АНТИАНГИОГЕННОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
ANTIANGIOGENIC MEDICINAL AGENT AND METHOD OF ITS PRODUCTION

Изобретение относится к фармакологии и медицине, в частности к способу получения нового антиангиогенного средства, которое может быть использовано для лечения различных патологий, связанных с нарушением ангиогенеза.
Ангиогенез, который также называется неоваскуляризацией, представляет собой процесс формирования новых кровеносных сосудов из предсуществующих, и играет ключевую роль в широком спектре физиологических и патологических процессов.
В организме здорового взрослого человека наблюдается низкая интенсивность ангиогенеза в большинстве органов и тканей, за исключением физиологически значимых процессов, связанных с репарацией поврежденных тканей и репродуктивным циклом у женщин.
Во взрослом здоровом организме ангиогенез находится под жестким контролем регуляторных систем организма, обеспечивающих баланс между позитивными и негативными регуляторами ангиогенеза, и в основном поддерживается на низком уровне или носит периодический и кратковременный характер. Неадекватная или несбалансированная васкуляризация является причиной многочисленных патологических состояний, приводящих к таким заболеваниям как воспаление, артрит, псориаз, злокачественные новообразования, диабетическая ретинопатия, дегенерация желтого пятна и другие неоваскулярные глазные заболевания.
Действительно, как это хорошо известно в данной области, имеется ряд известных заболеваний и состояний, при которых очень важно применение средства, способного подавлять ангиогенез, пролиферацию гладкой мускулатуры, пролиферацию эндотелиальных клеток и/или прорастание новых кровеносных сосудов, и они включают без ограничения: солидные опухоли, метастазы опухолей, доброкачественные опухоли, ангиогенез в миокарде, неоваскуляризацию бляшек, атеросклероз, ангиогенез в ишемических конечностях, ангиогенные состояния глаза и роговицы, например, отторжение трансплантата роговицы, покраснение, неоваскулярную глаукому, диабетическую ретинопатию, заживление ран, переломы, псориаз, ревматоидный артрит, образование спаек кишечника, рубцевание, гипертрофические рубцы (т.е. келоиды), грануляцию ран.
Особенно важную роль ангиогенез играет в процессе развития и метастазирования злокачественных новообразований.
Впервые принципы терапевтических подходов, направленных на подавление ангиогенеза, важнейшего компонента роста и метастазирования опухолей, сформулированы в работах Falkman J., когда молекулярные механизмы патологической неоваскуляризации были неизвестны (Falkman J., 1971). Исследование механизмов ангиогенеза на молекулярном и клеточном уровнях позволило определить молекулярные мишени и избирательные подходы к ингибированию различных звеньев ангиогенеза.
Клетки эндотелия опухоли имеют на своей поверхности рецепторы к фактору роста эндотелия (EGF). Клетки опухоли, продуцируя фактор роста эндотелия (VEGF), стимулируют деление и ускоряют формирование капилляров в ткани опухоли, а, продуцируя ферменты матричные металлопротеиназы, разрушают внеклеточный матрикс, упрощая инвазию клеток эндотелия и образование капилляров в опухолевой ткани. Инвазия сосудов в опухоль и способность опухолевых клеток с помощью металлопротеиназ растворять базальные мембраны обеспечивает им проникновение в кровоток и метастазирование в различные органы и ткани (Falkman J., 1995; Nelson A.R. et al., 2000).
Одним из наиболее сильных ингибиторов ангиогенеза является ангиостатин - протеолитический фрагмент плазминогена, который системно ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток [O'Reilly M.S. et al., Cell, v.79, pp.315-328, 1994]. Существенным недостатком ангиостатина является его быстрое выведение из организма [Drixler T.A. et al., Cancer Res., v.60, рр.1761-1765, 2000]. Кроме того, для достижения желаемого противоопухолевого эффекта необходимо длительное применение препарата, что будет причинять неудобства пациентам и потребует большого количества препарата. Для того чтобы избежать этого, необходимо снизить скорость выведения ангиостатина и увеличить эффективность его терапевтического действия.
