ПЕПТИДНЫЕ АНАЛОГИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАССТРОЙСТВ
PEPTIDE ANALOGS FOR TREATMENT OF DISEASES AND DISORDERS

Родственные заявки
Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США, №61/554771, поданной 2 ноября 2011, и предварительной заявке на патент США, №61/578620, поданной 21 декабря 2011, и заявке на патент США №13/667578, поданной 2 ноября 2012, которые полностью включены в данное описание путем ссылок.
Область техники
Объекты, раскрытые в данном описании, относятся к миметикам кальцитонина, и в частности, к их применению при лечении различных заболеваний и расстройств, в том числе диабета (типа I и типа II), избыточной массы тела, избыточного потребления пищи и метаболического синдрома, для регуляции уровней глюкозы в крови, регуляции реакции на тесты на переносимость глюкозы, регуляции потребления пищи, лечения остеопороза и лечения остеоартрита, не ограничиваясь этим.
Предпосылки создания изобретения
Во всем мире имеется примерно 250 миллионов диабетиков и предполагается, что их число удвоится в последующие два десятилетия. Свыше 90% этих людей страдают от сахарного диабета типа 2 (T2DM). По оценке, в настоящее время поставлен диагноз только 50-60% людей, имеющих T2DM, или в находящимся на стадиях, непосредственно предшествующих T2DM.
T2DM является гетерогенным заболеванием, характеризующимся аномальностями в углеводном и жировом обмене. Причины T2DM многофакторны и включают как генетические элементы, так и элементы окружающей среды, которые воздействуют на функцию β-клеток и чувствительность к инсулину в тканях, таких как мышцы, печень, поджелудочная железа и жировая ткань. Как следствие, наблюдается ухудшенная секреция инсулина и параллельно прогрессирующее снижение β-клеточной функции и хроническая инсулинорезистентность. Неспособность эндокринной поджелудочной железы компенсировать периферическую инсулинорезистентность ведет к гипергликемии и началу клинического диабета. Резистентность ткани к инсулинопосредуемому поглощению глюкозы теперь считается основной патофизиологической детерминантой T2DM.
Критерием успешного вмешательства при T2DM является снижение уровни глюкозы в крови, которое может быть как постоянным снижением уровней глюкозы в крови, так и повышенной способностью переносить высокие уровни глюкозы после приема пищи, которое описывается более низкими пиками уровней глюкозы и более быстрым клиренсом. Обе указанные ситуации ведут к меньшей нагрузке на продукцию инсулина и функцию β-клеток.
Диабет типа I характеризуется утратой способности продуцировать инсулин в ответ на потребление пищи и, следовательно, неспособностью регулировать глюкозу в крови до нормального физиологического уровня.
Физическая структура кости может быть поставлена под угрозу различными факторами, включая заболевание и повреждение. Одним из наиболее распространенных костных заболеваний является остеопороз, который характеризуется низкой костной массой и ухудшением структуры костной ткани, что ведет к хрупкости костей и повышенной подверженности переломам, в частности, бедра, позвоночника и запястья. Остеопороз развивается, когда возникает такой дисбаланс, что скорость резорбции кости превышает скорость образования кости. Показано, что введение эффективного количества средства против резорбции, такого как кальцитонин, предотвращает резорбцию костной ткани.
Воспалительные или дегенеративные заболевания, в том числе заболевания суставов, например, остеоартрит (OA), ревматоидный артрит (RA) или ювенильный ревматоидный артрит (JRA), и в том числе воспаление, которое является результатом аутоиммунной реакции, например, волчанка, анкилозирующий спондилит (AS) или рассеянный склероз (MS), могут привести к существенной потере подвижности из-за боли и разрушения суставов. Хрящ, который покрывает и служит «подушкой» кости в суставах, может начать разрушаться со временем, допуская, таким образом, нежелательный прямой контакт двух костей, что может ограничивать движение одной кости относительно другой и/или вызывать повреждение одной костью другой во время движения сустава. Субхондриальная кость, которая находится как раз под хрящом, также может разрушаться. Введение эффективного количества средства против резорбции, такого как кальцитонин, может предотвратить резорбцию костной ткани.
Сущность изобретения
В данном описании раскрываются миметики кальцитонина.
Согласно аспектам, поясняемым в данном описании, предлагается пептид, имеющий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
Согласно аспектам, поясняемым в данном описании, предлагается способ, который включает введение пациенту эффективного количества пептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 17, для влияния на снижение массы пациента.
Согласно аспектам, поясняемым в данном описании, предлагается способ, который включает введение пациенту эффективного количества пептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 17, для влияния на гликемический контроль у пациента после приема пищи.
Согласно аспектам, поясняемым в данном описании, предлагается способ, который включает введение пациенту эффективного количества пептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 17, для влияния на улучшение гликемического контроля у пациента.
m
a
Согласно аспектам, поясняемым в данном описании, предлагается способ, который включает введение пациенту эффективного количества пептида SEQ ID NO: 18, имеющего последовательность CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTDVGANXaaXaa, с тем, чтобы ослабить у пациента, по меньшей мере, одно из костной резорбции и разрушения хряща.
Краткое описание чертежей
Раскрываемые в данном описании воплощения далее будут поясняться с обращением к прилагаемым чертежам, которые иллюстрируют принципы раскрываемых здесь вариантов воплощения.
На фигуре 1А, фигуре 1В, фигуре 1С и фигуре 1D показан эффект от перорального введения привычного кальцитонина лосося («sCT») в сравнении с вводимым перорально UGP302, оказываемый на массу тела и поглощение пищи у крыс DIO при измерении в примере 1.
На фигуре 2А и фигуре 2В показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально UGP302 на переносимость глюкозы в процессе OGTT у крыс DIO при измерении в примере 1.
На фигуре 3 показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально UGP302 на гликемию натощак у крыс DIO при измерении в примере 1.
На фигуре 4А и фигуре 4В показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально UGP302 на массу тела и поглощение корма у крыс DIO, наблюдаемое в примере 2 при первой дозировке.
На фигуре 5А и фигуре 5В показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально UGP302 на массу тела и поглощение корма у крыс DIO, наблюдаемое в примере 2 при второй дозировке.
На фигуре 6А и фигуре 6В показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально UGP302 на массу тела и поглощение корма у крыс DIO, наблюдаемое в примере 2 при третьей дозировке.
На фигуре 7А и фигуре 7В показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально UGP302 при первой дозировке на переносимость глюкозы в процессе OGTT у крыс DIO при измерении в примере 2.
На фигура 8А и фигуре 8В показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально UGP302 при второй дозировке на переносимость глюкозы в процессе OGTT у крыс DIO при измерении в примере 2.
На фигуре 9А, фигуре 9В, фигуре 9С, фигуре 9D, фигуре 9Е и фигуре 9F показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с тремя вводимым перорально UGP на массу тела и поглощение корма у крыс DIO при измерении в примере 3.
На фигуре 10А, фигуре 10В, фигуре 10С, фигуре 10D, фигуре 10Е и фигуре 10F показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с тремя вводимым перорально UGP на уровни глюкозы в тесте на переносимость глюкозы у крыс DIO при измерении в примере 3.
На фигуре 11 приведены результаты связывания шести соединений UGP с кальцитониновыми рецепторами клеток T47D при измерении в примере 4.
На фигуре 12А и фигуре 12В представлены результаты измерения потребления корма (12А) и изменения массы (12В) для UGP282 при измерении в примере 5.
На фигуре 13А и фигуре 13В представлены результаты измерения потребления корма (13А) и изменения массы (13В) для UGP283 при измерении в примере 5.
На фигуре 14А и фигуре 14В представлены результаты измерения потребления корма (14А) и изменения массы (14В) для UGP284 при измерении в примере 5.
На фигуре 15А и фигуре 15В представлены результаты измерения потребления корма (15А) и изменения массы (15В) для UGP298 при измерении в примере 5.
На фигуре 16А и фигуре 16В представлены результаты измерения потребления корма (16А) и изменения массы (16В) для UGP302 при измерении в примере 5.
На фигуре 17А и фигуре 17В представлены результаты измерения потребления корма (17А) и изменения массы (17В) для UGP303 при измерении в примере 5.
На фигуре 18 и фигуре 19 представлены соответственно уменьшение костной резорбции и резорбции хряща у крыс, вызванное применением UGP302.
Хотя на описанных выше чертежах представлены раскрытые в данном случае варианты воплощения, предлагаются также другие варианты воплощения, как отмечается в данном описании. Приведенные здесь характерные варианты воплощения представлены лишь для пояснения, о они не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Специалистами в данной области техники могут быть разработаны многочисленные другие модификации и варианты воплощения, которые соответствуют объему и сущности принципов тех изобретений, которые раскрыты в данном описании.
