ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ БИОСИНТЕЗАβ-МАННАНАЗЫ ГРИБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

УДК 576.809.33

Доцент И.В. Черемушкина1, магистрант Н.А. Некрасова1, старший преподаватель С.Н. Черняева , профессор О.С. Корнеева1

'(Воронеж. гос. ун-т. инж. технол.) кафедра микробиологии и биохимии, тел. (473) 255-55-57

2(Вороиеж. гос. ун-т. инж. Технол) кафедра информационных технологий, моделирования и управления

Оптимизация условий биосинтеза р-маннаназы грибного происхождения

Оптимизированы условия биосинтеза фермента Р-маннаназы методом математического моделирования эксперимента. Проведенные экспериментальные испытания подтвердили эффективность оптимизации на основе математического моделирования эксперимента методом наименьших квадратов. При этом активность Р-маннаназы, синтезируемой микромицетом Trichoderma harzianum, составила 564,0 ед/мл, что превышает активность фермента на контрольной среде в 2,7 раза. Удельные энергозатраты процесса культивирования снизились на 12 %.

Biosynthesis conditions of P-mannanase enzymes have been optimized by a method of mathematical experiment modeling. The experimental tests have confirmed the effectiveness of optimization based on mathematical modeling of the experimental method of least squares. In this case, the activity of P-mannanase synthesized by Trichoderma harzianum was 564.0 U / mL, which is higher than the activity of the enzyme in the control environment at 2.7 times. Specific energy consumption of the process of cultivation decreased by 12%.

Ключевые слова: Р-маннаназа, активность, удельные энергозатраты, метод наименьших квадратов.

ß-Маннаназа (ЕС 3.2.1.78) - фермент, относящийся к классу О-гликозид-гидролаз, расщепляет внутренние Р-1,4-гликозидные связи в маннанах, являющихся полимерами клеточной стенки многих растений. Продуктами их ферментативного гидролиза являются манноза и низкомолекулярные маннооли-госахариды, которые обладают выраженным пребиотическим и иммуностимулирующим действием [1, 2, 3].

В настоящее время ß-маннаназы стали объектом повышенного внимания в связи с перспективами их применения в различных отраслях промышленности, в частности, при производстве биофармацевтических препаратов для ветеринарии и использования в качестве биодобавки в кормопроизводстве [4, 5].

При промышленном производстве ферментных препаратов высокая стоимость питательной среды неизбежно приводит к удорожанию целевого продукта, поэтому использование органических источников питания среды, являющихся относительно дешевым и доступным сырьем, будет положительно сказываться на рентабельности производства.

© Черемушкина И.В., Некрасова H.A., Черняева С.Н., Корнеева О.С., 2013

В предыдущих работах для глубинного культивирования микроскопического гриба Тпскоёвгта ка^апыт в качестве источников азотного и углеродного питания были предложены NN03 (0.1 % по азоту) и 4 % фруктозы соответственно. Активность Р-маннаназы составила 210 ед/мл [6].

Использование для биосинтеза Р-

маннаназы органических источников азота и углерода представляет экономический интерес, поскольку эти компоненты являются относительно дешевым и доступным сырьем, что немаловажно для рентабельности промышленного производства ферментного препарата.

Целью данной работы было проведение оптимизации состава питательной среды для глубинного культивирования микро-мицета Тпскоёвгта ка^апыт с целью повышения биосинтеза им Р-маннаназы и снижения удельных энергозатрат на процесс культивирования.

Культивирование продуцента осуществляли глубинным способом в ферментере вместимостью 100 л (ООО - фирма «Про-интех») на питательной среде Чапека в течение 72 ч при температуре 30-32 °С, в качестве источника углерода вносили кукурузную му-

ку, в качестве источника азота - белково-витамиииый концентрат. Условия культивирования продуцента и органические источники азота и углерода были выбраны в ходе ранее проведенных исследований [7].

Определение активности Р-маннаназы проводили методом Сомоджи-Нельсона. В качестве субстрата использовали галактоманнан ЬБО (камедь рожкового дерева). За единицу активности принимали такое количество фермента, которое при гидролизе галактоманнана образует 1 ммоль маннозы за одну минуту в ацетатном буфере рН 4,5 при 60 °С [8, 9].

Оптимизацию условий биосинтеза проводили с применением методов математического моделирования: построение адекватной математической модели процесса методом наименьших квадратов с последующим статистическим анализом результатов; нахождение оптимальных условий биосинтеза фермента и энергозатрат процесса.

Программа исследований закладывалась в экспериментальную матрицу, включающую 32 отдельных опыта. Для получения простейшей адекватной модели требовалось связать выходные параметры системы ф-маннаназная активность, удельные энергозатраты) с входными - условиями культивирования и концентрацией компонентов среды.

