Детекция потенциальных сайтов рекомбинации вируса клещевого энцефалита методами сравнительной геномики

также в ранних стадиях инфекции. Этот эффект может являться причиной перехода бессимптомной стадии ВИЧ-инфекции в манифестирующую.

Было впервые показано, что изменчивость регу-ляторных генов зависит от субтипа вируса. Исходя из этого факта можно предположить, что в субтипе gagA/envB, для которого выявлена большая частота мутаций в регуляторных генах, при лечении также быстрее образуются мутации и в структурных генах (gag, pol и env), ведущие к появлению вариантов, устойчивых к антиретровирусным препаратам.

литература/references

1. Öhagen A., Gabuzda D. Role of Vif in Stability of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 Core. J. Virol. 2000; 74(23): 11055-66.

2. Raymond A.D., Campbell-Sims T.C., Khan M., Lang M., Huang M.B., Bond V.C. et al. HIV type 1 Nef is released from infected cells in CD45+ microvesicles and is present in the plasma of HIV-infected individuals. AIDS Res. Hum. Retrovir. 2011; 27(2): 167-78.

3. Mologni D., Citterio P., Menzaghi B., Zanone Poma B., Riva C., Broggini V. et al. Vpr and HIV-1 disease progression: R77Q mutation is associated with long-term control of HIV-1 infection in different groups of patients. AIDS. 2006; 20(4): 567-74.

4. Huigen M.C., Kamp W., Nottet H.S. Multiple effects of HIV-1 trans-activator protein on the pathogenesis of HIV-1 infection. Eur. J. Clin. Investig. 2004; 34: 57-66.

5. Boya P., Pauleau A.L., Poncet D., Gonzalez-Polo R.A., Zamzami N., Kroemer G. Viral proteins targeting mitochondria: Controlling cell death. Biochim. Biophys. Acta. 2004; 1659 (2-3): 178-89.

6. Chase A., Zhou Y., Siliciano R.F. HIV-1-induced depletion of CD4+ T cells in the gut: Mechanism and therapeutic implications. Trends Pharmacol. Sci. 2006; 27: 4-7.

Поступила 23.05.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДк 578.833.26:578.56].083.2

ДжиоевЮ.П.1'2, Парамонов А.И.2, Рева О.Н.3, БукинЮ.С.4, КозловаИ.В.1'2, Демина Т.В.5, Ткачев С.Е.6,

Злобин В.И.1

Детекция потенциальных сайтов рекомбинации вируса клещевого энцефалита методами сравнительной геномики

1ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, 664025, г. Иркутск; 2ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН, 664003, г. Иркутск; ^Университет Претории, ЮАР; 4Лимнологический институт СО РАН, 664082, г. Иркутск; 5ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия», 664038, г. Иркутск; 6Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, г. Новосибирск

Представлены результаты биоинформационного поиска потенциальных сайтов рекомбинации в полногеномных структурах вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) с помощью ряда программных методов. Проанализировано 55 геномов штаммов ВКЭ, из которых у 21 выявлено наличие сайтов рекомбинации. Рекомбинантные штаммы относились к дальневосточному (n = 19) и европейскому (n = 2) генотипам. Выявленные 22 сайта рекомбинации отнесены к 5 типам по позиционным, штаммовым и региональным характеристикам. Определены родительские штаммы, которые по генотипическим и географическим параметрам не противоречат возможности формирования рекомбинантов. Почти УУ сайтов расположены в области генов NS4a и NS4b штаммов ВКЭ, являющейся «горячей точкой» рекомбинации, при этом большая их часть концентрируется в гене NS4. Показано, что рекомбинационные процессы у ВКЭ происходят на уровне генотипа (европейского), определенных групп внутри генотипа (дальневосточного) и характерны для периферийных популяций ареала.

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита; сайты рекомбинации; методы программирования рекомбинации; родительские штаммы; «горячая точка» рекомбинации.

Для цитирования: Вопросы вирусологии. 2015; 60(3): 44-49.