Подробное описание
Кальцитонины высококонсервативны у множества видов. Полноразмерный нативный кальцитонин имеет 32 аминокислоты в длину. Последовательности различных кальцитонинов приведены ниже.
Различные варианты воплощения, согласно настоящего описанию, относятся к миметикам кальцитонинов. Аминокислотные последовательности миметиков кальцитонинов по изобретению приводятся ниже в таблице 1.
m
а
2
В некоторых вариантах воплощения цистеин в позиции 1 миметиков кальцитонинов, обсуждаемых выше, модифицирован («C») для уменьшения положительного заряда первой аминокислоты. Например, ацетильная группа (SEQ ID NO: 11, 12 и 15), пропионильная группа (SEQ ID NO: 13) или сукцинильная группа (SEQ ID NO: 14 и 17) могут быть заменены на цистеин-1. В некоторых вариантах воплощения аминокислота в последней позиции («Хаа») (позиция 32 в SEQ ID NO: 11, 13-15 и 17-18 или позиция 33 в SEQ ID NO: 16) может включать амидированную группу «NH». Другие пути уменьшения положительного заряда включают, но не ограничиваются указанным, пегилирование на основе полиэтиленгликоля или присоединение другой аминокислоты, такой как глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, по N-концу. С другой стороны, по N-концу пептидов, описанных выше, могут быть присоединены другие аминокислоты, в том числе, но без ограничения, лизин, глицин, формилглицин, лейцин, аланин, ацетилаланин и диаланил. Пример аминокислоты, добавленной по N-концу пептидов, включает SEQ ID NO: 16, где добавлен лизин.
«Хаа» в SEQ ID NO: 18 в таблице 1 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту. В одном воплощении Хаа в позиции 31 выбирают из треонина или аланина. В одном воплощении Хаа в позиции 32 выбирают из тирозина или пролина. Таким образом, SEQ ID NO: 11, 15, 16 и 17 охватываются SEQ ID NO: 18.
Как будет понятно специалистам в данной области техники, у пептидов, имеющих несколько цистеиновых остатков, часто образуется дисульфидный мостик между двумя цистеиновыми остатками. Все такие пептиды, упоминаемые в данном описании, определяются как необязательно включающие один или несколько таких дисульфидных мостиков. Хотя описанные здесь миметики кальцитонина могут существовать в форме свободной кислоты, предпочтительно, чтобы С-концевая аминокислота была амидирована. Заявители предполагают, что такое амидирование может вносить вклад в эффективность и/или биодоступность пептида. Предпочтительным методом получения амидированных вариантов описанные здесь миметиков кальцитонинов является реакция предшественников (имеющих глицин на месте С-концевой аминогруппы нужного амидированного продукта) в присутствии альфа-амидирующей пептидилглицин монооксигеназы согласно известным методам, при этом предшественники превращаются в амидированные продукты с помощью реакций, описанных, например, в пат. США №4706934 и опубликованных Европейских патентах №№0308067 и 0382403. Рекомбинантное получение предпочтительно как для предшественника, так и для фермента, который катализирует конверсию предшественника до кальцитонина лосося. Такое рекомбинантное получение обсуждается в Biotechnology, Vol. 11 (1993), pp. 64-70, где также описывается конверсия предшественника до амидированного продукта. В данном случае рекомбинантный продукт идентичен природному кальцитонину лосося, и кальцитонин лосося получен с использованием раствора и твердофазного химического синтеза пептидов. Получение амидированных продуктов также можно выполнить с использованием способа и амидирующего фермента, описанных Consalvo et al., патент США №7445911; Miller et al., опубликованный патент США №2006/0292672; Ray et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26: 249-259; и Mehta, 2004, Biopharm. International, July, pp. 44-46.
2
Получение предпочтительных амидированных пептидов может проходить, например, путем продуцирования в Е.coli удлиненного глицином предшественника в виде растворимого белка, слитого с глутатион-S-трансферазой, или путем прямой экспрессии предшественника согласно методу, описанному в пат. США №6103495. Такой удлиненный глицином предшественник имеет молекулярную структуру, которая идентична нужному амидированному продукту за исключением С-конца (где продукт заканчивается -X-NH, в то время как предшественник заканчивается -X-gly, причем X представляет собой С-концевой аминокислотный остаток продукта). Описанный в приведенных выше публикациях альфа-амидирующий фермент катализирует конверсию предшественника в продукт. Такой фермент предпочтительно получают рекомбинантно, например, в клетках яичника китайского хомячка (СНО), как описано в цитированных выше статьях в Biotechnology and Biopharm.
Подобным образом можно также получить описанные здесь активные пептиды в форме свободной кислоты, за исключением того, что в «предшественника» не включают С-концевой глицин, где предшественник является конечным пептидным продуктом, и не требуется стадия амидирования.
За исключением случаев, когда указано иное, для описанных здесь миметиков кальцитонинов предпочтительная дозировка, как для лечебных, так и для профилактических целей, является идентичной. Нужные дозировки подробнее обсуждаются ниже и различаются в зависимости от типа введения.
За исключением случаев, когда непосредственно указано или иное или же оно непосредственно следует из контекста, дозировки в данном описании относятся к массе активных соединений, не подвергшихся влиянию фармацевтических эксципиентов, разбавителей, носителей или других ингредиентов, хотя такие дополнительные ингредиенты желательно включать, что можно видеть из примеров, приведенных в данном описании. Любая лекарственная форма (капсула, таблетка, инъекция или подобная форма), традиционно используемая в фармацевтической промышленности для доставки активных пептидных средств, подходит для применения в данном случае, и термины «эксципиент», «разбавитель» или «носитель» включают такие неактивные ингредиенты, которые как правило включают в подобную лекарственную форму вместе с активными ингредиентами при промышленном производстве. Предпочтительной является пероральная лекарственная форма, которая подробнее обсуждается далее, но не рассматривается как исключительный способ введения описанных здесь активных средств.
Описанные здесь миметики кальцитонинов можно вводить пациенту для лечения ряда заболеваний или расстройств. Используемый в данном описании термин «пациент» обозначает любой организм, принадлежащий к царству животных. В одном воплощении термин «пациент» относится к позвоночным, предпочтительнее, млекопитающим, включая людей.
Соответственно, в настоящем изобретении предлагается способ лечения диабета типа I, диабета типа II или метаболического синдрома, ожирения, или для подавления аппетита, или для облегчения инсулинорезистентности, или для снижения нежелательно высокого уровня глюкозы в крови натощак, или для снижения нежелательно высокого максимального уровня сывороточной глюкозы, или для снижения нежелательно высокого максимального уровня сывороточного инсулина, или для уменьшения нежелательно сильной реакции на тест на переносимость глюкозы, или лечения остеопороза или лечения остеоартрита.
Используемый в данном описании термин «гликемический контроль» относится к типичным уровням сахара (глюкозы) в крови у субъекта с сахарным диабетом. Процент гемоглобина, который гликозилирован (измеренный как гемоглобин A1c), используют как достоверный показатель длительного гликемического контроля. Используемый в данном описании термин «улучшенный гликемический контроль» относится к способности миметика кальцитонина по настоящему раскрытию снижать процент гемоглобина, который гликозилирован.
Существует ряд признанных в технике показателей нормального интервала для массы тела с учетом ряда факторов, таких как пол, возраст и рост. Пациент, нуждающийся в схемах лечения или предупреждения, описанных в данном описании, включает пациентов, чья масса тела превышает признанные нормы, или которые, в силу наследственности или факторов окружающей среды или другого признанного фактора риска, находятся в большей опасности приобрести излишний вес или ожирение, чем общая популяция. Согласно настоящему описанию предполагается, что миметики кальцитонинов можно использовать для лечения диабета, где контроль за массой тела является одним из аспектов лечения.
В одном воплощении способ включает энтеральное введение пациенту, нуждающемуся в лечении от указанного состояния, фармацевтически эффективного количества любого из описанных здесь пептидов.
В одном воплощении способ включает парентеральное введение пациенту, нуждающемуся в лечении от указанного состояния, фармацевтически эффективного количества любого из описанных здесь пептидов. В случае парентерального введения (включая интраперитонеальую, подкожную, внутривенную, интрадермальную или внутримышечную инъекцию) можно использовать, например, растворы описанного здесь пептида в сезамовом или арахисовом масле или в водном пропиленгликоле. Водные растворы при необходимости должны быть соответственно забуферены (предпочтительно, до рН свыше 8), и жидкий разбавитель в первую очередь придает изотоничность. Такие водные растворы подходят для целей внутривенной инъекции. Масляные растворы подходят для целей интраартикулярной, внутримышечной и подкожной инъекции. Получение всех таких растворов в стерильных условиях легко осуществляется стандартными фармацевтическими методами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Для парентерального применения примеры подходящих препаратов включают растворы, предпочтительно, масляные или водные растворы, а также суспензии, эмульсии или имплантаты, в том числе, суппозитории. Пептиды могут быть введены в состав в стерильной форме в форматах нескольких или одной дозы, когда диспергированы в жидком носителе, таком как стерильный физиологический раствор или 5% раствор декстрозы в физиологическом растворе, обычно используемых с препаратами для инъекций.
