Свободно-циркулирующая ДНК плазмы крови. Возможности применения в онкологии

Раздел - обзоры

Свободно-циркулирующая ДНК плазмы крови. Возможности применения в онкологии

Телышева Е. Н.

ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России

117997 Москва, ул. Профсоюзная, д. 86

В обзоре представлены данные о свободно-циркулирующей ДНК (сцДНК) плазмы крови, ее биологических свойствах. Подробно рассматриваются возможности и ограничения применения анализа сцДНК плазмы крови в онкологической практике. Приведена характеристика современных высокочувствительных методов, с помощью которых можно проводить анализ сцДНК плазмы крови.

Ключевые слова: соматические мутации, биомаркеры, свободно-циркулирующая ДНК (сцДНК), «жидкостная биопсия».

Cell-free circulating DNA in plasma. Possibility of application in oncology Telysheva E. N.

FBSI "Russian Scietific Center of Roentgenology&Radiology" Ministry of Health 117997 Moscow, Profsoyuznaya 86

This review presents data on cell-free circulating DNA (cfDNA) of blood plasma and its biological properties. Advantages and limitations of application of cfDNA analysis in the routine oncological practice are considered in detail. The description of new high-sensitivity methods allowing to carry out the cfDNA analysis is presented.

Key words: somatic mutation, biomarkers, cell-free circulating DNA (cfDNA), «liquid biopsy»

Оглавление

Введение

Биологические свойства свободно-циркулирующих нуклеиновых кислот Диагностическая значимость определения концентрации сцДНК в плазме крови Свободно-циркулирующая опухолевая ДНК

Анализ ДНК опухолевой ткани и сцДНК плазмы крови: возможности и ограничения Методы детекции сцДНК в плазме крови Заключение Список литературы

Введение

Онкологические заболевания являются одной из наиболее распространенных причин смертности людей во всем мире. Результаты лечения большинства видов злокачественных опухолей человека до сих пор остаются неудовлетворительными. По этой причине значительные усилия ученых, работающих в области молекулярной онкологии, направлены на поиски чувствительных и специфических биомаркеров для ранней диагностики и прогноза заболевания, а также мониторинга пациентов в процессе лечения.

Как известно, различные белки, выделяемые опухолью в кровеносное русло, используются в повседневной клинической практике в качестве онкомаркеров, например: простат-специфический антиген при раке простаты, альфа-фетопротеин при гепатокарциноме, раковые антигены СА 15-3 и СА 19-9 при раке молочной железы и при панкреатобилиарных опухолях, соответственно [28]. Однако данные онкомаркеры не являются строго специфичными, т.к. их уровень в крови может повышаться в результате клинических ситуаций, не связанных с ростом и прогрессией опухоли что, соответственно, ограничивает их применение.

Известно, что рак возникает и прогрессирует как последовательность комплексных процессов, в которые вовлечены разнообразные генетические и эпигенетические нарушения, способные приводить к неконтролируемому клеточному росту. Такие молекулярные нарушения могут быть выявлены в опухолевой ткани, полученной после оперативного лечения или при биопсии. Однако биопсия опухолевой ткани, которая является инвазивной процедурой, к сожалению, не всегда может быть выполнена. Даже если такая возможность имеется, анализ биопсийного материала не позволяет судить о динамике опухолевого процесса и, соответственно, об изменении чувствительности опухоли к проводимой терапии. В связи с этим большое значение имеет разработка

неинвазивных методов анализа онкомаркеров, с помощью которых имеется возможность отслеживать динамику опухолевого процесса в реальном времени. "Жидкостная биопсия", основанная на исследовании свободно-циркулирующих нуклеиновых кислот (сцНК) в плазме или сыворотке крови, может стать идеальным объектом исследования у больных с онкопатологией [14,23,43].

В последние десятилетия появилось много работ, посвященных изучению сцНК, хотя первые данные об их существовании были представлены достаточно давно. Так, об обнаружении сцНК в образцах плазмы крови людей впервые было сообщено Mandel и Metais еще в середине 20 века. И уже с 1948 года началось активное изучение клинического значения сцНК не только в онкологии, но и в других областях медицины [13].

Важным этапом в исследовании сцНК плазмы крови стала работа Leon и соавторов, которые показали, что у онкологических больных уровень сцДНК значительно выше, чем у здоровых людей, и что пациенты с устойчиво высокими уровнями сцДНК после лечения имеют более плохой прогноз, чем те, у кого уровни сцДНК после лечения снизились [36]. Несколькими годами позже Stroun и соавторы предположили, что, по крайней мере, часть сцДНК плазмы крови происходит из первичной опухоли [59]. Эта гипотеза позже была подтверждена двумя независимыми исследованиями, в которых были выявлены мутации в гене KRAS при анализе плазмы крови больных с опухолью поджелудочной железы и при миелоидном лейкозе [61,70]. В результате этих исследований появились совершенно новые возможности для поиска и разработки онкомаркеров.

Несмотря на рост в последнее время числа исследований, посвященных анализу сцНК плазмы крови, и усовершенствование технологий, позволяющих проводить их изучение, до сих пор остаются неизвестными такие важные аспекты, как механизмы высвобождения и циркуляции сцНК, а также их биологическая роль в прогрессировании

рака. Основными лимитирующими факторами в исследовании сцНК являются, в первую очередь, отсутствие высокочувствительных методов анализа, часто малые выборки больных, включенных в исследование, а также, что немаловажно, гетерогенность опухолевой ткани.

Биологические свойства свободно-циркулирующих нуклеиновых кислот

Термин "свободно-циркулирующие нуклеиновые кислоты" объединяет различные типы внеклеточных НК, а именно, геномную ДНК (gDNA), митохондриальную ДНК (mitDNA), вирусную ДНК и РНК, информационую РНК (mRNA), а также микроРНК (miRNA), о наличии которой в плазме стало известно совсем недавно [23]. Внеклеточные нуклеиновые кислоты содержатся не только в плазме или сыворотке человека, но и в ликворе, асцитной жидкости, молоке, лимфе, простатической и перитонеальной жидкостях, моче, бронхиальном смыве, мокроте, желудочном соке, желчи и кале [14]. В данном обзоре приведены данные о сцДНК плазмы крови.

