ПРИМЕНЕНИЕ ПРОБИОТИКОВ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ МУЖСКОЙ ФЕРТИЛЬНОСТИ
USING PROBIOTICS TO ENHANCE MALE FERTILITY

Настоящее изобретение относится к применению состава, содержащего два штамма видов микробов с пробиотической способностью, а именно Lactobacillus rhamnosus и Bifidobacterium longum, для усиления мужской фертильности. Таким образом, настоящее изобретение относится к области репродукции человека и животных с применениями как в фармацевтической, так и в агропищевой промышленности.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Пробиотики являются живыми микроорганизмами, которые приносят пользу для здоровья потребителей при потреблении их в соответствующих дозах. В основном их используют в качестве ингредиентов в функциональных пищевых продуктах или пищевых добавках; поэтому, они представляли и представляют большой интерес для агропищевой и фармацевтической промышленностей, соответственно. Подавляющее большинство пробиотиков, используемых на сегодняшний день, имеют тенденцию быть эффективными в пищеварительном тракте и оказывают положительное влияние на расстройства пищеварения, такие как колит, запор или воспаление кишечника и другие. Кроме того, в научной литературе имеются примеры использования пробиотиков при вагинальных инфекциях, нарушениях кожи или даже при ожирении или аутизме.
th
Применение пробиотиков в области репродукции человека ограничено и в основном фокусируется на женском факторе и на вышеупомянутых случаях вагинальных инфекций. В этом отношении имеются исследования, в которых пробиотики использовали в качестве терапевтического средства при бактериальном вагинозе, что давало положительные результаты в клинических испытаниях (Mastromarino et al, 2013. New Microbiol. 36(3): 229-38; Borges et al, 2014. Arch Gynecol Obstet, 289(3): 479-89). Напротив, не описано влияние пробиотиков на мужскую фертильность у людей. Обнаружили, что на животной модели данио потребление пробиотиков существенно повышает молекулярные маркеры, ассоциированные с репродуктивным качеством (Riesco et al, 2013. Evaluation of a probiotic diet on zebrqfish sperm quality markers. 4 International workshop on the biology of Fish Gametes (Albufeira, Portugal)), но на сегодняшний день нет научных публикаций, в которых оценивается влияние потребления пробиотиков на параметры качества спермы у людей или корреляция потребления таких добавок с улучшенной подвижностью сперматозоидов.
Кроме того, исследовали антиоксидантные эффекты молочнокислых бактерий и бифидобактерий на животных, но никогда в отношении качества спермы у человека (Riesco et ah, 2013, упомянутая ad supra). В последние десятилетия, были проведены клинические исследования по установлению полезных эффектов антиоксидантных методов лечения по улучшению параметров спермы у мужчин, а также степеней оплодотворения или беременности у их партнеров-женщин. Наиболее часто изучаемыми антиоксидантами являются витамин С, витамин Е, селен, глутатион, цинк, N-ацетилцистеин и L-карнитин (Gharagozloo et al, 2011. Hum Reprod. 26 (7): 1628-1640; Ко and Sabanegh, 2012. J Androl 33 (3): 292-308; Showell et al, 2013. Cochrane Database Syst Rev, 5; 8: CD007807). В некоторых из этих исследований оценивали эффект таких антиоксидантов в анализах in vitro (добавленных в качестве добавок в криопротекторном растворе) и пришли к выводу о том, что наблюдается положительный эффект этих добавок в отношении защиты спермы от окислительных молекул, образующихся в условиях замораживания и оттаивания (Walczak-Jedrzejowska et al., 2013. Cent European J Urol. 66(1): 60-7). В других исследованиях оценивали эффект пероральных антиоксидантов на параметры спермы. Например, в 2010 году Ross et al (Ross et al, 2010, Reprod Biomed Online, 20 (6): 711-23) описали полезные эффекты перорального потребления антиоксидантов в отношении параметров спермы. В патенте Испании ES 2225625 описывается состав для улучшения качества спермы человека, содержащий по меньшей мере один источник цинка и необязательно витамин В12, магний, бетаин, холин, SAM, витамин В2 и витамин В6. Подобным образом, в патенте Испании ES 2397657 описывается комбинированный препарат для улучшения качества спермы, содержащий активные ингредиенты L-карнитин, коэнзим Q, витамин Е, источник цинка, витамин В, источник селена, глутатион, L-аргинин или их соли или производные. Однако эффекты этих методов лечения не всегда выдерживают проверку временем, и не ясно, снижают ли они фрагментацию ДНК в сперматозоидах - один из наиболее важных параметров качества спермы.
Поэтому, в уровне техники существует пробел при потребности обеспечения альтернативных способов усиления мужской фертильности, улучшающих качество спермы, которые лишены вышеупомянутых недостатков.
Раскрытие настоящего изобретения
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что комбинированное введение штамма Lactobacillus rhamnosus и штамма Bifidobacterium longum усиливает мужскую фертильность. Согласно конкретному варианту осуществления штаммами являются Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 и Bifidobacterium longum СЕСТ 7347. Как показано в примере 1, потребление состава, содержащего комбинацию штаммов Lactobacillus rhamnosus и Bifidobacterium longum, участниками испытания приводило к усилению подвижности их сперматозоидов и к снижению фрагментации ДНК в сперматозоидах, что является двумя ключевыми параметрами в оценивании качества спермы. Таким образом, потребление комбинации этих пробиотических штаммов улучшает качество спермы и, поэтому, усиливает мужскую фертильность. Кроме того, усиленная фертильность сохраняется до шести недель после завершения последнего потребления с достижением тем самым длительного эффекта. Возможным объяснением таких результатов может быть то, что комбинация антиоксидантной способности штамма Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 с противовоспалительной способностью штамма Bifidobacterium longum СЕСТ 7347 отвечает за такую повышенную подвижность сперматозоидов и пониженную фрагментацию ДНК в сперматозоидах. Поэтому, настоящее изобретение, описываемое в настоящем документе, подтверждает применение бактериальных штаммов с пробиотическими свойствами в адресных терапевтических методах для усиления мужской фертильности перед содействием репродукции или естественной репродукции, или даже перед осуществлением сдачи спермы для будущих осеменений.
На основании данного открытия авторы настоящего изобретения разработали ряд аспектов настоящего изобретения, которые будут подробно описаны ниже.