Указанный способ может включать предварительную стадию определения, страдает ли пациент от указанного состояния и/или последующую стадию определения того, до какой степени указанное лечение эффективно в облегчении состояния у указанного пациента, например, в каждом случае выполнения перорального теста на переносимость глюкозы или определения основного уровня сахара в крови.
Для улучшенного регулирования массы тела пациента, для достижения потери массы или для того, чтобы избежать роста массы, активное соединение предпочтительно вводят, по меньшей мере, дважды в сутки, например, 2-4 раза в сутки. Препараты активного соединения могут содержать дозированную лекарственную форму, соответствующую такой схеме введения. Активные соединения можно вводить с учетом регулирования массы пациента, претерпевающего лечение от диабета или метаболического синдрома.
Энтеральные препараты для перорального применения являются препаратами для приема внутрь путем проглатывания для последующего высвобождения в кишечнике после желудка, и, следовательно, доставки через воротную вену в печень, в отличие от препаратов, которые держат во рту для возможности перехода в кровоток сублингвальным или трансбуккальным путем.
Подходящие лекарственные формы для использования согласно настоящему изобретению включают таблетки, минитаблетки, капсулы, гранулы, драже, порошки, твердые шипучие средства и жевательные твердые препараты. Такие препараты могут включать желатин, который предпочтительно представляет собой гидролизованный желатин или низкомолекулярный желатин. Такие препараты можно получить сублимационной сушкой гомогенного водного раствора, включающего кальцитонин или его фрагмент или конъюгат и гидролизованный желатин или низкомолекулярный желатин, и последующей переработкой полученного твердого материала в указанный фармацевтический препарат, и при этом желатин может иметь среднюю молекулярную массу от 1000 до 15000 дальтон. Такие препараты могут включать защитное соединение-носитель, такое как 5-CNAC, или другие, раскрытые в данном описании.
Хотя пероральные препараты, такие как таблетки и капсулы, являются предпочтительными, композиции для применения согласно настоящему описанию могут принимать форму сиропов, эликсиров или подобную и суппозиториев или подобную. Пероральная доставка является, как правило, оптимальным путем доставки, поскольку такой путь удобен, относительно легок и, как правило, безболезнен, что приводит к тому, что пациенты чаще соблюдают режим лечения относительно других путей доставки. Однако биологические, химические и физические барьеры, такие как изменяющийся рН в желудочно-кишечном тракте, сильные пищеварительные ферменты и непроницаемые для активного вещества оболочки желудочно-кишечного тракта, делают проблематичной пероральную доставку кальцитониноподобных пептидов млекопитающим,- например, пероральная доставка кальцитонинов, которые представляют собой длинноцепочечные полипептидные гормоны, секретируемые парафолликулярными клетками щитовидный железы у млекопитающих и ультимолбранхиальной железы птиц и рыб, исходно считается трудной из-за, по меньшей мере частично, недостаточной устойчивости кальцитонина в желудочно-кишечном тракте, а также неспособности кальцитоцина легко проникать через стенки кишечника в кровоток.
Однако ниже описаны подходящие пероральные препараты.
Лечение пациентов
В одном воплощении миметик кальцитонина по настоящему изобретению вводят в адекватной дозировке для поддержания сывороточных уровней миметика у пациента от 5 до 500 пг на мл, предпочтительно, от 10 до 250 пг на мл. Сывороточные уровни можно измерить радиоиммунными методами, известными в данной области техники. Лечащий врач может следить за реакцией пациента и затем может изменить дозировку до некоторой степени с учетом метаболизма и ответа у отдельного пациента. Почти одновременное высвобождение лучше всего достигается путем введения всех компонентов по настоящему изобретению в виде одной пилюли или капсулы. Однако изобретение также включает, например, разделение требуемого количества миметика кальцитонина на две или три таблетки или капсулы, которые можно вводить вместе, так что они вместе обеспечивают необходимое количество всех ингредиентов. Как используется в данном описании, «фармацевтическая композиция» включает, но не ограничивается указанным, полную дозировку, подходящую для определенного введения пациенту, несмотря на то, одна или две таблетки или капсулы (или другие лекарственные формы) рекомендуются для данного введения.

Миметик кальцитонина по настоящему изобретению может быть введен в композицию для перорального введения с использованием способов, используемых в продуктах Unigene Enteripep. Они могут включать способы, описанные в патенте США №5912014, патенте США №6086918, патенте США №6673574, патенте США №7316819, патенте США №8093207 и в публикации US №2009/0317462. В частности, способ может включать конъюгацию соединения с мембранным транслокатором, таким как домен белковой трансдукции белка ТАТ ВИЧ, совместное введение вместе с одним или несколькими ингибиторами протеаз и/или агентом, снижающим рН, которые могут быть покрыты и/или кислотостойким носителем и/или усилителем абсорбции, который может представлять собой поверхностно-активное вещество.
В одном воплощении миметик кальцитонина по настоящему изобретению предпочтительно вводят в композицию для пероральной доставки способом, известным из публикации заявки на патент США №2009/0317462. Предпочтительная пероральная лекарственная форма указана ниже в таблице 2.
В одном воплощении миметик кальцитонина по настоящему изобретению может быть введен в композицию для энтерального, в особенности, перорального введения путем смешивания с подходящим носителем. Подходящие носители включают соединения, описанные в патенте США №5773647 и патенте США №5866536, и из них особенно эффективным является 5-CNAC (N-(5-хлорсалицилоил)-8-аминокаприловая кислота, обычно в виде ее динатриевой соли). Другими предпочтительными носителями или средствами доставки являются SNAD (натриевая соль 10-(2-гидроксибензамидо)декановой кислоты) и SNAC (натриевая соль N-(8-[2-гидроксибензоил]амино)каприловой кислоты). В одном воплощении фармацевтическая композиция по настоящему описанию включает эффективное для доставки количество носителя, такого как 5-CNAC, т.е., количество, достаточное для доставки соединения для желательного эффекта. Как правило, носитель, такой как 5-CNAC, присутствует в количестве 2,5 мас.% - 99,4 мас.%, предпочтительнее, 25 мас.% - 50 мас.% от всей композиции.
Кроме того, в WO 00/059863 раскрываются динатриевые соли формулы
в которой
1
2
3
4
6
7
1
4
1
4
R, R, R и R представляют собой независимо водород, -ОН, -NRR, галоген, C-С алкил или С-С алкокси;
5
6
7
2
16
2
16
1
12
1
12
1
4
R представляет собой замещенный или незамещенный С-С алкилен, замещенный или незамещенный С-С алкенилен, замещенный или незамещенный С-С алкил(арилен) или замещенный или незамещенный арил(C-C алкилен); и R и R представляют собой независимо друг от друга водород, кислород или С-С алкил;
и их гидраты и сольваты как особенно эффективные для пероральной доставки активных агентов, таких как кальцитонины, например, кальцитонин лосося, и их можно использовать согласно настоящему описанию.
Предпочтительные энтеросолюбильные препараты с использованием необязательно очень тонко измельченного 5-CNAC могут предпочтительно быть такими, как описанные в WO 2005/014031.
Соединение может быть введено в композицию для перорального введения с использованием способов, использованных в продукте капситонине от Bone Medical Limited. Они могут включать способы, включенные в композиции Axcess. Конкретнее, активный ингредиент может быть инкапсулирован в энтеросолюбильную капсулу, способную пройти через желудок. Капсула может содержать активное соединение вместе с усиливающим абсорбцию гидрофильным ароматическим спиртом, например, как описано в WO 02/028436. В известном способе энтеросолюбильное покрытие может стать проницаемым в зависимости от рН, например, при рН от 3 до 7. В WO 2004/091584 также описываются подходящие способы получения композиций с использованием усиливающих абсорбцию гидрофильных ароматических спиртов.
Соединение может быть введено в композицию с использованием способов, показанных для продуктов Oramed, которые могут включать получение композиции с омега-3 жирной кислотой, как видно из WO 2007/029238 или как описано в US 5102666.
Как правило, можно использовать фармацевтически приемлемые соли (в особенности, моно- или динатриевые соли), сольваты (например, спиртовые сольваты) и гидраты таких носителей или агенты для доставки.
