УСТРОЙСТВО, СПОСОБ И КОМПЬЮТЕРНАЯ ПРОГРАММА ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЙ
DEVICE, METHOD AND COMPUTER PROGRAM FOR MEASURING

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к устройству и способу измерения для подсчета частиц, например лейкоцитов в пробе, например пробе крови. Настоящее изобретение дополнительно относится к компьютерной программе для анализа пробы.
Уровень техники изобретения
Определение количества лейкоцитов часто имеет большое значение при лечении пациента. Настоящий анализ может потребоваться для диагностики, например, лейкемии или инфекционных или воспалительных заболеваний или для контроля методов лечения. Желательно, чтобы результаты анализов можно было получать как можно быстрее, чтобы минимизировать время ожидания пациентов и предоставлять врачу возможность принимать решение по поводу лечения и диагноза непосредственно во время первого осмотра пациента. Поэтому полезно было бы создать способ анализа, пригодный для быстрого исполнения врачом или медсестрой, без необходимости передачи анализа в лабораторию. Определение количества лейкоцитов является одним из самых распространенных анализов, выполняемых на пациентах при постановке диагноза. Поэтому было бы очень полезно иметь в наличии скоростной и простой способ выполнения анализа.
В настоящее время количество лейкоцитов обычно получают вручную путем окрашивания пробы крови и наблюдения под микроскопом пробы в специальной счетной камере, т.е. камере Бюркера. Счетная камера снабжена сеткой, делящей камеру на четко определенные небольшие объемы. Лейкоцитам дают осесть на дно счетной камеры, чтобы можно было сфокусировать микроскоп на все клетки в камере и тем самым облегчить подсчет. Таким образом, пробе следует дать отстояться несколько минут до того, как можно будет выполнять подсчет. Затем можно определять количество лейкоцитов подсчетом количества частиц клеток крови на ячейку в сетке. Количество лейкоцитов определяет вручную химик-лаборант, который должен иметь опыт выполнения анализа, чтобы обладать способностью к выполнению надежного анализа.
Данный анализ занимает много времени. Кроме того, поскольку анализ выполняется вручную, результаты анализа могут изменяться в зависимости от человека, выполняющего анализ.
Известно небольшое число существующих автоматизированных способов анализа для определения количества лейкоцитов. Количество лейкоцитов можно определить с использованием принципа Культера, который основан на определении размера клеток и тем самым типа клеток путем измерения импеданса. Способ подсчета лейкоцитов по принципу Культера описан в патенте США 5,262,302. Устройство измерения по принципу Культера является дорогим и поэтому требующим крупных капитальных затрат. Таким образом, больница или лаборатория не будет испытывать желания вкладываться в более чем одно устройство. Указанные соображения подразумевают, что анализ потребуется выполнять в централизованном пункте и пациент будет вынужден ожидать результатов анализа.
Принцип Культера является преобладающим автоматизированным способом, который применяют в настоящее время. Однако существует несколько других способов, которые описаны к настоящему времени. Один подобный способ для определения количества лейкоцитов описан в US 5,585,246. В данном случае пробу крови следует готовить смешением с флуоресцентным красителем и лигандным комплексом, который метит лейкоциты. Пробу вводят в капилляр и облучают лазерным источником, который сканирует пробу в капилляре. Флуоресценцию измеряют для определения количества лейкоцитов. В WO 97/02482 описан аналогичный способ, использующий флуоресцентный краситель и лазерный источник, сканирующий по капилляру. Данный способ адаптирован для подсчета лейкоцитов в материалах с аферезом, содержащих невысокое количество лейкоцитов. В данном случае капилляр является достаточно толстым и необходимо подождать, пока не произойдет оседания лейкоцитов на дно капилляра, когда капилляр можно будет сканировать.
В WO 99/45384 показана камера с пробой, имеющая переменную толщину. Переменная толщина разделяет разные соединения крови. Пробу крови окрашивают пигментом для разной подсветки, по меньшей мере, трех разных типов лейкоцитов в пробе крови. Лейкоциты можно подсчитывать сканирующим оптическим прибором для просмотра участка камеры.
В WO 98/50777 предлагается способ для оценки количества соматических клеток в молоке. Способ содержит этап подачи объема пробы в отсек для пробы и этап передачи проходящих электромагнитных сигналов из отсека для пробы на матрицу обнаруживающих элементов. Интенсивности обнаруженных электромагнитных сигналов обрабатываются и результаты коррелируют с количеством клеток, присутствующих в пробе.
При этом сохраняется потребность в ускорении и упрощении существующих автоматизированных способов определения количества лейкоцитов, чтобы анализ мог выполняться любым пользователем без обязательного специального обучения и чтобы измерительные устройства могли быть относительно дешевыми.
Вышеперечисленные требования предполагают, что анализ может быть выполнен в месте обслуживания. Кроме того, поскольку получение количества лейкоцитов является настолько распространенным анализом, то любое усовершенствование способа анализа было бы полезно для обслуживания пациента. Особенно полезен был бы способ анализа, обеспечивающий возможность получения результатов в месте обслуживания.
Кроме того, полезно было бы получение лейкоцитарной формулы, то есть исследование распределения лейкоцитов разных типов в пробе крови. Данная лейкоцитарная формула может указывать, имеет ли место нормальное распределение присутствующих клеток или имеет место рост или снижение количества клеток какого-либо типа. Информация может быть полезна при диагностике конкретных видов заболеваний. Например, рост количества нейрофилов говорит о бактериальной инфекции, тогда как рост количества лимфоцитов обычен для острой вирусной инфекции.
Лейкоцитарную формулу можно также получать наблюдением под микроскопом и ручным подсчетом окрашенных клеток крови в камере Бюркера. Существует также несколько автоматизированных способов. Например, лейкоцитарную формулу можно получать по принципу Культера посредством анализа формы и размера электрического импульса, формируемого клеткой, проходящей через электрическое поле. Форма и размер импульса могут зависеть от типа обнаруженного лейкоцита. Один подобный способ описан в US 4,528,274.
В US 5,123,055 описан другой способ распознавания различных типов лейкоцитов. Данный способ требует последовательного анализа нескольких параметров размера и цвета, чтобы различать типы лейкоцитов.
Желательно также обеспечить ускорение и упрощение существующих автоматизированных способов определения лейкоцитарной формулы. Было бы особенно полезно обеспечить быстрый, простой и относительно недорогой способ анализа, чтобы анализ можно было проводить в месте обслуживания.
Сущность изобретения
Целью изобретения является обеспечение простого анализа для определения объемного количества частиц, например лейкоцитов в пробе, например пробе крови, и определение дифференциального количества частиц, например лейкоцитарной формулы.
Таким образом, в соответствии с одним аспектом изобретения предлагается измерительное устройство для подсчета количества частиц, например лейкоцитов в пробе, например пробе крови.
Устройство содержит держатель, который выполнен с возможностью вмещения пробоотборного устройства, содержащего измерительную полость, которая вмещает пробу, систему формирования изображения, выполненную с возможностью получения, по меньшей мере, одного увеличенного цифрового изображения пробы. Устройство дополнительно содержит анализатор изображений, который выполнен с возможностью анализа, по меньшей мере, одного полученного цифрового изображения для распознавания частиц и определения количества частиц в пробе, причем анализатор изображений выполнен с возможностью анализа, по меньшей мере, одного полученного цифрового изображения для распознавания частиц, которые отображаются в фокусе, и определения типов и количества упомянутых частиц, причем типы распознаются по физическим особенностям частиц, благодаря чему определяется соотношение частиц разных типов в пробе.
Система формирования изображения может содержать увеличительное средство и, по меньшей мере, одно средство получения цифрового изображения.
В соответствии с одним вариантом осуществления устройство выполнено с возможностью подсчета лейкоцитов в пробе крови, измерительная полость выполнена с возможностью вмещения окрашенной и гемолизированной пробы крови и при этом анализатор изображений выполнен с возможностью анализа, по меньшей мере, одного полученного цифрового изображения для распознавания окрашенных лейкоцитов и определения количества лейкоцитов в пробе, причем анализатор изображений выполнен с возможностью анализа, по меньшей мере, одного полученного цифрового изображения для распознавания лейкоцитов, которые отображаются в фокусе, и определения типов и количества упомянутых лейкоцитов, причем типы распознаются по геометрическим особенностям лейкоцитов, благодаря чему определяется соотношение лейкоцитов разных типов в пробе.
В соответствии с другим аспектом изобретения предлагается способ подсчета частиц в пробе, при этом упомянутый способ содержит следующие этапы: получают пробу в измерительную полость пробоотборного устройства, получают, по меньшей мере, одно цифровое изображение с увеличением облученной пробы в измерительной полости, анализируют цифровым образом, по меньшей мере, одно цифровое изображение для распознавания частиц и определения количества частиц в пробе и анализируют цифровым образом, по меньшей мере, одно цифровое изображение для распознавания частиц, которые отображаются в фокусе, и определения типов и количества упомянутых частиц, причем типы распознаются по геометрическим особенностям частиц, благодаря чему определяется соотношение частиц разных типов в пробе.
В соответствии с одним вариантом осуществления способ предназначен для подсчета лейкоцитов в пробе крови. Способ содержит этап, заключающийся в том, что получают пробу крови в измерительную полость пробоотборного устройства. Пробу крови смешивают с реагентом, содержащим гемолизирующее вещество для лизиса эритроцитов в пробе крови и окрашивающее вещество для окрашивания лейкоцитов в пробе крови. Окрашивающее вещество предпочтительно селективно окрашивает лейкоциты и не окрашивает другие клетки в пробе крови. Способ дополнительно содержит этап, заключающийся в том, что получают, по меньшей мере, одно цифровое изображение с увеличением пробы в измерительной полости. Способ дополнительно содержит этапы, заключающиеся в том, что анализируют цифровым образом, по меньшей мере, одно цифровое изображение для распознавания окрашенных лейкоцитов и определения количества лейкоцитов в пробе и анализируют цифровым образом, по меньшей мере, одно цифровое изображение для распознавания лейкоцитов, которые отображаются в фокусе, и определения типов и количества упомянутых лейкоцитов, причем типы распознаются по геометрическим особенностям окрашенных клеток, благодаря чему определяется соотношение лейкоцитов разных типов в пробе крови.
Как измерительное устройство, так и способ измерения в соответствии с изобретением дают возможность простого анализа пробы цельной крови. С этой целью измерительное устройство выполнено с возможностью получения, по меньшей мере, одного цифрового изображения пробы крови, при этом проба смешана с окрашивающим веществом для окрашивания лейкоцитов. Окрашивание лейкоцитов подразумевает, что лейкоциты можно распознавать в цифровом изображении и разные типы лейкоцитов можно распознавать по геометрическим особенностям клеток в одном и том же или другом цифровом изображении.
Следовательно, измерительное устройство и способ измерения предназначены как для определения объемного количества всех лейкоцитов в пробе крови, так и для определения лейкоцитарной формулы.
В то время, как многие существующие способы способны подсчитывать разные клетки крови и даже подгруппы клеток крови, измерительное устройство в соответствии с изобретением выполнено с возможностью анализа конкретно лейкоцитов. Реагент содержит гемолизирующее вещество, которое будет подвергать лизису эритроциты в пробе крови. Лизис исключает возможность подсчета эритроцитов в пробе. С другой стороны, лизис эритроцитов упрощает различение и распознавание лейкоцитов в пробе крови.
