Воспроизводство оздоровленного исходного материала для семеноводства картофеля: 6. Методы лабораторного контроля

5. Королев В.А. Изменение физических свойств черноземов обыкновенных при длительном сельскохозяйственном использовании // Почвоведение. - №6. - 2002. - С. 697-704.

6. Вадюнина А.Ф., Корчагина З.А. Методы исследования физических свойств почвы. - М.: Агропромиздат, 1986. - 416 с.

7. Dobzanski B., Whkowska, Walczak R. Soil aggregation and water stability index // Polish J. Soil Sci. - №1. - 1975. V.VIII. - P. 3-8.

8. Теории и методы физики почв. Коллективная монография/под ред. Е.В. Шеина иЛ.О. Карпачевского. - М.: «Гриф и К», 2007. - 616 с.

9. Смирнова Л.Г., Новых Л.Л., Пелехоце Е.А. Различия физических свойств черноземов на склоне в ландшафтной системе земледелия // Почвоведение. - №3. - 2006. - С. 311-316.

alteration of aggregate-structural coNDmoN of cHERNoZEMic soiLs iN A GEoMoRPHoLoGicAL PRoFILE on PoLAR ExPosuRE slopes

E.V. dubovik

summary. Alteration of aggregate-structural condition of chernozems in a geomorphological profile on the slopes of northern and southern exposures at the inclination of 1°, 3°, 5° and on the watershed plateau as well has been studied.

As a result of the studies conducted it has been established that the soil density regardless of slope location and steepness was the highest in the horizons Ap and A. The density of the horizons AB and A is characterized as optimal practically on all the variants studied. Estimation of soil structure conducted in respect to its water stability by the total amount of aggregates more than 0,25 mm obtained by wet sieving and that of aggregation index as well has shown that the water stability of soil fragments and aggregate condition are deteriorating with the depth in soil cross sections.

By the results of the investigations conducted it has been established that on chernozemic soils of the northern slope with the inclination increase deterioration of the structural condition and water stability takes place which can result in intensive development of erosion processes. The soils of the watershed plateau have a good structural condition and water stability, which reveals their stability in respect to the soils of polar exposure slopes. Owing to geomorphological peculiarities of a southern slope, i .e. increase of calcium content both down through the soil profile and down the slope, improvement both of soil structural condition and its water stability takes place with the increase of the inclination degree.

Key words: density, slope exposure, inclination degree, aggregate-structural condition, water stability.

УДК 635.21:631.531.02

ВОСПРОИЗВОДСТВО ОЗДОРОВЛЕННОГО ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ СЕМЕНОВОДСТВА КАРТОФЕЛЯ: 6. МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ

А.И.УСКОВ, кандидат биологических наук, зав. отделом

ВНИИ картофельного хозяйства Россельхозака-демии

E-mail: korenevo2000@mail.ru

Резюме. Разработаны современные высокочувствительные тест-системы ИФА и ИХГА для лабораторной и экспресс-диагностики патогенов, поражающих культуру картофеля (вирусов PVX, PVS, PVM, PVY, PAMV, PLRV, PVA, TRV и возбудителей бактериозов - черной ножки и кольцевой гнили). Чувствительность тест-систем для иммуноферментного определения вирусов составила 10. ..50 нг/мл, бактерий - 103.105 шт./мл, что превышает чувствительность серологического метода капельной агглютинации соответственно на 2.3 и на 3.4 порядка.

Чувствительность иммунохроматографических тест-систем для выявления вирусов в образцах составила 2.8 нг/мл, а время детекции - 10.20 мин. Совпадение результатов выявления вирусов картофеля методами ИФА и ИХГА составило для растений инфицированных PVXи PVYсоответственно 100 и 89 %, для здоровых - 100 %.

Ключевые слова: лабораторное тестирование, иммунофер-ментный анализ, экспресс-диагностика, иммунохроматография на тест-полосках.

Совершенствование схемы контроля патогенов в процессе воспроизводства исходного материала для семеноводства картофеля предполагает значительное увеличение объемов лабораторного тестирования [10]. В связи с этим к лабораторным методам для рутинных анализов предъявляются определенные требования. Наряду с высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью важное значение приобретают производительность, возможность автоматизации и объективного документиро-

вания, а также время проведения и себестоимость одного теста [13].

В соответствии с предъявляемыми во многих регламентируемых системах контроля в процессе воспроизводства и размножения семенного картофеля требованиями широкое распространение получил высокотехнологичный «сэндвич-вариант» иммуноферментного анализа (DAS-ELISA), который обладает чувствительностью определения патогенов в пределах 0,1...10 нг/мл [12].

При работе с семенным материалом в полевых питомниках важная роль отводится экспресс-диагностике патогенов в целях первичной оценки качества базовых клонов и их отбора для дальнейшего размножения [1].

