ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ПАТОЛОГИЙ ПРОСТАТЫ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR USE IN THE TREATMENT OF PROSTATE PATHOLOGIES

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, предназначенной для применения при лечении патологий простаты. Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей смесь, которая включает или, альтернативно, состоит из эффективного количества Serenoa repens, бромелайна, куркумина, цинка, селена и ликопина, и фармацевтически приемлемого или пищевого качества технологических вспомогательных веществ и/или добавок. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, предпочтительно в форме мягких желатиновых капсул, для применения в лечении нарушений или заболеваний или патологий, связанных с простатитом и/или доброкачественной гиперплазией предстательной железы и/или возникающих в результате этого.
Заболевания тканей предстательной железы хорошо известны. Простатит представляет собой одну из наиболее распространенных патологий в урологической области. Это наиболее распространенная урологическая проблема среди молодых людей, которая становится еще более распространенной после 50 лет. К сожалению, не так много известно об этиологии простатита, поэтому часто бывает трудно определить наиболее подходящую терапию для лечения этой патологии. Простатит подразделяют на:
• категория I - острый простатит бактериального происхождения;
• категория IIа - хронический простатит бактериального происхождения;
• категория IIb - хронический простатит небактериального происхождения;
• категория III - синдром хронической тазовой боли;
• категория IV - бессимптомный простатит.
Острый простатит бактериального происхождения характеризуется внезапным возникновением лихорадки и расстройством мочеиспускания. Его следует лечить с помощью антибактериальной терапии, и любая альтернативная терапия с применением трав нецелесообразна, поскольку это может привести к задержке начала антибактериальной терапии, что приведет к большим трудностям в удалении возбудителя заболевания.
Хронический простатит категории II характеризуется рецидивирующими инфекциями мочевыводящих путей, вызванными бактериями, локализованными в предстательной железе. Грамотрицательные бактерии, такие как E. coli и Enterobacter, или грамположительные бактерии, такие как коагулазонегативные стафилококки, представляют собой основные этиологические агенты. В простатической жидкости и мочеиспускательном канале мужчин, страдающих хроническим простатитом, были обнаружены и другие микроорганизмы, такие как уреаплазма, хламидии и микоплазма, но пока не было обнаружено прямой корреляции между присутствием этих микроорганизмов и развитием патологии.
Большинство зарегистрированных случаев простатита относятся к категории III, то есть к синдрому хронической тазовой боли (CP/CPPS). Простатит типа III, называемый CP/CPPS (хронический простатит/синдром хронической боли в области малого таза), характеризуется болью в области малого таза, симптомами мочевыводящих путей и болезненным семяизвержением, и часто документированная инфекция мочевыводящих путей уропатогенами отсутствует. Синдром может быть изнурительным, он затрагивает 10-15% мужского населения и приводит к почти 2 миллионам амбулаторных посещений в год. Эта самая распространенная форма простатита, помимо прочего, представляет собой самую загадочную форму заболевания: она часто характеризуется отсутствием инфекции, хотя в некоторых случаях ее могут вызывать бактериальные инфекции, и в то же время она демонстрирует признаки хронического воспаления или аутоиммунного заболевания. Даже в отсутствии повышения уровня лейкоцитов в плазме, секреты предстательной железы и семенной жидкости пациентов, страдающих хроническим простатитом категории III, содержат повышенные концентрации провоспалительных цитокинов и молекул, возникающих в результате окислительного стресса. Существенное ограничение в установлении молекулярных механизмов CP/CPPS заключается том, что причина состояния в значительной степени неизвестна. Считается, что провоцирующие события, такие как инфекция или травма, могут привести к острому воспалению ткани предстательной железы, которое впоследствии становится хроническим и приводит к развитию синдрома хронической тазовой боли. Наиболее часто назначаемая терапия при простатите - это антибактериальная терапия. Учитывая, что для того, чтобы достичь ткани предстательной железы, антибактериальное вещество должно иметь возможность пройти барьер «кровь-простата», проницаемость которого не изменяется при инфекции, необходимо, чтобы антибактериальное вещество имело низкую молекулярную массу, высокую pKa и высокое значение logP, а, следовательно, высокую липофильность. К классам антибактериальных средств, которые попадают в эту категорию, относятся хинолоны, сульфамиды, макролиды и тетрациклины. Первоначальная терапевтическая мера часто состоит из назначения фторхинолонов в течение 4-6 недель, что эффективно у 50% мужчин, которые начинают терапию при первом появлении симптомов.
