АНТИТЕЛО К СКЛЕРОСТИНУ, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
SCLEROSTIN ANTIBODY, ITS ANTIGEN-BINDING FRAGMENT AND MEDICAL APPLICATION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается со склеростином человека (SOST) с высокой аффинностью, и его антигенсвязывающему фрагменту, а также антителу в качестве терапевтического агента, в особенности для костных заболеваний или расстройств, опосредованных SOST, таких как остеопороз, где субъект получает пользу от повышения по меньшей мере одного из костной массы, минеральной плотности костей, минерального содержания костей или прочности костей.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Остеопороз (ОП), включая постменопаузальный остеопороз (ПМО) и возрастной остеопороз, представляет собой систематическое расстройство костного метаболизма, характеризующееся низкой костной массой и разрушением костной микроструктуры, что приводит к сниженной прочности костей, повышенной хрупкости костей и подверженности переломам. Согласно статистике, около 200 миллионов людей в мире страдают от остеопороза, и заболеваемость поднялась до верхней семерки наиболее распространенных и часто возникающих заболеваний. Распространенность остеопороза среди женщин Китая старше 60 лет составляет вплоть до 60%, а распространенность среди мужчин также составляет 40-50%.
Помимо укрепляющих упражнений, приема кальция и витамина D, распространения знаний о предупреждении переломов и других общепринятых мер, существующее медицинское лечение главным образом ограничено снижением деминерализации костей для предупреждения перелома. Лекарственные средства против деминерализации костей включают кальцитонин, бисфосфонаты, заменители эстрогена и селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов (СМЭР), и т.д. Хотя эти ингибиторы деминерализации костей, представленные бисфосфонатами, могут предотвратить дальнейшую потерю костной ткани, они неспособны восстановить потерянную костную ткань, а также эти ингибиторы деминерализации костей не способны ингибировать остеогенез при ингибировании деминерализации костей. Гормональные лекарственные средства обладают дополнительным риском, связанным с венозным тромбозом и сердечнососудистыми заболеваниями. Более того, анаболические лекарственные средства для лечения костных заболеваний в их истинном качестве не только повышают костную массу, но также эффективно улучшают костную микроструктуру и стимулируют остеогенез. Однако это именно то, что существующие лекарственные средства, препятствующие деминерализации костей, неспособны сделать. За последние 15 лет в клинических исследованиях были систематически изучены различные медицинские меры, направленные на снижение риска переломов, тогда как фактически все еще доступно ограниченное число лекарственных средств. На сегодняшний момент только для лекарственных средств на основе паратиреоидного гормона (ПТГ) была доказана способность стимулировать остеогенез. Однако очевидны многие недостатки. Например, его эффект недостаточен для участия в ремоделировании костной ткани и слабо влияет на восстановление переломов, он также требует ежедневного чрескожного введения в течение более одного года, и вводится лишь в малых дозах; имеет высокую стоимость и не может непрерывно применяться в течение более двух лет; кроме того, проблемы с безопасностью его применения требуют особого предостережения от FDA США (Управление по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США), и т.д.
Склеростин является новой биологической мишенью для разработки лекарственных средств; ее принцип заключается в том, что остеопороз может лечиться регуляцией анаболизма остеобластов. Такая мишень восполняет пробел в области лечения остеопороза регуляцией костного метаболизма.
Склеростин представляет собой секреторный гликопротеин, экспрессируемый геном SOST, и его аминокислотная последовательность характеризуется 190 остатками и кольцевым доменом, содержащим цистеин. Было доказано, что он главным образом экспрессируется в клетках костной ткани, но имеет очень низкую экспрессию в остеобластах, хряще, печени, почках, костном мозге, сердце, поджелудочной железе и других местах.
Исследования показали, что склеростин способен регулировать остеогенез посредством ингибирования сигнального пути Wnt, связываясь с рецептором липопротеинов низкой плотности LRP5/6. На сегодняшний момент лекарственные средства на основе моноклональных антител к новой мишени, разрабатываемые несколькими компаниями, вступили в III или II фазу клинических испытаний, соответственно. Показаниями к применению этих антител являются остеопороз, разрушение костей/связанная остеопатия, и так далее. Родственными патентами являются: WO 2008133722, WO 2010130830, WO 2013063095, WO 2014006100, WO 2014081955, WO 2005014650, WO 2006119062, WO 2008115732. Следует отметить, что некоторые исследования показали, что антитела к склеростину не конфликтуют с лечением, основанным на применении традиционно используемых бисфосфонатов, и эти два лекарственных средства могут применяться в комбинации.
В настоящем изобретении предложены новые антитела, разработанные против новой мишени, для лечения костных заболеваний, таких как остеопороз, где указанное антитело характеризуется высокой аффинностью, высокой эффективностью, увеличенным периодом полувыведения и сниженным количеством введений. Кроме того, новые молекулы по настоящему изобретению обладают высокой растворимостью и хорошей стабильностью, что упрощает изготовление препарата, тем самым снижая стоимость производства.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Антитела по настоящему изобретению представляют собой химерные моноклональные антитела или гуманизированные моноклональные антитела, содержащие конкретную полипептидную последовательность, раскрытую в настоящем описании, которые специфически связываются со склеростином человека с высокой аффинностью и могут применяться для повышения по меньшей мере одного параметра, выбранного из группы, состоящей из костной массы, минеральной плотности костей, минерального содержания костей и прочности костей млекопитающего, предпочтительно человека.
В настоящем изобретении предложено SOST антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее по меньшей мере одну область CDR (область, определяющую комплементарность), где указанная область CDR выбрана из следующих последовательностей или их мутанта, или аминокислотных последовательностей, обладающих по меньшей мере 95% идентичностью со следующими:
последовательность HCDR (определяющей комплементарность области тяжелой цепи) вариабельной области тяжелой цепи: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9;
и
последовательность LCDR (определяющей комплементарность области легкой цепи) вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено SOST антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит по меньшей мере одну область HCDR, выбранную из следующих последовательностей или их мутанта: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено SOST антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит по меньшей мере одну область LCDR, выбранную из следующих последовательностей или их мутанта: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено SOST антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, где антитело содержит последовательности области HCDR SEQ ID NO: 7 (HCDR1), SEQ ID NO: 8 (HCDR2) и SEQ ID NO: 9 (HCDR3), или их мутант, и последовательности области LCDR SEQ ID NO: 10 (LCDR1), SEQ ID NO: 11 (LCDR2) и SEQ ID NO: 12 (LCDR3), или их мутант.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено SOST антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, где мутант области CDR представляет собой область CDR, имеющую от 1 до 3 аминокислотных мутаций, оптимизирующих активность антитела, где мутант области HCDR2 предпочтительно представлен SEQ ID NO: 13.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено SOST антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой мышиное антитело или его фрагмент.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено SOST антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного антитела представлена SEQ ID NO: 5 или аминокислотными последовательностями, обладающими по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 5.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено SOST антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, где последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного антитела представлена SEQ ID NO: 6 или аминокислотными последовательностями, обладающими по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 6.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено SOST антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного антитела представлена SEQ ID NO: 5, и последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного антитела представлена SEQ ID NO: 6.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено мышиное антитело или его фрагмент, как описано выше, где вариабельная область тяжелой цепи антитела дополнительно содержит область FR (каркасную область) тяжелой цепи, полученную из мышиного IgG1 (иммуноглобулина 1), IgG2, IgG3 или IgG4, или ее вариант.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено мышиное антитело или его фрагмент, как описано выше, дополнительно содержащее константную область тяжелой цепи, полученную из мышиного IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или ее вариант.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено мышиное антитело или его фрагмент, как описано выше, где вариабельная область легкой цепи антитела дополнительно содержит область FR легкой цепи, выбранную из мышиной κ- или λ-цепи, или ее вариант.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено мышиное антитело или его фрагмент, как описано выше, дополнительно содержащее константную область легкой цепи, выбранную из мышиной κ- или λ-цепи, или ее вариант.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено SOST антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, где антитело представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело, или его фрагмент.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, где вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела дополнительно содержит область FR тяжелой цепи, полученную из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, или ее вариант.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, где последовательность области FR тяжелой цепи на вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела получена из каркасной последовательности области FR1, FR2, FR3 и области FR4 тяжелой цепи зародышевой линии человека IGHV1-18*01, или ее мутанта, предпочтительно мутантная последовательность содержит от 0 до 10 обратных мутаций аминокислот.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, где гуманизированное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 14-16, или их мутанта, или аминокислотных последовательностей, обладающих по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 14-16.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, где последовательность области FR легкой цепи на вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела получена из каркасной последовательности области FR1, FR2, FR3 и области FR4 легкой цепи зародышевой линии человека IGKV1-39*01 и/или IGKV4-1*01 или ее мутанта, предпочтительно мутант содержит от 0 до 10 обратных мутаций аминокислот.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, где гуманизированное антитело содержит последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 17-19, или их мутанта, или аминокислотных последовательностей, обладающих по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 17-19.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, где гуманизированное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 14-16, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 17-19.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, где гуманизированное антитело содержит комбинацию последовательности вариабельной области тяжелой цепи и последовательности вариабельной области легкой цепи, выбранную из одной из (а) - (с):
(a) Последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 14, и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:  17;
(b) Последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 15, и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 18; или
(с) Последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 16, и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 19.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, где константная область тяжелой цепи гуманизированного антитела содержит константную область, полученную из человеческого IgG1, или ее вариант, человеческого IgG2, или ее вариант, человеческого IgG3, или ее вариант, или человеческого IgG4, или ее вариант, предпочтительно константную область, полученную из человеческого IgG1, или ее вариант, или человеческого IgG4, или ее вариант, наиболее предпочтительно константную область, полученную из человеческого IgG4, или ее вариант. Константная область также может иметь некоторые модификации, такие как "YTE", для изменения активности.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, где гуманизированное антитело содержит полноразмерную последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 24-26 или последовательностей, обладающих по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 24-26.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, где вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела дополнительно содержит область FR легкой цепи, необязательно выбранную из человеческой κ- или λ-цепи, или ее вариант.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, дополнительно содержащее константную область легкой цепи, выбранную из человеческой κ- или λ- цепи, или ее вариант.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, где гуманизированное антитело содержит полноразмерную последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 27-29 или последовательностей, обладающих по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 27-29.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, где гуманизированное антитело содержит полноразмерную последовательность тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 24-26, и полноразмерную последовательность легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 27-29.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено гуманизированное SOST антитело или его фрагмент, как описано выше, где гуманизированные антитела содержат комбинацию полноразмерной последовательности легкой цепи и полноразмерной последовательности тяжелой цепи, выбранную из одной из следующих:
Ab-10: Тяжелая цепь, представленная SEQ ID NO: 24, и легкая цепь, представленная SEQ ID NO: 27;
Ab-9: Тяжелая цепь, представленная SEQ ID NO: 25, и легкая цепь, представленная SEQ ID NO: 28; или
Ab-5: Тяжелая цепь, представленная SEQ ID NO: 26, и легкая цепь, представленная SEQ ID NO: 29.