Кроме того, измерительное устройство, в частности, выполнено с возможностью анализа, по меньшей мере, одного цифрового изображения так, чтобы распознавались клетки, которые отображаются в фокусе. Данный подход позволяет получать изображение относительно толстой пробы при подсчете только тех клеток, которые являются сфокусированными. Такая особенность полезна, в частности, с учетом того, что подсчет общего количества лейкоцитов осуществляется легче, чем распознавание типа лейкоцитов, поскольку определение типа требует анализа большего объема детальных сведений о клетке. Следовательно, благодаря обеспечению подсчета только таких клеток, которые находятся в фокусе, можно выполнять распознавание типа лейкоцитов в пробе, которую можно одновременно использовать для определения статистически надежного объемного подсчета лейкоцитов в пробе.
Измерительное устройство и способ измерения в соответствии с изобретением обеспечивают очень простой анализ пробы цельной крови. Анализ не нуждается в сложном измерительном устройстве или усложненных этапах, которые должны выполняться оператором. Поэтому анализ может быть выполнен в непосредственной связи с обследованием пациента, причем не обязательно высококвалифицированным техником. Необходимо просто получить пробу крови и смешать ее с окрашивающим веществом. Затем пробу крови можно поместить в держатель измерительного устройства и непосредственно в ответ на такое действие измерительное устройство может представить результаты анализов.
Фактически смешение пробы крови с реагентом можно обеспечивать в измерительной полости. Следовательно, не обязательно осуществлять ручное приготовление пробы. В течение нескольких минут или еще быстрее взаимодействие пробы крови с реагентом приведет к гемолизу эритроцитов и окрашиванию лейкоцитов, так что проба становится готовой к оптическому измерению с получением, по меньшей мере, одного цифрового изображения. Пробу крови можно смешивать с реагентом посредством, например, дисперсии или диффузии реагента в пробе крови или посредством активации вибрации или движения пробоотборного устройства, чтобы вызывать перемешивание в измерительной полости.
Измерительное устройство может дополнительно содержать источник электромагнитного излучения, который выполнен с возможностью облучения пробы, вмещенной в измерительную полость пробоотборного устройства.
Система формирования изображения может быть выполнена с возможностью получения множества цифровых изображений пробы с использованием разных оптических настроек, при этом анализатор изображения выполнен с возможностью анализа каждого полученного цифрового изображения для распознавания частиц или окрашенных лейкоцитов и определения количества частиц или лейкоцитов в пробе, причем анализатор изображения выполнен с возможностью анализа каждого полученного цифрового изображения для распознавания частиц или лейкоцитов, которые отображаются в фокусе, и определения типов и количества упомянутых частиц или лейкоцитов, причем типы распознаются по геометрическим особенностям частиц или окрашенных лейкоцитов, благодаря чему определяется соотношение частиц или лейкоцитов разных типов в пробе.
Благодаря получению множества цифровых изображений на разных уровнях в направлении глубины резкости в пробе можно анализировать относительно большой объем пробы даже при использовании сильного увеличения. По причине получаемой малой глубины резкости сильное увеличение осложняет просмотр всего объема в одном изображении. Поскольку коэффициент увеличения влияет на глубину резкости, этап получения множества цифровых изображений допускает применение более сильного увеличения, что, в свою очередь, позволяет различать в каждом изображении разные типы лейкоцитов в зависимости, помимо прочего, от формы, числа или размера ядер.
В соответствии с другим вариантом осуществления система формирования изображения выполнена с возможностью обеспечения информации о направлении света в полученном изображении для облегчения фокусировки, что обеспечивает возможность сдвига фокусировки в полученном изображении. Данный подход предполагает, что одно изображение можно использовать как для подсчета общего количества лейкоцитов в пробе путем анализа всей глубины пробы за один раз, так и для определения соотношения лейкоцитов разных типов в пробе крови путем анализа клеток в изображении, когда изображение представлено со сфокусированным участком толщины пробы крови. Изображение, содержащее информацию о направлении света в изображение, может быть получено с использованием растра из небольших линз (например, составной линзы), обеспечивающего возможность отслеживания лучей в полученном изображении таким образом, чтобы можно было фокусироваться на различных частях изображения.
Система формирования изображения может быть выполнена с возможностью получения первого и второго цифровых изображений пробы с использованием разных оптических настроек, при этом анализатор изображений выполнен с возможностью анализа первого полученного цифрового изображения для определения количества частиц или лейкоцитов в пробе и анализатор изображений выполнен с возможностью анализа второго полученного цифрового изображения для определения соотношения частиц или лейкоцитов разных типов в пробе.
Следовательно, измерительное устройство выполнено с возможностью, в частности, получения двух цифровых изображений с использованием разных оптических настроек. Данное решение предполагает, что оптические настройки можно оптимизировать и применять, во-первых, для определения количества лейкоцитов в объеме и, во-вторых, для определения соотношения лейкоцитов разных типов.
Система формирования изображений может содержать две, по меньшей мере, частично раздельные части, которые направляют свет от облучаемой пробы в первую и вторую части системы формирования изображения.
Операция определения, находится ли лейкоцит в фокусе или нет, может выполняться путем использования того факта, что цитоплазма клетки может действовать как линза, преломляющая свет. Для отображаемого в фокусе лейкоцита, ядра представляются в виде затемнений, а окружающая цитоплазма является почти невидимой. Ядра представляются в виде областей со значительно сниженной интенсивностью света, а цитоплазма не влияет на интенсивность света.
Для лейкоцита, отображаемого слишком близко к системе формирования изображений (слишком близко, чтобы быть сфокусированным), ядра представляются в виде затемнений, а окружающая цитоплазма действует как линза и преломляет свет, что имеет следствием образование темного кольца вокруг ядра. Ядра представляются как области со значительно сниженной интенсивностью света относительно сфокусированного изображения ядер, и цитоплазма представляется в свете низкой интенсивности.
Для лейкоцита, отображаемого слишком далеко от системы формирования изображений (слишком далеко, чтобы быть сфокусированным), ядра представляются в виде затемнений, а окружающая цитоплазма действует как линза и преломляет свет, что имеет следствием образование светлого кольца вокруг ядер. Ядра представляются в виде области со значительно сниженной интенсивностью света относительно сфокусированного изображения ядер, а цитоплазма представляется в свете высокой интенсивности.
В альтернативном варианте, распознавание клеток, которые отображаются в фокусе, может выполняться посредством анализа краев отображаемых клеток, чтобы оценивать, отображается ли клетка в фокусе по спаду интенсивности на краю. Клетки, которые не находятся в фокусе, будут проявлять медленное снижение интенсивности на краях, а сфокусированные клетки будут отображаться с резким краем, представляющимся как резкое снижение интенсивности на краю клетки. Следовательно, путем анализа характера изменения интенсивности на краю изображения клетки можно определить, отображается ли клетка в фокусе или нет.
Альтернативный способ определения типа клетки состоит в том, что в анализаторе изображения для конкретной частицы или клетки определяют количество упомянутых изображений, в которых отображается упомянутая частица или клетка, считая от изображения, в котором частица или клетка определяется как расфокусированная в первом направлении, до изображения, в котором частица или клетка определяется как расфокусированная во втором направлении.
Анализатор изображения может быть выполнен с возможностью определения по подсчитанному числу изображений, геометрической особенности, относящейся к размеру упомянутой частицы или клетки.
Система формирования изображений с оптической настройкой, применяемой для получения упомянутого, по меньшей мере, одного цифрового изображения, может иметь коэффициент увеличения 1-50 крат, предпочтительнее 1-20 крат, предпочтительнее 3-20 крат, предпочтительнее 5-20 крат и предпочтительнее приблизительно 10 крат.
Система формирования изображений может быть выполнена с возможностью получения упомянутого, по меньшей мере, одного цифрового изображения с глубиной резкости в диапазоне 2-60 микрометров, предпочтительнее в диапазоне 2-30 микрометров, предпочтительнее приблизительно 8-10 микрометров.
Для целей настоящего описания термин «глубина резкости» означает длину в направлении по оптической оси, вдоль которой строится изображение, достаточно сфокусированное, чтобы допускать анализ изображения для опознавания клеток, расположенных в пределах упомянутой длины. Данная «глубина резкости» может быть больше, чем традиционная глубина, задаваемая оптическими настройками. При большем коэффициенте увеличения глубина резкости уменьшается.
Источник электромагнитного излучения может быть выполнен с возможностью излучения на длине волны, соответствующей максимуму поглощения окрашивающего вещества. Следовательно, окрашенные лейкоциты, которые содержат накопленное окрашивающее вещество, будут обнаруживаться по критерию слабого пропускания света в цифровых изображениях.
Источник электромагнитного излучения может содержать лазерный источник. Лазерный источник может обеспечивать свет строго заданной длины волны, соответствующей поглощению окрашивающего вещества. Кроме того, лазерный источник может обеспечивать направленный свет, сводящий к минимуму помехи от рассеянного света, чтобы точка слабого пропускания света была четко различимой.
В альтернативном варианте источник электромагнитного излучения может содержать светодиод. Данный источник излучения может по-прежнему обеспечивать удовлетворительные условия излучения для правильного распознавания лейкоцитов среди других материалов в пробе.
Анализатор изображений может быть выполнен с возможностью опознавания зон сильного поглощения электромагнитного излучения для определения количества частиц или лейкоцитов в пробе. Анализатор изображений может быть выполнен с дополнительной возможностью опознавания черных или темных точек в изображении. Поскольку окрашивающее вещество может накапливаться в ядрах лейкоцитов, то поглощение электромагнитного излучения может характеризоваться максимумами в отдельных местах. Данные места будут формировать черные точки в цифровом изображении и могут классифицировать как лейкоциты.
Анализатор изображений может быть выполнен с возможностью опознавания частиц или лейкоцитов разных типов посредством анализа формы и размеров выявленных зон сильного поглощения электромагнитного излучения в, по меньшей мере, одном цифровом изображении. Поскольку лейкоциты разных типов имеют различающиеся размеры, то тип лейкоцита можно распознать посредством определения размера клетки крови. Кроме того, разные типы могут различно окрашиваться, что приводит к разным формам распознаваемых зон в цифровом изображении. Данный подход можно применять также для опознавания типа лейкоцитов. Лейкоцитарную формулу, характеризующую соотношение лейкоцитов трех разных типов, можно получать посредством анализа размеров клеток крови. Лейкоцитарная формула, различающая пять разных типов лейкоцитов, может потребовать исследования дополнительных особенностей клеток крови. Например, возможен анализ числа ядер каждой клетки крови, интенсивности излучения, проходящего сквозь клетку крови, или формы клетки крови.
Окрашивающее вещество может быть предназначено для селективного окрашивания ядер лейкоцитов. Данный подход предполагает, что лейкоциты можно распознавать как окрашенные точки и поэтому легко различать и подсчитывать в цифровом изображении. Кроме того, для распознавания типа лейкоцитов можно использовать размер окрашенных пятен, так как лейкоциты разных типов имеют разные размеры.
Окрашивающее вещество может быть любым веществом в группе, состоящей из гематоксилина, метиленового синего, метиленового зеленого, метиленового азура, ацетата крезилового фиолетового, толуидинового синего, генцианового фиолетового, аналогов суданового красителя, галлоцианина или аналогов фуксинового красителя или любой их комбинации. Однако следует понимать, что окрашивающее вещество не ограничено упомянутой группой и возможно применение многих других веществ.
Гемолизирующее вещество может быть солью четвертичного аммониевого основания, сапонином, желчной кислотой, например дезоксихолевой кислотой, дигитоксином, змеиным ядом, глюкопиранозидом или неионогенным детергентом типа Тритона. Однако следует понимать, что гемолизирующее вещество не ограничено упомянутой группой и возможно применение многих других веществ.
