Способ снижения резистентности возбудителя туляремии к цефалоспоринам (варианты)
METHOD FOR REDUCTION OF TULAREMIA PATHOGEN RESISTANCE TO CEPHALOSPORINS (VERSIONS)

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к вопросу изучения природной антибиотикорезистентности Francisella tularens is и возможностям ее снижения путем использования нетоксичных поверхностно-активных веществ (ПАВ).
В настоящее время возрастает актуальность исследований, направленных на разработку альтернативных схем лечения инфекционных заболеваний в связи с нарастанием антибиотикорезистентности (1, 2).
Francisella tularensis - возбудитель туляремии характеризуется природной устойчивостью к β-лактамным антибиотикам (пенициллины и цефалоспорины), макролидам (Francisella tularensis subsp. holarctica biovar II), клиндамицину, полимиксину (3, 4, 5). Поэтому арсенал средств этиотропной терапии туляремии ограничен аминогликозидами, фторхинолонами, рифампицином и тетрациклинами.
В этой связи приобретает особую актуальность исследование, направленное на поиск путей преодоления природной устойчивости Francisella tularensis к антибактериальным препаратам, а именно цефалоспоринам, для повышения их эффективности при лечении туляремии ввиду их малой токсичности. Одним из перспективных направлений является поиск нетоксичных для человека веществ, в комбинации с которыми антибиотики повышают свою активность против патогенных бактерий (6, 7).
Известен способ повышения проницаемости клеточной стенки бактерий при воздействии на микробы ПАВ (8, 9), что может создавать условия для облегченного доступа антибиотика к мишеням в бактериальной клетке.
Однако в литературе отсутствуют данные по влиянию ПАВ на чувствительность туляремийного микроба к антибактериальным препаратам.
За прототип выбран способ снижения резистентности возбудителя туляремии к цефалоспоринам(10), включающий использование в качестве препарата неионогенного поверхностно-активного вещества твин80 в количестве 0,25%.
Однако предложенная технология имеет недостаточную эффективность в снижении резистентности возбудителя туляремии в отношении к цефалоспоринам.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка нового эффективного способа, позволяющего повысить антибактериальную активность цефалоспоринов в отношении туляремийного микроба in vitro и in vivo, с использованием нетоксичного ПАВ - твин 80Поставленный результат достигается тем, что в известном способе снижения резистентности возбудителя туляремии к цефалоспоринам, включающем использование препарата для повышения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, в качестве препарата используют неионогенный ПАВ твин 80 в количестве (0,5-1)%, при этом исследования осуществляют in vivo и in vitro, причем в последнем случае используют диско-диффузионный метод и метод серийных разведений, после этого проводят оценку результатов исследований, соответствующую проведенным методам.
8
При этом для диско-диффузионного метода готовят чашки с агаром Мюллера-Хинтона в два ряда, в один из которых вводят (0,5-1)% твин 80, затем на поверхность агара засевают бактерии исследуемых штаммов туляремии из предварительно подготовленной суспензии, содержащей 10 м.кл./мл, после впитывания суспензии в агар на его поверхность накладывают диски с цефалоспориновыми антибиотиками, а на контрольные чашки с твином и без него диски не накладывают, посевы инкубируют в течение 24-48 часов при 37°С, оценку результатов проводят визуально по формированию зон подавления роста бактерий, если последние имеют в диаметре 25-40 мм, то подтверждают их чувствительность к антибиотику, причем на чашках со средой без твина 80 зоны подавления отсутствуют.
8
Кроме того, для метода серийных разведений готовят два ряда чашек с питательной средой Мюллера-Хинтона, куда вводят цефалоспориновый антибиотик в различных концентрациях, а именно 25, 50, 100, 250, 500 мкг/мл среды, при этом параллельно готовят такой же ряд чашек, но в среду дополнительно вводят твин 80 в концентрации (0,5-1)%, затем на чашки засевают по 0,05 мл исследуемого штамма из бактериальной взвеси, содержащей 10 м.кл./мл по оптическому стандарту мутности 10 ед., в качестве контроля используют среду Мюллера-Хинтона без антибиотика и среду Мюллера-Хинтона, содержащую (0,5-1)% твина 80 без антибиотика, посевы инкубируют при 37°С в течение 24-48 часов, после этого учитывают рост бактерий по величине минимальной подавляющей концентрации, чем она меньше, тем чувствительней штамм туляремийного микроба к антибиотикам при обязательном росте бактерий на контрольных чашках.
