Способ характеристики пористости скаффолдов и/или клеточно-инженерных конструкций
METHOD FOR POROSITY OF SCAFFOLDS AND / OR CELL-ENGINEERING STRUCTURES

Предполагаемое изобретение относится к медицине, биотехнологии, тканевой инженерии, регенеративной медицине, в частности к способам оценки структурных параметров скаффолдов и клеточно-инженерных конструкций (КИК) – характеристики пористости.
Одним из основных направлений современной регенеративной медицины и биотехнологий является разработка тканезамещающих материалов для восстановления поврежденных тканей и органов. Развитие скаффолд-технологий связано, прежде всего, с культивированием клеток на трехмерных матрицах естественного или искусственного происхождения с целью пространственного трехмерного формирования ткани будущего трансплантата. Внутренняя архитектоника скаффолда, размеры, количество пор и канальцев, обеспечивающих внутренние коммуникации между порами в клеточно-инженерной конструкции, могут оказывать влияние на клеточную миграцию, пролиферацию и дифференцировку клеток. Наличие пор в структуре скаффолда обеспечивает трехмерный рост клеток с формированием множественных отростков и межклеточных контактов с образованием густой клеточной сети. Развитая система пор позволяет создать условия для поддержания нормального метаболизма, пролиферативной активности и дифференцировки клеток, и, как следствие, может обуславливать возможности васкуляризации и ремоделирования регенерирующей ткани. Данные литературы свидетельствуют о непосредственном влиянии микроструктуры скаффолда/КИК на клеточную адгезию, миграцию и пролиферацию (Шпичка А.И., Королев А.В., Дайвик, А. и др. Оценка васкулогенного потенциала гидрогелей на основе модифицированного фибрина // Цитология. 2016. Т. 58. № 10. С. 785–91; Ahn S., Koh Y.H., Kim G. A three-dimensional hierarchical collagen scaffold fabricated by a combined solid freeform fabrication (SFF) and electrospinning process to enhance mesenchymal stem cell (MSC) proliferation // J. Micromechanics Microengineering. 2010. V. 20. № 6. С. 65015; Ho W., Tawil B., Dunn J.C.Y. et al. The behavior of human mesenchymal stem cells in 3D fibrin clots: dependence on fibrinogen concentration and clot structure. // Tissue Eng. 2006. V. 12. № 6. С. 1587–1595; Sadeghi-Ataabadi M., Mostafavi-pour Z., Vojdani Z. et al. Fabrication and characterization of platelet-rich plasma scaffolds for tissue engineering applications // Mater. Sci. Eng. C. 2017. V. 71. С. 372–380). Одной из актуальных проблем, возникающих при разработке материалов для тканевой инженерии и проведении исследовании в области скаффолд-технологий, является определение микроархитектуры скаффолдов и клеточно-инженерных конструкций, в том числе определение наличия развитой системы пор в трехмерной структуре матриц, распределение пор по толще скаффолда и характеристика пористости.
Современные методы анализа пористости структуры скаффолдов не являются универсальными, часто длительны и трудоемки, требуют больших затрат, использования токсичных материалов (например, ртуть), либо нацелены на исследование образцов только определенной макроструктуры (порошки, слои, объемные тела). Так, например, калориметрические методы определения, методы пикнометрии позволяют проводить оценку только твердых пористых структур. Газовая волюмометрия применяется для измерения плотности сыпучих и пористых сред, а также плохо смачивающихся или недопускающих контакта с жидкостью веществ. Универсальные методы порометрии, пригодные для исследования любых пористых структур, отсутствуют. Отсутствие универсальных методов исследования пористой структуры усложняет выбор нужной методики исследования и приводит к необходимости комплексирования,  унифицирования и модификации уже имеющихся методик и разработки новых подходов для характеристики пористых материалов создаваемых для использования в регенеративной медицине.
