СПОСОБ ИНОКУЛЯЦИИ ДРОЖЖЕЙ ВО ФРУКТОВЫЙ СОК
METHOD FOR INOCULATING YEAST INTO FRUIT JUICE

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу инокуляции дрожжей во фруктовый сок или фрукт. Это важно в целом для производства напитков, особенно для производства вина.
Уровень техники
За последние 50 лет виноделы привыкли к инокуляции вина чистыми культурами дрожжей. Такие инокуляционные культуры можно также обозначить как «стартовые/заквасочные культуры». Дрожжи находятся в обезвоженной форме, называемой активными сухими дрожжами (АСД), которые производят в ферментерах, концентрируют, а затем сушат в барабане, в способе, называемом сушкой в кипящем слое. Здесь так могут обозначаться также лиофилизированные дрожжи.
Из-за того что дрожжи обезвожены, они требуют регидратации, чтобы быть метаболически активными, перед нанесением на субстрат, такой как виноградный сок, как в случае изготовления вина. Это очень тонкий процесс для дрожжевых клеток, требующий тщательного внимания и осторожности, чтобы обеспечить гидратацию дрожжевых клеток таким путем, чтобы сохранить их жизнеспособность.
Как обсуждается в учебнике Roger Boulton et al., 1996, на странице 124, левая колонка, во время процесса сушки при производстве активных сухих дрожжей клеточные мембраны дрожжей теряют их барьерную функцию для проницаемости. Таким образом, для восстановления этой функции важно регидрировать мембраны путем добавления дрожжей в воду при 40°С в течение 20 минут.
2
2
Таким образом, процесс регидратации дрожжей обычно занимает 20-30 минут в нехлорированной воде или в смеси вода/виноградный сок (2:1) при температуре 35-38°С c последующим добавлением виноградного сока того же объема (50:50 смеси сока и воды), с выдерживанием еще 20-30 минут перед добавлением в вино. Важно, чтобы виноградный сок не содержал какого-либо SO, способного убить дрожжевые клетки во время чувствительного процесса регидратации (O'Kennedy, 2008). Кроме того, регидратационную смесь нужно охладить соком спустя 20 минут в воде температурой 5°С за один раз. Невозможность охлаждения с температуры регидратации спустя 30 минут может также вести к значительной гибели клеток (O'Kennedy, 2008). Далее нужно тщательно соблюдать применение неконтаминированного виноградного сока для протокола регидратации, поскольку регидратация контаминированным виноградным соком приведет к контаминации ферментации всего вина, инокулированного с применением регидратированной смеси. Различные производители предлагают варианты этого протокола, но критическим этапом является то, что обезвоженные клетки требуют воздействия воды или смеси воды/сока при определенных температурах, условий и определенного времени для надлежащей гидратации, чтобы избежать гибели клеток и последующей потери активности. Не рекомендуется добавлять активные дрожжи прямо в вино, поскольку высокая концентрация сахара, SO и других соединений в виноградном соке не обеспечивает оптимальной регидратации дрожжей. По этой причине ни один из производителей винных дрожжей не предлагает прямой инокуляции активных сухих дрожжей в виноградное сусло.
Как известно специалистам в данной области техники, в контексте настоящего изобретения термин фруктовый сок и фрукт нужно понимать как одно и то же и эти термины могут применяться здесь взаимозаменяемо.
Как описано в Soubeyrand et al., 2006, активные сухие дрожжи (лиофилизированные) теряют активность при отсутствии оптимальной регидратации. Неправильная регидратация активных сухих дрожжей также может вести к нарушению спиртового брожения (O'Kennedy, 2008). Таким образом, регидратация активных сухих дрожжей требует значительного количества времени и концентрации и обычно требует больших трудозатрат для специалистов в коммерческом виноделии при изготовлении вина.
Заявки ЕР 1645198 А1 (Minaki Advance Co Ltd, Japan); EP 2090647 Al (Chr. Hansen) и WO 2009/095137A1 (Chr. Hansen) можно рассматривать как релевантные документы из предшествующего уровня техники.
