Способ оценки токсичности жидкости
METHOD FOR ASSESSING LIQUID TOXICITY

Изобретение относится к водной токсикологии и предназначено для оценки токсичности жидкостей-загрязнителей в водных объектах.
Известен способ оценки токсичности жидкости, предусматривающий культивирование одноклеточных водорослей в контакте с этой жидкостью, как тест-объекта, их освещение и определение флуоресцентных характеристик, по изменению которых судят о токсичности контролируемой жидкости (см. SU №462805, МПК G01N 33/18, 1975).
Недостаток этого решения - недостаточная точность оценки анализа и его низкая оперативность.
Известен также способ оценки токсичности жидкости, предусматривающий культивирование одноклеточных водорослей в контакте с этой жидкостью, как тест-объекта, их освещение и определение флуоресцентных характеристик, по изменению которых судят о токсичности контролируемой жидкости (см. SU №1515105, МПК G01N 33/18, 1989). В качестве тест-объекта используют культуру Chlorella vulgaris, штамм S-39/64688. При этом в качестве признака позволяющего оценить токсичность контролируемой жидкости используют интенсивность люминесценции тест-объекта в различных световых состояниях. Фактически, косвенным образом оценивают выживаемость тест-объекта.
Недостаток этого решения слабая доступность данного штамма в регионах, удаленных от депозитария штаммов и отсутствие его в водах региональных бассейнов. Невозможность быстрого наращивания его биомассы в целях практического применения. Кроме того, достоверность результатов измерений недостаточно велика, в связи с использованием косвенных методов оценки выживаемости тест-объекта при воздействии жидкости, токсичность которой оценивают. Кроме того, способ не позволяет использовать современные средства измерений. Все это снижает адекватность оценки токсичности жидкости, из-за недостаточной ее оперативности и точности.
Задача изобретения - повышение адекватности оценки токсичности жидкости, ее оперативности и точности.
Технический результат, получаемый при решении поставленной задачи, выражается в том, что обеспечивается возможность использования современного измерительного прибора - проточного цитофлюориметра, при этом в качестве тест-объектов предлагаются к использованию микроводоросли, обеспечивающие: простоту культивирования и содержания в лабораторных условиях; возможность быстрого наращивания биомассы культур; имеющие высокую чувствительность к действию токсикантов и доступность (они широко распространены в морских акваториях Дальневосточного региона).
Для достижения поставленного технического результата, способ оценки токсичности жидкости, предусматривающий культивирование одноклеточных водорослей в контакте с этой жидкостью, как тест-объекта, их освещение и определение флуоресцентных характеристик, по изменению которых судят о токсичности контролируемой жидкости, отличается тем, что как тест-объект используют водоросли Attheya ussuriensis или Porphyridium purpureum или Chaetoceros muelleri или Heterosigma akashiwo, при этом подсчитывают количество живых водорослей через 24 часа, 96 часов и 7 дней, причем каждую водоросль регистрируют проточным цитофлюориметром, как объект, имеющий автофолюоресценцию по хлорофиллу а, для чего освещают водоросли лазером с длиной волны 488 нм, а их эмиссию фиксируют фильтром эмиссии с длиной волны 690 нм, причем из общего числа водорослей исключают мертвые, для чего тест-объект еще до подсчета количества водорослей окрашивают витальным красителем Propidium Iodide и выявляют водоросли имеющие флюоресценцию при освещении лазером с длиной волны 488 нм, а их эмиссию фиксируют фильтром эмиссии с длиной волны 610 нм, токсичность контролируемой жидкости рассчитывают статистически
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
При этом совокупность признаков отличительной части формулы изобретения обеспечивают повышение адекватности оценки токсичности жидкости, ее оперативности и точности, причем отличительные признаки отличительной части формулы изобретения обеспечивают решение нижеследующего комплекса функциональных задач:
Признаки «…как тест-объект используют водоросли Attheya ussuriensis или Porphyridium purpureum или Chaetoceros muelleri или Heterosigma akashiwo…» обеспечивают простоту культивирования и содержания тест-объектов в лабораторных условиях, возможность быстрого наращивания их биомассы при высокой чувствительности к действию токсикантов и их доступность (они широко распространены в морских акваториях Дальневосточного региона).
