СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНОЙ ЯЗВЫ РОГОВИЦЫ
METHOD OF TREATMENT OF PURULENT CORNEAL ULCER

Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, а именно к фармакотерапии глазных болезней, и может быть использовано для консервативного лечения гнойной язвы роговицы.
Предшествующий уровень
Снижение остроты зрения является одной из наиболее важных и социально значимых проблем медицины. Согласно последним данным число людей с ослабленным зрением во всем мире составляет примерно 285 миллионов человек. При этом инфекция роговицы - это одна из главных причин снижения зрения
Несмотря на применение современных антибактериальных лекарственных препаратов, эффективность лечения не является 100%. Частота осложнений бактериальных язв роговицы в виде развития десцеметоцеле, перфораций, абсцессов роговицы, эндофтальмита и панофтальмита варьирует от 9% до 37,9% (Keay L. et al. Ophthalmology. 2006; 113(1): 109-16). Эти данные актуализируют разработку новых подходов к фармакотерапии данной патологии.
Одну из ключевых ролей в патогенезе гнойной язвы роговицы играет активизация свободнорадикального окисления. Являясь эволюционно-выработанным механизмом, направленным на защиту макроорганизма от чужеродных микроорганизмов, продукция свободных радикалов при чрезмерной активизации может привести и к повреждению тканей макроорганизма, и, как следствие, к развитию осложнений (Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., 2001). Поэтому патогенетически обоснованным является применение антиоксидантов в комплексной терапии бактериальной язвы роговицы.
Известен способ лечения экспериментальной гнойной язвы роговицы, вызванной Pseudomonas aeruginosa, заключающийся в аппликации раствора супероксиддисмутазы. Данный способ улучшает течение кератита в течение первых 6 дней, предотвращая пенетрацию роговицы и уменьшая повреждение эпителия под воздействием полиморфноядерных лейкоцитов (Matsumoto K. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998; 39(1): 30-35). Однако при гнойной язве роговицы, вызванной Staphylococcus aureus (одним из основных возбудителей), местное применении супероксиддисмутазы на фоне снижения выраженности окислительного стресса, определяемого по хемилюминесценции люминола, существенно не влияет на клиническое течение репаративных процессов. (Alio J.L. et al. Cornea. 1995; 14(2): 175-179).
Известен также антибактериальный, антиоксидантный, иммуномодулирующий и антиканцерогенный препарат, содержащий лактоферрин человека и способ его применения для лечения токсикозов различной этиологии, инфекций, воспалений путем внутривенного введения раствора, а также для очищения ран, гнойных полостей и ускорения грануляции путем промывания ран раствором, содержащим препарат (патент РФ 2165769, опубл. 27.04.2001, Бюлл. 12). Данный патент был принят за прототип.
К причинам, препятствующим достижению лечебного эффекта при использовании известного препарата, принятого за прототип, относятся:
- в прототипе заявлено использование лактоферрина при конъюнктивите, однако не исследовано применение его для лечения гнойной язвы роговицы. Эти два заболевания имеют разную тяжесть клинического течения. Гнойная язва роговицы имеет скоротечность, которая нередко приводит к гибели глаза. Эти заболевания имеют также разную этиологию. При гнойной язве роговицы главными являются два важных фактора: дефицит переднего эпителия и внедрение микрофлоры в ткань роговицы. Природа нарушения эпителиального покрова роговицы может быть самая разная. Из микрофлоры, вызывающей гнойное поражение роговицы, можно назвать патогенную и паразитарную.
- ограничения по показаниям к применению препарата, содержащего лактоферрин (в прототипе описано применение лактоферрина при лечении конъюнктивита), в заявленном изобретении рассматривается гнойная язва роговицы;
- отсутствие в прототипе схемы назначения препарата, содержащего лактоферрин, в зависимости от стадии патологического процесса (инфильтрация, изъязвление, эпителизация, рубцевание);
- отсутствие данных о возможности комбинирования препарата, содержащего лактоферрин, с антибактериальными препаратами.
Реализация изобретения
Задачей заявленного изобретения является увеличение эффективности способа лечения гнойной язвы роговицы путем снижения выраженности окислительного стресса, усиления антибактериальной активности противомикробных препаратов и ускорения эпителизации роговицы.
Указанная задача решается за счет того, что в способе лечения гнойной язвы роговицы к стандартной антибактериальной терапии с использованием тобрамицина или ципрофлоксацина добавляют инстилляции в конъюнктивальную полость раствора лактоферрина в фазах инфильтрации, изъязвления и эпителизации и до начала формирования рубца, при этом концентрацию лактоферрина берут 0,5-5,0 мг/мл, а инстилляции в конъюнктивальную полость раствора лактоферрина проводят 3 раза в день по 2 капли.
