ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/ВИКТОРИЯ/2011/89 (H3N2) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ
STRAIN OF INFLUENZA VIRUS A/17/VICTORIA/2011/89 (H3N2) FOR PRODUCTION OF LIVE INFLUENZA INTRANASAL VACCINE FOR ADULTS AND CHILDREN

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А, А/17/Виктория/2011/89 (H3N2).
Известный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Брисбен/07/1 сероподтипа (H3N2) - прототип изобретения [Патент РФ № 2416640, дата приоритета 11.01.2010. Опубл. БИ №11, 2011, 27.06.2011] - утратил антигенную актуальность и, вследствие этого, не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичным вирусу А/Виктория/361/2011 (H3N2).
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности для взрослых и для детей на основе нового дрейфового варианта вируса гриппа А/Виктория/361/2011 (H3N2). Штаммы вирусов гриппа для живых вакцин, применяемые в настоящее время, получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977. - №4. - С.387-395.]. Донором аттенуации для гриппозных вакцин типа А является А/Ленинград/13 4/17/57 (H2N2) -холодоадаптированный (са) температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. 151 с.].
Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие антигенно значимые поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от циркулирующего эпидемического вируса, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS), от безопасного донора аттенуации.
В результате предлагаемого изобретения получен вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2), для чего использовали метод генетической реассортации эпидемического вируса А/Виктория/361/2011 (H3N2) с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Изобретение осуществили посредством инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах и последующей селекции клонов с заданными свойствами при пониженной до 25°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищали трехкратным клонированием методом предельных разведений под прессом антисыворотки к донору при пониженной (25°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистые клоны были проверены по фенотипическим характеристикам (ts-, са-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям к вакцинному штамму.
Заявляемый вакцинный штамм характеризуется следующими свойствами. Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА идентичен вирусу А/Виктория/361/2011 (H3N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется.
Формула генома 6:2 вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины, т.е. гены, кодирующие поверхностные белки НА и NA, принадлежат эпидемическому родительскому вирусу А/Виктория/361/2011 (H3N2), а гены, кодирующие внутренние
Таблица 1
Праймеры для скрининга реассортантных вирусов гриппа сероподтипа A (H3N2) - кандидатов в живую вакцину на основе эпидемически актуального вируса и донора аттенуации
Сегмент генома
Родительский вирус
Нуклеотидная позиция
Последовательность прямого праймера (5'→3')
Последовательность обратного праймера (5'→3')
ЭВ<sup>a</sup>
1477-2115
GGTGTGGATGAATACTCCAGTA
CATATCCCTCATGCACADTTAGC
РВ2
донор att<sup>b</sup>
1273-2118
GGTGATCTGAATTTCGTTAATAGG
GCCCATTTTGCTGACTCTTAAC
РВ1
ЭВ
1755-2223
GAAGCTGTGGGATCAAACCCAA
GTTAATGCTCTAATTAGGTAAC
донор att
1206-2169
TCTCCTAATAGATGGCACAGTC
AGTTTGGTCCTCCATCCGAAAT
PA
ЭВ
970-1851
GGATGGAAAGAACCTTATATAGTC
GCCTGAACAATGAGGAGCAAC
донор att
914-1712
ACGAAGGAGAGGGAATACCAC
GTCCTGCAGTTCTGCCAGTAAT
ид
ЭВ
29-593
CATGAAGACCATCATTGCTTTGAGCTAC
CCACCCATCTACCATTCC
tLr\
донор att
6-858
AAGCAGGGGTTATACCATAGACAACCAAAA
CCTTCTGTTTTCATGATCCCTGAACTACCT
NP
ЭВ
135-1122
GAAGATGATTGATGGAATTGGGA
GATCCTTCATTACTCATGTCAAAG
донор att
640-1331
CGTGGGATCAATGATCGGAAC
GAAAGTTTCCCCCTTGGGAT
NA
ЭВ
34-568
AAAGATAATAACRATTGGCTCTGTT
TATTTTAGTACAGCCAC
донор att
902-1334
TGGAAAGGCTCTAATAGGCCCGTTA
CCATCAGTCATTACTACTG
M
ЭВ
51-547
CGTATGTTCTCTCTATCGTTCCA
CACATATAAGGCCAAATGCTGA
донор att
53-887
TACGTTCTCTCTATCGTCCCG
TTTTCAGACCGTGTTTAAAGAAG
мс
ЭВ
86-78
ACAAGTTGTAGACCAAGAACTGA
AGCCATCTTATTTCTTCAAACTTC
11 0
донор att
13-726
GTGACAAAGACATAATGGATCCT
ATTTGCTCAAAACTATTCTCTGTTA
<sup>a </sup>- Эпидемически актуальные вирусы гриппа А сероподтипа (H3N2).
