СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАМПИРИНА В ПРЕПАРАТАХ С АНТИОКСИДАНТНЫМИ СВОЙСТВАМИ МЕТОДОМ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION STAMPYRINE IN PREPARATIONS WITH ANTIOXIDANT PROPERTIES USING VOLTAMMETRIC TECHNIQUE

Изобретение относится к области фармацевтической химии и касается способов количественного определения биологически активных веществ с антиоксидантными свойствами, в частности антипириламида стеариновой кислоты или стампирина-синтезированного вещества с выраженными противовоспалительными и антиоксидантными свойствами. Метод определения - вольтамперометрия.
Электрохимические методы определения характеризуются высокой чувствительностью, экспрессностью и простотой в аппаратурном оформлении. Они успешно применяются для количественного химического определения веществ органической и неорганической природы.
Лекарственные препараты в этом ряду имеют особое значение, т.к. от точности измерения их концентрации зависит и дозировка данных препаратов и их лечебное воздействие на организм.
Антипириламид стеариновой кислоты (АПСК) известен как противовоспалительный препарат стампирин (фиг.1), который прошел клинические испытания и допущен к применению.
Фиг.1. Структурная формула антипириламида стеариновой кислоты (АПСК) (стампирин).
Проведенные исследования in vivo показали, что АПСК малотоксичен, в условиях эксперимента оказывает выраженное антимутагенное действие у мышей на фоне обработки циклофосфаном, повышает выживаемость мышей и проявляет гепатозащитную активность (хемопревентивное действие) при воздействии четыреххлористого углерода в токсических дозах, обладает выраженным антивирусным действием в отношении вируса везикулярного стоматита. Полученные результаты позволяют предположить наличие у АПСК выраженных антирадикальных и антиоксидантных свойств in vivo, радиопротекторных и гепатозащитных свойств. Соединение АПСК является перспективным для дальнейшего углубленного изучения и разработки в качестве гепатозащитного, антиоксидантного и противовирусного средства.
Для обеспечения контроля качества лекарственного средства необходимо разработать методику количественного определения антипириламида стеариновой кислоты в субстанции и лекарственной форме. В настоящее время из методик количественного определения стампирина в субстанции и лекарственной форме используются методы хроматографии и спектрофотометрии (И.С.Иванов. Связь структуры и токсичности в ряду производных изоборнилфенола // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии: Матер. конф. / Под ред. В.В.Жданова. - Томск: Изд-во Томск. ун-та, 2007, с.106).
Количественное определение стампирина методом спектрофотометрии проводят в УФ-области спектра. Оптическую плотность рабочих растворов, приготовленных из порошка растертых таблеток, измеряют при длине волны 282 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 96% этиловый спирт.
В качестве хроматографического метода определения стампирина в разных объектах используют чувствительный и селективный метод ВЭЖХ с электрохимическим способом детектирования.
Представленные методы имеют ряд недостатков: оборудование и растворители для высокоэффективной жидкостной хроматографии имеют высокую стоимость, а спектрофотометрия не обладает необходимой селективностью и чувствительностью.
Перспективно использование вольтамперометрии для количественного определения лекарственных веществ - простого, чувствительного и экспрессного метода. Информация о применении метода вольтамперометрии для определения стампирина отсутствует.
Известны данные об условиях вольтамперометрического окисления родственного пространственно-затрудненного 3-бензоил-1-фенил-4-циано-5-аминопиразола на платиновом электроде при потенциалах от +1.5 до +1.7 В в среде ацетонитрила (G.M. Abou-Elenien, N.A. Ismail, А.А. El-Maghraby, G.M. Al-abdallah / Electrochemical studies on some pyrazole, oxadiazole and thiadiazole derivatives. // Electroanalysis, 2001, V 13, p.1022-1029). Недостатком метода является то, что условия эксперимента не обеспечивают чувствительное определение 3-бензоил-1-фенил-4-циано-5-аминопиразола в субстанции.
Наиболее близким к предлагаемому решению прототипом является метод вольтамперометрии 4-метил-2,6-ди-трет-бутилфенола. Сущность методики состоит в электроокислении 4-метил-2,6-ди-трет-бутилфенола с использованием стеклоуглеродного электрода на фоне 0,1 моль/л уксусной кислоты в диметилформамиде при потенциале, равном 1,15 В, при скорости развертки потенциала 100 мВ/с (Г.К.Зиятдинова, Д.М.Гильметдинова, Г.К.Будников, Е.Н.Офицеров. Вольтамперометрическое поведение соединений фенольного ряда, обладающих антиоксидантными свойствами // Ученые записки Казанского государственного университета, серия естеств. Науки, 2005, Т.147, №1, с.141-149).
