Сравнительная эффективность деградации нефтепродуктов консорциумом плазмидосодержащих штаммов-деструкторов и биопрепаратами "МикроБак", "Биоойл"

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2013. Вып. 2. Ч.1. С. 258-272

Химия

УДК 579.222; 574.24; 579.6

Сравнительная эффективность деградации нефтепродуктов консорциумом плазмидосодержащих штаммов-деструкторов и биопрепаратами «МикроБак», «Биоойл» *

А. А. Ветрова, А. А. Иванова, А. Е. Филонов, В. А. Забелин,

И. А. Нечаева, Ле Тхи Бич Нгует, А. М. Боронин

Аннотация. Проведены сравнительные испытания разработанного консорциума плазмидосодержащих штаммов-деструкторов и биопрепаратов «МикроБак» и «Биоойл» в жидкой минеральной среде и в модельных почвенных системах, загрязненных нефтью или дизельным топливом при температурах 4 и 24°С. Проведена оценка эффективности деградации нефти микробным консорциумом в сравнении с биопрепартами «Биоойл» в условиях реального разлива на нефтяном месторождении Ямало-Ненецкого автономного округа.

Ключевые слова: биодеградация, микроорганизмы, плазмиды, нефть.

Введение

За последние десять лет на территории РФ наблюдается увеличение чрезвычайных ситуаций, связанных с разливами нефти и нефтепродуктов, что связано, в первую очередь, с увеличением объемов добычи нефти, интенсификацией нефтеперевозок и вводом в эксплуатацию новых месторождений как на суше, так и на море [1]. Наиболее перспективным направлением биоремедиации нефтезагрязненных объектов является применение биологического метода, основанного на использовании биохимического потенциала микроорганизмов, позволяющих ускорить разложение нефти и нефтепродуктов, не нанося дополнительного ущерба нарушенной экосистеме [2].

* Работа была выполнена при финансовой поддержке ФЦП ГК № 14.515.11.0027 и гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых — кандидатов наук, договор № 16.120.11.4341-МК.

Препятствиями для эффективной очистки окружающей среды от нефти является низкая температура, повышенная концентрация соли, низкое содержание питательных веществ, отсутствие или низкая деградативная активность природных микробных популяций. Поскольку значительная часть нефти в РФ добывается в регионах с холодным климатом, в настоящее время большое внимание уделяется изучению процессов биоремедиации при низких положительных температурах [3].

Температура играет одну из ключевых ролей в регулировании микробного метаболизма, который важен для биоремедиации in situ. Биодоступность и растворимость гидрофобных, плохо растворимых в воде субстратов, таких как алифатические и ароматические углеводороды, зависят от температуры. Понижение температуры увеличивает их вязкость, при этом уменьшается скорость диффузии органических компонентов. Микроорганизмы, способные деградировать компоненты нефти при низких температурах, имеют комплекс структурных и адаптационных механизмов. Их адаптационные приспособления связаны с ростом и ферментативной активностью, компенсирующими негативное влияние низких температур на биохимические процессы [4, 5]. В работе Делиля и Кулона [6] показано уменьшение содержания углеводородов нефти более чем на 70 % и 80% почве, и более чем на 76 % и 96 % в песке, инкубированных при температурах 4 °С и 20 °С, соответственно.

Экосистемы с повышенным содержанием соли широко распространены в природе. Использование микроорганизмов, способных деградировать органические вещества в присутствии соли, может позволить избежать необходимости снижения, часто дорогостоящего, концентрации соли в загрязнённом участке путём разбавления, обратного осмоса, ионного обмена или электродиализа до биологической обработки. В ряде работ описана минерализация или трансформация ряда органических поллютантов микроорганизмами, способными к росту в присутствии соли [7, 8].

Целью настоящей работы была оценка эффективности ассоциации плазмидосодержащих штаммов-деструкторов при деструкции нефти и дизельного топлива в присутствии 3% морской соли при температурах 4 °С и 24 °С в лабораторных экспериментах и в условиях реального разлива нефти по сравнению с биопрепаратами «МикроБак» и «Биоойл».

Материалы и методы исследования

Бактериальные штаммы. В работе использовали ранее разработанный консорциум микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти, состоящий из Rhodococcus erythropolis S26, Acinetobacter baumanii 1B, Acinetobacter baumanii 7 и Pseudomonas putida F701 [9]. Сравнение проводили с биопрепаратами «Биоойл» [10] и «МикроБак» [11].

