Способ получения ксантановой камеди
METHOD FOR PRODUCING XANTHAN GUM

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения ксантановой камеди. Ксантан (ксантановая камедь) – внеклеточный полисахарид, который представляет собой продукт жизнедеятельности бактерий Xanthomonas.
Ксантановая камедь представляет собой микробиологический полимер, широко применяемый в пищевой, фармацевтической, косметической промышленности, а также при добыче нефти.
Стандартная технология производства ксантановой камеди предусматривает осаждение полисахаридов при помощи низших спиртов – изопропилового или этилового.
Из документа RU 2639557 (опубликован 2017.12.21) известен способ получения ксантановой камеди, включающий культивирование штамма Xanthomonas campestris 2017 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, и перемешивания. Полученную культуральную жидкость центрифугируют. Для осаждения ксантана в супернатант добавляют этиловый спирт или изопропиловый спирт в соотношении 1:2. Общими признаками известного и заявленного способа являются культивирование штамма из вида Xanthomonas на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и последующим отделением ксантана. Однако, известный способ характеризуется невысоким выходом ксантановой камеди.
Известен способ получения раствора ксантановой камеди по патентному документу CN101240308 (МПК C08B37/00; C09K8/60; C12P19/06; опубл. 13.08.2008 г.). Способ получения ксантановой камеди включает культивирование бактерий Xanthomonas в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли в условиях аэрации с отделением после завершения ферментации ксантановой камеди мембранной фильтрацией, причем культивирование проводят в две стадии, на первой стадии выращивают посевной материал, на второй стадии осуществляют ферментацию с получением культуральной жидкости, содержащей ксантановую камедь, при этом используют деионизованную воду. Общими признаками известного и заявленного способов являются культивирование бактерий вида Xanthomonas в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли в условиях аэрации, причем культивирование проводят в две стадии, и отделение ксантановой камеди. Однако в известном способе не обеспечивается оптимальных условий роста бактерий, который обеспечивает повышение выхода продукта. Наиболее близким аналогом изобретения является техническое решение, описанное в патенте США US4299825 (опубликован 1981.11.10). Из прототипа известен способ получения ксантановой камеди, включающий культивирование бактерий Xanthomonas в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, с отделением после завершения ферментации ксантановой камеди двухступенчатой фильтрацией на мембранных фильтрах. Целевым продуктом в данном способе является вязкий раствор ксантана. Общими признаками известного и заявленного способов являются культивирование бактерий вида Xanthomonas в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, и отделение ксантановой камеди. Однако, известный способ не обеспечивает оптимальных условий для роста бактерий и, соответственно, высокого выхода продукта.
Исходя из предшествующего уровня техники, техническая проблема состоит в создании оптимального способа получения ксантановой камеди с высокими выходами.
Технический результат заключается в увеличении продуктивности способа, увеличении концентрации продукта в собранной среде, полученная ксантановая камедь имеет улучшенные физико-химические свойства и определенный интервал по молекулярной массе. В предложенном способе увеличена скорость роста бактерий, также увеличено содержание ксантана в культуральной жидкости. Предложенный способ обеспечивает высокую концентрацию клеток с повышенной биосинтетической активностью бактерий и тем самым увеличивает продуктивность способа и концентрацию продукта в собранной среде. Выход продукта увеличивается в связи с оптимизированными условиями для роста клеток.
Для достижения указанного технического результата в способе получения ксантановой камеди, включающем культивирование бактерий Xanthomonas в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, с отделением после завершения ферментации ксантановой камеди, при этом культивирование проводят в две стадии, на первой стадии выращивают посевной материал, на второй стадии осуществляют ферментацию с получением культуральной жидкости, содержащей ксантановую камедь, причём на первой стадии для приготовления питательной среды используют  воду с пониженным содержанием дейтерия.
Отделение ксантановой камеди от культуральной жидкости можно проводить двухступенчатой фильтрацией, причём сначала фильтрацией на полых волокнах с отделением осадка с молекулярной массой больше или равно 300 кДа, а затем концентрирование ксантановой камеди на полых волокнах с пределом отсечения меньше или равно 100 кДа путём ультрафильтрации фильтрата, полученного на предыдущей стадии. В результате на первой стадии отделяют от культуральной жидкости бактерии, на второй – ксантановую камедь.
Отделение ксантановой камеди от образующейся в результате культивирования культуральной жидкости можно проводить путем осаждения одноатомным спиртом или фильтрацией. В рамках заявленного способа предложено использование фильтрации, в частности, двухступенчатой фильтрации, что позволяет усилить технический результат в части повышения выхода продукта относительно осаждения спиртом. Работа со спиртами имеет ряд трудностей, начиная с вредных и опасных факторов работы и заканчивая экономической неэффективностью, которая заключаются в расходе дополнительных компонентов, прекращении жизнедеятельности культуральной жидкости и дополнительное загрязнение остаточным количеством примесей готовой ксантановой камеди.
