СПОСОБ ДВУХФАЗНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ
METHOD OF TWO-PHASE OBTAINING OF LIPOSOMES AND METHODS OF THEIR APPLICATION IN PRODUCTION OF DIAGNOSTIC REAGENTS

Изобретение относится к способу двухфазного получения липосом, в ходе которого неполярная органическая фаза, содержащая определенную смесь природных и синтетических фосфолипидов, и несмешивающаяся с ней полярная водная (буферная) фаза смешиваются при помощи технически простой механической процедуры. Липосомная эмульсия уникальной структуры, полученная предлагаемым способом, может предпочтительно применяться in vitro, когда активный компонент прикрепляется к поверхности липосомных мембран.
Кроме того, возможные примеры осуществления изобретения относятся к получению диагностических реагентов для исследования свертывания крови in vitro. В группе примеров осуществления изобретения упомянутый реагент состоит из предлагаемой липосомной эмульсии уникальной структуры, обеспечивающей мембранную поверхность для активных компонентов, и активных компонентов белкового типа, а именно природного или рекомбинантного тканевого фактора. В возможном примере из этой группы прикрепление белка к поверхности мембраны осуществляется на предварительно полученных липосомах. В другом возможном примере из этой группы прикрепление белка происходит одновременно со сборкой поверхности липосомной мембраны. В другой группе примеров осуществления изобретения упомянутый реагент состоит из предлагаемой липосомной эмульсии уникальной структуры и растворимых активных компонентов небелкового типа, добавленных к упомянутой эмульсии путем простого механического смешивания. Растворимые активные компоненты небелкового типа могут представлять собой либо органическую(ие) кислоту(ы), либо неорганическое(ие) соединение(ия) (например: эллаговая кислота, дубильная кислота, рутин, кверцетин или неорганический диоксид кремния).
Объектом изобретения является способ, при осуществлении которого приготавливаются диагностические реагенты для исследования свертывания крови in vitro. Диагностические реагенты для исследования свертывания крови in vitro, полученные с помощью предлагаемого способа, пригодны для измерения протромбинового времени и активированного частичного тромбопластинового времени. Еще одним объектом описания изобретения является возможность промышленной реализации вышеупомянутого способа.
Наиболее часто выполняемые измерения в диагностике свертывания крови предназначены для определения протромбинового времени (РТ) и активированного частичного тромбопластинового времени (АРТТ). Обе диагностические процедуры обеспечивают мониторинг ферментативных процессов в системе свертывания крови для указания гемостатического состояния обследуемого организма.
Свертывание крови - это ферментативная цепная реакция каскадного типа, состоящая из комплексных биохимических стадий сгущения и разжижения. Определяющее большинство ферментативных реакций системы свертывания крови представляет собой мембраносвязанные процессы, включающие молекулы белкового и небелкового типа (ферменты и кофакторы) и мембранные компоненты. Основными составляющими мембранных компонентов являются полярные и неполярные липиды, играющие основную структурную (прикрепление) и функциональную (например, кофермент активности фермента) роль. Для моделирования мембраносвязанных процессов in vivo в системе in vitro мембранные функции могут поддерживаться специальной процедурой липидизации, обеспечивающей систему in vitro соответствующими липидными компонентами.
В соответствии с настоящим изобретением липидосодержащие компоненты диагностических реагентов для исследования свертывания крови in vitro представляют собой липосомы, то есть липидные везикулы диаметром меньше микрометра, которые образуют устойчивую эмульсию с водными растворами соответствующих составов. Упомянутые липосомы обеспечивают мембранную поверхность, как среду, необходимую для диагностических реакций свертывания крови in vitro, то есть они пригодны для прикрепления органических соединений (например, природных или рекомбинантных белков, имеющих соответствующую аминокислотную последовательность) и для связывания органических или неорганических соединений, имеющих соответствующие структуры. Кроме того, поверхность липосомных мембран выполняет функцию кофактора в поверхностно-активных реакциях прикрепленных активных белков или растворимых активных неорганических соединений.
Целью измерений протромбинового времени (РТ) и активированного частичного тромбопластинового времени (АРТТ) является определение времени полимеризации фибриногена плазмы крови как результат основного этапа системы свертывания крови, то есть превращение неактивного протромбина в активный тромбин.
При измерениях протромбинового времени (РТ) используется эффект начала коагуляции так называемого тромбопластина, то есть начала так называемого внешнего пути свертывания крови [Mackman H. et al. (2007): Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 27:1687-1693]. Тромбопластин содержит тканевой фактор (TF, фактор свертывания крови III), встроенный в фосфолипидную мембрану. Тканевой фактор представляет собой трансмембранный гликопротеин, перекрывающий клеточные мембраны [Bazan J.F.(1990): PNAS 87, 6934-6938]. Несмотря на то что обнаруживаемый уровень тканевого фактора в циркулирующей крови здоровых людей проблема спорная [Monroe D.M., Key N.S.(2007): J.Thromb.Haemost. 5:1097-1105], после повреждения сосудистого русла мембраносвязанный тканевой фактор высвобождается из клеток вдоль раны (например, эндотелиальные клетки, белые кровяные клетки), что инициирует каскад свертывания крови.
2+
Высвобожденный мембраносвязанный тканевой фактор связывает и активирует фактор свертывания крови VII, таким образом, мембраносвязанный тканевой фактор действует как кофактор и рецептор активированного фактора свертывания Vila. Мембраносвязанный тканевой фактор и активированный фактор свертывания Vila способствуют активации фактора свертывания X в присутствии ионов Са. Превращение протромбина в тромбин вызвано протромбиназным комплексом, который собран из активированного X фактора свертывания (то есть фактор Xa) и активированного фактора свертывания V (то есть фактора Va), последний выполняет функцию регулирующего белка. Тромбин расщепляет белковую цепочку фибриногена до получения мономеров фибрина. Тромбин также активирует фактор XIII; активированные формы фактора XIIIa, фермент лигазы из семейства трансглутаминазы, действующий как стабилизирующий фактор фибрина. Стабильная фибриновая сеть, фибрин-полимер создается из фибриновых мономеров путем ковалентной перекрестной сшивки под влиянием активированного стабилизирующего фибрин фактора XIIIa [Edgington T.S. et al. (1991): The Structural Biology of Expression and Function of Tissue Factor, Thrombosis and Haemostasis, 66: 67-79].
Как описано выше, тромбопластин представляет собой содержащий мембранный комплекс тканевой фактор, прикрепленный к липидной мембране соответствующего состава. Кроме того, наличие белка в сочетании с окружающей липидной мембраной играет важнейшую роль в инициировании каскада свертывания крови в пространстве и времени. Решающее большинство существующих РТ реагентов производится путем гомогенизации богатых липидами животных или человеческих эндотелиальных тканей в водных растворах. Тем не менее, в некоторых новейших продуктах применяется содержащий тромбопластин рекомбинантный тканевой фактор в сочетании с искусственными липидными структурами.
При измерениях активированного частичного тромбопластинового времени [АРТТ] каскад активации начинается без компонента тканевого фактора (частичный тромбопластин), но запускается активными компонентами с результирующим отрицательным зарядом (диоксид кремния, органические кислоты) и липидными мембранами.
Известные растворы для производства диагностических реагентов для исследования свертывания крови отличаются друг от друга методом получения мембранных компонентов, то есть липосом. Во всех методах, применяемых для производства РТ реагентов, тромбопластин получают путем смешивания хранящегося в растворе тканевого фактора при помощи поверхностно-активного вещества (детергента) и подготовленной липосомной дисперсии [такие растворы описаны в патенте US 5625036, патенте US 5314695, патенте US 6124110, в патенте US 6733985, патенте US 7049087 и в патенте US 7148067]. Затем поверхностно-активные вещества удаляют из системы с помощью соответствующих процессов разделения, а именно путем диализа [см., например, патент US 5314695, патент US 4622188, патент US 6124110 и патент US 6733985], путем ультрафильтрации [патент US 5625036; и патент US 5314695] или путем адсорбционных способов [как описано в патенте US 7049087; и патенте US 7148067], так как присутствие детергентов в количестве свыше 0,05% ингибирует реакции свертывания крови. Процесс удаления детергента, то есть когда концентрация детергентов достигает своего конечного значения, необходимо проверять путем проведения нескольких измерений в процессе производства. Большим недостатком использования детергентов, помимо увеличения этапов способа, является высокая стоимость собственно детергента и/или используемой для его удаления технологии.
