Биосенсорный подход к оценке агрохимикатов на основе гуминовых веществ

УДК 543.94+577.15.08

БИОСЕНСОРНЫЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ АГРОХИМИКАТОВ НА ОСНОВЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ

Е.В. Емельянова, А. А. Макаренко, Е.А. Михина, А.Н. Решетилов, А. А. Савинов, И.В. Шемонаев

Рассмотрена возможность использования биосенсорной методики для выявления воздействия агрохимикатов на основе гуминовых веществ на фермент. Установлено, что показатели амперометрического глюкозооксидазного сенсора (ГОД-сенсор) зависят от присутствия и концентрации в анализируемой смеси гуминовых веществ и от методики их внесения. Полученные результаты указывают, что ГОД-сенсор может послужить удобным инструментом для дальнейшего выяснения физиологической активности гуминовых веществ.

Ключевые слова: амперометрический биосенсор, глюкозооксидаза, кислородный электрод, гуминовые вещества.

Введение

Гуминовые вещества (ГВ) представляют собой сложную смесь природных органических соединений, образующихся при разложении отмерших растений и их гумификации. Они являются обязательными участниками не только биологического круговорота наземных и водных экосистем, но и глобального геохимического круговорота. ГВ входят в состав органической массы торфа (до 60 %), бурых углей (20-40 %), почв (до 10 %).

История изучения гуминовых веществ началась с первой публикации Achard в журнале "Chemical Annalen" в 1786 году [1]. В нашей стране исследования состава и биологической активности ГВ ведутся с 50-х годов прошлого столетия [2]. В настоящее время препараты на основе гуминовых веществ широко используются не только в традиционных областях, таких как растениеводство, в качестве биостимуляторов, но и для ремедиации загрязнённых почв.

Несмотря на длительную историю изучения гуминовых веществ, практически не решены многие вопросы. До сих пор не ясен механизм их физиологической активности по отношению к растениям. Традиционные методологические подходы к изучению функций ГВ не дают ответов на имеющиеся вопросы, и нет единого сертифицированного метода для оценки качества гуматсодержащих препаратов. Обычно для тестирования агрохимикатов на основе гуминовых веществ применяются растения; в этом случае биологическая активность ГВ оценивается по увеличению всхожести семян, длины стеблей и корней, массы проростков и т.д. Такие

методики довольно трудоёмки, требуют много времени и недостаточно объективны.

Использование биосенсорной методики [3] значительно снижает количество необходимой для анализа биомассы или фермента и существенно сокращает время проведения эксперимента. Нами было показано, что использование клеток, адаптированных с помощью гуминовых веществ, в качестве рецептора сенсора позволяет изменять чувствительность биосенсора в зависимости от целей анализа [4]. В настоящей работе была предпринята попытка биосенсорного подхода для оценки воздействия гуминовых веществ на фермент.

Известно, что полимеры типа гуминовых кислот связывают поступающие в почву оксидоредуктазы, обеспечивая тем самым стабильность ферментов и их активность [2, 5, 6]. Их аналогом может выступать глюкозооксидаза (ГОД), катализирующая окисление глюкозы с потреблением молекулярного кислорода и образованием перекиси водорода. ГОД была использована нами в амперометрическом ферментном биосенсоре на основе кислородного электрода типа Кларка, который применяют для определения глюкозы.

Целью настоящего исследования было изучение показателей амперометрического глюкозооксидазного сенсора в присутствии гуминовых веществ.

Материалы и методы

Для формирования рецепторного элемента сенсора глюкозооксидазу (EC 1.1.3.4), выделенную из Aspergillus niger, с активность 265 ед/мг (ICN, США) иммобилизовали на нитроцеллюлозной мембране Millipore (тип SC, диаметр пор 0,8 мкм, Sigma, США) кросс-сшивкой глутаровым альдегидом. На мембрану наносили 15 мкл смеси следующего состава: 5 мкл 10 %-го раствора ГОД в 30 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5), 5 мкл 17 %-го раствора бычьего сывороточного альбумина в вышеуказанном буфере и 5 мкл 10 %-го водного раствора глутарового альдегида. Затем мембрану подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин и хранили при температуре +4°С. Перед проведением измерений, от мембраны отделяли фрагмент размером 5*5 мм и фиксировали его на измерительной части электрода с помощью нейлоновой сетки.

