Молекулярно-генетический анализ двух VNTR-полиморфных локусов среди популяций юга Центральной России

При проведении кластерного анализа выявлено (рис.), что на дендрограмме изучаемые районы формируют две группировки. Первая группировка включает Барятинский и Боровский районы Калужской области, к ним присоединяются в пределах группы Михайловский район Рязанской области и Петровский район Тамбовской области. Вторая группировка включает Болховский район Орловской области и Спасский район Рязанской области.

6

5

4

>- 3

2

1

О -------

6 4 5 3 2 1

X

Рис. Дендрограмма генетических взаимоотношений популяций 6 районных популяций Центральной России (построена методом У орда): 1 -Барятинский район, 2-Боровский район, 3-Михайловский, 4-Спасский район, 5-Петровский район, 6- Болховский район.

Таким образом, можно заключить, что распределение частот фенотипов и аллелей системы С*3 у русского населения Центральной России, изменяясь в пределах вариаций характерных для русский, имеет свои определенные популяционные особенности. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов РГНФ и РФФИ

Литература

1. Батсуурь Ж., Петрищев В.Н., Раутиан Г.С., Шнейдер Ю.В. Определение генетического полиморфизма третьего компонента комплемента(С'З) методом вертикального электрофореза в полиакриламид-ном геле // Генетика. - 1985. - т.21, №4. - С.658-663.

2. Наследственные болезни в популяциях человека/ Под ред. Е.К. Гинтера. - М.: Медицина, - 2002. - 304 с.

3. Прокоп О., Гелер В. Группы крови человека. М.: Медицина, - 1991. - 380с.

4. Спицын В.А. Биохимический полиморфизм человека. М: Медицина, - 1991. - 512с.

5. Спицын В.А., Куххойзер В., Макаров C.B., Бычковская Л.С., Пай Г.В., Балановский О.П., Афанасьева И.С. Русский генофонд. Частоты генетических маркеров // Генетика. - 2001. - т.37, №3. - С.386-401.

6. Arnaiz- Villena А. С'З polymorphism, HLA, and chronic renal failure in Spaniard // Hum. Genet. -1984.-Vol. 67.-P. 440.

7. McKusick V. A. The human genome through the eyes of a clinical geneticist // Cytogenet. Cell Genet. -1982.-Vol. 32.-P. 7.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДВУХ VNTR-ПОЛИМОРФНЫХ ЛОКУСОВ СРЕДИ ПОПУЛЯЦИЙ ЮГА ЦЕНТРАЛЬНОЙ РОССИИ

В.Ю. Песик1 у H.A. Рудых1, М.И. Чурносов 1, Е.В. Б(шанвеская 2

Белгородский государственный университет1 ГУ Медико-генетический научный центр РАМН2

В последние годы все большее число исследователей в области популяционной генетики отдают предпочтение молекулярно-генетическим маркерам. Это связано с тем, что информационное содержание ДНК значительно выше белкового, кроме того техника исследований маркеров ДНК сводиться практически к одному методу - полимераз-ной цепной реакции. Но самым важным преимуществом маркеров ДНК является наличие неограниченного числа генетических маркеров с полиморфизмом разного типа и значимости.

За последние 15-20 лет получены молекулярно-генетические характеристики для многих популяций мира по различным ДНК маркерам ядерного генома человека [3,4,5]. В результате этих исследований показано, что гипервариабельные локусы ДНК являются более информативными полиморфными маркерами. В качестве гиипервариа-бельных ДНК-маркеров можно использовать VNTR-полиморфный участок гена фени-лаланингидроксилазы (VNTR-PAH) и минисателлит гена аполипопротеина В (АроВ).

Ген фенилаланингидроксилазы (ФАГ) раположен на 12 хромосоме в области q22-q24.1. Минисателлитный регион расположен между двумя постоянными Hindlll сайтами на 3 т.п.о. ниже тринадцатого экзона гена ФАГ. Этот регион содержит непостоянное число тандемных повторов с длиной одной копии 30 п.н. [6].

Ген аполипопротеина В расположен в коротком плече хромосомы 2 в регионе 2р23-р24. Гипервариабельный участок расположен вблизи 3'-конца на расстоянии 100 п.н. от сигнала полиаденилирования. В состав этого вариабельного участка входят богатые аденином и тимином 14 и 16 членные тандемные повторы [7].

Цель настоящей работы - провести молекулярно-генетический анализ вариабельности аллелей VNTR-полиморфных участков генов фенилаланингидроксилазы и аполипопротеина В среди коренного русского населения юга Центральной России.

Материалом для исследования послужили образцы ДНК 785 коренных русских жителей юга Центральной России. Из которых 433 человека из Яковлевского (140 человек), Прохоровского (146 человек) и Красненского районов (147 человек) Белгородской области, 108 человек из Пристенского (46 человек) и Черемисиновского районов (62 человека) Курской области, 127 человек из Ливенского района Орловской области и 117 человек из Репьевского района Воронежской области. ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции [8]. Анализ локусов осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров. Условия амплификации и электрофореза для полиморфных локусов представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Условия амплификации и электрофореза для исследованныхлокусов_

л о кус Условия амплификации Условия электрофореза

VNTR-PAH [6] Начальная денатурация 4 мин при 95°С. 29 циклов: 45 сек при 95°С; 45 сек при 55°С; 1 мин при 72°С. Элонгация 10 мин при 72°С [6]. Разделяли в 7%-ном полиакрила-мидном геле в течение 5-ти часов при 250У.

