БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ СЫВОРОТКА КРОВИ, СПОСОБЫ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
BIOTREATMENT BLOOD SERUM, METHODS OF PRODUCTION AND APPLICATION

Настоящее изобретение относится к способу получения продукта сыворотки крови, продукту сыворотки крови и фармацевтической композиции, содержащей указанный продукт сыворотки крови, а также к их применению для лечения различных заболеваний и состояний, включая эпилептические припадки и апоплексию.
Уровень техники
Способы получения активных веществ из сыворотки крови известны из уровня техники. Один из них основан на взятии крови у людей или животных, последующем инкубировании, а также отделении активного вещества и, наконец, консервации вещества (см., например, JP 2123287, EP 0542303, RU 2096041, RU 2120301). Способ предшествующего уровня техники касается получения сыворотки крови, которая повышает устойчивость организма к экзогенным и эндогенным факторам, как давление воздуха, температура воздуха, сила тяжести, свет и т.д., а также голод, жажда, сон и сексуальное влечение и т.д. Сыворотку крови берут у донора, который был предварительно приведен в определенное функциональное состояние и в зависимости от длительности применения, от функционального состояния и типа функционального состояния, например, бессонницы, алкогольной зависимости, зависимости от никотина и т.д., может быть получена сыворотка крови с различной биологической активностью, которая проявляет митогенное, сомногенное, офтальмогенное, аудиоактивирующее, термоактивирующее, влияющее на режим питания, влияющее на сексуальную активность, антигипоксическое, антиалкогольное и антиникотиновое действие.
Отличный способ раскрыт в EP 1283047 и касается обработки сыворотки крови животного гамма-облучением с целью повышения биологической активности продукта сыворотки крови.
В настоящее время большое количество исследований сосредоточено на механизмах, которые регулируют клеточную пролиферацию различных тканей человека. В этом отношении исследованы как стимуляторы, так и ингибиторы пролиферации нормальных и патологически измененных соматических клеток, включая нервные клетки (см., например, Aschmarin, 1.Р. "Neurochemistry", Moskwa, Publishers of the Biomedical Chemical Institute of the Russian Academy of Science", 1996).
Было отмечено, что пептидные факторы роста кроме общих активирующих функций, например, стимуляции митоза, клеточной дифференцировки и роста клеток различных типов нормальной ткани, увеличения заживления ран, могут вызвать формирование и рост опухоли (см., например, Bouneres, P. (1993), Horm. Res, 40: 31; Robinson C., (1993) Ann. Med 25: 535; Dignez, С and Casanueva F. (1995) Trends Endocrin. Metab. 6: 55, Menster D. et al. (1995) Clin. Exp. Metastasis 13: 67).
Такие пептиды, как, например, пептиды паращитовидной железы, гастрин или бомбезин способствуют развитию опухолевых клеток, а также развитию рака молочной железы, рака костей и толстой кишки (см., например, Kitazawa S. and Maeda S. (1995) Clin. Orthop. 312: 45-50 and Kaji et al. (1995) Endocrinology 136: 842).
Несмотря на то что некоторые пептиды способствуют делению нормальных клеток и являются стимуляторами для человека и животных, существует опасность, что их применение приведет к развитию опухолевых клеток и, в конечном счете, к развитию рака.
Более ранние эксперименты показали, что стимуляция животных электричеством приводит к повышению уровня β-эндорфина в крови (см., например, Litvinova S.V. et al. (1990) Biomed. Sci. 5: 471). В ссылочной работе Udovitschenko W.L. представлены многочисленные данные в отношении результатов стимулирования или шока вследствие различных причин. Показано, что, например, электрошок приводит к заметному увеличению концентрации β-эндорфинов, мета- и лейэнцефалинов в крови (см. Udowitschenko W.I. (1989) "Xenogenic Opioid System in Shock" Pathiological Physiology and Experimental Therapy" 6: 72-77).
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является разработка нового способа получения биологически активной сыворотки крови из крови животного. Неожиданно было обнаружено, что биологически активная сыворотка крови, полученная в соответствии со способом по настоящему изобретению, продемонстрировала новые терапевтические свойства.
Следовательно, одним из аспектов настоящего изобретения является способ получения биологически активной сыворотки крови, предусматривающий этапы:
a) электростимуляции животного, не являющегося человеком,
b) взятия крови у указанного животного,
c) выделения сыворотки из указанной крови, и
d) гамма-облучения указанной сыворотки.
В предпочтительном варианте осуществления животное, не являющееся человеком, выбрано из группы, включающей млекопитающих и птиц, предпочтительно, домашних птиц, например, курицу, утку, гуся, страуса и перепела.
Несмотря на то что электростимуляцию можно применять для любой части тела, предпочтительно, чтобы этап a) способа по настоящему изобретению применялся на голове, шее, теле и/или одной или более конечностях животного. Из них, предпочтительно, электростимуляции подвергают голову животного. В контексте настоящего изобретения термины электростимуляция и электрошок используются взаимозаменяемо.
В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению электростимуляцию выполняют в течение интервала времени между 1 и 60 секундами, предпочтительно, между 1 и 30 секундами и, более предпочтительно, между 2 и 10 секундами. Также предпочтительно электростимуляцию выполняют с напряжением в диапазоне между 50 В и 150 В, предпочтительно, в диапазоне между 80 В и 120 В, и, более предпочтительно, в диапазоне между 110 В и 120 В. При осуществлении электростимуляции предпочтительными являются определенные значения силы тока, и, предпочтительно, электростимуляцию выполняют с силой тока в диапазоне между 0,01 A и 0,4 A, предпочтительно, в диапазоне между 0,02 A и 0,1 A, и, более предпочтительно, в диапазоне между 0,04 A и 0,06 A.
В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению электростимуляцию выполняют с частотой в диапазоне между 10 и 200 Гц, предпочтительно, в диапазоне между 20-100 Гц и, более предпочтительно, в диапазоне между 45-65 Гц.
60
137
67
67
111
192
99m
l70
В еще одном предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению гамма-облучение привносится с поглощенной дозой излучения между 10 и 40 кГр, предпочтительно, 15 и 35 кГр и, более предпочтительно, между 20 и 30 кГр. Источник гамма-излучения может представлять собой любой источник, однако предпочтительный источник гамма-излучения выбран из группы, состоящей из Co, Cs, Cu, Ga, In, Ir, Tc и Tm.
В более предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению способ дополнительно предусматривает этап инкубирования указанной крови перед этапом c).
В более предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению способ дополнительно предусматривает этап лиофилизации указанной сыворотки перед этапом d).
В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению кровь представляет собой артериальную и/или венозную кровь.
Другим аспектом настоящего изобретения является биологически активная сыворотка крови, продуцируемая в соответствии со способом по настоящему изобретению.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая сыворотку крови по настоящему изобретению и один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей; носителей; эксципиентов, включая наполнители, связывающие вещества, смазывающие вещества, агенты скольжения, дезынтегрирующие агенты, адсорбенты и/или консервант.
В предпочтительном варианте осуществления фармацевтической композиции по настоящему изобретению композиция приготовлена в виде сиропа, раствора для инфузии или инъекции, таблетки, капсулы, твердой таблетки в форме капсулы, пастилки, липосомы, свечи, пластыря, бинта, капсулы пролонгированного действия, порошка или препарата замедленного высвобождения. Предпочтительно разбавитель представляет собой воду, буфер, буферный солевой раствор или солевой раствор, и носитель, предпочтительно, выбран из группы, включающей масло какао и vitebesole.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является применение сыворотки крови по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, которое может быть вызвано увеличением содержания циклической аденозинмонофосфорной кислоты в мозге пациента.
Другим аспектом настоящего изобретения является применение сыворотки крови по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для улучшения когнитивных и/или учебных навыков, в частности, для улучшения долговременной памяти.
Другим аспектом настоящего изобретения является применение сыворотки крови по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения припадков, в частности, эпилептических приступов.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является применение сыворотки крови по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения пролиферативных заболеваний и апоплексии.
