СПОСОБ АНАЛИЗА МАТРИЧНОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, СПОСОБ АНАЛИЗА ВЕЩЕСТВА-МИШЕНИ, НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА МАТРИЧНОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ВЕЩЕСТВА-МИШЕНИ И АНАЛИЗАТОР ДЛЯ МАТРИЧНОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ВЕЩЕСТВА-МИШЕНИ

1. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты, включающий стадии:
фракционирования образца, содержащего матричную нуклеиновую кислоту, на множество фракций матричной нуклеиновой кислоты;
амплификации последовательности-мишени и комплементарной ей последовательности в матричной нуклеиновой кислоте в отношении каждой из множества фракций матричной нуклеиновой кислоты в присутствии реактива для амплификации нуклеиновой кислоты;
обнаружения генерации или гашения сигнала, который отражает амплификацию последовательности-мишени или комплементарной последовательности, в отношении каждой из множества фракций матричной нуклеиновой кислоты после стадии амплификации; и
различения фракции матричной нуклеиновой кислоты, в которой обнаружены генерация или гашение сигнала, который отражает амплификацию, среди множества фракций матричной нуклеиновой кислоты в качестве амплифицированной фракции, в которой амплифицирована последовательность-мишень или комплементарная последовательность, где
реактив для амплификации нуклеиновой кислоты содержит набор праймеров, которые амплифицируют последовательность-мишень и комплементарную последовательность, и генерирующее сигнал вещество, которое генерирует или гасит сигнал в ответ на амплификацию, и
генерирующее сигнал вещество генерирует сигнал в состоянии, в котором оно связано в зависимости от последовательности, и гасит сигнал в состоянии, в котором оно не связано, или гасит сигнал в состоянии, в котором оно связано в зависимости от последовательности, и генерирует сигнал в состоянии, в котором оно не связано, и генерация и гашение сигнала обратимы.
2. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 1, в котором
генерирующее сигнал вещество включает флуорогенный зонд, содержащий генерирующее сигнал вещество, и
флуорогенный зонд содержит по меньшей мере две флуоресцентные атомные группы, которые демонстрируют экситонный эффект, в качестве генерирующего сигнал вещества на молекулу.
3. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, в котором
набор праймеров содержит флуорогенный праймер, содержащий генерирующее сигнал вещество, и
флуорогенный праймер представляет собой праймер, который генерирует сигнал в состоянии, в котором он связан с мишенью, и гасит сигнал в состоянии, в котором он диссоциирован с мишенью или праймер, который гасит сигнал в состоянии, в котором он связан с мишенью, и генерирует сигнал в состоянии, в котором он диссоциирован с мишенью.
4. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 3, в котором
флуорогенный праймер содержит по меньшей мере две флуоресцентные атомные группы, которые демонстрируют экситонный эффект, в качестве генерирующего сигнал вещества на молекулу.
5. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 2 или 4, в котором
основание, которое содержит пару флуоресцентных атомных групп, которые демонстрируют экситонный эффект, содержит структуру, представленную следующей формулой (16), (16b), (17) или (17b).
6. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-5, в котором
способ амплификации, используемый на стадии амплификации, представляет собой по меньшей мере один из способа изотермальной амплификации и способа ПЦР.
7. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-6, который дополнительно включает стадии:
извлечения амплифицированной фракции из множества фракций матричной нуклеиновой кислоты после стадии различения.
8. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 7, который дополнительно включает стадии:
амплификации последовательности-мишени и комплементарной последовательности в матричной нуклеиновой кислоте в отношении амплифицированной фракции после стадии различения, где амплификация представляет собой вторую стадию амплификации.
9. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 8, в котором
способ амплификации, используемый на второй стадии амплификации, представляет собой по меньшей мере один из способа изотермальной амплификации и способа ПЦР.
10. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-9, в котором
стадию обнаружения проводят посредством анализа кривой плавления.
11. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-10, который дополнительно включает стадии:
проведения анализа посредством анализа кривой плавления после стадии обнаружения.
12. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-11, в котором
образец, содержащий матричную нуклеиновую кислоту, содержит реактив для амплификации нуклеиновой кислоты, и
на стадии фракционирования образец, содержащий матричную нуклеиновую кислоту и реактив для амплификации нуклеиновой кислоты, фракционируют на множество фракций матричной нуклеиновой кислоты.
13. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, в котором
стадия фракционирования предусматривает то, что каждая из множества фракций матричной нуклеиновой кислоты содержит реактив для амплификации нуклеиновой кислоты.
14. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-13, в котором
стадия фракционирования включает стадию формирования эмульсии из образца,
фракция матричной нуклеиновой кислоты представляет собой каплю образца, диспергированную в эмульсии, и
стадия обнаружения представляет собой стадию обнаружения генерации или гашения сигнала в отношении капли в эмульсии.
15. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 14, в котором
на стадии обнаружения,
эмульсию пропускают через канал потока, и
генерацию или гашение сигнала обнаруживают в отношении капли в предварительно определяемом месте канала потока, когда капля в эмульсии проходит через канал потока.
16. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 14 или 15, в котором
эмульсия представляет собой эмульсию вода-в-масле (типа W/O).
17. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-13, в котором
стадия фракционирования представляет собой стадию фракционирования образца на множество фракций матричной нуклеиновой кислоты посредством распределения образца по чипу, на поверхности которого предусмотрено множество частей формирования фракций матричной нуклеиновой кислоты.
18. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 17, в котором
в чипе поверхность части формирования фракции матричной нуклеиновой кислоты является гидрофильной и поверхность области, не содержащей часть формирования фракции матричной нуклеиновой кислоты, является гидрофобной, и
стадия фракционирования представляет собой стадию фракционирования образца на множество фракций матричной нуклеиновой кислоты посредством нанесения образца на поверхность чипа для того, чтобы разделять образец в части формирования фракции матричной нуклеиновой кислоты.
19. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 17, в котором
в чипе часть формирования фракции матричной нуклеиновой кислоты представляет собой выемку на поверхности чипа,
область, не содержащая часть формирования фракции матричной нуклеиновой кислоты, представляет собой не выемку, и
стадия фракционирования представляет собой стадию фракционирования образца посредством введения образца в выемки на поверхности чипа.
20. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 17, в котором
в чипе часть формирования фракции матричной нуклеиновой кислоты представляет собой выемку на поверхности чипа и внутренняя поверхность части формирования фракции матричной нуклеиновой кислоты является гидрофильной, и
область, не содержащая часть формирования фракции матричной нуклеиновой кислоты, представляет собой не выемку и поверхность области, не содержащей часть формирования фракции матричной нуклеиновой кислоты, является гидрофобной.
21. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 17-20, в котором
реактив для амплификации нуклеиновой кислоты располагают в части формирования фракции матричной нуклеиновой кислоты в чипе, и
стадия фракционирования предусматривает то, что фракция матричной нуклеиновой кислоты содержит реактив для амплификации нуклеиновой кислоты в части формирования фракции матричной нуклеиновой кислоты в чипе.
22. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 17-21, в котором
стадия обнаружения представляет собой стадию получения изображения множества фракций матричной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на одном чипе, и
стадия различения представляет собой стадию различения фракции матричной нуклеиновой кислоты на чипе, в которой генерацию или гашение сигнала обнаружили на изображении, в качестве амплифицированной фракции.
23. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-22, в котором
стадия фракционирования представляет собой стадию фракционирования образца на множество фракций матричной нуклеиновой кислоты посредством капания образца.
24. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-23, в котором
на стадии фракционирования усредненный объем множества фракций матричной нуклеиновой кислоты составляет от 0,0001 до 5000 нл.
25. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-24, в котором
образец содержит матричные нуклеиновые кислоты по меньшей мере двух типов,
реактив для амплификации нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере два набора праймеров и по меньшей мере два генерирующих сигнал вещества,
каждый из по меньшей мере двух наборов праймеров позволяет амплифицировать последовательность-мишень и комплементарную последовательность в каждой из различных матричных нуклеиновых кислот, и
каждое из по меньшей мере двух генерирующих сигнал веществ имеет одно и то же флуоресцентное свойство и генерирует или гасит сигнал в ответ на амплификацию последовательности-мишени и комплементарной последовательности в каждой из различных матричных нуклеиновых кислот.
26. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-25, в котором
образец содержит по меньшей мере две матричные нуклеиновые кислоты,
реактив для амплификации нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере два набора праймеров и по меньшей мере два генерирующих сигнал вещества,
каждый из по меньшей мере двух наборов праймеров позволяет амплифицировать последовательность-мишень и комплементарную последовательность в каждой из различных матричных нуклеиновых кислот, и
каждое из по меньшей мере двух генерирующих сигнал веществ имеет флуоресцентное свойство, отличающееся от другого, и генерирует или гасит сигнал в ответ на амплификацию последовательности-мишени и комплементарной последовательности в каждой из различных матричных нуклеиновых кислот.
27. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-26, в котором
образец содержит по меньшей мере две матричные нуклеиновые кислоты,
реактив для амплификации нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере два набора праймеров и нефлуорогенный зонд,
каждый из по меньшей мере двух наборов праймеров позволяет амплифицировать последовательность-мишень и комплементарную последовательность в каждой из различных матричных нуклеиновых кислот, и
каждый из генерирующего сигнал вещества и нефлуорогенного зонда генерирует или гасит сигнал в ответ на амплификацию последовательности-мишени и комплементарной последовательности в каждой из различных матричных нуклеиновых кислот.
28. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-27, в котором
генерацию или гашение сигнала, который отражает амплификацию последовательности-мишени или комплементарной последовательности, обнаруживают в отношении каждой из множества фракций матричной нуклеиновой кислоты перед стадией амплификации, и
на стадии различения, посредством сравнения сигнала, обнаруживаемого перед стадией амплификации, и сигнала, обнаруживаемого после стадии амплификации, фракцию матричной нуклеиновой кислоты, в которой обнаружены генерация или гашение сигнала, который отражает амплификацию, среди множества фракций матричной нуклеиновой кислоты различают в качестве амплифицированной фракции, в которой амплифицирована последовательность-мишень или комплементарная последовательность.
29. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-28, в котором
генерацию или гашение сигнала, который отражает амплификацию последовательности-мишени или комплементарной последовательности, обнаруживают в отношении образца, содержащего матричную нуклеиновую кислоту, перед стадией фракционирования, и
на стадии различения, посредством сравнения сигнала, обнаруживаемого перед стадией фракционирования, и сигнала, обнаруживаемого после стадии амплификации, фракцию матричной нуклеиновой кислоты, в которой обнаружены генерация или гашение сигнала, который отражает амплификацию, среди множества фракций матричной нуклеиновой кислоты различают в качестве амплифицированной фракции, в которой амплифицирована последовательность-мишень или комплементарная последовательность.
30. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-29, в котором
анализ матричной нуклеиновой кислоты представляет собой анализ модификации матричной нуклеиновой кислоты, и
способ дополнительно включает стадию:
получения матричной нуклеиновой кислоты перед стадией фракционирования.
31. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 30, в котором
анализ матричной нуклеиновой кислоты представляет собой анализ метилирования матричной нуклеиновой кислоты, и
стадия предварительной обработки представляет собой стадию превращения неметилированного остатка цитозина матричной нуклеиновой кислоты в остаток урацила или остаток производного урацила.
32. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 31, в котором
на стадии предварительной обработки превращение проводят с использованием бисульфита.
33. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 30, в котором
анализ матричной нуклеиновой кислоты представляет собой анализ метилирования матричной нуклеиновой кислоты, и
стадия предварительной обработки представляет собой стадию расщепления неметилированной области или метилированной области матричной нуклеиновой кислоты.
34. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 33, в котором
на стадии предварительной обработки расщепление проводят с использованием рестрикционного фермента.
35. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 30, в котором
анализ матричной нуклеиновой кислоты представляет собой анализ метилирования матричной нуклеиновой кислоты, и
стадия предварительной обработки представляет собой стадию обогащения метилированной матричной нуклеиновой кислоты.
36. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 35, в котором
на стадии предварительной обработки, используя по меньшей мере одно из связывающего метилированную ДНК белка и антитела против метилцитозина, метилированную матричную нуклеиновую кислоту обогащают посредством связывания по меньшей мере одного из связывающего метилированную ДНК белка и антитела против метилцитозина с метилированной матричной нуклеиновой кислотой.
37. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 30, в котором
анализ матричной нуклеиновой кислоты представляет собой анализ гидроксиметилирования матричной нуклеиновой кислоты, и
стадия предварительной обработки представляет собой стадию превращения остатка гидроксиметилцитозина матричной нуклеиновой кислоты в остаток негидроксиметилированного основания.
38. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 37, в котором
на стадии предварительной обработки, остаток гидроксиметилцитозина превращают в остаток тимина или остаток производного тимина с использованием вольфрамового окислителя.
39. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 37, в котором
4
на стадии предварительной обработки, остаток гидроксиметилцитозина превращают в остаток урацила или остаток производного урацила с использованием перрутената калия (KRuO) и бисульфита.
40. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 30, в котором
анализ матричной нуклеиновой кислоты представляет собой анализ гидроксиметилирования матричной нуклеиновой кислоты, и
стадия предварительной обработки включает стадии:
гликозилирования гидроксиметилированной области гидроксиметилированной матричной нуклеиновой кислоты; и
расщепления гликозилированной области гидроксиметилированной матричной нуклеиновой кислоты.
41. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 40, в котором
на стадии предварительной обработки расщепление проводят с использованием чувствительного к гликозилированию рестрикционного фермента.
42. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 30, в котором
анализ матричной нуклеиновой кислоты представляет собой анализ гидроксиметилирования матричной нуклеиновой кислоты, и
стадия предварительной обработки включает стадии:
гликозилирования гидроксиметилированной области гидроксиметилированной матричной нуклеиновой кислоты; и
обогащения гликозилированной гидроксиметилированной матричной нуклеиновой кислоты.
43. Способ анализа матричной нуклеиновой кислоты по п. 42, в котором
на стадии предварительной обработки, используя антитело к гликозилированию и гидроксиметилированию, гликозилированную гидроксиметилированную матричную нуклеиновую кислоту обогащают посредством связывания антитела с гликозилированной гидроксиметилированной матричной нуклеиновой кислотой.
44. Способ анализа вещества-мишени, включающий стадии:
приведения образца, содержащего по меньшей мере одно вещество-мишень, в контакт с по меньшей мере одним флуорогенным зондом, который генерирует сигнал в состоянии, в котором он специфически связан с веществом-мишенью, и гасит сигнал в состоянии, в котором он не связан с веществом-мишенью, или гасит сигнал в состоянии, в котором он специфически связан с веществом-мишенью, и генерирует сигнал в состоянии, в котором он не связан в реакционном растворе, чтобы приводить по меньшей мере один флуорогенный зонд в контакт с каждым флуорогенным зондом; и
обнаружения генерации или гашения сигнала флуорогенного зонда в ответ на связывание между нуклеиновой кислотой-мишенью и зондом.
45. Способ анализа вещества-мишени по п. 44, в котором
вещество-мишень представляет собой нуклеиновую кислоту или последовательность нуклеиновой кислоты.
46. Способ анализа вещества-мишени по п. 44 или 45, в котором
флуорогенный зонд содержит по меньшей мере две флуоресцентные атомные группы, которые демонстрируют экситонный эффект, в качестве генерирующего сигнал вещества на молекулу.
47. Способ анализа вещества-мишени по п. 46, в котором
основание, которое содержит пару флуоресцентных атомных групп, которые демонстрируют экситонный эффект, содержит структуру, представленную следующей формулой (16), (16b), (17) или (17b).
48. Способ анализа вещества-мишени по любому из пп. 44-47, в котором
стадия обнаружения представляет собой стадию обнаружения яркости или интенсивности сигнала по меньшей мере одного типа в реакционном растворе.
49. Способ анализа вещества-мишени по любому из пп. 44-48, в котором
стадия обнаружения представляет собой стадию обнаружения сигнала по меньшей мере одного типа в реакционном растворе посредством подсчета на молекулярном уровне флуорогенного зонда.
50. Способ анализа вещества-мишени по любому из пп. 44-49, в котором
анализируют вещества-мишени по меньшей мере двух типов,
используют флуорогенные зонды по меньшей мере двух типов для веществ-мишеней, и способ включает стадии:
вычисления соотношения концентраций или относительного содержания каждого вещества-мишени по значению обнаруживаемого сигнала флуорогенных зондов по меньшей мере двух типов, обнаруживаемого на стадии обнаружения.
51. Способ анализа вещества-мишени по любому из пп. 44-50, в котором
анализируют по меньшей мере два вещества-мишени и вещества-мишени по меньшей мере двух типов являются смежными друг с другом, и
используют по меньшей мере два флуорогенных зонда для веществ-мишеней, и
каждый из флуорогенных зондов содержит генерирующее сигнал вещество, имеющее флуоресцентное свойство, отличное от другого, и генерирует или гасит сигнал в ответ на связывание с различными веществами-мишенями с резонансным переносом энергии флуоресценции.
52. Способ анализа вещества-мишени по любому из пп. 44-51, в котором
анализируют по меньшей мере два вещества-мишени и вещества-мишени по меньшей мере двух типов являются смежными друг с другом, и
используют по меньшей мере два флуорогенных зонда для веществ-мишеней, и
каждый из флуорогенных зондов содержит генерирующее сигнал вещество, обладающее флуоресцентным свойством, отличным от другого, генерирует или гасит сигнал в ответ на связывание с различными веществами-мишенями и обнаруживает присутствие или отсутствие пространственного перекрытия сигналов нескольких типов.
