ДВУХФОТОННЫЙ СКАНИРУЮЩИЙ МИКРОСКОП

Полезная модель относится к оборудованию для научных исследований, в частности к двухфотонным сканирующим микроскопам, предназначенным для получения изображения люминесцирующих объектов, точнее к люминесцентно-микроскопическому анализу объектов, обладающих флуоресценцией при освещении возбуждающим излучением.
Двухфотонная микроскопия является частным случаем многофотонной микроскопии и находит широкое применение при изучении различных физических и биологических явлений и объектов, как правило, в конфокальной геометрии. Данный метод диагностики материалов включает в себя такие методики, как генерация второй оптической гармоники (ГВГ) и двухфотонная люминесценция (ДФЛ).
На сегодняшний день основное применение многофотонной конфокальной микроскопии - биология. Это связано с тем, что данная методика позволяет получать трехмерные изображения тканей за счет изменения фокусировки лазерного излучения (W. Denk, J.H. Strickler, and W.W. Webb, Science 248, 73, 1990), что оказывается возможным в связи с существенно большей глубиной проникновения излучения на основной длине волны (700-1000 нм) в биологические ткани (биологическое окно прозрачности - B.J. Tromberg, N. Shah, R. banning, A Cerussi, J. Espinoza, T. Pham, L. Svaasand, J. Butler. Neoplasia. 2000; 2(1-2), 26-40).
Одним из важных преимуществ микроскопии с двухфотонным возбуждением является ее способность получать оптические срезы лучшего качества на больших глубинах толстых образцов, чем это возможно другими методами. Однако, применение двухфотоной микроскопии для различного рода биологических исследований, как например, исследования морфологии срезов головного мозга, и исследования на живых образцах имеют свои особенности.
Главными аспектами при разработке оптической системы для микроскопических исследований живых клеток являются чувствительность фотоприемника (отношение сигнал/шум), требуемая скорость получения изображений и выживаемость (жизнеспособность) образца. Работая с живыми клетками, необходимо всеми средствами избегать воздействия на них излучения сравнительно большой интенсивности и в течение длительных периодов времени, обычно использующихся для получения изображений связанных клеток и тканей (когда основным фактором является фотообесцвечивание).
Простейший способ улучшения отношения сигнал/шум состоит в регистрации большего количества фотонов, обычно, за счет удлинения экспозиции или увеличения уровня возбуждающего излучения, например повышения интенсивности лазерного излучения. Однако эти меры увеличивают фототоксичность, снижают жизнеспособность клеток и в конечном итоге приводят перегреву и выгоранию исследуемого образца.
Другим требованием, предъявляемым к флуоресцентным микроскопам, является возможность комплексного изучения биологических процессов как in vivo, так и in vitro. Для удовлетворения этого требования необходимо предусмотреть возможность быстрой модификации конструкции микроскопа в соответствии с особенностями процесса сканирования образца.
Для наблюдения люминесцирующих объектов применяются различные по конструкции устройства. В одних из них источником света служит дуговая лампа или лампа накаливания. Свет от источника света с помощью системы линз направляется на объект, возбуждая его флуоресценцию. Свет флуоресценции объекта собирается объективом, который передает изображение объекта на детектор света или на фотопленку, или на ПЗС-камеру для регистрации изображения. Недостатком данной системы является необходимость применения в качестве источника света высокомощных ламп, которые дают свет в широкой области спектра, включая инфракрасную область, так что более 90% излучения лампы является паразитным и с ним необходимо бороться установкой специальных фильтров. Кроме того высокомощные лампы производят большое количество избыточной тепловой и световой энергии, по сравнению с энергией, требуемой для освещения образца. Высокий уровень потребляемой и выделяемой мощности и большие размеры этих ламп делают системы, в которых они применяются, громоздкими. Выполнение устройств портативными является проблематичным. Стоимость таких систем очень высока.
Другим источником излучения возбуждающего флуоресценцию является лазер. Лазеры используются, в основном, в сканирующих устройствах для обеспечения высокой интенсивности освещения в узкой спектральной области и на малой площади образца. Как правило, применяют фемтосекундный импульсный лазер, который обеспечивает требуемый поток фотонов для двухфотонного возбуждения, сохраняя при этом среднюю интенсивность лазерного луча достаточно низкой.
