Комплексное применение модельных биологических систем для оценки окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы

ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

УДК 61:577.1

Г. К. Рубцов

КОМПЛЕКСНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МОДЕЛЬНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ ДЛЯ ОЦЕНКИ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ В ПУЛЕ МОЛЕКУЛ СРЕДНЕЙ МАССЫ

Исследован уровень окислительной модификации белков (ОМБ) в пуле молекул средней массы (МСМ) на модельных биологических системах, в качестве которых были выбраны желточные липопротеиды, продукты пчеловодства, сыворотка крови экспериментальных животных (крысы). Выявлены особенности этих модельных биологических систем по уровню ОМБ в условиях спонтанного и Fe2+-индуцированного окисления. Обоснованы возможности комплексного использования изученных модельных биологических систем для исследования уровня ОМБ в пуле МСМ, одной из которых может служить модельная биологическая система маточного молочка с добавлением желточных липопротеидов, а также с добавлением сыворотки крови крыс.

Ключевые слова: модельные биологические системы, окислительная модификация белков, молекулы средней массы.

ВВЕДЕНИЕ

В патогенезе многих расстройств важную роль играет оксидативный стресс, развивающийся в результате дисбаланса между оксидантной и антиок-сидантной системами [1—3].

Продукты пчеловодства обладают антиоксидан-тными свойствами и могут быть использованы для коррекции нарушений процессов свободнорадикального окисления при патологических состояниях, физических нагрузках и стрессе [4-18].

Это позволяет рассматривать продукты пчеловодства как возможные модельные биологические системы для оценки уровня свободнорадикального окисления, в том числе окислительной модификации белков.

Вместе с тем механизм лечебного действия продуктов пчеловодства невозможно полностью объяснить вследствие сложности и многообразия их состава [19]. В этом плане остаются актуальными и практически значимыми биохимические исследования по изучению механизмов влияния продуктов пчеловодства на обменные процессы в организме, в том числе на процессы свободнорадикального окисления (ПОЛ, ОМБ) и антиоксидантной защиты.

Одним из аспектов таких исследований может явиться рассмотрение продуктов пчеловодства как модельных биологических систем оценки окислительной модификации белков и величин молекул средней массы в комплексе с использованием других модельных биологических систем, апробированных ранее для изучения состояния свободнорадикального окисления: например, модельной биологической системой желточных липопротеидов [20]. Кроме того, может представлять интерес применение модельных биологических систем, содер-

жащих продукты пчеловодства и предусматривающих инкубацию в присутствии крови, для выявления степени их влияния на уровень окислительных процессов (как спонтанного, так и металлиндуци-руемого характера).

С клинико-биохимических позиций практически значимо комплексное изучение молекул средней массы (МСМ) и ОМБ для оценки эндотоксикоза [21].

Цель работы - обосновать комплексное применение модельных биологических систем для оценки окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В данной работе использована методика исследования в соответствии с [22].

В качестве базовой модельной биологической системы применялись желточные липопротеиды, полученные по методике Г. И. Клебанова и соавт. [20]. В соответствии с указанной методикой желточные липопротеиды - одна из модельных систем, позволяющая оценить антиоксидантную активность исследуемых веществ и чувствительная к инициации свободнорадикальных процессов ионами Бе2+.

Также в качестве модельных биологических систем использовали сыворотку крови белых беспородных крыс (самок и самцов) и продукты пчеловодства - прополис, гомогенат трутневого расплода, мед, маточное молочко (препарат «Апилак») в виде 30 % водных растворов, приготовленных стандартизированно по методике, аналогично предложенной Е. А. Дубцовой [19].

Согласно Г. И. Клебанову и соавт. [20], введение в систему ионов Бе2+ сопровождается ускоре-

нием процессов свободнорадикального окисления, уровень аутоокисления плазмы крови и суспензии желточных липопротеидов крайне мал, причем плазма крови, по сравнению с желточными липо-протеидами, в присутствии ионов Бе2+ окисляется намного меньше. Г. И. Клебанов и соавт. предположили, что в самом общем случае ингибирование плазмой крови пероксидации липидов желточных липопротеидов в присутствии ионов Бе2+ обусловлено наличием в плазме крови антиоксидантов и (или) веществ, обеспечивающих окисление и связывание ионов Бе2+.

Металлкатализируемое окисление представляет собой местный специфический процесс, протекающий в нормально функционирующем организме, и его уровень является важным прогностическим показателем. То есть диагностическое значение имеет не только определение спонтанной ОМБ, которая указывает на количество модифицированных аминокислот, но и металлиндуциро-ванная деструкция белковых молекул. Индуцированная ОМБ позволяет выявить как изменения аминокислот, входящих с состав полипептидной цепи, так и модификации, связанные с конформацией молекулы и состоянием белкового окружения [23].

