобактерии, к кишечному эпителию для индивидуального подбора препарата для коррекции дисбиотических состояний у данного пациента.
К недостаткам данного способа, рассматриваемого нами как способ индивидуального подбора пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии, в отношении УПМ, можно отнести также и то, что не учитываются такие важные моменты, как определение биосовместимости исследуемых пробиотических препаратов с индигенными лакто- и бифидобактериями пациента, а также выявление антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии, в отношении УПМ, выделенных от пациента.
Отсутствие определения биосовместимости повышает риск использования пробиотиков, которые могут подавлять собственную индигенную микрофлору данного пациента и приводить к дисбалансу кишечной микрофлоры, усугубляя дисбиоз.
Отсутствие определения антагонистической активности также значительно сужает спектр подобранных пробиотических препаратов, поскольку только лишь определение адгезивности указывает на вероятность колонизации биотопа данными пробиотическимй штаммами, но не характеризует вероятность подавления УПМ, выделенных у данного пациента, с использованием данного перечня препаратов, а значит, не делает назначение препаратов с целью элиминации УПМ в достаточной мере индивидуализированным и подходящим для конкретного пациента с достаточной для данного пациента адгезивностью.
Задачей изобретения является снижение риска использования пробиотиков, которые могут подавлять собственную индигенную микрофлору данного пациента, а также расширение спектра оптимально подобранных пробиотических препаратов, содержащих как лактобактерии, так и бифидобактерии, для конкретного пациента для элиминации УПМ, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
Техническим результатом изобретения является:
- разработка способа индивидуального подбора пробиотических препаратов, содержащих как лактобактерии, так и бифидобактерии, для элиминации УПМ, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, способа, учитывающего антагонистическую и адгезивную активности указанных пробиотических препаратов, а также их биосовместимость с индигенными лакто- и бифидобактериями пациента;
- повышение точности выявления антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии, в отношении УПМ, выделенных при исследовании на дисбактериоз кишечника у конкретного пациента;
- упрощение посева и учета полученного результата.
Технический результат достигается тем, что получают буккальный эпителий пациента. Выделяют штаммы УПМ, лактобактерии и бифидобактерии из фекалий обследуемого. Затем выделяют лактобактерии и/или бифидобактерии, входящие в состав пробиотиков в чистой культуре, после чего определяют адгезивную активность пробиотических лакто- и бифидобактерий к клеткам буккального эпителия пациента путем подсчета количества микроорганизмов, адсорбировавшихся на каждой из не менее чем 5 клеток. Определяют индекс адгезивности по среднему числу адгезировавшихся микроорганизмов и присваивают балльную оценку: 1 балл - до 30 адгезированных микроорганизмов на одной клетке, 2 балла - 31-60, 3 балла - 61-90, 4 балла - 91-120, 5 баллов - 121 и более. При количестве адгезированных микроорганизмов в 1-2 балла определяют низкую степень адгезии, в 3 балла - среднюю степень, 4-5 - высокую. Затем выявляют биосовместимость пробиотических штаммов лактобактерий и/или бифидобактерий и штаммов лактобактерий и бифидобактерий, выделенных от конкретного пациента, с использованием капельной методики и определяют ее наличие или отсутствие. Затем при наличии биосовместимости определяют антагонистическую активность лактобактерий и/или бифидобактерий одновременно методом двухслойного агара и методом перевернутого агара, при этом посев осуществляют по Gold. Оценивают мощность антагонистического воздействия пробиотических штаммов по степени интенсивности подавления штаммов УПМ по сравнению с контролем: низкая степень - подавление на 1-2 lg, средняя степень - на 3-4 lg, высокая степень - на 5-9 lg, вплоть до полного подавления роста УПМ. Выявляют наличие антагонистической активности в отношении УПМ, выделенного от конкретного больного, при выявлении антагонистической активности пробиотиков одним из этих методов или двумя. При отсутствии антагонистической активности или выявлении низкой или средней степени интенсивности подавления УПМ антагонистическую активность дополнительно определяют капельной методикой и выявляют наличие антагонистической активности в отношении УПМ, выделенного от конкретного больного, при выявлении антагонистической активности пробиотика. Пробиотический препарат подбирают при наличии средней или высокой степеней адгезивности к буккальному эпителию пациента и/или наличии биосовместимости с лакто- и бифидобактериями этого же пациента и высокой степени антагонистической активности к штамму УПМ, выделенного от данного пациента.
Способ осуществляется следующим образом.
Стандартными способами выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов, лактобактерий и бифидобактерий из фекалий обследуемого и чистую культуру пробиотических лактобактерий и/или бифидобактерий. Деревянным стерильным шпателем получают клетки буккального эпителия пациента с выявленным дисбактериозом кишечника.
Перед исследованием полученные клетки отмывают путем трехкратного центрифугирования в цитрат-фосфатном буфере (1000 об/мин - 5 мин). После отмывки из осадка готовят контрольные мазки. Образец считают пригодным для дальнейшего исследования, если при микроскопии в каждом поле зрения не менее 2-3 эпителиальных клеток.
Для изучения адгезивной активности в центрифужную пробирку вносят 200 мкл суспензии эпителиальных клеток и 200 мкл суспензии лакто- или бифидобактерий. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют в течение 2 часов при температуре 37°C с периодическим перемешиванием. После инкубации неадсорбированные бактериальные клетки удаляют путем двухкратного отмывания центрифугированием (1000 об/мин - 3 мин). Из осадка готовят мазки, которые окрашивают метиленовым синим. При микроскопии подсчитывают количество прикрепившихся бактериальных клеток. В каждом препарате анализируют не менее 5 клеток. Результат выражают в виде среднеарифметического числа бактерий на поверхности одного эпителиоцита. Интенсивность адгезии пробиотических микроорганизмов оценивают в баллах: до 30 адгезированных клеток - 1 балл, от 31 до 60 - 2 балла, от 61 до 90 - 3 балла, от 91 до 120 - 4 балла, 121 и более - 5 баллов. При количестве адгезированных микроорганизмов в 1-2 балла определяют низкую степень адгезии, в 3 балла - среднюю степень, 4-5 - высокую.
5-6
Для определения биосовместимости пробиотических и индигенных лактобактерий и бифидобактерий используют капельную методику. Суточную культуру пробиотических лакто- и/или бифидобактерий, выращенных в жидкой среде Шедлера, наносят на поверхность колумбийского агара бактериологической петлей диаметром 3 мм. Посев оставляют при комнатной температуре до полного впитывания капли. После этого, отступив 1-2 мм от края первого пятна, наносят каплю культуры индигенного штамма лакто- или бифидобактерий, предварительно выращенного в жидкой среде Шедлера. Индигенными считались микроорганизмы, которые обнаруживались в фекалиях пациентов в количестве не менее 10 KOE/г. Растекаясь, вторая капля затекает на пятно культуры пробиотика до половины диаметра. В той части, где произошло наложение капель, возникают конкурирующие отношения культур. Свободные части пятен каждой культуры служат контролем жизнеспособности каждой из культур и всхожести питательной среды. Авторская модификация данной методики заключается в том, что в случае посева двух штаммов лактобактерий после подсыхания капель чашки инкубируют в анаэростате в микроаэрофильных условиях при 37°C, при посеве двух штаммов бифидобактерий или одного штамма лактобактерий и одного штамма бифидобактерий - в анаэростате в анаэробных условиях. Наличие антагонизма выявляют визуально по наличию признаков подавления одной культуры другой. Культуры считают биосовместимыми в случае обнаружения роста двух исследуемых культур, сходного с ростом в контроле. При задержке или отсутствии роста одной из культур (при росте контрольных) взаимоотношения между ними рассматриваются как антагонистические и культуры считаются бионесовместимыми.
Оценку антагонистического влияния пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии, на УПМ, выделенные от данного пациента, осуществляют одновременно методом двухслойного агара и методом перевернутого агара, а при необходимости оценку антагонистического влияния пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии, дополнительно осуществляют капельной методикой.
9
Метод двухслойного агара для тестирования штаммов пробиотиков и УПМ используют в варианте, модифицированном авторами заявляемого способа, то есть используя посев по Gold. Нижний слой среды готовят из колумбийского агара. В расплавленную остывающую среду вносят 1 мл тестируемого пробиотического штамма в конечной концентрации 10 клеток по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича на 1 мл среды, разливают по 10 мл в чашки Петри и оставляют на 1 час в термостате при 37°С. Затем на поверхность нижнего слоя наливают 10 мл колумбийского агара. Приготовленный таким образом двухслойный агар оставляют на 1 час при 37°С. Засеянные лактобактерии и бифидобактерии инкубируют в аэробных условиях. При посеве бифидобактерий в толщу агара и наслаивании сверху дополнительного слоя плотной среды создаются условия культивирования, близкие к анаэробным, поэтому анаэробная техника не используется.
