Количественное определение IgG антител к основному белку миелина у больных с рассеянным склерозом

Медицинская иммунология 1999, Г. 1, № 5, стр 79-Н2 © 1999, СПб РО РА АКИ

Краткие сообщения

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ IgG АНТИТЕЛ К ОСНОВНОМУ БЕЛКУ МИЕЛИНА У БОЛЬНЫХ С РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ

Гервазиева В.Б.*, Воробьева H.JI.*, Завалишин И.А.**

*НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, г. Москва.

* *НИИ неврологии РАМН, г. Москва.

Резюме. Данная работа посвящена изучению диагностической значимости количественного определения содержания IgG антител к основному белку миелина иммуноферментным методом для оценки особенностей течения демиелинизирующего процесса. Для этого авторами было проведено исследование содержания IgG антител к основному белку миелина у 69 больных рассеянным склерозом с различными характером, активностью, формой и длительностью течения заболевания. В ходе исследования было показано, что высокое содержание IgG антител к основному белку миелина патогномично для рассеянного склероза. При этом наиболее высокий уровень IgG антител к основному белку миелина выявлен у больных в фазе обострения заболевания, при длительном и прогредиентпом течении рассеянного склероза. На группе больных было показано достоверное снижение содержания IgG антител к основному белку миелина на фоне терапии мегипредом. Авторы полагают, что именно количественное определение позволяет выявлять достоверную разницу в содержании IgG антител к основному белку миелина у больных с различным характером течения, активностью и продолжительностью заболевания и дает возможность с большой долей вероятности оценить прогноз течения демиелинизирующего процесса и эффекгивность проведения лечебных мероприятий.

Ключевые слона: рассеянный склероз, антитела к основному белку миелина

V.B. Geivasieva, N.L. Vorobyeva, LA. Zavalishin

QUANTITATIVE DETERMINATION OF HUMAN IgG ANTIBODIES TO THE MYELIN BASIC PROTEIN IN PATIENTS WITH MULTIPLE SCLEROSIS

Abstract. In this work authors studied the diagnostic significance of the quantitative determination of human IgG antibodies to the myelin basic protein (MBP) in ELISA for the assessment of specialities of the demyelizing disease. The authors studied quantity of IgG antibodies to the MBP in 69 patients with multiple sclerosis of different severity, activity form and length. The highest level of IgG antibodies to the MBP was found in patients with acute phase, severe progressing course of multiple sclerosis. In the group of patients, who received methypred therapy, it was shown reliable reduction the quantity of IgG antibodies to the MBP.

The authors suppose that the quantitative determination enables to reveal the reliable difference of the content of IgG antibodies to the MBP in patients with different course, activity and lenght of the disease and lets to evaluate the prognosis of demyelizing process and the efficiency of therapy with the more probability.

Более ста лет назад была выделена обособленная группа заболеваний, характеризующихся развитием тяжелых прогрессирующих органических поражений в центральной нервной системе (ЦНС), патофизиологическую основу которых составляет

Адрес для переписки:

к.м.н. Надежда Львовна Воробьева 103064, г. Москва, Малый Казенный переулок, дом 5 А Лаборатория аллергодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, г. Москва Телефон/факс: (095) 917-20-26

разрушение миелииовой оболочки проводников головного и спинного мозга. Именно по атому признаку целый ряд патологий ЦІІС был выделен в группу так называемых демиелинизирующих заболеваний, к которым относят рассеянный склероз, ретробульбарный неврит, рассеянный энцефаломи-елополирадикулоневрит и другие.

На сегодняшний день наиболее распространенной точкой зрения в отношении механизма демиелиниза-ции является то, что это клеточно-обусловленная аутоиммунная атака на антигенные структуры миелина

