БЕЛКИ ЛИЗИСА КЛЕТОК VERO, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА ДЛЯ КЛЕТОК VERO, СОДЕРЖАЩИЙ БЕЛКИ ЛИЗИСА

1. Способ получения выделенных при лизисе клеток Vero белков, включающий следующие стадии:
а) культивирование и сбор клеток Vero;
б) разрушение и лизис клеток Vero;
в) очистка выделенных при лизисе клеток Vero белков и
г) концентрирование полученных выделенных при лизисе клеток Vero белков.
2. Способ по п.1, где разрушение и лизис клеток включает химический лизис клеток, разрушение клеток осмотическим шоком, повторяющееся замораживание и размораживание, ферментативный лизис клеток, ультразвуковое разрушение и механический лизис клеток.
3. Способ по п.2, где разрушение и лизис клеток представляет собой ультразвуковое разрушение.
4. Способ по п.1, в котором очистка включает стадии предварительной очистки и тонкой очистки, где метод для стадии предварительной очистки выбран из изоэлектрического осаждения, высаливания и экстракции органическими растворителями; метод для тонкой очистки выбран из хроматографических методов, включая эксклюзионную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, металл-хелатную хроматографию или ковалентную хроматографию.
5. Способ по п.4, где метод для предварительной очистки представляет собой экстракцию органическим растворителем.
6. Способ по п.5, где экстракция органическим растворителем включает добавление к полученному после разрушения клеток раствору равного объема трихлорметана, встряхивание смеси 20-30 мин, центрифугирование смеси при 4000 об/мин при температуре 2-8°С в течение 20-25 мин и отбор верхней водной фазы, содержащей белки.
7. Способ по п.5 и 6, где стадия предварительной очистки включает добавление к полученному после разрушения клеток раствору равного объема трихлорметана, встряхивание смеси в течение 20 мин, центрифугирование смеси при 4000 об/мин при температуре 2-8°С в течение 20 мин и отбор верхней водной фазы, содержащей белки.
8. Способ по п.4, где стадия тонкой очистки включает ультрафильтрацию образца, полученного после стадии предварительной очистки, через мембрану с MWCO (предел эксклюзии) = 100 кДа, очистку методом гидрофобной хроматографии и эксклюзионной хроматографии и сбор желаемого белка, где указанный желаемый белок характеризуется тем же диапазоном собираемых белковых пиков, что и собираемые пики вирусов и их компонентов в процессе производства вакцины.
9. Способ по п.8, где вирус и его компоненты являются вирусом гепатита А и его компонентами.
10. Способ по п.8, где указанная очистка методом гидрофобной хроматографии представляет собой очистку на фенилсефарозе Phenyl Sepharose 6FF, которую проводят следующим образом: образец загружают в буфере нанесения при скорости 30-60 см/ч, затем колонку промывают 3 CV (объемами колонки) 1,0 моль/л РВ раствора с рН 6,0-7,5, после чего белки линейно элюируют 5 CV 0,02 моль/л РВ раствора с рН 6,0-7,5 и, наконец, собирают элюированные фракции с проводимостью ниже 48 мСм/см; указанная эксклюзионная хроматография представляет собой эксклюзионную хроматографию на сефарозе Sepharose 4 Fast Flow, причем элюцию проводят с использованием 0,01 моль/л раствора PBS с рН 7,4 при скорости потока 45 см/ч, при элюции собирают второй пик.
11. Выделенные при лизисе клеток Vero белки, полученные по методам, описанным в любом из пп.1-10.
12. Выделенные при лизисе клеток Vero белки по п.11, где выделенные при лизисе клеток Vero белки представляют собой смесь белков с молекулярной массой в следующем диапазоне: 11 кДа, 17-34 кДа, 55 кДа и 72 кДа-170 кДа.
13. Антитела против выделенных при лизисе клеток Vero белков по п.11 или 12.
14. Антитела по п.13, которые представляют собой IgG морской свинки против выделенных при лизисе клеток Vero белков или IgG кролика против выделенных при лизисе клеток Vero.
15. Применение выделенных при лизисе клеток Vero белков по п.11 или 12 для получения реагента для обнаружения НСР клеток Vero.
16. Набор для анализа НСР клеток Vero, состоящий из твердой фазы, антител в твердой фазе, конъюгированных с лигандом антител и белков-стандартов, где указанные антитела представляют собой антитела против выделенных при лизисе клеток Vero белков, а указанные белки-стандарты представляют собой выделенные при лизисе клеток Vero белки, указанные выделенные при лизисе клеток Vero белки получают по методу, описанному в любом из пп.1-10.
17. Набор для анализа НСР клеток Vero по п.16, дополнительно содержащий модифицированные биотином антитела и конъюгированный с лигандом авидин.
18. Набор для анализа НСР клеток Vero по п.16, дополнительно содержащий модифицированные 2,4-динитрофенолом антитела и конъюгированные с лигандом антитела против 2,4-динитрофенола.
19. Набор для анализа НСР клеток Vero по любому из пп.16, 17 или 18, где антитела к выделенным при лизисе клеток Vero белкам представляют собой IgG морской свинки против выделенных при лизисе клеток Vero белков или IgG кролика против выделенных при лизисе клеток Vero белков.
20. Набор для анализа НСР клеток Vero по любому из пп.16, 17 или 18, где метка в указанных конъюгированных с лигандом антителах представляет собой фермент, нуклид или является флуоресцентной меткой.
21. Набор для анализа НСР клеток Vero по любому из пп.16, 17 или 18, где фермент выбран из пероксидазы, β-D-галактозидазы, щелочной фосфатазы или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.
3
188
131
22. Набор для анализа НСР клеток Vero по любому из пп.16, 17 или 18, где указанный нуклид выбран из Н, Re или I.
23. Набор для анализа НСР клеток Vero по п.20, где флуоресцентная метка выбрана из изотиоцианата флуоресцеина, тетраэтилродамина, изотиоцианата тетраметилродамина или хелатов трехвалентных лантаноидов.
24. Набор для анализа НСР клеток Vero по любому из пп.16, 17 или 18, где твердая фаза представляет собой планшет для ИФА или белковый чип.