ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ СИНДРОМА ПОЛИКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING POLYCYSTIC OVARY SYNDROME

Изобретение относится к области фармакологии, в частности к фармацевтическим композициям для профилактики и лечения синдрома поликистозных яичников (СПКЯ), и могут быть использованы в качестве биологически активных добавок и лекарственных средств.
Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) – расстройство, которое поражает около 5% женщин репродуктивного возраста (Carmina Е., Lobo R. Polycystic ovary syndrome (PCOS): arguably the most common endocrinopathy is associated with significant morbidity in women. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 1897-9). Распространенность этого заболевания в мире оценивается от 2,2 до 26,7%, в зависимости от используемых диагностических критериев (X. Chen, D. Yang, Y. Mo, L. Li, Y. Chen, Y. Huang, Prevalence of polycystic ovarysyndrome in unselected women from southern China, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 139 (1) (2008) 59-64). Основными диагностическими критериями этого синдрома являются гиперандрогения, поликистоз яичников и дисфункция овуляции. Данное заболевание представляет собой мультифакториальное расстройство, связанное с гиперсекрецией лютеинизирующего гормона (ЛГ),. гиперандрогенизмом, относительно пониженным уровнем фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), поликистозом или полифолликулярными яичниками, олиго/ановуляцией (менструальной дисфункцией), гирсутизмом, бесплодием, повышенными уровнями воспалительных маркеров, неврологическими и психологическими проблемами, инсулинорезистентностью (ИР), дислипидемией и т.д. (D.A. Ehrmann, Polycystic ovary syndrome, N Engl J Med 352 (12) (2005) 1223-1236. S. Franks, Do animal models of polycystic ovary syndrome help to understand its pathogenesis and management? Yes, but their limitations should be recognized, Endocrinology 150 (9) (2009) 3983-3985. V. Padmanabhan, A. Veiga-Lopez, Animal models of the polycystic ovary syndrome phenotype, Steroids 78 (8) (2013) 734-740).
К факторам способствующим развитию СПКЯ, в первую очередь относят генетические, пренатальные нарушения и эпигенетические изменения в жизни плода, экологические факторы, отклонение веса новорожденного от нормы, гормональный дисбаланс и т.д. (S.M. Sirmans, K.А. Pate, Epidemiology, diagnosis, and management of polycystic ovary syndrome, Clinical epidemiology 6 (2014) 1. K. Mykhalchenko, D. Lizneva, T. Trofimova, W. Walker, L. Suturina, M.P. Diamond, R. Azziz, Genetics of polycystic ovary syndrome, Expert review of molecular diagnostics 17 (7) (2017) 723-733. W.-L. Chiu, J. Boyle, A. Vincent, H. Teede, L.J. Moran, Cardiometabolic Risks in Polycystic Ovary Syndrome: Non-Traditional Risk Factors and the Impact of Obesity, Neuroendocrinology 104 (4) (2017) 412-424).
Поскольку отсутствует четкая этиология для СПКЯ, то при лечении ориентируются прежде всего на проявление симптомов у пациента. Общие цели лечения заключаются в том, чтобы вызвать овуляцию у женщин, желающих зачать ребенка, снизить уровень андрогенов, снизить массу тела и снизить долгосрочные риски для здоровья при сопутствующих заболеваниях: сахарном диабете и сердечно-сосудистых. В лечении СПКЯ в качестве первоначальных средств для индукции овуляции у пациентов рекомендуется кломифен цитрат (кломифен). В качестве альтернативных средств для пациентов с резистентностью к кломифену включают терапию гонадотропином и лапароскопический дриллинг яичников. Основной целью лечения гирсутима при СПКЯ является центральное или периферическое подавление андрогенов (The treatment of polycystic ovary syndrome Ajossa S., Guerriero S., Paoletti A.M.,  M., Melis G.B. Minerva Ginecologica 2004 February; 56(1): 15-26).
