СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ БАКТЕРИИ-ПРОДУЦЕНТА (2S,3R,4S)-4-ГИДРОКСИ-L-ИЗОЛЕЙЦИНА, БАКТЕРИЯ-ПРОДУЦЕНТ (2S,3R,4S)-4-ГИДРОКСИ-L-ИЗОЛЕЙЦИНА И СПОСОБ ПРОДУКЦИИ (2S,3R,4S)-ГИДРОКСИ-L-ИЗОЛЕЙЦИНА ИЛИ ЕГО СОЛИ
METHOD OF BUILDING (2S,3R,4S)-4-HYDROXY-L-ISOLEUCINE PRODUCING BACTERIA, (2S, 3R, 4S)-4-HYDROXY-L-ISOLEUCINE PRODUCING BACTERIA AND METHOD OF PRODUCING (2S, 3R, 4S)-HYDROXY-L-ISOLEUCINE OR SALT THEREOF

Область техники
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения 4-гидрокси-L-изолейцина или его соли с использованием бактерии-продуцента L-изолейцина. Данная бактерия модифицирована путем введения фрагмента ДНК, содержащего ген, кодирующий белок с L-изолейциндиоксигеназной активностью, что ведет к продукции (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина.
Описание предшествующего уровня техники
4-гидрокси-L-изолейцин является аминокислотой, которая может быть экстрагирована и очищена из семян пажитника греческого (Trigonella foenum-graecum L.leguminosae). Препарат 4-гидроксиизолейцина проявляет инсулинотропную активность, что вызывает большой интерес, поскольку этот стимулирующий эффект явно зависит от концентрации глюкозы в плазме, что показано как на модели изолированных перфузионных поджелудочных железах крыс, так и в кусочках ткани поджелудочных желез человека (Sauvaire, Y. et al. Diabetes, 47: 206-210 (1998)). Такая зависимость инсулинотропного эффекта от концентрации глюкозы не подтверждается в случае с сульфонилмочевиной (Drucker, D.J., Diabetes 47: 159-169 (1998)), единственным инсулинотропным препаратом, используемым в настоящее время для лечения диабета типа II [не инсулинзависимого диабета (NIDD) или (NIDDM)], и, как следствие, гипогликемия остается основным нежелательным побочным эффектом лечения сульфонилмочевиной (Jackson, J., and Bessler, R. Drugs, 22: 211-245; 295-320 (1981); Jennings, A. et al. Diabetes Care, 12: 203-208 (1989)). Известно также свойство 4-гидроксиизолейцина повышать толерантность организма к глюкозе (Am. J. Physiol. Endocrinol., Vol.287, E463-E471, 2004). Способность 4-гидроксиизолейцина ускорять метаболизм глюкозы и потенциальная возможность его применения в качестве лекарственного средства и компонента функционального питания были раскрыты в выложенной патентной заявке Японии Hei 6-157302 и в патентной заявке США US 2007-000463 A1.
4-гидрокси-L-изолейцин обнаружен только в растениях и благодаря его специфической инсулинотропной активности может рассматриваться в качестве нового стимулятора секреции с потенциальным применением для лечения диабета II типа, т.к. это заболевание характеризуется недостаточной секрецией инсулина, связанной с различной степенью устойчивости к инсулину (Вrоса, С. et al. Am. J. Physiol. 277 (Endocrinol. Metab. 40):Е617-Е623 (1999)).
Метод окисления изолейцина кислородом воздуха в присутствии железа, аскорбиновой кислоты и 2-оксиглутаровой кислоты с использованием диоксигеназной активности экстракта пажитника греческого был предложен в качестве способа получения 4-гидрокси-L-изолейцина (Phytochemistry, Vol.44, No.4, pp.563-566, 1997). Однако этот способ не пригоден для промышленного получения 4-гидроксиизолейцина, так как активность фермента ингибируется субстратом при концентрациях изолейцина от 20 мМ и выше, к тому же фермент до сих пор не идентифицирован, его получают из экстрактов растений в небольших количествах и активность его быстро падает.
