ПРОИЗВОДСТВО 2S-БЕЛКА КАНОЛЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИОННОГО ОБМЕНА
PRODUCING 2S CANOLA PROTEIN USING ION EXCHANGE

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение обеспечивает способ производства 28-белка канолы в чистом, в основном, виде, включающий применение ионообменной хроматографии.
Предшествующий уровень техники
Изоляты белка канолы, имеющие содержание белка, по меньшей мере, 100% масс. (N×6,25) в пересчете на сухую массу (d.b.), можно получить из муки из масличных семян канолы способом, описанным в совместно рассматриваемых патентных заявках США №10/137391 с датой подачи 3 мая 2002 г. (публикация патентной заявки США №20030125526 A1) и №10/476230 с датой подачи 9 июня 2004 г. (публикация патентной заявки США №20040254353 A1) и в соответствующей РСТ публикации № WO 02/089597, правопреемником по которым является автор настоящей заявки и которые включены в перечень ссылок к настоящей заявке. Способ представляет собой многостадийный процесс, включающий экстракцию муки из масличных семян канолы солевым раствором; отделение образовавшегося водного белкового раствора от остаточной муки из масличных семян; повышение концентрации белка водного раствора, по меньшей мере, примерно до 200 г/л при одновременном поддержании ионной силы раствора, в основном, постоянной с применением селективной мембранной техники; разбавление полученного концентрированного белкового раствора в охлажденной воде для инициирования образования белковых мицелл; осаждение белковых мицелл отстаиванием с получением аморфной, клейкой, студнеобразной, подобной клейковине, белковой мицеллярной массы (РММ) и извлечение из супернатанта белковой мицеллярной массы, имеющей содержание белка, по меньшей мере, около 100% масс. при определении методом Кьельдаля (N×6,25). В контексте описания содержание белка определяется в пересчете на сухую массу. Извлеченная РММ может подвергаться сушке.
В одном варианте осуществления вышеописанного способа супернатант от стадии отстаивания РММ подвергается обработке с целью получения белкового изолята, содержащего высушенный белок влажной РММ и супернатанта. Эта процедура может проводиться путем предварительного концентрирования супернатанта с использованием ультрафильтрационных мембран, смешивания концентрированного супернатанта с влажной РММ и сушки смеси. Полученный изолят белка канолы имеет высокую степень чистоты, по меньшей мере, примерно 90% масс. белка (N×6,25), предпочтительно, по меньшей мере, примерно 100% масс. белка (N×6,25).
В другом варианте вышеописанного способа супернатант от стадии отстаивания РММ подвергается обработке с целью извлечения белка из супернатанта. Эта процедура может осуществляться путем предварительного концентрирования супернатанта с использованием ультрафильтрационных мембран и сушки концентрата. Полученный изолят белка канолы имеет высокую степень чистоты, по меньшей мере, примерно 90% масс. белка (N×6,25), предпочтительно, по меньшей мере, примерно 100% масс. белка (N×6,25).
Способы, описанные в вышеупомянутых патентных заявках США, являются, по существу, периодическими способами. В совместно рассматриваемой патентной заявке США №10/298678 с датой подачи 19 ноября 2002 г. (публикация патентной заявки США №20040039174 А1) и в соответствующей опубликованной Международной заявке № WO 03/043439, правопреемником по которым является автор настоящей заявки и которая включена в перечень ссылок к настоящей заявке, описан непрерывный способ производства изолятов белка канолы. В соответствии с этим способом, мука из масличных семян канолы непрерывно смешивается с солевым раствором; смесь транспортируется по трубопроводу с одновременным экстрагированием белка из муки из масличных семян канолы с образованием водного белкового раствора; водный белковый раствор непрерывно отделяется от остаточной муки из масличных семян канолы; водный белковый раствор непрерывно пропускается через селективную мембрану с целью повышения содержания белка водного белкового раствора, по меньшей мере, примерно до 200 г/л при одновременном поддержании ионной силы раствора, в основном, постоянной; полученный концентрированный белковый раствор непрерывно смешивается с охлажденной водой с тем, чтобы инициировать образование белковых мицелл, и белковые мицеллы непрерывно осаждаются отстаиванием, в то время как супернатант непрерывно сливается до тех пор, пока в резервуаре-отстойнике не накопится требуемое количество РММ. РММ отводится из резервуара-отстойника и может подвергаться сушке. РММ имеет содержание белка, по меньшей мере, примерно 90% масс. при определении азота по Кьельдалю (N×6,25), предпочтительно, по меньшей мере, примерно 100% масс. (N×6,25).