Поскольку воспаление представляет собой характерную черту всех категорий простатита, то часто назначают стероидные и нестероидные противовоспалительные препараты. Нет никаких сомнений в эффективности этих терапевтических средств в уменьшении боли, связанной с воспалением, которое присутствует в случае простатита.
Проблема заключается в том, что эти терапевтические средства связаны с многочисленными побочными эффектами. Нестероидные противовоспалительные препараты могут привести к возникновению язвы желудочно-кишечного тракта и кровотечению, дисфункции печени и почек и кожным реакциям. С применением глюкокортикоидов связаны следующие побочные эффекты: дерматит, телеангиэктазия, мышечная атрофия, миопатия, остеопороз, катаракта, синдром Кушинга, сахарный диабет и воздействия на сердечнососудистую систему.
Таким образом, среди практикующих специалистов в данной области все еще существует потребность в методе лечения простатита и, в общем, патологий простаты, который, с одной стороны, будет эффективен, а с другой стороны, свободен от побочных эффектов, присутствующих в известных методах лечения.
Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) известна. Доброкачественная гиперплазия предстательной железы представляет собой одну из наиболее распространенных патологий мочевыводящих путей у лиц мужского пола. Заболевание обычно возникает после 40 лет, и частота заболеваний прямо пропорциональна возрасту, составляя 50% в возрасте 60 лет и 90% в возрасте 85 лет. Доброкачественная гиперплазия предстательной железы характеризуется высокой заболеваемостью и низкой смертностью и считается проблемой здравоохранения.
При этой патологии выделяют две стадии: начальная стадия протекает бессимптомно и касается, прежде всего, периуретральной зоны, в то время как более поздняя стадия, также известная как клиническая стадия, представляет собой стадию, в которой увеличенная предстательная железа сжимает стенки мочеиспускательного канала, что приводит к увеличению сопротивления мочеиспусканию, а иногда и к воспалению (простатиту). Это состояние вызывает симптомы, связанные с клинической картиной, известной как «простатизм», которая характеризуется статическими и динамическими компонентами. Первые относятся к стромальной ткани и связаны с повышением тонуса гладких мышц шейки мочевого пузыря и стромальной части простаты. Обструктивные симптомы, вызванные динамическими компонентами, представлены следующим: дриблинг мочи после мочеиспускания, ощущение неполного опорожнения мочевого пузыря, задержка мочи, снижение скорости и силы мочеиспускания и прерывистость мочеиспускания. Статические компоненты клинической формы ДГПЖ (доброкачественной гиперплазии предстательной железы) представляют собой никтурию, недержание мочи, гематурию, срочность мочеиспускания и повышенную частоту мочеиспускания. Вышеописанные симптомы могут приводить к беспокойству, нарушениям сна, сексуальным нарушениям и нарушению чувства благополучия, что может приводить к перебоям в трудовой деятельности и социальных отношениях, что очень негативно влияет на качество жизни (QoL).
Происхождение доброкачественной гиперплазии предстательной железы еще не было четко определено. Были предложены три теории о его патогенезе. Первая теория основана на роли андрогенов, эстрогенов и факторов роста. Вторая теория патогенеза ДГПЖ основана на присутствии небольшого процента андроген-независимых клеток простаты, которые могут обновляться в условиях, когда андрогены отсутствуют. Наконец, третья теория касается взаимодействий между стромой и эпителием простаты.
Лечение этой патологии (ДГПЖ) зависит от индивидуума и серьезности симптомов. Первоначально, на менее продвинутых стадиях патологии достаточно проходить частые проверки простаты и менять свой образ жизни. Когда симптомы ухудшаются, можно переходить к фармакологической терапии или к применению лекарственных растений.
