Физиологические механизмы секреции кальцитонина при инсулиновой гипогликемии

ФИЗИОЛОГИЯ, БИОФИЗИКА, БИОХИМИЯ

УДК 612.349.7.018.014:46:615.357.441

С. С. Бутакова, А. Д. Ноздрачев

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ

СЕКРЕЦИИ КАЛЬЦИТОНИНА

ПРИ ИНСУЛИНОВОЙ ГИПОГЛИКЕМИИ

В предыдущих исследованиях нами были установлены гипокальциемия и усиление секреции кальцитонина при инсулиновой гипогликемии [1, 2]. Механизм стимулирующего влияния гипогликемии на секрецию кальцитонина подробно еще не изучен. В основе этого явления могут лежать разнообразные физиологические механизмы — нервные (изменение тонуса автономной (вегетативной) нервной системы) и гуморально-гормональные (увеличение продукции гормонов сахароповышающего действия и др.). Определенную роль в изменении секреции кальцитонина играют глюкокортикоиды, а также биологически активные продукты поджелудочной железы. Для выяснения значения последних были проведены опыты на двусторонне адреналэктомированных и панкреатэк-томированных животных. Поскольку гипогликемия вызывает значительные изменения тонуса вегетативной нервной системы (особенно повышение активности ее симпато-ад-реналового отдела), можно было предполагать, что указанные сдвиги обусловливают повышенную секрецию кальцитонина при инсулиновой гипогликемии. В связи с этим были проведены исследования, цель которых — выяснить, как изменятся кальцитони-новая активность (КТ-активность) плазмы крови и содержание в ней общего кальция при инсулиновой гипогликемии в условиях блокирования синаптической передачи в симпатических ганглиях или периферических холино- и адренорецепторных структурах.

Эксперименты проведены на 130 половозрелых крысах-самцах линии '^81аг весом 270-300 г, которые были разделены на 11 групп. Крысы 1-й группы служили контролем. Крысам 2-й группы вводили внутримышечно инсулин в дозе 1 МЕ/100 г массы тела. Крысам 3-й группы вводили такую же дозу гормона, а 30 и 60 мин спустя — внутрибрюшинно 2 мл глюкозы для предотвращения значительного снижения уровня глюкозы в крови. Через 2 ч после введения инсулина у крыс 2-й и 3-й групп из бедренной вены под легким эфирным наркозом делали забор крови. Крысам 4-й и 5-й групп была произведена двусторонняя адреналэктомия [5]. Эксперимент на этих животных проводили на 4-й день после операции. Крысы 4-й группы служили контролем,

© С. С. Бутакова, А. Д. Ноздрачев, 2010

а крыс 5-й группы подвергали действию экзогенного инсулина, вводимого аналогично животным 2-й группы. Крысам 6-й и 7-й групп была произведена панкреатэктомия по общепринятой методике [5]. В эксперимент животных брали спустя час после операции. 6-я группа животных была контрольной, а крысам 7-й группы вводили инсулин, аналогично крысам 2-й группы. Животным 8-й группы вводили ганглиоблокатор пентамин (2,5 мг/100 г массы тела), 9-й группы — блокатор М-холинорецепторов атропин (0,2 мл),

10-й группы — а-адреноблокатор тропафен (0,1 мг/100 г) и 11-й группы — в-адренобло-катор обзидан (0,1 мг/100 г) внутримышечно. Через 30 мин после инъекции указанных препаратов так же, как крысам 2-й группы, вводили инсулин.

Для оценки степени гипогликемии содержание глюкозы в крови определяли колориметрическим методом Frank, Kirberger [11]. О состоянии секреции кальцитонина судили по КТ-активности плазмы, устанавливаемой по методу Laljee [12] с использованием в качестве стандарта лососевого кальцитонина (метод биологического тестирования). Содержание общего кальция в плазме определяли комплексонометрическим способом [6]. Показателем кортикостероидной функции служила концентрация 11-оксикортикосте-роидов (11-ОКС) в плазме крови, определяемая по методу Усватовой и Панкова [7]. Для биологического тестирования использовано 190 мышей.

