АГЕНТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С PSMA, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
PSMA-BINDING AGENTS AND USING THEM

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка заявляет приоритет согласно предварительным заявкам США №№61/085462, поданной 1 августа 2008 года, и 61/111791, поданной 6 ноября 2008 года, полное содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки. Настоящее изобретение было создано при поддержке правительства США на основании NIH гранта NIH U24 92871, NIH R21 CA114111, NIH CA111982 и DOD PC050825. Правительство имеет определенные права на настоящее изобретение.
Предпосылки изобретения
Область техники
Настоящее изобретение, в основном, относится к радиоизотопно-меченным, связывающимся с простата-специфическим мембранным антигеном (PSMA) соединениям, химическим предшественникам радиоизотопно-меченных связывающихся с PSMA соединений и способам визуализации с использованием радиоизотопно-меченных соединений.
Уровень техники
18
Рак предстательной железы (PCa) занимает второе место среди связанных с раком причин смертности мужчин (1). Локализация только половины опухолей, вызываемых Pca, клинически определяется при диагностировании, и половина из них демонстрируют экстракапсулярное распространение. Локализация такого распространения, а также определение общей PCa нагрузки на организм имеют важное значение для терапии, особенно в связи с развитием новых комбинированных и фокальных терапевтических методов. Также существует огромная необходимость в агентах направленного действия на мишень, которые могут обеспечить считывание биологии опухоли, с возможностью прогнозирования, какие опухоли будут находиться в спящем состоянии, и какие будут развиваться в агрессивное метастатическое заболевание. Существующий клинический стандарт для определения локализации рака - включая PCa - это переход от анатомических методов визуализации, таких как компьютерная томография (CT) и магнитный резонанс (MR), к более физиологически релевантным способам, в которых используют молекулярную визуализацию, такую как MR спектроскопия, однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT) и позитроннная эмиссионная томография (PET) (2). Такие новые способы, в которых используют молекулярную визуализацию, могут обеспечить биологическое считывание, необходимое для выяснения физиологии опухоли, обеспечивают более точный прогноз и терапевтический мониторинг. Молекулярная визуализация может не только обеспечить путь определения опухолей in vivo, но также обеспечить информацию, касающуюся биологии поражения, если используют механизм-специфическое вещество. Например, [F]FDHT можно использовать для исследования андроген-рецепторного статуса опухолей (3).
В отличие от многих других типов рака, PCa особенно трудно определить с использованием существующих индикаторов для молекулярной визуализации. Для этого есть несколько причин, включая относительно медленную скорость роста и метаболизма PCa по сравнению с другими злокачественными опухолями, а также небольшой размер органа и близость к мочевому пузырю, в который, в конечном счете, выделяется большая часть радиофармацевтических агентов.
I8
18
18
18
18
18
18
Из-за относительно низкого метаболизма PCa, PET с [F]фтордезоксиглюкозой (FDG-PET) оказалась неэффективной для диагностической визуализации этого заболевания. Появляются другие перспективные экспериментальные радиофармацевтические средства для визуализации PCa, включая вещества из ряда холинов (4)(5)(6), радиоактивно меченные ацетаты (7), анти-1-амино-3-[F]фторциклобутил-1-карбоновую кислоту (анти[F]F-FACBC) (8)(9), 1-(2-дезокси-2-[F]фтор-1-арабинофуранозил)-5-метилурацил ([F]FMAU) (10) и [F]фтордигидротестостерон ([F]FDHT) (3). Каждое вещество имеет свои преимущества и недостатки, при этом ни одно вещество не является идеальным, т.е. не предполагает простоту синтеза, низкий метаболизм и не демонстрирует опухоль-специфическое поглощение, во всех PCa фенотипах.
111
Экспрессирующийся в чрезмерном количестве на большинстве вновь образованных сосудах солидных опухолей (11), а также в случае рака предстательной железы, простата-специфический мембранный антиген (PSMA) становится привлекательной мишенью для визуализации и терапии рака (12) (13). Агенты на основе PSMA могут сообщать о присутствии этого маркера, который является все более признаваемым в качестве важной прогностической детерминанты в PCa (14). Он также является мишенью для различных новых PCa терапевтических методов (15). ProstaScint™ представляет собой In-меченное моноклональное антитело против PSMA, которое является клинически доступным для визуализации PCa. ProstaScint™ и радиоактивно меченные варианты этого антитела имеют такие недостатки, как долгое время циркуляции и плохой контраст между мишенью и тканью, которая не является мишенью, что ограничивает применимость этих веществ (16)(17)(18).
Сущность изобретения
Настоящее изобретение отвечает давно существующим и неудовлетворенным до настоящего времени потребностям в новых ткане-специфических соединениях для визуализации рака предстательной железы и ангиогенеза. Настоящее изобретение, в частности, обеспечивает агенты визуализации, которые отличаются от известных из уровня техники модификациями, которые ранее не были известны или предполагались. Кроме того, изобретение обеспечивает агенты визуализации, которые предлагают лучший контраст между тканями, являющимися мишенью, и тканями, не являющимися мишенью.
Настоящее изобретение относится к соединениям, имеющим структуру (I), представленную ниже.
2
где Z представляет собой тетразол или COQ; каждый Q независимо выбран из водорода или защитной группы.
В некоторых вариантах воплощения формулы I, m имеет значение 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; R представляет собой пиридиновое кольцо со структурой
2
2
3
3
3
2
2
2
2
2
P
2
p
2
P
1
6
1
6
2
2j
3
3
3
2
+
2
2
2
2
3
3
8
8
8
2
3
+
2
2
2
2
где X представляет собой фтор, иод, радиоизотоп фтора, радиоизотоп иода, хлор, бром, радиоизотоп брома, радиоизотоп астата, NO, NH, N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R), B(OH), -NHNH, -NHN=CHR, -NHNH-CHR; n имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5; Y представляет собой O, S, N(R'), C(O), NR'C(O), C(O)N(R'), OC(O), C(O)O, NR'C(O)NR', NR'C(S)NR', NR'S(O), S(CH), NR'(CH), O(CH), OC(O)CHRNHC(O), NHC(O)CHRNHC(O) или ковалентную связь; где p имеет значение 1, 2 или 3, R' представляет собой H или C-C алкил, и R представляет собой алкил, арил или гетероарил, каждый из которых может быть замещен; R представляет собой C-C алкил; и R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, бромом, радиоизотопом брома, радиоизотопом астата, NO, NH N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) или B(OH).
2
2
P,
2
p
2
p
1
6
8
8
8
В некоторых вариантах воплощения формулы I, m имеет значение 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; Y представляет собой O, S, N(R'), C(O), NR'C(O), C(O)N(R'), OC(O), C(O)O, NR'C(O)NR, NR'C(S)NR', NR'S(O), S(CH) NR'(CH), O(CH), OC(O)CHRNHC(O), NHC(O)CHRNHC(O) или ковалентную связь; где p имеет значение 1, 2 или 3, R' представляет собой H или C-C алкил, и R представляет собой алкил, арил или гетероарил, каждый из которых может быть замещен; R представляет собой
1
3
3
3
+
2
2
2
2
2
2
2
2,
3
3
3
2
где X выбран из группы, включающей NHNH, -NHN=CHR и -NHNH-CHR; где R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, хлором, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата, NO, NH N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) или B(OH); и n имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5.
В других вариантах воплощения формулы I, m имеет значение 4, Y представляет собой NR', и R представляет собой
1
6
2
2
2
2,
3
3
3
2.
7
3
3
3
+
2
2
2
2
где G представляет собой O, NR' или ковалентную связь; R' представляет собой H или C-C алкил; p имеет значение 1, 2, 3 или 4, и R выбран из группы, включающей NH, N=CHR, NH-CHR, где R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, хлором, бромом, радиоизотопом брома, радиоизотопом астата, NO, NH N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) или B(OH)
Некоторые соединения по настоящему изобретению взаимодействуют с простата-специфическим мембранным антигеном (PSMA). Как результат, когда соединения включают радиоизотоп, они могут быть подходящими в качестве агентов визуализации, диагностических средств и/или терапевтических средств.
Во многих случаях, радиоизотоп, используемый в соединении, является короткоживущим изотопом. Поэтому радиоизотопно-меченные соединения получают непосредственно перед их использованием или незадолго до этого или только в количестве, достаточном для введения. Поэтому настоящее изобретение также включает предшественники радиоизотопно-меченных соединений, которые могут быть химически преобразованы в радиоизотопно-меченные соединения по настоящему изобретению.
Краткое описание рисунков
Фиг.1 представляет схематическое изображение наилучшего расположения для 3, 6 и 8 с кристаллическим лигандом, т.е. 3, в виде соединения, со-кристаллизованного с PSMA, в присутствии молекулы воды в активном сайте PSMA (PDB ID: 3D7H). Темные круги (ионы цинка), светлый круг (хлоридный ион).
Фиг.2 представляет схематическое изображение наилучшего расположения (3, 6 и 8) с кристаллическим лигандом (3) в отсутствие молекулы воды в активном сайте PSMA. Темный круг (ионы цинка), светлый круг (хлоридный ион).
125
125
Фиг.3 представляет [I]3 SPECT-CT в моделях PCa опухоли (4 часа после инъекции). Характерное поглощение только в PSMA+PIP опухоли. Поглощение в почках имеет место большей частью из-за специфического связывания [I]3 с корковым веществом почки.
18
125
125
Фиг.4 представляет изображение, полученное при помощи [F]6 PET совместно с CT в моделях PCa опухоли (~100 минут после инъекции). Характерное поглощение только в PSMA+PIP опухоли. Поглощение в почках имеет место большей частью из-за специфического связывания [I]3 с корковым веществом почки. Наблюдается более интенсивное поглощение опухолью и меньшее печенью с использованием этого агента по сравнению с [I]3.
125
125
18
Фиг.5 представляет [I]8 SPECT-CT в PSMA+ LNCaP опухолях (4 часа после инъекции). Характерное интенсивное поглощение в опухоли. Подобный результат был получен для PSMA+ PIP, но не для PSMA-flu опухолей (данные не показаны). Наблюдается меньшее поглощение в почках и печени с использованием этого агента, чем с галогенбензоилированными аналогами, [I]3 и [F]6, соответственно.
Подробное описание иллюстративных вариантов воплощения
Варианты воплощения настоящего изобретения включают соединения в соответствии с формулой I, представленной ниже:
2
где Z представляет собой тетразол или COQ, и каждый Q независимо выбран из водорода или защитной группы.
В иллюстративных вариантах воплощения (A), m имеет значение 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, R представляет собой пиридиновое кольцо, выбранное из группы, включающей
2
2
3
3
3
2
2
2
2
2
p
2
p
2
p
1
6
1
6
2
2
3
3
3
2
+
2
2
2
2
3
3
8
8
8
2
3
+
2
2
2
2
где X представляет собой фтор, иод, радиоизотоп фтора, радиоизотоп иода, хлор, бром, радиоизотоп брома, радиоизотоп астата, NO, NH, N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R), B(OH), -NHNH, -NHN=CHR, -NHNH-CHR; n имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5; Y представляет собой O, S, N(R'), C(O), NR'C(O), C(O)N(R'), OC(O), C(O)O, NR'C(O)NR', NR'C(S)NR', NR'S(O), S(CH), NR'(CH), O(CH), OC(O)CHRNHC(O), NHC(O)CHRNHC(O) или ковалентную связь; p имеет значение 1, 2 или 3, R' представляет собой H или C-C алкил, и R представляет собой алкил, арил или гетероарил, каждый из которых может быть замещен; R представляет собой C-C алкил; и R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, хлором, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата, NO, NH, N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) или B(OH); или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
2
2
P
2
P
2
p
1
6
8
8
8
В других вариантах воплощения (B), m имеет значение 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; Y представляет собой O, S, N(R'), C(O), NR'C(O), C(O)N(R'), OC(O), C(O)O, NR'C(O)NR', NR'C(S)NR', NR'S(O), S(CH), NR'(CH), О(CH), OC(O)CHRNHC(O), NHC(O)CHRNHC(O) или ковалентную связь; p имеет значение 1, 2 или 3; R' представляет собой H или C-C алкил; R представляет собой алкил, арил или гетероарил, каждый из которых может быть замещен; R представляет собой
2
2
2
2
3
3
3
2
1
6
3
3
3
+
2
2
2
2
2
где X' выбран из группы, включающей NHNH, -NHN=CHR и -NHNH-CHR; где R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, хлором, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата; NO, NH, N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) или B(OH); R представляет собой C-C алкил; n имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5; или или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
В следующих вариантах воплощения (C), m имеет значение 4; Y представляет собой NR'; и R представляет собой
1
6
2
2
2
2,
3
3
3
2
1
6
7
3
3
3
+
2
2
2
2
2
где G представляет собой O, NR' или ковалентную связь; R' представляет собой H или C-C алкил; p имеет значение 1, 2, 3 или 4, и R выбран из группы, включающей NH, N=CHR, NH-CHR, где R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата; NO, NH N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) или B(OH); R представляет собой C-C алкил; или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
Соединения, описанные в настоящем изобретении, могут содержать один или несколько асимметрических центров или плоскостей. Соединения по настоящему изобретению, содержащие асимметрически замещенный атом, могут быть выделены в оптически активной или рацемической формах. Из предшествующего уровня техники хорошо известно, как получить оптически активные формы, например, путем разделения рацемических форм (рацематов), путем асимметрического синтеза или путем синтеза из оптически активных исходных веществ. Разделение рацематов можно осуществить, например, традиционными способами, такими как кристаллизация в присутствии агента разделения или хроматография с использованием, например, хиральной ВЭЖХ колонки. Многие геометрические изомеры олефинов, C=N двойные связи и подобные также могут присутствовать в соединениях, описанных в настоящем изобретении, и все такие стабильные изомеры предусматриваются в настоящем изобретении. Цис и транс геометрические изомеры соединений по настоящему изобретению описаны и могут быть выделены в виде смеси изомеров или в виде отдельных изомерных форм. Предусматриваются все хиральные (энантиомерные и диастереомерные) и рацемические формы, а также все геометрические изомерные формы структуры, если только конкретно не указывается определенная стереохимия или изомерная форма.
Соединения, описанные в настоящем изобретении, могут содержать один или несколько заряженных атомов. Например, соединения могут быть цвиттерионными, но, в целом, могут быть нейтральными. Другие варианты воплощения могут содержать одну или несколько заряженных групп, в зависимости от pH и других факторов. В этих вариантах воплощения, соединение может быть ассоциировано с подходящим противоионом. Из предшествующего уровня техники хорошо известны способы получения солей или обмена противоионов. Как правило, такие соли можно получить путем взаимодействия формы свободной кислоты этих соединений со стехиометрическим количеством подходящего основания (такого как гидроксид, карбонат, бикарбонат Na, Ca, Mg или K или подобного) или путем взаимодействия формы свободного основания этих соединений со стехиометрическим количеством подходящей кислоты. Такие реакции типично осуществляют в воде или в органическом растворителе или в смеси вышеуказанных. Противоионы могут быть заряжены, например, с использованием методов ионного обмена, таких как ионообменная хроматография. Предусматриваются все цвиттерионы, соли и противоионы, если только конкретно не указан определенный противоион или соль. В некоторых вариантах воплощения, соль или противоион могут быть фармацевтически приемлемыми для введения субъекту. Фармацевтически приемлемые соли обсуждаются ниже.
n
Когда какая-либо переменная присутствует в количестве больше чем 1 в каком-либо составляющем фрагменте или формуле соединения, ее определение в каждом случае является независимым от ее определения в каждом другом случае. Так, например, если группа показана как замещенная (X)заместителем, где n имеет значение 1, 2, 3, 4 или 5, тогда указанная группа, необязательно, может иметь в качестве заместителей вплоть до пяти X групп, и в каждом случае их независимо выбирают из определения X. Также возможны комбинации заместителей и/или переменных, только если такие комбинации приводят к стабильным соединениям.
Как указано выше, различные заместители различных формул являются "замещенными" или "могут быть замещены". Термин "замещенный", как он используется в настоящем изобретении, означает, что любой один или несколько атомов водорода на указанном атоме или группе заменены заместителем, при условии, что не превышается нормальная для указанного атома валентность, и что такое замещение приводит к стабильному соединению. Когда заместитель представляет собой оксо (кето, т.е. =О), тогда на одном атоме заменены 2 атома водорода.