вследствие вирусной инфекции и генетически предрасположенном организме [11, 14]. Полагают, что основным аутоантигепом в этом процессе выступает основной белок миелина (ОБМ), поэтому с ним связывают возможность диагностики и лечения этой категории больных. Известно, что в процессе онтогенеза ОБМ и его пептиды опосредуют иммунологическую толерантность к структурным компонентам ЦНС [4,6,12]. Поддержание толерантности осуществляется сложным регуляторным механизмом, при котором неиммушгепные формы ОБМ - малые пептиды, включающие специфическую иммупорегуляторпую детерминанту, лишенную эпцефалнтогеппых свойств, циркулируют в крови и активируют клоп 'Г-супрессоров, последние ингибируют пролиферацию аутореактивного к ОБМ клопа Т-хсл-иеров и таким образом поддерживают толерантность к ОБМ. Многие исследователи связывают развитие де-миелииизации с тем, что при определенных условиях, в результате клиренса иммунорегуляторпой детерминанты антителами (АТ), возможно вирусипдуцирован-ными, нроисходат отмена иммунологической толерантности [5,8,9]. Вследствие этого запускается продукция аутореактивного клопа Т-хелперов, которые распознают ОБМ как “чужой" и с помощью выделяемых цито-кинов (EL-2, EFN-y, TNF-ß) запускают синтез АТ к ОБМ. Таким образом, определение содержания АТ к ОБМ может служить достоверным диагностическим маркером наличия, особенностей течения и прогноза демие-липизирующего процесса, а также эффективности проведения патогенетической терапии. В связи с этим целью данной работы явилось изучение динамики iy-моральпого иммунного ответа к ОБМ у больных с рассеянным склерозом.

Материалы и методы

Материалом для исследования послужили сыворотки крови 69 больных рассеянным склерозом, находившихся на лечении в НИИ неврологии РАМН, г. Москвы.

Определение содержания АТ к ОБМ осуществляли при помощи разработанного в лаборатории аллергодиагностики НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН, г. Москвы твердофазного иммупофермепт-ного метода количественного определения IgG АТ к ОБМ в сыворотке [3].

В работе использовали мышиные моноклональные антитела (МкАТ) против всех эпитопов IgG человека, предоставленные ЦНИИРИ М3 РФ (г. Санкт-Петербург); ОБМ, выделенный авторами из головного мозга человека по методу Kies [10] в собственной модификации [4].

Принцип метода состоит в том, что па планшеты фирмы "Nunc” сорбировали ОБМ. По окончании времени сорбции первый ряд лупок оставляли свободным для копъюгатного контроля. Во второй и третий

рады планшета вносили двукратные разведения калибровочного реагента ^ в известной концентрации. Во все последующие ряды вносили тестируемые сыворотки в рабочем разведении. Реакцию проявляли конъюгатом пероксидазы с анти-^О МкАТ. Количественный учет искомых АТ осуществляли по калибровочной кривой зависимости оптической плотности (ОП) от концентрации 1§С в калибровочном реагенте. При таком варианте иммупофермептного анализа пероксидазпый конъюгат анти-^О МкАТ выявляет из всех изотипов иммуноглобулинов в сыворотке только АТ к ОБМ, иммунологически связанные на твердой фазе с последним, а использование этого же конъюгата в референс-системе позволяет количественно соотнести содержание lgG АТ к ОБМ с концентрацией 1цС калибровочного реагента.

В качестве нормативного количества 1§С АТ к ОБМ было принято среднее значение содержания АТ в 450 сыворотках здоровых взрослых людей с учетом значений верхней границы доверительного интервала, которое составило 40 мкг/мл [2].

Результаты и обсуждение

Изучение диагностической значимости метода предполагает возможность его использования для выявления и оценки связи количественного содержания АТ к ОБМ с особешшостями течения демиелинизирующего процесса. В этой связи нами было проведено исследование содержания АТ у больных рассеянным склерозом с различными характером, активностью, формой и длительностью течения заболевания.

В клинике рассеянного склероза выделяют два основных варианта течения патологического процесса - ремиттирующее и неуклонно прогредиепт-ное. В первом случае заболевание протекает более благоприятно с чередованием периодов ремиссий и обострений. Во втором случае периоды ремиссии и длительной стабилизации процесса отсутствуют [1, 7]. Поскольку характер течения рассеянного склероза определяется степенью напряженности аутоиммупитета, уровень АТ к ОБМ может служить достоверным критерием прогноза заболевания. В нашем исследовании высо-

Таблица 1. СОДЕРЖАНИЕ |дб АТ К ОБМ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА

Тяжесть Число Содержание Уровень

течения рассеян- больных IgG АТ к ОБМ достоверности

ного склероза (М ± т) в мкг/мл разности t

Ремиттирующее 41 1104 ±118 3,6

течение

Прогредиентное 28 1911 ±192 р<0,001

течение

1999, Т. 1, №5

Кол. опред. /#С АТ к ОБМ у в-ых РС.