Применение комбинированного введения штаммов видов Lactobacillus rhamnosus и Bifidobacterium longum для усиления мужской фертильности субъекта
Авторы настоящего изобретения выявили, что комбинированное введение штамма Lactobacillus rhamnosus и штамма Bifidobacterium longum усиливает мужскую фертильность. Однако из-за исключительной антиоксидантной способности Lactobacillus rhamnosus, в частности, L. rhamnosus СЕСТ 8361, по сравнению с другими видами Lactobacillus применение Lactobacillus rhamnosus отдельно в получении фармацевтического состава для усиления мужской фертильности не должно исключаться. Авторы настоящего изобретения полагают, что антиоксидантная способность Lactobacillus rhamnosus, в частности, штамма L. rhamnosus СЕСТ 8361, защищает сперму от реакционно способных форм кислорода, которые могут изменять мембраны сперматозоидов, целостность ДНК и подвижность сперматозоидов. Поэтому, авторы настоящего изобретения полагают, что антиоксидантная способность штамма повышает качество спермы; в частности, она повышает подвижность сперматозоидов и снижает фрагментацию ДНК в сперматозоидах, что в итоге усиливает мужскую фертильность. Кроме того, благодаря противовоспалительной способности Bifidobacterium longum, в частности Bifidobacterium longum СЕСТ 7347, настоящее изобретение также относится к возможному применению Bifidobacterium longum отдельно, в частности Bifidobacterium longum СЕСТ 7347, индивидуумом для усиления мужской фертильности. Авторы настоящего изобретения полагают, что способность Bifidobacterium longum СЕСТ 7347 снижать уровни воспалительного TNFa и усиливать продуцирование противовоспалительного цитокина IL-10 защищает сперму от окислительного стресса. Поэтому, в настоящем документе также представлено применение составов, содержащих по меньшей мере L. rhamnosus СЕСТ 8361 и Bifidobacterium longum СЕСТ 7347, в усилении мужской фертильности субъекта.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к применению Lactobacillus rhamnosus в комбинации с Bifidobacterium longum для получения состава (далее в настоящем документе «состава в соответствии с настоящим изобретением») для усиления мужской фертильности у субъекта.
Бактерии Lactobacillus rhamnosus обычно используют в качестве пробиотиков, в основном в йогурте и других молочных продуктах. Научная классификация Lactobacillus rhamnosus: Царство: Bacteria; Отдел: Firmicute; Класс: Bacilli; Порядок: Lactobacillales; Семейство: Lactobacillaceae, Род: Lactobacillus; Вид: Lactobacillus rhamnosus. Кроме того, Bifidobacterium longum является грамотрицательной бактерией, каталаза-отрицательной, круглой формы, располагающейся в желудочно-кишечном тракте, где она продуцирует молочную кислоту. Научная классификация Bifidobacterium longum: Царство: Bacteria; Отдел: Firmicutes; Класс: Actinobacteria; Порядок: Bifidobacteriales; Семейство: Bifidobacteriaceae; Род: Bifidobacterium; Вид: Bifidobacterium longum.
Используемый в настоящем документе термин «усиление мужской фертильности» у субъекта означает улучшение качества спермы указанного субъекта с повышением тем самым вероятности оплодотворения женщины и получения потомства. Специалисту в области настоящего изобретения будет понятно, что, качество спермы данного субъекта улучшается вследствие потребления штаммов в соответствии с настоящим изобретением по сравнению с качеством спермы того же субъекта до потребления штаммов в соответствии с настоящим изобретением. Качество спермы субъекта может быть измерено рядом параметров, таких как без ограничения подвижность сперматозоидов, жизнеспособность сперматозоидов, морфология сперматозоидов, состав мембраны сперматозоидов, концентрация сперматозоидов, объем эякулята и целостность ДНК сперматозоидов. В уровне техники описаны некоторые способы измерения этих параметров, и их применение является рутинной практикой для специалиста в данной области. Известны некоторые оценивания целостности ДНК сперматозоидов: анализ TUNEL (Terminal Transferase dUTP Nick End Labeling), анализ структуры хроматина сперматозоида (SCSA), анализ Comet и тест диспергирования хроматина в сперматозоидах (SCD). С помощью других тестов идентифицируют дефекты в упаковке хроматина в сперматозоидах: окрашивание толуидином синим, акридином оранжевым и хромомицином А. Кроме того, имеется несколько молекулярных маркеров, таких как различные типы РНК (mRNA, microRNA и т.д.), которые могут быть ассоциированы с более высоким качеством спермы, даже если их не выполняют в рутинной клинической практике.
Поэтому, согласно конкретному варианту осуществления повышенная мужская фертильность предусматривает усиление подвижности сперматозоидов, жизнеспособности сперматозоидов, улучшенный состав мембраны сперматозоидов, повышенную концентрацию морфологически нормальных сперматозоидов и/или общее число сперматозоидов в эякуляте, и/или предусматривает снижение фрагментации ДНК в сперматозоидах и улучшенную целостность хроматина в сперматозоидах.
Уменьшение фрагментации ДНК в сперматозоидах позволяет избежать ухудшения подвижности и фертильности и снижает вероятность аномалий при раннем эмбриональном развитии и у потомства.
В настоящем документе следует учитывать, что целостность хроматина в сперматозоидах улучшается, если ДНК в сперматозоидах располагается компактно и стабильно с упаковкой генетического материала таким образом, что обеспечивается доставка ДНК в физической и химической форме, которая позволяет ее высвобождение в соответствующий момент в процессе оплодотворения и передачу неповрежденной ДНК.
Используемый в настоящем документе термин «субъект» эквивалентен термину «индивидуум»; поэтому, оба термина могут быть использованы в настоящем документе взаимозаменяемо. Термин «субъект» означает любого индивидуума, самца любого животного, принадлежащего любому виду (в том числе без ограничения людей), который продуцирует гаметы для репродукции. Примеры субъектов включают в себя без ограничения представляющих коммерческий интерес животных, таких как рыба (форель, сардины, карп, лосось и т.д.), птицу (кур, страусов, цыплят, гуся, перепела и т.д.), кроликов, зайцев, домашних животных (собак, кошек и т.д.), овечьих и козьих (овец, коз и т.д.), свиней (кабанов, свиней и т.д.), лошадиных (лошадей, пони и т.д.) или бычьих (быков, буйволов и т.д.); представляющих охотничий интерес животных, т.е. добычу, такую как олень, северный олень и т.д.; представляющих экологический интерес животных, т.е. животных, которые находятся под угрозой исчезновения, или популяции которых являются немногочисленными в природе, например, белые тигры, носороги, панды, кугуары, рысь и т.д., а также людей. Однако согласно конкретному варианту осуществления субъектом является рыба или млекопитающее, предпочтительно млекопитающее, выбранное из группы, состоящей из людей, свиней, лошадей, кроликов, буйволов и быков.