Два основных класса лекарств, применяемых для лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ), представлены антагонистами α1-адренергических рецепторов (празозин, теразозин, доксазозин, альфузозин, тамсулозин, силодозин) и ингибиторам 5α-редуктазы (финастерид, дутастерид), часто эффективно применяемыми в комбинации в качестве профилактической терапии против дальнейшего прогрессирования данной патологии.
Из-за многочисленных и иногда серьезных побочных эффектов ранее описанных классов лекарственных средств и ввиду высокой заболеваемости и длительной латентности данной патологии у практикующих в этой области специалистов существует острая необходимость в способе лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ), который, с одной стороны, будет эффективен, а с другой стороны, свободен от побочных эффектов, присущих известным способам лечения.
Таким образом, существует острая необходимость иметь фармацевтическую композицию для применения при лечении патологий предстательной железы. Кроме того, существует острая потребность в наличии композиций для применения при лечении нарушений или заболеваний или патологий, связанных с простатитом и/или доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ) и/или возникающих в результате этого.
После длительной интенсивной научно-исследовательской деятельности Заявитель определил и разработал комбинацию (смесь) соединений и веществ, которые способны эффективно, синергетически действовать против нарушений или заболеваний или патологий, связанных с простатитом и/или доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ) и/или возникающих в результате этого.
Преимущественно, указанная комбинация (смесь) соединений и веществ хорошо переносится и не имеет побочных эффектов, даже если вводить ее в течение длительных периодов в форме композиции для перорального применения, например, фармацевтической композиции в форме, например, мягких желатиновых капсул.
Преимущественно, указанная комбинация (смесь) соединений и веществ в форме композиции для перорального применения, например, фармацевтическая композиция в форме, например, мягких желатиновых капсул, хорошо переносится, когда ее применяют саму по себе или в связи/в сочетании с фармакологическим и/или хирургическим лечением.
Настоящее изобретение относится к композиции, включающей смесь, которая включает или, альтернативно, состоит из соединений и веществ, а также фармацевтически приемлемых или пищевых технологических вспомогательных веществ и/или добавок, имеющих признаки, определенные в прилагаемой формуле изобретения.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для применения в качестве лекарственного средства, включающей смесь, которая включает или, альтернативно, состоит из соединений и веществ, а также фармацевтически приемлемых или пищевых технологических вспомогательных веществ и/или добавок, имеющих признаки, определенные в прилагаемой формуле изобретения.
Настоящее изобретение относится к композиции для применения при лечении расстройств или заболеваний или патологий, связанных с простатитом и/или доброкачественной гиперплазией предстательной железы, и/или возникающих в результате этого, причем указанная композиция состоит из смеси, которая содержит или, альтернативно, состоит из соединений и веществ и фармацевтически приемлемых или пищевых технологических вспомогательных веществ и/или добавок, имеющих признаки, определенные в прилагаемой формуле изобретения.
Предпочтительные воплощения настоящего изобретения проиллюстрированы ниже без какого-либо намерения ограничить его объем.
Заявитель разработал и усовершенствовал смесь соединений и веществ, которые вместе демонстрируют синергетическую активность. Указанная синергетическая активность достигается, когда соединения и вещества вводят все вместе одновременно или в единой лекарственной форме - однократной или монолитной - или, альтернативно, когда указанные соединения и указанные вещества вводят раздельно последовательным образом в течение какого-то времени.
Если не указано иное, в пределах объема настоящего изобретения проценты и количества компонента в смеси предназначены для обозначения массы этого компонента по отношению к общей массе смеси.
Если не указано иное, в рамках настоящего изобретения в отношении диапазонов числовых значений для определенного признака указание «от X до Y» содержит крайние значения, то есть X и Y, а также все возможные промежуточные числовые значения.
В контексте настоящего изобретения термин «композиция (композиции)» включает фармацевтическую композицию, композицию для пищевой добавки, композицию для пищевого изделия или композицию для медицинского устройства.
