Способ моделирования тендинопатии
METHOD FOR MODELING TENDINOPATHY

Сухожилия представляют собой плотные тяжи, соединяющие мышцы и кости. Сухожилия являются разновидностью соединительной ткани. Они образованы из параллельно расположенных пучков коллагена. С их помощью мышцы прочно прикрепляются к поверхности костей. Патология связочного аппарата часто описывается как тендинит - заболевание воспалительной природы. Другой термин, используемый в травматологии - тендиноз, относится к дегенеративному процессу, исключающему воспалительный элемент. Она описывается как дегенеративное состояние сухожильной ткани и наконец, термин тендинопатия описывает хроническое заболевание сухожилий, этиология которого неясна [15]. Большинство авторов полагают, что тендинопатия включает в себя воспалительный компонент, но преобладающая часть представляет собой дегенеративный процесс.
Тендинопатии - общее название дегенеративно-воспалительных заболеваний сухожилий микротравматической этиологии и их поражения при серонегативных спондилопатиях.
Среди этиологических факторов называется избыточная нагрузка на мышцы, перенесенные повреждения по типу ушибов и разрывов сухожилий, нарушение метаболизма, гормональный дисбаланс, инфекционные процессы, поражающие соединительную ткань, воспаление, вследствие изношенности и разрушения суставов. При чрезмерном растяжении сухожилие может порваться. Сухожилия могут быть подвержены функциональным перегрузкам, как при интенсивных прыжках и беге нарушается структура сухожилий четырехглавой мышцы и ахиллово сухожилие, так и при долгой сидячей работе в патологический процесс вовлекаются сухожилия мышц предплечья (7, 9)
Известны три теории, описывающие происхождение тендинопатии: механическая, сосудистая, нейронная.
Согласно механической теории, сухожилия предназначены для адаптации к изменяющейся нагрузке. Его внутренняя структура состоит из сложно ориентированных молекул коллагена, фибрилл, теноцитов и др. компонентов. Иерархическая структура и гофрирующий рисунок коллагеновых волокон работают как приспособительный механизм, защищающий от повреждений в случае перегрузки. Волокнистые гофры создают своего рода механический буфер и поглотитель энергии. Каждая деформация сухожильной ткани в физиологическом диапазоне вызывает выпрямление гофров и временную деформацию. Стресс, превышающий физиологические возможности ткани, т.е. дистресс, приведет к разрыву волокон. Физиологическая активность проявляется увеличением интенсивности метаболизма матрикса и синтеза коллагена. Регулярная функциональная активность приводит к развитию структуры сухожилия и обновлению тканей. Исследования на животных показали положительное влияние тренировки на увеличение синтеза коллагена I типа и увеличение диаметра сухожилия. Другие тесты на животных in vivo с высокой нагрузкой показали, что циклическая чрезмерная, дистрессовая нагрузка испытуемых вызывала микротравмы сухожилий [5, 7, 8, 12, 14]. Установлено, что иммобилизация приводит к низкой активности ферментов и снижению синтеза коллагена - важнейшей составляющей сухожилий.
Согласно механической теории, основным звеном патогенеза тендинопатий являются повторяющиеся механические растяжения и микротравмы сухожилия, известные в литературе как "патология чрезмерного использования" [4, 13]. Тен-доны - это волокнисто-упругие структуры, физиологически адаптированные к максимальной нагрузке, которая вызовет деформацию 4% его длины (по последним данным, в патологии величина деформации составляет от 6% до даже 8%). Механическое растяжение в диапазоне от 0 до 4% длины сухожилия обеспечивает дифференцировку стволовых клеток сухожилия в теноциты. Мультипотентные стволовые клетки способны трансформироваться в различные линии. Увеличение числа теноцитов характеризуется повышенным уровнем экспрессии гена коллагена I типа. Механическая стимуляция сухожилий в физиологическом диапазоне 0-4% позволяет получать новые теноциты и поддерживать правильную структуру сухожилия. Каждое напряжение сверх физиологического значения 4% приводит к образованию микротрещин в структуре коллагена. Растяжение более чем на 8% длины сухожилия вызывает дифференцировку стволовых клеток в адипогенные, хондрогенные и остеогенные линии [10]. Повторяющаяся травма приводит к разрушению внутренней структуры сухожилий, не способной восстанавливать внеклеточный матрикс. Сухожилия становятся уязвимыми к вторичным повреждениям, и с каждой последующей травмой они накапливаются. Биомеханические свойства рубцовой ткани нарушаются в результате дегенеративных изменений [15].