Dzhioev Yu. P.12, Paramonov A. '-2, Reva O. N.3, Bukin Yu. S.4, Kozlova I. V.12, Demina T. V.5, Tkachev S. E.6,

Zlobin V. I.1

Detection of potential sites of recombination in the Tick-borne encephalitis virus by

the methods of comparative genomics

1Irkutsk State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation, 664025, Irkutsk, Russia; 2Scientific Center of Family Health Problems and Human Reproduction, Siberian Branch, Russian Academy of Medical Sciences, 664003, Irkutsk, Russia; 3University of Pretoria, South Africa; 4Limnological Institute, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, 664082, Irkutsk, Russia; 5Irkutsk State Agricultural Academy, 664038,Irkutsk, Russia; institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, 630090,Novosibirsk, Russia

The results of the bioinformatic search for the potential sites of the recombination in the genome-wide structures of the tick-borne encephalitis virus (TBEV) through a series of software techniques were presented in this work. The genomes of the 55 TBEV strains were assayed, 21 of them showed the presence of the recombination sites. Recombinant strains belonged to the Far Eastern (19 strains) and European (2 strains) genotypes. 22 sites of the recombination attributed were identified to five types based on position, strain, and regional characteristics. The parental strains were identified based on the genotypic and geographical parameters, which do not contradict the possibility of the formation of the recombinants. Nearly two-thirds of the sites are located in the regions of NS4a and Ns4b genes, which are the "hot spots" of the recombination, most of them being concentrated in the gene NS4. it was shown that the recombination processes did not occur at the level of the genotypes (European genotype) or certain groups within the genotype (Far East) and were typical of the peripheral populations.

Key words: tick-borne encephalitis virus; recombination sites; parent strains; recombination hotspot.

Citation: Voprosy virusologii. 2015; 60(3): 44-49. (In Russ.) For correspondence: Yuriy Dzhioev, MD, PhD; e-mail: alanir07@mail.ru

Received 17.01.14

Для корреспонденции: Джиоев Юрий, канд. мед наук; e-mail: alanir07@mail.ru

Введение

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), относящийся к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus, вызывает у людей тяжелые нейроинфекции, в ряде случаев, с параличами, парезами и высокой летальностью [1, 2]. Описаны 3 основных генотипа ВКЭ - дальневосточный, западный (европейский) и урало-сибирский (сибирский). Два генетических варианта (прототипные штаммы 886-84 и 178-79) рассматриваются как 4-й и 5-й генотипы [3].

Одним из ведущих факторов изменчивости и эволюции живых систем являются процессы рекомбинации, создающие новые генотипы путем объединения генетического материала из различных линий, повышая генетическое разнообразие популяции [4]. Они также являются основной движущей силой в эволюции вирусов, непосредственно влияя на их адаптацию к новым хозяевам и патогенность [5]. Рекомбинация отмечена во всех группах ДНК-содержащих и у многих РНК-содержащих вирусов, в том числе у ряда представителей рода Flavivirus [6, 7]. Однако существование рекомбинации у ВКЭ до сих пор оспаривается из-за противоречивых данных разных авторов [8, 9]. Вместе с тем в ряде работ последних лет в результате использования более эффективных биоинформационных программных методов были представлены данные о выявлении сигналов рекомбинации в геномах ВКЭ [6, 10, 11].

Целью данной работы было обнаружение в геномных последовательностях штаммов ВКЭ потенциальных сайтов рекомбинации, зафиксированных высокочувствительными программными методами, ориентированными на выявление рекомбинационных событий.

Материалы и методы

Последовательности нуклеотидов ВКЭ. Материал представлен выборкой данных о кодирующей части геномов 55 штаммов ВКЭ из базы данных GenBank: TEU27491, TEU27495, TEU39292, AF091010, AB062063, AB062064, AY182009, L40361, DQ989336, DQ486861, EU106868, DQ862460, EF469661, EF469662, EU816450-EU816455,

FJ402885, FJ402886, FJ906622, FJ997899, GQ228395, GQ266392, AY169390,GU121642, HM859894, HM859895, HQ201303, HM120875, HM535610, HM535611, HQ901366, HQ901367, JF316707, JF316708, FJ968751, JF819648, GU183379-GU183384, JN003205- JN003209, AF527415, AY217093, DQ401140 и штамм Софьин [12]. Последовательности выровнены программой Clustal W с использованием штрафа за открытие делеции 15 и штрафа за продолжение 6,66 [13].

Компьютерные программные методы. Положение сайтов рекомбинации определяли с помощью 7 программных методов, реализованных в пакете программ RDP v. 3.34: RDP (Recombination detection program); Geneconv (Statistical Tests for Detecting Gene Conversion); BootScan (Bootstrap-based detection of recombination breakpoints); Chimaera (Maximum mismatch chi-square); 3Seq (Method for inferring mosaic structure in sequence triplets); SiScan (Sister-scanning), MaxChi (Maximum chi-square) [14-20]. Программы выполняли статистическую оценку полученных результатов. Результат считали достоверным, когда значение p было равным или меньше 0,05. Для пакета программ RDP были установлены следующие общие настройки: «последовательности линейные, коррекция Бонефолли, не требуется филогенетического подтверждения, отшлифовывать точки рекомбинации, показывать все события». В ходе работы с программами применяли следующие настройки: «RDP - внешние и внутренние ссылки, размер окна 30; Geneconv, g-scale = 1; BootScan - длина окна 200, шаг 20, использовать UPGMA дерево, число повторов бутстрепа 100; MaxChi - заданный размер окна, 70 вариабельных сайтов на окно, не использовать пропуски; Chimaera - заданный размер окна, 70 вариабельных сайтов на окно». Все прочие настройки выставлены по умолчанию. Для статистической поддержки полученных результатов был использован метод Phi-тестирования [21]. Филогенетическое предположение присутствия рекомбинаций было получено с использованием программы Splits Tree v. 4.1 [22], методом Neighbor-net [23]. Данный метод отображает конфликтующие филогенетические сигналы в виде циклов внутри неукорененного дре-

