СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНОМАЛИЙ УПАКОВКИ ХРОМАТИНА СПЕРМАТОЗОИДОВ ПРИ МУЖСКОМ БЕСПЛОДИИ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR ABNORMAL CHROMATIN PACKAGING IN MALE INFERTILITY

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к области вспомогательных репродуктивных технологий, в частности, для увеличения частоты наступления беременности, и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации за счет отбраковки образцов спермы, содержащих клетки с нарушенной упаковкой хроматина, и диагностики необходимости специфической терапии или восстановительных процедур при неблагоприятном прогнозе относительно эффективности вспомогательных репродуктивных технологий.
В настоящее время принятые ВОЗ методы диагностики аномалий развития сперматозоидов, приводящих к мужскому бесплодию, основаны на оценке их количества, подвижности и выявлении разрывов ДНК. В тоже время показано, что одной из распространенных причин мужского бесплодия является аномальная или не полностью завершенная компактизация ДНК генома в сперматозоидах.
Известен (RU, заявка 2006130740) способ определения целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах животных, включающий стадию обработки образца, содержащего сперматозоиды, денатурирующим ДНК раствором, одну стадию обработки лизирующим раствором для экстракции ядерных белков, стадию определения целостности хроматина/ДНК сперматозоидов, характеризующуюся тем, что лизирующий раствор не содержит денатурирующего белки детергента и не разрушает значительно хвостики сперматозоидов.
Недостатком известного способа следует признать, что оценивается целостность ДНК по наличию или отсутствию разрывов, а этот показатель не коррелирует с патологией, связанной с неполной или аномальной упаковкой хроматина.
Известен также (RU, патент 2262107) способ определения зрелости сперматозоидов путем оценки степени конденсации хроматина сперматозоидов при исследовании эякулята. В процессе определения сравнивают интенсивность флуоресценции ДНК сперматозоидов до и после насильственной деконденсации хроматина гепарином посредством статической обработки методом Колмогорова-Смирнова с определением индекса подобия кривых интенсивности флуоресценции n, при значении которого меньше 48,5 судят о незрелом состоянии сперматозоидов, а при значении n больше 48,5 судят о зрелости сперматозоидов.
Недостатком известного способа следует признать, что свойство хроматина деконденсироваться под действием гепарина лишь косвенно отражает аномалии в его упаковке.
Известен также (RU, 2118822) способ диагностики мужского бесплодия путем проточно-цитофлуориметрического анализа состояния хроматина сперматозоидов, отличающийся тем, что состояние хроматина оценивают по интенсивности флуоресценции ядер клеток, окрашенных бромистым этидием до и после обработки гепарином, и при наличии образца спермы, в котором интенсивность флуоресценции повышена исходно более чем у 30% клеток либо она возрастает более чем в 2 раза у более 50% клеток после обработки гепарином, диагностируют мужское бесплодие.
Недостатком известного способа следует признать, что метод не является строго количественным и, как и при использовании для деконденсации гепарина, лишь косвенно отражает аномалии в упаковке хроматина. Кроме того, этот метод требует сложного и дорогостоящего оборудования и не может использоваться для широкого скрининга.
Для выявления не полностью завершенной компактизаци ДНК генома в сперматозоидах предложено использовать (см. Методическая рекомендация «Электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов как функциональный тест при диагностике мужского бесплодия» (Москва, 2003 г.)) способ электронно-микроскопического анализа. Этот метод позволяет выявить в эякуляте инфертильных мужчин сперматозоиды с так называемым «незрелым хроматином», упаковка которого отличается от упаковки хроматина в сперматозоидах здорового донора.
Существенными недостатками метода следует признать трудоемкость и высокую стоимость, длительное время (около 2 недель) пробоподготовки и использование уникального дорогостоящего оборудования (электронный микроскоп, ультрамикротом). Принципиально важно, что метод электронной микроскопии не дает возможности дать точную количественную оценку доли сперматозоидов с нарушенной компактизацией ДНК и объективно охарактеризовать глубину данной патологии.
Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в создании диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.
Технический результат, получаемый при реализации разработанного способа, состоит в упрощении и удешевлении метода при одновременном повышении информативности исследования.