В качестве основных факторов, влияющих на биосинтез Р-маннаназы Т.ка^аппт, были взяты: Х1 - температура культивирования, °С; Х2 - рН среды; Х3- продолжительность культивирования ч.; Х4 -концентрация источника углерода (кукурузная мука), %; Х5 -концентрация источника азота белково-витаминный (БВК), %. Все эти факторы совместимы и некоррелируемы между собой. Пределы изменения исследуемых факторов приведены в таблице 1.

Таблица 1

Пределы изменения факторов при биосинтезе Р-маннаназы Т.Ьагаапиш

Условия планирования Кодированное значение Значения факторов

Х1 Х2 Хэ Х4 Х5

т, °с рН т, ч. С^М^ % Сбвю %

Основной уровень 0 32 4 72 4 0,2

Интервал варьирования Д 6 1 12 1 0,1

Верхний уровень +1 38 5 84 5 0,3

Нижний уровень -1 26 3 60 3 0,1

Критериями оценки влияния различных факторов на биосинтез Р-маннаназы была активность в глубинной культуре (У1, ед/мл) и удельные энергозатраты процесса культивирования (У2, кВтч/л).

Оптимизация условий культивирования продуцента заключалась в подборе таких тех-

Матрица экспериментальных данных

нологических режимов, при которых величина Р-маннаназной активности была бы максимальной, а удельные затраты процесса культивирования минимальными.

Экспериментальная матрица включала в себя 32 различных эксперимента (таблица 2).

Таблица 2

Опыты Кодированные значения факторов Уи ед/мл У2, кВтч/л

X, Х2 Х3 Х4

1 2 3 4 5 6 7 8

1 384,5 436,9 418,3 384,0 540,5 432,8 0,202

2 384,5 397,5 418,3 384,0 422,3 401,3 0,204

3 413,8 436,9 418,3 384,0 422,3 415,0 0,208

4 413,8 397,5 418,3 384,0 422,3 409,5 0,208

5 384,5 436,9 415,0 384,0 422,3 408,5 0,216

6 384,5 397,5 415,0 384,0 540,5 424,3 0,218

7 413,8 436,9 415,0 384,0 540,5 438,0 0,225

8 413,8 397,5 415,0 384,0 422,3 409,3 0,223

9 384,5 436,9 418,3 534,9 422,3 439,4 0,210

10 384,5 397,5 418,3 534,9 540,5 455,1 0,213

1 2 3 4 5 6 7 8

11 413,8 436,9 418,3 534,9 540,5 468,9 0,219

12 413,8 397,5 418,3 534,9 422,3 437,5 0,217

13 384,5 436,9 415,0 534,9 540,5 462,3 0,227

14 384,5 397,5 415,0 534,9 422,3 430,8 0,225

15 413,8 436,9 415,0 534,9 422,3 427,9 0,232

16 413,8 397,5 415,0 534,9 540,5 460,5 0,234

17 239,8 563,0 563,0 523,6 563,0 490,5 0,213

18 198,2 563,0 563,0 523,6 563,0 481,9 0,219

19 563,0 280,4 563,0 523,6 563,0 498,8 0,215

20 563,0 297,8 563,0 523,6 563,0 502,2 0,217

21 563,0 563,0 354,7 523,6 563,0 513,5 0,202

22 563,0 563,0 316,4 523,6 563,0 505,6 0,231

23 563,0 563,0 563,0 246,6 563,0 500,0 0,206

24 563,0 563,0 563,0 563,0 563,0 557,4 0,223

25 563,0 563,0 563,0 523,6 232,5 489,0 0,213

26 563,0 563,0 563,0 523,6 507,3 543,8 0,217

27 563,0 563,0 563,0 523,6 563,0 563,0 0,216

28 563,0 563,0 563,0 523,6 563,0 564,0 0,216

29 563,0 563,0 563,0 523,6 563,0 563,0 0,216

30 563,0 563,0 563,0 523,6 563,0 563,0 0,216

31 563,0 563,0 563,0 523,6 563,0 563,0 0,216

32 563,0 563,0 563,0 523,6 563,0 562,0 0,216

Проверка показала, что экспериментальные данные являются нормально распределенными и однородными.