В предпочтительном варианте осуществления применения настоящего изобретения пролиферативное заболевание выбрано из группы, включающей малигном желудочно-кишечного или колоректального тракта, печени, поджелудочной железы, почки, мочевого пузыря, щитовидной железы, простаты, слизистой оболочки матки, шейки матки, яичника, матки, яичек, кожи, ротовой полости; меланомы; диспластической слизистой оболочки рта; инвазивных раковых опухолей ротовой полости; мелкоклеточной и немелкоклеточной карцином легких; опухолей молочной железы, в частности, гормональнозависимых раковых опухолей молочной железы и гормональнонезависимых раковых опухолей молочной железы; переходно-клеточной и плоскоклеточной раковых опухолей; неврологических злокачественных образований, включая нейробластомы, глиомы, астроцитомы, остеосаркомы, менингиомы; саркомы мягких тканей; гемангиом и опухолей желез внутренней секреции, в частности, аденом гипофиза, феохромоцитом, параганглиом, гематологических злокачественных образований, в частности, лимфом и лейкемии.
Кроме того, в еще одном предпочтительном варианте осуществления применения настоящего изобретения пролиферативное заболевание содержит клетки, подобные линии Jurkat клеток лимфомы Т-клеток человека, линии Raji клеток лимфомы В-клеток человека, линии Bro клеток меланомы человека, линии HeLa клеток рака шейки матки человека, линии MCF-7 клеток аденокарциномы человека, линии Mg63 клеток остеосаркомы, линии HT1080 клеток фибросаркомы, линии IMR-32 клеток нейробластомы и линии HepG2 клеток гепатокарциномы.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления применения настоящего изобретения лекарственное средство вводят пациенту в количестве, изменяющемся от 50 до 150 мг/кг веса тела, предпочтительно, изменяющемся от 90 до 100 мг/кг веса тела.
Подробное описание изобретения
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что стимуляция животных, в частности кур, электрическим током и дополнительная обработка сыворотки крови, полученной из крови, γ-излучением приводит к значительному увеличению биологической активности продукта сыворотки крови. Получающиеся продукты могут оказывать положительное действие на различные функции тела, состояния и заболевания пациента.
Благоприятное действие сыворотки крови, обработанной электрошоком и γ-излучением, является неожиданным по двум причинам. Во-первых, в предшествующем уровне техники известно, что удары током вызывают тяжелые нарушения всех жизненных функций и систем в организме, в частности центральной нервной системы, крови и кровеносной системы и системы органов дыхания (см., например, Orlow, A.N. et al. (1977) Medicine). Во-вторых, также было обнаружено, что кровь и сыворотка, полученная из крови, чувствительна к радиации и является неустойчивой, и инактивируется при ионизирующем облучении (см., например, Radiomedicine - M Atomisdat (1972) 123-125 and Gergely, 3. et al. (1967) Radiosterilization of Medical Products 115-124).
Данные исследования не приводили к результатам настоящего изобретения и можно было предположить, что получить биологическую активную сыворотку крови путем сочетания обработки электрошом и γ-излучением невозможно. Таким образом, неожиданностью было то, что из артериальной и/или венозной крови, взятой у животного, в частности у курицы, обработанной электрошоком II-III уровня и гамма-излучением, можно получить биологически активную сыворотку крови. Конкретная активность полученной таким образом сыворотки крови описана более подробно ниже.
Соответственно, первым аспектом настоящего изобретения является способ получения биологически активной сыворотки крови, предусматривающий этапы:
a) электростимуляции животного, не являющегося человеком,
b) взятия крови у указанного животного,
c) выделения сыворотки из указанной крови, и
d) гамма-облучения указанной сыворотки.
В способе настоящего изобретения могут использоваться различные животные, однако предпочтительно животное, не являющееся человеком, выбрано из группы, включающей млекопитающих и птиц. По причине доступности, в частности, предпочтительно использовать сельскохозяйственных животных, таких как домашнюю птицу, например, курицу, утку, гуся, страуса и перепела. Особенно предпочтительным животным, которое может использоваться в способе по настоящему изобретению, является курица. Тип млекопитающего, который может использоваться в способе по настоящему изобретению, конкретно не ограничен и включает без ограничения грызунов, например мышь, хомяка и крысу, кошек, собак, лошадей, ослов, овец, коров и коз.
Предполагается, что электростимуляция приводит к высвобождению в теле животного определенных соединений, которые вызывают и/или вносят свой вклад в неожиданное терапевтическое действие биологически активной сыворотки крови по настоящему изобретению. Животное, не являющееся человеком, может быть стимулировано в различных областях организма. Предпочтительно электростимуляцию выполняют на голове, шее, теле и/или на одной или более конечностях. Можно стимулировать организм только в одном месте или сразу в нескольких местах. Особенно предпочтительной частью тела для электростимуляции является голова соответствующего животного. При стимулировании птиц, в частности, курицы предпочтительно, электростимуляции подвергают голову.
Электростимуляция может быть выполнена известными из уровня техники способами, предпочтительно, с применением металлических электродов или ванн с водой, которые, например, используют при выбраковке скота или умерщвлении домашней птицы электрическим током. Предпочтительно электростимуляция выполняется в течение интервала времени между 1 и 60 секундами, предпочтительно, между 1 и 30 секундами, более предпочтительно, между 2 и 10 секундами и, наиболее предпочтительно, между 3 и 4 секундами. Длительность интервала времени больше в случае, если электростимуляции подвергают крупное животное, и может быть меньше в случаях, если электростимуляции подвергают мелких животных. Например, для стимулирования голов кур, в частности, предпочтительный интервал времени электростимуляции составляет между 2 и 10 секундами и более предпочтительно между 3 и 4 секундами. Другими параметрами, которые могут быть изменены в ходе электростимуляции животного, являются напряжение, сила тока и частота тока, и авторы настоящего изобретения определили некоторые предпочтительные диапазоны для этих параметров. Выбранный текущий параметр частично зависит от размера животного, а также от области тела животного, которое стимулируют. По существу, более крупные животные и более крупные области требуют более высокого напряжения и силы тока. Таким образом, электростимуляцию предпочтительно выполнять с напряжением в диапазоне между 50 вольт и 150 вольт, предпочтительно, от 80 вольт до 120 вольт и, более предпочтительно, между 110 вольт и 120 вольт. Диапазоны для силы тока, которые могут быть применены, составляют между 0,01 A и 0,4 A, предпочтительно, между 0,02 A и 0,1 A, более предпочтительно, между 0,04 A и 0,06 A и, наиболее предпочтительно, около 0,05 A. Напряжение, сила тока и время применения, предпочтительно, выбраны для передачи энергии в диапазоне между 1 и 1000 ватт·с, предпочтительно, в диапазоне от 10 до 200 ватт·с и, еще более предпочтительно, в диапазоне от 15 до 100 ватт·с.
Для стимуляции предпочтительных животных, то есть курицы, предпочтительно выполнять электростимуляцию с напряжением в диапазоне между 80 вольт и 120 вольт и, более предпочтительно, между 110 вольт и 120 вольт. Кроме того, сила тока в диапазоне между 0,04 A и 0,06 A, в частности, 0,05 A является предпочтительной применительно к электростимуляции птиц, в частности курицы.
В особенно предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению электростимуляция птицы, в частности курицы, выполняется в течение 3-4 секунд при напряжении между 80 В и 120 В, в частности, 110 В и 120 В. В этом предпочтительном варианте выполнения сила тока, предпочтительно, составляет между 0,04 A и 0,06 A и, наиболее предпочтительно, около 0,05 A.
По-видимому, частота электростимуляции не является особенно важной, но, предпочтительно, находится в диапазоне между 10 и 200 Гц, более предпочтительно, в диапазоне между 45 и 65 Гц и, наиболее предпочтительно, составляет около 50 Гц.
60
137
67
67
111
192
99m
170
60
137
192
170
60
Гамма-облучение сыворотки в ходе этапа d) способа по настоящему изобретению может быть выполнено с помощью любого гамма-источника, включая источники рентгеновских лучей и радионуклиды. Предпочтительно источник гамма-излучения представляет собой радионуклиды с определенным характером гамма-излучения. Предпочтительные источники гамма-излучения выбраны из группы, включающей Co, Cs, Cu, Ca, In, Ir, Tc и Tm. Для авторов изобретения в способе настоящего изобретения из них особенно предпочтительными источниками гамма-излучения являются Co, Cs, Ir и Tm и, наиболее предпочтительным, является Co. Поглощенная сывороткой доза излучения находится в диапазоне между 10 и 40 кГр, предпочтительно, в диапазоне между 15 и 35 кГр и, более предпочтительно, в диапазоне между 20 и 30 кГр, то есть 25±5 кГр.