Согласно сосудистой теории сухожилии относятся к метаболически активным тканям и, как и другие ткани, нуждаются в кровоснабжении. Питание сухожилий зависит от доставки синовиальной жидкости и кровоснабжения из местного сосудистого русла. Сухожилия характеризуются низким сосудистым кровотоком и формированием критических зон с недостаточным сосудистым снабжением в специфических сухожилиях [6]. Считается, что постепенная деградация тен-донов связана с гиповаскулярными областями и зонами тканевой гипоксии. Аваскулярные области с пониженной плотностью сосудов называются критическими зонами или водораздельными зонами и встречаются в ахилловом сухожилии, сухожилиях вращательной манжеты, сухожилии бицепса и заднем сухожилии большеберцовой кости [6]. Неоваскуляризация отсутствует в здоровых сухожилиях, но она является распространенным явлением при острой и хронической патологии сухожилий.
Согласно нейронной теории развития тендинопатии, в сухожилиях обычно выделяют четыре типа нервных окончаний: тельца Руффини, свободные нервные окончания, тельца Пачини, главным образом в месте расположения сухожилия, и сухожильные органы Гольджи, главным образом в месте расположения мышцы [16]. При этом, нервные волокна возникают из окружающих мышц и кожных нервов. Нервные окончания выделяют местные медиаторы, известные как нейротрансмиттеры: субстанцию Р и CGRP (пептид, связанный с геном кальцитонина). Нейромедиаторы приводят к дегрануляции тучных клеток и высвобождению ферментов, хемотаксических факторов и факторов роста, которые представляют собой группу биологически активных веществ, регулирующих оборот матрикса. Вещество Р и CGRP, высвобождаемое из нервных окончаний, индуцируют нейрогенное воспаление. Нейромедиаторы участвуют в развитии болевых расстройств при тендинопатии. Субстанция Р, CGRP, ММР 2 (металлопротеиназа 2-го типа), ММР 9 (металлопротеиназа 9-го типа), VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста), IL 1 (интерлейкин 1-го типа), IL 6 (интерлейкин 6-го типа) и TNF-α (фактор некроза опухоли α) стимулируют поздние ноцицепторы. Вышеупомянутые вещества были обнаружены в повышенном количестве в структуре сухожилий, пораженных тендинопатией. Врастание нервной ткани сопровождает процесс неоваскуляризации, знаменующий хронизацию воспаления.
Анализ литературных данных показывает, что в механизмах развития тендинопатии значимую роль играет механическая травма, активирующая воспаление, неоваскуляризация и дистрофические процессы. Ряд авторов признает, что первичным, триггерным фактором тендинопатии, выступают микротравмы и воспаление. В этой связи для моделирования тендинопатии в литературе используется введение ципролета или ципрофлоксацина, вызывающего разволокнение и разрыв связок, в первую очередь, ахиллова сухожилия (18, 19).
Целью изобретения было разработка простого, дешевого, максимально приближенного к механизму развития тендинопатии в клинике.
В проведенных нами экспериментах на половозрелых крысах линии Вистар, массой от 300 до 400 г под анестезией рометаром (согласно инструкции) моделировали тендинопатию двумя методами.
