КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ПУТИ АРГИНИН/N-ДЕГРОНА
COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITION OF PROTEOLYTIC PATH OF ARGININE/N-DEGRON

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Перечень последовательностей, связанных с настоящей заявкой, представлен в текстовом формате и, таким образом, включается в настоящее описание посредством ссылки. Файл, содержащий перечень последовательностей, называется SL_1541-14.txt. Текстовый файл, созданный 17 марта 2020, имеет размер примерно 66 килобайт и представляется в электронном виде.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения опухолевых заболеваний.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Bialecki E.S., Di Bisceglie A.M. Diagnosis of hepatocellular carcinoma // HPB. 2005. V.7, pp.26-34
Personeni N., Pressiani T., Santoro A., Rimassa L. Regorafenib in hepatocellular carcinoma: latest evidence and clinical implications // Drugs Context. 2018. V.7, p.212533
В последние годы появился ряд значительных достижений в лечении рака, которые предлагают многообещающие решения для ранее неизлечимых заболеваний. Однако, некоторые виды рака, такие как гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), остаются мало восприимчивыми к текущей терапии. Функциональная активность даже поврежденной печени и отсутствие явных патологических симптомов ГЦК осложняют ее раннюю диагностику (), что приводит к большому числу неоперабельных пациентов. Кроме того, у многих пациентов развивается резистентность к сорафенибу, еще недавно единственному препарату для терапии ГЦК. В последние годы для лечения ГЦК был одобрен регорафениб - множественный ингибитор киназ, а также два различных ингибитора контрольных точек (вторая линия лечения после появления резистентности к сорафенибу) ().
На сегодняшний день широко применяются следующие основные средства и способы терапии ГЦК:
1. Низкомолекулярные киназные ингибиторы, подавляющие как внутриклеточные киназы (серин/треонинкиназы c-CRAF, BRAF), так и расположенные на поверхности клеток рецепторные тирозинкиназы (Сорафениб, Сунитиниб, Орантиниб, Бриваниб, Линифаниб, Регорафениб).
2. Ингибиторы контрольных точек иммунного ответа (антитела к PD-1, PD-L1, CTLA-4, например, Ниволумаб, Пембролизумаб).
90
3. Радиоэмболизация иттрием-90 (Y).
4. Антитела, селективно ингибирующие VEGFR2 (например, Рамуцирумаб).
5. Трансплантация печени или резекция части печени.
Несмотря на некоторые успехи при применении перечисленных подходов, они обладают рядом значительных недостатков, включая резистентность к лечению, недостаточную эффективность и профиль безопасности. Кроме того, медиана выживаемости для неоперабельных пациентов с ГЦК, подвергающихся одному или нескольким из перечисленных выше видов терапии, все еще остается крайне низкой, составляя от 6 до 8 месяцев.
Таким образом, существующие известные средства и способы лечения гепатоцеллюлярной карциномы на сегодняшний день весьма ограничены и малоэффективны. В связи с этим существует необходимость разработки новых лекарственных препаратов и способов терапии.
Терапия с применением малых интерферирующих РНК (миРНК)
Haussecker D. Current issues of RNAi therapeutics delivery and development // Journal of Controlled Release. 2014. V.195, pp.49-54; Mansoori B. et al. RNA Interference and its role in cancer therapy // Adv. Pharm. Bull. 2014. V4(4), pp.313-321
РНК-интерференция - это селективное посттранскрипционное подавление экспрессии генов, опосредованное малыми интерферирующими РНК (миРНК, siRNA) в клетках эукариот. Полагают, что этот процесс посттранскрипционного сайленсинга генов является эволюционно консервативным механизмом защиты клеток, используемым для предотвращения экспрессии чужеродных генов. Достижения молекулярной биологии и генной инженерии позволяют синтезировать миРНК, направленные против любой РНК с любой нуклеотидной последовательностью. В настоящее время ряд конструкций миРНК продемонстрировал способность специфично подавлять экспрессию генов в моделях как in vitro, так и in vivo. Часть из этих миРНК проходит оценку в клинических исследованиях, а два препарата одобрены для применения в клинике в США и Евросоюзе. При этом, РНК-интерференцию считают многообещающим способом для лечения опухолей, например, путем выключения генов, характеризующихся повышенной экспрессией в трансформированных клетках, либо генов, принимающих участие в делении клетки. Кроме того, на сегодняшний день важным направлением исследований в области РНК-интерференции для клинического применения является разработка способов безопасной и эффективной доставки малых РНК ().
Hu B., Weng Y., Xia X.H., Liang X.J., Huang Y. Clinical advances of siRNA therapeutics // J. Gene Med. 2019. V.21, p.e3097
Недавние разработки на основе РНК-терапии для лечения наследственных и метаболических заболеваний печени привели к созданию эффективных пролонгированных препаратов, которые превосходят низкомолекулярные соединения и антитела (). Однако, РНК после внутривенной или подкожной инъекции быстро выводится почками, что приводит к низкой эффективности доставки в ткани и органы, поэтому существует потребность в разработке новых эффективных систем для адресной доставки миРНК в клетки.
in vivo
Tatiparti K., Sau S., Kashaw S.K., Iyer A.K. siRNA delivery strategies: a comprehensive review of recent developments // Nanomaterials (Basel). 2017. V.7, p.77; Zatsepin T.S., Kotelevtsev Y.V., Koteliansky V. Lipid nanoparticles for targeted siRNA delivery - going from bench to bedside // Int. J. Nanomedicine. 2016. V.11, pp.3077-3086; Cullis P.R., Hope M.J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies // Mol. Ther. 2017. V.25, pp.1467-1475
Chen D., Parayath N., Ganesh S., Wang W., Amiji M. The role of apolipoprotein- and vitronectin-enriched protein corona on lipid nanoparticles for in vivo targeted delivery and transfection of oligonucleotides in murine tumor models // Nanoscale. 2019. V.11, pp.18806-18824
Kulkarni J.A., Witzigmann D., Chen S., Cullis P.R., van der Meel R. Lipid nanoparticle technology for clinical translation of siRNA therapeutics // Acc. Chem. Res. 2019. V.52, pp.2435-2444
Adams D., Gonzalez-Duarte A., O
Riordan W.D., Yang C.C., Ueda M., Kristen A.V., Tournev I., Schmidt H.H., Coelho T., Berk J.L., et al. Patisiran, an RNAi therapeutic, for hereditary transthyretin amyloidosis // N. Engl. J. Med. 2018. V.379, pp.11-21
Среди известных систем доставки миРНК следует выделить стабильные липидные наночастицы (ЛНЧ), обеспечивающие эффективную доставку в клетки печени , что было продемонстрировано при проведении клинических исследований (). Во время циркуляции в кровотоке поверхность ЛНЧ покрывается белками, включая аполипопротеины, которые обеспечивают специфическую рецептор-опосредованную доставку ЛНЧ в гепатоциты (). Оптимизация композиций липидных наночастиц, содержащих миРНК, для адресной доставки в печень () позволила разработать лекарственное средство для транстиретин-опосредованной наследственной амилоидной полинейропатии, одобренное управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) в 2018 году ('). Эта технология также может применяться для подавления любых молекулярных путей в трансформированных клетках, в том числе в клетках гепатоцеллюлярной карциномы.
Протеолитический путь Arg/N-дегрона
Brower C.S., Piatkov K.I., Varshavsky A. Neurodegeneration-associated protein fragments as short-lived substrates of the N-end rule pathway // Mol. Cell. 2013. V.50, pp.161-171; Shearer R.F., Iconomou M., Watts C.K., Saunders D.N. Functional roles of the E3 ubiquitin ligase UBR5 in cancer // Mol. Cancer Res. 2015. V.13, pp.1523-1532; Mao J., Liang Z., Zhang B., Yang H., Li X., Fu H., Zhang X., Yan Y., Xu W., Qian H. UBR2 enriched in p53 deficient mouse bone marrow mesenchymal stem cell-exosome promoted gastric cancer progression via Wnt/b-catenin pathway // Stem Cells. 2017. V.35, pp.2267-2279
Varshavsky A. N-degron and C-degron pathways of protein degradation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2019. V.116, pp.358-366; Varshavsky A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis // Protein Sci. 2011. V.20, pp.1298-1345
Piatkov K.I., Brower C.S., Varshavsky A. The N-end rule pathway counteracts cell death by destroying proapoptotic protein fragments // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V.109, pp.E1839-E1847; Xu Z., Payoe R., Fahlman R.P. The C-terminal proteolytic fragment of the breast cancer susceptibility type 1 protein (BRCA1) is degraded by the N-end rule pathway // J. Biol. Chem. 2012. V.287, pp.7495-7502
В последние годы появились данные, свидетельствующие о том, что протеолитический путь Arg/N-дегрона участвует в процессах связанных с развитием онкологических заболеваний (). Регулируя деградацию специфических белков, путь Arg/N-дегрона (ранее известный, как путь Arg/правила N-конца) влияет на большое количество биологических функций (). Недавние исследования выявили основные анти-апоптотические функции пути Arg/N-дегрона - благодаря своей способности избирательно разрушать специфические про-апоптотические фрагменты белков, включая Asp-BRCA1, Arg-BIMEL, Cys-TRAF1 и CysRIPK1 (). Поскольку апоптоз имеет решающее значение для удаления ненужных или поврежденных клеток, то блокирование внутриклеточных апоптотических путей важно для выживания раковых клеток. И наоборот, стимулирование гибели клеток является основным подходом к лечению большинства видов рака. Анти-апоптотическое действие пути Arg/N-дегрона позволяет предположить, что его активация может подавлять апоптоз и, тем самым, оказывать влияние на прогрессирование опухолевого заболевания.
O
Brien P.M., Davies M.J., Scurry J.P., Smith A.N., Barton C.A., Henderson M.J., Saunders D.N., Gloss B.S., Patterson K.I., Clancy J.L., et al. The E3 ubiquitin ligase EDD is an adverse prognostic factor for serous epithelial ovarian cancer and modulates cisplatin resistance in vitro // Br. J. Cancer. 2008. V.98, pp.1085-1093
Действительно, недавние исследования показали, что внутриклеточный уровень UBR5 (EDD), одной из ключевых убиквитин лигаз этого пути, часто увеличен при карциномах печени, легких и яичников, что также подтверждает возможность уменьшения выживаемости раковых клеток при ингибировании UBR5 (').
Zhang G., Lin R.K., Kwon Y.T., Li Y.P. Signaling mechanism of tumor cell-induced up-regulation of E3 ubiquitin ligase UBR2 // FASEB J. 2013. V.27, pp.2893-2901
Было показано, что другая убиквитин лигаза пути Arg/N-дегрона, UBR2, активируется в опухолях в ответ на кахектические стимулы, включая про-воспалительные цитокины ().
