СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ ВО ВЛАГЕ ПЕРЕДНЕЙ КАМЕРЫ ГЛАЗА У ПАЦИЕНТОВ С ПРЕСИНИЛЬНОЙ КАТАРАКТОЙ ГЛАЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПОСТОПЕРАЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ
METHOD FOR DETERMINING THE PRO-INFLAMMATORY AND ANTI-INFLAMMATORY INTERLEUKINS IN THE ANTERIOR CHAMBER OF THE EYE IN THE PATIENTS WITH PRESENILE CATARACT OF THE EYE FOR DIAGNOSING THE POSTOPERATIVE COMPLICATIONS

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и может быть использовано для диагностики особенностей воспалительного процесса в передней камере глаза у пациентов перенесших факоэмульсификацию катаракты.
Интерлейкины - универсальные медиаторы, регулирующие все этапы воспалительного процесса, от момента его индукции до разрешения. В свете современных достижений молекулярной медицины установлена приоритетная роль про- и противовоспалительных интерлейкинов в регуляции местного воспалительного процесса, в том числе и после тканевого повреждения (Шаимова В.А. Роль провоспалительных цитокинов при заболеваниях глаз. Цитокины и воспаление 2005; 2 (4): 13-15.). Доказано, что локальная продукция цитокинов в очаге воспаления превосходит их системный синтез (Симбирцев А.С. Цитокины новая система регуляции защитных реакций организма // Цитокины и воспаление - 2002 - №1- С. 9-16). В воспалительный процесс могут вовлекаться структуры глаза, ограничивающие его переднюю камеру, после хирургического лечения или травмы глаза (Anderson D.H., et al. A role for local inflammation in the formation of drusenin the aging eye. Am. J. Ophthalmol. 2002. №134. P. 411-431). В тоже время показано, дисбаланс в синтезе эпителиальными клетками роговицы глаза противовоспалительных и провоспалительных интерлейкинов, имеет важное значение в патогенезе глаукомы, катаракты и дегенеративных заболевания глаза (Бикбов М.М., Шевчук Н.Е., Файзрахманов P.P., Ярмухаметова А.Л., Гильманшин Т.Р. Локальный уровень цитокинов при различных морфологических вариантах неоваскулярной мембраны у пациентов с влажной формой возрастной макулярной дегенерации. Медицинский альманах №1 (31) март 2014, 66-68; Шпак А.А., Гехт А.Б., Дружкова Т.А., Козлова К.И. Соотношения нейротрофических факторов в слезной жидкости и влаге передней камеры у больных с возрастной катарактой. Офтальмохирургия. 2017; (1): 16-20; Chua J., Vania М., Cheung СМ., Ang М. et al. Expression profile of inflammatory cytokines in aqueous from glaucomatous eyes. Molecular Vision 2012; 18:431-438; Sawada H., Fukuchi Т., Tanaka Т., Abe H. Tumor necrosis factor-alpha concentrations in the aqueous humor of patients with glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci 2010). С этих позиций остается открытым вопрос о локальной продукции цитокинов при не осложненном и осложненном течении постоперационного процесса при хирургическом лечении пресинильной катаракты глаза. С другой стороны доказано, что интерлейкиновый профиль имеет конституциональную вариабельность даже у соматически здоровых людей, что может определять течение и исход хирургической операции по экстракции катаракты методом факоэмульсификации (Бурилов К.Б., Костенев С.В., Трунов А.Н. Оценка содержания провоспалительных цитокинов в слезной жидкости после формирования роговичного клапана механическим микрокератомом и фемтосекундным лазером, Офтальмология, 2017, 6, 66-79). Тем самым, преоперационный уровень провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин 1 бэта (IL-1b) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа), может прогнозировать операционные и постоперационные осложнения.
Исследования системных и топических концентраций провоспалительных и противовоспалительных интерлейкинов для дополнительной диагностики постоперационных осложнений при хирургическом лечении катаракты глаза предлагались неоднократно.