Пероральное введение фармацевтических композиций по изобретению можно выполнять регулярно, например, один или несколько раз ежедневно или еженедельно; с перерывами, например, нерегулярно в течение суток или недели; или циклически, например, регулярно на протяжении дней или недель с последующим периодом без введения. Лекарственная форма фармацевтических композиций в различных вариантах воплощения настоящего изобретения может представлять собой любую известную форму, например, жидкие или твердые лекарственные формы. Жидкие лекарственные формы включают растворы, эмульсии, суспензии, сиропы и эликсиры. Кроме активного соединения и носителя, такого как 5-CNAC, жидкие препараты также могут включать инертные эксципиенты, обычно используемые в данной области техники, такие как солюбилизаторы, например, этанол; масла, такие как хлопковое, касторовое и сезамовое масло; смачивающие вещества; эмульгаторы; суспендирующие вещества; подслащивающие вещества; корригенты и растворители, такие как вода. Твердые лекарственные формы включают капсулы, мягкие желатиновые капсулы, таблетки, кэплеты, порошки, гранулы или другие твердые пероральные лекарственные формы, которые можно получить способами, хорошо известными в данной области техники. Фармацевтические композиции могут дополнительно включать добавки в традиционно используемых количествах, в том числе, но без ограничения, регулятор рН, консервант, отдушку, вещество, придающее вкус, ароматизатор, увлажнитель, тонизирующее средство, краситель, поверхностно-активное вещество, пластификатор, смазывающее вещество, такое как стеарат магния, вещество, способствующее текучести, вещество, способствующее сжатию, солюбилизатор, эксципиент, разбавитель, такой как микрокристаллическая целлюлоза, например авицел РН 102, поставляемый FMC Corporation, или их любую комбинацию. Другие добавки могут включать фосфатные буферные соли, лимонную кислоту, гликоли и другие диспергаторы. Композиция также может включать один или несколько ингибиторов ферментов, таких как актинонин или эпиактинонин, и их производные; апротинин, тразилол и ингибитор Bowman-Birk. Кроме того, в композициях по настоящему изобретению может присутствовать ингибитор переноса, т.е. [rho]гликопротеин, такой как кетопрофин. Твердые фармацевтические композиции по рассматриваемому изобретению можно получить традиционными способами, например, путем перемешивания смеси активного соединения, носителя, такого как 5-CNAC, и любых других ингредиентов, формуя и наполняя капсулы или, вместо наполнения капсул, путем формования с последующим таблетированием или путем прямого прессования для получения таблеток. Кроме того, можно получить твердую дисперсию известными способами с последующей дополнительной переработкой для формования таблеток или капсул. Предпочтительно ингредиенты в фармацевтических композициях по рассматриваемому изобретению в твердой лекарственной форме смешаны гомогенно или равномерно.
С другой стороны, активное соединение можно ввести в композицию в виде конъюгата с указанным носителем, который может представлять собой олигомер, например, описанный в US 2003/0069170
Такие конъюгаты можно ввести в комбинацию с жирной кислотой и желчной солью, как описано в указанной ссылке.
Можно использовать конъюгаты с полиэтиленгликолем (ПЭГ), как описано, например, Mansoor et al.
С другой стороны, активное соединение можно смешать с нитрозо-N-ацетил-D,L-пеницилламином (SNAP) и раствором карбопола или таурохолатом и раствором карбопола с образованием мукоадгезивной эмульсии.
Активное соединение можно ввести в композицию, загружая в хитозанные нанокапсулы, как раскрыто Prego et al. (необязательно модифицированные ПЭГ, как по Prego Prego С, Torres D., Fernandez-Megia Ε., Novoa-Carballal R., Quiñoá E., Alonso M.J.) или покрытые хитозаном или ПЭГ липидные наночастицы, как раскрыто Garcia-Fuentes et al.. Наночастицы хитозана для такой цели могут быть модифицированы иминотиоланом, как описано Guggi et al. Их можно ввести в эмульсии вода/масло/вода, как описано Dogru et al. Биодоступность активного соединения может быть улучшена так, как описано Sinko et al. или Song et al.. Вообще, подходящие наночастицы как носители обсуждаются в работе de la Fuente et al. и могут использоваться в настоящем описании.
Другие подходящие стратегии для перорального препарата включают использование системы усилителя временной проницаемости (ТРЕ), как описано в WO 2005/094785, Chiasma Ltd.. ТРЕ позволяет применять масляную суспензию твердых гидрофильных частиц в гидрофобной среде для защиты молекулы лекарственного средства от инактивации враждебной желудочно-кишечной (GI) средой и в то же время действует на GI стенку, индуцируя проникание содержащихся в ней молекул лекарственного средства.
Также для ингибирования действия насосов для оттока на слизистую оболочку возможно применение глутатиона или соединений, содержащих несколько тиольных групп, как описано в US 2008/0200563. Практические примеры таких методов также описаны в Caliceti P., Salmaso S., Walker G. and Bernkop-Schnürch Α. (2004) «Development and in vivo evaluation of an Пероральный insulin-PEG delivery system.», Eur. J. Pharm. Sci., 22, 315-323; в Guggi D., Krauland A.H. and Bernkop-Schnürch A. (2003) «Systemic peptide delivery via the stomach: in vivo evaluation of an Пероральный dosage form for salmon calcitonin)), J. Control. Rel., 92, 125-135; и в Bernkop-Schnürch Α., Pinter Y., Guggi D., Kahlbacher H., Schöffmann G., Schuh M., Schmerold I., Del Curto M.D., D'Antonio M., Esposito P. and Huck Ch. (2005) «The use of thiolated polymers as carrier matrix in Пероральный peptide delivery» - Proof of concept. J. Control. Release, 106, 26-33.
Активное соединение может находиться в препарате в цельных микросферах, как описано в WO 2004/084870, где активный фармацевтический ингредиент солюбилизирован в виде эмульсии, микроэмульсии или суспензии, или быть введенным в минисферы, с различными покрытиями, нанесенными по традиционным или новым технологиям. Результатом является инкапсулированное лекарственное средство в «предварительно солюбилизированной» форме, которая, когда введена перорально, обеспечивает предварительно установленное немедленное или отсроченное высвобождение активного лекарственного средства в определенном месте и с определенной скоростью по всему желудочно-кишечному тракту. По существу, предварительная солюбилизация лекарственного средства увеличивает предсказуемость его кинетического профиля, причем в то же время усиливает проницаемость и устойчивость лекарственного средства.
Можно использовать нанокапсулы с хитозановым покрытием, описанные в US 2009/0074824. Активная молекула, вводимая с помощью такой технологии, представляет собой защищенные изнутри нанокапсулы, так как они устойчивы против действия жидкости желудка. Кроме того, мукоадгезивные свойства системы увеличивают время адгезии к стенкам кишечника (подтверждено, что существует замедление в желудочно-кишечном транзите в таких системах), содействуя более эффективной абсорбции активной молекулы.
Можно использовать способы, разработанные TSRI Inc.. Такие способы включают технологию гидрофильной солюбилизации (HST), при которой желатин - экстракт природного коллагена, несущий как положительный, так и отрицательный заряды, покрывает частицы активного ингредиента, содержащиеся в лецитиновых мицеллах, и предотвращает их агрегацию или слеживание. Это приводит к улучшенной смачиваемости гидрофобных частиц лекарственного средства посредством полярные взаимодействий. Кроме того, амфифильный лецитин уменьшает поверхностное натяжение между растворяющей жидкостью и поверхностью частиц.
Активный ингредиент может быть включен в композицию с кукурбитурилами в качестве эксципиентов.
Альтернативно, можно использовать технологию GIPET от Merrion Pharmaceuticals для получения таблеток с энтеросолюбильным покрытием, содержащих активный ингредиент с усилителем абсорбции, который может представлять собой жирную кислоту со средней длинной цепи или ее производное жирной кислоты, как описано в US 2007/0238707, или перемещающийся через мембрану пептид, как описано в US 7268214.
Можно использовать технологию GIRES™, по которой лекарственную форму с регулируемым высвобождением, находящуюся внутри надутого мешка, помещают в лекарственную капсулу для перорального введения. После растворения капсулы газогенерирующая система надувает мешок в желудке. При клинических испытаниях показано, что мешок сохраняется в желудке в течение 16-24 часов.
www.biocon.com
Альтернативно, активное средство можно конъюгировать с защитным модификатором, который позволяет активному средству противостоять ферментативному расщеплению в желудке и облегчает его абсорбцию. Активное средство может быть ковалентно конъюгировано с монодисперсным производным короткоцепочечных метоксиполиэтиленгликольгликолипидов, которое после очистки кристаллизуют и лиофилизуют до сухого активного фармацевтического ингредиента. Такие способы описаны в US 5438040 и на сайте .
www.diasome.com
Также можно использовать для доставки активного ингредиента везикулу, направленную в печень (HDV). HDV может состоять из липосом (диаметром ≤150 нм), инкапсулирующих активный ингредиент, которые в своем липидном двойном слое также содержат гепатоцит-нацеливающую молекулу. Нацеливающая молекула направляет доставку инкапсулированного активного ингредиента в клетки печени и поэтому для действия требуются относительно небольшие количества активного ингредиента. Такая технология описана в US 2009/0087479 и также на сайте .