Индукция овуляции с помощью кломифена демонстрирует хорошие результаты, однако, непереносимость этого препарата некоторыми пациентами ограничивает возможности применения такой терапии (Messinis IE: Ovulation induction: a mini review. Hum Reprod. 2005, 20 (10): 2688-2697. 10.1093/humrep/dei128., Kousta E, White D, Franks S: Modern use of clomiphene citrate in induction of ovulation. Hum Reprod Update. 1997, 3 (4): 359-365. 10.1093/humupd/3.4.359). Управление гиперандрогенизмом включает применение антиандрогенов и гипогликемических лекарственных средств, таких как метформин (Tang Т, Glanville J, Hayden CJ, White D, Barth JH, Balen AH: Combined lifestyle modification and metformin in obese patients with polycystic ovary syndrome. A randomized, placebo-controlled, double-blind multicentre study. Hum Reprod. 2006, 21 (1): 80-89). Метфомин показал свою эффективность для повышения чувствительности к инсулину и гиперандрогении, однако его использование связано с высокой частотой проявления побочных эффектов, включая тошноту, рвоту и желудочно-кишечные расстройства (Tang Т, Lord JM, Norman RJ, Yasmin E, Balen AH: Insulin-sensitising drugs (metformin, rosiglitazone, pioglitazone, D-chiro-inositol) for women with polycystic ovary syndrome, oligo amenorrhoea and subfertility. Cochrane Database Syst Rev. 2010, 1: 2-12).
Резистентность к инсулину (РИ) играет ключевую роль в СПКЯ. Инсулин-сенсибилизирующие агенты, такие как метформин и инозитолы, как было показано, улучшают эндокринные и метаболические процессы при СПКЯ (Franca Fruzzetti, Daria Perini, Marinella Russo, Fiorella Bucci & Angiolo Gadducci (2017) Comparison of two insulin sensitizers, metformin and myo-inositol, in women with polycystic ovary syndrome (PCOS), Gynecological Endocrinology, 33:1, 39-42, DOI: 10.1080/09513590.2016.1236078).
Из уровня техники известны биологически активные добавки (БАД) «Фертина» (Орион Фарма, Россия) и «Иноферт» (Хумана Фарма Интернешнл С.П.А., Италия) в состав которых входят: инозит - 1000 мг и фолиевая кислота 0,1 мг. Они имеет ограниченное функциональное применение и для успешной профилактики СПКЯ вместе с ними желательно применять другие препараты, например: витамина D3, который обеспечивает восстановление нормального менструального цикла, и снижает инсулинорезистентность при метаболическом синдроме. Альфа-липоевой кислоты улучшающей репродуктивную функцию и метаболические показатели у женщин страдающих СПКЯ (Capasso I, Esposito Е, Maurea N, et al. Combination of inositol and alpha lipoic acid in metabolic syndrome-affected women: a randomized placebo-controlled trial. Trials. 2013; 14: 273. Published 2013 Aug 28. doi:10.1186/1745-6215-14-273); D-хиро-инозитола, который положительно влияют на качество цитоплазмы ооцита, снижает уровень тестостерона и улучшает чувствительности к инсулину и т.д.
Известна биологически активная добавка, содержащая компоненты способствующие лечению и профилактике СПКЯ. Она представляет собой комбинацию мио-инозитола и D-хиро-инозитола с красным дрожжевым рисом (WO 2014135956). Эффективность ее применения для профилактики СПКЯ ограничивается необходимостью использования дополнительных источников альфа-липоевой кислоты, действие которой обеспечивает восстановление резистентность к инсулину, улучшает липидный профиль, и восстанавливает менструальный цикл (Capasso I, Esposito Е, Maurea N, et al. Combination of inositol and alpha lipoic acid in metabolic syndrome-affected women: a randomized placebo-controlled trial. Trials. 2013; 14: 273. Published 2013 Aug 28. doi:10.1186/1745-6215-14-273).
