Разработка метода мультиплексного анализа полимеразной цепной реакции для количественного определения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии PH05-026-0048 в пищевых продуктах

Качество и безопасность пищи. Методы контроля

Материал и методы. Изучение фактического питания 80 детей в возрасте от 3 до 6 лет г. Казани проводилось в двух направлениях: изучение индивидуального и семейного питания (анкетно-опросный метод) и изучение питания в коллективах, где ребенок получает полный или частичный рацион (хронометражно-весовой метод). Для расчета экспозиции использовались данные о содержании изучаемых химических веществ в пищевых продуктах и данные о потреблении пищевых продуктов детским населением за период 2011-2014 гг. на основании медианы и 95th percentile в соответствии с МУ 2.3.7.2519-09. Оценку неканцерогенного риска осуществляли по результатам исследований ртути в пищевых группах продуктов, выполненных на базе аккредитованной лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Татарстан» в соответствии с Р 2.1.10.1920-04 и Агентства по охране окружающей среды (USEPA). Характеристика общетоксических эффектов выполнена на основе коэффициентов опасности (HQ) отдельных веществ и суммарных индексов опасности (HI) для веществ с однонаправленным механизмом действия.

Результаты. Результаты оценки показали, что максимальный вклад в экспозицию ртути на уровне медианы и 95th percentile вносили мясо и мясопродукты (36,86 и 28,84% соответственно), зерновые, крупяные и хлебобулочные изделия (18,45 и 42,74% соответственно), рыба и морепродукты (28,79 и 19,80%). Величина экспозиции метилртути у детей на уровне медианы (0,1 мкг/кг массы тела в неделю) и 95th percentile (0,33 мкг/кг массы тела в неделю) не превысила рекомендаций USEPA и JECFA Объединенного комитета экспертов FAO/WHO. Оценка диетического воздействия метилртути с рыбой проводилась путем перерасчета на основании, что почти 90% общего количества ртути, присутствующего в мясе рыбы, рыбо- и морепродуктах, существует в виде MeHg. Метилртуть легко всасывается в организм через желудочно-кишечный тракт и имеет более высокие уровни воздействия. Уровень неканцерогенного риска от воздействия ртути с основными группами продуктов на уровне медианы и 95th percentile является приемлемым (<1), HQ=0,078 и 0,442. Неканцерогенный риск у детей при поступлении метилртути с рыбой на уровне медианы составил 0,661 (<1), на уровне 95th percentile - 2,29, что превысило допустимый уровень (HQ>1).

Обсуждение. Зависимость «доза-эффект» и «доза-ответ» до 6 лет из-за различий со старшими детьми и взрослыми в структурных и функциональных характеристиках обусловливает их большую уязвимость при экспозиции к химическим веществам. Полученные уровни риска на уровне 95th percentile свидетельствует о риске нейропсихологических нарушений для детей младшего возраста г. Казани, обусловленных употреблением рыбы и морских продуктов.

Заключение. Загрязнение метилртутью в рыбе является всемирной проблемой для окружающей среды, поскольку рыба содержит высококачественный белок и другие необходимые питательные вещества, необходимые для роста и развития детей. Рыба является прекрасным источником омега-3 жирных кислот, и балансирование рисков и преимуществ становится все более важной целью рекомендаций по потреблению рыбы. С учетом анатомо-физиологических особенностей детского организма и поведенческих реакций необходимо рассматривать потенциальные выгоды для здоровья от потребления рыбы, которое может составлять в нашем регионе не более 1-2 раз в неделю и не превысит уровень TWI. Однако полученные уровни риска на уровне 95th percentile свидетельствует о риске нейропсихологических нарушений для детей младшего возраста г. Казани, обусловленных употреблением рыбы и морских продуктов.

Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной ФГАОУ ВО «Казанский федеральный университет», для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности 19.9777.2017/8.9.

Сухачева М.В.1, Груздев Д.С.1, Тышко Н.В.2, Садыкова Э.О.2

РАЗРАБОТКА МЕТОДА МУЛЬТИПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННОГО КАРТОФЕЛЯ ЛИНИИ PH05-026-0048 В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

1 Институт биоинженерии ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Москва

2 ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва

Актуальность. Среди существующих в настоящее время методов, позволяющих выявлять генно-инженерно-модифицированные организмы растительного происхождения (ГМО) в пищевой продукции, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) считается наиболее надежным и высокочувствительным, поскольку объектом исследования является ДНК - высокоспецифичный и устойчивый к технологической переработке материал. Рутинная практика количественного определения рекомбинантной ДНК предполагает применение методов ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), при этом регистрация накопления продуктов амплификации возможна по нескольким каналам детекции. Таким образом, ПЦР-РВ позволяет одновременно использовать несколько видов красителей и гасителей их флуоресценции (с неперекрывающими спектрами излучения), что и лежит в основе концепции мультиплексной ПЦР. Мультиплексная ПЦР-РВ предусматривает протекание двух и более реакций в одной пробирке, позволяя существенно сократить время проведения анализа, снизить расход реагентов, риск возникновения ошибок при пипетировании и т.п.

