СПОСОБ СКРИНИНГА ДЛЯ ОТБОРА РАСТЕНИЙ, ОБНАРУЖИВАЮЩИХ ПОНИЖЕННОЕ НАРУШЕНИЕ ОКРАСКИ ПОВЕРХНОСТИ, ВЫЗЫВАЕМОЕ ПОВРЕЖДЕНИЕМ, И РАСТЕНИЕ И ЧАСТИ РАСТЕНИЯ, ПОЛУЧАЕМЫЕ ТАКИМ ОБРАЗОМ
METHOD OF SCREENING TO SELECT PLANTS THAT DEMONSTRATE LOWER DISCOLORATION OF SURFACE CAUSED BY DAMAGE AND PLANT AND PARTS OF PLANT PRODUCED THEREFORE

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способу скрининга популяции растений или частей растений на присутствие в ней особей, обнаруживающих пониженное нарушение окраски поверхности, вызываемое повреждением, по сравнению с контрольным растением. Изобретение также относится к растениям и частям, полученным из них, обнаруживающим отсутствие или пониженное нарушение окраски поверхности, вызываемое повреждением, полученным этим способом, и к их частям и потомству.
Уровень техники
Из-за увеличивающегося спроса обработка свежего продукта, в частности салата, значительно увеличилась за последние годы. Сбор урожая и обработка салата вовлекают обширное срезание листьев, которое вызывает сильную реакцию на повреждение. Эта реакция на повреждение приводит к быстрому ухудшению обработанного продукта. Это ухудшение проявляется в нарушении окраски из-за ферментативного потемнения или порозовения на и вокруг поврежденной поверхности, дыхания и высушивания из-за испарения. В особенности ферментативному потемнению или порозовению придают существенное значение при прямом или косвенном определении общего качества свежесобранного, упакованного салата.
Более того, вследствие такого повреждения может значительно увеличиться количество микроорганизмов, которые могут поставить под угрозу безопасность продукта. Высокоскоропортящаяся природа обработанного салата приводит к сильному ухудшению цвета, неприятному аромату и ухудшению строения ткани в восприятии потребителем, которые препятствуют более быстрому росту, чем настоящий, так называемого рынка удобства.
Чтобы ингибировать процесс ухудшения, было разработано много химических или физических послеуборочных обработок урожая, которые могут быть использованы для замедления ухудшения обработанного салата.
Среди них упаковка свежесрезанного салата в модифицированной газовой среде, использование съедобных покрытий, обработка тепловым шоком и добавление химических веществ, которые ингибируют ферментативное потемнение. Когда свежесрезанный салат упакован в атмосфере пониженного кислорода при низких температурах, ферментативное потемнение может быть существенно снижено. Однако такая модифицированная среда с низким содержанием кислорода приводит к анаэробному дыханию, которое создает неприятный привкус и неприятный аромат продукта, который воспринимается как очень непривлекательный.
Съедобные покрытия являются тонкими слоями материалов, которые действуют как физический барьер изоляции и которые эффективно защищают продукт от различных видов ухудшения, таких как испарение и потемнение. Эти покрытия могут, например, быть сделаны из смол, полисахаридов или белка.
Было дополнительно продемонстрировано, что потемнение свежесрезанного салата может быть предотвращено путем применения кратковременного теплового шока в течение 90 секунд при 45°C, сразу же после обработки. Возможно, тепловой шок переводит биосинтез белка от ферментов, вовлеченных в процесс повреждения, к белкам теплового шока, таким образом снижая ферментативную способность потемнения. В качестве альтернативы влияние обработки тепловым шоком на потемнение может быть объяснено термочувствительностью ферментов, вовлеченных в процесс нарушения окраски.
Химическими веществами, которые могут быть использованы, могут быть, например, восстановители, такие как витамин C, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, комплексообразователи, такие как циклодекстрин, и ингибиторы ферментов, такие как L-цистеин. Применение химических веществ в свежих продуктах, очевидно, вовлекает вопрос безвредности пищевых продуктов и требует разрешения контролирующего органа. Могут быть использованы комбинации послеуборочных технологий, описанных выше, и, в конечном счете, используемая процедура является компромиссом между технологической эффективностью, стоимостью и безвредностью продуктов.
Независимо от используемой технологии улучшение послеуборочного качества обработанного салата окажется затратным, и поэтому существует очевидная потребность в области техники в разработке альтернатив, которые устранят или снизят потребность в применении физических или химических послеуборочных технологий.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является разработка способа скрининга для отбора растений, которые обнаруживают пониженную реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением, для обеспечения растениями и происходящим из них потомством, устойчивыми к послеуборочным нарушениям в результате обработки, такими как ферментативное потемнение или порозовение. Дополнительной целью изобретения является получение растений, обнаруживающих значительно сниженное при повреждении в виде порозовения или потемнения при повреждении. Нарушение окраски при повреждении может также быть видимым в частях растений, таких как стебли, семена, плоды, листья, цветы, клубни, побеги. Таким образом, дополнительной целью изобретения является разработка способа скрининга для отбора растений, обнаруживающих пониженную реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением, в их частях растения.
Изобретение, таким образом, относится к способу скрининга популяции растений или частей растений на присутствие в ней особей, обнаруживающих пониженное нарушение окраски поверхности, вызываемое повреждением, по сравнению с контрольным растением или частью растения, который включает:
a) предоставление популяции растений или частей растений из популяции;
b) получение поврежденной поверхности на скринируемых растениях или частях растений и на контрольных растениях или частях растений;
c) инкубацию поврежденных поверхностей для появления нарушения окраски в них и на них;
d) наблюдение нарушения окраски поврежденной поверхности в или на растениях или частях растений;
e) сравнение наблюдаемого нарушения окраски поврежденной поверхности в или на скринируемых растениях или частях растений с нарушением окраски, наблюдаемым на или в контрольном растении или части растения для идентификации растений или частей растений, обнаруживающих отсутствие нарушения окраски или нарушение окраски, сниженное по сравнению с контрольным растением или частью растения.
Способ по изобретению может быть использован для любого растения, которое может быть подвергнуто нарушению окраски, но он, в частности, является полезным для продуктов, в частности овощей или фруктов или для цветов. Способ среди прочего является подходящим для листовых овощей, таких как салат, для клубнеплодов, таких как картофель или батат, для корней, таких как сельдерей, для побегов, таких как витлуф или для грибов. Способ, кроме того, может быть использован для фруктов, таких как яблоко, банан, авокадо, персик, груша, абрикос, манго, баклажан и для цветов или цветочных стеблей, таких как стебли гербер, цветы хризантем, нижние части артишока и т.д.
Способ скрининга по изобретению предназначен для идентификации растений, обладающих пониженным нарушением окраски поверхности, вызываемым повреждением, в одной или более своих частей или тканей. Поэтому для скрининга очень полезно использовать часть или ткань, склонную к нарушению окраски. В салате это может быть лист или его часть, такая как вырезанная часть, в банане могут быть соответственно использованы кусочки очищенного фрукта и в цветках части стебля являются очень удобным испытательным образцом.
Asteraceae
Lactuca
Lactuca
sativa
Cichorium
Cichorium
intybus
Cichorium
endivia
В частном варианте осуществления способ, в частности, использован для отбора растений, принадлежащих к семейству , в частности растений рода  и более конкретно к видам  или растениям, принадлежащим к роду  и, в частности, к видам  и , которые обнаруживают отсутствие или пониженное нарушение окраски поверхности, вызываемое повреждением.
Популяция растения, скринируемая способом по изобретению, может быть любой популяцией растения, но предпочтительно изменчивой популяцией растения, содержащей много различных участников для увеличения возможности обнаружения растения, обнаруживающего пониженное нарушение окраски, вызываемое повреждением. Такая изменчивая популяция может быть создана посредством мутагенной обработки с использованием, например, химических веществ и/или облучения и затем называется в настоящем описании популяцией мутантного растения. Альтернативными популяциями являются коллекции зародышевой плазмы, которые являются коллекциями растений, обнаруживающих естественную вариацию. Также может быть использована популяция трансгенных растений.