В публикации Nordio M, Proietti E. «The combination therapy with myo-inositol and D-chiro-inositol reduces the risk of metabolic disease in PCOS overweight patients compared to myo-inositol supplementation alone», описываются результаты терапии мио-инозитолом и комбинацией мио-инозитола с D-хиро-инозитолом в соотношении 40:1. Эта композиция позволила улучшить метаболические и гормональные параметры и была более эффективна, чем препарат мио-инозита у женщин с СПКЯ (Nordio М, Proietti E. "The combination therapy with myo-inositol and D-chiro-inositol reduces the risk of metabolic disease in PCOS overweight patients compared to myo-inositol supplementation alone". Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012; 16(5): 575-81).
Наиболее близким к заявляемому изобретению является композиция, содержащая в своем составе мио-инозитол и D-хиро инозитол в соотношениях от 10:1 до 100:1 (ЕР 3424497). Было показано, что комбинированное лечение мио-инозитом и D-хиро-инозитом является более эффективным, чем лечение одним только мио-инозитом или D-хиро-инозитом. Также эта композиция приводила к положительным эффектам в отношении классических симптомов менопаузы: раздражительность, гипертония, остеопороз, дислипидемия, увеличение веса, приливы и старение кожи. К недостаткам этого изобретения именно для лечения и профилактики СПКЯ можно отнести некоторую ограниченность по действующим факторам, например, в него не включаются вещества, оказывающие улучшающее воздействие непосредственно на репродуктивную функцию и метаболические показатели у пациентов (альфа-липоевая кислота). Сами авторы этого изобретения позиционируют его, как возможность удовлетворить существующий в медицинской и фармацевтической промышленности спрос на новые препараты, которые еще более активно снижают уровень инсулина и андрогенов у женщин. А заболевание СПКЯ является мультифакториальным расстройством и в целом требует комбинированного воздействия.
Заявляемое изобретение направлено, прежде всего, на контроль и регулирование основных факторов способствующих развитию СПКЯ. Техническим результатом от его применения будет расширение количества регулируемых факторов в организме пациента, повышение эффективности использования, увеличение продолжительности воздействия (срок нормализации систем организма).
Заявленный технический результат достигается тем, что фармацевтическая композиция для профилактики и лечения синдрома поликистозных яичников (СПКЯ), содержит в своем составе витамин D3, витамин В9, альфа-липоеву кислоту, мио-инозитол, Д-хиро-инозитол. Указанные активные вещества берутся при следующем соотношении компонентов, в масс %: витамин D3 - от 0,0006 до 0,001; витамин В9 (фолиевая кислота) - от 0,004 до 0,006; альфа-липоевая кислота от - 5,3 до 7,1; мио-инозитол - от 89,9 до 92,5; Д-хиро-инозитол - от 2,0 до 2,6; марганца глюконат - от 0,35 до 0,47.
Экспериментальным путем подобранно такое соотношение известных компонентов, что с одной стороны они по своему воздействию перекрывают весь спектр факторов, нормализация которых требуется для устранения СПКЯ, а с другой стороны проявляют синергетический эффект, за счет совместного влияния нескольких активных веществ на каждую из регулируемых систем организма. Также заявляемая фармацевтическая композиция обеспечивает снижение прироста массы тела, нормализацию эстрального цикла и восстановление числа фолликулов с процессом овуляции.
В заявляемую фармацевтическую композицию входят активные вещества, использование которых известно в акушерстве и гинекологии, но имеено их комбинация и количественное соотношение приводят к заявленному техническому результату.
