СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИТЕЛ К IL-22 ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR USING HUMAN IL-22 ANTIBODIES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Настоящее изобретение относится к антителам, например антителам человека, и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связывают интерлейкин-22 (IL-22), в частности IL-22 человека, и к их применению для регуляции связанных с IL-22 активностей. Указанные антитела, раскрытые в данной заявке, пригодны для диагностирования, предотвращения и/или лечения связанных с IL-22 расстройств, например аутоиммунных расстройств, включая артрит.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Антигены инициируют иммунные ответы и активируют две самые большие популяции лимфоцитов: Т-клетки и В-клетки. После контакта с антигеном Т-клетки пролиферируют и дифференцируются в эффекторные клетки, тогда как В-клетки пролиферируют и дифференцируются в секретирующие антитела плазматические клетки. Указанные эффекторные клетки секретируют и/или отвечают на цитокины, которые представляют собой низкомолекулярные белки (< приблизительно 30 кДа), секретируемые лимфоцитами и клетками других типов.
[0003] Интерлейкин-22 (IL-22) представляет собой цитокин II класса, который проявляет гомологию с последовательностью IL-10. Его экспрессия в Т-клетках активируется IL-9 или конканавалином A (Dumoutier L. и др. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(18):10144-9). Дальнейшие исследования показали, что экспрессия мРНК IL-22 индуцируется in vivo в ответ на введение липополисахарида (ЛПС), и что IL-22 модулирует параметры, свидетельствующие об острофазовом ответе (Dumoutier L. и др. (2000), Pittman D. и др. (2001) Genes and Immunity 2:172) Вдобавок, IL-22 увеличивает экспрессию антимикробных пептидов, связанных с иммунной защитой организма, включая β-дефензин, S100A7, S100A8 и S100A (Wolk и др., Immunity, 21:241-54 (2004), Boniface и др., J Immunol 174.3695-3702 (2005), Liang и др, J. Exp. Med., 203(10)-2271-79 (2006)). В совокупности, эти наблюдения свидетельствуют о том, что IL-22 играет некоторую роль в воспалении (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3)-223-40).
[0004] Считают, что IL-22 связывается с рецепторным комплексом, состоящим из IL-22R и IL-10R2, двух членов семейства цитокиновых рецепторов II класса (CRF2) (Xie М.Н. и др. (2000) J Biol Chem 275(40):31335-9; Kotenko S.V. и др. (2001) J Biol Chem 276(4):2725-32). Обе цепи рецептора IL-22 экспрессируются конститутивно в ряде органов. Линии эпителиальных клеток, полученных из этих органов, отвечают на IL-22 in vitro (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3):223-40). IL-22 индуцирует активацию JAK/STAT3 и ERK путей, а также является интермедиатом других МАФК путей (Dumoutier L. и др. (2000) выше; Xie М.Н. и др. (2000) выше; Dumoutier L и др (2000) J. Immunol 164(4): 1814-9; Kotenko S.V. и др. (2001) J Biol Chem 276(4).2725-32; Lejeune, D. и др. (2002) J Biol Chem 277(37):33676-82).
[0005] Члены семейства CRF2 представляют собой рецепторы для интерферона α/β, интерферона γ (INF γ), фактора свертывания крови VIIa, IL-10 и родственных IL-10 белков IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, так же как и недавно идентифицированных подобных интерферону цитокинов IL-28 и IL-29 (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3):223-40; Kotenko, S.V. и др. (2000) Oncogene 19(21)2557-65; Sheppard, P. и др. (2003) Nature Immunology 4(1):63-8; Kotenko, S.V. и др. (2003) Nature Immunology 4(1).69-77). Вдобавок к этим мембранным рецепторам, семейство CRF2 также включает растворимый белок, IL-22-связывающий белок (IL-22CБ), который специфичен к IL-22 и блокирует его активность (Dumoutier, L. и др. (2001) J Immunol 166(12):7090-5; Kotenko, S.V. и др. (2001) J Immunol 166(12):7096-103; Xu, W. и др. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(17):9511-6; Gruenberg, B.H. и др. (2001) Genes & Immunity 2(6):329-34; Wei C-C и др. (2003) Genes & Immunity 4.204-211). Тогда как IL-22 рецепторный комплекс связывает только IL-22, каждая из его цепей (а именно, IL-22R и IL-10R2) может объединяться с другими членами семейства CRF2 с образованием функциональных рецепторов к другим цитокинам, включая IL-20, IL-24 (IL-22R/IL-20R2), IL-28, IL-29 (INF -λ R1/IL-10R2) и IL-10 (IL - 10R1/IL-10R2) (Dumoutier, L. и др. (2001) J. Immunol 167(7):3545-9; Wang, М. и др. (2002) J Biol Cnem 277(9):7341-7; Parrish-Novak, J. и др. (2002) J Biol Chem 277 (49).47517-23; Kotenko, S.V. и др (1997) EMBO J. 16(19) 5894-903; Spencer, S.D. и др. (1998) J Ехр Med 187(4):571-8).
[0006] Обе цепи рецептора, составленного из членов семейства CRF2, необходимы для передачи сигналов. Одна цепь составного рецептора была исторически описана как цепь, связывающая лиганд (например, INF γ R1), на основании ее высокой аффинности к указанному цитокину. Другая цепь (например, INF γ R2) была описана как вспомогательная или дополнительная цепь и сама по себе проявляет минимальную аффинность к указанному цитокину (Kotenko, S.V. и др. (2000) Oncogene 19(21):2557-65). IL-22R представляет собой высокоаффинную субъединицу рецептора для IL-22, a IL-10R2 затем связывается с IL-22/IL-22R комплексом (Li, J. и др. (2004) Int. Immunopharmacol. 4(5) 673-708; Logsdon, N.J. и др. (2002) J. Interferon Cytokine Res 22(11):1099-1112).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] Настоящая заявка обеспечивает, по меньшей мере в части, связывающие IL-22 агенты, такие как антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с интерлейкином-22 ("IL-22"), в частности IL-22 человека, с высокой аффинностью и специфичностью. Указанные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, согласно настоящему изобретению, также упоминаются в данной заявке как "анти-IL-22 антитела" и " фрагменты антител", соответственно. В одном варианте реализации, указанное антитело или его фрагмент снижает, ингибирует или оказывает антагонистическое воздействие на активность IL-22. Такие антитела можно применять для регуляции иммунных ответов или связанных с IL-22 расстройств путем оказания антагонистического воздействия на активность IL-22. В других вариантах реализации, указанные анти-IL-22 антитела можно применять в целях диагностики или в качестве нацеливающих антител для доставки терапевтического или цитотоксического агента к клеткам, экспрессирующим IL-22. Таким образом, указанные анти-IL-22 антитела согласно настоящему изобретению пригодны для диагностирования, лечения и/или предотвращения связанных с IL-22 расстройств, например аутоиммунных расстройств, например артрита (включая ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, псориатический артрит, артрит, связанный с волчанкой или анкилозирующий спондилит), склеродермии, системной красной волчанки, ВИЧ, синдрома Шегрена, васкулита, множественного склероза, аутоиммунного тиреоидита, дерматита (включая атопический дерматит и экзематозный дерматит), миастении gravis, воспалительного заболевания кишечника (IBD), болезни Крона, колита, сахарного диабета (I типа); воспалительных состояний, например, кожи (например, псориаза), сердечно-сосудистой системы (например, атеросклероза), нервной системы (например, болезни Альцгеймера), печени (например, гепатита), почек (например, нефрита) и поджелудочной железы (например, панкреатита); сердечно-сосудистых заболеваний, например, нарушения обмена холестерина, повреждения бескислородными радикалами, ишемии; расстройств, связанных с заживлением ран; респираторных расстройств, например астмы и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) (например, муковисцидоза); острых воспалительных состояний (например, эндотоксикоза, сепсиса и общего заражения, синдрома токсического шока и инфекционных заболеваний); отторжения трансплантата и аллергии. В одном варианте реализации, указанное связанное с IL-22 расстройство представляет собой артритическое расстройство, например расстройство, выбранное из одного или более: ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, остеоартрита, псориатического артрита, или анкилозирующего спондилита; респираторного расстройства (например, астмы, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ); или воспалительного состояния, например, кожи (например, псориаза), сердечно-сосудистой системы (например, атеросклероза), нервной системы (например, болезни Альцгеймера), печени (например, гепатита), почек (например, нефрита), поджелудочной железы (например, панкреатита) и органов желудочно-кишечного тракта, например колита, болезни Крона и IBD.
12
-1
11
-1
10
-1
9
-1
6
-1
50
50
50
50
50
50
50
50
[0008] В соответствии с этим, в одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к изолированному антителу, которое связывается с IL-22, в частности с IL-22 человека. В некоторых вариантах реализации, указанное анти-IL-22 антитело может иметь по меньшей мере один из следующих характерных признаков: (1) указанное антитело представляет собой моноклональное или моноспецифичное антитело; (2) указанное антитело представляет собой антитело человека; (3) указанное антитело представляет собой полученное in vitro антитело; (4) указанное антитело представляет собой полученное in vivo антитело (например, в трансгенной системе), (5) указанное антитело связывается с IL-22 с константой ассоциации, равной по меньшей мере 10 М; (6) указанное антитело связывается с IL-22 с константой ассоциации, равной по меньшей мере 10 М; (7) указанное антитело связывается с IL-22 с константой ассоциации, равной по меньшей мере 10 М; (8) указанное антитело связывается с IL-22 с константой ассоциации, равной по меньшей мере 10 М; (9) указанное антитело связывается с IL-22 с константой ассоциации, равной по меньшей мере 10 М; (10) указанное антитело связывается с IL-22 с константой диссоциации, равной 500 нМ или менее; (11) оно связывается с IL-22 с константой диссоциации, равной 10 нМ или менее; (12) указанное антитело связывается с IL-22 с константой диссоциации, равной 150 пикоМоль или менее; (13) указанное антитело связывается с IL-22 с константой диссоциации, равной 60 пикоМоль или менее; (14) указанное антитело ингибирует связывание IL-22 с рецептором IL-22R или рецепторным комплексом, состоящим из IL-22R и IL-10R2, со значением IC, равным 10 нМ или менее; (15) указанное антитело блокирует опосредуемую IL-22 пролиферацию клеток BaF3, трансформированных рецептором IL-22, со значением IC, равным 1 нМ или менее, в одном варианте реализации, со значением IC, равным 150 пМ или менее, в другом варианте реализации, со значением IC, равным 100 пМ или менее, в другом варианте реализации, и со значением IC, равным 10 пМ или менее, в другом варианте реализации; и (16) указанное антитело блокирует IL-22-опосредуемую секрецию GROa из клеток НТ29 со значением IC, равным 1 нМ или менее, в одном варианте реализации, со значением IC, равным 150 пикоМоль или менее, в другом варианте реализации, и со значением IC, равным 10 пикоМоль или менее, еще в одном варианте реализации. Опосредуемую IL-22 пролиферацию клеток BaF3 и опосредуемую IL-22 секрецию GROa из клеток НТ29 можно измерить, как описано в приведенных примерах.
[0009] Неограничивающие иллюстративные варианты реализации антител согласно настоящему изобретению упоминаются в данной заявке как "GIL01", "GIL16", "GIL45", "GIL60", "GIL68", "GIL92", "097D09", "062А09", "062G05", "087В03", "367D04", "368D04", "166В06", "166G05", "375G06", "376В10", "354А08", "355В06", "355Е04" и "356А11". Эти антитела могут быть эмбрионизированными или не эмбрионизированными. В другом варианте реализации, указанное антитело выбрано из 356А11, 354А08, 087В03, и 368D04. Антитела согласно настоящему изобретению могут специфично связываться с тем же самым эпитопом IL-22 или со сходным эпитопом (например, с перекрывающимся эпитопом), с которым связывается GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 или 356А11. В других вариантах реализации, указанные антитела специфично связываются с фрагментом IL-22, например, фрагментом из по меньшей мере 10, 20, 50, 75, 100, 150 или 200 аминокислот, близкой к последовательности аминокислот, которая указана как SEQ ID NO:1, или некоторой последовательностью, которая по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична ей. В других вариантах реализации, указанное антитело конкурентно ингибирует связывание по меньшей мере одного из антител GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 или 356А11 с его целевым эпитопом.
H
L
H
L
H
L
[0010] В одном варианте реализации, антитело согласно настоящему изобретению содержит V домен, V домен или их комбинацию, Fv фрагмента антител GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166 В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 или 356А11. Например, указанное антитело содержит V и/или V домен, имеющий последовательность аминокислот, которая указана в Таблицах 1 и 7 (SEQ ID NO:5, 23, 41, 59, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, 203, 221, 239, 257, 275, 293, 311, 329, 347, 365, 383, 401, 419, 437, 455, 473, 491, 509, 527, 545, 563, 581, 599 или 617 для V и SEQ ID NO:6, 24, 42, 60, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186, 204, 222, 240, 258, 276, 294, 312, 330, 348, 366, 384, 402, 420, 438, 456, 474, 492, 510, 528, 546, 564, 582, 600 или 618 для V), или последовательность, по существу идентичную ей (например, последовательность по меньшей мере примерно на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную ей, или которая отличается на не более, чем на 1, 2, 5, 10 или 15 аминокислотных остатков от SEQ ID NO:5, 6, 23, 24, 41, 42, 59, 60, 77, 78, 95, 96, 113, 114, 131, 132, 149, 150, 167, 168, 185, 186, 203, 204, 221, 222, 239, 240, 257, 258, 275, 276, 293, 294, 311, 312, 329, 330, 347, 348, 365, 366, 383, 384, 401, 402, 419, 420, 437, 438, 455, 456, 473, 474, 491, 492, 509, 510, 527, 528, 545, 546, 563, 564, 581, 582, 599, 600, 617 или 618).
H
L
[0011] В другом варианте реализации, антитело согласно настоящему изобретению содержит V домен, V домен, или их комбинацию, указанного Fv фрагмента антитела, выбранного из 356А11, 354А08, 087В03 и 368D04. В этом варианте реализации, указанное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит:
H
L
[0012] V домен, включающий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:167 или 491, и/или V домен, включающий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:168 или 492 (087В03);
H
L
[0013] V домен, включающий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:293 или 545, и/или V домен, имеющий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:294 или 546 (354А08);
H
L
[0014] V домен, включающий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:203 или 617, и/или V домен, включающий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:204 или 618 (368D04); или
H
L
[0015] V домен, включающий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:347 или 599, и/или V домен, включающий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:348 или 600 (356А11).
H
L
H
L
[0016] В другом варианте реализации, указанное антитело содержит V и/или V домен, который кодирует нуклеиновая кислота, имеющая последовательность нуклеотидов, которая указана в Таблицах 1 и 7 (SEQ ID NO: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356, 374, 392, 410, 428, 446, 464, 482, 500, 518, 536, 554, 572, 590, 608 или 626 для V и SEQ ID NO:15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357, 375, 393, 411, 429, 447, 465, 483, 501, 519, 537, 555, 573, 591, 609 или 627 для V), или некоторую последовательность, по существу идентичную ей (например, последовательность по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную ей, или которая отличается на не более чем 1, 2, 3, 6, 15, 30 или 45 нуклеотидов от SEQ ID NO: 14, 15, 32, 33, 50, 51, 68, 69, 86, 87, 104, 105, 122, 123, 140, 141, 158, 159, 176, 177, 194, 195, 212, 213, 230, 231, 248, 249, 266, 267, 284, 285, 302, 303, 320, 321, 338, 339, 356, 357, 374, 375, 392, 393, 410, 411, 428, 429, 446, 447, 464, 465, 482, 483, 500, 501, 518, 519, 536, 537, 554, 555, 572, 573, 590, 591, 608, 609, 626 или 627).
H
L
H
H
[0017] В других вариантах реализации, указанное антитело содержит Fv домен, имеющий последовательность аминокислот, которая указана в Таблицах 1 и 7 (SEQ ID NO:7, 25, 43, 61, 79, 97, 115, 133, 151, 169, 187, 205, 223, 241, 259, 277, 295, 313, 331, 349, 367, 385, 403, 421, 439, 457, 475, 493, 511, 529, 547, 565, 583, 601 или 619), или последовательность, по существу идентичную ей (например, последовательность по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную ей, или которая отличается на не более чем 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30 или 35 аминокислотных остатков от SEQ ID NO:7, 25, 43, 61, 79, 97, 115, 133, 151, 169, 187, 205, 223, 241, 259, 277, 295, 313, 331, 349, 367, 385, 403, 421, 439, 457, 475, 493, 511, 529, 547, 565, 583, 601 или 619). В другом варианте реализации, указанное антитело согласно настоящему изобретению содержит Fv домен антитела, выбранного из 356А11 (SEQ ID NO:349 или 601), 354А08 (SEQ ID NO:295 или 547), 087В03 (SEQ ID NO:169 или 493), и 368D04 (SEQ ID NO:205 или 619). В другом варианте реализации, указанное антитело содержит Fv домен, кодируемый нуклеиновой кислотой, имеющей последовательность нуклеотидов, которая указана в Таблицах 1 и 7 (SEQ ID NO:16, 34, 52, 70, 88, 106, 124, 142, 160, 178, 196, 214, 232, 250, 268, 286, 304, 322, 340, 358, 376, 394, 412, 430, 448, 466, 484, 502, 520, 538, 556, 574, 592, 610 или 628), или последовательность, по существу идентичную ей (например, последовательность по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную ей, или которая отличается на не более чем 1, 2, 3, 6, 15, 30, 45, 60, 90 или 105 нуклеотидов от SEQ ID NO:16, 34, 52, 70, 88, 106, 124, 142, 160, 178, 196, 214, 232, 250, 268, 286, 304, 322, 340, 358, 376, 394, 412, 430, 448, 466, 484, 502, 520, 538, 556, 574, 592, 610 или 628). В других вариантах реализации, указанное антитело содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) этих V и V доменов Например, указанное антитело может содержать один, два или три CDR указанного V домена, имеющего последовательность аминокислот, которая указана как или заключена в указанных последовательностях в Таблицах 1 и 7 (SEQ ID NO:5, 7, 8, 9, 10, 23, 25, 26, 27, 28, 41, 43, 44, 45, 46, 59, 61, 62, 63, 64, 77, 79, 80, 81, 82, 95, 97, 98, 99, 100, 113, 115, 116, 117, 118, 131, 133, 134, 135, 136, 149, 151, 152, 153, 154, 167, 169, 170, 171, 172, 185, 187, 188, 189, 190, 203, 205, 206, 207, 208, 221, 223, 224, 225, 226, 239, 241, 242, 243, 244, 257, 259, 260, 261, 262, 275, 277, 278, 279, 280, 293, 295, 296, 297, 298, 311, 313, 314, 315, 316, 329, 331, 332, 333, 334, 347, 349, 350, 351, 352, 365, 367, 368, 369, 370, 383, 385, 386, 387, 388, 401, 403, 404, 405, 406, 419, 421, 422, 423, 424, 437, 439, 440, 441, 442, 455, 457, 458, 459, 460, 473, 475, 476, 477, 478, 491, 493, 494, 495, 496, 509, 511, 512, 513, 514, 527, 529, 530, 531, 532, 545, 547, 548, 549, 550, 563, 565, 566, 567, 568, 581, 583, 584, 585, 586, 599, 601, 602, 603, 604, 617, 619, 620, 621 или 622), или последовательность, по существу гомологичную ей (например, последовательность, по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную ей). В другом варианте реализации, антитело согласно настоящему изобретению соедржит один, два или три CDR указанного V домена антитела, выбранного из 356А11, 354А08, 087В03 и 368D04. В этом варианте реализации, указанное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую:
[0018] a) SEQ ID NO:170 или 494; b) SEQ ID NO:171 или 495; и/или c) SEQ ID NO:172 или 496 (087В03);
[0019] a) SEQ ID NO:296 или 548; b) SEQ ID NO:297 или 549; и/или с) SEQ ID NO:298 или 550 (354А08),
[0020] a) SEQ ID NO:206 или 620, b) SEQ ID NO:207 или 621; и/или с) SEQ ID NO:208 или 622 (368D04); или
[0021] a) SEQ ID NO:350 или 602; b) SEQ ID NO:351 или 603; и/или с) SEQ ID NO:352 или 604 (356А11).
L
L
[0022] В другом варианте реализации, указанное антитело может включать один, два или три CDR указанного V домена, имеющего последовательность аминокислот, которая соответствует или соедржится в последовательностях, указанных в Таблицах 1 и 7 (SEQ ID NO:6, 7, 11, 12, 13, 24, 25, 29, 30, 31, 42, 43, 47, 48, 49, 60, 61, 65, 66, 67, 78, 79, 83, 84, 85, 96, 97, 101, 102, 103, 114, 115, 119, 120, 121, 132, 133, 137, 138, 139, 150, 151, 155, 156, 157, 168, 169, 173, 174, 175, 186, 187, 191, 192, 193, 204, 205, 209, 210, 211, 222, 223, 227, 228, 229, 240, 241, 245, 246, 247, 258, 259, 263, 264, 265, 276, 277, 281, 282, 283, 294, 295, 299, 300, 301, 312, 313, 317, 318, 319, 330, 331, 335, 336, 337, 348, 349, 353, 354, 355, 366, 367, 371, 372, 373, 384, 385, 389, 390, 391, 402, 403, 407, 408, 409, 420, 421, 425, 426, 427, 438, 439, 443, 444, 445, 456, 457, 461, 462, 463, 474, 475, 479, 480, 481, 492, 493, 497, 498, 499, 510, 511, 515, 516, 517, 528, 529, 533, 534, 535, 546, 547, 551, 552, 553, 564, 565, 569, 570, 571, 582, 583, 587, 588, 589, 600, 601, 605, 606, 607, 618, 619, 623, 624 или 625), или последовательность, по существу идентичную ей (например, последовательность, по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную ей). В другом варианте реализации, антитело согласно настоящему изобретению включает один, два или три CDR указанного V домена антитела, выбранного из 356А11, 354А08, 087В03 и 368D04. В этом варианте реализации, указанное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельную область легкой цепи, включающую:
[0023] a) SEQ ID NO:173 или 497; b) SEQ ID NO:174 или 498; и/или с) SEQ ID NO:175 или 499 (087В03);
[0024] a) SEQ ID NO:299 или 551; b) SEQ ID NO:300 или 552; и/или с) SEQ ID NO:301 или 553 (354А08);
[0025] a) SEQ ID NO:209 или 623; b) SEQ ID NO:210 или 624; и/или с) SEQ ID NO:211 или 625 (368D04); или
[0026] a) SEQ ID NO:353 или 605; b) SEQ ID NO:354 или 606; и/или с) SEQ ID NO:355 или 607 (356А11).
H
[0027] В дополнительном варианте реализации, указанное антитело содержит H3 фрагмент указанного V домена антител GIL01, G1L16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166 В06, 166G05, 375G06, 376 В10, 354А08, 355 В06, 355Е04 или 356А11, например, Н3 фрагмент, имеющий последовательность аминокислот, которая указана в Таблицах 1 и 7 (SEQ ID NO:10, 28, 46, 64, 82, 100, 118, 136, 154, 172, 190, 208, 226, 244, 262, 280, 298, 316, 334, 352, 370, 388, 406, 424, 442, 460, 478, 496, 514, 532, 550, 568, 586, 604 или 622), или последовательность, по существу идентичную ей (например, последовательность, по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную ей).
2
1
2
3
4
1
2
1κ
1λ
[0028] Антитело согласно настоящему изобретению может быть полноразмерным (например, включать по меньшей мере одну целую тяжелую цепь и по меньшей мере одну целую легкую цепь) или может включать только антигенсвязывающий фрагмент (например, Fab, F(ab'), вариабельный фрагмент антитела - Fv, одноцепочечный Fv фрагмент, Fd фрагмент, или dAb фрагмент (фрагмент антитела с одним доменом)). Указанное антитело может включать константную область, или ее часть, выбранную из любого из генов константной области: каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю. Например, можно использовать константные области тяжелой цепи различных указанных изотипов, включая: IgG, IgG, IgG, lgG, IgM, IgA, lgA, IgD и IgE. Указанную константную область легкой цепи можно выбрать из цепей каппа или лямбда. Указанное антитело может быть IgG, или оно может также быть IgG или IgG.
[0029] Указанное анти-IL-22 антитело, описанное в данной заявке, может быть модифицировано или связано с другой функциональной молекулой (такой, как другой пептид или белок (например, Fab фрагмент)). Например, антитело согласно настоящему изобретению может быть функционально связано (например, путем химического связывания, генетического слияния, нековалентной связью или другим образом) с по меньшей мере одним другим молекулярной структурой, таким как другое антитело (например, биспецифичное или мультиспецифичное антитело), токсин, радиоактивный изотоп, цитотоксический или цитостатический агент, в числе прочих.
[0030] В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере одно анти-IL-22 антитело и фармацевтически приемлемый носитель. Указанная фармацевтическая композиция может дополнительно включать комбинацию из по меньшей мере одного анти-IL-22 антитела и по меньшей мере одного терапевтического агента (например, ингибитора цитокинов и фактора роста, иммуносупрессанта, противовоспалительного агента, ингибитора метаболизма, ингибитора ферментов, цитотоксического агента, цитостатического агента, или их комбинации, как описано более детально в данной заявке). Комбинации указанного анти-IL-22 антитела и терапевтического агента также входят в объем настоящего изобретения. Указанные композиции и комбинации согласно настоящему изобретению можно применять для регуляции связанных с IL-22 воспалительных состояний, например, путем модулирования передачи сигналов IL-22 через его рецепторы, расположенные на эпителиальных клетках ряда тканей, включая, но не ограничиваясь перечисленными, клетки поджелудочной железы, кожи, легкого, кишки, печени, почек, слюнной железы и эндотелия сосудов, вдобавок к потенциально активируемым и находящимся в ткани клеткам иммунной системы (иммуноцитам).
[0031] В другом своем аспекте, настоящее изобретение характеризует способ лечения субъекта со связанным с IL-22 расстройством. Указанный способ включает введение субъекту анти-IL-22 антитела в количестве, достаточном для ингибирования по меньшей мере одной IL-22 активности иммуноцитов, в результате чего происходит лечение или предотвращение указанного связанного с IL-22 расстройства
[0032] Указанное анти-IL-22 антитело можно вводить субъекту само по себе или в комбинации с другими терапевтическими агентами, как описано в данной заявке. Указанным субъектом может быть млекопитающее, например, человек. Например, указанный способ можно применять для лечения субъекта со связанным с IL-22 расстройством, таким как аутоиммунные расстройства, например, артрит (включая ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, псориатический артрит, артрит, связанный с волчанкой или анкилозирующий спондилит), склеродермия, системная красная волчанка, ВИЧ, синдром Шегрена, васкулит, множественный склероз, аутоиммунный тиреоидит, дерматит (включая атопический дерматит и экзематозный дерматит), миастения gravis, воспалительное заболевание кишечника (IBD), болезнь Крона, колит, сахарный диабет (I типа); воспалительные состояния, например, кожи (например, псориаз), сердечно-сосудистой системы (например, атеросклероз), нервной системы (например, болезнь Альцгеймера), печени (например, гепатит), почек (например, нефрит) и поджелудочной железы (например, панкреатит); сердечно-сосудистые заболевания, например, нарушение обмена холестерина, повреждение бескислородными радикалами, ишемия; расстройства, связанные с заживлением ран; респираторные расстройства, например, астма и ХОБЛ (например, муковисцидоз), острые воспалительные состояния (например, эндотоксикоз, сепсис и общее заражение, синдром токсического шока и инфекционное заболевание), отторжение трансплантата и аллергия. В одном варианте реализации настоящего изобретения, указанное связанное с IL-22 расстройство представляет собой артритическое расстройство, например расстройство, выбранное из одного или более расстройств: ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, псориатический артрит или анкилозирующий спондилит; респираторное расстройство (например, астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ); или воспалительное состояние, например, кожи (например, псориаз), сердечно-сосудистой системы (например, атеросклероз), нервной системы (например, болезнь Альцгеймера), печени (например, гепатит), почек (например, нефрит), поджелудочной железы (например, панкреатит) и органов желудочно-кишечного тракта, например колит, болезнь Крона и IBD.
[0033] В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу ослабления, ингибирования или снижения острофазового ответа у субъекта. Указанный способ включает введение субъекту агента, связывающего IL-22, например, антагониста IL-22 (например, анти-IL-22 антитела или его фрагмента, как описано в данной заявке), в количестве, достаточном для ослабления, ингибирования или снижения указанного острофазового ответа у субъекта. В одном варианте реализации, указанный субъект представляет собой млекопитающее, например, человека, страдающего от связанного с IL-22 расстройства, включая, например, респираторные расстройства, воспалительные расстройства и аутоиммунные расстройства. В одном варианте реализации, указанный агент, связывающий IL-22, вводят локально, например, местно, подкожно или другими путями введения, без введения в системное кровообращение.
[0034] В другом аспекте, агент, связывающий IL-22, можно применять для изменения типа иммунного ответа и/или повышения эффективности вакцинного препарата, применяемого для иммунизации субъекта. Например, анти-IL-22 антитело согласно настоящему изобретению можно вводить перед, во время и/или после иммунизации для повышения эффективности вакцины. В одном варианте реализации, указанный вакцинный препарат содержит один или более антагонист IL-22 и антиген, а именно, иммуноген, включая, например, вирусный, бактериальный или опухолевый антигены. В другом варианте реализации, указанный антагонист IL-22 и указанный иммуноген вводят раздельно, например, с интервалом в один час, три часа, один день или два дня друг от друга.
[0035] В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения присутствия IL-22 в образце in vitro. Образцы могут включать биологические образцы, такие как сыворотка, плазма, ткань и образец биопсии. Способ согласно настоящему изобретению можно применять для диагностирования расстройства, такого как связанное с IL-22 расстройство, как описано в данной заявке. Указанный способ включает: (1) приведение в контакт указанного образца или контрольного образца с анти-IL-22 антителом, и (2) обнаружение образования комплекса между указанным анти-IL-22 антителом и указанным образцом или контрольным образцом, согласно которому статистически значимое изменение в образовании указанного комплекса в указанном образце, по сравнению с контрольным образцом, указывает на присутствие IL-22 в образце.
