Способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов
METHOD OF ASSESSING THE MORPHOLOGICAL STRUCTURE OF BIOFILMS OF MICROORGANISMS

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, инфекционным болезням, дезинфектологии и может быть использовано для изучения действия химических веществ и физических факторов на биопленку и биопленкообразующую способность разных микроорганизмов.
Биопленки - высокоорганизованные, подвижные, непрерывно изменяющиеся гетерогенные сообщества микроорганизмов, состоящие, как правило, из клеточной части и, преимущественно полисахаридного, матрикса, обеспечивающего защиту от неблагоприятных внешних факторов, в том числе эффекторов иммунитета и антибиотиков (Сидоренко С.В. и соавт., 2017). Существующие методы визуализации биопленки не предусматривают дифференцированной окраски ее компонентов, т.к. нет возможности установить субстрат, окрашиваемый, например генцианвиолетом, поскольку этот краситель может формировать комплексы, как с внутриклеточными, так и внеклеточными структурами. В целом, имеющиеся подходы не позволяют адекватно оценивать антибиопленочные эффекты препаратов, в то время как результаты изучения взаимодействия лекарственных средств с компонентами биопленки могут обеспечивать их наиболее корректный выбор.
Известен способ оценки биопленокоообразующей способности микроорганизмов при экспозиции в течение 40 минут в 0,1% водном растворе генцианвиолета с последующей его экстракцией спиртом в течение 10 минут [O'Toole, G.A. Microtiter dish biofilm formation assay. J. Vis. Exp.2011; 47: 2437].
Недостатки прототипа: недостаточная точность способа из-за отсутствия возможности визуализации и дифференцировки отдельных структурных компонентов микробной биопленки, невозможность проведения морфометрических исследований, отсутствие возможности сохранения результатов исследований на электронных носителях.
Технический результат: повышение информативности способа за счет дифференцировки и визуализации отдельных структурных компонентов биопленки, возможность изучения структурных особенностей пленок при разных методах их окраски, сохранение результатов исследования в виде файлов формата jpg, доступность способа для изучения биопленкообразующей способности практически всех известных микроорганизмов.
Сущность метода заключается в том, что для оценки морфологической структуры биопленки используют двухэтапный подход, позволяющий на первом этапе культивировать штаммы на границе раздела двух сред «воздух-жидкость» для создания условий для биопленкообразования, а на втором - визуализировать отдельные структурные компоненты биопленки и провести их морфометрическое исследование с помощью видеоокуляра DCM 310 (Китай) в программе ScopePhoto х86, 3.1.312 (США) с последующим сохранением результата на электронных носителях в формате файлов jpg. Такой способ дает возможность определять точки действия лекарственных препаратов и повышать терапевтический эффект за счет комбинации лекарственных средств, с различными мишенями действия.
Способ осуществляют следующим образом:
Биопленки исследуемых культур микроорганизмов формируют в стерильной чашке Петри, в которую помещают предметное стекло под углом 30° и в пространство под ним наливают питательный бульон с предварительно подготовленной микробной взвесью. Для создания оптимальных условий биопленкообразования в чашку Петри помещают стерильный тампон, смоченный дистиллированной водой. По окончании 24 часовой инкубации стекло извлекают и аккуратно промывают забуференным физиологическим раствором, после чего подсушивают на воздухе. Далее после фиксации препарата в пламени спиртовки можно использовать любой из доступных методов окраски, например, метод Грама [Silhavy T.J., Kahne D., Walker S. The Bacterial Cell Envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2010. 2 (5).]. В последующем при микроскопии препаратов с помощью видеоокуляра DCM 310 (Китай) и программы Scope Photo х86, 3.1.312 (США) оценивается морфологическая структура биопленки: наличие каналов и камер, количество и толщина слоев матрикса, выраженность клеточного компонента. Далее полученные результаты фиксируют на электронном носителе (например, HDD, съемные USB-носители и др.) в виде файлов jpg.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. В чашку Петри поместили предметное стекло под углом 30° и заполнили пространство под ним мясо-пептонным бульоном с взвесью Staphylococcus aureus. Для создания условий влажной камеры в чашку Петри поместили стерильный ватный тампон, смоченный дистиллированной водой. После 24 часовой инкубации стекло извлекли и промыли забуференным физиологическим раствором и после непродолжительного подсушивания фиксировали в пламени спиртовки с последующей окраской по методу Грама. С помощью видеоокуляра DCM 310 и программы Scope Photo х86, 3.1.312 произвели визуализацию биопленки и морфометрическую оценку отдельных структурных компонентов биопленки, с последующим сохранением результатов морфометрических исследований на электронном носителе в формате файлов jpg.
