ОПТИМИЗИРОВАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ L1 HPV45 В ДРОЖЖАХ
OPTIMISED EXPRESSION LI HPV45 IN YEAST

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится, главным образом, к лечению человека, зараженного вирусом папилломы (HPV). В частности, настоящее изобретение относится к синтетическим полинуклеотидам, кодирующим белок L1 HPV45, а также к рекомбинантным векторам и хозяевам, включающим указанные полинуклеотиды. Настоящее изобретение относится также к вирусоподобным частицам (VLP) HPV45, причем данные частицы образуются путем экспрессии рекомбинантных белков L1 или L1+L2 вируса HPV45 в дрожжевых клетках, и к их использованию в вакцинах и в фармацевтических композициях для профилактики и лечения больных HPV.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
смотрите
Int. J. Exp. Pathol.
in situ
J. Natl. Cancer Inst.
смотрите
J. Natl. Cancer Inst.
Существует свыше 80 типов вируса папилломы человека (HPV), многие из которых ассоциированы с большим числом биологических фенотипов, начиная с развивающихся доброкачественных бородавок до злокачественных карцином ( обзор McMurray и соавт., 82(1): 15-33 (2001)). HPV6 и HPV11 представляют собой типы вируса папиллом, чаще всего ассоциированные с доброкачественными бородавками и/или с незлокачественной кондиломой слизистых половых или дыхательных органов. HPV16 и HPV18 представляют собой типы папиллом повышенного риска, часто ассоциированные с -карциномами и с инвазивными карциномами шейки матки, влагалища, наружных женских половых органов и анального канала. Свыше 90% заболеваний рака шейки матки связаны с заражением вирусами HPV16, HPV18 или менее распространенными канцерогенными типами HPV31, -33, -45, -52 и -58 (Schiffman и соавт., 85(12): 958-64 (1993)). Наблюдение о том, что ДНК HPV детектируется более чем у 90% больных раком шейки матки, является веским эпидемиологическим свидетельством того, что многие типы HPV вызывают карциному шейки матки ( Bosch и соавт.,  87(11): 796-802 (1995)).
Вирусы папилломы представляют собой небольшие (50-60 нм), безоболочечные, икосаэдрические ДНК-вирусы, которые кодируются восемью ранними и двумя поздними генами. Открытые рамки считывания (ORF) вирусных геномов обозначают E1-E7, а также L1 и L2, где "E" означает ранний, а "L" означает поздний. L1 и L2 кодируют белки капсида вируса, а E-гены связаны с такими функциями, как репликация вируса и клеточная трансформация.
Белок L1 представляет собой главный белок капсида и обладает молекулярной массой 55-60 кДа. Белок L2 представляет собой минорный белок капсида. Иммунологические данные дают основание полагать, что бтльшая часть белка L2 находится в вирусном капсиде внутри белка L1. И белок L1, и белок L2 разных вирусов папилломы являются высококонсервативными.
смотрите
Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses
смотрите
J. Clin. Virol.
Экспрессия белка L1 или сочетания белков L1 и L2 в дрожжах, в клетках насекомых, клетках млекопитающих или бактериальных клетках приводит к самосборке вирусоподобных частиц (VLP) ( обзор Schiller and Roden, в ; Lacey, ed. Leeds, Великобритания: Leeds Medical Information, pp. 101-12 (1996)). VLP-частицы морфологически сходны с аутотентичными вирионами и при введении животному способны индуцировать высокие титры нейтрализующих антител. Поскольку VLP-частицы не содержат потенциально онкогенного вирусного генома, они представляют собой безопасную альтернативу использования живого вируса для создания HPV-вакцины ( обзор Schiller and Hidesheim, 19: 67-74 (2000)). По этой причине гены L1 и L2 были идентифицированы в качестве иммунологических мишеней при создании профилактической и терапевтической вакцин для HPV-инфекции и заболевания.
Созданию и организации поточного производства HPV-вакцины препятствовали трудности, связанные с получением высокого уровня экспрессии экзогенных генов в успешно трансформированных организмах-хозяевах, лимитирующих продукцию очищенного белка. Поэтому, несмотря на идентификацию нуклеотидных последовательностей дикого [немутантного] типа, кодирующих белки HPV L1, таких как HPV45 L1-белок, было бы весьма желательно создать легко возобновляемый источник неочищенного HPV L1-белка, который использует HPV45 L1-кодирующие нуклеотидные последовательности, оптимизированные для экспрессии в предполагаемой клетке-хозяине. Кроме того, было бы целесообразно получать большие количества VLP-частиц HPV45 L1, обладающих свойствами нативных белков вызывать иммунитет для использования в разработке вакцин.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композициям и к способам активизации или усиления иммунитета к белковым продуктам, экспрессируемым генами L1 HPV45, которые ассоциированы с раком шейки матки. В частности, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотиды, кодирующие белок L1 HPV45, причем данные полинуклеотиды были кодон-оптимизированы для высокоуровневой экспрессии в дрожжевой клетке. Настоящее изобретение обеспечивает также вирусоподобные частицы (VLP) HPV45, где указанные VLP-частицы получают путем экспрессии рекомбинантных L1 или L1+L2 HPV45 в дрожжевых клетках, а также раскрыто использование VLP-частиц HPV45 в фармацевтических композициях и в вакцинах для профилактики и/или лечения больных HPV-ассоциированной злокачественной опухолью.
Настоящее изобретение относится к синтетическим ДНК-молекулам, кодирующим белок L1 HPV45. Кодоны данных синтетических молекул сконструированы таким образом, чтобы использовать данные кодоны предпочтительно в дрожжевой клетке. Указанные синтетические молекулы можно использовать в качестве источника белка L1 HPV45, который может подвергаться самосборке в VLP-частицы. Указанные VLP-частицы можно использовать для создания вакцины на основе VLP.
Пример осуществления настоящего изобретения включает в себя синтетическую молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок L1 HPV45, представленный в SEQ ID NO:2, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:1.
Также обеспечиваются рекомбинантные векторы и рекомбинантные клетки-хозяева, как прокариотические, так и эукариотические, которые содержат молекулы нуклеиновой кислоты, раскрытые в данном описании.
Настоящее изобретение относится также к способу экспрессии белка L1 HPV45 в рекомбинантной клетке-хозяине, предусматривающему: (а) внедрение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок L1 HPV45, в дрожжевую клетку-хозяина; и (b) культивирование дрожжевой клетки-хозяина в условиях, которые делают возможным экспрессию указанного белка L1 HPV45.
Далее, настоящее изобретение относится к способу экспрессии белка L1 HPV45 в рекомбинантной клетке-хозяине, включающему в себя: (а) внедрение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок L1 HPV45, в дрожжевую клетку-хозяина; где молекула нуклеиновой кислоты является кодон-оптимизированной для оптимальной экспрессии в дрожжевой хозяйской клетке-хозяине; (b) культивирование данной дрожжевой клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию указанного белка L1 HPV45.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеотидов, представленную в виде SEQ ID NO:1 (R-последовательность L1 типа 45).