Свободно-циркулирующие ДНК - это двухцепочечные низкомолекулярные молекулы геномной ДНК, фрагментированные на короткие (70-200 пар оснований) и длинные (до 21 тыс. пар оснований) отрезки, устойчивые к РНКазам и проназам, но расщепляемые с помощью ДНКазы I [14,29]. Анализ этих фрагментов позволил изучить их происхождение. По мнению одних исследователей, основной причиной появления сцДНК является некроз тканей [9,37], по версии других - апоптоз, если учесть размер фрагментов ДНК, детектируемых в плазме [29,61]. Другим возможным источником сцДНК могут быть клетки, в первую очередь лимфоциты [18,60,61,66]. Таким образом, есть два возможных источника сцДНК: пассивное высвобождение посредством клеточной смерти (апоптоз и некроз) и активное высвобождение путем клеточной секреции [1]. Недавние исследования, в основу которых легло полногеномное секвенирование ДНК плазмы крови, продемонстрировали, что часть сцДНК содержит последовательность всего

генома опухоли (так называемая, циркулирующая опухолевая ДНК), которая может отражать при этом клональную эволюцию опухоли [45]. Известно, что фракция циркулирующей опухолевой ДНК (цоДНК) часто может составлять менее 1% от общей сцДНК [13, 27].

Теоретически, сцНК должны были бы быстро деградировать в кровеносном русле благодаря присутствию там нуклеаз. Тем не менее, в норме постоянно поддерживается определенная концентрация внеклеточной ДНК в крови. Показано, что ДНК-связывающей активностью обладает около 1,5% сывороточных белков. Нуклеиновые кислоты, высвобождаемые из клетки, могут циркулировать в составе комплексов с этими белками. Исследование взаимодействия олигонуклеотидов с белками сыворотки крови т \1\о показало, что НК в крови могут связывать альбумин, иммуноглобулины классов M и G, фибронектин (гепарин-связывающий белок), лактоферрин и пр. Другим механизмом, обеспечивающим длительную циркуляцию ДНК в крови, по-видимому, может быть упаковка нуклеинового материала, фрагментированного в результате апоптоза, в окруженные клеточной мембраной апоптотические тельца. Также сохранность сцДНК в кровотоке может обеспечить упаковка ее фрагментов в олигонуклеосомные частицы -нуклеосомы. Было показано, что олигонуклеосомные частицы в крови циркулируют в составе иммунных комплексов с анти-ДНК-антителами, и их содержание в крови коррелирует с клиническими параметрами развития заболевания. Внеклеточные НК могут быть связаны с поверхностью клеточных элементов крови (эритроцитов и лейкоцитов) неспецифическими связями (ионные взаимодействия), а также посредством специализированных мембранных белков. Такие НК можно элюировать с поверхности этих клеток с помощью фосфатного буфера или обработкой трипсином [1,6,33,64].

Диагностическая значимость определения концентрации сцДНК в плазме крови

Leon и соавт. впервые показали, что средняя концентрация сцДНК в сыворотке онкологических больных выше, чем у здоровых людей [36]. Позже многочисленные исследования подтвердили данное явление [3,53,63]. Большинство здоровых людей имеют низкую концентрацию ДНК в плазме крови по сравнению с повышенными значениями ДНК, обнаруженными у больных с онкопатологией [14,30 63]. Также имеются данные о высоких концентрациях сцДНК в плазме и сыворотке у пациентов с различной локализацией опухоли - колоректальный рак, рак легких, молочной железы, желудка и пищевода [3,57]. В исследовании, проведенном Shapiro и соавторами, было предложено использовать данные о концентрации сцДНК в плазме крови в качестве клинического показателя для дифференциальной диагностики: например, больные, имеющие доброкачественные гастроэнтеральные заболевания, имели более низкое среднее значение концентрации сцДНК плазмы, чем пациенты со злокачественными новообразованиями [53].

Позже, в других исследованиях было предложено использовать количественное определение сцНК плазмы и сыворотки в качестве скринингового метода при колоректальном раке, раке молочной железы и раке легких. У больных с диагнозом "колоректальный рак" такой метод показал даже большую чувствительность, чем количественное определение раково-эмбрионального антигена (РЭА) [17]. При раке молочной железы уровень сцДНК в плазме крови был ассоциирован с клинико-патологическими показателями: размером и стадией опухоли, лимфаденопатией, мутационным статусом гена HER2/neu и уровнем его экспрессии [25]. При обследовании больных раком легкого было высказано предположение, что повышенная концентрация свободно-циркулирующей ДНК может свидетельствовать о наличии заболевания и быть прогностическим показателем в течение всего периода наблюдения [48,74].

Интересно, что другие авторы не подтвердили наличие корреляции между

концентрацией сцДНК в плазме крови и такими клиническими показателями, как размер и

7

локализация опухоли, стадия заболевания [20,41,56,73]. Также было установлено, что увеличение концентрации сцДНК в плазме может наблюдаться уже на ранней стадии развития опухоли. Garcia-Olmo и соавторы провели модельные исследования на животных для более глубокого понимания кинетики сцДНК. Они обнаружили, что во время опухолевой прогрессии освобождаются большие количества неопухолевой ДНК, особенно на ранних стадиях, когда происходит активное взаимодействие между опухолевыми и нормальными клетками [19].

При дальнейших исследованиях правомочность использования количественной оценки сцДНК в плазме крови как уникального диагностического маркера была поставлена под сомнение, а также было показано, что использовать его при раке легкого и СА125-ассоциированном раке яичников нецелесообразно [5,75]. Примечательно, что концентрация сцДНК у онкологических больных и здоровых индивидуумов в состоянии физиологического стресса (например, физические упражнения), у пожилых людей, у пациентов с травмами, предраковыми заболеваниями, а также с острыми и хроническими воспалительными заболеваниями или сепсисом может быть близкой по значению [2,14,16,30,34,38,73].

Возможно, что одной из причин таких результатов может быть использование различных методов выделения сцДНК и разных по чувствительности методов детекции сцДНК. Также важно отметить, что концентрация сцДНК - неспецифичный показатель, который отражает только количество, не определяя при этом качественный состав, а именно наличие или отсутствие опухолевой ДНК (ДНК из опухолевых или здоровых клеток).

Неоднократно предпринимались попытки установить референсные значения концентраций для различных типов опухолей, однако разнородность применяемых лабораторных методов (количественная ПЦР, спектрофотометрия, флуорометрия и пр.), а

также малые и неоднородные выборки пациентов не позволили прийти к единому мнению [14,30,52,72].