[0036] В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения присутствия IL-22 in vivo (например, in vivo визуализация в субъекте). Указанный способ можно применять при диагностировании расстройства, например, связанного с IL-22 расстройства, как описано в данной заявке. Указанный способ включает: (1) введение анти-IL-22 антитела субъекту или контрольному субъекту в условиях, при которых возможно связывание указанного антитела с IL-22, и (2) обнаружение образования комплекса между указанным антителом и IL-22, согласно которому статистически значимое изменение в образовании указанного комплекса у субъекта по сравнению с контролем, например контрольным субъектом, указывает на присутствие IL-22.
[0037] Указанное антитело можно непосредственно или опосредованно пометить детектируемым веществом, чтобы облегчить обнаружение связавшегося или несвязавшегося антитела. Подходящие детектируемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флюоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы.
[0038] В другом своем аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ доставки агента или придания специфичности агенту (нацеливания агента), например, терапевтического или цитотоксического агента, к клеткам, экспрессирующим IL-22, in vivo Указанный способ включает введение анти-IL-22 антител субъекту при условиях, в которых возможно связывание указанного антитела с IL-22. Указанное антитело может быть связано со вторым терапевтическим веществом, таким как токсин.
H
L
[0039] Настоящее описание раскрывает последовательности нуклеиновых кислот V и V доменов антител GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 и 356А11. Также описаны последовательности нуклеиновых кислот, которые включают по меньшей мере один CDR из GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376 В10, 354А08, 355В06, 355Е04 и 356А11. Настоящее описание также обеспечивает векторы и клетки-хозяева, которые содержат такие нуклеиновые кислоты.
H
L
H
L
[0040] Настоящее описание дополнительно раскрывает способы получения новых V и V доменов и функциональных антител, которые содержат целиком или частично такие домены, полученные из V или V доменов антител GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 или 356А11.
[0041] Дополнительные аспекты настоящего описания будут изложены частично в опсании, и частично будут очевидно следовать из настоящего описания, или могут быть изучены при осуществлении настоящего изобретения. Настоящее изобретение изложено и детально определено в формуле изобретения, и настоящее описание не должно быть истолковано как ограничивающее объем формулы изобретения. Нижеследущее подробное описание включает примеры различных вариантов реализации настоящего изобретения, которые не являются ограничительными для настоящего изобретения, определенного формулой изобретения. Сопутствующие фигуры составляют часть этого описания изобретения и, вместе с описанием, служат исключительно для иллюстрации вариантов реализации и не ограничивают настоящее изобретение.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0042] Фигура 1. Эффективность родительских анти-IL-22 scFv клонов при тестировании с рецепторным комплексом IL-22: связывание био.IL-22 с рецепторным комплексом IL-22 в конкурентном анализе DELFIA (диссоционно-усиленный лантанидный флюороиммунный анализ).
[0043] Фигура 2. Профили scFv клонов с наилучшими характеристиками при тестировании с IL-22 рецепторным комплексом: связывание био.IL-22 с IL-22 рецепторным комплексом в конкурентном анализе DELFIA. (А) Образец, полученный из GIL 1. (В) полученный из GIL 16. (С) полученный из GIL 16, GIL 60 и GIL 68. (D) полученный из GIL 60. (Е) полученный из GIL 68. (F) полученный из GIL 68. (G) полученный из GIL 92.
[0044] Фигура 3. Эффективность IgG при тестировании с GROa в клеточной системе. Оптимизированные GIL-IgG при тестировании на GROa с IL-22 человека. (А) Эмбрионизированные IgG. (В) Неэмбрионизированные IgG.
[0045] Фигура 4. Перекрестная межвидовая реактивность IL-22 антител при твердофазном иммуноферментном анализе ELISA. Оптимизированные GIL-IgG специфично связываются с IL-22. (А) Эмбрионизированные IgG. (В) Не эмбрионизированные IgG.
[0046] Фигура 5. Последовательности аминокислот и нуклеотидов IL-22 человека. Последовательность нуклеотидов IL-22 человека представлена как SEQ ID NO:2 и включает поли-(А) фрагмент. Указанная последовательность нуклеотидов содержит открытую рамку считывания и последовательность аминокислот полноразмерного белка IL-22, соответствующего вышеупомянутой последовательности нуклеотидов, обозначенной как SEQ ID NO:1. Указанная последовательность аминокислот зрелого IL-22 соотвествует примерно аминокислотам 34-179 последовательности SEQ ID NO:1.
[0047] Фигура 6. Последовательности аминокислот и нуклеотидов IL-22 мыши.
H
L
[0048] Фигура 7. Последовательности аминокислот и нуклеотидов неэмбрионизированных антител GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 и 356А11, включающих V и V домены, и CDR (H1, H2, H3, L1, L2 и L3).
H
L
[0049] Фигура 8. Последовательности аминокислот и нуклеотидов эмбрионизированных антител GIL01, G1L16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062А09, 087В03, 166В06, 166G05, 354А08, 355В06, 355Е04, 356А11 и 368D04, включающих V и V домены, и CDR (Н1, Н2, Н3, L1, L2 и L3).
[0050] Фигура 9. Последовательности аминокислот и нуклеотидов scFv для неэмбрионизированных антител GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 и 356А11, с подчеркнутыми CDR (Н1, Н2, Н3, L1, L2 и L3).
1
[0051] Фигура 10. Последовательности аминокислот и нуклеотидов scFv для эмбрионизированных антител GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062А09, 087В03, 166В06, 166G05, 354А08, 355В06, 355Е04, 356А11 и 368D04 с подчеркнутыми CDR (Hl H2, Н3, L1, L2 и L3).
[0052] Фигуры 11А-В. Время полужизни in vivo (A) 356A11 и (В) 368D04.
[0053] Фигуры 12А-В. Средние показатели (баллы) тяжести болезни (А) или показатели тяжести болезни (В) при различных дозах 356А11, вводимых через день в модельных мышей КИА (CIA).
-1
[0054] Фигуры 13A-D. Средние показатели тяжести болезни для 8 мг·кг356А11, вводимого через день в модельных мышей КИА при многократных испытаниях.
-1
[0055] Фигуры 14А-В. Средние показатели тяжести болезни для 8 мг·кг356A11, вводимого один или два раза в неделю в модельных мышей КИА.
-1
[0056] Фигуры 15А-В. Показатели тяжести болезни для двух отдельных испытаний для 8 мг·кг 356А11, вводимого через день, два раза в неделю или один раз в неделю в модельных мышей КИА.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
[0057] Фигуры 16A-F. Гистологическая оценка (лапа) прогрессирования болезни в нескольких исследованиях, в которых использовали мышей, которым вводили (А) 8 мг·кг 356А11 через день или (В) 16 мг·кг 356А11 через день, (С) 8 мг·кг 356A11 через день, один раз в неделю или два раза в неделю, (D) 8 мг·кг 356A11 один раз в неделю, (Е) 8 мг·кг 356A11 два раза в неделю или (F) 8 мг·кг 356A11 через день, на модельных мышах КИА.
[0058] Фигура 17. Обнаружение и стабилизация in vivo IL-22 (нг/мл) в мышах, страдающих артритом, которых лечили 356А11.
[0059] Фигура 18. Обнаружение in vivo IL-22 (нг/мл) в мышах, страдающих артритом, которым вводили изотипическое контрольное антитело.
[0060] Фигура 19. Повышенная регуляция белков IL-22 и IL-22R в псориатических поражениях человека
[0061] Фигура 20. Оценка заболевания у мышей, которых лечили 16 мг/кг 356A11, 368D04, или контрольного антитела, в модели псориаза на мышах. (А) Клиническое прогрессирование болезни через 10 недель. (В) Клинический показатель на 10 неделе.
[0062] Фигура 21. Обнаружение in vivo уровней IL-22 в сыворотке (пг/мл) у мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11, 368D04 или контрольного антитела.
[0063] Фигура 22. Обнаружение in vivo уровней в сыворотке (A) IL-17A, (В) IL-17F, (С) IL-17A/F и (D) IL-6 у мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11, 368D04 или контрольного антитела.
[0064] Фигура 23. Анализ методом проточной цитометрии объединенных CD4+ клеток лимфатического узла, которых обрабатывали форболмиристатацетатом (РМА) и иономицином, после выделения из мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11, 368D04, или контрольного антитела, и окрашенных на IL- 22 и IL-17A; IL-22 и IL-17F; IL-17A и IL-17F; IL-22 и TNFα; IL-22 и интерферон-γ (IFNγ) или TNFα и интерферон-γ.
[0065] Фигура 24. Экспрессия генов цитокинов в ушах мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11, 368D04 или контрольного антитела. (А) IL-22. (В) IL-17. (С) интерферон-γ. (D) IL-17F. (Е) IL-6.
[0066] Фигура 25. Обнаружение цитокинов в супернатантах объединенных клеток лимфатического узла, выделенных из мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11, 368D04 или контрольного антитела, и стимулированных ех vivo в присутствии и без связанного с подложкой анти-CD3 антитела. (А) IL-22. (В) IL-6. (С) интерферон-γ. (D) IL-17F. (Е) IL-17A/F. (F) IL-17A.
[0067] Фигура 26. Экспрессия генов цитокинов в объединенных клетках лимфатического узла, выделенных из мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11, 368D04 или контрольного антитела, и стимулированных ех vivo связанными с подложкой анти-CD3 антителами. (А) IL-22. (В) IL-6. (С) интерферон-γ. (D) IL-17F. (Е) IL-17A.
[0068] Фигура 27. Оценка заболевания у мышей, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела, в модели псориаза на мышах. Мышей обрабатывали IL-12 и липополисахаридом (LPS) в первый день после адоптивного переноса Т клеток. (А) Клиническое прогрессирование болезни через 10 недель. (В) Клинический показатель на 10 неделе.
[0069] Фигура 28. Обнаружение in vivo уровней IL-22 в сыворотке (нг/мл) у мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела. Мышей обрабатывали IL-12 и LPS в первый день после адоптивного переноса Т-клеток.
[0070] Фигура 29. Обнаружение in vivo уровней в сыворотке (A) IL-17A, (В) IL-17F, (С) IL-17A/F и (D) IL-6 у мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела. Мышей обрабатывали IL-12 и LPS в первый день после адоптивного переноса Т-клеток.
[0071] Фигура 30. Экспрессия генов цитокинов в ушах мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела. (A) IL-17. (В) IL-22. (С) IL-17F. (D) интерферон-γ. (Е) IL-6. Мышей обрабатывали IL-12 и LPS в первый день после адоптивного переноса Т-клеток.
[0072] Фигура 31. Анализ методом проточной цитометрии объединенных CD4+ клеток лимфатического узла, которые обрабатывали РМА и иономицином после выделения из мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела, и окрашенных на IL-22 и IL-17A; IL-22 и IL-17F; IL-17A и IL-17F; IL-22 и TNFα; IL-22 и интерферон-γ или TNFα и интерферон-γ. Мышей обрабатывали IL-12 и LPS в первый день после адоптивного переноса Т-клеток.
[0073] Фигура 32. Обнаружение цитокинов в супернатантах объединенных клеток лимфатического узла, выделенных из мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела, и стимулированных ех vivo в присутствии или без связанных с подложкой анти-СD3 антител. (А) IL-22. (В) IL-6. (С) интерферон-γ. (D) IL-17A. (Е) IL-17F. Мышей обрабатывали IL-12 и LPS в первый день после адоптивного переноса Т-клеток.
[0074] Фигура 33. Экспрессия генов цитокинов в объединенных клетках лимфатического узла, выделенных из мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела, и стимулированных ех vivo связанными с подложкой анти-CD3 антителами. (А) IL-22. (В) IL-6. (С) интерферон-γ. (D) IL-17A. (Е) IL-17F. Мышей обрабатывали IL-12 и LPS в первый день после адоптивного переноса Т-клеток.
[0075] Фигура 34. Оценка заболевания мышей, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела в модели псориаза на мышах. (А) Клиническое прогрессирование болезни через 10 недель. (В) Клинический показатель на 10-й неделе.
[0076] Фигура 35. Обнаружение in vivo уровней IL-22 в сыворотке (нг/мл) у мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела.
[0077] Фигура 36. Экспрессия генов цитокинов в ушах мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела. (А) IL-22, (В) IL-17, (С) IL-17F, (D) IL-1 F6 (6 член семейства IL-1), (Е) IL-6, (F) интерферон-γ, (G) IL-22 СБ (IL-22-связывающий белок) или (Н) IL-22R1 (субъединица рецептора IL-22).
[0078] Фигура 37. Оценка заболевания мышей, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела, в модели псориаза на мышах. (А) Клиническое прогрессирование болезни через 10 недель. (В) Клинический показатель на 10-й неделе. Мышей обрабатывали IL-12 и LPS в первый день после адоптивного переноса Т-клеток
[0079] Фигура 38. Обнаружение in vivo уровней IL-22 в сыворотке (нг/мл) у мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела. Мышей обрабатывали IL-12 и LPS в первый день после адоптивного переноса Т-клеток.
[0080] Фигура 39. Обнаружение in vivo уровней в сыворотке (A) IL-17A и (В) IL-6 у мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела (без одновременного введения IL-12 и LPS) и (С) IL-17A и (D) IL-6 у мышей, страдающих псориазом, которых лечили 16 мг/кг 356А11 или контрольного антитела (IL-12 и LPS вводят одновременно в первый день после адоптивного переноса Т-клеток).
-1
[0081] Фигура 40. (А) Средний показатель тяжести болезни или (В) показатель тяжести болезни на 30 день для модельных мышей КИА, которым вводили через день 16 мг·кг антитела 356А11.
-1
[0082] Фигура 41. Средний показатель тяжести болезни для модельных мышей КИА, которым вводили через день, один раз в неделю или два раза в неделю 8 мг·кг антитела 356А11.
-1
-1
-1
[0083] Фигура 42. Гистологическая оценка (лапа) прогрессирования болезни у мышей, которых лечили (А) 8 мг·кг 356А11 один раз в неделю, (В) 8 мг·кг 356А11 два раза в неделю или (С) 8 мг·кг 356А11 через день.
-1
[0084] Фигура 43. Гистологическая оценка (средний показатель тяжести поражения лапы) прогрессирования болезни у мышей, которых лечили 8 мг·кг356А11 один раз в неделю, два раза в неделю или через день.
-1
[0085] Фигуры 44А-В. Средние показатели тяжести болезни по результатам двух отдельных исследований на модельных мышах КИА, которым вводили 8 мг·кг 356А11 один раз в неделю.
-1
[0086] Фигуры 45А-В. Гистологическая оценка (лапа) прогрессирования болезни по результатам двух отдельных исследований на модельных мышах КИА, которых лечили 8 мг·кг 356А11 один раз в неделю.
-1
[0087] Фигуры 46А-С.Средние показатели тяжести болезни по результатам трех отдельных исследований на модельных мышах КИА, которым вводили 8 мг·кг 368D04 один раз в неделю.
-1
[0088] Фигуры 47А-С. Гистологическая оценка (лапа) прогрессирования болезни по результатам трех отдельных исследований на модельных мышах КИА, которых лечили 8 мг·кг 368D04 один раз в неделю.
[0089] Фигура 48. Уровни в сыворотке (A) IL-6 (пг/мл) и (В) CXCL1 (нг/мл) у мышей, которых лечили 356А11 (8 мг/кг один раз в неделю), на модельных мышах КИА.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. Определения
[0090] Для лучшего понимания настоящего изобретения сначала представлены определения некоторых терминов. Дополнительные определения приведены в подробном описании изобретения.
2
[0091] Термин "антитело" относится к иммуноглобулину или его фрагменту и охватывает любой полипептид, который содержит антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий домен. Указанный термин включает, но не ограничивается, поликлональные, моноклональные, моноспецифичные, полиспецифичные, неспецифичные, гуманизированные, человеческие, одноцепочечные, химерные, синтетические, рекомбинантные, гибридные, мутированные, привитые и полученные in vitro антитела. Если нет предшествующего слова "интактное", указанный термин "антитело" охватывает фрагменты антител, такие как Fab, F(ab'), Fv, scFv, Fd, dAb, и другие фрагменты антител, у которых сохранилась функция связывания антигена. Обычно, такие фрагменты содержат антигенсвязывающий домен.
L
H
H
L
H
L
H
2
H
H
L
H
H
L
H
L
H
[0092] Указанные термины "антигенсвязывающий домен" и "антигенсвязывающий фрагмент" относятся к части молекулы антитела, которая содержит аминокислоты, отвечающие за специфичное связывание между антителом и антигеном. Часть антигена, которая специфично распознается и связывается указанным антителом, упоминается как "эпитоп". Антигенсвязывающий домен может включать вариабельную область легкой цепи (V) антитела и вариабельную область тяжелой цепи (V) антитела; тем не менее, он не обязательно включает обе. Fd фрагменты, например, имеют два V участка и обычно частично сохраняют функцию связывания антигена интактного антигенсвязывающего домена. Примеры антигенсвязывающих фрагментов антитела включают (1) Fab фрагмент, моновалентный фрагмент, имеющий V, V, C и C1 домены; (2) F(ab') фрагмент, бивалентный фрагмент, имеющий два Fab фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (3) Fd фрагмент, имеющий два V и C1 домена; (4) Fv фрагмент, имеющий V и V домены одного плеча антитела, (5) dAb фрагмент (Ward и др., (1989) Nature 341:544-546), который имеет V домен; (6) изолированный гипервариабельный участок (CDR); и (7) одноцепочечный Fv (scFv). Хотя два домена указанного Fv фрагмента, V и V, кодируются отдельными генами, их можно соединить, примененяя рекомбинантные способы, с помощью синтетического линкера, который позволяет им образовать единую белковую цепь, в которой V и V области в паре образуют моновалентные молекулы (известные как одноцепочечное Fv (scFv); см. например, Bird и др. (1988) Science 242:423-426; и Huston и др. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Эти фрагменты антител получают, применяя обычные методики, известные специалистам в данной области, и функционирование указанных фрагментов оценивают тем же образом, что и интактных антител.
[0093] Термин "эффективное количество" относится к дозировке или количеству, которое является достаточным для регуляции активности IL-22, чтобы улучшить клинические симптомы или достигнуть желаемого биологического результата, например, ослабления активности Т-клеток и/или В-клеток, супрессии аутоиммунитета, супрессии отторжения трансплантата и т.д.
[0094] Термин "антитело человека" включает антитела, имеющие вариабельную и константную области, соответствующие по существу эмбриональным последовательностям иммуноглобулинов человека, известных в данной области, включая, например, описанные Kabat и др. (См Kabat, и др. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, пятое издание, Министерство здравоохранения и социального обеспечения США, NIH номер публикации 91-3242). Указанные антитела человека согласно настоящему изобретению могут содержать остатки аминокислот, не кодируемые эмбриональными последовательностями иммуноглобулинов человека (например, мутации, внесенные в результате неспецифического или сайт-специфического мутагенеза in vitro или в результате соматической мутации in vivo), например, в последовательностях CDR, и в частности в CDR3. Указанное антитело человека может иметь по меньшей мере одно, два, три, четыре, пять или более положений, в которых присуствует аминокислотный остаток, который не кодируется эмбриональной последовательностью иммуноглобулина человека.
[0095] Выражения "ингибирует" или "антагонизирует/оказывает антагонистическое воздействие на" активность IL-22 и его производных относятся к снижению, ингибированию или уменьшению другим образом по меньшей мере одной активности IL-22 вследствие связывания анти-IL-22 антитела, при этом указанное снижение сравнивают с активностью IL-22 в отсутствие того же антитела. Указанную активность можно измерить, применяя любую методику, известную в данной области, включая, например, такую, как описано в Примерах 7 и 9. Ингибирование или антагонизм не обязательно свидетельствуют о полном исчезновении биологической активности полипептида IL-22. Снижение активности может быть приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более.
[0096] Термин "интерлейкин-22" или "IL-22" относится к цитокину класса II (который может быть интерлейкином млекопитающего), способному связываться с IL-22R и/или рецепторным комплексом, состоящим из IL-22R и IL-10R2, и который имеет по меньшей мере одну из следующих характерных особенностей: (1) последовательность аминокислот встречающегося в природе полипептида IL-22 млекопитающего (полноразмерной или зрелой формы), или его фрагмента, например, последовательность аминокислот, обозначенную как SEQ ID NO:1 (человека) или SEQ ID NO:3 (мыши), или ее фрагмент; (2) последовательность аминокислот по существу идентичную, например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичную, последовательности аминокислот, обозначенной как SEQ ID NO:1 или ее аминокислотам 34-179 (человека) или SEQ ID NO:3 (мыши), или ее фрагменту; (3) последовательность аминокислот, которая кодируется встречающейся в природе последовательностью нуклеотидов IL-22 млекопитающего или ее фрагментом (например, SEQ ID NO:2 или нуклеотидами с 71 по 610 (человека) или SEQ ID NO:4 (мыши), или ее фрагмент); (4) последовательность аминокислот, кодируемую последовательностью нуклеотидов, которая является по существу идентичной, например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной, последовательности нуклеотидов, обозначенной как SEQ ID NO:2, или ее нуклеотидам с 71 по 610 (человека) или SEQ ID NO:4 (мыши) или ее фрагменту; (5) последовательность аминокислот, кодируемую последовательностью нуклеотидов, вырожденной по отношению к встречающейся в природе IL-22 последовательности нуклеотидов, или ее фрагменту, например, SEQ ID NO:2 (человека) или SEQ ID NO: 4 (мыши), или ее фрагмент; или (6) последовательностью нуклеотидов, которая гибридизуется с одной из вышеупомянутых последовательностей нуклеотидов в жестких условиях, например в очень жестких условиях. IL-22 может связываться с IL-22R и/или рецепторным комплексом, состоящим из IL-22R и IL-10R2, происходящим от млекопитающего, например человека или мыши.
[0097] Указанная последовательность нуклеотидов и предсказанная последовательность аминокислот IL-22 человека представлены как SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:1, соответственно. Указанная последовательность аминокислот зрелого IL-22 человека соответствует аминокислотам 34-179 последовательности SEQ ID NO:1. Анализ рекомбинантного IL-22 человека выявил множество структурных доменов. (Nagem и др. (2002) Structure, 10 1051-62; заявка на патент США номер US 2002/0187512 А1).
+
+
[0098] Термин "активность IL-22" относится к по меньшей мере одному клеточному процессу, который инициируется или прекращается в результате связывания IL-22 с рецепторным комплексом, состоящим из IL-22R и IL-10R2, находящимся на клетке. Активность IL-22 включает по меньшей мере один из следующих процессов, но не ограничена ими: (1) связывание IL-22R или рецепторного комплекса, состоящего из IL-22R и IL-10R2 (например, IL-22 R человека с или без IL-10R2 человека); (2) ассоциация с сигнальными молекулами (например, JAK-1); (3) стимулирование фосфорилирования STAT белков (например, STAT5, STAT3, или их комбинации); (4) активирование STAT белков; и (5) модулирование (например, повышение или ослабление) пролиферации, дифференцировки, функции эффекторных клеток, цитолитической активности, секреции цитокинов, выживаемости, или их комбинации, эпителиальных клеток, фибробластов, или иммуноцитов. Эпителиальные клетки включают, но не ограничены ими, клетки кожи, кишки, печени и почек, так же как и эндотелиальные клетки. Фибробласты включают, но не ограничены ими, синовиальные фибробласты. Иммуноциты (клетки иммунной системы) могут включать CD8 и CD4 Т-клетки, NK-клетки, В-клетки, макрофаги и мегакариоциты. Активность IL-22 можно определить in vitro, например, применяя тест на ингибирование рецептора IL-22, как описано в Примерах 2 и 6, тест на секрецию GROa в Примере 9 или тест на пролиферацию BAF3 из Примера 7. Активность IL-22 также можно определить in vivo, например, путем оценки прогрессирования иммунного ответа или расстройства, как описано в Примере 13.
[0099] При использовании в данной заявке "полученное in vitro антитело" относится к антителу, в котором вся или часть указанной вариабельной области (например, по меньшей мере один CDR) образована в результате селекции клеток, отличных от иммуноцитов (например, фаговый дисплей in vitro, белковый чип или любой другой способ, в котором подходящие последовательности можно тестировать на их способность связываться с антигеном). Этот термин исключает последовательности, образованные путем геномной перестройки в иммунной клетке.
[00100] Термин "выделенный" относится к молекуле, которая является по существу свободной от ее естественной среды. Например, выделенный белок по существу свободен от клеточного материала, или других белков из клетки или ткани, из которой он происходит. Указанный термин также относится к препарату, где указанный выделенный белок является достаточно чистым для фармацевтических композиций; или по меньшей мере на 70-80% (в весовом отношении) чистый; или по меньшей мере на 80-90% (в весовом отношении) чистый; или по меньшей мере на 90-95% чистый; или по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% чистый (в весовом отношении).
[00101] Выражение "процентно-идентичный" или "процент идентичности" относится к схожести между по меньшей мере двумя различными последовательностями Этот процент идентичности можно определить с помощью стандартных алгоритмов выравнивания, например, по методу поиска на основе определения степени локальной схожести (BLAST, Basic Local Alignment Search Tool), описанного Altshul и др. ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410); алгоритма Нидельмана и др. ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453); или алгоритма Майерса и др. ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17). Набором параметров может служить матрица выравнивания Blosum 62 со штрафом за внесение делеции, равным 12, штрафом за продолжение делеции, равным 4, и штрафом за внесение делеции со сдвигом рамки считывания, равным 5. Процент идентичности между двумя последовательностями аминокислот или нуклеотидов можно также определить, применяя алгоритм Е.Meyers и W.Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17), который был встроен в программу ALIGN (версия 2.0), применяя таблицу весов остатков РАМ 120, штраф за продолжение делеции, равный 12, и штраф за внесение делеции, равный 4. Процент идентичности обычно рассчитывается путем сравнения последовательностей схожей длины.
[00102] Термин "репертуар" относится по меньшей мере к одной последовательности нуклеотидов, происходящей полностью или частично по меньшей мере от одной последовательности, кодирующей по меньшей мере один иммуноглобулин. Указанную последовательность(и) можно получить путем перестройки in vivo сегментов V, D и J тяжелой цепи и сегментов V и J легкой цепи. В качестве альтернативы, указанную последовательность(и) можно получить из клетки в ответ, например, на стимуляцию in vitro, в результате которой происходит перестройка. В качестве альтернативы, часть или всю последовательность(и) можно получить путем сплайсинга ДНК, синтеза нуклеотидов, мутагенеза и другими способами, см., например, патент США 5,565,332. Репертуар может включать только одну последовательность или может включать множество последовательностей, включая последовательности из генетически разнообразной коллекции.
А
6
-1
[00103] Термины "специфичное связывание" или "специфично связывает" относятся к двум молекулам, образующим комплекс, который относительно стабилен при физиологических условиях. Специфичное связывание характеризуется высокой аффинностью и от низкой до умеренной способности к связыванию в отличие от неспецифичного связывания, у которого обычно низкая аффинность и от умеренной до высокой способности к связыванию. Обычно, связывание считают специфичным, когда константа ассоциации К выше, чем 10 М. Если необходимо, неспецифичное связывание может быть уменьшено по существу без нарушения специфичного связывания путем варьирования условий связывания. Подходящие условия связывания, такие как концентрация антител, ионная сила раствора, температура, время, отпущенное для связывания, концентрация блокирующего агента (например, сывороточного альбумина, казеинового молока) и т.д., могут быть оптимизированы специалистом в данной области с применением обычных методик. Иллюстративные условия указаны в Примере 3, но другие условия, известные среднему специалисту в данной области, входят в объем настоящего изобретения.
[00104] При использовании в данной заявке, термин "жесткие" описывает условия гибридизации и промывки. Понятие «жесткие условия» хорошо известно специалистам в данной области, и примеры таких условий можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Нью-Йорк (1989), 6.3.1-636. В данном источнике описаны как водные, так и безводные способы, и каждый из них можно использовать. Одним примером жестких условий гибридизации является гибридизация в 6х хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при приблизительно 45°С, после чего проводят по меньшей мере одну промывку в 0.2х SSC, 0.1% додецилсульфата натрия (SDS) при 50°С. Другим примером жестких условий гибридизации является гибридизация в 6х SSC при приблизительно 45°С, после чего проводят по меньшей мере одну промывку в 0.2х SSC, 0.1% SDS при 55°С. Еще одним примером жестких условий гибридизации является гибридизация в 6х SSC при приблизительно 45°С, после чего проводят по меньшей мере одну промывку в 0.2х SSC, 0.1% SDS при 60°С. Дополнительным примером жестких условий гибридизации является гибридизация в 6х SSC при приблизительно 45°С, после чего проводят по меньшей мере одну промывку в 0.2х SSC, 0.1% SDS при 65°С. Очень жесткие условия включают гибридизацию в 0.5 М фосфате натрия, 7% SDS при 65°С, после чего проводят по меньшей мере одну промывку в 0.2х SSC, 1% SDS при 65°C.
H
L
[00105] Выражение "по существу как приведено", "по существу идентичный" или "по существу гомологичный" означает, что соответствующие аминокислоты или последовательности нуклеотидов (например, CDR(ы), V или V домен) идентичны или имеют несущественное отличие (в результате консервативных замен аминокислот) по сравнению с последовательностями, которые приведены. Несущественные отличия включают незначительные замены аминокислот, такие как 1 или 2 замены в последовательности, состоящей из 5 аминокислот, установленной области. В случае антител, второе антитело имеет ту же специфичность и имеет по меньшей мере 50% аффинности первого антитела.
[00106] Последовательности, по существу идентичные или гомологичные (например, последовательности, идентичные по меньшей мере примерно на 85%) последовательностям, раскрытым в данной заявке, также представляют собой часть настоящей заявки. В некоторых вариантах реализации, идентичность последовательностей может быть примерно 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или выше. В качестве альтернативы, существенная идентичность или гомология существует, когда сегменты нуклеиновых кислот гибридизуются в селективных условиях гибридизации (например, очень жестких условиях гибридизации) с комплементарной последовательностью. Указанные нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, лизатах клеток или находиться в частично очищенной или по существу чистой форме.
[00107] Термин "терапевтический агент" означает вещество, которое лечит или способствует лечению расстройства. Терапевтические агенты могут включать, но не ограничены ими, вещества, которые модулируют клетки иммунной системы или иммунные ответы таким образом, что дополняют активность IL-22 или анти-IL-22 антител. Неограничивающие примеры и применения терапевтических агентов описаны в данной заявке.