Активный ингредиент может быть включен в композицию, содержащую дополнительно по существу неводную гидрофильную среду, включающую спирт и сорастворитель, в сочетании со среднецепочечным неполным глицеридом, необязательно, в смеси с длинноцепочечными видами ПЭГ, как описано в US 2002/0115592 в отношении инсулина.
Альтернативно, можно использовать интестинальные пэтчи, как описано в Shen Ζ., Mitragotri S., Pharm. Res., 2002, Apr, 19(4): 391-5: «Intestinal patches for oral drug deliver».
Активный ингредиент может быть включен в съедобную матрицу, образованную из гидрогеля, смешанного с гидрофильным полимером, как описано в патенте США №7189414.
Подходящие уровни пероральной дозировки для взрослого человека, которого лечат, могут находиться в интервале 0,05-5 мг, предпочтительно, примерно 0,1-2,5 мг.
Частота приема доз при лечении пациентов может составлять 1-6 раз в сутки, например, от двух до четырех раз в сутки. Лечение желательно должно поддерживаться в течение продолжительного времени, по меньшей мере, 6 недель, предпочтительно, по меньшей мере, 6 месяцев, предпочтительно, по меньшей мере, год, и необязательно, на протяжении жизни.
Комбинированные лечения для соответствующих состояний можно выполнять с использованием композиции по настоящему изобретению и отдельного введения одного или нескольких других терапевтических средств. Альтернативно, композиция по настоящему изобретению может включать одно или нескольких других терапевтических средств для комбинированного введения.
Комбинированная терапия по настоящему изобретению включает комбинации описанного активного соединения с инсулином, GLP-2, GLP-1, GIP или амилином или вообще с другими противодиабетическими средствами. Такая комбинированная терапия, включающая смешанные препараты, может быть осуществлена с сенсибилизирующими инсулин веществами, включая бигуанидины, такие как метоформин, буформин и фенформин, TZD (PPAR), такие как балаглитазон, пиоглитазон, ривоглитазон, розиглитазон и троглитазон, двойные агонисты PPAR, такие как алеглитазар, мураглитазар и тезаглитазар, или средства, усиливающие секрецию, включая сульфонилмочевины, такие как карбутамид, хлорпропамид, гликлазид, толбутамид, толазамид, глипизид, глибенкламид, глибурид, гликвидон, гликлопирамид и глимепририд, меглитиниды/глиниды (K+), такие как натеглинид, репаглинид и митиглинид, аналоги GLP-1, такие как экзенатид, лираглутид и альбиглутид, ингибиторы DPP-4, такие как алоглиптин, линаглиптин, саксаглиптин, ситаглиптин и вилаглиптин, аналоги инсулина или специальные препараты, такие как (быстродействующие) инсулин лизпро, инсулин аспарт, инсулин глулизин, (длительного действия) инсулин гларгин, инсулин детемир, инсулин, который можно вводить ингаляцией - экзубра, и инсулин NPH, и другие, в том числе, ингибиторы альфа-глюкозидаз, такие как асарбоза, миглитол и воглибоза, аналоги амилина, такие как пралинтид, ингибиторы SGLT2, такие как дапаглифлозин, ремоглифлозин и сергилифлозин, а также вещества смешанного типа, такие как бенфлуорекс и толрестат.
2
Другие комбинации включают совместное введение или смешанный препарат с лептинами. Лептиноустойчивость является хорошо известным компонентом диабета типа 2, однако инъекции лептина пока не приносят улучшения при таком состоянии. Напротив, доказывается, что амилин и также молекулы со схожими с амилином возможностями как миметики кальцитонина лосося способны улучшать чувствительность к лептину. Показано, что комбинация амилин/лептин оказывает синергичное действие на массу тела и поглощение пищи и также инсулинорезистентность [Kusakabe T. et al.]. Соответственно, настоящее изобретение относится к соединению формулы Ac-CSNLSTCVLG KLSQELHKLQ TYPRTDVGAN AP-NH (SEQ ID NO: 15), которое будет называться в данном описании «миметик кальцитонина 1» или «UGP302».
Соответственно, настоящее изобретение включает фармацевтический препарат такого пептида для энтерального введения, например, для лечения диабета типа I, диабета типа II или метаболического синдрома, или для облегчения инсулинорезистентности, или для снижения нежелательно высокого уровня глюкозы в крови натощак, или для снижения нежелательно высокого максимального уровня сывороточной глюкозы, или для снижения нежелательно высокого максимального уровня сывороточного инсулина, или для уменьшения нежелательно сильной реакции на тест на переносимость глюкозы, или лечения остеопороза или лечения остеоартрита. Препарат также может включать носитель, служащий для обеспечения эффективного энтерального введения указанного активного соединения.
Предпочтительно указанный препарат составляют для перорального введения в пищеварительный тракт.
Предпочтительно указанный носитель включает 5-CNAC, SNAD или SNAC.
Кроме того, настоящее изобретение включает указанные пептиды как новые соединения.
Раскрытые здесь варианты воплощения настоящего изобретения описываются последующих примерах, которые приводятся с целью облегчения понимания изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения, определенного в формуле изобретения, которая следует далее. Приведенные далее примеры предлагаются с тем, чтобы предоставить специалистам в данной области полное раскрытие и описание того, как можно выполнять и применять описанные здесь варианты воплощения, и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения или создания представления, что только приведенные ниже эксперименты являются выполнимыми. Приложены определенные усилия для гарантии точности в отношении используемых величин (например, количеств, температуры и т.д.), но в расчет следует принять возможные ошибки эксперимента или отклонения. Если не указано иное, части представляют собой массовые части, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура приводится в градусах по шкале Цельсия, и давление равно или примерно равно атмосферному.
Примеры
Пример 1
Длительное действие миметика кальцитонина 1 (СМ1) по сравнению с sCT
Животные
Исследование выполняют на самцах крыс Levin-DIO (чувствительные к диете) и Levin-DR (устойчивые к диете) (TacLevin: CD (SD) DIO) (Taconic, Hudson, NY, U.S.A.), полученных в возрасте 6-7 недель. По прибытии крысы DIO получают рацион с высоким содержанием жира (60 ккал.%) (#D12495, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ., USA), и их держат на таком рационе в течение 16 недель до эксперимента, и во время эксперимента. Крысы DR получают рацион с низким содержанием жира и служат в качестве контрольной группы. На протяжении исследования животных содержат в клетках попарно. За крысами ухаживают и предварительно дают им один раз в сутки H2O MilliQ в течение 2-3 недель до начала эксперимента для снижения вызванной стрессом гипергликемии. Базовые параметры регистрируют в состоянии натощак (6 час). Крыс произвольно распределяют на группы обработки на основании массы тела натощак (BW) и глюкозы в плазме натощак (FPG). Массу тела, поглощение корма и воды в период исследования регистрируют один раз в неделю.
Соединение
Раствор sCT или миметика кальцитонина 1 для перорального введения получают в день введения, смешивая носитель с данным соединением на основании вычислений, указанных далее.
5-CNAC (носитель)
Животным, которым вводят перорально 5-CNAC, получают дозу 150 мг/кг, растворенную в H2O milliQ.
Уровень дозировки для 5-CNAC
150 мг/кг;
объем дозы
5 мл/кг;
концентрация соединения
30 мг/мл.
sCT / Миметик кальцитонина 1
Животные, которым вводят перорально sCT или миметик кальцитонина 1, получают дозы 1,0 мг/кг в комбинации с 150 мг/кг 5-CNAC - все растворены в H2O milliQ.
Уровень дозировки для sCT/миметика кальцитонина 1
1,0 мг/кг;
объем дозы
5 мл/кг;
концентрация соединения
0,2 мг/мл.
Лекарственное средство в период исследования вводят перорально (р.о.) через зонд два раза в день (в 7-8 часов до полудня и в 3-4 часа после полудня) и утром до начала OGTT.
Количество принудительно введенной перорально глюкозы во время OGTT получают с помощью вычислений, указанных далее.
D-глюкоза
Животные получают однократную дозу 2 г/кг, растворенную в H2O milliQ.
Уровень дозировки для D-глюкозы
2 г/кг;
объем дозы
4 мл/кг;
концентрация соединения
500 мг/мл.
Схема эксперимента
Образцы крови берут и измеряют гликемию с помощью пункции хвостовой вены (хвост был предварительно согрет).
Общие уровни глюкозы в крови определяют глюкометром ACCU-CHEK Avia (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Швейцария). Кровь (приблиз. 300 мкл) собирают в 1-мл пробирки для плазмы MiniCollect K3EDTA (Greiner-Bio-One GmbH, Frickenhausen, Германия), переворачивают и хранят на льду. Пробирки центрифугируют при 3000×g (5000 об/мин в настольной центрифуге) в течение 10 мин при 4°С, и получают плазму. Образцы плазмы хранят до анализа при -20°С. Во время OGTT получают всего ~2,5 мл крови (~0,3% от массы тела).