Материалы XVII Всероссийского конгресса с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты нутрициологии и диетологии. Лечебное, профилактическое и спортивное питание»

Целью данной работы являлась разработка метода количественного определения содержания ДНК генно-моди-фицированного (ГМ) картофеля линии PH05-026-0048 в анализируемых образцах в формате двухкомпонентной (дуплексной) ПЦР-РВ по технологии TaqMan PCR.

Материал и методы. Дуплексная система количественного определения ГМ картофеля линии PH05-026-0048 включала использование двух систем ПЦР-РВ, каждая из которых имела специфические ДНК-праймеры и флуоресцентно-меченные зонды: первая выявляла последовательность ДНК, специфичную для трансформационного события (PH05-026-0048); вторая - ДНК, специфичную для соответствующего вида растения. Разработка метода дуплексной ПЦР включала выбор таксон-специфичного гена, оптимизацию реакционной смеси, проверку эффективности и валидацию метода.

Результаты и обсуждение. По результатам анализа литературных данных в качестве вероятных претендентов на роль таксон-специфичных генов картофеля были рассмотрены монокопийные гены sus4, Stp23 и fru (Кочиева и др., 2013), последовательность которых высокоспецифична для генома картофеля (Potato Genome Sequencing Consortium, 2011). Монокопийное состояние генов, а также высокая специфичность праймерных систем делают ДНК маркеры на их основе наиболее эффективными при количественном определении геномной ДНК картофеля. На основании проверки эффективности всех трех таксон-специфичных праймерных систем для дальнейшей работы был выбран ген Stp23.

Для обеспечения точности двухкомпонентного анализа уровень амплификации одной из мишеней не должен превышать уровень амплификации другой, так как «доминирующая мишень» будет потреблять общие реагенты в бoльшем количестве, смещая баланс эффективностей реакций. Для решения этой задачи была проведена оптимизация состава реакционной смеси [концентрация праймеров, зондов, ионов Mg2+, дезоксирибонуклеотидов, бычьего сывороточного альбумина (БСА)] и протокола проведения ПЦР в режиме реального времени: амплифика-ционная смесь для идентификации PH05-026-0048 и контрольного гена Stp23в дуплексной системе содержала 2,5х реакционный буфер для проведения ПЦР-РВ в присутствии ROX (НПК «Синтол», Россия), праймеры, специфичные для ГМ-компонента (PH05F/PH05R) и целевого таксона (GPF3/GPR3) в количестве 250 и 150 нМ соответственно, зонды - 250 и 200 нМ соответственно; БСА 0,02%; MgCl2 - 3,0 мМ; dNTP - 0,3 мМ. Температурно-временной профиль реакции: начальная денатурация 95°С - 5 мин, последующие 50 циклов: 95 °С- 20 с, 58 °С - 20 с, 62 °С - 40 с.

В соответствии с требованиями по валидации (МУК 4.2.3389-16) экспериментально подтверждены линейность, прецизионность, правильность метода. Высокая эффективность предложенного метода доказана результатами независимых амплификаций анализируемого фрагмента ДНК в диапазоне концентраций от 0,1 до 5%, при этом угол наклона стандартной кривой лежал в интервале от -3,2 до -4,1, а коэффициент корреляции линейной регрессии (R2) превышал 0,98. Предел обнаружения (LOD) составил 0,038% или 22 копии геномной ДНК картофеля линии PH05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК (RSDr <25%). Предел количественного обнаружения (LOQ) - 0,12% или 66 копий геномной ДНК картофеля линии PH05-026-0048 из расчета на 100 нг суммарной ДНК (RSDr <25%).

Таким образом, разработан метод количественного определения ДНК ГМ картофеля линии PH05-026-0048 в формате дуплексного ПЦР-анализа. Линейность, прецизионность, правильность и предел определения метода подтверждены в исследованиях in vitro и свидетельствуют о его надежности, что позволяет рекомендовать данный метод для использования в рамках надзора за обращением ГМ картофеля в Российской Федерации.

Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет гранта Российского научного фонда (проект №16-16-04123).

Тышко Н.В.1, Шестакова С.И.1, Садыкова Э.О.1, Сухачева М.В.2, Груздев Д.С.2

МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННОГО КАРТОФЕЛЯ ЛИНИИ РН05-026-0048

1 ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва

2 Центр «Биоинженерия» РАН, ФГУ «Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии"» РАН, Москва

Сложившаяся практика контроля за генно-инженерно-модифицированными организмами растительного происхождения (ГМО) предусматривает использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения, идентификации и количественного определения целевого участка ДНК, характерного для соответствующего ГМО. Поскольку список генно-модифицированных (ГМ) сельскохозяйственных культур, представленных на мировом рынке, постоянно растет (508 линий по ситуации на июль 2018 г.), расширение перечня ПЦР протоколов также осуществляется в плановом порядке. Официальному утверждению метода контроля за ГМО в Российской Федерации предшествует процедура валидации, направленная на подтверждение правомерности применения именно этого метода и объективности полученных результатов.

Материал и методы. Подтверждение характеристик, определенных для количественного метода идентификации ГМ картофеля линии РН05-026-0048, было проведено с использованием сертифицированных стандартных образ-