1
6
Настоящее изобретение предполагает включение всех изотопов (включая радиоизотопы) атомов, присутствующих соединениях по настоящему изобретению. Когда соединения являются замещенными, они могут быть, таким образом, замещены в одном или нескольких доступных положениях, типично в 1, 2, 3 или 4 положениях, одной или несколькими подходящими группами, такими как группы, раскрытые в настоящем описании. Подходящие группы, которые могут присутствовать на "замещенной" группе, включают, например, галоген; циано; гидроксил; нитро; азидо; амино; алканоил (такой как C-C алканоильная группа, такая как ацил или подобные); карбоксамидо; алкильные группы (включая циклоалкильные группы, содержащие от 1 до около 8 атомов углерода, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода); алкенильные и алкинильные группы (включая группы, содержащие одну или несколько ненасыщенных связей и от 2 до около 8, например, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода); алкоксигруппы, содержащие одну или несколько кислородных связей и от 1 до около 8, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода; арилокси, такой как фенокси; алкилтиогруппы, включая группы, содержащие одну или несколько тиоэфирных связей и от 1 до около 8 атомов углерода, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода; алкилсульфинильные группы, включая группы, содержащие одну или несколько сульфинильных связей и от 1 до около 8 атомов углерода, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода; алкилсульфонильные группы, включая группы, содержащие одну или несколько сульфонильных связей и от 1 до около 8 атомов углерода, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода; аминоалкильные группы, включая группы, содержащие один или несколько N атомов и от 1 до около 8, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода; карбоциклический арил, содержащий 4, 5, 6 или более атомов углерода и одно или несколько колец, (например, фенил, бифенил, нафтил или подобные, каждое кольцо является замещенным, либо незамещенным ароматическим); арилалкил, содержащий от 1 до 3 отдельных или конденсированных колец и от 6 до около 18 кольцевых атомов углерода, (например, бензил); арилалкокси, содержащий от 1 до 3 отдельных или конденсированных колец и от 6 до около 18 кольцевых атомов углерода (например, O-бензил); или насыщенную, ненасыщенную или ароматическую гетероциклическую группу, содержащую от 1 до 3 отдельных или конденсированных колец, с от 3 до около 8 членов на кольцо, и один или несколько N, O или S атомов (например, кумаринил, хинолинил, изохинолинил, хиназолинил, пиридил, пиразинил, пиримидил, фуранил, пирролил, тиенил, тиазолил, триазинил, оксазолил, изоксазолил, имидазолил, индолил, бензофуранил, бензотиазолил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, пиперидинил, морфолинил, пиперазинил и пирролидинил). Такие гетероциклические группы могут быть дополнительно замещены, например, гидрокси, алкилом, алкокси, галогеном и амино.
1
6
1
4
1
6
1
6
1
6
n
i
c
n
i
s
t
c
Как он используется в настоящем изобретении, "алкил" включает разветвленные, линейные и циклические насыщенные алифатические углеводородные группы. Примеры алкила включают, но не ограничиваются этим, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил и втор-пентил. В некоторых вариантах воплощения, алкильные группы представляют собой C-C алкильные группы или C-C алкильные группы. Конкретные алкильные группы представляют собой метил, этил, пропил, бутил и 3-пентил. Термин "C-C алкил", как он используется в настоящем изобретении, означает линейные, разветвленные или циклические C-C углеводороды, которые являются полностью насыщенными и их гибриды, такие как (циклоалкил)алкил. Примеры C-C алкильных заместителей включают метил (Me), этил (Et), пропил (включая н-пропил (n-Pr, Pr), изопропил (i-Pr, Pr) и циклопропил (c-Pr, Pr)), бутил (включая н-бутил (n-Bu, Bu), изобутил (i-Bu, Bu), втор-бутил (s-Bu, Bu), трет-бутил (t-Bu, Bu) или циклобутил (c-Bu, Bu)) и т.д. "Циклоалкил" включает насыщенные кольцевые группы, такие как циклопропил, циклобутил, циклопентил или циклогексил. Циклоалкильные группы типично содержат от 3 до около 8 кольцевых членов. В термине "(циклоалкил)алкил" циклоалкил и алкил имеют значения, определенные выше, с точкой присоединения по алкильной группе. Этот термин охватывает, но не ограничивается этим, циклопропилметил, циклопентилметил и циклогексилметил.
Как он используется в настоящем изобретении, "алкенил" включает углеводородные цепи либо линейной, либо разветвленной конфигурации, включающие одну или несколько ненасыщенных углерод-углеродных связей, которые могут присутствовать в любой стабильной точке по всей протяженности цепи, такие как этенил и пропенил. Алкенильные группы типично содержат от 2 до около 8 атомов углерода, более типично от 2 до около 6 атомов углерода.
Как он используется в настоящем изобретении, "алкинил" включает углеводородные цепи либо линейной, либо разветвленной конфигурации, включающие одну или несколько углерод-углеродных тройных связей, которые могут присутствовать в любой стабильной точке по всей протяженности цепи, такие как этинил и пропинил. Алкинильные группы типично содержат от 2 до около 8 атомов углерода, более типично от 2 до около 6 атомов углерода.
Как он используется в настоящем изобретении, "галогеналкил" включает как разветвленные, так и линейные насыщенные алифатические углеводородные группы, содержащие указанное количество атомов углерода, замещенные 1 или более атомами галогена. Примеры галогеналкильных групп включают, но не ограничиваются этим, моно-, ди- или три-фторметил, моно-, ди- или три-хлорметил, моно-, ди-, три-, тетра- или пента-фторэтил и моно-, ди-, три-, тетра- или пента-хлорэтил и т.д.. Типичные галогеналкильные группы содержат от 1 до около 8 атомов углерода, более типично от 1 до около 6 атомов углерода.
Как он используется в настоящем изобретении, "алкокси" представляет собой алкильную группу, определенную выше, присоединенную через кислородный мостик. Примеры алкокси включают, но не ограничиваются этим, метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, 2-бутокси, трет-бутокси, н-пентокси, 2-пентокси, 3-пентокси, изопентокси, неопентокси, н-гексокси, 2-гексокси, 3-гексокси и 3-метилпентокси. Алкоксигруппы типично содержат от 1 до около 8 атомов углерода, более типично от 1 до около 6 атомов углерода.
Как он используется в настоящем изобретении, "галогеналкокси" представляет собой галогеналкильную группу, определенную выше, с указанным количеством атомов углерода, присоединенную через кислородный мостик. Галогеналкоксигруппы содержат от 1 до около 8 атомов углерода, более типично от 1 до около 6 атомов углерода.
Как он используется в настоящем изобретении, "алкилтио" включает группы, содержащие одну или несколько тиоэфирных связей и типично от 1 до около 8 атомов углерода, более типично 1 до около 6 атомов углерода.
Как он используется в настоящем изобретении, термин "алкилсульфинил" включает группы, содержащие одну или несколько сульфоксидных (SO) связывающих групп и типично от 1 до около 8 атомов углерода, более типично 1 до около 6 атомов углерода.
2
Как он используется в настоящем изобретении, термин "алкилсульфонил" включает группы, содержащие одну или несколько сульфонильных (SO) связывающих групп и типично от 1 до около 8 атомов углерода, более типично от 1 до около 6 атомов углерода.
Как он используется в настоящем изобретении, термин "алкиламино" включает группы, содержащие одну или несколько групп первичного, вторичного и/или третичного амина и типично от 1 до около 8 атомов углерода, более типично от 1 до около 6 атомов углерода.
Как он используется в настоящем изобретении, "гало" или "галоген" относится к фтору, хлору, брому или иоду; и "прттивоион" используется для обозначения небольших, отрицательно заряженных частиц, таких как хлорид, бромид, гидроксид, ацетат, сульфат и подобные.
Как он используется в настоящем изобретении, термин "карбоциклическая группа" означает любую стабильную 3-7- членную моноциклическую или бициклическую или 7-13-членную бициклическую или трициклическую группу, при этом любая из таких групп может быть насыщенной, частично ненасыщенной или ароматической. Помимо примеров, приведенных в других разделах настоящей заявки, примеры таких карбоциклов включают, но не ограничиваются этим, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, адамантил, циклооктил, [3,3,0]бициклооктанил, [4,3,0]бициклононанил, [4,4,0]бициклодеканил, [2,2,2]бициклооктанил, флуоренил, фенил, нафтил, инданил и тетрагидронафтил.
Как он используется в настоящем изобретении, термин "арил" включает группы, которые содержат от 1 до 3 отдельных или конденсированных колец и от 6 до около 18 кольцевых атомов, без гетероатомов в качестве кольцевых членов. Примеры арильных групп включают, но не ограничиваются этим, фенил и нафтил, включая 1-нафтил и 2-нафтил.
Как он используется в настоящем изобретении, термин "гетероциклическая группа" включает насыщенные, частично ненасыщенные или ненасыщенные (ароматические) группы, содержащие от 1 до 3 (возможно конденсированных) колец, с от 3 до около 8 членов на кольцо, при этом, по меньшей мере, одно кольцо содержит атом, выбранный из N, O или S. Гетероатомы азота и серы, необязательно, могут быть окислены. Термин "гетероциклоалкил" используется как относящийся к насыщенным гетероциклическим группам.
Гетероциклическое кольцо может быть присоединено к его боковой группе по любому гетероатому или углеродному атому, который обеспечивает стабильную структуру. Гетероциклические кольца, описанные в настоящем изобретении, могут быть замещены по атому углерода или азота, если получаемое соединение является стабильным. Азот в гетероцикле, необязательно, может быть кватернизированным.
Как он используется в настоящем изобретении, термин "гетероарил" включает любую стабильную 5-7-членную моноциклическую или 10-14-членную бициклическую гетероциклическую ароматическую кольцевую систему, которая включает атомы углерода и от 1 до 4 гетероатомов, независимо выбранных из группы, включающей N, O и S. В иллюстративных вариантах воплощения общее количество S и O атомов в ароматическом гетероцикле составляет не более чем 2, и типично не более чем 1.
Примеры гетероарила включают, но не ограничиваются этим, примеры, указанные в других разделах настоящей заявке, и, кроме того, включают акридинил, азоцинил, бензимидазолил, бензофуранил, бензотиофуранил, бензотиофенил, бензоксазолил, бензтиазолил, бензтриазолил, бензтетразолил, бензизоксазолил, бензизотиазолил, бензимидазолинил, карбазолил, NH-карбазолил, карболинил, хроманил, хроменил, циннолинил, декагидрохинолинил, 2H,6HA,5,2-дитиазинил, дигидрофуро[2,3-b]тетрагидрофуран, фуранил, фуразанил, имидазолидинил, имидазолинил, имидазолил, 1H-индазолил, индолинил, индолинил, индолизинил, индолил, 3H-индолил, изобензофуранил, изохроманил, изоиндазолил, изоиндолинил, изоиндолил, изохинолинил, изотиазолил, изоксазолил, морфолинил, нафтиридинил, октагидроизохинолинил, оксадиазолил, 1,2,3-оксадиазолил, 1,2,4-оксадиазолил; -1,2,5оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил, оксазолидинил, оксазолил, оксазолидинил, пиримидинил, фенантридинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, феноксатиинил, феноксазинил, фталазинил, пиперазинил, пиперидинил, птеридинил, пуринил, пиранил, пиразинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиразолил, пиридазинил, пиридооксазол, пиридоимидазол, пиридотиазол, пиридинил, пиридил, пиримидинил, пирролидинил, пирролинил, 2H-пирролил, пирролил, хиназолинил, хинолинил, 4H-хинолизинил, хиноксалинил, хинуклидинил, тетрагидрофуранил, тетрагидроизохинолинил, тетрагидрохинолинил, 6H-1,2,5-тиадиазинил, 1,2,3-тиадиазолил, 1,2,4-тиадиазолил, 1,2,5-тиадиазолил, l,3,4-тиадиазолил, тиантренил, тиазолил, тиенил, тиенотиазолил, тиенооксазолил, тиеноимидазолил, тиофенил, триазинил, 1,2,3-триазолил, 1,2,4-триазолил, 1,2,5-триазолил, 1,3,4-триазолил и ксантенил. Иллюстративные гетероарильные группы включают, но не ограничиваются этим, пиридинил, пиримидинил, фуранил, тиенил, пирролил, пиразолил, пирролидинил, морфолинил, пиперидинил, пиперазинил и имидазолил.
2
В некоторых вариантах воплощения, Z представляет собой тетразол или COQ. Когда Z представляет собой тетразол, тетразольное кольцо присоединено через атом углерода, как показано ниже.
t
В некоторых вариантах воплощения, Q представляет собой защитную группу. Как он используется в настоящем изобретении, термин "защитная группа" означает химический заместитель, который может быть селективно удален с использованием легко доступных реагентов, которые не оказывают неблагоприятного действия на восстановленную функциональную группу или другие функциональные группы в молекуле. Подходящие защитные группы можно найти, например, в Wutz et al. ("Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition," Wiley-Interscience, 2007). Защитные группы для защиты карбоксильной группы, описанные в Wutz et al. (стр. 533-643), используют в некоторых вариантах воплощения. В некоторых вариантах воплощения, защитную группу можно удалить путем обработки кислотой. Конкретные примеры защитных групп включают, но не ограничиваются этим, бензил, п-метоксибензил (PMB), третичный бутил (Bu), метоксиметил (MOM), метоксиэтоксиметил (MEM), метилтиометил (MTM), тетрагидропиранил (THP), тетрагидрофуранил (THF), бензилоксиметил (BOM), триметилсилил (TMS), триэтилсилил (TES), трет-бутилдиметилсилил (TBDMS) и трифенилметил (тритил, Tr).
8
8
8
3
3
2
2
3
2
3
2
3
2
2
2
2
В некоторых вариантах воплощения, R представляет собой алкил, арил или гетероарил, каждый из которых может быть замещен. В некоторых вариантах воплощения, R описывает боковую цепь природной или синтетической α-аминокислоты. Конкретные примеры R включают водород, метил (CH), изопропил (CH(CH)), 2,2-диметилэтил (CHCH(CH)), 2-метилпропил (CH(CH)CHCH), фенил, 4-гидроксифенил, гидроксиметил (CHOH), карбоксиметил (CHCOH), тиометил (CHSH), имидазолилметил, индолилметил и т.д..
2
2
Некоторые варианты воплощения включают соединения в соответствии с формулой I, где Z представляет собой COQ. В других вариантах воплощения, Q представляет собой водород. В некоторых специфических вариантах воплощения, Z представляет собой COQ и Q представляет собой водород.
Некоторые варианты воплощения включают соединения в соответствии с формулой I, где m имеет значение 1, 2, 3 или 4.
Другие варианты воплощения включают соединения в соответствии с формулой I, где m имеет значение 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; R представляет собой пиридиновое кольцо, выбранное из группы, включающей
2
2
3
3
3
2
2
2
2
2
2
P
2
P
2
P
1
6
1
6
2
2
3
3
3
2
+
2
2
2
2
3
3
8
8
8
2
3
+
2
2
2
2
3
где X представляет собой фтор, иод, радиоизотоп фтора, радиоизотоп иода, хлор, бром, радиоизотоп брома, радиоизотоп астата, NO, NH, N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R), B(OH), -NHNH, -NHN=CHR, -NHNH-CHR. В некоторых вариантах воплощения, n имеет значение 1. Каждый Q независимо выбран из водорода или защитной группы; Z представляет собой тетразол или COQ; Y представляет собой O, S, N(R'), C(O), NR'C(O), C(O)N(R'), OC(O), C(O)O, NR'C(O)NR, NR'C(S)NR', NR'S(O), S(CH), NR'(CH), O(CH), OC(O)CHRNHC(O), NHC(O)CHRNHC(O) или ковалентную связь; где p имеет значение 1, 2 или 3, R' представляет собой H или C-C алкил, и R представляет собой алкил, арил или гетероарил, каждый из которых может быть замещен; R представляет собой C-C алкил; и R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, хлором, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата; NO, NH, N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) или B(OH). В некоторых вариантах воплощения, R представляет собой арил, замещенный фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата.
Другие варианты воплощения включают соединения, имеющие структуру
где m является отличным от 0. R представляет собой пиридиновое кольцо, выбранное из группы, включающей
2
2,
3
3
3
2
2
2
1
6
2
2,
3
3
3
2
2
+
2
2
2
2
3
3
2
3
+
2
2
2
2
3
где X представляет собой фтор, иод, радиоизотоп фтора, радиоизотоп иода, хлор, бром, радиоизотоп брома, радиоизотоп астата, NO, NH N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R), B(OH), -NHNH, -NHN=CHR или -NHNH-CHR. R представляет собой C-C алкил; и R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, хлором, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата; NO, NH N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) или B(OH). В некоторых вариантах воплощения, n имеет значение 1. Другие специфические варианты воплощения включают соединения, где X представляет собой фтор, иод или радиоизотоп фтора, радиоизотоп иода, хлор, бром, радиоизотоп брома или радиоизотоп астата. В некоторых вариантах воплощения, R представляет собой арил, замещенный фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата. Специфические варианты воплощения включают соединения, имеющие структуру, представленную выше, где Z представляет собой COQ, Q представляет собой водород и m имеет значение 4.
Соединения в соответствии с этим вариантом воплощения можно получить, например, из п-метоксибензил (PMB) - защищенного предшественника Lys-C(O)-Glu в соответствии со Схемой 1, представленной ниже.