Другим ингибитором ангиогенеза является эндостатин - фрагмент коллагена XVIII [O'Reilly et al., Cell, v.88, pp.277-285, 1997].
Основным препятствием в использовании ангиостатина и эндостатина является то, что для достижения нужного клинического эффекта необходимо ежедневно вводить большие количества белков в течение длительного срока, от нескольких недель до нескольких месяцев.
Разработаны и другие подходы для угнетения роста сосудов, например, применение антител к белковому фактору роста эндотелия сосудов (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF). Доказана роль этого фактора в патогенезе многих патологических состояний. Препарат Авастин (Бевацизумаб) представляет собой рекомбинантное гиперхимерное (гуманизированное, приближенное к человеческому) моноклональное антитело и является препаратом таргетной терапии, т.е. его действие направлено на определенные компоненты опухоли и ее параметры. Авастин селективно связывается с биологически активным фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) и нейтрализует, блокирует его, что приводит к уменьшению проницаемости сосудистой стенки, увеличению доставки химитерапевтических средств в опухоль и торможению сосудообразования. Режим применения Авастина включает только внутривенное капельное введение. Авастин имеет достаточно много побочных проявлений, такие как гипертензия, протеинурия, тромбозы, кровотечения, миокардиопатии, головная боль, перфорация органов пищеварительного тракта, замедление заживления ран. Наиболее частым побочным явлением является гипертензия, с чем связана необходимость постоянного контроля артериального давления у получающих препарат пациентов [В.А.Горбунова и др. Таргетная терапия: продление и улучшение качества жизни у больных раком молочной железы // Медицинская газета «Здоровье Украины», 2007, №10, с.48-49].
Недостатки известных ингибиторов ангиогенеза создают предпосылки для создания новых лекарственных средств, обладающих антиангиогенной активностью.
Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего получить на основе доступного природного сырья лекарственное средство, обладающее антиангиогенной активностью, а также расширение аресенала лекарственных средств указанной активности.
Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в простоте и экономичности нового способа, высокой эффективности нового антиангиогенного средства при одновременно низкой токсичности.
Поставленная задача решается новым способом получения антиангиогенного средства.
Способ включает окислительный щелочной гидролиз гумифицированного материала, экстракцию полупродукта сложным эфиром карбоновой кислоты, удаление жидкого экстракта, экстракцию полученного осадка алканолом, выделение сухой фракции из спиртового экстракта, очистку полученной сухой фракции переосаждением с получением целевого продукта.
Гуминовые вещества - это высокомолекулярные природные органические соединения, характеризующиеся отсутствием строгого постоянства химического состава; чаще всего представляющие собой аморфные темно-коричневые или темно-бурые образования, содержащиеся в каустобиолитах (почвы, донные осадки, торфы, угли, бокситы и т.п.).
По химическому строению гуминовые вещества могут быть отнесены к классу полиоксикарбоновых кислот (гумусовые кислоты - смесь гуминовых и фульвокислот). Независимо от способа получения гуминовых веществ они характеризуются схожими химическими свойствами и характерными полосами поглощения в инфракрасной области.
Гуминовые вещества находят довольно широкое применение в народном хозяйстве, в качестве компонента промывочных жидкостей при бурении нефтяных и газовых скважин, кислотостойких наполнителей при изготовлении аккумуляторов, антисептиков при лечении кожных заболеваний сельскохозяйственных животных.
Способы выделения гуминовых веществ из различного природного гумифицированного материала довольно подробно изучены и описаны.
Гуминовые вещества могу быть получены и выделены щелочным окислением в присутствии кислорода (воздуха) из древесного лигнина.