Признаки указывающие, что «подсчитывают количество живых водорослей через 24 часа, 96 часов и 7 дней» позволяют оценить динамику процесса воздействия токсичного материала.
Признаки указывающие, что «каждую водоросль регистрируют проточным цитофлюориметром, как объект, имеющий автофолюоресценцию по хлорофиллу а» обеспечивают надежный и оперативный подсчет общего количества водорослей в том числе количества живых и мертвых водорослей.
Признаки указывающие, что для регистрации водоросли проточным цитофлюориметром, «освещают водоросли лазером с длиной волны 488 нм (одним из нескольких лазеров проточного цитофлюориметра), а их эмиссию (эмиссию водорослей) фиксируют фильтром эмиссии (элементом проточного цитофлюориметра) с длиной волны 690 нм» обеспечивают работу проточного цитофлюориметра в диапазоне, в котором имеет место максимально интенсивное свечение хлорофилл а.
Признаки указывающие, что «из общего числа водорослей исключают мертвые, для чего тест-объект еще до подсчета количества водорослей окрашивают витальным красителем Propidium Iodide» обеспечивают окраску только мертвых водорослей и их свечение в ином диапазоне (соответствующем этому красителю), по сравнению с живыми.
Признаки указывающие, что «выявляют водоросли имеющие флюоресценцию при освещении лазером с длиной волны 488 нм, а их эмиссию фиксируют фильтром эмиссии с длиной волны 610 нм» обеспечивают работу проточного цитофлюориметра в диапазоне, в котором имеет место максимально интенсивное свечение красителя, попадающего в клетки погибших водорослей через их разрушенные (в результате токсического воздействия тестируемой жидкости) оболочки. При этом в живые водоросли краситель не попадает.
50
Признаки указывающие, что «уровень токсичности (LC) рассчитывают статистически», позволяют по результатам замеров проточным цитофлюориметром определить уровень токсичности жидкости.
Признаки указывающие, что «токсичность контролируемой жидкости рассчитывают статистически», позволяют по результатам замеров проточным цитофлюориметром определить токсичность жидкости.
На фиг. 1 показаны графики смертности микроводоросли Attheya ussuriensis при тестировании гексана (синий), метанола (красный), дизельного топлива В0 (зеленый), биодизеля В100 (фиолетовый), смеси дизель-биодизель В20 (оранжевый) на острую токсичность (96 часов); На фиг. 2 показаны графики смертности микроводоросли Porphyridium purpureum при тестировании гексана (синий), метанола (красный), дизельного топлива В0 (зеленый), биодизеля В100 (фиолетовый), смеси дизель-биодизель В20 (оранжевый) на острую токсичность (96 часов); На фиг. 3 показаны графики смертности микроводоросли Chaetoceros muelleri при тестировании гексана (синий), метанола (красный), дизельного топлива В0 (зеленый), биодизеля В100 (фиолетовый), смеси дизель-биодизель В20 (оранжевый) на острую токсичность (96 часов); На фиг. 4 показаны графики смертности микроводоросли Heterosigma akashiwo при тестировании гексана (синий), метанола (красный), дизельного топлива В0 (зеленый), биодизеля В100 (фиолетовый), смеси дизель-биодизель В20 (оранжевый) на острую токсичность (96 часов).
2
2
7
2
2
7
50
Определена чувствительность выбранных культур микроводорослей к действию стандартного токсиканта бихромата калия KCrO, в таблице 1 приведены результаты исследований. Оценку чувствительности проводили по изменению численности клеток микроводорослей в контрольной и опытной пробе. Экспозиция клеток проводилась в 24-луночных планшетах, в климатстате при 20°С с циклом освещенности 12:12 (свет : темнота). Биоиспытания проводились при концентрациях KCrO 1, 2, 4, 8, 16, 32 мг/л. Для каждой концентрации и группы контроля (без токсиканта) эксперимент был проведен в 4 повторностях. Объем аликвоты микроводорослей в каждой повторности был 1,5 мл. Подсчет количества живых клеток осуществлялся с помощью проточного цитофлюориметра CytoFLEX (Beckman Coulter, USA) и программного обеспечения CytExpert v.2.0 через 96 часов (острая токсичность) и через 7 дней (хроническая токсичность). Жизнеспособность клеток оценивалась за счет окраски витальным красителем Propidium Iodide. Гейтирование (определение границ разделения клеток на графиках по данным интенсивности флюоресценции и светорассеянья) проводилось за счет определения клеток, имеющих автофлюоресценцию по хлорофиллу a (light source - laser 488 nm, emission filter - PC5.5, 690 nm) на точечной диаграмме FSC/PC5.5 и исключения из этого диапазона мертвых клеток, имеющих флюоресценцию по PI (light source - laser 488 nm, emission filter - ECD, 610 nm) на точечной диаграмме FSC/ECD. Расчет LC выполнен с помощью GraphPad Prism 7.04.