3
При этом для проведения in vivo, животных заражают подкожно предварительно подготовленной культурой возбудителя туляремии в объеме 0,1 мл, содержащем 10 м.кл./мл, затем через 24 часа животных начинают лечить цефтазидимом в количестве 12 мг/мышь, разведенным в растворе (0,5-1)% твина 80, курс проводят 7 дней, а результаты оценивают по эффективности терапии, а именно по процентному отношению выживших животных к количеству зараженных или средней продолжительности жизни выживших животных.
9
8
Причем предварительную подготовку исследуемых штаммов проводят по следующей технологии: готовят бактериальную взвесь концентрацией 10 м.кл./мл по оптическому стандарту мутности 10 ед., разводят ее физиологическим раствором в 10 раз до 10 м.кл./мл.
4
Кроме того, предварительную подготовку культуры возбудителя туляремии осуществляют следующим образом: из суточной агаровой культуры готовят суспензию на физиологическом растворе, соответствующую 1 млрд м.кл./мл по оптическому стандарту мутности 10 ед., после ее титруют с помощью 10-кратных разведений в физиологическом растворе до концентрации 10 м.кл./мл.
Способ осуществляется следующим образом
В работе используют 7 штаммов F. tularensis subsp. tularensis, 9 штаммов F. tularensis subsp. mediasiatica, 10 штаммов F. tularensis subsp. holarctica (включая 2 штамма японского биовара). Все штаммы получены из музея живых культур ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора, где они хранятся в лиофилизированном состоянии.
Культуры выращивают на среде Мюллера-Хинтона (Himedia, Индия).
В исследовании использованы следующие ПАВ: анионные - сульфанол (отечественного производства), додецилсульфат натрия (ДСН, Serva, Германия); катионные - катапин Б-300 (отечественного производства), полимиксин В (отечественного производства); неионогенные - тритон Х-100 (Serva, Германия), твин 80 (Sigma, США).
Определение МПК проводят методом серийных разведений ПАВ в плотной питательной среде (агар Мюллера-Хинтона). МПК определяют по минимальной концентрации вещества, подавляющей рост микробов.
За субингибирующую дозу принимают максимальную концентрацию ПАВ, не приводящую к подавлению роста бактерий исследуемых штаммов. Посевы инкубируют при 37°С в течение 24-48 ч. Учет результатов проводят при наличии роста культуры на контрольных чашках (без ПАВ). Результаты экспериментов суммированы в таблице 1, где отражены минимальные подавляющие концентрации ПАВ для F. tularensis трех основных подвидов.
Как видно из данных таблицы 1, все исследованные штаммы, вне зависимости от их подвидовой принадлежности, характеризуются высокой чувствительностью к ПАВ. Исключение составляют полимиксин В (МПК≥1000 мкг/мл) и твин 80 (МПК≥2%). Для последующих экспериментов выбраны концентрации ПАВ, составляющие 1/2-1/4 МПК, которые не подавляли рост бактерий (субингибирующие концентрации).
Определяют влияние субингибирующих концентраций ПАВ на устойчивость туляремийного микроба к β-лактамным антибиотикам с помощью диско-диффузионного метода или метода серийных разведений (без ПАВ и в присутствии субингибирующих концентраций ПАВ (1/2-1/4 МПК). В качестве критерия эффекта ПАВ на β-лактамрезистентность бактерий проводят сравнительную оценку зон подавления роста бактерий (диско-диффузионный метод) или МПК антибиотика при отсутствии и наличии ПАВ в среде.
Исследуют устойчивость франциселл к следующим β-лактамам: ампициллин (отечественного производства), цефотаксим (клафоран, Roussel, Франция), цефоперазон (цефобид, Pfizer, Бельгия), цефтазидим (фортум, Glaxo, Италия).
Данные по уровню резистентности туляремийного микроба к β-лактамным антибиотикам в присутствии субингибирующих концентраций ПАВ представлены в таблице 2.
Результаты проведенных исследований показали, что воздействие анионных или катионных ПАВ на бактериальную клетку не приводят к существенному изменению устойчивости F. tularensis к изученным антибиотикам. В противоположность этому, неионогенные детергенты (твин 80, тритон Х-100), не изменяя уровень устойчивости к ампициллину, приводят к достоверному повышению антибактериальной активности цефалоспоринов против туляремийного микроба. При проведении бактериологического контроля установлено, что эти ПАВ в используемых субингибирующих концентрациях не вызывают снижение количества жизнеспособных бактерий F. tularensis (аналогичные показатели КОЕ).
