СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА БРОМЕЛАЙНА В ГЕЛЕ НА ОСНОВЕ ПИЩЕВОГО ХИТОЗАНА И СУКЦИНАТА ХИТОЗАНА
METHOD OF PRODUCING BROMELAIN IN GEL BASED ON FOOD CHITOSAN AND CHITOSAN SUCCINATE

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, исследовательских целях и ветеринарии при изготовлении лекарственных средств, обладающих регенерирующим и ранозаживляющим действием.
Бромелайн (КФ 3.4.22.32) - протеолитический растительный фермент, получаемый из ананаса. Коммерческий препарат бромелайна представляет собой смесь разных тиол-эндопептидаз и других, еще не полностью охарактеризованных компонентов: фосфатаз, глюкозидаз, пероксидаз, целлюлаз, гликопротеинов и углеводов. Его готовят из охлажденного ананасового сока, используя центрифугирование, ультрафильтрацию и лиофилизацию. На выходе получают желтоватый порошок, ферментативную активность которого определяют с помощью различных субстратов, таких как казеин, желатин или хромогенные трипептиды [H.R. Maurer Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical use // CMLS Cellular and Molecular Life Sciences. - 2001. - V. 58. - P. 1234-1245].
Бромелайн относится к группе высокоактивных протеолитических ферментов. Он оказывает противовоспалительное действие, способствует улучшению пищеварения и является мощным катализатором важнейших процессов углеводного и белкового обменов, способствует быстрому расщеплению жиров, тормозит жировую инфильтрацию печени. Известны его противораковые свойства и способность предотвращать образование тромбов [Патент RU 2256334, МПК А23С 23/00, опубл. 20.07.2005].
Ферменты часто являются неустойчивыми к воздействию денатурирующих факторов окружающей среды, легко инактивируются, поэтому целесообразно иммобилизовать их на матрице нерастворимых носителей. Иммобилизация приводит к увеличению термической стабильности фермента, дает возможность осуществлять его адресную доставку, фиксацию в определенном участке организма.
На сегодняшний день известно множество методов иммобилизации ферментов, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Иммобилизация ферментов на синтетических носителях ограничивает сферы их применения в фармакологии и пищевой промышленности [А.А. Shakeel, Н. Qayyum Potential applications of enzymes immobilized on/in nano materials: A review // Biotechnology Advances. - 2012. - V. 30. - P. 512-523], поэтому мы использовали в качестве носителей для иммобилизации бромелайна пищевой хитозан с молекулярной массой менее 100 кДа и сукцинат хитозана.
Хитозан представляет собой аминополисахарид, получаемый из хитина панцыря ракообразных. В зависимости от источника и метода получения, средняя молекулярная масса хитозана может составлять от 50 до 1000 кДа. Хитозан представляет собой полукристаллический полимер, степень кристаллизации которого зависит от степени деацетилирования. Из-за стабильной кристаллической структуры хитозан, как правило, нерастворим в водных растворах с рН выше 7. Однако в разбавленных кислотах аминогруппы протонируют, и молекула становится полностью растворимой при рН ниже 5. Растворимость хитозана, зависящая от значения рН среды, обеспечивает удобный механизм для его использования в прикладных целях. Одной из наиболее перспективных функций хитозана является очень высокая способность к переработке его матрицы в пористые структуры для использования при трансплантации клеток и регенерации тканей. Кроме того, хитозан обладает антибактериальными и противогрибковыми свойствами. Благодаря вышеперечисленному, хитозан является перспективным носителем для иммобилизации ферментов медицинского и ветеринарного назначения [J.-K. Francis Suh, Howard W.T. Matthew Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: a review // Biomaterials. -2000. - V. 21. - P. 2589-2598].
В качестве прототипа служил способ получения гетерогенного препарата различной дисперсности на основе бромелайна и хитозана, изложенный авторами настоящего изобретения в заявке №2017123458 на патент РФ. Способ включает иммобилизацию бромелайна на матрицу кислоторастворимого хитозана среднемолекулярного (200 кДа) или высокомолекулярного (350 кДа) в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г указанной матрицы; при этом в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 50 мМ трис-глициновый буфер с рН 8.5-9.0 для среднемолекулярного и с рН 8.5 для высокомолекулярного хитозана; инкубирование при комнатной температуре в течение 4 часов для среднемолекулярного и 5 часов для высокомолекулярного хитозана; промывание образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером с рН 7.5 до отсутствия в промывных водах белка.
Недостатком прототипа является получение порошкового средства, не позволяющего проводить ферментативные реакции на твердых субстратах.
Технический результат заявленного изобретения заключается в увеличении скорости ферментативной реакции и повышении эффективности использования препарата на основе бромелайна и хитозана, в том числе при осуществлении реакции на твердых поверхностях.
В своей работе мы использовали в виде носителей для иммобилизации пищевой хитозан с молекулярной массой менее 100 кДа и его производное сукцинат хитозана, а бромелайн иммобилизовали путем включения в гель, благодаря чему фермент становится более стабильным и обладает пролонгированным действием.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного препарата в виде гелей на основе бромелайна и пищевого хитозана или сукцината хитозана, включающем иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя; инкубирование при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывку образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7.5) до отсутствия в промывных водах белка, согласно изобретению, иммобилизацию проводят на матрицу пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа или сукцината хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют либо 0.05 М глициновый буфер с рН 8.6 для пищевого хитозана или с рН 9.0-9.5 для сукцината хитозана; либо 0.05 М ацетатный буфер с рН 5.5 для пищевого хитозана или 5.0 для сукцината хитозана; инкубирование проводится в течение 2 часов.
