СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОФОРМ РЕЦЕПТОРОВ И ЛИГАНДОВ

1. Полипептид, содержащий изоформу рецепторной тирозинкиназы (RTK), функционально связанную прямо или опосредованно через полипептидный линкер с гетерологичной последовательностью-предшественником или ее достаточной частью для выполнения секреции, процессинга и/или направленной миграции этого связанного с RTK интронного слитого белка.
2. Полипептид по п.1, где изоформа RTK содержит эндогенную сигнальную последовательность.
3. Полипептид по п.1, где изоформа RTK не содержит эндогенной сигнальной последовательности.
4. Полипептид по любому из пп.1-3, где последовательность-предшественник выбрана из пре/пропоследовательности тканевого активатора плазминогена (tPA) или ее достаточной части для выполнения секреции и ее аллельных и видовых вариантов.
5. Полипептид по п.4, где пре/пропоследовательность tPA является пре/пропоследовательностью tPA млекопитающего.
6. Полипептид по п.4, где пре/пропоследовательность tPA содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO:2, или ее аллельные варианты или варианты, которые имеют по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности, где tPA-часть выполняет секрецию, процессинг и/или направленную миграцию связанной с RTK изоформы.
7. Полипептид по любому из пп.1-3, где изоформа RTK выбрана из слитого белка VEGFR, FGFR, PDGFR, MET, EPH, TIE, DDR и HER.
8. Полипептид по п.1, где изоформа RTK выбрана из DDR1, EphA1, EphA2, EphA8, EphB1, EphB4, EGFR, HER-2 (ErbB2), ЕrbВ3, FGFR-1, FGFR-2, FGFR-4, MET, RON, CSF1R, KIT, PDGFR-A, PDGFR-B, ТЕК, Tie-1, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 и их аллельных вариантов или вариантов, которые имеют по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с любой из этих изоформ RTK, где эти варианты имеют по меньшей мере одну активность соответствующей изоформы RTK.
9. Полипептид по п.8, где изоформа RTK содержит последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID NO: 140, 142, 143, 145, 147, 149, 150, 152, 153, 155, 157, 159, 161-168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 181, 183, 185, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229-231, 233, 245, 247-251, 253, 255, 257, 259, 261, 263-270, 274-280, 282, 284, 286, 288, 289-303, или ее активную часть.
10. Полипептид по любому из пп.1-3, где изоформа RTK функционально связана через линкер с последовательностью-предшественником tPA или ее достаточной частью для выполнения секреции.
11. Полипептид по п.10, где линкером является линкер рестрикционного фермента, который кодируется последовательностью нуклеотидов, узнаваемой одним или несколькими рестрикционными ферментами (рестриктазами).
12. Полипептид по п.11, где линкер рестрикционного фермента присоединен между изоформой и пре/пропоследовательностыо tPA или ее достаточной частью для выполнения секреции.
13. Полипептид по любому из пп.1-3, необязательно содержащий метку, которая облегчает очистку и/или детектирование полипептида.
14. Полипептид по п.13, где метка связана между линкером рестрикционного фермента и последовательностью-предшественником tPA или ее достаточной частью для выполнения секреции.
15. Полипептид по п.14, где этой меткой является метка туе.
16. Полипептид по п.15, где изоформа RTK выбрана из VEGFR-1, FGFR-2, FGFR-4, ТЕК, RON, MET и их аллельных вариантов или вариантов, которые имеют по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с любой из этих изоформ RTK, где варианты имеют по меньшей мере одну активность соответствующей изоформы RTK.
17. Полипептид по любому из пп.1-3, содержащий последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID NO: 32, 34, 36, 40, 42, 46 и 48.
18. Полипептид по п.13, где конструкция содержит линкер рестрикционного фермента и метка расположена между линкером рестрикционного фермента и изоформой.
19. Полипептид по п.13, где меткой является метка поли-His.
20. Полипептид по любому из пп.1-3, где изоформой RTK является HER-2 или его аллельный вариант.
21. Полипептид по п.1, содержащий последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NО:38.
22. Полипептид, содержащий изоформу рецептора конечных продуктов усиленного гликозилирования (RAGE), функционально связанную прямо или опосредованно через полипептидный линкер с гетерологичной последовательностью-предшественником или ее достаточной частью для выполнения секреции и/или направленной миграции изоформы RAGE.
