Противовирусное средство на основе гуминовых кислот
ANTIVIRAL AGENT BASED ON HUMIC ACIDS

Изобретение относится к препаратам для профилактики и лечения вирусных заболеваний, в частности, вызванных вирусами гриппа, простого герпеса 1-го и 2-го типа, иммунодефицита человека (ВИЧ-1) и вируса Западного Нила и может быть использовано в медицине, а именно в вирусологии, фармакологии и биотехнологии.
Гуминовые кислоты представляют собой высокомолекулярные гетерополимеры и являются составной частью объектов природного происхождения (торф, почва и бурый уголь). Для молекул гуминовых кислот характерны нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов и полидисперстность. Структурные единицы гуминовых кислот представляют собой ароматические конденсированные системы с боковыми цепями и гетероциклами. Функциональными группами являются карбоксильные, карбонильные, фенольные и спиртовые гидроксиды, хиноидные группировки, метоксилы, амино- и амидогруппы, моно-, ди-, полисахариды, пептиды, минеральные компоненты. Биологическая активность гуминовых кислот может быть обусловлена наличием в этих соединениях разнообразных функциональных групп; коллоидными свойствами и компонентным составом. Наличие в ГВ разнообразных функциональных групп обуславливает, во-первых, участие этих соединений в химических реакциях окисления-восстановления, а, во-вторых, реакционную способность в целом, включая ионный обмен и образование хелатных соединений. Будучи коллоидами, ГВ проявляют поверхностно-активные и электро-поверхностные свойства. Эти свойства определяют гидрофильно-гидрофобные и электростатические взаимодействия гумусовых соединений. Гуминовые вещества, являясь гетерополимерами, могут служить источником структурных фрагментов органических макромолекул при биосинтезе, происходящем в живых организмах (Попов А.И., Зеленков В.Н., Теплякова Т.В. Биологическая активность и биохимия гуминовых веществ. Часть 1. Биохимический аспект (обзор литературы) // Вестник Российской Академии естественных наук, 2016. - №1. - С. 11-18) [1]. Известно, что гуминовые вещества обладают широким спектром терапевтического действия: адаптогенным, антитоксическим, гепатопротекторным, противомикробным, диуретическим и противовоспалительным действием (Попов А.И., Зеленков В.Н., Теплякова Т.В. Биологическая активность и биохимия гуминовых веществ. Часть 2. Медико-биологический аспект. Обзор литературы) // Вестник Российской Академии естественных наук, 2016. - №5. - С. 9-15) [2]. Кроме того было показано, что гуминовые кислоты обладают противовирусной активностью в отношении вирусов иммунодефицита человека (Корнилаева Г.В., Перминова И.В., Гилязова А.В. и др. Гуминовые вещества как перспективные соединения для создания микробицидных препаратов // Российский иммунологический журнал. 2010. Т. 4 (13), №3. С.255-260) [3], а также (Теплякова Т.В., Гашникова Н.М., Балахнин С.М., Косогова Т.А. Антиретровирусная активность экстрактов из чаги, меланина и гуминовых соединений. Современная микология в России // Материалы 3-го съезда микологов России. Т. 3. М.: Национальная академия микологии, 2012. С. 419-420) [4], простого герпеса и гриппа (Ilycheva T.N., Balakhnin S.M., Gashnikova N.M. et al. Antiviral Activity of Humic Substances // Third International Conference of CIS IHSS on Humic Innovative Technologies Tenth International Conference daRostim «Humic Substances and Other Biologically Active Compounds in Agriculture» HIT-daRostim-2014 November 19-23, 2014, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia. P. 42. J Immunol Methods. 1983 Dec 16; 65(1-2): 55-63) [5].
Известно применение природных препаратов гуминовых кислот, выделенных из почвы, для лечения ВИЧ-инфекции (заявка США №20040137085, МПК А61К 35/78, опубл. 15.07.2004 г.). Препарат изготавливается американской компанией Aldrich Chemical Company и упоминается в заявке как AVC. Подавление ВИЧ-инфекции происходит при контакте лейкоцитов ВИЧ-инфицированного человека с препаратом гуминовой кислоты. Заявлен также метод иммуностимуляции интерлейкина-2, метод усиления иммунного ответа на вакцинацию с использованием гуминовой кислоты в качестве адъюванта при вакцинации пациента с ВИЧ-инфекцией.