В первую группу числом 5 вошли крысы, которым моделировали тендинопатию путем введения 0,2% раствора ципрофлоксацина в парасухожильное простанство левого пяточного сухожилия 0,3-0,2 мл (в зависимости от массы экспериментального животного). Интервал введения ципрофлоксацина через трое суток на четвертые, кратность введения - 11 иньекций. Из фармакологических справочников известно, что длительный прием ципрофлоксацина вызывает разволокнение сухожилий, в первую очередь, ахиллова. Это одно из важных побочных эффектов этого антибиотика. На 44 сутки крыс выводят из эксперимента путем введения летальной дозы рометара. Для исседования забирали часть ахиллова сухожилия с прилежащими мягкими тканями (жировой и мышечной). Одновременно у 5 интактных, контрольных крыс (вторая группа) под рометаром аналогично как и в первой группе, забирали для морфологического исследования ткани связки с прилежащими мягкими тканями. Во третью группу числом 5 вошли крысы, которым моделировали тендинопатию путем введения в паратендинальное пространство левого пяточного сухожилия от 0,3-0,2 мл взвеси стерильного талька, разведенного стерильным физиологическим раствором в отношении 1:10 (одна часть талька и 10 частей физиологического раствора), кратность введения - один раз в течение 4 суток, продолжительность моделирования составляла 44 сут. Для исседования забирали часть ахиллова сухожилия с прилежащими мягкими тканями. Фрагменты ткани связок с прилежащими мягкими тканями (жировой и мышечной) экспериментальных животных фиксировали в 10% забуференном формалине, проводили по батареи восходящих спиртов, заливали в парафин. Срезы ткани толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, толуидиновым синим, по Масону. Световая микроскопия выполнялась на микроскопе MICROS (AUCTRIA) при увеличении х100 и х400, с последующим фотографированием фотокамерой OLYMPUS.
Примеры конкретного выполнения.
Пример №1.
Половозрелой крысе самке массой 320 г из первой группы под рометаром выбрили кожу в области пяточного сухожилия, обработали кожу 70% этиловым спиртом и вводили в паратендинальное пространство левого пяточного сухожилилия 0,25 мл 0,2% раствора ципрофлоксацина. Иньекции повторяли один раз в 4 суток на протяжении 44 суток (11 инъекций). Вторую группу составляла интактная, контрольная крыса, которой не наносили повреждения. В группу три вошла крыс массой 340 г, которым моделировали тендинопатию путем введения в паратендинальное пространство 0,25 мл 10% суспензии стерильного талька.
Животных выводили из эксперимента на 44 сутки. Под рометаром забирали ткани для гистологического исследования у крыс из трех групп.Фрагменты ткани связок с прилежащими тканями фиксировали в 10% забуференном формалине, проводили по батареи восходящих спиртов, заливали в парафин. Срезы ткани толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, толуидиновым синим, по Масону. Световая микроскопия выполнялась на микроскопе MICROS (AUCTRIA) при увеличении х100 и х400, с последующим фотографированием фотокамерой OLYMPUS
В группе интактных животных сухожилие было представлено высокоорганизованными, слабо эозинофильно окрашенными волокнами, расположенными параллельно. Между пучками волокон располагались фиброциты (сухожильные клетки) с небольшим количеством фибробластов и основного аморфного вещества. У всех животных четко различимы пучки первого, второго и третьего порядка. Пучки первого порядка тонкие, представлены коллагеновыми волокнами, отделенными от соседнего слоя фиброцитами (сухожильными клетками). Пучки второго порядка представлены несколькими пучками первого порядка, окруженными тонкими прослойками рыхлой соединительной тканью. Пучки третьего порядка состоят из пучков второго порядка, разделенных более толстыми прослойками рыхлой соединительной ткани. В прослойках рыхлой соединительной ткани расположены кровеносные сосуды. Признаков дезорганизации, нарушения кровообращения и воспаления в участках сухожилия, и в окружающих мягких тканях не обнаружено.
Микроскопическое строение сухожилия в группе животных с введением ципрофлоксацина характеризовалось правильным гистологическим строением в виде рядов параллельно расположенных коллагеновых волокон, с формированием пучков первого, второго и третьего порядка. В коллагеновых волокнах сухожилий и в окружающих мягких тканях (жировой и мышечной) признаков дезорганизации, нарушения кровообращения, воспаления не выявлено.
Микроскопическое строение сухожилия в группе животных с введением 10% стерильной суспензии талька характеризовалось рядами параллельно расположенных коллагеновых волокон, с формированием пучков первого, второго и третьего порядка. В отдельных участках сухожилия отмечалось очаговое разволокнение коллагеновых волокон и очаговая дезорганизация коллагеновых волокон в виде мукоидной и липоидной дегенерации. Мукоидная дегенерация характеризовалась развитием феномена метахромазии при окраске толуидиновым синим и наблюдалась, также, при окраске по Масону. В единичных участках наблюдалась очаговая, слабо выраженная неоваскулязиризация. В прилежащих мягких тканях (жировой и мышечной) наблюдалась очагово-диффузная воспалительная инфильтрация преимущественно лимфоцитами и гистиоцитами, с небольшим количеством нейтрофильных лейкоцитов в отдельных участках, которая локализовалась в участках скоплений инородного материала.