Анализ концентрации сцДНК в плазме крови при мониторинге заболевания в процессе лечения представляется более целесообразным с клинической точки зрения. Имеются данные, что уровни сцДНК плазмы крови у онкологических больных после хирургического лечения резко повышались, достигая максимального уровня через неделю. Спустя 3-6 месяцев концентрация сцДНК плазмы крови снижалась, достигая даже более низких значений по сравнению с таковыми до начала лечения у пациентов без рецидивов заболевания. Однако пациенты, у которых заболевание прогрессировало, имели более высокие значения данного показателя [63]. Отмечено также, что больные, у которых сохранялся высокий уровень сцДНК в плазме крови, либо не отвечали на лечение, либо имели высокий риск рецидивирования [3,48,56].

Принимая во внимание имеющиеся достаточно разноречивые данные относительно применения концентрации сцДНК плазмы крови в качестве прогностического маркера, говорить о его практическом использовании в клинике пока преждевременно. Необходимы дальнейшие исследования с привлечением современных высокочувствительных методов анализа, включающие большие группы больных.

Свободно-циркулирующая опухолевая ДНК

Детекция цоДНК является не простой задачей в связи со сложностью отделения цоДНК от нормальной сцДНК, малым количеством цоДНК и необходимостью точной количественной оценки числа мутантных фрагментов в образце [39].

Циркулирующая опухолевая ДНК характеризуется наличием генетических

изменений, которые и позволяют дифференцировать ее от нормальной сцДНК.

Присутствие опухоль-ассоциированных нарушений в ДНК, выделенной из плазмы или

сыворотки крови, описано при раке молочной железы, шейки матки, яичников, толстой

кишки, пищевода, желудка, печени, почки, поджелудочной железы, кожи, носоглотки, легких, предстательной и щитовидной желез, а также при опухолях головы и шеи и злокачественных заболеваниях крови [14]. Пролиферация и выживание опухолевых клеток часто зависят от активации в них доминантных онкогенов. Наличие специфических изменений в таких генах зачастую имеет диагностическое значение, а также определяет ответ на терапию и отражает динамику опухолевого процесса в период лечения [22]. Жидкостная биопсия, являясь неинвазивной процедурой, позволяет оценить динамические изменения, происходящие в опухолевых клетках [49]. Теоретически, все методы секвенирования ДНК, способные идентифицировать соматические варианты, могут быть применены для идентификации цоДНК, при условии, что фрагменты опухолевой ДНК находятся в изобилии в кровотоке онкологических больных. Но, к сожалению, это не всегда можно осуществить на практике, принимая во внимание достаточно низкое содержание цоДНК [13,27]. Такие стандартные подходы, как секвенирование по Сэнгеру или пиросеквенирование, способны детектировать мутантные опухолевые фрагменты ДНК только у больных с большой опухолевой нагрузкой и высокими уровнями цоДНК.

Какая информация может быть получена при исследовании цоДНК? Фрагменты цоДНК содержат генетические дефекты, идентичные имеющимся непосредственно в опухоли. Большинство молекулярных нарушений, обнаруженных в сцДНК плазмы крови, отображают генетические и эпигенетические изменения, происходящие в первичной опухоли, поэтому анализ цоДНК является удобным методом для диагностики и мониторинга онкологических заболеваний. К таким нарушениям ДНК относятся точечные мутации (EGFR, KRAS), хромосомные перестройки (EML4-ALK), амплификация (HER2, MET) и даже анеуплодия. Более того, исследование плазмы больных теоретически должно помочь оценить молекулярную гетерогенность опухоли и ее метастазов, т. к. в общем

кровотоке объединены фрагменты цоДНК, полученные от всех новообразований, имеющихся в организме больного [12,4,45].

Таким образом, по сути, анализ цоДНК представляет собой жидкостную биопсию. Но, несмотря на имеющиеся данные, что цоДНК, является интегральным показателем, который отражает генетические изменения в опухоли и метастазах, их равнозначный вклад еще предстоит доказать [39]. Для выявления генетических нарушений в цоДНК среди большого количества нормальных молекул сцДНК требуются высокочувствительные методы. К сожалению, этот факт является одной из причин, почему до сих пор исследовательские группы получают данные, характеризующиеся весьма значительным разбросом [14,24,29].

Мутации в генах семейства RAS были первыми опухоль-ассоциированными изменениями, обнаруженными в сцДНК плазмы крови [58, 70]. Ген KRAS является важным объектом исследования по нескольким причинам. Изменение этого гена в некоторых опухолях является ранним событием при злокачественной трансформации. Наличие 3-х "горячих точек" в 12, 13 и 61 кодонах гена KRAS обусловило возможность разработки специфичных и высокочувствительных тестов при выборе таргетной терапии в клинической практике. Опубликованы исследования, в которых мутации в гене KRAS были идентифицированы при анализе сцДНК в плазме или сыворотке крови онкологических больных [31,42,44,68].

Самое крупное исследование по обнаружению мутаций в гене KRAS при анализе сцДНК плазмы крови было опубликовано Kopreski и соавторами и включало 2 группы обследованных: больных с диагнозом "колоректальный рак" и практически здоровых людей без онкопатологии [31]. В этом исследовании мутации, обнаруженные в ткани больных пациентов, были выявлены в сцДНК плазмы крови в 83% случаев. У некоторых здоровых пациентов (27%), колоноскопия которых не показала наличия

онкопатологии, в сцДНК плазмы крови также был выявлен мутантный ген KRAS. Не совсем понятно, имеют ли данные пациенты более высокий риск развития КРР, но полученные данные не должны остаться без внимания [31].

Наличие мутации KRAS в сцДНК плазмы крови и увеличение количества опухолевого маркера СА 19-9 являются независимыми событиями, однако в совокупности могут иметь более высокое прогностическое значение. Так, было показано, что чувствительность прогностического теста, основанного на анализе обоих вышеупомянутых маркеров, может достигать 90% [11,65].

Другим немаловажным событием, происходящим в опухолевой ткани, является микросателлитная нестабильность. "Микросателлиты" - это короткие тандемно повторяющиеся последовательности (длина повтора от одного до шести нуклеотидов), которые разбросаны по всему геному. Микросателлитная изменчивость проявляется либо за счет уменьшения, либо за счет увеличения количества повторов. Некоторые опухоли имеют повышенный уровень мутирования микросателлитов в результате нарушения процесса репарации ДНК, вызванного изменениями в генах MMR ("mismatch repair"). Данное явление получило название микросателлитной нестабильности (microsatellite instability, MSI). Биологическая функция микросателлитов до сих пор не до конца ясна, но они часто используются в качестве генетических маркеров в различных областях биологии и медицины [14].

