СОЕДИНЕНИЯ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ
COMPOUNDS AND METHODS FOR TREATMENT OF INFECTIONS

Область техники
Настоящее изобретение относится к соединениям Формулы I, способам лечения или профилактики бактериальной инфекции у субъекта с применением соединения Формулы I, применению соединения Формулы I для производства лекарственного средства для лечения бактериальной инфекции у субъекта, а также к медицинским устройствам, применяемым в способах лечения или профилактики бактериальной инфекции у субъекта.
Предшествующий уровень техники
Staphylococcus aureus
Enterococcus spp
Streptococcus pneumoniae
Escherichia coli
Enterobacter spp.
Salmonella
Acinetobacter baumannii
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Заметное увеличение распространения множественной лекарственной устойчивости у болезнетворных грамположительных (G+) (, . и ) и грамотрицательных (G-) патогенов (/, , spp., , и ) совпало с беспрецедентным глобальным снижением инвестиций в новые противоинфекционные лекарственные средства. В настоящее время зарегистрировано лишь небольшое количество лекарственных средств для лечения бактериальных инфекций со множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), в результате чего практикующие врачи вынуждены делать выбор в пользу лекарственных средств предыдущего поколения, таких как колистин, с узким спектром действия и значительным риском токсичных побочных эффектов. Кроме того, существует незначительное количество противоинфекционных терапевтических средств новых классов, находящихся в процессе разработки.
С 2000 года, в течение почти 15 лет, Управлением по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами (FDA) США было одобрено только 5 антибактериальных агентов с новым механизмом действия: линезолид (оксазолидинон) - в 2000 году, даптомицин (липопептид) - в 2003 году, ретапамулин (плевромутилин) - в 2007 году, фидаксомицин (макролид тиакумицин) - в 2011 году, и бедаквилин (диарилхинолин) - в 2012 году. Примечательно, что ни один из этих агентов не обладает значительной активностью в отношении грамотрицательных бактерий. В 2013 году не было одобрено ни одного из  антибактериальных агентов с новым механизмом действия,  и на сегодняшний день в 2014 году для одобрения в США были рекомендованы только тедизолид и далбаванцин, которые оба являются аналогами существующих классов. Хотя в настоящее время более 300 противоинфекционных лекарственных средств находятся на различных стадиях разработки, большинство из них, представляют собой ранее одобренные антибактериальные соединения или их производные, которые проходят проверку на возможность применения по новым показаниям.
Кроме того, распространение множественной лекарственной устойчивости среди патогенов, специфичных для животных, наряду с усложнением процедур регистрации и применения противомикробных препаратов у животных, побуждает ветеринаров в большей степени полагаться на традиционные классы противомикробных агентов. Риск передачи зоонозов с МЛУ от животных человеку также вызвал призывы к дальнейшим ограничениям применения некоторых недавно зарегистрированных антибактериальных препаратов, таких как фторхинолоны и цефалоспорины третьего и четвертого поколения.
Эпидемиология развития антибактериальной устойчивости у патогенов человека и животных
Staphylococcus
aureus
Staphylococcus
aureus
Эволюция развития устойчивости во многом обусловлена изменениями в эпидемиологии ключевых организмов с МЛУ. Когда-то ограниченные только больницами и организациями по уходу за престарелыми, метициллин-устойчивые штаммы  (MRSA, methicillin resistant ) в настоящее время распространены среди населения в угрожающих масштабах. Кроме того, штаммы MRSA, приобретенные населением, с большей долей вероятности несут токсин лейкоцидин Пантон-Валентина (ПВЛ), фактор вирулентности, связанный с поражениями кожи и мягких тканей, а также быстрой, молниеносной, некротической пневмонией со значительным числом ассоциированных с ними смертельных исходов. Недавно штаммы MRSA адаптировались к обитанию в ряде значимых видов животных в качестве хозяев, включая домашний скот, лошадей и домашних животных, и известны регулярные случаи их передачи от человека к животному и от животного к человеку. Этот факт имеет важные последствия для передачи штаммов и общественного здоровья. Недавнее обследование 751 австралийских ветеринаров на назальное носительство MRSA показало, что 21,4% ветеринаров, работающих с лошадьми, оказались MRSA-положительными, по сравнению с 4,9% ветеринаров, работающими с мелкими животными, и 0,9% ветеринаров, имевших незначительные контакты с животными. Такого рода смещение в экологии MRSA наряду с появлением устойчивости к новым лекарственным средствам, разработанным специально для MRSA, например, к линезолиду, подтверждает, что срочно необходимы новые противоинфекционные  средства для борьбы с MRSA. Более того, больницам, использующим ванкомицин для лечения MRSA, затем приходится бороться со вспышками среди пациентов инфекций, вызванных ванкомицин-устойчивыми энтерококками (VRE), для борьбы с которыми выбор противомикробных средств также ограничен.
E. coli
E. Coli
E.
coli
Глобальное появление и распространение в обществе высоко вирулентных грамотрицательных (G-) бактерии с МЛУ, таких как  O25b:ST131, подтверждает, что у бактериальных патогенов могут одновременно развиваться детерминанты как вирулентности, так и устойчивости. Как отголосок недавних эпидемий MRSA, штамм  O25b:ST131, основной возбудитель инфекций мочевыводящих путей и кровотока в организме человека, в настоящее время выделяют из внекишечных инфекций у домашних животных и птиц. Растущая значимость O25b:ST131 и других энтеробактерий с МЛУ при их комбинированной устойчивости к фторхинолонам и бета-лактамам расширенного спектра, а также карбапенемам является другой тревожной тенденцией, особенно с учетом того, что за последнее время было разработано лишь небольшое количество противоинфекционных препаратов со спектром действия против «G-» бактерий, за исключением продолжающегося продвижения лекарственных средств класса карбапенемов.
Всемирная организация здравоохранения определила устойчивость к антибиотикам в качестве одного из трех основных угроз здоровью людей в будущем. В недавнем сообщении от Центров профилактики и контроля заболеваемости США (CDC) подсчитано, что «в Соединенных Штатах каждый год более двух миллионов человек заболевают инфекциями, устойчивыми к антибиотикам, и в результате по меньшей мере 23000 из них умирают». Только в США дополнительный медицинские расходы, связанные с лечением и контролем одного случая инфекции, устойчивой к антибиотикам, по оценкам составляют от  18588 $ до  29069 $ в год, в результате чего общие прямые затраты системы здравоохранения США составляют более20 млрд $ в год. Кроме того, издержки американских семей в плане потери производительности оцениваются более чем в 35 млрд $ в год. Двадцать пять тысяч пациентов в странах Европейского союза (ЕС) по-прежнему ежегодно умирают в результате инфекций бактериями с МЛУ, несмотря на то, что во многих странах ЕС имеются лучшие системы надзора за больницами и стратегии инфекционного контроля мире. Затраты ЕС на здравоохранение и издержки в связи с потерей производительности, связанные с инфекциями с МЛУ, по оценкам составляют по меньшей мере € 1,5 млрд в год.
Clinical Infectious Diseases
Существует неудовлетворенная клиническая потребность в антибактериальных агентах с новыми механизмами действия для дополнения и замещения имеющихся в настоящее время антибактериальных агентов, эффективность которых все в большей степени подрывается механизмами устойчивости бактерий. Кроме того, сохраняется потребность в альтернативных антибактериальных агентах в лечении инфекций, вызванных бактериями со множественной устойчивостью. Однако, по сообщению Американского общества инфекционистов и Европейского центра по контролю и профилактике заболеваний, в настоящее время разрабатывается лишь небольшое количество новых препаратов, предлагающих многообещающие результаты, по сравнению с существующими способами лечения (Infectious Diseases Society of America 2010, , 50(8):1081-1083).
Задачей настоящего изобретения является преодоление по меньшей мере одного из недостатков предшествующего уровня техники.
Обсуждение предшествующего уровня техники, изложенное выше, предназначено для облегчения понимания всего настоящего изобретения. Обсуждение не подразумевает признание или принятие того, что какой-либо из упомянутых источников является или являлся частью общедоступных сведений на дату приоритета заявки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, предложено соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемая соль или пролекарство:
1
В одном предпочтительном варианте реализации R представляет собой Н, циклоалкил, или имеет Формулу II или Формулу III;
3
2
2,
2
3
2
где R представляет собой H, NH, NHNH O-CH-CH, NH-C(O)-фенил, NH-хлорфенил, NH-CH-хлорфенил, NH-N=CH--циклоалкил или имеет Формулу IV, Формулу V или Формулу VI
;
0
0
0
4
2
где А представляет собой N, С, СН, или А представляет собой С и А соединен с Rпосредством R с образованием триазольного кольца;
1
6
5
где A представляет собой N, C, NH, =CH-CH=N-, =(CH)C-CH=N- или имеет Формулу VII;
2
А представляет собой N, С, NH, N-С(O) -фенил, или имеет формулу VII;
3
4
5
6
7
8
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
23
24
25
26
27
где A, A, A, A, A, A, A, A,A, A, A, A, A, A, A, A, AA, A, A, A и A независимо представляют собой C, O, N, NH, S;
9
2
3
3
2
2
3
2
2
2
2
2
2
3
2
где AC, O, N, NH, N-C(O)-O-CH-CH, N-C(O)-O-CH(CH), N-C(O)-NH-CH-CH, N-C(O)-NH-CH-фенил, N-C(O)-CH-CH-CH-CH-CH-CH, N-C(O)-CH-фуран-2-ил;
10
6
5
где А представляет собой C, NH, -N=CH-CH=, -N=CH-C(CH)=;
22
3
3
2
где А представляет собой CH(CH)-, -N-CH-, -N-C(CH)-, N-C(CHOH)-;
2
2
2
2
2
2
2
4
2
9
R представляет собой Н, СООН, CHNH, CHOH, CHNHNH, метил, этил, пропил, бутил, циклопентил или имеет Формулу VII, и R и R соединены вместе с образованием кольца пиримидина, пиразина или триазина, или R и R соединены вместе с образованием кольца пирролидинила оксиндола;
4
4
0
2
4
4
2
где Rпредставляет собой N, NH, О, S, или R и А соединены посредством R с образованием триазольного кольца, или R представляет собой N и R и R соединены с образованием пиримидинового кольца;
7
3
3
3
3
3
3
2
3
7
8
трет
н
изо
где R представляет собой H, Cl, Br, F, OH, CH, OCH, SCH, CN, CCH, CF, OCF, SCF, NO, бутил, -бутил, диметиламино, фенил, -пропил, -пропил, - NH-C(O)-CH, -CH=CH-COOH, пиперазин-1-ил, или R и R соединены вместе с образованием замещенного или незамещенного, насыщенного или ненасыщенного алифатического кольца, гетероциклического кольца или бензольного кольца;
6
8
14
16
25
27
3
3
2
3
8
7
14
15
8
9
14
13
где R, R, R, R, R и Rнезависимо представляют собой H, OH, Cl, F, Br, CH, CN, OCH, COOH, NO, CF, R и R соединены вместе с образованием замещенного или незамещенного, насыщенного или ненасыщенного алифатического кольца, гетероциклического кольца или бензольного кольца, R и R соединены вместе с образованием замещенного или незамещенного, насыщенного или ненасыщенного алифатического кольца, гетероциклическое кольца или бензольного кольца, R и R соединены вместе с образованием замещенного или незамещенного, насыщенного или ненасыщенного алифатического кольца, гетероциклического кольца или бензольного кольца, или R и R соединены вместе с образованием замещенного или незамещенного насыщенного или ненасыщенного алифатического кольца, гетероциклического кольца или бензольного кольца;
5
9
17
24
28
2
3
3
3
2
3
3
9
8
13
14
где R, R,  R, R и R независимо представляют собой H, O, OH, Cl, F, Br, NH, CH, CF, OCH, CN, NO, фенил, -NH-CH(OH)-CH, -NH-C(O)-CH, или R и R соединены вместе с образованием замещенного или незамещенного, насыщенного или ненасыщенного алифатического кольца, гетероциклического кольца или бензольного кольца, или R и R соединены вместе с образованием замещенного или незамещенного насыщенного или ненасыщенного алифатического кольца, гетероциклического кольца или бензольного кольца;
10
11
19
20
22
23
10
11
19
20
22
23
где R, R, R, R, R и R независимо представляют собой Н, Cl или Br, или R и R соединены вместе с образованием замещенного или незамещенного, насыщенного или ненасыщенного алифатического кольца, гетероциклического кольца или бензольного кольца, или R и R соединены вместе с образованием замещенного или незамещенного, насыщенного или ненасыщенного алифатического кольца, гетероциклического кольца или бензольного кольца, или R и R соединены вместе с образованием замещенного или незамещенного, насыщенного или ненасыщенного алифатического кольца, гетероциклического кольца или бензольного кольца;
12
18
21
2
2
2
12
13
где R, R и R независимо представляют собой Н, СООН, CHNH, CHOH, метил, этил, пропил, бутил, циклопентил, или R и R соединены вместе с образованием кольца пирролидинила оксиндола;
15
26
3
3
3
3
3
3
2
3
15
14
где R и R независимо представляют собой Н, Cl, Br, F, ОН, СН, ОСН, SCH, CN, CF, OCF, ScF, NO, ССН, н-бутил, трет-бутил, диметиламино, фенил, н-пропил, изо-пропил, -NH-C(O)-СН, -СН = СН-СООН, пиперазин-1-ил, или R и R соединены вместе с образованием замещенного или незамещенного, насыщенного или ненасыщенного алифатического кольца, гетероциклического кольца или бензольного кольцо;
где "----" представляет собой двойную связь или простую связь.
Соединение формулы I предпочтительно представляет собой хлористую соль (хлорид).
В другом аспекте изобретения предложено соединение или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемая соль или пролекарство, выбранное из списка соединений, представленных на Фигуре 1. В тех случаях, где на Фигуре 1 приведена соль, изобретение охватывает как представленную соль, так и свободное основание этой соли и стереоизомеры, таутомеры, другие фармацевтически приемлемые соли, а также другие пролекарства свободного основания.
Предпочтительно, соединение согласно настоящему изобретению представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство,
0
где А представляет собой С;
1
где А представляет собой N или имеет Формулу VII;
2
где А представляет собой N или NH;
3,
4
6
7
11
12
14
15
где A A, A, A, A, A, A, A,представляют собой N или С;
5
13
23
24
25
26
27
где A, A, A, A, A, A и A представляют собой С;
8
21
где А и А представляют собой S;
9
где А представляет собой NH;
10
где А представляет собой N;
22
3
2
где А представляет собой -N-CH-; -N-C(CH)-; или -N-C(CHOH)-;
1
где Rпредставляет собой Н; имеет Формулу II; Формулу III; представляет собой циклоалкил;
2
2
2
2
2
4
где R представляет собой Н; метил; этил; CHNHNH; CHOH; бутил; циклопентил; или имеет формулу VII, и R присоединен к R с образованием пиримидинового кольца;
3
2
2
2
3
где R представляет собой NH; Формулу IV; Формулу V; Формулу VI; NH, NH-N=CH-циклоалкил или O-CH-CH;
4
4
4
2
где R представляет собой NH; О; S; или R представляет собой N и R и R соединены вместе с образованием пиримидинового кольца;
7
3
7
8
3
7
8
3
3
3
трет
изо
н
н
где R представляет собой Н; F, Cl; CF; метил; R и R соединены вместе с образованием незамещенного бензольного кольца; OH; -бутила; фенила; диметиламино; -пропила; -пропила; CN; CCH;-бутила; SCH;R и Rсоединены вместе с образованием незамещенного ненасыщенного гетероциклического кольца; ОСН; Br; OCF; пиперазин-1-ила или SCF;
6
8
14
16
3
3
8
7
8
7
14
15
14
15
где R, R, R и R независимо представляют собой H; OH; F; OCH; CF;метил; Cl; CN; Br; Rи R соединены вместе с образованием незамещенного бензольного кольца; R и R соединены вместе с образованием незамещенного ненасыщенного гетероциклического кольца; R и R соединены вместе с образованием незамещенного бензольного кольца; или R и R соединены вместе с образованием незамещенного ненасыщенного гетероциклического кольца;
5
9
13
17
2
3
3
где R, R, R и R независимо представляют собой H; OH; NH; Cl; F; OCH; OH; -NH-CH(OH)-CH;
12
2
где R представляет собой Н; метил; этил; СНОН; или циклопентил;
15
3
7
8
3
15
14
3
3
3
трет
изо
н
н
где R представляет собой Н; F, Cl; CF; метил; R и Rсоединены вместе с образованием незамещенного бензольного кольца; OH; -бутила; фенила; диметиламино; -пропила; -пропила; CN; CN; CCH; -бутила; SCH; R и R соединены вместе с образованием незамещенного ненасыщенного гетероциклического кольца; OCH; Br; OCF; пиперазин-1-ила или SCF;
24
28
где R и R независимо представляют собой Н; OH или Cl;
25
27
где R и R независимо представляют собой Н или ОН;
26
3
2
3
где R представляет собой H; CH; Br; Cl; OH; диметиламино; -O-P(O)(OEt); CFили F; и
где "----" независимо представляет собой простую или двойную связь.
Более предпочтительно, соединение согласно настоящему изобретению представляет собой соединение формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, выбранное из группы, включающей: NCL008; NCL009; NCL023; NCL025; NCL026; NCL029; NCL036; NCL037; NCL039; NCL040; NCL050; NCL061; NCL064; NCL065; NCL068; NCL075; NCL076; NCL078; NCL079; NCL080; NCL081; NCL084; NCL085; NCL086; NCL088; NCL089; NCL090; NCL092; NCL094; NCL095; NCL097; NCL098; NCL099; NCL101; NCL104; NCL105; NCL106; NCL108; NCL111; NCL112; NCL114; NCL115; NCL116; NCL118; NCL119; NCL121; NCL122; NCL123; NCL124; NCL125; NCL126; NCL130; NCL131; NCL132; NCL133; NCL135; NCL136; NCL137; NCL138; NCL139; NCL140; NCL141; NCL144; NCL145; NCL146; NCL147; NCL148; NCL150; NCL152; NCL153; NCL154; NCL156; NCL157; NCL158; NCL159; NCL161; NCL162; NCL164; NCL165; NCL166; NCL167; NCL168; NCL169; NCL170; NCL171; NCL172; NCL173; NCL174; NCL176; NCL177; NCL178; NCL179; NCL180; NCL181; NCL183; NCL184; NCL185; NCL186; NCL187; NCL188; NCL189; NCL190; NCL193; NCL194; NCL195; NCL196; NCL197; NCL198; NCL199; NCL200; NCL201; NCL202; NCL203; NCL204; NCL205; NCL206; NCL207; NCL208; NCL209; NCL210; NCL211; NCL212; NCL213; NCL215; NCL216; NCL217; NCL218; NCL219; NCL220; NCL221; NCL222; NCL223; NCL224; NCL225; NCL226; NCL227; NCL228; NCL229 и NCL230.
Еще более предпочтительно, соединение согласно настоящему изобретению представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, выбранное из группы, включающей: NCL040; NCL078; NCL079; NCL080; NCL081; NCL084; NCL088; NCL089; NCL097; NCL099; NCL123; NCL146; NCL157; NCL158; NCL177; NCL179; NCL188; NCL193; NCL195; NCL196; NCL197; NCL199; NCL202; NCL204; NCL205; NCL215; NCL216; NCL217; NCL219 и NCL221.
Еще более предпочтительно, соединение согласно настоящему изобретению представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, выбранное из группы, включающей: NCL078; NCL079; NCL080; NCL081; NCL084; NCL089; NCL097; NCL157; NCL158; NCL179; NCL188; NCL193; NCL195; NCL196; NCL199; NCL204; NCL216; NCL217; NCL219 и NCL221.
Еще более предпочтительно, соединение согласно настоящему изобретению представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, выбранное из группы, включающей: NCL089; NCL097; NCL157; NCL179; NCL188; NCL193; NCL195; NCL196; NCL216; NCL219 и NCL221.
Наиболее предпочтительно, соединение согласно настоящему изобретению представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, выбранное из группы, включающей: NCL097; NCL157; NCL179; NCL188; NCL195 и NCL196.
В одном предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где соединение не является соединением, выбранным из группы, включающей: NCL812, NCL001, NCL002, NCL003, NCL004, NCL005, NCL006, NCL007, NCL010, NCL011, NCL012, NCL013, NCL014, NCL015, NCL016, NCL017, NCL018, NCL019, NCL020, NCL021, NCL022, NCL024, NCL027, NCL028, NCL030, NCL031, NCL032, NCL033, NCL034, NCL035, NCL038, NCL041, NCL042, NCL043, NCL044, NCL045, NCL046, NCL047, NCL048, NCL049, NCL051, NCL052, NCL053, NCL054, NCL055, NCL056, NCL057, NCL058, NCL059, NCL060, NCL062, NCL063, NCL066, NCL067, NCL069, NCL070, NCL071, NCL072, NCL073, NCL074, NCL077, NCL082, NCL083, NCL087, NCL091, NCL093, NCL096, NCL100, NCL102, NCL103, NCL107, NCL109, NCL110, NCL113, NCL117, NCL120, NCL127, NCL128, NCL129, NCL134, NCL142, NCL143, NCL149, NCL151, NCL155, NCL160, NCL163, NCL175, NCL182, NCL191, NCL192 и NCL214.
Е
В предпочтительном аспекте настоящего изобретения соединение Формулы I не является робенидином (также упоминается в настоящей заявке как NCL812 и также известен как 1,3-бис [()-(4-хлорфенил)метиленамино]гуанидин), который имеет следующую структуру:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
7
9
12
13
15
16
17
4
8
14
3
0
1
В одном предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R,R  представляют собой H; R  представляет собой O; R и R представляют собой CF; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и везде в Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
2
1
2
0
3
4
5
6
7
2
5
6
7
8
4
9
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R представляет собой NH; A представляет собой N и A представляет собой NH; A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R представляет собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A и везде в Формуле II “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R,R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой F; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и везде в Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
7
9
12
13
15
16
17
4
8
14
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R,R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой F; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и везде в Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
7
8
12
14
15
16
17
4
9
13
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R,R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой OCH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и везде в Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
7
9
12
13
15
16
17
4
8
14
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R,R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой OCH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и везде в Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
2
1
2
0
3
4
5
6
7
2
5
6
8
9
4
7
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R представляет собой NH; A представляет собой N; A представляет собой NH; A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R представляет собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, и везде в Формуле II “----“  представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R,R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой CF; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R,R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой метил; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
7
8
12
14
15
16
17
4
9
13
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R,R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой метил; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
7
9
12
13
15
16
17
4
8
14
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, Rи R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой метил; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
2
1
2
0
3
4
5
6
7
2
5
6
8
9
4
7
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R представляет собой NH; A представляет собой N; A представляет собой NH; A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R представляет собой CF; и “----“ в Формуле I между A и A, и везде в Формуле II “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
2
1
2
0
3
4
5
6
7
2
5
6
7
9
4
8
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R представляет собой NH; A представляет собой N; A представляет собой NH; A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R представляет собой CF; и “----“ в Формуле I между A и A, и везде в Формуле II “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
2
1
2
0
3
4
5
6
7
2
5
6
8
9
4
7
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R представляет собой NH; A представляет собой N; A представляет собой NH; A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R представляет собой метил; и “----“ в Формуле I между A и A, и везде в Формуле II “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
2
1
2
0
3
4
5
6
7
2
5
6
7
9
4
8
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R представляет собой NH; A представляет собой N; A представляет собой NH; A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R представляет собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, и везде в Формуле II “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
7
9
12
13
15
16
17
4
8
14
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R,R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
12
5
6
8
9
13
14
16
17
4
7
15
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R и R представляют собой метил; R, R, R, R, R, R, R,R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой CF; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
12
5
6
8
9
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R и R представляют собой метил; R, R, R, R, R, R, Rи R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
2
1
2
0
3
4
5
6
7
2
5
6
8
9
4
7
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R представляет собой NHNH; A представляет собой N; A представляет собой NH; A, A, A, A, A и A представляют собой C; R представляет собой метил, R, R, R и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R представляет собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, и везде в Формуле II “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
7
9
12
13
15
16
17
4
8
14
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой S; R и R представляют собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи.  Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
2
1
2
0
3
4
5
6
7
2
5
6
8
9
4
7
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R представляет собой NH; A представляет собой N;A представляет собой NH; A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R представляет собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, и везде в Формуле II “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
2
1
2
0
3
4
5
6
7
2
5
6
8
9
4
7
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R представляет собой NHNH; A представляет собой N; A представляет собой NH; A, A, A, A, A и A представляют собой C; R представляет собой метил; R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R представляет собой CF; и “----“ в Формуле I между A и A, и везде в Формуле II “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
4
7,
15
17
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R R и R представляют собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
4
7
15
3
17
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; Rпредставляет собой Cl; R представляет собой CF; R представляет собой F; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL078):
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R и R  представляют собой H; R представляет собой NH; Rпредставляет собой Cl; R представляет собой F; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL079):
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
13
14
16
17
4
7
12
15
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R и R  представляют собой H; R представляет собой NH; Rпредставляет собой Cl; R представляет собой метил; R представляет собой CF; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL080):
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
13
14
16
17
4
7
15
12
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R и R  представляют собой H; R представляет собой NH; Rи Rпредставляют собой Cl; R представляет собой метил; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
15
16
4
7
17
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; Rи Rпредставляют собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
4
7
15
17
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; Rи R представляют собой Cl; R представляет собой F; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL084):
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
15
16
17
4
7
14
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; Rпредставляет собой Cl; R представляет собой CN; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
15
16
4
7
17
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; Rпредставляет собой Cl; R представляет собой F; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
12
5
6
8
9
13
14
16
17
4
7
15
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R и R представляют собой метил; R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; Rпредставляет собой Cl; R представляет собой CF; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL089):
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
9
12
13
16
17
4
7
8
14
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R соединены вместе с образованием незамещенного бензольного кольца; R и R соединены вместе с образованием незамещенного бензольного кольца; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
0
1
2
1
3
4
2
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где A представляет собой C; A представляет собой N; A представляет собой NH; R представляет собой циклогексил; R представляет собой NH-N=CH-циклогексил; R представляет собой NH; R представляет собой H; и “----“ в Формуле I между A и Aпредставляет собой двойную связь. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
12
13
14
15
2
5
9
12
13
17
4
6
7
8
14
15
16
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, , A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R, R, R, R, R, и R представляют собой OH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL097):
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой трет-бутил; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
7
8
9
12
13
14
15
4
5,
6
16
17
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R R, R, и R представляют собой OH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
8
12
14
17
4
6,
7
9
13
15
16
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R R, R, R, R, и R представляют собой OH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
12
16
17
4
7,
8
9
13
14
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R R, R, R, R, и R представляют собой OH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL097):
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
6
7
8
9
12
13
14
15
16
4
5
17
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой OH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
7
8
9
12
13
14
15
17
4
6
16
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой OH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
8
9
12
13
14
17
4
6,
7
15
16
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R R, R, и R представляют собой OH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой фенил; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой диметиламино; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
8
9
12
13
14
17
4
6
16
3
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой OCH; R и R представляют собой OH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой изо-пропил; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой N-пропил; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
8
9
12
13
14
17
4
6
7
15
16
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R, R, R, и R представляют собой F; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой CCH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
7
8
9
12
13
14
15
17
4
6
16
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой Br; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой бутил; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
6
5
10
6
5
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
7
8
9
12
13
14
15
16
17
4
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A представляет собой -C(CH)-CH-N- и A представляет собой -N=CH-C(CH)=; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой CHS; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
0
2
21
1
20
2
19
8
21
4
10
11
22
23
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу III; R имеет Формулу VI; A представляет собой C; R и R  представляют собой H; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A и A представляют собой S; R представляет собой NH; R и R соединены вместе с образованием замещенного бензольного кольца;  R и R соединены вместе с образованием замещенного бензольного кольца;  и “----“ в Формуле I между A и A, и везде в Формуле III и Формуле VI “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
12
5
6
7
8
9
13
14
15
16
17
4
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R и R представляют собой метил; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
9
12
13
16
17
4
7
8
14
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R соединены вместе с образованием незамещенного гетероциклического кольца; R и R соединены вместе с образованием незамещенного ненасыщенного гетероциклического кольца; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; Aпредставляет собой =CH-CH=N-и A представляет собой-N-(CH)-; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой OCH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой OH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
12
5
6
8
9
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R и R представляют собой этил; R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
12
5
6
8
9
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R и R представляют собой метил; R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой Br; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
12
14
16
17
4
7
15
9
13
2
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и Rпредставляют собой Cl; R и R представляют собой NH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL157):
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
12
5
17
6
8
9
13
14
16
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R и R представляют собой этил; R и R представляют собой OH; R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL158):
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
12
5
17
6
8
9
13
14
16
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R и R представляют собой циклопентил; R и R представляют собой OH; R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой OCF; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
12
5
6
8
9
13
14
16
17
4
7
15
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R и R представляют собой метил; R, R, R, R, R, R, R и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой пиперазин-1-ил; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
2
3
1
2
0
3
4,
5
6
7
2
5
6
8
9
4
7
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R  представляет собой O-CH-CH; A представляет собой N; A представляет собой NH; A, A, A A, A и A представляют собой C; R представляет собой метил; R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R представляет собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, и везде в Формуле II “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
5
6
8
9
12
13
14
16
17
4
7
15
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, R, R и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой SCF; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
6
8
9
12
13
14
16
4
7
15
5
17
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A,A, A, A, A и A представляют собой C; R,  R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой Cl; R и R представляют собой -NH-CH(OH)-CH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает:
0
1
2
4
3
2
1
2
2
4
2
0
1
2
22
24
25
27
28
23
24
25
26
27
26
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где A представляет собой C; R представляет собой H; A и R представляют собой N; R представляет собой NH; A имеет Формулу VII; R имеет Формулу VII и R соединен с R с образованием пиримидинового кольца; “----“ в Формуле I между R и A, и между A и A представляют собой двойные связи; A представляет собой -N-CH-; R, R, R и R  представляют собой H; A, A, A, A и A представляют собой C; и R представляет собой Cl. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL179):
1
3
2
1
2
4
0
3
4
5
6
7
5
6
8
9
2
7
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R представляет собой NH; A представляет собой N; A и R представляют собой NH; A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой бутил; R представляет собой Cl; и “----“ в Формуле I между A и A, и везде в Формуле II “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL188):
0
1
2
4
3
2
1
2
2
4
2
0
1
2
22
24
25
27
28
23
24
25
26
27
26
3
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где A представляет собой C; R представляет собой H; A и R представляют собой N; R представляет собой NH; A имеет Формулу VII; R имеет Формулу VII и R соединен с R с образованием пиримидинового кольца; “----“ в Формуле I между R и A, и между A и A представляют собой двойные связи; A представляет собой -N-CH-; R, R, R и R  представляют собой H; A, A, A, A и A представляют собой C; и R представляет собой CH. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL195):
0
1
2
4
3
2
1
2
2
4
2
0
1
2
22
24
25
27
28
23
24
25
26
27
26
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где A представляет собой C; R представляет собой H; A и R представляют собой N; R представляет собой NH; A имеет Формулу VII; R имеет Формулу VII и R соединен с R с образованием пиримидинового кольца; “----“ в Формуле I между R и A, и между A и A представляют собой двойные связи; A представляет собой -N-CH-; R, R, R и R  представляют собой H; A, A, A, A и A представляют собой C; и R  представляет собой OH. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL196):
0
1
2
4
3
2
1
2
2
4
2
0
1
2
22
24
25
27
28
23
24
25
26
27
26
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где A представляет собой C; R представляет собой H; A и R представляют собой N; R представляет собой NH; A имеет Формулу VII; R имеет Формулу VII и R соединен с R с образованием пиримидинового кольца; “----“ в Формуле I между R и A, и между A и A представляют собой двойные связи; A представляет собой -N-CH-; R, R, R и R  представляют собой H; A, A, A, A и A представляют собой C; и R представляет собой Br. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL193):
0
1
2
4
3
2
1
2
2
4
2
0
1
2
22
24
25
26
27
28
23
24
25
26
27
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где A представляет собой C; R представляет собой H; A и R представляют собой N; R представляет собой NH; A имеет Формулу VII; R имеет Формулу VII и R соединен с R с образованием пиримидинового кольца; “----“ в Формуле I между R и A, и между A и A представляют собой двойные связи; A представляет собой -N-CH-; R, R, R, R и R  представляют собой H; и A, A, A, A и A представляют собой C. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL199):
0
1
2
4
3
2
1
2
2
4
2
0
1
2
22
3
24
25
27
28
23
24
25
26
27
26
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где A представляет собой C; R представляет собой H; A и R представляют собой N; R представляет собой NH; A имеет Формулу VII; R имеет Формулу VII и R соединен с R с образованием пиримидинового кольца; “----“ в Формуле I между R и A, и между A и A представляют собой двойные связи; A представляет собой -N-C(CH)-; R, R, R и R  представляют собой H; A, A, A, A и A представляют собой C; и R представляет собой Cl. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL204):
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
6
8
9
12
13
14
16
4
7
15
5
17
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R, R, R, R, R, R, R, и R  представляют собой H; R представляет собой NH; Rи R представляют собой Cl; R и R представляют собой F; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL216):
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
12
5
6
8
9
13
14
16
17
4
7
15
3
0
1
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R и R представляют собой метил; R, R, R, R, R, R, Rи R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой CH; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL217):
1
3
1
10
2
9
0
3
4
5
6
7
11
12
13
14
15
2
12
5
6
8
9
13
14
16
17
4
7
15
0
1
трет
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где R имеет Формулу II; R имеет Формулу IV; A и A представляют собой N; A и A представляют собой NH; A, A, A, A, A, A, A, A, A, A и A представляют собой C; R и R представляют собой метил; R, R, R, R, R, R, Rи R  представляют собой H; R представляет собой NH; R и R представляют собой -бутил; и “----“ в Формуле I между A и A, везде в Формуле II и Формуле IV “----“ представляют собой двойные связи. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL219):
0
1
2
4
3
2
1
2
2
4
2
0
1
2
22
24
25
27
28
23
24
25
26
27
26
3
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение представляет собой соединение Формулы I или его стереоизомер, таутомер, фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, где A представляет собой C; R представляет собой H; A и R представляют собой N; R представляет собой NH; A имеет Формулу VII; R имеет Формулу VII и R соединен с R с образованием пиримидинового кольца; “----“ в Формуле I между R и A, и между A и A представляют собой двойные связи; A представляет собой -N-CH-; R, R, R и R  представляют собой H; A, A, A, A и A представляют собой C; и R представляет собой CF. Пример соединения данного варианта реализации изобретения включает (NCL221):
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предложен способ лечения или профилактики бактериальной колонизации или инфекции у субъекта, включающий стадию: введения субъекту терапевтически эффективного количества соединения Формулы I, или его терапевтически приемлемой соли. В этом аспекте бактериальная колонизация или инфекция вызвана бактериальным агентом. Способ лечения или профилактики бактериальной инфекции или колонизации у субъекта также может включать введение фармацевтической или ветеринарной композиции согласно настоящему изобретению.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предложено применение соединения Формулы I или терапевтически приемлемой соли, в изготовлении лекарственного средства для лечения бактериальной колонизации или инфекции у субъекта. В этом аспекте бактериальная инфекция вызвана бактериальным агентом.
Субъект может представлять собой любой субъект, который может быть колонизирован и инфицирован бактериями. Субъект может представлять собой млекопитающее, рыбу или птицу. Предпочтительно субъект выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, человека, псовых, кошачьих, крупный рогатый скот, овец, коз, других видов жвачных, свиней, лошадей, птиц или рыб.
Соединение Формулы I можно вводить субъекту в дозе, выбранной из группы, включающей от 0,1 мг до 250 мг/кг массы тела, предпочтительно от 1 мг/кг до 100 мг/кг массы тела, и более предпочтительно от 5 мг/кг до 50 мг/кг массы тела. Соединение Формулы I можно вводить субъекту с помощью режима дозирования, выбранного из группы, включающей: каждый час, три раза в день; два раза в день; ежедневно; через день; два раза в неделю; один раз в неделю; один раз в две недели; один раз в месяц; один раз в два месяца, или путем инфузии с постоянной скоростью или с переменной скоростью. Предпочтительно, соединение Формулы I вводят до тех пор, пока колонизация или признаки и симптомы инфекции или колонизации не будут по меньшей мере частично излечены или облегчены.
В одном варианте реализации концентрация соединения Формулы I (или метаболита) в крови субъекта после лечения находится в пределах диапазона, выбранного из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными: от 0,1 до 10 мкг/мл через 2 часа, от 1 до 200 мкг/мл через 12 часов; от 0,1 до 5 мкг/мл после 24 часов; от 0,01 до 2 мкг/мл после 48 часов; от 0,0001 до 1 мкг/мл после 72 часов. Предпочтительно, концентрация выбрана из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, менее чем 200 мкг/мл после 12 часов; менее чем 5 мкг/мл после 24 часов; менее чем 1 мкг/мл после 48 часов и менее чем 0,5 мкг/мл после 72 часов.
Clostridium
perfringens
et al
Chemosphere
et al
EnvironmentalPollution
Агент, вызывающий бактериальную инфекцию, представляет собой бактериальный агент. В одном предпочтительном варианте реализации агент не является видом простейших В одном предпочтительном варианте реализации агент не является простейшим группы кокцидий. Более предпочтительно агент не представляет собой ни , ни гетеротрофные виды бактерий, присутствующие в образцах почвы, собранных Хансеном и соавторами в Жиндеваде, Дания, как описано в следующих статьях: Hansen . 2012, , 86:212-215; and Hansen . 2009,  157:474-480.
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамотрицательным. В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным. В другом варианте реализации бактериальный агент не имеет клеточной стенки. В другом варианте реализации бактериальная инфекция вызвана смесью по меньшей мере двух агентов, выбранных из группы, включающей: грамотрицательных, грамположительных бактериальных агентов и бактериальных агентов, не имеющих клеточной стенки.
Staphylococcus
Enterococcus
Leuconostoc
Corynebacterium
Arcanobacteria
Trueperella
Rhodococcus
Bacillus
Actinomyces
Clostridium
Nocardia
Erysipelothrix
Listeria
Kytococcus spp
Mycoplasma
Ureaplasma
Mycobacterium
Бактериальный агент, вызывающий бактериальную инфекцию, может представлять собой грамположительный бактериальный агент, выбранный из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, spp, стрептококки, spp, spp, spp, spp, spp, spp, spp, анаэробные кокки, анаэробные грамположительные неспорулирующие бациллы, spp, spp, spp, spp, spp, , spp, spp и spp.
Staphylococcus spp
Staphylococcus spp
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus hominis, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus pettenkoferi, Staphylococcus pulvereri, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus simulans, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus arlettae, Staphylococcus caseolyticus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus condimenti, Staphylococcus delphini, Staphylococcus equorum, Staphylococcus felis, Staphylococcus fleurettii, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus lutrae, Staphylococcus muscae, Staphylococcus nepalensis, Staphylococcus piscifermentans, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simiae, Staphylococcus succinus
Staphylococcus vitulinus
В одном варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными,. Примеры бактерий включают и .
Streptococcus spp
Streptococcus spp
Streptococcus agalactiae
Streptococcus alactolyticus
Streptococcus anginosus
Streptococcus canis
Streptococcus constellatus, Streptococcus cricetus
Streptococcus cristatus
Streptococcus downei
Streptococcus dysgalactiae
dysgalactiae, Streptococcus dysgalactiae
equisimilis
Streptococcus equi
equi, Streptococcus equi
zooepidemicus
Streptococcus ferus
Streptococcus gallolyticus
gallolyticus
Streptococcus bovis
Streptococcus gallolyticus
pasteurianus
Streptococcus bovis
Streptococcus gordonii
Streptococcus hyointestinalis
Streptococcus hyovaginalis
Streptococcus infantarius
Streptococcus infantarius
infantarius
Streptococcus infantis
Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus lutetiensis
Streptococcus bovis
Streptococcus macaccae
Streptococcus mitis
Streptococcus mutans
Streptococcus oralis
Streptococcus orisratti, Streptococcus parasanguinis
Streptococcus peroris
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus porcinus
Streptococcus pseudintermedius, Streptococcus pyogenes
Streptococcus ratti
Streptococcus salivarius
Streptococcus sanguinis
Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis
Streptococcus thermophilus
Streptococcusvestibularis
Abiotrophia defectiva, Granulicatella adiacens, Granulicatella elegans
Granulicatella para-adiacens)
Rothia mucilaginosa
Stomatococcus mucilaginosus
Pediococcus
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, . Примеры  включают , , , , , , , subsp. subsp. , subsp. subsp. , , subsp. (ранее биотип i), subsp. (ранее биотип ii/2), , , , , subsp. , , (ранее биотип ii.1), , , , , , , , , , , , , , , , а также варианты стрептококков по потребляемым питательным веществам (недостаточность по питательным веществам) (и  и родственные виды, такие как (ранее ) и .
