Нарушения в системе белка р53 и их влияние на патогенез хронических лимфопролиферативных заболеваний

Нарушения в системе белка р53 и их влияние на патогенез хронических лимфопролиферативных заболеваний

П.М. Кондратовский, А.И. Дубиков, А.Ю. Дорошевская

Владивостокский государственный медицинский университет

Контакты: Павел Максимович Кондратовский k855va@gmail.com

В настоящее время активно обсуждается роль белков семейства р53 как в рамках патогенеза хронических лимфопролиферативных заболеваний, так и в свете растущего интереса к терапевтическому потенциалу так называемых малых молекул, способных влиять на регуляторные «взаимоотношения» молекул р53, MDM2, p21 и PUM A. Представленная статья является попыткой обобщить данные экспериментальных моделей на тканях опухоли и мышиных моделях и доступных в литературе исследований с использованием материала лимфоидных опухолей человека. Рассмотрены как аспекты прогностической значимости экспрессии белков семейства р53 при лимфопролиферативных заболеваниях, так и возможные терапевтические подходы, использующие особенности взаимоотношений р53-молекулы с генами-регуляторами и эффекторами.

Ключевые слова: хронические лимфопролиферативные заболевания, лимфомы, хронический лимфолейкоз, апоптоз, р53, MDM2, p21, PUMA

P53 pathway changes and their influence on chronic lymphoproliferative diseases pathogenesis

P.M. Kondratovskiy, A.I. Dubikov, A.Yu. Doroshevskaya

Vladivostok State Medical University

The role of p53 family proteins, both in the pathogenesis of chronic lymphoproliferative disorders, and in aspects of the growi ng interest in the therapeutic potential of so-called small molecules capable of influencing the regulatory "relationship" ofp53, MDM2, p21 and P UMA is currently actively debated. The article is an attempt to summarize the data on experimental tumor and mouse models and availableiithe literature results of studies using human lymphoid tumors. Prognostic significance of p53 family proteins expression in lymphoproliferativ e diseases and possible therapeutic approaches using the features of the p53 relationship with regulators and effectors genes are considered.

Key words: chronic lymphoproliferative diseases, lymphomas, chronic lymphocytic leukemia, apoptosis, p53, MDM2, p21, PUMA

Введение

Учение о лимфопролиферативных заболеваниях (ЛПЗ) — пожалуй, самая обширная область гематологии и внутренних болезней. Поскольку клетки, составляющие иммунную систему, являются широко распространенными и обладают значительной функциональной гетерогенностью, ЛПЗ могут возникать фактически в любом органе и иметь различные гистологические черты, клинические проявления и прогноз.

Во всем мире наблюдается рост частоты неходж-кинских лимфом (НХЛ). В России, по данным РО НЦ им. Н.Н. Блохина РАМН за 2004 год и отдельных публикаций, показатель заболеваемости всеми формами лимфом составил 8,0 на 100 тыс. населения, что на 3,9 % больше, чем в 2003 г. Заболеваемость хроническим лим-фолейкозом колеблется от 2,0 до 6,0 на 100 тыс. взрослого населения. Максимальный уровень заболеваемости приходится на возраст 70—79 лет за счет НХЛ. В целом наблюдается линейная зависимость возраста и заболеваемости всеми формами лимфом.

Утрата контроля над пролиферацией, вызванная последствиями транслокаций хромосомного материала, открывает путь к неоплазии, но сама по себе недостаточна для злокачественной трансформации. Имеющиеся данные свидетельствуют, что для окон-

чательного становления автономной пролиферации клеток (опухоли) необходимо наличие еще как минимум одного случайного неблагоприятного события.

В настоящее время активно обсуждается роль белков семейства р53 как в рамках патогенеза хронических ЛПЗ, так и в свете растущего интереса к терапевтическому потенциалу так называемых малых молекул, способных влиять на регуляторные «взаимоотношения» молекул р53, MDM2, p21 и PUMA. Данные в этой области проходят стадию первоначального накопления и представлены экспериментальными моделями на тканях опухоли и мышиных моделях и доступных в литературе исследований с использованием материала лимфоидных опухолей человека представлены сравнительными описаниями частоты экспрессии различных белков семейства р53 с выводами об их вероятной прогностической значимости. Принимая во внимание лавинообразный рост подобных сообщений и привлекательность идеи использования воздействия малых молекул на регуляторные механизмы естественной клеточной гибели, особенно в такой широко распространенной группе онкогематологических заболеваний, возникает естественный интерес к анализу доступных литературных данных и проведению иссле-

3 ’201 1

3 ’201 1

дований на материале опухолей человека с использованием современных технологий.

Апоптоз и онкогенез

Одним из важных патогенетических механизмов онкогенеза является нарушение механизма программируемой гибели клетки — апоптоза. Апоптоз регулируется белками р53 и Bcl-2. Дикий (т. е. нормальный) тип р53 индуцирует апоптоз, а Bcl-2 и Bcl-X его блокируют. В результате мутации дикого типа ТР53 образуется мутантный тип гена ТР53, клетка теряет способность к апоптозу, вследствие чего может возникать опухоль. Дикий тип гена ТР53 является геном-супрессором, продукт которого ингибирует трансформацию клеток, мутантный ген ТР53 — онкогеном, который наряду с другими онкогенами участвует в механизмах канцерогенеза. Дикий тип белка р53 не только индуцирует апоптоз, но и блокирует клеточный цикл, возможно, совместно с MY C протеином, в точке контроля в фазе G1 или перехода фазы G1 в S-фазу . Продукты гена ТР53 нужны клетке для инициации апоптоза в ответ на генотоксические повреждения. Этот фундаментальный путь позволяет организму освобождаться от поврежденных и потенциальных опухолевых клеток [1] (рис. 1).

Другие гены, контролирующие апоптоз, — это семейство Bcl-2. Первым белком, регулирующим апоп-тоз, был описан Bcl-2, кодиру емый протоонкогеном Bcl-2. Затем было выявлено целое семей ство генов Bcl-2, контролирующих апоптоз.

Ген ТР53, располагающийся на коротком плече хромосомы 17, кодирует образование ядерного белка, состоящего из 393 аминокислот, с молекулярной массой 53 кД. Т етрамер p53 функционирует как транскрипционный фактор, связываясь своим карбоксильным окончанием со специфическими регионами генов-мишеней [2]. Белок р53 находится в цитоплазме в латентном состоянии, активация его происходит не только в ответ на поражение ДНК, но также может явиться следствием многих других процессов, происходящих в клетке, в том числе, активации онкогенов, гипоксии, дефицита питания, старения и др. (рис. 2).

При активации белок р53 способен инициировать независимо друг от друга 2 программы:

• временную остановку клеточного цикла в G1-фазе с помощью белка p21W AFI, ингибирующего циклин-зависимые киназы;

• стимуляцию апоптоза путем активации генов Вах или Bid — проапоптотических генов семьи Bcl-2 и/или активации образования свободных форм кислорода, способствующих выходу цитохрома из митохондрий.