Питательные среды, источники углерода и энергии. В качестве минимальной среды использовали среду Эванса [12], полноценной — агаризованные среды Лурия-Бертани (ЛБ) [13], Кинга Б (КБ) [14].

Условия культивирования бактериальной ассоциации и биопрепаратов «МикроБак» и «Биоойл» в жидкой минеральной среде Эванса. Микроорганизмы засевали в колбы Эрленмейера, содержащие 100 мл минеральной среды Эванса с добавлением нефти или дизельного топлива до конечной концентрации 15 % весовых в присутствии

3 % морской соли. Инокулирование колб с нефтью или дизельным топливом проводили суспензией микроорганизмов (1 мл на 100 мл среды, посевная доза 1-5 х106 кл/мл). После засева колбы помещали на круговую качалку (120 об/мин) и инкубировали в течение 30 суток при температурах 4 и 24 °С. Через 15-30 суток роста отбирали пробы выращенных культур по 0,5 мл и проводили серийные десятикратные разведения. Затем полученные суспензии высевали в трех повторностях на чашки Петри с агаризованной полноценной средой Лурия-Бертани для точного определения числа колониеобразующих единиц (КОЕ), характеризующего прирост биомассы.

Определение влагоемкости почвы. Определение влагоемкости почвы проводили согласно методике, описанной в Вадюниной и Корчагиной [15]. Влажность в течение модельных почвенных экспериментов поддерживали в диапазоне 23-25%.

Приготовление модельных почвенных систем. Для приготовления модельных почвенных систем использовалась лугово-аллювиальная почва, взятая у р. Ока вблизи г. Пущино Московской области. Перед использованием почву просеивали через сито с диаметром отверстий 2,0 мм. Затем навеску почвы массой 1 кг тщательно перемешивали с нефтью (20 г), чтобы уровень загрязнения составлял 2 %. Приготовленную таким образом почву с нефтью помещали в пластиковые контейнеры (толщина слоя почвы 10 см). Модельные почвенные системы инкубировали при температуре 18-25 °С.

Внесение инокулята в модельные почвенные системы. Бактерии выращивали в жидкой среде ЛБ до конца экспоненциальной фазы роста (1х109 КОЕ/мл среды). Затем, используя стандарт мутности, суспензию бактерий разводили фосфатным буфером до концентрации 1-5 х108 КОЕ/мл. Приготовленную таким образом бактериальную суспензию добавляли в стерильную водопроводную воду, и затем воду с инокулятом вносили в почву. Вносимое количество воды рассчитывали исходя из влажности 25 %. Количество вносимой бактериальной суспензии рассчитывали так, чтобы конечная концентрация составляла не менее 1 х 106 КОЕ/г сухой почвы. Интродукцию микробной ассоциации и биопрепаратов «МикроБак» и «Биоойл» осуществляли 2 раза с интервалом 4 недели. В качестве биогенных источников азота, фосфора и калия использовали минеральное удобрение «Нитроаммофоска» (ООО «Фаско+», Россия),

которое вносили в количестве 1,5 г на 1 кг почвы. Затем почву в контейнерах тщательно гомогенизировали шпателем. Ежедневно проводилось рыхление почвы стерильным шпателем, измерение температуры и добавление воды для поддержания влажности на уровне 25 %.

Отбор проб из модельных почвенных систем. Для определения численности микроорганизмов и содержания нефти отбирали усредненные пробы (1 и 5 г, соответственно) из 3-4 разных участков почвы. Пробы весом 1 г суспендировали в 9 мл фосфатного буфера и перемешивали на миксере «Рагаш1х 2» (Германия) в течение 1 минуты при комнатной температуре и после соответствующих стандартных разведений высевали на чашки с ЛБ-агаром. Чашки инкубировали при 24 °С в течение суток. Число колониеобразующих единиц рассчитывали на 1 г сухой почвы.

Условия проведения полевого эксперимента. Полевые испытания проводились на территории Ямало-Ненецкого автономного округа, на участках Пограничного нефтяного месторождения площадью 0,826 га в период июнь-август 2008 г. В течение эксперимента температура воздуха колебалась в диапазоне 2-34 °С, а средняя температура грунта на глубине 10 см составляла 10 °С. Для увеличения доступа кислорода проводили вспашку, а дополнительное увлажнение повышало скорость транспорта питательных веществ к клеткам микроорганизмов. Значение рН грунта составляло

4 единицы. В качестве дополнительных питательных веществ вносили минеральные удобрения - мочевину (150 кг/га). Для определения степени восстановления плодородия и физико-химических характеристик грунта, ранее загрязненной сырой нефтью, в результате естественных разливов, использовали смесь овса и многолетних трав в качестве биоиндикатора. Уровень начального загрязнения грунта составлял 110 г нефти на 1 кг почвы.