Как описано в вышеупомянутых патентных заявках США №№10/137391 и 10/471230, слитый с осадка супернатант можно подвергнуть обработке с целью извлечения из него изолята белка канолы.
Известно, что семена канолы содержат примерно от 10% до 30% масс. белков, и несколько различных белковых компонентов канолы уже идентифицированы. Эти белки различаются разными коэффициентами седиментации (S). Эти известные и идентифицированные белки включают глобулин 12S, известный как круциферин, глобулин 7S и альбумин 2S, известный как напин.
Канола известна также как рапс или как масличный рапс.
В совместно рассматриваемых патентных заявках США №10/413371 с датой подачи 25 августа 2003 г. (публикация патентной заявки США №20040034204) и №10/510766 с датой подачи 15 апреля 2003 г., а также в соответствующей опубликованной Международной заявке № WO 03/08876, правопреемником по которым является автор настоящей заявки и которые включены в перечень ссылок к настоящей заявке, описан состав изолята белка канолы, полученного из РММ, и изолята белка канолы, выделенного из супернатанта. Изолят белка канолы, выделенный из супернатанта, содержит преимущественно белок 2S, наряду с меньшими количествами белка 7S и следовым количеством белка 12S. Белок 2S представляет собой низкомолекулярный альбумин. Продукт из РММ содержит преимущественно белок 7S, наряду с присутствующими в относительно малых количествах белками 2S и 12S. Белки 7S и 12S представляют собой глобулины с более высокой молекулярной массой, причем молекула белка 7S составляет половину молекулы белка 12S.
Как описывается в вышеупомянутых заявках, изолят белка канолы, выделенный из супернатанта, имеет белковый профиль, который включает:
примерно от 60% до 95% масс. белка 2S,
примерно от 5% до 40% масс. белка 7S и
от 0 до примерно 5% масс. белка 12S, предпочтительно
примерно от 70% до 95% масс. белка 2S,
примерно от 5% до 30% масс. белка 7S и
от 0 до примерно 2% масс. белка 12S.
Изолят белка канолы, полученный из РММ, имеет белковый профиль, который включает;
примерно от 60% до 98% масс. белка 7S,
примерно от 1% до 15% масс. белка 12S и
от 0 до примерно 25% масс. белка 2S, предпочтительно
примерно от 88% до 98% масс. белка 7S,
примерно от 1% до 10% масс. белка 12S и
от 0 до примерно 6% масс. белка 2S.
Установлено, что выделенный из супернатанта изолят белка канолы, состоящий преимущественно из белка 2S, показывает в некоторых случаях применения функциональные свойства, превосходящие функциональные свойства выделенного из РММ изолята белка канолы, состоящего, главным образом, из белка 7S. В способах, описанных в вышеупомянутых заявках, для получения изолята белка канолы из супернатанта необходимо пройти через стадии образования РММ и обеспечения супернатанта, т.е., по сути, через фракционирование белков канолы.
В патентной заявке США №11/038086 с датой подачи 21 июля 2005 г. (публикация патентной заявки США №US 2005-0181112 A1), правопреемником по которой является автор настоящей заявки и которая включена в перечень ссылок к настоящей заявке (WO 2005/067729), описывается способ, в котором супернатант от осаждения РММ перед или после мембранной обработки подвергается тепловой обработке с целью осаждения белка 7S и получения белкового раствора, обогащенного белком 2S. Оставшийся раствор может подвергаться распылительной сушке для получения белка 2S в сухом виде.