D-хиро-инозитол и мио-инозитол
В контролируемом рандомизированном двойном слепом исследовании сравнивалось влияние двух препаратов Мио-инозитол (МИО) и D-хиро-инозитол (ДХИ), на качество ооцитов. Пять женщин получали 550 мг МИО + 300 мг ДХИ ежедневно (группа с высоким содержанием ДХИ), в то время как 6 женщинам давали ежедневную дозу 550 мг МИО только с 27,6 мг ДХИ (группа с низким содержанием ДХИ). Согласно многофакторному анализу, высокие дозы ДХИ положительно влияют на качество цитоплазмы ооцита. Оболочка, плазматическая мембрана, цитоплазма ооцитов были улучшены с любой комбинацией МИО/ДХИ за счет снижения тестостерона или улучшения чувствительности к инсулину, независимо от возраста и индекса массы тела (Mendoza, N., Galan, М.I., Molina, С., Mendoza-Tesarik, R., Conde, С., Mazheika, M., Diaz-Ropero M.P., Fonolla J., Tesarik J., Olivares, M. (2019). High dose of d-chiro-inositol improves oocyte quality in women with polycystic ovary syndrome undergoing ICSI: a randomized controlled trial. Gynecological Endocrinology, 1-4. doi:10.1080/09513590.2019.1681959).
В последнее время, известно что инозиты - мио-инозит и D-хиро-инозит - это эффективная и безопасная альтернатива в лечении СПКЯ, так как обе изоформы инозита способны противодействовать последующим последствиям резистентности к инсулину. Тем не менее, в то время как ДХИ участвует в проявлении активности инсулина в основном на не яичниковых тканях, МИО проявляет специфическое воздействие на яичник, главным образом, путем модуляции метаболизма глюкозы и передачи сигналов фолликулостимулирующего гормона. Кроме того, МИО также может улучшать функции яичников путем модуляции метаболизма стероидов через инсулиннезависимые пути. Поскольку активность ДХИ и МИО, вероятно, включает в себя различные биологические механизмы, обе изоформы инозита могут быть использованы синергически, в соотношении, соответствующем их относительному физиологическому количеству в плазме (40:1). Новые экспериментальные и клинические данные с МИО плюс ДХИ подтвердили эффективность такого комплексного подхода и дали многообещающие результаты (Monastra, G., Unfer, V., Harrath, А.Н., & Bizzarri, М. (2016). Combining treatment with myo-inositol and D-chiro-inositol (40:1) is effective in restoring ovary function and metabolic balance in PCOS patients. Gynecological Endocrinology, 33(1), 1-9. doi: 10.1080/09513590.2016.1247797).
По результатам клинического исследования показа высокая эффективность комбинированной терапии сочетания метформин + миоинозитол + фолиевая кислота. В исследование были включены пациентки с избыточной массой тела/ожирением, страдающих СПКЯ, которые получали одно из лечений: девять - только с диетой (D); девять с диетой и метформином 1000 мг/день непрерывно (D+М); девять с диетой, метформин 500 мг/день и миоинозитол 4 г/день плюс 400 мкг фолиевой кислоты ежедневно, непрерывно (D+M+F). Менструальный цикл, показатель Ферримана-Галлвея (оценка степени тяжести гирсутизма), индекс массы тела и т.д. были измерены до начала терапии и через 3 месяца. По результатам исследования регулярность менструального цикла была восстановлена у значительного числа пациентов группы D+M+F (р<0,05); Показатель Ферримана был значительно улучшен потерей веса (р<0,05). Масса тела, ИМТ, окружность талии и бедер значительно уменьшились во всех группах (Diet, metformin and inositol in overweight and obese women with polycystic ovary syndrome: effects on body composition. Le Donne M, Alibrandi A, Giarrusso R, Lo Monaco I, Muraca U. Minerva Ginecol. 2012 Feb).
Витамин D3
Витамин D играет физиологическую роль в репродуктивной системе, включая развитие фолликулов яичников и лютеинизацию посредством изменения передачи сигналов анти-мюллерового гормона (АМГ), чувствительности к фолликулостимулирующему гормону и продукции прогестерона в клетках гранулезы (Sacchi S, D'Ippolito G, Sena P, et al. The  hormone (АМН) acts as a gatekeeper of ovarian steroidogenesis inhibiting the granulosa cell response to both FSH and LH. J Assist Reprod Genet. 2016; 33(1): 95; 100. doi:10.1007/s10815-015-0615-y). Потенциальное влияние витамина D на гомеостаз глюкозы включает присутствие специфического рецептора витамина D (VDR) в β-клетках поджелудочной железы и скелетных мышцах.