Известна работа P.P. Абдуллина (2004), который изучал уровни IL-1b и TNF-альфа в слезе и сыворотке крови у пациентов перед экстракции травматической катаракты с имплантацией ИОЛ. Автор установил, что исследование этих интерлейкинов позволяет контролировать степень послеоперационной воспалительной реакции. Так по результатам работы было установлено, что развитие травматической катаракты ассоциировано с существенным повышением уровней (IL-1b, TNF-альфа) в слезной жидкости и сыворотке крови. Кроме того, было показано, что хирургическое вмешательство приводит к увеличению продукции провоспалительных цитокинов у пациентов, независимо от сроков травмы и операции, и дальнейшего течения послеоперационного периода (P.P. Абулина 2004). Основным недостатком этого метода является то, что определялись только провоспалительные интерлейкины без учета противовоспалительного потенциала и в группе пациентов с травматической катарактой при которой нарушается гематоофтальмический барьер.
В отношении развития не травматической возрастной катаракты установлена ассоциативная положительная связь с уровнем IL-6 в слезной жидкости (Fodor М,  А,  Е,  J, Bessenyei Е, Kardos L, Berta A. Enhanced release of IL-6 and IL-8 into tears in various anterior segment eye diseases. Ophthalmic Res. 2006; 38 (4): 182-8. Epub 2006 May 5). Кроме того, авторы указывают, что определение уровня данного цитокина может быть использовано в качестве индикатора воспалительных реакций в раннем послеоперационном периоде. Данные исследования были выполнены на когорте пациентов из Франции и результаты этого исследования не могут быть транспорированы на популяции России. Кроме того исследовалась слезная жидкость, которая продуцируется на поверхность роговицы и объем жидкости может иметь выраженные индивидуальные особенности, а значит и концентрация интерлейкинов будет широко варьировать.
Кроме того, исследование топических интерлейкинов в глазе связанно с анализом более пяти аналитов в небольшом объеме биологического материала. Однако с развитием технологий мультиплексного анализа и капиллярного электрофореза эта проблема отходит на второй план (Sharma R.K., Rogojina A.T., Chalam K.V. Multiplex immunoassay analysis of biomarkers in clinically accessible quantities of human aqueous humor. Molecular Vis 2009; 15: 60-69; Tzovolou D.N., Lamari F., Mela E.K., Gartaganis S.P., Karamanos N.K. Capillary electrophoretic analysis of brimonidine in aqueous humor of the eye and blood sera and relation of its levels with intraocular pressure. Biomedical chromatography: BMC 2000; 14 (5): 301-305. doi:10.1002/1099-0801(200008) 14:5<301::AID-BMC4>3.0.CO;2-Q). В тоже время широкого использования этих технологий в практическом здравоохранении Российской Федерации нет из-за отсутствия отечественных приборов и расходных материалов и высокой себестоимости исследования.
Наиболее близкими к заявленному способу по технической сущности и достигаемому результату является методический подход, используемый Fodor М. (Fodor М,  А,  Е,  J, Bessenyei Е, Kardos L, Berta A. Enhanced release of IL-6 and IL-8 into tears in various anterior segment eye diseases. Ophthalmic Res. 2006;38(4): 182-8. Epub 2006 May 5), при котором исследовались провоспалительные цитокины в слезной жидкости при не травматической возрастной катаракте. Недостатки метода представлены выше.
Технический результат изобретения заключается в улучшении эффективности диагностики постоперационных осложнений при хирургическом лечении пресинильной катаракты глаза за счет выявления дисбаланса провоспалительных и противоспалительных интерлейкинов во влаге передней камеры глаза.
Известно, что эпителий роговицы и клетки стромы роговицы глаза постоянно продуцирует интерлейкины прежде всего с супрессорными качествами (интерлейкин 10 - IL1), но при повреждениях структур передней камеры глаза и при физиологическом процессе образования интраокулярных антигенов в этих клетках индуцируется синтез провоспалительных интерлейкинов, таких как интерлейкина 1 - IL-1, интерлейкина 6 - IL-6, интерлейкина 8 - IL-8, фактора некроза опухоли альфа - TNF-a и интерферона гамма - INF-g (Еричев В.П., Петров С.Ю., Суббот A.M., Волжанин А.В., Германова В.Н., Карлова Е.В. Роль цитокинов в патогенезе глазных болезней. Национальный журнал глаукома 2017, Т. 16, №1, стр. 85-99 Russian journal of glaucoma 2017, Vol.16, №1, pp. 85-99), так же неоднократно показана связь между выраженностью воспалительного процесса в передней камере глаза и активизацией провоспалительных цитокинов (Нао X., Yi С., Wang Y., Li J. et al. Identification of intraocular inflammatory mediators in patients with endophthalmitis. Molecular Vision 2016; 22:563-574). Эти данные послужили отправной точкой для нового способа диагностики постоперационных осложнений при хирургическом лечении пресинильной катаракты глаза.