Впервые была показана возможность обнаружения изменения микросателлитов в ДНК плазмы крови онкологических больных в двух работах [8,46]. В этих исследовании микросателлиты были проанализированы у пациентов с диагнозом "рак легкого" и опухолями головы и шеи. Позже подобные исследования были проведены у пациентов с опухолью молочной железы, меланомой, колоректальным раком, раком почки, мочевого пузыря, простаты, печени и яичников. Несмотря на то, что такие изменения в плазме

крови являются более вероятными на поздних стадиях, некоторые исследователи предполагают их потенциальную ценность на этапе диагностики опухолевой патологии [5,51]. Также имеются данные, что применение микросателлитных маркеров в сочетании с простат-специфическим антигеном при раке простаты позволяет повысить чувствительность диагностического теста [62].

Существуют очевидные преимущества анализа цоДНК в качестве маркера динамики опухоли по сравнению с обычными белковыми биомаркерами или даже визуальными исследованиями. Во-первых, цоДНК имеет сравнительно короткий период полураспада (часы, а не недели), позволяющий оценивать изменения, происходящие в опухоли за часы, а не за недели или месяцы. Изменения опухолевой ДНК могут быть обнаружены в цоДНК раньше, чем их можно будет обнаружить при визуальных исследованиях или при исследовании белковых биомаркеров [10,13]. Кроме того, набор определенных мутаций в цоДНК характеризует опухолевую ткань в целом, при этом в нормальной ткани данные изменения отсутствуют, что исключает ложноположительные результаты, которые могут встречаться при использовании белковых биомаркеров.

Несколько исследований показали, что изменения уровней цоДНК так же, как изменения вирусной нагрузки (например, вирусная нагрузка ВИЧ), соответствуют клиническому течению заболевания. Исследования меланомы, рака яичников, молочной железы и толстой кишки подтвердили потенциальную полезность этого подхода для более точного определения динамики опухолевого процесса при проведении терапии у пациентов с прогрессированием заболевания. Было показано быстрое увеличение концентрации цоДНК в процессе прогрессирования заболевания и, соответственно, снижение ее уровня после успешного лечения [10,13,15,54].

Клиническим применением анализа цоДНК плазмы крови может быть

прогнозирование ответа опухоли на терапию и потенциальное определение неясных

клинических случаев [15]. Зная изменения в цоДНК, можно предсказать ответ на лечение

13

в начале курса терапии, что, в свою очередь, поможет своевременно изменять схему лечения, а не ждать несколько недель или месяцев, чтобы проконтролировать реакцию на терапию с помощью стандартных методик. В настоящее время вопросы, касающиеся практического применения анализа цоДНК плазмы крови, активно обсуждаются и, по-видимому, только исследования, которые проводятся в рамках клинических испытаний и тестирования новых терапевтических агентов позволят оценить потенциальные возможности данного маркера [39].

Анализ ДНК опухолевой ткани и сцДНК плазмы крови: возможности и ограничения

На сегодняшний день молекулярно-генетическое исследование опухолевой ткани является золотым стандартом в клинической и исследовательской практике. Достижения в таргетной терапии основываются на молекулярно-генетическом анализе опухолевой ткани, полученной с помощью биопсии до начала терапии или в процессе ее, когда может развиться резистентность опухоли. Анализ опухолевой ткани после наступления клинической резистентности помогает определить механизмы вторичной резистентности к данным таргентным препаратам [41]. Однако зачастую возникают серьезные препятствия при проведении подобных процедур. Биопсия не всегда бывает информативна и, что крайне важно, являясь инвазивной процедурой, нередко может сопровождаться клиническими осложнениями. Так, в обзоре Anderson Cancer Center сообщается о клинических осложнениях в 17% и 1,6% случаев при проведении биопсий грудной и брюшной полостей, соответственно [47].

Большинство опухолей, особенно на поздних стадиях, характеризуются гетерогенностью. Помимо внутриопухолевой неоднородности существует межметастатическая гетерогенность, то есть даже метастазы у одного и того же пациента имеют различный генетический профиль. Анализ биопсийного или операционного материала, полученного из одной части опухоли не может дать полного представления о

генетическом профиле опухоли и ее метастазов. Поэтапное проведение биопсии различных участков опухоли является достаточно трудоемким и дорогостоящим методом, если анализировать каждый взятый участок опухоли. Кроме того, обработка и фиксация операционного материала в формалине может оказать отрицательное воздействие на качество ДНК за счет образования сшивок и разрывов и, как следствие, сказаться на результатах молекулярно-генетического исследования [21,71].

Использование сцДНК плазмы или сыворотки крови позволяет преодолеть ограничения, связанные с анализом биопсийного материала [27]. Теоретически, анализируя сцДНК, а именно цоДНК, можно получить ту же генетическую информацию, что и при изучении биопсии. Доступ к кровотоку имеет явные преимущества. Во-первых, сцДНК выделяется из венозной крови пациента, то есть - это источник ДНК, свободной от консервантов. Подобная ДНК не подвергается обработке дополнительными химическими реагентами, такими как формальдегид. Забор крови является минимально инвазивной процедурой и избавляет от осложнений, возникающих при биопсии. Кроме того, кровь может быть взята у пациента в любое время в течение курса терапии, что обеспечивает динамическое наблюдение за молекулярными изменениями, происходящими в опухоли [39,49].

Методы детекции генетических изменений в сцДНК плазмы крови

Для выявления нарушений в сцДНК плазмы крови онкологических больных необходимы высокочувствительные методы анализа. В зависимости от задач, стоящих перед клиницистами, на сегодняшний день имеется реальная возможность применять различные методы исследования свободно-циркулирующих нуклеиновых кислот плазмы крови, краткая характеристика которых представлена ниже.

Методы молекулярной цитогенетики, такие как спектральное кариотипирование, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и сравнительная геномная гибридизация

хромосом (CGH) характеризуются более высокой разрешающей способностью и чувствительностью по сравнению с обычным методом кариотипирования на основе визуализации метафазных хромосом. Тем не менее, наиболее существенные изменения в получении все более подробных и полных характеристик опухолевых геномов произошли в течение последнего десятилетия. Появление целого ряда новых технологий - в том числе "омиксного" профилирования, микрочипов на основе CGH, анализа олигонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и секвенирования следующего поколения (next generation sequencing - NGS), позволило исследовать геном и протеом опухоли более подробно, что привело к лучшему пониманию ее биологии [40].

