МИКРОКОНТЕЙНЕРЫ ДЛЯ ЗАЩИТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ
MICROCONTAINERS FOR PROTECTION OF MICROORGANISMS FOR AGRICULTURE

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение предлагает способ повышения жизнеспособности микроорганизмов, являющихся действующим веществом в пестицидах, родентицидах, инсектицидах, и иных препаратах для борьбы с вредителями (например, грызунами в санитарно-эпидемиологической практике), а также агрохимикатах, путем помещения данных микроорганизмов в защитные микроконтейнеры, и предназначено для использования в промышленности, сельском хозяйстве, садоводстве и лесоводстве.
Уровень техники
Из уровня техники известны биологические препараты для борьбы с различными вредителями, в которых в качестве действующих веществ используются различные виды микроорганизмов: грибы, бактерии, вирусы, стрептомицеты.
В частности, известен препарат «Ризоплан», с действующим веществом - бактериями Pseudomonasfluorescens, который используется в качестве пестицида и фунгицида против гельминтоспориозной гнили, мучнистой росы, бурой ржавчины, пятнистостей, фитофтороза картофеля, серой и плодовой гнилей на плодовых и ягодниках, черной ножки, слизистого и сосудистого бактериозов капусты. Выпускается в виде жидкости с концентрацией 1 млрд КОЕ/мл. В настоящее время известен препарат «Биостоп», содержащий Bacillusthuringiensis, Streptomycessp. и Beauveriabassiana, обладает избирательным действием в отношении широкого спектра вредных чешуекрылых. Также выпускается в виде жидкости. Таким образом, существуют различные пестициды и фунгициды с биологическими или бактериальными препаратами.
Вместе с тем, известны недостатки таких биологических препаратов.
Так, при применении биологических препаратов в полевых условиях (путем распыления рабочего раствора или непосредственно препарата на защищаемые объекты) под воздействием ультрафиолета (солнечный свет) и иных неблагоприятных факторов, например, осадков или ветра, значительная часть полезных микроорганизмов либо погибает, либо смывается в течение первых суток с обработанных поверхностей, что снижает эффективность действия препаратов и вынуждает повышать дозировку или требует дополнительной или повторной обработки.
Кроме того, биологические препараты имеют ограниченный срок хранения, связанный с относительно коротким периодом сохранения полезными микроорганизмами в активном состоянии своей жизнеспособности, а также требуют специальных условий хранения (прежде всего по температуре), что не всегда возможно обеспечить в полевых условиях. Например, указанные выше препараты Ризоплан и Биостоп имеют срок хранения 3 месяца при температуре от 4 до 10°С. Все это накладывает существенные ограничения по использованию.
Известны способы повышения срока хранения препаратов путем перевода микроорганизмов в состояние анабиоза за счет высушивания. Однако существующие способы сушки культуральной жидкости либо связаны с значительными потерями полезных микроорганизмов. Например, при сушке в распылительной сушилке производственные потери могут составлять до 50% от исходного количества сырья. В случае лиофилизации биологических препаратов, которые содержат значительное количество влаги, этот процесс сопряжен со значительными энергозатратами и объемами производственных помещений. Отдельно может возникать проблема повреждения и гибели бактериальных препаратов при лиофилизации.
Известны исследования введения в биологические пестициды наполнителей как протекторов микрорганизмов. В нескольких исследованиях показана перспективность использования таких наполнителей, как глины, гуматы, активированный уголь, диоксид титана, оксид цинка, флюорисцентные отбеливатели (Tinopal LPW, Blankophor BSU), растительные и минеральные масла, меласса, сухое молоко, яичный альбумин и др. См., напримерработы: Inglis G.D., Goettel M.S., Johnson D.L. Influence of ultraviolet light protectants on persistence of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana II Biol. Contr. 1995. V 5. № 4. P. 581-590, Edgington S., Segura H., de La Rosa W., Williams T. Photoprotection of Beauveria bassiana: testing simple formulations for control of the coffee berry borer // Int. J. Pest Manag. 2000. V. 46. № 3. P. 169-176; Kassa A. Development and testing of mycoinsecticides based on submerged spores and aerial conidia of the ento-mopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhiziumanisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes) for control of locusts, grasshoppers and storage pests. Doctoral diss. GOttingen: Georg-August-University, 2003. 170 p.; Inglis G.D., Goettel M.S., Eriandson M.A., Weaver D.K. Grasshoppers and locusts // Field manual of techniques in invertebrate pathology. Application and evaluation of pathogens for control of insects and other invertebrate pests. Springer, 2007. P. 627-654.
