Экспериментальная модель для лечения пародонтита с использованием эубиотических штаммов Veillonella parvula и Streptococcus salivarius

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАРОДОНТИТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭУБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ VEILLONELLA PARVULA И STREPTOCOCCUS SALIVARIUS

В.Н. Царев, Е.В. Ипполитов

Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова

В настоящее время различные компании по производству пищевых продуктов финансируют исследования по созданию новых пробиоти-ков или эубиотиков для использования в профилактических и лечебных целях с целью коррекции нормофлоры организма человека. Антагонистические свойства живых микробов, входящих в состав эубиотиков, играют важную роль в обеспечении защиты макроорганизма от инфекции, с одной стороны, и в регулировании состава микрофлоры в желудочно-кишечном тракте - с другой. Конкурентная антагонистическая активность эубиотической микрофлоры, в частности, бифидо- и лактобактерий, против широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов обусловлена созданием неблагоприятных для последних значений рН, продуцированием бактериоцинов и антибиотических веществ, а также селективным преимуществом при адгезии к слизистой оболочке полости рта и желудочно-кишечного тракта.

В связи с этим в последние годы в комплексном лечении воспалительных заболеваний па-родонта уделяется внимание применению эу-биотических препаратов, укрепляющих барьеры колонизационной резистентности организма человека за счет микробного антагонизма (А.И. Воложин с соавт., 2004; Самоукина А.М., 2006; Соколова С.И. и соавт., 2007). В отечественной и зарубежной литературе описаны попытки применения лактококков и лактобактерий для лечения пародонтита и профилактики рецидивов заболевания. К стабилизирующей микрофлоре полости рта относятся также вейлонеллы (Veillonella parvula) и слюнные стрептококки (Streptococcus salivarius), однако их роль при воспалительных заболеваниях пародонта не изучена, что побудило нас к проведению данного экспериментального исследования.

Целью исследования явилась разработка экспериментальной (крысиной) модели для оценки влияния штаммов микробов - потенциальных эубиотиков на микрофлору пародонта и изучения цитоморфологических изменений при лечении экспериментального пародонтита у крыс.

Материалы и методы исследования. В исследовании использовали модель лигатурного паро-донтита у крыс по А.И. Воложину (1991). Экспериментальный пародонтит воспроизводили под гексеналовым наркозом путем наложения шелковой лигатуры в области шейки нижних резцов. Эксперименты проведены на 18 крысах Вистар (самцы) массой тела 250±12 г. Через 14 дней, после того как в области пародонта развился воспалительный процесс, лигатуру удаляли и крыс разделяли на 2 группы. В экспериментальной группе в питьевую воду добавляли эубиотическую микрофлору - суспензию референтных штаммов Veillonella parvula + Streptococcus salivarius (Великобритания). В контрольной группе животные получали обычную питьевую воду. Концентрация бактерий в суспензии эубиотика составляла 108 CFU/ml. Материал для культурального исследования (в условиях анаэробиоза) забирали из зоны предполагаемого наложения лигатуры, а затем на 10-е, 20-е и 28-е сутки опыта. Прекращение приема суспензии эубиотика проводили за 1 неделю до конца эксперимента.

Результаты. Микробное число слизистой оболочки десны у крыс до начала эксперимента составляло 7,0±0,3 (lg CFU), доминировали стафилококки и энтерококки (5,5±0,3; 100 %). Собственные штаммы S. salivarius и V. parvula определены у 20 % животных. После развития лигатурного пародонтита контаминация стафилококком и энтерококком достоверно не изменилось. Собственные штаммы S. salivarius выделены у 1 крысы, а V. parvula - не выделены. Через 10 суток эксперимента у крыс экспериментальной группы установлено улучшение гигиенического состояния полости рта (микробное число слизистой оболочки снизилось до 5,0±0,3; P<0,05). Частота выделения стафилококков резко уменьшилась. Увеличилось колонизация десны эубио-тической флорой: S. salivarius выделяли у 80 % животных, а V. parvula - у 20 % (в количестве 4,5-4,0). В последующие дни в экспериментальной группе увеличивалась колонизация эубио-тическими штаммами V. parvula и S. salivarius, а в контрольной - количество стафилококков

НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2013. № 2 (9). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК

и энтерококков увеличивалось в 1000 раз. Контрольное исследование через 1 неделю (28-е сутки) после прекращения приема эубиотика показало сохранение 5. ваНиапив у 40 %, а V. рапиЬа -у 60 % животных.