Настоящее изобретение относится также к вирусоподобным частицам (VLP) HPV, которые продуцируются в дрожжевых клетках, к способам получения VLP-частиц HPV45, и к способам использования VLP-частиц HPV45.
Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis
Schizosaccharomyces pombe
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения дрожжи выбраны из группы, состоящей из и .
Другой аспект настоящего изобретения составляет VLP-частицу HPV45, где VLP-частицу получают в результате рекомбинантной экспрессии L1 HPV45 или L1+L2 HPV45 в дрожжевой клетке.
Еще один аспект настоящего изобретения составляет VLP-частица HPV45, которая содержит белок L1 HPV45, кодируемый кодон-оптимизированным L1-геном HPV45. В примере осуществления данного аспекта настоящего изобретения кодон-оптимизированный L1-ген HPV45 включает в себя последовательность нуклеотидов, представленную SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение обеспечивает также способ индукции у животного иммунного ответа, предусматривающий введение данному животному вирусоподобных частиц HPV45. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения VLP-частицы HPV45 производят с помощью кодон-оптимизированного гена.
Еще один аспект настоящего изобретения составляет способ профилактики или лечения рака шейки матки, вызванного HPV, включающий в себя введение млекопитающему вакцины, содержащей VLP-частицы HPV45. В предпочтительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения
VLP-частицы HPV45 получают в дрожжах.
Настоящее изобретение относится также к вакцине, включающей вирусоподобные частицы (VLP) HPV45.
В альтернативном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения вакцина дополнительно содержит VLP-частицы, по меньшей мере, одного дополнительного типа HPV. По меньшей мере, один дополнительный тип HPV может представлять собой любой интересующий тип HPV, включая любой тип HPV, описанный в данной области техники, либо тип HPV, который можно было бы идентифицировать впоследствии. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения тип HPV представляет собой тип, который ассоциируется с таким клиническим фенотипом как бородавки, или рак шейки матки. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один тип HPV выбран из группы, состоящей из: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, и HPV68.
Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим вирусоподобные частицы HPV45. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим VPL-частицы HPV45, а также VLP-частицы одного из дополнительных типов HPV. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один дополнительный тип HPV выбран из группы, состоящей из: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 и HPV68.
Используемые в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число, за исключением особо оговоренных случаев.
В данном описании и в прилагаемой формуле изобретения применяют нижеследующие определения и сокращения.
Термин "промотор" относится к сайту узнавания в цепи ДНК, с которым связывается РНК-полимераза. Промотор образует с РНК-полимеразой инициирующий комплекс, который инициирует и направляет транскрипционную активность. Данный комплекс можно модифицировать с помощью активирующих последовательностей, именуемых "энхансерами", или "вышележащими активирующими последовательностями", либо с помощью ингибирующих последовательностей, именуемых "сайленсерами".
Термин "вектор" относится к тем средством, с помощью которых ДНК-фрагменты могут быть введены в организм хозяина или в ткань хозяина. Существуют разнообразные типы векторов, включая плазмиды, вирусы (в том числе аденовирусы), бактериофаги и космиды.
Определение "последовательность L1 дикого типа 45" относится к ДНК-последовательности L1 HPV45, раскрытой здесь в виде SEQ ID NO:3 (45 L1 wt). Несмотря на то что ДНК-последовательность L1 дикого типа HPV 45 была описана раньше, в препаратах ДНК клинических изолятов нередко обнаруживают незначительные изменения этой последовательности. Поэтому типичная ДНК-последовательность L1 дикого типа 45 выделена из клинических образцов, показывающих содержание ДНК HPV45 (смотрите ПРИМЕР 1). Эту последовательность L1 дикого типа 45 используют в качестве стандартной последовательности для сравнения раскрытых здесь кодон-оптимизированных последовательностей L1 45 (смотрите ФИГУРУ 1).
Обозначение "HPV 45 L1 R" или "45 L1 R" относится к раскрытой здесь типичной синтетической нуклеотидной последовательности L1 HPV45 (SEQ ID NO:1), причем данная последовательность была реконструирована таким образом, чтобы она включала кодоны, которые предпочтительны для высокоуровневой экспрессии в дрожжевой клетке.
Термин "эффективное количество" подразумевает введение достаточного количества вакцинной композиции для получения адекватного уровня соответствующего полипептида, вызывающего иммунную реакцию. Специалисту в данной области техники очевидно, что данный уровень может варьироваться.
"Консервативная аминокислотная замена" относится к замене одного аминокислотного остатка другим, химически сходным аминокислотным остатком. Примеры таких консервативных замен включают: замену одного гидрофобного остатка (изолейцин, лейцин, валин, или метионин) другим; замену одного полярного остатка другим полярным остатком с таким же зарядом (например, аргинин на лизин; глутаминовая кислота на аспарагиновую кислоту).
Термин "млекопитающее" относится к любому млекопитающему, включая человека.
"VLP-частица" или "VLP-частицы" подразумевает вирусоподобную частицу или вирусоподобные частицы.
Термин "синтетический" означает, что ген L1 HPV45 создан так, что он содержит последовательность нуклеотидов, которая отличается от последовательности нуклеотидов, представленной в указанном естественно встречаемом гене L1 дикого типа HPV45 (45 L1 wt, SEQ ID NO:3). Как указано выше, синтетические молекулы, приведенные здесь, включают последовательность нуклеотидов, содержащую кодоны, которые предпочтительны для экспрессии в дрожжевых клетках. Синтетические молекулы, приведенные здесь, кодируют ту же аминокислотную последовательность, что и аминокислотная последовательность гена L1 дикого [немутантного] типа HPV45 (SEQ ID NO:2).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На ФИГУРЕ 1 представлено выравнивание ДНК последовательностей, показывающая нуклеотиды, которые были изменены в синтетическом гене L1 HPV45 настоящего изобретения (SEQ ID NO:1, представленная в виде "45 L1 R") (смотрите ПРИМЕР 2). Стандартная последовательность представляет собой последовательность L1 дикого [немутантного] типа 45 (SEQ ID NO:3, представленная в виде "45 L1 wt"; смотрите ПРИМЕР 1). Измененные нуклеотиды указаны в их соответствующем местоположении. Количество нуклеотидов дано в скобках. Идентичные нуклеотиды в реконструированной последовательности L1 45 изображены с помощью точек.
На ФИГУРЕ 2 представлены реконструированная синтетическая нуклеотидная последовательность L1 HPV45 и соответствующая однокодоновая аминокислотная последовательность. Количество нуклеотидов указано слева.
На ФИГУРЕ 3 представлены результаты Нозерн-блотт-зондирования, специфичного для РНК L1 HPV45 в очень жестких условиях (смотрите ПРИМЕР 4). Дорожка (1) содержит 5 мкг РНК R L1 HPV45, а дорожка (2) содержит 10 мкг РНК R L1 HPV45. На полученном блотте виден единственный полноразмерный РНК-транскрипт. Стрелка слева указывает предсказанное положение полноразмерного L1-транскрипта HPV45.
