ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ ЛИЗАТА ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНЕ
DERIVED FROM HUMAN THROMBOCYTE LYSATE, EXTRACELLULAR VESICLES FOR USE IN MEDICINE

Уровень техники
Лизат тромбоцитов человека (hPL) известен как альтернативная добавка для замены фетальной бычьей сыворотки (FBS) в культуре клеток человека. Ее обычно используют для добавления в базальную среду в культуре мезенхимальных стволовых клеток человека для экспериментальных и клинических целей. HPL имеет преимущество по сравнению с традиционно используемой FBS, поскольку не содержит ксеногенов, и, следовательно, подходит для создания терапевтических продуктов для применения в клеточной терапии. HPL выглядит как мутная светло-желтая жидкость, получаемая в результате лизиса тромбоцитов крови человека с помощью цикла (циклов) замораживания/оттаивания. Благодаря своей физиологической функции в восстановлении тканей, тромбоциты являются богатым источником многочисленных биологически активных молекул, таких как факторы роста, цитокины, включая хемокины и интерлейкины, другие метаболиты и внеклеточные везикулы (EV). Во время хранения и лизиса тромбоциты высвобождают большое количество факторов роста и внеклеточных везикул (EV, например, экзосом, микровезикул, апоптотических тел), размером приблизительно 40-1000 нм. Эти секретируемые везикулы обозначаются как внеклеточные везикулы, полученные из лизата тромбоцитов человека (hPLEV). В последние годы на рынке появилось несколько произведенных согласно GMP продуктов, связанных с hPL, предназначенных для применения в системах культивирования клеток, например, продукты от Stem Cell Technologies, Macopharma, COMPASS Biomedical и PL Biosciences. Недавно Центр клинической трансфузионной медицины в Тюбингене получил лицензию на производство лизата тромбоцитов человека в соответствии с германским Законом о лекарственных средствах (AMG) от местного органа власти Тюбингена. Такие hPL-продукты необходимы для культивирования стволовых клеток в соответствии с нормативными требованиями к их применению у людей. Между тем, hPL является золотым стандартом для культивирования стволовых клеток человека, особенно мезенхимальных стволовых клеток. Лизат тромбоцитов человека, полученный в условиях чистых помещений GMP, считается "сырьем человеческого происхождения" для фармацевтического производства, например, для применения в клинических испытаниях или для изготовления имеющих лицензию для производства лекарственных средств для клеточной терапии.
Хотя значение hPL в культивировании стволовых клеток является общепризнанным, свойства отдельных факторов в hPL, таких как факторы роста и EV, еще не проанализированы подробно. В то время как EV из hPL ранее не считались представляющими клинический интерес, EV, полученные из других стволовых клеток, таких как МСК, все чаще оказываются в фокусе клинического и терапевтического интереса.
Известно, что EV передают информацию между клетками, органами и даже между организмами и были обнаружены в различных жидкостях организма, таких как кровь, моча, спинномозговая жидкость, грудное молоко и слюна. Экзосомы и микровезикулы составляют наиболее хорошо описанные классы EV. Они окружены фосфолипидной мембраной и содержат специфичные для клеточного типа комбинации белков, включая ферменты, факторы роста, рецепторы и цитокины, а также липиды, кодирующие и некодирующие РНК, мРНК, микроРНК или даже небольшие количества ДНК и метаболитов. Экзосомы определяются как производные эндосомального компартмента размером 70-170 нм (+/-20 нм, в зависимости от литературного источника и методики анализа). При средних размерах 100-1000 нм микровезикулы представляют собой класс более крупных EV, которые образуются в результате почкования плазматической мембраны наружу. В настоящей заявке термин EV включает все вышеупомянутые везикулы.
На данный момент, по-видимому, только полученные из стволовых клеток EV широко рассматриваются и обсуждаются как имеющие терапевтический потенциал в соответствии с терапевтическими целями. В WO 2012/053976 раскрыто применение экзосом, которые секретируются мезенхимальными стволовыми клетками человека, для стимулирования роста волос и заживления ран. Эти эффекты раскрыты в отношении экзосомного иммуномодулирующего карго. В WO 2012/053976 рассмотрено иммуномодулирующее действие препарата на основе экзосом.
WO 2014013029 А1 относится к применению препаратов, содержащих экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из тканей новорожденных или взрослых, для предотвращения или терапии воспалительных состояний, таких как пренатальные и постнатальные поражения головного мозга (т.е. повреждения нейронов) или иммунологические осложнения после трансплантации стволовых клеток (болезнь "трансплантат против хозяина", БТПХ).
Последний доклад, опубликованный ISEV (Международное общество по внеклеточным везикулам) в Journal of Extracellular Vesicles авторства Thomas Leneret et al., 2015 (Applying extracellular vesicles based therapeutics in clinical trials. 4: 30087) описывает недавно обсуждавшиеся перспективные с терапевтической точки зрения источники EV. Клеточными источниками, которые исследуются для применения в регенеративной медицине, являются эндотелиальные клетки и эндотелиальные колониеобразующие клетки, включая человеческие эндотелиальные клетки из пупочной вены и поздние эндотелиальные клетки. Кроме того, кроветворные предшественники, которые способны дифференцироваться в миелоидные и лимфоидные клетки, могут выполнять проангиогенные функции. Нервные стволовые клетки (НСК) использовались в доклинических моделях при различных неврологических и нейровоспалительных заболеваниях, таких как инсульт, рассеянный склероз (PC) или повреждения спинного мозга. Однако стало очевидным, что, аналогично МСК, НСК также оказывают терапевтическое воздействие паракринным и системным образом, а не мигрируя в места поражения. В этом контексте полагают, что EV, происходящие из НСК, взаимодействуют с иммунной системой хозяина опосредуя нейропротекцию и иммуномодуляцию. Нейропротекция и нейрорегенерация могут также опосредоваться EV, высвобождаемыми из резидентных глиальных клеток нервной системы. Наконец, в самых последних исследованиях описано выделение EV из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), их способность переносить РНК и белки в сердечные клетки и заживляющие эффекты in vivo при ишемической миокарде. Кроме того, ИПСК могут быть использованы в качестве источника для масштабируемого выращивания соматических стволовых клеток для крупномасштабного производства EV или для получения клеток в качестве источника EV, которые трудно получить из первичного донорского материала, такого как человеческие НСК. В этом контексте уже было показано, что EV, высвобождаемые из МСК, полученных из ИПСК, облегчают ишемическую болезнь конечностей. Обсуждаются возможные новые терапевтические применения комбинации ИПСК и EV-технологий в будущем.
Для обзора информации в вышеупомянутом недавнем докладе (Journal of Extracellular Vesicles 2015, 4: 30087) следует подчеркнуть, что терапевтический потенциал EV, происходящих из hPL, не рассматривается.
EV, происходящие из стволовых клеток человека, таких как МСК, НСК или ИПСК, не так легко доступны, поскольку культивирование стволовых клеток является сложным, дорогим, и источники для фармацевтического крупномасштабного производства ограничены.
В публикации Torreggiani et al. (2014, European Cells and Materials Vol. 28, 137-151) обсуждается, что полученные из hPL экзосомы могут рассматриваться как новые эффекторы в активности лизата тромбоцитов человека. Torreggiani et al. обсуждают применение полученных из тромбоцитов экзосом для регенерации кости. В их исследовании была изучена роль полученных из PL (лизата тромбоцитов) экзосом в связи с обеспечением культивирования клеток МСК.
Однако препарат, описанный Torreggiani et al., как представляется, не соответствует стандарту качества для надежного извлечения EV.
Кроме того, в большинстве клинических исследований с использованием полученных из МСК EV, МСК культивируют в средах с добавлением hPL, причем потенциальные синергетические эффекты hPLEV не рассматриваются и не обсуждаются. В предшествующем уровне техники эффекты, наблюдаемые в исследованиях EV, происходящих из МСК, приписывают EV, происходящим из МСК, даже если в качестве добавки к базальной среде в культурах мезенхимальных стволовых клеток использовали hPL.
Кроме того, имеется множество научных статей, патентных заявок и патентов на применение плазмы, обогащенной тромбоцитами (PRP), например, Eppley BL et al. (2006) в Plast Reconstr Surg 118(6): 147e-159e, Mishra AK et al. (2012) в Curr Pharm Biotechnol 13(7): 1185-1195 и Carlson NE et al. (2002) в J Am Dent Assoc 133(10):1388-1386. PRP состоит из концентрированных живых тромбоцитов и плазмы, полученной из цельной крови пациента, центрифугированной для удаления эритроцитов и других нежелательных компонентов. Она имеет большую концентрацию факторов роста, чем цельная кровь, и использовалась для инъекций в ткани в различных дисциплинах, включая стоматологию, ортопедическую хирургию и спортивную медицину.
Однако до сих пор, на 2016 год, результаты фундаментальных научных и доклинических исследований все еще не были подтверждены в широкомасштабных рандомизированных контролируемых исследованиях. В обзоре 2009 года была систематически просмотрена научная литература, и было найдено лишь несколько рандомизированных контролируемых исследований, которые адекватно оценивали безопасность и эффективность лечения PRP. Был сделан вывод, что PRP является "многообещающим, но не доказанным вариантом для лечения повреждений суставов, сухожилий, связок и мышц" (см. также Foster et al. (2009). Am J Sports Med 37 (11): 2259-72).
Что касается применения PL, были описаны конкретные применения в области заживления ран, как например в WO 20130765507, где описана фармацевтическая композиция, содержащая лизат тромбоцитов, и ее применение для лечения ран, анальных трещин, вагинальной атрофии или морщин. В работе Fontana et al. (2016) ASC Appl Mater Interfaces 8 (1): 988-996 описаны PL-модифицированные микрочастицы кремния для ускорения пролиферации клеток в применениях для заживления ран.
Подводя итог, представляется, что в предшествующем уровне техники, связанном с PRP, использование hPL или hPLEV для клинических применений, помимо применений для заживления ран, не описано.
Учитывая уровень техники, существует острая необходимость в средствах и способах, позволяющих осуществлять простые, дешевые, надежные и эффективные способы лечения с использованием PRP и PL в качестве источника. То же самое относится к препаратам на основе EV, не основанным на сложных и дорогих системах культивирования стволовых клеток.
Задачей настоящего изобретения является удовлетворение упомянутых выше потребностей и предложение EV, полученных из hPL, в качестве нового инструмента в медицине, в частности в терапевтической, регенеративной и профилактической медицине.
Краткое описание
Настоящее изобретение относится к фармацевтическому препарату, содержащему лизат тромбоцитов человека или фракцию, обогащенную внеклеточными везикулами, полученными из лизата тромбоцитов человека (далее эта фракция также обозначается аббревиатурой hPLEV), для применения в медицине, особенно для предотвращения и/или лечения, острых и/или хронических воспалительных заболеваний и иммунных нарушений (включая аутоиммунные заболевания и заболевания, возникающие в результате отторжения трансплантата, например, БТПХ), неврологических и нейродегенеративных заболеваний (инсульт, ишемическая болезнь), дерматологических заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, ортопедических заболеваний, инфекционных заболеваний, раковых заболеваний, для регенерации тканей (твердых органов, полых структур, при травмах).
Настоящее изобретение также относится к косметическому применению лизата тромбоцитов человека или фракции, обогащенной внеклеточными везикулами, полученными из лизата тромбоцитов человека. Эти применения включают: косметические противовоспалительные средства для кожи, регенерацию кожи после повреждения или ожога, антивозрастные методы лечения кожи, а также предотвращение и лечение выпадения волос.