Enterococcus spp
Enterococcus spp
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Enterococcus gallinarum
Enterococcus durans
Enterococcus avium
Enterococcus raffinosus
Enterococcus pallens
Enterococcus gilvus
Enterococcus cecorum
Enterococcus malodoratus
Enterococcus italicus
Enterococcus sanguinicola
Enterococcus mundtii
Enterococcus casseliflavus/flavescens
Enterococcus dispar
Enterococcus hirae
Enterococcus pseudoavium
Enterococcus bovis
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, . Примеры включают , , , , , , , , , , , , , , , , и .
Leuconostoc
Leuconostoc
Leuconostoc mesenteroides
Leuconostoc pseudomesenteroides
Leuconostoc paramesenteroides
Leuconostoc citreum
Leuconostoc lactis
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбраны из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, spp. Примеры spp. включают , , ,  и .
Corynebacterium
Corynebacterium
Corynebacterium
Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium striatum, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium argentoratense, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium confusum, Corynebacterium cystidis, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium simulans, Corynebacterium sundvallense, Corynebacterium thomssensii, Corynebacterium freneyi
Corynebacterium aurimucosum
Corynebacterium
Corynebacterium afermentansafermentans, Corynebacterium auris, Corynebacterium pseudodiphtheriticum
Corynebacterium propinquum,
Corynebacterium
Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium afermentanslipophilum, Corynebacterium accolens, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium tuberculostearum, Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium bovis, CDCcoryneform
F-1 и G
Corynebacterium lipophiloflavum
Corynebacterium
Turicella, Arthrobacter, Brevibacterium, Dermabacter, Rothia, Oerskovia, Microbacterium
Leifsoniaaquatica
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, spp. Примеры spp включают нелипофильные ферментативные виды spp, такие как и , нелипофильные неферментативные виды spp, такие как и  и липофильные виды spp, такие как групп и , а также другие виды spp, такие как и .
Arcanobacteria
Arcanobacteria
A. haemolyticum, A. pyogenes (
Trueperella pyogenes
Actinomyces pyogenes)
A. bernardiae
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, spp. Примеры spp. включают сейчас известный как , ранее известный как и .
Rhodococcus spp
Rhodococcus spp
Rhodococcus equi, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus fasciens
Rhodococcus rhodochrous
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, . Примеры  включают и .
Gordonia
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными,  spp.
Tsukamurella
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными,  spp.
Acholeplasma
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными,  spp.
Crossiella equi
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, такие как актинобактерии, такие как .
Bacillus
Bacillus
Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Brevibacillus brevis, Brevibacillus laterosporus
Paenibacillus alvei.
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными,  spp. Примеры  spp. включают и
Anaerococcus murdochii, Anaerococcus prevotii, Anaerococcus tetradius, Anaerococcus octavius, Anaerococcus hydrogenalis, Anaerococcus lactolyticus, Anaerococcus vaginalis, Atopobium parvulum, Finegoldia magna, Gallicola barnesae, Gemella asaccharolytica, Gemella bergeri, Gemella cuniculi, Gemella haemolysans, Gemella morbillorum, Gemella palaticanis, Gemella sanguinis; Parvimona smicra, Peptococcus niger, Peptoniphilus asaccharolyticus, Peptoniphilus gorbachii, Peptoniphilu sindolicus, Peptoniphilus harei, Peptoniphilus ivorii, Peptoniphilus lacrimalis, Peptoniphilus olsenii, Peptostreptococcus stomatis, Peptostreptococcus anaerobius, Ruminococcus productus, Slackia heliotrinireducens
Staphylococcus saccharolyticus
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, анаэробные кокки. Примеры анаэробных кокков включают и .
Alloscardoviaomnicolens
Atopobium
Atopobiumminutum
Atopobiumrimae
Atopobiumparvulum
Atopobiumvaginae)
Bifidobacteria
Bifidobacteria adolescentis,Bifidobacteria dentium
Bifidobacteria scardovii
Catabacter hongkongensis
Collinsellaaerofaciens
Eggerthella (
Eggerthella lenta, Eggerthella hongkongensis
Eggerthella sinensis)
Eubacterium
Eubacterium nodatum, Eubacterium tenue,Eubacterium brachy
Eubacterium infirmum
Eubacterium minutum
Eubacterium nodatum
Eubacterium saphenum
Eubacterium sulci
Filifactoralocis
Mogibacterium timidum
Mogibacterium vescum
Pseudoramibacteralactolyticus
Bulleidiaextructa
Solobacterium moorei
Lactobacillus
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus casei
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus gasseri
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus iners
Lactobacillus ultunensis
Mobiluncus
Mobiluncus curtisii, Mobiluncus mulieris
Moryella indoligenes
Olsenella
Olsenellauli
Olsenellaprofuse)
Oribacterium sinus
Propionibacterium
Propionibacterium acnes
Propionibacterium
propionicum), Slackia exigua
Turicibacter sanguine.
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, анаэробные грамположительныенеспорулирующие бациллы. Примеры анаэробных грамположительных неспорулирующих бацилл включают , виды (такие как , ,  и , (такие как , ), , , такие как и ,  и родственные виды (такие как , , , , , , , , , ,  и ), виды (такие как , , , , , , и ), виды (такие как ), , оральные виды (такие как и , , (такие как и  и
Actinomyces spp
Actinomyces spp
Actinomyces israelii, Actinomyces  naeslundii, Actinomyces viscosus, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces meyeri
Actinomyces gerencseriae
Actinomyces israelii
Actinomyces  europaeus, Actinomyces neuii, Actinomyces radingae, Actinomyces graevenitzii, Actinomyces hordeovulneris
Actinomyces turicensis, Actinomyces georgiae,Arcanobacterium
Actinomyces
pyogenes, Arcanobacterium
Actinomyces
bernardiae,Actinomyces funkei, Actinomyces lingnae, Actinomyces houstonensis
Actinomyces cardiffensis
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, . Примеры включают и (ранее серотип II), , () () и .
Clostridium
Clostridium
Clostridium baratii, Clostridium bifermentans
Clostridium botulinum, Clostridium botulinum
Clostridium butyricum, Clostridium difficile, Clostridium histolyticum
Clostridium novyi (
), Clostridium novyi (
), Clostridium perfringens, Clostridium perfringens (
), Clostridium ramosum, Clostridium septicum, Clostridium sordelli, Clostridium sphenoides
Clostridium tertium
Clostridium tetani.
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, spp. Примеры spp. включают ,  (типы A, B, C, D, E, F, G), , тип Aтип Bтипы A-E,  и
Nocardia
Nocardia
Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis, Nocardia farcinica, Nocardia nova, Nocardia otitidiscaviarum
Nocardia transvalensis.
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, spp. Примеры spp включают и
Erysipelothrix
Erysipelothrix
rhusiopathiae
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными,  spp, такие как .
Listeria
Listeriamonocytogenes
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, spp, например, .
Kytococcus spp
Kytococcusschroeteri
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, , такие как .
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycobacterium abscessus, Mycobacterium arupense, Mycobacterium asiaticum, Mycobacterium aubagnense, Mycobacterium avium complex, Mycobacterium bolletii, Mycobacterium bolletii, Mycobacterium branderi, Mycobacterium canettii, Mycobacterium caprae, Mycobacterium celatum, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium chimaera, Mycobacterium colombiense, Mycobacterium conceptionense, Mycobacterium conspicuum, Mycobacterium elephantis, Mycobacterium farcinogenes
Mycobacterium florentinum, Mycobacterium fortuitum group, Mycobacterium genavense, Mycobacterium goodii, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium heckeshornense, Mycobacterium heidelbergense, Mycobacterium houstonense, Mycobacterium immunogenum, Mycobacterium interjectum, Mycobacterium  intracellulare, Mycobacterium senegalense, Mycobacterium  africanum, Mycobacterium  avium subsp paratuberculosis, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium lacus, Mycobacterium lentiflavum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium  lepraemurium
Mycobacterium mageritense, Mycobacterium malmoense, Mycobacterium marinum, Mycobacterium massiliense, Mycobacterium  microti
Mycobacterium montefiorense (
), Mycobacterium moracense, Mycobacterium mucogenicum, Mycobacterium nebraskense, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium novocastrense, Mycobacterium palustre, Mycobacterium parmense, Mycobacterium  phlei
Mycobacterium phocaicum, Mycobacterium  pinnipedii
Mycobacterium porcinum, Mycobacterium pseudoshottsii
(
), Mycobacterium  pseudotuberculosis
Mycobacterium saskatchewanense, Mycobacterium scrofulaceum,  Mycobacterium senuense, Mycobacterium septicum, Mycobacterium simiae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium terrae/chromogenicum complex, Mycobacterium triplex, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tusciae, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium wolinskyi
Mycobacterium xenopi
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, spp. Примеры spp включают , , , патоген угрей, , патоген рыб, и .
Trueperella
Trueperella
Trueperella abortisuis
Trueperella bernardiae
Trueperella bialowiezensis
Trueperella bonasi
Trueperella pyogenes
Arcanobacterium pyogenes
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, spp. Примеры spp включают , , , ,  ().
Actinobaculumsuis, Actinomycesbovis, Arcanobacteriumpyogenes, Bacillusanthracis, cereus, licheniformis, pumilus, melaninogenicus, subtilis, Clostridiumbotulinum, chauvoei, haemolyticum, novyi, perfringens, septicum, sordellii, tetani, colinum, Corynebacterium pseudotuberculosis, renale, Dermatophilus congolensis, Enterococcus spp
E.faecalis, E.faecium, E.durans, E.avium, E.hirae
Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeriaivanovii, grayi, innocua, seeligeri, welshimeri, monocytogenes, Mycobacterium avium, bovis, paratuberculosis
, Mycoplasma (
capricolumsubsp. capripneumoniae, subsp. capricolum, M. Mycoides subsp mycoides, M. agalactiae, M. ovipneumoniae, M. conjunctivae, M. arginini, M. Bovis
M. putrefaciens) Mycoplasma bovis, dispar, mycoidessubsp. mycoides
Mycoplasma gallisepticum (MG), iowaemeleagridis (MM), synoviae (MS) Mycoplasma haemosuis
Eperythrozoonsuis
, alkalescens, bovigenitalum, bovirhinis, bovoculi, californicum, canadense, cynos, equigenitalium, gateae, haemocanis, haemofelis, hyopneumoniae, hyorhinis, hyosynoviae, iowae, leachii, meleagridis, mycoidessubspcapri, wenyonii,suis, Rhodococcus equi, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus felis, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus warneri, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus cohniisubsp. cohnii, Staphylococcus cohniisubsp. urealyticus, Staphylococcus capitissubsp. capitis, Staphylococcus capitissubsp. urealyticus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus delphini, Staphylococcus schleiferisubsp. coagulans, Staphylococcus aureussubsp. anaerobius, Streptococcus uberis, Streptococcus canis
Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus bovis, Streptococcus equisubsp. Zooepidemicus, Streptococcus equinus, Streptococcus equi (Streptococcus equisubspequi), Streptococcus equisimilis (Streptococcus dysgalactiaesubspequisimilis), porcinus, suis, zooepidemicus, Streptococcus zooepidemicus (Streptococcus equisubspzooepidemicus), Streptococcus dysgalactiaesubsp. equisimilis, Propionibacteriumacnes, Propionibacteriumgranulosum, Eubacterium, Peptococcus indolicus
Peptostreptococcus anaerobius;
Actinobacillus, Aeromonas, Anaplasma, Arcobacter, Avibacterium, Bacteroides, Bartonella, Bordetella, Borrelia, Brachyspira, Brucella, Campylobacter, Capnocytophaga, Chlamydia, Chlamydophila, Chryseobacterium, Coxiella, Cytophaga, Dichelobacter, Edwardsiella, Ehrlichia, Escherichia, Flavobacterium, Francisella, Fusobacterium, Gallibacterium, Haemophilus, Histophilus, Klebsiella, Lawsonia, Leptospira, Mannheimia, Megasphaera, Moraxella, Neorickettsia, Nicoletella,Ornithobacterium, Pasteurella, Photobacterium, Piscichlamydia, Piscirickettsia, Porphyromonas, Prevotella, Proteus, Pseudomonas, Rickettsia, Riemerella, Salmonella, Streptobacillus, Tenacibaculum, Vibrio
Yersinia.
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным, грамотрицательным или не имеет клеточной стенки, и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, патогенысельскохозяйственных животных. Примеры патогенов сельскохозяйственных животных включают  (такие как ),  (болезнь Джона)такие как  и (например, возбудители контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота, CBPP) (ранее ), и а также различные виды родов следующих грамотрицательных бактерий: и
Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Corynebacterium pseudotuberculosis, Clostridium piliforme, Actinomyces bovis, Staphylococcus aureus, betahaemolytic, Steptococcus  spp, Dermatophilus congolense, Clostridiium tetani
Clostridium botulinum.
Staphylococcus  spp
Streptococcus  spp
Clostridium
Actinomyces
Enterococcus  spp
Nocardia
Mycoplasma
Mycobacterium
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамположительным и выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, патогены видов домашних животных (животных-компаньонов), таких как кошки, собаки и лошади. Примерами таких патогенов являются патогены лошадей, такие как и  Другие примеры включают патогены собак и кошек, такие как , , spp, spp, , spp, spp и spp.
Acetobacteraceae:- Roseomonas cervicalis; Roseomonas fauriae; Roseomonas gilardii. -- Aeromonadaceae:- Aeromonas allosaccharophila; Aeromonas aquariorum; Aeromonas caviae; Aeromonas hydrophila (and subspecies); Aeromonas salmonicida; Aeromonas shubertii; Aeromonas veronii biovar sobria (Aeromonas sobria). -- Alcaligenaceae:- Achromobacter xylosoxidans; Alcaligenes faecalis; Bordetella ansorpii; Bordetella avium; Bordetella bronchiseptica; Bordetella hinzii; Bordetella holmesii; Bordetella parapertussis; Bordetella pertussis; Bordetella petrii; Bordetella trematum; Oligella ureolytica; Oligella urethralis. -- Anaplasmataceae:- Anaplasma phagocytophilum; Anaplasma platys; Anaplasma bovis; Anaplasma centrale; Anaplasma marginale; Anaplasma odocoilei; Anaplasma ovis; Ehrlichia canis; Ehrlichia chaffeensis; Ehrlichia ewingii; Ehrlichia muris; Ehrlichia ovina; Ehrlichia ruminantium; Neoehrlichia lotoris; Neoehrlichia mikurensis; Neorickettsia helminthoeca; Neorickettsia risticii; Neorickettsia sennetsu; Wolbachia pipientis. -- Armatimonadaceae:- Armatimonas rosea. -- Bacteroidaceae:- Bacteroides forsythus; Bacteroides fragilis; Bacteroides melaninogenicus; Bacteroides ruber; Bacteroides urealtyicus. -- Bartonellaceae:- Bartonella alsatica; Bartonella australis; Bartonella bacilliformis; Bartonella birtlesii; Bartonella bovis; Bartonella capreoli; Bartonella chomelii; Bartonella clarridgeiae; Bartonella doshiae; Bartonella elizabethae; Bartonella grahamii; Bartonella henselae; Bartonella koehlerae; Bartonella peromysci; Bartonella phoceensis; Bartonella quintana; Bartonella rattimassiliensis; Bartonella rochalimae; Bartonella schoenbuchensis; Bartonella talpae; Bartonella tamiae; Bartonella taylorii; Bartonella tribocorum; Bartonella vinsonii subsp  berkhoffii; Bartonella vinsonii subsp. arupensis; Bartonella vinsonii subsp. vinsonii. -- Bdellovibrionaceae:- Bdellovibrio spp. -- Brachyspiraceae:- Brachyspira spp including Brachyspira hampsonii, Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira murdochii, Brachyspira pilosicoli. -- Brucellaceae:- Brucella abortus; Brucella canis; Brucella ceti; Brucella melitensis; Brucella ovis; Brucella pinnipedialis; Brucella suis; Ochrobactrum anthropi; Ochrobactrum intermedium. -- Burkholderiaceae:- Burkholderia aboris; Burkholderia ambifaria (genomovar VII); Burkholderia anthina (genomovar VIII); Burkholderia cenocepacia (genomovar III); Burkholderia cepacia (genomovar I); Burkholderia diffusa; Burkholderia dolosa (genomovar VI); Burkholderia latens; Burkholderia mallei; Burkholderia metallica; Burkholderia multivorans (genomovar II); Burkholderia pseudomallei; Burkholderia pyrrocinia (genomovar IX); Burkholderia seminalis; Burkholderia stabilis (genomovar IV); Burkholderia ubonensis (genomovar X); Burkholderia vietnamiensis (genomovar V); Cupriavidus pauculus; Cupriavidus gilardii; Ralstonia pickettii; Ralstonia mannitolilytica; Sphaerotilus hippei; Sphaerotilus montanus; Sphaerotilus natans. -- Campylobacteraceae:- Arcobacter spp includng Arcobacter skirrowii; Campylobacter coli; Campylobacter concisus; Campylobacter curvus; Campylobacter fetus; Campylobacter gracilis; Campylobacter helveticus; Campylobacter hominis; Campylobacter hyointestinalis; Campylobacter insulaenigrae; Campylobacter jejuni; Campylobacter lanienae; Campylobacter lari; Campylobacter laridis; Campylobacter mucosalis; Campylobacter rectus; Campylobacter showae; Campylobacter sputorum; Campylobacter upsaliensis. -- Candidatus:- Piscichlamydia salmonis. - Cardiobacteriaceae: - Cardiobacterium hominis; Cardiobacterium valvarum; Dichelobacter nodosus. - Chlamydiaceae:- Chlamydia spp including Chlamydia avium, Chlamydia gallinacea, Chlamydia muridarum, Chlamydia suis, Chlamydia trachomatis; Chlamydophila spp including Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila caviae, and Chlamydophila felis. -- Chthonomonadaceae: - Chthonomonas calidirosea. -- Comamonadaceae:- Comamonas testosteroni; Verminephrobacter spp. -- Coxiellaceae:- Coxiella burnetii. -- Cytophagaceae:- Cytophaga columnaris; Cytophaga hutchinsonii; Flexibacter echinicida; Flexibacter elegans; Flexibacter flexilis; Flexibacter litoralis; Flexibacter polymorphus; Flexibacter roseolus; Flexibacter ruber. -- Desulfovibrionaceae:- Bilophila wadsworthia; Lawsonia intracellularis. -- Enterobacteriaceae:- Cedecea davisae; Cedecea lapagei; Cedecea neteri; amalonaticus; Citrobacter diversus; Citrobacter freundii; Citrobacter koseri; Cronobacter condimenti; Cronobacter dublinensis; Cronobacter helveticus; Cronobacter malonaticus; Cronobacter muytjensii; Cronobacter pulveris; Cronobacter sakazakii; Cronobacter turicensis; Cronobacter universalis; Cronobacter zurichensis; Edwardsiella ictaluri; Edwardsiella tarda; Enterobacter aerogenes; Enterobacter agglomerans; Enterobacter cloacae; Enterobacter cowanii; Escherichia albertii; Escherichia coli,
AIEC =
E. coli, EaggEC =
E. coli; EHEC =
E. coli; EIEC =
э
E. coli; EPEC =
E. coli; ETEC =
E. coli; ExPEC =
E. coli, NMEC = E. coli
, NTEC =
E. coli, UPEC =
E. coli.; Escherichia fergusonii; Ewingella americana; Hafnia alvei; Hafnia paralvei; Klebsiella granulomatis; Klebsiella oxytoca; Klebsiella pneumoniae; Kluyvera ascorbata; Kluyvera cryocrescens; Morganella morganii; Pantoea (formerly Enterobacter) agglomerans; Photorhabdus asymbiotica; Plesiomonas shigelloides; Proteus mirabilis; Proteus penneri; Proteus vulgaris; Providencia alcalifaciens; Providencia rettgeri; Providencia stuartii; Raoultella electrica; Raoultella ornithinolytica; Raoultella planticola; Raoultella terrigena; Salmonella bongori, Salmonella enterica subspecies enterica (
); Serratia liquifaciens; Serratia marcesans; Shigella boydii; Shigella dysenteriae; Shigella flexneri; Shigella sonnei; Yersinia enterocolitica; Yersinia pestis; Yersinia pseudotuberculosis; Yersinia ruckeri. -- Fimbriimonadaceae:- Fimbriimonas ginsengisoli. -- Flavobacteriaceae:- Bergeyella zoohelcum; Capnocytophaga canimorsus; Capnocytophaga cynodegmi; Capnocytophaga gingivalis; Capnocytophaga granulosa; Capnocytophaga haemolytica; Capnocytophaga leadbetteri; Capnocytophaga ochracea; Capnocytophaga sputigena; Chryseobacterium indologenes; Chryseobacterium piscicola; Elizabethkingia meningoseptica; Flavobacterium branchiophilum; Flavobacterium columnare; Flavobacterium oncorhynchi; Flavobacterium piscicida; Flavobacterium psychrophilum; Myroides odoratus; Myroides odoratimimus; Ornithobacterium rhinotracheale; Riemerella anatipestifer; Riemerella columbina; Riemerella columbipharyngis; Tenacibaculum dicentrarchi; Tenacibaculum discolour; Tenacibaculum gallaicum; Tenacibaculum maritimum; Tenacibaculum soleae; Weeksella virosa. -- Francisellaceae:- Francisella tularensis subsp. tularensis; Francisella tularensis subsp. holarctica; Francisella tularensis subsp. novicida; Francisella philomiragia; Francisella noatunensis; Francisella noatunensis subsp. orientalis (
Francisella asiatica). -- Fusobacteriaceae:- Fusobacterium spp.
Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium nucleatum, Fuso-bacterium polymorphum. -- Helicobacteraceae: - Helicobacter cinaedi; Helicobacter fennelliae; Helicobacter pylori. -- Legionellaceae:- Legionella pneumophila and other species including; Legionella anisa; Legionella birminghamensis; Legionella bozemannii; Legionella cincinnatiensis; Legionella dumoffii; Legionella feeleii; Legionella gormanii; Legionella hackeliae; Legionella jordanis; Legionella lansingensis; Legionella longbeachae; Legionella maceachernii; Legionella micdadei; Legionella oakridgensis; Legionella parisiensis; Legionella sainthelens; Legionella tusconensis; Legionella wadsworthii; Legionella waltersii. -- Leptospiraceae:- Leptospira alexanderi (
Leptospira alexanderi serovar Hebdomadis, Leptospira alexanderi serovar Manhao 3); Leptospira alstoni (
Leptospira alstoni serovar Pingchang, Leptospira alstoni serovar Sichuan); Leptospira biflexa (
Leptospira biflexa serovar Ancona, Leptospira biflexa serovar Canela); Leptospira borgpetersenii (
Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo, Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii serovar Pomona, Leptospira borgpetersenii serovar Tarassovi); Leptospira broomii (
Leptospira broomii serovar Hurstbridge); Leptospira fainei (
Leptospira fainei serovar Hurstbridge); Leptospira idonii; Leptospira inadai (
Leptospira inadai serovar Lyme, Leptospira inadai serovar Malaya); Leptospira interrogans (
Leptospira interrogans serovar Australis, Leptospira interrogans serovar Autumnalis, Leptospira interrogans serovar Bratislava, Leptospira interrogans serovar Canicola, Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa, Leptospira interrogans serovar Hardjo, Leptospira interrogans serovar Hardjo-bovis, Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, Leptospira interrogans serovar Pomona, Leptospira interrogans serovar Pyrogenes, Leptospira interrogans serovar Tarassovi); Leptospira kirschneri (
Leptospira kirschneri serovar Bulgarica, Leptospira kirschneri serovar Cynopteri, Leptospira kirschneri serovar Grippotyphosa); Leptospira kmetyi; Leptospira licerasiae; Leptospira meyeri (
Leptospira meyeri serovar Sofia); Leptospira noguchii (
Leptospira noguchii serovar Panama, Leptospira noguchii serovar Pomona); Leptospira santarosai; Leptospira terpstrae; Leptospira vanthielii; Leptospira weilii (
Leptospira weilii serovar Celledoni, Leptospira weilii serovar Sarmin); Leptospira wolbachii; Leptospira wolffii; Leptospira yanagawae. - Leptotrichiaceae: - Leptotrichia buccalis; Streptobacillus moniliformis. - Methylobacteriaceae: - Methylobacterium extorquens group; Methylobacterium fujisawaense; Methylobacterium mesophilicum; Methylobacterium zatmanii. -- Moraxellaceae:- Acinetobacter baumannii (genomic species 2); Acinetobacter baylyi; Acinetobacter bouvetii; Acinetobacter calcoaceticus (genomic species 1); Acinetobacter gerneri; Acinetobacter grimontii; Acinetobacter haemolyticus (genomic species 4); Acinetobacter johnsonii (genomic species 7); Acinetobacter junii (genomic species 5); Acinetobacter lwoffi (genomic species 8/9); Acinetobacter parvus; Acinetobacter radioresistens (genomic species 12); Acinetobacter schindleri; Acinetobacter tandoii; Acinetobacter tjernbergiae; Acinetobacter towneri; Acinetobacter ursingii; Acinetobacter venetianus; Moraxella atlantae; Moraxella boevrei; Moraxella bovis; Moraxella bovoculi; Moraxella canis; Moraxella caprae; Moraxella catarrhalis; Moraxella caviae; Moraxella cuniculi; Moraxella equi; Moraxella lacunata; Moraxella lincolnii; Moraxella macacae; Moraxella nonliquefaciens; Moraxella oblonga; Moraxella osloensis; Moraxella ovis; Moraxella phenylpyruvica; Moraxella pluranimalium; Moraxella porci. -- Moritellaceae:- Moritella abyssi; Moritella dasanensis; Moritella japonica; Moritella marina; Moritella pro-funda; Moritella viscosa; Moritella yayanosii. -- Neisseriaceae:- Chromobacterium violaceum; Eikenella corrodens; Kingella denitrificans, Kingella kingae, Kingella oralis, Kingella potus; Neisseria cinerea; Neisseria elongata; Neisseria flavescens; Neisseria gonorrhoeae; Neisseria lactamica; Neisseria meningitidis; Neisseria mucosa; Neisseria polysaccharea; Neisseria sicca; Neisseria subflava; Neisseria weaver; Vitreoscilla spp. -- Nitrosomonadaceae:- Nitrosomonas eutropha; Nitrosomonas halophila; Nitrosomonas oligotropha. -- Pasteurellaceae:- Actinobacillus actinomycetemcomitans; Actinobacillus equuli; Actinobacillus lignieresii; Actinobacillus pleuropneumoniae; Actinobacillus seminis; Actinobacillus succinogenes; Actinobacillus ureae; Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Aggregatibacter segnis, Aggregatibacter aphrophilus; Avibacterium avium; Avibacterium endocarditidis; Avibacterium gallinarum; Avibacterium paragallinarum; Avibacterium volantium; Bibersteinia trehalose; Gallibacterium anatis; Gallibacterium genomospecies 1; Gallibacterium genomospecies 2; Gallibacterium genomospecies 3; Gallibacterium group V; Gallibacterium melopsittaci; Gallibacterium salpingitidis; Gallibacterium trehalosifermentans; Haemophilus aegyptius; Haemophilus avium; Haemophilus ducreyi; Haemophilus haemolyticus; Haemophilus influenzae; Haemophilus parahaemolyticus; Haemophilus parainfluenzae; Haemophilus parasuis; Histophilus somni; Mannheimia caviae; Mannheimia glucosida; Mannheimia granulomatis; Mannheimia haemolytica; Mannheimia ruminalis; Mannheimia varigena; Nicoletellasemolina
Pasteurella aerogenes; Pasteurella bettyae; Pasteurella caballi; Pasteurella canis; Pasteurella dagmatis; Pasteurella multocida (
multocida, septicum, gallicida); Pasteurella pneumotropica; Pasteurella stomatis; Pasteurella trehalosi. -- Piscirickettsiaceae: - Piscirickettsia salmonis. -- Plesiomonadaceae:- Plesiomonas shigelloides. -- Polyangiaceae: - Sorangium cellulosum. -- Porphyromonadaceae:- Dysgonomonas capnocytophagoides; Dysgonomonas gadei; Dysgonomonas hofstadii; Dysgonomonas mossii; Dysgonomonas oryzarvi; Dysgonomonas wimpennyi; Porphyromonas gingivalis. -- Prevotellaceae: - Prevotella spp.
Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica. -- Pseudomonadaceae: - Chryseomonas luteola; Pseudomonas aeruginosa; Pseudomonas luteola; Pseudomonas fluorescens; Pseudomonas putida; Pseudomonas stutzeri; Pseudomonas oryzihabitans. -- Rhizobiaceae: - Agrobacterium tumefaciens; Rhizobium radiobacter. -- Rickettsiaceae:- Orientia chuto; Orientia tsutsugamushi; Rickettsia aeschlimannii; Rickettsia africae; Rickettsia akari; Rickettsia argasii; Rickettsia asiatica; Rickettsia australis; Rickettsia bellii; Rickettsia canadensis; Rickettsia conorii; Rickettsia cooleyi; Rickettsia felis; Rickettsia heilongjiangensis; Rickettsia helvetica; Rickettsia honei; Rickettsia hoogstraalii; Rickettsia hulinensis; Rickettsia hulinii; Rickettsia japonica; Rickettsia marmionii; Rickettsia martinet; Rickettsia massiliae; Rickettsia monacensis; Rickettsia montanensis; Rickettsia monteiroi; Rickettsia moreli; Rickettsia parkeri; Rickettsia peacockii; Rickettsia philipii; Rickettsia prowazekii; Rickettsia raoultii; Rickettsia rhipicephali; Rickettsia rickettsii; Rickettsia sibirica subgroup; Rickettsia slovaca; Rickettsia tamurae; Rickettsia typhi. - Shewanellaceae: - Shewanella putrefaciens. -- Sphingomonadaceae: - Sphingobacterium multivorum; Sphingobacterium spiritivorum; Sphingomonas paucimobilis. -- Spirillaceae: - Spirillum minus; Spirillum volutans; Spirillum winogradskyi. -- Spirochaetaceae:- Borrelia afzelii; Borrelia anserina; Borrelia bissettii; Borrelia burgdorferi; Borrelia coriaceae; Borrelia duttonii; Borrelia garinii; Borrelia hermsii; Borrelia hispanica; Borrelia japonica; Borrelia lonestari; Borrelia lusitaniae; Borrelia miyamotoi; Borrelia parkeri; Borrelia persica; Borrelia recurrentis; Borrelia spielmanii; Borrelia turicatae; Borrelia turicatae; Borrelia valaisiana; Treponema carateum; Treponema pallidum ssp. endemicum; Treponema pallidum ssp. pallidum; Treponema pallidum ssp. pertenue. -- Succinivibrionaceae: - Anaerobiospirillum spp. -- Sutterellaceae: - Sutterella spp
Sutterella wadsworthia. - Thermaceae: - Meiothermus spp. -- Thermotogaceae: - Thermotoga neapolitana. -- Veillonellaceae:- Dialister spp; Megamonas spp; Megasphaera spp; Pectinatus spp; Pelosinus spp; Propionispora spp; Sporomusa spp; Veillonella spp.; Zymophilus spp. -- Vibrionaceae:- Photobacterium damselae; Vibrio adaptatus; Vibrio alginolyticus; Vibrio azasii; Vibrio campbellii; Vibrio cholera; Vibrio damsel; Vibrio fluvialis; Vibrio furnisii; Vibrio hollisae; Vibrio metchnikovii; Vibrio mimicus; Vibrio parahaemolyticus; Vibrio vulnificus. -- Wolbachieae:- Wolbachia spp. -- Xanthomonadaceae:- Luteimonas aestuarii; Luteimonas aquatica; Luteimonas composti; Luteimonas lutimaris; Luteimonas marina; Luteimonas mephitis; Luteimonas vadosa; Pseudoxanthomonas broegbernensis; Pseudoxanthomonas japonensis; Stenotrophomonas maltophilia; Stenotrophomonas nitritireducens
В другом варианте реализации бактериальный агент является грамотрицательным и выбран из группы, включающей следующие репрезентативные семейства и виды: втомчисле адгезивно-инвазивныеэнтероагрегативные энтерогеморрагическиентероинвазивныеэнтеропатогенные энтеротоксигенныевнекишечныепатогенныенеонатальногоменингитанекротоксигенныеуропатогенныемножествосеротиповтакжеизвестныйкакВключая включаявключаявключаявключаявключаявключаявключаявключаявключаявключаявключаявключая; подвидывключаявключая.
Acinetobacter
Aeromonas hydrophila, Citrobacter
Enterobacter
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa
Stenotrophomonas maltophilia
Наиболеепредпочтительно,бактериальныйагент, вызывающийбактериальнуюинфекцию, являетсяграмотрицательнымивыбранизгруппы, включающей: виды , species,species,и.
В другом предпочтительном варианте реализации бактериальный агент, вызывающий бактериальную колонизацию или инфекцию, устойчив к стандартным антибиотикам, используемым для лечения колонизации или инфекции. В одном предпочтительном варианте реализации бактериальный агент устойчив к соединению, выбранному из группы, включающей: один или более аминогликозид (например гентамицин, тобрамицин, амикацин или нетилмицин); цефалоспорины, действующие против MRSA (например цефтаролин); антипсевдомонадные пенициллины + ингибиторы β-лактамазы (например тикарциллин-клавулановая кислота или пиперациллин-тазобактам); карбапенемы (например, эртапенем, имипенем, меропенем или дорипенем); цефалоспорины не расширенного спектра; цефалоспорины 1-го и 2-го поколения (например цефазолин или цефуроксим); цефалоспорины расширенного спектра; цефалоспорины 3-го и 4-го поколения (например цефотаксим или цефтриаксон); цефамицины (например цефокситин или цефотетан); фторхинолоны (например, ципрофлоксацин); ингибиторы фолатного пути (например, триметоприм-сульфаметоксазол); глицилциклины (например, тигециклин); монобактамы (например, азтреонам); пенициллины (например, ампициллин); пенициллины + ингибиторы β-лактамазы (например амоксициллин-клавуланат или ампициллин сульбактам); фениколы (например, хлорамфеникол); фосфоновые кислоты (например фосфомицин), полимиксины (например колистин) и тетрациклины (например тетрациклин, доксициклин или миноциклин). Предпочтительно, бактериальный агент, устойчивый к этим соединениям, является грамотрицательным.
Предпочтительно, бактериальный агент устойчив к соединению, выбранному из группы, включающей: пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы, монобактамы и другиеβ-лактамные антибиотики, фузиданы, аминогликозиды, фторхинолоны, стрептограмины, тетрациклины, глицилциклины, хлорамфеникол и других фениколы, макролиды и кетолиды, линкозамиды, оксазолидиноны, аминоциклитоли, полимиксины, гликопептиды, липопептиды, бацитрацин, мупирицин, плевромутилины, рифамицины, сульфаниламиды и триметоприм. Предпочтительно, соединение выбрано из группы, включающей: бета-лактамы, гликопептиды, липопептиды, макролиды, тетрациклины и оксазолидиноны. Предпочтительно, бактериальный агент является устойчивым к указанному соединению, когда соединение находится в диапазоне концентраций, выбранным из следующих: 0,001 мкг/мл - 10000 мкг/мл; 0,01 мкг/мл - 1000 мкг/мл; 0,10 мкг/мл - 100 мкг/мл; и 1 мкг/мл - 50 мкг/мл.
Staphylococcus aureus
Staphylococcus pseudintermedius, Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Streptococcusagalactiae
Streptococcus uberis, Enterococcus faecium
Enterococcusfaecalis
Clostridium difficile
В другом варианте реализации бактериальный агент, вызывающий бактериальную инфекцию выбран из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, грамположительные бактерии. Микроорганизм предпочтительно представляет собой грамположительный бактериальный агент, выбранный из группы, включающей , , , , ,  и .
Mycoplasma spp
Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma amphoriforme, Mycoplasma arginini, Mycoplasma bovigenitalum, Mycoplasma bovirhinis, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovoculi, Mycoplasma buccale, Mycoplasma californicum, Mycoplasma canadense, Mycoplasma capricolumsubsp. capricolum, Mycoplasma capricolumsubsp. capripneumoniae, Mycoplasma conjunctivae, Mycoplasma cynos, Mycoplasma dispar, Mycoplasma equigenitalium, Mycoplasma faucium, Mycoplasma felis, Mycoplasma fermentans (incognitusstr.), Mycoplasma gallisepticum (MG), Mycoplasma gateae, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma haemocanis, Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemosuis (
Eperythrozoonsuis), Mycoplasma hominis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma iowaemeleagridis (MM), Mycoplasma iowae, Mycoplasma leachii, Mycoplasma lipophilum, Mycoplasma meleagridis, Mycoplasma mycoidessubspcapri, Mycoplasma mycoidessubspmycoides, Mycoplasma mycoidessubsp. mycoides (
), Mycoplasma orale, Mycoplasma ovipneumoniae, Mycoplasma ovis, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma pirum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma primatum, Mycoplasma putrefaciens, Mycoplasma salivarium, Mycoplasma spermatophilum, Mycoplasma suis, Mycoplasma synoviae (MS), Mycoplasma wenyonii, Mycoplasma, Ureaplasma spp, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma
Ureoplasma diversum
В одном предпочтительном варианте реализации бактериальный агент не имеет клеточной стенки. Предпочтительно, бактериальный агент выбран из группы, включающей: , ранее например, возбудитель контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота, CBPPи .
Staphylococcus aureus
В другом наиболее предпочтительном варианте реализации бактериальный агент представляет собой .
В другом предпочтительном варианте реализации бактериальный агент устойчив к соединению, выбранному из группы, включающей: один или более из аминогликозидов (например гентамицин); ансамицинов (например рифампицин); цефалоспорины, действующие против MRSA (например цефтаролин); противостафилококковые β-лактамы (или цефамицины) (например, оксациллин или цефокситин); карбапенемы (например, имипенем эртапенем, меропенем или дорипенем); цефалоспорины не с расширенным спектром; цефалоспорины 1-го и 2-го поколения (например, цефазолин или цефуроксим); цефалоспорины расширенного спектра; цефалоспорины 3-го и 4-го поколения (например, цефотаксим или цефтриаксон); цефамицины (например, цефокситин или цефотетан); фторхинолоны (например, ципрофлоксацин или моксифлоксацин); ингибиторы фолатного пути (например, триметоприм-сульфаметоксазол); фуциданы (например, фузидовая кислота); гликопептиды (например, ванкомицин, тейкопланин или телаванцин); глицилциклины (например, тигециклин); линкозамиды (например, клиндамицин); липопептиды (например, даптомицин); макролиды (например, эритромицин); оксазолидиноны (например, линезолид или тедизолид); фениколы (например, хлорамфеникол); фосфоновые кислоты (например, фосфомицин); стрептограмины (например, хинупристин-дальфопристин); тетрациклины (например, тетрациклин, доксициклин или миноциклин). Предпочтительно, бактериальный агент, устойчивый к этим соединениям, является грамположительным.
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumonia
В другом наиболее предпочтительном варианте бактериальный агент представляет собойс . может представлять собой штамм, устойчивый к одному или более из β-лактамов и макролидов.
Streptococcus pyogenes
В другом наиболее предпочтительном варианте реализации бактериальный агент представляет собой .
Streptococcus agalactiae
В другом наиболее предпочтительном варианте бактериальный агент представляет собой .
Enterococcus faecium
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Enterococcus faecalis
В другом наиболее предпочтительном варианте реализации бактериальный агент представляет собой или . или может представлять собой штамм, устойчивый к аминогликозидам (например, к гентамицину (высокий уровень) или к стрептомицину (например, стрептомицинк (высокий уровень)); карбапенемам (например, имипенему, меропенему или дорипенему); фторхинолонам (например, ципрофлоксацину, левофлоксацину или моксифлоксацину); гликопептидам (например, ванкомицину или тейкопланину); глицилциклинам (например, тигециклину); липопептидам (например, даптомицину); оксазолидинонам (например, линезолиду); пенициллинам (например, ампициллину); стрептограминам (например, хинупристин-дальфопристину); тетрациклинам (например, доксициклину или миноциклину).