Однако ни один из этих документов предшествующего уровня техники не раскрывает способа, в котором дрожжи добавляют в замороженном виде к фруктовому соку перед ферментацией.
Настоящее изобретение относится к новому способу инокуляции дрожжей во фруктовый сок или фрукт, в котором могут быть устранены вышеупомянутые недостатки. Авторы изобретения неожиданно установили, что замороженную культуру (замороженную стартовую/заквасочную культуру) дрожжей можно непосредственно добавить во фруктовый сок при сохранении высокого уровня выживаемости дрожжевых клеток.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает новый продукт из винных дрожжей в замороженном виде. Продукт получают в ферментере, концентрируют и добавляют криопротекторы. Эту смесь затем морозят при -50°С в подходящих контейнерах.
Уникальным продукт делает то, что помимо того факта, что он является замороженным, его можно добавлять непосредственно в виноградный сок, поскольку не требуется регидратации, потому что дрожжи не были обезвожены в процессе производства. Этот продукт в настоящее время находится в форме замороженного мешка (пластикового DIM пакета), содержащего 1 кг замороженной культуры дрожжевых клеток.
Как показано в Примере 1, когда напрямую инокулировали замороженные дрожжи, к удивлению авторов настоящего изобретения, отмечалось лишь относительно небольшое уменьшение числа клеток по сравнению с активными сухими дрожжами, где наблюдалось существенно большее снижение числа клеток при прямой инокуляции по сравнению с правильной регидратацией. Таким образом, эта характеристика делает замороженные дрожжи пригодными для прямой инокуляции, простого способа, когда неспециалист может открыть контейнер и напрямую добавить содержимое в виноградный сок без риска значительной гибели клеток и последующей потери активности, как в случае активных сухих дрожжей. Далее прямая инокуляция дрожжей предотвращает возможное нарушение ферментации вина контаминированными регидратационными смесями.
Соответственно, на основании этой удивительной находки можно понять, что применение замороженных дрожжей может быть очень выгодным при производстве вина в соответствии с настоящим изобретением.
Дополнительным преимуществом является то, что прямая инокуляция существенно экономит время и трудозатраты виноделов, поскольку регидратация активных сухих дрожжей может занимать до часа и требует приготовления специалистами высокоспецифичных субстратов регидратации, а прямая инокуляция замороженных дрожжей занимает несколько минут и не требует специального обучения или навыков, осуществляясь простым добавлением продукта к виноградному соку или мятому винограду.
Указанные результаты были получены с применением винных дрожжей Pichia kluyveri. Специалист в данной области техники может легко перенести технологию на другие типы дрожжей, такие как Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces bayanus или Torulaspora delbreuckii, Kluyveromyces thermololerans и т.д.
Продукт можно также применять для производства иных напитков, чем вино, таких как пиво, сидр, сакэ, кефир, безалкогольные напитки и те напитки, где необходимо действие конкретных дрожжей и где дрожжи применяются в удобной форме для прямой инокуляции. Заквасочную культуру можно применять для ферментации любого типа среды на основе сахара, такой как виноградный сок, или яблочный сок, или альтернативно цельные фрукты.
Краткое описание чертежей
Фигуры 1 и 2 демонстрируют результаты соответствующих экспериментов, как подробно обсуждается ниже в рабочем примере 1.
Раскрытие изобретения
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу инокуляции дрожжей во фруктовый сок или фрукт. Указанные дрожжи должны вызывать ферментацию, а продукт этой ферментации можно применять в пищевой промышленности, в частности в производстве напитков. Предполагаемыми напитками являются вино, пиво, сидр или другие напитки, получаемые ферментацией фруктового или растительного материала, такого как фруктовый сок, овощи, растения или фрукты. Примерами фруктового или растительного материала является виноград, виноградный сок, яблоки или яблочный сок, или ячмень.