Данные протекторы могут различаться по своей эффективности в зависимости от видов используемых микроорганизмов, целевых объектов и среды их обитания, т.е. не отличаются универсальностью.
Известно использование в пестицидах различных микрокапсул, состоящих из оболочки и ядра, содержащего как химические пестициды и иные химические вещества (патенты № 2126628, 2518449, 2496483, 2516357, 2488437, 2602196), так и живые микроорганизмы (патент № 2220716). Данные микрокапсулы потенциально способны выполнить роль протекторов; однако микрокапсулы при применении в биологических пестицидах не дают возможности высушить препарат, переведя микроорганизмы из активного состояния в состояние анабиоза (т.е. увеличить срок хранения препарата), значительная часть способов получения микрокапсул не применимы к биологическим препаратам, так как предполагают проведение реакции в агрессивной для микроорганизмов среде, не способны обеспечить немедленное действие препарата (необходимо время на разрушение оболочки), в силу значительного диаметра (более 50 мкм) не могут быть применены в современных системах опрыскивания (УМО).
Наиболее близким аналогом является изобретение, раскрытое в патенте RU 2581929, предлагающее способ получения биопестицида, включающий введение биологически-активной суспензии в виде спор энтомопатогенных грибов и жидкой фазы в микроконтейнеры, представляющие собой пустотелые емкости, в виде оболочки из синтетического полимерного материала, по меньшей мере, с одним отверстием для введения спор, декантацию жидкой фазы и высушивание при температуре 25÷45°С микроконтейнеров вместе со спорами энтомопатогенных грибов в проточных условиях до постоянного веса,  также способ защиты растений от вредителей, включающий активацию биопестицида в водной среде и нанесение названного препарата на растения. При этом микроконтейнер полностью защищает биопестицид, находящийся в нем, от вредного УФ-излучения, поддерживает необходимую внутри себя влажность для жизни микроорганизмов, защищает их от высоких температур, имеет пролонгированное заранее заданное время действия и хорошие "прилипающие" свойства.
При этом описанное в патенте RU2581929 изобретение предполагает использование в качестве действующего вещества только споры грибов, что ограничивает защитное действие биологического пестицида. Соответственно, настоящее изобретение направлено на дальнейшее развитие изобретения по патенту № 2581929 на основе определенных там принципов.
Техническое решение согласно настоящему изобретению позволяет расширить диапазон применения биопестицидов с микроконтейнерами в отношении более широкого спектра вредителей и болезней растений.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение предлагает микроконтейнер, представляющий собой пустотелую емкость размером до 40 мкм, имеющий по меньшей мере одно отверстие, содержащий в качестве действующего вещества живые микроорганизмы и/или их споры, либо зараженные вирусами клетки эукариотов, при этом живые микроорганизмы не включают споры грибов. При этом живые микроорганизмы и/или их споры выбраны из группы: спорообразующие и неспорообразующие бактерии; актиномицеты; стрептомицеты; конидии, мицелий и бластоспоры грибов; рикетсии; простейшие; зараженные вирусами клетки эукариотов, любая их часть, или смесь любой части из них или смесь указанных микроорганизмов. Также микроконтейнеры могут дополнительно содержать грибы, или их части, а также комбинации различных видов грибов. Также в состав веществ, помещенных в микроконтейнеры могут быть добавлены поверхностно-активные вещества (ПАВ) в виде ионогенных и неионогенных ПАВ.