Clostridium difficile
В другом наиболее предпочтительном варианте реализации бактериальный агент представляет собой .
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Streptococcus agalactiae
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pneumonia
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Clostridium difficile
Бактериальная инфекция у субъекта может вызывать заболевание, выбранное из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, внутрибольничную пневмонию, вызванную  (штаммы с МЛУ, ШЛУ, ПЛУ или метициллин-чувствительные или устойчивыештаммы), или инвазивные пневмококковые заболевания, такие как пневмония, бронхит, острый синусит, отит среднего уха, конъюнктивит, менингит, бактериемия, сепсис, остеомиелит, септический артрит, эндокардит, перитонит, перикардит, подкожная флегмона и абсцесс головного мозга, вызванный  (в том числе штаммами с множественной лекарственной устойчивостью [MDRSP], например, устойчивыми к β-лактамам и макролидам), осложненные инфекции кожи и подкожной клетчатки, в том числе инфекции на фоне диабетической стопы, с или без сопутствующего остеомиелита, вызванные  (метициллин-чувствительные и устойчивые штаммы),  или , неосложненныеинфекции кожи и подкожной клетчатки, вызванные  (метициллин-чувствительные или устойчивые штаммы) или , внебольничная пневмония, вызванная  (в том числе штаммами с множественной лекарственной устойчивостью [MDRSP], в том числе случаи с сопутствующей бактериемией), или  (метициллин-чувтсвительные или устойчивые штаммы) иинфекции кровотока, вызванные  (бактериемия), в том числе с правосторонним инфекционным эндокардитом, вызванным метициллин-чувствительными и метициллин-устойчивыми изолятами, инфекции, вызванные устойчивыми к ванкомицину энтерококками, в том числе случаи с сопутствующей бактериемия, а также лечение -ассоциированной диареи (CDAD).
Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus aphrophilus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, Kingella kingae
Neisseriameningitidis, Streptococcuspneumoniae
Haemophilus influenza
Streptococcus agalactiae
Escherichia coli
Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis
Escherichia coli
Salmonella, Campylobacter, Shigella, Vibrio cholera
Yersinia enterocolitica
Mobiluncus
Gardnerella vaginalis
Atopobium vaginae
Mycoplasma hominis
Mycoplasma hominis
C. trachomatis
N. gonorrhoeae
M. Genitalium
Escherichia coli
Klebsiella
Klebsiella pneumonia
Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae, Chlamydophila (Chlamydia) psittaci, Haemophilus influenza
Klebsiella pneumonia
Pseudomona saeruginosa, Acinetobacter baumannii, Burkholderia pseudomallei
Pseudomona saeruginosa
Staphylococcus aureus
Proteus
Klebsiella
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza
Moraxella catarrhalis
Acinetobacter baumannii
Neisseria meningitides,
Pseudomona saeruginosa
Rickettsia
Orientia
Bartonella
Грамотрицательные организмы являются значимымивозбудителями многих инфекционных заболеваний у человека и других видов животных: инфекции костей и суставов (грамотрицательные организмы или смешанные бактерии, являются значимыми возбудителямивертебрального остеомиелита и септического артрита), инфекции сердечно-сосудистой системы (в том числе эндокардит, вызванный группой HACEK - ), инфекции центральной нервной системы (наиболее распространенными возбудителями бактериального менингита являются , а также у невакцинированных детей младшего возраста  типа В (Hib), у новорожденных и детей младше 3 месяцев -  (стрептококк группыВ), и другие аэробные грамотрицательные палочки являются значимыми патогенами, абсцесс головного мозга или субдуральная эмпиема, при этом вызывающий инфекцию организм (организмы) варьируют в зависимости от провоцирующих причин, но в случаях, когда местом начала инфекции является ухо, обычно задействованы кишечные грамотрицательные палочки), инфекции глаза (распространенные патогены включают  или ), инфекции желудочно-кишечного тракта (задействован широкий спектр патогенных микроорганизмов, в том числе энтеротоксигенная кишечная палочка  (ETEC), и ), генитальные инфекции (бактериальный вагиноз представляет собой полимикробный клинический синдром с высокой концентрацией анаэробных (например, видов ) и других бактерий, требующих особых условий обитания (в том числе  и ), и ; воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ), приобретенные не половым путем, как правило, вызываются смешанной вагинальной флорой, в том числе анаэробными, факультативными грамотрицательными бактериями и , тогда как ВЗОМТ, передающиеся половым путем, обычно инициируются или , при этом появляется все больше свидетельств в пользу того, что инфекция участвует в значительном меньшинстве случаев), инфекции брюшной полости (перитонит вследствие перфорированности внутреннего органа, как правило, представляет собой полимикробную инфекцию аэробной и анаэробной флорой кишечника, а спонтанный бактериальный перитонит (СБП), как правило, вызывается грамотрицательными энтеробактериями, такими как  и виды , при этом все чаще выявляют как причину абсцесса печени), внебольничная пневмония (, аэробные грамотрицательные палочки, в том числе , ), отит наружного уха (в том числе острый диффузный) (в бактериальных культурах обычно выявляют , , а также виды и ), отит среднего уха (в том числе острый) (распространенные бактериальные патогены включают и ), сепсис (в том числе тяжелой формы) (в том числе , диссеминированный гонококковый сепсис, вызванный грамотрицательными энтеробактериями, менингококковый сепсис) и , системные инфекции (пятнистая лихорадка () и речная японская лихорадка (), бруцеллез, болезнь кошачьих царапин и другие инфекции, вызываемые , лептоспироз, болезнь Лайма, мелиоидоз, лихорадка Q, тифозные и паратифозные лихорадки (кишечные лихорадки), инфекции мочевыводящих путей (острый цистит, острый пиелонефрит, рецидивирующие инфекции мочевыводящих путей и катетер-ассоциированная бактериурия и инфекции мочевых путей).
Escherichia coli (E. coli), Klebsiellapneumoniae (K. pneumoniae)
Pseudomonasaeruginosa (P. aeruginosa)
У человека грамотрицательные бактерии являются распространенными причинами инфекций брюшной полости (ИБП), инфекций мочевыводящих путей (ИМП), внутрибольничной пневмонии и бактериемии. и  являются значимыми патогенами в условиях больниц, и на них приходится 27% среди всех патогенов и 70% среди всех грамотрицательных патогенов, вызывающих внутрибольничные инфекции [Sievert DM, Ricks P, Edwards JR, et al. Antimicrobial-resistant pathogens associated with healthcare-associated infections: summary of data reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention, 2009-2010. Infect Control Hosp Epidemiol. 2013;34:1-14].
E.coli
K. pneumoniae
Грамотрицательные бактерии демонстрируют возрастающую степень устойчивости к современной терапии. Распространенным механизмом устойчивости является продукция ферментов β-лактамаз расширенного спектра (БЛРС). Доля БЛРС-продуцирующих  и значительно возросла, в результате чего эти бактерии становятся все более устойчивыми к широко используемым противомикробным препаратам.
P. aeruginosa
является самым распространенным грамотрицательным возбудителем внутрибольничной пневмонии, а вторым по распространенности возбудителем ИМП, связанных с катетером, в США.
E. coli
E. coli
K. Pneumonia
P. aeruginosa
E. coli
K. pneumoniae
является наиболее распространенным возбудителем ИМП. Увеличивается число случаев ИМП, вызванных БЛРС-продуцирующих и , а также , в том числе штаммов с МЛУ. БЛРС-продуцирующие и  также часто выделяют у пациентов с осложненными инфекциями брюшной полости (ИБП).
P. aeruginosa
P. aeruginosa
представляет собой клинически сложный и вирулентный патоген, которые может быть причиной распространенных инфекций у человека, таких как внутрибольничная пневмония, ИМП, ИБП, и инфекций кровотока.  является наиболее распространенным грамотрицательным организмом, вызывающим ИВЛ-ассоциированная пневмонию, и вторым по распространенности возбудителем катетер-ассоциированной ИМП.
Увеличение числа инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, сопровождается ростом степени устойчивости. Возможности терапии для решения этой проблемы являются все более и более ограниченными. Существует острая необходимость в новых антибиотиках для удовлетворения потребностей пациентов в настоящее время и в будущем.
В одном предпочтительном аспекте настоящего изобретения субъекту вводят более одного соединения по настоящему изобретению.
В другом предпочтительном варианте реализации соединение Формулы I или его терапевтически приемлемую соль вводят вместе с соединением или агентом, который устраняет или по существу устраняет или уменьшает целостность клеточной стенки бактериальной агента. В качестве примера, соединение выбрано из группы, включающей: β-лактамы, фосфомицин, лизоцим, полимиксины и хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). В качестве примера, агент представляет собой иммунологическим агент (такой как антитело или вакцина), который уменьшает целостность клеточной стенки. В одном предпочтительном варианте реализации соединение Формулы I или его терапевтически приемлемую соль вводят вместе с соединением, которое устраняет или по существу устраняет или уменьшает целостность наружной клеточной стенки грамотрицательного бактериального агента.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена антибактериальная фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения Формулы I или его терапевтически приемлемой соли. Предпочтительно, композиция представляет собой антибактериальную фармацевтическую композицию.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена антибактериальное ветеринарная композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения Формулы I или его терапевтически приемлемой соли. Предпочтительно, композиция представляет собой антибактериальную ветеринарную композицию.
Фармацевтическая композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемоевспомогательное веществоили носитель. Ветеринарная композиция может дополнительно включать ветеринарно приемлемоевспомогательное вещество или носитель.
Фармацевтическая или ветеринарная композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит соединение Формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в концентрации, выбранной и группы, включающей: от 1 мг/г до 500 мг/г; от 5 мг до 400 мг/г; от 10 мг/г до 200 мг/г; от 20 мг/г до 100 мг/г; от 30 мг/г до 70 мг/г и от 40 мг/г до 60 мг/г.
В другом варианте реализации фармацевтическая или ветеринарная композиция содержит примеси, при этом количество примесей в процентах от общей массы композиции выбрано из группы, включающей: менее 20% примесей (от общеймассы композиции); менее 15% примесей; менее 10% примесей; менее 8% примесей; менее 5% примесей; менее 4% примесей; менее 3% примесей; менее 2% примесей; менее 1% примесей, менее 0,5% примесей; менее 0,1% примесей. В одном варианте реализации фармацевтическая или ветеринарная композиция содержит микробные примеси или вторичные метаболиты, при этом количество микробных примесей в процентах от общей массы композиции выбрано из группы, включающей: менее 5%; менее 4%; менее 3%; менее 2%; менее 1%; менее 0,5%; менее 0,1%; менее 0,01%; менее 0,001%. В одном варианте реализации фармацевтическая или ветеринарная композиция стерильна и хранится в герметичном и стерильном контейнере. В одном варианте реализации фармацевтическая или ветеринарная композиция не содержит детектируемого уровня микробного загрязнения.
Фармацевтическая или ветеринарная композиция согласно настоящему изобретению может содержать дополнительный противомикробный агент. Дополнительный противомикробный агент может представлять собой противогрибковый агент или антибактериальный агент. Способ лечения или профилактики бактериальной инфекции или колонизации у субъекта также может включать введение соединения Формулы I с дополнительным противомикробным агентом.
Фармацевтическая или ветеринарная композиция согласно настоящему изобретению может содержать более одного соединения согласно настоящему изобретению, например, комбинацию соединений. Способ лечения или профилактики бактериальной инфекции или колонизации у субъекта также может включать в себя введение более одного соединения согласно настоящему изобретению.
В одном варианте реализации  противогрибковый агент выбран из группы, включающей, но не ограниченной природными агентами, включающими Эхинокандины (Анидулафунгин, Каспофунгина, Микафунгин), Полиены (Амфотерицин В, Кандицидин, Филипин, Фунгихромин (Пентамицин), Хачимицин, Гамицин, Люцензомицин, Мепартрицин, Натамицин, Нистатин, Пецилоцин, Перимицин), и другие природные противогрибковые агенты, включающие Гризеофульвин, Олигомицины, Пирролнитрин, Сикканин и Виридин. Противогрибковое средство может быть синтетическим соединением, выбранным из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, Аллиламины (бутенафин, Нафтифин, Тербинафин) Имидазолы (Бифоназол, Бутоконазол, Хлормидазол, Климбазол, Кроконазол (Клоконазол), Клотримазол, Эберконазол, Эконазол, Энилконазаол, Фентиконазол, Флутримазол, Фосфлюконазол, Изоконазол, Кетоконазол, Ланоконазол, Луликоназол, Миконазол, Нетриконазол, Омоконазол, Оксиконазола нитрат, Парконазол, Сертаконазол, Сулконазол, Тиоконазол), Тиокарбаматы (Лиранафтат, Толциктат, Толиндат, Толнафтат), Триазолы (Флуконазол, Изавуконазол, Итраконазол, Позаконазол, Равуконазол, Саперконазол, Терконазол, Вориконазол), и другие синтетические агенты, такие как Акризорцин, Аморолфин, Бромсалицилхлоранилид (Бромхлорсалициланилид), Буклозамил, Кальция пропионат, Хлорфенезин, Циклопирокс, Клоксиквин, Копараффинат, Экзаламид, Флуцитозин, Галопрогин, Гексетидин, Лофлукарбан, Нифуратель, Нифуроксим, Пироктон, Калия йодид, Пропионовую кислоту, Пиритион, Салициланилид, Натрия парахлорбензоат, Натрия пропионат, Сулбентин, Тенонитрозол, Триацетин, Триметрексат, Ундециленовую кислоту (Ундеценовую кислоту) и Цинка пропионат.
Композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать антибиотик, выбранный из группы, включающей, но не ограниченный перечисленными ингибиторы β-лактамазы (Авибактам, Клавулановую кислоту, Сульбактам, Сультамициллин, Тазобактам), ингибиторы почечной дипептидазы (Циластатин) и протекторы почек (Бетамипрон).
В одном варианте реализации композиция по настоящему изобретению содержит дополнительный антибиотик, выбранный из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, 2,4-диаминопиримидины, в том числе, Баквилоприм,Бродимоприм, Иклаприм, Орметоприм, Пириметамин, Тетроксоприм, Триметоприм; Аминокумарины, в том числе Новобиоцин; АМИНОЦИКЛИТОЛИ, в том числе Спектиномицин, Аминогликозиды, в том числе Амикацин, Апрамицин, Арбекацин, Беканамицин, Бутирозин, Дибекацин, Дигидрострептомицин, Этимицин, Фортимицины (Астромицин), Фрамицетин, Гентамицин, Гигромицин, Изепамицин, Канамицин, Микрономицин, Неомицин, Нетилмицин, Паромомицин, Плазомицин, Рибостамицин, Сизомицин, Стрептомицин, Тобрамицин, Вердамицин; аминометициклины, в том числе Омадациклин; Амфениколы, в том числе Азидамфеникол, Хлорамфеникол, Флорфеникол, Тиамфеникол; Ансамицины, в том числе Рифабутин, Рифамид, Рифампин (Рифампицин), Рифамицин, Рифапентин, Рифаксимин; Антисептические АГЕНТЫ, в том числе производные Акридина (в том числе Акрифлавин, Аминоакридин, Этакридин, Профлавин), Биспиридины (в том числе октенидина дигидрохлорид), Бромированные салициланилиды (в том числе бромсалаеы), Хлоргексидин, производны Фенола (в том числе тимол и триклозан), Четвертичные аммониевые соединения (в том числе Алкилдиметилэтилбензиламмония хлорид, хлорид бензалкония, хлорид цетилпиридиния, бензетонийхлорид, цетримониум); Противотуберкулезные АГЕНТЫ, в том числе Циклосерин, Деламанид, Этамбутол, Этионамид, Изониазид (Фтивазид), Моринамид, Парааминосалициловая кислота (ПАС), Протионамид, Пиразинамид, Теризидон, Тиоацетазон, Тиокарлид; мышьяковистые СОЕДИНЕНИЯ, в том числе Арсаниловая кислота, Роксарзон; БактериоцинЫ, в том числе Низин, Брилацидин (PMX-30063); β-лактамНЫЕ карбацефемы, в том числе Лоракарбеф; β-лактамНЫЕ Карбапенемы, в том числе Биапенем, Дорипенем, Эртапенем, Фаропенем, Имипенем, Меропенем, Панипенем, Разупенем, Ритипенем, Сулопенем, Тебипенем, Томопенем; β-лактамНЫЕ Цефалоспорины, в том числе Цефацетрил, Цефаклор, Цефадроксил, Цефалексин, Цефалоглицин, Цефалониум, Цефалоридин, Цефалотин, Цефамандол, Цефапирин, Цефатризин, Цефазафлур, Цефазедон, Цефазолин, Цефкапен, Цефдинир, Цефдиторен, Цефепим, Цефетамет, Цефиксим, Цефменоксим, Цефодизим, Цефоницид, Цефоперазон, Цефоранид, Цефоселис, Цефотаксим, Цефотиам, Цефовецин, Цефозопран, Цефпимизол, Цефпирамид, Цефпиром, Цефподоксим, Цефпрозил, Цефхином, Цефрадин, Цефроксанид, Цефсулодин, Цефтаролин, Цефтазидим, Цефтерам, Цефтезол, Цефтибутен, Цефтиофур, Цефтизоксим, Цефтобипрол, Цефтолозан, Цефтрадин, Цефтрезол, Цефтриаксон, Цефтоксадин, Цефуроксим, Цефузонам, Пивцефалексин; β-лактамНЫЕ Цефамицины, в том числе Цефбуперазон, Цефметазол, Цефминокс, Цефотетан, Цефокситин;β-лактамНЫЕ Монобактамы, в том числе Азтреонам, Карумонам, Тигемонам; β-лактамНЫЕ ОксацефемЫ, в том числе Фломоксев, Латамоксев, Моксалактам; β-лактамНЫЕ пенициллины, в том числе Амдиноциллин (Мециллинам), Амоксициллин, Ампициллин, Апалциллин, Аспоксициллин, Азидоциллин, Азлоциллин, Бакампициллин, Карбенициллин, Кариндациллин, Циклациллин, Клемизол Пенициллин, Клометоциллин, Клоксациллин, Циклациллин, Диклоксациллин, Эпициллин, Фенбенициллин, Флоксациллин (Флуклоксациллин), Гетациллин, Ленампициллин, Мециллинам, Метампициллин, Метициллин натрия, Мезлоциллин, Нафциллин, Оксациллин, Пенамециллин, Пенетамат гидроиодид, Пенициллин G, Пенициллин G Бензатин, Пенициллин G Прокаин, Пенициллин N, Пенициллин O, Пенициллин V, Фенетициллин калия, Пиперациллин, Пивампициллин, Пивмециллинам, Пропициллин, Квинациллин, Сулбенициллин, Сультамициллин, Талампициллин, Темоциллин, Тикарциллин; БИЦИКЛОМИЦИНЫ, в том числе Бикозамицин; Борсодержащие антибактериальныЕ агентЫ, в том числе AN3365 (аминометил бензоксаборолы), GSK2251052 (ингибиторы лейцил-тРНК синтетазы); Циклические сложные эфиры, в том числе Фосфомицин; ингибиторы СИНТЕЗА Жирных кислот (FabI), AFN-1252, MUT056399, FAB-001; Фторхинолоны, в том числе Аварофлоксацин, Балофлоксацин, Безифлоксацин, Чинфлоксацин, Циноксацин, Ципрофлоксацин, Клинафлоксацин, Данофлоксацин, Делафлоксацин, Дифлоксацин, Эноксацин, Энрофлоксацин, Финафлоксацин, Флероксацин, Флумекин, Гареноксацин, Гатифлоксацин, Гемифлоксацин, Грепафлоксацин, Ибафлоксацин, Левофлоксацин, Ломефлоксацин, Марбофлоксацин, Милоксацин, Моксифлоксацин, Надифлоксацин, Норфлоксацин, Офлоксацин, Орбифлоксацин, Пазуфлоксацин, Пефлоксацин, Прадофлоксацин, Прулифлоксацин, Розоксацин, Руфлоксацин, Сарафлоксацин, Ситафлоксацин, Спарфлоксацин, Темафлоксацин, Тосуфлоксацин, Тровафлоксацин, Забофлоксацин; ФУЗИДАНЫ, в том числе фузидовая кислота; ГЛИКОЛИПОДЕПСИПЕПТИДЫ, в том числе Рамопланин; Гликопептиды, в том числе Авопарцин, Далбаванцин, Норванкомицин, Оритаванцин, Тейкопланин, Телаванцин, Ванкомицин; ГЛИКОФОСФОЛИПИДЫ, в том числе Бамбермицины (бамбермицин, моеномицины, флавофосфолипол); ГЛИЦИЛЦИКЛИНЫ, в том числе Тигециклин; Гибриды, Кадазолид (Оксазолидинон-хинолон), TD-1792 (гликопептид-цефалоспорин); Линкозамиды, в том числе Клиндамицин, Линкомицин, Пирлимицин; Липопептиды, в том числе Даптомицин, Суротомицин; Макролиды, в том числе Азитромицин, Карбомицин, Цетромицин, Кларитромицин, Диритромицин, Эритромицин, Фидаксомицин, Флуритромицин, Гамитромицин, Джозамицин, Китазамицин, Лейкомицин, Мелеумицин, Мидекамицины, Миокамицин, Мирозамицин, Олеандомицин, Примицин, Рокитамицин, Розарамицин, Рокситромицин, Седекамицин, Солитромицин, Спирамицин, Телитромицин, Тердекамицин, Тилдипирозин, Тилмикозин, Тролеандомицин, Тулатромицин, Тилозин, Тилвалозин; Нитрофураны, в том числе Фуралтадон, Фуразидин, Фуразолидон, Фуразолиум хлорид, Нифуратель, Нифурфолин, Нифуроксазид, Нифурпиринол, Нифуртоинол, Нифурзид, Нитрофурал, Нитрофурантоин, Нитрофуразон; Нитроимидазолы, в том числе Диметридазол, Метронидазол, Орнидазол, Ронидазол, Секнидазол, Тинидазол; Олигосахариды, в том числе Авиламицин, Эверниномицин; Другие антибактериальныЕ средствА, в том числе Ауриклосен, Хлороксин, Хлорхинальдол, Клиохинол, Клофоктол, Халхинол, Лотилибцин, Миндальная кислота, Метенамин (гексамин), Нитазол, Нитроксолин, Перхлозон, Тауролидин, Теноевая кислота, Ксиборнол; Оксазолидиноны, в том числе Эперезолид, Линезолид, Позизолид, Радезолид, Сутезолид, Тедизолид (Торезолид); Ингибиторы ПЕПТИД-ДЕФОРМИЛАЗЫ, в том числе GSK1322322; Пептиды, в том числе Омиганан, Пексиганан; Плевромутилины, в том числе Ретапамулин, Тиамулин, Валнемулин; Полиэфирные ионофоры, в том числе Лайдломицин, Лазалоцид, Мударамицин, Монензин, Наразин, Салиномицин, Семдурамицин; Полимиксины, в том числе Колистин, Полимиксин B; Полипептиды, в том числе Бацитрацин Амфомицин, Капреомицин, Эндурацидин, Анрамицин, Энвиомицин, Фузафунгин, Грамицидин (Грамицидины), Изеганан, Магаинины, Нозигептид, Ристоцетин, Тиострептон, Туберактиномицин, Тироцидин, Тиротрицин, Виомицин; Псевдомоновые кислоты, в том числе Мупироцин; Хинолоны, в том числе Налидиксовая кислота, Немоноксацин, Оксолиновая кислота, Озеноксацин, Пипемидовая кислота, Пиромидиновая кислота; Хиноксалины, в том числе Карбадокс, Олаквиндокс; РИМИНОФЕНАЗИНЫ, в том числе Клофазимин; Статины, в том числе Аторвастатин, Флувастатин, Ловастатин, Мевастатин, Питавастатин, Правастатин, Розувастатин, Симвастатин; Стрептограмины, в том числе Дальфопристин, Флопристин, Линопристин, Пристинамицин, Квинупристин, Виргиниамицин; Стрептотрицины, в том числе Ноурсетрицин; Сульфаниламиды, в том числе Ацетил Сульфаметоксипиразин, Хлорамин-B, Хлорамина-Т, Дихлорамин T, Формосульфатиазол,  Мафенид, N4-Сульфанилилсульфаниламид, Ноприлсульфамид, N-Сульфанилил-3,4-ксиламид, Ормаосульфатиазол, Фталилсульфацетамид, Фталилсульфатиазол, Салазосульфадимидин, Сукцинилсульфатиазол, Сульфабензамид, Сульфакарбамид, Сульфацетамид, Сульфахлорпиридазин, Сульфахризоидин, Сульфаклозин, Сульфацитин, Сульфадиазин, Сульфадикрамид, Сульфадиметоксин, Сульфадимидин, Сульфадоксин, Сульфаэтидол, Сульфагуанидин, Сульфагуанол, Сульфален, Сульфалоксовая кислота, Сульфамеразин, Сульфаметер, Сульфаметазин, Сульфаметизол, Сульфаметомидин, Сульфаметоксазол, Сульфаметоксипиридазин, Сульфаметилтиазол, Сульфаметопиразин, Сульфаметрол, Сульфамидохризоидин, Сульфамонометоксин, Сульфамоксол, Сульфаниламид, Сульфанилмочевина, Сульфаперин, Сульфафеназол, Сульфапроксилин, Сульфапиразин, Сульфапиридин, Сульфахиноксалин, Сульфатиазол, Сульфатиомочевина, Сульфатроксазол, Сульфизомидин, Сульфисоксазол (Сульфафуразол); Сульфоны, в том числе Ацедиасульфон, Дапсон, Глюкосульфон натрия, p-Сульфанилилбензиламин, Сукцисульфон, Сульфаниловая кислотуа, Сульфоксон натрия, СульфоксонТиазосульфон; Тетрациклины, в том числе Хлортетрациклин, Кломоциклин, Демеклоциклин, Доксициклин, Эравациклин, Гуамециклин, Лимециклин, Меклоциклин, Метациклин, Миноциклин, Окситетрациклин, Пенимепициклин, Пипациклин, Ролитетрациклин, Сарециклин, Тетрациклин.
Композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать вспосогательное вещество, выбранное из группы, включающей, но не ограниченной перечисленными, связующие агенты и добавки для прессования, покрытия и пленки, красители, разбавители и носители, разрыхлители, эмульгаторы и солюбилизаторы, ароматизаторы и подсластители, репелленты, скользящие вещества и смазывающие вещества, пластификаторы, консерванты, пропелленты, растворители, стабилизаторы, суспендирующие агенты и усилители вязкости.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предложено медицинское устройство для применения в способе лечения или профилактики бактериальной инфекции у субъекта.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предложено медицинское устройство, содержащее композицию согласно настоящему изобретению. Композиция согласно настоящему изобретению может быть в любой форме с замедленным высвобождением и/или в форме покрытия на указанном медицинском устройстве.
Медицинское устройство может быть представлено в форме, выбранной из группы, включающей: имплантат, пластырь, бинт и другую повязку, применяемую при бактериальной инфекции у субъекта.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предложен способ уничтожения бактерий, при этом способ включает стадию контактирования бактерий с соединением настоящего изобретения или его терапевтически приемлемой солью.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретени предложено применение соединения настоящего изобретения или терапевтически приемлемой соли для уничтожения бактерий, при этом указанное применение включающий стадию контактирования бактерий с соединением настоящего изобретения или его терапевтически приемлемой солью.
Термины, используемые в настоящей заявке, имеют свои обычные значения в данной области техники, если не указано иное. При использовании в настоящей заявке термин робенидин (также известный как 1,3-бис[(E)-(4-хлорфенил)метилиденамино]гуанидин или NCL812, согласно настоящему описанию) относится к соединению, имеющему химическую структуру:
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Дополнительные признаки настоящего изобретения более полно описаны в последующем описании нескольких не ограничивающих вариантов его реализации. Данное описание представлено исключительно для иллюстрации настоящего изобретения. Описанные варианты реализации изобретения никоим образом не ограничивают краткого описания, раскрытия или описания изобретения, как изложено выше. Описание приведено со ссылкой на прилагаемые фигуры, где:
На Фигуре 1 приведено химическое название и химическая структура соединений с  NCL001 по NCL230;
Staphylococcus aureus
На Фигуре 2 показан график, иллюстрирующий влияние NCL812 на синтез макромолекул ДНК у  в соответствии с Примером 2;
Staphylococcus aureus
На Фигуре 3 показан график, иллюстрирующий влияние NCL812 на синтез макромолекул РНК у  в соответствии с Примером 2;
Staphylococcus aureus
На Фигуре 4 показан график, иллюстрирующий влияние NCL812 на синтезмакромолекул белка у  (ATCC29213) в соответствии с Примером 2;
Staphylococcus aureus
На Фигуре 5 показан график, иллюстрирующий влияние NCL812 на синтез макромолекул клеточной стенки у  (ATCC29213) в соответствии с Примером 2;
Staphylococcus aureus
На Фигуре 6 показан график, иллюстрирующий влияние NCL812 на синтез макромолекул липидов у  (ATCC29213) в соответствии с Примером 2;
Staphylococcus aureus
На Фигуре 7 показан график, суммирующий влияние NCL812 на синтез макромолекул у  (ATCC29213) в соответствии с Примером 2;
Staphylococcus aureus
На Фигуре 8 показан график, иллюстрирующий влияние NCL812 на высвобождение АТФ у  (ATCC29213) в соответствии с Примером 3;
На Фигуре 9 приведен график, показывающий средние пики кривых плавления на основании отрицательных производных - dF/dT после ПЦР в реальном времени с праймерами к гену mecA для метициллин-устойчивых изолятов S.aureus, сгруппированых по генным комплексам mec, A (n=4), B (n=10), C2 (n=4) и неклассифицированные (n=2). Группы, обозначенные различными надстрочными индексами статистически значимо различаются (р<0,05) в соответствии с Примером 4;
На Фигуре 10 представлен график со значениями оптической плотности в контрольном образце (рост в контроле) без добавок, а также при добавлении ампициллина и различных концентраций антибактериального агента NCL812, действующих против метициллин-чувствительного штамма S. aureus ATCC 49775, полученные при использовании метода микроразведений в среде в соответствии с Примером 4. Тестируемые значения концентраций NCL812 составили МИК и четырехкратную МИК, определенную в условиях тестирования при инкубации до 24 ч. Ампициллин тестировали при МИК. Бактерицидную активность антибактериальных агентов тестировали на сроках 0, 1, 2, 4, 8, 12 и 24 ч;
На Фигуре 11 представлен график с кинетическими кривыми элиминации (kill kinetic curves) для метициллин-чувствительного штамма S. Aureus ATCC 49775, демонстрирующий бактерицидную активность NCL812 с помощью метода макроразведений Института клинических и лабораторных стандартов в 10 мл флаконах в соответствии с Примером 4. Концентрации тестируемых антибактериальных агентов составили 1× и 4× МИК, как определено в условиях тестирования. Бактерицидную активность определяли через 0, 1, 2, 4, 8, 12 и 24 часов после добавления антибактериального агента. Бактерицидную активность определяли как 3-log10 (99,9%) снижение количества жизнеспособных бактерий в исходном размере инокулюма;
На Фигуре 12 приведен график, иллюстрирующий изменение рН при анализе методом макроразведений в среде для штамма S.pneumoniae D39 под воздействием 4 мкг/мл NCL812 и 0,0023 мкг/млампициллина в соответствии с Примером 5;
На Фигуре 13 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill («время-элиминация») в течение 48-часового периода для штамма S. pneumoniae D39, обработанного NCL812 в соответствии с Примером 5;
На Фигуре 14 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill («время-элиминация») в течение 48-часового периода для штамма S. pneumoniae D39, обработанного NCL062 в соответствии с Примером 5;
На Фигуре 15 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill в течение 14-часового периода для штамма S. pneumoniae D39, обработанного NCL812 в соответствии с Примером 5;
S. pneumoniae
На Фигуре 16 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill в течение 14-часового периода для штамма  D39, обработанного NCL062 в соответствии с Примером 5;
S. pneumoniae
На Фигуре 17 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill в течение 14-часового периода для штамма  D39, обработанного ампицилллином в соответствии с Примером 5;
S. pneumoniae
На Фигуре 18 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill в течение 12-часового периода для штамма  D39, обработанного NCL812 (взятый с Фигуры 43) в соответствии с Примером 5;
S. pneumoniae
На Фигуре 19 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill в течение 12-часового периода для штамма  D39, обработанного NCL062 (взятый с Фигуры 44) в соответствии с Примером 5;
S. pneumoniae
На Фигуре 20 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill в течение 48-часового периода для штамма  D39, обработанного ампицилллином в соответствии с Примером 5;
S. pneumoniae
На Фигуре 21 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill в течение 48-часового периода для штамма  D39, обработанного эритромицином в соответствии с Примером 5;
S. pneumoniae
На Фигуре 22 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill в течение 48-часового периода для штамма  D39, обработанного NCL812 и 5% хлоридом холина;
S. pneumoniae
На Фигуре 23 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill в течение 12-часового периода для штамма  D39, обработанного NCL812 и 5% хлоридом холина в соответствии с Примером 5;
S. pneumoniae
На Фигуре 24 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill в течение 48-часового периода для штамма  D39, обработанного NCL062 и 5% хлоридом холина в соответствии с Примером 5;
S. pneumoniae
На Фигуре 25 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill в течение 12-часового периода для штамма  D39, обработанного NCL062 и 5% хлоридом холина в соответствии с Примером 5;
S. pneumoniae
На Фигуре 26 приведен график, иллюстрирующий результаты анализа time-kill в течение 48-часового периода для штамма  D39, обработанного ампициллином и хлоридом холина в соответствии с Примером 5;
На Фигуре 27 приведен график, иллюстрирующий относительную МБК для штаммаD39, обработанного NCL812 или NCL062 в течение 48-часового периода в соответствии с Примером 5;
S.pneumoniae
На Фигуре 28 приведен график, иллюстрирующий относительную минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) для штамма  D39, обработанного ампициллином в течение 48-часового периода в соответствии с Примером 5;
S.pneumoniae
На Фигуре 29 приведен график, иллюстрирующий относительную МБК для штамма D39, обработанного эритромицином в течение 48-часового периода в соответствии с Примером 5;
10
S.pneumoniae
На Фигуре 30 приведен график, иллюстрирующий количество жизнеспособных микроорганизмов (logKOE/мл) штамма  D39, обработанного NCL812, полученное для макроразведений в анализе time-kill в течение 24 часов в соответствии с Примером 5;
10
S.pneumoniae
На Фигуре 31 приведен график, иллюстрирующий количество жизнеспособных микроорганизмов (logKOE/мл) штамма  D39, обработанного ампициллином, полученное для макроразведений в анализе time-kill в течение 24 часов в соответствии с Примером 5;
Фигура 32 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую среднюю толщину клеточной мембраны у обработанного и необработанного штамма D39 в соответствии с Примером 5;
Фигура 33 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую среднюю ширину периплазматического пространства у обработанных (16 мкг/мл NCL812) и необработанных образцов штамма D39 в соответствии с Примером 5;
На Фигуре 34 приведены данные по анализу кинетики элиминации (kill kinetics) для изолята MRSA 580 при разных концентрациях NCL812 при времени инкубации 8 ч в соответствии с Примером 7;
На Фигуре 35 приведены данные по анализу кинетики элиминации (kill kinetics) для изолята MRSA 580 при разных концентрациях NCL812 при времени инкубации 24 ч в соответствии с Примером 7;
На Фигуре 36 приведены данные по анализу кинетики элиминации (kill kinetics) для изолята MRSA 698 при разных концентрациях NCL812 при времени инкубации 24 ч в соответствии с Примером 7;
На Фигуре 37 приведены данные по анализу кинетики элиминации (kill kinetics) для изолята VRE 26c(dc) при разных концентрациях NCL812 при времени инкубации 24 ч в соответствии с Примером 7;
На Фигуре 38 приведены данные по анализу кинетики элиминации (kill kinetics) для изолята VRE 16c(dc) при разных концентрациях NCL812 при времени инкубации 24 ч в соответствии с Примером 8;
Staphylococcus aureus
На Фигуре 39 приведены данные по анализу кинетики элиминации (kill kinetics) для KC01 при разных концентрациях NCL812 при времени инкубации до 24 ч в соответствии с Примером 8;
Enterococcus faecalis
На Фигуре 40 приведены данные по анализу кинетики элиминации (kill kinetics) для  USA01 при разных концентрациях NCL812 при времени инкубации до 24 ч в соответствии с Примером 8; и
Фигура 41 представляет собой график, иллюстрирующий совокупное высвобождение NCL812 и NCL099 из Препарата B в соответствии с Примером 10;
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ
Общая часть
Перед описанием настоящего изобретения в деталях следует отметить, что изобретение не ограничивается конкретными способами, приведенными в качестве примеров, или композициями, описанными в данном документе. Также следует понимать, что используемая в настоящей заявке терминология предназначена только описания конкретных вариантов реализации изобретения и не является ограничивающей.
Все публикации, упоминаемые в настоящей заявке, в том числе патенты и заявки на патент, включены посредством ссылок в полном объеме. Однако заявки, упомянутые в настоящем документе, приведены только в целях описания и раскрытия способов, протоколов и реагентов, указанных в публикации, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. Цитирование какой-либо публикации в данном документе не следует толковать как признание того, что изобретение не имеет права датироваться более ранним числом на основании предшествующего изобретения.
Кроме того, при осуществлении настоящего изобретения специалистами в данной области техники используютсястандартные микробиологические методы, если не указано иное. Такие стандартные методы известны специалистам в данной области.
В настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения формы слов, приведенные в единственном числе, включают также множественное число, если из контекста явно не следует иное.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют те же значения, которые обычно понятны среднему специалисту в области, к которой относится данное изобретение. Хотя для осуществления настоящего изобретения могут использоваться любые материалы и методы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящей заявке, предпочтительные материалы и методы описаны в данном документе.
Изобретение, описанное в настоящей заявке, может включать один или несколько диапазонов значений (например, размер, концентрация, доза и т.д.). Следует понимать, что диапазон значений включает все значения в пределах диапазона, в том числе значения, определяющие диапазон, и значения, примыкающие к диапазону, которые обеспечивают такой же или по существу такой же результат, как и значения, непосредственно примыкающие к тому значению, которое определяет границу диапазона.
Фармацевтические или ветеринарные композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в различных стандартных дозах в зависимости от способа введения, целевой области, физиологического состояния пациента и других вводимых лекарственных средств. Например, стандартная лекарственная форма, пригодная для перорального введения, включает твердые лекарственные формы, такие как порошки, таблетки, пилюли и капсулы, а также жидкие лекарственные формы, такие как эликсиры, сиропы, растворы и суспензии. Активные ингредиенты могут быть также введены парентерально в стерильных жидких лекарственных формах. Желатиновые капсулы могут содержать активный ингредиент и неактивные ингредиенты, такие как порошок-носитель, глюкоза, лактоза, сахароза, маннитол, крахмал, целлюлоза или производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновая кислота, натриевая соль сахарин, тальк, карбонат магния и тому подобное.
Выражение «терапевтически эффективное количество» при использовании в настоящей заявке относится к количеству, достаточному для ингибирования роста бактерий, ассоциированного с бактериальной инфекцией или колонизацией. То есть упоминание введения терапевтически эффективного количества соединения Формулы I согласно способам или композициям по настоящему изобретению относится к терапевтическому эффекту, в котором существенная бактерицидная или бактериостатическая активность вызывает существенное ингибирование бактериальной инфекции. Термин «терапевтически эффективное количество» при использовании в настоящей заявке относится к нетоксичному, но достаточномудля обеспечения желаемого биологического, терапевтического и/или профилактического результата количеству композиции. Желаемые результаты включают устранение бактериальной инфекции или колонизации или уменьшение и/или облегчение признаков, симптомов или причин заболевания или любое другое желаемое изменение биологической системы. Эффективное количество в каждом отдельном случае может быть определено одним из специалистов в данной области техники с использованием стандартных экспериментов. По отношению к фармацевтической или ветеринарной композиции, эффективные количества могут представлять собой дозы, рекомендуемые для изменения болезненного состояния или признаков, или их симптомов. Эффективные количества различаются в зависимости от применяемой композиции и применяемого способа введения. Эффективные количества обычно оптимизированы с учетом фармакокинетических и фармодинамических характеристик, а также различных факторов у конкретного пациента, таких как возраст, вес, пол, и т.д., и области, подверженной заболеванию, или микроорганизмов, вызвавших заболевание.
