ШТАММ Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 ДЛЯ РАЗЛОЖЕНИЯ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ
Gordona terrae VKPM As-1741 STRAIN FOR DECOMPOSING PETROLEUM AND PETROLEUM PRODUCTS

Изобретение относится к микробиологии и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и нефтепродукты, которая может быть использована, например, для очистки загрязненных поверхностей.
Загрязнение нефтью и нефтепродуктами окружающей среды является актуальной экологической проблемой современного мира. Добыча, транспортировка, переработка и хранение углеводородов неизбежно влечет утечки значительных количеств токсичного поллютанта во внешнюю среду и его накопления. Решение данной проблемы включает использование метаболического потенциала нефтеокисляющих микроорганизмов.
6
Наиболее близким аналогом является штамм Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1668, выделенный из нефтезагрязненных почв республики Башкортостан (патент RU 2257409, МПК С12N 1/20, В09С 1/20, C02F 3/34). Штамм используется для очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений. Согласно способу очистка осуществляется путем внесения в объект окружающей среды (вода, почва) культуральной жидкости с конечным содержанием бактериальных клеток 1·10 кл/мл с добавлением 0,2% нитроаммофоски.
Известен штамм Rhodococcus globerulus Н-42, выделен при воздействии космических излучений на штамм Rhodococcus globerulus TCH-OK (патент RU 2300561 С1, МПК С12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/100). Штамм используется для разложения нефти и нефтепродуктов.
Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении нового штамма, обеспечивающего высокоэффективную очистку загрязненных поверхностей от нефти и нефтепродуктов, являющихся единственными источниками углерода и энергии в процессе очистки.
Указанный технический результат достигается новым штаммом Gordona terrae ВКПМ Ac-1741, выделенным из озера Беленовское Оренбургского района Оренбургской области из альго-бактериальной ассоциации зеленой водоросли Chlamydomonas Reinhardtii Dang.
Выделенный штамм Gordona terrae ИКВС 19 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИ Генетики и имеет регистрационный номер Ас-1741.
Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков.
Химический состав клеточной стенки анализировали методом тонкослойной газожидкостной хроматографии (Методы почвенной микробиологии и биохимии. Под ред. Д.Т. Звягинцева, М.: МГУ, 1991, с.131-133).
Биохимическую идентификацию проводили с использованием дифференциально-диагностических сред, описанных в «Справочнике по микробиологическим и вирусологическим методам исследования» под ред. Биргера М.О., Москва, 1982 и в «Определителе бактерий Берджи» под ред. Дж.Хоулта и др., изд. «Мир», 1997.
Хранение штамма осуществляется на 0,7% МПА при температуре 4°С в течение 3-х месяцев. Более длительное хранение осуществляется путем периодического (раз в 3 месяца) пересева на свежую питательную среду или путем лиофильного высушивания штамма с последующим хранением в запаянных ампулах при температуре 4°С.
Условия и среды для размножения штамма: посев исходной культуры на 1,5% МПА, или модифицированный агар Чапека, или среду Раймонда, содержащую нефть или нефтепродукты в качестве единственного источника углерода, с последующим выращиванием в условиях термостата при t 25-27°С в течение 48 часов.
Штамм Gordona terrae ВКПМ Ac-1741 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
При выращивании на обычных питательных средах при температуре 25-27°С штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 на поверхности плотной питательной среды растет в течение двух суток с образованием характерных изолированных колоний бледно-оранжевого цвета. На модифицированном агаре Чапека растет в течение двух суток с образованием характерных слизистых изолированных колоний ярко-оранжевого цвета. При дальнейшем культивировании наблюдается слизистый «сливной» рост. Пигмент, не диффундирующий в среду. При выращивании в мясопептонном бульоне штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 растет в течение двух суток и вызывает равномерное помутнение среды, к шестым суткам культивирования образуется осадок оранжевого цвета.
На минеральной среде Раймонда, содержащей нефть или нефтепродукты в качестве единственного источника углерода, штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 к третьим суткам образует бактериальную пленку на границе раздела «среда-нефтепродукт». Эта бактериальная пленка на границе «среда-нефтепродукт» к шестым суткам утолщается, в толще среды образуется слегка опалесцирующая муть. Визуально наблюдается изменение структуры нефти: нефтяная пленка становиться неровной, появляются «окна», под слоем нефти формируется беловато-кремовое кольцо, образованное бактериями. При встряхивании нефть распадается на мелкие хлопья коричневого цвета, что не наблюдается при встряхивании нативной нефти.
В состав клеточной стенки штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 входит мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза, миколовые кислоты, что соответствует 4-му типу клеточной стенки (Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии/ Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М. - Киев: Наук. Думка, 1985, стр.336).