Схема 1
Другие варианты воплощения включают соединения, имеющие структуру
где m является отличным от 0. R представляет собой пиридиновое кольцо, выбранное из группы, включающей
2
2
3
3
3
2
2
2
1
6
2
2,
3
3
3
2
2
+
2
2
2
2
3
3
2
3
+
2
2
2
2
3
где X представляет собой фтор, иод, радиоизотоп фтора, радиоизотоп иода, хлор, бром, радиоизотоп брома, радиоизотоп астата, NO, NH, N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R), B(OH), -NHNH, -NHN=CHR, -NHNH-CHR. R представляет собой C-C алкил; и R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, хлором, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата; NO, NH N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) или B(OH). В некоторых вариантах воплощения, n имеет значение 1. Другие специфические варианты воплощения включают соединения, где X представляет собой фтор, иод или радиоизотоп фтора, радиоизотоп иода, хлор, бром, радиоизотоп брома или радиоизотоп астата. В некоторых вариантах воплощения, R представляет собой арил, замещенный фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата. Специфические варианты воплощения включают соединения, имеющие структуру, представленную выше, где Z представляет собой COQ, Q представляет собой водород, и m имеет значение 1, 2 или 3.
Другие варианты воплощения включают соединения в соответствии с формулой I, где R представляет собой структуру, показанную ниже
1
3
3
3
+
2
2
2
2
2
3
+
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
3
3
2
1
6
2
2,
3
3
3
2
где X выбран из группы, включающей -NHNH, -NHN=CHR, -NHNH-CHR. В таких вариантах воплощения, R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата; NO, NH, N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R), B(OH). R представляет собой C-C алкил; и R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, хлором, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата; NO, NH N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) или B(OH). В некоторых вариантах воплощения, R представляет собой арил, замещенный фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата. Специфические варианты воплощения включают соединения, где n имеет значение 1.
2
2
3
3
3
2
+
2
2
2
2
Соединения в соответствии с этим вариантом воплощения можно получить, например, из гидразин-замещенных фенильных предшественников, с последующей модификацией с использованием алкильного, алкенильного, алкинильного, арильного или гетероарильного реагента, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, хлором, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата NO, NH, N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) и B(OH), как показано на схеме 2 ниже.
Схема 2
2
2
2
2
2
4
3
2
4
18
a. сукцинимидил 4-[2-(трет-бутоксикарбонил)гидразинобензоат, триэтиламин, DMF, CHCl; b. TFA, CHCl; c. 4-фторбензальдегид, 50 мМ KHPO, CHCN; d. 4-[F]фторбензальдегид, 50 мМ KHPO.
Другие варианты воплощения включают соединения в соответствии с формулой I, где m имеет значение 4, Y представляет собой NR' и R представляет собой
1
6
2
2
2
2;
3
3
3
2
1
6
7
3
3
3
+
2
2
2
2
2
3
где G представляет собой O, NR' или ковалентную связь, R' представляет собой H или C-C алкил, и p имеет значение 1, 2, 3 или 4. R может быть выбран из NH, N=CHR и NH-CHR, где R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, бромом, радиоизотопом брома, радиоизотопом астата, NO, NH N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) или B(OH), где R представляет собой C-C алкил. В некоторых вариантах воплощения, R представляет собой арил, замещенный фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, хлором, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата. В некоторых вариантах воплощения, G представляет собой O или NR'.
2
2,
3
3
3
2
+
2
2
2
2
Соединения в соответствии с этим вариантом воплощения можно получить, например, путем ацилирования PMB- защищенного Lys-C(O)-Glu с использованием ацилирующего агента, содержащего свободный или защищенный амин, с последующим удаление защиты амина, если это необходимо, и модификацией с использованием алкильного, алкенильного, алкинильного, арильного или гетероарильного реагента, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, хлором, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата, NO, NH N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) или B(OH), как показано на Схеме 3, представленной ниже.
Схема 3
2
2
18
a. N-трет-бутилоксикарбонил-O-(карбоксиметил)гидроксиамин гидроксисукцинимидиловый эфир, триэтиламин, CHCl; b. TFA, анизол; c. п-фторбензальдегид, триэтиламин, метанол; d. п-[F]фторбензальдегид, триэтиламин, метанол.
18
123
124
125
126
131
75
76
77
80
80m
82
83
211
Другие варианты воплощения включают соединения в соответствии с любым из вариантов воплощения, обсуждаемых в настоящей заявке, которые включают радиоизотоп. Специфические иллюстративные радиоизотопы включают F, I, I, I, I, I, Br, Br, Br, Br, Br, Br, Br и At. Радиоизотоп-содержащие соединения в соответствии с любым вариантом воплощения настоящего изобретения можно получить с использованием достаточной радиоактивной метки, которую используют для визуализации. Иными словами, соединения можно получить с использованием концентраций радиоизотопа больше, чем его естественное содержание, когда конкретный радиоизотоп встречается в природе.
Конкретные примеры соединений в соответствии с описанными выше вариантами воплощения включают структуры, представленые ниже
Другие варианты воплощения включают фармацевтически приемлемые соли соединений, описанных в представленных выше вариантах воплощения.
125
123
18
124
+
2
2
2
2
2
2
3
3
3
2
2
2
3
2
Соединения в соответствии с настоящим изобретением, в частности, различные меченные радиоактивными изотопами соединения, можно использовать для диагностических целей, для визуализации или терапевтических целей. Например, некоторые соединения, например, соединения, меченные I и I, разработаны для SPECT визуализации, тогда как некоторые соединения, например, соединения, меченные F и I, разработаны для PET визуализации, и некоторые радиоизотопно-меченные соединения можно использовать для терапевтических целей. В основном, пригодность конкретного радиоизотопа для конкретного назначения хорошо известна из уровня техники. Другие иллюстративные варианты воплощения представляют собой соединения, используемые в качестве предшественников для меченных радиоактивными изотопами соединений, в которых заместитель может быть непосредственно заменен радиоизотопом на одной или нескольких стадиях. Если не указано иное, термины "преобразованный", “модифицированный", "замененный" или "прореагировавший" предназначены для охвата одной или нескольких стадий. Примеры заместителей, которые могут быть обменены на радиоизотопы, включают галогены, NO, N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) и B(OH). Другие соединения являются предшественниками, которые можно подвергнуть химическому взаимодействию с радиоизотопно-меченным реагентом, с получением стабильного радиоизотопно-меченного соединения. Соединения, содержащие заместители, такие как галоген, -NH, -NHNH, Sn(R) и B(OH), например, могут быть преобразованы в радиоизотопно-меченные соединения при помощи химической реакции, известной специалистам в данной области.
Соединения по настоящему изобретению можно получить способами, известными из уровня техники.
Например, асимметрические мочевины, используемые в качестве предшественников, можно получить в соответствии с общей схемой, представленной ниже, где R представляет собой боковую цепь природной или синтетической аминокислоты, которая содержит группу, которую можно далее модифицировать. Конкретные примеры аминокислот включают лизин, цистеин, гомоцистеин, серин, треонин, тирозин, фенилаланин и замещенный фенилаланин. Замещенный фенилаланин имеет структуру фенилаланина, где фенильная боковая цепь замещена, например, нитро, амино или галогеном.
Защищенные мочевинные предшественники Cys-C(O)-Glu и Lys-C(O)-Glu (показанные ниже), где Q представляет собой п-метоксибензил (PMB), используют для синтеза иллюстративных соединений. Получение предшественника Cys-C(O)-Glu описано, например, Kozikowski et al. (29), тогда как получение Lys-C(O)-Glu описано, например, Banerjee et al. (19).
Соединения по настоящему изобретению можно получить, например, путем взаимодействия защищенного мочевинного предшественника с реагентом, замещенным радиоизотопным или другим заместителем, который может быть преобразован или модифицирован в радиоизотоп-содержащее соединение. Защищенный мочевинный предшественник, такой как описанные выше, можно подвергнуть взаимодействию, например, с активированным бензоатом или пиридинкарбоксилатом. Синтез таких галогенбензоатных и пиридинкарбоксилатных радионуклид-содержащих предшественников описан в литературе (20)(21)(22)(23)(25)(37)(38).
18
Пиридинкарбоксилатные F предшественники, такие как н-гидроксисукцинимид-активированные пиридинкарбоксилаты, можно получить, например, в соответствии со схемой, представленной ниже.
18
Другие F пиридиновые предшественники можно получить способами, описанными Olberg et al. (J. Labelled Compd. Radiopharm, vol. 52: Supplement 1, p. S 160, 2009), которые представлены ниже.
18
F пиридинкарбоксилатный предшественник можно использовать для получения соединений в соответствии с настоящим изобретением, например, в соответствии со Схемой, представленной ниже.
18
Аналогичным образом, может быть получен предшественник, который затем можно преобразовать в F-замещенное соединение. Например, можно получить соединения в соответствии со схемой, представленной ниже.
Другие соединения можно получить из подходящего защищенного предшественника, такого как соединения обсуждаемые выше, путем взаимодействия с бромметилпиридиновыми соединениями, содержащими радиоизотопные заместители или заместители, которые могут быть преобразованы в радиоизотопы или модифицированы при помощи радиоизотоп-содержащих соединений. Например, схема, представленная ниже, показывает получение иллюстративного соединения из PMB-защищенного предшественника Cys-C(O)-Glu.
18
+
2
3
3
Бромметилпиридиновые соединения, такие как F-, NO- или N(CH) -замещенный бромметилпиридин, подходящие для получения соединений в соответствии с настоящим изобретением, можно получить, например, в соответствии со Схемой, представленной ниже.
2
2
2,
3
3
3
2
+
2
2
2
2
Другие соединения можно получить, например, из гидразин(-NHNH)-замещенных пиридиновых предшественников с последующей модификацией с использованием алкильного, алкенильного, алкинильного, арильного или гетероарильного реагента, каждый из которых замещен фтором, иодом, радиоизотопом фтора, радиоизотопом иода, хлором, бромом, радиоизотопом брома или радиоизотопом астата, NO, NH N(R), Sn(R), Si(R), Hg(R) и B(OH). Например, альдегидный реагент можно подвергнуть взаимодействию с гидразидным заместителем, как показано на схеме 4, представленной ниже. Полученный имин также может быть восстановлен, например, при помощи цианоборогидрида натрия или другого восстановителя, с получением восстановленного соединения.
Схема 4
2
2
2
2
2
4
3
2
4
18
a. сукцинимидил 6-(N'-трет-бутоксикарбонил-гидразино)-никотинат, триэтиламин, CHCl; b. TFA, CHCl; c. 4-фторбензальдегид, 50 мМ KHPO, CHCN; d. 4- [F]фторбензальдегид, 50 мМ KHPO.
Другие варианты воплощения включают соединения, имеющие формулу
5
4
где R представляет собой водород или п-метоксибензил; R выбран из группы, включающей водород,
3
3
2
где A представляет собой фтор, иод, радиоизотоп фтора, радиоизотоп иода, бромом, радиоизотоп брома, радиоизотоп астата, Sn(R), Si(R) или HgCl. Следующие варианты воплощения включают соединения в соответствии со структурой, представленной выше, которые включают радиоизотоп. Один конкретный вариант воплощения включает соединение, имеющее формулу, представленную ниже, также известное как PMB-защищенный Lys-C(O)-Glu.
где PMB представляет собой п-метоксибензил. Другой конкретный вариант воплощения включает соединение 2-[3-(5-амино-1-карбокси-пентил)-уреидо]-пентандиовой кислоты, также известное как Lys-C(O)-Glu. Другие иллюстративные варианты воплощения включают соединения, представленные ниже.
Иллюстративные радиоизотоп-содержащие соединения включают соединения, представленные ниже.
Другие варианты воплощения настоящего изобретения включают способы визуализации одной или нескольких клеток, органов или тканей, включающие воздействие на клетки или введение субъекту эффективного количества соединения с изотопной меткой, подходящей для визуализации. В некоторых вариантах воплощения, один или несколько органов или тканей включают ткань предстательной железы, ткань почки, ткань головного мозга, сосудистую ткань или опухолевую ткань.
В другом варианте воплощения, способ визуализации является подходящим для исследований методом визуализации ингибиторов PSMA, например, путем исследования конкурентного связывания не меченных радиоактивными изотопами ингибиторов. В следующем варианте воплощения способ визуализации является подходящим для визуализаци рака, опухоли или новообразования. В следующем варианте воплощения, рак выбран из рака глаза или глазного рака, ректального рака, рака толстой кишки, цервикального рака, рака предстательной железы, рака молочной железы и рака мочевого пузыря, рака полости рта, доброкачественных и злокачественных опухолей, рака желудка, рака печени, рака поджелудочной железы, рака легкого, рака матки, рака яичника, рака предстательной железы, тестикулярного рака, рака почек, рака головного мозга (например, глиом), рака горла, меланомы кожи, острого лимфоцитарного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, саркомы Эвинга, саркомы Капоши, базально-клеточной карциномы и сквамозно-клеточной карциномы, мелкоклеточного рака легкого, хориокарциномы, рабдомиосаркомы, ангиосаркомы, гемангиоэндотелиомы, опухоли Вильмса, нейробластомы, рака рта/глотки, рака пищевода, рака гортани, лимфомы, нейрофиброматоза, туберозного склероза, гемангиома и лимфангиогенеза.
Способы визуализации по настоящему изобретению являются подходящими для томографии любого физиологического процесса или характерного признака с вовлечением PSMA. Типично, способы визуализации являются подходящими для идентификации участков тканей или мишеней, которые экспрессируют высокие концентрации PSMA. Типичные применения включают визуализацию глутаматергической нейротрансмиссии, пресинаптической глутаматергической нейротрансмиссии, злокачественных опухолей или рака, которые экспрессируют PSMA, рака предстательной железы (включая метастатический рак предстательной железы) и ангиогенеза. По существу, все солидные опухоли экспрессируют PSMA в неоваскулатуре. Поэтому способы по настоящему изобретению можно использовать для визуализации практически всех солидных опухолей, включая опухоль легкого, почечно-клеточную, глиобластому, поджелудочной железы, мочевого пузыря, саркому, меланому, молочной железы, толстой кишки, зародышевых клеток, феохромоцитому, пищевода и желудка. Также, в соответствии с настоящим изобретением можно визуализировать некоторые доброкачественные поражения и ткани, включая эндометрии, шванному и хроническую пептическую язву пищевода (синдром Баррета).
Способы визуализации ангиогенеза, обеспечиваемые настоящим изобретением, являются подходящими для использования в визуализации различных заболеваний и расстройств, при которых имеет место ангиогенез. Иллюстративные неограничивающие примеры включают опухоли, коллагеновое сосудистое заболевание, рак, удар, порок развития сосудов, ретинопатия. Способы визуализации ангиогенеза, обеспечиваемые настоящим изобретением, также являются подходящими для использования в диагностике и наблюдении развития нормальной ткани.
PSMA часто экспрессируется в эндотелиальных клетках капиллярных сосудов в околоопухолевой и внутриопухолевой областях различных злокачественных опухолей, таким образом, соединения по настоящему изобретению и способы визуализации с использованием таких соединений являются подходящими для визуализаци таких злокачественных опухолей.
В некоторых вариантах воплощения, меченное радиоактивным изотопом соединение является стабильным in vivo.
В некоторых вариантах воплощения, меченное радиоактивным изотопом соединение определяют при помощи позитрон-эмиссионной томографии (PET) или однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT).
В одном варианте воплощения, изобретение обеспечивает способ, где субъектом является человек, крыса, мышь, кошка, собака, лошадь, овца, корова, обезьяна, птица или амфибия. В другом варианте воплощения, клетка находится в условиях in vivo или in vitro. Типичными субъектами, которым можно вводить соединения по настоящему изобретению, являются млекопитающие, в частности, приматы, особенно человек. Для ветеринарных целей, будут подходящими множество различных субъектов, например, домашний скот, такой как быки, овцы, козы, коровы, свиньи и подобные; домашняя птица, такая как куры, утки, гуси, индюки и подобные; и домашние животные, в частности, такие как собаки и кошки. Для диагностических или исследовательских целей, будут подходящими множество различных млекопитающих субъектов, включая грызунов (например, мыши, крысы, хомяки), кролики, обезьяны и свиньи, такие как инбредные свиньи и подобные. Кроме того, для in vitro применений, таких как in vitro диагностические и исследовательские применения, подходящими для использования будут жидкости организма и образцы клеток указанных выше субъектов, например, млекопитающих, в частности, приматов, таких как человек, кровь, моча или образцы тканей, или кровь моча или образцы тканей животных, указанных для применения в ветеринарии.
В некоторых способах по настоящему изобретению соединения по настоящему изобретению быстро экскретируются из тканей организма для предотвращения длительного воздействия радиации в результате введения пациенту меченного радиоактивным изотопом соединения. Типично, соединения по настоящему изобретению выводятся из организма в течение менее чем около 24 часов. Более типично, соединения по настоящему изобретению выводятся из организма в течение менее чем около 16 часов, 12 часов, 8 часов, 6 часов, 4 часа, 2 часа, 90 минут или 60 минут. Иллюстративные соединения выводятся в течение времени от около 60 минут до около 120 минут.
В некоторых вариантах воплощения, соединения сильно связываются с PSMA белком, например, путем включения структурных особенностей, которые находятся во вспомогательном сайте связывания. Например, в соединении 3, 4-иодбензоильная группа находится в гидрофобном кармане, добавочном к сайту связывания S1 (39).