К настоящему времени описан эффективный способ синтеза оптически чистого (2S,3R,4S)-4-гидроксиизолейцина с общим выходом 39%, состоящий из восьми стадий. Ключевая стадия этого процесса синтеза включает в себя биотрансформацию этил-2-метилацетоацетата в этил-(2S,3S)-2-метил-3-гидроксибутаноат с помощью Geotrichum candidum и асимметрического синтеза Штрекера (Wang, Q. et al., Eur. J. Org. Chem., 834-839 (2002)).
Также описан короткий шестистадийный ферментохимический способ синтеза (2S,3R,4S)-4-гидроксиизолейцина с общим контролем стереохимии, последней стадией которого является ферментативное разложение путем гидролиза производного N-фенилацетиллактона с использованием коммерчески доступной пенциллинацилазы G, иммобилизованной на Eupergit C(E-PAC) (Rolland-Fulcrand, V. et al., J. Org. Chem., 873-877 (2004)).
Однако в настоящее время отсутствуют сообщения о продукции (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина с использованием бактерии-продуцента L-изолейцина, модифицированной путем введения фрагмента ДНК, содержащего ген, кодирующий белок с L-изолейциндиоксигеназной активностью.
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является увеличение продукции (2S,3R,4S)-4-L-гидроксиизолейцина (данный термин может включать как его свободную форму, так и его соли и может также упоминаться как «(2S,3R,4S)-4HIL»), предоставление способа продукции (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина или его соли путем прямого энзиматического гидроксилирования L-изолейцина. В данном способе используют бактерию-продуцент L-изолейцина, модифицированную путем введения фрагмента ДНК, содержащего ген, кодирующий белок с L-изолейциндиоксигеназной активностью.
Изобретатели настоящего изобретения выделили из природного источника бактерию с высоким уровнем L-изолейциндиоксигеназной активности, клонировали ген, кодирующий L-изолейциндиоксигеназу, и обнаружили, что L-изолейциндиоксигеназа предпочтительно используется для синтеза (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина.
Цель настоящего изобретения включает предоставление способа продукции гидрокси-L-изолейцина с использованием бактерии-продуцента L-изолейцина, модифицированной путем введения фрагмента ДНК, содержащего ген, кодирующий белок с активностью L-изолейциндиоксигеназы. Вышеупомянутая цель была достигнута обнаружением того факта, что бактерия с L-изолейциндиоксигеназной активностью продуцировала (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцин.
Целью настоящего изобретения является предоставление способа конструирования бактерии-продуцента (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина путем введения фрагмента ДНК, содержащего ген, кодирующий белок с L-изолейциндиоксигеназной активностью, в бактерию-продуцент L-изолейцина.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что бактерия принадлежит к роду Escherichia, Brevibacterium, Corynebacterium, Serratia или Mycobacterium.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что бактерия - Escherichia coli, Brevibacterium flavum, Corynebacterium glutamicum, Serratia marcescens или Mycobacterium album,
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что ген выбран из группы, состоящей из:
(a) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером 1 (SEQ ID No: 1);
(b) ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, приведенной в Перечне последовательностей под номером 1 (SEQ ID No: 1), при этом указанная ДНК кодирует белок с L-изолейциндиоксигеназной активностью;
(c) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером 2 (SEQ ID No: 2);
(d) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером 2 (SEQ ID No: 2), за исключением того, что указанная аминокислотная последовательность содержит замену, делецию, вставку, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков и при этом указанный белок имеет L-изолейциндиоксигеназную активность; и
(е) ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, включающий аминокислотную последовательность, гомологичную по крайней мере на 98% аминокислотной последовательности, приведенной в Перечне последовательностей под номером 2 (SEQ ID No: 2), при этом указанный белок имеет L-изолейциндиоксигеназную активность.
Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина, полученной описанным выше способом. Также целью настоящего изобретения является предоставление способа продукции (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина или его соли, включающего:
культивирование описанной выше бактерии в питательной среде и
выделение (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что бактерия модифицирована с целью увеличения активности L-изолейциндиоксигеназы.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что активность L-изолейциндиоксигеназы увеличена путем усиления экспрессии гена, кодирующего указанную L-изолейциндиоксигеназу.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что экспрессия L-изолейциндиоксигеназы увеличена за счет модификации последовательности, контролирующей экспрессию гена, кодирующего L-изолейциндиоксигеназу, или за счет увеличения числа копий гена, кодирующего L-изолейциндиоксигеназу.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что бактерия принадлежит к роду Escherichia, Brevibacterium, Corynebacterium, Serratia или Mycobacterium.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что бактерия - Escherichia coli, Brevibacterium flavum, Corynebacterium glutamicum, Serratia marcescens или Mycobacterium album.
Настоящее изобретение детально описано ниже.
НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Бактерия настоящего изобретения
В настоящем изобретении термин "(2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцин" или "(2S,3R,4S)-4HIL" или "4HIL" относится к отдельному химическому соединению или к смеси соединений, содержащей (2S,3R,4S)-4-гидроксиизолейцин.
Термин "бактерия", как он употребляется в настоящем описании, включает фермент-образующую бактерию, мутант и генетический рекомбинант такой бактерии, в которой имеется или увеличена целевая ферментативная активность, и т.п.
Можно употреблять аббревиатуру L-изолейциндиоксигеназы - IDO (L-isoleucine dioxygenase).
В результате скрининга природных микроорганизмов обнаружена уникальная бактерия - штамм Bacillus thuringiensis 2-e-2, обладающий активностью, катализирующей реакцию, в которой (2S,3R,4S)-4HIL образуется непосредственно из L-изолейцина, как в свободной форме, так и в форме соли. Из микробных клеток после культивирования очистили L-изолейциндиоксигеназу, в сокращенном варианте она может называться IDO(Lys, 23).
Кроме того, определена N-концевая аминокислотная последовательность IDO(Lys, 23) очищенной диоксигеназы штамма Bacillus thuringiensis 2-e-2. Штамм Bacillus thuringiensis 2-e-2 был назван Bacillus thuringiensis AJ 110584 и депонирован в соответствии с Будапештским Договором в International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan) 27 сентября 2006 г. с инвентарным номером FERM ВР-10688.
ДНК, кодирующая IDO(Lys, 23), представлена в Перечне последовательностей под SEQ ID No: 1. Кроме того, аминокислотная последовательность IDO(Lys, 23), кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, представлена в Перечне последовательностей под SEQ ID No: 2, SEQ ID NO: 2 - аминокислотная последовательность IDO(Lys, 23), кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. IDO(Lys, 23) с последовательностью SEQ ID NO: 2 обладает L-изолейциндиоксигеназной активностью и катализирует реакцию, в которой (2S,3R,4S)-4HIL, выраженный следующей формулой (I), синтезируется непосредственно из одной молекулы L-изолейцина.
ДНК, кодирующая IDO, катализирующую реакцию, в которой (2S,3R,4S)-4HIL образуется из L-изолейцина - не только ДНК, представленная в SEQ ID No: 1. Это связано с возможностью различий в нуклеотидных последовательностях среди видов и штаммов Bacillus, образующих IDO, катализирующую реакцию образования (2S,3R,4S)-4HIL из L-изолейцина.
ДНК настоящего изобретения включает не только выделенную ДНК, кодирующую IDO, но также и ДНК, кодирующую IDO, в которую искусственно введены мутации. Эта ДНК может быть выделена из хромосомы продуцирующего IDO микроорганизма. ДНК настоящего изобретения должна кодировать IDO, способную катализировать вышеуказанную реакцию. Методы искусственного введения мутаций включают обычно используемые методы введения сайт-специфических мутаций, описанные в Method, in Enzymol., 154 (1987).
ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности SEQ ID No: 1, и кодирующая белок с активностью IDO, также включена в ДНК настоящего изобретения. В рамках настоящего изобретения «жесткие условия» означают такие условия, при которых специфические гибриды образуются тогда, как неспецифические гибриды не образуются. Хотя количественное описание этих условий является затруднительным, в качестве примера можно сослаться на условия, при которых молекулы ДНК, имеющие более высокую гомологию, предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 80%, еще более предпочтительней не менее 90% и особенно предпочтительно не менее 95% или более, гибридизуются друг с другом, тогда как молекулы ДНК, имеющие более низкую гомологию, не гибридизуются друг с другом, или такие условия, при которых гибридизация имеет место при обычных условиях отмывки во время проведения гибридизации по Саузерну, которая проводится при концентрации солей, 0.1×SSC, 0.1% SDS при температуре 37°С, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS при температуре 60°С, и более предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS при температуре 65°С. Длина зонда может быть выбрана соответствующим образом, в зависимости от условий гибридизации и обычно варьирует от 100 п.о. до 1 тыс. п.о. Кроме того, "L-изолейциндиоксигеназная активность" может быть описана как активность, осуществляющая синтез (2S,3R,4S)-4HIL из L-изолейцина. Однако нуклеотидная последовательность, гибридизующаяся в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID No: 1, предпочтительно сохраняет L-изолейциндиоксигеназную активность на 10% или более, предпочтительно 30% или более, более предпочтительно 50% или более, и еще более предпочтительно 70% или более, относительно белка с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 2 в условиях 37°С и рН 8.
Кроме того, ДНК, кодирующая белок, по существу идентичный IDO, кодируемой SEQ ID No: 1, также включена в ДНК настоящего изобретения. А именно, следующие ДНК также включены в ДНК настоящего изобретения:
(a) ДНК с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No: 1;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID No: 1, и кодирующая белок с L-изолейциндиоксигеназной активностью;
(c) ДНК, кодирующая белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 2;
(d) ДНК, кодирующая белок с аминокислотной последовательностью, содержащей замену, делецию, вставку, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2, и обладающий L-изолейциндиоксигеназной активностью; и
(e) ДНК, кодирующая белок с аминокислотной последовательностью, гомологичной по крайней мере на 70%, предпочтительно по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 90% и еще более предпочтительно по крайней мере на 95% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и обладающий L-изолейциндиоксигеназной активностью.
В рамках настоящего изобретения фраза «один или несколько» означает диапазон изменений, при котором третичная структура белка или активность L-изолейциндиоксигеназы изменяется незначительно, в частности соответствует значениям от 1 до 78, предпочтительно от 1 до 52, более предпочтительно от 1 до 26 и еще более предпочтительно от 1 до 13.
Замена, деления, вставка, добавление или инверсия одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность фермента при этом сохраняется. Примером консервативной мутации(ий) являет(ют)ся консервативная замена(ы). Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Cys на Ser или Ala, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr, замену Ile на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val or Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp и замену Val на Met, Ile или Leu.
Кроме того, термин «L-изолейциндиоксигеназная активность» означает способность к продукции (2S,3R,4S)-4HIL из L-изолейцина, как описано выше. Однако, в случае, когда аминокислотная последовательность содержит замену, делению, вставку, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID No: 2, L-изолейциндиоксигеназная активность сохраняется, по крайней мере, не менее чем на 10%, предпочтительно не менее чем на 30%, более предпочтительно не менее чем на 50% и еще более предпочтительней на 70% и более от активности белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2, в условиях поддержания температуры на уровне 30°С и рН 6. Активность IDO L-изолейциндиоксигеназы согласно настоящему изобретению может быть измерена путем анализа образования (2S,3R,4S)-4HIL из L-изолейцина с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Кроме того, фрагмент ДНК, гомологичный фрагменту ДНК, показанному на SEQ ID NO: 1, может быть использован в качестве гена, кодирующего L-изолейциндиоксигеназу согласно настоящему изобретению. Тот факт, что гомологичный фрагмент ДНК кодирует или не кодирует L-изолейциндиоксигеназу, может быть подтвержден путем измерения L-изолейциндиоксигеназной активности в клеточном лизате или в клеточном лизате микроорганизма, в котором гомологичный фрагмент ДНК сверхэкспрессируется.
Фрагмент ДНК, гомологичный показанному на SEQ ID NO: 1, может быть также приготовлен из геномной ДНК других видов бактерий рода Bacillus, например из Bacillus cereus, Bacillus weihenstephanensis.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E. coli).