Взятие крови у животного может осуществляться любым способом, известным из уровня техники и включает взятие с помощью шприца, а также прокалывание артерий или вен, или обезглавливание, в частности, применительно к взятию крови у птиц. Можно брать только часть крови или всю кровь животного. Последнее предпочтительно использовать, если к животному была применена смертельная доза электричества. Взятая кровь может быть артериальной и/или венозной.
Сыворотка может быть выделена из крови любым известным способом, включая фильтрацию, осаждение и центрифугирование. Тем не менее, предпочтительным является инкубирование крови в течение 4-72 часов при низкой температуре, например, между 2 и 10°C, предпочтительно, между 4 и 8°C, для обеспечения свертывания крови, которое приводит к высвобождению в кровь дополнительных факторов. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению способ дополнительно предусматривает этап инкубирования крови после взятия крови у животного и до выделения сыворотки из крови, например, в течение 4-72 часов при низкой температуре, например, между 2 и 10°C, предпочтительно между 4 и 8°C.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению способ предусматривает дополнительный этап лиофилизации сыворотки до этапа облучения d). Лиофилизация обеспечивает более легкую обработку сыворотки в ходе облучения и оптимизирует поглощение излучения компонентами сыворотки.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является непосредственно биологически активная сыворотка крови, которую получают способом по настоящему изобретению. Она отличается от сывороток крови предшествующего уровня техники, при получении которых не используют этапы способа по настоящему изобретению, для нее доказано специфическое терапевтическое действие, которое не проявляют продукты сыворотки крови предшествующего уровня техники.
Поскольку было неожиданно обнаружено, что биологически активная сыворотка крови по настоящему изобретению обеспечивает определенное терапевтическое действие, например антипролиферативную активность или антиэпилептическую активность, дополнительным аспектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая биологически активную сыворотку крови, получаемую в соответствии со способом по настоящему изобретению. Такая фармацевтическая композиция может дополнительно содержать один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей; носителей; формообразующих, включая наполнители, связывающие вещества, смазывающие вещества, глиданты, дезынтегранты и адсорбенты; и/или консервантов.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться различными хорошо известными путями, включая пероральное и парентеральное введения, например внутривенные, внутримышечные, внутриносовые, внутрикожные, подкожные и подобные пути введения. Предпочтительными являются парентеральное введение и определенное внутривенное введение. В зависимости от пути введения требуются различные фармацевтические препараты, и для некоторых из них может потребоваться нанесение на лекарственный препарат защитных покрытий для предотвращения расщепления биологически активной сыворотки, например, в пищеварительном тракте.
Таким образом, предпочтительно, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению получают в виде сиропа, раствора для инфузии или раствора для инъекции, таблетки, капсулы, твердой таблетки в форме капсулы, твердые таблетки в форме капсулы, пастилки, липосомы, свечи, пластыря, бинта, капсулы пролонгированного действия, порошка или препарата замедленного высвобождения.
Особенными предпочтительными фармацевтическими формами являются формы, подходящие для применения в виде инъекции, и включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсии для инъекции по индивидуальному рецепту. Во всех случаях конечная форма раствора или дисперсии должна быть стерильной и жидкой. Как правило, такой раствор или дисперсия включают растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, водно-буферные водные растворы, например биологически совместимые буферы, этанол, многоатомный спирт, такой как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, их подходящие смеси, поверхностно-активные вещества или растительные масла. Биологически активная сыворотка крови по настоящему изобретению может также быть получена в липосомах, в частности, для парентерального введения. Преимуществом липосомы является увеличение периода полувыведения из кровотока по сравнению со свободным лекарственным средством и еще более длительное высвобождение заключенного в ней лекарственного средства.
Стерилизация растворов для инфузии или инъекции может быть выполнена любой методикой, принятой в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, добавку консервантов, таких как антибактериальные или фунгицидные агенты, например парабен, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота или тимерсал. Дополнительно в растворы для инфузии или инъекции могут быть включены изотонические агенты, такие как сахара или соли, в частности хлорид натрия.
Получение стерильных растворов для инъекции, содержащих биологически активную сыворотку крови, производится путем объединения биологически активной сыворотки в заданном количестве в подходящем растворителе, если требуется, с различными ингредиентами, перечисленными выше, с последующей стерилизацией. В случае необходимости для получения стерильного порошка приведенные выше растворы подвергают вакуумной сушке или сублимационной сушке. Предпочтительными разбавителями по настоящему изобретению являются вода, физиологически приемлемые буферы, физиологически приемлемые буферные солевые растворы или солевые растворы. Предпочтительными носителями по настоящему изобретению являются масло какао и vitebesole. Эксципиенты, которые могут использоваться в различных фармацевтических формах биологически активной сыворотки крови, могут быть выбраны из следующего неограничивающего списка:
a) связывающие вещества, такие как лактоза, маннит, кристаллический сорбит, двухосновные фосфаты, фосфаты кальция, сахара, крупнокристаллическая целлюлоза, карбоксилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, поливинил пирролидон и т.п.;
b) смазывающие вещества, такие как стеарат магния, тальк, стеарат кальция, стеарат цинка, стеариновая кислота, гидрогенизированное растительное масло, лейцин, глицериды и стеарилфумараты натрия,
c) дезынтегрирующие агенты, такие как крахмалы, кроскарамеллоза, натрийметилцеллюлоза, агар, бентонит, альгиновая кислота, карбоксилметилцеллюлоза, поливинилпирролидон и т.п.
Другие подходящие эксципиенты могут быть найдены в руководстве Handbook of Pharmaceutical Excipients, изданном Американской Фармацевтической Ассоциацией, которое включено в настоящей заявке в качестве ссылки.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является применение сыворотки крови или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, которое может быть вызвано увеличением содержания циклической аденозинмонофосфорной кислоты в мозге пациента.
Другим аспектом настоящего изобретения является применение биологически активной сыворотки крови или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для продукции лекарственного средства для улучшения ноотропных, когнитивных и/или учебных навыков пациента и, в частности, для улучшения долговременной памяти. Применимость для этого показания основана на открытии, что сыворотка крови или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению повышают учебные способности пациентов.
Кроме того, сыворотку крови или фармацевтическую композицию можно использовать для лечения припадков любого типа, в частности для лечения эпилептических припадков. В частности, при тяжелых формах эпилепсии и при больших эпилептических припадках введение биологически активной сыворотки крови или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может предотвратить смерть, которая в некоторых случаях связана с тяжелыми приступами. В связи с наблюдением, что настоящее изобретение можно использовать для лечения эпилептических приступов, также было обнаружено, что кровь, сыворотку или фармацевтическую композицию по данному изобретению можно использовать для лечения нервных заболеваний, включая, но ими не ограничиваясь, биполярное расстройство, депрессию, тревожные расстройства, эпилепсию, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, периферическую нейропатию, амилоидную ангиопатию головного мозга, нейродегенеративные расстройства и повреждение спинного мозга.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является применение сыворотки крови или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения пролиферативных заболеваний и апоплексии. Особенно неожиданным было то, что биологически активная сыворотка крови или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению действительно проявляли отмеченное антипролиферативное действие при тестировании на различных линиях опухолевых клеток in vitro. В связи с этим представляется, что биологически активная сыворотка крови или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, в частности, эффективны для лечения пролиферативных заболеваний, и предпочтительные пролиферативные заболевания, которые могут подвергаться лечению с применением настоящего изобретения, выбраны из группы, включающей малигномы желудочно-кишечного или колоректального тракта, печени, поджелудочной железы, почки, мочевого пузыря, щитовидной железы, простаты, слизистой оболочки матки, шейки матки, яичника, матки, яичек, кожи, ротовой полости; меланомы; диспластической слизистой оболочки рта; инвазивные раковые опухоли ротовой полости; мелкоклеточную и немелкоклеточную карциному легких; опухоли молочной железы, в частности, гормональнозависимых раковых опухолей молочной железы и гормональнонезависимых раковых опухолей молочной железы; переходно-клеточную и плоскоклеточную раковую опухоль; неврологические злокачественные образования, включая нейробластомы, глиомы, астроцитомы, остеосаркомы, менингиомы; саркомы мягких тканей; гемангиомы и опухоли желез внутренней секреции, в частности, аденомы гипофиза, феохромоцитомы, параганглиомы, гематологические злокачественные новообразования, в частности, лимфомы и лейкемии.