Kwon Y.T., Kashina A.S., Davydov I.V., Hu R.-G., An J.Y., Seo J.W., Du F., Varshavsky A. An essential role of N-terminal arginylation in cardiovascular development // Science. 2002. V.297, pp.96-99; Kashina A. Protein arginylation, a global biological regulator that targets actin cytoskeleton and the muscle // Anat. Rec. (Hoboken). 2014. V.297, pp.1630-1636; An J.Y., Seo J.W., Tasaki T., Lee M.J., Varshavsky A., Kwon Y.T. Impaired neurogenesis and cardiovascular development in mice lacking the E3 ubiquitin ligases UBR1 and UBR2 of the N-end rule pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V.103, pp.6212-6217
Наконец, генетические исследования с удалением генов отдельных Ubr-убиквитиновых лигаз в модельных организмах указывают на то, что этот путь положительно влияет на рост сосудов и подвижность клеток ().
Эти и другие данные подтверждают, что путь Arg/N-дегрона играет важную роль в положительной регуляции пролиферации, подвижности и выживаемости раковых клеток. Следовательно, ингибирование этого пути может являться потенциально эффективным подходом для лечения рака.
Varshavsky A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis // Protein Sci. 2011. V.20, pp.1298-1345; Sriram S.M., Kwon Y.T. The molecular principles of N-end rule recognition // Nat. Struct. Mol. Biol. 2010. V.17, pp.1164-1165; Tasaki T., Zakrzewska A., Dudgeon D.D., Jiang Y., Lazo J.S., Kwon Y.T. The substrate recognition domains of the N-end rule pathway // J. Biol. Chem. 2009. V.284, pp.1884-1895
Hwang C.S., Sukalo M., Batygin O., Addor M.C., Brunner H., Aytes A.P., Mayerle J., Song H.K., Varshavsky A., Zenker M. Ubiquitin ligases of the N-end rule pathway: assessment of mutations in UBR1 that cause the Johanson-Blizzard syndrome // PLoS One. 2011. V.6, p.e24925; Kwon Y.T., Xia Z., Davydov I.V., Lecker S.H., Varshavsky A. Construction and analysis of mouse strains lacking the ubiquitin ligase UBR1 (E3alpha) of the N-end rule pathway // Mol. Cell. Biol. 2001. V.21, pp.8007-8021; Sultana R., Theodoraki M.A., Caplan A.J. Specificity in the actions of the UBR1 ubiquitin ligase in the degradation of nuclear receptors // FEBS Open Bio. 2013. V.3, pp.394-397; Tasaki T., Mulder L.C.F., Iwamatsu A., Lee M.J., Davydov I.V., Varshavsky A., Muesing M., Kwon Y.T. A family of mammalian E3 ubiquitin ligases that contain the UBR box motif and recognize N-degrons // Mol. Cell. Biol. 2005. V.25, pp.7120-7136
Kwon Y.T. et al. Female lethality and apoptosis of spermatocytes in mice lacking the UBR2 ubiquitin ligase of the N-end rule pathway // Mol. Cell. Biol. 2003. V.23, pp.8255-8271; Saunders D.N. et al. Edd, the murine hyperplastic disc gene, is essential for yolk sac vascularization and chorioallantoic fusion // Mol. Cell. Biol. 2004. V.24, pp.7225-7234; Tasaki T. et al. UBR box N-recognin-4 (UBR4), an N-recognin of the N-end rule pathway, and its role in yolk sac vascular development and autophagy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V.110, pp.3800-3805
Choi W.S. et al. Structural basis for the recognition of N-end rule substrates by the UBR box of ubiquitin ligases // Nat. Struct. Mol. Biol. 2010. V.17, pp.1175-1181; Kitamura K. Inhibition of the Arg/N-end rule pathway-mediated proteolysis by dipeptide-mimetic molecules // Amino Acids. 2016. V.48, pp.235-243; Lee M.J. et al. Synthetic heterovalent inhibitors targeting recognition E3 components of the N-end rule pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V.105, pp.100-105; Matta-Camacho E. et al. Structural basis of substrate recognition and specificity in the N-end rule pathway // Nat. Struct. Mol. Biol. 2010. V.17, pp.1182-1187; Sriram S. et al. Development and characterization of monomeric N-end rule inhibitors through in vitro model substrates // J. Med. Chem. 2013. V.56, pp.2540-2546
Компоненты пути Arg/N-дегрона представляют собой специфические убиквитин лигазы Е3 (N-рекогнины), которые могут узнавать дестабилизирующие N-концевые аминокислоты, называемые N-дегронами (). У человека и мыши есть четыре известных белка пути N-дегрона, UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5, которые являются функционально избыточными () и важны для раннего эмбрионального развития (). Эти белки структурно отличаются и принадлежат к разным семействам убиквитин лигаз, поэтому разработка универсального низкомолекулярного ингибитора для всех четырех белков чрезвычайно сложна, если вообще возможна ().
Kitamura K. Inhibition of the Arg/N-end rule pathway-mediated proteolysis by dipeptide-mimetic molecules // Amino Acids. 2016. V.48, pp.235-243; Lee M.J. et al. Synthetic heterovalent inhibitors targeting recognition E3 components of the N-end rule pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V.105, pp.100-105; Baker R.T., Varshavsky A. Inhibition of the N-end rule pathway in living cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88, pp.1090-1094
Для регулирования пути N-дегрона малыми молекулами были предложены дипептиды, а также гетеровалентные лиганды, которые имитируют N-дегроны и конкурентно связываются с убиквитин лигазами, предотвращая взаимодействие с их естественными субстратами (). В частности, указанные низкомолекулярные ингибиторы могут непосредственно связывать N- и UBR-домены UBR-убиквитин-лигаз (UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5).
Saha S. et al. Small molecule inhibitors of arginyltransferase regulate arginylation-dependent protein degradation, cell motility, and angiogenesis // Biochem. Pharmacol. 2012. V.83, pp.866-873
Было также обнаружено, что другие соединения, такие как дубильная кислота и мербромин, могут специфически и эффективно подавлять активность белка ATE1 в клетке, который является критическим ферментом пути Arg/N-дегрона, действующим на этапе до E3 лигазы ().
Rageul J. et al. Conditional degradation of SDE2 by the Arg/N-End rule pathway regulates stress response at replication forks // Nucleic Acids Res. 2019. V.47, pp.3996-4010; Cipolla L. et al. UBR5 interacts with the replication fork and protects DNA replication from DNA polymerase h toxicity // Nucleic Acids Res. 2019. V.47, pp.11268-11283; Kim S.T. et al. The N-recognin UBR4 of the N-end rule pathway is required for neurogenesis and homeostasis of cell surface proteins // PLoS ONE. 2018. V.13, p.e0202260
in vitro
миРНК также использовались для подавления индивидуальных белков пути Arg/N-дегрона in vitro, что позволило изучить роли индивидуальных белков в деградации конкретных мишеней (). Однако, все эти исследования по временному или частичному ингибированию пути N-дегрона проводились только на перевиваемых клеточных линиях .
На основании вышеизложенного можно заключить, что протеолитический путь Arg/N-дегрона является новой мишенью для противоопухолевой терапии, поскольку может положительно регулировать многие процессы, сопровождающие развитие онкологических заболеваний, включая ангиогенез, пролиферацию клеток, их подвижность и выживание. Следовательно, ингибирование пути Arg/N-дегрона может стать высокоэффективным подходом для терапии ряда онкологических заболеваний.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение основано на новом подходе, использующем в качестве мишеней для терапии рака UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона, с применением клинически апробированной технологии РНК-интерференции, при этом ингибирование данного пути также может усиливать действие химиотерапевтических, цитостатических, проапоптических или таргетных препаратов, например, при лечении гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Указанный подход принципиально отличается от уже существующих средств и способов терапии ГЦК, поскольку обладает иным механизмом действия (РНК-интерференция), обеспечивающим подавление экспрессии целевых белков UBR-убиквитин-лигаз, относящихся к протеолитическому пути Arg/N-дегрона, что, в свою очередь, приводит к индукции спонтанного апоптоза в трансформированной клетке.
Кроме того, предложенный подход также отличается от вариантов комбинаторного лечения, применяющих миРНК в сочетании с химиотерапией или ингибиторами иммунных контрольных точек, поскольку такие комбинации, во-первых, не нацелены на путь Arg/N-дегрона, а, во-вторых, не предназначены для терапии ГЦК.
Кроме того, из уровня техники не известны специфические ингибиторы пути Arg/N-дегрона, нацеленные сразу на все четыре UBR-убиквитин-лигазы (UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5). Ранее описанные низкомолекулярные ингибиторы, нацеленные на UBR-убиквитин-лигазы, ингибируют не только N-дегроновые убиквитин-лигазы, но и любые другие убиквитин-лигазы, которые содержат UBR-домен. Следует отметить, что существует семь известных убиквитин-лигаз, содержащих UBR-домен, при этом три из них не являются частью пути Arg/N-дегрона. Кроме того, указанные низкомолекулярные ингибиторы обладают иным механизмом действия, требуют больших доз и не позволяют реализовать адресную доставку в печень.
Таким образом, с учетом существующей потребности в разработке новых препаратов, методов или оптимизации известных схем лечения ГЦК, настоящее изобретение направлено на расширение арсенала доступных терапевтических средств, а также усовершенствование способов их адресной доставки в орган-мишень, с устранением одного или более недостатков согласно предшествующему уровню техники.
Целью настоящего изобретения является создание новых средств, композиций и способов для ингибирования протеолитического пути аргинин/N-дегрона с применением технологий РНК-интерференции, для обеспечения индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли, расширения арсенала способов и средств для лечения онкологических заболеваний, а также для повышения эффективности действия химиотерапевтических цитостатических, проапоптических или таргетных препаратов, применяющихся для терапии указанных онкологических заболеваний.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что ингибирование по меньшей мере трех UBR-убиквитин-лигаз пути Arg/N-дегрона (UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5) с применением молекул малых интерферирующих РНК (миРНК) обеспечивает эффективное повреждение или по меньшей мере частичное разрушение трансформированных клеток вследствие индуцированного апоптоза, а также увеличивает чувствительность указанных трансформированных клеток к действию химиотерапевтических, цитостатических, проапоптических и таргетных агентов, что в свою очередь приводит к увеличению эффективности указанных агентов, а также позволяет применять их в более низких дозах, тем самым улучшая профиль безопасности лечения и уменьшая побочные эффекты.
