Устойчивость ультрамикробактерий к тяжелым металлам

6. Palleroni N.J. and Bradbury J.F. Stenotropho-monas, a new bacterial genus for Xanthomonas malto-philia (Hugh 1980) Swings et al. 1983. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 1993. № 43: р. 606-609.

7. Akiko K., Kurimi M., Satoshi O. and Yoko T. Arthrobacter oryzae sp. nov. and Arthrobacter humi-cola sp. nov. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2008. № 58: p. 53-56.

8. N.A. Kryazhevskikh et al. Comparison of the adaptive potential of the Arthrobacter oxydans and Aci-netobacter lwoffii isolates from permafrost sedimentary rock and the analogous collection strains // Microbiology January. 2013. Vol. 82 № 1: p. 29-42.

УСТОЙЧИВОСТЬ УЛЬТРАМИКРОБАКТЕРИЙ К ТЯЖЕЛЫМ МЕТАЛЛАМ

Лобанова А.А.

Московский Педагогический Государственный Университет, институт биологии и химии, Москва, Россия, студент (магистр) Институт физической химии и электрохимии им А.Н. Фрумкина РАН

RESISTANCE OF ULTRAMICROBACTERIA TO HEAVY METALS

Lobanova A.A.

Moscow State Pedagogical University, Institute of Biology and Chemistry, Moscow, Russia, student (master) A.N. Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry RAS

АННОТАЦИЯ

Работа посвящена изучению устойчивости ультрамикробактерий к воздействию тяжелых металлов. Получение данных о приспособленности ультрамикробактерий к токсическим факторам и изучение их метаболического потенциала является важной и актуальной задачей для микробиологии и биотехнологии, поскольку позволяет оценить их роль в экосистемах, подвергшихся антропогенному воздействию и определить возможность их использования в процессах биоремедиации. В работе было использовано два штамма бактерий, выделенных нами ранее и устойчиво образующие ультрамикроклетки: Arthrobacter sp. и Stenotrophomonas maltophilia. Методами электронной микроскопии и абсорбционной спектрофотомерии, а также с использованием дыхательного теста было показано, что обе культуры обладали повышенной устойчивостью к урану, хрому и цинку, кадмию и меди.

ABSTRACT

The work is devoted to the study of the resistance of ultramicrobacteria to the effects of heavy metals. Obtaining data on the adaptability of ultramicrobacteria to toxic factors and the study of their metabolic potential is an important and urgent task for microbiology and biotechnology, since it allows evaluating their role in ecosystems subjected to anthropogenic impact and determining the possibility of their use in bioremediation processes. In this work, we used two strains of bacteria that we isolated earlier and stably form ultramicrocells: Arthrobacter sp. and Stenotrophomonas maltophilia. Using electron microscopy and absorption spectrophotometry, as well as using the breath test, resistance to uranium, chromium and zinc, cadmium and copper for both cultures was shown.

Ключевые слова: ультрамикробактерии, уран, хром и цинк, кадмий, медь, резистентность.

Keywords: ultramicrobacteria, uranium, chromium and zinc, cadmium, copper, resistance.

Введение

Попадание высокотоксичных веществ в окружающую среду вследствие развития промышленности и сельского хозяйства приводит к изменению видового разнообразия экосистем. При этом, виды, обладающие механизмами устойчивости к экоток-сикантам, имеют преимущества и способны к интенсивному развитию в зонах интенсивного загрязнения за счет снижения конкуренции с другими видами. К наиболее токсичным веществам в окружающей среде относятся радионуклиды и тяжелые металлы, что обусловлено одновременно химическим и физическим механизмом их воздействия на организм. Наиболее устойчивыми к различным химическим и физическим факторам являются прокариотические микроорганизмы, при этом многие бактерии, обитающие в анаэробных

условиях при литотрофном росте способны проводить детоксификацию соединений за счет трансформации молекул или ионов до мало- или менее токсичных форм в процессе метаболизма. Считается, что наиболее приспособленными к токсическому стрессу являются бактерии ультрамелких форм с низкой интенсивностью метаболизма, которые относят к несистемной группе ультрамикробактерий.

Ультрамикробактерии (УМБ) представляют собой виды домена Bacteria, характеризующиеся очень небольшими размерами клеток и имеющие небольшие размеры генома [1]. Впервые термин «ультрамикробактерии» был применен в 1981 г. Франциско Торелла и Ричардом Морита и относился к выделенным из морской воды бактериям с клетками диаметром <0,3 мкм. Иногда к ультра-

микробактериям относят формы ультрамикрокле-ток. Этот термин используется для обозначения бактериальных клеток (чаще всего кокковидных), которые прошли через фильтры с порами 0,4 - 0,2 мкм [2]. Сами ультрамикроклетки имеют диаметр 0,4-0,15 мкм и встречаются повсеместно как в естественных средах обитания, так и в чистых культурах ультрамикробактерий, а также в старых или голодных культурах обычных бактерий.