Белок 2S, содержащий минимальные относительные доли белков 7S и 12S, обладает лучшей растворимостью, чем необработанный белок 2S (в том числе и при кислотных значениях pH), и способен обеспечивать улучшенную прозрачность водных растворов и безалкогольных напитков и напитков для спортсменов, давая прозрачные обогащенные белком напитки.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение использует альтернативный способ, включающий ионный обмен для получения, в основном, чистого 2S-белка канолы, не содержащего, в основном, 7S- и 12S-белков канолы.
В ионообменной хроматографии заряженная ионообменная среда используется для связывания противоположно заряженных молекул, в то время как равно заряженные и незаряженные материалы этой средой не задерживаются. Это делает ионообменную хроматографию полезным инструментом для очистки заряженных молекул, таких как белки. Два основных класса белков канолы имеют совершенно разные изоэлектрические точки. Изоэлектрическая точка глобулинов 7S/12S лежит в диапазоне от 6 до 7, в то время как для альбумина 2S это значение составляет примерно 11. Это различие используется в настоящем изобретении для разделения белков друг от друга ионообменной хроматографией.
Изобретение обеспечивает ионообменный процесс, в котором белок 2S улавливается в результате связывания его с катионообменной средой, в то время как другие белки и примеси вымываются в свободном (несвязанном) виде. Затем белок 2S извлекается из катионообменной среды путем воздействия на катионообменную среду солевого раствора с приемлемо высокой концентрацией соли.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения, обеспечивается способ производства, в основном, чистого 28-белка канолы, включающий солюбилизацию белков канолы из муки из масличных семян канолы с образованием раствора белков канолы; отделение раствора белков канолы от остаточной муки из масличных семян канолы; контактирование раствора белков канолы с катионообменной средой при условиях, при которых с катионообменной средой связывается предпочтительно 25-белок канолы, а не другие белки канолы; отделение связанного 28-белка канолы от несвязанных белков канолы и примесей и выделение связанного 28-белка канолы из катионообменной среды.
Подробное описание изобретения
Как упоминалось выше, ионообменной хроматографии подвергают раствор белков канолы с целью предпочтительного связывания 28-белка канолы с ионообменной средой и последующего извлечения 28-белка канолы в чистом, в основном, виде из ионообменной среды.
Процедура может осуществляться любым удобным образом. В одном предпочтительном аспекте изобретения водный раствор белка канолы контактирует с катионообменной средой при pH примерно от 5 до 6, в котором оба класса белков являются положительно заряженными. Концентрация соли служит для ограничения связывания в меньшей степени положительно заряженных 7S/12S белков канолы, а также примесей, таких как синапин.
Водный раствор белков канолы наиболее удобно получать путем экстракции муки из масличных семян канолы. Экстракция осуществляется водным солевым раствором с требуемой концентрацией соли и при значении pH, эффективном для обеспечения предпочтительного связывания 28-белка с катионообменной средой. В большинстве случаев солевой раствор имеет концентрацию соли примерно от 0.25М до 0,35М NaCl, a pH водного раствора белков канолы составляет примерно от 5 до 6.
Экстракцию муки из масличных семян канолы можно проводить при значениях pH вне требуемого диапазона, а затем установить рН раствора белков канолы в диапазоне pH примерно от 5 до 6 с помощью любой подходящей кислоты или основания, если это потребуется.
Альтернативно, белок может экстрагироваться из муки из масличных семян канолы солевым раствором с более низкой концентрацией соли с последующим добавлением дополнительной соли до требуемой концентрации. Однако предпочтительнее проводить экстракцию солевым раствором с концентрацией соли, требуемой для ионного обмена, поскольку раствор экстракта имеет форму, позволяющую наносить его прямо на катионообменную среду для отделения 2S-белка канолы сразу после получения. При этом остается крайне мало времени для протекания окислительных реакций или связывания фенольных соединений с белком.