При оценке биологической активности гуминовых веществ была использована биосенсорная установка, в которой иммобилизованная глюкозооксидаза служила биорецептором, а преобразователем -кислородный электрод типа Кларка (ООО "Кронас", Россия), фиксирующий скорость изменения концентрации кислорода с помощью потенциостата IPC-Micro (ООО "Кронас", Россия), интегрированного с персональным компьютером. Для управления потенциостатом и

регистрации измерений персональный компьютер был присоединён через стандартное последовательное подключение RS-232. Регистрируемым параметром являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt (нА/с; в дальнейшем - ответ сенсора), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации потреблённого кислорода.

Измерения проводили в 30 мМ калий-фосфатном буфере (рН 6,6), насыщенном кислородом воздуха, при комнатной температуре в открытой кювете объёмом 2 мл и постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки (400 об/мин). Объем вводимого субстрата (глюкозы) - 100 мкл. Каждое измерение проводили в трёхкратной повторности.

В качестве источника гуминовых веществ применяли гумино-минеральный комплекс "Гумиком" (марка А), содержащий 4-6 % гумата калия, выпускаемый ООО "Эмульсионные технологии" (Самарская область). Исходный препарат разводили до нужной концентрации, обеспечивающей содержание ГВ в буферном растворе измерительной кюветы от 0,05 до 0,001 % (0,5-0,01 мг/мл).

Во всех экспериментах фиксировали ответ глюкозооксидазного сенсора (ГОД-сенсора) на добавление 0,5 мМ глюкозы. Перед началом и после завершения измерений в присутствии ГВ проводили контрольное измерение, соответственно К1 и К2, то есть фиксировали реакцию сенсора на присутствие в буфере только глюкозы.

Результаты и обсуждение

Использовали различные схемы внесения гуминовых веществ в измерительную кювету. По одной из схем вначале, после проведения контрольного измерения (К1), в буфер вносили раствор ГВ до концентрации 0,001 %. При этом не было получено отклика ГОД-сенсора на гуминовые вещества. Через 2 мин в буферный раствор, содержащий ГВ, вносили глюкозу и фиксировали ответ сенсора. После отмывки электрода и выхода кривой на базовый уровень проводили аналогичную серию измерений при концентрации ГВ 0,01 %, а затем при 0,05 %. Все измерения проводили на одном рецепторном элементе, не меняя его после каждой серии экспериментов. В результате рецепторный элемент последовательно подвергался действию различных концентраций ГВ. В заключение проводили контрольное измерение (К2). Полученные результаты представлены на рис. 1.

я а

О 80 -

К1

К2

60 -

40

20 -

0

2

3

Рис. 1. Ответ ГОД-сенсора на 0,5 мМраствор глюкозы в присутствии "Гумиком" при последовательном увеличении концентрации гуматов: К - контроль

Добавление гуминового препарата (рис. 1) приводило к увеличению ответа биосенсора на глюкозу. Кроме того, наблюдалось увеличение контрольного измерения К2, что, вероятно, было связано с эффектом "накопления" воздействия гуминовых веществ на рецепторный элемент.

Поэтому следующая серия измерений была проведена по аналогичной схеме, но с другой последовательностью изменения концентрации гуматов: от большей концентрации (0,05 %) к меньшей (0,001 %). Результаты приведены на рис. 2.

Были получены результаты, которые выявили ту же закономерность, что и в экспериментах, представленных на рис. 1. Ответ сенсора увеличивался в присутствии ГВ. Наблюдался эффект "накопления" воздействия гуматов. Реакция на глюкозу (К2) у рецепторного элемента, подвергшегося воздействию ГВ, возросла на 36 % по сравнению с исходной (К1).

Судя по результатам экспериментов, величина стимулирующих концентраций ГВ на ответ сенсора, очевидно, лежит в области 0,001 % (в пересчёте на мг/мл это составляет 0,01 мг/мл), что сопоставимо с данными литературы, полученными для микроорганизмов. Для них положительные эффекты гуминовых кислот были выявлены при концентрациях 0,005-1 мг/мл [7].