Применение хитозана с меньшей молекулярной массой в совокупности с использованием 0.05 М ацетатного буфера позволило получить гелеобразный препарат, и кроме того, сократило необходимое время инкубации фермента с носителем на 3 часа. Гелеобразный препарат, в отличие от порошкового, позволяет проводить ферментативные реакции не только в растворах, но и на твердых субстратах, что в свою очередь облегчает нанесение препарата в область раны или ожога, увеличивает эффективность.
На Фиг. 1. изображена диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах иммобилизованного бромелайна; на фиг. 2 - Диаграмма значений общей активность (в ед на 1 мл раствора) препаратов иммобилизованного бромелайна; на фиг. 3 - Диаграмма значений удельной активности (в ед на 1 мг белка в пробе) препаратов иммобилизованного бромелайна, где 1 - бромелайн, иммобилизованный на пищевом хитозане с использованием ацетатного буфера; 2 - бромелайн, иммобилизованный на сукцинате хитозана с использованием ацетатного буфера; 3 - бромелайн, иммобилизованный на пищевом хитозане с использованием глицинового буфера; 4 - бромелайн, иммобилизованный на сукцинате хитозана с использованием глицинового буфера.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования был выбран бромелайн фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве носителей для иммобилизации применяли два вида хитозана (ЗАО «Биопрогресс»): хитозан пищевой с молекулярной массой менее 100 кДа и сукцинат хитозана.
Иммобилизацию бромелайна на матрице хитозана осуществляли путем включения в гель. К 1 г хитозана добавляли 20 мл раствора фермента (в концентрации 5 мг/мл), инкубировали в течение 2 часов. После окончания инкубации образовавшийся осадок (в виде геля) промывали 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7.5) до отсутствия в промывных водах белка (контроль осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Содержание белка в иммобилизованных препаратах бромелайна определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275]. Определение протеолитической активности фермента проводили на субстрате азоказеине (Fluka). К 50 мг образца добавляли 200 мкл трис-HCl буфера (рН 7.5), 800 мкл азоказеина (0.5% в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7.5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл ТХУ (5%), инкубировали 10 минут при -4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл трис-HCl буфера. За единицу каталитической активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную протеолитическую активность бромелайна рассчитывали по формуле:
ПА=D* 1000/120/200/Ср,
где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность пробы при 410 нм,
Ср - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы,
1000 - пересчет в мкМ.
Статистическую обработку полученных результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
На первом этапе экспериментов для получения гетерогенных биокатализаторов на основе бромелайна, иммобилизованного путем включения в гель на основе сукцината хитозана и пищевого хитозана, в качестве иммобилизационной среды мы использовали ацетатные буферные растворы с рН в диапазоне от 4.0 до 5.8 и глициновые буферные растворы с рН в диапазоне от 8.6 до 10.5. Результаты для наиболее подходящих буферных систем отражены на фиг. 1-3.
Анализ содержания белка в гетерогенных препаратах показал, что наибольшее количество бромелайна (в мг на г носителя), иммобилизованного путем включения в гель на основе пищевого хитозана, наблюдается при использовании глицинового буфера с рН 8.6 и ацетатного буфера с рН 4.0-4.5. При иммобилизации на сукцинате хитозана количество бромелайна оказалось выше при использовании глицинового буфера с диапазоном рН 8.6-10.5 и ацетатного буфера с рН 5.5-5.8 (фиг. 1).
Общая активность (в ед на мл раствора) бромелайна, иммобилизованного путем включения в гель на основе пищевого хитозана, оказалась выше при использовании следующих буферов: глициновый с рН 8.6, ацетатный с рН 4.0, 4.5, 5.5. При иммобилизации на матрице сукцината хитозана общая активность бромелайна оказалась выше при использовании глицинового буфера с рН 9.0, 9.5, 10.5 и ацетатного буфера в диапазоне рН 5.0-5.8 (фиг. 2).
Наибольшую удельную активность показали препараты бромелайна, иммобилизованные путем включения в гель на основе пищевого хитозана при использовании глицинового буфера с рН 8.6 и ацетатного буфера с рН 5.5. При иммобилизации на сукцинате хитозана удельная активность оказалась выше при использовании глицинового буфера с рН 9.0, 9.5, 10.5, а также ацетатного буфера с рН 5.0 (фиг. 3).
Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (в ед на мг белка) выявлено при иммобилизации бромелайна на матрице пищевого хитозана и сукцината хитозана при использовании глицинового буфера с рН 8.6 и 9.0-9.5 соответственно и 0.05 М ацетатного буфера с рН 5.5 и 5.0 соответственно.
Из вышеизложенного материала следует, что среди апробированных нами вариантов иммобилизации для создания гетерогенных препаратов на основе бромелайна и хитозана наиболее перспективным является включение фермента в гель на основе пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа или сукцината хитозана при использовании соответственно 0.05 М глицинового буфера с рН 8.6 и 9.0-9.5 или 0.05 М ацетатного буфера с рН 5.5 и 5.0.
Таким образом, была разработана методика получения гетерогенного биокатализатора на основе бромелайна, иммобилизованного на матрице пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа и сукцината хитозана путем включения в гель.