Однако в указанной заявке США рассматривается применение гуминовых кислот только для лечения ВИЧ-инфекции и нет данных о их применении для лечения других вирусных заболеваний.
Известно противовирусное средство на основе гуминовых кислот, полученных из медицинского лигнина (марки "Полифепан", peг. N 80/1211/3 - неспецифического энтерального сорбента) путем его окисления при 150-170°С в течение 0,5-1,5 ч при давлении 2,0-2,5 МПа (патент РФ №2172176, МПК А61К 35/78, опубл. 20.08.2001 г. ). Препарат эффективен против вируса простого герпеса 2-го типа, вируса гриппа типа A (PR-8), а также вируса саркомы Рауса BH-RSV(RAV-1) серологической подгруппы А.
Однако в описании к патенту на изобретение отсутствуют данные о допустимой токсичности противовирусного средства на основе гуминовых кислот, полученных из медицинского лигнина.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является средство против передачи ВИЧ/СПИД половым путем, выполненное в виде суппозитория, содержащего фармакологически приемлемую основу и активную субстанцию (патент РФ №2531945, МПК А61К 35/02, опубл. 27.07.2014 г.). В качестве активной субстанции с анти-ВИЧ-активностью используют фракцию гуминовых кислот, выделенных из окисленного бурого угля, а в качестве основы используется масло какао или твердый кондитерский жир и эмульгатор. Выделение фракции гуминовых кислот (НАС-1) осуществляют путем обработки бурого угля 1%-ным раствором гидроксида натрия (NaOH) и нагревании смеси в течение 2 часов на кипящей водяной бане (при температуре 80°С). После охлаждения продукты реакции центрифугируют, раствор декантируют, нерастворившийся остаток промывают один - два раза 100 мл 1%-ого раствора гидроксида натрия и вновь центрифугируют, собирая основной экстракт и промывные воды в один приемник. К полученному раствору добавляют раствор концентрированной соляной кислоты до рН 2 для осаждения гуминовых кислот. Образовавшийся осадок гуминовых кислот отделяют центрифугированием и обессоливают с помощью диализа. Полученный препарат гуминовых кислот высушивают при 80°С в сушильном шкафу.
Однако в описании к патенту РФ №2531945 рассматривается применение гуминовых кислот только для лечения ВИЧ-инфекции и нет данных о применении данного препарата для лечения других вирусных заболеваний, в частности, вызванных вирусами гриппа, простого герпеса 1-го и 2-го типа, Западного Нила. Кроме того, известно, что в составе гетерогенных молекул гуминовых кислот (ГК), в частности, содержатся пептидные цепочки различного состава и длины (http://powermatrix-spb.ru/guminovyie_kisloty), которые могут высвобождаться из молекул ГК в процессах клеточного метаболизма и оказывать токсическое действие на клетки человека.
Техническим результатом заявляемого изобретения является получение препарата гуминовых кислот из окисленного бурого угля с более низким содержанием токсичных веществ и более широким спектром противовирусного действия в отношении вирусов, патогенных для человека.
Указанный технический результат достигается тем, что в противовирусном средстве, содержащем водный раствор водорастворимой фракции гуминовых кислот (ВФГК), полученных из окисленного бурого угля, согласно изобретения, в качестве ВФГК оно содержит водорастворимую фракцию гуминовых кислот, обработанную ферментом трипсином в соотношении ВФГК и трипсин (25-35):1 в буферном растворе 1М Трис в течение не менее 5-6 часов с последующим осаждением ВФГК путем закисления до значения рН равного или менее 2,0 единиц с содержанием ВФГК в водном растворе в концентрации от 1,5 до 150 мкг/мл.