В некоторых вариантах воплощения, соединения по настоящему изобретению являются стабильными in vivo, таким образом, все, например, более чем около 50%, 60%, 70%, 80% или 90% введенного путем инъекции соединения не метаболизируется организмом до экскреции. Типичными субъектами, которым можно вводить соединения по настоящему изобретению, являются млекопитающие, в частности, приматы, особенно человек. Для ветеринарных целей, будут подходящими множество различных субъектов, например, домашний скот, такой как быки, овцы, козы, коровы, свиньи и подобные; домашняя птица, такая как куры, утки, гуси, индюки и подобные; и домашние животные, в частности, такие как собаки и кошки. Для диагностических или исследовательских целей, будут подходящими множество различных млекопитающих субъектов, включая грызунов (например, мыши, крысы, хомяки), кролики, обезьяны и свиньи, такие как инбредные свиньи и подобные. Кроме того, для in vitro применений, таких как in vitro диагностические и исследовательские применения, подходящими для использования будут жидкости организма и образцы клеток указанных выше субъектов, например, млекопитающих, в частности, приматов, таких как человек, кровь, моча или образцы тканей, или кровь моча или образцы тканей животных, указанных для применения в ветеринарии.
131
211
Другие варианты воплощения настоящего изобретения обеспечивают способы лечения опухолей, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения в соответствии с настоящим изобретением, включающего терапевтически эффективный радиоизотоп. В некоторых вариантах воплощения, опухолевые клетки могут экспрессировать PSMA, такие как клетки опухоли предстательной железы или метастазированные клетки опухоли предстательной железы. В других вариантах воплощения, опухоль можно лечить путем прицельного действия на прилегающие или расположенные рядом клетки, которые экспрессируют PSMA. Например, можно прицельно воздействовать на сосудистые клетки, в которых возникает ангиогенез, связанный с опухолью. По существу, все солидные опухоли экспрессируют PSMA в неоваскулатуре. Поэтому способы по настоящему изобретению можно использовать для лечения практически всех солидных опухолей, включая опухоль легкого, почечно-клеточную, глиобластому, поджелудочной железы, мочевого пузыря, саркому, меланому, молочной железы, толстой кишки, зародышевых клеток, феохромоцитому, пищевода и желудка. Также, в соответствии с настоящим изобретением можно лечить некоторые доброкачественные поражения и ткани, включая эндометрий, шванному и хронической пептической язвы пищевода (синдром Баррета). Примеры терапевтически эффективных радиоизотопов включают I и At.
Другие варианты воплощения обеспечивают наборы, включающие соединение в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах воплощения, набор обеспечивает упакованные фармацевтические композиции, включающие фармацевтически приемлемый носитель и соединение по настоящему изобретению. В некоторых вариантах воплощения упакованная фармацевтическая композиция включает реакционные предшественники, необходимые для образования соединения по настоящему изобретению при их сочетании с радиоактивно-меченным предшественником. Другие упакованные фармацевтические композиции, обеспечиваемые настоящим изобретением, дополнительно включают указания, включающие, по меньшей мере, одно из следующих: инструкции по получению соединений в соответствии с настоящим изобретением из поставляемых предшественников, инструкции по применению композиции для визуализации клеток или тканей, экспрессирующих PSMA, или инструкции по применению композиции для визуализации глутаматергической нейротрансмиссии у пациента, страдающего связанным со стрессом расстройством, или инструкции по применению композиции для визуализации рака предстательной железы.
В некоторых вариантах воплощения, набор в соответствии с настоящим изобретением содержит от около 1 до около 30 мКи радионуклид-меченного агента визуализации, описанного выше, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Агент визуализации и носитель могут предоставляться в растворе или в лиофилизированной форме. Когда агент визуализации и носитель присутствуют в наборе в лиофилизированной форме, набор, необязательно, может содержать стерильную и физиологически приемлемую среду для реструктурирования, такую как вода, физиологический раствор, забуференный солевой раствор и подобные. Набор может обеспечивать соединение по настоящему изобретению в растворе или в лиофилизированной форме, и эти компоненты набора по настоящему изобретению, необязательно, могут содержать стабилизаторы, такие как NaCl, силикат, фосфатные буферы, аскорбиновую кислоту, гентизиновую кислоту и подобные. Дополнительная стабилизация компонентов набора может быть обеспечена в этом вариант воплощения, например, путем обеспечения восстановителя в стойкой к окислению форме. Определение и оптимизацию таких стабилизаторов и способы стабилизации вполне могут осуществить специалисты в данной области.
125
131
123
124
18
76
75
211
В некоторых вариантах воплощения, набор обеспечивает не меченный радиоактивным изотопом предшественник, который подлежит сочетанию с радиоактивно-меченным реагентом на месте. Примеры радиоактивных реагентов включают Na[I], Na[I], Na[I], Na[I], K[F], Na[Br], Na[Br], Na[At]. Другие радиоактивно-меченные реагенты включают активированные радиоактивно-меченные бензоильные соединения, радиоактивно-меченные пиридинкарбоксилаты, радиоактивно-меченные бромметилпиридиновые соединения и радиоактивно-меченные альдегиды, обсуждаемые выше.
Специалисты в данной области смогут использовать агенты визуализации по настоящему изобретению в соответствии со способами по настоящему изобретению. Возможна визуализация благодаря разнице в пространственном распределении агентов визуализации, которые аккумулируются на участке при контактировании с PSMA. Пространственное распределение можно измерить с использованием любых средств, подходящих для конкретной метки, например, с использованием гамма-камеры, a PET аппарата, SPECT аппарата и подобных устройств. Степень аккумуляции агента визуализации можно количественно определить с использованием известных способов количественного определения радиоактивных эмиссий. Особенно полезный подход включает использование более чем одного агента визуализации для осуществления одновременных исследований.
Как правило, субъекту вводят эффективное для детекции количество агента визуализации по настоящему изобретению. В соответствии с настоящим изобретением, "эффективное для детекции количество" агента визуализации по настоящему изобретению определяется как количество, достаточное для приемлемой впзуализации с использованием оборудования, которое доступно для клинического использования. Эффективное для детекции количество агента визуализации по настоящему изобретению можно вводить с использованием более чем одной инъекции. Эффективное для детекции количество агента визуализации по настоящему изобретению может варьировать в зависимости от таких факторов, как степень восприимчивости субъекта, возраст, пол и масса тела субъекта, идиосинкратические ответы субъекта и дозиметрия. Эффективные для детекции количества агента визуализации по настоящему изобретению также могут варьировать в зависимости от оборудования и факторов, связанных с пленкой. Оптимизацию таких факторов вполне могут осуществить специалисты в данной области. Количество агента визуализации, используемого для диагностических целей, и длительность исследование методом визуализации зависят от радионуклида, используемого для мечения агента, массы тела пациента, природы и тяжести состояния, подлежащего лечению, природы терапевтических лечений, которые принимал пациент, и от идиосинкратических ответов пациента. В конечном счете, лечащий врач определяет количество агента визуализации для введения каждому отдельному пациенту и длительность исследования методом визуализации.
"Фармацевтически приемлемый носитель" относится к биосовместимому раствору, который в достаточной степени имеет такие характеристики, как стерильность, p[Eta], изотоничность, стабильность и подобные, и может включать любой и все из растворителей, разбавителей (включая старильный физиологический раствор, раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор декстрозы для инъекций, раствор декстрозы и хлорида натрия для инъекций, содержащий лактат раствор Рингера для инъекций и другие водные буферные растворы), дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические вещества и подобные. Фармацевтически приемлемый носитель также может содержать стабилизаторы, консерванты, антиоксиданты или другие добавки, которые хорошо известны специалистам в данной области, или другой наполнитель, известный из уровня техники.
2
n
Как он используется в настоящем изобретении, термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к производным раскрываемых соединений, где исходное соединение модифицируют так, чтобы получить нетоксичные кислотные или основные соли такого соединения. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но не ограничиваются этим, соли минеральных или органических кислот, образованные из основных остатков, таких как амины; щелочные или органические соли кислотных остатков, такие как карбоновые кислоты; и подобные. Фармацевтически приемлемые соли включают традиционные нетоксичные соли или четвертичные аммониевые соли исходного соединения, образованные, например, из нетоксичных неорганических или органических кислот. Например, традиционные нетоксичные соли кислот включают соли, образованные из неорганических кислот, таких как хлористоводородная, бромистоводородная, серная, сульфаминовая, фосфорная, азотная и подобные; и соли, полученные из органических кислот, например, уксусной, пропионовой, янтарной, гликолевой, стеариновой, молочной, яблочной, винной, лимонной, аскорбиновой, памовой, малеиновой, оксималеиновой, фенилуксусной, глутаминовой, бензойной, салициловой, метансульфоновой, сульфаниловой, 2-ацетоксибензойной, фумаровой, толуолсульфоновой, метансульфоновой, этандисульфоновой, щавелевой, изетионовой, HOOC-(CH)-COOH, где n имеет значение 0-4, и подобных. Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению можно синтезировать из исходного соединения, которое содержит основную или кислотную группу, традиционными химическими способами. Как правило, такие соли можно получить путем взаимодействия формы свободной кислоты этих соединений со стехиометрическим количеством подходящего основания (такого как гидроксид, карбонат, бикарбонат Na, Ca, Mg или K или подобные) или путем взаимодействия формы свободного основания этих соединений со стехиометрическим количеством подходящей кислоты. Такие реакции типично осуществляют в воде или в органическом растворителе или в смеси двух вышеуказанных растворителей. Как правило, используют неводные среды, такие как простой эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил, где это практически возможно. Перечень дополнительных подходящих солей можно найти, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985).
Содержание всех указанных ссылочных документов (включая литературные источники, изданные патенты, опубликованные патентные заявки), на которые ссылаются в настоящей заявке, включено в настоящую заявку посредством ссылки. Настоящее изобретение, а также путь и способ его осуществления и использования описаны с такой полнотой, ясностью, точностью и конкретностью, что позволяет любому специалисту в области, к которой оно относится, осуществить и использовать его.
Должно быть понятно, что выше описаны иллюстративные варианты воплощения настоящего изобретения, и что возможно осуществление их модификаций без отступления от сути или объема настоящего изобретения, раскрытых в прилагаемой формуле изобретения.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие изобретение. При практическом осуществлении настоящего изобретения используют, если не указано иное, традиционные технические приемы, которые известны из уровня техники. Такие технические приемы в полном объеме описаны в литературе.
Синтез
1
Общие процедуры. Все реагенты и растворители закупали либо у Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), либо у Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Тозилатную соль PMB-защищенного LyS-C(O)-Glu (соединение 1) получали в соответствии с опубликованной процедурой (19). H ЯМР спектры получали с использованием спектрометра Varian Mercury 400 мГц или Bruker Avance 400 мГц. ESI масс-спектры получали с использованием системы API 150EX™ или Bruker Esquire 3000 plus. Масс-спектры высокого разрешения (HRMS) получали с использованием масс-спектрометра JEOL JMS-AX505HA в лаборатории масс-спектрометрии Университета Notre Dame. ВЭЖХ очистку ссылочных соединений осуществляли с использованием системы Waters 625 LC с Waters 490E мультиволновым УФ/Vis детектором (Milford, MA).
125
18
18
2
18
[I]NaI закупали у MP Biomedicals (Costa Mesa, CA). [F]фторид получали путем 18 MeV протонной бомбардировки находящейся под высоким давлением [O]HO мишени с использованием биомедицинского циклотрона General Electric PETtrace (Milwaukee, WI). Картриджи для твердофазной экстракции (C plus, Sep-Pak) закупали у Waters Associates. Радиоактивность измеряли в дозокалибраторе Capintec CRC-IOR (Ramsey, NJ). Удельную радиоактивность рассчитывали как радиоактивность, проявляющуюся при времени удерживания продукта в процессе очистки методом полупрепаративной ВЭЖХ, деленную на массу, соответствующую площади под кривой УФ абсорбции.
ПРИМЕР 1
Бис-(4-метокси-бензил)овый эфир 2-{3-[5-(4-иод-бензоиламино)-1-(4-метокси-бензилоксикарбонил)-пентил]-уреидо}-пентандиовой кислоты (2).
2
2
3
43
48
3
11
1
+
К раствору соединения 1 (0,126 г, 0,148 ммоль) в CHCl (4 мл) добавляли триэтиламин (0,1 мл, 0,712 ммоль), с последующим добавлением N-гидроксисукцинимидил-4-иодбензоата (24) (0,073 г, 0,212 ммоль). После перемешивания в течение 2 часов при комнатной температуре растворитель выпаривали при помощи роторного испарителя. Неочищенное вещество очищали на колонке с силикагелем с использованием метанола/метиленхлорида (5:95) с получением 0,127 г (94%) соединения 2. H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,69 (д, J=8,8 Гц, 2H), 7,49 (д, J=8,8 Гц, 2H), 7,17-7,26 (м, 6H), 6,77-6,86 (м, 7H), 5,37-5,46 (м, 2H), 4,93-5,09 (м, 6H), 4,32-4,40 (м, 2H), 3,76-3,77 (м, 9H), 3,30-3,33 (м, 2H), 2,30-2,36 (м, 2H), 2,07-2,12 (м, 1H), 1,84-1,92 (м, 1H), 1,70-1,79 (м, 1H), 1,49-1,57 (м, 3H), 1,25-1,33 (м, 2H). ESI-Mass рассчитано для CHINONa [M+Na] 932,2, найдено 932,7.
ПРИМЕР 2
2-{3-[1-Карбокси-5-(4-иод-бензоиламино)-пентил]-уреидо}-пентандиовая кислота (3).
2
3
2
3
19
24
3
8
19
25
3
8
1
+
+
Раствор 3% анизола в TFA (15 мл) добавляли к соединению 2 (0,117 г, 0,129 ммоль) при 0°C. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, затем концентрировали при помощи роторного испарителя. Неочищенное вещество очищали при помощи ВЭЖХ (Econosil C18 10 мкм, 250×10 мм, HO/CHCN/TFA (70/30/0,1), 4 мл/мин, соединение 3 элюировало на 11 минуте) с получением 0,040 г (57%) соединения 3. H ЯМР (400 МГц, DO:CDCN=1:1 (об/об)) δ 7,79 (д, J=8,0 Гц, 2H), 7,46 (д, J=8,0 Гц, 2H), 4,08-4,16 (м, 2H), 3,26 (м, 2H), 2,35 (м, 2H), 2,00-2,03 (м, 1H), 1,72-1,84 (м, 2H), 1,52-1,62 (м, 3H), 1,34-1,36 (м, 2H). ESI-Mass рассчитано для CHINONa [M+Na] 572,1, найдено 572,0, FAB-HRMS рассчитано для CHINO [M+H] 550,0686, найдено 550,0648.
ПРИМЕР 3
Бис-(4-метокси-бензил)овый эфир 2-{3-[1-(4-метокси-бензилоксикарбонил)-5-(4-трибутилстаннанил-бензоиламино)-пентил]-уреидо}-пентандиовой кислоты (4).
2
2
3
55
75
3
11
1
+
К раствору соединения 1 (0,120 г, 0,148 ммоль) в CHCl (6 мл) добавляли триэтиламин (0,1 мл, 0,712 ммоль) с последующим добавлением N-гидроксисукцинимидил-4-трибутилстаннилбензоата (24) (0,075 г, 0,147 ммоль). После перемешивания в течение 2 часов при комнатной температуре реакционную смесь конденсировали при помощи роторного испарителя. Неочищенное вещество очищали на колонке с силикагелем с использованием метанола/метиленхлорида (5:95) с получением 0,130 г (86%) соединения 4. H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,68 (д, J=8,4 Гц, 2H), 7,49 (д, J=7,6 Гц, 2H), 7,18-7,24 (м, 6H), 6,80-6,85 (м, 6H), 6,47 (м, 1H), 5,44-5,47 (м, 2H), 4,95-5,09 (м, 6H), 4,41-4,45 (м, 2H), 3,76-3,77 (м, 9H), 3,32-3,38 (м, 2H), 2,35-2,37 (м, 2H), 2,08-2,16 (м, 1H), 1,90-1,94 (м, 1H), 1,70-1,79 (м, 1H), 1,45-1,64 (м, 9H), 1,24-1,30 (м, 8H), 1,01-1,06 (м, 6H), 0,85-0,87 (м, 9H). ESI-Mass рассчитано для CHNOSnNa [M+Na] 1096,4, найдено 1096,7.
ПРИМЕР 4
Бис-(4-метокси-бензил)овый эфир 2-{3-[5-(4-фтор-бензоиламино)-1-(4-метокси-бензилоксикарбонил)-пентил]-уреидо}-пентандиовой кислоты (5).
