Модифицированный синтетический аналог природного опиоидного пептида энкефалина
MODIFIED SYNTHETIC ANALOGUE OF NATURAL OPIOID PEPTIDE ENKEPHALIN

Изобретение относится к области биологии, фармакологии, ориентированной на применение синтетических пептидов в медицинских целях (лекарственные пептиды, therapeutic peptides).
Мет-энкефалин (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met) и Leu-энкефалин (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu) являются природными пептидными нейромедиаторами, взаимодействующими с опиоидными рецепторами. Одним из проявлений такого взаимодействия является снижение (притупление) болевых ощущений (анестезия) и снятие судорог. Попытки стимулировать этот эффект путем введения энкефалина извне оказались малоэффективными из-за неблагоприятной фармакодинамики: быстрого разрушения пептида под действием пептидаз, локализованных на внешней поверхности нейронов.
2
Впервые более устойчивый синтетический аналог энкефалина был создан 50 лет тому назад. В нем 1-й глицин заменен на D-аланин (DAla), а С-концевой метионин (Met) амидирован: (Tyr-DAla-Gly-Phe-Met-NH). При внесении в мозг экспериментальных животных (крыса) эта модификация энкефалина оказала пролонгированное анестезирующее действие (до 90 мин) [1], [2.]
[1]. Pert СВ, Pert A, Chang JK, Fong ВТ (1976) (D-Ala 2)-Met-enkephalinamide: а potent, long-lasting synthetic pentapeptide analgesic. Science, 194, 330-332.
[2]. Katsuura G, Inouye K, Itoh S, Hsiao S. (1984) Analgesic effects of enkephalin analogs in rats. Life Sci., 35, 815-818.
Следует отметить, что D-аланин, входящий в состав указанной модификации, энкефалина, высвобождаясь при пусть и задержанном разрушении пептида, может оказаться токсичным (как конкурентный ингибитор при синтезе белков и др.). Этим можно объяснить отсутствие позднейших публикаций, посвященных этой модификации энкефалина.
Другая группа исследователей замкнула молекулу энкефалина в кольцо. С этой целью на 2-ю позицию (вместо 1-го глицина) помещали аминокислоту, в боковом радикале которой присутствует аминогруппа (была использована γ-аминомасляная кислота с внесенной аминогруппой). Эта аминогруппа, взаимодействуя с концевой карбоксильной группой замыкала молекулу в кольцо, оставляя тирозин (1-я позиция) снаружи (вне кольца).
Закольцованный таким способом энкефалин проявил устойчивость к внеклеточным пептидазам мозга, и в опытах с животными обнаружил продление (по сравнению с обычным энкефалином) биологической (анестезирующей) активности не менее чем на 60 мин. [3], [4]
[3] DiMaio J, Schiller PW (1980) A cyclic enkephalin analog with high in vitro opiate activity. Proc Natl Acad Sci USA, 77, 7162-7166.
[4] Touati-Jallabe Y, Bojnik E, Legrand В,  E, Chung NN, Schiller PW, Benyhe S, Averlant-Petit MC, Martinez J, Hernandez JF (2013) Cyclic enkephalins with a diversely substituted guanidine bridge or a thiourea bridge: synthesis, biological and structural evaluations. J Med Chem, 56, 5964-5973.
Слабым звеном в этой конструкции является находящийся вне кольца N-концевой тирозин, который может отщепляться присутствующими в мозге ферментами (аминопептидазами). Потерявшая биологическую активность кольцевая структура может быть очень стабильной и накапливаться в мозге как ненужный, а скорее, вредный шлак. Процедура получения закольцованной формы энкефалина технологически сложная. К синтезу модернизированного пептида добавляются этапы образования кольцевой структуры и ее очистки. При этом неизбежны и значительные потери.
