Гистологические свойства тапиоковых крахмалов, модифицированных амилосубтилином и амилазой Bacillus licheniformis

УДК 664

М. С. Цыганов, Е. В. Никитина ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТАПИОКОВЫХ КРАХМАЛОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ АМИЛОСУБТИЛИНОМ И АМИЛАЗОЙ BACILLUS LICHENIFORMIS

Ключевые слова: амилаза, амилосубтилин, тапиоковый крахмал, гистологические свойства, световая микроскопия.

Модификация тапиокового крахмала была проведена с помощью промышленного амилосубтилина Г3Х и амилазы Bacillus licheniformis. Ферментно модифицированные тапиоковые крахмалы, при варьировании концентрации фермента, демонстрировали различное поведение при микроскопировании. Максимальную деструкцию гранул исследуемых крахмалов наблюдали у образцов А-0,5 и В-1, присутствовали множественные осколочные остатки гранул с неправильной формой, разрыхленной поверхностью, превалировало содержание мелких гранул.

Key words: amylase, amylosubtilin, tapioca starch, histological properties, microscopy.

The modification of tapioca starch was carried out with industrial amylosilutilin G3X and amylase Bacillus licheniformis. Enzymatically modified tapioca starches, when the enzyme concentration was varied, showed different behavior during microscopy. Maximum destruction of the granules of the investigated starches was observed in samples A-0.5 and B-1, multiple fragment fragments of irregularly shaped granules with a loosened surface were present, the content of fine granules prevailed.

Введение

Крахмал является основной энергетической валютой растений и одним из самых распространенных полисахаридов, обнаруженным в природе. Он состоит из остатков глюкозы, связанных только двумя типами связей: а-1,4 и а-1,6 гликозидными связями. Крахмал накапливается в виде гранул в различных типах тканей растений на протяжении их вегетации [1]. Гранулы крахмала отличаются по размеру, форме и свойствам в зависимости от их ботанического происхождения [2].

Кассава (Manihot esculenta) является одним из самых важных источников крахмала для коммерческого производства в тропических и субтропических странах. Данная культура является третей по потреблению и культивированию после риса и кукурузы, и согласно FAQ ее производство на 2014 год составило 272,93 млн. тонн. Лидерами по производству маниоки являются Нигерия (54,83 млн. тонн), Тайланд (30,00 млн. тонн), Индонезия (23,43 млн. тонн), Бразилия (23,25 млн. тонн) и Гана (16,52 млн. тонн) [3]. Содержание сухого вещества в кассаве составляет около 33,6 %, из которых в среднем 73,7 до 84,9% приходится на крахмал [4,5]. По сравнению с другими тропическими культурами крахмал из данного вида растения является самым изученным [6].

Крахмал широко применяется во многих отраслях промышленности, в частности, в пищевых производствах, где он используется в качестве основного сырья для питания человека, а также в качестве пищевой добавки. В составе пищевых систем крахмал может работать как загуститель или эмульгатор, как заменитель жира, как гелеобразующий элемент или водосорбиру-ющий агент, как субстрат для ферментации и как смазывающий или склеивающий наполнитель. Однако, для достижения такого широкого спектра применения, крахмалы зачастую подвергают определенной модификации: химической, физической или ферментной [7]. Эти модификации могут улучшить физико-химические свойства дисперсий крахмала, улучшить термические

свойства, растворимость, замедлить ретрограда-цию, улучшить прозрачность и механические свойства [8].

Преимуществом ферментной модификации является ее низкая себестоимость, образование меньшего количества побочных продуктов, высокий выход специфичного продукта, лучший контроль за процессом модификации [9].

Целью данной работы являлся анализ гистологических свойств, модифицированных та-пиоковых крахмалов, при варьировании концентрации ферментов, в качестве которых использовали амилосубтилин и амилазу Bacillus licheniformis.

Материалы и методы исследования

Используемые крахмалы. В качестве объектов исследования выступал нативный тапиоковый крахмал (Nat) (ГОСТ Р 51953-2002) и крахмалы, ферментированные амилосубтилином и препаратом амилазы B. licheniformis. Характеристика ферментных бактериальных препаратов была приведена ранее [10, 11].

Ферментную модификацию осуществляли в дистиллированной воде при pH=7 при температуре 40 °C, 60 мин, с регулярным перемешиванием реакционной смеси крахмала и фермента. Концентрация крахмала в реакционной смеси 30г/100 мл. Реакцию гидролиза останавливали путем добавления концентрированной серной кислоты до pH=2. Затем крахмал отделяли от жидкости фильтрованием и высушивали при 40°C в сушильном шкафу с дальнейшим высушиванием при комнатной температуре.

Крахмалы, модифицированные амилосубти-лином, были названы А-1; А-0,5; А-0,25; А-0,1; А-0,05 [10], а крахмалы, модифицированные амилазой B. licheniformis Bl-1; Bl-0,5; Bl-0,25; Bl-0,1; Bl-0,05 [11] (табл.1 ).