Филогенетические сети, построенные методом Neighbor-net для исследуемой группы штаммов вируса клещевого энцефалита.

Таблица 1

Позиции сайтов рекомбинации, родительские штаммы и фиксирующие их программы

Штамм

Номер в GenBank

Позиции сайтов

Фиксирующие программы

Родительские штаммы, %

MDJ-02

MDJ-03

Senzhang

Irkutsk-1861

Sofjin-Ho

Sofjin

Sofjin-KSY

Primorye-89

Primorye-92

Primorye-94

MDJ-01

Joutseno

AS33

Primorye-2239

Sofjin-Ru

Dalnegorsk

205

Glubinnoe

Primorye-501

Primorye-1153

Primorye-633

JF316707 JF316708 AY182009 JN003205 AB062064

Нет JF819648 FJ906622 HQ201303 EU816454 AY217093 GU183381 GQ266392 HM859895

JN229223 FJ402886 DQ989336

DQ862460 HQ901367

HQ901366 HM859894

7951-9122 7951-9122 7934-9122 6485-7030 6497-7013

6484-7011

6485-7030

6484-7007

6500-7013

6497-7013

7945-9122

7951-9122

7139-8558

6844-8558

942-1701

946-1701

6497-7013

6488-6670 6484-7007

6487-6734 6497-7013

6488-6570

359-1008 6506-6931

679-893 412-1008 359-1008 6488-6725 6488-6570 6497-7013

6488-6725 6488-6570 6497-7013

6444-6725 6444-6569 6458-7007

RDP RDP MaxChi Chimaera

3Seq

RDP, Geneconv, Chimaera Geneconv MaxChi Geneconv MaxChi Chimaera

SiScan, Geneconv Chimaera

SiScan Chimaera Geneconv

RDP

RDP, MaxChi

MaxChi

Geneconv MaxChi RDP SiScan Geneconv Chimaera

SiScan Geneconv Chimaera

SiScan Geneconv Chimaera

Маж. род. Senzhang, 99,8

Мин. род. MDJ-01, 99,9 Маж. род. Senzhang, 99,7 Мин. род. МЭ.Т-02, 99,8 Маж. род. МЭ.Т-03, 99,7 Мин. род. неизвестен (МЭ.Г-01) Маж. род. Рптогуе-332, 95,1 Мин. род. неизвестен (205) Маж. род. Рптопе-332, 95,3 Мин. род. неизвестен (205) Маж. род. Рптогуе-332, 95,1 Мин. род. неизвестен (205) Маж. род. Рптогуе-332, 95,2 Мин. род. неизвестен (205) Маж. род. Рптогуе-322, 95,4 Мин. род. неизвестен (205) Маж. род. Рптогуе-332, 95,5 Мин. род. неизвестен (205) Маж. род. Рптогуе-332, 95,4 Мин. род. неизвестен (205) Маж. род. неизвестен (Senzhang) Мин. род. МЭ.Т-02, 99,9 Маж. род. AS33, 98,7 Мин. род. Est3476, 99,9 Маж. род. Joutseno, 98,7 Мин. род. неизвестен (Est3476) Маж. род. Рптогуе-332, 95,5 Мин. род. неизвестен (205) Маж. род. Рптогуе-69, 95,3 Мин. род. неизвестен (205) Маж. род. Рптогуе-332, 95,2 Мин. род. неизвестен (205) Маж. род. Рптогуе-69, 95,3 Мин. род. неизвестен (205) Маж. род. Рптогуе-332, 95,2 Мин. род. неизвестен (205) Маж. род. Рптогуе-69, 95,3 Мин. род. неизвестен (205) Маж. род. Рптогуе-2239, 95,7

Мин. род. Glubinnoe, 98,3 Маж. род. неизвестен

Мин. род. Р-212, 98,4 Маж. род. неизвестен

Мин. род. Рптогуе-332, 98,1 Маж. род. неизвестен (Рптогуе-2239) Мин. род. 205, 100

Маж. род. Рптогуе-69, 95,6 Мин. род. неизвестен

Примечание. Маж. род. - мажорный родитель; мин. род. - минорный родитель; в скобках указан предполагаемый родитель.