В контексте настоящего изобретения термин «медицинское устройство» применяют в значении в соответствии с итальянским законодательным декретом № 46 от 24 февраля 1997 и директивой 93/42/EEC от 14 июня 1993, т.е. он указывает на вещество или другой продукт, независимо от того, применяют ли их по отдельности или в комбинации, предназначенные производителем для применения людьми для диагностики, профилактики, мониторинга, лечения или облегчения заболевания, которые не достигают своего основного предполагаемого действия в организме или на теле человека, для которого оно было предназначено с помощью фармакологических, иммунологических или метаболических способов, но которые могут оказать помощь в его функции с помощью таких средств.
В одном воплощении смесь соединений и веществ включает или, альтернативно, состоит из Serenoa repens (W. Batram) Small., бромелайна (термин, относящийся к двум протеолитическим ферментам, идентифицированным у Ananas comosus - семейство Bromeliaceae), куркумина (Curcuma longa), цинка, ликопина и селена. В качестве примера описаны ингредиенты, составляющие смесь по настоящему изобретению: Serenoa repens предпочтительно получают путем сверхкритической экстракции из плодов, титрованных, по меньшей мере, до 90% в липидостероловом экстракте, ликопин, предпочтительно, из плодов Solanum lycopesicum, бромелайн, предпочтительно, применяют как таковой или извлекают из стебля Ananas comosus L. Merr., цинк может предпочтительно представлять собой оксид цинка или глюконат цинка или ацетат цинка, куркумин предпочтительно получают из корневища Curcuma Longa, и селен может предпочтительно представлять собой селенометионин или селенит натрия.
Serenoa repens (W. Batram) Small. оказывает противовоспалительное и противоотечное действие.
Бромелайн представляет собой смесь протеолитических ферментов, извлеченных из ананасов. Показано, что бромелайн обладает различными интересными с фармакологической точки зрения активностями, в том числе, ингибирование агрегации тромбоцитов, снижение интенсивности стенокардии, лечение бронхита, синусита и тромбофлебита и увеличение поглощения различных активных ингредиентов. Предполагается, что механизм действия бромелайна заключается в следующих активностях: a) увеличение фибринолитической активности; b) снижение уровня фибриногена в плазме; c) снижение уровня брадикинина (с уменьшением проницаемости сосудов, уменьшением отека и боли); d) снижение уровня PGE2; е) снижение уровня TXA2; e) модуляция адгезии некоторых клеток иммунной системы.
Исследования по эффективности бромелайна в лечении простатита или патологий простаты в целом в настоящее время отсутствуют; тем не менее, Заявитель полагает, что его противовоспалительная активность может быть полезна при лечении этих патологий, а также при лечении доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ).
Куркумин представляет собой продукт природного происхождения, в основном, наделенный противовоспалительной активностью. Куркумин может быть полезен при лечении простатита и доброкачественной гиперплазии предстательной железы.
Одна из основных проблем куркумина заключается в его низкой пероральной биодоступности из-за его плохой растворимости.
Цинк обладает антиоксидантными, а также антимикробными свойствами. Кроме того, цинк способствует модуляции уровня тестостерона.
Ликопин проявляет антиоксидантную и антипролиферативную активность, обладая способностью увеличивать процент клеток в стадии покоя G0/G1 и ингибировать семейство IGF. Следовательно, применение ликопина может быть полезным для противодействия возникновению доброкачественной гиперплазии предстательной железы и рака простаты, которое может быть вызвано, среди различных факторов, также окислительным повреждением ДНК, индуцированным АФК (активными формами кислорода) во время воспалительного процесса.
Селен обладает противовоспалительной и антиоксидантной активностью.
Кроме того, он способен ингибировать пролиферацию клеток и стимулировать апоптоз.
