Устройство для криоконсервирования и подготовки тромбоцитов к трансфузии
DEVICE FOR CRYOPRESERVATION AND PREPARATION OF THROMBOCYTES FOR TRANSFUSION

Изобретение относится к медицинской технике, в частности к устройствам, применяемым в трансфузиологии, и предназначено для заготовки тромбоцитов длительного хранения, пригодных к экстренной трансфузии.
Известны устройства для криконсервирования клеток человека и животных, выпускаемые отечественными и зарубежными фирмами Виробан, Макофарма, Бакстер, Фрезениус и др. Такие устройства содержат отдельные  контейнеры, соединенные трубками с зажимами,  и предназначены для замораживания, хранения при низких температурах и размораживания клеток, но не позволяют в закрытой системе проводить технологические операции, обязательные для криоконсервирования тромбоцитов.
Известен также «Комплект изделий для криоконсервирования эритроцитов однократного применения, стерильный», производства ОАО «Синтез», состоящий из нескольких контейнеров, соединенных трубками с зажимами, в одном из которых содержится гемоконсервант «Глюгицир». Заготовленную в этой системе цельную донорскую кровь центрифугируют, переводят плазму в отдельный контейнер, а контейнер с  эритроцитной массой соединяют с контейнером, содержащим раствор криопротектора «Криосин». Соединение контейнеров, проводят с нарушением герметичности и замкнутости системы путем введения перфоратора, находящегося на трубке   контейнера с раствором «Криосин», в порт контейнера с эритроцитной массой. Тем самым возрастает риск микробной контаминации эритроцитов из-за условно стерильного соединения контейнеров.
Наиболее близкими аналогами к некоторым структурным частям предлагаемого устройства являются три устройства, описанные в патентах RU  169287, 169578, 167874, которые в силу их конструктивных особенностей невозможно при производстве объединить в единое стерильное изделие. Каждое устройство необходимо для выполнения только некоторых операций целостной технологической цепочки криоконсервирования и подготовки тромбоцитов для трансфузии. Эти операции описаны в виде отдельных способов в патентах RU  2623081, 2623083, 2623864. Работа с устройствами – аналогами возможна только в асептических условиях при наличии «чистых» помещений, локальных стерильных зон и ламинарных шкафов, сохраняющих стерильность целевого продукта – тромбоцитного концентрата. Кроме того, упомянутые выше способы сопряжены с необходимостью использования дорогостоящего оборудования для многократного стерильного и не всегда надежного соединения встык трубок каждого из трех устройств. Эти сварные соединения подвергаются воздействию влияющих на их прочность множества физических факторов: центрифугирование при высоких перегрузках, быстрое совместное замораживание и размораживания клеток и жидкостей в широком диапазоне низких и высоких температур.
Необходимо единое, целостное и замкнутое устройство, которое без нарушения стерильности на всех стадиях технологического процесса может обеспечить реализацию следующих технологических этапов:
- перевод в устройство дозы богатой тромбоцитами плазмы, полученной от донора,
- концентрирование тромбоцитов и отделение плазмы от тромбоцитного концентрата,
- извлечение части плазмы и разведение ею криопротектора,
- перевод оставшейся плазмы в отдельный контейнер,
- введение по определенной программе (скорость, время, концентрация, объем) порции разведенной плазмой криопротектора в контейнер с тромбоцитным концентратом,
- удаление воздуха из устройства,
- замораживание в отдельных контейнерах плазмы и суспензии тромбоцитного концентрата в криопротекторе, разведенной плазмой.
- длительное хранение при низких отрицательных температурах,
- размораживание тромбоцитного концентрата и плазмы,
- ресуспендирование плазмой по определенной программе тромбоцитного концентрата при помешивании,
- перевод ресуспендированных тромбоцитов в газопроницаемый контейнер,
- хранение до трансфузии в газопроницаемом контейнере ресуспендированных тромбоцитов при помешивании.
В связи с этим задачей изобретения является реализация описанной  многостадийной технологии криоконсервирования, длительного хранения и подготовки тромбоцитов для трансфузии с помощью единственного замкнутого устройства взамен трех, не объединяемых вместе различных устройств для каждого этапа технологии.
