Генетические эффекты лекарственных препаратов — модуляторов липидного обмена

Оригинальные исследования

199

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ -МОДУЛЯТОРОВ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА

М.Я. Ибрагимова 1 В.В. Семенов 2, Я.Х. Ибрагимов 3, Ш.Д. Валидов 1, Р.И. Жданов 1

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

2 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия

3 Казанская государственная медицинская академия, Казань, Россия

Genetic effects of medicines - lipid exchange modulators

M.Y. Ibragimova 1, V.V. Semenov 2, YaKh Ibragimov 3, ShZ. Validov1, R.I. Zhdanov1

1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

2 Kazan State Medical University, Kazan, Russia

3 Kazan State Medical Academy, Kazan, Russia

Известны лекарственные вещества — лиганды адренорецепторов, воздействующие на разные аспекты липидного обмена, поэтому изучение их мутагенного и антимутагенного потенциала, их генотоксичности представляет большой интерес.

Исследования выполнены на мышах (самцы) линии С 57В4/6 массой 20 г (1,5-2-месячный возраст). Мутагенный и антимутагенные эффекты веществ были определены in vivo на двух тест-объектах: клетки костного мозга мышей (число аберраций хромосом) и эритроциты (количество клеток с микроядрами из 2000 проанализированных клеток) периферической крови мышей. На каждый экспериментальный и контрольный вариант брали по 6 самцов лабораторных животных.

Все исследованные лекарственные препараты — эпи-нефрин, фенилэфрин, орципреналин, пророксан и про-пранолол (кроме эпинефрина, 50 мг/кг) — в большинстве исследованных доз достоверно не повышали уровень аберраций хромосом и число микроядер в эритроцитах периферической крови. Эпинефрин, фенилэфрин, орципреналин в исследованных дозах проявляли протекторный эффект и снижали уровень аберраций и микроядер в эритроцитах периферической крови мышей, индуцированных циклофос-фамидом. Пророксан и пропранолол не снижали уровень аберраций. Оказалось, что лиганды адренорецепторов, снижающие или повышающие уровень липидов, в большинстве исследованных доз не оказывали мутагенного эффекта и, наоборот, проявляли антимутагенный эффект в широком диапазоне доз.

Полученные результаты свидетельствуют, что на уровне организма функционирует система, участвующая одновременно в реализации липидного обмена и мутагенеза/анти-мутагенеза, действие которой реализуется через мембранные рецепторы клеток. По механизму действия эта система полирецепторна, то есть в ней принимают участие и аи p-адренорецепторы, а также поливалентна, то есть и стимуляторы и блокаторы рецепторов участвуют в формировании клеточного антимутагенеза.

Ключевые слова: мутагенез, антимутагенез, генотоксичность, циклофосфамид, адренорецепторы и их лиганды.

Одним из важных факторов контроля баланса липидов в организме является сложная система адренорецепторов [1]. В настоящее время известно большое количество лигандов адренорецепторов, воздействующих на разные аспекты липидного обмена, поэтому изучение их мутагенного и антимутагенного потенциала в зависимости от природы их влияния на липидный обмен представляет большой интерес [2—5]. В связи с тем, что катехоламины (адреналин и норадреналин) активно участвуют в липогенезе, для нас представляло интерес исследование генетических эффектов лигандов адренорецепторов.

е-mail: milyaushayakub@rambler.ru

There are medicines known as adrenoreceptors ligands, which influences a variety of lipid exchange, therefore the study of their mutagenic and antimutagenic potentials, their genotoxicity, is of great interest.

The study are fullfiled using C57B4/6 mice (males) of 20 g and 1,5—2 months of age. Mutagenic and antimutagenic effects of the ligands were evaluated using in vivo tests: mouse brain skeleton cells (a number of chromosomal aberrations) and mouse peripheral red blood cells peripheral (a number of cells with micronuclei from 2000 analyzed cells). 6 male mice were used for every experimental and control variant.