23. Полипептид по п.22, где изоформа RAGE содержит эндогенную сигнальную последовательность.
24. Полипептид по п.22, где белок изоформы RAGE не содержит эндогенной сигнальной последовательности.
25. Полипептид по любому из пп.22-24, где последовательность-предшественник является пре/пропоследовательностью тканевого активатора плазминогена (tPA) или ее достаточной частью для выполнения секреции или ее аллельными вариантами или ее вариантами, которые имеют по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с последовательностью-предшественником, для выполнения секреции, и/или процессинга, или направленной миграции изоформы RAGE.
26. Полипептид по п.25, где пре/пропоследовательность tPA является пре/пропоследовательностью tPA млекопитающего.
27. Полипептид по п.25, где пре/пропоследовательность tPA содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NО:2, или ее аллельные варианты.
28. Полипептид по любому из пп.22-24, где изоформа RAGE содержит последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID NО: 235, 237, 239, 241, 243, или ее активную часть или ее вариант, который имеет по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с ней.
29. Полипептид по любому из пп.22-24, где изоформа RAGE функционально связана линкером с пре/пропоследовательностью tPA или ее достаточной частью для выполнения секреции.
30. Полипептид по п.29, где линкером является линкер рестрикционного фермента, который кодируется последовательностью нуклеотидов, узнаваемой одним или несколькими рестрикционными ферментами.
31. Полипептид по п.30, где линкер рестрикционного фермента присоединен между изоформой RAGE или ее активной частью и пре/пропоследовательностью tPA или ее достаточной частью для выполнения секреции.
32. Полипептид по любому из пп.22-24, необязательно содержащий метку, которая облегчает очистку и/или детектирование полипептида.
33. Полипептид по п.32, где полипептид содержит линкер рестрикционного фермента и метка связана между линкером рестрикционного фермента и пре/пропоследовательностью tPA или ее достаточной частью для выполнения секреции.
34. Полипептид по п.33, где этой меткой является метка туе.
35. Полипептид по п.22, содержащий последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 44.
36. Полипептид, содержащий изоформу рецептора фактора некроза опухолей (TNFR), функционально связанную прямо или опосредованно через линкер с гетерологичной последовательностью-предшественником или ее достаточной частью для выполнения секреции, процессинга и/или направленной миграции изоформы TNFR.
37. Полипептид по п.36, где изоформа TNFR содержит эндогенную сигнальную последовательность.
38. Полипептид по п.36, где изоформа TNFR не содержит эндогенной сигнальной последовательности.
39. Полипептид по любому из пп.36-38, где последовательность-предшественник является пре/пропоследовательностью тканевого активатора плазминогена (tPA) или ее достаточной частью для выполнения секреции или ее аллельными вариантами или ее вариантами, которые имеют по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с ней.
40. Полипептид по п.39, где пре/пропоследовательность tPA является пре/пропоследовательностью tPA млекопитающего.
41. Полипептид по п.39, где пре/пропоследовательность tPA содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID N0:2.
42. Полипептид по любому из пп.36-38, где изоформой TNFR является изоформа TNFR1 или TNFR2.
43. Полипептид по п.42, где изоформой TNFR является изоформа TNFR2.
44. Полипептид по п.43, где изоформа TNFR содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO:272, или ее активную часть или ее вариант, который имеет по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с ней.
45. Полипептид по любому из пп.36-38, где изоформа TNFR функционально связана линкером с пре/пропоследовательностью tPA или с ее достаточной частью для выполнения секреции, процессинга и/или направленной миграции.
46. Полипептид по п.45, где линкер является линкером рестрикционного фермента, который кодируется последовательностью нуклеотидов, узнаваемой одним или несколькими рестрикционными ферментами.
47. Полипептид по п.46, где линкер рестрикционного фермента присоединен между изоформой или ее активной частью и пре/пропоследовательностью tPA или ее достаточной частью для выполнения секреции.
48. Полипептид по любому из пп.36-38, необязательно содержащий метку, которая облегчает очистку и/или детектирование полипептида.
49. Полипептид по п.48, где полипептид содержит линкер рестрикционного фермента и метка связана между линкером рестрикционного фермента и последовательностью-предшественником tPA или ее достаточной частью для выполнения секреции.