9
Далее на поверхность верхнего слоя засевают мерно по Gold тест-культуры УПМ, выделенные от обследуемого. Для этого готовят суспензию культуры условно-патогенного микроорганизма в конечной концентрации 10 клеток по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Методика проведения посева градуированной петлей штриховым методом по Gold заключается в следующем: бактериологической петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл производят посев исследуемого материала на сектор А чашки Петри с питательной средой (30-40 штрихов). После этого петлю прожигают и делают 4 штриховых посева из сектора А в сектор 1, аналогично из первого во второй, из второго в третий, каждый раз прожигая петлю. После инкубации подсчитывают число колоний, выросших на разных секторах питательной среды. Количество бактерий в 1 мл суспензии определяют по расчетной таблице 4 (Расчетная таблица для определения количества бактерий в мл жидкости) [12].
Контролем служат чашки с такой же питательной средой без пробиотиков, на которые засевают УПМ в таком же количестве, как и в опыте. Засев тест-культур может осуществляться уже через 2 часа после начала инкубации. Кроме этого, появляется возможность культивировать тест-культуры с различными потребностями, варьируя состав второго слоя.
Антагонистически активными считают пробиотики, при тестировании которых с использованием метода двухслойного агара происходит снижение роста УПМ по сравнению с контролем. Авторами заявляемого способа предлагается оценивать мощность антагонистического воздействия пробиотических штаммов по степени интенсивности подавления штаммов УПМ по сравнению с контролем: 1 степень (низкая) - подавление на 1-2 lg, 2 степень (средняя) - на 3-4 lg, 3 степень (высокая) - на 5-9 lg, вплоть до полного подавления роста УПМ (таблица 1).
9
9
Метод перевернутого агара для тестирования штаммов пробиотиков и УПМ используют в варианте, модифицированном авторами заявляемого способа, то есть используя посев по Gold. Пробиотические препараты лактобактерий и/или бифидобактерий в концентрации 1×10 по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича в количестве 50 мкл засевают газоном на колумбийский агар. Предполагаемые антагонистические метаболиты пробиотиков диффундируют в толщу агара и в дальнейшем влияют на рост тест-культур. Инкубируют в анаэробных условиях при 37°С 48 ч. Затем агар переворачивают с помощью стерильного деревянного шпателя и засевают тест-культуры УПМ с обратной стороны в концентрации 10 клеток/мл, используя количественный посев УПМ мерной петлей по Gold для простоты дальнейшего подсчета (табл.4 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в мл жидкости).
Инкубируют 24 ч в аэробных условиях при 37°С. Для контроля штаммы УПМ высевают на колумбийский агар без пробиотиков по Gold.
Антагонистическую активность данного пробиотического штамма считают выявленной с использованием метода перевернутого агара, если происходит снижение количества УПМ на питательной среде по сравнению с контролем. Оценивают мощность антагонистического воздействия пробиотических штаммов по степени интенсивности подавления штаммов УПМ по сравнению с контролем: низкая степень -подавление на 1-2 lg, средняя степень - на 3-4 lg, высокая степень - на 5-9 lg, вплоть до полного подавления роста УПМ (табл.3 - Различия в степени антагонистической активности пробиотиков в отношении УПМ. Метод перевернутого агара).
В случае выявления низкой или средней степени интенсивности подавления УПМ или полного отсутствия антагонистической активности изучаемого лактосодержащего пробиотика используют капельную методику, дающую качественную оценку наличия антагонизма. Суточную культуру пробиотических лактобактерий, выращенных в жидкой среде Шедлера, наносят на поверхность колумбийского агара бактериологической петлей диаметром 3 мм. Посев оставляют при комнатной температуре до полного впитывания капли. После этого, отступив 1-2 мм от края первого пятна, наносят каплю культуры тестируемого УПМ, предварительно выращенного в мясо-пептонном бульоне (МПБ). Растекаясь, вторая капля затекает на пятно культуры пробиотика до половины диаметра. В той части, где произошло наложение капель, возникают конкурирующие отношения культур. Свободные части пятен каждой культуры служат контролем жизнеспособности каждой из культур и всхожести питательной среды. После подсыхания капель чашки инкубируют в анаэростате в микроаэрофильных условиях при 37°С. Чтобы исключить возможность влияния последовательности наслоения капель тест-штаммов УПМ и культур лактобактерий, каждый опыт ставят в двух вариантах, меняя очередность посева культур. Наличие антагонизма выявляют визуально по наличию признаков подавления одной культуры другой. При задержке или отсутствии роста одной из культур (при росте контрольных) взаимоотношения между ними рассматривают как антагонистические.
При регистрации антагонистической активности хотя бы одним способом антагонистическая активность пробиотика в отношении УПМ, выделенного от данного больного, считается выявленной. При этом наиболее эффективными в отношении штамма УПМ, выделенного от конкретного пациента, считаются пробиотики с третьей (высокой, сильной) степенью интенсивности антагонистического воздействия.
Пробиотический препарат подбирают при наличии средней или высокой степеней адгезивности к буккальному эпителию пациента, наличии биосовместимости с лакто- и бифидобактериями этого же пациента и высокой степени антагонистической активности к штамму условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента.
Существенными отличительными признаками заявляемого способа являются:
- получают клетки буккального эпителия от конкретного пациента, выделяют штаммы условно-патогенных микроорганизмов, лакто- и бифидобактерий из фекалий обследуемого, выделяют лактобактерии и/или бифидобакгерии, входящие в состав пробиотиков, в чистой культуре;
- определяют степень адгезивности пробиотических лакто- и/или бифидобактерий к буккальному эпителию пациента путем подсчета количества микроорганизмов, адсорбировавшихся на каждой из не менее чем 5 клеток, после чего определяют индекс адгезивности по среднему числу адгезировавшихся микроорганизмов и присваивают балльную оценку: 1 балл - до 30 адгезированных микроорганизмов на одной клетке, 2 балла - 31-60, 3 балла - 61-90, 4 балла - 91-120, 5 баллов - 121 и более, и при количестве адгезированных микроорганизмов в 1-2 балла определяют низкую степень адгезии, в 3 балла - среднюю степень, 4-5 - высокую;
- определяют биосовместимость лакто- и бифидобактерий из фекалий обследуемого и лактобактерий и/или бифидобактерий, входящих в состав пробиотиков, капельной методикой, при этом при посеве двух штаммов лактобактерий инкубацию осуществляют в анаэростате в микроаэрофильных условиях, при посеве двух штаммов бифидобактерий или одного штамма лактобактерий и одного штамма бифидобактерий - в анаэростате в анаэробных условиях;
- определяют антагонистическую активность лактобактерий и/или бифидобактерий в отношении условно-патогенных микроорганизмов одновременно методом двухслойного агара и методом перевернутого агара;
- посев осуществляют по Gold и оценивают мощность антагонистического воздействия пробиотических штаммов по степени интенсивности подавления штаммов условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с контролем: низкая степень - подавление на 1-2 lg, средняя степень - на 3-4 lg, высокая степень - на 5-9 lg, вплоть до полного подавления роста УПМ;
- при выявлении низкой или средней степени интенсивности подавления условно-патогенных микроорганизмов или при ее отсутствии антагонистическую активность лактобактерий дополнительно определяют капельной методикой;
- выявляют наличие и степень антагонистической активности в отношении условно-патогенного микроорганизма, выделенного от конкретного больного, при выявлении антагонистической активности пробиотика хотя бы одним из этих методов;
- пробиотический препарат подбирают при наличии средней или высокой степеней адгезивности к буккальному эпителию пациента, наличии биосовместимости с лакто- и бифидобактериями этого же пациента и высокой степени антагонистической активности к штамму условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента.
Причинно-следственная связь между существенными отличительными признаками и достигаемым результатом
- Одним из важных требований к препаратам пробиотиков является их адгезивная активность [1, 2, 6]. Пробиотические штаммы лакто- и бифидобактерий способны в той или иной степени связываться со слизистой оболочкой кишечника. Однако их адгезивность значительно ниже, чем адгезивность штаммов, выделенных от человека [3, 4]. Предполагается, что эффективность адгезии и дальнейшее приживление пробиотических штаммов зависит от соответствия рецепторов штамма пробиотиков рецепторам эпителиальных клеток [5]. Именно чужеродностью пробиотических штаммов иногда объясняют тот факт, что положительный эффект от применения пробиотиков носит транзиторный характер [8].
Авторами заявляемого способа впервые определена взаимосвязь между степенью адгезии пробиотических лактобактерий и бифидобактерий, применяемых для коррекции дисбиоза, к буккальному и кишечному эпителию данного пациента, что позволяет использовать в качестве тест-объекта адгезии буккальный эпителий данного пациента.
Оценивали адгезивную активность пробиотических штаммов к эпителиальным клеткам конкретных пациентов с использованием 10 пробиотиков, содержащих штаммы лакто- и бифидобактерий: 1) «Лактобактерин», «Микроген», Пермь, 2) «Лактобактерин», «Имбио», Н.Новгород, 3) «Лактобактерин», «Иммунопрепарат», Уфа, 4) «Нормофлорин-Л», 5) лактобактерии йогурта «Актимель», 6) «Бифидумбактерин», «Микроген», Пермь, 7) «Бифидумбактерин», «Экополис», Ковров, 8) «Бификол», 9) «Нормофлорин-Б», 10) «Бифиформ».