Раствор экстракта белков канолы наносится на катионообменную среду, которая может иметь любую удобную форму, например, форму гранул смолы или мембранного адсорбера. В мембранном адсорбере ионообменные группы связаны с микропористыми мембранами. Использование мембран вместо заполненных смолой колонок позволяет применять более высокие скорости потока и за счет этого ускорять процесс.
Контакт раствора экстракта белков канолы с катионообменной средой при соответствующих pH и уровне соли приводит к адсорбции предпочтительно 2S-белка, в отличие от в меньшей степени положительно заряженных 7S/12S белков. После отделения катионообменной среды от раствора экстракта белков канолы 28-белок может извлекаться из катионообменной среды путем приведения ее в контакт с водным солевым раствором, имеющим более высокую концентрацию соли, чем солесодержащий водный раствор белков канолы, например, примерно от 0,55М до 0,70М NaCl.
Элюированный раствор 28-белка имеет высокую концентрацию соли и перед сушкой белка обессоливается любым пригодным для этого способом, таким как диафильтрация. Эта процедура обеспечивает получение высокочистого изолята 28-белка канолы, не содержащего, в основном, 78/128-белков и имеющего содержание белка, по меньшей мере, примерно 100% масс. (N×6,25) в пересчете на сухую массу (d.b.).
7S/12S-белки канолы могут извлекаться из экстракта белков канолы после его контакта с ионообменной средой в неденатурированном виде в отличие от отделения 2S-белка изоэлектрическим осаждением или осаждением нагревом.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1
Настоящий пример иллюстрирует получение, в основном, чистого 2 S-белка канолы с использованием катионообменной колонки.
(а) Экстрагирование белка
Серия 15% (масс./об.) экстракций муки из масличных семян канолы проводилась, как общепринято, с использованием 150 мл солевого раствора/22,5 г муки. Образцы перемешивались в течение 30 минут при комнатной температуре с помощью магнитного стержня. В каждом случае экстракт отделялся от отработанной муки центрифугированием при 10200 g в течение 10 минут, а затем осветлялся путем последовательной фильтрации через бумажный фильтр с размером пор 25 мкм и фильтрующие шприцы с размером пор 0,45 мкм. Содержание белка в осветленном экстракте определялось аналитическим методом LECO (с помощью анализатора для определения азота методом сжигания - LECO FP 528), а белковый профиль - эксклюзионной (основанной на разделении по размеру) хроматографией (SEC) HPLC (жидкостная хроматография высокого разрешения). В различных экспериментах концентрация соли в солевом растворе варьировала от 0,26М до 0.35М NaCl.
Манипулирование концентрацией соли при экстракции оказало некоторое влияние на содержание белка и белковый профиль исходного осветленного экстракта (табл.1 ниже). Повышенная концентрация соли была желательна в рамках выхода белка и экстрагирования 28-белка, но она отрицательно сказалась на разделении белков, что будет видно ниже.
Таблица 1
Анализ экстрактов, полученных при различных уровнях соли
Концентрация NaCl (М)
pH
Концентрация белка (%)
Площадь пика (%) 2S-белка на HPLC-грамме
0,26
5,60
2,62
n.d.*
0,29
5,67
2,71
n.d.*
0,30
5,61
n.d.*
36,9
0,35
5,61
2,82
37,4
n.d.* = не определялась
(б) Хроматография
Образцы подвергались катионообменной (CIEX) хроматографии с использованием колонки с SP Sepharose XL (20 мл), работающей вкупе с системой GradiFrac LPLC (Pharmacia Biotech) с коллектором пиков. При анализе каждой серии образцов 10 мл осветленного экстракта наносились на колонку с помощью пробоотборной петли в системе. При применяемых концентрациях соли солевого раствора 2S-белок связывался с колонкой, в то время как 7S- и 12S-белки канолы и другие примеси проходили через колонку в свободном (несвязанном) виде. Несвязанный материал улавливался, после чего на колонку наносился солевой раствор с более высокой концентрацией соли, чем в экстракте, с целью извлечения связанного 2S-белка. Применяемые концентрации соли регулировались по мере проведения процессов разделения с тем, чтобы достигнуть лучшего разделения белков и гарантировать полное извлечение связанного материала. Применяемая программа анализа образцов GradiFrac показана в нижеследующей табл.2.