Кроме того, настоящее изобретение предлагает применение микроконтейнеров для получения пестицида, агрохимиката или препарата для борьбы с вредителями и болезнями растений и семян. Также с помощью описанных микроконтейнеров может быть реализован способ защиты растений или семян, включающий нанесение путем опрыскивания раствором, который содержит предварительно разведённые в воде микроконтейнеры, как в рабочем растворе. Описанные микроконтейнеры также могут быть использованы в способе питания растений или семян, включающем нанесение микроконтейнеров путем опрыскивания, при этом микроконтейнеры предварительно разведены в воде как в рабочем растворе, или путем опудривания без предварительного разведения в воде. Также предложен способ регулирования плодородия почв, включающий нанесение микроконтейнеров путем опрыскивания, при этом микроконтейнеры предварительно разведены в воде как в рабочем растворе, или путем непосредственного внесения в почву без предварительного разведения в воде. Более того, с помощью микроконтейнеров можно приготовить приманку для борьбы с вредителями и получить родентициды. Также описанные микроконтейнеры можно применять для приготовления препаратов для приготовления препаратов для борьбы с болезнями растений.
9
Настоящее изобретение предлагает способ получения биопестицида путем добавления микроконтейнеров, полученных согласно патенту RU2581929, например, на основе полимочевины, или полученных иным способом, и представляющих собой пустотелые емкости, в виде оболочки из синтетического полимерного материала, по меньшей мере с одним отверстием, в культуральную жидкость с содержанием микроорганизмов - действующих веществ биологических пестицидов. Например, описанные микроконтейнеры помещают в ферментер в начале стандартного цикла процесса наращивания биомассы, в оптимальном соотношении 1 насыпной литр порошка микроконтейнеров на 3 литра культуральной жидкости (при титре 10 в конце процесса).
При этом микроорганизмами могут быть бактерии и их споры, например, бактерии рода Pseudomonas,Bacillus, SalmonellaBradyrhizobiumjaponicum, Azotobacter;стрептомицеты;конидии, бластоспоры и мицелий грибов; клетки эукариотов и поражающих их вирусов.
Полученную культуральную жидкость с микроконтейнерами фильтруют, а фильтрат высушивают в лиофильной, вакуумной или в распылительной сушилке до прекращения потери массы, либо оставляют в виде концентрата с добавлением ПАВ (ионогенных или неионогенных) в размере от 10 до 90% от отфильтрованной массы смеси культуральной жидкости и микроконтейнеров. При этом микроорганизмы переходят в состояние анабиоза, что увеличивает срок хранения биопестицида без потери свойств.
Материалами для микроконтейнеров могут быть природные или искусственные материалы. Например, в качестве искусственных материалов могут быть использованы подходящие полимерные материалы, например, полимочевина, полистиролы и их сополимеры, например, поли (стирол)-b-(поли(метилметалакрилат)-сополи(глицидальметакрилат) сополимер; (полистирол-b-(ПММА-со-ПГМА) и поли (метилметакрилат), полиакрилцианоакрилаты, полимеры и сополимеры полилактидов, производные полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, и другие. В качестве природных полимеров могут быть использованы целлюлоза и ее производные, например, метилцеллюлоза, метилпропилцеллюлоза, гидроксиметилпропилцеллюлоза и другие прозиводные, хитозан и его производные, декстран и циклодекстрин различных форм, альгинаты и их производные, глюканы и их производные, альбумин, желатин и его производные, агар и другие природные полимеры.
В дальнейшем полученный порошок или концентрат микроконтейнеров с конкретным видом микроорганизмов возможно комбинировать с аналогичными микроконтейнерами с другими микроорганизмами, получая сложносоставные (с несколькими действующими веществами) универсальные биопестициды с расширенным спектром действия на вредителей и болезни растений.
Перед применением биопестициды с микроконтейнерами могут быть активированы путем замачивания или разведения в воде, после чего находящиеся в анабиозе микроорганизмы переходят в активную фазу.
Предлагаемое изобретение будет проиллюстрировано примерами ниже. Данные примеры ни в коей мере не предназначены для ограничения объема изобретения.