В известных способах методы получения липосом [например, в патенте US 4622188] основаны на том явлении, что в растворах соответствующей полярности поверхностно-активные вещества, имеющие как полярные, так и неполярные части молекулы, образуют однослойные или многослойные везикулы, в зависимости от физико-химических условий.
"A" - Наиболее часто используемый классический способ производства липосом представляет собой так называемый сухой метод [описан в патенте US 4438052, патенте US 5556637 и патенте US 7169410]. В этом способе первым этапом является растворение липидов в органическом растворителе. Затем растворитель полностью испаряется из раствора, с помощью вакуума или инертного газа. Сухая липидная пленка, образовавшаяся на стенке сосуда, окончательно диспергируется в соответствующем водном растворе. Конечную липосомную эмульсию из этой дисперсии получают путем интенсивного перемешивания [такой раствор описан в патенте US 6296870] и/или с помощью ультразвукового измельчения [см. патент US 5234634]. Эти известные способы в основном дают в результате многослойные липосомы с довольно широким распределением по размеру. Соответствующего распределения по размеру и подходящей слоистости можно достичь путем экструзии вышеупомянутой грубой дисперсии на оборудовании высокого давления, обеспечивающим узкое распределение по размеру и однослойные или двухслойные везикулы. Метод экструзии стал широко использоваться в девяностые годы [примеры такого раствора описаны в патенте US 4529561, патенте US 5204112 и патенте US 6926905].
В зависимости от смешиваемости с водой растворителя, содержащего липиды, способы смешивания с растворителем можно разделить на две группы.
В случае использования растворителя, смешиваемого с водой, способ называется однофазным способом [примером является патент US 6261792].
"B" - В однофазных способах липиды растворяются в полярных органических растворителях, как правило, в спиртах, и липидный раствор смешивается с водным растворителем. Полученные липосомы, как правило, содержат два или более слоев, во внутренней полости липосом содержится смесь водного раствора и спирта. В целях снижения многослойности липосом и сужения распределения по размеру используются методы, перечисленные в случае технологии сухой пленки.
"C" - Частный случай однофазных способов, когда липидная смесь растворяется в водном растворе при использовании молекул детергента, добавляемых в относительно высокой концентрации (1-2%). Детергент удаляется с помощью ультрафильтрации, диализа или с помощью абсорбирующей прокладки. При этом известном решении могут образовываться как однослойные, так и многослойные липосомы, теоретически пропорцию их получения можно регулировать до определенной степени скоростью удаления детергента и соответствующим ионным составом водного раствора.
В случае использования растворителя, не смешиваемого с водой, способ называется двухфазным способом [см., например, патент US 5723147]. В случае двухфазных способов дополнительное разграничение возможно на основе объемного соотношения растворителей.
"D" - Традиционно, липосомы, полученные из липидов, растворенных в небольшом количестве неполярного органического растворителя и смешанных с существенно большим количеством водного (полярного) растворителя, называются эмульсией типа «масло-в-воде».
"E" - Липосомы, полученные из липидов, растворенных в большом количестве неполярного растворителя и смешанных с небольшим количеством воды, называются эмульсиями типа «вода-в-масле».
В большинстве известных двухфазных способов фазу меньшего объема впрыскивают в фазу большего объема и в течение всего процесса осуществляется интенсивное вихревое перемешивание. Для сужения распределения липосом по размеру после выполнения этих способов также может применяться экструзия, либо впрыскивание и экструзия могут выполняться в один этап на одном и том же оборудовании.
I
II
Предполагая получение монослоя в случае эмульсии типа «масло-в-воде», поверхности липосом образуются полярным концом липидной молекулы (головка), в то время как неполярный конец молекулы (хвост) указывает на неполярный растворитель, помещенный в везикулу. В случае эмульсий типа «вода-в-масле» ситуация противоположная. В соответствии с теоретическими соображениями в случае полного исключения растворителей липосомы расположены в псевдо-гексагональных решетках, строение которых называется гекса I (H) структурой в случае эмульсий типа «масло-в-воде» и гекса II (H) структурой в случае эмульсий типа «вода-в-масле».
Специалистам в данной области ясно, что в технологиях, основанных на прикреплении активных молекул к липидной мембране, когда активные молекулы (например, белки) проявляют свое действие по отношению к водной фазе (например, диагностические реагенты), собранные монослои должны формироваться исключительно в Hi структуре. То есть, эмульсия типа «масло-в-воде» может применяться как модель клеточной мембраны. Кроме того, в случае многослойных липосом везикулы с таким внешним поверхностным слоем, в котором только головки липидов направлены на водную фазу, способны нести вышеуказанные функции.
При проведении критического анализа известных способов, которые могут быть приняты во внимание, авторы рассматривают только способы, пригодные для производства диагностических реагентов, поэтому методы из группы E не являются предметом для сравнения.
В основном, методы, относящиеся к группам A, B и C, дают в результате эмульсии многослойных липосом с широким диапазоном размера, требующих дополнительной физической обработки. Способы из группы D по большей части дают в результате более узкое распределение по размеру и однослойные липосомы.
Еще одним недостатком сухих методов, включенных в группу A, является то, что получение липосом может быть реализовано с помощью относительно большого числа этапов (растворение липидов, сушка, смешивание в водном растворе, интенсивное перемешивание/ультразвуковое измельчение). Несмотря на то, что эти этапы можно выполнять при помощи доступных для приобретения и относительно простых устройств, фактическое распределение по размеру может регулироваться только экструзией, для которой требуется дорогостоящее оборудование. На рынке диагностических реагентов отсутствуют продукты, полученные исключительно таким образом.
Способ B может выполняться в два основных этапа (растворение липидов, смешивание в водном растворе) при помощи простейших приспособлений, но, как и в методах из группы A, требуется дополнительная физическая обработка полученных таким образом липосом. То есть, для регулирования размера рекомендуется использование экструдера. В продукционной эмульсии и полостях липосом содержится неполярный органический растворитель, который необходимо удалять, если это требуется согласно применяемой технологии. На рынке диагностических реагентов отсутствуют продукты, полученные таким образом.
Способ C также может выполняться в два основных этапа (растворение липидов в растворе детергента, удаление детергента), но удаление детергента представляет собой длительный и дорогостоящий процесс с применением любого из известных методов (абсорбционный прокладочный материал, ультрафильтрующая или диализная мембрана) и требует дорогостоящего и уникального оборудования (диализатор, ультрафильтрационное оборудование/центрифуга, хроматографическая колонка и система). Полученные липосомы представляют собой однослойные или многослойные везикулы, хотя слоистость может регулироваться путем корректировки соответствующего химического состава растворителя. В полостях липосом конечного продукта может содержаться некоторое количество детергента, для удаления которого может понадобиться дополнительный этап, если это требуется согласно применяемой технологии. Для обеспечения распределения по размеру рекомендуется использование экструдера. На рынке диагностических реагентов имеются продукты, полученные исключительно таким образом [Морриссей и Смит. Тромбопластиновые Реагенты, согласно патенту US 7148067].
Способ D может выполняться в два этапа (растворение липидов, смешивание в водном растворе). Однако для смешивания фаз используются специально разработанные инжекторы и смесительное оборудование, что повышает затраты на данный способ. Липосомы, созданные традиционным образом, представляют собой однослойные везикулы, их размер находится в пределах относительно узкого диапазона, но в полостях липосом находится органический растворитель, для удаления которого может понадобиться дополнительный этап, если это требуется согласно применяемой технологии. Для обеспечения распределения по размеру рекомендуется использовать экструдер. На рынке диагностических реагентов отсутствуют продукты, полученные таким образом.
В методе C, который хорошо зарекомендовал себя и применяется исключительно для изготовления липосом, используемых в диагностических реагентах, применяемая добавка (детергент) дорогостояща сама по себе, для ее удаления требуется длительный и сложный процесс, который еще больше повышает стоимость способа. Во время процесса удаления добавки необходимо проверять концентрацию детергента путем выполнения нескольких измерений в течение процесса производства, поскольку наличие остаточного детергента может нарушить диагностическую реакцию. Несмотря на то, что распределение по размеру полученного продукта можно до некоторой степени контролировать, для получения конечного продукта используется экструдер (гомогенизатор), что делает продукт еще дороже.