[00108] При использовании в данной заявке выражение "терапевтически эффективное количество" анти-IL-22 антитела относится к такому количеству антитела, которое является эффективным при введении одной или нескольких доз субъекту (такому как пациент-человек) для лечения, предотвращения, излечивания, замедления, снижения тяжести и/или уменьшения выраженности по меньшей мере одного симптома расстройства или рецидивирующего расстройства или увеличения продолжительности жизни субъекта по сравнению с тем, что ожидалось в отсутствие такого лечения.
[00109] Термин "лечение" относится к терапевтической или предупредительной мере. Лекарственный препарат можно вводить субъекту, имеющему расстройство или который в перспективе может приобрести указанное расстройство, с целью предотвратить, вылечить, отложить, уменьшить тяжесть и/или уменьшить выраженность одного или более симптомов расстройства или рецидивирующего расстройства или с целью увеличения продолжительности жизни субъекта по сравнению с тем, что ожидалось в отсутствии такого лечения.
II. Анти-IL-22 Антитела
[00110] Настоящее описание обеспечивает новые анти-IL-22 антитела, которые включают новые антигенсвязывающие фрагменты.
[00111] Специалистам в данной области, известно множество способов получения антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Например, антитела можно получить, примененяя способы рекомбинантной ДНК (патент США 4,816,567). Моноклональные антитела можно также получить путем получения гибридомы (см. например, Kohler и Milstein (1975) Nature, 256: 495-499) в соответствии с известными способами. Гибридомы, образованные таким образом, затем подвергают скринингу, применяя стандартные способы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и анализ способом поверхностного плазменного резонанса (BIACORE™), чтобы определить одну или более гибридом, которые продуцируют антитело, которое специфично связывается с конкретным антигеном. Любая форма конкретного антигена может быть использована в качестве иммуногена, например, рекомбинантный антиген, встречающиеся в природе формы, любые варианты или их фрагменты, так же как и их антигенные пептиды.
[00112] Один примерный способ получения антител включает скрининг белковых экспрессионных библиотек, например, библиотек фагового или рибосомного дисплея. Фаговый дисплей описан, например, в Ladner и др./ патент США номер 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson и др. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks и др. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597 WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047; WO 92/09690; и WO 90/02809.
[00113] Помимо использования дисплейных библиотек, определенный антиген можно применять для иммунизации отличного от человека животного, например грызуна, например мыши, хомяка или крысы. В одном варианте реализации, отличное от человека животное имеет по меньшей мере часть гена иммуноглобулина человека. Например, можно создать линии мышей, способные продуцировать антитела мыши с большими фрагментами Ig локусов человека. С применением указанной гибридомной методики, можно получить и отобрать антиген-специфичные моноклональные антитела, полученные для указанных генов, с желаемой специфичностью. См, например, XENOMOUSE™, Green и др. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096, опубликованная 31 октября, 1996, и заявка РСТ номер PCT/US96/05928, отправленная 29 апреля, 1996.
[00114] В другом варианте реализации, моноклональное антитело, полученное от отличного от человека животного и затем измененное, например, гуманизированное, деиммунизированное, химерное, может быть получено с применением методик рекомбинантных ДНК, известных в данной области. Было описано множество подходов для получения химерных антител. См например, Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:6851, 1985; Takeda и др., Nature 314:452, 1985, Cabilly и др., патент США номер 4,816,567; Boss и др., патент США номер 4,816,397; Tanaguchi и др., патентной публикации ЕР171496; европейском патенте 0173494, патент Великобритании GB 2177096 В. Гуманизированные антитела можно также получить, например, с применением трансгенных мышей, которые экспрессируют гены тяжелой и легкой цепи человека, но неспособны экспрессировать эндогенные гены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов мыши. Winter описывает пример способа CDR-прививки, который можно использовать для получения гуманизированных антител, описанных в данной заявке (патент США номер 5,225,539). Все CDR отдельного антитела человека можно заместить по меньшей мере частью не происходящих от человека CDR, или можно заместить только некоторые CDR на не происходящие от человека CDR. Необходимо только заместить некоторое количество CDR, необходимых для связывания гуманизированного антитела с заранее определенным антигеном.
[00115] Гуманизированные антитела или их фрагменты можно получить путем замещения последовательностей вариабельного домена Fv, которые не участвуют непосредственно в связывании антигена, на эквивалентные последовательности из вариабельных доменов Fv человека. Примеры способов получения гуманизированных антител или их фрагментов есть в Morrison (1985) Science 229:1202-1207; в Oi и др. (1986) BioTechniques 4:214; и в US 5,585,089. US 5,693,761; US 5,693,762; US 5,859,205; и US 6,407,213. Эти способы включают выделение, манипулирование и экспрессирование указанных последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют целый или часть Fv вариабельного домена иммуноглобулина, из по меньшей мере одной из тяжелой или легкой цепи. Такие нуклеиновые кислоты можно получить из гибридомы, продуцирующей антитело против заранее определенной мишени, как описано выше, так же как и из других источников. Рекомбинантную ДНК, кодирующую указанную гуманизированную молекулу антитела, затем можно клонировать в подходящий вектор экспрессии.
[00116] В некоторых вариантах реализации, гуманизированное антитело оптимизируют путем введения консервативных замен, замен в консенсусной последовательности, замен в эмбриональных генах и/или обратных мутаций. Измененные таким образом молекулы иммуноглобулинов можно получить любыми из нескольких методик, известных в данной области (например, Teng и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 7308-7312, 1983; Kozbor и др., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson и др., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982), и можно получить в соответствии с обучающими методиками публикации РСТ WO 092/06193 или ЕР 0239400).
H
L
[00117] Антитело или его фрагмент можно также изменить путем специфичной делеции Т-клеточных эпитопов человека или "деиммунизации" с помощью способов, раскрытых в WO 98/52976 и WO 00/34317. Вкратце, указанные вариабельные домены тяжелой и легкой цепи антитела можно проанализировать на наличие пептидов, которые связываются с главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса II; эти пептиды представляют собой потенциальные Т-клеточные эпитопы (как определено в WO 98/52976 и WO 00/34317). Для обнаружения потенциальных Т-клеточных эпитопов можно применить подход компьютерного моделирования, названный "нанизывание пептидов", и вдобавок можно по базе данных пептидов, связывающих главный комплекс гистосовместимости класса II человека, провести поиск мотивов, представленных в последовательностях V и V, как описано в WO 98/52976 и WO 00/34317. Эти мотивы связываются с любыми из 18 DR аллотипов главного комплекса гистосовместимости класса II и, тем самым, составляют потенциальные Т-клеточные эпитопы. Обнаруженные потенциальные Т-клеточные эпитопы можно элиминировать путем замещения небольшого числа аминокислотных остатков в вариабельных доменах или, предпочтительно, с помощью единичных замен аминокислот. Обычно, делают консервативные замены. Часто, но не исключительно, можно использовать аминокислоту, характерную для данного положения в эмбриональных последовательностях антител человека. Эмбриональные последовательности антител человека, например, раскрыты в Tomlinson и др. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G.P. и др. (1995) Immunol. Today, том 16 (5): 237-242; Chothia, D. и др. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; и Tomlinson и др. (1995) EMBO J. 14:4628-4638. «V BASE Directory of Human V Gene Sequences» обеспечивает полный указатель последовательностей вариабельной области иммуноглобулинов человека (составленный Tomlinson, I. А. и др. MRC Centre for Protein Engineering, Кэмбридж, Великобритания). Эти последовательности можно использовать как источник последовательностей человека, например, для каркасных областей и CDR. Консенсусные каркасные области человека можно также использовать, например, как описано в патенте США номер 6,300,064.
[00118] В некоторых вариантах реализации, антитело может содержать измененную константную или Fc область иммуноглобулина. Например, антитело, полученное в соответствии с методиками, предложенными в данной заявке, может связываться сильнее или с большей специфичностью с эффекторными молекулами, такими как комплемент и/или Fc рецепторы, которые могут контролировать некоторые иммунные функции указанного антитела, такие как активность эффекторной клетки, лизис, активность, опосредуемая комплементом, выведение антител и время полужизни антитела Типичные Fc рецепторы, которые связываются с Fc областью антитела (например, IgG антитела) включают, но не ограничены ими, рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII, и FcγRIII и FcRn, включая аллельные варианты и, в качестве альтернативы, спланированные формы этих рецепторов. Fc рецепторы рассмотренны в Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92, 1991; Capel и др., Immunomethods 4:25-34,1994; и de Haas и др., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41, 1995).
[00119] Для обзора дополнительных методик получения антител, см. Antibodies: A Laboratory Manual, ред. Harlow и др., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Настоящее изобретение не обязательно ограничено каким-либо конкретным источником, способом получения или другой специальной характеристикой антитела.
1
2
3
4
1
2
L
L
H
H
H
H
H
H
L
[00120] Антитела, также известные как иммуноглобулины, обычно представляют собой тетрамерные гликозилированные белки, состоящие из двух легких (L) цепей молекулярной массы приблизительно 25 кДа каждая и двух тяжелых (Н) цепей приблизительно 50 кДа каждая. В антителах могут встречаться два типа легкой цепи, названные лямбда и каппа. В зависимости от последовательности аминокислот константного домена тяжелой цепи, иммуноглобулины можно отнести к пяти основным классам: A, D, Е, G и М, и некоторые из них могут быть дополнительно поделены на подтипы (изотипы), например, IgG, lgG, IgG, lgG, IgA и IgA. Каждая легкая цепь содержит N-концевой вариабельный (V) домен (V) и константный (С) домен (C). Каждая тяжелая цепь содержит N-концевой V домен (V), три или четыре С домена (C) и шарнирную область. C домен, наиболее близкий к V, обозначают как C1. V и V домены состоят из четырех областей относительно консервативных последовательностей, названных каркасными областями (FR1, FR2, FR3 и FR4), которые образуют каркас для трех областей гипервариабельных последовательностей (гипервариабельных участков, CDR). CDR содержат большинство остатков, отвечающих за специфичные взаимодействия указанного антитела с антигеном. CDR упоминаются как CDR1, CDR2 и CDR3. В соответствии с этим, составляющие CDR на тяжелой цепи упоминаются как Н1, Н2 и Н3, тогда как составляющие CDR на легкой цепи упоминаются как L1, L2 и L3.
H
H
L
L
H
L
H
[00121] CDR3 обычно представляет собой наибольший источник молекулярного разнообразия в указанном сайте связывания антитела. Н3, например, может состоять всего лишь из двух аминокислотных остатков, или более чем из 26 аминокислот. Структуры и трехмерные конфигурации субъединиц различных классов иммуноглобулинов хорошо известны в данной области. Для обзора структуры антитела, см. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ред. Harlow и др., 1988. Для специалиста в данной области очевидно, что каждая структура субъединицы, например, структура C, V, C, V, CDR, FR, включает активные фрагменты, например, участки V, V или CDR субъединицы, которые связываются с антигеном, а именно, антигенсвязывающий фрагмент, или, например, участок указанной C субъединицы, которая связывает и/или активирует, например, Fc рецептор и/или комплемент. Указанные CDR обычно относят к CDR Кабата, как описано в Sequences of Proteins of Immunological Interest, Министерство здравоохранения и социального обеспечения США (1991), ред. Kabat и др. Другой стандарт характеристики сайта связывания антигена относится к гипервариабельным петлям, в описании Chothia. См., например, Chothia, D. и др. (1992; J. Mol. Biol. 227:799-817; и Tomlinson и др. (1995) ЕМВО J. 14:4628-4638. Еще один стандарт представляет собой определение AbM, применяемое в программном обеспечении для моделирования антител Oxford Molecular's АbМ. См., обычно, например, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains, в: Antibody Engineering Lab Manual (ред: Duebel, S. и Kontermann, R, Springer-Verlag, Хайдельберг). Варианты реализации, описанные с учетом CDR по Кабату могут в качестве альтернативы быть реализованы с применением описанных сходным образом отношений, с учетом гипервариабельных петлей в описании Chothia или петлей, определенных АbМ.
H
H
L
L
v
H
L
H
L
L
H
3
[00122] Указанный Fab фрагмент (Фрагмент связывания антигена) состоит из V-C1 и V-C доменов, ковалентно связанных дисульфидным мостиком между константными областями. Указанный F фрагмент меньше и состоит из V и V доменов, связанных нековалентно. Чтобы предотвратить возможную диссоциацию связанных нековалентной связью доменов, можно сконструировать одноцепочечный Fv фрагмент (scFv) Указанный scFv содержит гибкий полипептид, который связывает (1) С-конец V с N-концом V, или (2) С-конец V с N-концом V. В качестве линкера можно использовать 15-мерный (Gly4Ser) пептид, но другие линкеры также известны в данной области.
10
[00123] Последовательность генов антител после сборки и соматической мутации имеет большое разнообразие, и эти разнообразные гены, как оценивали, кодируют 10 различных молекул антител {Immunoglobulin Genes, 2ое изд, ред Jonio и др., Academic Press, Сан-Диего, Калифорния, 1995).
[00124] "Биспецифичное" или "бифункциональное антитело" представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различных пары тяжелая/легкая цепь и два различных сайта связывания. Биспецифичные антитела можно получить множеством способов, включая слияние гибридом или сшивание Fab' фрагментов. См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin: Exp. Immunol 79:315-321 (1990); Kostelny и др., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). В одном варианте реализации, указанное биспецифичное антитело включает первый домен связывания полипептида, такой как Fab' фрагмент, сшитый через константную область иммуноглобулина со вторым доменом связывания полипептида.
[00125] Small Modular ImmunoPharmaceuticals (SMIP™) обеспечивают пример вариантной молекулы, включающей полипептид домена связывания. SMIP и их применение и приложения раскрыты, например, в опубликованных заявках на патент США с номерами 2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534 и 2005/0238646, и родственных им членах семейства патентов-аналогов, каждый из которых настоящим включен посредством ссылки в данную заявку в полном объеме.
Н
Н
Н
Н
Н
Н
Н
Н
Н
Н
Н
[00126] SMIP™ обычно относится к химерному белку, состоящему из домена связывания и иммуноглобулина, который соедржит домен связывания полипептида, который находится в виде белка слияния или другим образом присоединен к шарнирной или действующей как шарнирная области полипептида иммуноглобулина, которая, в свою очередь, слита или другим образом присоединена к области, включающей одну или более нативных или сконструированных константных областей из тяжелой цепи иммуноглобулина, отличной от С1, например, С2 и С3 области IgG и IgA, или С3 и С4 области IgE (см. например, US 2005/0136049, Ledbetter, J. и др., содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки, для более полного описания). Химерный белок, состоящий из домена связывания и иммуноглобулина, может дополнительно содержать область, которая включает нативный или сконструированный полипептид С2 константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (или С3 в случае конструкции, полученной целиком или частично из IgE), которая находится в виде белка слияния или другим образом соединена с шарнирной областью полипептида и с нативным или сконструированным полипептидом С3 константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (или С4 в случае конструкции, полученной целиком или частично из IgE), которая находится в виде белка слияния или другим образом соединена с полипептидом С2 константной области (или С3 в случае конструкции, полученной целиком или частично из IgE). Обычно, такие химерные белки, состоящие из домена связывания и иммуноглобулина, способны проявлять по меньшей мере один вид иммунологической активности, выбранный из группы, состоящей из цитотоксичности, опосредованной зависящими от антител клетками, фиксации комплемента, и/или связывания с мишенью, например, с целевым антигеном, таким как IL-22 человека.
[00127] Терапевтические белки, а именно белок или пептид, который имеет биологическое влияние на область тела, на которую он действиет, или на область тела, на которую он удаленно действует через интермедиаты, также применимы для осуществления настоящего изобретения. Терапевтический белок может включать пептидные миметики. Миметики представляют собой содержащие пептиды молекулы, которые имитируют элементы вторичной структуры белка. См., например, Johnson и др., "Peptide Turn Mimetics" в BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto и др., ред., Chapman и Hall, Нью-Йорк (1993), включенные в данную заявку посредством ссылки. Обоснование, лежащее в основе использования пептидных миметиков, состоит в том, что пептидный остов белков существует преимущественно для ориентации боковых цепей аминокислот таким образом, чтобы облегчить молекулярные взаимодействия, такие как взаимодействия антитела и антигена. Пептидный миметик, как ожидается, обеспечивает молекулярные взаимодействия, сходные с таковыми для природной молекулы. Эти принципы можно использовать для конструирования молекул второго поколения, имеющих множество естественных свойств нацеливающих пептидов, раскрытых в данной заявке, но с измененными и потенциально улучшенными характеристиками.
[00128] Другие варианты реализации терапевтических белков включают рекомбинантные белки (белки слияния). Эти молекулы обычно имеют весь или существенную часть нацеливающего пептида, например, IL-22 или анти-IL-22 антитела, пришитого за N- или С-конец к целой молекуле или к части второго полипептида или белка. Например, при слиянии можно применять лидерные последовательности из других видов, чтобы позволить рекомбинантную экспрессию белка в гетерологичном хозяине. Другие полезные модификации включают добавление иммунологически активного домена, такого как эпитоп для антитела, чтобы облегчить очистку химерного белка. Включение сайта расщепления в месте или рядом с местом соединения слитых белков облегчит удаление лишнего полипептида после очистки. Другие полезные рекомбинантые модификации включают связывание функциональных доменов, таких как активные сайты различных ферментов, домены гликозилирования, клеточные нацеливающие сигналы или трансмембранные области. Примеры белков или пептидов, которые можно вводить в состав химерного белка, включают цитостатические белки, цитоцидные белки, проапоптические агенты, анти-ангиогенные агенты, гормоны, цитокины, факторы роста, пептидные лекарственные препараты, антитела, Fab фрагменты антител, антигены, рецепторные белки, ферменты, лектины, белки МНС, белки адгезии клеток и белки связывания. Способы получения рекомбинантных белков хорошо известны специалистам в данной области. Такие белки можно получить, например, путем химического присоединения с применением бифункциональных перекрестносшивающих реагентов, путем синтеза de novo целого химерного белка или путем присоединения последовательности ДНК, кодирующей нацеливающий пептид, к последовательности ДНК, кодирующей второй пептид или белок, после чего проводят экспрессию интактного химерного белка.
[00129] В одном варианте реализации настоящего изобретения, указанный нацеливающий пептид, например, IL-22 или анти-IL-22 антитело, находится в виде белка слияния с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, такой как Fc фрагмент, который содержит два домена константной области и шарнирную область, но в котором отсутствует вариабельная область (см. патенты США с номерами 6,018,026 и 5,750,375, включенные в данную заявку посредством ссылки). Указанная Fc область может быть встречающейся в природе Fc областью или может быть изменена для улучшения некоторых характеристик, таких как терапевтические характеристики, время циркуляции, пониженная агрегация и т.д. Пептиды и белки, слитые с Fc областью, обычно проявляют большее время полужизни in vivo, чем неслитые аналоги. Также, слияние с Fc областью позволяет димеризацию/мультимеризацию химерных полипептидов.
[00130] VHH молекулы (или нанотела), как известно специалисту в данной области, представляют собой вариабельные домены тяжелой цепи, полученные из иммуноглобулинов, по своей природе свободных от легких цепей, таких как полученные из Camelidae, как описано в WO 9404678, содержание которого включено в данную заявку посредством ссылки. Такую VHH молекулу можно получить из антител, образованных в видах Camelidae, например в верблюде, ламе, дромедаре, альпаке и гуанако, и ее иногда называют камелидным или камелизированным вариабельным доменом. См., например, Muyldermans., J. Biotechnology (2001) 74(4):277-302, включенный в данную заявку посредством ссылки. Другие виды, кроме Camelidae, могут продуцировать антитела, состоящие из тяжелых цепей, в которых естественно отсутствуют легкие цепи. VHH молекулы приблизительно в 10 раз меньше, чем молекулы IgG. Они представляют собой единичные полипептиды и являются очень стабильными, устойчивыми к экстремальным условиям рН и температуры. Более того, они устойчивы к действию протеаз, в отличие от традиционных антител. Более того, в результате in vitro экспрессии VHH, получают с высоким выходом правильно сложенные функциональные VHH. Вдобавок, антитела, полученные в камелидах, будут распознавать эпитопы, отличные от эпитопов, распознаваемых антителами, полученными in vitro путем использования библиотек антител или путем иммунизации млекопитающих, отличных от камелидов (см. WO 9749805, который включен в данную заявку посредством ссылки).
[00131] Один аспект настоящего изобретения включает антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают IL-22. Настоящее описание обеспечивает новые CDR, полученные из библиотек генов иммуноглобулинов человека. Структурой, несущей CDR, обычно является тяжелая или легкая цепь антитела или его часть, где CDR располагается в области природного CDR. Структуры и положения вариабельных доменов можно определить, как описано в Kabat и др Sequences of Proteins of Immunological Interest, номер 91-3242, публикации Национальных институтов здравоохранения, Бетесда, Мэриленд (1991).
H
L
H
L
[00132] ДНК и последовательности аминокислот (АК) иллюстративных вариантов реализации анти-IL-22 антител настоящего изобретения, включая их scFv фрагменты, V и V домены, и CDR, такие, которые указаны на Фигурах 7-10 и перечислены в Таблицах 1 и 7. Двадцать конкретных вариантов реализации неэмбрионизированных антител обозначены как GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, G1L68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166 В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 и 356А11. Положения CDR в V и V доменах неэмбрионизированных антител приведены в Таблице 2. Пятнадцать специфичных вариантов реализации эмбрионизированных антител обозначены как GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062А09, 087В03, 166В06, 166G05, 354А08, 355В06, 355Е04, 356А11 и 368D04.
Таблица 1А
Последовательности аминокислот и нуклеотидов V<sub>H</sub> и V<sub>L</sub> доменов, Fv и CDRs неэмбрионизированных антител
Участок
Тип
GIL01 SEQ ID
GIL16 SEQ ID
GIL45 SEQ ID
GIL60 SEQ ID
GIL68 SEQ ID
GIL92 SEQ ID
097D09 SEQ ID
062А09 SEQ ID
062G05 SEQ ID
087В03 SEQ ID
V<sub>H</sub>
АА
NO:5
NO:23
NO:41
NO:59
NO:77
NO:95
NO:113
NO:131
NO:149
NO:167
V<sub>L</sub>
АА
NO:6
NO:24
NO:42
NO:60
NO:78
NO:96
NO:114
NO:132
NO:150
NO:168
scFv
АА
NO:7
NO:25
NO:43
NO:61
NO:79
NO:97
NO:115
NO:133
NO:151
NO:169
Н1
АА
NO:8
NO:26
NO:44
NO:62
NO:80
NO:98
NO:116
NO:134
NO:152
NO:170
Н2
АА
NO:9
NO:27
NO:45
NO:63
NO:81
NO:99
NO:117
NO:135
NO:153
NO:171
Н3
АА
NO:10
NO:28
NO:46
NO:64
NO:82
NO:100
NO:118
NO:136
NO:154
NO:172
L1
АА
NO:11
NO:29
NO:47
NO:65
NO:83
NO:101
NO:119
NO:137
NO:155
NO:173
L2
АА
NO:12
NO:30
NO:48
NO:66
NO:84
NO:102
NO:120
NO:138
NO:156
NO:174
L3
АА
NO:13
NO:31
NO:49
NO:67
NO:85
NO:103
NO:121
NO:139
NO:157
NO:175
V<sub>H</sub>
DNA
NO:14
NO:32
NO:50
NO:68
NO:86
NO:104
NO:122
NO:140
NO:158
NO:176
V<sub>L</sub>
DNA
NO:15
NO:33
NO:51
NO:69
NO:87
NO:105
NO:123
NO:141
NO:159
NO:177
scFv
DNA
NO:16
NO:34
NO:52
NO:70
NO:88
NO:106
NO:124
NO:142
NO:160
NO:178
H1
DNA
NO:17
NO:35
NO:53
NO:71
NO:89
NO:107
NO:125
NO:143
NO:161
NO:179
Н2
DNA
NO:18
NO:36
NO:54
NO:72
NO:90
NO:108
NO:126
NO:144
NO:162
NO:180
Н3
DNA
NO:19
NO:37
NO:55
NO:73
NO:91
NO:109
NO:127
NO:145
NO:163
NO:181
L1
DNA
NO:20
NO:38
NO:56
NO:74
NO:92
NO:110
NO:128
NO:146
NO:164
NO:182
L2
DNA
NO:21
NO:39
NO:57
NO:75
NO:93
NO:111
NO:129
NO:147
NO:165
NO:183
L3
DNA
NO:22
NO:40
NO:58
NO:76
NO:94
NO:112
NO:130
NO:148
NO:166
NO:184
Таблица 1Б
Последовательности аминокислот и нуклеотидов V<sub>H</sub> и V<sub>L</sub> доменов, Fv и CDRs неэмбрионизированных антител
Region
Type
367D04 SEQ ID
368D04 SEQ ID
166B06 SEQ ID
166G05 SEQ ID
375G06 SEQ ID
376B10 SEQ ID
354A08 SEQ ID
355B06 SEQ ID
355E04 SEQ ID
356A11 SEQ ID
V<sub>H</sub>
AA
NO:185
NO:203
NO:221
NO:239
NO:257
NO:275
NO:293
NO:311
NO:329
NO:.347
V<sub>L</sub>
AA
NO:186
NO:204
NO:222
NO:240
NO:258
NO:276
NO:294
NO:312
NO:330
NO:348
scFv
AA
NO:187
NO:205
NO:223
NO:241
NO:259
NO:277
NO:295
NO:313
NO:331
NO:349
H1
AA
NO:188
NO:206
NO:224
NO:242
NO:260
NO:278
NO:296
NO:314
NO:332
NO:350
H2
AA
NO:189
NO:207
NO:225
NO:243
NO:261
NO:279
NO:297
NO:315
NO:333
NO:351
H3
AA
NO:190
NO:208
NO:226
NO:244
NO:262
NO:280
NO:298
NO:316
NO:334
NO:352
L1
AA
NO:191
NO:209
NO:227
NO:245
NO:263
NO:281
NO:299
NO:317
NO:335
NO:353
L2
AA
NO:192
NO:210
NO:228
NO:246
NO:264
NO:282
NO:300
NO:318
NO:336
NO:354
L3
AA
NO:193
NO:211
NO:229
NO:247
NO:265
NO:283
NO:301
NO:319
NO:337
NO:355
V<sub>H</sub>
DNA
NO:194
NO:212
NO:230
NO:248
NO:266
NO:284
NO:302
NO:320
NO:338
NO:356
V<sub>L</sub>
DNA
NO:195
NO:213
NO:231
NO:249
NO:267
NO:285
NO:303
NO:321
NO:339
NO:357
scFv
DNA
NO:.196
NO:214
NO:232
NO:250
NO:268
NO:286
NO:304
NO:322
NO:340
NO:358
H1
DNA
NO:197
NO:215
NO:233
NO:251
NO:269
NO:287
NO:305
NO:323
NO:341
NO:359
H2
DNA
NO:198
NO:216
NO:234
NO:252
NO:270
NO:288
NO:306
NO:324
NO:342
NO:360
Н3
DNA
NO:199
NO:217
NO:235
NO:253
NO:271
NO:289
NO:307
NO:325
NO:343
NO:361
L1
DNA
NO:200
NO:218
NO:236
NO:254
NO:272
NO:290
NO:308
NO:326
NO:344
NO:362
L2
DNA
NO:201
NO:219
NO:237
NO:255
NO:273
NO:291
NO:309
NO:327
NO:345
NO:363
L3
DNA
NO:202
NO:220
NO:238
NO:256
NO:274
NO:292
NO:310
NO:328
NO:346
NO:364
Таблица 2
Положения CDR в составе последовательностей аминокислот V<sub>H</sub> и V<sub>L</sub> доменов неэмбрионизированных антител
CDR
GIL01
GIL16
GIL45
GIL60
GIL68
GIL92
097D09
062A09
062G05
087B03
m
31-35
31-35
31-35
31-35
31-35
31-35
31-35
31-35
31-35
31-35
H2
50-66
50-66
50-66
50-66
50-66
50-66
50-66
50-66
50-66
50-66
H3
99-108
99-108
99-108
99-110
99-108
99-110
99-108
99-108
99-108
99-110
L1
24-34
24-34
23-36
23-36
23-33
23-36
24-34
24-34
24-34
23-36
L2
50-56
50-56
52-58
52-58
49-55
52-58
50-56
50-56
50-56
52-58
L3
89-97
89-97
91-100
91-100
88-98
91-101
89-97
89-97
89-97
91-100
CDR
367D04
368D04
166B06
166G05
375G06
376B10
354A08
355B06
355E04
356A11
H1
31-35
31-35
31-35
31-35
31-35
31-35
30-34
31-35
31-35
31-35
H2
50-66
50-66
50-66
50-66
50-66
50-66
49-65
50-66
50-66
50-66
H3
99-110
99-110
99-108
99-108
99-108
99-108
98-109
99-110
99-110
99-110
L1
23-36
23-36
23-33
23-33
23-33
23-33
23-36
23-36
23-36
22-35
L2
52-58
52-58
49-55
49-55
49-55
49-55
52-58
52-58
52-58
51-58
L3
91-100
91-100
88-98
88-98
88-98
88-98
91-101
91-101
91-101
90-100
L
K
λ
H
H
L
[00133] Анти-IL-22 антитела согласно настоящему изобретению могут включать константные области антител или их части. Например, V домен может быть присоединен своим С-концом к константному домену легкой цепи, как C или С. Сходным образом, V домен или его часть может быть присоединен к целой или части тяжелой цепи, такой как IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, имеющие любой подкласс изотипа. Константные области известны в данной области (см., например, Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, номер 91-3242, публикации Национальных институтов здравоохранения, Бетесда, Мэриленд (1991)). Таким образом, антитела, входящие в объем настоящего изобретения, включают V и V домены, или их части, объединенные с константными областями, известными в данной области.