2
2
3
43
48
3
11
1
+
К раствору соединения 1 (0,120 г, 0,164 ммоль) в CHCl (4 мл) добавляли триэтиламин (0,1 мл, 0,712 ммоль) с последующим добавлением N-гидроксисукцинимидил-4-фторбензоата (22) (0,043 г, 0,181 ммоль). После перемешивания в течение 2 часов при комнатной температуре растворитель выпаривали при помощи роторного испарителя. Неочищенное вещество очищали на колонке с силикагелем с использованием метанола/метиленхлорида (5:95) с получением 0,120 г (91%) соединения 5. H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,78 (м, 2H), 7,16-7,24 (м, 6H), 7,01 (м, 2H), 6,80-6,85 (м, 7H), 5,51-5,64 (м, 2H), 4,93-5,09 (м, 6H), 4,34-4,40 (м, 2H), 3,75-3,77 (м, 9H), 3,28-3,34 (м, 2H), 2,26-2,38 (м, 2H), 2,04-2,15 (м, 1H), 1,82-1,91 (м, 1H), 1,68-1,74 (м, 1H), 1,44-1,57 (м, 3H), 1,25-1,33 (м, 2H). ESI-Mass рассчитано для CHFNONa [M+Na] 824,3, найдено 824,7.
ПРИМЕР 5
2-{3-[1-Карбокси-5-(4-фтор-бензоиламино)-пентил]-уреидо}-пентандиовая кислота (6).
2
3
2
19
24
3
8
19
25
3
8
1
+
+
Раствор 3% анизола в TFA (15 мл) добавляли к соединению 5 (0,081 г, 0,1 ммоль) при 0°C. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут, затем концентрировали при помощи роторного испарителя. Неочищенное вещество очищали при помощи ВЭЖХ (Econosil C18 10 мкм, 250×10 мм, HO/CHCN/TFA (75/25/0,1), 4 мл/мин, очищенное соединение 6 элюировало примерно на 9 минуте) с получением 0,035 г (79%) соединения 6. H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,66-7,69 (м, 2H), 7,11-7,16 (м, 2H), 4,12-4,19 (м, 2H), 3,28-3,31 (м, 2H), 2,39-2,43 (м, 2H), 2,07-2,09 (м, 1H), 1,79-1,90 (м, 2H), 1,55-1,69 (м, 3H), 1,39-1,40 (м, 2H). ESI-Mass рассчитано для CHFNONa [M+Na] 464,1, найдено 464,4. FAB-HRMS рассчитано для CHFNO [M+H] 442,1626, найдено 442,1646.
ПРИМЕР 6
Бис-(4-метокси-бензил)овый эфир 2-(3-{1-(4-метокси-бензилоксикарбонил)-5-[(5-трибутилстаннанил-пиридин-3- карбонил)-амино]-пентил}-уреидо)-пентандиовой кислоты (7).
2
2
3
54
75
4
11
1
+
К раствору соединения 1 (0,120 г, 0,148 ммоль) в CHCl (2 мл) добавляли триэтиламин (0,1 мл, 0,712 ммоль) с последующим добавлением N-гидроксисукцинимидил-5-(три-н-бутилстаннил)-3- пиридинкарбоксилата (25) (0,075 г, 0,147 ммоль). После перемешивания в течение 30 минут при комнатной температуре неочищенное вещество очищали на колонке с силикагелем с использованием метанола/метиленхлорида (5:95) с получением 0,115 г (76%) соединения 7.H ЯМР (400 МГц, CDCI) δ 8,85 (с, 1H), 8,65 (с, 1H), 8,19 (с, 1H), 7,19-7,24 (м, 6H), 6,81-6,85 (м, 6H), 6,65 (м, 1H), 5,32-5,35 (м, 1H), 5,22-5,25 (м, 1H), 4,96-5,10 (м, 6H), 4,40-4,47 (м, 2H), 3,70-3,77 (м, 9H), 3,34 (м, 2H), 2,35-2,39 (м, 2H), 2,10-2,15 (м, 1H), 1,90-1,94 (м, 1H), 1,72-1,79 (м, 1H), 1,46-1,59 (м, 9H), 1,27-1,36 (м, 8H), 1,02-1,25 (м, 6H), 0,84-0,87 (м, 9H). ESI-Mass рассчитано для CHINOSn [M+H] 1075,4, найдено 1075,5.
ПРИМЕР 7
2-(3-{1-карбокси-5-[(5-иод-пиридин-3-карбонил)-амино]-пентил}-уреидо)-пентандиовая кислота (8).
2
2
2
3
2
18
24
4
8
18
24
4
8
1
+
+
К раствору соединения 7 (0,025 г, 0,023 ммоль) в 2 мл метанола добавляли 0,020 мл уксусной кислоты и иодид натрия (0,017 г, 0,113 ммоль), с последующим добавлением N-хлорсукцинимида (0,025 г, 0,187 ммоль). По прошествии 20 минут при комнатной температуре растворитель удаляли под потоком азота. Затем к остатку добавляли раствор TFA в CHCl (1:1, 2 мл). По прошествии 1 часа при комнатной температуре соединение 8 (0,008 г, 62%) выделяли при помощи ВЭЖХ (Econosphere C18 10 мкм, 250×10 мм, HO/CHCN/TFA (85/15/0,1), 4 мл/мин, пик продукта элюировал на 10 минуте).H ЯМР (400 МГц, DO) δ 9,00-9,15 (м, 3H), 4,18-4,24 (м, 2H), 3,40-3,41 (м, 2H), 2,45-2,49 (м, 2H), 2,12-2,13 (м, 1H), 1,85-1,97 (м, 2H), 1,64-1,73 (м, 3H), 1,44 (м, 2H). ESI-Mass рассчитано для CHINO [M+H] 551,1, найдено 551,0. FAB-HRMS рассчитано для CHINO [M+H] 551,0639, найдено 551,0607.
ПРИМЕР 8
125
125
2-{3-[1-карбокси-5-(4-[I]иод-бензоиламино)-пентил]-уреидо}-пентандиовая кислота ([I]3).
125
125
125
125
2
2
3
[I]3 получали через иододестаннилирование соответствующего три-н-бутилстаннил-предшественника 4 с последующим удалением защиты. К раствору соединения 4 (1 мг, 0,932 мкмоль) в 0,1 мл метанола добавляли 0,001 мл уксусной кислоты и [I]NaI, с последующим добавлением N-хлорсукцинимида (0,25 мг, 0,187 мкмоль) в 0,025 мл метанола. После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 минут растворитель удаляли под потоком N. Затем к остатку добавляли раствор 3% анизола в TFA (0,1 мл). По прошествии 5 минут при комнатной температуре, [I]3 выделяли при помощи ВЭЖХ (Econosil C18 10 мкм, 250×4,6 мм, HO/CHCN/TFA (72/28/0,1), 1 мл/мин). Очистку [I]3 методом обращено-фазовой радио-ВЭЖХ осуществляли с использованием насоса Waters 510, УФ/Vis детектора с вариабельной длиной волны Waters 490E при 254 нм и детектора радиоактивности Bioscan Flow Count PMT (Washington, DC). Выходы этой реакции составили 65-80% (три отдельных определения). Удельная радиоактивность всегла была > 700 Ки/ммоль (25,9 GBq/мкмоль).
ПРИМЕР 9
18
18
N-Гидроксисукцинимидил-4-[F]фторбензоат [F]SFB.
18
18
2
3
N-гидроксисукцинимидил-4-[F]иодбензоат ([F]SFB) получали с использованием описанной в литературе процедуры (23) и очищали при помощи ВЭЖХ (Econosphere C18 10 мкм, 250×10 мм, HO/CHCN/TFA (75/25/0,1), 5 мл/мин, пик продукта элюировал на 19 минуте).
18
18
2-{3-[1-карбокси-5-(4-[F]фтор-бензоиламино)-пентил]-уреидо}-пентандиовая кислота ([F]6).
3
2
2
2
3
18
18
18
18
18
18
18
В сосуд, содержащий 2 мг соединения 1 и 0,002 мл EtN, добавляли [F]SFB в CHCl. Реакционную смесь нагревали при 45°C в течение 20 минут и затем растворитель удаляли под потоком азота. Затем добавляли 0,1 мл раствора 3% анизола/TFA и реакционную смесь нагревали при 45°C в течение 5 минут. Конечный продукт ([F]6) получали после ВЭЖХ очистки (Econosphere C18 10 мкм, 250×10 мм, HO/CHCN/TFA [80/20/0,1], 4 мл/мин). Скорректированные на распад выходы [F]6 составили 30-35%, в расчете на исходный [F]фторид (три отдельных определения). Среднее время синтеза составило 180 минут от времени добавления [F]фторида. Исходя из 40 мКи [F]фторида, было обнаружено, что удельная радиоактивность [F]6 составляет 250-300 Ки/ммоль (9,1 - 11,1 GBq/мкмоль).
ПРИМЕР 10
125
125
2-(3-{1-карбокси-5-[(5-[I]иод-пиридин-3-карбонил)-амино]-пентил}-уреидо)-пентандиовая кислота ([I]8).
125
125
125
125
2
3
[I]8 получали с использованием иододестаннилирования соответствующего три-н-бутилстаннил предшественника 7 с последующим удалением защиты. К раствору соединения 7 (0,05 мг, 0,047 мкмоль) в 0,05 мл метанола добавляли 0,002 мл уксусной кислоты, [I]NaI с последующим добавлением N-хлорсукцинимида (0,1 мг, 0,749 мкмоль) в 0,010 мл метанола. По прошествии 20 минут при комнатной температуре растворитель удаляли под потоком азота. Затем к остатку добавляли раствор 3% анизола в TFA (0,1 мл). По прошествии 5 минут при комнатной температуре [I]8 выделяли при помощи ВЭЖХ (Econosil C18 10 мкм, 250×4,6 мм, HO/CHCN/TFA [85/15/0,1], 1 мл/мин). Очистку [I]8 методом обращено-фазовой радио-ВЭЖХ осуществляли с использованием насоса Waters 510, УФ/Vis детектора с вариабельной длиной волны Waters 490E при 354 нм и детектора радиоактивности Bioscan Flow Count PMT (Washington, DC). Выходы этой реакции составили 59-75% (три отдельных определения). Удельная радиоактивность была > 2,000 Ки/ммоль (74,0 GBq/мкмоль) в каждом случае.
ПРИМЕР 11
Синтез 2-(3-{1-карбокси-5-[2-(4-фтор-бензилиденаминоокси)-ацетиламино]-пентил}-уреидо)-пентандиовой кислоты (9).
2
2
3
43
57
4
14
1
+
К раствору соединения 1 (0,062 г, 0,073 ммоль) в CHCl (2 мл) добавляли триэтиламин (0,045 мл, 0,320 ммоль), с последующим добавлением гидроксисукцинимидилового эфира N-трет-бутилоксикарбонил-O-(карбоксиметил)гидроксиамина (0,025 г, 0,087 ммоль, Bioconjugate Chemistry 1993, 4, 515-20). После перемешивания в течение 30 минут при комнатной температуре растворитель выпаривали. Неочищенное вещество очищали на колонке с силикагелем с использованием метанол/метиленхлорида (5:95) с получением 0,055 г (89%) соединения 10.H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,98 (шир.с, 1H), 7,91 (с, 1H), 7,25-7,27 (м, 6H), 6,85-6,88 (м, 6H), 5,56-5,63 (м, 2H), 5,01-5,11 (м, 6H), 4,47-4,53 (м, 1H), 4,27-4,38 (м, 3H), 3,79 (м, 9H), 3,30-3,38 (м, 1H), 3,15-3,21 (м, 1H), 2,36-2,41 (м, 2H), 2,10-2,15 (м, 1H), 1,89-1,95 (м, 1H), 1,74-1,81 (м, 1H), 1,23-1,61 (м, 14H). ESI-Mass рассчитано для CHNO [M+H] 853,4, найдено 853,5.
2
3
2
14
25
4
9
1
+
Раствор 3% анизола в TFA (1 мл) добавляли к соединению 10 (0,031 г, 0,036 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут, затем концентрировали при помощи роторного испарителя. Неочищенное вещество очищали при помощи ВЭЖХ (Econosil C18 10 мкм, 250×10 мм, HO/CHCN/TFA (90/10/0,1), 4 мл/мин) с получением 0,009 г (49%) соединения 11.H ЯМР (400 МГц, DO) δ 4,68 (с, 2H), 4,28-4,35 (м, 2H), 3,34 (м, 2H), 2,58 (м, 2H), 2,24 (м, 1H), 1,78-2,13 (м, 3H), 1,62(м, 2H), 1,49 (м, 2H). ESI-Mass рассчитано для CHNO [M] 393,2, найдено 393,2.
2
3
2
3
21
27
4
9
21
28
4
9
1
+
+
К раствору соединения 11 (0,005 г, 0,010 ммоль) в метаноле (0,3 мл) добавляли триэтиламин (0,0075 мл, 0,05 ммоль) с последующим добавлением 4-фторбензальдегида (0,0017 мл, 0,016 ммоль). По прошествии 30 минут при комнатной температуре реакционную смесь очищали при помощи ВЭЖХ (Econosil C18 10 мкм, 250×10 мм, HO/CHCN/TFA (75/25/0,1) и получали соединение 9 (0,002 г, 41%).H ЯМР (400 МГц, DO: CDCN = 1:1) δ 8,26 (с, 1H), 7,56-7,80 (м, 2H), 7,10-7,14 (м, 2H), 4,53 (с, 2H), 4,13-4,17 (м, 1H), 3,96-4,00 (м, 1H), 3,16 (м, 2H), 2,37 (м, 2H), 2,10-2,16 (м, 1H), 1,80-1,88 (м, 2H), 1,65 (м, 1H), 1,54 (м, 1H), 1,42 (м, 1H), 1,28 (м, 1 H). ESI-Mass рассчитано для CHFONa [M+Na] 521,2, найдено 521,3. FAB-HRMS рассчитано для CHFNO [M+H] 499,1840, найдено 499,1869.
ПРИМЕР 12
18
18
Синтез 2-(3-{1-карбокси-5-[2-(4-[F]фторбензилиденаминоокси)-ацетиламино]-пентил}-уреидо)-пентандиовой кислоты ([F]9).
18
18
18
18
18
2
3
2
4-[F]фторбензальдегид синтезировали с использованием процедуры, описанной в литературе {Nuclear Medicine and Biology 19 (1992) 275-281) и очищали при помощи ВЭЖХ (HO/CHCN/TFA 70/30/0,1). ВЭЖХ элюент 4-[F]фторбензальдегид разбавляли при помощи HO, пропускали через C18 Sep Pak, элюировали при помощи 2 мл метанола. К раствору соединения 11 (1 мг) в метаноле (0,05 мл) добавляли [F]4-фторбензальдегид в 2 мл метанола. После перемешивания в течение 30 минут при комнатной температуре реакционную смесь очищали при помощи ВЭЖХ с получением соединения [F]9. Радиохимический выход (скорректированный на распад и в расчете на исходный [F]фторид, n = 2) составил 6-9%. Было обнаружено, что удельная активность конечного соединения составила 350-1300 мКи/мкмоль.
ПРИМЕР 13
Синтез 2-[3-(1-карбокси-5-{4-[N'-(4-фтор-бензилиден)-гидразино]-бензоиламино}-пентил)-уреидо]-пентандиовой кислоты (12).
2
2
3
48
59
5
13
1
+
К раствору соединения 1 (0,030 г, 0,035 ммоль) в CHCl (2 мл) добавляли триэтиламин (0,020 мл, 0,142 ммоль) с последующим добавлением сукцинимидил 4-[2-(трет-бутоксикарбонил)гидразино бензоата (0,020 г, 0,057 ммоль, Bioconjugate Chem. 1991, 2, 333-336) в DMF (0,2 мл). После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре растворитель выпаривали. Неочищенное вещество очищали на колонке с силикагелем с использованием метанола/метиленхлорида (5:95) с получением 0,025 г (78%) соединения 13.H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,63 (д, J=8,0 Гц, 2H), 7,19-7,23 (м, 6H), 6,81-6,85 (м, 6H), 6,68 (д, J=8,8 Гц, 2H), 6,61 (с, 2H), 6,15 (шир.с, 1H) 5,68 (м, 2H), 4,95-5,07 (м, 6H), 4,34-4,45 (м, 2H), 3,74 (м, 9H), 3,25 (м, 2H), 2,31 (м, 2H), 2,10 (м, 1H), 1,84 (м, 1H), 1,19-1,74 (м, 14H). ESI-Mass рассчитано для CHNONa [M+Na] 936,4, найдено 935,9.
2
2
2
3
2
19
28
5
8
1
+
Раствор TFA/CHC1 1:1 (2 мл) добавляли к соединению 13 (0,025 г, 0,027 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем концентрировали при помощи роторного испарителя. Неочищенное вещество очищали при помощи ВЭЖХ (Econosphere C18 10 мкм, 250×10 мм, HO/CHCN/TFA (92/8/0,1), 4 мл/мин) с получением 0,010 г (64%) соединения 14.H ЯМР (400 МГц, DO) δ 7,72 (д, J=8,8 Гц, 2H), 7,02 (д, J=8,8 Гц, 2H), 4,15-4,23 (м, 2H), 3,35 (м, 2H), 2,46 (м, 2H), 2,10-2,17 (м, 1H), 1,80-1,95 (м, 2H), 1,59-1,74 (м, 3H), 1,45 (м, 2H). ESI-Mass рассчитано для CHNO [M+H] 454,2, найдено 453,9.