2
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено SOST антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, где антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab, Fv, sFv или F(ab').
В настоящем изобретении предложена последовательность ДНК, кодирующая экспрессию продукта-предшественника SOST антитела или антигенсвязывающего фрагмента, описанного выше.
В настоящем изобретении дополнительно предложен экспрессионный вектор, содержащий последовательность ДНК, как описано выше.
В настоящем изобретении дополнительно предложена клетка-хозяин, трансформированная экспрессионным вектором, как описано выше.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложена клетка-хозяин как описано выше, где клетка-хозяин представляет собой клетки млекопитающего, предпочтительно клетки СНО (клетки яичника китайского хомячка).
В настоящем изобретении дополнительно предложена фармацевтическая композиция, содержащая SOST антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, а также один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, разбавителей или носителей.
В настоящем изобретении дополнительно предложено применение SOST антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано выше, или содержащей его фармацевтической композиции, для приготовления лекарственного средства для повышения по меньшей мере одного из костной массы, минеральной плотности костей, минерального содержания костей или прочности костей.
В настоящем изобретении дополнительно предложено применение SOST антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано выше, или содержащей его фармацевтической композиции, для приготовления лекарственного средства для лечения SOST-опосредованного костного заболевания или расстройства, где заболевание или расстройство выбрано из остеопороза, остеопении или остеоартрита, ревматоидного артрита, заболеваний пародонта или миеломной болезни или расстройства; предпочтительно остеопороза.
В настоящем изобретении дополнительно предложен способ лечения или предупреждения SOST-опосредованного заболевания или расстройства, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества SOST антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано выше, или содержащей его фармацевтической композиции; где заболевание или расстройство выбрано из остеопороза, остеопении или остеоартрита, ревматоидного артрита, заболеваний пародонта или миеломной болезни или расстройства; предпочтительно остеопороза.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
0-t
Фиг. 1 демонстрирует кривую зависимости концентрации лекарственного средства от времени для гуманизированного антитела к SOST по настоящему изобретению у яванского макака. Результаты демонстрируют, что при одинаковой дозе AUC(мг/мл*сутки), полученная при использовании гуманизированного антитела по настоящему изобретению, составила 22,3, что более чем в два раза превышало это значение для антитела положительного контроля ромосозумаба (9,95).
Фиг. 2 демонстрирует процентное повышение минеральной плотности костей (МПК) поясничных позвонков, достигнутое при использовании гуманизированного антитела к SOST по настоящему изобретению. Результаты демонстрируют, что эффективность гуманизированного антитела к SOST по настоящему изобретению у яванского макака была дозозависимой. Гуманизированное антитело к SOST Ab-5 обладает эффективностью при 10 мг/кг, что сравнимо с 30 мг/кг для молекулы положительного контроля. Это означает, что эффективность молекулы по настоящему изобретению у обезьяны была в три раза выше, чем для молекулы положительного контроля ромосозумаба.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Специалистам хорошо известно, что дозировка лекарственного средства зависит от множества различных факторов, включая, но не ограничиваясь следующими: активность конкретного используемого соединения, возраст пациента, масса тела пациента, состояние здоровья пациента, режим питания пациента, время введения, режим введения, интенсивность экскрекции, сочетание лекарственных средств и т.д. Кроме того, оптимальная тактика лечения, например, режим введения, суточная дозировка антитела или содержащей его композиции, или тип фармацевтически приемлемой соли, может быть установлена в соответствии с общепринятыми схемами лечения.
Для упрощения понимания изобретения некоторые технические и научные термины специально определены ниже. Если в настоящем описании специально не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, как традиционно понимается специалистами в области, к которой принадлежит данное изобретение.
ТЕРМИНЫ
Использованные в настоящем описании однобуквенные и трехбуквенные обозначения аминокислот описаны в J. Biol. Chem, 243, с. 3558 (1968).
При использовании в настоящем описании термин "склеростин" или "SOST", или "белок SOST" относится к продукту экспрессии (белку) гена склеростина (SOST). Если специально не указано иное, например, SOST мыши (m-SOST) или SOST яванского макака (cyno-SOST), этот термин в настоящем изобретении относится к SOST человека (h-SOST). Нуклеотидные последовательности SOST человека, мыши и яванского макака, использованные в настоящем изобретении, получены из GenBank, например, NP_079513.1 представляет собой последовательность белка SOST человека.
Термин "антитело" по отношению к антителу к склеростину по изобретению (или, упрощенно, "антитело по изобретению") при использовании в настоящем описании относится к моноклональному антителу. Моноклональное антитело или mAb согласно настоящему изобретению относится к антителу, полученному из одного клонального клеточного штамма, не ограниченного эукариотической, прокариотической или фаговой клонированной клеточной линией. Моноклональные антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены рекомбинацией, например, гибридомными техниками, рекомбинантными техниками, техниками фагового дисплея, техниками синтеза, другими комбинациями сведений, известных из уровня техники, или другими техниками, хорошо известными из уровня техники.
"Моноклональное антитело" или "антитело по изобретению" или, упрощенно, "антитело" может представлять собой интактное антитело (содержащее интактный или полноразмерный Fc-фрагмент), или часть или фрагмент антитела, содержащая антигенсвязывающую часть, например, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, или F(ab')2-фрагмент химерного или гуманизированного антитела. Особенно предпочтительные антигенсвязывающие фрагменты антитела по изобретению сохраняют способность ингибировать или нейтрализовывать одну или более характеристик биоактивности склеростина млекопитающего in vivo или in vitro. Например, в одном из вариантов осуществления антигенсвязывающая часть антитела по изобретению может ингибировать взаимодействие склеростина человека с одним или более его лигандов и/или может ингибировать одну или более из опосредованных рецептором функций склеростина человека.
Кроме того, "моноклональное антитело" или "антитело по изобретению", или, упрощенно, "антитело" при использовании в настоящем описании может представлять собой одноцепочечный Fv-фрагмент, который может быть получен путем связывания ДНК, кодирующей LCVR и HCVR, с линкерной последовательностью (см. Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, c. 269-315, 1994). Подразумевается, что вне зависимости от того, указаны ли антигенсвязывающие фрагменты или части, термин "антитело" при использовании в настоящем описании включает такие фрагменты или части, а также одноцепочечные формы. Если не указано иное, белок относится к термину "антитело", при условии что он сохраняет способность специфически связывать склеростин.
Термин "антитело к склеростину", "антитело, специфически связывающее склеростин человека", "антитело к SOST", "анти-SOST", "SOST антитело" или "антитело, связывающееся с SOST" в настоящем изобретении относится к антителу, способному связывать SOST с достаточной аффинностью, так что антитело может применяться в качестве диагностического агента и/или терапевтического агента, нацеленного на SOST.
При использовании в настоящем описании термин "специфическое связывание" определяется техниками, известными из уровня техники, такими как конкурентный ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ), анализ BIACORE или анализ KINEXA. Термин также применим, когда, например, антигенсвязывающий домен антитела по изобретению является специфическим для определенного эпитопа, присутствующего у многих антигенов, в таком случае антитело, несущее антигенсвязывающий домен, будет способно к специфическому связыванию различных антигенов, несущих такой эпитоп. Термин "эпитоп" относится к молекулярной группировке, которая может быть распознана и связана антителом в антигенсвязывающей области одного или более антител.
Выражение "биоактивность" по отношению к антителу по изобретению включает, но не ограничивается указанными, эпитоп- или антигенсвязывающую активность, способность нейтрализовать или выступать антагонистом биоактивности склеростина in vivo или in vitro, IC50, измеренную в анализе связывания антитела к склеростину in vitro в отношении связывания и блокады склеростина человека и LRP-6 (например, как описано в Примере 1, 2 в настоящем описании), или измеренную в другом анализе активности in vitro, стабильность антитела in vivo и/или in vitro. Вышеуказанные свойства или характеристики могут наблюдаться или быть измерены с помощью известных из уровня техники методик, включающих, но не ограниченных указанным, ELISA, конкурентный ELISA, анализ с использованием поверхностного плазмонного резонанса, неограниченные анализы нейтрализации in vitro и in vivo, рецепторное связывание и иммуногистохимическое исследование со срезами ткани из различных источников (включая человека, примата) или любого другого источника по мере необходимости.
Выражение "биоактивность" по отношению к склеростину включает, но не ограничивается указанными, специфическое связывание склеростина с другим белком (например, рецептором или членом семейства TGF-β), одну или более опосредованных рецептором функций склеростина человека, сигнальную трансдукцию, иммуногенетические свойства, стабильность in vivo или in vitro, воздействие на уровень или активность другого белка in vivo или in vitro (см., например, Примеры 1-5), уровень экспрессии склеростина и распределение в тканях.
Термин "ингибировать" или "нейтрализовывать" при использовании в настоящем описании по отношению к биоактивности антитела по изобретению означает способность в значительной степени противодействовать, препятствовать, предупреждать, сдерживать, замедлять, нарушать, устранять, останавливать, уменьшать или обращать биоактивность склеростина (например, как измерено в примере 2 в настоящем описании).
Термин "нумерация по Kabat" при использовании в настоящем описании известен из уровня техники и относится к системе нумерации аминокислотных остатков, более вариабельных (т.е., гипервариабельных), чем другие аминокислотные остатки, в областях тяжелой и легкой цепей антитела (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)). Позиции CDR в вариабельной области антитела обозначаются в соответствии с нумерацией по Kabat или, упрощенно, "Kabat."
Термины "субъект" и "пациент", взаимозаменяемо используемые в настоящем описании, относятся к млекопитающему, предпочтительно человеку. В определенном варианте осуществления субъект дополнительно характеризуется как страдающий от заболевания или расстройства, или состояния, который получил бы пользу от сниженного уровня склеростина или сниженной биоактивности склеростина.
Термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была функционально связана. Данный термин включает, но не ограничивается указанными, плазмиды и вирусные векторы. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они были введены, в то время как остальные векторы могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, таким образом, реплицированы вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящем описании называются "рекомбинантными экспрессионными векторами" (или, упрощенно, "экспрессионными векторами"). Иллюстративные векторы хорошо известны из уровня техники.
При использовании в настоящем описании выражения "клетка", "клетка-хозяин" и "клеточная культура" являются взаимозаменяемыми и включают различные клетки или клеточную культуру, являющиеся реципиентом любого выделенного полинуклеотида по изобретению или любого рекомбинантного вектора (любых рекомбинантньгх векторов), содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую HCVR, LCVR или антитело по изобретению. Клетка-хозяин включает клетки, трансформированные, трансдуцированные или инфицированные одним или более рекомбинантным вектором или полинуклеотидом, экспрессирующим моноклональное антитело по изобретению или его легкую или тяжелую цепь.
Каждая тяжелая цепь полноразмерного антитела содержит N-концевую вариабельную область тяжелой цепи (обозначаемый здесь "HCVR") и константную область тяжелой цепи. Каждая легкая цепь полноразмерного антитела содержит N-концевую вариабельную область легкой цепи (обозначаемый здесь "LCVR") и константную область легкой цепи. Область HCVR и LCVR может быть дополнительно разделена на гипервариабельную область, называемую областью, определяющей комплементарность ("CDR"). CDR перемежаются более консервативными областями, называемыми каркасными областями ("FR"). На функциональную способность антитела связывать определенный антиген или эпитоп в значительной степени влияют шесть CDR вариабельной области антитела. Каждая HCVR и LCVR содержит три CDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3 в HCVR, и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 в LCVR) и четыре FR, расположенные от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR содержат большую часть остатков, вступающих в специфические взаимодействия с антигеном. Позиции CDR в пределах вариабельной области обозначаются в соответствии с нумерацией по Kabat.
Легкие цепи классифицируются как каппа или лямбда, и характеризуются определенной константной областью, как известно из уровня техники. Тяжелые цепи классифицируются как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, и определяют изотип антитела как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Некоторые из этих изотипов могут, в свою очередь, быть дополнительно разделены в подклассы, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Каждый тип тяжелой цепи характеризуются определенной константной областью, имеющей последовательность, хорошо известную из уровня техники. Предпочтительными константными областями антител по изобретению являются константная область легкой цепи каппа и константные области тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Химерные антитела могут иметь константные области, не принадлежащие к человеческому роду, предпочтительно крысиные или мышиные.
При использовании в настоящем описании "антигенсвязывающая область" или "антигенсвязывающая часть" относится к части в пределах вариабельной области молекулы антитела, содержащей аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и придающие антителу специфичность и аффиность к антигену. Эта часть антитела включает каркасные аминокислотные остатки, необходимые для поддержания надлежащей конформации антигенсвязывающих остатков.
Предпочтительное антитело по настоящему изобретению содержит шесть CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 и 12. Более предпочтительное антитело по настоящему изобретению содержит шесть CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 19, 27, 28, 32, 36 и 40. Более предпочтительно, оптимизированные CDR антител по изобретению содержат по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с CDR исходного антитела, оптимизированные CDR антител по изобретению содержат шесть CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7, 13, 9, 10, 11 и 12. CDR этих предпочтительных антител находятся в позиции, как указано в Таблице 1. Позиции CDR в вариабельной области обозначены в соответствии с нумерацией по Kabat.
Предпочтительное антитело по изобретению содержит HCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 14, 15 и 16. Другие предпочтительные моноклональные антитела по изобретению содержат LCVR, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, 18 и 19. Более предпочтительно, антитело по изобретению содержит LCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 17, и HCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 14. Альтернативное антитело по изобретению содержит LCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 18, и HCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 15. Более предпочтительное антитело по изобретению содержит HCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 16, и LCVR, имеющую последовательность SEQ ID NO: 19. Такие HCVR по изобретению предпочтительно связаны с константной областью тяжелой цепи, предпочтительно человеческого происхождения, предпочтительно константной областью тяжелой цепи IgG1 или IgG4, более предпочтительно константной областью тяжелой цепи IgG4. Такие LCVR предпочтительно связаны с константной областью легкой цепи, предпочтительно человеческого происхождения, предпочтительно каппа-цепи.
Одно из предпочтительных антител по настоящему изобретению содержит полипептид тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и полипептид легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
Другое предпочтительное антитело по настоящему изобретению содержит полипептид тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и полипептид легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
Другое предпочтительное антитело по настоящему изобретению содержит полипептид тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и полипептид легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29.
SEQ ID NO их последовательностей перечислены в Таблице 1.
D
D
Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению дополнительно характеризуется K для склеростина человека, составляющей менее чем приблизительно 10 нМ, 3 нМ, 1 нМ или 0,3 нМ, более предпочтительно менее чем приблизительно 0,1 нМ. Кроме того, такое антитело предпочтительно дополнительно определено K для склеростина яванского макака, составляющей менее чем приблизительно 10 нМ, 3 нМ, 1 нМ или 0,3 нМ, или более предпочтительно менее чем приблизительно 0,1 нМ.
Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению дополнительно характеризуется IC50, составляющим менее чем 100 нМ или менее, приблизительно 50 или 30 нМ или менее, более предпочтительно приблизительно 25 нМ, даже более предпочтительно приблизительно 20 нМ (например, 17,9 нМ) или менее, как измерено в эксперименте по блокаде связывания между склеростином человека и LRP-6 (см., например, Пример 2 в настоящем описании).
D
Более предпочтительно, антитело по настоящему изобретению дополнительно характеризуется K для склеростина человека, составляющей менее чем приблизительно 10 нМ, 3 нМ, 1 нМ или 0,3 нМ, более предпочтительно менее чем приблизительно 0,1 нМ, и также характеризуется IC50, составляющим менее чем 100 нМ или менее, приблизительно 50 или 30 нМ или менее, более предпочтительно приблизительно 25 нМ, даже более предпочтительно приблизительно 20 нМ (например, 17,9 нМ) или менее, как измерено в эксперименте по блокаде связывания между склеростином человека и LRP-6. Шесть CDR, HCVR, LCVR, HCVR и LCVR, полная тяжелая цепь, полная легкая цепь или полная тяжелая цепь и полная легкая цепь в указанном антителе определены определенной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO в настоящем описании.
D
D
Даже более предпочтительно, антитело по настоящему изобретению дополнительно характеризуется K для склеростина человека, составляющей менее чем приблизительно 10 нМ, 3 нМ, 1 нМ или 0,3 нМ, более предпочтительно менее чем приблизительно 0,1 нМ, и также характеризуется IC50, составляющим менее чем 100 нМ или менее, приблизительно 50 или 30 нМ или менее, более предпочтительно приблизительно 25 нМ, даже более предпочтительно приблизительно 20 нм (например, 17,9 нМ) или менее, как измерено в эксперименте по блокаде связывания между склеростином человека и LRP-6; и также характеризуется K, составляющей менее чем 10 нМ, 3 нМ, 1 нМ или 0,3 нМ, более предпочтительно менее чем приблизительно 0,1 нМ, как измерено в эксперименте связывания ELISA in vitro с помощью антитела склеростина яванского макака. Шесть CDR, HCVR, LCVR, HCVR и LCVR, полная тяжелая цепь, полная легкая цепь или полная тяжелая цепь и полная легкая цепь в указанном антителе определены определенной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO в настоящем описании.
Экспрессия антитела
Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, экспрессирующим антитело к склеростину по изобретению. Установление и выделение линий клетки-хозяина, продуцирующей антитело по изобретению, может быть выполнено с помощью стандартных техник, известных из уровня техники.
Для экспрессии антитела по настоящему изобретению может быть использовано большое разнообразие экспрессирующих систем хозяев, включая прокариотические (бактериальные) и эукариотические экспрессирующие системы (такие как клетки дрожжей, бакуловируса, растений, млекопитающих и клетки других животных, трансгенных животных и гибридомные клетки), а также экспрессирующие системы фагового дисплея.
Антитело по изобретению может быть получено рекомбинантной экспрессией генов легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяина трансформируют, трансдуцируют или инфицируют одним или более рекомбинантным экспрессионным вектором, несущим фрагменты ДНК, кодирующие легкие и/или тяжелые цепи иммуноглобулинов, так что легкие и/или тяжелые цепи экспрессируются в клетке-хозяине. Тяжелая цепь и легкая цепь могут независимо экспрессироваться с разных промоторов, с которыми они функционально связаны в одном векторе или, альтернативно, тяжелая цепь и легкая цепь могут независимо экспрессироваться с разных промоторов, с которыми они функционально связаны в двух векторах (одном, экспрессирующем тяжелую цепь, и одном, экспрессирующем легкую цепь). Необязательно, тяжелая цепь и легкая цепь могут экспрессироваться в различных клетках-хозяевах.
Кроме того, рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, облегчающий секрецию легкой и/или тяжелой цепи антитела к склеростину из клетки-хозяина. Ген легкой и/или тяжелой цепи антитела к склеростину может быть клонирован в вектор, так что сигнальный пептид функционально связан внутри рамки считывания с аминокислотным концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой иммуноглобулиновый сигнальный пептид или гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно, рекомбинантные антитела секретируются в среду, в которой культивируют клетки-хозяева, из которой антитела могут быть выделены или очищены.
Выделенная ДНК, кодирующая область HCVR, может быть преобразована в полноразмерный ген тяжелой цепи путем функционального связывания HCVR-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область тяжелой цепи. Последовательности генов константных областей тяжелых цепей человека, а также других млекопитающих, известны из уровня техники. Фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены, например, стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область тяжелой цепи может быть константной областью любого типа (например, IgG, IgA, IgE, IgM или IgD), любого класса (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4) или подкласса, и любым ее аллотипическим вариантом, как описано в нумерации по Kabat (supra). Предпочтительный константная область тяжелой цепи содержит константную область IgG1 или ее вариант, или IgG4 или ее вариант.
Выделенная ДНК, кодирующая область LCVR, может быть преобразована в полноразмерный ген легкой цепи (а также в ген легкой цепи Fab) путем функционального связывания LCVR-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи. Последовательности генов константных областей легких цепей человека, а также других млекопитающих, известны из уровня техники. Фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены, например, стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа- или лямбда-цепи.