Величины глюкозы, общего кальция и 11-ОКС плазмы крови контрольных крыс составляли соответственно 5,6 ± 0,3 ммоль/л, 2,2 ± 0,08 ммоль/л и 158 ± 6 мкг/л, т. е. находились в пределах нормы для этого вида лабораторных животных. КТ-активность плазмы в базальных условиях не определялась (табл. 1).

Введение инсулина приводило к уменьшению содержания глюкозы в крови до 2,4±0,2 ммоль/л (Pi < 0,001) и увеличению КТ-активности плазмы до 23,1 ±3,5 мед/мл. Высокий уровень КТ-активности сопровождался понижением содержания общего кальция в плазме крови до 1,4 ± 0,09 ммоль/л (Pi < 0,001). Содержание 11-ОКС в плазме крови повышалось при инсулиновой гипогликемии до 312 ± 27 мкг/л (Pi < 0,001). Тесная отрицательная корреляция установлена между уровнем кальция и содержанием

11-ОКС в плазме крови (г = -0,89, P < 0,05), а также уровнем глюкозы и содержанием 11-ОКС (г = -0,87, P < 0,05), что свидетельствует о взаимодействии регуляторных влияний кальциевого и углеводного обмена.

Патогенетическое значение гипогликемии в увеличении КТ-активности плазмы явствует из результатов опытов, в которых развитие гипогликемии предотвращалось вну-трибрюшинным введением глюкозы. При такой постановке эксперимента содержание глюкозы в крови уменьшалось лишь до 5,2 ± 0,2 ммоль/л, Pi > 0,1 (см. табл. 1).

При этом КТ-активность плазмы не выявлялась, а содержание общего кальция составляло 2,1 ± 0,01 ммоль/л, что было немного (хотя и достоверно) ниже, чем у контрольных крыс. Таким образом, можно сделать заключение, что секреция кальцитони-на после введения инсулина обусловлена гипогликемическим состоянием.

Для изучения роли гормонов коры надпочечников в активировании секреции каль-цитонина при инсулиновой гипогликемии мы прибегли еще к созданию экспериментальной надпочечниковой недостаточности.

На 4-е сутки после операции уровень глюкозы в крови адреналэктомированных животных составлял 5,2 ± 0,3 ммоль/л, что было достоверно ниже, чем у крыс с интакт-ными надпочечниками (5,6 ± 0,3 ммоль/л, P2 < 0,05). Концентрация 11-ОКС в плазме составляла всего 29 ± 5 мкг/л (при 158 ± 6 мкг/л у интактных крыс), т. е. возникала выраженная кортикостероидная недостаточность. Достоверно была уменьшена и концентрация общего кальция — 1,8 ± 0,05 ммоль/л, КТ-активность плазмы не выявлялась.

Таблица 1. Влияние введения инсулина на уровень глюкозы, кальция, кальцитониновую активность и 11-ОКС плазмы крови у интактных, адреналэктомированных и панкреатэктомированных крыс

Экспериментальные группы Глюкоза, ммоль/л

Интактные крысы,

Контроль 5,6 ±0,3 158 ±6 2,2 ±0,08 0

п 10 5 10 10

Введение инсулина 2,4 ±0,2 312 ±27 1,4 ±0,09 23,1 ±3,5

п 20 5 20 20

Р1 < 0,001 < 0,001 < 0,001

Введение инсулина и глюкозы 5,2 ±0,3 - 2,1 ±0,01 0

п 10 10 10

Р1 > 0,1

Адреналэктомированные крысы

Контроль 5,2 ±0,3 29 ±5 1,8 ±0,05 0

п 5 5 5 5

Р2 < 0,05 < 0,001 < 0,001

Введение инсулина 1,6 ± 0,2 32 ±6 1,45 ±0,05 2,6 ±0,8

п 7 5 7 7

Р1 < 0,001 > 0,5 < 0,001

Р2 < 0,001 < 0,001 > 0,1 < 0,001

Панкреатэктомированные крысы

Контроль 4,9 ±0,5 - 2,0 ±0,09 0,5

п 7 7 7

Р2 < 0,01 < 0,001

Введение инсулина 2,3 ±0,3 - 1,9 ±0,5 0,5

п 7 7 7

Р1 < 0,001 > 0,2

Р2 > 0,5 < 0,05

Примечание. Р1 — достоверность различий по сравнению с контрольной группой животных; Р2 — достоверность различий по сравнению с аналогичной группой интактных крыс; п — количество животных.