Дрожжи, которые можно использовать, могут относиться к любому типу дрожжей, применяемых в производстве напитков или продуктов питания. Примеры включают, например, Pichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces bayanus, Torulaspora delbreuckii или Kluyveromyces thermotolerans и т.д.
Обычно дрожжи применяют в производстве вина. Типичными дрожжами, используемыми при производстве вина, являются дрожжи из семейства Saccharomycetaceae (аскомицетные дрожжи). Обычно применяют дрожжи из рода Saccharomyces (например, вид Saccharomyces cerevisiae (SC)). Другие используемые дрожжи относятся к тому же самому семейству Saccharomycetaceae, но к другому роду, такому как Kluyveromyces (например, вид Kluyveromyces thermotolerans (КТ)) и роду Torulaspora (например, вид Torulaspora delbrueckii (TD)).
Для инокуляции ферментируемого фруктового или растительного материала можно применять чистую дрожжевую культуру (т.е. культуру, содержащую только один тип дрожжей), но в качестве инокулянта можно также применять смешанную культуру из двух или более типов дрожжей.
Для смешанной заквасочной/стартовой культуры может быть важно знать конкретное количество/соотношение каждого вида дрожжей в готовой коммерческой заквасочной культуре. Это особенно справедливо для винной заквасочной культуры, содержащей Saccharomyces ssp., Kluyveromyces ssp. и/или Torulaspora ssp.
10
Заквасочную культуру можно получить путем ферментации дрожжей с последующим сбором дрожжей путем центрифугирования. При этом получают жидкую дрожжевую биомассу. Обычно в ферментере 1000 л получают примерно 100 кг «влажной массы дрожжей» в форме жидкой пасты. В расчете на влажную массу эта паста обычно содержит примерно 10 КОЕ на грамм. После замораживания остается примерно 10 КОЕ/г.
Для защиты клеток от жестких условий замораживания можно добавлять криопротектор после или до центрифугирования. Примеры криопротекторов включают глюкозу, сахарозу, трегалозу.
9
Такие криопротекторы обычно добавляют в количестве примерно 5-20%. Количество должно быть достаточным для сохранения числа КОЕ на уровне примерно 10 или выше.
После добавления криопротектора и сбора жидкой биомассы дрожжей биомассу переносят в подходящий контейнер, например пластиковые мешки. Эти контейнеры затем замораживают при температуре от -10°С до -60°С. Предпочтительным температурным интервалом является интервал от -10°С до -30°С.
Способ в соответствии с изобретением влечет за собой добавление замороженной заквасочной культуры в среду на основе сахара в количестве, достаточном для инициации и поддержки ферментации растительного материала.
Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к способу инокуляции дрожжей во фруктовый сок, включающему следующие стадии:
a) обеспечение фруктового сока в контейнере и
b) добавление дрожжей в замороженном виде в количестве, достаточном для инициации и поддержания ферментации фруктового сока.
Специалисту в данной области техники понятно, что при добавлении дрожжей в замороженном виде во фруктовый сок в соответствии со стадией (b), указанной выше, не требуется регидратации дрожжей.
Как понятно специалисту в данной области техники, описанный способ в соответствии с настоящим изобретением можно назвать способом прямой инокуляции.
В рабочем примере 1 обсуждаются эксперименты, относящиеся к применению замороженных дрожжевых заквасочных культур для инокуляции. Неожиданно было установлено, что при оттаивании замороженной дрожжевой культуры перед добавлением в виноградный сок выживание клеток (КОЕ/мл) в виноградном соке было даже лучше, чем достигаемое при прямой инокуляции замороженной дрожжевой культуры в виноградный сок.
Соответственно, в отдельном аспекте изобретение относится к способу инокуляции дрожжей во фруктовый сок, включающему следующие стадии:
i) обеспечение фруктового сока в контейнере;
ii) обеспечение дрожжей в замороженном виде;
iii) оттаивание замороженных дрожжей до получения дрожжей в жидком виде; и
iv) добавление дрожжей в жидком виде в количестве, достаточном для инициации и поддержания ферментации фруктового сока.