Применение, описываемое в настоящем документе, предусматривается в отношении любого субъекта мужского пола для усиления фертильности, независимо от того, является ли фертильность сниженной (субфертилный) или нет (фертильный). У фертильных субъектов мужского пола повышение фертильности может представлять интерес для повышения способности к репродукции. Кроме того, повышенная фертильность может также представлять общий интерес, предоставляя преимущество человечески парам, которые хотят улучшить вероятность беременности. Для субфертильных индивидуумов мужского пола состав в соответствии с настоящим изобретением может быть использован для лечения субфертильности, т.е. для повышения вероятности успешного оплодотворения.
При другом предпочтительном применении состав в соответствии с настоящим изобретением может быть введен индивидууму мужского пола вида млекопитающих и, в частности, человеку, без информации a priori о том, является ли указанный индивидуум мужского пола фертильным или субфертильным. Данный вариант осуществления предусматривает без ограничения введение состава в соответствии с настоящим изобретением субъекту мужского пола в парах, испытывающих позднее оплодотворение, например, во избежание необходимости проведения тестов и/или до выполнения тестов. Это важно, поскольку тестирование сперматозоидов является дорогостоящим и неприятным для рассматриваемого индивидуума, поскольку специфика и чувствительность систем тестирования варьируют, а также потому, что могут наблюдаться колебания в количестве и/или качестве сперматозоидов.
Состав в соответствии с настоящим изобретением также может быть использован для индивидуумов мужского пола в парах, которые намереваются иметь ребенка, с целью усиления вероятности оплодотворения и/или с целью противостояния вероятным проблемам мужской фертильности, опять же без необходимости предварительного тестирования.
Состав в соответствии с настоящим изобретением также может быть использован для предупреждения или для предотвращения длительных эффектов колебаний количества и качества сперматозоидов в отношении репродукции.
Кроме того, состав также может быть использован прифилактически для предупреждения ухудшения качества спермы у индивидуумов с риском или индивидуумов с расстройствами мочеполового тракта и/или другими дисфункциями, которые могут влиять на качество спермы (например, у индивидуумов мужского пола, которые принимают (или будут принимать) лечение лекарственными средствами), а также в ходе терапии лекарственными средствами или радиотерапии. В качестве дополнения, составы и/или препараты в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы, например, для улучшения качества спермы под воздействием факторов, таких как неполноценное питание, факторы окружающей среды и/или воздействие вредных веществ.
Пропорция штамма Lactobacillus rhamnosus в отношении штамма Bifidobacterium longum может варьировать в широком диапазоне. Соотношение Lactobacillus rhamnosus:Bifidobacterium longum в составе в соответствии с настоящим изобретением включает в себя без ограничения 10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10 и 95:05. Однако согласно конкретному варианту осуществления соотношение Lactobacillus rhamnosus:Bifidobacterium longum составляет приблизительно 50:50.
Специалисту в данной области будет понятно, что состав в соответствии с настоящим изобретением может быть получен для фармацевтического введения, т.е. для образования части других фармацевтических продуктов, потребляемых или поглощаемых субъектом, или для введения с пищей, т.е. как часть пищевого продукта в диете субъекта. Поэтому, согласно конкретному варианту осуществления составом в соответствии с настоящим изобретением является фармацевтический состав или функциональный питательный состав.
Фармацевтический состав представляет собой ряд компонентов, образованный по меньшей мере штаммами в соответствии с настоящим изобретением в любой концентрации, который может в качестве дополнения содержать один или несколько компонентов или соединений, обладающих некоторой биологической, фармакологической и/или ветеринарной активностью; в частности, соединения могут проявлять указанную биологическую активность при пероральном введении субъекту. Такими дополнительными соединениями могут быть одно или несколько соединений, которые, как известно per se, обладают благоприятным эффектом в отношении фертильности и/или качества спермы индивидуума мужского пола при введении (перорально) субъекту мужского пола или индивидууму определенного вида, в частности, вида млекопитающих; и/или могут быть один или несколько компонентов, которые при введении субъекту могут дополнительно повышать, усиливать и/или обеспечивать активность штаммов в соответствии с настоящим изобретением. Как будет понятно специалисту в данной области, дополнительные соединения должны быть совместимыми со штаммами в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, в контексте настоящего изобретения термин «фармацевтический состав» также включает в себя ветеринарные составы.
Дополнительными соединениями могут быть одно или несколько соединений для обеспечения сперматогенеза или любого процесса и/или части сперматогенеза. Неограничивающие примеры таких соединений включают в себя без ограничения:
- магний, т.е. в качестве источника биодоступного магния, такого как биодоступная соль магния (например, магния цитрат);
- один или несколько витаминов и, в частности, витамин В12 и/или витамин В2;
- подходящий источник метальных групп, такой как метионин, бетаин и/или холин; последнее, например, в виде фосфатидилхолина; или их подходящий источник, такой как лецитин;
- соответствующее метилирующее средство, такое как S-аденозилметионин (SAM);
- источник глюкозы;
- или какая-либо соответствующая их комбинация.
2+
Такими дополнительными компонентами также могут быть одно или несколько соединений, которые улучшают (снижают) уровни глутатиона в сперме. Неограничивающим примером такого типа соединения является витамин В6, который может быть представлен или может вводиться в форме пиридоксина или его производного, такого как пиридоксал или пиридоксамин. Усиление статуса глутатиона спермы улучшает качество спермы, в том числе среди других факторов, увеличивает продолжительность жизни спермы, ее подвижность и/или ее способность оплодотворять яйцеклетку. Другие компоненты, подходящие для применения в составах и препаратах в соответствии с настоящим изобретением, могут содержать подходящий источник меди и, в частности, ионы Cu, такие как меди(II) сульфат, меди(II) карбонат или меди(И) цитрат.
Примеры других соединений, которые помогают усиливать мужскую фертильность, включают в себя без ограничения фолиевую кислоту, цинк, глутатион, аргинин и альфа-липоевую кислоту.
Согласно конкретному варианту осуществления фармацевтический состав содержит фармакологически приемлемые носитель и/или вспомогательное средство.