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Brevibacterium" означает, что данная бактерия классифицирована как принадлежащая к роду Brevibacterium согласно классификации, известной специалисту в области микробиологии. Примеры бактерии, принадлежащей к роду Brevibacterium, в качестве используемой в настоящем изобретении включают, но не ограничиваются, Brevibacterium flavum.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Corynebacterium" означает, что данная бактерия классифицирована как принадлежащая к роду Corynebacterium согласно классификации, известной специалисту в области микробиологии. Примеры бактерии, принадлежащей к роду Corynebacterium, в качестве используемой в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются, Corynebacterium glutamicum.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Serratia" означает, что данная бактерия классифицирована как принадлежащая к роду Serratia согласно классификации, известной специалисту в области микробиологии. Примеры бактерии, принадлежащей к роду Serratia, в качестве используемой в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются, Serratia marcescens.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Mycobacterium" означает, что данная бактерия классифицирована как принадлежащая к роду Mycobacterium согласно классификации, известной специалисту в области микробиологии. Примеры бактерии, принадлежащей к роду Mycobacterium, в качестве используемой в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются, Mycobacterium album.
Термин "бактерия-продуцент L-изолейцина", как он используется здесь, означает бактерию, которая способна к продукции L- изолейцина и вызывает накопление L-изолейцина в ферментационной среде в больших количествах, по сравнению с природным или родительским штаммом, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде L-изолейцин в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее чем 1.0 г/л.
Примеры бактерии-продуцента L-изолейцина, котрая может использоваться в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, мутантные штаммы, устойчивые к 6-диметиламинопурину (JP 5-304969 А), мутантные штаммы, устойчивые к аналогу изолейцина, такому как тиаизолейцин и гидроксамат изолейцина, и мутантные штаммы, дополнительно устойчивые к DL-этионину и/или гидроксамату аргинина и т.п. (JP 5-130882 А).
Кроме того, в качестве родительских штаммов могут также использоваться рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, кодирующими белки, вовлеченные в биосинтез L-изолейцина (JP 2-458 A, FR 0356739, and U.S. Patent No. 5,998,178).
Из бактерий-продуцентов L-изолейцина, принадлежащих к роду Escherichia, согласно настоящему наиболее предпочтительны бактерии Escherichia coli, содержащие оперон thrABC, который включает ген thrA, кодирующий аспартокиназу I-гомосериндегидрогеназу I, по существу не ингибируемую L-треонином. Данная бактерия также может содержать оперон ilvGMEDA, включающий ген ilvA, кодирующий треониндеаминазу, по существу не ингибируемую L-изолейцином, и с удаленной областью аттенуации. Кроме того, штамм-хозяин указанной бактерии, дефектный по гену thrC, может расти в присутствии 5 мг/мл L-треонина, дефектный по треониндегидрогеназной активности, и ген ilvA имеет мутацию с остаточным уровнем экспрессии. Конкретные примеры таких штаммов включают штаммы Escherichia coli AJ 12919 и AJ 13100 (U.S. Patent No. 5.998,178) и т.п.
Бактерией-продуцентом L-изолейцина, принадлежащей к роду Escherichia, согласно настоящему изобретению может также быть бактерия Escherichia, содержащая оперон thrABC, включающий ген thrA, кодирующий аспартокиназу I-гомосериндегидрогеназу I, по существу не ингибируемую L-треонином. Данная бактерия также может содержать ген lysC, кодирующий аспартокиназу III, по существу не ингибируемый L-лизином. Кроме того, данная бактерия может содержать оперон ilvGMEDA, включающий ген UvA, кодирующий треониндеаминазу, по существу не ингибируемую L-изолейцином, и с удаленной областью, требуемой для ослабления (U.S. Patent No. 5,998,178) и т.п.
Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, может включать оперон thrABC, ген lysC и оперон ilvGMEDA, описанные выше, на плазмиде или плазмидах.
Кроме того, бактерией-продуцентом L-изолейцина, принадлежащей к роду Escherichia, может быть штамм Escherichia coli с увеличенной активностью фосфоенолпируваткарбоксилазы и трансгидрогеназы, а также с увеличенной активностью аспартазы (ЕР 1179597 B1).