Экспериментальные данные с выключением генов позволяют предположить, что приоритетной для большинства клеток является программа временной остановки митотического цикла. Есть сведения и об участии р53 в процессах репарации ДНК путем активации

гена P53R2, кодирующего рибонуклеотидредуктазу. Программа апоптоза включается при невозможности репарировать ДНК во время остановки клеточного цикла и/или дефиците белка p21WAFI. В некоторых клетках генетически обусловлен приоритет программы апоптоза при активации гена ТР53.

Основной функцией гена ТР53 следует считать включение программы апоптоза при повреждении клеточного генома, что можно рассматривать как защитную реакцию организма от накопления генетически дефектных клеток. Снижение активности гена ТР53 или мутация в нем, приводящая к потере способности к включению апоптоза, является серьезным фактором, предрасполагающим к возникновению опухолей и развитию резистентности к химиотерапии. Мутация гена ТР53 обнаруживается более чем в половине раковых опухолей, частота ее повышается при длительной химиотерапии.

Итак, ген ТР53 необходим для реализации программы апоптоза при повреждении ДНК и токсических воздействиях на клетку. Следующим шагом в проведении проапоптотического сигнала по этому пути является включение семьи Вс1-2 генов.

Интерес к апоптозу резко возрос в середине 80-х годов, когда было выявлено [3, 4], что усиление активности онкогена Вс1-2, являющееся следствием обычной для В-клеточной фолликулярной лимфомы человека транслокации ^14;18), приводит к образованию опухолевого клона не за счет у силения пролиферации, а вследствие повышения выживаемости опухолевых клеток. Позднее было показано, что при этой транслокации онкоген Вс1-2, изначально располагавшийся на хромосомном сегменте 18q21, сливается с локу сом, кодирующим тяжелую цепь ^ на хромосоме 14q32, что приводит к его повышенной экспрессии. Молекулярногенетические исследования показали, что в так называемую семью Вс1-2 генов, картированных у человека на хромосоме 18, входят и другие гены, экспрессирующие белки с противоположной функцией [5—7].

В настоящее время клонировано 16 генов, составляющих эту семью. Белки, производные этих генов, объединяет сходный морфологический состав — каждый из них имеет хотя бы одну из четырех консервативных аминокислотных последовательностей, характерных для Вс1-2. Эти последовательности известны как регионы, гомологичные Вс1-2 (ВН1—ВН4). Функциональное значение этих регионов до конца не ясно, но, по мнению некоторых исследователей, именно они определяют реактивные способности белков этого семейства.

Только 6 белков из 16 контролиру емых генами семейства Вс1-2 оказывают антиапоптотическое действие: защищают клетки от широкого спектра физиологических и экспериментальных воздействий, направленных на индукцию апоптоза. К таким стимулам относятся повреждение ДНК, действие глюкокорти-коидов, прекращение цитокиновой регуляции и др.

1 20303

Рис. 1. Структура гена р53 человека: 22 000 пар оснований; 11 экзонов (синий цвет), кодирующих матричную РНК. Т рансляция начинается в экзоне 2. Размеры экзонов и интронов указаны в парах оснований

Подавление опухолевого роста Созревание

Модулирование стволовых клеток Фертильность

Ишемия

Синдром Тричера Коллинза

Нейродегенерация

Старение

* PUMA >• DRAM >• p21 >• R2 >• LIF TSP1 TIGAR

- Апоптоз

MDM2

>• PAI-1

- Аутофагия

- Остановка клеточного цикла

- Репарация ДНК

- Имплантация эмбриона

- Угнетение ангиогенеза

- Угнетение ROS / Выживание

IGAM-1 ------ Врожденный иммунитет

SCO2 ------- Метаболизм

- Регуляция p53

- Старение

Рис. 2. Схема основных каскадов, в которых участвует р53

В дополнение к своей хорошо известной роли опухолевого супрессора, р53 также регулирует другие клеточные (справа) и физиологиче ские/па-тологические процессы (слева). Эти процессы включают как положительные исходы (красная стрелка), так и заболевания и другие неблагоприятные исходы (черная стрелка). Также показаны примеры генов-мишенейр53 (выделены синим цветом), регулируемые р53 и влекущие утзанные клеточные ответы

Некоторые из белков этой группы имеют СОО Н-кон-цевой гидрофобный регион, ответственный за прикрепление белков к наружной поверхности митохондриальной мембраны.

Остальные 10 членов семьи Вс1-2 вызывают апоптоз. Эти проапоптотические белки могут быть подразделены на 2 подгруппы в зависимости от числа ВН-регионов, которыми они располагают. Первые 3 имеют по 2—3 ВН-региона, в то время как у 7 остальных обнаруживается только 1 ВНЗ-регион. Именно с этим регионом связывают проапоптотическую функ-

цию белков. Многие из проапоптотических белков так же, как антиапоптотические белки этой семьи, имеют концевой гидрофобный домен, но в отличие от последних не прикрепляются к митохондрии до получения проапоптотического сигнала.

Восприятие анти- или проапоптотических сигналов членами семьи Вс1-2 происходит как на уровне генов (так, белок р53 повышает экспрессию гена Вах), так и на уровне посттранскрипционных белков (действие цито-кинов). При этом между самими белками наблюдаются сложные взаимодействия, иногда антагонистические.

3 ’201 1

3 ’201 1

68

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ

Значительное

повреждение

ДНК

I I

Умеренное

повреждение

ДНК

Гены мишени

Исход

AIP1

Y

Апоптоз

PUMA

PUMA

Апоптоз

Р21

Остановка клеточного цикла

Рис. 3. Основные функциональные домены р53 и основные механизмы его регуляции

Основные доменыр53 включают домены активации транскрипции (Т АО I, остатки 20-40и Т АО II, остатки 40-60), пролиновый домен (РР , остатки 60-90), ДНК-связывающий домен (остатки 100-300), связывающий регион (L, остатки 301-324), домен тетрамеризации (Т, остатки 325-356) и основной С-терминальный домен (++, остатки 363-393). Приведены примеры, в которых есть некоторые остатки, модифициру е-мые через фосфорилирование (Р), ацетилирование (Ас) или убиквинирование (иЬ), что приводит к специфическим клеточным исходам в ответ на активацию р53 (для примера — апоптоз или остановка клеточного цикла), что в свою очередь зависит от преимущественной активац ии указанных генов-мишеней

В процессе этих взаимодействий про- и антиапоптоти-ческие протеины могут образовывать гомо- и гетеродимеры как внутри своей группы, так и с протеинами противоположной направленности действия.

В результате многочисленных экспериментов к настоящему времени сложилось впечатление, что решение, жить или умереть клетке, принимается на уровне семьи Вс1-2 на основании относительного преобладания активных супрессоров или промоторов апоптоза [7, 8] (рис. 3).