H
L
v
H
L
V
H
L
H
[00134] Некоторые варианты реализации включают V домен, V домен, или их комбинацию, указанного F фрагмента из GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 или 356А11. Другой вариант реализации включает V домен, V домен, или их комбинацию, указанного F фрагмента из антитела, выбранного из 356А11, 354А08, 087B03 и 368D04. Дополнительные варианты реализации включают один, два, три, четыре, пять или шесть гипервариабельных участков (CDR) из указанных V и V доменов. Антитела, последовательности CDR которых входят в SEQ ID NO:5-13, 23-31, 41-49, 59-67, 77-85, 95-103, 113-121, 131-139, 149-157, 167-175, 185-193, 203-211, 221-229, 239-247, 257-265, 275-283, 293-301, 311-319, 329-337, 347-355, 365-373, 383-391, 401-409, 419-427, 437-445, 455-463. 473-481, 491-499, 509-517, 527-535, 545-553, 563-571, 581-589, 599-607 или 617-625, входят в объем настоящего изобретения. Например, в одном варианте реализации, антитело содержит Н3 фрагмент V домена из эмбрионизированного или неэмбрионизированного GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 или 356А11, или из антитела, выбранного из 356А11, 354А08, 087B03 и 368D04.
H
L
[00135] В некоторых вариантах реализации, указанные V и/или V домены могут быть эмбрионизированными, а именно, каркасные области (FR) этих доменов мутируют, применяя традиционные методики молекулярной биологии, чтобы они соответствовали областям атител, продуцируемых эмбриональными клетками. В других вариантах реализации, последовательности FR остаются отличными от консенсусных эмбриональных последовательностей. В одном варианте реализации настоящего изобретения, эмбрионизированные антитела представлены в Таблице 7.
H
L
[00136] В одном варианте реализации, настоящее изобретение обеспечивает последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот для указанных эмбрионизированных антител GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 или 356А11. Последовательности аминокислот и нуклеотидов для V домена эмбрионизированных антител GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062А09, 087В03, 166В06, 166G05, 354А08, 355В06, 355Е04, 356А11 и 368D04 приведены в Таблице 7 и на Фигуре 8. Последовательности аминокислот и нуклеотидов для V домена эмбрионизированных антител GIL01, GIL16. GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062А09, 087В03, 166В06, 166G05, 354А08, 355В06, 355Е04, 356А11 и 368D04 также приведены в Таблице 7 и на Фигуре 8.
H
L
[00137] В одном варианте реализации, чтобы сделать антитело более сходным с одной или более эмбриональными последовательностями, применяют мутагенез. Это может быть желательным, когда мутации вводят в каркасную область антитела путем соматического мутагенеза или путем ПЦР с увеличенной частотой ошибок. Эмбриональные последовательности для указанных V и V доменов можно идентифицировать путем выполнения выравнивания последовательностей аминокислот и нуклеиновых кислот по базе данных VBASE (MRC Center for Protein Engineering, Великобритания). VBASE представляет собой полный указатель всех эмбриональных последовательностей вариабельной области иммуноглобулинов человека, составленный из более чем тысячи опубликованных последовательностей, включая последовательности из текущих сообщений библиотек данных Genbank и EMBL. В некоторых вариантах реализации, указанные FR области scFv мутированы в соответствии с наиболее близкими совпадениями в базе данных VBASE и CDR части оставлены интактными.
A
6
-1
9
-1
10
-1
11
-1
12
-1
[00138] В некоторых вариантах реализации, антитела согласно настоящему изобретению специфично реагируют с эпитопом, который является таким же, как и эпитоп, распознаваемый антителами GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 или 356А11, таким образом, что они конкурентно ингибируют связывание антител GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 или 356А11 с IL-22 человека. Такие антитела можно определить в тестах на конкурентное связывание. В одном варианте реализации, указанное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывается с эпитопом IL-22, который распознается антителом 368D04, таким образом, что указанное антитело конкурентно ингибирует связывание антитела 368D04 с IL-22 человека. В другом варианте реализации, указанное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывается с эпитопом IL-22, который распознается антителом 356А11, таким образом, что указанное антитело конкурентно ингибирует связывание 356А11 с IL-22 человека. В другом варианте реализации, указанное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывается с эпитопом IL-22, который распознается антителом 354А08, таким образом, что указанное антитело конкурентно ингибирует связывание 354А08 с IL-22 человека. В другом варианте реализации, указанное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывается с эпитопом IL-22, который распознается антителом 087В03, таким образом, что указанное антитело конкурентно ингибирует связывание 087В03 с IL-22 человека. В одном варианте реализации, константа ассоциации (K) этих антител с IL-22 человека равна по меньшей мере 10 М. В другом варианте реализации, константа ассоциации этих антител с IL-22 человека равна по меньшей мере 10 М. В других вариантах реализации, константа ассоциации этих антител с IL-22 человека равна по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 10 М или по меньшей мере 10 М. Аффинность связывания можно определить, применяя методики, известные в данной области, такие как ELISA, биосенсорная технология, такие как анализ биоспецифичных взаимодействий, или другие методики, включая описанные в данной заявке.
[00139] Предполагается, что антитела согласно настоящему изобретению могут связывать другие белки, такие как, например, рекомбинантные белки, которые содержат IL-22 целиком или частично.
[00140] Для среднего специалиста в данной области очевидно, что раскрытые в данном описании антитела можно применять для обнаружения, измерения и/или ингибирования белков, которые в некоторой степени отличаются от IL-22. Например, эти белки могут быть гомологами IL-22. Ожидается, что анти-IL-22 антитела связывают белки, которые содержат последовательность, которая по меньшей мере примерно на 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более идентична любой последовательности из по меньшей мере 100, 80, 60, 40 или 20 следующих друг за другом аминокислот в последовательности, представленной как SEQ ID NO:1.
[00141] Вдобавок к анализу гомологии последовательностей, можно провести картирование эпитопов (см., например, Epitope Mapping Protocols, ред. Morris, Humana Press, 1996) и анализ вторичной и третичной структур, чтобы определить специфичные 3D структуры, предполагаемые для раскрытых в настоящей заявке антител и их комплексов с антигенами. Такие способы включают, но не ограничены ими, рентгеноструктурную кристаллографию (Engstom (1974) Biochem. Exp. Biol., 11:7-13) и компьютерное моделирование виртуальных изображений антител согласно настоящему изобретению (Fletterick и др. (1986) Computer Graphics and Molecular Modeling, в Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк).
H
L
[00142] Настоящее описание обеспечивает способ получения анти-IL-22 антител, который включает создание антител с измененной V и/или V последовательностью(ями), Таблица 1. Такие антитела могут быть получены специалистом с применением методик, известных в данной области. Например, замены аминокислот, делеции или вставки можно ввести в FR и/или CDR области. Изменение FR обычно проводят, чтобы улучшить стабильность и иммуногенность указанного антитела, тогда как изменение CDR обычно проводят, чтобы повысить аффинность антитела к его антигену. Указанные изменения, которые повышают аффинность, можно проверить путем изменения последовательности CDR и измерения аффинности антитела к его мишени (см. Antibody Engineering, 2-е изд, Oxford University Press, ред Borrebaeck, 1995)
[00143] Антитела, CDR последовательности которых несущественно отличаются от тех, которые соответствуют или содержаться в указанных последовательностях: SEQ ID NO:5-13, 23-31, 41-49, 59-67, 77-85, 95-103, 113-121, 131-139, 149-157, 167-175, 185-193, 203-211, 221-229, 239-247, 257-265, 275-283, 293-301, 311-319, 329-337, 347-355, 365-373, 383-391, 401-409. 419-427, 437-445, 455-463, 473-481, 491-499, 509-517, 527-535, 545-553, 563-571, 581-589, 599-607 или 617-625, входят в объем настоящего изобретения Обычно, они содержат замену аминокислоты на аминокислоту, имеющую сходные заряд, гидрофобные или стереохимические характеристики. Можно также осуществлять более существенные замены в FR областях, в противоположность CDR областям, так как они не оказывают отрицательного влияния на свойства связывания указанного антитела (например, не снижают аффинность на более чем 50% по сравнению с неизмененным антителом). Замены можно также совершить с целью сделать указанное антитело таким же, как эмбриональное, или стабилизировать сайт связывания антигена.
[00144] Консервативные модификации позволят получить молекулы, имеющие функциональные и химические свойства, сходные с таковыми для молекулы, над которой совершили такие модификации. В противоположность, существенные модификации функциональных и/или химических свойств указанных молекул можно создать путем выбора замен в последовательности аминокислот, которые значительно отличаются по своему эффекту на поддержание (1) структуры молекулярного остова в области замены, например, конформации слоя или спирали, (2) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте или (3) размера молекулы.
[00145] Например, "консервативная замена аминокислоты" может включать замену нативного аминокислотного остатка на ненативный остаток таким образом, что это производит небольшой эффект или не производит эффекта на полярность или заряд аминокислотного остатка в этом положении (см., например, MacLennan и др., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki и др., 1998, Adv. Biophys 35:1-24).
[00146] Требуемые замены аминокислот (либо консервативные, либо неконсервативные) могут определить специалисты в данной области, когда такие замены желательны. Например, замены аминокислот можно проводить для определения важных остатков в последовательности молекулы, или для повышения или снижения аффинности молекул, описанных в данной заявке. Примеры замен аминокислот включают, но не ограничены ими, такие замены, которые указаны в Таблице 3.
Таблица 3
Замены аминокислот
Исходные остатки
Примеры замен
Наиболее консервативные замены
А1а (А)
Val, Leu, Ile
Val
Аrg (R)
Lys, Gln, Asn
Lys
Asn (N)
Gln
Gln
Asp (D)
Glu
Glu
Cys (С)
Ser, Ala
Ser
Gln (Q)
Asn
Asn
Gly (G)
Pro, Ala
Ala
His (H)
Asn, Gln, Lys, Arg
Аrg
Ile (l)
Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucine
Leu
Leu (L)
Norleucine, Ile, Val, Met, Ala, Phe
Ile
Lys (K)
Arg, 1,4 Diamino-butyric Acid, Gln, Asn
Аrg
Met (M)
Leu, Phe, Ile
Leu
Phe (F)
Leu, Val, Ile, Ala, Tyr
Leu
Pro (P)
Ala
Gly
Ser (S)
Thr, Ala, Cys
Thr
Thr (T)
Ser
Ser
Trp(W)
Tyr, Phe
Tyr
Tyr(Y)
Trp, Phe, Thr, Ser
Phe
Val (V)
Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucine
Leu
[00147] В некоторых вариантах реализации, консервативные замены аминокислот также охватывают не встречающиеся в природе аминокислотные остатки, которые обычно включают путем химического пептидного синтеза, а не путем синтеза в биологических системах.
H
H
H
L
H
[00148] В одном варианте реализации, указанный способ получения измененного V домена включает вставку, делецию или замену по меньшей мере одной аминокислоты в описанных V доменах, или комбинирование описанных V доменов с по меньшей мере одним V доменом, и проверку измененного V домена на связывание IL-22 или модуляцию активности IL-22.
L
L
L
H
L
[00149] Аналогичный способ получения измененного V домена включает вставку, делецию или замену по меньшей мере одной аминокислоты в описанных V доменах, или комбинирование описанных V доменов с по меньшей мере одним V доменом, и проверку измененного V домена на связывание IL-22 или модуляцию активности IL-22.
[00150] Дополнительный аспект настоящего описания обеспечивает способ получения антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфично связывают IL-22. Указанный способ включает:
H
(a) получение начального репертуара нуклеиновых кислот, кодирующих V домен, в котором отсутствует по меньшей мере один CDR или содержится по меньшей мере один CDR, который нужно заменить;
H
(b) вставку или замену указанной CDR области начального репертуара на по меньшей мере одну донорную нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательность аминокислот, как по существу изложено в данной заявке, для V CDR, давая репертуар продуктов;
(c) экспрессию указанных нуклеиновых кислот репертуара продуктов;
(d) выбор специфичного антигенсвязывающего фрагмента, который связывается с IL-22; и
(e) получение указанного специфичного антигенсвязывающего фрагмента или нуклеиновой кислоты, кодирующей его.
L
L
H
L
H
L
[00151] В аналогичном способе, по меньшей мере один V CDR согласно настоящему изобретению объединен с репертуаром нуклеиновых кислот, кодирующих V домен, в котором отсутствует по меньшей мере один CDR или содержится по меньшей мере один CDR, который необходимо заменить. Указанный по меньшей мере один V или V CDR может представлять собой CDR1, CDR2, CDR3, или их комбинацию, включая комбинации V и V CDR, такие, которые приведены в Таблицах 1 или 7, включая соответствующие SEQ ID NO:8, 9, 10, 11, 12, 13, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 620, 621, 622, 623, 624 или 625.
[00152] В одном варианте реализации, указанный вариабельный домен содержит CDR3, который необходимо заменить, или в нем отсутствует область, кодирующая CDR3, и указанная по меньшей мере одна донорная нуклеиновая кислота кодирует по существу такую последовательность аминокислот, как приведено в SEQ ID NO:10, 13, 28, 31, 46, 49, 64, 67, 82, 85, 100, 103, 118, 121, 136, 139, 154, 157, 172, 175, 190, 193, 208, 211, 226, 229, 244, 247, 262, 265, 280, 283, 298, 301, 316, 319, 334, 337, 352, 355, 370, 373, 388, 391, 406, 409, 424, 427, 442, 445, 460, 463, 478, 481, 496, 499, 514, 517, 532, 535, 550, 553, 568, 571, 586, 589, 604, 607, 622 или 625.
[00153] В другом варианте реализации, указанный вариабельный домен содержит CDR1, который необходимо заменить, или в нем отсутствует область, кодирующая CDR1, и указанная по меньшей мере одна донорная нуклеиновая кислота кодирует по существу такую последовательность аминокислот, как приведено в SEQ ID NO:8, 11, 26, 29, 44, 47, 62, 65, 80, 83, 98, 101, 116, 119, 134, 137, 152, 155, 170, 173, 188, 191, 206, 209, 224, 227, 242, 245, 260, 263, 278, 281,296,299,314,317,332,335,350,353,368, 371, 386,389,404.407, 422, 425, 440, 443, 458, 461, 476, 479, 494, 497, 512, 515, 530, 533, 548, 551, 566, 569, 584, 587, 602, 605, 620 или 623.
[00154] В другом варианте реализации, указанный вариабельный домен содержит CDR2, который необходимо заменить, или в нем отсутствует область, кодирующая CDR2, и указанная по меньшей мере одна донорная нуклеиновая кислота кодирует по существу такую последовательность аминокислот, как приведено в SEQ ID NO:9, 12, 27, 30, 45, 48, 63, 66, 81, 84, 99, 102, 117, 120, 135, 138, 153, 156, 171, 174, 189, 192, 207, 210, 225, 228, 243, 246, 261, 264, 279, 282, 297, 300, 315,318,333,336,351,354, 369, 372, 387, 390, 405, 408, 423, 426, 441, 444, 459, 462, 477, 480, 495, 498, 513, 516, 531, 534, 549, 552, 567, 570, 585, 588, 603, 606, 621 или 624.
[00155] В другом варианте реализации, указанный вариабельный домен содержит CDR3, который необходимо заменить, или в нем отсутствует область, кодирующая CDR3, и дополнительно содержит CDR1, который необходимо заменить, или в котором отсутствует область, кодирующая CDR1, где по меньшей мере одна донорная нуклеиновая кислота кодирует последовательность аминокислот, по существу такую, как приведено в Таблицах 1 или 7.
[00156] В другом варианте реализации, указанный вариабельный домен содержит CDR3, который необходимо заменить, или в нем отсутствует область, кодирующая CDR3, и дополнительно включает CDR2, который необходимо заменить, или в котором отсутствует область, кодирующая CDR2, где по меньшей мере одна донорная нуклеиновая кислота кодирует по существу такую последовательность аминокислот, как приведено в Таблицах 1 или 7.
[00157] В другом варианте реализации, указанный вариабельный домен содержит CDR3, который необходимо заменить, или в нем отсутствует область, кодирующая CDR3, и дополнительно включает CDR1 и CDR2, которые необходимо заменить, или в котором отсутствует область, кодирующая CDR1 и CDR2, где по меньшей мере одна донорная нуклеиновая кислота кодирует последовательность аминокислот, по существу такую, как приведено в Таблицах 1 или 7.
H
L
[00158] Применение способов рекомбинантных ДНК, описанные последовательности CDR можно ввести в репертуар V или V доменов, в которых отсутствуют соответствующие области CDR (Marks и др. BioTechnology (1992) 10: 779-783). Например, можно применять праймер примыкающий к 5'-концу указанного вариабельного домена, и праймер к третьему FR для получения репертуара последовательностей вариабельных доменов, в которых отсутствует CDR3. Этот репертуар можно объединить с CDR3 описанного антитела. Примененяя аналогичные методики, части описанной последовательности CDR можно перемешать с частями последовательностей CDR из других антител, чтобы обеспечить репертуар антигенсвязывающих фрагментов, которые связывают IL-22. Любой репертуар можно экспрессировать в системе хозяина, такой как фаговый дисплей (описанный в WO 92/01047 и соответствующем ей патенте США номер 5,969,108), таким образом, можно отобрать подходящие антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с IL-22.
H
L
H
L
[00159] В дополнительной альтернативе применяют неспецифический мутагенез описанных V или V последовательностей для получения измененных V или V доменов, все еще способных связывать IL-22. Методика с применением ошибочно-направленной ПЦР описана у Gram и др. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1992) 89. 3576-3580).
H
L
[00160] В другом способе применяется направленный мутагенез описанных V или V последовательностей. Такие методики описаны у Barbas и др. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1994) 91: 3809-3813) и Schier и др. (J. Mol. Biol. (1996)263:551-567).
H
L
[00161] Часть вариабельного домена будет содержать по меньшей мере одну CDR область по существу такую, как изложено в данной заявке и, возможно, промежуточные каркасные области из V или V доменов, как изложено в данной заявке. Указанная часть может содержать С-концевую половину FR1 и/или N-концевую половину FR4. Дополнительные остатки на N-конце или С-конце указанного вариабельного домена могут отличаться от остатков, которые присутствуют в природных антителах. Например, при конструировании антител с помощью методик рекомбинантной ДНК, часто вводятся N- или С-концевые остатки из применяемых линкеров. Некоторые линкеры можно использовать для соединения вариабельных доменов с другими вариабельными доменами (например, бивалентных антител, diabodies), константными доменами, или белковыми метками.
H
L
L
H
[00162] Хотя указанные варианты реализации, проиллюстрированные в Примерах, включают "подходящую" пару из V и V доменов, для специалиста в данной области очевидно, что альтернативные варианты реализации могут включать антигенсвязывающие фрагменты, содержащие только один CDR либо из V, либо из V домена. Любой из указанных одноцепочечных специфичных антигенсвязывающих доменов можно применять для скрининга на комплементарные домены, способные образовывать двухдоменный специфичный антигенсвязывающий фрагмент, способный, например, связываться с IL-22. Указанный скрининг можно совершить с помощью способов скрининга в системе фагового дисплея, применяя так называемый иерархический дуальный комбинаторный подход, раскрытый в WO 92/01047. В этом подходе, отдельную колонию, содержащую клон либо с Н, либо с L цепью, используют для заражения полной библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (L или Н), и получившийся двухцепочечный специфичный антигенсвязывающий домен отбирают в соответствии с описанными методиками фагового дисплея.
[00163] В некоторых альтернативных вариантах реализации, указанные анти-IL-22 антитела могут быть связаны с белком (например, альбумином) с помощью химического введения перекрестных сшивок или рекомбинантных способов. Описанные антитела могут также быть связаны с рядом небелковых полимеров (например, полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем или полиоксиалкиленами) такими способами, которые указаны в патентах США с номерами 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; или 4,179,337. Указанные антитела могут быть химически модифицированы путем ковалентного конъюгирования с полимером, например, для увеличения их времени полужизни в кровотоке. Примеры полимеров и способов присоединения показаны в Патентах США с номерами 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285 и 4,609,546.
[00164] Описанные антитела можно модифицировать, чтобы изменить их статус гликозилирования; а именно, по меньшей мере одну молекулу углевода можно удалить или добавить к указанному антителу. Делецию или добавление сайтов гликозилирования можно осуществить путем изменения последовательности аминокислот, чтобы удалить или создать консенсусные сайты гликозилирования, которые хорошо известны в данной области. Другими средствами добавления молекул углеводов являются химическое или ферментативное соединение гликозидов с аминокислотными остатками указанного антитела (см. WO 87/05330 и Aplin и др. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306). Удаление молекул углеводов можно также совершить химически или ферментативно (см. Hakimuddin и др. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52; Edge и др. (1981) Anal. Biochem., 118: 131; Thotakura и др. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350).
[00165] Способы изменения константной области антитела известны в данной области. Антитела с измененной функцией (например, измененной аффинностью к эффекторному лиганду, такие как FcR на клетке или компонент С1 системы комплемента) можно получить путем замещения по меньшей мере одного аминокислотного остатка в константной части указанного антитела на остаток другой аминокислоты (см., например, ЕР 388,151 А1, US 5,624,821 и US 5,648,260). Могут быть описаны похожие типы изменений, которые, если применяются к антителам мыши или другого вида, будут уменьшать или элиминировать похожие функции.
[00166] Например, возможно изменить аффинность Fc области антитела (например, IgG, такого как IgG человека) к FcR (например, Fc гамма R1) или C1q. Указанную аффинность можно изменить путем замещения по меньшей мере одного точно определенного остатка на по меньшей мере один остаток, имеющий подходящую функциональную группу в своей боковой цепи, или путем введения заряженной функциональной группы, такой как глутамат или аспартат, или, возможно, ароматического неполярного остатка, такого как фенилаланин, тирозин, триптофан или аланин (см., например, US 5,624,821).
[00167] Например, замещение остатка 297 (аспарагин) на аланин в константной области IgG значительно ингибирует рекрутинг эффекторных клеток, притом, что лишь незначительно снижает (уменьшение приблизительно в три раза) аффинность к C1q (см., например, US 5,624,821). Указанная нумерация остатков в тяжелой цепи соответствует европейскому перечню (см. Kabat и др., 1991 выше). Такая замена разрушает указанный сайт гликозилирования, и считают, что присутствие сахара необходимо для связывания Fc рецептора. Любую другую замену в этом сайте, которая разрушает указанный сайт гликозилирования, считают вызывающей сходное ослабление литической активности. Другие замены аминокислот, например, изменение любого одного из остатков 318 (Glu), 320 (Lys) и 322 (Lys), на Ala, также, как известно, нарушают связывание C1q с Fc областью антител IgG (см., например, US 5,624,821).
3
[00168] Можно получить модифицированные антитела, которые проявляют ослабленное взаимодействие с Fc рецептором. Например, было показано, что в IgG человека, который связывается с Fc гамма R1 рецептором человека, замена Leu 235 на Glu нарушает его взаимодействие с рецептором. Также можно получать мутации в примыкающих или близких сайтах в указанной шарнирной области антитела (например, замещение остатков 234, 236 или 237 на Ala) для влияния на аффинность антитела к указанному Fc гамма R1 рецептору. Указанная нумерация остатков в тяжелой цепи соответствует европейскому перечню (см. Kabat и др., 1991 выше).
Н
[00169] Дополнительные способы изменения литической активности антитела, например, путем изменения по меньшей мере одной аминокислоты в N-концевой области С2 домена, описаны в WO 94/29351, Morgan и др. и US 5,624,821.
131
99
[00170] Указанные антитела согласно настоящему изобретению можно пометить детектируемой или функциональной меткой. Такие метки включают радиоактивные метки (например, I или Tc), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза) и другие химические молекулы (например, биотин).
12
-1
11
-1
10
-1
9
-1
6
-1
50
50
50
50
50
50
50
50
[00171] Настоящее изобретение также описывает изолированное антитело, которое связывается с IL-22, в частности с IL-22 человека В некоторых вариантах реализации, указанное анти-IL-22 антитело имеет по меньшей мере один из следующих характерных признаков: (1) представляет собой моноклональное или моноспецифичное антитело; (2) представляет собой антитело человека; (3) представляет собой полученное in vitro антитело;. (4) представляет собой полученное in vivo антитело (например, в системе трансгенной мыши); (5) связывается с IL-22 с константой ассоциации, равной по меньшей мере 10 М; (6) связывается с IL-22 с константой ассоциации, равной по меньшей мере 10 М; (7) связывается с IL-22 с константой ассоциации, равной по меньшей мере 10 М; (8) связывается с IL-22 с константой ассоциации, равной по меньшей мере 10 М; (9) связывается с IL-22 с константой ассоциации, равной по меньшей мере 10 М; (10) связывается с IL-22 с константой диссоциации, равной 500 нМ или менее; (11) связывается с IL-22 с константой диссоциации, равной 10 нМ или менее; (12) связывается с IL-22 с константой диссоциации, равной 150 пМ или менее; (13) связывается с IL-22 с константой диссоциации, равной 60 пМ или менее; (14) ингибирует связывание IL-22 с рецептором IL-22R или с рецепторным комплексом, состоящим из IL-22R и IL-10R2, со значением IC, равным 10 нМ или менее; (15) блокирует опосредуемую IL-22 пролиферацию BaF3 клеток, в которые введен рецептор IL-22, со значением IC, равным 1 нМ или менее, в одном варианте реализации, со значением IC, равным 150 пикоМоль или менее, в другом варианте реализации, со значением IC, равным 100 пикоМоль или менее, в другом варианте реализации и со значением IC, равным 10 пикоМоль или менее, в другом варианте реализации, и (16) блокирует IL-22 опосредуемую секрецию GROa из НТ29 со значением IC, равным 1 нМ или менее, в одном варианте реализации, со значением IC, равным 150 пикоМоль или менее, в другом варианте реализации и со значением IC, равным 10 пикоМоль или менее, в другом варианте реализации.
[00172] Для специалиста в данной области очевидно, что указанные модификации, описанные выше, не являются всеисчерпывающими и что многие другие модификации являются очевидными для специалиста в данной области в свете концепции настоящего описания.
III. Нуклеиновые кислоты, клонирование и системы экспрессии
[00173] Настоящее описание обеспечивает выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие описанные антитела. Указанные нуклеиновые кислоты могут включать ДНК или РНК, и они могут быть синтетическими (полностью или частично) или рекомбинантными (полностью или частично). Ссылка на последовательность нуклеотидов, как изложено в данной заявке, охватывает молекулу ДНК с точно определенной последовательностью и охватывает молекулу РНК с точно определенной последовательностью, в которой U заменено на Т.
H
L
[00174] Также предусмотрены нуклеиновые кислоты, которые включают кодирующую последовательность для одного, двух или трех CDR, V домена, V домена, или их комбинации, как описано в данной заявке, или последовательность, по существу идентичную ей (например, последовательность по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную ей, или которая способна гибридизоваться в жестких условиях с описанными последовательностями).
[00175] В одном варианте реализации, указанные выделенные нуклеиновые кислоты имеют последовательности нуклеотидов, кодирующих вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи анти-IL-22 антитела, которое содержит по меньшей мере один CDR, выбранный из указанных последовательностей аминокислот: SEQ ID NO:8-13, 26-31, 44-49, 62-67, 80-85, 98-103, 116-121, 134-139, 152-157, 170-175, 188-193, 206-211, 224-229, 242-247, 260-265, 278-283, 296-301, 314- 319, 332-337, 350-355, 368-373, 386-391, 404-409, 422-427, 440-445, 458-463, 476-481, 494-499, 512-517, 530-535, 548-553, 566-571, 584-589, 602-607 или 620-625; или последовательность, кодирующую CDR, которая отличается на одну или две аминокислоты от описанных в данной заявке последовательностей.
1
2
3
4
1
2
1
[00176] Указанная нуклеиновая кислота может кодировать только вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи, или может также кодировать константную область легкой или тяжелой цепи антитела, функционально связанную с соответствующей вариабельной областью. В одном варианте реализации, указанная вариабельная область легкой цепи связана с константной областью, выбранной из константной области типов каппа или лямбда. Указанная константная область легкой цепи может также быть легкой цепью иммуноглобулина человека каппа или лямбда типа. В другом варианте реализации, указанная вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи изотипа антитела, выбранного из IgG (например, IgG, lgG, IgG, lgG), IgM, IgA, lgA, IgD и IgE. Указанная константная область тяжелой цепи может принадлежать к изотипу IgG (например, IgG).
[00177] Композиции нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, несмотря на то, что они часто содержат нативные последовательности (кДНК или геномных ДНК или их смесей), за исключением модифицированнных сайтов рестрикции и тому подобных, можно мутировать в соответствии со стандартными методиками для получения последовательностей генов. Для кодирующих последовательностей эти мутации могут требуемым образом влиять на последовательность аминокислот. В частности, предусмотрены последовательности нуклеотидов, по существу идентичные или полученные из нативных V, D, J, константных областей, последовательностей «переключателей» и других подобных последовательностей, описанных в данной заявке (где "полученные из" указывает на то, что последовательность является идентичной другой последовательности ее модификации).
[00178] В одном варианте реализации, указанная нуклеиновая кислота отличается (например, отличается на замену, вставку, или делецию) от приведенных последовательностей (например, как указано далее, на по меньшей мере один, но менее чем на 10, 20, 30 или 40 нуклеотидов, на по меньшей мере один, но менее чем на 1%, 5%, 10% или 20% от общего количества нуклеотидов в обсуждаемой нуклеиновой кислоте). Если необходимо, для данного анализа указанные последовательности нужно выровнять по максимальной гомологии. "Выпетленные" из-за делеций или вставок или несовпадений последовательности рассматриваются как различие. Указанное различие может быть в нуклеотиде(ах), кодирующем заменимый остаток(ки), или указанное различие может быть консервативной заменой(ами).
[00179] Настоящее описание также обеспечивает конструкции нуклеиновых кислот в форме плазмид, векторов, транскрипционных или экспрессионных кассет, которые содержат по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, как описано в данной заявке.
[00180] Настоящее описание дополнительно обеспечивает клетку-хозяина, которая содержит по меньшей мере одну конструкцию нуклеиновой кислоты, описанной в данной заявке.
H
L
[00181] Также предусмотрены способы получения кодируемого белка(ков) из указанной нуклеиновой кислоты (кислот), включающей последовательность, описанную в данной заявке. Указанный способ включает культивирование клеток-хозяев при подходящих условиях, таким образом, что они экспрессируют указанный белок с указанной нуклеиновой кислоты. После экспрессии и продукции, указанный V или V домен, или участника специфичного связывания, можно выделить и/или очистить с применением любой подходящей методики, а затем использовать, как необходимо. Указанный способ может также включать этапы слияния нуклеиновой кислоты, кодирующей scFv, с нуклеиновыми кислотами, кодирующими Fc часть антитела, и экспрессирования таких рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетке. Указанный способ может также включать этап эмбрионизации.
