СПОСОБ ОЦЕНКИ ДЕГИДРОГЕНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ БЕЛКОВЫХ ЭКСТРАКТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ МИКРООРГАНИЗМОВ
METHOD FOR ESTIMATING THE DEHYDROGENASE ACTIVITY OF PROTEIN EXTRACTS PRODUCED FROM MICROORGANISMS

Изобретение относится к биоэлектрохимии и может быть использовано для оценки дегидрогеназной активности белковых экстрактов, полученных из микроорганизмов. Белковые экстракты - альтернативный тип биоэлектрокатализатора для биотопливных элементов и самопитаемых биосенсоров. Такой экстракт содержит в своем составе каскад ферментных и коферментных систем, требующихся для осуществления окислительного или восстановительного превращения, что делает его привлекательным для практического использования объектом. Для контроля качества белкового экстракта при его технологическом производстве требуются методы оценки дегидрогеназной активности. В настоящее время существует ряд методов, позволяющих определить дегидрогеназную активность в отношении различных биологических объектов, однако не указаны методы в отношении именно белковых экстрактов из микроорганизмов. По принципу действия их можно разделить на следующие:
Фотоколориметрические
В качестве акцептора водорода выступает метиленовый синий (патент RU 2476598 С2 «Способ количественного определения дегидрогеназной активности микроорганизмов», Чекалов В.П. Определение с помощью метиленового синего сорбционной способности и дегидрогеназной активности донных отложений //Экология моря. - 2006. - Т. 72. - С. 103-109., Варакин Е. А. и др. Определение дегидрогеназной активности микроорганизмов активного ила в процессе биологической очистки сточных вод //Биотехнологии в химико-лесном комплексе. - 2014. - С. 99-104.)
В качестве акцептора водорода выступает ресазурин (патент RU 2440418 С2 «Способ определения токсичности отходов и почв»)
В качестве акцептора водорода выступает тетразолий п-нитротетразолий фиолетовый (патент SU 1320751 А1 «Способ определения относительной активности дегидрогеназ в лейкоцитах крови»
В качестве акцептора водорода 2,3,5 - трифенилтетразолий хлорид (ТТХ) (патент RU 2491137 С1 «Способ контроля эффективности рекультивации нарушенных тундровых почв различного гранулометрического состава посредством анализа активности дегидрогеназы», патент RU 2387996 С1 «Способ контроля очистки почв, загрязненных углеводородами, и нейтрализации углеводородных шламов посредством анализа активности дегидрогеназы», патент RU 2199211 С2 «Способ определения жизнеспособности коконов земляных червей», методические указания по санитарно микробиологическому исследованию почвы" (утв. главным государственным санитарным врачом ссср 19.02.81 №2293-81 «Определение дегидрогеназной активности микроорганизмов», Zhang, Xinying, et al. "Responses of Scirpus triqueter, soil enzymes and microbial community during phytoremediation of pyrene contaminated soil in simulated wetland." Journal of Hazardous Materials 193 (2011): 45-51.))
Цитохимические методы (патент SU 1553903 А1 «Способ определения активности дегидрогеназ в лимфоцитах», акцептор водорода - п-нитротетразолий фиолетовый). Фотоколориметрические методы с применением ТТХ основаны на способности дегидрогеназ отщеплять водород от различных субстратов (органических кислот, спиртов, углеводов и т.п.) и восстанавливать бесцветный 2,3,5 - трифенилтетразолий хлористый до формазана, окрашенного в красный цвет. Однако недостатками фотоколориметрических методов с применением тетразолиевых солей (патент RU 2491137 С1 «Способ контроля эффективности рекультивации нарушенных тундровых почв различного гранулометрического состава посредством анализа активности дегидрогеназы», патент RU 2387996 С1 «Способ контроля очистки почв, загрязненных углеводородами, и нейтрализации углеводородных шламов посредством анализа активности дегидрогеназы», патент RU 2199211 С2 «Способ определения жизнеспособности коконов земляных червей», методические указания по санитарно - микробиологическому исследованию почвы" (утв. главным государственным санитарным врачом СССР 19.02.81 №2293-81 «Определение дегидрогеназной активности микроорганизмов», Zhang, Xinying, et al. "Responses of Scirpus triqueter, soil enzymes and microbial community during phytoremediation of pyrene contaminated soil in simulated wetland."Journal of Hazardous Materials 193 (2011): 45-51) является негативное воздействие меди на абсорбцию продукта восстановления акцептора водорода 2,3,5 - трифенилтетразолия хлорида, что приводит к невозможности определить дегидрогеназную активность биологического материала, содержащего медь [Obbard J.P. Measurement of dehydrogenase activity using 2-p-iodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyltetrazolium chloride (INT) in the presence of copper //Biology and fertility of soils. - 2001. - Т. 33. - №. 4. - C. 328-330.]. В патенте RU 2440418 C2 «Способ определения токсичности отходов и почв» на основе измерения дегидрогеназной активности определяют токсичность твердых отходов и почв. В качестве акцептора водорода используют ресазурина. Недостатком данного способа является длительное время инкубации реакции - 24 часа.
В патенте RU 2476598 С2 предложен способ количественного определения дегидрогеназной активности микроорганизмов с помощью метиленового синего. Недостатком данного способа является необходимость создания анаэробных условий, в то время как биоэлектрокатализаторы на основе белковых экстрактов работают аэробно.