Статистика
Статистический анализ выполняют методом одностороннего ANOVA с последующей проверкой по Дуннетту для множественного сравнения. Определяют критерий Стьюдента для сравнения двух парных групп. Все анализы выполняют с использованием программного обеспечения GRAPHPAD PRISM (GraphPad Prism, San Diego, CA. U.S.A). Инкрементальную площадь под кривой (iAUC) во время OGTT вычисляют трапецеидальным методом. Считают, что удовлетворительной является величина Ρ<0,05. Все данные приводятся как среднее ± значение стандартной ошибки среднего (SEM).
3. Результаты
Базовые характеристики
Результаты суммируются на фигуре 1 (поглощение корма и масса тела), фигуре 2 (OGTT) и фигуре 3 (FPG). На фигурах 1А, 1В, 1С и 1D показан эффект от перорального введения привычного кальцитонина лосося («sCT») в сравнении с пероральным введением UGP302, оказываемый на массу тела и поглощение корма у крыс DIO при измерении в примере 1. На фигурах 2А и 2В показан эффект от перорального введения sCT в сравнении с пеоральным введением UGP302, оказываемый на переносимость глюкозы во время OGTT у крыс DIO при измерении в примере 1. На фигуре 3 показан эффект от перорального введения sCT в сравнении с пероральным введением UGP302, оказываемый на гликемию натощак у крыс DIO при измерении в примере 1.
Одну дозу sCT/миметика кальцитонина 1, содержащую 1 мг/кг соединения, вводят перорально через зонд дважды в сутки четырем группам крыс в течение 4 недель. Группа, которой перорально вводят наполнитель, служит, соответственно, в качестве контроля дозировки. *Ρ<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001, против носителя. Результаты приводятся как среднее ± SEM.
16-Недельный ad libitum рацион с высоким содержанием жира вызывает отчетливый фенотип ожирения у крыс, чувствительных к диете (DIO), когда массу тела сравнивают с однопометными устойчивыми к диете (DR) животными (Р<0,001) (таблица 1). Гликемия при 6-часовом голодании между DIO и DR не различается. Напротив, вычисленные площади под кривой (AUC) во время OGTT существенно выше для крыс DIO по сравнению с крысами DR, что указывает на непереносимость глюкозы, вызванную рационом с высоким содержанием жира (таблица 1).
Масса тела и поглощение корма
Во время первой недели введения, поглощение корма при пероральном введении sCT существенно уменьшается по сравнению с крысами, которым перорально вводили носитель. Более того, введенный перорально sCT защищает от дальнейшего прироста массы тела, которое наблюдают для группы, которой перорально вводили носитель (фигура 1). Таким образом, данные наблюдения подтверждают острый сильный аноректический эффект у крыс DIO, вызванный пероральным применением sCT.
Представляет интерес, что со 2 недели введения и на протяжении исследования поглощение корма крысами, которым вводили sCT, нормализуется и походит на прием у тех, которым перорально вводят носитель, что приводит к утрате различия в отношении суммарного поглощения корма в конце исследования. Это находится в согласии с полученными ранее данными, где предполагалось временный эффект на поглощение энергии от введенного перорально sCT. Однако на протяжении периода исследования введенный перорально sCT продлевает защитное действие от прироста массы тела и существенно снижает массу тела от исходного значения, что было выявлено при сравнении с введенным перорально носителем в конце исследования (фигура 1). Это согласуется с возможным эндогенным эффектом, оказываемым перорально введенным sCT, на расход энергии для постоянного регулирования энергетического баланса.
Вообще, пероральное применение миметика кальцитонина 1 походит на сильное аноректическое действие перорально введенного sCT в первую неделю введения и существенно снижает поглощение корма и защищает от прироста массы тела по сравнению с группой, которой перорально вводят носитель (фигура 1).
Как отмечают и для вводимого перорально sCT, миметик кальцитонина 1 вызывает временное действие на поглощение корма, хотя во время периода исследования поглощение корма имеет склонность к снижению при сравнении с теми, которым перорально вводят sCT. Таким образом, после четырех недель применения суммарное поглощение корма существенно снижается с миметиком кальцитонина 1 при сравнении с вводимым перорально носителем. Более того, при сравнении с вводимым перорально носителем наблюдают более отчетливое значительное снижение массы тела, что свидетельствует о более сильном влиянии на энергетический баланс.
Переносимость глюкозы
Результаты представлены на фигуре 2. Одну дозу sCT/миметика кальцитонина 1, содержащую 1 мг/кг соединения, вводят перорально через зонд дважды в сутки четырем группам крыс в течение 4 недель. Группа, которой перорально вводят носитель, служит в качестве контроля дозировки. OGTT выполняют в следующие 2 недели применения после голодания в течение ночи. ***Ρ<0,001 vs носитель. Результаты приводятся как среднее ± SEM.
Вводимый перорально sCT существенно снижает iAUC глюкозы во время OGTT после 2 недель применения по сравнению с вводимым перорально носителем (фигура 2), подтверждая, таким образом, что пероральное применение sCT, оказывает влияние на гликемический контроль после приема пищи, как это было показано ранее. Как правило, миметик кальцитонина 1 демонстрирует сходное существенное снижение iAUC, которое наблюдается для sCT, хотя в этом отношении отчетливого преимущества над принимаемым перорально sCT не имеется.
Гликемия натощак
После 2 и 4 недель введения пероральное применение sCT не дает существенного отличия от крыс, которым вводят носитель, что находится в противоречии с более ранними результатами для самцов крыс, когда после обычного введения, как правило, наблюдают 1-1,5 мМ снижение глюкозы в крови натощак. В случае миметика кальцитонина 1 на протяжении периода исследования наблюдался превосходство в отношении гликемии натощак при сравнении с вводимым перорально носителем или sCT.
Пример 2
Острое и кратковременное действие вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально миметиком кальцитонина 1
Животные
Исследование выполняют на самцах крыс Levin-DIO (чувствительные к диете) и Levin-DR (устойчивые к диете) (TacLevin: CD (SD) DIO) (Taconic, Hudson, NY, U.S.A.), полученных в возрасте 6-7 недель. По прибытии крысы DIO получают рацион с высоким содержанием жира (60 ккал.%) (#D12495, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ., USA), и их держат на таком рационе в течение 12 недель до эксперимента и во время эксперимента. Крысы DR получают рацион с низким содержанием жира и служат в качестве контрольной группы. На протяжении исследования животных содержат в клетках попарно. За крысами ухаживают и предварительно дают им один раз в сутки H2O MilliQ в течение 2-3 недель до начала эксперимента для снижения вызванной стрессом гипергликемии. Накануне начала исследования животным дают одну дозу носителя. Базовые параметры регистрируют в состоянии голодания в течение ночи (16 час). Крыс произвольно распределяют на группы обработки на основании массы тела натощак (BW) и глюкозы в плазме натощак (FPG). Массу тела, поглощение корма и воды регистрируют перед и по окончании исследования.
Соединения
Раствор sCT/миметика кальцитонина 1 для перорального введения получают в день введения, смешивая носитель с данным соединением на основании вычислений, указанных далее.
5-CNAC (носитель)
Животные, которым вводят перорально 5-CNAC, получают дозу 150 мг/кг, растворенную в H2O milliQ.
Уровень дозировки для 5-CNAC
150 мг/кг;
объем дозы
5 мл/кг;
концентрация соединения
30 мг/мл.
sCT/Миметик кальцитонина 1
Животные, которым вводят перорально sCT или миметиком кальцитонина 1, получают дозы 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг или 2,0 мг/кг в комбинации с 150 мг/кг 5-CNAC - все растворены в H2O milliQ.
Уровень дозировки для sCT/миметика кальцитонина 1
0,5 мг/кг;
объем дозы
5 мл/кг;
концентрация соединения
0,1 мг/мл.
Уровень дозировки для sCT/миметика кальцитонина 1
1,0 мг/кг;
объем дозы
5 мл/кг;
концентрация соединения
0,2 мг/мл.
Уровень дозировки для sCT/миметика кальцитонина 1
2,0 мг/кг;
объем дозы
5 мл/кг;
концентрация соединения
0,4 мг/мл.
Лекарственное средство в период исследования вводят перорально (р.о.) через зонд дважды в день и в виде одной дозы утром до начала OGTT.
Количество принудительно введенной перорально глюкозы во время OGTT получают с помощью вычислений, указанных далее.
D-Глюкоза
Животные получают однократную дозу 2 г/кг, растворенную в H2O milliQ.