Для дальнейших исследований высушенный крахмал измельчали до порошкообразного состояния. Влажность крахмалов была в пределах нормы и варьировала от 7 до 9 %.

Таблица 1 - Варианты и условия получения фер-ментно обработанных крахмалов

Для световой микроскопии использовали предварительно выдержанный течение 10 мин при комнатной температуре 5 % растворы полученных крахмалов, которые окрашивали раствором Люголя (I2/KI раствор; 1:2 w/w). Немедленно просматривали под световым микроскопом Axio Imager Carl Zeiss, Germany в комплекте с видео камерой. Для просмотра использовали увеличение в 400 раз.

Методики анализа амилозы, декстрозного эксвива-лента, динамической вязкости и температуры желиро-вания описаны ранее [10, 11].

Результаты и их обсуждение

Наблюдение исследуемого объекта под микроскопом давно признано самым быстрым и эффективным методом, который позволяет понять морфологические особенности и структуру гранул крахмалов, благодаря чему можно предположить дальнейшую пригодность крахмалов для промышленного использования [12].

При микроскопировании гранулы нативного крахмала визуализировались в виде частиц с четко выраженным контуром, округлой формой, окраска гранул интенсивная, равномерная по всей поверхности, незначительно просматривается слоистая структура гранул (рис.1). Цвет гранул интенсивно сине-фиолетовый, что свидетельствует о преобладании амилопектина.

В случае обработки тапиокового крахмала амило-субтилином в самой малой концентрации (образце А-0,05) выявлены незначительное просветление гранул, что свидетельствует о снижении концентрации амило-пектина, и размывания границ крупных гранул. Значимые изменения в морфологии гранул наблюдали у образца А-0,1 (активность фермента 0,83 U/г крахмала), в этом случаев в первую очередь были разрушены границы крупных гранул, их поверхностные слои, визуализируются четкие радиальные линии, что возможно свидетельствует о затрагивании поверхностных слоев гранулы крахмала. У образца А-0,25 наблюдалось разрушение крупных частиц, у которых четко проявлялись

радиальные линии и концентрические круги, ряд гранул потеряли четкую структуру и выглядили в виде осколков. Увеличение концентрации фермента при обработке крахмалов приводило к более масштабному разрушению гранул, количество поврежденных частиц больше, наблюдалось увеличение количества гранул с изъязвлениями, выпячиваниями, обломками, появились частицы неправильной формы с концентрическими и радиальными линиями. У образца А-1 (максимальная доза фермента из используемых) наблюдали снижение процента крупных гранул, множественные осколки неправильной формы.

При модификации амилазой Bacillus licheniformis гидролиз молекул и процесс деградации гранул происходил схоже, однако интенсивность процесса была выше. Значимые изменения структуры гранул крахмала наблюдали уже у образца Bl -0,05 (наименьшей концентрация обработки - 0,415 U/г крахмала). Визуализировали уменьшение сине-фиолетовой окраски крахмала, гранулы с разрыхлением поверхности, начинали проявляться повреждения в виде небольших зон концентрических и радиальных полос. Эти эффекты нарастали по мере увеличения дозы фермента при модификации.

Увеличение количества ферментного препарата B. licheniformis до 8,3 U/г крахмала (образец Bl-1) приводило к усугублению этих эффектов: наблюдали гранулы крахмала неправильной формы с появлением внутри гранул участков с темноокрашенным амилопектиновым содержимым. Наличие темных контуров у исследуемых образцов свидетельствуют о разрушении амилозы и увеличении доли амилопектина на поверхности гранул, что согласуется с ранее проведенными исследованиями по анализу физико-химических параметров (табл. 2).

Таблица 2 - Влияние ферментной обработки на физико-химические и технологические свойства тапиоковых крахмалов

Выявлено, что изменение количества амилозы, дектрозного эквивалента, динамической вязкости и температуры желирования происходили уже после обработки минимальными дозами

Вариант Активность фер- Вид модифицирован-

мента, ного крахмала

U/г крахмала

0 0 Нативный

1 8,3 А-1

2 4,15 А-0,5

3 2,07 А-0,25

4 0,83 А-0,1

5 0,415 А-0,05

6 8,3 Bl -1

7 4,15 Bl -0,5

8 2,07 Bl -0,25

9 0,83 Bl -0,1

10 0,415 Bl -0,05

Вид крахмала Содеражание амилозы, % Дестрозный эквивалент, г глюкозы/100 г крахмала Динамическая вязкость, Т Температура желирования, °C

Нативный 5,22 10,55 8,43 52,7

А-0,05 20,22 4,26 2,74 55,1

А-0,1 22,69 4,77 3,17 52,1

А-0,25 24,99 5,49 2,03 52,3

А-0,5 23,54 4,26 4,52 51,8

А-1 22,26 1,73 4,85 50,9

Bl-0,05 22,69 3,89 3,08 55,0

Bl-0,1 25,33 6,27 1,44 54,8

Bl-0,25 23,71 5,10 2,40 55,8

Bl-0,5 20,47 5,31 3,98 57,5

Bl-1 16,47 3,97 4,33 59,9

ферментных препаратов (образцы А-0,05 и Bl-0,05) (табл.2).

