Микробиоценоз толстого кишечника крыс при пероральном применении зооглеи Medusomyces gysevii (чайный гриб)

медицинский вестник северного кавказа

2017. Т. 12. № 1

medical news of north caucasus

2017. Vоl. 12. Iss. 1

© Коллектив авторов, 2017

УДК 616-093/-095+611.34+615.012.6

DOI - http://doi.org/10.14300/mnnc.2017.12024

ISSN - 2073-8137

МИКРОБИОЦЕНОЗ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА КРЫС ПРИ ПЕРОРАЛЬНОМ ПРИМЕНЕНИИ ЗООГЛЕИ MEDUSOMYCES GYSEVH

Н. И. Бондарева \ Л. Д. Тимченко \ Е. В. Алиева 2, Ю. М. Добрыня \ Н. И. Гандрабурова \ С. И. Писков \ Л. И. Калмыкова 2

1 Северо-Кавказский федеральный университет, Ставрополь, Россия

2 Ставропольский государственный медицинский университет, Россия

MICROBIOCENOSIS OF THE LARGE INTESTINE OF RATS AFTER ORAL APPLICATION OF ZOOGLOEAS MEDUSOMYCES GYSEVH

Bondareva N. I. 1, Timchenko L. D. 1, Alieva E. V. 2, Dobrynja Yu. M. 1, Gandraburova N. I. 1, Piskov S. I. 1, Kalmykova L. I. 2

1 North-Caucasian Federal University, Stavropol, Russia

2 Stavropol State Medical University, Russia

В настоящее время актуальной является проблема дисбиозов, для коррекции которых предпочтительно применение пребиотиков. В качестве потенциального сырьевого объекта для получения пребиотика, за счет широкого спектра биохимических составляющих микробного происхождения, рассмотрена зооглея симбионта Medusomyces gysevii (чайный гриб). Проводилось изучение влияния этой субстанции на микробиоциноз кишечника крыс. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при пероральном поступлении инакти-вированной зооглеи Medusomyces gysevii в организм млекопитающих в толстом отделе кишечника происходит изменение количественного соотношения микроорганизмов, что отражается в снижении грибов рода Candida, а также в увеличении числа животных с возросшим уровнем лакто- и бифидобактерий.

Ключевые слова: пребиотик, Medusomyces gysevii, чайный гриб, зооглея, микрофлора, кишечник

Nowadays, dysbioses is a very important problem. The most effective way to correct them is preferable to use prebiotics. Due to a wide range of biochemical constituents of microbial origin, zoogloea of a natural symbiont Medusomyces gysevii (kombucha) is a potential raw material which can be used like an object to produce a prebiotic. Study of the effect of this substance on microbiocenosis of intestine of rats was conducted. The results indicate that the oral admission of inactivated Medusomyces gysevii zoogloeas by mammals changes the quantitative composition of microorganisms' relationship in the large intestine, which is reflected in the reduction of Candida fungi, as well as in the increase of the number of animals with increased level of lactobacilli and bifidobacteria.

Keywords: prebiotic, Medusomyces gysevii, kombucha, zoogloea, microflora, intestine

Нормальная микрофлора желудочно-кишечного тракта является одним из основополагающих факторов поддержания здоровья организма [5]. все большую популярность среди эффективных средств, способствующих самовосстановлению микрофлоры кишечника посредством стимуляции собственных популяций бактерий [10], приобретают принципиально новые препараты, созданные на основе компонентов микробных клеток или их метаболитов. Актуальна разработка новых препаратов пребиотиков, обладающих поликомпонентным составом, которая в первую очередь заключается в поиске и подборе сырья, отвечающего как можно большему количеству требований, предъявляемых к субстанциям, способствующим самовосстановлению собственной кишечной микрофлоры.

В связи с вышеизложенным в качестве потенциального сырьевого объекта, за счет широкого спек-

тра биохимических составляющих микробного происхождения, нами рассмотрена плотная биомасса (зооглея) симбионта Medusomyces gysevii (чайный гриб).

