СПОСОБ ОЦЕНКИ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD FOR ASSESSING CELL METABOLIC ACTIVITY AND DEVICE FOR IMPLEMENTATION THEREOF

Изобретение относится к области биохимии, может быть использовано для исследования и анализа материалов с помощью электрохимических средств в биотехнологии и для диагностики в медицине, ветеринарии.
Известен способ анализа метаболитов в клеточных биотехнологиях [1] с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Данным способом разделяют и детектируют компоненты лизата клеток, полученного путем экстракции метаболитов, например, в ацетонитириле, время удерживания метаболитов в хроматографической колонке используют для идентификации метаболита, а величину генерируемого метаболитом аналитического сигнала используют для определения концентрации метаболита. Недостатками способа [1] являются существенные затраты времени на подготовку проб и их анализа, потребность использования труднодоступного, объемного каталога эталонов и стандартов (для анализа исследуемой пробы путем сравнения с материалами), потребность использования дорогостоящего оборудования со сложностями его эксплуатации, необходимость привлечения к анализу персонала высокой квалификации. Недостатки существенно ограничивают применение способа [1] в биотехнологиях, медицинской и ветеринарной практике, особенно - для экспресс-анализа метаболитов клеточных материалов.
Известен способ анализа метаболитов форменных элементов крови и других клеток человека в клеточных биотехнологиях [2], с использованием оптической микроскопии и проточной цитометрии. В способе [2] используют флуоресцентные красители, меченные антителами, для специфичного определения клеточных метаболитов в суспензии клеток с помощью микроскопа и/или проточного анализатора, которые детектируют флуоресценцию красителей. Недостатком способа [2] является сложность осуществления анализа метаболитов в клетках, значительная продолжительность и трудоемкость анализа, необходимость использования дорогостоящих красителей и потребность участия высококвалифицированного персонала. Указанные недостатки существенно ограничивают возможность применения способа [2] в клинической практике.
Наиболее близким по существу предлагаемого изобретения, прототипом по совокупности общих признаков является известный способ определения аденозинтрифосфата (далее по тексту - АТФ) с помощью электрохимического сенсора в виде платинового микроэлектрода, модифицированного ферментами - глюкозоксидазой и гексокиназой [3]. АТФ-нуклеотид, играющий исключительно важную роль в обмене энергии и веществ в организмах; соединение известно как универсальный источник энергии для всех биохимических процессов, протекающих в живых системах. В прототипе [3] модифицированный ферментами платиновый микроэлектрод помещают в электрохимическую ячейку, содержащую исследуемый образец, и детектируют с помощью потенциостата пропорциональный концентрации АТФ сигнал окисления перекиси водорода (образуется в ходе ферментативного катализа в присутствии глюкозы). Недостатками способа [3] являются необходимость использования подверженных влиянию внешних помех высокочувствительных приборов, неудовлетворительная воспроизводимость аналитических характеристик сенсора, приводящая к низкой достоверности результатов анализа. Кроме того, возможность способа [3] ограничивается определением только одного метаболита или однотипной группы метаболитов (являющихся субстратами используемых ферментов) при использовании одного сенсора. При необходимости же анализа множества метаболитов различных биологических материалов требуется обязательное использование иных сенсоров на основе других ферментов, что существенно ограничивает использование прототипа для диагностики в медицине и ветеринарии.
Основной целью заявляемого технического решения является оценка метаболической активности клеток за счет реализации заявленной последовательности способа и применения заявленного сенсора, кроме этого обеспечивается реализация ряда других целей не менее важных целей:
- расширение области применения электрохимических средств исследования и анализа путем определения электрохимических параметров биологических материалов,
- повышение достоверности результата анализа в биотехнологии,
- повышение точности диагностики в медицине, ветеринарии,
- упрощение способа выполнения анализа,
- повышение доступности осуществления способа за счет применения сенсора,
- обеспечение более высокой информативности анализа,
- обеспечение высокой скорости выполнения анализа метаболической активности клеток при одновременном повышении достоверности и точности результатов,
- снижение себестоимости анализа,
- повышением производительности и качества труда персонала.
