СПОСОБ СОЗДАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ УМЕРЕННОГО ТОРМОЖЕНИЯ РОСТА ОПУХОЛИ И МЕТАСТАЗОВ КАРЦИНОМЫ ЛЕГКИХ ЛЬЮИС С ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОЙ ЦИКЛОФОСФАНИНДУЦИРОВАННОЙ ЛЕЙКОПЕНИЕЙ У МЫШЕЙ
METHOD FOR CREATING BIOLOGICAL MODEL OF MODERATE GROWTH INHIBITION OF TUMOUR AND METASTASES IN LEWIS LUNG CARCINOMA WITH PROLONGED CYCLOPHOSPHANINE-INDUCED LEUKOPENIA IN MICE

Изобретение относится к области медицины, конкретно, к онкологии, и может быть использовано для доклинического исследования веществ, повышающих противоопухолевое, противометастатическое действие цитостатиков и снижающих их токсичность на клетки белой крови.
В современной клинической онкологии химиотерапия является одним из основных методов лечения пациентов со злокачественными новообразованиями, в частности, на поздних стадиях развития опухолевого процесса при наличии обширного метастазирования [1].
Большинство противоопухолевых препаратов - цитостатиков обладают побочным действием и поражают не только раковые клетки, но и здоровые с высокой фракцией роста, прежде всего, клетки крови, провоцируя развитие гипо- и апластических состояний. Такие нарушения являются основным лимитирующим фактором для проведения химиотерапии. Одним из широко применяемых препаратов в онкологической клинике является циклофосфан, который наряду с цитостатическим действием на опухоль обладает рядом токсических проявлений (нарушение кроветворения, иммунодепрессия), что лимитирует его продолжительное использование в высокоэффективных дозах для лечения больных с новообразованиями. Таким образом, повышение противоопухолевой и противометастатической активности циклофосфана при снижении его токсичности является актуальным.
В литературе имеются сведения, что при однократном внутрибрюшинном введении мышам циклофосфана в дозе 125 мг/кг (1/2 максимально переносимой дозы - МПД) значительно тормозится рост первичного опухолевого узла и метастазов карциномы легких Льюис. При этом наблюдается лейкопения с минимальными значениями на 3 и 4 сут и восстановлением показателей периферической крови с 5 сут после введения циклофосфана [2].
Известно, что 2-кратное введение циклофосфана в дозе 60 мг/кг мышам с карциномой легких Льюис приводит к существенному торможению роста опухоли (63%) и метастазов (индекс ингибирования метастазирования равен 82%) [3].
В данных биологических моделях наблюдается выраженная ингибиция роста опухоли и метастазов, при которой невозможно провести оценку вклада в повышение эффективности цитостатической терапии веществ различной природы при включении их в схему лечения.
Учитывая тот факт, что в клинической практике цитостатическая терапия применяется курсами (как правило, 3-кратными), возникающая при этом длительная лейкопения является препятствием для полного проведения лечения.
Таким образом, предлагаемая нами модель умеренного торможения роста первичного опухолевого узла и метастазов при развитии карциномы легких Льюис у мышей с сопутствующей продолжительной лейкопенией, вызванная 3-кратным введением циклофосфана, может быть использована при доклиническом изучении веществ, повышающих эффективность химиотерапии и снижающих токсическое действие цитостатиков на клетки белой крови.
В проанализированной литературе адекватного прототипа не обнаружено.
Задачей изобретения является создание новой биологической модели умеренного торможения роста опухоли и метастазов с сопутствующей продолжительной лейкопенией.
Поставленная задача решается путем многократного введения животным циклофосфана. Новым является то, что в качестве модели курсового использования цитостатика применяют 3-кратное внутрибрюшинное введение мышам линии C57B L/6 с перевитой внутримышечно по 4 млн клеток карциномой легких Льюис циклофосфана в дозе 83,3 мг/кг (1/3 МПД) на 6, 12 и 18 сут после трансплантации опухоли. Первый раз циклофосфан вводят на 6 сут после перевивки опухоли в связи с тем, что к этому сроку уже заложены метастазы карциномы легких Льюис и возможно оценить влияние цитостатика на их развитие [4]. Далее циклофосфан вводят на 12 и 18 сут после трансплантации опухоли, чтобы поддерживать умеренное ингибирующее влияние цитостатика на развитие опухолевого процесса в течение эксперимента. Кроме того, циклофосфан вводят трижды с интервалом в 6 сут, чтобы сниженное в результате цитостатического воздействия количество клеток белой крови оставалось на одном уровне длительное время. При умеренном влиянии цитостатика на развитие опухолевого процесса и сопутствующей длительной лейкопенией возможно оценить вклад в повышении эффективности противоопухолевого лечения и снижения токсичности на клетки белой крови дополнительно включенных в схему терапии веществ различной природы.