Инъекция инсулина адреналэктомированным крысам приводила к еще большему снижению уровня глюкозы в крови, чем у крыс с интактными надпочечниками (1,6±0,2 и 2,4 ± 0,2 ммоль/л соответственно, Р2 < 0,001), что, по-видимому, объясняется снижением у них уровня катехоламинов и глюкокортикоидов в крови. Уровень 11-ОКС у адреналэктомированных животных, невзирая на столь значительную гипогликемию, практически не изменился, что дополнительно указывало на выраженный гипокор-тицизм. КТ-активность плазмы в этих условиях составляла всего 2,6 ± 0,8 мед/мл, т. е. стимуляция секреции кальцитонина была невелика, несмотря на резкое снижение концентрации глюкозы в крови. Обращает внимание то, что содержание общего кальция в крови адреналэктомированных крыс после введения инсулина снижалось до 1,45±0,05 ммоль/л. По-видимому, в условиях дефицита 11-ОКС даже небольшое увеличение секреции кальцитонина (увеличение КТ-активности плазмы до 2,6 ± 0,8 мед/мл) достаточно для существенного гипокальциемического эффекта. Таким образом, инсулиновая гипогликемия вызывала у адреналэктомированных крыс понижение уровня кальция и незначительное повышение КТ-активности плазмы. Учитывая тот факт, что глюкокортикоиды стимулируют секрецию кальцитонина [13], можно сделать заключение, что данные гормоны примают участие в регуляции секреции кальцитонина при инсулиновой гипогликемии.

У панкреатэктомированных крыс через час после операции содержание глюкозы составляло 4,9 ± 0,1 ммоль/л, т. е. было не только выше, но даже ниже, чем у интакт-ных крыс. Это указывало на то, что в течение срока, прошедшего после операции, еще не успели развиться нарушения углеводного обмена, характерные для сахарного диабета. Исходное содержание общего кальция составляло 2,0 ± 0,09 ммоль/л, что было достоверно меньше, чем у интактных крыс. КТ-активность составляла 0,5 мед/мл.

Уровень глюкозы после введения инсулина у панкреатэктомированных крыс снижался до 2,3 ± 0,3 ммоль/л, содержание общего кальция в плазме также снижалось, но только до 1,9 ± 0,1 ммоль/л. КТ-активность не превышала 0,5 мед/мл. Следовательно, у панкреатэктомированных крыс инсулиновая гипогликемия не вызывала увеличения секреции кальцитонина.

Как известно, поджелудочная железа вырабатывает большое число биологически активных веществ, секретируемых в кровь: инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический гастрин, липокаин, калликреин, а также пищеварительные ферменты. Непосредственное отношение к секреции кальцитонина имеет глюкагон, под влиянием которого активируется выработка С-клетками кальцитонина [8]. Известно также, что при гипогликемических состояниях одной из первых реакций организма является усиление продукции глюкагона. Последний, совместно с адреналином, способствует распаду печеночного гликогена и восстановлению нормального уровня глюкозы в крови. С этих позиций можно полагать, что отсутствие повышения КТ-активности плазмы у пан-креатэктомированных крыс объясняется в значительной мере отсутствием глюкагона. Однако нельзя категорически отрицать и возможность влияния иных биологически активных веществ, продуцируемых поджелудочной железой.

На фоне введения пентамина (табл. 2) у крыс происходило снижение уровня глюкозы до 1,8 ± 0,3 ммоль/л, содержания общего кальция — до 1,6 ± 0,05 ммоль/л. КТ-ак-тивность увеличивалась лишь до 2,3 ± 0,5 мед/мл.