Учитывая вышеизложенное, в данной работе изучалась ОМБ как спонтанная, так и инициированная (в присутствии ионов Бе2+).

Регистрация уровней ОМБ проводилась на четырех длинах волн: при 356 нм - алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны нейтрального характера, при 370 нм - алифатические кетондинит-

рофенилгидразоны нейтрального характера, при 430 и 530 - алифатические альдегиддинитрофенил-гидразоны и кетондинитрофенилгидразоны основного характера [24].

Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях вивария на обычном рационе питания. В каждой серии наблюдений эксперименты проводили в 7 повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Одним из оптимальных вариантов комплексного применения модельных биологических систем для анализа изучаемых тестов выявлено маточное молочко. Уровни МСМ в маточном молочке с добавлением желточных липопротеидов и сыворотки крови крыс при спонтанном и Бе2+-индуцированном окислении представлены на рис. 1.

При добавлении сыворотки крови крыс, как самок, так и самцов, уровень МСМ меньше в случае Бе2+-индуцированного окисления, по отношению к модельной биологической системе «желточные ли-попротеиды + маточное молочко», - в 1,4 и 1,3 раза соответственно (р < 0,05).

Уровни ОМБ, регистрируемые при 430 и 530 нм, в маточном молочке с добавлением желточных ли-попротеидов и сыворотки крови крыс при спонтанном и Бе2+-индуцированном окислении показаны на рис. 2 и 3.

Тенденции изменений уровней ОМБ, регистрируемых при 430 и 530 нм, в модельных биологических системах «желточные липопротеи-ды + маточное молочко + сыворотка крови», по сравнению к модельной биологической системе «желточные липопротеиды + маточное молочко»,

Рис. 2. Уровни ОМБ, регистрируемые при 430 нм, в маточном молочке с добавлением желточных липопротеидов и сыворотки крови крыс

при спонтанном и Рв2+-индуцированном окислении

Рис. 3. Уровни ОМБ, регистрируемые при 530 нм, в маточном молочке с добавлением желточных липопротеидов и сыворотки крови крыс

при спонтанном и Fe^-индуцированном окислении

обратны тенденциям изменений уровня МСМ - ве- окисления, при 43G нм - в 1,2 раза, при 53G нм - в личины ОМБ возрастают. При добавлении сыво- 1,4 и 1,6 раза соответственно (р < G,G5).

ротки крови крыс, как самок, так и самцов, уро- Уровни МСМ в прополисе с добавлением жел-

вень ОМБ больше в случае Fe2+-индyцированного точных липопротеидов и сыворотки крови крыс

при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении представлены на рис. 4. При добавлении сыворотки крови крыс, как самок, так и самцов, уровень МСМ меньше в случае Ре2+-индуцированного окисления, по отношению к модельной биологической системе «желточные липопротеиды + прополис», - в 1,6 и 1,5 раза соответственно (р < 0,05).

Уровни ОМБ, регистрируемые при 430 и 530

0,7

нм, в прополисе с добавлением желточных липо-протеидов и сыворотки крови крыс при спонтанном и Ре2+-индуцированном окислении показаны на рис. 5 и 6. При добавлении сыворотки крови крыс, как самок, так и самцов, уровень ОМБ больше в случае Ре2+-индуцированного окисления, при 430 нм - в 1,2 раза, при 530 нм - в 1,3 раза и 1,2 раза соответственно (р < 0,05).

О,С

0,5

0,4

Т

I спонтанное окисление

индуцированное ионами железа (II окисление

прополис желточные липопротеиды ЖЛП+прополис ЖЛ П+прополис+сыво- ЖЛП+прополис+сыво-

Рис. 4. Уровни МСМ в прополисе с добавлением желточных липопротеидов и сыворотки крови крыс при спонтанном и Рв2+-

индуцированном окислении

Рис. 6. Уровни ОМБ, регистрируемые при 530 нм, в прополисе с добавлением желточных липопротеидов и сыворотки крови крыс

при спонтанном и Рв2+-индуцированном окислении

Выявленные тенденции уровней МСМ и ОМБ в модельной биологической системе «желточные липопротеиды + сыворотка крови + прополис» аналогичны таковым тенденциям в модельной биологической системе «желточные липопротеиды + сыворотка крови + маточное молочко», по сравнению с модельной биологической системой «желточные липопротеиды + прополис».

