Варианты химозина с улучшенными свойствами

1. Выделенный вариант полипептида химозина, отличающийся тем, что:
(а) этот выделенный вариант полипептида химозина имеет значение С/Р (удельная активность свертывания/протеолитическая активность), составляющее по меньшей мере 200% от значения С/Р выделенного верблюжьего химозина, характеризующегося зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2; и
(б) этот выделенный вариант полипептида химозина расщепляет αS1-казеин с частотой менее 80% от частоты расщепления αS1-казеина выделенным верблюжьим химозином, характеризующимся зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2, где расщепление αS1-казеина определяют посредством количественного определения пептидов αS1-казеина, полученных путем инкубации обезжиренного молока с вариантом химозина или с верблюжьим химозином, где количественное определение проводят с помощью RP-HPLC (обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография) в сочетании с масс-спектрометром ESI-Q-TOF (времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением).
2. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 1, где родительский полипептид имеет по меньшей мере 80%, такую как, например, по меньшей мере 80%, 85%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин).
3. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 1 или 2, который содержит одну или более следующих замен, где замена указана по отношению к аминокислотной последовательности зрелого полипептида SEQ ID NO: 2: Y11I, Y11V, L12M, K19T, V51L, R61S, H76Q, E83S, I96L, L105E, D144Q, Q162S, S164G, M165E, L166V, L180I, V203A, L221I, S226T, T239S, R242E, G251D, G251W, L253I, V260T, I263L, R266V, S273Y, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L и/или V317L.
4. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 1-3, который содержит одну или более комбинаций следующих замен, и где каждая замена указана по отношению к аминокислотной последовательности зрелого полипептида SEQ ID NO: 2:
Y21S+H76Q+Y307F+V317L,
R61S+L166V+T239S,
V32L+E294Q+R316L+V317L,
S226T+G244D+I263L+G289S,
V203A+V248I+G251W+L253I+Y268F,
D59N+L222I+G251D+E83S+Q162S,
D59N+L222I+G251D+Y21S+L215V+L105E,
D59N+L222I+G251D+H76Q+L105E+V260T,
D59N+L222I+G251D+V203A+R266V+F223A,
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+V203A+L222I+G251D+V309I,
L12M+V51L+H76Q+M165E+G251D,
L12M+V51L+D59N+H76Q+L166V+L222I+G251D,
L12M+D59N+H76Q+D144Q+M165E+V203A+L222I,
L12M+K19T+D59N+H76Q+S154A+M165E+V198I+L222I+G251D,
L12M+V51L+D59N+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W,
V51L+D59N+H76Q+M165E+L180I+L222I+G251D+E262T,
L12M+D59N+H76Q+M165E+G251D+Q288E+V309I+K321P,
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+R242E+G251D,
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y,
K19T+D59N+H76Q+I96L+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y,
H76Q+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y,
Y21S+H76Q+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y,
D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y,
D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y,
K19T+D59N+H76Q+S164G+L222I+N249D+S273Y,
H76Q+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I,
H76Q+I96L+S164G+G251D+S273Y+V309I,
K19T+D59N+H76Q+S164G+R242E+N249D+G251D+S273Y,
Y21S+D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I
D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+N249D+G251D+S273Y,
H76Q+S164G+L166V+L222I+S226T+S273Y,
D59N+H76Q+L130I+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y+V309I,
D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+R242E,
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D,
D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I,
D59N+H76Q+L130I+S164G+G251D+V309I,
D59N+H76Q+L130I+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y,
Y21S+D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y,
K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+S226T+G251D+S273Y,
D59N+H76Q+L130I+S132A+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y,
K19T+Y21S+H76Q+S164G+L222I+G251D+S273Y,
D59N+H76Q+S164G+L222I+R242E+S273Y+V309I,
K19T+Y21S+D59N+H76Q+S132A+S164G+L222I+G251D+S273Y,
K19T+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y,
D59N+H76Q+S164G+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I,
K19T+Y21S+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S273Y,
Y21S+D59N+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y+V309I,
K19T+D59N+H76Q+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y,
D59N+S132A+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+S273Y,
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y,
Y21S+D59N+H76Q+S164G+L166V+N249D+G251D+S273Y,
H76Q+S132A+S164G+L222I+N249D+G251D,
D59N+H76Q+S132A+S164G+L166V+S273Y,
K19T+D59N+H76Q+S132A+L222I+G251D+S273Y+V309I,
H76Q+L130I+L222I+S226T+G251D+S273Y,
Y21S+D59N+H76Q+I96L+L222I+S273Y,
Y11I+K19T+D59N+E83S+I96L+S164G+L222I+N249D,
Y11I+K19T+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D,
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E,
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I+I263L,
Y11V+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+L253I+I263L,
K19S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E,