°
°
В качестве прототипа выбран способ количественного анализа внутренней пористой структуры (см. Lin S.C., Wang Y., Wertheim D.F., Coombes A.G.A. Production and in vitro evaluation of macroporous, cell-encapsulating alginate fibres for nerve repair // Materials Science & Engineering: C. Mater Biol Appl.  2017 Volume 73. P. 653-664), применяемый для характеристики пористости гидрогелиевого скаффолда представленного в виде альгинатных волокон, включающий: замораживание скаффолда в криомолдах с помощью крио-среды (Tissue Tek O.C.T. Compound) при  -80С в течении 24 часов, перемещение замороженных блоков в криостат (Leica microsystems CM1850) при -20С для уравновешивания температуры блока и криостата, получение срезов образцов толщиной 8 мкм, перемещение образцов в 2-луночные лабораторные слайды Lab-Tek (Permanentox) для визуализации внутренней структуры скаффолдов и записи изображений на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе FluoView FV1000 (Olympus Corporation, Япония), получение 2D-изображений, формируемых путем сшивки 26 снимков, снятых со срезов образцов по оси z (104 мкм) с интервалом 4 мкм, предварительная обработка конфокальных изображений с помощью специального программного комплекса анализа и обработки изображений (MATLAB The MathWorks Inc., Natick, MA, USA) с использованием преобразования изображения в оттенки серого, и обработка с использованием порогового значения для обнаружения границы пор и формирования двоичного изображения (threshold), подбора пороговых уровней вручную для каждого изображения, с дальнейшим построением 3D-изображения структуры из последовательных 2D-изображений (до 110 изображений) с использованием программного обеспечения Amira v 5.3 (Visage Imaging GmbH, Берлин, Германия). Полученные 3D-изображения анализируются с помощью вычислительных алгоритмов, разработанных авторами способа. Результатом является характеристика пористости гидрогелиевого скаффолда, выражаемая в процентном соотношении объема пористой фазы с общим объемом скаффолда.
0
0
0
Способ, представленный в прототипе, требует дорогостоящего криооборудования, специализированных криосред (Leica microsystems CM1850, Tissue Tek O.C.T. Compound), а также сложного дополнительного программного обеспечения, в частности MATLAB The MathWorks Inc., Natick, MA, USA), Amira v 5.3 (Visage Imaging GmbH, Берлин, Германия). Для реализации представленного в прототипе способа необходимо жесткое соблюдение температурных режимов, что значительно усложняет работу с анализируемыми образцами и проведение анализа. Существенным недостатком прототипа является ручная настройка пороговых уровней для каждого изображения, что приводит к субъективизму в подсчете и учете пор, находящихся на границе пороговых уровней изображения. Еще одним недостатком является длительность и трудоемкость способа, так замораживание скаффолда в криосреде происходит при -80С в течение 24 часов, перед разрезанием блока на образцы необходимо «нагревание» замороженного при -80 блока до температуры криостата -20С, что требует несколько часов непрерывной работы. Кроме того, используемые для реализации способа прототипа криосрезы имеют микронный размер, в связи с этим, для получения изображений, необходимо проводить съемку с использованием функции z-стек. Таким образом, для получения одного, включаемого в анализ 2D-изображения, требуется сделать 26 снимков по оси z (104 мкм) с интервалом 4 мкм. В представленном прототипе в анализ включаются не 2D-изображения, а формируемые на их основе 3D-изображения. При этом для построения одного 3D-изображения необходимо до 110 последовательных 2D-изображений, что существенно усложняет процедуру и повышает временные затраты.
Задача предполагаемого изобретения – усовершенствование способа.
Технический результат – получение характеристик пористости скаффолдов и/или клеточно-инженерных конструкций (КИК) менее трудоемким, более быстрым и дешевым способом.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем получение 2D изображений срезов скаффолдов, загрузку 2D-изображений в программный комплекс анализа и обработки изображений, обработку полученных изображений с формированием двоичного изображения, до получения срезов образцы скаффолдов и/или клеточно-инженерных конструкций последовательно фиксируют в 2,5% растворе глутаральдегида на фосфатном буфере и в 1% растворе OsO4, затем подвергают пробоподготовке препаратов для электронной микроскопии, получают ультратонкие срезы, с полученных срезов на трансмиссионном электронном микроскопе при увеличении 4400× получают 2D-изображения с пяти и более EM-полей зрения, которые обрабатывают с применением процедуры формирования двоичного изображения с использованием автоматической настройки верхнего и нижнего значений пороговых уровней, полученное двоичное изображение анализируют по принципу сканирования всего изображения, при котором в качестве области интереса принимают структурообразующую часть скаффолда, а за фон изображения - просвет пор, измеряют выделенные с помощью порогового значения объекты, делают расчет процентного отношения структурообразующей части скаффолда (С) от общей площади анализируемого изображения, включая просвет пор, процент просвета пор рассчитывается по формуле: П (%)= 100% - С(%).
Способ оценки пористости скаффолдов и/или клеточно-инженерных конструкций осуществляют следующим образом:
1. Образцы скаффолов и/или клеточно-инженерных конструкций фиксируют в 2,5%-ном растворе глутаральдегида на фосфатном буфере (рН=7,4) с последующей фиксацией в 1%-ном растворе OsO4.
