Определение количества гликопротеиновых рецепторов iib/iiia и экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов методом проточной цитофлуориметрии у больных острым миелоидным лейкозом

определение количества

гликопротеиновых рецепторов iib/iiia и экспрессии p-селектина на поверхности тромбоцитов методом проточной цитофлуориметрии у больных острым миелоидным лейкозом

B.Н. Семелев, В.В. Тыренко, В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, А.К. Юркин, Л.А. Тараканова, Н.Ю. Демьяненко

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия

Determining the number of IIb / IIIa glycoprotein receptors and expression of P-selectin on the surface of platelets using flow cytometry in patients with acute myeloid leukemia

V.N. Semelev, V.V. Tyrenko, V.Yu. Nikitin, IA. Sukhina, A.K. Yurkin, L.A. Tarakanova, N.Y. Demyanenko

C.M. Kirov Military Medical Academy, Saint Petersburg, Russia

Проведено исследование функциональной активности тромбоцитов методом проточной цитофлуориметрии у 11 больных с диагнозом острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), находящихся в клинико-гематологической ремиссии, и 11 практически здоровых добровольцев. Функциональная активность тромбоцитов оценивалась по динамике изменения количества гликопротеиновых рецепторов (ОР) 11Ь/111а на мембране тромбоцитов и доли тромбоцитов, экспресси-рующих Р-селектин (СйВ2Р) до и после индукции 10 мкМ АДФ. Количество рецепторов ОР 11Ь/111а на поверхности тромбоцитов определяли по показателю средней интенсивности флуоресценции. Средний возраст обследуемых в группе больных ОМЛ — 44,4±5,2 лет, в группе контроля - 38,5±6,8 лет (р>0,05). В группе больных ОМЛ количество тромбоцитов составляло 104,6±3,1 х109/л, в контроле - 210,5±20,8х109/л (р<0,01). После индукции наблюдалось увеличение количества рецепторов ОР 11Ь/111а у больных ОМЛ, а в контрольной группе — уменьшение. Однако статистически значимых различий между группами по количеству рецепторов ОР 11Ь/111а до и после стимуляции АДФ выявлено не было (р>0,05). В то же время, разница в доле экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов до и после активации АДФ в обеих группах была статистически значима (р<0,001). Доля тромбоцитов, экспрес-сирующих СйВ2Р, в группе ОМЛ в среднем увеличивался в 2,1 ±0,23 раза, а в контроле — в 3,31±0,93 раза. При проведении межгруппового анализа не было получено статистически значимых различий по количеству рецепторов ОР 11Ь/111а и доле СйВ2Р+-тромбоцитов до и после индукции АДФ. На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что у больных ОМЛ функциональная активность тромбоцитов не отличается от таковой у практически здоровых добровольцев.

Ключевые слова: функциональная активность тромбоцитов, Р-селектин, рецепторы ОР 11Ь-111а, АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов, острый миелоид-ный лейкоз, проточная цитофлуориметрия.

A study of the functional activity of platelets by flow cytometry is conducted in 11 patients with a diagnosis of AML are in clinical remission and 11 almost healthy volunteers. The functional activity of platelets was evaluated according to the dynamics of the number of glycoprotein receptors (GP) 11 b/111 a on the platelet membrane and the percentage of platelets expressing P-selectin (CD62P) before and after induction 10 ^m ADP. The number of GP Ilb/IIIa receptors on the platelet surface was evaluated by the mean fluorescence intensity. The average age of the subjects in the group of AML patients was 44,4±5,2 years in the control group, 38,5±6,8 years (p>0,05). In the group of AML patients platelet counts was 104,6±3,1 x109/L in the control group 210,5±20,8x109/L (p<0,01). After induction, increasing the number of receptors were observed in patients with AML, and they decrease in the control group. In patients with AML increase the number of receptors were observed after induction and the decrease in the control group. However, statistically significant differences (p>0,05) in the number of receptor GP 11 b/111 a before and after ADP stimulation in both groups have been identified. At the same time, there was no statistically significant difference (p< 0,001) percent of CD62P expression on the platelet surface upon activation of ADP in AML patients and the control group. The percentage of CD62P expression on platelets in AML group increased average 2,1±0,23 times, and in the control group by 3,31 ±0,93 times. During the intergroup analysis it is not obtained statistically significant between the number of GP IIb/IIIa receptors and CD62P expression rate before and after induction of ADP in the studied groups. On the basis of obtained results it can be concluded that in this group of patients with AML functional activity of platelets does not differ from healthy volunteers.