Известно также устройство, в котором возбуждение люминесценции объекта осуществляют лазером и регистрируют изображение люминесцирующего объекта с помощью ПЗС-камеры. Лазер помещается сбоку от образца и освещает его под углом Брюстера. Изображение образца создается с помощью двух одинаковых фотографических объективов, расположенных навстречу друг другу, и передающих изображение объекта в масштабе 1:1. Особенностью данной схемы является то, что она необходима для создания параллельного пучка света между объективами, что позволяет расположить между ними интерференционный светофильтр. Вместе с тем, эта схема резко ограничивает области применения системы и уменьшает ее чувствительность. Система дает увеличение 1:1 и позволяет анализировать объекты, размеры которых сопоставимы с размерами чипа ПЗС-камеры. Одним из недостатков системы является ее недостаточная чувствительность, что заставляет использовать длительные (порядка 10 минут) экспозиции при записи изображения. Увеличение экспозиции приводит к выцветанию образца во время анализа, а также требует охлаждения ПЗС камеры жидким азотом (-196°С) для снижения темнового тока. Другой существенный недостаток системы вызван тем фактом, что луч лазера неоднороден в своем сечении (в нем имеются так называемые «спеклы»), в результате чего разные места объекта освещаются с разной интенсивностью. («Fluorescence Array Detector for Large-Field Quantitative Fluorescence Cytometry" K.D. Wittrup, R.J. Westerman, R. Desai, Cytometry» v. 16, p. 206-213, 1994).
Известен принцип спектральной флуоресцентной микроскопии, содержащий лазер, зеркало, направляющее излучение лазера на исследуемый объект, установленные по ходу флуоресцентного излучения запирающий фильтр, не пропускающий излучение лазера, но пропускающий весь спектр флуоресцентного излучения исследуемого образца, зеркало, поворачивающее излучение флуоресценции, перестраиваемый анализатор поляризации, акустооптический перестраиваемый фильтр изображений и цифровую камеру, связанную с компьютером, содержащим программные средства и средства хранения информации, выход которого связан со входами электронного блока управления акустооптическим перестраиваемым фильтром, и электронным блоком управления перестраиваемого анализатора поляризации (патент РФ №2312326 МПК G01N 21/64). Однако к недостаткам данной конструкции можно отнести недостаточно удовлетворительную работу при низком уровне флуоресценции образца. Перестройка данного микроскопа, например, под исследование in-vivo животных, например в шаре виртуальной реальности является и вовсе невозможной.
Для исследования методом двухфотонной микроскопии разработаны коммерческие образцы двухфотонных микроскопов. Такого рода приборы присутствуют в модельном ряду компаний, занимающихся изготовлением оптических микроскопов и комплектующих к ним, например Nikon (A1RMP), Olympus (FV1000MPE), Carl Zeiss (LSM880 NLO). Конструкция и оптическая система таких микроскопов требует применения сложных и, следовательно, дорогостоящих сканирующих и электронных устройств и электронных детекторов излучения с соответствующими преобразователями сигналов, которые необходимы для получения изображения. Кроме того у представленных микроскопов, невысокий показатель детектирования низкого уровня флуоресценции образца.
Стоит отметить, что стоимость представленных микроскопов высока и для работы на них требуется докупка дорогостоящих комплектующих и расходных материалов.
Известен двухфотонный сканирующий микроскоп содержащий платформу для размещения исследуемого образца, выполненную с возможностью перемещения, по крайней мере, в вертикальном и горизонтальном направлениях, источник лазерного излучения для направления излучения через оптико-механический прерыватель, используемый для модуляции и предварительного снижения мощности излучения, падающего на исследуемый образец, и оптический вентиль с полуволновой пластиной к системе ориентировано расположенных под углом к направлению излучения зеркал для последующей передачи излучения через другую полуволновую пластинку и фокусирующую линзу на исследуемый образец для приема отраженного от исследуемого образца излучения приемной частью, включающей в себя детектор, используемый для приема отраженного излучения через фильтр и короткофокусную линзу на входную апертуру оптического волокна, при этом детектор установлен с возможностью изменения своего углового положения по отношению к поверхности платформы для размещения исследуемого образца и связан с монохроматором, имеющим поворотное зеркало для переключения между выходом, связанным с ПЗС-матрицей, используемой для регистрации спектральных зависимостей, и выходом, связанным с фотоэлектронным умножителем, связанным с синхронным детектором, синхронизированным с оптико-механическим прерывателем для регистрации или регистрации световых потоков низкой интенсивности в режиме счета фотонов (патент РФ №2472118, G01J 3/30, G01N 21/64, В82В 3/00, 2013), выбранный в качестве прототипа. К недостаткам можно отнести отсутствие съемных модулей для проведения комплексных исследований in vivo и in vitro, в том числе невозможность перестройки микроскопа под исследование in-vivo в шаре виртуальной реальности. Также у данного микроскопа малая скорость сканирования, невысокое разрешение и недостаточное детектирование сигнала при низком уровне флуоресценции образца.
