Полиморфизм генов белков ангиогенеза в условиях шумовой и химической техногенной экспозиции

42

ЗНиСО ноябрь №11

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ БЕЛКОВ АНГИОГЕНЕЗА В УСЛОВИЯХ ШУМОВОЙ И ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОГЕННОЙ ЭКСПОЗИЦИИ

О.В. Долгих, А.В. Кривцов, О.А. Бубнова, Е.Д. Данилова, О.О. Синицына, Р.А. Предеина, Д.Г. Дианова, Т.С. Лыхина

POLYMORPHISM OF GENES OF PROTEINS ANGIOGENESIS NOISE AND CONDITIONS OF CHEMICAL EXPOSURE TECHNOGENIC

O.V. Dolgikh, A.V. Krivtsov, O.A. Bubnova, E.D. Danilova, O.O. Sinitsyna, R.A. Predeina, D.G. Dianova, T.S. Lykhina

ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», г. Пермь

Проведен анализ распределения частот генов матриксной металлопротеиназы (ММР9), эндотелиального фактора роста (VEGF) и эндотелиальной NO-синтазы (NOS3) у детей в условиях комбинации шумовой и химической экспозиции. Выявлены особенности генетического полиморфизма генов металлопротеиназы (ММР9), эцдотелиального фактора роста (VEGF) и эндотелиальной NO-синтазы (NOS3) в виде высокой распространенности минорных гомозиготных аллелей генов VEGF (34 %) и ММР9 (56 %), а также их ассоциация с контаминацией биосред химическими мутагенами и специфическим иммунологическим ответом на гаптен.

Ключевые слова: ген матриксной металлопротеиназы, ген эндотелиального фактора роста, ген эндотелиальной NO-синтазы, полиморфизм генов, шум, формальдегид, марганец, бензол.

In this study, we analyzed the polymorphism of matrix metallopeptidase-9 gene (MMP9), gene of vascular endothelial growth factor (VEGF) and endotelial NO-syntetase gene (NOS3) in children exposed to chemicals and noise. The features of gene polymorphism were detected. We observed the high prevalence of minor homozygous alleles of VEGF and MMP9 genes (34% and 56%). The correlation between features of gene polymorphism and chemical contamination of biological medium was found.

Keywords: matrix metallopeptidase-9 gene, gene of vascular endothelial growth factor, endothelial NO-syntetase gene, gene polymorphism, noise, formaldehyde, manganese, benzol.

Восприимчивость организма к воздействию техногенных факторов в значительной мере зависит от особенностей генетических ассоциаций, определяющих состояние белков ангиогенеза [1, 2, 4]. Вследствие генетической гетерогенности популяции человека в ней присутствуют индивиды, генетические особенности которых обусловливают повышенную чувствительность к действию техногенных факторов, имеющих физическую и химическую природу [1, 3, 5].

К ключевым полиморфизмам, реализующим взаимодействие антропогенных химических факторов и процессов иммунологического гомеостаза, относятся полиморфизмы патогенетических генов, в том числе генов матриксной металлопротеиназы, эндотелиального фактора роста (VEGF) и эндотелиальной ^-синтазы (NOS3) [1, 2, 4].

Применение современных молекулярно-генетических технологий, в частности ПЦР, послужит основой создания критериев комплексной оценки воздействия химических факторов на адаптацию организма, с дальнейшей коррекций иммунного ответа и состояния гомеостатических факторов ангиогенеза [3, 4, 5].

Цель — оценка особенностей полиморфизма ключевых патогенетических генов у детей в условиях воздействия комбинации техногенных факторов (шума, бензола, формальдегида, марганца) на примере ДНК-полиморфизма генов металлопро-теиназы (ММР9), эндотелиального фактора роста (VEGF) и эндотелиальной NO-синтазы (NOs3).

Материалы и методы. При углубленном изучении состояния здоровья детского населения выполнено генетическое и иммунологическое диагностическое обследование 97 детей в возрасте от 3 до 10 лет, постоянно проживающих в зоне влияния крупного аэропорта. Группу контроля составили 25 детей, проживающих вне зоны влияния аэропорта. Зоны воздействия формировались по принципу возрастающей удаленности от санитарно-защитной зоны аэропорта и снижения доли техногенных физических и химических факторов в комбинированной нагрузке: зона 1 — на границе санитарно-защитной зоны аэропорта, зона 2 — на удалении от аэропорта до 7 км, зона 3 — расположена по ходу взлетов и посадок самолетов под глиссадой, зона 4 (контроль) — на значительном (более 7 км) удалении от аэропорта.

