К вопросу идентификации биологически активных веществ нового средства для лечения мочекаменной болезни

УДК 615.254.7:577.112

К ВОПРОСУ ИДЕНТИФИКАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НОВОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МОЧЕКАМЕННОЙ БОЛЕЗНИ

Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул Жариков А.Ю., Жарикова Г.В., Мазко О.Н., Макарова О.Г., Кирьякова В.О.

Цель исследования - идентифицировать и определить массовую долю аминокислот в составе нового средства для лечения мочекаменной болезни. Определение аминокислот проводилось методом капиллярного электрофореза на системе капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ-105/105М» с положительной полярностью высокого напряжения. В результате проведённого эксперимента в субстанции нового фармакологического средства для лечения мочекаменной болезни были идентифицированы 12 аминокислот: лизин (0,2333%), тирозин (0,1303%), фенилаланин (0,1605%), лейцин+изолейцин (0,2928%), метионин (0,1928%), валин (0,1244%), пролин (0,2058%), треонин (0,2081%), серин (0,3469%), аланин (0,3586%), глицин (0,4278%). Полученные результаты позволяют предположить, что эти аминокислоты в составе олигопептидов либо в свободном состоянии могут определять антилитогенное действие нового средства из тканей свиных почек.

Ключевые слова: мочекаменная болезнь, фармакологическое средство, аминокислоты.

Research objective - to identify and determine the mass fraction of amino acids in the composition of the new drug for kidney stone disease treatment. The identification of amino acids was carried by means of capillary electrophoresis method with the use of capillary electrophoresis system «KAPEL-105/105M» with positive polarity of high voltage.

As a result of the conducted experiment in the composition of substance for the treatment of kidney stone disease there were identified 12 amino acids: lysine (0,2333%), tyrosine (0,1303%), phenylalanine (0,1605%), leucine+isoleucine (0,2928%), methionine (0,1928%), valine (0,1244%), proline (0,2058%), threonine (0,2081%), serine (0,3469%), alanine (0,3586%), glycine (0,4278%). The obtained results allow to assume, that these amino acids in composition of oligopeptides or in a free state, are able to determine the antilithogenic activity of the new substance of tissues of pig kidneys.

Key words: kidney stone disease, pharmacological drug, amino acids.

Мочекаменная болезнь (МКБ) - широко распространённая патология мочевыделительной системы, которой страдают 10-15% населения [1]. Таким образом, в целом по России абсолютные цифры заболеваемости варьируют в районе 14 млн человек. При этом основной контингент больных - это наиболее трудоспособные и социально активные люди: мужчины в возрасте 30-50 лет [1]. В этой связи профилактика и лечение МКБ является важной медицинской проблемой.

Несмотря на все успехи современной урологии, проблема эффективной и безопасной терапии МКБ остаётся очень актуальной. Лечение и по сей день в основном приходится проводить при помощи литотрипсии в различных её вариантах, особенно в случае оксалатной формы МКБ [2]. В то же время арсенал фармакологических средств довольно ограничен, а те, что применяются, не лишены серьёзных недостатков [1]. Поэтому проблема поиска новых эффективных и безопасных лекарственных средств для лечения МКБ сохраняет свою остроту.

Ранее в доклиническом исследовании мы продемонстрировали высокую антилитоген-ную активность фармакологического средства из сырья свиных почек, разработанного в нашей

лаборатории [3]. В эксперименте оказалось, что трёхнедельное применение этого средства в условиях экспериментального оксалатного нефролитиаза сопровождается снижением пересыщения мочи оксалат-ионами, устранением повреждающего фактора, ослаблением оксида-тивного стресса и многократным уменьшением количества и размеров почечных камней. Полученные результаты, естественно, поставили перед нами вопрос о возможном механизме(ах) антилитогенного действия нового средства. Учитывая природное происхождение нового средства, решение данного вопроса целесообразно было начать с идентификации биологически активных веществ, входящих в его состав.

Цель исследования

Цель настоящего исследования - идентифицировать и определить массовую долю аминокислот в составе нового средства для лечения мочекаменной болезни.

Материалы и методы

Определение аминокислот проводилось методом капиллярного электрофореза на системе капиллярного электрофореза «КА-ПЕЛЬ-105/105М» с положительной полярностью высокого напряжения.

Пробоподготовка осуществлялась следующим образом. Для гидролиза белков и пептидов из тканевого материала свиных почек до аминокислот навеска фармакологического средства массой 100 мг помещалась в виалу для гидролиза и добавлялось 10 мл 6М соляной кислоты. Гидролиз проводили при температуре 110°С в течение 16 часов. После этого проба охлаждалась при комнатной температуре и фильтровалась через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Из полученного гидролизата отбирали 50 мкл, помещали в стеклянный бюкс вместимостью 10-15 мл и выпаривали досуха в струе тёплого воздуха. Затем добавляли 150 мкл 0ДМ раствора натрия карбоната и 300 мкл фе-нилизотиоционата в изопропиловом спирте и оставляли на 35 минут при комнатной температуре. Далее полученный раствор выпаривали досуха в струе тёплого воздуха, сухой остаток растворяли в 0,5 мл дистиллированной воды и центрифугировали в течение 1 минуты при 7000 об/мин. Супернатант использовали для проведения электрофореза.