Таблица 1
Оценка чувствительности тест-объектов к действию бихромата калия
Вид
96 часов LC<sub>50</sub> (мг/л)
7 дней LC<sub>50</sub> (мг/л)
Attheya ussuriensis
>33.13
7.91 (7.00-8.96)
Porphyridium purpureum
1.18 (0.57-1.80)
0.15 (5,02e-005-0,45)
Chaetoceros muelleri
>42.36
29.66 (24.00-38.20)
Heterosigma akashiwo
13.88 (12.10-15.62)
8.94 (7.89-10.17)
Способ осуществляется следующим образом:
Микроводоросли культивируются в фильтрованной (фильтр с размером пор 0,22 мкм), стерилизованной морской воде в колбах Эрленмейера при температуре 20°C, солености 33%, с циклом освещенности 12:12. Используется питательная среда f/2. Для эксперимента отбираются водоросли в экспоненциальной фазе роста, через 7-10 дней с момента последнего пересева.
В 24 луночный пластиковый планшет раскапывается по 1,5 мл водорослей и добавляется исследуемый образец в концентрациях 0,01-120 мл/л. Для каждой концентрации и группы контроля эксперимент проводится в 4 повторениях.
Подсчет количества живых клеток осуществляется через 24 часа, 96 часов, 7 дней с помощью проточного цитофлюориметра. Отделение мертвых клеток осуществляется за счет окрашивания витальным красителем Propidium Iodide (PI). Гейтирование проводилось за счет определения клеток, имеющих автофлюоресценцию по хлорофиллу a (источник света - лазер 488 нм, фильтр эмиссии - 690 нм) на точечной диаграмме и исключения из этого диапазона мертвых клеток, имеющих флюоресценцию по PI источник света - лазер 488 нм, фильтр эмиссии - 610 нм).
50
Основным показателем, с помощью которого оценивают уровень токсичности добавленных в среду образцов, является численность клеток водорослей. По результатам экспериментов составляют таблицу численности клеток во всех вариантах эксперимента в абсолютных единицах, а также значений численности клеток водорослей, выраженных в относительных единицах (% относительно контроля). Расчет уровня токсичности (LC) выполняется статистически с помощью GraphPad Prism 7.04 используя t - критерий Стьюдента при сравнении параметра численности при уровне значимости р<0.05.
Результаты реализации способа приведены в таблице 2.
Оценивали уровень токсичности биодизеля, полученного из использованных фритюрных масел (B100) и смеси данного биодизеля с дизельным топливом в соотношении 20% биодизеля, 80% дизельного топлива и сравнивали уровень токсичности с чистым дизельным топливом, гексаном и метанолом.