Физиолого-биохимические признаки.
По типу питания штамм является прототрофом. Обладает бродильным типом метаболизма, продуцирует уреазу, желатиназу, амилазу; фосфатаза - отрицательный, протеолитические ферменты отсутствуют, восстанавливает нитраты в нитриты, усваивает натриевые соли α-кетоглутаровой кислоты, не разлагает тирозин, не растет на среде с моноэтаноламином, растет на среде, содержащей 7% натрия хлорид; не образует кислоту из мальтозы, лактозы; образует кислоту из галактозы, сахарозы, фруктозы, сорбита, маннита; чувствителен к лизоциму.
Штамм обладает высоким уровнем каталазной активности, что обеспечивает устойчивость заявляемого штамма к активным формам кислорода, которые образуются в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов (Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный С.В. Механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами // Успехи соврем. биологии, 2006 г. - Т.3. - С.285-296).
Уровень каталазной активности продуцируемой Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 определяется фотометрически по методике (Бухарин О.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В. и др. Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 P. // Билл. эксперим. биологии, 2000 г. - Т.130, №7. - С.80-82).
6
3
7
3
Накопление численности клеток по сравнению с исходным количеством (1·10кл/см) при росте на минеральной питательной среде Раймонда, содержащей нефть в качестве единственного источника углерода и энергии, происходит к 6 суткам и составляет 7·10кл/см. Таким образом, количество клеток по сравнению с исходным увеличивается в 70 раз. При потреблении нефти или нефтепродукта на 50% и более происходит постепенное снижение численности штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741, что связано с уменьшением количества углерода в среде, при условии использования нефти и нефтепродуктов в качестве единственного источника углерода.
Эффективность нефтепотребления штамма к 6 суткам составляет от 50% до 90% зависимости от вида углеводорода. Эффективность нефтепотребления определяли на среде Раймонда визуально по степени деградации нефти, а также по результатам химанализа с использованием флуориметрического метода.
Применение на практике данного штамма обуславливается его физиолого-биохимическими особенностями. Заявляемый штамм предназначен для ликвидации последствий загрязнения воды и почвы нефтью и нефтепродуктами.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1.
Культуру штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 выращивали на агаризированной среде Чапека следующего состава: нитрат натрия 2 г, двузамещенный фосфат калия 1 г, сульфат марганца 7-водный 0,5 г, хлорид калия 0,5 г, сульфат железа (II) 7-водный 0,01 г, сахароза 30 г, дрожжевой экстракт 2 г, агар-агар 15 г, дистиллированная вода 1000 мл. Приготовленную среду разливали по флаконам, автоклавировали при 1 атм в течение 20 мин. Питательную среду остужали до 45-50°С, разливали по стерильным чашкам Петри в объеме 10 мл. Давали питательной среде застыть. На застывшую поверхность агаризованной среды Чапека засевали бактериологической петлей (d 0,4 мм) культуру штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 среды. Посевы выращивали в термостате при температуре 25-27°С в течение 48 часов. Из выращенной культуры готовили взвесь по стандарту мутности БАК-5 (ГИСК им. Л.А.Тарасевича).
Пример 2.
Культуру штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 выращивали и готовили из нее взвесь аналогично примеру 1.
3
3
3
6
3
1 см приготовленной взвеси вносили в опытную среду Раймонда следующего состава: хлорид аммония 2 г, сульфат магния 7-водный 0,2 г, однозамещенный фосфат калия 2 г, двузамещенный фосфат натрия 3 г, хлорид кальция 6-водный 0,01 г, карбонат натрия 0,1 г, сульфат марганца 5-водный 1% раствор 2 мл, сульфат железа (II) 1% раствор 1 мл, вода дистиллированная 1000 мл. В качестве единственного источника углерода добавляли стерильное дизельное топливо из расчета 1 см на 1 дм среды. Исходная концентрация штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 в среде Раймонда составляла 1·10 кл/см. Время инкубации - 35 суток при температуре 25-27°С.
3
Готовили контроль для учета испаряемости дизельного топлива. Для этого в среду Раймонда добавляли дизельное топливо из расчета 1 см на 1 л среды. Время инкубации - 35 суток при температуре 25-27°С.
3
В процессе эксперимента рост численности бактерий учитывали чашечным методом путем посева инокулята, объемом 0,1 см на питательную агаризированную среду Чапека. Подсчет выросших колоний осуществляли с помощью установки для автоматического учета колоний микроорганизмов на чашках ProtoCOL HR (Great Britan).