На ФИГУРЕ 4 показан Вестерн-блотт L1 дикого типа 45 и трех R-изолятов L1 HPV45. Содержимое дорожек: 45 L1 wt (дорожка 1), 45 L1 R#4 (дорожка 2), 45 L1 R#7 (дорожка 3), 45 L1 R#11 (дорожка 4), контроль L1 HPV16 (дорожка 5). Дрожжевой экстракт, содержащий пятнадцать микрограмм тотального белка, вносят на каждую дорожку 10%-го SDS-ПААГ. Для специфической идентификации L1-белка HPV45 используют поликлональную антисыворотку козы против химерного белка L1 TrpE HPV45. Стрелка слева указывает положение 55 кДа-белка.
На ФИГУРЕ 5 частично представлены данные двух экспериментов ИФА в нг VLP/мкг общего белка (смотрите ПРИМЕР 7). Показано сравнение между wt L1 45 и R L1 45 двух отдельных клонов. Экспрессия реконструированной VLP L1 HPV45 оказывается примерно в 2 раза выше, чем L1 wt 45.
На ФИГУРЕ 6 представлен типичный образец VLP-частиц HPV45, составленный из белковых молекул R L1 HPV45, описанных здесь, которые визуализируют с помощью просвечивающей электронной микроскопии (смотрите ПРИМЕР 8). Подчеркнутое соответствует приблизительно 10 нм.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Большинство карцином шейки матки связано с инфицированием специфическими онкогенными типами вируса папилломы человека (HPV). Настоящее изобретение относится к композициям и к способам получения или усиления иммунитета по отношению к белковым продуктам, экспрессируемым генами онкогенных типов HPV.
В частности, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотиды, кодирующие белок L1 HPV45, который подвержен самосборке в вирусоподобные частицы (VLP) HPV45, а также раскрыто использование указанных полинуклеотидов и VLP-частиц в фармацевтических композициях и в вакцинах для профилактики и/или лечения HPV-ассоциированной злокачественной опухоли.
Curr. Top. Microbiol. Immunol.
Сообщается о нуклеотидной последовательности L1 дикого типа HPV45 (Инвентарный № в Genbank NC_001590; смотрите также Delius and Hofmann,  186:13-31 (1994)). Настоящее изобретение обеспечивает синтетические молекулы ДНК, кодирующие белок L1 HPV45. Синтетические молекулы настоящего изобретения включают в себя последовательность кодонов, в которой, по меньшей мере, часть кодонов была изменена для их использования в высокоуровневой экспрессии преимущественно в дрожжевых клетках. Данные синтетические молекулы можно использовать в виде кодирующей последовательности для экспрессии белка L1 HPV45, который может подвергаться самосборке в VLP-частицы. Указанные VLP-частицы можно использовать в вакцине, основанной на VLP, для создания эффективной иммунопрофилактики инфицирования вирусом папилломы с помощью нейтрализующих антител и клеточноопосредованного иммунитета.
Экспрессия VLP-частиц HPV45 в дрожжевых клетках дает преимущества, заключающиеся в рентабельности и легкой адаптации при масштабном выращивании в ферментерах. Вместе с тем, многие белки L1 HPV, в том числе и L1 HPV45, экспрессируются в дрожжевых клетках на уровне, который ниже желательного для масштабного коммерческого производства.
В соответствии с этим настоящее изобретение относится к последовательностям гена L1 HPV45, которые "оптимизируют" для достижения высокоуровневой экспрессии в среде дрожжевых клеток.
E. coli
E. coli
E. coli
Кодоновый "триплет" из четырех возможных нуклеотидных оснований может существовать более чем в 60 вариантных формах. Поскольку данные кодоны содержат информацию лишь для 20 разных аминокислот (а также для инициации транскрипции и терминации), некоторые аминокислоты могут кодироваться более чем одним кодоном, и это явление известно как вырожденность генетического кода. По не вполне понятным причинам альтернативные кодоны неодинаково представлены в эндогенных ДНК разных типов клеток. Очень похоже, что существует изменчивая естественная иерархия, или "предпочтение", для некоторых кодонов в некоторых типах клеток. В качестве примера, аминокислота лейцин задается любым из шести ДНК-кодонов, включая CTA, CTC, CTG, CTT, TTA и TTG. Всесторонний анализ частот использованных кодонов у микроорганизмов показал, что эндогенная ДНК  обычно содержит специфичный для лейцина CTG-кодон, тогда как ДНК дрожжей и слизевиков чаще всего включают специфичный для лейцина TTA-кодон. С учетом данной иерархии обычно полагают, что вероятность получения с помощью высокоуровневой экспрессии богатого лейцином полипептида до некоторой степени зависит от определенной частоты использования данного кодона. Например, возможно, что богатый TTA-кодонами ген будет недостаточно экспрессироваться в , а богатый CTG-кодонами ген будет, по-видимому, высокоэкспрессируемым в данном хозяине. Сходным образом, предпочтительным кодоном для экспрессии богатого лейцином полипептида в дрожжевых хозяйских клетках предполагается TTA.
Значение феномена кодонового предпочтения в технике рекомбинантных ДНК очевидно, и это явление может служить объяснением многих прежних неудач в достижении высокоуровневой экспрессии экзогенных генов у успешно трансформированных организмов-хозяев - менее "предпочтительный" кодон может быть повторно представлен во встроенном гене, и механизм экспрессии может действовать неэффективно. Наличие данного феномена означает, что синтетические гены, предназначенные для включения предпочтительных кодонов в предполагаемые клетки-хозяева, предусматривает придание оптимального вида чужеродному генетическому материалу для экспрессии рекомбинантного белка на практике. Следовательно, один из аспектов настоящего изобретения заключается в том, что ген L1 HPV45 является кодон-оптимизированным для высокоуровневой экспрессии в любой дрожжевой клетке. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выясняется, что использование альтернативных кодонов, кодирующих одну и ту же белковую последовательность, может исключить ограничения по экспрессии L1-белков HPV45 в дрожжевых клетках.
Saccharomyces cerevisiae
Yeast
В соответствии с настоящим изобретением сегменты гена L1 HPV45 конвертируют в последовательности, обладающие идентичными транслируемыми последовательностями, но с использованием альтернативного кодона, как это описано у Sharp и Cowe (Synonymous Codon Usage in .  7:657-678 (1991)), который включен здесь в качестве ссылки. Данная методика, как правило, состоит из идентифицикации кодонов в последовательности дикого [немутантного] типа, которые, в общем, не связаны с высокоэкспрессируемыми дрожжевыми генами, а также с их замещением на оптимальные кодоны для высокой экспрессии в дрожжевых клетках. Затем полученную новую генную последовательность проверяют на наличие нежелательных последовательностей, образованных в результате данных кодоновых замен (например, "ATTTA"-последовательностей, случайно созданных интронных сплайс-сайтов узнавания, нежелательных сайтов фермента рестрикции, высокого содержания GC, наличия сигналов терминации транскрипции, которые узнаются дрожжами, и т.д., и т.п.). Нежелательные последовательности элиминируют путем замены существующих кодонов другими, кодирующими ту же аминокислоту. Затем сегменты синтетического гена тестируют на улучшенную экспрессию.