Перечень фигур
На фиг. 1 представлена таблица №1. «Клинические проявления гнойной язвы роговицы на фоне разного лечения». Показано влияние инстилляций раствора лактоферрина в различных концентрациях на клиническое и гистологическое течение гнойной язвы роговицы и на бактериальную обсемененность пораженной поверхности.
На фиг. 2 представлена таблица №2. «Клинические проявления гнойной язвы роговицы на фоне разного лечения» при использовании лактоферрина с антибактериальными препаратами. Показаны данные патологии у животных без лечения, при лечении тобрамицином, при лечении тобрамицином с инстилляцией раствора лактоферрина в концентрации 0,5 мг/мл, при лечении ципрофлоксацином с инстилляцией раствора лактоферрина в концентрации 0,5 мг/мл.
На фиг. 3 представлена таблица №3. «Влияние лактоферрина, тобрамицина, ципрофлоксацина и их комбинаций на площадь дефекта эпителия в разные сроки течения гнойной язвы роговицы». Показан % отношения площади прокрашиваемого язвенного дефекта к площади наносимого повреждения в разные сроки течения гнойной язвы роговицы.
На фиг. 4 представлена таблица №4. «Влияние лактоферрина, тобрамицина, ципрофлоксацина и их комбинаций на количество колоний золотистого стафилококка при их посеве в разные сроки течения гнойной язвы роговицы». Показано количество колоний золотистого стафилококка в разные сроки течения гнойной язвы роговицы.
На фиг. 5 представлена таблица №5. «Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы (М±m)». Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы представлена в разные сроки течения гнойной язвы роговицы без лечения».
На фиг. 6 представлена таблица №6. «Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы на фоне лечения лактоферрином в концентрации 0,5 мг/мл (M±m)». Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы показана в разные сроки течения гнойной язвы роговицы.
На фиг. 7 представлена таблица №7. «Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы на фоне лечения «лактоферрином» в концентрации 1,5 мг/кг (M±m)». Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы показана в разные сроки течения гнойной язвы роговицы.
На фиг. 8 представлена таблица №8. «Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы на фоне лечения «лактоферрином» в концентрации 2,5 мг/мл (M±m)». Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы показана в разные сроки течения гнойной язвы роговицы.
На фиг. 9 представлена таблица №9. «Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы на фоне лечения «лактоферрином» в концентрации 5 мг/мл (M±m)». Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы показана в разные сроки течения гнойной язвы роговицы.
На фиг. 10 представлена таблица №10. «Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы на фоне лечения тобрамицином (M±m)». Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы показана в разные сроки течения гнойной язвы роговицы.
На фиг. 11 представлена таблица №11. «Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы на фоне лечения ципрофлоксацином (M±m)». Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы показана в разные сроки течения гнойной язвы роговицы.
На фиг. 12 представлена таблица №12. «Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы на фоне лечения тобрамицином и лактоферрином (концентрации 0,5 мг/мл) (M±m)». Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы показана в разные сроки течения гнойной язвы роговицы.
На фиг. 13 представлена таблица №13. «Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы на фоне лечения ципрофлоксацином и лактоферрином (концентрации 0,5 мг/мл) (M±m)». Выраженность окислительного стресса при развитии стафилококковой гнойной язвы показана в разные сроки течения гнойной язвы роговицы.
Раскрытие изобретения
Способ лечения гнойной язвы роговицы заключается в том, что к стандартной антибактериальной терапии (например, с использованием тобрамицина или ципрофлоксацина) добавляют инстилляции в конъюнктивальную полость раствора лактоферрина с концентрацией от 0,5 мг/мл до 5 мг/мл по 2 капли 3 раза в день в фазах инфильтрации, изъязвления и эпителизации.
Данный способ позволяет уменьшить объем изъязвления, снизить выраженность окислительного стресса, усилить антибактериальную активность противомикробных препаратов и ускорить эпителизацию роговицы.
Пример 1
Исследование эффективности воздействия различных доз лактоферрина на клиническое и гистологическое течение гнойной язвы роговицы на разных стадиях течения заболевания.
В таблице 1 представлены клинические проявления гнойной язвы роговицы на фоне лечения разными дозами лактоферрина.
Показано влияние инстилляций раствора лактоферрина в различных концентрациях на клиническое и гистологическое течение гнойной язвы роговицы и на бактериальную обсемененность пораженной поверхности.
Концентрация раствора была выбрана экспериментальным путем с учетом данных об эффективной концентрации лактоферрина в опытах in vivo.