0,6

Уровни МСМ в меде с добавлением желточных липопротеидов и сыворотки крови крыс при спонтанном и Бе2+-индуцированном окислении представлены на рис. 7.

Как и в случае маточного молочка и прополиса, при добавлении сыворотки крови крыс, как самок, так и самцов, уровень МСМ меньше в случае Бе2+-индуцированного окисления, по отношению к

0,5

0,4

0,3

0,2

од

: 1

I спонтанное окисление

индуцированное ионами железа (II) окисление

желточ ные л и попрогеи д ы

ЖЛП+мед+сы ворот ка ЖЛП+мед+сыворотка

крови

Рис. 7. Уровни МСМ в меде с добавлением желточных липопротеидов и сыворотки крови крыс при спонтанном и Рв2+-индуцированном

окислении

модельной биологической системе «желточные липопротеиды + мед», - в 1,3 и 1,4 раза соответственно (р < 0,05).

Уровни ОМБ, регистрируемые при 430 и 530 нм, в меде с добавлением желточных липопротеидов и сыворотки крови крыс при спонтанном и Бе2+-индуцированном окислении показаны на рис. 8 и 9.

При добавлении сыворотки крови крыс - и самок, и самцов - уровень ОМБ больше в случае Бе2+-индуцированного окисления, при 430 нм - в 1,2 раза, при 530 нм - в 1,3 и 1,2 раза соответственно (р < 0,05).

Выявленные тенденции уровней МСМ и ОМБ в модельной биологической системе «желточные

I спонтанное окисление

индуцированное ионами железа (II) окисление

желточ н ы е л и попротеиды

ЖЛП+мед+сы воротка ЖЛП+мед+сы воротка

крови

Рис. 8. Уровни ОМБ, регистрируемые при 430 нм, в меде с добавлением желточных липопротеидов и сыворотки крови крыс при спонтанном и Рв2+-индуцированном окислении

0,7 п--------------------------------------------------------------------------------------

0,6

0,5

-Т-

0,4 -

0,3

і спонтанное окисление

индуцированное ионами железа (II) окисление

0,2

ОД----------1

желточные л и поп ротеи д ы

ЖЛП+мед

ЖЛП+мед+сы во ротка ЖЛП+мед+сы воротка крови

липопротеиды + сыворотка крови + мед», по отношению к модельной биологической системе «желточные липопротеиды + мед», схожи с таковыми тенденциями в аналогичных модельных биологических системах с использованием маточного молочка и прополиса.

Уровни МСМ в гомогенате трутневого расплода с добавлением желточных липопротеидов и сыворотки крови крыс при спонтанном и Fe2+-инду-цированном окислении представлены на рис. 10. Как и в случае маточного молочка, прополиса и меда, при добавлении сыворотки крови крыс, как самок, так и самцов, уровень МСМ меньше в случае Fe2+-индуцированного окисления, по отношению к модельной биологической системе «желточные липопротеиды + гомогенат трутневого расплода», - в 1,2 раза (р < 0,05).

Уровни ОМБ, регистрируемые при 430 и 530 нм, в гомогенате трутневого расплода с добавлением желточных липопротеидов и сыворотки крови крыс при спонтанном и Fe2+-индуцированном окислении показаны на рис. 11 и 12. При добавлении сыворотки крови крыс - и самок, и самцов -уровень ОМБ больше в случае Fe2+-индуцированного окисления, при 430 нм - в 1,2 раза, при 530 нм - в 1,3 и 1,2 раза соответственно (р < 0,05).

Выявленные тенденции уровней МСМ и ОМБ в модельной биологической системе «желточные липопротеиды + сыворотка крови + гомогенат трутневого расплода», по отношению к модельной биологической системе «желточные липопротеиды + гомогенат трутневого расплода», схожи с таковыми тенденциями в аналогичных модельных биологических системах с использованием маточного молочка, прополиса и меда.

Таким образом, проведено обоснование оптимальных вариантов комплексного применения модельных биологических систем для оценки окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы, одним из которых является модельная биологическая система маточного молочка с добавлением желточных липопротеидов, а также с добавлением сыворотки крови крыс.

ВЫВОДЫ

1. Величины МСМ при Бе2+-индуцированном окислении в маточном молочке были выше, чем в других продуктах пчеловодства: например, больше, чем в прополисе, в 1,4 и 1,7 раза соответственно (р < 0,05).