Зооглея Medusomyces gysevii (чайный гриб) состоит из микробной массы (уксуснокислые бактерии, дрожжи) и метаболитов микробного происхождения: слизистой основы, лигнина, клетчатки, которая включает в себя целлюлозу, гемицеллюлозу [13, 14], и ферментативной жидкости, составляющей до 90 % от общего объема. Ферментативная жидкость имеет достаточно сложный химический состав: органические кислоты (яблочная, молочная, уксусная, глюку-роновая, глюконовая, лимонная, щавелевая, пиро-виноградная, фосфорная), этиловый спирт, сахара (моносахариды, дисахариды), витамины (с, В!, РР, D), ферменты (амилаза, сахараза, протеаза, катала-за), липиды (фосфатиды, стерины, жирные кислоты), пигменты, пуриновые основания, дубильные веще-

оригинальные исследования

Экспериментальная медицина

oRiGiNAL RESEARCH

Experimental medicine

ства, смолистые вещества, альдегиды, белки, кофеин, сапонины [3]; проявляет бактериостатическое и бактерицидное действие в отношении Helicobacter pylori, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Agrobacterium tumefaciens, Bacillus cereus, Shigella sonnei, Salmonella enteritidis, Escherichia coli [11, 12].

Таким образом, целью проведенного исследования являлось изучение влияния зооглеи Medusomyces gysevii (чайный гриб) на микробиоценоз толстого кишечника крыс.

Материал и методы. В исследовании была использована зооглея Medusomyces gysevii, находящаяся в двадцатисуточной культуральной жидкости. Для культивирования Medusomyces gysevii готовили жидкую питательную среду по универсальному рецепту: в кипящую воду объемом 1 л добавляли 100 г сахара до полного его растворения, затем в этот раствор на 20 минут помещали марлевый мешочек, содержащий 10 г черного чая, и охлаждали до комнатной температуры (24-26 °С). В емкость с полученной средой вносили 100 г массы зооглеи, закрывали четырехслой-ной марлевой салфеткой, обеспечивающей доступ кислорода, необходимый для нормальной жизнедеятельности бактерий симбионта Medusomyces gysevii. Культивирование симбионта производили при температуре 25-30 °C [3, 4].

С целью исключения дополнительного проби-отического эффекта для инактивации микробной составляющей массу зооглеи перед скармливанием автоклавировали при 110 °С 15 минут. Контроль стерильности осуществляли в соответствии с МУК 4.2.577-96 [6]. Расчет количества применяемого вещества, кратности и длительности применения производили исходя из рекомендаций к применению пребиотических препаратов[5].

Исследование микробиоценоза кишечника при пероральном применении зооглеи Medusomyces gysevii (чайный гриб) проводилось на 60 половозрелых крысах - самцах линии Вистар со средней массой 250 г, в возрасте 9 месяцев. Животные содержались в виварии в стандартных условиях. Все эксперименты на животных были выполнены согласно Директиве EC 86/609/EEC и в соответствии с законодательством Российской Федерации, регулирующим проведение экспериментов на животных. С учетом результатов, полученных Н. И. Пеньковой, Г. Н. Блажновой [8], особое внимание уделяли организации кормления, при этом поддерживался режим, рекомендуемый НИИ питания РАН. Крысам опытной группы (n=30) три раза в день на протяжении тридцати дней скармливали зооглею чайного гриба в количестве 160 мг на 1 кг массы в сутки. Крысам контрольной группы (n=30) скармливание зоо-глеи чайного гриба не производили.

Бактериологический анализ проводили по стандартным методикам [7].

Материалом для бактериологического исследования послужили фекалии крыс. Пробу для исследования брали из средней или последней порции фекалий. Сбор фекалий производили в стерильную, герметически закрывающуюся посуду стерильным шпателем. Время от момента взятия материала до его обработки в лаборатории не превышало 5 часов. В промежутке между взятием пробы и посевом хранение материала осуществляли при температуре +4 °С.