Среди известных решений для методов A, B и D дорогие добавки не требуются, но в результате выполнения способов A и B получаются многослойные липосомы с широким распределением по размеру, что делает неизбежной последующую гомогенизацию, и, следовательно, затраты на производство конечного продукта повышаются.
Целью способа, разработанного авторами настоящего изобретения, является исключение недостатков известных методов и разработка способа, который технически упрощает получение липосомных эмульсий и снижает затраты на их изготовление.
Применяя метод D без использования дорогостоящего инжектора/смесительного оборудования, даже без дополнительных операций по обработке, можно получить липидную эмульсию пригодного состава. Поскольку содержимое липосом вряд ли когда-либо попадет в реакционное пространство в диагностических технологиях, органические растворители, помещенные в везикулы, не вызывают проблему, поэтому удаление растворителя не требуется. Общая схема изобретения удовлетворяет требованию метода D.
Известные решения, в соответствии с их физической реализацией, дают в результате липосомы с широким распределением по размеру и слоистостью. Липосомы, пригодные для диагностических реагентов, имеющие наружный диаметр 50-100 нм и собранные с одним или двумя слоями мембраны (монослой и бислой), получают путем выполнения последовательных этапов обработки на дорогостоящем оборудовании (ультразвуковое измельчение, фильтрация, экструдирование, центрифугирование) и/или используя поверхностно-активные вещества. В этом случае также необходимо удалять детергент, при всех других недостатках, присущих этому дополнительному этапу.
Предлагаемый способ основан на том явлении, что граница не смешивающихся друг с другом фаз выполняет функцию поверхности для размещения поверхностно-активных веществ в виде отдельного слоя молекул (монослоя), подобно слою фосфолипидов в описываемом случае. Так как целью изобретения является получение водной эмульсии липосом, специалистам в данной области ясно, что липиды, растворенные в неполярном органическом растворителе, нацелены своими полярными головками на водную фазу, а их неполярный хвост направлен на органическую фазу. При смешивании фаз молекулярный слой, который может характеризоваться нулевой кривизной до этой точки, закрывается до образования сферы (везикулы). В большом объеме водного раствора полярные головки липидов нацелены на водную фазу, а неполярный хвост липидных молекул нацелен на неполярный растворитель, захваченный внутрь везикул. При соответствующей пропорции растворителей и соответствующем составе и концентрации липидов, можно добиться того, чтобы все количество органических растворителей могло быть захвачено внутрь липосом. Учитывая, что при выполнении диагностических измерений содержимое липосом вряд ли когда-либо попадет в реакционное пространство, органический растворитель, находящийся внутри везикул, не вызывает никаких проблем при выполнении диагностических измерений, так что удалять растворитель не нужно. Если согласно применяемой технологии требуется, то захваченный липосомами органический растворитель может быть полностью удален путем вакуумного испарения или лиофилизации липосомной эмульсии, и высушенную эмульсию можно снова растворить в водном растворе [см. способ авторов Джанофф и др. в соответствии с патентом US 4880635; патентом US 5578320 и патентом US 5922350].
На основании своего опыта авторы выяснили, что сборка липосом происходит за счет простого смешивания (шейкером, вихревым смесителем, мешалкой) фаз, то есть требуется меньший объем неполярной органической фазы с соответствующим липидным составом, расслоенным под большим объемом верхней полярной водной (буферной) фазы, таким образом, специальный инжекторный смеситель не требуется.
Авторами установлено, что для получения однослойных липосом с оптимальным распределением по размеру важное значение имеет специальная смесь липидных молекул, представляющая положительную или нулевую кривизну. Кроме того, путем изменения пропорции липидных молекул, представляющих положительную или нулевую кривизну, диаметр липосом можно задавать факультативно в определенных пределах, таким образом, обеспечивается соответствующий липидный состав, что дает в результате воспроизводимый метод получения стабильных эмульсий с требуемым распределением по размеру.
Авторами экспериментально установлено, что мембранная поверхность липосомной эмульсии уникальной структуры, созданная с помощью вышеописанного способа, пригодна для мониторинга поверхностно-активных процессов (например, реакций свертывания крови) путем прикрепления к ней активного(ых) компонента(ов) или просто путем взаимодействия с активными молекулами в растворе.
Опыт авторов показал, что для прикрепления активных молекул к поверхности мембраны липосомной эмульсии уникальной структуры не требуются никакие дополнительные молекулы (например, детергент) или физическая обработка. Следовательно, предлагаемая липосомная эмульсия уникальной структуры, полученная с помощью вышеупомянутого способа, обеспечивает соответствующий компонент мембраны для диагностических реагентов, предназначенных для исследования свертывания крови in vitro, наряду с тем, что предлагаемый способ может также распространяться и на другие профессиональные области за счет привлечения других дополнительных активных компонентов.
Авторами также установлено, что молекулы тканевого фактора, несущие соответствующие части якорной молекулы неполярной мембраны, внедряются в мембрану предлагаемой липосомной эмульсии уникальной структуры в процессе, результатом которого является реагент для определения протромбинового времени (РТ), таким образом, конечный реагент-продукт можно производить в течение одного и того же процесса, что и получение липосом, за один единственный этап. Специалистам в данной области ясно, что основным условием для одноэтапного производства является то, что активная молекула, несущая части якорной молекулы неполярной мембраны, должна содержаться в водной фазе в начале процесса, когда развивающийся липидный монослой имеет нулевую кривизну. Таким образом, активные молекулы, настроенные на требуемую ориентацию (то есть, направленные к мембране своим «якорным» концом, а к водной фазе активной головкой), внедряются в развивающийся липидный монослой на границе фаз. Если бы активные молекулы были растворены в органической фазе, во время сборки липосомы активная головка была бы расположена преимущественно внутри липосомы, таким образом, активный компонент не смог бы оказывать свое действие.
Согласно исследованиям авторов, для обеспечения соответствующей концентрации тканевого фактора, необходимой для его прикрепления к поверхности липосомной мембраны, детергент не нужен. На основании опыта авторов, прикрепление может быть реализовано путем примешивания раствора тканевого фактора соответствующего состава к предварительно полученным липосомам или к одновременно собираемой поверхности липосомной мембраны. Кроме того, было установлено, что в диагностических тест-системах, требующих использования активированных мембранных поверхностей, диагностические реагенты можно изготавливать простым смешиванием водного раствора активных компонентов [например, органическая(ие) кислота(ы), неорганическое(ие) соединение(ия)] соответствующего состава с предлагаемой липосомной эмульсией уникальной структуры.
Данное изобретение относится к двухфазному способу получения липосом. Двухфазный метод, описанный в настоящем изобретении, предполагает технически простое и дешевое механическое смешивание неполярной органической фазы, содержащей отдельную смесь природных и синтетических фосфолипидов, с полярной водной (буферной) фазой, несмешивающейся с первой, в результате чего получается липосомная эмульсия уникальной структуры. Предлагаемая липосомная эмульсия уникальной структуры, обеспечивающая мембранную поверхность для активных компонентов, прикрепляемых к ней, может быть успешно включена в технологии in vitro для тестирования поверхностно-активных реакций.
Среди возможных примеров осуществления изобретения выделяется получение диагностических реагентов для исследования свертывания крови in vitro. В группе примеров осуществления изобретения упомянутый реагент состоит из предлагаемой липосомной эмульсии уникальной структуры и активных компонентов белкового типа, то есть природный или рекомбинантный тканевой фактор. Прикрепление белка к поверхности мембраны осуществляется на предварительно полученных липосомах уникальной структуры или выполняется одновременно со сборкой поверхности липосомной мембраны. В другой группе примеров осуществления изобретения упомянутый реагент состоит из предлагаемой липосомной эмульсии уникальной структуры и растворимых активных компонентов небелкового типа; их соединение осуществляется путем простого механического смешивания. В качестве вышеупомянутых растворимых активных компонентов небелкового типа может выступать, например, эллаговая кислота, дубильная кислота, рутин, кверцетин или неорганический диоксид кремния.