50. Полипептид по любому из пп.36-38, где меткой является метка myc.
51. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид по любому из пп.1-50.
52. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, представленную в любой из SEQ ID NO: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 и 47.
53. Вектор, содержащий молекулу по п.51 и п.52.
54. Вектор по п.53, который является экспрессирующим вектором млекопитающего.
55. Вектор по п.54, который выбран из вектора рС1 и вектора pcDNA3.1.
56. Вектор по п.53, который выбран из аденовирусного вектора, вектора на основе аденоассоциированного вируса, EBV, SV40, цитомегаловирусного вектора, вектора на основе вируса коровьей оспы, герпесвирусного вектора, ретровирусного вектора, лентивирусного вектора или искусственной хромосомы.
57. Вектор по любому из пп.53-56, который является эписомным или который интегрируется в хромосому клетки, в которую его вводят.
58. Клетка, содержащая вектор по любому из пп.53-57.
59. Клетка по п.58, которая является клеткой млекопитающего.
60. Клетка по п.59, где клетка млекопитающего выбрана из клетки мыши, крысы, человека, обезьяны, курицы и хомячка.
61. Клетка по любому из пп.59 или 60, где клетка выбрана из линий клеток СНО, Balb/3Т3, HeLa, MT2, линий мышиных клеток NSO и других линий миеломных клеток, гибридомных и гетерогибридомных линий клеток, лимфоцитов, фибробластов, клеток Sp2/0, COS, NIH3T3, НЕК293, 293Т, 293S, 2 В8 и НКВ и клетки EBNA-1.
62. Способ получения изоформы CSR или изоформы лиганда, предусматривающий культивирование клетки по любому из пп.58-61, посредством которого эта изоформа секретируется.
63. Способ по п.62, дополнительно предусматривающий очистку секретированной изоформы из клеточной культуры.
64. Способ по п.63, в котором
изоформа содержит эпитопную метку для облегчения очистки и эпитопная метка экспрессируется на белке.
65. Способ по любому из пп.63 и 64, где очищенный белок обрабатывают экзопротеазой.
66. Способ по п.65, где экзопротеаза является плазминподобной протеазой.
67. Способ получения изоформы CSR или изоформы лиганда, предусматривающий введение конструкции ДНК, кодирующей изоформу и сигнальную последовательность, посредством чего изоформа секретируется из клетки.
68. Способ по п.67, где клетка является клеткой млекопитающего.
69. Способ по п.68, где клетка млекопитающего выбрана из клетки мыши, крысы, человека, обезьяны, курицы и хомячка.
70. Способ по любому из пп.68 и 69, где клетка выбрана из линий клеток СНО, Balb/3Т3, HeLa, MT2, линий мышиных клеток NSO и других линий миеломных клеток, гибридомных и гетерогибридомных линий клеток, лимфоцитов, фибробластов, клеток Sp2/0, COS, NIH3T3, НЕК293, 293Т, 293S, 2 В8 и НКВ и клетки EBNA-1.
71. Способ по любому из пп.67-69, где молекула нуклеиновой кислоты является конструкцией ДНК по п.51 или 52.
72. Способ по любому из пп.67-69, где молекулу нуклеиновой кислоты вводят в клетку способом, выбранным из трансфекции, электропорации и ядерной микроинъекции.
73. Способ по любому из пп.67-69, где молекулу нуклеиновой кислоты вводят в клетку с использованием фосфата кальция, катионного липидного реагента или поликатиона.
74. Способ по п.73, где катионный липидный реагент выбран из: 1:1 (м/м) готовой формы катионного липида хлорида N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTMA) и диолеилфосфатидилэтаноламина (DOPE); 3:1 (м/м) готовой формы поликатионного липида 2,3-диолеилокси-N-[2-(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминийтрифторацетата (DOSPA) и диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE) и других композиций, содержащих один или несколько из DOTMA, DOSPA и DOPE.
75. Способ по любому из пп.67-69, дополнительно предусматривающий очистку секретированной изоформы из культуры клеток.
76. Способ по п.75, где очистка изоформы облегчается использованием эпитопной метки, экспрессируемой белком.
77. Способ по п.75, где очищенный белок обрабатывают экзопротеазой.