Данные существенные признаки не выявлены из научно-медицинской и патентной литературы. Они явным образом не следуют из уровня техники для специалистов. Предлагаемая в качестве изобретения модель курсового применения циклофосфана может быть использована для доклинического изучения веществ, повышающих эффективность химиотерапии и снижающих токсическое действие цитостатиков в отношении клеток белой крови.
Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Данная модель прошла экспериментальное исследование в лабораториях онкофармакологии и патологической физиологии и экспериментальной терапии ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН г.Томска.
Исследования проведены на трехмесячных мышах-самках линии C57B L/6 массой 19-20 г. В качестве модели злокачественного роста использовали гематогенно метастазирующую карциному легких Льюис (3LL), перевиваемую внутримышечно по 4 млн опухолевых клеток на мышь. Для моделирования курсовой схемы химиотерапии применяли 3-кратное внутрибрюшинное введение циклофосфана (1/3 МПД - 83,3 мг/кг на 6, 12, 18 сут после перевивки опухоли).
Для выявления противоопухолевого и антиметастатического действия, а также токсического влияния на показатели периферической крови у животных (общее количество лейкоцитов, нейтрофильные и эозинофильные гранулоциты, лимфоциты, моноциты) при 3-кратном введении циклофосфана в дозе 83,3 мг/кг был поставлен следующий эксперимент.
Пример
Животных делили на следующие группы:
1. «Фон» (n=10) - здоровые мыши.
2. «Контроль» (n=6) - нелеченые мыши с карциномой легких Льюис.
3. «Циклофосфан» (n=6) - мыши с карциномой легких Льюис, получавшие циклофосфан внутрибрюшинно в дозе 83,3 мг/кг на 6, 12, 18 сут развития опухоли.
За 1 сут до перевивки опухоли и на 3 сут после 1, 2 и 3 введения циклофосфана (9, 15, 21 сут после трансплантации опухоли) из хвостовой вены мышей проводили забор периферической крови, определяли ее показатели (общее количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула) стандартными гематологическими методами [5]. Показатели периферической крови определяли на 3 сут после каждого введения циклофосфана в связи с тем, что на этот срок обнаруживается максимально низкое число клеток белой крови.
В конце эксперимента (21 сут после трансплантации опухоли) определяли массу опухоли, процент торможения ее роста, частоту метастазирования, количество и площадь метастазов в легких, индекс ингибирования метастазирования [6, 7]. Обработку полученных результатов проводили с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считали достоверными при Р<0,05 [8].
В эксперименте выявлено, что 3-кратное внутрибрюшинное введение циклофосфана в дозе 83,3 мг/кг оказало умеренное ингибирующее влияние на рост первичного опухолевого узла и метастазов. Так, к концу эксперимента торможение роста опухоли составило 34%, количество метастазов снизилось в 4,7 раза (Р<0,01), уменьшилась также площадь метастатического поражения легких по сравнению с контрольными значениями, частота метастазирования составила 100%, как и в контроле (табл.1).
Исследование показателей периферической крови у мышей контрольной группы (с опухолями) выявило повышенное содержание общего количества лейкоцитов на все сроки наблюдения относительно этого показателя у здоровых животных (Фон), преимущественно, за счет увеличения количества нейтрофильных гранулоцитов (табл.2). Наиболее выраженный лейкоцитоз наблюдался к 21 сут эксперимента, когда общее количество лейкоцитов увеличилось 1,5 раза (Р<0,01), за счет повышения числа сегментоядерных нейтрофилов в 4,3 раза (Р<0,01) по сравнению с таковым у фоновых мышей.
Депрессия белого ростка кроветворения, вызванная 3-кратным введением циклофосфана, выражалась в снижении общего количества лейкоцитов в периферической крови мышей на протяжении всего периода исследования: на 3 сут после 1, 2, 3 введения циклофосфана - в 3,4; 3,2; 5,9 раза (Р<0,01) соответственно относительно таковых у животных контроля. На эти же сроки наблюдения отмечено уменьшение количества сегментоядерных нейтрофилов (в 7,9; 2,5 и 5,8 раза, Р<0,01) и лимфоцитов (в 3,0; 3,6 и 6,1 раза, Р<0,01) относительно этих показателей в контроле (табл.2).