Согласно одному варианту реализации изобретения предложена молекула миРНК, снижающая уровень мРНК убиквитин лигаз в клетке, при этом указанная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, длиной по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, и отличающуюся не более чем на 3 нуклеотида от последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82.
Согласно предпочтительному варианту реализации, указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82.
Согласно одному варианту реализации изобретения указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона.
Согласно одному варианту реализации изобретения в предложенной молекуле миРНК по меньшей мере один нуклеотид из последовательности содержит химическую модификацию. В предпочтительном варианте реализации указанная химическая модификация выбрана из 2'-O-метилнуклеотида, 3'-межнуклеотидного тиофосфата и их комбинаций.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 14.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 40.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 56.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 70.
Согласно дополнительному варианту реализации изобретения, указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, более предпочтительно клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена липидная наночастица, содержащая одну или более молекул миРНК согласно изобретению.
В предпочтительном варианте реализации указанная липидная наночастица содержит одну или более молекул миРНК, содержащих последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 56 и SEQ ID NO. 70.
В одном из вариантов реализации изобретения предложенная липидная наночастица имеет размер, составляющий от 60 до 140 нм. Согласно другому варианту реализации предложенная липидная наночастица характеризуется дзета-потенциалом, составляющим от -15 до +15 мВ.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложена комбинация для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложена комбинация для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение молекулы миРНК согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение молекулы миРНК согласно изобретению для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение липидной наночастицы согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение липидной наночастицы согласно изобретению для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение комбинации, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение комбинации, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.
В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с молекулой миРНК согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с липидной наночастицей согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляет собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с комбинацией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляет собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы и холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в трансформированной клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с комбинацией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляет собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы и холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества молекулы миРНК согласно изобретению, липидной наночастицы согласно изобретению, фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют посредством внутривенной инъекции. В другом варианте реализации указанное введение осуществляют в дозе, составляющей от 0,1 мг/кг до 5 мг/кг.
В другом варианте реализации указанное введение осуществляют один раз в неделю.
В еще одном варианте реализации указанное введение осуществляют два раза в неделю.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего 4 недели.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего не более 5 недель.
Согласно дополнительному варианту реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего не более 12 недель.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанный способ включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, который может представлять собой химиотерапевтический, цитостатический, проапоптический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный дополнительный терапевтический агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с молекулой миРНК согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с липидной наночастицей согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
in vitro
in vivo.
in vivo
Фиг. 1. Отбор миРНК в экспериментах и (А) Оценка уровня мРНК в культуре клеток Hepa1-6 после трансфекции 1 нМ миРНК, специфичными к Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5. Уровень мРНК анализировали через 24 часа после трансфекции. (Б) Кривые зависимости уровня мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5 в культуре клеток Hepa1-6 от концентрации миРНК. Уровень мРНК анализировали через 24 часа после трансфекции (среднее значение ± SD). Р-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа, по сравнению с контролем. (*P <0,05, ** P< 0,005, *** P< 0,0005, **** P 0,0001). (В) Оценка уровня Ubr мРНК в печени через 3 дня после инъекции соответствующих миРНК в составе липидных наночастиц (ЛНЧ). (Г) Зависимость уровня мРНК в клетках печени от дозы миРНК через 3 дня после инъекции ЛНЧ. (Д) Восстановление уровня мРНК и белка Ubr убиквитин лигаз в печени через 3, 5, 7, 10 или 15 дней после однократных инъекций соответствующих миРНК в составе ЛНЧ. (Е) Оценка тканеспецифической активности миРНК через 3 дня при системном введении в составе ЛНЧ. Для всех экспериментов  количество повторов n=3 и результаты представлены в виде среднего ± SEM. Р-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа, по сравнению с контролем (*P <0,05, ** P< 0,005, *** P< 0,0005, **** P< 0,0001).
in vitro
1119
f
f
R48
1119
f
1119
f
Фиг. 2. Эффект подавления экспрессии Ubr-убиквитин лигаз пути Arg/N-дегрона . (А) Анализ уровня белков UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 методом иммуноблоттинга в клеточных культурах Hepa 1-6 и AML-12 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК siUbrs. (Б) Количественная оценка уровня экспрессии UBR белков в клеточных культурах Hepa 1-6 и AML-12 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК. (В) Asp-BRCA1 (образующийся из DHFR-Ub-Asp-BRCA1) и Val-BRCA1 экспрессировали в культуре клеток Hepa 1-6, трансфицированных миРНК. Образцы клеточных лизатов анализировали методом гель-электрофореза по Лэммли и визуализировали иммуноблоттингом антителами к FLAG. (Г) Анализ уровня пролиферации клеток при окрашивании красителем нейтральным красным в культуре Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 10 нМ миРНК. (Д) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 10 нМ миРНК. Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-положительными клетками. Шкала 100 мкм. (Е) Тест на миграцию клеток проводили на культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли по критерию Стьюдента (*P 0,01).
in vitro
Фиг. 3. Фенотип, наблюдаемый  при подавлении экспрессии Ubr убиквитин лигаз является результатом прямого специфичного действия миРНК. (А) Анализ миграции клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции двумя различными смесями миРНК, специфичных к Ubr убиквитин лигазам (10 нМ). (Б) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции двумя различными смесями миРНК (10 нМ). Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-позитивными клетками. Шкала -100 мкм. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*Р <0,05).
Фиг. 4. Подавление Ubr убиквитин лигаз приводит к активации апоптоза. Анализ уровня гибели клеток методом проточной цитометрии при окрашивании Аннексином V /7AAD культуры клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*Р <0,05).
high
+
Фиг. 5. Продолжительное подавление экспрессии Ubr-убиквитин лигаз в печени вызывает воспаление. В течение 4 недель дважды в неделю мыши получали инъекцию миРНК в липидных наночастицах. Комбинированная доза липидных частиц содержала по 0,3 мг/кг миРНК UBR1, UBR2 и UBR5 и 0,5 мг/кг миРНК UBR4, общая доза по всем миРНК 1,4 мг/кг. Контрольные мыши получали инъекцию липидных частиц LNP-siCtrl с контрольной миРНК к люциферазе в дозе 1,4 мг/кг. (А) Уровень мРНК и (Б) уровень белков UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 в печени мышей после инъекции липидных частиц. Уровень UBR5 в печени не определялся. (В) Кривая массы тела животных, получавших инъекции ЛНЧ. Масса животных измерялась перед каждой инъекцией ЛНЧ и усреднялась по группе. Изменения массы животного выражались в процентах от исходной массы животного в начальный день эксперимента (0 день). (Г) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в клетках печени мышей, получавших инъекции ЛНЧ. Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-положительными клетками. Масштаб 100 мкм. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*P 0,02). (Д) Окрашивание гематоксилином и эозином тканей печени мышей, получавших инъекции ЛНЧ. Масштаб 200 мкм (10x) и 100 мкм (20x). (Е) Анализ представленности популяций нейтрофилов, макрофагов и эозинофилов в печени мышей, получавших инъекции ЛНЧ, методом проточной цитометрии. (Ж) % нейтрофилов, Ly6C макрофагов или эозинофилов в печени мышей, получавших инъекции ЛНЧ или носителя, гейтированные на CD45 клетки. Результаты представлены как среднее значение ± SEM. n=5 мышей на группу.
Фиг. 6. Характеристика селезенки при хроническом подавлении экспрессии Ubr-убиквитин лигаз. (А) Уровни мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5 в селезенке мышей, после инъекций смеси ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5. (Б) Анализ представленности популяций нейтрофилов, макрофагов и эозинофилов в селезенке мышей, получавших инъекции ЛНЧ, методом проточной цитометрии. (В) % нейтрофилов, Ly6Chigh макрофагов и эозинофилов в селезенке мышей, получавших инъекции ЛНЧ, нормированных на CD45+ клетки Результаты представлены как среднее значение ± SEM. n=5 мышей на группу. Р-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа, по сравнению с контролем (*P <0,05, ***P< 0,0005, ****P< 0,0001).
Фиг. 7. Экспрессия уровня Ubr-убиквитин лигаз в печени мышей с ГЦК. Уровни мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5 в печени здоровых мышей и мышей с ГКК определяли после инъекций ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5 в течение 5 недель. Инъекции проводили дважды в неделю, суммарная доза миРНК в смеси составляла 1,4 мг/кг. (***Р< 0,0005, ****Р< 0,0001).
high
high
+
Фиг. 8. Подавление экспрессии Ubr-убиквитин лигаз пути Arg/N-дегрона в модели гепатоклеточной карциномы (ГЦК) увеличивает опухолевую нагрузку и воспаление. Схема эксперимента: временная шкала индукции опухоли (инъекция онкоген-кодирующих плазмид) и режим инъекций ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5. Инъекции ЛНЧ-миРНК проводили в течение 4 недель (А) или в течение 5 недель (Б), один или два раза в неделю. Образцы ткани для анализа извлекали на 66 день после индукции опухоли. (В-Г) Анализ соотношения массы печени к массе тела животных с индуцированной гепатоклеточной карциномой и получавших инъекции ЛНЧ-миРНК в течение 4 недель (В) или 5 недель (Г). Соотношение масса печени/масса тела в каждой группе соотносили к контрольной группе мышей с ГЦК. (Д) Анализ представленности популяций нейтрофилов, и Ly6C макрофагов в селезенке мышей с ГЦК, получавших инъекции ЛНЧ, методом проточной цитометрии. (Е) % нейтрофилов and Ly6C макрофагов в селезенке мышей с ГЦК, получавших инъекции ЛНЧ-миРНК, нормированных на CD45 клетки. Результаты представлены как среднее значение ± SEM. n=3-10 мышей на группу. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*P <0,05).
Фиг. 9. Подавление экспрессии UBR-убиквитиновых лигаз пути Arg/N-дегрона усиливает действие препаратов, индуцирующих апоптоз in vitro. (А) Анализ пролиферации клеток Hepa 1-6 cells после ко-трансфекции миРНК и добавления доксорубицина (левая панель) или только доксорубицина (правая панель). (Б-В) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК к UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 и 48-часовой инкубации в присутствии доксорубицина. Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-положительными клетками. Масштаб 100 мкм. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа (****P <0,0001).
in vitro
Фиг. 10. Нокдаун UBR-убиквитин лигаз пути Arg/N-дегрона усиливает действие препаратов, индуцирующих апоптоз . (А) Анализ пролиферации клеток Hepa 1-6 cells после ко-трансфекции миРНК и добавления стауроспорина (левая панель) или только стауроспорина (правая панель). (Б) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 и 24-часовой инкубации в присутствии 50 нМ стауроспорина. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. P-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа (**Р <0,001, ****Р <0,0001).