В последние годы за рубежом для этого стали широко использовать метод иммунохроматографии на тест-полосках, который позволяет достоверно выявлять наличие вирусов в течение нескольких минут [15].

Цель наших исследований - разработка и освоение отечественных лабораторных тест-систем для рутинного тестирования и экспресс-анализов материала в процессе воспроизводства и размножения семенного картофеля.

Условия, материалы и методы. Разработку тест-системы «сэндвич-варианта» иммуноферментного анализа (ИФА) осуществляли в 1982-84 гг. в рамках комплексной целевой программы «Биотехнология» на основе совместных исследований Биологического факультета МГУ, Института биоорганической химии РАН и ВНИИКХ [8].

Технологические аспекты использования ИФА в практической селекционно-семеноводческой работе отрабатывали путем постановки специальных опытов

и в процессе проведения рутинных анализов на базе Испытательной лаборатории ВНИИКХ в Системе сертификации семян (1996-2010 гг).

Отечественные иммунохроматографические тест-системы для визуальной экспресс-диагностики вирусных инфекций картофеля на поликомпозитных мембранных тест-полосках разрабатывали в 2008-2010 гг. с использованием технологии проточного латерального иммуноанализа [14] в рамках совместного проекта кафедры вирусологии биологического факультета МГУ,

НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского, ЗАО НВО «Иммунотех» и ВНИИКХ [5].

Результаты и обсуждение. В процессе разработки тест-системы для ИФА были решены такие методические вопросы технологии производства им-муноспецифических препаратов [10], как накопление биоматериала, содержащего моноштаммы патогенов, выделенные из природных источников; получение вы-сокоочищенных препаратов вирусов и чистых культур возбудителей бактериозов картофеля; изготовление высокоспецифических антисывороток из плазмы крови иммунизированных животных (кроликов); выделение специфических иммуноглобулинов и их конъюгирова-ние с пероксидазой из хрена обыкновенного (Armoracia rusticana Lam).

В результате проведенных исследований были созданы отечественные тест-системы «сэндвич-варианта»

ИФА и оптимизированы их параметры для идентификации таких наиболее распространенных на территории Российской Федерации вирусов, как PVX, PVS, PVM,

PVY PAMV, PLRV [7], PVA [3], TRV [9], и возбудителей бактериозов картофеля - черной ножки [6] и кольцевой гнили [11]. Чувствительность тест-систем для иммуно-ферментного определения вирусов составила 10...50 нг/мл, бактерий - 103.105 шт./мл, что соответственно на 2.3 и 3.4 порядка выше, чем у серологического метода капельной агглютинации.

Сравнительные испытания полученных тест-систем показали полное совпадение по количеству положительных результатов с другими методами диагностики. Одновременно при помощи иммуноферментных тест-систем в условиях теплицы удавалось выявить больше зараженных растений, чем при использовании аммонийно-сульфатного метода, в 6,3 раза, в поле - в 2,0 раза (см. табл.).

В результате проведенных исследований были сконструированы мультимембранные поликомпозит-ные иммунохроматографические стрипы с линейной формой движения фронта раствора, определены условия проведения иммунохроматографической реакции и оптимизированы кинетические параметры работы тест-системы на основе использования наночастиц коллоидного золота в качестве визуального маркера специфических антител [2].

При постановке реакции в неосветленных листовых экстрактах не было обнаружено существенного влияния эндогенных микро- и макрокомпонентов растительного сока на результаты проводимых измерений (см. рисунок).

Окрашенные пигменты *ЭМ - электронная микроскопия, ИФА - иммуноферментный анализ, АСМ -сока листьев практически аммонийно-сульфатный метод (капельная агглютинация); ** - вирусы не иденти-полностью задерживались на фицировали

Рисунок. Интенсивность окраски реакции при определении ВТМ (штамм I11) в зависимости от концентрации вируса: -

- в буферном растворе ТФ, И -в соке листьев растений

табака.

впитывающей мембране и не мешали инструментальной и визуальной оценке результатов анализа.

Чувствительность выявления разработанными им-мунохроматографическими тест-системами Х-, М- и Y-вирусов картофеля в образцах составила 2.8 нг/мл, а время детекции - 10.20 мин. [4].

При этом соответствие результатов выявления вирусов методами ИФА и ИХГА для инфицированных растений для PVX и РУУ было равно соответственно 100 и 89 %, для здоровых растений - 100 %.

В 2008-2010 гг с использованием отечественных иммунохроматографических стрипов было отобрано 590 клонов 37 сортов, поддерживаемых в Банке здоровых сортов картофеля (Архангельская область), почти 92 % из них подтвердили безвирусный статус при проведении послеуборочного лабораторного теста с использованием ИФА.