Использование условий в способе-прототипе не обеспечивает чувствительности и экспрессности определения стампирина в субстанции и таблетированной лекарственной форме.
Новая техническая задача - увеличение чувствительности и экспрессности способа определения стампирина в субстанции и таблетированной лекарственной форме методом инверсионной вольтамперометрии.
а
Поставленная задача достигается тем, что стампирин переводят из пробы в этанольный раствор и проводят вольтамперометрическое определение. Используют инверсионную вольтамперометрию, при этом накопление стампирина проводят с использованием индикаторного стеклоуглеродного электрода в течение 120 с при потенциале накопления +1,2 В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода на фоне 0,1 моль/л перхлората натрия в этаноле с последующей регистрацией анодных пиков при постоянно-токовой форме развертки потенциала со скоростью 0.05 В/с при потенциале анодного окисления Е+1.05 В. Концентрацию стампирина определяют по высоте анодного пика окисления в диапазоне потенциалов от +1,0 до +1,1 В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода (фиг.2).
4
2
5
-5
-5
-4
Фиг.2. Вольтамперограммы анодного окисления антипириламида стеариновой кислоты на СУЭ в фоновом электролите 0.1 М NaClO в CHOH: 1 - фоновая кривая; 2, 3, 4 - при концентрации вещества 5.7·10 моль/л, 8.5·10 моль/л, 1.1·10 моль/л соответственно.
В качестве оборудования для проведения анализа использовали вольтамперометрический анализатор «ТА-2» (производство «ООО Томьаналит» г.Томск).
Новым в способе является использование удобного в аппаратурном оформлении чувствительного метода инверсионной вольтамперометрии с предварительным электрохимическим накоплением субстрата на поверхности стеклоуглеродного электрода при потенциале электролиза, равном +1.2 В, в течение 120 с. В качестве рабочего электрода используют дешевый и чувствительный стеклоуглеродный электрод, который перед каждым анализом подвергается очистке путем промывания в концентрированной азотной кислоте в течение 6 минут с последующим промыванием в дистиллированной воде.
-5
-4
а
4
2
5
На основании полученных результатов получена линейная концентрационная зависимость тока окисления стампирина от его концентрации в растворе в диапазоне от 1.42·10 до 3.33·10 моль/л (фиг.3). Фиг.3. Зависимость тока электроокисления при Е+1.05 В от концентрации стампирина на стеклоуглеродном электроде в фоновом электролите 0.1 М NaClO в CHOH.
На основании полученных результатов выведено уравнение математической модели зависимости тока окисления стампирина от его концентрации в растворе:
-5
-4
Произведена проверка гипотезы линейности данного градуировочного графика. Оценена адекватность математической модели по критерию Фишера. В диапазоне концентраций стампирина от 1.42·10 до 3.33·10 моль/л модель адекватна.
Определены следующие метрологические характеристики методики.
1. Показатель повторяемости рассчитывается в виде среднеквадратичного отклонения (СКО) результатов, полученных в условиях повторяемости.
2. Показатель внутрилабораторной прецизионности - в виде СКО результатов, полученных в условиях внутрилабораторной прецизионности (в разное время, разные операторы, реактивы, мерная посуда, экземпляры средств измерений).
-5
-4
Обобщенные результаты, полученные в лаборатории для диапазона концентраций от 1.42·10 до 3.33·10 моль/л стампирина представлены в таблице 1.
Таблица 1. Диапазон измерений, значения показателей повторяемости и внутрилабораторной прецизионности методики определения стампирина при доверительной вероятности Р 0.95
Указанные выше показатели качества результатов анализа являются установленными характеристиками погрешности для любой совокупности результатов анализа, полученных при соблюдении требований методики при ее реализации в отдельной лаборатории. Проверка правильности разработанной методики проведена методом «введено-найдено» (табл.2).
Таблица 2. Результаты количественного определения стампирина методом «введено-найдено» (n 5, Р 0.95)
Пример 1. Определение стампирина в субстанции методом инверсионной вольтамперометрии.