Уровень дозировки для D-глюкозы
2 г/кг;
объем дозы
4 мл/кг;
концентрация соединения
500 мг/мл.
Схема эксперимента
Интенсивное тестирование - период применения для 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг и 2,0 мг/кг
го
го
После начального (1) OGTT животных распределяют по группам обработки на основании FBG и BW. Животных будут предварительно вводить в течение 3 дней (b.i.d.) до 2 OGTT. Введение дозы лекарства будет происходить утром (7-8 час до полудня) и после полудня (3-4 часа после полудня).
Исследование выполняют по перекрестной (x-over) схеме, причем каждое животное имеет свой собственный контроль.
OGTT после голодания в течение ночи (16 час)
Образцы крови берут и измеряют гликемию с помощью пункции хвостовой вены (хвост предварительно согревают).
Общие уровни глюкозы в крови определяют глюкометром ACCU-CHEK Avia (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Швейцария). Кровь (приблиз. 300 мкл) собирают в 1-мл пробирки для плазмы MiniCollect K3EDTA (Greiner-Bio-One GmbH, Frickenhausen, Германия), переворачивают и хранят на льду. Пробирки центрифугируют при 3000×g (5000 об/мин в настольной центрифуге) в течение 10 мин при 4°С, и получают плазму. Образцы плазмы хранят до анализа при -20°С. Во время OGTT получают всего ~2,5 мл крови (~0,3% от массы тела).
Статистика
Статистический анализ выполняют методом одностороннего ANOVA с последующей проверкой по Дуннетту для множественного сравнения. Определяют критерий Стьюдента для сравнения двух парных групп. Все анализы выполняют с использованием программного обеспечения GRAPHPAD PRISM (GraphPad Prism, San Diego, CA. U.S.A). Инкрементальную площадь под кривой (iAUC) во время OGTT вычисляют трапецеидальным методом. Считают, что удовлетворительной является величина Ρ<0,05. Все данные приводятся как среднее ± значение стандартная ошибка среднего (SEM).
3. Результаты
Базовые характеристики
12-Недельный ad libitum рацион с высоким содержанием жира вызывает отчетливый фенотип ожирения у крыс, чувствительных к диете (DIO), когда массу тела сравнивают с однопометными устойчивыми к диете (DR) животными (Р<0,001) (таблица 1). Гликемия натощак между DIO и DR не различается. Напротив, вычисленные площади под кривой (AUC) во время OGTT существенно выше для крыс DIO по сравнению с крысами DR, что указывает на непереносимость глюкозы, вызванную рационом с высоким содержанием жира (таблица 2).
AUC - площадь под кривой; OGTT - пероральный тест на переносимость глюкозы. Данные представляют собой среднее ± SEM (n=12/DR, n=24 / DIO).
Масса тела и поглощение корма
Три различные дозы sCT/миметика кальцитонина 1, содержащие 0,5, 1 и 2 мг/кг соединения, вводят перорально через зонд дважды в сутки к 4 группам крыс в течение 3 дней. *Ρ<0,05, **Ρ<0,01 vs вводимого перорально носителя.
Результаты приводятся на фигуре 4, фигуре 5 и фигуре 6 как среднее ± SEM. На фигуре 4А и фигуре 4В показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально UGP302 на массу тела и поглощение корма у крыс DIO, наблюдаемые в примере 2 при первой дозировке. На фигуре 5А и фигуре 5В показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально UGP302 на массу тела и поглощение корма у крыс DIO, наблюдаемые в примере 2 при второй дозировке. На фигуре 6А и фигуре 6В показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально UGP302 на массу тела и поглощение корма у крыс DIO, наблюдаемые в примере 2 при третьей дозировке.
Масса тела и поглощение корма снижаются в зависимости от дозы вводимого перорально sCT после кратковременного периода применения, и таким образом подтверждается аноректическое действие, индуцированное направленностью на амилиновый рецептор, как наблюдали ранее. Как правило, миметик демонстрирует зависимое от дозы преимущество перед вводимым перорально sCT в отношении снижения массы тела, что показано на фигуре 4, фигуре 5 и фигуре 6. Показано, что применение миметика кальцитонина 1В количестве 0,5 мг/кг существенно отличается от вводимого перорально sCT в количестве 0,5 мг/кг. Поглощение корма в случае миметика имеет склонность снижаться в зависимости от дозы по сравнению с вводимым перорально sCT.
Переносимость глюкозы
Три различные дозы sCT/миметика кальцитонина 1, содержащие 0,5, 1 и 2 мг/кг соединения, вводят перорально через зонд дважды в сутки 4 группам крыс в течение 3 дней перед OGTT. Схема эксперимента представляет собой перекрестный план. *Р<0,05, **Р<0,01, *** Ρ<0,001 vs вводимого перорально носителя. Результаты приводятся на фигуре 7 и фигуре 8 как среднее ± SEM. На фигуре 7А и фигуре 7В показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально UGP302 при первой дозировке на переносимость глюкозы во время OGTT у крыс DIO при измерении в примере 2. Фигура 8А и фигура 8В показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально UGP302 при второй дозировке на переносимость глюкозы во время OGTT у крыс DIO при измерении в примере 2.
Вводимый перорально sCT существенно снижает iAUC глюкозы во время OGTT в случае доз 0,5, 1 и 2 мг/кг по сравнению с вводимым перорально носителем (фигура 2), подтверждая, таким образом, что пероральное применение sCT влияет га гликемический контроль после приема пищи. Миметик кальцитонина 1 демонстрирует подобное существенное снижение iAUC, которое наблюдают для вводимого перорально sCT, хотя отчетливого преимущества различных UGP перед вводимым перорально sCT не имеется.
Пример 3
Острое и кратковременное действие вводимого перорально sCT по сравнению с UGP284, UGP298 и UGP302
Животные
Исследование выполняют на самцах крыс Levin-DIO (чувствительные к диете) и Levin-DR (устойчивые к диете) (TacLevin: CD (SD) DIO) (Taconic, Hudson, NY, U.S.A.), полученных в возрасте 6-7 недель. По прибытии крысы DIO получают рацион с высоким содержанием жира (60 ккал.%) (#D12495, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ., USA), и их держат на таком рационе в течение 12 недель до эксперимента и во время эксперимента. Крысы DR получают рацион с низким содержанием жира и служат в качестве контрольной группы. На протяжении исследования животных содержат в клетках попарно. За крысами ухаживают и предварительно дают им один раз в сутки H2O MilliQ в течение 2-3 недель до начала эксперимента для снижения вызванной стрессом гипергликемии. Накануне начала исследования животным дают одну дозу носителя. Базовые параметры регистрируют в состоянии голодания в течение ночи (16 час). Крыс произвольно распределяют на группы обработки на основании массы тела натощак (BW) и глюкозы в плазме натощак (FPG). Массу тела, поглощение корма и воды регистрируют перед и по окончании исследования.
Соединение
Раствор вводимого перорально sCT/ UGP получают в день введения, смешивая носитель с данным соединением на основании вычислений, указанных далее.
5-CNAC (носитель)
Животные, которым вводят перорально 5-CNAC, получают дозу 150 мг/кг, растворенную в H2O milliQ.
Уровень дозировки для 5-CNAC
150 мг/кг;
объем дозы
5 мл/кг;
концентрация соединения
30 мг/мл.
(sCT/UGP284/UGP298/UGP302)
2
Животные, которым вводят перорально sCT или UGP284/UGP298/UGP302, получают дозы 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг или 2,0 мг/кг в комбинации с 150 мг/кг 5-CNAC - все растворены в НО milliQ.
Уровень дозировки для sCT/UGP284/UGP298/UGP302
0,5 мг/кг;
объем дозы
5 мл/кг;
концентрация соединения
0,1 мг/мл.
Уровень дозировки для sCT/UGP284/UGP298/UGP302
1,0 мг/кг;
объем дозы
5 мл/кг;
концентрация соединения
0,2 мг/мл.
Уровень дозировки для sCT/UGP284/UGP298/UGP302
2,0 мг/кг;
объем дозы
5 мл/кг;
концентрация соединения
0,4 мг/мл.
Лекарственное средство в период исследования вводят перорально (р.о.) через зонд дважды в день и в виде одной дозы утром до начала OGTT.
Количество принудительно введенной перорально глюкозы во время OGTT получают с помощью вычислений, указанных далее.
D-Глюкоза
Животные получают однократную дозу 2 г/кг, растворенную в H2O milliQ.
Уровень дозировки для D-глюкозы
2 г/кг;
объем дозы
4 мл/кг;
концентрация соединения
500 мг/мл.
Схема эксперимента
Интенсивное тестирование - период применения для 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг и 2,0 мг/кг
го
го
После начального (1) OGTT животных распределяют по группам обработки на основании FBG и BW. Животных будут предварительно вводить в течение 3 дней (дважды в день.) до 2 OGTT. Исследование выполняют по перекрестной схеме, причем каждое животное имеет свой собственный контроль.