Таблица 2
Сравнительная оценка уровня токсичности различных жидкостей
Токсин/Время воздействия
24 часа LC<sub>50</sub>
96 часов LC<sub>50</sub>
7 дней LC<sub>50</sub>
Attheya ussuriensis
Hexane
-
>52.92
>57.37
Methanol
-
77.56 (55.99-132.2)
40.29 (30-57.48)
B0
>120
29.84 (25.19-35.14)
12.82 (11.39-14.40)
B20
>40
10.41 (9.40-11.44)
0.92 (0.76-1.07)
B100
19.69 (15.88-24.22)
9.83 (8.67-11.09)
0.72 (0.423-1.02)
Porphyridium purpureum
Hexane
-
10.54 (<19.23)
41.71 (<64.78)
Methanol
-
13.17 (11.26-15.5)
16.53 (12.17-21.21)
B0
35.05 (24.44-50.95)
20.44 (17.08-23.95)
12.33 (7.99-16.09)
B20
2.81 (1.44-4.52)
8.25 (7.51-9.05)
5.53 (5.16-5.98)
B100
7.72 (4.66-18.82)
9.89 (8.45-11.4)
6.59 (6.24-6.94)
Chaetoceros muelleri
Hexane
-
52.70 (46.91-58.09)
42.79 (42.58-43.00)
Methanol
-
>156.2
>108.1
B0
>120
51.81 (48.27-54.31)
-
B20
10.89 (9.99-11.84)
6.50 (6.04-6.99)
-
B100
6.46 (5.98-7.02)
2.53 (2.19-2.93)
-
Heterosigma akashiwo
Hexane
-
30.41 (29.89-31.46)
27.24 (22.07-32.86)
Methanol
-
32.16 (31.26-33.05)
30.65 (26.28-33.38)
B0
>118.8
10.05 (9.01-11.14)
5.73 (4.75-6.63)
B20
13.74 (12.55-14.99)
17.51 (15.46-19.74)
~2.40
B100
6.24 (5.67-6.84)
~3.75
~2.24
Анализы на микроводорослях в рамках заявленного способа дают статистическое преимущество перед многими тест-объектами, так как можно легко использовать большее количество клеток, требуются намного меньшие объемы проб и время тестирования, содержание запасных культур, вследствие их редкого пересевания и низкой требовательности к условиям культивирования, не требует больших затрат труда и средств. Процесс тестирования легко автоматизировать.
По результатам экспериментов для микроводорослей Attheya ussuriensis, Chaetoceros muelleri и Heterosigma akashiwo максимальный уровень токсичности показал образец чистого биодизеля B100. Для красной водоросли Porphyridium purpureum более токсичным оказался образец diesel-biodiesel blend B20.
50
50
50
50
50
Porphyridium purpureum как самый чувствительный из тестируемых видов по бихромату калия, гексану и метанолу, оказался самым устойчивым для B100 и B20. Кроме этого, Porphyridium purpureum и Heterosigma akashiwo показали способность к адаптации к присутствию тестируемых загрязнителей. Так для Porphyridium purpureum наблюдается увеличение LC для гексана и метанола на 7 дней экспозиции (хроническая токсичность) в сравнении с измерением на 96 часов (острая токсичность), а для B20 и B100 наблюдается увеличение LC с 24 часов на 96 часов, затем к 7 дню эксперимента проявляется хроническая токсичность и LC снижается. Heterosigma akashiwo в ходе эксперимента адаптируется только к B20, показывая увеличение LC с 24 часов на 96 часов и резкое снижение LC на 7 сутки. Для диатомовых водорослей Chaetoceros muelleri и Attheya ussuriensis уровень токсичности увеличивался прямо пропорционально с увеличением времени экспозиции клеток с тестируемыми веществами. Для Attheya ussuriensis B20 и B100 проявляют максимальный уровень хронической токсичности.
Тренд чувствительности используемых видов микроводорослей, предварительно определенный с помощью бихромата калия (от более чувствительного к менее чувствительному) полностью совпадает для гексана, метанола и дизельного топлива B0: Porphyridium purpureum > Heterosigma akashiwo > Attheya ussuriensis > Chaetoceros muelleri. Однако, биодизель B100 оказался напротив более токсичными для Heterosigma akashiwo и Chaetoceros muelleri и наименее токсичен для Porphyridium purpureum. Тренд чувствительности для образца B100 представлен следующим образом: Heterosigma akashiwo > Chaetoceros muelleri > Attheya ussuriensis > Porphyridium purpureum.
Уровень токсичность образца B20 во многом подобен B100. Заметное отличие наблюдается для Heterosigma akashiwo, где клетки микроводоросли показали значительно большую устойчивость к B20 по сравнению с чистым биодизелем B100.
Примечательно то, что во всех случаях уровень токсичности образцов, содержащих биодизель из отходов пищевых масел, заметно превосходит токсичность чистых гексана, метанола и дизельного топлива, что свидетельствует о низком качестве очистки исходного сырья и высокой опасности полученного биотоплива для морских гидробионтов.