Сравнительный анализ морфологических показателей функционального состояния связок показывает, что максимальные проявления тендинопатии выявлены при введении 10% суспензии талька. Это очаговое разволокнение коллагеновых волокон, их мукоидная и липоидная дегенерация, неоангиогенез. В прилежащих мягких тканях - воспалительная инфильтрация лимфоцитами и гистиоцитами.
Пример 2
Эксперимент выполнен на 3 крысах, по одной из трех групп. Половозрелой крысе самке массой 295 г из первой группы под рометаром выбрили кожу в области пяточного сухожилия, обработали кожу 70% этиловым спиртом и ввели в паратендинальное пространство левого пяточного сухожилилия 0,2 мл 0,2% раствора ципрофлоксацина. Иньекции повторяли один раз в 4 суток на протяжении 44 суток (11 иньекций). Вторую группу составляла интактная, контрольная крыса, которой не наносили повреждения. В группу три вошла крыса массой 310 г, которой моделировали тендинопатию путем введения в паратендинальное пространство 0,2 мл 10% суспензии стерильного талька. Животных выводили из эксперимента на 44 сутки. Под рометаром забирали ткани связок для гистологического исследования. Фрагменты ткани связок с прилежащими тканями фиксировали в 10% забуференном формалине, проводили по батареи восходящих спиртов, заливали в парафин. Срезы ткани толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, толуидиновым синим, по Масону. Световая микроскопия выполнялась на микроскопе MICROS (AUCTRIA) при увеличении х100 и х400, с последующим фотографированием фотокамерой OLYMPUS
В группе интактных животных(вторая группа) сухожилие было представлено высокоорганизованными, слабо эозинофильно окрашенными волокнами, расположенными параллельно. Между пучками волокон располагались фиброциты (сухожильные клетки) с небольшим количеством фибробластов и основного аморфного вещества. У всех животных четко различимы пучки первого, второго и третьего порядка. Пучки первого порядка тонкие, представлены коллагеновыми волокнами, отделенными от соседнего слоя фиброцитами (сухожильными клетками). Пучки второго порядка представлены несколькими пучками первого порядка, окруженными тонкими прослойками рыхлой соединительной тканью. Пучки третьего порядка состоят из пучков второго порядка, разделенных более толстыми прослойками рыхлой соединительной ткани. В прослойках рыхлой соединительной ткани расположены кровеносные сосуды. Признаков дезорганизации, нарушения кровообращения и воспаления в участках сухожилия, и в окружающих мягких тканях не обнаружено. Морфологическая картина соответствует структуре нормальных связок.
Микроскопическое строение сухожилия у крысы из первой группы на фоне введения ципрофлоксацина характеризовалось правильным гистологическим строением в виде рядов параллельно расположенных коллагеновых волокон, с формированием пучков первого, второго и третьего порядка. В коллагеновых волокнах сухожилий и в окружающих мягких тканях (жировой и мышечной) признаков дезорганизации, нарушения кровообращения, воспаления не выявлено.
Микроскопическое строение сухожилия из группы животных номер три, которому вводили 10% стерильную суспензию стерильного талька, характеризовалось рядами параллельно расположенных коллагеновых волокон, с формированием пучков первого, второго и третьего порядка. В отдельных участках сухожилия отмечались очаговое разволокнение коллагеновых волокон, их очаговая дезорганизация в виде мукоидной и липоидной дегенерации. Мукоидная дегенерация характеризовалась развитием феномена метахромазии при окраске толуидиновым синим, при окраске по Масону. В единичных участках наблюдалась очаговая, слабо выраженная неоваскулязиризация. В прилежащих мягких тканях (жировой и мышечной) наблюдалась очагово-диффузная воспалительная инфильтрация преимущественно лимфоцитами и гистиоцитами, с небольшим количеством нейтрофильных лейкоцитов в отдельных участках, которая локализовалась в участках скоплений инородного материала.