- обеспечение возможности оценки эффективности действия лекарственных средств в процессе лечения путем сравнительной оценки уровня метаболической активности клеток в норме и при патологии.
Заявленные цели достигают за счет того, что способ электрохимической оценки метаболической активности клеток осуществляют, адсорбируя клеточные метаболиты на рабочем электроде, модифицированном адсорбирующим клеточные метаболиты углеродным материалом, регистрируя и сравнивая количество пиков и величины сигналов окисления/восстановления адсорбированных на электроде метаболитов клеток в норме и при патологии, по количеству пиков сигнала и величине пиков сигнала окисления/восстановления определяют количество групп метаболитов и содержание метаболитов каждой из этих групп в исследуемых клетках, оценку метаболической активности выполняют с использованием клеток, выделенных из биологических материалов. Оценку метаболической активности выполняют с использованием:
- культур живых клеток,
- суспензии живых клеток,
- контактировавшего с клетками раствора.
- лизата клеток,
для придания рабочему электроду адсорбирующей способности углеродный материал подвергают химическому окислению, для придания рабочему электроду адсорбирующей способности углеродный материал подвергают окислению в смеси кислот, для придания рабочему электроду адсорбирующей способности углеродный материал подвергают химическому окислению в смеси концентрированных азотной и серной кислот в соотношении 1 к 3 по объему, способ осуществляют путем использования устройства, представляющего собой электрохимический анализатор для оценки метаболической активности клеток, содержащий электрохимическую ячейку с погруженным в электролит и соединенным с регистрирующим устройством трехэлектродным сенсором, состоящим из противоэлектрода, электрода сравнения и модифицированного углеродным материалом рабочего электрода. В качестве трехэлектродного сенсора используют печатный электрод с модифицированным углеродным материалом рабочей поверхностью.
Для реализации поставленных целей используют следующие рабочие электроды;
- электрод, модифицированный углеродными нанотрубками,
- электрод, модифицированный углеродными наноконусами,
- электрод, модифицированный фуллеренами.
Заявленное техническое решение поясняется следующими материалами:
На Фиг.1 представлена блок-схема электрохимического анализатора.
На Фиг.2 показаны вольтамперограммы различных живых клеток: линии HeLa (а), мононуклеаров (б) и эритроцитов крови человека (в) на поверхности сенсора 7.
На Фиг.3 показан калибровочный график для оценки (по заявляемому способу) содержания АТФ в водном растворе.
На Фиг.4 представлены результаты исследования действия дексаметазона на электрохимический сигнал (вольтамперограмму).
Заявленное техническое решение осуществляют, например, следующим образом, с использованием заявляемого устройства. Используют электрохимический анализатор, блок-схема которого показана на Фиг.1, где 1 - регистрирующее устройство, например - потенциостат-гальваностат; 2 - электрохимическая ячейка, содержащая электролит 3, например - фосфатно-солевой буферный раствор; 4 - электрод сравнения, например - хлоридсеребряный; 5 - противоэлектрод, например - углеродный; 6 - рабочий электрод, например - углеродный, модифицированный, например - углеродными нанотрубками. Электроды 4, 5, 6 образуют трехэлектродную схему сенсора 7, например - изготовленного из печатного электрода путем модификации его рабочего электрода 6. Электроды 4, 5, 6 сенсора 7 погружены в электролит 3 электрохимической ячейки 2 и соединены, например - электропроводами, с регистрирующим устройством 1.