Отбор проб в полевом эксперименте. Среднюю смешанную пробу составляли из нескольких десятков первоначальных проб, общая масса которой составляла примерно 10 кг. Отбор проводили с учетом вертикальной структуры, неоднородности покрова почвы, рельефа и климата местности, а также с особенностей свойств загрязняющих веществ. Пробы отбирали с условием, чтобы в каждом случае проба являлась типичной для данной точки отбора. В точках, намеченных для взятия образцов, предварительно удаляли остатки растительности. Пробы, отобранные для проведения химического анализа, упаковывали в емкости из химически нейтрального материала.

Определение численности микроорганизмов в лабораторных и полевых экспериментах по ремедиации нефтезагрязненных

почв. Общую численность микроорганизмов

пробы из соответствующих разведений высевали на агаризованную среду Эванса с добавлением дизельного топлива или нефти в качестве единственного источника углерода и энергии.

Определение степени деструкции нефти. Деградацию нефти исследуемыми штаммами оценивали по суммарному показателю убыли нефти в жидкой среде и грунте, методом ИК-спектрометрии [16]. Образцы анализировали относительно контрольных систем, загрязненных нефтью или дизельным топливом, без интродукции бактерий ассоциации или биопрепаратов «МикроБак» и «Биоойл».

Обработка результатов. Обработку результатов осуществляли с помощью встроенного статистического пакета Excel (MS Office 2003).

Результаты и их обсуждение

1.1. Оценка эффективности деградации нефти микробной ассоциацией по сравнению с биопрепаратами «Биоойл» и «МикроБак» в жидкой минеральной среде.

Рис. 1. Степень деструкции нефти при культивировании разработанной ассоциации и биопрепаратов «Биоойл» и «МикроБак» в жидкой минеральной среде в течение 30 дней при температурах 4 0 С

На рис. 1 представлены результаты анализа степени деструкции нефти, полученные методом ИК-спектрометрии, в условиях культивирования ассоциации и биопрепаратов «Биоойл» и «МикроБак» в жидкой минеральной среде с 15 % нефти при температурах 4 ° Си 24 ° Св течение 30 дней. При температуре 4 °С ассоциация имела наибольший процент убыли углеводородов нефти (44 %) через 30 суток, в то время как, значение степени деструкции в системах, интродуированных биопрепаратом «Биоойл» в течение первых 15 суток было незначительным (8 %), а к концу эксперимента (через 30 суток) этот параметр достиг показателя 36 %, сравнимого с уровнем деградации биопрепарата «МикроБак» — 40 % (рис. 1,а).

При температуре 24 °С применение ассоциации привело к наибольшей убыли углеводородов нефти как через 15 суток — 31 %, так и через 30 суток - 39 % (рис. 1б). Сравнение степени деструкции биопрепаратов «Биоойл» 36 и «МикроБак» 34 % показало, что оба биопрепарата проявляли себя практически одинаково в отношении деструкции нефти. Потребление нефти бактериями, входящими в состав биопрепаратов «МикроБак» и «Биоойл» по сравнению со штаммами ассоциации (рис. 1), происходило медленнее, что, возможно, связано с более длинным периодом адаптации микроорганизмов-деструкторов, что подтверждалось результатами определения динамики численности бактерий (данные не представлены).

1.2. Оценка эффективности деградации нефти отобранной микробной ассоциацией, по сравнению с биопрепаратами «Биоойл» и «МикроБак» в жидкой минеральной среде с 3 % морской соли.

Результаты анализа показали, что максимальная степень деструкции (33 %) была достигнута при культивировании ассоциации в жидкой минеральной среде с 15 % нефти и 3 % морской соли при 4°С в течение 30 дней (рис.

2,а). Показатели убыли нефти в системах инокулированных биопрепаратами «МикроБак» (23 %) и «Биоойл» (18 %) были ниже на 10-15 %. Следует отметить, что через 30 суток численность микроорганизмов, входящих в состав ассоциации, снизилась на 0,5-1 порядок. В случае биопрепарата «Биоойл» наблюдалось следующее: штаммы родов Acinetobacter и Bacillus увеличили свою концентрацию на 0,5 порядка, а остальные — снизили свою концентрацию на 0,5-1 порядок. Анализ данных, полученных для биопрепарата «МикроБак», показал, что концентрация бактерий рода Pseudomonas — увеличилась, бактерий рода Rhodococcus — уменьшилась (данные не представлены).