Средство содержит:
- водный раствор ВФГК в концентрации от 4,2 до 5,4 мкг/мл, обладающий активностью против вируса Западного Нила (ВЗН);
- водный раствор ВФГК в концентрации от 1,5 до 5,5 мкг/мл, обладающий активностью против вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ-2);
- водный раствор ВФГК в концентрации от 3,0 до 4,0 мкг/мл, обладающий активностью против вируса гриппа A/H1N1/California/2009;
- водный раствор ВФГК в концентрации от 100 до 150 мкг/мл, обладающий активностью против вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1);
- водный раствор ВФГК в концентрации от 45 до 55 мкг/мл, обладающий активностью против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).
Таким образом, отличительными особенностями средства является, во-первых, пониженная токсичность (безопасность) для клеток человека, благодаря очистке и ферментативной обработке гуминовых кислот; во-вторых, широкий спектр противовирусного действия, показанный экспериментально. Согласно данным заявителя, гуминовые кислоты имеют высокую противовирусную активность в отношении пяти вирусов (см. примеры 2-6), вызывающих тяжелые заболевания человека, и относящихся к разным семействам.
Пример 1. Метод получения противовирусного средства на основе гуминовых кислот
1.1. Выделение гуминовых кислот.25 г бурого угля Абанского месторождения, измельченные до размера частиц не более 0,2 мм, смешали с 50 мл 2% аммиака. К полученной смеси, при непрерывном перемешивании добавили 40 мл концентрированной перекиси водорода. После окончания процесса газовыделения смесь центрифугировали для отделения нерастворившейся части угля.
1.2. Очистка гуминовых кислот. Для осаждения гуминовых кислот супернатант, содержащий растворенные гуминовые кислоты, закисляли до значения рН менее 2,0 единиц добавлением соляной кислоты и снова центрифугировали, супернатант отбрасывали. Далее проводили процедуру переосаждения (последовательно пять раз) гуминовых кислот по следующей схеме: осадок ресуспендировали в 10-ти кратном количестве воды и доводили рН до значения не менее 10,0 единиц добавлением 20% NaOH; полученный раствор гуминовых кислот затем снова закисляли до значения рН менее 2,0 единиц и центрифугировали.
Осадок гуминовых кислот растворили в небольшом количестве воды и довели рН до значения 7-8 единиц. Затем гуминовые кислоты высушили при 30°С.
1.3. Ферментативная обработка. В составе гетерогенных молекул гуминовых кислот (ГК), в частности, содержатся пептидные цепочки различного состава и длины, которые могут высвобождаться из молекул ГК в процессах клеточного метаболизма и оказывать токсическое действие на клетки человека. Чтобы снизить токсичность, образцы гуминовых кислот обработали протеазой. Для этого от 4 до 5,5 г очищенных гуминовых кислот растворили в 100 мл воды, добавили 5 мл 1М Трис и 150 мг трипсина. Смесь инкубировали не менее 5-6 часов при 37°С. Затем осадили гуминовые кислоты соляной кислотой путем закисления до значения рН менее 2,0 единиц. Осадок ГК растворили в небольшом количестве воды и довели рН до значения 7-8 единиц. Далее гуминовые кислоты высушили при 30°С.
Пример 2. Исследование токсичности и противовирусной активности образцов гуминовых кислот в отношении вируса простого герпеса второго типа (ВПГ-2)
50
Оценку активности образцов гуминовых кислот (ГК) в отношении вируса простого герпеса 2 типа проводили в культуре клеток Vero. В работе был использован штамм MS вируса простого герпеса 2 типа (получен из Американской коллекции типовых культур). Приготовленные разведения препаратов наносили на двухсуточную культуру (по 3 повтора на каждое разведение), за исключением контрольных лунок (контроль вируса и контроль клеток). Для оценки токсичности образцов ГК клетки окрашивали раствором генциан-виолета. Результаты окрашивания регистрировали с помощью фотометра 680 Земфира с управляющим компьютером BioRed RU Zemf в соответствии с инструкцией производителя. Получали показатели оптической плотности (ОП) для каждой из лунок планшета при длине волны 570 нм. Вычисляли среднее значение ОП для каждой группы из трех лунок с различными концентрациями образца. По полученным значениям строили график зависимости ОП от концентрации образца. По графикам определяли 50% токсическую концентрацию (ТС).