Фиг. 11. Химиотерапия при ГЦК эффективнее в условиях подавления пути Arg/N-дегрона. (А) Схема эксперимента: хронология индукции опухоли (инъекция онкоген-кодирующих плазмид) и инъекций миРНК в составе ЛНЧ (черная шкала) и доксорубицина (серая шкала). Ткани для анализа извлекали на 68-й день после индукции опухоли. (Б) Окрашивание гематоксилином и эозином срезов тканей печени мышей с ГЦК, получавших инъекции ЛНЧ и доксорубицина. Шкала 100 мкм. (В) Анализ методом проточной цитометрии нейтрофилов, макрофагов и дендритных клеток в селезенке мышей с ГЦК, получавших инъекции ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5 и доксорубицина.
Фиг. 12. Химиотерапия гепатоклеточной карциномы проходит эффективнее в условиях подавления пути Arg/N-дегрона. (А) Анализ соотношения массы печени к массе тела животных с индуцированной гепатоклеточной карциномой и получавших в течение 4 недель инъекции ЛНЧ с дозой 1 мг/кг и дополнительно получавших или не получавших доксорубицин. n=10-18 мышей на группу. Результаты представлены как среднее значение ± SEM. (Б) Кривая массы тела животных, получавших инъекции ЛНЧ. Масса животных измерялась перед каждой инъекцией ЛНЧ и усреднялась по группе. Изменения массы животного выражались в процентах от исходной массы животного в день первой инъекции. (В) Срезы печени прокрашивали антителами к маркеру пролиферации Ki67 n=4 мыши на группу. (Г) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в срезах печени. Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-положительными клетками Шкала 100 мкм. n=2-3 мыши на группу. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*P <0,05, ***P<0,001, ****P< 0,0001).
Фиг. 13. Распределение липидных частиц по размерам, полученное методом динамического светорассеяния. (А) ЛНЧ с миРНК UBR1; (Б) ЛНЧ с миРНК UBR2; (В) ЛНЧ с миРНК UBR4; (Г) ЛНЧ с миРНК UBR5; (Д) ЛНЧ с миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5 (миРНК siUbr); (Е) ЛНЧ с контрольной миРНК, специфичной к мРНК люциферазы (миРНК Ctrl).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к использованию в качестве мишеней для терапии рака UBR-убиквитин-лигаз пути Arg/N-дегрона, с применением клинически апробированной технологии РНК-интерференции, при этом ингибирование данного пути также может усиливать действие химиотерапевтических, цитостатических, проапоптических или таргетных препаратов, при лечении опухолевых заболеваний.
Согласно одному варианту реализации изобретения предложены молекулы миРНК, снижающие уровень мРНК убиквитин лигаз в клетке, при этом указанные молекулы миРНК содержат смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, длиной по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, и отличающуюся не более чем на 3 нуклеотида от последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82.
Согласно предпочтительному варианту реализации, указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82.
Согласно одному варианту реализации изобретения указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона.
O
Согласно одному варианту реализации изобретения в предложенной молекуле миРНК по меньшей мере один нуклеотид из последовательности содержит химическую модификацию. В предпочтительном варианте реализации указанная химическая модификация выбрана из 2'--метилнуклеотида, 3'-межнуклеотидного тиофосфата и их комбинаций.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 14.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 40.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 56.
Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 70.
Согласно дополнительному варианту реализации изобретения, указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку. Более предпочтительно указанная опухолевая клетка представляет собой клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена липидная наночастица, содержащая одну или более молекул миРНК согласно изобретению.
В предпочтительном варианте реализации указанная липидная наночастица содержит одну или более молекул миРНК, содержащих последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 56 и SEQ ID NO. 70.
В одном из вариантов реализации изобретения предложенная липидная наночастица имеет размер, составляющий от 60 до 140 нм.
Согласно еще одному варианту реализации предложенная липидная наночастица характеризуется дзета-потенциалом, составляющим от -15 до +15 мВ.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложена комбинация для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В еще одном предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложена комбинация для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В еще одном предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение молекулы миРНК согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение молекулы миРНК согласно изобретению для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение липидной наночастицы согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение липидной наночастицы согласно изобретению для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение комбинации, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение комбинации, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с молекулой миРНК согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с липидной наночастицей согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с комбинацией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы и холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в трансформированной клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с комбинацией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы и холангиокарциномы.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества молекулы миРНК согласно изобретению, липидной наночастицы согласно изобретению, фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют посредством внутривенной инъекции. В другом варианте реализации указанное введение осуществляют в дозе, составляющей от 0,1 мг/кг до 5 мг/кг.
В другом варианте реализации указанное введение осуществляют один раз в неделю.
В еще одном варианте реализации указанное введение осуществляют два раза в неделю.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего 4 недели.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего не более 5 недель.
Согласно дополнительному варианту реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего не более 12 недель.
Согласно некоторым вариантам реализации, указанный способ включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, который может представлять собой химиотерапевтический, цитостатический, проапоптический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный дополнительный терапевтический агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с молекулой миРНК согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с липидной наночастицей согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы
Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы
Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.
Указанные и другие варианты реализации изобретения подробно описаны в Примерах ниже.
ПРИМЕРЫ
Подавление экспрессии UBR-убиквитин лигаз in vitro
Для подавления экспрессии мышиных мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5, был проведен скрининг 10 лучших кандидатов миРНК для каждой UBR-убиквитин-лигазы в линии клеток Hepa 1-6 (фиг. 1A). Для предотвращения подавления побочных мишеней, миРНК были отобраны на основании нескольких известных критериев. В результате были выбраны две наиболее эффективные миРНК для каждой UBR-убиквитин-лигазы и использованы в дальнейших исследованиях (фиг. 1Б). Полученные низкие концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) позволяют использовать низкие концентрации миРНК, что дополнительно уменьшает вероятность побочных эффектов. Было показано, что 0,25 нМ каждой миРНК достаточно для достижения снижения уровня белка на 70-80% после 72 часов воздействия в клетках Hepa 1-6 и AML-12 (фиг. 2А и 2Б). Затем нами был использован репортер деградации Asp1119-BRCA1 для доказательства того, что наблюдаемое подавление UBR-убиквитин-лигаз пути Arg/N-дегрона является достаточным для снижения функциональной активности пути. Эта репортерная система состоит из контрольной FLAG-меченной дигидрофолатредуктазы мыши (fDHFR-UbR48), связанной с FLAG-меченной изучаемой мишенью пути Arg/N-дегрона. Котрансляционное расщепление белка Ub деубиквитилазами дает как белок с исследуемым N-концевым остатком, так и фрагмент контрольного белка в эквимолярном соотношении. В нормальных условиях про-апоптотический фрагмент белка BRCA-1 (Asp-BRCA1) разрушается UBR-убиквитин-лигазами пути Arg/N-дегрона и, следовательно, должен накапливаться, если функциональная активность пути нарушена. Действительно, замедленная деградация про-апоптотического фрагмента BRCA1 наблюдалась, когда клетки Hepa 1-6 обрабатывали миРНК против Ubrs (фиг. 2В), что указывает на ингибирование функциональной активности пути Arg/N-дегрона в нашей системе.
in vitro
Известно, что путь Arg/N-дегрона положительно регулирует пролиферацию и миграцию клеток. Далее авторы настоящего изобретения подтвердили, что подавление UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 снижало пролиферацию и миграцию клеток Hepa 1-6 через 72 ч после воздействия миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 (siUbrs) по сравнению с контролем миРНК (siCtrl) (фиг. 2Г-2Е; фиг. 3A). С другой стороны, путь Arg/N-дегрона ответственен за деградацию проапоптотических фрагментов. Следовательно, подавление UBR-убиквитин-лигаз должно приводить к увеличению спонтанного апоптоза в клетках, предварительно трансфицированных миРНК siUbr. Спонтанный апоптоз был повышен на 3-8% по сравнению с контрольной группой, что продемонстрировали результаты анализа методом TUNEL (фиг. 2E) и окрашивания аннексином V (фиг. 4). Авторы настоящего изобретения не обнаружили положительных 7-аминоактиномициновых D (7AAD) клеток, что указывает на то, что в клетках, обработанных миРНК-siUbr, была увеличена гибель только апоптотических клеток. Результаты  также были проверены с использованием второго набора высокоэффективных миРНК siUbr (фиг. 3), подтверждая прямое влияние подавления UBR-убиквитин-лигаз на пролиферацию, миграцию и апоптоз клеток.
Подавление экспрессии UBR-убиквитин лигаз в здоровой печени мыши
in vivo
Выбранные миРНК для подавления экспрессии UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 убиквитин лигаз были индивидуально упакованы в липидные наночастицы с использованием липидоида C12-200, и далее были проверены на активность подавления мишеней  через 72 часа после однократной внутривенной инъекции в дозе 0,25 мг/кг (каждая миРНК) (фиг. 1В). Поскольку возможно упаковывать сразу несколько разных миРНК в одну ЛНЧ, то авторы настоящего изобретения получили ЛНЧ, содержащие как одну, так и все четыре миРНК для подавления убиквитин-лигаз UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5. Благодаря своим размерам (80-90 нм) и почти нейтральному заряду, ЛНЧ с миРНК легко проходят через эндотелиальные слои, которые отделяют гепатоциты от кровотока, и в дальнейшем интернализуются гепатоцитами посредством макропиноцитоза. Биологическое распределение таких ЛНЧ с миРНК на основе липидоида C12-200 после внутривенной инъекции мышам было оценено ранее и подтверждено, что подавление мишеней происходило только в клетках печени. Наиболее эффективные ЛНЧ-миРНК (si1-6, si2-9, si4-7 и si5-4; Таблица 1) были выбраны для проведения экспериментов по зависимости подавления мишени от дозы миРНК, восстановлению уровня экспрессии мишени от времени после единичной инъекции и биораспределению (фиг. 1Г-1Е), а также всех дальнейших экспериментов в этом исследовании. Однократное введение ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 в дозах от 0,125 до 0,5 мг/кг приводило к сильному снижению уровня мРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 (80-85%) в печени здоровых животных через 72 ч после инъекции (фиг. 1Г). Ни одна из протестированных доз не привела к гибели животных, что свидетельствует о том, что эффективное подавление экспрессии UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 возможно при использовании количеств миРНК гораздо ниже максимально переносимой дозы. В селезенке, почке, легких и костном мозге не было выявлено значительного подавления мишени. Тем не менее, 50-60% нокдаун Ubrs наблюдался в висцеральной жировой ткани (фиг. 1Е), возможно, из-за доставки в периферические макрофаги. Подавление мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4, Ubr5 в печени здоровых животных более чем на 60% продолжалось, по меньшей мере 10 дней, что обеспечивает удобный режим инъекций раз в неделю при многократном применении. Хроническое применение ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 показало, что длительное подавление UBR-убиквитин-лигаз может быть достигнуто в печени здоровых мышей без индукции значительной гепатотоксичности (фиг. 3). Самки мышей линии C57BL/6 получали инъекцию ЛНЧ-миРНК (суммарно 1,4 мг/кг миРНК) в течение 4 недель. Хотя уровни АЛТ, АСТ и АЛП были увеличены у мышей, получавших ЛНЧ-миРНК (Таблица 2), не наблюдалось значительного изменения веса или различий в поведении мышей между группами (фиг. 5В), что указывает на хорошую переносимость ЛНЧ-миРНК. Было достигнуто подавление мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5 в печени на 75-90% по сравнению с контрольной группой, которой вводили фосфатно-солевой буфер; однако снижение уровней мРНК всех Ubrs также наблюдалось в группе с контрольной ЛНЧ-миРНК. При этом снижение уровня мРНК Ubr не наблюдалось при многократных инъекциях в меньшей или равной дозе контрольными ЛНЧ-миРНК siCtlr, с миРНК к люциферазе (фиг. 7). Также не наблюдалось никаких фенотипических различий между здоровыми животными и группой получавшей ЛНЧ-миРНК.
