РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ПЛАЗМИНОГЕНА ЧЕЛОВЕКА ПРЕВРАЩАТЬСЯ ПРИ АКТИВАЦИИ В ПЛАЗМИН, КОТОРЫЙ КАТАЛИЗИРУЕТ РАСЩЕПЛЕНИЕ ФИБРИНА, ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ПОЛИПЕПТИДА И ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ КЛЕТКА Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА
RECOMBINANT POLYPEPTIDE WITH HUMAN PLASMINOGEN PROPERTIES TO CONVERT INTO PLASMIN IF ACTIVATED WHICH CATALYSES FIBRIN SPLITTING, DNA FRAGMENT CODING POLYPEPTIDE, RECOMBINANT PLASMID DNA FOR POLYPEPTIDE EXPRESSION AND TRANSFORMED Escherichia coli CELL - POLYPEPTIDE PRODUCER

Изобретение относится к области биотехнологии, генетической и белковой инженерии, т.е. к технологии получения белков с видоизмененными природными или новыми свойствами.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к рекомбинантным полипептидам со свойствами плазминогена человека, что предполагает возможность их использования для создания фибринолитических лекарственных средств.
Изобретение относится также к последовательностям ДНК, которые кодируют новые полипептиды со свойствами плазминогена человека, рекомбинантным плазмидным ДНК, содержащим кодирующие новые полипептиды последовательности ДНК, а также трансформированным клеткам Escherichia coli - продуцентам новых полипептидов со свойствами плазминогена человека.
Тромбозы и их лечение - очень острая проблема в медицине. Тромбоз - образование внутрисосудистых сгустков крови, препятствующих нормальному кровотоку. Тромбоз в системе коронарного кровообращения ведет к инфаркту миокарда, тромбоз сосудов мозга - к инсульту. При отрыве тромба может произойти эмболия - внезапная закупорка сосудистого русла оторвавшимся кусочком тромба. Клиническая практика последних десятилетий свидетельствует о продолжающемся нарастании количества тромбозов и эмболии магистральных сосудов, их тяжелых осложнений. (Bramlage P. et al., Current concepts for the prevention of venous Thromboembolism, European Journal of Clinical Investigation (2005) 35, (Suppl. 1), pp.4-11). Международная статистика такова: на 100000 человек приходится 150 случаев тромбоза глубоких вен в год. Диагностика и лечение таких больных пока неудовлетворительны; доказательством этого является высокая смертность больных (по литературным данным от 20 до 35%) и высокая частота ампутаций конечностей по поводу гангрены, достигающая почти 20% (Савельев B.C., Ангиографическая диагностика и рентгеноэндоваскулярная хирургия неотложных состояний. М., 1986, с.7). Не менее чем у 600 тыс. человек развивается тромбоэмболия легочной артерии. При тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА) летальность среди нелеченых пациентов достигает 40%, тогда как при проведении своевременной терапии она не превышает 10%. ТЭЛА стала ведущей причиной материнской смертности в экономически развитых странах. Большое количество мозговых инсультов в неврологии - следствие эмболии тромбами. По статистике на втором месте причиной смерти больных со злокачественными опухолями стоят тромбозы.
Проблема лечения инфаркта миокарда также остается одной из наиболее актуальных проблем медицины и здравоохранения ибо касается около 0,2% населения ежегодно. Несмотря на введение тромболитической терапии (ТЛТ) в стандартную практику лечения в большинстве промышленно развитых стран мира (значительно снизившей госпитальную смертность от инфаркта миокарда), общая смертность от инфаркта достигает 45%, а госпитальная 15% (Sayer J.W et al., Prognostic implications of ventricular fibrillation in acute myocardial infarction: new strategies required for further mortality reduction; Heart, 2000, 84, pp.258-261). Применение, в основном на догоспитальном этапе, активаторов плазминогена таких как «Актилиза», «Тенектеплаза» (Германия, Берингер) на основе рекомбинантного tPA (тканевого активатора плазминогена) или «Пуролаза» (Россия, экспериментальное предприятие ФГУ «РКНПК Росмедтехнологий») на основе рекомбинантного uPa (урокиназного активатора плазминогена), двух естественных активаторов плазминогена, весьма эффективно при условии быстрого (до 3-6 часов) применения после возникновения окклюзии.
При других тромбозах больные обращаются к врачу, как правило, когда применение активаторов плазминогена уже малоэффективно. Более того, удаление протяженных и застарелых тромбов требует неоднократного введения активатора плазминогена и поддержание его концентрации на уровне, значительно превышающем физиологический, в течение длительного времени. Это приводит к изменению общего гемостаза: индукции ингибиторов активаторов плазминогена РАI1 и PAI2 и истощению содержания плазминогена, альфа-2 антиплазмина и др., что естественно приводит к неэффективности повторных введений активаторов плазминогена из-за, в частности, отсутствия субстрата для активатора плазминогена. Естественное восстановление концентрации этих компонентов происходит за 24 часа.
Препарата, в полной мере пригодного для локального растворения протяженных тромбов, на мировом рынке пока нет.
Для восстановления кровотока необходимо растворить фибриновые нити, из которых состоит тромб. Растворение тромба, происходит оно физиологически или фармакологически, обусловлено в конце концов активной короткоживущей сериновой протеазой - плазмином. В нормальных физиологических условиях плазминоген, синтезируемый в печени, циркулирует в кровотоке и лимфотоке в концентрации около 1-2 мкМ, в два раза меньшей, чем концентрация основного необратимого ингибитора плазмина альфа-2 антиплазмина. Плазминоген в отличие от плазмина полностью устойчив к альфа-2 антиплазмину. Плазмин получается из плазминогена, циркулирующего в плазме гликопротеина, с помощью активаторов: tPA, стрептокиназы, uPa.
