СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ УСИЛИВАЮЩЕЙ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИПЕПТИДА

++
++
++
++
1. Способ повышения активности полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, предусматривающий: добавление растворимого активирующего катиона двухвалентного металла к композиции, содержащей полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от около 0,001 мМ до около 50 мМ в ходе разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья, и наличие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, который повышает уровень разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья композицией целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом GH61, обладающим усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, но без добавления растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла выбран из группы, состоящей из Mn, Co, Mg, Ca и их сочетания, и где композиция целлюлолитического фермента содержит эндоглюканазу, целлобиогидролазу, бета-глюкозидазу или их сочетание.
2. Способ по п.1, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла присутствует в эффективной концентрации, составляющей от около 0,001 мМ до около 50 мМ, около 0,01 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 10 мМ, от около 0,3 мМ до около 5 мМ, от около 0,3 мМ до около 2,5 мМ, и от около 0,3 мМ до около 1 мМ.
3. Способ по п.1 или 2, где полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, выбран из группы, состоящей из:
(а) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] и [FW]-[TF]-K-[AIV], где Х обозначает любую аминокислоту, X(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях и X(4) обозначает любую аминокислоту в 4 соседних положениях;
(b) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], где х обозначает любую аминокислоту, х(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях и х(3) обозначает любую аминокислоту в 3 соседних положениях;
где полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащий [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] и [FW]-[TF]-K-[AIV], необязательно также содержит:
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV],
[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV] или
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] и [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],
где Х обозначает любую аминокислоту, X(1,2) обозначает любую аминокислоту в 1 положении или в 2 соседних положениях и X(3) обозначает любую аминокислоту в 3 соседних положениях и X(2) обозначает любую аминокислоту в 2 соседних положениях;
(с) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична зрелому полипептиду с последовательностью SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8; или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:14;
(d) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях по меньшей мере средней жесткости, в условиях по меньшей мере от средней до высокой степени жесткости, в условиях по меньшей мере высокой жесткости и в условиях по меньшей мере очень высокой жесткости с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:13, или его полноразмерной комплементарной цепью;
(е) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, кодируемого полинуклеотидом, последовательность которого по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:13;
(f) варианта полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего замену, делецию и/или вставку одной или нескольких аминокислот зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:14; и
(g) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего или состоящего из зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:14; или его фрагмента, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью.
4. Способ разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья, предусматривающий: обработку содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством композиции целлюлолитического фермента, содержащей эффективное количество полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от около 0,001 мМ до около 50 мМ, и наличие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, который повышает уровень разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья композицией целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом GH61, обладающим усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, но без добавления растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла выбран из группы, состоящей из Mn++, Co++, Mg++, Ca++ и их комбинации, и где композиция целлюлолитического фермента содержит эндоглюканазу, целлобиогидролазу, бета-глюкозидазу или их сочетание.
5. Способ по п.4, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла присутствует в эффективной концентрации, составляющей от около 0,001 мМ до около 50 мМ, около 0,01 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 10 мМ, от около 0,3 мМ до около 5 мМ, от около 0,3 мМ до около 2,5 мМ, и от около 0,3 мМ до около 1 мМ.
6. Способ по п.4 или 5, отличающийся тем, что полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, выбран из группы, состоящей из:
(а) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] и [FW]-[TF]-K-[AIV], где Х обозначает любую аминокислоту, X(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях и X(4) обозначает любую аминокислоту в 4 соседних положениях;
(b) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], где х обозначает любую аминокислоту, х(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях и х(3) обозначает любую аминокислоту в 3 соседних положениях;
где полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, включающий [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] и [FW]-[TF]-K-[AIV], необязательно также включает:
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV],
[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV] или
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] и [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], где Х обозначает любую аминокислоту, X(1,2) обозначает любую аминокислоту в 1 положении или в 2 соседних положениях и X(3) обозначает любую аминокислоту в 3 соседних положениях и X(2) обозначает любую аминокислоту в 2 соседних положениях;
(с) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична зрелому полипептиду с последовательностью SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:14;
(d) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях по меньшей мере средней жесткости, в условиях по меньшей мере от средней до высокой степени жесткости, в условиях по меньшей мере высокой жесткости и в условиях по меньшей мере очень высокой жесткости с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:13, или его полноразмерной комплементарной цепью;
(е) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, кодируемого полинуклеотидом, последовательность которого по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:13;
(f) варианта полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего замену, делецию и/или вставку одной или нескольких аминокислот зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:14; и
(g) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего или состоящего из зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:14; или его фрагмента, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью.
7. Способ по п.4, включающий также обработку содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством бета-глюкозидазы.
8. Способ по п.4, включающий также обработку содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из: гемицеллюлазы, эстеразы, протеазы, лакказы, пероксидазы или их смесей.
9. Способ по п. 4, включающий внесение добавки растворимого активирующего катиона двухвалентного металла в концентрации, позволяющей поддерживать эффективную концентрацию указанного растворимого активирующего катиона двухвалентного металла на уровне от около 0,001 мМ до около 50 мМ.
10. Способ по п.4, включающий также восстановление деградированного содержащего целлюлозу сырья.