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164N+L166I+L222I+G251D,
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y,
Y11V+K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D,
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+L253I,
K19T+D59N+I96V+S164G+L166V+L222I+R242E+I263L,
Y11V+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D+L253V,
I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L,
K19S+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D,
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D,
Y11I+K19T+D59N+S164G+L222I+G251D+I263V,
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+1263V,
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I,
I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+I263L,
K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D+L253I,
D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L,
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+N249D+I263L,
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242D+G251D+I263V,
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249D+L253I,
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249D,
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I,
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y,
K19T+E83T+I96L+S164G+L222I+R242E+L253V,
K19T+I96L+S164G+R242E+L253I,
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+N249E+G251D+L253V+I263L,
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+N249E+G251D+1263V,
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D,
K19T+I96L+S164N+L222I+R242E+I263L,
K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I,
K19T+D59N+E83T+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D,
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D,
D59N+I96L+L166V+L222I+R242E+G251D,
Y11I+K19T+D59N+I96V+L222I+R242D+G251D,
K19T+I96V+S164G+L222I+N249D+G251D+L253I,
H76Q+N100Q+N291Q,
R67Q+L130I+M157L+D158S+R242E+N291Q,
V32L+R67Q+L130I+M157L+K231N+M256L,
R67Q+V136I+M157L+L222I+V248I,
Y11V+R67Q+L130I+M157L+L222I+R242E,
R67Q+I96L+N100Q+L130I+M157L+N292H.
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I,
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D,
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D,
Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D,
Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I,
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D,
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I,
Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D,
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D,
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D,
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D,
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D,
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D,
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E,
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D,
Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E,
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D,
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I,
Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D,
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L1661+R242E+N249E+G251D+L253I,
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D,
Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166 V+L222I+R242E+N249E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E,
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D,
Y11I+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D,
Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D,
Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I,
Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D или
Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D.
5. Выделенный вариант полипептида химозина, отличающийся тем, что
(а) этот выделенный вариант полипептида химозина имеет значение С/Р, составляющее по меньшей мере 200% от значения С/Р выделенного верблюжьего химозина, характеризующегося зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2; и
(б) этот выделенный вариант полипептида химозина расщепляет αS1-казеин с частотой более 115% от частоты расщепления αS1-казеина выделенным верблюжьим полипептидом химозином, характеризующимся зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2, где расщепление αS1-казеина определяют посредством количественного определения пептидов αS1-казеина, полученных путем инкубации обезжиренного молока с вариантом химозина или с верблюжьим химозином, где количественное определение проводят с помощью RP-HPLC в сочетании с масс-спектрометром ESI-Q-TOF.
6. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 5, где родительский полипептид имеет по меньшей мере 80%, такую как, например, по меньшей мере 80%, 85%, 95%), 97%, 98%, 99% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин).
7. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 5 или 6, который содержит одну или более следующих замен, где замена указана по отношению к аминокислотной последовательности зрелого полипептида SEQ ID NO: 2: V32L, I45V, N50K, G70D, G70N, D98V, N100Q, V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I, I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, Е262Т, D267Q, D279E, T284S, N291Q N292H, L295K и/или K321P.
8. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 5-7, который содержит одну или более комбинаций следующих замен, и где каждая замена указана по отношению к аминокислотной последовательности зрелого полипептида SEQ ID NO: 2:
G70D+S74F+D158S+R254S+S277N,
L130I+M142I+I200V+V259I+E294Q,
Y21S+R61S+H146R,
R61S+G163E+M256L+S277N,
D59N+S271P+T284S,
V248I+S226T+E294Q,
S74F+G244D+S271P,
V221K+V248I+S255Y,
V183I+G251W+M256L,
R61Q+V136I+Y268F+T284S+Y307F,
N50K+D158S+V203A+E294Q,
D98V+G251D+M256L+V259I,
V183I+V248I+G244D+T284S,
N50K+R61S+Y127F+G244D+G251D,
I96L+F223V+G244D+R254S+M256L,
H146R+D158S+S273Y,
S74F+V259I+Y268F,
G70N+D98V+V136I,
I96L+M142I+R145Q+H146R,
V32L+G163E+T186S+Q188E+L295K,
R61Q+V136I+Y268F+T284S+Y307F,
S132A+Q188E+F223V,
I200V+G251D+G289S,
N50K+D158S+V203A+E294Q,
F223V+G251W+S273Y+D279E,
D59N+L222I+G251D+V32L+L12M+T284S,
D59N+L222I+G251D+V155F+Е262Т+V32L,
D59N+L222I+G251W+S154A+V203A,
D59N+L222I+G251D+V32L+K321P+V260T,
D59N+L222I+G251D+V198I+V203A+K321P,
D59N+L222I+G251D+S273Y+T284S+D267Q
V32L+N100Q+N291Q,
N292H+N100Q+N291Q,
V221K+N100Q+N291Q,
I297A+N100Q+N291Q,
R67Q+N100Q+L130I+M157L+L222I+K231N,
R67Q+L130I+V248I+M256L+N292H,
V32L+R67Q+L130I+K231N+N292H,
L130I+M157L+V248I+M256L+N291Q,
V32L+R67Q+V136I+M157L+N291Q,
R67Q+L130I+K231N+V248I+N291Q,
V32L+R67Q+G70D+N100Q+M157L,
R67Q+N100Q+L130I+D158S+V248I,
R67Q+N100Q+L130I+M157L+K231N+N291Q,
R67Q+N100Q+L130I+M157L+V248I+N291Q и/или
N100Q+L130I+S132A+M157L+K231.
9. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 1-4, включающий следующие стадии:
(а) осуществление модификации в одном или более положениях в последовательности ДНК, кодирующей зрелый полипептид SEQ ID NO: 2, где изменение включает замену, удаление или вставку по меньшей мере в одном аминокислотном положении;
(б) получение и выделение модифицированного полипептида со стадии (а).
10. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п. 9, где: (а) этот вариант содержит одну или более следующих замен, где замена указана по отношению к аминокислотной последовательности зрелого полипептида SEQ ID NO: 2: Y11I, Y11V, L12M, K19T, V51L, R61S, H76Q, E83S, I96L, L105E, D144Q, Q162S, S164G, M165E, L166V, L180I, V203A, L222I, S226T, R242E, G251W, L253I, V260T, I263L, R266V, S273Y, T239S, G251D, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L, V317L.
11. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 5-8, включающий следующие стадии:
(а) осуществление модификации в одном или более положениях в последовательности ДНК, кодирующей зрелый полипептид SEQ ID NO: 2, где изменение включает замену, удаление или вставку по меньшей мере в одном аминокислотном положении;
(б) получение и выделение модифицированного полипептида со стадии (а).
12. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п. 11, где вариант содержит одну или более следующих замен, где замена указана по отношению к аминокислотной последовательности зрелого полипептида SEQ ID NO: 2: V32L, I45V, N50K, G70D, G70N, D98V, N100Q, V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I,I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, Е262Т, D267Q, D279E, T284S, N291Q N292H, L295K, K321P.
13. Способ получения пищевого или кормового продукта, включающий добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 1-8 к пищевому(ым) или кормовому(ым) ингредиенту(ам) и осуществление дальнейших стадий производства с получением пищевого или кормового продукта.
14. Способ по п. 13, где пищевой или кормовой продукт представляет собой продукт на основе молока.
15. Пищевой или кормовой продукт, содержащий вариант полипептида химозина по любому из пп. 1-8.
16. Применение варианта полипептида химозина по любому из пп. 1-8 в способе получения сыра.
17. Применение варианта полипептида химозина по п. 16 в способе получения вытяжного сыра, чеддера, сыров континентального типа, мягкого сыра или белого рассольного сыра.