При микроскопии окрашенного препарата было установлено, что биопленка имеет три слоя матрикса, продольный канал и в нижней части -область локализации клеток стафилококка.
Пример 2. В чашку Петри поместили предметное стекло под углом 30° и заполнили пространство под ним мясо-пептонным бульоном с взвесью Staphylococcus aureus. После этого в жидкую часть добавляли раствор цефтазидима (10 мкг/мл). Для создания условий влажной камеры в чашку Петри поместили стерильный ватный тампон, смоченный дистиллированной водой. После 24 часовой инкубации стекло извлекли и промыли забуференным физиологическим раствором и после непродолжительного подсушивания фиксировали в пламени спиртовки с последующей окраской по методу Грама. С помощью видеоокуляра DCM 310 и программы Scope Photo х86, 3.1.312 производили визуализацию биопленки и морфометрическую оценку отдельных структурных компонентов биопленки, результаты морфометрических исследований сохраняли на электронном носителе в формате файлов jpg.
При микроскопии окрашенного препарата было установлено, что биопленка после действия антибиотика имеет те же три слоя матрикса, продольный канал и в нижней части область локализации клеток стафилококка. Однако было выявлено, что диаметр канала существенно сужен, а толщина слоев матрикса в несколько раз больше, чем в аналогичных пробах, но без антибиотика. Можно сделать заключение, что при использовании такой дозы антибиотика тест-штамм усиливает свою биопленкообразующую активность, что выражается в увеличении толщины слоев, а также в сужении просвета канала, по которому возможно поступление антибиотика в глубжележащие слои биопленки.
Пример 3. В чашку Петри поместили предметное стекло под углом 30° и заполнили пространство под ним мясо-пептонным бульоном с взвесью Staphylococcus aureus. После этого в жидкую часть добавляли 150 мкл свежеполученной плазмы крови от практически здорового донора. Для создания условий влажной камеры в чашку Петри поместили стерильный ватный тампон, смоченный дистиллированной водой. После 24 часовой инкубации стекло извлекли и промыли забуференным физиологическим раствором и после непродолжительного подсушивания фиксировали в пламени спиртовки с последующей окраской по методу Грама. С помощью видеоокуляра DCM 310 и программы Scope Photo х86, 3.1.312 производили визуализацию биопленки и морфометрическую оценку отдельных структурных компонентов биопленки, результаты морфометрических исследований сохраняли на электронном носителе в формате файлов jpg.
При микроскопии окрашенного препарата было установлено, что биопленка имеет слабо выраженный слой матрикса, продольный канал практически отсутствует или сужен до крайней степени. В слоях биопленки наблюдаются полости и каверна-подобные образования. Можно сделать заключение, что факторы свежеполученной плазмы, обладая бактерицидным эффектом, нарушают жизнедеятельность и функционирование бактериальных клеток, в результате чего биопленка имеет существенные структурные изменения.
Положительный эффект заявляемого способа состоит в следующем: способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов позволяет отдифференцировать отдельные структурные части биопленки, изучить их размеры и расположение, обеспечивая получение дополнительной информации, способствующей повышению эффективности антимикробной терапии.