Таблица 2. Влияние введения пентамина, атропина, тропафена и обзидана на секрецию кальцитонина и уровень общего кальция в плазме крови при инсулиновой гипогликемии

Условия эксперимента Глюкоза, ммоль/л (М±т) Р1 Р2 Кальций, ммоль/л (М±т) Р1 Р2 КТ-активность, мед/мл (М±т) Р2

Интактные крысы 5,6 ±0,3 2,2 ±0,08 0

п 10 10 10

Инсулин 2,4 ±0,2 < 0,001 1,4 ±0,09 23,1 ±3,5

п 20 20 20

Пентамин + инсулин 1,8 ±0,3 < 0,001 < 0,01 1,6 ±0,05 < 0,001 < 0,001 2,3 ±0,5 < 0,001

п 5 5 5

Атропин + инсулин 1,4 ±0,1 < 0,001 < 0,001 2,0 ±0,09 < 0,001 < 0,001 0

п 8 8 8

Тропафен + инсулин 2,0 ±0,2 < 0,001 < 0,01 1,6 ±0,02 < 0,001 < 0,001 4,6 ±0,6 < 0,001

п 10 10 10

Обзидан + инсулин 1,3 ±0,3 < 0,001 < 0,001 1,9 ±0,01 < 0,001 < 0,001 0,63 ±0,2 < 0,001

п 5 5 5

Примечание. Рх — достоверность различий по сравнению с интактными крысами; Р2 — достоверность различий по сравнению с данными на фоне инсулина; п —количество животных.

У крыс, которым вводили атропин, наблюдалось еще большее снижение уровня глюкозы в крови по сравнению с контролем— 1,4 ± 0,1 ммоль/л, тем не менее содержание общего кальция оставалось в пределах нормы — 2,0 ± 0,09 ммоль/л, а КТ-активность не определялась.

Уровень глюкозы в крови у крыс, получавших тропафен, составлял после введения инсулина 2,0 ± 0,2 ммоль/л, содержание общего кальция составляло 1,6 ± 0,02 ммоль/л, величина КТ-активности — 4,56 ± 0,6 мед/мл.

У крыс, которым вводили обзидан, гипогликемия достигала самых низких величин — 1,3±0,3 ммоль/л. Уровень общего кальция у них понижался до 1,9±0,01 ммоль/л, КТ-активность увеличивалась лишь до 0,63 ± 0,2 мед/мл, что находилось в пределах нормы.

Ганглиоблокаторы тормозят передачу нервного возбуждения с преганглионарных на постганглионарные волокна вегетативных нервов, вегетативный узел (симпатический и парасимпатический) становится нечувствительным к возбуждающему действию раздражителей, М-холиноблокатор тормозит проведение возбуждения, блокируя рецепторы постганглионарных парасимпатических, а а- и в-адреноблокаторы блокируют рецепторы постганглионарных симпатических волокон, в результате чего изменяются функции всех органов, снабженных вегетативной иннервацией. Можно полагать, что в наших исследованиях инъекция ганглиоблокатора пентамина, М-холиноблока-тора атропина, а-адреноблокатора трапафена и в-адреноблокатора обзидана на фоне инсулиновой гипогликемии вызывает угнетение функциональной активности С-клеток щитовидной железы, продуцирующих кальцитонин, в связи с чем наблюдалось снижение КТ-активности плазмы крови крыс. Подтверждением тому могут служить результаты исследований об изменении активности С-клеток щитовидной железы крыс с экспериментальным гипертиреозом при введении в-адреноблокатора пропранолола [16].

Снижение содержания общего кальция в плазме крови при инсулиновой гипогликемии на фоне введения пентамина, тропафена и обзидана, несмотря на угнетение секреции кальцитонина, связано, по-видимому, с известным гипокальциемическим действием инсулина. Введение же атропина не вызывало значительной гипокальциемии. Известно, что М-холиноблокатор атропин влияет на периферические М-холинорецепторы, делает их нечувствительными к ацетилхолину, образующемуся в области окончаний пост-ганглионарных парасимпатических нервов. В настоящее время установлено, что парасимпатическая нервная система стимулирует секрецию инсулина, а симпатическая — угнетает [10]. Следовательно, инъекция атропина, блокируя проведение вобуждения по парасимпатическим волокнам, вызывала торможение секреции инсулина, в результате чего значительного снижения содержания общего кальция в плазме крови крыс при инсулиновой гипогликемии не происходило.

