Способ получения концентрата ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров из морских гидробионтов
METHOD FOR OBTAINING CONCENTRATE OF UNSATURATED ALKYL-GLYCERINE ETHERS FROM SEA HYDROBIONTS

Изобретение относится к пищевой и фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения из морских жиров алкил-глицериновых эфиров, обладающих высоким биологическим действием.
Под названием «морские липиды» объединено большое количество биологически активных веществ - полиненасыщенные жирные кислоты, фосфолипиды, углеводороды, такие как сквален и сквалан, каротиноиДы и прочие. В состав суммарной липидной некоторых гидробионтов входят необычные липиды - 1-О-алкил-диацилглицерины - соединения, образованные жирными кислотами и спиртами (батиловым, химиловым и селахиловым и др. - 1-О-алкил-глицериновыми эфирами (АГЭ), см. Фиг. 1 и Фиг. 2.
Алкильные радикалы в 1-ом положении глицерина бывают насыщенными, как в случае с химиловым и батиловым спиртами, так и ненасыщенными - у селахилового спирта. Химическая структура алкил-глицериновых эфиров (АГЭ) приведена на фиг. 1, АГЭ успешно применяют в реабилитационной терапии при лечении рака, лучевых поражений, иммунодефицитных состояний, нарушений высшей нервной деятельности и др.
Как показали новейшие исследования, АГЭ с ненасыщенным радикалом (в первую очередь, селахиловый спирт) обладают большей биологической активностью, возможно, значительно большей, чем насыщенные АГЭ (A.-L. Deniau, P. Mosset, D.Lе Bot, А.В. Legrand Which alkylglycerols from shark liver oil have anti-tumour activities? / Biochimie. 2010. P. 1-3). Поэтому поиск методов выделения таких соединений и создания препаратов с их участием является важным в свете профилактики и лечения многих патологий.
На данный момент не существует простого способа получения в одном процессе ненасыщенных и насыщенных АГЭ с высоким выходом, эффективностью производства, снижением временного параметра и упрощением всей технологической схемы, позволяющей осуществлять способ доступными средствами в любой лаборатории.
Известен способ получения концентратов ненасыщенных АГЭ из печени колючей акулы (катрана), гренландской акулы и химеры (Hallgren В., Larsson S.O. «Separation and identification of alkoxyglycerols» // Acta Chem. Scand. 1959. Vol.13, N 7. P. 2147-2148). Способ осуществляют следующим образом: неомыляемые вещества, извлеченные из гидролизованного печеночного жира рыб, хроматографируют на колонке с активированной окисью алюминия, для элюции АГЭ используют смесь 10%-ного раствора метанола в метиленхлориде. Получены концентраты ненасыщенных АГЭ следующего содержания (по селахиловому спирту) - 47,8% для катрана, 59,4% для гренландской акулы и 53,6% для химеры. Другие уточняющие данные по выделению АГЭ отсутствуют.
Недостатки способа: 1) осуществление данного способа скорее иллюстрирует само наличие АГЭ в печени гидробионтов, чем действительно предлагает рациональный способ их выделения;
2) хроматографическое разделение АГЭ, без предварительного концентрирования, для получения препаратов в значительных объемах не приемлемо - низкая эффективность метода, проблемы с регенерацией сорбента, а, главное, высокая себестоимость получаемого продукта;
3) использование метилового спирта снижает интерес к способу, так как использует чрезвычайно токсичный растворитель, не допустимый в пищевых производствах.
Известен способ выделения алкил-глицериновых эфиров из жира командорского кальмара Berryteuthis magister (Патент РФ №2415125 МПК C07C 43/13, C07C 41/16, C07C 41/40, опубл. 27.03.2013). Способ включает гидролиз морского жира для выделения свободных жирных кислот и высвобождения неомыляемой фракции, содержащей АГЭ, нейтрализацию полученной жировой смеси кислотой, промывку водой и последовательную двойную кристаллизацию из органического растворителя, фильтрацию и сушку образующегося осадка после каждой кристаллизации. Для проведения первой и второй кристаллизации жировую смесь в органическом растворителе выдерживают сначала в течение 10-12 часов при комнатной температуре, а затем в течение 12-15 часов при 0-4°С.