-5
50
50
Для определения противовирусной активности в лунки добавляли вирус в дозе 2×10 БОЕ/клетку (объем рабочей смеси составлял 100 мкл). Учет реакции проводили на 4 сутки. Оценка активности проводилась при помощи метода ингибирования бляшкообразования. Клетки окрашивали генциан-виолетом. Процент ингибирования бляшкообразования (%ИБ) определяли по формуле: %ИБ = [1 - (число бляшек в тесте / количество бляшек в контроле вируса)] × 100. Определяли концентрацию, способную ингибировать развитие 50% бляшкообразующих единиц (БОЕ) от количества БОЕ в контроле (50% ингибирующую концентрацию - IС). Вычисляли среднее значение %ИБ для каждой группы из двух лунок с различными концентрациями образца. По полученным значениям строили график зависимости %ИБ от концентрации образца. По графикам определяли IС. Индекс селективности (IS) определяли как отношение 50% токсической дозы к 50% ингибирующей дозе.
Из анализа полученных данных в таблице 1 видно, что после ферментативной обработки токсичность образца гуминовых кислот для клеток человека снизилась почти в 2 раза, при сохранении уровня противовирусной активности в отношении вируса простого герпеса (ВПГ-2).
Пример 3. Тестирование образца гуминовых кислот на наличие противовирусной активности в отношении вируса Западного Нила (ВЗН).
3
Оценку образцов гуминовых кислот в отношении лихорадки Западного Нила проводили на культуре клеток Vero. В работе был использован штамм Egypt 101 ВЗН (получен из Государственной коллекции вирусных штаммов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва, Россия). Для тестировании противовирусной активности использовали ВЗН в титре 10 ТЦПД50/мл: в такой дозе вирус вызывает видимое под микроскопом 100%-ное ЦПД на клетки Vero.
Таким образом, в таблице 2 показано, что гуминовые кислоты обладают противовирусной активностью в отношении вируса Западного Нила, относящегося к семейству Flaviridae.
Пример 4. Исследование токсичности и противовирусной активности образцов гуминовых кислот в отношении вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm09) в культуре клеток MDCK (клетки почки собаки).
50
50
50
50
50
Клетки MDCK рассевали в 96-луночных планшетах с посевной концентрацией 300000 кл./мл по 100 мкл в лунке. Разведения исследуемых образцов гуминовых кислот готовили в поддерживающей среде. В работе использовали последовательные двоичные разведения образцов. Приготовленные разведения препаратов наносили на суточную культуру (по 2 повтора на каждое разведение), за исключением контрольных лунок (контроль вируса и контроль клеток). Для определения противовирусной активности в лунки добавляли вирус в дозе 100 ТЦИД/лунку. Учет реакции проводили на 3 сутки. Оценка активности образцов была проведена с использованием красителя нейтрального красного. Результаты теста регистрировали с помощью фотометра 680 Земфира с управляющим компьютером BioRad RU Zemf в соответствии с инструкцией производителя. Получены показатели оптической плотности при длине волны 490 нм для каждой из лунок планшета. 50% ингибирующую и токсическую концентрации препаратов рассчитывали при помощи графиков, построенных по средним значениям оптической плотности (ОП) для каждой группы из двух инфицированных и неинфицированных лунок с различными концентрациями препарата. Для каждого разведения вычисляли среднее значение ОП. По полученным значениям строили графики зависимости ОП от концентрации препарата. По графикам определяли ТС и IС. Индекс селективности (IS) рассчитывали, как отношение ТС к IC.
Проведенное тестирование (таблица 3) подтвердило высокую противовирусную активность ГК в отношении вируса гриппа, относящегося к семейству Orthomyxoviridae.
Пример 5. Исследование токсичности и противовирусной активности образца гуминовых кислот в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1)
Клетки. Для работы с вирусом иммунодефицита человека использованы перевиваемые лимфобластоидные клетки человека МТ-4 из коллекции культур клеток «Института вирусологии им. Д.И. Ивановского» ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Вирусы. В качестве источника вируса иммунодефицита человека использован штамм ВИЧ-1 899А (субтип В) (Германия), штамм ВИЧ-1 ИВ735 (субтип В) (Россия), штамм ВИЧ-1 ИВ741 (субтип АЕ) (Россия) из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека «Института вирусологии им. Д.И.Ивановского» ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Исследование цитотоксического действия препарата. Добавление к клеткам исследуемого препарата в различных концентрациях.