В отличие от ганглиоблокатора пентамина тропафен и обзидан — а- и в-адренобло-каторы прерывают проведение эфферентного нервного возбуждения, действуя на пост-ганглионарные сигналы и не влияя на передачу возбуждения в ганглиях. а-адренобло-катор блокирует главным образом стимулирующие эффекты, связанные с возбуждением а-адренорецепторов, причем не блокирует все эффекты адреналина. Мало меняется его гипергликемическое действие. В связи с этим на фоне введения тропафена при инсулиновой гипогликемии уровень глюкозы снижается значительно меньше, чем на фоне введения пентамина, атропина и обзидана. в-Адреноблокаторы блокируют эффекты, связанные с действием симпатических нервных импульсов и симпатических веществ на в-адренорецепторы. Обзидан обладает только блокирующим действием на в-ад-ренорецепторы, блокируя одновременно в1- и в2-рецепторы. Как упоминалось выше,

симпатическая нервная система тормозит секрецию инсулина [10]. Поскольку введение обзидана блокировало симпатические нервные импульсы, поступающие к в-клеткам поджелудочной железы, то угнетения секреции инсулина не происходило, и в наших исследованиях наблюдалась более значительная гипогликемия при введении инсулина.

Таким образом, введение ганглиоблокатора, М-холиноблокатора, а- и в-адренобло-каторов приводило к резкому снижению секреции кальцитонина при инсулиновой гипогликемии, что указывает на участие симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы посредством синаптической передачи нервного возбуждения в ганглиях и через тканевые адрено- и холинорецепторные структуры.

Установленное нами повышение секреции кальцитонина при инсулиновой гипогликемии имеет биологическое значение, так как кальцитонин и уменьшение концентрации внеклеточного кальция тормозят секрецию эндогенного инсулина [3, 9] — основного сахаропонижающего гормона и тем самым предохраняют организм от чрезмерного снижения уровня глюкозы в крови. Помимо того, под влиянием кальцитонина увеличивается секреция сахароповышающих гормонов — катехоламинов и кортизола [14]. С другой стороны, кальцитонин оказывает гипергликемическое действие [4, 15], также противодействуя гипогликемии.

Суммируя результаты проведенных исследований, можно сделать следующее заключение: 1) инсулиновая гипогликемия вызывает активирование секреции кальцито-нина, выражающееся в увеличении КТ-активности плазмы и снижении содержания в ней общего кальция; 2) комбинированное введение инсулина и глюкозы, не вызывающее гипогликемии, не отражается существенно на КТ-активности плазмы и содержании в ней кальция. Это указывает на роль гипогликемии в стимуляции секреции кальци-тонина; 3) на фоне дефицита глюкокортикоидов, вызванных двусторонней адренал-эктомией, инсулиновая гипогликемия приводит к снижению уровня общего кальция и незначительному увеличению ее КТ-активности. Это позволяет считать, что глюкокор-тикоиды принимают участие в активировании секреции кальцитонина при инсулиновой гипогликемии; 4) отсутствие повышения КТ-активности плазмы крови у панкреатэк-томированных крыс при инсулиновой гипогликемии дает основание полагать, что в значительной мере это связано с отсутствием глюкагона; 5) пентамин, тропафен, обзи-дан, и особенно атропин, оказывают тормозящее влияние на секрецию кальцитонина, несмотря на одновременное усиление гипогликемии, вызванной инъекцией инсулина; 6) сопоставление данных позволяет считать, что в регуляции секреции кальцитонина при инсулиновой гипогликемии участвуют симпатический и парасимпатический отделы, а также периферические М-холинорецепторные, а- и в-адренорецепторные структуры вегетативной нервной системы.