Таблица 1. Последовательности миРНК, протестированные и использованные в данном исследовании.
Последовательности смысловой цепи
Последовательности антисмысловой цепи
si-Ctrl
si-LUC
cuuAcGcuGAGuAcuucGATsT
UCGAAGuACUcAGCGuAAGTsT
si-Ubr1
si-1-1
caAAGuAGuGuucauAAAAdTsdT
UUUuAUGAAcACuACUUUGdTsdT
si-1-2
ccuucGGuGAuAAaAuAcAdTsdT
UGuAUUUuAUcACCGAAGGdTsdT
si-1-3
gguuAuGGcucAccAGAAAdTsdT
UUUCUGGUGAGCcAuAACCdTsdT
si-1-4
gacuuuAGAcAGAuAuuuudTsdT
AAAAuAUCUGUCuAAAGUCdTsdT
si-1-5
gacAGGAAcAAuAaAuucAdTsdT
UGAAUUuAUUGUUCCUGUCdTsdT
si-1-6
caGAcuAGGuGcuauuucAdTsdT
UGAAAuAGcACCuAGUCUGdTsdT
si-1-7
gauuAAAcAGuAuaAuAcAdTsdT
UGuAUuAuACUGUUuAAUCdTsdT
si-1-8
gcuuAGAGAAuGucAuAAAdTsdT
UUuAUGAcAUUCUCuAAGCdTsdT
si-1-9
ggcccGGcuGuuAcuGAAAdTsdT
UUUcAGuAAcAGCCGGGCCdTsdT
si-1-10
caGAAuAucGGGuuAuAAudTsdT
AUuAuAACCCGAuAUUCUGdTsdT
si-Ubr2
si-2-1
gauGGuGAAcAGccAAucAdTsdT
UGAUUGGCUGUUcACcAUCdTsdT
si-2-2
ccAAGAAAAAGuuaGcAuudTsdT
AAUGCuAACUUUUUCUUGGdTsdT
si-2-3
auuGuuAAGcAAAaGuGAAdTsdT
UUcACUUUUGCUuAAcAAUdTsdT
si-2-4
aaGuGAAGuGGcAuAuAAAdTsdT
UUuAuAUGCcACUUcACUUdTsdT
si-2-5
aguGAAGuGGcAuauAAAudTsdT
AUUuAuAUGCcACUUcACUdTsdT
si-2-6
aguGGcAuAuAAAuuuccAdTsdT
UGGAAAUUuAuAUGCcACUdTsdT
si-2-7
gcuccuAccucuAaGuGAAdTsdT
UUcACUuAGAGGuAGGAGCdTsdT
si-2-8
gauAGAAcAuccucuuAGAdTsdT
UCuAAGAGGAUGUUCuAUCdTsdT
si-2-9
ggcGAGAGAuGuucGAcAAdTsdT
UUGUCGAAcAUCUCUCGCCdTsdT
si-2-10
gacuAuGGGAAGAgAuucAdTsdT
UGAAUCUCUUCCcAuAGUCdTsdT
si-Ubr4
si-4-1
caAAGAAGAuGAcuAcGAAdTsdT
UUCGuAGUcAUCUUCUUUGdTsdT
si-4-2
gcAAGuGuAGuucaGuGAAdTsdT
UUcACUGAACuAcACUUGCdTsdT
si-4-3
gaAccuAGGGuuuccGAAAdTsdT
UUUCGGAAACCCuAGGUUCdTsdT
si-4-4
gcAuuuGGcuGuuaGccAudTsdT
AUGGCuAAcAGCcAAAUGCdTsdT
si-4-5
cgAucAAccuGuAcuAcAAdTsdT
UUGuAGuAcAGGUUGAUCGdTsdT
si-4-6
cacGGAGcAuuGuauuAcAdTsdT
UGuAAuAcAAUGCUCCGUGdTsdT
si-4-7
ggAcAuGAccAcAgGuAcAdTsdT
UGuACCUGUGGUcAUGUCCdTsdT
si-4-8
gccGGuAucAAGAacAAcAdTsdT
UGUUGUUCUUGAuACCGGCdTsdT
si-4-9
ccAuGGAAAuGAGauuGAAdTsdT
UUcAAUCUcAUUUCcAUGGdTsdT
si-4-10
gcuuGAGuGuGuAcAucuudTsdT
AAGAUGuAcAcACUcAAGCdTsdT
si-Ubr5
si-5-1
agcuGAAcAAGuAcAAuuudTsdT
AAAUUGuACUUGUUcAGCUdTsdT
si-5-2
ggAGcAGGcuAcuauuAAAdTsdT
UUuAAuAGuAGCCUGCUCCdTsdT
si-5-3
ggcAcAAGuuGuucuAcAAdTsdT
UUGuAGAAcAACUUGUGCCdTsdT
si-5-4
ugAuAAGGAuGGAacAAAAdTsdT
UUUUGUUCcAUCCUuAUcAdTsdT
si-5-5
guAGcuAcuGAAAauAAcAdTsdT
UGUuAUUUUcAGuAGCuACdTsdT
si-5-6
ccGAGAAGAcuGAaAuAcudTsdT
AGuAUUUcAGUCUUCUCGGdTsdT
si-5-7
gcGcucAGAAAGAaAuAcAdTsdT
UGuAUUUCUUUCUGAGCGCdTsdT
si-5-8
gaAucAGGGAGGAucGcAAdTsdT
UUGCGAUCCUCCCUGAUUCdTsdT
si-5-9
ggcuucGuccAAAaAGAAAdTsdT
UUUCUUUUUGGACGAAGCCdTsdT
si-5-10
caGccAAuuGGAAaAuGcAdTsdT
UGcAUUUUCcAAUUGGCUGdTsdT
Прописные буквы: обозначают рибонуклеотиды;
Строчные буквы: обозначают 2'-O-метил-нуклеотиды;
s: обозначает тиофосфатную межнуклеозидную связь
Таблица 2. Влияние длительного подавления Ubr-убиквитин лигаз N-концевого правила в печени мыши на показатели химического состава сыворотки крови.
PBS
LNP-siCtrl
LNP-siUbrs
ANOVA P-критерий
ALP (Ед/л)
102 ± 11
88 ± 10
212 ± 54<img file="00000001.jpg" he="6" wi="8" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0.0001
AST (Ед/л)
102 ± 34
106 ± 35
207 ± 59<img file="00000001.jpg" he="6" wi="8" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0.0038
ALT (Ед/л)
19 ± 4
23 ± 3
62 ± 21<img file="00000001.jpg" he="6" wi="8" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0.0006
BUN (мг/дл)
32 ± 5
31 ± 2
27 ± 4
0.1830
Альбумин (г/дл)
2.9 ± 0.1
2.9 ± 0.1
2.6 ± 0.2<img file="00000001.jpg" he="6" wi="8" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0.0007
Общий билирубин (мг/дл)
0.16 ± 0.05
0.10 ± 0.00
0.20 ± 0.07<img file="00000002.jpg" he="5" wi="5" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0.0302
Общий белок (г/дл)
4.7 ± 0.1
5.0 ± 0.1<img file="00000003.jpg" he="5" wi="4" img-content="undefined" img-format="jpg" />
4.3 ± 0.3<img file="00000001.jpg" he="6" wi="8" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0.0001
Глобулин (г/дл)
1.7 ± 0.1
2.1 ± 0.1<img file="00000003.jpg" he="5" wi="4" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1.7 ± 0.1<img file="00000002.jpg" he="5" wi="5" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<0.0001
Холестерин (мг/дл)
75 ± 4
86 ± 10
32 ± 3<img file="00000001.jpg" he="6" wi="8" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<0.0001
ALP: щелочная фосфатаза; AST: Аспартатаминотрансфераза; ALT: Аланинаминотрансфераза; BUN: азот мочевины крови; LNP - липидные наночастицы
Апостериорное сравнение по критерию Тьюки LNP-siUbrs относительно PBS, P< 0.01, P< 0.001
Апостериорное сравнение по критерию Тьюки LNP-siCtrl относительно LNP-siUbrs, P< 0.01, P< 0.001
Апостериорное сравнение по критерию Тьюки PBS относительно LNP-siCtrl, P< 0.01
high
Введение контрольных ЛНЧ-миРНК немного снижала уровень белка UBR4, что могло быть результатом ускоренной лизосомальной деградации UBR4. Действительно, многократные инъекции ЛНЧ-миРНК могут привести к значительному накоплению липидов в клетках печени и увеличению аутофагии, что, в свою очередь, инициирует деградацию лизосом. Наконец, хроническое подавление UBR-убиквитин-лигаз привело к небольшому, но значительному увеличению апоптотических клеток и расширению межклеточного пространства в печени (фиг. 5Г и 5Д), что подтверждает уменьшение активности пути Arg/N-дегрона в этом органе. Еще одним значимым результатом является инфильтрация мононуклеарных клеток в печени мышей, получавших ЛНЧ, содержащие миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 (фиг. 5Д). С помощью проточной цитометрии были идентифицированы нейтрофилы, макрофаги Ly6C и эозинофилы (фиг. 5Е и 5Ж), что указывает на наличие хронического воспаления в печени. Эти популяции клеток также были увеличены в селезенке тех же животных (фиг. 6Б и 6В), что, по-видимому, является следствием воспаления, присутствующего в печени, а не влияния пути Arg/N-дегрона в селезенке, поскольку в селезенке не наблюдалось подавления мРНК UBR-убиквитин-лигаз (фиг. 6A).