Обнаруженный эффект зарегистрирован как для β-лактамазопозитивных, так и для β-лактамазонегативных (subsp. mediasiatica) штаммов F. tularensis (11), что позволяет сделать вывод, что действие ПАВ связано не с инактивацией β-лактамазы, а обусловлено повышением проницаемости клеточной стенки для цефалоспоринов и большей доступностью бактериальных мишеней для действия антибиотика.
Проведенные исследования продемонстрировали, что повышение проницаемости наружной мембраны под воздействием неиногенных ПАВ приводит к существенному снижению устойчивости F. tularensis к цефалоспоринам.
Варианты примеров, проведенных in vitro и in vivo подтверждающих возможность использования ПАВ для увеличения антибактериальной активности цефалоспоринов против туляремийного микроба.
Пример 1.
Исследования проводят in vitro диско-диффузионным методом на типичных штаммах туляремийного микроба 3-х основных подвидов - F. tularensis subsp. tularensis Schu9(1), F. tularensis subsp. mediasiatica 543(2), F. tularensis subsp. holarctica 503(3) с использованием неионогенного ПАВ твин 80 (Sigma).
8
9
8
Готовят параллельно два ряда чашек, содержащих агар Мюллера-Хинтона, причем в чашки второго ряда вводят (0,5-1)% твин 80. После этого на поверхность агара засевают бактерии исследуемых штаммов из суспензии, содержащей 10 м.кл./мл. Для этого готовят бактериальную взвесь, соответствующую концентрации 10 м.кл./мл по оптическому стандарту мутности 10 ед., которую разводят физиологическим раствором в 10 раз (до 10 м.кл./мл). После впитывания суспензии в агар на его поверхность накладывают диски с цефтазидимом. В качестве контролей служат посевы на чашки со средой, содержащей твин или без него, на которые диски не накладывают. Посевы инкубируют в течение 24-48 часов при 37°С.
Результаты учитывают по диаметру зон задержки роста бактерий. На среде без твина 80 зоны задержки отсутствуют (показатель устойчивости бактерий к антибиотику), тогда как на среде, содержащей 0,5-1% твина 80, вокруг дисков формируется зона ингибиции роста бактерий от 25 до 40 мм в диаметре (появление чувствительности к антибиотику), см. фото.
Вывод: на фотографии видно, что на среде без ПАВ (чашка 1) зона подавления роста бактерий вокруг дисков с цефтазидимом отсутствуют. При введении в состав среды (0,5-1)% твина 80 (чашка 2) вокруг дисков появляется зона ингибиции роста бактерий, свидетельствующая о повышении чувствительности бактерий к антибиотику.
Пример 2.
8
Исследование проводят на штаммах 3-х основных подвидов: F. tularensis subsp. tularensis - 3, F. tularensis subsp. mediasiatica - 4, F. tularensis subsp. holarctica - 6 методом серийных разведений in vitro с использованием неионогенного ПАВ твин 80 (Sigma). Оценивают снижение устойчивости штаммов туляремийного микроба к цефалоспоринам (цефотаксим, цефтазидим, цефоперазон). Готовят два ряда чашек с питательной средой Мюллера-Хинтона: 1-й ряд содержит различные концентрации исследуемого антибиотика (цефотаксим, цефоперазон, цефтазидим) - 25, 50, 100, 250, 500 мкг/мл среды. Параллельно готовят такой же ряд чашек, но в среду дополнительно вводят твин 80 в концентрации (0,5-1)%. На чашки засевают по 0,05 мл (капля) исследуемого штамма из бактериальной взвеси, содержащей 10 м.кл./мл по оптическому стандарту мутности 10 ед. В качестве контролей используют среду Мюллера-Хинтона без антибиотика и среду Мюллера-Хинтона, содержащую 0,5% твина 80 без антибиотика. Посевы инкубируют при 37°С в течение 24-48 ч. Результаты учитывают по величине МПК (минимальная подавляющая концентрация) при обязательном росте бактерий на контрольных чашках (см. таблицу 2). Из таблицы видно, что при воздействии на бактерии твина 80 возбудитель туляремии снижает резистентность к исследуемым цефалоспоринам в 10 раз.
Пример 3.
Проводят оценку эффективности цефалоспоринов при туляремии in vivo с помощью ПАВ - твин 80, используя модель экспериментальной туляремии белых мышей. Для этого животных заражают подкожно в объеме 0,1 мл бактериальной суспензией типичных штаммов туляремийного микроба (F. tularensis subsp. tularensis Schu, F. tularensis subsp. holarctica 503), содержащей 1000 м. кл. Каждая группа составляла 12 животных.