Полногеномный анализ ДНК, применяемый для идентификации генетических

вариантов, включает CGH на основе чипов, который является одним из подходов для

улучшения качества выявления структурных вариаций, затрагивающих много пар

оснований. Этот метод основан на принципе комплементарной гибридизации между

множеством олигонуклеотидных проб, иммобилизованных на предметном стекле, двумя

пробами, помеченными различными флуоресцентными метками и контрольными

образцами ДНК [67]. Принципы SNP теста аналогичны и основаны на гибридизации

фрагментированной одноцепочечной ДНК к матрице, содержащей уникальные

последовательности нуклеотидных зондов, иммобилизованных на твердой поверхности

[32]. Специализированное оборудование может измерять интенсивность сигнала,

связанного с каждым зондом и его мишенью после гибридизации. Платформы SNP тестов

содержат олигонуклеотидные пробы, которые исследуют как изменение числа копий

генов, так и SNP. Благодаря появлению технологии микрочипов стали возможны

полногеномные исследования для одновременного анализа более одного миллиона SNP

[55]. В настоящее время совместно Институтом молекулярной биологии им. В. А.

Энгельгардта (лаборатория биологических микрочипов) и нашей лабораторией

начаты исследования сцДНК плазмы крови с применением данной технологии для анализа мутационного статуса генов KRAS, BRAF.

Принцип технологии секвенирования следующего поколения (NGS) основан на использовании метода массового параллельного секвенирования одновременно тысяч молекул ДНК. Благодаря этому повышается скорость исследования и увеличивается объем получаемых данных. Это метод значительно опередил классический метод секвенирования Сэнгера. Платформы NGS предоставляют широкое разнообразие методов, позволяющих применять эту технологию в проектах, связанных с исследованием генома, транскриптома и эпигенома. Используя метод NGS, Forshew с соавторами идентифицировали опухолевые мутации в генах KRAS, TP53 и EGFR в сцДНК плазмы крови с частотами аллелей всего 2%, с чувствительностью и специфичностью более 97% [15]. Различия в методах зависят от того, из какого материала была получена ДНК или РНК, какие цели и задачи преследуются исследованием. На рынке представлено множество различных панелей для пробоподготовки ДНК для последующего полногеномного, полноэкзомного и таргетного секвенирования.

Полногеномное секвенирование (whole genome sequencing - WGS) позволяет

обнаруживать генетические изменения, разбросанные по всему геному, и с его помощью

можно исследовать цоДНК у пациентов. Но на данный момент эта технология достаточно

дорогая и позволяет анализировать одновременно только небольшое количество образцов.

В связи с тем, что анализируется весь геном, большой глубины покрытия не достигается,

однако это не мешает успешно использовать данный метод для обнаружения изменений

числа копий генов. В исследовании 2012 года Leary с соавторами, используя технологию

полногеномного секвенирования, провели анализ цоДНК плазмы 10 пациентов с

диагнозами "колоректальный рак" и "рак молочной железы", а также 10 здоровых

доноров. У всех больных были выявлены структурные перестройки, которые не были

обнаружены в сцДНК плазмы здоровых доноров [35]. В исследовании 2012 года Heitzer с

17

соавторами, применяя аналогичную технологию - WGS, в 13 образцах сцДНК плазмы от 9 пациентов с диагнозом "рак простаты" обнаружили множественные нарушения числа копий, такие как потери участка хромосомы 8p и увеличение числа копий участка 8q, а также высокое увеличение числа копий локуса AR [26]. Для выявления перестроек или одиночных замен (single nucleotide variants - SNVs) в сцДНК плазмы при полногеномном секвенировании требуются более высокие значения глубины покрытия. Более того, там, где частота мутантного аллеля низкая и присутствуют высокие частоты аллеля "дикого типа", например, при начальной стадии заболевания, необходима еще большая глубина покрытия для обнаружения фрагментов цоДНК. Кроме того, при применении технологии WGS выявляется большее количество мутаций-"пассажиров", чем при таргетном ресеквенировании. Однако на сегодняшний день данные изменения не являются целью при назначении таргетной терапии, так как клиническая значимость мутаций-"пассажиров" не ясна.

Как известно, экзом составляет менее 2% от человеческого генома, но содержит большинство генетических вариантов, являющихся причиной болезней. Методы, основанные на полноэкзомном секвенировании (whole exome sequencing - WES), позволяют более углубленно рассматривать только кодирующие регионы генов. Таким образом, WES секвенирование является экономически более эффективной заменой полногеномному секвенированию и, следовательно, представляет собой метод, приемлемый для рутинного анализа мутаций в серийных образцах плазмы. Данный подход использовали в исследовании с участием 6-ти пациентов с метастатическими опухолями. Образцы плазмы больных собирали в начале лечения и в момент рецидива. Последующее секвенирование и анализ генетических вариантов путем сравнения обнаруженных мутаций в образцах до и после рецидива, продемонстрировали обогащение образцов ДНК мутациями, которые могут быть причиной лекарственной резистентности.

Необходимо отметить, что данный метод менее чувствителен при использовании его для идентификации изменений числа копий генов (CNV) [45].

Таргетное секвенирование (NGS), при котором проводится анализ определенной группы генов или областей генома, позволяет исследователям сэкономить время и расходы, сосредоточив все внимание на конкретных генах, представляющих для них особый интерес. Такой подход дает возможность секвенировать эти регионы с более высоким уровнем покрытия, чем при WGS и WES. Например, стандартное WGS исследование достигает уровня покрытия 30x-50x на геном, в то время как таргетное ресеквенирование может легко покрыть целевую область 500x-1000x раз или даже выше, что крайне важно при низком содержании мутантного аллеля при анализе сцДНК. Такие значения покрытия позволяют идентифицировать редкие варианты, которые было бы либо невозможно обнаружить методом WGS или WES, либо это было бы слишком дорого. В исследовании 2016 года с использованием данного метода был проведен анализ цоДНК у 44 пациентов с диагнозами "метастатический колоректальный рак" и 35 пациентов с диагнозом "рак легкого". Метод NGS позволил выявить сотни генетических вариантов при анализе плазмы крови. При этом у 17 пациентов (из 22 - с мутацией в гене EGFR, выявленной в опухолевой ткани) были обнаружены аналогичные генетические изменения в гене EGFR при анализе сцДНК (чувствительность составила 77,3%). Конкордантность при анализе мутаций в гене KRAS была значительно ниже, что, по-видимому, связано с гетерогенностью опухоли. У двух пациентов с диким типом гена EGFR методом NGS были выявлены мутации в данном гене при анализе сцДНК. Последующая проверка опухолевой ткани и сцДНК плазмы крови этих пациентов с применением метода цифровой ПЦР подтвердила наличие мутаций во всех образцах - и в ткани, и в плазме крови. Авторы делают вывод, что, несмотря на высокую чувствительность метода NGS при анализе сцДНК плазмы крови, его применение в клинической практике может быть

ограничено сроком получения плазмы для исследования (до или после операции) и гетерогенностью опухоли [50].