Подавление пути N-дегрона в спонтанной модели ГЦК
high
Чтобы оценить эффекты подавления пути Arg/N-дегрона на ГЦК, авторы настоящего изобретения использовали спонтанную модель ГЦК, разработанную Твардом и др. Вкратце, плазмиды, кодирующие белок MET человека, белок DN90-бета-катенин человека и транспозазу Sleeping Beauty доставлялись в гепатоциты методом гидродинамической инъекции, далее онкогены интегрировались в геном клеток с помощью транспозазы. Через 5 недель после инъекции плазмид, было показано наличие альфа-фетопротеина (биомаркер ГЦК) в сыворотке крови мышей, а к концу 10-й недели печень значительно увеличивается до массового отношения печени к телу от 15% до 40 % против 4-5% у контрольных животных. Ранее авторы настоящего изобретения продемонстрировали эффективную доставку ЛНЧ-миРНК в клетки опухоли, которые развиваются у мышей после инъекции плазмиды. Поскольку ранее сообщалось, что UBR5 и UBR2 оверэкспрессированы при некоторых типах рака, то авторы настоящего изобретения оценили уровень экспрессии мРНК у всех четырех UBR-убиквитин лигаз и обнаружили, что ни одна из них не была повышена в нашей специфической модели ГЦК (фиг. 7). Влияние подавления пути Arg/N-дегрона на опухолевую нагрузку оценивали путем инъекции ЛНЧ-миРНК мышам с опухолями в течение 4 или 5 недель, один или два раза в неделю (фиг. 7, 8А и 8Б). ЛНЧ-миРНК содержали Ubr или контрольную миРНК, доза составляла 1,4 мг/кг. Во всех испытанных схемах подавление целевых UBR-убиквитин-лигаз с высокой дозой ЛНЧ-миРНК приводило к увеличению отношения печени к массе тела и развитию ГЦК (фиг. 8В и 8Г). Увеличенные популяции нейтрофилов и клеток Ly6C также наблюдались в селезенках животных с ГЦК, получавших ЛНЧ-миРНК siUbr два раза в неделю (фиг. 8Д и 8Е), демонстрируя рост воспаления у этих животных - хорошо известного фактора развития и прогрессирования ГЦК. Как следствие, авторы настоящего изобретения повторно проанализировали режим инъекций ЛНЧ-миРНК и выбрали более низкую дозу и частоту инъекций для последующих экспериментов, чтобы уменьшить наблюдаемое воспаление.
Подавление пути Arg/N-дегрона усиливает действие препаратов, индуцирующих апоптоз
in vitro
Чтобы замедлить развитие ГЦК в результате подавления пути Arg/N-дегрона за счет уменьшения пролиферации и увеличения апоптоза в раковых клетках, и одновременно избегая при этом воспаления, была принята следующая стратегия: комбинаторное применение препаратов, индуцирующих апоптоз, в сочетании с уменьшенной дозой миРНК против убиквитин лигаз UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5. Этот подход был сначала опробован  на клеточной линии гепатоцитов для оценки эффекта влияния подавления убиквитин лигаз UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 в присутствии стауроспорина или доксорубицина на пролиферацию и апоптоз. Клетки Hepa 1-6 трансфецировали миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 и через 72 часа добавляли доксорубицин (фиг. 9) или стауроспорин (фиг. 10) с последующим ожиданием в течение 48 или 24 часов, соответственно. Пролиферация клеток ингибировалась при более низких дозах миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5, когда доксорубицин дополнительно добавлялся к клеткам (фиг. 9А). Действительно, при 0,156 нМ миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5, когда пролиферация клеток ингибируется на 15-25%, добавление доксорубицина в дозах, не влияющих на пролиферацию (фиг. 9А, правый график), усиливает этот фенотип еще на 15-20%. Что касается апоптоза, обработка клеток только миРНК к UBR-убиквитин-лигазам приводит к увеличению на 4-5% апоптотических клеток по сравнению с контролем. Тем не менее, когда миРНК используются в сочетании с апоптоз-индуцирующими препаратами, апоптоз увеличивается на 11,5-13,5% по сравнению с контролем (фиг. 9Б и 9В). Следовательно, комбинаторный подход уменьшает пролиферацию и увеличивает апоптоз при более низких дозах миРНК и низкомолекулярных соединений, индуцирующих апоптоз, которые в противном случае были бы неэффективны по одиночке. Это демонстрирует, что оба подхода действуют синергически, позволяя уничтожить раковые клетки при меньших концентрациях действующих веществ.
Наконец, комбинаторный подход был протестирован на модели мыши с спонтанной ГЦК. Мышам с ГЦК альтернативно вводили ЛНЧ-миРНК в количестве 1 мг/кг и/или доксорубицин (2 мг/кг или 4 мг/кг) каждые 3-4 дня в общей сложности в течение 4 недель, начиная на 37 день после инъекции плазмид, индуцирующих ГЦК (фиг. 11A). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что длительное подавление пути Arg/N-дегрона в сочетании с применением химиотерапевтического агента приводило к ингибированию прогрессирования ГЦК. Относительный вес печени был снижен в среднем на 30% по сравнению с контролем (фиг. 12А), а опухолевая нагрузка была значительно ниже, чем нагрузка, наблюдаемая с одним доксорубицином и контрольной ЛНЧ-миРНК с доксорубицином. Морфология печени ГЦК, обработанной ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5 и доксорубицином, напоминала нормальную ткань печени, в отличие от всех других групп, что указывает на снижение пролиферации и меньшее повреждение ткани (фиг. 11Б). Уменьшенная доза ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5, используемая в этом случае, позволила избежать увеличения воспалительных иммунных клеток (фиг. 11В). Кроме того, доксорубицин не оказывает непосредственного влияния на воспаление и не влияет на жизнеспособность иммунных клеток, о чем свидетельствует одинаковая или увеличенная популяция нейтрофилов, макрофагов или дендритных клеток в селезенке мышей, получавших LNP и доксорубицин (фиг. 11Б). Чтобы продемонстрировать влияние комбинаторного лечения на пролиферацию и выживаемость опухолевых клеток, окрашивали фиксированные срезы печени по белку Ki67, маркера клеточной пролиферации (фиг. 12Б).
У животных, получавших ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5, Ki67-положительные клетки уменьшались в среднем на 6% по сравнению с контролем, и добавление доксорубицина увеличивает разницу до 9% (р = 0,0001, тест Манна-Уитни). Наконец, обработка доксорубицином привела к значительному увеличению TUNEL-положительного окрашивания в печени мышей с ГЦК, получавших ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5 (фиг. 12Г). Вместе эти данные свидетельствуют о том, что комбинированные эффекты подавления пути Arg/N-дегрона с использованием химиотерапии на прогрессирование гепатоцеллюлярной карциномы опосредованы не модуляцией воспалительного ответа, а прямым подавлением пролиферации и увеличением апоптоза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Линии клеток и трансфекция
Линии гепатоцитов мышей Hepa 1-6 и AML-12 (ATCC, Manassas, VA) выращивали в среде DMEM, с добавлением 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Gibco, Waltham, MA) и 2 мМ L-глютамином (Gibco) без антибиотиков. Работа с клетками проводилась при конфлюентности 80%. Плазмиды трансфицировали с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Waltham, MA), а миРНК - Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), в соответствии с инструкциями производителя.
Разработка и селекция миРНК, упаковка в состав ЛНЧ
O
Авторы настоящего изобретения разработали и выбрали химически модифицированные миРНК, на основании последовательности мРНК мышиных Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5 (10 миРНК на ген) (номера NCBI GenBank: NM_009461.2, GenBank: NM_001177374.1, GenBank: NM_001160319.1 и GenBank: NM_00. 3). миРНК были отобраны таким образом, чтобы избежать неспецифической активности, на основании нескольких известных критериев. Последовательности 19-звенных кандидатов были сопоставлены с базой данных мРНК (RefSeq) и оценены по их способности связываться вне целевой мишени. В частности, миРНК были ранжированы на основе количества/положений несоответствий в разных частях и несоответствий в положении сайта расщепления. Полученные последовательности дополнительно проверяли, чтобы исключить наличие известных мотивов микроРНК и мотивов иммуностимулирующих последовательностей. Введение 2'--метил (2'-OMe) пиримидиновых нуклеотидов в миРНК дополнительно снижает иммунный ответ и возможность неспецифичного действия, а вместе с использованием 3'-межнуклеотидных тиофосфатов повышает стабильность против нуклеаз. Эффективность миРНК к мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5, изучали путем трансфекции клеток Hepa 1-6 с последующим анализом методом обратной транскрипции с последующим ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) через 24 часа. Для дальнейших исследований была выбрана миРНК с наименьшей IC50 и наибольшей эффективностью понижения мРНК мишени (Таблица 1). Контрольная миРНК к мРНК люциферазы светлячка (siCtrl). миРНК были упакованы в липидные наночастицы (ЛНЧ), как описано ранее. Вкратце, ЛНЧ были получены путем смешивания растворов миРНК в кислом водном буфере и липидов в этаноле (3:1, по объему) с использованием микрофлюидного устройства NanoAssemblr (Precision NanoSystems), как описано ранее. миРНК (0,4 мг/мл для отдельной миРНК или 0,1 мг/мл каждая для смеси из четырех) разводили в 10-мМ цитратном буфере (рН 3,0), а смесь липидов (С12 -20045: 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC, 850365; Avanti Polar Lipids): холестерин (S8667; Sigma-Aldrich): PEG-липид (880150; Avanti Polar Lipids)) получали в мольном соотношении 50:10:38,5:1,5 в этаноле (всего 8,83 мг/мл).
Растворы миРНК и липидов смешивали со скоростью 10 мл/мин в соответствии с протоколом производителя. Конечное массовое соотношение миРНК:С12-200 после смешивания составляло 1:5. Суспензию ЛНЧ-миРНК разбавляли стандартным фосфатно-солевым буфером, далее проводили диализ 500 объемами стандартного фосфатно-солевого буфера при pH 7,4 в диализных кассетах с мембраной, отделяющей соединения с молекулярной массой 20000 Да (MW) (66012; Thermo Fisher Scientific) 18 часов и фильтровали через шприцевой фильтр из полиэфирсульфона (PES) (поры 0,2 мм) (3915; Corning). Измерения размера частиц и зета-потенциала проводили с использованием Zetasizer Nano ZSP (Malvern Panalytical) в соответствии с протоколом производителя (фиг. 13; Таблица 3). Измерения зета-потенциала проводили в условиях нейтрального рН. Указанные значения являются средней величиной для 10-25 повторов. Эффективность включения миРНК в ЛНЧ определяли с использованием реагента Quant-iT RiboGreen (R11491; Thermo Fisher Scientific), как описано ранее.