35.00

і?

* 30,00

§ 25,00

§. 20,00 £ 15,00

Ц 10,00

1 5,00

й 0.00

23

1S ІГ

rh

і 1

ассоциация Биоойл ЛХпкроБак

А) при температуре 4 °С

35.00

30.00

25.00

20.00

15.00

10.00 5,00 0,00

71

ПН 21 ph

3

Г^І

ассоциация Бпоопл ЛХпкроБак

Б) при температуре 24 °С

Рис. 2. Степень деструкции нефти при культивировании разработанной ассоциации и биопрепаратов «Биоойл» и «МикроБак» в жидкой минеральной среде Эванса с 3 % морской соли в течение 30 дней при температурах 4 0 С

В результате проведения аналогичных экспериментов при комнатной температуре 24 °С в течение 30 дней (рис. 2,б), наибольшая эффективность

процесса деградации (около 21 %) наблюдалась при интродукции ассоциации или биопрепарата «МикроБак», в то время как в случае биопрепарата «Биоойл» этот показатель достиг всего лишь 3 %. При сравнении данных рис. 2,а и 2,б было отмечено, что процент деградации нефти исследуемой ассоциацией и биопрепаратами выше при пониженной положительной температуре. При оценке численности микроорганизмов в процессе культивировании в жидкой минеральной среде с 15 % нефти и 3 % морской соли при 24 °С в течение 30 дней было отмечено, что численность штаммов, входящих в биопрепарат «МикроБак», практически не изменилось (10 7 КОЕ/мл); концентрация всех бактерий-деструкторов ассоциации снизилась незначительно (10 6 КОЕ/мл). В случае биопрепарата «Биоойл» наблюдалось увеличение концентрации для штаммов Acinetobacter и Bacillus (10 6 КОЕ/мл), а численность микроорганизмов Enterobacter — снизилась (на 1 и 2 порядка соответственно).

Обобщая результаты, полученные в ходе проведения данного эксперимента можно сделать вывод, что присутствие морской соли в среде снижало скорость деградации нефти микробной ассоциацией и биопрепаратами «МикроБак» и «Биоойл».

1.3. Оценка эффективности деградации дизельного топлива отобранной ассоциацией по сравнению с биопрепаратами «Биоойл» и «МикроБак» в жидкой минеральной среде с 3 % морской соли.

При проведении экспериментов в жидкой минеральной среде с добавлением 15 % дизельного топлива и 3 % морской соли при температуре 4 °С (рис. 3,а) через 30 дней степень деструкции достигла 63% для ассоциации, тогда как этот показатель для биопрепаратов «Биоойл» и «МикроБак» — 42 % и 52 % соответственно.

ассоциация Бпоойл МикроБак ассоциация Биоойл МпкроБак

А) при температуре 4 °С Б) при температуре 24 °С

Рис. 3. Степень деструкции дизельного топлива при культивировании разработанной ассоциации и биопрепаратов «Биоойл» и «МикроБак» в жидкой минеральной среде с 3 % морской соли в течение 30 суток при температурах 4 0 С

Следует отметить, что максимальная скорость убыли загрязнителя для систем, инокулированных биопрепаратом «Биоойл» и консорциумом, была выявлена в первой половине эксперимента (через 15 суток). Анализ динамики численности микроорганизмов, входящих в состав биопрепаратов «МикроБак» и «Биоойл» показал, что через 15 суток началось снижение концентрации клеток бактерий. В то время как, численность практически всех штаммов ассоциации увеличилась почти на 1 порядок к 30 суткам культивирования по сравнению с 15 сутками эксперимента.

При температуре 24 °С, по результатам ИК-спектрометрии, степень деградации дизельного топлива достигла максимума на 30 сутки культивирования для ассоциации и составила 61 % (рис. 3,б), значения степени деструкции для биопрепаратов «Биоойл» и «МикроБак» составили 30 и 37 % соответственно. Исследование динамики численности микроорганизмов, входящих в состав биопрепарата «МикроБак», показало, что через 15 суток культивирования в жидкой минеральной среде с 15 % дизельного топлива и 3 % морской соли при 24 °С начиналось снижения концентрации клеток бактерий. В случае ассоциации на 15 сутки у всех штаммов, кроме S26, наблюдалось увеличение численности клеток микроорганизмов. У микроорганизмов в составе биопрепарата «Биоойл» динамика численности изменялась следующим образом: наблюдался рост штамма Acinetobacter через 15 суток культивирования; у Bacillus через 15 суток началось снижение концентрации клеток, а остальные бактерии практически не изменили свою численность в течение эксперимента.