Таблица 2
Программа GradiFrac для CIEX-извлечения 2S-белка из экстракта
Объем (мл)
Концентрация NaCl в буфере (М)
Скорость истечения буфера (мл/мин.)
Максимальный объем собранной фракции (мл)
Функция
0
Экстракция
5
0
Уравновешивание колонки
19,9
Экстракция
5
0
20
Клапан для впрыска образца открыт
а) внесение образца
Экстракция
5
25
б) связывание 2S
20
Клапан для впрыска образца закрыт
в) элюирование 7S/12S
50
Экстракция
5
25
г) элюирование примесей
119,9
120
Элюирование
5
25
Элюирование 2S
194,9
Элюирование
5
25
195
1,00
5
0
Очистка колонки
254,9
1,00
5
0
255
Экстракция
5
0
Уравновешивание колонки
335
Экстракция
5
0
Примечание: по мере совершенствования метода имели место некоторые незначительные изменения объемов.
Примечание: как только было установлено, что на этапе элюирования выделен весь 28-белок, очистка колонки 1М раствором NaCl между анализами более не проводилась.
Элюированные фракции от всех процессов разделения в каждый из дней проведения экспериментов объединялись и замораживались при -60°С, за исключением продукта от процессов 20-26, который охлаждался для последующего обессоливания на следующий день. Нижеприведенная табл.3 показывает концентрации соли, применяемые для экстракции и элюирования в различных процессах разделения.
Таблица 3
Концентрации соли, применяемые для экстракции и элюирования 2S-белка в различных процессах разделения
Серия образцов
Концентрация NaCl при экстракции (M)
Концентрация NaCl для элюирования 2S (M)
1
0,30
0,55
2
0,30
0,60
3-8
0,35
0,65
9-13
0,29
0,65
14-26
0,26
0,65
Концентрация соли, применяемая для экстракции/разделения белков и элюирования 2S-белка, тонко корректировалась по мере проведения процессов разделения. В первом процессе разделения применяемые концентрации соли составляли 0,30M/0,55M. Несвязанный материал собирался в виде перекрывающих парных пиков, причем первый пик, как было установлено, содержал почти все 7S/12S-белки, небольшое количество несвязанного 2S-белка и большую часть примесей, присутствующих в экстракте, за исключением части синапина. Второй пик в паре, который был несколько вытянутым и выступал из колонки, содержал, как было установлено, заметное количество синапина и очень незначительные количества белка и других примесей. Элюирование 0,55M раствором NaCl не привело к выделению всего 2S-белка из колонки, поскольку заметный пик 2S-белка был получен в ходе очистки колонки 1M раствором NaCl.
Во втором процессе разделения уровень соли для элюирования был увеличен до 0,60M в целях улучшения высвобождения 2S-белка. На этот раз пик 2S-белка, как было установлено, уменьшился в ходе очистки колонки. В третьем процессе разделения уровень NaCl на стадии элюирования был увеличен до 0,65M, и этот уровень, как было установлено, эффективно устранил пик, ранее заметный в ходе очистки колонки. Начальный уровень соли в третьем процессе разделения был увеличен до 0,35M NaCl в надежде сблизить указанные два свободных пика. Расстояние между парными пиками сократилось, но пара все равно сохранилась. Итак, проведение разделения при таком повышенном уровне соли давало увеличение количества 2S-белка, не связанного с колонкой и обнаруженного в несвязанном материале.
Впоследствии начальный уровень соли снижался до 0,29M, затем до 0,26M, что последовательно приводило к снижению уровня потерь 2S-белка с несвязанным материалом (табл.4 ниже). Возникли опасения, что снижение этого начального уровня соли приведет к связыванию некоторой части 7S/12S белков или синапина с колонкой, что было бы крайне нежелательно, поскольку это усложнило бы стадию элюирования 2S-белка. Однако наблюдения показали, что при 0,26M NaCl единственным белком, связанным с колонкой, был 2S-белок.