2
Инкубирование клеток при 37С° в атмосфере с 5% СO и 98% влажности 5 дней. Учет результатов: определение жизнеспособности и количества клеток при помощи красителя.
50
2
Исследование противовирусного действия препарата. Добавление исследуемого препарата в различных дозах одновременно с инфицированием вирусом в дозе 0,01 ТЦИД/клетка. Инкубирование культур клеток при 37С° в атмосфере с 5% СO и 98% влажности 5 дней. Учет результатов окрашиванием клеток с помощью тетразолиевого красителя (метод МТТ) со спектрофотометрией и световой микроскопией: исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПЭ) и вирусиндуцируемого синцитийобразования (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран), определению антигена вируса в культуральной жидкости, инфицированных клеток.
Степень защиты клеток от цитодеструктивного действия вируса определяли по формуле:
А - число жизнеспособных клеток в опытной группе;
В - то же в инфицированной культуре (контроль вируса);
К- то же в неинфицированной культуре (контроль клеток).
Определение антигена вируса в культуральной жидкости инфицированных клеток проводили методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора GENSCREEN™ ULTRA HIV Ag-Ab фирмы «ВIO-RAD» согласно инструкции изготовителя. Результаты учитывали с помощью фотометра «Stat Fax-3200» производства США при длине волны 450/630 нм. Чувствительность тест-системы - менее 25 пкг/мл. Результаты представлены в таблице 4.
Полученные данные (таблица 4) показали, что образец гуминовых кислот в концентрации 50±5 мкг/мл обладал противовирусной активностью в отношении ВИЧ-1. Отмечена выраженная защита клеток от цитопатического действия вируса и снижения уровня вирусного антигена в культуральной жидкости ВИЧ-инфицированных клеток. При этом препарат был эффективен в отношении штаммов ВИЧ-1 разных субтипов, выделенных в разных регионах мира (Западная Европа и Россия).
Пример 6. Изучение противовирусной активности соединений, содержащих гуминовые кислоты в отношении вируса герпеса простого, тип 1 (ВПГ-1)
Материалы и методы.
2
Клетки. Культура клеток фибробластов почки зеленой мартышки VERO-перевиваемая линия клеток, чувствительная к вирусу герпеса простого, культивировалась при 37°С и при 5,0% СO.
Вирус. В работе использовали вирус простого герпеса, тип 1, штамм Л2, полученный из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им Д.И. Ивановского (ВПГ-1).
Исследуемые вещества. Гуминовые кислоты.
50
2
Схема экспериментов. В монослойную культуру клеток Vero вносили испытуемые вещества в концентрации 100, 150, 200 и 300 мкг/мл. Через 24 часа клетки, подвергнувшиеся воздействию испытуемых веществ, инфицировали вирусом ВПГ в дозе 100 ТЦИД. Контролем служили клетки, не обработанные исследуемыми веществами и инфицированные ВПГ-1. Опытные и контрольные клетки в 96-луночных панелях помещали в инкубатор при 37°С и 5,0% СO до поражения 100%) клеток в контроле. Учет проводили микроскопически и методом МТТ (с помощью тетразолиевого красителя).
Результаты исследования.
В контрольных культурах клеток (инфицированных ВПГ-1 и не обработанных исследуемыми веществами) через 48 часов развивалось вирусиндуцированное ЦПЭ. В культурах клеток, обработанных гуминовыми кислотами обнаружена защита клеток от цитопатического действия ВПГ-1 на 75-100% при концентрации 100-150 мкг/мл, соответственно (таблица 5).
Таким образом, примеры 1-6 подтверждают достижение заявляемого технического результата заявляемого изобретения, а именно: получение препарата гуминовых кислот из окисленного бурого угля с более низким содержанием токсичных веществ и более широким спектром противовирусного действия в отношении вирусов, патогенных для человека.