Способ по изобретению соответствующим образом выполняют с частями растений, имеющих поврежденную поверхность. Очень полезными испытательными образцами являются диски, вырезанные из листа, так называемые листовые диски. В качестве альтернативы может быть использована ткань центральной жилки жилистых листовых овощей. Соответственно диски вырезают из жилок.
Lactuca
Cichorium
Инкубацию проводят соответственно в водной среде. Способ по изобретению может быть очень хорошо осуществлен с листовыми дисками, инкубируемыми на или между смоченными фильтровальными бумагами. Тогда на бумаге очень хорошо видна реакция нарушения окраски вокруг краев повреждения. В случае растений родов  и  нарушение окраски является реакцией порозовения.
В качестве альтернативы водная среда включает воду или раствор. В конкретном способе осуществления, который будет дополнительно проиллюстрирован ниже, раствор содержит L-3,4-дигидроксифенилаланин. Это соединение преобразовано для получения черного пигмента меланина посредством фермента полифенолоксидазы. Альтернативные соединения, которые могут быть использованы в этом отношении, включают, но не ограничены ими, хлорогеновую кислоту, изохлорогеновую кислоту, L-тирозин и катехол.
Изобретение дополнительно относится к растению, обнаруживающему пониженное нарушение окраски поверхности, вызываемое повреждением, растению, получаемому путем использования на популяции растений способа скрининга по изобретению и отбора растений из популяции, обнаруживающих отсутствие нарушения окраски поверхности при скрининге или обнаруживающих при скрининге нарушение окраски поверхности, сниженное по сравнению с контрольным растением.
Lactuca
Lactuca
sativa
Cichorium
Cichorium
intybus
Cichorium
endivia
Растение является соответственно листовым овощным растением, более конкретно растением, принадлежащим к роду  и, в частности, к виду  или растением, принадлежащим к роду  и, в частности, к виду  и .
Предпочтительно, растение по изобретению идентифицируют при отборе и впоследствии отбирают как обладающее пониженным или отсутствием нарушения окраски поверхности, вызываемого повреждением, но впоследствии анализируют для определения наличия у него нормального признака. Более конкретно растение предпочтительно не должно обнаруживать отрицательного плейотропного эффекта.
Согласно изобретению были идентифицированы и отобраны растения, обнаруживающие отсутствие или значительно пониженное нарушение окраски поверхности, вызываемое повреждением. Потомство семян этих растений было депонировано с NCIMB и был присвоен номер доступа как, перечислено в Таблице 1. Подробности о происхождении семени депозитов даны в Примере 4 и в Примере 6. Эти депозиты созданы поскольку, они имеют единственный особенный признак отсутствия или значительно пониженного нарушения окраски, вызываемого повреждением. Их не тестировали на DUS-критерии для регистрации сорта, то есть различимость, однородность, устойчивость по всем регистрационным характеристикам, и в любом случае не ожидают, что эти критерии будут выполнены.
Таблица 1
Растение №
Внутренняя ссылка(=NCIMB ссылка)
Номер доступа NCIMB
Дата депонирования
06D.210202
06D.863B2
41454
3 Янв.2007
05D.202539
07G.9979
41441
10 Окт.2006
Изобретение дополнительно относится к растениям, имеющим пониженное или отсутствие нарушения окраски поверхности, вызываемое повреждением, и получаемым путем скрещивания растения по изобретению с другим растением тех же видов. Признак "пониженное или отсутствие нарушения окраски поверхности, вызываемого повреждением" может, таким образом, быть принесен в другие растения, которые первоначально не имеют признак. Являются ли растения, получаемые из такого скрещивания, в действительности растениями по изобретению, может быть проанализировано путем использования для этих растений способа скрининга по изобретению. Предпочтительно, растения, отбираемые как растения по изобретению, затем также анализируют на наличие нормального признака.
Изобретение дополнительно относится к потомству родительского растения по изобретению, которое сохраняет отсутствие или пониженное нарушение окраски листьев, вызываемое повреждением, как обнаруживается в родительском растении. Такое потомство может быть удалено на многие поколения от родителя. Растение является растением по изобретению при условии, что ему присущ признак "пониженное или отсутствие нарушения окраски поверхности, вызываемого повреждением".
Изобретение дополнительно относится к частям растений по изобретению. Части растений, таких как салат или головки эндивия или листья, обычно являются частями, имеющими поверхность среза, которая может быть подвергнута нарушению окраски.
Части растения по изобретению могут быть использованы в тканевой культуре для регенерации растений, которые сохраняют отсутствие или пониженное нарушение окраски листьев, вызываемое повреждением, как обнаруживается в растении, из которого получают ткань для тканевой культуры. Такие регенерированные растения также являются частью этого изобретения.
Изобретение дополнительно относится к семени растения по изобретению. Из семени могут быть выращены растения, которые также обладают признаком "пониженное или отсутствие нарушения окраски поверхности, вызываемого повреждением". Независимо от того сохранили ли семена и, таким образом, выращенные из них растения признак может быть проанализирован способом скрининга по изобретению. Изобретение также относится к дополнительному поколению семян, сохраняющих отсутствие или пониженное нарушение окраски листьев, вызываемое повреждением, как обнаруживается у исходных семян.
Изобретение является коммерчески очень интересным для рынка обработанных растений. Как объяснено выше, нарушение окраски продукта, в частности свежих фруктов и овощей, считается нежелательным, поскольку продукт с нарушением окраски бракуется потребителем. Признак "пониженное или отсутствие нарушения окраски поверхности, вызываемого повреждением" по изобретению, таким образом, является подходящим для обнаружения в обработанных растительных продуктах, как срезанный салат, эндивий или витлуф или их комбинации. При скрининге с применением способа по изобретению обработанные овощи по изобретению обнаруживают отсутствие или ограниченное нарушение окраски листьев, вызываемое повреждением. Все обработанные овощи, в частности обработанный салат, эндивий и витлуф, которые проходят отбор, являются частью изобретения, поскольку они демонстрируют изменение, приводящее к пониженному PAL и/или PPO зависимому метаболическому потоку.
Подробное описание изобретения
Когда салат собран и обработан срезанием, образуется много листовых поверхностей повреждения, которые приводят к существенной реакции растения или частей растения, проявляющейся в изменении окраски на темную или розовую или рядом с поверхностью повреждения. Порозовение можно также наблюдать на участках, отдаленных от поверхности повреждения, у центральной жилки листа, так же как на торце. Иногда порозовение можно также наблюдать на стадиях непосредственно перед сбором урожая, которое рассматривают как следствие абиотического стресса или перезрелости урожая.
На различные виды нарушения окраски влияет ферментативная активность, которая сильно возрастает вследствие повреждения и которая производит несколько видов полифенолов и продуктов реакции, получаемых из них.
Важной ферментативной активностью, вовлеченной в реакцию потемнения, является PPO. Активность PPO в отношении ферментативного потемнения не ограничена салатом, но была описана для многих других видов растений, подверженных послеуборочному ухудшению, как в яблоке, банане и картофеле. Фактически, PPO широко признан как один из самых важных ферментов, вовлеченных в послеуборочное ухудшение многих обрабатываемых свежих фруктов и овощей.
По этой причине PPO был целью многих технологий, которые стремятся снизить или предотвратить его активность, чтобы увеличить послеуборочное качество продовольственных продуктов. PPO катализирует реакцию, в которой полифенолы, находящиеся в ткани растения, окисляются для начала образования o-хинонов. Впоследствии ферментативные и неферментативные реакции приводят к образованию коричневых или черных пигментов.
Во многих видах растений PPO кодируется небольшим семейством генов, индивидуальные участники которого могут иметь различные временные и пространственные паттерны экспрессии, указывающие на функциональное расхождение. Например, показано, что салат содержит различные изоформы PPO в фотосинтезирующей и сосудистой ткани листа.
Естественный субстрат PPO может отличаться между различными видами. В салате производные кофейной кислоты, такие как хлорогеновая и изохлорогеновая кислота, главным образом, действуют как субстрат PPO.
Уровень фермента PPO не является специально вызываемым при повреждении тканей растения, но он находится в хлоропласте в неактивном виде. При повреждении PPO активируется, что проявляется вследствие того, что фенольный субстрат, присутствующий в вакуолях, приводится в контакт с PPO из-за разрушения ткани.