При использовании в качестве загрязнителя дизельного топлива наблюдалась увеличение степени деструкции этого полютанта во всех системах (см. рис. 3) по сравнению с результатами по убыли нефти в аналогичных экспериментах (см. рис. 1 и 2) при пониженной температуре. По-видимому, это связано с тем, что в состав дизельного топлива входят более легкоутилизируемые микроорганизмами углеводороды, по сравнению с многокомпонентным составом нефти. В мезофильных условиях (24 °С) только при применении консорциума наблюдались более высокие показатели деструкции дизельного топлива (61 %), чем нефти (38 % — рис. 1,б и 22 % — рис. 2,б в присутствии морской соли). Возможно, микроорганизмы биопрепаратов «МикроБак» и «Биоойл» менее устойчивы к токсичным низкомолекулярным соединениям, входящим в состав дизельного топлива.

В целом можно отметить, что при культивировании биопрепаратов «МикроБак», «Биоойл» и разработанного микробного консорциума в жидкой минеральной среде с нефтью или дизельным топливом, была выявлена наибольшая эффективность деградации полютанта при низкой положительной температуре. Кроме того, во всех проведенных экспериментах в жидкой минеральной среде бактериальный консорциум был наиболее эффективен в отношении деградации нефти и дизельного топлива. Возможно это связано с тем, что при низкой положительной температуре абиотическая убыль за счет испарения низкомолекулярных углеводородов

меньше по сравнению с этим же параметром при комнатном температуре, поэтому бактериям, находящимся в системах при температуре 4 °С, доступны более легкоусваиваемые фракции полютанта, что и обусловливает большую степень деградации.

2. Оценка эффективности деградации нефти бактериальной ассоциацией по сравнению с биопрепаратами «Биоойл» и «МикроБак» в модельных нестерильных почвенных системах, загрязненных 2 % нефти. Оценка эффективности отобранной

ассоциации по сравнению с биопрепаратами «Биоойл» и «МикроБак» также была проведена в модельных нестерильных почвенных системах, загрязненных 2 % нефти в течение 42 суток.

Схема эксперимента:

1) система, загрязненная нефтью, использовалась в качестве контроля — использовали для оценки влияния аборигенных почвенных микроорганизмов на процесс деградации нефти;

2) система с добавлением стимулирующих питательных веществ (нитроаммофоска) использовали для оценки влияния удобрения на процесс деградации нефти аборигенными почвенными микроорганизмами;

3) система с добавлением нитроаммофоски, инокулируемая биопрепаратом «МикроБак», использовали для оценки влияния интродуцируемого биопрепарата «МикроБак» и удобрений на деструкцию нефти;

4) система с добавлением нитроаммофоски, инокулируемая биопрепаратом «Биоойл», использовали для оценки влияния интродуцируемого биопрепарата «Биоойл» и удобрений на деструкцию нефти;

5) система с добавлением нитроаммофоски, инокулируемая консорциумом штаммов, использовали для оценки влияния интродуцируемого консорциума и удобрений на деструкцию нефти.

Использованная в данных экспериментах алювиально-луговая почва содержала аборигенные микроорганизмы-нефтедеструкторы, что и обуславливало снижение исходной концентрации нефти на 23 % в микрокосме 1. Внесение в качестве минеральных источников азота и фосфора удобрения «Нитроаммофоски» способствовало увеличению степени деструкции нефти аборигенными микроорганизмами на 8 % в микрокосме 2 по сравнению с микрокосмом 1.

Интродукция в почву бактериальных препаратов «МикроБак», «Биоойл» и исследуемой ассоциации способствовало повышению степени деградации загрязнителя (табл. 1) и увеличению численности углеводородокисляющих микроорганизмов по отношению к контрольной нефтезагрязненной почве. Аналогичные результаты были получены для биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» в работе Биккининой [17].