Лигнин, входящий в состав древесины, является ценным лекарственным сырьем, запасы которого практически не ограничены. Лечебные свойства лигнина всесторонне рассмотрены в монографии (Леванова В.П. Лечебный лигнин. - Под ред. Н.А.Белякова: Санкт-Петербург, 1992 г., 136 с.). Хотя лигнин и препараты на его основе в медицине до настоящего времени в основном рассматривались в качестве сорбентов, многие исследователи помимо сорбционных свойств отмечали антисептические, гипохолестеринемические и др. свойства.
Согласно изобретению в качестве исходного сырья для получения нового антиангиогенного средства могут быть использованы различные гумифицированные материалы.
В качестве гумифицированного материала может быть использовано лигнинсодержащее сырье, а также твердые остатки экстракционной переработки растительного сырья, лигнин медицинский или энтеросорбенты такие как «Полипефан» или «Лигносорб».
Согласно изобретению гумифицированный материал подвергают окислительному щелочному гидролизу, отделению жидкой фазы, ее подкислению, отделению полученного осадка, его промывке и последующей сушке.
Полученный полупродукт подвергают экстракции сложным эфиром карбоновой кислоты, который затем удаляют.
кип
В качестве сложного эфира карбоновой кислоты используют сложный эфир с Т порядка 80-120°С (н-пропилформиат, бутилформиат, этилацстат, н-пропилацетат и др.). Этилацетат является наиболее предпочтительным в качестве экстрагента для первой экстракции.
Далее проводят экстракцию полученного осадка алканолом. В качестве алканола используют алканол С2-С6 с неразветвленной углеводородной цепью, предпочтительно н-бутанол.
Стадии экстракции осуществляют при массовом соотношении полупродукта и указанного экстрагента 1:(8-20), предпочтительно 1:(8-12), при этом экстракцию проводят до обесцвечивания экстрагента.
После проведения экстракции алканол удаляют, а оставшийся сухой остаток очищают переосаждением из щелочного раствора с получением целевого продукта. Стадию переосаждения осуществляют с использованием водного раствора минеральной кислоты, например водного раствора соляной кислоты.
Изобретение также относится к антиангиогенному средству, полученному описанным способом.
Полученное средство может быть объединено с фармацевтически приемлемыми эксципиентами и носителями и использовано в различных препаративных формах. Подходящими эксципиентами являются органические и неорганические вещества, которые подходят для энтерального (например, перорального или ректального), парентерального (например, внутривенной инъекции) или локального (например, местного, дермального, глазного или назального) введения, причем их примерами являются вода или водный изотонический солевой раствор, низшие спирты, растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, триацетат глицерина и другие глицериды жирных кислот, желатин, лецитин сои, углеводы, такие как лактоза или крахмал, стеарат магния, тальк, целлюлоза и вазелин.
Для перорального введения большой интерес представляют простые таблетки, таблетки, покрытые оболочкой, капсулы, особенно таблетки, покрытые оболочкой, и капсулы, имеющие энтеросолюбильное покрытие. Суппозитории применяются для ректального введения, растворы, предпочтительно водные или масляные растворы, а также суспензии или эмульсии применяются для парентерального введения.
Способ реализуется следующим образом.
Гумифицированный материал, например лигнинсодержащее сырье, освобождают от растворимых компонентов и подвергают щелочному гидролизу в присутствии кислорода, предпочтительно в поле ультразвуковых колебаний, наиболее желательно в режиме развитой кавитации, охлаждают и фильтруют реакционную смесь. Отделенную жидкую фазу подкисляют до выпадения осадка, который отделяют от жидкой фазы. После промывки и высушивания осадок представляет собой нерастворимый в воде порошок темно-коричневого цвета без вкуса и запаха.