Р53 белок и хронические лимфопролиферативные заболевания

Известно, что от 50 до 80 % солидных опухолей содержат мутации гена ТР53. Исследования, проведенные ранее, показали, что мутантный ТР53 определяется в 16 % фолликулярных лимфом [9] и в 13% первичных В-крупноклеточных лимфом средостения [10]. По данным Gaidano et а1., мутации ТР53 были выявлены в опухолевой ткани МАЕГ-лимфом высокой степени злокачественности [11]. В этих условиях именно врожденные полиморфизмы гена ТР53, приводящие к нарушению функционирования соответствующего белка, могут обусловливать предрасположенность их носителей к развитию неходжкинских злокачественных лимфом.

Ниже приведены иллюстрации частоты мутационных событий и их распределение в гене ТР53 при В-клеточных лимфомах/лейкозах и В-клеточных НХЛ (рис. 4—7).

Ряд исследователей в своих работах указывают на влияние экспрессии белка р53 и мутационного статуса ТР53 на прогноз, ответ на проводимую терапию у больных с ЛПЗ. Отмечено повышение экспрессии р53 при Т- и NK-клеточных лимфомах с редко встречающимися мутациями гена [12]. С другой стороны, снижение экспрессии белка р53 и мутации гена ТР53 приводят к ухудшению ответа на терапию при кожных лимфомах [13]. Выяснено, что мутации в ТР53 являются спутниками озлокачествления МАЕ Г-лимфом [14], потеря экспрессии р53 и нарушения регуляции гена приводят к резистентности к лечению и ухудшению прогноза при лимфомах из клеток маргинальной зоны селезенки [15], лимфомах из клеток зоны мантии [16] и фолликулярных лимфомах [17].

Имеются данные, что уровень экспрессии р53 может отличаться в зависимости от степени злокачественности. В недавнем исследовании показано, что более высокий уровень экспрессии р53 имеют лимфо-мы высокой степени злокачественности и соответственно более низкий — лимфомы низкой степени злокачественности [18].

The UMD p53 database

Linn Hjortsbeg and Thierry Soussi, 2008

10

http://p53.free.fr

The UMD p53 database

Linn Hjortsbeg and Thierry Soussi, 2008

http://p53. free. fr

12--------.-..-.------------

Неходжки некие 10 лимфомы

о

ь 4-

273

N= 125

175

L.._L

Кодон p53

393

Рис. 4. Мутационные события в генер53 при В-клеточныхлимфомах/ Рис. 6. Мутационные события в генер53 при В-клеточных НХЛ лейкозах

The UMD p53 database

Linn Hjortsbeg and Thierry Soussi, 2008

45-

40-

35-

#

s 30" s

ra 25S

ra 20-

<3

у 15-

N = 236

10

5

0

I

http://p53.free.fr

В-ХЛЛ / Лимфома из малых лимфоцитов

Изменения CpG динуклеотида

1 1  1

бС ^ АТ АТ ^ бС бС ^ Сб бС^ТА АТ ^ Сб АТ ^ТА Прочие Мутационные события

Рис. 5. Распределение мутаций р53 при В-клеточных лимфомах/лейкозах

The UMD p53 database

Linn Hjortsbeg and Thierry Soussi, 2008

60

50

:40

му30

о u 20

N = 125

10

0

http://p53. free. fr

Неходжкинские

лимфомы

В Изменения CpG динуклеотида

I......шш

бС ^ АТ ' АТ ^ бС бС ^ Сб бС ^ ТА ' АТ ^ Сб ' АТ ^ ТА ' Прочие Мутационные события

Рис. 7. Распределение мутацийр53 при В-клеточных НХЛ

Что касается хронического лимфолейкоза, то экспрессия р53 в подавляющем большинстве случаев для этого заболевания нехарактерна. Случаи заболевания с гиперэкспрессией р53 характеризуются более агрессивным течением, как правило, плохим ответом на терапию, в том числе и пуриновыми аналогами, что происходит либо ввиду мутаций ТР53 с развитием множественной лекарственной у стойчивости, либо со снижением апоптотической гибели клеток при воздействии пуриновых аналогов [19].

Практический интерес представляют потенциальные возможности использования измененной экспрессии р53 при различных ЛПЗ у человека как в диагностическом, так и в терапевтическом аспектах. Очевидно, что само по себе изменение экспрессии р53 не имеет самостоятельного значения без изучения полиморфизма ассоциированных с ним генов-эффекторов, каковыми являются молекулы PUMA, р21, MDM2.

Белок PUMA: активный участник лимфопролиферации

Доминирующий взгляд на ключевую роль р53 в развитии феномена программированной клеточной смерти (апоптоз) не подвергается сомнению. Однако неуклонно растет количество фактов, указывающих на то, что р53 обладает и другими функциями, сдерживающими процессы пролиферации и злокачественного роста. То, что апоптоз не является единственным феноменом в арсенале р53, стало очевидным с открытием белка PUMA (p53-upregulated modulator of apoptosis). PUMA — единственный BH3 (Bcl-2 homology domain 3) протеин, инициирующий митохондриальный путь апоптоза. Изучение мышей, не имеющих этого протеина, показало, что PUMA необходим для развития апоптоза в ответ на активацию р53-молекулы во многих тканях [20]. Т ем не менее нулевые по белку PUMA мыши необязательно разви-

3 ’201 1

3 ’201 1

вают злокачественные опухоли [21], хотя ряд исследований показал, что потеря PUMA способству ет канцерогенезу, определяемому онкогеном MYC [22]. Становится ясным, что р53 может сохранять антипро-лиферативные свойства даже в отсутствие апоптоти-ческого ответа.

В 2 исследованиях, результаты которых опубликованы в журнале Genes & Development [23, 24], изучали белок PUMA в условиях повреждения ДНК. Известно, что р53 не может инициировать процесс апоптоза в отсутствие белка PUMA. Принимая во внимание этот факт, исследователи создали линию нокаутированных по гену PUMA мышей и подвергли их воздействию радиации, вызывающей повреждение молекул ДНК. Ученые ожидали увидеть быстрое развитие опухолей и гибель животных, но вместо этого мыши жили дольше, чем животные из контрольной группы.

Другая исследовательская группа, под руководством Андреаса Штрассера (Andreas Strasser), наблюдала этот же феномен: отсутствие белка PUMA нисколько не вредило мышам, подвергшимся воздействию радиации и, напротив, увеличивало продолжительность их жизни в сравнении с нормальными животными, подвергавшимися облучению [24]. Исследования проводились на конкретном типе опухоли, а именно на тимической лимфоме, которая была вызвана многократным воздействием радиации на экспериментальных животных в течение месяца.

В то же время другими авторами на модели лим-фомы Беркитта у мышей было отчетливо показано, что делеция гена PUMA приводит к ускорению лимфо-могенеза и 75 % клеток опухолевой линии избавляется от его экспрессии [22]. Более того, в 40 % первичных опухолей вообще не выявлено какого-либо уровня экспрессии PUMA [22].

Анализ литературных данных, посвященных исследованию экспрессии PUMA и его связи с белком р53 при ЛПЗ, позволяет предполагать, что наибольшее значение нарушения в белке PUMA, со снижением его экспрессии, имеют при В-клеточных ЛПЗ [21, 24].

