Ранние биологические эффекты действия ионизирующих излучений с различной ЛПЭ в малых дозах у клеток дрожжей

Ранние биологические эффекты действия ионизирующих излучений с различной ЛПЭ в малых дозах у клеток дрожжей

Цыб Т.С., Малинова И.В., Комарова Е.В.

ГУ - Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск

В экспериментах с клетками дрожжей Saccharomyces штамма Мегри 139-В показано, что малые дозы а-частиц 239Pu 1,0; 2,0; 6,0 Гр, нейтронов 3,5; 6,0; 8,0; 12,0 Гр и у-квантов от 2,0 до 50 Гр, которые не вызывают инактивацию клеток (выживаемость100 %), нарушают процесс почкования во 2-4 циклах размножения. Это проявляется в формировании облученными клетками микроколоний, которые характерны для дрожжей, облученных в летальных дозах и известны как формы репродуктивной гибели клеток дрожжей.

Введение

Интерес к исследованиям биологических эффектов малых доз ионизирующего излучения (ИИ), в частности плотноионизирующего излучения, обусловлен несколькими причинами. Прежде всего, загрязнениями окружающей среды, обусловленными выбросами радионуклидов, связанных с техногенными катастрофами на ядерных установках и производствах, при которых живые объекты подвергаются воздействию радиации. С другой стороны, внедрение в биологию и медицину нейтронов и источников частиц с высокой энергией ставят задачу исследования биологических эффектов действия этих излучений, включая эффекты малых доз.

Эффекты малых доз ионизирующего излучения с различной линейной передачей энергии (ЛПЭ) описываются в терминах здоровья населения и окружающей среды [1], адаптивный ответ, индукция гиперчувствительности или радиорезистентности, гормезис [2].

В радиобиологии верхнее значение малых доз по различным эффектам оцениваются в пределах от сГр до нескольких Гр. Для дрожжевых клеток эти дозы точно не определены и часто термин «малая» доза дополняется пояснением «в районе плеча». Имеются единичные работы [3, 4] с описанием эффектов воздействия ИИ с низкой ЛПЭ в малых дозах на дрожжевые клетки (от 0,004 Гр до 5,0 Гр), в то время как данных по изучению эффектов действия ИИ с высокой ЛПЭ, включая нейтроны, в малых дозах в доступной нам литературе не найдено.

При действии малых доз ИИ с различной ЛПЭ обычно анализируется состояние облученных клеток и редко их потомство. Принято считать, что клетки, формирующие большие клоны (макроколонии), видимые невооруженным глазом на твердой питательной среде, считаются способными к неограниченному размножению или репродуктивно выжившими. Клетки, не способные формировать макроколонии, считаются погибшими, при этом не известно погибли сами облученные клетки или их ближайшие потомки.

По мнению некоторых авторов [5, 6], классическая оценка гибели клеток по способности образовывать макроколонии на твердой питательной среде не является адекватной для определения кинетики формирования радиационного поражения, она лишь отражает последствия

его. Выжившие дрожжевые клетки после любого воздействия можно определить и другим методом - по образованию микроколоний на твердой питательной среде после инкубации в течение 24 часов при температуре 30 °С [7]. За этот срок клетки, способные к бесконечному размножению, образуют микроколонии, состоящие из тысяч почкующихся компактно расположенных клеток. Клетки, летально поврежденные излучением, почкуются один или несколько раз, формируя различного вида микроколонии: цепочки клеток, состоящие из 8-40 клеток - первая форма инактивации, колонии, состоящие из 2-8 клеток - вторая форма инактивации или погибают без размножения - 3 форма инактивации, которая характерна при воздействии очень больших доз - 104 Гр. Выжившими считаются клетки, сформировавшие микроколонии, состоящие из 40-50 клеток за 24 часа культивирования при 30 °С. Анализ микроколоний позволяет судить об особенности реакции клеток сразу после воздействия, анализировать клетки, которые погибнут, судить о динамике их размножения и сроках инактивации.