Таким образом, 3-кратное внутрибрюшинное введение циклофосфана в дозе 83,3 мг/кг мышам с карциномой легких Льюис приводит к умеренному торможению роста опухоли, метастазов и сопровождается длительной лейкопенией на протяжении всего периода исследования. Умеренное влияние циклофосфана на развитие опухолевого процесса и продолжительная лейкопения позволит выявить возможность повышения противоопухолевого и противометастатического действия цитостатика и коррекции его токсических проявлений при введении в схему лечения веществ различной природы.
Предложенная биологическая модель позволит проводить изучение возможности использования препаратов-корректоров цитостатической терапии для онкологической клиники.
Таблица 2
Динамика содержания общего количества лейкоцитов и их отдельных форм (×10<sup>9</sup> г/л) в периферической крови мышей с карциномой легких Льюис в условиях 3-кратного введения циклофосфана в дозе 83,3 мг/кг (Х±m)
Группа наблюдения, доза препарата × число введений (количество животных)
Общее количество лейкоцитов
Нейтрофильные гранулоциты
Лимфоциты
Эозинофилы
Моноциты
Палочко-ядерные
Сегменто-ядерные
Исходный фон (1 сут до перевивки 3LL)
А. Фон (n=10)
8,75±0,7
0,03±0,02
1,2±0,22
7,34±0,55
0,09±0,02
0,08±0,02
3 сут после 1 введения циклофосфана, 83 мг/кг (9 сут)
1. Контроль (n=6)
10,83±1,84
0,06±0,04
1,75±0,38
8,75±1,5
0,08±0,04
0,19±0,06
2. Циклофосфан, 83 мг/кг ×1 (n=6)
3,21±0,48
0,01±0,01
0,22±0,07
2,92±0,42
0±0
0,06±0,03
1-2Р<0,01
1-2Р<0,01
1-2Р<0,01
3 сут после 2 введения циклофосфана, 83 мг/кг (15 сут)
1. Контроль (n=6)
9,00±1,23
0±0
2,05±0,21
6,70±1,2
0,06±0,03
0,17±0,03
2. Циклофосфан, 83 мг/кг ×2 (n=6)
2,79±0,32
0±0
0,81±0,15
1,86±0,2
0,02±0,01
0,10±0,03
1-2Р<0,01
1-2Р<0,01
1-2Р<0,01
3 сут после 3 введения циклофосфана, 83 мг/кг (21 сут)
1. Контроль (n=6)
13,08±1,16
0,10±0,07
5,20±0,58
7,62±0,67
0,14±0,07
0,03±0,03
А-1Р<0,01
А-1Р<0,01
2. Циклофосфан, 83 мг/кг ×3 (n=6)
2,21±0,61
0,01±0,01
0,90±0,33
1,25±0,28
0,01±0,01
0,05±0,03
1-2Р<0,01
1-2Р<0,01
1-2Р<0,01
Список литературы
1. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний / Под ред. Н.И.Переводчиковой. - М.: Практическая медицина, 2005. - С.26.
2. Абрамова Е.В. Влияние экстракта шлемника байкальского на процессы регенерации кроветворения в условиях химиотерапии: Автореф. дисс.… канд. мед. наук., Томск, 1992. - С.10, 15.
3. Патент на изобретение №2270682 РФ. Способ повышения противоопухолевой и антиметастатической активности циклофосфана в эксперименте / Кокорев О.В., Чердынцева Н.В., Зюзикова О.В. Опубликовано: 27.02.2006, Бюлл. №6.
4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под Р.У.Хабриева. - М.: Медицина, 2005. - С.677.
5. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во Томского Университета, 1992. - С.210, 214.
6. Архипов С.А., Юнкер В.М., Грунтенко Е.В. Изменение интенсивности метастазирования в легкие перевиваемых опухолей мышей в зависимости от величины перевивочной дозы опухолевых клеток // Исследование по индукции и метастазированию опухолей у экспериментальных животных. - Новосибирск, 1984. - С.29.
7. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США / Под ред. З.П.Софьиной, А.Б.Сыркина (СССР), А.Голдина, А.Кляйна (США). - М.: Медицина, 1979. - С.131.
8. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - Л.: Медицина, 1978. - С.193.