Все ныне применяющиеся тромболитические агенты - активаторы плазминогена. Их свойства позволяют им эффективно работать на относительно небольших тромбах в коронарных артериях (инфаркт миокарда). Однако их недостаток - зависимость от концентрации плазминогена - проявляется, когда тромб протяженный, а доставка плазминогена из кровотока нарушена. Такие тромбы обычно бывают при окклюзии периферических артерий или при тромбозе глубоких вен. Фактически, в этом случае системное введение активаторов плазминогена неэффективно для растворения этих массивных тромбов. Более эффективна местная доставка с помощью катетера. В тех случаях, когда тромбы обрабатывают локально с помощью катетера, традиционные тромболитики (такие, как активаторы плазминогена), по-видимому, не являются лучшими лекарствами для этой цели, растворение проходит малоэффективно и длительно, и представляется заманчивым применение прямого тромболитика. Плазмин проявляет прямую фибринолитическую активность, не требуя плазминогена или плазминоген-активатора. По сравнению с плазминоген-активаторами эта независимость от эндогенного плазминогена позволяет плазмину эффективно растворять протяженные образования.
Активный плазмин рассматривали как тромболитический агент еще полстолетия назад. Впервые опробованный более 40 лет назад плазмин оказался неэффективным при внутривенном введении, так как нейтрализовался антиплазмином плазмы. Непосредственная доставка плазмина к тромбу через катетер предотвращает нейтрализацию плазмина и он проявляет свою тромболитическую активность, однако технические сложности по доставке препарата прямо к тромбу в то время привели к отказу от этого направления. Плазмин, который получали из плазмы крови человека, был недостаточно чистым, в нем была примесь стрептокиназы или трипсина, которые превращала плазминоген в плазмин, существовала опасность контаминации препарата вирусами. Наконец, выделенный плазмин был нестабилен и разлагался на всех стадиях выделения, хранения и применения. Быстрая инактивация препарата существующим в крови избытком альфа-2 антиплазмина позволяла использовать эти препараты для локального применения, например в офтальмологии. С развитием методов малоинвазивной хирургии возобновился интерес к применению плазмина в качестве тромболитика. Идея ведения прямого тромболизиса активными протеиназами с недавних пор стала очень привлекательной для фармацевтических компаний. Появились сообщения о создании штаммов-продуцентов рекомбинантного плазминогена человека, а также различных мутантных форм этого белка (Nagai N. Recombinant human microplasmin production and potencial therapeutic properties, Thrombosis and Haemostasis, 2003, v.1, pp.307-313) с целью обработки периферических тромбозов и для очистки тромбированных инструментов, таких как петля-катетер, и синтетических сосудистых трансплантатов. Начаты работы по применению кислотозащищенных препаратов плазмина для фибринолиза, особенно при тромбоэмболиях сонной артерии, на лабораторных животных.
Исследование препарата на кроликах показало, что плазмин в отличие от тканевого активатора плазминогена не вызывает геморрагии, плазмин имеет 6-кратный запас безопасности в отличие от тканевого активатора плазминогена, который вызывает геморрагию в тромболитической концентрации. Плазмин вызывает кровотечения, лишь когда полностью исчерпаны факторы коагуляции, что можно определить для каждого больного аналитически, таким образом предсказав вероятность осложнений (Novokhatny V.V. et al., Locally delivered plasmin: why should it be superior to plasminogen activators for direct thrombolysis, Trends Pharmacol. Sci., 2004, 25(2), pp.72-75; Shlansky-Goldberg R.D. et al., A first-in-human phase I trial of locally delivered human plasmin forhemodialysis graft occlusion, Thrombosis and Haemostasis, 2008, 6(6), pp.944-950).
Таким образом, плазмин более пригоден и более безопасен, чем активаторы плазминогена при растворении протяженных кровяных тромбов у человека. Его единственным ожидаемым недостатком является очень короткое время жизни в кровотоке. Поскольку плазмин является активным ферментом, производить и хранить его значительно удобнее в виде плазминогена, активируя непосредственно перед применением или в процессе применения.
Природный плазминоген состоит из каталитического домена (предшественника сериновой протеазы), пяти крингл-доменов и аминотерминального фрагмента. После протеолитической активации соответствующей протеазой-активатором каталитический домен превращается в активную протеазу - плазмин, гидролизующую фибрин тромба или некоторые белки межклеточного матрикса до растворимых пептидных фрагментов. Аминотерминальный фрагмент и крингл-домены обеспечивают специфичность плазминогена (и образующегося из него плазмина) именно к фибрину.
Человеческий плазминоген имеет последовательность, состоящую из 791 аминокислоты, без сигнального пептида, отрезаемого при секреции (http://www.uniprot.org/uniprot/P00747; Forsgren M. et al., Molecular cloning and characterization of a full-length cDNA clone for human plasminogen, FEBS Lett. 1987, v.213, pp.254-260).
Природный не модифицированный плазминоген может быть выделен из плазмы донорской крови. Однако это - трудоемкий и дорогостоящий процесс, базирующийся на дефицитном сырье, к тому же чреватый вирусным заражением.
Получение природного плазминогена в культуре клеток человека дорого и также требует постоянного внимания в отношении вирусов.