Отбирали навеску фекалий и после взвешивания гомогенизировали её в таком объеме физиологического раствора (0,85 % раствор хлорида натрия, pH 7,0), чтобы получить исходное разведение материала в 10 раз (1 г навески - 9 мл физиологическо-

го раствора). Содержимое тщательно перемешивали стеклянной палочкой и оставляли при комнатной температуре на 10-15 минут. Далее готовили дальнейшие десятикратные разведения. В расставленные в штативе пробирки вносили по 4,5 мл стерильного нейтрального физиологического раствора. Из первого разведения стерильной пипеткой объемом 1 мл с неповрежденным концом переносили 0,5 мл материала во вторую пробирку. При этом кончик пипетки прислоняли к внутренней стенке пробирки, не касаясь содержащейся в ней жидкости. После этого пипетку сбрасывали, брали другую такую же пипетку и перемешивали жидкость во второй пробирке путем пипетирования не менее 5 раз. После перемешивания этой же пипеткой переносили 0,5 мл в следующую пробирку, соблюдая те же правила, пока не закончили подготовку всех разведений. Из приготовленных разведений делали дозированные посевы на селективные питательные среды для культивирования различных групп микроорганизмов.

Эффективность исследования в значительной степени зависит от набора и качества используемых селективных питательных сред. При проведении данного исследования использовались питательные среды: Блаурокка (ФБУН Ростов НИИМП Роспотребнадзора), MRS - Agar (Base) (SIFIN Institut für Immunpräparate und Nährmedien GmbH, Берлин, Германия), Плоскирева (Микроген НПО ФГУП НПО «Питательные среды», Россия), Эндо (НПО «Питательные среды», Махачкала), Левина (ГНЦ ПМБ, Оболенск), кровяной агар (Агат-Мед, Москва), агар манитол-солевой (Lab M, Великобритания), Вильсон - Блера (ХимМедСервис, Ярославль), Сабуро (ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск), агар МакКонки (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, Индия), висмут-сульфитный агар (Микроген НПО ФГУП НПО «Питательные среды», Россия), Клиглера (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск), цитратный агар Симмонса (Микроген НПО ФГУП НПО «Питательные среды», Россия).

После инкубации при 37 °С в течение 48 часов в аэробных условиях и в условиях анаэробиоза 72 часа производили учет и идентификацию выросших микроорганизмов. Подсчет колоний аэробных бактерий на плотных питательных средах производили по формуле

M = N xio n+1, где M - количество микроорганизмов в 1 г фекалий;

N - количество выросших на чашке колоний;

n - степень разведения фекалий.

Подсчет колоний производили при помощи счетчика колоний микроорганизмов Scan 100 (Interscience, Франция).

Идентификацию выделенных культур микроорганизмов производили по характерным культуральным свойствам на агаровых средах, по наличию характерных клеток в мазках, окрашенных по Граму, а также с использованием биохимических тест-систем, зарегистрированных в РФ.

Микроскопию проводили с использованием Axio Imager 2 (A2) (Carl Zeiss Microscopy, Германия), микроскопа Axio ZOOM.V16 (Carl Zeiss Microscopy, Германия). Визуализацию изображения микропрепаратов производили при помощи специализированной фотокамеры AxioCam MRc5 и программного обеспечения Zena 2012 Pro (Carl Zeiss Microscopy, Германия).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программы Primer of Biostatistics (Version 4.03).

Результаты и обсуждение. На начальном этапе эксперимента, до кормления крыс зооглеей Medusomyces gysevii, у всех экспериментальных жи-

медицинский вестник северного кавказа

2017. Т. 12. № 1

вотных, вошедших в опытную и контрольную группы, было проведено фоновое бактериологическое исследование содержимого толстого кишечника.

Принципиальных отличий в качественном и количественном составе микрофлоры толстого отдела кишечника крыс, отобранных в контрольную и опытную группы, не наблюдалось (табл. 1). Патогенные микроорганизмы и микроорганизмы рода Proteus, Klebsiella, dtrobacter, гемолизирующая флора у всех экспериментальных крыс до начала кормления зоо-глеей Medusomyces gysevi нами не обнаружены.