Примеры
Пример 1
Получение микроконтейнеров
Пример 1а
В ферментер объемом 1000 л загружали питательную среду(уровень заполнения 65-70% от объема ферментера), например L-бульон, стерилизовали путем нагрева при 1-1,5 ати в течение 30-45 мин, затем охлаждали до температуры 25-28°С. После этого в среду в стерильных условиях заливали посевной материал, представляющий собой культуру клеток Bacillusthuringiensis. Клетки выращивали в течение 36-48 ч при непрерывном перемешивании и аэрации (1-1,5 л воздуха на 1 л среды) до высыпания бактериальных спор на уровне 70-80%. Затем процесс культивирования останавливали, клетки отфильтровывали на микрофильтре. Полученный концентрат смешивали с микроконтейнерами в соотношении 1:1, перемешивают непрерывно в течение 1-2 ч и сушили в распылительной сушилке при температуре входящего воздуха 130-150°С, выходящего воздуха - 60-70°С.
Пример 1б
Далее в ферментер объемом 1000 л загружали питательную среду (уровень заполнения 65-70% от объема ферментера), например, L-бульон, стерилизовали путем нагрева при 1-1,5 ати в течение 30-45 минут, затем охлаждали до температуры 25-28°С, после чего в среду стерильно заливали посевной материал, представляющий собой культуру клеток Streptomycessp. Клетки выращивали в течение 48 часов при непрерывном перемешивании и аэрации (1л воздуха на 1 л среды). Затем процесс культивирования останавливали, клетки концентрировали путем седиментации в центробежном поле. Полученный концентрат смешивали с микроконтейнерами в соотношении 1:2-1:3, перемешивали непрерывно в течение 1-2 часов и отфильтровывали на нутч-фильтре до получения массы, похожей на мокрый песок. Данную массу высушивали лиофильно или на роторной сушилке под вакуумом.
Порошки микрокапсул, полученных в примере 1а и 1б смешивали в соотношении 1:1, с получением универсального пестицида широкого спектра действия (далее - опытный пестицид).
Проведенные с ним полевые испытания позволили выявить следующее.
Пример 2
Испытания на активность
11-13
8-10
Посадки сои (Краснодарский край) с концентрацией хлопковой совки, превышающей экономический порог вредоносности в 7-8 раз(10-12 гусениц на 10 растений), обрабатывали пестицидом Биостоп, с расходом 3 л на 1 га (общий титр 10 КОЕ на гектар), содержащим те же действующие вещества, что и опытный пестицид (Биостоп Супер), с расходом 50 и 100 г на гектар (общий титр 10 КОЕ на гектар), предварительно растворенном в воде (3 л на гектар). Температура наружного воздуха была 29°С, погода стояла солнечная. Пестициды наносили распылителем с помощью опрыскивателя ОП-2000.
Через 8 дней получены следующие результаты:
ПовторностьЭксперимента, Стадия вредителя
Участок 1,Биостоп (3 л/га),выжившие вредители, на 10 растений
Участок 2,Опытный пестицид(50 г/га), выжившие вредители, на 10 растений
Участок 3,Опытный пестицид(100 г/га),выжившие вредители, на 10 растений
Личинки 1-3-го возраста
2
2
1
Личинки 1-3-го возраста
3
2
0
Личинки 1-3-го возраста
3
3
1
Как видно, опытный пестицид активнее контрольного. Более того, при повышении концентрации возрастает эффективность применяемого пестицида.
Пример 3
Испытания на активность
Посадки рапса (Рязанская область) с концентрацией рапсового листоеда 8-9 жуков на 1 кв. м (что превышает экономический порог вредоносности в 3-5 раз), обрабатывали пестицидом Биостоп с расходом3 л на 1 га, содержащим те же действующие вещества, что и опытный пестицид Биостоп Супер, с расходом 50 и 100 г на гектар, предварительно растворенном в воде как рабочей жидкости (расход 3 л на гектар). Температура наружного воздуха была 23°С, погода стояла пасмурная. Для нанесения пестицида использовали опрыскиватель ОП-2000.