В салате образование полифенолов, являющихся субстратом PPO, вызывается при повреждении. Поэтому потенциал потемнения ткани салата кажется ограничен не количеством PPO в ткани листа, а скорее скоростью биосинтеза полифенола при повреждении.
В этом отношении ситуация может отличаться между сельскохозяйственными культурами. Например, в яблоке количество полифенолов достаточно для вызова реакции потемнения плодов в течение одного часа после повреждения, тогда как в салате реакция потемнения может занять несколько дней вследствие того, что в салате пул полифенолов в значительной степени должен быть синтезирован de novo при повреждении.
Синтез полифенолов происходит через хорошо изученный биохимический путь, названный фенилпропаноидным путем. Первая осуществляемая стадия этого пути катализируется ферментом фенилаланин аммоний-лиазой (PAL, Hahlbrock, K and Scheel, D (1989) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 40, 347-369). PAL превращает аминокислоту фенилаланин, синтезируемую через шикиматный путь, в коричную кислоту.
В салате повреждение листьев приводит к сильной индукции экспрессии гена PAL и активности PAL. Образование полифенолов коррелирует с этой ферментативной активностью, что предполагает, что активность PAL, вызываемая повреждением салата, является важным фактором, ответственным за потемнение (Campos, R. Et al. (2004) Physiologica Plantarum 121, 429-438 и ссылки в ней). Однако в настоящее время неясно, какие другие факторы определяют итоговый результат реакции нарушения окраски, вызываемой повреждением. Например, было предложено, что активность пероксидаз (POD) также является важной в установлении итогового уровня нарушения окраски при повреждении (Fukumoto, L. R. Et al. (2002) J. Agric. Food Chem. 540, 4503-4511; Martin-Diana A. et al (2005) Biosci. Biotechnol. Biochem. 69, 1677-1685).
Поскольку активность фермента зависит от доступности внутреннего пероксида водорода, вклад POD в нарушение окраски может быть ограничен.
Дополнительно очевидно, что повреждение, так или иначе, воспринимается растением, и впоследствии сигнал вызывается через каскад, который в настоящее время плохо изучен для салата. Кажется очевидным, что эти активности будут, прежде всего, нацелены на заживление раны и защиту против болезнетворных микроорганизмов. Поэтому, вероятно, что многие генетические факторы вовлечены в образование реакции нарушения окраски поврежденной ткани салата и каждый из них является потенциальной целью для генетической модификации, чтобы снизить или устранить нарушение окраски, вызываемое повреждением.
Большинство из этих генетических факторов в настоящее время неизвестно, и для тех, которые известно, что вовлечены, неясно до какой степени эти факторы играют специфическую роль в реакции нарушения окраски или возможно имеют более общую функцию в отношении физиологии повреждения растения.
Например, хотя вызываемая повреждением активность PAL рассматривается как определяющая уровень потемнения салата, продукты фенилпропаноидного пути, как известно, вовлечены, среди прочего, в биосинтез клеточной стенки или также защитную реакцию. Поэтому снижение вызываемой повреждением активности PAL для снижения потенциала потемнения может поставить под угрозу другие функции помимо вызываемого повреждением потемнения, которые могут быть менее желательными в отношении других аспектов культивирования салата.
Аналогично, подразумевали, что активность PPO вовлечена в защитную реакцию, и поэтому снижение потенциала потемнения путем снижения уровня PPO может увеличить восприимчивость к болезнетворным микроорганизмам (Thipyapong, P. et al (2004) Planta 220, 105-117). Поэтому изобретателями было обоснованно, что более беспристрастный подход может быть более успешным в этом отношении. Такой подход включает следующие стадии:
1. Создание изменчивой популяции растений, в частности мутантной популяции. Такая популяция мутанта может быть создана путем обработки семян или тканей растений мутагенными агентами, такими как сульфонат этилметана (ems) или рентгеновским излучением.
2. Проведение эффективного фенотипического скрининга, в котором отбор основан на нарушении окраски растения, вызываемом реакцией на повреждение, в частности листовых овощей, более конкретно салата, эндивии или витлуфа, опосредованных через PAL и/или PPO.
3. Описание мутантов с модифицированной реакцией на повреждение в отношении потенциала послеуборочного нарушения окраски и отсутствия плейотропных эффектов модификации, которые ставят под угрозу рост и обработку растения, в частности, листовых овощей, более конкретно, салата, эндивии или витлуфа, согласно традиционной практике.
Изобретение, таким образом, относится в одном варианте осуществления к беспристрастному способу скрининга для идентификации, отбора и получения растения, обнаруживающего пониженное нарушение окраски, вызываемое повреждением и послеуборочными нарушениями в результате обработки, такое как ферментативное потемнение или порозовение.
Изобретение в другом варианте осуществления относится к более пристрастному способу, в котором используют субстрат, превращаемый в пигмент посредством PPO. В этом испытании отбор проводится, в частности, на PPO мутанты. Подходящим субстратом является L-DOPA, который превращают в черный пигмент меланин.
Изобретение иллюстрировано в настоящем описании со ссылкой на листовые овощи, такие как салат, но также может быть осуществлено тем же образом с другими растениями, как указано выше.
Популяция мутантного растения для применения в способе по изобретению может, например, быть приготовлена следующим образом:
a) обработка M0 семян модифицируемого вида растения мутагенным средством для получения М1 семян;
b) выращивание растений из полученных, таким образом, М1 семян для получения М1 растений;
c) опционально повторение стадий b) и c) n раз для получения Мl+n семян;
d) проращивание полученных, таким образом, Ml+n семян, выращивая растения от тех семян.
Согласно изобретению эти растения впоследствии оценивают на их реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением. Отбирают растения, которые не обнаруживают или обнаруживают пониженную реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением. Затем, потомство отобранных растений выращивают и оценивают реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением.
Для создания генетической изменчивости может быть полезным мутагенез. Специалисту в области техники известны несколько химических веществ или физических обработок, которые могут быть применены, чтобы индуцировать генетические мутации в видах растения, таких как салат.
Например, можно обработать семена салата в растворе, содержащем различные концентрации мутагена, такого как ems. Ems алкилирует прежде всего G-остатки нити ДНК, которые во время репликации ДНК приводят к спариванию с T вместо C. Поэтому пары оснований GC переходят в пары оснований AT с частотой, которая определяется эффективной дозой ems и активностью системы репарации ошибочно спаренных оснований растения.
Эффективная доза ems зависит от применяемой концентрации, размера семени и других физических свойств и времени инкубации семян в растворе ems. Семена, обработанные ems, типично называют М1 семенами. Вследствие обработки ткани М1 семян содержат случайные точечные мутации в геномах своих клеток, и тех, которые находятся в подпопуляции клеток, которые образуют зародышевую ткань (зародышевые клетки), которые будет переданы следующему поколению, которое называют M2. Мутации или их комбинации, которые являются гаплонедостаточными, приводя к бесплодию, или те, которые вызывают смертность эмбрионов, не будут переданы поколению M2.
Подобную процедуру, как описано выше, для применения ems применяют также для других мутагенных агентов. Подходящие мутагенные агенты хорошо известны в области техники. Особенно полезными являются алкилирующие мутагенные агенты, такие как диэтиловый сульфат (des), этиленимин (ei), пропансультон, N-метил-N-нитрозоуретан (mnu), N-нитрозо-N-метилмочевина (NMU), N-этил-N-нитрозомочевина (enu), азид натрия.
В качестве альтернативы мутации вводят посредством облучения, которое, например, отбирают из рентгеновского излучения, быстрых нейтронов, УФ-излучения.
В другом варианте осуществления изобретения мутации вводят посредством генной инженерии, так как, например, посредством использования химерных олигонуклеотидов, гомологичных рекомбинаций, направленного воздействия на гены, введения модифицированных генов-мишеней, которые конкурируют с эндогенным продуктом, инактивации посредством РНК-интерференции и т.д.