кис уровни ЛТ к ОБМ определяли как при ирогредиептном, гак и при ремиттируклцем течении рассеянного склероза, тем не менее для про-греднентного течения заболевания характерны более высокие уровни ЛТ (табл.1).

У больших с ремиттирующим течением рассеянного склероза содержание АТ к ОБМ в период обострения достоверно превышало таковое в период ремиссии (табл. 2).

Таблица 2. СОДЕРЖАНИЕ № АТ К ОБМ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ АКТИВНОСТИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА

Активность Число Содержание Уровень

рассеянного больных Ідй АТ к ОБМ достоверности

склероза (М ± т) в мкг/мл разности (

Обострение 57 1737 ± 223 6,6

Ремиссия 26 260 ± 54,3 р<0,001

Определение более высоких уровней АТ к ОБМ при прогредиентном течении рассеянного склероза свидетельствует о длительной активации процесса демиелинизации. В случае ре-миттирующего течения заболевания можно говорить о более доброкачественном характере иммунопатологического процесса. Однако то, что в период ремиссии уровень 1§С АТ к ОБМ не снижается до “нормальных" значений, свидетельствует о сохраняющейся напряженности аутоиммунных реакций в нервной ткани. Значительное увеличение содержания 1§0 АТ к ОБМ в период обострения рассеянного склероза косвенно свидетельствует об активации процесса формирования новых очагов демиелинизации, сопровождающегося поступлением в циркуляцию иммунорегуляторных пептидов ОБМ, стимулирующих синтез специфических АТ к ОБМ.

Поскольку степень распространения патологического процесса час то определяет тяжесть течения и про-

Таблица 3. СОДЕРЖАНИЕ 1дв АТ К ОБМ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФОРМЫ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА

Форма рассеянного склероза Число больных Содержание Ідв АТ к ОБМ (М ± т) в мкг/мл Уровень достоверности разности 1

Церебральная 21 1584 ±209 ^ = 0,2; р>0,05

Спинальная 7 1635 ±173 ^ = 0,6; р>0,05

Цереброспи- нальная 54 1829 ±257 V, = 0,7; р>0,05

Таблица 4. СОДЕРЖАНИЕ ДО АТ К ОБМ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДЛИТЕЛЬНОСТИ ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ.

Длительность течения рассеянного склероза Число больных Содержание № АТ к ОБМ (М ± т) в мкг/мл Уровень достоверности разности!

Менее 5 лет 18 958 ± 70 1,2 = 4,3; р <0,001

От 5 до 10 лет 29 1723 ±162 •,, = 3,9; р<0,001

Более 10 лет 9 1003 ±94 ^,=0,4; р>0,05

гноз заболевания, мы провели сравнительный анализ содержания АТ к ОБМ у больных с цереброспинальной, спинальной и церебральной формой рассеянного склероза (табл. 3). Однако достоверной разницы между уровнем АТ к ОБМ при различных формах заболевания выявлено не было. Это подтверждает тот факт, что демиелипизация, несмотря па клиническую форму проявления, представляет собой не ограниченный, а генерализованный процесс [7, 13].

При изучении взаимосвязи содержания АТ к ОБМ с длительностью течения патологического процесса (табл. 4) было обнаружено, что при давности заболевания до 5 лет уровни АТ достоверно ниже таковых, определяемых при заболевании длительностью от 5 до 10 лет, что также свидетельствует о нарастающей активности аутоиммунного процесса в нервной ткани с течением времени. В то же время при более длительном течении рассеянного склероза, уровень АТ достоверно понижался, несмотря на выраженность проявления неврологических симптомов. Г1о-видимому, это обусловлено истощением иммунного ответа к ОБМ в результате столь продолжительной антигенной стимуляции.

Исследование динамики синтеза АТ к ОБМ для оценки эффективности терапии метипредом проводили у больных с ремиттирующим и прогре-диентным течением рассеянного склероза (табл. 5).

Таблица 5. ДИНАМИКА УРОВНЯ 1дв АТ К ОБМ НА ФОНЕ ПРОВЕДЕНИЯ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ МЕТИПРЕДОМ

Группа больных с рассеянным склерозом Число больных Содержание 1дСАТ к ОБМ (М ± т) в мкг/мл до после лечения Уровень достоверности разкхти ї

Ремитрующее течение 19 1104 ± 118 162,6 ±16,2 7,5 р<0,001

Прогредивнтное течение 22 623 ± 60,1 279 ± 27,4 8,7 р<0,001

При этом длительность применения и дозу препарата подбирали для каждого больного индивидуально. Уровень ДО АТ к ОБМ оценивали до назначения препарата и после окончания курса лечения.

