СПОСОБ МОЛЕКУЛЯРНОГО ТИПИРОВАНИЯ Neisseria gonorrhoeae
METHOD FOR MOLECULAR TYPING OF Neisseria gonorrhoeae

Изобретение относится к микробиологии и представляет собой способ молекулярного типирования Neisseria gonorrhoeae. Изобретение может быть использовано для изучения эпидемиологии гонококковой инфекции и оценки генетического (клонального) родства отдельных штаммов и изолятов гонококков.
Разработка эффективных мероприятий по снижению уровня заболеваемости инфекциями, которые передаются половым путем, и, в частности, гонококковой инфекцией, должна базироваться на четких представлениях об особенностях эпидемиологии таких болезней. Одним из основных условий для этого является возможность выявления сходства и различия между штаммами бактерий одного биологического вида, выделенных от различных пациентов, то есть типирования.
Первоначально для типирования бактерий использовались фенотипические методы, основанные на выявлении их способности к утилизации отдельных субстратов (биохимическое типирование), наличия общих антигенных детерминант (серотипирование), чувствительности к бактериофагам (фаготипирование), а также к антибактериальным препаратам (типирование по антибиотикограмме). Однако, в целом, для фенотипических методов характерен ряд недостатков, которые ограничивают их применение. Важнейшим из них является невозможность оценивать эволюционные связи и структуру бактериальных популяций. Фенотипические методы отличаются значительной трудоемкостью и недостаточной воспроизводимостью.
Указанные недостатки фенотипических методов типирования бактерий потребовали поиска новых подходов. К ним, в первую очередь, следует отнести методы молекулярного типирования.
Одним из критериев выбора способа типирования является воспроизводимость метода и разрешающая (дискриминирующая) способность. При этом получаемые результаты должны легко учитываться и интерпретироваться без привлечения дополнительной экспертизы, под которой подразумевают способность метода оценить, как отдельные типы, штаммы, случайно отобранные из бактериальной популяции. Для количественной оценки дискриминирующей способности методов типирования применяют индекс разнообразия Симпсона (D) [Gaston, M. A. and P. R. Hunter. 1989. Efficient selection of tests for bacteriological typing schemes. J Clin Pathol 42:763-766; Hunter, P. R. and M. A. Gaston. 1988. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J Clin Microbiol 26:2465-2466], который рассчитывают по формуле
где S - число групп, на которое данный метод разделяет всю выборку штаммов,
j
n - число штаммов в j-й группе и N - общее число штаммов в исследованной выборке.
В идеале для методов с максимальной разрешающей способностью индекс Симпсона должен быть равен 1. Это означает, что метод может отнести к различным типам два любых штамма.
Другими критериями выбора метода молекулярного типирования могут быть
- способность осуществлять анализ большого количества образцов. Для лабораторий, проводящих обширные эпидемиологические исследования, данный критерий может являться определяющим.
- хранение генетических профилей, то есть создание базы данных также является важным критерием выбора метода.
В литературе имеется описание различных методик молекулярного типирования. Большинство из них проанализированы В.А.Верещагиным (см. автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук-2006 год «Молекулярное типирование клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae). Автором проанализированы такие методики, как por-типирование, типирование мультилокусным секвенированием. Для данных способов установлена довольно высокая степень дискриминации D=0.97 и D=0.98, соответственно. Кроме этого, в данной работе указано, что методика прямого белкового профилирования с использованием MALDI-TOF масс-спектроскопии показала низкую степень дискриминации (D=0,27), что не позволило использовать ее для типирования N.gonorrhoeae.
В уровне техники имеются также следующие статьи, в которых в той или иной степени описаны различные методики типирования. Так, из публикации Е.Н.Ильиной и др. «Молекулярное типирование клинических штаммов N. gonorrhoeae, распространенных на территории РФ», опубликованной в Бюллетене экспериментальной биологии и медицины 2003, том 136, №8, с.205-208, известны также, как упомянутая выше методика por-типирования, так и использование сочетания методов сексенирования роr гена с opa-типированием.