В другом исследовании 2016 года с использованием метода таргетного секвенирования был проведен анализ образцов плазмы крови и ткани опухоли у 58 пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) ранней стадии на наличие соматических драйверных мутаций (драйверные мутации, это мутации -"водители"). Авторами были выявлены частые драйверные мутации в цоДНК плазмы и ДНК опухолевой ткани в генах ЕОГЯ, КЯЛ8, Р1К3СА и ТР53, а также более редкие мутации в других генах, при этом общая конкордантность исследования составила 50,4%, а чувствительность и специфичность - 53,8 и 47,3% соответственно. Было обнаружено, что концентрация сцДНК значительно связана с некоторыми клиническими особенностями, включая стадию и подтип опухоли. Данное исследование демонстрирует потенциальную целесообразность идентификации мутаций в цоДНК плазмы у пациентов с ранней стадией рака легкого посредством таргетного секвенирования в процессе лечения НМРЛ [7].

Еще один метод, который успешно применяется при анализа жидкостной биопсии, - капельная цифровая ПЦР (ddPCR). Данный метод включает в себя проведение реакции ПЦР в большом количестве отдельных капелек объемом в один пиколитр и измерение флуоресценции в реальном времени от каждой отдельной капли в процессе ПЦР. Капельная цифровая ПЦР обладает большей специфичностью и чувствительностью при обнаружении мутантных последовательностей, которые могут присутствовать в ДНК в малых количествах. Аналитическая чувствительность капельной цифровой ПЦР в реальном времени может составлять до 0,0045% молекул, имеющих мутацию. С применением метода капельной цифровой ПЦР исследовали плазму крови 19 пациентов с диагнозом "колоректальный рак", имеющих мутацию гена КЯЛ8, выявленную с помощью мультиплексной цифровой ПЦР в опухолевой ткани. Соответствие данных по

выявленным мутациям в образцах сцДНК плазмы крови и в образцах ДНК опухоли составило приблизительно 73% [69].

Заключение

Имеющиеся в литературе данные позволяют заключить, что сцНК являются чрезвычайно ценным объектом молекулярно-генетического анализа. Результаты такого анализа позволяют получить информацию о специфических патологических процессах в организме больного, а данные о молекулярных изменениях, происходящих в опухолевых клетках, могут стать основой для разработки новых диагностических и прогностических маркеров. Одним из ключевых преимуществ анализа цоДНК является его высокая специфичность, поскольку выявленные мутации, по существу, являются "опухолевыми" -они содержатся только в ДНК опухоли и отсутствуют в соответствующей нормальной ДНК. Большое значение анализ цоДНК может иметь при назначении таргетной терапии, мониторинге опухолевого процесса, для выявления минимальной остаточной болезни, оценки молекулярной гетерогенности опухоли и выявлении приобретенной лекарственной устойчивости. На ранних стадиях заболевания или при определении минимальной остаточной болезни, когда в плазме крови может присутствовать очень малое количество сцДНК, для ее детекции необходимо применять высокочувствительные методы анализа.

Чтобы понять, насколько анализ сцДНК плазмы крови применим в рутинной клинической практике при обследовании больных с различными онкологическими заболеваниями, необходимы дальнейшие исследования с применением самых современных высокочувствительных метод, таких как, NGS, цифровая ПЦР и др.

Список литературы

1. Тамкович С.Н., Власов В.В., Лактионов П.П. Циркулирующие ДНК крови и их использование в медицинской диагностике. Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 1. С. 12-23.

2. Atamaniuk J., Vidotto C., Tschan H., et al. Increased concentrations of cell-free plasma DNA after exhaustive exercise. Clin Chem. 2004. V. 50. N. 9. P. 1668-1670.

3. Catarino R., FerreiraM.M., Rodrigues H., et al. Quantification of free circulating tumor DNA as a diagnostic marker for breast cancer. DNA Cell Biol. 2008. V. 27. N. 8. P. 415-421.

4. Chan K.C., Jiang P., Zheng Y.W., et al. Cancer genome scanning in plasma: detection of tumor-associated copy number aberrations, single-nucleotide variants, and tumoral heterogeneity by massively parallel sequencing. Clin Chem. 2013. V. 59. N. 1. P. 211-224.

5. Chang H.W., Lee S.M., Goodman S.N., et al. Assessment of plasma DNA levels, allelic imbalance, and CA-125 as diagnostic tests for cancer. J Natl Cancer Inst. 2002. V. 94. N. 22. P. 1697-1703.

6. Chelobanov B.P., Laktionov P.P., Kharkova M.V., et al. Isolation of nucleic acid binding proteins: an approach for isolation of cell surface, nucleic acid binding proteins. Ann N Y Acad Sci. 2004. V. 1022. P. 239-243.

7. Chen K. Z., Lou F., Yang F., et al. Circulating tumor DNA detection in early-stage non-small cell-lung cancer patients by targeted sequencing. Scientific Reports. 2016. V. 6. Article ID 31985. doi: 10.1038/srep31985.

8. Chen X.Q., StrounM., Magnenat J.L., et al. Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients. Nat Med. 1996. V. 2. N. 9. P. 1033-1035.

9. Choi J.J., Reich C.F., Pisetsky D.S. The role of macrophages in the in vitro generation of extracellular DNA from apoptotic and necrotic cells. Immunology. 2005. V. 115. N. 1. P. 5562.

10. Dawson S.J., Tsui D.W., Murtaza M., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N Engl J Med. 2013. V. 368. N. 13. P. 1199-1209.

11. Dianxu F., Shengdao Z., Tianquan H., et al. A prospective study of detection of pancreatic carcinoma by combined plasma KRAS mutations and serum CA19-9 analysis. Pancreas. 2002. V. 25. N. 4. P. 336-341.