Настоящее изобретение относится также к диагностическим применениям лизата тромбоцитов человека или фракции, обогащенной внеклеточными везикулами, полученными из лизата тромбоцитов человека.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу изготовления фармацевтического препарата или диагностического препарата или косметического препарата, включающему стадию добавления лизата тромбоцитов человека или фракции, обогащенной внеклеточными везикулами, полученными из лизата тромбоцитов человека, в указанный фармацевтический препарат или диагностический препарат или косметический препарат.
Несмотря на ряд преимуществ с точки зрения биологической важности, затрат и усилий при замене EV, полученных из стволовых клеток, на hPLEV, такая замена никогда не предлагалась в предшествующем уровне техники. Поскольку hPL происходит из крови/плазмы человека, указанный источник является регенеративным и легкодоступным в отличие от МСК, ЭСК, НСК или других типов стволовых клеток. Таким образом, hPLEV легче доступны и дешевле, чем EV, полученные из культур стволовых клеток. Дополнительным преимуществом настоящего изобретения перед соответствующими EV, полученными из культуры стволовых клеток, является тот факт, что тромбоциты не требуют условий чистых помещений, и не требуется длительная и дорогая характеризация клеточных объектов методом проточной цитометрии. Кроме того, избытки продукта концентрата тромбоцитов человека, произведенного для применения в больницах и клиниках, срок годности которого истекает через несколько дней, можно все еще использовать для производства hPL вместо их утилизации.
Кроме того, изобретение относится к hPL, который производится из замороженных и хранившихся тромбоцитов с истекшим сроком годности, особенно не позднее, чем через семь дней после сбора, с получением активных компонентов тромбоцитов непосредственно, а не путем постепенного высвобождения живыми тромбоцитами. Таким образом, один важный аспект настоящего изобретения относится к применению hPL- или hPLEV для медицинского или косметического лечения, вместо использования живых тромбоцитов, например терапии обогащенной тромбоцитами плазмы, причем терапия hPL или hPLEV имеет неожиданное преимущество.
Следует отметить, что настоящее изобретение впервые описывает непосредственное применение лизата тромбоцитов человека или фракции, обогащенной внеклеточными везикулами, полученными из лизата тромбоцитов человека, в медицине, в частности, для предотвращения и/или лечения острых и/или хронических воспалительных заболеваний и иммунных нарушений (также включая аутоиммунные заболевания и заболевания, возникающие в результате отторжения трансплантата, например, БТПХ), неврологических и нейродегенеративных заболеваний (инсульт, ишемическая болезнь), дерматологических заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, ортопедических заболеваний, инфекционных заболеваний, раковых заболеваний, для регенерации тканей (твердых органов, полых структур, травм) и лечения заболеваний, при которых антимикробное лечение является преимуществом.
В настоящем изобретении впервые предлагается непосредственное применение лизата тромбоцитов человека или фракции, обогащенной внеклеточными везикулами, полученными из лизата тромбоцитов человека, в качестве лекарственного средства и для косметических применений. Эти применения включают косметические кожные противовоспалительные средства, противомикробные средства, регенерацию кожи после травмы или ожога, препараты против старения кожи, а также предотвращение и лечение выпадения волос.
В настоящем изобретении впервые предлагается новое применение hPL или hPLEV в качестве лекарственного средства, которое может быть изготовлено при низких затратах, представляет собой ксеногенный и бесклеточный продукт с высоким медицинским качеством, при этом не требуется никакого клинического промежуточного продукта культуры клеток.
Подробное описание
Для облегчения понимания изобретения ниже определены несколько терминов. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в данной области. Хотя при практическом применении или тестировании формулы изобретения могут использоваться любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые приведены в настоящей заявке, далее описаны примерные способы и материалы.
Более того, ссылка на элемент с неопределенным артиклем не исключает возможности присутствия более одного элемента, если только контекст явно не требует наличия одного и только одного элемента. Таким образом, неопределенный артикль обычно означает "по меньшей мере, один".
Термин "приблизительно" означает величину в пределах статистически значимого диапазона значения или значений, таких как заявленная концентрация, длина, молекулярная масса, рН, временные рамки, температура, давление или объем. Такое значение или диапазон может быть в пределах порядка величины, обычно в пределах 20%, более типично в пределах 10% и даже более типично в пределах 5% от данного значения или диапазона. Допустимое отклонение, охватываемое словом "приблизительно", будет зависеть от конкретной рассматриваемой системы.
Термины "содержащий", "имеющий", "включающий" и "вмещающий" следует толковать как открытые термины (то есть означающие "включающий, помимо прочего"), если не указано иное.
Перечисление диапазонов значений в данном документе предназначено только для того, чтобы служить кратким способом индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в данный диапазон, и включает в себя граничные точки, определяющие диапазон, если в настоящей заявке не указано иное, и каждое отдельное значение включено в данную спецификацию, как если бы оно было перечислено в настоящей заявке отдельно.
В контексте настоящего изобретения hPL означает любой вид/пул лизата тромбоцитов человека, который оказывает полезное терапевтическое или косметическое действие. Тромбоциты представляют собой неоднородные, дискообразные компоненты в крови, которые способствуют свертыванию крови. При нормальном свертывании крови тромбоциты агглютинируют путем агрегации. Хотя тромбоциты часто классифицируют как клетки крови, они не имеют ядра. Они происходят из крупных клеток, называемых мегакариоцитами, которые находятся в костном мозге. Для производства hPL тромбоциты лизируют с высвобождением их внутреннего содержимого в окружающую плазму. Лизис тромбоцитов может быть достигнут циклами замораживания и оттаивания. Соответствующие протоколы можно найти в предшествующем уровне техники.
Одним биологическим компонентом, содержащимся в высокой концентрации в лизате тромбоцитов человека, является EV. Поскольку EV присутствуют в большинстве жидкостей организма, происходящие из плазмы EV могут происходить из разных типов клеток, таких как лейкоциты, эритроциты, дендритные клетки (DC), тромбоциты, тучные клетки, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки и нейроны. С одной стороны, hPL может содержать полученные из плазмы EV, которые уже присутствовали в плазме крови в момент сдачи крови. С другой стороны, hPL может содержать большое количество специфических EV тромбоцитов, выделяемых живыми тромбоцитами во время хранения продуктов концентрата тромбоцитов. В течение приблизительно одной недели хранения при 20-24°С клетки продолжают секретировать свои специфические EV в окружающую плазму. Когда истекает срок годности концентратов тромбоцитов и продукты крови могут быть использованы для других целей, например, производства продуктов лизата тромбоцитов, это специфическое обогащение EV все еще должно присутствовать в лизате, который может быть далее обработан для получения обогащенных hPLEV фракций. Кроме того, в процессе лизиса тромбоциты разрываются и высвобождают свои растворимые внутренние компоненты в плазму.
Белковые профили EV различаются в зависимости от их клеточного происхождения.
Специфическими CD-маркерами для характеризации тромбоцитов являются поверхностные маркеры CD9, CD41b, CD42a, CD42b и CD61, которые появляются на поверхности тромбоцитов перед активацией.
Есть также маркеры, которые появляются на поверхности тромбоцитов во время активации, такие как РАС-1, CD62P, CD31, CD63 и синтенин.
Экзосомы из тромбоцитов или эндотелиальных клеток можно, например, идентифицировать по экспрессии типичных поверхностных маркеров (например, CD31 = молекула адгезии тромбоцит-эндотелиальных клеток-1 или CD62P = Р-селектин). Эти маркеры соответствуют поверхностным маркерам на секретирующих клеточных объектах. Плазменные EV могут происходить из разных субпопуляций клеток и, следовательно, могут также содержать разные субпопуляции маркеров.
Другой важный момент заключается в том, что hPL содержит EV, которые высвобождались из живых тромбоцитов в течение периода хранения тромбоцитарных концентратов (20-24°С) до истечения срока годности через 4-6 дней. Таким образом, hPL содержит значительную долю EV, происходящих из тромбоцитов человека. По сравнению с обычными продуктами плазмы, лизаты тромбоцитов, полученные из тромбоцитарных концентратов с истекшим сроком годности, высоко обогащены тромбоцитами. В момент лизиса с последующей обработкой все растворимые паракринные факторы концентратов сохраняются, при устранении клеток и других клеточных компонентов.
EV функционируют в качестве носителя для различных биомолекул, включая липиды, белки (например, факторы транскрипции, цитокины, факторы роста) и нуклеиновые кислоты, такие как мРНК, микроРНК или даже небольшие количества ДНК.
Липидные компоненты экзосом включают мембранные липиды, такие как сфингомиелин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, ганглиозиды (GM3), фосфатидилинозитол, простагландины и лизобисфосфатидная кислота.
Кроме того, в дополнение к липидам и белкам, экзосомы также могут содержать нуклеиновые кислоты, включая мРНК, микроРНК и большое разнообразие других небольших некодирующих видов РНК, включая транскрипты РНК, перекрывающиеся с областями, кодирующими белок, последовательности повторов, структурные РНК, тРНК, рРНК, vault-РНК, Y-PHK и малые интерферирующие РНК (миРНК), а также митохондриальные ДНК и короткие последовательности ДНК ретротранспозонов.
Используемый в настоящей заявке термин "нуклеиновая кислота" обычно включает в себя полирибонуклеотиды (РНК) и полидезоксирибонуклеотиды (ДНК), каждый в одноцепочечной и/или двухцепочечной форме, линейный или кольцевой или их смеси, включая гибридные молекулы. РНК могут включать, помимо прочего, матричные РНК (мРНК), некодирующие (нкРНК, включая антисмысловые РНК), сайленсер-РНК, микро-РНК, короткие шпилечные РНК (shRNA), малые интерферирующие РНК (миРНК), повтор-ассоциированные малые интерферирующие РНК (памиРНК), piwi-взаимодействующие РНК (piPHK), Y-PHK, длинные некодирующие РНК (длинные нкРНК, IncRNA), транспортные РНК (тРНК), рибосомные РНК (рРНК), малые ядерные РНК (мяРНК), малые ядрышковые рибонуклеиновые кислоты (мякРНК), сплайсированные лидерные РНК (слРНК). Все вышеупомянутые РНК в принципе возможны в качестве компонентов EV и могут быть использованы в способах по настоящему изобретению.
EV также содержат белки и пептиды. Термины "полипептид" и "белок" используются в настоящей заявке взаимозаменяемо. Термин "полипептид" относится к белку или пептиду, который обычно содержит или состоит, по меньшей мере, из 20 и предпочтительно, по меньшей мере, из 30, например, по меньшей мере, из 50 аминокислот. Термин "пептид" относится к олигомеру, содержащему или состоящему из по меньшей мере от 2 до приблизительно 19 аминокислот.
Наиболее часто идентифицируемыми белками EV являются мембранные транспортеры и слитые белки (например, ГТФазы, такие как Rab5, аннексины и флотиллины), белки теплового шока (например, HSC70), тетраспанины (например, CD9, CD63 и CD81), белки из MVB-биогенеза (например, Alix и TSG101), липид-связанные белки и фосфолипазы, белки цитоскелета (актины, кофилин-1, эзрин/радиксин/моезин, профилин-1 и тубулины), метаболические ферменты и рибосомные белки. Некоторые белки распознаются как экзосомальные маркеры, среди которых тетраспанины (например, CD63, CD81) и TSG101, белок ЭСКРГГ-комплекса, являются наиболее часто используемыми маркерами для детектирования.
Хотя последние обычно используются в качестве маркеров экзосом, они могут не быть исключительными для экзосом и могут быть обнаружены на других внеклеточных везикулах.