Также в таких методах не учитывается возможность содержания в биологических образцах веществ, способных восстанавливать акцепторы водорода без присутствия дегидрогеназ.
Задачей, на которое направлено данное изобретение, является разработка нового подхода к количественной оценке дегидрогеназной активности в белковых экстрактах, а именно с помощью электрохимического метода. Технический результат изобретения достигается путем измерения токовых откликов в биоэлектрохимической системе «экстракт + медиатор + субстрат». Задача решается тем, что в стеклянную электрохимическую ячейку помещают три электрода, а именно, рабочий электрод из стеклоуглеродного материала; насыщенный хлоридсеребряный электрод сравнения, вспомогательный электрод из платиновой фольги, далее в стеклянную ячейку заливают рабочий раствор, содержащий калий-фосфатный буферный раствор в качестве фонового электролита, субстрат, феррицианид калия в качестве медиатора, добавляют белковый экстракт, затем подключают электроды к потенциостату и накладывают напряжение 534 мВ, полученную систему перемешивают в течение 20-60 минут до получения стабильных токовых откликов. Измерения проводят в стандартной стеклянной трехэлектродной ячейке (рабочий электрод - стеклоуглеродный электрод; электрод сравнения -насыщенный хлоридсеребряный электрод, отделенного от рабочего отделения ячейки стеклянной фриттой; вспомогательный электрод (противоэлектрод) платиновая фольга, также отделенная от рабочего отделения ячейки стеклянной фриттой) с разделенными пространствами, содержащей 0.5М калий-фосфатного буферного раствора, рН 7.6, в качестве фонового электролита, 4.6 мМ (0.4% согласно мольному соотношению) субстрата, 5 мМ феррицианида калия (1% согласно мольному соотношению) в качестве медиатора. Отделение противоэлектрода и электрода сравнения от рабочего пространства ячейки стеклянной фриттой позволяет исключить влияние процессов на них. Затем электроды подключают к потенциостату, вводят в рабочий раствор ячейки 0.6 мл (0.001% согласно мольному соотношению) исследуемого белкового экстракта и в течение 30 минут измеряют токовые отклики при потенциале поляризации 534 мВ. Токовые кривые снимают при перемешивании раствора на магнитной мешалке со скорость 150-300 об/мин. Медиатор в исходном растворе субстрата (без добавления белкового экстракта) находится в окисленном состоянии. Введение в раствор белкового экстракта приводит к окислению субстрата и восстановлению медиатора в соответствии с ур. (1). При высоком анодном потенциале окисление медиатора на поверхности электрода происходит мгновенно (в тот самый момент, когда медиатор в восстановленном виде достиг поверхности электрода). В перемешиваемом растворе концентрация медиатора вблизи поверхности электрода мгновенно обновляется. Таким образом, измеряемый ток пропорционален концентрации образующегося в реакции (1) продукта.
Ox
Red
где M и M - окисленная и восстановленная формы медиатора.
Достоинством данного способа является простое технологическое исполнение и достаточно быстрая оценка качества биоэлектрокатализатора, а полученные результаты коррелируют с данными, оцененными фотоколориметрическим методом.
Пример 1. Оценка дегидрогеназной активности белковых экстрактов, полученных из энтеробактерий, с субстратом глюкоза.
Измерения проводят в стандартной стеклянной трехэлектродной ячейке с разделенными пространствами, содержащей 0.5 М калий-фосфатного буферного раствора, рН 7.6, в качестве фонового электролита, 4.6 мМ субстрата, 5 мМ феррицианида калия в качестве медиатора и 0.6 мл белкового экстракта, полученного из E.Coli. Потенциометрические измерения проводят относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода сравнения, отделенного от рабочего отделения ячейки стеклянной фриттой. Вспомогательным электродом (противоэлектрод) служит платиновая фольга, также отделенная от рабочего отделения ячейки стеклянной фриттой (для исключения влияния процессов на противоэлектроде). Рабочим электродом служит стеклоуглеродный электрод. Затем в течение 30 минут измеряют токовые отклики при потенциале поляризации 534 мВ. Токовые кривые снимают при перемешивании раствора на магнитной мешалке со скорость 150 об./мин Концентрация образующегося в ходе реакции продукта будет пропорциональна плотности генерируемого тока в ходе биоэлектрохимической реакции.
где j - плотность тока, I - сила тока, s - площадь рабочего электрода.
Дегидрогеназная активность, оцененная предложенным методом, будет выражаться в мкА/см.
Таким образом, дегидрогеназная активность экстрактов, полученных из E.Coli, оцененная электрохимическим методом коррелируют с данными, полученными при помощи фотоколориметрического метода с использованием ТТХ.
Пример 2. Оценка дегидрогеназной активности белковых экстрактов, полученных из аскомицетов, с субстратом глюкоза.
Измерения проводят, как описано в примере 1. Только в качестве образцов выступают экстракты, полученные из Saccharomyces cerevisiae.
Таким образом, дегидрогеназная активность экстрактов, полученных из Saccharomyces cerevisiae, оцененная электрохимическим методом коррелируют с данными, полученными при помощи фотоколориметрического метода с использованием ТТХ.