Известно, что легкие фракции обладают наибольшей токсичностью по отношению к живым организмам, но влияние их достаточно кратковременно вследствие быстрого испарения, биодеградации, рассеивания. Тяжелые

Таблица 1

Убыль нефти в модельных нестерильных почвенных системах через 42

суток

Модельная система Убыль нефти, %

1 Контроль без внесенных микроорганизмов 22,83±3,25

2 Контроль + нитроаммофоска 30,59±2,53

3 МикроБак + нитроаммофоска 51,23±4,26

4 Биоойл + нитроаммофоска 44,48±2,51

5 Разработанная микробная ассоциация + нитроаммофоска 58,71±1,59

фракции менее токсичны, но они значительно ухудшают свойства почв, затрудняя водо- и газообмен. Эти компоненты очень устойчивы и могут сохраняться в земле продолжительное время. Наиболее опасна группа полициклических ароматических углеводородов, являющихся продуктами неполного сгорания ископаемого топлива и органических веществ [18].

По данным фракционного анализа, микроорганизмы ассоциации способны к деструкции разных фракций нефти [9] (бактерии рода Acineto-bacter 1B и 7, Rhodococcus erythropolis S26 минерализуют преимущественно углеводороды гексановой фракции, а штамм Pseudomonas putida F701 — бензольной), что возможно, и обеспечило максимальную убыль нефти в данном эксперименте 59% (табл. 1). Кроме того, присутствие катаболических плазмид во всех штаммах ассоциации также давало преимущество в деградации нефти по сравнению с модельными системами, обработанными другими биопрепаратами.

Ранее было показано, что углеводородокисляющие микроорганизмы, входящие в основу биопрепарата и вносимые в почву, должны обладать высокой жизнеспособностью [19]. Видимо, это требование справедливо для штаммов ассоциации, поскольку их численность находилась примерно на одном уровне в течение всего эксперимента (микрокосм 5).

В результате проведенной агротехнической обработки (рыхление, внесение минеральных удобрений, увлажнение) в искусственных нефтезагрязненных почвенных системах наблюдалось увеличение численности в первую очередь углеводородокисляющих микроорганизмов. Известно, что загрязнение нефтью обуславливает флуктуацию среды, снижает видовое разнообразие микроорганизмов за счет отбора немногочисленных видов с повышенной метаболической активностью [20]. В наших экспериментах максимальный прирост биомассы нефтедеструкторов был достигнут к 28 дню от начала проведения эксперимента. Наблюдалось увеличение общей численности нефтедеструкторов на 1 порядок в модельных системах 3-5 за счет физиологической и метаболической активности интродуцированных штаммов-деструкторов, входящих в состав биопрепаратов и ассоциации, по сравнению с контролем (микрокосм 1). В

целом, проведенные лабораторные испытания продемонстрировали более эффективную утилизацию углеводородов нефти консорциумом (58,71 %) по сравнению с биопрепаратами «МикроБак» (51,23 %) и «Биоойл» (44,48 %) через 42 дня.

Полевые испытания ассоциации и биопрепаратов ЗАО «Биоойл». На основе отобранной микробной ассоциации была приготовлена опытная партия лиофильно высушенного препарата. Эффективность опытного образца ассоциации была продемонстрирована при проведении сравнительных полевых испытаний с биопрепаратами «Биоойл-СН» и «Биоойл-Югра» на территории Ямало-Ненецкого автономного округа на участках Пограничного нефтяного месторождения в период с июня по август 2008 г. В процессе работы были созданы благоприятные условия для роста и развития микроорганизмов за счет внесения минеральных и органических удобрений (мочевина), вспашка и полива. Было установлено, что через 2 месяца после внесения разработанной ассоциации и минеральных удобрений в опытном участке степень очистки грунта от нефти составила 80%, по сравнению с участками обработанными биопрепаратами ЗАО «Биоойл» (50-70%). Следует отметить, что наибольшая скорость убыли нефти была выявлена на всех участках уже через 1 месяц, но при этом, максимальная скорость удаления нефти обнаружена на сайте, обработанном ассоциацией.

Таким образом, особенности композиции отобранной ассоциации дают очевидное преимущество в эффективности деградации углеводородов нефти уже на первых этапах очистки нефтезагрязненных сайтов. Полученные результаты подтверждаются данными микробиологического анализа, демонстрирующими завершение экспоненциальной фазы роста микроорганизмов к концу первого месяца эксперимента. Так, до начала испытаний концентрация аборигенных почвенных нефтедеструкторов была низкой 5,2 Х101 КОЕ/ г почвы, так как нефть негативно влияет на численность почвенных микроорганизмов при содержании нефтяных углеводородов более 10% от массы почвы [21]. Однако, после обработки биопрепаратами «Биоойл-ЮГРА», «Биоойл-СН» и разработанным микробным консорциумом численность углеводородокисляющих микроорганизмов увеличилась на 3 порядка за счет интродуцируемых бактерий, что способствовало интенсификации биодеградации нефти и подтверждено данными по определению остаточной концентрации нефти в почве (рис.