ras
Так как антипролиферативное действие биологически активной сыворотки крови по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению в первую очередь было создано для различных линий клеток опухолей, она особенно подходит для лечения пролиферативных заболеваний, которые содержат клетки и/или опухолевую ткань, содержащую клетки, подобные линиям опухолевых клеток, используемым в данных экспериментах. Соответственно, предпочтительные пролиферативные заболевания, которые лечат с помощью биологически активной сыворотки крови или фармацевтической композиции, содержащей биологически активную сыворотку, содержат клетки, подобные линии Jurkat клеток лимфомы Т-клеток человека, линии Raji клеток лимфомы В-клеток человека, линии Bro клеток меланомы человека, линии HeLa клеток рака шейки матки человека, линии MCF-7 клеток аденокарциномы человека, линии Mg63 клеток остеосаркомы, линии HT1080 клеток фибросаркомы, линии IMR-32 клеток нейробластомы и линии HepG2 клеток гепатокарциномы. В данном контексте термин "подобные клетки" обозначает клетки, которые имеют то же происхождение, например Т-клетка, В-клетка или последовательность поколений нервных клеток, что и соответствующая линия клеток, и которые несут мутацию в том же или функционально эквивалентном гене, и где данная мутация вносит свой вклад в пролиферативную активность клетки, например мутация в p53, pRb, cdc 2, cdk 4, cyclin A, cyclin B, p21, c-fos, c-jun, p107, p130 и т.п.; которые несут тот же или функционально эквивалентный экзогенный ген, например вирус папилломы человека (HPV), E 6 или E 7, инсерцию вируса гепатита В в промоторе циклина В и т.п.; или которые содержат ту же хромосомную перестановку или нарушение, то есть делецию, множественность хромосом и т.д.
На основании результатов, полученных на животных и клеточной культуре, предпочтительными являются определенные количества биологически активной сыворотки крови для лечения заболеваний и состояний, для которых могут использоваться сыворотка крови и фармацевтическая композиция. Однако следует понимать, что для выявления терапевтического действия в зависимости от соответствующего состояния, а также от соответствующего пациента, то есть в зависимости от тяжести заболевания или состояния, общего состояния здоровья пациента и т.д., необходимы различные дозы биологически активной сыворотки крови или фармацевтической композиции. Определение подходящей дозы производится по усмотрению лечащего врача. Ожидается, что дозировка биологически активной сыворотки крови в терапевтическом способе изобретения должна быть в диапазоне от около 0,1 мг до около 200 мг сыворотки на кг веса тела. Однако в предпочтительном применении настоящего изобретения биологически активную сыворотку крови вводят индивиду, которому это требуется, в диапазоне от 50 до 150 мг/кг веса тела, предпочтительно, в пределах от 90 до 100 мг/кг веса тела. Продолжительность терапии биологически активной сывороткой крови изменяется в зависимости от тяжести заболевания, и состояния, и идиосинкразии каждого индивидуального пациента.
Следующие примеры приведены для демонстрации предпочтительных вариантов выполнения изобретения. Специалисты в данной области должны принять во внимание, что методиками, раскрытыми в следующих примерах, являются методики, для которых авторы изобретения обнаружили, что они хорошо функционируют в практике изобретения и, таким образом, их можно считать предпочтительными вариантами данной практики. Однако в свете настоящего описания специалисты в данной области должны принять во внимание, что в конкретных раскрытых вариантах выполнения могут быть сделаны множества изменений без отступления от смысла и объема изобретения, как изложено в приложенной формуле изобретения. Все приведенные ссылки включены в настоящую заявку в качестве ссылок.
Краткое описание фигур
Фиг.1 - цитотоксическое действие двух фармацевтических препаратов на клетки Jurkat.
Цитотоксическое действие на линию Jurkat клеток лимфомы Т-клеток человека отображено для двух различных фармацевтических препаратов, содержащих различные концентрации биологически активной сыворотки в соответствии с изобретением. Жизнеспособность клеток Jurkat отображена на оси Y в процентах, в то время как количество биологически активной сыворотки обозначено на оси X в мг/мл.
Фиг.2 - цитотоксическое действие двух фармацевтических препаратов на клетки Raji.
Цитотоксическое действие на линию Raji клеток лимфомы B-клеток человека отображено для двух различных фармацевтических препаратов, содержащих различные концентрации биологически активной сыворотки в соответствии с изобретением. Жизнеспособность клеток Raji отображена на оси Y в процентах, в то время как количество биологически активной сыворотки обозначено на оси X в мг/мл.
Фиг.3 - цитотоксическое действие двух фармацевтических препаратов на клетки Bro B-19.
Цитотоксическое действие на линию Bro B-19 клеток лимфомы T-клеток человека отображено для двух различных фармацевтических препаратов, содержащих различные концентрации биологически активной сыворотки в соответствии с изобретением. Жизнеспособность клеток Bro B-19 отображена на оси Y в процентах, в то время как количество биологически активной сыворотки обозначено на оси X в мг/мл.
Фиг.4 - цитотоксическое действие двух фармацевтических препаратов на клетки HeLa.
Цитотоксическое действие на линию HeLa клеток лимфомы T-клеток человека отображено для двух различных фармацевтических препаратов, содержащих различные концентрации биологически активной сыворотки в соответствии с изобретением. Жизнеспособность клеток HeLa отображена на оси Y в процентах, в то время как количество биологически активной сыворотки обозначено на оси X в мг/мл.
Фиг.5 - цитотоксическое действие двух фармацевтических препаратов на клетки MCF-7.
Цитотоксическое действие на линию MCF-7 клеток лимфомы T-клеток человека отображено для двух различных фармацевтических препаратов, содержащих различные концентрации биологически активной сыворотки в соответствии с изобретением. Жизнеспособность клеток MCF-7 отображена на оси Y в процентах, в то время как количество биологически активной сыворотки обозначено на оси X в мг/мл.
Фиг.6 - цитотоксическое действие двух фармацевтических препаратов на клетки IMR-32.
Цитотоксическое действие на линию IMR-32 клеток лимфомы T-клеток человека отображено для двух различных фармацевтических препаратов, содержащих различные концентрации биологически активной сыворотки в соответствии с изобретением. Жизнеспособность клеток IMR-32 отображена на оси Y в процентах, в то время как количество биологически активной сыворотки обозначено на оси X в мг/мл.
Фиг.7 - цитотоксическое действие двух фармацевтических препаратов на клетки HT1080.
Цитотоксическое действие на линию HT1080 клеток лимфомы T-клеток человека отображено для двух различных фармацевтических препаратов, содержащих различные концентрации биологически активной сыворотки в соответствии с изобретением. Жизнеспособность клеток HT1080 отображена на оси Y в процентах, в то время как количество биологически активной сыворотки обозначено на оси X в мг/мл.
Фиг.8 - цитотоксическое действие двух фармацевтических препаратов на клетки HepG2.
Цитотоксическое действие на линию HepG2 клеток лимфомы T-клеток человека отображено для двух различных фармацевтических препаратов, содержащих различные концентрации биологически активной сыворотки в соответствии с изобретением. Жизнеспособность клеток HepG2 отображена на оси Y в процентах, в то время как количество биологически активной сыворотки обозначено на оси X в мг/мл.
Фиг.9 - "колоколообразная" кривая пролиферативной активности клеток, обработанных митогенами.
Кривая пролиферативной активности лимфоцитов проанализирована на основе активности биосинтеза ДНК по отношению к концентрации митогена. Активность биосинтеза ДНК измерена количеством импульсов в минуту включенной радиоактивности и нерастворимой кислоты.
Фиг.10 - митогенная активность фармакологической композиции.
Отображено митогенное действие фармацевтической композиции на активность биосинтеза ДНК в диапазоне концентраций вещества от 0,1 до 100,0 мг/мл. Активность синтеза ДНК оценена на основании количества радиоактивности, включенной в ДНК.