В контексте настоящего изобретения hPL включает любой лизат тромбоцитов человека, который может быть полезен в контексте терапевтического, диагностического или косметического применения. Предпочтительно это hPL, полученный в соответствии с GMP-условиями, и предпочтительно он был изготовлен в соответствии с германским законом о лекарственных средствах (AMG). HPL может происходить из единичных или объединенных в пул донорских тромбоцитов. Может быть предпочтительным использовать hPL, происходящий от доноров крови в определенном возрасте, например от доноров крови в возрасте 10-60 лет, 18-50 лет, 18-40 лет, 18-30 лет или 18-20 лет. В контексте прецизионной медицины может быть выгодно лечить пациента лизатом тромбоцитов человека или фракцией, обогащенной внеклеточными везикулами, полученными из лизата тромбоцитов человека, произведенными из его собственной сданной крови. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения hPL происходит от здоровых людей.
Во избежание недоразумений следует уточнить, что hPL обычно обогащены внеклеточными везикулами, полученными из тромбоцитов человека, по сравнению с плазменными EV перед любым способом обогащения, выделения или очистки EV. В контексте настоящего изобретения термин "фракция, обогащенная внеклеточными везикулами, полученными из лизата тромбоцитов человека", означает, что hPL прошли обработку в ходе по меньшей мере одного этапа обогащения, выделения или очистки EV. После указанной стадии обогащения, выделения или очистки "фракция, обогащенная внеклеточными везикулами, полученными из лизата тромбоцитов человека", содержит меньше примесей, не относящихся к EV.
HPL или фракция, обогащенная hPL, могут быть получены из тромбоцитов, которые были инкубированы перед лизисом с одним или несколькими соединениями, известными как активаторы тромбоцитов из предшествующего уровня техники, например, предшествующего уровня техники, связанного с PRP-терапией, которая активирует тромбоциты и, таким образом, улучшает качество препарата по изобретению.
Согласно одному варианту реализации изобретения hPL может быть получен из пуповинной крови человека. Препараты лизата тромбоцитов пуповинной крови человека известны из уровня техники (например, US 8501170 В2, Parazzi, V., С. Lavazza, et al. (2015) или Forte, D., M. Ciciarello, et al. (2015).
Для целей настоящего изобретения термин "выделение" во всех грамматических формах относится к акту отделения или извлечения EV из их среды, например, образца сыворотки или плазмы. Термин "очистка" во всех грамматических формах относится к акту (по существу) снижения содержания/истощения посторонних веществ (не EV) в растворе требуемых EV. Термин "обогащение" во всех грамматических формах означает увеличение доли EV в соответствующих растворителях.
Описанный в настоящей заявке hPL или фракция, обогащенная hPLEV, может быть использован в медицине. В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения hPL или фракция, обогащенная hPLEV, используется для предотвращения и/или лечения воспалительных заболеваний. Воспалительные нарушения составляют большую группу нарушений, которые лежат в основе широкого спектра заболеваний человека. Иммунная система часто связана с воспалительными расстройствами, проявляющимися как в виде аллергических реакций, так и некоторых миопатий, при этом многие нарушения иммунной системы приводят к аномальному воспалению. Неиммунные заболевания с этиологическим происхождением в воспалительных процессах включают рак, атеросклероз и ишемическую болезнь сердца. В воспалительных процессах участвует большое разнообразие белков. Любой из них может быть изменен из-за генетических мутаций, приводящих к нарушениям или дисрегуляциям нормальной функции белка или экспрессии белка. Примеры расстройств, ассоциированных с воспалением, включают: обыкновенные угри, астму, аутоиммунные заболевания, целиакию, хронический простатит, гломерулонефрит, гиперчувствительность, воспалительные заболевания кишечника, воспаление тазовых органов, реперфузионное поражение, ревматоидный артрит, саркоидоз, отторжение трансплантата, васкулит, васкулит и интерстициальный цистит. Считается, что многие заболевания сопровождаются воспалением или классифицируются как аутоиммунные заболевания. Некоторые различные типы воспалительных заболеваний включают следующие: подагра, волчанка, астма, плеврит, экзема, артрит, гастрит, спленит, синусит, гепатит, нефрит, псориаз, васкулит, ларингит, тиреоидит, простатит, фарингит, саркоидоз, атеросклероз, аллергические реакции, рассеянный склероз, некоторые миопатий, ревматоидный артрит, себорейный дерматит, гранулематоз Вегенера, синдром раздраженного кишечника (СРК; болезнь Крона), язвенный колит, дивертикулит.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения hPL или фракция, обогащенная hPLEV, используются для предотвращения и/или лечения нейродегенеративных заболеваний, например, помимо прочего, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, кортикобазальная дегенерация, лобно-височная деменция, связанные с ВИЧ когнитивные нарушения, болезнь Хантингтона, деменции с тельцами Леви, легкое когнитивное нарушение, атрофия задней части коры головного мозга, первичная прогрессирующая надфарциальная атрофия мышц, первичная прогрессирующая парафазия.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения hPL или фракция, обогащенная hPLEV, используются для предотвращения и/или лечения иммунных/аутоиммунных заболеваний, например помимо прочего, болезни Аддисона, целиакии-спру (глютен-чувствительная энтеропатия), дерматомиозита, болезни Грейвса, тиреоидита Хашимото, рассеянного склероза, миастении, пернициозной анемии, реактивного артрита, ревматоидного артрита, синдрома Шегрена, системной красной волчанки и сахарного диабета типа I.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения hPL или фракция, обогащенная hPLEV, используются для предотвращения и/или лечения сердечно-сосудистых заболеваний, например помимо прочего, ишемической болезни сердца, цереброваскулярных заболеваний, заболеваний периферических артерий, ревматических заболеваний сердца, врожденных пороков сердца, тромбоза глубоких вен и легочной эмболии.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения hPL или фракция, обогащенная hPLEV, используются для предотвращения и/или лечения дерматологических заболеваний, например помимо прочего, угрей, экземы (атопической экземы), грибковых инфекций ногтей, герпеса и псориаза.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения hPL или фракция, обогащенная hPLEV, используются для предотвращения и/или лечения ортопедических заболеваний, например, помимо прочего, ревматоидного артрита, бурсита, боли и проблем в локтевом суставе, синдрома кубитального канала, медиального эпикондилита ("локтя игрока в гольф или бейсбол"), фибромиалгии, боли и проблем в ступне, переломов, перелома бедра, боли в пояснице, боли и проблем в руках, синдрома запястного канала, боли и проблем в коленном суставе, повреждения связок колена, разрыва мениска, кифоза, боли и проблем в шее, остеопороза, болезни Педжета, сколиоза, боли и проблем в плече, травм мягких тканей.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, hPL или фракция, обогащенная hPLEV, используются для предотвращения и/или лечения в области регенеративной медицины тканей. Тканевая инженерия развилась из области разработки биоматериалов и относится к практике объединения скаффолдов, клеток и биологически активных молекул в функциональные ткани. Целью тканевой инженерии является сборка функциональных конструкций, которые восстанавливают, поддерживают или улучшают поврежденные ткани или целые органы. Искусственная кожа и хрящи являются примерами инженерных тканей, которые были одобрены FDA, однако в настоящее время у пациентов-людей они имеют ограниченное применение. Регенеративная медицина представляет собой широкую область, которая включает тканевую инженерию, но также включает в себя исследования по самовосстановлению - когда организм использует свои собственные системы для восстановления клеток, тканей и органов, иногда поддерживаемых чужеродным/аллогенным биологическим материалом. Термины "тканевая инженерия" и "регенеративная медицина" стали в значительной степени взаимозаменяемыми, так как в данной области основное внимание будет уделяться средствам для полного излечения, а не только терапии сложных и часто хронических заболеваний.
В соответствии с еще одним вариантом реализации настоящего изобретения hPL или фракция, обогащенная hPLEV, используются для предотвращения и/или лечения онкологических заболеваний, например, помимо прочего, рака мочевого пузыря, рака кости, рака молочной железы, рака толстой кишки/прямой кишки, болезни Ходжкина, лейкоза, рака печени, рака легких, лимфомы кожи, множественной миеломы, рака носоглотки, неходжкинской лимфомы, остеосаркомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака простаты, саркомы - рака мягких тканей у взрослых, рака кожи, рака тонкой кишки и рака желудка.
В соответствии с еще одним вариантом реализации настоящего изобретения hPL или фракция, обогащенная hPLEV, используются для предотвращения и/или лечения отторжения трансплантата. В соответствии с еще одним вариантом реализации настоящего изобретения hPL или фракция, обогащенная hPLEV, используются для предотвращения и/или лечения инсульта, ишемической болезни или болезни "трансплантат против хозяина".
В соответствии с предпочтительным вариантом реализации заболевание может быть выбрано из группы заболеваний, которые в настоящее время лечат с помощью клеточной терапии, например, помимо прочего, приложениями аллогенной клеточной терапии, терапией эмбриональными стволовыми клетками человека, терапией нервными стволовыми клетками, терапией мезенхимальными стволовыми клетками и приложениями трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
В области аллогенной клеточной терапии продолжаются попытки разработать такие продукты для лечения различных состояний, включая болезнь Крона и различных сосудистых заболеваний. Исследования эмбриональных стволовых клеток человека были использованы в качестве основы для ряда терапевтических применений, включая возможные способы лечения диабета и болезни Паркинсона. В области терапии нервными стволовыми клетками нервные стволовые клетки (НСК) являются предметом текущих исследований для возможных терапевтических применений, например, для лечения ряда неврологических расстройств, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона. Терапия мезенхимальными стволовыми клетками используется для широкого спектра препаратов, включая иммуномодулирующую терапию, регенерацию костей и хрящей, регенерацию миокарда и лечение синдрома Херлера, скелетного и неврологического расстройства.
В соответствии с еще одним вариантом реализации настоящего изобретения hPL или фракция, обогащенная hPLEV, может использоваться для предотвращения или лечения инфекционных заболеваний, в частности, вызываемых бактериями, вирусами, грибами или паразитами. Одним предпочтительным вариантом реализации является лечение инфекционных заболеваний в дерматологии, таких как целлюлит, рожа, гнойный гидраденит, импетиго и эктима, лимфаденит, лимфангит, некротические кожные инфекции или стафилококковый ожогоподобный кожный синдром.
Еще одним предпочтительным применением препарата по настоящему изобретению является применение в контексте показаний, для которых в предшествующем уровне техники описан положительный эффект лечения тромбоцитами или плазмой с высоким содержанием тромбоцитов. Из уровня техники известно о растущем понимании важных функций тромбоцитов, связанных с иммунитетом и воспалением, и в норме и при заболеваниях. Ряд исследований продемонстрировал, что полезный эффект тромбоцитов при воспалительных процессах наблюдается в диапазоне от атеросклероза до инфекционных заболеваний, что делает тромбоциты наиболее распространенным типом циркулирующих клеток, обладающих иммунной функцией. Тромбоциты взаимодействуют с лейкоцитами и эндотелиальными клетками сосудов напрямую через контактно-зависимые механизмы и косвенно через механизмы секретируемых иммуномедиаторов. Поэтому, опосредованные тромбоцитами иммунные эффекты возникают локально в местах активации и отложения тромбоцитов или системно в местах, удаленных от непосредственной активации тромбоцитов.