Плазминоген из рогатого скота биохимически похож на человеческий, но иммуногенен, и также остается опасность вирусного заражения.
Поэтому предпочтительным решением оказывается продукция плазминогена в клетках микроорганизмов, например в клетках Escherichia coli.
Известны различные рекомбинантные модифицированные варианты природного плазминогена. Так, в патенте США №5688644 сайт активации, по которому происходит расщепление молекулы плазминогена активаторами плазминогена, заменен участком, который расщепляется тромбином. А в патенте США №5637495 сайт активации заменен участком, который расщепляется тромбином или Фактором Ха. Описаны аналоги природного плазминогена, имеющие такие замены в сайте активации, которые позволяют катализировать расщепление одним из следующих ферментов, вовлеченных в процесс тромбообразования: калликреин, Факторы XIIa, XIa, IXa, VIIa, Ха, тромбин или активированный белок С (Европейский патент №0502968). Все вышеописанные варианты модифицированного плазминогена по свойствам мало отличаются от фермента плазмина, а вот по развитию кинетики активации во времени и пространстве они совершенно иные. Эти варианты модифицированного плазминогена нацелены на лизис свежеобразующихся (а не застарелых) тромбов. Кроме того, они не являются прямыми аналогами человеческого плазминогена и функционально они ближе даже к антикоагулянтам, нежели к фибринолитикам.
Вследствие сложной структуры полноразмерной молекулы природного человеческого плазминогена (каталитический домен, 5 крингл-доменов, каждый из которых содержит по 3 дисульфидных связи, аминотерминальный домен и пр.) затруднительно использовать бактериальную систему экспрессии для производства этого белка: плазминоген, получаемый в виде нерастворимых телец включения, плохо поддается рефолдингу, выход низок, реконструкция не эффективна.
Домены плазминогена достаточно автономны. Так, каталитический домен, отщепляемый в результате автопротеолиза in vitro, может быть активированным, после чего обладает каталитической активностью полного плазминогена, но лишен способности специфически связываться с фибрином (Wu H. L. et al., Structure and formation of microplasmin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84(24), pp.8793-8795). Он получил название микроплазминогена и имеет последовательность, состоящую из 249 аминокислот (с 543 по 791 АК последовательности плазминогена человека).
Фрагмент, отщепляемый при неполном гидролизе in vitro эластазой, включающий в себя каталитический домен и 5-й крингл-домен, называют миниплазминогеном (Moroz L.A., Mini-plasminogen: a mechanism for leukocyte modulation of plasminogen activation by urokinase. Blood, 1981, v. 58, pp.97-104; Machovich R., Owen W.G., An elastase-dependent pathway of plasminogen activation, Biochemistry, 1989, 28(10), pp.4517-4522). Он также обладает каталитической активностью и способностью связываться с отдельными доменами фибрина (Takada A. et al., Activation of Val442-plasminogen (mini-plasminogen) by urokinase, streptokinase and tissue plasminogen activator, Thromb Res., 1988, v.9 (№2), pp.253-263,), но лишен характерной для плазминогена лизинсвязывающей активности (см. Moroz L.A.). Таким образом, миниплазминоген, получаемый in vitro гидролизом полноразмерного плазминогена эластазой, имеет фибринсвязывающие свойства, промежуточные между полноразмерным плазминогеном и микроплазминогеном (Suenson E., Thorsen S., Secondary-site binding of Glu-plasmin, Lys-plasmin and miniplasmin to fibrin, Biochem. J. (1981), v.197, pp.619-428). Миниплазминоген состоит из 348 аминокислот (с 444 по 791 АК последовательности плазминогена человека).
Микроплазминоген и миниплазминоген экспрессировались в клетках E.coli с удоволетворительным выходом продукта (Medynski D. et al., Refolding, purification and activation of miniplasmmogen and microplasminogen isolated from E.coli inclusion bodies, Protein Expr. Purif, 2007, 52(2), pp.395-402).
Однако микроплазминоген неспецифичен к фибрину и имеет сниженную ферментативную активность по отношению даже к модельным пептидам (см. ссылку выше (Medynski D. et al.).
Миниплазминоген более активен и специфичен. Однако миниплазминоген в том виде, в каком его отрезает эластаза, плохо укладывается in vitro.
Достаточно близким к описываемым рекомбинантным полипептидам со свойствами плазминогена человека является делеционный вариант плазминогена (delta-plasminogen), содержащий каталитический домен и один из крингл-доменов: 1-й крингл-домен. Утверждается, что кроме каталитической активности, проявляющейся после активации, этот белок обладает выраженными свойствами связывать лизин и фибрин, характерными для полноразмерного плазминогена (WO 2005/105990). Однако дельта-плазминоген после активации обладает фибринолитической активностью, которая ингибируется α2-антиплазмином со скоростью от 5 до 60 раз большей, чем плазмин, что является неприемлемым для наших целей.
Заявляемые новые рекомбинантные полипептиды со свойствами плазминогена были получены путем направленного поиска вариантов человеческого плазминогена, обладающих высокой каталитической активностью в активированной форме, способностью к эффективной продукции в клетках E.coli с последующей реконструкцией трехмерной структуры.
Поиск производился среди вариантов, заведомо содержащих некоторые, но не все структуры, участвующие в связывании фибрина.