До начала оценки метаболической активности клеток на основе печатного электрода изготавливают сенсор 7 путем модификации стандартного рабочего электрода 6. Для этого рабочий электрод 6 модифицируют углеродным материалом, например - многослойными Углеродными НаноТрубками (далее по тексту - УНТ), подвергнутыми химическому окислению, например - в смеси кислот. В одном из вариантов окисление осуществляют в смеси азотной и серной кислот, имеющих соответственно концентрацию от 40% до 70% и от 40% до концентрированной, взятых в соотношении 1 к 3 по объему соответственно. Продолжительность процесса окисления углеродного материала составляет 2…4 часа в зависимости от концентрации окислителей, например - кислот. При уменьшении времени окисления и использовании низких концентраций кислот снижается эффективность данного процесса, а при увеличении времени и применении больших концентраций кислот происходит разрушение углеродного материала.
Химическое окисление придает углеродному материалу, например - УНТ, свойство растворяться в жидкости, например - воде, при концентрации УНТ 10 мг/мл. Окисление превращает углеродный материал в структуру, способную адсорбировать молекулы [4], обеспечивающие метаболическую активность клеток.
Перечень адсорбирующих клеточные метаболиты модифицирующих углеродных материалов не ограничивается углеродными нанотрубками. В качестве модифицирующего углеродного материала используют также иные углеродные наноразмерные частицы и структуры, например - фуллерены, конусы. Для модификации рабочую поверхность электрода 6 покрывают, например - с помощью пипетки, суспензией УНТ и удаляют растворитель, например - высушиванием суспензии на воздухе. Так завершают изготовление сенсора 7, необходимого для осуществления способа.
2
4
2
4
Далее на поверхность модифицированного рабочего электрода 6 (сенсора 7) наносят аликвоту исследуемого биологического материала (определенный объем жидкого, газообразного или сыпучего гомогенного вещества, представляющий собой часть целого [5]), например - подготовленную известным путем суспензию исследуемых живых клеток с известной концентрацией (клеток). Биологическим материалом служат, например, культуры живых клеток, лизат клеток, выделенные из биологических жидкостей клетки, например - крови, лимфатической жидкости. В ином варианте вместо живых клеток используют контактировавшие с исследуемыми клетками растворы, например - надосадочную жидкость в виде фосфатно-солевого буферного раствора (137 мМ NaCl, 2.7 мМ KСl, 10 мМ NaHPO, 2 мМ KНРO, рН 7.4), оставшегося после центрифугирования суспензии исследуемых живых клеток с известной концентрацией.
2
4
2
4
В другом варианте вместо живых (клеток) используют клетки с разрушенными клеточными мембранами (лизат клеток). Готовят суспензию исследуемых клеток, например - на основе известного фосфатно-солевого буферного раствора (137 мМ NaCl, 2.7 мМ KСl, 10 мМ NaHPO, 2 мМ KНРO, рН 7.4). Аликвоту исследуемых живых клеток выдерживают в контакте с сенсором 7, например - в течение 1 мин. Это приводит к адсорбции клеточных метаболитов на рабочем электроде 6 сенсора 7. Далее сенсор 7 с адсорбированными на поверхности рабочего электрода 6 метаболитами переносят в электрохимическую ячейку 2 с электролитом 3, не содержащим клеток и электроактивных веществ (электроактивное вещество в электрохимической системе - это вещество, участвующее в окислительно-восстановительных реакциях на электродах). Сенсор 7, погруженный в электролит 3 электрохимической ячейки 2, подсоединяют к регистрирующему устройству 1, например - потенциостату-гальваностату, и при развертке потенциала от +0,6 до +1,3 вольт (далее по тексту - В) регистрируют величину тока окисления/восстановления (далее по тексту - сигнала) клеточных метаболитов, адсорбированных на рабочем электроде 6. При увеличении потенциала свыше +1,3 В наблюдается высокий фоновый сигнал за счет окисления электролита, при потенциале меньше +0,6 В также наблюдается высокий фоновый сигнал за счет реакции самих нанотрубок. Использованием углеродных материалов для модификации рабочего электрода обеспечивают возможность адсорбции биомолекул на поверхности сенсора 7 [6], что позволяет оценить метаболическую активность клеток по заявленному способу.