Исследование экспрессии PUMA при хроническом лимфолейкозе в сопоставлении с уже достаточно известными прогностическими факторами, такими как стадия заболевания, экспрессия CD38, ZAP-70, уровни ЛДГ и р2-микроглобулина, а также неблагоприятными хромосомными аномалиями, отчетливо демонстриру ет снижение уровня экспрессии PUMA при всех факторах плохого прогноза [25]. Голландские исследователи продемонстрировали, что терапия пуриновыми аналогами вызывает индукцию проапоптотических генов Bax

и PUMA, опосредованную р53, с более выраженным эффектом в случае наличия мутаций в генах IgVH [26].

Следует отметить, что вышеприведенные исследования проводились на мышиных моделях В-клеточных лимфом высокой степени злокачественности, а указаний на исследования в группе более распространенных В-зрелоклеточных лимфом с использованием

опухолевого материала лимфомной ткани человека нам не встретилось. Т акже вызывают ряд вопросов противоречия, связанные с ролью нарушений в активности гена PUMA, а именно отсутствие однозначного эффекторного ответа при его инактивации или снижении экспрессии. Тем более актуальной становится попытка комплексной оценки системы медиаторов и эффекторов системы р53 при ЛПЗ.

Белок р21 и р53: диалектика взаимодействия и особенности экспрессии при лимфопролиферативных заболеваниях

Р53 содержит также другие возможности анти-пролиферативного эффекта. Одной из них является способность останавливать клеточную пролиферацию и рост, эффективно останавливать клеточный цикл, активируя транскрипцию ингибитора циклин-зави-симой киназы р21, хотя несколько других генов-мишеней р53-молекулы (14-3-3sigma и GADD45) могут вносить свой вклад в этот феномен [27]. При этом надо отметить, что р21 чрезвычайно чувствителен к самым низким концентрациям р53 и ведет к немедленной остановке клеточного цикла в фазе G1 при малейшем повреждении клетки, позволяя ей пережить неблагоприятный период. Однако в случае канцерогенеза (или нецелесообразной пролиферации) подобного рода реакция позволит сохраниться клеткам со злокачественным потенциалом. Серия интереснейших исследований высветила важность феномена старения в ингибировании злокачественной пролиферации и идентифицировала при этом ключевую роль р53-молекулы в биологическом ответе подобного рода.

В нескольких работах было показано, что ключевую роль в развитии феномена старения играет повреждение ДНК через активацию онкогенов или в ответ на дисфункцию теломер, что повышает активность р53 протеина [28, 29].

Более того, старение остается ключевым феноменом в ответ на активацию р53 при злокачественной пролиферации в далеко зашедших стадиях. В моделях на мышах реактивация р53 белка привела к существенной регрессии различных типов злокачественных опухолей, доказывая высокий терапевтический потенциал такого подхода к лечению [30—32]. Что интересно, при саркомах и карциномах в ответ на повышение активности р53-молекулы развивается прежде всего феномен старения, а не апоптоза. Хотя исследования на культурах тканей свидетельствуют о том, что развитие феномена старения является скорее цитостати-ческим ответом, стабилизирующим заболевание, но не вызывающим его обратное развитие, исследования in vivo отчетливо показали возможность полной эра-дикации злокачественного клона при сопутствующей стимуляции иммунной системы [32]. Одним из ключевых регуляторов р53 опосредованного старения является белок р21 [33]. Супрессия злокачественной пролиферации мутантной формой р53 R172P, дефект-

ной по апоптозу, сопровождается, прежде всего, активацией р21-молекулы и феномена старения [34, 35]. Более того, введение мутантной формы р53-линии мышей нулевой по наличию р21 белка, приводило к полной потере способности к остановке клеточного цикла и ускоряло рост злокачественных опухолей [36]. Все эти факты убедительно свидетельствуют, что р53 опосредованная активация р21-молекулы является важным звеном в угнетении злокачественной пролиферации через феномен старения.

Складывается впечатление, что р53-зависимые феномен апоптоза и феномен старения являются своего рода страховкой друг для друга и развитие того или иного определяется конкретным типом клеток и состоянием окружающей среды (тканевым контекстом).

На модели тимической лимфомы было показано, что снижение экспрессии р21 у мышей нока утных или гаплодефицитных по ТР53 сдерживает темпы прогрессирования опухоли и приводит к увеличению средней продолжительности жизни [37]. Более того, выяснено, что снижение экспрессии р21 у облученных мышей снижает вероятность возникновения лимфомы, а уровень апоптоза у р21 дефицитных мышей выше, чем у мышей с достаточной (профицитной) экспрессией р21.

Большое ретроспективное исследование, выполненное на гистологическом материале различного типа ЛПЗ, достаточно четко дает понять, что повышение экспрессии р21, напрямую коррелирующее в большинстве случаев с повышенной экспрессией р53, более характерно для анапластических вариантов лимфом, тогда как при CD30 негативных вариантах лимфопролиферации экспрессии этих партнеров не выявлено [38].

Исследователи из Китая на примере N^/1-клеточной лимфомы показали, что интенсивность экспрессии р21 прямо коррелирует с экспрессией р53 и зависит от стадии заболевания и степени его злокачественности. Чем более продвинута стадия заболевания и (или) имеется более злокачественный гистологический вариант болезни, тем интенсивнее будет экспрессия р21 и р53 [39].

Данную тенденцию можно проследить и по материалам, представленным корейскими коллегами. Анализ экспрессии р21 и р53 в группе лимфом желудка продемонстрировал активность р21 и р53 белков практически только у В-крупноклеточных лимфом, тогда как в группе В-зрелоклеточных МАЬ Т-лимфом экспрессия р53 единичная, а р21 вовсе отсутствует [40].

Обзор литературных данных роли р21 при ЛПЗ раскрывает как минимум одну сторону вопроса, а именно, экспрессия р21 в подавляющем большинстве случаев коррелирует с экспрессией р53 и характерна для быстро растущих и продвинутых вариантов пролиферации. Это может оказаться полезным для определения дополнительных прогностических характеристик заболевания, и заставляет задуматься о р21-молекуле как о потенциальной терапевтической мишени.

MDM2-молекула — негативный регулятор р53 белка

При нормальных условиях в клетке экспрессируются и белок р53, и белок MDM2. Функция белка MDM2 первоначально была у становлена у мышей, отсюда название MDM2 (mouse double minute chromosome amplified oncogene — онкоген, который был амплифицирован на хромосоме типа «double minute»).

N-концевой домен белка MDM2 связывается с N-концевым трансактивирующим доменом белка р53. Таким образом, белок MDM2 препятствует активирующему действию белка р53. Кроме того, комплекс MDM2^53 является ингибитором транскрипции (вероятно, вследствие сохранения способности белка р53 к присоединению к ДНК). Опубликованы детальные обзоры о взаимодействии р53 с MDM2 [41—44].