5

Определение органических соединений (мг/л) в крови выполнялось в соответствии с МУК 4.1.2102—4.1.2116—06 на жидкостном и газовом хроматографах.

Исследование биосред на содержание металлов (мг/дм3) выполнено в соответствии с методическими указаниями МУК 4.1.763—4.1.799—99 МЗ России методом прямого определения на атомно-абсорбционном спектрофотометре фирмы Perkin Elmer 3110.

Забор материала для ПЦР проводился методом взятия мазков со слизистой оболочки ротоглотки. Затем проводили выделение ДНК с помощью сор-бентного метода, в основе которого лежит разрушение клеток с дальнейшей сорбцией нуклеиновых кислот на сорбент.

Для исследования полиморфных вариантов в изучаемых генах использовали методику ПЦР, в основе которой лежит реакция амплификации и детекция продуктов этой реакции в режиме реального времени с помощью флюоресцентных меток, которыми предварительно помечают используемые для реакции амплификации праймеры. Для одновременной детекции нескольких продуктов реакции используют разные флюоресцентные метки и зонды (мультиплексная Пцр). В качестве прай-меров использовали участок ДНК генов ММР9, эндотелиального фактора роста (VEGF) и эндотелиальной NO-синтазы (NOS3). Для определения генотипа человека использовали метод аллельной дискриминации, когда различия между гетерозиго-тами, гомозиготами дикого и минорного вариантов устанавливали по различиям в протекании реакций амплификации соответствующих праймеров.

Основные результаты. Наиболее высокие уровни загрязнения атмосферы химическими примесями, измеряемыми в рамках социально-гигиенического мониторинга (бензол, толуол, этилбензол, аммиак, бенз(а)пирен, фенол, формальдегид, марганец, кадмий, свинец), регистрируются на границе санитарно-защитной зоны аэропорта или в непосредственной близости к ней. Приоритетными примесями, которые вносят наибольшие вклады в уровни суммарного загрязнения атмосферы, являются азота диоксид, взвешенные вещества, фенол, формальдегид, марганец и его соединения. Наибольшей зашумленностью (до 90 дБ максимальный шум и 66,6 дБ эквивалентный шум) характери-

ноябрь №11

43

g

g

Таблица. Распределение частот генов ММР, VEGF, eNOS у детей, проживающих в зоне влияния аэропорта

Гены Генотип 1 зона 2 зона 3 зона 4 зона

VEGF GG 63,S%

GC 32%

CC 4,6%

G В0% 85% 66% В2%

C 20% 1б% 34% 1В%

eNOS GG S0%

GT S0%

TT 0%

G 7S%o 76% В7,б% В0%

T 2S%o 24% 12,S% 20%

MMP9 AA 41%

AG 4S%o

GG 14%

A 64% S9% 44% 60%

G 36% 41% S6% 40%

зуются территории на границе санзоны аэропорта и в непосредственной близости к ней.

В крови детей, проживающих в зоне влияния аэропорта, были обнаружены концентрации бензола, толуола, ксилолов, а также формальдегида и его гомологов на более высоком уровне, чем на территории сравнения (кратность превышения от 1,1 до 1,6 раза). Данные концентрации достоверно превышают концентрации ароматических углеводородов и алифатических альдегидов, характерные для контаминации биологических сред детей, проживающих вне зон техногенного влияния (р < 0,05).

Содержание в крови детей химических веществ, характерных для внешнесредовой экспозиции (прежде всего марганца, меди, формальдегида, бензола и толуола), достоверно активирует клеточное звено иммунитета, дестабилизирует регуляционные клеточные механизмы, активирует пролиферативные, некротические и апоптотические процессы в тканях (Я2 от 0,1 до 0.89, р<0.05).

Сопряженным анализом экспозиции и уровней содержания примесей в крови установлены достоверные зависимости «концентрация (доза) примеси в воздухе — концентрация примеси в крови» для бензола, марганца, и формальдегида; (р < 0,05, Я2 от 0,10 до 0,44).

Исследования показали, что содержание маркера состояния эндотелия сосудов (VEGF-эндотелиальный фактор роста) не отличалось от физиологической нормы у детей исследуемой группы, однако было в 1,5 раза ниже соответствующего показателя группы контроля без достоверности выявленных различий. Оценка отношения шансов изменения теста при возрастании концентрации контаминантов в биологических средах позволило установить достоверное (р < 0,05) понижение: содержания VEGF при увеличении в крови концентрации бензола (г2 = 0,12 при р < 0,05), меди (г2 = 0,19 при р < 0,05).