Общим признаком диагностических реагентов in vitro, полученных с помощью описанного в изобретении способа, является размер частиц (везикул) стабильной липосомной эмульсии уникальной структуры в диапазоне 50-100 нм. Неполярная органическая фаза в предлагаемом способе - это отдельная смесь липидных молекул, представляющих положительную или нулевую кривизну, как например фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, лизофосфатидная кислота, лизофосфатидилхолин, и меньшего количества других фосфолипидов природного происхождения, растворенных в органической фазе, с концентрацией в диапазоне 0,5-1,5 г/мл и при условиях реакции, включающих температуру 55°C и pH=2.
3
Вышеупомянутая полярная водная (буферная) фаза в предлагаемом способе содержит неорганические ионы соответственно низкой концентрации и буферизованный показатель pH, предпочтительно в диапазоне между 6,0 и 7,4, наиболее предпочтителен показатель pH=6,6, органическими соединениями, например, с 0,025 М трицином и добавленнным антибактериальным консервантом, например, 0,05 М NaN. Конечное значение pH водной фазы устанавливается с помощью раствора 5 М NaOH.
Липосомную эмульсию уникальной структуры получают путем простого механического смешивания двух фаз, как описано выше, таким образом, что неполярная органическая фаза меньшего объема добавляется в полярную водную (буферную) фазу большего объема. Объемное соотношение фаз составляет значение в диапазоне от 5 до 50, наиболее предпочтительно двадцать.
Простое механическое смешивание полярной водной (буферной) фазы и неполярной органической фазы, причем последняя располагается слоями под первой, может осуществляться просто их встряхиванием вместе при комнатной температуре (25°C). Смешивание также можно выполнять таким образом, чтобы в результате вращательного движения смесительного(ых) элемента(ов) или эксцентричного вращения смесителя фаза большего объема приводилась в вихревое движение, затем фаза меньшего объема впрыскивается, распыляется или наиболее предпочтительно вводится по каплям в вихрь при комнатной температуре.
Во время двухфазного получения липосомного компонента предлагаемого реагента для определения протромбинового времени (РТ) неполярная органическая фаза, содержащая отдельную смесь фосфолипидов, и полярная водная (буферная) фаза механически смешиваются, как описано выше, а затем активный компонент РТ реагента, природный или рекомбинантный тканевой фактор, прикрепляется к поверхности мембраны полученных липосом. Этого можно добиться, например, путем примешивания активного компонента (природного или рекомбинантного тканевого фактора) предпочтительно при концентрации 0,5-1,0 µМ, наиболее предпочтительно при концентрации 0,8 µМ, к поверхности мембраны липосом, полученных в результате простого и дешевого механического смешивания, а затем липосомную систему, содержащую якорный тканевой фактор, оставляют на некоторое время в покое.
В другом примере осуществления изобретения раствор тканевого фактора соответствующей концентрации добавляется к полярной водной (буферной) фазе, используемой при сборке липосом, в результате прикрепление белка осуществляется одновременно со сборкой липосомной мембраны.
2
2
Во время двухфазного получения липосомного компонента предлагаемого реагента для определения активированного частичного тромбопластинового времени (АРТТ) неполярная органическая фаза, содержащая отдельную смесь фосфолипидов, и полярная водная (буферная) фаза смешиваются механически, как описано выше. Водный раствор активных компонентов АРТТ реагента - органическая(ие) кислота(ы), неорганическое(ие) соединение(ия) - соответствующей концентрации примешивается к предлагаемой липосомной эмульсии уникальной структуры, полученной в результате простого и дешевого механического смешивания, а затем липосомную систему, содержащую активное соединение, оставляют на некоторое время в покое. В данном способе в качестве активных компонентов могут использоваться, например, эллаговая кислота, дубильная кислота, рутин, кверцетин, SiO в соответственно выбранной концентрации (например эллаговая кислота: 0,5-1 мМ, дубильная кислота: 1-2%, SiO: 2-4 г/л).
2
3
4
Для получения окончательной композиции РТ и АРТТ реагентов полученные и оставленные на некоторое время в покое продукты, как описано выше, разбавляют буферными растворами, состав и концентрация которых пригодны для соответствующего теста оценки свертывания крови, и которые имеют предпочтительное значение pH, в пропорции 3:1. В случае применения РТ реагента, в качестве разбавляющего раствора может использоваться буферный раствор, содержащий 0,025 М трицина, 0,25 М глицина, 0,11 М NaCl, 0,02 М CaCl, 0,025 М NaN, 16 г/л ПЭГ 4000 и 0,0024 М Полибрена, предпочтительно значение рН берется в диапазоне 7,0-7,8, в данном примере pH=7,4. В случае применения АРТТ реагента, в качестве примера может выступать буферный раствор, содержащий 0,25 М глицина, 0,01 М хепеса, 0,001 М NiSO, 0,2 мМ тимеросала, при предпочтительном значении pH в диапазоне 6,8-7,8, в данном примере pH=7,0.
Оба предлагаемых способа характеризуются возможностью дополнительной стабилизации реагентов с помощью сублимационной сушки (лиофилизации). Перед лиофилизацией используются образующие матрицу добавки, например, в следующих концентрациях: маннит 1-3%, сахароза 1-3%, бычий сывороточный альбумин 0,1 мМ. Перед применением лиофилизированные реагенты необходимо восстановить с помощью водного раствора.
Ниже приводится подробное описание способа в соответствии с настоящим изобретением.
1. Изготовление реагентов с липосомами, полученными на предварительной стадии изготовления
Получение липосом
Состав и концентрация липидного раствора
Липидный состав: Специалистам в данной области ясно, что на форму и слоистость липосом может влиять изменение пропорции фосфолипидов, представляющих отрицательную, нулевую или положительную кривизну поверхности в зависимости от формы их молекул. Безусловно, доминирование фосфолипидов, представляющих нулевую или отрицательную кривизну поверхности, способствует формированию больших плоских поверхностей, когда в водном растворе минимизация поверхностной энергии может реализовываться путем складывания в слои, поэтому фосфолипидные смеси такого состава дают в результате большие многослойные липосомы или слоистые ламинарные липидные агрегаты без закрытого внутреннего пространства. Легко понять, что полезная поверхность таких липосом, то есть поверхность, которая дает возможность встраивания активных молекул по мере необходимости (направленных к водному раствору), является небольшой по сравнению с количеством агрегированных липидов. Следовательно, фосфолипиды, представляющие положительную или нулевую кривизну поверхности, наиболее пригодны для получения липосом в целях диагностических реагентов, так как они дают в результате липосомные везикулы с размером и формой (сферические) в требуемом диапазоне. Таким образом, определяющая пропорция липидной смеси должна предпочтительно устанавливаться при помощи фосфатидилхолина, представляющего нулевую кривизну поверхности, и фосфатидилсерина, представляющего небольшую положительную кривизну. На размер липосом может предпочтительно влиять добавление небольшого количества лизоформных молекул, то есть молекул, содержащих только один единственный сложный эфир жирной кислоты с глицериновым скелетом, предпочтительно лизофосфатидилхолиная и/или лизофосфатидная кислота, представляющие положительную кривизну. Необходимо избегать высокой концентрации холестерина или фосфатидилэтаноламина, представляющего отрицательную кривизну поверхности. Для получения липосом могут использоваться фосфолипиды, выделенные из искусственных или природных источников. Специалистам в данной области ясно, что фосфолипидный состав изолятов клеточных мембран обеспечивает требуемую пропорцию, но фосфолипидный состав источников растительного или животного происхождения колеблется в очень широком диапазоне. Тогда как для получения рекомбинантных диагностических реагентов изоляты мембранных липидов из мозга кролика могут использоваться без изменений или добавок, извлеченный из сои экстракт можно использовать для получения таких липосом только после добавления лизолипидов надлежащего качества и в надлежащем количестве.