Образцы крови берут и измеряют гликемию с помощью пункции хвостовой вены (хвост предварительно согревают). Общие уровни глюкозы в крови определяют глюкометром ACCU-CHEK Avia (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Швейцария). Кровь (приблиз. 300 мкл) собирают в 1-мл пробирки для плазмы MiniCollect K3EDTA (Greiner-Bio-One GmbH, Frickenhausen, Германия), переворачивают и хранят на льду. Пробирки центрифугируют при 3000×g (5000 об/мин в настольной центрифуге) в течение 10 мин при 4°С, и получают плазму. Образцы плазмы хранят до анализа при ~20°С. Во время OGTT получают всего ~2,5 мл крови (~0,3% от массы тела).
Статистика
Статистический анализ выполняют методом одностороннего ANOVA с последующей проверкой по Дуннетту для множественного сравнения. Определяют критерий Стьюдента для сравнения двух парных групп. Все анализы выполняют с использованием программного обеспечения GRAPHPAD PRISM (GraphPad Prism, San Diego, CA. U.S.A). Инкрементальную площадь под кривой (iAUC) во время OGTT вычисляют трапецеидальным методом. Считают, что удовлетворительной является величина Ρ<0,05. Все данные приводятся как среднее ± значение стандартная ошибка среднего (SEM).
3. Результаты
Базовые характеристики
12-Недельный ad libitum рацион с высоким содержанием жира вызывает отчетливый фенотип ожирения у крыс, чувствительных к диете (DIO), когда массу тела сравнивают с однопометными устойчивыми к диете (DR) животными (Р<0,001) (таблица 3). Гликемия натощак между DIO и DR не различается. Напротив, вычисленные площади под кривой (AUC) во время OGTT существенно выше для крыс DIO по сравнению с крысами DR, что указывает на непереносимость глюкозы, вызванную рационом с высоким содержанием жира (таблица 3).
Масса тела и поглощение корма
Дозы вводимого перорально sCT после кратковременного периода применения, и таким образом подтверждается аноректическое действие, индуцированное направленностью на амилиновый рецептор, как наблюдали ранее. Как правило, все миметики UGP демонстрируют зависимое от дозы преимущество перед вводимым перорально sCT в отношении снижения массы тела, что иллюстрируется на фигуре 9. Применение UGP302 в количестве 0,5 мг/кг показывает существенное отличие от вводимого перорально sCT в количестве 0,5 мг/кг. В случае UGP284 наблюдают существенное различие при 2 мг/кг, когда сравнивают с 2 мг/кг вводимого перорально sCT. Наконец, UGP298 в дозах как 1 мг/кг, так и 2 мг/кг при сравнении существенно отличается от вводимого перорально sCT в подобных дозах (фигура 9). На фигурах 9А, 9В, 9С, 9D, 9Е и 9F показан эффект от трех различных доз sCT/UGP284/UGP298/UGP302, содержащих 0,5, 1,0 и 2,0 мг/кг соединения, вводимых перорально через зонд дважды в сутки 4 группам крыс в течение 3 дней. *Ρ<0,05, **Ρ<0,01, vs вводимого перорально sCT. Результаты приводятся как среднее ± SEM.
Переносимость глюкозы
На фигурах 10А, 10В, 10С, 10D, 10Е и 10F показан эффект от вводимого перорально sCT в сравнении с вводимым перорально UGP на переносимость глюкозы во время OGTT у крыс DIO. Три различные дозы sCT/UGP284/UGP298/UGP302, содержащие 0,5, 1 и 2 мг/кг соединения, вводят перорально через зонд дважды в сутки 4 группам крыс в течение 3 дней перед OGTT. Схема эксперимента представляет собой перекрестный план. *Р<0,05, **Р<0,01, ***Ρ<0,001 vs вводимого перорально носителя. Результаты приводятся как среднее ± SEM.
Все UGP демонстрируют существенное снижение LAUC, что наблюдают и для вводимого перорально sCT (фигура 10).
В заключение применение UGP284, UGP298 и UGP302 в дозах 0,5, 1 и 2 мг/кг демонстрирует превосходство над эквивалентыми дозами вводимого перорально sCT в отношении энергетического баланса у самцов крыс DIO. Более того, UGP284, UGP298 и UGP302 в дозах 0,5, 1 и 2 мг/кг дают улучшение по переносимости глюкозы во время OGTT.
Пример 4
Связывание аналогов sCT с кальцитониновыми рецепторами клеток T47D
Аналоги sCT в различных концентрациях испытывают в биоанализе с клетками T47D (линия эпителиальных клеток молочной железы человека). Известно, что такая клеточная линия имеет следующие рецепторы: кальцитонина, андрогена, прогестерона, глюкокортикоидов, пролактина и эстрогена. Результаты приводятся на фигуре 11 в виде % связывания сАМР относительно sCT, где за 100% связывание принимают сАМР в концентрации 1000 пг/мл. Можно видеть, что UGP302 обеспечивает самый высокий уровень связывания из всех испытываемых соединений, и что он обеспечивает более высокий уровень связывания, чем sCT.
Прием 5
Потребление корма и изменение массы у крыс, получавших аналоги sCT
Самцов крыс Sprague-Dawley содержат по одному в клетках, в которых происходит циклическая смена света и темноты. Крысам дают возможность кормиться ad libitum. Потребление корма и массу крыс во время каждого испытания контролируют ежедневно. Крысам внутримышечно инъецируют физиологический раствор как плацебо или указанный пептид в определенной дозе в физиологическом растворе. Данные в следующих далее таблицах суммированы в виде среднего изменения потребления корма относительно дня накануне начала применения (день 1) и в виде среднего изменения массы относительно дня накануне начала применения.
Результаты приводятся на фигурах 12, 13, 14, 15, 16 и 17. На фигурах 12А 12В приведены результаты измерения потребления корма (фигура 12А) и изменения массы тела (фигура 12В) для UGP282, проведенные в примере 5. На фигуре 13А и фигуре 13В приведены результаты измерения потребления корма (фигура 13А) и изменения массы тела (фигура 13В) для UGP283, проведенные в примере 5. На фигуре 14А и фигуре 14В приведены результаты измерения потребления корма (фигура 14А) и изменения массы тела (фигура 14В) для UGP284, проведенные в примере 5. На фигурах 15А и а 15В приведены результаты измерения потребления корма (фигура 15А) и изменения массы тела (фигура 15В) для UGP298, проведенные в примере 5. На фигурах 16А и 16 В приведены результаты измерения потребления корма (фигура 16А) и изменения массы тела (фигура 16В) для UGP302, проведенные в примере 5. На фигурах 17А и 17В приведены результаты измерения потребления корма (фигура 17А) и изменения массы тела (фигура 17В) для UGP303, проведенные в примере 5.
Можно видеть, что все испытываемые соединения вызывают потерю массы и снижают потребление корма.
Пример 6
Маркеры остеопороза и остеоартрита
Влияние sCT/миметика кальцитонина на потерю костной и хрящевой массы исследуют на крысах DIO. Животным дают дозы, как описано в таблице ниже, и через 2 часа после введения берут образцы крови пункцией из хвостовой вены (хвост предварительно согревают).
Уровни CTX-I в сыворотке как показатель костной резорбции измеряют с использованием ELISA RatLaps™, и уровни СТХ-II в сыворотке как показатель
Результаты представлены на фигуре 18 и фигуре 19, где миметик кальцитонина SEQ ID NO: 18 демонстрирует более сильный эффект в отношении снижения как костной резорбции, так и разрушения хряща, чем sCT.
В некоторых вариантах воплощения пептид по настоящему изобретению имеет последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
В некоторых вариантах воплощения способ включает введение пациенту эффективного количества пептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 17, для влияния на снижение массы у пациента.
В некоторых вариантах воплощения способ включает введение пациенту эффективного количества пептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 17, для влияния на гликемический контроль у пациента после приема пищи.
m
a
В некоторых вариантах воплощения способ включает введение пациенту эффективного количества пептида SEQ ID NO: 18, имеющего последовательность CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTDVGANXaaXaa, с тем, чтобы уменьшить у пациента, по меньшей мере, одно из костной резорбции и разрушения хряща.
Все патенты, заявки на патенты и опубликованные ссылки, которые цитировались в данном описании, включены в данное описание посредством ссылок. Следует иметь в виду, что некоторые из раскрытых выше и других особенностей и функций или их альтернатив можно при желании комбинировать во многие другие различные системы или применения. Также предполагается, что различные непредвиденные ныне или неожиданные на данный момент альтернативы, модификации, вариации или усовершенствования, которые впоследствии могут быть осуществлены специалистами в данной области техники, охватываются следующей далее формулой изобретения.