Метод MLST (мультилокусного секвенирования) основан на проведении секвенирования и последующего анализа нуклеотидных последовательностей большого числа (от 13 до 16) генов домашнего хозяйства микроорганизма. Одними из первых бактерий, к типированию которых был применен метод MLST, были менингококки [Feavers, I.M., S.J.Gray, R.Urwin, J.E.Russell, J.A.Bygraves, E.B.Kaczmarski, and M.C.Maiden. 1999. Multilocus sequence typing and antigen gene sequencing in the investigation of a meningococcal disease outbreak. J Clin Microbiol 37:3883-3887]. Для типирования популяции N. gonorrhoeae были предложены схемы мультилокусного секвенирования, основанные на анализе нуклеотидных последовательностей 13 и 16 различных генов домашнего хозяйствам, gonorrhoeae [Viscidi, R.P. and J.C.Demma. 2003. Genetic Diversity of Neisseria gonorrhoeae Housekeeping Genes. J.Clin.Microbiol. 41:197-204; Perez-Losada, M., R.P.Viscidi, J.C.Demma, J.Zenilman, and K.A.Crandall. 2005. Population genetics of Neisseria gonorrhoeae in a high-prevalence community using a hypervariable outer membrane porB and 13 slowly evolving housekeeping genes. Mol Biol Evol 22:1887-1902].
Однако данный метод MLST- типирования пока не нашел широкого применения в практике ввиду значительной трудоемкости и длительности выполнения исследований, сложности интерпретации получаемых результатов из-за необходимости одновременного изучения большого числа генов N.gonorrhoeae, недостаточно высокой разрешающей способности и производительности. На основе данного метода не было создано международных баз данных.
Что касается метода NG-MAST- типирования, то он также известен из таких публикаций, как, например, M DE JONGH Neisseria gonorrhoeae multi-antigen sequence typing (NG-MAST) of ciprofloxacin resistant isolates of Pretoria, South Africa. J Clin Pathol. 2008 May; 61(5):686-7. Epub 2007 Dec 5.
Принципом метода NG MAST является одновременное определение наиболее полиморфных нуклеотидных последовательностей фрагментов двух генов N.gonorrhoeae: гена поринового канала (por), обеспечивающего проникновение лекарственных средств внутрь клетки микроорганизма, и гена tbp, кодирующего бета-субъединицу трансферрин - связывающего белка N.gonorrhoeae; на основе данного метода создана международная база данных (www.ng-mast.net).
Недостатком указанного способа является то, что данный метод обладает недостаточно высокой разрешающей способностью.
Данный способ NG-MAST- типирования, известный из М DE JONGH Neisseria gonorrhoeae multi-antigen sequence typing (NG-MAST) of ciprofloxacin resistant isolates of Pretoria, South Africa. J Clin Pathol. 2008 May;61(5):686-7. Epub 2007 Dec 5, является наиболее близким к заявляемому способу молекулярного типирования Neisseria gonorrhoeae. Данный способ выбран в качестве ближайшего аналога предлагаемого способа.
Задачей изобретения является разработка более эффективного способа молекулярного типирования Neisseria gonorrhoeae.
Технический результат изобретения заключается в повышении разрешающей способности метода типирования Neisseria gonorrhoeae.
Это достигается за счет того, что из чистой культуры штамма Neisseria gonorrhoeae производят выделение бактериальной ДНК Neisseria gonorrhoeae; с помощью полимеразной цепной реакции получают амплифицированные фрагменты вариабельных участков трех генов Neisseria gonorrhoeae, таких как роr, tbp и glnA, проводят их секвенирование, восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей.
Способ осуществляется следующим образом.
Из чистой культуры штамма N. gonorrhoeae, полученной от больного гонореей, стандартным образом производят выделение бактериальной ДНК N.gonorrhoeae.
С помощью полимеразной цепной реакции получают амплифицированные фрагменты вариабельных участков трех генов N. gonorrhoeae, таких как роr, tbp и glnA. Характеристика генов-мишеней, использованных для типирования Neisseria gonorrhoeae, праймеров для их амплификации и условий постановки полимеразной цепной реакции для N. gonorrhoeae, представлены в таблице 1.
Гены-мишени, использованные для типирования Neisseria gonorrhoeae, праймеры для их амплификации и условия постановки полимеразной цепной реакции.
ген
Название праймера
Последовательность 5′-3′
Размер ампликона п.н.