Измерительное устройство может дополнительно содержать линзу объектива, которая является общей при разных оптических настройках. Данное решение предполагает, что цифровые изображения можно получать формированием изображения вдоль одного и того же оптического пути, чтобы изображения были центрированными относительно одной точки в измерительной полости. Данное решение обеспечивает компактность измерительного устройства.
В соответствии с одним вариантом осуществления система формирования изображения может содержать две, по меньшей мере, частично раздельные части, которые направляют свет от излучаемой пробы в первую и вторую части системы формирования изображения. Данное решение предполагает, что путь света от пробы в систему формирования изображения может быть задан внутри неподвижной оптической установки. Следовательно, измерительное устройство может быть жестким и нечувствительным к ударам.
Система формирования изображения может дополнительно содержать делитель пучка для направления света из линзы объектива к первой или второй части системы формирования изображения. Данное решение предполагает, что первое и второе цифровые изображения можно получать одновременно, благодаря чему возможно очень быстрое выполнение анализа.
Первая часть системы формирования изображения может быть выполнена с возможностью получения света непосредственно из делителя пучка, то есть без установки оптического элемента между первой частью системы формирования изображения и делителем пучка. В альтернативном варианте можно организовать прохождение света непосредственно из линзы объектива в первую часть системы формирования изображения. Тогда для получения второго цифрового изображения в световой путь вместо делителя пучка можно ввести зеркало для отклонения света во вторую часть системы формирования изображения.
Система формирования изображения может дополнительно содержать линзу окуляра между делителем пучка и частью системы формирования изображения, предназначенной для получения цифровых изображений. Следовательно, линза окуляра может обеспечивать дополнительное увеличение пробы для распознавания разных типов лейкоцитов. В предпочтительном варианте применяют линзовые блоки, и тогда линзовый блок окуляра будет перемещать мнимую главную плоскость внутри линзового блока объектива, чтобы изменять расположение плоскости изображения относительно линзового блока объектива для обеспечения возможности дополнительного увеличения.
Система формирования изображения может дополнительно содержать оптический элемент между делителем пучка и частью системы формирования изображения, предназначенной для получения цифровых изображений, для воздействия на изображения клеток, не расположенных в фокусе системы формирования изображения, и тем самым облегчается распознавание лейкоцитов, которые отображаются в фокусе.
Оптический элемент допускает получение изображения пробы по толщине, намного большей, чем глубина резкости системы формирования изображения. Оптический элемент гарантирует, что клетки, которые находятся не в фокусе, могут быть исключены из рассмотрения для повышения достоверности измерения. Поскольку оптический элемент влияет на формирование изображения расфокусированных клеток, то будут легко распознаваться сфокусированные клетки. Оптический элемент может быть выполнен в виде пространственного фильтра, который влияет на формирование изображения клетки так, что край клетки будет содержать выброс интенсивности выше, чем интенсивность фона, когда клетка отображается благодаря поглощению света.
В соответствии с альтернативным вариантом осуществления система формирования изображения может дополнительно содержать элемент кодирования волнового фронта между делителем пучка и второй частью системы формирования изображения. Элемент кодирования волнового фронта преднамеренно искажает лучи света посредством пропускания их через волновую пластинку вогнутой формы, то есть относительно плоской в середине, но с раковиновидными кромками. Данная форма создает особую оптическую аберрацию, изображение представляется нерезким, но дефокусировка идентична в большом диапазоне изменения расстояний. Тем самым данный элемент кодирования волнового фронта увеличивает вдоль оптической оси глубину, которую можно анализировать. Искажения в изображении определяются, главным образом, формой дефокусирующего элемента кодирования волнового фронта, который точно известен. Поэтому компьютер может устранять нерезкость по точкам. Компьютер может декодировать изображение с применением, по существу, цифрового фильтра и формировать тем самым изображение, которое является четким в пределах большой глубины резкости. Таким образом, возможно увеличение глубины резкости системы формирования изображения, что дает возможность отображать в фокусе увеличенную глубину пробы.
В соответствии с другим вариантом осуществления одна часть системы формирования изображения выполнена с возможностью получения как первого, так и второго изображений, и, по меньшей мере, часть увеличительной системы является переключаемой для получения первого и второго цифровых изображений с использованием разных оптических настроек. Данное решение предполагает, что измерительное устройство должно содержать всего лишь одну единственную часть системы формирования изображения. Кроме того, данное решение допускает применение нескольких разных оптических настроек, например, посредством обеспечения главной линзы, которую можно перемещать между строго заданными положениями вдоль оптической оси.
Система формирования изображения может быть выполнена с более высоким коэффициентом увеличения при оптических настройках, применяемых для получения второго цифрового изображения, чем при оптических настройках, применяемых для получения первого цифрового изображения. Данное решение предполагает, что во втором цифровом изображении детали могут просматриваться лучше, благодаря чему лейкоциты разных типов можно легче отличать один от другого.
Система формирования изображения с оптическими настройками, применяемыми для получения первого цифрового изображения, может иметь коэффициент увеличения 1-50 крат, предпочтительнее 1-20 крат, предпочтительнее 3-20 крат, предпочтительнее 3-10 крат и предпочтительнее приблизительно 4 крат. С коэффициентом увеличения в приведенных диапазонах лейкоциты достаточно увеличиваются для их обнаружения, тогда как система формирования изображения может быть выполнена с возможностью отображения толщины пробы с наводкой на фокус, достаточной, чтобы оценить количество клеток крови в изображении. Таким образом, система формирования изображения может иметь глубину резкости, охватывающую толщину пробы. Однако вся толщина пробы не обязательно должна отображаться в пределах глубины резкости системы формирования изображения при использовании обычного толкования глубины резкости. Клетки, которые отображаются немного не в фокусе, все же можно правильно подсчитывать с использованием умело разработанного метода анализа изображений. Небольшой коэффициент увеличения предполагает, что можно получить большую «глубину резкости». Следовательно, можно обеспечить большую толщину пробы и можно анализировать большой объем. Однако, если применяют небольшой коэффициент увеличения, то обнаружение лейкоцитов может быть сложной задачей, так как каждая клетка крови отображается на поверхности очень малого числа пикселей, например 3-4 пикселей. Небольшой коэффициент увеличения можно применять при увеличении числа пикселей в полученном изображении, то есть при повышении разрешения в цифровом изображении. Таким образом можно применить оптическое увеличение 1-4 крат, при этом все же с возможностью обнаружения лейкоцитов.
Система формирования изображения с оптической настройкой, применяемой для получения второго цифрового изображения, может иметь коэффициент увеличения 1-50 крат, предпочтительнее 1-20, крат, предпочтительнее 3-20 крат, предпочтительнее 5-20 крат и предпочтительнее приблизительно 10 крат. С коэффициентом увеличения в приведенных диапазонах лейкоциты достаточно увеличиваются для распознавания разных типов лейкоцитов. Меньший коэффициент увеличения можно применить при использовании оптического элемента для выделения клеток, которые отображаются в фокусе, и облегчения распознавания данных клеток.
Система формирования изображения может быть выполнена с возможностью получения первого изображения с глубиной резкости, равной, по меньшей мере, толщине измерительной полости пробоотборного устройства. Данное решение предполагает, что получают достаточно сфокусированное изображение всей толщины пробы, чтобы всю толщину измерительной полости можно было анализировать одновременно в цифровом изображении пробы. Следовательно, устранена необходимость ожидания, пока лейкоциты осаждаются в измерительной полости, что сокращает время выполнения анализа. Однако, возможно, остается необходимость ожидать окончания реакции взаимодействия, вызывающей гемолиз эритроцитов, и успокоения перемещений, вызванных введением пробы в измерительную полость. Времена такого ожидания должны бы очень короткими, порядка 30 секунд или меньше. При выборе метода с не очень резкой фокусировкой на конкретную часть пробы получают достаточную фокусировку пробы по всей толщине, чтобы можно было определить количество лейкоцитов в пробе. Данный подход предполагает, что лейкоциты могут быть несколько нерезкими и все же считаться сфокусированными в силу расположения в пределах глубины резкости. Таким образом, анализируемый объем пробы может быть строго задан толщиной измерительной полости и размером цифрового изображения, задающим отображаемую площадь поперечного сечения измерительной полости.
Система формирования изображения может быть выполнена с возможностью получения первого изображения с глубиной резкости в пределах 50-200 микрометров. Данную глубину резкости можно отрегулировать соответственно глубине или толщине измерительной полости. Толщина, по меньшей мере, 50 микрометров позволяет анализировать больший объем крови по небольшой площади поперечного сечения и тем самым избегнуть сжатия клеток крови в монослой. Следовательно, с использованием относительно небольшого изображения пробы крови можно анализировать объем пробы крови, достаточно большой для получения надежных значений количества лейкоцитов. Кроме того, сложно получать глубину резкости свыше 200 микрометров с получением в то же время цифрового изображения с достаточным увеличением. Даже получение глубины резкости свыше 170 микрометров является сложной задачей.
Система формирования изображения может быть выполнена с возможностью получения второго изображения с глубиной резкости в пределах 2-60 микрометров. Данную глубину резкости можно получать посредством формирования изображения участка по толщине измерительной полости. В данном случае только упомянутый участок толщины измерительной полости отображается в фокусе. Затем второе цифровое изображение анализируется посредством учета только тех лейкоцитов, которые отображаются достаточно сфокусированными для определения их типа. Поскольку второе цифровое изображение используют для определения соотношения лейкоцитов разных типов, то формирование изображения строго определенного объема не имеет существенного значения. Следовательно, соответствующие первое и второе изображения можно получать посредством отображения одного и того же участка измерительной полости. Однако, в альтернативном варианте, второе изображение можно получать отображением другого участка измерительной полости, в силу чего, данный участок может иметь толщину, соответствующую глубине резкости системы формирования изображения для получения второго изображения.
Анализатор изображений может быть выполнен с возможностью электронного увеличения, по меньшей мере, одного полученного изображения. Хотя пробу увеличивают для получения увеличенного цифрового изображения пробы, само полученное цифровое изображение может быть увеличено в электронике для упрощения различения объектов, которые отображаются очень близко один к другому в получаемом цифровом изображении.
В соответствии с другим аспектом изобретения предлагается пробоотборное устройство для определения количества лейкоцитов в пробе крови. Пробоотборное устройство содержит измерительную полость для вмещения пробы крови. Измерительная полость имеет первую и вторую предварительно заданные фиксированные толщины, ограниченные между внутренними стенками измерительной полости, при этом первая толщина предназначена для определения общего объемного количества лейкоцитов в пробе крови, а вторая толщина предназначена для определения соотношения лейкоцитов разных типов в пробе крови. Пробоотборное устройство дополнительно содержит реагент, который размещен в сухой форме на поверхности, ограничивающей измерительную полость. Реагент содержит гемолизирующее вещество для лизиса эритроцитов в пробе крови и окрашивающее вещество для селективного окрашивания лейкоцитов в пробе крови.
Пробоотборное устройство обеспечивает возможность непосредственного отбора пробы цельной крови в измерительную полость и представления ее для анализа. Необходимость подготовки пробы отсутствует. Фактически проба крови может всасываться в измерительную полость непосредственно из уколотого пальца пациента. Снабжение пробоотборного устройства реагентом допускает взаимодействие внутри пробоотборного устройства, что подготавливает пробу к анализу. Взаимодействие начинается, когда проба крови приходит в контакт с реагентом. Следовательно, отсутствует необходимость в ручном приготовлении пробы, вследствие чего анализ особенно пригоден для выполнения непосредственно в смотровом кабинете, пока пациент ожидает.
Поскольку реагент обеспечен в сухой форме, пробоотборное устройство можно транспортировать и хранить длительное время без ущерба для применимости пробоотборного устройства. Следовательно, пробоотборное устройство с реагентом можно изготавливать и подготавливать задолго до выполнения анализа пробы крови.
