СПОСОБ ВИЗУАЛИЗАЦИИ И КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ФАЗ МИНЕРАЛИЗАЦИИ КОСТНОГО МАТРИКСА В ПРОЦЕССЕ ОСТЕОГЕНЕЗА
METHOD OF VISUALISATION AND COLORIMETRIC ANALYSIS OF MINERALISATION PHASES OF BONE MATRIX IN OSTEOGENESIS

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при оценке минерализации межклеточного матрикса в процессе ремоделирования и регенерации кости.
Известен способ группировки оттенков аддитивного цифрового цвета в RGB-модели, включающий оцифровку изображения микропрепарата, сохранение его в памяти компьютера в графической и табличной формах, группировку всех пикселов изображения на 13 цветовых тональностей по вариантам соотношения интенсивностей (I) красного (R), зеленого (G), синего (В) каналов, расчет их долей в общей площади изображения и его геометрическую калибровку по длине эталонного отрезка - оцифрованного при тех же условиях изображения шкалы объект-микрометра (Щудло М.М., Щудло Н.А. Принцип группировки оттенков аддитивного цифрового цвета в RGB-модели. Известия Челябинского научного центра (УрО РАН), 2006. вып.4 (34). С.140-144).
Однако способ не адаптирован для анализа изображений окрашенных трехцветным методом по Массону срезов кости.
R
G
B
R
G
B
Известен способ оценки цветовых характеристик окрашенных трихромным методом по Массону (пропись с анилиновым синим) поперечных гистологических срезов декальцинированной компактной кости, включающий оцифровку и сохранение изображений в виде полноцветных графических файлов формата *.bmp без компрессии, геометрическую калибровку изображения по оцифрованному в тех же условиях изображению шкалы объект-микрометра, выделение участка для анализа и удаление содержимого резорбционной полости и/или гаверсова канала из изображения, сохранение анализируемого участка изображения в виде таблицы, где каждому пикселу соответствует одна строка, в ячейках которой зарегистрированы его координаты, а также значения интенсивности по каналам красного (I), зеленого (I) и синего (I), группировку массива табличных данных на 13 цветовых тональностей соответственно возможным комбинациям отношений I, I и I, расчет доли каждой цветовой тональности в общей площади анализируемого участка и сегментацию изображения на указанные 13 цветовых тональностей (Щудло М.М. Оценка колориметрических и информационных характеристик микропрепаратов компактной кости при разных методах окраски. Научный вестник Ханты-Мансийского гос. медицинского института, 2008, вып.3-4. - С.134-143).
Однако данный способ не предназначен для визуализации и колориметрического анализа фаз минерализации костного матрикса в процессе остеогенеза.
Задачей изобретения является разработка способа, обеспечивающего возможность визуализации и колориметрического анализа фаз минерализации костного матрикса в процессе остеогенеза.
R
G
B
R
G
B
Указанная задача решается тем, что в способе визуализации и колориметрического анализа фаз минерализации межклеточного матрикса в процессе остеогенеза, включающем оцифровку изображений окрашенных трихромным методом по Массону поперечных гистологических срезов декальцинированной компактной кости, их сохранение в виде полноцветных графических файлов без компрессии, геометрическую калибровку изображения по оцифрованному в тех же условиях изображению шкалы объект-микрометра, выделение участка для анализа и удаление содержимого резорбционной полости и/или гаверсова канала из изображения, сохранение анализируемого участка изображения в виде таблицы, где каждому пикселу соответствует одна строка, в ячейках которой зарегистрированы его координаты, а также значения интенсивности по каналам красного (I), зеленого (I) и синего (I), группировку массива табличных данных на 13 цветовых тональностей соответственно возможным комбинациям отношений I, I и I, расчет доли каждой цветовой тональности в общей площади анализируемого участка изображения и его сегментацию на указанные 13 цветовых тональностей, оцифровку изображений осуществляют без светофильтров в режиме автоматического баланса белого при инструментальных увеличениях микроскопа не менее 200х, в качестве репрезентативных участков для анализа используют поперечно срезанные базовые многоклеточные единицы на уровне остеобластического конуса на разных стадиях остеоногенеза, из массива полученных табличных данных выбирают пикселы, окраска которых описывается выражениями:
B
G
R
I>I>I, соответствующим изображению остеоида;
B
G
R
I>I=I, соответствующим изображению фронта минерализации;
B
R
G
I>I>I, соответствующим изображению слоя аморфной фазы;
R
B
G
I>I>I, соответствующим изображению ядер кристаллизации;
R
B
G
I>I>I, соответствующим изображению кристаллической фазы,
визуализируют фазы минерализации, выделяя разными цветами указанные выше цветовые тональности в анализируемом изображении, по отношениям площади остеоида и площади ядер кристаллизации к площади аморфной фазы определяют, соответственно, индекс первичной минерализации и индекс нуклеации.