Специалисту в данной области техники понятно в контексте настоящего изобретения, что при оттаивании замороженных дрожжей до получения в жидком виде с последующим добавлением дрожжей в жидком виде во фруктовый сок в соответствии со стадией (iii) не требуется регидратации дрожжей.
Как известно специалисту в данной области техники, температура для стадии ферментации фруктового сока в винодельне обычно составляет от 15 до 25°С. Соответственно, когда в винодельне добавляют дрожжи в замороженном виде во фруктовый сок (т.е. в соответствии со стадией (b)), то дрожжи в замороженном виде обычно оттаивают при температуре от 15 до 25°С.
В рабочем примере 1 температура оттаивания составила 30°С.
Не желая углубляться в теорию, считается, что наилучшие результаты достигаются, когда температура оттаивания на стадии (iii) составляет от 25 до 35°С.
Как понятно специалисту в данной области техники, вышеуказанную стадию оттаивания (iii) можно осуществить, например, путем добавления дрожжей в замороженном виде в воду или в смесь воды и сока, где вода или смесь воды и сока имеет подходящую температуру. Как понятно специалисту в данной области техники, таким образом получают дрожжи в жидком виде, которые можно добавить во фруктовый сок в соответствии с вышеуказанной стадией (iv).
Примеры
Материалы и методы
В качестве активных сухих дрожжей в данном примере применяли Saccharomyces bay anus В52 (Lesaffre). В качестве замороженных дрожжей в данном примере применяли Pichia kluyveri (Chr. Hansen). Все инокуляции проводили в трех повторностях со среднеквадратическим отклонением, указанным на гистограмме на фигурах 1 и 2 ниже. После инокуляции дрожжей смесь тщательно перемешивали для растворения содержимого перед получением стандартных разведений для выращивания культуры. Для определения количества клеток в данном продукте готовили разведения в пептонной воде и 1 мл выливали на чашки Петри, после чего добавляли агар с дрожжевым экстрактом и глюкозой (YGM) в жидкой форме при 40°С. Чашки инкубировали в течение 3 суток при 30°С, после чего подсчитывали число колоний. Рассчитывали КОЕ/г, как показано на фигурах 1 и 2, из расчета исходной массы добавленных АСД и замороженных дрожжей.
Для определения числа клеток дрожжей после инокуляции в среде с синтетическим виноградным соком использовали тот же протокол. Замороженные или оттаявшие дрожжи Pichia kluyveri в количестве 50 г/л инокулировали в 200 мл среды с синтетическим виноградным соком при комнатной температуре (21°С).
6
Активные сухие дрожжи либо регидратировали (20 мин при 37°С, 1 г в 10 мл нехлорированной воды), либо готовили навеску для прямой инокуляции в количестве 0,3 г/л, что соответствовало 2·10 КОЕ/мл. Для инокулируемых напрямую и регидратированных АСД температуру синтетического виноградного сусла подводили до 30°С для облегчения выживания из-за разницы температур между инокулятом и средой.
Синтетическое виноградное сусло готовили в соответствии с Costello et al., 2003, с концентрацией сахара 250 г/л и рН 3,5. После инокуляции готовили разведения в пептонной воде и 1 мл выливали на чашки Петри, после чего добавляли агар с дрожжевым экстрактом и глюкозой (YGM) в жидком виде при 40°С.Чашки инкубировали в течение 3 суток при 30°С, после чего подсчитывали число колоний. С помощью количества дрожжевой массы, добавленной в синтетическое виноградное сусло, и значения КОЕ/мл, полученного при анализе чашек, рассчитывали значение в КОЕ/г.
Пример 1: Применение замороженных дрожжей - сравнение с лиофилизированными дрожжами.