АроВ [2] Начальная денатурация 10 мин при 95°С. 31 цикл: 1 минпри95°С; 1 мин при 60°С; 2 мин при 72°С. Элонгация 10 мин при 72°С Г21. Разделяли в 6%-ном полиакрила-мидном геле в течение 7-ми часов при 200У.

По окончании электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия (0,1мкг/мл) в течение 15 минут и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Размеры аллелей УЫТЯ-РАН определяли относительно двух частых аллелей с длиной амплифицируемого фрагмента 380 п.н. и 530 п.н. (рис.1).

12 34 56789 10 11

Рисунок 1. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации локуса VNTR-PAH. 1-560/650; 2-500/530; 3-440/530; 4-380/650; 5, 11-380/500; 6-380/380; 7-530/530; 8-440/560; 9, 10-380/530.

Размеры аллелей VNTR-ApoB определяли путем одновременного электрофореза с маркером молекулярной массы DNA LadderMixlOOO («Fermentas»), содержащий фрагменты длиной 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1030 п.н. и т.д. (рис. 2). При анализе использовалась номенклатура аллелей VNTR-ApoB по Ludwig [5,7].

1 2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 2. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации УКТЯ-АроВ. 1 - 30/36; 2 - 32/35; 3 - 34/36; 4 - 38/38; 5 - маркер молекулярной массы; 6 - 34/36; 7 - 46/48; 8 - 34/36.

Математическая обработка полученных результатов проводилась общепринятыми статистическими методами.

В таблице 2 представлены результаты распределения частот УТЧТЯ аллелей гена ФАГ у русских жителей Центрального Черноземья.

Таблица 2

Распределение частот У1ЧТЯ аллелей гена ФАГ у русских жителей Центрального Черноземья

Популяции N VNTR-аллели, п.н.

710 650 560 530 500 470 440 380

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Белгородская область

Красненский р-он 147 0 0.04 0.13 0.34 0.14 0.01 0.01 0.33

Прохоровский р-он 146 0 0.03 0.08 0.36 0.17 0 0 0.36

Яковлевский d-oh 140 0 0.03 0.12 0.39 0.1 0 0 0.35

Курская область

Черемисиновский р 62 0 0.01 0.08 0.37 0.15 0 0.02 0.37

Продолжение табл. 2.

Пристенский р-он 46 0 0.1 0.07 0.34 0.11 0 0 0.38

Воронежская область

Репьевский р-он 117 0.01 0.03 0.14 0.28 I 0.14 0 0 0.4

Орловская область

Ливенский р-он 127 0 0.06 0.11 0.36 0.12 0.01 0 0.34

В целом во всех изученных популяциях было обнаружено 8 различных аллелей данного полиморфного участка, 7 из которых были описаны ранее для народов Волго-Уральского региона [1]. Выявленные ПЦР-фрагменты включали аллели размером 380, 440, 470, 500, 530, 560, 650 и 710 п.н., что соответствует 3, 5, 6, 7, 8, 9, 12 и 14 копиям повтора. Аллель 710 п.н. ранее в доступной нам литературе не описан и был выявлен впервые у одного индивидуума из Репьевского района Воронежской области. Частота аллеля в данной популяции составила 0.01. Во всех изученных популяциях с наиболее высокой частотой определялись аллель 380 (от 0.33 у русских Красненского района Белгородской области до 0.4 у русских Репьевского района Воронежской области) и аллель 530 (от 0.28 у русских Репьевского района Воронежской области до 0.39 у русских Яковлевского района Белгородской области). Реже всего во всех исследованных популяциях выявлялся аллель 650, частота которого варьировала от 0.01 в популяции Черемисиновского района Курской области до 0.1 в Пристенском районе Курской области. Аллель 440 был выявлен среди русских Красненского района Белгородской области (0.01) и Черемисиновского района Курской области (0.02). Аллель 470 был обнаружен среди жителей Красненского района Белгородской области и Ливенского района Орловской области с частотой 0.01. Распределение во всех исследованных популяциях соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга.

Среди всех обследованных индивидов выявлено 23 аллельных варианта миниса-теллита АроВ (от 660 до 1030 п.н.) с различной частотой встречаемости. С наибольшей частотой встречаются два аллельных варианта АроВ34 и АроВЗб (суммарно 60-80%), причем во всех исследованных популяциях самым частым оказался аллель АроВЗб (от 0.32 в Пристенском районе Курской области до 0.42 в Яковлевском районе Белгородской области). Далее с частотой от 0.07 до 0.13 в каждой районной популяции встречаются чаще всего это аллели АроВЗО, АроВ32, АроВ38 и АроВ40. Остальные аллели встречаются с частотой менее 0.05. Таким образом, распределение аллельных частот у исследованных русских популяций носит бимодальный характер (обнаруживаются 2 пика в области 34 и 36 аллеля), как и в популяциях Восточной Европы [3,4]. На рисунке 3 дано частотное распределение аллелей минисателлита АроВ для исследованных популяций юга Центральной России.

Таким образом, результаты анализа полиморфизма гипервариабельных локусов АроВ и VNTR-PAH свидетельствуют о высокой информативности данных локусов для популяционно-генетических исследований в силу их мультиаллельности и высокой ге-терозиготности в популяциях.