Сущность изобретения
Предлагается способ определения провоспалительных и противовоспалительных интерлейкинов во влаге передней камеры глаза у пациентов с пресинильной катарактой глаза для диагностики постоперационных осложнений включающий сбор анамнеза с учетом наследственных факторов, наличий хронических соматических заболеваний, травм и патологий глаз, инфекционных заболеваний, забор влаги передней камеры глаза и исследование провоспалительных и противовоспалительных интерлейкинов во влаге передней камеры глаза.
Отличием является то, что исследование влаги передней камеры глаза проводится с использованием полимеразной цепной реакции с выделением ДНК, выявление топических цитокинов и цитокинов собственных, приобретенных в результате наследственных заболеваний, определение их соотношения и количественной их оценкой.
Операция по удалению катаракты полостная, происходит со вскрытием оболочки глаза. Операция приводит к выбросу определенного количества топических цитокинов. Но, вследствие наличия наследственных заболеваний во влаге передней камеры глаза содержатся собственные цитокины, как результат наследственных заболеваний. Ранее диагностика проводилась по слезной жидкости, которая омывает глаз. И как показала практика, ранее применяемая диагностика давала значительную погрешность. Слезная жидкость является индикатором воспалительных процессов поверхности глаза, а не внутренних структур.
Ранее ПЦР (полимеразная цепная реакция) не применялась для исследования цитокинов. С использованием ПЦР исследовались возможные антигены, которые могли быть во влаге до операции в результате наследственных, приобретенных заболеваний, хронических инфекций. То есть инфекции, которые предшествовали операции, они уже находились внутри во влаге передней камеры, они служили тем неблагоприятным фоном, который сработал при вскрытии передней камеры при операции.
ДНК - это носитель информации о цитокинах, ее (это кислота) количество измеряется согласно описанию заявки в пг/мл. Повышенное содержание во влаге передней камеры фактора некроза опухоли в пг/мл -являлось маркером воспаления.
Заявленным способом проведено обследование 24 пациента в возрасте 38-55 лет (средний возраст 45,28±0,21 лет), госпитализированных планово в КОКОВ в период с февраля 2016 г по декабрь 2016 г.для хирургического лечения пресенильной катаракты глаза. В данной группе было 14 мужчин и 10 женщин.
Критериями включения в группу было наличие у пациента не осложненной пресенильной катаракты одного глаза; отсутствие острых инфекционных заболеваний, а также хронического гепатита С, гепатита В, сифилиса и ВИЧ-инфекции; возраст пациента от 38 до 55 лет; согласие пациента на участие в научном исследовании.
При поступлении пациентов в стационар проводился сбор анамнеза по разработанной анкете, где учитывались наследственные факторы, наличие хронических соматических заболеваний, травм глаз, ранее перенесенное хирургическое лечение катаракты глаза или другой патологии глаз, а также инфекционные острые и хронические заболевания (гепатиты, туберкулез, сифилис, ВИЧ). При осмотре офтальмолога учитывалось внутриглазное давление и острота зрения.
Всем пациентам во время хирургического лечения катаракты глаза проводился забор влаги передней камеры для исследования в ней концентрации цитокинов и проведения ПЦР диагностики на герпетические вирусы.
В постоперационный период оценивались осложнения со стороны внутренних органов, глаза и пересаженного хрусталика, а также степень прибавки остроты зрения. Для оценки постоперационных осложнений использовали бальную систему (наличие осложнений - 1 балл, отсутствие - О баллов).