4
3
Предварительно из суточной агаровой культуры готовят бактериальную суспензию на физиологическом растворе, соответствующую 1 млрд м.кл./мл по оптическому стандарту мутности 10 ед.. Суспензию титруют с помощью 10-кратных разведений в физиологическом растворе до концентрации 10 м.кл./мл, из которой 0,1 мл (заражающая доза - 10 м.кл./мышь) вводят подкожно белым мышам. Через 24 часа после заражения животных начинают лечить среднетерапевтическими дозами цефтазидима (12 мг/мышь, внутримышечно), разведенным в физиологическом растворе. Параллельно проводится такой же эксперимент, однако антибиотик разводится в растворе 1% твина 80. Курс лечения продолжается 7 дней. В качестве контролей служат: группа животных, зараженная той же дозой бактерий, без последующего лечения антибиотиком, и группа животных, зараженная той же дозой бактерий, с последующим введением раствора (0,5-1)% твина 80 (без антибиотика) в течение 7 дней. Результаты учитывают через 21 день после окончания лечения по показателям эффективности терапии, а именно процентное отношение количества выживших к количеству зараженных животных или средней продолжительности жизни павших животных.
Влияние твина 80 на эффективность цефтазидима при лечении экспериментальной туляремии белых мышей отражено в таблице 3.
Таким образом, из таблицы видно, что в случае заражения животных голарктическим штаммом 503 антибиотик, разведенный раствором 1% твина 80, достоверно повышает эффективность цефтазидима по сравнению с препаратом на физиологическом растворе (100% и 67%, соответственно). При заражении животных наиболее патогенным штаммом Schu зарегистрировано увеличение средней продолжительности жизни павших мышей в группе, получавшей антибиотик на твине, по сравнению с животными, получавшими антибиотик на физиологическом растворе.
Использование предлагаемого изобретения дает возможность применения цефалоспоринов в комбинации с неионогенным ПАВ - твин 80 при лечении туляремии, что позволяет повысить антибактериальную активность антибиотика в отношении голарктическиих штаммов или удлинять сроки жизни для последующего комбинированного применения цефалоспоринов с другими антибактериальными средствами в отношении высокопатогенных штаммов неарктического подвида.
Кроме того, перспективным направлением является создание комбинированных препаратов в этой области медицины с применением неионогенных ПАВ, а именно твина 80.
Информационные источники
1. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / Под ред. Л.С. Страчунского и др. - М., 2007. - 464 с.
2. Lee C.-R., Cho Н., Jeong В.С. et al. Strategies to Minimize Antibiotic Resistance // Int. J. Environ. Res. Public Health. - 2013. - Vol. 10. - P. 4274-4305.
3. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии / Н.Г. Олсуфьев. - М., 1975. - 200 с.
4. Павлович Н.В. Биологические свойства и факторы патогенности Francisella tularensis: Автореф. дис. … д-ра. мед. наук / Саратов, 1993. - 37 с.
5. Sutera V., Caspar Y., Boisset S., Maurin M. A new dye uptake assay to test the activity of antibiotics against intracellular Francisella tularensis I Front. Cell Infect. Microbiol. - 2014. - Vol. 4, №36. - P. 1-7.
6. Страчунский Л.С. Современная антимикробная химиотерапия: Руководство для врачей / Л.С. Страчунский, С.Н. Козлов. - М., 2002. - 436 с.
7. Lindgren, Н. Gallium Potentiates the Antibacterial Effect of Gentamicin against Francisella tularensis / H. Lindgren, A.  // Antimicrob. Agents Chemother. - 2015. - Vol. 60, №1. - P. 288-295.
8. Действие физиологически активных соединений на биологические мембраны / Под ред. Л.А. Пирузяна - М., 1974. - 385 с.
9. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенных бактерий / Ю.В. Езепчук. – М., 1977. - 216 с.
10. Цимбалистова М.В., Павлович Н.В. Современные аспекты изучения особо опасных и других ифекционных болезней. Материалы научно-практической конференции, посвященной 8-летию Ростовского научно-исследовательского противочумного института, г. Ростов-на-Дону, 2014 г., с. 103-106.
11. Цимбалистова М.В., Павлович Н.В. Особенности формирования устойчивости Francisella tularensis subsp.mediasiatica к β-лактамным антибиотикам // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2014. - №1. - С. 3-8.