2
4
2
3
2
3
26
31
5
8
1
+
К раствору соединения 14 (0,004 г, 0,009 ммоль) в воде (0,030 мл) добавляли 0,1 мл 50 мМ KHPO с последующим добавлением 4-фторбензальдегида (0,0011 г, 0,009 ммоль) в 0,05 мл ацетонитрила. Реакционную смесь нагревали при 90ºC в течение 10 минут, затем очищали при помощи ВЭЖХ (Econosphere C18 10 мкм, 250×10 мм, HO/CHCN/TFA (65/35/0,1) и получали соединение 12 (0,003 г, 76%). H ЯМР (400 МГц, DO:CDCN=3:2) δ 7,82 (с, 1H), 7,64 (м, 4H), 7,11 (м, 4H), 4,14 (м, 2H), 3,24 (м, 2H), 2,01 (м, 2H), 1,94 (м, 1H), 1,80 (м, 2H), 1,52-1,63 (м, 3H), 1,35 (м, 2H). ESI-Mass рассчитано для CHFNO [M+H] 560,2, найдено 560,1.
ПРИМЕР 14
18
18
Синтез 2-[3-(l-карбокси-5-{4-[N'-(4-[F]фтор-бензилиден)-гидразино]-бензоиламино}-пентил)-уреидо]-пентандиовой кислоты (F]12).
18
18
18
2
4
2
3
4-[F]фторбензальдегид синтезировали с использованием известной процедуры (Nuclear Medicine and Biology 33 (2006) 677-683). К неочищенному DMSO раствору 4-[F]фторбензальдегида добавляли 1-2 мг соединения 14, 0,2 мл 50 мМ KHPO. Сосуд закрывали и нагревали при 90ºC в течение 15 минут. Реакционную смесь затем очищали при помощи ВЭЖХ (Ecomosphere C18 10 мкм, 250×10 мм, HO/CHCN/TFA [70/30/0,1], 4 мл/мин). Радиохимический выход (скорректированный на распад и в расчете на исходный [F] фторид, n = 2) составил 30-55%. Соединение 12 быстро разлагалось после его получения. Удельную активность конечного соединения не определяли.
ПРИМЕР 15
Синтез 2-{3-[1-карбокси-5-({6-[N'-(4-фтор-бензилиден)-гидразино]-пиридин-3-карбонил}-амино)-пентил]-уреидо}-пентандиовой кислоты (15).
2
2
3
47
59
6
13
1
+
К раствору соединения 1 (0,040 г, 0,047 ммоль) в CHCl (2 мл) добавляли триэтиламин (0,020 мл, 0,14 ммоль) с последующим добавлением сукцинимидил 6-(N'-трет-бутоксикарбонил-гидразино)-никотината (0,020 г, 0,057 ммоль, Bioconjugate Chem. 1991, 2, 333-336). После перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре растворитель выпаривали. Неочищенное вещество очищали на колонке с силикагелем с использованием метанола/метиленхлорида (10:90) с получением 0,032 г (74%) соединения 16.H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 8,54 (с, 1H), 7,90 (м, 1H), 7,17-7,23 (м, 6H), 6,90-7,05 (м, 3H), 6,79-6,84 (м, 6H), 6,55 (д, J=8,8 Гц, 2H), 5,79 (м, 2H), 4,94-5,07 (м, 6H), 4,38-4,45 (м, 2H), 3,74 (м, 9H), 3,26 (м, 2H), 2,33 (м, 2H), 2,07 (м, 1H), 1,85 (м, 1H), 1,68 (м, 1H), 1,18-1,55 (м, 13H). ESI-Mass рассчитано для CHNO [M+H] 915,4, найдено 914,9.
2
2
2
3
2
18
27
6
8
1
+
Раствор TFA/CHC1 1:1 (2 мл) добавляли к соединению 16 (0,032 г, 0,035 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем концентрировали при помощи роторного испарителя. Неочищенное вещество очищали при помощи ВЭЖХ (Econosphere C18 10 мкм, 250×10 мм, HO/CHCN/TFA (92/8/0,1), 4 мл/мин) с получением 0,009 г (45%) соединения 17.H ЯМР (400 МГц, DO) δ 8,07-8,40 (м, 2H), 7,00-7,13 (м, 1H), 4,18-4,24 (м, 2H), 3,38 (м, 2H), 2,48 (м, 2H), 2,14 (м, 1H), 1,86-1,98 (м, 2H), 1,62-1,65 (м, 3H), 1,44 (м, 2H). ESI-Mass рассчитано для CHNO [M+H] 455,2, найдено 455,0.
2
4
2
3
2
25
30
6
8
1
+
К раствору соединения 17 (0,005 г, 0,0011 ммоль) в воде (0,030 мл) добавляли 50 мМ KHPO 0,1 мл с последующим добавлением 4-фторбензальдегида (0,002 г, 0,0016 ммоль) в 0,05 мл ацетонитрила. Реакционную смесь нагревали при 90ºC в течение 10 минут, затем очищали при помощи ВЭЖХ (Econosphere C18 10 мкм, 250×10 мм, HO/CHCN/TFA (80/20/0,1) и получали соединение 15 (0,002 г, 41%). H ЯМР (400 МГц, DO) δ 8,38 (м, 1H), 8,22 (м, 2H), 7,83 (м, 2H), 7,20 (м, 3H), 4,26 (м, 2H), 3,41 (м, 2H), 2,52 (м, 2H), 2,11 (м, 1H), 1,92 (м, 2H), 1,73 (м, 3H), 1,47 (м, 2H). ESI-Mass рассчитано для CHFNO [M+H] 561,2, найдено 560,9.
ПРИМЕР 16
18
18
Синтез 2-{3-[1-карбокси-5-({6-[N'-4-[F]фтор-бензилиден)-гидразино]-пиридин-3-карбонил}-амино)-пентил]-уреидо}-пентандиовой кислоты ([F]15)
I8
18
18
2
4
2
3
4-[F]фторбензальдегид синтезировали с использованием известной процедуры (Nuclear Medicine and Biology 33 (2006) 677-683). К неочищенному DMSO раствору 4-[F]фторбензальдегида добавляли 1-2 мг соединения 16, 0,2 мл 50 мМ KHPO. Сосуд закрывали и нагревали при 90ºC в течение 15 минут. Реакционную смесь затем очищали при помощи ВЭЖХ (Ecomosphere C18 10 мкм, 250×10 мм, HO/CHCN/TFA [80/20/0,1], 4 мл/мин). Радиохимический выход (скорректированный на распад и в расчете на исходный [F] фторид, n = 1) составил 49%.
ПРИМЕР 17
In vitro связывание.
3
50
i
Анализ NAALADазы. Гидролиз NAAG осуществляли, по существу, как описано ранее (26)(27). Вкратце, LNCaP клеточные экстракты получали путем обработки ультразвуком в NAALADазном буфере (50 мМ Трис [pH 7,4] и 0,5% Triton X-100). Клеточные лизаты инкубировали с ингибитором или без ингибитора при 37°C в течение 10 минут. После инкубации добавляли радиоактивно-меченный субстрат N-ацетил-L-аспартил-1-(3,4-H)глутамат (NEN Life Science Products, Boston, MA) до конечной концентрации 30 нМ при 37°C в течение 10-15 минут. Реакцию останавливали путем добавления равного объема охлажденного льдом 100 мМ фосфата натрия и 2 мМ EDTA. Продукты разделяли при помощи анионообменной хроматографии с использованием AG 1-X8 формиатной смолы (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), элюировали при помощи 1 M формиата натрия и осуществляли количественные определения при помощи жидкостного сцинтилляционного счетчика. Кривые ингибирования определяли с использованием полулогарифмических графиков и ИК значения определяли по концентрации, при которой ферментная активность ингибировалась на 50%. Анализы осуществляли в трех повторах, повторяя полностью испытание ингибирования, по меньшей мере, один раз, для подтверждения сродства к связыванию и способа ингибирования. Данные собирали в ходе линейной фазы гидролиза (т.е. < 20% расщепления от общего количества субстрата). Константы ферментного ингибирования (K значения) получали с использованием преобразования Cheng-Prusoff (28). Анализ данных осуществляли с использованием программы GraphPad Prism версия 4.00 для Windows (GraphPad Software, San Diego, California).
PSMA активность также определяли с использованием анализа на основе флуоресценции, в соответствии с процедурой, которая была описана ранее (29). Вкратце, лизаты LNCaP клеточных экстрактов инкубировали с ингибитором в присутствии 4 мкМ NAAG. Количество восстановленного глутамата измеряли путем инкубирования с рабочим раствором из набора Amplex Red глутаминовой кислоты (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA). Флуоресценцию определяли путем считывания с использованием VICTOR3V планшет-ридера для различных меток (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, USA) с возбуждением при 490 нм и эмиссией при 642 нм.
i
i
i
3
3
3
Анализ ингибирования NAALADазы осуществляли для определения значения K для 3, 6 и 8 (26). Концентрацию каждого соединения изменяли от 0,01 нМ ло 1000 нМ против фиксированного количества [H]NAAG (30 нМ). NAALADазу (PSMA) получали из LNCaP клеточных лизатов. Процент полученного продукта ферментативного расщепления, [H]глутамата, измеряли при помощи сцинтилляционного счетчика и использовали для построения графика против логарифмической концентрации исследуемого соединения. Анализ линейной регрессии полученных данных осуществляли для 50% продукции [H]глутамата (50% ингибирование) и получали K значения 0,010 нМ для 3, 0,256 нМ для 6 и 0,351 нМ для 8 (Таблица 1). Такой результат согласуется с другими соединениями этого класса (30). Когда эти соединения оценивали при помощи анализа ингибирования на основе флуоресценции в качестве вторичной проверки на сродство, K значения для 3, 6 и 8 составили 0,010, 0,194 и 0,557 нМ, соответственно.
Таблица 1Активности ингибирования PSMA in vitro и рассчитанные значения ClogD
Соединение
K<sub>i</sub>[нМ]<sup>а</sup>
SD<sup>b</sup>
K<sub>i</sub>[нМ]<sup>c</sup>
SD<sup>b</sup>
ClogD
3
0,010
0,003
0,010
0,004
-5,16
6
0,256
0,038
0,194
0,134
-5,64
8
0,351
0,257
0,557
0,265
-5,88
<sup>а</sup>получены из анализа NAALADазы(радиометрический). <sup>b</sup>95% доверительный интервал
<sup>с</sup>получены из анализа на основе флуоресценции.
ПРИМЕР 18 - Моделирование ингибиторов в активном сайте PSMA
2+
-
Получение белка. 3-D координаты GCPII для стыковочных испытаний получали в виде GCPII кристаллических структур в комплексе с 2-PMPA (PDB ID: 2PVW) или соединением 3 (PDB ID:3D7H) через процесс очистки, который осуществляли в Discovery Studio 2,0 (DS 2,0), что позволяет скорректировать на структурную неупорядоченность, фиксировать порядок связи и связность аминокислотных остатков. CHARMm силовое поле, которое прилагали к белку и сайту связывания для стыковочных испытаний, получали автоматизированным способом с использованием опции определения сайтов из полостей рецептора. Два иона цинка и один хлоридный ион в активном сайте были определены как типы Zn и Cl, с формальными зарядами +2 и -1, соответственно.
Стыковочные испытания с использованием CDOCKER. Стыковочные испытания соединений 3, 6 и 8 осуществляли с двумя конформерами 2PVW с использованием CDOCKER модуля, используемого в качестве инструмента в DS 2.0, путем модификации настроек по умолчанию (Top hits: 20, случайные конформации: 20, стадии динамики случайных конформаций: 1000, целевая температура динамики случайных конформаций: 1000, ориентация на улучшение: 20, максимум неправильных ориентаций: 800, ориентационный vdW энергетический порог: 300, моделирование стадий нагревания: 2000, целевая температура нагрева: 700, стадии охлаждения: 5000, целевая температура охлаждения: 300, Grid расширение: 8, парциальный заряд лиганда: CHARMm). Лучшее расположение каждого лиганда с высокой CDOCKER энергией использовали для получения наложения структур (Фиг.1 и 2) с кристаллическим лигандом 3 (показан более светлым цветом) из GCPII комплекса (PDB ID: 3D7H). Семь молекул воды в пределах 3Å из кристаллического лиганда 3 были включены для стыковочных испытаний с 3D7H.
Использовали для растворения кристаллическую структуру PSMA в комплексе с 3, которая была депонирована в банке данных белков (PDB ID: 3D7H). Подробное описание PSMA, со-кристаллизованного с 3, а также с другими ингибиторами PSMA на основе мочевины, такими как DCIT, DCMC и DCFBC, можно найти в Barinka et al. (39). Как было предсказано испытаниями моделирования, только связывающая конформация аргининового участка была обнаружена в PSMA комплексе с 3. Для выяснения потенциальных путей связывания двух других соединений (6 и 8), осуществляли стыковочные испытания с использованием 3-D коррдинат 3D7H в присутствии или в отсутствие молекул воды в активном сайте. Наилучшие расположения 3, 6 и 8 из стыковочных испытаний с использованием CDOCKER модуля показаны на Фиг.1, с наложением кристаллического лиганда, т.е. соединения, со-кристаллизованного с PSMA, 3. Как показано на Фиг.1, все из радионуклид-содержащих групп (4-иодфенил, 4-фторфенил и 5-иод-3-пиридил) были расположены в пределах аргининового участка сайта связывания S1. 4-Иодфенильная и 4-фторфенильная группы глубоко выступали в субкарман по сравнению с 5-иод-3-пиридильной группой. CDOCKER оценки трех расположений имеют следующий порядок 3 (80,63)>6 (72,39)>8 (69,78). Ароматические кольца соединений 3, 6 и 8 обеспечивают π-π взаимодействия с гуанидиновыми функциональными группами Arg 463 и Arg 534, приводя к стабилизации лиганда в субкармане. В случае 8, азот пиридинового кольца делает возможным электростатическое взаимодействие с карбоксилатом Asp 465 и водородное связывание с одной молекулой воды. Результаты стыковочного испытания PSMA без молекул воды в активном сайте показали, что радионуклид-содержащие группы соединений 6 и 8 были за пределами субкармана и выступали в туннельную область (Фиг.2), тогда как 4-иодфенильная группа соединения 3 выступала в субкарман. На основании показателей активности ингибирования PSMA in vitro и испытаний молекулярного моделирования оказалось, что взаимодействие лиганда с субкарманом сайта связывания S1 больше способствует сродству к связыванию, чем взаимодействие с туннельной областью.
'
Не удивительно, что 3, 6 и 8 принимают подобные конформации в активном сайте PSMA. Радионуклид-содержащая группа в каждом случае находится в пределах аргининового участка сайта связывания S1, однако в случае соединения 8 не выдвигается глубоко в карман (Фиг.1). Соединение 3 было со-кристаллизовано с PSMA, и связывающая конформация для этого соединения показывает продуктивный π-π стекинг с Arg 463 и Arg 534 фермента, тогда как пиридиновая группа соединения 8 неспособна к образованию подобного продуктивного π-π взаимодействия. Однако, в отличие от 3 или 6, соединение 8 способно взаимодействовать с Asp 465 (через азот пиридина), с Asp 453 (через кислород карбонила) и с молекулой воды, поскольку карбонильная группа радионуклид-содержащего фрагмента обращена в направлении S1 субкармана. Такие дополнительные взаимодействия, вероятно, компенсируют менее продуктивную π-π связывающую геометрию соединения 8, обеспечивая высокоаффинное взаимодействие и агент визуализации, который дает четкое изображение опухоли (Фиг.5). Хотя соединение 6 принимает очень похожую конформацию в активном сайте, как у соединения 3, оно связывается с значительно более низким сродством, вероятно из-за дополнительных взаимодействий иода в пределах положительно-заряженного аргининового участка для 3. В целом, аффинности 3, 6 и 8 (Таблица 1) соответствуют предсказанным на основании молекулярного моделирования.
Биораспределение и визуализация
+
-
Клеточные линии и мышиные модели: PC-3 PIP (PSMA) и PC-3 flu (PSMA) клеточные линии получали от Dr. Warren Heston (Cleveland Clinic) и поддерживали, как описано ранее (19). Все клетки выращивали до 80-90% конфлюентности перед трипсинизацией и формулированием в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS, Sigma, St. Louis, MO) для имплантации мышам.
6
Все исследования на животных осуществляли в полном соответствии с институционными указаниями, относящимися к проведению экспериментов на животных. Самцам мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) имплантировали подкожно 1-5×10 клеток в переднюю часть каждого плеча. PC-3 PIP клетки имплантировали сзади левого плеча, а PC-3 flu клетки имплантировали сзади правого плеча. Снимки мышей получали или мышей использовали в анализах биораспределения, когда опухолевые ксенотрансплантаты достигали 3-5 мм в диаметре.