2. Фиксированные образцы подвергают пробоподготовке для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), которая общепринята как стандартная подготовка образцов для ТЭМ (Бисерова Н.М. Методы визуализации биологических ультраструктур. Подготовка биологических объектов для изучения с помощью электронных и флуоресцентных конфокальных лазерных микроскопов. Практическое руководство для биологов. Москва: Товарищество научных изданий КМК. 2013. 104 с., 24 вкл.): образцы дегидратируют в спиртах восходящей концентрации (от 50 до 100%) и ацетоне (100%), далее выдерживают в смеси 50% заливочной среды и 50% ацетона с последующим заключением в смесь Эпон-Аралдит. Помещенные в смесь образцы выдерживают сутки при 37°С, затем полимеризуют при 60°С.
3. С помощью ультрамикротома получают ультратонкие срезы толщиной 75-80 нм.
4. Полученные срезы визуализируют с использованием трансмиссионного электронного микроскопа с целью получения 2D-изображений внутренне структуры скаффолдов и/или КИК. EM-изображения получают при увеличении 4400× по одному изображению с пяти и более электронно-микроскопических полей (EM-полей) зрения.
5. EM-изображения загружают в программный комплекс анализа и обработки изображений (например, ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD)), где проводится процедура формирования двоичного изображения (threshold) с использованием автоматической настройки верхнего и нижнего значения порога с целью сегментирования области интереса и заднего фона изображения. При этом в качестве области интереса выступает структурообразующая часть скаффолда, а за фон изображения принимается просвет пор. Процедура формирования двоичного изображения (threshold) позволяет преобразовать изображения в оттенки серого, и сформировать двоичные изображения, где все пиксели, значения яркости которых попадают в пороговый интервал отображаются как черные, а все остальные – белые. Полученное двоичное изображение анализируют по принципу сканирования всего изображения и выделения объектов по заданному ранее пороговому значению (например, с использованием команды Analyze Particles). После этого выделенные с помощью порогового значения объекты измеряются. Делается расчет процентного отношения площади области интереса к площади всего изображения, что в случае анализа EM-изображений срезов скаффолдов и/или КИК соответствует проценту, приходящемуся на долю структурообразующей части скаффолда (С) от общей площади анализируемого изображения (принимаемого за 100%) включая просвет пор. Процент просвета пор (П) рассчитывается по формуле: П (%)= 100% - С (%).
Полученные данные дают возможность охарактеризовать пористость исследуемого образца по процентному соотношению структурообразующей части скаффолда и просвета пор, а так же получить соотношение в целых числах: для получения соотношения в целых числах С (%) принимают равной 1, П в целых числах рассчитывают по формуле  П = П (%) / С (%).
Пример 1.
Для исследования пористости взяты два фрагмента фибрин-коллагенового скаффолда, отличающиеся вводимым в их состав при изготовлении коллагеном. Образец №1 – в составе коллаген I типа бычий, образец №2 – в составе коллаген I типа рыбный, выделенный из шкур трески. Образцы скаффолдов №1 и №2 фиксировали в 2,5%-ном растворе глутаральдегида на фосфатном буфере (рН=7,4) и в 1%-ном растворе OsO4. Затем, согласно представленному способу (п.2-4), была сделана пробоподготовка образцов для электронной трансмиссионной микроскопии с получением ультратонких срезов толщиной 75-80нм на ультратоме UC7 (Leica), и проведено исследование на трансмиссионном электронном микроскопе Morgagni 268D (FEI). В результате было получено по 7 EM-изображений каждого образца с 7 случайных различных полей зрения при увеличении 4400×. На рисунке 1 приведены примеры ЕМ-изображений исследуемых образцов скаффолдов, где А – образец №1, B - образец №2. Полученные EM-изображения загружены в программный комплекс анализа и обработки изображений ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) с последующим проведением всех процедур описанных в п.5 представленного способа.
Согласно полученным результатам образец скаффолда №1, имеет более плотную структуру, чем образец №2. Так процент структурообразующей части образца №1 статистически значимо в 1,5 раза превышал таковой в образце №2 (Табл.1). При анализе процентного соотношения структурообразующей части скаффолда и просвета пор было установлено, что в образце №1 это соотношение составляло 24,86:75,14 а в образце №2 – 16,29:83,71 соответственно. Соотношение структурообразующей части скаффолда и просвета пор в целых числах в образце №1 составляло 1:3, а в образце №2 – 1:5, соответственно.