All medicines studied — epinephrine, phenylephrine, orciprenalin, proroxan, and propranolol (besides epinephrine, 50 mg/kg) — in a majority of doses used don't increase the level of chromosomal aberrations and the number of red blood cells with micronuclei.Epinephrin, phenylephrine, orciprenalin in doses studied demonstrated a protector effect and decreased a level of chromosomal aberrations and a number of red blood cells with micronuclei induced by cyclophosphamide administration. Proroxan and propranolol didn't change a level of aberrations. It was shown that adrenoreceptor ligands decreasing or increasing lipid level did not express mutagenic effect, and, in opposite, expressed antimutageni which testify that the system participating simultaneously in a realization of lipid exchange and mutagenesis/ antimutagenesis exists. An action of the system is realized via cell membrane receptors. According mechanism of action, the system is polyreceptoric (a- and р-adrenoreceptors take a part) and polyvalent, namely, receptor stimulators and blocators take a part in a formation of cell antimutagenesis.

Key words: mutagenesis, antimutagenesis, genotoxicity, cyclophosphamide, adrenoreceptors and their ligands.

В данной работе представлены данные о количественном анализе хромосомных аберраций, генотоксичности, под влиянием стимуляторов и блокаторов адренорецепторов: эпинефрина гидротартрата (ЭГТ, а- и р-адреномиметик), фенилэфрина, (ФЭР, а-адреномиметик), орци-преналина (ОРП, p-адреномиметик), пророксана (ПРС, а-адреноблокатор) и пропранолола (ППЛ, Р-адреноблокатор). Генотоксичность этих биоактивных веществ была определена на двух тестобъектах: клетки костного мозга мышей (in vivo) и эритроциты (микроядра) периферической крови мышей (in vivo).

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

200

Оригинальные исследования

Генотоксичность определяли в два этапа. На первом этапе исследовали мутагенную, на втором — антимутагенную активность лигандов. Это позволило отобрать немутагенные дозы препаратов для второго этапа исследования протекторной активности. В этом случае мутагенный эффект биоактивных веществ не перекрывал антимутагенный.

Материал и методы

Определение мутагенной и антимутагенной

активности биологически активных веществ

Исследования выполнены на мышах (самцы) линии С 57В4/6 массой 20 г (1,5-2-месячный возраст). На каждый экспериментальный и контрольный вариант брали по 6 животных. Мыши содержались в условиях вивария согласно международным критериям на подстилку rinofix, корм и воду adlibitum. При определении мутагенного и антимутагенного эффектов лиганды адренорецепторов вводили подкожно однократно. Через 8 ч внутрибрюшинно вводили индуктор мутаций — алкилирующий цитостатический препарат — циклофосфамид (ЦФ) в дозе 30 мг/кг. Мутаген и биологически активные добавки (БАВ) растворяли в физиологическом растворе непосредственно перед введением животным. За 2,5 ч до окончания опыта мышам внутрибрюшинно вводили 2,5 мг/кг колхицина. Через 24 ч после инъекции животных эвтанази-ровали путем делонгации. Препараты костного мозга готовили по стандартной методике [5, 6].

Костный мозг из бедренных костей мышей вымывали 0,95% раствором лимоннокислого трехза-мещенного цитрата натрия. После термостатирования (40 мин), центрифугирования (5 мин, 1000 об/мин) остаток трижды фильтровали в смеси метанол: ледяная уксусная кислота (3:1). Суспензию раскапывали на охлажденные предметные стекла и высушивали в струе теплого воздуха. В контрольном и экспериментальном вариантах анализировали по 500 метафаз. Регистрировали клетки с 40 хромосомами, с хорошим разбросом, без наложений.

Для анализа микроядер использовались стандартные методики [7], в частности, в эритроцитах периферической крови через 24 ч после инъекции производили забор крови из хвостовой вены мыши, изготавливали мазок и проводили исследование под микроскопом. Подсчитывали количество клеток с микроядрами из 2000 проанализированных клеток [8]. Антимутагенный эффект (АЭ) лигандов рассчитывали по формуле:

АЭ = (((Ам - Ак) - (Ал+м - Ал)) / (Ам - Ак))-100,

где Ам - уровень микроядер (МЯ); индуцированных мутагеном; Ак (контроль) - уровень МЯ (спонтанных аберраций); Ал+м - уровень МЯ при обработке тестобъекта лигандом и мутагеном; Ал (контроль) - уровень МЯ после обработки клеток лигандом [9,10].