Электрофорез проводился с использованием капилляра с характеристиками ЬЭфф/ЬобЩ=65/75 см, ID=50 мкм при температуре капилляра 30°С, напряжении +25 кВ и скорости ввода пробы 300 мбар/сек. Детектирование проводилось при длине волны 200 нм. Расчёт осуществляли по методу абсолютной градуировки с использованием стандартных растворов аминокислот различной концентрации.

Результаты и обсуждение

В результате проведённого эксперимента в солянокислом гидролизате субстанции нового

фармакологического средства для лечения мочекаменной болезни были идентифицированы 12 аминокислот: лизин, тирозин, фенилаланин, лейцин, изолейцин, метионин, валин, пролин, треонин, серин, аланин, глицин (рисунок 1).

Как следует из рисунка, первой на электро-фореграмме регистрировалась аминокислота лизин, время удерживания которой составило 10,477 мин. Время удерживания следующих затем тирозина и фенилаланина составило 10,890 и 11,062 мин. соответственно. Далее регистрировался сдвоенный пик, соответствующий аминокислотам лейцину и изолейцину (1Уд.. = 11,900 мин.). После этого в хронологическом порядке регистрировался выход аминокислот метиони-на (ЬуА. = 12,183 мин.), валина (1уд.. = 12,362 мин.), пролина (1уд.= 12,637 мин.), треонина (1:Уд.. = 12,835 мин.), серина (1уд.. = 13,350 мин.), аланина (Ъуд.. = 13,525 мин.) и глицина (1Уд.. = 14,438 мин.).

Кроме того, были определены количественные характеристики обнаруженных аминокислот, представленные в таблице 1. Оказалось, что суммарная массовая доля аминокислот составила 2,6813% от навески исследуемого средства.

Таким образом, исследование показало, что в структуру белков и пептидов субстанции из тканей свиных почек входит по меньшей мере 12 аминокислот, ряд из которых обладает выраженной биологической активностью, способной прямо или опосредованно влиять на развитие нефролитиаза. Разумеется, результаты настоящего эксперимента не позволяют установить структуру белков и/или пептидов, в которые входят эти аминокислоты. Однако сам факт присутствия аминокислот в субстанции разработанного нами фармакологического средства

0 . . . . . . 9 10 11 12 13 14

мин

Рисунок 1.

Электрофореграмма нового фармакологического средства для лечения мочекаменной болезни

Таблица 1

Массовые доли идентифицированных аминокислот

№ п/п Название аминокислоты Массовая доля

1 Глицин 0,4278

2 Аланин 0,3586

3 Серин 0,3469

4 Лейцин + изолейцин 0,2928

5 Лизин 0,2333

6 Треонин 0,2081

7 Пролин 0,2058

8 Метионин 0,1928

9 Фенилаланин 0,1605

10 Тирозин 0,1303

11 Валин 0,1244

Суммарно: 2,6813

позволяет сделать некоторые предположения о характере его влияния на течение нефролити-аза.

Роль аминокислот и биоактивных пептидов в патогенезе нефролитиаза обсуждается достаточно давно. Так, установлено, что у пациентов, страдающих оксалатной и фосфатной формами МКБ, наблюдается 50-процентное снижение относительно нормы экскреции с мочой аминокислот серина, глицина, таурина и изолейцина. При этом у больных оксалатным нефролитиа-зом дополнительно понижена экскреция тирозина и орнитина [4]. В другом исследовании обнаружено 40-процентное снижение мочевого уровня лизина при оксалатном нефролитиазе, притом что добавление этой аминокислоты в мочу способствует растворению камней [5]. Причины зафиксированных явлений и их корреляция с конкретными звеньями патогенеза нефролитиаза пока неизвестны. Однако эти данные позволяют обоснованно полагать, что нарушения обмена аминокислот играют весомую роль в развитии МКБ. При этом пять из указанных выше аминокислот идентифицированы в структуре разработанного нами фармакологического средства. Это позволяет предположить, что данные аминокислоты, попадая в организм, могут оказывать определённое анти-литогенное действие.

Хорошо известна роль перекисного окисления липидов в процессе камнеобразования [7-9]. При этом неоднократно продемонстрировано участие глутатиона и глутатионперок-сидазы в компенсации оксидативного стресса, возникающего во время литогенеза [3,7-9]. Как известно, глутатион в организме образуется в результате метаболизма глицина, идентифицированного нами в составе исследуемого средства. Не исключено, что глицин, попавший

в организм, метаболизируется до глутатиона, увеличивая тем самым антиоксидантный потенциал в почечной ткани.