Объектом, на который адгезировали микроорганизмы, служили клетки кишечного эпителия, забранные с помощью ректальной петли. Ввиду того что забор данных клеток часто сопряжен с определенными трудностями, параллельно использовали буккальный эпителий этих же больных, чтобы сравнить степень адгезии на двух типах эпителия одного и того же пациента и оценить возможность использования буккального эпителия вместо кишечного в качестве тест-объекта.
Провели 81 тест параллельно с буккальным и кишечным эпителием 11 пациентов. Сопоставление различий в результатах, полученных на сопоставляемых тест-объектах (буккальном и кишечном эпителии), проводили с помощью двухвыборочного F-теста для дисперсии для каждого препарата и каждого пациента отдельно, учитывая количество адгезированных микроорганизмов на каждой из пяти клеток одного вида эпителия. Только в пяти опытах была отклонена нулевая гипотеза и доказана достоверность различий, в 94,4% случаях (в 85 опытах) была доказана недостоверность различий между двумя выборками. Таким образом, степень прикрепления к разным видам эпителия одного пациента была сопоставима. F-критерий составил от 0,004 до 6,205 при критическом F=7,71; α=0,05 (dF=5, критерий односторонний).
Для определения силы взаимосвязи между количеством адгезированных пробиотических микроорганизмов на буккальном и кишечном эпителиях результаты обрабатывали методами корреляционного анализа - расчета коэффициента корреляции Пирсона (r) и Спирмена (ρ). Степень адгезии на каждой из пяти клеток одного вида эпителия соответствовала нормальному распределению. При расчете коэффициентов r и ρ использовали среднее арифметическое адгезированных бифидо- или лактобактерий на буккальном и кишечном эпителиях. Коэффициент Пирсона определяли как для всей совокупности пациентов для выявления общей тенденции корреляции, так и для каждого пациента отдельно (табл.5 - Коэффициент корреляции Пирсона для всей выборки биопрепаратов, тестируемых на адгезивную активность на двух видах эпителия).
При определении связи среди всех проверенных биопрепаратов выявлена прямая сильная связь. Связь такой же силы выявлена в группе пробиотических препаратов, содержащих бифидобактерии (45 опытов: 9 больных по 5 препаратов), и в группе препаратов с лактобактериями (45 опытов: 9 больных по 5 препаратов). Достоверность подтверждена с помощью средней ошибки. Таким образом, независимо от типа препарата степень его адгезии зависит не столько от типа эпителия, сколько от соответствия рецепторам эпителия конкретного пациента.
При определении коэффициента корреляции Пирсона для отдельных больных оказалось, что различия были достоверны лишь у двух пациентов, у которых степень адгезии к разным видам эпителия варьировала. В обоих случаях это были препараты бифидобактерий, при этом определялась связь средней силы.
В остальных случаях наблюдалась сильная достоверная корреляционная взаимосвязь между степенью адгезии к буккальному и кишечному видам эпителия: коэффициент линейной корреляции (r) колебался от 0,7 до 1, коэффициент ранговой корреляции Спирмена - от 0,6 до 1 (Р>0.05). Степень взаимосвязи несколько колебалась в зависимости от вида препарата и лишь в четырех случаях из 90 опытов была слабой или отсутствовала (в одном случае ρ был равен 0,5, в трех случаях - 0,6). В прочих 86 опытах связь была достоверной (табл.5).
Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования оценки степени адгезии микроорганизмов (в данном случае пробиотических штаммов лакто- и бифидобактерий) к клеткам буккального эпителия для представления об их адгезивной способности по отношению к кишечному эпителию конкретного пациента.
Доказав сопоставимость результатов, получаемых при адгезии на разные типы эпителиальных клеток одного и того же пациента, в дальнейшем сравнивали интенсивность адгезии одного и того же пробиотического штамма на буккальном эпителии разных пациентов. Цель эксперимента: оценить значимость этого критерия - интенсивности адгезивной активности - для успешного подбора пробиотического препарата для конкретного пациента. Для оценки значимости разницы степени адгезии разных пробиотических препаратов к эпителию конкретного больного использовали однофакторный дисперсионный анализ. Отдельно сравнивали прикрепление 5 препаратов лактобактерий к эпителию пациента и 5 препаратов бифидобактерий к этому же эпителию. Таким образом, получили 40 совокупностей препаратов для сравнения достоверности различий внутри каждой из них с помощью F-критерия.
С помощью заявляемого способа адгезии на буккальный эпителий нами было проведено 200 опытов с эпителиальными клетками 20 пациентов. Адсорбция экзогенных лакто- и бифидобактерий в целом достаточно низкая, находится в основном в пределах 1-2 баллов (фиг.1 - Адгезивная активность штаммов лакто- и бифидобактерий, входящих в состав пробиотиков). Этим может объясняться то, что положительный эффект пробиотиков даже при длительном применении часто носит транзиторный характер. Поэтому подбор пробиотиков должен проводиться особенно тщательно и учитывать степень адгезии к эпителию данного больного (фиг.2 - Сравнение адгезивной активности пробиотиков к буккальному эпителию разных пациентов; табл.6, 7, 8 - Адгезивная активность пробиотических штаммов, выявленная в отношении буккального эпителия, полученная при исследовании на дисбактериоз).
- Для оценки целесообразности проведения исследования на биосовместимость лактобактерий и бифидобактерий, входящих в состав коммерческих пробиотических препаратов, и индигенных лакто- и бифидобактерий, выделенных от больных с дисбиозом кишечника, использовали капельную методику [8]. Тестировали 16 культур индигенных лактобацилл и 12 культур индигенных бифидобактерий. В работе использовано 10 пробиотических штаммов лактобацилл и бифидобактерий. Культуры считали биосовместимыми в случае обнаружения роста двух исследуемых культур, сходного с ростом в контроле. При задержке или отсутствии роста одной из культур (при росте контрольных) взаимоотношения между ними рассматривались как антагонистические и культуры считались бионесовместимыми. Совместное культивирование выявило 2 типа взаимодействия между индигенными и пробиотическими культурами: отсутствие антагонизма - биосовместимость, и подавление роста индигенной флоры - бионесовместимость по типу «пробиотик против хозяина» (табл.9 - Взаимоотношения индигенных лактобактерий и бифидобактерий с пробиотическими штаммами при их совместном культивировании).
Биосовместимыми (т.е. имелся рост двух исследуемых культур, сходный с ростом в контроле) с препаратом «Лактобактерин» (Пермь) и с «Лактобактерином» (Н.Новгород) оказались 87,5% индигенных штаммов лактобактерий. Бифидобактерии «Бификола» совместимы с 75% штаммов лактобактерий, с «Лактобактерином» (Пермь) и «Бифидумбактерином» (Ковров) - по 18,8%, с лактобактериями препарата «Нормофлорин-Л» и «Бифидумбактерин» (Пермь) - по 25%.
С L.casei йогурта «Актимель» и «Нормофлорином-Б» биосовместимыми оказалось 31,3% проверенных индигенных штаммов лактобактерий и 58,3% индигенных бифидобактерий. С бифидобактериями «Бифиформа» совместима половина штаммов индигенных штаммов лактобактерий и 58,3% индигенных бифидобактерий.
Наибольшее количество совместимых индигенных штаммов бифидобактерий выявлено при тестировании с препаратом «Лактобактерин» (Н.Новгород), 75% индигенных бифидобактерий оказались биосовместимыми с «Лактобактерином» (Пермь) и препаратом «Бификол»; 41,7% штаммов совместимы с «Нормофлорином-Б», «Бифиформом» и лактобактериями йогурта «Актимель». С «Лактобактерином» (Уфа) и «Бифидумбактерином» (Пермь) биосовместимыми были 5 штаммов (41,7%), «Бифидумбактерин», «Экополис», совместим с 4 штаммами (33,3%).
Проведенные исследования показали, что коммерческие пробиотические препараты и индигенные микроорганизмы могут проявлять антагонизм в отношении друг друга. Можно предположить, что в условиях in vivo при введении больших концентраций пробиотических лактобацилл эти микроорганизмы могут вызвать дисбаланс в индигенной лакто- и бифидофлоре хозяина. Для выбора того или иного пробиотика следует предварительно исследовать взаимоотношения пробиотиков с индигенными микроорганизмами пациента, которому предполагается назначить данный препарат (табл.10, 11, 12 - Взаимоотношения индигенных лактобактерий и бифидобактерий, выделенных при исследовании на дисбактериоз, с пробиотическими штаммами при их совместном культивировании). Это позволит отбирать наиболее эффективные для данного человека пробиотики с минимальным отрицательным воздействием на нормальную микрофлору кишечника.
- Каждый пробиотический штамм действует за счет разного набора факторов и обладает индивидуальным спектром антагонистического действия. Антагонистическая активность изучаемого препарата в зависимости от используемого метода может варьировать, что не характеризует метод как низко- или высокоэффективный. Такие вариации объясняются разной природой антагонизма: накоплением в среде культивирования органических кислот (молочной, муравьиной, уксусной) и изменением pH, разной скоростью размножения микробных популяций, конкуренцией за пищевой субстрат, выработкой лизоцима, бактериоцинов и других биологически активных веществ [11, 13, 8, 12, 14, 6, 15, 16]. Поэтому методы для выявления антагонизма также могут быть разнообразны.