В процессе используют ацетон или гексан, причем может использоваться только один растворитель во всем процессе или их комбинация.
При использовании в качестве органического растворителя гексана соотношение жировая смесь - гексан составляет при первой кристаллизации 1:10, кг/л, а при второй кристаллизации промежуточного продукта 1:50, кг/л.
При использовании в качестве органического растворителя ацетона целесообразно соотношение жировая смесь - ацетон 1:10, кг/л, как при первой, так и при второй кристаллизации промежуточного продукта.
Метод позволяет получать насыщенные АГЭ с выходом 50-59,0% и чистотой более 99%.
Недостатки:
1) метод использует значительные объемы растворителей, что требует использование больших емкостей, соответствующих фильтровальных установок и постоянную регенерацию растворителей;
2) две кристаллизации метода разделены сушкой осадка для того, чтобы при смене растворителя не было загрязнения одного растворителя другим; сушка реально прерывает процесс и откладывает последующую вторую кристаллизацию на несколько часов;
3) продолжительность проведения всего процесса - от исходного жира до целевого продукта (АГЭ) - составляет не менее 59 часов, в среднем 65 часов, притом, что проведение процесса между стадиями является неразрывным. Такая большая продолжительность процесса крайне негативно сказывается на производительности линии получения АГЭ и не позволяет быстро и своевременно перерабатывать поступающее сырье.
4) АГЭ, выделяемые по данному способу на 98-99% состоят из насыщенных соединений, все ненасыщенные АГЭ, обладающие наибольшей биологической активностью, остаются в неиспользуемом остатке и теряются из-за не разработанности технологии.
3
Известен способ выделения и концентрирования алкил-глицериновых эфиров из морских жиров (Patent GB 1,076,706, МПК C07C 43/02, опубл. 19.07.1967). Способ заключается в следующем: морской жир (жир печени акулы) путем переэтерификации с метиловым спиртом (допускаются этиловый и изопропиловый) и щелочным катализатором (КОН или Na-ОСН) переводили в метиловые эфиры жирных кислот при температуре 70°С в течение 16 часов и перемешивании, при этом в смесь высвобождались алкил-глицериновые эфиры, оставшийся в смеси метанол упаривали под вакуумом, а АГЭ из общей смеси многократно экстрагировали 90%-ными водно-метанольными или водно-этанольными растворами в соотношении смесь-экстрагент 0,6:1, кг/л, при 50°С и перемешивании в течение 15 минут и отстаивании в течение 2-х часов, фазу с растворителем отделяли и заново экстрагировали смесь при таких же условиях (6-ть раз), объединенные водно-спиртовые растворы упаривали, получая целевые АГЭ.
Выход суммарных АГЭ (насыщенных и ненасыщенных) - 71%, концентрация в продукте (чистота) - 40%.
Недостатки способа:
1) использование метанола недопустимо в пищевых производствах и нежелательно в фармацевтических;
2) способ предполагает использование хорошо отлаженной технологической линии, что затрудняет его внедрение на малых и других рыбохозяйственных и пищевых предприятиях отечественной индустрии;
3) в формуле указано использование низкомолекулярных спиртов для экстракции - 1-3 атома углерода, однако никаких примеров, кроме метанола не приведено, и в описании патента преимущество отдается метанолу;
4) способ также допускает использование в экстракционной смеси уксусной кислоты и ацетонитрила, такие возможности только усложняют регенерацию растворителей и удаление их из конечного продукта;
5) данным способом можно получить суммарные АГЭ с чистотой только 47,7% (авторы указывают, что тот же самый опыт, пример 4, был несколько лучше в лабораторных условиях), что недостаточно для коммерческого применения и предполагает в дальнейшем дополнительные стадии очистки;
6) авторы в описании патента допускают выход АГЭ при 7-8-и кратной экстракции до 90%, но никаких убедительных доказательств не приводят, хотя в примере 4, в котором была использована семикратная экстракция, достигается выход в 71%;
7) ни о каком концентрате ненасыщенных АГЭ не может быть речи, так как метод экстракции не избирательный и концентрирование в продукте насыщенных и ненасыщенных АГЭ происходит с одинаковой эффективностью, а предварительного удаления насыщенных АГЭ авторы не проводят;
8) способ достаточно трудоемкий и, судя по описанию, требует повышенных экономических затрат на свое функционирование.