Сравнительный анализ морфологических показателей функционального состояния связок показывает, что максимальные проявления тендинопатии воспалительно - дегенеративной природы выявлены при введении 10% суспензии талька. Это очаговое разволокнение коллагеновых волокон, их мукоидная и липоидная дегенерация, неоангиогенез. В прилежащих мягких тканях - очаговая воспалительная инфильтрация лимфоцитами и гистиоцитами. Неоангиогенез - знаменует собой формирование зоны хронического воспаления, что соответствует основному звену механизма развития тендинопатии, имеющей воспалительно-дистрофическую природу.
Пример 3
Половозрелой крысе самке массой 405 г из первой группы под рометаром выбрили кожу в области пяточного сухожилия, обработали кожу 70% этиловым спиртом и ввели в паратендинальное пространство левого пяточного сухожилилия 0,3 мл 0,2% раствора ципрофлоксацина. Иньекции повторяли один раз в 4 суток на протяжении 44 суток (11 иньекций). Вторую группу составляла интактная, контрольная крыса, которой не наносили повреждения. В группу три вошла крыса массой 385 г, которой моделировали тендинопатию путем введения в паратендинальное пространство 0,3 мл 10% суспензии стерильного талька.
Животных выводили из эксперимента на 44 сутки. Под рометаром забирали ткани для гистологического исследования. Фрагменты ткани связок с прилежащими тканями фиксировали в 10% забуференном формалина, проводили по батареи восходящих спиртов, заливали в парафин. Срезы ткани толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, толуидиновым синим, по Масону. Световая микроскопия выполнялась на микроскопе MICROS (AUCTRIA) при увеличении х100 и х400, с последующим фотографированием фотокамерой OLYMPUS
У крысы из группы интактных животных сухожилие было представлено высокоорганизованными, слабо эозинофильно окрашенными волокнами, расположенными параллельно. У всех животных четко различимы пучки первого, второго и третьего порядка. Пучки первого порядка тонкие, представлены коллагеновыми волокнами, отделенными от соседнего слоя фиброцитами, с небольшим количеством фибробластов и основного аморфного вещества. Пучки второго порядка представлены несколькими пучками первого порядка, окруженными тонкими прослойками рыхлой соединительной тканью. Пучки третьего порядка состоят из пучков второго порядка, разделенных более толстыми прослойками рыхлой соединительной ткани. В прослойках рыхлой соединительной ткани расположены кровеносные сосуды. Признаков дезорганизации, нарушения кровообращения и воспаления в участках сухожилия, и в окружающих мягких тканях не обнаружено.
Микроскопическое строение сухожилия в группе животных с введением ципрофлоксацина (группа один) характеризовалось правильным гистологическим строением в виде рядов параллельно расположенных коллагеновых волокон, с формированием пучков первого, второго и третьего порядка как это описано в группе интактных крыс. В коллагеновых волокнах сухожилий и в окружающих мягких тканях (жировой и мышечной) признаков дезорганизации, нарушения кровообращения, воспаления не выявлено. Морфологическая картина максимально приближена к сухожилиям крыс из контрольной серии.
Микроскопическое строение сухожилия из группы животных с введением 10% стерильной суспензии талька (группа три) характеризовалось рядами параллельно расположенных коллагеновых волокон, с формированием пучков первого, второго и третьего порядка. В отдельных участках сухожилия отмечались очаговое разволокнение коллагеновых волокон и очаговая дезорганизация коллагеновых волокон. Выявляются признаки мукоидной и липоидной дегенерации, проявляющиеся метахромазией при окраске по Масону и толуидиновым синим. Местами наблюдали признаки очаговой, слабо выраженной неоваскулязиризация, которая появляется обычно в зоне хронизации воспаления. В прилежащих мягких тканях (жировой и мышечной) наблюдалась очагово-диффузная воспалительная инфильтрация преимущественно лимфоцитами и гистиоцитами, с небольшим количеством нейтрофильных лейкоцитов в отдельных участках, которая локализовалась в участках скоплений инородного материала.