Тромбоциты наиболее известны как клеточный медиатор тромбоза (см. Craig N. Morrell et al. 2014. "Emerging roles for platelets as immune and inflammatory cells" Blood: 123 (18)). В указанной статье описан рост в настоящее время понимания важной иммунной и воспалительной роли тромбоцитов как для в норме, так и при заболеваниях. Ряд исследований продемонстрировал, что полезный эффект тромбоцитов при воспалительных процессах наблюдается в диапазоне от атеросклероза до инфекционных заболеваний, что делает тромбоциты наиболее распространенным типом циркулирующих клеток, обладающих иммунной функцией. Тромбоциты взаимодействуют с лейкоцитами и эндотелиальными клетками сосудов напрямую через контактно-зависимые механизмы и косвенно через механизмы секретируемых иммуномедиаторов. Поэтому иммунные эффекты тромбоцитов отмечаются как локально в местах активации и отложения тромбоцитов, так и системно в местах, удаленных от самой активации тромбоцитов. Craig N. Morrell et al. пришли к выводу, что взаимодействия тромбоцитов с воспалительными клетками могут опосредовать провоспалительные исходы, но эти взаимодействия, вероятно, развились, с целью эффективного ограничения инфекции. Например, при повреждении кожи происходит воздействие патогенных микроорганизмов, а благодаря сочетанию тромботических функций и функций иммунного рекрутинга тромбоциты могут помочь нацелить гемостаз и иммунные реакции против потенциальных инфекционных агентов для предотвращения проникновения патогенов. Однако продолжающееся или хроническое взаимодействие тромбоцитов с лейкоцитами или эндотелиальными клетками может привести к неблагоприятным эффектам из-за чрезмерной иммуностимуляции и воспалительного поражения, см. Craig N. Morrell et al. (2014). Из уровня техники известно, что тромбоциты оказывают положительный эффект в контексте регенерации аксонов, заживления ран и уменьшения боли (Kuffler DP et al. in Mol Neurobiol. 2015 Oct; 52(2):990-1014).
Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что важные иммунные и воспалительные функции тромбоцитов могут быть частично замещены, а регенеративные свойства могут быть улучшены путем применения hPL или hPLEV вместо живых тромбоцитов.
Предпочтительные показания включают, таким образом, заживление ран, регенерацию тканей, повреждение нервов, тендинит, остеоартрит, повреждение сердечной мышцы, восстановление и регенерацию кости, а также пластическую и стоматологическую хирургию.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения препарат является бесклеточным. "Бесклеточный" в контексте настоящего изобретения означает, что препарат по существу не содержит живых интактных клеток и фрагментов клеток. Фракции hPLEV по изобретению предпочтительно представляют собой бесклеточные препараты, которые обогащены EV, в то время как концентрации других компонентов снижены.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения, hPL или фракция, обогащенная hPLEV, является основным фармацевтически активным ингредиентом в препарате.
Термин "основной фармацевтически активный ингредиент" означает, что hPL или фракция, обогащенная hPLEV, обладает терапевтическим или другим значением при введении человеку. Основной фармацевтически активный ингредиент означает также, что препарат по существу не содержит других фармацевтически активных ингредиентов, кроме лизата тромбоцитов человека, компонентов hPL или фракции, обогащенной внеклеточными везикулами, полученными из тромбоцитов человека.
Препарат в соответствии с настоящим изобретением может содержать одно или несколько вспомогательных веществ помимо лизата тромбоцитов человека или фракции, обогащенной внеклеточными везикулами, полученными из лизата тромбоцитов человека. Такое вспомогательное вещество может представлять собой природное или синтетическое вещество, смешанное с активным ингредиентом, например, с целью долгосрочной стабилизации, для увеличения объема твердых составов, которые содержат сильнодействующие активные ингредиенты (поэтому их часто называют "объемообразующими агентами", "наполнителями", или "разбавителями"), или для придания терапевтического усиления активному ингредиенту в конечной лекарственной форме, например, облегчения всасывания лекарственного средства, уменьшения вязкости или повышения растворимости. Вспомогательные вещества также могут быть полезны в производственном процессе, чтобы помочь в обращении с соответствующим активным веществом, например, путем текучести порошка или скользящих свойств, в дополнение к повышению стабильности in vitro, такой как предотвращение денатурации или агрегации в течение ожидаемого срока годности. Выбор подходящих наполнителей также зависит от пути введения и лекарственной формы, а также от активного ингредиента и других факторов.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения внеклеточные везикулы фракции, обогащенной внеклеточными везикулами (экзосомами), полученными из лизата тромбоцитов человека, имеют размер от приблизительно 70 до 200 нм, предпочтительно от приблизительно 70 до 140 нм или более предпочтительно от приблизительно 70 до 120 нм. "Приблизительно" означает отклонение +/-20%. Кроме того, предпочтительно, экзосомы являются положительными на на наличие характерных EV- или экзосомных маркеров, и даже еще более предпочтительно, содержание белка в фармацевтическом препарате составляет выше 0,5 мг/мл, предпочтительно выше 1 мг/мл.
Маркеры hPLEV включают белки теплового шока (например, HSC70), тетраспанины (например, CD9, CD10, CD26, CD53, CD63, CD82), белки из MVB-биогенеза (например, Alix и TSG101), ЕрСАМ или Rab5, но по существу не включают CD81 (который обычно является общим поверхностным маркером EV), CD2, CD8, CD11 а и CD25 (Koliha et al, 2016).
Согласно другому варианту предоставления настоящего изобретения внеклеточные везикулы являются положительными на наличие по меньшей мере одного из EV- или экзосомных маркеров, состоящих из группы: CD9, CD41a, CD41b, CD42b, CD61, CD62P и CD63. Предпочтительно внеклеточные везикулы являются положительными на наличие 2, 3, 4, 5, 6 или 7 вышеупомянутых EV- или экзосомных маркеров.
Быть "положительным" в соответствии с настоящим изобретением означает, что интенсивность флуоресценции фоновой среды одного из вышеупомянутых положительных поверхностных маркеров при проведении мультиплексного анализа на платформе на основе гранул согласно методу, описанному в Koliha, Nina et al. (2016) выше, чем для образца сравнения с внеклеточными везикулами, происходящими из NK-клеток.
Альтернативно, для определения специфического белка вышеупомянутых маркеров могут быть применены другие методы, такие как анализ вестерн-блоттинг.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения внеклеточные везикулы являются отрицательными на наличие по меньшей мере одного из поверхностных маркеров, состоящих из группы CD81, CD3, CD4, CD19, CD20, CD2, CD8, CD11a и CD25. Предпочтительно внеклеточные везикулы являются отрицательными на наличие 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 из вышеупомянутых клеточных экзосомных маркеров.
Чтобы подтвердить качество фракций, обогащенных hPLEV, должны быть выполнены несколько общих характеризирующих критериев биологических и биофизических свойств содержащихся EV. Уровень техники для такой характеристики включает критерии и стандарты, рекомендованные Международным обществом по внеклеточным везикулам (ISEV). Исходя из последних научных знаний в области EV, чтобы приписать EV любое специфическое биологическое карго или функцию, должны использоваться эти критерии.
Основные критерии/стандарты качества:
1. Определение содержания белка [мг/мл] стандартными методами количественного определения белка с использованием ВСА-анализов, аналогичных анализов, таких как анализ Брэдфорда, или приборов, основанных на спектрометрии (например, "NanoDrop").
2. Определение среднего размера частиц [нм] и распределения по размерам [кривых] с помощью платформы анализа траекторий наночастиц (NTA), такой как Nanosight и Zetaview, или проточной цитометрии с визуализацией на ImageStream, такой как "Amnis", которая позволяет анализировать EV на уровне отдельной частицы.
3. Полуколичественное обнаружение белков типичных EV-маркеров, включая EV- или экзосомные белки (ДНС-ПААГ, вестерн-блоттинг, обнаружение с помощью специфических антител, детектирование сигналов). В целом, содержание EV в значительной степени зависит от клеточного источника, от предварительной подготовки продуцирующих клеточных линий и от способа получения. Однако EV, такие как экзосомы, демонстрируют общий набор ожидаемых маркеров, которые можно использовать для их характеризации. Наиболее часто используемыми маркерами являются тетраспанины (CD9, CD63, CD81), эндосомные или мембраносвязывающие белки (TSG101, аннексины, Rab, синтенин, флотиллины) и шапероновые белки (HSC70, HSP90). В случае с PL-EV характерно отсутствие CD81.
4. Определение чистоты путем полуколичественного сравнения клеточных лизатов и фракций PL-EV. Фракции PL-EV не должны содержать клеточных остатков, таких как белки из эндоплазматического ретикулума (например, Grp94, калнексин), комплекса Гольджи (например, GM130) или митохондрий (например, прохибитин, цитохром С). Такие маркеры могут быть использованы в качестве отрицательных маркеров. Кроме того, в качестве примеров для отрицательного контроля могут быть использованы нуклеиновые белки (гистоны, комплекс argonaute/RISC).
Для 3+4: Аналитические подходы для обнаружения типичных EV-маркеров могут включать вестерн-блоттинг (WB), проточную цитометрию (с высоким разрешением) или глобальный протеомный анализ с использованием методов масс-спектрометрии. Дополнительная характеризация PL-EV-обогащенных фракций основана на следующих методах:
Протеомика
Аналитические подходы для профилирования белков hPLEV, которые включают Вестерн-блоттинг (WB), проточную цитометрию (высокого разрешения) или глобальный протеомный анализ с использованием масс-спектрометрии, также являются современными методами для характеризации других EV-маркеров, таких как иммунологические маркеры, сигнальные маркеры, цитокины и другие ассоциированные компоненты, состоящие из биологически активного белка.
Микрочиповый анализ РНК из hPLEV
Для профилирования РНК hPLEV может применяться технология микрочипов. Микрочипы представляют собой хорошо зарекомендовавший себя метод анализа экспрессии известных фрагментов нуклеиновых кислот с использованием сред на основе слайдов или чипов. Доступны микрочипы для скрининга видов мРНК, микроРНК и длинных некодирующих РНК (длинных нкРНК).
Липидомика
Липиды и связанные с липидным плотом белки в везикулярных мембранах обеспечивают внеклеточным везикулам стабильность и структурную целостность. hPL-EV должны иметь аналогичный липидный состав с исходными клетками.
PL-EV могут быть обогащены фосфатидилсерином, ненасыщенным фосфатидилэтаноламином, ненасыщенным фосфатидилхолином, сфингомиелином, ганглиозидом и холестерином. Для идентификации состава и соотношения липидов могут быть использованы масс-спектрометрия, проточная цитометрия или другие общепринятые анализы.
Анализ с помощью цитокиновых панелей
Цитокиновый анализ фракций, обогащенных EV, на основе ИФА-анализов Фракции, содержащие HPLEV, можно полуколичественно проанализировать на цитокиновые профили, используя, например, коммерчески доступные мембранные цитокиновые чипы. Цитокины включают хемокины, факторы некроза опухолей, интерлейкины, интерфероны и колониестимулирующие факторы. Указанная методика обеспечивает очень чувствительный способ для одновременного обнаружения множества различных конкретных белков (например, 200 цитокинов). Может быть обнаружено количество белка всего несколько пикограмм. Указанный анализ основан на мембранах, с которыми связаны иммобилизованные специфические первичные антитела. Цитокины, содержащиеся в окружающей жидкости, связываются с этими первичными антителами во время инкубации. В следующей реакции образуется так называемый "сэндвич-комплекс", в котором биотин-связанные вторичные антитела связываются с первичными антителами. В результате комплекс антитело-цитокин является меченым биотином. HRP-связанный стрептавидин или другие молекулы-маркеры могут связываться с биотином и благодаря этому делать комплекс обнаружимым с помощью хемилюминесценции, калориметрии или инфракрасного света. Сигналы детектирования можно сравнить с сигналами известного стандарта, в случае хемилюминесценции для сравнения анализируемых белков можно проводить денситометрические измерения сигналов.