Ex Vivo биораспределение и визуализация
ПРИМЕР 19
125
125
Соединение [I]3. SCID мышам с ксенотрансплантатом вводили путем инъекции через хвостовую вену 74 Bq (2 мкКи) [I]3. Каждый раз по четыре мыши умерщвляли путем цервикального смещения в момент времени 30, 60, 120, 300 минут, 12, 24 и 48 часов после инъекции. Сердце, легкие, печень, желудок, поджелудочную железу, селезенку, жировую ткань, почки, мышцы, тонкий и толстый кишечник, мочевой пузырь и PIP и flu опухоли быстро удаляли. Также собирали 0,1 мл образец крови. Органы взвешивали и радиоактивность тканей измеряли с использованием автоматического гамма-счетчика (1282 Compugamma CS, Pharmacia/LKB Nuclear, Inc, Gaithersburg, MD). Рассчитывали процент введенной дозы (ID) на грамм ткани (% ID/г) путем сравнения с образцами стандартного разведения исходной дозы. Все измерения были скорректированы на распад.
125
+
+
Таблица 2 представляет ex vivo результаты распределения в тканях у грызунов для [I]3. Кровь, почки, мочевой пузырь, селезенка и PSMA PC-3 PIP опухоль показывают высокое поглощение в начальной точке, 30 минут после инъекции (p.i.). К 60 минуте p.i. мочевой пузырь показывает самое высокое поглощение, тогда как поглощение в PSMA PC-3 PIP опухоли также достигает его наивысшей абсолютной величины. Максимальное поглощение в почке достигается в момент 24 часа p.i. Значения, отмеченные для почек, большей частью являются результатом специфического связывания, а не почечного клиренса, из-за экспрессии больших количеств PSMA в проксимальном почечном канальце (31)(32). Поглощение мочевым пузырем представляет экскрецию во всех временных точках, т.е. не было никакого специфического связывания со стенкой мочевого пузыря. Поглощение опухолью демонстрирует высокую степень специфичности, представленную PIP:flu отношением 10:1 на 60 минуте и возрастающим до 140:1 к временной точке 48 часов. Поглощение радиофармацевтического средства в опухоли относительно других органов также увеличивается с увеличением времени. Исследования сайт-специфической блокады не осуществляли, поскольку сочли это излишним в свете использования полученных инженерией (PC-3 PIP и PC-3 flu) опухолей для определения специфичности связывания.
Таблица 2Ex vivo биораспределение [<sup>125</sup>I]3 у мышей с опухолью<sup>а,b</sup>
Орган
30мин
60мин
2 ч
5 ч
12 ч
24 ч
48 ч
кровь
0,9±0,8(10)
0,6±0,2(22)
0,3±0,1(36)
0,4±0,2(31)
0,1±0,03(125)
ND
ND
сердце
2,7±0,9(3)
1,9±0,3(7)
1,4±0,7(8)
0,9±0,2(14)
0,5±0,2(25)
0,5±0,2(28)
0,1±0,1(100)
легкое
5,8±2,4(1,5)
4,5±0,5(3)
3,6±2,8(3)
3,5±0,6(3,5)
2,6±0,8(5)
1,1±0,8(12)
0,5±0,04(22)
печень
7,7±3,1(1)
7,5±0,8(2)
5,9±3,5(2)
4,5±1,0(3)
1,4±0,2(9)
1,4±0,6(9)
0,7±0,1(16)
желудок
1,5±0,9(6)
1,5±0,3(9)
1,6±1,5(8)
0,8±0,03(15)
0,3±0,06(39)
0,7±0,6(18)
0,4±0,2(25)
поджелу-дочная железа
2,0±0,3(4)
2,3±0,3(6)
2,0±0,7(6)
1,6±0,5(8)
0,6±0,2(21)
1,2±0,7(11)
1,1±0,6(10)
селезенка
83±8(0,1)
141±14(0,1)
104±43(0,1)
119±9(0,1)
69±39(0,2)
39±6(0,3)
22±8,6(0,5)
жир
4,5±1,1(2)
5,6±1,0(2)
6,2±0,8(2)
6,8±1,3(2)
3,8±0,8(3)
1,6±1,9(8)
2,8±0,7(4)
почка
119±15(0,1)
121±17(0,1)
111±34(0,1)
132±12(0,1)
169±29(0,1
234±140(0,1)
101±30(0,1)
мышца
2,7±2,4(3)
0,8±0,2(17)
0,6±0,2(21)
0,4±0,1(31)
1,0±0,1(12,5)
0,4±0,1(33)
0,25±0,03(44)
тонкий кишечник
4,9±1,9(2)
3,8±0,4(3,5)
1,5±0,3(8)
1,5±0,2(8)
1,0±0,4(12,5)
0,25±0,1(54)
0,1±0,1(110)
толстый кишечник
1,4±0,6(6)
1,0±0,2(13,5)
0,6±0,1(21)
0,7±0,6(17)
0,6±0,2(21)
1,6±1,9(9)
0,15±0,1(73)
мочевой пузырь
5,2±1,7(2)
6,1±0,8(2)
4,0±2,6(3)
3,0±1,7(4)
0,8±0,3(16)
0,2±0,2(64)
0,3±0,04(37)
PC-3 PIP
8,8±4,7
13,5±2,1
11,8±5,6
12,4±6,4
12,5±4,8
13,4±5,1
11,0±0,2
PC-3 flu
1,8±1,0
1,2±0,3
0,7±0,3
0,6±0,05
0,3±0,1
0,1±0,06
0,08±0,06
PIP:flu
5
11
18
19
48
131
140
a. Значения представлены как % ID/г ± SD(стандартное отклонение); ND = не определяли; n = 4, за исключением временной точки 48 часов, где n = 3.b. Отношения Pip опухоль:орган указаны в скобках
ПРИМЕР 20
18
125
18
Соединение [F]6. Ex vivo биораспределение проходило так же, как для [I]3, за исключением следующего: мышам вводили путем инъекции 3,7 MBq (100 [мкКи) соединения [F]6, и временные точки для определения поглощения были 30, 60, 120 и 300 минут p.i.
18
+
18
Таблица 3 иллюстрирует поглощение в тканях [F]6. Это радиофармацевтическое средство также показало быстрое специфическое поглощение в PSMA PIP опухолях (8,58 ± 3,09% ID/г в точке 30 минут. p.i.) и почках (72,05 ± 3,19% ID/г в точке 30 минут. p.i.). Поглощение в и вымывание из неспецифических тканей было низким и быстрым, соответственно. Только печень и селезенка показали величину поглощения, которая соперничает с наблюдаемой в PIP опухоли. Селезенка демонстрирует наивысшее поглощение из всех неспецифических тканей (12,67 ± 0,36% ID/г в точке 30 минут. p.i.), возможно из-за присутствия GCPIII, близкого гомолога GCPII/PSMA (33). Предполагают, что [F]6 может связываться с GCPIII, а также с GCPII, поскольку, как было показано, это происходит с некоторыми другими PSMA лигандами (34).
Таблица 3Ex vivo биораспределение [<sup>18</sup>F]6 у мышей с опухолью<sup>а,b</sup>
Орган
30мин
60мин
2 ч
5 ч
кровь
2,5±1,7(3)
0,7±0,5(9)
0,4±0,2(9)
0,03±0,00(117)
сердце
0,8±0,1(11)
0,2±0,02(35)
0,15±0,05(25)
0,03±0,01(117)
легкое
1,7±0,3(5)
0,5±0,1(13)
1,0±0,9(4)
0,1±0,1(35)
печень
8,7±1,8(1)
5,8±0,6(1)
11,7±7,0(0,3)
1,0±0,6(3,5)
желудок
0,8±0,1(11)
0,25±0,1(26)
0,3±0,1(13)
0,04±0,02(88)
поджелудочная железа
0,8±0,1(11)
0,3±0,1(21)
0,15±0,03(25)
0,05±0,03(70)
селезенка
12,7±0,4(0,7)
7,2±1,6(1)
4,4±1,2(1)
1,0±0,6(3,5)
почка
72±3(0,1)
48±5(0,1)
29±12(0,1)
14±9(0,3)
мышца
2,4±3,1(4)
0,5±0,7(13)
0,2±0,1(19)
0,1±0,1(35)
тонкий кишечник
1,7±0,7(5)
0,6±0,2(H)
0,3±0,2(12)
0,1±0,04(35)
толстый кишечник
1,2±0,8(7)
0,5±0,1(13)
0,2±0,1(19)
0,6±0,6(6)
мочевой пузырь
6,8±3,5(1)
17±21(0,4)
11±8(0,3)
5,2±8,9(0,7)
PC-3 PIP
8,6±3,1
6,4±0,9
3,7±1,2
3,5±2,3
PC-3 flu
0,8±0,3
0,3±0,05
0,25±0,1
0,1±0,1
PIP:flu
11
21
15
35
a. Значения представлены как % ID/г ± SD(стандартное отклонение); n = 4b. Отношения Pip опухоль:орган указаны в скобках
ПРИМЕР 21
125
125
Соединение [I]8. SCID мышам с ксенотрансплантатом PC-3 PIP и PC-3 flu вводили путем инъекции через хвостовую вену 74 KBq (2 мкКи) [I]8. Каждый раз по четыре мыши умерщвляли путем цервикального смещения в момент времени 30, 60, 240 минут, 8 и 24 часов после инъекции (p.i.). Сердце, легкие, печень, желудок, поджелудочную железу, селезенку, жировую ткань, почки, мышцы, тонкий и толстый кишечник, мочевой пузырь и PIP и flu опухоли быстро удаляли. Также собирали 0,1 мл образец крови. Органы взвешивали и радиоактивность тканей измеряли с использованием автоматического гамма-счетчика (1282 Compugamma CS, Pharmacia/LKB Nuclear, Inc, Gaithersburg, MD). Рассчитывали %ID/г путем сравнения с образцами стандартного разведения исходной дозы. Все измерения были скорректированы на распад.
125
+
+
125
Таблица 4 представляет ex vivo результаты распределения в тканях у грызунов для [I]8. Печень, селезенка, почки и PSMA PC-3 PIP опухоли показали высокое поглощение в начальной временной точке, 30 минут p.i. К моменту времени 60 минут p.i. почки показали наивысшее поглощение, тогда как поглощение в PSMA PC-3 PIP опухоль оставалось на постоянном уровне, показывая аналогичное значение, как во временной точке 30 минут. К моменту времени 24 часа наблюдали полное выведение радиоактивности из отдельных не являющихся мишенью органов. Значения, отмеченные для почек, большей частью являются результатом специфического связывания, а не почечного клиренса, как для других радиофармацевтических средств, обсуждаемых выше. Поглощение мочевым пузырем представляет экскрецию во всех временных точках, т.е. не было никакого специфического связывания со стенкой мочевого пузыря, тогда как поглощение опухолью демонстрирует высокую степень специфичности, представленную PIP:flu отношением 18:1 в точке времени 30 минут, и возрастающим до 48:1 к точке времени 24 часа. Что касается [I]3, поглощение радиофармацевтического средства в опухоли относительно других органов также увеличивается с увеличением времени.
Таблица 4Ex vivo биораспределение [<sup>125</sup>I]8 у мышей с опухолью<sup>а,b</sup>
Орган
30мин
60мин
4 ч
8 ч
24 ч
кровь
2,5±1,4(6)
1,1±0,5(11)
0,25±0,2(17)
0,06±0,01(23)
0,00±0,00
сердце
0,9±0,2(16)
0,4±0,3(30)
0,06±0,02(20)
0,02±0,01(70)
0,00±0,00
легкое
2,7±3,2(5)
2,3±1,0(5)
0,3±0,1(14)
0,1+0,05(12)
0,01±0,00(9)
печень
8,2±1,2(2)
9,7±1,2(1)
4,8±0,9(1)
1,6±0,4(1)
0,04±0,03(2)
желудок
0,8±0,3(18)
0,5±0,3(23)
0,1±0,05(42)
0,06±0,02(23)
0,01±0,01(9)
поджелудочная железа
0,9±0,2(15)
0,8±0,3(16)
0,3±0,3(14)
0,03±0,00(47)
0,00±0,00
селезенка
26±12(0,5)
13,0±6,8(1)
1,25±0,4(3)
0,5±0,2(3)
0,03±0,02(3)
жировая ткань
3,5±0,2(4)
1,4±0,5(8)
0,04±0,1(105)
0,2 + 0,2(7)
0,00±0,01
почка
160±27(0,1)
205±46(0,06)
71±27(0,06)
24±10(0,06)
0,97±0,94(0,1)
мышца
1,9±2,4(7)
0,9±0,7(13)
0,2±0,3(21)
0,1±0,1(14)
0,00±0,00
тонкий кишечник
0,8±0,2(18)
1,1±1,3(11)
0,2±0,05(21)
0,1±0,02(14)
0,01±0,01(9)
толстый кишечник
0,9±0,4(16)
0,6±0,3(21)
0,2±0,1(21)
0,1±0,1(14)
0,00±0,00
мочевой пузырь
1,9±0,4(8)
4,8±4,9(2,5)
7,0±3,6(0,6)
2,8±2,1(0,5)
0,05±0,01(2)
PC-3 PIP
14,2±9,5
12,1±4,9
4,2±1,5
1,4±0,4
0,09±0,04
PC-3 flu
0,8±0,1
0,6±0,25
0,1±0,02
0,03±0,01
0,00±0,00
PIP:flu
18
20
42
47
a. Значения представлены как % ID/г ± SD(стандартное отклонение); n = 4b. Отношения Pip опухоль:орган указаны в скобках
99m
Что касается ex vivo биораспределения, соединение 3 демонстрирует только примерно в два раза большее поглощение опухолью на момент времени 1 час p.i. по сравнению с соединением 6, тогда как его сродство примерно в двадцать пять раз выше. Отношение мишень:не-мишень (PIP:flu) для 6, однако, выше для 3, что отражает более низкое неспецифическое связывание. Такие отношения мишень:не-мишень увеличиваются примерно до 140 к моменту времени 48 часов p.i. для соединения 3 и до 31 к моменту времени 5 часов p.i. для соединения 6. Соединение 8 отличается от соединения 3 тем, что ароматическое кольцо представляет собой пиридин, и иод замещен в положении три. Во временной точке один час p.i. соединение 8 показало аналогично высокое поглощение опухолью (12,05 ± 4,92%ID/г) по сравнению с 3, но имело намного большее отношение мишень:не-мишень (PIP:flu) на этот момент времени (22), которое и возрастало до 48,3 к моменту времени 24 часа p.i. Интересно, что сродство у соединения 8 самое низкое из этих трех испытанных соединений (Таблица 1), однако это обеспечивает самое высокое отношение мишень:не-мишень на момент 1 час p.i. Как продемонстрировано в предыдущей работе с Tc-меченными соединениями этой серии, снова показано, что нет явной взаимосвязи между сродством и in vivo селективностью поглощения опухолью. Примечательно то, что все эти аффинности достаточно высокие, и получают четкие изображения опухолей (Фиг.3-5).
In Vivo Биораспределение и визуализация
ПРИМЕР 22
125
125
Соединение [I]3. Одной SCID мыши имплантировали сразу оба ксенотрансплантата PC-3 PIP и PC-3 flu и вводили путем внутривенной инъекции 37 MBq (1 мКи) [I]3 в физиологическом растворе. В момент времени 4 и 6 часов p.i. мышь анестезировали изофлураном и поддерживали в условиях 1% изофлурана в кислороде. Мышь размещали на X-SPECT (Gamma Medica, Northridge, CA) помосте и сканировали с использованием двух низко-энергетических, имеющих высокое разрешение коллиматоров с булавочными отверстиями (Gamma Medica), поворачивающихся на 360° с 6° инкрементами, по 45 секунд на инкремент. Все гамма изображения реконструировали с использованием программы Lunagem (Gamma Medica, Northridge, CA). Сразу после получения данных SPECT мышей сканировали при помощи CT (X-SPECT) в поле зрения 4,6 см с использованием 600 мкА, 50 кВ луча. SPECT и CT данные затем совместно регистрировали с использованием программы поставщика (Gamma Medica, Northridge, CA) и выводили на дисплей с использованием AMIDE (http://amide.sourceforge.net/). Данные восстанавливали с использованием алгоритма Ordered Subsets-Expectation Maximization (OS-EM).
125
125
125
Фиг.3 представляет SPECT-CT изображение поглощения радиофармацевтического средства на момент времени 4 часа p.i. Отмечается интенсивное поглощение в PC-3 PIP и отсутствие поглощения в PC-3 flu опухоли. Поглощение щитовидной железой меченого атома указывает на присутствие свободного [I]иодида в результате де-иодирования под действием дегалогеназ (35) (36). Однако количество свободного [I]иодида является небольшим по сравнению с количеством поглощения PC-3 PIP опухолью (щитовидная железа:мышца = 2; PIP опухоль:щитовидная железа = 12,5). Небольшое количество поглощения радиофармацевтического средства, наблюдаемое в печени, при отсутствии одновременного поглощения в желудочно-кишечном тракте, вероятно является результатом гидрофильной природы [I]3 (ClogD = -5,16 при pH 7,4).