Способ поясняется описанием, примером практического использования и иллюстративным материалом, на котором изображено:
Фиг.1 - фрагмент табличной формы записи цифрового изображения с регистрацией координат каждого пиксела по осям "х" и "y", значений интенсивности (I) по каналам красного (R), зеленого (G) и синего (В) и выражения, характеризующего цветовую тональность, к которой относится пиксел.
Фиг 2 - номера и выражения цветовых тональностей.
Фиг.3 - изображение базовой многоклеточной единицы на уровне остеоногенеза; объектив - 16; окуляр - 12,5х; окраска - трихром по Массону; а - содержимое резорбционного канала выделено контуром, b - удалено.
Фиг.4 - табличная и графическая формы колориметрического профиля анализируемого изображения, представленного на фиг.3b: выявлены 5 цветовых тональностей: ЦТ 2, ЦТ 7, ЦТ 8, ЦТ 9 и ЦТ 10 (соответствующие строки в таблице выделены жирным).
Фиг.5 - базовая многоклеточная единица на стадии остеоногенеза (а), выделенный контуром фрагмент стенки развивающегося остеона (b) и результаты сегментации (c, d, e, f, g) этого фрагмента на цветовые тональности; h - увеличенное изображение выделенного контуром фрагмента, в котором пикселы ЦТ 9 выделены черным, а ЦТ 10 - зеленым, в результате чего визуализированы и остальные цветовые тональности (фазы минерализации): 1 - ЦТ 8 - слой остеоида, 2 - ЦТ 9 - фронт минерализации, 3 - ЦТ 7 - зона накопления фосфата кальция (аморфная фаза), 4 - ЦТ 10 - ядра кристаллизации, 5 - ЦТ 2 - зона накопления гидроксиапатита (кристаллическая фаза минерализации).
Фиг.6 - колориметрический анализ изображения поперечного среза базовой многоклеточной единицы на стадии остеона: колонка I - а) анализируемое изображение (содержимое гаверсового канала удалено). Объектив - 16; окуляр - 12,5х. Окраска - трихром по Массону; b) в том же изображении пикселы цветовой тональности 10 выделены черным; колонка II - табличная форма записи колориметрического профиля анализируемого изображения: обнаружены только 3 цветовые тональности - ЦТ 2, ЦТ 7 и ЦТ 10 (выделены жирным); их площади - количество пикселов в колонке II pix, а доли в общей площади изображения - в колонке II %; колонка III - анализируемое изображение сегментировано на указанные цветовые тональности.
Способ осуществляют следующим образом.
Микропрепарат - окрашенный трихромным методом по Массону (пропись с анилиновым синим) поперечный гистологический срез декальцинированной компактной кости - размещают на предметном столике микроскопа, снабженного цифровой фото- или видеокамерой, выбирают режим камеры «автоматический баланс белого», при увеличении микроскопа от 200х и более выбирают нужное поле зрения, без свтофильтров регулируют освещение, тщательно фокусируют и оцифровывают изображение препарата. При тех же условиях оцифровывают изображение шкалы объект-микрометра. Изображения сохраняют как полноцветные графические файлы формата *.bmp без компрессии и, при необходиости, транспортируют по учрежденческой сети в специализированный компьютер.