Функциональные анализы in vitro
Количественные анализы in vitro для исследования влияния hPLEV на иммунные клетки
Потенциальные иммуномодулирующие способности обогащенных EV фракций должны быть определены, по меньшей мере, в одном функциональном анализе in vitro с использованием клеток иммунной системы человека (например, МКПК). Принцип такого анализа заключается в исследовании иммуномодулирующего воздействия на иммунные клетки в присутствии или отсутствии hPLEV. Для данной задачи используются анализы проточной цитометрии. Чтобы вызвать иммунный ответ, клетки стимулируют, добавляя, например, РНА (фитогемагглютинин), РМА (форболмиристеацетат), иономицин, моноклональные антитела, антигены (например, белки грибков кандида или бактерий) или другие возможные компоненты, даже из имеющихся в продаже наборов для активации. Также могут быть применимы такие методики, как реакция смешанных лимфоцитов (MLR). Активация может быть индуцирована неспецифично (с использованием, например, РНА) в отношении всех МКПК, или специфично, например, избирательно только в отношении Т-клеток или других определенных субпопуляций МКПК. Посредством стимуляции иммунные клетки активируются, что может быть обнаружено среди прочего по изменению профиля экспрессии поверхностных маркеров клеток. Позднее можно также обнаружить увеличение пролиферативной активности (например, в случае Т-клеток), если стимул достаточно сильный. В присутствии фракций, обогащенных hPLEV, должны быть обнаружимы различия (например подавление пролиферации Т-клеток и экспрессия маркеров активации) в контрольных клетках без воздействия EV.
Пример такого количественного анализа: "Анализ МКПК-CFSE-PHA":
"Анализ МКПК-CFSE-PHA" можно использовать для анализа РНА-индуцированной пролиферации клеток в присутствии обогащенных hPLEV фракций. CFSE (карбоксифлуоресцеин-сукцинимидиловый эфир) представляет собой флуоресцентный краситель, который можно использовать для отслеживания клеток с использованием проточного цитометра для анализа. Молекула-предшественник CFSE-SE (карбоксифлуоресцеин-диацетат-сукцинимидиловый эфир) пассивно диффундирует в клетки, расщепляется внутриклеточными ферментами и может быть обнаружена флуоресценцией. Из-за каждого клеточного деления пролиферирующие CFSE-меченные клетки уменьшают свою интенсивность флуоресценции на 50%.
Изолированные МКПК, окрашенные CFSE, культивируют в течение 5 дней в 24-луночных планшетах для суспензионных клеток в среде RPMI + 10% АВ-сыворотки человека, либо в присутствии, либо в отсутствие EV. Клеточную стимуляцию индуцируют непосредственно после начала культивирования с помощью 200-300 нг РНА (день 0) на лунку. Культивируют 200000 клеток в объеме 400 мкл на лунку. Через 5 дней клетки можно анализировать проточной цитометрией. По сравнению с днем 0, уменьшение флуоресценции указывает на высокие скорости пролиферации, стабильная флуоресценция показывает подавление пролиферации из-за EV-эффектов. Кроме того, также может быть проанализирована экспрессия маркеров активации в разные моменты времени. Посредством специфического окрашивания конъюгированных антител клеточные субпопуляции иммунных клеток могут быть выделены и проанализированы по отдельности.
Количественные анализы in vitro для исследования влияния hPLEV на ангиогенез:
Ангиогенез является фундаментальным процессом на всех этапах роста и развития, а также при заживлении ран и регенерации тканей при ишемических заболеваниях сосудов. При ангиогенезе возникают новые капилляры из уже существующей сосудистой системы, и указанный процесс контролируется чувствительным балансом про- и антиангиогенных факторов. Эндотелиальные клетки активируются в ответ на ангиогенный стимул, такой как повреждение, воспаление и гипоксия.
Анализ образования трубко-подобных структур
Одним из наиболее широко используемых анализов in vitro для моделирования реорганизационной стадии ангиогенеза является количественный анализ образования трубок. Анализ измеряет способность эндотелиальных клеток образовывать капилляроподобные структуры (трубки). Образование трубок обычно определяют количественно, измеряя количество, длину или площадь этих капилляроподобных структур на двухмерных микроскопических изображениях культуральной чашки.
Анализ заживления ран
Для измерения миграции клеток in vitro используют анализ методом зарастания царапины. Основные этапы включают создание "царапины" в клеточном монослое гомогенной популяции, регистрация изображений в начале и через регулярные промежутки времени в процессе миграции клеток, закрывающих царапину, и сравнение этих изображений для количественной оценки скорости миграции клеток с помощью микроскопии отображения живых клеток.
Эти анализы могут быть использованы для изучения влияния hPL-EV на ангиогенез, на межклеточные взаимодействия и клеточные миграции, которые могут имитировать миграцию клеток во время заживления ран in vivo.
Основные критерии безопасности/стандарты для применения hPLEV в клиниках:
Для применения hPLEV в клиниках следует контролировать безопасность, потенциальную токсичность и иммуногенность. В соответствии с законодательством о тканях и клетках и АТМР ("лекарственные средства для новейших видов терапии") перед применением в клинических испытаниях необходимо рассмотреть платформу минимальных критериев для характеризации лекарственных средств на основе клеток человека. Таким образом, необходимо рассмотреть вопрос о том, являются ли продукты (а) аутологичными, аллогенными или ксеногенными по происхождению; (b) интенсивно или минимально модифицированными in vitro и (с) иммунологически активными или нейтральными. Кроме того, должны быть определены (а!) пролиферативная способность клеток и (е) клеточная или тканеподобная организация, а также динамическое взаимодействие между клетками со структурными компонентами и (f) предполагаемое применение.
Как правило, hPL согласно настоящему изобретению происходит из любого возможного образца крови человека, содержащего тромбоциты. Согласно другому варианту настоящего изобретения лизат тромбоцитов человека происходит из концентратов тромбоцитов, таких как, например, так называемая обогащенная тромбоцитами плазма (PRP). PRP представляет собой концентрат тромбоцитов в плазме, полученный из цельной крови пациента, центрифугированный для удаления эритроцитов и других нежелательных компонентов. Она имеет более высокую концентрацию факторов роста, чем цельная кровь, и использовалась в качестве инъекции в ткани в различных дисциплинах, включая стоматологию, ортопедическую хирургию и спортивную медицину. Концентраты тромбоцитов могут, например, происходить из экстрактов тромбоцитов, экстрагированных из лейкотромбоцитарного слоя, или из афереза тромбоцитов.
Согласно настоящему изобретению внеклеточные везикулы могут содержать биологические факторы, такие как генетический материал, например мРНК, микроРНК, небольшие количества ДНК, липидов и белков, включая факторы транскрипции, цитокины и факторы роста.
Поскольку фармацевтический препарат по изобретению происходит из тромбоцитов, он обычно содержит различные факторы роста, в частности, один или несколько, предпочтительно все из следующих факторов роста: PDGF, VEGF, FGF, EGF, TGF, особенно TGF-β и CTGF. Композиция содержит предпочтительно 2, 3, 4, 5 или 6 из этих факторов роста. Тромбоцитарные факторы роста (PDGF) способствуют росту и образованию клеток, восстановлению кровеносных сосудов и выработке коллагена. Факторы роста сосудистого эндотелия (VEGF) способствуют росту и образованию эндотелиальных клеток сосудов. Факторы роста фибробластов (FGF) способствуют восстановлению тканей, росту клеток, выработке коллагена и выработке гиалуроновой кислоты. Эпителиальный фактор роста (EGF) способствует росту эпителиальных клеток, ангиогенезу и заживлению ран. Трансформирующие факторы роста (TGF), особенно TGF-β, способствуют росту и регенерации эпителиальных клеток и заживлению ран. Факторы роста соединительной ткани (CTGF) способствуют заживлению ран. Таким образом, фармацевтический препарат по настоящему изобретению способствует образованию новых фибробластов. Эти новые фибробласты рождаются эластичными и здоровыми, производя новый коллаген и меньше металлопротеаз. Восстановление фибробластов (основных клеток в синтезе, поддержании и обеспечении структурного каркаса) приводит к более здоровой, обновленной коже. Также было показано, что PDGF увеличивает подвижность фибробластов, позволяя фибробластам перемещаться в сайт введения. Естественные факторы роста, обнаруженные в альфа-гранулах тромбоцитов (такие как PDGF, VEGF, FGF, EGF и TGF), способствуют выработке коллагена и гиалуроновой кислоты, восстановлению тканей, росту и регенерации эндотелиальных клеток и эпителиальных клеток, а также образованию новых кровеносных сосудов (что восстанавливает снабжение кислородом и удаляет нежелательные молекулы). Все эти факторы помогают восстановить морщинистый и поврежденный внеклеточный матрикс (ЕСМ) обратно к его здоровому состоянию. Каждый из этих факторов роста играет свою роль в регенерации и восстановлении кожи, как индивидуально, так и совместно друг с другом. Процедуры, стимулирующие выработку нового не фрагментированного коллагена, значительно улучшат внешний вид и здоровье.
Согласно еще одному варианту реализации препарат по настоящему изобретению, например, фракции, обогащенные hPLEV по настоящему изобретению, содержит биологические факторы, такие как белки, цитокины (например, IFN-γ, IL-8, IL-10, TGF-β и HLA-G, RANTES, Nap-2) и/или нуклеиновые кислоты, такие как, например, микроРНК.
Препарат согласно настоящему значению может содержать цитокины с антимикробиологическими свойствами. Препарат по настоящему изобретению может, в частности, содержать большие количества цитокина RANTES или цитокина NAP-2 или обоих цитокинов по сравнению с уровнями других присутствующих цитокинов.
Цитокины RANTES и NAP-2 были ранее описаны по их антимикробиологическим свойствам, например,, в статье Mariani et al. (2015) (ВМС Microbiology 15: 149). Антимикробиологические свойства препарата согласно настоящему критерию могут быть измерены в соответствии с методом, лежащим в основе фиг. 2 - фиг. 7 статьи Mariani et al., который служит эталонным методом.
В контексте настоящего изобретения предусматривается, что данный препарат пригоден, например, для внутривенного введения или инфузии, или для внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции, внутрикостной инъекции, внутрицеребровентрикулярной инъекции, внутримышечной инъекции, внутриглазной инъекции или для местного применения.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическому препарату, содержащему обогащенную фракцию внеклеточных везикул, полученных из тромбоцитов человека, получаемых способом, включающим следующие стадии:
a) получение лизата тромбоцитов человека из донорских тромбоцитов от одного донора или из пула донорских тромбоцитов от по меньшей мере 15 доноров, предпочтительно по меньшей мере 20 или по меньшей мере 30 или по меньшей мере 40 доноров.
b) обогащение внеклеточных везикул, полученных из лизата тромбоцитов человека
c) необязательно, определение эффекта in vitro, такого как иммуномодулирующий эффект, в частности противовоспалительный эффект и/или иммуносупрессивный эффект, указанных обогащенных внеклеточных везикул, например, посредством снижения уровня IL-β, TNF-α, пролиферации Т-клеток и
d) необязательно, отбор тех обогащенных фракций внеклеточных везикул, которые проявляют такой эффект in vitro, такой как иммуномодулирующий эффект, в частности противовоспалительный эффект и/или иммуносупрессивный эффект,
e) необязательно, отбор тех обогащенных внеклеточных везикул из стадии b), которые демонстрируют внеклеточные везикулы, отрицательные на наличие маркера EV/экзосом, CD81 и положительные на наличие маркера EV/экзосом, CD9, и
f) необязательно, смешивание указанных обогащенных внеклеточных везикул из стадии b), d) или е) по меньшей мере с одним подходящим фармацевтическим вспомогательным веществом и/или носителем.
Согласно одному варианту реализации изобретения hPL из стадии а) может быть получен из тромбоцитов, которые были инкубированы перед лизисом с одним или несколькими соединениями, известными как активаторы тромбоцитов из предшествующего уровня техники, например предшествующего уровня техники, связанного с PRP-терапией, которые активируют тромбоциты и, таким образом, улучшает качество препарата по изобретению.
