СПОСОБ ИЗОТОПНОГО ОБОГАЩЕНИЯ КЛЕТОК E.coli
METHOD FOR ISOTOPE ENRICHMENT OF E.coli CELLS

Способ изотопного обогащения клеток E.coli относится к микробиологии, энзимологии для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов.
2
2
6
4
4
4
Известен способ изотопного обогащения (патент РФ №2399409, опубл. 20.09.10), содержащий стадию осуществления изотопного обмена между водным раствором, содержащим, по меньшей мере, два компонента, каждый из которых представлен формулой HO-HSiF·nSiF (где n≥0), и газом, содержащим SiF, для обогащения стабильного изотопа Si. Возможно, что SiF растворяют в водном растворе до состояния насыщения, а также, что водный раствор имеет азеотропный состав.
Недостатком данного способа является невозможность его использования для обогащения клеток E.coli, т.к. данный раствор не содержит питательных веществ для бактерий и не имеет pH=6.5-7.5, при котором растут и размножаются клетки.
Техническим результатом заявляемого способа изотопного обогащения клеток E.coli является эффективное замещение природного внутриклеточного магния соответствующим изотопом.
24
25
26
4
2
4
2
4
4
Задача решается тем, что в способе изотопного обогащения клеток E.coli, содержащего стадию изотопного обмена между клетками E.coli и водным раствором, отличающийся тем, что изотопный обмен между клетками E.coli и водным раствором осуществляют в течение 10-16 часов при температуре 37°C, причем в водный раствор, обогащенный по одному из изотопов магния Mg, Mg, Mg, входят NHCl, глюкоза, NaHPO, KHPO, NaCl и MgSO, при следующем содержании на 1 л дистиллированной воды:
4
NHCl - 2 г;
4
MgSO - 200-260 мг;
глюкоза (сухая) - 8-10 г;
2
4
NaHPO - 11,9-12,1 г;
2
4
KHPO - 5,95-6,05 г;
NaCl - 0,98-1,02 г.
Способ изотопного обогащения клеток E.coli осуществляли следующим образом.
5
Музейный штамм Escherichia coli K12TG1 предварительно инкубировался в Lb-бульоне (производства Sigma Aldrich Co.), который содержит природный магний, в течение 24 часов при температуре 37°C. Далее трижды производился посев микроорганизмов исходной концентрации 10 KOE/мл в синтетическую питательную среду М9 - водный раствор с разной концентрацией 6 компонентов на 1 л дистиллированной воды.
Первый водный раствор:
4
4
2
4
2
4
NHCl - 2 г; MgSO - 200 мг; глюкоза (сухая) - 8 г; NaHPO - 11,9 г; KHPO - 5,95 г; NaCl - 0,98 г.
Второй водный раствор:
4
4
2
4
2
4
NHCl - 2 г; MgSO - 230 мг; глюкоза (сухая) - 9 г; NaHPO - 12 г; KHPO - 6 г; NaCl - 1 г.
Третий водный раствор:
4
4
2
4
2
4
NHCl - 2 г; MgSO - 260 мг; глюкоза (сухая) - 10 г; NaHPO - 12, 1 г; KHPO - 6,05 г; NaCl - 1,02 г.
4
4
2
4
2
4
4
Первые три вещества, NHCl, глюкоза (сухая) и MgSO, входят в питательный раствор, необходимый для поддержания жизнеспособности клеточной культуры и ее роста, требуемого для накопления изотопно-обогащенной магнием клеточной биомассы. Последние три вещества, NaHPO, KHPO и NaCl, являются буферным раствором, который поддерживает pH=6.5-7.5 среды. Два раствора готовятся отдельно, стерилизуют в автоклаве 25 минут при давлении 1,5-2 атм. После автоклавирования растворы сливаются; pH контролируют до и после стерилизации. Изотопы магния добавляют в среду в виде сульфата магния MgSO, концентрация которого составляет 2.2 мМ/л. Характеристики существующих в природе стабильных изотопов магния и их природное содержание приведены в таблице 1.
Таблица 1
Изотоп
Магнитный момент (µв)
Природное содержание, %
<sup>24</sup>Mg
0
79
<sup>25</sup>Mg
0.85
10
<sup>26</sup>Mg
0
11
24
25
26
Для приготовления сульфатов использовались изотопно-чистые оксиды MgO, MgO и MgO производства ФГУП «Электрохимприбор» с рекордно высоким изотопным обогащением 99.8, 98.8 и 97.7 атомных процентов, соответственно. Паспортные данные оксидов изотопов магния приведены в таблицах 2-3.
Таблица 2
Содержание изотопа магния, ат.%
Изотоп
для <sup>24</sup>MgO
для <sup>26</sup>MgO
для <sup>25</sup>MgO
<sup>24</sup>Mg
99,88±0,02
97,70±0,20
99,37±0,08
<sup>25</sup>Mg
0,07
1,98
0,33
<sup>26</sup>Mg
0,05
0,20
0,30
Таблица 3
Содержание примесей, вес.%
Элемент
для <sup>24</sup>MgO
для <sup>26</sup>MgO
для <sup>25</sup>MgO
K
<0,005
<ПО
0,017
Na
0,002
<ПО
0,004
Ca
<0,005
0,008
0,34
Fe
<0,005
0,019
0,048
Al
0,0011
0,0008
0,031
Si
<0,005
<ПО
<0,005
Cr
-
<ПО
0,0030
Ni
0,0001
<0,0002
<0,0001
Cu
0,0029
0,0021
0,0004
Mn
0,0032
0,0021
0,059
Pb
<ПО*
<ПО
0,0015
Lu
<ПО
<ПО
0,0003
Pt
<ПО
0,0031
0,0002
B
<ПО
0,008
0,0026
Ti
<ПО
<ПО
0,0015
Co
<ПО
<ПО
0,0011
Sr
<ПО
<ПО
0,0002
Ba
<ПО
0,0003
0,0002
La
<ПО
<ПО
0,0003
Eu
<ПО
<ПО
0,0002
Zn
0,0006
0,0005
0,0009
Ru
<ПО
0,0001
<ПО
Cd
<ПО
0,0001
<ПО
P
<0,005
<ПО
<ПО
Контроль соотношения изотопов магния, содержащихся в питательной среде М9, осуществлялся с помощью масс-спектрометрического анализа. Соотношение изотопов магния для сред М9 в % приведено в таблице 4.