Анализ состава микрофлоры толстого отдела кишечника крыс контрольной группы, проведенный после окончания эксперимента, показал отсутствие качественных и достоверных количественных изменений по сравнению с данными, полученными на начальном этапе у этих животных (табл. 1). После перорального примене-

medical news of north caucasus

2017. Vоl. 12. Iss. 1

ния зооглеи Medusomyces gysevii установлены количественные изменения показателей кишечной микрофлоры у экспериментальных крыс опытной группы (табл. 1). Так, отмечено достоверное увеличение количества Bifidobacterium spp. на 10,6 %, Lactobacillus spp. - на 12,6 %, снижение количества Candida spp. - на 16,3 %.

Патогенные микроорганизмы и микроорганизмы рода Proteus, Klebsiella, dtrobacter, гемолизирующая флора у всех экспериментальных крыс опытной группы после кормления их зооглеей Medusomyces gysevi нами не обнаружены.

Из данных внутригруппового анализа состава микрофлоры кишечника крыс (табл. 2) видно, что в контрольной группе после окончания эксперимента не наблюдалось качественных и количественных изменений по сравнению с данными, полученными на начальном этапе у этих животных.

Таблица 1

качественный и количественный состав микрофлоры толстого кишечника крыс,

1д кОЕ/г

Микрофлора Начало эксперимента Завершение эксперимента

Контрольная группа, n = 30 Опытная группа, n = 30 Контрольная группа, n = 30 Опытная группа, n = 30

Bifidobacterium spp. 7,79±0,38 7,85±0,34 7,84±0,27 8,68±0,16*

Lactobacillus spp. 6,89±0,22 6,92±0,31 6,85±0,19 7,79±0,31*

Escherichia coli 4,16±0,13 4,11±0,17 4,06±0,15 4,79±0,32

Candida spp. 2,67±0,22 2,63±0,18 2,46±0,23 2,20±0,07*

*(Р<0,05) - в сравнении с показателями данной группы на начальном этапе эксперимента.

Таблица 2

Частота выявления отдельных представителей микрофлоры толстого кишечника крыс, %

Срок исследования Bifidobacterium spp. Lactobacillus spp. Escherichia coli Staphylococcus spp. Candida spp.

106 107 109 105 106 107 108 109 103 104 105 102 104 105 102 103 106

Контрольная группа

начало эксперимента, % выделения 63,3 - 36,7 - 13,3 80 - 6,7 60 6,7 33,3 - - 26,7 63,3 26,7 10

Завершение эксперимента, % выделения 60 - 40 - 16,7 80 - 3,3 60 10 30 - - 26,7 60 30 10

Опытная группа

начало эксперимента, % выделения 60 - 40 20 - - 80 - 66,6 6,7 26,7 - - 23,3 60 33,3 6,7

Завершение эксперимента, % выделения - 46,7 53,3 - 13,3 - - 86,7 26,7 40 33,3 - 20 83,3 16,7 -

При этом внутригрупповой анализ данных в опытной группе показал:

- Bifidobacterium spp. до начала применения субстанции Medusomyces gysevii обнаружены в количестве 109 КОЕ у 40 % животных и 106 КОЕ - у 60 %; после применения Medusomyces gysevii 109 КОЕ - у 53,3 % животных и 107 КОЕ - у 46,7 %.

- Lactobacillus spp. до начала применения субстанции Medusomyces gysevii обнаружены в количестве 108 КОЕ у 80 % животных и 105 КОЕ - у 20 %; после применения Medusomyces gysevii 109 КОЕ - у 86,7 % животных и 106 КОЕ у - 13,3 %.

- Escherichia coli до начала применения субстанции Medusomyces gysevii обнаружена в количестве 105 КОЕ у 26,7 % животных, 104 КОЕ - у 6,7 % и

103 КОЕ - у 66,6 %; после применения Medusomyces gysevii 105 КОЕ - у 33,3 % животных, 104 КОЕ - у 40 %, 103 КОЕ - у 26,7 %.

- Staphylococcus spp. до начала применения субстанции Medusomyces gysevii обнаружен в количестве 105 КОЕ у 23,3 % животных; после применения Medusomyces gysevii 105 КОЕ - у 20 % животных.