Наиболее близким к заявляемому способу по достигаемому результату является способ выделения ненасыщенного селахилового спирта из смеси алкил-глицериновых эфиров (US Patent 7,368,603, МПК C07C 51/42, опубл. 06.05.2008). Способ осуществляют следующим образом.
3
Подготавливают ионообменную смолу (сорбент Amberlite 15), насыщая ее ионами азотнокислого серебра, AgNO, до концентрации 4,6 мг-экв/г (501,4 мг/г сорбента) (колонка 4, абзац 1-й; колонка 7, абзацы 2 и 3-й). Далее смолу смешивают со смесью разделяемых соединений (насыщенных и ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров - химилового, батилового и селахилового спиртов) в органическом растворителе (Формула изобретения, п. 6), которым могут являться спирты, эфиры, кетоны и др. растворители (Формула изобретения, пп. 12 и 13). Затем растворитель из системы отфильтровывают, а из комплекса, образованного смолой и разделяемыми веществами, последовательно элюируют вещества органическими растворителями разной полярности в соответствии с их свойствами, включая ненасыщенный алкил-глицериновый эфир - селахиловый спирт.Для получения целевых продукьтов полученные элюаты упаривают.
Недостатки способа.
1. Главная задача данного изобретения - получение чистых насыщенных соединений. В описании дается только два примера и оба посвящены разделению производных насыщенных миристиновой (С14:0), пальмитиновой (С16:0) и стеариновой (С18:0) кислот.
2. Упоминание о разделении смеси алкил-глицериновых эфиров не приведено в примерах, а дано только в п. 6 Формулы. При этом никакие условия процесса не приведены, например - соотношение смолы и разделяемой смеси, концентрация ненасыщенного селахилового спирта в смеси, растворитель для первичного нанесения на смолу, растворитель или группа растворителей или их смесей для смыва веществ, сорбированных на смоле.
Отсутствуют выход и концентрация (по основному веществу) выделяемых веществ.
3. Авторы ничего не упоминают о регенерации смолы (и нанесенного серебра, в частности). Является ли получаемая смола многократно используемой или предназначена для единичных опытов. Экономическая сторона процесса не задета полностью, при этом следует учитывать, что любые технологические изыскания, связанные с импрегнированным серебром без учета его регенерации не рентабельны, а авторы заявляют об использовании данного метода при получении фармацевтических препаратов (колонка 1, абзацы 3 и 4 снизу).
4. Из описания изобретения невозможно определить чистоту ненасыщенного алкил-глицеринового эфира (селахилового спирта), также невозможно определить выходы и производительность процесса. Поэтому предлагаемый способ следует квалифицировать как потенциальный для этих целей, но реальные возможности которого не подтверждены.
Техническая проблема, поставленная перед изобретением, - разработка эффективного и экономичного способа получения из морских жиров ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров с целью максимального их извлечения из заготовленного сырья при одновременно высоком качестве целевого продукта.