Бактерии Xanthomonas выбирают из группы: Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas sp., Xanthomonas cynarae, Xanthomonas citri, Xanthomonas euversicatoria, Xanthomonas perforans, Xanthomonas gardneri, Xanthomonas fuscans и Хanthobacter viscosus.
В частном случае осуществления способа после второй фильтрации дополнительно проводят распылительное высушивание ксантановой камеди.
В предпочтительном варианте способа осадок, образовавшийся после первой ультрафильтрации, подают на  вторую стадию культивирования.
В частном случае осуществления способа культивирование на первой стадии проводят от 24 до 44 часов. В качестве источника углерода могут быть использованы глюкоза в количестве, например, от 2,0 до 3,0 % мас и гидролизат рыбокостной муки  в количестве от 2,0 до  6,0% мас, в качестве источника азота могут быть использованы меласса в количестве, например, от 2 до 3% мас. и сульфат аммония в количестве от 0,1 до 0,5% мас., а в качестве минеральных солей м,огут быть использованы   гидрофосфат калия и гептагидрат сульфата  магния в количестве, например,  от около 0,005 до около 0,02% мас.
В одном из случаев осуществления способа на второй стадии культивирования используют воду с пониженным содержанием дейтерия.
Для приготовления питательной среды возможно использование воды с содержанием дейтерия в количестве 10-20 ppm.
Технический результат достигается за счёт использования воды с пониженным содержания дейтерия («лёгкой» воды) для питательной среды, при использовании которой происходит повышение роста и выхода посевного материала, что как следствие, приводит к более высокому выходу ксантановой камеди.
1
2
16
17
18
1
16
2
1
16
2
2
Молекула воды состоит из двух атомов водорода и одного атома кислорода. Водород имеет два стабильных изотопа — протий (Н) — H и дейтерий (D) — H. У кислорода три устойчивых изотопа: O, O и O. Содержание воды, состоящей из лёгких стабильных изотопов HO («лёгкой воды», в отличие от содержащей повышенное количество тяжелого изотопа водорода H «тяжёлой воды») в природной воде составляет 99,73 — 99,76 мол.%. Лёгкая вода как моноизотопная композиция HO является предельным случаем изотопной чистоты. Природная вода представляет собой многокомпонентную смесь изотопологов. В природной воде весовая концентрация тяжёлых изотопологов может достигать 2,97 г/кг, что является значимой величиной, сопоставимой, например, с содержанием минеральных солей. Изотопологи отличаются друг от друга по физическим, химическим и биологическим свойствам. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о различии физико-химических свойств легкой воды и деионизированной воды природного изотопного состава [V. Goncharuk, V.B. Lapshin, T.N. Burdeinaya, T.V. Pleteneva, A.S. Chernopyatko et al. Physicochemical Properties and Biological Activity of the Water Depleted of Heavy Isotopes // 2011, published in Khimiya i Tekhnologiya Vody, 2011, Vol. 33, No. 1, pp. 15-25. Journal of Water Chemistry and Technology, 2011, Vol. 33, No. 1, pp. 8-13]. В наибольшей степени эффекты лёгкой воды проявляются на биологических объектах, для которых характерны каскадные реакции. Реакция биосистем при воздействии на них воды может изменяться в зависимости от количественных и качественных изменений её изотопного состава. Лёгкая (обогащенная Н или обедненная D) вода обладает высокой биологической активностью.
Известно, что в лёгкой воде изменяется скорость протекания химических реакций, сольватация ионов, их подвижность и т.д. Лёгкая вода оказывает стимулирующее действие на живые системы, существенно повышает их активность, жизнестойкость к различным негативным факторам, репродуктивную деятельность, улучшает и ускоряет обмен веществ [патент РФ 2438765]. Реакция биосистем при воздействии на них воды может изменяться в зависимости от количественных и качественных изменений изотопного состава воды. На разных объектах зарегистрирована положительная биологическая активность вод, полученных с помощью различных технологических процессов, относящихся к категории изотопно-легких, со сниженной в той или иной мере по сравнению с исходной концентрацией дейтерия. Т.е. количественные и качественные показатели изотопного состава воды существенным образом отражаются на ее эффективности при использовании воды в качестве растворителя или ингредиента.
В рамках заявленного изобретения вода с пониженным содержанием дейтерия используется как основа питательной среды на первой стадии культивирования бактерий и приводит к значительно росту бактерий.
На фиг. 1 приведен график, наглядно показывающий увеличение выхода бактерий Xanthomonas при времени культивирования в течении 24-44 часов на первой стадии с использованием воды, обедненной дейтерием.
