ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
PHOTOSENSITISER AND METHOD OF ITS OBTAINING

Изобретения относятся к области фармакологии, а именно к биологически активным соединениям хлоринового ряда и к способу их получения, и могут быть использованы для получения трисмеглуминовой соли хлорина е6 в лиофильно высушенной форме, которая может быть использована в качестве высокоэффективного фотосенсибилизатора (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) рака и других новообразований различного генезиса, а также для флюоресцентной диагностики раковых клеток.
В составе большинства современных ФС для ФДТ рака и других заболеваний используются производные хлорина е6. Некоторые из них нашли реальное воплощение в медицинской практике и широко применяются в качестве разрешенных препаратов для ФДТ рака и других новообразований. Так, например, из данных Регистра Лекарственных Средств России РЛС РФ (см. www.rlsnet.ru), разрешенный для клинического применения, ФС ФОТОЛОН [RU 2152790 С1 от 20.07.2000, Кл. А61К 31/409] (выпускается АО Белмедпрепараты) представляет собой лиофильно-высушенный пористый порошок, содержащий тринатриевую соль хлорина е6 с целым рядом побочных хлоринов (см. Н.А. Isakau, T.V. Trukhacheva, A.L Zhebentyaev, P.T. Petrov, HPLC study of chlorine е6 and its molecular complex with polyvinylpyrrolidone. Biomedical Chromatogr., (2007), 21, 318-325) и .A. Isakau, T.V. Trukhacheva, P.T. Petrov Isolation and identification of impurities in chlorine е6. J. of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, (2007), 45, 20-29) в комплексе с поливинилпирролидоном (ПВП). По мнению авторов присутствие в лекарственной форме ФОТОЛОНА значительного количества ПВП способствует улучшению некоторых характеристик данного препарата в качестве диагностического средства.
Другой ФС - РАДАХЛОРИН [RU 2183956 С1, А61К 31/79 от 27.06.2002., US Pat 7550587 от 23.06.2009] выпускается ООО РАДА-ФАРМА - представляет собой водный раствор смеси различных хлоринов переменного состава, в которой содержание основного продукта - тринатриевой соли хлорина е6 составляет 80-90% от общей суммы всех хлоринов. И, наконец, ФС - ФОТОДИТАЗИН [RU 2276976 С2, А61К 31/409 от 27.05.2006] (выпускается 000 ВЕТА-ГРАНД) - представляет собой водный раствор смеси бис-N-метил-D-глюкаминовой соли хлорина е6 и небольшого количества других хлоринов (не более 2-4%) с ПВП.
Практическое использование ФС типа ФОТОЛОН, РАДАХЛОРИН или ФОТОДИТАЗИН для внутривенного - (в/в) применения имеют некоторые ограничения из-за присутствия в их составе большого количества побочных ингредиентов (ПВП или родственных хлоринов) с гораздо меньшей растворимостью в воде, чем хлорин е6 в виде меглюминовой соли, и поэтому этот процесс осуществляют обычно в виде разбавленных растворов капельным способом. Для этой цели один флакон ФС, содержащий примерно 35 мг ФОТОДИТАЗИНА или РАДАХЛОРИНА, или же 100 мг тринатриевой соли хлорина е6 в ФОТОЛОНЕ, разбавляют до 100 мл раствора, и прикалывают в/в в течение 30-40 минут. Необходимо отметить, что присутствие ПВП в составе лекформы ФС накладывает ограничения в использовании более концентрированных растворов из-за повышенной вязкости инъекционных растворов и для применения струйного метода в/в введения.
Известен также ФС на основе хлорина е6, представляющий собой бисмеглуминовую мононатриевую соль хлорина е6, в виде лиофильновысушенной формы в присутствии мальтозы в качестве криостабилизатора [см. патент RU №2367434 CL, А61К 31/409, от 20.09.20091. Однако этот ФС не используется в практической медицине.