Вышеописанные способы используют для создания сегментов синтетического гена L1 HPV45, с получением гена, содержащего кодоны, оптимизированные для высокоуровневой экспрессии в клеточной дрожжевой среде. Хотя вышеприведенная методика предполагает краткое изложение нашего метода по созданию кодон-оптимизированных генов для их использования в HPV-вакцинах, специалистам в данной области техники очевидно, что подобную вакцину для эффективной или повышенной экспрессии генов можно создать путем незначительных изменений данной методики или путем незначительных вариаций данной последовательности.
В соответствии с этим настоящее изобретение относится к синтетическому полинуклеотиду, включающему в себя последовательность нуклеотидов, кодирующую L1-белок HPV45, либо биологически активный фрагмент или мутантную форму L1-белка HPV45, полинуклеотидную последовательность, включающую кодоны, оптимизированные для экспрессии в дрожжевых клетках-хозяевах. Указанные мутантные формы белка L1 HPV45 включают, но не ограничиваются: замены консервативных аминокислот, аминоконцевые усечения, карбоксиконцевые усечения, делеции или добавки. Любой такой биологически активный фрагмент и/или мутант будет кодировать либо белок, либо белковый фрагмент, который, по меньшей мере, существенно имитирует иммунологические свойства белка L1 HPV45, представленнного в SEQ ID NO:2. Синтетические полинуклеотиды настоящего изобретения кодируют молекулы мРНК, которые экспрессируют функциональный белок L1 HPV45, пригодный для создания терапевтической или профилактической HPV-вакцины.
Один из аспектов настоящего изобретения представляет собой кодон-оптимизированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей белок L1 HPV45 и представленной SEQ ID NO:2, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, представленных SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение относится также к рекомбинантным векторам и к рекомбинантным клеткам-хозяевам, как прокариотическим, так и эукариотическим, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, раскрытые в данном описании.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual;
Current Protocols in Molecular Biology
Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual
Синтетическую ДНК HPV45 или ее фрагменты, сконструированные с помощью описанных здесь способов, можно рекомбинантно экспрессировать путем молекулярного клонирования в экспрессионный вектор, содержащий подходящий промотор и другие соответствующие элементы регуляции транскрипций, и затем перенести в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева для создания рекомбинантного L1 HPV45. Методы такой обработки полностью описаны у Sambrook и соавт. (Cold Spring Harbor, New York (1989); , Ausubel и соавт., Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York (1988); , Rose и соавт., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1990)), которые, тем самым, полностью включены здесь путем ссылки.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу экспрессии белка L1 HPV45 в рекомбинантной клетке-хозяине, включающему в себя: (а) введение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок L1 HPV45, в дрожжевую клетку-хозяина; и (b) культивирование данной дрожжевой клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию указанного белка L1 HPV45.
Настоящее изобретение относится также к способу экспрессии белка L1 HPV45 в рекомбинантной клетке-хозяине, включающему в себя: (а) введение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок L1 HPV45, в дрожжевую клетку-хозяина; причем указанная молекула нуклеиновой кислоты является кодон-оптимизированной для оптимальной экспрессии в данной дрожжевой клетке-хозяине; и (b) культивирование указанной дрожжевой клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию указанного белка L1 HPV45.
Настоящее изобретение относится также к способу экспрессии белка L1 HPV45 в рекомбинантной клетке-хозяине, включающему в себя: (а) введение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, представленную SEQ ID NO:1, в дрожжевую клетку-хозяина; и (b) культивирование данной дрожжевой клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию указанного белка L1 HPV45.
GAL1 S. cerevisiae
GAL10, GAL7, ADH1, TDH1
PGK-
ADH1
GAL1
ADH1
Синтетические гены настоящего изобретения могут быть собраны в экспрессионную кассету, которая включает в себя последовательности, предназначенные для обеспечения эффективной экспрессии белка L1 HPV45 в соответствующей клетке-хозяине. Кассета предпочтительно содержит синтетический ген с присоединенным к нему транскрипционными и трансляционными регуляторными последовательностями функционально связанными с ним, такими как промоторные последовательности, а также последовательности терминации. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный промотор представляет собой промотор , хотя специалистам в данной области техники известно, что можно использовать любой из ряда других известных дрожжевых промоторов, таких как илипромоторы, либо иных промоторов эукариотических генов. Предпочтительным терминатором транскрипции является терминатор , хотя можно использовать и другие известные терминаторы транскрипции. Особенно предпочтительным является сочетание промотора  и терминатора .
смотрите
Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses
Biophys. J.
Другой аспект настоящего изобретения касается вирусоподобной частицы (VLP) HPV45, получаемой с помощью рекомбинантной экспрессии в дрожжевой клетке генов L1 или L1+L2 HPV45, способов получения VLP-частиц HPV45, а также способов использования VLP-частиц HPV45. VLP-частицы могут образовываться путем самосборки в том случае, если L1, главный белок капсида вирусов папилломы человека и животных, экспрессируется в дрожжевых клетках, клетках насекомого, клетках млекопитающего или в бактериальных клетках (обзор Schiller and Roden, в ; Lacey, ed. Leeds, Великобритания: Leeds Medical Information, pp.101-12 (1996)). Морфологически неразличимые VLP-частицы можно также получить путем экспрессии сочетания капсидных белков L1 и L2. VLP-частицы L1 состоят из 72 пентамеров с икосаэдрической структурой T=7 (Baker и соавт., 60(6):1445-56 (1991)).
J. Virol.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
смотрите
J. Clin. Virol.
VLP-частицы морфологически сходны с аутентичными вирионами, и при введении животному способны индуцировать высокие титры нейтрализующих антител. Иммунизация кроликов (Breitburd и соавт.,  69(6):3959-63 (1995)) и собак (Surich и соавт., 92(25):11553-57 (1995)) с VLP-частицами показала индуцирование нейтрализующих антител и защиту от экспериментального заражения вирусом папилломы. Но, поскольку VLP-частицы не содержат потенциально онкогенного вирусного генома и могут подвергаться самосборке при экспрессии одного гена, они представляют безопасную альтернативу использования живого вируса для создания HPV-вакцины ( обзор Schiller and Hidesheim, 19:67-74 (2000)).