Термин «вспомогательное средство» относится к любому веществу, которое усиливает абсорбцию любого компонента состава, т.е. штаммов в соответствии с настоящим изобретением, или которое стабилизирует указанные компоненты и/или помогает в получении фармацевтического состава тем, что обеспечивает консистенцию или вкус, которые делают его более приемлемым. Таким образом, вспомогательные средства могут действовать со связыванием компонентов (например, крахмалы, сахара или целлюлоза), подслащиванием, обеспечением цвета, защитой активного ингредиента (например, с изоляцией от воздуха и/или влаги), действием в качестве наполнителя в пилюле, капсуле или какой-либо форме презентации, с целью распадаемости для того, чтобы облегчить растворение компонентов, и т.п., без исключения других вспомогательных средств, не упомянутых в данном параграфе. Поэтому, термин «вспомогательное средство» определяется как материал, который включают в конечную дозированную форму, его добавляют в активные ингредиенты или ассоциированные ингредиенты с целью облегчения его получения и стабильности, с целью модификации органолептических свойств или физико-химических свойств фармацевтического состава и биодоступности. «Фармакологически приемлемое» вспомогательное средство не должно ингибировать активность соединений фармацевтического состава, то есть оно должно быть совместимым со штаммами в соответствии с настоящим изобретением.
Термин «галеновый состав» или «дозированная форма» относится к принципам, посредством которых активные ингредиенты и вспомогательные средства адаптируют для получения состава или лекарственного средства. Это определяется комбинацией формы, в которой фармацевтический состав получает изготовитель, и того, как она вводится.
Термин «носитель» или «среда доставки лекарственного средства» предпочтительно означает инертное вещество. Функция носителя/среды заключается в облегчении включения других соединений, а также в улучшении дозировки и введения и/или в обеспечении консистенции и формы фармацевтического состава. Поэтому, носителем/средой является вещество, используемое в лекарственном средстве для разбавления какого-либо компонента фармацевтического состава в соответствии с настоящим изобретением с целью придания объема или массы; или вещество, которое не разбавляет эти компоненты, но обеспечивает лучшую дозировку и введение и/или придает консистенцию и форму лекарственному средству. При обеспечении в жидкой форме фармакологически приемлемым носителем является разбавитель.
Кроме того, вспомогательное средство и носитель/среда должны быть фармакологически приемлемыми, т.е. вспомогательное средство и носитель являются допустимыми и, как было продемонстрировано, являются безвредными для субъекта, которому их вводят.
В каждом случае формат фармацевтического состава будет адаптирован по отношению к форме введения. Поэтому, состав может иметь форму раствора или любую другую химически приемлемую форму введения и находиться в терапевтически эффективном количестве. Фармацевтический состав в соответствии с настоящим изобретением может быть составлен в виде твердых, полутвердых или жидких препаратов, таких как таблетки, капсулы, порошки, гранулы, растворы, суппозитории, гели или микросферы. Согласно конкретному варианту осуществления фармацевтический состав имеет форму, подходящую для перорального введения.
Форма, адаптированная для перорального введения, относится к физическому состоянию, которое обеспечивает пероральное введение. Указанная форма, адаптированная для перорального введения, выбрана из перечня, состоящего без ограничения из капель, сиропа, травяного чая, эликсира, суспензии, экстемпоральной суспензии, питьевой ампулы, таблетки, капсулы, гранулы, крахмальной капсулы, пилюли, таблетки, леденца, пастилки и лиофилизата.
В качестве дополнения к описанному выше, в настоящем документе предусматривается возможность того, что состав в соответствии с настоящим изобретением может быть введен субъекту в сочетании с другими соединениями, хотя они не являются частью состава в соответствии с настоящим изобретением. Примеры таких соединений были упомянуты выше.
Таким образом, субъект может потреблять указанные соединения одновременно или последовательно с составом в соответствии с настоящим изобретением.
В случае, если состав в соответствии с настоящим изобретением разработан в виде функционального питательного состава, указанный питательный состав может быть пищей или может быть включен в пищу или в пищевой продукт, предназначенный для потребления человеком и/или для скармливания животному. Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления функциональный питательный состав выбирают либо из пищи (которой может быть пища для целей специального питания, или медицинская пища, или функциональная пища), либо из пищевой добавки.
Термин «функциональный пищевой состав» или «функциональный питательный состав» в соответствии с настоящим изобретением относится к пище, которая независимо от обеспечения субъекта питательными веществами, оказывает благоприятный эффект на одну или несколько функций организма, обеспечивая, таким образом, улучшение здоровья и хорошее самочувствие. Указанный в настоящем документе функциональный питательный состав направлен на улучшение мужской фертильности.
Термин «добавка» является синонимом любому из следующих терминов «диетическая добавка», «питательная добавка» или «пищевая добавка», относящихся к компоненту или компонентам, которые являются добавкой к диете. Примеры диетических добавок включают в себя без ограничения витамины, минералы, растительные компоненты, аминокислоты и пищевые компоненты, такие как ферменты и экстракты желез. Они не предназначены для замены традиционной пищи или отдельных компонентов пищи или диеты, но служат в качестве диетической добавки.
Примеры видов пищи, которые могут содержать штамм Lactobacillus rhamnosus и штамм Bifidobacterium longum или состав, который содержит их, как поясняется в приведенном выше параграфе, включают в себя без ограничения корм для животных, молочные продукты, растительные продукты, мясные продукты, закуски, виды шоколада, напитки, детское питание, зерновые, жареные пищевые продукты, хлебобулочные продукты, печенья и т.д. Примеры молочных продуктов включают в себя без ограничения ферментированные продукты из молока (такие как без ограничения йогурт или сыр) или неферментированные продукты (например, без ограничения сливки, масло, маргарин или сыворотка). Растительным продуктом является, например, без ограничения зерновые, представленные в любой форме, ферментированные или неферментированные, или закуска. Напитком может быть без ограничения неферментированное молоко. Однако согласно конкретному варианту осуществления пищевой продукт выбран из группы, состоящей из молочного продукта, мясного продукта, растительного продукта, корма для животного и напитка.
Согласно другому конкретному варианту осуществления состав в соответствии с настоящим изобретением вводят субъекту посредством диеты.