H
L
[00182] Антигенсвязывающие фрагменты, V и/или V домены, и кодирующие молекулы нуклеиновых кислот и векторы можно выделить и/или очистить из их естественной среды, в по существу чистой или гомогенной форме, или, в случае нуклеиновой кислоты, свободной или по существу свободной от нуклеиновой кислоты или генов отличного происхождения от такового для указанной последовательности, кодирующей полипептид с требуемой функцией.
[00183] Системы для клонирования и экспрессии полипептидов в ряде клеток-хозяев известны в данной области. Клетки, подходящие для продукции антител, описаны, например, в Fernandez и др. (1999) Gene Expression Systems, Academic Press, ред. Вкратце, подходящие клетки-хозяева включают клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, клетки дрожжей, или прокариотические клетки, например, Е. coli. Клетки млекопитающих, доступные в данной области для экспрессии гетерологичных полипептидов, включают лимфоцитарные линии клеток (например, клетки мышиной миеломы NSO), эмбриональные клетки почек человека НЕК293, клетки яичников китайского хомячка (СНО), клетки африканской зеленой мартышки COS, клетки карциномы шейки матки человека HeLa; клетки почек хомячков, клетки ооцитов, и клетки из трансгенного животного, например, эпителиальные клетки молочной железы. В одном варианте реализации, указанные GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 и 356А11 антитела экспрессируют в клетках НЕК293 или СНО. В другом варианте реализации, выборку антител, выбранных из 365А11, 354А08, 087В03 и 368D04, экспрессируют в клетках НЕК293 или СНО. В других вариантах реализации, указанные нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные антитела согласно настоящему изобретению, помещают под контроль тканеспецифичного промотора (например, специфичного промотора молочной железы), и указанные антитела продуцируют в трансгенных животных. Например, указанные антитела секретируются в молоко указанных трансгенных животных, таких как трансгенная корова, свинья, лошадь, овца, коза или грызун.
[00184] Подходящие векторы можно выбрать или сконструировать так, чтобы они содержали подходящие регуляторные последовательности, включая последовательности промотора, последовательности терминатора, последовательности полиаденилирования, последовательности энхансера, маркерные гены и другие последовательности. Указанные векторы могут также содержать плазмидную или вирусную основу. Для подробностей, см. Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-e изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Многие широко известные способы работы с векторами, включая манипуляции, получение, мутагенез, секвенирование, и трансфекцию ДНК, описаны в Current Protocols in Molecular Biology, второе издание, Ausubel и др. ред., John Wiley & Sons (1992).
[00185] Дополнительный аспект настоящего описания обеспечивает способ введения нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Для эукариотических клеток подходящие методики трансфекции могут включать трансфекцию фосфатом кальция, ДЭАЭ-декстраном, электропорацией, трансфекцию, опосредуемую липосомами, и трансдукцию с применением ретровируса или других вирусов, например, осповакцины или бакуловируса. Для бактериальных клеток, подходящие методики могут включать трансформацию хлоридом кальция, электропорацию и трансфекцию с применением бактериофага. После введения ДНК можно использовать методы селекции (например, резистентность к лекарственному средству) для отбора клеток, которые содержат указанную нуклеиновую кислоту.
IV. Применения анти-IL-22 антител
H
[00186] Анти-IL-22 антитела, которые действуют как антагонисты IL-22, можно применять для регуляции по меньшей мере одного IL-22-опосредуемого иммунного ответа, такого как воздействие на эпителиальные клетки в солидной ткани и опосредованная модуляция зависящих от него иммунных ответов, таких как блокировка экспансии субпопуляций Т-клеток, включая, например, T17 Т-клетки. В одном варианте реализации, антитела согласно настоящему изобретению применяются в способе регуляции иммунного ответа, указанный способ включает осуществление контакта IL-22 с антителом согласно настоящему изобретению, регулируя тем самым иммунный ответ. В одном варианте реализации, указанный иммунный ответ включает пролиферацию клеток, цитолитическую активность, секрецию цитокинов или секрецию химокинов.
[00187] В соответствии с этим, указанные антитела согласно настоящему изобретению можно применять для непосредственного или опосредованного ингибирования активности (например, пролиферации, дифференцировки, и/или выживаемости) иммунной или гематопоэтической клетки (например, клетки миелоидной, лимфоидной или эритроидной линии дифференцировки, или их клеток-предшественников), и, тем самым, можно применять для лечения ряда расстройств иммунной системы и гиперпролиферативных расстройств. Неограничивающие примеры расстройств иммунной системы, которые можно лечить, включают, но не ограничены ими, аутоиммунные расстройства, например, артрит (включая ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, псориатический артрит, артрит, связанный с волчанкой или анкилозирующий спондилит), склеродермию, системную красную волчанку, ВИЧ, синдром Шегрена, васкулит, множественный склероз, аутоиммунный тиреоидит, дерматит (включая атопический дерматит и экзематозный дерматит), миастению gravis, воспалительное заболевание кишечника (IBD), болезнь Крона, колит, сахарный диабет (I типа); воспалительные состояния, например, кожи (например, псориаз), сердечно-сосудистой системы (например, атеросклероз), нервной системы (например, болезнь Альцгеймера), печени (например, гепатит), почек (например, нефрит) и поджелудочной железы (например, панкреатит); сердечно-сосудистое заболевание, например, нарушения обмена холестерина, повреждения бескислородными радикалами, ишемию; расстройство, связанные с заживлением ран; респираторные расстройства, например, астму и ХОБЛ (например, муковисцидоз); острые воспалительные состояния (например, эндотоксикоз, сепсис и общее заражение, синдром токсического шока и инфекционное заболевание); отторжение трансплантата и аллергию. В одном варианте реализации, указанное связанное с IL-22 расстройство представляет собой артритическое расстройство, например, расстройство, выбранное из одного или более перечисленных: ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, псориатический артрит или анкилозирующий спондилит; респираторное расстройство (например, астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ); или воспалительное состояние, например, кожи (например, псориаз), сердечно-сосудистой системы (например, атеросклероз), нервной системы (например, болезнь Альцгеймера), печени (например, гепатит), почек (например, нефрит), поджелудочной железы (например, панкреатит), и органов желудочно-кишечного тракта, например, колит, болезнь Крона и IBD; острые воспалительные состояния, например, эндотоксикоз, сепсис и общее заражение, синдром токсического шока и инфекционное заболевание; полиорганная недостаточность; респираторное заболевание (ARD); амилоидоз; нефропатии, такие как гломерулосклероз, мембранозная нефропатия, ренальный артериосклероз, гломерулонефрит, фибропролиферативные заболевания почек, так же, как и другие дисфункции почек и опухоли почек. Вследствие действия IL-22 на эпителий анти-IL-22 антитела можно применять для лечения эпителиальных раков, например, карциномы, меланомы и других. Для описания основания ингибирования IL-22 в этих и других болезненных состояниях, см. WO 03/083062 (страницы 58-75).
[00188] Множественный склероз представляет собой заболевание центральной нервной системы, которое описывается воспалением и потерей миелиновых оболочек - жирового материала, который изолирует нервные волокна, и который необходим для их надлежащего функционирования. Воспаление, которое возникает в результате иммунного ответа, который зависит от IL-22, можно лечить указанными антителами и композициями согласно настоящему изобретению. В экспериментальном аутоиммунном энцефалите (ЕАЕ), модели на мышах для множественного склероза, (Tuohy и др. (J Immunol. (1988) 141: 1126-1130), Sobel и др. (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401), и Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129), лечение мышей инъекциями антител GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 или 356А11 перед (и затем продолжительно) индукцией ЕАЕ, могло серьезно задержать начало болезни. Это может служить моделью для подтверждения применения указанного антитела согласно настоящему изобретению. Указанные антитела согласно настоящему изобретению можно сходным образом применять для лечения множественного склероза у людей.
+
+
[00189] Артрит представляет собой заболевание, описываемое воспалением суставов. Ревматоидный артрит (РА) представляет собой наиболее частую форму артрита, включающую воспаление соединительной ткани и синовиальной мембраны, мембраны, которая выстилает сустав. Воспаленная синовиальная мембрана часто инфильтрирует сустав и повреждает суставной хрящ и кость. IL-22 и IL-22R белок и/или транскрипт связаны с обоими заболеваниями человека В синовиальном биопсийном материале РА, белок IL-22 обнаруживают в виментин синовиальных фибробластах и некоторых CD68 макрофагах, тогда как IL-22R обнаруживают в синовиальных фибробластах. Обработка синовиальных фибробластов IL-22 индуцирует продукцию моноцитарного хемоатрактантного белка-1, МСР-1, так же, как и общую метаболическую активность (Ikeuchi, H., и др. (2005) Arthritis Rheum. 52:1037-46). Ингибиторы IL-22 улучшают симптоматику ревматоидного артрита (WO 2005/000897 А2, патент США номер 6,939,545). Повышенную секрецию воспалительных цитокинов и хемокинов и, что более важно, усиленние заболевания в результате иммунных ответов, которые зависят от IL-22, можно лечить антителами согласно настоящему изобретению. Сходным образом, указанные антитела и композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения РА или других артритических заболеваний у людей.
[00190] Отторжение трансплантата представляет собой иммунологическое явление, когда ткани от донора специфично "атакуют" иммуноциты хозяина. Основными "атакующими" клетками являются Т-клетки, Т-клеточные рецепторы которых распознают МНС молекулы донора как "чужие". Это распознавание активирует Т-клетки, которые пролиферируют и секретируют множество цитокинов и цитолитических белков, которые в конечном счете разрушают трансплантат. Модели смешанной лимфоцитарной реакции (MLR) и трансплантации были описаны в Current Protocols in Immunology, второе издание, Coligan и др. ред., John Wiley & Sons, 1994; Kasaian и др. (Immunity (2002) 16: 559-569); Fulmer и др. (Am. J. Anat. (1963) 113: 273-285), и Lenschow и др. (Science (1992) 257: 789-792). Указанные антитела и композиции согласно настоящему изобретению можно применять для уменьшения MLR и лечения отторжения трансплантата и связанных с этим заболеваний, которые зависят от IL-22 (например, реакции "трансплантат против хозяина") у людей.
[00191] Антитела согласно настоящему изобретению можно также применять для лечения гиперпролиферативных расстройств, связанных с аберрантной активностью клеток, чувствительных к IL-22, и клеток, отвечающих на IL-22 R/IL-10R2, путем введения указанных антител в количестве, достаточном для ингибирования или снижения гиперпролиферации клеток, отвечающих на IL-22 и/или IL-22R и/или IL-10R2, у субъекта и позволения указанным антителам вылечить или предотвратить указанное расстройство. Экспрессия IL-22 и IL-22R является конститутивной в эпителиальных клетках в ряде тканей, включая, но не ограничиваясь перечисленными: поджелудочную железу, легкое, кожу, кишку, печень, почки (Kotenko, S.V. и др. (2001) J. Biol. Chem 276:2725-32, Xie, М.Н. и др. (2000) J. Biol. Chem.275:31335-9; Wolk, K. и др. (2004) Immunity 21:241 -54). Вдобавок, IL-22 рецепторный комплекс также экспрессируется на поверхности фибробластов из пораженного болезнью сустава и нормальной кишки (Ikeuchi, H. и др. (2005) Arthritis Rheum 52:1037-46, Andoh, А. и др. (2005) Gastroenterology 129:969-84). Неопластические производные этих типов клеток могут проявлять чрезмерный ответ на IL-22, что модулирует способность этих клеток выживать в организме. Следовательно, антитела к IL-22 можно применять для ингибирования прогрессирования таких новообразований, например, плоскоклеточных карцином, базально-клеточных карцином, переходно-клеточных папиллом и карцином, аденом, аденокарцином, диффузного рака желудка, инсулиномы, глюкагономы, гастриномы, ВИПомы, холангиокарциномы, гепатоклеточной карциномы, аденокистозной карциномы, карциноидной опухоли аппендикса, пролактиномы, онкоцитомы, аденомы из клеток Гюртле, почечно-клеточного рака, опухоли Гравитца, полиэндокринных аденом, эндометриоидной аденомы, новообразований придатков матки и придатков кожи, мукоэпидермоидных новообразований, кистозных, муцинозных и серозных новообразований, кистозной аденомы, псевдомиксомы брюшины, протоковых, дольковых и медуллярных новообразований, новообразований ацинарных клеток, сложных эпителиальных новообразований, опухоли Уортина, тимомы, специализированных новообразований гонад, опухолей стромы полового тяжа, текомы, гранулезоклеточной опухоли, арренобластомы, опухоли из клеток Сертоли-Лейдига, параганглиомы, феохромоцитомы, гломусной опухоли, меланоцитарного невуса, злокачественной меланомы, меланомы, узелковой меланомы, диспластического невуса, ограниченного предракового меланоза, поверхностно-распространяющейся меланомы или лентигиноза конечностей. Тогда как рецептор IL-22 не обнаруживается ex vivo на наивных или активированных иммуноцитах, нарушение регуляции указанного рецептора может сделать такие производные неопластические клетки отвечающими на IL-22 и, тем самым, ингибируемыми антителом к IL-22.
[00192] В другом своем аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ ослабления, ингибирования или снижения острофазового ответа у субъекта. Указанный способ включает введение субъекту анти-IL-22 антитела или его фрагмента, как описано в данной заявке, в количестве, достаточном для ослабления, ингибирования или уменьшения острофазового ответа у субъекта. В одном варианте реализации, указанный субъект представляет собой млекопитающее, например человека, страдающего от связанного с IL-22 расстройства, как описано в данной заявке, включая, например, респираторные расстройства, воспалительные расстройства и аутоиммунные расстройства. В одном варианте реализации, указанный агент, связывающий IL-22, вводят локально, например, местно, подкожно, или другими путями введения, без введения в системное кровообращение.
[00193] Считают, что IL-22 оказывает свое воспалительное действие локально, например, путем действия (например, непосредственного действия) в качестве модулятора или регулятора тканевого воспаления в противоположность прямому системному действию. В соответствии с этим, ингибирование активности IL-22, с применением, например, анти-IL-22 антитела согласно настоящему изобретению, может обеспечить более эффективный (например, менее токсичный) тканеспецифичный, противовоспалительный агент, чем системные противовоспалительные процедуры. Более того, ингибирование IL-22 локально с применением, например, анти-IL-22 антитела, или его фрагмента, описанного в данной заявке, может обеспечить полезный компонент для комбинации с системными противовоспалительными процедурами.
V. Комбинированная терапия
[00194] В одном варианте реализации, фармацевтическую композицию, которая содержит по меньшей мере одно анти-IL-22 антитело и по меньшей мере один терапевтический агент, вводят в рамках комбинированной терапии. Указанная терапия полезна для лечения патологических состояний или расстройств, таких как иммунные и воспалительные расстройства. Термин "в комбинации" в данном контексте означает, что указанную композицию антител и указанный терапевтический агент дают по существу в одно время, либо одновременно, либо последовательно. В одном варианте реализации, при введении последовательно, при начале введения второго соединения, первое из двух указанных соединений все еще детектируется в эффективных концентрациях в месте обработки. В другом варианте реализации, при введении последовательно, при начале введения второго соединения, первое из двух указанных соединений уже не детектируется в эффективных концентрациях в месте обработки.
[00195] Например, указанная комбинированная терапия может включать по меньшей мере одно анти-IL-22 антитело, находящееся в одной лекарственной форме и/или одновременно вводимое с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом. Указанные дополнительные агенты могут включать по меньшей мере один ингибитор цитокина, ингибитор фактора роста, иммуносупрессант, противовоспалительный агент, ингибитор метаболизма, ингибитор фермента, цитотоксический агент и цитостатический агент, как описано более подробно ниже. В одном варианте реализации, указанный дополнительный агент представляет собой стандартное лекарство от артрита, включая, но не ограничиваясь перечисленными: средства нестероидной противовоспалительной терапии (НСПВТ); кортикостероиды, включая преднизолон, преднизон, кортизон, и триамцинолон; и базовые противоревматические препараты, модифицирующие течение болезни (БПРП), такие как метотрексат, гидроксихлорохин (Плаквенил) и сульфасалазин, Лефлуномид (Арава), ингибиторы фактора некроза опухоли, включая этанерцепт (Энбрел), инфликсимаб (Ремикад) (с метотрексатом или без), и Адалимумаб (Хумира), анти-CD20 антитело (например, Ритуксан), растворимый рецептор интерлейкина-1, такой как анакинра (Кинерет), золото, миноциклин (Миноцин), пеницилламин, и цитотоксические агенты, включая азатиоприн, циклофосфамид и циклоспорин. Такая комбинированная терапия может преимущественно позволить применение более низких дозировок вводимых терапевтических агентов, тем самым позволяя избежать возможной токсичности или осложнений, связанных с рядом монотерапий. Более того, указанные дополнительные терапевтические агенты, описанные в данной заявке, действуют на тех же путях передачи сигналов или на путях, отличных от IL-22/IL-22R/IL-10R2 пути передачи сигналов и, тем самым, как ожидается, усиливают и/или обладают синергичным действием с анти-IL-22 антителами.
[00196] Терапевтическими агентами, применяемыми в комбинации с анти-IL-22 антителами, могут быть такие агенты, которые вмешиваются на различных стадиях в аутоиммунный и последующий воспалительный ответ. В одном варианте реализации, по меньшей мере одно анти-IL-22 антитело, описанное в данной заявке, может входить в состав лекарственного средства и/или вводиться одновременно с по меньшей мере одним цитокином и/или антагонистом фактора роста. Указанные антагонисты могут включать растворимые рецепторы, пептидные ингибиторы, малые молекулы, белки слияния с лигандом, антитела и их связывающие фрагменты (которые связывают цитокины или факторы роста или их рецепторы, или другие молекулы на поверхности клетки), и "противовоспалительные цитокины" и их агонисты.
[00197] Неограничивающие примеры указанных агентов, которые можно применять в комбинации с анти-IL-22 антителами, описанными в данной заявке, включают, но не ограничены ими: антагонисты по меньшей мере одного интерлейкина (например, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 (или одной из его субъединиц, р35 или р40), IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A-F (включая их гетеродимеры, например, гетеродимер IL-17A/IL-17F), IL-18, IL-19, IL-20, IL-21 и IL-23 (или одной из его субъединиц, р19 или р40); цитокина (например, TNFα, LT, EMAP-II и GM-CSF); и фактора роста (например, FGF и PDGF). Указанные агенты могут также включать, не ограничиваясь перечисленными, антагонисты по меньшей мере одного рецептора для интерлейкина, цитокина, и фактора роста. Анти-IL-22 антитела также могут быть объединены с ингибиторами (например, антителами или их связывающими фрагментами) молекул на поверхности клетки, таких как CD2, CD3, CD4, CDS, CD20 (например, Ритуксан), CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (В7.1), CD86 (В7.2), CD90, или их лигандов (например, CD154 (g39, CD40L)), или LFA-1/ICAM-1 и VLA-4/VCAM-1 (Yusuf-Makagiansar и др. (2002) Med. Res. Rev. 22(2):146-67)) В некоторых вариантах реализации, антагонисты, которые можно применять в комбинации с анти-IL-22 антителами, описанными в данной заявке, могут включать антагонисты IL-1, IL-12 (или одной из его субъединиц, р35 или р40), TNFα, IL-15, IL-17A-F (включая их гетеродимеры, например, гетеродимер IL-17A/IL-17F), IL-18, IL-19, IL-20, IL-21 и IL-23 (или одной из его субъединиц, р19 или р40), и их рецепторов.
[00198] Примеры таких агентов включают антагонисты IL-12 (такие, как антитела, которые связывают IL-12 (см., например, WO 00/56772) или одну из его субъединиц, р35 или р40); ингибиторы рецептора IL-12 (такие, как антитела к рецептору IL-12); и растворимый рецептор IL-12 и его фрагменты. Примеры антагонистов IL-15 включают антитела против IL-15 или его рецептора, растворимые фрагменты рецептора IL-15 и IL-15-связывающие белки. Примеры антагонистов IL-18 включают антитела к IL-18, растворимые фрагменты рецептора IL-18, и IL-18-связывающие белки (IL-18CБ, Mallet и др (2001) Circ. Res. 28). Примеры антагонистов IL-1 включают ингибиторы интерлейкин-1 конвертирующего фермента (ICE) (такие, как Vx740), антагонисты IL-1 (например, IL-1RA (ANIKINRA (или Кинерет), AMGEN)), растворимый IL-1RII (Immunex) и антитела к рецептору IL-1.
[00199] В одном варианте реализации, указанная комбинированная терапия включает по меньшей мере одно анти-IL-22 антитело, находящееся в одной лекарственной форме и/или одновременно вводимое с антагонистом, таким, как антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или растворимый рецептор, по меньшей мере одного из IL-17A, IL-17F, гетеродимера IL-17A/IL-17F или IL-23 (или одной из его субъединиц, р19 или р40).
TM
[00200] Примеры антагонистов TNF включают антитела к TNF (например, TNFα человека), такие как D2E7 (анти-TNFα антитело человека, US 6,258,562, Humira™, BASF); CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (гуманизированные анти-TNFa антитела, Celltech/Pharmacia); сА2 (химерное анти-TNFα антитело, Remicade™, Centocor); и анти-TNF фрагменты антител (например, CPD870). Другие примеры включают растворимые фрагменты и производные рецептора TNF (например, р55 или р75 человека), такие, как р55 кДа TNFR-IgG (55 кДа химерный белок TNF рецептор-IgG, Lenercept™) и 75 кДа TNFR-IgG (75 кДа химерный белок TNF рецептор-IgG, Enbrel, Immunex, см, например, Arthritis & Rheumatism (1994) том 37, S295; J. Invest. Med. (1996) том 44; 235A). Дополнительные примеры включают антагонисты ферментов (например, ингибиторы TNFα-конвертирующего фермента (ТАСЕ), такие, как производное альфа-сульфонил-гидроксамовой кислоты (WO 01/55112) или ингибитор N-гидроксиформамид (GW 3333, -005 или -022)) и TNF- СБ/p-TNFR (растворимый TNF-связывающий белок, см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) том 39, номер 9 (приложение), стр.284; и Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. (1995) том 268, стр.37-42). Антагонистами TNF могут быть растворимые фрагменты и производные рецептора TNF (например, р55 или р75 человека), такие как 75 кДа TNFR-IgG; и ингибиторы TNFa-конвертирующего фермента (ТАСЕ).
[00201] В других вариантах реализации, указанные анти-IL-22 антитела, описанные в данной заявке, можно вводить в комбинации с по меньшей мере одним из следующего: антагонисты IL-13, такие как растворимые рецепторы IL-13 и/или анти-IL-13 антитела; и антагонисты IL-2, такие как IL-2 слитые белки (например, DAB 486-IL-2 и/или DAB 389-IL-2, Seragen, см., например, Arthritis & Rheumatism (1993) том 36, 1223) и анти-IL-2R антитела (например, анти-Тас (гуманизированное антитело, Protein Design Labs, см. Cancer Res. 1990 Mar 1,50(5): 1495-502)). Другая комбинация включает анти-IL-22 антитела в комбинации с необедняющими анти-CD4 ингибиторами, такими, как IDEC-CE9.1/SB 210396 (анти-CD4 антитело, IDEC/SmithKline). Другие дополнительные комбинации включают анти-IL-22 антитела с антагонистами (такими, как антитела, растворимые рецепторы или антагонистические лиганды) костимуляторных молекул, таких, как CD80 (В7.1) и CD86 (В7.2); ICOSL, ICOS, CD28 и CTLA4 (например, CTLA4-Ig (atabacept)); гликозилированным белком Р-селектин лигандом (PSGL); и противовоспалительными цитокинами и их агонистами (например, антителами). Указанные противовоспалительные цитокины могут включать IL-4 (DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000, рекомбинантный IL-10, DNAX/Schenng); IL-13; и ТGF.
[00202] В других вариантах реализации, по меньшей мере одно анти-IL-22 антитело может находиться в одной лекарственной форме и/или одновременно вводиться с по меньшей мере одним противовоспалительным лекарственным препаратом, иммуносупрессантом, ингибитором метаболизма, и ферментативным ингибитором. Неограничивающие примеры лекарственных препаратов или ингибиторов, которые можно применять в комбинации с антагонистами IL-22, описанными в данной заявке, включают, но не ограничены перечисленными, по меньшей мере одно из следующего: средства нестероидной противовоспалительной терапии (НСПВТ); (такие, как ибупрофен, Tenidap (см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) том 39, номер 9 (приложение), стр.280)), Напроксен (см, например, Neuro Report (1996) том 7, стр.1209-1213), Мелоксикам, Пироксикам, Диклофенак и Индометацин), Сульфасалазин (см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) том 39, номер 9 (приложение), стр 281); кортикостероиды (такие, как преднизолон), подавляющее цитокины противовоспалительное средство (CSAID); и ингибитор биосинтеза нуклеотидов (такой, как ингибитор биосинтеза пуринов (например, антагонист фолата, такой, как метотрексат) и ингибитор биосинтеза пиримидинов (например, ингибитор дигидрооротат дегидрогеназы (ДГОДГ), такой, как лефлуномид (см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) том 39, номер 9 (приложение), стр.131; Inflammation Research (1996) том 45, стр.103-107)). Терапевтические агенты для применения в комбинации с IL-22/IL-22R или IL-22/IL-10R2 антагонистами могут включать НСПВТ, CSAID, ДГОДГ ингибиторы (такие, как лефлуномид), и антагонисты фолата (такие, как метотрексат).
[00203] Примеры дополнительных ингибиторов включают по меньшей мере одно из следующего: кортикостероид (пероральный, ингаляционный и для местной инъекции); иммуносупрессант (такой, как циклоспорин и такролимус (FK-506)); ингибитор mTOR (такой, как сиролимус (рапамицин) или производное рапамицина (например, эфирное производное рапамицина, такое, как CCl-779 (Elit. L. (2002) Current Opinion Investig. Drugs 3(8): 1249-53; Huang, S. и др. (2002) Current Opinion Investig. Drugs 3(2):295-304))); агент, который препятствует передаче сигналов провоспалительных цитокинов, таких, как TNFα и IL-1 (например, IPAK, NIK, IKK, р38 или ингибитор MAP киназы); ингибитор СОХ2 (например, целекоксиб и его варианты (МК-966), см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Том 39, номер 9 (приложение), стр.81); ингибитор фосфодиэстеразы (такой, как R973401, см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Том 39, номер 9 (приложение), стр.282)); ингибитор фосфолипазы (например, ингибитор цитозольной фосфолипазы А2 (cPLA2), такой, как аналоги трифторметилкетона (US 6,350,892)); ингибитор фактора роста эндотелия сосудов (VEGF); ингибитор рецептора VEGF; и ингибитор ангиогенеза. Терапевтические агенты для приемения в комбинации с анти-IL-22 антителами могут включать иммуносупрессанты (такие, как циклоспорин и такролимус (FK-506)); и ингибиторы mTOR (такие, как сиролимус (рапамицин) или производные рапамицина (например, эфирное производное рапамицина, такое, как CCI-779)); ингибиторы СОХ2 (такие, как целекоксиб и его варианты); и ингибиторы фосфолипазы (такие, как ингибиторы цитозольной фосфолипазы А2 (cPLA2) (например, аналоги трифторметилкетона)).
[00204] Примеры терапевтических агентов, которые можно вводить и/или включать в лекарственную форму совместно с по меньшей мере одним анти-IL-22 антителом, включают, но не ограничены перечисленным, по меньшей мере одно из следующего: антагонисты TNF (такие, как анти-TNF антитела); растворимые фрагменты рецепторов TNF (например, р55 и р75 человека) и их производные (такие, как р55 кДа TNFR-IgG (55 кДа химерный белок TNF рецептор-IgG, Lenercept™) и 75 кДа TNFR-IgG (75 кДа химерный белок TNF рецептор-IgG, Enbrel™)); антагонисты ферментов TNF (такие, как ингибиторы ТАСЕ); антагонисты IL-12 (или одной из его субъединиц, р35 или р40), IL-15, IL-17A-F (включая их гетеродимеры, например, гетеродимер IL-17A/IL-17F), IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22 и IL-23 (или одна из его субъединиц, р19 или р40), агенты, обедняющие Т-клетками и В-клетками (такие, как анти-СD4 или анти-CD22 антитела); низкомолекулярные ингибиторы (такие, как метотрексат и лефлуномид); сиролимус (рапамицин) и их аналоги (такие, как CCI-779), ингибиторы СOX2 и cPLA2; p38, TPL-2, Mk-2 и ингибиторы NFkB; рецептор к продуктам повышенного гликозилирования AGE (RAGE) и растворимый RAGE; ингибиторы Р-селектина и PSGL-1 (такие, как антитела к ним и низкомолекулярные ингибиторы); и агонисты эстрогенового рецептора бета (ERB), и антагонисты ERB-NFkB. Терапевтические агенты, которые можно вводить вместе и/или вводить в состав лекарственного средства вместе с по меньшей мере одним анти-IL-22 антителом, могут включать по меньшей мере один из перечисленных: растворимый фрагмент рецептора TNF (например, р55 или р75 человека), такой, как 75 кДа TNFR-IgG (75 кДа химерный белок TNF рецептор-IgG, Enbrel™); метотрексат; лефлуномид; и сиролимус (рапамицин) и их аналоги (такие, как ССI-779).
[00205] Анти-IL-22 антитела, раскрытые в данной заявке, можно применять в комбинации с другими терапевтическими агентами для лечения специфичных расстройств иммунной системы, как обсуждается в дополнительных деталях ниже.