Интересным представляется потенциальный вклад серина в лечебное действие разработанного нами средства. Известно, что серин - метаболический предшественник ци-стеина - аминокислоты, содержащей в своей структуре сульфгидрильную группу. Достаточно давно существуют предположения, что за счёт наличия такой группы цистеин может блокировать печёночную гликолатоксидазу, ингибируя тем самым синтез оксалат-ионов, из которых образуются оксалатные камни. И эти сведения находят экспериментальные подтверждения [9,10]. Кроме того, цистеин может метаболизироваться до глутатиона (роль которого описана выше) и таурина - вещества, дефицит которого в моче выявляется при оксалатном нефролитиазе [4].

Обсуждения достоин и факт обнаружения метионина - ещё одной серосодержащей аминокислоты, участвующей в довольно широком спектре биохимических реакций. Так, например, известны антиоксидантные свойства метионина. В контексте нефролитиаза существуют экспериментальные данные о том, что введение метионина крысам с нефролитиазом на фоне индуцированного дефицита витамина В6 нивелирует оксидативный стресс и подавляет кам-необразование [11].

Суммируя вышеизложенное, отметим, что в результате проведённого исследования в составе разработанного нами нового фармакологического средства для лечения МКБ обнаружен ряд аминокислот, которые, по современным представлениям, могут играть существенную роль в ослаблении литогенных процессов. Не исключено, что эти аминокислоты либо в составе олигопептидов, либо в свободном состоянии хотя бы отчасти определяют антилитогенное действие нового средства из тканей свиных почек.

Заключение

Проведённое исследование позволило идентифицировать в составе нового фармакологического средства из свиных почек 12 аминокислот (лизин, тирозин, фенилаланин, лейцин, изо-лейцин, метионин, валин, пролин, треонин, серин, аланин, глицин), которые могут участвовать в развитии его антилитогенного эффекта.

Список литературы

1. Вощула В.И. Мочекаменная болезнь: эти-отропное и патогенетическое лечение, профилактика / В.И. Вощула - Минск: ВЭВЭР, 2006. - С. 107-110.

2. Капсаргин Ф.П., Гульман М.И., Неймарк

A.И. К вопросу о выборе рационального метода лечения нефролитиаза // Урология, 2010. - № 3. - С. 26-30.

3. Жариков А.Ю., Лампатов В.В., Брюханов

B.М. и др. Экспериментальная апробация новой биомедицинской субстанции из свиных почек для лечения мочекаменной болезни // Сибирский научный медицинский журнал, 2015. - Т. 35, № 6. - С. 45-51.

4. Atanassova S.S, Panchev P., Ivanova M. Plasma levels and urinary excretion of amino acids by subjects with renal calculi // Amino Acids, 2010. - V.38, № 5. - P. 12771282.

5. Atanassova S.S. Influence of the lysine on the calcium oxalate renal calculi // Int Urol Nephrol, 2014. - V.46, №3. - P. 593-597.

6. Мотин Ю.Г., Жариков А.Ю., Брюханов В.М. и др. Оксидативный стресс как один из факторов повреждения на ранних сроках экспериментального нефролитиаза // Морфолопя, 2011. - T.V, № 1. - С. 33-37.

7. Мотина Н.В., Зверев Я.Ф., Лепилов А.В. и др. Оксидативное повреждение почек при экспериментальном оксалатном нефролитиазе / // Нефрология, 2010. -Т.14, №1,-С. 68-72.

8. Жариков А.Ю., Талалаева О.С., Зверев Я.Ф. и др. Роль антиоксидантной терапии в фармакологической коррекции экспериментального нефролитиаза // Нефрология, 2010. - Т.14, №4. - С. 53-58.

9. Sharma М., Sud A., Kaur Т. et al. N-acetylcysteine with apocynin prevents hyperoxaluria-induced mitochondrial protein perturbations in nephrolithiasis // Free Radic Res, 2016. - V.50, № 9. - P. 10321044.

10. Sharma M.,. Kaur T, Singla S.K. Role of mitochondria and NADPH oxidase derived reactive oxygen species in hyperoxaluria induced nephrolithiasis: therapeutic intervention with combinatorial therapy of N-acetyl cysteine and Apocynin // Mitochondrion, 2016. - V.27. - P. 15-24.

11. Selvam R., Ravichandran V. Restoration of tissue antioxidants and prevention of renal stone deposition in vitamin B6 deficient rats fed with vitamin E or methionine // Indian J Exp Biol, 1993. - V.31, № 11. - P. 882-887.

Контактные данные:

656038, г. Барнаул, пр. Ленина, 40. Алтайский государственный медицинский университет. Тел.: (3852) 241859. Email: zharikov@agmu.ru