Бактерией-продуцентом L-изолейцина, принадлежащей к роду Brevibacterium, предпочтительно могут быть бактерии Brevibacterium flavum или Brevibacterium lactofermentum. У бактерий предпочтительно снижены чувствительность активности синтазы ацетогидроксикислот к ингибированию по типу обратной связи и ингибирование треониндеаминазы L-изолейцином. Конкретные примеры таких бактерий включают штаммы Brevibacterium flavum AJ 12406 (FERM P-10143, FERM BP-2509), Brevibacterium lactofermentum AJ 12403/pAJ220V3 (ЕР 0356739 B1) и т.п.
Бактерия-продуцент L-изолейцина, принадлежащая к коринебактериям, - предпочтительно бактерия, принадлежащая к коринеформным образующим глутаминовую кислоту организмам, устойчива к треонингидроксамату. Конкретные примеры таких штаммов включают штамм Corynebacterium glutamicum H-4260 (JP 62195293) и т.п.
Введение в бактерию фрагмента ДНК, содержащего ген, кодирующий L-изолейциндиоксигеназу, осуществляли путем трансформации бактерии вектором, содержащим фрагмент ДНК, содержащий ген, кодирующий L-изолейциндиоксигеназу. Подходящий вектор, например, - плазмида, автономно реплицирующаяся в клетках выбранных бактерий.
«Трансформация бактерии ДНК, кодирующей белок» означает введение ДНК в бактерию, например, традиционными методами. Трансформация этой ДНК приведет к увеличению экспрессии гена(-ов), кодирующего(-их) белок(-ки) настоящего изобретения, и к увеличению активности белка в бактериальной клетке. Трансформация может быть выполнена любыми известными методами, о которых имеются сведения к настоящему времени. Например, может быть использован метод обработки реципиентных клеток хлоридом кальция, для того чтобы увеличить проницаемость клеток для ДНК, описанный для штамма Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
Наличие или отсутствие гена на хромосоме бактерии можно определить известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну и т.п.
Приготовление плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. может быть выполнено обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
2. Способ согласно настоящему изобретению.
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина путем культивирования бактерии настоящего изобретения в питательной среде и выделения образовавшегося (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина из культуральной жидкости.
Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма, могут использоваться спирты, такие как этанол, и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами.
Примеры методов выделения и очистки могут включать метод, при котором (2S,3R,4S)-4HIL связывается с ионообменной смолой для адсорбции основных аминокислот с последующей элюцией и кристаллизацией, и метод, при котором продукт, полученный после элюции, обесцвечивается и фильтруется через активированный уголь с последующей кристаллизацией для получения (2S,3R,4S)-4HIL.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖА
На чертеже показана структура рекомбинантной плазмиды pMW119-IDO(Lys, 23).
Примеры
Настоящее изобретение будет более детально разъяснено ниже со ссылкой на примеры, которыми не ограничивается настоящее изобретение.
Lac
Пример 1. Конструирование штамма MG1655 (P-lacI-IlvA*)[pMW119-IDO(Lys, 23); pVIC401.
1.1. Конструирование плазмиды pMW119-IDO(Lys, 23).
Фрагмент ДНК хромосомы штамма Bacillus thuringiensis strain 2-e-2 величиной 0.8 т.п.н. амплифицировали в ПЦР с использованием олигонуклеотидов SVS 170 (SEQ ID No: 3) и SVS 169 (SEQ ID No: 4) в качестве праймеров и очищенной хромосомной ДНК в качестве матрицы. Использовали следующие условия для ПЦР: начальный цикл в течение 30 секунд при 94°С; 4 цикла: 40 секунд при 94°С; 30 секунд при 49°С; 40 секунд при 72°С; 35 циклов: 30 секунд при 94°С; 30 секунд при 54°С; 30 секунд при 72°С. Полученный в ПЦР фрагмент ДНК обрабатывали рестриктазами BamHI и SacI и затем лигировали в вектор pMW119, предварительно обработанный теми же рестриктазами. Таким образом была сконструирована плазмида pMW119-IDO(Lys, 23) (чертеж).
Lac
1.2. Конструирование штамма MG1655 (P-lacI-IlvA*)[pMW119-IDO(Lys, 23), pVIC40].