R
G
B
Для проведения колориметрического анализа изображение микропрепарата открывают в программе - графическом редакторе, осуществляют геометрическую калибровку изображения по оцифрованному изображению шкалы объект-микрометра, инструментом типа "лассо" выделяют репрезентативный участок - поперечно срезанную базовую многоклеточную единицу на уровне заднего (остеобластического) конуса на одной из стадий остеоногенеза - от 2-3 костных пластинок до зрелых остеонов - и удаляют из изображения содержимое резорбционной полости или гаверсова канала; подготовленный таким образом участок для анализа сохраняют и как графический файл, и в виде таблицы (фиг.1), где каждому пикселу соответствует одна строка, в ячейках которой зарегистрированы его координаты в анализируемом участке изображения, значения интенсивности по каналам красного (I), зеленого (I) и синего (I), а также выражение, характеризующее отношение между этими интенсивностями - цветовую тональность конкретного пиксела.
R
G
B
Массив табличных данных о пикселах изображения группируют на 13 цветовых тональностей (ЦТ) соответственно возможным комбинациям отношений I, I и I (фиг.2), рассчитывают доли каждой цветовой тональности в общей площади анализируемого участка и сегментируют изображение на те же 13 цветовых тональностей, полученный при этом колориметрический профиль анализируемого изображения сохраняют в табличной и графической формах (фиг.4).
Выбирают соответствующие окраске фаз минерализации цветовые тональности, которые описываются выражениями:
B
G
R
I>I>I, соответствующим изображению остеоида - ЦТ 8;
B
G
R
I>I=I, соответствующим изображению фронта минерализации - ЦТ 9;
B
R
G
I>I>I, соответствующим изображению слоя аморфной фазы - ЦТ 7;
R
B
G
I>I>I, соответствующим изображению ядер кристаллизации - ЦТ 10;
R
B
G
I>I>I, соответствующим изображению кристаллической фазы - ЦТ 2.
РМ
N
PM
ост
аморф
N
ядер
аморф
Вслед за этим, выделяя разными цветами указанные выше цветовые тональности, визуализируют в анализируемом изображении фазы минерализации и определяют характеризующие состояние костной ткани индексы первичной минерализации (I) и нуклеации (I). Первый представляет собой отношение площади (в пикселах) остеоида к площади аморфной фазы (I=А/А), второй - отношение площади ядер кристаллизации к площади аморфной фазы (I=А/А).
При необходимости выполнения расчетов в метрических единицах, с помощью эталонного (оцифрованного при том же увеличении) изображения объект-микрометра проводят геометрическую калибровку изображения, определяя длину стороны и площадь одного пиксела. Расчет указанных выше индексов, в этом случае, выполняют по соотношению площадей соответствующих участков изображения. Результаты геометрической калибровки могут быть также использованы для измерений и расчетов гистоморфометрических параметров в полученных при сегментации изображениях - толщины слоя, абсолютной площади, угловых размеров.
Практическое использование способа иллюстрируют следующие примеры: микропрепарат - окрашенный трихромным методом по Массону (пропись с анилиновым голубым) поперечный гистологический срез декальцинированной компактной кости - разместили на предметном столике большого исследовательского фотомикроскопа фирмы "Opton" (Германия), на котором смонтирован АПК "DiaMorph" (Москва). При объективе 16 и окуляре 12,5х (инструментальное увеличение = 200х) выбрали поле зрения с базовой многоклеточной единицей на стадии остеоногенеза - присутствует ряд функционально активных остеобластов и 4-5 костных пластинок (пример 1), тщательно сфокусировали и без светофильтров отрегулировали освещение, выбрали режим камеры «автоматический баланс белого» и оцифровали изображение препарата. Для примера 2 выбрали и оцифровали другое поле зрения - с базовой многоклеточной единицей на стадии сформированного остеона. При тех же условиях оцифровали изображение шкалы объект-микрометра. Все изображения сохранили в памяти компьютера как полноцветные (24 бит/пиксел) графические файлы формата *.bmp без компрессии и транспортировали по учрежденческой сети в специализированный компьютер для анализа.