В кварцевый стаканчик вместимостью 20 мл вносят 10,0 мл раствора фонового электролита 0,1 моль/л перхлората натрия в этаноле и помещают в электрохимическую ячейку вольтамперометрического анализатора. Опускают в раствор электроды: индикаторный - стеклоуглеродный, вспомогательный и электрод сравнения - насыщенные хлорид-серебряные. Перемешивают 10 с, успокаивают 20 с, проводят процесс электронакопления при потенциале +1,2 В в течение 120 с, затем фиксируют анодную вольтамперограмму в диапазоне потенциалов от +1.0 В до +1.1 В (фиг.2) при скорости развертки напряжения 0.05 В/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем в стаканчик с фоновым раствором вносят аликвоту (0.1 мл) раствора стампирина в этаноле. Перемешивают раствор 10 с, успокаивают 20 с и проводят электрохимическе накопление при потенциале +1,2 В в течение 120 с, и вновь снимают вольтамперограмму в тех же условиях. Анодный пик регистрируют в диапазоне потенциалов от +1,0 В до +1,1 В. Концентрацию стампирина определяют методом градуировочного графика (фиг.3) или расчетным способом, используя выражение (1), по высоте анодного пика вещества.
Пример 2. Определение антипириламида стеариновой кислоты в таблетках «Стампирин».
Одну таблетку стампирина растирают в ступке, порошок стампирина взвешивают и переносят в колбу, добавляют 10-15 мл этанола и нагревают на водяной бане при температуре 45-50°C в течение 10 минут. После этого раствор фильтруют через бумажный фильтр, который промывают этанолом два раза по 5 мл. Затем в кварцевый стаканчик вместимостью 20 мл вносят 10,0 мл раствора фонового электролита 0,1 моль/л перхлората натрия в этаноле и помещают в электрохимическую ячейку вольтамперометрического анализатора. Опускают в раствор электроды: индикаторный - стеклоуглеродный, вспомогательный и электрод сравнения - насыщенные хлорид-серебряные. Перемешивают 10 с, успокаивают 20 с, проводят процесс электронакопления при потенциале +1,2 В в течение 120 с, затем фиксируют анодную вольтамперограмму в диапазоне потенциалов от +1,0 В до +1.1 В при скорости развертки напряжения 0.05 В/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем в стаканчик с фоновым раствором вносят аликвоту фильтрата стампирина в этаноле объемом 0,1 мл. Перемешивают раствор 10 с, успокаивают 20 с и проводят электрохимическе накопление при потенциале +1,2 В в течение 120 с, и вновь снимают вольтамперограмму в тех же условиях. Анодный пик регистрируют в диапазоне потенциалов от +1,0 В до +1,1 В. Концентрацию стампирина определяют методом градуировочного графика (фиг.3) или расчетным способом, используя выражение (1), по высоте анодного пика вещества.
Предложенный способ количественного определения стампирина отличается простотой, не требует больших трудозатрат, значительного количества реактивов и отличается высокой селективностью, экспрессностью и чувствительностью.
Предложенный способ может быть использован для количественного определения стампирина в порошке, его лекарственных формах, для контроля производства, сточных вод и воздушной зоны химико-фармацевтических предприятий.
Таблица 1
Способ количественного определения стампирина в препаратах с антиоксидантными свойствами методом вольтамперометрии
Диапазон измеряемых концентраций, С/10<sup>-5</sup>, моль/л
Показатель повторяемости σ<sub>r</sub>/10<sup>-5</sup>, моль/л
Показатель внутрилабораторной прецизионности, σ<sub>R</sub>/10<sup>-5</sup>, моль/л
От 1.42 до 33.30 включ.
0.15
0.25
Таблица 2
Способ количественного определения стампирина в препаратах с антиоксидантными свойствами методом вольтамперометрии
Введено,С/10<sup>-5</sup>, моль/л
Найдено,С/10<sup>-5</sup>, моль/л
ε/10<sup>-5</sup>,моль/л
ε, %
1.42
1.25
0.20
16
2.84
2.69
0.30
11
4.25
4.11
0.57
14
5.65
5.60
0.54
9.6
7.04
7.10
0.93
13
8.43
8.50
0.89
11
9.80
9.7
1.1
11
11.20
11.20
0.77
6.9
13.90
14.20
0.89
6.3
16.60
16.9
1.0
5.9
19.20
19.60
0.79
4.0
23.20
23.10
0.64
2.8
27.00
27.20
0.87
3.2
33.30
32.80
0.67
2.0