Недавнее исследование, показавшее, что потеря р53 приводит к снижению ранней летальности у мышей с мутацией MDM2 (отсутствует активность лигазы Е3), указывает на первичную роль MDM2 в деградации р53 [45]. Как было показано, MDM2 способен уменьшать ацетилирование белка р53, смещая остаток р300, ингибируя и разрушая белок PCAF [46, 47]. MDM2 также может рекрутировать гистоновые деаце-тилазы HDAC1 и KAP1, которые являются дополнительными инструментами, с помощью которых MDM2 репрессирует ацетилирование р53 или гистонов в местах связывания с р53. MDM2, экспрессиру емый из эндогенных локусов, ассоциируется с р53 в зоне р21 промотора [48, 49]. Гиперэкспрессируемый эктопически MDM2 (MdmX) связывается с некоторыми другими целевыми промоторами р53, за исключением самого MDM2 промотора [49].

Повышение в 2 раза уровня MDM2 в клетках линии H1299 в условиях тетрациклин-регулируемой экспрессии р53 сопровождается снижением уровня PIG3, но не влияет на экспрессию р21 и Bax [48]. В связи с наличием способности смещать деацетилазы или убиквинировать гистон H2B, а, возможно, и через другие механизмы MDM2, белок ассоциируется с р53-молекулой в зоне промоторов генов-мишеней, тем самым отрицательно влияя на трансактивацию р53 [50].

Белок MDM2 является ферментом группы E3 системы убиквитин-зависимого протеолиза, причем MDM2 специфичен в отношении белка р53. Это означает, что белок MDM2 катализирует перенос активированного убиквитина с фермента группы Е2 на белок р53. Таким образом, белок MDM2 является Е3-лигазой. Маркированный убиквитином белок р53 является субстратом для 26S-протеасомы, которая осуществляет протеолиз молекул белка р53. В нестрессовых у словиях постоянно образуется комплекс MDM2^53 и осуществляется протеолиз р53. Этим объясняется низкая концентрация р53 в клетке в отсутствие стресса. Центральная роль белка MDM2 в деградации белка р53 подтверждается и тем фактом, что добавление к клеткам моноклональных

3 ’201 1

3 ’201 1

антител к комплексу MDM2:p53 приводит к значительному увеличению концентрации белка р53. Из приведенных рассуждений становится понятным, что повышенная экспрессия белка MDM2 является онкогенным фактором, а сам белок следу ет отнести к протоонкогенам.

Анализ 87 случаев НХЛ и в более специализированной группе В-клеточных MALT-лимфом на предмет коэкспрессии р53, р21 и MDM2 [51, 52] выявил, что преимущество в коэкспрессии одновременно 3 протеинов имели лимфомы более высокой степени злокачественности. Авторы указывают , что в отсутствие экспрессии р53 не стоит ждать экспрессии р21 и MDM2, а одновременная экспрессия всех 3 белков указывает на наличие, скорее всего, дикого (немутантного) р53. Вместе с тем дискордантная экспрессия р53 в отсутствие экспрессии р21 и MDM2 доказывает присутствие мутировавшего варианта р53 белка.

В свою очередь, отсутствие экспрессии MDM2 при сохраненной экспрессии р53 и р21 не исключает как мутацию р53 с сохраненным (независимо) уровнем р21, так и само нарушение регуляции MDM2 при диком типе р53.

На основании ретроспективного анализа комплексного иммуногистохимического исследования гистологического материала 186 случаев фолликулярной лимфомы с использованием значительного количества антител, в частности, к MDM2, p21 белкам, а также клинических данных, было отмечено, что случаи с более высокой экспрессией MDM2 характеризовались менее длительной общей выживаемостью. Это позволило включить ряд иммуногистохимических критериев, в том числе уровень экспрессии MDM2, в международный прогностический индекс фолликулярной лимфомы [53].

Непосредственное участие MDM2 белка в лимфо-могенезе было подтверждено в другом исследовании. На материале В-клеточных опухолей мышей показано, что увеличенная экспрессия MDM2 способствует пролиферации и уменьшает чувствительность к р53-обусловленному апоптозу, что связано с угнетением р53 и подавлением экспрессии р21. Отмечено также повышение уровня спонтанных генетических аномалий в клетках этих линий, что также способствовало В-клеточной трансформации in vivo [54].

Недавнее исследование на материале анапласти-ческой крупноклеточной лимфомы, характеризующейся в большинстве случаев наличием транслокации t(2;5)(p23;q35), которая кодирует, в свою очередь, продукцию NPM-ALK белка со свойствами киназы, показало, что вновь образованный белок обладает способностью инактивировать и/или уменьшать уровень дикого р53. В связи с этим опухолевая линия с данной хромосомной аномалией обладает сниженной способностью к апоптозу и, несмотря на наличие немутантного р53, — нормальной экспрессией MDM2. Более того, применение Nutlin-3a, связывающего

MDM2, приводит к активации апоптоза в клетках опухоли [55].

Описано успешное применение новых терапевтических агентов при хроническом лимфолейкозе. Исходя из того, что в большинстве случаев хронического лимфолейкоза имеется гиперэкспрессия MDM2, препятствующая активации р53-опосредованного апоптоза в ответ на стандартную химиотерапию, Кешике Kojima et а1. предложили использовать малую молекулу N^1^^, как антагонист MDM2-молекулы. N^1^^ вызывает как транскрипционно-зависимую, так и транскрипционно-независимую индукцию апо-птотических механизмов, стимулируя, при сочетанном применении с флударабином, значительное повышение уровня р53 белка [56].

Вполне очевидно, что самостоятельной роли в патогенезе хронических ЛПЗ MDM2 не играет. Несмотря на достаточно хорошо описанные общие механизмы взаимодействия в системе р53-MDM2, в доступных литературных источниках пока недостаточно данных, чтобы можно было сделать окончательный вывод о роли подобного тандема в патогенезе лимфопроли-ферации.

Терапевтический потенциал

Несмотря на то что многие аспекты «жизни» молекулы р53 еще не изучены, представляется вполне реальным использование регуляторных механизмов р53 в лечении многих заболеваний. Поскольку функция р53 нарушена при многих пролиферативных процессах, особенно злокачественного характера, независимо от морфологического типа ткани и локализации, кажется логичным восстановление ингибиторных свойств белка р53. Эта концепция получила наглядное подтверждение в экспериментальных моделях на животных, в которых реактивация нормального белка р53 сопровождалась выраженной регрессией опухолевой массы [30—32].

Каким же образом молекула р53 может быть реактивирована? Одно из направлений, которое оказалось успешным, это использование генной терапии для введения р53 в опухоль с использованием в качестве вектора аденовируса [57]. Существенно расширившееся понимание механизмов регуляции функций молекулы р53 привело к созданию препаратов (малых молекул), которые способны стабилизировать и активировать р53 протеин. Недавно были идентифицированы клеточные ингибиторы сиртуина, белка, который может ограничивать диапазон активности р53 [58].