При действии на клетки плотноионизирующих излучений, включая нейтроны, повреждения чувствительных структур клетки возникают за счет разных частей энергетического спектра с различными величинами ЛПЭ. Это может привести к повреждениям клеточных структур.

Известно [8-11], что малые дозы плотноионизирующих излучений индуцируют ДР, хромосомные аберрации, мутации, онкогенную трансформацию, клеточную гибель у клеток млекопитающих. Предполагается вероятность появления и отдаленных эффектов облучения ионизирующими излучениями с высокой ЛПЭ, в частности, а-частицами. На такую возможность указывают публикации об индукции хромосомной нестабильности, которые проявляются через несколько пострадиационных делений клеток [12].

Изучение ранних эффектов, таких как кинетика клеточного цикла, в клетках, облученных малыми дозами ионизирующего излучения, целесообразно проводить с использованием хорошо изученных, простых и надежных биологических объектов, к которым относятся дрожжевые клетки Saccharomyces - классический объект эукариотических клеток в радиобиологии.

Целью наших исследований являлось изучение ранних биологических эффектов низких доз радиации у клеток дрожжей Мегри 139-В по двум критериям:

1. динамика почкования клеток и образование микроколоний;

2. морфология микроколоний.

Материалы и методы

В экспериментах использовали диплоидные клетки дрожжей Saccharomyces vini дикого типа Мегри 139-B, хорошо изученные в радиобиологическом отношении. Клетки культивировали на среде YEPD 4-5 дней до достижения стационарной стадии роста. Монослой одиночных (почек не более 1 %) клеток облучали а-частицами 239Pu (E=3,4 МэВ, LET(E)=124 КэВ/цт, мощность дозы = 4,0 Гр/мин). Суспензию этих же клеток в концентрации 106 мл облучали Y-излучением 60Co («Gamma-Cell 220», Atomic Energy of Canada Ltd, мощность дозы = 0,23 Гр/мин и на установке «Исследователь», мощность дозы = 50-60 Гр/мин.), нейтронами реактора БАРС-6 (Еср=1,44 МэВ), нейтронами реактора БР-10 (Еср=0,85 МэВ) (ГНЦ РФ ФЭИ).

Используемые дозы облучения: а-частицы 239Ри (0,35; 1,0; 2,0; 6,0; 10,0 Гр), у-излучение 60Со (2,0; 10,0; 20; 50,0 Гр), нейтроны (3,5; 6,0; 8,0; 12,0 Гр).

Одну часть облученных и необлученных клеток высевали на питательный агар и культивировали 5-7 суток при 30 °С для определения выживаемости по образованию макроколоний. Другую часть клеток высевали на пластинки с питательным агаром для изучения микроколоний. С помощью светового микроскопа наблюдали за динамикой почкования клеток и образованием микроколоний при различных сроках инкубации (2, 4, 6, 8, 12, 14, 24 часов).

Вариабельность данных не превышала 10 % в параллельных и повторных экспериментах.

Результаты и обсуждение

Клетки, облученные ионизирующими излучениями в исследуемых диапазонах доз, формировали на питательном агаре через 7 суток инкубации при 30 °С типичные макроколонии, т.е. выживаемость клеток (Б) - 100 %.

Снижение выживаемости клеток штамма Мегри 139-В регистрируется при облучении у-излучением в дозах 100-120 Гр, а-частицами 25-30 Гр и нейтронами 35-40 Гр. Таким образом, при исследовании ранних реакций клеток на облучение в неинактивирующих дозах (Б=100 %) критерий формирования макроколоний для определения степени поражения клеток не приемлем. В то время как анализ формирования микроколоний позволяет судить о реакции клеток на облучение в ранние сроки (в первые часы 2-24) по динамике их размножения.