11. Способ получения продукта ферментации, предусматривающий (а) осахаривание содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством композиции целлюлолитического фермента, содержащей эффективное количество полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем указанный растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной предпочтительно от около 0,001 мМ до около 50 мМ и наличие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, который повышает уровень разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья композицией целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом GH61, обладающим усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, но без добавления растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла выбран из группы, состоящей из Mn++, Co++, Mg++, Ca++ и их комбинации, и где композиция целлюлолитического фермента содержит эндоглюканазу, целлобиогидролазу, бета-глюкозидазу или их сочетание; (b) ферментацию осахаренного содержащего целлюлозу сырья со стадии (a) одним или несколькими ферментирующими организмами с получением продукта ферментации; и (c) восстановление продукта ферментации из ферментационной среды.
12. Способ по п.11, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла присутствует в эффективной концентрации, составляющей от около 0,001 мМ до около 50 мМ, около 0,01 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 10 мМ, от около 0,3 мМ до около 5 мМ, от около 0,3 мМ до около 2,5 мМ, и от около 0,3 мМ до около 1 мМ.
13. Способ по п.11 или 12, где полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, выбран из группы, состоящей из:
(a) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, включающего [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] и [FW]-[TF]-K-[AIV], где Х обозначает любую аминокислоту, X(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях и X(4) обозначает любую аминокислоту в 4 соседних положениях;
(b) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, который включает [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], где x обозначает любую аминокислоту, x(4,5) обозначает любую аминокислоту в 4 или 5 соседних положениях и x(3) обозначает любую аминокислоту в 3 соседних положениях;
где полипептид GH61, обладающий усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, включающий [ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ] и [FW]-[TF]-K-[AIV], необязательно также включает:
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV],
[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV] или
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV] и [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV], где Х обозначает любую аминокислоту, X(1,2) обозначает любую аминокислоту в 1 положении или в 2 соседних положениях и X(3) обозначает любую аминокислоту в 3 соседних положениях и X(2) обозначает любую аминокислоту в 2 соседних положениях;
(с) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична зрелому полипептиду с последовательностью SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:14;
(d) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях по меньшей мере средней жесткости, в условиях по меньшей мере от средней до высокой степени жесткости, в условиях по меньшей мере высокой жесткости и в условиях по меньшей мере очень высокой жесткости с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:13, или его полноразмерной комплементарной цепью;
(е) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, кодируемого полинуклеотидом, последовательность которого по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97% идентична последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:13;
(f) варианта полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего замену, делецию и/или вставку одной или нескольких аминокислот зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:14; и
(g) полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, содержащего или состоящего из зрелого полипептида с последовательностью SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:14; или его фрагмента, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью.
14. Способ по п.11, включающий также обработку содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством бета-глюкозидазы.
15. Способ по п.11, включающий также обработку содержащего целлюлозу сырья эффективным количеством одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из: гемицеллюлазы, эстеразы, протеазы, лакказы, пероксидазы или их смеси.
16. Способ по п. 11, включающий также внесение добавки растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, позволяющий поддерживать эффективную концентрацию растворимого активирующего катиона двухвалентного металла на уровне от около 0,001 мМ до около 50 мМ.
++
++
++
++
17. Композиция целлюлолитического фермента для разложения содержащего целлюлозу сырья, содержащая эффективное количество полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от около 0,001 мМ до около 50 мМ в ходе разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья, и наличие указанного растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, повышает уровень разложения содержащего целлюлозу сырья композицией целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом GH61, обладающим усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, но без растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла выбран из группы, состоящей из Mn, Co, Mg, Ca и их комбинации, и где композиция целлюлолитического фермента содержит эндоглюканазу, целлобиогидролазу, бета-глюкозидазу или их сочетание.
18. Композиция целлюлолитического фермента по п.17, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла присутствует в эффективной концентрации, составляющей от около 0,001 мМ до около 50 мМ, около 0,01 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 10 мМ, от около 0,3 мМ до около 5 мМ, от около 0,3 мМ до около 2,5 мМ, и от около 0,3 мМ до около 1 мМ.
++
++
++
++
19. Композиция для разложения содержащего целлюлозу сырья, содержащая эффективное количество полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, и растворимый активирующий катион двухвалентного металла, причем растворимый активирующий катион двухвалентного металла находится в эффективной концентрации, равной от около 0,001 мМ до около 50 мМ в ходе разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья композицией целлюлолитического фермента, и наличие растворимого активирующего катиона двухвалентного металла и полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, повышает уровень разложения указанного содержащего целлюлозу сырья композицией целлюлолитического фермента, по сравнению с полипептидом GH61, обладающим усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, но без растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла выбран из группы, состоящей из Mn, Co, Mg, Ca и их комбинации, и где композиция целлюлолитического фермента содержит эндоглюканазу, целлобиогидролазу, бета-глюкозидазу или их сочетание.
20. Композиция по п.19, где растворимый активирующий катион двухвалентного металла присутствует в эффективной концентрации, составляющей от около 0,001 мМ до около 50 мМ, около 0,01 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 25 мМ, от около 0,1 мМ до около 10 мМ, от около 0,3 мМ до около 5 мМ, от около 0,3 мМ до около 2,5 мМ, и от около 0,3 мМ до около 1 мМ.