M2 популяция мутагенной обработки может быть применена в процедурах скрининга, нацеленных на реакцию на повреждение, которая опосредована через PAL и PPO. Специалисту в области техники будет очевидно, что любая популяция растений, которая несет генетическую изменчивость, может быть взята в качестве исходного материала для такого фенотипического скрининга.
Предпочтительно, изобретение дополнительно относится к pyramiding аллелям, обуславливающим пониженную реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением.
Получение М1 и M1+n семян подходящим образом проводят посредством самоопыления.
Изобретение дополнительно относится к получению растений или частей растений с измененными генотипами, растениям или частям растений, которые обнаруживают пониженную восприимчивость к физиологическим послеуборочным нарушениям в результате обработки, таким как ферментативное потемнение или порозовение. Изобретение относится к растениям или частям растений, которые имеют в своем геноме генетическую информацию, ответственную за пониженную восприимчивость к послеуборочным нарушениям в результате обработки, таким как ферментативное потемнение или порозовение, и обнаружена в геноме растения салата.
Потомство растений как заявлено также является частью этого изобретения. "Потомство" как применено в настоящем описании предназначено для того, чтобы охватить все растения, обладающие такой же или подобной пониженной восприимчивостью к послеуборочным нарушениям в результате обработки, в частности ферментативному потемнению или порозовению, как исходные растения, описанные в настоящем описании и получаемые из них любым способом, таким как половое размножение, как самоопыление или перекрестное опыление с другим растением того же рода, или вегетативное размножение, такое как черенкование, тканевая культура, гаплоидная культура, культура протопластов, слияние протопластов или другими методами. Такое потомство является не только первым поколением растений, полученных одним или более из этих методов, но также и каждым последующим поколением растений, полученных одним или более из этих методов при условии, что получаемые растения обладают пониженной восприимчивостью.
Для выполнения фенотипического скрининга по изобретению должна образовываться поврежденная поверхность по мере протекания ферментативной реакции нарушения окраски, вызываемой при повреждении. Повреждение является необратимым нарушением натурального растения, ткани и/или клеточной структуры такими способами, как срезание, вырезание, разрезание, истирание, сплющивание, перелом, очищение, раздавливание, прессование, размазывание, измельчение, введение жидкости, осмотический шок, отделение, кошение, дробление, стирание и разрывание.
Впоследствии фенотипический признак должен стать проявлением, которое является диагностическим для пути, приводящего к нарушению окраски ткани, и которое может быть очень эффективно применено при скрининге мутантной популяции.
К удивлению, было обнаружено, что такие фенотипические признаки могут быть получены путем взятия частей листьев растений салата и инкубации их при очень специфических условиях, которые способствуют появлению различных видов нарушения окраски поврежденной поверхности. Впоследствии такие испытания могут быть применены к большим количествам мутантных растений для того, чтобы отобрать те растения, которые обнаруживают пониженную реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением.
Один вариант осуществления этого изобретения основан на удивительном обнаружении, что, когда диски из листьев, в частности листьях салата, взяты и инкубированы между смоченными фильтровальными бумагами при 5ºC, приблизительно через 4 дня становится видимым образование розового окрашивающего вещества по краям листовых дисков. Подходящая фильтровальная бумага является фильтровальной бумагой типа 1450 CV, Ref.no. 10 313 281 от Schleier & Schuell, Microscience GmbH, Dassel, Германия. При дальнейшей инкубации сигнал усиливается и приблизительно через одну неделю была достигнута максимальная интенсивность. Образование розового окрашивающего вещества проявляется особенно на поврежденных поверхностях.
sativa
sativa
Нарушение окраски может быть измерено путем оценки по визуальной шкале от 0, что означает отсутствие потемнения или порозовения, до 10, что означает потемнение и порозовение как у стандартного сорта салата (L. ). В настоящем примере L.  сорт “Troubadour” применен в качестве стандарт для 10. По желанию могут быть использованы фотографии для сравнения, чтобы ценить промежуточные классы между 0 и 10. В дополнение могут быть сделаны цифровые фотографии фильтровальной бумаги с розовым окрашивающим веществом, с последующим подсчетом количества пикселей с интенсивным розовым цветом на одно положение листового диска. С применением одного из этих измерений могут быть выполнены простые статистические анализы, такие как t-критерий, известный специалисту в области техники, для определения, является ли растение или группа растений значительно менее розовеющими, чем стандарт, как cv. “Troubadour”. Используемый уровень значимости одностороннего критерия равен 0,001.
Для мутантов статистическое сравнение может быть проведено между оценками порозовения исходного сорта, который является самым лучшим доступным стандартом, и оценками порозовения индивидуальных мутантов и/или их потомства.
Для обнаружения признака по изобретению в существующих растениях могут быть применены репрезентативные образцы сортов, линий разведения и/или зарегистрированных образцов банка генов. Статистическое сравнение может затем быть проведено между оценками порозовения индивидуального исследуемого зарегистрированного образца и остальной частью популяции. При статистическом анализе особей на значительно меньшее порозовение могут быть необходимы критерии множественного сравнения для сохранения корректного общего уровня значимости, например, критерий множественного сравнения Даннета с одним стандартом (Dunnett CW, J. Amer. Statict. Assoc. 50: 1096-1121 (1955)).
Дополнительно было показано, что реакция нарушения окраски, вызываемая повреждением, может быть получена с использованием многих различных видов листовой ткани различных стадий развития. Например, в ткани центральной жилки также можно вызвать эту реакцию в результате повреждения. При применении к различным видам салата, таким как кочанный, айсберг, кос, батавия или дуболистный, не были обнаружены индивидуальные зарегистрированные образцы, которые бы показали значительно меньшее порозовение, чем остальная часть исследованной популяции.
Было дополнительно продемонстрировано согласно изобретению, что специфический ингибитор PPO, L-цистеин, при применении во время реакции, сильно подавлял образование розового окрашивающего вещества. В дополнение было обнаружено, что образование розового окрашивающего вещества было ингибировано коричным альдегидом, который является ингибитором активности PAL и потемнения свежесрезанного салата (Fujita, N. Et al. (2006) Biosci. Biotechnol. Biochem. 70, 672-676). Эти результаты показывают, что реакция нарушения окраски салата в виде порозовения является PAL и PPO зависимой.
Ферментативное потемнение свежесрезанного салата, как известно, очень эффективно предотвращается применением краткосрочного теплового шока. Наблюдаемый эффект может быть объяснен предположением перенаправления биосинтеза белка с фенилпропаноидного пути на белки теплового шока, снижающего, таким образом, метаболический поток в сторону образования полифенолов.
В качестве альтернативы эффект может быть объяснен предположением того, что ферменты, вовлеченные в окисление полифенолов, такие как PPO и POD, инактивируются посредством теплового шока. При применении теплового шока к салату, который впоследствии оценивали на реакцию порозовения, было показано, что эта реакция, такая как ферментативное потемнение, была эффективно ингибирована. Это демонстрирует, что реакция порозовения салата, являющаяся частью этого изобретения, физиологически очень схожа с известной ферментативной реакцией потемнения.
Это обнаружение было дополнительно доказано применением L-цистеина в качестве восстановителя. Помимо того, что L-цистеин является ингибитором PPO, также известно, что он реагирует с окрашенными o-хинонами и превращает их обратно в бесцветные дифенолы в химической реакции восстановления. Когда розовое окрашивающее вещество, образованное листовыми дисками салата, обрабатывали L-цистеином, было продемонстрировано, что розовое соединение было превращено в бесцветное соединение. Поэтому кажется вероятным, что розовое окрашивающее вещество является o-хиноном, образованным посредством PPO.
Это было подтверждено обнаружением, что восстановители, такие как аскорбиновая кислота или глютатион, также превращают розовое окрашивающее вещество в бесцветное соединение.
В дополнение обработка L-цистеином растений, взятых в поле, обнаруживающих порозовение, также устраняет нарушение окраски в виде порозовения. Это демонстрирует, что реакция порозовения листового диска представляет происходящее в природе явление порозовения, которое иногда можно видеть на растениях, растущих в полевых условиях.