Надо отметить, что создание подобного рода лекарств вызвало большую дискуссию об их потенциальной токсичности, обусловленной системной активацией молекулы р53 в здоровых тканях. В экспериментальных моделях на животных отсутствие MDM2 в здоровых тканях, экспрессирующих р53, сопровождалось множеством побочных эффектов [59]. Авторы высказывают мнение, что, может быть, лекарства,

ингибирующие активность MDM2, будут менее эффективны, но с лучшей переносимостью в сравнении с препаратами, удаляющими этот ген. Более того, поскольку ингибиторы активности не являются генотоксичными, они смогут избежать побочных эффектов, характерных для традиционной химиотерапии, также активирующей функции молекулы р53 в клетках. Интересно, что в некоторых исследованиях было показано, что лечение ингибиторами MDM2 было эффективней, если в клетке были запущены сигнальные механизмы, возникающие при повреждении ДНК. Последнее обстоятельство отличает здоровую клетку от злокачественной [60]. Если использование активаторов р53-молекулы кажется перспективным при злокачественной пролиферации, следует оценить возможный побочный эффект ускоренного старения — следствие длительной системной терапии подобного рода препаратами. Восстановление функций мутантного р53 в злокачественных опухолях — очень сложная задача, хотя описаны малые молекулы, способные реактивировать нормальные функции молекулы р53 [61]. Такого рода подход является наиболее трудным, но он обещает избирательное воздействие на злокачественные клетки с мутантной формой р53.

Одна из перспективных областей — это применение малых молекул, способных угнетать активность негативного регулятора р53-молекулы, — MDM2 белка. Опубликовано достаточно большое количество работ по использованию таких малых молекул на моделях ЛПЗ у животных, и в частности мышей [62—68]. Наиболее исследованы возможности одной из первых, использованной в терапевтических целях, малой молекулы Nutlin^. Изучены возможности нутлина в активации апоптоза при лимфомах из клеток зоны мантии как в монотерапии [62], так и в комбинации с другими проапоптотическими препаратами, такими как бортезомиб. При этом терапевтический ответ наблюдался даже в линии клеток, резистентных к монотерапии бортезомибом [63, 64]. Описаны терапевтическая активность Nutlin-3a на модели анапластиче-ской крупноклеточной лимфомы [65], у спешное его применение в комбинации с другими цитостатически-ми препаратами при хроническом В-клеточном лим-фолейкозе [66].

Проходят доклинические испытания и другие малые молекулы, способные специфически угнетать активность MDM2, отличаясь в большинстве своем аффинностью действия, но имеющие сходные механизмы и сопоставимую эффективность in vitro и in vivo. Подобные исследования, например, проведены на клеточной линии фолликулярной лимфомы с использованием малых молекул MI-319, MI-219 в сопоставлении с Nutlin-3a [67]. Описано эффективное применение малой молекулы MI-63, нарушающей взаимодействие между MDM2 (HDM2) и р53, в комбинации с ингибиторами протеосом (бортезомибом) на клеточной линии лимфомы из клеток мантийной зоны и множественной миеломе [68].

Концепция реактивации нормальных функций р53 белка в озлокачествленных клетках подтверждается экспериментальными исследованиями и рядом исследований у человека, показавшими связь между мутациями р53-молекулы и плохим прогнозом [69]. Однако клеточный ответ на стимуляцию р53 может широко варьировать от смерти клетки до выживания, что трудно предсказать. В самом деле, ингибирование функции р53 белка при раке молочной железы защищает раковые клетки от некоторых видов химиотерапии и, таким образом, ассоциируется с плохим ответом на лечение [70]. Возможно, подобного рода эффект можно использовать как повод к изменению тактики терапевтического подхода. Отсутствие ответа опухолевой клетки на манипуляции с р53-молекулой предполагает сохранение чувствительности к химиотерапевтическим препаратам, воздействующим на S-фазу или G2/M-фазу клеточного цикла. Эти лекарственные препараты будут менее токсичными для нормальной клетки [71]. Продолжением этой идеи является использование препаратов, активирующих р53 с целью защиты здоровых клеток во время химиотерапии [72, 73].

Что интересно, идея хемопротекции нормальных клеток предлагает в том числе использовать лекарственные препараты, ингибирующие р53-молекулу . Понятно, что большинство токсических эффектов во время химиотерапии генотоксическими препаратами обусловлено активацией р53-молекулы и р53-индуцированной смертью радиочувствительных клеток гематопоэтической системы, эпителия кишечника и других тканей. В этом случае супрессия функций р53-молекулы в здоровых клетках поможет защитить их от смерти и повысить толерантность больного к более высоким дозам химиопрепаратов и лучевой нагрузки [74, 75].

Что касается использования белка PUMA как мишени для потенциальных терапевтических воздействий, то препарат ABT-263, ингибирующий белок PUMA, недавно успешно прошел I фазу клинических испытаний [24].

Выводы

Таким образом, ЛПЗ являются широко распространенными заболеваниями с тенденцией к постоянному росту. Они характеризуются значительной разнородностью благодаря особенностям созревания клеток иммунной системы, что в большинстве случаев ведет к фактической неизлечимости патологического процесса, несмотря на разработанные в последнее время новые терапевтические агенты. Эти особенности диктуют необходимость разработки новых и коррекции существующих подходов в терапии ЛПЗ.

В основе патогенеза ЛПЗ лежат изменения на уровне человеческого генома. До настоящего времени окончательно неясна роль системы белка р53 в патогенезе онкологических заболеваний в целом и ЛПЗ в частно-

3 ’201 1

3 ’201 1

74

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ

сти, ввиду необычайно широкого спектра эффекторных ответов р53. Изучение роли программируемой клеточной гибели, взаимоотношений р53-молекулы с генами-

регуляторами и эффекторами в процессе развития ЛПЗ может открыть новые перспективы не только в диагностике, но и в лечении этого вида патологии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Новиков B.C. Программированная клеточная гибель. СПб.: «Наука», 1996.

2. Hansen R., Oren M. P53 from inductive signal to cellular effect. Curr Opin Genet 1997;7:46-51.

3. Bakhshi A.J., Jensen P., Goldman P. et al. Cloning the chromosomal breakpoint of t(14;18) human lymphomas: clustering around JH on chromosome 14 and near a transcriptional unit on 18. Cell 1985;41:889-906.

4. Tsujimoto Y., Gorham J., Cossman J. et al. The t(14;18) chromosome translocations involved in B-cell neoplasms result from mistakes in VDJ joining. Science 1985;229:1390-3.

5. Deary M., Smith S., Sclar J. Cloning and structional analysis of cDNAs Bcl-2 and

a hybrid Bcl-2/immunoglobulin transcript resulting from the t(14;18) translocation.

Cell 1986;47:19-23.

6. Kelekar Т., Thompson C. Bcl-2 family proteins: the role of the BH3 domain in apoptosis. Trends Cell Biol 1998;8:324-30.

7. Puthalakath H., Huang D., O’Reily L. et al. The proapoptotic activity of the Bcl-2 family member Bim is regulated by interaction with the dynein motor complex. Mol Cell 1999;3:287-96.