ва [22]. Статистический тест проводили с помощью метода Conduct Phi Test for Recombinations из программной системы Splits Tree 4 тест [21]. Хотя для получения данных о филогенетических несовместимостях мы использовали расстояния Джукса-Кантора, с исключением делеции и неинформативных для парсимонии сайтов, похожие результаты получаются с использованием и других параметров [24].

Результаты

Поиск сайтов рекомбинации обычно начинают с создания филогенетической сети, построенной методом Neighbor-net по геномам исследуемых штаммов при анализе таких рети-куляционных событий, как гибридизация, горизонтальный перенос генов, рекомбинация, дупликация или потеря генов [22, 23]. Представленная на рисунке филогенетическая сеть похожа на филогенетическое древо генотипов ВКЭ, однако в ветвях имеется множество циклов и расколов, указывающих на возможность рекомбинаций, по крайней мере для некоторых последовательностей, представленных на этой модели. Для более достоверной оценки филогенетической сети, предполагающей наличие событий рекомбинации было использовано 7 программных методов из пакета программ RDP v. 3.34 [14-20]. Учитывали только те выявленные сайты, в которых достоверность фиксации сигналов рекомбинации была меньше 0,05. Разные программы выявили следующие частоты рекомбинаций: Geneconv - 30 случаев, RDP - 13, MaxChi и SiScan - по 10, менее всего -3Seq и BootScan - по 4. По итогам детекции был выявлен 21 рекомбинантный штамм ВКЭ, а также определены его предполагаемые родительские штаммы (табл. 1). Родительские штаммы, которые устанавливали с наибольшей долей вероятности, определяли как мажорные, а с менее значимой вероятностью - как минорные.

Штаммы по количеству выявленных сайтов рекомбинаций на геном разделились на основную группу из 20 штаммов с одним сайтом рекомбинации и штамм 205 с двумя сайтами. В основной группе за исключением штамма Glubinnoe все сайты рекомбинации выявлены в неструктурной области генома, причем 3 сайта - в области гена NS5 (китайские штаммы MDJ-03, MDJ-03, Senzhang). Сайты для штаммов MDJ-02 и MDJ-03 определены методом RDP. Наиболее вероятным (мажорным) их родительским штаммом является Senzhang, но по менее вероятному (минорному) родителю они различаются: у MDJ-02 это штамм MDJ-01, а у штамма MDJ-03 - MDJ-02. Для рекомбинанта Senzhang мажорным родителем является штамм MDJ-03 при неизвестном, но предполагаемом минорном родителе MDJ-01 (выявлены программой MaxChi). Далее, у 7 штаммов (№ 4-10, в табл. 1) все сайты расположены в гене NS4a и на стыке генов NS4a и NS4b (табл. 2). Мажорным родителем для этих рекомбинантов является штамм Primorye-332, а в качестве минорного предполагается штамм 205.

У остальных штаммов (№ 11-21, кроме штамма 205, см. табл. 1) в геноме условно посредством разных программ выделяются по 2 или 3 сайта рекомбинации с небольшими различиями по длине фрагмента. В китайском штамме MDJ-01 разными программами показаны 2 сайта, различающихся по длине всего на 5 нуклеотидов и имеющих одинаковые родительские штаммы. Хотя мажорный штамм достоверно не определен, но предполагается штамм Senzhang. В европейских штаммах AS33 и Joutseno сайты рекомбинации различны по положению в геноме. В штамме AS33 сайт расположен в гене Е, имея общих мажорного и предполагаемого минорного родителей - Joutseno и Est 3476. Сайты в штамме Jout-seno расположены на стыке генов NS4b и NS5 (см. табл. 2), имея общего мажорного (4S 33) и минорного (Est 3476) родителей. В штамме Primorye-2239 оба сайта зафиксированы на стыке генов NS4a и NS4b, выявляются разными программами и имеют разных предполагаемых родителей.

Аналогичная картина наблюдается для штаммов Sofjin-Ru и Dalnegorsk, но у них варианты предполагаемых родителей совпадают. При сопоставлении Sofjin-Ru с его тремя однокорневыми вариантами (Sofjin-HO, Sofjjin, Sofjin-KSY) заметны различия.