Химический анализ на содержание нефтепродуктов проводили флуориметрическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат - 02». Деструкцию нефтепродуктов бактериями рассчитывали по формуле:
Д=((с1-с2)/с 1)·100%, где
Д - деструкция нефтепродуктов, %;
3
с1 - начальное содержание нефтепродуктов, мг/дм;
3
с2 - содержание нефтепродуктов в опыте, мг/дм.
Максимальная интенсивность деструкции дизельного топлива была отмечена на 6 сутки - 95,6% (таблица 1).
Пример 3.
Аналогично примеру 2 проводили эксперимент со штаммом Gordona terrae ВКПМ Ас-1741. В качестве единственного источника углерода и энергии в минеральную среду Раймонда добавляли нефть Сорочинского месторождения (Оренбургская область).
По результатам химического анализа штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 к 12 суткам эксперимента потребил до 48%, к 35 суткам убыль нефти в опыте составила 78,8% (таблица 2).
Пример 4.
Культуру штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 выращивали аналогично примеру 1.
6
3
В качестве модели был использован образец загрязненной почвы с территории Бугурусланского месторождения (Оренбургская область). Для биообработки поверхности почвы готовили взвесь штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 в пресной воде с конечной концентрацией клеток 1·10 кл/см. Взвесью обрабатывали загрязненную почву. На почве при пересыхании обрабатываемой поверхности проводили полив и рыхление.
Готовили контроль из загрязненного углеводородами образца почвы, взятого с того же участка, что и в опыте, без внесения каких-либо дополнительных микроорганизмов.
По результатам химического анализа штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 к 6 суткам эксперимента потребил до 55,9%, к 35 суткам убыль нефти в опыте составила 78,0% (таблица 2).
В таблицах 1, 2, 3 приведены результаты тестирования деградирующей способности штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 в лабораторных экспериментах.
В таблице 1 представлены результаты лабораторного тестирования деградирующей способности штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 в отношении дизельного топлива.
Таблица 1
Объект
Сутки
Содержание дизельного топлива,
Степень очистки, %
мг/дм<sup>3</sup>
%
Gordona terrae ВКПМ Ас-1741
0
610
100
0
6
26,8
3,6
95,6
12
20,3
2,7
96,7
23
10,6
1,4
98,3
35
0,5
0,07
99,9
Контроль
0
610
100
0
6
605
99,2
0,8
12
605
99,2
0,8
23
580
95,1
4,9
35
550
90,2
9,8
В таблице 2 представлены результаты эксперимента по утилизации нефти Сорочинского месторождения штаммом Gordona terrae ВКПМ Ас-1741.
Таблица 2
Объект
Сутки
Содержание Сорочинской нефти,
Степень очистки, %
мг/дм<sup>3</sup>
%
Gordona terrae ВКПМ Ас-1741
0
750
100
0
6
722
96,3
3,7
12
390
52
48,0
23
162
21,6
78,4
35
159
21,2
78,8
Контроль
0
750
100
0
6
669
89,2
10,8
12
652
86,9
13,1
23
623
83,1
16,9
35
607
80,9
19,1
В таблице 3 представлены результаты эксперимента по утилизации нефти Бугурусланского месторождения штаммом Gordona terrae ВКПМ Ас-1741.
Таблица 3
Объект
сутки
Содержание Бугурусланской нефти,
Степень очистки, %
мг/дм<sup>3</sup>
%
Gordona terrae ВКПМ Ac-1741
0
750
100
0
6
331
44,1
55,9
12
322
42,9
57,1
23
201
26,8
73,2
35
165
22
78,0
Контроль
0
750
100
0
6
700
93,3
6,6
12
631
84,1
15,8
23
556
74,1
25,9
35
550
73,3
26,7
В таблице 4 представлены результаты эффективности потребления нефти и нефтепродукта штаммом Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 к 6 и 35 суткам эксперимента.
Таблица 4
Вид углеводорода
Начальное содержание углеводородов
Содержание углеводородак 6 суткам эксперимента
Эффективность очистки%
Содержание углеводорода к 35 суткам эксперимента
Эффективность очистки%
мг/дм<sup>3</sup>
%
мг/дм<sup>3</sup>
%
мг/дм<sup>3</sup>
%
Дизельное топливо
610
100
26,8
3,6
95,6
0,5
0,07
99,9
Нефть Сорочинского месторождения
750
100
722
96,3
3,7
159
21,2
78,8
Нефть Бугурусланского месторождения
750
100
331
44,1
55,9
165
22
78
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 к шестым суткам может быть достигнута эффективная деградация нефти и нефтепродуктов до 50-90% в зависимости от вида углеводорода, и этот штамм может быть использован для удаления нефтяных загрязнений с поверхности почвы и водоемов.