- Candida spp. до начала применения субстанции Medusomyces gysevii обнаружены в количестве 106 КОЕ у 6,7 % животных, 103 КОЕ - у 33,3 % , 102 КОЕ - у 60 %; после применения Medusomyces gysevii 103 КОЕ обнаружены у 16,7 % животных, 102 КОЕ - у 83,3 %.

Полученные результаты согласуются с имеющимися данными М. Н. Веревкиной, В. В. Хачатряна [1, 9]. Однако в их исследованиях с целью коррекции ми-

оригинальные исследования

Экспериментальная медицина

ORiGiNAL RESEARCH

щ Experimental medicine

крофлоры кишечника у человека и животных использовали только культуральную жидкость, в которой снижено содержание или отсутствует ряд веществ, присутствующих в зооглее Medusomyces gysevii (чайный гриб) и являющихся признанными пребиотика-ми. Эти исследования доказывают симбиотическое действие культуральной жидкости, в котором долю пребиотического эффекта трудно оценить за счет отсутствия возможности четкой унификации и стандартизации микробной составляющей. Следует отметить, что на практике именно зооглея остается не использованным побочным сырьем после получения культуральной жидкости, которая широко применяется в пищевой промышленности. Однако до сегодняшнего дня в этом направлении исследований зооглеи Medusomyces gysevii (чайный гриб) не было.

Литература

1. Веревкина, М. Н., Природные микробные ассоциации / М. Н. Веревкина, Е. В. Светлакова, С. Н. Повет-кин, С. В. Пруцаков // Ветеринария Кубани. - 2010. -№ 4. - С. 19-20.

2. Волкова, Е. В. Особенности микробной сукцессии кишечника крыс в норме и при экспериментальном дис-бактериозе в постнатальном онтогенезе / Е. В. Волкова, Н. И. Гандрабурова // Экология человека. - 2006 (Прил. 4/2). - С. 69-71.

3. Даниелян, Л. Т. Чайный гриб и его биологические особенности / Л. Т. Даниелян. - М. : Медицина, 2005. -83 с.

4. Добрыня, Ю. М. Динамика амилолитической активности культуральной жидкости Medusomycesgisevii (чайного гриба) в процессе культивирования / Ю. М. Добрыня, С. С. Аванесян, Н. И. Бондарева [и др.] // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 3. - Режим доступа: https://science-education.ru/ru/article/view?id=18777

5. Лаздин, О. А. Микробиоценоз кишечника и его коррекция / О. А. Лаздин, В. М. Червинец, Т. Д. Табакова. - Тверь, 1999. - 60 с.

6. Методы контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов: МУК 4.2.577-96.

7. Методики клинических лабораторных исследований : справочное пособие / под ред. В. В. Меньшикова. - М. : Лабора, 2009. - Т. 3.- 880 с.

Referenses

1. Verevkina M. N., Svetlakova E. V., Povetkin S. N., Prucakov S. V. Veterinarija Kubani. - Veterinariya Kubani. 2010;4:19-20.

2. Volkova E. V., Gandraburova N. I. Jekologija cheloveka. -Human ecology. 2006;4(2):69-71.

3. Danieljan L. T. Chajnyj grib i ego biologicheskie osobennosti. Mocsow: «Medicina», 2005.

4. Dobrynja J. M., Avanesjan S. S., Bondareva N. I., Timchenko L. D., Rzhepakovskij I. V., Simechjova E. I. Sovremennye problemy nauki i obrazovanija. - Modern Problems of science and education. 2015;3.

5. Lazdin O. A., Chervinec V. M., Tabakova T. D. Mikrobiocenoz kishechnika i ego korrekcija. Tver', 1999.

6. Metodi controlja productov detskogo, lechebnogo pitanija i ih komponentov: MUK 4.2.577-96.

7. Men'shikov V. V. Metodiki klinicheskih laboratornyh issledovanij: Spravochnoe posobie. M.: «Labora», 2009.

Заключение. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при пероральном поступлении зооглеи Medusomyces gysevii в организм млекопитающих в течение 30 дней в дозировке 160 мг на 1 кг веса в сутки в толстом отделе кишечника происходит изменение количественного соотношения микроорганизмов. Это выражается в увеличении уровня Lactobacillus spp. на 12,6 %, Bifidobacterium spp. - на 10,6 %, в снижении Candida spp. - на 16,3 %. Полученные результаты, по нашему мнению, подтверждают наличие пребиотического действия испытуемой субстанции.