Задачей заявляемой полезной модели является разработка двухфотонного лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа с улучшенными функциональными и эксплуатационными свойствами для проведения как in vivo, так и in vitro исследований.
Технический результат заявляемой полезной модели - расширение функциональных возможностей при одновременном улучшении эксплуатационных свойств за счет предлагаемой оптической системы в сочетании с конструктивным исполнением микроскопа, причем в конструкции микроскопа предусмотрена многофункциональная несущая П-образная стойка с креплениями для установки на нее блоков и элементов микроскопа, позволяющая модифицировать микроскоп как для проведения in vivo, так и in vitro исследований. Кроме того предлагаемый микроскоп расширяет арсенал технических средств в области флуоресцентной микроскопии.
Для достижения указанного технического результата в двухфотонном сканирующем микроскопе, содержащем источник активирующего лазерного излучения, источник сканирующего лазерного излучения, блок преобразования активирующего лазерного излучения, соединенный с источником активирующего лазерного излучения, блок преобразования сканирующего лазерного излучения, соединенный с источником сканирующего лазерного излучения, дихроичное зеркало для совмещения активирующего и сканирующего лазерного излучения, объектив, поворотное зеркало, причем поворотное зеркало выполнено с возможностью переключения между выходами ПЗС-камеры и бинокуляра, блок фильтрации и детектирования флуоресцентного излучения, блок преобразования активирующего лазерного излучения содержит систему зеркал и гальванометрический сканер оптического пути, управление которым осуществляется с помощью персонального компьютера, а система зеркал содержит дихроичные зеркала на подвижных подставках, блок преобразования сканирующего лазерного излучения содержит систему зеркал и резонансный сканер оптического пути, управление которым осуществляется с помощью персонального компьютера, а система зеркал содержит дихроичные зеркала на подвижных подставках, дихроичное зеркало соединено с поворотным зеркалом с помощью помехозащищенной турели, блок фильтрации и детектирования флуоресцентного излучения содержит полосовой фильтр на входе, систему зеркал, два детектора, а также полосовые фильтры, расположенные перед детекторами, причем детекторы расположены в непосредственной близости от апертуры объектива и выполнены с возможностью подключения к персональному компьютеру, причем предлагаемый микроскоп дополнительно снабжен двумя блоками фиксации объекта исследований, имеющие съемное исполнение и выполненные взаимозаменяемыми в зависимости от типа исследований, причем первый блок фиксации объекта исследований состоит из источника излучения, линзы, рассеивателя, конденсора, предметного столика, на котором располагается объект исследований, и предназначен для проведения in vitro исследований, второй блок фиксации объекта исследований выполнен в виде шара виртуальной реальности и предназначен для проведения in vivo исследований, несущую П-образную стойку, на которой расположены вышеперечисленные блоки и элементы, выполненную с возможностью подсоединения блока фиксации объекта исследований.
Для развития эксплуатационных свойств предлагаемого двухфотонного сканирующего микроскопа:
в качестве источника активирующего лазерного излучения используют фемтосекундный лазер;
в качестве источника сканирующего лазерного излучения используют фемтосекундный лазер;
соединение источника сканирующего лазерного излучения с блоком преобразования сканирующего лазерного излучения выполнено в виде помехозащищенного короба;
соединение источника активирующего лазерного излучения с блоком преобразования активирующего лазерного излучения выполнено в виде помехозащищенного короба;
оптический путь до резонансного сканера в блоке преобразования сканирующего лазерного излучения выполнен с помощью помехозащищенных оптических штанг, закрепленных на антивибрационном столе;
оптический путь до гальванометрического сканера в блоке преобразования активирующего лазерного излучения выполнен с помощью помехозащищенных оптических штанг, закрепленных на антивибрационном столе;
в качестве детектора используют фотоэлектронный умножитель.