4). Возможно, это связано с адаптацией биогеоценозов к нефтяному загрязнению, что приводит к перестройке ферментативного аппарата бактерий и повышению, таким образом, углеводородокисляющей способности почвы [22].

Химическая токсичность нефти по отношению к биологическим объектам не всегда очевидна [23]. Зачастую восстановление нефтезагрязненных грунтов часто отслеживается по изменению концентрации загрязнителя

S' 100,00

БноонлС'Н ассоцпацпя БпооплЮгра

Рис. 4. Степень деструкции нефти в условиях реального разлива через 1 и 2 месяца (серые столбцы — через 1 месяц, темные столбцы — через 2

месяца)

в почве, убыль которого иногда не отражает снижение его токсичности для живых организмов. Известно, что почва служит резервуаром, где загрязнения могут накапливаться в большом количестве в силу наличия адсорбирующей поверхности. Таким образом, почва может быть сильнозагрязненной, но не токсичной и, наоборот, — слабозагрязненной, но сильнотоксичной для биологических объектов. Поэтому, целесообразно вести контроль за биоремедиацией не только по содержанию остаточных нефтепродуктов, но и по показателям токсичности [24, 25]. В связи с этим в наших полевых экспериментах проводилась визуальная оценка фитотоксичности и фотосъемка почвы через 2 месяца, которая выявила больший прирост биомассы растений на участке, обработанном разработанной ассоциацией по сравнению биопрепаратами «Биоойл-ЮГРА», «Биоойл-СН».

Таким образом, проведенные сравнительные лабораторные испытания отобранной ассоциации плазмидосодержащих штаммов-деструкторов и биопрепаратов «МикроБак» и «Биоойл» в жидкой минеральной среде и в модельных почвенных системах, загрязненных нефтью или нефтепродуктами (дизельное топливо), и в условиях реального разлива нефти выявили наибольшую эффективность деградации нефти разработанным +бактериальным консорциумом.

Список литературы

1. http://www.ecoportal.ru/

2. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах: автореф. дис. д-ра биол. наук. СПб, 1996. 25 с.

3. Нечаева И.А. Биодеградация углеводородов нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами: автореф. дис. канд. биол. наук. Пущино, 2009. 24 с.

4. Margesin R., Shinner F. Cold-adapted organism. Berlin, Heidelberg, New York: Springer, 1999.

5. Cold-adapted microorganisms: adaptation strategies and biotechnological potential. Bitton G The encyclopedia of environmental microbiology / R. Margesin [et al.]. New York: Wiley, 2002. V. 2. P. 871-885.

6. Delille D., Coulon F. Comparative mesocosm study of biostimulation efficiency in two different oil-amended sub-Antarctic soils // Microb. Ecol. 2007. V. 9. P. 1-10.

7. Microbial degradation of pollutants at high salt concentrations / A. Oren [et al.] // Biodegradation. 1992. V. 3. P. 387-398.

8. Margesin R., Schinner F. Bioremediation (natural attenuation and biostimulation) of diesl-oil-contaminated soil in an alpine glacier skiing area // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 7. P. 3127-3133.

9. Oil-Spill Bioremediation, Using A Commercial Biopreparation «MicroBak» And A Consortium Of Plasmid-Bearing Strains «V&O» With Associated Plants / A. Filonov [et al.] // Introduction to Enhanced Oil Recovery (EOR) Processes and Bioremediation of Oil-Contaminated Sites. Rijeka: InTech, 2012. P. 291-318.

10. Препарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов / А.Ю. Алексеев [и др.]. Патент на изобретение РФ №2337069, 02.04.2007.

11. Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения / А.Е. Филонов [и др.]. Патент на изобретение РФ № 2378060, 05.07.2007.

12. Evans C., Herbert D., Tempest D. The continiuous cultivation of microorganisms.

2. Construction of a Chemostat // Methods in Microbiology. 1970. V. 2. № 4. P. 277-327.

13. Sambrook J., Fernley H., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. 480 p.

14. King E., Ward M., Raney D. Two simple media for demonstration of pyocyanin and fluorescin // J. Lab. Clin. Med. 1954. V. 44. № 2. P. 301-307.

15. Вадюнина А.Ф., Корчагина З.А. Методы исследования физических свойств почв. М.: Агропромиздат, 1986. 416 с.