Предпочтительными клетками-хозяевами млекопитающих для применения в изобретении являются клетки СНО (например, АТСС CRL-9096), клетки HEK 293Е (например, АТСС CRL-1573), клетки NS0, клетки SP2/0 и клетки COS (АТСС например, CRL-1650, CRL-1651). Дополнительные клетки-хозяева для применения в изобретении включают другие клетки млекопитающих, клетки дрожжей и прокариотические клетки. При введении рекомбинантных экспрессирующих векторов, кодирующих гены антитела, в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для экспрессии антитела в клетках-хозяевах, или, более предпочтительно в течение периода времени, достаточного для секреции антитела в культуральную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из клетки-хозяина и/или культуральной среды с помощью стандартных методов очистки.
Экспрессированный продукт (в форме целого антитела, легкой цепи и тяжелой цепи, или других форм иммуноглобулина) может быть очищен стандартными процедурами, известными из уровня техники, включая осаждение сульфатом аммония, ионный обмен, аффинность, обращенную фазу, гидрофобную колоночную хроматографию, гелевый электрофорез и тому подобные. Для фармацевтических применений предпочтительными являются по существу чистые иммуноглобулины, обладающие гомогенностью, составляющей по меньшей мере 90%, 92%, 94% или 96%, и наиболее предпочтительной является гомогенность, составляющая от 98 до 99% или выше. После очистки частично очищенные или очищенные до гомогенности, в зависимости от необходимости, стерильные антитела могут быть использованы в терапевтических целях, как указано в настоящем описании.
Гуманизированное антитело
Предпочтительно, антитело по изобретению для применения в терапевтических целях обладает последовательностью каркасного и константной облатси (в случае, когда она присутствует в антителе), полученной из млекопитающего, указанное антитело используется в качестве терапевтического агента для снижения возможности индукции у млекопитающего иммунного ответа терапевтическим антителом против терапевтического антитела. Особенный интерес представляют гуманизированные антитела, поскольку они являются полезными для терапевтического применения и снижают вероятность ответа человека против мышиного антитела, что часто наблюдается при введении человеку антител мышиного происхождения или антител, содержащих части мышиного происхождения. Предпочтительные инъецируемые гуманизированные антитела могут иметь период полувыведения, более схожий с природными человеческими антителами, по сравнению с, например, мышиными антителами, что позволяет осуществлять менее частое введение или введение меньших доз субъекту.
Термин "гуманизированное антитело" в контексте настоящего описания относится к антителу, по меньшей мере часть которого имеет человеческое происхождение. Например, гуманизированное антитело может содержать части, полученные из антитела нечеловеческого происхождения (такого, как мышиное), и части, полученные из антитела человеческого происхождения, объединенные, например, традиционными химическими техниками (например, синтезом), или полученные в виде непрерывного полипептида с помощью технологий генной инженерии.
Предпочтительно, "гуманизированное антитело" имеет CDR, происходящие или полученные из исходного антитела (то есть, антитела, не являющегося человеческим, предпочтительно, мышиного моноклонального антитела), тогда как каркасная и константная область, в случае, когда они присутствуют, (или существенная или большая их часть, т.е., по меньшей мере приблизительно 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) кодируются информацией нуклеотидной последовательности, присутствующей в области иммуноглобулина зародышевой линии человека (см., например, международную базу данных ImMunoGeneTics) или в его рекомбинантных или мутантных формах, вне зависимости от того, были ли указанные антитела продуцированы в человеческой клетке. Предпочтительно, по меньшей мере два, три, четыре, пять или шесть CDR гуманизированного антитела оптимизированы посредством CDR исходного антитела нечеловеческого происхождения, из которого было получено гуманизированное антитело, для получения желаемого свойства, например, улучшенной специфичности, аффинности или нейтрализации, что можно идентифицировать скрининговым анализом, например, анализом ELISA. Предпочтительно, оптимизированный CDR в антителе по изобретению содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с CDR в исходном антителе. Некоторые аминокислотные замены в CDR гуманизированных антител по изобретению по сравнению с CDR в исходных антителах (см. пример 4 в настоящем описании) снижают вероятность нестабильности антитела (например, удаление остатков Asn в CDR) или снижают иммуногенность антитела при введении человеку (например, как предсказано технологией IMMUNOFILTER™).
Гуманизированные антитела предпочтительно содержат минимальную последовательность, полученную из антитела, не являющегося человеческим. Гуманизированные антитела могут содержать остатки, отсутствующие и в антителе реципиента, и в CDR или каркасных последовательностях, взятых из исходного антитела. Гуманизированные антитела могут быть подвергнуты мутагенезу in vitro с помощью рутинных методов, известных из уровня техники, и, таким образом, аминокислотные последовательности каркасной области областей HCVR и LCVR гуманизированных рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи полученными из последовательностей, относящихся к последовательностям HCVR и LCVR зародышевой линии человека, не могут в естественных условиях существовать в репертуаре антитела зародышевой линии человека in vivo. Предполагается, что такие аминокислотные последовательности каркасных областей HCVR и LCVR гуманизированных рекомбинантных антител обладают по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98% или более предпочтительно по меньшей мере 99%, или наиболее предпочтительно 100% идентичностью с последовательностью зародышевой линии человека.
В предпочтительном варианте осуществления гуманизированное антитело по изобретению содержит каркасную последовательность тяжелой цепи зародышевой линии человека и каркасную последовательность легкой цепи зародышевой линии человека. Такие каркасные последовательности могут быть получены из публичных баз данных ДНК, содержащих последовательности гена антитела зародышевой линии, или из опубликованных источников. Например, последовательности ДНК зародышевой линии генов вариабельных областей тяжелой и легкой цепи человека можно найти в базе данных последовательности зародышевой линии человека "VBase" (доступной в сети Интернет по адресу: www.mrccpe.com.ac.uk/vbase). а также в Kabat, ЕА, et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. В предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательности мышиных CDR гуманизированного SOST антитела выбраны из SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 и 12. Каркасные области вариабельной области человеческого антитела были разработаны и селектированы, где последовательность области FR легкой цепи на вариабельной области легкой цепи антитела получена из области FR1, FR2, FR3 и области FR4 легкой цепи зародышевой линии человека IGKV1-39*01 и IGKV4-1*01; где последовательность области FR тяжелой цепи на вариабельной области легкой цепи антитела получена из области FR1, FR2, FR3 и области FR4 тяжелой цепи зародышевой линии человека IGHV1-18*01.
Из уровня техники известно множество способов генерации гуманизированных антител. Например, гуманизированные антитела могут быть получены посредством получения нуклеотидных последовательностей, кодирующих HCVR и LCVR исходного антитела (например, мышиного антитела, или антитела, полученного с помощью гибридомы), которое специфически связывает склеростин, предпочтительно склеростин человека, идентификации CDR в указанных HCVR и LCVR (нечеловеческие), и пересадки таких CDR-кодирующих нуклеотидных последовательностей на выбранные человеческие нуклеотидные последовательности, кодирующие каркасную область. Необязательно, область CDR может быть оптимизирована случайным мутагенезом или мутагенезом в конкретных позициях для замещения одной или более аминокислот в CDR другой аминокислотой перед пересадкой области CDR в область каракасной последовательности. Альтернативно, область CDR может быть оптимизирована после введения в каркасную область человека с помощью способов, известных специалисту в данной области техники.
После того, как кодирующие CDR последовательности пересажены на выбранные человеческие последовательности, кодирующие каркасную область, полученные последовательности ДНК, кодирующие последовательности гуманизированной вариабельной тяжелой и легкой цепи, затем экспрессируются с получением гуманизированного антитела, связывающего склеростин. Гуманизированные HCVR и LCVR могут экспрессироваться в виде части целой молекулы антитела к склеростину, т.е., как слитый белок с человеческими последовательностями константного домена. Однако последовательности HCVR и LCVR могут также экспрессироваться с получением гуманизированного Fv к склеростину, в отсутствие константных последовательностей.
Ссылки, дополнительно описывающие способы, включающие гуманизацию мышиного антитела, которые могут быть использованы, включают, например, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991 и способ Winter и коллег [Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534(1988)].
Терапевтические применения
Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело к склеростину по изобретению, может применяться для повышения по меньшей мере одного из костной массы, минеральной плотности костей, минерального содержания костей или прочности костей в позвоночных или непозвоночных костях, или обоих, где эффективное количество вводится человеку, нуждающемуся в этом. Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело к склеростину по изобретению, может применяться для снижения числа переломов позвоночных и/или непозвоночных костей, где эффективное количество вводится человеку, нуждающемуся в этом. Снижение числа переломов включает снижение вероятности или фактического числа переломов у человека по сравнению с контрольной группой, не проходящей лечение.
Более того, антитело по изобретению может быть полезным для лечения состояний, заболеваний или расстройств, при которых наличие склеростина вызывает или способствует нежелательным патологическим эффектам; или снижение уровней склеростина или биоактивности склеростина оказывает терапевтический эффект у людей. Такие состояния, заболевания или расстройства включают, но не ограничивается указанными, остеопороз, остеопению, остеоартрит, боль, связанную с остеоартритом, заболевания пародонта или миеломной болезни. Субъекты могут быть мужского или женского пола. Предпочтительно, человек подвержен риску перелома позвоночной и/или непозвоночной кости, более предпочтительно, человек подвержен риску развития или страдает от остеопороза. Человек предпочтительно представляет собой женщину, и более предпочтительно женщину, подверженную риску развития или страдающую от постменопаузального остеопороза. Предполагается, что субъект с любой стадией остеопороза может получить пользу от способа по изобретению.
Кроме того, предполагается применение антитела по изобретению в производстве лекарственного средства для лечения по меньшей мере одного из вышеуказанных расстройств.
Подразумевается, что термины "лечение" и "лечить" относятся ко всем процессам, при которых происходит замедление, прерывание, прекращение, контроль или остановка прогрессирования расстройств, раскрытых в настоящем описании, но необязательно указывает на полное устранение всех симптомов расстройства. "Лечение" при использовании в настоящем описании включает введение соединения по настоящему изобретению для лечения заболевания или состояния у млекопитающего, в частности у человека, и включает: (а) ингибирование дальнейшего прогрессирования заболевания, т.е., прекращение его развития; и (b) ослабление заболевания, т.е., регрессию заболевания или расстройства, или облегчение его симптомов или осложнений. Режимы дозирования могут регулироваться для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, может вводиться разовая доза, несколько разделенных доз могут независимо вводиться в течение периода времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, в зависимости от того, чего требует терапевтическая ситуация.