В то время как многие существующие способы могут подсчитывать разные клетки крови и даже подгруппы клеток крови, пробоотборное устройство в соответствии с изобретением специально предназначено для осуществления подсчета количества лейкоцитов. Реагент содержит гемолизирующее вещество, которое будет подвергать лизису эритроцитов в пробе крови. Упомянутый лизис сводит к нулю вероятность подсчета эритроцитов в крови. С другой стороны, лизис эритроцитов упрощает различение и распознавание лейкоцитов в пробе крови.
Окрашивающее вещество обеспечивает маркировку отдельных лейкоцитов. Упомянутая маркировка допускает просмотр или обнаружение отдельных лейкоцитов. Лейкоциты можно обнаружить, например, сканированием измерительной полости или получением изображения измерительной полости.
Пробоотборное устройство дополнительно обеспечивает первую толщину измерительной полости, специально предназначенную для облегчения определения объемного количества лейкоцитов. Измерительная полость может иметь достаточную толщину, чтобы допускать анализ довольно большого объема пробы крови и поэтому обеспечивать надежные статистические данные для определения объемного количества лейкоцитов. Таким образом, объемное количество лейкоцитов можно получать суммированием количества обнаруживаемых по отдельности лейкоцитов в определенном объеме.
Пробоотборное устройство обеспечивает также вторую толщину измерительной полости, специально предназначенную для облегчения распознавания разных типов лейкоцитов. Для этого вторая толщина может быть меньше, чем первая толщина, что дает возможность формирования изображения по всей второй толщине в пределах глубины резкости при большем увеличении. Упомянутое большее увеличение может потребоваться при распознавании разных типов лейкоцитов по сравнению с простой задачей определения общего количества лейкоцитов независимо от их типа внутри пробы крови.
Пробоотборное устройство может содержать корпусной элемент, имеющий две плоские поверхности, формирующие внутренние стенки для ограничения упомянутой измерительной полости. Плоские поверхности могут располагаться на предварительно заданном расстоянии одна от другой для определения глубины или толщины пробы для оптического измерения. Данное решение предполагает, что пробоотборное устройство обеспечивает строго определенную глубину или толщину для оптического измерения, которую можно использовать для точного определения количества лейкоцитов на единицу объема пробы крови. Объем анализируемой пробы будет точно задан толщиной измерительной полости и отображаемой площадью пробы. Следовательно, точно заданный объем можно использовать для привязки количества лейкоцитов к объему пробы крови, чтобы определить объемное количество лейкоцитов.
Измерительная полость предпочтительно имеет первую равномерную толщину 50-200 микрометров. Толщина, по меньшей мере, 50 микрометров предполагает, что измерительная полость не вызывает растягивания пробы крови в монослой, что дает возможность анализировать больший объем крови по небольшой площади поперечного сечения. Таким образом, с использованием относительно небольшого изображения пробы крови можно анализировать объем пробы крови, достаточно большой для получения надежных значений количества лейкоцитов. В более предпочтительном варианте первая толщина составляет, по меньшей мере, 100 микрометров, что позволяет выполнять анализ по еще меньшей площади поперечного сечения или еще большему объему пробы. Кроме того, первая толщина, по меньшей мере, 50 микрометров и, предпочтительнее, 100 микрометров также упрощает изготовление измерительной полости, имеющей строго определенную толщину между двумя плоскими поверхностями.
Для большинства проб, находящихся в полости, имеющей толщину не более чем 200 микрометров, количество лейкоцитов является настолько малым, что будут иметь место лишь незначительные отклонения, вызываемые расположением лейкоцитов с перекрытием между собой. Тем не менее, эффект упомянутых отклонений будет зависеть от количества лейкоцитов и поэтому может быть, по меньшей мере, до некоторой степени устранен путем статистической коррекции результатов, по меньшей мере, для больших значений количеств лейкоцитов. Упомянутая статистическая коррекция может осуществляться на основании калибровок измерительного устройства. Отклонения будут даже меньше для измерительной полости, имеющей первую толщину не более чем 170 микрометров, и даже меньше для измерительной полости, имеющей первую толщину не более, чем 150 микрометров, вследствие чего можно применять более простую калибровку. С упомянутой толщиной может даже не требоваться никакая калибровка для учета перекрывающихся клеток крови.
Кроме того, первая толщина измерительной полости достаточно мала, чтобы допускать получение измерительным устройством цифрового изображения таким образом, чтобы можно было одновременно производить анализ по всей толщине измерительной полости. Поскольку в измерительном устройстве предусмотрено применение системы увеличения, то получение большой глубины резкости является нелегкой задачей. Поэтому для одновременного анализа всей толщины в цифровом изображении было бы целесообразно, чтобы первая толщина измерительной полости не превосходила 150 микрометров. Глубину резкости можно настроить на работу со 170-микрометровой или даже 200-микрометровой первой толщиной измерительной полости.
Измерительная полость предпочтительно имеет вторую равномерную толщину 20-60 микрометров. Данная вторая толщина измерительной полости допускала бы отображение всей второй толщины в пределах глубины резкости при увеличении, необходимом для распознавания лейкоцитов разных типов. Кроме того, вторая толщина еще может допускать формирование изображения объема, достаточного для анализа значительного количества лейкоцитов. Такое количество позволило бы определять соотношение разных типов лейкоцитов с высокой статистической достоверностью. Обычно желательно подвергать анализу тип 200 лейкоцитов.
Пробоотборное устройство можно снабдить реагентом, который нанесен на поверхность в состоянии, растворенном в быстроиспаряющейся жидкости, которая после испарения оставляет реагент в сухой форме.
Как уже понятно, реагент растворяют предпочтительно в быстроиспаряющейся жидкости перед введением в измерительную полость. Данное решение предполагает, что жидкость может эффективно испаряться из узкого пространства измерительной полости во время изготовления и подготовки пробоотборного устройства. Реагент может находиться предпочтительно в сухой форме в части измерительной полости с первой толщиной.
Реагент можно растворять предпочтительно в органическом растворителе и, предпочтительнее, можно растворять в метаноле. Данные растворители являются быстроиспаряющимися и могут применяться соответственно для высушивания реагента на поверхности измерительной полости.
Пробоотборное устройство может дополнительно содержать впускное отверстие для пробы, обеспечивающее сообщение измерительной полости с наружной стороной пробоотборного устройства, при этом впускное отверстие выполнено с возможность отбора пробы крови. Впускное отверстие для пробы может быть выполнено с возможностью втягивания пробы крови капиллярной силой, и измерительная полость может дополнительно втягивать кровь из впускного отверстия в полость. Кроме того, пробоотборное устройство может быть выполнено с возможностью транспортирования сначала пробы в участок измерительной полости с первой толщиной. Затем часть пробы может дополнительно транспортироваться капиллярной силой в участок измерительной полости со второй толщиной. В результате пробу крови можно легко отбирать в измерительную полость простым приведением впускного отверстия для пробы в контакт с кровью. Тогда капиллярные силы впускного отверстия для пробы и измерительной полости будут втягивать строго определенное количество крови в измерительную полость. В альтернативном варианте пробу крови можно всасывать или втягивать в измерительную полость посредством приложения внешнего откачивающего воздействия к пробоотборному устройству. В соответствии с другим альтернативным вариантом пробу крови можно отбирать в пипетку и затем вводить в измерительную полость пипеткой.
Пробоотборное устройство может быть одноразовым, т.е. созданным только для разового применения. Пробоотборное устройство обеспечивает набор для выполнения подсчета лейкоцитов, так как пробоотборное устройство может вмещать пробу крови и вмещать все реагенты, необходимые для подготовки пробы к подсчету клеток. В данной форме пробоотборное устройство особенно доступно, так как предназначено только для однократного использования и может быть сформировано без учета возможностей очистки пробоотборного устройства и повторного нанесения реагента. Кроме того, пробоотборное устройство можно формовать из пластикового материала и тем самым изготавливать с небольшими затратами. Следовательно, применение одноразового пробоотборного устройства может быть по-прежнему экономичным.
Изобретение относится также к компьютерному программному продукту, содержащемуся на машиночитаемом носителе информации, для анализа пробы, при этом упомянутый продукт содержит: компьютерный код для цифрового анализа, по меньшей мере, одного изображения пробы для определения количества частиц в пробе; компьютерный код для цифрового анализа, по меньшей мере, одного изображения пробы для распознавания, по меньшей мере, одного типа частиц в сфокусированной области пробы, при этом каждый тип частицы соответствует, по меньшей мере, одной характерной физической особенности; компьютерный код для выдачи информации, соответствующей количеству и типам частиц в пробе. Изобретение относится также к компьютерной программе для анализа пробы, при этом компьютерная программа содержит компьютерный программный код для анализа, по меньшей мере, одного цифрового изображения для распознавания частиц и определения количества частиц в пробе и анализа, по меньшей мере, одного цифрового изображения для распознавания частиц, которые отображаются в фокусе, и определения типов и количества упомянутых частиц, при этом типы распознаются по физическим особенностям частиц, благодаря чему определяется соотношение частиц разных типов в пробе.
Краткое описание чертежей
Ниже приведено подробное описание изобретения на примерах со ссылкой на прилагаемые чертежи.
Фиг. 1 - схематичное изображение пробоотборного устройства.
Фиг. 2 - схематичная блок-схема измерительного устройства в соответствии с первым вариантом осуществления.
Фиг. 3 - схематичная блок-схема измерительного устройства в соответствии со вторым вариантом осуществления.
Фиг. 4 - блок-схема последовательности операций способа в соответствии с первым вариантом осуществления изобретения.
Фиг. 5 - схематичное изображение компоновки подвижной линзы в соответствии с вариантом осуществления изобретения.
Фиг. 6 - схематичное изображение компоновки в соответствии с вариантом осуществления изобретения.
Фиг. 7 - изображение пробы, представленной в трех разных слоях.
Фиг. 8a - изображение лейкоцита в поле зрения камеры, когда лейкоцит расположен не в фокусе измерительного устройства в соответствии с фиг. 10.
Фиг. 8b - изображение лейкоцита в поле зрения камеры, когда лейкоцит расположен в фокусе измерительного устройства в соответствии с фиг. 10.
Фиг. 8c - изображение лейкоцита в поле зрения камеры, когда лейкоцит расположен не в фокусе измерительного устройства в соответствии с фиг. 10.
Фиг. 9a - изображение зарегистрированных интенсивностей в сечении лейкоцита, подлежащего анализу, когда лейкоцит расположен не в фокусе измерительного устройства в соответствии с фиг. 10.
Фиг. 9b - изображение зарегистрированных интенсивностей в сечении лейкоцита, подлежащего анализу, когда лейкоцит расположен в фокусе измерительного устройства в соответствии с фиг. 10.
Фиг. 9c - изображение зарегистрированных интенсивностей в сечении лейкоцита, подлежащего анализу, когда лейкоцит расположен не в фокусе измерительного устройства в соответствии с фиг. 10.
Фиг. 10 - схематичное изображение измерительного устройства в соответствии с третьим вариантом осуществления.
Фиг. 11 - блок-схема последовательности операций способа в соответствии со вторым вариантом осуществления изобретения.
Фиг. 12 - схематичное изображение измерительного устройства в соответствии с четвертым вариантом осуществления.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
Описание пробоотборного устройства 10 в соответствии с первым вариантом осуществления приведено ниже со ссылкой на фиг. 1. Пробоотборное устройство 10 предпочтительно является одноразовым и подлежит выбросу после использования для анализа. Данное условие подразумевает, что пробоотборное устройство 10 не нуждается в сложном обращении. Пробоотборное устройство 10 предпочтительно сформировано из пластикового материала и может быть изготовлено литьевым прессованием. Данное решение упрощает и удешевляет изготовление пробоотборного устройства 10, следовательно, можно не допустить повышения стоимости пробоотборного устройства 10.