16. Кучурова Л.С., Максакова Е.И. Определение концентрации нефти в почве методом инфракрасной спектрофотометриию: метод. указания. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006. 16 с.

17. Повышение эффективности процесса биоремедиации отработанной отбеливающей земли, загрязненной углеводородами, при совместном использовании комплекса биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» / О.Н. Биккинина [и др.] // Биотехнология. 2006. № 5. C. 57-62.

18. Методические рекомендации по биорекультивации нефтезагрязненных земель / Л.В. Панченко [и др.]. Саратов: Изд-во СГУ, 2003. 28 с.

19. Гузев B.C., Левин С.В., Звягинцев Д.Г. Диагностические признаки различных уровней загрязнения почвы нефтью // Почвоведение. 1998. № 1. С. 72-78.

20. Исмаилов Н.И., Пиковский Ю.И. Современное состояние методов рекультивации нефтезагрязненных земель. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М.: Наука, 1988. С. 222-236.

21. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. Т. 32. № 6. С. 579-585.

22. Киреева Н.А., Водопьянов В.В., Мифтахова A.M. Биологическая активность нефтезагрязненных почв. Уфа.: Гилем. 2001. 376 с.

23. Проблема диагностики и нормирования почв нефтью и нефтепродуктами / Ю.И. Пиковский [и др.] // Почвоведение. 2003. № 9. С. 1132-1140.

24. A comparision of five bioassay to monitor toxity during bioremediation of pentachlorophenol-contaminated soil / K.L. Knoke [et al.] // Water, Air and Soil Pollution. 1999. V. 10. P. 157-169.

25. Monitoring bioremediation in creosote-contaminated soil using chemical analisis and toxity tests / T.M. Phillips [et al.] // J. of industrial microbiology & Biotechnology. 2000. № 24. P. 132-139.

Ветрова Анна Андрияновна (vetrova123@rambler.ru), к.б.н., н.с.,

лаборатория биологии плазмид, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Иванова Анастасия Алексеевна (anastasia_777@rambler.ru), к.б.н., н.с., лаборатория биологии плазмид, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Филонов Андрей Евгеньевич (filonov@ibpm.pushchino.ru), к.б.н., н.с., лаборатория биологии плазмид, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Забелин Владимир Аркадиевич (zabelin53@mail.ru), к.т.н., директор ЗАО «Биоойл».

Нечаева Ирина Александровна (pyrchenkova@rambler.ru), к.б.н., ассистент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Ле Тхи Бич Нгует (anhtrangxanh10@yahoo.com), студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Боронин Александр Михайлович (boronin@ibpm.pushchino.ru), д.б.н., член-корреспондент РАН, зав. лабораторией, лаборатория биологии плазмид, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Comparative efficiency of oil degradation by consortium of plasmid-bearing degrader strains and biopreparations «MikroBak» and « Biooil»

A. A. Vetrova, A. A. Ivanova, A.E. Filonov, V. A. Zabelin, I. A. Nechaeva, Le Thi Bich Nguyet, A. M. Boronin

Abstract. Comparative tests of the developed consortium of plasmid-bearing degrader strains and biopreparations «MikroBak» and «Biooil» in a liquid mineral medium and in model soil systems contaminated with oil or diesel fuel at

temperatures of 4 and 24°C were carried out. The oil degradation efficiency by microbial consortium and biopreparations «Biooil» were compared under real oil spill at Yamal peninsula.

Keywords : biodegradability, microorganisms, plasmid, oil.

Anna Vetrova (vetrova123@rambler.ru), candidate of biological sciences, researcher, laboratory of plasmid biology, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Anastasiya Ivanova (anastasia_777@rambler.ru), candidate of biological sciences, researcher, laboratory of plasmid biology, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Andrey Filonov (filonov@ibpm.pushchino.ru), candidate of biological sciences, researcher, laboratory of plasmid biology, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Vladimir Zabelin (zabelin53@mail.ru), candidate of technical sciences, director of JSC «Biooil».

Nechayeva Irina (pyrchenkova@rambler.ru), candidate of biological sciences, assistant, department of chemistry, Tula State University.

Le Thi Bich Nguyet (anhtrangxanh10@yahoo.com), student, department of chemistry, Tula State University.

Alexander Boronin (boronin@ibpm.pushchino.ru), doctor of biological sciences, corresponding member of RAS, head of laboratory, laboratory of plasmid biology, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Поступила 20.04-2013