СИНТЕТИЧЕСКИЙ АНАЛОГ ПРИРОДНОГО ПЕПТИДНОГО АНАЛЬГЕТИКА ЭНКЕФАЛИНА, ОБЛАДАЮЩИЙ ПОВЫШЕННЫМ И ПРОЛОНГИРОВАННЫМ АНЕСТЕЗИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ
SYNTHETIC ANALOGUE OF NATURAL PEPTIDE ANALGESIC OF ENKEPHALIN WITH HIGHER AND PROLONGED ANESTHETIC EFFECT

Изобретение относится к области биологии, фармакологии, ориентированной на применение синтетических пептидов в медицинских целях (лекарственные пептиды, therapeutic peptides).
Мет-энкефалин (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met) и Leu-энкефалин (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu) являются природными пептидными нейромедиаторами, взаимодействующими с опиоидными рецепторами. Одним из проявлений такого взаимодействия является снижение (притупление) болевых ощущений (анестезия) и снятие судорог. Попытки стимулировать этот эффект путем введения энкефалина извне оказались малоэффективными из-за неблагоприятной фармакинетики: быстрого разрушения пептида под действием пептидаз, локализованных на внешней поверхности нейронов.
2
Ранее уже предпринимались попытки модификации синтетического аналога энкефалина (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met), заключавшейся в замене 1-го глицина на D-аланин (DAla), а С-концевой карбоксильной группы - на амид: (Tyr-DAla-Gly-Phe-MetNH). При внесении в мозг экспериментальных животных (крыса) эта модификация энкефалина оказала пролонгированное анестезирующее действие (до двух часов) [1], [2].
1. Pert СВ, Pert A, Chang JK, Fong ВТ (1976) (D-Ala 2)-Met-enkephalinamide: a potent, long-lasting synthetic pentapeptide analgesic. Science, 194, 330-332.
2. Katsuura G, Inouye K, Itoh S, Hsiao S. (1984) Analgesic effects of enkephalin analogs in rats. Life Sci., 35, 815-818.
Следует отметить, что D-аланин, входящий в состав указанной модификации, является чужеродным для млекопитающих. Высвобождаясь при пусть и задержанном гидролизе (разрушении) пептида, D-аланин может оказаться токсичным (как конкурентный ингибитор при синтезе белков и др.). Этим можно объяснить отсутствие позднейших публикаций в данном направлении
Другая группа исследователей замкнула молекулу энкефалина в кольцо. С этой целью на 2-ю позицию (вместо 1-го глицина) помещают аминокислоту, в боковом радикале которой присутствует аминогруппа (была использована γ-аминомасляная кислота с внесенной аминогруппой). Эта аминогруппа вместе с концевой карбоксильной группой замыкала молекулу в кольцо, оставляя тирозин (1-я позиция) снаружи (вне кольца).
Закольцованный таким способом энкефалин проявил устойчивость к внеклеточным пептидазам мозга, и в опытах с животными обнаружил продление (по сравнению с обычным энкефалином) биологической (анестезирующей) активности не менее чем на 1 час.
(DiMaio J, Schiller PW (1980) A cyclic enkephalin analog with high in vitro opiate activity. Proc Natl Acad Sci USA, 77, 7162-7166 [3];
1
(Touati-Jallabe Y, Bojnik E, Legrand B,  E, Chung NN, Schiller PW, Benyhe S, Averlant-Petit MC, Martinez J, Hernandez JF (2013) Cyclic enkephalins with a diversely substituted guanidine bridge or a thiourea bridge: synthesis, biological and structural evaluations. J Med Chem, 56, 5964-5973 [4];
Stefanucci A, Novellino E, Mirzaie S, Macedonio G, Pieretti S, Minosi P,  E, Erdei AI,  F, Benyhe S, Mollica A (2017) Opioid Receptor Activity and Analgesic Potency of DPDPE Peptide Analogues Containing a Xylene Bridge. ACS Med Chem Lett, 8, 449-454 [5]).
Слабым звеном в этой конструкции является находящийся вне кольца N-концевой тирозин, который может отщепляться присутствующими в мозге ферментами (аминопептидазами). Потерявшая биологическую активность кольцевая структура может быть очень стабильной и будет накапливаться в мозге как ненужный, а скорее, вредный шлак. Процедура получения закольцованной формы энкефалина технологически сложная. К синтезу модернизированного пептида добавляются этапы образования кольцевой структуры и ее очистки. При этом неизбежны и значительные потери [5].