Дополнительный вариант осуществления этого изобретения основан на следующем эксперименте. Части листа головки салата получают путем отрезания и инкубируют при 16°C в воздушной атмосфере. В качестве реакции поврежденная поверхность становится темной через приблизительно 4 дня. Потемнение можно отчетливо наблюдать в особенности на поврежденной поверхности центральной жилки. Более того, реакцию потемнения можно также наблюдать на уровне всего растения в результате повреждения листьев посредством срезания или истирания.
Все эти реакции потемнения могут быть полностью ингибированы L-цистеином, ингибитором PPO, который демонстрирует, что эти фенотипы проявляются через активность PPO и поэтому могут считаться диагностическими для послеуборочного потемнения, наблюдаемого во время обработки и упаковки салата.
Эти реакции потемнения, вызываемые повреждением, могут быть вызваны эффективным образом, что может быть применено в способе фенотипического скрининга для идентифицикации мутантного растения с пониженным потенциалом потемнения, вызываемого повреждением.
Дополнительный вариант осуществления этого изобретения основан на нарушении окраски поврежденных поверхностей тканей салата, вызванном применением субстратов, которые могут быть превращены фенолокисляющими ферментами в окрашенные соединения.
Например, при инкубации листовых дисков салата с субстратом PPO L-3,4-дигидроксифенилаланин (L-DOPA) наблюдают нарушение окраски поврежденной поверхности в виде сильного потемнения до почернения, которое является проявлением образования меланина посредством PPO. При одновременном применении L-цистеина нарушение окраски в виде почернения было полностью ингибировано, что подтверждает предположение о том, что это нарушение окраски является PPO опосредованным.
Хотя L-DOPA не считают естественным субстратом для PPO салата, он может быть полезен в испытаниях, нацеленных на идентификацию мутантов, которые обнаруживают пониженное нарушение окраски, вызываемое повреждением.
Подобным образом, как описано для L-DOPA, могут быть применены другие субстраты для повышения реакции нарушения окраски. Таковые включают, но не ограничены ими, хлорогеновую кислоту, изохлорогеновую кислоту, L-тирозин и катехол.
В совокупности образование различных окрашивающих веществ на поврежденных поверхностях, созданных в растениях, прослеживает изменения пути, начинающегося с индукции сигнала повреждения, опосредованного через PAL и PPO и приводящего к нарушению окраски. Как описано, эти реакции нарушения окраски, вызываемые повреждением, могут с легкостью быть оценены посредством визуального осмотра, который делает возможным очень эффективный способ скрининга мутантов. Объяснение, лежащее в основе способа, описанного этим изобретением, иллюстрировано на Фигуре 1.
in vitro
Согласно этому изобретению, таким образом, было обнаружено, что путь нарушения окраски листовых дисков, вызываемого повреждением,  в значительной степени совпадает с нарушением окраски салата, вызываемым повреждением, в промышленном масштабе и поэтому может считаться диагностическим для этого процесса. Это подтверждено представлением о том, что ингибиторы PAL или PPO ингибируют ферментативное потемнение обрабатываемого и упаковываемого салата в осуществимых промышленных условиях. Важно, поскольку способ включает стадию индукции, т.е. повреждения, и одно из итоговых метаболических превращений посредством PPO, способ позволяет захватить все генетические факторы, прямо или косвенно вовлеченные в этот физиологический процесс. Более того, поскольку эта реакция может быть вызвана с использованием целого диапазона листовых тканей или листьев различных стадий развития, скрининг мутантов может быть нацелен на эти различные стадии или ткани, когда считается уместным.
Мутантные растения, идентифицированные как изменяемые в отношении физиологического процесса, ведущего от повреждения к PAL- и PPO-зависимому нарушению окраски, на основе одного или более фенотипических испытаний, описанных выше, могут быть дополнительно описаны. Такое описание может быть сделано на различных уровнях, например, на молекулярном, биохимическом, физиологическом и фенотипическом уровне.
Специалистам в области техники очевидно, что можно наблюдать переменные уровни нарушения окраски, которые могут отражать присутствие как различных мутантных локусов, так и различных аллельных вариантов идентичных локусов, действуя на признак нарушения окраски в исходной популяции.
В случае рецессивных мутаций две эти возможности можно легко различить путем проведения тестов на аллелизм, которые включают скрещивание двух мутантных растений и определение фенотипа гибрида. В случае аллелизма мутаций признак пониженного нарушения окраски будет очевиден в Fl, в то время как в случае, если фенотип в мутантах определен различными рецессивными локусами, это не так.
Поскольку для получения начальной популяции применяли случайный мутагенез, мутации в генетическом фоне могут также способствовать изменению фенотипа при экспериментальных условиях. Для различения между одиночными мутациями различной силы и комбинированным эффектом мутаций в генетическом фоне должны быть выполнены обратные скрещивания, чтобы создать однородные генетические фоны для различных случаев пониженного нарушения окраски.
Такая процедура дополнительно имеет значение для определения, проявляют ли мутации в специфических локусах, вовлеченные в нарушение окраски, вызываемое повреждением, плейотропные эффекты.
M2 растения, отобранные таким образом на основе пониженной реакции нарушения окраски, применены для выращивания M3 семян. Впоследствии, инбредные линии, происходящие от случаев пониженного нарушения окраски, заново оценивают на их пониженную реакцию нарушения окраски. В дополнение пониженное потемнение или порозовение могут быть оценены в различных генетических фонах и при различных условиях культивирования и обработки сельскохозяйственной культуры.
Биохимические исследования могут быть выполнены для решения вопросов, связанных с путями, нарушаемыми генетической модификацией. Молекулярные исследования могут быть выполнены для определения, модифицированы ли кандидатные гены, предположительно вовлеченные в реакцию ферментативного потемнения или порозовения, такие как гены, кодирующие PAL, PPO или пероксидазы. Впоследствии будет выполнен генетический анализ, чтобы продемонстрировать, является ли модификация, найденная в кандидатном гене, причинной в отношении измененного фенотипа.
Хотя индуцированный мутагенез является предпочтительным способом для применения в этом изобретении, специалисту в области техники известно, что существует технология, позволяющая особым образом модифицировать гены-мишени, находящиеся в геноме растения. Например, было продемонстрировано, химерные олигонуклеотиды являются эффективными мутагенами со специфическим способом действия.
Другой подход состоит в модификации генов-мишеней посредством гомологичной рекомбинации или направленного воздействия на гены. С применением такого подхода фрагмент гена заменяется фрагментом введенной ДНК, содержащим желательную модификацию. Также возможны трансгенные подходы, в которых вводят модифицированные гены-мишени, конкурирующие с эндогенным продуктом. Это может привести к доминирующим отрицательным эффектам. Более того, специфическая инактивация экспрессии генов возможна посредством РНК-интерференции.
В случае применения мутагенных олигонуклеотидов направленного воздействия на гены или трансгенных подходов для модификации генетического фактора, вовлеченного в реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением, очевидно, должна быть известна первичная структура соответствующих генов.
Дополнительная часть этого изобретения относится к мутантам салата и получаемому из них потомству, которые были идентифицированы на основе нарушения окраски листовых дисков салата, вызываемого повреждением, в виде порозовения. Применение этого испытания на порозовение к растениям популяции M2, которые содержат случайные ems-индуцированные мутации, привело к идентификации ряда мутантов, которые обнаруживали существенное снижение реакции порозовения по сравнению с контрольными растениями, которые не имели ems-индуцированных мутаций.
Большинство таких мутантов обнаружили dwarfed и часто хлоротичный фенотип. Однако, к удивлению, было обнаружено, что некоторые мутанты с пониженной реакцией обнаруживали нормальный характер роста, т.е. размер, форма, рост и цвет очень схожи с контрольными растениями.
Полученные растения потомства этого специфического мутанта, выращенные из семян, полученных посредством самоопыления, оценивали на порозовение, наблюдали снижение, подобное обнаруженному у исходных идентифицированных мутантов. Это демонстрирует, что пониженная реакция нарушения окраски в виде порозовения может быть наследственной и обусловленной модификацией генома.
Дополнительное удивительное обнаружение было фактом, что у растений потомства, выращенных до созревания и проанализированных на ферментативное потемнение поврежденной ткани центральной жилки, эта реакция была также сильно ингибирована.