Фармацевтическая композиция
Антитело по изобретению может быть включено в состав фармацевтической композиции, подходящей для введения человеку. Антитело по изобретению может вводиться человеку по отдельности или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем в разовой дозе или многократных дозах. Такие фармацевтические композиции разработаны с тем, чтобы подходить для выбранного режима введения, и при необходимости используются фармацевтически приемлемые разбавители, носители и/или эксципиенты, такие как диспергирующие агенты, буферы, поверхностно-активные вещества, консерванты, солюбилизирующие агенты, агенты, регулирующие изотоничность, стабилизаторы и тому подобные. Указанные композиции могут быть разработаны в соответствии с традиционными техниками, раскрытыми в, например, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, где кратко перечислены основные техники приготовления лекарственных форм, известные практикующим клиницистам. Подходящие носители для фармацевтических композиций включают любой материал, который при объединении с моноклональным антителом по изобретению сохраняет активность молекулы и не взаимодействует с иммунной системой субъекта.
Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело к склеростину по изобретению, может вводиться субъекту, подверженному риску или демонстрирующему патологии, раскрытые в настоящем описании, например, остеопороз, остеоартрит или другие дегенеративные костные заболевания, посредством стандартных техник введения.
Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно содержит "эффективное количество" антитела по изобретению. Эффективное количество относится к количеству, необходимому (в дозировках и в течение периодов времени, и для средств введения) для достижения желаемого терапевтического результата. Эффективное количество антитела может варьировать в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания, возраст, пол и масса тела человека, и способности антитела или части антитела вызывать желаемый ответ у человека. Эффективное количество также является количеством, в котором терапевтически полезные эффекты превосходят любое токсическое или вредное воздействие антитела.
Эффективное количество представляет собой по меньшей мере минимальную дозу, но менее токсической дозы, активного агента, необходимую для того, чтобы повлечь терапевтический эффект у субъекта. Другими словами, эффективное количество или терапевтически эффективное количество антитела по изобретению представляет собой количество, которое у млекопитающих, предпочтительно, людей, (i) повышает по меньшей мере одно из костной массы, минеральной плотности костей, минерального содержания костей или прочности костей, или (ii) лечит состояние, расстройство или заболевание, где наличие склеростина вызывает или способствует нежелательному патологическому эффекту, или (iii) снижение уровня склеростина или биоактивности склеростина оказывает положительный терапевтический эффект у млекопитающего, предпочтительно человека; где указанное состояние, заболевание или расстройство включает, но не ограничивается указанными, остеопороз, остеопению, остеоартрит, ревматоидный артрит, заболевания пародонта или миеломную болезнь.
Далее настоящее изобретение дополнительно описано со ссылкой на примеры. Однако объем настоящего изобретения ими не ограничен.
В примерах или тестовых примерах настоящего изобретения, где не описаны конкретные условия, эксперименты, как правило, проведены в общепринятых условиях или в соответствии с условиями, рекомендуемыми производителем исходного материала или продукта. См. Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Contemporary Molecular Biology Approach, за авторством Ausubel et al., Greene Publishing Association, Wiley Interscience, NY. Где специально не указан источник реагентов, они представляют собой коммерчески доступные общепринятые реагенты.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Клонирование и экспрессия SOST
Кодирующая последовательность склеростина человека с His-меткой (His-h-SOST), кодирующая последовательность склеростина человека с Flag-меткой (h-SOST-Flag), кодирующая последовательность склеростина мыши с Flag-меткой (m-SOST-Flag), и кодирующая последовательность склеростина яванского макака с Flag-меткой (cyno-SOST-Flag) были синтезированы CRO Shanghai Xuguan Biotechnology Development Co., Ltd (матричные последовательности вышеуказанного рекомбинантного белка склеростина были разработаны в настоящем изобретении), и клонированы в вектор рТТ5 (Biovector, Кат. №102762), соответственно. Рекомбинантный белок SOST экспрессировался в 293 клетках и был очищен в примере 2. Очищенный белок может быть использован в следующих экспериментальных примерах.
Последовательность ДНК His-h-SOST:
Последовательность ДНК h-SOST-Flag:
Последовательность ДНК m-SOST-Flag:
Последовательность ДНК cyno-SOST-Flag:
Пример 2. Очистка рекомбинантного белка SOST
1. Стадии очистки рекомбинантного белка SOST с His-меткой
280
Супернатант клеточной экспрессии центрифугировали при высокой скорости для удаления примесей, и буфер заменяли на PBS (натрий-фосфатный буфер), добавляли имидазол до конечной концентрации 5 мМ. Колонку для никель-хелатной хроматографии уравновешивали раствором PBS, содержащим 5 мМ имидазола, и промывали 2-5 колоночными объемами. Затем супернатант загружали на колонку. Колонку промывали раствором PBS, содержащим 5 мМ имидазола, до тех пор, пока значение А не снизилось до уровня базовой линии. И затем хроматографическую колонку промывали PBS с 10 мМ имидазола для удаления неспецифически связанных белков, и собирали элюат. Целевой белок элюировали раствором PBS, содержащим 300 мМ имидазола, и собирали пик элюирования.
Собранный элюат очищали с помощью ионного обмена (колонка SP). Готовили раствор А: 0,01М РВ, рН8,0. Готовили раствор В: раствор А + 1М NaCl. Целевой белок, элюированый раствором PBS, содержащим имидазол, сначала подвергали диализу против раствора А, и колонку SP уравновешивали раствором А; загружали образец; градиент концентрации раствора В составил 0-100%; целевой белок элюировали 10 колоночными объемами и собирали пик элюирования. Полученный белок идентифицировали с помощью электрофореза, пептидного картирования и LC-MS (жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией), и из корректного образца отбирали аликвоты для использования. Получали склеростин человека с His-меткой (His-h-SOST).
2. Стадии очистки рекомбинантного белка SOST с Flag-меткой
280
Образец центрифугировали на высокой скорости для удаления примесей и концентрировали до подходящего объема. Колонку с анти-Flag сорбентом для аффинной хроматографии уравновешивали 0,5×PBS и промывали 2-5 колоночными объемами. Образцы супернатанта затем загружали на колонку после удаления примеси. Колонку промывали 0,5×PBS до тех пор, пока значение А не снизилось до уровня базовой линии. Затем колонку промывали PBS, содержащим 0,3 М NaCl, и примесный белок промывали и собирали. Целевой белок элюировали ОД М уксусной кислотой (рН 3,5-4,0) и собирали, рН доводили до нейтрального значения. Собранный образец идентифицировали с помощью электрофореза, пептидного картирования, LC-MS, и из корректного образца отбирали аликвоты для использования.
Получали склеростин человека с Flag-меткой (h-SOST-Flag), склеростин мыши с Flag-меткой (m-SOST-Flag) и склеростин яванского макака с Flag-меткой (cyno-SOST-Flag), и использовали в настоящем изобретении для исследования характеристик антител.
Пример 3. Получение моноклонального антитела к SOST человека
Моноклональное антитело к SOST человека получали с помощью иммунизации мышей. Подопытные белые мыши SJL, самки, возрастом 6 недель (Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., лицензионный животноводческий номер: SCXK (Пекин) 2012-0001).
Условия кормления: уровень SPF (свободные от специфической патогенной микрофлоры). После приобретения мышей животных держали в лаборатории в течение 1 недели, в условиях цикла 12/12 часов света/темноты, при температуре 20-25 , влажности 40-60%. Мышей, акклиматизировавшихся к условиям окружающей среды, делили на две группы (А/В), по 10 мышей в каждой группе.
Человеческий рекомбинантный белок SOST с His-меткой (His-h-tag) использовали в качестве иммуногена. В группе А для эмульгирования использовали адъювант Фрейнда (кат.No sigma: F5881/F5506): первую иммунизацию проводили с полным адъювантом Фрейнда (CFA), и бустер-иммунизации проводили с неполным адъювантом Фрейнда (IFA). Соотношение между антигеном и адъювантом составляло 1:1, 200 мкл/200 мкг/мышь (первая иммунизация), 200 мкл/100 мкг/мышь (буст). В группе В проводили перекрестную иммунизацию с Titermax (кат. № sigma: Т2684) и Alum кат. № Thremo: 77161). Соотношение между антигеном и адъювантом (titermax) составляло 1:1, и соотношение между антигеном и адъювантом (Alum) составляло 3:1, 200 мкл/200 мкг/мышь (первая иммунизация), 200 мкл/100 мкг/мышь (буст). Антиген эмульгировали и инокулировали на 0, 14, 28, 42, 56 день.
На 0 день мышам в группе А/В интраперитонеально (IP) инъецировали 50 мкг/мышь эмульгированного антигена. На 14 день мышам подкожно (s.c.) инъецировали 25 мкг/мышь в нескольких местах (обычно в 6-8 местах на спине). На 28 и 42 день выбирали инъекцию антигена в область спины или интраперитонеальную инъекцию, в зависимости от припухлостей на спине и отечности в области живота. Бустер-иммунизацию проводили посредством интраперитонеальной (IP) инъекции раствора антигена, приготовленного с физиологическим раствором, в количестве 200 мкг/мышь за 3 дня до слияния спленоцитов.
Исследование титра крови проводили на 22, 36, 50, и 64 день, и активность связывания мышиной сыворотки со склеростином человека измеряли методом ELISA по Тестовому примеру 1, результат приведен в Таблице 2. После четвертой иммунизации мышей с высоким титром крови и тенденцией к выходу на плато выбирали для проведения слияния спленоцитов. Гибридомные клетки получали слиянием спленоцитов с клетками миеломы Sp2/0 (ATCCTCRL-8287™) с помощью оптимизированной процедуры слияния, опосредованной ПЭГ (полиэтиленгликолем). Активность блокады связывания между SOST человека и LRP-6 антителом к SOST человека в мышиной сыворотке детектировали, как показано в Тестовом примере 2, и выбирали штамм моноклональных гибридомных клеток Ab-1 с хорошей активностью связывания и блокады in vitro, результаты приведены в Таблице 2.
Пример 4. Гуманизация мышиного антитела к склеростину человека
Выбирали штамм моноклональных гибридомных клеток Ab-1 с хорошей биоактивностью in vitro, гибридому секвенировали, и затем проводили гуманизацию, рекомбинантную экспрессию и оценку активности.
Процесс секвенирования гибридомы проводили следующим образом. Гибридомные клетки собирали в логарифмической фазе роста и выделяли РНК в тризол (Invitrogen 15596-018, согласно инструкциям в наборе), и затем по инструкции проводили обратную транскрипцию РНК (PrimeScript™ Reverse Transcriptase, Takara, кат. №2680A). кДНК, полученные с помощью обратной транскрипции, амплифицировали посредством ПЦР (полимеразной цепной реакции) с помощью набора mouse Ig-Primer Set (Novagen, TB326 Rev.B 0503) и секвенировали в компании, предоставляющей услуги секвенирования. Аминокислотные последовательности, соответствующие полученной последовательности ДНК, были представлены как SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6.