При использовании в настоящей заявке термин «лечение» относится к полному или частичному снятию симптомов и признаков заболевания. Например, при лечении бактериальной инфекции или колонизации лечение полностью или частично снимает симптомы инфекции. Предпочтительно при лечении инфекции лечение уменьшает или устраняет инфицирующий бактериальный патоген, что приводит к микробному излечению.
Staphylococcus
Streptocccus
Bacillus
Enterococcus
Listeria
Escherichia coli
Enterobacter
Klebsiella
Pseudomonas
Mycoplasma
Ureaplasma
Staphylococcus
, Streptococcus
,Enterococcus
Clostridium difficile, Escherichia coli
Enterobacter
Klebsiella
Pseudomonas
При использовании в настоящей заявке термин «бактерии» относится к членам большого домена прокариотических микроорганизмов. Обычно несколько микрометров в длину, бактерии могут иметь разную форму, от сфер до палочек и спиралей, и могут быть представлены в виде отдельных клеток или в виде линейных цепочек или кластеров, состоящих из разногоколичестваклеток и имеющих разнообразную форму. Предпочтительно термин «бактерии» и его прилагательное «бактериальный» относятся к бактериям, таким как грамположительные бактерии из родов spp, spp, spp, spp, spp, и анаэробные бактерии; грамотрицательные бактерии из родов , spp, spp и spp; и не имеющие клеточной стенки бактерии, такие как spp и spp. Указанные термины могут относиться к штаммам, чувствительным к антибиотикам, или к штаммам, устойчивым к антибиотикам. В предпочительном варианте реализации термины относятся к MRSA или MRSP. В другом предпочительном варианте реализации термины относятся к видам с МЛУ родов sppsppspp, , spp, spp и spp.
Staphylococcus
При использовании в настоящей заявке термин «метициллин-устойчивые бактерии» (например, метициллин-устойчивый ) относится к бактериальному изоляту, который демонстрирует устойчивость в любой дозе ко всем бета-лактамам, включая пенициллины, карбапенемы и цефалоспорины от первогодо четвертого поколения, но не цефалоспорины пятого поколения, дейтсвующие против MRSA (например, цефтаролин). Множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) определяют как приобретенную невосприимчивость по меньшей мере к одному агенту в трех или более категориях противомикробных агентов, широкую лекарственную устойчивость (ШЛУ) определяют как невосприимчивость по меньшей мере к одному агенту ко всем, кроме двух или менее категориям противомикробных агентов (то есть бактериальные изоляты остаются чувствительными только к одой или двум категориям) и полная лекарственная устойчивость (ПЛУ) определяется как не восприимчивость ко всем агентам во всех категориях противомикробных агентов, имеющихся в настоящее время.
Staphylococcus aureus
Примером восприимчивых (чувствительных) бактерий и бактерий с МЛУ, ШЛУ и ПЛУ являются следующие. Изоляты  дикого типа, которые не подвергались воздействию антибактериальных агентов, которые, вероятно, будут восприимчивыми ко всем следующим категориям антибатериальных агентов (и антибактериальным агентам): аминогликозиды (например, гентамицин); ансамицины (например, рифампицин); цефалоспорины, действующий против MRSA (например, цефтаролин); противостафилококковые бета-лактамы (например, оксациллин или цефокситин); карбапенемы (например, имипенем, эртапенем, меропенем или дорипенема); цефалоспорины не с расширенным спектром; цефалоспорины 1-го и 2-го поколения (например, цефазолин или цефуроксим); цефалоспорины расширенного спектра; цефалоспорины 3-го и 4-го поколения (например, цефотаксим или цефтриаксон); цефамицины (например, цефокситин или цефотетан); фторхинолоны (например, ципрофлоксацин или моксифлоксацин); ингибиторы фолатного пути (например, триметоприм-сульфаметоксазол); фуциданы (например, фузидовая кислота); гликопептиды (например, ванкомицин, тейкопланин или телаванцин); глицилциклины (например, тигециклин); линкозамиды (например, клиндамицин); липопептиды (например, даптомицин); макролиды (например, эритромицин); оксазолидиноны (например, линезолид или тедизолид); фениколы (например, хлорамфеникол); фосфоновые кислоты (например, фосфомицин); стрептограмины (например, хинупристин-дальфопристин); тетрациклины (например, тетрациклин, доксициклин или миноциклин). Изоляты, которые являются невосприимчивыми (устойчивы) более чемк одному агентуиз более чем трех категорий противомикробных агентов, относят к МЛУ (все MRSA, например, отвечают определению бактерий с МЛУ). Изоляты, которые являются невосприимчивыми более чем к одному агентуиз всех, кроме одного или двух категорий противомикробных агентов, относят к ШЛУ. Изоляты, которые являются невосприимчивыми ко всем перечисленным антибактериальными агентами являются ПЛУ
Фармацевтически и ветеринарно приемлемые соли включают соли, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства соединений согласно настоящему изобретению и которые не являются биологически или иным образом нежелательными. Во многих случаях соединения, описанные в настоящей заявке здесь, способны образовывать кислотные и/или основные соли в силу наличия амино и/или карбоксильных групп, или групп подобных им. Приемлемые аддитивные соли могут быть получены из неорганических и органических оснований. Соли, полученные из неорганических оснований, включают, в качестве примера, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния. Соли, полученные из органических оснований, включают, но не ограничиваются перечисленными, соли первичных, вторичных и третичных аминов, таких как, только  в качестве примера, алкиламины, диалкиламины, триалкиламины, замещенные алкиламины, ди- (замещенный алкил) амины, три (замещенный алкил) амины, алкениламины, диалкениламины, триалкениламины, замещенные алкениламины, ди- (замещенный алкенил) амины, три- (замещенный алкенил) амины, циклоалкиламины, ди- (циклоалкил) амины, три- (циклоалкил) амины, замещенные циклоалкиламины, дизамещенные циклоалкиламины, тризамещенные циклоалкиламины, циклоалкениламины, ди(циклоалкенил)амины, три(циклоалкенил)амины, замещенные циклоалкениламины, дизамещенные циклоалкениламины, тризамещенные циклоалкениламины, ариламины, диариламины, триариламины, гетероариламины, дигетероариламины, тригетероариламины, гетероциклические амины, дигетероциклические амины, тригетероциклические амины, смешанные ди- и триамины, где по меньшей мере два из заместителей у амина ращличаются между собой и выбраны из группы, включающей алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, циклоалкил, замещенный циклоалкил, циклоалкенил, замещенный циклоалкенил, арил, гетероарил, гетероциклил, и т.п. Также охвачены амины, где два или три заместителя вместе с атомом азота из аминогруппы образуют гетероциклическую или гетероарильную группу.
Фармацевтически и ветеринарно приемлемые кислотно-аддитивные соли могут быть получены из неорганических и органических кислот. Неорганические кислоты, которые могут быть использованы для этой цели, включают, в качестве примера, соляную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и т.п. Органические кислоты, которые могут быть использованы для этой цели, включают, в качестве примера, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, яблочную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислота, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту, салициловую кислоту и т. п.
th
Фармацевтически и ветеринарно приемлемые соли соединений, применяемых в настоящем изобретении, могут быть синтезированы из исходного соединения, которое содержит основную или кислотную группу, обычным химическими способами. Как правило, такие соли могут быть получены взаимодействием свободных кислотных или основных форм указанных соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе или в смеси двух. Как правило, предпочтительны неводные среды, такие как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Списки подходящих солей можно найти в справочнике Ремингтона Remington's Pharmaceutical Sciences. 17 ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985), p. 1418, включено в настоящее описание посредством ссылки. Примерами таких приемлемых солей являются иодид, ацетат, фенилацетат, трифторацетат, акрилат, аскорбат, бензоат, хлорбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, метилбензоат, о-ацетоксибензоат, нафталин-2-бензоат, бромид, изобутират, фенилбутират, γ-гидроксибутират, β-гидроксибутират, бутин-1,4-диоат, гексин-1,4-диоат, гексин- ,6-диоат, капроат, каприлат, хлорид, циннамат, цитрат, деканоат, формиат, фумарат, гликолат, гептаноат, гиппурат, лактат, малат, малеат, гидроксималеат, малонат, манделат, мезилат, никотинат, изоникотинат, нитрат, оксалат, фталат, терефталат, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, пропионат, пропионат, фенилпропионат, салицилат, соль себациновой кислоты, сукцинат, суберат, сульфат, бисульфат, пиросульфат, сульфит, бисульфит, сульфонат, бензолсульфонат, п-бромфенилсульфонат, хлорбензолсульфонат, пропансульфонат, этансульфонат, 2-гидроксиэтансульфонат, метансульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат, p-толуолсульфонат, ксилолсульфонат, тартрат и т.п.
Фармацевтические или ветеринарные композиции согласно настоящему изобретению могут быть включены в состав препаратов традиционным способом, вместе с другими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, если это необходимо, в форме, подходящей для перорального, парентерального или местного введения. Способы введения могут включать в себя парентеральное, например, внутримышечное, подкожное и внутривенное введение, пероральное введение, местное введение и прямое введение в место инфекции, такое как внутриглазное, внутриушное, внутриматочное, интраназальное, интрамаммарне, внутрибрюшинное,  внутриочаговое и т.п.
Фармацевтические или ветеринарные композиции согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены для перорального введения. Могут быть добавлены стандартные неактивные ингредиенты для обеспечения желаемого цвета, вкуса, стабильности, буферной емкости, дисперсии или других известныхжелаемых особенностей. Примеры включают красную окись железа, силикагель, лаурилсульфат натрия, диоксид титана, пищевые белила и т.п. Стандартные разбавители могут применяться для получения прессованных таблеток. И таблетки и капсулы могут быть приготовлены в виде композиций с замедленным высвобождением для постоянного высвобождения лекарства в течение определенного периода времени. Прессованные таблетки могут иметь сахарную оболочку или пленочное покрытие, или энтеросолюбильное покрытие таблетки для селективного распада в желудочно-кишечном тракте. Жидкие лекарственные формы для перорального введения могут содержать красители и/или ароматизаторы для увеличения комплаентности у пациентов. В качестве примера, пероральный препарат, содержащий соединение согласно настоящему изобретению, может представлять собой таблетку, содержащую любой из, или комбинацию из, следующих вспомогательных веществ: двузамещённый кальция фосфат дигидрат, микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и тальк.
Описанные в настоящей заявке композиции могут быть в форме жидкого препарата. Примерами предпочтительных жидких композиций включают растворы, эмульсии, инъекции и растворы, содержащиеся в капсулах. Жидкий препарат может содержать раствор, который включает терапевтический агент, растворенный в растворителе. Как правило, можно применять любой растворитель, который имеет желаемый эффект, в котором растворяется терапевтический агент и который может быть введен субъекту. Как правило, можно применять любую концентрацию терапевтического агента, которая оказывает желаемое действие. В некоторых вариантах препарат представляет собой раствор, который является ненасыщенным, насыщенным или перенасыщенным. Растворитель может быть чистым растворителем или может быть смесью жидких компонентов растворителя. В некоторых вариантах раствор представлен в форме гелеобразующего insitu препарата. Растворители и типы растворов, которые можно применять, хорошо известны специалистам в области технологии доставки лекарств.
Композиция, описанная в настоящей заявке, может быть в форме жидкой суспензии. Жидкие суспензии могут быть получены в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области технике. Примеры жидких суспензий включают микроэмульсии, образование комплексных соединений и стабилизирующие суспензий. Жидкая суспензия может находиться в неразбавленной или концентрированной форме. Жидкие суспензии для перорального применения могут содержать подходящие консерванты, антиоксиданты и другие вспомогательные вещества, известные в данной области, в качестве одного или более диспергирующих агентов, суспендирующих агентов, загустителей, эмульгаторов, увлажнителей, солюбилизаторов, стабилизаторов, вкусовых добавок и подсластителей, красителей и т. п. Жидкой суспензии могут содержать глицерин и воду.
Композиция, описанная в настоящей заявке, может быть представлена в форме пасты для перорального введения. Паста для перорального введения может быть получена в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области.
Композиция, описанная в настоящей заявке, может быть представлена в форме жидкого препарата для инъекций, например, внутримышечных инъекций, и она может быть получена с применением способов, известных в данной области техники. Например, жидкий препарат может содержать поливинилпирролидон K30 и воду.
Композиция, описанная в настоящей заявке, может быть представлена в форме препаратов для местного применения. Препарат для местного применения может быть в форме лосьона или крема, полученных с использованием способов, известных в данной области техники. Например, лосьон может быть приготовлены на водной или масляной основе и может включать в себя одно или более вспомогательных веществ, известных в данной области, в качестве усилителей вязкости, эмульгаторов, ароматизаторов или отдушек, консервантов, хелатирующих агентов, модификаторов рН, антиоксидантов и т.п. Например, препарат для местного применения, содержащий одно или более соединение согласно настоящему изобретению, может представлять собой гель, содержащего любой из следующих экципиентов или их комбинацию: ПЭГ 8000, ПЭГ 4000, ПЭГ 200, глицерин, пропиленгликоль. Соединение NCL812 также может быть приготовлено в виде твердой дисперсии с использованием SoluPlus (BASF, www.soluplys.com) и может входить в состав препарата вместе и одним из следующих вспомогательных веществ или их комбинацией: ПЭГ 8000, ПЭГ 4000, ПЭГ 200, глицерин и пропиленгликоль.
Для аэрозольного введения композиция по изобретению может быть представлена в тонкодисперсной форме вместе с нетоксичным поверхностно-активным веществом и пропеллентом. Поверхностно-активное вещество предпочтительно растворимо в пропелленте. Такие поверхностно-активные вещества могут включать эфиры или неполные эфиры жирных кислот.
Композиции согласно настоящему изобретению, как альтернатива, могут быть приготовлены для доставки путем инъекции. В качестве примера, соединение вводят путем инъекции с помощью одного из следующих путей: внутривенного, внутримышечного, внутрикожного, внутрибрюшинного и подкожного.
Препараты, включающие композиции согласно настоящему изобретению, как альтернатива, могут быть составлены с применением методов доставки лекарств на основе нанотехнологий, таких, которые известны в данной области. Преимуществом систем доставки лекарств на основе нанотехнологий является улучшенная биодоступность, комплаентность пациента и снижение побочных эффектов.
AdvancedDrugDeliveryReviews
Приготовление препаратов, включающих композиции настоящего изобретения включает приготовление наночастиц в виде наносуспензий или наноэмульсий, основанных на растворимости соединения. Наносуспензий представляют собой дисперсии наноразмерных частиц лекарственного средства, подготовленных на основе технологии «снизу вверх» или «сверху вниз» и стабилизированных с помощью подходящих вспомогательных веществ. Этот подход может применяться для соединений настоящего изобретения, которые могут иметь низкую водную и липидную растворимость, в целях повышения растворимости при насыщении и улучшения характеристик растворения. Пример такого подхода изложен в работе Шарма и Гарг (Sharma and Garg (2010). Pure drug and polymer-based nanotechnologies for the improved solubility, stability, bioavailability, and targeting of anti-HIV drugs. , 62: p. 491-502). Растворимость при насыщении, как следует понимать, является константой, специфичной для конкретного соединения и зависящая от температуры, свойств среды для растворения и размера частиц (<1-2 мкм).
Композиция согласно настоящему изобретению может быть представлена в виде наносуспензии. Для наносуспензий увеличение площади поверхности может привести к увеличению растворимости при насыщении. Наносуспензии представляют собой коллоидные системы доставки лекарственных средств, состоящие из частиц менее 1 мкм. Композиции согласно настоящему изобретению могут быть в форме наносуспензий, включая нанокристаллические суспензии, твердые липидные наночастицы (solid lipid nanoparticles, SLNs), полимерные наночастицы, нанокапсулы, полимерные мицеллы и дендримеры. Наносуспензии могут быть получены с использованием подхода «сверху вниз» таким образом, что более крупные частицы могут быть измельчены до нанометровых размеров с помощью различных методов, известных в данной области, в том числе мокрого помола и гомогенизации при высоком давлении. В качестве альтернативы, наносуспензии могут быть получены с использованием технологии «снизу вверх» таким образом, что контролируемое осаждение частиц может осуществляться из раствора.
Композиция согласно настоящему изобретению может быть представлена в виде наноэмульсии. Наноэмульсии обычно представляют собой прозрачные двухфазные системы «масло-в-воде» или «вода-в-масле» с размером капель в интервале 100-500 нм, и при этом целевое соединение присутствует в гидрофобной фазе. Приготовление наноэмульсий может улучшить растворимость соединения согласно настоящему изобретению, описанного в настоящей заявке, что обеспечивает лучшую биодоступность. Наноразмерные суспензии могут включать агенты для электростатической или стерической стабилизации, такие как полимеры и поверхностно-активные вещества. Композиции в форме SLN могут содержать биоразлагаемые липиды, такие как триглицериды, стероиды, воски и эмульгаторы, такие как соевый лецитин, яичный лецитин, и полоксамеры. Приготовление препаратов SLN может включать растворение/диспергирование лекарственного средства в расплавленном липиде с последующей горячей или холодной гомогенизацией. Если используется горячая гомогенизация, расплавленная липидная фаза может быть диспергирована в водной фазе, и таким образом получена эмульсия. Она может быть отверждена путем охлаждения до достижения SLN. При использовании холодной гомогенизации липидная фаза может быть отверждена в жидком азоте и измельчена до микронных размеров. Полученный порошок может быть подвергнут гомогенизации при высоком давлении в водном растворе поверхностно-активного вещества.
Соединение Формулы I, как описано в настоящей заявке, может быть растворено в маслах/ жидких липидах и стабилизирован с образованием препарата в виде эмульсии. Наноэмульсии могут быть получены с помощью высоко- и низкоэнергетических методов измельчения капель. Высокоэнергетические методы могут включать гомогенизацию при высоком давлении, ультразвуковую обработку и микрофлюидизацию. При использовании низкоэнергетических методов спонтанную наноэмульсию создает диффузия растворителя и инверсия фазы. Липиды, используемые в наноэмульсиях, могут быть выбраны из группы, включающей триглицериды, соевое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло. Также могут быть добавлены другие компоненты, такие как эмульгаторы, антиоксиданты, модификаторы рН и консерванты.
Композиция может быть представлена в форме препарата с контролируемым высвобождением и может включать разлагаемый или неразлагаемый полимер, гидрогель, органогель или другую физическую структуру, которая модифицирует высвобождение соединения настоящего изобретения. Следует понимать, что такие композиции могут включать дополнительные неактивные ингредиенты, которые добавляют для обеспечения желаемого цвета, стабильности, буферной емкости, дисперсии или других известных желательных характеристик. Такие препараты могут дополнительно включать липосомы, такие как эмульсии, пены, мицеллы, нерастворимые монослои, жидкие кристаллы, фосфолипидные дисперсии, пластинчатые слои и т. п. Липосомы для применения в настоящем изобретении могут быть изготовлены из стандартных образующих везикулы липидов, как правило, включающих нейтральные и отрицательно заряженные фосфолипиды и стерол, такой как холестерин.
Препаратынастоящего изобретения могут иметь преимущество, заключающееся в повышенной растворимости и/или стабильности соединений, в особенности для препаратов, приготовленных с применением методов нанотехнологий. Такое повышение растворимости и/или стабильности соединений Формулы I может улучшить биологическую доступность и усилить воздействие препарата в виделекарственных форм для перорального и/или парентерального введения.
В данном описании, если из контекста не следует иное, слово «содержать» или его формы, такие как «содержит» или «содержащий», подразумевает включение указанного элемента или группы элементов, но не исключение любого другого элемента или группы элемента.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
:
Staphylococcus aureus
Enterococcus
Streptococcus pneumoniae
Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для NCL812 у метициллин-устойчивого  (MRSA), ванкомицин-устойчивого  spp. (VRE) и .
Специальные сведения
Как видно из предыдущего описания изобретения, изобретение относится к соединениям Формулы I, способам лечения бактериальной инфекции, к применению и медицинским устройствам.
Staphylococcus aureus
Enterococcus
Streptococcus pneumoniae
Данное исследование было проведено для определения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) для антибактериального агента NCL812. Этот антибактериальный агент представляет собой потенциально новый класс препаратов с узконаправленным спектром действия по отношению к  бактериям и с новым механизмом действия. В данном исследовании внимание уделено недавно выделенным изолятам трех основных оппортунистических патогенов человека, с которыми связана проблема развития устойчивости к существующим классам антибактериальных агентов: метициллин-устойчивому (MRSA), ванкомицин-устойчивому spp. (VRE) и ,
S. pneumoniae
50
90
В этом примере, минимальные ингибирующие концентрации (МИК) NCL812 были определены для 61 австралийского клинического изолята (в том числе 21 изолята MRSA, 20 предположительных изолятов VRE и 20 изолята ). Профили МИК для NCL812 оказались существенно согласованными при значениях МИКи МИК, составляющих 4 мкг/мл, как было определено для каждого из тестируемых видов.
Материалы и методы
Сбор и идентификация бактериальных изолятов
Staphylococcus aureus
Enterococcus
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium.
S. pneumoniae
Шестьдесят один тестируемый изолят был получен из клинических диагностических микробиологических лабораторий. Изоляты MRSA изначально были культивированы на селективном хромогенном агаре для MRSA (Brilliance MRSA Chromogenic Agar, Oxoid). Были отобраны предполагаемые колонии на основании их появления на данном агаре, идентификация их как проводилась на основании характеристик колоний на неселективном агаре с овечьей кровью (Sheep Blood Agar, SBA) и фенотипических характеристик, таких как окрашивание по Граму, положительный тест на каталазу, положительный тест на коагулазу (пробирочный тест на коагулазу с применением плазмы крови кролика) и фактора агглютинации (агглютинация с помощью латексного теста Oxoid Staphytect latex test), положительный результат в тесте Фогеса-Проскауера и способность производить кислоту из трегалозы. Положительная устойчивость к цефокситину позволила определить изоляты как MRSA. Все изоляты  прошли стандартную биохимическую идентификацию. Биохимическое профилирование позволило предположительно определить четыре из изолятов VRE как и оставшийся как Все изоляты были идентифицированы на основании стандартного биохимического профилирования.
Подготовка антибактериальных агентов
Был получено соединение NCL812 с аналитической степенью чистоты (номер партии 20081214) со определенной активностью 1000 мг/г (т.е. 100%). Порошок хранили при температуре -20°С. Аликвоты (1 мл) исходного раствора (25,6 мг/мл) готовили в ДМСО, хранили при -80°С и размораживали непосредственно перед использованием.
Подготовка 96-луночных планшетов для тестирования МИК с помощью микроразведений в среде с использованием NCL812
2+
2+
Среду Мюллера-Хинтона со стандартизированным содержанием катионов (CAMHB) готовили с использованием 100 мл стерильной среды Мюллера Хинтона (с отрегулированным значением рН). В каждый объем 100 мл добавляли в асептических условиях 125 мкл стокового раствора кальция (10 мг Ca на мл) и 43 мкл стокового раствора магния (10 мг Mg на мл). Готовили достаточное количество среды для использованиея в течение дня, не использованные остатки хранили при 4°С в течение ночи.
Streptococcus
Планшеты для микроразведений с 4% лизированной лошадиной кровью в CAMHB готовили путем лизирования лошадиной крови (Oxoid) при повторном замораживании и оттаивании (3-4 раза) и смешивания лизированной лошадиной крови (LHB) 50:50 со стерильной дистиллированной воды в асептических условиях. Бесклеточную суспензию  получали при центрифугировании 50% LHB при 16000 х g (7000 об/мин/) в течение 20 мин. Супернатант удаляли, повторно центрифугировали и хранили в замороженном виде. 50% LHB разбавляли CAMHB с получением конечной концентрации 4% (7 мл LHB в 93 мл CAMHB). 4% LHB-CAMHB использовали вместо CAMHB на всех этапах при подготовке планшетов с микроразведениями и подготовки растворов противомикробных агентов лоя видов .
Рабочие стоковые растворы антибиотика NCL812 готовили в концентрации 25,60 мг/мл. Эффективность была определена как 1000 мг/г или 100%. Порошок растворяли в 10 мл ДМСО, распределяли аликвоты объемом 1 мл по пробиркам типа эппендорф и хранили при -80°С. При добавлении к CAMHB образовывался тонкий белесоватый осадок, и его хорошо тщательно встряхивали до и во время разделения на аликвоты.
Стоковый раствор ампициллина готовили в концентрации 25,60 мг/мл. Ампициллин использовали для внутреннего контроля качества. Ампициллин в виде порошка растворяли в 4 мл фосфатного буфера рН 8,0, 0,1 моль/л, затем разбавляли в 6 мл фосфатного буфера рН 6,0, 0,1 моль/л. Аликвоты объемом 1 мл распределяли в пробирки типа эппендорф и хранили при -80°С.
Staphylococcus aureus
Для готовили рабочий раствор с концентрацией 256 мкг/мл путем разведения исходных растворов, описанных выше, 1: 100 в CAMHB (100 мкл в 9,9 мл). При добавлении 90 мкл в каждую лунку 12 осуществляли разведение 1: 2, таким образом, что в лунке 12 содержался антибиотик в концентрации 128 мкг/мл. Диапазон противомикробного агента рассчитывали как от 0,25 мкг/мл (лунка 3) до 128 мкг/мл (лунка 12).
Enterococcus
Для видов  готовили рабочий раствор с концентрацией 64 мкг/мл путем разведения стоковых растворов, описанных выше, 1: 400 в CAMHB (100 мкл в 9,9 мл, с помледующим разбавлением 1: 4). При добавлении 90 мкл к лунке 12 осуществляли разведение 1: 2, таким образом, что в лунке 12 содержался антибиотик в концентрации 32 мкг/мл.
Streptococcus pneumonia
Для готовили рабочий раствора 64 мкг/мл готовили разведением стоковых растворов, описанных выше, 1: 400 в 4% LHB-CAMHB (100 мкл в 9,9 мл, с последующим разведением 1: 4). При добавлении 90 мкл к лунке 12 осуществляли разведение 1: 2, таким образом, что в лунке 12 содержался антибиотик в коенцентрации 32 мкг/мл.
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Streptococcus pneumoniae
Серийные разведения готовили в 96-луночных планшетах в боксе с биологической безопасностью в соответствии с методами, стандартными в данной области техники. Кратко: 90 мкл рабочего раствора антибиотика добавляли в каждую лунку в колонке 12 планшета и хорошо перемешивали, перед тем как перенести 90 мкл в колонку 11. Растворы вновь перемешивали, а затем переносили в следующую колонку, как и раньше, продолжая разведения до колоки 3.  Для перемешивания содержимого лунки необходимо отобрать дозатором  и вновь выпустить объем 90 мкл в каждой лунке 3-4 раза, прежде чем отобрать и перенести 90 мкл в следующую лунку. Колонка 2 (бактериальный положительный контроль) и колонка 1 (отрицательный контроль) не входили в серийные разведения. Планшеты распределяли следующим образом: 2 штамма тестировали в двух повторностях наодном планшете, один планшет, таким образом, что штамм 1 был расположен в рядах с А по D, штамм 2 был расположен в рядах с Е по Н и т.п. Стандарты для интерпретации МИК (мкг/мл) для ампициллина с использованием контрольных штаммов приведены в Таблице 1 ниже. Принятый диапазон МИК для ампициллинау ATCC 29213 = от 0,5 до 2 мкг/мл, Принятый диапазон МИК для ампициллинау ATCC 29212 = 0,5 2 мкг/мл, Принятый диапазон МИК для ампициллинау ATCC 49619 = 0,06 до 0,25 мкг/мл.
Таблица 1
: Стандарты интерпретации МИК (мкг/мл) для ампициллина с использованием контрольных штаммов в соответствии с Примером 1
Чувствительный
Промежуточный
Устойчивый
Staphylococcus aureus
≤0,25
≥0,5
виды Enterococcus
≤8
≥16
Streptococcus pneumoniae
≤2
4
≥8
Подготовка бактериальной суспензии для определения МИК методом микроразведений в среде
600
8
6
5
6
5
6
Готовили свежие культуры бактерий для тестирования на агаре с овечьей кровью (SBA) и инкубировали их в течение ночи при 37°С, как описано ниже; 2-3 колонии каждого из штаммов выращивали в 7 мл стерильного солевого раствора, и измеряли OD как показатель оптической плотности (прибл. 0,5×10 КОЕ/мл или 0,5 по стандарту МакФарланда). Суспензию бактерий доводили до конечного значения поглощения от 0,08 до 0,100 с использованием солевого раствора для достижения необходимой плотности, и использовали солевой раствор как контрльный образец для измерения. В течение 15 минут подготовки доведенные до необходимой плотности бактериальные суспензии разбавляли стерильным физиологическим раствором 1:20 (1 мл в 19 мл стерильного физиологического раствора) до достижения конечной концентрации бактерий от 4 до 5×10 КОЕ/мл. Бактериальный раствор помещали в стерильную кювету и добавляли по 10 мкл бактериального раствора в лунки с 2 по 12 в каждом необходимом ряду (разведение 1:10 при конечной концентрации бактерий в лунках = 5×10 КОЕ/мл). Планшеты запечатывали пленкой и инкубировали при 37°С в течение 18-24 ч. Чистоту бактериальной суспензии проверяли, нанося штрихи из 50 мкл разведения 1:20 на чашки с SBA, которые инкубировали при 37°С в течение 18 ч и  затем оценивали. Учето жизнеспособных микроорганизмов проводили для проверки того, что в лунки был добавлен бактериальный раствор с правильной концентрацией бактерий. Разбавленный бактериальный раствор (от 4 до 5×10 КОЕ/мл) разводили 1:10 в сторону уменьшения, добавляя от 100 мкл до 900 мкл стерильного солевого раствора в стерильные пробирки, и продолжали серийные разведения 1:10 для 5 пробирок. 100 мкл (4-5 капли) в 4-го и 5-го разведения (пробирка 4 = 10 и пробирка 5 = 10 КОЕ/мл) высевали в двух повторностях на предварительно высушенные чашки с агаром PCA и инкубировали при 37°С в течение ночи. На следующий день подсчитывали число колоний на чашках и оценивали среднее количество в 100 мкл. Полученное значение умножали на 10 с получением количества жизнеспособных бактерий на мл.
Описание и идентификация изолятов
Staphylococcus aureus
Изоляты MRSA изначально культивировали на селективном хромогенном агаре для MRSA (Brilliance MRSA Chromogenic Agar, Oxoid). Были отобраны предполагаемые колонии на основании их появления на данном агаре, идентификация их как проводилась на основании характеристик колоний на неселективном агаре SBA и фенотипических характеристик, таких как окрашивание по Граму, положительный тест на каталазу, положительный тест на коагулазу (пробирочный тест на коагулазу с применением плазмы крови кролика) и фактораагглютинации (агглютинация с помощью латексного теста Oxoid Staphytect latex test), положительный результат в тесте Фогес-Проскауэра и способность производить кислоту из трегалозы. Положительная устойчивость к цефокситину позволила определить изоляты как MRSA.
Клональные комплексы MRSA определяли с помощью быстрого молекулярного типирования. Два штамма из исследованных не смогли пройти типирование с помощью  быстрого метода, как показано в Таблице 2 ниже.
Таблица 2
: Клональные комплексы MRSA согласно Примеру 1
<b>Организм/номер робразца</b>
<b>Клональный комплекс </b>
<b>Staph. aureus ATCC 29213 </b>
NA
MRSA 718
CC8
MRSA 741
CC8
MRSA 580
CC8
MRSA 622
CC22
MRSA 815
CC88
MRSA 844
CC22
MRSA 606
CC22
MRSA 786
CC88
MRSA 570
CC8
MRSA 773
TBD
MRSA 698
CC1
MRSA 787
CC8
MRSA 728
CC88
MRSA 713
CC8
MRSA 747
CC8
MRSA 616
CC5
MRSA 734
CC8
MRSA 516
TBD
MRSA 823
CC8
MRSA 778
CC8
MRSA 610
CC22
NA: не предусмотрено; TBD: изоляты не смогли пройти типирование с помощью быстрого метода и в настоящее время проводится их иднетификация с помощью традифионных методик.
Enterococcus
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
S. Pneumonia
Все изоляты  прошли упрощенную биохимическую идентификацию на основании Квинн и соваторов (Quinn et al., 1994, Clinical Veterinary Microbiology, Mosby Ltd, New York). Биохимическое профилирование позволило предположительно определить четыре из изолятов VRE как и оставшийся как . Все изоляты были идентифицированы на основании стандартного биохимического профилирования.
Тестируемый продукт и его хранение
Было получено соединение NCL812 аналитической степени чистоты (номер партии 20081214) с определенной активностью 1000 мг/г (т.е. 100%), и порошок хранили при температуре -20°С. Аликвоты (1 мл) раствора (25,6 мг/мл) готовили в ДМСО и хранили при -80°С, и размораживают непосредственно перед использованием.
Определение минимальной ингибирующей концентрации
Минимальные ингибирующие концентрации (мкг/мл) определяли с помощью метода микроразведений в среде, рекомендованного Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI) (Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Seventh Edition. CLSI M7-A7, 2006; Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard - Second Edition. CLSI M31-A2, 2002; Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; CLSI M2-A9, 2006).
Enterococcus faecalis
S. aureus
S. pneumoniae
50
90
МИК определяли как наименьшую концентрацию противомикробного агента, которая полностью ингибирует рост организмов в лунках микропланшета с микроразведениями при оценке невооруженным глазом. Пограничные значения МИК определяли путем визуальной оценки, а затем подтверждали с помощью планшет-ридера для ИФА, измеряя оптическую плотность при 450 нм. Рост бактерий (мутности) в лунках с противомикробным агентом сравнивали с уровнем роста (мутностью) в лунке с контролем роста (не содержащей противомикробный агент). Все изоляты тестировали в двух повторностях, если в результатах наблюдалась разница более чем в одно двухкратное разведение, тест повторяли в третий раз. Степень чистоты изолятов тщательно контролировать в процессе тестирования, пересевая подготовленный бактериальный инокулюм на чашки с SBA. Контрольные организмы (штамм ATCC 29212, штамм  ATCC 29213 и штамм ATCC 49619) использовали в ходе тестирования для оценки контроля качества. МИК для контрольных штаммов для ампициллина (составляющие 1,0, 2,0 и 0,06 мкг/мл, соответственно) определяли при каждом измерении в качестве внутреннего контроля качества. Значения МИК, МИК и диапазон МИК (минимальное и максимальное) рассчитывали для каждой из групп бактерий.
Результаты
Таблице 3
Таблице 4
Таблице 5
Таблице 6 ниже
S. pneumoniae
50
90
50
90
Значения МИК для ампициллина, полученные для контрольных штаммов АТСС, находились в пределах нормального диапазона, ожидаемого на основании рекомендаций CLSI. Значения МИК для NCL812 и ампициллина для каждого изолята указаны в  (изоляты MRSA), на  (изоляты VRE) и в (изоляты) ниже. Значения МИК, МИК, моду МИК и диапазон МИК для каждого из протестированных видов бактерий представлены в . За МИК принимали самую низкую концентрацию, которая ингибировала видимый рост для 50% изолятов. За МИК принимали самую низкую концентрацию, которая ингибировала видимый рост у 90% изолятов. Мода МИК представляет собой наиболее часто встречающееся значение МИК, а диапазон МИК -  полученные минимальные и максимальные значения МИК.
Таблица 3:
Staphylococcus aureus
Минимальные ингибирующие концентрации для индивидуальных изолятов  в соответствии с Примером 1
Таблица 4:
Enterococcus
Минимальные ингибирующие концентраций для индивидуальных изолятовв соответствии с Примером 1
Таблица 5:
Streptococcus pneumoniae
Минимальные ингибирующие концентрации для индивидуальных изолятов в соответствии с Примером 1
Таблица 6:
50
90
S.
pneumoniae
Значения МИК, МИК, мода МИК и диапазон МИК для NCL812 для австралийских изолятов MRSA, VRE и
50
90
S. pneumoniae
Значения МИК для NCL812 были согласованы в пределах видов и между каждым из трех видов. Значения МИК и МИК были оба равными (4 мкг/мл) для изолятов MRSA, VRE и , при этом менее 10% изолятов показали значения МИК либо на 1-2 разведение ниже или только на одно разведение выше этого значения.
На основании полученных результатов NCL812 представляет новый антибактериальный агент.
Пример 2:
Staphylococcus aureus
Влияние NCL812 на синтез макромолекул у
Материалы и методы
Тестируемые соединения
Тестируемое соединение NCL812 доставляли к экспериментальной установке в условиях температуры окружающей среды и затем хранили при 2-8°С до анализа. Стоковые растворы получали растворением сухого порошка NCL812 в 100% ДМСО до концентрации 6400 мкг/мл. Ванкомицин (кат. № 1134335), рифампицин (кат. № R-7382) и церуленин (кат. № C-2389) были приобретены у Sigma, ципрофлоксацин был получен от USP (кат. № 1134335), а линезолид был получен от ChemPacific (кат. №  35710).
Оценка минимальной ингибирующей концентрации
Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-Eighth Edition.
S. aureus
Метод оценки МИК соответствовал процедуре, описанной Институтом клинических и лабораторных стандартов или CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) CLSI document M07-A8 [ISBN 1-56238-689-1]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-19898 USA, 2009), и для проведения серийных разведений и переноса жидкостей использовали автоматизированное устройство для дозирования жидкостей. Для анализа  МИК использовали среду Мюллера-Хинтона II (MHB II- Becton Dickinson, Sparks, MD; Cat No 212322; Lot 9044411). Штамм ATCC 29213 служил в качестве штамма контроля качества, линезолид был использован как контроль качества антибиотика для проверки работы метода. NCL812 и линезолид растворяли в 100% ДМСО перед добавлением к питательной среде.
Оценка синтеза макромолекул
Бактерии и условия роста
S. aureus
Эффект NCL812 на синтез тотальной клеточную ДНК, РНК, клеточной стенки, белков и липидов был исследован с помощью ATCC 29213 . Клетки выращивали при 35°С в течение ночи на триптиказо-соевом агаре. Колонии с чашки использовали для инокуляции 10 мл среды Мюллера-Хинтона II (MHBII), культуру выращивали до ранней экспоненциальной фазы роста (OD600 = от 0,2 до 0,3) при инкубации в шейкере при 35°С и 200 об/мин.
Синтез ДНК, РНК и белков.
Когда клетки достигали ранней экспоненциальной фазы 100 мкл культуры добавляли в лунки с тремя повторностями, содержащими различные концентрации тестируемого соединения или контрольные антибиотики (5 мкл) при 20-кратной конечной концентрации в 100% ДМСО. Культура, обработанная 5% ДМСО, служила в качестве  контроля «без лекарственных агентов» во всех экспериментов. Клетки добавляли в MHBII при 105% для учета объема добавленного препарата в каждой реакции или в минимальную среду М9 для реакций синтеза белка. После 15 мин инкубации при комнатной температуре добавляли либо [3H] тимидин (синтез ДНК), либо [3H] уридин (синтез РНК), либо [3H] лейцин (синтез белка) по 0,5-1,0 мкКи на реакцию, в зависимости от эксперимента. Реакции проводили при комнатной температуре в течение 15-30 мин, затем  их останавливали добавлением 12 мкл холодной 5% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) или 5% ТХУ/2% казаминовой кислоты (только синтез белка). Реакционные смечи инкубировали на льду в течение 30 мин и преципитированное ТХУ вещество собирали на 25 мм GF/А фильтр. После трехкратной промывки с 5 мл холодной 5% ТХУ фильтры промывали два раза с помощью 5 мл 100% этанола, оставляли высушиваться, а затем считывали, используя жидкостной сцинтилляционный счетчик Beckman LS3801.
Синтез клеточной стенки
Бактериальные клетки в ранней экспоненциальной фазе роста переносили на минимальную среду М9 и добавляли в 1,5 мл пробирки Эппендорф (по 100 мкл на пробирку), содержащие различные концентрации тестируемого соединения или контрольных антибиотиков (5 мкл) в 20Х конечной концентрации в 100% ДМСО, как описано выше. После 5 мин инкубации при 37°С в каждую пробирку добавляли [14C] N-ацетилглюкозамин (0,4 мкКи/реакция) и инкубировали в течение 45 мин при 37°С в нагревательном блоке. Реакции останавливали путем добавления 100 мкл 8% SDS в каждую пробирку. Затем реакции нагревали при 95°С в течение 30 мин в нагревательном блоке, охлаждали, коротко центрифугировали и наносили на предварительно увлажнённые фильтры HA (0,45 мкм). После трехкратной промывки с 5 мл 0,1% SDS фильтры промывали два раза с помощью 5 мл деионизированной воды, оставляли высушиваться, а затем считывали с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика Beckman LS3801.