Таблица 3. Параметры липидных наночастиц (LNP), использованных для доставки миРНК, в данном исследовании.
LNP-siRNA
Размер частиц, нм
Индекс полидисперсности, PdI
Зета-потенциал
LNP si-Ubr1
84,5 ± 1,1
0,093
3,2 ± 1,7
LNP si-Ubr2
85,9 ± 0,6
0,100
3,7 ± 1,7
LNP si-Ubr4
85,4 ± 0,7
0,094
3,4 ± 1,4
LNP si-Ubr5
92,1 ± 2,0
0,100
3,2 ± 1,2
LNP si-Ubrs
94,8 ± 3,7
0,130
2,9 ± 1,5
LNP si-Ctrl
80,0 ± 0,8
0,062
3,9 ± 1,5
Синтез кДНК и ПЦР-РВ
Для выделения общей РНК ткани печени лизировали с использованием TRIzol (Invitrogen) с использованием прибора MP FastPrep-24 и набора реагентов Lysing Matrix D (MP Biomedicals) с последующим осаждением изопропанолом в соответствии с инструкциями производителя. кДНК получали с использованием набора для обратной транскрипции кДНК (Applied Biosystems). Уровни мРНК оценивали с помощью наборов для проведения ПЦР-РВ с использованием SYBR Green (Thermo Fisher Scientific) в термоциклере QuantStudio 5 (Applied Biosystems). Количества мРНК были нормализованы с использованием мРНК глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (mGAPDH) мыши. Список праймеров приведен в таблице 4.
Таблица 4. Последовательности праймеров, использованных в данном исследовании.
Название
Последовательность, <img file="00000006.jpg" he="4" wi="12" img-content="undefined" img-format="jpg" />
mGAPDH dir
AGGTCGGTGTGAACGGATTTG
mGAPDH rev
TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
mUbr1up
CCCAGCAGTTCCTGTCTTGT
mUbr1lo
ATCAGGAGGCACTTTCAGGC
mUbr2up
AGAGTTTTCAGTCGCAGACCT
mUbr2lo
TGATCGGGTCCATTCCCTGC
mUbr4up
GCAGGGAGGGGTACAAGTTC
mUbr4lo
GGCCTCTAGCCAACCTGAC
mUbr5up
AGAACCATTACCACCACGGC
mUbr5lo
CCACCTCAACCTCTTCCACG
Функциональный анализ пути Arg/N-дегрона
Клетки Hepa 1-6 высевали при достижении 40% конфлюентности в 24-луночные планшеты и трансфицировали плазмидами, кодирующими FLAG-меченные нативную (fDHFR-UbR48-Asp1119-BRCA1f) или стабильную (fDHFR-UbR48-Val1119-BRCA1f) версии проапоптотического фрагмента BRCA1 с использованием Lipofectamine 2000, с или без 2,5 нМ миРНК. Через 72 часа клетки лизировали с помощью 1% SDS, 5 мМ DTT, содержащего полную смесь ингибиторов протеаз (Roche), с последующим нагреванием при 95°C в течение 10 минут. Образцы разбавляли в стандартном буфере для образцов додецилсульфата лития (LDS), нагревали при 95°C в течение 10 минут и анализировали методом денатурирующего гель-электрофореза по Лэммли (5-12%). После переноса белков на мембрану, ее инкубировали с антителом анти-FLAG M2 (Sigma, St. Louis, MO) и визуализировали с использованием реагентов SuperSignal West Femto (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя на Fusion Solo S Imager (Vilber Lourmat, ). Франция).
Анализ пролиферации, миграции и апоптоза клеток in vitro
2
Клетки Hepa 1-6 высевали с плотностью, необходимой для достижения конфлюентности 80% через 72 ч или 96 ч, далее трансфицировали миРНК против люциферазы (контроль) или убиквитин лигаз UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 в течение 72 ч и обрабатывали или не обрабатывали доксорубицином (Millipore-Sigma) в течение 48 часов или стауроспорин (Millipore-Sigma) в течение 24 часов. Для оценки пролиферации в клетках Hepa 1-6 использовали анализ с использованием нейтрального красного (метод, адаптированный из работы Фауц и др.). После обработки среду заменяли раствором 50 мг/мл нейтрального красного (Millipore-Sigma) в DMEM с добавлением 10% FBS в течение 3 ч при 37°С, 5% CO. Затем клетки один раз промывали PBS, и краситель экстрагировали из клеток, добавляя элюирующий буфер (50% EtOH, 1% уксусная кислота). После 5 мин инкубации буфер для элюции переносили на новый планшет и считывали оптическую плотность при 540 нм. Для оценки миграции в монослое клеток делали царапину с помощью наконечника автоматической пипетки на 200 мкл. Фотографии были сделаны после внесения первоначальной царапины и спустя 24 часа миграция была оценена путем расчета расстояния между краями царапины. Апоптоз измеряли с использованием набора для определения гибели клеток In situ на основе TMR red (Roche). Обработанные клетки фиксировали 4% параформальдегидом, удаляли мембрану раствором 0,25% Тритон Х-100/0,25% Твин-20 в течение 7 минут на льду и анализировали в соответствии с протоколом производителя. Клетки контрастировали с использованием красителя Hoechst 33342 (Thermo Scientific) и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием системы визуализации EVOS FL (Thermo Fisher Scientific).
Исследования на животных
Все процедуры проводились в соответствии с руководством Национального института здравоохранения и были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных и Управлением по исследованиям лабораторных животных в Массачусетском технологическом институте (Массачусетс, США) и Институте развития Биология (Москва, Россия), где проводилось настоящее исследование. Мыши линии C57BL/6 или FVB/N в возрасте 6-8 недель были приобретены в компании Charles River или выращены на месте. Мышей содержали при 22°С и световом цикле 12 часов света/12 часов темноты и кормили стандартным кормом для грызунов. Липидные наночастицы и доксорубицин разбавляли в стерильном физиологическом растворе и вводили через хвостовую вену. Гепатоцеллюлярная карцинома была индуцирована у мышей FVB/N, как описано ранее, с использованием плазмид, кодирующих транспозазу Sleeping Beauty и белки человека DN90-b-катенин и MET. Уровни альфа-фетопротеина в сыворотке крови определяли методом вестерн-блоттинга на 35-й день (анти-фетопротеин [AFP]; R&D Systems Minneapolis, MN). Животных умерщвляли на 66-68 дни после индукции опухоли, если не указано иное. После сбора сыворотки для анализа и отбора образцов печени для гистологии и иммуногистохимии, остальная часть печени была заморожена в жидком азоте и размолота для проведения анализа мРНК и белка.
Гистологический и иммуногистохимический анализ
Образцы печени фиксировали в 4% параформальдегиде и заливали парафином с использованием стандартных процедур. Срезы толщиной 5 мм окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) или иммуногистохимически. Окрашивание H&E проводили с использованием красителя ThermoShandon Gemini (Eosin и Hematoxylin от Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Система Envision (Dako) была использована для непрямой пероксидазной реакции с использованием 3,3'-диаминобензидина (DAB) для обнаружения Ki67 (BioCare Medical, Pacheco, CA). Окрашивание TUNEL проводили на срезах печени, обработанных протеиназой K, с использованием набора для определения гибели клеток In situ TMR red. Срезы контрастировали 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием системы визуализации EVOS FL.
Приготовление лизатов клеток и тканей. Анализ методом вестерн-блоттинга
Клетки лизировали в буфере для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA), а образцы печени мыши обрабатывали в буфере для лизиса (20 мМ HEPES, 10% глицерина, 0,1 мМ ЭДТА, 75 мМ KCl, pH 7,9), содержащем полный набор ингибиторов протеаз (Roche), используя прибор MP FastPrep-24 и набор реагентов Lysing Matrix D (MP Biomedicals). Экстракты центрифугировали при 12000 g в течение 10 минут при 4°С. Концентрации общего белка в супернатантах определяли с использованием бицинхониновой кислоты (набор реагентов BCA, Pierce) с последующим добавлением концентрированного буфера для образца LDS (Pierce) до конечной концентрации 1Х буфера, нагревания при 95°C в течение 10 минут. Далее образцы анализировали методом денатурирующего гель-электрофореза по Лэммли (5-12%), с общим количеством белка 50-100 мг в дорожку. Разделенные белки анализировали вестерн-блоттингом с использованием следующих антител: анти-UBR1 (Abcam, Cambridge, MA, US), анти-UBR2 (Abcam), анти-UBR4 (Abcam), анти-EDD (Санта-Круз, Даллас, Техас), анти-б-актин (сигма). Вестерн-блоты визуализировали с использованием реагента SuperSignal West Femto в соответствии с инструкциями производителя.
Биохимический анализ крови
Сыворотку собирали пункцией сердца с последующим центрифугированием при 1700 g в течение 20 минут. Биохимический анализ был выполнен в IDEXX Laboratories (США).
Анализ клеток методом проточной цитометрии
7
Образцы селезенки разрушали вручную, используя тупой конец поршня шприца, тогда как печень инкубировали в коллагеназе типа IV (0,5 мг/мл) в сбалансированном солевом растворе Хэнка с кальцием (Pierce) в течение 30 минут до разрушения и градиентного разделения с использованием Optiprep (Cosmo Bio, Carlsbad, CA). Клетки при плотности 1*10 клеток/мл ресуспендировали в DMEM с 2% FBS и инкубировали 15 минут при комнатной температуре с разбавленными моноклональными антителами, а затем промывали и ресуспендировали в PBS с 2% FBS для последующего анализа. Были использованы следующие моноклональные антитела BioLegend: изотиоцианат флуоресцеина (FITC)-anti-CD11b (M1/70), фикоэритрин (PE)-anti-F4/80 (BM8), PerCPCy5.5-анти- CD11c (N418), PeCy7-анти-B220 (RA3-6B2), BV421-анти-Ly6G (1A8), BV510-анти-CD45 (30-F11), аллофикоцианин (APC)-анти-IA/IE (M5/114.15.2), APCFire-анти-Ly6C (HK1.4). Окрашивание аннексином V/7AAD проводили в соответствии с инструкциями производителя (BioLegend). Данные были получены с использованием прибора BD LSRFortessa, а анализ данных проточной цитометрии был выполнен с использованием программного обеспечения FlowJo (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния).