2
2
4
4
4
4
Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. При реализации разработанного способа образец спермы очищают от сопутствующих соматических и недифференцированных клеток, очищенные сперматозоиды осаждают центрифугированием, промывают в буферном растворе с pH 7,6÷8,0, осадок ресуспендируют в буферном растворе с pH 7,8÷8,2 в присутствии 10÷15 мМ Трис-HCl, инкубируют при охлаждении, клетки осаждают центрифугированием с последующим промыванием осадка, промытый осадок ресуспендируют в растворе с pH 7,8÷8,2 в присутствии 8,0÷12 мМ Трис-HCl, к полученной суспензии добавляют микрококковую нуклеазу, образцы инкубируют при температуре от 10 до 40°С, останавливают гидролиз с последующей гомогенизацией и повторным центрифугированием образцов с получением осадка, содержащего нерастворимый хроматин, и супернатанта, содержащего растворимый хроматин, в полученных осадке и супернатанте раздельно определяют содержание ДНК и по процентному содержанию ДНК в осадке диагностируют наличие аномалии упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. Предпочтительно образец спермы очищают по стандартному методу. Осаждение сперматозоидов осуществляют обычно при скорости центрифугирования 4000÷6000 об/мин. При меньшей скорости не происходит полноты отделения, а при большей скорости может происходить повреждение сперматозоидов. Предпочтительно при ресуспендировании используют 1% раствор Тритон Х-100. Кроме того, могут быть использованы другие неионные детергенты. Обычно инкубирование осуществляют в течении 5-10 минут на льду. Это обусловлено тем, что при более высокой температуре структура хроматина может подвергаться необратимым изменениям. Осадок предпочтительно промывают, по меньшей мере, один раз буферным раствором. Обычно осадок ресуспендируют в растворе, содержащем 20 мМ Трис-HCl (pH 8), 2 мМ CaCl, 2 мМ MgCl. Преимущественно микрококковую нуклеазу добавляют в диапазоне концентраций от 10 ед/мг до 50 ед/мг. Это обусловлено эмпирическим подбором. Обычно гидролиз останавливают добавлением ЭДТА до 10 мМ во льду. Однако возможны и другие варианты остановки гидролиза. Гомогенизацию образцов обычно осуществляют энергичным встряхиванием или в приборе «Вортекс». Обычно образцы повторно центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5-10 минут. Это обусловлено необходимостью полностью разделить фракции. Предпочтительно для определения количества ДНК в осадке к осадку добавляют 0,5 мл 0,5 н. NaOH, суспензию инкубируют 20 минут при 60°С, образцы переносят на лед, после чего добавляют HClO до 5%, образцы центрифугируют при 5000 об/мин в течении 5 минут для отделения РНК, к осадку добавляют 5% HClO, суспензию кипятят 15 минут, центрифугируют при 5000-8000 об/мин в течение 5-7 мин, после центрифугирования концентрацию ДНК определяют на спектрофотометре. Однако возможны и другие варианты. Предпочтительно для определения количества ДНК во фракции растворимого хроматина к супернатанту добавляют 57% HClO до конечной концентрации 5%, инкубируют на льду в течении 10 минут и центрифугируют суспензию, отделяют осадок, к осадку, содержащему растворимый хроматин, добавляют 5% HClO, суспензию кипятят 15 минут с последующим центрифугированием, после центрифугирования концентрацию ДНК определяют на спектрофотометре. Однако возможны и другие варианты. Иногда для получения дополнительной информации для оценки глубины гидролиза ДНК в супернатанте, содержащем кислоторастворимый хроматин, измеряют концентрацию ДНК на спектрофотометре.
В дальнейшем сущность разработанного метода будет рассмотрена более подробно.
Суть предлагаемого метода - в определении аномалий упаковки хроматина сперматозоидов по его доступности для гидролиза микрококковой нуклеазой.
Метод состоит в количественной оценке глубины гидролиза хроматина микрококковой нуклеазой. После гидролиза хроматина производят разделение материала гидролизата на 2 фракции: растворимого хроматина, нерастворимого хроматина (и иногда - кислоторастворимого хроматина). Контролем при этом является характер гидролизата хроматина сперматозоидов доноров с показателями спермограммы, соответствующими норме.