Сравнительный анализ морфологических показателей функционального состояния связок показывает, что максимальные проявления тендинопатии выявлены при введении 10% суспензии талька. Это очаговое разволокнение коллагеновых волокон, их мукоидная и липоидная дегенерация, неоангиогенез - знаменующий формирование хронического воспаления. В прилежащих мягких тканях -очаговая воспалительная инфильтрация лимфоцитами и гистиоцитами. Т.о., выявленные изменения соответствуют ведущему звену тендинопатии, имеющему воспалительно-дегенеративную природу.
Отсутствие признаков дегенерации у крыс на фоне длительного введения ципрофлоксацина, вероятно, являются следствием активации механизмов деструкции и выведения из организма его молекул, которые не позволяют накопиться токсической дозе этого антибиотика. Надо заметить, что это осложнение и при лечении антибиотиком встречается крайне редко. В этой связи предлагаемая модель для моделирования тендинопатии стабильно воспроизводит воспалительно-дегенеративную природу этой патологии, проста в использовании и не требует значимых материальных вложений.
Литература.
Animal models for the study of tendinopathy / Warden S.J. // British Journal of Sports Medicine. - 2007. - №41. - C. 232-240.
1. Tendinopathy of tendo achillis / Maffulli N, Kader D. // Journal Bone And Joint Surgery. - 2002. - №84(1). - C. 1-8.
2. Animal models of tendinopathy / Spencer P. Lake, Heather L. Ansorge, Louis J. Soslowsky // Journal Disability and Rehabilitation. - 2008. - №30. - C. 1530-1541.
3. Lian QB, Engebretsen L, Bahr R. Prevalence of jumper's knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. Am J Sports Med 2005; 33:561-7.
4. Khan KM, Cook JL, Bonar F, et al. Histopathology of common tendinopathies:
5. Singer DI, Morrison WA, Gumley GJ, et al. Comparative study of vascularized and nonvascularized tendon grafts for reconstruction of flexor tendons in zone 2: an experimental study in primates. J Hand Surg [Am] 1989; 14:55-63.
6. Dahlgren LA, van der Meulen MC, Bertram JE, et al. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. J Orthop Res 2002; 20:910-9.
7. Cohen MS, Turner TM, Urban RM. Effects of implant material and plate design on tendon function and morphology. Clin Orthop 2006; 445:81-90.
8. Palmes D, Spiegel HU, Schneider TO, et al. Achilles tendon healing: long-term biomechanical effects of postoperative mobilization and immobilization in a new mouse model. J Orthop Res 2002; 20:939-46.
9. Zantop T, Gilbert TW, Yoder MC, et al. Extracellular matrix scaffolds are repopulated by bone marrow-derived cells in a mouse model of Achilles tendon reconstruction. J Orthop Res 2006; 24:1299-309.
10. Lin TW, Cardenas L, Glaser DL, et al. Tendon healing in interleukin-4 and interleukin-6 knockout mice. J Biomech 2006; 39:61-9.
11. Maffulli N, Testa V, Capasso G, et al. Similar histopathological picture in males with Achilles and patellar tendinopathy. Med Sci Sports Exerc 2004; 36:1470-5.
12. Yu JS, Popp JE, Kaeding CC, et al. Correlation of MR imaging and pathologic findings in athletes undergoing surgery for chronic patellar tendinitis. AJR Am J Roentgenol 1995; 165:115-8.
13. Cook JL, Feller JA, Bonar SF, et al. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons.
Orthop Res 2004; 22:334-8.
14. Tallon C, Maffulli N, Ewen SW. Ruptured Achilles tendons are significantly more degenerated than tendinopathic tendons. Med Sci Sports Exerc 2001; 33:1983-90.
15. Reeves ND. Adaptation of the tendon to mechanical usage. J Musculoskelet Neuronal Interact 2006; 6:174-80.
17. C, Boquist L, Friden J, et al. Chronic Achilles paratenonitis with tendinosis: an experimental model in the rabbit. J Orthop Res 1990; 8:541-7.
18. Кукес В.Г. Клиническая фармакология и фармакотерапия. 2012. Изд-е 3. 712 с.
19. Регистр лекарственных средств. Россия 2020. Ципрофлоксацин.