Как показали цитоморфологические исследования, степень выраженности альтерации тканей пародонта и резорбции альвеолярной кости существенно различались в экспериментальной (получавшей эубиотик) и контрольной группах.

Контрольная группа. Через 10 дней после снятия лигатуры в пришеечной зоне зуба обнаруживали выраженные воспалительные изменения десны, которые сопровождались массивным инфильтратом, состоящим в основном из сегмен-тоядерных лейкоцитов и макрофагов. Обнаруживались деструктивные изменения, особенно в пришеечной части и в расположенной здесь костной ткани, которые проявлялись в резорб-тивных процессах при участии остеокластов, тесно контактирующих с костной тканью. Эпителий десны выглядел утолщенным, обнаруживались явления паракератоза. Нижняя поверхность эпителия имела сосочки, глубоко внедряющиеся в подлежащую соединительную ткань. Как правило, эпителиальное прикрепление было нарушено с образованием десневого кармана. В некоторых случаях отмечены явления некроза, затрагивавшие как ткани десны, так и костную ткань альвеолы. В зоне некроза ткани имели однородный вид, клеточные элементы в кости отсутствовали. Подобные изменения затрагивали области, непосредственно граничащие с десневым карманом. В одном случае при резком распаде тканей десны некротизированные костные фрагменты оказывались лежащими на поверхности. В то же время в глубоких отделах периодонта, расположенных ближе к верхушке корня, воспалительные изменения были значительно слабее. Это же относилось и к деструкции костной ткани.

На 20-е сутки эксперимента в пришееч-ной зоне сохранялась выраженная воспалительная реакция. Инфильтрат состоял из сегменто-ядерных лейкоцитов, макрофагов и молодых фи-бробластов. Расположенный здесь эпителий десны по-прежнему был утолщен с явлениями па-ракератоза на поверхности. Эпителиальное прикрепление во всех случаях нарушено, а расположенный здесь эпителий обнаруживал тенденцию к погруженному росту. Эпителиальные сосочки глубоко внедрялись в подлежащую соединительную ткань. Особенно причудливые ветвления эпителиальных сосочков отмечали в зоне дес-невого кармана. Сама ткань, лежащая в области десневого кармана, напоминала грануляционную. Пучки коллагеновых волокон были частично разрушены, а сохранившиеся структуры разрыхлены. Окраска коллагеновых волокон не изменена. Костная ткань несла следы резорбтив-

ных процессов, хотя по сравнению с предыдущим сроком, наряду с остеокластами, встречались ба-зофильные остеобласты. Они располагались по периферии сохранившихся костных фрагментов. Остеоциты приобретали базофилию цитоплазмы, напоминая молодые клетки остеобластическо-го ряда. Отмечено расширение каналов остеонов с появлением в них остеобластов. В зоне расположения остеобластов увеличивалось содержание кровеносных сосудов.

Через 30 суток в пришеечной зоне интенсивность воспалительного процесса несколько уменьшилась. Клетки воспалительного инфильтрата располагались отдельными участками, разделенные пучками утолщенных коллагеновых волокон. Сами волокна имели бледно-розовую окраску, пласт эпителия десны утолщен, в его поверхностных слоях по-прежнему обнаруживались явления паракератоза. Эпителиальное прикрепление, как и в предыдущие сроки, было нарушено с образованием десневого кармана. Эпителий, лежащий в его зоне, образовывал врастания в виде клина, внедряющегося в соединительную ткань. Костная ткань обнаруживала проявления репаративных изменений, что выражалось в наличии на поверхности кости остеобластов с базофильной цитоплазмой. Здесь же обнаруживали участки новообразованной кости с расположенными в ней остеоцитами, которые, как правило, были связаны с сохранившимися фрагментами костной ткани. Иногда они имели вид костных балочек, окруженных остеобластами. Промежутки между этими балочками были заполнены рыхлой тканью, напоминающей грануляционную. Здесь же в зоне восстановления кости встречались многоядерные остеокласты, лежащие в лакунах. Некротических изменений в костной ткани альвеолы не обнаруживалось. По своей окраске и строению она соответствовала пластинчатой кости с наличием типичных остеонов. Новообразование молодой костной ткани шло не только с поверхности костных фрагментов, но и со стороны расширенных каналов остеонов, в которых обнаруживались остеобласты. Как и в предыдущих сроках, все указанные изменения затрагивали пародонт верхней трети корня.