Аналогичная картина представлена у штамма Glubinnoe, в

Таблица 2

Характеристика выявленных сайтов рекомбинации штаммов

ВКЭ

Позиции Размер Штаммы, в которых встре- Гены, в кото-

сайтов сайтов, н.о. чаются сайты рых расположены сайты

359-1008 649 205, Glubinnoe М + Е

412-1008 591 Glubinnoe M + E

679-893 214 Glubinnoe M + E

942-1701 759 AS33 E

6444-6569 125 Primorye-633 NS4a

6444-6725 281 " NS4a

6488-6570 82 Primorye-501, Dalnegorsk NS4a

6488-6725 237 Primorye-1153, Primorye-501 NS4a

6488-6670 182 Primorye-2239 NS4a

6458-7007 549 Primorye-633 NS4a + NS4b

6484-7007 523 Sofjin-Ru, Primorye-89 NS4a + NS4b

6484-7011 527 Sofjin NS4a + NS4b

6487-6734 247 Sofjin-Ru NS4a + NS4b

6497-7013 516 Sofjin-HO, Primorye -94, Primorye-2239, Dalnegorsk, Primorye-501, Primorye-1153 NS4a + NS4b

6500-7013 513 Primorye-92 NS4a + NS4b

6485-7030 545 Sofjin-KSY, Irkutsk-1861 NS4a + NS4b

6506-6931 425 205 NS4b

6844-8558 1714 Joutseno NS4b + NS5

7139-8558 1419 " NS4b + NS5

7934-9122 1188 Senzhang NS5

7945-9122 1177 MDJ-01 NS5

7951-9122 1171 MDJ-01, MDJ-02, MDJ-03 NS5

Примечание. н.о. - нуклеотидные основания.

котором все условные 3 сайта, с одной стороны, расположены на стыке структурных генов М и Е, а с другой, имея общего предполагаемого мажорного родителя Primorye-2239, фиксируются тремя разными программами (см. табл. 1). Однако, у штаммов Primorye-501, Primorye-1153 и Primorye-633 сайты рекомбинации выявляются одними и теми же программами, которым соответствуют одни и те же комбинации родительских штаммов. Совпадают у них также позиции сайтов в генах NS4a и NS4b (см. табл. 2). У штамма 205 сайт 359-1008 выявляется на стыке двух структурных генов М и Е и фиксируется методом RDP, имея родителей Primorye-2239 и Glubinnoe. Второй сайт 6506-6931 расположен в гене NS4b, и это единственный сайт среди всех, который определяется в этом гене (см. табл. 2). При этом программы, фиксирующие сайт, выявляют различных родителей (см. табл. 1).

Далее в табл. 2 приводятся характеристики позиций и размерностей 22 вариантов сайтов рекомбинации с оценками их генной принадлежности. Здесь размерность сайтов варьирует в широком диапазоне - от 82 до 1714 н.о. Наиболее крупные сегменты выявляются на стыке генов NS4b и NS5 и в гене NS5. Чаще сайты обнаруживаются в гене NS4a и в районах стыковок этого гена с геном NS4b (68,2%). Этот участок генома можно охарактеризовать как «горячую точку» рекомбинации ВКЭ. На ген NS4a приходится 80% рекомбинационных замен, и его можно считать ядром «горячей точки» рекомбинационных событий у ВКЭ. В генах С, NS1, NS2a, NS2b, NS3 не были зафиксированы сигналы рекомбинации, что можно объяснить (исключив ген С) тем, что они представляют высококонсервативный репликативный комплекс ВКЭ [12].

Как видно из табл. 2, все 22 выявленных сайта рекомбинации можно разделить на 5 типов по позиционным, штам-мовым и региональным характеристикам. К первому типу можно отнести сайты под 1-3, которые расположены на стыке генов М и Е. Они выявлены в двух штаммах - 205 и Glu-binnoe. Второй тип характерен для гена структурного белка Е, носителем которого является европейский штамм AS33

(№ 4). Штаммы третьего типа (№ 5-17) расположены в генах N84а и N84Ь и на их стыках. Четвертая группа представлена штаммом 1ои^епо, сайты которого (№ 18-19) расположены на стыке генов К84Ь и N85 и являются самыми длинными ре-комбинантными фрагментами - 1714 и 1419 н.о. Китайские штаммы 8епгЬа^, МЭ1-01, МЭ1-02, МЭ1-03 формируют пятый тип, их сайты занимают позиции в гене N85 (№ 20-22) и специфичны только для них.