53. Способ анализа вещества-мишени по любому из пп. 44-52, в котором
на стадии контактирования и стадии обнаружения управляют температурой реакционного раствора.
54. Способ анализа вещества-мишени по любому из пп. 44-53, в котором
вещество-мишень представляет собой вещество-мишень в состоянии, в котором оно связано с веществом, которое специфически связывается с веществом-мишенью.
55. Способ анализа вещества-мишени по п. 44, в котором
анализ вещества-мишени представляет собой анализ модификации вещества-мишени, и
способ дополнительно включает стадию:
предварительной обработки вещества-мишени перед стадией обнаружения.
56. Способ анализа вещества-мишени по п. 55, который дополнительно включает стадии:
амплификации предварительно обработанного вещества-мишени после стадии предварительной обработки и перед стадией обнаружения, где
амплифицированный продукт, получаемый на стадии амплификации, используют в качестве вещества-мишени на стадии обнаружения.
57. Способ анализа вещества-мишени по п. 55 или 56, в котором
анализ вещества-мишени представляет собой анализ метилирования вещества-мишени, и
стадия предварительной обработки представляет собой стадию превращения неметилированного остатка цитозина вещества-мишени в остаток урацила или остаток производного урацила.
58. Способ анализа вещества-мишени по п. 57, в котором
на стадии предварительной обработки превращение проводят с использованием бисульфита.
59. Способ анализа вещества-мишени по п. 55 или 56, в котором
анализ вещества-мишени представляет собой анализ метилирования вещества-мишени, и
стадия предварительной обработки представляет собой стадию расщепления неметилированной области или метилированной области вещества-мишени.
60. Способ анализа вещества-мишени по п. 59, в котором
на стадии предварительной обработки расщепление проводят с использованием рестрикционного фермента.
61. Способ анализа вещества-мишени по п. 55 или 56, в котором
анализ вещества-мишени представляет собой анализ метилирования вещества-мишени и
стадия предварительной обработки представляет собой стадию обогащения метилированного вещества-мишени.
62. Способ анализа вещества-мишени по п. 61, в котором
на стадии предварительной обработки, используя по меньшей мере один из связывающего метилированную ДНК белка и антитела против метилцитозина, метилированное вещество-мишень обогащают посредством связывания по меньшей мере одного из связывающего метилированную ДНК белка и антитела против метилцитозина с метилированным веществом-мишенью.
63. Способ анализа вещества-мишени по п. 55 или 56, в котором
анализ вещества-мишени представляет собой анализ гидроксиметилирования вещества-мишени, и
стадия предварительной обработки представляет собой стадию превращения остатка гидроксиметилцитозина вещества-мишени в остаток негидроксиметилированного основания.
64. Способ анализа вещества-мишени по п. 63, в котором
на стадии предварительной обработки остаток гидроксиметилцитозина превращают в остаток тимина или остаток производного тимина с использованием вольфрамового окислителя.
65. Способ анализа вещества-мишени по п. 63, в котором
4
на стадии предварительной обработки, остаток гидроксиметилцитозина превращают в остаток урацила или остаток производного урацила с использованием перрутената калия (KRuO) и бисульфита.
66. Способ анализа вещества-мишени по п. 55 или 56, в котором
анализ вещества-мишени представляет собой анализ гидроксиметилирования вещества-мишени и
стадия предварительной обработки включает стадии:
гликозилирования гидроксиметилированной области гидроксиметилированного вещества-мишени; и
расщепления гликозилированной области гидроксиметилированного вещества-мишени.
67. Способ анализа вещества-мишени по п. 66, в котором
на стадии предварительной обработки расщепление проводят с использованием чувствительного к гликозилированию рестрикционного фермента.
68. Способ анализа вещества-мишени по п. 55 или 56, в котором
анализ вещества-мишени представляет собой анализ гидроксиметилирования вещества-мишени и
стадия предварительной обработки включает стадии:
гликозилирования гидроксиметилированной области гидроксиметилированного вещества-мишени; и
обогащения гликозилированного гидроксиметилированного вещества-мишени.
69. Способ анализа вещества-мишени по п. 68, в котором
на стадии предварительной обработки, используя антитело к гликозилированию и гидроксиметилированию, гликозилированное гидроксиметилированное вещество-мишень обогащают посредством связывания антитела с гликозилированным гидроксиметилированным веществом-мишенью.
70. Набор для анализа вещества-мишени, который позволяет осуществлять способы анализа по любому из пп. 1-69.
71. Анализатор вещества-мишени, который позволяет осуществлять способы анализа по любому из пп. 1-69.