8. Oltvai Z., Korsmeyer S. Checkpoints of dueling dimers foil death wishes.

Cell 1994;79:189-92.

9. Bellido M., Capello D., Altes A. et al. Bcl-6 p53 mutations in lymphomas carrying the Bcl-2/Jh rearrangement. Haematologica 2002;87(9):908-17.

10. Scorpa A., Moore P.S., Rigaurd G. et al. Molecular features of primary mediastinal B-cell lymphoma: involvement of p16INK4A, p53 and c-myc. Br J Haematol 1999;107(1):106-13.

11. Gaidano G., Volpe G., Pastore C. et al. Detection of BCL-6 rearrangements and p53 mutations in MALT-lymphomas.

Am J Hematol 1997;56(4):206-13.

12. Petit B., Leroy K., Kanavaros P. et al. Expression of p53 protein in T- and natural killer-cell lymphomas is associated with some clinicopathologic entities but rarely related to p53 mutations. Hum Pathol 2001 Feb;32(2):196-204.

13. Kapur S., Tiemann M., Menke M.A. et al. The role of p53 and anaplastic lymphoma kinase genes in the progression of cutaneous CD30(+) lymphoproliferative diseases. Indian J Med Res 2005 Jan;121(1):46-54.

14. Поддубная И.В. Лимфосаркома желудочно-кишечного тракта (клиника,

диагностика, лечение). Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 1985.

15. Gruszka-Westwood A.M., Hamoudi R.A., Matutes E. et al. P53 abnormalities in splenic lymphoma with villous lymphocytes.

Blood 2001 Jun 1;97(11):3552—8.

16. Greiner T.C., Moynihan M.J.,

Chan W.C. et al. P53 mutations in mantle cell lymphoma are associated with variant cytology and predict a poor prognosis.

Blood 1996 May 15;87(10):4302-10.

17. Sander C.A., Yano T., Clark H.M. et al. P53 mutation is associated with progression in follicular lymphomas. Blood 1993 Oct 1; 82(7):1994-2004.

18. Villuendas R., Piris M.A., Orradre J.L. et al. P53 protein expression in lymphomas and reactive lymphoid tissue. J Pathol 1992 Mar;166(3):235-41.

19. Cordone I., Masi S., Mauro F.R. et al. P53 expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia: a marker of disease progression and poor prognosis. Blood 1998 Jun 1;91(11):4342-9.

20. Yu J., Zhang L. No PUMA, no death: implications for p53-dependent apoptosis. Cancer Cell 2003;4:248-9.

21. Michalak E.M., Villunger A.,

Adams J.M. et al. In several cell types tumour suppressor p53 induces apoptosis largely via Puma but Noxa can contribute. Cell Death Differ 2008;15:1019-29.

22. Garrison S.P., Jeffers J.R., Yang C. et al. Selection against PUMA gene expression in Myc-driven B cell lymphomagenesis.

Mol Cell Biol 2008;28:5391-402.

23. Labi V., Erlacher M., Krumschnabel G. et al. Apoptosis of leukocytes triggered by acute DNA damage promotes lymphoma formation. Genes Dev 2010 August 1; 24:1602-7; doi:10.1101/gad.1940210.

24. Michalak E.M., Vandenberg C.J., Delbridge A.R., Wu L., Scott C.L.,

Adams J.M., Strasser A. Apoptosis-promoted tumorigenesis: gamma-irradiation-induced thymic lymphomagenesis requires Puma-driven leukocyte death. Genes Dev 2010 August 1;24:1608—13; doi:10.1101/ gad.1940110.

25. Zhu H.J., Xu W., Cao X. et al. Detection of puma mRNA levels by real-time quantitative RT-PCR in chronic lymphocytic leukemia and its clinical significance. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 2010 Aug;18(4):843-8.

26. Mackus W.J., Kater A.P., Grummels A. et al. Chronic lymphocytic leukemia cells

display p53-dependent drug-induced Puma upregulation. Leukemia 2005 Mar;19(3):427-34.

27. El-Deiry W.S. Regulation of p53 downstream genes. Semin Cancer Biol 1998;8:345-57.

28. Deng Y., Chan S.S., Chang S. Telomere dysfunction and tumour suppression:

the senescence connection. Nat Rev Cancer 2008;8:450-8.

29. Halazonetis T.D., Gorgoulis V.G., Barteck J. An oncogene-induced DNA damage model for cancer development. Science 2008;319:1352-5.

30. Martins C.P., Brown-Swigart L., Evan G.I. Modeling the therapeutic efficacy of p53 restoration in tumors. Cell 2006;127:1323-34.

31. Ventura A., Xu G., Wang H. et al. Expressions of p53 and p21 in nasal NK/ T-cell lymphoma and their relationship with the proliferation and apoptosis of cells. Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai

Ke Za Zhi 2009 Jan;23(2):73-6.

32. Xue W., Zender L., Miething C. et al. Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas. Nature 2007;445:656-60.

33. Brown J.P., Wei W., Sedivy J.M. Bypass of senescence after disruption of p21CIP1/ WAF1 gene in normal diploid human fibroblasts. Science 1997;277:831-4.

34. Cosme-Blanco W., Shen M.F.,

Lazar A.J.F. et al. Telomere dysfunction suppresses spontaneous tumorigeesis in vivo by initiating p53-dependent cellular senescence. EMBO Rep 2007;8:497-503.

35. Van Nguyen T., Puebla-Osorio N.,

Pang H. et al. DNA damage-induced cellular senescence is sufficient to suppress tumorigenesis: a mouse model. J Exp Med 2007;204:1453-61.

36. Barboza J.A., Liu G., El-Naggar A.K. et al. p21 delays tumor onset by preservation of chromosomal stability. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:19842-7.

37. De la Cueva E., Garcia-Cao I., Herranz M. et al. Tumorigenic activity of p21Waf1/Cip1

in thymic lymphoma. Oncogene 2006 Jul 6; 25(29):4128—32. Epub 2006 Feb 6.

38. Chilosi M., Doglioni C., Magalini A. et al. p21/WAF1 cyclin-kinase inhibitor expression in non-Hodgkin's lymphomas:

a potential marker of p53 tumor-suppressor gene function. Blood 1996 Nov 15; 88(10):4012—20.

39. Xu G., Wang H., He G. et al. Expressions of p53 and p21 in nasal NK/T-cell

lymphoma and their relationship with the proliferation and apoptosis of cells.

Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi 2009 Jan;23(2):73-6.

40. Go J.H., Yang W.I. Expressions of p53 and p21 in primary gastric lymphomas.

J Korean Med Sci 2001 Dec;16(6):731-5.

41. Marine J.C., Francoz S., Maetens M. et al. Keeping p53 in check: essential and synergistic functions of MDM2 and MDM4. Cell Death Differ 2006;13:927-34.

42. Marine J.C., Dyer M.A.,

Jochemsen A.G. MDMX: from bench to bedside. J Cell Sci 2007;120:371-8.