Так, например, при использовании метода прямого антагонизма (метод штрихов), когда осуществляется одновременный посев пробиотика и тестируемых культур, бактериоцины не успевают выработаться и диффундировать в среду и, очевидно, действуют другие механизмы, например изменение физико-химической среды. Но этот механизм не универсален, так как в кишечнике человека могут и не произойти подобные изменения.
При прямом совместном культивировании (капельная методика) происходит непосредственное взаимодействие пробиотика и испытуемой культуры.
При использовании метода перевернутого агара метаболиты пробиотика в течение 2 суток инкубации насыщают питательную среду и влияют на рост тест-штамма.
В методе двухслойного агара пробиотики растут в условиях, близких к анаэробным, и могут максимально проявлять свои свойства, однако при этом нет прямого взаимодействия с индикаторными культурами.
Антагонистическая активность одного и того же пробиотического штамма может быть обусловлена несколькими одновременно действующими механизмами. Поэтому, применяя один метод определения антагонизма пробиотика, затруднительно судить о достоверности получаемых результатов, а отрицательный результат не означает отсутствие активности. Таким образом, применяя только один метод выявления антагонистической активности пробиотических лактобактерий и/или бифидобактерий, можно добиться искусственного ограничения успешного применения конкретного препарата в отношении штамма, выявленного у данного пациента. Одновременное использование нескольких методов определения антагонистической активности повышает эффективность выбора препарата для коррекции дисбиоза. При этом в случае даже одного положительного результата можно говорить о наличии антагонистической активности пробиотика к изучаемому штамму микроорганизма.
Для выбора оптимального метода, комбинаций или последовательности методов авторами исследована антагонистическая активность пяти лактосодержащих и пяти бифидосодержащих пробиотиков в отношении штаммов УПМ, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника. При этом активность лактосодержащих пробиотиков изучалась четырьмя методами: штрихов, перевернутого агара, двухлойного агара, капельной методикой. Активность бифидосодержащих пробиотиков изучалась тремя методами: штрихов, перевернутого агара, двухслойного агара. Было проведено 500 серий тестов в отношении пробиотических бифидобактерий со ста культурами УПМ и использованием пяти штаммов пробиотиков в трех методах. Таким образом, общее количество опытов с пробиотическими бифидобактериями составило 1500 (таблица 17 - Выявление антагонистической активности пробиотических бифидобактерий разными методами). В отношении пробиотических лактобактерий было проведено 500 серий тестов со ста культурами УПМ и использованием пяти штаммов пробиотиков в четырех методах. Таким образом, общее количество опытов с пробиотическими лактобактериями составило 2000 (таблица 15 - Выявление антагонистической активности пробиотических лактобактерий разными методами).
9
Тестировали антагонистическую активность десяти пробиотических культур, входящих в препараты: 1) «Бифидумбактерин сухой», «Микроген», г.Пермь; 2) «Бифидумбактерин», ЗАО «Экополис», Ковров; 3) «Бификол», ОАО «Биомед» имени Мечникова, Московская область; 4) «Нормофлорин-Б», ООО «Бифилюкс», Москва; 5) «Бифиформ», «Ferrosan», Дания; 6) «Лактобактерин», НПО «Микроген», Пермь; 7) «Лактобактерин», НПО «Имбио», Нижний Новгород; 8) «Лактобактерин», НПО «Иммунопрепарат»; 9) «Нормофлорин-Л», ООО «Бифилюкс», Москва; 10) йогурт «Актимель». Все коммерческие лиофилизированные культуры пробиотиков предварительно оживляли путем трехкратного пассажа на жидкой среде Шедлера так, чтобы их концентрация составляла 10 КОЕ/мл.
В качестве тест-культур изучали 100 штаммов УПМ, изолированных от больных с дисбактериозом толстого кишечника, - по 20 штаммов Enterobacter spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., S.aureus, «атипичной» E.coli. Культуры предварительно выращивали на ГМФ-бульоне при 37°С в течение 16-18 часов.
Число положительных результатов при тестировании пробиотических бифидобактерий с использованием комбинации из трех методов составило 413 из 500 проведенных тестов (таблица 17 - Выявление антагонистической активности пробиотических бифидобактерий разными методами). Не выявлено антагонистической активности ни одним методом лишь в 87 сериях тестов. При тестировании пробиотических лактобактерий с использованием комбинации из четырех методов число положительных результатов составило 327 из 500 проведенных тестов (таблица 15 - Выявление антагонистической активности пробиотических лактобактерий разными методами). Не выявлено антагонистической активности ни одним методом лишь в 173 сериях тестов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что зачастую антагонизм, не выявленный одним методом, выявлялся другим методом. Т.е. в разных методиках выявления антагонистической активности выявляются разные чувствительные штаммы условно-патогенных микроорганизмов, не обязательно повторяющиеся в каждой из них (таблицы 18, 13, 14 - Антагонистическая активность пробиотических штаммов, выявленная различными методиками в отношении штаммов УПМ, выделенных при исследовании на дисбактериоз). Таким образом, не существует универсальной стандартизированной методики определения антагонистической активности. Используя несколько вариантов определения антагонистической активности, можно охватить большее количество восприимчивых тест-штаммов. Применяя только один метод выявления антагонистической активности пробиотических бифидобактерий и лактобактерий, можно добиться искусственного ограничения успешного применения конкретного препарата в отношении штамма, выявленного у данного пациента (таблицы 18, 13, 14, 16, 19). Как видно из таблицы 16 (Сравнительная характеристика двух подходов выявления антагонистической активности пробиотических штаммов в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выявленных при диагностике дисбактериоза кишечника), доля случаев невыявленной антагонистической активности при использовании какого-либо одного метода составляет 60,6% при тестировании бифидобактерий и 78,65% при тестировании лактобактерий. В то же время при одновременном использовании нескольких методик процент невыявленных случаев резко снижается и составляет 17,4% для бифидобактерий и 34,6% для лактобактерий. Во избежание неоправданного сужения выбора пробиотиков рекомендуется использовать несколько методик определения антагонизма, и в случае выявления даже одного положительного результата в одном из методов можно говорить о наличии антагонистической активности данного пробиотика к данному штамму микроорганизма.
Авторами проанализирована значимость каждой из методик и предложена последовательность их применения при тестировании пробиотических бифидобактерий и лактобактерий. При сравнении эффективности каждого метода в отдельности показано, что наименьшей эффективностью обладает метод штрихов. Выявляемость антагонизма методом штрихов составила 1,2±2,6% (9 положительных результатов из 500 опытов) для бифидобактерий и для 4,6±2,6% (23 положительных результата из 500 опытов) для лактобактерий. Статистически достоверна неэффективность этого метода (фиг.3, 4).
При этом в 5 случаях антагонистическая активность бифидобактерий была выявлена и другими методами. Таким образом, только 4 результата (0,9% от общего числа положительных результатов) могут быть «упущены», если отказаться от метода штрихов. Очевидно, что его использование не оправдывает затрат. Наибольшая эффективность при тестировании пробиотических бифидобактерий в отношении УПМ зафиксирована в отношении метода перевернутого агара - 42,4±1,5%. При этом статистически достоверно различие с другими применяемыми методами (фиг.4). Использование метода перевернутого агара как основного метода при оценке антагонистической активности пробиотических бифидобактерий в отношении УПМ оправдано. Однако это не позволяет отказаться от применения дополнительного метода, так как при использовании нескольких методик статистически достоверно повышается выявляемость антагонизма - до 65,4±3,4% (фиг.4). Поэтому показано одновременное применение методов перевернутого и двухслойного агара.
При анализе значимости каждой из методик при выборе препаратов, содержащих лактобактерии, также показана низкая эффективность метода штрихов - 4,6±2,6% (23 положительных результата из 500 опытов). При этом антагонистическая активность пробиотических лактобактерий в 12 случаях была выявлена и другими методами. Таким образом, только 11 результатов (3,4% от общего числа положительных результатов) могут быть не зарегистрированы в случае отказа от метода штрихов. Наибольшая эффективность при тестировании пробиотических лактобактерий в отношении УПМ зафиксирована в отношении метода двухслойного агара - 46,6±1,5%. Статистически достоверно различие с другими применяемыми методами (фиг.3). Использование метода двухслойного агара как основного метода при оценке антагонистической активности пробиотических лактобактерий в отношении УПМ оправдано. Однако это не позволяет отказаться от применения других методов, так как при использовании нескольких методик статистически достоверно повышается выявляемость антагонизма - до 65,4±3,4%, что иллюстрируют диаграммы выявляемости антагонизма пробиотических лактобактерий с использованием двух подходов (одним методом и комплексной методикой из 4-х методов) на фиг.3.