Ранее в мозге млекопитающих авторами настоящей заявки была обнаружена группа низкоспецифичных пептидаз, локализованных на поверхности аксонных окончаний нейронов. Они являются наиболее вероятными исполнителями функции катаболизма широкого круга нейропептидов. Эта функция является необходимой для контроля количества секретируемых клетками (эндогенных) нейропептидов, но эти же пептидазы способны разрушить вносимые в мозг (экзогенные) лекарственные пептиды. Наши исследования впервые показали, что принадлежащие указанной группе аминопептидаза и карбоксипептидаза, деградирующие пептиды, соответственно, с N- и С-конца, не способны нарушить пептидную связь, в которой участвует бета-аланин (βAla) [6]. (Neurochem Res. 2016, Jun 27. [Epub ahead of print] PMID:27350576 http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11064-016-1979-9).
Однако при наличии этих данных нельзя однозначно предсказать, что та или иная конструкция лекарственного пептида, несмотря на то что даже если предварительно выполнены эксперименты с моделирующими суспензиями и т.д., окажется приемлемой для лекарственного пептида, созданного для определенного живого органа.
Возможно, его модифицированная форма теряет свои лекарственные качества по неизученным пока причинам. Поэтому в каждом отдельном случае лекарственный пептид помимо теста в модельной системе на сохранность должен быть испытан в опытах на животных на сохранение лекарственных качеств. Любой результат для определенного органа окажется новым.
Технический эффект и решаемая задача в заявляемом изобретении заключается в создании нетоксичного модифицированного пептида аналога энкефалина, защишенного от действия пептидаз в мозге млекопитающих с пролонгированным лекарственным (анестезирующим) действием.
Технический эффект достигается тем, что предлагается модифицированный синтетический аналог природного пептидного анальгетика Мет-энкефалина, недоступный внеклеточнм экзопептидазам, в котором новым является то, что на обоих концах Мет-энкефалина (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met) помещены остатки бета-аланина, блокирующие действие низкоспецифичных пептидаз, локализованных на поверхности аксонных окончаний нейронов мозга, имеющий формулу
βAla-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-βAla,
обладающий повышенной устойчивостью к активности внеклеточных экзопептидаз мозга и в опытах на животных (крысах) пролонгированным анестезирующим действием.
Для проверки стабильности этой модификации энкефалина была использована суспензия синаптосом в среде 0.1 М фосфатный буфер (рН 7.4) - 0.14 М NaCl. Эта суспензия моделирует участки синапсов в контакте с внеклеточной средой мозга, где оперируют указанные выше пептидазы.
Работа проводилась следующим образом.
o
t
t
o
К порциям суспензии синаптосом (по 165 мкл) добавляли Met - энкефалин (контроль) или Мет-энкефалин, защищенный на обоих концах остатками бета-аланина, до концентрации 0.2 мМ. Оба препарата инкубировали при 37°С с отбором проб (по 20 мкл), которые анализировали методом тонкослойной хроматографии. Конкретно, осуществлялась денситометрия исходного пятна (d) и в последовательные моменты времени остаточных пятен (d) полного пептида. Мерой сохранности исходного пептида в каждом случае было отношение (d/d). Результаты представлены на графиках - фиг. 1.
На фиг. 1 приведены графики, характеризующие сохранность энкефалина (кривая 1) и энкефалина, модифицированного добавлением на флангах остатков бета-аланина (кривая 2), при инкубации в суспензии синаптосом. Они показывают, что в условиях эксперимента незащищенный Met-энкефалин исчезает (подвергнут полному разрушению) в течение 60-90 минут. Защищенный Met-энкефалин в течение этого времени сохраняется почти полностью, и через 180 минут сохраняют целостность 50% его молекул.
t
k
t
k
Для проверки, сохраняет ли фланкированный остатками бета-аланина Met-энкефалин биологические (лекарственные) свойства, был поставлен опыт на экспериментальных животных (крысы самцы, возраст 2 месяца). Была выбрана стандартная методика подсчета частоты судорожных движений, вызванных инъекциями определенной дозы уксусной кислоты. Опыт ставился следующим образом. В начальный момент (t=0) животному интраназально (в слизистую оболочку носа) вносят пептид из расчета 0.04 микромоля/100 г веса животного). Вдоль нервных волокон препарат проникает непосредственно в мозг. Каждому животному назначается временной интервал после внесения в его мозг пептида (t). За 20 мин до этой «точки» животному в брюшную полость вводится доза уксуса, и, начиная еще через 10 мин в течение 20 мин подсчитывается число корчей (n - частота корчей). На каждую точку брали не менее трех животных. В качестве контроля использовали животных, не получавших ни одной из форм энкефалина, т.е. полностью лишенные обезболивания. Частота корчей у этих животных - наибольшая (n). Чем меньше отношение n/n, тем лучше обезболивание. Для построения графиков фиг. 2 была использована формула
t
k
у=1-n/n,
согласно которой у=1 - полное обезболивание (нет корчей), а у=0 - полное его отсутствие (частота корчей, как в контроле).