На фиг. 1 показана принципиальная схема заявляемого двухфотонного сканирующего микроскопа с блоком фиксации объекта исследования для проведения in vitro исследований;
на фиг. 2 - оптический путь для реализации работы от источника сканирующего лазерного излучения и источника активирующего лазерного излучения до резонансного и гальванометрического сканера;
на фиг. 3 - оптический путь после резонансного и гальванометрического сканеров до детекторов, на фиг. 4 - 3D модель микроскопа;
Конструктивно устройство содержит:
1 - источник света;
2 - линза;
3 - рассеиватель;
5 - конденсор;
6 - объект исследований;
7 - блок фиксации объекта исследования;
8 - объектив;
9 - поворотное зеркало;
10- ПЗС-камера;
11 - фокусирующая линза;
12 - бинокуляр;
13 - источник сканирующего лазерного излучения;
14 - блок преобразования сканирующего лазерного излучения;
15, 16, 20, 21, 23, 25, 26, 29, 32, - зеркало;
17,18 - зеркальный гальванометр;
19 - фокусирующая линза;
22 - дихроичное зеркало;
24 - помехозащищенная турель;
27 - блок фильтрации и детектирования флуоресцентного излучения;
28, 30, 33 - полосовой фильтр;
31, 34 - детектор;
35 - источник активирующего лазерного излучения;
36 - блок преобразования активирующего лазерного излучения;
37 - резонансный сканер;
38 - гальванометрический сканер;
39 - помехозащищенный короб;
40, 41 - оптические штанги;
42 - несущая П-образная стойка.
Полезная модель работает следующим образом. Луч проходящего света начинает свое движение от источника света 1, например лампы. Далее свет улавливается линзой 2 и обретает необходимую плотность с помощью рассеивателя 3. После этого отражается от зеркала 4 и, проходя через конденсор 5, равномерно освещает объект исследований 6, расположенный на предметном столике. Элементы 1-6 функционально могут быть объединены в блок фиксации объекта исследования для проведения in vitro исследований 7. Проходя сквозь объект исследований, луч света попадает в объектив 8. Здесь же происходит интерференция разделенных ранее лучей. Объектив установлен на подставке с возможностью вертикального перемещения. После прохождения указанного оптического пути луч отправляется в зависимости от выбранного положения поворотного зеркала 9 либо на ПЗС-камеру 10, выводящую изображение на монитор, либо через фокусирующую линзу 11 на бинокуляр 12.
Рассмотрим теперь оптический путь от источника сканирующего лазерного излучения 13 до объекта исследований. В качестве источника сканирующего лазерного излучения может быть использован фемтосекундный Ti:Sap лазер с частотой повторения импульсов 100МГц и длительностью 100 фс. Лазер позволяет перестраивать длину волны автоматически в диапазоне от 690 до 1080 нм. Средняя выходная мощность излучения составляет 1,6 Вт. Начиная свой путь от лазера, через специальный помехозащищенный короб, предотвращающий влияние внешней среды на качество передачи луча, луч попадает в блок преобразования сканирующего лазерного излучения 14. По вертикальной оптической штанге, в которой находится зеркало 15, и, отражаясь от него, луч попадает на зеркало 16, которое обеспечивает доставку луча на нужную высоту. Далее луч попадает в резонансный сканер. В качестве резонансного сканера может быть использован сканер фирмы Cambridge Technology модель 6SC08KA012-02Y. Его задача с помощью синхронной работы зеркальных гальванометров 17, 18 и фокусирующей линзы 19 просканировать объект исследований, а так же выполнить модуляцию сигнала и автоматическое снижение мощности падающего на объект исследований излучения. Параметры резонансного сканера контролируют на персональном компьютере (ПК) с помощью контроллера, например Cambridge Technology SC500-VTYS, что позволяет осуществлять более качественное управление сканером. С помощью зеркал 20 и 21 луч попадает на совмещающий элемент - специальное дихроичное зеркало 22, которое пропускает луч, попадающий на него с зеркала 21, и отражает приходящий с зеркала 23. Потом лучи фокусируются в одной плоскости в элементе 24, представляющем собой вертикальную помехозащищенную турель, выполненную с возможностью добавления необходимых фильтров, отсекающих фоновый сигнал, и затем отражаются от зеркала 25, отражающего в диапазоне длин волн 300-920 нм. При выборе режима предварительной визуализации элемент 25 должен пропускать проходящий свет к ПЗС-камере 10 от отражающего зеркала 9. Далее луч, проходя через зеркало 26 и фокусируясь в нужной плоскости с помощью объектива 8, попадает на объект исследований 6, активируя его флуоресценцию в нужной области, и в зависимости от выбранного режима сканирования по траектории, которая с помощью ПК задается к выполнению резонансному сканеру, сканирует весь объект исследований.