Lac
Lac
Lac
Lac
Клетки штамма MG1655(P-lacI-IlvA*) (Сычева Е.В. и др. Биотехнология, No. 4, 22-34, (2003)) трансформировали плазмидой pMW119-IDO(Lys, 23). Полученные клоны отбирали на чашках с X-gal/IPTG агаром (blue/white тест). Таким образом был получен штамм MG1655(P-lacI-IlvA*) [pMW119-IDO(Lys, 23)]. Штамм MG1655 (P-lacI-IlvA*) [pMW119-IDO(Lys, 23)] трансформировали плазмидой pVIC40 (RU 1694643, US 7,138,266). Полученные клоны отбирали на L-агаре с добавлением Sm. Таким образом был получен штамм MG1655(P-lacI-IlvA*) [pMW119-IDO(Lys, 23), pVIC40].
Lac
Пример 2. Продукция 4HIL штаммом E.coli MG1655(P-lacI-IlvA*) [pMW119-IDO(Lvs, 23), pVIC40].
Lac
Lac
4
2
4
2
4
4
3
Для оценки влияния экспрессии гена, кодирующего IDO, на продукцию 4HIL клетки штаммов MG1655(P-lacI-IlvA*) [pMW119, pVIC40] и MG1655(P-lacI-IlvA*) [pMW119-IDO(Lys, 23), pVIC40] инокулировали в среду ILE [глюкоза - 60 г/л, (NH)SO 15 г/л, KHPO 1.5 г/л, MgSO 1 г/л, тиамин 0.001 г/л, Триптон 1 г/л. Дрожжевой экстракт 0.5 г/л, СаСО 25 г/л, рН 7.0 (КОН), 1 мМ ИПТГ, соответствующие антибиотики (Ар, 100 мг/л; Sm, 100 мг/л)]. Клетки культивировали при 32°С в течение 72 часов с энергичным перемешиванием.
Затем исследовали накопление Ilе и 4HIL с использованием ВЭЖХ. Для ВЭЖХ анализа использовали хроматограф высокого давления (Waters, USA) со спектрофлуорометром серии 1100 (Agilent, USA). Выбранные диапазоны длин волн: длина волны возбуждения 250 нм, область длин волн эмиссии 320-560 нм. Разделение с помощью метода accq-tag осуществляли на колонке Nova-Pak™ C18 150×3,9 мм, 4 мкм (Waters,США) при +40°С. Объем пробы составлял 5 мкл. Образование производных аминокислот и их разделение осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя Waters (Liu. H. et al., J. Chromatogr. A, 828, 383-395 (1998); Waters accq-tag chemistry package. Instruction manual. Millipore Corporation, pp.1-9 (1993)).
Для получения производных аминокислот с 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбаматом использовали набор Accq-FluorTM (Waters, США). Анализ с помощью метода accq-tag осуществляли с использованием концентрированного элюента Accq-tag Eluent A (Waters, США). Все растворы готовили с использованием воды Milli-Q, стандартные растворы хранили при +4°С.
Lac
Lac
Lac
Результаты определения Ile и 4HIL, образованных штаммами MG1655(P-lacI-IlvA*) [pMW119, pVIC40] и MG1655(P-lacI-IlvA*) [pMW119-IDO(Lys, 23), pVIC40], представлены в Таблице. Как следует из Таблицы, MG1655(PLac-lacI-HvA*) [pMW119-IDO(Lys, 23), pVIC40] образовывал 4HIL, в отличие от MG1655(P-lacI-IlvA*) [pMW119, pVIC40].
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.
Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.
Промышленная применимость
Согласно настоящему изобретению может быть увеличена продукция (2S,3R,4S)-4-гидрокси-L-изолейцина, полезного в качестве компонента фармацевтических композиций с инсулинотропной активностью, с использованием бактерии, трансформированной фрагментом ДНК, содержащим ген, кодирующий белок с L-активностью изолейциндиоксигеназы.
Таблица
Штамм
Полученные конц., мМ
Ile
4HIL
MG1655(P<sub>Lac</sub>-lacI-IlvA*)[pMW119-IDO(Lys, 23); pVIC40]
14
1
MG1655(P<sub>Lac</sub>-lacI-IlvA*)[pMW119; pVIC40]
15
-