Кроме того, из данных (cм. www.drugs.com) известен новый ФС-ТАЛАПОРФИН - mono-aspartyl-Chlorin е6 (Синонимы: Talaporfin Sodium, NPe6 или Laserphyrin), (CAS registry number 0110230-98-3), выпускаемый фирмой Meiji Seika Kaishi (Japan), представляющий собой амид хлорина е6 с аспарагиновой кислотой в виде тетранатриевой соли (см. US Pat. Appl. №20110105745. Publication date: 2011-05-05). Его получение основано на взаимодействии хлорина е6 с карбодиимидом с образованием неизвестного ранее циклического ангидрида, который затем раскрывается динатриевой солью аспарагиновой кислоты до Талапорфина. Однако стоимость данного препарата очень высока и составляет 387208 йен (~$4000) за флакон (100 мг).
Специальными исследованиями показано, что максимально выраженным фотосенсибилизирующим эффектом обладает хлорин е6, а сопутствующие примеси, которые в основной своей массе легко агрегируют в водных средах, имеют более низкий квантовый выход генерации синглетного кислорода (см. Ю.А. Белый, А.В. Терещенко, П.Л. Володин, А. Каплан, Г.В. Пономарев. Сравнительное изучение фотодинамических эффектов фотосенсибилизаторов хлоринового ряда на интактной сетчатке экспериментальных животных «Рефракционная хирургия и офтальмология» 2006, 6, №2, с.55-7). Эффективность препарата как ФС определяется коэффициентом тропности или контрастности. Поэтому, присутствующие в препаратах ФОТОЛОН и РАДАХЛОРИН и, отчасти, в ФОТОДИТАЗИНЕ примеси сопутствующих хлоринов размывают четкую границу между раковой опухолью и близ расположенной здоровой тканью, что заметно снижает эффективность ФДТ при работе с данным препаратом из-за заметной фотодеструкции и рядом расположенной здоровой ткани. Таким образом, наличие примесей даже хлориновой природы заметно снижает эффективность препарата как ФС. Поэтому главной целью при создании ФС на основе хлорина е6 является получение исходного хлорина е6 максимально возможной чистоты с минимально возможными технологическими проблемами.
В настоящее время существует несколько способов получения высокочистого хлорина е6. Один из них заключается в специфической переработке «живой» хлореллы (Chlorella ellipsoidea) через последовательное выделение феофитина и его щелочного превращения до тринатриевой соли хлорина е6 с общим выходом до 1% с содержанием основного вещества в образце до 93-98%. Корейскими авторами подробно описана методика получения хлорина е6 высокой степени чистоты (US Pat 8349335, от January 8, 2013, Кл. 424/195.17), из которой следует, что только использование нативной («живой») хлореллы непосредственно в местах ее промышленной добычи позволяет получать в итоге высокоочищенный продукт с содержанием основного вещества не менее 93-98% с выходом около 1% считая на сухую хлореллу. Использование же высушенной хлореллы приводит к резкому снижению выхода (до 20-и раз). Основу метода получения хлорина е6 согласно данному патенту составляют несколько обязательных этапов: 1) многократная отмывка « живой» хлореллы от неорганических солей; 2) постепенная отмывка хлореллы водным этанолом для удаления полярных примесей; 3) экстракция хлорофилла а с применением 100%-ного этанола; 4) обработка хлорофильного спиртового экстракта IN соляной кислотой до рН 2.5 и отделения выпавшего феофитина фильтрацией; 5) кристаллической тринатриевой соли хлорина е6 фильтрацией хроматтографическая очистка феофитина на колонке с нейтральной окисью алюминия с помощью градиентной хроматографии в системе гексан-хлористый метилен; 6) растворение кристаллического феофитина в ацетоне, добавление IN NaOH до рН 12; выдерживание щелочного раствора 12 часов и отделение; 7) растворение соли хлорина е6 в воде, фильтрация от нерастворимых примесей и лиофильная сушка водного раствора.