Это показывает, что испытание на порозовение листовых дисков, которое является частью этого изобретения, причинно связано с ферментативным потемнением в салате и что испытание на порозовение может быть применено для прогнозирования уровня ферментативного потемнения зрелого растения салата.
Поэтому испытание на порозовения листовых дисков может быть применено в качестве инструмента отбора для идентификации растений салата с пониженным ферментативным потенциалом потемнения. Такой инструмент может быть применен для идентификации растений салата с пониженным ферментативным потенциалом потемнения из любого вида популяции растений независимо от причины генетической изменчивости, присутствующей в такой популяции. Например, в дополнение к ems популяциям можно применять естественные зарегистрированные образцы или размножающиеся популяции.
Asteraceae
Lactuca
Cichorium
Cichorium
endivia
Cichorium
intybus
Один или более способов скрининга, предоставленных этим изобретением, могут быть применены к любым видам листовых овощей, для которых послеуборочное качество обработки нуждается в усовершенствовании. Поэтому в дополнение к культурному салату это изобретение также может быть применено к другим видам растений, принадлежащим к , таким как дикие виды рода . Более того, изобретение может быть применено, в частности, к видам растений, принадлежащим к роду , к которому принадлежат виды, такие как эндивий (), цикорий и витлуф цикорий ().
Настоящее изобретение относится к фенотипическому признаку, который может быть обнаружен в растении путем выполнения одного из способов скрининга, которые раскрыты в настоящем описании. Растения по изобретению являются растениями, которые, по сравнению с контрольным растением, обнаруживают отсутствие или снижение нарушения окраски поверхности, вызываемого повреждением. Присутствие признака определяют посредством одного или более из трех тестов на нарушение окраски, а именно появление порозовения или потемнения или способности превращать субстрат L-DOPA в меланин. Растение по изобретению является растением, которое, по меньшей мере, в одном из этих тестов обнаруживает нарушение окраски, которое является, по меньшей мере, пониженным по сравнению с контролем.
"Контроль" как применено здесь является любым растением, о котором известно, что оно обнаруживает одну или более реакций нарушения окраски порозовение, потемнение и превращение L-DOPA в меланин, которые могут быть ингибированы L-цистеином или коричным альдегидом. Соответственно применяют растение, листовой диск которого при инкубации между смоченными фильтровальными бумагами при 5ºC в течение 7 дней обнаруживает нарушение окраски в виде порозовения по краям диска.
Настоящее изобретение будет дополнительно иллюстрировано в Примерах, которые следуют далее и никоим образом не предназначены для ограничения изобретения. Примеры относятся к салату, но вместо салата могут быть применены другие продуктовые растения или их части, в частности свежие фрукты и овощи. В Примерах приведена ссылка на следующие фигуры.
Фигура 1: Схематический план объяснения behind the design способа скрининга мутантов популяций салата на пониженное послеуборочное ферментативное нарушение окраски. Сигналом на входе отбора является повреждение листовой ткани, которое ощущается растением и которое вызывает дивергентную сигнальную реакцию, приводящую к ряду физиологических процессов, включающих старение, дыхание и нарушение окраски ткани. Этот сигнал на входе может быть объединен с применением фенольных соединений в качестве субстратов PPO.
Сигнал на выходе отбора является нарушением окраски в виде потемнения или порозовения в зависимости от применяемых условий, диагностической поврежденной поверхности на послеуборочное потемнение и порозовение. Это заключено из факта, что сигнал на выходе полностью ингибирован коричным альдегидом и L-цистеином, которые являются специфическими ингибиторами PAL и PPO соответственно.
Фигура 2: Представительное изображение итогового фенотипа отбора, основанного на нарушении окраски листовых дисков в виде порозовения. Листовые диски растений салата (1 диск на растение) располагали между смоченными фильтровальными бумагами и инкубировали при 5ºC в течение 7 дней. Нарушение окраски в виде порозовения можно отчетливо наблюдать вокруг каждого листового диска на поврежденной поверхности.
Фигура 3: Испытание на порозовение листового диска (4 диска на чашку) выполняли в присутствии различных концентраций коричного альдегида, ингибитора PAL. Число над каждой чашкой показывает % примененного коричного альдегида.
Фигура 4: Ингибирующее влияние L-цистеина, ингибитора PPO, на нарушение окраски в виде порозовения листовых дисков салата (4 диска на чашку), инкубированных между смоченными фильтровальными бумагами. Число над каждой чашкой показывает % примененного L-цистеина.
Фигура 5: Ингибирующее влияние L-цистеина, ингибитора PPO, на нарушение окраски в виде почернения листовых дисков салата (4 диска на чашку), инкубированных между смоченными фильтровальными бумагами в присутствии 1,5 мМ L-DOPA. Число над каждой чашкой показывает концентрацию мМ примененного L-цистеина.
Фигура 6: Влияние предварительной обработки тепловым шоком на порозовение листовых дисков салата. Тепловой шок применяли в течение 90 секунд на неповрежденных листьях при температуре, указанной на каждой чашке.
Фигура 7: Превращение розового окрашивающего вещества, образованного реакцией салата на повреждение, в бесцветное соединение посредством L-цистеина. Верхний ряд чашек показывает испытание с L-DOPA, в то время как нижний ряд чашек показывает испытание на порозовение. Нижний их двух дисков в каждой чашке был обработан L-цистеином после завершения реакции на повреждение. Концентрация примененного L-цистеина составляла 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 и 10 мМ, как указано выше.
Фигура 8: Снижение порозовения в зарегистрированном выращенном салате посредством L-цистеина. Верхняя группа показывает типичные симптомы порозовения листа салата, взятого от растения, которое было подвергнуто очень сильному стрессу путем погружения в воду. Центральные жилки обнаруживают присутствие розового окрашивающего вещества. Правая нижняя группа показывает диск, взятый из листа, обнаруживающего признаки порозовения после обработки с 1 мМ L-цистеина в течение 30 минут при комнатной температуре. Левая нижняя группа показывает подобный листовой диск после обработки водой в течение 30 минут при комнатной температуре.
Фигура 9: Группа A: Фенотипический анализ особей M2 растений салата (сгруппированных в пулы) на нарушение окраски листового диска согласно способу, описанному этим изобретением. В общей сложности 138 образцов из 12000 показаны в этой группе, один из которых, указанный стрелкой, обнаружил сильно пониженное нарушение окраски в виде порозовения. Группа B: Повторная оценка отобранной особи, указанной в группе А, подтвердила практически отсутствие образования нарушения окраски в виде порозовения (образец в среднем положении) по сравнению с контрольными образцами, которые обнаруживают отчетливую реакция нарушения окраски.
Фигура 10: Фенотипы M2 растений салата. Растения, маркированные 1, 2, 4, 5, 7, 10 и 12, обнаруживают пониженное нарушение окраски листового диска в виде порозовения с применением испытания по этому изобретению. Растения 3, 6, 8, 9 и 11 являются растениями, которые показали уровень нарушения окраски листового диска в виде порозовения, сопоставимый с диким видом контроля. Растение 1 является единственным примером мутанта, который обнаруживает сильное понижение нарушения окраски в виде порозовения и нормальный характер роста. Растения 2, 4, 5, 7, 10 и 12 обнаруживают пониженное нарушение окраски в виде порозовения и dwarfed, bleached фенотип.
Фигура 11: Тестирование потомства мутантного салата, обнаруживающего пониженное нарушение окраски. Слева показаны 25 образцов контроля, которые обнаруживают нормальную реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением. Справа показана группа образцов, которая взята из группы из 35 растений потомства, полученных от одного мутанта, которая имеет сильно пониженную реакцию нарушения окраски, вызываемую повреждением.
Фигура 12: Представительное изображение итогового фенотипа отбора, основанного на нарушении окраски частей центральной жилки листа в виде потемнения, взятых от взрослых растений салата. На фотографии показаны диски ткани центральной жилки внешних листьев салата после инкубации в течение 3 дней при 16°C. Можно отчетливо наблюдать типичное нарушение окраски в виде потемнения на поврежденной поверхности. Каждая чашка содержит 3 диска, взятых из различных частей центральной жилки (зеленый, светло-зеленый и белый). Число над чашкой указывает на концентрацию мМ L-цистеина, добавленного к фильтру.