Состав и концентрация органических растворителей: в двухфазных способах основное требование к органическим растворителям, которые применяются для получения липосом, заключается в том, что он не должен смешиваться с водой и должен растворять липиды требуемого состава. На практике могут использоваться смеси хлороформа и метанола соответствующей пропорции, при изменении относительного количества растворителей в пределах пропорций 5:1 и 1:1, предпочтительно пропорция хлороформ-метанол составляет 2:1. Растворимость и характеристики формирования определенной кривизны поверхности фосфолипидов, содержащих способную к диссоциации головную группу (например фосфатидилсерин), зависят в основном от протонирования головной группы, таким образом, большое значение имеет поддержание надлежащего уровня pH липидного раствора во время выполнения способа. Предпочтительно соответствующую величину pH липидного раствора можно установить с помощью органических кислот. Для этой цели может использоваться муравьиная кислота, уксусная кислота, трихлоруксусная или трифторуксусная кислота. Применение трифторуксусной кислоты является особенно предпочтительным благодаря ее летучести. Во время распада липидов величина pH должна быть предпочтительно между значениями 2 и 4, наиболее подходящее значение 2,5. Концентрация трифторуксусной кислоты составляет 0,5%.
II
Концентрация липидных растворов: поскольку в водном растворе фосфолипиды очень легко объединяются в H ориентацию, что является неблагоприятным фактором с точки зрения низкого выхода активного продукта, предпочтительно использование высоких концентраций липидов. В зависимости от метода механического перемешивания, предпочтительная концентрация липидов может составлять от 0,2 г/мл до 2 г/мл, наиболее предпочтительная концентрация составляет 1 г/мл. В этом диапазоне концентраций раствор хлороформ-метанол-фосфолипида находится скорее в состоянии геля, чем в жидком состоянии.
Температура липидного раствора: в целях достижения соответствующей концентрации липидов при растворении липидов должна обеспечиваться температура выше комнатной температуры (25°C). Применимый диапазон температур определяется температурой кипения растворителей (хлороформ: 61,2°C; метанол: 64,5°C) и термостабильностью фосфолипидов. Пригодный диапазон температур от 30°C до 55°C, предпочтительно следует применять более высокие температурные значения.
Состав и концентрация водного буферного раствора
3
+
Состав раствора: Специалистам в данной области нетрудно понять, что суммарный заряд головных групп фосфолипидов в значительной степени влияет на их характеристики кривизны поверхности, так что качество сборки липосом определяется ионным составом и ионной силой раствора. Ионная сила, которая представляет собой примерную концентрацию соли в водной фазе, следует предпочтительно поддерживать на минимальном уровне, около нуля. Вместо неорганических солей для установления требуемой величины значения pH раствора необходимо использовать органические буферы, предпочтительно величина должна быть в диапазоне между pH=6,0 и pH=7,4; наиболее предпочтительно величина pH должна равняться 6,6, откорректированная с помощью раствора 5М NaOH. Пригодные для использования органические вещества с буферным эффектом - это предпочтительно MOPS, CHAPS, трицин и глицин. Поскольку липосомные эмульсии восприимчивы к бактериальным инфекциям, в растворе предпочтительно должен содержаться антибактериальный реагент. Такими реагентами могут быть тимеросал или NaN, при этом концентрация последнего должна поддерживаться на минимальном уровне вследствие содержания в нем Na.
3
Концентрация: концентрация буферного компонента в используемом водном растворе должна быть достаточной для достижения необходимого значения pH и буферной емкости, то есть в случае применения трицина предпочтительный диапазон концентрации от 0,05 до 0,1 М, оптимальная концентрация составляет 0,07 М. В случае использования NaN в качестве антибактериального реагента, концентрация не может быть выше 0,1 М, предпочтительно она должна составлять 0,05 М. Возможный состав водного раствора представлен в описанных ниже примерах.
В зависимости от метода смешивания пропорция органической и водной фазы предпочтительно находится в диапазоне между 1:5 и 1:100.
Получение реагента для определения протромбинового времени
Составы и концентрации водного раствора
3
Раствор тканевого фактора (TF): состав и концентрации водного буферного раствора такие же, как и определенные в описании водного буферного раствора, используемого при получении липосом. В случае использования трицина, предпочтительный диапазон концентрации от 0,05 до 0,1 М, оптимальная концентрация 0,07 М, а раствор содержит 0,5-1,0 µM, наиболее предпочтительно 0,8 µМ, тканевого фактора. В случае использования антибактериального реагента NaN, концентрация не должна превышать 0,1 М, предпочтительно она должна составлять 0,05 М. Возможный состав водного раствора представлен в приведенных ниже примерах.
+
2+
-
-
2+
+
3
Разбавляющий буфер для липосомной эмульсии, содержащей активные молекулы: Специалистам в данной области нетрудно понять, что в случае с использованием реагентов для исследования свертывания крови реакция свертывания крови и качество образовавшегося сгустка, более того, конечное качество и срок хранения продукта чрезвычайно зависят от ионной среды, качественных и количественных соотношений добавок. Такой конечный состав предпочтительно регулируется разбавлением раствора, содержащего липосомы и активные молекулы. Концентрация ионов Na и Са, качество противоионов катионов, то есть наличие Cl и/или OH ионов, имеет исключительное значение с точки зрения ионной среды в этом разбавляющем растворе. Среди добавок, влияющих на качество реакции коагуляции и сгустка, важную роль играет концентрация ионов Ni, а также качество и количество добавочного полиэтиленгликоля. С точки зрения ионной среды, качество и концентрация органических буферных компонентов, отвечающих за поддержание предпочтительного диапазона pH, то есть pH=7,0-7,8, имеют очень большое значение. Так как концентрацию Na следует поддерживать на соответствующем уровне, конечное значение pH необходимо предпочтительно устанавливать с помощью раствора 5М NaOH. Кроме того, качество и количество добавочного полиэтиленгликоля также влияют на коагулирующие способности реагентов. Поскольку конечный продукт содержит липидные компоненты, чувствительные как к окислению, так и к микробному разложению, продукт должен содержать антиоксиданты и противомикробные агенты. Предпочтительно, чтобы противомикробным агентом был NaN, при этом содержание иона Na в котором необходимо учитывать при адаптировании ионной среды. Если водный раствор, используемый при получении липосомы, не содержит коагуляционную добавку Полибрена, то его следует добавить в буфер для разбавления. Возможный состав раствора представлен в приведенном ниже примере.
Пропорции смешивания при разбавлении липосомной эмульсии уникальной структуры, содержащей активные молекулы
Пропорции смешивания разбавляющего раствора определяются требуемыми характеристиками конечного продукта. Предпочтительно диапазон разбавления должен варьироваться от 2-кратного до 6-кратного, наиболее пригодно 4-кратное разбавление.
Получение реагента для определения активированного частичного тромбопластинового времени
Составы и концентрации водного раствора
2
Активирующий раствор: Специалистам в данной области ясно, что в процессе получения АРТТ реагентов можно рассматривать несколько активных молекул (например, эллаговая кислота, дубильная кислота, рутин, кверцетин, SiO), а фактический состав и пропорция концентрации раствора определяются их физико-химическими характеристиками. В случае применения дубильной кислоты предпочтительно 2% водный раствор разбавлять в 1-2 раза, наиболее подходит разбавление в 1,2 раза раствором, состав и концентрация которого определяются в соответствии с описанием, приведенным выше в части «Состав и концентрация водного буферного раствора». Возможный состав водного раствора представлен в приведенном ниже примере.
2+
+
-
-
2+
Разбавляющий буфер для липосомной эмульсии, содержащей активные молекулы: Специалистам в данной области нетрудно понять, что в случае использования реагентов для исследования свертывания крови реакция свертывания крови и качество образовавшегося сгустка, более того, конечное качество и срок хранения продукта, в высокой степени зависят от ионной среды, качественных и количественных соотношений добавок. Такой конечный состав предпочтительно достигается разбавлением раствора, содержащего липосомы и активные молекулы. В случае применения АРТТ реагента важно, чтобы разбавляющий раствор не содержал ионы Са. Концентрация ионов Na, качество противоионов катионов, то есть наличие ионов Cl и/или OH, имеет исключительное значение с точки зрения ионной среды в этом разбавляющем растворе. С точки зрения ионной среды, качество и концентрация органических буферных компонентов, отвечающих за поддержание предпочтительного диапазона pH, то есть pH=6,8-7,8, имеют очень большое значение. Так как концентрацию Na следует поддерживать на соответствующем уровне, конечное значение pH необходимо предпочтительно устанавливать с помощью раствора 5М NaOH. Среди добавок, влияющих на качество реакции коагуляции и сгустка, важную роль играет концентрация ионов Ni. Поскольку конечный продукт содержит липидные компоненты, чувствительные как к окислению, так и к микробному разложению, продукт должен также содержать антиоксиданты и противомикробные агенты. Предпочтительно, чтобы противомикробным агентом был тимеросал. Возможный состав раствора представлен в приведенном ниже примере.