На рис. 1 (а, б, в) представлена, как пример, динамика почкования и образования микроколоний клетками, облученными а-частицами. Из рис. 1а видно, что лаг-период (когда клетки находятся в покое) составляет приблизительно 1 час. Затем происходит резкое снижение числа одиночных клеток («единиц») как в контроле, так и в облученной популяции, что является показателем начала процесса почкования, который постепенно нарастает во времени. Известно, что дрожжевые клетки, облученные у-излучением в дозе, не превышавшей 1000 Гр, почти все образовывали почку после 2-3 часов культивирования на питательной среде, что указывает на устойчивость первого почкования к действию радиации [7].

Данные, приведенные на рис. 1 б, показывают, что к 4 часу культивирования на твердой питательной среде 40 % необлученных клеток завершили первое почкование (рис. 1 б, кривая 1), а более 50 % прошли 2-3 деление (рис. 1в, кривая 1). Облученные клетки (рис. 1б, кривые 2, 3) задерживаются во 2 делении. Число клеток облученной популяции, вошедших во второе деление в 1,5 раза меньше по сравнению с контролем. Такое торможение почкования части облученной популяции наблюдается при последующих 3-4 циклах размножения. Повышение максимума на кривой 3 по сравнению с контролем (кривая 1) означает задержку отделения почки от материнской клетки. Это, очевидно, имеет место и при последующих циклах почкования.

часы

Рис. 1. Динамика почкования дрожжевых клеток. а - «единицы»,  - контроль, облучение в дозах: о - 6 Гр а-частиц, А - 10 Гр а-частиц;

б - «двойки», обозначения те же; в - «тройки-восьмерки», обозначения те же; микроколонии: • - контроль, облучение в дозах,  - 6 Гр а-частиц, * - 10 Гр а-частиц.

Примерно к 6 циклу деления (8-10 часов) необлученные клетки формируют мелкие (не более 50 клеток) типичные для дрожжевых клеток микроколонии, состоящие из компактно расположенных клеток (рис. 2.1). Облученные клетки начинают формировать наряду с типичными многообразные формы микроколоний в виде «цепочек», «веточек» из 8-20 крупных клеток (рис. 2.2), что является следствием замедления скорости размножения потомков, облученных клеток.

К 10-12 часу количество таких микроколоний, (имеющих вид «паука») нарастает в зависимости от дозы, достигая 18 % при дозе 6,0 Гр а-излучения и 19 % при 50 Гр у-излучения (табл. 1). Нейтронное облучение клеток одиночным импульсом реактора БАРС-6 (мощность дозы в импульсе 106 Гр/сек) и непрерывно нейтронами канала Б-3 реактора БР-10 в дозах 2-12 Гр также приводит к формированию таких форм микроколоний (табл. 1).

Рис. 2. Микроколонии клеток: 1 - контроль, 2 - облученные а-частицами (в дозе 6,0 Гр).

Таблица 1

Количество измененных микроколоний («пауки») в зависимости от дозы и типа излучения

Доза а-частиц, Гр «пауки», % Доза нейтронов (0,85 МэВ), Гр ^ 35 а п Доза нейтронов (1,44 МэВ), Гр «пауки», % Доза у-излучения, Гр 15? а п

0,35 1,6 - - - - 2,0 2,0

1,0 2,0 - - 3,5 2,5 10,0 2,9

2,0 6,5 8,0 14,3 6,0 3,3 20,0 7,0

6,0 18,0 12,0 16,0 8,4 10,0 50,0 19,0

Необходимо особо подчеркнуть, что такие формы микроколоний принято рассматривать как формы инактивации дрожжевых клеток, облученных ИИ в летальных дозах [7], а в наших экспериментах использовались дозы в 5-10 раз меньше среднелетальных. Микроколонии, формируемые облученными клетками, характеризуются неоднородностью, состоят из более крупных клеток Ь=40-50 мкм, с1=20-30 мкм в сравнении с Ь=20-25 мкм, с1=10 мкм для контрольных клеток (рис. 3).

К 14-му часу инкубации (рис. 1в) все необлученные клетки сформировали типичные микроколонии и только 60 % клеток, облученных а-частицами в дозе 10,0 Гр и 80 % клеток, облученных в дозе 6,0 Гр, образовали такие же микроколонии.