3
Поставленная техническая проблема решается тем, что в известном способе выделения ненасыщенных алкил-глицериновых эфиров (АГЭ), включающим обработку смеси насыщенных и ненасыщенных АГЭ сорбентом в растворе органического растворителя, удаление органического растворителя из системы фильтрованием, элюирование АГЭ с сорбента органическими растворителями с разной полярностью, упаривание полученного элюата, отличающийся тем, что в качестве смеси насыщенных и ненасыщенных АГЭ используют гидролизат морского жира, полученный в результате щелочного гидролиза, который подкисляют, промывают водой, затем кристаллизуют насыщенные АГЭ из ацетона, отфильтровывают осадок, а полученный фильтрат упаривают и далее, пропускают его через сорбент. В качестве сорбента используют колонку с силикагелем и элюирующую систему из органических растворителей с повышением их полярности, элюат упаривают, затем ведут экстракцию ненасыщенных АГЭ, для чего упаренный элюат растворяют в неполярном органическом растворителе до концентрации АГЭ 0,5-2%, смешивают с растворами азотнокислого серебра в 20-60%-ном водном этаноле при соотношении жидких фаз неполярная: полярная=1:1-2,8, об./об., и соотношении ненасыщенные АГЭ:AgNO=1:3-7, моль/моль, перемешивают, центрифугируют, отделяют нижний водно-этанольный слой, подкисляют соляной кислотой до рН=4, фильтруют раствор, упаривают органический растворитель, выделяя ненасыщенные АГЭ.
Проведение процесса кристаллизации насыщенных АГЭ из ацетона позволяет отделить основную массу насыщенных АГЭ из смеси, вследствие чего, способствует получению чистого целевого продукта - ненасыщенных АГЭ.
3
Использование AgNO в процессе позволяет селективно связывать ненасыщенные соединения (вещества, имеющие одну и более двойных связей в молекуле), при этом ионы серебра инертны в отношении насыщенных соединений. В отличие от прототипа, в котором используют ионообменную смолу импрегнированную солью серебра заявляемый способ обеспечивает, как значительное удобство работы при разделении веществ, так и высокие выходы целевого продукта. Нитрат серебра, хорошо растворимый в водно-этанольных смесях, но не растворимый в неполярных растворителях (гексан, петролейный эфир и пр.) в растворе диссоциирует с образованием активных ионов серебра (Ag+), которые при обработке разделяемой смеси данным раствором связываются координационными связями с двойными связями в ненасыщенных АГЭ и, фактически, «перетаскивают» данные соединения в водно-спиртовой раствор. Такой подход более эффективен, чем использование смолы, импрегнированной солью серебра, так как каждый раз нагрузки (загружаемая смесь) на смолу из-за различий в исходном составе должны подбираться индивидуально, что требует дополнительных пробных исследований и, по этой же причине должны быть внесены коррективы в набор растворителей, их соотношение при вымывании веществ со смолы.
Целесообразно в качестве органических растворителей с повышением полярности в системе для элюции при хроматографии использовать последовательно хлороформ→хлороформ+этанол(этанол+уксусная кислота, а в качестве неполярного органического растворителя для разделяемой смеси алкил-глицериновых эфиров использовать пентан, гексан, петролейный эфир.
Эти неполярные органические растворители являются наиболее приемлемыми, поскольку они не образуют эмульсий с полярной фракцией, тем самым создавая гомогенную среду и повышая чистоту выделяемых ненасыщенных АГЭ.
Для повышения выхода ненасыщенных АГЭ экстракцию АГЭ из неполярного органического растворителя ведут от одного до трех раз.
Описание общей схемы заявленного способа.
Гидролиз жира из пищеварительной железы командорского кальмара
Начальной стадией выделения АГЭ является щелочной гидролиз липидов пищеварительной железы кальмара, в результате которого происходит отщепление ЖК от молекулы алкил-диацил-глицерина (АДАГ), схема гидролиза приведена на фиг. 2.
К 1 кг жира добавляют 075 л 96%-ного этанола и 0,5 л 40%-ого раствора КОН. Реакцию проводят при 60°С в течение 1 ч. Окончание реакции гидролиза контролируют методом тонкослойной хроматографии.