Синтез липидов
Бактериальные клетки выращивали до ранней экспоненциальной фазы роста в среде MHBII и добавляли в 1,5 мл пробирки Эппендорф (в трех повторностях), содержащие различные концентрации тестируемого соединения или контрольные антибиотики, как описано выше. После 5 мин инкубации при комнатной температуре добавляли [3H] глицерин по  0,5 мкКи на реакцию.
2
Реакции проводили при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем останавливали путем добавления 375 мкл смеси хлороформ/метанол (1:2) с последующим встряхиванием на вортексе в течение 20 секунд после каждого добавления. Затем к каждой реакции добавляли хлороформ (125 мкл), встряхивали на вортексе, и затем добавляли 125 мкл dHO и встряхивали на вортексе. Реакции центрифугировали при 13000 оборотах в минуту в течение 10 мин, а затем 150 мкл органической фазы переносили в сцинтилляционный флакон и оставляли высушиваться в вытяжном шкафу в течение по меньщей мере 1 часа. Затем считывали образцы с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика.
Результаты
S. aureus
Оценку восприимчивости проводили с NCL812 и штаммом  ATCC 29213 для определения концентраций лекарственного средства, необходимых для оценки синтеза макромолекул.
Таблице 7
Фигуры 11
16
Стандарты для тестирования противомикробной восприимчивости;. Девятнадцатое Информационное приложение
S. aureus
S. aureus
В  показано, что МИК для NCL812 составляла 4 мкг/мл, в то время как МИК для контрольного агента линезолид соответствовала установленному CLSI диапазону контроля качества (Институт клинических и лабораторных стандартов. , документ CLSI M100-S20 [ISBN 1-56238-716-2]. Институт Клинических и лабораторных стандартов, 940 West Valley Road, Suite 1400, Уэйн, штат Пенсильвания 19087-1898 США, 2010 г.). Преципитация NCL812 наблюдалась при ≥8 мкг/мл на чашках, подготовленных идентичным образом, но не инокулированных . Оценку ингибирования синтеза макромолекул проводили с использованием концентраций NCL812, эквивалентных 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 или 8-кратному значению МИК (4 мкг/мл) для ATCC 29213 (-) .
Таблица 7:
Staphylococcus aureus
Значения минимальных ингибирующих концентраций для NCL812 (робенидин) и линезолида в отношении  ATCC29213 согласно Примеру 2
Фигуре 2
Фигура 3
На  показано влияние NCL812 на синтез ДНК. NCL812 демонстрирует отсутствие ингибирования при 0,25-кратной МИК, 40% ингибирование при 0,5-кратной и примерно 95% ингибирование при МИК. Для сравнения, используемый в качестве контроля ципрофлоксацин демонстрировал 51% ингибирование при 8-кратной МИК (0,5 мкг мл). Результаты ингибирования синтеза РНК для NCL812 были очень схожи с данными по оценке синтеза ДНК, при этом рифампицин использовали в качестве положительного контроля (). Следует отметить, что преципитация наблюдалась при 4-8 кратной МИК в среде Мюллера-Хинтона II, используемой при анализе синтеза ДНК и РНК.
Фигура 4
Синтез белка ингибировался дозозависимым способом при 0,25, 0,5 и 1-кратных значениях МИК для NCL812, демонстрируя до 97% ингибирование при МИК (). Линезолид показал приблизительно 61% ингибирование синтеза белка при 8-кратной МИК (2 мкг/мл). В анализе синтеза белка преципитация NCL812 наблюдалась при 4 и 8-кратной МИК.
Фигуре 5
Фигура 6
На соединение NCL812 также показало в некоторой степени дозозависимое ингибирование синтеза клеточной стенки, хотя при этом наблюдалось значительное увеличение ингибирования при от 1- до 2-кратной МИК. Однако ингибирование снижалось до примерно 68% и 52% при 4- и 8-кратной МИК, соответственно. Преципитация NCL812 наблюдалась при 2-, 4- и 8-кратной МИК в минимальной среде М9, используемой для анализа синтеза клеточной стенки, и это является вероятной причиной снижения ингибирования. Для сравнения, используемый в качестве положительного контроля ванкомицин показал 96% ингибирование при 8-кратной МИК (2 мкг/мл).NCL812 показало профиль ингибирования в отношении синтеза липидов, схожий с тем, который был показан для синтеза ДНК и РНК, достигая примерно 90% ингибирования при МИК (). Используемый в качестве положительного контроля ингибитор церулинин показал 72% ингибирование при 8-кратной МИК (32 мкг/мл).
Фигура 7
представляет собой объединение результатов для всех пяти реакций синтеза макромолекул. Видно, что кривые ингибирования были сходными для каждого пути, что свидетельствует о глобальном ингибировании NCL812 нескольких путей одновременно. Возможно, что мишенью NCL812 является клеточная мембрана, в результате чего происходит утечка основных ионов и/или метаболитов, что приводит к глобальной остановке путей синтеза в клетке..
S. aureus
Таким образом, NCL812 ингибировало пути синтеза ДНК, РНК, белков, клеточной стенки и липидов в растущей культуре . Хотя отмечены некоторые случаи дозозависимого ингибирования синтеза, все пять макромолекулярных реакций синтеза были одинаково чувствительны к NCL812.
ПРИМЕР 3
:
Staphylococcus aureus
Влияние NCL812 на высвобождение АТФ у
Материалы и методы
Тестируемые соединения
Тестируемое соединение NCL812 доставляли в условиях температуры окружающей среды и затем хранили при 2-8°C до проведения анализа. Стоковые растворы получали растворением сухого порошка NCL812 в 100% ДМСО до концентрации 1600 мкг/мл. Полимиксин В был получен от Sigma (кат. № P-4932).
Тестируемый организм
S. aureus
ATCC 29213 был изначально получен из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Виргиния).
Анализ высвобождения АТФ
600
Люминесцентный анализ жизнеспособности клеток с системой CellTiter-Glo (Promega) был использован для измерения утечки АТФ из бактерий. Культуры выращивали до ранней экспоненциальной фазы (0,2-0,3 OD) в среде Мюллера-Хинтона II, затем обрабатывали семью различными концентрациями NCL812 или полимиксином В (положительный контроль) с использованием значений МИК для каждого соединения в качестве ориентиров (0, 0,25-, 0,5-, 1-, 2-, 3-, 4- или 8-кратная МИК). Отрицательный контроль обрабатывали 2% ДМСО, который представлял собой конечную концентрацию ДМСО в каждом анализе. После 30 мин воздействия лекарственным агентом клетки осаждали центрифугированием и супернатант анализировали на присутствие АТФ. Результаты учитывали в виде концентрации АТФ, высвобожденного в среду (мкм).
Результаты
S. aureus
МИК для NCL812 ранее была определена как 4 мкг/мл. Анализ высвобождения АТФ осуществлялся путем выращивания  до экспоненциальной фазы и последующего добавления лекарственного средства при кратных значениях МИК с целью выявления дозозависимого ответа.
Фигуре 8
S. aureus
Как показано на , используемый в качестве положительного контроля полимиксин B дозозависимым способом стимулировал высвобождение АТФ из клеток с максимальным высвобождением примерно 0,34 мкМ АТФ при 8-кратной МИК (256 мкг/мл). Высвобождение АТФ в присутствии NCL812 зависело от дозы при 0,5 - 1-кратной МИК, при этом максимальное высвобождение (0,33 мкМ) наблюдали при МИК (4 мкг/мл). Высвобождение АТФ затем фактически снижалось при 2-8-кратной МИК. Следует отметить, что в предыдущих исследованиях при 4-8-кратной МИК в среде Мюллера-Хинтона II наблюдалась преципитация NCL812.
S. aureus
S. aureus
Таким образом, соединение NCL812 демонстрировало дозозависимое высвобождение АТФ из активно растущих клеток . Высвобождение  АТФ из клеток в питательную среду достигало максимальных уровней при значениях МИК, и затем высвобождение АТФ снижалось при более высоких дозах. Полученные данные указывают на то, что NCL812 может взаимодействовать с клеточной мембраной , в результате чего происходит утечка жизненно важных метаболитов, таких как АТФ.
ПРИМЕР 4:
in vitro
Staphylococcus aureu
Антибактериальная активностьNCL812  в отношении метициллин-устойчивого и метициллин-чувствительного
Материалы и методы
Противомикробные агенты
Аликвоты стокового раствора NCL812 (25,6 мг/мл) готовили в диметилсульфоксиде, хранили при -80°С и размораживали непосредственно перед использованием. Ампициллин был получен от Sigma-Aldrich (Австралия). Противомикробные диски были получены от Thermo Fisher Scientific (Австралия).
Микроорганизмы
S. aureus
Были получены клинические изоляты MRSA, которые представляют собой наиболее растпространенные типы последодвательностей как для больничных MRSA (HA-MRSA), так и для внебольничных MRSA (CA-MRSA), которые описаны в Таблице 8 ниже. В качестве контрольного организма использовали  АТСС 49775. Идентификация изолятов была подтверждена общепринятыми способами фенотипической характеристики, в том числе с помощью пробы на коагулазу, теста Фогеса-Проскауэра, чувствительности к полимиксину B (300-единиц) и реакции латекс-агглюцинации белка А на стеклах (Staphytect Plus Protein A latex slide agglutination, Thermo Fisher Scientific, Австралия). Бактерии хранили при -80°С в 40% глицериновой среде, выращивали из стока на стандартном агаре с овечьей кровью (SBA) при 37°С. В последующих экспериментах были использованы только свежие культуры <24 ч.
Таблица 8:
Staphylococcus aureus
Наименование клона/изолята , тип, источник, антибиограмма, статус устойчивости к клиндамицину, тип мультилокусной последовательности (MLST), тип стафилококковой хромосомной кассеты mec (SCCmec), клональный комплекс, статус лейкоцидина Пантон-Валентина (PVL), тип spa для изолятов, используемых в соответствии с Примером 4
Staphylococcus aureus
S. aureus
S. aureus
MSSA; метициллин-чувствительный . HA-MRSA; больничный метициллин-устойчивый . CA-MRSA; внебольничный метициллин-устойчивый . Em; эритромицин. Ci; ципрофлоксацин. Gn; гентамицин. Tm; триметоприм. Te; тетрациклин. FA; фузидовая кислота. Rf; рифампицин. Mp; мупироцин.
Определение профиля устойчивости изолятов
Определение профиля восприимчивости к антибиотикам коллекции изолятов проводилось с помощью диско-диффузионного метода Кирби-Бауэра, как это рекомендовано Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI) на агаре  Мюллера-Хинтона. Изоляты выращивали в течение ночи на SBA при 37°С. Колонии суспендировали в физиологическом растворе. Мутность доводили до 0,5 по стандарту МакФарланда, суспензии распределяли по среде. Диски с антибиотиками согласно Таблице 9, ниже, переносили на инокулированную среду и анализировали после 24-часовой инкубации при 37°С. Изоляты, определенные как MRSA, которые не были устойчивыми к бета-лактаму на основании теста Кирби-Бауэра, выращивали из стока на агаре для подсчета колоний с добавлением 5 мкг/мл ампициллина, и подвергали их повторному тестированию, поскольку экспрессия PBP2a (Penicillin Binding Protein2a) может быть индуцирована путем воздействия бета-лактамных противомикробных агентов.
Таблица 9:
Интерпретационные размеры диаметра зоны для антибактериальных агентов для диско-диффузионный метода Кирби-Бауэра, использованного в соответствии с Примером 4
<b>Класс антибактериальных агентов</b>
<b>Агент</b>
<b>Содержимое диска</b>
<b>Интерпретационные размеры диаметра зоны (мм)</b>
<b>устойчивый</b>
<b>промежуточный</b>
<b>восприимчивый</b>
Аминогликозид
Гентамицин
10 мкг
≤12
13-14
≥15
Анзамицин
Рифампицин
5 мкг
≤16
17-19
≥20
Цефалоспорин
Цефалексин
30 мкг
≤14
15-17
≥18
Цефамицин
Цефотетан
30 мкг
≤12
13-15
≥16
Ингибитор фолатного пути
Триметоприм-сульфаметоксазол
1,25/23,75 мкг
≤10
11-15
≥16
Гликопептид
Ванкомицин
30 мкг
-
-
≥15
Линкозамид
Клиндамицин
2 мкг
≤14
15-20
≥21
Макролид
Эритромицин
15 мкг
≤13
14-22
≥23
Фторхинолон
Ципрофлоксацин
5 мкг
≤15
16-20
≥21
Тетрациклин
Тетрациклин
30 мкг
≤14
15-18
≥19
β-лактам/пенициллин
Пенициллин-G
10 единиц
≤28
-
≥29
β-лактам/пенициллин-стабильный пенициллин
Оксациллин
1 мкг
≤10
11-12
≥13
β-лактам/β- комбинация ингибиторов лактамазы
Амоксициллин- клавулановая кислота
20/10 мкг
≤19
-
≥20
Молекулярное определение белка А и генов mecA для подтверждения статуса MRSA
spa
mecA
mecA
spa
spa
mecA
spa
mecA
spa
mecA
mecA
spa
Идентичность изолятов была подтверждена генотипически при применении дуплексного с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленной на гены (белок А) и  (устойчивость к метициллину). Кроме того, изоляты тестировали на наличие генов и  с помощью ПЦР в реальном времени с использованием красителя SYBR Green. Приблизительно десять колоний из каждой ночной бактериальной субкультуры суспендировали в 1×фосфатном буферном растворе (рН 7,4) и перемешивали на вортексе. Из изолятов выделяли ДНК с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Австралия), следуя протоколам производителя. Матричную ДНК элюировали с помощью 50 мкл элюирующего буфера и использовали либо непосредственно в ПЦР, либо хранили при -20°С до амплификации ДНК, используя прямой (5'-TGATACAGTAAATGACATTG-3') и обратный праймер (5'-TTCTTATCAACAACAAGTTC-3') к гену  и прямой (5'-TTCGTGTCTTTTAATAAGTGAGG-3') и обратный (5'-ATGAAGTGGTAAATGGTAATATCG-3 ') праймер к гену(Invitrogen, Австралия). Стандартную амплификацию методом ПЦР проводили в объеме 20 мкл, содержащем 10 мкл HotStarTaq Plus Master Mix (Qiagen, Австралия), 0,5 мкм каждого праймера, 0,2 мкм каждого праймера и 3 мкл выделенной ДНК. Автоматизированный термоциклер (T100 Термоциклер, Bio-Rad) использовали для ПЦР-амплификации генови согласно следующим условиям: Этапы ПЦР (активация фермента при 95°C в течение 300 сек, с последующими 38 циклами амплификациями, включающими 94°C в течение 30 сек (денатурация), 50°C в течение 30 сек (отжиг праймеров) и 72°C в течение 38 сек (элонгация), и затем стадия охлаждения до 20° при необходимости); Этапы ПЦР в реальном времени (активация фермента при 95°C в течение 300 сек, с последующими 40 циклами амплификации, включающими 95°C в течение 15 сек (денатурация), 50°C в течение 20 сек (отжиг праймеров) и 70°C в течение 40 сек (элонгация), единичный этап - 95°C в течение 5 сек, единичный этап - 55°C в течение 20 сек, непрерывное построение кривых плавления при температуре от 95°C до 0°C  и стадия охлаждения 40°C в течение 30 сек. Амплифицированные фрагменты и размером 325 и 120 п.н., соответственно, выявляли при окрашивании GelRed после электрофореза в 2% агарозном геле.
Определение минимальной ингибирующей концентрации
in vitro
5
600
50,
90
Активности  NCL812 и ампициллина в качестве положительного контроля были определены путём микроразведений в среде, как рекомендовано CLSI, в среде Мюллера-Хинтона II со стандартизированным содержанием катионов. Микротитровальные планшеты, содержащие двукратные разбавления каждого противомикробного агента, инокулировали с ~ 10 КОЕ/мл каждого изолята в 100 мкл конечного объема. Планшеты инкубировали в течение 24 ч при 37°С. Мутность (поглощение при OD) измеряли с помощью микропланшетного спектрофотометра Bio-Rad Benchmark Plus с использованием Microplate Manager версии 5.2.1 (Bio-Rad). Предельные значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) определяли как наиболее низкую концентрацию противомикробного агента, измеренную при помощи спектрофотометра, ингибирующую рост бактерий. АТСС 49775 был включен коллекцию изолятов в качестве контрольного организма, с предельными значениями, определенными CLSI. Рассчитывали значения МИКМИК (концентрации, ингибирующие рост ниже 50% и 90% от общего объема организмов, соответственно), и диапазон МИК (минимальное и максимальное значения) для определения профиля чувствительности к противомикробным агентам у коллекции изолятов.
Бактерицидная активность
Бактерицидная активность NCL812 была установлена путём определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) и анализа «время-элиминация» (time-kill) с использованием рекомендаций CLSI. МБК была определена, как самая низкая концентрация лекарственного агента, при которой было элиминировано 99,95% от исходного инокулюма.
10
5
S. aureus
Анализ «время-элиминации» (time-kill assay) для АТСС 49775 проводили в среде Мюллера-Хинтона II со стандартизированным содержанием катионов в микротитровальных планшетах также в объеме 10 мл для анализа макроразведений при концентрациях противомикробных агентов, эквивалентных 1× и 4× МИК. Бактерицидную активность в анализах макроразведений определяли как уменьшение 3log от исходного размера инокулюма. Бактерии культивировали в течение ночи при 37°С на SBA. Колонии суспендировали в среде и мутность доводили до 0,5 по стандарту МакФарланда, чтобы получить бактериальную суспензию ~10-КОЕ/мл. Бактериальные суспензии инкубировали при 37°С в шейкере-инкубаторе. Аликвоты отбирали через  0, 1, 2, 4, 8, 12 и 24 ч после добавления противомикробного агента, разбавляли, высевали в SBA и инкубировали в течение 48 часов при 37°С для определения количества жизнеспособных организмов. Турбидиметрические кривые роста для были получены для анализа микротитровальных планшетов путем мониторинга изменения оптической плотности, с использованием планшетного спектрофотометра Benchmark Plus Bio-Rad при 600 нм. Оптическую плотность измеряли через 0, 1, 2, 4, 8, 12, и 24 ч после добавления противомикробного агента.
Статистические методы
Микробиологические данные интерпретировали с использованием рекомендаций CLSI. Данные исследовали с помощью t-теста Стьюдента, точного критерия Фишера, дисперсионного анализа и обобщенной линейной модели для тестирования межсубъектных эффектов, где это было необходимо. Различия считались статистически значимыми при уровне 0,05 при использовании программного обеспечения IBM SPSS версии 19.0.
Результаты
Подтверждение индентификации Staphylococcus aureus и статуса гена mecA
S. aureus
spa
S. aureus,
Staphylococcus spp
Staphylococcus pseudintermedius
mecA
mecA
mecA
Реакция латекс-аглюцинации подтвердила, что все 30 изолятов являлись положительными на присутствие белка А. При использованиии агглютинации на стеклах изоляты дали положительную реакцию на коагулазную активность. Проба Фогеса-Проскауера и тест на устойчивость к полимиксину B подтвердили, что все изоляты принадлежали к кроме единственного метициллин-чувствительного изолята MSSA DE-25, как показано в Таблице 10, ниже. На основании ПЦР-амплификации гена  это изолят не был идентифицирован как изолят несмотря на положительный результат в тесте латекс-агглютинации на белок А и коагулозный тест на стеклах. Этот изолят , полученный от собак, был идентифицирован как  на основе биохимических характеристик. Результаты стандартной ПЦР и ПЦР в реальном времени для гена подтвердили, что 66,66% изолятов были отнесены к метициллин-устойчивым на основании присутствия гена . Никаких существенных различий между стандартной ПЦР и ПЦР в реальном времени по способности определять наличие гена обнаружено не было (P>0,05).
Таблица 10:
S. Aureus
Процент предположительно индетифицированных изолятов , демонстрирующих положительный ответ в выбранных фенотипическиз и генотипических тестах в соответствии с Примером 4
S. aureus
S. aureus
S. aureus
S. aureus
mecA
HA-MRSA; больничный метициллин-устойчивый  . CA-MRSA; внебольничный метициллин-устойчивый . Изоляты   были идентифицированы как положительные в тесте латекс-агллютинации с белком А (Белок A), тесте на коагулазу на стеклах, тесте Фогес-Проскауэра и устойчивости к полимиксину B, а также как давшие положительный ответ при амплификации гена spa методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР в реальном времени. Метициллин-устойчивые изоляты  были идентифицированные как изоляты, положительные по критериям, описанным выше, а также положительными при анализе гена  методом ПЦР и ПЦР в реальном времени.
Таблица 11:
S. aureus
Устойчивость изолятов  к антибактериальным агентам с использованием диско-диффузного метода Кирби-Бауэра в соответствии с Примером 4
S. aureus
S. Aureus
HA-MRSA; больничный метициллин-устойчивый . CA-MRSA; внебольничный метициллин-устойчивый .
Определение профилей чувствительности к антибиотикам у Staphylococcus aureus
mecA
Анализ чувствительности к антибиотикам показал, что изоляты HA-MRSA имели высший средний показатель распространенности устойчивости к нескольким классам антибиотиков (P<0,000). Изоляты CA-MRSA были следующими по устойчивости (Р<0,007), а вслед за ними - метициллин-чувствительные стафилококки (Р<0,037), как показано в Таблице 11 ниже. Устойчивость к оксациллину наблюдалась только у 80,00% и 10,00% изолятов HA-MRSA и CA-MRSA, соответственно. Устойчивость к цефотетану наблюдалась у 80,00% и 20,00% изолятов HA-MRSA и CA-MRSA, соответственно. Хотя оксациллин и цефотетан существенно не различались по способности выявлять MRSA (P>0,05), детекция была значительно улучшена при использовании ПЦР для гена , при сравнении с диско-диффузным методом (Р<0,013). Большинство изолятов HA-MRSA проявляли устойчивость к амоксициллин-клавулановой кислоте, цефотетану, цефалексину, клиндамицину, эритромицину, оксациллину, пенициллину G, в то время как большинство изолятов CA-MRSA были устойчивы только к клиндамицину, эритромицину, пенициллину-G. Ни один из протестированных изолятов не был устойчив к ванкомицину. В целом, наиболее распространенными были устойчивые фенотипы, устойчивые к пенициллину G (83,33%), эритромицину (73,33%) и клиндамицину (43,33%), в то время как лишь единичные изоляты (3,33%) были устойчивы к триметоприм-сульфаметоксазолу и рифампицину.
Взаимодействия в пределах генного комплекса mec
mec
mec
mec,
У всех изолятов MRSA, принадлежащих к типу Агенного комплекса , наблюдалась устойчивость к оксациллину и цефотетану, как показано в Таблице 12, ниже. Однако только 20% изолятов MRSA с типом B генного комплекса были фенотипически устойчивы к этим антибактериальным агентам. Среди изолятов MRSA, содержащих тип С2 генного комплекса только у одного изолята наблюдалась метициллин-устойчивость к оксациллину, и только у двух изолятов наблюдалась устойчивость к цефотетану. У не классифицированных изолятов  MRSA наблюдалась полная устойчивость к оксациллину и цефотетану.
Таблица 12:
S. aureus,
Количество и процент идентифицированных генных комплексов mec у 20 штаммов классифицированных как метициллин-устойчивые в соответствии с Примером 4
Генный комплекс mec (число изолятов)
Типы SCCmec
Оксациллин-устойчивые изоляты
Цефотетан-устойчивые изоляты
A(n=4)
II
3 (100%)
3 (100%)
III
1 (100%)
1 (100%)
Всего
4 (100%)
4 (100%)
B(n=10)
I
1 (50%)
1 (50%)
IV
1 (12,5%)
1 (12,5%)
Всего
2 (20%)
2 (20%)
C2(n=4)
V
1 (25%)
2 (50%)
Всего
1 (25%)
2 (50%)
Неклассифицированные(n=2)
Всего
2 (100%)
2 (100%)
SCCmec
mecA
mecA
Указаны соответствующие комплексы стафилококковой хромосомной кассеты () и типы, проявляющие фенотипически устойчивость к оксациллину и цефотетану,  а также статус при анализе гена  методом ПЦР в реальном времени, и средние отрицательные пики dF/dT, полученные в анализе кривых плавления для гена  методом ПЦР в реальном времени.
mecA,
mec
mec
SCCmec
Фигура 9
Пики точек плавления на графике отрицательных производных -dF/dT, полученных при ПЦР в реальном времени для гена отличались между типами комплекса генов  (P<0,003) () В среднем, тип B генного комплекса  и неклассифицированные изоляты демонстрировали более высокие значения пиков температуры плавления, чем другие типы (P<0,012).
Физические свойства тестируемых антибактериальных агентов и сравнение результатов оценки минимальных ингибирующих концентраций с исходным аналогичным тестированием
Тестируемые противомикробные агенты были выбраны на основании их растовримости и противомикробной активности из предварительных исследований. При растоврении NCL812 в среде Мюллера-Хинтона II со стендартизированным содержанием катионов наблюдали образование белесоватых преципитатов, как показано в Таблице 13 ниже. На основании исходного тестирования структуры и активности каждого синтезированного аналога было показано, что NCL812 обладает согласованными значениями МИК в настоящем исследовании.
Таблица 13:
Характеристики антибактериального агента NCL812 и β-лактамного антибактериального агента ампициллина в соответствии с Примером 4
Соединение
Растворимость
Исходные значения МИК (мкг/мл) при 24 ч<sup>1</sup>
Наблюдаемые значения МИК (мкг/мл) при 24 ч
ДМСО
CAMHB
MRSA580
MRSA698
MRSA580
MRSA698
ATCC 49775
NCL812
Хорошая
Белесоватый преципитат
4
4
4
4
4
Ампициллин
Хорошая
Хорошая
>128
16
>128
16
0.25
S. aureus
S. aureus
S. aureus
S. aureus
Подробное описание растворимости антибактериальных агентов в диметилсульфоксиде (ДМСО), в среде Мюллера-Хинтона II со стендартизированным содержанием катионов (CAMHB), и средние значения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) (мкг/мл при 24 ч) в отношении метициллин-устойчивых (MRSA), которые были определены в предварительных исследований и в ходе настоящего исследования. ATCC 49775; метициллин-чувствительный изолят  и контрольный штамм ATCC. MRSA580; метициллин-устойчивый изолят  #580. MRSA698; метициллин-устойчивый изолят  #698.
Антибактериальная активность In vitro: минимальные ингибирующие концентрации
50
90
Таблице 14, ниже
S. aureus
Значения МИК и МИК для соединения NCL812 (4- и 4-8 мкг/мл) приведены в . Значения МИК отличались у разных классов (восприимчивые, HA- или CA-MRSA) (P<0,005). Во многих случаях соединение NCL812 показывало значительно более высокую активность против CA-MRSA и метициллин-чувствительных стафилококков при одном разведении, при сравнении  с HA-MRSA (P<0,002 и P<0,020, соответственно), однако не было обнаружено существенных различий между значениями МИК для метициллин-чувствительных стафилококков и СА-MRSA (P>0,05). Значения МИК для ампициллина, полученные для контрольного штамма ATCC, находились в пределах нормального диапазона, ожидаемого на основании рекомендаций CLSI.
Таблица 14:
in vitro
S. aureus
Активность  нового антибактериального агента NCL812 и β-лактамного антибактериального агента ампициллина в отношении клинических изолятов  в соответствии с Примером 4
Организм и противомикробный агент
МИК (мкг/мл)
МБК (мкг/мл)
(число протестированных изолятов)
МИК<sub>диапазон</sub>
МИК<sub>50</sub>
МИК<sub>90</sub>
МБК<sub>диапазон</sub>
МБК<sub>50</sub>
МБК<sub>90</sub>
Метициллин-чувствительный стафилококки (n=10)
NCL812
2-8
4
4
2-8
4
8
Ампициллин<sup>1</sup>
0,25-16
0,25
8
-
-
-
HA-MRSA (n=10)
NCL812
4-8
4
8
4-8
8
8
Ампициллин<sup>1</sup>
16->128
64
>128
-
-
-
CA-MRSA (n=10)
NCL812
2-4
4
4
2-4
4
4
Ампициллин<sup>1</sup>
8-128
64
128
-
-
-
Общее число бактериальных изолятов (n=30)
NCL812
2-8
4
8
2-8
4
8
Ампициллин<sup>1</sup>
0,25->128
16
128
-
-
-
S. aureus
S. aureus
50
90
HA-MRSA; больничный метициллин-устойчивый . CA-MRSA; внебольничный метициллин-устойчивый . МИК; минимальная ингибирующая концентрация (мкг/мл). МБК; минимальная бактерицидная концентраций (мкг/мл). Диапазон МИК/МБК; минимальный и максимальные значения МИК/МБК лдя всех изолятов. МИК/МБК; значение МИК/МБК, при котором ингибируется 50% изолятов. МИК/МБК; значение МИК/МБК, при котором ингибируется 90% изолятов.
Антибактериальная активность in vitro: минимальные бактерицидные концентрации
S. aureus
Таблица 14
Значения МБК, определенные для NCL812, были эквивалентны МИК для 93,33% и 83,33% изолятов , соответственно (). Во всех остальных случаях значения МБК были на одно разведение выше. Для NCL812 диапазон значений МБК составил 2-8 мкг/мл и 4-16 мкг/мл, соответственно.
Исследования «время-элиминация» (time-kill studies)
По сравнению с турбидиметрической кривой роста для ATCC 49775, видимого роста бактерий не наблюдалось при инокуляции АТСС 49775 в среде Мюллера-Хинтона со стандартизированным содержанием катионов с добавлением NCL812 при 1× и 4× МИК при анализе методом микроразведений (P< 0,033 и P<0,038, соответственно)
Фигура 10
().
Фигура 11
При анализе методом макроразведений в 10 мл в среде с добавлением противомикробных агентов при 1× и 4× МИК и инокуляции ATCC 49775 наблюдалось значительное снижение количества жизнеспособных микроорганизмов для обеих концентраций NCL812, по сравнению с ростом в контрольной группе (0,000<P<0,008) (). Кроме того, профили «время-элиминация» (time-kill profiles) для обеих концентраций NCL812 значительно не отличались (P>0,05). Оба при обеих концентрациях бактерицидные свойства сохранялись примерно в течение 8-12 ч после добавления, где наблюдался возобновление роста бактерий. Значительное варьирование в элиминирующей активности NCL812 наблюдалось после 8-24 ч. Хотя после 24 часов соединение NCL812 более не проявляло бактерицидной активности, количество живых клеток при 1× МИК оставалось значительно более низким, по сравнению со значениями для среды без добавок (P<0,046).
in vitro
S. pseudintermedius
S. aureus
Таким образом, пример, изложенный выше, показывает бактерицидную активность по отношению как к метициллин-чувствительным стафилококкам, так и к метициллин-устойчивым стафилококкам. Значения МИК и МБК были стабильно низкими для разных изолятов (диапазон МИК 2-8 мкг/мл). NCL812 сохраняет хорошую противомикробную активность  в отношении распространенных изолятов MRSA со множественной лекарственной устойчивостью, в том числе вызывающие эпидемии изоляты UK EMRSA-15, EMRSA-16 и EMRSA-17, Irish EMRSA-1, AUS EMRSA-3, NY/JAPAN HA-MRSA и доминирующие клоны CA-MRSA. Соединение NCL812 было также активно в отношении одного изолята, который был первоначально идентифицирован как штамм .
S. aureus
Предварительное тестирование позволяет предположить, что мишенью соединения NCL812 является клеточная мембрана , в результате чего происходит дозозависимое высвобождение жизненно важных метаболитов, таких как АТФ. Нарушение мембранного бислоя бактерий или белков, которые являются важной составляющей функционирования мембраны у бактерий, является мишенью для многочисленных крупных групп противомикробных агентов, которые широко распространены в природе; в том числе гликолипидов, липопептидов, липопротеинов, жирных кислот, нейтральных липидов, фосфолипидов и биосурфактантов. Хотя NCL812 является искусственным соединением с низкой молекулярной массой (≤500-DA), оно, по-видимому, оказывает аналогичное с другими противомикробными агентами бактерицидное действие, которое нацелено на грамположительную клеточную мембрану, в том числе с таким, как высокомолекулярный противомикробный агент из группы циклических липодепсипептидов даптомицин или низкомолекулярное соединение HT61, производное хинолона, химическая структура которого на настоящий момент недоступна. Многие из таких липофильных антибактериальных агентов также не эффективны в отношении грамотрицательных микроорганизмов из-за наличия наружного липидного слоя двухслойной мембраны, в котором находятся узкие каналы порины, которые препятствуют проникновению некоторых соединений в клетку.
in vitro
Нерастворимость NCL812 даже в низких концентрациях в микробиологических средах может отражать амфипатическую и олигомерную природу этого противомикробного агента и предполагается, что реальная МИК может быть значительно ниже, чем наблюдаемое значение, так как существует вероятность того, что NCL812 является биологически активным только в растворе. В исследованиях «время-элиминация» соединение NCL812  проявляло быструю бактерицидную активность  в отношении АТСС 49775. Эти данные также согласуются с профилем в анализе «время-элиминация» для ингибиторов функции клеточной мембраны, таких как даптомицин и HT61.
in vitro
in vitro
in vivo,
in vivo
Важно отметить, что видимый короткий период полураспада  этого противомикробного агента приводил к возобновлению бактериального роста, который наблюдался через 12 ч после добавления противомикробного агента. Это указывает на то, что если жизнеспособная бактериальная популяция выживает после первоначального воздействия NCL812 до инактивации противомикробного агента, то произойдёт возобновление бактериального роста. Развитие устойчивости к NCL812 в этих исследованиях было исключено, поскольку тестиремые бактерии остались восприимчивы к NCL812 после сбора, промывок и тестирования МИК. Хотя видимый короткий период полураспада NCL812 может быть желаемой характеристикой для будущего применения  это указывает на то, что NCL812 следует вводить каждые 8 часов в последующих экспериментах  по исследованию безопасности и для поддержания адекватной системной концентрации, хотя из профиля «время-элиминация» представляется, что серии соединения NCL являются скорее зависимыми от концентрации, чем зависимыми от времени противомикробными агентами.
mecR
mec
mecA
mecA
Staphylococcus spp
Для преодоления метициллин-чувствительного фенотипа увеличение времени инкубации диффузии дисков с 24 до 48 часов компенсирует медленную дерепресию гена . Хотя эффект более длительной инкубации не был изучен, и малый размер выборки изолятов MRSA препятствует дальнейшему изучению взаимодействий генного комплекса , генетические методы значительно улучшили чувствительность, по сравнению с фенотипическими методами подтверждения статуса  у изолятов в настоящем исследовании. Хотя генетические методы не всегда используются в качестве рутинного метода обнаружения MRSA, идентификация присутствия гена визолятах  с помощью ПЦР в реальном времени остается золотым стандартом диагностики.
ПРИМЕР 5
in vitro
Streptococcus pneumoniae
: Фармакодинамика  нового противомикробного агента для .
Материалы и методы
Пневмококковая чувствительность к антибиотикам
Пневмококковые штаммы и условия роста
et al
Infect Immun
et al
J. Infec. Diseases
et al
Infect Immun
et al
Science
et al
J. Exp Med
et al
Nature Reviews Microbiology
in vivo
,
Таблица 15
Объектами данного исследования были двадцать пневмококковых изолятов, которые состоят из шести охарактеризованных лабораторных штаммов и 14 клинических изолятов (P9/6A, P21/3, WCH16/6A, WCH43/4, WCH46/4, WCH57/8, WCH77/5, WCH86/4, WCH89/7, WCH92/4, WCH137/6A, WCH158/19F, WCH184/19F and WCH211/11; штамм/серотип, соотвественно). Также в данном примере были использованы другие изоляты: A66.1/3 (Francis ., 2001. . 69: 3350-2358); EF3030/19F (Briles ., 2003 . 188:339-348); L82016/6B (Briles ., 2000 . 68:796-800); TIGR4/4 (Tettlelin ., 2001  293:498-506) и WU2/3 (Briles ., 1981 . 153:694-705). Фенотипические характеристики изолятов, использованных в настоящем исследовании, см. в Таблице 15 ниже. В качестве контроля роста для всех исследований МИК и МБК был использован контрольный штамм D39 (Avery ., 2010  8:260-271)  из Национальной коллекции типовых культур (NCTC, The National Collection of Type Cultures). D39 позже был взят для исследования кинетики элиминации клеток, оценки устойчивости и анализа методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), поскольку этот штамм является широко исследованным лабораторным штаммом с определенным патогенезом ()что отразилось в согласованных значениях МИК и МБК для NCL812.
Таблица 15:
Пневмококковые изоляты и их фенотипическое описание в соответствии с Примером 5
<b>Щтамм</b>
<b>Фенотипическое описание</b>
<b>ИД</b><sub><b>50</b></sub>
D39(NCTC 7466)
Плоские, округлые, ширина 1 мм, темно-зеленые, α-гемолиз
10<sup>2 *</sup>
A66.1
Слегка выпуклые, волнообразные, нерегулярной формы, колонии шириной 2 мм, глянцеватые, темно-зеленые, мукодиные. α-гемолиз
8×10<sup>3 </sup>(10,98)
EF3030
Слегка выпуклые, волнообразные, нерегулярной формы, колонии шириной 2 мм, глянцеватые, темно-зеленые, мукодиные. α-гемолиз
≥10<sup>5 *</sup>
L82016
Плоские, округлые, шириной 1 мм, бледно-зеленые, α-гемолиз
≥10<sup>5 *</sup>
P9
Плоские, округлые, колонии шириной 0,5 мм, глянцеватые, светло-зеленые, α-гемолиз
10<sup>4*</sup>
P21
Слегка выпуклые, волнообразные, нерегулярной формы, колонии шириной 4 мм, глянцеватые, темно-зеленые, мукоидные, α-гемолиз
≤10<sup>1 *</sup>
TIGR4
Плоские, округлые, шириной 1 мм, бледно-зеленые, α-гемолиз
10<sup>4*</sup>
WU2
Слегка выпуклые, волнообразные, нерегулярной формы, колонии шириной 4 мм, глянцеватые, темно-зеленые, мукоидные. α-гемолиз
5×10<sup>12 *</sup>
WCH16
Плоские, округлые, шириной 1 мм, бледно-зеленые, α-гемолиз
5×10<sup>4*</sup>
WCH43
Плоские, округлые, шириной 1 мм, бледно-зеленые, α-гемолиз
10<sup>2*</sup>
WCH46
Плоские, округлые, шириной 1 мм, бледно-зеленые, α-гемолиз
10<sup>4*</sup>
WCH57
Слегка выпуклые, волнообразные, нерегулярной формы, колонии шириной 2 мм, глянцеватые, темно-зеленые, мукоидные. α-гемолиз
10<sup>4*</sup>
WCH77
Слегка выпуклые, округлой формы, колонии шириной <1 мм, глянцеватые, темно-зеленые, незначительный α-гемолиз.
10<sup>4 *</sup>
WCH86
Плоские, округлые, шириной 1 мм, бледно-зеленые, α-гемолиз
10<sup>4*</sup>
WCH89
Плоские, округлые, шириной >1 мм, бледно-зеленые, α-гемолиз
≥10<sup>5*</sup>
WCH92
Плоские, округлые, шириной 1 мм, темно-зеленые, α-гемолиз
≤10<sup>4*</sup>
WCH137
Слегка выпуклые, округлой формы, колонии шириной <1 мм, глянцеватые, темно-зеленые, незначительный α-гемолиз.