Keywords: functional activity of platelets, P-selectin, GP IIb/IIIa receptors, ADP-platelet aggregation, acute myeloid leukemia, flow cytofluometry, mean fluorescence intensity.

введение

Гемостаз — это сложная, многокомпонентная система, центральную роль в которой играют тромбоциты [1]. Тромбоциты в неактивированном состоянии представляют собой уплощенные, овальные, двояковыпуклые, безъядерные фрагменты мегакариоцитов костного мозга диаметром 2—3 мкм, толщиной 0,5— 0,75 мкм и объемом 7—8 мкм3 [2—4]. Средняя продолжительность жизни циркулирующих тромбоцитов составляет 8—9 дней [5]. В гемостазе тромбоциты осуществляют ангиотрофическую, ангиоспастиче-скую, адгезивно-агрегационную, коагуляционно-тромбоцитарную и репаративную функции. Наиболее важную роль тромбоциты играют в клеточном меха-

е-таП: vsemelev@yandex.ru

низме гемостаза, который обеспечивает агрегацию форменных элементов крови, их прикрепление к эндотелию сосудов и выделение из них веществ, активирующих каскадный процесс свертывания крови за счет плазменных факторов гемостаза [В, 7].

Ключевую роль в процессах адгезии и агрегации тромбоцитов играют гликопротеиновые рецепторы 11Ь/111а (ЭР 11Ь/111а) [8—10]. На поверхности неактивированных тромбоцитов количество этих рецепторов приблизительно составляет 40 000—80 000 и около 20 000—40 000 внутри клетки [8]. Под воздействием индукторов агрегации происходят конформаци-онные изменения комплекса поверхностного глико-протеина ОР 11Ь/111а на поверхности тромбоцитов,

преобразующие его в рецептор для фибриногена [5]. Связывание молекул фибриногена с рецепторами на различных тромбоцитах приводит к формированию тромбоцитарных агрегатов. Этот механизм не зависит от стимула агрегации тромбоцитов и представляет собой окончательный и обязательный путь к тромбоцитарной агрегации [9—11].

Наряду с рецепторами ЭР 11Ь/111а практический интерес представляет белок Р-селектин (СР62Р), содержащийся в а-гранулах тромбоцитов и тельцах WeiЬel-Palade эндотелиальных клеток. Этот белок обеспечивает быструю адгезию нейтрофилов и моноцитов к активированным тромбоцитам и сосудистому эндотелию на ранней фазе воспаления [12, 13]. СР62Р используется как специфический маркер активации тромбоцитов, так как он появляется на поверхности их мембраны сразу же после взаимодействия с индуктором агрегации.

Из всех существующих методов оценки функциональной активности тромбоцитов (ФАТ) наиболее информативным считается метод проточной цитоф-луориметрии [14—17].

В последние годы в мире отмечается тенденция к росту заболеваемости гемобластозами, среди которых острые лейкозы занимают одно из ведущих мест. Долгосрочные результаты лечения острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) взрослых в течение последних лет, несмотря на совершенствование методов терапии и использования ряда новых препаратов, принципиально не изменились. В среднем, 5-летняя общая выживаемость больных в возрасте до 60 лет составляет 35—50%, в группе пожилых не превышает 10—12%, а доля летальных исходов, связанных с лечением, составляет 7—18% [18]. При этом ведущими причинами летальности, не связанными с прогрессированием основного заболевания, остаются геморрагические и инфекцион-но-септические осложнения. Изменения в системе гемостаза у данной группы больных носят комплексный характер, но ведущая роль в большинстве случаев отводится нарушениям в тромбоцитарном звене [19, 20].

В современной литературе большинство работ посвящены оценке функционального состояния тромбоцитов в период постцитостатической цитопе-нии [21, 22]. При этом вопросы оценки ФАТ у больных ОМЛ, находящихся в ремиссии, изучены недостаточно.

Цель исследования — изучение функциональной активности тромбоцитов методом проточной цитоф-луориметрии у больных ОМЛ, находящихся в клини-ко-гематологической ремиссии.