Выводы. В результате совместных комплексных исследований МГУ им. М.В.Ломоносова, Института биоорганической химии РАН и ВНИИКХ усовершенствованы биотехнологические аспекты лабораторной диагностики для рутинного и экспресс- определения фитопатогенов в процессе воспроизводства и размножения семенного картофеля. В рамках этих исследований получены следующие результаты:

разработана отечественная тест-система «сэндвич-варианта» иммуноферментного анализа (ИФА) с чувствительностью определения вирусов 10.50 нг/ мл, бактерий - 103.105 клеток/мл, что превышает чувствительность серологического метода капельной агглютинации соответственно на 2.3 и 3.4 порядка;

созданы отечественные иммунохроматографи-ческие тест-системы и отработана методика их применения для экспресс-диагностики X-, М- и У-вирусов картофеля с порогом чувствительности выявления Таблица. Сравнительная эффективность различных методов диагностики

вирусов картофеля Г7

Метод диагнос- тики Число образцов, шт. Положительных реакций, шт. Образцов с положительной реакцией, шт. Число совпадений, шт.

ЖВК 1 SВК 1 MВК I YВК

Микрорастения in vitro

ЭМ* 34 . 13** 13

ИФА 34 6 2 9 2 13

Тепличные растения

АСМ 461 0 11 11 0 11 11

ИФА 461 47 15 32 18 70

Полевые растения

АСМ 244 12 40 130 10 130 130

ИФА 244 20 69 243 21 243

НтП: земледелие и растениеводство

патогенов на уровне 2.8 нг/мл и временем детекции впадение результатов выявления вирусов картофеля

10.20 мин. Производственные испытания опытной методами ИФА и ИХГА для растений инфицированных

партии таких диагностических наборов показали со- PVX и PVY соответственно 100 и 89 %, здоровых - 100 %.

Литература

1. Анисимов Б.В., Овес Е.В., Юрлова С.М., Алябьева А.В., Хутинаев О.С., Бойко Ю.П., Абашкин О.В., Абросимов Д.В. Совершенствование системы качества в процессе производста семенного картофеля. // Картофелеводство: результаты исследований, инновации, практический опыт. Материалы научно-практической конференции и координационного совещания «Научное обеспечение и инновационное развитие картофелеводства» / Рос. акад. с.-х. наук, Всерос. НИИ картоф. хоз-ва; под ред. Е.А.Симакова. - М., 2008. - Т.1. - с.278-289.

2. Блинцов А.Н., Дрыгин Ю.Ф., Григоренко В.Г., Андреева И.П., Осипов А.П., Атабеков И.Г. Инновационная технология экспресс-диагностики вирусных инфекций растений методом иммунохроматографии на тест-полосках. // Картофелеводство: результаты исследований, инновации, практический опыт. Материалы научно-практической конференции и координационного совещания «Научное обеспечение и инновационное развитие картофелеводства» / Рос. акад. с.-х. наук, Всерос. НИИ картоф. хоз-ва; под ред. Е.А.Симакова. - М., 2008. - Т.1. - с.290-297.

3. Варицева Г.П., Варицев Ю.А. А-вирус картофеля: выделение, получение антисыворотки, иммуноферментный анализ. //Биотехнология в картофелеводстве. Научные труды. - Рос. с.-х. акад., НИИ картоф. хоз-ва. - М., 1991. - вып.53. -с.57-62.

4. Кравченко Д.В., Усков А.И., Варицев Ю.А. Инновационная технология диагностики вирусов картофеля методом иммунохроматографии на тест-полосках. // Перспективы инновационного развития картофелеводства. Материалы научно-практической конференции. - Чебоксары: КУП ЧР «Агро-Инновации», 2010. - с.58-60.

5. Кравченко Д.В., Усков А.И., Варицев Ю.А., Овэс Е.В. Возможности использования иммунохроматографических тест-систем для диагностики вирусов картофеля. // Картофелеводство: Сборник научных трудов. Материалы координационного совещания и научно-практической конференции, посвященной 120-летию со дня рождения А.Г.Лорха / Рос. акад. с.-х. наук, Всерос. НИИ картоф. хоз-ва; под ред. Е.А.Симакова. - М., 2010. - с.208-213.

6. Писарев В.Б., Князева В.П., ШнейдерА.Ю. Использование иммуноферментного анализа для диагностики латентной формы возбудителя ченой ножки. // Биотехнология в картофелеводстве. Научные труды. - Рос. с.-х. акад., НИИ картоф. хоз-ва. - М., 1991. - вып.53. -с.74-78.