К 20-24 часам видимые в микроскоп измененные формы микроколоний, сформированные облученными клетками, исчезают, хотя среди множества типичных микроколоний правильной формы встречаются нетипичные микроколонии с изрезанными краями, более рыхлые по струк-

туре, но, которые при инкубации на питательной среде в течение 4-5 суток при 30 °С также формируют макроколонии, не отличающиеся от макроколоний, сформированных необлученны-ми клетками, т.е. за это время процессы восстановления в клетках, облученных в исследованных диапазонах доз, полностью завершены. Таким образом, полученные данные показывают, что малые дозы ионизирующих излучений индуцируют в клетке некие повреждения, которые приводят к нарушению динамики почкования, но и в итоге не приводят к потере колонеобра-зующей способности.

с

Рис. 3. Измененные микроколонии.

Известно [4], что малые дозы 1,0-5,0 Гр у-излучения индуцируют стойкие наследственные летальные повреждения в дрожжевых клетках, которые автор относит к нестохастическим эффектам. Показателем повреждения клеток, по нашему мнению, также может служить задержка формирования типичных микроколоний в сравнении с необлученными клетками и формирование различных форм микроколоний в ранние сроки (4-8 часов) после облучения. Относительное содержание таких форм микроколоний, очевидно, определяется характером распределения по клеткам элементарных повреждений. Не исключено, что наблюдаемые нами ранние эффекты, индуцируемые малыми дозами ИИ, возможно, приведут к развитию вторичных нарушений, проявляющихся у отдаленных потомков, которые мы наблюдали [13] при электрономикроскопическом исследовании отдаленных потомков клеток (50-ая генерация) дрожжей, облученных 60Со в дозах 300-1000 Гр (рис. 4). Видно, что часть клеток образовали гроздья неотделившихся почек. Подобные нарушения функции ядра (нарушение деления) понижают жизнеспособность клеток, что приводит к отмиранию клеток или появлению дегеративного потомства. Такие же нарушения функции ядра в первом делении наблюдались под микроскопом [14] с применением метода окраски по Фёльгену.

Пока не ясно, какие системы (или повреждения, мишени) ответственны за ранние эффекты, проявляющиеся в процессе деления облученных клеток, одинаковы ли они с теми, что ответственны за репродуктивную гибель или различаются. Есть мнение [7], что ответственным за задержку клеточного деления является поражение массовых структур клетки.

Рис. 4. Электронограмма потомков клеток дрожжей БассЬаготусвэ, облученных у-квантами 60Со в дозе 340 Г р. Ув. 7600х.

Наиболее ярко эффективность малых доз а-частиц 239Ри проявилась при комбинированном (последовательном и одновременном) действии а-частиц и у-излучения, особенно при одновременном воздействии. 2,5 % а-частиц в общей дозе значительно увеличивало эффективность пучка [15] относительно предполагаемого независимого действия двух излучений. Величина относительной биологической эффективности (ОБЭ) смешанного пучка составляла 3,4-2,65 в районе низких доз (до 400 Гр), где выживаемость была 80-90 %. В работе [16] с эпителиальными клетками 1ЕС показано, что присутствие всего 0,06 Гр а-частиц 238Ри в смешанном пучке с рентгеновским излучением приводило к значительному увеличению эффекта облучения по тесту гибели и индукции микроядер. Также найдено [17], что а-частицы 239Ри в дозах от 0,5 до 6,0 сГр приводят к индукции нелетальных хромосомных аберраций и сетсринских хроматид-ных обменов (СХО) в клетках китайского хомячка, которые по мнению авторов, могут быть значимы в канцерогенезе, вызванном излучением с высокой ЛПЭ.

На основании полученных нами данных можно заключить, что:

1. Облучение клеточной популяции дрожжей ионизирующими излучениями с различной ЛПЭ в малых дозах (выживаемость 100 %) приводит к нарушению динамики почкования, которое регистрируются у ближайших потомков, и имеет обратимый характер.