Материал и методы

В исследование были включены 11 больных с ОМЛ, проходивших лечение и обследование в клинике факультетской терапии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ. Диагноз ОМЛ был верифицирован на основании цитологических, иммунофенотипических и цитогенетических методов обследования. Все больные получали терапию, согласно унифицированному протоколу лечения больных ОМЛ в возрасте моложе 60 лет (ФГБУ ГНЦ МЗ РФ). На момент обследования у больных была диагностирована или подтверждена клинико-гемато-логическая ремиссия. В исследование были вклю-

чены больные, у которых на момент обследования не были выявлены состояния, влияющие на систему гемостаза, не получающие препараты, влияющие на ФАТ, и которым менее чем за 5 сут. до обследованием не проводили заместительную трансфузию тромбоцитного концентрата. Забор материала проводился перед началом очередного курса терапии при уровне тромбоцитов в периферической крови более 100х109/л.

Контрольную группу составили 11 практически здоровых добровольцев, не применяющих антиагре-гантных препаратов.

Пациенты и добровольные доноры перед забором материала подписывали добровольное информированное согласие.

В качестве маркеров активации тромбоцитов измеряли плотность рецепторов ЭР 11Ь/111а и экспрессию СР62Р на поверхности тромбоцитов до и после активации. В качестве индуктора агрегации был использован АДФ в концентрации 10 мкМ ^дта-АШпсИ, США). Содержание рецепторов ЭР 11Ь/111а и СР62Р на поверхности тромбоцитов определяли на проточном цитофлуориметре «Су^тюэ РС500» (Весктап Сои^ег, США) с применением 4-цвет-ной комбинации прямых моноклональных антител Сй61-Р!ТС/Сй62Р-РЕ/Сй41-РС5/Сй45-РС7 той же фирмы. Цитометрическое исследование проводили в цельной венозной крови, разведенной в 50 раз однократным фосфатным буфером (1хРВБ). Для окрашивания флуоресцентно мечеными антителами разведенную кровь в объеме 40 мкл инкубировали с 5 мкл Сй61-Р!ТС или СР62Р-РЕ в течение 15 мин. при комнатной температуре. Для активации тромбоцитов одновременно с антителами добавляли 10 мМ АДФ. В качестве отрицательного контроля использовали антитела к мышиному иммуноглобулину, меченые Р!ТС и РЕ (Весктап Сои^ег, США). Реакцию останавливали добавлением 455 мкл 1хРВБ, и образцы анализировали на проточном цитофлуориме-тре. Количество ЭР !!Ь/!!!а на поверхности тромбоцитов до и после индукции 10 мкМ АДФ оценивали по показателю средней интенсивности флуоресценции (МР!). Экспрессию СР62Р на поверхности тромбоцитов оценивали как долю клеток, меченых СР62Р-РЕ, до и после индукции 10 мкМ АДФ [23].

Статистический анализ полученных результатов выполняли с помощью пакета программ 10.0». Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05. Выборочные характеристики были представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Проверку на нормальность распределения количественных признаков в группах сравнения проводили с использованием W-теста Шапиро — Уилка. Статистически значимое различие между количественными параметрами с распределением, соответствующим нормальному закону, оценивали по ^критерию Стьюдента. При несоответствии нормальному распределению применяли Ы-критерий Манна — Уитни и W-критерий Вилкоксона. Различия во всех случаях считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

При анализе групп обследуемых статистически значимых различий по возрасту и полу выявлено не было. Средний возраст обследуемых в группе боль-

ных ОМЛ составлял 44,4±5,2 лет, в контроле — 38,5±6,8 лет (р>0,05). В группе ОМЛ средние значения абсолютного количества тромбоцитов были статистически значимо ниже (104,6±3,1 х109/л), чем в группе контроля (210,5±20,8х109/л; р<0,01).

В группе ОМЛ наблюдалось увеличение количества рецепторов ЭР !!Ь/!!!а после стимуляции АДФ, а в контрольной группе незначительное их уменьшении при отсутствии статистически значимых различий в обеих группах (р>0,05) (табл.).

В то же время, были выявлены статистически значимые различия (р<0,001) в количестве СР62Р+-тромбоцитов при активации АДФ как в группе больных ОМЛ, так и в контрольной группе (табл.). Показатель в группе ОМЛ в среднем увеличивался в 2,1 ±0,23 раза, а в контроле — в 3,31 ±0,93 раза.