На фиг. 2 представлены данные экспериментов по проверке сохранности биологических свойств фланкированного остатками бета-аланина Met-энкефалина (сохранность эффекта анестезии (обезболивания) при внесении в мозг крысы энкефалина (кривая 1) и энкефалина, модифицированного добавлением на флангах остатков бета-аланина (кривая 2). Эти данные, показывают:
- Эффект анестезии существенно пролонгирован в случае применения модифицированного энкефалина, флангированного остатками бета-аланина (не менее, чем до 250 мин). Этот результат свидетельствует о защищенности модифицированного энкефалина от действия экзопептидаз не только в модельной системе, но и в «живом» мозге.
- Эффект анестезии у модифицированного энкефалина оказался не ниже, а существенно выше самого энкефалина (на 20-25%).
В терминах нейрохимии это означает, что модифицированный (фланкированный остатками бета-аланина) энкефалин взаимодействует с опиатными рецепторами нервных клеток не менее, а, скорее, даже более эффективно по сравнению с самим энкефалином, вызывая ослабение межклеточных коммуникаций и, как следствие, снижение чувствительности к сигналам, вызывающим болевые ощущения.
Это доказывают целесообразность применения фланкированного остатками бета аланина энкефалина в качестве лекарственного пептида, оказывающего повышенное и пролонгированное анестезирующее воздействие в нейронах мозга.
Таким образом, в заявляемом пептиде аминопептидаза и карбоксипептидаза, деградирующие пептиды, соответственно, с N- и С-конца, не способны нарушить пептидную связь, в которой участвует бета-аланин (βAla).
2
Следует отметить, что бета-аланин, размещенный в заявляемом изобретении на обоих концах Мет-энкефалина, синтезируется в самом организме и входит в состав эндогенного дипептидного нейромедиатора карнозина, что говорит об его нетоксичности. С другой стороны, использовавшийся ранее для модификации энкефалина D-аланин (замена 1-го глицина, работы [1], [2]), заключающаяся в замене 1-го глицина на D-аланин (DAla), а С-концевой карбоксильной группы - на амид: (Tyr-DAla-Gly-Phe-MetNH)] не синтезируется в организме, т.е. является для него чужеродным и может оказаться токсичным после высвобождения из пептида.
Таким образом, предлагается модифицированный синтетический аналог природного пептидного анальгетика Мет-энкефалина, который обладает повышенной устойчивостью к внеклеточным экзопептидазам мозга, что проявляется в пролонгировании анестезического действия энкефалина до не менее 250 мин (фиг. 2), в котором на обоих концах Мет-энкефалина помещены остатки бета-аланина, блокирующие действие экзопептидаз, локализованных на поверхности аксонных окончаний нейронов, имеющий формулу: βAla-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-pAla.
ЛИТЕРАТУРА
1. Pert СВ, Pert A, Chang JK, Fong ВТ (1976) (D-Ala 2)-Met-enkephalinamide: a potent, long-lasting synthetic pentapeptide analgesic. Science, 194, 330-332.
2. Katsuura G, Inouye K, Itoh S, Hsiao S. (1984) Analgesic effects of enkephalin analogs in rats. Life Sci., 35, 815-818.
3. DiMaio J, Schiller PW (1980) A cyclic enkephalin analog with high in vitro opiate activity. Proc Natl Acad Sci USA,. 77, 7162-7166.
1
4. Touati-Jallabe Y, Bojnik E, Legrand B, Mauchauffee E, Chung NN, Schiller PW, Benyhe S, Averlant-Petit MC, Martinez J, Hernandez JF (2013) Cyclic enkephalins with a diversely substituted guanidine bridge or a thiourea bridge: synthesis, biological and structural evaluations. J Med Chem, 56, 5964-5973.
5. Stefanucci A, Novellino E, Mirzaie S, Macedonio G, Pieretti S, Minosi P,  E, Erdei AI,  F, Benyhe S, Mollica A (2017) Opioid Receptor Activity and Analgesic Potency of DPDPE Peptide Analogues Containing a Xylene Bridge. ACS Med Chem Lett, 8, 449-454.
6. Kropotova ES, Mosevitsky MI. A Group of Weakly Bound to Neurons Extracellular Metallopeptidases (NEMPs). Neurochem Res. 2016, Jun 27. [Epub ahead of print] PMID:27350576 http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11064-016-1979-9