Табл.1
№ EM-изображения
Образец №1
Образец №2
С (структурообразующая часть, %)
П(просвет пор, %)
С (структурообразующая часть, %)
П(просвет пор, %)
1
25,45
74,55
13,84
86,16
2
23,38
76,62
12,98
87,02
3
28,40
71,60
12,20
87,80
4
23,03
76,97
15,70
84,30
5
22,03
77,98
21,02
78,98
6
25,55
74,45
17,09
82,91
7
26,20
73,80
21,20
78,80
% соотношение(среднее)
24,86
75,14
16,29
83,71
Соотношение в целых числах
1
3
1
5
Примечание: где в строке «Соотношение в целых числах» С (%) принято равным 1, а П в целых числах рассчитано по формуле П = П (%) / С (%).
Пример №2.
2
0
Для исследования была сформирована клеточно-инженерная конструкция (КИК) на основе естественных биополимеров (фибрина и коллагена) с мезенхимальными стволовыми клетками человека (МСК). Клеточно-инженерная конструкция культивировалась в стандартных условиях (в культуральной среде αMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки в клеточном инкубаторе с содержанием CO5% и температурой 37С) в течение девяти суток. Известно, что в оптимальных условиях, которые должна обеспечивать бесклеточная часть КИК, МСК должны преобразовывать структуру клеточно-инженерной конструкции, созданную на основе естественных биополимеров. Одним из критериев оценки изменения структуры в процессе культивирования КИК является изменение характеристик пористости. Для характеристики пористости исследуемой клеточно-инженерной конструкции в процессе ее культивирования на 2 и 9 сутки после ее формирования были взяты два фрагмента. Фрагмент КИК №1 (2 сутки культивирования) и фрагмент №2 (9 сутки культивирования) фиксировали в 2,5%-ном растворе глутаральдегида на фосфатном буфере (рН=7,4) и в 1%-ном растворе OsO4. Затем, согласно представленному способу (п.2-4), была сделана пробоподготовка образцов для электронной трансмиссионной микроскопии с получением ультратонких срезов толщиной 75-80нм на ультратоме UC7 (Leica), и проведено исследование на трансмиссионном электронном микроскопе Morgagni 268D (FEI). В результате было получено по 7 EM-изображений каждого образца с 7 случайных различных полей зрения при увеличении 4400× (Рис.1). Полученные EM-изображения загружены в программный комплекс анализа и обработки изображений ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) с последующим проведением всех процедур описанных в п.5 представленного способа.
Показано, что характеристики пористости клеточно-инженерной конструкции на 2 сутки ее культивирования значительно отличалась от таковых на 9 сутки (Табл.2).
Табл.2
№ EM-изображения
Фрагмент №1
Фрагмент №2
С (структурообразующая часть, %)
П (просвет пор, %)
С (структурообразующая часть, %)
П (просвет пор, %)
1
33,01
66,99
48,44
51,56
2
31,72
68,28
44,54
55,46
3
28,36
71,64
54,32
45,68
4
27,35
72,65
49,09
50,91
5
25,55
74,45
39,65
60,35
% соотношение(среднее)
29,20
70,80
47,21
52,79
Соотношение в целых числах
1
2
1
1
Примечание: где в строке «Соотношение в целых числах» С (%) принято равным 1, а П в целых числах рассчитано по формуле П = П (%) / С (%).
Так, процент структурообразующей части КИК фрагмента №2 в 1,6 раза превышал этот же показатель фрагмента №1. При анализе процентного соотношения структурообразующей части КИК и просвета пор было установлено, что во фрагменте №1, взятом на 2 сутки культивирования, это соотношение составляло 29,20:70,80 (соотношение в целых числах 1:2), а во фрагменте №2, взятом на 9 сутки – 47,21:52,79 (соотношение в целых числах 1:1) соответственно. Использование способа позволило охарактеризовать структуру КИК и выявить изменения в характеристиках структуры КИК при ее культивировании.
Таким образом, предложенный способ позволяет получить объективные характеристики пористости скаффолдов и клеточно-инженерных конструкций с применением общепринятых методов, используемых в электронной микроскопии, без применения сложного и дорогостоящего криооборудования. Способ не требует дополнительного специализированного программного обеспечения, а может быть реализован с использованием программного комплекса анализа и обработки изображений с открытым исходным кодом, распространяемого без лицензионных ограничений, например, ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD),  что значительно удешевляет реализацию и повышает доступность представленного способа. Использование стандартных автоматизированных настроек при обработке изображений, в частности при применении процедуры формирования двоичного изображения (threshold), позволяет стандартизовать обработку изображений и, таким образом, снизить субъективизм при оценке результатов, имеющийся в прототипе. Использование для характеристики пористости ультратонких срезов скаффолдов / КИК позволяет упростить процедуру визуализации внутренней структуры образцов и сократить временные и трудозатраты (при получении изображений для анализа и непосредственно при проведении процедуры анализа изображений) по сравнению с прототипом, где используются срезы микронного размера.