Пробоотборное устройство 10 содержит корпусной элемент 12, который имеет основание 14, до которого может дотрагиваться оператор без причинения каких-либо помех результатам анализа. Основание 14 может иметь также выступы 16, которые могут плотно входить в держатель в устройстве анализа. Выступы 16 могут быть расположены так, чтобы пробоотборное устройство 10 правильно располагалось в устройстве анализа.
Пробоотборное устройство 10 дополнительно содержит впускное отверстие 18 для пробы. Впускное отверстие 18 для пробы ограничено между противоположными стенками внутри пробоотборного устройства 10, при этом стенки расположены так близко между собой, что во впускном отверстии 18 для пробы может создаваться капиллярная сила. Впускное отверстие 18 для пробы сообщается с наружной стороной пробоотборного устройства 10, чтобы обеспечивать возможность втягивания крови в пробоотборное устройство 10. Пробоотборное устройство 10 дополнительно содержит камеру для подсчета лейкоцитов в форме измерительной полости 20, расположенной между противоположными стенками внутри пробоотборного устройства 10. Измерительная полость 20 по своему построению сообщается с впускным отверстием 18 для пробы. Стенки, ограничивающие измерительную полость 20, расположены ближе между собой, чем стенки впускного отверстия 18 для пробы, чтобы капиллярная сила могла втягивать кровь из впускного отверстия 18 для пробы в измерительную полость 20.
Измерительная полость 20 содержит первый участок 20a, имеющий первую толщину, и второй участок 20b, имеющий вторую, меньшую, толщину. Первый участок 20a сообщается с впускным отверстием 18 для пробы, а второй участок 20b сообщается с первым участком 20a. Таким образом, капиллярная сила может втягивать кровь из первого участка 20a измерительной полости 20 во второй участок 20b.
Стенки первого участка 20a измерительной полости 20 расположены на расстоянии 50-200 микрометров одна от другой. В более предпочтительном варианте первый участок 20a имеет толщину, по меньшей мере, 100 микрометров. Кроме того, в более предпочтительном варианте первый участок 20a имеет толщину не менее чем 150 микрометров. Расстояние является обычно одинаковым по всему первому участку 20a. Толщина первого участка 20a определяет исследуемый объем крови. Поскольку результат анализа следует сравнивать с исследуемым объемом пробы крови, то, как правило, равномерная толщина первого участка 20a должна быть очень точной, т.е. допускаются лишь очень малые вариации толщины между первыми участками 20a разных пробоотборных устройств 10. Толщину выбирают так, чтобы обеспечивать возможность анализа относительно больших объемов проб в небольшой зоне полости, то есть, чтобы для подсчета было доступно достаточное количество частиц или клеток. Первый участок 20a измерительной полости 20, в частности, выполнен с возможностью определения объемного общего количества лейкоцитов в пробе крови. Полную толщину первого участка 20a можно выбирать для создания возможности формирования его изображения в пределах глубины резкости системы формирования изображения. Затем можно анализировать изображение и можно подсчитывать количество лейкоцитов, присутствующих в изображении, для определения объемного количества лейкоцитов.
9
9
9
9
Пробоотборное устройство 10 обычно выполнено с возможностью измерения количеств лейкоцитов свыше 0,5·10 клеток/литр крови. При намного меньших количествах лейкоцитов объем пробы будет слишком малым для того, чтобы можно было подсчитать статистически значимые содержания лейкоцитов. Кроме того, когда количество лейкоцитов превосходит 12·10 клеток/литр крови, эффект расположения клеток крови с перекрытием между собой начнет сильно сказываться на измеренном количестве лейкоцитов. При описанном количестве лейкоцитов лейкоциты будут покрывать приблизительно 8% сечения анализируемой пробы, если толщина первого участка 20a составляет 140 микрометров. Таким образом, чтобы получать точные количества лейкоцитов, потребуется учитывать упомянутый эффект. Поэтому можно применять статистическую поправку значений количеств лейкоцитов выше 12·10 клеток/литр крови. Упомянутая статистическая поправка будет возрастать с увеличением количеств лейкоцитов, поскольку эффект перекрытия клеток крови усиливается с увеличением количеств лейкоцитов. Статистическую поправку можно определять посредством калибровки измерительного устройства. В качестве альтернативы, статистическую поправку можно определять при общем уровне для установки измерительных устройств, подлежащих использованию в связи с пробоотборным устройством 10. Упомянутая статистическая поправка имеет величину, сходную с величинами статистических поправок, которые в настоящее время вносят в устройствах анализа, которые используют принцип Культера. Предполагается, что пробоотборное устройство 10 можно применять для анализа количеств лейкоцитов до 50·10 клеток/литр крови.
Второй участок 20b измерительной полости 20, в частности, выполнен с возможностью определения соотношения разнотипных лейкоцитов в пробе крови. Полная толщина второго участка 20b должна отображаться в пределах глубины резкости системы формирования изображения. Затем можно анализировать изображение и можно подсчитывать количество лейкоцитов каждого типа, присутствующих в изображении, чтобы определить соотношение лейкоцитов разных типов.
Стенки второго участка 20b измерительной полости 20 расположены на расстоянии 20-60 микрометров одна от другой. Расстояние обычно является равномерным по всему второму участку 20b. Поскольку анализ предназначен, главным образом, для сравнения количеств лейкоцитов разных типов между собой, то знание точного анализируемого объема некритично. Поэтому толщина второго участка 20b не обязательно должна быть такой же точной, как толщина первого участка 20a. Толщина второго участка 20b должна допускать анализ достаточного количества лейкоцитов, чтобы получать статистически значимые результаты. Кроме того, как указано выше, толщина второго участка 20b должна быть выполнена с возможностью формирования изображения полностью в пределах поля зрения системы формирования изображения. Таким образом, все лейкоциты в пробе отображаются в фокусе, и анализ пробы не затрудняется помехой в изображении от частей пробы, отображаемых не в фокусе. Второй участок 20b тоньше, чем первый участок 20a, чтобы допускать применение большего увеличения и при этом допускать формирование изображения всего второго участка в пределах глубины резкости системы формирования изображения. Большее увеличение может потребоваться, чтобы допускать не только подсчет общего количества лейкоцитов, но также определение типа лейкоцитов.
Поверхность стенки измерительной полости 20, по меньшей мере, частично покрывают реагентом 22. Реагент 22 может быть лиофилизирован, термически просушен или просушен в вакууме и нанесен на поверхность измерительной полости 20. Когда пробу крови отбирают в измерительную полость 20, кровь приходит в контакт с просушенным реагентом 22 и начинается взаимодействие между реагентом 22 и кровью.
Реагент 22 наносят введением реагента 22 в измерительную полость 20 с помощью пипетки или дозатора. Реагент 22 растворен в легкоиспаряющейся жидкости, например органическом растворителе, например метаноле, при введении в измерительную полость 20. Растворитель с реагентом 22 может наполнять измерительную полость 20. Затем выполняют просушку, чтобы растворитель испарился и реагент 22 пристал к поверхностям измерительной полости 20.
Поскольку реагент приходится наносить сушкой на поверхность узкого пространства, то жидкость будет иметь очень малую поверхность контакта с окружающей атмосферой, из-за чего испарение жидкости будет осуществляться медленно. Следовательно, полезно применять легкоиспаряющуюся жидкость, например метанол, который является жидкостью, способной эффективно испаряться из узкого пространства измерительной полости.
В соответствии с альтернативным способом изготовления пробоотборное устройство 10 можно формировать скреплением между собой двух деталей, из которых одна деталь формирует нижнюю стенку измерительной полости 20, а другая деталь формирует верхнюю стенку измерительной полости 20. Данное решение обеспечивает возможность сушки реагента 22 на открытой поверхности перед скреплением между собой двух деталей. Следовательно, реагент 22 можно растворять в воде, и тогда растворитель не обязательно должен быть легкоиспаряющимся.
Реагент 22 содержит разрушающее эритроциты или гемолизирующее вещество и окрашивающее лейкоциты вещество. Гемолизирующее вещество может быть солью четвертичного аммониевого основания, сапонином, желчной кислотой, например дезоксихолевой кислотой, дигитоксином, змеиным ядом, глюкопиранозидом или неионогенным детергентом типа Тритона. Окрашивающее вещество может быть гематоксилином, метиленовым синим, метиленовым зеленым, метиленовым азуром, ацетатом крезилового фиолетового, толуидиновым синим, генциановым фиолетовым, аналогом суданового красителя, галлоцианином или аналогом фуксинового красителя или любой их комбинацией. Когда проба крови приходит в контакт с реагентом 22, гемолизирующее вещество начнет подвергать лизису эритроциты так, что разрушенные эритроциты будут смешиваться с плазмой крови. Кроме того, окрашивающее вещество будет накапливаться в ядрах лейкоцитов. Реагент 22 должен содержать достаточные количества окрашивающего вещества, чтобы отчетливо окрашивать все ядра лейкоцитов. Таким образом, окрашивающее вещество будет часто присутствовать в избытке, который будет перемешиваться в плазме крови. Избыток окрашивающего вещества будет создавать равномерный низкий фоновый уровень окрашивающего вещества в плазме крови. Окрашивающее вещество, накапливаемое в лейкоцитах, будет отличаться от фонового уровня окрашивающего вещества.
Реагент 22 может также содержать другие составляющие, которые могут быть активными, т.е. принимать участие в химическом взаимодействии с пробой крови, или неактивными, т.е. не принимать участие в химическом взаимодействии с пробой крови. Активные составляющие могут быть предназначены, например, для катализа гемолизирующего или окрашивающего действия. Неактивные составляющие могут быть предназначены, например, для совершенствования сцепления реагента 22 с поверхностью стенки измерительной полости 20.
В течение несколько минут или даже меньше, чем за минуту, проба крови будет взаимодействовать с реагентом 22, чтобы разрушились эритроциты и окрашивающее вещество накопилось в ядрах лейкоцитов.
Ниже со ссылкой на фиг. 2 приведено описание первого варианта осуществления измерительного устройства 30 для анализа лейкоцитов в пробе крови. Устройство 30 содержит держатель 32 пробы для вмещения пробоотборного устройства 10 с пробой крови. Держатель 32 пробы выполнен с возможностью вмещения пробоотборного устройства 10 таким образом, чтобы измерительная полость 20 пробоотборного устройства 10 правильно устанавливалась внутри устройства 30. Устройство 30 содержит источник 34 света для облучения пробы крови внутри пробоотборного устройства 10. Источник 34 света может быть лампой накаливания, которая излучает свет во всем диапазоне видимого спектра. Окрашивающее вещество, которое накапливается в ядрах лейкоцитов, будет поглощать свет конкретных длин волн, чтобы ядра лейкоцитов появлялись на цифровом изображении пробы. Если снимается цветное изображение, то лейкоциты будут проявляться в виде специально окрашенных точек. Если снимается черно-белое изображение, то лейкоциты будут проявляться в виде темных точек на более светлом фоне.
В альтернативном варианте источник 34 света может быть лазером или светодиодом. Данный вариант можно применять для повышения контраста в изображении, чтобы можно было удобнее обнаруживать лейкоциты. В данном случае источник 34 света выполнен с возможностью излучения электромагнитного излучения с длиной волны, которая соответствует максимуму поглощения окрашивающего вещества. Длину волны следует дополнительно выбирать так, чтобы поглощение нелейкоцитарных компонентов крови было сравнительно низким. Кроме того, стенки пробоотборного устройства 10 должны быть, по существу, прозрачными на данной длине волны. Например, когда окрашивающим веществом служит метиленовый синий, источник 34 света может располагаться с возможностью облучения светом с длиной волны 667 нм.