Целью данной работы было определение полулетальных (LD50) и летальных доз (LD100) для Cr, Zn, Cd, U и Cu для двух штаммов бактерий, способных к образованию ультрамикроклеток, выделенных из водоносных горизонтов, загрязненных тяжелыми металлами.

Для изучения резистентности ультрамикро-бактерий к тяжелым металлам было взято два штамма бактерий, выделенных ранее и устойчиво образующие ультрамикроклетки: Arthrobacter sp. и Stenotrophomonas maltophilia.

Культивирование проводили в стандартной в жидкой среде (TEG), содержащей (г/л): бакто-трип-тон - 5.0; дрожжевой экстракт - 2.5; глюкозу - 1.0; NaCl - 1.0 и раствор микроэлементов (1.0 мл/л), pH 7.0-7.2, а также в среде Адкинса [3], дополненной ацетатом натрия (2.5 г/л) в качестве источника энергии и углерода и нитратом натрия (0.85 г/л) в качестве акцептора электронов. Среда содержала (г/л): KH2PO4 - 0.6; K2HPO4 - 1.0; NaNO3 - 1.0; NaCl - 0.8; Na2SO4 - 0.1; MgSO4-7H2O - 0.1; KCl - 0.1; раствор микроэлементов (1.0 мл/л), pH 7.0-7.2. В среды были добавлены металлы в виде солей марки ХЧ.

Рост микроорганизмов, определяли с помощью МТТ-теста [4], который основан на уменьшении в среде концентрации растворимой соли тетра-золия (3-(4,5-диметилтиазол-2-у1)-2,5-дифенилтет-

малорастворимого продукта синего формазана NAD(P)H зависимыми оксидоредуктазами - дыхательными ферментами, активно растущих и делящихся клеток. Таким образом, интенсивность окраски формазана в среде отражает жизнеспособность клеток и напрямую зависит от интенсивности микробного дыхания. Для инкубации добавляли раствор МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиумбромид) в среду LB (триптон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, NaCl - 5 г, на 1 л дистиллированной воды) до конечной концентрации 0.1%. Культуру инкубировали в течение 1 часа для восстановления МТТ при микробном дыхании. Далее добавляли 1,5 мл ДМСО (диметилсульфок-сида) для растворения образовавшихся кристаллов формазана и образования окрашенного комплекса с восстановленным МТТ. Культуры центрифугировали (10 мин, 7000 об/мин), сливали супернатант и добавляли в осадок 1,5 мл ДМСО. Оптическую плотность определяли спектрофотометрически при 540 нм на приборе Ultrospec 2100 pro («Amersham Biosciences», Великобритания) за вычетом измеренного фонового поглощения.

Результаты и обсуждение Известно, что содержание в среде ионов тяжелых металлов даже в низких концентрациях негативно влияет на жизнедеятельность организмов [5]. В связи с этим существует большое количество исследований, связанных с поиском различных механизмов приспособления к жизни при высоких концентрациях тяжелых металлов [6; 7; 8; 9]. Хронический эксперимент Был проведен микроскопический анализ (рис. 1, 2) для определения количества и соотношения живых и мертвых клеток в посевах при недельном культивировании с металлами.

Рис 1.

Содержание живых клеток вида Arthrobacter &р. в пробе с концентрацией Сё2+ 50 мкг/л и 300 мкг/мл.

Рис 2. Содержание живых клеток вида Stenotrophomonas maltophШa в пробе с концентрацией Си 2+10

мкг/л и 130 мкг/мл.

Острый эксперимент

Далее представлены данные, отражающие устойчивость культур к наличию в среде тяжелых металлов (рис. 3 - 7) полученные методом оценки активности дыхания клеток после внесения в среду ионов тяжелых металлов и культивировании в течении часа.

зЯ

а

«

Н

Ы «

ю л ^

н ° «

о 35 еа

н

а <

100

50

25

100

200

300

400

Сг2072", мкг/мл

АгШгоЬаС;ег Бр.

81епо1горЬошопа8 шакорЫНа

Рис 3. Дыхательная активность бактерий при разных концентрациях ионов Сг207

35

а

«

Н

к

«

ю л ^

н ° «

о 35 еа

н

к

<

100

50

10 25 50 Zn2+, мкг/мл

100

200

АгШгоЬаСег Бр. 81епо1горЬошопав шакорЫНа

Рис 4. Дыхательная активность бактерий при разных концентрациях ионов 2п2+

0

0

2

0

0

о4

100

а

н 80

к

« ю 60

ЛЗ н 40

«

о 35 20

еа

н 0

к

<

10 50 100 С^+,мкг/мл

200

300

Arthrobacter sp. Stenotrophomonas maltopЫlia

Рис 5. Дыхательная активность бактерий при разных концентрациях ионов Cd2+

50

« 100 а

и н

к

«

«5 ЛЗ

н

1 0 еа

Н

к

<

10 100 200 и022+,мкг/мл

300

400

Arthrobacter sp. Stenotrophomonas maltophilia

Рис 6. Дыхательная активность бактерий при разных концентрациях ионов UO22+ Содержание в среде ионов UO22+

для штамма

Arthrobacter sp. не имело значительного токсического воздействия, полулетальная доза для данного

штамма превышает 200 мкг/мл. Летальная доза урана установлена только для штамма Stenotropho-monas maltophШa.