Нативный

А-1

Bl-1

Рис. 1 - Морфологические свойства нативного и ферментно модифицированных тапиоковых крахмалов

Таким образом, результаты по исследованию влияния обработки промышленным амилосубти-лином Г3Х и амилазой Bacillus licheniformis на гистологические свойства тапиоковых крахмалов выявили следующие закономерности.

Значительный видимый разрушительный эффект гранул ферментно модифицированных та-пиоковых крахмалов, в первую очередь, зависит от концентрации используемых ферментных бактериальных препаратов.

При использовании больших доз ферментных препаратов выявлены различия в их действии, как на морфологическом, так и на физико-химическом уровнях. В больших дозах (8,3 U/г крахмала, образец А-1, Bl-1) наблюдаются четкие различия в морфологии: у образца А-1 визуализировались мелкие гранулы с небольшими обломками, тогда как у Bl-1 выявляли множественные утратившие четкие границы частицы крупных размеров, крупные разбухшие гранулы. Эти закономерности согласуются с химическим анализом, у А-1 количество амилозы находилсь на урвоне других амилосубтилиновых крахмалов, а у Bl-1 - это количество сокращалось. Эти химичексие перестройки ферментативного характера ображались на вязкости и температуре желирования. Наблюдаемый эффект, возможно, связан с механизмом действия используемого фермента: препарат амилосубтилин состоит из смеси ферментов [13], в то время как амилаза Bacillus licheniformis имеет ведущую а-амилазную активность (250 U/мл при 40 °C).

Таким образом, исследования морфологических изменений гранул крахмала выявили, что результаты ферментативной модификации зависят от амилолитической активности ферментного препарата, а также от источника ферментного препарата. Последний фактор, очевидно, определяет специфический механизм действия мульти-ферментных препаратов на крахмал, а также характеризуется наличием минорных ферментативных активностей.

Использование описанных нюансов в использовании мультиферментных бактериальных препаратов позволит получать биологически модифицированные безопасные крахмалы с различными технологическими свойствами для различных отраслей промышленности, в том числе в пищевых производствах.

Литература

1. Appelqvist I.A.M., Debet M.R.M. // Food Reviews International. - 1997. - V. 13. - № 2. - P. 163-224.

2. Tester R.F., Karkalas J., Qi X. // Journal of Cereal Science. - 2004. - V. 39. - № 2. - P. 151-165.

3. Statistics. FAO. Food and Agriculture Organization of the United Nations [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.fao.org/statistics/en/, свободный. - Проверено 23.06.2017.

4. Sancheza T., Salcedoa E., Ceballosa H., Dufoura D., Maflaa G., Morantea N., Callea F., Péreza J.C., De-

boucka D., Jaramilloa G., Morenoa I.X. // Starch - Stärke. -2009. - V. 61. - № 1. - P. 12-19.

5. Moorthy S.N. // Starch in Food: Structure, Function and Applications. - 2004. - P. 321-359.

6. Rickard J., Asaoka M., Blanshard M.V. // Trop. Sci. - 1991. -V. 31. - № 2. - P. 189-207.

7. Hizukuri S. // Food Science and Technology. - 1996. - V. 74. - P. 347-429.

8. Oladzadabbasabadi N., Ebadi S., Nafchi A.M., Karim A.A., Kiahosseini S.R. // Carbohydr. Polym. - 2017. - V. 160. - P. 43-51.

9. Storz E., Steffens K.J. // Starch-Stärke. - 2004. - V. 56. - № 2. - P. 58-62.

10. Никитина Е.В., Цыганов М.С. // Вестник технологического университета. - 2017. - Т 20. - № 2, -C.156-158.

11. Никитина Е.В., Цыганов М.С. // Вестник технологического университета. - 2017. - Т 20. - № 13, -C.133-136.

12. James Jr D.W., Preiss J., Elbein A.D. // The Polysaccharides. - 1985. - V. 3. - P. 107-207.

13. ГОСТ Р 57232-2016 Препарат ферментный амило-субтилин Г3х. Технические условия. М.: Стандар-тинформ, 2016. - 7 с.

© М.С. Цыганов - студент каф. технологии пищевых производств КНИТУ, refuser@inbox.ru; Е. В. Никитина - канд. биол. наук, доц. каф. технологии пищевых производств КНИТУ, НОЦ фармацевтики КФУ, ev-nikitina@inbox.ru.

© M. S. Tsyganov - the student of the department of technology of food production KNRTU, refuser@inbox.ru; E. V. Nikitina -PhD, Assoc. of prof. of Dep. Of food production technology KNRTU, REC pharmacy, Kazan (Volga Region) Federal University, ev-nikitina@inbox.ru.