6
12
9
6
12
9
Специалисту в данной области будет понятно, что организмы Lactobacillus rhamnosus и Bifidobacterium longum должны присутствовать в составе в соответствии с настоящим изобретением в терапевтически эффективном количестве для обеспечения эффекта усиления мужской фертильности при введении субъекту. Используемый в настоящем документе термин «терапевтически эффективное количество» означает количество компонента в фармацевтическом составе, которое при введении субъекту является достаточным для обеспечения эффекта. Указанный компонент фармацевтического состава относится к штаммам в соответствии с настоящим изобретением. Терапевтически эффективное количество будет варьировать в зависимости, например, от возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и диеты субъекта, а также в зависимости от пути и времени введения, скорости экскреции или комбинаций лекарственных средств среди прочих факторов. Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления общая концентрация микроорганизмов штаммов Lactobacillus rhamnosus и Bifidobacterium longum в составе составляет от 10 до 10 КОЕ, предпочтительно 10 КОЕ. Согласно другому конкретному варианту осуществления вводимая доза микроорганизмов Lactobacillus rhamnosus и Bifidobacterium longum в составе составляет от 10 до 10 КОЕ/сутки, предпочтительно 10 КОЕ/сутки, и согласно другому более конкретному варианту осуществления введение дозы осуществляют по меньшей мере один раз в сутки, в частности, два раза в сутки и, более конкретно, три раза в сутки, один раз с каждым приемом пищи (с завтраком, обедом и ужином).
Согласно конкретному варианту осуществления штаммом Lactobacillus rhamnosus является штамм Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 или штамм, полученный из него, и/или штаммом Bifidobacterium longum является штамм Bifidobacterium longum СЕСТ 7347 или штамм, полученный из него. Данный конкретный вариант осуществления настоящего изобретения будет подробно описан ниже.
Состав II в соответствии с настоящим изобретением
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к составу, далее в настоящем документе называемому «составом II в соответствии с настоящим изобретением», содержащему Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 и Bifidobacterium longum СЕСТ 7347 или штаммы, полученные из них, комбинация которых обладает способностью усиления мужской фертильности.
Штамм Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 выделили из фекалий здорового вскармливаемого грудью ребенка возрастом трех месяцев. Данный штамм разместили в депозитарии 27 мая 2013 года в соответствии с Будапештским договором в Испанской коллекции типовых культур, Международном депозитарном органе (Edificio 3 CUE, Pare  Universitat de Valencia,  Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) SPAIN). Ему присвоили номер доступа СЕСТ 8361 (далее в настоящем документе «штамм в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 8361» или «Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361»). Научная классификация штамма в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 8361: Царство: Bacteria; Отдел: Firmicutes; Класс: Bacilli; Порядок: Lactobacillales; Семейство: Lactobacillaceae; Род: Lactobacillus; Вид: Lactobacillus rhamnosus.
В ходе выделения штамма в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 8361 авторы настоящего изобретения обнаружили, что Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 демонстрирует на удивление более высокую антиоксидантную активность, чем другие штаммы, выделенные из рода Lactobacillus, то есть он обеспечивает клетки более высокой защитой от окислительного стресса. Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления штамм Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 демонстрирует более высокую антиоксидантную активность, чем другие штаммы Lactobacillus. Следовательно, авторы настоящего изобретения полагают, что антиоксидантная способность штамма имеет отношение к объяснению повышенного качества спермы, в частности, к усилению подвижности сперматозоидов и снижению фрагментации ДНК в сперматозоидах, что в конечном итоге усиливает мужскую фертильность.
Штамм Bifidobacterium longum СЕСТ 7347 выделили из фекалий здорового вскармливаемого грудью ребенка возрастом трех месяцев и разместили в депозитарии 20 декабря 2007 года в соответствии с Будапештским договором в Испанской коллекции типовых культур, Международном депозитарном органе (Valencia, SPAIN). Ему присвоили номер доступа СЕСТ 7347 (далее в настоящем документе «штамм в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 7347» или ((Bifidobacterium longum СЕСТ 7347»). Научная классификация штамма в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 7347: Царство: Bacteria; Отдел: Firmicutes; Класс: Actinobacteria; Порядок: Bifidobacteriales, Семейство: Bifidobacteriaceae, Род: Bifidobacterium, Вид: Bifidobacterium longum. Штамм в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 7347 демонстрирует противовоспалительную активность.
В настоящем документе также представлены те микроорганизмы или бактерии, которые получены из штамма в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 8361 и штамма в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 7347 и которые сохраняют способность усиления мужской фертильности, поскольку они улучшают качество спермы и/или снижают фрагментацию ДНК в сперматозоидах, а также улучшают целостность хроматина. Примерами штаммов или микроорганизмов, полученных из штаммов в соответствии с настоящим изобретением, могут быть мутанты, обладающие изменениями в своем геноме по сравнению с геномом штаммов в соответствии с настоящим изобретением, при этом указанные изменения не влияют на способность штаммов усиливать мужскую фертильность. Таким образом, также в настоящем документе представлены мутантные штаммы, полученные из штаммов в соответствии с настоящим изобретением, которые сохраняют способность усиления фертильности. Поэтому, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к штаммам, полученным из штамма в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 8361 и штамма в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 7347, со способностью усиления мужской фертильности при введении субъекту в комбинации.
Штаммы, полученные из штамма в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 8361 и штамма в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 7347, могут быть образованы естественным путем или целенаправленно методом мутагенеза, известным специалистам в данной области, таким как без ограничения выращивание родительского штамма в присутствии мутагенных средств или факторов, вызывающих стресс, или генетическим конструированием с модификацией, делецией и/или вставкой определенных генов. Таким образом, в настоящем документе также представлены генетически модифицированные организмы, полученные из штаммов в соответствии с настоящим изобретением, которые сохраняют свою способность усиления мужской фертильности.
Кроме того, настоящий документ также относится к клеточным компонентам, метаболитам и молекулам, секретируемым штаммом в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 8361 и штаммом в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 7347 или штаммами, полученными из штамма в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 8361 и штамма в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 7347, а также к составам, содержащим эти соединения, и к их применениям для усиления мужской фертильности. Клеточные компоненты бактерий могут включать в себя компоненты клеточной стенки (такие как без ограничения пептидогликан), нуклеиновые кислоты, мембранные компоненты и другие, такие как белки, липиды и углеводы, а также их комбинации (такие как липопротеины, гликопротеины или гликолипиды). Метаболиты включают в себя любую молекулу, продуцируемую или модифицируемую бактериями в результате метаболической активности при росте, их применении в технологических процессах или при хранении продукта. Примерами таких метаболитов являются без ограничения органические и неорганические кислоты, белки, пептиды, аминокислоты, ферменты, липиды, углеводы, липопротеины, гликолипиды, гликопротеины, витамины, соли, металлы или нуклеиновые кислоты. Секретируемые молекулы включают в себя любую молекулу, секретируемую или высвобождаемую в окружающую среду бактериями при росте, их применении в технологических процессах (например, при обработке пищевых продуктов или в лекарственных средствах) или при хранении продукта. Примерами таких метаболитов являются без ограничения органические и неорганические кислоты, белки, пептиды, аминокислоты, ферменты, липиды, углеводы, липопротеины, гликолипиды, гликопротеины, витамины, соли, металлы или нуклеиновые кислоты.