J. Med. Virol.
Marais и соавт. (60:331 (2000)) описывают VLP-частицы HPV45, которые были получены в клетках насекомых с гена L1 HPV45, экспрессируемого из бакуловируса. Экспрессия VLP-частиц в клетках насекомых не имеет преимущества при создании вакцины из-за высокой стоимости. Кроме того, зачастую трудно наладить масштабную экспрессию генов L1 HPV45 в культуре клеток насекомых с получением больших объемов, необходимых для создания коммерческого продукта. Получение VLP-частиц HPV45 в дрожжевых клетках ранее не было описано. Экспрессия VLP-частиц HPV в дрожжевых клетках дает преимущества в рентабельности и легко применима для масштабированного выращивания клеток в ферментерах. Помимо этого, дрожжевой геном можно легко изменить, что обеспечивает селекцию рекомбинантов, получение дрожжей с усиленным ростом и экспрессионным потенциалом.
Таким образом, настоящее изобретение относится к вирусоподобным частицам, включающим рекомбинантный белок L1 или рекомбинантные белки L1+L2 HPV45, где данный рекомбинантный белок экспрессируется в дрожжевой клетке.
Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis
Schizosaccharomyces pombe
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения VLP-частицы HPV45 получают путем экспрессии L1 HPV45 или L1+L2 HPV45 в дрожжах, выбранных из группы, состоящей из: и .
Следующий аспект настоящего изобретения касается VLP HPV45, которые включают в себя белок L1 HPV45, производимый путем экспрессии кодон-оптимизированного гена L1 HPV45. В предпочтительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения кодон-оптимизированный ген L1 HPV45 включает в себя последовательность нуклеотидов, представленную SEQ ID NO:1.
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой способ получения VLP-частиц HPV45, включающий в себя: (а) трансформацию дрожжей с помощью рекомбинантной ДНК-молекулы, кодирующей белок L1 HPV45 или белки L1+L2 HPV45; (b) культивирование трансформированных таким образом дрожжей в условиях, которые делают возможными экспрессию рекомбинантной ДНК-молекулы для получения рекомбинантного белка HPV45; и (с) вытделение рекомбинантного белка HPV45 и получение VLP-частиц HPV45.
В предпочтительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения соответствующие дрожжи трансформируют кодон-оптимизированным геном L1 HPV45 для получения VLP-частиц HPV45. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения кодон-оптимизированный ген L1 HPV45 включает в себя последовательность нуклеотидов, представленную SEQ ID NO:1.
Настоящее изобретение обеспечивает также способ индукции у животного иммунной реакции, предусматривающий введение данному животному вирусоподобных частиц HPV45. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данные VLP-частицы HPV45 получают с помощью кодон-оптимизированного гена.
Еще один аспект настоящего изобретения касается способа профилактики заболевания или лечения пациента с HPV-ассоциированным раком шейки матки, включающего в себя введение млекопитающему вакцины, содержащей VLP-частицы HPV45. В предпочтительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения VLP-частицы HPV45 получают в дрожжах.
Настоящее изобретение относится также к вакцине, содержащей вирусоподобные частицы (VLP) HPV45.
В альтернативном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения указанная вакцина дополнительно включает VLP-частицы, по меньшей мере, одного дополнительного HPV-типа. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один указанный дополнительный HPV-тип выбран из группы, состоящей из: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 и HPV68.
В предпочтительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения указанная вакцина дополнительно содержит VLP-частицы HPV16.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная вакцина дополнительно содержит VLP-частицы HPV16 и VLP-частицы HPB18.
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная вакцина дополнительно содержит VLP-частицы HPV6, VLP-частицы HPV11, VLP-частицы HPV16 и VLP-частицы HPV18.
Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, включающим в себя вирусоподобные частицы HPV45. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим в себя VLP-частицы HPV45 и VLP-частицы, по меньшей мере, одного дополнительно HPV-типа. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один дополнительный HPV-тип выбран из группы, состоящей из: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 и HPV68.
Вакцинные композиции настоящего изобретения могут использоваться поодиночке в соответствующих дозах, установленных при рутинном тестировании для того, чтобы получить оптимальное подавление HPV45-инфекции, а также минимизировать любую потенциальную токсичность. Кроме того, может быть желательно также совместное или последовательное введение иных агентов.
Количество вирусоподобных частиц, которое вводят в вакцину для реципиента, зависит от иммуногенности экспрессируемого генного продукта. В большинстве случаев в мышечную ткань непосредственно вводят иммунологически или профилактически эффективную дозу около 10-100 мкг, и предпочтительно прямо в мышечную ткань вводят около 20-60 мкг VLP-частиц. Предполагаются также подкожная инъекция, внутрикожное введение, чрескожное воздействие и иные способы введения, такие как внутрибрюшинное, внутривенное или путем ингаляции. Предполагается также создание активных прививок. Преимуществом является также парентеральное введение, такое как внутривенное, внутримышечное, подкожное или иные способы введения с адъювантами, такими как квасцы или адъювант фосфат алюминия Merck, одновременно или с последующим парентеральным введением вакцины настоящего изобретения.
Все указанные здесь публикации включены в качестве ссылки с целью описания и раскрытия методов и материалов, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. Ничего из того, что здесь рассмотрено в качестве допущения, не дает права настоящему изобретению датировать такое раскрытие задним числом на основании предшествующего изобретения.
Описав предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения со ссылкой на прилагаемые чертежи, следует иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничивается определенными вариантами его осуществления, и что специалистом в данной области техники могут быть осуществлены различные изменения и модификации, не выходящие за рамки объема или существа настоящего изобретения, которые определены в прилагаемой формуле изобретения.
Нижеследующие примеры иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение.
ПРИМЕР 1
Определение типичной L1-последовательности HPV45.
смотрите
Curr. Top. Microbiol. Immunol.
Taq-
E. coli
F L1 HPV45
B L1 HPV45
L1-последовательность HPV45 описана раньше (№ по каталогу в Genbank NC_001590;  Delius and Hofmann 186:13-31 (1994)). Вместе с тем, нередко в полученных клинических изолятах среди молекул ДНК обнаруживают небольшие вариации последовательности. Для определения типичной последовательности L1 дикого типа HPV45 выделяли ДНК из четырех клинических образцов, в которых ранее показано наличие ДНК HPV45. Последовательности L1 HPV45 амплифицировали в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ДНК полимеразы и следующих праймеров:  5'-CCACCACCACCTATATAGGTATTC-3' (SEQ ID NO:4) и  5'-CAAACATACATATATGTGCTAACA-3' (SEQ ID NO:5). Полученные амплифицированные продукты разделяли с помощью электрофореза в агарозных гелях и визуализировали путем окрашивания бромистым этидием. Из геля вырезали полосы L1 размером около 1500 п.н. и ДНК выделяли с использованием набора QUA для быстрого выделения очисткой продуктов ПЦР (Qiagen, Hilden, Германия). Затем выделенную ДНК лигировали с TA-клонирующим вектором (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), трансформировали с помощью данной лигирующей смеси, высевали на LB-агар с ампициллином, ИПТГ и X-gal для отбора голубых/бесцветных колоний. Засеянные чашки опрокидывали и инкубировали в течение 16 часов при 37°С.