На Фиг.2 показаны вольтамперограммы различных живых клеток: линии HeLa (а), мононуклеаров (б) и эритроцитов крови человека (в) на поверхности сенсора 7. На вольтамперограммах клеток содержится от одного до трех пиков при потенциалах +0,8; +1,1 и +1,2 В, далее обозначенных как пик 1, пик 2 и пик 3 соответственно. Вольтамперограммы клеток (Фиг.2) обусловлены окислением метаболитов, выделяемых клетками в окружающий буферный раствор. Экспериментально установлено, что сигнал клеток (Фиг.2) обусловлен следующими группами метаболитов:
- наличие пика 1 свидетельствует о наличии метаболитов типов глутатион, ароматические аминокислоты/белки, никотинамидадениндинуклеотид;
- наличие пика 2 свидетельствует о наличии метаболитов типа гуаниновые нуклеотиды, включая гуанозинтрифосфат - ГТФ;
- наличие пика 3 свидетельствует о наличии метаболитов типа адениновые нуклеотиды, включая аденозинтрифосфат - АТФ.
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет одновременно детектировать в отличие от прототипа:
- более одной группы соединений, являющихся ключевыми метаболитами клеток. Абсолютная величина (микроамперы или мкА) пиков 1, 2, 3, а также их (величины пиков) соотношение, отражает количественное содержание (в единицах измерения) в клетке указанных метаболитов, например - в миллимолях (мМ) на миллилитр объема клеточной массы.
Заявляемый способ позволяет оценить содержание метаболита и/или однотипной группы метаболитов клеток, например - адениновых нуклеотидов, включая аденозинтрифосфат (АТФ) - в лизате клеток. На Фиг.3 показан калибровочный график для оценки (по заявляемому способу) содержания АТФ в водном растворе. График свидетельствует о том, что устройство характеризуется линейной зависимостью сигнала от концентрации метаболита, например - для АТФ - в диапазоне от 0,1 до 10,0 мМ с выходом сигнала на плато при 15,0 мМ.
В отличие от прототипа, оценивающего метаболическую активность клеток путем определения содержания одного вида метаболита, а именно - АТФ, заявляемое изобретение позволяет оценивать метаболическую активность клеток путем выявления и оценки различных групп метаболитов, например - белков и нуклеотидов. Оценка метаболической активности клеток с определением спектра метаболитов (по сравнению с прототипом) существенно повышает достоверность результата оценки и точность диагностики на основе этих результатов, например в медицинской и ветеринарной практике. Возможности заявляемого способа не ограничиваются вышеприведенным примером - при оценке метаболической активности клеток пример с измерением содержания АТФ использован ввиду того, что содержание АТФ является одним из наиболее характерных и информативных показателей жизнедеятельности клетки. Так, содержание АТФ в клетках используют в качестве критерия жизнеспособности и запуска апоптоза клеток [7], иммунного статуса организма [8], репродуктивной функции сперматозоидов [9], патогенности микроорганизмов [10].
Пример осуществления оценки метаболической активности (клеток) с использованием заявляемых способа и устройства доказывает наличие достоинств заявляемого изобретения по сравнению с прототипом. Используемое для реализации заявленного изобретения устройство проще (по сравнению с прототипом) в изготовлении и эксплуатации, обладает более высоким быстродействием, не требует использования ферментов с нестабильными свойствами. Эти достоинства заявляемого изобретения повышают достоверность результатов определения метаболической активности клеток. Кроме того, предлагаемое устройство для осуществления способа имеет существенно (100-кратно) меньшую себестоимость, чем используемые в прототипе платиновые микроэлектроды. Другим преимуществом предлагаемого способа и устройства для его осуществления является обеспечение возможности оценки метаболического состава клеток. Изобретение позволяет одновременно оценивать метаболическую активность клетки на основе определения различающихся по своим окислительно-восстановительным и биологическим свойствам групп метаболитов, а не одного метаболита (АТФ) как в случае прототипа. По сравнению с аналогами и прототипом заявляемое изобретение позволяет достигнуть существенного повышения качества и достоверности результатов анализа клеточных метаболитов, уменьшения себестоимости анализов и диагностики. Достоинства заявленного способа делают его применимым в массовых исследованиях и клинической диагностике, то есть промышленно применимым. Так, содержание различных метаболитов в клетках является важнейшим показателем здоровья клеток, а также наличия в них патологических процессов [11].