Полученный полупродукт подвергают экстракции при нагревании с использованием в качестве экстрагента сложного эфира карбоновой кислоты. Экстракцию проводят до обесцвечивания экстрагента, что занимает 3-4 часа. Полученный жидкий экстракт удаляют, а оставшийся осадок экстрагируют алканолом при нагревании. Вторую экстракцию также проводят до обесцвечивания экстрагента, что занимает 4-5 часов. Затем система охлаждается до комнатной температуры, экстрагент удаляется в вакууме при температуре не более 50°С. Высушенный осадок переносится в лотки и высушивается на воздухе в течение 18-20 часов.
Полученная сухая фракция растворяется в водном растворе NaOH при рН ~9,0, затем полученный раствор обрабатывают концентрированной соляной кислотой до рН ~1,95. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают и высушивают.
Выход целевого продукта составляет 40-50%.
Полагается, что специалист в данной области, основываясь на данном описании, сможет использовать настоящее изобретение в полном объеме.
Следовательно, последующие конкретные воплощения предназначены только для иллюстрации и никоим образом не ограничивают раскрытие.
Пример осуществления предложенного способа.
В емкость помещают 150 г NaOH, прибавляют 5-6 литров дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения, затем прибавляют 1 кг «Полифепана». Суспензию реакционной массы загружают в автоклав, доводят давление в реакторе до 15 атм и пропускают воздух со скоростью 30 л/мин. Доводят температуру в реакторе до 140°С. По окончании процесса (190 мин) реакционную массу охлаждают, выгружают в виде суспензии, отделяют жидкую фазу фильтрацией или центрифугированием. Отделенную жидкую фазу подкисляют до рН=2, выпавший осадок - полупродукт отделяют от жидкой фазы и сушат на воздухе.
Полученный полупродукт (18 г) помещают в аппарат Сокслета, заливают в колбу этилацетат (массовое соотношение полупродукт-этилацетат 1:10) и нагревают до кипения этилацетата. Экстракция проводится до обесцвечивания этилацетата в рабочем объеме аппарата Сокслета, что занимает 3-4 часа. Прекращают нагрев, доводят температуру растворителя до комнатной, удаляют колбу с этилацетатным экстрактом, а осадок оставляют в аппарате Сокслета.
С помощью н-бутанола удаляют остатки этилацетата над осадком (этилацетат-бутанольный экстракт), а дальнейшую экстракцию проводят н-бутанолом (массовое соотношение полупродукт-н-бутанол 1:10) и продолжают экстракцию при температуре кипения экстрагента до обесцвечивания и прозрачности н-бутанола в рабочем объеме, что занимает 5-6 часов. Систему охлаждают до комнатной температуры, объединяют н-бутанольный экстракт с этилацетат-бутанольным экстрактом, удаляют растворитель при пониженном давлении (10-15 мм Hg) и выделяют сухую фракцию. Полученный осадок переносят в лотки и досушивают на воздухе в течение 18-20 часов.
2
К высушенному осадку (бутанольная фракция) приливают 300 мл водного раствора NaOH с рН ~9,0 и доводят до полного растворения. Раствор обрабатывают концентрированной соляной кислотой до рН ~1,95. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант удаляют, осадок промывают водой, подкисленной соляной кислотой до рН ~2,0. После удаления промывных вод осадок с помощью этилового спирта переносят в колбу, на роторном испарителе удаляют растворитель при Т<50°С, затем высушивают в вакууме при 25 мм Hg в вакуумном сушильном шкафу над безводным CaCl при комнатной температуре в течение 18-20 часов. Выход целевого продукта составляет ~7,7 г (43%).
Было проведено изучение токсического действия полученного средства на мышах СВА и на крысах. Препарат вводился однократно. Было установлено, что при пероральном введении мыши переносят препарат без каких-либо отрицательных последствий в дозах до 1000 мг/кг. При внутримышечном и подкожном введении дозы до 1000 мг/кг не вызывали гибели животных. Побочное действие препарата у мышей при внутримышечном и подкожном введении выражалось в болевой реакции и некотором возбуждении животных в первые часы после введения препарата. При внутримышечном введении, кроме того, отмечалась развивающаяся постепенно в течение нескольких часов и сохранявшаяся несколько дней отечность мышцы, в которую проводилась инъекция. Отечности и инфильтратов в месте подкожной инъекции выявлено не было. Гибели крыс при внутримышечном введении препарата в дозах до 1000 мг/кг не отмечалось.