Для статистического анализа рекомбинационных событий использовали РЫ-тестирование [21]. Было сформировано 6 групп (табл. 3). В первой группе, куда вошли все исследованные 55 штаммов, достоверно не выявлено наличия сигналов рекомбинации (степень критерия достоверности р = 0,137). В группе из всех проанализированных дальневосточных штаммов также не обнаружено сайтов рекомбинации (р = 0,092), но в группе штаммов европейского генотипа были зафиксированы высокодостоверные сигналы рекомбинации (р = 0,008). Для штаммов сибирского генотипа не было выявлено достоверных сигналов рекомбинации. При анализе выборки из 21 выявленного рекомбинантного штамма критерий достоверности - также р = 0,137. Однако после удаления из этой группы 2 штаммов европейского генотипа в остальных 19 штаммах дальневосточного генотипа был зафиксирован высокодостоверный сигнал рекомбинации (р = 0,0015). В этом случае результаты, полученные с помощью RDP-метода и РЫ-теста, совпадают, фиксируя сигналы рекомбинации среди групп штаммов европейского и дальневосточного генотипов и не выявляя их в сибирском генотипе.

Обсуждение

Рекомбинации и мутации являются первичными внутренними источниками генетической изменчивости организмов (в том числе вирусов), формирующими эволюционный и адаптационный потенциалы вида. Мутации обеспечивают увеличение разнообразия генофонда популяции за счет точечной перестройки существующего генетического материала без притока генов извне, а рекомбинации в рамках существующих геномов дают начало образованию новых генотипов за счет перераспределения уже существующих генетических структур [4, 5]. Отсюда можно сделать вывод, что если определенный вид (в том числе вид вируса) имеет генотипиче-скую структуру, то рекомбинации в таких случаях должны играть определяющую роль. Как известно, все виды живых организмов имеют определенный ареал и соответственно подразделены на популяционные иерархические структуры, а в пространстве ареала распределяются на периферийные и центральную популяции [4, 24]. В работе Э. Майра [24] отмечено, что в центральных популяциях видов в генотипах превалируют мутационные процессы, а в периферийных возрастают возможности рекомбинационных процессов. Эта концепция экстраполируется и на вирусные популяции исходя из общебиологических принципов, согласно которым вирусы в своей эволюционной и адаптационной стратегии также подчиняются им [5]. Поэтому утверждения ряда авторов о невозможности рекомбинаций у ВКЭ [8, 9] представляются недостаточно обоснованными. Их утверждения опровергаются также обнаружением рекомбинационных событий у вирусов, для которых ранее они отрицались [6, 7, 10, 11].

Таким образом, можно выделить несколько следующих особенностей, определяющих и характеризующих структуру выявленных сайтов рекомбинации у ВКЭ. Выявлена группа из 21 штамма, в геномах которых зафиксированы потенциальные участки рекомбинации с одним или двумя сайтами. Зафиксированные сайты рекомбинации можно подразделить на 5 типов по позиционным, штаммовым и региональным характеристикам. Выявлен регион (гены К84а и N845), образующий «горячую точку» рекомбинации ВКЭ. Сайты рекомбинации привязаны к двум генотипам - дальневосточному и европейскому. Показано, что рекомбинационные процессы у ВКЭ происходят на уровне как генотипа (европейский генотип), так и определенных групп внутри генотипа (дальневосточный). Выявлено пространственное распределение сайтов рекомбинации: они фиксируются только в периферийных регионах (популяциях) ареала ВКЭ - европейском и дальне-

Таблица 3

Результаты статистического анализа методом Phi-теста

№ группы Группы штаммов, принадлежащих к разным генотипам Число штаммов Оценка по Phi-тесту

1 Все исследованные штаммы 55 0,137

2 Все исследованные штаммы дальневосточного генотипа 30 0,092

3 Все исследованные штаммы европейского генотипа 13 0,008

4 Все исследованные штаммы сибирского генотипа 10 0,526

5 Все штаммы с выявленными 21 0,137

признаками рекомбинации

6 Штаммы с выявленными 19 0,0015

признаками рекомбинации

Примечание. В группах не учитываются штаммы 886-84 и 178-79.

восточном. В штаммах из сибирского региона, занимающих центр ареала ВКЭ, всеми используемыми программными методами не были определены достоверные сайты рекомбинации, что соответствует принципам популяционной генетики - рекомбинации более вероятны в периферийных популяциях, чем в популяциях центральной части ареала вида [24]. Предполагаемые родительские штаммы географически и генотипи-чески связаны с конкретными рекомбинантными штаммами, что может отражать достоверность их родственных связей. Показаны различия в степени чувствительности и специфичности используемых программных методов. Все программы RDP по-разному оценивают и фиксируют как сайты рекомбинации, так и родительские штаммы рекомбинантов. Тем не менее в совокупности они предоставляют высокодостоверную информацию о наличии в геномах штаммов ВКЭ потенциальных сигналов рекомбинации и определяют границы рекомби-нантных сайтов. Вместе с Phi-тестированием они фиксируют связь рекомбинационных событий у ВКЭ с определенными иерархическими уровнями: генотипическим (европейский), субгенотипическим (дальневосточный) и популяционным (ре-комбинанты выявляются в популяциях на периферии ареала).