Исследование проведено при финансовой поддержке Минобрнауки России, в рамках выполнения базовой части государственного задания (2014/216).

8. Пенькова, Н. И. Микробиоценоз кишечника белых крыс при несбалансированном кормлении в лабораторных условиях / Н. И. Пенькова, Г. Н. Блажнова // Биологическое разнообразие Кавказа : материалы X Международной конф. - Назрань, 2008. - С. 350-351.

9. Хачатрян, В. В. Чайный гриб / В. В. Хачатрян. - М. : Диля, 2012. - 240 с.

10. Чичерин, И. Ю. Аутопребиотикотерапия / И. Ю. Чичерин, И. П. Погорельский, И. А. Лаундовских [и др.] // Журнал инфектологии. - 2013. - Т. 5, № 4.- С. 43-54.

11. Юркевич, Д. И. Метод 1Н ЯМР спектроскопии в исследовании экзометаболитов развивающихся микроорганизмов : дис. ... канд. биол. наук : 03.00.02 / Юркевич Д. И. - Пущино, 2002. - 201 с.

12. Battikh, H. Antimicrobial effect of Kombucha analogues LWT / H. Battikh, A. Bakhrouf, E. Ammar // Food Sci. Technol. - 2012. - Vol. 47, № 1. - P. 71-77.

13. Jayabalan, R. Changes in content of organic acids and tea polyphenols during kombucha tea fermentation / R. Jayabalan, S. Marimuthu, K. Swaminathan // Food Chemistry. - 2007. - Vol. 102, № 1. - P. 392-398.

14. Kozyrovska, N. O. Kombuchamicrobiome as a probiotic: a view from the perspective of post-genomics and synthetic ecology / N. O., Kozyrovska, O. M., Reva, V. B., Goginyan, J. P. de Vera // Biopolymers and Cell. - 2012. -Vol. 28, № 2. - P. 103-113.

8. Pen'kova, N. I., Blazhnova, G. N. Biologicheskoe raznoobrazie Kavkaza: materiali X Mezhdunarodnoj konferencii. Nazran, 2008. P. 350-351.

9. Hachatrjan V. V. Chajnyj grib. Moscow: «Dila», 2012.

10. Chicherin I. Ju., Pogorel'skij I. P., Laundovskih I. A., Gavrilov K. E., Shabalina M. R., Dramov I. V. Zhurnal infektologii. - Journal of Infectology. 2013;5(4):43-54.

11. Jurkevich D. I. Metod 1N JaMR spektroskopii v issledovanii jekzometabolitov razvivajushhihsja mikroorganizmov. Pushhino, 2002. 201 p.

12. Battikh H., Bakhrouf A., Ammar E. Food Science and Technology. 2012;47(1):71-77.

13. Jayabalan R., Marimuthu S., Swaminathan K. Food Chemistry. 2007;102(1):392-398.

14. Kozyrovska N. O., Reva O. M., Goginyan V. B., J. P. de Vera. Biopolymers and Cell. 2012;28(2):103-113.

Сведения об авторах:

Бондарева надежда Ивановна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник; тел.: 89187595603; e-mail: nadusha.bondareva@gmail.com

Тимченко Людмила Дмитриевна, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующая лабораторией; тел.: 89054173022; e-mail: l_timchenko@mail.ru

Алиева Елена васильевна, доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом бактериологии; тел.: 89624013896; e-mail: elalieva.ru@mail.ru

Добрыня Юлия Михайловна, аспирант; тел.: 89187517996; e-mail: dobruniajulia@rambler.ru

Гандрабурова надежда Ивановна, кандидат биологических наук, начальник отдела; тел.: 89054656928; e-mail: nadivgan@mail.ru

Писков Сергей Иванович, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник; тел.: 8-905-419-1482; e-mail: piskovsi77@mail.ru

Калмыкова Людмила Ивановна, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией; тел.: 8-962-4013896; e-mail: elalieva.ru@mail.ru