Заявитель обнаружил, что смесь соединений и веществ и, следовательно, содержащая их композиция, в соответствии с настоящим изобретением, обе демонстрируют полезный эффект при лечении нарушений или заболеваний или патологий, связанных с простатитом и/или доброкачественной гиперплазией предстательной железы и/или возникающих в результате этого. Полезного эффекта достигают, когда доза смеси (которая соответствует количеству по массе индивидуальных соединений и веществ, присутствующих в смеси) содержится в композиции по настоящему изобретению, предпочтительно, указанная композиция находится в форме мягких желатиновых капсул, и указанная смесь имеет следующие признаки, сами по себе или в комбинации:
i) Serenoa repens (W. Batram) Small. присутствует в количестве от 200 до 600 мг, предпочтительно, от 300 до 500 мг, более предпочтительно, 400 мг, и/или
ii) Бромелайн присутствует в количестве от 10 до 400 мг, предпочтительно, от 120 до 180 мг, более предпочтительно, 150 мг, и/или
iii) Куркумин присутствует в количестве от 50 до 500 мг, предпочтительно, от 75 до 150 мг, более предпочтительно, 100 мг, и/или
iv) Цинк присутствует в количество по массе, составляющем от 10 до 20 мг, предпочтительно, от 12 до 18 мг, более предпочтительно, 15 мг, и/или
v) Ликопин присутствует в количестве по массе, составляющем от 1 до 10 мг, предпочтительно, от 3 до 8 мг, более предпочтительно, 6 мг, и/или
vi) Селен присутствует в количестве по массе, составляющем от 20 мкг до 100 мкг, предпочтительно, от 40 мкг до 60 мкг, более предпочтительно, 45 мкг.
Воплощения смеси соединений и веществ по настоящему изобретению были следующими (Таблица 1):
Таблица 1
Активный ингредиент
1-Доза
2-Доза
3-Доза
4-Доза
Serenoa repens, фитостероловый экстракт
400 мг
300 мг
450 мг
500 мг
Бромелайн
150 мг
250 мг
200 мг
120 мг
Куркумин
100 мг
150 мг
100 мг
75 мг
Цинк
15 мг
20 мг
15 мг
10 мг
Ликопин
6 мг
8 мг
8 мг
6 мг
Селен
41,5 мкг
50 мкг
40 мкг
41,5мкг
Доза, имеющая признаки, обозначенные как 1-доза, представляет собой преимущественно предпочтительную дозу.
Композиция, содержащая смесь соединений и веществ по настоящему изобретению, позволяет достичь, по меньшей мере, одного из следующих эффектов/преимуществ: (а) антиандрогенный и антипролиферативный эффект, и/или (б) противовоспалительный эффект, и/или (в) антиоксидантный эффект и/или (г) миорелаксантный эффект.
Экстракт Serenoa repens проявляет ингибирующую активность в отношении 5α-редуктазы, которая снижает концентрацию дигидротестостерона, что приводит к антипролиферативному действию вследствие более низкой экспрессии, на уровне простаты, факторов роста, которые будут способствовать пролиферации клеток простаты. В дополнение к антипролиферативному действию он также проявляет проапоптотическую активность благодаря своей способности ингибировать экспрессию антиапоптотических белков и увеличивать активность каспазы, что приводит к дальнейшей блокировке пролиферации клеток. Ликопин способен выступать в качестве антагониста рецепторов андрогенов, таким образом, проявляя антиандрогенную активность, но с механизмом действия, отличным от такового у Serenoa repens: по этой причине два активных ингредиента обладают синергетическим действием. Селен проявляет антипролиферативную активность, которая может дополнять антиандрогенную активность (которая приводит к ингибированию экспрессии фактора роста) Serenoa repens и ликопина. Цинк, также обладает антиандрогенной активностью и действует синергически с Serenoa repens, селеном и ликопином.
2
Липостериновый экстракт Serenoa repens может ингибировать экспрессию различных медиаторов воспаления и способен непосредственно ингибировать активность фосфолипазы A, с последующим снижением синтеза простагландинов и лейкотриенов: таким образом, он уменьшает собственно воспаление. Куркумин представляет собой молекулу, обладающую противовоспалительной активностью. Он ингибирует экспрессию многочисленных провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, IL-8, IL-1β и IL-6, а также других белков, связанных с воспалением, таких как NF-kB, COX-2, STAT3 и MDA. Бромелайн также обладает противовоспалительной активностью, которая может действовать синергетически с другими активными ингредиентами, содержащимися в нашей композиции. Ликопин и селен также, по-видимому, обладают противовоспалительной активностью, которая должна способствовать дальнейшему снижению воспаления, связанного с простатитом, а также с доброкачественной гиперплазией предстательной железы.