3
2
1
Синтез специально очищенного с помощью хроматографии хлорина е6 из триметилового эфира хлорина е6 с низким выходом (около 25%) был недавно осуществлен в лаборатории К.М.Смита [Jinadasa, R. G, W., Ни, X., Vicente, M.G.H., and Smith, К. М. (2011) Syntheses and cellular investigations of 17-, 15-, and 13-amino acid derivatives of chlorin е6. J. Med. Chem., 54, 7464-7476].
Однако этот метод пригоден лишь для приготовления исключительно аналитических количеств хлорина е6, и, конечно, не может быть использован в получении практически значимых производственных количеств ФС для клинических исследований. Получение хлорина е6 высокой степени чистоты из метилфеофорбида а путем его щелочного гидролиза и ряда последовательных химических операций предложено также в патенте [RU 2330037 С1 от 27.07.2008].
Поскольку только хлорин е6 высокой степени чистоты обладает максимально выраженными фотодинамическими свойствами к определенной опухоли или органу, наличие в фотосенсибилизаторе примесей хлоринового ряда, с примерно такими же фотофизическими и фотодинамическими свойствами в опытах ин витро, но значительно различающимися по своему воздействию в опытах ин виво, значительно ухудшает потребительские свойства фотосенсибилизатора как лекарственного препарата. Поэтому основные требования к созданию ФС - это максимально возможное качество (т.е. чистота исходной субстанции), устойчивость лекарственной формы и, по возможности, простота и воспроизводимость технологического процесса.
Все эти требования реализованы в предлагаемом нами способе получения фотосенсибилизатора на основе высокоочищенного хлорина е6 из метилфеофорбида а.
По технической сущности наиболее близким к предлагаемому препарату является фотосенсибилизатор для ФДТ в лиофильно высушенной форме, содержащий бис-(N-метил-D-глюкамин) мононатриевую соль хлорина е6 и криостабилизатор мальтозу в соотношении 1:1 вес.ч. [см. патент RU №2367434 С1, по Кл. А61К 31/409, от 20.09.20091].
Однако этот ФС содержит большое количество балласта (мальтозы), что затрудняет получение высококонцентрированных инъекционных растворов для осуществления струйного метода в/в введения препарата.
По технической сущности наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения ФС для ФДТ, заключающийся в том, что хлорин е6 суспендируют в апирогенной воде, добавляют при перемешивании N-метил-D-глюкамин (меглумин) и NaOH в следующих мольных соотношениях: хлорин е6, N-метил-D-глюкамин (меглумин) и NaOH - 1:2:1 соответственно, полученный раствор фильтруют, добавляют к нему криостабилизатор мальтозу в соотношении 1:1 к соли хлорина е6 по весу и лиофилизуют [см. патент RU №2367434 CL A61K 31/409J от 20.09.2009].
Согласно приведенному примеру этот способ реализуется путем предварительного получения хлорина е6 из метилфеофорбида а.
Однако использование в данном способе значительного количества мальтозы не позволяет получать высококонцентрированные инъекционные растворы ФС, что затрудняет проведение струйного метода в/в введения и снижает потребительские свойства медицинского препарата.
Техническим результатом предлагаемых изобретений является разработка ФС, более устойчивого при длительном хранении даже при комнатной температуре, обладающего повышенными потребительскими качествами, упрощение практического использования его в медицинских учреждениях, а также разработка способа его получения, позволяющего получить ФС с высокими эксплуатационными и потребительскими свойствами.