Таблица 4
Содержание 2S-белка в общем количестве несвязанного материала в пересчете на концентрацию соли в экстракте
Концентрация NaCl (M)
Площадь пика 2S (расчетная)
0,26
66769
0,29
115540
0,30
n.d.*
0,35
224545
n.d.* = не определялась
(в) Обессоливание элюированного 2S-белка
Замороженные образцы элюированного 2S-белка помещались в холодильник на всю ночь для оттаивания. На следующий день все еще замороженные контейнеры помещались в теплую водяную баню, на которой образцы нагревались до полного расплавления кристаллов льда. Далее, все оттаявшие образцы фильтровались через бумажный фильтр с размером пор 25 мкм и объединялись в один большой образец. Полученный раствор 2S-белка обессоливался путем концентрирования и диафильтрации (DF) на ультрафильтрационной мембранной установке Vivaflow 5000 MWCO Hydrosart. Общий объем собранных 2S-белковых фракций составил около 1500 мл. Объединенный раствор 2S-белка концентрировался до 25-30 мл, и затем к нему добавлялись 300 мл воды для диафильтрации. Образец повторно концентрировался до 25-30 мл и к нему добавлялись следующие 300 мл воды, после чего образец вновь концентрировался. Как можно видеть из результатов, приведенных в нижеследующей табл.5, особенно эффективным оказалось проведение обессоливания в две стадии до примерно 10 объемов диафильтрации.
Таблица 5
Снижение содержания соли диафильтрацией
Образец 2S
Проводимость (мСм)
pH
Концентрация белка (%)
Объединенные GradiFrac фракции
49,6
5,83
0,31
После добавления воды для DF1
5,68
5,28
n.d.*
После добавления воды DF2
0,943
4,92
n.d.*
Полученный ретентат
n.d.*
n.d.*
5,84
n.d.* = не определялись
Полученный ретентат подвергался сублимационной сушке.
(г) Готовый продукт
Оценка цвета готового сухого продукта проводилась с помощью хромаметра Minolta CR-310; был приготовлен, также раствор для оценки цвета продукта во влажном состоянии. Для этого сухой белок (0,5 г) смешивался с водой (10 мл) с помощью вихревой мешалки. Затем образец центрифугировался при 7800 g в течение 10 мин. (преимущественно для удаления воздуха), и содержание белка в супернатанте определялось анализатором LECO. Аликвотное количество (8 мл) супернатанта переносилось в небольшой химический стакан и к нему добавлялось количество воды, достаточное для доведения содержания белка до 5%. После фотографирования образца его аликвотное количество использовалось для анализа белкового профиля (SEC HPLC). Некоторые образцы также разбавлялись водой до 3,5% белка; они также были сфотографированы. Содержание белка в сухом порошке определялось анализатором LECO, но этого количества образца было недостаточно для проведения анализа на влагосодержание. Поэтому содержание белка выражалось только в пересчете на влажную массу.
В настоящем исследовании общее количество готового продукта составило 1,63 г. Содержание белка в порошке в пересчете на влажную массу составило 105,82% масс./масс. (N×6,25). Если выразить это в пересчете на сухую массу, как того требует стандарт, то в этом случае содержание белка будет еще выше. Хроматографический анализ регидратированного продукта показал, что 96,1% площади пика, обнаруженного при 280 нм, относится к 2S-белку, а 3,8% площади пика - к пронапину. Следовательно, 99,9% площади пика составляет изучаемый белок. Белков 7S и 12S не было обнаружено.
Оценки цвета сухого продукта показаны в табл.6.
Таблица 6
Цвет сухого 28-белка, выделенного из экстракта путем катионного обмена
Образец
L*
а*
b*
2S
83,05
-2,61
15,49
Цвет регидратированного водой влажного продукта показал зеленоватый оттенок, и прозрачность раствора была отличной. Это позволяет предположить, что при полном отсутствии 7S/12S-белков прозрачность раствора должна оставаться практически стабильной при большинстве условий.