При проведении сравнительного межгруппового анализа не выявлены статистически значимые различия по количеству рецепторов ЭР !!Ь/!!!а на тромбоцитах и количеству Сй62Р+-тромбоцитов до и после активации.

Таблица. Количество рецепторов GP НЬ/Н^ на поверхности тромбоцитов и доля тромбоцитов, экспрессирующих CD62P, до и после активации 10 мкМ АДФ в исследуемых группах

GP МЬ/ШЗ CD62P

Группа д0 активации после активации до активации после активации

АДФ АДФ АДФ АДФ

Больные ОМЛ (п = 11) 12,78±0,54 13,76±1,28 28,96±3,36 45,85±2,54

Контроль (п = 11) 11,6±0,73 10,33±0,77 21,16±3,41 47,10±4,15

Обсуждение

Степень тромбоцитопении не всегда является определяющим фактором развития геморрагических осложнений у онкогематологических больных [22]. Вероятнее всего с функцией тромбоцитов связано то, что у одних больных отсутствуют признаки геморрагического синдрома при уровне тромбоцитов менее 10х109/л, а у других проявляются при более высоких цифрах — более 50х109/л [24—26].

На ФАТ у больных ОМЛ влияют как патологические факторы, связанные с самим заболеванием, так и факторы, обусловленные действием цитоста-тиков, инфекционными осложнениями и сопроводительной терапией.

В настоящее время опубликовано значительное количество работ, посвященных изучению ФАТ с помощью метода проточной цитофлуориметрии у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями и заболеваниями, при которых необходим постоянный мониторинг антиагрегантной терапии [23, 27]. Меньшее количество исследований ФАТ у больных ОМЛ обусловлено тем, что в периоды верификации диагноза и проведения курсов химиотерапии, как правило, проводятся трансфузии тромбоцитов с профилактической или лечебной целью.

Одним из критериев установления полной кли-нико-гематологической ремиссии является уровень тромбоцитов не менее 100х109/л. При этом функциональная активность тромбоцитов и, соответственно, их способность выполнять свою функцию в полном объеме не учитываются.

Исходя из этого, мы выбрали временной интервал для анализа функциональной активности тромбоцитов — период между установлением полной клинико-гематологической ремиссии и началом очередного курса противоопухолевой терапии. Данный временной период при ОМЛ непродолжителен, но позволяет сделать вывод о состоянии функциональной активности тромбоцитов перед очередным курсом терапии.

По результатам проведенного исследования нами не было выявлено достоверных различий ФАТ между группой больных ОМЛ, находящихся в ремиссии, и контрольной группой, состоящей из практически здоровых добровольцев. Следовательно, можно сделать вывод о том, что у данной группы больных ОМЛ функциональная активность тромбоцитов позволяет обеспечить состояние тромбоци-тарного гемостаза на необходимом уровне безопасности.

Полученные результаты показывают важность дальнейшего изучения ФАТ у больных ОМЛ на каждом этапе терапии (после проведения курсов индукции, консолидации и поддерживающей терапии). При этом необходим более строгий подход к формированию групп обследуемых с учетом цитогенетических и иммунофенотипических особенностей различных вариантов ОМЛ, а также осложнений, перенесенных в период проведения цитостатической терапии (инфекционные, грибковые и т.д.) и объема заместительной гемокомпо-нентной терапии.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Paulus J.M. Platelet size in man. Blood 1975; 46(3): 321-36.

2. Stritt S., Nieswandt B. In vitro platelets in sight. Blood 2014; 124(12): 1849-50.

3. Столяр М.А., Ольховский И.А. Диагностическое значение определения агрегационной активности тромбоцитов методом им-педансометрии. Бюллетень лабораторной службы 2012; 15: 27-42.

4. Machlus K.R., Thon J.N., Italiano J.E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: A review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology 2014; 165(2): 227-36.

5. Harker L.A., Roskos L.K., Marzec U.M. et al. Effects of megakaryocyte growth and development factor on platelet production,

platelet life span, and platelet function in healthy human volunteers. Blood 2000; 95(8): 2514-22.

6. Philippova O.I., Koloskov A.V., Stolitsa A.A. Testing of platelet function (review), http://www.medline.ru/public/art/tom13/art40.html.