Экстракт Serenoa repens проявляет антиоксидантную активность, которая может дополнительно способствовать защите предстательной железы от повреждения окислительным стрессом. Ликопин и селен также проявляют антиоксидантную активность. Цинк продемонстрировал антиоксидантную активность, и его присутствие, по-видимому, имеет основополагающее значение для правильного функционирования ткани предстательной железы. Активность этих последних четырех активных ингредиентов, содержащихся в смеси соединений и веществ и, следовательно, в композиции по настоящему изобретению, приводит к снижению окислительного стресса, возникающего в случае простатита и доброкачественной гиперплазии предстательной железы.
Наконец, Serenoa repens экстракт способен блокировать α1-рецепторы и мускариновые рецепторы, тем самым ингибируя сокращение гладких мышц и проявляя миорелаксантную активность, которая может способствовать облегчению симптомов доброкачественной гиперплазии предстательной железы.
Синергетическое действие имеет место между Serenoa repens (Batram) Small., бромелайном, куркумином, цинком, ликопином и селеном.
Синергизм возникает, когда Serenoa repens (Batram) Small., присутствует в массовом количестве от 200 мг до 600 мг, бромелайн присутствует в массовом количестве от 10 мг до 400, куркумин присутствует в массовом количестве от 50 мг до 500 мг, цинк присутствует в массовом количестве т от 10 мг до 20 мг, ликопин присутствует в массовом количестве от 1 мг до 10 мг, а селен присутствует в массовом количестве от 20 мкг до 100 мкг.
Преимущественно доза, имеющая признаки, обозначенные как 1-доза в таблице 1, представляет собой предпочтительную дозу.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Было проведено несколько исследований композиции по настоящему изобретению для применения при лечении простатита и доброкачественной гиперплазии предстательной железы.
Влияние композиции по настоящему изобретению, как описано выше, и составляющих ее индивидуальных компонентов оценивали с целью наблюдения синергетического эффекта между отдельными компонентами на:
(i) продуцирование провоспалительных цитокинов и хемокинов эпителиальными клетками предстательной железы;
(ii) пролиферацию эпителиальных клеток простаты,
(iii) противовоспалительное действие на мышиной модели простатита.
Материалы и способы (in vitro тест на маркеры воспаления)
2
Нормальные клетки эпителия простаты (PrEC) поддерживали при температуре 37°C в увлажненной атмосфере, состоящей из 95% воздуха и 5% CO. Культуру клеток поддерживали в культуральной среде. Игла с добавлением 10%-ной инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ раствора глютамина, 100 Ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. В качестве альтернативы можно было применять специфическую среду для культивирования эпителиальных клеток простаты.
Для экспериментов клетки высевали в чашку Петри и держали в инкубаторе для тканевых клеток. Клетки PrEC обрабатывали в течение 24-х часов с помощью TNF-α в концентрациях от 5 до 20 нг/мл перед экстракцией РНК для ее анализа.
Материалы и способы (in vitro тест на пролиферацию клеток)
2
Нормальные эпителиальные клетки простаты (PrEC) культивировали при температуре 37°C в увлажненной атмосфере, состоящей из 95% воздуха и 5% CO. Культуру клеток поддерживали в культуральной среде. Игла с добавлением 10%-ной инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ раствора глютамина, 100 Ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. В качестве альтернативы можно было применять специфическую среду для культивирования эпителиальных клеток простаты.
Клетки высевали в чашку Петри и заливали 5 мл культуральной среды.
Материалы и способы (in vivo тест)
Для исследования применяли крыс линии Вистар. Животных содержали в комнатах с контролируемой температурой (температура 23 ± 2°С, влажность 40-70%, 12-часовые циклы свет-темнота), и они имели свободный доступ к воде и пище (состоявшей из стандартной диеты). Крыс кастрировали под наркозом, индуцированным диэтиловым эфиром. Затем крысам подкожно вводили раствор 17β-экстрадиола в кунжутном масле в дозе 0,25 мг/2 мл/кг в качестве индуктора простатита. Лечение проводили в течение 30-ти дней, начиная с первого дня после кастрации [1].