Учитывая, что СПКЯ является частой причиной дисфункции яичников у женщин с ановуляцией, проявление этого расстройства связано с различной степенью гонадотропных и метаболических нарушений, определяемых взаимодействием множества генетических факторов и факторов окружающей среды. Распространенность дефицита витамина D у женщин с СПКЯ составляет около 67-85 процентов при концентрации в сыворотке 25-ОН D<20 нг/мл (Thomson RL, Spedding S, Buckley JD. Vitamin D in the aetiology and management of polycystic ovary syndrome. Clin Endocrinol (Oxf) 2012; 77: 343-50). Хотя нет существенной разницы в уровнях 25-ОН D между СПКЯ и нормальными контрольными женщинами, было обнаружено, что высокая распространенность дефицита витамина D связана с метаболическим синдромом (Moini A, Shirzad N, Ahmadzadeh М, Hosseini R, Hosseini L, Sadatmahalleh SJ. Comparison of 25-hydroxyvitamin D and calcium levels between polycystic ovarian syndrome and normal women, hit J Fertil Steril. 2015; 9: 1-8).
Недавние исследования показывают, что низкий уровень витамина D может быть основным фактором в начале и развитии СПКЯ (Rashidi, В., Haghollahi, F., Shariat, М., & Zayerii, F. (2009). The Effects of Calcium-Vitamin D and Metformin on Polycystic Ovary Syndrome: A Pilot Study. Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology, 48(2), 142-147), и что диетическое пополнение этого важного витамина может помочь восстановить нормальные менструальные циклы у женщин (Hahn S, Haselhorst U, Tan S, et al. Low serum 25-hydroxyvitamin D concentrations are associated with insulin resistance and obesity in women with polycystic ovary syndrome. Exp Clin Endocrinol Diabetes 2006; 114: 577-83).
Фолиевая кислота
Из результатов исследований известно влияние добавок фолиевой кислоты на общий уровень гомоцистеина и инсулина, а также относительно связи между гипергомоцистеинемией и гиперинсулинемией у женщин с СПКЯ (Woo KS, Chook Р, Chan LL, Cheung AS, Fung WH, Oiao M, et al. Long-term improvement in homocysteine levels and arterial endothelial function after one-year folic acid supplementation. Am J Med 2002; 112: 535-9).
Известно, что лечение метформином повышает уровень гомоцистеина, в связи с чем было предложено назначать витамин В12 и фолиевую кислоту женщинам с СПКЯ, особенно тем, кто использует метформин и планирует беременность (Esmaeilzadeh S., Gholinezhad-Chari М., Ghadimi R. The Effect of Metformin Treatment on the Serum Levels of Homocysteine, Folic Acid, and Vitamin В12 in Patients with Polycystic Ovary Syndrome. J Hum Reprod Sci. 2017; 10(2):95÷101. doi: 10.4103/jhrs.JHRS_74_16).
В исследовании Kazerooni Т. и др. показано, что 3-месячная терапия фолиевой кислотой уменьшает уровень гомоцистеина у женщин с СПКЯ независимо от того, имели ли они инсулинорезистентность (Kazerooni, Т., Asadi, N., Dehbashi, S., & Zolghadri, J. (2008). Effect of folic acid in women with and without insulin resistance who have hyperhomocysteinemic polycystic ovary syndrome. International Journal of Gynecology & Obstetrics, 101(2), 156-160. doi: 10.1016/j.ijgo.2007.10.024).
Альфа-липоевая кислота
Альфа-липоевая кислота (АЛК) представляет собой природное антиоксидантное липофильное соединение, которое действует как важный кофактор для митохондриальных ферментов. АЛК повышает эффективность других антиоксидантов, особенно в клетках печени, легких и почек.