Литература

1. Бутакова С. С. Секреция кальцитонина при различных состояниях углеводного обмена в онтогенезе у крыс // Материалы VII Всерос. конф. «Нейроэндокринология-2005». СПб., 2005. С. 36-37.

2. Бутакова С. С. Кальцитониновая активность плазмы и содержание в ней кальция при различных состояниях углеводного обмена в онтогенезе у крыс // Материалы Всерос. симпозиума с междунар. участием «Гормональные механизмы адаптации» (Посвящается памяти проф. А. А. Филаретова). 3-5 октября 2007. СПб., 2007. С. 32.

3. Бутакова С. С. Кальцитонин — модулятор секреторного процесса поджелудочной железы // Механизмы функционирования висцеральных систем: VI Всерос. конф. с междунар.

участием, посвящ. 50-летию открытия А. М. Уголевым мембранного пищеварения. Тезисы докладов. СПб.: Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН, 2008. С. 26-27.

4. Бутакова С. С., Ноздрачев А. Д. Влияние однократного введения препаратов кальци-тонина на уровень глюкозы и кальция у крыс разных возрастных групп // Успехи геронтол. 2010. Т. 23, 1. С. 93-97.

5. Ноздрачев А. Д., Поляков Е.Л., Багаев В. А. Экспериментальная хирургия лабораторных животных. СПб.; М.; Краснодар, 2007. С. 125, 130-132.

6. Оелочник Л. И., Брискин А. И., Антонова Е. Е. Фотоэлектроколориметрическое определение концентрации кальция в плазме или сыворотке с применением ЭДТА и мурексида // Химико-фармацевт. журн. 1978. Т. 12, №10. С. 138-140.

7. Усватова И. Я., Панков Ю. А. Флуориметрические методы определения стероидных гормонов в биологических жидкостях. М., 1969. С. 38.

8. Шустов С. Б., Халимов Ю.Ш. Функциональная и топическая диагностика в эндокринологии. СПб., 2001. 238 с.

9. Ярошевский Ю. А., Даринский Ю. А., Бутакова С. С. Влияние кальцитонина на секрецию инсулина и глюкагона поджелудочной железой // Пробл. эндокринол. 1989. Т. 35, №4. С. 58-61.

10. Ahren B. Automatic regulation of islet hormone secretion — implications for health and disease // Diabetologia. 2000. Vol. 43, N4. P. 393-410.

11. Frank H., Kirberger E. Eine Kolorimetrische methode zur bestimmung der «Wahren Glucose» und Galactose in 0,05 rm3 // Blut. Biochem. Ztschr. 1950. Bd 320. P. 359-367.

12. Laljee H. C. K., Smith K. I., Dorrington K. J. The assay of human thyrocalcitonin in mice // Calcitonin. Proceedings of the symposium on thyrocalcitonin and the C-cells. London: Heinemann medical books LTD, 1967. P. 32-35.

13. Lineberry M. P., Waite L. C. Calcitonin responses in intact and adrenalectomized rats // Life Sci. 1978. Vol. 22, N6. P. 511-518.

14. Moore M. C., Lin D. W., Colburn C. A. et al. Insulin- and glucagons-independent effects of calcitonin gene-related peptide in the conscious dog // Metab. Clin. Exp. 1999. Vol. 48, N5. P. 603-610.

15. Young A. A., Wang M. W., Gedulin B. Diabetogenic effects of salmon calcitonin are attributable to amylin-like activity // Metab. Clin. Exp. 1995. Vol. 44, N12. P. 1581-1589.

16. Zbucki R.L., Dadan I., Sawicki B., Bialuk I., Kosiozek P., Winnicka M., Puchalski Z. Propranololalters the activity of thyroid C cells in the experimental model of hyperthyroiism in rats: Tez. 15 International Congress of the Polish Pharmacological Society. Poznan. Sept., 12-14, 2004 // Pol. J. Pharmacol. 2004. Vol. 56. Suppl. P. 223.

Статья поступила в редакцию 3 декабря 2009 г.