За 100% антимутагенный эффект принят такой, при котором вещество полностью нивелирует эффект мутагена (или выводит определяемый параметр мутагенности на уровень спонтанного контроля).

В эксперименте использовали следующие лекарственные препараты: ЭГТ в ампулах

(Познаньский фармацевтический завод «Польфа», Польша); ПРС в таблетках по 0,015 г или в ампулах (1%) (Ай си эн октябрь, Россия); ППЛ в таблетках по 40 мг или в ампулах (0,1%) (ISIS PHARMA, Германия) [5, 11-13]. В качестве мутагена использовали ЦФ, (Биохимик, Россия) [14, 15].

Расчет АЭ производили по двум формулам. Первая формула позволяет рассчитать процент снижения аберраций хромосом относительно индуктора мутаций:

АЭ = ((М1 - М2) / М1)-100,

где М1 - процент метафаз с нарушениями при действии мутагена; М2 - процент метафаз с нарушениями при действии мутагена и протектора.

Вторая формула позволяет дать количественную оценку эффекта модификации (g), повреждающего действия мутагена:

g = (A / (В + С - (В-С)) - 1,

где А - число генетических повреждений (аберрации хромосом) при совместном применении модификатора и мутагена; В - число генетических повреждений, наблюдаемых при использовании мутагена; С - число генетических повреждений, наблюдаемых при использовании антимутагена (контроль). Положительное значение показателя g свидетельствует об усилении мутагенного эффекта, отрицательное -об его уменьшении [9].

Данные обработаны методами статистического анализа и представлены в виде M+/-m, где М - среднее значение и m - средняя квадратичная ошибка.

Результаты

Мутагенные эффекты модуляторов

липидного обмена

Как видно из данных, представленных на рисунках 1 и 2, практически все исследованные лекарственные препараты в большинстве использованных доз достоверно не повышали уровень аберраций хромосом в клетках костного мозга (рис. 1) и число микроядер (рис. 2) в эритроцитах периферической крови мышей (in vivo).

Исключение составил ЭГТ (рис. 1), который в дозе 50 мг/кг достоверно повысил число мутаций (6,40%), по сравнению с контролем (2,22%).

АЭ модуляторов липидного обмена в клетках

костного мозга мышей

Поскольку препараты, использованные в исследовании, являются адреномиметикам и адренобло-каторам, поэтому сначала представлены результаты опытов по модификации мутагенного эффекта ЦФ стимуляторами адренорецепторов (ЭГТ, ФЭР, ОРП), а затем блокаторами (ПРС, ППЛ) [16, 17].

Значения максимальных АЭ биологически активных веществ в зависимости от индуктора мутаций ЦФ представлены на рис. 3. ЭГТ в большинстве исследованных доз достоверно снижал уровень аберраций, индуцированный ЦФ. Доза 5 мг/кг не привела к статистически значимому снижению числа аберраций хромосом (18,20% в опыте и 19,20% в контроле). Наиболее значительный протекторный эффект выявлен у препарата в дозе, равной 5х10-2 мг/кг, наименее - в дозе 0,5 мг/кг (55,2% и 40,6%, соответственно). При ЦФ-индуцированном мута-

гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

Оригинальные исследования

201

генезе ФЭР в дозе 10 мг/кг достоверно снижал уровень аберраций (АЭ = 35,3%) (рис. 3). Дозозависимый эффект препарата не отмечен. ОРП обладал способностью снижать уровень ЦФ-индуцированных мутаций. Однако протекторный эффект был характерен для препарата в высоких дозах. ОРП при воздействии на ЦФ-индуцированный мутагенез проявил активность при дозах 0,005—5 мг/кг. Наибольший антимутагенный эффект был равен 50,0% при дозе препарата 0,5 мг/кг. Отчетливой зависимости эффекта от дозы не отмечалось. ПРС ни в одном случае не уменьшил число перестроек хромосом, индуцированных ЦФ. ППЛ снижал уровень хромосомных мутаций, индуцированных ЦФ, только в одной дозе 1х10-2 мг/кг. АЭ этой дозы составил 32,5%.