Фотоны света захватываются апертурой объектива 8, отражаются зеркалом 26 и попадают в блок фильтрации и детектирования флуоресцентного излучения 27. В виду того, что при регистрации низкого уровня флуоресценции объекта исследований высока вероятность захвата «нежелательного» света, предусмотрено наличие защитных фильтров. Поэтому, далее поток фотонов проходит сквозь полосовой фильтр 28, обрезающий поток и пропускающий излучение с длинами волн 350-690 нм. Далее с помощью делителя потоков - зеркала 29, одна часть лучевого потока, пройдя сквозь полосовой фильтр 30, находящийся перед первым детектором 31, попадает в детектор, после чего флуоресцентное излучение детектируется детектором 31, передается на ПК и обрабатывается с помощью специализированного программного обеспечения. Вторая часть потока, отражаясь от зеркала 32, проходит сквозь аналогичный полосовой фильтр 33, попадает на второй детектор 34, после чего флуоресцентное излучение детектируется детектором 32, далее передается на ПК и обрабатывается с помощью специализированного программного обеспечения. В качестве детектора для получения изображений глубоких слоев ткани образца может быть использован фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), например детекторы фирмы Hamamatsu модель R5900U-20-L16 и Hamamatsu R7600-20, размещенные рядом с задней апертурой объектива. Использование пары детекторов позволяет также задействовать два измерительных канала для детектирования флуоресцентного излучения с разным диапазоном длин волн, что в свою очередь позволяет использовать два красителя при проведении биологических исследований. Детекторы для лучшей регистрации низкой интенсивности флуоресценции работают в режиме счета фотонов.
Лазерный луч поочередно направляется в каждую точку образца при этом программное обеспечение записывает интенсивность флуоресценции излучаемых образцом и соотносит ее с координатами точки, из которой она была получена. После сканирования всех точек в поле зрения, изображение записывается в память компьютера и реконструируется на экране. Анализ полученных данных, их запись, и обратная связь с микроскопом осуществляют с помощью разработанного заявителем программного обеспечения в среде программирования MatLab.
Оптический путь лазерного луча от источника активирующего лазерного излучения 35 до зеркала 22, аналогичен пути, от источника сканирующего лазерного излучения до элемента 22, с той лишь разницей, что применяют гальванометрический сканер, например фирмы Cambridge Technology, модель 6215НМ40, в составе блока преобразования активирующего лазерного излучения 36.
Оптический путь для реализации работы от источника сканирующего лазерного излучения 13 и источника активирующего лазерного излучения 35 до резонансного сканера 37 и гальванометрического сканера 38, показан на фиг. 2 и должен соответствовать следующим требованиям:
A) часть оптического пути, от источника сканирующего лазерного излучения 13 и источника активирующего лазерного излучения 35 до зеркал 15 выполняют из специального помехозащищенного короба 39, предотвращающего влияние внешней среды на качество передачи луча от лазеров к первым отражающим зеркалам 15, крепят короб к антивибрационному столу и располагают горизонтально. В качестве отражающих зеркал 15 могут быть использованы, например, зеркала фирмы Cambridge Technology, модель 6M2005S20F025S1.