В последнее время в литературе основное внимание уделяется димеризованным модификациям энкефалина - бифалинам (biphalins). Бифалины организованы по принципу «хвост к хвосту», и у них отсутствуют С-концевые звенья (Met5), а предыдущие звенья (Phe4) амидированы. Димеризация осуществляется по принципу «хвост к хвосту»:
2 (Tyr1-Gly2-Gly3-Phe4NH2)→
→Туг1-Gly2-Gly3-Phe4N-NPhe4'-Gly3'-Gly2'-Tyr1'
Для замыкания бифалина в кольцо вместо звеньев Gly2 и Gly2' вставлены звенья, способные образовать связь друг с другом, например, остатки цистеина (Cys), содержащие сульфгидрильные группы. При этом N-концевые звенья Tyr1 остаются вне кольца, что необходимо для сохранения пептидом биологической активности. Во многих вариантах, которые считаются наиболее эффективными, замыкание в кольцо происходит через циклическую молекулу-линкера (ксилол) [5]. В результате, получается довольно сложная конструкция с потенциально токсичными элементами (связь =N-N=, ксилол). В производстве такой препарат не может быть дешевым.
[5]. Stefanucci A, Carotenuto A, Macedonio G, Novellino Е, Pieretti S, Marzoli F,  E, Erdei A,  F, Benyhe S, Mollica A. (2017) Cyclic Biphalin Analogues Incorporating a Xylene Bridge: Synthesis, Characterization, and Biological Profile. CS Med Chem Lett. 8: 858-863.
Ранее [6] в мозге млекопитающих была обнаружена группа низкоспецифичных внеклеточных металлопептидаз, локализованных на поверхности аксонных окончаний нейронов. Они являются наиболее вероятными исполнителями функции катаболизма широкого круга нейропептидов. Эта функция является необходимой для контроля количества секретируемых клетками (эндогенных) нейропептидов, но эти же пептидазы способны разрушить вносимые в мозг (экзогенные) лекарственные пептиды [1, 2].
В работе [6] впервые было показано, что принадлежащие указанной группе аминопептидаза и карбоксипептидаза, деградирующие пептиды, соответственно, с N- или С-конца, не способны нарушить пептидную связь, в которой участвует бета-аланин βAla).
[6]. Kropotova ES, Mosevitsky MI. (2016) A Group of Weakly Bound to Neurons Extracellular Metallopeptidases (NEMPs). Neurochem Res. 41, 2666-2674.
Реализован способ защиты синтетических пептидов от разрушения внеклеточными экзопептидазами мозга, модифицированный таким образом, что на оба конца природного пептидного анальгетика Мет-энкефалина помещены остатки βAla, имеющий формулу: βAla-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-βAla (далее МодЭнк1), который обладает повышенной устойчивостью к активности внеклеточных экзопептидаз мозга, и в опытах на животных (крысах) при интраназальном его введении в количестве 0,4 микромоль/кг оказывает пролонгированное анестезирующее действие: патент РФ на изобретение №2658014 [7].
Однако, добавление на концах пептида (Энк) остатков βAla увеличило число внутренних пептидных связей в МодЭнк1, вследствие чего, будучи защищенным от действующих на концевые связи экзопептидаз, МодЭнк1 оказывается более доступным действующим на внутренние связи эндопептидазам.
Технический результат изобретения заключается в конструировании новой модифицированной формы (МодЭНК2) опиоидного пептида энкефалина,обладающей по сравнению с МодЭнк1 более значительным пролонгированием анестезирующего воздействия.
Задача для достижения данного технического результата состояла в создании такого пептида, который защищен от экзопептидаз, атакующих в пептидах крайние (концевые) связи, и менее, чем МодЭнк1, доступен эндопептидазам, атакующим в пептидах внутренние связи.
В заявляемом изобретении предложен модифицированный синтетический аналог природного пептидного анальгетика энкефалина, МодЭнк2, имеющий формулу:
2
βAla-Tyr-Gly-Gly-Phe-NH,
обладающий повышенной устойчивостью к действию экзопептидаз и малой доступностью для эндопептидаз (последнее свойство достигнуто благодаря укорочению пептида, в котором присутствуют только две внутренние связи), обладающий высокой стабильностью и обеспечивающий существенно пролонгированное по сравнению с МодЭнк1 анестезирующее действие.