Фигура 13: Превращение L-DOPA на поверхности листа салата в меланин. Группа А показывает испытание в 1,5 мМ растворе L-DOPA. Верхний тюбик является отрицательным контролем, другие 3 тюбика идентичны. Группа B показывает результат инкубации листовых дисков между смоченными фильтровальными бумагами, содержащими 1,5 мМ L-ДОПУ.
Фигура 14: Тестирование потомства мутанта салата, обнаруживающего пониженное нарушение окраски в виде порозовения, вызываемое повреждением, на потемнение центральной жилки. Группа А показывает диски центральной жилки 8 растений потомства мутанта с пониженным порозовением, пронумерованные от 1 до 8 (3 диска на растение). Группа B показывает диски центральной жилки 8 контрольных растений, обнаруживающих нормальную реакцию потемнения, пронумерованные от 9 до 16 (3 диска на растение).
Фигура 15: Оценка мутанта салата, обнаруживающего пониженное нарушение окраски в виде порозовения или реакцию потемнения, вызываемые повреждением, после срезания и упаковки в атмосфере окружающей среды. Части листа головки контрольного растения показаны слева, а части листа мутанта с пониженным нарушением окраски показаны справа. Свежесрезанный листовой материал хранили в течение 6 дней при 4°C. В контрольных образцах можно отчетливо наблюдать нарушение окраски в виде потемнения, в то время как мутантные образцы остаются неизменными.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Генетическая модификация салата с использованием ems
Приблизительно 2000 семян сортов салата Troubadour, Apache, Yorvik и Roderick инкубировали в аэрированном растворе или 0,05% (масс./об) или 0,07% (масс./об) ems в течение 24 часов при комнатной температуре. После ems обработки М1 семена промывали водой и сажали в оранжерее при 20°C при режиме 16 часов света, 8 часов темноты, чтобы вырастить взрослые растения и вызвать стрелкование и цветение для получения M2 семян. После созревания M2 семена собирали, складывали и сохраняли до последующего применения. Частоту мутации оценивали на основе относительного числа особей растений с bleached фенотипом, у которых нарушен биосинтез хлорофилла.
ПРИМЕР 2
Разработка диагностики фенотипического отбора на нарушение окраски салата, вызываемое повреждением, на основе образования розового пигмента
Было разработано фенотипическое испытание, в котором легко может быть оценено нарушение окраски листа салата, вызываемое повреждением. Этот подход позволяет скринировать молодые растения на нарушение окраски. Листовые диски диаметром 5 мм были взяты из молодых или взрослых растений и помещены между смоченными фильтровальными бумагами на подносе. Систему инкубировали при 5°C в течение 7 дней. Во время инкубации на поврежденной стороне листового диска образовывалось розовое окрашивающее вещество, которое стало отчетливо заметным в виде отпечатанного круга на фильтровальной бумаге (Фигура 2).
Чтобы продемонстрировать, что образование розового окрашивающего вещества требует действующего фенилпропаноидного пути, в этом испытании было протестировано влияние ингибиторов PAL (коричный альдегид, Фигура 3) и PPO (L-цистеин, Фигура 4). При применении коричного альдегида во время испытания нарушение окраски в виде порозовения было полностью ингибировано при концентрации 0,01% или выше.
Схожий результат был получен с использованием L-цистеина в концентрации 0,001% и выше, в то время как другие аминокислоты, такие как L-лейцин или L-аланин, не оказывали какого-либо влияния. Это демонстрирует, что L-цистеин может ингибировать реакцию порозовения листовых дисков салата и что ингибирующее действие L-цистеина является специфическим.
Чтобы продемонстрировать, что L-цистеин в действительности действует как ингибитор активности PPO в этой системе, листовые диски салата инкубировали с субстратом PPO L-3,4-дигидроксифенилаланином (L-DOPA). Хотя L-DOPA не считается естественным субстратом для PPO салата, на поврежденной поверхности наблюдали нарушение окраски от темно-коричневой до черной, которое является проявлением образования меланина посредством PPO. При одновременном применении 1 мМ или более высокой концентрации L-цистеина нарушение окраски было полностью ингибировано, как показано на Фигуре 5.
Реакция порозовения листового диска салата была дополнительно охарактеризована путем применения теплового шока перед вызовом реакции на повреждение. Отдельные листья инкубировали в течение 90 секунд при 21, 40, 50 и 60°C. После этой обработки листовые диски брали и оценивали на порозовение. Реакция порозовения была полностью ингибирована при проведении теплового шока при температуре 50°C или выше. Этот результат показан на Фигуре 6.
Поскольку известно, что L-цистеин реагирует с o-хинонами, которые являются продуктами PPO, путем превращения их обратно в бесцветные дифенолы, определяли влияние L-цистеина на образующееся в листовых дисках салата розовое окрашивающее вещество. Параллельно определяли влияние L-цистеина на образование меланина при инкубация с L-DOPA.
Листовые диски брали и инкубировали согласно описанным выше способам. После завершения реакции на повреждение к листовому диску добавляли ряд концентраций L-цистеина и наблюдали за изменением цвета. Результат показан на Фигуре 7. Эксперимент отчетливо продемонстрировал, что L-цистеин превращал розовое окрашивающее вещество обратно в бесцветное соединение, тогда как на черный меланин, образованный в испытании L-DOPA, L-цистеин не повлиял. Это демонстрирует, что розовое окрашивающее вещество, вероятно, является o-хиноном, который образует система окисления полифенолов в салате.
Чтобы продемонстрировать, что наблюдаемая in vitro реакция отражает физиологически соответствующую реакцию, к выращенному в поле материалу применили нарушение окраски на основе L-цистеина. Это было выполнено путем снятия листа с выращенного в поле растения салата, обнаруживающего серьезные признаки порозовения вдоль прожилок. Эти растения были подвергнуты стрессу, например, посредством условий сильного погружения в воду. Лист был применен для приготовления листовых дисков, которые сразу же инкубировали с 1 мМ L-цистеина. Через приблизительно 30 минут инкубации при комнатной температуре нарушение окраски в виде порозовения исчезло, как показано на Фиг. 8.
В совокупности эти экспериментальные данные показывают, что путем повреждения в листовых дисках салата можно вызвать образование нарушения окраски в виде порозовения, которое является PAL и PPO зависимым. Этот фенотип делает возможным производительный и эффективный способ скрининга мутантов салата, с нарушением окраски, вызываемым модифицированной реакцией на повреждение, опосредованной через PAL, PPO или оба.
ПРИМЕР 3
Скрининг мутантов с пониженным нарушением окраски, вызываемым повреждением
Чтобы идентифицировать мутанты салата с низким ферментативным потемнением или потенциалом порозовения, вызываемым повреждением, к растениям мутантной популяции салата было применено испытание листовых дисков, описанное в Примере 2.
12000 растений были выращены в оранжерее (Расположение: De Lier, Нидерланды; посев 28 марта; сбор 18 апреля; выращивание в обычных условиях производителя салата), и из каждой особи растения брали листовой диск (сбор образцов с 15 мая и позже) и инкубировали пулы (в среднем) из 25 образцов между смоченными фильтровальными бумагами при 5ºC в течение 7 дней. Каждому диску была дана визуальная оценка в зависимости от интенсивности нарушения окраски в виде порозовения. На основе этой оценки были отобраны растения, листовые диски которых обнаруживали отсутствие или относительно низкую степень нарушения окраски поврежденной поверхности. Растению с едва видимыми следами нарушения окраски был присвоен номер 06D.210202.
Из этих 12000 растений было, наконец, отобрано 1 растение, которое обнаруживало только следы нарушения окраски, которые были едва заметны и 11, которые обнаруживали относительно низкий уровень повреждения. Результат одного из этих испытаний показан на Фигуре 9.
Испытание нарушения окраски повторяли для первоначально отобранных 12 особей и для большинства особей, первоначальный результат был подтвержден. Только подтвержденных особей отбирали для дальнейшего анализа и получения семян.