78. Способ по п.77, где экзопротеаза является плазминподобным белком.
79. Полипептид, содержащий изоформу рецептора клеточной поверхности (CSR) или лиганда, где
полипептид лишен эндогенной последовательности-предшественника; и
полипептид содержит одну или несколько аминокислот на его N-конце.
80. Полипептид по п.79, где эндогенная последовательность-предшественник содержит сигнальную последовательность.
81. Полипептид по п.79, где эндогенная последовательность-предшественник содержит сигнальную последовательность и одну дополнительную аминокислоту.
82. Полипептид по любому из пп.79-81, где изоформа CSR является изоформой, выбранной из изоформы RTK, TNFR и RAGE.
83. Полипептид по любому из пп.79-81, где изоформа лиганда является изоформой HGF.
84. Полипептид по любому из пп.79-81, содержащий всю или часть последовательности аминокислот, представленной в любой из SEQ ID NO: 140, 142, 143, 145, 147, 149, 150, 152, 153, 155, 157, 159, 161-168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 181, 183, 185, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229-231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247-251, 253, 255, 257, 259, 261, 263-270, 272, 274-280, 282, 284, 286, 288, 289-303, 350, 352 и 354, ее аллельных или видовых вариантов и ее вариантов, которые имеют по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с ней и имеют по меньшей мере одну активность соответствующего полипептида, представленного в любой из SEQ ID NO: 140, 142, 143, 145, 147, 149, 150, 152, 153, 155, 157, 159, 161-168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 181, 183, 185, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229-231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247-251, 253, 255, 257, 259, 261, 263-270, 272, 274-280, 282, 284, 286, 288, 289-303, 350, 352 и 354.
85. Полипептид по любому из пп.79-81, где одна или несколько дополнительных аминокислот на N-конце являются одной или несколькими линкерными последовательностями рестрикционных ферментов или частью пропоследовательности tPA или эпитопной меткой, где линкер рестрикционного фермента кодируется последовательностью нуклеотидов, узнаваемой одним или несколькими рестрикционными ферментами.
86. Полипептид по любому из пп.79-81, где одна или несколько дополнительных аминокислот на N-конце являются GAR, SR или LE.
87. Полипептид по любому из пп.79-81, где одна или несколько дополнительных аминокислот на N-конце являются GARSR или GARLE.
88. Полипептид по любому из пп.1, 22, 36 и 79, содержащий домен мультимеризации.
89. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-50 и 79-88.
90. Способ лечения заболевания или состояния, предусматривающий введение субъекту фармацевтической композиции по п.89, где заболевание или состояние опосредовано когнатным CSR или лигандом.
91. Способ по п.90, где заболевание или состояние является воспалительным заболеванием, раком, опосредованным ангиогенезом заболеванием или гиперпролиферативным заболеванием.
92. Способ по п.91, где заболевание или состояние выбрано из глазного заболевания, атеросклероза, диабета, ревматоидного артрита, гемангиомы, заживления ран, болезни Альцгеймера, болезни Кройтцфельдта-Якоба, болезни Гентингтона, заболевания, связанного с пролиферацией гладких мышц, рассеянного склероза, сердечно-сосудистого заболевания и болезни почек.
93. Способ по п.91, где рак выбран из карциномы, лимфомы, бластомы, саркомы, лейкоза, лимфоидных злокачественных новообразований, плоскоклеточного рака, рака легких, включающего мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого, рака брюшины, печеночно-клеточного рака, желудочного рака или рака желудка, включающего рак желудочно-кишечного тракта, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака яичника, рака печени, рака мочевого пузыря, гепатомы, рака молочной железы, рака ободочной кишки, ректального рака, колоректального рака, эндометриального рака или рака матки, рака слюнных желез, рака почки или ренального рака, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы, карциномы печени, анальной карциномы, карциномы полового члена и рака головы и шеи.
94. Полипептид, содержащий изоформу фактора роста гепатоцитов (HGF), функционально связанную прямо или опосредованно с гетерологичной последовательностью-предшественником или ее достаточной частью для выполнения секреции и/или направленной миграции изоформы HGF.
95. Полипептид по п.94, где изоформа HGF содержит эндогенную сигнальную последовательность.
96. Полипептид по п.94, где изоформа HGF не содержит эндогенной сигнальной последовательности.