ND
WCH158
Округлые, заглубленные, шириной 1 мм, темно-зеленые, α-гемолиз
10<sup>5*</sup>
WCH184
Плоские, округлые, шириной 1 мм, темно-зеленые, α-гемолиз
10<sup>8</sup>(14)
WCH211
Плоские, округлые, шириной >1 мм, темно-зеленые, α-гемолиз, нерегулярной формы
5×10<sup>6*</sup>
ND = не определено.
in vitro
2
2
Для всех исследований  свежие пневмококковые изоляты выращивали в течение ночи (O/N, overnight) в чашках Петри на агаре с кровью лошади (HBA, horse blood agar) (39 г/л Основа колумбийского кровяного агара [Oxoid] 5% [об./об.] дефибринированная кровь лошади [Oxoid]) при 37°C с добавлением 5% CO. Кровяной агар Мюллера-Хинтона с 5% дефибринированной овечьей кровью (MHSBA Roseworthy Media and Blood Service) был использован для диско-диффузного анализа в соответствии со стандартами Клинического института лабораторных стандартов (CLSI). Пневмококков выращивали в среде, содержащей 4% лизированной крови лошади (LHB, lysed horse blood) в среде Мюллера-Хинтона со стандартизированным содержанием катионов (CAHMB, Cation Adjusted Mueller Hinton Broth) [Difco] при 37°С с добавлением 5% CO. Среда с лошадиной сывороткой (HSB, Horse serum broth, 10% (об./об.) донорной лошадиной сыворотки в среде [10 г/л пептона, 10 г/л Lab Lemco (Oxiod) и 5 г/л NaCl]) также была использована в некоторых исследованиях МИК. Изоляты хранили в HSB при -80°С.
Стоковые растворы антибиотиков и реагенты
NCL812 был получен в виде сухого порошка. Всего 256 мг было разведено в 10 мл 100% ДМСО для приготовления стокового раствора 25,6 мг/мл, который затем разбавляли в соотношении 1:100 в CAHMB для получения окончательного рабочего стокового раствора 256 мкг/мл. Ампициллин в виде сухого порошка был получен от Sigma A0166. Исходный стоковй раствор 25,6 мг/мл разбавляли в солевом растворе в соотношении 1:100, 1:4, 1:20 и 1:16 в CAMHB с получением окончательного рабочего стокового раствора 0,18 мкг/мл. Эритромицин был  приобретен у Sigma Aldrich, хлорид холина был получен от Roche Diagnostics. Двадцать микролитров раствора эритромицина с концентрацикй 0,05 мкг/мл разбавляли в соотношении 1:25 в 4,980 миллилитрах CAMHB для получения конечного рабочего стокового раствора 0,2 мкг/мл. Холин хлорид (0,5%) добавляли в 4% LHB CAMHB для отдельных исследований кинетики элиминации (kill kinetic assays).
Определение чувствительности к антибиотикам у пневмококковых изолятов
Таблица 16
Таблица 16
Streptococcus pneumoniae
600nm
2
2
Восприимчивость изолятов к 12 разным противомикробным агентам () была определена методами согласно CLSI и Европейскому комитету по тестированию противомикробной восприимчивости (EUCAST). Противомикробные агенты были выбраны на основании рекомендаций CLSI и EUCAST. Стандартизированные бактериальные суспензии наносили на MHSBA с помощью стерильного ватного тампона. [Бактериальные суспензии  были стандартизированы по OD между 0,08 и 0,1 с использованием спектрофотометра, а затем разбавлены в соотношении 1:20. Бактериальные колонии были взяты с O/N чашек Петри с агаром с лошадиной кровью. Для проверки чистоты бактериальной суспензии 1:20 50 мкл суспензии на носили на агар с лошадиной кровью и инкубировали O/N при 37°С с 5% СО. КОЕ рассчитывали и сравнивали с исходными количеством на чашках.] Диски с антибиотиками (приобретены у Sigma Aldrich) были размещены с помощью дискового дозатора (приобретен у Oxoid) в соответствии со стандартами CLSI. Планшеты MHSBA инкубировали в течение 16-24 часов при 37°С в 5% СО. Зоны полного ингибирования измеряли в трех повторностях с точностью до миллиметра с помощью линейки при оценке роста в естетственном освещении, и моду представляли как величину диаметра для каждого изолята. Пневмококковые изоляты классифицировали как чувствительные, промежуточные (I) и устойчивые (R) в соответствии с диапазонами стандартов CLSI и контролем качества (QC) ().
Таблица 16:
Антибактериальные агенты, используемые в диско-диффузном анализе со стандартами интерпретации для диаметров зон (мм) согласно Примеру 5
Стандарты интерпретации для диаметров зон (мм)
Класс антибиотиков
Противомикробный агент (мкг)
Устойчивый (R)
Устойчивый (R)
Устойчивый (R)
β-лактам
Оксациллин (1 мкг)°
≤20
≤20
≥20
Ампициллин (10 мкг)°
≤20
≤20
≥20
Амоксициллин-клавуланат (20/10 мкг) °
≤20
≤20
≥20
Фторохинол
Ципрофлоксацин (5 мкг)*
≤22
≤22
≥22
Ингибитор фолатного пути
Триметоприм сульфометоксазол (1,25/23,75 мкг)°
≤15
16-18
≥19
Гликопептид
Ванкомицин (30 мкг)°
-
-
≤17
Линкозамид
Клиндамицин (2 мкг) °
≤15
16-18
≥19
Макролид
Эротромицин (15 мкг) °
≤15
16-20
≥21
Кларитромицин (15 мкг) °
≤16
17-20
≥21
Фенкол
Хлорамфеникол (30 мкг) °
≤20
-
≥21
Рифамцин
Рифампин (5 мкг) °
≤16
17-18
≥19
Тетрациклин
Тетрациклин (30 мкг) °
≤18
19-22
≥23
S. pneumoniae
° Диаметры зон для противомикробных агентов, кроме ципрофлоксацина для определены согласно стандартам CLSI;
S. pneumoniae
* Диаметры зон для восприимчивости к ципрофлоксацину для  определены по EUCAST .
Определение МИК
, МИК
, диапазона МИК и МБК
, МБК
, диапазона МБК
50
90
50
90
Таблице 15
600
2
2
50
90
50
90
50
90
50
90
луночных
МБК
МБК
S.pneumoniae
МБК
МБК
МБК
МБК
Значения МИК для NCL812 всех изолятов, перечисленных в , определяли путем измерения оптической плотности OD (спектрофотометр Spectramax, Molecular Devices Corporation) в качестве показателя бактериального роста с использованием 96-микротитровальных планшетов после инкубации в течение 24 часов при 37°С в 5% СО. [Микроразведения в среде и 96-луночные планшеты получали следующим способом: наносили аликвоты 90 мкл 4% LHB: CAMHB во все лунки с помощью многоканальной пипетки. 90 мкл рабочих растворов противомикробных агентов не серийным способом разбавляли вниз по планшету в соотношении 1:2. Среду как отрицательный контроль и контроль разведения были учтены при планировании схемы расположения проб в 96-луночном планшете.] Затем 10 мкл бактериальной суспензии добавляли в соответствующие лунки 96-луночного планшета. В каждый анализ включали соответствующие контроли: положительный (без противомикробного агента), отрицательный (без противомикробного агента или бактерий) и отрицательный контроль для разведения (контрольное серийное разведение противомикробного агента и среды).  и число колоний на чашках при анализе кинетики элиминации определяли путем нанесения аликвоты 20 мкл из каждой лунки микротитрационного 96-луночного планшета на среду HB и инкубирования при 37°С с 5% СО.  определяли по 99,95% ингибированию  с учетом коэффициента разбавления. МИК и  были определяли в четырех повторностях и полученную моду принимали в качестве репрезентативного значения. МИК, МИК, диапазон МИК и МБК,  и диапазон МБК определяли в соответствии со стандартами CLSI. МИК и МИК или МБК и  определяли как самые низкие концентрации, которые, после того как все полученные значения МИК и  изолятов были отсортированы от низшего к высшему, ингибировали 50-й и 90-й перцентиль от общего количества изолятов, соответственно.
Анализ «время-элиминация» при микроразведениях в среде для NCL812 с использованием штамма D39
2
600
Бактериальные суспензии добавляли в трех повторностях в 96-луночный планшет, содержащий NCL812 с исходной концентрацией 128 мкг/мл и последовательно серийно разведенный в соотношении 1:2 до концентрации 0,25 мкг/мл. Отрицательные контроли разведения вычитали из медианного значения роста для получения подходящего показателя общей продукции бактерий. 96-луночный планшет инкубировали при 37°С в 5% СОи OD считывали каждые 2 часа в течение первых 12 часов, после чего конечное считывание проводили через 24 и 48 ч. Для дальнейшего расширения этих данных для подтверждения тенденции в кривых роста, наблюдаемых при исходных исследованиях микроразведений в среде, проводили отдельный эксперимент, в котором 96-луночный планшет автоматически считывали каждые полчаса с помощью спектрофотометра (Spectramax спектрофотометра, Molecular Devices Corporation) в течение 14 ч.
МБК и исследование «время-элиминация» для NCL812 с использованием штамма D39
«время-элиминация»
2
Оценку МБК проводили с использованием 96-луночных микропланшетов. В определенные моменты времени на основании аликвот, взятых с планшетов после инкубации при 37 градусах в 5% СО на HBA, оценивали количество жизнеспособных микроорганизмов, и определяли МБК после 24 часов роста.
Исследование «время-элиминация» при макроразведениях в среде для NCL812 с использованием D39
S. pneumoniae
2
2
Бактериальные суспензии и рабочие стоковые растворы антибиотиков получали как описано выше. [Для приготовления макроразведений в среде в каждую из 20 мл пробирок добавляли 9 мл 4% LHB:CAMHB. 9 мл рабочего стокового растора антибиотика разбавляли в соотношении 1:2 при добавлении к одной пробирок, и затем серийно разбавляли от высокой до низкой концентрации противомикробного агента. В соответствующие пробирки, в том числе с положительным контролем, добавляли 1 мл бактериальной суспензии . Пробирки инкубировали при 37°С с 5% СО при осторожном покачивании вручную пробирок с добавлением NCL812 каждые 10 мин в течение первых 12 часов. Каждые 2-3 часа в течение первых 12 часов роста, а затем через 24 часа и 48 часов, по 50 мкл каждой бактериальной суспензии высевали на HBA и инкубировали при 37°С с 5% СОв течение 16-24 часов.]
Таблице 17
2
2
В  ниже указаны концентрации, используемые для каждого противомиркобного агента. Культуры инкубировали при 37°С в 5% СО, осторожно наклоняя вручную через каждые 10 минут в течение первых 12 часов. Число жизнеспособных микроорганизмов из 50 мкл аликвот каждой концентрации учитывали после инкубации при 37°С в 5% СО в течение 24 часов. Значения pH каждого образца измеряли в заданные моменты времени с помощью индикаторных полосок рН. Сплошной рост определяли в том случае, когда на чашку насчитывалось более 1000 колоний. Бактерицидное действие определяли как 100-кратное снижение (99,9%) от исходнойсуспензии клеток, которое определяли через 24 часа для каждой концентрации.
Таблица 17:
Концентрация антибактериальных агентов, используемых в анализе макроразведений в среде согласно Примеру 5
Серийное разведение
NCL812 (мкг/мл)
NCL062 (мкг/мл)
Ампициллин (мкг/мл)
1
128
128
0,09
2
64
64
0,045
3
32
32
0,023
4
16
16
0,011
5
8
8
0,0065
6
4
7
2
Проверка устойчивости к NCL812
2
Макроразведения в среде проводили, как описано выше. Культуры штамма D39 (10 мл) инкубировали в присутствии 2 мкг/мл и 4 мкг/мл NCL812 и 0,022 мкг/мл ампициллина в течение 6 ч при 37°С в 5% СО. Образцы центрифугировали при центробежном ускорении 101,45 RCF (relative centrifugal force) в течение 10 мин и дважды промывали в 50 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) для удаления остатков противомикробных агентов и/или бактериальных конечных продуктов и среды. Промытые бактерии ресуспендировали,  и затем определяли МИК.
Влияние NCL812 на ультраструктуру клеточной мембраны D39.
Просвечивающая электронная микроскопия
2
С помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) определяли морфологические особенности и проводили морфометрический анализ клеточной мембраны. Бактериальные суспензии и 10 мл культуры D39 готовили, как описано выше. Образцы инкубировали при 37°С в 5% СО при осторожном ручном перемешивании  культур каждые 10 минут. К культурам добавляли 1 мкг/мл, 4 мкг/мл либо 16 мкг/мл NCL812, и собирали бактерии через 6 или 12 ч путем центрифугирования при RCF 101,45×g в течение 20 мин, и дважды промывали в 50 мл PBS. Критические моменты времени для работы ПЭМ определяли путем анализа тенденций в кривых роста, полученных из исследований кинетики элиминации. Образцы ресуспендировали в PBS, содержащем 20% глицерин, и хранили при -80°С до использования. Перед фиксацией удаляли 20% глицерин путем центрифугирования и трижды промывали на льду в 50 мл PBS.
S.pneumoniae
Образцы фиксировали с использованием модифицированных протоколов, определенных в предыдущем исследовании по изучению ультраструктуры клеточной стенки , (Hammerschmidt S. и др. 2005. Infect Immun 73:. 4653-4667).Процедура фиксации на основе ацетата лизина с использованием глутаральдегида-формальдегида рутения красного-осмия включала фиксацию бактериальных осадков с помощью какодилатного буферного раствора, содержащего 2% формальдегида, 2,5% глутарового альдегида, 0,075% рутения красного и 0,075 М ацетата лизина в течение 1 ч. После 3-кратной промывки в какодилатном буфере, содержащем 0,075% рутения красного, в течение 1,5 ч проводили вторую фиксацию в какодилатном буферном растворе, содержащем 2% формальдегида, 2,5% глутарового альдегида и 0,075% рутения красного. Затем клетки промывали три раза в какодилатном буферном растворе, содержащем 0,075% рутения красного, и подвергали окончательной фиксации в 1% тетроксиде осмия в какодилате, содержащим 0,075% рутения красного, в течение 1 часа. Затем образцы промывали три раза в какодилатном буфере, содержащем только 0,075% рутений красный.
Образцы промывали и обезвоживали при помощи градуированных серий этанола (70, 90, 95 и 100%) в течение 10-20 мин, по два раза для каждого этапа. Образцы инфильтрировали с помощью 50:50 смолы LR White в 100% этаноле в течение 1 ч, а затем промывали с 100% смолы LR White в течение 1 ч и оставляли O/N в третьей смене 100% смолы LR White для обеспечения адекватной инфильтрации смолы. Затем образцы заключали в свежую смолу LR White и инкубировали при 50°С в течение 48 ч. Получали срезы по 1 мкм с использованием стеклянного ножа, затем окрашивали толуидиновым синим и просматривали под световым микроскопом при 400-кратном увеличении для идентификации присутствия окрашенных пневмококков. Затем делали по меньшей мере четыре ультратонких среза толщиной 90 нм с использованием алмазного ножа и помещали на матричную решётку, по одному срезу на решетку. Ультратонкие срезы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца поочерёдно с 5-минутными интервалами с последующими тремя промывками дистиллированной водой в промежутках между каждой экспозицией. Окрашенные срезы помещали на решётки и просматривали при 25000-кратном и 130000-кратном увеличении на просвечивающим электронном микроскопе Philips CM100. Изображения были получены при 130000-кратном увеличении и проанализированы с помощью системы analySIS [Olympus Soft Imaging Systems].
Статистический анализ
Был проведен статистический анализ с помощью статистической программы GraphPad Prism (5-е изд, GraphPad Software Inc.) для Windows. Для кривых роста были представлены средние значения и стандартная ошибка среднего  (SEM) (представлены в виде планок погрешностей) для каждой точки, за исключением исследований макроразведений в среде, где не могло быть проведено несколько повторностей из-за высоких затрат, связанных с данным анализом. Проводили двусторонние, непарные t-тесты.
Результаты
Фармакодинамика NCL812 для S. pneumoniae
Контроль качества диско-диффузного анализа для 20 изолятов S. pneumoniae
Таблица 18 и Таблица 19
Таблица 19
Таблица 18
Хотя для девяти из двенадцати противомикробных агентов, использованных для диско-диффузного анализа, был установлен диапазон контроля качества (КК) от EUCAST, диапазоны КК не были определены для амоксициллина-клавуланата, кларитромицина и клиндамицина (). WCH16 и WCH184 были устойчивы по меньшей мере к двум антибактериальным агентам, тогда как изоляты EF3030 и WCH137 оказались промежуточным и устойчивым к триметоприм-сульфаметоксазолу, соответственно (). Другие оставшиеся шестнадцать изолятов были чувствительны ко всем двенадцати противомикробным агентам. Чувствительность к ампициллину была подтверждена для каждого изолята, что позволяет использовать ампициллин в качестве положительного контроля в последующих анализах микроразведений в среде ()).
Таблица 18:
S. pneumoniae
Восприимчивость к антибиотикам у 20 изолятов для шести различных антибактериальных агентов согласно Примеру 5
Голубые ячейки соответствуют чувствительным изолятам, оранжевые ячейки соответствуют промежуточным (I), зеленые - устойчивым (R) изолятам.
Таблица 19:
S. pneumoniae
Восприимчивость к антибиотикам у 20 изолятов для шести различных антибактериальных агентов согласно Примеру 5
Голубые ячейки соответствуют чувствительным изолятам, оранжевые ячейки соответствуют промежуточным (I), зеленые - устойчивым (R) изолятам.
Растворимость и активность NCL812 и NCL062 в различных средах
Таблица 20
20
Таблица 21  и Таблица 22
S. pneumoniae
Соединение NCL812 визуально имело более высокую растворимость в 100% ДМСО, по сравнению с NCL062, и давало мутный раствор только при дальнейшем его разбавлении в CAMHB или PBS (). Хотя растворитель CAMHB для NCL062 казался прозрачным при визуальной оценке (Таблица), дальнейшие исследования NCL062 с использованием разбавителя CAMHB выявили полную конфлюентность в анализе микроразведений в среде для шести изолятов  по сравнению с ростом с разбавителем ДМСО ().
Таблица 20:
Визуальный анализ растворимости NCL812, NCL062 и ампициллина согласно Примеру 5
Разбавитель
NCL812
NCL062
Ампициллин
CAMHB
Мутный
Прозрачный
Прозрачный
ДМСО
Прозрачный
Преципитат
Прозрачный
PBS
Преципитат
Преципитат
Прозрачный
Media
4% LHB: CAMHB
Мутный
Прозрачный
Прозрачный
10% среда с добавлением лошадиной сыворотки
Преципитат
Прозрачный
Прозрачный
Таблица 21:
Индивидуальные значения МИК для NCL062 для каждого пневмококкового изолята согласно Примеру 5
NCL062
МИК (мкг.мл<sup>-1</sup>)
МБК (мкг.мл<sup> -1</sup>)
D39
2
4
EF3030
16
16
A66.1
8
32
TIGR4
8
8
WU2
16
64
L82016
8
32
P9
4
16
P21
4
4
WCH158
16
16
WCH89
4
4
WCH57
4
8
WCH77
8
8
WCH46
32
32
WCH86
4
8
WCH137
2
4
WCH184
16
16
WCH16
32
32
WCH43
2
4
WCH92
8
8
WCH211
2
4
Таблица 22:
Различия в активности NCL812 и NCL062 в различных средах с использованием микроразведений в среде для оценки МИК в качестве показателя согласно Примеру 5
NCL062
Ампициллин
Изолят
Статус устойчивости к ампициллину
МИК(мкг/мл)
МБК(мкг/мл)
МИК(мкг/мл)
МБК(мкг/мл)
D39
Чувствительный
Конфлюентный
*
0,0225
*
A66.1
Чувствительный
Конфлюентный
*
0,045
*
WU-2
Чувствительный
Конфлюентный
*
0,0225
*
P21
Чувствительный
Конфлюентный
*
0,0225
0,045
WCH158
Чувствительный
Конфлюентный
64
0,0225
0,022
WCH57
Чувствительный
Конфлюентный
*
0,09
0,09
S. pneumoniae
Таблица 23
Таблица 24
Фигура 12
Рост штамма  D39 при анализе МИК для NCL812 и NCL062 с использованием 10% HSB (220 мл лошадиной сыворотки фильтровали до 10% в 180 мл в питательной среде LEMCO) привел к трехкратному увеличению МИК для штамма D39, обработанного NCL812 и NCL062 () с двукратным увеличением для положительного контроля - ампициллина. При различных условиях хранения предварительно подготовленных микротитрационных 96-луночных планшетов не наблюдалось изменений в МИК для D39 (). При макроразведениях в среде рН среды не изменялся, по сравнению с соответствующим контролем (.
Таблица 23:
S. pneumoniae
Рост штамма  D39 в исследовании по оценке МИК для NCL812 и NCL062 с использованием средц с добавлением лошадиной сыворотки
Сравнительные значения МИК с использованием разного типа сред для D39 (мкг.мл<sup>-1</sup>)
Противомикробный агент
4%LHB:CAMHB
Среда с добавлением 10% лошадиной сыворотки
Кратность увеличения
NCL812
4
32
3
NCL062
4
32
3
ампициллин
0,023
0,09
2
Таблица 24:
Хранение приготовленных микротитровальных планшетов для микроразведений в среде не вызывает изменений значений МИК для D39 согласно Примеру 5
Условия хранения
Противомикробный агент
-2°C
4°C
NCL812
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
NCL062
4 мкг.мл<sup>-1</sup>
4 мкг.мл<sup>-1</sup>
ампициллин
0,023 мкг.мл<sup>-1</sup>
0,023 мкг.мл<sup>-1</sup>
Определение восприимчивости S. pneumoniae к NCL812 и NCL062 in vitro
Определение МИК
, МИК
, диапазона МИК для NCL812 и NCL062
50
90
50
90
Таблица 25 и Таблица 26
Таблицы 25
26 и Фигура 13
NCL812 демонстрировал МИК и МИК, составляющие 8 мкг/мл, а диапазон МИК составил 4-8 мкг/мл, тогда как соответствующие значения для NCL062 были выше и более вариабельными (). МИК для ампициллина был сопоставим с недавно опубликованными результатами, полученными с помощью метода микроразведений, как ожидаемый результат для устойчивости к противомикробным агентам у пневмококковых изолятов, подтверждая тем самым достоверность МИК, полученных для NCL812 и NCL062 (-).
Таблица 25:
50
90
50
90
МИК, МИК, МБК, МБК и диапазон МИК для всех изолятов, обработанных NCL812, NCL062 и ампициллином согласно Примеру 5
NCL812 (мкг/мл)
NCL062 (мкг/мл)
Ампициллин (мкг/мл)
МИК<sub>50 </sub>
8
8
0,023
МИК<sub>90</sub>
8
32
0,023
Диапазон МИК
4-8
2-32
0,011 - 0,09
МБК<sub>50</sub>
8
16
0,023
МБК<sub>90</sub>
8
32
0,023
Диапазон МБК
4-8
4-64
0,011-0,09
Таблица 26:
Значения МИК для NCL812 для каждого пневмококкового изолята согласно Примеру 5
NCL812
Ампициллин
МИК (мкг.мл<sup>-1</sup>)
МБК (мкг.мл<sup>-1</sup>)
МИК (мкг.мл<sup>-1</sup>)
МБК (мкг.мл<sup>-1</sup>)
D39
4
8
0,023
0,023
EF3030
8
8
0,023
0,023
A66.1
8
8
0,045
0,045
TIGR4
4
8
0,023
0,023
WU2
4
8
0,023
0,023
L82016
8
8
0,023
0,023
P9
8
8
0,023
0,023
P21
4
8
0,023
0,023
WCH158
4
8
0,023
0,023
WCH89
4
4
0,023
0,023
WCH57
8
8
0,023
0,023
WCH77
4
8
0,023
0,023
WCH46
4
4
0,023
0,045
WCH86
4
8
0,023
0,023
WCH137
4
8
0,023
0,023
WCH184
4
4
0,045
0,045
WCH16
8
автолиз
0,023
автолиз
WCH43
4
8
0,023
0,023
WCH92
8
8
0,09
0,09
WCH211
4
8
0,023
0,023
Определение
, МБК
, диапазона МБК для NCL812 и NCL062
50
90
МБК
50
90
50
90
МБК
МБК
Таблица 25 и Таблица 26
Таблица 25
Минимальные бактерицидные концентрации (МБК,  и диапазон МБК, соответственно) были определены для NCL812 и ампициллина для всех двадцати изолятов (). Значения МБК,  и диапазона МБК были ниже и более согласованы для NCL812, по сравнению с NCL062 ().
Исследование «время-элиминация» (time kill studies) с помощью микроразведений в среде для штамма D39, обработанного соединением NCL812 и NCL062
Фигуры 13 и14
Фигуры 14 и 15
Фигуры с 15 по 17
Фигуры 13, 14, 18 и 19
600
Под воздействием субингибирующих концентраций (≤ 2 мкг/мл) NCL812 или NCL062 штамм D39 характеризовался ростом, схожим с ростом у не обработанных контролей в течение 48-часового периода (). Более высокие концентрации NCL812 и NCL062 (≥ 16 мкг/мл) приводили к отсутствию роста бактерий в течение 48 часов (). Такие характеристики роста были подтверждены исследованием кинетики элиминации на основе микроразведений в среде с использованием спектрофотометра Spectramax, оценивающего рост (представленный как OD) в получасовых интервалах в течение 14 часов при действии NCL812, NCL062 и ампициллина (). Наблюдалось примерно шестичасовое различие между началом экспоненциального роста у D39, обработанным NCL812 и у D39, обработанным NCL062 ().
Фигуры 20 и21
Фигура 20
Фигура 21
Фигуры с 22 по 26
Рост штамма D39, обработанного NCL812 или NCL062, сравнивали с ростом D39, обработанным ампициллином или эритромицином в течение 48 часов (). D39, обработанный ампициллином демонстрировал такой  же рост, как и при воздействии NCL812 или NCL062 в течение 48 часов (). D39, обработанный эритромицином, характеризовался кривыми роста, отличающихся от тех, которые наблюдались при обработке NCL812 и NCL062, где наблюдалась большая разница в росте между концентрациями (). Добавление 5% хлорида холина в среду в течение 48-часов не привело к значительным отличиям в росте для NCL812 и NCL062, по сравнению с положительным контролем и ростом в контроле ().
Проверка возможной устойчивости
Фигуры 13 и 18
Штамм D39, обработанный ≤4 мкг/мл NCL812, входил в логарифмическую фазу роста в течение 6 часов (), как показано в четырех независимых экспериментах. Возможность противомикробной устойчивости к NCL812 между 5 и 6 часами исследовали при дальнейшем определении МИК на D39 при воздействии 2 мкг/мл NCL812, 4 мкг/мл NCL812 и 0,0225 мкг/мл ампициллина в течение 6 ч. Согласно полученным результатам не наблюдалось значительного увеличения МИК для всех образцов D39, подвергавшихся воздействию NCL812, по сравнению с ростом в контроле и ампициллином (Таблица 27).
Таблица 27:
Значения МИК для штамма D39, обработанного 2 мкг/мл или 4 мкг/мл NCL812 в течение 6 часов согласно Примеру 5
Исходное значение МИК для D39
Значение МИК для D39 после обработки NCL-812 в течение 6 часов.
Исходное значение МБК для D39
Значение МБК для D39 после обработки NCL-812 в течение 6 часов.
D39, обработанный 2 мкг/мл NCL812
4 мкг.мл<sup>-1</sup>
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
D39 обработанный 4 мкг/мл NCL812
4 мкг.мл<sup>-1</sup>
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
D39 обработанный 0,023 мкг/мл ампициллина
0,023 мкг,мл<sup>-1</sup>
0,045 мкг,мл<sup>-1</sup>
0,023 мкг,мл<sup>-1</sup>
0,023 мкг,мл<sup>-1</sup>
рост D39 *
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
рост D39 2 **
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
8 мкг.мл<sup>-1</sup>
S. pneumoniae
* D39 контроль роста: штамм  D39, выращиваемый в течение 6 часов в 4% LHB:CAMHB;
S. pneumoniae
600
** D39 контроль роста-2: штамм  D39 на HBA O/N, ресуспендированный в солевом растворе (0,1 OD) и разбавленный в соотношении 1/20 в стерильном солевом растворе.
Макроразведения в среде путём измерения относительной МБК в заданные временных точках
Фигура 27
Фигуры 20 и 21
Таблицы 26 и 28
Фигуры 28 и 29
(Фигура 27).
Фигура 27
МБК
Относительные значения МБК были определены в заданные промежутки времени с использованием проб из анализа разведений в среде, инкубированных в течение 48 часов, для NCL812 и NCL062 (), а также контрольных противомикробных агентов ампициллина и эритромицина (). Были определены значения МИК ампициллина и эритромицина для штамма D39 (). Описаны сравнительные особенности роста при воздействии ампициллина и эритромицина (). Ампициллин и эритромицин демонстрировали зависящее от времени уменьшение бактерий. NCL062 демонстрировал быстрое бактерицидное действие, с быстродействующей (в пределах первых 10 минут введения) МБК, составляющей 8 мкг/мл  Хотя наблюдалась несогласованность в значениях МИК для NCL062 между 5 и 12 ч, соединение NCL062 характеризовалось стабильной бактерицидной концентрацией (4 мкг/мл) между 24 и 48 ч. Соединение NCL812 демонстрировало быстрое бактерицидное действие, о чем свидетельствует приблизительно 3х-кратное снижение  в течение 5 часов (). Устойчивые бактерицидные концентрации для NCL812 (8 мкг/мл) поддерживались в течение полных 48 часов.
Таблица 28
: Значения МИК и МБК для эритромицина для штамма D39 согласно Примеру 5
Изолят
Статус устойчивости к эритромицину
МИК(мкг/мл)
МБК(мкг/мл))
D39
Чувствителен
0,00275
0,00275
Исследование «время-элиминация» для D39 на основе макроразведений в среде с использованием NCL812 и NCL062
10
10
10
Фигура 30
Фигура 31
Фигура 30
Фигура 20 и 31
Фигура 31
4
Количество жизнеспособных бактерий для каждого момента времени было представлено в виде logКОЕ/мл снижения для NCL812 () и для ампициллина (). Согласованный сплошной рост (определяемый пределом 2×10 КОЕ) наблюдали у контрольной группы без воздействия агентов и при воздействии 2 мкг/мл NCL812. Полная бактерицидная активность (определяемая как 3log снижение КОЕ) наблюдалась для 128 мкг/мл NCL812 при 4log снижении КОЕ в течение 3 ч, и концентрации между 16 мкг/мл и 64 мкг/мл NCL812 были эффективны для устранения бактериального роста в течение 8 часов (). По всей вероятности, NCL812 при концентрациях 4 мкг/мл и 8 мкг/мл инактивируется через 11 часов после воздействия, так как после этого момента времени наблюдалось увеличение роста штамма D39 (). Значения количества жизнеспособных баткерий штамма D39, обработанного ампициллином, были согласованными в данном конкретном исследовании, демонстрируя постоянное снижение зависимой от времени элиминации в течение 48 ч ().
Просвечивающая электронная микроскопия
Фигуры
32 и 29
Фигуры 29 и 33
Морфометрический анализ показал значительные изменения в клеточной мембране штамма D39 при воздействии 16 мкг/мл NCL812 в течение 6 ч, по сравнению с контролем роста. Образцы, обработанные 4 мкг/мл, а также 12 ч культуры не включали в морфометрический анализ в связи с отсутствием бактериальных клеток в каждом срезе. Обработанные образцы обладали значительно более толстой клеточной мембраной (6,43±0,29 нм), по сравнению с необработанными образцами (4,35±0,24 нм) (р <0,0001) (). Периплазматическое пространство (внутриклеточное пространство между клеточной мембраной и клеточной стенкой) у клеток штамма D39, обработанного 16 мкг/мл NCL812, было значительно шире (4,54±0,096 нм), по сравнению с необработанными образцами (3,91±0,14 нм) (P <0,001) ().
Таблица 29
: Морфометрические исследования ультраструктуры клеток штамма D39, обработанного NCL812 в течение 6 часов в соответствии с Примером 5
<b>Контроль роста</b>
<b>Обработка (16 мг/мл NCL812 в течение 6 ч)</b>
Статистический тест
Среднее значение ± SEM
Среднее значение ± SEM
Непарный t-тест (P-значение)
Клеточная мембрана
4,35 ± 0,24 нм,n = 12
6,43 ± 0,29  нм,n = 13
P<0,0001
Периплазмическое пространство
3,91 ± 0,14 нм,n = 11
4,54 ±0,096 нм,n = 11
P<0,001
S. pneumoniae
МБК
Таким образом, соединение NCL812 демонстрирует в высокой степени стабильные значения МИК и эквивалентные МБК для коллекции штамма , что подтверждаем, что данное соединение обладает бактерицидным действием против этого организма. В исследованиях кинетики элиминации, в которых измеряли относительную  в течение 48 ч, соответствующий бактерицидный эффект был выявлен у D39 после 6 часов от первоначального воздействия NCL812.
S. pneumoniae
in vitro
Такая бактерицидная активность была показана для  впервые. Этот результат свидетельсвует о том, что NCL812 эффективен в отношении пневмококков.
in vivo
Конкурентное связывание между компонентами в крови, сыворотке или среде привело к снижению противомикробной активности NCL. Это отразилось в увеличении значений МИК, наблюдаемых для различных типов сред и растворителей. После завершения этих исследований, последние независимые исследования подтвердили преципитацию NCL812 в PBS и показали полную растворимость в воде, содержащей 4% ДМСО после первоначального разбавления в 100% ДМСО. Водорастворимый NCL812 позволит значительно улучшить биодоступность  и преодолеть отрицательное взаимодействие с белками сыворотки или крови.
S. pneumoniae
in vivo
На основании результатов данного исследования, соединение NCL812 характеризуется механизмом действия против , который отличается от механизма действия атибиотиков из классов β-лактамов или макролидов, поскольку данное соединение, по-видимому, демонстрирует зависимую от концентрации бактерицидную активность, в противоположность активности, зависящей от времени. Определение максимальной фармакокинетической концентрации в сыворотке для NCL812  позволит подтвердить зависимый от концентрации характер его фармакодинамической активности. Кроме того, добавление в среду хлорида холина подтвердило, что механизм действия соединения NCL не связан со сродством к холин-связывающим белкам клеточной стенки, и, следовательно, может быть не ассоциирован с клеточной стенкой.
Морфометрический анализ клеточной мембраны и периплазматического пространства клеток штамма D39, обработанных 16 мкг/мл NCL812 в течение 6 ч, показал, что клеточная мембрана и периплазматическое пространство были шире в обработанных образцах, по сравнению с контрольными образцами. Очевидное увеличение размера мембраны может быть обусловлено накоплением электроноплотного внутриклеточного вещества под клеточной мембраной. Увеличение размера периплазматического пространства может быть обусловлено нарушением клеточной мембраны, возможно, за счет деполяризации или ингибирования АТФ. Механизм действия NLC812 может быть не зависимым от кальция, поскольку на электронных микрофотографиях, по всей видимости, не наблюдалось конкурентного связывания между NLC812 и рутениевым красным, ингибитором кальциевых каналов липидного бислоя.
in vitro
S. pneumoniae
В заключение, данное исследование  показало, что NCL812 обладает многими востребованными характеристиками как быстродействующий зависимый от концентрации бактерицидный противомикробный агент, мишенью которого, по-видимому, является клеточная мембрана . Эти характеристики являются желаемыми для лечения острых пневмококковых инфекций. Так как NCL812 может обладать механизмом действия, который нацелен на клеточную мембрану, он будет действовать гораздо быстрее, чем зависящие от времени противомикробные агенты, такие, как β-лактамы и макролиды, и потенциально является более эффективным, чем другие бактерицидные противомикробные агенты, зависящие от концентрации, такие как фторхинолоны, которые воздействуют на внутриклеточные мишени.
ПРИМЕР 6:
Staphylococcus pseudintermedius
in vitro
Характеристика метициллин-чувствительных и метициллин-устойчивых изолятов  из Австралии и предварительный анализ эффективности  нового противостафилококкового соединения.
Материалы и методы
Сбор образцов и идентификация метициллин-чувствительных изолятов Staphylococcus pseudintermedius (MSSP) и метициллин-устойчивых изолятов Staphylococcus pseudintermedius (MRSP).
Staphylococcus pseudintermedius
Таблица 30
Всего было получено 23 изолята из собак ().
Таблица 30:
Staphylococcus pseudintermedius
Изоляты , протестированные согласно Примеру 6
Staphylococcus pseudintermedius
in vitro
mecA
Для исследования было собрано десять метициллин-чувствительных и 13 метициллин-устойчивых изолятов . Изоляты были фенотипически классифицированы как устойчивые к метициллину на основании их устойчивости к оксациллину и наличия гена , что было проанализировано в соответствии со стандартными процедурами.
mecA
Проводили оценку чувствительности к оксациллину и цефокситину с использованием диско-диффузного метода и эпсилометрии (E-тест). Идентификацию гена осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР (ПЦР).
Staphylococcus pseudintermedius
Тестирование чувтсвительности диско-диффузным методом CLSI проводили для 23 изолятов  для следующих противомикробных агентов: пенициллин, амоксициллин, эритромицин, гентамицин, клиндамицин, ципрофлоксацин, цефалексин, хлорамфеникол, тетрациклин, окситетрациклин, ванкомицин, цефотетан, моксифлоксацин и рифампин.
Оценку минимальной ингибирующей концентрации (МИК) и минимальной бактерицидной концентрации (МБК) для NCL812 проводили с использованием методологии CLSI, используя ампициллин в качестве контроля. Затем тестировали активность противостафилококковых соединений против всех изолятов 23 и определяли  минимальные ингибирующие концентрации (МИК) в соответствии со стандартными протоколами. После определения МИК проводили оценку минимальных бактерицидных концентраций для определения того, обладают ли эти соединения бактериостатическим или бактерицидным действием.
Результаты
mecA
Таблицы 30 и 31
Наличие гена  было выявлено у 13 изолятов MRSP, а его отсутвтие - у 10 изолятов MSSP (). Все изоляты MRSP были устойчивы к оксациллину на основании диско-диффузного анализа (≤17 мм) и Е-теста МИК (≥0,5 мг/л).
Таблица 30 и 31
При установленном пограничном значении для устойчивости к цефокситину  на уровне ≤24 мм, 3/13 (23%) и 5/13 (38%) из протестированных изолятов MRSP были восприимчивы к цефокситину. При пограничном значении на уроне ≤30 мм только 1/13 (7,7%) из изолятов протестированных MRSP оказались восприимчивыми к цефокситину ().
Таблица 30 и 31
Изоляты MRSP были устойчивы к нескольким классам антибиотиков. Из 13 изолятов MRSP все 13 были чувствительны к рифампицину. 3/13 (23%) были чувствительны к хлорамфениколу; 10/13 (77%) были чувствительны к ванкомицину ().
Таблица 30 и 31
Интересно, что 3/13 (23%) из MRSP изолятов были чувствительны к амоксициллину; 8/13 (62%) были чувствительны к цефалотину; 12/13 (92%) были чувствительны к цефотетану и 12/13 (92%) были чувствительны к моксифлоксацину ().
Все 23 изолята были чувствительны к NCL812 на основании МИК. Кроме того, соединение NCL812 проявляло бактерицидное действие на основании минимальных бактерицидных концентрациях (МБК).
Staphylococcus pseudintermedius
Staphylococcus pseudintermedius
Staphylococcus pseudintermedius
Таблица 32
Таблица 33
Таблица 33
50
90
Диапазон МИК для NCL812 в отношении изолятов  составил от 1 мкг/мл до 4 мкг/мл (). Значения МИК и МИК для NCL812 в отношении изолятов  были определены как 2 мкг/мл и 4 мкг/мл, соответственно (). Мода МИК и диапазон МИК для f NCL812 в отношении изолятов  были определены как 2 мкг/мл и 1-4 мкг/мл, соответственно ().