Условия амплификации
1
Por
Porf
ggccaagaagacctcggcaa
721
30 циклов
95 0С-30 сек
60 0С-15 сек
2
Porr
ccgacaaccacttggtcgt
72 0С -20 сек
3
TbpB
Tbpf
cgttgtcggcagcgcgaaaac
568
30 циклов
95 0С-30 сек
64 0С-15 сек
4
Tbpr
ttcatcggtgcgctcgccttg
72 0С-20 сек
5
glnA
gInAf
agacggcatctgttttgtcg
1600
30 циклов
95 0С-30 сек
60 0С-15 сек
6
gInAr
gcattgctactgaaacccga
72 0С-20 сек
Постановку реакции секвенирования проводят с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя. Анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе ABI-3130 (Applied Biosystem, USA).
Восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей проводят с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI 9.0» (Informax, Inc).
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности генов рог и tbp сравнивают с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных Ng-MAST (www.ng-mast.net). Нуклеотидные последовательности гена домашнего хозяйства N. gonorrhoeae гена glnA - Glutamine synthetase) анализируемых штаммов сравнивают с последовательностями, представленными в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
На основании анализа молекулярной характеристики сиквенс-типа штамма N. gonorrhoeae, сиквенс-типу штамма N. gonorrhoeae присваивают порядковый номер, зависящий от результатов анализа генетических изменений штамма, и результаты типирования штамма N. gonorrhoeae помещают в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов N. gonorrhoeae.
Пример №1
Обследован пациент мужского пола (1), с подозрением на наличие инфекции, передаваемой половым путем. При обследовании соскобного материала уретры методом ПЦР (тест-система НПФ «Литех», «Гонопол» г.Москва) у пациента обнаружена ДНК N. gonorrhoeae.
Проведено типирование N. gonorrhoeae в соответствии с предлагаемым способом.
Этапы исследования включали:
- выделение тотальной бактериальной ДНК N. gonorrhoeae из соскобного материала уретры с использованием набора для выделения «ДНК ЭКСПРЕСС» (ООО НПФ Литех, ТУ-9398-450-17253567-03);
- подбор праймеров для проведения полимеразной цепной реакции с целью выявления и амплификации фрагментов генов роr, tbp и о glnA (таблица 1);
- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения амплификатов фрагментов генома С.trachomatis в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1 и использованием следующих реактивов: l0xReaction buffer [раствор: 0,66 М трис-HCL (кат. №Т 6791, фирма Sigma, США); 25 мМ магния хлорида (кат. №960-9, фирма Sigma, США); раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ)[водный раствор дНТФ -дАТФ (кат. №ТЗ-100, НПО "Вектор", Новосибирск); дГТФ (кат. №ТЗ-ПО, НПО "Вектор", Новосибирск); дЦТФ (кат. №ТЗ-130, НПО "Вектор", Новосибирск); дТТФ (кат.№ТЗ-120, НПО "Вектор", Новосибирск)]; концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ]; вода депонированная [фирма Millipore, США (кат. №ZPMG 23004)], Taq-полимераза (Promcga, USA);
- оценку результатов прохождения реакций амплификации проводили в 2% агарозном геле (агароза (кат. №А 9918, фирма Sigma, США), раствор бромистого этидия (1% раствор (кат. №11615, фирма Merk, Германия), 50-кратный ТАЕ-буфер:
2 М трис-ацетат (кат. №Т 1258, фирма Sigma, США), 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2);
- визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью видеосистемы для документирования гель-электрофореграмм по появлению светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм;
- постановку реакции секвенирования с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя. Анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе ABI-3130 (Applied Biosystem, USA);
- восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI 9.0» (Informax, Inc).
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивали с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
В результате секвенирования фрагмента гена роr установлено наличие замены A на С в 105 положении.
В результате секвенирования фрагмента гена tbp установлено его полное сходство с референсной последовательностью.
В результате секвенирования фрагмента гена glnA установлено наличие замены T на C в 56 положении.
На основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов роr, tbp и glnA штамму N. gonorrhoeae присвоен номер 5 сиквенс-типа N. gonorrhoeae; номер сиквенс-типа N. gonorrhoeae помещен в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов N. gonorrhoeae.