- Эпинефрина гидротартрат Пророксан

• Фенилэфрин ..... Пропранолол

Орципреналин

Рис. 1. Мутагенная активность лигандов адренорецепторов в клетках костного мозга мышей

Рис. 2. Мутагенная активность лигандов адренорецепторов в эритроцитах периферической крови мышей

s? во

ЭГТ ФЭР ОРП ПРС ППЛ

Рис. 3. Максимальный антимутагенный эффект биологически активных веществ в клетках костного мозга мышей: ЭГТ — эпинефрина гидротартрат;

ФЭР — фенилэфрин; ОРП — орципреналин;

ПРС — пророксан; ППЛ — пропранолол

АЭ лекарственных препаратов в эритроцитах периферической крови мышей

Значения максимальных антимутагенных эффектов лекарственных веществ в зависимости от индуктора мутаций ЦФ представлены на рисунке 4. ЭГТ во всех исследованных дозах снижал число микроядер в эритроцитах периферической крови мышей, индуцированных ЦФ. Как и в случае учета хромосомных аберраций, не отмечен дозозависимый эффект препарата. Наиболее значительный протекторный эффект выявлен у препарата в дозах 5 и 0,5 мг/кг, наименьший — в дозе 5х10-3 мг/кг (87,5% и 62,5%, соответственно). При мутагенезе, индуцированном ЦФ, ФЭР во всех исследованных дозах 0,001—10 мг/кг снижал уровень аберраций (АЭ = 75,0—87,5%). ОРП во всех исследованных дозах 0,005—5 мг/кг понижал число аберраций (АЭ = 62,5—87,5%), индуцированных ЦФ. ПРС во всех исследованных дозах (0,001—10 мг/кг) проявлял протекторные свойства. ППЛ снижает число микроядер в эритроцитах периферической крови мышей, индуцированных ЦФ. Наибольший антимутагенный эффект проявлялся при двух дозах: 1х10-3 и 1 мг/кг (АЭ = 75,0%), наименьший — при 1х10-2 и 10 мг/кг (АЭ = 50,0%).

100 т

5s 90 -

ЭГТ ФЭР ОРП ПРС ППЛ

Рис. 4. Максимальный антимутагенный эффект биологически активных веществ в эритроцитах периферической крови мышей: ЭГТ — эпинефрина гидротартрат; ФЭР — фенилэфрин;

ОРП — орципреналин; ПРС — пророксан;

ППЛ — пропранолол

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

202

Оригинальные исследования

Обсуждение

В работе мы исследовали способность модуляторов липидного обмена — адренотропных биологически активных веществ — индуцировать в клетке два противоположных эффекта: мутагенез и антимутагенез. В полной мере оценить эти эффекты мы могли лишь при изучении генетической активности этих лигандов в широком диапазоне доз. Используемые нами методы анализа хромосомных мутаций в клетках костного мозга мышей и микроядра в эритроцитах периферической крови мышей после введения анализируемых лекарственных средств позволили получить наглядное и подробное представление о генетических эффектах лигандов АР, участвующих в липидном обмене.

Мы выявили небольшой, но достоверный мутагенный эффект высоких доз ЭГТ в клетках костного мозга лабораторных рандобредных мышей (50 мг/кг) (см. рис. 1). Очевидно, в экстремальных ситуациях у животных и человека их стресс-реализующая система, в том числе и адренергическая, может быть причиной резкого возрастания числа аберраций в клетках. Подобный факт описали некоторые исследователи [16—21]. Антимутагенный эффект с небольшими колебаниями сохранялся до действующей дозы эпинефрина 10-3 мг/кг в опытах с мышами. Показано, что ЭГТ, по сравнению с другими препаратами, проявлял больший генопротекторный эффект — у него один из наиболее высоких АЭ (см. рис. 3). Для выяснения механизма защитного действия эпинефрина лучше учитывать работы [2, 22], в которых показано, что вследствие быстрого распада эпинеф-рина в клетках животных внутриклеточные взаимодействия этого гормона не представляют большого научного интереса по сравнению с тем, какое существенное значение имеют его взаимодействия с рецепторами клеточной мембраны.