<sup>b </sup>- Донор аттенуации А/Ленинград /134/17/57 (H2N2).
белки (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Это установлено методом «да-нет» PCR. Метод основан на сравнении ДНК-копий участков РНК вирусов, амплифицированных с помощью селективно работающих праймеров (табл.1).
Подобраные праймеры специфично работают либо только с последовательностями генов донора аттенуации, либо только с последовательностями современных эпидемических вирусов [Киселева И.В., Voeten J.T.M., Teley L.C.P. и др. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2011. - №4. - С.29-36].
На фиг.1, в качестве примера, представлен электрофорез в 1.7%-ном агарозном геле, содержащем 0.5 мкг/мл этидиума бромида, амплифицированных ДНК фрагментов гена, кодирующего белок РА с праймерами специфичными (а) - для эпидемического вируса гриппа А/Виктория/361/2011 (H3N2), (б) - для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Обозначения: 1-я дорожка - маркер молекулярного веса; 2 и 5-я дорожки - РА ген донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), 3, 4 и 6-я дорожки - РА ген кандидата в вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2), 7-я дорожка - РА ген эпидемического вируса гриппа А/Виктория/361/2011 (H3N2).
Результаты анализа всех генов в составе генома вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) представлены в таблице 2.
Таблица 2 Состав генома реассортантного вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Виктория/2011/89 (H3N2)
Ген
Родительские вирусы
Реассортантный вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2)
Эпидемический вирус А/Виктория/361/2011 (H3N2)
Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2)
РВ2
ЭВ<sup>1</sup>
Лен17<sup>2</sup>
Лен17
РВ1
ЭВ
Лен 17
Лен17
РА
ЭВ
Лен17
Лен17
НА
ЭВ
Лен17
ЭВ
NP
ЭВ
Лен17
Лен17
NA
ЭВ
Лен17
ЭВ
М
ЭВ
Лен17
Лен17
NS
ЭВ
Лен17
Лен17
<sup>1 </sup>- Ген принадлежит эпидемическому вирусу гриппа А/Виктория/361/2011 (H3N2).
<sup>2 </sup>- Ген принадлежит донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2).
50
50
50
В экспериментах in vitro определены фенотипические свойства полученного штамма. Вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) является температурочувствительным (ts маркер: <1 lg ЭИД/мл при 40°С, где ЭИД - эмбриональная инфекционная доза, вызывающая гибель 50% РКЭ) и холодоадаптированным (са маркер: 6,7 lg ЭИД/мл при 26°С).
Стабильность его фенотипических признаков подтверждена анализом способности к репродукции при оптимальной температуре (32°С) и при температурах за пределами температурного оптимума (25°С и 40°С) до и после его пятикратного пассирования в куриных эмбрионах (табл.3).
Таблица 3 Фенотипические свойства вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) до и после его пассирования в куриных эмбрионах
Вирус
Титр, lg ЭИД<sub>50</sub>/0.2 мл
RCT<sub>25</sub>
RCT<sub>40</sub>
Фенотип
32°С
25°С
40°С
А/Ленинград/134/17/57
8.2
6.5
2.0
1.7
6.2
ts, ca
А/Виктория/361/2011
7.5
1.3
7.0
6.2
0.5
non-ts, non-ca
А/17/Виктория/2011/89 (H3N2), до пассирования
8.5
7.3
<1.0
1.2
>7.5
ts, ca
А/17/Виктория/2011/89 (H3N2), 5-й пассаж
8.2
7.0
<1.0
1.2
>7.2
ts, ca
У созданного штамма установлена генетическая стабильность кодирующих мутаций. Генетическую стабильность вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций во внутренних генах «до» и «после» пятикратного пассирования вакцинного штамма в куриных эмбрионах. Секвенированием генов кандидата в вакцинный штамм продемонстрирована идентичность мутаций во всех внутренних генах донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) «до» и «после» его пятикратного пассирования, в том числе, в генах полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА), ответственных за аттенуирующий фенотип (табл. 4).