Устройство 30 дополнительно содержит систему 36 формирования изображения, которая располагается со стороны держателя 32 пробы, противоположной источнику 34 света. Таким образом, система 36 формирования изображения расположена с возможностью получения излучения, которое прошло сквозь пробу крови. Система 36 формирования изображения в данном варианте осуществления содержит увеличительное средство 38, которое разделено на две отдельные части. Первая часть 38a увеличительного средства 38 выполнена с возможностью получения излучения, которое прошло сквозь пробу крови в первом участке 20a измерительной полости 20. Система формирования изображения дополнительно содержит первое средство 40 получения изображения, которое выполнено с возможностью получения изображения первого участка 20a измерительной полости 20, увеличенного первой частью 38a увеличительного средства 38. Первая часть 38a увеличительного средства 38 выполнена с возможностью обеспечения оптического увеличения 1-50 крат, предпочтительнее 1-20 крат и наиболее предпочтительно 1-4 крат. При оптическом увеличении в указанных пределах возможно различение лейкоцитов. Изображение можно получать с повышенным разрешением, чтобы допускать применение меньшего оптического увеличения. Кроме того, глубину резкости первой части 38a увеличительного средства 38 можно установить так, чтобы охватывать толщину измерительной полости 20.
Первая часть 38a увеличительного средства 38 содержит линзу или систему 42 линз объектива, которая расположена вплотную к держателю пробы 32, и линзу или систему 44 линз окуляра, которая расположена на расстоянии от линзы 42 объектива. Каждая из линзы или системы 42 линз объектива и линзы или системы 44 линз окуляра может содержать одну или множество отдельных линз или других оптических компонентов. Линза 42 объектива обеспечивает первое увеличение пробы, которая дополнительно увеличивается линзой 44 окуляра. Увеличительное средство 38 может содержать дополнительные линзы для достижения соответствующего увеличения и формирования изображения пробы. Первая часть 38a увеличительного средства 38 расположена так, чтобы проба в первом участке 20a измерительной полости 20 при помещении в держатель 32 пробы фокусировалась в плоскость изображения первого средства 40 получения изображения.
Первое средство 40 получения изображения выполнено с возможностью получения первого цифрового изображения пробы. Первое средство 40 получения изображения может быть цифровой камерой любого вида, например камерой CCD или CMOS. Упоминание цифровой камеры в настоящем описании следует считать всего лишь одним вариантом осуществления участка анализа изображения. Размер пикселя цифровой камеры налагает на систему 36 формирования изображения ограничение в том, что кружок нерезкости в плоскости изображения не может превосходить размер пикселя в пределах глубины резкости. Однако лейкоциты еще можно обнаруживать, даже если они являются несколько нерезкими, и поэтому можно допускать кружок нерезкости больше размера пикселя, пока считают его находящимся в пределах глубины резкости согласно определению в этом смысле. Следовательно, для целей настоящего описания термин «глубина резкости» будет означать длину в направлении по оптической оси, вдоль которой строится изображение, достаточно сфокусированное, чтобы допускать анализ изображения для опознавания клеток, расположенных в пределах упомянутой длины. Данная «глубина резкости» может отличаться от традиционной глубины, задаваемой оптическими настройками, и может зависеть от конкретного анализа изображения, который следует выполнять.
Цифровая камера 40 будет получать первое цифровое изображение пробы в первом участке 20a измерительной полости 20, при этом проба по всей глубине в первом цифровом изображении будет достаточно сфокусированной для подсчета лейкоцитов. Система 36 формирования изображения будет ограничивать зону первого участка 20a измерительной полости 20, которая будет отображаться в первом цифровом изображении. Отображаемая зона вместе с толщиной первого участка 20a измерительной полости 20 задает отображаемый объем пробы.
Вторая часть 38b увеличительного средства 38 выполнена с возможностью получения излучения, которое прошло сквозь пробу крови во втором участке 20b измерительной полости 20. Система формирования изображения дополнительно содержит второе средство 41 получения изображения, которое выполнено с возможностью получения изображения второго участка 20b измерительной полости 20, увеличенного второй частью 38b увеличительного средства 38. Вторая часть 38b увеличительного средства 38 выполнена с возможностью обеспечения оптического увеличения 5-200 крат, предпочтительнее 5-100 крат и наиболее предпочтительно 5-20 крат. При оптическом увеличении в указанных пределах возможно различение лейкоцитов. Изображение можно получать с повышенным разрешением, чтобы допускать применение меньшего оптического увеличения. Кроме того, глубину резкости второй части 38b увеличительного средства 38 можно еще установить так, чтобы охватывать толщину измерительной полости 20.
Аналогично первой части 38a вторая часть 38b увеличительного средства 38 также содержит линзу или систему 43 линз объектива, которая расположена вплотную к держателю пробы 32, и линзу или систему 45 линз окуляра, которая расположена на расстоянии от линзы 43 объектива. И в данном случае каждая из линзы или системы 43 линз объектива и линзы или системы 45 линз окуляра может содержать одну или множество линз или других оптических компонентов. Линза 43 объектива обеспечивает первое увеличение пробы, которая дополнительно увеличивается линзой 45 окуляра. Увеличительное средство 38 может содержать дополнительные линзы или другие оптические компоненты для достижения соответствующего увеличения и формирования изображения пробы. Вторая часть 38b увеличительного средства 38 расположена так, чтобы проба во втором участке 20b измерительной полости 20 при помещении в держатель 32 пробы фокусировалась в плоскость изображения второго средства 41 получения изображения.
Первое средство 41 получения изображения выполнено с возможностью получения второго цифрового изображения пробы. Второе средство 41 получения изображения может быть цифровой камерой любого вида, например камерой ССD или CMOS. Поскольку второе изображение предназначено для определения разных типов лейкоцитов, то кружок нерезкости в плоскости изображения не может превосходить размер пикселя в пределах глубины резкости. Цифровая камера 41 будет получать второе цифровое изображение пробы во втором участке 20b измерительной полости 20, при этом проба по всей толщине во втором цифровом изображении будет достаточно сфокусированной для распознавания типа присутствующих лейкоцитов.
Система 36 формирования изображения может быть выполнена с возможностью формирования изображения проб крови в пробоотборном устройстве 10 без необходимости регулировки системы 36 формирования изображения. В предпочтительном варианте система 36 формирования изображения расположена в корпусе, который удерживает систему формирования изображения в зафиксированном положении относительно держателя пробы.
Устройство 30 дополнительно содержит анализатор 46 изображений. Анализатор 46 изображений подключен к первой и второй цифровым камерам 40, 41 для приема первого и второго цифровых изображений, полученных цифровыми камерами 40, 41. Анализатор 46 изображений выполнен с возможностью распознавания образов в первом цифровом изображении, которые соответствуют лейкоциту для подсчета количества лейкоцитов, присутствующих в цифровом изображении. Таким образом, анализатор 46 изображений может быть с возможностью опознавания темных точек на более светлом фоне. Анализатор 46 изображений может быть выполнен с возможностью первого электронного увеличения цифрового изображения перед анализом цифрового изображения. Упомянутая возможность предполагает, что анализатор 46 изображений может легче различать лейкоциты, которые отображаются ближе один к другому, даже несмотря на то, что электронное увеличение цифрового изображения будет делать цифровое изображение несколько нерезким.
Анализатор 46 изображений может содержать процессор, выполненный с возможностью получения информации об изображении от первой и второй цифровых камер 40, 41. Процессор может быть сконфигурирован с программными средствами или алгоритмами, которые служат для анализа изображений и точные характеристики которых, например, могут быть адаптированы для выполнения анализов, описанных в настоящем описании.
Анализатор 46 изображений может вычислять количество лейкоцитов на единицу объема крови путем деления количества лейкоцитов, опознанных в первом цифровом изображении на объем пробы крови, который строго задан, как описано выше. Объемное количество лейкоцитов может представляться на дисплее устройства 30.
Анализатор 46 изображений дополнительно выполнен с возможностью распознавания образов во втором цифровом изображении, которые соответствуют лейкоциту для подсчета количества лейкоцитов, присутствующих в цифровом изображении. Анализатор 46 изображений будет дополнительно анализировать форму и размер каждого обнаруженного лейкоцита, чтобы определять тип лейкоцита. Следовательно, анализатор 46 изображений может быть с возможностью опознавания лейкоцитов как темных точек на более светлом фоне. Анализатор 46 изображений может быть выполнен с возможностью первого электронного увеличения цифрового изображения перед анализом цифрового изображения. Упомянутая возможность предполагает, что анализатор 46 изображений может быть способен легче различать лейкоциты, которые отображаются ближе один к другому, даже несмотря на то, что электронное увеличение цифрового изображения будет делать цифровое изображение несколько нерезким. Затем анализатор 46 изображений будет определять тип лейкоцита по различным физическим критериям, из которых важным критерием является размер изображаемого лейкоцита. Согласно литературе лимфоциты имеют диаметр приблизительно 5-11 микрометров, гранулоциты имеют диаметр приблизительно 8-15 микрометров и моноциты имеют диаметр приблизительно 16-25 микрометров. Поскольку расчетные размеры в некоторых случаях перекрываются, то в предпочтительном варианте для различения между собой лейкоцитов разных типов применяют дополнительную информацию. Данная информация может быть, например, формой и/или размером ядра. Гранулоциты могут распознаваться, например, по присутствию, по меньшей мере, двух точек в клетке, соответствующих сегментированному ядру. Данный подход можно применять для улучшения оценки, выполняемой посредством классификации размеров.
Количество лейкоцитов, разделяемое на пять частей, с дополнительным различением гранулоцитов как эозинофилы, нейтрофилы и базофилы, можно получать с использованием дополнительных физических характеристик. Кроме того, количество лейкоцитов в третьей части можно уточнить с использованием упомянутых физических характеристик. Следовательно, анализ может дополнительно исследовать форму обнаруживаемых клеток крови. Кроме того, анализ может дополнительно исследовать интенсивность излучения, проходящего через обнаруживаемые клетки крови.
Анализатор 46 изображений может вычислять количество лейкоцитов каждого типа. Обычно анализатор 46 изображений может подсчитывать и классифицировать некоторое количество, например 1000 лейкоцитов. Затем процентное или относительное содержание каждого типа лейкоцитов можно определить как количество лейкоцитов, классифицируемых как принадлежащие к данному типу, деленное на общее количество проанализированных лейкоцитов. Статистически значимое измерение можно выполнять путем анализа приблизительно 200 лейкоцитов одного типа. Однако желательно, чтобы анализировалось большее количество лейкоцитов одного типа для улучшения статистики. Кроме того, анализатор 46 изображений может быть выполнен с возможностью анализа лейкоцитов, изображения которых достаточно сфокусированы для правильной классификации. Кроме того, когда, по меньшей мере, два лейкоцита находятся слишком близко один к другому, их правильное разделение может быть сложной задачей, и, следовательно, такие лейкоциты могут быть совсем проигнорированы анализатором 46 изображений. С другой стороны, поскольку система 36 формирования изображения выполнена с возможностью формирования сфокусированного изображения всей толщины второго участка 20b измерительной полости 20, то анализатор 46 изображений может определять объемное количество каждого типа лейкоцитов только по второму цифровому изображению.
Анализатор 46 изображений может быть выполнен в виде блока обработки, который содержит коды для выполнения анализа изображения.