Согласно одному варианту реализации изобретения hPL из стадии а) может быть получен из пуповинной крови человека. Препараты лизата тромбоцитов пуповинной крови человека известны из уровня техники (например, US 8501170 В2, Parazzi, V., С.Lavazza, et al. (2015) or Forte, D., M. Ciciarello, et al. (2015).
На стадии а) способа изобретения, определенного выше, следует использовать лизат тромбоцитов человека, который получен либо из донорских тромбоцитов, полученных от одного донора, либо из объединенных в пул донорских тромбоцитов от, по меньшей мере, 15 доноров, предпочтительно, по меньшей мере, 20 или, по меньшей мере, 30 или как минимум 40 доноров.
Если требуется лечение в контексте прецизионной медицины, может быть полезным использовать лизат тромбоцитов человека, полученный из собственной крови пациента. Если требуется общее лечение, целесообразно использовать пул от по меньшей мере 15 доноров, предпочтительно по меньшей мере 20 или по меньшей мере 30 или по меньшей мере 40 доноров, чтобы избежать возможных индивидуальных отклонений лизата тромбоцитов человека по сравнению с лизатом тромбоцитов человека, полученным из пула по меньшей мере 40 доноров.
Может быть предпочтительным, чтобы hPL из стадии а) способа, упомянутого выше, был получен посредством афереза тромбоцитов или из тромбоцитов лейкотромбоцитарного слоя, более предпочтительно - посредством афереза тромбоцитов.
Иммуномодулирующие эффекты, опосредованные фракциями, обогащенными hPLEV, могут представлять собой иммуносупрессивные эффекты, обнаружимые с помощью описанных ниже анализов in vitro и соответствующих регистрируемых показателей. Было обнаружено, что hPLEV-фракции обладают способностью подавлять пролиферацию иммунных клеток и, следовательно, являются иммуносупрессивными. Ингибирующее воздействие на пролиферацию стимулированных МКПК можно наблюдать в таком анализе in vitro, также для субпопуляций, таких как CD3-положительные клетки (Т-клетки) и CD3-отрицательные клетки (включая, например, В-клетки, NK-клетки). Кроме того, ингибирующее воздействие на экспрессию профиля маркеров активации Т-клеток (снижение количества CD69 или CD25 в присутствии hPLEV-фракций.
Способ получения фармацевтического препарата согласно настоящему результату включает стадию специфического обогащения для EV. Как объяснено ранее, было обнаружено, что EV в большом количестве присутствуют во многих тканях и жидкостях организма и успешно очищались с использованием дифференциального ультрацентрифугирования (Raposo, G. et al. J. Exp. Med. 1996; 183(3): 1161-1172). Другие исследования также показали, что EV могут быть выделены с помощью ультрацентрифугирования в непрерывном градиенте плотности сахарозы (Escola JM et al., J Biol Chem. 1998 Aug 7; 273(32):20121-7). Экзосомы также были выделены методами иммуноаффинного захвата с использованием лектинов или антител против обычных экзосомных маркеров, таких как CD63, CD81, ЕрСАМ или Rab5 (Barres С et al., Blood. 2010 Jan 21; 115(3):696-705 и Chen, Lab Chip. 2010 Feb 21; 10(4):505-11).
Как правило, для очистки и/или обогащения можно использовать любой подходящий способ, такой как методы, включающие ПЭГ-осаждение, методы на основе монолитных структур, магнитные частицы, фильтрацию, диализ, ультрацентрифугирование, ExoQuick™ (Systems Biosciences, Калифорния, США), хроматографию или тангенциальную поточную фильтрацию. Однако важно помнить, что в зависимости от метода выделения могут быть обогащены различные EV-подтипы, и даже если они получены из одних и тех же типов клеток, они могут различаться по своим функциональным свойствам.
Тем не менее, предпочтительным является способ, который включает осаждение полиэтиленгликолем.
Для производства фармацевтического препарата согласно настоящему изобретению предпочтителен способ, при котором обогащенные EV фракции дополнительно анализируют в микробиологических тестах, тестах на вирулентность, содержании белка, тестах на пирогенность и размер частиц, чтобы определить наиболее подходящую фракцию в соответствии с изобретением.
Можно обнаружить, что фракции, обогащенные hPLEV, были особенно полезны в способах согласно настоящему изобретению, если они проявляли сильные иммуномодулирующие эффекты в тестах на активность in vitro.
Кроме того, можно было обнаружить, что фракции, обогащенные hPLEV, были особенно полезны в способах согласно настоящему изобретению, если они проявляли снижение ответа у эффекторных клеток донора на цитокины IL-β, TNF-α и/или IFN-γ.
Кроме того, предпочтительным является способ согласно настоящему изобретению, отличающийся тем, что указанные экзосомы имеют размер от приблизительно 70 до 200 нм, предпочтительно от приблизительно 70 до 140 нм или более предпочтительно от приблизительно 70 до 120 нм. "Приблизительно" означает отклонение +/-20%. Кроме того, предпочтительно, чтобы экзосомы были положительными на наличие EV/экзосомных маркеров, и даже еще более предпочтительно, чтобы содержание белка в фармацевтическом препарате составляло более 0,5 мг/мл и еще более предпочтительно превышало 1 мг/мл (в зависимости от конечного объема ресуспендирования/элюции) и начального объема PL, который обрабатывают).
Было обнаружено, что обогащенные hPLEV фракции были особенно полезны в способах согласно настоящему уровню, если они демонстрировали сильные иммуномодулирующие эффекты in vitro в тестах на активность, и когда после добавления указанной EV-фракции может быть обнаружено снижение ответа эффекторных клеток донора на цитокины IL-β, TNF-α и/или IFN-γ. Анализы ELISpot (метод иммуноферментных пятен) показали, что в присутствии фракций, содержащих экзосомы, реакция эффекторных клеток на IL-β, TNF-α и/или IFN-γ искажается в сторону аллогенных клеток. Другие методы, которые можно использовать для анализа способности вызывать иммуномодулирующие эффекты in vitro, включают, например, Luminex, ИФА и/или проточную цитометрию.
Таким образом, настоящее изобретение основано на новой концепции улучшения предотвращения и лечения заболеваний, особенно у пациентов, страдающих от риска воспалительных заболеваний, нейродегенеративных заболеваний, иммунных/аутоиммунных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, дерматологических заболеваний, отторжения трансплантата, БТПХ, инсульта, ишемической болезни и связанных с ними осложнений, например, для предотвращения воспалительных реакций до или во время операции, а также для предотвращения воспалительных состояний и реакций пациентов, которые подключены к устройству жизнеобеспечения. В одном варианте реализации заболевания могут быть выбраны из пре- или постнатальных повреждений нервной системы, таких как, например, повреждения головного мозга, связанные с гипоксией, воспалением и/или ишемической болезнью. В другом варианте реализации эти заболевания могут быть выбраны из реакции "трансплантат против хозяина" или отторжения трансплантата после трансплантации органов, соответственно.
В особенно предпочтительном варианте реализации изобретения обогащенные EV фракции, полученные из hPL, которые были обогащены с применением протокола осаждения полиэтиленгликолем, профилактически и/или терапевтически переливают пациентам, в частности новорожденным и/или пациентам, которые подвергаются трансплантации и/или операции.
Фармацевтический препарат согласно настоящему значению предпочтительно обогащен EV, которые содержат биологические факторы, такие как, например, белки, такие как противовоспалительные цитокины, IL-10, TGF-β и HLA-G, и/или нуклеиновые кислоты, такие как, например, микроРНК. Это приводит к дополнительному преимуществу согласно изобретению, заключающемуся в том, что а) выполняется мультимодальное (комплексное) вмешательство, b) используются биологические физиологические ("собственные") вещества, и с) уменьшаются нежелательные побочные эффекты препарата.
Настоящее изобретение представляет собой мультимодальное вмешательство. Таким образом, используется не только специфический фактор (и вмешательство будет осуществляться только в часть каскада (или основного клинического фенотипа)), но и биологически сложные и эндогенные медиаторы и модуляторы. Эти компоненты присутствуют в каждом человеке, и поэтому каких-либо значительных побочных эффектов не ожидается.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения фармацевтического препарата согласно настоящему уровню, включающему следующие этапы: а) обеспечение hPL, b) обогащение указанного hPL по содержанию hPLEV, необязательно включающее осаждение полиэтиленгликолем, с) определение in vitro иммуномодулирующего эффекта, в частности противовоспалительного эффекта и/или иммуносупрессивного эффекта, указанной фракции, обогащенной hPLEV, например, по снижению ответа эффекторных клеток донора на цитокины IL-Iβ, TNF-α, пролиферации Т-клеток и/или IFN-γ, d) отбор тех обогащенных hPLEV фракций, которые проявляют иммуномодулирующий эффект, в частности противовоспалительный эффект и/или иммуносупрессивный эффект, и е) смешивания указанных обогащенных экзосом стадии d) по меньшей мере с одним подходящим фармацевтическим вспомогательным веществом и/или носителем.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения, препарат является подходящим, например,, для внутривенного введения или инфузии, или для внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции, внутрикостной инъекции, внутрицеребровентрикулярной инъекции, внутримышечной инъекции, внутриглазной инъекции или для местного применения. Местное применение может быть выполнено, например, нанесением косметических средств для ухода за кожей или масок, намотанными тампонами и т.д., предварительно изготовленными или предварительно обработанными препаратом по изобретению или поставляемыми в наборе с ним.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является способ изготовления фармацевтического препарата или диагностического препарата или косметического препарата, включающий стадию добавления лизата тромбоцитов человека или фракции, обогащенной внеклеточными везикулами, полученными из лизата тромбоцитов человека, к фармацевтическому препарату или диагностическому препарату или косметическому препарату.
В объем настоящего изобретения входят препараты, содержащие в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество hPL или hPLEV-фракцию, отдельно или в комбинации с фармацевтическим носителем или разбавителем. В соответствии с желаемыми дозированными формами специалист может выбрать подходящий носитель. Дозированные формы включают, например, таблетки, гранулы, капсулы, жидкие дозированные формы, гель, суппозиторий, крем, мазь, припарки или пластырь. Одним предпочтительным вариантом реализации является комбинация hPLEV-фракции с подходящей полимерной матрицей, например как описано в WO2013076507. Еще более предпочтительным является внутривенное применение в 0,9% растворе NaCl.
Косметические применения препарата по настоящему изобретению могут быть реализованы с применением подходящих вспомогательных веществ. Обычно лизат тромбоцитов человека или фракция, обогащенная внеклеточными везикулами, полученными из лизата тромбоцитов человека, согласно настоящему изобретению, может заменить PRP при применении в косметике. PRP-терапия применяется во многих различных областях медицины, таких как косметическая хирургия, стоматология, спортивная медицина и лечение боли. PRP стала, например, востребованной нехирургической процедурой для омоложения кожи лица и кожи. PRP-терапия - это лечение, при котором используются собственные тромбоциты доноров крови для стимулирования роста новых клеток, помогая улучшить цвет лица, текстуру кожи и восстановить утраченный объем лица.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения PRP-терапия может быть заменена косметическим препаратом, содержащим hPL или hPLEV-фракцию вместо PRP. Аутологичный hPL или hPLEV-фракцию от самого донора крови затем повторно вводят в кожу, чтобы стимулировать коллаген и новые клетки кожи. HPL или hPLEV-фракция используют полезные функции собственных тромбоцитов пациентов и, следовательно, нет риска аллергии или неприятия лечения. HPL или hPLEV-фракция также могут быть успешно использованы для лечения истонченных волос и выпадения волос, особенно при облысении по мужскому типу. Для пациента может быть важно начать лечение как можно раньше.
Предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения является применение hPL или hPLEV-фракции в области регенерации кожи, например в качестве антивозрастной терапии, при солнечных ожогах, аллергических реакциях после укуса насекомого, аутоиммунных или аллергических кожных реакциях, угревых воспалениях. hPL или hPLEV-фракция могут быть компонентом косметических композиций для ухода за кожей или волосами. Изобретение обеспечивает регенеративную терапию, которая непосредственно направлена на каждую из проблем, связанных с морщинами, и улучшает кожу и нижележащий каркас. Лечение препаратом, описанным в изобретении, обращает дегенеративный цикл поврежденной кожи к здоровой физиологии нормальной кожи. Препарат по настоящему изобретению работает путем восстановления баланса клеток в соединительной ткани, уравновешивания передачи молекулярных сигналов и восстановления внеклеточного матрикса. Процесс естественного заживления и регенерации тканей приводит к усилению синтеза коллагена, регенерации внеклеточного матрикса коллагена и пролиферации фибробластов внутри матрикса.
Диагностическое применение
Согласно настоящему изобретению, основанному на hPLEV, могут быть созданы диагностические тесты in vitro для применения в диагностических целях и для мониторинга заболеваний в режиме реального времени. HPLEV могут быть использованы в качестве диагностических биомаркеров заболевания с помощью неинвазивного анализа крови. Конкретное содержание препарата hPLEV у отдельного донора может быть использовано в качестве биомаркера при опухолевых заболеваниях или заболеваниях, связанных с воспалительными заболеваниями.
Для лучшего понимания настоящего изобретения и его преимуществ, следующий пример приводится только в иллюстративных целях. Пример не предназначен для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.
Примеры
В практике настоящего изобретения будут использованы, если не указано иное, обычные методы химии, молекулярной биологии, микробиологии, ДНК-рекомбинации и иммунологии, которые находятся в пределах возможностей специалиста в данной области. Такие методы объяснены в литературе. См. например, J. Sambrook, Е.F. Fritsch, and Т. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 и периодические дополнения; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J.M. Polak and James O'D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D.M.J. Lilley and J.E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855; and Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3. Каждый из этих общих текстов включен в заявку посредством ссылки.
Пример 1: Способ - примеры приготовления обогащенной тромбоцитами плазмы
1.1. Концентрат тромбоцитов (PRP-PC)
Собирали 450 мл цельной крови в пакет объемом 450 мл для разделения цельной крови на три компонента, содержащий антикоагулянт CPDA1 (TERUMO PENPOL, Ltd. Puliyarakonam, Тривандрум, Индия). Обогащенную тромбоцитами плазму отделяли от цельной крови "легким" центрифугированием (на низких оборотах) на охлаждаемой центрифуге Heraeus 6000i, Германия, 1750 об/мин в течение 11 минут при 21°С, с 5 и 4 кривыми ускорения и замедления соответственно, а тромбоциты концентрировали центрифугированием на высоких оборотах 3940 об/мин в течение 5 минут при 21°С, с кривыми ускорения и замедления 9 и 5 соответственно с последующим удалением надосадочной плазмы. Мешок с концентратом тромбоцитов оставляли неподвижным, стороной с этикеткой вниз, при комнатной температуре в течение приблизительно 1 часа. Плазму с низким содержанием тромбоцитов быстро замораживали и хранили в виде свежезамороженной плазмы (СЗП) при температуре -30°С или ниже в течение одного года.
Способ приготовления концентрата тромбоцитов лейкотромбоцитарного слоя (ВС-РС)
Собирали 450 мл цельной крови в пакет для разделения цельной крови на четыре компонента объемом 450 мл, содержащий 63 мл антикоагулянта CPD, с добавочным раствором (SAGM). (TERUMO PENPOL, Ltd., Puliyarakonam, Тривандрум, Индия). Цельную кровь сначала подвергали центрифугированию на высоких оборотах 3940 об/мин в течение 5 минут при 21°С с кривыми ускорения и замедления 9 и 4 соответственно. Цельную кровь разделяли на различные компоненты в зависимости от их удельного веса.
- Верхний слой - супернатант плазмы, бедной тромбоцитами (150-200 мл).
- Средний слой - лейкотромбоцитарный слой, содержащий приблизительно 90% тромбоцитов, 70% лейкоцитов и 10% эритроцитов.
- Нижний слой - эритроцитарная масса.
Супернатант с низким содержанием тромбоцитов отжимали в один сателлитный пакет, а лейкотромбоцитарный слой - в другой сателлитный пакет. Приблизительно 20-30 мл плазмы возвращали в лейкотромбоцитарный слой с целью очистки пробирок от остаточных клеток и получения соответствующего количества плазмы в лейкотромбоцитарном слое. К эритроцитам добавляли раствор SAGM. Затем пакеты, содержащие эритроциты и плазму, удаляли. Эритроциты помещали в холодильник при 4°С, а плазму с низким содержанием тромбоцитов - в морозильник -40°С в виде свежезамороженной плазмы (FFP). Лейкотромбоцитарный слой осторожно смешивали с плазмой и снова подвергали центрифугированию на низких оборотах 1100 об/мин в течение 6 минут при 21°С, с кривыми ускорения и замедления 5 и 4 соответственно, вместе с одним пустым сателлитным пакетом. Обогащенную тромбоцитами плазму отжимали в пустой пакет для хранения тромбоцитов, а затем герметизировали пробирки. Пакет с остаточными лейкоцитами и эритроцитами утилизировали.
1.2. Приготовление концентрата тромбоцитов аферезом тромбоцитов от одного донора (SDP)-PC
Оборудование автоматического сепаратора клеток может быть снабжено технологией с прерывистым потоком или с непрерывным потоком клеток, с использованием однократного или двойного венозного доступа. Может использоваться автоматический сепаратор клеток с непрерывным потоком, двойным венозным доступом - CS3000 plus, Baxter, Fenwal Division, Дирфилд, 14 60015, США.
1. После подробного объяснения процедуры, затрат времени и возможных опасностей и преимуществ получали письменное согласие донора.
2. Важным фактором для доноров афереза является венозный доступ, и во время забора крови его вены исследуют по следующим причинам -
- Большая продолжительность процедуры
- Продолжительный расход
- Частая потребность в двух венопункциях при применении оборудования с непрерывным потоком.
3. Документировали возраст доноров.
4. Перед процедурой афереза выполняли типирование ABO/Rh и тестирование на маркеры инфекционных заболеваний (ВИЧ, HBV, HCV, VDRL и малярия) доноров для тромбоцитфереза.
5. Доноров, которые принимали аспирин или другие НПВП, которые могли повлиять на функцию тромбоцитов, переносили на другое время.
5
6. Для тромбоцитфереза отбирали доноров, у которых количество тромбоцитов > 1,5×10/мкл,.
1.3. Процедура
Процедуру выполняли в закрытой системе. В сепаратор с непрерывным потоком устанавливали одноразовый комплект, затем машину заполняли. Донора готовили путем очистки двух участков венепункции в области латеральной подкожной вены обеих рук с помощью бетадина, и выполняли флеботомию с минимальной травмой донора. Во время процедуры предотвращали коагуляцию крови контролируемым образом в точке забора, и поддерживали соотношение цельной крови и антикоагулянта (ACD) на уровне от 9:1 до 11:1. Антикоагулированную кровь закачивали в вращающийся сепаратор. Эритроциты спрессовывались центробежной силой в направлении внешних краев контейнера, а затем эритроциты удалялись из разделительного контейнера. Компоненты с более низкой плотностью, такие как плазма, тромбоциты или лейкоциты, удалялись плазменным насосом и поступали во вращающийся сборный контейнер, где тромбоциты спрессовывались центробежной силой в направлении внешних краев контейнера. Отделенные тромбоциты оставались спрессованными в контейнере, в то время как другие компоненты крови возвращались донору. В конце процедуры сбора пакет для сбора тромбоцитов энергично встряхивали, чтобы отделить тромбоциты от стенок пакета, и выдерживали в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы получить равномерную суспензию. Вся эта процедура занимала 1,5-2,5 часа. Конечный объем полученного аферезом концентрата тромбоцитов составлял 200-300 мл.
Пример 2. Получение лизатов тромбоцитов человека (hPL)
Получение лизата тромбоцитов человека (hPL) основано на дальнейшей переработке концентратов тромбоцитов человека с истекшим сроком годности hPC/hTC). Для получения hTC обычно используют два различных метода. Один определяется использованием объединенных в пул продуктов лейкотромбоцитарного слоя, полученных из донорской цельной крови от нескольких доноров, а в другом используют аферез-концентраты. Согласно указанной методике донора подключали к экстракорпоральному клеточному сепаратору, и тромбоциты отфильтровывали, а другие компоненты крови, такие как эритроциты лейкоциты и плазма, возвращали донору. В обоих случаях получаемые в результате продукты крови представляют собой обедненные лейкоцитами концентраты тромбоцитов. Эти продукты содержат живые тромбоциты в течение не менее 4-5 дней и могут использоваться, например, для замены дефицитных тромбоцитов у пациентов с тромбоцитопенией.
После истечения срока годности, излишки продукта могут быть использованы для получения hPL. В результате циклов замораживания и оттаивания (-20°С и комнатная температура) тромбоциты разрушаются/растрескиваются и выделяют свое внутреннее содержимое в окружающую жидкость (плазму). Существуют различные протоколы, включая этапы центрифугирования от 3200 до 10000 г в течение приблизительно 1 часа. Лизированные клетки, клеточные фрагменты и другие остатки разрушенных клеток истощают центрифугированием. В результате получается прозрачная вязкая желтая жидкость, состоящая из лизатов тромбоцитов и плазмы. Для стерилизации продукта после процедуры дополнительно могут быть использованы 200 нм фильтры. Параллельно удаляют частицы размером более 200 нм, включая внеклеточные везикулы, которые по размеру отличны от экзосом.
Пример 3. Выделение периферических мононуклеарных клеток (МКПК) с использованием центрифугирования в градиенте плотности фиколла и культивирования клеток in vitro.
Периферические мононуклеарные клетки получали из продуктов лейкотромбоцитарного слоя, полученного в результате полного донорства крови.
Выделение МКПК проводили с использованием центрифугирования в градиенте плотности фиколла в соответствии со следующим описанием:
1. Приблизительно 100 мл продукта лейкотромбоцитарного слоя поровну распределяли по трем 50 мл полипропиленовым пробиркам. При необходимости отсутствующий объем заменяли PBS (фосфатно-солевым буфером).
2. Три дополнительных 50 мл полипропиленовых пробирки заполняли 10 мл фиколла.
3. При осторожном наливании 35 мл крови на 10 мл фиколла образовывались два отдельных слоя.
4. Центрифугирование в градиенте плотности проводили при 900 g в течение 20 минут при температуре 10°С (выключение установлено на 0 или 1).
5. После образования градиента содержащую МКПК интерфазу переносили в новую 50-мл полипропиленовую пробирку.
6. Собранную фракцию с МКПК дополняли PBS до объема 50 мл.
7. Для истощения тромбоцитов проводили центрифугирование при 650 g в течение 5 минут.
8. Супернатанты, содержащие тромбоциты, выбрасывали.
9. Для лизиса эритроцитов клетки ресуспендировали в 20-25 мл лизирующего буфера с последующей 7-минутной инкубацией при 4°С.
10. Реакцию лизирования останавливали, дополняя PBS до объема 50 мл.
11. Проводили истощение лизированных фрагментов центрифугированием при 900 g в течение 5 мин.
12. Супернатант отбрасывали и клетки ресуспендировали в 50 мл PBS.
13. Клетки подсчитывали вручную с использованием камеры Нейбауэра или, альтернативно, автоматически, например, с помощью гемоцитометра Sysmex.
14. МКПК ресуспендировали в культуральных средах (RPMI, 10% термоинактивированной hAB-сыворотки, 1% PSG (пенициллин/стрептомицин/L-глутамин) и устанавливали соответствующую концентрацию согласно последующим анализам in vitro.