Таблица 4. Кодирующие мутации в геноме вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) по сравнению с донором аттенуации А/Ленинград/13 4/17/57 (H2N2) и его диким предшественником, вирусом А/Ленинград/13 4/5 7 (H2N2)
Ген
Нуклеотид
Аминокислота
Мутации
Лен/wt<sup>1</sup>
Лен 17
А/17/Виктория/2011/89 (H3N2)
до пассирования
5 пассаж
РВ2
1459
478
Val
Leu
Leu
Leu
РВ1
819
265
Lys
Asn
Asn
Asn
1795
591
Val
He
He
He
PA
107
28
Leu
Pro
Pro
Pro
1045
341
Val
Leu
Leu
Leu
NP
NP ген донора аттенуации не содержит мутаций
Ml
68
15
He
Val
Val
Val
NS2
798
100
Met
He
He
He
<sup>1</sup> Наличие мутаций в геноме вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) определяли сравнением его аминокислотных последовательностей с последовательностями дикого предшественника донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), а именно, с вирусом дикого типа А/Ленинград/134/57 (H2N2), с помощью секвенирования.
Обозначения: Лен 17 - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); Лен/wt вирус дикого типа А/Ленинград/134/57 (H2N2), предшественник донора аттенуации.
У созданного штамма была проверена чувствительность к неспецифическим гамма-ингибиторам сыворотки крови, реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с нормальной (неиммунной) сывороткой крови лошади, прогретой 10 минут при 80°С. Продемонстрировано, что вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2), равно как и его эпидемический родитель А/Виктория/361/2011 (H3N2), высоко устойчивы к гамма-ингибиторам сыворотки крови лошади.
50
Изучение острой токсичности вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) проводили в экспериментах на белых мышах обоего пола. Мышам вводили вирус внутрибрюшинно однократно в объеме 0.5 мл. Животным контрольной группы не вводили ничего. Безвредность вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) оценивали по выживаемости животных и прибавке в весе. Вирус вводили в дозе 71g ЭИД/0.2мл. В результате испытаний установлена безвредность вакцинного штамма для лабораторных животных при его внутрибрюшинном введении. Отмечена прибавка в весе животных при их 100%-ной выживаемости (табл. 5).
Таблица 5. Результаты изучения безвредности вакцинного штамма в экспериментах на мышах
Пол
Введено
Выжило
Прибавка веса, г
Самцы
ВШ в/б
10/10
+1.2
Самки
ВШ в/б
10/10
+1.4
Самцы
контроль
10/10
+1.4
Самки
контроль
10/10
+1.3
Обозначения: ВШ - вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2);в/б - внутрибрюшинное введение.
У нового штамма определяли аттенуацию и нейровирулентность для мышей. Изучение аттенуирующих свойств вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) проводили в экспериментах на белых мышах после их интраназального заражения, оценивая степень репродукции вируса в легких по сравнению с уровнем репродукции донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и его дикого предшественника, вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2).
50
Отсутствие нейровирулентной активности у вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) изучали путем интраназального заражения мышей с последующим выделением вируса из ткани мозга. В качестве контроля был использован нейровирулентный штамм вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1). Вирусы вводили в дозе 7 lg ЭИД/0.2мл.
Опыты показали, что вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) выделялся из легких и носовых ходов мышей в титрах, аналогичных донору аттенуации А/Ленинград/13 4/17/5 7 (H2N2). При этом вирусы дикого типа, такие как А/Ленинград/134/57 (H2N2) и A/WSN/33 (H1N1), использованные в тестировании созданного штамма, активнее репродуцировались в легких мышей по сравнению с холодоадаптированными вирусами (табл. 6), что подтверждает аттенуированный фенотип вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2). Установлено полное отсутствие проникновения вакцинного штамма А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) в мозг инфицированных животных после их интраназального заражения при активной репродукции в мозговой ткани нейровирулентного вируса A/WSN/33 (H1N1).