97. Полипептид по любому из пп.94-95, где последовательность-предшественник является пре/пропоследовательностью тканевого активатора плазминогена (tPA) или ее достаточной частью для выполнения секреции или ее аллельными вариантами или ее вариантами, которые имеют по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности, где варианты выполняют секрецию, процессинг и/или направленную миграцию связанной изоформы.
98. Полипептид по п.97, где пре/пропоследовательность tPA является пре/пропоследовательностью tPA млекопитающего.
99. Полипептид по п.97, где пре/пропоследовательность tPA содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO:2, или ее аллельные варианты.
100. Полипептид по любому из пп.94-96, где изоформа HGF содержит последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID NO:350, 352 и 354, или ее активную часть.
101. Полипептид по любому из пп.94-96, где изоформа HGF функционально связана линкером с пре/пропоследовательностью tPA или ее достаточной частью для выполнения секреции, процессинга и/или направленной миграции связанной изоформы.
102. Полипептид по п.101, где линкер является линкером рестикционного фермента, который кодируется последовательностью нуклеотидов, узнаваемой одним или несколькими рестрикционными ферментами.
103. Полипептид по п.102, где линкер рестрикционного фермента присоединен между изоформой или ее активной частью и пре/пропоследовательностью tPA или ее достаточной частью для выполнения секреции.
104. Полипептид по любому из пп.94-96, необязательно содержащий метку, которая облегчает очистку и/или детектирование полипептида.
105. Полипептид по п.104, где
полипептид содержит линкер рестрикционного фермента, где линкер является линкером рестрикционного фермента, который кодируется последовательностью нуклеотидов, которые узнаются одним или несколькими рестрикционными ферментами; и
метка связана между линкером рестрикционного фермента и последовательностью-предшественником tPA или ее достаточной частью для выполнения секреции.
106. Полипептид по любому из пп.94-96, где метка является меткой myc.
107. Полипептид по любому из пп.1, 22, 36, 79 и 94, где изоформа является интронным слитым белком.
108. Способ по любому из пп.62-64, 67-69, где изоформа является интронным слитым белком.
109. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.51 или 52 или вектор по любому из пп.53-57 или клетку по любому из пп.58-61, где заболевание или состояние опосредовано CSR или его лигандом.
110. Способ лечения заболевания или состояния, предусматривающий: введение субъекту фармацевтической композиции по п.109, где заболевание или состояние опосредовано когнатным CSR или лигандом.
111. Способ по п.110, где заболевание или состояние является воспалительным заболеванием, раком, опосредованным ангиогенезом заболеванием или гиперпролиферативным заболеванием.
112. Способ по п.110, где заболевание или состояние выбрано из глазного заболевания, атеросклероза, диабета, ревматоидного артрита, гемангиомы, заживления ран, болезни Альцгеймера, болезни Кройтцфельдта-Якоба, болезни Гентингтона, заболевания, связанного с пролиферацией гладких мышц, рассеянного склероза, сердечно-сосудистого заболевания и болезни почек.
113. Способ по п.112, где рак выбран из карциномы, лимфомы, бластомы, саркомы, лейкоза, лимфоидных злокачественных новообразований, плоскоклеточного рака, рака легких, включающего мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легкого и плоско клеточную карциному легкого, рака брюшины, печеночно-клеточного рака, желудочного рака или рака желудка, включающего рак желудочно-кишечного тракта, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака яичника, рака печени, рака мочевого пузыря, гепатомы, рака молочной железы, рака ободочной кишки, ректального рака, колоректального рака, эндометриального рака или рака матки, рака слюнных желез, рака почки или ренального рака, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы, карциномы печени, анальной карциномы, карциномы полового члена и рака головы и шеи.
114. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.51 или 52, или вектора по любому из пп.53-57, или клетки по любому из пп.58-61 для лечения заболевания или состояния, опосредованного CSR или его лигандом.
115. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.51 или 52, или вектора по любому из пп.53-57, или клетки по любому из пп.58-61 для приготовления лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, опосредованного CSR или его лигандом.
116. Применение по п.114 или 115, где заболевание или состояние является воспалительным заболеванием, раком, опосредованным ангиогенезом заболеванием или гиперпролиферативным заболеванием.