2
4
По окончании реакции смесь переносят в делительную воронку, прибавляют 2 л воды и нейтрализуют водным раствором HSO до значения pH=4 по индикаторной бумаге. Гидролизованные липиды дважды промывают 1,5 л 1%-го раствора NaCl.
Осаждение (кристаллизация) насыщенных алкил-глицериновых эфиров
Отбирают 0,5 кг гидролизованных липидов, растворяют в 1,4 л ацетона, интенсивно перемешивают и помещают в морозильную камеру (-15°С) на 18 часов для осаждения (кристаллизация) насыщенных АГЭ. По окончании процесса, осадок насыщенных АГЭ отфильтровывают, а ацетоновый раствор упаривают, получая начальный продукт ненасыщенных АГЭ для дальнейшего концентрирования.
Выделение суммарных насыщенных и ненасыщенных АГЭ методом хроматографии 50 г продукта с предыдущей стадии загружают на хроматографическую колонку со 300 г силикагеля (размер частиц 100 мкм). Элюцию проводят последовательно смесями растворителей - 1) хлороформ (1000 мл), 2) хлороформ-этанол, 9:1, об./об. (800 мл), 3) этанол-уксусная кислота, 1:0,02, об./об. (800 мл). Контроль за фракциями, содержащими суммарные АГЭ, осуществляют тонкослойной хроматографией. Фракции с АГЭ объединяют и упаривают.
3
Экстракция ненасыщенных АГЭ растворами с AgNO
3
Смесь суммарных насыщенных и ненасыщенных АГЭ с предыдущей стадии, 600 мг, растворяют в неполярном органическом растворителе до концентрации алкил-глицериновых эфиров 0,5-2% и смешивают с растворами азотнокислого серебра в 20-60%-ном водном этаноле при соотношении жидких фаз неполярная: полярная=1:1-2,8, об./об. и соотношении ненасыщенные алкил-глицерины: AgNO=1:3-7, моль/моль, перемешивают, центрифугируют смесь при 3000 об./мин, отделяют нижний водно-этанольный слой, повторяют экстракцию ненасыщенных АГЭ из неполярного растворителя дополнительно 1-2 раза при тех же самых условиях, объединенные водно-этанольные экстракты подкисляют соляной кислотой до рН=4 для осаждения соли серебра, фильтруют раствор и упаривают растворитель, выделяя ненасыщенные алкил-глицериновые эфиры.
При разработке способа были найдены решения, позволившие осуществить его наиболее экономичным, а главное, простым способом.
Было найдено, что оптимальные концентрации АГЭ в неполярном растворителе должны составлять 0,5-2,0%. Это, во-первых, обеспечивает хорошую растворимость вещества, а, во-вторых, способствует эффективному извлечению ненасыщенной фракции АГЭ из суммарной смеси. Снижение концентрации суммарных АГЭ в растворителе менее 0,5% не увеличивало выход и качество целевого продукта, а приводило лишь к увеличению самой смеси для экстракции и не оправдано большим тратам растворителя. Увеличение концентрации АГЭ в растворе свыше 2% снижало качество продукта - в нем увеличивалась пропорция насыщенных АГЭ.
3
В качестве полярного растворителя для экстракции использовали водные растворы этилового спирта. Как оказалось, оптимальные концентрации этанола находятся в пределах 20-60%. При этом, снижение концентрации спирта менее 20% делает раствор настолько не приемлемым для экстракции липидов, что, не смотря на содержание AgNO, значительная часть ненасыщенных АГЭ остается в неполярном растворителе, а повышение концентрации более 60% приводит к излишнему переходу в экстрагент насыщенных АГЭ, снижая чистоту продукта.