Выход продукта оказался довольно высоким. Репрезентативный выход довольно трудно было рассчитать, поскольку условия разделения изменялись много раз, и, как известно, имели место потери 2S-белка, в частности, в ходе начальных процессов разделения из-за неполного связывания со смолой, а также неполного элюирования. В заключительных процессах разделения был элюирован весь 2S-белок, но все же оставалось небольшое количество несвязанного с колонкой белка. Как упоминалось выше, снижение начального содержания соли может помочь решить эту проблему при условии, что оно не приведет к связыванию других видов с колонкой. Если принять, что из 260 мл (26×10 мл - впрыски) осветленного экстракта извлекается 1,63 г 28-белка, то путем экстраполяции можно рассчитать, что из 1000 л осветленного экстракта можно получить 6,3 кг 2S-белка.
Пример 2
Настоящий пример иллюстрирует применение катионообменной мембраны для получения, в основном, чистого 2S-белка канолы.
(а) Экстрагирование белка
10% (масс./об.) - экстракции 30 г муки из масличных семян канолы проводились с использованием 300 мл 0,3М NaCl путем объединения муки с солевым раствором и перемешивания образцов в течение 30 минут при комнатной температуре с помощью магнитного стержня. Экстракт отделялся затем от отработанной муки центрифугированием при 10200 g в течение 10 минут, после чего осветлялся путем последовательной фильтрации через бумажный фильтр с размером пор 25 мкм и фильтровальные диски с размером пор 1 мкм и 0,45 мкм. Белковый профиль экстракта определялся методом SEC HPLC.
Концентрация 0,26М NaCl идентифицировалась в примере 1 как наилучший выбор уровня соли для экстракционного раствора. Этот уровень соли сначала был испытан в предварительных экспериментах с мембранным адсорбером (данные не показаны), но, как было установлено, небольшие количества 7S-/12S-белков и некоторое количество синапина оказались связанными с мембраной. Повышение содержания соли в экстракционном растворе до 0,3М NaCl ограничило связывание 7S-/12S-белков. Анализ белкового профиля 0,3М NaCl экстракта показал, что 64,6% площади белковых пиков относились к 7S-/12S-белкам, а 35,4% - к 2S-белку.
(б) Ионный обмен
Ионообменное разделение осуществлялось с помощью двух размещенных последовательно мембранных установок с сильнокислотным катионным адсорбентом Sartobind S75 (Sartorius AG, Геттинген, Германия). Для продвижения различных растворов через мембранные установки использовался перистальтический насос. Схема разделения образцов показана в табл.7.
Таблица 7
Схема разделения образцов для выделения 2S-белка из экстракта с применением катионообменного мембранного адсорбера
Стадия
Раствор
Объем(мл)
Скорость потока (мл/мин)
Уравновешивание
0,3М NaCl
40
20
Загрузка образца
Осветленный экстракт
10
20
Ополаскивание мембраны
0,3М NaCl
50
20
Элюирование 2S-белка
0,67M NaCl
30
20
Примерно 32 процесса разделения были завершены в течение двух дней. В каждый из этих дней элюированные 2S-белковые фракции от всех процессов разделения объединялись и замораживались до последующего обессоливания. Белковые профили несвязанных материалов/смывов и элюированных фракций определялись методом SEC HPLC.
Установлено, что потери 2S-белка с несвязанной фракцией были незначительны (7,7% площади белковых пиков) и объясняются, по всей вероятности, перегрузкой системы. Элюированные фракции почти полностью (99,6% площади белковых пиков) состояли из 2S-белка. В первый день проведения процессов разделения в качестве буфера для элюирования использовался 0,65М NaCl, а в конце дня была проведена очистка мембранных адсорберов с помощью 1M NaCl (40 мл). Анализ (SEC HPLC) полученного с применением 1M NaCl элюата показал присутствие в нем небольшого количества 2S-белка, который не был элюирован 0,65M раствором NaCl. Во второй день в процессах разделения в качестве буфера для элюирования использовался 0,67M NaCl. Очистка мембран 1M раствором NaCl не привела к высвобождению 2S-белка, что указывает на то, что 0,67M NaCl является вполне достаточной концентрацией для извлечения всего связанного 2S-белка.