Анализ проводили следующим образом.
РМ
Пример 1. Изображение микропрепарата открыли в программе DiaMorphCito_W, инструментом типа "лассо" выделили репрезентативный участок - базовую многоклеточную единицу на стадии остеоногенеза (фиг.3а), оконтурили и удалили содержимое резорбционного канала (фиг.3b), полученное изображение для анализа сохранили и как графический файл, и как таблицу. Провели группировку табличных данных на цветовые тональности, результаты которой - колориметрический профиль - представлены на фиг.4: в анализируемом изображении присутствуют 5 цветовых тональностей (соответствующие строки в таблице выделены жирным): ЦТ 2, ЦТ 7, ЦТ 8, ЦТ 9 и ЦТ 10. Рассчитали индекс первичной минерализации (1), характеризующий интенсивность накопления в остеоиде аморфного фосфата кальция:
РМ
ост
аморф
I=А/А=150/1145=0,131
N
и индекс нуклеации (I), характеризующий активность фазового (аморфная → кристаллическая) перехода:
N
ядер
аморф
I=А/А=44 /1145=0,038.
Чтобы увидеть каждую из 5 присутствующих цветовых тональностей по отдельности, в анализируемом изображении оконтурили участок стенки развивающегося остеона (фиг.5а), вырезали его, сохранили как отдельный файл (фиг.5b) и выполнили цветовую сегментацию, сохранив результаты в самостоятельных файлах: фиг.5с - ЦТ 8 (соответствует остеоиду), фиг.5d - ЦТ 9 (соответствует фронту минерализации), фиг.5е - ЦТ 7 (соответствует аморфной фазе), фиг.5f - ЦТ 10 (соответствует ядрам кристаллизации) и фиг.5g - ЦТ 2 (соответствует кристаллической фазе).
Для визуализации одновременно всех пяти цветовых тональностей в увеличенном изображении выделенного участка стенки развивающегося остеона пикселы ЦТ 9 выделили черным, а ЦТ 10 - зеленым (фиг.5h).
Пример 2. Изображение микропрепарата открыли в программе DiaMorphCito_W, инструментом типа "лассо" выделили репрезентативный участок для анализа - сформированный остеон, удалили содержимое гаверсова канала; подготовленный таким образом участок для анализа сохранили в табличном и графическом (фиг.6-Iа) форматах. В результате группировки табличных данных (фиг.6-11) в составе анализируемого изображения обнаружены только 3 цветовые тональности - ЦТ 2, 7 и 10 - с характерной для зрелых остеонов топографией (фиг.6, III): ЦТ 7 локализуется во внутренней пластинке остеона, ЦТ 2 - в более наружных пластинках, а ЦТ 10 - на границе между ними. Для визуализации выявленных цветовых тональностей в анализируемом изображении пикселы ЦТ 10 были выделены черным (фиг.6-Ib).
Для оценки активности процесса фазового перехода рассчитали индекс нуклеации
N
ядер
аморф
I=А/А=17/1539-0,011.
Расчет индекса первичной минерализации в примере 2 невозможен из-за отсутствия остеоида и фронта минерализации в стенке развитого остеона.
Использование предложенного способа в РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А.Илизарова показало, что его применение обеспечивает возможность визуализации и колориметрического анализа фаз минерализации костного матрикса в процессе остеогенеза, повышая тем самым информативность морфологических исследований. При этом предлагаемый способ позволяет зарегистрировать различия в наборах цветовых тональностей и в значениях индексов, характеризующих процесс минерализации костного матрикса, на разных стадиях остеогенеза.