Технический результат состоит в сохранении качества подготовленных к трансфузии размороженных тромбоцитов и снижении вероятности их микробной контаминации.
Дополнительный технический результат заключается в том, что не требуется асептических условий для осуществления всех технологических манипуляций, многократного стерильного присоединения к устройству различных внешних функциональных элементов, упрощается и облегчается работа персонала.
,
Поставленная задача решена и технический результат достигнут тем, что устройство для криоконсервирования и подготовки тромбоцитов к трунсфузии содержит два контейнера, соединенных трубками с зажимами, где первый предназначен для замораживания, хранения и размораживания тромбоцитного концентрата, второй – для плазмы,  в котором второй контейнер соединен трубкой с зажимом с первым патрубком первого четверника, трубка с зажимомзакрытая с противоположного конца, соединена со  вторым патрубком, бактериальный фильтр, оканчивающийся коннектором Луер-Лок, соединен трубкой с зажимом с  третьим патрубком, а четвертый патрубок соединен трубкой с первым патрубком первого тройника. Второй патрубок этого тройника соединен трубкой с зажимом с входом ограничителя скорости ресуспендирующего потока плазмы, выход которого соединен со вторым патрубком второго тройника. Третьи патрубки тройников соединены между собой обводной трубкой с зажимом, а первый патрубок второго тройника соединен трубкой с зажимом со вторым патрубком второго четверника, первый патрубок которого соединен трубкой с зажимом с бактериальным фильтром, оканчивающимся коннектором Луер-Лок. Третий патрубок соединен трубкой с зажимом с обратным клапаном, оканчивающимся коннектором Луер-Лок. Четвертый патрубок соединен трубкой с зажимом с первым контейнером, при этом коннекторы Луер-Лок снабжены съемными герметизирующими колпачками.
Другие предпочтительные признаки и особенности устройства указаны в зависимых пунктах формулы изобретения. В частности, дополнительный технический результат получают за счет того, что при ресуспендировании размороженных и помешиваемых тромбоцитов гидравлическое сопротивление ограничителя скорости ресуспендирующих потоков плазмы или растворов SSP/SSP+ отрегулировано так, что величина этой скорости находится в диапазоне 10 – 20 мл/мин.  При этом  контейнеры с размороженной плазмой или раствором должны быть расположены на 70 – 100 см выше уровня размещения контейнера с размороженными и помешиваемыми тромбоцитами.
Кроме того, ограничитель скорости ресуспендирующих потоков плазмы или растворов SSP/SSP+ выполнен в виде капиллярной трубки с внутренним диаметром в диапазоне 0,2 – 2,0 мм и длиной в диапазоне 10 – 40 мм, вставленной в трубку, соединяющую тройники. Ограничитель скорости ресуспендирующих потоков плазмы или растворов  SSP/SSP+ также может быть выполнен в виде заполненной губчатым открытоячеистым наполнителем трубки, соединяющей тройники.
0
Предложено, чтобы контейнеры для плазмы и тромбоцитов имели номинальный объем 150 – 300 мл и были выполнены из прозрачного, эластичного, тромбоцитосовместимого и газопроницаемого полимерного материала, выдерживающего центрифугирование с перегрузкой до 1500 g и замораживании при низких температурах – до минус 196 С  с сохранением при размораживании герметичности  контейнеров, всех элементов устройства и их соединений.
Удобно зажимы выполнить в виде плоских съемных или несъемных щелевых зажимов или зажимов-защелок.
Целесообразно, чтобы бактериальные фильтры имели  стерилизующую мембрану с порами размером не более 0,2 мкм.
Если вывесить контейнер с размороженной плазмой или контейнер с раствором  SSP+ (SSP) на высоте 70 - 100 см от уровня расположения контейнера с размороженными и помешиваемыми тромбоцитами (фиг. 3) и использовать в качестве ограничителя скорости потока плазмы или раствора капиллярную трубку с внутренним диаметром предпочтительно в диапазоне 0,2 - 2,0 мм и длиной предпочтительно в диапазоне 10 – 40 мм, то  скорость ресуспендирующего тромбоциты потока плазмы или раствора будет находиться в пределах 10 – 20 мл/мин. При такой скорости тромбоциты не испытывают осмотического шока, большинство тромбоцитов сохраняет свою структуру, форму и функциональную активность. Меньшие скорости потока значительно удлиняют процесс ресуспендирования и негативно сказываются на сохранности тромбоцитов. Наилучшие результаты получены в случае использования капилляра с внутренним диаметром 0,4 мм и длиной 15 мм. Для плазмы скорость ресуспендирующего потока составила 15 – 18 мл/мин, а для раствора SSP+ (SSP):  10 – 14 мл/мин.