Для этого на кроликах породы «Шиншилла» исследовалось влияние инстилляций (по две капли три раза в день) раствора лактоферрина в концентрациях 0,5 мг/мл, 1,5 мг/мл, 2,5 мг/мл, 5 мг/мл на биохимические характеристики оксидантно-антиоксидантного статуса роговицы, клиническое и гистологическое течение гнойной язвы роговицы, площадь язвенного дефекта, бактериальную обсемененность пораженной поверхности (см. фиг. 1).
Стафилококковую гнойную язву роговицы моделировали по методике Н.А. Адамовой (1990). Полученные результаты представлены в таблицах 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Из представленных данных видно, что при экспериментальной стафилококковой гнойной язве роговицы раствор лактоферрина в разных концентрациях оказывает выраженное антиоксидантное, антибактериальное и репаративное действие.
Учитывая сведения о наличии в одном глазу сочетания морфологической картины ранних стадий воспаления (альтерации и экссудации) с более поздней продуктивной стадией воспаления - пролиферацией (регенерацией эпителия роговицы), задержке полной эпителизации дна дефекта и избыточном образовании непрозрачной рубцовой ткани при применении лактоферрина в концентрациях 1,5, 2,5 и 5 мг/мл, дальнейшие эксперименты для комбинированного применения с антибактериальными препаратами (тобрамицином и ципрофлоксацином) проводили с концентрацией лактоферрина 0,5 мг/мл в фазах инфильтрации, изъязвления и эпителизации. Однако применение лактоферрина в концентрациях 1,5, 2,5 и 5 мг/мл, также дает положительный эффект по сравнению с использованием только препаратов тобрамицина или ципрофлоксацина.
Пример 2
Исследование эффективности применения комбинации лактоферрина с антибактериальными препаратами (тобрамицином и ципрофлоксацином) проводили на кроликах-самцах породы «Шиншилла», массой 2500-3000 г. Все животные были разделены на 6 групп: 1 группа - интактные животные; 2 группа - контроль патологии, животные, у которых моделировали экспериментальную гнойную язву роговицы без лечения; 3 группа - стандартное лечение гнойной язвы с помощью инстилляции антибактериального препарата тобрамицина по 2 капли три раза в день («тобрекс», «Alcon-Couvreur»); 4 группа - животные, которым к стандартной терапии тобрамицином прибавляли инстилляцию раствора (0,5 мг/мл) лактоферрина, но вводили его только в течение 14 дней; 5 группа - стандартное лечение гнойной язвы с помощью инстилляции антибактериального препарата ципрофлоксацина по 2 капли три раза в день («ципролет», «Д-р Редди'с Лабораторис Лтд»); 6 группа - животные, которым к стандартной терапии ципрофлоксацином прибавляли инстилляцию раствора (0,5 мг/мл) лактоферрина, но вводили его также только в течение 14 дней.
Вторая, третья, четвертая, пятая и шестая группы включали в себя 8 серий опытов - 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21 и 28 сутки эксперимента (или 2, 3, 4, 6, 8, 15, 22, 29 сутки после внесения бактериальной культуры). В каждой серии было по 3 кролика (6 глаз).
Для моделирования гнойной язвы роговицы использовали чистую культуру стафилококка, Staphylococcus aureus (АТСС 25923), предоставленную кафедрой микробиологии ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.
7
8
Стафилококковую гнойную язву роговицы моделировали по методике Н.А. Адамовой (1990). После инстилляционной анестезии 0,5% раствором проксиметакаина в центральных отделах роговицы трепаном диаметром 5 мм наносили насечку на глубину 150 мкм, в пределах которой роговица расслаивалась, и отсепарованные слои удалялись. В полученный дефект втирали одну стандартную петлю (10-10 KOE) чистой культуры золотистого стафилококка. Через сутки после нанесения микробов на всех глазах развивались типичные гнойные язвы роговицы. С этого момента начинали вводить исследуемые лекарственные препараты. Патология воспроизводилась на обоих глазах животных. В указанные сроки животных забивали методом воздушной эмболии под тиопенталовым наркозом.
С язвенного дефекта бактериологической петлей проводился забор материала, помещался в пробирку с 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Пипеткой 0,1 мл полученный раствор переносился на чашку Петри с желточно-солевым агаром и тщательно растирался шпателем. Учет выросших колоний осуществлялся через 48 часов инкубации в термостате при 37°С.
Затем для окрашивания язвенного дефекта и оценки его площади на роговицу наносили раствор флуоресцеина. Глаза кроликов фотографировали цифровой камерой Canon Power Shot G5. Ввод и анализ изображений осуществляли с использованием программы Adobe Photoshop CS 2.0. Оценивали относительную площадь язвенного дефекта, которую рассчитывали как отношение площади дефекта роговицы, прокрашенного флуоресцеином, к площади дефекта формируемого первоначально трепаном.