180 160 140

о4

120

Л &

§ 100

я

и

« 80 Н

и

— 60

н

О

40 20 0

К1

К2

2

3

Рис. 2. Ответ ГОД-сенсора на 0,5 мМраствор глюкозы в присутствии "Гумиком" при последовательном уменьшении концентрации гуматов: К - контроль (при 0 % ГВ), К1 - до проведения измерений, К2 - после проведения измерений; концентрация гуматов: 1 - 0,05 %,

2 - 0,01 %, 3 - 0,001 %. Ответы сенсора даны в процентах по отношению к начальному контролю

Известно, что ГВ обладают способностью сорбироваться на различных поверхностях [7, 8]. Поэтому наблюдаемый эффект "накопления" воздействия гуминовых веществ на рецепторный элемент можно объяснить, в том числе, и сорбцией гуматов на поверхности подложки рецепторного элемента (мембрана MiШpore). Поэтому была изменена схема проведения эксперимента. Для каждой концентрации гуматов использовали свежий рецепторный элемент. В этом случае рецептор подвергался воздействию только одной концентрации ГВ.

И в этой серии (рис. 3) был отмечен "накопительный" эффект (изменение контроля К2). Причём, он был выше при использовании более высокой концентрации гуматов (0,05 %). Полученный результат, вероятно, свидетельствует о воздействии ГВ на рецепторный элемент: как то сорбция на подложке или действие на сам фермент. Эффект увеличения ответа сенсора на субстрат в присутствии ГВ (рис. 3) присутствовал. Однако существенных различий в величине стимулирующего эффекта в зависимости от концентрации ГВ не было отмечено.

Были сопоставлены результаты, полученные при последовательном внесении веществ: гуматов, а затем глюкозы (с интервалом в 2 мин) - и при их одномоментном внесении. Эти результаты приведены на рисунке 4 для разных концентраций гуматов: 0,001 % и 0,05 %.

140

120

100 -

« а

О и

X

«

и

н

а н

О

80 -

60 -

40 -

20 -

К1 ГВ К2

Рис. 3. Ответ ГОД-сенсора на 0,5 мМраствор глюкозы в присутствии "Гумиком" при одномоментном внесении глюкозы и гуматов. К - контроль (при 0 % ГВ): К1 - до проведения измерений, К2 - после проведения измерений; концентрация гуматов: 1 - 0,001 %, 2 - 0,01 %, 3 - 0,05 %. Ответы сенсора даны в процентах по отношению

к начальному контролю

а

б

«

а 100 о

в н О

] 0.05% ] К2

Рис. 4. Сравнение ответов ГОД-сенсора при последовательном

(с использованием свежих рецепторных элементов) для разных концентраций ГВ: а) - 0,001 %; б) - 0,05 %. К - контроль (при 0 % ГВ): К1 - до проведения измерений, К2 - после проведения измерений. Ответы сенсора даны в процентах по отношению к начальному

контролю

0

3

140

120 -

100 -

80 -

80 -

60 -

60

40 -

40 -

20 -

20 -

0

Известно, что в почве гуминовые вещества способны не только прочно связывать многие детергенты, пестициды, но и способствовать их трансформации и разрушению [2], [10]. Поэтому было высказано предположение о возможном воздействии ГВ и на субстрат сенсора -глюкозу. Судя по полученным результатам (рис. 4), действие гуминовых веществ в нашем случае было направлено на рецепторный элемент (иммобилизованный фермент), а не на субстрат сенсора.

Таким образом, показана возможность использования биосенсорной методики для оценки воздействия агрохимикатов на основе гуминовых веществ на фермент. Установлено, что показатели амперометрического глюкозооксидазного сенсора зависят не только от присутствия в анализируемой смеси гуминовых веществ и их концентрации, но и от методики их внесения. Полученные результаты указывают, что ГОД-сенсор может послужить удобным инструментом и для выяснения механизма биологической активности гуминовых веществ.

Список литературы

1. Achard F.K. Chemische Untersuchung des Torfs // Greils Chem. Ann. 1786. V. 2. P. 391-403.

2. Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993. 237 с.

3. Влияние гуминового комплекса препарата "Гумиком" на окисление органических веществ бактериальной культурой Gluconobacter oxydans./ Емельянова Е.В., Савинов А.А., Михина Е.А. [и др.] // Агрохимия. 2014. № 8. С. 63-71.