Фибринсвязывающая активность позволяет плазминогену и его модификациям физически находиться на месте тромболизиса, тем самым создавая высокую локальную концентрацию. Отсутствие сродства к фибрину, как в случае микроплазминогена, может рассматриваться как недостаток. С другой стороны, высокая фибринсвязывающая активность полноразмерного плазминогена или дельта-плазминогена (WO 2005/105990) затрудняет диффузию препарата при больших физических размерах тромба или сгустка. Более того, в природном полноразмерном плазминогене существует достаточно сложная регуляция фибринсвязывающей активности, предусматривающая взаимодействие крингл-доменов между собой и взаимодействие их с аминотерминальным фрагментом, модулирующие сродство к фибрину (см. выше Suenson Т., Thorsen S., Biochem. J. (1981), v.197, pp.619-428, и An S.S.A. et al., Structural/functional properties of the Glul-Ser57 N-terminal and interaction with kringle domains fragment of human plasminogen: Conformational characterization, Protein Sci. 1998 №7, pp.1947-1959).
Таким образом, оба варианта: как с отсутствием фибринсвязывающей активности, так и с высокой фибринсвязывающей активностью, не являются оптимальными как возможный инструмент лизиса тромбов.
Поэтому поиски оптимального варианта велись среди вариантов структур плазминогена, содержащих по крайней мере один крингл-домен (5-й) и не содержащих аминотерминального фрагмента и 1-го крингла, поскольку микроплазминоген, т.е. только каталитический домен, не имеющий дополнительного сродства к субстрату - фибрину, не представляет интереса, а излишнее сродство к фибрину, обусловленное прежде всего 1-м кринглом, нецелесообразно.
Таким образом, возможный N-конец требуемого полипептида находился в диапазоне остатков 163-165, 244-255 и 334-357 последовательности природного полноразмерного плазминогена. Первые два варианта (без 1-го крингла и без 1-го и 2-го крингла) не дали удовлетворительных результатов. Предпочтительным оказался третий вариант, когда N-конец находился в диапазоне остатков 334-357 последовательности природного полноразмерного плазминогена, т.е. оставались только 5-й и 4-й кринглы (при этом целостность явных структурных доменов (кринглов) не нарушалась.
Итак, как уже писалось выше, полноразмерный плазминоген и дельта-плазминоген (каталитический домен плюс 1-й крингл) обладают слишком сильной сорбцией на фибрине, что способствует их «залипанию» на одном месте вместо нужного для тромболизиса постоянного перемещения от одного участка тромба к другому. Микроплазминоген, представляющий собой только один каталитический домен, обладая каталитической активностью, лишен в то же время способности специфически связываться с фибрином. Миниплазминоген более активен и специфичен. Однако миниплазминоген в том виде, в каком его отрезает эластаза, плохо укладывается in vitro. В то же время выбранные нами новые рекомбинантные полипептиды, состоящие из каталитического домена и двух (5-го и 4-го) крингл-доменов представляют наилучший вариант из всех перечисленных выше.
Новые рекомбинантные полипептиды со свойствами плазминогена человека содержат каталитический домен плазминогена, 5-й и 4-й крингл-домены плазминогена, видоизмененный фрагмент аминокислотной последовательности, предшествующий 4-му крингл-домену плазминогена и имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5.
В рекомбинантном полипептиде с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 участок, предшествующий 4-му крингл-домену, представляет собой аминокислотную последовательность Met Gln Asp.
В рекомбинантном полипептиде с аминокислотной последовательность SEQ ID NO:3 участок, предшествующий 4-му крингл-домену представляет собой аминокислотную последовательность Met Thr Gln Asp.
В рекомбинантном полипептиде с аминокислотной последовательность SEQ ID NO:5 участок, предшествующий 4-му крингл-домену представляет собой аминокислотную последовательность Met Ser Thr Gln Asp.
Следующим объектом описываемой группы изобретений являются фрагменты ДНК, кодирующие полипептиды со свойствами плазминогена человека по п.1 и имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6 или аналогичные последовательности, обусловленные вырожденностью генетического кода.
Так фрагмент ДНК с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2 кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.
Фрагмент ДНК с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:4 кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.
Фрагмент ДНК с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:6 кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5.
Фрагменты ДНК получают путем обратной траскрипции мРНК клеток человека с последующей амплификацией нужного фрагмента методом ПЦР. В дальнейшем участки, расположенные между сайтами рестрикции, могут быть заменены синтетическими фрагментами с требуемой последовательностью.
Еще одним объектом изобретения являются рекомбинантные плазмидные ДНК pPGL для экспрессии новых полипептидов со свойствами плазминогена человека, содержащие один из фрагментов ДНК, их кодирующих, и одну или несколько регуляторных последовательностей.
Примером такой плазмидной ДНК может служить рекомбинантная плазмидная ДНК pPGL1 для экспрессии полипептида SEQ ID NO:1, содержащая следующие последовательно соединенные конструктивные элементы: HindIII-EcoRI фрагмент плазмиды pUC19 размером 2,7 т.п.о., несущий в себе участок начала репликации, ген устойчивости к антибиотику и lac-промотор; HindIII-NdeI фрагмент, представляющий 5'-нетранслируемую область, участок инициации трансляции и инициирующий кодон;
фрагмент NdeI-BamH1, кодирующий последовательность SEQ ID NO:1 и имеющий ДНК-последовательность SEQ ID NO:2; 3'-нетранслируемая область BamH1-Acc65 I; BsaBI-SphI-фрагмент генома Escherichia coli размером 450 п.о.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pPGL2 служит для экспрессии полипептида с последовательностью SEQ ID NO:3. В ней фрагмент NdeI-BamH1 имеет ДНК-последовательность SEQ ID NO:4.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pPGL3 служит для экспрессии полипептида с последовательностью SEQ ID NO:5. В ней фрагмент NdeI-BamH1 имеет ДНК-последовательность SEQ ID NO:6.