Экспериментально установлены следующие оптимальные соотношения неполярного органического растворителя и водно-спиртовых растворов при экстракции ненасыщенных АГЭ - 1:1-2,8, об./об, соответственно. Оказалось, что использование соотношения менее 1:1 приводит к загрязнению экстрагента насыщенными АГЭ, что требует в дальнейшем дополнительной очистки продукта. Увеличение соотношения более 1:2,8, об./об., не оказывает влияние на извлекаемые ненасыщенные АГЭ, т.е. увеличение экстрагента станет затратным при осуществлении способа.
3
3
3
3
Особо значимым результатом, неожиданным по своей эффективности, при проведении экспериментальных исследований явилось определение действительных значений соотношения ненасыщенных АГЭ в неполярном органическом растворителе к количеству AgNO в водно-спиртовом экстрагенте - ненасыщенные АГЭ:AgNO=1:3-7, моль/моль. Установлено, что минимальный предел присутствия AgNO в смеси должен быть не менее 3-х моль на 1 моль ненасыщенных АГЭ. Нарушение пропорции приводит к снижению извлечения ненасыщенных АГЭ из неполярного растворителя в водно-этанольную фракцию. При содержании AgNO в экстрагенте более 7-ми моль выход продукта не увеличивается, а расход реагентов возрастает в несколько раз.
При проведении процесса было установлено, что однократная экстракция не обеспечивает максимальное извлечение ненасыщенных АГЭ. Для увеличения этого показателя дополнительно проводили 1 или 2 экстракции при тех же самых условиях. Суммарное количество экстракций не превышало 3. Повторными, 4-й и более экстракциями, уже не возможно было увеличить выход целевого продукта.
Изобретение иллюстрируется следующими фиг. и табл.; на фиг. 1 - схема щелочного гидролиза алкил-диацил-глицеринов (АДАГ); на фиг. 2. приведена структурная формула алкил-глицериновых эфиров в табл.представлен состав липидов в продуктах (и полупродуктах) на разных стадиях выделения ненасыщенных АГЭ.
Способ осуществляют следующим образом.
ПРИМЕР 1
Выделение насыщенных и ненасыщенных АГЭ из жира пищеварительной железы командорского кальмара Berryteuthis magister
Основными классами липидов пищеварительной железы являются алкил-диацил-глицерины (АДАГ) и свободные жирные кислоты, 37,5% и 29,7% соответственно. Кроме перечисленных компонентов, в состав липидов входят также триацил-глицерины (18,5%), холестерин (7,0%). Полярные липиды, эфиры стеринов и воски присутствуют в незначительных количествах.
Качественный и количественный состав смесей липидов на всех стадия процесса оценивают, используя метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) (пластинки «Sorbfil», система гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота 50:50:1, об./об./об.) с использованием планшетного сканера и оценки плотности (интенсивности) проявленных на ТСХ-хроматограммах пятен, применяя программу «ТСХ-менеджер версия 3.1 2005 @PinSoft».
Состав АГЭ, выделенных из гидролизованных липидов, а также полученных фракций определяли методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС).
Берут 10 кг пищеварительной железы (замороженные внутренности кальмара) нагревают в шнеке с водяной рубашкой и сепарируют.Получают 4,85 кг жира.
Гидролиз липидов пищеварительной железы кальмара
К 1 кг жира добавляют 0,75 л 96%-ного этанола и в 0,5 л 40%-ого раствора КОН. Реакцию проводят при 60°С в течение 1 ч. Окончание реакции гидролиза контролируют методом тонкослойной хроматографии.
2
4
По окончании реакции смесь переносят в делительную воронку, прибавляют 2 л воды и нейтрализуют водным раствором HSO до значения pH=4 по индикаторной бумаге. Отделившиеся липиды дважды промывают 1,5 л 1%-ного водного раствора NaCl.
Получено 0,88 кг гидролизованного жира.
Выход (на исходную массу липидов) - 88%.
Состав липидов после проведенного гидролиза показан в сводной табл.1.