Пример №2
Обследована пациентка женского пола (2) с целью исключения гонококковой инфекции, которая являлась половым партнером пациента (1). При обследовании соскобного материала шейки матки и уретры методом ПЦР (тест-система НПФ «Литех», «Гонопол» г.Москва) у пациентки обнаружена ДНК N. gonorrhoeae.
Проведено типирование N. gonorrhoeae в соответствии с предлагаемым способом.
Этапы исследования включали:
- выделение тотальной бактериальной ДНК N. gonorrhoeae из соскобного материала шейки матки и уретры с использованием набора для выделения «ДНК ЭКСПРЕСС» (ООО НПФ Литех, ТУ-9398-450-17253567-03);
- подбор праймеров для проведения полимеразной цепной реакции с целью выявления и амплификации фрагментов генов роr, tbp и glnA (таблица 1);
- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения амплификатов фрагментов генома N. gonorrhoeae в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1 и использованием следующих реактивов: 10×Reaction buffer [раствор: 0,66 М трис-HCL (кат. №Т 6791, фирма Sigma, США); 25 мМ магния хлорида (кат. №960-9, фирма Sigma, США); 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2; раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ)[водный раствор дНТФ -дАТФ (кат. №Т3-100, НПО "Вектор", Новосибирск); дГТФ (кат. №Т3-ПО, НПО "Вектор", Новосибирск); дЦТФ (кат. №Т3-130, НПО "Вектор", Новосибирск); дТТФ (кат. №ТЗ-120, НПО "Вектор", Новосибирск)]; концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ]; вода депонированная [фирма Millipore, США (кат. №ZPMG 23004)], Taq-полимераза (Promcga, USA);
- оценку результатов прохождения реакций амплификации проводили в 2% агарозном геле (агароза (кат. №А 9918, фирма Sigma, США), раствор бромистого этидия (1% раствор (кат. №11615, фирма Merk, Германия), 50-кратный ТАЕ-буфер: 2 М трис-ацетат (кат. №Т 1258, фирма Sigma, США), 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2);
- визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью видеосистемы для документирования гель-электрофореграмм по появлению светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм;
- постановку реакции секвенирования с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя. Анализ результатов реакции секвенирования проводили на приборе ABI-3130 (Applied Biosystem, USA);
- восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI 9.0» (Informax, Inc).
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивали с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
В результате секвенирования фрагмента гена роr установлено наличие замены A на С в 105 положении.
В результате секвенирования фрагмента гена tbp установлено его полное сходство с референсной последовательностью.
В результате секвенирования фрагмента гена glnA установлено наличие замены T на С в 56 положении.
На основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов роr, tbp и glnA штамму N. gonorrhoeae присвоен номер 5 сиквенс-типа N. gonorrhoeae; номер сиквенс-типа N. gonorrhoeae помещен в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов N. gonorrhoeae.
В результате типирования N. gonorrhoeae, выделенной от пациентов (1) и (2), являвшихся половыми партнерами, было установлено наличие в урогенитальном тракте обоих партнеров идентичных штаммов N. gonorrhoeae, относившихся к одному сиквенс-типу.
Полученные данные позволяют заключить, что примененный метод типирования N. gonorrhoeae может быть применен для установления половых партнеров и изучения путей распространения гонококковой инфекции.
Пример №3
Обследована пациентка женского пола (3) с подозрением на наличие инфекции, передаваемой половым путем. При обследовании соскобного материала шейки матки и уретры методом ПЦР (тест-система НПФ «Литех», «Гонопол» г.Москва) у пациентки обнаружена ДНК N. gonorrhoeae.
Проведено типирование N. gonorrhoeae в соответствии с предлагаемым способом.