35
49
29
n
Ксантановая камедь (ксантан) —  химическое соединение полисахарид (CHO). Свойства ксантана регулируют изменяя условия жизни бактерий. Главная цепь полимера идентична молекуле целлюлозы. Ответвления представляют собой остатки молекул глюкозы, маннозы, глюкуроновой кислоты, а также пировинограднокислые (пируватные) и ацетильные группы. Число пируватных групп определяет вязкость водных растворов ксантана. Поскольку ксантановая камедь является микробиологическим продуктом, его характеристики в большой степени зависят от микроорганизмов-продуцентов. Изменяя условия их жизнедеятельности можно регулировать молекулярную массу и свойства ксантана.
Влияние использования воды с пониженным содержанием дейтерия на технический результат обусловлено высокими скоростями образования и разрыва водородных связей при культивировании бактерий. Влияние легкой воды на жизнедеятельность бактерий оказывает влияние также и на физико-химические свойства ксантана, что позволяет получить повышенный выход ксантана определенной молекулярной массы при отделении методом фильтрации.
Использование лёгкой воды на второй стадии культивирования оказывает дополнительное влияние на процесс культивирования бактерий и образующуюся ксантановую камедь.
Дополнительно при использовании воды с пониженным содержанием дейтерия на второй стадии культивирования совместно с условиями проведения первой стадии культивирования, наблюдается увеличение выхода ксантана с определенной молекулярной массой в пределах от 100 до 300 кДа и изменение физико-химических свойств полученной ксантантановой камеди.
За счёт использования двухступенчатой фильтрации обеспечивается непрерывность процесса производства, т.к. живые бактерии культуры Xanthomonas возвращаются в процесс ферментации – на вторую стадию культивирования. В изобретении использование двухступенчатой фильтрации на полых волокнах разных размеров позволяет не только отделить штамм для последующего использования, но также провести отделение конечного продукта с обеспечением более высокой степени чистоты конечного продукта. В изобретении используется ультрафильтрация ксантановой камеди, отделяя бактерии от полисахарида: по завершении процесса ферментации из культуральной жидкости фильтром на полых волокнах с размером пор 300 кДа в качестве осадка отделяются бактерии, а фильтрат подается на такого же типа фильтр с размером пор 100 кДа. За счёт использования фильтров с размером пор 100 кДа, на котором осадком является концентрат полисахаридов с более высокой молекулярной массой, обеспечивается снижение концентрации низкомолекулярных метаболитов, которые поступают в фильтрат, что позволяет говорить о повышении чистоты конечного готового продукта.
Экспериментальным путём подобраны фильтрационные элементы  – полые волокна, которые имеют дополнительное преимущество по обеспечению контролируемости процесса. Использование ультрафильтрации на полых волокнах позволяет выделить полисахарид без применения спиртов и сделать процесс непрерывным.
Изобретение поясняется графиком, представленным на фиг. 1, поясняющий влияние использования воды, обедненной дейтерием, на концентрацию бактерий в культуральной среде, где 1 – рост клеток при использовании обычной воды для питательной среды, 2 – рост клеток при использовании воды с пониженным содержанием дейтерия (10 ppm). Из графика наглядно виден значительный рост  количества бактерий при уменьшении содержания дейтерия в воде.
Синтез ксантановой камеди согласно настоящему изобретению описан ниже.
3
3
3
3
3
3
9
Для культивирования в колбы вносят синтетическую питательную среду в количестве, составляющем 1/5 объёма колбы. Синтетическая питательная среда представляет собой мясо-пептидный бульон (ГОСТ 20730-75. Питательные среды. Мясо-пептидный бульон, включающий Пептон ферментативный, экстракт мясной и натрия хлорид), разбавленный водой с пониженным содержанием дейтерия (20 об. %  питательного бульона и 80 об. % воды). При необходимости стандартный синтетический бульон может быть обогащен углеводами, солями. Посевным материалом является штамм Xanthomonas campestris ВКМ-615. Доза на колбу составляет 106 клеток/см. Микробные культуры штаммов выращивают при температуре (32±1)°С в течение (48±4)ч с постоянным механическим перемешиванием. Питательную среду в количестве 50 см вносят в колбы емкостью 250 см, и 100 см- в колбы 750 см. Засевают колбы, концентрация клеток в начальной стадии культивирования должна составлять не менее 106 клеток/см.Культивирование ведется при (32+2,0)°С, в режиме 150-160 об/мин, в течение (32±4) ч. По окончании процесса культивирования оценивают прирост биомассы путем определения общего количества микробных клеток, в случае необходимости - количества жизнеспособных клеток методом определения концентрации колониеобразующих единиц (КОЕ). Ориентировочно общее количество (5-7)*10 клеток/мл.