Ниже со ссылкой на фиг. 3 приведено описание второго варианта осуществления измерительного устройства 130 для анализа лейкоцитов в пробе крови. Устройство 130 содержит держатель 132 пробы для вмещения пробоотборного устройства 110 с пробой крови. Устройство 130 выполнено с возможностью вмещения пробоотборного устройства 110, при этом измерительная полость 120 имеет одну равномерную толщину по всей отображаемой зоне. Следовательно, измерительная полость 120 имеет толщину, соответствующую первому участку 20a измерительной полости 20 пробоотборного устройства 10 в соответствии с вариантом осуществления, описанным выше со ссылкой на фиг. 1. Держатель 132 пробы выполнен с возможностью вмещения пробоотборного устройства 110 таким образом, чтобы измерительная полость 120 пробоотборного устройства 110 правильно устанавливалась внутри устройства 130. Устройство 130 содержит источник 134 света для облучения пробы крови внутри пробоотборного устройства 110 соответствующим образом, как источник 34 света в первом варианте осуществления.
Устройство 130 дополнительно содержит систему 136 формирования изображения, которая располагается со стороны держателя 132 пробы, противоположной источнику 134 света. Таким образом, система 136 формирования изображения расположена с возможностью получения излучения, которое прошло сквозь пробу крови. Система 136 формирования изображения в данном варианте осуществления выполнена с возможностью получения первого и второго цифровых изображений вдоль одного оптического пути, чтобы изображения имели центр в одной точке в измерительной полости 120. Первое и второе цифровые изображения пробы по-прежнему получают с использованием разных оптических настроек. Указанное решение можно обеспечить множеством способов, как поясняется ниже.
Как показано на фиг. 3, система формирования изображения содержит увеличительное средство 138, которое содержит общую часть и две отдельные части. Таким образом, увеличительное средство 138 может содержать линзу или систему 142 линз объектива, которая расположена вплотную к держателю пробы 132 и которая является общей для двух оптических настроек при получении как первого, так и второго цифровых изображений. Линза 142 объектива обеспечивает первое увеличение пробы. Система 136 формирования изображения может дополнительно содержать делитель 139 пучка для направления света по двум разным направлениям к первому и второму средствам 140, 141 получения изображения, которые могут быть цифровой камерой любого вида, например камерой CCD. Увеличительное средство 138 содержит первую линзу или систему 144 линз окуляра, которая расположена между делителем 139 пучка и первой цифровой камерой 140. Линза 142 объектива обеспечивает первое увеличение пробы, которая дополнительно увеличивается линзой 144 окуляра. Увеличительное средство 138 может содержать дополнительные линзы или оптические элементы для достижения соответствующего увеличения и формирования изображения пробы в виде первого цифрового изображения.
Увеличительное средство 138 дополнительно содержит вторую линзу или систему 145 линз окуляра, которая расположена между делителем 139 пучка и второй цифровой камерой 141. Линза 142 объектива обеспечивает первое увеличение пробы, которая дополнительно увеличивается линзой 145 окуляра. Увеличительное средство 138 может содержать дополнительные линзы или оптические элементы для достижения соответствующего увеличения и формирования изображения пробы в виде второго цифрового изображения. Линза 142 объектива и линза 145 окуляра могут быть выполнены в виде линзовых блоков, и тогда линзовый блок 145 окуляра будет перемещать мнимую главную плоскость внутри линзового блока 142 объектива, чтобы изменять положение плоскости изображения относительно линзового блока 142 объектива для обеспечения возможности дополнительного увеличения в то время, как пробоотборное устройство 110 не перемещается относительно линзового блока 142 объектива. При этом в первом и втором цифровых изображениях можно получать разные увеличения.
В частности, увеличительное средство 138, как показано в данном варианте осуществления, содержит оптический элемент 147, который выделяет отображение лейкоцитов, которые находятся в фокусе. Данное решение повышает возможности опознавания типов клеток крови, которые отображаются в фокусе, и поэтому должны рассматриваться при различении разнотипных лейкоцитов.
Оптический элемент 147 позволяет получать изображение по толщине пробы, намного большей, чем глубина резкости части системы 136 формирования изображения, которая получает второе цифровое изображение. Оптический элемент 147 гарантирует, что клетки, которые находятся не в фокусе, могут быть исключены из рассмотрения для повышения степени достоверности измерения. Поскольку оптический элемент 147 оказывает влияние на формирование изображения клеток не в фокусе, то клетки в фокусе будут легко опознаваться. Оптический элемент 147 можно реализовать как пространственный фильтр, который влияет на формирование изображения клетки так, что край клетки будет содержать выброс амплитуды выше, чем интенсивность фона, когда клетка отображается благодаря поглощению света. Данный эффект можно легко обнаруживать в процессе анализа изображения, и поэтому упомянутые клетки можно быстро отбрасывать без рассмотрения.
В соответствии с альтернативным вариантом осуществления увеличительное средство может содержать элемент кодирования волнового фронта между делителем 139 пучка и второй цифровой камерой 141. Таким образом, элемент кодирования волнового фронта может заменять оптический элемент 147. Элемент кодирования волнового фронта преднамеренно искажает лучи света посредством пропускания их через волновую пластинку вогнутой формы, то есть относительно плоской в середине, но с раковиновидными кромками. Данная форма создает особую оптическую аберрацию, изображение представляется нерезким, но дефокусировка идентична в большом диапазоне изменения расстояний. Тем самым элемент кодирования волнового фронта увеличивает вдоль оптической оси глубину, которую можно анализировать. Искажения в изображении определяются, главным образом, формой дефокусирующего элемента кодирования волнового фронта, который точно известен. Поэтому компьютер может устранять нерезкость по точкам. Компьютер может декодировать изображение с применением, по существу, цифрового фильтра и формировать тем самым изображение, которое является четким в пределах большой глубины резкости. Таким образом, увеличительное средство может увеличивать глубину резкости системы формирования изображения, что дает возможность отображать в фокусе увеличенную глубину пробы.
В данном варианте осуществления делитель пучка в системе 136 формирования изображения можно заменять зеркалом или другим элементом (не показанными) для направления, по существу, всего света от пробы на выбранную одну из двух цифровых камер 140, 141. Затем зеркало можно поворачивать или сдвигать для переключения камеры 140, 141, которая наблюдает пробу. Данное решение допускает прохождение больше света к цифровым камерам 140, 141 и, следовательно, улучшает условия облучения при получении изображений. Однако два изображения нельзя регистрировать одновременно, и система 136 формирования изображения будет нуждаться в перемещении частей. В соответствии с одной альтернативой одна из камер может располагаться так, чтобы наблюдать пробу, когда зеркало полностью выведено из оптического пути.
В соответствии с другим альтернативным вариантом линза 142 объектива может обеспечивать все увеличение, необходимое для получения первого изображения. Таким образом, свет может проходить непосредственно от делителя пучка или зеркала к первой цифровой камере 140.
В соответствии с еще одним альтернативным вариантом отсутствует линза объектива, совместно используемая для первой и второй оптических настроек. Следовательно, делитель пучка или зеркало могут находиться ближе к держателю 132 пробы, и увеличительное средство 138 может содержать как линзу объектива, так и линзу окуляра в обоих оптических путях между делителем пучка и первой цифровой камерой 140 и между делителем пучка и второй цифровой камерой 141.
В соответствии с дополнительным альтернативным вариантом первое и второе цифровые изображения получают одной цифровой камерой. В данном случае увеличительное средство 138 требует переключения или изменения, чтобы изменять оптическую настройку для получения двух цифровых изображений. Таким образом, линза 242 объектива может перемещаться между двумя разными четко определенными положениями, как показано на фиг. 5. Следовательно, линза 242 объектива может быть выполнена так, чтобы перемещаться вдоль оптической оси, и будет приходить в контакт с упором, например кромкой, приходящей в контакт выступом 250, 252 вдоль оптической оси. Таким образом, расстояние между линзой объектива и пробоотборным устройством можно точно регулировать для регулировки увеличения изображения, которое должно быть получено.
В любом из вышеописанных альтернативных вариантов первая цифровая камера 140 выполнена с возможностью отображения измерительной полости 120 с первой оптической настройкой, обеспечиваемой увеличительным средством 138. Следовательно, увеличительное средство 138 выполнено с возможностью обеспечения оптического увеличения 1-50 крат, предпочтительнее 1-20 крат и наиболее предпочтительно 1-4 крат. При оптическом увеличении в указанных пределах возможно различение лейкоцитов. Изображение можно получать с повышенным разрешением, чтобы допускать применение меньшего оптического увеличения. Кроме того, глубину резкости увеличительного средства 138 можно установить так, чтобы охватывать толщину измерительной полости 120.
Как пояснялось со ссылкой на первый вариант осуществления, показанный на фиг. 2, первая цифровая камера 140 во втором варианте осуществления выполнена с возможностью получения первого цифрового изображения пробы. Первая цифровая камера 140 наблюдает пробу так, что измерительная полость 120 по всей ее толщине находится в пределах глубины резкости, заданной для первого варианта осуществления. Система 136 формирования изображения будет задавать зону измерительной полости 120, которая будет отображаться в первом цифровом изображении. Отображаемая зона вместе с толщиной измерительной полости 120 задает отображаемый объем пробы.
Кроме того, в любом из вышеописанных вариантов осуществления вторая цифровая камера 141 выполнена с возможностью отображения измерительной полости 120 со второй оптической настройкой, обеспечиваемой увеличительным средством 138. Увеличительное средство 138 выполнено с возможностью обеспечения оптического увеличения 5-200 крат, предпочтительнее 5-100 крат и наиболее предпочтительно 5-20 крат. При оптическом увеличении в указанных пределах возможно различение лейкоцитов. Изображение можно получать с повышенным разрешением, чтобы допускать применение меньшего оптического увеличения. Однако, поскольку второе цифровое изображение отображает ту же самую часть измерительной полости 120, что и первое цифровое изображение, то большее увеличение, применяемое со второй оптической настройкой, может помешать формированию изображения измерительной полости 120 по всей ее толщине в пределах глубины резкости. Следовательно, второе цифровое изображение будет отображать лейкоциты, находящиеся в фокусе, но будет также отображать лейкоциты и другие части пробы крови, которые находятся не в фокусе, что вызывает нерезкость в изображении. В описанных условиях, вышеописанный оптический элемент 147 будет повышать вероятность опознавания клеток, которые отображаются в фокусе, что облегчает классификацию по типам.
Увеличительное средство 138 может быть предпочтительно выполнено с возможностью размещения верхнего участка толщины измерительной полости 120 в фокусе в плоскости изображения второй цифровой камеры 141. Данное решение подразумевает, что искажения частей пробы крови, которые находятся не в фокусе, происходят вблизи низа и остаются относительно слабыми. Однако можно понять, что во втором цифровом изображении любой участок измерительной полости 120 отображается в фокусе. Кроме того, увеличительное средство 138 может быть выполнено с возможностью отображения в фокусе обычно 20-60 микрометров толщины измерительной камеры 120.
В соответствии с еще одним альтернативным вариантом, представленным на фиг. 6, получают только одно цифровое изображение. Однако данное цифровое изображение должно обеспечивать информацию, касающуюся направления обнаруженного света. Приведенное требование предполагает, что цифровое изображение содержит информацию не только об обнаруженном излучении, но также о точке в пространстве, из которой испускается обнаруженное излучение. Затем упомянутое цифровое изображение можно представлять таким образом, что фокусировку цифрового изображения можно сдвигать по требованию. Таким образом, цифровое изображение можно использовать, во-первых, для подсчета общего количества лейкоцитов в пределах всей толщины измерительной полости и, во-вторых, посредством сдвига фокусировки на участок толщины для определения соотношения лейкоцитов разных типов в пробе. Возможное исполнение данного альтернативного варианта осуществления, как показано на фиг.6, содержит источник 334 света, линзу 342 объектива и одну цифровую камеру 340. Упомянутые части могут быть выполнены аналогично тому, как описано выше. Устройство дополнительно содержит растр из небольших линз 360, обеспеченный в оптическом пути между пробоотборным устройством 110 и цифровой камерой 340. Растр из небольших линз 360 обеспечивает возможность отслеживания лучей в полученном изображении, чтобы можно было помещать в фокус различные части изображения.