ПЦР колоний осуществляли на восьми бесцветных колониях, происходящих от каждого из четырех клинических изолятов, которые были подвергнуты ПЦР-амплификации. ДНК L1 HPV45 подвергали ПЦР-амплификации с использованием праймеров F L1 HPV45 и B L1 HPV45. Конкретный ПЦР-протокол состоял из 25 циклов по 15 секунд при 98°С (денатурация), 30 секунд при 50°С (отжиг) и 2-х минут при 68°С (удлинение). ПЦР-продукты после гель-электрофореза визуализировали путем окрашивания бромистым этидием. Некоторые колонии каждого изолята содержали L1-полосы. Вторую колонию каждого изолята культивировали в LB-среде с ампициллином, встряхивая при 37°С в течение 16 часов. Из каждой такой колонии осуществляли минипрепаративное экстрагирование плазмидной ДНК.
ДНК-секвенирование осуществляли на плазмидах, содержащих амплифицированную и клонированную ДНК L1 HPV45 из четырех клинических изолятов. ДНК и транслируемые аминокислотные последовательности сравнивали друг с другом и с L1-последовательностями HPV45 из Genbank. Анализ последовательностей из четырех клинических изолятов обнаружил, что ни одна из последовательностей не идентична последовательности из Genbank. Плазмида L1 HPV45 из изолята №33 была выбрана для представления последовательности дикого типа (wt) L1 45 и приводится здесь в качестве "последовательности дикого типа L1 45" (SEQ ID NO:3, смотрите ФИГУРУ 1). Данная последовательность содержит девять нуклеотидов, три аминокислоты, делецию, которая сохраняет открытую рамку считывания последующей последовательности, пять точковых мутаций, дающих изменения в пяти аминокислотах, и восемь дополнительных молчащих точковых мутаций. В последовательности L1 wt 45 аминокислоты 495-497, характерные для Genbank последовательности, делетированы. Номера аминокислот из Genbank 23 (S->N), 55 (N->S), 303 (I->T), 357 (S->N), и 356 (Q->H) соответствуют пяти аминокислотным заменам (Genbank aa->45 L1 wt aa). Указанные 8 молчащих мутаций распределены по всей данной последовательности. Смотрите ФИГУРУ 1.
LS-112
EAS L1 HPV45
Bgl
Vent
Bgl
Bgl
Bam
Virology
E. coli
Pst
Eco
Hind
Последовательность L1 45 дикого типа амплифицировали с использованием праймеров  5'-CTCAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGAC-2' (SEQ ID NO:6) и  5'-GACAGATCTTATTTTTTACTACGTATACGTACACG-3' (SEQ ID NO:7) с добавлением II-удлинений. ПЦР осуществляли с использованием -полимеразы. Амплифицированный ПЦР-продукт визуализировали, окрашивая агарозный гель бромистым этидием. Вырезали полосу размером около 1500 п.н. и выделяли очисткой ДНК с использованием гель-экстрагирующего набора QIAEX II (Qiagen). Экстрагированный ПЦР-продукт обрабатывали с помощью II при 37°С в течение 2 часов и выделяют очисткой с использованием набора QIA для быстрого выделения очисткой продукта ПЦР. Обработанный с помощью II ПЦР-продукт L1 HPV45 лигировали с HI-обработанной pGAL110 (как описано у Hofmann и соавт.,  209:506-18 (1995)) и с помощью данной лигирующей смеси трансформировали штамм DH5 .Колонии подвергали скринингу с помощью ПЦР на наличие вставки L1 HPV45 в правильной ориентации. Последовательность нуклеотидов и ориентацию подтверждали с помощью ДНК-секвенирования. Отобранный клон получал название pGAL110-HPV 45 L1 #6. Данный клон обрабатывали с помощью I, RI и III, чтобы определить профиль рестрикциионного фрагмента гена L1 HPV45 в векторе pGAL110. ДНК-фрагменты подвергали электрофорезу в агарозных гелях. Полученный профиль рестрикционных фрагментов визуализировали путем окрашивания бромистым этидием и просматривали под УФ-светом.
Saccharomyces cerevisiae
Готовили maxiprep ДНК. Клетки  делали компетентными, превращая их в сферопласты с помощью Glusulase, и трансформировали с помощью pGAL110-HPV 45 L1 #6. Смесь для трансформации дрожжей наслаивали на поверхность агара с Leu(-)-сорбитом в чашках с Leu(-)-сорбитом и инкубировали их в перевернутом состоянии в течение 5-7 дней при 30°С. Колонии отбирали и высевали штрихом для выделения клонов на Leu(-)-сорбитных чашках. Выделенные колонии последовательно выращивали при 30°С во вращающихся культуральных пробирках, содержащих по 5 мл 5Х Leu(-) Ade(-)-сорбита с 1,6% глюкозы и 4% галактозы, чтобы индуцировать транскрипцию L1 и экспрессию белка.
ПРИМЕР 2
Кодон-оптимизация дрожжей.
Saccharomyces cerevisiae
Описаны предпочтительные кодоны дрожжей (Sharp, Paul M. and Cowe, Elizabeth 1991 Synonymous Codon Usage in YEAST 7:657-678). Обнаружена экспрессия белка L1 wt HPV45; однако для получения повышенной экспрессии, необходимой для создания коммерческого продукта, ген L1 HPV45 реконструировали с использованием кодонов, предпочтительных для дрожжей. Указанная реконструировали последовательность должна обеспечить повышенную экспрессию L1 HPV45, что было бы шагом вперед по использованию последовательности дикого типа в создании вакцины. Если данную последовательность реконструировать с использованием оптимизированных дрожжевых кодоновых последовательностей, то нуклеотидная последовательность L1 wt 45 окажется измененной по 392 позициям с образованием R L1 45 (R=реконструировать). Тем не менее, соответствующая аминокислотная последовательность не изменится. Указанные нуклеотидная (SEQ ID NO:1) и аминокислотная (SEQ ID NO:2) последовательности представлены на ФИГУРЕ 2.
Pfu
Способ реконструкции данного гена использовали для создания обширного перекрывания смыслового и антисмыслового олигомеров, чтобы охватить данный ген, заменяя нуклеотиды на предпочтительные дрожжевые кодоновые последовательности при сохранении исходной аминокислотной последовательности. Данные олигомеры использовали вместо ДНК-матрицы в технике ПЦР. Создавали дополнительные амплификационные праймеры и использовали для амплификации реконструированных последовательностей с данной матрицы олигомеров. В ПЦР из 25 циклов использовали -ДНК-полимеразу.
Оптимальными для амплификации являлись специфичные условия для каждого участка, однако более употребима следующая программа: 94°С в течение 5 минут (денатурирующих) с последующими 25 циклами при 95°С в течение 30 сек (денатурация), 55-50°С в течение 30 сек (отжиг), и 72°С в течение 1,5 минут (удлинение), с последующим окончательным удлинением в течение 7 минут при 72°С и выдерживания при 4°С. ПЦР-продукты исследовали с помощью электрофореза в агарозном геле. Полосы соответствующего размера вырезали и из них выделяли очисткой ДНК. Полученные амплифицированные фрагменты использовали затем в качестве матрицы для сборки реконструированного гена L1 HPV45 длиной 1533 п.н..