Карта плазмиды pPGL1 представлена на чертеже. Карта не дает исчерпывающей информации о деталях последовательности, например о сайтах рестрикции, присутствующих в данной ДНК, однако указанные на этом чертеже сайты являются достаточными для однозначного распознавания функциональных элементов плазмиды. В основе получения плазмид pPGL лежит технология рекомбинантных ДНК, все методы которой хорошо известны специалистам в данной области. Так, для получения рекомбинантной плазмидной ДНК pPGL1 плазмиду pUC19 между сайтами HindIII и EcoRI последовательно модифицируют синтетическим видоизмененным фрагментом гена ompA E.coli в виде фрагмента HindIII-NdeI, амплифицированным фрагментом кДНК плазминогена человека (фрагмент NdeI-BamH1), далее следует добавление синтетического фрагмента ВаmН1-Acc65I, содержащего внутри себя характерный BamH1-Acc65I участок. Фрагмент Acc65I-EcoRI замыкает кольцо и содержит в себе BsaBI-SphI фрагмент ДНК E.coli.
Рекомбинантные плазмидные ДНК pPGL2 и pPGL 3 получают из плазмиды pPGL1 заменой фрагмента NdeI-NcoI в начале кодирующей области на синтетический.
Следующим объектом описываемой группы изобретений являются клетки бактерий Escherichia coli штамма JM109, трансформированные рекомбинантными плазмидными ДНК pPGL1, pPGL 2 и pPGL3, кодирующими новые полипептиды со свойствами плазминогена человека, имеющими последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 и SEQ ID:5 соответственно.
Еще одним объектом заявляемой группы изобретений является фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитическим действием, которая содержит в качестве действующего вещества любой из рекомбинантных полипептидов со свойствами плазминогена человека и имеющий последовательность SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:3, или SEQ ID:5 в эффективной терапевтической дозе.
Таким образом, удачно выбранные последовательности полипептидов и строение экспрессирующей части рекомбинантных плазмидных ДНК pPLG позволяют получать с высоким уровнем экспрессии и хорошими фибринолитическими свойствами новые рекомбинантные полипептиды, способные быть активной основой лекарственных фибринолитических средств.
Для лучшего понимания настоящего изобретения описание сопровождается следующей иллюстрацией.
На чертеже представлена карта рекомбинантной плазмидной ДНК pPGL1, содержащая основные функциональные элементы плазмиды и характерные участки узнавания рестриктазами. Промотор lac-оперона E.coli обозначен как "Plac"; «ori» - участок начала репликации; «bla» - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; «А» - 5'-нетранслируемая область, имеющая последовательность SEQ ID NO:7; «В» - область, имеющая последовательность SEQ ID NO:2 и кодирующая новый полипептид со свойствами плазминогена человека с последовательностью SEQ ID NO:1; «С» - 3'-нетранслируемая область, имеющая последовательность SEQ ID NO:8; «D» - фрагмент ДНК E.coli. Для привязки расположения функциональных элементов к физической карте (последовательности) приведены участки узнавания рестриктазами: HindIII, EcoRI, Ndel, BamHI, Acc65I, SphI и др.
Перечень последовательностей аминокислот и нуклеотидов, характеризующих настоящее изобретение, включает следующие последовательности:
SEQ ID NO:1 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного полипептида со свойствами плазминогена человека, в котором участок, предшествующий 4-му крингл-домену имеет последовательность MetGlnAsp.
SEQ ID NO:2 представляет собой фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.
SEQ ID NO:3 представляет собой аминокислотную последовательность полипептида, в котором участок, предшествующий 4-му крингл-домену, имеет последовательность MetThr Gln Asp.
SEQ ID NO:4 представляет собой фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.
SEQ ID NO:5 представляет собой аминокислотную последовательность полипептида, в котором участок, предшествующий 4-му крингл-домену, имеет последовательность Met SerThr Gln Asp.
SEQ ID NO:6 представляет собой фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5.
SEQ ID NO:7 представляет собой фрагмент ДНК, кодирующий 5'-нетранслируемую область транскрипта, инициирующегося с промотора lac -оперона (см. чертеж) и кодирущего полипептиды SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:3, или SEQ ID NO:5.
SEQ ID NO:8 представляет собой фрагмент ДНК, кодирующий 3'-нетранслируемую область транскрипта, инициирующегося с промотора lac-оперона (см. чертеж) и кодирущего полипептиды SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:3, или SEQ ID NO:5.
Ниже приводятся примеры конкретного осуществления настоящего изобретения. Однако следует иметь в виду, что эти примеры иллюстрирует, но не ограничивают настоящее изобретение.
Пример 1. Получение полипептида с последовательностью SEQ ID NO:1.
А. Создание кодирующей последовательности.
На матрице РНК из печени человека синтезируют кДНК и затем с помощью полимеразной цепной реакции и нижеуказанных олигонуклеотидов получают фрагмент ДНК с последовательностью SEQ ID NO:2, кодирующей полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1.
Для осуществления ПЦР были использованы следующие олигонуклеотиды:
5'-CCCATATGCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGC-3'
5'-AGGTGGATCCAGTGCGTCACTCTGTCTCCCGTCCAATTA-3'
Используя встроенные в ПЦР-праймеры участки узнавания рестриктаз NdeI (catatg) и BamH1 (ggatcc), получают фрагмент Ndel -BamH1, кодирующий SEQ ID NO:1.