Продукция провоспалительных цитокинов и хемокинов in vitro
Экспрессия TNF-α, IL-8, IL-1β и IL-6 может быть оценена с помощью вестерн-блоттинга в соответствии со способом, описанным Cho et al. [2].
Клетки были разделены на 3 группы:
- Первую группу обрабатывали только культуральной средой;
- Вторую группу обрабатывали культуральной средой, содержавшей экстракт Serenoa repens, цинк, селен и ликопин;
- Третью группу обрабатывали культуральной средой, содержавшей экстракт Serenoa repens, цинк, селен, ликопин, куркумин и бромелайн.
После обработки различными культуральными средами клетки собирали для вестерн-блот-анализа. Экстракты целых клеток получали с применением буфера для лизиса [10 мМ Трис (рН 7,4), 5 мМ ЭДТА, 130 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, фенилметилсульфонилфторид (PMSF, 10 мг/мл), апротинин (10 мг/мл), лейпептин (10 мг/мл), 5 мМ фенантролин и 28 мМ бензамидин гидрохлорид].
3
4
3
4
2
Для определения фосфопротеинов клетки промывали солевым раствором, забуференными фосфатами, содержавшим 1 мМ NaVO и 1 мМ NaF, и лизировали в буфере [20 мМ Трис-Cl (pH 8,0), 137 мМ NaCl, 10% глицерин, 1% Тритон Х-100, 1 мМ NaVO, 1 мМ NaF, 2 мМ ЭДТА, 200 нМ апротинин, 20 мкМ лейпептин, 50 мкМ фенантролин, 280 мкМ бензамидин гидрохлорид]. Для выделения ядерных белков клетки лизировали в гипотоническом буфере при температуре 0°С в течение 20-ти минут и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10-ти минут. Супернатант содержал цитозольную фракцию. Осадки гомогенизировали в буфере для экстракции ядер [10 мМ Трис-Cl (pH 7,5), 0,5 М NaCl, 2,5% глицерина, 1,5 мМ MgCl, 0,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 2 мМ PMSF, 200 нМ апротинин] при температуре 0°С в течение 20-ти минут. Затем их центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10-ти минут. Супернатант содержал ядерную фракцию.
Концентрацию белка в экстрактах определяли с помощью реагента Брэдфорд, применяя сывороточный альбумин в качестве стандарта. Белки разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, содержавшем 10-12% додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Затем белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану промывали солевым раствором, забуференным Трис (10 мМ Трис, 150 мМ NaCl), содержавшим Твин-20 (известный как смесь TBST), и блокировали в TBST, содержавшем 5% обезжиренного сухого молока. Мембрану инкубировали с различными антителами, чтобы обеспечить распознавание белков. Затем мембрану инкубировали с вторичными антителами, сопряженными с пероксидазой хрена, и, наконец, обрабатывали хемолюминесцентными реагентами (ECL, реагенты для вестерн-детектирования с усиленной хемолюминесценцией).
Пролиферация клеток
Клетки были разделены на три группы:
• первую группу обрабатывали только культуральной средой с низким содержанием факторов роста;
• Вторую группу обрабатывали культуральной средой, с низким содержанием факторов роста и содержавшей экстракт Serenoa repens, цинк, селен и ликопин;
• Третью группу обрабатывали культуральной средой, с низким содержанием факторов роста и содержавшей экстракт Serenoa repens, цинк, селен, ликопин, куркумин и бромелайн.
Через 48 часов синхронизированные клетки снова стимулировали культуральной средой, содержавшей нормальные концентрации факторов роста и активных ингредиентов, если они присутствовали. Через 12 часов клетки подвергали трипсинизации и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в 1 мл солевого фосфатного буфера, и 100 мкл суспензии применяли для подсчета клеток с помощью теста с освобождением трипанового синего. Оставшиеся клетки промывали 4 мл солевого фосфатного буфера, снова центрифугировали и ресуспендировали в 0,5 мл солевого фосфатного буфера. После добавления суспензии клеток к 4,5 мл этанола при температуре 0°С образцы замораживали при температуре -20°С. Для анализа методом проточной цитометрии образцы центрифугировали в течение 5 минут при 200 g, промывали 5 мл солевого фосфатного буфера и затем ресуспендировали в окрашивающем растворе. После 30-ти минут инкубации при комнатной температуре проводили анализ. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. Для оценки распределения клеток на различных стадиях клеточного цикла применяли специальное программное обеспечение.