7. Yip J., Shen Y., Berndt M.C. et al. Primary platelet adhesion receptors. IUBMB Life 2005; 57(2): 103-8.

8. Newman P.J., Poncz M. Inherited disorders of platelets. In: Scriver C.R., Beaduet A.L., Sly W.S., editors. The metabolic and molecular bases of inherited disease. New York: McGraw-Hill Professional; 1995. p. 3335-67.

9. Bussel J.B., Kunicki T.J., Michelson A.D. Platelets: new understanding of platelet glycoproteins and their role in disease. Hematology 2000; 1: 222-40.

10. Макацария А.Д., Бицадзе В.О. Тромбофилии и противо-тромботическая терапия в акушерской практике. Москва: Триада-Х; 2003.

11. Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Сергеевичев Д.С. и др. Мембранные рецепторы тромбоцитов: функции и полиморфизм. Вестник ВОГиС 2006; 10(3): 553-64.

12. Berger C., Hartwell D.W., Wagner D.D. P-Selectin and platelet clearance. Blood 1998; 92: 4446-52.

13. Маклецова С.А., Галявич А.С. Сердечно-сосудистые лекарственные средства и активация тромбоцитов. Казанский медицинский журнал 2003; 84(3): 204-7.

14. Козловский В.И., Ковтун О.М., Сероухова О.П. и др. Методы исследования и клиническое значение агрегации тромбоцитов. Фокус на спонтанную агрегацию. Вестник ВГМУ 2013; 12(4): 79-91.

15. Leytin V., Mody M., Semple J.W. et al. Flow cytometric parameters for characterizing platelet activation by measuring P-selectin (CD62P) expression: theoretical consideration and evaluation in thrombin-treated platelet populations. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 269: 85-90.

16. Michelson A.D., Barnard M.R., Krueger L.A. et al. Evaluation of platelet function by flow cytometry. Methods 2000; 21(3): 259-70.

17. Гусина А.А. Генетический полиморфизм гликопротеиновых рецепторов тромбоцитов как фактор риска тромбообразования. Кардиология в Беларуси 2009; 3(4): 17-24.

18. Савченко В.Г., Паровичникова Е.Н., Афанасьев Б.В. и др. Национальные клинические рекомендации по диагностике и лечению острых миелоидных лейкозов. Гематол. и трансфузиол. 2014; 59(1): 1-32.

19. Баркаган З.С. ДВС-синдром и тромботическая тромбо-цитопеническая пурпура при онкогематологических заболеваниях. Пробл. клинич. медицины. 2005; 1: 22-4.

20. Абдулкадыров K.M. Неотложные состояния в гематологии. Вестн. гематологии. 2005; 1(1): 51-8.

21. Baaten C.C., Moenen F.C., Henskens Y.M. et al. Multiple functional defects in platelets from thrombocytopenic cancer patients undergoing chemotherapy. J. Thromb. Haemost. 2016; 140(1): 171.

22. Psaila B., Bussel J.B., Frelinger A.L. et al. Differences in platelet function in patients with acute myeloid leukemia and myelodysplasia compared to equally thrombocytopenic patients with immune thrombocytopenia. J. Thromb. Haemost. 2011; 9(11): 2302-10.

23. Сироткина О.В., Боганькова Н.А., Ласковец А.Б. и др. Иммунологические методы в оценке функциональной активности тромбоцитов у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Медицинская иммунология 2010; 12(3): 213-218.

24. Friedmann A.M., Sengul H., Lehmann H. et al. Do basic laboratory tests or clinical observations predict bleeding in thrombocytopenic oncology patients? A reevaluation of prophylactic platelet transfusions. Transfus. Med. Rev. 2002; 16: 34-45.

25. Psaila B., Petrovic A., Page L.K. et al. Intracranial hemorrhage (ICH) in children with immune thrombocytopenia (ITP): study of 40 cases. Blood 2009; 114: 4777-83.

26. Slichter S.J., Kaufman R.M., Assmann S.F. et al. Dose of prophylactic platelet transfusions and prevention of hemorrhage. N. Engl. J. Med. 2010; 362: 600-13.

27. Хаспекова С.Г., Зюряев И.Т., Якушкин В.В. и др. Средний объем тромбоцитов: взаимосвязи с агрегационной активностью тромбоцитов и уровнем экспрессии гликопро-теинов IIB-IIIA и IB. Биомедицинская химия 2014; 60 (1): -94-108.

Поступила: 18.06.2016