Относительно проще  ограничитель скорости ресуспендирующего потока изготовить в виде целостного упругого цилиндра из откротопористого пенополиуретана диаметром  3,1 – 3,2 мм, длиной 20 – 25 мм, пористостью 90 – 95% со средним размером пор 0,2 мм, который  вставлен в трубку с внутренним диаметром 3,0 мм, соединяющую тройники устройства. В этом случае скорости ресуспендирующего потока плазмы или раствора SSP+ (SSP) почти не отличаются от тех же скоростей при использовании капиллярного ограничителя скорости потока. В отличие от аналогов устройства персоналу не требуется точно регулировать роликовым зажимом поток плазмы, визуально подсчитывая число капель в единицу времени, что затруднительно, т.к. необходимо отсчитывать 3 – 4 капли в секунду. Использование, как у аналога, регулятора скорости потока от инфузионной системы Exadrop, требует стерильного соединения трубок и наличия термосваривающего полимерные трубки аппарата CompoDock (Фрезениус) или аналогичных аппаратов.
Номинальный объем контейнеров 150 – 300 мл выбран с учетом малого объема тромбоцитного концентрата в порции плазмы, получаемой от донора, и небольшим объемом стакана ротора центрифуги, в котором необходимо разместить не только контейнеры, но все устройство. По тому же соображению целесообразно использовать малогабаритные плоские  щелевые зажимы трубок или зажимы-защелки.
Использование в устройстве бактериальных фильтров с гидрофильной мембраной для растворов, имеющей поры не более 0,2 мкм, позволяет осуществлять «холодную» стерилизацию растворов, вводимых в устройство.
Предпочтительные признаки изобретения описаны в зависимых пунктах формулы изобретения, а также следуют из приведенного ниже конкретного, но не ограничивающего примера выполнения устройства со ссылками на прилагаемые чертежи.
Фиг.1 – схема устройства для криоконсервирования и подготовки тромбоцитов к трансфузии. Устройство на фиг. 1 состоит из контейнера для тромбоцитов – К1, контейнера для плазмы К2, зажимов 1 – 9, коннекторов Луер-Лок со съемными герметизирующими колпачками 11 – 13, бактериальных фильтров 14, 15, первого четверника 16, второго четверника 17, первого тройника 18, второго тройника 19, обратного клапана 20, ограничителя скорости потока плазмы или растворов  SSP+ (SSP) 21. Перечисленные элементы устройства соединены трубками с зажимами с применение сварных и клеевых технологий, причем трубка с зажимом 2 закрыта с одного конца.
Фиг. 2  - схема присоединения к устройству контейнера с исходным тромбоцитным концентратом - К4, полученным от донора, контейнера с раствором SSP+ (SSP) - К3 (в случае технологической необходимости), шприца 22 для отбора порции плазмы (показано слева на фиг.2) и введения в устройство с помощью того же шприца 22 криопротектора, разведенного плазмой (показано справа на фи.3). Стрелки указывают направления потоков исходного тромбоцитного концентрата, плазмы, отделенной центрифугированием от тромбоцитного концентрата, криопротектора, разведенного плазмой, а также потока размороженной плазмы на этапе ресуспендирования ею размороженных тромбоцитов или совместного с потоком раствором SSP+ (SSP) в случае технологической необходимости.
Фиг. 2 также поясняет к каким коннекторам устройства присоединяют контейнеры К4, К3 и шприц 22. Двумя пунктирными линиями, стрелками рядом с ними и буквой «С» показано место герметизирующего термосоединения трубок встык. Пунктирными линиями А1 – А3 обозначены места и последовательность запаивания трубок и герметичного отсоединения вышележащих частей устройства.