Таким образом, модифицированный синтетический аналог природного пептидного анальгетика энкефалина, названный МодЭнк2, имеет новое сочетание структурных изменений в Met-энкефалине: на N-конце Met-энкефалина (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met) помещен остаток бета-аланина, (βAla), удален остаток Met5 и ставший концевым остаток Phe4 амидирован.
Благодаря этим модификациям пептид МодЭнк2, защищен на обоих концах от действия экзопептидаз и, благодаря присутствию только двух внутренних пептидных связей, малодоступен для нарушающих внутренние связи эндопептидаз, локализованных на поверхности аксонных окончаний нейронов мозга, что доказывается высокой стабильностью, проявляемой МодЭнк2 при инкубации в суспензии выделенных аксонных окончаний нейронов (синаптосом) и проявляется в опытах на животных (крысах) в существенном пролонгировании анестезирующего действия.
Испытания МодЭнк2 на токсичность, проведенные согласно принятым инструкциям на крысах, показали отсутствие токсичности у этого пептида и, в частности, отсутствие негативного влияния на память.
В заявляемом пептиде МодЭнк2 две внутренние пептидные связи - на две меньше, чем в МодЭнк1. Благодаря этому МодЭнк2, сохраняя устойчивость к экзопептидазам, также в меньшей степени, чем МодЭнк1, подвержен воздействию эндопептидаз, атакующих в пептидах внутренние связи. В результате, МодЭнк2 обеспечивает более длительную анестезию.
2
Также был создан пептид:, который короче МодЭнк2 на одно звено благодаря изъятию одного остатка Gly. Его формула: βAla-Tyr-Gly-Phe-NH (МодЭнк3). Этот пептид показал высокую стабильность в суспензии синаптосом, но в опытах с животными (крысами) как анальгетик оказался малоэффективным. Поэтому МодЭнк3 был исключен из дальнейшего рассмотрения.
В заявляемом изобретении решена задача создания нетоксичного модифицированного пептида, защищенного от действия пептидаз в мозге млекопитающих с эфективным и существенно пролонгированным лекарственным (анестезирующим) воздействием.
На фиг. 1 представлен график стабильности пептидов в суспензии синаптосом, которая моделирует условия пребывания пептида в мозге.
МодЭнк1 - кривая 1, МодЭнк2 - кривая 2, Мет-энкефалин - кривая 3.
На фиг. 2 представлен тест на сохранение пептидом МодЭнк2 способности обезболивать и на длительность этого эффекта в сравнении с другими обезболивающими, где: МодЭнк1 - кривая 1; МодЭнк2 - кривая 2; Мет-энкефалин - кривая 3; морфин - кривая 4; бифалгин - кривая 5.
6
Для проверки стабильности исследуемых пептидов была использована суспензия синаптосом (концентрация 5×10/мл) в среде 0.1 М фосфатный буфер (рН 7.4)-0.14 М NaCl. Эта суспензия моделирует участки мозга, где оперируют указанные выше пептидазы.
Работа проводилась следующим образом.
2
o
t
t
o
К порциям суспензии синаптосом (по 165 мкл) добавляли до концентрации 0.25 мМ Мет-энкефалин (контроль) или Мет-энкефалин, защищенный на обоих концах остатками бета-аланина (МодЭнк1) или заявляемый авторами вариант модификации Мет-энкефалина в МодЭнк2, в которой, βAla помещен на N-конец, удален Met5, а ставший концевым Phe4 амидирован (βAla-Tyr-Gly-Gly-Phe-NH). Указанные препараты инкубировали при 37°С с отбором проб (по 20 мкл), которые анализировали методом тонкослойной хроматографии. Конкретно, осуществлялась денситометрия исходного (t=0) пятна полного пептида (d) и в последовательные моменты времени остаточных пятен полного пептида (d). Мерой сохранности исходного пептида было выраженное в процентах отношение (d/d)×100%. Результаты представлены на графиках фиг. 1.