Достигается это тем, что ФС для ФДТ в лиофильно высушенной форме, согласно изобретению, содержит в качестве соли хлорина е6 меглумин формулы (I), а в качестве криостабилизатора - меглумин в соотношении 1: 0.1-0.2 вес.ч., кроме того, дополнительное количество меглумина сверх эквимолярного, т.е. три моля на 1 моль хлорина е6, в количестве 0.1-0.2 вес.ч. необходимо для доведения в растворе рН=9.30-9.35, что создает условия для полной ионизации всех трех карбоксильных групп в молекуле хлорина е6 и, соответственно, к получению стабильной хорошо растворимой в воде лекформы, кроме того, в способе получения ФС для ФДТ, включающем растворение метилфеофорбида а в ацетоне, обработку полученного раствора водной щелочью, с последующей нейтрализацией реакционной смеси разбавленной соляной кислотой до рН=4.5-5.0, отделение выпавшего осадка хлорина е6 с последующей промывкой дистиллированной водой, обработку осадка водным раствором меглумина и лиофилизацию, согласно предлагаемому изобретению, обработку раствора метилфеофорбида а в ацетоне водной щелочью проводят только при 40-50°С, отделение осадка хлорина е6 осуществляют фильтрацией через слой целита 545 и извлекают хлорин е6 с целита 545 водным раствором меглюмина до достижения в растворе концентрации соли хлорина е6, соответствующей оптической плотности 230-240 /1 мл при длине волны максимума поглощения 655 нм и рН раствора 9.30-9.35, раствор фильтруют через миллипоры 0.22 ммк и лиофилизуют.
Сравнение предложенных решений с известными позволяет утверждать о соответствии критерию «новизна», а отсутствие в аналогах отличительных признаков говорит о соответствии критерию «изобретательский уровень». Предварительные испытания позволяют судить о возможности широкого практического использования.
Заявленный фотосенсибилизатор не уступает прототипу по биологической и фармакологической активности, а созданная на его основе лиофилизированная лекформа, содержащая в одном флаконе 37.5-40 мг активного вещества - хлорина е6, является оптимальной по сравнению с другими, официально разрешенными, препаратами для клинического применения (ФОТОЛОН. РАДАХЛОРИН, ФОТОДИТАЗИН) и устойчива в течение 2 лет, что подтверждается данными ЖХВД стабильности лекформы при хранении при температуре 8-12°С.
Так, постоянство исходного сырья обусловлено использованием метилфеофорбида а, а процесс химического превращения метилфеофорбида а в хлорин е6 максимально унифицирован и возможен без потери качества при использовании значительно больших загрузок. В то же время, получаемый в результате обработки стерильный водный раствор из расчета 1 моль хлорина е6 на три моля меглюмина позволяет получать после разливки этого раствора по 10 мл в флаконы темного стекла и лиофилизации фотосенсибилизатор, названный ГЕЛИОХЛОРИНОМ, который по своим потребительским качествам - устойчивости при длительном хранении (не менее 2-3 лет) и количеству хлорина е6, в расчете на 1 флакон, заметно превосходит ФС ФОТОДИТАЗИН и ФС РАДАХЛОРИН. Анализ полученного фотосенсибилизатора проводился методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ЖХВД) (См. Пример №1). Способ получения ФС для ФДТ включает растворение метилфеофорбида а в ацетоне, обработку полученного раствора водной щелочью, с последующей нейтрализацией реакционной смеси, разбавленной соляной кислотой до рН=4.5-5.0, отделение выпавшего осадка хлорина е6 с последующей промывкой дистиллированной водой, обработку осадка водным раствором меглумина и лиофилизацию. Согласно предлагаемому изобретению, обработку раствора метилфеофорбида а в ацетоне водной щелочью проводят только при 40-50 оС, отделение осадка хлорина е6 осуществляют фильтрацией через слой целита 545 и извлекают хлорин е6 с целита 545 водным раствором меглюмина до достижения в растворе концентрации соли хлорина е6, соответствующей оптической плотности 230-240 1 мл при длине волны максимума поглощения 655 нм и рН раствора 9.30-9.35, раствор фильтруют через миллипоры 0.22 ммк и лиофилизуют.
Из данных жидкостной хроматографии высокого давления -ЖХВД следует, что разрушение фотосенсибилизатора за 2 года хранения практически не происходит (см. Пример №1).