Таблица 6 Изучение репродукции вакцинного штамма во внутренних органах мышей после интраназального заражения
Введенный мышам вирус
Выделение вируса из органов, lg ЭИД<sub>50</sub>/0.2 мл
Легкие
Носовые ходы
Мозг
Лен 17
2.1
1.2
Не выделен
Лен/wt
5.5
3.6
Не выделен
А/17/Виктория/2011/89
2.1
1.3
Не выделен
A/WSN/33
6.3
4.8
5.3
Плацебо
Не выделен
Не выделен
Не выделен
Обозначения: Лен17 - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2);Лен/wt - вирус дикого типа А/Ленинград/134/57 (H2N2), предшественник донора аттенуации.
Обозначения: Лен17 - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2);
Лен/wt - вирус дикого типа А/Ленинград/134/57 (H2N2), предшественник донора аттенуации.
50
В ходе исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Виктория/361/2011 (H3N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации. Инфекционная активность вакцинного штамма при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 8,8 lg ЭИД/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:1024. Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз). Штамм аттенуирован и безвреден для лабораторных животных. Морфология штамма полиморфная, типичная для вируса гриппа.
Таким образом, вакцинный штамм А/17/Виктория/2011/89 (H3N2) по биологическим свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП Р№ 003224/01-050210 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения и действующему приказу Министерства здравоохранения РФ от 07.08.1998 №156/79 «О подготовке новых вакцинных, производственных и диагностических штаммов вируса гриппа и их внедрении в производство вакцин и диагностических препаратов».
В прилагаемом паспорте на штамм указаны требуемые для вакцинного штамма характеристики.
Штамм депонирован в Государственную коллекцию вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Штамму присвоен № депонента ГКВ № 2724.
ПАСПОРТ ВАКЦИННОГО ШТАММА
1 Название штамма А/17/Виктория/2011/89
2 ИЭМ№ 8995.
3 Серия (Лот №) Серия №1.
4 Сероподтип H3N2.
5 Метод подготовки Классическая реассортация в куриных эмбрионах.
6 Родительские вирусы.
6.1 Эпидемический штамм: А/Виктория/361/2011 (H3N2); CDC ID# 2012702646.
6.2 Донор аттенуации: А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).
7 Пассажи в куриных Е7/Е1 (совместное заражение, два селективных пассажа, эмбрионах в процессе четыре клонирования и одно накопление) реассортации
8 Состав генома Гены РВ2, FBI, PA,NP, M и NS от донора аттенуации, НА и NA - от эпидемического вируса (формула генома 6:2).
9 Характеристика штамма до лиофильной сушки.
9.1 Оптимальные условия накопления 32°С, 48 часов.
9.2 Титр ГА 1:1024 с 1.0% куриными эритроцитами.
10
50
9.3 Титр вируса при оптимальной температуре 32°С 8.8 log ЭИД/мл.
9.4 Взаимодействие с неспецифическими γ-ингибиторами сыворотки крови лошади и морской свинки: устойчив.
50
9.5 ts маркер: <1 lg ЭИД/мл при 40°С (ts фенотип).
50
9.6 са маркер: 6.7 lg ЭИД/мл при 26°С (са фенотип).
10 Характеристика штамма после лиофильной сушки
10.1 Дата лиофилизации: 16.04.2012 г.
10.2 Объем материала в ампуле: 0.5 мл.
50
10.3 Титр вируса при 32°С: 8.0 lg ЭИД/мл.
10.4 Титр ГА - 1:512 с 1.0% куриными эритроцитами.
11 Антигенная специфичность
11.1 Гемагглютинин: идентичен эпидемическому вирусу А/Виктория/3 61/2011 (H3N2), что подтверждено в РТГА с гипериммунной крысиной сывороткой.
11.2 Нейраминидаза: идентична эпидемическому вирусу А/Виктория/3 61/2011 (H3N2), подтверждено секвенированием.
12 Токсикологическое: Не токсичен после внутрибрюшинного заражения исследование in vivo (острая мышей токсичность)
13 Контроль стерильности Стерилен (30.04.2012).