Полученный продукт авторы впервые использовали в качестве антиангиогенного средства.
При изучении антиангиогенных свойств нового лекарственного средства in vitro использована культура эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10, трансформированная вирусом SV40 [Walter-Yohrling et al., J. Clin. Cancer Res. 2004, 10:2179-2189].
Для исследования использовали препарат «Бутафол» (содержание гуминовых веществ 9,9 мг/мл).
Все эксперименты были повторены не менее 4 раз.
50
Проведенные исследования показали, что Бутафол блокирует пролиферативную активность эндотелиальных клеток, высаженных в низкой плотности (3 т/лунку), в концентрациях 500-250 мкг/мл гуминовых веществ (ИК=330 мкг/мл гуминовых веществ). В концентрациях 250-62,5 мкг/мл Бутафол блокирует миграционную активность эндотелиальных клеток «в рану» и образование трубочко-подобных структур. Не обнаружено цитотоксического действия препарата Бутафол на эндотелиальные клетки, высаженные в высокой плотности (15 т/лунку), в концентрациях 500-15 мкг/мл.
Было проведено с помощью гистологических и иммуногистохимических методов изучение действия препарата Бутафол на морфологическое строение меланомы В16 и ангиогенез в ней.
Штамм меланомы В16 получен из Банка опухолевых штаммов ГУ РОНЦ. Для проведения опытов выполнено пассирование опухоли на мышах-самках линии C57BL6. В опытах использована 3-я генерация in vivo. Трансплантацию выполняли по 50 мг взвеси клеток меланомы на мышь в 0,5 мл среды 199.
Препарат вводили в/м ежедневно в дозе 50 мг/кг на 3-7-й дни после трансплантации, всего 5 раз. Животных умерщвляли на 4-й и 9-й дни после окончания лечения (11-й и 15-й дни после трансплантации опухоли соответственно).
Эффективность лечения иллюстрируется уменьшением объема опухолей в 8 раз по сравнению с контролем (введение физиологического раствора хлористого натрия в адекватной схеме). Этот эффект возрастал во времени и в течение недели достиг 97% при развитии видимого некроза в опухоли в группе Бутафола.
В результате гистологического исследования обнаружено, что препарат снижает пролиферативную активность опухолевых клеток. После введения Бутафола число митозов и индекс плотности распределения сосудов (MVD) снижались в 2 раза на 4-й день после окончания лечения, а площадь некрозов увеличивалась почти в 2 раза по сравнению с контролем. К 9-му дню после лечения митотическая активность восстанавливается не полностью, площадь некрозов была в 1,5 раза больше, чем в контроле. Эти процессы сопровождают процесс торможения роста опухоли до 92% в сравнении с контролем.
Проведенное иммуногистохимическое исследование с определением VEGF в меланоме В16 позволило установить, что подавление митотической активности клеток и замедление роста опухоли под влиянием Бутафола связано с ингибированием ангиогенеза и реализуется через подавление активности фактора эндотелия сосудов VEGF. Это документируется практически двукратным снижением интенсивности иммуногистохимической реакции в клетках меланомы и уменьшением числа опухолевых клеток, содержащих VEGF. Изменения пролиферации клеток и состояния ангиогенеза в них наиболее выражены на 4-й день после проведенного лечения и сохраняются в течение 9-ти дней.
Таким образом, в результате проведенного гистологического и иммуногистохимического исследования установлено, что Бутафол реализует ингибирующее действие на подкожно трансплантированную меланому В16 путем подавления неоангиогенеза. Это действие связано с выключением главного регулятора развития кровеносных сосудов - фактора роста эндотелия сосудов VEGF.