Этапы исследования включали:
выделение тотальной бактериальной ДНК N. gonorrhoeae из соскобного материала уретры с использованием набора для выделения «ДНК ЭКСПРЕСС» (ООО НПФ Литех, ТУ-9398-450-17253567-03);
- подбор праймеров для проведения полимеразной цепной реакции с целью выявления и амплификации фрагментов генов роr, tbp и glnA (таблица 1);
- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения амплификатов фрагментов генома N. gonorrhoeae в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1 и использованием следующих реактивов: l0xReaction buffer [раствор: 0,66 М трис-HCL (кат. №Т 6791, фирма Sigma, США); 25 мМ магния хлорида (кат. №960-9, фирма Sigma, США); 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2; Раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ)[водный раствор дНТФ -дАТФ (кат. №ТЗ-100, НПО "Вектор", Новосибирск); дГТФ (кат. №ТЗ-ПО, НПО "Вектор", Новосибирск); дЦТФ (кат. №ТЗ-130, НПО "Вектор", Новосибирск); дТТФ (кат. №ТЗ-120, НПО "Вектор", Новосибирск)]; концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ]; вода депонированная [фирма Millipore, США (кат. №ZPMG 23004)], Taq-полимераза (Promcga, USA);
- оценку результатов прохождения реакций амплификации проводили в 2% агарозном геле (агароза (кат. №А 9918, фирма Sigma, США), раствор бромистого этидия (1% раствор (кат. №11615, фирма Merk, Германия), 50-кратный ТАЕ-буфер: 2 М трис-ацетат (кат. №Т 1258, фирма Sigma, США), 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2);
- визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью видеосистемы для документирования гель-электрофореграмм по появлению светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм;
- постановку реакции секвенирования с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя. Анализ результатов реакции секвенирования проводили на приборе ABI-3130 (Applied Biosystem, USA);
- восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI 9.0» (Informax, Inc).
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивали с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
В результате секвенирования фрагмента гена por установлено его полное сходство с референсной последовательностью.
В результате секвенирования фрагмента гена tbp установлено его полное сходство с референсной последовательностью.
В результате секвенирования фрагмента гена glnA установлено наличие замены T на Г в 156 положении.
На основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов роr, tbp и glnA штамму N. gonorrhoeae присвоен номер 7 сиквенс-типа N. gonorrhoeae; номер сиквенс-типа N. gonorrhoeae помещен в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов N. gonorrhoeae, получаемых из разных территорий Российской Федерации.
В результате типирования N. gonorrhoeae, выделенной от пациентов (1) и (2), являвшихся половыми партнерами, и пациентки (3) было установлено, что в урогенитальном тракте обследованных половых партнеров - пациенты (1) и (2) присутствует N. gonorrhoeae, относящаяся к одному сиквенс-типу, а в урогенитальном тракте пациентки (3) присутствует N. gonorrhoeae, относящаяся к другому сиквенс-типу. Таким образом, примененный метод типирования N. gonorrhoeae позволил выявить различие между двумя штаммами N. gonorrhoeae, полученными от лиц, не являющихся половыми партнерами, что свидетельствует о его высокой дискриминирующей способности.
Полученные данные позволяют заключить, что примененный метод типирования N. gonorrhoeae может быть применен для оценки генетического родства отдельных штаммов возбудителя гонококковой инфекции, а также путей ее распространения.
При сравнении заявленного метода типирования с другими наиболее распространенными методами, такими как метод MLST и метод NG-MAST были выявлены следующие преимущества указанного способа:
- исследование небольшого (в сравнении с методом MLST) числа генов N. gonorrhoeae позволяет значительно снизить стоимость и сократить время проведения исследований по типированию штаммов N. gonorrhoeae и увеличивает его производительность; а также повысить разрешающую способность и воспроизводимость метода типирования N. gonorrhoeae;
- проведение секвенирования вариабельных участков трех генов N. gonorrhoeae, обладающих выраженным нуклеотидным полиморфизмом, позволяет (в сравнении с методом NG-MAST) значительно повысить разрешающую способность и воспроизводимость метода типирования N. gonorrheae.
Сравнительная характеристика методов молекулярного типирования N.gonorrhoeae приведена в таблице 2.
Таблица 2.Сравнительная характеристика молекулярных методов типирования N.gonorrhoeae
Метод типирования
Воспроизводимость
Разрешающая способность (индекс разнообразия Симпсона)
Производительность
Стоимость
Легкость
Интерпретации
Выполнения
MLST
средняя
0.97
средняя
высокая
низкая
средняя
NG-MAST
высокая
0.98
высокая
невысокая
высокая
высокая
Заявляемый способ
высокая
0.99
высокая
невысокая
высокая
высокая