Исследование интерлейкинов и во влаге передней камеры. Концентрацию интерлейкина 1 (IL-1b), рецепторного антагониста интерлейкина 1 (IL-IRa), интерлейкина 4 (IL-4), фактора некроза опухоли альфа (TNF-a) и интерферона альфа (INF-a) в крови и во влаге передней камеры глаза исследовали методом иммуноферментного анализа на коммерческих наборах ООО «Цитокин» г. Санкт-Петербурга согласно прилагаемым инструкциям. В отношении концентрации цитокинов в секретах в литературе неоднократно вставал вопрос о трактовке концентраций того или иного аналита. Один из предлагаемых способов выравнивания концентраций связан с пересчетом количества анализируемого вещества на грамм белка, содержащегося в исследуемом секрете. Учитывая возможность различного разведения влаги передней камеры глаза, провели исследования в каждой пробе общего белка колориметрическим методом с использованием красителя пирогаллолового красного. Получили концентрацию общего белка 0,5 г/л в каждой пробе, величина была постоянная. Исходя из того, что соответствующий коэффициент пересчета концентраций цитокинов на грамм белка также получался постоянным, отказались от данного способа выравнивания и в дальнейшем концентрацию цитокинов, полученную в ИФА, анализировали в пг/мл.
ПЦР диагностике на наличие во влаге передней камеры глаза геномов вируса простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ), а также цитомегаловируса (ЦМВ) подверглись все пациенты, у которых во время операции была взята влага передней камеры глаза. Выделение ДНК из влаги передней камеры глаза и собственно ПЦР проводилась на коммерческих наборах НПФ «ДНК-диагностика», г.Москва, согласно прилагаемым инструкциям. Использовались наборы для проведения ПЦР в реальном времени на амплификаторе реального времени ДТ-322 НПФ «ДНК-технологии», г.Москва.
Исследование концентрации цитокинов и ПЦР диагностика выполнены на базе ООО «Современные медицинские технологии» (главный врач - д.м.н., доцент Шабалдина Елена Викторовна).
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета прикладных програм MS Excel 2007, "Statistica for Windows v. 7.0" и «SPSS v. 22.0 for Windows». Для каждого количественного признака проводилось изучению характера распределения. Для этого использовали тесты Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. В работе использовались подходы описательной статистики. При нормальном распределении показателей использована описательная статистика, представленная в виде среднего арифметического значения (М) и стандартной ошибки среднего (m). При отсутствии нормального распределения описательная статистика представлена в виде медианы (Me), а также 25 и 75 квартилей (Q25 - UQ и Q75 - LQ). Достоверность различий нормально распределенных показателей в сравниваемых группах определялась с использованием критерия Стьюдента (t-критерия) при уровне статистической значимости менее 0,05. При сравнении непараметрических показателей использовался критерий Вилкоксона. Для определения значимости различий для попарного сравнения использовался критерий Манна-Уитни. Сила связи между изученными признаками в случае параметрического распределение признаков определялась при помощи коэффициентов корреляции Пирсона, а при непараметрическом распределении - Спирмена.
Достоверность изменения показателей считалась при ошибке менее 5%, что соответствует медико-биологическим исследованиям (Лакин В.М., 1991 Биометрия).
Проведенное исследование показало, что у обследованных пациентов во влаге передней камеры глаза обнаруживались все исследуемые интерлейкины. Наиболее выраженная концентрация была у IL-IRa во влаге передней камеры (100,91±0,48 пг/мл), а также для IL-1b (10,56+0,22 пг/мл) и IL-4 (2,67±0,11 пг/мл). Минимальные концентрации в исследуемой биологической жидкости были у INF-a и у TNF-a. Контрольные показатели интерлейкинов влаги передней камеры глаза взяты из работы Еричева В.П. (Еричев В.П., Петров С.Ю., Суббот A.M., Волжанин А.В., Германова В.Н., Карлова Е.В. Роль цитокинов в патогенезе глазных болезней. Национальный журнал глаукома 2017, Т. 16, №1, стр.85-99 Russian journal of glaucoma 2017, Vol.16, №1, pp.85-99), где для TNF-a указаны интервал нормальных значений 0,8-3,1 пг/мл. Эти нормативные показатели были взяты для разрабатываемого способа диагностики постоперационных осложнений при хирургическом лечении катаракты глаза.