Фиг.11 - действие фармакологической композиции на клетки MCF-7.
Отображена активность синтеза ДНК в линии MCF-7 клеток рака молочной железы человека по отношению к количеству биологически активной сыворотки, входящей в состав фармакологической композиции.
Примеры
Пример 1
Способ получения крови курицы, подвергнутой электрошоку
60
Для получения сыворотки курицы курицу обрабатывали электрошоком II-III уровня (электрическое напряжение 80-120 В, сила тока 0,05 A, частота 50 Гц, время применения 3-4 с, на голове). Кровь брали из сонной артерии и дополнительно инкубировали при температуре 4-8°C в течение 18-24 часов в полиэтиленовых колбах. После полного отвода кровяных сгустков колбы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20-30 минут. Сыворотку отделяли от кровяных сгустков и лиофилизировали при условиях, известных в уровне техники. Колбы с лиофилизированной сывороткой обрабатывали в приборе RZ-100-M с 20-30 кГр, предпочтительно, в пределах 25 кГр с применением в качестве источника гамма-излучения Co. Обработанную сыворотку хранили при температуре между 4-8°C для более позднего применения.
Доказательство стимулирующего действия сыворотки крови курицы, обработанной электрошоком
Описанные ниже эксперименты выполняли с использованием самцов крыс Wistar со средней массой тела 280-300 г. Животных случайным образом распределили по 4 группам по 10 крыс в каждой. Первой группе вводили 1,0 мл физиологического раствора. Второй группе вводили дозу сыворотки крови 100±5,0 мг/кг веса тела по настоящему изобретению в 1,0 мл раствора. По истечении 30 минут после инъекции крыс обезглавливали. Крысам третьей группы вводили 1 мл физиологического раствора, и крысы четвертой группы получали биологическую активную сыворотку (100±5 мг/кг веса тела) в растворе в объеме 1,0 мл. По истечении 30 минут после инъекции животных, которым прикрепляли груз к хвосту (10% веса тела крысы), помещали в таз с водой (25°C). После первых симптомов мучений животных вынимали из воды и обезглавливали.
В качестве образцов для дальнейшего анализа брали мозг, сердце, печень (органы, подвергнутые обширному энергетическому напряжению в процессах экстремальной адаптации), а также скелетные мышцы (как орган, подвергнутый наиболее сильному воздействию). Образцы ткани каждой крысы взвешивали, охлаждали изотоническим раствором NaCl и быстро замораживали в жидком азоте. Полное время, прошедшее между приложением "стресса" и конечной обработкой образцов, составляло как максимум в диапазоне между 5-6 минутами.
Определяли количество аденозинтрифосфорной кислоты, аденозиндифосфорной кислоты и аденозинмонофосфорной кислоты в скелетных мышцах крыс. Нуклеотиды разделяли посредством ионообменной хроматографии в колонках с применением Anionit Dowex 1. Определение количества аденозинтрифосфорной кислоты, аденозиндифосфорной кислоты и аденозинмонофосфорной кислоты проводили спектрофотометрически в диапазоне 256 нм (спектрофотометр Hitachi-557). Энергетический потенциал определяли согласно следующей формуле
(АТФ-0,5АДФ)/(АТФ+АДФ+АМФ)
Определение количества циклической аденозинмонофосфорной кислоты в мозге, сердце и печени выполняли с применением известного радиоиммунологического анализа с прибором для детекции Amersham (Великобритания).
Определение меченой аденозинмонофосфорной кислоты выполняли с применением способов известных в уровне техники, с применением сцинтилляционного счетчика GS-8.
Результаты
Различие количеств аденозинтрифосфорной кислоты, аденозиндифосфорной кислоты и аденозинмонофосфорной кислоты и увеличение энергетического потенциала являются очевидными, по сравнению с третьей группой или с контрольной первой группой, или со второй группой (p<0,05) являются очевидными, так же как при сравнении четвертой группы либо с контрольной первой группой, либо со второй группой (p<0,05) и, кроме того, при сравнении третьей и четвертой группы между собой (p<0,05) (см. также таблицу 1).
Таблица 1Количество аденозинтрифосфорной кислоты, аденозиндифосфорной кислоты и аденозинмонофосфорной кислоты и значение энергетического потенциала в ткани скелетных мышц при введении биологически активной сыворотки и без нее
Группа крыс
Количество нуклеотидов (мкмоль/л/г ткани)
Энергетический потенциал (условный коэффициент)
АТФh M±m
АДФh M±m
АМФh M±m
I (физиологический раствор - контроль) n=10
7,55±0,19 (7,28-7,85)
0,95±0,12 (0,79-1,18)
0,25±0,08 (0,14-0,37)
0,917±0,080
II (сыворотка) n=10
7,89±0,12 (7,65-8,02)
1,12+0,11 (0,93-1,27)
0,14±0,05 (0,08-0,25)
0,923±0,125
III (физиологический раствор + окунание)n=10
1,34±0,08 (1,19-1,49)
3,56±0,17 (3,21-3,81)
0,78±0,07 (0,65-0,93)
0,549±0,014
IV (сыворотка + окунание) n=10
4,78±0,17 (4,35-4,95)
2,55±0,11 (2,36-2,72)
0,33±0,09 (0,19-0,48)
0,790±0,095
Количество аденозинфосфорной кислоты, определенное в течение активного периода и 30 минут после умеренного стресса, связанного с инъекцией (контрольная группа I), подтверждает, что под влиянием сыворотки в мышечной ткани происходит смешение количества аденозинтрифосфорной кислоты и аденозиндифосфорной кислоты при значениях верхней нормы, в то время как количество аденозинмонофосфорной кислоты уменьшается.
Эти результаты можно интерпретировать так, что биологически активная сыворотка приводит к увеличению энергетического потенциала в мышечной ткани. Вычисление энергетического потенциала подтверждает эту тенденцию.
Под влиянием экстремального стресса окунания в третьей группе (физиологический раствор + окунание) было определено уменьшение содержания аденозинтрифосфорной кислоты и увеличение содержания аденозиндифосфорной и аденозинмонофосфорной кислоты по отношению к контрольной группе.
При экстремальном стрессе крыс четвертой группы (сыворотка + окунание) общие тенденции изменения количеств аденозинтрифосфорной, дифосфорной и монофосфорной кислот, с наблюдаемыми в третьей группе, оставались сходными, однако количество аденозинтрифосфорной кислоты оставалось существенно большим, и при вычислении энергетического потенциала наблюдалось увеличение энергетического потенциала на 43% (p<0,05) по сравнению с третьей группой.
Сравнительный анализ циклической аденозинмонофосфорной кислоты в ткани сердца и печени, а также в ткани мозга крыс первой и второй группы демонстрировал, что под влиянием сыворотки в ткани мозга может быть обнаружено увеличение количества циклической монофосфорной кислоты (p<0,01), в то время как в ткани сердца и печени значительной разницы по сравнению с контрольной группой не было определено (см. таблицу 2).
Таблица 2Количество циклической аденозинмонофосфорной кислоты АМФ в ткани мозга, сердца и печени после введения биологически активной сыворотки
Группа крыс
Количество циклической аденозинмонофосфорной кислоты (пмоль/л/г необработанной ткани)
мозг M±m
сердце M±m
печень М±m
I (физиологический раствор - контроль) n=10
3,95±0,58 (3,32-4,55)
3,07±0,11(2,98-3,32)
2,75±0,18(2,47-2,99)
II (сыворотка) n=10
4,58±0,23 (4,26-4,85)
3,26+0,16(3,02-3,47)
2,98±0,99(2,95-3,12)
III (физиологический раствор + окунание) n=10
0,82±0,13 (0,66-1,05)
0,49±0,17(0,32-0,78)
1,01±0,07(0,86-1,14)
IV (сыворотка + oкунание) n=10
1,58±0,13 (1,38-1,76)
0,83±0,14 (0,56-0,96)
1,27±0,08(1,12-1,41)
Под влиянием экстремального стресса во всех тканях крыс третьей группы (физиологический раствор + окунание) а также четвертой группы (сыворотка + окунание) наблюдалось значительное уменьшение (p<0,05) количества циклической аденозинмонофосфорной кислоты. Однако данное уменьшение снизилось под влиянием биологически активной сыворотки. Соответственно, количество аденозинмонофосфорной кислоты в ткани мозга было на 92% большим, чем соответствующее количество в третьей группе (p<0,05), на 96% большим в ткани сердца и на 25,7% большим в ткани печени.