43. Poyurovsky M.V., Prives C. Unleashing the power of p53: lessons from mice and men. Genes Dev 2006;20:125-31.

44. Toledo F.G., Wahl M. Regulating the p53 pathway: in vitro hypotheses, in vivo veritas. Nat Rev Cancer 2006;6:909-23.

45. Itahana K., Mao H., Jin A. et al.

Targeted inactivation of MDM2 RING finger E3 ubiquitin ligase activity in the mouse reveals mechanistic insights into p53 regulation. Cancer Cell 2007;12:355-66.

46. Ito A., Lai C.H., Zhao X. et al. p300/ CBP-mediated p53 acetylation is commonly induced by p53-activating agents and inhibited by MDM2. EMBO J 2001;20:1331-40.

47. Teufel D.P., Freund S.M., Bycroft M.

et al. Four domains of p300 each bind tightly to a sequence spanning both transactivation subdomains of p53. Proc Natl Acad Sci USA 2007;104:7009-14.

48. Ohkubo S., Tanaka T., Taya Y. et al. Excess HDM2 impacts cell cycle and apoptosis and has a selective effect on p53-dependent transcription. J Biol Chem 2006;281:16943-50.

49. Tang Y., Zhao W., Chen Y., et al. Acetylation is indispensable for p53 activation. Cell 2008;133:612-26.

50. Minsky N., Oren M. The RING domain of Mdm2 mediates histone ubiquitylation and transcriptional repression. Mol Cell 2004;16:631-9.

51. Tzardi M., Kouvidou Ch., Panayiotides I. et al. p53 protein expression in non-Hodgkin's lymphoma. Comparative study with the wild type p53 induced proteins MDM2 and p21/waf1. Clin Mol Pathol 1996 Oct;49(5):278-82.

52. Stefanaki K., Tzardi M., Kouvidou C. et al. Expression of p53, p21, MDM2, Rb, Bax and Ki67 proteins in lymphomas of the mucosa-associated lymphoid (MALT) tissue.

Anticancer Res 1998 Jul-Aug; 18(4A): 2403-8.

53. Camacho F.I., Bellas C., Corbacho C. et al. Improved demonstration of immunohistochemical prognostic markers for survival in follicular lymphoma cells.

Mod Pathol 2011 May;24(5):698-707.

Epub 2011 Jan 14.

54. Wang P., Lushnikova T., Odvody J. et al. Elevated MDM2 expression induces chromosomal instability and confers a survival and growth advantage to B cells. Oncogene 2008 Mar 6;27(11):1590-8.

55. Cui Y.X., Kerby A., McDuff F.K. et al. NPM-ALK inhibits the p53 tumor suppressor pathway in an MDM2 and JNK-dependent manner. Blood 2009 May 21;113(21):5217-27.

56. Kojima K., Konopleva M., McQueen T. et al. MDM2 inhibitor Nutlin-3a induces p53-mediated apoptosis by transcription-dependent and transcription-independent mechanisms and may overcome Atm-mediated resistance to fludarabine in chronic lymphocytic leukemia. Blood 2006 August 1; 108(3):993-1000.

57. Senzer N., Nemunaitis J. A review of contusugene ladenovec (Advexin) p53 therapy. Curr Opin Mol Ther 2009;

11:54-61.

58. Lain S., Hollick J.J., Campbell J. et al. Discovery, in vivo activity, and mechanism of action of a small-molecule p53 activator. Cancer Cell 2008;13:454-63.

59. Ringshausen I., O’Shea C.C., Finch A.J. et al. MDM2 is critically and continuously required to suppress lethal p53 activity

in vivo. Cancer Cell 2006;10:501-14.

60. Brummelkamp T.R., Fabius A.W., Mullenders J. et al. An shRNA barcode screen provides insight into cancer cell vulnerability to MDM2 inhibitors.

Nat Chem Biol 2006;2:202-6.

61. Selivanova G., Wiman K.G. Reactivation of mutant p53: molecular mechanisms

and therapeutic potential. Oncogene 2007;26:2243-54.

62. Drakos E., Atsaves V., Li J. et al. Stabilization and activation of p53 downregulates mTOR signaling through AMPK in mantle cell lymphoma. Leukemia

2009 Apr;23(4):784-90.

63. Jin L., Tabe Y., Kojima K. et al. MDM2 antagonist Nutlin-3 enhances bortezomib-mediated mitochondrial apoptosis in TP53-mutated mantle cell lymphoma. Cancer Lett

2010 Dec 28;299(2):161—70.

64. Tabe Y., Sebasigari D., Jin L. et al. MDM2 antagonist nutlin-3 displays antiproliferative and proapoptotic activity in mantle cell lymphoma. Clin Cancer Res 2009 Feb 1;15(3):933-42.

65. Drakos E., Atsaves V., Schlette E. et al. The therapeutic potential of p53 reactivation by nutlin-3a in ALK+ anaplastic large cell lymphoma with wild-type or mutated p53. Leukemia 2009 Dec;23(12):2290-9.

66. Coll-Mulet L., Iglesias-Serret D., Santidrian A.F. et al. MDM2 antagonists activate p53 and synergize with genotoxic drugs in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood 2006 May 15; 107(10):4109-14.

67. Mohammad R.M., Wu J., Azmi A.S. et al. An MDM2 antagonist (MI-319) restores p53 functions and increases the life span of orally treated follicular lymphoma bearing animals. Mol Cancer 2009 Dec 3;8:115.

68. Jones R.J., Chen Q., Voorhees P.M. et al. Inhibition of the p53 E3 ligase HDM-2 induces apoptosis and DNA damage — independent p53 phosphorylation in mantle cell lymphoma. Clin Cancer Res 2008 Sep 1;14(17):5416-25.

69. Petitjean A., Achatz M.I.,

Borresen-Dale A.L. et al. TP53 mutations in human cancers: functional selection and impact on cancer prognosis and outcomes. Oncogene 2007;26:2157-65.

70. Bertheau P., Espie M., Turpin E. et al. TP53 status and response to chemotherapy in breast cancer. Pathobiology 2008; 75:132-9.

71. Sur S., Pagliarini R., Bunz F. et al.

A panel of isogenic human cancer cells suggests a therapeutic approach for cancers with inactivated p53. Proc Natl Acad Sci USA 2009;106:3964-9.

72. Carvajal D., Tovar C., Yang H. et al. Activation of p53 by MDM2 antagonists can protect proliferating cells from mitotic inhibitors. Cancer Res 2005;65:1918-24.

73. Kranz D., Dobbelstein M. Nongenotoxic p53 activation protects cells against S-phase-specific chemotherapy. Cancer Res 2006;66:10274-80.

74. Gudkov A.V., Komarova E.A.

Prospective therapeutic applications of p53 inhibitors. Biochem Biophys Res Commun 2005;331:726-36.

75. Strom E., Sathe S., Komarov P.G. et al. Small-molecule inhibitor of p53 binding

to mitochondria protects mice from gamma radiation. Nat Chem Biol 2006;2:474-9.

3 ’201 1