2. При добавлении сыворотки крови крыс, как самок, так и самцов, уровень МСМ был меньше в маточном молочке в случае Бе2+-индуци-рованного окисления, по отношению к модельной

спонтанное

окисление

индуцированное ионами железа II) окисление

гомогенат трутневого желточные ЖЛП+гомогенат ЖЛП+гомогенат ЖЛП+гомогенат

рай їли да /м мимри іеидьі (ЖЛ П) і ру і мевиі и расі шида і ру і невиі и іруїмеьиіи

распл ода+сы воротка расп_лода+сы воротка крови

Рис. 11. Уровни ОМБ, регистрируемые при 430 нм, в гомогенате трутневого расплода с добавлением желточных липопротеидов и сыворотки крови крыс при спонтанном и Рв2+-индуцированном окислении

Рис. 12. Уровни ОМБ, регистрируемые при 530 нм, в гомогенате трутневого расплода с добавлением желточных липопротеидов и сыворотки крови крыс при спонтанном и Рв2+-индуцированном окислении

биологической системе «желточные липопротеиды случае Бе2+-индуцированного окисления, по отно-

+ маточное молочко», - в 1,4 и 1,3 раза соответ- шению к модельной биологической системе «жел-

ственно (р < 0,05). точные липопротеиды + маточное молочко», при

3. При добавлении сыворотки крови крыс, как 430 нм - в 1,2 раза, при 530 нм - в 1,4 и 1,6 раза

самок, так и самцов, уровень ОМБ был больше в соответственно (р < 0,05).

Список литературы

1. Безручко Н. В., Васильков В. Г., Келина Н. Ю., Осинькин Д. В., Рубцов Г. К. Биохимические параметры выраженности эндотоксикоза при хроническом холецистите // Вестн. Том. гос. пед. ун-та. 2011. № 5. С. 73-76.

2. Besruchko N. V., Vasilkov V. G., Kelina N. U., Osinkin D. V., Rubsov G. K. Program of clinical-laboratory monitoring biochemical markers of estimation from endogen intoksikation during chronicle and acute cholecystitis // Tomsk state pedagogical university bulletin. 2011. Vol. 8. P. 115-118.

3. Безручко Н. В., Рубцов Г. К., Ганяева Н. Б., Козлова Г. А., Садовникова Д. Г. Каталаза биологических сред организма человека и ее клинико-биохимическое значение в оценке эндотоксикоза // Вестн. Том. гос. пед. ун-та. 2012. № 7. С. 94-100.

4. Галиновский С. П. Антиоксидантная терапия продуктами пчеловодства // Апитерапия сегодня: материалы VII науч.-практ. конф. по апитерапии. Рыбное, 2000. С. 161-163.

5. Макарова В. Г., Якушева Е. Н., Киселева В. А. Влияние продуктов пчеловодства на перекисное окисление липидов // Материалы Меж-

дунар. науч. конф. «Пчеловодство - XXI век». М., 2000. С. 68-70.

6. Макарова В. Г., Узбекова Д. Г., Рябков А. Н., Романов Б. К. Продукты пчеловодства: биологические и фармакологические свойства, клиническое применение. Рязань, 2000. 127 с.

7. Макарова В. Г., Киселева В. А., Рябков А. Н. Оценка антиоксидантных свойств и действия нативного маточного молочка, пыльцевой обножки и женьшеня при экспериментальной свободно-радикальной патологии печени // Апитерапия сегодня. Рыбное, 2004. С. 28-32.

8. Баймурзина Ю. Л. Влияние продуктов пчеловодства на процессы свободнорадикального окисления в норме и экстремальных условиях: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Уфа, 2002. 30 с.

9. Быков В. А., Шикова Ю. В. Изучение антиокислительной активности оксиметилурацила, дибунола и экстракта прополиса в опытах in vitro // Вестн. Воронеж. гос. ун-та. 2004. № 2. С. 172-174.

10. Гущина Г. В., Жолнин А. В. Влияние меда, полученного с применением биологически активной добавки люцевита, на физическую рабо-

тоспособность спортсменов и уровень свободных радикалов // Вестн. Южно-Уральского гос. ун-та. 2007. № 16. С. 75-76.

11. Громенко Д. С., Громенко Ю. Ю., Галимов Ш. Н., Фархутдинов P. P., Мухамедзянов P. M. Воздействие биофлавоноидов прополиса на процессы липопероксидации в гонадах крыс при интоксикации полихлорированными бифенилами // Вопросы питания. 2008. № 6. С. 9-13.

12. Макарова Н. В., Лиманова B. C., Бординова В. П. Антиоксидантные вещества различных сортов меда // Известия вузов. Пищевая технология. 2011. № 1. С. 18-20.