Следовательно, сыворотка в соответствии с настоящим изобретением, обработанная электрошоком и γ-излучением, увеличивает энергетический потенциал в скелетных мышцах крыс, увеличивает количество циклической аденозинмонофосфорной кислоты в ткани мозга как в течение фаз покоя, так и при экстремальном физическом стрессе, и способствует увеличению содержания циклической аденозинмонофосфорной кислоты в ткани сердца и печени после физического стресса крыс.
Пример 2
Долговременная память
В данном эксперименте использовали 150 самцов крыс Wistar. Всех крыс предварительно протестировали с помощью классического теста "открытое поле" и распределили в соответствии с активностью на три группы: активные, со средней активностью и пассивные.
Для создания рефлекса ситуации крыс разместили в цилиндре, который был расположен в регулируемом с помощью термостата бассейне. Цилиндр размещали на трех опорах, и он позволял животным нырять под нижний край цилиндра, чтобы добраться до платформы, расположенной вне цилиндра.
Определяли латентный период для первого эксперимента, а также латентный период конечного решения задачи "высвобождения" из закрытой комнаты и из воды.
При установлении рефлекса ситуации крыс разделяли на три группы:
- "быстро выныривающие" - те крысы, которые могли найти выход в течение первой минуты;
- "медленно выныривающие" - те крысы, которые только начали искать выход по истечении 2-3 минут;
- крысы, которые не желали решать задачу в течение 10 минут.
Биологически активную сыворотку вводили в брюшную полость за 30 минут до начала эксперимента в дозе 100 мг/кг веса тела. Контрольным животным вводили 1 мл физиологического раствора. На следующий день тестировали поведение рефлекса ситуации и впоследствии крысам давали перерыв в 40 дней.
В соответствии с данным способом были "обучены" 120 крыс - 60 контрольных крыс и 60 крыс, получающих биологически активную сыворотку. Крыс предварительно разделяли на три группы, как указано выше, то есть активные, со средней активностью и пассивные (20 животных в каждой группе), кроме того, для данных анализов их подразделяли на "быстро" и "медленно" выныривающих.
Результаты
Некоторые крысы вообще не проявляли "рефлекс выныривания" (таблица 3). В контрольной группе шесть из числа активных крыс и крыс со средней активностью и 12 животных пассивной группы вообще не проявляли "рефлекс выныривания". На второй день это количество оставалось тем же для активных крыс и для крыс со средней активностью, однако уменьшилось для пассивных животных до 7. По истечении 42 дней те же 11 крыс пассивной группы отказывались нырять под край цилиндра (1 крыса умерла в ходе эксперимента).
Среди активных крыс, получающих биологически активную сыворотку, не было ни одной крысы, которая отказалась решать задачу на второй день. Из всех крыс со средней активностью три отказывались решать задачу на первый день, но, тем не менее, решили ее на второй день и сохраняли эту способность даже по истечении 42 дней. Среди пассивных крыс, получающих сыворотку, 4 крысы не проявляли желания решать задачу, однако на второй день это количество уменьшилось до 2 и оставалось постоянным даже по истечении 42 дней.
Таблица 3Количество крыс, которые не проявляли "рефлекс выныривания"
Тестируемое животное
1 день (24 часа)
1
2
42
Активные крысы и крысы со средней активностью
Контроль
6
6
6
Сыворотка
3
0
0
Пассивные крысы
Контроль
12
7
11∗
Сыворотка
4
2
2
∗ одна крыса умерла в течение эксперимента
В группе "быстро выныривающих" единичная инъекция сыворотки в 40-дневный интервал времени проведения эксперимента не демонстрировала значительного изменения в поддержании рефлекса ситуации.
Для "медленно выныривающих" была значительная, с точки зрения статистики, возможность поддерживать способность быстро находить путь для избегания экстремальной ситуации (таблица 4). Таким образом, время формирования рефлекса на второй день уменьшилось по сравнению с первым днем как для контрольной группы, так и для испытуемой группы. В контрольной группе данные рефлексы полностью исчезли по истечении 42 дней, в то время как у животных, которые получили инъекцию биологически активной сыворотки, рефлекс полностью сохранялся. Кроме того, была разница во времени, требуемом для рефлекса, которое было в 2-3 раза больше (p<0,01) у контрольных крыс.
Таблица 4Влияние сыворотки крови на формирование и поддержание рефлекса ситуации у "медленно выныривающих" (с)
Тестируемое животное
1 день (24 часа)
1
2
42
LP-1 (латентный период)
LP-2
LP-1
LP-2
LP-1
LP-2
Группа активных
Контроль
125,7+25
176,7+19,6
45,5+9,9
59,0+8,8
37,5+30,0
181,5+15,5
Сыворотка
111,3+39,7
164,8+33,5
55,3+15,6
68,4+18,8
3,8+29,3
55,7+37,28
Группа средней активности
Контроль
144,8+21,8
191,2+16,3
49,6+11,2
62+14,3
3,8+24,0
19,2+9,8
Сыворотка
118,2+71,6
178,6+76,8
3,8+50,3
77+54,1
9,2+28,8
54,6+39,7
Группа пассивных
Контроль
53,3+25,7
189,6+12,6
53+15,0
66,6+8,0
149,3+24,7
196,0+11,1
сыворотка
18,2+71,6
178,6+76,8
63,8+50,3
77+54,1
39,2+28,8
54,6+39,7
При формировании и длительном поддержании информации значительная роль приписывается H-холинергическим механизмам. 30 животных, которых обучали в течение пяти дней нырять под "колокол", подразделили на три группы.
Физиологический раствор цитизина (H-холинергический антагонист мозга) вводили в дозе 1 мг/кг веса тела в брюшную полость за 30 минут до тестирования животных первой группы (десять крыс).
Животным второй группы (десять крыс) вводили биологически активную сыворотку в дозе 100 мг/кг веса тела и через 30 минут вводили раствор цитизина в дозе 1 мг/кг веса тела.
Третья группа животных (контроль - десять крыс) получала 1 мл инъекции физиологического раствора.
Сложное поведение животных тестировали в соответствии с обозначенным выше способом по истечении 48 часов после инъекции обозначенных веществ. По истечении 48 часов после применения цитизина биологические тесты продемонстрировали выраженное замедление "реакции высвобождения" из закрытой комнаты, а именно 3-кратное замедление по сравнению с контрольными животными.
Введение сыворотки до инъекции цитизина не только уменьшило действие данного антагониста, но также привело к усилению реакции "высвобождения" на 20% по сравнению с контрольной группой, и полное действие биологически активной сыворотки превысило действие антагониста в 5 раз.
Таблица 5Латентные периоды реакции крыс на ситуацию в связи с введением цитизина и биологически активной сыворотки (с)
Временной параметр
Контроль (третья группа)
Введение цитизина (первая группа)
Введение сыворотки + цитизин (вторая группа)
По истечении 48 ч
13,33±0,58
40,0±14
8,3±5,5
<0,05
>0,05
<0,05
На основе результатов было определено, что Н-холиновые рецепторы мозга играют роль в восстановлении "реакции высвобождения" в связи с моделированием сложного поведения животных и что биологически активная сыворотка предотвращает ухудшение способности к обучению.
Таким образом, биологически активная сыворотка крови стимулирует формирование долговременной памяти и особенно проявляет данное действие у животных с замедленной реакцией высвобождения из закрытой комнаты и из воды. Кроме того, как представляется, H-холинергические механизмы мозга играют важную роль в поддержании долговременной памяти, и действию веществ, отрицательно действующих на H-холинергические механизмы мозга, может противостоять биологически активная сыворотка по настоящему изобретению.
Пример 3
Эпилепсия
В уровне техники известно, что камфора в токсической дозировке приводит к гиперактивации моторной области центральной нервной системы, которая в свою очередь вызывает развитие тонических спазмов. В связи с этим камфору используют наряду с коразолом на модельных животных для вызывания спазмов. В зависимости от доз вводимой камфоры возможно вызвать все разновидности малого и большого эпилептического приступа, включая большие эпилептические припадки.