Б. Конструирование экспрессирующей плазмиды pPGL1.
1. Проводят модификацию 5'-нетранслируемой области E.coli ompA гена. Для этой цели проводят анализ конструкций вторичных структур РНК, соответствующих гену ompA E.coli до ATG и далее фрагменту кодирующих областей полипептида. Используя вырожденность генетического кода, в ходе анализа проводят замены в последовательности 5'-концевых участков кодирующей области и 5'-нетранслируемой области с целью получить структурированную 5'-нетранслируемую область. Оптимальную найденную структуру синтезируют как пару комплементарных олигонуклеотидов и впоследствии вставляют в вектор, пользуясь рестриктными сайтами HindIII и NdeI.
2. Продукт ПЦР (из раздела А данного примера) клонируют в вектор pUC19 по сайту SmaI и отбирают рекомбинантные клоны с помощью ПЦР из лизатов бактериальных колоний с использованием тех же олигонуклеотидов, что использовались для ПЦР с кДНК. После подтверждения нуклеотидной последовательности из промежуточной конструкции выделяют фрагмент NdeI-BamH1 гидролизом соответствующими рестриктазами и препаративным электрофорезом в агарозном геле.
3. Модификация 3'- области. Анализ последовательностей на 3'-концах сильно экспессируемых генов выявил необходимость для увеличения экспрессии GC-богатой вторичной структуры. Для этого проводят необходимые теоретические расчеты:
а) берут случайную последовательность "G" и "С" длиной 40 символов; трактуют как последовательность нуклеотидов в направлении от 5' к 3' и строят комплементарную цепь также в направлении от 5' к 3';
б) генерируют случайную последовательность "А", "G", "С" и "Т" длиной 12 символов и трактуют как последовательность нуклеотидов в направлении от 5' к 3';
в) генерируют случайную последовательность "А", "G", "С" и "Т" длиной 45 символов и трактуют как последовательность нуклеотидов в направлении от 5' к 3';
д) берут фрагмент ДНК бактериофага Т7 длиной 45 нуклеотидов;
е) к последовательности из пункта (в) добавляют исходную последовательность из пункта (а), далее из (б), затем комплементарную последовательность из пункта (а) и фрагмент фага Т7 из пункта (д).
Далее теоретически строят вторичную структуру, включающую последние 25 нуклеотидов 3'-конца кДНК плазминогена и последовательность, сгенерированную в пункте (е). Вносят случайные замены нуклеотидов, пока не получают последовательность, вторичная структура которой не затрагивает кодирующей области и терминатора транскрипции (исходно ДНК фага Т7). Полученный фрагмент синтезируют химически и впоследствии вставляют в плазмиду по рестриктным сайтам ВаmН1-Асс65I.
4. Сборка плазмиды - предшественницы pPGL0.
Вектор pUC19 гидролизуют рестриктазами HindIII и EcoRI. Больший фрагмент изолируют препаративным электрофорезом в агарозном геле. Это первый компонет лигазной смеси.
Синтетический фрагмент HindIII-NdeI (подпункт 1 раздела Б данного примера) фосфорилируют полинуклеотидкиназой фага Т4 и тем самым получают второй компонент лигазной смеси.
Третьим компонентом служит фрагмент NdeI-BamH1, полученный в п.2 раздела Б данного примера.
Синтетический фрагмент ВаmН1-Асс65I (подпункт 3 раздела Б данного примера) служит четвертым компонентом, его фосфорилируют полинуклеотидкиназой фага Т4.
Пятый компонет носит технический характер и представляет собой синтетический адаптер, состоящий из 2 комлементарных олигонуклеотидов с последовательностями:
5'-GTACCCCGTTGATTTCCATCCGCCCGGGGCATGCCTCGAGG-3' и
5'-AATTCCTCGAGGCATGCCCCGGGCGGATGGAAATCAACGGG-3'.
Его фосфорилируют полинуклеотидкиназой фага Т4.
Благодаря уникальному свойству самосборки фрагменты, описанные выше, собираются по липким концам и лигируются ДНК-лигазой фага Т4. Полученная промежуточная плазмида обеспечивает синтез регистрируемого количества полипептида SEQ ID NO:1. Полипептид может быть детектирован электрофоретическим анализом водонерастворимой фракции белков E.coli как полоса с подвижностью, соответствующей молекулярной массе 50 кДа.
5. Получение pPGL1.
Промежуточную плазмиду pPGL0 гидролизуют рестриктазами BsaBI и SphI. ДНК E.coli JM109 также гидролизуют рестриктазами BsaBI и SphI. Фрагмент вектора и область фрагментов ДНК E.coli размером 0.4-0.6 т.п.о. выделяют препаративным электрофорезом в агарозном геле и полученные ДНК лигируют.
Продуктом лигирования трансформируют клетки E.coli JM109, колонии анализируют по продукции водонерастворимого полипептида размером 50 кДа. Таким образом был отобран фрагмент ДНК E.coli BsaBI-SphI размером 450 п.о., содержащий сайты рестриктаз PstI и BstBI, активирующий экспрессию в транс-положении по отношению к экспрессируемому полипептиду.
В результате из отобранного клона получают плазмиду pPGL1.
В. Получение биомассы и первичная очистка. Определение уровня экспресии.