ЛИТЕРАТУРА

1. Зильбер Л.А. Весенний (весенне-летний) эпидемический клещевой энцефалит. Архив биологических наук. 1939; 2: 9-37.

2. Thiel H.-J., Collett M. S., Gould E. A., Heinz F. X., Houghton M., Meyers G. et al. Family Flaviviridae. In: Fauquet C.M. et. al., eds. Virus Taxonomy : Classification and Nomenclature. Eighth Report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses. Amsterdam: Elsevier; 2005; 981-98.

3. Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Козлова И.В., Верхозина М.М., Ткачев С.Е., Дорощенко Е. К., и др. Генотипы 4 и 5 вируса клещевого энцефалита: особенности структуры геномов и возможный сценарий их формирования. Вопросы вирусологии. 2012; 4: 13-9.

4. Суходолец В.В. Значение генетических рекомбинаций для сохранения и прогресса видов в эволюции. Журнал общей биологии. 2003; 3: 215-26.

5. Цилинский Я.Я. Популяционная структура и эволюция вирусов. М.: Медицина; 1988.

6. Bertrand Y, ^pel M, E^ng A, Melik W, Johansson M. First dating of a recombination event in mammalian tick-borne flaviviruses. PLoS One. 2012; (7): 1-12.

7. Carney J., Daly J.M., Nisalak A., Solomon T. Recombination and positive selection identified in complete genome sequences of Japanese encephalitis virus. Arch. Virol. 2012; 157: 75-3.

8. Taucher C., Berger A., Mandl C.W. A trans-complementing recombination trap demonstrates a low propensity of flaviviruses for intermolecular recombination. J. Virol. 2010; 84: 599-11.

9. Twiddy S.S., Holmes E.C. The extent of homologous recombination in members of the genus Flavivirus. J. Gen. Virol. 2003; 84: 429-40.

10. Джиоев Ю.П., Парамонов А.И., Демина Т.В., Козлова И.В., Вер-хозина М.М., Ткачев С.Е. и др. Обнаружение рекомбинаций у вируса клещевого энцефалита с помощью компьютерного анализа вирусных геномов. Вопросы вирусологии. 2012; 2: 14-8.

11. Norberg P., Roth A., Bergstrom T. Genetic recombination of tickborne flaviviruses among wild-type strains. Virology. 2013; 440: 105-16.

12. Pletnev A.G., Yamshchikov V.F., Blinov V.M. Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus. Virology. 1990; 174: 250-63.

13. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994; 22: 4673-80.

14. Boni M.F., Posada D., Feldman M.W. An exact nonparametric method for inferring mosaic structure in sequence triplets. Genetics. 2007; 176: 1035-47.

15. Gibbs M.J, Armstrong J.S, Gibbs A.J. Sister-Scanning: a Monte Carlo procedure for assessing signals in recombinant sequences. Bioin-formatics. 2000; 16: 573-82.

16. Martin D.P., Posada D., Crandall K.A., Williamson C. A modified bootscan algorithm for automated identification of recombinant sequences and recombination breakpoints. AIDS Res. Hum.Retrovirus-es. 2005; 21: 98-2.

17. Martin DP, Lemey P, Lott M, Moulton V, Posada D, Lefeuvre P. Rdp3: A flexible and fast computer program for analyzing recombination. Bioinformatics.2010; 26: 2462-63.

18. Maynard S.J. Analyzing the mosaic structure of genes. J. Mol. Evol. 1992; 34: 126-9.

19. Padidam M., Sawyer S., Fauquet C.M. Possible emergence of new Gemini viruses by frequent recombination. Virology.1999; 265: 21825.

20. Posada D., Crandall K.A. Evaluation of methods for detecting recombination from DNA sequences: Computer simulations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001; 98: 13757-62.

21. Bruen T. C., Philippe H., Bryant D. A quick and robust statistical test to detect the presence of recombination. Genetics.2006; 172: 2665-81.

22. Huson D.H., Scornavacca C. A survey of combinatorial methods for phylogenetic networks. Genome Biol. Evol. 2011; 3: 23-5.

23. Bryant D., Moulton V. Neighbor-Net: An agglomerative method for the construction of phylogenetic networks. Mol. Biol. Evol. 2004; 21: 255-65.

24. Jukes T.H., Cantor C.R. Evolution of Protein Molecules. In: Munvo, ed. Mammalian Protein Metabolism. New York: Academic Press; 1969: 21-132.