В ходе исследования наблюдали достаточно выраженную отрицательную динамику ДО! АТ к ОБМ. Так, во всех обследованных группах больных уровень ¡ДО АТ к ОБМ снижался примерно в 6,8. Полученные нами низкие значения содержания ДО АТ к ОБМ после проведенного курса лечения свидетельствуют о подавлении гуморального ответа на антигены миелина при использовании метипреда. Следовательно, при проведении адекватной терапии у больных с демиелипизирующими заболеваниями можно добиться выраженной стабилизации аутоиммунного процесса.

На основании проведенного исследования можно заключить, что высокое содержание АТ к ОБМ патопюмичио для рассеянного склероза. При этом наиболее высокий уровень АТ соответствует максимальной активности демиелинизирующего процесса у больных (обострение, более длительное и прогредиептпое течение рассеянного склероза). При меньшей активности заболевания (ремиссия, малая длительность и ремиттирующсс течение), а также на фоне проводимой терапии АТ к ОБМ определяются в значительно более низких количествах. Следует отметить, что именно количественное определение содержания АТ к ОБМ позволяет выявлять достоверную разницу в содержании АТ к ОБМ у больных с различным характером течения, активностью и продолжительностью заболевания и дает возможность с большой долей вероятности оцепить прогноз течения деми-елипизирующего процесса и эффективность проведения лечебных мероприятий.

Благодарности. Авторы выражают глубокую признательность сотрудникам НИИ неврологии, РАМН г. Москвы за предоставленный материал для исследования, а также научным сотрудникам и техническому персоналу лаборатории аллергодиашос-тики НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН за консультацию и помощь в выполнении исследования.

Список литературы.

1. Алаев Б.А., Уманский К.Г. - Рассеянный склероз. - Ташкент, - Медицина УзССР, - 1990, - с.127.

2. Воробьева Н.Л. - Антитела изотинов IgG и IgE к основному белку миелина при демиелинизи-ругощих заболеваниях. - Автореф. дис. канд. мед. наук, - М., - 1998.

3. Гервазиева В.Б., Воробьева Н.Л., Свераповс-кая В.В..- Иммунофермелтпый метод количественного определения IgG антител к основному белку миелина. - Иммунология, -1999.

4. Гервазиева В.Б., Сверапонская В.В., Козлов В.Е. - Основной белок миелина и его иммунобиологические свойства. - Иммунология., - 1982, - №3, р. 9-14.

5. Йегер Л. - Демиелинизирующие заболевания центральной нервной системы. - В кн. Клиническая иммунология и аллергия. - Пер. с англ., - М., - Медицина, - 1990, - Т. 3, - с. 369-378.

6. Фопталип Л.Н., Певпицкий Л.А. - Иммунологическая толерантность. - М., - 1978.

7. Хопдкариан О.А., Завал и шин И. А., Невсгаш О.М. - Рассеянный склероз. - М., - Медицина, - 1987, - с. 256.

8. A transgenic approach to the study of peripheral T-cell tolerance. - Miller J.F., Morahan A.P., Allison G., Hoffman M. - Immunol. Rew., - 1991, - v.122, -p.103-116.

9. Gupta M. - Myelin basic protein and demyelinating diseases. - Crit. Rev. Clin.Lba. Sci., - 1987, - v.24, - № 4, -p.287-314.

10. Kies M.V. - Chemical studies on an encephalitogenic protein from guinea pig brain/ - Ann.N.Y.Acad.sci., - 1965, -v.122,-p. 161-170.

11. Multiple sclerosis as autoimmune disease: myelin antigens. - Rew. Immunol., -1989,-v. 140,-№ 2.-p.l81-187.

12. Multiple sclerosis: New insights from old tools.-Mayo Clin.Proc., - 1993, - v.68, -p.711-712.

13. Nyland H., Myhr KM. - Multiple sclerosis. -Tidsskrift for Den Norske Laegeforening., -1995, - v. 115,-N 17,-p. 2072-2077.

14. The natural history of multiple sclerosis -Weinshenker, Bass B., Rice G. et al. - Brain., - 1989, - v. 112, -p. 1419-1428.

поступила в редакцию 20.11.99 принята к печати 06.12.99