Они показывают, что в условиях эксперимента незащищенный Мет-энкефалин исчезает (подвергнут полному разрушению) за 60 минут (кривая 3). МодЭнк1 в течение этого времени сохраняется почти полностью, и через 180 минут сохраняют целостность 50% его молекул (кривая 1). МодЭнк2, как и ожидалось, оказался еще более стабильным: через 180 минут сохраняют целостность 75% его молекул (кривая 2).
n
Тест на сохранение пептидом МодЭнк2 способности обезболивать и на длительность этого эффекта в сравнении с МодЭнк1 и другими обезболивающими средствами был проведен на крысах по стандартной методике отдергивания погруженного в горячую воду (55°С) хвоста (Tail flick) [5, 8]. Чем дольше хвост задерживается в горячей воде, тем сильнее обезболивание (анестезия). Животное в момент t=0 получало интраназально пептид (0.4 микромоля пептида /кг в 10 микролитрах воды). Контрольные животные получали только воду. Через определенные отрезки времени (t=t) хвост животного погружался в горячую воду и определялась длительность задержки в секундах (латентный период). Чем больше латентный период, тем эффективнее обезболивание.
Степень обезболивания (анестезию) вычисляли по стандартной формуле [5, 8]. Ее значения после усреднения по всем животным, участвовавшим в тесте (в количестве не менее четырех в опытах с каждым пептидом и в контроле) для Мет-энкефалина, МодЭнк1 и МодЭнк2 представлены в форме графиков на фиг. 2.
Из этих данных следует, что модифицированные формы МодЭнк1 (кривая 1) и МодЭнк2 (кривая 2) многократно превосходят энкефалин (кривая 3) в длительности обезболивания. При этом МодЭнк2 действует дольше, чем МодЭнк1 (50%-ная эффективность у МодЭнк1 при t=70 мин, а у МодЭнк2 при t=110 мин).
На фиг. 2 приведены для сравнения данные таких же тестов, где обезболивающими были морфин (Fig. 2D в [8]) (кривая 4, фиг. 2) или циклический бифалин (Fig. 1 в [5]) (кривая 5, фиг. 2).
[8]. A. Mollica, A. Carotenuto, Е. Novellino, A. Limatola, R. Costante, F. Pinnen, A. Stefanucci, S. Pieretti, A. Borsodi, R. Samavati, F. Zador, S. Benyhe, P. Davis, F. Porreca, V.J. Hruby, Novel cyclic biphalin analogue with improved analgesic properties. ACS Med. Chem. Lett. 2014, 5, 1032-1036.
Сопоставление представленных на фиг. 2 графиков показывает, что в примененном тесте «отдергивание хвоста» наиболее длительное обезболивание обеспечивают МодЭнк2 (кривая 2) и бифалин (кривая 5). Важным преимуществом МодЭнк2 перед морфином и бифалинами является отсутствие токсичности.
Эксперименты по определению токсичности МодЭнк2 проведены на 10 крысах линии Вистар (5 самцов и 5 самок, вес животного около 250 г). Животные получали интраназально 5-кратную дозу МодЭнк2 (2 микромоля/кг). Наблюдение за животными осуществляли в течение 3-х суток. По всем контролируемым параметрам (Тест на острую токсичность ГОСТ 32644-2014) отклонений от нормы не обнаружено).
В терминах нейрохимии МодЭнк2 эффективно взаимодействует с опиатными рецепторами нервных клеток, вызывая длительное ослабление межклеточных коммуникаций и, как следствие, снижение чувствительности к сигналам, вызывающим болевые ощущения.