- Выбор дополнительного метода при тестировании лактобактерий не очевиден, так как количество выявленных случаев антагонизма методом перевернутого агара и капельной методикой практически совпадает - 19,4±1,1% и 18,2±1,2% соответственно. Различия статистически недостоверны (фиг.3). Для выбора приоритетного метода из двух вышеозначенных были проанализированы совпадения при изучении антагонизма этими методиками (таблица 19 - Совпадения при выявлении антагонистической активности пробиотических лактобактерий в отношении УПМ методом перевернутого агара и капельной методикой). Лишь в 5,8% от общего числа положительных результатов (в 3,8% протестированных случаях) получены совпадения в капельной методике и методе перевернутого агара (таблица 19), а в 38,6% (20,4%+18,2%) от всех положительных результатов (28,4% протестированных случаев) требуется использованием двух методик одновременно для выявления антагонистической активности лактобактерий.
Однако, учитывая тот факт, что капельная методика носит качественный характер, ее применение должно носить дополнительный характер в случае отсутствия антагонизма в других методах или при слабой и средней степенях антагонистической активности пробиотиков.
Метод прямого совместного культивирования на поверхности плотной питательной среды (капельная методика) проводят только для лактобактерий. В отличие от метода перевернутого агара, где культивирование пробиотических культур и УПМ разобщено во времени и используются сначала анаэробные, а затем аэробные условия, при методе совместного культивирования оба микроорганизма (пробиотический штамм и штамм УПМ) должны культивироваться одновременно в одинаковых условиях. Бифидобактерии не растут в микроаэрофильных условиях, а УПМ при культивировании в анаэробных условиях вырастают в значительно меньшем количестве, чем при культивировании в присутствии кислорода, поэтому эта методика наиболее подходит для тестирования пробиотических лактобактерий, которые менее требовательны по сравнению с бифидобактериями.
- Методика посева по Gold позволяет отказаться от предварительной подтитровки посевной дозы и легко рассчитать подавляемое количество микроорганизмов с использованием расчетной таблицы, тогда как при посеве шпателем, особенно в случае интенсивного роста, подсчет всех колоний на питательной среде занимает несоизмеримо большее время. Например, при использовании способа прототипа, то есть метода двухслойного агара, для посева используется сразу несколько чашек, и в итоге можно потратить 30-60 минут на учет полученного результата. Используя методику посева по Gold, затрачивается 2-3 минуты.
- Мощность антагонистического воздействия пробиотических штаммов оценивают по степени интенсивности подавления штаммов условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с контролем: низкая степень - подавление на 1-2 lg, средняя степень - на 3-4 lg, высокая степень - на 5-9 lg, вплоть до полного подавления роста УПМ.
Таким образом, наиболее целесообразно пошаговое определение антагонистической активности пробиотических лактобактерий в отношении УПМ, выделенных при диагностике дисбактериоза. Сначала определяют антагонистическую активность лактобактерий в отношении УПМ одновременно методом двухслойного агара и методом перевернутого агара. Оценивают мощность антагонистического воздействия пробиотических штаммов по степени интенсивности подавления штаммов условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с контролем. При отсутствии антагонистической активности, а также при низкой или средней степени интенсивности подавления условно-патогенных микроорганизмов антагонистическую активность дополнительно определяют одновременно капельной методикой и выявляют наличие антагонистической активности в отношении условно-патогенного микроорганизма, выделенного от конкретного больного, при выявлении антагонистической активности пробиотика одним из этих методов или двумя.
Закономерностей в эффективности подавления различных условно-патогенных микроорганизмов тем или иным биопрепаратом также не выявлено. Один и тот же препарат может проявлять мощное антагонистическое воздействие против одних штаммов и быть неактивным в отношении других, что делает необходимым индивидуальное выявление антагонистической активности пробиотиков в отношении штаммов, выделенных от обследуемого при бактериологической диагностике дисбактериоза (таблицы 15, 17, 13, 14, 18 - Антагонистическая активность пробиотических штаммов, выявленная различными методиками в отношении штаммов УПМ, выделенных при исследовании на дисбактериоз);
- пробиотический препарат подбирают при наличии средней или высокой степеней адгезивности к буккальному эпителию пациента, наличии биосовместимости с лакто- и бифидобактериями этого же пациента и высокой степени к штамму условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента. Препарат может быть рекомендован даже при наличии средней степени адгезивности в случае высокой степени антагонизма и наличия биосовместимости с данным препаратом при отсутствии препаратов с высокой адгезивностью, так как основной целью индивидуального подбора пробиотиков является успешная элиминация условно-патогенных микроорганизмов за счет высокой степени антагонизма пробиотика, а не заместительная терапия данным пробиотиком.
Таким образом, для прогнозирования эффективности подбора того или иного пробиотического препарата в отношении конкретного пациента рекомендуется проводить комплексное лабораторное тестирование нескольких пробиотиков по следующим направлениям:
1) определение адгезивной активности пробиотических штаммов с использованием буккального эпителия конкретного пациента;
2) определение биосовместимости пробиотических и индигенных лакто- и бифидобактерий;
3) определение антагонистической активности пробиотических штаммов несколькими способами в отношении условно-патогенного микроорганизма, выделенного от конкретного пациента.
Совокупность отличительных существенных признаков является новой и снижает риск использования пробиотиков, которые могут подавлять собственную индигенную микрофлору данного пациента, расширяет спектр оптимально подобранных пробиотических препаратов для конкретного пациента, повышает точность выявления антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии, в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника у конкретного пациента, а также упрощает посев и учет полученных результатов.
Примеры конкретного выполнения заявляемого способа
6
Пример 1. При бактериологическом исследовании кала на дисбиоз кишечника (№846) обнаружено повышенное содержание условно-патогенной микрофлоры (Staphylococcus aureus - 10 KOE/г). Проводили индивидуальный подбор пробиотика для данного пациента для элиминации данного штамма УПМ из числа десяти лактосодержащих и бифидосодержащих пробиотиков. На первом этапе определили адгезивность десяти пробиотических препаратов к буккальному эпителию пациента (не менее 5 эпителиоцитов) (таблица 6 - Адгезивная активность пробиотических штаммов, выявленная в отношении буккального эпителия, полученная при исследовании на дисбактериоз №846). Препараты «Бифиформ», «Лактобактерин» (Уфа) показали среднюю степень адгезивности на клетках буккального эпителия данного пациента, поэтому вопрос о выборе препарата в значительной мере будет основываться на других показателях - биосовместимости и антагонистической активности против выделенного от данного пациента штамма Staphylococcus aureus. Препараты «Лактобактерин» (Пермь), «Нормофлорин-Б» показали высокую степень адгезивности на клетках буккального эпителия данного пациента. Остальные препараты показали низкую степень адгезивности к клеткам данного пациента - в пределах 1-2 баллов.
На втором этапе определяли биосовместимость лакто- и бифидобактерий, выделенных от данного пациента и пробиотических штаммов (таблица 10 - Взаимоотношения индигенных лактобактерий и бифидобактерий, выделенных при исследовании на дисбактериоз №846, с пробиотическими штаммами при их совместном культивировании). Штаммы, входящие в состав препаратов «Нормофлорин-Л», «Бифидумбактерин» (Пермь) и «Бифидумбактерин» (Ковров), проявляли антагонизм в отношении индигенной микрофлоры данного пациента, поэтому дальнейшее исследование этих штаммов для данного пациента нецелесообразно. Штаммы всех препаратов «Лактобактерин» и «Бифиформ» были биосовместимы с индигенными лакто- и бифидобактериями пациента. Штаммы, входящие в состав йогурта «Актимель» и препарата «Нормофлорин-Б», были совместимы только с индигенными бифидобактериями. Поэтому при наличии достаточной силы антагонизма в отношении данного штамма Staphylococcus aureus, учитывая адгезивность и биосовместимость, приоритет принадлежит препаратам «Лактобактерин» (Пермь), «Лактобактерин», «Лактобактерин» (Уфа), «Бифиформ». При этом, учитывая, что не выявлено пробиотических штаммов, проявляющих антагонизм одновременно в отношении индигенных лактобактерий и индигенных бифидобактерий, требуется определение антагонистической активности в отношении УПМ тест-культур, входящих в состав препаратов «Лактобактерин» (Пермь), «Лактобактерин» (Уфа), «Нормофлорин-Б», «Бифиформ».
На третьем этапе определяли антагонистическую активность десяти лактосодержащих и бифидосодержащих пробиотиков в отношении выделенного микроорганизма (таблица 18 - Антагонистическая активность пробиотических штаммов, выявленная различными методиками в отношении Staphylococcus aureus, выделенного при исследовании на дисбактериоз №846). При тестировании лактосодержащих пробиотиков с использованием методов двухслойного и перевернутого агара выявили антагонистическую активность третьей степени (высокую) пробиотика «Лактобактерин» (Пермь) и активность первой степени (низкую) пробиотика «Лактобактерин» (Н.Новгород). Пробиотик «Лактобактерин» (Пермь) не нуждается в дальнейших исследованиях и может применяться даже при третьей степени дисбактериоза, как в данном случае. При необходимости выбора среди оставшихся препаратов и объективной оценки перспективности использования данных препаратов в отношении УПМ, выделенного от данного пациента, требуется сравнение результатов, полученных методом двухслойного и перевернутого агара, а также дополнительного исследования капельной методикой. Присутствие антагонистической активности пробиотика «Лактобактерин» (Н.Новгород) подтверждено капельной методикой. Однако ввиду того что этот метод качественный, а не количественный, оценку степени антагонистического воздействия дать нельзя, а применение данного препарата может быть с равной вероятностью эффективным и малоэффективным (не полностью подавлять выделенный УПМ). Антагонистическая активность пробиотических лактобактерий йогурта «Актимель» выявлена только методом двухслойного агара (средняя степень подавления) и капельной методикой. Степень подавления этого штамма позволяет снизить количество УПМ, выделенных от данного пациента, на 3-4 порядка, что недостаточно, учитывая нормативы ОСТа, согласно которым Staphylococcus aureus должен отсутствовать в фекалиях. Таким образом, потенциально наиболее эффективным лактосодержащим пробиотиком в отношении штамма Staphylococcus aureus, выделенного от данного пациента, может рассматриваться «Лактобактерин» (Пермь).