Вариабельная область тяжелой цепи, полученная из гибридомных клеток:
Вариабельная область легкой цепи, полученная из гибридомных клеток:
Гуманизацию мышиного моноклонального антитела к SOST человека проводили согласно способам, раскрытым во множестве источников уровня техники. Вкратце, домен константной области исходного (мышиного антитела) заменяли доменом константной области человека, и антитело зародышевой линии человека выбирали в соответствии с гомологией между мышиным и человеческим антителом. Рассматриваемые молекулы, демонстрирующие хорошую активность в настоящем изобретении, были гуманизированы, и результаты были следующими.
1. Область CDR мышиного антитела к склеростину
Аминокислотные остатки CDR VH/VL идентифицировали и аннотировали по системе нумерации Kabat.
Последовательности CDR мышиного Ab-1 по настоящему изобретению описаны в Таблице 3:
2. Выбор последовательности области FR зародышевой линии человека
Основываясь на типичной структуре CDR VH/VL мышиного антитела, проводили сравнение последовательностей вариабельной области тяжелой и легкой цепи с базой данных антитела зародышевой линии, была выбрана матрица зародышевой линии человека с высокой гомологией. Где каркасная область легкой цепи зародышевой линии человека происходила из гена легкой каппа-цепи человека, и предпочтительно, матрица легкой цепи IGKV1-39*01 или IGKV4-1*01 зародышевой линии человека была выбрана для настоящего изобретения. Каркасная область тяжелой цепи зародышевой линии человека происходила из тяжелой цепи человека, и предпочтительно, матрица тяжелой цепи IGHV1-18*01 зародышевой линии человека была выбрана для настоящего изобретения. Область CDR мышиного антитела Ab-1 трансплантировали на выбранную гуманизированную матрицу, заменяя гуманизированную вариабельную область, и затем рекомбинировали с константной областью IgG. На основании трехмерной структуры мышиного антитела были проведены обратные мутации на захваченных остатках, на остатках, напрямую взаимодействующих с областями CDR, а также на остатках, оказывающих важные эффекты на конформации VL и VH, и остатки в области CDR, демонстрирующих химическую нестабильность (CDR2 тяжелой цепи была оптимизирована для получения последовательности новой CDR2 тяжелой цепи, DIDPNDGDILYNQKFRD, SEQ ID NO: 13) были оптимизированы, и была получена конечная гуманизированная молекула. Последовательности вариабельной области тяжелой цепи конечной гуманизированной молекулы были представлены SEQ ID NO: 14-16, и эти последовательности могут быть совмещены с любой из константных областей тяжелой цепи, представленных SEQ ID NO: 20-22. Последовательности вариабельной области легкой цепи конечной гуманизированной молекулы представлены SEQ ID NO: 17-19, и эти последовательности могут быть совмещены с последовательностями константной области легкой цепи, представленными SEQ ID NO: 23, соответственно.
1. Вариабельная область тяжелой цепи:
Вариабельная область тяжелой цепи Ab-5:
Вариабельная область тяжелой цепи Ab-9:
Вариабельная область тяжелой цепи Ab-10:
2. Константная область тяжелой цепи каждого антитела может иметь одну из следующих последовательностей:
Константная область тяжелой цепи человеческого IgG4 (аминокислотные остатки K были удалены):
Константная область тяжелой цепи человеческого IgG4:
Константная область тяжелой цепи человеческого IgG2:
3. Вариабельная область легкой цепи: Вариабельная область легкой цепи Ab-5:
Вариабельная область легкой цепи Ab-9:
Вариабельная область легкой цепи Ab-10:
4. Константная область легкой цепи, полученная из человеческой κ-цепи:
Антитела клонировали, экспрессировали и очищали с помощью генетического клонирования и рекомбинантной экспрессии, и затем детектировали анализом связывания ELISA (Тестовый пример 1 и Тестовый пример 3), проводили исследование блокады связывания между антигеном и рецептором (Тестовый пример 2), Biacore (Тестовый пример 4), определение клеточной активности (Тестовый пример 5) и т.д., наконец, выбирали гуманизированные антитела Ab-5, Ab-9, Ab-10 с наилучшей активностью, и последовательности были представлены следующими:
Гуманизированное антитело Ab-10:
Тяжелая цепь:
Легкая цепь:
Гуманизированное антитело Ab-9:
Тяжелая цепь:
Легкая цепь:
Гуманизированное антитело Ab-5:
Тяжелая цепь:
Легкая цепь:
Данные по активности связывания между гуманизированным антителом к SOST человека и склеростином человека (h-SOST-Flag) в настоящем изобретении представлены в Таблице 4.
Тестовые примеры:
Оценка биоактивности in vitro
Тестовый пример 1: Анализ связывания ELISA
Антитело к склеростину блокирует связывание склеростина с его рецептором на клеточной мембране, блокируя тем самым передачу сигнала склеростином внутрь клетки. Эксперименты ELISA использовали для определения свойств связывания антител к склеростину. Склеростин с Flag-меткой (h-SOST-FLAG, кодируемый SEQ ID NO: 2) биотинилировали с помощью набора для мечения биотином (Dojido Chem, LK03) и иммобилизировали на 96-луночном EIA/RIA планшете посредством связывания со стрептавидином, покрывающим планшет. После добавления антитела величину сигнала использовали для определения активности связывания между антителом и склеростином человека.
2
4
Стрептавидин (Sigma, S4762-5MG) разбавляли до концентрации 5 мкг/мл буфером PBS при рН 7,4 (Sigma, Р4417-100ТАВ) и добавляли в 96-луночный EIA/RIA планшет (Corning,CLS3590-100EA) в объеме 50 мкл/лунку, и затем планшет инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 2 часов. После удаления жидкости планшеты блокировали блокирующим раствором в количестве 200 мкл/лунку, содержащим 5% обезжиренного молока (обезжиренное молоко Guangming) в PBS, и инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 2,5 часов или в течение ночи при 4°С (16-18 часов). После блокирования блокирующий раствор удаляли и планшет 5 раз промывали буфером PBST (РН7,4 PBS, содержащий 0,05% твин 20). Биотинилированный белок SOST-FLAG (R&D SYSTEM, 1505-LR-025) разбавляли буфером для разбавления образцов (РН7,4 PBS, содержащий 1%BSA (бычий сывороточный альбумин)) до 0,5 мкг/мл, и добавляли в каждую лунку в количестве 50 мкл/лунку, затем планшет инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 2 ч. После инкубации реакционный раствор удаляли из планшета, и промывали планшет PBST 6 раз, и затем добавляли 50 мкл/лунку антитела, градиентно разбавленного буфером для разбавления образцов, и планшет инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 2 ч. Планшет после инкубирования 6 раз промывали PBST, и затем добавляли 100 мкл/лунку HRP-меченого козьего антимышиного антитела (Jackson Immuno Research, кат. №115-035-003) или HRP-меченого козьего античеловеческого вторичного антитела (Jackson Immuno Research, кат. №109-035-003), разбавленного буфером для разбавления образцов, и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После 6-кратной промывки планшетов PBST в каждую лунку добавляли 50 мкл/лунку субстрата ТМВ (тетраметилбензидина) (KPL, кат. №52-00-03) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 мин, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 1М HSO. Значение OD (оптической плотности) при длине волны 450 нм считывали на ридере для микропланшетов NOVOStar, и затем рассчитывали значения ЕС50 связывания между антителом к склеростину по настоящему изобретению и склеростином человека, результаты приведены в Таблице 4.
Результаты демонстрируют, что гуманизированные антитела к SOST человека по настоящему изобретению сохраняют такую же активность связывания, как и исходное антитело.
Тестовый пример 2: Оценка блокады связывания склеростина с LRP-6 антителом к SOST
Склеростин способен ингибировать активность сигнального пути wnt/β-катенина посредством связывания с корецептором LRP5/LRP-6 сигнального пути wnt/β-катенина на клеточной мембране для блокады остеогенеза. В данном эксперименте активность блокады связывания между SOST человека/SOST обезьяны и LRP-6 человека отобранным антителом к SOST человека определяли с помощью оценки блокады in vitro. В качестве положительного контроля выступал ромосозумаб (способ получения соответствовал описанному в ссылке WHO Drug Information, Vol. 25, No. 4, 2011, 413-465, P434).
Способ заключается в том, что козье античеловеческое Fc-антитело наносили на 96-луночный EIA/RIA планшет и затем добавляли слитый белок LRP-6-Fc для инкубации. Биотинилированный белок склеростин и антитело к склеростину совместно инкубировали и затем добавляли в планшет для инкубации. После промывки планшета измеряли связывание между биотинилированным склеростином и LRP-6 и рассчитывали значение IC50 активности блокады для антитела к склеростину.
2
4
Козье античеловеческое Fc-антитело разбавляли до концентрации 1 мкг/мл буфером PBS с рН 7,4 (Sigma, Р4417-100ТАВ) и добавляли к 96-луночному EIA/RIA планшету в объеме 100 мкл/лунку, и затем инкубировали планшет при 37°С в течение 2 часов. После удаления жидкости планшеты блокировали 200 мкл/лунку блокирующего раствора, содержащего 5% обезжиренного молока (обезжиренное молоко Guangming) в PBS, и инкубировали при 37°С в течение 2,5 часов. После блокирования блокирующий раствор удаляли, и планшет 5 раз промывали буфером PBST (РН7,4 PBS, содержащий 0,05% твин 20). Слитый белок LPR-6-Fc (R&D SYSTEM, 1505-LRP-025) разбавляли буфером для разбавления образцов (РН7,4 PBS, содержащий 1% BSA) до 1 мкг/мл и добавляли в количестве 50 мкл/лунку, затем планшет инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Белок склеростин человека (R&D SYSTEM, 1406-ST/CF) в концентрации 1,12 мкг/мл метили с помощью набора для мечения биотином (Dojido Chemical, LK03) и добавляли в планшет для разбавления в объеме 30 мкл/лунку, и в каждую лунку добавляли 30 мкл/лунку исследуемого антитела к склеростину, разбавленного до подходящей концентрации, затем проводили смешивание и инкубировали планшет в инкубаторе при 37°С в течение 2 ч. После инкубации реакционный раствор удаляли из планшета. Планшет 6 раз промывали PBST, и затем к планшету добавляли смесь антигена и антитела в планшете для разбавления и инкубировали при 4°С в течение ночи (16-18 ч). Раствор удаляли из планшета и 6 раз промывали планшет PBST; затем в каждую лунку добавляли 50 мкл/лунку полимера стрептавидин-пероксидазы (Sigma, S2438-250UG), разбавленного буфером для разбавления образцов в соотношении 1:600, и инкубировали планшет при 37°С в течение 1 ч. После 6-кратной промывки планшетов PBST в каждую лунку добавляли 50 мкл/лунку субстрата ТМВ (KPL, кат. №52-00-03) и инкубировали при комнатной температуре в течение 3-10 мин, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 1М HSO. Значение OD при длине волны 450 нм считывали на ридере для микропланшетов NOVOStar, и затем рассчитывали значения IC50 блокады связывания между склеростином человека и LRP-6 для антитела к склеростину, результаты представлены в Таблице 5.