600
Бактерии штамма E.coli JM109, трансформированные плазмидой pPGL1, выращивают до плотности OD=2.5 в течение 14 ч в 250 мл LB-среды с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°C и интенсивной аэрации. По окончании выращивания клетки собирают центрифугированием в течение 30 мин при 3000 об/мин, суспендируют в 20 мл буферного раствора (Трис-HCl 20 мМ, рН 6.7, NaCl 50 мМ), добавляют 20 мг лизоцима и инкубируют 10 мин при 4°С. К полученной смеси добавляют Трис-HCl, рН 8.3, до 100 мМ. Тритон Х-100 до 0,5% и ЭДТА до 20 мМ, инкубируют 30 мин при 4°С, после чего обрабатывают ультразвуком 1 мин. Осадочную фракцию клеточного экстракта отделяют центрифугированием в течение 90 мин при 5000 об/мин, суспендируют в 20 мл раствора (50 мМ Трис-HCl 7,5, 2%-ный Тритона X-100. 50 мМ NaCl) и центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин. Осадок суспендируют в 20 мл раствора, содержащего 5 мМ ЭДТА и 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, и осаждают в тех же условиях. Промытый осадок растворяют в 25 мл денатурирующего раствора (6 М мочевина, 0,1 М Трис-основание) при перемешивании, нерастворимый осадок убирают центрифугированием.
Для определения уровня экспрессии аликвот суспензии осадочной фракции клеточного экстракта, соответствующий 20 мкл культуры анализируют электофорезом в полиакриламидном геле (Laemmli U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (1970), v.227 (№5259), pp.680-685). На одном геле с исследуемым образцом наносят разведения стандартов: БСА и лизоцима куриных яиц с нагрузкой от 0.05 до 2 мкг на трек. Интенсивность полосы 50 кДа (полипептид SEQ ID NO:1) сравнивают с интенсивностями стандартов методом просвечивающей денситометрии. Выход рекомбинантного белка составляет 40 мг в пересчете на 1 л культуры.
Г. Реконструкция ферментативной активности.
Процедуру реконструкции ферментативной активности проводят следующим образом. Раствор разбавляют в 10 раз буфером: 100 мМ Трис-основание, 0,5 мМ восстановленный глютатион, 0,5 мМ окисленный глютатион, и инкубируют в течение 20 ч при 4°С. Выпавший осадок удаляют центрифугированием и подтверждают активность растворимой фракции белка тестом на амидолитическую активность.
Ренатурированный рекомбинантный модифицированный плазминоген представлен, главным образом, проферментной формой с молекулярной массой 50 кДа, выход водорастворимого белка более 50%, что подтверждают данные электрофоретического анализа, выполняемого, как описано выше.
Д. Очистка рекомбинантного полипептида.
Ренатурированный белок подвергают хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе (колонка 70 мл, уравновешенная раствором 0,6 М мочевины - 0,1 М Трис-основания). После нанесения белка колонку промывают стартовым буфером, белок элюируют раствором 0,2 М Трис-Ацетета, рН 5,0. Объединенные белковые фракции разбавляют до 50 мМ Трис-Ацетата и наносят на колонку (15 мл) с SP-сефарозой, уравновешенной 50 мМ Трис-2 мМ ЭДТА. Белок с колонки элюируют градиентом концентрации NaCl 0-1 М (2×80 мл) в 20 мМ Трис-Ацететном буфере, рН 5.0, собирая фракции по 2 мл. Рекомбинантный плазминоген элюируется узким пиком в диапазоне концентраций 250-400 мМ NaCl.
Е. Активация урокиназой и определение амидолитической активности рекомбинантного полипептида с последовательностью SEQ ID NO:1.
40 мкл образца полипептида добавляют к 360 мкл 0.1% раствора БСА в фосфатном буфере (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, рН 7.5). К контрольным пробам вместо образца полипептида добавляется фосфатный буфер.
К половине раствора (200 мкл) добавляют урокиназу до 20 нМ и инкубируют 60 мин при 37°С для активации плазминогена. К обоим растворам добавляют 8 мкл 27 мМ раствора хромогенного субстрата S2251 (D-норвалил-циклогексилаланил-лизил-паранитроанилид, конечная концентрация 1 мМ) и через 3, 6 и 9 минут отбирают 40 мкл в пробирку, содержащую 40 мкл 10% уксусной кислоты. К пробам добавляют 140 мкл воды и измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм. Скорость расщепления хромогенного субстрата соответствует протеолитической активности полученного плазмина. В качестве сравнения используют плазмин фирмы "Sigma" (кат. №Р-1867, удельная активность 1.5-2 ед/мг) в тех же концентрациях. По наклону начального (линейного) участка кривых делают вывод о скорости гидролиза хромогенного субстрата. Скорость гидролиза, отнесенная к концентрации фермента, характеризует удельную активность фермента. По сравнению удельных активностей активированного урокиназой препарата и неактивированного делается вывод об активации полипептида SEQ ID NO:1 урокиназой. Контрольные образцы (буфер и буфер с урокиназой) не гидролизуют хромогенный субстрат, т.е. не приводят к увеличению оптической плотности при 405 нм. Одна единица амидолитической активности определяется фирмой Sigma, как количество фермента, производящего 1 мкмоль п-нитроанилина в мин при 37°С и рН 7.5. Удельная активность полипептида SEQ ID NO:1, прошедшего первичную очистку, составляет не менее 1 единицы на 1 мг белка.
Ж. Определение фибринолитической активности рекомбинантного полипептида с последовательностью SEQ ID NO:1.