[00206] Неограничивающие примеры агентов для лечения артритических расстройств (например, ревматоидного артрита, воспалительного артрита, ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, остеоартрита и псориатического артрита), с которыми можно комбинировать анти-IL-22 антитела, включают по меньшей мере одно из следующего: TNF антагонисты (такие, как анти-TNF антитела); растворимые фрагменты рецепторов TNF (например, р55 и р75 человека) и их производные (такие, как р55 кДа TNFR-IgG (55 кДа химерный белок TNF рецептор-IgG, Lenercept™) и 75 кДа TNFR-IgG (75 кДа химерный белок TNF рецептор-IgG, Enbrel™)); антагонисты фермента TNF (такие, как ингибиторы ТАСЕ); антагонисты IL-12 (или одной из его субъединиц, р35 или р40), IL-15, IL-17A-F (включая их гетеродимеры, например, гетеродимер IL-17A/IL-17F), IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-23 (или одной из его субъединиц, р19 или р40) и IL-24; агенты, обедняющие Т-клетками и В-клетками (такие, как анти-CD4, анти-CD20 или анти-CD22 антитела); низкомолекулярные ингибиторы (такие, как метотрексат и лефлуномид); сиролимус (рапамицин) и их аналоги (например, CCI-779); ингибиторы Сох-2 и cPLA2; NSAID; p38, TPL-2, Mk-2, и ингибиторы NFkB; RAGE или растворимый RAGE; ингибиторы Р-селектина или PSGL-1 (такие, как низкомолекулярные ингибиторы и антитела к ним); агонисты эстрогенового рецептора бета (ERB), и антагонисты ERB-NFkB.
Терапевтические агенты, которые можно вводить вместе и/или вводить в состав лекарственного средства вместе с по меньшей мере одним антагонистом IL-22/IL-22R/IL-10R2, могут включать по меньшей мере один из перечисленных растворимый фрагмент рецептора TNF (например, р55 или р75 человека), такой, как 75 кДа TNFR-IgG (75 кДа химерный белок TNF рецептор-IgG, Enbrel™); метотрексат; лефлуномид; и сиролимус (рапамицин) или их аналоги (например, CCI-779).
[00207] Неограничивающие примеры агентов для лечения множественного склероза, с которыми можно комбинировать анти-IL-22 антитела, включают интерферон-β, например, интерферон-β-1а и интерферон-β-1b), Копаксон, кортикостероиды, ингибиторы IL-1, ингибиторы TNF, антитела к лиганду CD40, антитела к CD80, и антагонисты IL-12, включая антитела, которые связывают IL-12 (или одну из его субъединиц, р35 или р40).
[00208] Неограничивающие примеры агентов для лечения воспалительного заболевания кишечника или болезни Крона, с которыми можно комбинировать анти-IL-22 антитела, включают будесонид; эпидермальный фактор роста; кортикостероиды; циклоспорин; сульфасалазин; аминосалицилаты; 6-меркаптопурин; азатиоприн; метронидазол; ингибиторы липоксигеназы; месаламин; олсалазин; балсалазид; антиоксиданты; ингибиторы тромбоксана; антагонисты рецептора IL-1; анти-IL-1 моноклональные антитела; анти-IL-6 моноклональные антитела; факторы роста; ингибиторы эластазы; соединения пиридинила-имидазола; антагонисты TNF, как описано в данной заявке; IL-4, IL-10, IL-13, и/или TGFp или их агонисты (например, агонисты антитела); IL-11; конъюгированные с глюкуронидом или декстраном пролекарственные формы преднизолона, дексаметазон или будесонид; антисмысловые фосфоротиоатные олигодезоксинуклеотиды IСАМ-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc); растворимый рецептор комплемента 1 (ТР10, Т cell Sciences, Inc); месалазин с замедленным высвобождением, метотрексат; антагонисты фактора активации тромбоцитов (PAF), ципрофлоксацин; и лигнокаин.
[00209] В других вариантах реализации, анти-IL-22 антитела можно применять в комбинации с по меньшей мере одним антителом, направленным на другие мишени, участвующие в регуляции иммунных ответов, например, отторжении трансплантата или реакции «трансплантат против хозяина». Неограничивающие примеры агентов для лечения иммунных ответов, с которыми можно комбинировать антагонист IL-22/IL-22R/IL10R2 согласно настоящему изобретению, включают следующие: антитела против молекул поверхности клетки, включая, но не ограничиваясь перечисленными: CD25 (IL-2 рецептор α), CD11a (LFA-1), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (В7-1), CD86 (В7-2), или их комбинации. В другом варианте реализации, анти-IL-22 антитело применяют в комбинации с по меньшей мере одним общим иммунодепрессивным средством, таким, как циклоспорин А или FK506.
[00210] Другой аспект настоящего изобретения в соответствии с этим относится к наборам для осуществления комбинированного введения указанных анти-IL-22 антител с другими терапевтическими агентами. В одном варианте реализации, указанный набор включает по меньшей мере одно анти-IL-22 антитело, включенное в фармацевтический носитель, и по меньшей мере один терапевтический агент, находящийся в подходящей лекарственной форме, в одном или более отдельных фармацевтических препаратах.
VI. Диагностические применения
[00211] Указанные антитела можно также применять для обнаружения присутствия IL-22 в биологических образцах. Путем соотношения присутствия или уровня этих белков с патологическим состоянием специалист в данной области может диагностировать указанное патологическое состояние. Например, IL-22 индуцирует изменения, связанные с таковыми, вызываемыми воспалительными цитокинами (такими, как IL-1 и TNFα), и ингибиторы IL-22 улучшают симптомы ревматоидного артрита (WO 2005/000897 А2). Иллюстративные патологические состояния, которые можно диагностировать указанными антителами согласно настоящему изобретению, включают множественный склероз, ревматоидный артрит, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, панкреатит и отторжение трансплантата.
[00212] Основанные на антителах способы обнаружения хорошо известны в данной области техники, и включают ELISA, радиоиммунологические способы анализа, иммуноблоттинг, Вестерн-блоттинг, проточную цитометрию, иммунофлюоресценцию, иммунопреципитацию и другие сходные методики. Указанные антитела могут входить в диагностический набор, который включает по меньшей мере одну из этих процедур детекции IL-22. Указанный набор может содержать другие компоненты, упаковку, инструкции или другой материал, способствующий обнаружению указанного белка и использованию набора.
[00213] Антитела могут быть модифицированы детектируемыми маркерами, включая группы лигандов (например, биотин), флюорофоры и хромофоры, радиоактивные изотопы, электронно-плотные реагенты, или ферменты. Ферменты детектируются по своей активности. Например, пероксидаза хрена определяется по ее способности превращать тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, измеримый количественно с помощью спектрофотометра. Другие подходящие связывающиеся партнеры включают биотин и авидин, IgG и белок А, и другие пары рецептор - лиганд, известные в данной области.
[00214] Антитела могут также быть функционально связаны (например, с помощью химического связывания, генетического слияния, нековалентного связывания или другим образом) с по меньшей мере одним другим молекулярным соединением, таким, как другое антитело (например, биспецифичное или мультиспецифичное антитело), токсины, радиоактивные изотопы, цитотоксические или цитостатические агенты, в числе прочих. Другие преобразования и возможности очевидны для средних специалистов в данной области, и они рассматриваются эквивалентами, входящими в объем настоящего изобретения.
VII. Фармацевтические композиции и способы их введения
[00215] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения охватывают композиции, которые содержат антитела согласно настоящему изобретению. Указанные композиции могут быть подходящими для фармацевтического применения и введения пациентам. Указанные композиции содержат антитело согласно настоящему изобретению и фармацевтическое вспомогательное вещество. При использовании в данной заявке, "фармацевтическое вспомогательное вещество" включает растворители, диспергент, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты, и т.д., которые совместимы с введением фармацевтического препарата. Применение этих агентов для фармацевтически активных субстанций хорошо известно в данной области. Указанные композиции могут также содержать другие активные соединения, обеспечивая вспомогательные, дополнительные или улучшенные терапевтические функции. Указанные фармацевтические композиции могут также быть заключены в контейнер, упаковку или диспенсер вместе с инструкциями по введению.
[00216] Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению формулируют таким образом, что она является совместимой с планируемым путем ее введения. Способы осуществления введения известны специалистам в данной области. Фармацевтические композиции можно вводить местно или перорально, или через слизистые мембраны. Примеры введения фармацевтической композиции включают пероральный прием внутрь или ингаляцию. Введение может также быть внутривенным, интраперитонеальным, внутримышечным, внутриполостным, подкожным, кожным или трансдермальным.
[00217] Растворы или суспензии, применяемые для внутрикожного или подкожного введения, обычно содержат по меньшей мере один из следующих компонентов: стерильный разбавитель, такой, как вода, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другой синтетический растворитель; антибактериальные агенты, такие, как бензиловый спирт или метилпарабены, антиоксиданты, такие, как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие, как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA); буферы, такие, как ацетатный, цитратный, или фосфатный; и средства, поддерживающие тоничность, такие, как хлорид натрия или декстроза. рН можно подвести с помощью кислот или оснований. Такие препараты можно заключить в ампулы, шприцы одноразового использования или виалы, содержащие множество доз.
[00218] Растворы или суспензии, применяемые для внутривенного введения, содержат носитель, такой, как физиологический раствор, бактериостатическая вода, Cremophor EL™ (BASF, Парсиппани, Нью-Джерси), этанол, или полиол. Во всех случаях, указанная композиция должна быть стерильной и жидкой для легкого прохождения через шприц. Надлежащая текучесть может быть достигнута с применением лецитина или поверхностно-активных веществ. Указанная композиция должна также быть стабильной при определенных условиях изготовления и хранения. Предохранения от микроорганизмов можно достичь, применяя антибактериальные и противогрибковые агенты, например, парабены, хлоробутанол, фенол, аскорбиновую кислоту, тимеросал, и т.д. Во многих случаях, изотонические агенты (сахар), полиспирты (маннитол и сорбитол) или хлорид натрия могут быть включены в композицию. Пролонгированного всасывания указанной композиции можно достичь путем добавления агента, который замедляет всасывание, например, моностеарат алюминия и желатин.
[00219] Пероральные композиции содержат инертный разбавитель или пищевой носитель. Указанная композиция может быть заключена в желатин или спрессована в таблетки. Для перорального введения указанные антитела могут быть объединены со вспомогательными веществами и помещены в таблетки, пастилки или капсулы. Фармацевтически совместимые связывающие агенты или адъювантные материалы могут быть включены в указанную композицию. Указанные таблетки, пастилки и капсулы могут содержать (1) связующее вещество, такое, как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; (2) вспомогательное вещество, такое, как крахмал или лактоза, (3) дезинтегрирующий агент, такой, как альгиновая кислота, Primogel, или кукурузный крахмал; (4) лубрикант, такой, как стеарат магния; (5) вещество, облегчающее скольжение, такое, как коллоидный диоксид кремния; или (6) подслащивающее вещество или вкусовую добавку.
[00220] Указанную композицию можно также вводить трансмукозальным или трансдермальным путем. Например, антитела, которые включают Fc фрагмент, могут быть способны проходить через слизистые мембраны в кишечном тракте, во рту или в легких (посредством Fc рецепторов). Трансмукозальное введение можно осуществлять с использованием таблеток для рассасывания, назальных спреев, ингаляторов или суппозиториев Трансдермальное введение можно также осуществить с помощью применения композиции, содержащей смазки, мази, гели или крема, известные в данной области. Для трансмукозального или трансдермального введения, применяют пенетранты (вещества усиливающие всасывание), подходящие для преодоления барьера, сквозь который нужно проникнуть. Для введения путем ингаляции, указанные антитела вводят в аэрозольной струе из контейнера, находящегося под давлением, или диспенсера, который содержит пропеллент (например, жидкость или газ) или небулайзер.
[00221] В некоторых вариантах реализации, антитела согласно настоящему изобретению входят в состав вместе с носителями для защиты указанных антител от быстрого выведения из организма. Часто используют биоразлагаемые полимеры (например, этиленвиниловый ацетат, полиангидриды, полигликолиевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры, полимолочную кислоту). Способы приготовления таких лекарственных форм известны специалистам в данной области. Липосомальные суспензии также можно использовать как фармацевтически приемлемые носители. Липосомы можно получить, следуя установленным способам, известным в данной области (патент США номер 4,522,811).
[00222] Антитела или композиции антител согласно настоящему изобретению вводят в терапевтически эффективных количествах, как было описано. Терапевтически эффективные количества могут варьироваться в зависимости от возраста субъекта, состояния его здоровья, пола и тяжести патологического состояния. Подходящие дозировки может определить лечащий врач на основании клинических показаний. Указанные антитела или композиции можно вводить в болюсной дозе для максимального увеличения уровня циркулирующих в кровотоке антител на наибольший период времени. Продолжительная инфузия может также применяться после болюсной дозы.
[00223] При использовании в данной заявке, подразумевается, что термин "субъект" охватывает как человека, так и отличного от человека животного. Субъекты могут включать пациента-человека, имеющего расстройство, характеризуемое клетками, которые экспрессируют IL-22, например, раковыми клетками или иммунными клетками. Термин "отличное от человека животное" согласно настоящему изобретению включает всех позвоночных, таких, как не относящиеся к человеку приматы, овцы, собаки, коровы, цыплята, амфибии, рептилии и т.д.
[00224] Примеры диапазонов дозировок, которые можно вводить субъекту, могут быть выбраны из: от 1 мкг/кг до 20 мг/кг, от 1 мкг/кг до 10 мг/кг, от 1 мкг/кг до 1 мг/кг, от 10 мкг/кг до 1 мг/кг, от 10 мкг/кг до 100 мкг/кг, от 100 мкг/кг до 1 мг/кг, от 250 мкг/кг до 2 мг/кг, от 250 мкг/кг до 1 мг/кг, от 500 мкг/кг до 2 мг/кг, от 500 мкг/кг до 1 мг/кг, от 1 мг/кг до 2 мг/кг, от 1 мг/кг до 5 мг/кг, от 5 мг/кг до 10 мг/кг, от 10 мг/кг до 20 мг/кг, от 15 мг/кг до 20 мг/кг, от 10 мг/кг до 25 мг/кг, от 15 мг/кг до 25 мг/кг, от 20 мг/кг до 25 мг/кг и от 20 мг/кг до 30 мг/кг (или выше). Эти дозировки можно вводить ежедневно, еженедельно, раз в две недели, ежемесячно или реже, например, дважды в год, в зависимости от дозировки, способа введения, расстройства или симптома(ов), которые нужно вылечить, и индивидуальных особенностей субъекта. Дозировки можно также вводить путем продолжительной инфузии (такой, как с помощью насоса). Вводимая доза может также зависеть от пути введения. Например, подкожное введение может требовать более высокой дозировки, чем внутривенное введение.
[00225] При определенных обстоятельствах, может оказаться предпочтительным сформулировать композиции в виде лекарственной формы, содержащей одну дозу, для облегчения введения и равномерности дозировки. Лекарственная форма, содержащая одну дозу, как используется в данной заявке, относится к физически отдельным единицам, подходящим указанному пациенту. Каждая единичная доза содержит заранее определенное количество антител, рассчитанное таким образом, чтобы оно вызывало терапевтический эффект, совместно с указанным носителем. Указанная единичная доза зависит от свойств указанного антитела и конкретного терапевтического эффекта, которого нужно достигнуть.
50
50
50
50
[00226] Токсичность и терапевтическую эффективность указанной композиции можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур в культурах клеток или на экспериментальных животных, например, определяя LD (доза, летальная для 50% популяции) и ED (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции). Соотношение доз между токсичностью и терапевтическими эффектами представляет собой терапевтический индекс, и его можно выразить, как LD/ED Антитела, которые проявляют высокие терапевтические индексы, могут быть менее токсичны и/или более терапевтически эффективны.
50
50
[00227] Данные, полученные в результате тестов на культурах клеток и исследований животных, можно применять для определения диапазона дозировки для людей. Указанная дозировка этих соединений может лежать в диапазоне концентраций циркулирующих в крови антител, который включает ED с малой токсичностью или с отсутствием токсичности. Указанная дозировка может изменяться в рамках этого диапазона, в зависимости от дозировки используемой формы композиции и пути введения. Для любого антитела, которое применяют в соответствии с настоящим изобретением, терапевтически эффективную дозу можно изначально оценить, применяя тесты на культуре клеток. Доза может быть определена в моделях на животных для достижения циркулирующего в плазме диапазона концентраций, который включает IC (а именно, концентрации антител, которая обеспечивает половину от максимального ингибирования симптомов). Эффекты от любой конкретной дозировки можно наблюдать с помощью подходящего биологического теста. Примеры подходящих биологических тестов включают тесты на репликацию ДНК, тесты, основанные на транскрипции, тесты на связывание IL-22/IL-22R, тесты на связывание IL-22/IL-10R2, IL-22/IL-22R/IL-10R2 и другие иммунологические тесты.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Селекция анти-IL-22 scFv
Селекция родительских GIL01 и GIL68
10
12
[00228] GIL01 и GIL68 были выделены из scFv библиотек путем селекции на IL-22 в растворе. Селекцию в растворе выполняли, применяя биотинилированный IL-22 с присоединенным к N-концу His/FLAG метящим белком (био. IL-22 H/F). Био IL-22 H/F изначально использовали в концентрации, равной 100 нМ. Фагмидную библиотеку scFv, которая представляет собой расширенную версию описанной 1.38×10 библиотеки (Vaughan и др., 1996), применяли для селекции антител, специфичных к IL-22. Очищенный scFv фаг (10 трансдуцирующих единиц (tu)) блокировали в течение 30 минут в 100 мкл 3% МФБР (3% сухое молоко на ФБР), затем добавляли био IL-22 H/F и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Фаг/антиген добавляли к 50 мкл магнитных гранул, покрытых стрептавидином (Dynal M280 Streptavidin magnetic beads), которые блокировали в течение 1 часа при 37°С в 1 мл 3% МФБР, затем инкубировали в течение дополнительных 15 минут при комнатной температуре. Гранулы собирали с помощью магнитного штатива и промывали 4 раза в 1 мл 3% МФБР/ 0.1% (в объемном отношении) Tween 20, после чего проводили три промывки в ФБР. После последней промывки, гранулы ресуспендировали в 100 мкл ФБР и использовали для заражения 5 мл находящихся в фазе экспоненциального роста клеток Е. coli TG-1 Клетки и фаги на гранулах инкубировали в течение 1 часа при 37°С (30 минут неподвижно, 30 минут встряхивали на 250 об/мин), затем распределяли по чашкам 2TYAG. Чашки инкубировали при 37°С в течение ночи и колонии наблюдали на следующий день. Колонии соскребали с чашек в 10 мл питательной среды 2TY и добавляли 15% глицерина для хранения при -70°С.
[00229] Культуры из глицеринового маточного раствора после первого раунда отбора путем пеннинга суперинфицировали фагом-помощником и высвобождали, чтобы позволить фаговым частицам, экспрессирующим scFv антитела, пройти второй раунд селекции. Второй и третий раунды селекции в растворе проводили, как описано выше, снижая концентрацию био.IL-22 H/F до 50 нМ.
Выделение родительских GIL16, GIL45, GIL60 и GIL92
12
2
[00230] GIL16, GIL45, GIL60 и GIL92 выделяли из scFv библиотек с помощью комбинации пеннинга на химерном белке IL-22 и селекции в растворе на био.IL-22 H/F. Лунки микротитрационного планшета покрывали 10 мкг/мл (в физиологическом растворе, забуференным фосфатом Дульбекко, рН 7.4) химерного белка IL-22 человека и инкубировали в течение ночи при 4°С. Лунки промывали в ФБР и блокировали в течение 2 часов при 37°С в 3% МФБР. Очищенный фаг (10 tu) в 100 мкл 3% МФБР добавляли в блокированные лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Лунки промывали 10 раз ФБРТ (ФБР, содержащим 0.1% в объемном отношении Tween20), затем 10 раз ФБР. Связавшиеся фаговые частицы элюировали 100 мкл раствора трипсина (0.5 мкг/мл трипсина в 50 мМ Tris рН 8, 1 мМ CaCl) в течение 30 минут при 37°С. Элюированный фаг использовали для заражения 10 мл находящихся в фазе экспоненциального роста E. coli TG1. Зараженные клетки растили в питательной среде 2TY в течение 1 часа при 37°С, как описано выше, затем сеяли штрихом на чашки 2TYAG и инкубировали в течение ночи при 30°С. Полученные колонии соскребали с чашек и высвобождали фаг, как описано выше. Второй раунд селекции в растворе проводили, как описано выше, используя 100 нМ био.IL-22 H/F.
Пример 2: ScFv блокирует связывание IL-22 с рецептором IL-22R
[00231] Тесты на ингибирование выполняли на родительских антителах GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68 и GIL92 для идентифиации антител, которые блокируют или влияют на связывание IL-22 с рецептором IL-22R и/или IL-22 рецепторным комплексом. Неочищенные периплазматические экстракты, содержащие scFv, подвергали скринингу на способность ингибировать связывание био. IL-22 H/F с белком рецептора IL-22 человека (hIL-22R) Полученные в результате селекции колонии помещали в 96-луночные планшеты, содержащие 100 мкл 2TYAG. Продукцию scFv индуцировали путем добавления 1 мМ изопропилтиогалактозида (IPTG) к находящимся в фазе экспоненциального роста культурам и инкубировали в течение ночи при 30°С. Периплазматические экстракты готовили (Griffiths и др., 1993) в 50 мМ 3-(N-морфолин)-пропансульфониевой кислоты (MOPS) рН 7.4/0.5 мМ EDTA/0.5 М сорбитола.
[00232] Микротитрационные планшеты покрывали 1.25 мкг/мл антител к белку рецептора IL-22 (в ФБР) в течение 1.5 часов при комнатной температуре. Планшеты затем промывали три раза в ФБР и блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре в ФБР, содержащем 2% сухое молоко (2% МФБР). После дополнительных 3 промывок, 50 мкл 25% кондиционированной клетками среды, содержащей белок рецептора IL-22, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение ночи при 4°С. На следующий день, 25 мкл образца и 25 мкл био. IL-22 H/F (54 нг/мл в ФБР/0.05% БСА/0.05% Tween) добавляли в промытые планшеты и инкубировали в течение 1.5 часов при комнатной температуре. После 3 промывок в ФБРТ детектировали связывание био. IL-22 H/F с помощью меченного европием стрептавидина и флюоресценцию с разрешением во времени (TRF) детектировали с помощью набора реагентов DELFIA и микропланшетного ридера Victor 2™ (Perkin Elmer).
50
[00233] Клоны, которые проявили ингибирование связывания IL-22, подвергали тесту еще раз в качестве очищенных scFv. Применяли как тест на связывание IL-22/IL-22R (описанный выше), так и тест на IL-22/IL-22 рецепторный комплекс (описанный ниже). Концентрации scFv титровали с целью установить эффективность клонов, что измеряли с помощью значений IC в тесте. Это определяли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism и подбора кривой по четырехпараметрическому логистическому уравнению. Образцы результатов теста на IL-22 рецепторный комплекс показаны на Фигуре 1.
Пример 3: Подтверждение связывания IL-22 с помощью анализа связывания фагов по методу ELISA
[00234] Чтобы установить специфичность указанных scFv к IL-22, выполняли анализ связывания фагов по методу ELISA, используя химерный белок IL-22, IL-22 H/F и неродственные белки Отдельные колонии Е. coli, содержащие фагмиды, засевали в 96-луночные планшеты, содержащие 100 мкл 2TYAG среды на лунку. Фаг-помощник М13К07 добавляли до множественности заражения (moi), равной 10, к находящейся в фазе экспоненциального роста культуре, и планшеты инкубировали дополнительно 1 час при 37°С. Планшеты центрифугировали в настольной центрифуге при 2000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант удаляли и осадки клеток ресуспендировали в 100 мкл 2TYAG и инкубировали при 37°С в течение ночи при встряхивании. На следующий день планшеты центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 минут и 100 мкл содержащего фаги супернатанта из каждой лунки переносили в новый 96-луночный планшет. Пробы фагов блокировали в МФБР с конечной концентрацией, равной 3%, в течение 1 часа при комнатной температуре.
2
4
[00235] Микротитрационные планшеты покрывали 1 мкг/мл IL-22 химерного белка, IL-22 H/F или неродственного белка и инкубировали в течение ночи при 4°С. После этого указанные растворы удаляли из лунок, и планшеты блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре в 3% МФБР. Планшеты ополаскивали ФБР, затем добавляли 50 мкл предварительно блокированного фага в каждую лунку. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем промывали 3 сменами ФБРТ, после чего проводили промывки 3 сменами ФБР. В каждую лунку добавляли 50 мкл разбавленного 1:5000 анти-М13-НRР конъюгата (с пероксидазой хрена) (Pharmacia) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшеты промывали 3 раза ФБРТ, затем 3 раза ФБР. Пятьдесят мкл ТМВ субстрата добавляли в каждую лунку и инкубировали до проявления цвета. Реакцию останавливали добавлением 25 мкл 0.5 М HSO, и измеряли абсорбцию на 450 нм. Эти эксперименты подтвердили специфичность связывания scFv клонов с IL-22.
Пример 4: Конверсия scFv в IgG
H
L
H
L
[00236] V области тяжелой и легкой цепи из scFv клонов амплифицировали с применением специфичных к клонам праймеров. ПЦР продукты расщепляли подходящими рестрикционными ферментами и субклонировали в векторы, содержащие константный домен тяжелой цепи IgG4 человека (для V доменов), или при необходимости в векторы, содержащие константные домены лямбда или каппа легкой цепи человека (V домены). Определяли наиболее близкие эмбриональные последовательности человека для V и V сегментов и эту информацию использовали для выявления, использовались ли константные домены каппа или лямбда легкой цепи (Таблица 4). Правильную вставку доменов V области в плазмиду проверяли секвенированием плазмидной ДНК из отдельных колоний Е. coll. Плазмиды получали из культур Е. coli стандартными методиками, и конструкциями тяжелой и легкой цепи совместно трансфецировали НЕК 293 EBNA клетки, применяя стандартные методики. Секретируемый IgG очищали, используя протеин А-сефарозу (Pharmacia) и буфер заменяли на ФБР.
Таблица 4
Эмбриональные последовательности V<sub>H</sub> и V<sub>L</sub> нейтрализующих клонов IL-22
Клон
Эмбриональный V<sub>H</sub>
Эмбриональный V<sub>L</sub>
GIL01
3-11 (DP35)
Vk1.L12
GIL16
1-18 (DP14)
Vk1:L12
GIL45
3-33 (DP50)
VL2:2a2 (DPL11)
GIL60
3-20 (DP32)
VL2-2a2 (DPL11)
GIL68
1-2 (DP8)
VL3:3h
GIL92
1-2 (DP8)
VL1:1e(DPL8)
[00237] Эффективность очищенных IgG подтверждали в биохимическом тесте на ингибирование IL-22 рецепторного комплекса, как описано ниже. Концентрации IgG титровали, чтобы получить оценку эффективности. Данные по эффективности проб представлены в Таблице 5.
Таблица 5
Эффективность IL-22 scFv и IgG в тесте на ингибирование IL-22 рецепторного комплекса
Клон
ScFv эффективность (nM)
IgG эффективность (nM)
GIL01
104
13
GIL16
49
10
GIL60
43
15
GIL68
7
2
GIL92
16
данные отсутствуют
GIL45
358
180
Пример 5: Оптимизация IL-22 антител
[00238] Обширные библиотеки рибосомного дисплея были созданы и подвергнуты скринингу на scFv, которые специфично распознают рекомбинантный IL-22 человека, по существу как описано в Hanes и др. (2000). Сначала пять родительских клонов (GIL01, GIL16, GIL60, GIL68 и GIL92) перевели в формат рибосомного дисплея, и эту матрицу затем применяли для создания библиотеки. На уровне ДНК, промотор Т7 был добавлен к 5'-концу для эффективной транскрипции в мРНК. На уровне мРНК, указанная конструкция содержала прокариотический сайт связывания рибосом (последовательность Шайна-Дальгарно) и 5' и 3' структуры «стебель-петля» для стабильности мРНК. На 3' конце одной цепи стоп-кодон удаляли, и добавляли сегмент gIII, который будет действовать как спейсер, позволяя укладку scFv в отдалении от рибосомного канала (Hanes и др. 2000).
[00239] Библиотеки рибосомного дисплея, полученные из ведущих клонов (клонов, обладающих наилучшими желательными характеристиками), были созданы путем мутагенеза одноцепочечных гипервариабельных участков (CDR) с применением ПЦР с Taq ДНК полимеразой, не обладающей корректирующей активностью. Селекцию, основанную на аффинности, выполняли, когда указанную библиотеку инкубировали с био. IL-22H/F, с последующей инкубацией с покрытыми стрептавидином парамагнитными гранулами (Dynal M280). Тройные комплексы (мРНК-рибосома-scFv) выделяли путем разделения в магнитном поле, а несвязавшиеся комплексы вымывали МРНК, кодирующие связавшиеся scFv, затем восстанавливали с помощью ПЦР с обратной транскрипцией, как описано (Hanes и др., 2000), и повторяли процесс селекции с уменьшением концентраций био. IL-22H/F (100 нМ - 10 пМ за 5 раундов).
[00240] Ошибочно-направленную ПЦР (error-prone PCR - ПЦР с увеличенной частотой ошибки) использовали, чтобы дополнительно увеличить размер библиотеки. Используемая частота ошибок составляла, в среднем, 7 2 мутации на 1,000 п.о. после стандартной реакции ПЦР, основанной на методе, описанном Cadwell и Joyce (1992). Первичные ошибочно-направленные реакции ПЦР проводили между первым и вторым раундами селекции.
H
L
H
L
H
H
L
L
[00241] V/V рекомбинантные библиотеки для каждого родительского клона создавали на основе полученных с помощью рибосомного дисплея V и V CDR либо после второго, либо после четвертого раунда селекции. Часть V, полученных после селекции V CDR, для отдельной линии специфично амплифицировали с помощью ПЦР, применяя клонспецифичные праймеры. Часть V, полученных после селекции V CDR, для той же линии амплифицировали отдельно. Эти два продукта ПЦР рекомбинировали путем перекрывающейся ПЦР реакции. Это позволило получить полную библиотеку scFv продуктов, содержащих все компоненты, необходимые для дальнейших раундов селекции из рибосомного дисплея.
H
L
H
L
H
L
[00242] Для некоторых клонов также применяли библиотеки фагового дисплея. Фаговые библиотеки создавали путем мутагенеза одноцепочечных CDR, применяя ПЦР реакции с подходящими праймерами, и проводили селекцию, как описано выше. Полученные продукты также объединяли с результатами селекции из рибосомного дисплея для создания V/V рекомбинантных библиотек Результаты селекции V четвертого раунда рибосомного дисплея, вместе с результатами третьего раунда фагового дисплея, рекомбинировали с результатами V из той же линии. Этого добивались, применяя клонспецифичные праймеры и перекрывающиеся ПЦР для получения V/V рекомбинантных библиотек. Селекцию растворимыми био. IL-22 H/F продолжали в формате рибосомного дисплея, как описано выше. ScFv области результатов селекции направленно клонировали в pCANTAB6 для продукции scFv для биохимического высокопроизводительного скрининга.