В настоящем документе следует учитывать, что штамм или комбинация штаммов обладает способностью «усиления мужской фертильности», если после поглощения субъектом указанный штамм(ы) способен улучшать качество спермы субъекта и тем самым повышать вероятность оплодотворения женщины и появления потомства.
Пропорция штамма в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 8361 и штамма в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 7347 в составе в соответствии с настоящим изобретением может варьировать в широком диапазоне. Соотношение Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361:Bifidobacterium longum СЕСТ 7347 в составе в соответствии с настоящим изобретением включает в себя без ограничения 10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10 и 95:05. Однако согласно конкретному варианту осуществления соотношение Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361: Bifidobacterium longum СЕСТ 7347 составляет приблизительно 50:50.
Как объясняется выше в отношении применения состава в соответствии с настоящим изобретением для усиления мужской фертильности, состав II в соответствии с настоящим изобретением может быть разработан для фармацевтического введения или питательного введения, поэтому, согласно конкретному варианту осуществления составом является фармацевтический состав или функциональный питательный состав.
Фармацевтический состав представляет собой ряд компонентов, образованный по меньшей мере штаммом в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 8361 и штаммом в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 7347 в любой концентрации, который может в качестве дополнения содержать один или несколько компонентов или соединений, обладающих некоторой биологической, фармакологической и/или ветеринарной активностью; в частности, соединения могут проявлять указанную биологическую активность при пероральном введении субъекту. Такими дополнительными соединениями могут быть одно или несколько соединений, которые, как известно per se, обладают благоприятным эффектом в отношении фертильности и/или качества спермы индивидуума мужского пола при введении (перорально) субъекту мужского пола или индивидууму определенного вида, в частности, вида млекопитающих; и/или могут быть один или несколько компонентов, которые при введении субъекту могут дополнительно повышать, усиливать и/или обеспечивать активность штаммов в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 8361 и СЕСТ 7347. Как будет понятно специалисту в данной области, дополнительные соединения должны быть совместимыми со штаммами в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, в контексте настоящего изобретения термин «фармацевтический состав» также включает в себя ветеринарные составы.
Дополнительным соединением или соединениями могут быть одно или несколько соединений, которые гарантируют сперматогенез или любую часть и/или процесс сперматогенеза. Неограничивающие примеры таких соединений описаны выше в аспекте настоящего изобретения и являются применимыми к составу II в соответствии с настоящим изобретением.
Согласно конкретному варианту осуществления фармацевтический состав содержит фармацевтически приемлемые носитель/среду и/или вспомогательное средство. Термины «носитель», «среда», «вспомогательное средство» и «фармацевтически приемлемый» имеют определяемое ранее значение и применимы для данного аспекта настоящего изобретения.
В каждом случае формат фармацевтического состава будет адаптирован по отношению к типу введения. Фармацевтический состав может быть составлен в твердые, полутвердые или жидкие препараты, такие как таблетки, капсулы, порошки, гранулы, растворы, гели или микросферы. Согласно конкретному варианту осуществления фармацевтический состав имеет форму, адаптированную для перорального введения. Примеры перорального введения объяснялись выше.
В качестве дополнения, в настоящем документе предусматривается возможность того, что состав в соответствии с настоящим изобретением может быть введен субъекту в сочетании с другими соединениями. Примеры таких соединений также были упомянуты выше. Таким образом, введение данных соединений субъекту может быть выполнено одновременно или последовательно с составом в соответствии с настоящим изобретением.
В случае, если состав, содержащий штамм в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 8361 и штамм в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 7347, составляют в виде функционального питательного состава, указанный питательный состав может быть пищей или может быть включен в пищу или в пищевой продукт/кормовой продукт, предназначенный для потребления человеком и/или для скармливания животному. Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления функциональный питательный состав выбирают либо из пищи (которой может быть пища для целей специального питания, или медицинская пища, или функциональная пища), либо из пищевой добавки. Термины «функциональный питательный состав», «добавка» и примеры пищи, которая может содержать штаммы в соответствии с настоящим изобретением или состав II в соответствии с настоящим изобретением, были описаны выше. Однако согласно конкретному варианту осуществления пищевой продукт выбран из группы, состоящей из молочного продукта, мясного продукта, растительного продукта, корма для животного и напитка. Согласно другому конкретному варианту осуществления состав в соответствии с настоящим изобретением вводят субъекту посредством диеты.
6
12
9
Специалисту в данной области будет понятно, что штаммы в соответствии с настоящим изобретением должны присутствовать в составе в соответствии с настоящим изобретением в терапевтически эффективном количестве для обеспечения эффекта усиления мужской фертильности при введении субъекту. Термин «терапевтически эффективное количество» был описан ранее, также как и пути, дозы и режимы введения, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения. Согласно конкретному варианту осуществления общая концентрация микроорганизмов Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 и Bifidobacterium longum СЕСТ 7347 в составе в соответствии с настоящим изобретением составляет от 10 до 10 КОЕ, предпочтительно 10 КОЕ.
Способ усиления мужской фертильности у субъекта
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу усиления мужской фертильности, далее в настоящем документе «способ в соответствии с настоящим изобретением», который предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества состава, содержащего Lactobacillus rhamnosus и Bifidobacterium longum, в частности, штаммы Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 и Bifidobacterium longum СЕСТ 7347.
Специалисту в данной области будет понятно, что все конкретные варианты осуществления, описанные выше для применения Lactobacillus rhamnosus и Bifidobacterium longum, применимы к способу в соответствии с настоящим изобретением: формы введения, формат, типы состава, доза, субъекты, которых можно лечить, и т.д.
По всему описанию и формуле изобретения слово «содержать» и его вариации не предназначены для исключения других технических характеристик, добавок, компонентов или стадий. Специалистам в данной области другие цели, преимущества и признаки настоящего изобретения будут частично понятны из описания, а частично из осуществления настоящего изобретения. Следующие примеры и графические материалы представлены с целью иллюстрации и не предназначены ограничивать настоящее изобретение.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлен столбиковый график, демонстрирующий вариацию подвижных сперматозоидов (%) на протяжении схемы эксперимента: С (контроль; n=9), Т1 (лечение 1; n=8), Т2 (лечение 2; n=7), L1 (период вымывания 1; n=8), L2 (период вымывания 2; n=7). Значения (среднее ± ошибка), помеченные звездочкой, существенно отличаются от контроля согласно статистическому анализу t-критерия Стьюдента для соответствующих образцов (р<0,05).