35

а

«

Н

к

«

ю л ^

н ° «

о 35 еа

н

к

<

100

50

10 25 50 Си2+,мкг/мл

70

130

Arthrobacter sp. Stenotrophomonas maltophilia

Рис 7. Дыхательная активность бактерий при разных концентрациях ионов

Добавление меди приводило к высокому уровню токсического воздействия на культуры

Stenotrophomonas maltophШa и Arthrobacter sp.

Таким образом, штамм Stenotrophomonas maltophШa обладал самой низкой устойчивостью

ко всем металлам. Полулетальная доза (LD5o) для всех ионов металлов, кроме Сг2072-, достигалась при концентрации до 10 мкг/мл. Самое токсическое

0

0

0

0

воздействие на данный штамм оказывало присутствие в среде ионов СГ2О72", ЬБюо достигалось при концентрации 25 мкг/мл.

Более устойчивыми к содержанию в среде ионов тяжелых металлов являлся штамм ЛНкгоЬас-tег Для него ЬБ50 достигалась при концентрации 2и2+ - 10 мкг/мл; Сг2О72- - 25 мкг/мл. Значения ЬБ50 и ЬБцж приведены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Штамм Концент |)ация металла, мкг/мл

Zn2+ Cd2+ UÜ22+ Cr2Ü72- Cu2+

Arthrobacter sp. 10 До 50 200-300 25 До 10

Stenotrophomonas maltophilia До 10 До 10 До 10 До 25 До 10

Таблица 2.

Значение LD100, в остром эксперименте_

Штамм Концент |)ация металла, мкг/мл

Zn2+ Cd2+ UÜ22+ Cr2Ü72- Cu2+

Arthrobacter sp. 200 100 - 300 130

Stenotrophomonas maltophilia 100 100 400 25 130

Выводы

Исследованные штаммы ультрамикробакте-рий имели разную приспособленность к тяжелым металлам в среднем предельно допустимые концентрации находились от 25 мкг/мл для СГ2О72" и до 400 мкг/мл у и UO22+; Наиболее токсичными были ионы меди и кадмия. Полученные данные свидетельствуют о том, что изученные культуры имеют в среднем высокую устойчивость к тяжелым металлам и способны обитать при высоких уровнях антропогенных нагрузок. Они могут быть использованы в процессе биоремедиации загрязненных тяжелыми металлами экосистем.

Литература

1. Duda V., Suzina N., Polivtseva V., Boronin A. Ultramicrobacteria: Formation of the Concept and Contribution of Ultramicrobacteria to Biology // Microbiology. 2012. № 81(4): p. 379-390.

2. Полянская Л.М., Городничев Р.Б., Звягинцев Д.Г. Размеры клеток бактерий в почвах, определяемые методом "каскадной" фильтрации // Известия РАН. Серия биологическая. 2013. № 1: с. 18.

3. Adkins J.P., Cornell L.A., Tanner R.S. Microbial composition of carbonate petroleum reservoir fluids // Geomicrobiol. J. 1992. 10. Р. 87-97.

4. Berridge, M.V., Tan M.V. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): Subcellular localization substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction // Arch. Biochem. Biophys. 1993. 303(2). P. 474-482.

5. Nies D.H. Microbial heavy-metal resistance // Applied Microbiology and Biotechnology. 1999. № 51(6): p. 730-50.

6. Özdemir S. et al. Cd, Cu, Ni, Mn and Zn resistance and bioaccumulation by thermophilic bacteria. Geobacillus toebii subsp decanicus and Geobacillus thermoleovorans subsp stromboliensis // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2012. №28 (1): p. 155-63.

7. Teitzel G.M., Parsek M.R. Heavy metal resistance of biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa // Applied Environmental Microbiology. 2003. № 69 (4): p. 2313-2320.

8. Nies D.H. Heavy metal-resistant bacteria as extremophiles: molecular physiology and biotechno-logical use of Ralstonia sp. CH34 // Extremophiles. 2000. Vol.4 №2: p. 77-82.

9. Jana E.K., Harichova T., Stojnev D., Pangallo P.F. The isolation of heavy-metal resistant culturable bacteria and resistance determinants from a heavy-metal-contaminated site // Biologia. 2011. Vol.66 №1: p. 18-26.

УСТОЙЧИВОСТЬ УЛЬТРАМИКРОБАКТЕРИЙ К ВОЗДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕГО

ИЗЛУЧЕНИЯ

Лобанова А.А.

Московский Педагогический Государственный Университет, институт биологии и химии, Москва, Россия, студент (магистр) Институт физической химии и электрохимии им А.Н. Фрумкина РАН

RESISTANCE OF ULTRAMICROBACTERIA TO IONIZING RADIATION

Lobanova A.A.

Moscow State Pedagogical University, Institute of Biology and Chemistry,

Moscow, Russia, student (master) A.N. Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry RAS