ПРИМЕР 23
18
18
Соединение [F]6. In vivo PET-CT: Мышь SCID с введенными подкожно PC-3 PIP и PC-3 flu ксенотрансплантатами анестезировали с использованием 3% изофлурана в кислороде для индукции и 1,5% изофлурана в кислороде при скорости потока 0,8 л/минута для поддержания наркоза и размещали в распростертом положении на помосте PET сканера для мелких животных GE eXplore Vista (GE Healthcare, Milwaukee, WI). Мыши вводили путем внутривенной инъекции 7,4 MBq (200 мкКи) соединения [F]6, затем получали изображение с использованием следующего протокола: Изображения получали в виде псевдодинамического скана, т.е. ряд последовательных изображений всего тела, полученных в трех положениях стенда всего в течение 90 минут. Время выдержки в каждом положении составляло 5 минут, так, чтобы определенное положение стенда (или органа мыши) возвращалось через каждые 15 минут. Использовали энергетическое окно 250 - 700 keV. Изображения реконструировали с использованием FORE/2D-OSEM метода (2 повтора, 16 подборок) и включали коррекции на радиоактивный распад, время нечувствительности сканера и рассеянную радиацию.
18
I25
18
125
125
Фиг.4 представляет усредненные результаты динамического сканирования 94-120 минут p.i. Картина поглощения для [F]6 очень похожа на наблюдаемую для [I]3: явно наблюдается в PIP опухоли, отсутствие в flu опухоли, высокое поглощение в почках и умеренная степень поглощения в печени. Такой результат был ожидаемым из-за схожих ClogD значений для [F]6 (-5,64 при pH 7,4) и [I]3. Что качается [I]3, мочевой пузырь виден из-за постоянно накапливающейся радиоактивной мочи, однако специфическое связывание со стенкой мочевого пузыря не было продемонстрировано.
ПРИМЕР 24
125
125
Соединение [I]8. Одной SCID мыши, которой имплантировали LNCaP ксенотрансплантат, и вводили путем внутривенной инъекции 37 MBq (1 мКи) [I]8 в физиологическом растворе. В момент времени 4 часа p.i. мышь анестезировали изофлураном и поддерживали в условиях 1% изофлурана в кислороде. Мышь размещали на X-SPECT (Gamma Medica, Northridge, CA) помосте и сканировали с использованием двух низкоэнергетических, имеющих высокое разрешение коллиматоров с булавочными отверстиями (Gamma Medica), поворачивающихся на 360º с 6º инкрементами, по 45 секунд на инкремент. Все гамма изображения реконструировали с использованием программы Lunagem (Gamma Medica, Northridge, CA). Сразу после получения данных SPECT мышей сканировали при помощи CT (X-SPECT) в поле зрения 4,6 см с использованием 600 мкА, 50 кВ луча. SPECT и CT данные затем совместно регистрировали с использованием программы поставщика (Gamma Medica, Northridge, CA) и выводили на дисплей с использованием AMIDE (http://amide.sourceforge.net/). Данные восстанавливали с использованием алгоритма Ordered Subsets-Expectation Maximization (OS-EM).
125
Фиг.5 представляет SPECT-CT изображение поглощения радиофармацевтического средства на момент времени 4 часа p.i. Поглощение и удерживание в опухоли было высоким, с медленным вымыванием, тогда как вымывание [I]8 из не являющейся мишенью ткани было быстрым.
Сравнительные данные для отношений мишень/не-мишень для фенильных против пиридиновых аналогов.
Отношения мишень/не-мишень представлены для соединения 3 (4-иодбензоильное производное) на момент времени 5 часов после инъекции и соединения 8 (3-иод-5-карбоксил-пиридильное производное) на момент времени 4 часа после инъекции. Отношения мишень/не-мишень представлены в Таблице 5 ниже.
Таблица 5
Опухоль(О)/орган
Соединение 3 (5 часов после инъекции)
Соединение 8 (4 часа после инъекции)
О/кровь
31
17
О/сердце
14
20
О/легкое
3,5
14
О/печень
3
1
О/желудок
15
42
О/поджелудочная железа
8
14
О/селезенка
0,1
3
О/жировая ткань
2
105
О/почка
0,1
0,1
О/мышца
31
21
О/тонкий кишечник
8
21
О/толстый кишечник
17
21
Оказалось, что улучшенные отношения мишень/не-мишень для соединения 8 против 3 являются результатом более быстрого вывыдения соединения 8 из не являющейся мишенью ткани, даже если выведение каждого из крови является сопоставимым, и 3 имеет более высокое удерживание в опухоли, особенно в более поздних точках времени. Соединение 3 является более липофильным, чем соединение 8, и имеет более высокое поглощение в жировой ткани. Удерживание соединения 3 в жировой ткани может обеспечить медленное высвобождение соединения 3 для поглощения в опухоли и нормальных органах.
Высокое и пролонгированное поглощение опухолью и почками (у мышей с высоким уровнем PSMA) соединения 3 является результатом сильного связывания этого соединения с PSMA. 4-Иодфенильная группа находится в гидрофобном кармане, который является вспомогательным для S1 сайта связывания, и обеспечивает дополнительные гидрофобно-гидрофобные взаимодействия (39). Пиридиновые аналоги являются более полярными, чем 3, таким образом, они должны иметь меньше гидрофобно-гидрофобных взаимодействий в этом сайт связывания.
Соединение 6 имеет еще более лучшие отношения мишень/не-мишень, чем у соединения 8. Поэтому фоновый клиренс более полярного пиридинового аналога 6 должен дать еще более лучшие отношения опухоль:не-мишень.
ЛИТЕРАТУРА
1. Jemal, A., Murray, T., Samuels, A., Ghafoor, A., Ward, E., and Thun, M. J. (2003) Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin 53, 5-26.
2. Geus-Oei, L. F., and Oyen, W. J. (2008) Predictive and prognostic value of FDG-PET. Cancer Imaging 8, 70-80.
3. Larson, S. M., Morris, M., Gunther, I, Beattie, B., Humm, J. L., Akhurst, T. A., Finn, R. D., Erdi, Y., Pentlow, K., Dyke, J., Squire, O., Bornmann, W., McCarthy, T., Welch, M., and Scher, H. (2004) Tumor localization of 16beta-18F-fluoro-5alpha-dihydrotestosterone versus 18F-FDG in patients with progressive, metastatic prostate cancer. JNucl Med 45, 366-373.
4. Scher, B., Seitz, M., Albinger, W., Tiling, R., Scherr, M., Becker, H. C, Souvatzogluou, M., Gildehaus, F. J., Wester, H. J., and Dresel, S. (2007) Value of 11C-choline PET and PET/CT in patients with suspected prostate cancer. Eur JNucl Med Mol Imaging 34, 45-53.
5. Reske, S. N., Blumstein, N. M., Neumaier, B., Gottfried, H. W., Finsterbusch, F., Kocot, D., Moller, P., Glatting, G., and Perner, S. (2006) Imaging prostate cancer with 11C-choline PET/CT. J Nucl Med 47, 1249-1254.
6. Vees, H., Buchegger, F., Albrecht, S., Khan, H., Husarik, D., Zaidi, H., Soloviev, D., Hany, T. F., and Miralbell, R. (2007) 18F-choline and/or 11C-acetate positron emission tomography: detection of residual or progressive subclinical disease at very low prostate-specific antigen values (<1 ng/mL) after radical prostatectomy. BJU Int 99, 1415-1420.
7. Ponde, D. E., Dence, C. S., Oyama, N., Kim, J., Tai, Y. C, Laforest, R., Siegel, B. A., and Welch, M. J. (2007) 18F-fluoroacetate: a potential acetate analog for prostate tumor imaging - in vivo evaluation of 18F-fluoroacetate versus 11C-acetate. JNucl Med 48, 420-428.
8. Schuster, D. M., Votaw, J. R., Nieh, P. T., Yu, W., Nye, J. A., Master, V., Bowman, F. D., Issa, M. M., and Goodman, M. M. (2007) Initial experience with the radiotracer anti-1-amino-3-18F-fluorocyclobutane-1-carboxylic acid with PET/CT in prostate carcinoma. JNucl Med 48, 56-63.
9. Oka, S., Hattori, R., Kurosaki, F., Toyama, M., Williams, L. A., Yu, W., Votaw, J. R., Yoshida, Y., Goodman, M. M., and Ito, O. (2007) A preliminary study of anti-1-amino-3-18F-fluorocyclobutyl-1-carboxylic acid for the detection of prostate cancer. JNucl Med 48, 46-55.
10. Tehrani, O. S., Muzik, O., Heilbrun, L. K., Douglas, K. A., Lawhorn-Crews, J. M., Sun, H., Mangner, T. J., and Shields, A. F. (2007) Tumor imaging using 1-(2'-deoxy-2'-18F- fluoro-beta-D-arabinofuranosyl)thymine and PET. J Nucl Med 48, 1436-1441.
11. Chang, S. S., Reuter, V. E., Heston, W. D., Bander, N. H., Grauer, L. S., and Gaudin, P. B. (1999) Five different anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) antibodies confirm PSMA expression in tumor-associated neovasculature. Cancer Res 59, 3192- 3198.
12. Zhou, J., Neale, J. H., Pomper, M. G., and Kozikowski, A. P. (2005) NAAG peptidase inhibitors and their potential for diagnosis and therapy. Nat Rev Drug Discov 4, 1015-1026.
13. Chang, S. S. (2004) Overview of prostate-specific membrane antigen. Rev Urol 6 Suppl 10, S13-18.
14. Murphy, G. P., Kenny, G. M., Ragde, H., Wolfert, R. L., Boynton, A. L., Holmes, E. H., Misrock, S. L., Bartsch, G., Klocker, H., Pointner, J., Reissigl, A., McLeod, D. G., Douglas, T., Morgan, T., and Gilbaugh, J., Jr. (1998) Measurement of serum prostate-specific membrane antigen, a new prognostic marker for prostate cancer. Urology 51, 89-97.
15. Galsky, M. D., Eisenberger, M., Moore-Cooper, S., Kelly, W. K., Slovin, S. F., DeLaCruz, A., Lee, Y., Webb, I. J., and Scher, H. I. (2008) Phase I trial of the prostate-specific membrane antigen-directed immunoconjugate MLN2704 in patients with progressive metastatic castration-resistant prostate cancer. J CHn Oncol 26, 2147-2154.
16. Lange, P. H. (2001) PROSTASCINT scan for staging prostate cancer. Urology 57, 402-406.
17. Haseman, M. K., Rosenthal, S. A., and Polascik, T. J. (2000) Capromab Pendetide imaging of prostate cancer. Cancer Biother Radiopharm 15, 131-140.
18. Rosenthal, S. A., Haseman, M. K., and Polascik, T. J. (2001) Utility of capromab pendetide (ProstaScint) imaging in the management of prostate cancer. Tech Urol 7, 27-37.
19. Banerjee, S. R., Foss, C. A., Mease, R. C, Fox, J., Kozikowski, A. P., and Pomper, M. G. (2008) Synthesis and evaluation of 99mTc/Re labeled PSMA inhibitors. J Med Chem 51, 4504-4517.
18
20. Vaidyanathan, G., and Zalutsky, M. R. (1994) Improved synthesis of N-succinimidyl 4-[F]fluorobenzoate and its application to the labeling of a monoclonal antibody fragment. Bioconjug Chem 5, 352-356.
18
21. Vaidyanathan, G., and Zalutsky, M. R. (2006) Synthesis of N-succinimidyl 4-[F]fluorobenzoate, an agent for labeling proteins and peptides with 18F. Nature protocols 1, 1655-1661.
18
22. Vaidyanathan, G., and Zalutsky, M. R. (1992) Labeling proteins with fluorine-18 using N-succinimidyl-4-[F]fluorobenzoate. Int J Rad Appl Instrum Part B 19, 275-281.
23. Chen, X., Park, R., Shahinian, A. H., Tohme, M., Khankaldyyan, V., Bozorgzadeh, M. H., Bading, J. R., Moats, R., Laug, W. E., and Conti, P. S. (2004) 18F-labeled RGD peptide: initial evaluation for imaging brain tumor angiogenesis. Nucl Med Biol 31, 179-189.
24. Dekker, B., Keen, H., Shaw, D., Disley, L., Hastings, D., Hadfield, J., Reader, A., Allan, D., Julyan, P., Watson, A., and Zweit, J. (2005) Functional comparison of annexin V analogues labeled indirectly and directly with iodine-124. Nucl Med Biol 32, 403-413.
25. Garg, S., Garg, P. K., and Zalutsky, M. R. (1991) N-succinimidyl 5-(trialkylstannyl)-3-pyridinecarboxylates: a new class of reagents for protein radioiodination. Bioconjug Chem 2, 50-56.
26. Lupoid, S. E., Hicke, B. J., Lin, Y., and Coffey, D. S. (2002) Identification and characterization of nuclease-stabilized RNA molecules that bind human prostate cancer cells via the prostate-specific membrane antigen. Cancer Res 62, 4029-4033.
27. Robinson, M. B., Blakely, R. D., Couto, R., and Coyle, J. T. (1987) Hydrolysis of the brain dipeptide N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamate. Identification and characterization of a novel N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase activity from rat brain. J Biol Chem 262, 14498-14506.
28. Cheng, H. C. (2001) determination of KB or Ki from IC50. A closer look at the Cheng-Prusoff equation, the Schild plot and related power equations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 46, 61-71.
29. Kozikowski, A. P., Nan, F., Conti, P., Zhang, J., Ramadan, E., Bzdega, T., Wroblewska, B., Neale, J. H., Pshenichkin, S., and Wroblewski, J. T. (2001) Design of remarkably simple, yet potent urea-based inhibitors of glutamate carboxypeptidase II (NAALADase). J Med Chem 44, 298-301.
30. Kozikowski, A. P., Zhang, J., Nan, F., Petukhov, P. A., Grajkowska, E., Wroblewski, J. T., Yamamoto, T., Bzdega, T., Wroblewska, B., and Neale, J. H. (2004) Synthesis of urea-based inhibitors as active site probes of glutamate carboxypeptidase II: efficacy as analgesic agents. J Med Chem 47, 1729-1738.
31. Slusher, B. S., Tsai, G., Yoo, G., and Coyle, J. T. (1992) Immunocytochemical localization of the N-acetyl-aspartyl-glutamate (NAAG) hydrolyzing enzyme N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase (NAALADase). J Comp Neurol 315, 217-229.
32. Silver, D. A., Pellicer, L, Fair, W. R., Heston, W. D., and Cordon-Cardo, C. (1997) Prostate-specific membrane antigen expression in normal and malignant human tissues. Clin Cancer Res 3, 81-85.
33. Bzdega, T., Crowe, S. L., Ramadan, E. R., Sciarretta, K. H., Olszewski, R. T., Ojeifo, O. A., Rafalski, V. A., Wroblewska, B., and Neale, J. H. (2004) The cloning and characterization of a second brain enzyme with NAAG peptidase activity. J Neurochem 89, 627-635.
34. Hlouchova, K., Barinka, C, Klusak, V., Sacha, P., Mlcochova, P., Majer, P., Rulisek, L., and Konvalinka, J. (2007) Biochemical characterization of human glutamate carboxypeptidase III. J Neurochem 101, 682-696.
35. Bakker, W. H., Krenning, E. P., Breeman, W. A., Koper, J. W., Kooij, P. P., Reubi, J. C, Klijn, J. G., Visser, T. J., Docter, R., and Lamberts, S. W. (1990) Receptor scintigraphy with a radioiodinated somatostatin analogue: radiolabeling, purification, biologic activity, and in vivo application in animals. J Nucl Med 31, 1501-1509.
36. Bakker, W. H., Krenning, E. P., Breeman, W. A., Kooij, P. P., Reubi, J. C, Koper, J. W., de Jong, M., Lameris, J. S., Visser, T. J., and Lamberts, S. W. (1991) In vivo use of a radioiodinated somatostatin analogue: dynamics, metabolism, and binding to somatostatin receptor-positive tumors in man. J Nucl Med 32, 1184-1189.
37. Garg, S., Garg, P.K., Zhao, X-G., Friedman, H.S., Bigner, D.D., and Zalutsky, M.R., Radioiodination of a monoclonal antibody using N-succinimidyl 5-iodo-3- pyridinecarboxylate Nucl. Med. Biol. 20: 835-842 (1993).
38. Ghirmai, S., Mume, E., Tolmachev, V., and Sjoberg, S., Synthesis and radioiodination of some daunorubicin and doxorubicin derivatives Carbohydrate Research 340 15-24 (2005).
39. Barinka, C, Byun, Y., Dusich, CL., Banerjee, S. R., Chen, Y., Castanares, M., Kozikowski, A.P., Mease, R.C., Pomper, Martin G., and Lubkowski, J., Interactions between human glutamate carboxypeptidase II and urea-based inhibitors: Structural Characterizations. J. Med. Chem. 51: 1131 -11 A3 (2008).