13. Шикова Ю. В., Баймурзина Ю. Л., Лиходед В. А., Фархутдинов Р. Р., Епифанова А. В., Кадырова З. Р., Бахтиярова С. Б., Зарипов Р. А. Антиоксидантные свойства экстракта личинок большой восковой моли и экстракта прополиса // Мед. альманах. 2011. № 2. С. 151-152.

14. Kancheva V. D., Bankova V. S. Chain-breaking antioxidant of two new chalcones from propolis of el Salvador in homogeneous and micellar media // Bulgarian Chemical Communications. 2008. Vol. 40. № 4. P. 546-555.

15. Herken E. N., Erel O., Guzel S., Celik H., Ibanoglu S. Total antioxidant, phenolic compounds, and total oxidant status of certified and uncertified turkey's honeys // International Journal of Food Properties. 2009. Vol. 12. № 3. P. 461-468.

16. Dobre I., Gadei G., Patrascu L., Elisei A. M., Segal R. The antioxidant activity of selected Romanian honeys // Annals of the University Dunarea de Jos of Galati. Fascicle VI: Food Technology. 2010. Vol. 34. № 2. P. 67-73.

17. Gülgin T., §ehitoglu M. H., Bursal E., Bilsel M., Gören A. C. Polyphenol contents and antioxidant activity of lyophilized aqueous extract of propolis from Erzurum, Turkey // Food and Chemical Toxicology. 2010. Vol. 48. № 8-9. P. 2227-2238.

18. Abu-Mellal A., Koolaji N., Tran V. H., Duke C. C., Duke R. K. Prenylated cinnamate and stilbenes from kangaroo island propolis and their antioxidant activity // Phytochemistry. 2012. Vol. 77. P. 251-259.

19. Дубцова Е. А. Клинико-экспериментальное обоснование применения продуктов пчеловодства в комплексной терапии некоторых заболеваний органов пищеварения: автореф. дис. ... докт. мед. наук. Москва, 2009. 38 с.

20. Клебанов Г. И., Бабенкова И. В., Теселкин Ю. О., Комаров О. С., Владимиров Ю. А. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лабораторное дело. 1988. № 5. С. 59-62.

21. Рубцов Г. К., Безручко Н. В., Садовникова Д. Г., Козлова Г. А., Анопин К. Д. Клинико-биохимическое значение комплексного изучения молекул средней массы и окислительной модификации белков для оценки эндотоксикоза // Вопр. биол., мед. и фарм. химии. 2013. № 2. С. 41-47.

22. Рубцов Г. К., Безручко Н. В., Генгин М. Т., Васильков В. Г., Борисова Е. Ю., Анопин К. Д., Васильева А. Д., Садовникова Д. Г., Козлова Г. А., Кручинина А. Д., Гамзин С. С. Способ определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы в сыворотке крови, плазме, эритроцитах и в моче. Заявка на патент на изобретение Российской Федерации № 2012153044, приоритет от 7.12.2012.

23. Ведунова М. В., Сазанов А. И., Конторщикова К. Н. Влияние низких терапевтических доз озона на уровень окислительной модификации белков // Вестн. Нижегород. ун-та им. Н. И. Лобачевского. 2010. № 2. С. 504-507.

24. Дубинина Е. Е., Бурмистров С. О., Ходов Д. А., Поротов И. Г. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы мед. химии. 1995. № 1. С. 24-26.

Рубцов Г. К., ассистент кафедры.

Пензенский государственный университет.

Ул. Красная, 40, Пенза, Россия, 440026.

E-mail: rubczoff.georgij@yandex.ru

Материал поступил в редакцию 28.03.2013.

G. K. Rubsov

COMPLETE APPLICATION OF MODEL BIOLOGICAL SYSTEMS FOR ASSESSMENT OF OXIDATIVE MODIFICATION OF PROTEINS IN THE POOL OF AVERAGE WEIGHT MOLECULES

The article deals with the level of oxidative modification of proteins (OMP) in the pool of molecules, the mass of media (MSM) to model biological systems, which have been selected as the yolk lipoproteins, bee products and blood serum of experimental animals (rats). It shows features of these model biological systems in terms of OMP in a spontaneous and Fe(II)-induced oxidation. The author proves reasonably of possible integrated use of the studied model for the study of biological systems at the level of the pool OMP MSM, one of which can serve as a model biological system of royal jelly with the addition of yolk lipoprotein, as well as with the addition of the blood serum of rats.

Key word: model biological systems, oxidative modification ofproteins, the molecules of average weight.

Penza State University.

Ul. Krasnaya, 40, Penza, Russia, 440026.

E-mail: rubczoff.georgij@yandex.ru