Выделение насыщенных алкил-глицериновых эфиров
После щелочного гидролиза проводят кристаллизацию насыщенных АГЭ из ацетона, согласно разработанному ранее методу (Патент РФ №2476611, МПК C22B 7/04, C22B 15/00, C22B 23/00, C22B 4/06, опубл. от 27.02.2013, «Способ получения алкил-глицериновых эфиров из морских жиров» / Касьянов С.П., Латышев Н.А., Чу Куанг Чуен).
Отбирают 0,5 кг гидролизованных липидов растворяют в ацетоне, интенсивно перемешивают и помещают в морозильную камеру (-15°С) на 18 часов для осаждения насыщенных АГЭ. Выпавший осадок отфильтровывают через фильтрованную бумагу при -15°С. Полученный фильтрат, содержащий жирные кислоты и ненасыщенные алкил-глицериновые эфиры упаривают под вакуумом.
Выпавший осадок повторно кристаллизуют из ацетона при тех же самых условиях, отфильтровывают от растворителя, высушивают.
Полученный осадок представляет собой смесь насыщенных АГЭ с чистотой 99,6%, основным компонентом которой являлся химиловый спирт (содержание 95,7%).
Выход насыщенных АГЭ составил 11,0% от взятых на кристаллизацию липидов, или 42,0% от содержания АГЭ в гидролизованных липидах.
Выделение суммарных насыщенных и ненасыщенных АГЭ методом хроматографии
Для выделения ненасыщенных АГЭ используют упаренный фильтрат, полученный после первой кристаллизации гидролизованной смеси из ацетона при -15°С.
50 г упаренного фильтрата с предыдущей стадии загружают на хроматографическую колонку со 300 г силикагеля (размер частиц 100 мкм). Элюцию проводят последовательно смесями растворителей с повышением их полярности - 1) хлороформ (1000 мл), 2) хлороформ-этанол, 9:1, об./об. (800 мл), 3) этанол-уксусная кислота, 1:0,02, об./об. (800 мл). Контроль за фракциями, содержащими суммарные АГЭ, осуществляют тонкослойной хроматографией. Фракции с АГЭ объединяют и упаривают.
Получено 7,06 г суммарных АГЭ.
Выход (на исходное содержание АГЭ в упаренном фильтрате) - 92%.
Содержание суммарных АГЭ в продукте - 99%.
Содержание ненасыщенных АГЭ, от суммарных АГЭ, - 37,6%.
3
Экстракция ненасыщенных АГЭ растворами с AgNO
3
Смесь суммарных насыщенных и ненасыщенных АГЭ с предыдущей стадии, 600 мг, растворяют в 120 мл гексана (концентрация алкил-глицериновых эфиров в растворе 0,5%) и смешивают с раствором азотнокислого серебра (560 мг) в 120 мл 20%-ного водного этанола при соотношении жидких фаз неполярная: полярная = 1:1, об./об. и соотношении ненасыщенные алкил-глицерины: AgNO=1:5, моль/моль, перемешивают, центрифугируют смесь при 3000 об./мин, отделяют нижний водно-этанольный слой, повторяют экстракцию ненасыщенных АГЭ из неполярного растворителя дополнительно 1 раз при тех же самых условиях, объединенные водно-этанольные экстракты подкисляют соляной кислотой до рН=4 для осаждения соли серебра (AgCl), фильтруют раствор и упаривают растворитель, выделяя ненасыщенные алкил-глицериновые эфиры.
Получено 204 мг концентрата ненасыщенных АГЭ.
Концентрат ненасыщенных АГЭ представлял собой слегка коричневатую маслянистую жидкость при 20-25°С и твердую маргариноподобную массу при 0-5°С со слабым не выраженным запахом.
Выход ненасыщенных АГЭ на стадии экстракции - 90,4%.
Общий выход ненасыщенных АГЭ (от исходного содержания в жире) - 74,8%.
Содержание ненасыщенных АГЭ в концентрате - 68,5%.
Основными компонентами концентрата были изомеры селахилового спирта (С-18:1) (53,5%). Результаты представлены в табл.