Таблица 4
Изотоп
Среда М9 с <sup>24</sup>Mg
Среда М9 с <sup>25</sup>Mg
Среда М9 с <sup>26</sup>Mg
<sup>24</sup>Mg
99,7
1,4
4,5
<sup>25</sup>Mg
0,12
98,1
0,61
<sup>26</sup>Mg
0,13
0,5
94,9
5
8
9
В подготовленные таким образом водные растворы производили посев микроорганизмов с начальной концентрацией 10 КОЕ/мл (колониеобразующих единиц на 1 мл раствора). После этого образцы выдерживали в термостате при температуре 37°C в течение 10, 13 и 16 часов. Контроль накопления клеточной биомассы осуществлялся с помощью стандартных методов измерения оптической плотности суспензии микроорганизмов и измерения колониеобразующих единиц. При достижении бактериями плотности популяции 10-10 КОЕ/мл или 0,6-0.7 отн. ед. оптической плотности клеточная биомасса осаждалась методом центрифугирования на 15 тыс. об. в течение 15 минут. После производился двукратный отмыв клеточной биомассы бактерий E.coli дистиллированной водой с повторным центрифугированием.
Полученная таким образом клеточная биомасса исследовалась на содержание изотопов магния масс-спектральным (PlasmaQuad 2, VG Elemental, Англия) и атомно-эмиссионным методами (ICAP-61, Thermo Jarrell Ash, США). Клеточная биомасса предварительно подвергалась лиофильной сушке и автоклавному разложению. Данные по соотношению изотопов магния в клетках E.coli после цикла культивирования на изотопных средах М9 приведены в таблице 5.
Таблица 5
Изотоп
Исход-ная  куль тура
Выдержка в термоста-те, час.
Клетки, выращенные на среде М9 с <sup>24</sup>Mg
Клетки, выращенные на среде М9 с <sup>25</sup>Mg
Клетки, выращенные на среде М9 с <sup>26</sup>Mg
1-й водный р-р
2-й водный р-р
3-й водный р-р
1-й водный р-р
2-й водный р-р
3-й водный р-р
1-й водный р-р
2-й водный р-р
3-й водный р-р
<sup>24</sup>Mg
87,8
10
90,8
94,5
95,1
5,9
6,3
6,1
12,5
9,8
9,8
13
91,1
99,5
99,4
6,0
6,6
6,5
10,4
10,0
9,9
16
93,5
99,5
99,5
6,2
6,6
6,5
9,7
10,0
10,0
<sup>25</sup>Mg
5,9
10
6,2
3,5
3,4
90,2
91,9
91,3
2,1
3,3
3,7
13
5,8
0,23
0,22
91,9
92,5
92,1
2,0
1,6
2,6
16
4,7
0,24
0,23
92,3
92,5
92,4
2,2
1,6
1,7
<sup>26</sup>Mg
6,3
10
3,0
2,0
1,4
3,9
1,8
2,6
85,4
86,9
86,5
13
3,1
0,23
1,5
2,1
0,87
1,4
87,6
88,4
87,5
16
1,8
0,22
0,22
1,5
0,87
1,1
88,1
88,4
88,3
* Погрешность определения от 1.2% отн. для 95%; до 15% для 0.5%
После 10-16 часов культивирования на магний-изотопных средах, в течение которых происходил изотопный обмен между клетками и водным раствором, бактерии были обогащены по соответствующему изотопу магния до 99,5 по сравнению с исходной бактериальной культурой, выращенной на питательном бульоне Lb, как видно из второго столбца данных таблицы 5. Цикл культивирования бактерий на питательных средах М9, содержащих изотопы магния, приводит к практически полному замещению внутриклеточного магния на конкретный изотоп.
Используемый способ изотопного обогащения микроорганизмов в присутствии магнитного и немагнитных изотопов магния оказался уникальным и применяется впервые. Данный способ может использоваться для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов, который найдет свое применение в различных исследовательских работах в микробиологии, энзимологии. Кроме того, он может использоваться в различных медицинских и биотехнологических приложениях как простой и нетрудоемкий способ получения изотопно-обогащенных биомолекул (АТФ, ДНК и т.д.), клеточных подструктур и самих клеток. Немаловажно, что подобные выделенные молекулы и клеточные подструктуры нерадиоактивны, так как для изотопного обогащения используются только стабильные изотопы. Данный способ может быть модифицирован для других стабильных изотопов жизненно важных химических элементов, а также для других микроорганизмов.
Таким образом, по сравнению с прототипом, заявляемый способ изотопного обогащения клеток E.coli позволяет эффективно проводить до 90% изотопный обмен между природным магнием, изначально содержащимся в клетках, и изотопом магния из водного раствора.