Вышеуказанный способ может применяться для определения значений IC 50 блокады связывания между склеростином обезьяны (кодируемым и выраженным SEQ ID NO: 4 и затем очищенным) и LRP-6 для антитела к склеростину по настоящему изобретению, результаты представлены в Таблице 5.
Результаты демонстрируют, что блокирующая активность гуманизированного антитела к SOST человека по настоящему изобретению в отношении блокады связывания между склеростином человека/обезьяны и LRP-6 сравнима с такой активностью для антитела положительного контроля ромосозумаба.
Тестовый пример 3: Определение с помощью Biacore
Для определения аффинности гуманизированного антитела к SOST с SOST человека, обезьяны, мыши, использовали систему компании Biacore (GE).
Захватывающее античеловеческое антитело ковалентно связывали с биосенсорным чипом СМ5 (кат. №BR-1000 -12, GE) прибора Biacore (Biacore X100, GE) согласно способу, описанному в инструкции к набору для захвата человеческого антитела (GE, Cat.# BR-1008-39) для определения аффинности связывания определенного количества исследуемого антитела. Затем через поверхность биочипа пропускали градиент концентраций антигена SOST (SOST человека, R&D SYSTEM, кат. №1406-ST-025/CF, R&D; SOST обезьяны, cyno-SOST-Flag, полученный посредством очистки, кодируемый SEQ ID NO: 4 согласно Примеру 1; SOST мыши, m-SOST-Flag, полученный посредством очистки, кодируемый SEQ ID NO: 3 согласно Примеру 1). Реакционный сигнал регистрировали в реальном времени с помощью прибора Biacore (GE, BiacoreX100), получая кривые ассоциации и диссоциации. После завершения каждого цикла диссоциации в эксперименте биочип промывали и регенерировали раствором для регенерации из набора для захвата человеческого антитела. Набор аминного связывания, использованный в экспериментах, был приобретен в GE (кат. №BR-1000-50, GE), и буфер представлял собой HBS-EP + 10 × буферный раствор (кат. №BR-1006-69, GE), и буфер разбавляли до 1 × (рН 7,4) деионизованной водой.
Полученные данные аппроксимировали к модели Ленгмюра для связывания 1:1 с помощью программного обеспечения GE BIAevaluation версии 4.1, и получали величину аффинности, результаты представлены в Таблице 6.
Примечание: «отсутствует» означает, что активность блокады не была обнаружена.
Гуманизированное антитело Ab-5 по настоящему изобретению обладает высокой аффинностью с SOST человека и SOST обезьяны, и эта аффинность более чем в 10 раз выше по сравнению с молекулой положительного контроля.
Тестовый пример 4: Исследование активности антитела к склеростину в отношении клеток
В данном исследовании оценивали in vitro активность SOST антитела по настоящему изобретению в отношении клеток в соответствии со значением ЕС50 посредством определения активности щелочной фосфатазы (ALP) в клетках.
4
3
2
2
Клетки С2С12 (Китайская Академия наук, банк клеточных культур, каталожный №GNM26) культивировали в среде DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко), содержащей 10% FBS, и пересевали от 2 до 3 раз в неделю в соотношении 1:5 или 1:10. Во время пересева культуральную среду удаляли и использовали 5 мл 0,25% трипсина для промывания клеточного слоя, и затем трипсин удаляли. Клетки расщепляли в инкубаторе в течение 3-5 минут и ресуспендировали в свежей среде. В 96-луночный культуральный планшет добавляли 100 мкл клеточной суспензии с плотностью 5×10 клеток/мл, среда представляла собой среду DMEM, содержащую 10% FBS, и только 100 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS, добавляли снаружи 96-луночного планшета. Затем культуральные планшеты культивировали в инкубаторе в течение 24 часов (37°С, 5% СО). Как только наблюдалась клеточная адгезия, среду удаляли; и в каждую лунку добавляли 70 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS. В каждую лунку добавляли 10 мкл of wnt3a (R&D, каталожный №5036-WN-010) в конечной концентрации 100 нг/мл и SOST (R&D, каталожный №1406-ST-025) в конечной концентрации 5 мкг/мл, соответственно. Исследуемые образцы разбавляли PBS с получением градиентов различных концентраций, и по 10 мкл различных концентраций исследуемого образца добавляли в культуральный планшет. Затем культуральный планшет инкубировали в инкубаторе в течение трех дней (37°С, 5% СО). Среду удаляли и в каждую лунку добавляли 150 мкл субстрата ALP, и инкубировали культуральный планшет в инкубаторе в течение 2 ч. Значение OD при длине волны 450 нм считывали на ридере для микропланшетов (PerkinElmer, каталожный №VICTOR), и затем рассчитывали значения ЕС50, результаты представлены в Таблице 7.
Результаты демонстрируют, что активность гуманизированного SOST антитела Ab-5 по настоящему изобретению в отношении воздействия на клетки сравнима с такой активностью для антитела положительного контроля ромосозумаба.
Оценка фармакокинетики
Тестовый пример 5: Оценка Т1/2 гуманизированного антитела к SOST у яванского макака
Три яванских макака, использованные в эксперименте, были самками, возрастом 4-5 лет, менее 4 кг, и были приобретены у Guangxi Guidong Primate Breeding Development Co., Ltd. Условия кормления: общая комната. После приобретения яванских макак каждую обезьяну держали в отдельной клетке, и обезьянам был предоставлен неограниченный доступ к воде и пище. Продолжительность адаптации к лабораторным условиям составляла не менее 14 дней, в условиях цикла 12/12 часов света/темноты, при температуре 23-29°С и относительной влажности 40-70%. Перед началом эксперимента три яванских макака были пронумерованы. В день эксперимента каждому яванскому макаку подкожно вводили исследуемое лекарственное средство или молекулу положительного контроля (30 мг/кг) в количестве 8 мл/обезьяну/введение.
Обезьян фиксировали на стуле-фиксаторе для обезьян и брали кровь из локтевой вены или подкожной вены (около 1,5 мл крови на каждый отбор пробы) для получения сыворотки, которую хранили при -20 градусах. Отбор проб крови осуществляли: за 12 ч до введения, через 1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч, 12 ч, 24 ч (второй день) после введения в первый день, третий день, пятый день, седьмой день, четырнадцатый день, двадцать первый день и двадцать восьмой день. После того, как пробы крови были собраны, была определена концентрация лекарственного средства в сыворотке с помощью ELISA, и был проведен ФК (фармакокинетический) анализ, результаты представлены в Таблице 8.
Результаты демонстрируют, что рассматриваемые гуманизированные молекулы обладают более длительным периодом полувыведения у яванского макака in vivo, что приблизительно в два раза (Ab-5) больше, чем для молекулы положительного контроля ромосозумаба.
Оценка биологической активности in vivo
Тестовый пример 6: Оценка эффективности гуманизированного антитела к SOST у яванского макака in vivo
Три яванских макака, использованные в эксперименте, были самками, возрастом 4-5 лет, менее 4 кг, и были приобретены у Guangxi Guidong Primate Breeding Development Co., Ltd. Условия кормления: общая комната. После приобретения яванских макак каждую обезьяну держали в отдельной клетке, и обезьянам был предоставлен неограниченный доступ к воде и пище. Продолжительность адаптации к лабораторным условиям составляла не менее 14 дней, в условиях цикла 12/12 часов света/темноты, при температуре 23-29°С и относительной влажности 40-70%. За день до начала эксперимента три яванских макака были пронумерованы, и после анестезии проводили забор крови для получения сыворотки и плазмы, и исследовали минеральную плотность костей и минеральное содержание костей поясничного отдела позвоночника и дистального отдела лучевой кости, полученное значение использовали в качестве базового. Каждому яванскому макаку подкожно инъецировали исследуемое лекарственное средство (10, 30, 60 мг/кг, различные дозы) и молекулы положительного контроля (30 мг/кг) в количестве 8 мл/обезьяну/введение. Лекарственные средства вводили раз в месяц, всего 2 раза. В ходе эксперимента, на четвертую и восьмую недели после введения, исследовали минеральную плотность костей и минеральное содержание костей поясничного позвонка и дистального отдела лучевой кости животных, соответственно.
По прошествии двух месяцев с начала эксперимента животных анестезировали и усыпляли (избыточной дозой пентобарбитала натрия). После этого исследовали минеральную плотность костей и минеральное содержание костей со второго по пятый поясничных позвонков и дистального отдела лучевой кости.
Результаты представлены в Таблице 9, на Фиг. 1 и Фиг. 2.
0-t
Результаты демонстрируют, что эффективность гуманизированного антитела к SOST по настоящему изобретению у яванского макака in vivo была дозозависимой. Эффективность гуманизированного антитела к SOST Ab-5 в дозе 10 мг/кг была равна эффективности молекулы положительного контроля в дозе 30 мг/кг (Фиг. 2). Это означает, что эффективность гуманизированного антитела к SOST по настоящему изобретению у обезьяны в два раза выше, чем молекулы положительного контроля ромосозумаба. При введении в одной и той же дозе AUC (мг/мл*сутки) гуманизированного антитела составила 22,3, что более чем в 2 раза больше, чем у молекулы положительного контроля ромосозумаба (9,95) (см. Фиг. 1).
Исследование растворимости
Тестовый пример 7: Растворимость гуманизированного антитела к SOST
Для определения растворимости гуманизированного антитела к SOST определяли содержания растворимых мономеров антитела, осадка и содержание полимера для антитела Ab-5 и антитела положительного контроля ромосозумаба в возрастающем градиенте концентраций. В исследовании начальная концентрация антитела составила 10 мг/мл, которую растворяли в буфере PBS с РН7,4. Образцы центрифугировали в ультрафильтрационном концентраторе (Millipore, Amicon Ultra-15 50K) при 4 градусах, при 4000 об./мин. Во время центрифугирования образцы отбирали с интервалом в 5-10 минут, и определяли концентрацию антитела до тех пор, пока она не достигла 30 мг/мл и 90 мг/мл. Образцы с различной концентрацией отбирали и подвергали анализу эксклюзионной ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), соответственно, результаты представлены в Таблице 10.