ПРИМЕР 4
Скрининг мутантов с пониженным нарушением окраски, вызываемым повреждением
Чтобы идентифицировать мутанты салата с низким ферментативным потенциалом потемнения, вызываемым повреждением, к растениям мутантной популяции салата применяли испытание листовых дисков, описанное в Примере 2. 8500 растений были выращены в оранжерее до 3 недельного возраста (6-8 листовая стадия), и из каждой особи брали листовой диск и инкубировали между смоченными фильтровальными бумагами при 5ºC в течение 7 дней.
Каждому диску была дана визуальная оценка в зависимости от интенсивности нарушения окраски в виде порозовения. На основе этой оценки были отобраны растения, листовые диски которых обнаруживали отсутствие или относительно низкую степень нарушения окраски поврежденной поверхности. Из этих 8500 растений были отобраны 8 растений, который не обнаруживали какого-либо видимого нарушения окраски и 10 обнаруживали относительно низкое нарушение окраски. Испытание нарушения окраски повторяли для 18 особей, которые были первоначально отобраны, и для большинства особей был подтвержден первоначальный результат. Двенадцать особей показаны на фигуре 10. Только подтвержденных особей отбирали для дальнейшего анализа и получения семян. Одному мутантному растению без плейотропных побочных эффектов (например, bleaching, dwarfing) присвоили номер 05D.202539. Семени, полученному путем самоопыления этого растения, был присвоен номер 05D.810596. Семени, полученному путем самоопыления трех растений, выращенных из семян 05D.810596, был присвоен номер 07G.9979 и их депонировали в NCIMB. NCIMB-номер 41441 (депонировано 10 октября 2006).
ПРИМЕР 5
Фенотипический анализ отобранных мутантов, обнаруживающих пониженное нарушение окраски, вызываемое повреждением
Из этих 12 мутантов, отобранных в результате отбора, представленного в Примере 3, 6 обнаружили фенотип сильно сниженного роста и bleaching. Другие мутанты развивались нормально, т.е. согласно виду исходной популяции эксперимента мутагенеза.
В Dwarfed и bleached мутантах, вероятно, нарушена функция хлоропластов. Поскольку PPO находится в этих клеточных органоидах, это может объяснять относительно низкую реакцию в испытании листовых дисков. Поскольку такие плейотропные мутации нежелательны, эти мутанты считали менее подходящими.
Мутантное растение 06D.210202, которое обнаружило наибольшее снижение нарушения окраски листового диска, обнаружило нормальный фенотип, и поэтому мутацию считали специфической для нарушения окраски без сильных плейотропных эффектов.
ПРИМЕР 6
Подтверждение фенотипа близкого к отсутствию нарушения окраски в потомстве
Чтобы продемонстрировать, что пониженное нарушение окраски мутантов салата, таких как растение 06D.210202 из Примеров 3 и 5, вызвано генетическим эффектом, вызванным мутагенной обработкой, описанной в настоящем описании, семена получали путем самоопыления. Семени, полученному путем самоопыления растения 06D.210202, был присвоен номер 06D.819784. Семена проращивали в почве, и растения тестировали на нарушение окраски с применением испытания на порозовение листовых дисков.
Этот эксперимент ясно показал, что измененный фенотип имел генетическое основание, поскольку все растения потомства обнаружили сходный фенотип, т.е. сильное снижение нарушения окраски в виде порозовения, как и мутант, который был применен для получения семян. Этот результат иллюстрирован на Фигуре 11.
Семени, полученном путем самоопыления трех растений, выращенным из семян 06D.819784, был присвоен номер 06D.863B2 и они были депонированы в NCIMB. NCIMB-номер 41454 (депонировано 3 января 2007).
ПРИМЕР 7
Разработка диагностики фенотипического скрининга на нарушение окраски салата, вызываемое повреждением, на основе образования коричневого пигмента
Растения салата выращивали до зрелости, и части внешних листьев были взяты путем вырезания дисков из ткани, пронизанной жилками. Диски инкубировали на смоченной фильтровальной бумаге при 16ºC. Через приблизительно 72 часа поврежденная поверхность стала темной. В присутствии 10 мМ L-цистеина реакция потемнения была ингибирована, указывая на то, что наблюдаемое нарушение окраски является PPO-опосредованным. Представительный результат подобного эксперимента показан на Фигуре 12.
Поскольку реакция, как показано на Фигуре 12, является PPO-опосредованной реакцией потемнения, способ скрининга, как описано в этом примере, может быть рассмотрен как эффективный и беспристрастный для отбора мутантов, обнаруживающих пониженное нарушение окраски в виде потемнения, которое появляется во время обработки салата.
ПРИМЕР 8
Разработка диагностики фенотипического скрининга на нарушение окраски салата, вызываемое повреждением, на основе превращения L-3,4-дигидроксифенилаланина (L-DOPA) в черный пигмент, называемый меланином
В дополнение к испытаниям, которые обращены на нарушение окраски, вызываемое повреждением, в широком смысле, способ согласно этому изобретению также делает возможным отбор более конкретным образом для мутантов с пониженной активностью PPO. Фенотипическое испытание, показательное для активности PPO, было разработано с применением листовых дисков, которые инкубировали в присутствии 1,5 мМ L-DOPA. Поскольку нарушение окраски в виде почернения стало очевидным, можно заключить, что L-DOPA может легко быть превращен системой окисления полифенолов, на поврежденной поверхности листьев салата, в черный пигмент, называемый меланином. PPO превращает L-DOPA в реакционноспособный L-D0PA-quinone, превращаемый без участия ферментов через допахром и индол хинон в черный меланин.
Более того, показано, что реакция может быть ингибирована добавлением 1 мМ L-цистеина во время реакции (Фигура 5). Поэтому это испытание делает возможным идентификацию мутантов, модифицированных в способности увеличивать активность PPO на поврежденной поверхности листа. Реакцию листовых дисков салата на присутствие L-DOPA можно наблюдать как в растворе, так и между смоченными фильтровальными бумагами, как показано на Фигуре 13.
ПРИМЕР 9
Оценка потомства мутанта, обнаруживающего близкое к отсутствию нарушение окраски, на пониженную реакцию потемнения с применением испытания на потемнение дисков, пронизанных жилками
Чтобы продемонстрировать, что пониженное нарушение окраски мутантов салата, таких как растение номер 06D.210202 из Примеров 3, 5 и 6 то, имеют значительно пониженное нарушение окраски в виде порозовения поврежденных поверхностей листовых дисков, также имеют эффективно пониженную реакцию потемнения, вызываемую повреждением, ряд растений потомства выращивали до зрелости.
На этой стадии развития из внешних листьев ряда растений потомства брали по 3 диска с центральной жилкой. Эти диски, пронизанные жилками, инкубировали согласно способу, описанному в Примере 7. Показано, что растения потомства мутанта, которые, как ранее было показано, имеют сильно пониженное нарушение окраски в виде порозовения, вызываемое повреждением, также имеют сильно пониженное потемнение центральной жилки, вызываемое повреждением. Результат этого эксперимента показан на Фигуре 14.
ПРИМЕР 10
Оценка потомства мутанта, обнаруживающего близкое к отсутствию нарушение окраски, на пониженную реакцию потемнения, с применением свежесрезанных головок салата, упакованных в пластиковые пакеты
Зрелые головки растений салата, выращенные из семени номер 06D.819784 из Примера 6, имеющие значительно пониженное нарушение окраски в виде порозовения поврежденных поверхностей листовых дисков, разрезали на части при помощи ножа и упаковывали в пластиковый пакет с окружающей атмосферой. Контрольные растения, обнаруживающие нормальную реакцию нарушения окраски в виде порозовения листовых дисков, обрабатывали идентичным образом. Пакеты хранили при 4°C в течение 6 дней, после чего листовой материал оценивали на реакцию потемнения.
Этим экспериментом показано, что растения потомства мутанта, которые, как было ранее показано, имеют сильно пониженное нарушение окраски в виде порозовения, вызываемое повреждением, также имеют сильно пониженное потемнение центральной жилки, вызываемое повреждением, после обработки и хранении в пластиковых пакетах с применением окружающей атмосферы. Результат этого эксперимента показан на Фигуре 15.