АЛК может использоваться у пациентов с диабетом 2 типа для улучшения гликемического контроля и уменьшения симптомов диабета, в особенности нейропатий (Cianci A, Panella М, Fichera М, et al. D-Chiro-Inositol and alpha lipoic acid treatment of metabolic and menses disorders in women with PCOS. Gynecol Endocrinol. 2015; 31: 483-486).
В гинекологии и акушерстве применение АЛК основано, на его антиоксидантном и противовоспалительном действии (Di Tucci, С., Di Feliciantonio, М., Vena, F., Capone, С., Schiavi, M.C., Pietrangeli, D., enedetti Panici, P. (2018). Alpha lipoic acid in obstetrics and gynecology. Gynecological Endocrinology, 1-5. doi:10.1080/09513590.2018.1462320).
АЛК играет роль в регуляции метаболизма глюкозы и липидов, стимулируя поглощение глюкозы с помощью переносчиков глюкозы GLUT1 и GLUT4, что также происходит при действии инсулина. Все больше данных свидетельствуют о том, что альфа-липоевая кислота может улучшать репродуктивную функцию и метаболические показатели у женщин, страдающих СПКЯ.
В данных представленных Alessandro D Genazzani и др. показана эффективность комбинации 400 мг альфа-липоевой кислоты и 1 г мио-инозита в восстановлении резистентность к инсулину в группе из 36 пациентов с СПКЯ, улучшающая также секрецию гонадотропина. У всех пациентов наблюдалось значительное снижение уровня ЛГ в сыворотке крови (Aless, Genazzani, R.D., Despini, G., Santagni, S., Prati, A., Rattighieri, E., Chierchia, E., & Simoncini, T. (2014). Effects of a Combination of Alpha Lipoic Acid and Myo-inositol on Insulin Dynamics in Overweight/Obese Patients with PCOS).
Лечение с комбинацией 1 г D-хироинозита и 600 мг АЛК ежедневно в течение 180 дней по сравнению с отсутствием лечения в группе из 46 женщин (26 исследований группа субъектов и 20 контролей) репродуктивного возраста привели к улучшению уровня инсулина, липидного профиля и частоты менструальных циклов (Cianci A, Panella М, Fichera М, et al. D-Chiro-Inositol and alpha lipoic acid treatment of metabolic and menses disorders in women with PCOS. Gynecol Endocrinol. 2015; 31: 483-486).
Введение препарата с контролируемым высвобождением АЛК (600 мг) два раза в день в течение 16 недель в группе из 6 худых женщины страдающих от СПКЯ, привело к снижению уровня триглицеридов, улучшению в чувствительности к инсулину и восстановлению менструального цикла (Masharani U, Gjerde С, Evans JL, et al. Effects of controlled-release alpha lipoic acid in lean, nondiabetic patients with polycystic ovary syndrome. J Diabetes Sci Technol. 2010; 4: 359-364).
Марганца глюконат
Марганец является важным элементом препятствующим окислительному стрессу и является кофактором для металлофермента - Mn-содержащей супероксиддисмутазы (MnSOD). Он нейтрализует высоко реактивные супероксид-ионы до менее реакционноспособной перекиси водорода (H2O2), за которым следует его немедленное превращение в H2O каталазой и другими пероксидазами в матрице митохондрий (Chu CJ, Lee SD, Hung TH et al. (2009) Insulin resistance is a major determinant of sustained virologic response in genotype 1 chronic hepatitis С patients receiving preginterferon alpha-2b plus ribavirin. Aliment Pharmacol Ther 29: 46-54). В исследовании Pratip Chakraborty и др. показано, что средняя сыворотка марганца у пациенток с СПКЯ составляла 0,230±0,012 ррм, что значительно ниже контроля (р<0,002). Предполагается, что повышение окислительного стресса при СПКЯ, сопровождается снижением марганца в сыворотке крови в результате потребления его в системе антиоксидантной защиты, включая MnSOD (Chakraborty, P., Ghosh, S., Goswami, S.K., Kabir, S.N., Chakravarty, В., & Jana, K. (2013). Altered Trace Mineral Milieu Might Play An Aetiological Role in the Pathogenesis of Polycystic Ovary Syndrome. Biological Trace Element Research, 152(1), 9-15. doi: 10.1007/s12011-012-9592-5).