Б) следующая часть пути выполняется, с помощью специальных оптических штанг 40, удовлетворяющих требованиям помехозащищенности. Крепление данной штанги осуществляется к антивибрационному столу, расположение ее вертикальное, путь луча должен доходить до второго отражающего зеркала 16. В качестве отражающих зеркал 16 могут быть использованы, например, зеркала фирмы Cambridge Technology, модель 6M2005S20F025S1.
B) часть пути от отражающих зеркал 16 до сканеров 37 и 38 выполняется в виде горизонтальной оптической штанги 41 с вертикальными креплениями к антивибрационному столу.
Дополнительное требование, помимо помехозащищенности, связано с точностью доставки луча к входам в сканеры. Зеркала 16 выполнены с возможностью изменения траектории лазерного луча не только на определенный угол, но также и в определенную точку пространства, благодаря подвижной в латеральной плоскости подставке (не показана на фиг. 2).
Оптический путь после резонансного и гальванометрического сканеров показан на фиг. 3 и состоит из следующих элементов:
А) от резонансного сканера 37 оптический луч попадает на дихроичное зеркало 22, например фирмы Semrock, модель FF593-Di03-25×36, которое пропускает луч с резонансного сканера без отражения. Проходя сквозь него луч, попадает на зеркало 25, например фирмы Optosigma, модель TFG-25.4C05-10, предназначенная для работы с широкополосными фемтосекундными импульсами, и с помощью него, фокусируется объективом 8 и попадает на объект исследований 6;
Б) от гальванометрического сканера 38 оптический луч попадает сначала на зеркало 23, далее на дихроичное зеркало 22, которое отражает луч с гальванометрического сканера. Далее луч попадает на зеркало 25. После прохождения объектива лазерный луч попадает на объект исследований, где при поглощении вызывает флуоресценцию;
В) конструкция оптического пути между элементами 22 и 25 должна обеспечивать фокусировку векторов лучей от сканеров в одной точке. Требования, предъявляемые к транспортировке луча, остаются такими же, как в предыдущих пунктах и должны обеспечивать помехозащищенность сигнала.
Г) Часть флуоресцентного излучения попадает обратно в объектив 8, после которого направляется зеркалом 26 на полосной фильтр 28, например фирмы Semrock, модель FF01-720/SP-25, которым выделяется полезный сигнал. Далее спектр разделяется на два потока путем прохождения через специальное зеркало 29, которое отражает одну часть фотонов и пропускает другую. Проходящий луч отражается зеркалом 32. Обе части проходят через полосовые фильтры 30 и 33, например фильтры фирмы Semrock, модель FF01-530/55-25, обеспечивающие защиту от нежелательного спектра фотонов, и попадают на детекторы 31 и 34 соответственно. Установку указанных детекторов необходимо осуществить в непосредственной близости от апертуры объектива (до 10 сантиметров), что позволяет детектировать низкий уровень флуоресценции.
Конструктивное исполнение микроскопа предполагает введение дополнительно двух блоков фиксации объекта исследований. Блоки имеют съемное исполнение и выполнены взаимозаменяемыми в зависимости от типа исследований на несущей П-образной стойке 42, причем первый блок фиксации объекта исследований предназначен для проведения in vitro исследований, второй блок фиксации объекта исследований предназначен для проведения in vivo исследований.
Первый блок фиксации объекта исследований состоит из источника излучения, линзы, рассеивателя, конденсора, предметного столика, на котором располагается объект исследований.
Второй блок фиксации объекта исследований выполнен, в зависимости от конструктивного исполнения либо в виде шара виртуальной реальности, либо, например, в виде расположенной на воздушной подушке цилиндрической платформы с боковыми стенками.
Блоки размещены на несущей П-образной стойке, которая позволяет с одной стороны соблюсти требования к жесткости конструкции, а с другой обеспечить ее минимально возможный вес.
В таблице 1 приведены данные сравнения характеристик разработанной установки с аналогами.
Из таблицы 1 видно, что разработанная установка при высокой скорости сканирования и широком детектируемом диапазоне длин волн, по сравнению с аналогами, позволяет проводить in vivo и in vitro эксперименты, благодаря наличию взаимозаменяемых сменных модулей в конструкции микроскопа. Пример выполнения показывает, что возможна реализация микроскопа на более высоком техническом уровне с улучшенными эксплуатационными характеристиками.