Показана положительная достоверная корреляция между выраженностью постоперационных осложнений (оцененных в баллах) и уровнем TNF-во влаге передней камеры глаза (пг/мл). Надо отметить, что уровень TNF-a во влаге передней камеры глаза имел положительную корреляцию с реакцией оседания эритроцитов (РОЭ) по общему анализу крови. Эти данные указывают на вовлеченность как местного, так и системного воспаления в продукцию TNF-a и его роль в формировании постоперационных осложнений при хирургическом лечении катаракты глаза.
Тем самым в предпочтительном варианте выполнения способа технически не сложная процедура забора влаги передней камеры глаза для исследования, не затратный по времени метод, не требующий дополнительных контрольных серий исследования.
В другом предпочтительном варианте проводится патогенетически обоснованное исследования локальной секреции набора провоспалительных и противоспалительных интерлейкинов, обеспечивающих иммунорегуляторный потенциал в передней камере глаза.
В следующем предпочтительном варианте метод исследования оказывается скрининговым, но достаточно специфичным для диагностики постоперационных осложнений при хирургическом лечении катаракты глаза.
Примеры
Пример 1. Пациент Г., 47 лет (медицинская карта ГБУЗ КО КОКОВ №2317) обратился к врачу офтальмологу с жалобами на снижение зрения правого глаза. При осмотре выявлена пресинильная катаракта левого глаза. Для диагностики возможных постоперационных осложнений был рекомендован забор влаги передней камеры во время проведения хирургического лечения и исследование в ней провоспалительных, противовоспалительных интерлейкинов. Забор влаги в объеме 100 мл был выполнен во время операции, осложнений не получено.
Исследование интерлейкинов влаги передней камеры глаза выявило повышения уровня фактора некроза опухоли альфа до 13,34 пг/мл, что более чем в 2 раза превышало нормальные значения данного аналита. Исследование влаги методом ПЦР на вирусы ЦМВ и ВПГ показало экспрессию вируса ЦМВ.
При осмотре пациетна через 6 дней была выявлена фибринная пленка на исскуственном хрусталике.
На основании полученных результатов выявили, что развитие постоперационного осложнения в виде фибринной пленке на искусственном хрусталики связано с активацией вирус-индуцированного воспаления маркером которого были повышенный уровень во влаге передней камеры глаза TNF-a и экспрессии ЦМВ.
Пример 2. Пациентка С, 52 года (медицинская карта ГБУЗ КО КОКОВ №2317) обратился к врачу офтальмологу с жалобами на снижение зрения При осмотре выявлена пресинильная катаракта правого глаза. Для диагностики возможных постоперационных осложнений был рекомендован забор влаги передней камеры во время проведения хирургического лечения и исследование в ней провоспалительных, противовоспалительных интерлейкинов. Забор влаги в объеме 10 мкл был выполнен во время операции, осложнений не получено.
Исследование интерлейкинов влаги передней камеры глаза выявило нормальный уровень фактора некроза опухоли альфа 2,6 пг/мл. Исследование влаги передней камеры глаза методом ПЦР на вирусы ЦМВ и ВПГ показало отсутствие экспрессии вирусных геномов. При осмотре пациента через 2 недели зрение восстановилось, искусственный хрусталик был прозрачный.
На основании полученных результатов выявили, что отсутствие постоперационного ассоциировано с нормальным уровнем TNF-a во влаге передней камеры глаза подавлением экспрессии ЦМВ.
Сущность отличий изобретения заключается в следующим. В способе определения во влаге передней камеры глаза уровней определенного набора провоспалительных и противовоспалительных интерлейкинов: интерлейкина-1-бэта, интерлейкина-4, рецепторного антагониста интерлейкина-1, интерферона-альфа, фактора некроза опухоли-алъфа - у пациентов с пресинильной катарактой глаза во время проведения хирургического лечения. Увеличении концентрации во влаге передней камеры глаза: фактора некроза опухоли - альфа более чем в 2 раза, по отношению к нормальным значениям, указывает на риск развития постоперационных осложнений.
Апробация способа проведена на базе ГБУЗ КО КОКОВ на 24 пациентах с пресенильной катаракты глаза. Осложнений при заборе влаги передней камеры глаза не получено. Обследование подтвердило значимость повышения TNF-a во влаге передней камеры глаза в диагностике постоперационных осложнений.