Коэффициенты уравнений регрессии вычисляются по методу наименьших квадратов в матричном виде, поэтому необходимо отметить, что экспериментальные данные должны быть однородными и нормально распределенными. Коэффициенты уравнений регрессии определялись по формуле:

Ь =

где Ф = {Фы} = Ш X)} - регрессионная матрица. Число строк матрицы равно числу экспе-

риментов, число столбцов равно числу функций модели;

У = |уэкси | - столбец выходных параметров;

Ь = Ь } - столбец искомых коэффициентов. Для определения коэффициентов взаимодействия необходимо расширить таблицу 2 дополнительными столбцами, учитывающими эффект двойного и квадратичного взаимодействия факторов. Будем рассматривать уравнения регрессии в виде:

У = Ь0+Ь1Х1+Ь2Х2+Ь3Х3+Ь4Х4+Ь5Х5+Ь6Х1Х2+Ь7Х1Х3+Ь8Х1Х4+Ь9Х1Х5+Ь10Х2Х3+ЬцХ2Х4+

2 2 2 2 2 +Ь12Х2Х5+Ь13Х3Х4+Ь14Х3Х5+Ь15Х4Х5+Ь16Х1 +ЬпХ2 +Ь:8Х3 +^9X4 +Ь20Х5

Эффекты взаимодействия определяли аналогично линейным эффектам. В соответствии с данными таблицы 2 рассчитывали коэффициенты уравнения регрессии. Величина коэффициента регрессии (Ьг) характеризует

вклад каждого фактора (X/) условия биосинтеза в значения уровня Р-маннаназной активности и энергозатрат (У/).

Полученные уравнения регрессии имели следующий вид:

10"5Х1Х2+2,24-10"4Х1Х3-1,15-10"3Х1Х4+

У1 = -121,3-0,14 Х1-0,2Х2+0,82Х3+1,5Х4-0,4Х5-8,1

+1,5-10"3Х1Х5+2,9-10"4Х2Х3-5,3-10"4Х2Х4+1,8-10"3Х2Х5+7,5-10"4Х3Х4-2,4-10"3Х3Х5+2,6-10"4Х4Х5+ +4,6-10"5Х12-9,3-10"5Х22+9,5-10"5Х32-1,2-10"3Х42+4,3-10"4Х52

У2= 2,33+2,97-10"4Х1-3,01-10"4Х2-8,7-10"3Х3-4,9-10"4Х4+2,8-10"4Х5-4,9-10"6Х1Х2+2,6-10"6Х1Х3--5,2-10"7Х1Х4+1,24-10"6Х1Х5+6,3-10"6Х2Х3+4,9-10"7Х2Х4-1,24-10"6Х2Х5+5,7-10"7Х3Х4-2,6-10"7Х3Х5--2,2-10"7Х4Х5+7,7-10"7Х12-1,9-10"9Х22+3,9-10"6Х32+4,5 10"7Х42-1,8-10"8Х52

Значимость коэффициентов регрессии проверяли по критерию Стьюдента. В результате проверки все критерии следует признать значимыми. Вычисляли значение остаточной дисперсии, которая определяет величину разброса выходных параметров y под действием случайных помех:

1 N

SL =—Z

где k - число коэффициентов модели.

Вычисленная остаточная дисперсия для обеих моделей составила: SioSt=9.025, S2oSt=3,481xl0-5

Значения диспресии свидетельствуют о том, что данные, полученные по модели, практически не расходятся с экспериментальными данными.

Проверку эффективности полученной модели проводили с использованием F-критерия Фишера. Вычисленное значение F было больше табличного, что доказывает эффективность полученной модели.

По построенным моделям найдем значения переменных xi, i= 1,5 , при которых удельные энергозатраты процесса культивирования будут минимальными, а активность фермента ß-маннаназы будут максимальными, т. е. необходимо решить задачу оптимизации двух критериев: Y2 ^ max, Y1 ^ min.

Введем линейную свертку критериев:

Q = Y2 - Y1 ^ max

С помощью математических расчетов в MathCAD были найдены оптимальные значения условий биосинтеза фермента и удельных энергозатраты процесса (таблица 3).

Таблица 3

Оптимальные условия культивирования продуцента

Для подтверждения достигнутых результатов проведен контрольный эксперимент: при исходных условиях культивирования и оптимальных, подтвердивший эффективность оптимизации на основе математического моделирования эксперимента методом наименьших квадратов.

При оптимальных условиях

Р-маннаназная активность выросла в 2,7 раза и составила 564,0 ед/мл, а удельные энергозатраты снизились по сравнению с затратами на процесс культивирования на контрольной среде на 10 %, что является более выгодным с экономической точки зрения.

ЛИТЕРАТУРА

1 Корнеева, О. С. Пребиотические свойства маннозы и ее влияние на специфическую резистентность. [Текст] / О. С. Корнеева, А. С. Глущенко, И. В. Черемушкина / Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012. - № 5. - С. 51-57.

2 Корнеева, О. С. Исследование пребиоти-ческих и иммуномодулирующих свойств маннозы и манноолигосахаридов [Текст] / О. С. Корнеева, И. В. Черемушкина, А. С. Глущенко / Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 4/1 (38). - С. 137-138.