При тестировании бифидосодержащих пробиотиков с использованием метода двухслойного агара выявили высокую степень антагонистической активности пробиотика «Нормофлорин-Б» и среднюю степень активности этого же пробиотика в методе перевернутого агара. Антагонистическую активность у пробиотика «Бифиформ» не выявили.
Исследование антагонистической активности штаммов, входящих в препараты «Нормофлорин-Л», «Бифидумбактерин» (Пермь) и «Бифидумбактерин» (Ковров), в отношении S.aureus не проводили из-за бионесовместимости с индигенными лакто- и бифидобактериями.
С точки зрения антагонистической активности в отношении данного штамма УПМ потенциально наиболее успешным должно быть применение пробиотиков с высокой степенью активности в отношении данного штамма Staphylococcus aureus - «Нормофлорин-Б» и «Лактобактерин» (Пермь).
Однако по совокупности полученных данных для указанного пациента наиболее целесообразно применение препарата «Лактобактерин» (Пермь).
8
Пример 2. При бактериологическом исследовании кала на дисбиоз кишечника (№578) обнаружено повышенное содержание условно-патогенной микрофлоры (Enterobacter agglomerans - 10 KOE/г). Проводили индивидуальный подбор пробиотика для данного пациента для элиминации данного штамма УПМ из числа десяти лактосодержащих и бифидосодержащих пробиотиков.
На первом этапе определили адгезивность десяти пробиотических препаратов к буккальному эпителию пациента (не менее 5 эпителиоцитов) (таблица 7 - Адгезивная активность пробиотических штаммов, выявленная в отношении буккального эпителия, полученная при исследовании на дисбактериоз №578). Штаммы, входящие в состав препаратов «Лактобактерин» (Н.Новгород), «Лактобактерин» (Уфа), «Актимель», «Бифидумбактерин» (Пермь), «Бифидумбактерин» (Ковров), «Нормофлорин-Б» и «Бифиформ», показали высокую степень адгезивности (4-5 баллов). Низкую степень адгезивности (2 балла) к клеткам данного пациента показали штамм бифидобактерий, входящий в состав препарата «Бификол», поэтому его применение потенциально может быть менее успешно, чем применение препаратов с высокой степенью адгезивности. Штаммы, входящие в состав препаратов «Лактобактерин» (Пермь) и «Нормофлорин-Л», показали среднюю степень адгезивности (3 балла), потому вопрос об их применении в значительной мере будет основываться на других показателях - биосовместимости и антагонистической активности против выделенного от данного пациента штамма Enterobacter agglomerans.
На втором этапе определяли биосовместимость лакто- и бифидобактерий, выделенных от данного пациента, и пробиотических штаммов (таблица 11 - Взаимоотношения индигенных лактобактерий и бифидобактерий, выделенных при исследовании на дисбактериоз №578, с пробиотическими штаммами при их совместном культивировании). Штамм, входящий в состав препарата «Лактобактерин» (Уфа), был совместим только с индигенными лактобактериями, тогда как штаммы, входящие в состав препаратов «Бифидумбактерин» (Пермь) и «Бифидумбактерин» (Ковров), были совместимы только с индигенными бифидобактериями. Штаммы препаратов «Лактобактерин» (Пермь), «Лактобактерин» (Н.Новгород), «Нормофлорин-Л», «Бификол», «Нормофлорин-Б», «Бифиформ» и йогурта «Актимель» были биосовместимы с индигенными лакто- и бифидобактериями пациента. Поэтому при наличии достаточной силы антагонизма в отношении данного штамма Enterobacter agglomerans, учитывая адгезивность и биосовместимость, приоритет принадлежит препаратам «Лактобактерин» (Н.Новгород), «Нормофлорин-Б» и «Бифиформ». При этом, учитывая, что не выявлено пробиотических штаммов, проявляющих антагонизм одновременно в отношении индигенных лактобактерий и индигенных бифидобактерий, требуется определение антагонистической активности в отношении УПМ всех тест-культур.
8
На третьем этапе определяли антагонистическую активность десяти пробиотиков в отношении выделенного микроорганизма (таблица 13 - Антагонистическая активность пробиотических штаммов, выявленная различными методиками в отношении Enterobacter agglomerans, выделенного при исследовании на дисбактериоз №578). Методом двухслойного агара антагонистическая активность средней степени выявлена только при тестировании пробиотических лактобактерий йогурта «Актимель». Однако данной силы антагонизма недостаточно для подавления Enterobacter agglomerans в количестве 10 KOE/г, т.к. даже при снижении числа микроорганизмов на 3-4 lg концентрация УПМ останется высокой, в результате чего дисбактериоз будет поддерживаться или усугубляться. Методом перевернутого агара выявили высокую степень антагонистической активности пробиотика «Лактобактерин» (Н.Новгород). «Нормофлорин-Л» проявил антагонистические свойства в капельной методике, однако качественным методом оценить мощность антагонизма и потенциальную эффективность применения этого пробиотика не представляется возможным. Таким образом, высока вероятность того, что наиболее эффективным окажется пробиотик «Лактобактерин» (Н.Новгород).
При выявлении антагонистической активности бифидосодержащих пробиотиков методом перевернутого агара выявили высокую степень антагонистической активности пробиотика «Нормофлорин-Б». Методом двухслойного агара выявили антагонистическую активность высокой степени у штаммов бифидобактерий пробиотика «Бификол», средней степени - у пробиотика «Бифидумбактерин» («Экополис», Ковров), низкой степени - у пробиотика «Бифиформ».
С точки зрения антагонистической активности в отношении данного штамма УПМ потенциально наиболее успешным должно быть применение пробиотиков с высокой степенью активности в отношении данного штамма Enterobacter agglomerans - «Нормофлорин-Б» и «Лактобактерин» (Н.Новгород). Эти препараты также показали высокую адгезивность к эпителию данного пациента и не проявили конкуренции в отношении индигенных микроорганизмов, поэтому по совокупности полученных данных для указанного пациента наиболее целесообразно применение препаратов «Нормофлорин-Б» и «Лактобактерин» (Н.Новгород).
6
Пример 3. При бактериологическом исследовании кала на дисбиоз кишечника (№628) обнаружено повышенное содержание условно-патогенной микрофлоры (Klebsiella pneumoniae - 10 KOE/г). Проводили индивидуальный подбор пробиотика для данного пациента для элиминации данного штамма УПМ из числа десяти лактосодержащих и бифидосодержащих пробиотиков. На первом этапе определили адгезивность десяти пробиотических препаратов к буккальному эпителию пациента (не менее 5 эпителиоцитов) (таблица 8 - Адгезивная активность пробиотических штаммов, выявленная в отношении буккального эпителия, полученная при исследовании на дисбактериоз №628). Препараты «Нормофлорин-Л», «Бифидумбактерин» (Пермь), «Бифидумбактерин» (Ковров) и «Бификол» показали высокую степень адгезивности к клеткам данного пациента (4-5 баллов). Препараты «Лактобактерин» (Уфа), «Нормофлорин-Б», «Бифиформ» и лактобактерии йогурта «Актимель» показали среднюю степень адгезивности к клеткам данного пациента (3 балла), поэтому вопрос о выборе препарата в значительной мере будет основываться на других показателях - биосовместимости и антагонистической активности против выделенного от данного пациента штамма Klebsiella pneumoniae. Низкую адгезивность (1-2 балла) показали препараты «Лактобактерин» (Пермь) и «Лактобактерин» (Нижний Новгород).
На втором этапе определяли биосовместимость лакто- и бифидобактерий, выделенных от данного пациента, и пробиотических штаммов (таблица 12 - Взаимоотношения индигенных лактобактерий и бифидобактерий, выделенных при исследовании на дисбактериоз №628, с пробиотическими штаммами при их совместном культивировании). Штамм, входящий в состав препаратов «Бификол», проявил антагонизм в отношении индигенной микрофлоры данного пациента, поэтому дальнейшее исследование этого штамма для данного пациента нецелесообразно. Штаммы, входящие в состав препаратов «Лактобактерин» (Пермь), «Лактобактерин» (Н.Новгород), «Лактобактерин» (Уфа), «Бифидумбактерин» (Пермь) и «Бифидумбактерин» (Ковров), были совместимы только с индигенными лактобактериями, тогда как штамм, входящий в состав препарата «Нормофлорин-Б», был совместим только с индигенными бифидобактериями. Штаммы препаратов «Нормофлорин-Л», «Бифиформ» и йогурта «Актимель» были биосовместимы с индигенными лакто- и бифидобактериями пациента. При наличии достаточной силы антагонизма в отношении данного штамма Enterobacter agglomerans, учитывая адгезивность и биосовместимость, приоритет принадлежит препаратам «Нормофлорин-Л», «Бифиформ» и «Актимель».