12. Diaz L.A.Jr, Williams R.T., Wu J., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 2012. V. 486. N. 7404. P. 537-540.

13. Diehl F., Schmidt K., Choti M.A., et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat Med. 2008. V. 14. N. 9. P. 985-990.

14. Fleischhacker M., Schmidt B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer - a survey. Biochim Biophys Acta. 2007. V. 1775. N. 1. P. 181-232.

15. Forshew T., Murtaza M., Parkinson C., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci Transl Med. 2012. V. 4.

N. 136. 136ra68.

16. Fournie J., Martres F., Pourrat J.P., et al. Plasma DNA as cell death marker in elderly patients. Gerontology. 1993. V. 39. N. 4. P. 215-221.

17. Frattini M., Gallino G., Signoroni S.., et al. Quantitative and qualitative characterization of plasma DNA identifies primary and recurrent colorectal cancer. Cancer Lett. 2008. V. 263. N. 2. P. 170-181.

18. Gahan P.B., Anker P., Stroun M. Metabolic DNA as the origin of spontaneously released DNA? Ann N Y Acad Sci. 2008. V. 1137. P.7-17. doi: 10.1196/annals.1448.046.

19. García-Olmo D.C., Picazo M.G., Toboso I., et al. Quantitation of cell-free DNA and RNA in plasma during tumor progression in rats. Mol Cancer. 2013. V.12:8. doi: 10.1186/1476-459812-8.

20. Gautschi O., Bigosch C., Huegli B., et al. Circulating deoxyribonucleic acid as prognostic marker in nonsmall-cell lung cancer patients undergoing chemotherapy. J Clin Oncol. 2004. V. 22. N. 20. P. 4157-4164.

21. Gerlinger M., Rowan A.J., Horswell S., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 2012. V. 366. N. 10. P. 883- 892.

22. Gold B., Cankovic M., Furtado L.V., et al. Do circulating tumor cells, exosomes, and circulating tumor nucleic acids have clinical utility? A report of the association for molecular pathology. J Mol Diagn. 2015. V. 17. N. 3. P. 209-224.

23. Gonzälez-Masiä J.A., Garcia-Olmo D., Garcia-Olmo D.C. Circulating nucleic acids in plasma and serum (CNAPS): applications in oncology. Onco Targets Ther. 2013. V. 6. P.819-832. doi: 10.2147/0TT.S44668.

24. Gormally E., Caboux E., Vineis P., et al. Circulating free DNA in plasma or serum as biomarker of carcinogenesis: practical aspects and biological significance. Mutat Res. 2007. V. 635. N. 2-3. P. 105-117.

25. Hashad D., Sorour A., Ghazal A., et al. Free circulating tumor DNA as a diagnostic marker for breast cancer. J Clin Lab Anal. 2012. V. 26. N. 6. P. 467-472.

26. Heitzer E., Ulz P., Belic J., et al. Tumor-associated copy number changes in the circulation of patients with prostate cancer identified through whole-genome sequencing. Genome Med. 2013. V. 5. N. 4:30. doi: 10.1186/gm434.

27. Holdhoff M., Schmidt K., Donehower R., et al. Analysis of circulating tumor DNA to confirm somatic KRAS mutations. J Natl Cancer Inst. 2009. V. 101. N. 18. P. 1284-1285.

28. Jacobs E.L., Haskell C.M. Clinical use of tumor markers in oncology. Curr Probl Cancer. 1991. V. 15. N. 6. P. 299-360.

29. Jahr S., Hentze H., Englisch S., et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer Res. 2001. V. 61. N. 4. P. 1659-1665.

30. Jung K., Fleischhacker M., Rabien A. Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker - a critical appraisal of the literature. Clin Chim Acta. 2010. V. 411. N. 21-22. P. 1611-1624.

31. Kopreski M.S., Benko F.A., Borys D.J., et al. Somatic mutation screening: identification of individuals harboring KRAS mutations with the use of plasma DNA. J Natl Cancer Inst. 2002. V. 92. N. 11. P. 918-923.

32. LaFramboise T. Single nucleotide polymorphism arrays: a decade of biological, computational and technological advances. Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. N. 13. P. 41814193.

33. Laktionov P.P., Tamkovich S.N., Rykova E.Y., et al. Cell-surface-bound nucleic acids: free and cell-surface-bound nucleic acids in blood of healthy donors and breast cancer patients. Ann N Y Acad Sci. 2004. V. 1022. P. 221-227.

34. Laktionov P.P., Tamkovich S.N., Rykova E.Y., et al. Extracellular circulating nucleic acids in human plasma in health and disease. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. V. 23. N. 67. P. 879-883.

35. Leary R.J., Sausen M., Kinde I., et al. Detection of chromosomal alterations in the circulation of cancer patients with whole-genome sequencing. Sci Transl Med. 2012. V. 4. N. 162. 162ra154.

36. Leon S.A., Shapiro B., Sklaroff D.M., et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 1977. V. 37. N. 3. P. 646-650.

37. Li C.N., Hsu H.L., Wu T.L., et al. Cell-free DNA is released from tumor cells upon cell death: a study of tissue cultures of tumor cell lines. J Clin Lab Anal. 2003. V. 17. N. 4. P. 103-107

38. Lo Y.M., Rainer T.H., Chan L.Y., et al. Plasma DNA as a prognostic marker in trauma patients. Clin Chem. 2000. V. 46. N. 3. P. 319-323.

39. Luis A., Diaz L.A.Jr, Bardelli A. Liquid Biopsies: Genotyping Circulating Tumor DNA. J Clin Oncol. 2014. V. 32. N. 6. P. 579-586.

40. Mabert K., Cojoc M., Peitzsch C., et al. Cancer biomarker discovery: current status and future perspectives. Int Radiat Biol. 2014. V. 90. N. 8. P. 659-677.

41. Maebo A. Plasma DNA level as a tumor marker in primary lung cancer. Nihon Kyobu Shikkan Gakkai Zasshi. 1990. V. 28. N. 8. P. 1085-1091.

42. Maire F., Micard S., Hammel P., et al. Differential diagnosis between chronic pancreatitis and pancreatic cancer: value of the detection of KRAS2 mutations in circulating DNA. Br J Cancer. 2002. V. 87. N. 5. P. 551-554.

43. Ma M., Zhu H., Zhang C., et al. "Liquid biopsy" - ctDNA detection with great potential and challenges. Ann Transl Med. 2015. V. 3. N. 16. P. 235.