Таблица 32:
Staphylococcus pseudintermedius
Значения МИК для NCL812 и ампициллина в отношении изолятов  согласно Примеру 6
Таблица 33:
Staphylococcus pseudintermedius
Значения МИК50, МИК90, мода МИК и диапазон МИК для NCL812 в отношении изолятов согласно Примеру 6
Staphylococcus pseudintermedius
Метициллин-устойчивый  (MRSP) является новым угрожающим фактором для собак, кошек и лошадей. Были идентифицированы два основных клона MRSP среди собак в Европе (ST 71) и Северной Америке (ST 68). Также были сообщения о MRSP, поражающих собак в Японии, один случай обнаружения MRSP у ветеринарного персонала в Гонконге.
mecA
in vitro
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
et al
Staphylococcus pseudintermedius
В настоящем исследовании изоляты MRSP были определены на основании комбинации методов, по наличию гена  и наличия устойчивости к оксациллину . Устойчивость к цефокситину была использована в качестве замены для оксациллина для метициллин-устойчивых изолятов . Однако, оценка устойчивости к цефокситину с помощью диско-диффузного метода на основании принципов интерпретации, рекомендованных для изолятов человека метициллин-устойчивого и коагулазо-негативных стафилококков является ненадежной при определении MRSP. Пограничное значение для устойчивости к цефокситину, согласно которому  ≤30 мм = устойчивые и ≥31 = восприимчивые изоляты, было предложено Бемис и соавторами, 2012 Bemis, D. A., R. D. Jones, . (2012). "Evaluation of cefoxitin disk diffusion breakpoint for detection of methicillin resistance in Staphylococcus pseudintermedius isolates from dogs." Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 24(5): 964-967]. Результаты данного иисследования согласуются с тем, что данное пограничное значение быть более надежным в прогнозировании метициллин-устойчивых изолятов .
in vitro
Изоляты MRSP, как правило, устойчивы к нескольким классам антибиотиков. В связи с этим, для всех инфекций с подозрением на MRSP рекомендуется анализ бактериальной культуры и устойчивости к антибиотикам для выбора соответствующих антибиотиков. Ограничением, отмеченным в данном исследовании,  является наблюдаемая  восприимчивость изолятов MRSP к амоксициллину и цефалоспоринам (цефалотин и цефотетан).
Staphylococcus pseudintermedius
NCL812 эффективен против всех 23 изолятов, как MSSP так и MRSP. Необходимо более масштабное исследование для подтверждения эффективности NCL812 против , поскольку это соединение может представлять собой безопасный альтернативный вариант антибиотика для появляющихся инфекции MRSP у домашних животных.
ПРИМЕР 7
:
Приготовление и тестирование аналогов NCL812 (также известных как соединения согласно настоящему изобретению).
Материалы и методы
NCL812
Было получено соединение NCL812 аналитической степени чистоты с определенной активностью 960 мг/г (т.е. 96%). Порошок хранили в герметичном контейнере для образцов вне воздействия прямых солнечных лучей и при комнатной температуре в исследовательском центре. Готовили аликвоты (1 мл) стокового раствора, (содержащего 25,6 мг/мл NCL812 в ДМСО), хранили при -80°С и размораживали непосредственно перед использованием.
Синтез и тестирование аналогов NCL812
Аналоги с NCL001 по NCL230, как указано на Фигуре 1, были синтезированы с использованием стандартных методов в данной области. В качестве примера, методы, используемые для изготовления соединений NCL097; NCL157; NCL179; NCL188; NCL195; и NCL196 были следующими:
NCL 097
(2,2'-бис[(3,4,5-тригидроксифенил)метилен]карбонимидик дигидразид гидрохлорид)
N, N
-
2
1
13
+
+
Суспензию 3,4,5-тригидроксибензальдегида (412,0 мг, 2,673 ммоль, 2,21 экв.) и 'диаминогуанидин гидрохлорида (152,0 мг, 1,211 ммоль) в EtOH (5 мл) подвергали микроволновому облучению (150 Вт ) при 100°С в течение 10 мин. Затем реакционную смесь оставляли охлаждаться до температуры окружающей среды. Полученный осадок собирали и промывали охлажденным EtOH (5 мл) и EtO (5 мл) с получением указанного карбонимидик дигидразида (369,0 мг, 77%) в виде бледно-коричневого твердого вещества. Темп. плавл. 292°С (разл.) H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6) δ 9,06 (уш.с, 6Н), 8,25 -. 8,01 (м, 4Н), 6,83 (с, 4Н). С ЯМР (75 МГц, ДМСО-d6) δ 152,2 149,7, 146,2, 136,5, 123,7, 107,4,. МСНР (ESI): 361,95 [M + 1].
NCL157
(2,2'-бис[(2-амино-4-хлорфенил)метилен]карбонимидик дигидразид гидрохлорид)
Синтез 2-амино-4-хлор-N-метокси-N-метилбензамида
O
N
N
-
N
J
2
2
4
3
3
1
13
. К раствору 2-амино-4-хлорбензойной кислоты (5,6691 г, 33,041 ммоль), N, -диметилгидроксиламин (5,7504 г, 58,954 ммоль, 1,78 экв.), -(3-диметиламинопропил)-'этилкарбодиимид гидрохлорида (7,7925 г, 40,649 ммоль, 1,23 экв.) и -гидроксибензотриазола (5,2371 г, 38,793 ммоль (на безводной основе), 1,17 экв.) в ДМФ (100 мл) добавляли диизопропилэтиламин (18,0 мл, 13,4 г, 104 ммоль, 3,15 экв.) и коричневый раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 7 ч. Затем реакционную смесь концентрировали в вакууме перед ее разбавлением с помощью 1 М NaOH (100 мл) и экстрагировали с CHCl (3×100 мл). Объединенные органические экстракты промывали 1 М HCl (100 мл), затем высушивали над MgSO и концентрировали в вакууме с получением коричневого сиропа. Полученное вещество затем дополнительно сушили при 60°С под высоким вакуумом с получением неочищенного амида Вайнреба (7,021 г, 99%) в виде коричневого сиропа, который кристаллизовался при стоянии. Полученное неочищенное вещество использовали без дальнейшей очистки. H-ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,24 (д, J = 8,4 Гц, 1H), 6,62 (д, J = 18 Гц, 1H), 6,54 (дд, = 8,4, 1,9 Гц, 1H), 4,75 (с , 2H), 3,48 (с, 3H), 3,24 (с, 3H). С-ЯМР (101 МГц, CDCl) δ 169,2, 148,4, 137,1, 130,6, 116,6, 116,1, 115,0, 61,1, 34,0.
Синтез 2-амино-4-хлорбензальдегида
J
J
4
4
3
3
4
3
3
1
13
. Неочищенный 2-амино-4-хлор-N-метокси-N-метилбензамид (751,1 мг, 3,532 ммоль) разделяли на порции примерно по 120 мг, и каждую из них растворяли в ТГФ (10 мл) и охлаждали до 0 °С перед добавлением к каждому из растворов LiAlH (2M в ТГФ, 0,5 мл) и полученные растворы перемешивали в течение 16 ч до достижения реакционной смеси комнатной температуры. Реакции гасили насыщенным NHCl (1 мл) перед объединением, разбавляли насыщенным раствором NaHCO (160 мл) и экстрагировали CHCl (2×150 мл, 1×75 мл). Объединенные органические слои сушили над MgSO и концентрировали в вакууме с получением неочищенного бензальдегида (463,3 мг, 85%) в виде желтых/оранжевых кристаллов. Вещество использовали без дальнейшей очистки. H (400 МГц, CDOD) 9,77 (д,  = 0,7 Гц, 1H), 7,46 (д,  = 8,3 Гц, 1H), 6,83 - 6,71 (м, 1H), 6,63 (дд, J = 8,4, 1,9 Гц , 1H). С-ЯМР (101 МГц, CDOD) δ 194,6 153,0, 142,5, 138,4, 118,3, 116,8, 116,1.
Синтез 2,2
-бис[(2-амино-4-хлорфенил)метилен] карбонимидик дигидразид гидрохлорида
N, N
J
J
J
1
13
6
6
'. Суспензию 2-амино-4-хлорбензальдегида (128,0 мг, 0,823 ммоль, 1,78 экв.) и '-диаминогуанидин гидрохлорида (58,0 мг, 0,462 ммоль) в EtOH (2 мл) подвергали микроволновому облучению (100 Вт ) при 60°С в течение 5 минут. Затем большую часть растворителя удаляли в вакууме, добавляли EtOH (1 мл) и колбу переносили в морозильную камеру для кристаллизации. Полученный осадок собирали и промывали этанолом (1 мл) с получением указанного карбонимидик дигидразида (21,0 мг, 13%) в виде бледно-желтого твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 11,71 (уш.с, 2Н), 8,40 (с, 2H), 8,37 (с, 2H), 7,29 (д,  = 8,4 Гц, 2H), 6,87 (д,  = 2,0 Гц, 2H), 6,73 (уш.с., 4H), 6,59 (дд,  = 8,3, 2,0 Гц, 2H). С ЯМР (101 МГц, ДМСО-d) δ 152,1 151,5, 148,9,, 136,0, 134,7, 115,1, 114,5, 112,8.
NCL179
Е
(4,6-бис (2 (() -4-хлорбензилиден) гидразинил) пиримидин-2-амин)
2
1
13
J
J
Суспензию 2-амино-4,6-дигидразинилпиримидина (67,3 мг, 0,434 ммоль) и 4-хлорбензальдегида (198,8 мг, 1,414 ммоль, 3,26 экв.) в EtOH (25 мл) нагревали с обратным холодильником в течение 16 ч. По истечении этого времени конденсатор удаляли и раствор концентрировали до прибл. 1 мл и полученный осадок фильтровали в горячем состоянии и промывали EtO (10 мл) с получением указанного аминопиримидина (42,8 мг, 25%) в виде белесого аморфного порошка. Темп. плавл. 275°С (разл.). H-ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 10,70 (с, 2H), 8,02 (с, 2H), 7,67 (д, = 8,4 Гц, 4Н), 7,52 (д,  = 8,4 Гц, 4Н), 6,28 (с , 1H), 5,85 (с, 2H). С-ЯМР (101 МГц, ДМСО) δ 162,8 162,6, 138,8, 134,1, 133.1, 128.9, 127.6, 73,5.
NCL188
Е
(()-2-(1-(4-хлорфенил)пентилиден)гидразин-1-карбоксимидамид гидрохлорид)
2
2
1
13
J
J
Суспензию 1- (4-хлорфенил)пентанона (1.8319 г, 9,3146 ммоль, 1,95 экв.) и аминогуанидин гидрохлорида (527,6 мг, 4,773 ммоль) в EtOH (15 мл) нагревали при 65°С в течение 16 ч. Неочищенный продукт охлаждали до комнатной температуры перед разбавлением EtO (60 мл) и охлаждали до 0°С для осаждения непрореагировавшего аминогуанидина гидрохлорида (174,5 мг). Маточную жидкость концентрировали в вакууме и остаток растворяли в EtO (20 мл). Затем раствор кипятили и добавляли гексаны (10 мл) с получением указанного карбоксимидамида в виде кремового твердого вещества. H-ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 11,54 (с, 1H), 7,99 (д,  = 8,7 Гц, 2H), 7,90 (с, 3H), 7,47 (д,  = 8,6 Гц, 2H), 2,91 - 2,82 (м, 2H), 1,48 - 1,32 (м, 4H), 0,89 - 0,84 (м, 3H). С-ЯМР (101 МГц, ДМСО) δ 156,2, 153,8, 134,8, 134,4, 128,7, 128,4, 28,1, 26,6, 22,0, 13,8.
NCL195
Е
(4,6-бис (2-(() -4-метилбензилиден) гидразинил) пиримидин-2-амин)
2
2
1
13
J
J
Суспензию 2-амино-4,6-дигидразинопиримидина (58,9 мг, 0,380 ммоль) и 4-метилбензальдегида (0,10 мл, 100 мг, 0,832 ммоль, 2,19 экв.) в EtOH (4 мл) нагревали с обратным холодильником в течение 16 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры перед сбором гранулоподобного преципитата, промывали EtO (20 мл). Затем «гранулы» разбивали и дополнительно промывали твердое вещество EtO (10 мл) с получением указанного пиримидина (85,8 мг, 63%) в виде белого «пушистого» порошка. Темп. плавл. 274-276 °С. H-ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 10,51 (с, 2H), 8,00 (с, 2H), 7,54 (д,  = 8,0 Гц, 4Н), 7,26 (д,  = 7,9 Гц, 4Н), 6,26 (с , 1H), 5,77 (с, 2H), 2,34 (с, 6Н). С-ЯМР (101 МГц, ДМСО) δ 162,8 162,6, 140,1, 138,4, 132,5, 129,4, 126,0, 73,3, 21,0.
NCL196
1E,1
E
(4,4'-((')-((2-аминопиримидин-4,6-диил) -бис (гидразин-2-ил-1-илиден)) бис (метанилилиден)) дифенола)
2
1
13
J
J
Суспензию 2-амино-4,6-дигидразинопиримидина (70,4 мг, 0,454 ммоль) и 4-гидроксибензальдегида (140,3 мг, 1,149 ммоль, 2,53 экв.) в EtOH (3 мл) нагревали с обратным холодильником в течение 16 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры перед сбором преципитата, промывали EtO (25 мл) с получением указанного пиримидина (91,4 мг, 55%) в виде белесого порошка. Темп. плавл. 298 °С (разл.). H-ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 10,31 (с, 2H), 9,74 (с, 2H), 7,94 (с, 2H), 7,48 (д,  = 8,6 Гц, 4Н), 6,83 (д,  = 8,6 Гц , 4H), 6,20 (с, 1H), 5,70 (с, 2H). C (101 МГц, ДМСО) δ 162,7, 162,5, 158,3, 140,5, 127,7, 126,3, 115,7, 73,0.
Оценка МИК
50
90
Минимальные ингибирующие концентрации (мкг/мл) определяли с использованием метода микроразведений в среде, рекомендованного Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI). Пограничные значения МИК были определены путем визуальной оценки, а затем их подтверждали с помощью планшет-ридера для ИФА, измеряя оптическую плотность при 600 нм. Рост бактерий (мутность) в лунках с противомикробными агентами сравнивали с ростом (мутностью) в лунке с контролем роста (не содержащей противомикробный агент). Все изоляты тестировали в двух повторностях, если в результатах наблюдалась разница более чем в одно двухкратное разведение, тест повторяли в третий раз. Степень чистоты изолятов тщательно контролировать в процессе тестирования, пересевая подготовленный бактериальный инокулюм на чашки с SBA (агар с овечьей кровью). МИК для контрольных штаммов для ампициллина определяли при каждом измерении в качестве внутреннего контроля качества. Значения МИК, МИК и диапазон МИК (минимальное и максимальное) рассчитывали для каждой из групп бактерий.
Активность NCL812 и МИК в отношении грамотрицательных бактерий
Активность NCL812 против грамотрицательных бактерий оценивали с помощью метода микроразведений в среде, рекомендованным Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI), и определяли МИК (мкг/мл) для NCL812 и ампициллина.
Определение минимального бактерицидной концентрации (МБК
)
Методология CLSI
Вкратце, 10 мкл содержимого каждой лунки, начиная с МИК, засевали на чашки с агаром с овечьей кровью (SBA)  Columbia и инкубировали при 37°С в течение 48 ч. Чашки оценивали через 24 и 48 ч, и МБК определяли как наименьшую концентрацию NCL812, при которой на чашке не наблюдалось роста бактериальных колоний (или наблюдалось значительное ингибирование роста, по сравнению с контролем) (CLSI 2005).
Оценка кинетики элиминации клеток (MRSA и VRE)
6
MRSA/VRE выращивали в течение ночи на агаре Columbia SBA при 37°С Несколько колоний бактерий суспендировали в CAMHB и доводили до оптической плотности от 0,08 до 0,10. Суспензию бактерий разводили 1:10. Один миллилитр бактерий добавляли к 9 мл среде CAMHB, содержащей различные концентрации (до 4×МИК) NCL812, до достижения конечной концентрации бактерий от 1 до 3×10 КОЕ/мл. . Пробирки инкубировали при 37°С при постоянном встряхивании. Для того чтобы определить число жизнеспособных бактерий, присутствующих в различные моменты времени, из каждой пробирки брали аликвоты по 100 мкл и разводили. Затем 100 мкл каждого разведения высевали на агар для подсчета колоний в двух повторностях и инкубировали в течение 48 ч при температуре 37°С. Через 24 ч подсчитывали число колоний, присутствующих на каждой чашке, и на основании этого подсчитывали количество жизнеспособных бактерий, присутствующих в исходной суспензии. Чашки повторно проверяли после 48 часов.
Исследование взаимодействия с другими классами противомикробных агентов
.
Int. J. Antimicrob. Agents
Staphylococcus aureus
Staphylococcus
Метод «шахматной доски» (Gunics et al., 2000 . 14:239-42) был использован для поиска взаимодействий (синергизм, антагонизм, отсутствие эффекта) соединения NCL812 в комбинации с тетрациклином, хлорамфениколом, эритромицином (макролид), ампициллином (β-лактам широкого спектра), гентамицином (аминогликозид), ципрофлоксацином (фторхинолон), сульфаметоксазолом (сульфонамид) или пенициллином G (β-лактам узкого спектра). Для первоначальных экспериментов был использован лабораторный штамм T3-129, однако этот штамм продемонстрировал противоречивые результаты для некоторых противомикробных препаратов, и в последующих тестах использовали новый штамм spp., обозначенный как МК1 (в настоящий момент проводится окончательная видовая идентификация), который был чувствителен ко всем тестируемым противомикробным препаратам.
Сначала были определены значения МИК для каждого антибиотика в отдельности в соответствии со стандартными принципами CLSI. Затем соединение NCL812 было протестировано в комбинации с каждым из указанных антибиотиков в двух повторностях. Для оценки эффекта комбинации была рассчитана фракционная ингибирующая концентрация (ФИК) для каждого антибиотика следующим образом:
ФИК для тестируемого антибиотика = МИК для тестируемого антибиотика в комбинации/МИК для антибиотика в отдельности;
ФИК для NCL812 = МИК для NCL812 в комбинации/МИК для NCL812 в отдельности;
и
ФИК = индекс ФИК = ФИК для NCL812 + ФИК для каждого тестируемого антибиотика.
и
и
и
В соответствии с методологией «шахматной доски» синергизм (S) определяли при ФИК<0,5, отсутствие эффекта (NE) определяли при 0,5<ФИК<4, антагонизм (А) определяли как 4<ФИК.
Тестирование аналогов NCL812
E. coli
Pseudomonas aeruginosa
Аналоги NCL812 хранили при 4°C до начала тестирования. Значения МИК определяли в отношении двух штаммов MRSA, двух штаммов VRE, одного штамма и одного штамма .
Результатв
Опрделение минимальной ингибирующей концентрации (МИК)
Таблице  34
Были определены сравнительные значения МИК для NCL812 и ампициллина (мкг/мл) для 21 изолята MRSA. Результаты исходных экспериментов (фаза I) и повторного тестирования (фаза II) приведены в . Каждый тест по определению МИК проводили в двух повторностях.
Таблица 34:
Значения МИК для NCL812 и ампициллина (мкг/мл) для 21 изолята MRSA, полученные в соответствии с Примером 7
Таблица 35:
Сравнительные значения МИК для NCL812 и ампициллина (мкг/мл) для 13 изолятов VRE, полученные в соответствии с Примером 7
Таблице 35
Были определены сравнительные значения МИК для NCL812 и ампициллина (мкг/мл) для 13 изолятов VRE. Результаты исходных экспериментов (фаза I) и повторного тестирования (фаза II) приведены в . Каждый тест по оценке МИК проводили в двух поторностях.
50
90
Таблице 6
Значения МИК, МИК, моду МИК и диапазон МИК для NCL812 были определены для австралийских изолятов MRSA и VRE, как показано в .  Сравнительные значения МИК для ампициллина указаны в скобках.
Активность NCL812 и МИК в отношении грамотрицательных бактерий
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella arizonae
Таблице 36
Были определены сравнительные значения для NCL812 и ампициллина (мкг/мл) для , и , как показано в . Каждый тест по оценке МИК проводили в двух повторностях.
Таблица 36:
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella arizona,
Сравнительные значения МИК для NCL812 и ампициллина (мкг/мл) для , и  полученные согласно Примеру 7
Организм
NCL812 1<sup>ый</sup>
NCL812 2<sup>ой</sup>
Ампициллин 1<sup>ый</sup>
Ампициллин 2<sup>ой</sup>
E. coli
>128 мкг/мл
>128 мкг/мл
4 мкг/мл
4 мкг/мл
P. aeruginosa
>128 мкг/мл
>128 мкг/мл
>128 мкг/мл
>128 мкг/мл
S. arizonae
>128 мкг/мл
>128 мкг/мл
1 мкг/мл
1 мкг/мл
Противомикробная активность NCL812 в отношении выбранных грамотрицательных бактерий составила >128 мкг/мл.
Определение минимлаьной бактерицидной концентрации (МБК)
Таблице 37
Результаты оцени МБК для изолятов MRSA показаны в , в  которой указаны значения МБК для NCL812 (мкг/мл) для 20 изолятов MRSA. Каждый тест по оценке МБК проводили в двух повторностях, начиная с концетрации, соответствующей МИК, до 16-кратной МИК.  Для всех изолятов МБК была равной МИК. Однако, для некоторых концентраций наблюдали рост на чашкахс агаром, не согласующийся с другими результатами.
Таблица 37:
Значения МБК для NCL812 (мкг/мл) для 20 изолятов MRSA согласно Примеру 7
Организм/№ образца.
МБК NCL812
4 мкг/мл
8 мкг/мл
16 мкг/мл
32 мкг/мл
64 мкг/мл
MRSA 1
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
N**
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
N
MRSA 2
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
N
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
N
MRSA 3
- 1<sup>ый</sup>
0
GB*
0
0
N
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
N
MRSA 4
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
N
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
N
MRSA 5
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
N
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
N
MRSA 6
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
N
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
N
MRSA 7
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
N
- 2<sup>ой</sup>
0
GB
0
0
N
MRSA 8
- 1<sup>ый</sup>
GB
0
0
0
N
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
N
MRSA 9
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
N
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
N
MRSA 10
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
N
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
N
MRSA 11
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
N
- 2<sup>ой</sup>
GB
0
0
0
N
MRSA 12
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
N
- 2<sup>ой</sup>
0
GB
0
0
N
MRSA 13
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
N
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
N
MRSA 14
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
N
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
N
MRSA 516
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
0
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
0
MRSA 570
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
0
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
0
MRSA 580
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
0
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
0
MRSA 606
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
GB
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
0
MRSA 610
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
0
0
- 2<sup>ой</sup>
0
GB
0
0
0
GB = рост бактерий на агаре с овечьей кровью;N** = не культивируется на агаре с овечьей кровью.
Таблице 38
Результаты для 10 изолятов VRE показаны в . Каждый тест по оценке МБК проводили в двух повторностях, начиная с концентрации МИК для NCL812 до 32-кратной МИК. Как и в случае протестированных изолятов MRSA, значения МБК оказались равными значениям МИК. Однако, для изолятов VRE наблюдался аномальный рост при более высоких концентрациях NCL812. Наблюдалось значимое подавление роста при концентрациях, близких к значениям МИК, но по мере увеличения концентрации NCL812 рост бактерии оказывался в меньшей степени ингибирован. Большое число бактерий наблюдалось на чашках при концентрациях NCL812 ≥16 мкг/мл.
Таблица 38:
Значения МБК NCL812 (мкг/мл) для r 10 изолятов VRE согласно Примеру 7
Организм/№ образца.
МБК NCL812
2 мкг/мл
4 мкг/мл
8 мкг/мл
16 мкг/мл
32 мкг/мл
64 мкг/мл
128 мкг/мл
VRE 26c(dc)
- 1<sup>ый</sup>
90*
20
4000
M
M
M
M
- 2<sup>ой</sup>
0
70
3500
M
M
M
M
VRE 37c
- 1<sup>ый</sup>
500
100
20
250
M
M
M
- 2<sup>ой</sup>
M
50
100
1100
1400
M
M
VRE 35t
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
720
0
0
0
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
10
20
10
VRE 16c(dc)
- 1<sup>ый</sup>
90
330
0
M
M
M
M
- 2<sup>ой</sup>
200
0
20
M
M
M
M
VRE 23c
- 1<sup>ый</sup>
0
120
20
10
M
M
M
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
0
570
M
M
VRE 25c
- 1<sup>ый</sup>
0
0
M
M
M
M
M
- 2<sup>ой</sup>
20
20
M
M
M
M
M
VRE 16c
- 1<sup>ый</sup>
10
820
980
M
M
M
M
- 2<sup>ой</sup>
M
790
890
M
M
M
M
VRE 19t
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
180
10
110
M
- 2<sup>ой</sup>
30
0
0
70
40
M
M
VRE 14t
- 1<sup>ый</sup>
10
0
10
0
180
970
M
- 2<sup>ой</sup>
0
0
0
40
780
M
M
VRE 12c
- 1<sup>ый</sup>
0
0
0
M
M
M
M
- 2<sup>ой</sup>
0
M
300
M
M
M
M
* Количество бактерий, выросших через 24 ч на мл образца (КОЕ/мл) (CFU/ml);M =  множество бактерий на чашке (слишком много для возможности подсчета).
Показано, что соединие NCL812 оказывает бактерицидное действие в отношении грамотрицательных бактерий при концентрациях, эквивалентных МИК.
Анализ кинетики элиминации (MRSA и VRE)
J. Antimicrob. Chemother.
10
max
В предварительных экспериментах подсчет колоний проводили в моменты времени 15, 30, 45 и 60 мин. Никаких существенных изменений в концентрации бактерий не наблюдалось на этих сроках, на основании чего можно предположить, что NCL812 не является быстродействующим бактерицидным агентов (для сравнения, липогликопептид Оритаванцин, как было показано (McKay et al. (2009)  63 (6): 1191-1199), вызывает 3log снижение числа жизнеспособных микроорганизмов в течение часа воздействия при концентрации, эквивалентной C). Таким образом, для будущих экспериментов сроки для оценки жизнеспособных клеток были увеличены до одночасового, а затем двухчасовых интервалов.
10
10
et al.
В исходных экспериментах для MRSA на сроке 4 часов наблюдалось снижение, составляющее по меньшей мере 2,5log КОЕ/мл, по сравнению с ростом в контроле. На сроке 8 ч наблюдалось различие между ростом бактерий в контроле и ростом бактерий, обработанных NCL812, составляющее по меньшей мере 3,5log КОЕ/мл. Через 24 ч число бактерий, присутствующих при всех концентрациях NCL812, существенно не отличалось от контроля. Наблюдалось последовательное снижения числа бактерий при концентрациях 4-16 NCL812 мкг/мл до 8 ч, но такого не наблюдалось при концентрациях, превышающих 16 мкг/мл. Для сравнения, большинство бактерицидных противомикробных агентов, которые применяются или разрабатываются для лечения MRSA и VRE (оритаванцин, даптомицин, ванкомицин) являются быстродействующими бактерицидным агентами, которые достигают аналогичного log снижения в пределах 1 ч обработки в зависимости от концентрации (McKay , 2009). В исследовании кинетики элиминации клеток бактериостатические противомикробные препараты, рекомендованные для лечения инфекций MRSA и VRE (тейкопланин и линезолид) лишь незначительно снижают количество жизнеспособных микроорганизмов и рост).
10
10
В случае VRE наблюдаемое снижение числа КОЕ/мл бактерий, обработанных NCL812, было меньше, чем в случае MRSA. На сроке 4 ч наблюдалось приблизительно 2log снижение жизнеспособных микроорганизмов, по сравнению с контролем, а на сроке 8 ч было примерно 2,5log снижение. Однако через 24 ч рост бактерий больше не был в такой значительной степени снижен, по сравнению с контролем. Число бактерий увеличивалось после 8 часов инкубации, и такой эффект оказался более выраженным с увеличением концентрации NCL812.
Фигуре 34
Фигуре 35
Были получены данные по кинетике элиминации для MRSA 580 при различных концентрациях NCL812 в течение периода 8 ч, как показано на . Кинетика элиминации MRSA 580 при различных концентрациях NCL812 в течение периода 24 ч показана на . Через 4 ч инкубации среду заменяли на свежую, содержащую такую же концентрацию NCL812.
Фигуре 36.
Данные по кинетике элиминации MRSA 698 при различных концентрациях NCL812 в течение периода 24 ч показаны на  Через 4 ч инкубации среду заменяли на свежую, содержащую такую же концентрацию NCL812.
Фигуре 37
Данные по кинетике элиминации VRE 26с(dc) при различных концентрациях NCL812 в течение периода 24 ч показаны на .
Фигуре 38.
Данные по кинетике элиминации VRE 16с(dc) при различных концентрациях NCL812 в течение периода 24 ч показаны на
Проверка бактериальной устойчивости к NCL812
Были проведены предварительные испытания для определения того, может ли устойчивость бактерий объяснить наблюдаемый бактериальный рост при более высоких концентрациях NCL812 и увеличение числа бактерий в экспериментах по оценке кинетики элиминации при инкубации 24 ч. Бактерии (MRSA), растущие при высоких концентрациях NCL812 в 96-луночных микротитрационных планшетах, пересевали на SBA и инкубировали в течение 24 ч, а затем проводили оценку МИК. У таких бактерий не было обнаружено изменений МИК. Бактерии, растущие в среде, используемые для экспериментов по оценке кинетики элиминации, также оценивали на возможное изменение значений МИК. Никаких изменений обнаружено не было.
Кроме того, бактерии, которые росли при высоких концентрацияи NCL812, затем пересевали на чашки с агаром для подсчета колоний, содержащий NCL812 (64 мкг/мл и 128 мкг/мл) и инкубировали в течение 24 ч при 37°С. Бактерии, растущие на чашках, затем  использовали для оценки МИК. В этом случае для бактерий также не наблюдали изменений МИК.
Streptococcus pneumonia,
В целом, NCL812 обладает бактерицидной активностью против MRSA, которая в меньшей степени выражен в отношении штаммов VRE. Бактерицидный эффект не является быстрым, по сравнению с бактерицидными противомикробными агентами, разработанными для инфекций MRSA и VRE (даптомицин, оратованцин, ванкомицин). Аберрантные результаты по бактерицидной активности при более высоких концентрациях NCL812 не свидетельствуют о развитии устойчивости, но могут указывать на потерю активности. В связи с этим, для понимания таких интересных, но в настоящее время не объяснимых результатов, необходимо исследование стабильности в питательной среде. Также вэто исследование необходимо включить подробное изучение литературы для определения того, наблюдалось ли такое явление для других классов противомикробных агентов. В этом случае потребуется более тщательное исследование кинетики элиминации между 8 и 24 ч. Кривые элиминации для NCL812 в отношении MRSA и VRE указывают на более высокую бактерицидную активность, в сравнении с бактериостатическими противомикробными препаратами (линезолида, тейкопланин). Также необходима оценка кривых элиминации для после того как будет исследован вопрос о стабильности NCL812, как, например, в случае с линезолидом, поскольку некоторые антибактериальные агенты могут оказывать бактериостатическое действие против одних бактерий и бактерицидное действие против других.
Исследования совместного действия с другими классами противомикробных агентов
и
Таблице 39
Значения МИК, ФИК, ФИК и взаимодействие между NCL812 и восемью антибиотиками приведены в . Ни одно из восьми тестируемых соединений, представляющих различные классы противомикробных агентов, не показало ни положительного (синергизм), ни отрицательного (антагонизм) взаимодействия с NCL812, что согласуется с аддитивным эффектом при добавлении антибактериальных агентов к NCL812.
Таблица 39:
и
Значения МИК, ФИК, ФИК и взаимодействие между NCL812 и восемью антибиотиками согласно Примеру 7
Название антибиотика
Эксперимент
Повторность
Антибиотик
NCL812
ФИК<sub>и</sub>
Результат
МИК (мкг/мл)
ФИК<sub>1</sub>
МИК (мкг/мл)
ФИК<sub>2</sub>
с NCL812
В отдельности
с антибиотиком
В отдельности
Тетрациклин<sup>1</sup>
1
1<sup>ая</sup>
0,25
0,5
0,5
1
4
0,25
0,75
NE
2<sup>ая</sup>
0,25
0,5
0,5
1
8
0,125
0,62
NE
2
1<sup>ая</sup>
0,031
0,25
0,125
4
8
0,5
0,625
NE
2<sup>ая</sup>
0,031
0,25
0,125
4
8
0,5
0,625
NE
Хлорамфеникол<sup>1</sup>
1
1<sup>ая</sup>
4
8
0,5
1
4
0,25
0,75
NE
2<sup>ая</sup>
2
4
0,5
2
8
0,25
0,75
NE
2
1<sup>ая</sup>
4
8
0,5
2
8
0,25
0,75
NE
2<sup>ая</sup>
0,5
8
0,0625
4
8
0,5
0,562
NE
Эритромицин<sup>1</sup>
1
1<sup>ая</sup>
0,031
0,125
0,25
2
4
0,5
0,75
NE
2<sup>ая</sup>
0,007
0,125
0,063
2
4
0,5
0,562
NE
2
1<sup>ая</sup>
0,007
0,25
0,25
2
8
0,25
0,5
NE
2<sup>ая</sup>
0,007
0,25
0,031
4
8
0,5
0,531
NE
Ампициллин<sup>1</sup>
1
1<sup>ая</sup>
0,125
0,25
0,5
1
4
0,25
0,75
NE
2<sup>ая</sup>
0,25
0,5
0,5
0,125
4
0,031
0,53
NE
2
1<sup>ая</sup>
0,062
0,125
0,5
2
8
0,25
0,75
NE
2<sup>ая</sup>
0,125
0,25
0,5
2
8
0,25
0,75
NE
Гентамицин<sup>2</sup>
1
1<sup>ая</sup>
0,062
0,125
0,5
0,5
4
0,125
0,625
NE
2<sup>ая</sup>
0,062
0,125
0,5
1
4
0,25
0,75
NE
2
1<sup>ая</sup>
0,5
1
0,5
1
4
0,25
0,75
NE
2<sup>ая</sup>
0,007
0,5
0,0156
2
4
0,5
0,515
NE
Ципрофлоксацин<sup>2</sup>
1
1<sup>ая</sup>
0,062
0,125
0,5
2
4
0,5
0,75
NE
2<sup>ая</sup>
0,003
0,125
0,025
4
2
0,5
0,525
NE
2
1<sup>ая</sup>
0,125
0,25
0,5
0,5
4
0,125
0,625
NE
2<sup>ая</sup>
0,125
0,25
0,5
0,25
4
0,0625
0,562
NE
Сульфаметоксазол<sup>2</sup>
1
1<sup>ая</sup>
4
8
0,5
1
4
0,25
0,75
NE
2<sup>ая</sup>
4
8
0,5
2
4
0,5
1
NE
2
1<sup>ая</sup>
4
8
0,5
1
4
0,25
0,75
NE
2<sup>ая</sup>
4
8
0,5
2
4
0,5
1
NE
Пенициллин G<sup>2</sup>
1
1<sup>ая</sup>
0,062
0,125
0,5
2
4
0,5
1
NE
2<sup>ая</sup>
0,062
0,125
0,5
2
4
0,5
1
NE
2
1<sup>ая</sup>
0,062
0,125
0,5
2
4
0,5
1
NE
2<sup>ая</sup>
0,031
0,25
0,125
2
4
0,5
0,625
NE
<sup>1 </sup>штамм S. aureus T3-29;
<sup>2 </sup>штамм Staphylococcus spp. MK1;
ФИК<sub>1</sub> = МИК для антибиотика в комбинации с NCL812/МИК для антибиотика в отдельности;
ФИК<sub>2</sub> = МИК NCL812 в комбинации с антибиотиком/МИК для NCL812 в отдельности;
ФИК<sub>и</sub> = индекс ФИК.
Тестирование аналогов NCL812
Фигуре 1.
Химическая структура аналогов с NCL001 по NCL230 показана на
Таблице
40.
Значения МИК для NCL812 и аналогов NCL001-070 приведены в
Таблице 41
Значения МИК для аналогов с NCL071 по 171 приведены в .
Таблице 42.