Пропорции смешивания при разбавлении липосомной эмульсии уникальной структуры, содержащей активные молекулы
Пропорции смешивания разбавляющего раствора определяются требуемыми характеристиками конечного продукта. Предпочтительно диапазон разбавления должен варьироваться от 2-кратного до 6-кратного, наиболее пригодно 4-кратное разбавление.
2. Получение липосом и реагента для определения протромбинового времени таким же способом.
Состав и концентрации липидного раствора такие же, как определено в описании липидного состава липидного раствора, используемого при получении липосом.
Состав и концентрация водного буферного раствора такие же, как определено в описании состава водного буферного раствора, используемого при получении липосом, с тем дополнением, что в этом способе в раствор предпочтительно добавляется коагуляционная добавка Полибрена, предпочтительно в концентрации 0,024 М.
Пропорция органической и водной фазы такая же, как определено в описании получения липосом.
Состав и концентрации разбавляющего буфера для липосомной эмульсии такие же, как определено в описании буфера для разбавления липосомной эмульсии для реагента для определения протромбинового времени.
Пропорции смешивания разбавляющего раствора для липосомной эмульсии, содержащей активные молекулы, такие же, как определено в описании реагента для определения протромбинового времени.
Подробные примеры реализации реагентов.
1. Сборка липосом с помощью фаз расслаивания и встряхивания
a. 1 г фосфолипидной смеси, выделенной из порошка из мозга кролика, растворяют в 1 мл смеси хлороформ-метанол с пропорцией 2:1, содержащей 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученная смесь геля хранится в жидком состоянии при 55°C.
3
b. При комнатной температуре (25°C) с помощью стеклянного шприца 50 мл фосфолипидного раствора осторожно вводят слоями под 1 мл раствора 0,07 М трицина и 0,05 М NaN. Значение pH водного раствора устанавливается равным 6,6 с помощью 5М NaOH.
c. Фазы встряхивают вместе с большой скоростью.
d. Осажденные гранулы липида удаляют.
2
3
e. Чистую липосомную эмульсию смешивают с 0,5 мл 0,8 М рекомбинантного тканевого фактора, растворенного в воде. Через 10 минут покоя 4-кратно разбавляют раствором 0,025 М трицина, 0,25 М глицина, 0,11 М NaCl, 0,02 М CaCl, 0,025 М NaN, 16 г/л ПЭГ 4000 и 0,0024 М Полибрена. Значение pH разбавляющего раствора устанавливается равным 7,4 с помощью 5М NaOH.
Проверка качества продукта выполнялась с помощью теста на протромбиновое время.
Измеренное время коагуляции составило 11,9 с на нормальной контрольной плазме и 17,2 с на патологической контрольной плазме.
2. Сборка липосом путем добавления по каплям липидного раствора в водную фазу при вихревом движении, когда вихрь создается с помощью магнитной мешалки и вращающего смесительного элемента.
a. 0,5 г фосфолипидной смеси, выделенной из порошка из мозга кролика, растворяют в 1 мл смеси хлороформ-метанол с пропорцией 2:1, содержащей 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученная смесь геля хранится в жидком состоянии при 55°C.
3
b. 100 µл фосфолипидного раствора по каплям с помощью шприца вводят в 10 мл раствора 0,07М трицина и 0,05 М NaN, приведенного в быстрое вихревое движение при комнатной температуре (25°C). Значение pH водного раствора устанавливается равным 6,6 с помощью 5М NaOH.
c. Осажденные гранулы липида удаляют.
2
3
d. Чистую липосомную эмульсию смешивают с 0,5 мл 0,8 М рекомбинантного тканевого фактора. Через 10 минут покоя 4-кратно разбавляют раствором 0,025 М трицина, 0,25 М глицина, 0,11 М NaCl, 0,02 М CaCl, 0,025 М NaN, 16 г/л ПЭГ 4000 и 0,0024 М Полибрена. Значение pH разбавляющего раствора устанавливается равным 7,4 с помощью 5М NaOH.
Проверка качества продукта выполнялась с помощью теста на протромбиновое время.
Измеренное время коагуляции составило 11,7 с на нормальной контрольной плазме и 16,9 с на патологической контрольной плазме.
3. Сборка липосом путем добавления по каплям липидного раствора в водную фазу при вихревом движении, когда вихрь создается с помощью эксцентричного вращения смесителя.
a. 0,5 г фосфолипидной смеси, выделенной из порошка из мозга кролика, растворяют в 1 мл смеси хлороформ-метанол с пропорцией 2:1, содержащей 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученная смесь геля хранится в жидком состоянии при 55°C.
3
b. 100 µл фосфолипидного раствора по каплям с помощью шприца вводят в 10 мл раствора 0,07 М трицина и 0,05 М NaN, приведенного в быстрое вихревое движение при комнатной температуре (25°C). Значение pH водного раствора устанавливается равным 6,6 с помощью 5М NaOH.
c. Осажденные гранулы липида удаляют.
2
3
d. Чистую липосомную эмульсию смешивают с 0,5 мл 0,8 М рекомбинантного тканевого фактора. Через 10 минут покоя 4-кратно разбавляют раствором 0,025 М трицина, 0,25 М глицина, 0,11 М NaCl, 0,02 М CaCl, 0,025 М NaN, 16 г/л ПЭГ 4000 и 0,0024 М Полибрена. Значение рН разбавляющего раствора устанавливается равным 7,4 с помощью 5М NaOH.
Проверка качества продукта выполнялась с помощью теста на протромбиновое время.
Измеренное время коагуляции составило 11,7 с на нормальной контрольной плазме и 16,9 с на патологической контрольной плазме.
4. Получение реагента для определения протромбинового времени с использованием липосом, предварительно полученных с помощью фаз расслаивания и встряхивания
a. 1 г фосфолипидной смеси, выделенной из порошка из мозга кролика, растворяют в 1 мл смеси хлороформ-метанол с пропорцией 2:1, содержащей 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученная смесь геля хранится в жидком состоянии при 55°C.
3
b. При комнатной температуре (25°C) с помощью стеклянного шприца 50 µл фосфолипидного раствора осторожно вводят слоями под 1 мл раствора 0,07 М трицина и 0,05 М NaN. Значение pH водного раствора устанавливается равным 6,6 с помощью 5М NaOH.
c. Фазы встряхивают вместе с большой скоростью.
d. Осажденные гранулы липида удаляют.
e. Готовят 0,8 М водный раствор рекомбинантного тканевого фактора.
f. Из липосомной эмульсии и раствора, полученного как описано в пункте е, получают смесь с пропорцией 2:1, смесь оставляют в покое на десять минут.
2
3
g. Липосомную эмульсию, содержащую введенный тканевой фактор, разбавляют 3-кратно раствором, содержащим 0,025 М трицина, 0,25 М глицина, 0,11 М NaCl, 0,02М CaCl, 0,025 М NaN, 16 г/л ПЭГ 4000 и 0,0024 М Полибрена. Значение pH разбавляющего раствора устанавливается равным 7,4 с помощью 5М NaOH.
Проверка качества продукта выполнялась с помощью теста на протромбиновое время.
Измеренное время коагуляции составило 11,9 с на нормальной контрольной плазме и 17,2 с на патологической контрольной плазме.
5. Получение реагента для определения протромбинового времени с использованием липосом, предварительно полученных путем добавления по каплям липидного раствора в водную фазу при вихревом движении, когда вихрь создается с помощью магнитной мешалки и вращающего смесительного элемента.
a. 1 г фосфолипидной смеси, выделенной из порошка из мозга кролика, растворяют в 1 мл смеси хлороформ-метанол с пропорцией 2:1, содержащей 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученная смесь геля хранится в жидком состоянии при 55°C.