В экспериментах исследовали влияние биологически активной сыворотки на эпилептическую активность, которую индуцировали путем инъекции камфоры в брюшную полость крыс. В данном эксперименте использовали 40 самцов крыс Wistar с весом 190-210 г. Раствор камфорового масла (20%) вводили в брюшную полость в количестве 0,25 и 0,5 мл (используя 20 крыс). Сыворотку вводили в дозировке 100±5,0 мг/кг веса тела (используя 20 крыс).
Эксперты наблюдали и оценивали приступы. Оценивали следующие параметры. Латентный период реакции, тип реакции спазма (тонически-клонические, большие и малые приступы), длительность эпилептического приступа и временные интервалы между ними, потеря нормальной подвижности и конечный результат (смерть животного или восстановление из патологического состояния). Результаты суммированы в таблице 6.
Таблица 6Действие биологически активной сыворотки на экспериментально индуцированную эпилепсию
Дозы камфоры
Эпилептические приступы
Контрольная группа (камфора)
Тестируемая группа (камфора + сыворотка в дозировке 100 мг/кг)
0,25
Возникновение тонических спазмов
7'20''±10''
5'30''±15''
Возникновение клонических спазмов в форме больших эпилептических припадков после
12'30''±32''
8'45''''±28''
Среднее количество приступов
Один в 6'-7'
Один в 8'-9'
Длительность приступов
70'-80'
15''-20''
Состояние животного по истечении 48 часов
Все выжили
Все выжили
0,5 мл
Возникновение тонических спазмов
5'40''±30''
5'00''-32''
Возникновение клонических спазмов в форме больших эпилептических припадков после
8'30''±27''
8'40''
Среднее количество приступов
Один в 5'
Один в 7'
Длительность приступов
90''-120''
25''-30''
Состояние животного по истечении 48 часов
60% умерло
Все выжили
Биологически активная сыворотка, вводимая в дозировке 100 мг/кг в латентный период эпилептических приступов, вызванных инъекцией камфоры, уменьшала все симптомы активности приступа; латентный период активности приступа увеличивался, наблюдались менее тяжелые клонические спазмы и сохранялась нормальная подвижность и дополнительно сыворотка, обработанная электрошоком, препятствовала смерти животных в модели тяжелых эпилепсий (все животные выжили при введении 0,5 мл 20% раствора камфоры).
Пример 4
Действие сыворотки крови по настоящему изобретению на пролиферацию клеток человека
Сыворотка крови по настоящему изобретению представляет собой лиофилизированную кровь курицы, обработанную электрошоком II-III уровня и γ-излучением. Биологически активную сыворотку использовали в двух типах препаратов: (i) сыворотка, ресуспендированная в воде при концентрации 100 мг/мл (испытуемая фракция 1), и (ii) супернатант суспензии 100 мг/мл биологически активной сыворотки в воде после трех минут центрифугирования суспензии при 10000×g (испытуемая фракция 2).
Культура клеток
2
Клетки линии Jurkat и Raji, а также лимфоциты периферической крови человека культивировали в пластиковых плашках для культуры тканей (Nunc или Falcon) в среде 1640-RPMI (Sigma), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (FCS, Gibco), 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при температуре 37°C, при 5% содержании CO и 95% влажности. Линии клеток Bro, HeLa, MCF-7, Mg63, HT1080, IMR-32, а также HepG2 культивировали, как описано выше, но с применением среды DMEM (Sigma) вместо среды 1640-RPMI.
Выделение мононуклеарных лейкоцитов (ML) в соответствии со способом Boyum
Мононуклеарные лейкоциты выделяли в соответствии со способом, описанным Boyum A. (Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood, 1968, Cand. J. Lab. Clin, Invest, 120 (97): 9-18).
15 мл раствора фиколл-пак помещали в каждую из двух конических пробирок (Falcon) и затем в фиколл добавляли 25 мл крови, разбавленной в два раза в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Затем пробирки центрифугировали при 400×g и 20°C в течение 30 минут в бакет-роторе. Верхнюю фазу, содержащую плазму, не использовали.
Мононуклеарные лейкоциты (ML), концентрирующиеся на границе раздела между плазмой и средой разделения, аккуратно высасывали с помощью пипетки и собрали в пробирке центрифуги. После этого клетки дважды промывали PBS путем центрифугирования клеток при 250×g в течение 10 минут и, в конечном счете, суспендирования их в культуральной среде. Эта фракция содержала 10-30% моноцитов и 80-90% лимфоцитов, которые ниже называются "лимфоцитами". Одну часть лимфоцитов использовали для изучения митогенной активности биологически активной сыворотки по настоящему изобретению и другую - для изучения пролиферации. С этой целью в суспензию клеток добавляли фитогемаглютинин в концентрации 20 мг/мл.
Оценка активности синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в клетках
3
3
3
2
Для оценки синтеза ДНК к клеткам добавляли H-тимидин и в нерастворимой фракции кислоты оценивали количество импульсов включенного излучения. Вкратце, лимфоциты инкубировали в 96-луночных плашках с 200 мкл среды, содержащей 200-800×10клеток. В каждую лунку добавляли различные концентрации биологически активной сыворотки по настоящему изобретению. За два часа до завершения инкубирования добавляли H-тимидин (1 мкКи/лунка, 40 мКи/ммоль/л). Для радиометрического анализа клетки собирали на фильтрах с помощью автоматического устройства для сбора клеток. Растворимые продукты кислоты вымывали 5% трифторуксусной кислотой (НО) и с помощью сцинтилляционного счетчика измеряли радиоактивность задержанных веществ. Активность биосинтеза ДНК измеряли в импульсах/мин.
Определение выживаемости клеток после инкубирования с различными веществами с применением теста MTT
MTT-тест выполняли, как описано Mosmann T. (Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays (1983) J. Immunol Meth. 65: 55-63).
6
Для выполнения теста клетки собирали в логарифмической фазе (адгезивные клетки собирали, когда они заполняли приблизительно половину плашки для культуры ткани). Их помещали в среду для выращивания в камере Горяева, считали и затем ресуспендировали в среде при концентрации 50-100×10/мл. Растворы для клеток помещали в 96-луночных плашках после добавления различных концентраций испытуемых фракций в общем объеме 100 мкл. Для подсчета жизнеспособных клеток в каждую из различных 96-луночных плашек после завершения инкубирования добавляли 50 мкл раствора бромида 3-4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5 дифенилтетразола (MTT) в культуральной среде. Для приготовления раствора MTT 1 мл маточного раствора MTT смешивали с 4 мл культуральной среды. Приготовление маточного раствора MTT выполняли путем растворения MTT в PBS (PBS содержит 0,01 ммоль/л буфера фосфата натрия, pH 7,4, с 0,15 ммоль/л NaCl) с концентрацией 5 мг MTT/мл, с последующей фильтрацией через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Маточный раствор хранили при +4°C до одного месяца. После добавления раствора MTT плашки для культуры ткани дополнительно инкубировали в течение 4 часов в термостате при идентичных условиях. После удаления питательной среды следующего этапа путем всасывания с помощью насоса в каждую лунку добавляли 150 мкл диметилсульфоксида (DMSO) для растворения образующихся синих кристаллов формазана и регистрировали оптическую плотность раствора в каждой лунке многоканальным спектрофотометром с устройством считывания микроплашек при длине волны 540 нм (Labsystem). Жизнеспособность клеток по отношению к концентрации добавленной испытуемой фракции 1 и 2 соответственно обозначена в процентах от выживаемости контрольных клеток. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения "Origin".
Результаты и обсуждение
50
50
Результаты отображены на фиг.1-8. Из данных результатов можно заключить следующее: высокая концентрация биологически активной сыворотки по настоящему изобретению (2,5-20 мг/мл) оказывала ингибирующее действие на все линии клеток, однако реакция клеток из различных типов ткани на испытуемые фракции 1 и 2 соответственно различается. Доза IC (концентрация вещества, которая приводит к 50% ингибированию клеток) существенно различается между линиями клеток от 2,2 (Jurkat) до >20 мг/мл (Mg63) для испытуемого вещества 1 и от 3,6 (лимфоциты периферической крови) до >20 мг/мл (Mg63 и HeLa) для растворимой фракции сыворотки крови по настоящему изобретению (испытуемая фракция 2). Для всех линий клеток токсичность исходного вещества (испытуемая фракция 1) была выше токсичности растворимого вещества (испытуемая фракция 2). Однако следует отметить, что токсичность, наблюдаемая для отдельных линий клеток, была почти идентична для обеих испытуемых фракций (Mg63, Rajii, лимфоциты периферической крови) и также для других (Jurkat, MCG-7, IMR-32), более того, была разница IC в 2-3 раза. Чувствительность клеток к испытуемым фракциям по сравнению с обычным средством от рака, доксорубицином, отображена в таблице 7.