В целях сопоставления были проведены эксперименты, в которых состав обеих питательных сред был идентичен друг другу, за исключением воды, состав оборудования и технологии приготовления посевного бактериального материала также были идентичны.
Концентрация дейтерия в воде определялась методом ядерно-магнитного резонанса (ЯМР). Результаты по подготовке культуры на питательной среде с различной водой: на обычной воде с концентрацией дейтерия 156 ppm (опыт 1) и на  воде с концентрацией дейтерия 10 рpm  (опыт 2) показаны на  фигуре 1, где  отображены зависимости концентрации клеток (роста посевного материала (штамм Xanthomonas campestris ВКМ-615) во времени. Показана интенсификация процесса роста клеток при использовании воды, обедненной дейтерием, в качестве основы для питательной среды при подготовке культуры.
Повышение количества клеток в посевном материале приводит также к увеличению выхода продукта – ксантановой камеди.
Полученный на лёгкой воде посевной материал ввели в биореактор, содержащий необходимую питательную среду оптимального состава, в котором поддерживаются заданные условия для аэробного продуцирования бактериями внеклеточной ксантановой камеди.
2
4
4
2
4
4
2
Ферментёр заполняется водой, обедненной дейтерием, в количестве 75 литров. Далее в него последовательно добавляются следующие компоненты для формирования питательной среды для выращивания культуры ксантановых бактерий:  Меласса -500 г,  Глюкоза - 700 г. 50% раствора, панкреатический гидролизат рыбы (рыбной муки) - 500 г.,   KHPO – гидрофосфат калия - 100 г., дрожжевой экстракт - 125 г. (0,5 заводской баночной упаковки), пеногаситель (подсолнечное масло) - 5-10 мл., (NH)SO*6H2O (гексагидрат сульфата аммония) - 250 грамм, MgSO*7HO (гептагидрат сульфата магния) - 15-20 г, NaOH (гидроксид натрия, иное название каустическая сода) - 50 г.
Подготовленный ферментёр с питательной средой закрывается крышкой, посуда с компонентами питательной среды (50% водные растворы NaOH и глюкозы) помещаются в автоклав и обрабатываются в соответствии с требованиями.
0
Ферментация проводится при следующих условиях. Температура ферментации 30С,  рН =7,2-7,5. Число оборотов магнитной мешалки 150 об/мин. Поддержание рН осуществляется 50% раствором NaOH. Углеводная подпитка 50% раствором глюкозы. Проводится контроль оптической плотности и вязкости культивируемого раствора. Время ферментации 72 часа.
При достижении необходимой концентрации клеток подключается фильтр на полых волокнах с порами на 300 кДа МР-2М-300 для отделения ксантановой камеди и возврата бактерий Xanthomonas campestris обратно в ферментёр для продолжения процесса наращивания ксантана. Отделённая ксантановая камедь при вязкости 350 сПз передаётся на второй этап очистки - при давлении 1,5 атм фильтруется через фильтр на полых волокнах с порами 100 кДа УФМ-2М-100. Далее отделённый ксантан при вязкости 1800 сПз  высушивают на распылительной сушилке при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определено  весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 51,5 г/л.
Полученный ксантан подвергается выходному контролю в соответствии с показателями отрасли, где он планируется к использованию.
В случае использования двухступенчатой фильтрации процесс наработки ксантана может продолжаться неограниченно долго при сохранении и защите среды от контаминации посторонней микрофлорой.
Также возможно отделение полученной культуральной жидкости одноатомным спиртом. Для этого полученную культуральную жидкость обрабатывали на центрифуге в течение 30 минут при 8000 об/мин для отделения бактерий. Для осаждения ксантана в супернатант (надосадочная жидкость) добавляли этиловый спирт в соотношении 1:2, затем смесь выдерживали в холодильнике при 4°C в течение 24 часов. Далее осажденный ксантан при вязкости 1560 сПз высушивают при 80°C до постоянной массы. Количество ксантана определено  весовым методом. Выход сухого ксантана составляет 11,6 г/л.
Таким образом, процесс наработки ксантана может продолжаться неограниченно долго при сохранении и защите среды от контаминации посторонней микрофлорой. При сравнении технологий осаждения спиртом и ультрафильтрацией,  разница в выходе продукта по сухому ксантану   более чем в 4 раза (11,6 г/л со спиртом и 51,5 г/л с применением лёгкой воды и ультрафильтрации).
Представленные примеры иллюстрируют заявленный способ и подтверждают достижение технического результата при реализации способа, который обеспечивается за счет использования воды с пониженным содержанием дейтерия при культивировании, а также отражают усиление технического результата при отделении ксантановой камеди методом фильтрации.