Метод осуществляют следующим образом.
2
2
2
2
Образцы спермы, взятой у здоровых доноров и инфертильных пациентов, размораживают при комнатной температуре, очищают от сопутствующих соматических и недифференцированных клеток по стандартному методу, очищенные сперматозоиды осаждают центрифугированием при 5000 об/мин, 2 раза промывают в фосфатном буфере (PBS) с 5 мМ PMSF. На этом этапе можно обойтись однократной промывкой, а вместо PBS можно использовать другой буфер с соответствующими значениями рН и ионной силы. Осадок ресуспендируют в фосфатном буфере (PBS) с 5 мМ фенилметилсульфанилфторида (PMSF) и 1% Тритоном Х-100, инкубируют 5-10 минут на льду, клетки осаждают центрифугированием, осадок промывают 2 раза PBS с 5 мМ PMSF без Тритона Х-100. Полученный осадок ресуспендируют в растворе 20 мМ Трис-HCl (pH 8), 2 мМ CaCl, 2 мМ MgCl. Можно использовать 10 мМ Трис-HCl, однако в этом случае концентрация CaCl, и MgCl должна составлять 1 мМ. К полученной суспензии добавляют микрококковую нуклеазу в диапазоне концентраций от 10 ед/мг до 50 ед/мг. Образцы инкубируют 3 минуты при температуре не ниже 10 и не выше 40°С. Реакцию гидролиза останавливают добавлением ЭДТА до 10 мМ во льду, образцы гомогенизируют энергичным встряхиванием или в приборе «Вортекс» и затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5-10 минут.
Полученный осадок (фракция 1) содержит нерастворимый хроматин (НРХ), супернатант (фракция 2) содержит растворимый хроматин (РХ).
4
4
4
4
4
Для определения количества ДНК к осадку (фракция 1) добавляют 0,5 мл 0,5 н. NaOH, суспензию инкубируют 20 минут при 60°С, образцы переносят на лед, после чего добавляют HClO до 5%. Образцы центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 минут для отделения РНК (супернатант). К осадку добавляют 5% HClO, суспензию кипятят 15 минут, центрифугируют при 5000-8000 об/мин в течение 5-7 мин. После центрифугирования концентрацию ДНК определяют на спектрофотометре. Для определения количества ДНК во фракции растворимого хроматина к супернатанту (фракция 2) добавляют 57% HClO до конечной концентрации 5%. Можно использовать 25% HClO, но конечная концентрация кислоты должна составлять не менее 5%. После инкубации на льду в течение 10 минут суспензию центрифугируют. В супернатанте, содержащем кислоторастворимый хроматин, измеряют концентрация ДНК на спектрофотометре. К осадку, содержащему растворимый хроматин, добавляют 5% HClO, суспензию кипятят 15 минут и центрифугируют. Можно кипятить суспензию 10 минут. После центрифугирования концентрацию ДНК определяют на спектрофотометре.
Затем рассчитывают концентрацию нуклеиновых кислот.
Метод был проверен на образцах спермы здоровых доноров и на образцах спермы инфертильных пациентов, предоставленных Центром планирования семьи.
1. Примеры здоровых доноров
№№ доноров
Нерастворимый хроматин (%)
Растворимый хроматин (%)
1613
98
0,3
210
94,4
2,3
2008
93,4
3,1
2. Примеры инфертильных пациентов
№№ пациентов
Нерастворимый хроматин (%)
Растворимый хроматин (%)
1
68,8
28,5
2
65,7
32
3
81,4
18,4
Следовательно, для спермы, взятой у здоровых доноров, содержание растворимого хроматина от общего количества хроматина не превышает 3%, а для спермы, взятой у инфертильных пациентов, содержание растворимого хроматина от общего количества хроматина, как правило, увеличивается в 10-20 раз и в некоторых случаях достигает 60% и выше.
Полученные данные коррелируют с электрономикроскопическими исследованиями тех же доноров и пациентов и представляют собой точную количественную оценку содержания в эякуляте инфертильных пациентов аномальных сперматозоидов.