Через 8 дней получены следующие результаты:
ПовторностьЭксперимента, Стадия вредителя
Участок 1,Биостоп (3 л/га),выжившие вредители, на 1 м<sup>2</sup>
Участок 2,Опытный пестицид(50 г/га), выжившие вредители, на 1 м<sup>2</sup>
Участок 3,Опытный пестицид(100 г/га),выжившие вредители, на 1 м<sup>2</sup>
Личинки 1-3-го возраста
2
2
1
Личинки 1-3-го возраста
1
2
0
Личинки 1-3-го возраста
2
2
0
Как видно, опытный пестицид обладает большей эффективностью, чем контрольный.
Пример 4
Испытания на стабильность
Проводили испытания на стабильность и срок хранения.
Пестициды, полученные в примерах 1а, 1б, а также пестицид Биостоп без микроконтейнеров хранили в светлом помещении, при температуре 20°С, имитируя солнечные погодные условия.
После хранения в течение каждых 6 мес. в течение 2 лет проводили вскрытие части микроконтейнеров и проводили испытания на активность бактерий. Как показали испытания, в течение 2 лет бактерии в микроконтейнерах сохранили практически 100% активность по сравнению с исходными показателями активности, в то время как бактерии без микроконтейнеров за 2 года полностью потеряли свои свойства.
Использование микроконтейнеров приводит к значительному уменьшению расхода действующего вещества при сохранении эффективности, что особенно важно при работе летом в солнечную и жаркую погоду.
Пример 5
В ферментер объемом 1000 л загружали питательную среду, бедную по источнику азота, при этом содержащую 10 г/л маннозы, 2 г/л фосфата натрия двузамещенного, 5 г/л натрия хлористого. Смесь готовили способом, описанном в примере 1а и 1б. Засевали аппарат азотофиксирующими организмами Bradyrhizobium (или Azotobacter), культивировали аналогично примеру 1а и 1б. Далее процесс седиментации, фильтрации и сушки проводили аналогично примеру 1а и 1б.
Если культура в процессе роста выделяла много полисахарида и становилась достаточно вязкой, то после остановки ферментации культуру смешивали без седиментации с микроконтейнерами в соотношении 1:1, перемешивали 3-4 ч и фильтровали на нутч-фильтре. Полученную отфильтрованную массу отправляли на лиофильную сушку.
Пример 6
Применение микроконтейнеров
Полученную сухую массу азотофиксирующих микроорганизмов (Bradyrhizobium), полученную согласно примеру 5, в количестве 1 кг смешивали с сухим поверхностно-активным веществом (ПАВ) в количестве 100 г или жидким ПАВ в количестве 500 мл, разводили в 10 л воды. Полученным раствором производили обработку семян бобовых (сои) из расчета: 10 л полученного разбавленного раствора на тонну сои. После обработки семян сою складировали на несколько месяцев и использовали при посеве без дополнительной инокуляции.
Вариант опыта
Урожайность по повторностям, ц/га
Средняя урожайность, ц/га
Bradyrhizobium с микроконтейнерами, обработка за 2 месяца до посева
23,1
22,9
24,2
23,7
23,5
116,9
Контроль
19,7
20,3
19,5
20,8
20,1
100
Данный метод применения азотофиксаторов в микроконтейнерах позволял проводить обработку семян азотофиксаторами (азотфиксирующими бактериями) заблаговременно, а не непосредственно перед посевом.
Соответственно, техническое решение согласно настоящему изобретению позволяет:
1. Снизить воздействие прямого УФ-излучения на микроорганизмы за счет помещения их внутрь микроконтейнера, стенка которого выступает защитным барьером, за счет чего можно значительно повысить их выживаемость;
2. Снизить бактериальную нагрузку за защищаемые растения (на Участках 2 и 3 в сравнении с Участками 1 и 1 соответственно в 1000 раз (расчет соотношений титра КОЕ на гектар), при сохранении и достижении лучшей эффективности в отношении уничтожения вредителей;
3. Продлить защитное действие опытного пестицида, что позволяет сократить кратность обработок;
4. Увеличить срок хранения пестицидов (2 года у опытного пестицида по сравнению с 6 месяцами у аналогичного ему биопестицида Биостоп, без микроконтейнеров);
5. Увеличить срок хранения семян, обработанных агрохимикатом.