Пример 6: Определение оптимальных клонов
[00243] Два теста применяли для высокопроизводительного скрининга результатов селекции. Результаты, полученные из клонов GIL01, GIL16 и GIL68, подвергали скринингу в гомогенном флюоресцентном анализе с временным разрешением (HTRF, Cis Biointernational), тогда как результаты из GIL60 и GIL92 подвергали скринингу в тесте DELFIA (Perkin Elmer).
HTRF конкурентный тест на эпитопы
[00244] Неочищенные супернатанты культур, содержащие scFv, получали из отобранных клонов GIL01, GIL16 и GIL68, как описано выше, и подвергали скринингу на ингибирование связывания био. IL-22H/F с GIL68 в тесте HTRF.
[00245] Помеченные криптатом GIL68 IgG (набор для мечения от Cis Biointemational) разбавляли в 400 раз в тест-буфере (ФБР/0,4М KF/ 0.05% БСА/0.05% Tween), после чего добавляли 7.5 нМ стрептавидина XL665 (Xlent, Cis Biointernational). Этот раствор смешивали с неочищенной пробой scFv (разбавленной в 125 раз) и био. IL-22H/F в 384-луночном планшете Packard black Optiplate (Perkin Elmer). Планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, затем считывали, применяя микропланшетный ридер Victor 2™ (Perkin Elmer). Соотношение эмиссии на 665 нм/620 нм использовали для расчета процента специфичного связывания в каждой лунке.
Флюоресцентный анализ с временным разрешением DELFIA
[00246] Отобранные GIL60 и GIL92 клоны подвергали скринингу на ингибирование связывания био.IL-22Н/F с IL-22 рецепторным комплексом.
[00247] Микротитрационные планшеты покрывали антителом к IL-22 рецепторному комплексу (1 мкг/мл в ФБР) и инкубировали в течение 1.5 часов при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза в ФБРТ, и блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре в 2% МФБР. После дополнительных 3 промывок добавляли разбавленную кондиционированную клетками среду, содержащую IL-22 рецепторный комплекс, и инкубировали в течение ночи при 4°С. Неочищенные scFv супернатанты получали, как описано выше. На следующий день 25 мкл разбавленной пробы scFv и 25 мкл био.IL-22 H/F (6 нг/мл) добавляли к промытым планшетам и инкубировали в течение 1.5 часов при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза в ФБРТ, затем детектировали связывание био.IL-22H/F с IL-22 рецепторным комплексом с помощью Европий-стрептавидина и набора реагентов DELFIA (Perkin Elmer). Флюоресценцию с временным разрешением измеряли, применяя микропланшетный ридер Victor 2™ (Perkin Elmer).
50
[00248] Очищенные scFv из позитивных клонов, идентифицированных в результате скрининга, тестировали в конкурентном тесте DELFIA с IL-22 рецепторным комплексом, как описано выше. Применяли титрование концентраций scFv, чтобы установить эффективность клонов, что измеряли по значениям IC в указанном тесте. Примеры результатов показаны на Фигуре 2. Четырнадцать оптимальных клонов были обозначены как 097D09, 062А09, 062G05, 087В03, 367D04, 368D04, 166В06, 166G05, 375G06, 376В10, 354А08, 355В06, 355Е04 и 356А11.
Пример 7: Сравнительный анализ оптимальных клонов в BAF3-IL-22 пролиферационном тесте
[00249] Пролиферационные тесты выполняли, чтобы установить способность антитела блокировать IL-22-опосредуемую пролиферацию BaF3 клеток. BaF3 клетки, экспрессирующие hIL22R/hIL10R2, были получены путем ко-трансфекции BaF3 клеток hIL22R-GFP и hIL10R2-YFP. BaF3 клетки, экспрессирующие как hIL22R, так и hIL10R2 (клетки BaF3-IL-22 рецептор), сортировали и собирали путем сортировки клеток с возбуждением флюоресценции - FACS.
2
2
5
[00250] Клетки BaF3-IL-22 рецептор обычно поддерживали в среде RPMI1640 с 10% эмбриональной бычьей сывороткой и 1 нг/мл IL-3 мыши. Непосредственно перед началом теста клетки промывали 4 раза в среде для теста (RPMI1640 с 10% эмбриональной бычьей сывороткой, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина), ресуспендировали в среде для теста и инкубировали при 37°С, 5% CO в течение 6-8 часов. Для подготовки тестовых планшетов, 100 мкл клеток (1×10/мл в среде для теста) добавляли к центральным 60 лункам 96-луночного планшета с плоским дном для выращивания культуры (Costar). Тестируемые пробы scFv или IgG готовили путем разбавления концентрированных проб в среде для теста, после чего проводили фильтрацию через 0.22 мкм фильтр. Серийное 5-кратное разведение проб готовили в отдельном планшете для разведения. Содержащие клетки лунки обрабатывали 50 мкл пробы, после чего добавляли 50 мкл IL-22 человека (40 нг/мл в среде для теста), а затем инкубировали в течение 40 часов при 37°С в 5% CO. Контрольные лунки содержали только среду и клетки, в отсутствие или в присутствии 10 нг/мл IL-22 человека.
2
50
50
[00251] Пролиферацию клеток детектировали путем добавления 20 мкл красителя Alamar Blue (Serotec) к лункам, после чего проводили инкубацию в течение 5 часов ±30 мин при 37°С в 5% CO. Содержимое планшетов смешивали путем аккуратного постукивания, чтобы обеспечить равномерное распределение сигнала по лункам перед измерением флюоресценции (возбуждение на 560 нм, эмиссия на 590 нм). Значения ЕС и IC оценивали с помощью подбора кривой по четырехпараметрическому логистическому уравнению (программное обеспечение Graphpad Prism 2) и использовали для упорядочения антител. Примеры данных по эффективности для оптимальных scFv и IgG показаны в Таблице 6.
Таблица 6
Значения IC<sub>50</sub> для scFv и IgG клонов в BaF3-lL-22 5 пролиферационном тесте
Клон
Родитель
IC<sub>50</sub> для scFv (РМ)
IC<sub>50</sub> для IgG (рМ)
097D09
GIL01
2981246
197±42
062А09
GIL16
267
83±37
062G05
GIL16
182
12±30
087В03
GIL60
212
105±17
367D04
GIL60
160±49
126±6
368D04
GIL60
186±66
127±10
166В06
GIL68
460
71±23
166G05
GIL68
204
97±23
375G06
GIL68
118±98
100±1
376В10
GIL68
104±47
119±6
354А08
GIL92
219±83
79±15*
355В06
GIL92
183±3
92±14*
355Е04
GIL92
192±47
100±14*
356А11
GIL92
124±21
53±5*
<sup>*</sup>Полученные из GIL92 клоны тестировали как эмбрионизированные IgG.
Пример 8: Эмбрионизация
H
L
50
[00252] Данные по последовательностям шести родительских клонов использовали для определения наиболее близкой эмбриональной последовательности для тяжелой и легкой цепи каждого клона. Подходящие мутации вводили, применяя стандартные методики сайт-направленного мутагенеза с подходящими мутагенными праймерами. Присутствие мутации подтверждали с помощью анализа последовательностей. Указанные последовательности эмбрионизированных клонов и их scFv и V и V доменами показаны в Таблице 7. Очищенные scFv из эмбрионизированных родительских клонов тестировали в конкурентном тесте на связывание биотинилированного IL-22 с IL-22 рецепторным комплексом, как описано ранее, чтобы установить эффективность клонов, что измеряли по значениям IC в тесте. Результаты суммированы в Таблице 8.
Таблица 7А
Последовательности аминокислот и нуклеотидов V<sub>H</sub> и V<sub>L</sub> доменов, Fv и CDR эмбрионизированных антител (GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062А09 и 087В03)
Фрагмент
Тип
GIL01 SEQ ID
GIL16 SEQ ID
GIL45 SEQ ID
GIL60 SEQ ID
GIL68 SEQ ID
GIL92SEQ ID
062А09 SEQ ID
087В03 SEQ ID
V<sub>H</sub>
АА
NO:365
NO:383
NO:401
NO:419
NO:437
NO:455
NO:473
NO:491
V<sub>L</sub>
АА
NO:366
NO:384
NO:402
NO:420
NO:438
NO:456
NO:474
NO:492
scF<sub>v</sub>
АА
NO:367
NO:385
NO:403
NO:421
NO:439
NO:457
NO:475
NO:493
Н1
АА
NO:368
NO:386
NO:404
NO:422
NO:440
NO:458
NO:476
NO:494
Н2
АА
NO:369
NO:387
NO:405
NO:423
NO:441
NO:459
NO:477
NO:495
Н3
АА
NO:370
NO:388
NO:406
NO:424
NO:442
NO:460
NO:478
NO:496
L1
АА
NO:371
NO:389
NO:407
NO:425
NO:443
NO:461
NO:479
NO:497
L2
АА
NO:372
NO:390
NO:408
NO:426
NO:444
NO:462
NO:480
NO:498
L3
АА
NO:373
NO:391
NO:409
NO:427
NO:445
NO:463
NO:481
NO:499
V<sub>H</sub>
DNA
NO:374
NO:392
NO:410
NO:428
NO:446
NO:464
NO:482
NO:500
V<sub>L</sub>
DNA
NO:375
NO:393
NO:411
NO:429
NO:447
NO:465
NO:483
NO:501
scFv
DNA
NO:376
NO:394
NO:412
NO:430
NO:448
NO:466
NO:484
NO:502
Н1
DNA
NO:377
NO:395
NO:413
NO:431
NO:449
NO:467
NO:485
NO:503
Н2
DNA
NO:378
NO:396
NO:414
NO:432
NO:450
NO:468
NO:486
NO:504
Н3
DNA
NO:379
NO:397
NO:415
NO:433
NO:451
NO:469
NO:487
NO:505
L1
DNA
NO:380
NO:398
NO:416
NO:434
NO:452
NO:470
NO:488
NO:506
L2
DNA
NO:381
NO:399
NO:417
NO:435
NO:453
NO:471
NO:489
NO:507
L3
DNA
NO:382
NO:400
NO:418
NO:436
NO:454
NO:472
NO:490
NO:508
Таблица 7В
Последовательности аминокислот и нуклеотидов V<sub>H</sub> и V<sub>L</sub> доменов, Fv и CDR эмбрионизированных антител (166В06, 166G05, 354А08, 355В06, 355Е04, 356А11 и 368D04)
Фрагмент
Тип
166B06 SEQ ID
166G05 SEQ ID
354A08 SEQ ID
355B06 SEQ ID
355E04SEQ ID
356A11 SEQ IO
368D04 SEQ ID
V<sub>H</sub>
AA
NO:509
NO:527
NO:545
NO:563
NO:581
NO:599
NO:617
V<sub>L</sub>
AA
NO:510
NO:528
NO:546
NO:564
NO:582
NO:600
NO:618
scF<sub>v</sub>
AA
NO:511
NO:529
NO:547
NO:565
NO:583
NO:601
NO:619
H1
AA
NO:512
NO:530
NO:548
NO:566
NO:584
NO:602
NO:620
H2
AA
NO:513
NO:531
NO:549
NO:567
NO:585
NO:603
NO:621
H3
AA
NO:514
NO:532
NO:550
NO:568
NO:586
NO:604
NO:622
L1
AA
NO:515
NO:533
NO:551
NO:569
NO:587
NO:605
NO:623
L2
AA
NO:516
NO:534
NO:552
NO:570
NO:588
NO:606
NO:624
L3
AA
NO:517
NO:535
NO:553
NO:571
NO:589
NO:607
NO:625
V<sub>H</sub>
DNA
NO:518
NO:536
NO:554
NO:572
NO:590
NO:608
NO:626
V<sub>L</sub>
DNA
NO:519
NO:537
NO:555
NO:573
NO:591
NO:609
NO:627
scFv
DNA
NO:520
NO:538
NO:556
NO:574
NO:592
NO:610
NO:628
H1
DNA
NO:521
NO:539
NO:557
NO:575
NO:593
NO:611
NO:629
H2
DNA
NO:522
NO:540
NO:558
NO:576
NO:594
NO:612
NO:630
H3
DNA
NO:523
NO:541
NO:559
NO:577
NO:595
NO:613
NO:631
L1
DNA
NO:524
NO:542
NO:560
NO:578
NO:596
NO:614
NO:632
L2
DNA
NO:525
NO:543
NO:561
NO:579
NO:597
NO:615
NO:633
L3
DNA
NO:526
NO:544
NO:562
NO:580
NO:598
NO:616
NO:634
Таблица 8
Эффективности scFv из неэмбрионизированных и эмбрионизированных родительских клонов в конкурентном тесте с рецептором IL-22
Родительский клон scFv
Среднее значение IC<sub>50</sub> nM при анализе конкурентного связывания IL-22
Родитель
Полностью эмбионизированный
GIL01
124±50
143±45
GIL16
44±1
38±1
GIL60
51±16
82±3
GIL68
9±1
14+1
GIL92
18±2
40±11
50
[00253] Девять из оптимальных антител эмбрионизировали, как описано выше. Восемь эмбрионизированных IgG подвергали пролиферационному тесту в BaF3-IL-22, как описано выше. Значения IС для антител из типичного эксперимента представлены в Таблице 9.
[00254] Последовательности антител затем отправляли в GENEART North America (28 Kirk Bradden Rd. East, Торонто, Онтарио, Канада M8Y2E6), где их синтезировали для оптимальной экспрессии в клетках СНО, применяя алгоритм, являющийся собственностью GENEART.
Таблица 9
IgG эффективности эмбрионизированных оптимальных клонов в BaF3-IL-22R пролиферационном тесте
Клон
Родитель
IC<sub>50</sub> (пикоМоль) для неэбрионизированного IgG
IC<sub>50</sub> (пикоМоль) для эбрионизированного IgG
087В03
GIL60
72±6
118±19
166В06
GIL68
109±16
169±32
166G05
GIL68
366±226*
109±31
356А11
GIL92
ND
53±5
355В06
GIL92
ND
92±14
355Е04
GIL92
ND
100±14
354А08
GIL92
ND
79±15
062А09
GIL16
108±23
Не определяется
<sup>*</sup>образец содержал преципитатND=не определен
Пример 9: Антитело ингибирует индуцируемую IL-22 секрецию GROa из клеток НТ29
4
[00255] GROa тесты выполняли, чтобы установить способность указанного антитела блокировать индуцируемую IL-22 секрецию GROa из клеток НТ29. Клетки НТ29 высевали в 96-луночный планшет с плоским дном для выращивания культуры (номер в каталоге Corning Inc.: 3595) в среде DMEM (DMEM +10% эмбриональной бычьей сыворотки +100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина +2 мМ глутамина) при плотности 5×10/лунку. 10 нг/мл IL-22 смешивали с серийно разбавленными в среде DMEM антителами и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Через 24 часа после высевания среду удаляли из клеток НТ29, и предварительно смешанные IL-22 и антитело добавляли к клеткам в 96-луночный планшет.
2
[00256] После 48 часов инкубации при 37°С с 5% СO среду собирали и секретированный GROa проверяли, применяя набор для иммуноанализа GROa человека (R&D Systems, в каталоге: DGR00), следуя указаниям производителя. Результаты представлены на Фигуре 3.
Пример 10: Антитело связывает и ингибирует различные виды IL-22
2
4
[00257] Перекрестную межвидовую реактивность эмбрионизированных и неэмбрионизированных оптимальных антител определяли, как указано далее: планшеты для ELISA (Costar, номер в каталоге; 3590) покрывали в течение ночи 1 мкг/мл IL-22 крысы, мыши или человека или IL-26 человека в буфере ФБР. Планшеты промывали буфером ФБРТ (0.05% Tween 20 в ФБР) 3 раза, затем блокировали 1% БСА (Sigma A8918) / ФБРТ в течение 1 часа при комнатной температуре. Антитела добавляли до концентрации 1 мкг/мл, инкубировали 1 час при 25°С. Планшеты промывали, затем добавляли HRP-конъюгированные антитела козы против IgG человека (Southern Biotech Association, номер в каталоге: 2040-05). Планшеты инкубировали в течение 1 часа при 25°С, затем промывали в ФБРТ и проявляли с помощью тетраметилбензидина, ТМБ (KPL, номер в каталоге: 50-76-04). Реакцию останавливали добавлением 0,18 М HSO. Планшеты считывали при оптической плотности 450 нм. Результаты представлены на Фигуре 4.
[00258] Эти антитела также оценивали как в GROa клеточном тесте, так и в BaF3-IL-22 пролиферационном тесте. Как показано в Таблицах 10(а) и 10(b), указанные антитела блокировали активность передачи сигналов IL-22 человека, обезьяны, крысы и мыши через рецептор IL-22 человека. 356А11 и 368D04 также продемонстрировали межвидовую реактивность против IL-22 мыши, крысы и обезьяны, согласно анализу биоспецифичных взаимодействий (BIA) в реальном времени, как обсуждается далее в Примере 11.
[00259]
Таблица 10(а)
Антитела против IL-22 с высокой эффективностью блокируют IL-22 других видов, как показано в тесте GROa, основанном на клеточной системе. Показанные значения представляют значения IC<sub>50</sub> в пМ.
Protein ID
human IL-22
murine IL-22
rat IL-22
monkey IL-22
356A11
123.64
143.76
210.91
89.57
368D04
154.07
156.25
281.12
184.10
control 1
353.18
468.34
1161.57
343.19
control 2
1955.80
3399.79
10697.17
1459.27
[00260]
Таблица 10(b)
Антитела против IL-22 с высокой эффективностью блокируют IL-22 других видов, как показано в тесте BaF3, основанном на клеточной системе. Показанные значения представляют значения IC<sub>50</sub> в пМ.
Protein ID
human IL-22
murine IL-22
rat IL-22
monkey IL-22
356A11
3.57
2.53
10.69
2.58
368D04
3.63
1.47
12.07
3.87
control 1
6.40
5-6
27.37
7.18
control 2
204.98
1033.26
2500.00
134.27
Пример 11: Сравнение кинетики связывания между моноклональными антителами крысы против IL-22 и моноклональными антителами человека против IL-22
[00261] Кинетика связывания моноклонального антитела человека против IL-22 (356A11 и 368D04) и моноклонального антитела крысы против IL-22 (Р3/3 (Ab-02) и Р3/2 (Ab-04) из WO 2005/000897 и WO 02/068476) с IL-22 человека оценивали с помощью анализа биоспецифичных взаимодействий (BIA) в реальном времени, применяя методику поверхностного плазмонного резонанса.
[00262] Для подготовки поверхности биосенсора для моноклональных антител крысы белок A/G (номер в каталоге Pierce: 21186, Рокфорд, Иллинойс) иммобилизовали на аналитическом чипе, покрытом карбоксиметилдекстраном (СМ5), применяя сочетание с аминами. Поверхность активировали EDC/NHS. Белок A/G вводили в концентрации 50 мкг/мл в натрий-ацетатном буфере (рН 4,0) Иммобилизацию осуществляли, применяя виртуозные инструменты, с целью добиться 3000 (единиц отклика) для белка A/G. Оставшиеся активированные группы блокировали 1.0 М этаноламином (рН 8.0). Первую проточную камеру использовали в качестве эталонной поверхности для корректировки коэффициента преломления, влияния матрицы и неспецифичного связывания основного объема клеток. Вторая, третья и четвертая проточные камеры были покрыты захватывающими молекулами. Моноклональные антитела крысы Ab-02 и Ab-04, которые связываются с белком A/G, были захвачены белком A/G, иммобилизованным на поверхности, после ввода 30 мкл их 1 мкг/мл раствора. Суммарную разницу между исходным уровнем и указанной точкой, приблизительно через 90 секунд после завершения ввода Ab-02 или Ab-04, использовали для представления количества связавшегося лиганда.
[00263] Для подготовки поверхности биосенсора для моноклональных антител человека, либо моноклональное антитело человека (356А11 или 368D04), либо контрольное антитело иммобилизовали на аналитическом чипе, покрытом карбоксиметилдекстраном (СМ5), применяя стандартное сочетание с аминами. Поверхность активировали с помощью EDC/NHS. Захватывающие антитела вводили в концентрации 1 мкг/мл в натрий-ацетатном буфере (рН 5.5). Оставшиеся активированные группы блокировали 1.0 М этаноламином (рН 8.0). Первую проточную камеру использовали в качестве эталонной поверхности для корректировки коэффициента преломления, влияния матрицы и неспецифичного связывания основного объема клеток. Вторая, третья и четвертая проточные камеры были покрыты захватывающими молекулами.
[00264] Для Ab-02 и Ab-04 растворы IL-22 человека в 300, 100, 50, 25, 12.5, 6.4, 3.2, 1.6 и 0 нМ концентрациях вводили в трех повторах при скорости потока 30 мкл в минуту в течение 3 минут, и количество связавшегося материала было записано как функция от времени в виде сенсограмм. Фазу диссоциации наблюдали в HBS/EP буфере в течение 10 минут при той же скорости потока, после чего вводили 5 мкл 0 1% тетрафторэтилена и 5 мкл глицина (рН 1.5), чтобы регенерировать полную активность захватывающей поверхности.
[00265] Для 356А11 и 368D04 растворы IL-22 человека в 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 и 0 нМ концентрациях вводили в трех повторах при скорости потока 100 мкл в минуту (сильный поток, чтобы избежать неспецифичного связывания) в течение 3 минут, и количество связавшегося материала было записано как функция от времени в виде сенсограмм. Фазу диссоциации наблюдали в HBS/EP буфере в течение 60 минут при той же скорости потока, после чего дважды вводили 5 мкл глицина (рН 1.5), чтобы регенерировать полную активность захватывающей поверхности.
[00266] Все кинетические эксперименты выполняли при 22.5°С в HBS/EP буфере. Эффекты фона и буфера вычитали для построения каждой сенсограммы, примененяя двойную калибровку. В контрольных экспериментах первое введение содержало буфер.
d
а
D
d
a
D
A
а
d
A
[00267] Кинетические данные анализировали, примененяя программное обеспечение для оценки BIA 3.0.2, примененное к модели 1:1. Наблюдаемые константы скорости диссоциации (K) и ассоциации (К) рассчитывали из подходящих областей сенсограмм, применяя общий анализ. Константы аффинности взаимодействия между антителом и анализируемым материалом рассчитывали из кинетических констант скоростей по следующей формуле. K=K/K, где K представляет собой константу диссоциации, и K=К/K, где K представляет собой константу ассоциации. Данные по связыванию для Ab-02 и Ab-04 суммированы в Таблицах 11А и 11В. Данные по связыванию для 356А11 и 368D04 суммированы в Таблице 12.
Таблица 11А
Кинетические параметры для взаимодействия между IL-22 человека и анти-IL-22 антителами Ab-02 и Ab-04
Ab-02 k<sub>a</sub> (M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)
Ab-02 k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>)
Ab-04 k<sub>a</sub> (M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)
Аb-04 k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>)
Белок A/G
2.78 Е+05
1.45 E-03
5.15 Е+05
1.23 E-03
Таблица 11B
Кинетические данные для моноклональных антител крысы и IL-22 человека
Антитело
Ka(1/Ms)
Kd(1/s)
KA(1/M)
KD(M)
Chi2
Ab-02
2.78 Е+05
1.45 E-03
1.92 E+08
5 22 E-08
0.49
Ab-04
5.15 Е+05
1.23 E-03
4.22 E+08
2.38E-09
0.53
Таблица 12
Кинетические данные для моноклинальных антител человека и IL-22 человека
Антитело
Ka(1/Ms)
Kd(1/s)
KA(1/M)
KD(M)
Chi2
356А11
7.91 Е+04
4.27 Е-06
1.85 Е+10
5.40 E-11
0.223
368D04
1.89 Е+05
2.50 Е-05
7.56 E+09
1.32 Е-10
0.298
D
D
D
D
-11
-8
-9
-10
[00268] Эти результаты показывают, что моноклональные анти-IL-22 антитела человека согласно настоящему изобретению имеют значительно более высокую аффинность к IL-22 человека, чем моноклональные анти-IL-22 антитела крысы Ab-02 и Ab-04, описанные в WO 2005/000897 и WO 02/068476 как имеющие способность нейтрализовать IL-22 человека. А именно, константа диссоциации 356А11 (K=5.40×10 М или 0.054 нМ) от IL-22 человека приблизительно в 1000 раз и более чем в 40 раз выше, чем константы диссоциации Ab-02 (K=5.22×10 М или 52 нМ) и Аb-04 (K=2.38×10 М или 2.38 нМ), соответственно. Сходным образом, 368D04 (К=1.32×10 М или 0.132 нМ) имело приблизительно в 400 раз и в 18 раз более сильную аффинность к IL-22 человека, чем Ab-02 и Ab-04, соответственно Профили связывания 356А11 и 368D04 с IL-22 обезьяны, мышей и крысы были сходны с таковыми для IL-22 человека (данные не представлены).
[00269] Специфичности связывания 356А11 и 368D04 также оценивали, применяя BIA Ни одно из антител не проявило перекрестную реактивность с IL-10 человека, IL-19 человека, IL-20 человека, IL-24 человека, IL-28A человека, IL-29 человека, интерфероном-α2с человека или интерфероном-ω человека (данные не представлены).
Пример 12: Время полужизни анти-IL-22 антител человека in vivo.
[00270] Антитела против IL-22 человека согласно настоящему изобретению имеют большое время полужизни in vivo. Например, время полужизни in vivo как 356А11, так и 368D04 в DBA/1 мышах равнялось восьми дням В частности, единичную дозу либо 356А11, либо 368D04 (16 мг/кг) вводили интраперитонеально DBA/1 мышам. Антитела 356А11 и 368D04 детектировали в сыворотке указанных мышей, применяя ELISA с определением антител человека класса IgG1. Динамика концентраций 356А11 и 368D04 в сыворотке показана на Фигурах 11А и В. Параметры фармакокинетики 356А11 и 368D04 суммированы в Таблице 13 ниже.
[00271]
Таблица 13
Параметры фармакокинетики 3536А11 и 368D04
Показатель РК
356А11
368D04
AUC (ng.hr/mL)
57273471
54052982
Cmax (ng/mL)
169854
177161
Tmax (hr)
48
24
t1/2 (hr)
192
206
t1/2(days)
8
8.6
Пример 13: Лечение артрита
+
+
[00272] Артрит представляет собой заболевание, характеризуемое воспалением в суставах. Ревматоидный артрит (РА) является наиболее частой формой артрита, включающей воспаление соединительной ткани и синовиальной мембраны, мембраны, которая выстилает сустав. Воспаленная синовиальная мембрана часто инфильтрирует сустав и повреждает суставной хрящ и кость. Как IL-22, так и IL-22R белок и/или транскрипт связаны с заболеванием человека. В синовиальном биопсийном материале РА, белок IL-22 обнаруживают в виментин синовиальных фибробластах и некоторых CD68 макрофагах, тогда как IL-22R обнаруживают в синовиальных фибробластах. Обработка синовиальных фибробластов IL-22 индуцирует продукцию моноцитарного хемоатрактантного белка-1, МСР-1, так же, как и общую метаболическую активность (Ikeuchi, H. и др (2005) Arthritis Rheum. 52:1037-46).
[00273] IL-22 используют для изучения его влияния на клетки из синовиальной мембраны, мембраны, которая выстилает суставы. Фибробластоподобные синовиоциты человека (HFLS) (Cell Applications (Сан-Диего, Калифорния)) выделяли из синовиальных тканей пациентов с ревматоидным артритом, которым проводили операцию на сустав. HFLS культивировали с IL-22 человека в течение 48 часов, и супернатанты удаляли и проверяли на хемокины и цитокины методом ELISA. IL-22 будет повышать секрецию клетками HFLS хемокинов МСР-1, эотаксина и IP-10, и цитокинов TNFα, IL-6 и IL-8. Эти хемокины и цитокины, как известно в данной области, вызывают воспаление посредством ряда активностей, и их повышенные концентрации в суставах, вызванные IL-22, обостряет воспаление и РА.
[00274] Способность анти-IL-22 антител человека улучшать симптоматику индуцируемого коллагеном артрита (КИА) изучали, применяя 356А11 и 368D04 антитела. КИА является стандартной моделью на мышах и крысах для изучения ревматоидного артрита, см., например, Holmdahl и др., (2002) Ageing Res. Rev., 1:135. На день 0, самцам DBA/1 (Jackson Laboratory, Бар Харбор, Мэн) мышей инъецировали подкожно в основание хвоста 100 мкг бычьего коллагена II типа (Chondrex, Редмонд, Вашингтон) в полном адъюванте Фрейнда, и на день 21 мышей подвергали поддерживающей иммунизации 100 мкг бычьего коллагена II типа в неполном адъюванте Фрейнда.
[00275] Мышей обследовали по меньшей мере два раза в неделю на предмет прогрессирования болезни. Тяжесть заболевания оценивали, применяя макроскопическую оценку лапы, как указано далее: 0 = нет припухлости, 1 = 1-2 опухших пальца или опухших голеностопа, 2 = больше, чем 2 опухших пальца или средняя припухлость лапы, 3 = обширная припухлость лапы и 4 = анкилоз лапы. Мышам инъецировали изотипические контрольные антитела после того, как инъекции коллагена вызвали развитие заболевания. Лечение либо 356А11, либо 368D04 значительно снижало прогрессирование болезни. Это были слепые исследования, поскольку исследователи не знали, какая группа животных получала какие антитела, до окончания исследования.
-1
-1
-1
[00276] Различные дозы 356А11 и 368D04 были оценены. Лечение 356А11 или 368D04 (или IgG 1λ изотипическим контролем антител человека) инициировали, когда 10% мышей в терапевтической группе имели показатель тяжести болезни, равный по меньшей мере 1. Указанное антитело вводили с разной частотой через день, один раз в неделю или два раза в неделю, и мышей наблюдали на предмет прогрессирования болезни. Введение либо 8, либо 16 мг·кг 356А11 через день значительно блокировало прогрессирование КИА во множестве исследований, как показано на Фигурах 12А-В, 13 и 40-41. Для отдельных КИА исследований (Фигуры 13A-D) испытание с 8 мг·кг 356А11 через день показало, что 356А11 антитело неизменно блокировало прогрессирование болезни у модельных мышей КИА. Удивительным образом, введения дважды в неделю и даже раз в неделю дозы 8 мг·кг 356А11 было также достаточно во многих исследованиях для значительной блокировки прогрессирования болезни, как показано на Фигурах 14-15, 41 и 44А-В.