На Фигуре 1 показаны результаты отрицательного влияния прямой инокуляции активных сухих дрожжей (АСД) при прямой инокуляции в синтетический виноградный сок (горизонтальные линии) по сравнению с регидратацией АСД в воде при 37°С в течение 20 минут с последующей инокуляцией в синтетический виноградный сок (вертикальные линии). После инокуляции подсчитывали клетки путем посева заливкой и полученные данные использовали для расчета среднего значения КОЕ/г.Среднее число клеток исходных активных сухих дрожжей в КОЕ/г составило 2,20Е+10 (столбец с штриховкой точками). Прямая инокуляция активных сухих дрожжей показала среднее значение в КОЕ/г 4.49Е+9, что означало, что 81,3% клеток погибло при прямой инокуляции. Однако, когда дрожжи вначале регидратировали в воде при 37°С в течение 20 минут, а затем инокулировали в синтетический виноградный сок, то расчетное среднее значение в КОЕ/г составило 2.35Е+10, что означало, что только примерно 2,1% клеток погибло после регидратации и инокуляции.
На Фигуре 2 показано влияние прямой инокуляции замороженных дрожжей в синтетическом виноградном сусле с первоначальным оттаиванием и без него. Количество клеток в исходном мороженом дрожжевом продукте составило 8,0Е+8 (штриховка точками). После прямой инокуляции замороженных дрожжей (без оттаивания) в виноградный сок среднее количество клеток составило 5,1Е+8 (горизонтальные линии), а после оттаивания с последующей прямой инокуляцией в виноградный сок среднее количество клеток составило 7,1+8 (вертикальные линии), что означало, что при прямой инокуляции в мороженом виде (без оттаивания) погибало только 36,3% клеток, а при прямой инокуляции в мороженом виде (после оттаивания) погибало только 11,3% клеток. Это очень благоприятно по сравнению с активными сухими дрожжами, где погибало 81,3% клеток, что свидетельствует, что замороженные дрожжи можно применять для прямой инокуляции без существенной потери количества клеток и последующей активности.
Выводы
Результаты Примера 1 показали, что активные сухие дрожжи (лиофилизированные) теряют значительное количество жизнеспособных клеток при прямой инокуляции (без регидратации) по сравнению с инокуляцией после регидратации в воде (при определенной температуре) и разбавления сока - т.е. эти результаты соответствуют знаниям предшествующего уровня техники, как обсуждалось выше.
Однако при прямой инокуляции замороженных дрожжей, к удивлению авторов настоящего изобретения, наблюдалось только относительно небольшое уменьшение числа клеток, как в вышеуказанном случае. Соответственно, на основе этой удивительной находки понятно, что применение замороженных дрожжей может быть очень выгодным при производстве вина в соответствии с настоящим изобретением.
Дополнительным преимуществом является то, что прямая инокуляция существенно экономит время виноделов, поскольку регидратация активных сухих дрожжей может занимать более часа, а прямая инокуляция замороженных дрожжей занимает несколько минут.
Как указано в примере выше, неожиданно было установлено, что при первом оттаивании замороженной культуры и последующей прямой инокуляции в виноградный сок выживание клеток (КОЕ/мл) было даже лучше, чем при прямой инокуляции замороженной дрожжевой культуры в виноградный сок без первоначального оттаивания.
Ссылки
1.ЕР 1645198.
2. ЕР 2090647.
3.WO 2009/095137.
4. Peter Costello, Paul Henschke and Andrew Markides (2003) Standardised methodology for testing malolactic bacteria and wine yeast compatibility. Australian Journal of Grape and Wine Research 9 (2): 127-137.
5. Roger Boulton, Vernon Singleton, Linda Bisson and Ralph Kunkee. 1996. Principles and Practices of Winemaking. Pp.124.
6. Karien O'Kennedy (2008). How to avoid stuck fermentations, The Australian & New Zealand Grapegrower & Winemaker. November, Issue 538, 103-105.
7. Virginie Soubeyrand, Anne Julien and Jean-Marie Sablayrolles (2006) Rehydration Protocols for Active Dry Wine Yeasts and the Search for Early Indicators of Yeast Activity American Journal of Enolology and Viticulture. 57(4)474-480.