3
b. 100 µл фосфолипидного раствора по каплям с помощью шприца вводят в 10 мл раствора 0,07 М трицина и 0,05 М NaN, приведенного в быстрое вихревое движение при комнатной температуре (25°C). Значение pH водного раствора устанавливается равным 6,6 с помощью 5М NaOH.
c. Осажденные гранулы липида удаляют.
d. Готовят 0,8 М водный раствор рекомбинантного тканевого фактора.
e. Из липосомной эмульсии и раствора, полученного как описано в пункте d, получают смесь с пропорцией 2:1, смесь оставляют в покое на десять минут.
2
3
f. Липосомную эмульсию, содержащую введенный тканевой фактор, разбавляют 3-кратно раствором, содержащим 0,025 М трицина, 0,25 М глицина, 0,11 М NaCl, 0,02M CaCl, 0,025 М NaN, 16 г/л ПЭГ 4000 и 0,0024 М Полибрена. Значение pH разбавляющего раствора устанавливается равным 7,4 с помощью 5М NaOH.
Проверка качества продукта выполнялась с помощью теста на протромбиновое время.
Измеренное время коагуляции составило 11,7 с на нормальной контрольной плазме и 16,9 с на патологической контрольной плазме.
6. Получение реагента для определения протромбинового времени с использованием липосом, предварительно полученных путем добавления по каплям липидного раствора в водную фазу при вихревом движении, когда вихрь создается с помощью эксцентричного вращения смесителя.
a. 1 г фосфолипидной смеси, выделенной из порошка из мозга кролика, растворяют в 1 мл смеси хлороформ-метанол с пропорцией 2:1, содержащей 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученная смесь геля хранится в жидком состоянии при 55°C.
3
b. 100 µл фосфолипидного раствора по каплям с помощью шприца вводят в 10 мл раствора 0,07 М трицина и 0,05 М NaN, приведенного в быстрое вихревое движение при комнатной температуре (25°C). Значение pH водного раствора устанавливается равным 6,6 с помощью 5М NaOH.
c. Осажденные гранулы липида удаляют.
d. Готовят 0,8 М водный раствор рекомбинантного тканевого фактора.
e. Из липосомной эмульсии и раствора, полученного как описано в пункте d, получают смесь с пропорцией 2:1, смесь оставляют в покое на десять минут.
2
3
f. Липосомную эмульсию, содержащую введенный тканевой фактор, разбавляют 3-кратно раствором, содержащим 0,025 М трицина, 0,25 М глицина, 0,11 М NaCl, 0.02M CaCl, 0,025 М NaN, 16 г/л ПЭГ 4000 и 0,0024 М Полибрена. Значение pH разбавляющего раствора устанавливается равным 7,4 с помощью 5М NaOH.
Проверка качества продукта выполнялась с помощью теста на протромбиновое время.
Измеренное время коагуляции составило 11,7 с на нормальной контрольной плазме и 16,9 с на патологической контрольной плазме.
7. Получение реагента для определения протромбинового времени в течение одного единственного этапа при одновременной [in situ] сборке липосом и внедрении активного компонента (тканевого фактора)
a. 1 г фосфолипидной смеси, выделенной из порошка из мозга кролика, растворяют в 1 мл смеси хлороформ-метанол с пропорцией 2:1, содержащей 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученная смесь геля хранится в жидком состоянии при 55°C.
3
b. Готовят смесь из раствора 0,07 М трицина и 0,05 М NaN при значении рН=6,6, установленном с помощью 5М NaOH, и 0,8 М водного раствора рекомбинантного тканевого фактора с пропорцией 1:1.
c. При комнатной температуре (25°C) с помощью стеклянного шприца 50 µл фосфолипидного раствора осторожно вводят слоями под 1 мл раствора, описанного в пункте b.
d. Фазы встряхивают вместе с большой скоростью.
e. Осажденные гранулы липида удаляют.
2
3
f. Липосомную эмульсию, содержащую введенный тканевой фактор, разбавляют раствором в 3 раза больше ее объема, содержащим 0,025 М трицина, 0,25 М глицина, 0,11 М NaCl, 0,02М CaCl, 0,025 М NaN, 16 г/л ПЭГ 4000 и 0,0024 М Полибрена. Значение pH разбавляющего раствора устанавливается равным 7,4 с помощью 5М NaOH.
Проверка качества продукта выполнялась с помощью теста на протромбиновое время.
Измеренное время коагуляции составило 11,7 с на нормальной контрольной плазме и 17,0 с на патологической контрольной плазме.
8. Дополнительная стабилизация реагента для определения протромбинового времени, полученного путем одновременной [in situ] сборки липосом и внедрения активного компонента (тканевой фактор) с помощью лиофилизации, когда в качестве образующей матрицу добавки используется бычий сывороточный альбумин
a. 1 г фосфолипидной смеси, выделенной из порошка из мозга кролика, растворяют в 1 мл смеси хлороформ-метанол с пропорцией 2:1, содержащей 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученная смесь геля хранится в жидком состоянии при 55°C.
3
b. Готовят смесь из раствора 0,07 М трицина и 0,05 М NaN при значении pH=6,6, установленном с помощью 5М NaOH, и 0,8 М водного раствора рекомбинантного тканевого фактора в пропорции 1:1.
c. При комнатной температуре (25°C) с помощью стеклянного шприца 50 µл фосфолипидного раствора осторожно вводят слоями под 1 мл раствора, полученного как описано в пункте b.
d. Фазы встряхивают вместе с большой скоростью.
e. Осажденные гранулы липида удаляют.
f. В качестве образующей матрицу добавки к продукту добавляют бычий сывороточный альбумин (BSA), предпочтительно в концентрации 0,1 мМ.
g. Эмульсию, полученную в соответствии с пунктом f, заливают в ампулу для лиофилизации.
h. Содержимое вышеупомянутой ампулы подвергается лиофилизации.
2
3
i. Перед использованием лиофилизированное вещество растворяют в 4 мл раствора 0,025 М трицина, 0,25 М глицина, 0,11 М NaCl, 0,02M CaCl, 0,025 М NaN, 16 г/л ПЭГ 4000 и 0,0024 М Полибрена. Значение pH разбавляющего раствора устанавливается равным 7,4 с помощью 5М NaOH.
Проверка качества продукта выполнялась с помощью теста на протромбиновое время.
Измеренное время коагуляции составило 12,4 с на нормальной контрольной плазме и 19,8 с на патологической контрольной плазме.
9. Дополнительная стабилизация реагента для определения протромбинового времени, полученного путем одновременной [in situ] сборки липосом и внедрения активного компонента (тканевой фактор) с помощью лиофилизации, когда в качестве образующей матрицу добавки используется маннит
a. 1 г фосфолипидной смеси, выделенной из порошка из мозга кролика, растворяют в 1 мл смеси хлороформ-метанол с пропорцией 2:1, содержащей 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученная смесь геля хранится в жидком состоянии при 55°C.
3
b. Готовят смесь из раствора 0,07 М трицина и 0,05 М NaN при значении рН=6,6, установленном с помощью 5М NaOH, и 0,8 М водного раствора рекомбинантного тканевого фактора в пропорции 1:1.
c. При комнатной температуре (25°C) с помощью стеклянного шприца 50 µл фосфолипидного раствора осторожно вводят слоями под 1 мл раствора, полученного как описано в пункте b.
d. Фазы встряхивают вместе с большой скоростью.
e. Осажденные гранулы липида удаляют.
f. В качестве образующей матрицу добавки к продукту добавляют маннит, предпочтительно в концентрации 1-3%.
g. Эмульсию, полученную в соответствии с пунктом f, заливают в ампулу для лиофилизации.
h. Содержимое вышеупомянутой ампулы подвергается лиофилизации.
2
3
i. Перед использованием лиофилизированное вещество растворяют в 4 мл раствора 0,025 М трицина, 0,25 М глицина, 0,11 М NaCl, 0,02M CaCl, 0,025 М NaN, 16 г/л ПЭГ 4000 и 0,0024 М Полибрена. Значение pH разбавляющего раствора устанавливается равным 7,4 с помощью 5М NaOH.
Проверка качества продукта выполнялась с помощью теста на протромбиновое время. Измеренное время коагуляции составило 12,7 с на нормальной контрольной плазме и 17,7 с на патологической контрольной плазме.