Агарозу (Bio-Rad Lab. Inc.) разводят водой до получения 1.2% суспензии; суспензию кипятят до полного растворения агарозы и охлаждают до температуры 37°С.
Фибриноген (Sigma F 8630, F 4753) растворяют в фосфатном буфере (20 мМ фосфата натрия, рН 7.5, 300 мМ NaCl, 0.1% Тритон Х-10, 5% глицерин) до концентрации 10 мг/мл при 37°С. Добавляют какодилат натрия (рН 7.4) до концентрации 5 мМ и тромбин (Sigma, Т 3399) - до концентрации 0.08 ед/мл. Растворы фибриногена и агарозы смешивают и разливают по лункам 96-луночного планшета. Полимеризция происходит при комнатной температуре.
К 20 мкл образца полипептида SEQ ID NO:1 добавляют 20 мкл 0.1% раствора БСА в фосфатном буфере (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, рН 7,4) и урокиназу до 10 нМ. К контрольным пробам вместо образца полипептида добавляется фосфатный буфер. Пробы инкубируют при 37°С в течение 60 мин. Далее пробы наносят на поверхность фибринового геля и инкубируют 2 часа при 37°С. Степень лизиса определяют по просветлению лунок (снижению светорассеяния при 500 нм) в сканере для 96-луночных планшетов. Базовый уровень отсутствия лизиса определяют в лунках, куда протеазу не добавляют; базовый уровень, соответствующий полному лизису, определяют в точках, куда вносили заведомый избыток протеазы (более 50 мкг). Разница между базовыми уровнями составляет обычно 1 о.е. (оптическую единицу). Активность разведений исследуемого препарата сравнима с активностью контрольного образца, которым служит очищенный препарат аутентичного человеческого плазмина (Sigma P1867).
3. Казеинолитический тест.
Казеинолитический тест менее специфичен, чем описанный выше фибринолитический тест, и проводится при невозможности провести последний. Такое возможно, например, в случае загрязрения препаратов фибриногена эндогенным плазминогеном (что нередко случается с коммерческими препаратами фибриногена).
Готовят 4% суспензию казеина (Sigma C8654) в 0.1 М NaCl, 20 мМ фосфата натрия, рН 7.5, раствор доводят 1М NaOH до рН 7.5. К 200 мкл раствора казеина добавляют 100 мкл образца полипептида SEQ ID NO:1 и контрольного образца, активированного урокиназой, в соотношении, приведенном в описании амидолитического теста. После инкубации в течение 20 минут при 37°С добавляют водный раствор трихлоруксусной кислоты до 5% и охлаждают до 4-10°С. После центрифугирования при 10000 g в течение 10 мин отбирают супернатант и измеряют оптическую плотность при 274 нм. Оптическая плотность при 274 нм пропорциональна количеству ароматических аминокислот, перешедших в кислоторастворимую форму под действием протеазы. Фоновую плотность при 274 нм определяют в точке, где к казеину добавляют буфер вместо активированного препарата полипептида. Одна единица казеинолитической активности определена как количество фермента, производящее оптической плотности 1 ОЕ при 274 нм. Ввиду крайней гетерогенности препаратов казеина удельная активность активированного плазминогена по данным разных авторов сильно варьирует. При проведении данного теста сравнивают переход оптической плотности при 274 нм в кислоторастворимую форму исследуемого препарата по сравнению с контрольнм препаратом фирмы Sigma P5661 и получают активность 6,5 ед/мг и 6,0 ед/мг соответственно.
Пример 2. Получение полипептида с последовательностью SEQ ID NO:3.
А. Создание кодирующей последовательности.
Модификацию кодирующей области плазмиды pPGL1 осуществляют заменой фрагмента NdeI-NcoI на синтетический при помощи рестриктаз NdeI и NcoI, ДНК-лигазы Т4 и синтетических адапторов 5'-TATGACACAGGACTGCTAC-3' и 5'-CATGGTAGCAGTCCTGTGTCA-3' с образованием плазмиды pPGL2, содержащей фрагмент ДНК с последовательностью SEQ ID NO:4, кодирующей полипептид с последовательностью SEQ ID NO:3. Никакие другие элементы плазмиды при этом не менялись.
Получение биомассы, очистку, реконституцию и определение ферментативных свойств полипептида SEQ ID NO:3 проводят аналогично примеру 1. Выход рекомбинантного белка составляет 60 мг в пересчете на 1 л культуры.
Ферментативные свойства данного полипептида аналогичны свойствам полипептида с последовательностью SEQ ID NO:1.
Пример 3. Получение полипептида с последовательностью SEQ ID NO:5.
А. Создание кодирующей последовательности.
Модификация кодирующей области плазмиды pPGL1 осуществляется заменой фрагмента NdeI-NcoI на синтетический при помощи рестриктаз NdeI и NcoI, ДНК-лигазы Т4 и синтетических адапторов 5'-TATGAGTACACAGGACTGCTAC-3' и 5'-CATGGTAGCAGTCCTGTGTACTCA-3' с образованием плазмиды pPGL3, содержащей фрагмент ДНК с последовательностью SEQ ID NO:6, кодирующей полипептид с последовательностью SEQ ID NO:5. Никакие другие элементы плазмиды при этом не менялись.
Получение биомассы, очистку, реконституцию и определение ферментативных свойств полипептида SEQ ID NO:5 проводят аналогично примеру 1. Выход рекомбинантного белка составляет 60 мг в пересчете на 1 л культуры.
Ферментативные свойства данного полипептида аналогичны свойствам полипептидов с последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