Фиг. 3 – вариант взаимного расположения контейнеров с размороженной плазмой, раствором SSP+ (SSP) и тромбоцитным концентратом на этапе ресуспендирования и помешивания тромбоцитов после размораживания.
Все компоненты устройства выполнены из нетоксичных тромбоцитосовместимых, гипоаллергенных и апирогенных полимерных материалов. Устройство стерилизовано радиационным методом дозой 20 +/-5 кГрей.
В соответствии с предложенным техническим решением сконструировано и изготовлено заявленное устройство. Посредством этого устройства и современных способов криконсервирования и подготовки к трансфузии тромбоцитов, описанных в патентах  RU  2623081, 2623083, 262386412, заготовлено 12 порций тромбоцитов. Порядок работы с устройством, последовательность манипуляций с его элементами, показатели процесса криоконсервирования и подготовки тромбоцитов к трансфузии, а также показатели качества подготовленных к переливанию тромбоцитов,  приведены на примере конкретного варианта  осуществления изобретения.
9
Богатой тромбоцитами порцию донорской плазмы 200 +/- 20 мл  с содержанием клеток  (1-1,5)х10в мл отбирают на аферезном аппарате Trima Accel в контейнер К4 (фиг.2), в качестве которого используют контейнер для хранения тромбоцитов PL-2410 (Бакстер, Фенвал) с номинальным объемом 1000 мл. В устройстве в качестве контейнеров К1 и К2 используют соответственно контейнеры CS250N (Криостор) и Maco Biotech Freezing – EVA bag, оба с номинальным объемом 250 мл. Закрывают все зажимы 1-9 на трубках устройства. Трубку контейнера К4 и  трубку с зажимом 2 стерильно соединяют между собой посредством термосваривающего аппарата CompoDock (Фрезениус). Открывают зажимы 2, 4, 7, 9 и переводят содержимое контейнера К4 в контейнер К1. Закрывают зажимы 2 и 9, размещают контейнер К1 в одном отделе,  а оставшуюся часть устройства – в другом отделе стакана ротора центрифуги Sorvall RC 3C Plus. Центрифугируют устройство в течение 7-12 минут с центробежным ускорением 1100-1400 g. Из 5 мл флакона набирают 1-3 мл стерильного комбинированного эндо- и экзоцитарного криопротектора, содержащего 55% ДМСО и 5% декстран 40,   в двухкомпонентный шприц 22 (фиг.2) объемом 12 мл. Сняв колпачок с коннектора 12, присоединяют шприц, открывают зажимы 6 и 9, отбирают из контейнера К1 плазму, которая после центрифугирования содержится в верхней части контейнера в виде супернатанта, и доводят концентрацию ДМСО в шприце до 10-15%. Обратный клапан 20 предотвращает случайный обратный заброс условно стерильного содержимого шприца в устройство. С помощью аппарата Гекон Б заваривают  трубку по линии А2 и отделяют ее.
Открывают зажимы 9 и 3 и,  сжимая вручную или с помощью плазмоэкстрактора Jouan контейнер К1, переводят из него плазму в контейнер К2. Закрывают зажимы 3 и 7.
Сняв колпачок с коннектора 13, присоединяют шприц, открывают зажим 8 и через стерилизующий бактериальный фильтр 15 ресуспендируют тромбоциты, оставшиеся в контейнере К1, порциями разведенной плазмой криопротектора по 2 мл с интервалом 2 минуты при постоянном помешивании тромбоцитов на тромбомиксере. Концентрация криопротектора ДМСО уменьшается до 4-6 %. По завершении ресуспендирования тромбоцитов  заваривают трубку по линии А3 и отделяют ее.
о
о
о
Контейнер К1 соответственно с ресуспендированными в криопротекторе тромбоцитами и контейнер К2 с плазмой размещают совместно с остальными элементами устройства в металлической или картонной кассете и замораживают в морозильной камере со скоростью 1-3/мин при температуре минус 85-100 С. Устройство с замороженными тромбоцитами и плазмой хранят при температуре минус 85-196 С до 2-х лет.
о
Размораживают замороженные тромбоциты и плазму соответственно в контейнерах К1 и К2 устройства в программируемом размораживателе Barkey Plasmatherm в течение 2-10 минут при температуре 37-40 С.