Пример 4: Анализы и характеристика препаратов внеклеточных везикул на молекулярном уровне
1. Определение общей концентрации белка с использованием ВСА-анализа (или альтернативных стандартных методов, таких как метод Бредфорда)
+
Суммарные концентрации белка в обогащенных EV фракциях могут быть определены с помощью стандартных методов. Для этой цели доступно множество коммерческих наборов и реактивов. Например, был использован набор для анализа белка ВСА от Thermo Scientific. Две молекулы бицинхониновой кислоты (ВСА) образуют хелатный комплекс вместе с одним ионом меди (1). Восстановление меди вызвано присутствием белков в щелочной среде. Образование хелатных комплексов соответствует изменению цвета анализируемых жидкостей с зеленого на фиолетовый. Интенсивность изменения цвета может быть измерена фотометрически на длине волны поглощения 562 нм. По сравнению с известными значениями калибровочных значений различных концентраций BSA можно определить концентрацию белка во фракциях EV.
2. Определение среднего размера частиц [нм] и распределения по размерам [кривые] и количества частиц (с использованием NTA-платформ, таких как Nanxide или Zetaview)
Для характеризации внеклеточных нановезикул использовали анализ с отслеживанием наночастиц (NTA). Указанный физический метод подходит для отслеживания частиц размера меньше, чем длина волны света. Метод основан на индукции электрического поля, в котором частицы начинают двигаться. Благодаря этому движению можно отслеживать их броуновское движение во время их диффузии через аналитическую кювету. Могут быть определены размер и распределение по размеру частиц во фракции, а также значения для концентрации частиц. Анализ броуновского движения можно наблюдать на экране, подключенном к видеомикроскопу. Полученные данные преобразуют с помощью программного обеспечения в цифровые данные. Размер рассчитывается по константе диффузии частиц и переводят в гидродинамические размеры частиц. Концентрации частиц, связанные с измеренным количеством рассеянного света, выводят из анализа срезов видеомикроскопа.
Методы выделения
Методы выделения могут основываться на ультрацентрифугировании (дифференциальное центрифугирование), эксклюзионной хроматографии (колонки Izon и Exospin), осаждении полимерами (PEG 1000, PEG 6000, PEG 8000 EV, Exoquick-Qiagen), сродстве к мембране (Exoeasy-Qiagen) и фильтрации потоком. Стандартизированной современной технологии для выделения EV для терапевтического применения или фундаментальных исследований не существует.Критериями выбора метода очистки являются начальный объем лизата тромбоцитов, который необходимо переработать, а также высокая чистота и выделение обогащенных PL-EV фракций.
Выбор метода очистки должен быть стандартизирован с учетом воспроизводимости, чистоты, примесей и поддержания функциональных свойств hPLEV. Применяемые методы должны оцениваться с точки зрения их масштабируемости и воспроизводимости. Методы, обеспечивающие наивысшую чистоту hPLEV, не обязательно будут оптимальными для извлечения терапевтически наиболее эффективных фракций EV из-за того факта, что компоненты, прикрепленные к поверхности hPLEV, или выделенные совместно ассоциированные кофакторы, не являющиеся hPLEV, могут быть потеряны во время очистки.
Хранение EV
Стандартизированного протокола для хранения EV в настоящее время нет.Условия хранения должны быть валидированы, поскольку они могут повлиять на стабильность EV. Ряд обычно используемых растворителей и буферов варьируется от хлорида натрия до PBS, TRIS-HCI, HEPES и глицерина.
Пример 5: Принципы центрифугирования
Центрифугирование используют для разделения компонентов, клеток и для выделения клеточных органелл. Она основана на движении частиц в жидкости, вызванном центробежной силой. Основным компонентом указанной методики является ротор. Существуют различные типы роторов, например роторы с фиксированным углом, вертикальные роторы или поворотные роторы. Ультрацентрифуги относятся к группе высокоскоростных центрифуг.Чтобы избежать выделяющей при трении теплоты из-за аэродинамического сопротивления, создают вакуум. Согласно физическому принципу, разделение компонентов происходит из-за размера и плотности. Частицы ускоряются центробежными силами в направлении наружу. Это ускорение зависит от угловой скорости частицы и ее расстояния до оси вращения. Ускорение вызывается силой тяжести д.
Уравнение Сведберга описывает скорость седиментации сферических частиц в вязкой жидкости. Величина коэффициента седиментации S (единицы Сведберга) из биологического материала: Коэффициент седиментации s определяется как скорость оседания, которая достигается в особых геометрических условиях в центробежном поле. Единица коэффициента седиментации s определяется как S-значение. Существуют различные методы центрифугирования: дифференциальное центрифугирование, зональное центрифугирование, изопикническое центрифугирование, центрифугирование в градиенте плотности.
Дифференциальное центрифугирование:
Дифференциальное центрифугирование основано на различных скоростях осаждения частиц.
Оно используется для обогащения частиц и для получения более высокой концентрации частиц в уменьшенном объеме. Используются роторы с фиксированным углом.
Поэтому требуется, чтобы скорости осаждения центрифугированных частиц достаточно отличались друг от друга.
Относительно клеток и их компонентов существуют следующие различия, которые позволяют выполнять разделение:
Сначала осаждаются целые клетки (1000 g, 2 мин), а затем крупные клеточные компоненты с высоким весом, такие как ядра (1000 g, 5-10 мин). Затем осаждаются ядерные мембраны и плазматические мембраны (1500 g, 15 мин), затем - комплексы Гольджи (2000 g, 20 мин), митохондрии, лизосомы и пероксисомы (10000 g, 25 мин). Микросомы осаждаются при 100000 g, 60 мин или дольше. К ним относятся также EV, в том числе экзосомы. Они обнаруживаются в финальном осадке.
Чистота фракций, полученных при дифференциальном центрифугировании:
Описанные компоненты не могут быть отделены и очищены до 100%. Осадки, состоящие из быстро осаждающихся частиц, всегда будут включать медленно оседающие частицы, которые находились вблизи от нижней части центрифужной пробирки. Из-за этих примесей полная чистота не может быть достигнута.
Дифференциальное центрифугирование, используемое для обогащения EV/экзосом:
На первом этапе центрифугирования EV-содержащие жидкости (такие как супернатанты клеточных культур, разбавленные плазмосодержащие жидкости или разбавленный hPL) центрифугируют при 2000 g в течение 15 минут.
Клетки, мертвые клетки, клеточный дебрис (ядра, ядерные мембраны, плазматические мембраны, комплекс Гольджи) осаждаются на дне и могут быть удалены. На втором этапе центрифугирования при 10000 g в течение 45 минут при 4°С супернатанты на этапе 1 очищаются от митохондрий, лизосом и пероксисом. Микросомы, такие как EV, включая экзосомы, остаются в супернатанте и, наконец, могут быть переведены в осадок ультрацентрифугированием (110000 g, 1-2 часа).
ПЭГ-осаждение
Для осаждения полиэтиленгликолем можно использовать ПЭГ-6000. Это вещество представляет собой полимер, полученный из этиленгликоля, и является водорастворимым, инертным и нетоксичным. ПЭГ можно использовать для осаждения высокомолекулярных веществ, таких как белки (также вирусные частицы и EV). В присутствии ПЭГ белки осаждаются, а низкомолекулярные вещества остаются растворимыми. В зависимости от выбранных условий осаждения граница для определения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ может варьироваться до определенной степени (молекулярная масса ПЭГ, концентрация ПЭГ и температура осаждения). При смешивании гидрофильного, незаряженного ПЭГ и белков в водных растворах, возникает конкуренция белков за воду гидратации. Если достигается определенная концентрация ПЭГ, белки осаждаются обратимым образом. Такое осаждение представляет собой очень мягкий способ осаждения (впервые описано: Poison et al., 1964).
ПЭГ-осаждение EV:
EV-содержащие жидкости, разбавленные, например, в 0,9% NaCl инкубируют в присутствии 10% об./об. ПЭГ-6000 в течение ночи (16 ч, 4°С) для осаждения EV. После инкубации выпавшие частицы осаждают при 1500 g в течение 30 минут (4°С). Супернатанты выбрасывают. Гранулы ресуспендируют, например, в 0,9% NaCl и подвергают ультрацентрифугированию (110000 g, приблизительно 2 часа). Этот этап можно альтернативно повторить как дополнительный этап промывки.
В предпочтительном варианте реализации предлагается способ предотвращения и/или лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из регенеративных заболеваний, воспалительных заболеваний, нейродегенеративных заболеваний, иммунных/аутоиммунных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, дерматологических заболеваний, инфекционных заболеваний, отторжения трансплантата, инсульта, ишемической болезни или болезни "трансплантат против хозяина", включающий введение указанному пациенту эффективного количества фармацевтического препарата по любому из пп. 1-13.
Предпочтительно указанный способ представляет собой способ, при котором указанный препарат пригоден для внутривенного введения или инфузии или для внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции, внутрикостной инъекции, внутрицеребровентрикулярной инъекции, внутримышечной инъекции, внутриглазной инъекции или для местного применения.
Предпочтительно предлагается способ изготовления фармацевтического препарата или диагностического препарата или косметического препарата, включающий стадию добавления лизата тромбоцитов человека или фракции, обогащенной внеклеточными везикулами, полученными из лизата тромбоцитов человека, в фармацевтический препарат или диагностический препарат или косметический препарат.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Thomas Lener et al. в аналитической записке ISEV в Journal of Extracellular Vesicles 2015, 4: 30087
2. Torreggiani etal. (European Cells and Materials Vol. 28, 2014 137-151
3. Foster ТЕ, Puskas BL, Mandelbaum BR, Gerhardt MB, Rodeo SA (2009). Am J Sports Med 37 (11): 2259-72)
4. Koliha, Nina et al. Journal of Extracellular Vesicles, [S.I.], Feb. 2016.
5. Craig N. Morrell et al., May 1,2014; Blood: 123(18)
6. Kuffler DP et al. in Mol Neurobiol. 2015 Oct; 52(2):990-1014. doi: 10.1007/sl 2035-015-9251-x. Epub 2015 Jun 6
7. Raposo, G. etal. J. Exp. Med. 1996; 183(3): 1161-1172
8. Escola JM et al., J Biol Chem. 1998 Aug 7; 273(32):20121-7).
9. Barres C. et al., Blood. 2010 Jan 21; 115(3):696-705
10. Chen, Lab Chip. 2010 Feb 21; 10(4):505-11).
11. Mariani et al. BMC Microbiology (2015) 15:149
12. Eppley, B.L, W.S. Pietrzak, etal. (2006) Plast Reconstr Surg 118(6): 147e-159e.
13. Mishra, A., K. Harmon, et al. (2012) Curr Pharm Biotechnol 13(7): 1185-1195 Carlson, N.E. and R.B. Roach, Jr. (2002) J Am Dent Assoc 133(10): 1383-1386.
14. Fontana, F., M. Mori, et al. (2016) ACS Appl Mater Interfaces 8(1): 988-996.
15. Naaijkens, В.A., H.W. Niessen, et al. (2012) Cell Tissue Res 348(1): 119-130.
16. Govindasamy, V., V.S. Ronald, et al. (2011) Cytotherapy 13(10): 1221-1233.
17. Parazzi, V., C. Lavazza, et al. (2015). "Extensive Characterization of Platelet Gel Releasate From Cord Blood in Regenerative Medicine." Cell Transplant 24(12): 2573-2584.
18. Forte, D., M. Ciciarello, et al. (2015). "Human cord blood-derived platelet lysate enhances the therapeutic activity of adipose-derived mesenchymal stromal cells isolated from Crohn's disease patients in a mouse model of colitis." Stem Cell Res Ther 6: 170.