На третьем этапе определяли антагонистическую активность десяти лактосодержащих и бифидосодержащих пробиотиков в отношении выделенного микроорганизма (таблица 14 - Антагонистическая активность пробиотических штаммов, выявленная различными методиками в отношении Klebsiella pneumoniae, выделенного при исследовании на дисбактериоз №628). При тестировании с использованием метода двухслойного агара, антагонистическая активность в отношении данного штамма Klebsiella pneumoniae отсутствовала у всех лактосодержащих препаратов, за исключением лактобактерий, входящих в йогурт «Актимель». Высокая степень активности, выявленная при этом, позволяет использовать йогурт «Актимель» даже при 3-й степени дисбактериоза, как в данном примере. Однако при необходимости выбора среди указанных препаратов ввиду отсутствия активности оставшихся четырех лактосодержащих препаратов в двухслойном методе необходимо учитывать результаты метода перевернутого агара, а также использовать дополнительный метод - капельную методику. Методом перевернутого агара активность лактосодержащих пробиотиков не выявлена. В капельной методике выявлена антагонистическая активность лишь у препарата «Лактобактерин» (Уфа). Этот метод является качественным, а не количественным, поэтому мощность антагонистического воздействия пробиотика оценить нельзя, а его применение может быть как эффективным, так и вызывать лишь незначительное подавление. Отсутствие антагонистической активности препарата «Нормофлорин-Л» делает нецелесообразным его применение у данного пациента для элиминации данного штамма несмотря на высокую адгезивность и биосовместимость с индигенной микрофлорой.
Антагонистическая активность бифидобактерий, выявленная методом двухслойного агара, варьировала: у пробиотика «Бифиформ» - активность высокой степени, у пробиотика «Бифидумбактерин» («Экополис», Ковров) - средней степени, у пробиотика «Бифидумбактерин» («Микроген», Пермь) - низкой степени. Методом перевернутого агара выявили среднюю степень антагонистической активности у пробиотика «Нормофлорин-Б», низкую степень - у пробиотика «Бифидумбактерин» («Экополис», Ковров).
Таким образом, исходя из совокупности полученных данных применение пробиотика «Бифиформ» в данном случае предполагается наиболее эффективным из бифидосодержащих препаратов, а йогурта «Актимель» - из лактосодержащих препаратов. «Бифиформ»: средняя степень адгезивности; наличие биосовместимости; высокая степень антагонистической активности. «Актимель»: средняя степень адгезивности; наличие биосовместимости; высокая степень антагонистической активности.
Нами тестировалась антагонистическая активность десяти пробиотических культур, входящих в препараты: 1) «Лактобактерин», НПО «Микроген», Пермь; 2) «Лактобактерин», НПО «Имбио», Нижний Новгород; 3) «Лактобактерин», НПО «Иммунопрепарат», Уфа; 4) «Нормофлорин-Л», ООО «Бифилюкс», Москва; 5) йогурт «Актимель»; 6) «Бифидумбактерин сухой», «Микроген», г.Пермь; 7) «Бифидумбактерин», ЗАО «Экополис», Ковров; 8) «Бификол», ОАО «Биомед» имени Мечникова, Московская область; 9) «Нормофлорин-Б», ООО «Бифилюкс», Москва; 10) «Бифиформ», «Ferrosan», Дания. В качестве тест-культур изучали 100 штаммов УПМ, изолированных от больных с дисбактериозом толстого кишечника, - по 20 штаммов Enterobacter spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., S.aureus, «атипичной» E.coli. Было проведено 2000 опытов с использованием четырех методик по отдельности и 500 опытов по предложенному авторами способу с использованием трех методов для лактосодержащих пробиотиков и 1500 опытов с использованием трех методик по отдельности и 500 опытов по предложенному авторами способу с использованием двух методов для бифидосодержащих пробиотиков.
При использовании метода двухслойного агара антагонизм был выявлен в отношении 233 культур лактобактерий (63,5% от всех полученных положительных опытов). При этом в 48 случаях была выявлена высокая степень антагонистической активности, поэтому дальнейшее тестирование пробиотика не потребовалось и результаты метода перевернутого агара были не важны (таблица 2). В 267 случаях антагонистическая активность методом двухслойного агара не была выявлена вообще. Поэтому исследование, проведенное методом перевернутого агара, а также дополнительно капельной методикой, было особенно важно. Оно позволило дополнительно выявить антагонистическую активность пробиотических лактобактерий методом перевернутого агара в 41 случае, капельной методикой - в 43, в 9 случаях - двумя перечисленными методами.
В 153 случаях методом двухслойного агара была выявлена низкая степень антагонистической активности лактобактерий, в 32 - средняя. В этом случае метод перевернутого агара позволил выявить и уточнить степень антагонистической активности лактобактерий. Так, низкая степень была подтверждена в 79 случаях, средняя - в 4, высокая - в 4 (таблица 3).
При использовании метода двухслойного агара антагонизм бифидобактерий был выявлен в отношении 119 культур. При этом в 91 случае была выявлена высокая степень антагонистической активности, поэтому дальнейшее тестирование пробиотика не потребовалось (таблица 2). В 219 случаях антагонистическая активность с использованием способа прототипа - метода двухслойного агара - не была выявлена вообще. Поэтому применение двух методов особенно важно. Это позволило дополнительно выявить антагонистическую активность бифидобактерий способом аналога - методом перевернутого агара - в 101 случае, в 52 случаях - двумя перечисленными методами. В качестве «выявленной» антагонистической активности бифидобактерий рассматривались только результаты со средней или высокой активностью.
В 162 случаях методом двухслойного агара была выявлена низкая степень антагонистической активности пробиотических бифидобактерий. В 196 случаях одним из способов аналогов - методом перевернутого агара - не была выявлена антагонистическая активность пробиотических бифидобактерий, а в 151 случае выявлена низкая степень антагонистической активности. Поэтому эти два метода взаимно дополняют друг друга при выявлении антагонистической активности пробиотических бифидобактерий.
Доля случаев невыявленной антагонистической активности при использовании какого-либо одного метода (метода двухслойного агара или метода перевернутого агара) составляет 60,6% при тестировании бифидобактерий и 78,65% при тестировании лактобактерий. В то же время при одновременном использовании нескольких методик, то есть при применении заявляемого способа, процент невыявленных случаев резко снижается и составляет 17,4% для бифидобактерий и 34,6% для лактобактерий.
Заявляемый способ позволяет в отличие от способа прототипа снизить риск использования пробиотиков, которые могут подавлять собственную индигенную микрофлору данного пациента, так как отсутствие определения биосовместимости повышает риск использования пробиотиков, которые могут подавлять собственную индигенную микрофлору данного пациента и приводить к дисбалансу кишечной микрофлоры, усугубляя дисбиоз.
Заявляемый способ позволяет также существенно расширить спектр оптимально подобранных пробиотических препаратов для данного конкретного пациента (фиг.5) в отличие от прототипа и аналога, благодаря тому что во внимание принимаются различные механизмы антагонистического воздействия.
Таким образом, вышеприведенные данные подтверждают, что заявляемый способ в отличие от способа прототипа снижает риск использования пробиотиков, которые могут подавлять собственную индигенную микрофлору данного пациента, и позволяет существенно расширить спектр оптимально подобранных пробиотических препаратов для конкретного пациента, в отличие от прототипа и аналогов повышает точность выявления антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника у конкретного пациента, а также упрощает посев и учет полученных результатов в отличие от аналогов.
Таблица 4
Расчетная таблица для определения количества бактерий в мл жидкости
А
I
II
III
Кол-во в 1 мл
1-6
-
-
-
<1000
8-20
-
-
-
3000
20-30
-
-
-
5000
30-60
-
-
-
10000
70-80
-
-
-
50000
100-150
5-10
-
-
100000
не сосч.
20-30
-
-
500000
-”-
40-60
-
-
1 млн
-”-
100-150
10-20
-
5 млн
-”-
не сосч.