На фиг. 2 представлен столбиковый график, демонстрирующий вариацию индекса фрагментации ДНК в сперматозоидах (DFI) (%) на протяжении схемы эксперимента: С (контроль; n=9), Т1 (лечение 1; n=9), Т2 (лечение 2; n=7), L1 (период вымывания 1; n=8), L2 (период вымывания 2; n=6). Значения (среднее ± ошибка), помеченные звездочкой, существенно отличаются от контроля согласно статистическому анализу t-критерия Стьюдента для соответствующих образцов (р<0,05).
На фиг. 3 представлен столбиковый график, демонстрирующий антиоксидантную способность Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 на Caenorhabditis elegans (далее в настоящем документе С. elegans). Выполняли скрининг двадцати изолятов, принадлежащих роду Lactobacillus из коллекции одного из двух заявителей настоящего изобретения, а именно Biopolis S.L., с целью тестирования антиоксидантной активности в отношении С. elegans. На фиг. показана выживаемость С. elegans, питающегося на каждом изоляте, по сравнению с С. elegans, выжившим в контрольных условиях (Е. coli ОР50). Положительные значения указывают на антиоксидантную активность, и отрицательные значения указывают на возможный прооксидантный эффект.
Примеры
Ниже настоящее изобретение будет иллюстрироваться предпринятыми авторами настоящего изобретения экспериментами, которые демонстрируют эффективность продукта в соответствии с настоящим изобретением.
Пример 1: Улучшение качества спермы после совместного введения субъекту штаммов Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 и Bifidobacterium longum СЕСТ 7347
Для осуществления данного исследования отбирали штаммы Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 и Bifidobacterium longum СЕСТ 7347. Такой отбор был основан на высокой антиоксидантной активности, демонстрируемой штаммом Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361, и противовоспалительной активности, ранее описанной для штамма Bifidobacterium longum СЕСТ 7347.
9
Введение осуществляли в форме капсулы, содержащей комбинацию обоих микроорганизмов по пятьдесят процентов (50%) каждого. Дозировка составляла одну капсулу в сутки, что соответствовало потреблению 10 КОЕ/сутки.
В соответствии с одобрением Комитета по биоэтике Университета Леона в эксперименте участвовали астенозооспермические мужчины, которые не принимали медикаменты и имели сходные предпочтения в еде, после подписания соответствующего информированного согласия в соответствии с Хельсинкской декларацией и в соответствии с законами, действующими в Испанском государстве.
Волонтеры сдавали образец своего эякулята, как описано в справочнике Всемирной организации здравоохранения (WHO, 2010), после трех дней сексуального воздержания и с использованием стерильных контейнеров. Донорские материалы быстро собирали сразу же после отбора образцов для немедленной обработки в лаборатории.
9
Биологические образцы, запрашиваемые от доноров, были следующими: контроль С (перед началом потребления пробиотика); лечение 1 Т1 (через 3 недели потребления пробиотика); лечение 2 Т2, (через 6 недель потребления пробиотика); период вымывания 1 L1 (через 3 недели после завершения потребления пробиотика); и период вымывания 2 L2 (через 6 недель после завершения потребления пробиотика). Потребление пробиотика было ежесуточным. Дозировка составляла одну капсулу в сутки; каждая капсула содержала оба штамма Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 и Bifidobacterium longum СЕСТ 7347 при концентрации 10 КОЕ/капсула.
6
Сперму разбавляли IX буфером PBS до конечной концентрации 10-20×10 клеток/мл. Это разбавление загружали в счетную камеру Маклера глубиной 10 мкм при 37°С. Подвижность сперматозоидов оценивали одинаковым образом для каждого образца с использованием выполняемого с помощью компьютера анализа спермы (CASA), предусматривающего тринокулярный фазово-контрастный микроскоп с использованием негативно-фазового контрастного объектива 10Х, оснащенного нагревающей до 37°С пластиной и цифровой камерой Basler A312fc. Изображения фиксировали и анализировали с использованием компьютеризированного анализатора подвижности со специфическими настройками для человеческой спермы. В целом система обеспечивала следующие три параметра: (1) процентное соотношение подвижных сперматозоидов, (2) процентное соотношение сперматозоидов с поступательной подвижностью и (3) процентное соотношение неподвижных сперматозоидов.
6
2
4
Осуществляли методику SCSA (анализ структуры хроматина сперматозоида) (Evenson) для оценивания фрагментации ДНК. Одно метахроматическое окрашивание выполняли с акридином оранжевым (АО) с одной аликвотой образца. Данная молекула испускает флуоресценцию в красной полосе пропускания при объединении с денатурированной ДНК и в зеленой полосе пропускания при объединении с неповрежденной двойной спиралью ДНК. Эякуляты разбавляли с помощью TNE буфера (0,15 М NaCl, 0,01 М Tris-HCl, 1 мМ EDTA, рН 7,4) до конечной концентрации клеток приблизительно 1-2×10 клеток/мл. Образцы немедленно замораживали в жидком азоте до обработки. Затем образцы размораживали в бане при 37°С и смешивали с 200 мкл раствора кислого детергента (0,08 N НС1, 0,15 М NaCl, 0,15 Triton X 100, рН 1,4). Через 30 секунд воздействия кислого детергента выполняли окрашивание акридиновым оранжевым путем добавления 1,2 мл окрашивающего раствора, содержащего 6 г OA на мл буфера (0,037 М лимонной кислоты, 0,126 М NaHPO, 0,0011 М EDTA (динатрия), 0,15 М NaCl, рН 6,0). Точно через 3 минуты окрашивания образцы анализировали на проточном цитометре, оснащенном стандартной оптикой и аргоновым лазером, настроенным на 488 мкм. Поток клеток поддерживали при приблизительно 200 клеток/секунда и 5000 событий подсчитывали для каждого образца. Данные, соответствующие красной (фотодетектор FL3; фильтр 670 Long Pass) и зеленой флуоресценции (фотодетектор FL1; полосовой фильтр 530/30) частиц, регистрировали и анализировали с помощью свободно распространяемого программного обеспечения Weasel 3.1. Анализировали основной параметр - индекс фрагментации ДНК (DFI), который соответствует отношению красной флуоресценции к общей флуоресценции (красной и зеленой).
Статистический анализ выполняли с использованием SPSS версии 20. Данные представляли как среднее ± SE во всех случаях. Средние значения каждой переменной сравнивали с использованием t-критерия Стьюдента для соответствующих образцов (р<0,05).