После этого роговицу разделяли на 2 части: одну часть фиксировали в 10% нейтральном формалине, для приготовления гистологических препаратов, а вторую - гомогенизировали в изотоническом фосфатном буфере с pH 7,4 - для проведения биохимических исследований полученного гомогената.
Для оценки антиоксидантного статуса роговицы определяли следующие параметры: концентрацию малонового диальдегида (МДА) по реакции с тиобарбитуровой кислотой (метод Стальной И.Д., Горишвили Т.Г., 1977); уровень безбелковых тиоловых групп (GSH) по реакции восстановления дисульфид 5,5-дитиобис(2-нитробензоата) (метод Habeeb, 1972); активность супероксиддисмутазы (SOD) по реакции торможения аутоокисления кверцитина (метод Костюк В.А. и др., 1990, Бурмистрова С.О. и др., 1997); активность глутатионпероксидазы (GPx) по реакции ферментативного восстановления глутатиона гидроперекисью третбутила (метод Paglia D.E., Valentine W.N., 1967 в модификации Панкина В.З.); активность глутатион-8-трансферазы (GT) по реакции ферментативной конъюгации глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом (метод Keen J.N., Iakoby W.B., 1978). (Фиг. 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12).
Применение комбинаций антибактериальных препаратов с лактоферрином приводит к доминированию перехода стадии инфильтрации в стадию эпителизации дефекта, существенному уменьшению доли глаз с выраженной перифокальной воспалительной реакцией, сокращению сроков начала эпителизации (в среднем на 7 дней относительно группы без лечения, на 3 дня относительно групп стандартной терапии антибактериальными препаратами), формирования фасетки (в среднем на 11 дней относительно группы без лечения, на 8 дней относительно группы стандартного лечения) и полной эпителизации (в среднем на 11 дней относительно группы без лечения, на 8 дней относительно группы лечения тобрамицином и ципрофлоксацином). Начало формирования рубца происходило раньше, чем при изолированном применении тобрамицина и ципрофлоксацина. Интенсивность помутнений была сопоставима с группами стандартного антибактериального лечения (таблица 2).
Использование комбинации лактоферрина (концентрация 0,5 мг/мл) и антибактериальных препаратов сопровождалось уменьшением площади дефекта роговицы на 7 сутки - 14 сутки как по сравнению с показателями животных контрольной группы (гнойная язва без лечения), так и по сравнению с животными, получавшими стандартное лечение (таблица 3).
На фоне комбинированного лечения антибактериальными препаратами и лактоферрином в гистологической картине роговицы на 1-3 сутки патологии отмечалась картина альтеративного и экссудативного воспаления, на 3-5 сутки - регенерация эпителия. На 7-28 сутки исследования роговица на всем протяжении имела обычное строение.
При проведении бактериологического исследования уже на третьи сутки гнойной язвы на фоне инстилляции тобрамицина или ципрофлоксацина совместно с лактоферрином при посеве материала с поверхности роговицы колонии золотистого Staphylococcus aureus не высевались (таблица 4).
На фоне применения лактоферрина в составе антибактериальной терапии экспериментальной гнойной язвы роговицы отмечалось снижение выраженности окислительного стресса как по сравнению с группой гнойной язвы роговицы, так и по сравнению с группами изолированного применения тобрамицина и ципрофлоксацина (таблица 5, 10, 11, 12, 13).
Таким образом, применение раствора лактоферрина в дозах 0,5 мг/мл, 1,5 мг/мл, 2,5 мг/мл и 5 мг/мл в качестве монотерапии экспериментальной гнойной стафилококковой язвы роговицы оказывает выраженное антиоксидантное, репаративное и антибактериальное действие. При комбинированной терапии гнойной язвы роговицы тобрамицином и ципрофлоксацином применение раствора лактоферрина в дозах 0,5 мг/мл, 1,5 мг/мл, 2,5 мг/мл и 5 мг/мл является более эффективным способом лечения гнойной язвы роговицы в сравнении с монотерапией раствором лактоферрина или монотерапией исследуемыми антибиотиками. Лечение проводится до момента окончания формирования полноценного слоя эпителия на дне язвы, то есть до начала формирования рубца, и приводит к уменьшению объема изъязвления, снижению выраженности окислительного стресса, усилению антибактериальной активности противомикробных препаратов и ускорению эпителизации роговицы, что подтверждается примерами (см. данные в таблицах).
Таким образом, поставленная задача решена в полном объеме. Приведенные примеры подтверждают промышленную применимость данного изобретения.