Полиморфизм генов ангиогенеза характеризуется повышенной распространенностью гетерозиготного и минорного гомозиготного варианта гена VEGF над группой контроля соответственно в 1,9 и 3,0 раза во 2 зоне и в 1,5 и 2,5 раза в 3 зоне. Выявленные нарушения усугубляются повышенной частотой минорного аллельного варианта гена eNOS в 1,2 раза в 1 и 2 зонах, что может акцентировать влияние сосудистого компонента в хрони-зации инфекционных и неинфекционных заболеваний, озлокачествлению соматической патологии в форме аутоиммунных заболеваний

Полиморфизм генов пролиферации эндотелия (VEGF) характерен для детей, проживающих в 3 и

2 зонах, причем в минорном гомозиготном состоянии, полиморфизм гена риска развития эндотели-альной дисфункции и других нарушений ангиогенеза (eNO-синтаза) был сопоставим в анализируемых группах, но более выражен во 2 зоне.

Анализ состояния гена ММР9 выявил наличие патологической гомозиготы у 37,5 % детей 3 зоны при 20 %-й распространенности в контроле. Причем распространенность минорного аллеля у детей основной группы превышала не только его частоту в контроле, но и цитируемую. Гетерозиготная распространенность мутантного аллеля характеризовала 2 исследуемую зону с преимущественной химической экспозицией как приоритетную — 59,0 %, против аналогичной 40 %-й распространенности в контроле. В целом распространенность мутантного аллеля характеризовалось максимальными величинами в третьей исследуемой зоне — 56 %. Причем в обследуемой зоне на долю ММР9 приходится 84 % от всех выявленных мутаций (см. табл.).

Вывод. Полиморфизм генов эндотелиальных протеинов, отвечающих за пролиферативные процессы в сосудистом русле характерен для детей, проживающих в 3-й зоне, характеризуется повышенной над группой контроля распространенностью гетерозиготного и минорного гомозиготного варианта гена VEGF; измененный полиморфизм гена eNOS характеризовался повышенной частотой минорного аллельного варианта гена eNOS в 1,2 раза в 1 и 2 зонах, полиморфизм металлопротеи-наз, отвечающих за пролиферативные процессы и онкологию, характерен для детей, проживающих в

3 зоне, причем в минорном гомозиготном состоянии; изменен полиморфизм ММР и у детей 2 зоны, причем для их генетики характерен гетерозиготный вариант, распространенность которого превышает контроль в 1,5 раза. Показателями факторной нагрузки, достоверно изменяющими значения показателей иммунитета, являются марганец, формальдегид, бензол.

Представленные данные свидетельствуют о высокой распространенности минорных гомозиготных аллелей генов факторов ангиогенеза у детей в условиях воздействия комбинированной техногенной нагрузки, а также их негативных ассоциациях с контаминацией биосред химическими мутагенами и специфическим иммунологическим ответом на гаптен.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Иммунные и ДНК-маркеры воздействия техногенной нагрузки /О.В. Долгих [и др.] //Вестник Уральской медицинской академической науки. 2012. № 4. С. 240—241.

2. Зайцева Н.В., Долгих О.В. Особенности клеточного звена иммунитета у детей в условиях внешнесредовой экспозиции толуолом, формальдегидом, фенолом //Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2012. Т. 14. № 5 (2). C. 341—343.

3. Зайцева Н.В., Май И.В. К вопросу установления и доказательства вреда здоровью населения при выявлении неприемлемого риска, обусловленного факторами среды обитания //Анализ риска здоровью. 2013. № 2. С. 14—27.

4. Ланин Д.В. Анализ корегуляции иммунной и нейроэндокрин-ной систем в условиях воздействия факторов риска // Анализ риска здоровью. 2013. № 1. С. 73—81.

5. Descotes J., Vial Th. Immunotoxic effects ofxenobiotics in humans: A review of current evidence //Toxicology in Vitro. 1994. Vol. 8. № 5. Р. 963—966.

Контактная информация:

Долгих Олег Владимирович, тел.: 8 (342) 236-39-30, e-mail: oleg@fcrisk.ru Contact Information: Dolgikh Oleg, phone: 8 (342) 236-39-30, e-mail: oleg@fcrisk.ru