Статус подвижности сперматозоидов донора подтверждали в контрольном образце, если было подтверждено, что волонтеры были классифицированы как астенозооспермические согласно стандартам Всемирной организации здравоохранения (WHO, 2010). Значение подвижности клеток, регистрируемое в этом образце, составляло 5,56±2,51% (среднее значение ± SEM). После трех недель введения пробиотика (Т1) процентное соотношение подвижных сперматозоидов повышалось в приблизительно пять раз по сравнению с предварительным забором образцов, достигая значения 31,88±6,01% (среднее значение ± ошибка). Такое повышение поддерживалось в течение шести недель потребления пробиотика (Т2) и в обоих образцах сохранялось через 3 и 6 недель после завершения введения пробиотика (L1 и L2). Собранные данные представляли собой, соответственно: 28,14±8,79; 33,25±6,38 и 39,57±8,52% (среднее ± SEM) (фиг. 1). После выполнения статистического анализа обнаруживали значимые различия между контролем и другими образцами (t-критерий Стьюдента для соответствующих образцов, р<0.05). См. фиг. 1.
На фиг. 2 показаны средние процентные отношения, полученные в каждой ключевой точке в ходе выполнения экспериментальной схемы для индекса фрагментации ДНК. Самый высокий DFI (индекс фрагментации ДНК в сперматозоидах) 25,74±0,59% находили в контрольном образце (С). После шести недель введения пробиотика процентное соотношение поврежденной ДНК снижалось до 21,11±1,00 и 21,58±0,94% (Т1 и Т2, соответственно). Данная тенденция сохранялась на протяжении первого периода вымывания (L1) со средним DFI 21,64±1,73%. Через шесть недель после завершения лечения штаммами улучшение, зафиксированное во время предыдущих отборов образцов, начинало меняться в период вымывания 2 (L2) с более высоким зарегистрированным DFI по сравнению с T1, Т2 и L1, с индексом фрагментации 23,09±1,28%, с изменением тем самым тенденции. Значимые различия (t-критерий Стьюдента для соответствующих образцов, р<0,05) по сравнению с контрольным образцом обнаруживали в T1, Т2 и L1.
Данные результаты демонстрируют, что штаммы Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361 и Bifidobacterium longum СЕСТ 7347 играют роль в стимулировании подвижности сперматозоидов при потреблении в виде функционального питательного состава. Данные результаты также подтверждают существенное снижение фрагментации ДНК в сперматозоидах после лечения.
Пример 2. Антиоксидантная активность Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361
Выполняли скрининг 23 изолятов, принадлежащих роду Lactobacillus, из коллекции одного из двух заявителей настоящего изобретения, а именно Biopolis S.L., по их антиоксидантной активности в отношении С. elegans. Штаммы, включенные в исследование, выделили из фекалий вскармливаемого грудью ребенка возрастом 3 месяцев.
На фиг. 3 показаны результаты, полученные в исследовании штамма Lactobacillus. Данные демонстрируют повышение процентных отношений выживаемости на животной модели С. elegans, питающейся каждым бактериальным штаммом, по сравнению с С. elegans, содержащейся при стандартных условиях (питающейся штаммом Escherichia coli ОР50). Как показано, изолят 1, идентифицированный как Lactobacillus rhamnosus, соответствовал наибольшей выживаемости С. elegans после применения окислительного стресса с пероксидом водорода (повышение выживаемости на 27% по сравнению с контрольными условиями).
Изолят 1 однозначно идентифицировали с помощью секвенирования 16S рибосомальной ДНК (rDNA) и последующего сравнения полученной последовательности с полными последовательностями генов, депонированными в общедоступных базах данных, с использованием BLAST в режиме он-лайн (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) в NCBI (Национальном центре биотехнологической информации). Штамм в соответствии с настоящим изобретением СЕСТ 8361 был идентифицирован как Lactobacillus rhamnosus с наивысшей гомологией (100%) с общедоступными последовательностями, принадлежащими этому виду. Штамм был депонирован в Испанской коллекции типовых культур (СЕСТ) как СЕСТ 8361.
SEQ ID NO: 1 - последовательность, полученная с помощью секвенирования 16S rDNA Lactobacillus rhamnosus СЕСТ 8361.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  БИОПОЛИС Эс. Эл.
<110>  УНИВЕРСИДАД ДЕ ЛЕОН
<120>  ПРИМЕНЕНИЕ ПРОБИОТИКОВ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ МУЖСКОЙ ФЕРТИЛЬНОСТИ
<130>  PCT3113.2
<150>  ES P201431977
<151>  2014-12-31
<160>  1
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  973
<212>  DNA
<213>  Lactobacillus rhamnosus
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (15)..(15)
<223>  n is a, c, g, or t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (695)..(695)
<223>  n is a, c, g, or t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (725)..(725)
<223>  n is a, c, g, or t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (753)..(754)
<223>  n is a, c, g, or t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (860)..(860)
<223>  n is a, c, g, or t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (870)..(870)
<223>  n is a, c, g, or t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (911)..(911)
<223>  n is a, c, g, or t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (935)..(935)
<223>  n is a, c, g, or t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (937)..(937)
<223>  n is a, c, g, or t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (952)..(952)
<223>  n is a, c, g, or t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (962)..(962)
<223>  n is a, c, g, or t
<400>  1
gtcgaacgag ttctnattat tgaaaggtgc ttgcatcttg atttaatttt gaacgagtgg       60
cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cccttaagtg ggggataaca tttggaaaca      120
gatgctaata ccgcataaat ccaagaaccg catggttctt ggctgaaaga tggcgtaagc      180
tatcgctttt ggatggaccc gcggcgtatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag      240
gcaatgatac gtagccgaac tgagaggttg atcggccaca ttgggactga gacacggccc      300
aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc      360
aacgccgcgt gagtgaagaa ggctttcggg tcgtaaaact ctgttgttgg agaagaatgg      420
tcggcagagt aactgttgtc ggcgtgacgg tatccaacca gaaagccacg gctaactacg      480
tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggatttatt gggcgtaaag      540
cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt gaaagccctc ggcttaaccg aggaagtgca      600
tcggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga ggacagtgga actccatgtg tagcggtgaa      660
atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaangcggc tgtctggtct gtaactgacg      720
ctgangctcg aaagcatggg tagcgaacag gannagatac cctggtagtc catgccgtaa      780
acgatgaatg ctaggtgttg gagggtttcc gcccttcagt gccgcagcta acgcattaag      840
cattccgcct ggggagtacn accgcaaggn tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc      900
acaagcggtg nagcatgtgg tttaattcga agcancncga agaaccttac cnggtcttga      960
cntcttttga tca                                                         973
<---