Как показано на фиг.3, устройство 130 дополнительно содержит анализатор 146 изображений. Анализатор 146 изображений подключен к первой и второй цифровым камерам 140, 141 для приема первого и второго цифровых изображений, полученных цифровыми камерами 140, 141. В альтернативном варианте анализатор 146 изображений принимает только одно цифровое изображение, содержащее информацию о направлении света в соответствии с описанием в вышеприведенном параграфе. Анализатор 146 изображений выполнен с возможностью анализа первого и второго цифровых изображений аналогично тому, как пояснялось для анализатора 146 изображений в вышеописанном первом варианте осуществления. Однако, поскольку второе цифровое изображение может быть получено посредством отображения только части толщины пробы в пределах глубины резкости, то от анализатора 146 изображений может потребоваться более тонкая обработка второго цифрового изображения. Во-первых, анализатор 146 изображений будет анализировать только лейкоциты, которые распознаются как отображаемые в фокусе. Данный анализ возможен потому, что анализатор 146 изображений может анализировать только соотношение лейкоцитов разных типов, и поэтому не нуждается в точном знании объема анализируемой пробы. Клетки, изображение которых формируется не в фокусе, могут быть такими нерезкими, что анализатор 146 изображений может неверно определять размеры клеток, и поэтому неверно классифицировать клетки. Таким образом, путем обеспечения анализа только тех клеток, изображение которых формируется в фокусе, повышается достоверность анализа.
На фиг. 7 показана проба 710, отображаемая в трех разных слоях 720a-c пробы 710. Слой 720b указывает плоскость фокусировки, которая подробно описана ниже. Оптическая система имеет глубину резкости, и объекты, находящиеся в пределах упомянутой глубины резкости, можно считать находящими в фокусе, даже если они не расположены точно в плоскости фокусировки. На фиг. 7 глубина резкости плоскости 720b фокусировки обозначена заштрихованной зоной 720b'.
На фиг. 8a-c показаны три разных лейкоцита в поле зрения камеры, а на фиг. 9a-c показаны соответствующие им распределения света.
На фиг. 8b показан лейкоцит, отображаемый в фокусе. Ядро представляется в виде затемнений, а окружающая цитоплазма является почти невидимой. На фиг. 9b показано распределение интенсивности света. Ядра представляются в виде областей со значительно сниженной интенсивностью света, а цитоплазма не влияет на интенсивность света.
На фиг. 8a показан лейкоцит, отображаемый слишком близко к средству 441 получения изображения, чтобы быть сфокусированным. Ядра представляются в виде затемнений, а окружающая цитоплазма действует как линза и преломляет и диффузно рассеивает свет, что имеет следствием образование темного кольца вокруг ядра. На фиг. 9a показано распределение интенсивности света. Ядра представляются как область со значительно сниженной интенсивностью света, а цитоплазма представляется в свете низкой интенсивности.
На фиг. 8c показан лейкоцит, отображаемый слишком далеко от средства 441 получения изображения, чтобы быть сфокусированным. Ядра представляются в виде затемнений, а окружающая цитоплазма действует как линза и преломляет свет, что имеет следствием образование светлого кольца вокруг ядра. На фиг. 9c показано распределение интенсивности света. Ядра представляются как участки со значительно сниженной интенсивностью света, а цитоплазма представляется в свете высокой интенсивности.
Анализатор 146 изображений дополнительно выполнен с возможностью определения размеров лейкоцитов, отображаемых в фокусе. Затем упомянутые измеренные размеры можно использовать для классификации лейкоцитов до некоторой степени соответственно тому, как пояснялось выше со ссылкой на первый вариант осуществления. Поскольку второе цифровое изображение может быть немного нерезким и представлять сложность для анализа, анализатор 146 изображений может быть выполнен с возможностью подсчета и классификации только относительно небольшого количества, приблизительно 200 лейкоцитов. Данное количество может все же быть достаточным для формирования статистически значимого результата соотношения лейкоцитов разных типов в пробе. В качестве альтернативы анализатор 146 изображений может быть выполнен с возможностью выполнения измерений размеров клетки и проверки того факта, отображается ли клетка сфокусированной в пределах одного и того этапа обработки изображения. Следовательно, определяется размер каждой отображаемой клетки, но при определении соотношения лейкоцитов разных типов учитываются только те клетки, изображения которых формируются в фокусе.
Анализатор 146 изображений может быть реализован в виде блока обработки, который содержит коды для выполнения анализа изображения.
При использовании основ, представленных на фиг. 7-9a-c, и схемы, показанной на фиг. 10, устройство 30 может быть выполнено с возможностью получения нескольких цифровых изображений пробы с использованием разных оптических настроек. Например, несколько цифровых изображений могут отображать десять разных слоев 720a-j пробы 710, как показано на фигуре 10. Анализатор изображений выполнен с возможностью определения для конкретной частицы или клетки количества упомянутых изображений, в которых отображается упомянутая частица или клетка. Подсчет изображений начинается с изображения, в котором частица или клетка определяется как расфокусированная в первом направлении, продолжается по изображению(ям), в котором(ых) частица или клетка определяется как сфокусированная, и заканчивается в изображении, в котором частица или клетка определяется как расфокусированная во втором направлении. Первое и второе направления представляют собой, по существу, противоположные нормали к плоскости фокусировки. На фиг. 8a и фиг. 9a клетка определяется как расфокусированная в первом направлении. Предел для расфокусировки в данном направлении определяется как изображение, в котором для конкретной клетки измерен максимальный контраст между разными зонами (центральной и кольцевой зонами). Для клеток, расположенных еще ближе к системе формирования изображений, будет обнаруживаться та же самая основная форма с темным кольцом вокруг темного ядра, но кольцо и ядро будут более нерезкими, и контраст будет ниже, чем в изображении, определяемом как предел для расфокусировки в первом направлении. Аналогично, другой предел будет определяться путем выявления изображения, в котором обнаружен максимальный контраст между темным ядром и светлым кольцом, окружающим ядро. В изображениях с плоскостью фокусировки, находящейся еще дальше от системы формирования изображений, клетки еще будут обнаруживаться как темное ядро и светлое кольцо, но кольцо и ядро будут более нерезкими, и контраст будет ниже, чем в изображении, которое рассматривается как предел для расфокусировки во втором направлении.
Вышеописанный подход будет предоставлять информацию, относящуюся к радиусу кривизны соответствующего лейкоцита. Сравнительно меньший лейкоцит будет обеспечивать сравнительно короткую длину фокусировки и при подсчете изображений между граничными изображениями будет создавать в результате сравнительно меньшее число изображений. В отношении такого поведения можно также сказать, что лейкоциты попадают в фокус и расфокусируются быстро. Сравнительно крупный лейкоцит будет обеспечивать большую длину фокусировки, и расстояние между изображением, в котором лейкоциты расфокусированы в одном направлении, и изображением, в котором лейкоциты расфокусированы в другом направлении, будет сравнительно больше. В отношении такого поведения можно также сказать, что лейкоциты будут попадать в фокус и расфокусироваться медленно при сравнении отличающихся получаемых изображений с изображениями из соседних слоев. Можно отметить, что длина фокусировки и граничные изображения имеют отношение к расстоянию, но при заданном расстоянии в плоскости фокусировки для соответствующего изображения, наоборот, расстояние может быть выражено как число изображений.
Вариант осуществления, показанный на фиг. 10, содержит источник 434 света, пробоотборное устройство 410, оптическую систему 438 (с 10-кратным коэффициентом увеличения), диафрагму 450, направляющую свет в средство 440 получения изображения. Ниже со ссылкой на фиг. 4 приведено описание способа определения объемного количества лейкоцитов. Способ содержит получение пробы крови в пробоотборное устройство на этапе 102. Неразбавленную пробу цельной крови получают в пробоотборное устройство. Пробу можно получать из капиллярной крови или венозной крови. Пробу капиллярной крови можно втягивать в измерительную полость непосредственно из уколотого пальца пациента. Проба крови приходит в контакт с реагентом в пробоотборном устройстве и вступает с ним во взаимодействие. Эритроциты подвергаются лизису, и окрашивающее вещество накапливается в ядрах лейкоцитов. Через несколько минут после получения пробы крови проба готова для анализа. В альтернативном варианте пробу крови получают и смешивают с гемолизирующим веществом и окрашивающим веществом перед введением в пробоотборное устройство. Затем пробоотборное устройство помещают в устройство анализа, на этапе 104. Анализ можно запускать нажатием кнопки устройства анализа. В альтернативном варианте анализ запускается автоматически при обнаружении устройством присутствия пробоотборного устройства.
Пробу облучают на этапе 106, и первое и второе цифровые изображения пробы получают на этапе 108 с использованием разных оптических настроек. Пробу облучают электромагнитным излучением с длиной волны, соответствующей максимуму поглощения окрашивающего вещества. Такое облучение предполагает, что цифровые изображения будут содержать черные или темные точки в положениях ядер лейкоцитов.
Полученные цифровые изображения передаются в анализатор изображений, который выполняет анализ изображения первого и второго цифровых изображений на этапе 110. Анализатор изображений подсчитывает количество черных точек в первом цифровом изображении для определения объемного количества всех лейкоцитов в пробе. Анализатор изображений анализирует также размеры и форму некоторого количества черных точек во втором цифровом изображении для классификации лейкоцитов и получения соотношения лейкоцитов разных типов в пробе крови.
В соответствии с другим вариантом осуществления, показанным на фиг. 11, этап 108b получения изображения содержит получения множества цифровых изображений в разных слоях.
В анализаторе изображений соответствующие цифровые изображения (из каждого слоя) анализируются для определения лейкоцитов, которые находятся в фокусе, и для данных лейкоцитов изображение анализируется для классификации лейкоцитов и получения соотношения лейкоцитов разных типов в пробе крови.
Следует подчеркнуть, что предпочтительные варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, ни в коем случае не являются ограничивающими, и что в пределах объема притязаний, определяемого прилагаемой формулой изобретения, возможно много альтернативных вариантов осуществления.
Устройство, показанное на фиг. 10, может быть отдельным блоком, поскольку общее количество лейкоцитов может определяться с одновременным определением классификации соответствующего лейкоцита. В альтернативном варианте устройство, показанное на фиг. 10, можно применять как средство 41 получения изображения в варианте осуществления, показанном на фиг. 2, или как средство 141 получения изображения в варианте осуществления, показанном на фиг. 3. Упомянутая конструкция показана, в принципе, на фиг. 12. Данный вариант осуществления содержит источник света 534, диафрагмы 550, пробоотборное устройство 510, делитель 539 пучка, первую оптическую систему 538a (с первым коэффициентом увеличения приблизительно 3 крат), направляющую свет в первое средство 540 получения изображения, и вторую оптическую систему 538b (со вторым коэффициентом увеличения приблизительно 10 крат), направляющую свет во второе средство 541 получения изображения посредством зеркала 534. Вторая оптическая система содержит также средство 542 для изменения фокусного расстояния или может быть подвижной. Благодаря этому второе средство 541 получения изображения может получать множество цифровых изображений. В одном варианте осуществления первое средство 540 получения изображения отсутствует, а общее количество частиц или лейкоцитов определяется по изображениям, полученным вторым средством 541 получения изображения.