3 Пат. № 2437663 Способ коррекции микрофлоры кишечника [Текст] / О. С. Корнеева, А. С. Глущенко, И. В. Черемушкина; опубл. 27.12.2011 г, Бюл. № 36.

4 Черемушкина, И. В. Роль биомодифи-цированных кормов в повышении качества продукции перепеловодства [Текст] / И. В. Черемушкина, Н. А. Чигирина, Е. П. Анохина и др. / Вестник Воронежской государственной технологической академии. - 2010. - Т. 45. -№ 3. - С. 82-84.

5 Черемушкина, И. В. Биотехнология маннозосодержащих гидролизатов и исследование пребиотических свойств маннозы [Текст]/ И. В. Черемушкина, А. С. Глущенко, Е. П. Анохина и др. // Биотехнология. - 2010. -№ 5 - С. 56-61.

6 Корнеева, О. С. Биосинтез Р-маннаназы грибом Trichoderma harzianum при глубинном культивировании [Текст] / О. С.Корнеева, Н. А. Чигирина // Вестник Воронежской государственной технологической академии. — 2004. — № 9. - С. 54-57.

Факторы биосинтеза Оптимальные значения факторов

Температура,°С 32

рН среды 4

Продолжительность культивирования, ч. 72

Концентрация источника углерода, % 3,7

Концентрация источника азота, % 0,2

7 Корнеева, О. С. Исследование пребио-тических и иммуномодулирующих свойств маннозы и манноолигосахаридов [Текст] /

0. С. Корнеева, И. В. Черемушкина, Н. А. Некрасова // Актуальная биотехнология. -2012.- № 2. - С. 41-42.

8 Полыгалина, Г. В. Определение активности ферментов [Текст]: справочник / Г. В. Полыгалина, В. С. Чередниченко, Л. В. Римарева. - М.: ДеЛи принт, 2003. - 375 с.

9. Somogyi, M. J. Determination of reducing sugar [Text] / M. J. Somogyi //J. Biol. Chem. - 1952. - V. 195. - № 1. - P. 19-28.

10 Линик, Ю. В. Метод наименьших квадратов и основы математико-статистической теории обработки наблюдений [Текст] / Ю. В. Линик. - М.: Государственное издательство физико-математической литературы, 1958. - 337 с.

REFERENCES

1 Korneeva, O. S. The prebiotic properties of mannose and its effect on specific resistance. [Text] / O. S Korneeva., A. S. Gluchenko, I.V Cheremush-kina // Journal of epidemiology, microbiology and immunobiology. - 2012. - № 5. - P. 51-57.

2 Korneeva, O. S. The study of prebiotic and immunomodulatory properties of mannose and mannooligosaccharides [Text] / O. S Korneeva,

1.V Cheremushkina, A. S. Gluchenko // Bulletin of Ural Medical academic science. - 2011. - № 4/1 (38). - P. 137-138.

3 Pat. № 2437663 The method of correction of the intestinal microflora [Text] / O. S. Korneeva, A. S. Gluchenko, I. V. Cheremushkina; publ. 27.12.2011, Bull. № 36.

4 Cheremushkina, I. V. Role biomodified feed in improving the quality of breeding quail products [Text] / I. V. Cheremushkina, N. A. Chigirina, E. P. Anohina et al / Bulletin of the Voronezh State Technological Academy. - 2010. - T. 45. - № 3. - P. 82-84.

5 Cheremushkina, I.V. Biotechnology man-nose containing hydrolysates and study pre-biotic properties of the mannose [Text]/ I.V. Cheremushkina, A. S. Gluchenko, E. P. Anohina // Biotechnology. - 2010. - № 5 - P. 56-61.

6 Korneeva, O. S. The biosynthesis of ß-mannanase by the fungus Trichoderma harzianum in the deep cultivation [Text] / O. S. Korneeva, N.A. Chigirina // Bulletin of the Voronezh State Technological Academy. - 2004. - № 9. - P. 54-57.

7 Korneeva O. S. The study of prebiotic and immunomodulatory properties of mannose and mannooligosaccharides [Text] / O. S. Korneeva, I.V Cheremushkina, N. A. Nekrasova // Actual biotechnology.- 2012. - № 2. - P. 41-42.

8 Polygalina, G. V. Determination of enzyme activity. [Text]: directory / G. V. Polygalina, V. S. Cherednichenko, L. V. Rimareva. - M.: DeLi print, 2003. - 375 p.

9 Somogyi, M.J. Determination of reducing sugar [Text] / M. J. Somogyi // J. Biol. Chem. -1952. - V. 195. - № 1. - P. 19-28.

10 Linik, Y. V. The method of least squares and the basis of mathematical-statistical theory of observation processing [Text] / Linik Y. V. - M.: State publishing house of physical and mathematical literature, 1958. - 337 p.