4. Биосенсор для определения органических веществ на основе адаптированных клеток Gluconobacter oxydans ВКМ В-1280 и кислородного электрода типа Кларка / Емельянова Е.В., Решетилов А.Н., Китова А.Е. [и др.] // Бюллетень изобретений полезных моделей. 2013. № 19. Патент РФ № 129930.

5. Зубкова Ю.Н., Рыктор И.А., Антонова А.Л. Влияние гуминовых препаратов на растения и возможные пути их практического применения // Вестник Донецкого национального университета. Сер. А: Естественные науки. 2009. Вып. 2. С. 225-231.

6. Юшкова Е.И. Биологическая активность гуминового комплекса различного происхождения и его влияние на рост и развитие растений: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. Воронеж, 2010. 44 с.

7. Проблемы оценки биоактивности гуминовых веществ по отношению к почве. / Дёмин В.В, Бызов Б.А., Завгородняя Ю.А. [и др.] // Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред: матер. Межд. конф. / МГУ. М.: БИНОМ Лаборатория знаний, 2013. С. 56.

8. Бирюков М.В. Биологическое действие гуминовых кислот и его пространственная локализация в почве: дис. ... канд. биол. наук. М., 2006. 103 с.

9. Применение стимуляторов роста растений гуминовой природы из торфа в сельском хозяйстве Томской области. Рекомендации. Томск, 2006. 13 с.

10. Трубецкой О.А., Трубецкая О.Е. Почвенные гуминовые кислоты: макромолекулы или супрамолекулярный комплекс? // Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред: матер. Межд. конф. / МГУ. М.: БИНОМ Лаборатория знаний, 2013. С. 217.

Емельянова Елена Викторовна, канд. техн. наук, научный сотрудник, elenvem@ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино Московской области, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН,

Макаренко Александр Александрович, канд. биол. наук, sansuno amail. ru, Россия, Самара, ООО "Эмульсионные технологии",

Михина Екатерина Андреевна, студент, busina92@rambler.ru, Россия, Самара, Самарский государственный университет,

Решетилов Анатолий Николаевич, д-р хим. наук, проф., зав. лабораторией, anatol@ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино Московской области, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН,

Савинов Алексей Алексеевич, студент, recrut199112@mail.ru, Россия, Самара, Самарский государственный университет,

Шемонаев Игорь Вячеславович, ecos83@mail. ru, Россия, Самара, ООО "Эмульсионные технологии"

A BIOSENSOR APPROACH TO EVALUATION OF HUMIC SUBSTANCES-

BASED AGROCHEMICALS

E.V. Emelyanova, A.A. Makarenko, E.A. Mikhina, A.N. Reshetilov, A.A Savinov.,

I.V. Shemonaev

The possibility of using a biosensor method for revealing the biological activity of humic substances-based agrochemicals was considered. It was found that testing with the use of amperometric glucose oxidase biosensor (GOD-sensor) depends on both the presences of humic substances in the mixture analyzed, their concentration and the technique of substances addition. The obtained results show that GOD-sensor can be convenient tools for making clear a still obscure mechanism ofphysiological activity of humic substances.

Key words: amperometric biosensor, glucose oxidase, oxygen electrode, humic substances.

Emelyanova Elena Viktorovna, candidate of technical science, researcher, elenvem@,ibpm.pushchino.ru, Russia, Pushchino, Moscow Region, G.K.Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,

Makarenko Aleksandr Aleksandrovich, candidate of biological science, sansuno@,mail.ru, Russia, Samara, LimComp "Emulsion technologies",

Mikhina Ekaterina Andreevna, student, busina92@,rambler. ru, Russia, Samara, Samara State University,

Reshetilov Anatoliy Nikolaevich, doctor of chemical sciences, professor, head of laboratory, anatol@,ibpm.pushchino.ru, Pushchino, Moscow Region, G.K.Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,

Savinov Aleksey Alekseevich, student, recrut199112@mail.ru, Russia, Samara, Samara State University,

Shemonaev Igor Vyacheslavovich, ecos83@mail. ru, Russia, Samara, LimComp "Emulsion technologies"