Статистический анализ
Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA) использовали для статистического анализа. Двусторонние непарные тесты Манна-Уитни с 95% доверительными границами или односторонние или двусторонние ANOVA использовались для статистического анализа, если не указано иное. Значение р<0,05 считали значимым.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Представленные примеры предназначены для того, чтобы помочь проиллюстрировать изобретение и не предназначены, и не должны истолковываться как ограничивающие объем изобретения. Более того, для специалистов в данной области техники из полного содержания настоящего документа, включая включенные в него примеры и ссылки на научные и патентные документы, станут очевидными различные модификации изобретения и многие другие варианты его реализации, в дополнение к тем, которые показаны и описаны в данном документе. Примеры содержат важную дополнительную информацию, примеры и руководство, которые могут быть адаптированы к практическому применению данного изобретения в различных вариантах его реализации и их эквивалентах.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Автономная некоммерческая образовательная организация высшего
образования «Сколковский институт науки и технологий»
Зэ Кох Инститьют фо Интегратив Кэнсэ Рисерч эт Массачусеттс
Инститьют оф Текнолоджи
<120>  КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ПУТИ
АРГИНИН/N-ДЕГРОНА
<130>  P-1541-14RU
<160>  Количество последовательностей SEQ ID NOS: 92
<210>  1
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (1)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (5)…(5)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (7)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (12)…(12)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (14)…(17)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>  1
cuuacgcuga guacuucgat t                                21
<210>  2
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (7)…(7)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (11)…(11)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   2
ucgaaguacu cagcguaagt t                                21
<210>  SEQ ID NO 3
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (11)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   3
caaaguagug uucauaaaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 4
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   4
uuuuaugaac acuacuuugt t                                21
<210>  SEQ ID NO 5
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(5)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (11)…(11)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (18)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   5
ccuucgguga uaaaauacat t                                21
<210>  SEQ ID NO 6
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (11)…(11)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   6
uguauuuuau caccgaaggt t                                21
<210>  SEQ ID NO 7
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(11)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   7
gguuauggcu caccagaaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 8
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (15)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   8
uuucugguga gccauaacct t                                21
<210>  SEQ ID NO 9
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(19)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   9
gacuuuagac agauauuuut t                                21
<210>  SEQ ID NO 10
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (5)…(5)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   10
aaaauaucug ucuaaaguct t                                21
<210>  SEQ ID NO 11
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (12)…(12)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   11
gacaggaaca auaaauucat t                                21
<210>  SEQ ID NO 12
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (7)…(7)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   12
ugaauuuauu guuccuguct t                                21
<210>  SEQ ID NO 13
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (5)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (12)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   13
cagacuaggu gcuauuucat t                                21
<210>  SEQ ID NO 14
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   14
ugaaauagca ccuagucugt t                                21
<210>  SEQ ID NO 15
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (11)…(11)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (18)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   15
gauuaaacag uauaauacat t                                21
<210>  SEQ ID NO 16
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (15)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   16
uguauuauac uguuuaauct t                                21
<210>  SEQ ID NO 17
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (11)…(11)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   17
gcuuagagaa ugucauaaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 18
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (15)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   18
uuuaugacauucucuaagct t                                21
<210>  SEQ ID NO 19
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(5)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (11)…(12)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   19
ggcccggcug uuacugaaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 20
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (7)…(7)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   20
uuucaguaac agccgggcct t                                21
<210>  SEQ ID NO 21
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (19)…(19)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   21
cagaauaucg gguuauaaut t                                21
<210>  SEQ ID NO 22
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (5)…(5)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   22
auuauaaccc gauauucugt t                                21
<210>  SEQ ID NO 23
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (17)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   23
gauggugaac agccaaucat t                                21
<210>  SEQ ID NO 24
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   24
ugauuggcug uucaccauct t                                21
<210>  SEQ ID NO 25
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (12)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (18)…(19)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   25
ccaagaaaaa guuagcauut t                                21
<210>  SEQ ID NO 26
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   26
aaugcuaacu uuuucuuggt t                                21
<210>  SEQ ID NO 27
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (5)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   27
auuguuaagc aaaagugaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 28
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   28
uucacuuuug cuuaacaaut t                                21
<210>  SEQ ID NO 29
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (12)…(12)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   29
aagugaaguggcauauaaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 30
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (5)…(5)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (15)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   30
uuuauaugcc acuucacuut t                                21
<210>  SEQ ID NO 31
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (11)…(11)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (19)…(19)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   31
agugaagugg cauauaaaut t                                21
<210>  SEQ ID NO 32
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (11)…(11)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   32
auuuauaugc cacuucacut t                                21
<210>  SEQ ID NO 33
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   33
aguggcauau aaauuuccat t                                21
<210>  SEQ ID NO 34
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (11)…(11)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   34
uggaaauuua uaugccacut t                                21
<210>  SEQ ID NO 35
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(12)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   35
gcuccuaccu cuaagugaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 36
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (7)…(7)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   36
uucacuuaga gguaggagct t                                21
<210>  SEQ ID NO 37
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   37
gauagaacau ccucuuagat t                                21
<210>  SEQ ID NO 38
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (2)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   38
ucuaagagga uguucuauct t                                21
<210>  SEQ ID NO 39
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (12)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (17)…(17)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   39
ggcgagagau guucgacaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 40
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   40
uugucgaaca ucucucgcct t                                21
<210>  SEQ ID NO 41
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   41
gacuauggga agagauucat t                                21
<210>  SEQ ID NO 42
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (15)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   42
ugaaucucuu cccauaguct t                                21
<210>  SEQ ID NO 43
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   43
caaagaagau gacuacgaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 44
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (5)…(5)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   44
uucguaguca ucuucuuugt t                                21
<210>  SEQ ID NO 45
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (11)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   45
gcaaguguag uucagugaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 46
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (11)…(11)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   46
uucacugaac uacacuugct t                                21
<210>  SEQ ID NO 47
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (11)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   47
gaaccuaggg uuuccgaaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 48
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   48
uuucggaaac ccuagguuct t                                21
<210>  SEQ ID NO 49
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (12)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(17)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (19)…(19)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   49
gcauuuggcu guuagccaut t                                21
<210>  SEQ ID NO 50
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   50
auggcuaaca gccaaaugct t                                21
<210>  SEQ ID NO 51
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(5)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (12)…(12)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (17)…(17)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   51
cgaucaaccu guacuacaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 52
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (7)…(7)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   52
uuguaguaca gguugaucgt t                                21
<210>  SEQ ID NO 53
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(11)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (18)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   53
cacggagcau uguauuacat t                                21
<210>  SEQ ID NO 54
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   54
uguaauacaa ugcuccgugt t                                21
<210>  SEQ ID NO 55
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (12)…(12)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (18)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   55
ggacaugacc acagguacat t                                21
<210>  SEQ ID NO 56
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   56
uguaccugug gucaugucct t                                21
<210>  SEQ ID NO 57
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (18)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   57
gccgguauca agaacaacat t                                21
<210>  SEQ ID NO 58
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   58
uguuguucuu gauaccggct t                                21
<210>  SEQ ID NO 59
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   59
ccauggaaau gagauugaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 60
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (15)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   60
uucaaucuca uuuccauggt t                                21
<210>  SEQ ID NO 61
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (12)…(12)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(19)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   61
gcuugagugu guacaucuut t                                21
<210>  SEQ ID NO 62
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (7)…(7)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (11)…(11)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (15)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   62
aagauguaca cacucaagct t                                21
<210>  SEQ ID NO 63
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (12)…(12)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (17)…(19)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   63
agcugaacaa guacaauuut t                                21
<210>  SEQ ID NO 64
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (7)…(7)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (15)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   64
aaauuguacu uguucagcut t                                21
<210>  SEQ ID NO 65
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (5)…(5)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (12)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   65
ggagcaggcu acuauuaaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 66
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (6)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   66
uuuaauagua gccugcucct t                                21
<210>  SEQ ID NO 67
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (5)…(5)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (12)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (17)…(17)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   67
ggcacaaguu guucuacaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 68
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   68
uuguagaaca acuugugcct t                                21
<210>  SEQ ID NO 69
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   69
ugauaaggau ggaacaaaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 70
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (9)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (15)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (18)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   70
uuuuguucca uccuuaucat t                                21
<210>  SEQ ID NO 71
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (5)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (18)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   71
guagcuacug aaaauaacat t                                21
<210>  SEQ ID NO 72
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(4)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (13)…(13)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (17)…(17)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   72
uguuauuuuc aguagcuact t                                21
<210>  SEQ ID NO 73
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(11)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (18)…(19)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   73
ccgagaagac ugaaauacut t                                21
<210>  SEQ ID NO 74
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(8)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   74
aguauuucag ucuucucggt t                                21
<210>  SEQ ID NO 75
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (18)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   75
gcgcucagaa agaaauacat t                                21
<210>  SEQ ID NO 76
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   76
uguauuucuu ucugagcgct t                                21
<210>  SEQ ID NO 77
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(5)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(15)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (17)…(17)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   77
gaaucaggga ggaucgcaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 78
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   78
uugcgauccu cccugauuct t                                21
<210>  SEQ ID NO 79
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(6)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   79
ggcuucgucc aaaaagaaat t                                21
<210>  SEQ ID NO 80
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   80
uuucuuuuug gacgaagcct t                                21
<210>  SEQ ID NO 81
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (1)…(2)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (4)…(5)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (8)…(9)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (14)…(14)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (16)…(16)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (18)…(18)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   81
cagccaauug gaaaaugcat t                                21
<210>  SEQ ID NO 82
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<223>  Описание комбинированной ДНК/РНК молекулы: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (3)…(3)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>   (10)…(10)
<223>  2'-O-метил нуклеотид
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Дезоксирибонуклеотиды
<220>
<221>  misc_feature
<222>   (20)…(21)
<223>  Фосфоротиоатная связь
<400>   82
ugcauuuucc aauuggcugt t                                21
<210>  SEQ ID NO 83
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400>   83
aggtcggtgt gaacggattt g                                21
<210>  SEQ ID NO 84
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400>   84
tgtagaccat gtagttgagg tca                                23
<210>  SEQ ID NO 85
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400>   85
cccagcagtt cctgtcttgt                                    20
<210>  SEQ ID NO 86
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400>   86
atcaggaggc actttcaggc                                20
<210>  SEQ ID NO 87
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400>   87
Agagttttca gtcgcagacc t                                21
<210>  SEQ ID NO 88
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400>   88
tgatcgggtc cattccctgc                                20
<210>  SEQ ID NO 89
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400>   89
gcagggaggg gtacaagttc                                20
<210>  SEQ ID NO 90
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400>   90
ggcctctagc caacctgac                                    19
<210>  SEQ ID NO 91
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400>   91
agaaccatta ccaccacggc                                20
<210>  SEQ ID NO 92
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400>   92
ccacctcaac ctcttccacg                                20
<---