30-40
-
10 млн
-”-
-”-
60-80
Единичные колонии
100 млн
Таблица 5
Коэффициент корреляции Пирсона для всей выборки биопрепаратов, тестируемых на адгезивную активность на двух видах эпителия
Выборка
r
Сила связи
Средняя ошибка m
Достоверность r*
Препараты бифидумбактерий (45 опытов)
0,91
сильная прямая
0,025
Достоверно
Препараты лактобактерий (45 опытов)
0,74
сильная прямая
0,07
Достоверно
Все биопрепараты больных (90 опытов)
0,86
сильная прямая
0,03
Достоверно
Примечание: * достоверность коэффициента корреляции определяли путем сравнения его величины с величиной средней ошибки (r должен в 3 раза превышать m)
Таблица 7
Адгезивная активность пробиотических штаммов, выявленная в отношении буккального эпителия, полученная при исследовании на дисбактериоз №578
Препарат*
Количество адгезировавшихся клеток пробиотических штаммов на эпителиоцитах (исследовано не менее 5)
Ср. арифметическое/баллы**
1
2
3
4
5
Л1
83
84
61
93
65
77/3
Л2
210
350
315
250
284
282/5
Л3
105
93
88
90
151
105/4
Л4
55
63
81
47
60
61/3
Л5
75
90
92
130
104
98/4
Б1
315
170
153
180
290
222/5
Б2
62
125
110
120
87
101/4
Б3
64
71
51
50
53
58/2
Б4
82
74
114
118
142
106/4
Б5
94
90
90
97
102
95/4
* Л1 - «Лактобактерин», «Микроген» (Пермь); Л2 - «Лактобактерин», «Имбио» (Нижний Новгород); Л3 - «Лактобактерин», «Иммунопрепарат» (Уфа); Л4 - «Нормофлорин-Л»; Л5 - лактобактерии йогурта «Актимель»; Б1 - «Бифидумбактерин», «Микроген» (Пермь); Б2 - «Бифидумбактерин», «Экополис» (Ковров); Б3 - «Бификол»; Б4 - «Нормофлорин-Б»; Б5 - «Бифиформ»
**1 балл - до 30 адгезированных микроорганизмов на одной клетке, 2 балла - 31-60, 3 балла - 61-90, 4 балла - 91-120, 5 баллов - 121 и более. При количестве адгезированных микроорганизмов в 1-2 балла определяют низкую степень адгезии, в 3 балла - среднюю степень, 4-5 - высокую
Таблица 10
Взаимоотношения индигенных лактобактерий и бифидобактерий, выделенных при исследовании на дисбактериоз №846, с пробиотическими штаммами при их совместном культивировании
Препараты
Индигенные лактобактерии
Индигенные бифидобактерии
Биосовместимые (+), Несовместимые (-)
Биосовместимые (+), Несовместимые (-)
«Лактобактерин», Пермь
+
+
«Лактобактерин», Н.Новгород
+
+
«Лактобактерин», Уфа
+
+
«Нормофлорин-Л»
-
-
йогурт «Актимель»
-
+
«Бифидумбактерин», Пермь
-
-
«Бифидумбактерин», Ковров
-
-
«Бификол»
+
+
«Нормофлорин-Б»
-
+
«Бифиформ»
+
+
Таблица 11
Взаимоотношения индигенных лактобактерий и бифидобактерий, выделенных при исследовании на дисбактериоз №578, с пробиотическими штаммами при их совместном культивировании
Препараты
Индигенные лактобактерии
Индигенные бифидобактерии
Биосовместимые (+), Несовместимые (-)
Биосовместимые (+), Несовместимые (-)
«Лактобактерин», Пермь
+
+
«Лактобактерин», Н.Новгород
+
+
«Лактобактерин», Уфа
+
-
«Нормофлорин-Л»
+
+
йогурт «Актимель»
+
+
«Бифидумбактерин», Пермь
-
+
«Бифидумбактерин», Ковров
-
+
«Бификол»
+
+
«Нормофлорин-Б»
+
+
«Бифиформ»
+
+
Таблица 12
Взаимоотношения индигенных лактобактерий и бифидобактерий, выделенных при исследовании на дисбактериоз №628, с пробиотическими штаммами при их совместном культивировании
Препараты
Индигенные лактобактерии
Индигенные бифидобактерии
Биосовместимые (+), Несовместимые (-)
Биосовместимые (+), Несовместимые (-)
«Лактобактерин», Пермь
+
-
«Лактобактерин», Н.Новгород
+
-
«Лактобактерин», Уфа
+
-
«Нормофлорин-Л»
+
+
йогурт «Актимель»
+
+
«Бифидумбактерин», Пермь
+
-
«Бифидумбактерин», Ковров
+
-
«Бификол»
-
-
«Нормофлорин-Б»
-
+
«Бифиформ»
+
+
Таблица 15
Выявление антагонистической активности пробиотических лактобактерий разными методами
Комбинации опытов, давших положитель-ный резуль-тат в сериях тестов*
Выявленная антагонистическая активность биопрепаратов** (количество чувствительных тест-культур)
Общее количество чувствительных культур в методе, абс. (%)
Л1
Л2
Л3
Л4
Л5
0
50
37
51
19
16
-
1
2
0
1
1
0
4 (1,2)
2
8
9
10
0
16
43 (13,2)
3
13
7
9
3
6
38 (11,6)
4
19
35
18
65
22
159 (48,6)
1 и 3
2
0
0
0
0
2 (0,6)
1 и 4
0
0
1
2
0
3 (0,9)
2 и 3
1
1
2
0
5
9 (2,8)
2 и 4
1
3
5
0
21
30 (9,2)
3 и 4
2
5
2
11
7
27 (8,3)
1, 2 и 4
0
0
0
0
2
2 (0,6)
2, 3 и 4
1
1
1
1
1
10 (3,1)
Примечание:
* 0 - антагонистическая активность не выявлена ни одним методом
1 - метод перпендикулярных штрихов
2 - метод совместного культивирования (капельная методика)
3 - метод перевернутого агара
4 - метод двухслойного агара
** Л1 - «Лактобактерин», «Микроген», Пермь; Л2 - «Лактобактерин», «Имбио», Нижний Новгород; Л3 - «Лактобактерин», «Иммунопрепарат», Уфа; Л4 - «Нормофлорин-Л»; Л5 - «Актимель»
Таблица 19
Совпадения при выявлении антагонистической активности пробиотических лактобактерий в отношении УПМ методом перевернутого агара и капельной методикой
Положительные результаты, выявленные
Количество чувствительных штаммов УПМ, выявленных данной методикой, абс. (% от числа всех положительных результатов)
только капельной методикой
75 (20,4)
только методом перевернутого агара
67 (18,2)
двумя методиками одновременно
19 (5,8)
Литература
1. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Адгезивные и гемагглютинирующие свойства лактобацилл. Журн. микро-биол., 1982, №9. С.75-78.
2. Бершадская Е.Д., Фиш Н.Г., Шевьев П.П., Огарков В.И. Стандартизация реакции прямой гемагглютинации, вызываемой бактериями рода Lactobacillus // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 1986. - №8. - С.69-71.
3. Lehto E.M., Salminen S.J. Adhesion of twelve different Lactobacillus strains to Caco-2 cell cultures. Nutr Today, 1996; 31:49S-50S.
4. Tuomola, E M: Salminen, S J. Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2 cell cultures. Int-J-Food-Microbiol. 1998, May 5; 41(1): 45-51.
5. Бойцов А.Г., Рищук С.В., Ильясов Ю.Ю., Гречанинова Т.А. Адгезия лактобактерий к клеткам вагинального и буккального эпителия // Вестник Санкт-Петербургской Медицинской академии им И.И.Мечникова. - 2004. - №4(5). С.191-193.
6. Schillinger Ulrich, Guigas Claudia and Holzapfel Wilhelm Heinrich. In vitro adherence and other properties of lactobacilli used in probiotic yoghurt-like products. International Dairy Journal, 2005, Volume 15, Issue 12, Pages 1289-1297.
7. Глушанова Н.А., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2005. - №2. - С.56-61.
8. Постникова Е.А., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2004. - №2. С.64-69.
9. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2004. - №5. - С.94-98.
10. Арзуманян В.Г., Михайлова Н.А., Гайдеров А.А., Баснакьян И.А., Осипова И.Г. Количественный способ оценки отсроченного антагонизма пробиотических культур против оппортунистических дрожжей // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - №5. С.53-54.
11. Глушанова Н.А., Блинов А.И., Бахаев В.В. Об антагонизме пробиотических лактобацилл // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2004. - №6. С.37-39.
12. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов иследования в клинико-диагностических лабораториях: приложение 1 к приказу Минздрава СССР №535. - 1986.
13. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Рахимова Н.Г, Поспелова В.В., Лагода И.В. К механизму антагонистической активности лактобацилл // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 1989. - №2. - С.3-8.
14. Jack R.W., Tagg J.R., Ray B. Bacteriocins of gram-positive bacteria // Microbiol. Rev. - Jun 1995. - Vol.59. - No.2. - P.171-200.
15. Anderssen E.L., Dzung B.D., Ingolf F.N., Eijsink V.G.H., Nissen-Meyer J. Antagonistic Activity of Lactobacillus plantarum C11: Two New Two-Peptide Bacteriocins, Plantaricins EF and JK, and the Induction Factor Plantaricin A // Appl. Environ. Microbiol. - 1998 June. - Vol. 64(6). - P.2269-2272.
16. Eijsink V.G.H., Skeie M., Middelhoven P.H., Brurberg М.В., Nes I.F. Comparative Studies of Class IIa Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria // American Society for Microbiology. Applied and Environmental Microbiology. - September 1998. - Vol.64. - No.9. - P.3275-3281.
17. Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2003. - №3. - С.109-113.
18. Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Вербицкая Н.Б. Проявление антагонистического действия бактериоциногенных Lactobacillus acidophilus на клетки Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii и Proteus mirabilis // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2006. - №7. - С.8-11.