25. Mайр Э. Популяция, виды и эволюция. М.: Мир; 1974.

references

1. Zil'ber L.A. Spring

2. Thiel H.-J., Collett M. S., Gould E. A., Heinz F. X., Houghton M., Meyers G., et.al. Family Flaviviridae. In: Fauquet C.M. et al., eds. Virus Taxonomy : Classification and Nomenclature. Eighth Report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses. Amsterdam: Elsevier; 2005: 981-98.

3. Demina T.V., Dzhioev Yu.P., Kozlova I.V., Verkhozina M.M., Tkachev S.E., Doroshchenko E. K. et al. Genotypes 4 and 5 are borne encephalitis virus : structural features of genomes and a possible scenario for their formation. Voprosy Virusologii. 2012; 4: 13-9.

4. Sukhodolets V.V. Value for the conservation of genetic recombination and progress in the evolution of species. Zhurnal Obshchey Bi-ologii. 2003; 3: 215-26.

5. Tsilinskiy Ya.Ya. Population structure and evolution of viruses [Popu-lyatsionnaya struktura i evolutsiya virusov]. Moscow: Meditsina; 1988.

6. Bertrand Y, Topel M, Elvang A, Melik W, Johansson M. First dating of a recombination event in mammalian tick-borne flaviviruses. PLoS One. 2012; (7): 1-12.

7. Carney J., Daly J.M., Nisalak A., Solomon T. Recombination and positive selection identified in complete genome sequences of Japanese encephalitis virus. Arch. Virol. 2012; 157: 75-3.

8. Taucher C., Berger A., Mandl C.W. A trans-complementing recombination trap demonstrates a low propensity of flaviviruses for intermolecular recombination. J. Virol. 2010; 84: 599-11.

9. Twiddy S.S., Holmes E.C. The extent of homologous recombination in members of the genus Flavivirus. J. Gen. Virol. 2003; 84: 429-40.

10. Dzhioev Yu.P., Paramonov A.I., Demina T.V., Kozlova I.V., Verkhozina M.M., Tkachev S.E. et al. Detection of recombinations have borne encephalitis virus using computer analysis of viral genomes. Voprosy Virusologii. 2012; 2: 14-8.

11. Norberg P., Roth A., Bergstrom T. Genetic recombination of tickborne flaviviruses among wild-type strains. Virology.2013; 440: 105-16.

12. Pletnev A.G., Yamshchikov V.F., Blinov V.M. Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus. Virology. 1990; 174: 250-63.

13. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994; 22: 4673-80.

14. Boni M.F., Posada D., Feldman M.W. An exact nonparametric method for inferring mosaic structure in sequence triplets. Genetics.2007; 176: 1035-47.

15. Gibbs M.J, Armstrong J.S, Gibbs A.J. Sister-Scanning: a Monte Carlo procedure for assessing signals in recombinant sequences. Bioin-formatics.2000; 16: 573-82.

16. Martin D.P., Posada D., Crandall K.A., Williamson C. A modified bootscan algorithm for automated identification of recombinant sequences and recombination breakpoints. AIDS Res. Hum.Retrovirus-es.2005; 21: 98-2.

17. Martin DP, Lemey P, Lott M, Moulton V, Posada D, Lefeuvre P. Rdp3: A flexible and fast computer program for analyzing recombination. Bioinformatics.2010; 26: 2462-63.

18. Maynard S.J. Analyzing the mosaic structure of genes. J. Mol. Evol. 1992; 34: 126-9.

19. Padidam M., Sawyer S., Fauquet C.M. Possible emergence of new Gemini viruses by frequent recombination. Virology. 1999; 265: 21825.

20. Posada D., Crandall K.A. Evaluation of methods for detecting recombination from DNA sequences: Computer simulations. Proc. Natl. Acad Sci. USA. 2001; 98: 13757-62.

21. Bruen T. C., Philippe H., Bryant D. A quick and robust statistical test to detect the presence of recombination. Genetics.2006; 172: 2665-81.

22. Huson D.H., Scornavacca C. A survey of combinatorial methods for phylogenetic networks. Genome Biol. Evol. 2011; 3: 23-5.

23. Bryant D., Moulton V. Neighbor-Net: An agglomerative method for the constructionof phylogenetic networks. Mol. Biol. Evol. 2004; 21: 255-65.

24. Jukes T.H., Cantor C.R. Evolution of Protein Molecules. In: Munvo, ed. Mammalian Protein Metabolism. New York: Academic Press; 1969: 21-132.

25. Mayr E. Population, species and evolution [Populyatsiya, vidy i evolutsiya]. Moscow: Mir; 1974.

Поступила 17.01.14