Таблица 7Чувствительность линий клеток, протестированных с применением доксорубицина
Линия клеток
IС<sub>50</sub>, ммоль/мл
Jurkat
100
Raji
20
Bro B-19
-∗∗
HeLa
400
MCF-7
150
Mg63
-∗∗
HT1080
-∗∗
IMR-32
4
HepG2
100
Лимфоциты периферической крови
40
Комментарии:∗ - ммоль/л = 0,58 мг/мл∗∗ - чувствительность к доксорубицину не тестировалась
Кроме того, наблюдалось, что в диапазоне концентрации от 0,3 до 3 мг/мл в зависимости от линии клеток и типа вещества (то есть испытуемая фракция 1 или испытуемая фракция 2) данное средство оказывало стимулирующее действие на некоторые клетки. Стимулирующее действие сыворотки настоящего изобретения наблюдалось для клеток Jurkat, Raji, Bro B-19, Mg63, HT1080 и HepG2. Стимулирующее действие было незначительным (10, 20, 40%), но присутствовало у обоих типов тестируемого вещества. Стимулирование не наблюдалось у клеток линии клеток HeLa, MCF-7, JMR-32 и у лимфоцитов периферической крови. Стимулирующее действие тестируемого вещества в первой форме наблюдалось при намного более низкой концентрации, чем в растворимой фракции (испытуемая фракция 2). Возможно, причиной данного стимулирования является не стимулирование пролиферации как таковое, а скорее увеличение интенсивности дыхания клеток, которое также могло бы регистрироваться с помощью способа MTT, используемого для оценки жизнеспособности клеток. Вопрос о том, было ли наблюдаемое стимулирующее действие вследствие стимулирования пролиферации или вследствие увеличения интенсивности дыхания, требовал некоторого дальнейшего изучения.
При изучении взаимодействия между различными веществами с иммунными компетентными клетками, по существу, необходимо обсудить, по меньшей мере, два вопроса:
3
1. Обладает ли тестируемое вещество митогенной активностью, то есть обладает ли оно способностью стимулировать пролиферацию лимфоцитов (в этом случае увеличение количества вещества обычно приводит к усилению биосинтеза ДНК лимфоцитов, который можно оценить путем включения H-тимидина)?
3
2. Обладает ли тестируемое вещество токсическим действием (этот вопрос обычно решается ингибированием пролиферации лимфоцитов, анализируемой с помощью количества включенного H-тимидина, или путем применения витальных красителей MTT-типа на лимфоцитах, которые предварительно стимулировали митогенами)?
Кроме того, следует отметить, что не активированные лимфоциты не делятся в культуре и что степень пролиферации только увеличивается с увеличением количества митогенов, добавленных в культуральную среду. Это выражается в увеличении радиоактивно меченой ДНК.
Действие митогенов на лимфоциты по отношению к вводимым дозам может быть описано так называемой "колоколообразной кривой" (см. фиг.9). Первый отрезок колоколообразной кривой отражает диапазон концентраций митогена, где увеличение митогена приводит к увеличению пролиферации (как измерено с помощью биосинтеза ДНК) и где, в связи с этим, существует прямое соотношение между концентрацией митогена и степенью пролиферации. Второй отрезок кривой (2) демонстрирует эффект насыщения, где дальнейшее увеличение концентрации митогена не приводит к дальнейшему увеличению степени пролиферации, то есть митоген уже проявил максимальное действие. Цитотоксическая активность еще не наблюдается. Отрезок (3) демонстрирует диапазон концентрации митогена, где митоген оказывает возрастающее цитотоксическое действие на лимфоциты.
Исследование митогенной активности испытуемых фракций 1 и 2 выполняли в двух экспериментах:
1. Предметом изучения данного эксперимента было определение действия испытуемых фракций на неактивированные лимфоциты человеческой периферической крови. Для этой цели определяли корреляцию пролиферативной активности (то есть действия) с вводимыми дозами.
2. Предметом изучения данного эксперимента было определение действия испытуемого вещества на активность синтеза ДНК лимфоцитов, активированных фитогемаглютинином (20 мкг/мл FHA) во второй фазе.
При исследовании вещества митогенная активность не наблюдалась, то есть в диапазоне концентраций вещества 0,1-100 мг/мл не наблюдалось стимулирования биосинтеза ДНК лимфоцитов периферической крови (фиг.10).
При увеличении дозы испытуемых фракций количество лимфоцитов периферической крови существенно не изменялось. При оценке действия испытуемых фракций на лимфоциты, которые впоследствии активировали с помощью 20 мг/мл FHA, наблюдалось ингибирование активированных лимфоцитов испытуемыми фракциями.
В экспериментах было определено, что испытуемые фракции ингибировали биосинтез ДНК стимулированных лимфоцитов при концентрации 0,3 мг/мл (фиг.11). Однако механизм действия еще следует определить. В связи с этим важны дополнительные эксперименты для объяснения цитостатического и цитотоксического действия.
Для того чтобы определить, как результаты, полученные в культуре клеток, соотносятся с лечением людей, важно определить концентрацию вещества в различных органах или тканях в экспериментах на животных. В данном контексте важно исследовать, какие отличающиеся концентрации биологически активной сыворотки по настоящему изобретению могут влиять на синтез ДНК в органах, участвующих в лимфогенезе. Таким образом, важно определить концентрацию биологически активной сыворотки, в частности, в костном мозге, селезенке и тимусе мыши.
Кроме лимфоцитов цитотоксическую активность сыворотки по настоящему изобретению также исследовали с применением клеток из линии клеток MCF-7 рака молочной железы человека в монослое. Из-за контактного ингибирования пролиферации у клеток не наблюдалось. В такой модели можно определить токсическое действие вещества, то есть можно отличить цитотоксическое действие от цитостатического действия. При использовании данной модели было определено, что сыворотка по настоящему изобретению оказывала цитотоксическое действие при концентрации 2,5 мг/мл независимо от факта, была ли нерастворимая фракция сыворотки по настоящему изобретению удалена или нет, то есть независимо от того, использовалась ли испытуемая фракция 1 или 2.
Примечательно, что токсическое действие заметно уменьшилось при инкубировании сыворотки по настоящему изобретению с делящимися клетками, что потенциально связано с фактом, что действие измеряли по истечении 24 часов после введения, а не по истечении 72 часов после введения, в случае наличия деления клеток (длительное инкубирование клеток в монослое может привести к смерти контрольных клеток).
Приведенные выше результаты демонстрируют, что биологически активная сыворотка по настоящему изобретению обладает как цитостатическим действием, так и цитотоксической активностью. Однако цитотоксическая активность была менее выражена, как объединение цитотоксической и цитостатической активности, несмотря на то, что она наблюдалось при той же концентрации.
3
Объединенная сыворотка крови от животных, обработанных электрошоком II-III уровня, и приготовленное впоследствии биологически активное вещество приводят к увеличению степени пролиферации линий Jurkat, Raji, Bro B-19, Mg63, HT1080 и HepG2 клеток человека на 10-40% по сравнению с контрольной группой. В HeLa, MCF-7, JMR-32 и лимфоцитах периферической крови биологически активная сыворотка по настоящему изобретению продемонстрировала значительное ингибирование пролиферации всех протестированных линий раковых клеток человека при более высоких дозировках (2,5-20 мг/мл). Чувствительность клеток к биологической активной сыворотке по настоящему изобретению намного больше, чем чувствительность к широко используемому противораковому средству доксорубицину. Кроме того, при использовании биосинтеза ДНК, оцениваемого с помощью включения в качестве метки H-тимидина, вещество настоящего изобретения обладает как цитостатическим, так и цитотоксическим действием.