Контейнер К2 с плазмой подвешивают на типовой трансфузионной стойке высотой 170 – 190 см на уровне 70-100 см от уровня расположения контейнера К1, который помещают на весы-помешиватели, расположенные на лабораторном столе (фиг.3). Закрывают зажим 4 на обводной трубке, открывают зажимы 3, 5, 7 и 9. Плазма из контейнера К2  под действием силы тяжести перетекает в контейнер с ресуспендируемыми и непрерывно помешиваемыми тромбоцитами через ограничитель потока 21, который при сборке устройства отрегулирован так, что задает скорость потока в диапазоне 10-20 мл/мин. Объем ресуспендируемых плазмой тромбоцитов, подготовленных для трансфузии,  в среднем составляет 150+/- 15 мл. При этом происходит примерно 10-и кратное разведение плазмой того же донора размороженных тромбоцитов и уменьшение концентрации криопротектора ДМСО до 0,4-0,6 %.
о
Закрывают зажимы 3 и 5, подвешивают контейнер К1 на трансфузионной стойке, открывают зажимы 2 и 4. Ресуспендированные в плазме тромбоциты под действием силы тяжести перетекают из контейнера К1 в газопроницаемый для кислорода и углекислого газа контейнер К4 (PL-2410 (Бакстер, Фенвал)), выполненный из тромбоцитосовместимого гидрофильного и низкоадгезивного к тромбоцитам материала. По линии А1 заваривают трубку с зажимом 2 и отделяют контейнер К4 от устройства. Размороженные тромбоциты хранят в контейнере К4 при температуре 20-24 С и постоянном помешивании не более 4 часов до трансфузии.
Ресуспендирование размороженных тромбоцитов размороженной плазмой того же донора из контейнера К2 проводят, в частности, для решения некоторых клинических задач ургентной хирургии, связанных с большой кровопотерей и необходимостью коррекции выраженной тромбоцитопении. Растворы SSP+ (SSP) из внешнего контейнера К3 совместно с плазмой из контейнера К2 или отдельно используют для профилактических трансфузий, например, в онкогематологии. В этом случае контейнер К3 с раствором SSP+ (SSP) с помощью коннектора 10 (фиг.2) присоединяют к коннектору 11 аналогично присоединению шприца 22 к коннектору 13.  Последовательно реперфузируют размороженные и помешиваемые тромбоциты, как показано на фиг.3, вначале плазмой из контейнера 2 через ограничитель потока 21, затем раствором SSP+ через тот же ограничитель потока 21, соблюдая соотношение (20% плазмы + 80% SSP+), а для раствора SSP соотношение (30% плазмы + 70% SSP).
Анализ качества размороженных тромбоцитов в каждой из 12 порций, заготовленных для трансфузии с использование предложенного устройства, проведенный способом оценки морфофункционального статуса тромбоцитов, описанным в патенте RU № 2485502,  показал, что биологическая полноценность (структурная и функциональная) тромбоцитов практически не нарушалась. Так, адгезивная активность размороженных тромбоцитов к концу 4 часа составляла не менее 90% от исходной адгезивной активности, что свидетельствовало о сохранении на достаточно высоком уровне основной функциональной характеристики качества размороженных тромбоцитов. Общее число размороженных тромбоцитов составило  в среднем 90+/-5% от исходного числа. Сохранялась также на высоком уровне  структурная полноценность тромбоцитов: количество тромбоцитов с гранулами в среднем составило 60+/-10%, что также свидетельствовало о сохранении на достаточно высоком уровне основной структурной характеристики качества размороженных тромбоцитов.
Тесты, проведенные в соответствии с ГОСТом EN 556-1-2011, не выявили нарушения стерильности криоконсервированных и размороженных тромбоцитов, подготовленных к трансфузии с использованием предложенного устройства, что свидетельствовало о достижении технического результата: низкой вероятности контаминации целевого продукта технологии криоконсервирования – ресуспендированных размороженных тромбоцитов. Вся многостадийная технология криоконсервирования и подготовки тромбоцитов к трансфузии осуществлена в одном замкнутом устройстве, не требовала по сравнению с устройствами-аналогами нескольких различных устройств для каждой стадии технологии, большого количества стерильных термосоединений трубок встык, наличия асептических условий и «чистых» производственных помещений.