Антимутагенный эффект лигандов проявлялся в широком диапазоне доз, что наиболее характерно для ЭГТ, ОРП и ППЛ. Анализируя АЭ эпинеф-рина, необходимо отметить, что он был выявлен в широком диапазоне доз, в том числе и в низких дозах. Показано, что протекторный эффект эпи-нефрина, достигнув определенной величины, имел тенденцию сохраняться с небольшими (как правило, недостоверными) колебаниями на протяжении значительного диапазона доз. Полученные результаты исследования позволяют утверждать, что АЭ эпинефрина может реализоваться через рецепторную систему клетки, активация которой приводит к формированию резистентности клетки к мутагенам. Это не исключает и другие пути формирования

ЛИТЕРАТУРА:

1. Северин Е.С. Биохимия: учебник для вузов. Москва: ГЭОТАР-Медиа; 2003.

2. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. Волгоград: Семь ветров; 1999.

3. Wacker D., Fenalti G., Brown M. A. et al. Conserved binding mode of human beta2 adrenergic receptor inverse agonists and antagonist revealed by X-ray crystallography. J. Am. Chem. Soc. 2010; 132 (33): 11443-5.

4. Ибрагимова М.Я., Семенов В.В., Валеева И.Х. и др. Оценка мутагенной и антимутагенной активности лигандовадренорецепто-ров на воздушно-сухих семенах Crepiscapillaries. Каз. Мед. Журнал. 2011; 92(1): 107-11.

5. Ибрагимова М.Я., Семенов В.В., Жданов Р.И. Мутагенная и антимутагенная активность лигандов а- и p-адренорецепторов в клетках костного мозга мышей. Каз. Мед. Журнал. 2011; 92(2): 249-51.

клеточного антимутагенеза. Один из таких путей, возможно, задействован при обработке клеток высокими дозами эпинефрина [4, 5]. Как известно, ЭГТ стимулирует а- и p-адренорецепторы. Наши результаты не позволяют однозначно связать супрессорный эффект эпинефрина с преимущественным действием на какой-либо определенный тип рецептора. Однако степень их участия в обеспечении защиты клетки/организма от мутагенов различна. В нашем исследовании в формировании резистентности клетки к мутагену ЦФ преимущественно принимали участие p-адренорецепторы. Как известно, эти рецепторы регулируют клеточный метаболизм (гомеостаз) через цАМФ-зависимую систему [23]. Эта система принимает участие в активации внутриклеточных систем защиты генома [24]. Известны факты, подтверждающие участие рецепторных систем клетки в формировании клеточного мутагенеза. Эти факты основываются на том, что ДНК-повреждающий эффект ряда мутагенов может реализоваться через рецепторную систему клетки [25]. В работе M.L. Arruzazabala и соавт. (2011) показано прямое взаимодействие жирных кислот с а-адрено-рецептором [26].

Таким образом, сказалось, что лиганды адренорецепторов, снижающие или повышающие уровень липидов, в большинстве исследованных доз не оказывали мутагенного эффекта (см. рис. 1, 2) и, наоборот, проявляли АЭ в широком диапазоне доз (см. рис. 3, 4). По всей видимости, на уровне организма функционирует система, участвующая одновременно в реализации липидного обмена и мутагенеза/ антимутагенеза, действие которой реализуется через мембранные рецепторы клеток. По механизму действия эта система полирецепторна, то есть в ней принимают участие представители различных типов рецепторов (а- и р-АР), и поливалентна, то есть и стимуляторы (ЭГТ, ФЭР, ОРП) и блокаторы (ПРС, ППЛ) рецепторов участвуют в формировании клеточного антимутагенеза [5, 25].

Благодарности

Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущихмировых научно-образовательных центров, а также за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности и поддержана грантом РФФИ № 12-03-97089-рповолжье.