Дополнительно марганец усиливает действие мио-инозитола в тканях, стимулируя работу фермента фосатидил-инозитола (Schoepp, D.D. (1985). Manganese Stimulates the Incorporation of [3H]Inositol into a Pool of Phosphatidylinositol in Brain That Is Not Coupled to Agonist-Induced Hydrolysis. Journal of Neurochemistry, 45(5), 1481-1486. doi:10.1111/j.l471-4159.1985.tb07216.x).
Предложенное соотношение активных компонентов заявляемой фармацевтической композиции обеспечивает снижение инсулинорезистентности (устранение метаболических нарушений), восстановление менструального цикла, улучшение функции яичников, качества ооцитов, нормализацию цикла, и восстанавливает овуляцию.
Заявляемая фармацевтическая композиция может быть использована для профилактики и лечения в составе комплексной терапии синдрома поликистозных яичников, гиперандрогении и дисфункции овуляции.
ПРИМЕР РЕАЛИЗАЦИИ:
Проверка заявленного технического результата проводилась в экспериментах с животными. В опытах использовалась композиция с составом активных веществ, указанным в Таблице 1.
Животных содержали в стандартных условиях в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 2.2.1.3218-14 по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) и ГОСТ 33044-2014.
Моделирование патологии осуществляли согласно методике, предложенной Tehrani F.R. с соавторами (Tehrani, F.R., Noroozzadeh, М., Zahediasl, S., Piryaei, A., & Azizi, F. (2014). Introducing a rat model of prenatal androgen-induced polycystic ovary syndrome in adulthood. Experimental Physiology, 99(5), 792-801. doi:10.1113/expphysiol.2014.078055).
Для этого производили ссаживание самцов и самок, в течение ночи в стандартных условиях содержания животных (12-12 ч циклов свет - темнота, контролируемая температура 23±3°С, относительная влажность воздуха 30-70%). Первым днем беременности считали появление паховой «пробки». Далее беременных крыс разделяли на две группы: интактную (без моделирования патологии) и контрольную группу (модель патологии). На 20-й день беременности самкам контрольный группы подкожно вводили раствор тестостерона в дозе 5 мг  БАЙЕР ФАРМА АГ), для развития у потомства нарушений характерных для СПКЯ. Из полученного потомства, по достижению 3 месячного возраста отбирали самок, массой 180-200 г (из интактных животных), 190-220 г (из животных с моделью патологии), для формирования экспериментальных групп.
Расчет доз проводили следующим образом: для предлагаемого препарата расчет доз проводили из расчета 2 таблетки в сутки на человека массой 70 кг, масса таблетки 1430 мг.Таким образом, расчетная доза препарата составляла: 1430×2/70×39/6,5=245,14 мг/кг/сут.
Препарат сравнения, брали в количестве эквивалентом содержанию мио-инозитола и D-хиро инозитола в предлагаемом препарате, что составило 96,66 мг/кг/сут (где 94,3 мио-инозитола и 2,36 мг D-хиро инозитола).
В ходе эксперимента было исследовано 4 группы животных (по двенадцать животных в каждой группе):
1 группа (интактные) - интактные животные, без моделирования патологии, которые получали 1% крахмальный клейстер;
2 группа (контроль) - контрольные животные, с моделью пренатального андроген-индуцированного синдрома поликистозных яичников, которые получали 1% крахмальный клейстер;
3 группа - группа животных, с моделью пренатального андроген-индуцированного синдрома поликистозных яичников, которые в качестве лечения получали предложенную композицию в дозе 245,14 мг/кг;
4 группа - группа животных, с моделью пренатального андроген-индуцированного синдрома поликистозных яичников, которые в качестве лечения получали композицию, предложенную в прототипе (ЕР 3424497) - в качестве препарата сравнения в дозе 96,66 мг/кг.