E. coli
Bam
Bam
Bam
E. coli
После реконструирования электрофорезированную полосу размером 1533 п.н. выделяли из геля очисткой, лигировали с pCR4 Blunt (Invitrogen) и TOP10-клетки трансформировали с помощью данной лигирующей смеси. Колонии растили в 4 мл LB с ампициллином, а плазмидную ДНК экстрагировали с помощью стандартных минипрепаративных методов. Экстрагированную плазмидную ДНК секвенировали, чтобы подтвердить наличие требуемых изменений в реконструированной L1 45. Указанную R (реконструированную) последовательность L1 45 реамплифицировали из pCR4Blunt-45 L1 R с добавленными HI-удлинениями по обоим концам и добавленной дрожжевой 5'-нетранслируемой лидерной последовательностью слева от ATG-кодона инициации. Полученный амплифицированный фрагмент клонировали, как указано выше, а плазмидную ДНК секвенировали. Данную плазмиду, pCR4 Blunt-45 L1 R (Bam), обрабатывали с помощью HI и ДНК-фрагменты подвергали электрофорезу в агарозном геле. Из геля выделяли очисткой фрагмент L1 R (Bam) 45 размером приблизительно 1550 п.н., лигировали его с HI-обработанной pGAL110 и трансформировали в TOP10F'  (Invitrogen).
S. cerevisiae
600
С помощью ПЦР скринировали колонии на наличие вставки R L1 HPV45 в правильной ориентации в pGAL110. Последовательность нуклеотидов и ориентацию подтверждали с помощью ДНК-секвенирования. Готовили maxiprep плазмидной ДНК и использовали его для трансформации клеток , которые были преобразованы в компетентные путем превращения в сферопласты. Трансформируемые дрожжи помещали сверху на Leu(-)-сорбитный агар в чашках с Leu(-)-сорбитом, которые инкубировали в перевернутом состоянии в течение 7 дней. Колонии сеяли штрихом в Leu(-)-сорбитные чашки для выделения клонов. Выделенные колонии последовательно растили при 30°С во вращающихся культуральных пробирках, содержащих по 5 мл 5X Leu(-)Ade(-)-сорбита с 1,6% глюкозы и 4% галактозы, чтобы индуцировать транскрипцию L1 и экспрессию белка. Через 48 часов объем культуры, эквивалентный ОП=10, осаждали, удаляли супернатант, а полученный осадок замораживали и хранили при -70°С.
ПРИМЕР 3
Получение РНК.
260
260/280
Осадок клеток трансформированных дрожжей, индуцированных для экспрессии L1 HPV45 в результате галактозной индукции, оттаивали на льду, суспендировали в 0,8 мл реактива Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. В данную пробирку приливали одну пятую объема хлороформа. Затем содержимое пробирки энергично встряхивали в течение 15 секунд для перемешивания и инкубировали при комнатной температуре в течение 3-х минут. После 5 минут центрифугирования при 13 тыс. об/мин собирали верхнюю фазу и переносили ее в новую пробирку. Приливали 0,4 мл изопропанола и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Центрифугирование до получения осадка РНК осуществляли при 13 тыс. об/мин в течение 10 минут. Образовавшийся супернатант сливали, оставшийся осадок РНК промывали 75%-ным EtOH и повторяли центрифугирование. Данный супернатант сливали, а осадок РНК сушили на воздухе в течение 15 минут и затем суспендировали его в воде, не содержащей РНКазы. Для определения концентрации РНК в данном образце его спектрофотометрировали, допуская, что считывание РНК при А дает 1=40 мкг/мл, при том, что А составляет 1,7-2,0.
ПРИМЕР 4
Нозерн-блотт-анализ.
Готовили 1,1%-ный агарозный гель с формальдегидом. Пять или десять микрограмм РНК объединяли с денатурирующим буфером (конечные концентрации: формальдегид - 6%, формамид - 50%, и 0,1 х MOPS) и в течение 10 минут нагревали до 65°С. К образцу добавляли одну десятую объема гелевого буфера и данный образец вносили в гель для электрофореза. Электрофорез осуществляли при напряжении 75 вольт в 1 х MOPS-буфере в течение приблизительно 3-х часов. Электрофорезированный гель промывают в 10 х SSC в течение 60 минут.
Электрофорезированную РНК капиллярно переносили на нейлоновую мембрану Hybond-N+ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) в 10 х SSC в течение свыше 16 часов. Затем перенесенную РНК фиксировали на нейлоновой мембране путем сшивки с использованием сшивки Stratagene UV-Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA). После фиксации данную нейлоновую мембрану сушили на воздухе.
Для мечения ДНК-последовательностей R L1 45 с помощью DIG, которые использовали в качестве зонда для детектирования РНК R L1 45 в Нозерн-блотте, применяли Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Kit I (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Швейцария). Прегибридизацию, гибридизацию и иммунологическое выявление с использованием конъюгированных с щелочной фосфатазой антител против DIG осуществляли по рекомендациям производителя. Вкратце, данный блотт прегибридизовали при 37°С в течение 30 минут при плавном покачивании. Зонд денатурировали путем нагревания до 95°С в течение 5 минут и резко охлаждали на льду. Охлажденный зонд вводили в раствор для гибридизации и наносили на данную мембрану в течение 4-х часов при 44,6°С при плавном покачивании. Затем раствор для гибридизации удаляли и данный блотт дважды отмывали в течение 5 минут в 2 х SSC с 0,1% SDS при комнатной температуре с последующей дополнительной отмывкой при 65°С с помощью 0,5 х SSC и 0,1% SDS. После этого отмытый блотт блокировали в течение 30 минут и на 30 минут наносили конъюгированные с щелочной фосфатазой антитела против DIG в разведении 1:5000. Полученный блотт отмывали, а присутствие фиксированного с РНК зонда определяли по NBT/BCIP-субстратной детекции щелочной фосфатазы, конъюгированной со связанными против DIG антителами.
Первоначальный анализ дрожжей, экспрессирующих wt L1 45, подтверждает существование функциональной транскрипции и трансляции L1 HPV45; однако данная последовательность, реконструированная с помощью дрожжевых предпочтительных кодоновых последовательностей для получения повышенного уровня экспрессии, пригодна для создания вакцины. Реконструированную последовательность L1 45 создавали, чтобы исключить вероятность появления любого раннего сайта терминации транскрипции и обеспечить устойчивую транскрипцию. Нозерн-блотт-анализ транскрипта R L1 45 показал образование полноразмерных транскриптов (ФИГУРА 3).
ПРИМЕР 5
Экспрессия белка L1 HPV45.