10. Дополнительная стабилизация реагента для определения протромбинового времени, полученного путем одновременной [in situ] сборки липосом и внедрения активного компонента (тканевой фактор) с помощью лиофилизации, когда в качестве образующей матрицу добавки используется сахароза
a. 1 г фосфолипидной смеси, выделенной из порошка из мозга кролика, растворяют в 1 мл смеси хлороформ-метанол с пропорцией 2:1, содержащей 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученная смесь геля хранится в жидком состоянии при 55°C.
3
b. Готовят смесь из раствора 0,07 М трицина и 0,05 М NaN при значении рН=6,6, установленном с помощью 5М NaOH, и 0,8 М водного раствора рекомбинантного тканевого фактора в пропорции 1:1.
c. При комнатной температуре (25°C) с помощью стеклянного шприца 50 µл фосфолипидного раствора осторожно вводят слоями под 1 мл раствора, полученного как описано в пункте b.
d. Фазы встряхивают вместе с большой скоростью.
e. Осажденные гранулы липида удаляют.
f. В качестве образующей матрицу добавки к продукту добавляют сахарозу, предпочтительно в концентрации 1-3%.
g. Эмульсию, полученную в соответствии с пунктом f, заливают в ампулу для лиофилизации.
h. Содержимое вышеупомянутой ампулы подвергается лиофилизации.
2
3
i. Перед использованием лиофилизированное вещество растворяют в 4 мл раствора 0,025 М трицина, 0,25 М глицина, 0,11 М NaCl, 0,02 М CaCl, 0,025 М NaN, 16 г/л ПЭГ 4000 и 0,0024 М Полибрена. Значение pH разбавляющего раствора устанавливается равным 7,4 с помощью 5М NaOH.
Проверка качества продукта выполнялась с помощью теста на протромбиновое время. Измеренное время коагуляции составило 12,7 с на нормальной контрольной плазме и 17,7 с на патологической контрольной плазме.
11. Получение реагента для определения активированного частичного тромбопластинового времени с использованием липосом, предварительно полученных с помощью фаз расслаивания и встряхивания
a. 1 г фосфолипидной смеси, выделенной из порошка из мозга кролика, растворяют в 1 мл смеси хлороформ-метанол с пропорцией 2:1, содержащей 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученная смесь геля хранится в жидком состоянии при 55°C.
3
b. Готовят смесь из раствора 0,07 М трицина и 0,05 М NaN при значении pH=6,6, установленном с помощью 5М NaOH, и 0,8 М водного раствора рекомбинантного тканевого фактора в пропорции 1:1.
c. При комнатной температуре (25°C) с помощью стеклянного шприца 50 µл фосфолипидного раствора осторожно вводят слоями под 1 мл раствора, полученного как описано в пункте b.
d. Фазы встряхивают вместе с большой скоростью.
e. Осажденные гранулы липида удаляют.
f. Готовят 2% водный маточный раствор дубильной кислоты.
3
g. 2% маточный раствор дубильной кислоты разбавляют в 1,2 раза раствором 0,07 М трицина и 0,05 М NaN.
h. Из липосомной эмульсии, полученной как описано в пункте е, и раствора, полученного как описано в пункте g, готовят смесь с пропорцией 1:1 и оставляют в покое на десять минут.
4
i. Липосомную эмульсию, содержащую дубильную кислоту, разбавляют 3-кратно раствором, содержащим 0,07 М маннита, 0,25 М глицина, 0,01 М хепеса, 0,001 М NiSO, 0,2 мМ тимеросала. Значение pH разбавляющего раствора было установлено равным 7,0 с помощью 5М NaOH.
Проверка качества продукта выполнялась с помощью теста на активированное частичное тромбопластиновое время. Измеренное время коагуляции составило 40,1 с на нормальной контрольной плазме и 76,9 с на патологической контрольной плазме.
12. Получение реагента для определения активированного частичного тромбопластинового времени с использованием липосом, предварительно полученных путем добавления по каплям липидного раствора в водную фазу при вихревом движении, когда вихрь создается с помощью магнитной мешалки и вращающего смесительного элемента.
a. 1 г фосфолипидной смеси, выделенной из порошка из мозга кролика, растворяют в 1 мл смеси хлороформ-метанол с пропорцией 2:1, содержащей 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученная смесь геля хранится в жидком состоянии при 55°C.
3
b. 100 µл фосфолипидного раствора по каплям с помощью шприца вводят в 10 мл раствора 0,07 М трицина и 0,05 М NaN, приведенного в быстрое вихревое движение при комнатной температуре (25°C). Значение pH водного раствора устанавливается равным 6,6 с помощью 5М NaOH.
c. Осажденные гранулы липида удаляют.
d. Готовят 2% водный маточный раствор дубильной кислоты.
3
e. 2% маточный раствор дубильной кислоты разбавляют в 1,2 раза раствором 0,07 М трицина и 0,05 М NaN.
f. Из липосомной эмульсии и раствора, полученного как описано в пункте e, готовят смесь с пропорцией 1:1, смесь оставляют в покое на десять минут.
4
g. Липосомную эмульсию, содержащую дубильную кислоту, разбавляют 3-кратно раствором, содержащим 0,07 М маннита, 0,25 М глицина, 0,01 М хепеса, 0,001 М NiSO, 0,2 мМ тимеросала. Значение pH разбавляющего раствора было установлено равным 7,0 с помощью 5М NaOH.
Проверка качества продукта выполнялась с помощью теста на активированное частичное тромбопластиновое время. Измеренное время коагуляции составило 36,2 с на нормальной контрольной плазме и 60,5 с на патологической контрольной плазме.
13. Получение реагента для определения активированного частичного тромбопластинового времени с использованием липосом, предварительно полученных путем добавления по каплям липидного раствора в водную фазу при вихревом движении, когда вихрь создается с помощью эксцентричного вращения смесителя.
a. 1 г фосфолипидной смеси, выделенной из порошка из мозга кролика, растворяют в 1 мл смеси хлороформ-метанол с пропорцией 2:1, содержащей 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученная смесь геля хранится в жидком состоянии при 55°C.
3
b. 100 µл фосфолипидного раствора по каплям с помощью шприца вводят в 10 мл раствора 0,07 М трицина и 0,05 М NaN, приведенного в быстрое вихревое движение при комнатной температуре (25°C). Значение pH водного раствора устанавливается равным 6,6 с помощью 5М NaOH.
c. Осажденные гранулы липида удаляют.
d. Готовят 2% водный маточный раствор дубильной кислоты.
3
e. 2% маточный раствор дубильной кислоты разбавляют в 1,2 раза раствором 0,07 М трицина и 0,05 М NaN.
f. Из липосомной эмульсии и раствора, полученного как описано в пункте e, готовят смесь с пропорцией 1:1, смесь оставляют в покое на десять минут.
4
g. Липосомную эмульсию, содержащую дубильную кислоту, разбавляют 3-кратно раствором, содержащим 0,07 М маннита, 0,25 М глицина, 0,01 М хепеса, 0,001 М NiSO, 0,2 мМ тимеросала. Значение pH разбавляющего раствора устанавливается равным 7,0 с помощью 5М NaOH.
Проверка качества продукта выполнялась с помощью теста на активированное частичное тромбопластиновое время. Измеренное время коагуляции составило 36,2 с на нормальной контрольной плазме и 60,5 с на патологической контрольной плазме.
Наиболее важным техническим преимуществами описанных выше методов для изготовления реагентов для исследования свертывания крови является то, что они могут быть реализованы с помощью простых и дешевых устройств (смеситель) и реагентов. Детергент не используется, поэтому нет необходимости удалять его, и не требуется дополнительная обработка полученных липосом (как, например, экструзия).
Наиболее важным экономическим преимуществом настоящего изобретения является то, что для его осуществления не требуются дорогостоящие реагенты и способы получения липосом, не требуется применение детергентов для растворения тканевого фактора, а полученные липосомы пригодны для изготовления реагентов для исследования свертывания крови напрямую, без какой-либо последующей обработки. Еще одно экономическое преимущество заключается в том, что изобретение, кроме того, может быть реализовано таким образом, что сборка липосом и изготовление реагентов может осуществляться за один единственный этап, в результате чего можно сэкономить дополнительные расходы. Реагент для определения протромбинового времени [РТ], изготовленный с помощью описанного в изобретении метода, демонстрирует биохимические характеристики, идентичные биохимическим характеристикам тромбопластина, выделенного из природных источников.