44. Misale S., Yaeger R., Hobor S., et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature. 2012. V. 486. N. 7404. P. 532-536.

45. Murtaza M., Dawson S.J., Tsui D.W., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 2013. V. 497. N. 7447. P. 108-112.

46. Nawroz-Danish H., Eisenberger C.F., Yoo G.H., et al. Microsatellite analysis of serum DNA in patients with head and neck cancer. Int J Cancer. 2004. V. 111. N. 1. P. 96-100.

47. Overman M.J., Modak J., Kopetz S., et al. Use of research biopsies in clinical trials: Are risks and benefits adequately discussed? J. Clin Oncol. 2013. V. 31. N. 1. P. 17-22.

48. Paci M., Maramotti S., Bellesia E., et al. Circulating plasma DNA as diagnostic biomarker in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2009. V. 64. N. 1. P. 92-97.

49. Patel K.M., Tsui D.W. The translational potential of circulating tumour DNA in oncology. Clin. Biochem. 2015. V. 48. N. 15. P. 957-961.

50. Rachiglio A. M., Abate R E., Sacco A. Limits and potential of targeted sequencing analysis of liquid biopsy in patients with lung and colon carcinoma. Oncotarget. 2016. V. 7. N. 41. P. 66595-66605.

51. Schwarzenbach H., Müller V., Stahmann N., et al. Detection and characterization of circulating microsatellite-DNA in blood of patients with breast cancer. Ann. N Y Acad. Sci. 2004. V. 1022. P. 25-32.

52. Schwarzenbach H., Hoon D.S., PantelK. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nat Rev Cancer. 2011. V. 11. N. 6. P. 426-437.

53. Shapiro B., Chakrabarty M., Cohn E.M., et al. Determination of circulating DNA levels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease. Cancer. 1983. V. 51. N. 11. P. 21162120.

54. Shinozaki M., O'Day S. J., Kitago M., et al. Utility of circulating B-RAF DNA mutation in serum for monitoring melanoma patients receiving biochemotherapy. Clin Cancer Res. 2007. V. 13. N. 7. P. 2068-2074.

55. Shu X.O., Long J., Lu W., et al. Novel genetic markers of breast cancer survival identified by a genome-wide association study. Cancer Res. 2012. V. 72. N. 5. P. 1182-1189.

56. Sozzi G., Conte D., Mariani L., et al. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients. Cancer Res. 2001. V. 61. N. 12. P. 4675-4678.

57. Sozzi G., Conte D., Leon M., et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol. 2003. V. 21. N. 21. P. 3902-3908.

58. Sorenson G.D., Pribish D.M., Valone F.H., et al. Soluble normal and mutated DNA sequences from single-copy genes in human blood. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1994. V. 3. N. 1. P. 67-71.

59. Stroun M., Anker P., Maurice P., et al. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients. Oncology. 1989. V. 46. N. 5. P. 318-322.

60. Stroun M., Maurice P., Vasioukhin V., et al. The origin and mechanism of circulating DNA. Ann N Y Acad Sci. 2000. V. 906. P. 161-168.

61. Stroun M., Lyautey J., Lederrey C., et al. About the possible origin and mechanism of circulating DNA apoptosis and active DNA release. Clin Chim Acta. 2001. V. 313. N. 1-2. P. 139-142.

62. Sunami E., Shinozaki M., Higano C.S., et al. Multimarker circulating DNA assay for assessing blood of prostate cancer patients. Clin Chem. 2009. V. 55. N. 3. P. 559-567.

63. Szpechcinski A., Chorostowska-Wynimko J., Kupis W., et al. Quantitative analysis of free-circulating DNA in plasma of patients with resectable NSCLC. Expert Opin Biol Ther. 2012. V. 12 Suppl 1.S. 3-9. doi: 10.1517/14712598.2012.668519.

64. Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Rykova E.Y., et al. Circulating nucleic acids in blood of healthy male and female donors. Clin Chem. 2005. V. 51. N. 7. P. 1317-1319.

65. Theodor L., Melzer E., SologovM., et al. Detection of pancreatic carcinoma: diagnostic value of KRAS mutations in circulating DNA from serum. Dig Dis Sci. 1999. V. 44. N. 10. P. 20142019.

66. Thijssen M.A., Swinkels D.W., Ruers T.J., et al. Difference between free circulating plasma and serum DNA in patients with colorectal liver metastases. Anticancer Res. 2002. V. 22. N. 1A. P. 421-425.

67. Tomioka N., Morita K., Kobayashi N., et al. Array comparative genomic hybridization analysis revealed four genomic prognostic biomarkers for primary gastric cancers. Cancer Genet Cytogenet. 2010. V. 201. N. 1. P. 6-14.

68. Trombino S., Neri M., Puntoni R., et al. Mutations in KRASs codon 12 detected in plasma DNA are not an indicator of disease in patients with non-small cell lung cancer. Clin Chem. 2005. V. 51. N. 7. P. 1313-1314.

69. Tu M., Chia D., Wei F., et al. Liquid biopsy for etection of actionable oncogenic mutations in human cancers and electric field induced release and measurement liquid biopsy (eLB). Analyst. 2016. V. 141. N. 2. P. 393-402.

70. Vasioukhin V., Anker P., Maurice P., et al. Point mutations of the NRAS gene in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia. Br J Haematol. 1994. V. 86. N. 4. P. 774-779.

71. Vogelstein B., Papadopoulos N., Velculescu V.E., et al. Cancer genome landscapes. Science. 2013. V. 339. N. 6127. P. 1546-1558.

72. Wu T.L., ZhangD., Chia J.H., et al. Cell-free DNA: measurement in various carcinomas and establishment of normal reference range. Clin Chim Acta. 2002. V. 321. N. 1-2. P. 77-87.

73. Xie G.S., Hou A.R., Li L.Y., et al. Quantification of plasma DNA as a screening tool for lung cancer. Chin Med J Engl. 2004. V. 117. N. 10. P. 1485-1488.

74. Yoon K.A., Park S., Lee S.H., et al. Comparison of circulating plasma DNA levels between lung cancer patients and healthy controls. J Mol Diagn. 2009. V. 11. N. 3. P. 182-185.

75. Zhang R., Shao F., Wu X., et al. Value of quantitative analysis of circulating cell-free DNA as a screening tool for lung cancer: a meta-analysis. Lung Cancer. 2010. V. 69. N. 2. P. 225231.