Таким образом, в результате предлагаемой обработки реакционной смеси получена практически не разрушающаяся в процессе хранения лекформа. Снижение оптической плотности раствора за 2 года составило всего 0.29%, что во много раз превышает устойчивость всех известных в настоящее время лекарственных препаратов класса ФС.
ПРИМЕР №1
К раствору 4 г метилфеофорбида а в 800 мл ацетона добавляют в течение 1 часа 500 мл 10%-ного раствора едкого натра при интенсивном барбатировании аргона, перемешивают 2 часа при той же температуре, охлаждают до 5-10°С, добавляют 2 л дистиллированной воды, раствор нейтрализуют при интенсивном перемешивании барботированием аргона разбавленной соляной кислотой (1:3) до рН 4-4.5 до выпадения аморфного рыхлого осадка так, чтобы надосадочная жидкость приобрела прозрачную бледно-фиолетовую окраску, надосадочную жидкость декантируют, осадок суспендируют в минимальном количестве воды и фильтруют через слой целита 545 высотой 5 см на стеклянном фильтре диаметром 8 см, промывают целит дистиллированной водой до отсутствия в фильтрате неорганических солей, верхний слой целита 545, содержащий хлорин е6, отделяют, помещают в колбу, добавляют 150 мл 1%-ного раствора меглюмина в апирогенной воде, перемешивают 5 минут, раствор хлорина е6 отфильтровывают, через целит пропускают еще 250 мл 1%-ного раствора меглюмина, целит дополнительно промывают еще 600 мл апирогенной воды, раствор профильтровывают дважды через фильтры Стерикап - миллипоры 0.22 ммк, доводят общий объем раствора до 1 л, если необходимо доводят рН раствора до 9.25-9.30, разливают во флаконы темного стекла по 10 мл, лиофилизуют в стандартных условиях и получают 100 флаконов фотосенсибилизатора в виде пористых таблеток, содержащих в каждом флаконе по 37.5-40 мг основного вещества - хлорина е6 (или не менее 75-80 мг гелиохлорина). Оптическая плотность ФС для гелиохлорина во флаконе при 655 нм и рН раствора 9.0-9.5 составляет 225-235. Аналогично, для ФОТОДИТАЗИНА оптическая плотность D (655 нм) составляет 205-210/1 мл, а для РАДАХЛОРИНА - 175-185/1 мл.
ПРИМЕР №2
Условия проведения ЖХВД:
Хроматограф LC-20 Prominence SHIMADZU (Япония) Насос LC-20AD;
Термостат СТО-20А;
Детектор - спектрофотометр SPD-20A;
Колонка «LUNA» фирмы «PHENOMENEX» С-18, 4×250 мм, 5 мк;
Элюент MeOH:H2O:CF3COOH (90:10:0.01 v/v);
Скорость потока - 0,85 мл/мин;
Объем петли - 5 мкл;
Температура - 25°С;
Детекция при 405 нм.
10 мкл раствора хлорина е6 разбавляют в 1 мл элюента (до образования кислого раствора, что определяется по изменению окраски от бурой до синей, т.е. возникновению дикатиона хлорина е6). Полученный раствор пропускают через одноразовый шприцевой фильтр «CHROMAFIL» с размером пор 0,45 мкм, а затем анализируют.
В качестве стандарта использовали образец лиофильно высушенного хлорина е6. В результате предлагаемой обработки реакционной смеси получена практически не разрушающаяся в процессе хранения лекформа. Снижение оптической плотности раствора за 2 года составило всего 0.29%, что во много раз превышает устойчивость всех известных в настоящее время лекарственных препаратов класса ФС.
Таким образом в предлагаемых технических решениях достигается поставленный технический результат:
повышение устойчивости лиофилизированной лекформы ФС при хранении за счет оптимизации соотношения соли хлорина е6 и криостабилизатора; Отсутствие балластных веществ в лекформе ФС;
упрощение и оптимизация получения раствора хлорина е6 высокой степени чистоты, исходя из метилфеофорбида а.