ПРИМЕР 2
Для получения ненасыщенных АГЭ было взято 600 мг суммарных насыщенных и ненасыщенных АГЭ, выделенных на стадии хроматографической очистки АГЭ в Примере 1.
Выделение ненасыщенных АГЭ было проведено как в Примере 1 со следующими изменениями:
- концентрация суммарных АГЭ в неполярном органическом растворителе составляла 1,15%;
- в качестве неполярного растворителя использовали пентан;
- экстракцию ненасыщенных АГЭ проводили 60%-ным водным этанолом;
- при экстракции соотношение жидких фаз неполярная: полярная=1:2,8, об./об.;
3
- соотношении ненасыщенные АГЭ: AgNO=1:3, моль/моль;
- количество экстракций 3.
Выход ненасыщенных АГЭ на стадии экстракции - 90,0%.
Общий выход ненасыщенных АГЭ (от исходного содержания в жире) - 74,1%.
Содержание ненасыщенных АГЭ в концентрате - 67,4%.
Результаты представлены в табл.
ПРИМЕР 3
Для получения ненасыщенных АГЭ было взято 600 мг суммарных насыщенных и ненасыщенных АГЭ, выделенных на стадии хроматографической очистки АГЭ в Примере 1.
Выделение ненасыщенных АГЭ было проведено как в Примере 1 со следующими изменениями:
- концентрация суммарных АГЭ в неполярном органическом растворителе составляла 2,0%;
- в качестве неполярного растворителя использовали петролейный эфир;
- экстракцию ненасыщенных АГЭ проводили 45%-ным водным этанолом;
- при экстракции соотношение жидких фаз неполярная: полярная=1:1,6, об./об.;
3
- соотношении ненасыщенные АГЭ: AgNO=1:7, моль/моль;
- количество экстракций 2.
Выход ненасыщенных АГЭ на стадии экстракции - 91,1%.
Общий выход ненасыщенных АГЭ (от исходного содержания в жире) - 75,4%.
Содержание ненасыщенных АГЭ в концентрате - 69,7%.
Результаты представлены в табл.
Предложенный методический подход позволил получить как насыщенные АГЭ с чистотой 96,0% (Биологически активная добавка к пище «Липидомарин»), так и концентрат с содержанием ненасыщенных АГЭ - 67,4-69,7%. При этом особенностью является использование простых методов выделения, не требующих сложного оборудования и высокой квалификации персонала, которые могут быть применены в любой исследовательской лаборатории для получения необходимых количеств биологически активных АГЭ.
Как видно из вышеприведенных примеров и результатов, приведенных в табл., заявляемый способ позволяет получить концентрат ненасыщенных АГЭ хорошего качества с высоким выходом, при этом способ является не только технологически не сложным, но и является экономически выгодным, поскольку максимально использует ценное морское сырье.
3
Осажденное при осуществлении способа серебро (в виде нерастворимой соли AgCl) отфильтровывают и известными химическими манипуляциями переводят в AgNO и заново используют в способе.
Сорбент (силикагель) после выделения суммарных алкил-глицериновых эфиров промывают смесью этанол-уксусная кислота, прокаливают при 650°С в течение 8 часов и заново используют для разделения липидов.
Растворы органических растворителей регенерируют, пуская заново в процесс, а не утилизируемый кубовый остаток, остающийся после выпаривания и представляющий собой свободные жирные кислоты, может быть использован в технологии получения концентрата омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (Патент РФ №1581737 от 21.05.1993 «Способ получения концентрата этиловых эфиров эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот», Касьянов С.П., Латышев Н.А., Глушенко Т.В.).
Получаемый по способу концентрат ненасыщенных АГЭ расширяет возможности исследователей по его применению в биохимических, медицинских и диетологических экспериментах по разработке отечественных эффективных лекарственных средств противоракового действия, при иммунодефицитных состояниях и других социально-значимых заболеваниях.