(в) Обессоливание выделенного 2S-белка
Элюированный 2S-белок обессоливался путем концентрирования и диафильтрации (DF) на ультрафильтрационной мембранной установке Vivaflow 5000 MWCO Hydrosart. Объем всех собранных 2S-белковых фракций составил около 1000 мл. Он концентрировался до 25-30 мл, после чего к нему добавлялись 300 мл воды для диафильтрации. Образец повторно концентрировался до 25-30 мл, и вновь к нему добавлялись следующие 400 мл воды, после чего образец снова повторно концентрировался. Ретентат, полученный после второй стадии диафильтрации, подвергался сублимационной сушке.
Проводимость (электропроводность) различных образцов измерялась кондуктометром. Цель диафильтрации заключалась в снижении проводимости образца до уровня ниже 1 мСм (миллисименс). Для анализа белкового профиля пермеатов применялась SEC HPLC.
Две стадии диафильтрации эффективно снизили проводимость образца 2S-белка (табл.8). В пермеатах от ультрафильтрации или диафильтрации белок не был обнаружен.
Таблица 8
Снижение содержания соли диафильтрацией
Образец 2S-белка
Проводимость (мСм)
Элюат
49,8
После добавления воды для DF1
7,56
После добавления воды для DF2
0,79
Полученный ретентат
n.d.*
n.d.* = не определялась
(г) Готовый продукт
Оценка цвета готового сухого продукта проводилась с помощью хромаметра Minolta CR-310; был приготовлен также раствор для оценки цвета продукта во влажном состоянии. Для этого сухой белок (0,6 г) смешивался с водой (10 мл) с помощью вихревой мешалки. Затем образец центрифугировался при 7800 g в течение 10 мин., и с помощью анализатора LECO определялось содержание белка в супернатанте. Аликвотное количество (8 мл) супернатанта переносилось в небольшой химический стакан и к нему добавлялось количество воды, достаточное для доведения содержания белка до 5%. Затем образец был сфотографирован, и аликвотное количество образца использовалось для анализа белкового профиля (SEC HPLC). Некоторые образцы также разбавлялись водой до 3,5% белка, и делались их фотографии. Содержание белка в сухом порошке определялось анализатором LECO, но указанного количества образца было недостаточно для проведения анализа на влагосодержание. Поэтому содержание белка выражалось только в пересчете на влажную массу.
В настоящем исследовании общее количество готового продукта составило 1,54 г. Степень чистоты продукта была очень высокой при содержании белка в порошке 101,99% масс./масс. (N×6,25) в пересчете на влажную массу. Как упоминалось выше, указанного количества образца было недостаточно для проведения анализа на влагосодержание, поэтому содержание белка нельзя было выразить в пересчете на сухую массу. Хроматографический анализ регидратированного продукта показал, что 99,85% площади пика, обнаруженного при 280 нм, относится к 2S-белку. Ни 7S-белка, ни 12S-белка не было обнаружено.
Оценки цвета сухого продукта, полученного с применением мембранного 2S-адсорбера, показаны в табл.9.
Таблица 9
Цвет сухого 2S-белка, выделенного из экстракта путем катионного обмена с применением мембранного адсорбера
Образец
L*
а*
b*
2S
84,21
-2,40
15,09
По цвету во влажном состоянии и прозрачности раствора продукт, регидратированный водой, напоминал 2S-белок, полученный колоночной хроматографией. Это позволяет предположить, что при полном отсутствии 7S-/12S-белков прозрачность раствора должна оставаться практически стабильной при большинстве условий.
Резюме изобретения
Если говорить кратко, то настоящее изобретение обеспечивает способ извлечения высокочистого 2S-белка канолы с применением ионообменной хроматографии. Возможны модификации в масштабе настоящего изобретения.