Вышеуказанные результаты демонстрируют, что при концентрации антитела по изобретению, составлявшей до 90 мг/мл, раствор все еще был прозрачным и не имел осадка, и количество мономера антитела не изменилось. Однако для молекулы положительного контроля в такой же концентрации наблюдалось массовое образование осадка, и количество мономера антитела снизилось с 95,8% до 92%.
Оценка стабильности
Тестовый пример 8: Стабильность гуманизированного антитела к SOST
Для исследования стабильности гуманизированного антитела к SOST по настоящему изобретению антитело Ab-5 и антитело положительного контроля ромосозумаб помещали в буфер PBS с рН 7,4 при 4 градусах на 7 дней. Для определения стабильности использовали два способа: один заключался в оценке количества образованного нерастворимого осадка, видимого невооруженным глазом, и расчете изменения концентрации нерастворимого осадка до и после помещения; другой способ заключался в исследовании изменений содержания растворимых мономеров антитела в образце посредством эксклюзионной ВЭЖХ. Исходная концентрация антитела составила 30 мг/мл, что являлось наивысшей возможной концентрацией раствора антитела положительного контроля. Результаты представлены в таблице 11.
Вышеуказанные результаты демонстрируют, что антитело положительного контроля образовало 19,3% осадка, и снижение количества мономеров антитела наблюдалось через 7 дней помещения, даже если антитело положительного контроля не образует осадок в начальной точке его достижимой концентрации (30 мг/мл). Тогда как антитело по настоящему изобретению было очень стабильным, не образовывало какого-либо осадка, и раствор был прозрачным.
Учитывая полученные результаты для растворимости и стабильности, антитело по настоящему изобретению обладает лучшими характеристиками, чем антитело положительного контроля, с точки зрения получения препарата антитела. Он может быть получен в высокой концентрации, такой как 90 мг/мл, оставаясь при этом стабильным.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD; SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.
<120> АНТИТЕЛО К СКЛЕРОСТИНУ, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
<130>
<160>  29
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  657
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  DNA sequence encoding human sclerostin with Histag (His-h-SOST)
<400>  1
atggacatga gggtgcctgc ccaactgctg ggcctgttgt tgctttggtt ccccggaagc     60
aggtgccatc atcaccacca tcatcagggc tggcaggcct tcaagaacga cgcaaccgag    120
attatccccg aactgggcga atatcccgag ccccctccag agctggagaa taacaagacc    180
atgaacaggg ccgagaacgg cggcagaccc ccccatcatc ccttcgagac taaagacgtg    240
agcgagtaca gctgcaggga gctgcatttc accaggtacg tgaccgatgg cccctgtagg    300
agcgccaagc ccgtgactga actggtgtgc agcggccagt gcggtccggc cagactgctg    360
ccgaacgcta tcggcagggg caagtggtgg aggccctctg gacccgactt caggtgcata    420
cccgacaggt accgcgctca gagagtgcaa ctgttgtgtc ctgggggcga ggctccgagg    480
gcgcgaaagg tgaggctggt ggccagttgt aagtgcaaga ggctgaccag gttccacaac    540
cagagcgagc tgaaggactt cggcaccgaa gcagccaggc cgcagaaggg caggaagccc    600
aggccacgag cacgatccgc caaagccaat caggcagagc tcgagaatgc ctactga       657
<210>  2
<211>  663
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  DNA sequence encoding human sclerostin with Flagtag (h-SOST-Flag)
<400>  2
atggacatga gggtgcctgc ccaactgctg ggcctgttgt tgctttggtt ccccggaagc     60
aggtgccagg gctggcaggc cttcaagaac gacgcaaccg agattatccc cgaactgggc    120
gaatatcccg agccccctcc agagctggag aataacaaga ccatgaacag ggccgagaac    180
ggcggcagac ccccccatca tcccttcgag actaaagacg tgagcgagta cagctgcagg    240
gagctgcatt tcaccaggta cgtgaccgat ggcccctgta ggagcgccaa gcccgtgact    300
gaactggtgt gcagcggcca gtgcggtccg gccagactgc tgccgaacgc tatcggcagg    360
ggcaagtggt ggaggccctc tggacccgac ttcaggtgca tacccgacag gtaccgcgct    420
cagagagtgc aactgttgtg tcctgggggc gaggctccga gggcgcgaaa ggtgaggctg    480
gtggccagtt gtaagtgcaa gaggctgacc aggttccaca accagagcga gctgaaggac    540
ttcggcaccg aagcagccag gccgcagaag ggcaggaagc ccaggccacg agcacgatcc    600
gccaaagcca atcaggcaga gctcgagaat gcctacgact acaaggatga cgacgacaag    660
tga                                                                  663
<210>  3
<211>  657
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  DNA sequence encoding mouse sclerostin with Flagtag (m-SOST-Flag)
<400>  3
atggacatga gggtgcctgc ccaactgctg ggcctgttgt tgctttggtt ccccggaagc     60
aggtgccagg gctggcaggc cttcaggaac gacgcaaccg aggtgatccc cggactgggc    120
gaatatcccg agccccctcc agagaataac cagaccatga acagggccga gaacggcggc    180
agaccccccc atcatcccta cgacgctaaa ggcgtgagcg agtacagctg cagggagctg    240
cattacacca ggttcctgac cgatggcccc tgtaggagcg ccaagcccgt gactgaactg    300
gtgtgcagcg gccagtgcgg tccggccaga ctgctgccga acgctatcgg cagggtcaag    360
tggtggaggc ccaacggacc cgacttcagg tgcatacccg acaggtaccg cgctcagaga    420
gtgcaactgt tgtgtcctgg gggcgccgct ccgaggagcc gaaaggtgag gctggtggcc    480
agttgtaagt gcaagaggct gaccaggttc cacaaccaga gcgagctgaa ggacttcggc    540
cccgaaacag ccaggccgca gaagggcagg aagcccaggc caggagcacg aggagccaaa    600
gccaatcagg cagagctcga gaatgcctac gactacaagg atgacgacga caagtga       657
<210>  4
<211>  663
<212>  DNA
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  DNA sequence encoding cyno sclerostin with Flagtag(cyno-SOST-Flag)
<400>  4
atggacatga gggtgcctgc ccaactgctg ggcctgttgt tgctttggtt ccccggaagc     60
aggtgccagg gctggcaggc cttcaagaac gacgcaaccg agattatccc cgaactgggc    120
gaatatcccg agccccctcc agagctggag aataacaaga ccatgaacag ggccgagaac    180
ggcggcagac ccccccatca tcccttcgag actaaagacg tgagcgagta cagctgcagg    240
gagctgcatt tcaccaggta cgtgaccgat ggccagtgta ggagcgccaa gcccgtgact    300
gaactggtgt gcagcggcca gtgcggtccg gccagactgc tgccgaacgc tatcggcagg    360
ggcaagtggt ggaggccctc tggacccgac ttcaggtgca tacccgacag gtaccgcgct    420
cagagagtgc aactgttgtg tcctgggggc gccgctccga gggcgcgaaa ggtgaggctg    480
gtggccagtt gtaagtgcaa gaggctgacc aggttccaca accagagcga gctgaaggac    540
ttcggccccg aagcagccag gccgcagaag ggcaggaagc ccaggccacg agcacgagga    600
gccaaagcca atcaggcaga gctcgagaat gcctacgact acaaggatga cgacgacaag    660
tga                                                                  663
<210>  5
<211>  117
<212>  PRT
<213>  murine
<400>  5
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Gln Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Asn Leu Asp Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Leu Thr Ile Ser Ser
115
<210>  6
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Murine
<400>  6
Asn Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Leu Leu Phe Val Ser Ala Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  7
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Murine
<400>  7
Asp Tyr Asn Leu Asp
1               5
<210>  8
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Murine
<400>  8
Asp Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1               5                   10                  15
Asp
<210>  9
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Murine
<400>  9
Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>  10
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Murine
<400>  10
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala
1               5                   10
<210>  11
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Murine
<400>  11
Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr
1               5
<210>  12
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Murine
<400>  12
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val Thr
1               5
<210>  13
<211>  17
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  HCDR2 Mutant
<400>  13
Asp Ile Asp Pro Asn Asp Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1               5                   10                  15
Asp
<210>  14
<211>  117
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Heavy chain variable region of Ab-5
<400>  14
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Asn Leu Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  15
<211>  117
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Heavy chain variable region of Ab-9
<400>  15
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Asn Leu Asp Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  16
<211>  117
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Heavy chain variable region of Ab-10
<400>  16
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Asn Leu Asp Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asp Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  17
<211>  107
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Light chain variable region of Ab-5
<400>  17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  18
<211>  107
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Light chain variable region of Ab-9
<400>  18
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  19
<211>  107
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Light chain variable region of Ab-10
<400>  19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  20
<211>  326
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210>  21
<211>  327
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  21
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210>  22
<211>  330
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  23
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  23
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210>  24
<211>  447
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Humanized antibody heavy chain of Ab-10
<400>  24
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Asn Leu Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115                 120                 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180                 185                 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210                 215                 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260                 265                 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340                 345                 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405                 410                 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  25
<211>  444
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Humanized antibody heavy chain of Ab-9
<400>  25
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Asn Leu Asp Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asn Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115                 120                 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180                 185                 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210                 215                 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225                 230                 235                 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245                 250                 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260                 265                 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275                 280                 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290                 295                 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305                 310                 315                 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325                 330                 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340                 345                 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355                 360                 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370                 375                 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385                 390                 395                 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405                 410                 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420                 425                 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435                 440
<210>  26
<211>  443
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Humanized antibody heavy chain of Ab-5
<400>  26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Asn Leu Asp Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Ile Asp Pro Asn Asp Gly Asp Ile Leu Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Trp Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115                 120                 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180                 185                 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210                 215                 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225                 230                 235                 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245                 250                 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260                 265                 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275                 280                 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290                 295                 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305                 310                 315                 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325                 330                 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340                 345                 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355                 360                 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370                 375                 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385                 390                 395                 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405                 410                 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420                 425                 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435                 440
<210>  27
<211>  214
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Humanized antibody light chain of Ab-10
<400>  27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  28
<211>  214
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Humanized antibody light chain of Ab-9
<400>  28
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  29
<211>  214
<212>  PRT
<213>  artificial sequence
<220>
<223>  Humanized antibody light chain of Ab-5
<400>  29
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Val
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<---