7. Трофимец Л.Н., Варицев Ю.А., Князева В.П., Герасимова К.Ф., Усков А.И., Бабоша А.В., Зимина Л.Б., Егорова Л.И., Русинова Е.Я., Плетнева В.А. Разработка и применение метода иммуноферментного анализа для диагностики вирусных и бактериальных болезней картофеля. // Селекция картофеля на иммунитет и защита от болезней и вредителей. Научные труды. - Госагропром РСФСР, НИИ картоф. хоз-ва. - М., 1986. - с.42-50.

8. Трофимец Л.Н. Биотехнология в картофелеводстве. - М.,1989.-45 с.

9. Усков А.И., Князева В.П., Варицев Ю.А. Разработка тест-системы ИФА для определения вируса пестростебельности картофеля (TRV). // Селекция и семеноводство овощных культур вXXI веке. Материалы международной научно-практической конференции/ Рос. акад. с.-х. наук, Всерос. НИИ селекции и сем-ва овощ. культур; под ред. акад. В.Ф.Пивоварова. - М., 2000. - Т.2. - с.293-294.

10. Усков А.И. Воспроизводство оздоровленного исходного материала для семеноводства картофеля: 5.Схема лабораторного контроля. // Достижения науки и техники АПК. - 2010. - № 9. - с.24-26.

11. Шнейдер А.Ю., Писарев В.Б., Князева В.П. Использование иммуноферментного анализа для диагностики кольцевой гнили картофеля.//Биотехнология в картофелеводстве. Научные труды. - Рос. с.-х. акад., НИИ картоф. хоз-ва. - М., 1991. - вып.53. -с.79-84.

12. Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. // J. Gen. Virol., 1977. - v.34. - p.475-483.

13. De Bokx J.A. Test plants. In: Viruses of potato and seed potato production./ De Bokx J.A. (Ed.) - Centre for Agr. Pub. and Doc., Wageningen, The Netherlands, 1972. - p.102-110.

14. Lateral Flow Immunoassay. / Wong R. and Tse H. (Eds.) - Humana Press, N.Y., 2010. - 235 p.

15. Sato K., Ichiyama S., Linuma Y., Nada T., Shimokata K., Nakashima N. Evaluation of immunochromatographic assay systems for rapid detection of hepatite B surface antigen and antibody.// J. Clin. Microbiol. - 1996. - v.34. - p.1420-1422.

REPRODUCTiON OF BASiC MATERiAL FOR SEED POTATO PRODUCTiON: 6. LABORATORY CONTROL METHODS

A.I.Uskov

Summary. Modern high sensitive domestic ELISA- and Quick Strip dipstick-tests for potato-affected pathogens detecting have been created: PVX, PVS, PVM, PVY, PAMV, PLRV, PVA, TRV, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms), Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca) син. Pectobacterium atroseptica (Patro). Sensitivity characteristics of ELlSA-tests are 10-50 ng/ml for viruses detecting and 103-105 cells/ml for bacteria.

Sensitivity characteristics of Quick Strip dipstick-tests are 2-8 ng/ml with time detection during 10-20 min. Correlation between ELISA-and Quick Strip dipstick-tests of PVX and PVY came up to 100 и 89% for infected and 100% for healthy plants.

Key words: laboratory test, immune-enzyme analysis, instant diagnosis, immunochromatography on dipsticks

УДК: (633.3+581.5) 470.331

ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ТРАВОСМЕСЕЙ С УЧАСТИЕМ КОЗЛЯТНИКА ВОСТОЧНОГО И УРОВНЯ МИНЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ АГРОФИТОЦЕНОЗОВ

|А.Г. КОБЗИН, доктор сельскохозяйственных наук

В.А. ТЮЛИН, доктор сельскохозяйственных наук, зав. кафедрой Тверская ГСХА

Н.Н. ИВАНОВА, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник

Д.А. ВАГУНИН, младший научный сотрудник ВНИИ мелиоративного земледелия Россельхоза-кадемии

E-mail: dmitrialec@yandex.ru

Резюме. Изучено формирование продуктивности четырех агроценозов: козлятник восточный одновидовой посев, коз-

лятник восточный + тимофеевка луговая, козлятник восточный + овсяница луговая, козлятник восточный + тимофеевка луговая + овсяница луговая на фоне Р40К60 и Р6юКа0.

Более продуктивным был одновидовой посев козлятника восточного. При внесении фосфорно-калийных удобрений его урожайность достигала 12,8 т/га. Самый низкий сбор сухой массы отмечен в варианте со смесью козлятника восточного с овсяницей луговой на фоне Р60Ка0, он составил 10,0 т/га. Наибольший индекс ценотической активности зафиксирован у козлятника восточного (1...2,4), а самый низкий - у овсяницы луговой в трехкомпонентной травосмеси (0,1...0,2). Возделывание козлятника восточного в одновидовом посеве с внесением повышенных доз минеральных удобрений (Р6юКа0) обеспечило самый высокий условно чистый доход - 22833