Продукция провоспалительных цитокинов и хемокинов in vivo
Крыс разделяли на 4 группы:
• группа нормальных крыс, которой вводили плацебо;
• группа с моделью простатита у крыс, которой вводили плацебо;
• группа с моделью простатита у крыс, которой вводили препарат, содержавший экстракт Serenoa repens, ликопин, селен и цинк;
• группа с моделью простатита у крыс, которой вводили препарат, содержавший экстракт Serenoa repens, ликопин, селен, цинк, куркумин и бромелайн.
После одной недели обработки были рассчитаны концентрации TNF-α, IL-8 и IL-6 в плазме и тканях предстательной железы [3].
Исследование массы и гистологии.
После того, как была введена последняя доза обработки и был взят образец крови, для того, чтобы можно было рассчитать концентрацию провоспалительных цитокинов, крыс умерщвляли. Простаты были полностью извлечены и взвешены. Относительную массу рассчитывали по следующей формуле:
После того как все предстательные железы были зафиксированы в 10%-ном растворе формалина, забуференном до нейтрального рН, каждая простата была разделена на срезы. На этом этапе образцы тканей были обезвожены и заключены в парафин. Срезы предстательной железы (толщиной 3-4 мм) окрашивали гематоксилин-эозином (HE), перйодной кислотой-реактивом Шиффа (PAS) и трихромным красителем по Массону. Каждый образец оценивали с гистопатологической точки зрения. Чтобы оценить повреждение клеток, эпителиальные ацинарные клетки были классифицированы на основе оценки, которая была назначена с использованием следующих критериев: столбчатая форма (2 балла), кубовидная форма (1 балл), форма, подобная плоскоклеточной (0 баллов) [1].
Для оценки присутствия воспаления назначали балл на основании наличия гистологических признаков воспаления: отека, кровоизлияния и инфильтрации лейкоцитов. Каждому из этих факторов присваивали балл от 0 до 3, в зависимости от его сущности (0 баллов = нет; 3 балла = максимум). Затем 3 балла были сложены вместе для количественного определения эффекта воспаления. Суммарные баллы менее 2 были классифицированы как легкое воспаление, баллы между 2 и 4 были классифицированы как умеренное воспаление, а баллы выше 5 были классифицированы как тяжелое воспаление [4].
Наконец, стало возможным определить пролиферацию стромы. Для этого все площади образцов и железистую область измеряли с помощью устройства для цифрового преобразования микрофотографий. Это позволило рассчитать коэффициент стромы [1].
ССЫЛКИ
[1] T. Kamijo, S. Sato, and T. Kitamura, “Effect of cernitin pollen-extract on experimental nonbacterial prostatitis in rats,” Prostate, vol. 49, no. 2, pp. 122-131, Oct. 2001.
[2] J.-W. Cho, K.-S. Lee, and C.-W. Kim, “Curcumin attenuates the expression of IL-1beta, IL-6, and TNF-alpha as well as cyclin and in TNF-alpha-treated HaCaT cells; NF-kappaB and MAPKs as potential upstream targets.,” Int. J. Mol. Med., vol. 19, no. 3, pp. 469-474, 2007.
[3] Q.-Y. Zhang, Z.-N. Mo, and X.-D. Liu, “[Reducing effect of curcumin on expressions of TNF-alpha, IL-6 and IL-8 in rats with chronic nonbacterial prostatitis].,” Zhonghua Nan Ke Xue, vol. 16, no. 1, pp. 84-8, Jan. 2010.
[4] K. E. Rippere-Lampe, M. Lang, H. Ceri, M. Olson, H. A. Lockman, and A. D. O'Brien, “Cytotoxic necrotizing factor type 1-positive Escherichia coli causes increased inflammation and tissue damage to the prostate in a rat prostatitis model,” Infect. Immun., vol. 69, no. 10, pp. 6515-6519, 2001.