-1
-1
[00277] В первом исследовании КИА с 368D04 (вводили через день в дозе 16 мг·кг), наблюдали небольшую эффективность или ее отсутствие. Тем не менее, введение 8 мг·кг 368D04 один раз в неделю во множестве исследований значительно блокировало прогрессирование болезни, как показано на Фигурах 46А-С.
[00278] Способность анти-IL-22 антител человека значительно блокировать прогрессирование болезни при введении один раз в неделю в указанной модели КИА свидетельствует, что указанное антитело можно вводить с той же частотой дозировок, или даже с дополнительно уменьшенной частотой дозировок, такой как раз в две недели, при введении людям.
-1
[00279] Лечебные эффекты анти-IL-22 антитела также оценивали путем гистопатологического анализа лап. По окончании исследования животных умерщвляли, лапы собирали и фиксировали в 10% формалине для гистологии, декальцифицировали и заключали в парафин для изготовления срезов и стандартного окрашивания гематоксилином и эозином. Лапы оценивали по 5-балльной шкале (0-4), чтобы охарактеризовать интенсивность и объем артрита Для оценки использовали воспалительные инфильтраты, вдобавок к другим изменениям, связанным с воспалением, таким, как формирование паннуса, волокнистость синовиальной мембраны, эрозия суставного хряща и/или субхондральное разрушение кости. Гистологические баллы определяли, используя показатели для отдельных лап: NAD=0 или не обнаружено ничего отличного от нормы; 1 = от легкого до умеренного; 2 = от слабого до умеренного; 3 = ясно различимый; 4 = выраженный. Гистологический эффект от терапевтического введения анти-IL-22 антител показан на Фигурах 16A-F, 42А-С, 43 и 45А-В. Как показано на Фигурах 16A-F, 42А-С, 43 и 45А-В, введение 356А11 во множестве исследований улучшало симптоматику индуцируемого коллагеном артрита у мышей. Сходным образом, введение 368D04 через день в дозе 8 мг·кг во множестве исследований улучшало симптомы индуцируемого коллагеном артрита у мышей. Фигуры 47А-С.
[00280] Кроме гистопатологических оценок, также изучали разрушение кости у подвергаемых лечению мышей. По окончании исследования, лапы фиксировали в латеральном положении и делали рентгеновские снимки с помощью аппарата Faxitron. Faxitron обеспечивает высокое разрешение рентгенограмм, и возможность сильного увеличения обеспечивает улучшенное качество визуализации. Faxitron рентгенограммы коррелировали с визуальными баллами макроскопической оценки лап и показали, что лечение анти-IL-22 антителами предотвращало разрушение кости, по сравнению с лечением изотипическим контролем антитела (данные не представлены).
Пример 14: Обнаружение IL-22 в сыворотке методом ELISA, и повышенное присутствие IL-22 в сыворотке in vivo при лечении 356А11
[00281] На данный момент, об обнаружении экспрессии гена IL-22 сообщали лишь на РНК уровне. Описанным ниже способом ELISA IL-22 не детектируется у нормальных мышей. Мы открыли, впрочем, что указанный способ ELISA позволяет обнаружить IL-22 в кровообращении мышей, страдающих артритом. Более того, введение 356А11 антитела позволяет обнаружить IL-22 на в десять раз более высоких уровнях. 356А11 антитело во вводимых дозах связывает указанный цитокин, тем самым нейтрализуя его активность, как показано в предыдущих примерах. По мере циркуляции этого антитела в кровотоке, комплекс указанного антитела со связанным IL-22 теперь можно было детектировать на высоком уровне с помощью способа ELISA. Это происходило вследствие уникальности и отличия эпитопов иммобилизованного и идентифицирующего антитела, которые составляют этот ELISA IL-22 мыши. Этот ELISA эквивалентно позволяет обнаружить IL- 22/356A11, IL-22 CБ/IL-22, IL-22 СБ/356А11/IL-22 и отдельный IL-22.
-1
[00282] В контексте исследования КИА, которое обсуждалось выше (Пример 13), мышей, страдающих артритом, лечили через день 16 мг·кгантитела 356А11. На день 30 после стимуляции коллагеном собирали сыворотку из мышей после умерщвления. Уровни IL-22 в образцах сыворотки затем измеряли методом ELISA.
[00283] Для этого формата ELISA, первым mGIL19P3/1, IgG1k моноклональным антителом крысы против IL-22 мыши, покрывали 96-луночный микротитрационный планшет для ELISA, чтобы использовать его в качестве иммобилизованного антитела. Образцы сыворотки, полученные из мышей, страдающих артритом, серийно разбавляли и затем добавляли к покрытым микротитрационным планшетам. После инкубирования образцов с первым антителом mGIL19P3/1 в микротитрационных планшетах, планшеты промывали и второе антитело hmGIL19P3/5-6no, IgG2ak моноклональное антитело крысы против IL-22, конъюгированное с биотином, добавляли к планшетам в качестве идентифицирующего антитела. После следующих этапов инкубации и промывки, добавляли стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP), которая превращает тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, измеримый количественно с помощью спектрофотометра, инкубировали и промывали планшет. После итоговой инкубации с ТМБ, после чего добавляли разбавленную N2804 для остановки ферментативной реакции, измеряли абсорбцию на 450 нм посредством спектрометра. В качестве альтернативы, и так как изотип идентифицирующего антитела, IgG2ak крысы, отличается от изотипа иммобилизованного антитела, также можно применять HRP-конъюгированное вторичное антитело, которое связывается с антителом IgG2a крысы. Применяя этот сэндвич-ELISA, мы показали, что добавление возрастающих количеств IL-22CБ мыши и/или 356А11 не влияет на способность обнаруживать фиксированные концентрации IL-22 мыши. Этот способ ELISA применяли для обнаружения IL-22 в сыворотке мышей после интраперитонеальной инъекции липополисахарида (LPS).
[00284] Когда КИА мышам вводили указанное 356А11 антитело, как указано выше, IL-22 детектировали в сыворотке на уровнях, варьирующихся от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 9 нг/мл. См. Фигуру 17. Напротив, у мышей, страдающих артритом в контрольной терапевтической группе, получающих IgG 1λ изотипический контроль антитела человека, отмечали значительно более низкие in vivo уровни IL-22 (меньше, чем 1 нг/мл). См. Фигуры 17 и 18. Таким образом, указанное 356А11 антитело захватывает IL-22 in vivo с образованием стабилизированного комплекса антитело/цитокин, который циркулирует в кровотоке. Это, в свою очередь, позволяет обнаружить in vivo IL-22 с повышенной чувствительностью, как показано на Фигуре 16. В противоположность большому количеству антител, используемых в вышеупомянутом исследовании, предложено, что 356А11 в значительно более низких уровнях можно также вводить и получать тот же эффект.
Пример 15: Лечение псориаза
[00285] Уровни IL-22 и IL-22R РНК измеряли в парах образцов ткани (патологическое изменение против непатологического изменения) из пациентов-людей, страдающих псориазом, применяя количественный ПЦР. Это исследование показало, что уровни IL-22 и IL-22R были повышенными в псориатических поражениях (Фигура 19). Другие данные свидетельствуют об участии IL-22 в развитии псориаза. Например, трансгенные мыши, которые конститутивно экспрессируют IL-22, имеют толстую кожу, инфильтраты мононуклеарных иммуноцитов, характерные для псориатических поражений, и умирают вскоре после рождения. WO 03/083062. Сходным образом, введение IL-22 мышам индуцирует утолщение кожи и инфильтрацию мононуклеарных иммуноцитов. WO 03/083062. IL-22 также индуцирует гиперплазию кератиноцитов человека, предполагая важность его роли в воспалительных процессах кожи. Boniface и др., J. Immunol., 2005 174:3695-3702.
-1
-1
[00286] Ксеногенная трансплантация в SCID мышей является известной моделью для изучения псориаза, см., например, Boehncke и др. Br. J. Dermatol. 2005, 153(4):758-66. При локальной анастезии, у пациента с хроническим бляшечным псориазом вырезали тонкий лоскут патологически измененной кожи (толщина приблизительно 0.5 мм). Лоскуты кожи человека трансплантировали черным SCID мышам в возрасте 6-8 недель. Следующие 3 недели лоскуту кожи позволяли прижиться у мышей и зарасти. Через 22 дня после трансплантации мышам инъецировали интраперитонеально 8 мг·кг анти-IL-22 антител человека, таких как эмбрионизированные 087В03, 368D04, 354А08 или 356А11, через день. В качестве негативного контроля, мышам ежедневно делали внутрижелудочные аппликации 200 мкл ФБР. В качестве позитивного контроля, мышам ежедневно делали внутрижелудочные аппликации 2 мг·кгдексаметазона в 200 мкл ФБР. У мышей из негативного контроля развивались признаки псориаза, включая акантоз, папилломатоз, паракератоз и плотный инфильтрат мононуклеаров. Мышей умерщвляли на день 50 после трансплантации и вырезали привитые лоскуты с окружающей кожей. Одну половину лоскутов фиксировали в формалине, а другую половину замораживали в жидком азоте. Выполняли стандартное окрашивание гематоксилином и эозином, и патологические изменения лоскутов анализировали как качественно (эпидермальная дифференцировка), так и количественно (толщина эпидермиса, воспалительный инфильтрат). Среднюю толщину эпидермиса можно измерить от верха сетчатых выступов до границы с жизнеспособным эпидермисом, применяя оптический микрометр. Плотность воспалительного инфильтрата можно определить путем подсчета числа клеток в трех примыкающих полях зрения микроскопа. Прогрессирование болезни можно оценить, применяя гистологический анализ для измерения признаков псориаза, таких, как акантоз, папилломатоз, паракератоз, воспалительные инфильтраты и появление роговичных и гранулярных слоев.
[00287] Мышам из негативного контроля инъецировали 200 мкл ФБР или изотипически сходного контрольного антитела, после того, как в результате трансплантации лоскута кожи прогрессивно развился псориаз. Так как псориатические поражения экспрессируют более высокие уровни IL-22, ожидали, что лечение анти-IL-22 антителами, например эмбрионизированными 087В03, 368D04, 354А08 или 356А11, подавит или задержит псориаз, что подтвердилось в исследовании по адоптивному переносу, о котором сообщается ниже.
+
выcoк
+
выc
к
[00288] Адоптивный перенос CD4CD45rb Т-клеток в scid/scid мышей является другой известной моделью для изучения псориаза у мышей. Hong и др., J. Immunol., 162(1):7480-91 (1999). В этой модели, одновременное введение LPS и IL-12 или стафилококкового энтеротоксина В в scid/scid мышей через 1 день после адоптивного переноса CD4CD45rb° Т-клеток индуцирует патологические изменения кожи, обнаруживающие признаки, наблюдаемые при псориазе у человека.
+
высок
-
+
высок
-
[00289] Применяя несколько модифицированную модель, CD4CD45rbCD25 Т-клетки переносили в scid/scid мышей одновременным введением или без LPS и IL-12 в первый день после адоптивного переноса. CD4CD45rbCD25 Т-клетки были способны индуцировать псориатические поражения, когда их переносили в scid/scid мышей, даже если их вводили без LPS и IL-12. Таким образом, введение IL-12 и LPS после адоптивного переноса не представлялось изменяющим эффективность анти-IL-22 антител в этой модели.
+
+
высок
-
6
5
+
выcoк
[00290] Клетки для адоптивного переноса готовили, как описано ранее, с небольшой модификацией. Селезенки отбирали у BALB/cBy донорных мышей в возрасте 6-8 недель (Jackson Laboratory, Бар Харбор, Мэн), и спленоциты выделяли путем механической гомогенизации селезенок. CD4 Т-клетки отбирали с применением набора для обогащения клетками CD4 мышей (R&D), следуя инструкции производителя. CD4 обогащенные Т-клетки метили анти-CD4-PE (Pharmingen), анти-CD45Rb-FITC и анти-CD25-АРС (Pharmingen). Клетки сортировали, применяя клеточный сортер Moflo (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния). Собирали CD4CD45RbCD25 клетки, которые были >95% чистые. Клетки ресуспендировали в физиологическом растворе при концентрации 2×10 клеток/мл, и 4×10 клеток инъецировали интраперитонеально C.B-17/Prkdc scid/scid мышам (Jackson Laboratory, Бар Харбор, Мэн). В некоторых случаях, 10 нг IL-12 и 20 мкг LPS вводили интраперитонеально реципиентным мышам, которые получили CD4CD45Rb клетки, на день 1, и дополнительную дозу IL-12 вводили на день 3. Мышам вводили дозу 16 мг/кг либо изотипического контроля антител, либо анти-IL-22 антител (356А11 или 368D04), в день адоптивного переноса, и один раз в неделю после этого в течение 10 недель. Мышей наблюдали на предмет клинических симптомов патологических изменений кожи два раза в неделю. По окончании исследования уши, кожу, лимфатические узлы и селезенку мышей собирали для дополнительных ex-vivo исследований.
[00291] Клиническая оценка
Мышей оценивали в рамках слепого исследования дважды в неделю, начиная с 10 дня после адоптивного переноса. Для регистрации прогрессирования болезни давали полуколичественные клинические показатели от 0 до 6 на основании физических проявлений: 0 = отсутствуют кожные или ушные симптомы; 0.5 = незначительная эритема на ухе или глазном веке, 1 = легкая, умеренная эритема на ушах или глазных веках с легким утолщением уха (<2% поверхности тела); 2 = от умеренной до сильной эритемы на 2-10% поверхности тела, легкая чешуйчатость, 3 = сильная эритема и чешуйчатость на 10%-20% поверхности тела; 4 = очень сильная, обширная эритема и чешуйчатость на 20%-40% поверхности тела; 5 = очень сильная, обширная эритема и чешуйчатость на 40%-60% поверхности тела; 6 = очень сильная, обширная эритема и чешуйчатость и чешуйчатость на более чем 60% поверхности тела. Специфичные наблюдения отмечали, на основании состояния шерсти, ушных проявлений, внешнего вида глазного века и наличия воспаления на лапах и хвосте.
[00292] В исследовании без одновременного введения LPS и IL-12, антитела 356А11 и 368D04 значительно подавляли воспаление кожи, по сравнению с мышами, которых лечили контрольными антителами, что начиналось настолько рано, как на день 21 для 356А11 и день 35 для 368D04 (Фигуры 20А-В). Сходные результаты наблюдали в исследовании с одновременным введением LPS и IL-12 в первый день после адоптивного переноса, в котором 356А11 и 368D04 значительно подавляли патологические изменения кожи, по сравнению с контрольным антителом, что начиналось настолько рано, как на день 28 после адоптивного переноса. (Фигуры 27А и В). В отдельном исследовании, 356А11, без (Фигуры 34А-В) или с (Фигуры и 37А-В) одновременным введением LPS и IL-12 в первый день после адоптивного переноса, значительно подавляли воспаление кожи, по сравнению с мышами, которых лечили контрольными антителами, что начиналось настолько рано, как на день 21.
[00293] Обнаружение цитокинов
Сыворотки мышей или супернатанты из культур клеток подвергали количественному анализу на IL-6, интерферон-γ и TNF-α, применяя набор для ELISA (R&D System). ELISA для IL-22, IL-17A, IL-17F и IL-17 A/F гетеродимера включал покрывание 96-луночного плоскодонного планшета (Costar) в течение ночи при 4°С 100 мкл 2 мкг/мл раствора анти-IL-22 (Ab-01), анти-IL-17А (R&D), или анти-IL-17F (RK015-01) антител в ФБР. Планшеты затем промывали ФБР/Tween (0.05% Tween-20 в ФБР) и блокировали 200 мкл ФБР плюс 1% БСА в течение 1 часа при комнатной температуре. Антитела против IL-22 мыши (Ab-01, Ab-02 и Ab-03) и IL-17F мыши (RK015-01) были получены способами, описанными в Li и др., Int. Immunopharmacol. 4:693-708 (2004). В промежутке между всеми последующими этапами планшеты промывали ФБР/Tween. Затем добавляли IL-22 (R&D), IL-17A (R&D), IL-17F и IL-17A/F стандарты, пробы супернатантов и пробы сыворотки (разбавленные с ФБР 1:5). Биотинилированные вторичные антитела против анти-IL-22 (Ab-03), анти-IL-17А (R&D) и анти-IL-17F (RK015-01) антител затем добавляли в соответствующие планшеты в концентрации 0.5 мкг/мл в 1% БСА/ФБР растворе, и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Стрептавидин, помеченый пероксидазой хрена, (Pierce) добавляли, следуя инструкции производителя, на 15 минут. Планшет проявляли путем добавления ТМБ субстрата на 15-30 минут. Тест затем считывали на микропланшетном ридере Molecular Devices (Саннивейл, Калифорния) и данные анализировали, применяя программное обеспечение SOFTmax.
[00294] В указанном исследовании без одновременного введения LPS и IL-12, детектировали более высокие уровни IL-22 в сыворотке у мышей, которых лечили 356А11, чем у мышей, которых лечили контрольным антителом, указывая на то, что 356А11 захватывает и стабилизирует IL-22 in vivo (Фигура 21), как обсуждалось в Примере 14. Сходные результаты также наблюдали у мышей, которых лечили 356А11 с одновременным введением LPS и IL-12 в первый день после адоптивного переноса. (Фигура 28). Эти результаты повторяли в отдельном исследовании с 356А11, без (Фигура 35) и с (Фигура 38) одновременным введением LPS и IL-12 в первый день после адоптивного переноса. IL-22 в сыворотке не был обнаружен у мышей, которых лечили 368D04 (Фигура 21).
[00295] В указанном исследовании без одновременного введения LPS и IL-12, детектировали значительно более низкие уровни в сыворотке IL-17F, IL-17А, IL-17A/F у мышей, которых лечили 356А11 и 368D04 (Фигуры 22А-С). Также наблюдалась тенденция к снижению уровней IL-6 в сыворотке у мышей, которых лечили 356А11 и 368D04 (Фигура 22D). Количества интерферона-γ и TNFα были ниже предела чувствительности в сыворотке из мышей, которых лечили контрольными, 356А11 или 368D04 антителами. Сходные результаты также наблюдали у мышей, которых лечили 356А11 с одновременным введением LPS и IL-12 в первый день после адоптивного переноса. (Фигуры 29A-D). В отдельном исследовании, значительно более низкие уровни в сыворотке IL-17A и IL-6 также наблюдали у мышей, которых лечили 356А11 без (Фигуры 39А-В) и с (Фигуры 39C-D) одновременным введением LPS и IL-12 в первый день после адоптивного переноса.
[00296] Выделение и стимуляция клеток лимфатического узла
6
-5
Псориатические поражения в указанной модели обычно прогрессируют от уха, глаза, морды и шеи к остальной части тела. У мышей, которых лечили лекарственными препаратами, обычно развивались легкие патологические изменения кожи только вокруг глаза и уха. Поэтому шейные лимфатические узлы, которые дренируют лицо, были выделены из каждой мыши для получения наибольшего числа активированных клеток Клетки лимфатического узла (ЛУ) извлекали путем механической гомогенизации. Клетки ЛУ отсортировали из приблизительно 9-10 мышей на группу и ресуспендировали при концентрации 1×10/мл в полной RPMI 1640 среде, дополненной 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone), 5×10 M 2-меркаптоэтанола (Sigma), 2 мМ глутамина (Life Technologies, Гейтерсбург, Мэриленд), 10 Ед/мл пенициллина, 100 мкг стрептомицина (Life Technologies), и 15 мМ HEPES. Все содержимое 200 мкг/лунку этой суспензии затем помещали в 96-луночный планшет и стимулировали анти-CD3 плюс анти-СD28 (1 мкг/мл каждого) в течение 48 часов.
[00297] Окрашивание внутриклеточных цитокинов
Для изучения эффекта от нейтрализации IL-22 на эффекторную популяцию Т-клеток выполняли окрашивание внутриклеточных цитокинов на клетках шейного лимфатического узла. Клетки стимулировали 50 нг/мл параметоксиамфетамина (РМА) (Sigma), 1 мкг/мл иономицина (Sigma), и ингибитором внутриклеточного транспорта GolgiPlug (Pharmingen) в течение 12 часов. Клетки сначала окрашивали на поверхностный антиген (CD4) и затем обрабатывали Cytofix/Cytoperm (Pharmingen), следуя указаниям производителя. Окрашивание внутриклеточных цитокинов выполняли, с применением антител к интерферону-γ, IL-22, IL-17A, IL-17F, TNFα и соответствующие IgG изотипические контроли. Анти-IL-22 (Аb-02) метили Alexa 647 (Molecular Probes) и анти-IL-17F (RK015-01) метили FITC (Pierce Biotechnologies), следуя указаниям производителя.
+
+
[00298] Клетки анализировали в рамках выделенной CD4+ популяции Результаты FACS анализа показывают, что у мышей, которых лечили 356А11 и 368D04 (без одновременного введения LPS и IL-12), было более низкое процентное содержание CD4 Т-клеток, продуцирующих IL-22, IL-17A, и оба IL-22 и IL-17F, но более высокое процентное содержание CD4 Т-клеток, продуцирующих интерферон-γ, по сравнению с таковым у мышей, которых лечили изотипическим контролем (Фигура 23). Сходные результаты также наблюдали у мышей, которых лечили 356А11 с одновременным введением LPS и IL-12 в первый день после адоптивного переноса (Фигура 31).
[00299] Количественный анализ транскриптов цитокинов
РНК выделяли из ушей или клеток ЛУ мыши (после стимуляции), применяя набор Qiagen Rneasy kit (Qiagen). Количественную ПЦР на транскрипты цитокинов выполняли, применяя предварительно проверенные праймеры и зонды (Applied Biosystems). Способ ΔΔCt применяли, чтобы нормализовать транскрипты на GAPDH и чтобы рассчитать, во сколько раз превышена индукция по сравнению с контрольными мышами.
[00300] Результаты количественной ПЦР с применением РНК из ушей мыши, показали, что мыши, которых лечили 356А11 и 368D04, имели более низкую экспрессию генов IL-22, IL-17F, IL-17A и IL-6, но повышенную экспрессию интерферона-γ по сравнению с мышами, которых лечили контрольным антителом (Фигуры 24А-Е). Сходные результаты также наблюдали у мышей, которых лечили 356А11 с одновременным введением LPS и IL-12 в первый день после адоптивного переноса. (Фигуры 30А-Е). Эти результаты повторяли в отдельном исследовании с 356А11 (без одновременного введения LPS и IL-12), в котором также наблюдали, что у мышей, которых лечили 356А11, была более низкая экспрессия гена 6 члена семейства белков IL-1 (IL-1 F6) и неизмененная экспрессия генов IL-22-связывающего белка и субъединицы рецептора IL-22 (IL-22R1), по сравнению с мышами, которых лечили контрольным антителом. (Фигуры 36А-Н).
[00301] Результаты количественной ПЦР с применением РНК из клеток лимфатического узла, стимулированных анти-СD3 и анти-СD28 в течение 48 часов, как описано выше, показали, что 356А11 и 368D04 подавляли экспрессию генов IL-22, IL-6, IL-17A и IL-17F ex vivo, но не вызывали значительных изменений в экспрессии гена интерферона-γ. (Фигуры 26А-Е). Сходные результаты также наблюдали у мышей, которых лечили 356А11 с одновременным введением LPS и IL-12 в первый день после адоптивного переноса. (Фигуры 33А-Е).
[00302] Супернатанты из клеток лимфатического узла, стимулированных анти-СD3 и анти-СD28, как описано выше, собирали для анализа цитокинов с применением наборов для ELISA (R&D System), как обсуждалось ранее. Результаты ELISA цитокинов отражали данные по экспрессии генов ЛУ, показывая, что 356А11 и 368D04 подавляли секрецию IL-22, IL-6, IL-17A и IL-17F ех vivo, но не вызывали значительных изменений в секреции интерферона-γ из стимулированных клеток. (Фигуры 25A-F). Сходные результаты также наблюдали у мышей, которых лечили 356А11 с одновременным введением LPS и IL-12 в первый день после адоптивного переноса. (Фигуры 32А-Е).
[00303] Гистопатологический анализ
Некропсию выполняли на тканях мышей по окончании in vivo исследования. Образцы ткани из кожи уха собирали и фиксировали в 10% растворе формалина для приготовления и анализа срезов. Для регистрация тяжести заболевания, предписывали полуколичественные гистологические оценки от 0 до 5, на основании тяжести воспаления. Гистологическая оценка была выполнена в рамках слепых исследований патоморфологами, прошедшими профессиональную сертификацию. 0 = в пределах нормы; 1 = минимальная, 2 = легкая, 3 = умеренная, 4 = заметная и 5 = сильная.
[00304] Иммуногистохимический анализ
Образцы ткани собирали и заключали в соединение Tissue Tek ОСТ (Miles, Элкхарт, Индиана) и замораживали с помощью сухого льда для получения криостатных срезов. Срезы ткани (5 мкм) фиксировали в 100% ацетоне и окрашивали анти-СD4, анти-CD11b антителами и антителами против нейтрофилов (PharMingen). Ткани оценивали как негативные = 0, с легкой = 1, умеренной = 2 и сильной = 3 патологией, на основании визуального наблюдения с помощью флуоресцентной микроскопии.
+
+
[00305] Результаты гистологического анализа показывают, что мыши, которых лечили 356А11 и 368D04, имели меньшую пролиферацию кератиноцитов, сетчатые выступы, и инфильтраты воспалительных клеток в коже, по сравнению с лечением изотипическим контролем. Дополнительно, результаты иммуногистохимии показали, что 356А11 снижало количество CD4, CD11b (макрофагов) и нейтрофилов в эпидермальном, дермальном и подкожном слоях. Указанные результаты гистологических исследований отражали результаты клинических исследований и поддерживали применение антагонистов IL-22, таких как антитела согласно настоящему изобретению, в качестве терапевтических агентов для лечения псориаза и других аналогичных псориазу кожных заболеваний.
[00306] Суммарные результаты показывают, что антитела согласно настоящему изобретению, такие как 087В03, 368D04, 354А08 или 356А11, эффективны в этой модели псориаза на мышах и свидетельствуют, что лечение анти-IL-22 антителами, включая 087В03, 368D04, 354А08 или 356А11, обеспечивает действенную стратегию для терапевтического вмешательства в псориаз человека.
Пример 16: Лечение пациентов
[00307] Пациенты с аутоиммунным расстройством, респираторным расстройством, воспалительным состоянием кожи, сердечно-сосудистой системы, нервной системы, почек, печени и поджелудочной железы или пациенты, которым была проведена трансплантация, принадлежат к типу пациентов, которых можно лечить указанными антителами согласно настоящему изобретению. Примеры схем лечения и ожидаемых результатов приведены ниже. Дозировки и частота введения, отличные от тех, которые указаны в Таблице 14, также можно использовать. Специалист в данной области может регулировать схемы лечения, как требуется, на основании пути введения или других известных варьирующихся параметров, таких как возраст, вес, состояние здоровья, пол, тяжесть патологического состояния и т.д., пациента, которого нужно вылечить.
Заболевание
Лечение
Дозировки
Частота
Предполагаемый результат
Множественный склероз
087В03, 368D04, 356А11 или 354А08
250 mg/kg -2 mg/kg
Раз в неделю, два раза в неделю, раз в месяц
Улучшение или стабилизация заболевания
Ревматоидный артрит
087В03, 368D04, 356А11 или 354А08
250 mg/kg -2 mg/kg
Раз в неделю, два раза в неделю, раз в месяц
Улучшение или стабилизация заболевания
Псориаз
087В03, 368D04, 356А11 или 354А08
250 mg/kg -2 mg/kg
Раз в неделю, два раза в неделю, раз в месяц
Улучшение или стабилизация заболевания
IBD
087В03, 368D04, 356А11 или 354А08
250 mg/kg -2 mg/kg
Раз в неделю, два раза в неделю, раз в месяц
Улучшение или стабилизация заболевания
Болезнь Альцгеймера
087В03, 368D04, 356А11 или 354А08
250 mg/kg -2 mg/kg
Раз в неделю, два раза в неделю, раз в месяц
Улучшение или стабилизация заболевания
[00308] Настоящее описание изобретения станет еще более понятным в свете принципов, изложенных в ссылках, цитированных в описании настоящего изобретения. Варианты реализации в описании настоящего изобретения предусматривают только иллюстрацию вариантов реализации настоящего изобретения и не должны быть истолкованы как ограничивающие объем настоящего изобретения. Для специалиста в данной области очевидно, что многие другие варианты реализации охвачены настоящим изобретением. Все публикации и патенты, цитированные в настоящем описании, включены посредством ссылки в полном объеме. В тех случаях, когда содержание источника, включенного посредством ссылки, противоречит или не соответствует описанию настоящего изобретения, описание настоящего изобретения заменяет любой подобный материал. Цитирование любых ссылок в данной заявке не является допущением, что подобные ссылки представляют известный уровень техники для настоящего изобретения.
[00309] Если не указано иное, все числа, выражающие количественное содержание ингридиентов, условия реакций и тому подобное, используемые в описании настоящего изобретения, включая формулу изобретения, должны пониматься перемененными во всех случаях, когда присутствует термин "приблизительно/примерно". В соответствии с этим, если не указано противоположное, численные параметры являются приблизительными и могут изменяться в зависимости от желаемых свойств, получения которых добиваются настоящим изобретением. Как минимум, и не как попытка ограничить применимость доктрины эквивалентов к объему настоящей формулы изобретения, каждый численный параметр должен пониматься в свете некоторого числа значащих разрядов и стандартных подходов к округлению чисел.
[00310] Если не указано иначе, термин "по меньшей мере", предшествующий группе элементов, должен пониматься относящимся к каждому элементу в группе. Специалисты в данной области поймут или смогут проверить, применяя не более чем стандартные эксперименты, множество эквивалентов конкретных вариантов реализации настоящего изобретения, описанных в данной заявке. Такие эквиваленты должны быть охвачены следующей формулой изобретения.