2. Нарушение динамики почкования клеток дозозависимо и наиболее выражено при воздействии а-частиц и нейтронов.

Литература

1. Evans H.J. Alpha-particle after effects //Nature. - 1992. - V. 355. - P. 674-675.

2. Skov K.A. Radioresponsiveness at low doses: hyper-radiosensitivity and increased radioresistance in

mammalian cells //Mutat. Res. - 1999. - V. 430, N 2. - P. 241-253.

3. Jordan A., Laskowski W. Effects of low X-ray doses in Saccharomyces cerevisiae //Radiat. Environ. Biophys. - 1987. - V. 26. - P. 301-312.

4. Бычковская И.Б. Проблема отдаленной радиационной гибели клеток. - М.: Энергоатомиздат, 1986. -160 c.

5. James A.P. Lethal Sectoring in yeast //Genetica. - 1973. - suppl. - P. 165. Proceedings of an International Workshop on the genetic Control of mutation, Texas.

6. Dertinger H., Jung H. Molecular radiation biology. - Berlin: Springer-Verlag, 1970.

7. Корогодин В.И. Проблемы пострадиационного восстановления. - М.: Атомиздат, 1966. - 392 с.

8. Hall E.J. Radiobiology for the Radiologist, 3rd ed., pp. 169-177. - Philadelphia, Lippincott, 1988.

9. Hei T.K., Нall E.J., Waldren C.A. Mutation induction and relative biological effectiveness of neutrons in

mammalian cells //Radiat. Res. - 1988. - V. 115. - P. 281-291.

10. Yang T.C., Tobias C.A. Neoplastic cell transformation by energetic heavy ions and its modification with chemical agents //Adv. Space Res. - 1984. - V. 4. - P. 207-218.

11. Ritter M.A., Cleaver J.E., Tobias C.A. High-LET radiations induce a large proportion of non-rejoining DNA breaks //Nature (London). - 1977. - V. 266. - P. 266.

12. Kadhim M.A. Radiation-induced genomic/chromosomal instability - recent advances in understanding this phenomenon //31st Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology. - Dresden, Germany,

2001. - P. 88.

13. Цыб Т.С. Морфологические проявления отдаленных последствий гамма-облучения дрожжевых организмов //Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях. - Ленинград, 1982. - С. 91-92.

14. Фофанова К.А. Количественный анализ реакции ядерного аппарата дрожжевых клеток на облучение //Журнал общей биологии. - 1967. - Т. 28, № 1. - С. 116-121.

15. Цыб Т.С. и др. Усиление биологической эффективности при одновременном воздействии электронов и альфа-частиц по сравнению с последовательным облучением. Перспективы медицинского применения //VI-я международная научная конференция: Сб. докл. ЦНИИАТОМИНФОРМ. - Звенигород,

2002. - С. 197-202.

16. Brooks A.L., Newton G.J., Shyr L.J. The combined effects of a-particles and X-rays on cell killing and micronuclei induction in lung epithelial cells //Int. J. of Radiat. Biol. - 1990. - V. 58, N 5. - P. 799-811.

17. Nagasawa H. et al. Response of X-ray-sensitive CHO Mutant Cells (xrs-6c) to radiation. II. Relationship between cell survival and the induction chromosomal damage with low doses of a-particles //Radiat. Res. -1991. - V. 126. - P. 280-288.

The early response of yeast to low doses of radiations with different LET

Tsyb T.S., Malinova I.V., Komarova E.V.

Medical Radiological Research Center of RAMS, Obninsk

The experiments were performed with the diploid wild strain Megry 139-B of yeast Saccharomyces. Monolayers of cells were irradiated with a-particles 239Pu (from 0.35 to 6.0 Gy), y-rays (from 1.0 to 50 Gy) and neutrons (from 3.5 to 12 Gy). It was found that the kinetics of irradiated cells budding and morphology of microcolonies formed by these cells were changed after exposures with low doses of a-particles, neutrons and y-rays. These alterations were revealed at the nearest descendants of irradiated cells (up to 8-10 generation).