Оценка эффективности БАД:
На следующий день после формирования групп, осуществляли ежедневное внутрижелудочное введение БАД и носителя (1% крахмальный клейстер), на протяжении 6 недель.
Определение массы тела животных проводили на 0, 21 и 42 день исследования. Результаты измерения массы тела и динамики прироста массы тела представлены в таблицах 2 и 3 соотвественно.
Несмотря на достоверное отличие массы тела экспериментальных групп от интактной, к 42 дню эксперимента, наблюдается снижение прироста массы тела в группе с изучаемой БАД, достоверное отличающееся от контроля (р<0,001) и от группы сравнения (р<0,001). Показатель прироста в группе с изучаемой БАД достигал уровня интактных животных, и превосходил показатель группы сравнения на 42% (р<0,001).
Начиная с 4 недели по 6 неделю включительно, определяли длительность эстрального цикла по картине влагалищного мазка. Результаты исследования представлены в таблице 4.
В группе контрольных животных наблюдалось увеличение эстрального цикла, достоверно отличающееся от группы интактных животных (р<0,001). Ежедневное введение предлагаемого БАД приводило к нормализации длительности эстрального цикла, достоверно отличаясь от группы контроля (р<0,001). При этом, показатель в группе предлагаемого БАД превосходил группу сравнения на 58%, что указывает на более высокую эффективность предлагаемой БАД и носит достоверный характер отличий (р=0,026).
На 43 день эксперимента проводили эвтаназию животных для последующего забора яичников определения их массы и последующего морфологического исследования. Данные полученные в группах представлены в таблице 5.
Полученные результаты указывают на достоверное увеличение абсолютной массы яичников у животных с андроген-индуцированным синдромом поликистозных яичников.
В группе контроля показатель превосходил на 8% группу интактных животных (р<0,001). Введение исследуемой БАД приводило к снижению массы яичников к значению в группе интактных животных, показатель был ниже на 6,5% группы контроля (р<0,001), и ниже группы сравнения на 2,3% (Р<0,05).
После взвешивая яичники фиксировали в 10% растворе формалина, после материал полностью заливали в стандартном режиме в парафин. Срезы для стандартного гистологического исследования окрашивали гематоксилином и эозином. Описательное исследование гистологических препаратов выполняли под микроскопом Axio Scope A1 (Carl Zeiss Microimaging GMbH, Германия). Подсчет количества фолликулов проводили при увеличении × 40 с 3 срезов на яичник, с каждого яичника животного. Результаты подсчетов представлены в таблице 6.
Исходя из результатов численного определения фолликулов, в группе животных с моделированием пренатального андроген-индуцированного синдрома поликистозных яичников наблюдается увеличение числа первичных, вторичных, атретических фолликулов и снижение числа третичных фолликулов, желтых тел. В группе животных с применением предлагаемой БАД, по всем параметрам оценки количества фолликулов, наблюдается приближение показателей к группе интактных животных, группа не имеет достоверного отличия от группы интактных животных (р>0,05), при этом количество третичных фолликулов увеличилось на 75% относительно группы с моделью патологии, что на 50% лучше группы сравнения.
Полученные результаты свидетельствуют о комплексном воздействии БАД на организм животных с индуцированным СПКЯ за счет чего наблюдается улучшение таких параметров как прирост массы тела, что говорит о влиянии БАД на метаболические процессы, длительность эстрального цикла, а также увеличение числа третичных фолликулов и овуляции. Осуществление выраженных корректирующих эффектов БАД говорит о потенцировании эффектов компонентов предложенной композиции, за счет чего предлагаемая композиция превосходит группу сравнения по параметрам эффективности.