6. Preston R.J., Dean B.J., Galloway S. et al. Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells. Mutat. Res. 1987; 189: 157-65.

7. Hodgson E. A Textbook of modern toxicology. USA: Wiley; 2004.

8. Ильинских И.Н., Новицкий В.В., Ильинских Е.Н. и др. Инфекционная кариопатология. Томск: Изд-во Томск. университета; 2005.

9. Бочков Н.П., Дурнев А.Д., Журков В.С. Система поиска и изучения соединений с антимутагенными свойствами. Хим.-фарм. журнал. 1992; 26(9): 42-6.

10. Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Мутагены. М.: Медицина; 1998.

11. LeeP., DayR.O., GreenfieldJ.R. et al. Formoterol, ahighlyp2-selective agonist, increases energy expenditure and fat utilization in men. Int. J. Obes. (Lond). 2013; 37(4): 593-97.

12. Tayel S.I., Khader H.F., El-Helbawy N.G. et al. Association of deletion allele of insertion/deletion polymorphism in а2В adrenoceptor

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

Оригинальные исследования

203

gene and hypertension with or without type 2 diabetes mellitus. Appl. Clin. Genet. 2012; 5: 111-8.

13. Ward P.W., Shaneyfelt T.M., Roan R.M. et al. Acute ischaemic colitis associated with oral phenylephrine decongestant use. BMJ Case Rep. 2014.

14. Ибрагимова М.Я., Скальный А.В., Валеева И.Х. и др. Влияние циклофосфамида на баланс макро- и микроэлементов и индикаторы перекисного окисления липидов в органах в эксперименте. Вестниквосстан. Мед. 2013; 2: 70-4.

15. Jnaneshwari S, Hemshekhar M., Santhosh M.S. et al. Crocin, a dietary colorant, mitigates cyclophosphamide-induced organ toxicity by modulating antioxidant status and inflammatory cytokines. J. Pharm. Pharmacol. 2013; 65(4): 604-14.

16. Ибрагимова М.Я., Семенов В.В., Ибрагимова Л.Я. и др. Адреналин — модификатор мутагенеза, индуцированного этилметансульфонатом. Каз. Мед. Журнал. 2005; 86(3): 231—2.

17. Ибрагимова М.Я., Семенов В.В., Харитонов В.С. и др. Имеется ли мутагенная и антимутагенная активность у стимуляторов а- и р- адренорецепторов? Каз. Мед. Журнал. 2007; 88 (3): 280.

18. Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. М.: Наука; 1981.

19. Михеев В.С., Анисимова Л.Е. Мутагенность гормонов и гормональных препаратов. 1988. Деп. в ВИНИТИ № 8871-В88.

20. Середенин С.Б., Дурнев А.Д. Фармакологическая защита генома. Москва: ВИНИТИ; 1992.

21. Pasachan S.C., Sabhlok V.P. Effect of thyroidectomy on bone marrow chromosomes and growth of swiss albino mice at various stages of development. HarayanaAgr. Univ. Res. 1983; 13: 213-7.

22. Петров Р.В., Зиганшина Л.Е. Справочник-путеводитель практикующего врача: Лекарственные средства. Москва: ГЭОТАР-МЕД; 2003.

23. Schlachetzki J.C., Fiebich B.L., Haake E. et al. Norepinephrine enhances the LPS-induced expression of COX-2 and secretion of PGE2 in primary rat microglia. J. Neuroinflammation. 2010; 7:2.

24. Семенов В.В., Студенцова И.А., Дурнев А.Д. и др. Антимутагены как модификаторы циклазной системы клетки. Вопросы медицинской химии. 1994; 40(3): 48-50.

25. Гайнуллина М.Я. Лиганды адренорецепторов - модуляторы клеточного мутагенеза [диссертация]. КГУ; 2000.

26. Arruzazabala M.L., Perez Y., Ravelo Y. et al. Effect of oleic, lauric and myristic acids on phenylephrine-induced contractions of isolated rat vas deferens. Indian J. Exp. Biol. 2011; 49 (9): 684-8.

Поступила: 17.09.2014

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014