Значения МИК для аналогов с NCL171 по 230 приведены в
Таблица 40:
Значения МИК для NCL812 и аналогов NCL001-070 согласно Примеру 7
Соединение
МИК (мкг/мл) при 24 ч
MRSA 1
MRSA 2
VRE 1
VRE 2
E. coli
P. aeruginosa
Ампициллин
Амп
>128
16
0,5
0,25
4
>128
NCL812
4
4
2
2
>128
>128
NCL812
1<sup>ый</sup>
4
2
2
2
>128
>128
2<sup>ой</sup>
4
2
2
1
>128
>128
NCL001
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL002
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL003
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL004
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL005
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL006
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL007
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL008
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL009
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL010
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL011
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
32
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
32
>128
>128
NCL012
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL013
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL014
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL015
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
128
>128
>128
NCL016
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL017
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL018
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL019
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL020
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL021
1<sup>ый</sup>
16
16
8
8
>128
>128
2<sup>ой</sup>
16
16
8
8
>128
>128
NCL022
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL023
1<sup>ый</sup>
16
16
32
16
>128
>128
2<sup>ой</sup>
16
16
32
16
>128
>128
NCL024
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL025
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL026
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL027
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL028
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
128
>128
>128
NCL029
1<sup>ый</sup>
32
32
32
32
>128
>128
2<sup>ой</sup>
32
32
32
32
>128
>128
NCL030
1<sup>ый</sup>
128
128
64
64
>128
128
2<sup>ой</sup>
128
128
64
64
>128
128
NCL031
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL032
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL033
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL034
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL035
1<sup>ый</sup>
16
16
8
4
>128
>128
2<sup>ой</sup>
16
16
4
4
>128
>128
NCL036
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL037
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL038
1<sup>ый</sup>
8**
8**
8**
8**
>128
>128
2<sup>ой</sup>
8**
8**
16**
8**
>128
>128
NCL039
1<sup>ый</sup>
32
32
32
8
>128
>128
2<sup>ой</sup>
64
32
32
8
>128
>128
NCL040
1<sup>ый</sup>
8
8
8
8
>128
>128
2<sup>ой</sup>
8
8
8
8
>128
>128
NCL041
1<sup>ый</sup>
64
64
64
64
128
128
2<sup>ой</sup>
64
64
64
64
64
128
NCL042
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL043
1<sup>ый</sup>
128
128
128
128
128
128
2<sup>ой</sup>
128
128
128
64
128
128
NCL044
1<sup>ый</sup>
128
128
128
128
>128
128
2<sup>ой</sup>
128
128
128
128
>128
128
NCL045
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL046
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL047
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL048
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL049
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL050
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL051
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL052
1<sup>ый</sup>
128
128
128
128
>128
128
2<sup>ой</sup>
128
128
128
128
>128
128
NCL053
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
128
NCL054
1<sup>ый</sup>
4
2
4
4
>128
>128
2<sup>ой</sup>
2
4
4
4
>128
>128
NCL055
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL056
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL057
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL058
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL059
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL060
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL061
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
8
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
8
>128
>128
NCL062
1<sup>ый</sup>
2
4
2
1
>128
>128
2<sup>ой</sup>
2
4
2
1
>128
>128
NCL063
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL064
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL065
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL066
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL067
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL068
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL069
1<sup>ый</sup>
128
128
128
64
>128
>128
2<sup>ой</sup>
128
128
128
64
>128
>128
NCL070
1<sup>ый</sup>
>128
>128
>128
32
>128
>128
2<sup>ой</sup>
>128
>128
>128
32
>128
>128
Таблица 41:
Значения МИК для аналогов NCL071-170 согласно Примеру 7
Код соединения NCL
МИК (мкг/мл) при 24 ч
MRSA 1
MRSA 2
VRE 1
VRE 2
E. coli
P. aeruginosa
NCL071
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL072
32
64
64
64
>128
>128
32
64
64
64
>128
>128
NCL073
128
128
16
64
>128
>128
128
128
16
64
>128
>128
NCL074
16
16
2
8
>128
>128
16
16
1
4
>128
>128
NCL075
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL076
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL077
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL078
4
16
4
4
>128
>128
4
8
2
2
>128
>128
NCL079
4
4
2
4
>128
>128
4
8
2
4
>128
>128
NCL080
4
4
2
4
>128
>128
4
8
2
4
>128
>128
NCL081
4
8
1
4
>128
>128
4
4
1
4
>128
>128
NCL082
8
8
4
2
>128
>128
4
8
4
4
>128
>128
NCL083
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL084
2
8
2
2
>128
>128
2
4
2
2
>128
>128
NCL085
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL086
>128
>128
>128
128
>128
>128
>128
>128
>128
128
>128
>128
NCL087
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL088
16
8
4
4
>128
>128
8
8
4
4
>128
>128
NCL089
4
4
0.5
1
>128
>128
8
4
0.5
1
>128
>128
NCL090
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL091
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL092
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL093
64
128
64
>128
>128
>128
64
128
64
>128
>128
>128
NCL094
128
128
64
128
>128
>128
128
128
64
128
>128
>128
NCL095
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL096
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL097
128
32
32
32
>128
128
128
32
32
32
>128
>128
NCL098
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL099
8
4
8
8
>128
>128
8
4
8
8
>128
>128
NCL100
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL101
32
32
64
128
>128
>128
32
32
64
128
>128
>128
NCL102
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL103
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL104
64
64
128
>128
>128
>128
64
64
128
>128
>128
>128
NCL105
64
>128
64
>128
>128
>128
64
>128
64
>128
>128
>128
NCL106
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL107
8
16
32
128
>128
>128
8
16
32
128
>128
>128
NCL108
64
64
64
128
>128
>128
64
64
64
128
>128
>128
NCL109
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL110
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL111
64
64
64
>128
>128
>128
64
64
64
>128
>128
>128
NCL112
>128
128
64
32
>128
>128
>128
128
64
32
>128
>128
NCL113
16
8
8
16
>128
>128
16
8
8
16
>128
>128
NCL114
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 115
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 116
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 117
64
128
64
64
>128
>128
64
128
64
64
>128
>128
NCL 118
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 119
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 120
8
4
2
8
>128
>128
8
8
2
8
>128
>128
NCL 121
32
32
8
32
>128
>128
32
32
8
64
>128
>128
NCL 122
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL123
16
4
4
4
>128
>128
32
8
4
4
>128
>128
NCL 124
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 125
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 126
>128
>128
4
>128
>128
>128
>128
>128
8
>128
>128
>128
NCL 127
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 129
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 130
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 131
>128
>128
4
>128
>128
>128
>128
>128
4
>128
>128
>128
NCL 132
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 133
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 134
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 135
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 136
64
128
32
128
>128
>128
64
128
32
128
>128
>128
NCL 137
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 138
<img file="00000102.jpg" he="33" wi="96" img-content="undefined" img-format="jpg" />>128
32
>128
>128
>128
>128
>128
32
>128
>128
>128
>128
NCL139
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 140
>128
16
2
8
>128
>128
>128
32
2
8
>128
>128
NCL 141
>128
>128
16
>128
>128
>128
>128
>128
16
>128
>128
>128
NCL 142
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 143
16
16
8
8
>128
>128
16
16
8
8
>128
>128
NCL 144
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 145
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 146
8
16
16
16
>128
>128
8
16
16
16
>128
>128
NCL 147
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 148
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 149
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 150
128
128
>128
>128
>128
>128
128
128
>128
>128
>128
>128
NCL 151
64
64
128
64
>128
>128
64
64
128
64
>128
>128
NCL 152
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 153
32
16
8
8
>128
>128
32
16
8
8
>128
>128
NCL 154
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 155
8
8
16
8
>128
>128
8
8
16
8
>128
>128
NCL 156
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 157
2
2
2
2
>128
>128
2
2
2
4
>128
>128
NCL 140
8
16
16
16
>128
>128
8
16
16
16
>128
>128
NCL 038
8
8
8
8
>128
>128
8
8
8
8
>128
>128
NCL 158
<img file="00000103.jpg" he="27" wi="91" img-content="undefined" img-format="jpg" />4
4
4
4
>128
>128
4
4
4
4
>128
>128
NCL 159
<img file="00000104.jpg" he="35" wi="91" img-content="undefined" img-format="jpg" />64
128
16
128
>128
>128
64
128
16
128
>128
>128
NCL 160
<img file="00000105.jpg" he="23" wi="111" img-content="undefined" img-format="jpg" />32
128
16
64
>128
>128
64
128
16
64
>128
>128
NCL 161
<img file="00000106.jpg" he="32" wi="118" img-content="undefined" img-format="jpg" />64
128
128
128
>128
>128
128
128
128
128
>128
>128
NCL 162
<img file="00000107.jpg" he="24" wi="65" img-content="undefined" img-format="jpg" />>128
128
>128
>128
>128
>128
>128
128
>128
>128
>128
>128
NCL 163
<img file="00000108.jpg" he="27" wi="76" img-content="undefined" img-format="jpg" />>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 164
<img file="00000109.jpg" he="25" wi="91" img-content="undefined" img-format="jpg" />>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 165
<img file="00000110.jpg" he="28" wi="73" img-content="undefined" img-format="jpg" />>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 166
<img file="00000111.jpg" he="24" wi="111" img-content="undefined" img-format="jpg" />32
64
8
128
>128
>128
32
64
8
128
>128
>128
NCL 167
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 168
32
32
64
32
>128
>128
32
32
64
32
>128
>128
NCL 169
32
64
32
32
>128
>128
32
64
32
32
>128
>128
NCL 170
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
Таблица 42:
Значения МИК для аналогов NCL171-230 согласно Примеру 7
Код соединенияNCL
МИК (мкг/мл) при 24 ч
MRSA 1
MRSA 2
VRE 1
VRE 2
E. coli
P. aeruginosa
NCL171
128
64
32
>128
>128
>128
128
64
32
>128
>128
>128
NCL 172
128
64
>128
>128
>128
>128
128
64
>128
>128
>128
>128
NCL 173
16
16
4
32
>128
>128
16
16
4
32
>128
>128
NCL 174
32
32
4
32
>128
>128
32
32
4
32
>128
>128
NCL 175
64
>128
32
>128
>128
>128
64
>128
32
>128
>128
>128
NCL 176
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL 177
8
8
4
8
>128
>128
8
8
4
8
>128
>128
Код соединенияNCL
МИК (мкг/мл) при 24 ч
S. aureus ATCC29213
E. faecalis #32
E. coli ATCC25922
Pseudomonas #008
NCL 178
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
NCL 179
4
8
>64
>64
4
8
>64
>64
NCL 180
>64
64
>64
>64
>64
64
>64
>64
NCL 181
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
NCL 182
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
NCL 183
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
NCL 184
>64
64
>64
>64
>64
64
>64
>64
NCL 185
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
NCL 186
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
NCL 187
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
NCL 188
32
32
64
>64
32
32
64
>64
NCL 189
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
NCL 190
32
64
>64
>64
64
64
>64
>64
NCL 191
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
NCL 192
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
>64
Код соединенияNCL
МИК (мкг/мл) при 24 ч
MRSA 1
MRSA 2
VRE 1
VRE 2
E. coli
P. aeruginosa
NCL193
2
2
4
4
>128
>128
2
4
4
8
>128
>128
NCL194
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL195
2
2
4
2
>128
>128
2
2
4
4
>128
>128
NCL196
32
64
32
64
64
64
32
32
64
64
64
128
NCL197
8
8
8
8
>128
>128
8
8
4
8
>128
>128
NCL198
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL199
2
4
>128
>128
>128
>128
4
4
>128
>128
>128
>128
NCL200
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL201
32
16
>128
>128
>128
>128
64
32
>128
>128
>128
>128
NCL202
8
8
8
8
>128
>128
8
8
8
>128
>128
NCL203
32
64
32
32
>128
>128
32
64
64
32
>128
>128
NCL204
4
4
64
>128
>128
>128
8
8
64
>128
>128
>128
NCL205
4
4
64
>128
>128
>128
8
8
64
>128
>128
>128
NCL206
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL207
16
32
>128
>128
>128
>128
32
32
>128
>128
>128
>128
NCL208
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL209
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL210
>128
>128
128
32
>128
>128
>128
>128
128
64
>128
>128
NCL211
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL212
>128
>128
32
16
>128
>128
>128
128
32
16
>128
>128
NCL213
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL214
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL215
8
8
2
4
>128
>128
16
8
4
8
>128
>128
NCL216
2
2
2
4
>128
>128
4
2
4
>128
>128
NCL217
4
4
2
4
>128
>128
4
4
2
4
>128
>128
NCL218
>128
>128
16
>128
>128
>128
>128
>128
16
>128
>128
>128
NCL219
2
2
16
16
>128
>128
2
2
16
16
>128
>128
NCL220
16
16
32
32
>128
>128
16
16
32
32
>128
>128
NCL221
4
2
64
64
>128
>128
4
2
64
64
>128
>128
NCL222
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL223
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL224
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL225
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL226
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL227
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL228
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL229
>128
>128
>128
>128
>128
>128
NCL230
>128
>128
>128
>128
>128
>128
Pseudomonas
Pseudomonas
Pseudomonas
Pseudomonas
Pseudomonas
E. coli
Аналоги NCL, демонстрирующие наибольший уровень антибактериальной активности в отношении грамотрицательных бактерий, включали NCL030 (в особенности ), NCL041, NCL043, NCL044 (в особенности ), NCL052 (в особенности ) и NCL053 (в особенности ), NCL097 (в особенности ), NCL196 и NCL188 (в особенности ).
Аналоги NCL, демонстрирующие наибольший уровень активности в отношении MRSA, включали: NCL021; NCL023; NCL029; NCL030; NCL035; NCL038; NCL039; NCL040; NCL041; NCL043; NCL044; NCL052; NCL054; NCL062; NCL069; NCL072; NCL073; NCL074; NCL078; NCL079; NCL080; NCL081; NCL082; NCL084; NCL088; NCL089; NCL093; NCL094; NCL097; NCL099; NCL101; NCL104; NCL107; NCL108; NCL111; NCL113; NCL117; NCL120; NCL121; NCL123; NCL136; NCL138; NCL140; NCL143; NCL146; NCL150; NCL151; NCL153; NCL155; NCL157; NCL158; NCL159; NCL160; NCL161; NCL166; NCL168; NCL169; NCL171; NCL172; NCL173; NCL174; NCL177; NCL178; NCL179; NCL180; NCL181; NCL182; NCL183; NCL184; NCL185; NCL186; NCL187; NCL188; NCL189; NCL190; NCL191; NCL192; NCL193; NCL195; NCL196; NCL197; NCL199; NCL201; NCL202; NCL203; NCL204; NCL205; NCL207; NCL215; NCL216; NCL217; NCL219; NCL220 и NCL221.
Аналоги NCL, демонстрирующие наибольший уровень активности в отношении VRE, включали: NCL011; NCL021; NCL023; NCL029; NCL030; NCL035; NCL038; NCL039; NCL040; NCL041; NCL043; NCL044; NCL052; NCL054; NCL061; NCL062; NCL069; NCL070; NCL072; NCL073; NCL074; NCL078; NCL079; NCL080; NCL081; NCL082; NCL084; NCL088; NCL093; NCL094; NCL097; NCL099; NCL101; NCL105; NCL107; NCL108; NCL111; NCL112; NCL113; NCL117; NCL120; NCL121; NCL123; NCL126; NCL131; NCL136; NCL140; NCL141; NCL143; NCL146; NCL151; NCL153; NCL155; NCL157; NCL158; NCL159; NCL160; NCL161; NCL166; NCL168; NCL169; NCL171; NCL173; NCL174; NCL175; NCL177; NCL178; NCL179; NCL180; NCL181; NCL182; NCL183; NCL184; NCL185; NCL186; NCL187; NCL188; NCL189; NCL190; NCL191; NCL192; NCL193; NCL195; NCL196; NCL197; NCL202; NCL203; NCL204; NCL205; NCL210; NCL212; NCL215; NCL216; NCL217; NCL218; NCL219; NCL220; and NCL221.
Таблице 43
Ранговая оценка биологической актиности протестированных аналогов указан в .
Таблица 43:
Ранговая оценка биологической актиности аналогов, протестированных согласно Примеру 7
NCL ID
G-ранг
NCL ID
M+R мкг/мл
M+R ранг
NCL ID
MRSA мкг/мл
MRSA ранг
NCL ID
VRE мкг/мл
VRE ранг
NCL097
1
NCL062
2,25
1
NCL157
2
1
NCL089
0,75
1
NCL196
1
NCL157
2,25
2
NCL195
2
2
NCL062
1,5
2
NCL030
1
NCL812
2,375
3
NCL179
2
3
NCL812
1,75
3
NCL041
1
NCL195
2,75
4
NCL219
2
4
NCL084
2
4
NCL043
1
NCL216
2,75
5
NCL216
2,5
5
NCL157
2,5
5
NCL044
1
NCL089
2,875
6
NCL193
2,5
6
NCL081
2,5
6
NCL052
1
NCL084
3
7
NCL062
3
7
NCL216
3
7
NCL053
1
NCL179
3
8
NCL812
3
8
NCL217
3
8
NCL054
3,5
9
NCL054
3
9
NCL079
3
9
NCL217
3,5
10
NCL221
3
10
NCL080
3
10
NCL081
3,75
11
NCL199
3,5
11
NCL078
3
11
NCL193
3,75
12
NCL084
4
12
NCL195
3,5
12
NCL079
4
13
NCL217
4
13
NCL082
3,5
13
NCL080
4
14
NCL158
4
14
NCL074
3,75
14
NCL158
4
15
NCL089
5
15
NCL179
4
15
NCL082
5,25
16
NCL081
5
16
NCL054
4
16
NCL078
5,5
17
NCL079
5
17
NCL158
4
17
NCL120
6
18
NCL080
5
18
NCL088
4
18
NCL088
7
19
NCL099
6
19
NCL123
4
19
NCL099
7
20
NCL204
6
20
NCL215
4,5
20
NCL177
7
21
NCL205
6
21
NCL193
5
21
NCL215
7,25
22
NCL082
7
22
NCL120
5
22
NCL197
7,5
23
NCL120
7
23
NCL035
5
23
NCL040
8
24
NCL078
8
24
NCL140
5
24
NCL038
9
25
NCL177
8
25
NCL177
6
25
NCL202
9
26
NCL197
8
26
NCL197
7
26
NCL219
9
27
NCL040
8
27
NCL099
8
27
NCL123
9,5
28
NCL038
8
28
NCL040
8
28
NCL074
9,875
29
NCL155
8
29
NCL202
8
29
NCL155
10
30
NCL088
10
30
NCL021
8
30
NCL035
10,5
31
NCL215
10
31
NCL143
8
31
NCL021
12
32
NCL202
10
32
NCL153
8
32
NCL113
12
33
NCL113
12
33
NCL038
10
33
NCL143
12
34
NCL146
12
34
NCL155
12
34
NCL146
14
35
NCL107
12
35
NCL113
12
35
NCL153
16
36
NCL123
15
36
NCL219
16
36
NCL188
16
37
NCL074
16
37
NCL146
16
37
NCL173
17
38
NCL035
16
38
NCL188
16
38
NCL023
20
39
NCL021
16
39
NCL173
18
39
NCL220
24
40
NCL143
16
40
NCL174
18
40
NCL174
25
41
NCL188
16
41
NCL039
20
41
NCL190
28
42
NCL173
16
42
NCL023
24
42
NCL039
30
43
NCL023
16
43
NCL212
24
43
NCL121
30
44
NCL220
16
44
NCL121
28
44
NCL029
32
45
NCL153
24
45
NCL220
32
45
NCL221
33,5
46
NCL190
24
46
NCL190
32
46
NCL168
40
47
NCL207
28
47
NCL029
32
47
NCL169
40
48
NCL174
32
48
NCL169
32
48
NCL203
44
49
NCL121
32
49
NCL180
32
49
NCL107
46
50
NCL029
32
50
NCL184
32
50
Пример 8:
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Влияние NCL812 на чувствительные к антимикробным агентам изоляты и
Материалы и методы
Сведения о штаммах
Staphylococcus aureus:
S. aureus
S. aureus
Enterococcus faecalis
В следующих экспериментах были использованы два изолята MK01, штамм обитающий на коже человека, и KC01, штамм, обитающий на коже лошадей. Эти изоляты были идентифицированы методом окрашивания по Граму и биохимическими методами, в том числе с помощью коммерческого набора Remel Staphaurex. Один изолят (USA01) был идентифицирован как штамм, не являющийся VRE (т.е. не ванкомицин-устойчивый энтерококк). Поскольку вид этого изолята был определен ранее, его не подвергали дальнейшим исследованиям, помимо наблюдений за равномерным характерным ростом на кровяном агаре.
Исследование Минимальной бактерицидной концентрации (МБК)
Методология CLSI
Как и в предыдущих экспериментах, 10 мкл содержимого каждой лунки, начиная с МИК, засевали на чашки с агаром с овечьей кровью (SBA)  Columbia и инкубировали при 37°С в течение 48 ч. Чашки оценивали через 24 и 48 ч, и МБК определяли как наименьшую концентрацию NCL812, при которой на чашке не наблюдалось роста бактериальных колоний (или наблюдалось значительное ингибирование роста, по сравнению с контролем) (CLSI 2005).
Метод оценки кинетики элиминации клеток (kill kinetics assays) S. aureus KC01 и E. faecalis USA01
S. aureus
E. faecalis
800
KC01 и USA01, которые были идентифицированы как не MRSA и не VRE, соответственно, выращивали в течение ночи на агаре Columbia SBA при 37°С. Затем несколько бактериальных колоний суспендировали в среде CAMHB (среда Мюллера-Хинтона со стандартизированным содержанием катионов) и доводили до оптической плотности OD от 0,08 до 0,10. Суспензию бактерий разводили 1:10. Один миллилитр бактерий добавляли к 9 мл среде CAMHB, содержащей различные концентрации (до 4 × МИК) NCL, до достижения конечной концентрации бактерий от 1 до 3 х 106 КОЕ/мл. Пробирки инкубировали при 37°С при постоянном встряхивании. Для того чтобы определить число жизнеспособных бактерий, присутствующих в различные моменты времени, из каждой пробирки брали аликвоты по 100 мкл и разводили. Затем 100 мкл каждого разведения высевали на агар для подсчета колоний в двух повторностях и инкубировали в течение 48 ч при температуре 37°С. Через 24 ч подсчитывали число колоний, присутствующих на каждой чашке, и на основании этого подсчитывали количество жизнеспособных бактерий, присутствующих в исходной суспензии. Чашки повторно проверяли после 48 часов.
Результаты
Минимальная ингибирующая концентрация (МИК)
S. aureus
E. faecalis
S. aureus
S. aureus
E. faecalis
Оценивали МИК соединения NCL812 в отношении изолятов MK01 и KC01, а также USA01. В результате было получено: МИК для MK01 = 4-8 мкг/мл, МИК для KC01 = 2 мкг/мл, МИК для USA 01 = 4 мкг/мл.
S. aureus
S. aureus
E. faecalis
S. aureus
S. aureus,
E. faecalis,
Таблице 45
Таблице 45
Таблице 37
Таблице 38
При исследовании изолятов  MK01 и KC01 не наблюдали роста бактерий, или наблюдали рост только при низких концентрациях NCL812 (2 мкг/мл), что свидетельствует о том, что это NCL812 оказывает бактерицидное действие против . Однако, для тестируемого изолята (USA01) рост бактерий наблюдался при всех протестированных концентрациях NCL812. Было заметно уменьшение числа бактерий с увеличением концентрации NCL812, но рост присутствовал, в сравнении с отсутствием роста у . Обобщенные результаты данного эксперимента приведены в . В  показаны результаты для оценки МБК для NCL812 на двух изолятах не являющихся MRSA, и на одном изоляте  не являющимся VRE. Каждый тест по оценке МБК проводили в двух повторностях. Никаких изменений в результатах не наблюдали на сроке 48 ч. В  указаны значения МБК (мкг/мл)  для NCL812 для 20 изолятов MRSA. Каждый тест по оценке МБК проводили в двух повторностях, начиная с концентрации NCL812, соответствующей МИК,  до 16-кратной МИК. В  указаны значения МБК (мкг/мл)  для NCL812 для 10 VRE изолятов. Каждый тест по оценке МБК проводили в двух повторностях, начиная с концентрации NCL812, соответствующей МИК, до 32-кратной МИК.
Таблица 45:
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Оценка МБК для NCL812 на двух не являющихся MRSA изолятах и на одном не являющемся VRE изоляте согласно Примеру 8
Организм/Номер образца .
МБК для NCL812
2 мкг/мл
4 мкг/мл
8 мкг/мл
16 мкг/мл
32 мкг/мл
64 мкг/мл
128 мкг/мл
S. aureus (KC01)
1<sup>st</sup>
+
0
0
0
0
0
0
2<sup>nd</sup>
+
+
+
0
0
0
0
S. aureus (MK01)
1<sup>st</sup>
0 (5)
0
0
0 (N)
0 (N)
0 (N)
0 (N)
2<sup>nd</sup>
0
0
0
0
0
0
0
E. faecalis (USA01)
1<sup>st</sup>
N
+ (488)
+
+
+ (7)
+ (1)
+
2<sup>nd</sup>
N
+
+
+
+
+
+
+ = Рост на агаре с овечьей кровью; 0 =  отсутствие роста на агаре с овечьей кровью ; N = не культивирован; Числа в скобках соответствует количеству бактерий, выросших через 24 ч на мл образца (КОЕ/мл)
Анализ кинетики элиминации (kill kinetics assays) для S. aureus KC01 и E. faecalis USA01
t
S. aureus
10
10
10
Подсчет колоний проводили при  = 0, 120, 240 и 360 мин, и затем при 24 ч. На сроке 2 ч KC01 показали не менее 2,5log снижение количества бактерий, по сравнению с исходными значениями, и более чем 3log  снижение, по сравнению с контролем на этом же сроке. Не менее  2log снижение было все еще очевидно при  6-часовой инкубации, однако через 24 ч число присутствующих бактерий, возросло, и оно  существенно не отличалось от контроля.
E. faecalis
S. aureus
10
10
10
Аналогичные результаты были получены для USA01, однако, наблюдаемое уменьшение числа бактерий было меньше, чем для KC01. 2log снижение КОЕ/мл наблюдалось через 2 ч, по сравнению с ростом в контроле. Однако, уменьшение КОЕ/мл, по сравнению с исходным числом бактерий, было больше только 1log. При концентрации NCL812 4-16 мкг/мл уменьшение числа бактерий оставалось неизменной до срока 6 ч. При концентрациях 32 и 64 мкг/мл на этом же сроке, однако, наблюдалось примерно 1logувеличение числа бактерий. Через 24 ч количество бактерий при всех концентрациях увеличивалось почти до такого же уровне, как и при росте в контроле.
S. aureus
E. faecalis,
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Фигуре 39.
Фигуре 40
Результаты, полученные для этих штаммов and согласуются с результатами, полученными в анализе кинетики элиминации для всех протестированных изолятов MRSA и VRE. Результаты анализа кинетики элиминации KC01 при различных концентрациях NCL812 до 24 ч периода инкубации показаны на  Результаты анализа кинетики элиминации USA01 при различных концентрациях NCL812 до 24 ч периода инкубации показаны на .
Пример 9:
Препараты, содержащие соединения.
С помощью стандартных способов, используемых в данной области, были приготовлены следующие препараты.
Препарат A
Препарат для местного применения - Гель на основе ПЭГ, содержащий соединения настоящего изобретения
-
4,0 г ПЭГ 4000;
3,5 ПЭГ 200;
0,6 пропиленгликоль;
1,9 г воды; и
0,204 г соединения (например, NCL099).
Смешивавли ПЭГ 4000, ПЭГ 200 и пропиленгликоль и нагревали до 150°С до растворения всех твердых кристаллов. Соединение добавляли к воде и обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут до полного суспендирования. Раствор соединения смешивали с гель-растворами и оставляли для охлаждения и отвердевания. Препарат А показал приемлемую вязкость, легкость нанесения на кожу, однородную суспензии и последовательной и соответствующую тонкую текстуру.
Препарат B
Препарат для местного применения - Гель на основе ПЭГ, содержащий соединения настоящего изобретения
-
3,0 г ПЭГ 4000;
1,0 г ПЭГ 8000;
3,0 ПЭГ 200;
1,0 пропиленгликоль;
1,9 г воды; и
0,202 г соединения (например, NCL099).
Смешивавли ПЭГ 4000, ПЭГ 8000,  ПЭГ 200 и пропиленгликоль и нагревали до 150°С до растворения всех твердых кристаллов. Соединение (например, NCL099) добавляли к воде и обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут до полного суспендирования. Раствор соединения смешивали с гель-растворами и оставляли для охлаждения и отвердевания. Препарат B показал приемлемую вязкость, легкость нанесения на кожу, однородную суспензии и последовательной и соответствующую тонкую текстуру.
Препарат C
Препарат для местного применения - Гель на основе ПЭГ, содержащий соединение-Soluplus
-
2,5 г ПЭГ 4000;
4,0 ПЭГ 200;
2,5 пропиленгликоль;
1,0 г воды; и
1,8 г твердой дисперсии соединение-SoluPlus.
SoluPlus был приобретен у BASF (www.soluplus.com). NCL812-SoluPlus готовили с помощью стандартных способов, известных в данной области. Смешивавли ПЭГ 4000, ПЭГ 200, соединение-SoluPlus и пропиленгликоль и нагревали до 150°С до растворения всех твердых кристаллов. Добавляли воду, после чего раствор обрабатывали ультразвуком. Раствор оставляли для охлаждения и отвердевания. Препарат C показал приемлемую вязкость, легкость нанесения на кожу, однородную суспензии и последовательной и соответствующую тонкую текстуру.
Препарат D
Препарат в форме таблеток
-
30 мг двузамещённый кальция фосфат дигидрат;
80 мг микрокристаллической целлюлозы;
50мг лактозы;
8 мг гидроксипропилметилцеллюлозы
1,5 мг талька
10 мг соединения (например, NCL099)
Вспомогательные вещества взвешивали и смешивали в течение 5 минут. Смесь помещали в загрузочную воронку таблеточного пресса, и запускали работу прибора в соответствии со стандартными процедурами в данной области техники. Препарат D показал приемлемую твердость, растворение и истираемость таблеток.
Препарат E - Суспензия для перорального применения
2,0 мл глицерина;
1,5 мл абсолютного этанола;
600 мг NCL812; и
до 60мл носителя
Порошок NCL812 просеивали через сито 75 мкм. 600 мг просеянного NCL812 смешивали с 2,0 мл глицерина и 1,5 мл абсолютного этанола. Смесь помещали в ступку и измельчали вручную до однородности суспензии NCL812. Суспензию обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут. Затем к суспензии добавляли носитель (55 мл Ora Sweet и Ora Plus mixture) измельчали в течение еще 10 минут. Доводили объем до 60 мл со смесью Ora plus и Ora sweet, перенося суспензию  в мерный цилиндр.
Препарат E характеризовался приемлемой суспнезией и показал приемлемую краткосрочную стабильности.
Препарат F
Препарат для внутримышечной инъекции
-
20мг/мл поливинилпирролидона К30 (PVPK30);
0,09 мг/мл NCL812; и
50 мл воды.
Готовили двухпроцентный (вес/масса) раствор PVP K30 путем добавления 1,0 г поливинилпирролидона K30 к 50 мл воды MilliQ. Затем раствор помещали в ультразвуковой аппарат на 30 минут для уравновешивания, добавляли 4,5 мг NCL812 к растворе PVP и оставляли в шейкере инкубатор при максимальной скорости 10 об./мин. в течение 24 часов с регулируемой температурой 25 ± 1° C. Раствор переносили во флаконы по 5 мл и оценивали их прозрачность, внешний вид, рН и краткосрочную стабильность. Значение рН раствора составило 7,25.
Препарат F показал приемлемую прозрачность и краткосрочную стабильность.
Пример 10
:
Высвобождение NCL812 и NCL099 из препарата В.
Цель данного исследования была оценка высвобождения соединения NCL812 и NCL099 из Препарата B, полученного в Примере 9.
Для количественной оценки скорости высвобождения NCL812 и NCL099 из препарата для местного применения использовали диффузионные ячейки Франца. Пять миллилитров абсолютного этанола, который был выбран в качестве среды для желаемого высвобождения, загружали в камеру-приемник. Температура жидкости приемника поддерживалась на постоянном уровне  при 32°С ± 1 с использованием водяной рубашки. Были выбраны ацетилцеллюлозные мембраны с размером пор 0,45 мкм (Pall Corporation), и их помещали между донорной камерой и камерой-приемником. После этого, в донорную камеру загружали ряд тестовых образцов (препарат B). Один миллилитр жидкости приемника собирали через определенные промежутки времени, составляющие 0,25, 0,50, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 24 часов, через порт для отбора проб. Один миллилитр свежего абсолютного этанола немедленно возвращали в камеру-приемник. Для анализа полученного содержимого жидкости приемника использовали УФ-ВЭЖХ.
На Фигуре 41 представлен совокупное высвобождение NCL812 и NCL099 с течением времени. Данное исследование показывает, что препарат В обеспечивает приемлемый профиль высвобождения для NCL812 и NCL099.
ПРИМЕР 11
:
Данные ЯМР-спектроскопии для соединений  NCL812, NCL001-NCL230
Таблице 46.
ЯМР-спектрокопию проводили для соединений NCL812, NCL001-NCL230 с использованием стендартных методов в данной области. Перечень данных по ЯМР-спектрокопии представлен в
Таблица 46:
Данные ЯМР-спектроскопии для соединений NCL812, NCL001-NCL230
ПРИМЕР 12
:
in vivo
Способ лечения бактериальной инфекции путем введения NCL812 или NCL099.
Целью данного исследования было определении эффективности исследуемого Ветеринарного лекартсенного препарата, содержащего NCL812 или NCL099., в лечении инфекции кожи у мышей.
Краткое описание модели: Применяемая модельная система на животных должна быть клинически релевантной, экспериментально надежной, приемлемой с этической точки зрения, удобной в осуществлении, и она должна давать надежные и воспроизводимые результаты. Описано много моделей на животных для изучения местных инфекций кожи, в том числе модель «кротоновое масло-воспаленная кожа» (Akiyama, H., H. Kanzaki, Y. Abe, J. Tada and J. Arata (1994). "Staphylococcus aureus infection on experimental croton oil-inflamed skin in mice." Journal of Dermatological Science 8(1): 1-10), модель «обожжённой кожи» (Stieritz, D. D., A. Bondi, D. McDermott and E. B. Michaels (1982). "A burned mouse model to evaluate anti-pseudomonas activity of topical agents." Journal of Antimicrobial Chemotherapy 9(2): 133-140), модель «кожный шов-рана» (McRipley, R. J. and R. R. Whitney (1976). "Characterization and Quantitation of Experimental Surgical-Wound Infections Used to Evaluate Topical Antibacterial Agents." Antimicrobial Agents and Chemotherapy 10(1): 38-44), модель с использованием липкой ленты (Kugelberg, E., T. Norström, T. K. Petersen, T. Duvold, D. I. Andersson and D. Hughes (2005). "Establishment of a Superficial Skin Infection Model in Mice by Using Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes." Antimicrobial Agents and Chemotherapy 49(8): 3435-3441) и метод линейного надреза скальпелем на всю толщину кожи (Guo, Y., R. I. Ramos, J. S. Cho, N. P. Donegan, A. L. Cheung and L. S. Miller (2013). "In Vivo Bioluminescence Imaging To Evaluate Systemic and Topical Antibiotics against Community-Acquired Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus-Infected Skin Wounds in Mice." Antimicrobial Agents and Chemotherapy 57(2): 855-863).
В ходе предварительных исследований перед проведением настоящего исследования был разработан новый метод инфицирования кожи в результате детального изучения моделей, упомянутых выше. Вкратце, мышей анестезировали, выстригали участок шкуры на спине до оголения кожи и иссекали круглый участок кожи с помощью ручного штампа, оставляя рану на спине с полостью в центре. Рану инфицировали с помощью микроорганизма с известным номером. Примерно через четыре-шесть часов после заражения, рану либо обрабатывали местно с помощью препарата, содержащего только носитель, либо с помощью активного препарата. Инфицированные кожные раны повторно обрабатывали каждые 12 часов, всего 14 обработок. Мышей подвергали эвтаназии гуманным способом, обрезали площадь исходной инфицированной раны, и оценивали содержание бактерий в извлеченном кожном участке с помощью стандартных микробиологических тестов. Таким образом, изменение концентрации бактерий за счет обработки активным препаратом можно легко определить путем анализа снижения бактериальной нагрузки, по сравнению с контрольным образцом, обработанным только носителем.
Материалы и методы
Приготовление инокулята для инфекции
Staphylococcus aureus)
7
Свежие культуры бактерий ( выращивали на агаре с овечьей кровью при 37°С в течение 16-18 часов. Несколько типичных колоний отбирали и суспендировали в 10 мл трипсинового соевого бульона и инкубировали в течение ночи в шейкере-инкубаторе (240 об/мин) при 37°С. Ночную суспензию перемешивали и разводили (1: 100) в свежем триптическом соевом бульоне (100 мкл [0,1 мл] в 9.9ml бульона). Свежую суспензию инкубировали в течение 3 часов в шейкере-инкубаторе (как описано выше) для получения бактерий в середине логарифмической фазы роста. Бактерий осаждали центрифугированием при 7500 об./мин. в течение 10 мин. Супернатант удаляли и бактерий суспендировали в 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Эти стадии повторяли еще два раза. Плотность суспензии проверяли путем измерения оптической плотности при 600 нм с помощью спектрофотометра, с физиологическим раствором в качестве контрольного образца, для подтверждения необходимой плотности примерно 0,100, что соответствовало плотности бактерий 2,5×10 КОЕ/мл. Суспензию помещали в штатив, помещенный в сейф для транспортировки с кусочками льда для охлаждения во время транспортировки, а затем хранили в прохладном помещении после доставки в лабораторию, где осуществляли инфицирование кожи мышей. Конечную суспензию тщательно перемешивали перед инфицировали кожной раны у мышей.
В целях обеспечения чистоты и точности суспензии, проводили следующие операции перед помещением суспензии в сейф.
7
Чистоту бактериальной суспензии проверяли, высевая 100 мкл конечной суспензии на чашку с SBA (агар c овечьей кровью), которую инкубируют при 37°С в течение 18 часов и впоследствии осматривали для проверки равномерного роста колоний одного типа. Оценку количества жизнеспособных микроорганизмов проводили для конечной суспензии, добавляя физиологический раствор в пробирки-эппендорфы (примерно 900 мкл на пробирку), отбирая по 100 мкл образца, и добавляя к первой пробирке, встряхивали смесь, и повторяли с использованием второго эппендорфа, содержащего солевой раствор. Этот процесс продолжали для 5-6 пробирок. Наконец, 100 мкл 5-го и 6-го разведения высевали на агар для подсчета колоний, инкубировали при 37°С в течение 18 часов, и оценивали число колоний для подтверждения значения КОЕ/мл, равного примерно 2,5×10. После инокуляции раны этот этап повторяли для проверки того, что в ходе операции не произошла контаминации или снижение числа жизнеспособных бактерий.
Хирургическая процедура нанесения раны на кожу
5
Каждую мышь помещали в индукционную камеру и анестезировали с помощью 2% изофлурана. Глаза каждой анестезированной мыши покрывали ветеринарной смазкой для глаз для предотвращения обезвоживания роговицы. Каждую мышь удаляли из индукционной камеры и помещали в операционное поле напротив индивидуального носового конуса для анестезии. В ходе анестезии у каждой мыши контролировали оценку глубины анестезии (ответ на боль, мигательный рефлекса, тонус скелетных мышц), а также дыхательную и сердечную функции. Волосы на спине выбривали в хирургической области с помощью механической машинки для стрижки. Выбритый участок очищали с помощью бумажного полотенца, смоченного 70% этанолом, а затем 10% раствором вес/объем повидон-йод. После высыхания раствора йода, вводили подкожную инъекцию нестероидного противовоспалительного агента мелоксикама. Аккуратно прищипывали кожу спины для возможности нанесения округлой раны во всю толщину кожи с помощью ушного штампа/ дерматома для биопсии. Раны у контрольных мышей (только носитель) и мышей из группы  NCL812 и группы NCL099, инокулировали с помощью 10 мкл бактериальной суспензии с помощью микропипетки (2,5×10 КОЕ/10 мкл). После высыхания бактериальной суспензии мышей помещали в индивидуальные боксы для восстановления, маркированные номерами, соответствующими каждой мыши. Записывали время прививки. Для каждой мыши измеряли массу тела и записывали значение в соответствующем протоколе. Мыши возвращались в полное сознание в течение 5 минут. После восстановления мышей возвращали в отдельные боксы для почасового наблюдения за осложнениями после хирургии или анестезии
Послеоперационный уход (4 часа после операции)
Мышей оценивали на послеоперационные осложнения, и наблюдения записывалина клиническом учетном бланке. Каждую мышь тщательно извлекали из ИВК (индивидумальной вентилируемой камеры) и помещали в контейнер для оценки, стараясь не прикасаться к хирургической области. После помещения внутрь контейнера каждую мышь обследовали, и наблюдения записывали на пост-хирургическом клиническом учетном бланке. Всякий раз, когда показания соответствовали угрозе здоровья, вводили послеоперационное обезболивание и записывали на клиническом учетном бланке.
Наблюдение и ежедневный уход за животными
Введение антибиотика (7 часов утра и 6 часов вечера). Первое нанесение мази с носителем или мази с NCL812 или NCL099 осуществляли серез 4 часа после операции. Каждый контейнер с мазью взвешивали перед введением, и записывали значения. Каждую мышь осторожно придерживали. Мазь (носитель или NCL812, или NCL099) наносили на область поражения и обработанную мышь возвращали в ИВК, отслеживая, чтобы  мазь не была сразу же удалена при груминге. Измеряли вес контейнера с мазью после применения, и записывали. Препарат с носителем и активный препарат с NCL812 наносили на кожные раны каждые 12 часов после первого введения, в общей сложности в ходе 14 последовательных процедур. Продукты как с NCL812, так и с NCL099 (Препарат B, как описано в Примере 9) содержали соответствующий активный ингредиент  в концентрации 20 мг/г. Каждый раз наносили примерно 0,1-0,2 г мази, обеспечивая полную актуальную дозу NCL812 или NCL099 от 28 до 56 мг для мышей весом от 18 г до 25 г.
Ежедневное наблюдение. Наблюдение каждой мыши проводили один раз в день около 12 часов дня. Каждую мышь аккуратно извлекали из ИВК и помещали в контейнер для обследования, стараясь не прикасаться к хирургической области. Тщательно оценивали параметры шерстного покрова, позы, глаза, поведение, вокализацию и активность во время пребывания в контейнере, и наблюдения записывали на учетном бланке. Оценивали консистенцию фекалий мышей (на полу клетки или в контейнере), наблюдения заносили в протокол. Массу тела каждой мыши определяли во время ее пребывания в контейнере, рассчитывали изменение массы тела и показания заносили в протокол. Контейнер для обследования дезинфицировали этанолом и оставляли высушиваться, и для следующей мыши использовали свежий контейнер. Каждый второй день мышей повторно анестезировали с помощью 2% изофуран и фотографировали с использованием линейки для масштаба. На этих фотографиях оценивали размер пораженных участков и прогрессирование инфекции в ходе испытания.
Анализ тканей и оценка антибактериальной эффективности
Staphylococcus aureus
В конце 7 дня оценки кожных ран всех тестовых мышей подвергали эвтаназии перед сбором образцов ран для патологоанатомического обследования. На спинке у каждой мыши иссекали кожную рану. Образец помещали в пробирку и взвешивали перед добавлением 1мл PBS и стерильных бусин для гомогенизации ткани. Образцы ткани гомогенизировали в течение 10 минут с помощью гомогенизатора тканей (Next Advance Bullet Blender) и затем встряхивали на вортексе в течение примерно 30 секунд. Отбирали 100 мкл супернатанта и помещали в пробирку-эппендорф, содержащую 900 мкл PBS. Эту процедуру повторяли с использованием серийных разведений, всего для 8 разведений. Наконец, по 100 мкл каждого разведения с помощью пипетки наносили на агар для подсчета колоний в двух повторностях и инкубировали в течение ночи при 37°С. Десять микролитров исходной суспензии помещали на овечий кровяной агар для оценки чистоты культуры и инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующий день оценивали количество жизнеспособных микроорганизмов с использованием чашек с агаром для подсчета колоний, и подтверждали идентичность собранного штамма  (микроорганизм, используемый для инфицирования).
Результаты
10
10
10
10
Среднее количество колоний на грамм ткани в группе, обработанной только носителем, составило 5888436 (6,77 log). Среднее количество колоний на грамм ткани в группе, обработанной NCL812, составило 141254 (5,15 log). Среднее количество колоний на грамм ткани у мышей, обработанных NCL099, составило 1,318 (3.12log). Значения log колониеобразующих единиц на грамм ткани и % снижения суммированы в следующей таблице.
10
Таблица 47: Log колониеобразующих единиц на грамм ткани и процентное уменьшение после местного введения носителя и лекарственного средства
Обработка
Log<sub>10</sub>(КОЕ/г)
% снижения
Носитель
6,77
NCL812
5,15
97,6
NCL099
3,12
99,96
Staphylococcus aureus
in vivo
Из данной таблицы следует, что обработка либо NCL812, либо NCL099 приводит к снижению числа инфицирующего патогена . Эти результаты свидетельствуют об эффективном лечении бактериальной колонизации или инфекции за счет введения соединений настоящего изобретения.