Экспериментальная группа. На 10-е сутки у подопытных животных отмечались изменения в пришеечной зоне, которые проявлялись в виде воспалительной реакции с образованием инфильтрата, носившего локальный характер. В основном он имел вид скоплений клеточных элементов, расположенных между пучками коллагено-вых волокон десневой группы. В состав инфильтрата входили сегментоядерные лейкоциты, молодые фибробласты. Принципиальных отличий по сравнению с животными контрольной группы не было, хотя субъективно выраженность деструктивных процессов была меньше.

На 20-е сутки опыта у животных этой группы в пришеечной области сохранялся локальный воспалительный процесс, который по своему характеру не отличался какими-либо особенностями. В основном он затрагивал слизистую оболочку прилегающей к зубу десны, располагаясь между волокнами. В десне воспалительная реакция обнаруживалась на ограниченном фрагменте, непосредственно примыкающем к десневому карману. По сравнению с животными контрольной группы деструктивные изменения затрагивали в основном находящиеся непосредственно в зоне воспаления коллагеновые волокна. Выявлялись клетки, характеризующиеся гетероморфизмом, причем сегментоядерные лейкоциты локализовались преимущественно в десневом кармане. За пределами зоны, связанной с десневым карманом, количество клеточных элементов заметно уменьшалось. Десневой карман имел вид узкого щелевидного промежутка между пришеечной частью корня и эпителием десны. Массивного обнажения подлежащих тканей, которое имело место у животных контрольной группы, в данной группе не наблюдалось. Признаков некротических изменений у животных данной группы в этот срок ни в одном случае не обнаруживалось.

На 30-е сутки эксперимента у животных опытной группы преобладали репаративные процессы. Толщина эпителия, прилежащая к дес-невому карману, заметно уменьшилась. Эпителиальные сосочки эпителия десны в основном были короткими и мало чем отличались от таковых в нормальном эпителии десны. Эпителиальное прикрепление хотя и нарушено, однако пласт эпителия достаточно плотно прилегал к прише-ечной части зуба. В расположенной здесь подлежащей соединительной ткани обнаруживались остаточные явления воспаления. Волокнистые структуры в основном имели характерную окра-

ску и расположение. В одном случае отмечалось увеличение волокнистых структур в пришееч-ной зоне. За пределами зоны травмы ткани десны полностью восстанавливали свою структуру. В костной ткани альвеолы также отмечена активная репаративная регенерация. Остеобласты располагались на периферии костных структур. Здесь же отмечено образование костных балочек, которые утолщались, и между ними появлялись анастомозы. Промежутки между балочками заполнены рыхлой тканью, богатой клеточными элементами. Между костными балочками располагались гиперемированные кровеносные сосуды. В некоторых случаях костные балочки почти сливались между собой. Наряду с регенерацией отмечены также процессы перестройки костной ткани и восстановления типичной пластинчатой кости.

Заключение. Применение экспериментальной эубиотической суспензии 5. вalivariuв и V. рапиЬа для лечения крыс с лигатурным пародон-титом продемонстрировало возможность колонизации слизистой оболочки полости рта, что констатировали более чем у половины крыс, взятых в эксперимент, причем колонизирующая ассоциация эубиотических штаммов стабильно сохранялась в течение недели после завершения приема взвеси животным.

Таким образом, колонизация слизистой оболочки десен представителями стабилизирующей микробной флоры - штаммами вейллонелл и слюнных стрептококков оказывает благоприятное влияние на динамику цитоморфологиче-ских изменений в тканях пародонта при экспериментальном пародонтите у крыс линии Вистар, что позволяет обосновать целесообразность создания соответствующего биопрепарата - эубиотика и изучить перспективы его применения для лечения пародонтита у человека.

СИСТЕМАТИКА И КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОКАРИОТ, ОСНОВАННАЯ НА ПРИМЕНЕНИИ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков

Омская государственная медицинская академия

С самого начала развития микробиологии как науки изучение фенотипических признаков микроорганизмов применялось для идентификации, систематики и классификации как в прикладном, так и в фундаментальном аспектах.

Наиболее полно задача быстрой идентификации прокариот решается с помощью «Определителя бактерий Берджи» (Bergey's Manual of

Determinative Bacteriology), выпускаемого Американским обществом микробиологов (American Society for Microbiology - ASM). В девятом издании этого документа, вышедшего в 1984-1989 гг. в 4 томах, все обнаруженные организмы, отнесенные в царство Prokaryotae, разделены на 33 группы. Уже в нем совершен отказ от построения классической иерархической системы