«Необычная» аминокислота бета-аланин, остаток которой присутствует в МодЭнк2 синтезируется в организме и входит в состав дипептидного нейромедиатора карнозина, что еще раз говорит о его нетоксичности. Капсулированный бета-аланин можно приобрести в аптеке с целью повышения синтеза карнозина, являющегося антиоксидантом и способствующего увеличению мышечной массы.
Экспериментально токсичность МодЭнк2 исследовалась согласно инструкции. После приема пятикратной дозы МодЭнк2 (200 микрограмм/кг) в течение пяти дней определялись 20 параметров, в том числе, смертность, поведение, аппетит, пульс, состав крови и др. После вскрытия определялось состояние внутренних органов. Во всех случаях отклонения от нормы не обнаружены.
Следует отметить потенциальную доступность МодЭнк2 как лекарства благодаря малым размерам и простоте синтеза.
Сказанное выше доказывает целесообразность применения МодЭнк2 в качестве лекарственного пептида, оказывающего повышенное и пролонгированное анестезирующее воздействие.
Предложен модифицированный синтетический аналог природного пептидного анальгетика энкефалина, МодЭнк2, имеющий формулу:
2
βAla-Tyr-Gly-Gly-Phe-NH,
обладающий повышенной устойчивостью к действию экзопептидаз и малой доступностью для эндопептидаз (последнее свойство достигнуто благодаря укорочению пептида, в котором присутствуют только две внутренние связи), обладающий высокой стабильностью (фиг. 1), и обеспечивающий повышенное существенно пролонгированное по сравнению с МодЭнк1 анестезирующее действие (фиг. 2).
2
Таким образом, предлагается модифицированный синтетический аналог природного пептидного анальгетика Мет-энкефалина МодЭнк2, в котором на N-конце Мет-энкефалина помещен остаток бета-аланина, удален остаток метионина и амидирован остаток фенилаланина, обладающий повышенной устойчивостью к внеклеточным пептидазам мозга, что проявляется в существенно пролонгированном обезболивающем действии (анестезии), не токсичный, простой по конструкции, имеющий формулу: βAla-Tyr-Gly-Gly-Phe-NH.
ЛИТЕРАТУРА
1. Pert СВ, Pert A, Chang JK, Fong ВТ (1976) (D-Ala 2)-Met-enkephalinamide: a potent, long-lasting synthetic pentapeptide analgesic. Science, 194, 330-332.
2. Katsuura G, Inouye K, Itoh S, Hsiao S. (1984) Analgesic effects of enkephalin analogs in rats. Life Sci., 35, 815-818.
3. DiMaio J, Schiller PW (1980) A cyclic enkephalin analog with high in vitro opiate activity. Proc Natl Acad Sci USA, 77, 7162-7166.
1
4. Touati-Jallabe Y, Bojnik E, Legrand В,  E, Chung NN, Schiller PW, Benyhe S, Averlant-Petit MC, Martinez J, Hernandez JF (2013) Cyclic enkephalins with a diversely substituted guanidine bridge or a thiourea bridge: synthesis, biological and structural evaluations. J Med Chem, 56, 5964-5973.
5. Stefanucci A, Carotenuto A, Macedonio G, Novellino E, Pieretti S, Marzoli F,  E, Erdei A,  F, Benyhe S, Mollica A. (2017) Cyclic Biphalin Analogues Incorporating a Xylene Bridge: Synthesis, Characterization, and Biological Profile. CS Med Chem Lett. 8:858-863.
6. Kropotova ES, Mosevitsky MI. (2016) A Group of Weakly Bound to Neurons Extracellular etallopeptidases (NEMPs). Neurochem Res. 41, 2666-2674.
7 Изобретение, Патент РФ №2658014
8. Yadlapallia J., Fordb В., Ketkarc A, Anqi Wana A, Penthalaa N., Eoffc R., Pratherb P., Dobretsovd M., Crooksa P. (2016). Antinociceptive effects of the 6-O-sulfate ester of morphine in normal and diabetic rats: Comparative role of mu- and delta-opioid receptors Pharmacol Res. 113(Pt A): 335-347.