600
2
4
Замороженные осадки индуцируемых галактозой культур дрожжевых клеток, эквивалентные ОП=10, оттаивали на льду и суспендировали в 300 мкл PC-буфера (100 мМ NaHPO и 0,5 М NaCl, рН 7,0) с 2 мМ PMSF. Добавляли промытые кислотой стеклянные шарики размером 0,5 мм. Содержимое пробирок подвергали турбулизации в течение 3-х циклов по 5 минут при 4°С с интервалом в 1 минуту. Приливали 7,5 мкл 20%-го Тритона Х100 и турбулизацию повторяли в течение 5 минут. Затем эти пробирки помещают на лед на 15 минут, после чего их центрифугировали в течение 10 минут при 4°С. Полученный супернатант переносили в стерильную микроцентрифужную пробирку, регистрировали в качестве тотального экстракта дрожжевого белка, датировали и хранили при -70°С.
ПРИМЕР 6
Вестерн-блотт-анализ.
Тотальный экстракт дрожжевого белка из двадцати выделенных дрожжевых колоний, каждая из которых содержит конструкт L1 45, анализировали с помощью Вестерн-блотт для подтверждения экспрессии белка L1 45 после индукции галактозой.
Десять микрограмм дрожжевого белка из тотального экстракта объединяли с SDS-ПААГ-буфером для внесения образца и нагревали до 95°С в течение 10 минут. Данный белок вносили в SDS-ПААГ-гель и подвергали электрофорезу в трис-глициновом буфере. После электрофоретического разделения белки подвергали Вестерн-переносу из данного геля на нитроцеллюлозу и этот блотт блокировали в 1 х разбавленном буфере (Kirkegaard and Perry Laboratories) в течение 1 часа при комнатной температуре с покачиванием. Полученный блотт отмывали три раза и затем инкубировали с козьей анти-trpE-HPV 45 L1-сывороткой в разведении 1:2500 при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем блотт отмывали три раза и инкубировали в течение 1 часа с анти-козьими-HRP-конъюгированными антителами, разбавленными 1:2500. Полученный блотт вновь отмывали три раза и наслаивали NBT/BCIP-детектирующий субстрат (Kirkegaard and Perry Laboratories). Иммунореактивные белки детектировались на блоте в виде пурпурных полос.
Полученные результаты свидетельствуют, что во всех случаях белок L1 45 детектируется на используемой нитроцеллюлозе в виде отчетливой иммунореактивной полосы, соответствующей приблизительно 57 кДа (ФИГУРА 4). Белок L1 16, который равен приблизительно 55 кДа, был включен в качестве позитивного контроля, наряду с экстрактом тотального дрожжевого белка, не содержащего L1 HPV, включенного в качестве негативного контроля (данные не представлены).
ПРИМЕР 7
ИФА-анализ.
Дрожжевые клетки, экспрессирующие L1 HPV45, выращивали различными способами, включая культивирование во вращающихся пробирках, в колбах со встряхиванием и в ферментерах. Выращенные дрожжи лизировали, а полученные белковые экстракты использовали для определения количества вирусоподобных частиц (VLP) L1 HPV45, образуемых на микрограмм тотального белка. Демонстрацию экспрессии VLP L1 HPV45 осуществляли с использованием сэндвич-ИФА.
Моноклональные антитела (mAb) H18R.5, которые распознают оба типа L1 VLPs HPV - тип 18 и 45, использовали для связывания VLP-частиц L1 тип 45, обнаруживаемых в дрожжевых белковых экстрактах. Несвязавшиеся белки отмывали, а H45.10B11.A5, VLP L 1 HVP45-типа и конформационные специфичные mAb использовали в качестве детекционных антител. Действительно, конформационно правильные VLP-частицы L1 45 оказывались связанными, и детекцию облегчало использование конъюгированных с HRP антител против IgG1 мыши и TMB-субстрат.
2
4
В частности, H18R.5 использовали для покрытия дна 96-луночных планшет Immulon 4 HBX в течение ночи при 4°С. Данные планшеты промывали три раза с помощью PBS и 0,005%-ным Твином 20, с последующим блокированием с помощью блокирующего раствора (PBS+0,05% Твин 20+1% BSA). Эти планшеты отмывали три раза и антигены (тотальные дрожжевые клеточные лизаты разбавляли в блокирующем растворе до 100 мкг/мл) наносили в ряд А в повторе. Стандартные образцы выделенных очисткой VLP-частиц L1 HPV45 наносили в ряд А колонок 1 и 2 при 3300 нг/мл по 100 мкг/мл тотального дрожжевого белка. Затем стандартный и опытный образцы последовательно разбавляли в два раза в каждой колонке. Через три часа при комнатной температуре избыток антигена удаляли отсасыванием, и данные планшеты промывали 3 раза. Клеточный супернатант, содержащий VLP L1 HPV45 и конформационные специфичные антитела mAb H45.10B11.A5, разбавляли 1:80 в блокирующем растворе и наслаивали в каждую лунку в течение одного часа при комнатной температуре. Данные планшеты промывали три раза и конъюгированные с HRP антитела к IgG1 мыши, разбавленные 1:8000 в блокирующем растворе, наслаивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты промывали и наносили TMB (Pierce) на 5 минут для детектирования комплексов конъюгированных с HRP антител. Реакцию детектирования останавливали добавлением 2М HSO. Планшеты прочитывали при длине волны 450 нм, а концентрацию VLP L1 HPV45, в нг VLP/мкг тотального белка, определяли путем сравнения со стандартными образцами.
Сравнение между wt L1 45 и двумя отдельными клонами R L1 45, проанализированные все в двух повторах, представлено на ФИГУРЕ 5. Экспрессия реконструированной VLP L1 HPV45 оказывается приблизительно в 2 раза выше результатов, полученных для wt L1 45 (ФИГУРА 6).
ПРИМЕР 8
Просвечивающая Электронная Микроскопия.
Чтобы продемонстрировать, что белок L1 45 в действительности подвержен самосборке с образованием пентамерных-L1 капсомеров, которые, в свою очередь, подвергаются самосборке в вирусоподобные частицы, частично выделенный очисткой из экстракта белок R L1 45 анализировали с помощью просвечивающей ЭМ.
Дрожжевые клетки выращивали в условиях ферментации в небольшом масштабе, осаждали и полученный осадок подвергали обработке по выделению очисткой. Осадок и очищенные дрожжевые экстракты анализировали с помощью иммуноблота, чтобы продемонстрировать экспрессию белка L1 и степень очистки после выделения очисткой. Затем очищенные дрожжевые экстракты подвергали центрифугированию через 45%-ную сахарозную подушку, а полученный осадок ресуспендировали в буфере для анализа с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ЭМ).
Полученный типичный образец VLPs R L1 45 представлен на ФИГУРЕ 6. Диаметр полученных сферических частиц в данном неочищенном образце колеблется в диапазоне от 40 до 60 нм, и некоторые частицы проявляют правильное расположение капсомеров.