Кроме того, заявляемое изобретение обладает дополнительными по сравнению с прототипом функциональными свойствами, расширяющими область применения, а именно позволяет оценивать эффективность действия лекарственных средств в процессе лечения путем сравнительной оценки уровня метаболической активности клеток в норме и при патологии. Пример наличия полезного (и отсутствующего у прототипа) свойства приводится далее. Так, воздействием на клетки HeLa модельного вещества дексаметазона (глюкокортикоидное средство, вызывающее апоптоз) оценивают изменение метаболической активности клеток в лизате. Влияние дексаметазона на метаболическую активность клеток оценивают при двух концентрациях (дексаметазона), подобранных с помощью известного МТТ теста: нетоксичной концентрации (0,1 миллимоль/л, далее по тексту - мМ/л) и вызывающей ингибирование роста клеток на 50% (1,0 мМ/л). МТТ тест используют для оценки токсичности соединений для клеток. МТТ тест основан на способности ферментов живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (МТТ-реагента) до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде.
Результаты исследования действия дексаметазона на электрохимический сигнал (вольтамперограмму) приведены на Фиг.4, где отображен сигнал сенсора 7 на метаболиты лизата клеток HeLa, выращенных в присутствии дексаметазона. Пику 1 соответствуют антиоксиданты (). Пику 3 соответствуют адениновые нуклеотиды (). Фиг.4 показывает, что в нетоксичной концентрации (0,1 мМ/л) дексаметазон вызывает повышение обоих пиков вследствие того, что это вещество (дексаметазон) в низкой концентрации индуцирует синтетические процессы в клетке [12]. В концентрации 1,0 мМ/л дексаметазон подавляет метаболическую активность клеток, что выражается в уменьшении сигнала (пики 1 и 3), что обусловлено его (дексаметазона) цитотоксичным действием и индукцией апоптоза [13]. Известно, что индукция апоптоза (запрограммированная гибель клетки) сопровождается разрушением клеток, ингибированием синтеза АТФ и других метаболитов [14].
Таким образом, выявляемые при использовании заявляемого изобретения различия (по величине и соотношению пиков сигнала) в сигнале окисления клеток позволяют оценить механизм влияния того или иного вещества, например - дексаметазона, на клетку. Это подтверждает, что заявленный способ применим для количественной оценки метаболической активности клеток, для диагностики состояний клеток, оценки влияния различных веществ на клетки биологических объектов, сопровождающиеся изменением содержания метаболитов клеток. Кроме того, количественная оценка метаболической активности клеток позволяет контролировать и регулировать производственные биотехнологические процессы, например - при производстве лекарственных препаратов.
Полученные с использованием предлагаемого изобретения данные применимы в биотехнологии, медицине, ветеринарии, а также в фундаментальных научных исследованиях.
Техническим результатом изобретения является расширение области применения электрохимических способов, средств исследования и анализа путем определения электрохимических параметров клеточных материалов живых организмов, повышение достоверности результата анализа, точности диагностики в медицине, ветеринарии, биотехнологии. По сравнению с известными аналогами заявляемое изобретение характеризуют простота и доступность осуществления, более высокая информативность, быстрота анализа метаболической активности клеток - то есть повышение достоверности и точности результатов, сопровождающиеся понижением себестоимости анализа и повышением производительности и качества труда.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный(е) технический(е) результат(ы).
Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость» предъявляемому к изобретениям, т.к его возможно реализовать в промышленных условиях, а именно в производстве диагностического оборудования, в деятельности организаций здравоохранения, в животноводстве, посредством использования стандартных технических устройств и оборудования.
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ
1. Dietmair S. Towards quantitative metabolomics of mammalian cells: Development of a metabolite extraction protocol / S. Dietmair et al. // Anal. Biochem. - 2010. - 15 Sept. - V.404 - P.155-164.
2. Krutzik P.O. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling / P.O.Krutzik, G.P.Nolan // Nat Methods. - 2006. - May. - V.3. - №5. - P.361-8.
3. Kueng A. Amperometric ATP biosensor based on polymer entrapped enzymes / A.Kueng, C.Kranz, B.Mizaikoff // Biosensors and Bioelectronics. - 2004. - №19. - P.1301-1307.
4. Абдуллин Т.И. Электроды, модифицированные углеродными нанотрубками, для электрохимических ДНК-сенсоров / Т.И.Абдуллин, И.И.Никитина, Д.Г.Ишмухаметова, Г.К.Будников, О.А.Коновалова, М.Х.Салахов. // Журн. аналит.химии. - 2007. - Т.62. - №6. - С.667-671.
5. Национальный стандарт Российской Федерации. ГОСТ Р 52361-2005.
6. Никитина И.И. Способ оценки депуринизации нуклеиновых кислот и устройство для его осуществления / И.И.Никитина, О.В.Бондарь, Т.И.Абдуллин // Патент РФ на изобретение №2390009, опубликован 20.05.2010, Бюл. №14.
7. Leist M. et al. Intracellular Adenosine Triphosphate (ATP) Concentration: A Switch in the Decision Between Apoptosis and Necrosis / M.Leist et al. // The Journal of Experimental Medicine. - 1997. - V.185. - P.1481-1486.
8. Lee T.C. Quantification of a low cellular immune response to aid in identification ofpediatric liver transplant recipients at high-risk for EBV infection / T.C.Lee et al. // Clin. Transplant. - 2006. - V.20. - P.689-694.
9. Chan S.Y. The diagnostic value of seminal adenosine triphosphate (ATP) in an in vitro fertilization (IVF) program / S.Y.Chan et al. // Andrologia. - 1990. - V.22. - P.531-537.
10. Venkateswaran K. АТР as a biomarker of viable microorganisms in clean-room facilities / K. Venkateswaran et al. // Journal of Microbiological Methods. - 2003. - V.52. - P.367-377.
11. Ellis D.I. Metabolic fingerprinting in disease diagnosis: biomedical applications of infrared and Raman spectroscopy / D.I. Ellis R. Goodacre // Analyst. - 2006. - V.131. - P.875-885.
12. Chauhan D. Cytochrome c-dependent and - independent Induction ofapoptosis in multiple myeloma cells / D.Chauhan, P.Pandey, A.Ogata, G.Teoh, N.Krett, R.Halgren, S.Rosen, D.Kufe, S.Kharbanda, K.Anderson // The Journal of Biological Chemistry. - 1997. - V.272. - P.29995-29997.
13. Sharma S. Dexamethasone-induced apoptotic mechanisms in myeloma cells investigated by analysis of mutant glucocorticoid receptors / S.Sharma, A.Lichtenstein // BLOOD. - 2008. - May 30. - V.112. - №4. - P.1338-1345.
14. Skulachev V.P. Why are mitochondria involved in apoptosis? Permeability transition pores and apoptosis as selective mechanisms to eliminate superoxide-producing mitochondria and cell / V.P.Skulachev // FEBS Lett. - 1996. - V.397. - №1. - Р.7-10.